(57)【要約】  それぞれが異なる細胞集団又は細胞系列を含む２つ以上の別個の領域を含む組織構成物を生成する方法を記載する。本方法は、２つ以上の物理的に別個の領域を含む支持基材又は基材アセンブリを設けるステップであって、支持基材又は基材アセンブリの２つ以上の物理的に別個の領域は互いに異なる、上記設けるステップと、支持基材又は基材アセンブリ上に１つ以上の細胞を堆積／配置するステップと、を含む。細胞は、少なくとも２つのゾーン（例えば、増殖ゾーン及び非増殖ゾーン）を有して、インビトロ腸モデルとして動作可能な連続的単層を形成することが可能である。このモデルは２次元であり、従って、迅速且つ軽快な画像化を容易にする。組織構成物を含む系、並びに組織構成物を使用して、腸細胞に対する薬、栄養補給食品、及び代謝産物の効果を測定する方法についても記載する。
2021525075.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それぞれが異なる細胞集団又は細胞系列を含む２つ以上の別個の領域を含む組織構成物を生成する方法であって、
（ａ）２つ以上の物理的に別個の領域を含む支持基材を設けるステップであって、前記支持基材の前記２つ以上の物理的に別個の領域は互いに異なる、前記設けるステップと、
（ｂ）前記支持基材上に１つ以上の細胞を堆積／配置するステップであって、前記１つ以上の細胞は前記支持基材に定着又は接着して、前記支持基材上で増殖する、前記堆積／配置するステップと、
を含み、
前記１つ以上の細胞は、前記支持基材の前記２つ以上の物理的に別個の領域上で異なる細胞集団又は細胞系列に転換する、
方法。
【請求項２】
前記支持基材の前記２つ以上の物理的に別個の領域は、異なる物理特性を含み、前記１つ以上の細胞は、前記支持基材の前記２つ以上の物理的に別個の領域上で、前記支持基材の前記２つ以上の物理的に別個の領域の前記異なる物理特性に応じて、異なる細胞集団又は細胞系列に転換する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記異なる物理特性は、多孔率、透過率、剛性率、又はこれらの組み合わせである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記１つ以上の細胞は初代細胞を含み、任意選択で、前記１つ以上の細胞は初代上皮細胞を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記２つ以上の物理的に別個の領域のうちの１つ以上を１つ以上の刺激に曝すステップを更に含み、前記１つ以上の刺激のそれぞれは、薬品、栄養補給食品、シグナリング分子、毒素、炎症性メディエータ、及び微生物由来化合物から成る群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記１つ以上の刺激の効果を検出又は測定するステップを更に含み、任意選択で、前記検出又は測定するステップは、前記１つ以上の刺激に曝された後の細胞分化及び細胞増殖の一方又は両方を、前記１つ以上の刺激に曝される前の細胞分化及び細胞増殖の一方又は両方、及び／又は、前記１つ以上の刺激に曝されていない比較可能な組織構成物中の細胞分化及び細胞増殖の一方又は両方と比較することを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
２つ以上の別個の領域を含む組織構成物を生成する装置であって、
底壁と、前記底壁から上方に延びる少なくとも１つの側壁と、前記少なくとも１つの側壁によって画定される上部開口部と、を含む管腔容器と、
前記底壁上にあるか前記底壁を含む細胞支持基材であって、前記細胞支持基材は２つ以上の物理的に別個の領域を含み、前記細胞支持基材の前記２つ以上の物理的に別個の領域は互いに異なり、前記細胞支持基材の前記２つ以上の物理的に別個の領域は異なる物理特性を含む、前記細胞支持基材と、
を含む装置。
【請求項８】
前記細胞支持基材は、異なる物理特性を含む２つ以上の物理的に別個の領域を含む単一材料層を含む、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
前記細胞支持基材は、第１の材料層及び第２の材料層を含み、前記第１の層は前記第２の層に被せられ、前記第１の層及び前記第２の層は異なる物理特性を有し、前記第１の層及び前記第２の層の一方が、前記第１の層又は前記第２の層の一方の表面から前記第１の層又は前記第２の層の反対側の表面まで延びる１つ以上の開口を含み、任意選択で、前記１つ以上の開口は微細穴である、請求項７に記載の装置。
【請求項１０】
前記第１の層は多孔質材料を含み、前記第２の層は非多孔質材料を含み、前記第２の層は前記１つ以上の微細穴を含み、任意選択で、前記第２の層は前記管腔容器の前記底壁である、請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
前記第１の層はヒドロゲルを含み、任意選択で、前記第１の層はコラーゲンを含む、請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
基礎容器を更に含み、前記基礎容器は、底壁と、前記底壁から上方に延びる少なくとも１つの側壁と、を含み、前記底壁及び前記少なくとも１つの側壁はウェルを画定し、
前記管腔容器は、前記基礎容器の前記ウェル内に保持され、
前記基礎容器の前記底壁は、前記管腔容器の前記底壁から間隔を置かれており、
基礎容器が、前記基礎容器の前記底壁と前記管腔容器の前記底壁との間で、且つ／又は前記基礎容器の前記少なくとも１つの側壁と前記管腔容器の前記少なくとも１つの側壁との間で画定される、
請求項７〜１１のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１３】
腸陰窩又は結腸陰窩の２次元生細胞培養モデルを調製する方法であって、
請求項７〜１２のいずれか一項に記載の装置を用意するステップと、
前記細胞支持基材上に１つ以上の上皮細胞を堆積／配置するステップであって、前記１つ以上の細胞は、前記細胞支持物に定着するか接着して、前記細胞支持基材又は基材アセンブリ上で増殖し、前記１つ以上の細胞は、前記支持基材又は基材アセンブリの前記２つ以上の別個の領域上で、前記支持基材又は基材アセンブリの前記物理的に別個の領域の前記異なる物理特性に応じて、異なる細胞集団又は細胞系列に転換する、前記堆積／配置するステップと、
を含む方法。
【請求項１４】
前記装置は基礎容器を含み、前記基礎容器は、前記基礎容器の前記底壁と前記管腔容器の前記底壁との間で、且つ／又は前記基礎容器の前記少なくとも１つの側壁と前記管腔容器の前記少なくとも１つの側壁との間で画定され、前記方法は、前記基礎容器に第１の増殖培地を供給し、前記管腔容器に第２の増殖培地を供給するステップであって、前記第１の増殖培地と前記第２の増殖培地は同じであってよく、異なってもよい、前記供給するステップを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１の増殖培地と前記第２の増殖培地は、前記１つ以上の細胞が堆積／配置された後の少なくとも第１の期間にわたって同一である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１及び第２の増殖培地は、幹細胞の増殖を支援する増殖因子を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の期間が経過した後に前記第１又は第２の増殖培地を第３の増殖培地に交換するステップを含み、前記第３の増殖培地は前記第１及び第２の増殖培地と異なり、任意選択で、前記第３の増殖培地は、幹細胞の増殖を支援する増殖因子がない、請求項１５又は請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第３の増殖培地は１つ以上の刺激を含み、各刺激は、薬品、栄養補給食品、シグナリング分子、毒素、炎症性メディエータ、及び微生物由来化合物から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１及び第２の増殖培地の一方又は両方が１つ以上の刺激を含み、各刺激は、薬品、栄養補給食品、シグナリング分子、毒素、炎症性メディエータ、及び微生物由来化合物から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記異なる細胞集団又は細胞系列のうちの１つ以上に対する前記１つ以上の刺激の効果を検出又は測定するステップを更に含み、任意選択で、前記検出又は測定するステップは、前記１つ以上の刺激に曝された後の、前記１つ以上の異なる細胞集団又は細胞系列における細胞分化及び細胞増殖の一方又は両方を、前記１つ以上の刺激に曝される前の、前記１つ以上の異なる細胞集団又は細胞系列における細胞分化及び細胞増殖の一方又は両方、及び／又は、前記１つ以上の刺激に曝されていない比較可能な細胞培養モデルの１つ以上の細胞集団又は細胞系列における細胞分化及び細胞増殖の一方又は両方と比較することを含む、請求項１８又は１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、開示内容が参照により完全な形で本明細書に組み込まれている、２０１８年５月２５日に出願された米国特許仮出願第６２／６７６，４１８号の利益及び優先権を主張するものである。
連邦支援の陳述
【０００２】
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された認可番号ＤＫ１０９５５９の下に、政府支援を受けてなされたものである。米国政府は本発明に対して一定の権利を有する。
【０００３】
本開示対象は、様々な細胞集団又は細胞系列を含む２つ以上の物理的に異なった領域を含む組織構成物を生成する方法に関する。本開示対象は更に、その組織構成物を生成する方法及び装置、並びに、その組織構成物を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
インビトロ培養系（例えば、腸オルガノイド培養、腸の自己複製単層、ガットオンチップ型デバイス等）の開発により、インビボ動物モデルの使用より有利である有用なインビトロプラットフォームが提供される。しかしながら、現時点で利用可能なインビトロプラットフォームは、腸構造のインビボ微小環境及び／又は細胞区画化を再現できず、或いは、それらの３次元性の為に（特に高スループットアッセイにおいて）アッセイ又は画像化することが困難である。
そこで、関心対象の組織構成物、特に２つ以上の異なる細胞集団を含みうる組織構成物（例えば、腸組織）を平面上に生成する新しい方法が常に必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記従来の技術の課題を解決するためになされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本概要では、本開示対象の幾つかの実施形態を列挙し、多くの場合、これらの実施形態の変形形態及び置換形態を列挙する。本概要は、多様な実施形態の例示に過ぎない。所与の実施形態の１つ以上の代表的な特徴の言及も同様に例示である。そのような実施形態は、典型的には、言及された特徴があってもなくても存在してよく、同様に、そのような特徴は、本概要で列挙されているかどうかにかかわらず、本開示対象の他の実施形態に適用されてよい。過剰な繰り返しを避ける為に、本概要は、そのような特徴のあらゆる可能な組み合わせを列挙又は示唆するものではない。
【０００７】
幾つかの実施形態では、それぞれが異なる細胞集団又は細胞系列を含む２つ以上の別個の領域を含む組織構成物を生成する方法を提供する。そのような方法は、幾つかの態様では、（ａ）２つ以上の物理的に別個の領域を含む支持基材を設けるステップであって、支持基材の２つ以上の物理的に別個の領域は互いに異なる、上記設けるステップと、支持基材上に１つ以上の細胞を堆積／配置するステップであって、１つ以上の細胞は支持基材に定着又は接着して、支持基材上で増殖する、上記堆積／配置するステップと、を含んでよい。１つ以上の細胞は、支持基材の２つ以上の物理的に別個の領域上で異なる細胞集団又は細胞系列に転換することが可能である。
【０００８】
幾つかの態様では、支持基材の２つ以上の物理的に別個の領域は、異なる物理特性を含み、１つ以上の細胞は、支持基材の２つ以上の物理的に別個の領域上で、支持基材の２つ以上の物理的に別個の領域の異なる物理特性に応じて、異なる細胞集団又は細胞系列に転換する。幾つかの実施形態では、異なる物理特性は、多孔率、透過率、剛性率、又はこれらの組み合わせである。幾つかの実施形態では、１つ以上の細胞は初代細胞を含み、任意選択で、１つ以上の細胞は初代上皮細胞を含む。
【０００９】
そのような方法は更に、２つ以上の物理的に別個の領域のうちの１つ以上を１つ以上の刺激に曝すステップを含んでよく、１つ以上の刺激のそれぞれは、薬品、栄養補給食品、シグナリング分子、毒素、炎症性メディエータ、及び微生物由来化合物から成る群から選択される。幾つかの実施形態では、本開示の方法は更に、１つ以上の刺激の効果を検出又は測定するステップを含んでよく、任意選択で、検出又は測定するステップは、１つ以上の刺激に曝された後の細胞分化及び細胞増殖の一方又は両方を、１つ以上の刺激に曝される前の細胞分化及び細胞増殖の一方又は両方、及び／又は、１つ以上の刺激に曝されていない比較可能な組織構成物中の細胞分化及び細胞増殖の一方又は両方と比較することを含む。
【００１０】
本明細書では、２つ以上の別個の領域を含む組織構成物を生成する装置を開示しており、本装置は、底壁と、底壁から上方に延びる少なくとも１つの側壁と、少なくとも１つの側壁によって画定される上部開口部と、を含む管腔容器と、底壁上にあるか底壁を含む細胞支持基材であって、細胞支持基材は２つ以上の物理的に別個の領域を含み、細胞支持基材の２つ以上の物理的に別個の領域は互いに異なり、細胞支持基材の２つ以上の物理的に別個の領域は異なる物理特性を含む、細胞支持基材と、を含む。幾つかの実施形態では、細胞支持基材は、異なる物理特性を含む２つ以上の物理的に別個の領域を含む単一材料層を含む。幾つかの実施形態では、細胞支持基材は、第１の材料層及び第２の材料層を含み、第１の層は第２の層に被せられ、第１の層及び第２の層は異なる物理特性を有し、第１の層及び第２の層の一方が、第１の層又は第２の層の一方の表面から第１の層又は第２の層の反対側の表面まで延びる１つ以上の開口を含み、任意選択で、１つ以上の開口は微細穴である。幾つかの実施形態では、第１の層は多孔質材料を含み、第２の層は非多孔質材料を含み、第２の層は１つ以上の微細穴を含み、任意選択で、第２の層は管腔容器の前記底壁である。幾つかの実施形態では、第１の層はヒドロゲルを含み、任意選択で、第１の層はコラーゲンを含む。
【００１１】
幾つかの実施形態では、本装置は更に、基礎容器を含み、基礎容器は、底壁と、底壁から上方に延びる少なくとも１つの側壁と、を含み、底壁及び少なくとも１つの側壁はウェルを画定し、管腔容器は、基礎容器のウェル内に保持されており、基礎容器の底壁は、管腔容器の底壁から間隔を置かれており、基礎容器が、基礎容器の底壁と管腔容器の底壁との間で、且つ／又は、基礎容器の少なくとも１つの側壁と管腔容器の少なくとも１つの側壁との間で画定されている。
【００１２】
本明細書では又、腸陰窩又は結腸陰窩の２次元生細胞培養モデルを調製する方法を提示しており、そのような方法は、本明細書に開示の装置を提供するステップと、細胞支持基材上に１つ以上の上皮細胞を堆積／配置するステップであって、１つ以上の細胞は、細胞支持物に定着するか接着して、細胞支持基材又は基材アセンブリ上で増殖し、１つ以上の細胞は、支持基材又は基材アセンブリの２つ以上の別個の領域上で、支持基材又は基材アセンブリの物理的に別個の領域の異なる物理特性に応じて、異なる細胞集団又は細胞系列に転換する、上記堆積／配置するステップと、を含む。幾つかの実施形態では、本装置は基礎容器を含み、基礎容器は、基礎容器の底壁と管腔容器の底壁との間で、且つ／又は基礎容器の少なくとも１つの側壁と管腔容器の少なくとも１つの側壁との間で画定され、本方法は、基礎容器に第１の増殖培地を供給し、管腔容器に第２の増殖培地を供給するステップであって、第１の増殖培地と第２の増殖培地は同じであってよく、異なってもよい、上記供給するステップを含む。幾つかの実施形態では、第１の増殖培地と第２の増殖培地は、１つ以上の細胞が堆積／配置された後の少なくとも第１の期間にわたって同一である。幾つかの実施形態では、第１及び第２の増殖培地は、幹細胞の増殖を支援する増殖因子を含む。
【００１３】
幾つかの実施形態では、本方法は、第１の期間が経過した後に第１又は第２の増殖培地を第３の増殖培地に交換するステップを含み、第３の増殖培地は第１及び第２の増殖培地と異なり、任意選択で、第３の増殖培地は、幹細胞の増殖を支援する増殖因子がない。幾つかの実施形態では、第３の増殖培地は１つ以上の刺激を含み、各刺激は、薬品、栄養補給食品、シグナリング分子、毒素、炎症性メディエータ、及び微生物由来化合物から選択される。幾つかの実施形態では、第１及び第２の増殖培地の一方又は両方が１つ以上の刺激を含み、各刺激は、薬品、栄養補給食品、シグナリング分子、毒素、炎症性メディエータ、及び微生物由来化合物から選択される。幾つかの実施形態では、本方法は更に、異なる細胞集団又は細胞系列のうちの１つ以上に対する１つ以上の刺激の効果を検出又は測定するステップを含み、任意選択で、上記検出又は測定するステップは、１つ以上の刺激に曝された後の、１つ以上の異なる細胞集団又は細胞系列における細胞分化及び細胞増殖の一方又は両方を、１つ以上の刺激に曝される前の、１つ以上の異なる細胞集団又は細胞系列における細胞分化及び細胞増殖の一方又は両方、及び／又は、１つ以上の刺激に曝されていない比較可能な細胞培養モデルの１つ以上の細胞集団又は細胞系列における細胞分化及び細胞増殖の一方又は両方と比較することを含む。
【００１４】
本開示の上述及び他の目的及び態様について、本明細書の以降において詳細に説明する。
【００１５】
ここまで述べてきた本開示対象の実施形態は、本開示対象によって全体として又は部分的に達成されるが、以下で詳述する添付の実施例とともに説明が進むにつれて他の実施形態が明らかになるであろう。
【００１６】
以下の図面を参照することにより、本開示対象をよりよく理解することが可能である。図面中の各構成要素は必ずしも正確な縮尺で描かれておらず、その代わりに、本開示対象の原理を（しばしば概略的に）示すことに重点を置いている。図面では、異なる複数の図面の間で類似の参照符号は対応する要素を表す。添付図面の図示において説明される実施形態を参照することにより、本開示対象の更なる理解を得ることが可能である。図示された実施形態は本開示対象を実施するシステムの例示に過ぎないが、図面及び以下の説明を参照することにより、本開示対象の構成及び動作方法の両方が全般的に、それらの更なる目的及び利点とともに、より容易に理解されるであろう。図面は、添付の、又は後で補正される特許請求項において具体的に明記される本開示対象の範囲を限定するものではなく、本開示対象を明確化及び例示するものに過ぎない。
【００１７】
本開示対象のより完全な理解の為に、この後は以下の図面を参照していく。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】細胞支持基材及び管腔容器を含む、本開示対象の一例示的装置の側面断面を示す概略図である。細胞支持基材は、マイクロパターニングされた穴を含む非多孔質材料層の上に多孔質材料層が被せられている。細胞支持基材は２つの異なる領域を含み、１つの領域では非多孔質材料の上に多孔質材料が被せられており、もう１つの領域では非多孔質材料中の穴の上に多孔質材料が位置している。
【図１Ｂ】図１Ａの装置が基礎容器に挿入されている、本開示対象の一例示的装置の側面断面を示す概略図である。
【図１Ｃ】図１Ｂの一例示的装置の、細胞が堆積して増殖した後の側面断面を示す概略図であり、ここでは、細胞支持基材の２つの異なる領域が細胞培地（任意選択で、異なる細胞培地）に曝されており、細胞は２つの異なる集団を形成している。第１の細胞集団（細胞１、例えば、幹細胞、薬品で処置された細胞等）は、穴の上の領域にある多孔質材料層の上面で増殖し、一方、第２の細胞集団（細胞２、例えば、分化細胞、未処置細胞等）は、穴の真上ではない領域にある多孔質材料層の上面で増殖する。
【図２Ａ】２つの異なる多孔率／透過率の領域を含む、本開示対象の一例示的細胞支持基材の側面を示す概略図である。支持物の外側部分は非多孔質支持材料（ＮＰＭ）を含み、一方、中央部分は多孔質支持材料（ＰＭ）を含み、これによって、物理特性が異なる材料を有する単層基材が実現されている。
【図２Ｂ】２つの異なる多孔率／透過率の領域を含む、本開示対象の一例示的細胞支持基材の側面を示す概略図である。中心部分は多孔質支持材料（ＰＭ）を含み、一方、外側部分は、（例えば、中央部分ＰＭに比べて）多孔率が低い多孔質材料（ＲＰＭ）を含む。
【図２Ｃ】２つの異なる多孔率／透過率の領域を含む、本開示対象の一例示的細胞支持基材の側面を示す概略図である。マイクロパターニングされた穴を含む非多孔質支持材料（ＮＰＭ）の層に、多孔質膜（ＰＭ）の層が被せられている。
【図２Ｄ】２つの異なる多孔率／透過率の領域を含む、本開示対象の一例示的細胞支持基材の側面を示す概略図である。マイクロパターニングされた穴を含む低多孔率の多孔質材料（ＲＰＭ）の層に、多孔質膜（ＰＭ）の層が被せられている。
【図２Ｅ】２つの異なる多孔率／透過率の領域を含む、本開示対象の一例示的細胞支持基材の側面を示す概略図である。多孔質材料（ＰＭ）の層に、マイクロパターニングされた穴を含む非多孔質材料（ＮＰＭ）の層が被せられている。
【図２Ｆ】２つの異なる多孔率／透過率の領域を含む、本開示対象の一例示的細胞支持基材の側面を示す概略図である。多孔質材料（ＰＭ）の層に、マイクロパターニングされた穴を含む低多孔率の多孔質材料（ＲＰＭ）の層が被せられている。
【図３】材料特性が異なる複数の領域を１つの支持物の中に有する細胞支持基材を製作する一例示的工程を示す概略図である。多孔質フォトレジスト材料の層が用意され（左図）、これに、この材料の上面の一部をブロックするマスクが被せられる。この材料のマスクされない部分は、化学反応又は光に曝され、これによって、多孔質材料のマスクされない部分が低多孔率の材料に転換される（中央図）。マスクが取り外されると、高多孔率の領域と低多孔率の領域とを有する支持物が得られる（右図）。
