(57)【要約】  本発明は、チアミン誘導体及びその薬剤学的に許容可能な塩を含む血管又は弁膜石灰化の予防又は治療用の薬学的組成物、及びチアミン誘導体及びその塩を含む血管又は弁膜石灰化改善用の食品組成物に関し、本発明の組成物は、血管又は弁膜石灰化の予防、治療又は改善用途に有用に利用可能である。【選択図】  図２
2021533170.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（１）で表示されるチアミン（Ｔｈｉａｍｉｎｅ）誘導体及びその薬剤学的に許容可能な塩を含む血管又は弁膜石灰化の予防又は治療用の薬学的組成物：
【化１９】
2021533170.tif 000022
上記式（１）において、
Ｒ１は、
【化２０】
2021533170.tif 000023
からなる群から選ばれるいずれか一つであり、
Ｒ２は、
【化２１】
2021533170.tif 000024
からなる群から選ばれるいずれか一つである。
【請求項２】
前記Ｒ１は、
【化２２】
2021533170.tif 000025
であり、Ｒ２は、
【化２３】
2021533170.tif 000026
である、請求項１に記載の血管又は弁膜石灰化の予防又は治療用の薬学的組成物。
【請求項３】
前記血管又は弁膜石灰化は、弁膜症、高脂血症、老化、エストロゲン不足、狭心症、心不全、腎臓疾患、尿毒症、糖尿病、炎症疾患及び心血管系疾患からなる群から選ばれるものに起因するものである、請求項１に記載の血管又は弁膜石灰化の予防又は治療用の薬学的組成物。
【請求項４】
前記血管石灰化は、中膜性石灰化（ｍｅｄｉａｌ  ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）又は粥状硬化性石灰化（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）である、請求項１に記載の血管又は弁膜石灰化の予防又は治療用の薬学的組成物。
【請求項５】
前記弁膜石灰化は、大動脈弁膜石灰化（Ａｏｒｔｉｃ  ｖａｌｖｅ  ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）である、請求項１に記載の血管又は弁膜石灰化の予防又は治療用の薬学的組成物。
【請求項６】
下記の式（１）で表示されるチアミン（Ｔｈｉａｍｉｎｅ）誘導体及びその塩を含む血管又は弁膜石灰化改善用の食品組成物：
【化２４】
2021533170.tif 000027
上記式（１）において、
Ｒ１は、
【化２５】
2021533170.tif 000028
からなる群から選ばれるいずれか一つであり、
Ｒ２は、
【化２６】
2021533170.tif 000029
からなる群から選ばれるいずれか一つである。
【請求項７】
前記Ｒ１は、
【化２７】
2021533170.tif 000030
であり、Ｒ２は、
【化２８】
2021533170.tif 000031
である、請求項６に記載の血管又は弁膜石灰化の予防又は治療用の薬学的組成物。
【請求項８】
前記血管又は弁膜石灰化は、弁膜症、高脂血症、老化、エストロゲン不足、狭心症、心不全、腎臓疾患、尿毒症、糖尿病、炎症疾患及び心血管系疾患からなる群から選ばれるものに起因するものである、請求項６に記載の血管又は弁膜石灰化改善用の食品組成物。
【請求項９】
前記血管石灰化は、中膜性石灰化（ｍｅｄｉａｌ  ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）又は粥状硬化性石灰化（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）である、請求項６に記載の血管又は弁膜石灰化改善用の食品組成物。
【請求項１０】
前記弁膜石灰化は、大動脈弁膜石灰化（Ａｏｒｔｉｃ  ｖａｌｖｅ  ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）である、請求項６に記載の血管又は弁膜石灰化改善用の食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管又は弁膜石灰化の予防、改善又は治療用の組成物に関し、特に、チアミン誘導体を含む血管又は弁膜石灰化の予防、改善又は治療用の組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管は、体液の移動を持続的に調節する循環器官であり、酸素及び栄養分などを組織に供給し、二酸化炭素や老廃物を組織から受けて処理する機能を有する。