【図４Ａ】平面陰窩アレイを増殖させることに使用可能な、材料特性が異なる複数の領域を有する細胞支持基材を含む装置を用意する為の一例示的工程を示す概略図である。上段左パネルは、スライドガラスの表面上でフォトレジスト（１００２Ｆ）フィルムに微細穴のアレイがパターニングされている側面を示している。フォトレジストフィルムがスライドガラスから取り外された後（上段中央パネル）、コラーゲンの層がフォトレジストフィルムに被せられ（上段右パネル）、脱水されると、凝縮されたコラーゲン層が残る（右側の上から２番目のパネル）。再水和後（右側の下から２番目のパネル）、コラーゲンの上面に細胞が堆積され、本装置の基礎容器／リザーバ及び管腔容器／リザーバに培地が加えられる。
【図４Ｂ】図４Ａの上段左パネルに示したフォトレジストフィルムの上面を示す概略図であり、微細穴アレイのパターン寸法を示す図である。単位陰窩は、３５０マイクロメートル（μｍ）×３５０μｍの正方形として規定されており、その中央に微細穴がある。各穴は５０μｍ径であり、１つの穴の中心から隣接する各穴の中心までの距離が３５０μｍである。
【図４Ｃ】フォトレジストフィルムに被せられたコラーゲンマトリックスの上面の、一対の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像であり、上は再水和前の画像（即ち、図４Ａの右側の上から２番目のパネルのフィルム）であり、下は再水和後の画像（即ち、図４Ａの右側の下から２番目のパネルのフィルム）である。矢印で示したように、脱水されたコラーゲンマトリックスの表面に塩結晶が見られる。上の画像の黒色のバーは２００μｍを表し、下の画像の白色のバーは２μｍを表す。
【図４Ｄ】図４Ａに示した装置の基礎容器から管腔容器への４０キロダルトン（ｋＤａ）の分子の拡散のモデルの一対のパネルである。上のパネルは、１００２Ｆフィルムの管腔表面のすぐ上（１０μｍ上）の平面にある４０ｋＤａの分子の濃度特性である。図示したのは、分子（３０ｎｇ／ｍＬ）を基礎リザーバに加えてから２４時間後の、アレイの中央部分にある８つの微細穴の近くの濃度特性である。白色の縮尺バーは３００μｍを表す。下のパネルは、１００２Ｆフィルム中の４つの微細穴の断面図である。挿入図は、１つの微細穴の断面を示す。
【図４Ｅ】図４Ａの装置の管腔容器（四角）と基礎容器（丸）との間のフルオレセインデキストラン（４０ｋＤａ）の経時拡散の実験測定値（塗りつぶし、破線）及びシミュレーション結果（塗りつぶしなし、実線）を示すグラフである（フルオレセインデキストランの濃度を、時間（単位は時間）に対してマイクログラム毎ミリリットル（μｇ／ｍＬ）単位で示した）。時刻０でフルオレセインデキストランを基礎容器に加えたが、管腔容器には加えなかった。データ点は、測定されたデータ点（ｎ＝２）の平均及び標準偏差を表し、直線はシミュレートされた濃度を示す。
【図５】アレイに４つの微細穴を有する、コラーゲンでコーティングされたフォトレジストフィルムを含む細胞支持基材の上面全体にわたる腸上皮細胞の増殖を示す一連の共焦点顕微鏡画像の対である（左が蛍光画像、右が微分干渉コントラスト画像）。左側の画像対（２日目、ＥＭ／ＥＭ）は、細胞支持物の管腔側及び基礎側の両方が増殖培地（ＥＭ）に曝された状態で細胞培養の２日目に撮影したものである。上段中央及び上段右の画像対は、細胞支持物の基礎側及び管腔側の両方に増殖培地（ＥＭ）として存続する培地条件（即ち、管腔／基礎：ＥＭ／ＥＭ）で、細胞培養の、それぞれ３日目及び４日目に撮影したものである。下段中央及び下段右の画像対は、細胞支持物の管腔側が分化培地（ＤＭ）に曝され、基礎側がＥＭに曝された状態（即ち、管腔／基礎：ＤＭ／ＥＭ）で、細胞培養の、それぞれ３日目及び４日目に撮影したものである。これらの画像は、単一ＸＹ平面に沿って撮影した。蛍光画像を、ＥｄＵ組み込み、ＡＬＰ活性、及びＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２染色に関して分析した。白色の縮尺バーは２００μｍを表す。全ての画像は倍率が同じである。
【図６Ａ】本開示対象の細胞支持基材上での初代マウス腸上皮細胞の増殖の代表的な共焦点顕微鏡画像の対である。細胞を、支持物の管腔側及び基礎側の両方で増殖培地（ＥＭ）に曝した（即ち、管腔／基礎：ＥＭ／ＥＭ）。左側の画像は、４つの平面陰窩の投影画像であり、右側の画像は、１つの平面陰窩の高倍率画像である。右側の画像の中央の白線は、図６Ｂに示した細胞単層の断面共焦点ビューの位置をマーキングしている。陰窩の中心にある光のスポットはＥｄＵ取り込みを表し、中心から外れた灰色のスポットはＡＬＰ活性を表す。左側の画像の右下にある縮尺バーは２００マイクロメートル（μｍ）を表し、右側の画像の右下にある縮尺バーは１００μｍを表す。
【図６Ｂ】本開示対象の細胞支持基材上の１つの平面陰窩での初代マウス腸上皮細胞の増殖の代表的な断面共焦点顕微鏡画像である。細胞を、支持物の管腔側及び基礎側の両方で増殖培地（ＥＭ）に曝した（即ち、管腔／基礎：ＥＭ／ＥＭ）。光のスポットはＥｄＵ取り込みを表す。画像の右下にある縮尺バーは５０マイクロメートル（μｍ）を表す。
【図６Ｃ】本開示対象の細胞支持基材上での初代マウス腸上皮細胞の増殖の代表的な共焦点顕微鏡画像の対である。細胞を、支持物の管腔側で分化培地（ＤＭ）に曝し、支持物の基礎側で増殖培地（ＥＭ）に曝した（即ち、管腔／基礎：ＤＭ／ＥＭ）。左側の画像は、４つの平面陰窩の投影画像であり、右側の画像は、１つの平面陰窩の高倍率画像である。右側の画像の中央の白線は、図６Ｄに示した細胞単層の断面共焦点ビューの位置をマーキングしている。光のスポットはＥｄＵ取り込みを表し、灰色のスポットはＡＬＰ活性を表す。左側の画像の右下にある縮尺バーは２００マイクロメートル（μｍ）を表し、右側の画像の右下にある縮尺バーは１００μｍを表す。
【図６Ｄ】本開示対象の細胞支持基材上の１つの平面陰窩での初代マウス腸上皮細胞の増殖の代表的な断面共焦点顕微鏡画像である。細胞を、支持物の管腔側で分化培地（ＤＭ）に曝し、支持物の基礎側で増殖培地（ＥＭ）に曝した（即ち、管腔／基礎：ＤＭ／ＥＭ）。光のスポットはＥｄＵ取り込みを表す。画像の右下にある縮尺バーは５０マイクロメートル（μｍ）を表す。
【図６Ｅ】支持物の管腔側で分化培地（ＤＭ）に曝され、支持基材の基礎側で増殖培地（ＥＭ）に曝された（即ち、管腔／基礎：ＤＭ／ＥＭ）４つの平面陰窩の蛍光画像の対である。左側の画像はムチン２に関して染色されており、一方、右側の画像はクロモグラニンＡ及びＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２に関して染色されている。各画像の左下にある縮尺バーは２００マイクロメートル（μｍ）を表す。
【図６Ｆ】支持基材の管腔側及び基礎側の両方で増殖培地（ＥＭ）に曝された（即ち、管腔／基礎：ＥＭ／ＥＭ）１つの平面陰窩のＥ−カドヘリン（左側）及びβカテニン（右側）免疫蛍光染色の投影分割画像である。画像の右下側にある縮尺バーは１００マイクロメートル（μｍ）を表す。
【図６Ｇ】支持基材の管腔側で分化培地（ＤＭ）に曝され、支持基材の基礎側で増殖培地（ＥＭ）に曝された（即ち、管腔／基礎：ＤＭ／ＥＭ）１つの平面陰窩のＥ−カドヘリン（左側）及びβカテニン（右側）免疫蛍光染色の投影分割画像である。画像の右下側にある縮尺バーは１００マイクロメートル（μｍ）を表す。
【図６Ｈ】支持基材の管腔側で分化培地（ＤＭ）に曝され、支持基材の基礎側で増殖培地（ＥＭ）に曝された（即ち、管腔／基礎：ＤＭ／ＥＭ）１つの平面陰窩の代表的な走査電子顕微鏡画像である。黒色及び白色のボックスは、陰窩エリアの中心領域及びエッジ領域をそれぞれ示しており、図６Ｉではこれらを高倍率で示した。画像の下にある縮尺バーは２００マイクロメートル（μｍ）を表す。
【図６Ｉ】図６Ｈに示した平面陰窩の別々の領域をより高倍率で示した、代表的な高倍率走査電子顕微鏡画像の対である。左側の画像は、図６Ｈの黒色ボックス内のエリアに対応する、陰窩の中央の細胞を表す。右側の画像は、図６Ｈの白色ボックス内のエリアに対応する、陰窩のエッジ領域の細胞を表す。左側の画像の右上、並びに右側の画像の右下にある縮尺バーは、２マイクロメートル（μｍ）を表す。
【図６Ｊ】本開示対象の細胞支持基材上で増殖し、細胞支持基材の管腔側及び基礎側の両方で増殖培地（ＥＭ）で処置されるか（管腔／基礎：ＥＭ／ＥＭ、四角）、細胞支持基材の管腔側で分化培地で処置され、細胞支持基材の基礎側で増殖培地で処置されるか（管腔／基礎：ＤＭ／ＥＭ、丸）、細胞支持基材の管腔側及び基礎側の両方で分化培地で処置される（管腔／基礎：ＤＭ／ＤＭ、三角）細胞について、取り込まれた５−エチニル−２'−デオキシウリジン（ＥｄＵ）の（陰窩の中心から外向きにマイクロメートル（μｍ）単位で測定された）半径方向の正規化蛍光強度を示すグラフである。データ点は平均を表し、エラーバーは５標本の標準偏差を表し、ここでは、陰窩の中心から幅５μｍの同心円において蛍光画像を測定した。
【図６Ｋ】本開示対象の細胞支持基材上で増殖し、細胞支持基材の管腔側及び基礎側の両方で増殖培地（ＥＭ）で処置されるか（管腔／基礎：ＥＭ／ＥＭ、四角）、細胞支持基材の管腔側で分化培地で処置され、細胞支持物の基礎側で増殖培地で処置されるか（管腔／基礎：ＤＭ／ＥＭ、丸）、細胞支持基材の管腔側及び基礎側の両方で分化培地で処置される（管腔／基礎：ＤＭ／ＤＭ、三角）細胞について、取り込まれたアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性の（陰窩の中心から外向きにマイクロメートル（μｍ）単位で測定された）半径方向の正規化蛍光強度を示すグラフである。データ点は平均を表し、エラーバーは５標本の標準偏差を表し、ここでは、陰窩の中心から幅５μｍの同心円において蛍光画像を測定した。
【図７Ａ】本開示対象の細胞支持基材上で、支持基材の管腔側では分化培地（ＤＭ）により、又、支持基材の基礎側では増殖培地（ＥＭ）により、４日間培養され、その後、５−エチニル−２'−デオキシウリジン（ＥｄＵ）で３時間インキュベートされ、その後、細胞の固定及び染色が行われた、４つの平面陰窩の共焦点蛍光顕微鏡画像である。左上にある縮尺バーは２００マイクロメートル（μｍ）を表す。
【図７Ｂ】本開示対象の細胞支持基材上で培養され、図７Ａに示した細胞に関して説明したように５−エチニル−２'−デオキシウリジン（ＥｄＵ）でパルス標識され、しかし更に２日間、ＥｄＵがない培地で培養されてから固定及び染色が行われた、４つの平面陰窩の共焦点蛍光顕微鏡画像である。左上にある縮尺バーは２００マイクロメートル（μｍ）を表す。
【図７Ｃ】ＥｄＵによる３時間のパルス標識の直後の、陰窩の中心からの（マイクロメートル（μｍ）単位で測定された）様々な距離における、図７Ａで説明したように培養された５−エチニル−２'−デオキシウリジン（ＥｄＵ）陽性細胞の数を示すグラフである。Ｎ＝５。
【図７Ｄ】ＥｄＵによるパルス標識の後の、陰窩の中心からの（マイクロメートル（μｍ）単位で測定された）様々な距離における、図７Ｂで説明したように培養された５−エチニル−２'−デオキシウリジン（ＥｄＵ）陽性細胞の数を示すグラフである。Ｎ＝５。
【図８Ａ】以下のように処置された平面陰窩、即ち、細胞支持基材の管腔側では分化培地（ＤＭ）により、又、細胞支持基材の基礎側では増殖培地（ＥＭ）により増殖した陰窩（ＤＭ／ＥＭ；対照）、管腔側ではＤＭ＋アセテートにより、又、基礎側ではＥＭにより増殖した陰窩（ＤＭ＋アセテート／ＥＭ）、管腔側ではＤＭ＋プロピオネートにより、又、基礎側ではＥＭにより増殖した陰窩（ＤＭ＋プロピオネート／ＥＭ）、管腔側ではＤＭ＋ブチレートにより、又、基礎側ではＥＭにより増殖した陰窩（ＤＭ＋ブチレート／ＥＭ）について、陰窩当たりの５−エチニル−２'−デオキシウリジン（ＥｄＵ）陽性面積を示すグラフである。「対照」は、細胞支持基材の管腔側では分化培地（ＤＭ）により、又、細胞支持基材の基礎側では増殖培地（ＥＭ）により処置された陰窩を表す。「アセテート」は、ＤＭがアセテートを含んでいた陰窩を表し、「プロピオネート」は、ＤＭがプロピオネートを含んでいた陰窩を表し、「ブチレート」は、ＤＭがブチレートを含んでいた陰窩を表す。陰窩当たりのＥｄＵ陽性面積を、単位陰窩当たりのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２染色面積に対して正規化した。２匹の異なるマウスのそれぞれからの１０個の陰窩（合計２０個の陰窩）を分析した。＊、＊＊、及び＊＊＊は、それぞれ、Ｐ≦０．０５、Ｐ≦０．０１、及びＰ≦０．００１を表す。
【図８Ｂ】図８Ａで説明したように処置された平面陰窩について、陰窩当たりのアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）陽性面積を示すグラフである。「対照」は、細胞支持基材の管腔側では分化培地（ＤＭ）により、又、細胞支持基材の基礎側では増殖培地（ＥＭ）により処置された陰窩を表す。「アセテート」は、ＤＭがアセテートを含んでいた陰窩を表し、「プロピオネート」は、ＤＭがプロピオネートを含んでいた陰窩を表し、「ブチレート」は、ＤＭがブチレートを含んでいた陰窩を表す。陰窩当たりのＡＬＰ陽性面積を、単位陰窩当たりのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２染色面積に対して正規化した。２匹の異なるマウスのそれぞれからの１０個の陰窩（合計２０個の陰窩）を分析した。＊＊及び＊＊＊は、それぞれ、Ｐ≦０．０１及びＰ≦０．００１を表す。
【図８Ｃ】様々な脂肪酸の場合の、単位陰窩当たりのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２陽性面積を、対照陰窩のＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２陽性面積との比較で示すグラフである。陰窩は、図８Ａで説明したように処置した。「対照」は、細胞支持基材の管腔側では分化培地（ＤＭ）により、又、細胞支持基材の基礎側では増殖培地（ＥＭ）により処置された陰窩を表す。「アセテート」は、ＤＭがアセテートを含んでいた細胞を表し、「プロピオネート」は、ＤＭがプロピオネートを含んでいた陰窩を表し、「ブチレート」は、ＤＭがブチレートを含んでいた陰窩を表す。２匹の異なるマウスのそれぞれからの１０個の陰窩（合計２０個の陰窩）を分析した。＊＊＊は、Ｐ≦０．００１を表す。
【図９】３つの異なる培地条件、即ち、管腔側に分化培地（ＤＭ）、基礎側に増殖培地（ＥＭ）という条件（ＤＭ／ＥＭ、左）、両側ともＥＭという条件（ＥＭ／ＥＭ、中央）、及び両側ともＤＭという条件（ＤＭ／ＤＭ）の下で、本開示対象の一装置を使用して増殖したヒト上皮細胞の４つの陰窩の３つの代表的な共焦点蛍光顕微鏡画像のセットである。各画像の左下にある縮尺バーは２００マイクロメートル（μｍ）を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下では本開示対象をより詳しく説明していく。但し、説明するのは、本開示対象の、全てとは限らない幾つかの実施形態である。実際、本開示対象は、多様な形態で実施されてよく、本明細書に記載の実施形態に限定されるものとして解釈されるべきではなく、むしろ、これらの実施形態は、本開示が適用可能な法的要件を満たすように提供される。
【００２０】
Ｉ．定義
本明細書で用いられる用語は、特定の実施形態を説明することだけを目的としており、本開示対象を限定するものではない。
【００２１】
以下において別段の定義がない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有するものとする。本明細書において採用されている技術への参照は、当該技術分野において一般的に理解されているようにその技術を参照するものとし、これには、当業者には明らかであると考えられる、それらの技術のバリエーション、又は等価な技術の置換が含まれる。以下の用語は、当業者には十分に理解されるものと考えられるが、本開示対象の説明を容易にする為に以下の定義を明記する。
【００２２】
本開示対象の説明においては、当然のことながら、幾つかの技術及びステップを開示する。これらのそれぞれは個別の利点があり、それぞれは、他の開示された技術のうちの１つ以上、又は場合によっては全てと併せて用いられてもよい。
【００２３】
従って、明確さの為に、本明細書では、個々のステップの可能な全ての組み合わせを不必要に繰り返すことを控える。しかしながら、本明細書及び特許請求項は、そのような組み合わせが完全に、本発明及び特許請求項の範囲内にあることを理解して読まれるべきである。
【００２４】
長く続いている特許法の慣習に従うと、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、特許請求の範囲を含む本出願において使用される場合には「１つ以上の」を意味する。従って、例えば、「単位細胞（ａ  ｕｎｉｔ  ｃｅｌｌ）」への参照は、複数のそのような単位細胞、その他を包含する。
特に断らない限り、本明細書及び特許請求項において使用されている、成分、反応条件、その他の量を表す全ての数値は、あらゆる場合において「約（ａｂｏｕｔ）」で修飾されるものと理解されたい。従って、反対のことが示されない限り、本明細書及び添付の特許請求項に記載された数値パラメータは、本開示対象により得られることが求められている所望の特性に応じて様々であってよい近似である。
【００２５】
本明細書では、「約（ａｂｏｕｔ）」という語は、組成、質量、重量、温度、時間、体積、濃度、割合等の値又は量に言及した場合に、明示された量からの、実施形態によっては±２０％、実施形態によっては±１０％、実施形態によっては±５％、実施形態によっては±１％、実施形態によっては±０．５％、実施形態によっては±０．１％のばらつきを包含していて、そのようなばらつきが、本開示の方法の実施、又は本開示の組成の採用において適切なものであることを意味する。
【００２６】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、又は「を特徴とする（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ）」と同義であって、包含的又はオープンエンドであり、未記載の要素又は方法ステップの追加を排除しない。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、指定された要素は必須であるが、他の要素が追加されても引き続き請求項の範囲内の構成を形成することが可能であることを意味する、請求項の言い回しで使用される専門用語である。
【００２７】
本明細書では、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という語句は、請求項で指定されない要素、ステップ、又は成分を全て排除する。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という語句は、請求項のプリアンブルの直後ではなく要部の句中に現れた場合には、その句中に明記された要素のみを限定し、他の要素は請求項全体からは排除されない。
【００２８】
本明細書では、「のみからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という語句は、請求項の範囲を、指定された材料又はステップ、並びに請求対象の基本的且つ新規な特性に実質的に影響しない材料又はステップに限定する。
【００２９】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」、及び「のみからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という語句に関しては、これら３つの語句の１つが本明細書で使用される場合には、本開示対象及び請求対象は、それ以外の２つの語句のいずれかの使用を包含することが可能である。
【００３０】
本明細書では、「及び／又は（ａｎｄ／ｏｒ）」という用語は、エンティティのリストの文脈で使用された場合には、単独で、又は組み合わせで存在しているエンティティを参照する。従って、例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、及び／又はＤ（Ａ，  Ｂ，  Ｃ，  ａｎｄ／ｏｒ  Ｄ）」という語句は、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤを個別に包含し、更に、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤのあらゆる組み合わせ及び副組み合わせを包含する。
【００３１】
本明細書では、「ＸからＹの間（ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｘ  ａｎｄ  Ｙ）」や「約ＸからＹの間（ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｂｏｕｔ  Ｘ  ａｎｄ  Ｙ）」等の語句は、Ｘ及びＹを含むものとして解釈されたい。本明細書では、「約ＸからＹの間（ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｂｏｕｔ  Ｘ  ａｎｄ  Ｙ）」等の語句は「約Ｘから約Ｙの間（ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｂｏｕｔ  Ｘ  ａｎｄ  ａｂｏｕｔ  Ｙ）」を意味し、「約ＸからＹまで（ｆｒｏｍ  ａｂｏｕｔ  Ｘ  ｔｏ  Ｙ）」等の語句は「約Ｘから約Ｙまで（ｆｒｏｍ  ａｂｏｕｔ  Ｘ  ｔｏ  ａｂｏｕｔ  Ｙ）」を意味する。
【００３２】
本明細書でのエンドポイントによる数値範囲の記載は、その範囲に包含される全ての数及び端数を包含する（例えば、１から５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．９０、４、４．２４、及び５を包含する）。同様に、本明細書でのエンドポイントによる数値範囲の記載は、その範囲に包含される副範囲を包含する（例えば、１〜５は、１〜１．５、１．５〜２、２〜２．７５、２．７５〜３、３〜３．９０、３．９０〜４、４〜４．２４、４．２４〜５、２〜５、３〜５、１〜４、及び２〜４を包含する）。
【００３３】
当然のことながら、ある要素が別の要素に「接している」、「取り付けられている」、「接続されている」、「結合されている」、及び／又は「接触している」等のように言及された場合、その要素は、直接その別の要素に接しているか、接続されているか、結合されているか、接触していてよく、或いは、介在要素が存在してもよい。これに対し、ある要素が別の要素に、例えば、「直接接している」、「直接取り付けられている」、「直接接続されている」、「直接結合されている」、「直接接触している」と言及された場合、介在要素は存在しない。又、当業者であれば理解されるように、ある構造又は特徴が別の特徴に「隣接して（ａｄｊａｃｅｎｔ）」配置されていて、その構造又は特徴が言及された場合、その言及は、隣接する特徴と部分的に重なり合うか、隣接する特徴の下層となる部分を有してよい。
【００３４】
「下に（ｕｎｄｅｒ）」、「下方に（ｂｅｌｏｗ）」、「下方の（ｌｏｗｅｒ）」、「上方の（ｏｖｅｒ）」、「上方の（ｕｐｐｅｒ）」等のような空間的に相対的な語句は、本明細書では、図面に示されるような、１つの要素又は特徴と別の要素又は特徴との関係を説明する場合に説明を簡単にする為に使用されてよい。当然のことながら、この空間的に相対的な語句は、使用時又は操作時の器具の、図面で描かれる向きに加えて、それ以外の向きも包含するものとする。例えば、図面内の器具が反転された場合、別の要素又は特徴の「下に（ｕｎｄｅｒ）」又は「真下に（ｂｅｎｅａｔｈ）」あると記載された要素は、その別の要素又は特徴の「上に（ｏｖｅｒ）」方向づけられることになる。従って、例えば、「下に（ｕｎｄｅｒ）」という語句は、「上に（ｏｖｅｒ）」及び「下に（ｕｎｄｅｒ）」の両方の向きを包含しうる。本装置は、他の方向づけ（９０度回転又は他の方向づけ）が行われてよく、それに応じて、本明細書で使用された空間的に相対的な記述子が解釈されてよい。同様に、「上方に（ｕｐｗａｒｄｌｙ）」、「下方に（ｄｏｗｎｗａｒｄｌｙ）」、「垂直方向の（ｖｅｒｔｉｃａｌ）」、「水平方向の（ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ）」等の用語は、本明細書では、特に断らない限り、説明のみを目的として使用される。
【００３５】
本明細書では、「実施例（ｅｘａｍｐｌｅ）、「例示的（ｅｘｅｍｐｌａｒｙ）」という語、及びそれらの文法的変化形は、本明細書で論じる非限定的な実施例及び／又は変形実施形態を意味するものとし、本明細書で論じる１つ以上の実施形態が他の１つ以上の実施形態より好ましいことを意味するものではない。
【００３６】
本明細書では、「増加する（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」、「増加している（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ）」、「増加した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」、「増大する（ｅｎｈａｎｃｅ）」、「増大した（ｅｎｈａｎｃｅｄ）」、「増大している（ｅｎｈａｎｃｉｎｇ）」、及び「増大（ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）」という語（並びにこれらの文法的変化形）は、対照と比較しての少なくとも約２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、又はそれ以上の上昇を示す。
【００３７】
本明細書では、「減少する（ｒｅｄｕｃｅ）」、「減少した（ｒｅｄｕｃｅｄ）」、「減少している（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）」、「減少（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」、「漸減する（ｄｉｍｉｎｉｓｈ）」、及び「減少する（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」という語（並びにこれらの文法的変化形）は、例えば、対照と比較しての少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の低下を示す。特定の実施形態では、低下の結果が検出可能な活動又は量にはならないか、本質的にそうならなない（即ち、有意でない量、例えば、約１０％未満、更には５％未満にしかならない）可能性がある。
【００３８】
「細胞培地」という用語は、本明細書では、細胞の増殖を支援する成分（例えば、細胞周期を調整するのに適切なエネルギ源及び成分）を含む液体又はゲルを意味する。幾つかの実施形態では、基礎培地は、他の成分を任意選択で追加できる最小必須タイプの培地（例えば、ダルベッコ改変イーグル培地、ハムＦ−１２、イーグル培地、ＲＰＭＩ、ＡＲ８等）を含んでよい。この用語は、特定用途向けに用意又は企図されているものの改変後は他の細胞型等に使用可能である培地を排除しない。
【００３９】
「化合物（ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」は、本明細書では、薬品、治療薬、調剤、小分子、又はこれらとして使用される為の候補、並びにこれらの組み合わせ及び混合物であると一般的に見なされる任意のタイプの物質又は薬剤を意味する。
【００４０】
「薬品（ｄｒｕｇ）」という用語は、本明細書では、既知の生物学的効能を有し、病気、不調、及び／又は症状を治療する為に医薬品として（例えば、医療用途及び／又は獣医学用途で）使用される化合物又は組成物を意味する。
【００４１】
「試験化合物」という用語は、本明細書では、生物学的効能が疑わしいか不明である化合物を意味する。
【００４２】
「検出する（ｄｅｔｅｃｔ）」という語とその文法的変化形の使用は、定量化を伴わない種の測定を意味するものとし、「測定する（ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ）」又は「測定する（ｍｅａｓｕｒｅ）」という語とその文法的変化形の使用は、定量化を伴う種の測定を意味するものとする。「検出する（ｄｅｔｅｃｔ）」及び「識別する（ｉｄｅｎｔｉｆｙ）」という用語は、本明細書では区別なく使用される。
【００４３】
「増殖因子（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）」という用語は、本明細書では、細胞又は組織の増殖を促進する生物活性分子を意味する。本開示において有用な増殖因子として、形質転換増殖因子−アルファ（ＴＧＦ−α）、形質転換増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）、血小板由来増殖因子（ＡＡ、ＡＢ、及びＢＢアイソフォームを含む）（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）（ＦＧＦ酸性アイソフォーム１及び２、ＦＧＦ塩基性フォーム２、並びにＦＧＦ  ４、８、９、及び１０を含む）、神経増殖因子（ＮＧＦ）（ＮＧＦ  ２．５ｓ、ＮＧＦ  ７．０ｓ、及びベータＮＧＦ、並びに神経栄養因子を含む）、脳由来神経栄養因子、軟骨由来因子、骨増殖因子（ＢＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＥＧ−ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ関連タンパク質、Ｂｖ８ＶＥＧＦ−Ｅ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）Ｉ及びＩＩ、肝細胞増殖因子、グリア神経栄養増殖因子、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、骨格増殖因子、骨マトリックス由来増殖因子、及び骨由来増殖因子とその混合物があり、これらに限定されない。幾つかの増殖因子は、細胞又は組織の分化を促進することも可能である。例えば、ＴＧＦは、細胞又は組織の増殖及び／又は分化を促進することが可能である。
【００４４】
「成分（ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）」という用語は、化学的起源であれ生物学的起源であれ、細胞の増殖、生存、又は分化を維持又は促進する為に細胞培地で使用可能な任意の化合物を意味する。「栄養素（ｎｕｔｒｉｅｎｔ）」、「サプリメント（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）」、及び「成分（ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）」という用語は区別なく使用可能であり、これらは全て、そのような化合物を意味するものとする。細胞培地で使用される典型的且つ非限定的な成分として、アミノ酸、塩、金属、糖、脂質、核酸、ホルモン、ビタミン、脂肪酸、タンパク質等がある。具体的なニーズに応じて、細胞の培養をエクスビボで促進又は維持する他の成分が当業者によって選択されてよい。
【００４５】
「抑制する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」という用語は、本明細書では、「抑制する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」という用語が使用される文脈に応じて、述べられた機能、レベル、活動、速度等を低下させたり遅らせたりする、化合物、薬剤、又は方法の能力を意味する。抑制は、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２５％、更により好ましくは少なくとも５０％であり、最も好ましくは、機能は少なくとも７５％抑制される。「抑制する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」という用語は、「低下させる（ｒｅｄｕｃｅ）」及び「妨げる（ｂｌｏｃｋ）」と区別なく使用される。
【００４６】
「材料（ｍａｔｅｒｉａｌ）」という用語は、本明細書では、合成材料及び天然材料（例えば、マトリックス成分（例えば、合成ポリマー又は天然ポリマー））を意味する。「材料及び化合物（ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）」という用語は、本明細書では、とりわけ、材料、化合物、細胞、ペプチド、核酸、薬品、マトリックス成分、及び造影剤を意味する。
【００４７】
「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」という用語は、本明細書では、活動、機能、又はプロセスのレベルを変化させることを意味する。「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」という用語は、活動、機能、又はプロセスを抑制することと刺激することの両方を包含する。「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」という用語は、本明細書では「調節する（ｒｅｇｕｌａｔｅ）」という用語と区別なく使用される。
【００４８】
「試料（ｓａｍｐｌｅ）」は、本明細書では、被験者から採取された生物学的試料を意味し、これには正常組織試料、罹患組織試料、生検試料、血液、唾液、糞、精液、涙、尿等が含まれ、これらに限定されない。試料は、被験者から採取された、関心対象の細胞、組織、又は流体を含む他の任意の素材供給源であってもよい。
【００４９】
「足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）」、「基材（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）」、「細胞支持体（ｃｅｌｌ  ｓｕｐｐｏｒｔ）」、「表面（ｓｕｒｆａｃｅ）」、「プラットフォーム（ｐｌａｔｆｏｒｍ）」、及び「細胞支持基材（ｃｅｌｌ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）」は、本明細書では支持外郭構造を意味し、例えば、インビボ又はインビトロでの細胞又は組織の増殖の為の支持外郭構造を意味する。これらの用語は、区別なく用いられ、任意のサイズの構造単位を意味し、上記構造単位又は基材は、分子構造の不動化、又は上記構造の改変に適する表面を有し、上記基材は、金属、金属薄膜、ガラス、溶融石英、合成ポリマー、膜等の材料で作られ、これらに限定されない。
【００５０】
「刺激する（ｓｔｉｍｕｌａｔｅ）」という用語は、本明細書では、活動又は機能を誘導したり、そのレベルを対照値より高くなるように上げたりすることを意味する。刺激は、直接又は間接的なメカニズムにより行われてよい。一態様では、活動又は機能は、対照値に比べて少なくとも１０％刺激され、より好ましくは少なくとも２５％刺激され、更により好ましくは少なくとも５０％刺激される。「刺激物（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）」という用語は、本明細書では、それを適用することによって関心対象のプロセス又は機能が刺激される任意の組成物、化合物、又は薬剤を意味し、そのようなプロセス又は機能として、創傷治癒、血管形成、骨折治癒、骨芽細胞の生成及び機能、並びに破骨細胞の生成、分化、及び活動等があり、これらに限定されない。
【００５１】
「組織（ｔｉｓｓｕｅ）」は、本明細書では、（１）特定の機能を実施する為に合体した同様の細胞の群、（２）同様の構造及び機能を有する細胞の凝集体で構成される有機体の一部分、及び／又は（３）構造及び機能によって同様に特徴付けられた細胞の集団（筋組織や神経組織等）を意味する。
【００５２】
本明細書では、「底壁の上に配置された（ｐｏｓｉｔｉｏｎｅｄ  ａｂｏｖｅ  ｔｈｅ  ｂｏｔｔｏｍ  ｗａｌｌ）」は「底壁上に配置された（ｐｏｓｉｔｉｏｎｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｂｏｔｔｏｍ  ｗａｌｌ）」を包含してよい。幾つかの実施形態では、底壁は細胞支持構造を含んでよい。
【００５３】
「細胞型」は、本明細書では、１つの種の中で形態学的に異なるか表現型が異なる細胞形態を意味する。
【００５４】
ＩＩ．概論
幹細胞の系列決定は、生化学的合図（例えば、シグナリング分子や代謝産物）及び組織の生物物理学特性（例えば、マトリックス特性、機械力等）を含む多数の因子に影響される。ターリン等（Ｔｅｒｒｙｎ  ｅｔ  ａｌ．）著、Ｆ１０００Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１８、ｐ．７、セムロー、ファン・オーデナールデン（Ｓｅｍｒａｕ  ａｎｄ  ｖａｎ  Ｏｕｄｅｎａａｒｄｅｎ）著、アニュアル  レビュー  オブ  セル  アンド  デベロップメント  バイオロジー（Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）  ２０１５年、３１号、ｐ．３１７−３４５、イトウ、イトウ（Ｉｔｏ  ａｎｄ  Ｉｔｏ）著、アニュアル  レビュー  オブ  セル  アンド  デベロップメント  バイオロジー  （Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、２０１６年、３２号、ｐ．３９９−４０９、ガッタッツォ等（Ｇａｔｔａｚｚｏ  ｅｔ  ａｌ．）著、バイオキミカ  エト  バイオフィジカ  アクタ（Ｂｉｏｃｈｍｉｎｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ）（ＢＢＡ）、ジェネラルサブジェクツ（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｓｕｂｊｅｃｔｓ）、２０１４年、１８４０号、ｐ．２５０６−２５１９、並びにリ等（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．）著、リジェネレイティブ  メディシン（Ｒｅｇｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、２０１１年、６、ｐ．２２９−２４０を参照されたい。腸上皮は、適正な機能を維持する為に系列決定が行われる系の一例である。腸上皮は、絶え間ない生化学的攻撃、微生物攻撃、及び物理的攻撃に直面して、それらから腸を保護する、腸の外層である。腸上皮は、腸幹細胞から派生した様々な細胞型からなる。結腸では、腸幹細胞は、陰窩の底部に位置して、急速に増殖し、陰窩に沿って動き、腸細胞、杯細胞、及び腸内分泌細胞のように機能が異なる細胞の様々な系列に分化する。腸上皮の幹細胞らしさの維持、増殖、及び分化のバランスが腸の健康を左右する。このバランスは、シグナリング分子、微生物由来化合物、ガス、及び剛性を含む局所微小環境によって調整される。ワン等（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）著、セルラー  アンド  モレキュラー  ガストロエンテロロジー  アンド  ヘパトロジー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）、２０１８年、５（３）、ｐ．４４０−４５３を参照されたい。例えば、高濃度のＷｎｔ、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリング用リガンド、及び低レベルの細菌代謝産物ブチレートを陰窩の底部に置くことにより、幹細胞集団を維持して閉じ込めることが可能である。
【００５５】
インビボ動物モデルによる最近の研究では、腸ホメオスタシスが、腸にとどまらず、ホストの健康状態や病状に広く影響することが示されている。ホール等（Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．）著、ネイチャー  レビューズ  ジェネティクス（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、２０１７年、１８、ｐ．６９０、ヤング（Ｙｏｕｎｇ）著、ブリティッシュ  メディカル  ジャーナル（ＢＭＪ）、２０１７年、３５６、ｊ８３１、シュライナー等（Ｓｈｒｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）著、カレント  オピニオン  イン  ガストロエンテロロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ）、２０１５年、３１、ｐ．６９、リンチ、ベデルセン（Ｌｙｎｃｈ  ａｎｄ  Ｐｅｄｅｒｓｅｎ）著、ニューイングランド  ジャーナル  オブ  メディシン（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、２０１６年、３７５、ｐ．２３６９−２３７９、並びにトレムレット等（Ｔｒｅｍｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．）著、アナルズ  オブ  ニューロロジー（Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ）、２０１７年を参照されたい。しかしながら、腸組織が複雑であることから、腸ホメオスタシスがいかにして維持及び調整されるかについては理解が進んでいない。腸組織は、上皮に加えて、筋線維芽細胞、内皮細胞、免疫細胞等を含む様々な細胞からなる更に、哺乳動物の腸は、宿主細胞より数が多い微生物細胞群落をホストする。動物モデルの場合は、腸におけるこれらの様々な担い手同士がいかにして相互に作用して腸ホメオスタシスを調整するかを描写することが困難な場合がある。更に、インビボ動物研究はインビトロ研究より時間や費用がかなり多くかかる。従って、腸の重要な構成要素を再現するインビトロモデル系の開発は、インビボ動物モデルに対する魅力的な代替手段である。
【００５６】
現時点でのインビトロ初代腸細胞培養の絶対的な基準となるのがオルガノイド系である。初代腸上皮幹細胞は、組織から分離されてヒドロゲル（例えば、マトリゲル）に埋め込まれる。この系は、ドナーによる遺伝的なばらつきがない初代腸細胞培養を可能にすることによって胃腸の研究を進展させた。オルガノイド系では、ほとんどの腸上皮細胞型を比較的濃縮された集団として生成することが可能である（イン等（Ｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）著、ネイチャー  メソッズ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）２０１４年、１１、ｐ．１０６、ヴァン・エス等（Ｖａｎ  Ｅｓ  ｅｔ  ａｌ．）著、ネイチャー  セル  バイオロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、２０１２年、１４、ｐ．１０９９、及びバサク等（Ｂａｓａｋ  ｅｔ  ａｌ．）著、セル  ステム  セル（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ）、２０１７年、２０、ｐ．１７７−１９０）を参照されたい。又、幾つかの病気モデル、例えば、嚢胞性線維症（デッカース等（Ｄｅｋｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．）著、ネイチャー  メディシン（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、２０１３年、１９、ｐ．９３９を参照）や病原性感染（フィンクバイナー等（Ｆｉｎｋｂｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）著、ＭＢｉｏ、２０１２年、３、ｅ００１５９、カルベ等（Ｋａｒｖｅ  ｅｔ  ａｌ．）、プロス  ワン（ＰｌｏＳ  ｏｎｅ）、２０１７年、１２、ｅ０１７８９６６、及びバートフェルド（Ｂａｒｔｆｅｌｄ）著、デベロップメント  バイオロジー（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、２０１６年、４２０、ｐ．２６２−２７０を参照）がオルガノイド系を使用してモデル化されている）。しかしながら、オルガノイド培養物の閉鎖構造により、（腸内の微生物叢の環境である）管腔側に到達しにくくなって、管腔操作又はアッセイの実施しやすさが制限される可能性がある。更に、オルガノイドの３次元構造は、画像化及び遺伝子操作に難題を突きつける。
【００５７】