血管石灰化（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、血管にカルシウム及びリン酸などの無機質が沈着することであり、血管の硬直度を増加させ、血管破裂を招く。このような血管石灰化は、動脈硬化、糖尿、慢性腎不全患者にしばしば見られ、カルシウム蓄積抑制機序の消失、骨形成誘導、血液内核化複合体、及び細胞死などが血管石灰化の主な原因とされているが、その正確な機序はまだ明らかになっていない。
特に、心血管系石灰化は、高血圧、心不全、急性冠状動脈症候群と弁膜疾患の悪化に寄与し、これによる様々な合併症（心臓突然死、心筋梗塞、狭心症及び虚血性心不全など）を誘発する。しかし、上述したように、血管石灰化の正確な機序はまだ明らかになっておらず、その予防及び治療剤もまだ開発されていない現状である。
そのため、血管又は弁膜石灰化の予防、改善又は治療用の組成物に関する技術の開発が至急望まれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明者らは、血管又は弁膜石灰化の予防、改善又は治療用の組成物を開発しようと鋭意究努力してきた。その結果、チアミン（Ｔｈｉａｍｉｎｅ）誘導体に血管石灰化抑制効果があることを究明し、本発明を完成するに至った。
したがって、本発明の目的は、チアミン（Ｔｈｉａｍｉｎｅ）誘導体及びその薬剤学的に許容可能な塩を含む、血管又は弁膜石灰化の予防又は治療用の薬学的組成物を提供することである。
本発明の他の目的は、チアミン（Ｔｈｉａｍｉｎｅ）誘導体及びその塩を含む、血管又は弁膜石灰化改善用の食品組成物を提供することである。
発明のさらに他の目的は、チアミン（Ｔｈｉａｍｉｎｅ）誘導体及びその薬剤学的に許容可能な塩を含む薬学的組成物を個体に投与する段階を含む、血管又は弁膜石灰化の予防又は治療方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、チアミン（Ｔｈｉａｍｉｎｅ）誘導体及びその薬剤学的に許容可能な塩を含む薬学的組成物の血管又は弁膜石灰化の治療用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、血管又は弁膜石灰化の予防、改善又は治療用の組成物を開発しようと鋭意究努力してきた。その結果、チアミン（Ｔｈｉａｍｉｎｅ）誘導体が血管石灰化抑制効果を有することを究明した。
本発明は、チアミン誘導体及びその薬剤学的に許容可能な塩を含む血管又は弁膜石灰化の予防又は治療用の薬学的組成物、チアミン誘導体及びその塩を含む血管又は弁膜石灰化改善用の食品組成物、チアミン誘導体及びその薬剤学的に許容可能な塩を含む薬学的組成物を用いた血管又は弁膜石灰化の予防／治療方法及びその血管又は弁膜石灰化の治療用途に関する。
以下、本発明をより詳しく説明する。
【０００５】
本発明の一態様は、下記の式（１）で表示されるチアミン（Ｔｈｉａｍｉｎｅ）誘導体及びその薬剤学的に許容可能な塩を含む血管又は弁膜石灰化の予防又は治療用の薬学的組成物に関する。
【化１】
2021533170.tif 000003
上記式（１）において、  Ｒ１は、
【化２】
2021533170.tif 000004
からなる群から選ばれるいずれか一つであり、
Ｒ２は、
【化３】
2021533170.tif 000005
からなる群から選ばれるいずれか一つである。
【０００６】
本発明の一具現例において、前記Ｒ１は、
【化４】
2021533170.tif 000006
であり、Ｒ２は、
【化５】
2021533170.tif 000007
であり得る。
【０００７】
上記式（１）において、Ｒ１が
【化６】
2021533170.tif 000008
であり、Ｒ２が
【化７】
2021533170.tif 000009
である場合、前記チアミン誘導体は、フルスルチアミン（Ｆｕｒｓｕｌｔｈｉａｍｉｎｅ；ｔｈｉａｍｉｎｅ  ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒｆｕｒｙｌ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）である。
【０００８】
上記式（１）において、Ｒ１が
【化８】
2021533170.tif 000010
であり、Ｒ２が
【化９】
2021533170.tif 000011
である場合、前記チアミン誘導体は、アリチアミン（Ａｌｌｉｔｈｉａｍｉｎｅ；ｔｈｉａｍｉｎｅ  ａｌｌｙｌ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）である。
上記式（１）において、Ｒ１が
【化１０】
2021533170.tif 000012
であり、Ｒ２が
【化１１】
2021533170.tif 000013
である場合、前記チアミン誘導体は、ベンフォチアミン（Ｂｅｎｆｏｔｉａｍｉｎｅ；Ｓ−Ｂｅｎｚｏｙｌｔｈｉａｍｉｎｅ  Ｏ−ｍｏｎｏｐｈｏｓｐａｔｅ）である。