腸上皮細胞の２次元培養物であれば、制限なく細胞に到達することが可能である。初代腸上皮細胞は、コラーゲンヒドロゲル上で（ワン等（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）著、セルラー  アンド  モレキュラー  ガストロエンテロロジー  アンド  ヘパトロジー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）、２０１７年、４、ｐ．１６５−１８２を参照）  、又は市販の多孔質膜付き細胞培養基材の細胞外マトリックスタンパク質コーティング（コラーゲンＩ又はＩＶ又はマトリゲル）上で、単層として増殖されてきた。イン等（Ｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）著、セルラー  アンド  モレキュラー  ガストロエンテロロジー  アンド  ヘパトロジー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）、２０１６年、２、ｐ．４８−６２）、トン等（Ｔｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）著、バイオマテリアルズ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）、２０１８年、１５４、ｐ．６０−７３）、及びコヅカ等（Ｋｏｚｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．）著、ステム  セル  レポート（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ）、２０１７年、９、ｐ．１９７６−１９９０を参照されたい。これらの２次元系は、３次元（３Ｄ）オルガノイドとの相互転換が可能であって、培養物の管腔側に制限なく到達することを可能にし、経上皮電気抵抗測定及び顕微鏡検査を含む実施が容易なアッセイを可能にする。しかしながら、両系とも、１つの試料の中で、腸幹細胞又は増殖細胞と分化細胞の両方を、空間的に制御された様式で取得することは困難である。これは、液体培地内で増殖の生化学的合図と分化の生化学的合図とを空間的に分離することが困難である為である。従って、３Ｄオルガノイド中の細胞と２次元（２Ｄ）単層培養物中の細胞が未分化になるか分化するかは、概ね培地組成によって決まる。
【００５８】
インビボ微小環境を３Ｄインビトロプラットフォームに再現することの改良が、インビボ組織と同じマイクロ構造を有する３Ｄコラーゲン足場上で、足場全体にわたる増殖因子勾配下で、ヒト及びマウスの初代腸細胞を培養することにより達成された。ワン等（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）著、バイオマテリアルズ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）、２０１７年、１２８、ｐ．４４−５５、ＡＣＳ  バイオマテリアルズ  サイエンス  アンド  エンジニアリング（ＡＣＳ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、２０１７年、３、ｐ．２５０２−２５１３、及びワン等（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）著、セルラー  アンド  モレキュラー  ガストロエンテロロジー  アンド  ヘパトロジー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）、２０１８年、５、ｐ．１１３−１３０を参照されたい。これらのプラットフォームにおける初代細胞は、増殖因子勾配に応答して、増殖細胞濃厚ゾーン（底部）と分化ゾーン（表面）とに分極する。更に、よく知られた細菌代謝産物である短鎖脂肪酸が、プラットフォーム中の腸上皮細胞の増殖と分化に大きな影響を及ぼすことが示された。しかしながら、マイクロ構造の３Ｄトポロジによってプラットフォームの使いやすさが制限される可能性があることから、アッセイ及び画像化はやはり困難である可能性がある。
【００５９】
本開示対象は、幾つかの実施形態では、インビトロ細胞培養プラットフォーム、並びにその作成方法及び使用方法を提供する。これは、例えば、異なる細胞集団を含む２つ以上の領域を含む平面組織構成物を生成することや、細胞増殖に対する様々な刺激（例えば、薬品、毒素、栄養補給食品、食物由来化合物、微生物由来化合物（例えば、微生物代謝産物）等）の効果を評価することに用いられる。一例として、幾つかの実施形態では、細胞培養プラットフォームは、陰窩の細胞区画化を、単に単層として、即ち、制御可能な寸法を有する、平板化された、又は２次元の陰窩として複製する腸細胞培養プラットフォームである。
【００６０】
一例示的実施形態では、細胞培養プラットフォームは、不透過性／非多孔質層にある開口又は穴（例えば、微細穴）のアレイに、透過性／多孔質材料を含む層を被せたマイクロデバイスを含む。図４Ａを参照されたい。この構成により、２つの物理的に別個の領域が生じる。これは、開口又は穴を覆う表面の特性と、不透過性層を覆う表面の特性とが異なる為である。プラットフォームは、プラットフォームの「基礎」面及び「管腔」面が別々の流体リザーバ／容器と接触することにより、各リザーバ／容器に別々の組成物が供給されて、プラットフォーム上で増殖した細胞培養物の選択領域を、細胞培養物の別の選択領域と異なる１つ以上の化合物で処理することを可能にするように構成されている。
【００６１】
本開示対象は、幾つかの実施形態では、ほぼ平らな表面上の複数の細胞集団の範囲を定める方法に関する。従って、幾つかの実施形態では、本開示対象は、それぞれが異なる細胞集団又は細胞系列を含む２つ以上の別個の領域を含む平面組織構成物を生成する方法を提供し、本方法は、（ａ）２つ以上の物理的に別個の領域を含む支持基材を設けるステップであって、支持基材の２つ以上の物理的に別個の領域は互いに異なる、支持基材を設けるステップと、（ｂ）支持基材上に１つ以上の細胞を堆積／配置するステップであって、１つ以上の細胞は支持基材又は基材アセンブリに定着又は接着して、支持基材上で増殖し、１つ以上の細胞は、支持基材の２つ以上の別個の領域上で異なる細胞集団又は細胞系列に転換する、細胞を堆積／配置するステップと、を含む。支持基材は、１つ以上の細胞が堆積する、ほぼ平らな表面を含んでよい。幾つかの実施形態では、２つ以上の物理的に別個の領域は、支持基材の２つの物理的に別個の場所にあり、例えば、（例えば、別々の化合物又は他の条件に曝されると）１つ以上の異なる細胞が別々の場所の表面上で異なる細胞集団に転換するように、１つ以上の異なる型の細胞を支持基材上に堆積／配置することが可能である。
【００６２】
幾つかの実施形態では、他の条件は、例えば、支持基材のうちの、異なる物理特性を有する別々の場所を含んでよい。従って、幾つかの実施形態では、基材のうちの２つ以上の物理的に別個の領域は異なる物理特性を有し、そのような物理特性として多孔率、透過率、及び／又は剛性率があり、これらに限定されない。支持物上に堆積した細胞は、支持基材の２つ以上の別個の領域上で、支持基材の物理的に別個の領域の異なる物理特性に応じて、異なる細胞集団又は細胞系列に転換することが可能である。例えば、１つの細胞型が支持基材の表面上に堆積／配置されて増殖して、基材のうちの１つの型の物理的に別個の領域で１つの細胞集団又は細胞系列に転換し、且つ、別の型の物理的に別個の領域で別の細胞集団又は細胞系列に転換することが可能である。
【００６３】
従って、幾つかの実施形態では、本開示対象は、２次元細胞支持物の別個の領域に２つ又は複数の（３つ以上の（例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、又はそれ以上の））材料特性を含む２次元細胞支持物上に、異なる細胞集団又は細胞系列の２つ又は複数の（３つ以上の（例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、又はそれ以上の））領域を生成する方法を提供する。幾つかの実施形態では、細胞支持物の別個の領域は、例えば、透過率、多孔率、及び／又は剛性率が異なる領域であってよく、これらに限定されない。
【００６４】
本開示対象の支持基材の一領域の物理特性の例示的範囲を以下の表１に示す。
【表１】
2021525075.tif 000003
【００６５】
表１に示した物理特性の範囲に加えて、幾つかの実施形態では、支持基材中の一領域の多孔率の範囲が約０％から約１０％、又は約０％から約２０％、又は約０％から約３０％、又は約０％から約４０％、又は約０％から約５０％、又は約０％から約７５％、又は約０％から約９０％、又は約５％から約９０％、又は約１０％から約８０％、又は約２０％から約７０％、又は約３０％から約６０％、又は約５％から約１００％、又は約１０％から約１００％、又は約２０％から約１００％、又は約３０％から約１００％、又は約４０％から約１００％、又は約５０％から約１００％、又は約７５％から約１００％であってよい。
【００６６】
表１に示した物理特性の範囲に加えて、幾つかの実施形態では、支持基材中の一領域の透過係数の範囲が約０ｃｍ／ｓから約１００ｃｍ／ｓ  （即ち、１０２ｃｍ／ｓ）、約０ｃｍ／ｓから約５０ｃｍ／ｓ、約０ｃｍ／ｓから約２５ｃｍ／ｓ、約０ｃｍ／ｓから約１０ｃｍ／ｓ、約１０ｃｍ／ｓから約１００ｃｍ／ｓ、約２０ｃｍ／ｓから約１００ｃｍ／ｓ、約３０ｃｍ／ｓから約１００ｃｍ／ｓ、約４０ｃｍ／ｓから約１００ｃｍ／ｓ、約５０ｃｍ／ｓから約１００ｃｍ／ｓ、又は約７５ｃｍ／ｓから約１００  ｃｍ／ｓであってよい。
【００６７】
表１に示した物理特性の範囲に加えて、幾つかの実施形態では、支持基材中の一領域の剛性率の範囲が約１×１００Ｐａから約１×１０１２Ｐａ、約１×１００Ｐａから約１×１０１１Ｐａ、約１×１００Ｐａから約１×１０１０Ｐａ、約１×１００Ｐａから約１×１０９Ｐａ、約１×１００Ｐａから約１×１０８Ｐａ、約１×１００Ｐａから約１×１０７Ｐａ、約１×１００Ｐａから約１×１０６Ｐａ、約１×１００Ｐａから約１×１０５Ｐａ、約１×１００Ｐａから約１×１０４Ｐａ、約１×１００Ｐａから約１×１０３Ｐａ、約１×１００Ｐａから約１×１０２Ｐａ、約１×１０１Ｐａから約１×１０１２Ｐａ、約１×１０２Ｐａから約１×１０１２Ｐａ、約１×１０３Ｐａから約１×１０１２Ｐａ、約１×１０４Ｐａから約１×１０１２Ｐａ、約１×１０５ＰＰａから約１×１０１２Ｐａ、約１×１０６Ｐａから約１×１０１２Ｐａ、約１×１０７Ｐａから約１×１０１２Ｐａ、約１×１０８Ｐａから約１×１０１２Ｐａ、約１×１０９Ｐａから約１×１０１２Ｐａ、約１×１０１０Ｐａから約１×１０１２Ｐａ、又は約１×１０１１Ｐａから約１×１０１２Ｐａであってよい。
【００６８】
本開示対象の目的の為には、どの物理特性においても支持基材中の別個の領域間の差は、約０．１％以上、又は約０．１％から約１００％、又は約１％から約９０％、又は約１％から約５０％であってよい。
【００６９】
異なる細胞集団又は細胞系列の複数の領域は、細胞支持物の材料特性に対する細胞反応、細胞支持物中の材料を介しての刺激への異なる接近容易性に対する細胞反応、又はこれら２つの因子の複合効果によって得られる。例えば、幾つかの実施形態では、異なる細胞集団又は細胞系列の複数の領域は、細胞支持物上の異なる領域の間に物理特性（例えば、剛性）の差があることによって、且つ、細胞支持物上の異なる領域の栄養分又は増殖因子への到達に差があることによって、単一細胞集団の培養物から得られる。
【００７０】
幾つかの実施形態では、２つ以上の材料を積層することによって、２つ以上の材料特性を有する細胞支持基材を製作することが可能である。幾つかの実施形態では、各層の厚さは、約１ミリメートル以下、約５００マイクロメートル（μｍ）以下、約２５０μｍ以下、約１００μｍ以下、約５０μｍ以下、又は約２５μｍ未満である。幾つかの実施形態では、１つ以上のマイクロパターン化フィルムを実装することにより、細胞支持物に材料特性のパターンを生成することが可能である。
【００７１】
幾つかの実施形態では、本開示対象を使用して、異なる型の細胞の別個ゾーンを有する組織模倣体を生成することが可能であり、これによって、異なる細胞の、（例えば）一試料中のシグナリング分子、代謝産物、サイトカイン、薬品又は試験化合物、微生物、及びガスに対する反応を調べることが可能になる。本開示対象は更に、最初は均質である細胞集団の制御されたエリアを任意のタイプの刺激に曝して（例えば、増殖細胞と分化細胞、或いはアポトーシス細胞と生存細胞が１つの平らな表面にあるような）非均質な細胞集団を実現することを可能にする。本開示の基材の２Ｄ構成は、従来の細胞培養容器又はマイクロ流体デバイスに容易に適応可能であり、高スループットスクリーニング向けにスケールアップすることが容易に可能である。
【００７２】
本開示対象の細胞支持基材は、例えば、多孔率／透過率／剛性率が異なる２つの材料を組み合わせて作ることが可能である。２つの異なる材料の配置の非限定的な例を図２Ａ〜２Ｆに示す。この２つの異なる材料は、同一平面構成になるようにつないでよく（図２Ａ及び２Ｂを参照）、或いは、層状に積み重ねて、一方の材料が１つ以上の開口又は穴（例えば、微細穴）を含むようにしてもよい。図２Ｃ〜２Ｆを参照されたい。従って、この支持物の物理的に別個の領域は、開口又は穴の上又は下に位置するエリアと、開口又は穴の上又は下に位置しないエリアとを含む。図２Ｃの例示的配置については、後述の実施例において、多孔質材料として乾燥コラーゲンフィルムを使用し、非多孔質材料として１００２Ｆエポキシフォトレジストを使用して実証した。図４Ａも参照されたい。
【００７３】
幾つかの実施形態では、細胞支持基材の１つ以上の層が開口又は穴を含んでよい。幾つかの実施形態では、開口又は穴は微細穴である。本明細書では「微細穴」は、細胞支持基材の１つ以上の層を延長する微小径を有する穴を意味しており、例えば、これらの穴は、図２Ｃ〜２Ｆ及び図４Ａに示した２層細胞支持基材の１つの層、又は多層構造のうちの１つ以上の層を延長する。微細穴の直径は、約１マイクロメートルから約５００マイクロメートルの間、或いは約１マイクロメートルから約２５０マイクロメートルの間であってよい。幾つかの実施形態では、微細穴の直径は、約１０マイクロメートルから約１００マイクロメートルの間（例えば、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００マイクロメートル）であってよい。幾つかの実施形態では、微細穴の直径は約５０マイクロメートルである。細胞基材は、単独の微細穴、又は２つ又は複数の微細穴を含んでよい。幾つかの実施形態では、微細穴は規則的なパターン（例えば、直線、円形、三角形等のパターン）で配置されてよい。幾つかの実施形態では、微細穴は、微細穴の２つ以上の列を含むアレイとして配置され、各微細穴の中心は、隣接する各微細穴の中心から等距離に位置する。
【００７４】
幾つかの実施形態では、１つの材料（例えば、１つの材料の１つの層）の中に、２つ又は複数の材料特性を有する細胞支持物が作られてよく、これは、図３に示すように、化学反応又は光化学反応と、材料の表面の選択領域をマスクするマスキング手法とにより行われてよい。例えば、図３に示したように、多孔質材料にマスキング材料を被せて、多孔質材料の１つ以上の領域の一方の表面を覆ってよい。その後、マスクされた材料を化学処理するか、ＵＶ光に曝すことにより、露出した領域の材料に化学反応を引き起こして、材料の特性を変化させることが可能である。例えば、ポリマー材料の化学架橋を劣化させて多孔率を上げたり、材料中の架橋レベルを高めて多孔率を下げたりすることが可能である。例えば、図３は、細胞支持物を調製する一工程を示しており、ここでは、多孔質材料を含む層にマスクを被せて、マスクされていない領域の多孔率を下げるように処理することにより、多孔率が相対的に低い領域と高い領域とを含む支持物が得られる。同様に、非多孔質材料をマスクして、マスクされていない領域を、非多孔質材料を多孔質にする条件に曝してよい。
【００７５】
特性が異なる３つ以上の異なる領域を細胞支持物に設ける為に、２つの異なる材料が同一平面に配列された支持物を（任意選択で微細穴のアレイを含む）第３の材料に被せてよい。或いは、２つの異なる材料が同一平面に配列された細胞支持物をマスクしてよく、それらの領域の一方又は両方の一部を、材料特性（例えば、多孔率）が変化するように（例えば、光又は化学物質で）処理してよい。
【００７６】
本開示対象に有用な例示的多孔質材料として、天然又は合成ヒドロゲル（例えば、コラーゲン、マトリゲル、ゼラチン、アガロース、キトサン、アルギン酸塩、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド）、塩浸出前の乾燥ヒドロゲル（例えば、コラーゲンヒドロゲルが乾燥され、塩が浸出されて細孔が生成される）、プラスチックトラックエッチング膜(例えば、ポリカーボネート、ポリエステル)、膜フィルタ（ポリテトラフルオロエチレン、セルロース、ポリエーテルスルホン樹脂)、マイクロモールドメッシュ(例えば、ポリジメチルシロキサン、エポキシフォトレジスト）があってよく、これらに限定されない。多孔率／透過率を変化させる方法として、固体材料の密度、架橋密度、及び／又は製造設計の調節等があってよく、これらに限定されない。
【００７７】
本開示対象に有用な例示的非多孔質材料として、１００２Ｆエポキシフォトレジスト、環状オレフィンポリマー（例えば、商品名「ＺＥＯＮＯＲ（登録商標）」で販売されているもの（日本ゼオン株式会社（Ｚｅｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、日本国東京））、ポリカーボネート、アクリレートポリマー（例えば、ポリ（メチルメタクリレート））、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、セルロース、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）プラスチック、ナイロン、アセタール樹脂（例えば、商品名「Ｄｅｌｒｉｎ（登録商標）」で販売されているアセタール樹脂（デュポン（Ｅ．Ｉ．  ｄｕ  Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、米国デラウェア州ウィルミントン））、ポリテトラフルオロエチレン（例えば、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）（ケマーズ（Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｏｕｒｓ  Ｃｏ．）、米国デラウェア州ウィルミントン））、ポリエステル（例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリトリメチレンテレフタレート、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、商品名「ＴＲＩＴＡＮ（商標）」で販売されているコポリエステル（イーストマンケミカルカンパニー（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、米国テネシー州キングスポート））、エポキシ（例えば、ＳＵ−８、１００１Ｆ、１００９Ｆ）、エラストマ（例えば、ポリジメチルシロキサン、商品名「ＥＣＯＦＬＥＸ（商標）」で販売されているエラストマ（スムースオン（Ｓｍｏｏｔｈ−Ｏｎ  Ｉｎｃ．）、米国ペンシルベニア州マカンジー））、ガラス、セラミック、及び／又は金属があってよく、これらに限定されない。
【００７８】
細胞支持基材の全厚は約１ｍｍから約１μｍの間であってよく、例えば、全厚は約５００μｍ以下、約２５０μｍ以下、約１００μｍ以下、又は約５０μｍ以下であってよい。細胞支持基材の上面は、平らな表面を含んでよく、或いは（例えば、図２Ｅ及び２Ｆのように上部基材層に微細穴がある場合には）約１ｍｍ未満であるが１μｍ超である（例えば、約５００μｍ未満、約２５０μｍ未満、約１００μｍ未満、約５０μｍ未満、約４０μｍ未満、約３０μｍ未満、約１０μｍ未満、又は約５μｍ未満である）１つ以上の押込みを含んでよい。幾つかの実施形態では、細胞支持基材の上面は平らであり、基材内のどの微細穴も基材の上部層には存在しない。
【００７９】
本開示対象に有用な細胞は、真核細胞株由来であってよく、且つ／又は初代細胞であってよい。幾つかの実施形態では、細胞は哺乳類細胞であってよく、任意選択でヒト細胞であってよい。
【００８０】
幾つかの実施形態では、１つ以上の細胞は、小腸上皮細胞、結腸上皮細胞（例えば、マウスとヒトの結腸上皮細胞）、胃上皮細胞、線維芽細胞、筋線維芽細胞、内皮細胞、肝細胞、含脂肪細胞、筋細胞、骨細胞、神経細胞、免疫細胞、及び／又は幹細胞（胚誘導多能性幹細胞、間充織幹細胞、造血幹細胞）であってよい。幾つかの実施形態では、１つ以上の細胞は、健康であるか、炎症を起こしているか、且つ／又は病気であるヒト又は動物のがん細胞であってよい。幾つかの実施形態では、１つ以上の細胞は、消化管、生殖器官、気道、眼、鼻、耳、腎臓、脳、肝臓、膵臓、胆嚢、リンパ系、神経系、皮膚、骨、腱、靱帯、軟骨、骨髄、結合組織、及び／又は血液に由来する細胞であってよく、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、１つ以上の細胞は、原核細胞、又は原核細胞と真核細胞の混合物からなるバイオフィルムであってよい。幾つかの実施形態では、細胞は、例えば、特定の関心対象（例えば、特定の症状があるか特定の症状が疑われるヒト又は動物）の生物学的試料から隔離された細胞であってよい。
【００８１】
幾つかの実施形態では、１つ以上の細胞は、上皮細胞を含むか、上皮細胞からなる。幾つかの実施形態では、１つ以上の細胞は、初代上皮細胞を含むか、初代上皮細胞からなる。幾つかの実施形態では、１つ以上の細胞は、マウス又はヒトの初代上皮細胞を含むか、マウス又はヒトの初代上皮細胞からなる。幾つかの実施形態では、１つ以上の細胞は、細胞支持物上での増殖後に少なくとも２つの細胞集団に分化する単一型の細胞（例えば、初代細胞、上皮細胞、初代上皮細胞等）を含んでよい。
【００８２】
１つ以上の細胞の堆積／配置後、（例えば、細胞の生存及び／又は増殖を支援する為に）細胞及び／又は支持基材を１つ以上の培地に曝してよい。培地は、定期的に（例えば、数時間毎に、又は毎日）除去及び交換されてよい。任意の適切な培養フォーマットが使用可能である（例えば、パッチや単層）。細胞支持基材の２つ以上の物理的に別個の領域は、同一培地に曝されてもよく、別々の培地に曝されてもよい。幾つかの実施形態では、２つ以上の物理的に別個の領域は、別々の培地に曝される。幾つかの実施形態では、２つ以上の物理的に別個の領域は、細胞の堆積／配置後の第１の期間にわたって同一培地に曝されてよく（例えば、第１の期間は、細胞が支持物上に堆積された時点から、堆積／配置から数時間又は約１日以上が経過した時点までである）、その後、（例えば、第１の期間の終了時点から始まる）第２の期間にわたって別々の培地に曝されてよい。
【００８３】
幾つかの実施形態では、細胞培地は１つ以上の増殖因子を含む。本開示対象に有用な増殖因子は、細胞集団を生成することに使用可能な任意の増殖因子であってよい。幾つかの実施形態では、細胞培地は、幹細胞の増殖の支援に適する１つ以上の増殖因子を含む（例えば、Ｗｎｔ３Ａ、Ｒ−スポンディン３、ノギン等）。幾つかの実施形態では、細胞培地は１つ以上の成分を含んでよく、そのような成分として、タンパク質又はペプチド（例えば、増殖因子（例えば、Ｗｎｔ３Ａ、Ｒ−スポンディン３、及びノギン）、サイトカイン、ホルモン、抗体）、代謝産物（例えば、アミノ酸、脂肪酸、脂質、ヌクレオチド、糖類）、神経伝達物質（アセチルコリン、アナンドアミド、ヒスタミン及び他の微量アミン、プリン）、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子（例えば、脂質又はポリマーと共役されたか、ウイルスベクターにカプセル化されたマイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）、薬品、試験化合物、毒素、抗がん剤、抗生物質、抗真菌薬、抗ウイルス薬、及び／又は環境危険（例えば、大気粒子状物質や汚染物質）があり、これらに限定されない。
【００８４】
幾つかの実施形態では、本開示対象においてガス刺激が使用されてよく、そのようなガス刺激として、酸素、窒素、二酸化炭素、一酸化炭素、水素、メタン、硫化水素、スカトール（肉の消化の副産物）、インドール（肉の消化の副産物）、メタンチオール（硫黄化合物）、硫化ジメチル（硫黄化合物）、揮発性アミン、揮発性硫黄化合物（ＶＳＣ）、メチルメルカプタン（ＭＭ）（メタンチオール（ＭＴ）とも呼ばれる）、ジメチル二硫化物（ＤＭＤＳ）、ジメチル三硫化物（ＤＭＴＳ）、揮発性脂肪酸、及び／又は一酸化窒素があり、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、本開示対象において揮発性有機化合物（ＶＯＣ）が使用されてよく、そのようなＶＯＣとして、脂肪族炭化水素、酢酸エチル、グリコールエーテル及びアセトン、クロロフルオロカーボン、ベンゼン、トルエン、塩化メチレン、ペルクロロエチレン、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、及び／又はホルムアルデヒドがあり、これらに限定されない。本開示対象に有用な生物学的刺激として、免疫関連細胞、血液細胞、循環腫瘍細胞、微生物、ウイルス、エクソソーム、リポ多糖体（ＬＰＳ）等の細菌由来分子、及び／又は微生物関連分子パターン（ＭＡＭＰ）及び／又はそれらの類似体があり、これらに限定されない。ガス刺激の使い方は、例えば、ガス刺激を含むチャンバに細胞支持物又はその一方の面を入れること、或いは、細胞支持物と接触している細胞培地の中でガス刺激を泡立てることであってよい。
【００８５】
幾つかの実施形態では、本開示の方法は更に、２つ以上の別個の領域のうちの１つ以上を関心対象の１つ以上の刺激に曝すステップを含み、これは、例えば、その刺激によって細胞の増殖又は分化を調節できるか（即ち、加減できるか）を調べる為に行われる。幾つかの実施形態では、１つ以上の刺激は、それぞれ、薬品、試験化合物、栄養補給食品、シグナリング分子、毒素、炎症性メディエータ、及び微生物由来化合物から成る群から選択される。例えば、本開示の方法は、細胞増殖に対する関心対象刺激の効果を測定することに使用されてよく、これは、その刺激に曝された領域で増殖した細胞と、その刺激に曝されていない領域で増殖した細胞とを比較することによって行われる。従って、幾つかの実施形態では、本方法は更に、１つ以上の刺激の効果を検出又は測定するステップを含む。幾つかの実施形態では、検出又は測定するステップは、その１つ以上の付加物に曝された後の細胞分化及び細胞増殖の一方又は両方を、その１つ以上の刺激に曝される前の細胞分化及び細胞増殖の一方又は両方、及び／又は、その１つ以上の刺激に曝されていない比較可能な組織構成物中の細胞分化及び細胞増殖の一方又は両方と比較することを含む。
【００８６】
幾つかの実施形態では、本開示対象は、腸陰窩又は結腸陰窩の２次元生細胞培養モデルを調製する方法を提供し、本方法は、２つ以上の物理的に別個の領域を含む支持基材を含む装置を用意するステップであって、支持基材の２つ以上の物理的に別個の領域は互いに異なり、例えば、支持基材の別個の各領域は異なる物理特性を有する、上記用意するステップと、細胞支持基材上に１つ以上の上皮細胞を堆積／配置するステップであって、１つ以上の細胞は、（例えば、細胞支持基材又は１つ以上の物理的に別個の領域、又は１つ以上の物理的に別個の領域の一部に供給された適切な細胞培地が存在する場合に）細胞支持物に定着するか接着して細胞支持基材上で増殖する、上記堆積／配置するステップと、を含み、１つ以上の細胞は、支持基材の２つ以上の別個の領域上の異なる細胞集団又は細胞系列に転換する。幾つかの実施形態では、１つ以上の細胞は、支持基材の物理的に別個の領域の異なる物理特性に応じて異なる細胞集団に転換する。
【００８７】
幾つかの実施形態では、上皮細胞は、初代細胞を含むか、初代細胞からなる。幾つかの実施形態では、上皮細胞は、マウス又はヒトの上皮細胞を含むか、マウス又はヒトの上皮細胞からなる。幾つかの実施形態では、上皮細胞は、ヒト初代上皮細胞又はマウス初代上皮細胞を含むか、ヒト初代上皮細胞又はマウス初代上皮細胞からなる。幾つかの実施形態では、上皮細胞は、関心対象からの生物学的試料に由来する。
【００８８】
幾つかの実施形態では、本装置は、管腔容器は、底壁と、底壁から上方に延びる少なくとも１つの側壁と、を含む容器（例えば、管腔容器）を含み、細胞支持基材は容器（例えば、管腔容器）の底壁上にある。容器内部に置かれた培地は、関心対象のインビボ微小環境を模倣することに使用されてよい。幾つかの実施形態では、容器内部に置かれた培地は、関心対象の管腔環境を模倣することに使用されてよく、この容器は「管腔容器」と呼ばれてよい。容器の上部は開放されていてよく、或いは取り外し可能なカバーを有してよい。
【００８９】
幾つかの実施形態では、本装置は更に、第２の容器を含み、例えば、第２の容器は、細胞支持基材の底部側と接触する培地を収容してよく、この容器は基礎容器と呼ばれてよい。基礎容器は、底壁と、底壁から上方に延びる少なくとも１つの側壁と、を含んでよい。幾つかの実施形態では、基礎容器は、円筒形状であってよいが、直径は管腔容器より大きく、その為、管腔容器を基礎容器に挿入することが可能である。従って、幾つかの実施形態では、基礎容器は、基礎容器の底壁と管腔容器の底壁との間で、且つ／又は基礎容器の少なくとも１つの側壁と管腔容器の少なくとも１つの側壁との間で画定されてよい。基礎容器内に置かれた培地は、細胞支持物の底部が曝される関心対象環境（例えば、関心対象の基礎環境）を模倣することに使用されてよい。本明細書の後のほうで更に述べるが、管腔容器は、管腔容器の側壁（の、例えば、管腔容器の上部又は上部近く）からアーム又はフランジが延びていてよく、これによって、管腔容器は、基礎容器を含むウェルに挿入されることが可能であり、アーム又はフランジは、管腔容器が別のより大きな容器の中で（例えば、管腔容器の底壁が基礎容器の底壁に接触しないように）定位置に保持されることを支援することが可能である。例えば、管腔容器のアーム又はフランジは、管腔容器が基礎容器に挿入されたときに、基礎容器の側壁の上端に載ってよい。
【００９０】
幾つかの実施形態では、本方法は、基礎容器に第１の増殖培地を供給し、管腔容器に第２の増殖培地を供給するステップを含む。第１の増殖培地と第２の増殖培地は同じであってよく、異なってもよい。第１及び第２の増殖培地は、１つ以上の細胞が細胞支持基材上に堆積／配置された直後に供給されてよい。幾つかの実施形態では、第１及び第２の増殖培地は、定期的に（例えば、数時間毎に、又は毎日）除去及び交換されてよい。
【００９１】
幾つかの実施形態では、第１の増殖培地と第２の増殖培地は、１つ以上の細胞が堆積／配置された後の少なくとも第１の期間にわたって同一である。幾つかの実施形態では、第１の期間は約１時間から約２日の間（例えば、約１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２８、３２、３６、４０、４４、又は約４８時間）である。幾つかの実施形態では、第１及び第２の増殖培地はそれぞれが、幹細胞の増殖を支援する増殖因子（例えば、Ｗｎｔ−３Ａ、Ｒ−スポンディン、ノギン等）を含む。幾つかの実施形態では、本方法は、第１の期間が経過した後に第１又は第２の増殖培地を第３の増殖培地に交換するステップを含み、第３の増殖培地は第１及び第２の増殖培地と異なる。幾つかの実施形態では、第３の増殖培地は、幹細胞の増殖を支援する増殖因子がない。幾つかの実施形態では、第３の増殖培地は、（例えば、上皮細胞に対する効果又は効果のレベルが既知又は未知である）１つ以上の関心対象刺激を含む。例えば、関心対象刺激は、薬品、栄養補給食品、微生物由来化合物（例えば、微生物代謝産物）、毒素、炎症性メディエータ、試験化合物（例えば、生物学的効能が疑わしいか不明である化合物）であってよく、これらに限定されない。追加又は代替として、幾つかの実施形態では、第１及び第２の増殖培地の一方又は両方が１つ以上の関心対象刺激を含み、例えば、各付加物が、薬品、栄養補給食品、シグナリング分子、毒素、炎症性メディエータ、及び微生物由来化合物から選択される。幾つかの実施形態では、第１及び第２の増殖培地は両方とも、一定期間後に別の増殖培地（例えば、第３及び第４の増殖培地。これらは同じであっても異なっていてもよい）に交換される。両培地の交換は、細胞が堆積／配置された後に、同一時点又は別々の時点で実施されてよい。
【００９２】
幾つかの実施形態では、１つ以上の関心対象刺激の、上皮細胞に対する効果が未知であり、本方法は更に、異なる上皮細胞集団又は細胞系列のうちの１つ以上に対する１つ以上の刺激の効果を検出又は測定するステップを含む。幾つかの実施形態では、測定するステップは、１つ以上の刺激に曝された後の１つ以上の異なる細胞集団又は細胞系列における細胞分化及び細胞増殖の一方又は両方を、１つ以上の刺激に曝される前の１つ以上の細胞集団又は細胞系列における細胞分化及び／又は細胞増殖と比較することを含む。幾つかの実施形態では、測定するステップは、１つ以上の異なる細胞集団又は細胞系列における細胞分化及び細胞増殖の一方又は両方を、１つ以上の刺激に曝されていない比較可能な細胞培養モデルの１つ以上の細胞集団又は細胞系列における細胞分化及び／又は細胞増殖と比較することを含む。細胞分化及び細胞増殖をアッセイする試薬及び方法は、当該技術分野において知られている。例えば、細胞増殖は、チミジンアナログＥｄＵの取り込みに関してアッセイされた細胞であってよい。従って、幾つかの実施形態では、本開示の平面陰窩モデルは、腸細胞に対する１つ以上の刺激の調節効果を検出又は測定することに使用されてよい。例えば、刺激は、細胞の増殖及び／又は分化を増加させたり刺激したりすること、又は細胞の生存度及び／又は分化を減少させることが可能である。
【００９３】
ＩＩＩ．装置
幾つかの実施形態では、本開示は、それぞれが異なる細胞集団又は細胞系列を含む２つ以上の別個の領域を含む組織構成物を生成すること、及び／又は腸陰窩又は結腸陰窩の２次元生細胞培養モデルを生成することの為の方法において有用な装置を提供する。幾つかの実施形態では、本装置は、底壁と、底壁から上方に延びる少なくとも１つの側壁と、少なくとも１つの側壁によって画定される上部開口部と、を含む管腔容器と、底壁上にあるか底壁を含む細胞支持基材であって、細胞支持基材は２つ以上の物理的に別個の領域を含み、支持基材の２つ以上の物理的に別個の領域は互いに異なり、支持基材又は基材アセンブリの２つ以上の物理的に別個の領域は異なる物理特性を含む、細胞支持基材と、を含む。
【００９４】
幾つかの実施形態では、細胞支持基材は、異なる物理特性を含む２つ以上の物理的に別個の領域を含む単層を含んでよく、例えば、この単層は管腔容器の底壁である。幾つかの実施形態では、細胞支持基材は、２つ以上の層を含む。幾つかの実施形態では、細胞支持基材は、第１の層及び第２の層を含み、第１の層は第２の層に被せられ、第１の層及び第２の層は異なる物理特性を有し、第１及び第２の層の一方が、その層の一方の表面からその層の反対側の表面まで延びる１つ以上の開口又は穴を含む。幾つかの実施形態では、第１及び第２の層の一方が、その層の一方の表面からその層の反対側の表面まで延びる１つ以上の開口又は微細穴（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、又はそれ以上の微細穴（微細穴と開口は本明細書全体を通して区別なく用いられる））を含む。幾つかの実施形態では、第２の層は管腔容器の底壁である。幾つかの実施形態では、第１及び第２の層の一方が、その層の一方の表面からその層の反対側の表面まで延びる４つ以上の微細穴を含むアレイを含む。幾つかの実施形態では、１つ以上の微細穴のそれぞれの径が、約１０マイクロメートルから約１００マイクロメートルの間（例えば、約５０マイクロメートル）である。幾つかの実施形態では、第１の層は多孔質材料を含み、第２の層は非多孔質材料を含み、第２の層は１つ以上の微細穴を含む。
【００９５】
本明細書において上述したように、細胞支持基材の全厚は約１ｍｍから約１μｍの間であってよく、例えば、全厚は約５００μｍ以下、約２５０μｍ以下、約１００μｍ以下、又は約５０μｍ以下であってよい。細胞支持基材の各層の個々の厚さは約１ｍｍから約１μｍの間であってよく、例えば、全厚は約５００μｍ以下、約２５０μｍ以下、約１００μｍ以下、又は約５０μｍ以下であってよい。各層は厚さが同一でも異なっていてもよい。幾つかの実施形態では、各層は個々に、約２μｍから約４０μｍの間（例えば、約２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、又は約４０μｍ）であってよい。
【００９６】
上述のように、本開示対象に有用な例示的多孔質材料として、天然又は合成ヒドロゲル（例えば、コラーゲン、マトリゲル、ゼラチン、アガロース、キトサン、アルギン酸塩、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド）、塩浸出前の乾燥ヒドロゲル（例えば、コラーゲンヒドロゲルが乾燥され、塩が浸出されて細孔が生成される）、プラスチックトラックエッチング膜(例えば、ポリカーボネート、ポリエステル)、膜フィルタ（ポリテトラフルオロエチレン、セルロース、ポリエーテルスルホン樹脂)、マイクロモールドメッシュ(例えば、ポリジメチルシロキサン、エポキシフォトレジスト）があってよく、これらに限定されない。多孔率／透過率を変化させる方法として、固体材料の密度、架橋密度、及び／又は製造設計の調節等があってよく、これらに限定されない。
【００９７】
本開示対象に有用な例示的非多孔質材料として、１００２Ｆエポキシフォトレジスト、環状オレフィンポリマー（例えば、商品名「ＺＥＯＮＯＲ（登録商標）」で販売されているもの（日本ゼオン株式会社（Ｚｅｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、日本国東京））、ポリカーボネート、アクリレートポリマー（例えば、ポリ（メチルメタクリレート））、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、セルロース、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）プラスチック、ナイロン、アセタール樹脂（例えば、商品名「Ｄｅｌｒｉｎ（登録商標）」で販売されているアセタール樹脂（デュポン（Ｅ．Ｉ．  ｄｕ  Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、米国デラウェア州ウィルミントン））、ポリテトラフルオロエチレン（例えば、ＴＥＦＬＯＮ（商標）（ケマーズ（Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｏｕｒｓ  Ｃｏ．）、米国デラウェア州ウィルミントン））、ポリエステル（例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリトリメチレンテレフタレート、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、商品名「ＴＲＩＴＡＮ（商標）」で販売されているコポリエステル（イーストマンケミカルカンパニー（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、米国テネシー州キングスポート））、エポキシ（例えば、ＳＵ−８、１００１Ｆ、１００９Ｆ）、エラストマ（例えば、ポリジメチルシロキサン、商品名「ＥＣＯＦＬＥＸ（商標）」で販売されているエラストマ（スムースオン（Ｓｍｏｏｔｈ−Ｏｎ  Ｉｎｃ．）、米国ペンシルベニア州マカンジー））、ガラス、セラミック、及び／又は金属があってよく、これらに限定されない。
【００９８】
幾つかの実施形態では、１つ以上の層（例えば、第１の層）がヒドロゲルを含む。幾つかの実施形態では、ヒドロゲルはコラーゲンを含む。幾つかの実施形態では、細胞支持基材は、第１の層が第２の層に被せられており、第１の層（即ち、１つ以上の細胞がその上に堆積される上面を有する層）はヒドロゲル（例えば、コラーゲン）を含む。
【００９９】
幾つかの実施形態では、本装置は更に、基礎容器を含み、基礎容器は、底壁と、底壁から上方に延びる少なくとも１つの側壁と、を含み、底壁及び少なくとも１つの側壁はウェルを画定し、管腔容器は、基礎容器のウェル内に保持されており、基礎容器の底壁は、管腔容器の底壁から間隔を置かれており、基礎容器が、基礎容器の底壁と管腔容器の底壁との間で、且つ／又は、基礎容器の少なくとも１つの側壁と管腔容器の少なくとも１つの側壁との間で画定されている。
【０１００】
幾つかの実施形態では、本開示の装置の管腔容器及び基礎容器の一方又は両方が、例えば、ペトリ皿、細胞培養皿、容器（ｖｅｓｓｅｌ）、又は基材であってよい。幾つかの実施形態では、それらは、市販の細胞培養皿、容器、又は基材を改変したものであってよく、市販の製品は、少なくとも２つの物理的に別個の領域を含む細胞支持基材を含有するように改変される。
【０１０１】
本開示対象の例示的装置１００Ａの断面図を図１Ａに示す。装置１００Ａは管腔容器（全体で１４０）を含む。管腔容器１４０は、全体として、側壁１４１で画定される円筒形状であってよく、その一方の端部が底壁１４２につながっている。管腔容器１４０は又、管腔フランジ１４２を含み、これは、管腔容器１４０の開放端部につながっているか隣接しており、壁１４１の上端から半径方向に延びている。底壁１４２は又、細胞支持基材１４５の底層を形成しており、細胞支持基材１４５は更に、底壁１４２を覆う上層１４６を管腔容器１４０の底部に含む。底壁／底層１４２は、微細穴１４７が横断する非多孔質材料を含む。上層１４６は、ヒドロゲル（例えば、コラーゲン）等の多孔質材料を含む。上層１４６の上面１４６’は、従って、２種類の物理的に別個の基材領域の表面を含む。領域１４６’ａは、細胞支持基材１４５が上層１４６及び底壁／底層１４２の両方を含む物理的に別個の領域のうちの１つの表面を表す。領域１４６’ｂは、微細穴１４７の１つの上に上層１４６がある第２のタイプの物理的に別個の領域の表面を表す。
【０１０２】
図１Ｂは、図１Ａの管腔容器１４０が基礎容器１６０に挿入されている例示的装置１００Ｂを示す。管腔容器１４０に関する参照符号は、図１Ａに関して記載されたものと同じである。基礎容器１６０は、全体として、一方の端部が閉じている円筒のような形状であってよい。基礎容器１６０は、全体として、側壁１６１で画定されており、側壁１６１は底壁１６２につながっている。管腔容器１４０が基礎容器１６０に挿入されているときには、管腔容器１４０の底壁１４２は基礎容器１６０の底壁１６２の上方に位置しているが、底壁１６２に接触していない。図１Ｂに示すように、基礎容器１６０は又、フランジ１６３を含み、フランジ１６３は、管腔容器１４０の開放端部につながっているか隣接しており、壁１４１の上端から半径方向に延びている。管腔容器１４０が基礎容器１６０に挿入されたときには、管腔容器１４０のフランジ１４３は、基礎容器１６０のフランジ１６３に載ることが可能である。或いは、フランジ１６３は、複数の基礎容器を含むアレイの上壁であってよい。
【０１０３】
図１Ｃは例示的装置１００Ｃを示しており、ここでは図１Ｂの装置１００Ｂに細胞が播種されていて、細胞の増殖が可能になっている。管腔容器１４０及び基礎容器１６０に関する参照符号は、図１Ａ及び１Ｂに関して記載されたものと同じである。図１Ｃでは、管腔容器１４０は細胞培地１４９で満たされていて、基礎容器１６０は、細胞培地１４９と異なる細胞培地１６９で満たされている。例えば、細胞培地１４９は分化培地であってよく、一方、培地１６９は（例えば、幹細胞を支援する増殖因子を含む）増殖培地であってよい。基礎容器１６０の細胞培地１６９は、底壁／底層１４２の微細穴１４７を埋めて、細胞培地１６９が細胞支持物１４５の多孔質上層１４６と接触することを可能にする。図１Ｃに示すように、細胞支持物１４５の上層１４６の上面１４６’に播種された細胞は、細胞１８２及び細胞１８４として例示されている２つの異なる細胞集団を形成する。細胞１８２は、エリア１４６’ａで増殖し、分化細胞集団（例えば、幹細胞を支援する増殖因子が管腔培地１４９にない場合）又は無処置細胞集団（例えば、スクリーニングされている関心対象の特定刺激（特定の薬品や試験化合物等）が管腔培地１４９にない場合）に転換する細胞である。細胞１８４は、エリア１４６’ｂで増殖し、幹細胞（例えば、幹細胞を支援する増殖因子が基礎培地１６９にある場合）又は処置細胞（例えば、関心対象の特定刺激（特定の薬品や試験化合物等）が基礎培地１６９にある場合）であってよい細胞である。
【０１０４】