【０００９】
上記式（１）において、Ｒ１が
【化１２】
2021533170.tif 000014
であり、Ｒ２が
【化１３】
2021533170.tif 000015
である場合、前記チアミン誘導体は、スルブチアミン（Ｓｕｌｂｕｔｉａｍｉｎｅ；Ｏ−ｉｓｏｂｕｔｙｒｙｌｔｈｉａｍｉｎｅ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）である。
【００１０】
本発明において、前記チアミン誘導体は、脂溶性の性質を有するので、小腸に直ちに吸収され、肝と筋肉、神経組織などで高い生体利用率を示すという長所がある。
本発明において“誘導体”とは、ある化合物を母体として作用基を導入、酸化、還元、原子の置換などを通じて化合物の一部を化学的に変化させて得られる化合物を意味し、母体化合物の構造と性質が大幅に変わらない限度で変化された類似の化合物である。普通は、化合物中の水素原子又は特定原子団が別の原子又は原子団に置換された化合物のことを指す。
【００１１】
本発明において、“血管又は弁膜石灰化”とは、血管又は弁膜内に細胞外性基質（ｍａｔｒｉｘ）水酸化燐灰石（ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ）（リン酸カルシウム）結晶沈着物（ｃｒｙｓｔａｌ  ｄｅｐｏｓｉｔｓ）の形成、成長又は沈着を意味する。
前記血管又は弁膜石灰化は、弁膜症、高脂血症、老化、エストロゲン不足、狭心症、心不全、腎臓疾患、尿毒症、糖尿病、炎症疾患又は心血管系疾患によるものであり得る。
【００１２】
前記腎臓疾患は、例えば、糸球体腎臓炎、糖尿病性腎症、ループス腎炎、多発性の嚢胞腎、腎盂腎炎、腎結石、腎結核又は腎腫瘍であり得る。
前記炎症疾患は、例えば、喘息、アレルギー性及び非アレルギー性鼻炎、慢性及び急性鼻炎、慢性及び急性胃炎又は腸炎、潰瘍性胃炎、急性及び慢性腎臓炎、急性及び慢性肝炎、慢性閉塞性肺疾患、肺線維症、過敏性大腸症候群、炎症性疼痛、片頭痛、頭痛、腰痛、線維筋肉痛、筋膜疾患、ウイルス感染（例えば、Ｃ型感染）、バクテリア感染、カビ感染、火傷、外科的又は歯科的手術による傷、プロスタグランジンＥ過剰症候群、アテローム性動脈硬化症、痛風、関節炎、関節リウマチ、強直性脊椎炎、ホジキン病、膵臓炎、結膜炎、虹彩炎、鞏膜炎、ブドウ膜炎、皮膚炎、湿疹又は多発性硬化症であり得る。
前記心血管系疾患は、例えば、心筋障害、原発性心臓停止、虚血性心不全、高血圧、虚血性心臓疾患、冠状動脈疾患、狭心症、心筋梗塞症、粥状硬化症又は不整脈であり得る。
【００１３】
前記血管石灰化は、冠状動脈、大動脈及びその他血管の石灰化を含み、例えば、中膜性石灰化（ｍｅｄｉａｌ  ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）又は粥状硬化性石灰化（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）であり得る。
前記中膜性石灰化は、中膜壁石灰化（ｍｅｄｉａｌ  ｗａｌｌ  ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）又はメンケベルグ硬化症（Ｍｏｅｎｃｋｅｂｅｒｇ’ｓ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）と同じ意味で使われてもよく、中膜壁内に沈着したカルシウムによる石灰化を意味する。このような中膜性石灰化は、糖尿、カルシウム代謝機序異常又は腎臓疾患などによって骨形成促進因子が血管に発現して発生することが知られている。
前記粥状硬化性石灰化は、内膜層に沿ってアテローム性プラーク（ａｒｔｈｅｒｏｍａｔｏｕｓ  ｐｌａｑｕｅｓ）内に発生する石灰化を意味する。このような粥状硬化性石灰化は、粥状硬化病巣の部位にカルシウムが直接沈着して発生することが知られている。
前記弁膜石灰化は、例えば、大動脈弁膜石灰化（Ａｏｒｔｉｃ  ｖａｌｖｅ  ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）であってもよい。
【００１４】
本発明において“予防”とは、本発明に係る薬学的組成物の投与によって血管又は弁膜の石灰化を抑制させたり、或いはその進行を遅延させる全ての行為を意味する。
本発明において“治療”とは、本発明に係る薬学的組成物の投与によって血管又は弁膜石灰化に対する症状が好転したり有益に変更される全ての行為を意味する。