本開示の装置及び方法は、多用途であって、異なる複数の用途に向けた実装が容易であり、そのような用途として例えば以下のものがあり、これらに限定されない。
１）生理学的研究（細胞間の高分子、イオン、及び水の輸送、酵素の機能、細菌との相互作用）の為のインビトロモデル。
２）薬品、生物学的製剤、食品化合物、毒素、突然変異原、発がん物質、病原体、ウイルス、微生物叢等のスクリーニング。
３）翻訳動物モデル又はヒトに由来する幹細胞及び／又は初代細胞を使用することによる病気モデル。
４）薬品、食品化合物等の包括的用量反応特性を含むスクリーニングの為の薬理学モデル、薬物動態学モデル、及び薬力学モデル。
５）代謝を研究する為のインビトロモデル。
６）バリア機能を維持及び修復する上皮組織の創傷治癒のインビトロモデル。
７）微生物とホストの相互作用の研究の為のインビトロモデル。
８）損傷した上皮を修復する移植の為の組織設計。
９）特定の遺伝的背景を有する個々の患者からの細胞に対して実施された研究によるオーダーメード医療。
１０）機能アッセイ（水及び電解質（ナトリウム、塩化物、重炭酸塩、プロトン、カリウム、カルシウム）、微生物由来代謝産物（短鎖脂肪酸等）の吸収及び輸送、未吸収栄養素の回収等）。
１１）（例えば、嚢胞性線維症における）粘液の生成、流れ、移動、及び粘液に対する病気関連の影響。
１２）便秘に対する下痢止めの薬剤及び治療（例えば、緩下剤）のアッセイ。
１３）シンバイオティクス、プレバイオティクス、及びプロバイオティクスのアッセイ。
１４）Ｘ線不透過性マーカ及びシンチグラフィマーカ検査、並びに上皮に対するそれらの影響のアッセイ。
１５）上皮に対する免疫細胞及びそれらの生成物（抗体及びサイトカイン）の影響。
１６）上皮に対する腸神経細胞及びそれらの生成物の影響。
１７）上皮に対する筋肉細胞、それらの収縮及び弛緩、並びにそれらの代謝産物の影響。
１８）水溶性繊維及び不溶性繊維、並びに上皮に対するそれらの影響のアッセイ。
１９）任意のタイプのけがに対する反応としての上皮の修復の理解。
２０）偽膜形成（例えば、クロストリジウムディフィシル）につながる細菌の調査。
２１）生物兵器化合物のスクリーニング。
２２）ＮＳＡＩＤ療法、化学療法、放射線療法等の薬品及び療法の副作用を理解する研究。
２３）上皮の完全性、機能、及び病気（例えば、炎症性大腸炎、腸疾患、がん等）に対する自然免疫系及び適応免疫系の役割の研究。
２４）オフターゲット効果を向上させる放射線療法及び化学療法並びに薬剤のアッセイ。
２５）液状がん（例えば、白血病や骨髄腫）及び／又は固体がん（例えば、黒色腫、がん腫、肉腫、リンパ腫、胚細胞腫瘍、及び／又は混合がん）を包含する低酸素状態又は時間及び／又は空間における酸素勾配を模倣する腫瘍モデル。
２６）抗菌剤、抗ウイルス薬、及び／又は抗真菌薬のアッセイ。
２７）片利共生細菌及び病原性細菌に対するバクテリオファージの効果、並びにそれらとホスト細胞との相互作用を理解する研究。
２８）グラム陰性菌、グラム陽性菌を包含するグラム陽性細菌感染及び／又はグラム陰性細菌感染のインビトロモデル系。そのような細菌として、アシネトバクターバウマニー、イスラエル放線菌、炭疽菌、バクテロイデスフラジリス、バルトネラヘンセラ菌、百日咳菌、ボレリアブルグドルフェリ、ボレリアガリニ、ボレリアアフゼリ、ボレリアレカレンチス、ウシ流産菌、イヌ流産菌、マルタ熱菌、ブタ流産菌、類鼻疽菌、カンピロバクタージェジュニ、クラミジアニューモニエ、クラミジアトラコマチス、オウム病クラミジア、ボツリヌス菌、クロストリジウムディフィシル、クロストリジウムパーフリンジェンス、破傷風菌、コリネバクテリウムアミコラトゥム、ジフテリア菌、コクシエラバーネッティ、エーリキアカニス、エーリキアシャフェンシス、大便連鎖球菌、エンテロコッカスフェシウム、大腸菌、腸管毒素原性大腸菌、病原性大腸菌、侵入性大腸菌、腸管出血性大腸菌、野兎病菌、インフルエンザ菌、ヘリコバクターピロリ、肺炎桿菌、レジオネラニューモフィラ、レプトスピラ種、リステリア菌、ハンセン菌、ヒト型結核菌、肺炎マイコプラズマ、淋菌、髄膜炎菌、パラクラミジア、緑膿菌、ノカルジアアステロイデス、ロッキー山紅斑熱リケッチア、サルモネラ菌、シゲラ菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、腐性ブドウ球菌、Ｂ群溶血性連鎖球菌、肺炎連鎖球菌、化膿連鎖球菌、ビリダンス型連鎖球菌、梅毒トレポネーマ、コレラ菌、ビブリオバルニフィカス、及び／又はエルシニア菌があってよく、これらに限定されない。
２９）二本鎖ＤＮＡウイルス、一本鎖ＤＮＡウイルス、二本鎖ＲＮＡウイルス、プラス鎖ＲＮＡウイルス、マイナス鎖ＲＮＡウイルス、円形一本鎖ＲＮＡウイルス、ＲＮＡ逆転写ウイルス、ＤＮＡ逆転写ウイルスを含むウイルスによる感染を理解する為のインビトロ培養システム。そのようなウイルスとして、シンプレックスウイルス、バリセロウイルス、サイトメガロウイルス、ロゼオロウイルス、リンホクリプトウイルス、ラディノウイルス、マストアデノウイルス、アルファパピローマウイルス、ベータパピローマウイルス、ガンマパピローマウイルス、ミューパピローマウイルス、ニューパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、モラスキポックスウイルス、オルトポックスウイルス、パラポックスウイルス、アルファトルクウイルス、ベータトルクウイルス、ガンマトルクウイルス、ゲミサーキュラーウイルス、エリスロウイルス、ディペンドウイルス、ボカウイルス、コルティウイルス、ロタウイルス、セドルナウイルス、ヘペウイルス、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、トロウイルス、マムアストロウイルス、ノロウイルス、サポウイルス、フラビウイルス、ヘパシウイルス、ペギウイルス、カルジオウイルス、コサウイルス、エンテロウイルス、ヘパトウイルス、コブウイルス、パレコウイルス、ロサウイルス、サリウイルス、アルファウイルス、ルビウイルス、デルタウイルス、リッサウイルス、ベシクロウイルス、フィロウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、パラミクソウイルス、ヘニパウイルス、モービリウイルス、レスピロウイルス、ルブラウイルス、メタニューモウイルス、ニューモウイルス、アレナウイルス、ペリブニヤウイルス、オルトブニヤウイルス、ハンタウイルス、ナイロウイルス、フェヌイウイルス、フレボウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、Ｃ型インフルエンザウイルス、トゴトウイルス、ガンマレトロウイルス、デルタレトロウイルス、レンチウイルス、スプーマウイルス、及び／又はオルトヘパドナウイルス等があり、これらに限定されない。
３０）低酸素状態を必要とするワクチンを生成する為のインビトロ培養システム。
３１）原虫感染症（例えば、赤痢アメーバ、クリプトスポリジウムパルバム、クリプトスポリジウムホミニス、サイクロスポーラカエタネンシス、及び／又はランブル鞭毛虫）の為のインビトロ培養システム。
３２）単細胞及び／又は多細胞真菌感染症の為のインビトロ培養システム。そのような菌類は、コウジカビ属、ブラストミセス属、カンジダ属、コクシジオイデス属、クリプトコッカスネオフォルマンス属、クリプトコッカスガッティ、ヒストプラスマ属、クモノスカビ属、ケカビ属、リクテイミア属、ニューモシスティスジロヴェチ、及び／又はスポロトリクス属の菌類である。
３３）抗バイオフィルム薬剤によるバイオフィルムの形成、成長、拡散、及び／又は崩壊のモデル。及び／又は、
３４）（空間又は時間における）酸素勾配又は低酸素状態を必要とするモデル系、又はそれらの系の組み合わせ。そのようなものとして、毛包ニッチ、脳卒中後の脳低酸素症、シアン化物中毒、ディッシュシステムの傷痕、線維症及び創傷の治癒、網膜症、角膜の酸素不足及び血管新生、歯周炎、上下気道モデル、細気管支炎、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺炎（細菌感染、ウイルス感染、マイコプラズマ感染）、間質性肺炎、肺水腫、低酸素性肺血管収縮反応モデル、肝臓組織モデル、肝再生、肝線維症、ウイルス性肝炎、脂肪肝疾患、腎症、腎炎、骨の成長と再生、軟骨再生、骨髄、骨折治癒機転モデル、血栓症、造血幹細胞ニッチ、鎌状赤血球病を含む貧血、運動中の筋肉のモデル、生殖器官モデル、子宮内膜症、子宮内低酸素症を含む胎盤発育モデル、胚発生モデル、虚血（心虚血、腸管虚血、脳虚血、肢虚血、皮膚虚血）及び虚血再灌流障害モデル、麻酔、及び／又は肥満モデルがある。
【０１０５】
実施例
以下の実施例は、本開示対象の代表的な実施形態を実施する為の指針を当業者に提供する為に記載したものである。本開示、及び当該技術分野における一般的な技量の観点から、当業者であれば理解されるように、以下の実施例は単に例示であるものとし、本開示対象の範囲から逸脱しない限り、様々な変更、修正、及び改変が行われてよい。
【０１０６】
材料と方法
マイクロデバイスの製造：
薄いフォトレジストフィルムに貫通穴をパターニングすることにより、（それぞれが５０μｍ径の）微細穴の１０×１０のアレイを薄いフォトレジストフィルムに作成した。パターニングしたフォトレジストフィルムを、修正されたＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）カセット（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ，  Ｉｎｃ．）、米国ニューヨーク州コーニング）の上にマウントし、細胞培養用コラーゲン層を切れ目なく、但し薄く被せた。
【０１０７】
より具体的には、パターニングされたフォトレジストフィルムを作成する為に、１００２Ｆ５０フォトレジストの層（２０μｍ厚）（パイ等（Ｐａｉ  ｅｔ  ａｌ．）著、アナリティカル  ケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２００７年、７９、ｐ．８７７４−８７８０を参照）  を、スライドガラス上に３０分間、１５００回転毎分（ｒｐｍ）でスピンコーティングし、その後、９５℃で３０分間ベーキングして固めた。フォトレジストを、（５０μｍ径の）開環がずらりと並んだフォトマスク越しに紫外光（５００ミリジュール（ｍＪ））に曝した。曝されたフォトレジストを、プロピレングリコールメチルエーテルアセテート（ＰＧＭＥＡ）中で現像し、９５℃で１２時間ベーキングして、非常に浅い深度（２０μｍ）のマイクロウェルのアレイを作成した。次に、スライドガラス上のフィルムを１５時間以上水に浸けて、ガラスに対するフィルムの粘着を弱めて、フィルムをＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）フレーム（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ，  Ｉｎｃ．）、米国ニューヨーク州コーニング）に容易に転写できるようにした。標準１２ウェルＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）インサートアレイ（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ，  Ｉｎｃ．）、米国ニューヨーク州コーニング）のベース上の膜をピンセットで完全に除去した後、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）フレーム（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ，  Ｉｎｃ．）、米国ニューヨーク州コーニング）を、パターニングされたマイクロウェルアレイのフォトレジスト側に両面医療テープ（３Ｍ、米国ミネソタ州メープルウッド）で貼り付けた。この時点で、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）フレーム（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ，  Ｉｎｃ．）、米国ニューヨーク州コーニング）は、スライドガラスに被せられた１００２Ｆフィルムに強固に貼り付けられていた。ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）フレーム（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ，  Ｉｎｃ．）、米国ニューヨーク州コーニング）を、貼り付けられたフィルムとともにスライドガラスからゆっくり持ち上げ、その後、フレームからはみ出たフィルムを全てトリミングすることにより、スライドをフレーム及び１００２Ｆフィルムから取り外した。
【０１０８】
最終的なマウス結腸細胞培養用マイクロデバイスを用意する為に、マイクロウェルアレイの表面全体にわたってコラーゲンの薄い層を形成した。まず、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）インサート（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ，  Ｉｎｃ．）、米国ニューヨーク州コーニング）内の１００２Ｆフィルムを５分間プラズマ処理して、その親水性及び水湿潤性を改善した。次に、プラズマ処理されたインサートを、パターニングされた１００２Ｆフィルムとともに、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）でコーティングされたペトリ皿の上に置いた（ＰＤＳＭは、商品名「ＳＹＬＧＡＲＤ（商標）  １８４」で販売されているシリコンエラストマキット（米国ミシガン州ダウコーニング）を使用して調製した）。中和されたコラーゲン（水酸化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、及びＰＢＳで中和された０．０２Ｎの酢酸溶液（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ，  Ｉｎｃ．）、米国ニューヨーク州コーニング）中の、２００μＬのラット尾コラーゲンＩ（ワン等（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）著、セルラー  アンド  モレキュラー  ガストロエンテロロジー  アンド  ヘパトロジー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）、２０１７年、４、ｐ．１６５−１８２を参照））をインサート内の１００２Ｆフィルム面上に定量供給した。このコラーゲンを３７℃で１時間インキュベートしてゲル化した。このコラーゲンゲルを４０℃のオーブンで１６時間乾燥させて、塩結晶で覆われたコラーゲンの薄い層にして、フォトパターニングされた１００２Ｆフィルムを被せた。この薄いコラーゲン膜は、１００２Ｆフィルム上の穴全体にわたるギャップにまたがった。インサートの、コラーゲンでコーティングされた１００２Ｆ面を水で穏やかにすすいで塩を除去し、７０％エタノールで滅菌し、滅菌ＰＢＳで洗浄した。コラーゲンフィルムへの細胞の接着を更に強化することを目的として、細胞培養の直前に、５０μｇ／ｍＬのラット尾コラーゲンＩ（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ））が入ったＰＢＳを加えて、３７℃で少なくとも１時間インキュベートした。
シミュレーションと拡散の研究：
【０１０９】
コムソルマルチフィジックス（ＣＯＭＳＯＬ  Ｍｕｌｔｉｐｈｙｓｉｃｓ）（コムソル（ＣＯＭＳＯＬ  Ｉｎｃ．）、米国マサチューセッツ州バーリントン）を使用して、コラーゲンで覆われた微細穴を通り抜ける増殖因子の拡散をモデル化した。微細穴アレイ及び管腔／基礎リザーバのジオメトリをモデルに組み込んだ。薄いコラーゲン層内の拡散係数を、水媒体内の拡散係数と同等であると仮定した。この仮定が妥当であるのは、このプラットフォームのコラーゲン層の厚さがわずか５μｍであった為（並びに、増殖因子が大きい場合でも膜を通り抜ける平均時間が１秒を下回ると考えられた為）である。微細穴アレイを通り抜ける増殖因子（３９．７キロダルトン（ｋＤａ）（Ｗｎｔ−３Ａ）、４０ｋＤａ（Ｒ−スポンディン））の拡散をシミュレートする為に、フルオレセインデキストラン（４０  ｋＤａ）の拡散を用いた。フルオレセインデキストラン（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、米国ミズーリ州セントルイス）をＰＢＳに溶かしてマイクロデバイスの基礎リザーバ内に置き（１．５ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ）、フルオレセインデキストランがないＰＢＳ（０．５ｍＬ）を管腔リザーバに収容した。２４時間毎に基礎リザーバ及び管腔リザーバから試料（５０μＬ）を採取した。試料の蛍光強度を測定して、各リザーバ内の蛍光デキストランの濃度を推定した。測定した濃度を、既存の報告にある４０ｋＤａのフルオレセインデキストランの拡散率、即ち、７．４×１０−１１ｍ２／ｓを用いたマイクロデバイス内のシミュレーション値と比較した。アーマド等（Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．）著、ＲＳＣアドバンセス（ＲＳＣ  Ａｄｖａｎｃｅｓ）、２０１５年、５、ｐ．７４８８１−７４８９１を参照されたい。マイクロデバイス内のコラーゲンを通って拡散した蛍光デキストランの実験データとシミュレーション値とが同等であったので、同じ拡散係数を使用して、マイクロデバイス内の増殖因子の拡散をシミュレートした。
【０１１０】
細胞培養と免疫蛍光染色
オスとメスのマウスの腸から採取した陰窩を、既述のように緩衝液（２．０ｍＭのＥＤＴＡと０．５ｍＭのＤＴＴ）に隔離した。ワン等（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）著、セルラー  アンド  モレキュラー  ガストロエンテロロジー  アンド  ヘパトロジー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）、２０１７年、４、ｐ．１６５-１８２を参照されたい。染色体の完全性を確保する為に、使用した細胞は全て、５継代培養未満とした。マウス腸細胞を、増殖培地（ＥＭ）下の中和コラーゲンゲル（６ウェルプレートに入れた１ｍＬ）の平らな表面上で単層として培養した。ＥＭは、培養物内の幹細胞を支援する為にＷｎｔ３Ａ、Ｒ−スポンディン３、及びノギンを有する。ＥＭの組成については後で表２において詳述する。ＥＭで使用した化学物質は、以下の供給元から購入した。即ち、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＧｌｕｔａＭＡＸ、及びＨＥＰＥＳをサーモフィッシャーサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．）（米国マサチューセッツ州ウォルサム））から、マウスＥＧＦをペプロテックＵＳ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  ＵＳ）（米国ニュージャージー州ロッキーヒル）から、Ａ８３−０１をシグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）（米国ミズーリ州セントルイス）から、Ｎ−アセチルシステインをＭＰバイオ（ＭＰ  Ｂｉｏ）（ＭＰバイオメディカル（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）、米国カリフォルニア州サンタアナ）から、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ−２７６３２）をアペックスバイオテクノロジー（ＡｐｅｘＢｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ＬＬＣ）（米国テキサス州ヒューストン）から、商品名ＰＲＩＭＯＣＩＮ（ＴＭ）で販売されている抗菌薬をインビボジェン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）（米国カリフォルニア州サンジエゴ）から、それぞれ購入した。
【０１１１】
ＥＭは、２日毎に新鮮なＥＭに交換した。細胞を３〜５日毎に継代培養した。これは、コラーゲンをコラゲナーゼで分解し、０．５ｍＭのＥＤＴＡで細胞を解離させて細胞のクランプにすることにより実施した。これらの単層は完全には単細胞に解離しなかったが、これは、結果として幹細胞の死亡率が高かった為である。マイクロデバイスの表面上に細胞を配置したら、細胞懸濁液をＥＭ中で１〜２倍に希釈して、マイクロデバイスの表面上に塗った。トランスウェルカセットの管腔リザーバ及び基礎リザーバの中にＥＭを入れて、細胞を２日間培養した。２日目に管腔培地及び基礎培地を後で表３に示すように変更し、細胞を１日間インキュベートした。３日目に管腔培地及び基礎培地を新鮮な培地（２日目の交換からの培地と同じもの）に交換し、更に１日間、細胞をインキュベートした。幾つかの実験では、管腔区画内の培地を分化培地（ＤＭ、表２を参照）に交換した。ＤＭはＥＭとよく似ているが、腸幹細胞を支援するのに必要な、キーとなる増殖因子がない。短鎖脂肪酸による実験では、各短鎖脂肪酸を、アセテートに対しては２４ｍＭ、プロピオネートに対しては６ｍＭ、ブチレートに対しては１ｍＭの濃度で管腔培地に加えた。
【表２】
2021525075.tif 000004
【表３】
2021525075.tif 000005
【０１１２】
製造元のプロトコル（Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ  ＥｄＵ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７イメージングキット、Ｃ１０３４０、サーモフィッシャーサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．）（米国マサチューセッツ州ウォルサム））に従って、細胞周期のＳ相にある細胞を、５−エチニル−２'−デオキシウリジン（ＥｄＵ）パルスのパルスによりインキュベートした。ＥｄＵは、ＤＮＡがＳ相で複製される際にＤＮＡに取り込まれるヌクレオチド類似体である。つまり、ＥｄＵ（１０μＭ）を管腔培地及び基礎培地に加えて、細胞を３７℃で３時間インキュベートした。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、４％のパラホルムアルデヒドを入れたＰＢＳで１５分間固定し、０．５％のトリトン−Ｘにより２５℃で２０分間透過処理した。製造元のプロトコル（Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ  ＥｄＵ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７イメージングキット、Ｃ１０３４０、サーモフィッシャーサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．）（米国マサチューセッツ州ウォルサム））に従い、細胞ＤＮＡに取り込まれたＥｄＵを、クリックケミストリによるＡｌｅｘａ  ６４７との反応によって可視化した。
【０１１３】
ＥｄＵによるパルス追跡実験の為に、細胞をＥＭで２日間増殖させた。２日目に管腔培地及び基礎培地を除去し、その後、管腔区画にＤＭを加え、基礎区画にＥＭを加え、細胞を１日間インキュベートした。培地を新鮮な培地（２日目の交換からの培地と同じもの）に交換し、更に１日間、細胞をインキュベートした。４日目にＥｄＵを管腔培地及び基礎培地に加えて、細胞を上述のように３時間インキュベートした。次に、管腔培地及び基礎培地をそれぞれ新鮮なＤＭ及びＥＭに交換し、更に２日間、培地を毎日交換して細胞をインキュベートした。
【０１１４】
培養の４日目に、細胞単層を、アルカリホスファターゼ活性に関してアッセイした。これは、ＡＬＰ基材混合物（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｒｅｄ  ＡＰ基材キットＳＫ−５１００、ベクターラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州バーリンゲーム）により、Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．４）中で３７℃で３０分間インキュベートすることにより実施した。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、上述のように固定及び透過処理した。細胞ＤＮＡを標識する為に、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（２μｇ／ｍＬ、Ｂ２２６１、シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）（米国ミズーリ州セントルイス））を細胞とともに（２５℃で１時間）インキュベートした。
【０１１５】
免疫蛍光染色の為に、Ｅ−カドヘリンに対する初代抗体（１：２００、２０８７４−１−ＡＰ、プロテインテック（ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈ）、米国イリノイ州ローズモント）、β−カテニン（１：２００、ｓｃ−７９６３、サンタクルーズバイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）、米国テキサス州ダラス）、ムチン２（１：２００、ｓｃ−１５３３４、サンタクルーズバイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）、米国テキサス州ダラス）、及びクロモグラニンＡ（１：１５００、ａｂ１５１６０、アブカム（Ａｂｃａｍ）、英国ケンブリッジ）、並びにＡｌｅｘａ  ４８８−共役ヤギ抗ウサギ抗体（１：５００、Ａ１１００８、ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、米国カリフォルニア州カールズバッド、Ｅ−カドヘリン、クロモグラニンＡ、及びムチン２の代用）又はＡｌｅｘａ  ６４７−共役ロバ抗マウス抗体（１：５００、７１５−６０５−１５０、ジャクソンイムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、米国ペンシルベニア州ウェストグローブ、β−カテニンの代用）を使用した。細胞を、ＥＭ中のマイクロデバイス上で２日間増殖させ、更に後述のように培養した。４日目に、細胞を、４％のパラホルムアルデヒドを入れたＰＢＳで１５分間固定し、０．５％のトリトン−Ｘにより２５℃で２０分間透過処理した。抗体の非特異的結合を最小限に抑える為に、細胞を、３％のＢＳＡを入れたＰＢＳにより℃で１時間ブロックした。次に、３％のＢＳＡを入れたＰＢＳにより、上述の各製造元が推奨する希釈比で希釈された各初代抗体を、細胞に加え、４℃で少なくとも１６時間インキュベートした。次に細胞を、３％のＢＳＡを入れたＰＢＳで３回洗浄し、３％のＢＳＡを入れたＰＢＳにより両方とも１：５００の比率で希釈された二次抗体及びＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２とともに２５℃で１時間インキュベートし、最後に３％のＢＳＡを入れたＰＢＳで２回洗浄し、次にＰＢＳだけで洗浄した。
細胞の画像化：
【０１１６】
マイクロデバイスからの細胞層を有するＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）インサート（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ，  Ｉｎｃ．）、米国ニューヨーク州コーニング）をＰＢＳ下の１２ウェルプレートに入れ、ＦＬＵＯＶＩＥＷ（登録商標）  ＦＶ３０００（登録商標）共焦点顕微鏡（オリンパス（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、日本国東京都）（１０倍、対物レンズ、開口数０．４）を使用して画像化した。Ａｌｅｘａ  ６４７、Ｖｅｃｔｏｒ−Ｒｅｄ−ＡＬＰ、及びＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を、それぞれ６４０、５６１、及び４０５ｎｍのレーザで励起し、それぞれ６５０〜７５０ｎｍ、５７０〜５９０ｎｍ、及び４３０〜４７０ｎｍの範囲で蛍光発光を収集した。これらの画像を、フィジー（Ｆｉｊｉ）ソフトウェアパッケージにより分析した。シンデリン等（Ｓｃｈｉｎｄｅｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）著、ネイチャー  メソッド（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）、２０１２年、９、ｐ．６７６を参照されたい。全ての実験に関して、サンプルサイズの数値の推定を、様々な条件下（α＝０．０５、β＝０．８５）でのＥｄＵ＋及びＡＬＰ活性をＧ＊Ｐｏｗｅｒで測定したワン等（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）（セルラー  アンド  モレキュラー  ガストロエンテロロジー  アンド  ヘパトロジー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）、２０１７年、４、ｐ．１６５−１８２）のデータに基づく統計的検出力分析により行った。ファウル等（Ｆａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．）著、ビヘイビア  リサーチ  メソッド（Ｂｅｈａｖｉｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）、２００７年、３９、ｐ．１７５−１９１を参照されたい。蛍光顕微鏡画像から得られたデータの全ての統計分析に一元配置分散分析を用いた。ＦＥＩ  ＱＵＡＮＴＡ（商標）  ２００  ＥＳＥＭ顕微鏡（サーモフィッシャーサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．）、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）を実施した。ＳＥＭ画像化の為に試料を最初に４％のパラホルムアルデヒドで固定し、臨界点乾燥機（ＰＶＴ−３、Ｔｏｕｓｉｍｉｓ  Ｓｅｍｉｄｒｉ、米国メリーランド州ロックビル）で乾燥させ、１０ｎｍの金属をスパッタコータ（Ｃｒｅｓｓｉｎｇｔｏｎ  １０８、クレッシングトンサイエンティフィックインスツルメント（Ｃｒｅｓｉｎｇｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、英国ワトフォード）でコーティングした。剛性測定：
【０１１７】
上述のコラーゲンの剛性、並びに１００２Ｆフィルムの微細穴に隣接する領域の剛性を、流体（１倍ＰＢＳ）中で原子間力顕微鏡（ＭＦＰ３Ｄ、アシラムリサーチ（Ａｓｙｌｕｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、米国ノースカロライナ州モリスビル）を使用して測定し、力対押込み量曲線（２つの試料。各試料について微細穴の上方にあるか微細穴に近接する１０箇所）を収集した。ポリスチレンビード（４．５μｍ径）を取り付けたシリコンカンチレバ（定格ばね定数０．０３Ｎ／ｍ）をノヴァスキャンテクノロジーズ（Ｎｏｖａｓｃａｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）（米国アイオワ州エイムズ）から購入した。全ての較正、データ収集、及びデータ分析を、アシラム（Ａｓｙｌｕｍ）ソフトウェアを使用して実施した。カンチレバのばね定数については、その熱運動を記録することによって、より正確に確定した（０．０３１７５Ｎ／ｍ）。試料に１０ｎＮを印加して力対押込み量曲線を記録し、各曲線の９０％（平均押込み量１４０ｎｍ）をＨｅｒｔｚモデルに当てはめることによって試料の剛性（ｋＰａ）を取得した。
【０１１８】
実施例１
平面腸陰窩を支持するマイクロデバイスの製作及び特性化
平面腸陰窩を支持するマイクロデバイス装置の製作の一例示的工程を図４Ａに示す。本デバイスを製作する為に、１００２Ｆの層（ＳＥＭで４０μｍ厚）をスライドガラスにコーティングし、１０×１０個の不透明の円のアレイ（５０μｍ径、エッジ間距離３００μｍ）を有するマスクを使用してフォトパターニングした。図４Ｂを参照されたい。水中でインキュベートすることにより１００２Ｆをスライドガラスから取り外し、このフィルムをＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）インサート（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ，  Ｉｎｃ．）、米国ニューヨーク州コーニング）（購入時に貼り付けられていた膜は除去されている）の底部に移した。１００２Ｆフィルムが貼り付けられたインサートをＰＤＭＳ面上に置き、コラーゲンをリザーバに装填して、マイクロパターニングされた１００２Ｆの上に１ｍｍ厚のコラーゲンゲルを形成した。次に、このコラーゲンを脱水すると、表面上に広がって微細穴間を架橋する凝縮されたコラーゲン層が残り、これを塩結晶で覆った。図４Ｃの上側のパネルを参照されたい。このコラーゲンを再水和すると、デバイスの上面全体にわたって、高密度ながら多孔質のコラーゲン膜（共焦点蛍光顕微鏡で４．７μｍ厚）が得られた。図４Ｃの下側のパネルを参照されたい。微細穴及び１０００２Ｆ面の上方の領域でのコラーゲン層の剛性は、４．５μｍ径のプローブチップを有するＡＦＭで測定すると、それぞれ５５．８３±１９．２１ｋＰａ及び１４６．３８±４２．２７ｋＰａ（ｎ＝３、試料毎に１０箇所、ｐ＜０．０００１）において有意差があった。脱水及び再水和の過程で、１００２Ｆ面全体にわたってコラーゲン密度が増加した。これは、このステップによってコラーゲン厚が１ｍｍから４．７μｍに減少した為である。そして、この密度の増加によって、非凝縮時には濃度に応じて剛性が１０〜１０００Ｐａであることが報告されているコラーゲンの剛性も同様に増加した。ワン等（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）著、セルラー  アンド  モレキュラー  ガストロエンテロロジー  アンド  ヘパトロジー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）、２０１７年、4、ｐ．１６５-１８２を参照されたい。コラーゲンでコーティングされた１００２Ｆ面の剛性が高くなったことは、コラーゲンのコーティングによって１００２Ｆフィルムの剛性が完全にマスクされるわけではないことを示唆している。ＥＰＯＮ樹脂の典型的な剛性は数ＧＰａである。エンゲルベルク、テソロ（Ｅｎｇｅｌｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｔｅｓｏｒｏ）著、ポリマー  エンジニアリング  アンド  サイエンス（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ＆  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９０年、３０、ｐ．３０３−３０７、並びにヴァッロ等（Ｖａｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．）著、ポリマー  ゲルス  アンド  ネットワークス（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｇｅｌｓ  ａｎｄ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ）、１９９３年、１、ｐ．２５７−２６６を参照されたい。ＡＦＭによると、押込み深さは約１５０ｎｍであった。これは、一般に細胞が感知する押込み深さより浅い。しかしながら、いかなる理論にもとらわれずに言えば、細胞は、ＡＦＭチップで検知できる以上に、下層の１００２Ｆフィルムの剛性を「感じる（ｆｅｅｌ）」ことができる可能性がある。ク等（Ｑｕ  ｅｔ  ａｌ．）著、サイエンティフィック  レポーツ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ）、２０１８年、８、ｐ．３２９５、並びにフランク等（Ｆｒａｎｃｋ  ｅｔ  ａｌ．）著、プロス  ワン（ＰｌｏＳ  ｏｎｅ）、２０１１年、６、ｐ．ｅ１７８３３を参照されたい。
【０１１９】
増殖因子が１００２Ｆ微細穴及びコラーゲンフィルムを通り抜けて移動する能力をＣＯＭＳＯＬでシミュレートした。図４Ｄ及び４Ｅを参照されたい。（分子量がＷｎｔ−３Ａ及びＲ−スポンディンと同等である）４０ｋＤａのフルオレセインデキストランのヒドロゲル中の拡散係数は、事前の測定では７．４×１０−１１ｍ２／ｓであった。アーマド等（Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．）著、ＲＳＣアドバンセス（ＲＳＣ  Ａｄｖａｎｃｅｓ）、２０１５年、５、ｐ．７４８８１−７４８９１を参照されたい。対照として、基礎区画から管腔区画へのフルオレセインデキストラン（４０ｋＤａ）の経時移動量を、これらのリザーバの試料採取によって測定し、シミュレーションによる予測と比較した。結果は一致した。図４Ｅを参照されたい。シミュレーションの予測では、フルオレセインデキストラン（３０ｎｇ／ｍＬ）を基礎区画にのみ装填してから２４時間後に、管腔区画内のフルオレセインデキストラン濃度が、コラーゲンでコーティングされた微細穴の上（表面から１０μｍ上方）で最大レベル（７．３〜８．３ｎｇ／ｍＬ）になり、全方向で急速に低下して、微細穴間の等距離にある点で４．５〜５．５ｎｇ／ｍＬになった。増殖因子濃度の低下の最も急な勾配は１８ｐｇ／ｍＬ／μｍであった。これは、いかなる理論にもとらわれずに言えば、結腸上皮細胞による２つの細胞区画、即ち、幹細胞／増殖細胞区画及び分化細胞区画の形成を引き起こすのに十分であると考えられる値である。報告されている、以前の測定では、７５ｐｇ／ｍＬ／μｍの勾配が、２００μｍ長のマウス結腸オルガノイドを分極させるのに十分であった（アーマド等（Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．）著、ＲＳＣアドバンセス（ＲＳＣ  Ａｄｖａｎｃｅｓ）、２０１５年、５、ｐ．７４８８１−７４８９１を参照）。しかしながら、この、以前の研究には剛性又は多孔性の勾配が組み込まれていない。このことは、本開示対象に従って測定された勾配より急な勾配が必要とされることを示していると考えられる。上述のシミュレーションには乱流混合又は対流混合が組み込まれていない為、シミュレーションで予測された勾配も同様に、１００２Ｆ面に沿った最低限の濃度差を表している。しかしながら、シミュレーションは、コラーゲンでコーティングされた微細穴のアレイが、微細穴の中心から外向きの増殖因子勾配を確立する局在化された増殖因子源として動作可能であることを示唆している。
【０１２０】
実施例２
コラーゲンでコーティングされ、パターニングされたフィルム上での初代マウス腸上皮細胞の増殖
管腔リザーバ（上側）及び基礎リザーバ（下側）にＥＭ又は幹細胞支持培地を置いて（ＥＭ／ＥＭ）、コラーゲンでコーティングされ、パターニングされた微細穴を有する１００２Ｆフィルム上で４日間、細胞を培養した。培養期間を４日間としたのは、マウス結腸上皮細胞の典型的な寿命（３〜５日）を模倣する為である。ツボウチ（Ｔｓｕｂｏｕｃｈｉ）著、デベロップメント  ダイナミクス（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）、１９８１年、１６１、ｐ．２３９−２４６を参照されたい。それぞれ、ＥｄＵ組み込み及びアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性によって示される細胞の増殖及び分化を経時追跡した。図５を参照されたい。２日目に細胞はロバストな増殖を示した。これは、フィルム表面全体にわたって細胞にＥｄＵを組み込んだことによって示された。一方、ＡＬＰ活性は、上皮細胞内ではほとんど検出されなかった。このことは、これらの条件下では、且つこの時点では、分化細胞がほとんど存在していないことを示唆している。培養の３日目には、ＥｄＵ＋細胞がアレイ全体にわたって存在したままであり、これに低レベルのＡＬＰ活性が伴った。しかしながら、培養の４日目には、微細穴の中心から外に５０−６０μｍ広がったＥｄＵ＋細胞の円形領域による特徴的な細胞パターニングが存在した。図５並びに図６Ａ及び６Ｊを参照されたい。微細貫通穴の中心から７０μｍを超える距離にはＥｄＵ＋細胞が存在しなかった。図５並びに図６Ａ及び６Ｊを参照されたい。一方、微細穴の中心から９０μｍを超える距離の細胞内に低レベルのＡＬＰ活性が存在したままであった。図５並びに図６Ａ及び６Ｋを参照されたい。微細穴の中心から７０μｍ以内の細胞には、測定可能なＡＬＰ活性が発現しなかった。微細穴の中心から６０〜７０μｍの過渡ゾーンにある細胞にはＥｄＵ組み込みもＡＬＰ活性もほとんどなかった。このことは、これらの領域で、増殖シグナルと分化シグナルとが等しくバランスしていたことを示唆している。
【０１２１】
増殖因子を有するＥＭを全ての細胞に与えたにもかかわらずこのように特徴的なパターニングになったことを理解する為に、ＥＭ／ＥＭ下で、コラーゲンでコーティングされた、微細穴がない１００２Ｆフィルム上で細胞を培養した。これは、硬くて不透過性である１００２Ｆ面が全ての細胞の下にあるようにする為である。培養の４日目に、細胞はＥｄＵ組み込みを示さなかった。このことは、これらの条件下では１００２Ｆ面の影響が支配的であり、それによって細胞の分割が止まったことを示唆している。下層に１００２Ｆフィルムがないコラーゲン層上でも、細胞をＥＭ／ＥＭ下で４日間培養した。この期間中は、これらの細胞のほぼ全てがＥｄＵ＋のままであった。剛性が低く多孔性が高い基材の存在下では、細胞増殖を駆動する能力が増殖因子にあった。従って、下層マトリックスの材料特性の変化だけが、アレイ上に２つの細胞ゾーン、即ち、増殖性が高い領域と、細胞分化の痕跡がある非増殖区画とを作成するのに十分であった。多孔性は幹細胞の挙動に有意の影響を及ぼすが、ヒドロゲル系においては大抵の場合、その影響は剛性と連動する。これは、剛性の増大（同時に細孔径の減少）に架橋頻度が用いられる為である。一例として、ＰＥＧヒドロゲルによる間充織幹細胞の移動が足場の多孔性、並びに剛性及び接着力に依存することが示されている。ペイトン等（Ｐｅｙｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）著、バイオテクノロジー  アンド  バイオエンジニアリング（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、２０１１年、１０８、ｐ．１１８１−１１９３を参照されたい。更に、硬質ポリスチレンの多孔性によって、ヒト幹細胞由来の神経突起の増殖を変化させることが可能である。ハイマン等（Ｈａｙｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル  オブ  バイオケミカル  アンド  バイオフィジカル  メソッズ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）、２００５年、６２、ｐ．２３１−２４０を参照されたい。多孔性は、上皮細胞内の細胞モルフォロジ及び細胞骨格形成にも影響する可能性がある。モデル上皮細胞株であるＭＤＣＫ  ＩＩ細胞は、より扁平で広がりのあるモルフォロジを採用しており、非多孔質基材上で、多孔質基材上の場合より厚いアクチンストレス線維を形成する。ロザー等（Ｒｏｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）著、ジャーナル  オブ  ザ  ロイヤル  ソサエティ  インタフェース（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）、２０１５年、１２、ｐ．２０１４１０５７、並びにヤンショフ等（Ｊａｎｓｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．）著、ジャーナル  オブ  アドヒージョン  サイエンス  アンド  テクノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、２０１０年、２４、ｐ．２２８７−２３００を参照されたい。コラーゲンで覆われた微細穴とコラーゲンでコーティングされた１００２Ｆとの間の剛性の変化も、小さいながら、細胞挙動に潜在的に影響を及ぼす可能性がある。胚性幹細胞において硬い表面が軟らかい表面に比べてＯｃｔ３／４又はＮａｎｏｇ多能性幹細胞マーカのタンパク質レベルを低下させることが示されており、���のことは、表面が硬いほど分化を増大させうることを示している。コージュリー等（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．）著、プロス  ワン（ＰｌｏＳ  ｏｎｅ）、２０１０年、５、ｐ．ｅ１５６５５、並びにリュー等（Ｌｕウムラウト  ｅｔ  ａｌ．）著、バイオマテリアルズ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）、２０１４年、３５、ｐ．３９４５−３９５５を参照されたい。最後に、マウス及びヒトの腸幹細胞が、ポリスチレン又はポリ（ジメチルシロキサン）のように、軟らかい表面に比べて非常に硬い表面上では、増殖しなくなって、より分化した表現型を採用するように見えることが示されている。ワン等（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）著、セルラー  アンド  モレキュラー  ガストロエンテロロジー  アンド  ヘパトロジー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）、２０１７年、4、ｐ．１６５-１８２を参照されたい。まとめると、本開示の研究は、多孔性及び剛性の変化が相まって細胞の末路を変える可能性があることを示している過去の研究と一致している。注目すべきは、ＥＭがＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２を含むことである。これは、初代腸細胞培養においてアノイキスを阻害する為によく使用される。ＲＯＣＫシグナリングは、メカノセンシング及びメカノトランスダクションを調節することが知られている為（イム、シーツ（Ｙｉｍ  ａｎｄ  Ｓｈｅｅｔｚ）著、ステム  セル  リサーチ  アンド  セラピー（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｙ）、２０１２年、３、ｐ．４１、並びにプロヴェンザーノ、キーリー（Ｐｒｏｖｅｎｚａｎｏ  ａｎｄ  Ｋｅｅｌｙ）著、ジャーナル  オブ  セル  サイエンス（Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ）、２０１１年、１２４、ｐ．１１９５−１２０５を参照）、Ｙ−２７６３２が存在すると、基材剛性に対する反応が変わる可能性がある。