本発明において薬剤学的に許容可能な塩は、当該技術の分野における通常の方法によって製造可能なものであり、例えば、塩酸、臭化水素、硫酸、硫酸水素ナトリウム、リン酸、炭酸などの無機酸との塩、又はギ酸、酢酸、シュウ酸、安息香酸、クエン酸、酒石酸、グルコン酸、ゲンチジン酸、フマル酸、ラクトビオン酸、サリチル酸、又はアセチルサリチル酸（アスピリン）のような有機酸と共に酸の塩を形成したり、又はナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属イオンと反応してそれらの金属塩を形成したり、又はアンモニウムイオンと反応してさらに他の形態の薬剤学的に許容可能な塩を形成することを意味する。
【００１５】
本発明に係る薬学的組成物は、前記の式（１）で表示される３−アリール−１，２，４−トリアゾール誘導体を有効成分として含み、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことができる。前記薬学的に許容可能な担体は、製剤時に通常用いられるものであり、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、シクロデキストリン、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、リポソームなどを含むが、これに限定されず、必要によって、抗酸化剤、緩衝液などの他の通常の添加剤をさらに含むことができる。さらに、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、潤滑剤などを付加して、水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒又は錠剤に製剤化することができる。好適な薬学的に許容される担体及び製剤化に関しては、レミングトンの文献に開示の方法を用いて各成分によって好ましく製剤化できる。本発明の薬学的組成物は、剤形に特に制限はないが、注射剤、吸込剤、皮膚外用剤などに製剤化できる。
【００１６】
本発明の薬学的組成物は、目的とする方法によって経口投与したり又は非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内又は局所に適用）でき、投与量は、患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路及び時間によって異なるが、当業者にとって適切に選択可能である。
【００１７】
本発明の薬学的組成物は薬学的に有効な量で投与する。本発明において“薬学的に有効な量”は、医学的治療に適用可能な合理的な受恵／危険の割合で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効容量レベルは、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、併用の薬物を含む要素及びその他の医学分野に周知の要素によって決定されてよい。本発明に係る薬学的組成物は、個別治療剤として投与したり、或いは他の治療剤と併用して投与でき、従来の治療剤とは順次に又は同時に投与でき、単回又は多重投与できる。上記の要素を全て考慮して、副作用無しで最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、これは、当業者にとっては容易に決定できる。
具体的に、本発明の薬学的組成物の有効量は、患者の年齢、性別、状態、体重、体内への活性成分の吸収度、不活性率及び排泄速度、疾病の種類、併用する薬物によって異なり得るが、通常、体重１ｋｇ当たり０．００１〜１５０ｍｇ、好ましくは０．０１〜１００ｍｇを、毎日又は隔日投与でき、１日１回〜３回に分けて投与できる。ただし、投与経路、肥満の重症度、性別、体重、年齢などにしたがって増減可能であり、前記投与量は、いかなる方法でも本発明の範囲を限定するものではない。
【００１８】
本発明の他の態様は、下記の式（１）で表示されるチアミン（Ｔｈｉａｍｉｎｅ）誘導体及びその塩を含む血管又は弁膜石灰化改善用の食品組成物に関する。
【化１４】
2021533170.tif 000016
上記式（１）において、Ｒ１は、
【化１５】
2021533170.tif 000017
からなる群から選ばれるいずれか一つであり、
Ｒ２は、
【化１６】
2021533170.tif 000018
からなる群から選ばれるいずれか一つである。
【００１９】
本発明の一具現例において、前記Ｒ１は、
【化１７】
2021533170.tif 000019
であり、Ｒ２は、
【化１８】
2021533170.tif 000020
であり得る。
【００２０】
上記式(１)は、上述した本発明の血管又は弁膜石灰化の予防又は治療用の薬学的組成物と同一であり、これら両者に共通する内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
【００２１】
本発明の食品組成物は、粉末、顆粒、錠剤、カプセル又は飲料などの形態で製造できる。例として、キャンディ類の各種食品類、飲料、ガム、茶、ビタミン複合剤、又は健康補助食品類などがある。
本発明の食品組成物は、アリチアミン、フルスルチアミン、ベンフォチアミン又はこれらの塩の他に、食品製造時に通常添加される成分も含むことができ、例えば、タンパク質、炭水化物、脂肪、栄養素、調味剤及び香味剤を含む。上述した炭水化物の例は、モノサッカライド、例えば、ブドウ糖、果糖など；ジサッカライド、例えば、マルトース、スクロース、オリゴ糖など；及びポリサッカライド、例えば、デキストリン、シクロデキストリンなどの通常の糖、及びキシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールが挙げられる。香味剤として、天然香味剤（タウマチン、ステビア抽出物（例えば、レバウジオシドＡ、グリチルリチンなど））及び合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を用いることができる。例えば、本発明の食品組成物がドリンク剤として製造される場合には、アリチアミン、フルスルチアミン、ベンフォチアミン又はこれらの塩の他に、クエン酸、液状果糖、砂糖、ブドウ糖、酢酸、リンゴ酸、果汁、杜沖抽出液、ナツメ抽出液、甘草抽出液などもさらに含めることができる。
【００２２】
本発明の他の態様は、チアミン（Ｔｈｉａｍｉｎｅ）誘導体及びその薬剤学的に許容可能な塩を含む薬学的組成物を個体に投与する段階を含む血管又は弁膜石灰化の予防又は治療方法に関する。
前記個体は、疾病の治療を必要とする対象を意味し、より具体的には、ヒト又は非ヒト霊長類、マウス（ｍｏｕｓｅ）、イヌ、ネコ、ウマ及びウシなどの哺乳類を意味する。
【００２３】
本発明のさらに他の態様は、チアミン（Ｔｈｉａｍｉｎｅ）誘導体及びその薬剤学的に許容可能な塩を含む薬学的組成物の血管又は弁膜石灰化の治療用途に関する。
前記組成物の重複する内容は、本明細書の複雑性を考慮して省略する。
【発明の効果】
【００２４】
本発明は、チアミン誘導体及びその薬剤学的に許容可能な塩を含む血管又は弁膜石灰化の予防又は治療用の薬学的組成物、及びチアミン誘導体及びその塩を含む血管又は弁膜石灰化改善用の食品組成物に関し、本発明の組成物は、血管又は弁膜石灰化の予防、治療又は改善用途に有用に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明の一実施例に係るフルスルチアミン（Ｆｕｒｓｕｌｔｈｉａｍｉｎｅ；Ｆ）及びアリチアミン（Ａｌｌｉｔｈｉａｍｉｎｅ；Ａ）による石灰化抑制効果を示す図である。
【図２】本発明の一実施例に係るフルスルチアミン及びアリチアミンによる石灰化抑制効果を確認するために、石灰化したカルシウムを定量した図である。
【図３】本発明の一実施例に係るフルスルチアミンによる石灰化抑制効果（ｉｎ  ｖｉｖｏ）を確認するために、フォンコッサ染色（Ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）を行った結果である。
【図４】本発明の一実施例に係るフルスルチアミンによる石灰化抑制効果（ｉｎ  ｖｉｖｏ）を確認するために、血管に沈着したカルシウムを定量した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、実施例を用いて本発明をより詳しく説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨によって、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないということは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
【００２７】
準備例１．血管平滑筋細胞（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ，ＶＳＭＣｓ）一次培養
雄ウシから分離した胸腹部大動脈から周辺組織を除去し、血管内壁の内皮細胞を除去した。手入れした血管を小さい断片に分け、２０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ，Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）含有のダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ，Ｌｏｗ  Ｇｌｕｃｏｓｅ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を入れた培養皿に整列した後、３７℃、５％  ＣＯ２細胞培養器で３〜４週間培養した。２日ごとに培地を新しく入れ換えながら、血管組織周囲から延び出た血管平滑筋細胞を一次培養した。