【０１２２】
細胞挙動に対する表面の影響についての知見を得る為に、本開示のアレイの別々の領域にある細胞の特性について更に調べた。Ｚ軸方向の細胞の断面から、表面上の全ての領域が単層として増殖したことが確認された。図６Ｂを参照されたい。図６Ｆの、Ｅ−カドヘリン染色で可視化された細胞輪郭は、微細穴の上の細胞密度（２．２±０．１細胞／１００μｍ２）が微細穴間の領域の細胞密度（０．８±０．１細胞／１００μｍ２）と有意差があることを示しており（ｎ＝３陰窩、ｐ＜０．０００５）、このことは、微細穴の上の細胞の形状が（インビボ腸上皮の場合と同様に）より柱状であって、中間領域の細胞はより広がりがあって扁平である形状を採用していたことを示唆している。これらの結果は、上述の多孔性基材及び非多孔質基材に対する上皮細胞の既知の反応と矛盾しない。しかしながら、表面の全ての領域の細胞が、接着結合マーカであるＥ−カドヘリンを発現しており、このことは、表面全体にわたって細胞間接着が保持されていたことを示唆している。図６Ｆを参照されたい。接着結合複合体内のカドヘリンに結合するＷｎｔシグナリングの下流エフェクタであるβ−カテニン（ヴァレンタ等（Ｖａｌｅｎｔａ  ｅｔ  ａｌ．）著、ジ  ＥＭＢＯ  ジャーナル（Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ）、２０１２年、３１、ｐ．２７１４−２７３６を参照）も、全ての領域の細胞に対して顕著であった（図６Ｆを参照）。このことは、たとえ微細穴から離れている細胞がＷｎｔ−３によって増殖を駆動されなくても全ての細胞がＷｎｔ−３Ａの結合及びシグナリングの作用を受け続けることを示している。これらのデータは、細胞を２つの領域、即ち、ｉ）腸細胞がほとんどなく細胞密度が高い増殖領域と、ｉｉ）腸細胞マーカＡＬＰがより高く、より扁平な形状を採用している非増殖領域とに分離することを開始するのに剛性及び／又は多孔性が十分であったことを示している。
【０１２３】
実施例３
幹細胞／増殖細胞区画及び分化細胞ゾーンの作成
いかなる理論にもとらわれずに言えば、分化細胞に高ＡＬＰ活性がなかったのは、おそらく増殖因子であるＷｎｔ−３、ノギン、及びＲ−スポンディンがずっと存在した為であった。ＥＭ／ＥＭ中のアレイ上で細胞を２日間培養して、コラーゲンでコーティングされた表面全体にわたって細胞が付着して広がることを可能にし、次に、ＤＭ／ＥＭ（管腔／基礎）に切り替えて更に２日間培養した。ＤＭ（分化培地）はＷｎｔ３Ａ、Ｒ−スポンディン、又はノギンを含まず、腸上皮細胞を腸細胞系列又は吸収性細胞系列に向けて強制分化させる。ワン等（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）著、ＡＣＳバイオマテリアルズ  サイエンス  アンド  エンジニアリング（ＡＣＳ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、２０１７年、３、ｐ．２５０２−２５１３を参照されたい。ＤＭ／ＥＭに曝された細胞の末路を調べる為に、細胞の増殖及び分化を経時追跡した。図５を参照されたい。培養の３日目に、増殖細胞を微細穴の上の表面領域にほぼ局在化し、ＡＬＰ活性がある細胞を他の領域に限定した。４日目に、２つの別個の細胞区画を難なく可視化した。微細穴の上にのみ配置された増殖細胞区画と、４日後に作成されたＥＭ／ＥＭの増殖細胞区画との間にサイズの統計的な差はなかった。図６Ｃ、６Ｄ、及び６Ｊを参照されたい。このことは、微細穴の上の細胞が拡散して微細穴を通り抜けて、ＥＭ中の増殖因子をすぐに利用できたことを示唆している。これに対し、細胞のＡＬＰ活性は、微細穴の中心から６０μｍのところで増え始め、１３０μｍのところで最大活性に達した。これらの外側領域では、ＡＬＰ活性は、ＥＭ／ＥＭによって生成されてから大幅に増えた（４．５倍、ｎ＝５陰窩、ｐ＜０．０００５）。図６Ｋを参照されたい。上部リザーバ内のＤＭは、その下の表面とともに、腸上皮細胞を非増殖表現型に方向づけ、ＡＬＰ活性を大幅に増やして、微細穴の上の増殖細胞ゾーン（０〜５０μｍ）を取り囲む分化細胞ゾーン（＞１３０μｍ）を作成した。この区画化された培養を、少なくとも６日目まで続行した。
【０１２４】
中央の増殖ゾーンが、下のＥＭから微細穴を通り抜けて拡散した増殖因子によって作成されたことを確認する為に、幾つかの対照を実施した。各対照実験では、細胞を、後述の表面上で２日間、ＥＭ／ＥＭ上で培養し、その後、更に２日間、後述の培地で培養した。第１の実験では、腸細胞を、下に１００２Ｆフィルムがない可撓性コラーゲン膜上で培養し、その後、３日目と４日目にＤＭ／ＥＭ内に置いた。４日目にはアレイ表面全体にわたって増殖細胞が存在していた。これも、増殖因子が難なく拡散してコラーゲン層を通り抜けたことを示唆している。第２の対照実験では、細胞を、微細穴がない、コラーゲンでコーティングされた１００２Ｆフィルム上で培養し、３日目及び４日目にＤＭ／ＥＭ内に置いた。予想された通り、ＥｄＵ＋細胞は存在しなかったが、表面全体にわたってＡＬＰ活性が見られた。第３の対照実験では、細胞を、コラーゲンでコーティングされた、微細穴のアレイ上で培養し、その後、３日目及び４日目にＤＭ／ＤＭ内に置いた。４日目には、これらのデバイスにＥｄＵ＋細胞がなかった。これは、微細穴の上のコラーゲンフィルムが、増殖因子がない中で細胞増殖を支援するのに十分ではなかったことを示している。これらのアレイ上で最大ＡＬＰ活性が観測されており、微細穴の中心から１００〜１１０μｍのところのＡＬＰ活性がＤＭ／ＥＭ培養の場合より大幅に大きかった（２．２倍、ｎ＝５陰窩、ｐ＜０．００５）。図６Ｋを参照されたい。ＤＭ／ＥＭとＤＭ／ＤＭとでＡＬＰ活性に大幅な差があったことは、ＤＭ／ＥＭ培養の分化細胞ゾーン内に拡散したらしい増殖因子の量が少なかったことを示唆している。
【０１２５】
増殖ゾーン及び分化ゾーンを有する平面陰窩を、免疫蛍光及びＳＥＭで更に特徴化した。図６Ｇに示すように、ＤＭ／ＥＭ下の平面陰窩内の細胞は、Ｅ−カドヘリンの存在によって示されるように当該エリア全体にわたって細胞間接着を維持しており、一方、β−カテニンによって可視化されるＷｎｔシグナリングは、ほとんどが微細穴近くに局在化された。ＤＭ／ＥＭ下では、分化ゾーン内の細胞は、これらの細胞が腸細胞分化経路を更に下に進むことを可能にする増殖因子を利用できなくなった。ＳＥＭ画像から明らかになったこととして、吸収性結腸細胞の特徴である微柔毛が、分化ゾーン内の微細穴から離れている細胞において顕著であって、微細穴の中心の上の細胞においては密度が低く短かった（これは分化の程度が小さい細胞型であることを示唆している）。図６Ｈ及び６Ｉを参照されたい。平面陰窩内に杯細胞が存在することも、ムチン２の免疫蛍光染色によって確認された。図６Ｅの左側の画像を参照されたい。腸細胞と異なり、胚細胞は主に微細穴近くに配置されていて、これは、多数の杯細胞がインビボで陰窩内に深く配置されていたことと矛盾しない。ビルチェノフ等（Ｂｉｒｃｈｅｎｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２０１６年、３５２、ｐ．１５３５−１５４２を参照されたい。最後に、平面陰窩では、腸内分泌細胞を表すクロモグラニンＡが少数（平面陰窩当たり約２個）であった（図６Ｅの右側の画像を参照）。このことは、この細胞型がインビボでまばらであることと矛盾しない。ステルニニ等（Ｓｔｅｒｎｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．）著、カレント  オピニオン  イン  エンドクライノロジー、  ダイアベテス、  アンド  オウビーシティ（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  ａｎｄ  Ｏｂｅｓｉｔｙ）、２００８年、１５、ｐ．７３を参照されたい。従って、本開示の平面陰窩アレイは、インビボで見られる細胞分離を再現するが、２次元で、且つ、製作及び維持が容易な形式で再現する。
【０１２６】
実施例４
平面陰窩アレイ上での腸上皮細胞の移動及び死
インビボの腸では、陰窩の底部にある幹細胞が増殖すると、増殖期細胞の移行が引き起こされ、増殖期細胞は分割し続け、腸の管腔表面に向かって陰窩の長軸を上昇し続ける。細胞は、管腔に近づくにつれて、分化して非分裂系列（腸細胞、胚細胞、及び腸内分泌細胞）になる。バーバー（Ｂａｒｂｅｒ）著、ネイチャー  レビューズ  モレキュラー  セル  バイオロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、２０１４年、１５、ｐ．１９を参照されたい。平面陰窩アレイ上の細胞が、この、増殖細胞区画から分化細胞領域への秩序立った細胞移動を再現するかどうかを調べる為に、コラーゲンでコーティングされた微細穴アレイ上のマウス内皮細胞をＥＭ／ＥＭで２日間（１日目及び２日目）培養し、その後、ＤＭ／ＥＭで更に２日間（３日目及び４日目）分極させた。その後、細胞をＥｄＵで３時間インキュベートし、その後、ＥｄＵを洗い流し、細胞をＤＭ／ＥＭで更に２日間（５日目及び６日目）培養した。ＥｄＵ＋細胞の位置を、４日目のＥｄＵインキュベーションの直後に測定し、（２日間の追跡期間を経て）６日目に再度測定した。４日目には、予想されたように、全てのＥｄＵ＋細胞が増殖細胞ゾーンの微細穴の上に位置した（細胞の平均位置は微細穴の中心から３６±１５μｍ、ｎ＝１６５細胞）。図７Ａ及び７Ｃを参照されたい。しかしながら、６日目には、ＥｄＵ＋細胞の大部分が分化細胞ゾーン内に位置した（細胞の平均位置は微細穴の中心から１０５±４４μｍ、ｎ＝３８６細胞、図７Ｂ及び７Ｄを参照）。このことは、これらの細胞がその間の２日間に増殖ゾーン（パルス位置）から分化細胞ゾーンに移動したことを示している。６日目のＥｄＵ＋細胞の位置は、４日目の位置との間に統計的な差があった（ｐ＜０．０００１）。ＥｄＵ＋細胞の多くが、６日目に測定されたＡＬＰ活性とも共局在化しており、このことは、これらの４日目の増殖細胞が、外向きに移動する間に分化したことを示している。これらの細胞の平均速度は１．６±１．１μｍ毎時であった（ＥｄＵが洗い流されてから０時間後及び４４時間後の平均ＥｄＵ＋細胞位置の差を４４時間で割ったもの）。これは、インビボの下部陰窩内での細胞移動速度と同等である（１．３μｍ毎時）。ツボウチ（Ｔｓｕｂｏｕｃｈｉ）著、デベロップメント  ダイナミクス（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）、１９８１年、１６１、ｐ．２３９−２４６を参照されたい。陰窩底部における幹／増殖ニッチから腸の管腔表面への細胞の上向きの流れは、平面陰窩アレイにおいて回復された。
【０１２７】
マウス大腸の管腔表面上のインビボ上皮細胞の生存日数は平均５日である。ツボウチ（Ｔｓｕｂｏｕｃｈｉ）著、デベロップメント  ダイナミクス（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）、１９８１年、１６１、ｐ．２３９−２４６を参照されたい。これらの管腔細胞は、死後、腸管腔内に捨てられ、それによって、新たに到着する細胞の為の空間ができる。バークラ、ギブソン（Ｂａｒｋｌａ  ａｎｄ  Ｇｉｂｓｏｎ）著、パソロジー（Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）、１９９９年、３１、ｐ．２３０−２３８を参照されたい。平面陰窩アレイ上の分化細胞の末路を理解する為に、細胞をＥＭ／ＥＭで２日間培養し、その後、ＤＭ／ＥＭで更に２日間培養した。アレイを（全ての死細胞をマーキングする）ヨウ化プロピジウム及び（アポトーシス細胞をマーキングする）フルオレセインアネキシンＶで染色することによって、壊死細胞及びアポトーシス細胞を可視化した。増殖ゾーンには、ヨウ化プロピジウム又はアネキシンＶの蛍光を示した細胞はほとんどなかった。一方、分化細胞領域では死細胞及び死にかけている細胞が容易に観測された。貫通穴から離れた領域では、コラーゲンでコーティングされたフォトレジストの露出した領域が残っている群において、死にかけている細胞が外れている場合がある。総合すれば、これらのデータは、増殖ゾーンにおいて分裂した細胞の子孫が、外向きに移動して分化細胞領域に入り、外向きに動くにつれて成熟して腸細胞になることを示唆している。それらの寿命の最後には、それらの非分裂細胞はアポトーシスによって死に、増殖ゾーンから新たに到着した細胞に取って代わられる。これらの機能により、細胞がインビボで陰窩底部から管腔上皮まで移動するにつれて細胞のライフサイクルが繰り返される。
【０１２８】
実施例５
マウス腸上皮細胞の増殖及び分化に対する短鎖脂肪酸の効果
結腸上皮増殖及び分化は、線維性物質の細菌発酵の間に生成される短鎖脂肪酸のような微生物生成物の影響を受ける。コー等（Ｋｏｈ  ｅｔ  ａｌ．）著、セル（Ｃｅｌｌ）、２０１６年、１６５、ｐ．１３３２−１３４５を参照されたい。例えば、プロピオネートやブチレートは、腸腫瘍細胞株における増殖を抑制する。ガーメット等（Ｇａｍｅｔ  ｅｔ  ａｌ．）著、インターナショナル  ジャーナル  オブ  カンサー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ）、１９９２年、５２、ｐ．２８６−２８９、並びにホワイトヘッド等（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．）著、ガット（Ｇｕｔ）、１９８６年、２７、ｐ．１４５７−１４６３を参照されたい。ブチレートは又、初代マウス腸オルガノイドにおける増殖を減少させる。カイコ等（Ｋａｉｋｏ  ｅｔ  ａｌ．）著、セル（Ｃｅｌｌ）、２０１６年、１６５、ｐ．１７０８−１７２０を参照されたい。平面陰窩アレイ上の腸上皮細胞の増殖及び分化に対する短鎖脂肪酸の効果を評価する為に、２日間の分極の間、即ち、アレイ上の細胞培養の３日目及び４日目に、短鎖脂肪酸（２４ｍＭのアセテート、６ｍＭのプロピオネート、又は１ｍＭのブチレート）をＤＭ管腔培地に加えた。ＥｄＵ＋及びＡＬＰ＋の面積を測定し、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２に対して陽性である面積（細胞数のプロキシとしての細胞核の総面積）に対して正規化した。アセテートは、ＥｄＵ＋細胞の正規化面積を大幅に増加させた。プロピオネート及びブチレートは、ＥｄＵ＋細胞の正規化面積を、短鎖脂肪酸のない対照の場合に比べて大幅に減少させた。図８Ｂを参照されたい。このことは、コラーゲンゲル上で単層として培養されたマウス腸細胞（ワン等（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）著、セルラー  アンド  モレキュラー  ガストロエンテロロジー  アンド  ヘパトロジー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）、２０１７年、４、ｐ．１６５−１８２を参照）、マトリゲルパテ内のマウス腸オルガノイド（カイコ等（Ｋａｉｋｏ  ｅｔ  ａｌ．）著、セル（Ｃｅｌｌ）、２０１６年、１６５、ｐ．１７０８−１７２０を参照）、及び組織培養ＨＴ２９ヒト結腸がん細胞の挙動と矛盾しない。ガーメット等（Ｇａｍｅｔ  ｅｔ  ａｌ．）著、インターナショナル  ジャーナル  オブ  カンサー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ）、１９９２年、５２、ｐ．２８６−２８９を参照されたい。対照的に、アセタートはＡＬＰ活性を大幅に減少させたが、プロピオナート及びブチラートは、ＡＬＰ活性を対照に対して大幅に増加させた。図８Ｃを参照されたい。ブチラート及びプロピオナートはＡＬＰ活性を大幅に増加させたが、これは、これら２つの短鎖脂肪酸を、初代ヒト結腸細胞から形成された３次元陰窩に対する勾配として適用した場合の影響と同様である。ワン等（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）著、セルラー  アンド  モレキュラー  ガストロエンテロロジー  アンド  ヘパトロジー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）、２０１８年、５、ｐ．１１３−１３０を参照されたい。ブチラ���トは、唯一の短鎖脂肪酸であった場合より大幅にＡＬＰ活性を増加させており、陰窩当たりのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２＋細胞数を約１７％（ｐ＜０．００１）減らした（図８Ｄを参照）。これは、以前の観測でブチラートがヒト結腸がん細胞株においてアポトーシスを引き起こしたことと矛盾しない。ルーメレ等（Ｒｕｅｍｍｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．）著、ガット（Ｇｕｔ）、２００３年、５２、ｐ．９４−１００、ファン等（Ｆｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル  オブ  プロテオーム  リサーチ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２０１１年１０、ｐ．１８６０−１８６９、並びにク等（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．）著、シグナル  トランスダクション  アンド  ターゲッテッド  セラピー（Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、２０１７年、２、ｐ．１６０３５を参照されたい。これらのデータは、平面陰窩アレイが微生物代謝産物に対する重要な腸上皮細胞応答を再現することを示している。
【０１２９】
実施例６
ヒト腸上皮モデル系の為の平面陰窩の形成
実施例１で説明し、実施例２で使用したものと同じマイクロデバイスを使用して、初代ヒト腸上皮細胞を使用するヒト平面陰窩を作成した。このプラットフォームで４日間、管腔培地及び基礎培地に増殖因子が存在する中でヒト初代上皮細胞を培養した。４日目に、細胞を更に４日間インキュベートした。これは、１）増殖因子が管腔培地及び基礎培地の両方に存在したＥＭ／ＥＭ条件、２）増殖因子が基礎培地にのみ存在したＤＭ／ＥＭ条件、そして、３）増殖因子がどの区画にも存在しなかったＤＭ／ＤＭ条件で実施した。培養中は２日毎に培地を交換した。８日目に細胞をＥｄＵで３日間パルス標識し、その後、３０分間のＡＬＰアレイにかけ、その後、固定して、増殖細胞及び結腸細胞をそれぞれ標識した。ＭＵＣ２抗体を使用した免疫蛍光により、杯細胞を検出した。クリックケミストリによってＣｙ５蛍光体をコンジュゲートすることにより、ＥｄＵを検出した。図９は、これら３つの異なる培地条件での、このプラットフォーム上の細胞を示す。ＤＭ／ＥＭ条件下の細胞だけがＥｄＵ＋増殖細胞及びＭＵＣ２＋杯細胞の両方を示した。ＥｄＵ＋増殖細胞は、穴の上及び近くに密集して増殖ゾーンを形成した。
【０１３０】
当然のことながら、本開示対象の範囲から逸脱しない限り、本開示対象の様々な細部を変更してよい。更に、ここまでの記述は、例示のみを目的としており、限定を目的とするものではない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
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【図６Ｊ】
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【図６Ｋ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【国際調査報告】
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