【００２８】
準備例２．血管平滑筋細胞の石灰化誘導
前記準備例１で培養した血管平滑筋細胞は、ペニシリン／ストレプトマイシン抗生剤及び１０％  ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭ（Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ）で継代培養（ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ）によって安定化させた後、６ウェル培養皿に各４×１０５個ずつ接種し、接種翌日に、無機リン酸（Ｐｉ）、又は無機リン酸及びチアミン（フルスルチアミン又はアリチアミン；１００ μＭ 又は２００μＭ）を共に処理した。４８時間ごとに培地及び薬物を新しく入れ替えながら１０日間培養した。
【００２９】
実験例１．血管平滑筋細胞の石灰化確認
前記準備例２の方法で石灰化を誘導した後、培養皿から培地を除去し、リン酸緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）で３回洗浄した。その後、４％パラホルムアルデヒド（Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）を入れ、４℃で１５分間固定した。固定が終わると、１次蒸留水で５分間２回洗浄し、５％硝酸銀（Ｓｉｌｖｅｒ  Ｎｉｔｒａｔｅ）を処理後に２０〜３０分間紫外線を照射して発色した。その後、１次蒸留水で２〜３回洗浄した後、光学顕微鏡（ＢＸ５３ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｊａｐａｎ）で石灰化程度を確認した。
図１から確認できるように、無機リン酸だけを処理した血管平滑筋細胞（Ｐｉ）では、石灰化（黒い点）が増加したが、フルスルチアミン（Ｆｕｒｓｕｌｔｈｉａｍｉｎｅ；Ｆ）及びアリチアミン（Ａｌｌｉｔｈｉａｍｉｎｅ；Ａ）をそれぞれ１００μＭ及び２００μＭずつ共に処理した血管平滑筋細胞（Ｐｉ＋Ｆ  １００μＭ、Ｐｉ＋Ｆ  ２００μＭ、Ｐｉ＋Ａ  １００μＭ、及びＰｉ＋Ａ  ２００μＭ）では、石灰化（黒い点）が抑制した。
【００３０】
実験例２．血管平滑筋細胞のカルシウム定量
前記準備例２の方法で石灰化を誘導した後、培養皿から培地を除去し、ＰＢＳで洗浄した。その後、０．６Ｎ  ＨＣｌを処理して４℃で２４時間脱カルシウム化（ｄｅｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）させた。上澄液は、カルシウム定量に用いるために回収し、細胞から０．１Ｎ  ＮａＯＨ／０．１％  ＳＤＳを用いてタンパク質を抽出し、ＢＣＡ方法を用いてそれを定量した。
ＱｕａｎｔｉｃｈｒｏｍＴＭカルシウム分析キット（ＤＩＣＡ−５００，ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，ＵＳＡ）を用いて６１２ｎｍにおいてカルシウムサンプル（Ｓｔａｎｄａｒｄ）の吸光度を測定し、下記の計算式１を用いてカルシウム濃度を測定した後、その値を前記定量したタンパク質量で割って（補正して）最終的にカルシウムを定量した。
【数１】
2021533170.tif 000021
（ＯＤＳＡＭＰＬＥ及びＯＤＢＬＡＮＫはそれぞれ、カルシウムサンプル及びＢＬＡＮＫ（水）のＯＤ６１２ｎｍ値を表し、Ｓｌｏｐｅは、測定された吸光度グラフの勾配値を表す。）
図２から確認できるように、無機リン酸だけを処理した血管平滑筋細胞（ビークル）では無機リン酸によってカルシウムの量が増加したが、フルスルチアミン（Ｆｕｒｓｕｌｔｈｉａｍｉｎｅ）及びアリチアミン（Ａｌｌｉｔｈｉａｍｉｎｅ）をそれぞれ１００μＭ及び２００μＭずつ共に処理した血管平滑筋細胞では、無機リン酸によって増加したカルシウムの量がフルスルチアミン及びアリチアミン処理によって減少した（＊ｐ＜０．０１  ｖｓ対照群；＊＊ｐ＜０．０１  ｖｓビークル）。
【００３１】
実験例３．Ｉｎ  ｖｉｖｏ
８〜９週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを７匹ずつ総５つの群に分け、４つの群（１つの群は対照群として使用）に高容量（９．０×１０５ＩＵ）のビタミンＤ３（Ｖｉｔ．Ｄ３）を１日１回で総３日間皮下投与して血管石灰化を誘導した。
このうち、３つの群に対してはそれぞれ、１０ｍｇ／ｋｇ及び３０ｍｇ／ｋｇのフルスルチアミン（Ｆｕｒｓｕｌｔｈｉａｍｉｎｅ）、及び５０ｍｇ／ｋｇのジクロロアセテート（ｄｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔａｔｅ；ＤＣＡ、陽性対照群）を、前記ビタミンＤ３の初投与３日前から経口投与し始め、１日１回で総１３日間投与した。
【００３２】
３−１．フォンコッサ染色
まず、ビタミンＤ３投与１０日後にマウスを犠牲させて開腹し、大動脈周辺組織をきれいに除去して分離した後、４％  ＰＦＡ（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）に２４時間固定した。固定した大動脈を洗浄後に５％硝酸銀（Ｓｉｌｖｅｒ  Ｎｉｔｒａｔｅ）溶液に浸し、ＵＶに３０分間反応させた。
図３から確認できるように、ビタミンＤ３グループでは、血管石灰化の増加によって大動脈の大部分が暗く着色したのに対し、陽性対照群のＤＣＡグループでは、ビークルグループに比べて着色した部分が明確に減少した。本願発明のフルスルチアミングループでも濃度依存的に着色した部分が減少（回復）したが、特に、３０ｍｇ／ｋｇ投与グループでは陽性対照群のＤＣＡに比べて回復程度が優れていた。
【００３３】
３−２．カルシウム定量
さらに、前記ビタミンＤ３投与１０日後にマウスを犠牲させて開腹し、大動脈周辺組織をきれいに除去して分離した後、液体窒素に冷凍させた。冷凍した組織を解凍させ、水気を除去して重量を測った後、０．６Ｎ  ＨＣｌ溶液で脱石灰化を行った。比色（ｃｏｌｏｒｍｅｔｒｉｃ）Ｃａ定量キット（Ｂｉｏａｓｓａｙ  ＤＩＣＡ−５００）を用いて脱石灰化させた０．６Ｎ  ＨＣｌ溶液でカルシウムを定量し、組織重量で補正した。
図４から確認できるように、ビタミンＤ３グループでは、ビタミンＤ３を注射していない対照群に比べて、カルシウム量が１０倍近く増加したが、陽性対照群のＤＣＡグループにおいて、ビタミンＤ３によって増加する大動脈のカルシウム量が有意に減少した。本願発明のフルスルチアミングループにおいても濃度依存的にカルシウム量が減少し、陽性対照群のＤＣＡに比べてその程度が優れていた。
【図１】
2021533170.tif 000032
【図２】
2021533170.tif 000033
【図３】
2021533170.tif 000034
【図４】
2021533170.tif 000035
【手続補正書】
【提出日】令和3年4月1日(2021.4.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（１）で表示されるチアミン（Ｔｈｉａｍｉｎｅ）誘導体又はその薬剤学的に許容可能な塩を含む血管又は弁膜石灰化の予防又は治療用の薬学的組成物：
【化１９】
2021533170.tif 000036
上記式（１）において、
Ｒ１は、
【化２０】
2021533170.tif 000037
からなる群から選ばれるいずれか一つであり、
Ｒ２は、
【化２１】
2021533170.tif 000038
からなる群から選ばれるいずれか一つである。
【請求項２】
前記Ｒ１は、
【化２２】
2021533170.tif 000039
であり、Ｒ２は、
【化２３】
2021533170.tif 000040
である、請求項１に記載の血管又は弁膜石灰化の予防又は治療用の薬学的組成物。
【請求項３】
前記血管又は弁膜石灰化は、弁膜症、高脂血症、老化、エストロゲン不足、狭心症、心不全、腎臓疾患、尿毒症、糖尿病、炎症疾患及び心血管系疾患からなる群から選ばれるものに起因するものである、請求項１又は２に記載の血管又は弁膜石灰化の予防又は治療用の薬学的組成物。
【請求項４】
前記血管石灰化は、中膜性石灰化（ｍｅｄｉａｌ  ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）又は粥状硬化性石灰化（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）である、請求項１から３のいずれかに記載の血管又は弁膜石灰化の予防又は治療用の薬学的組成物。
【請求項５】
前記弁膜石灰化は、大動脈弁膜石灰化（Ａｏｒｔｉｃ  ｖａｌｖｅ  ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）である、請求項１から４のいずれかに記載の血管又は弁膜石灰化の予防又は治療用の薬学的組成物。
【請求項６】
下記の式（１）で表示されるチアミン（Ｔｈｉａｍｉｎｅ）誘導体又はその塩を含む血管又は弁膜石灰化改善用の食品組成物：
【化２４】
2021533170.tif 000041
上記式（１）において、
Ｒ１は、
【化２５】
2021533170.tif 000042
からなる群から選ばれるいずれか一つであり、
Ｒ２は、
【化２６】
2021533170.tif 000043
からなる群から選ばれるいずれか一つである。
【請求項７】
前記Ｒ１は、
【化２７】
2021533170.tif 000044
であり、Ｒ２は、
【化２８】
2021533170.tif 000045
である、請求項６に記載の血管又は弁膜石灰化の予防又は治療用の食品組成物。
【請求項８】
前記血管又は弁膜石灰化は、弁膜症、高脂血症、老化、エストロゲン不足、狭心症、心不全、腎臓疾患、尿毒症、糖尿病、炎症疾患及び心血管系疾患からなる群から選ばれるものに起因するものである、請求項６又は７に記載の血管又は弁膜石灰化改善用の食品組成物。
【請求項９】
前記血管石灰化は、中膜性石灰化（ｍｅｄｉａｌ  ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）又は粥状硬化性石灰化（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）である、請求項６から８のいずれかに記載の血管又は弁膜石灰化改善用の食品組成物。
【請求項１０】
前記弁膜石灰化は、大動脈弁膜石灰化（Ａｏｒｔｉｃ  ｖａｌｖｅ  ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）である、請求項６から９のいずれかに記載の血管又は弁膜石灰化改善用の食品組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
本発明者らは、血管又は弁膜石灰化の予防、改善又は治療用の組成物を開発しようと鋭意究努力してきた。その結果、チアミン（Ｔｈｉａｍｉｎｅ）誘導体に血管石灰化抑制効果があることを糾明し、本発明を完成するに至った。
したがって、本発明の目的は、チアミン（Ｔｈｉａｍｉｎｅ）誘導体又はその薬剤学的に許容可能な塩を含む、血管又は弁膜石灰化の予防又は治療用の薬学的組成物を提供することである。
本発明の他の目的は、チアミン（Ｔｈｉａｍｉｎｅ）誘導体又はその塩を含む、血管又は弁膜石灰化改善用の食品組成物を提供することである。
発明のさらに他の目的は、チアミン（Ｔｈｉａｍｉｎｅ）誘導体又はその薬剤学的に許容可能な塩を含む薬学的組成物を個体に投与する段階を含む、血管又は弁膜石灰化の予防又は治療方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、チアミン（Ｔｈｉａｍｉｎｅ）誘導体又はその薬剤学的に許容可能な塩を含む薬学的組成物の血管又は弁膜石灰化の治療用途を提供することである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
本発明者らは、血管又は弁膜石灰化の予防、改善又は治療用の組成物を開発しようと鋭意究努力してきた。その結果、チアミン（Ｔｈｉａｍｉｎｅ）誘導体が血管石灰化抑制効果を有することを究明した。
本発明は、チアミン誘導体又はその薬剤学的に許容可能な塩を含む血管又は弁膜石灰化の予防又は治療用の薬学的組成物、チアミン誘導体又はその塩を含む血管又は弁膜石灰化改善用の食品組成物、チアミン誘導体又はその薬剤学的に許容可能な塩を含む薬学的組成物を用いた血管又は弁膜石灰化の予防／治療方法及びその血管又は弁膜石灰化の治療用途に関する。
以下、本発明をより詳しく説明する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
本発明の他の態様は、チアミン（Ｔｈｉａｍｉｎｅ）誘導体又はその薬剤学的に許容可能な塩を含む薬学的組成物を個体に投与する段階を含む血管又は弁膜石灰化の予防又は治療方法に関する。
前記個体は、疾病の治療を必要とする対象を意味し、より具体的には、ヒト又は非ヒト霊長類、マウス（ｍｏｕｓｅ）、イヌ、ネコ、ウマ及びウシなどの哺乳類を意味する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
本発明のさらに他の態様は、チアミン（Ｔｈｉａｍｉｎｅ）誘導体又はその薬剤学的に許容可能な塩を含む薬学的組成物の血管又は弁膜石灰化の治療用途に関する。
前記組成物の重複する内容は、本明細書の複雑性を考慮して省略する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
本発明は、チアミン誘導体又はその薬剤学的に許容可能な塩を含む血管又は弁膜石灰化の予防又は治療用の薬学的組成物、及びチアミン誘導体又はその塩を含む血管又は弁膜石灰化改善用の食品組成物に関し、本発明の組成物は、血管又は弁膜石灰化の予防、治療又は改善用途に有用に用いることができる。
【国際調査報告】
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2021533170.tif 000047
2021533170.tif 000048
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