(57)【要約】抗ＰＤ−１抗体またはその断片を提供する。がん、感染症、または免疫障害などの疾患を処置および診断するために抗体またはその断片を使用する方法も提供する。一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載される抗体またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される抗体またはその断片の重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。例えば、重鎖は、配列番号１９、２３、２７、３１、３５、３７、および３９からなる群より選択されるアミノ酸配列またはそのバリアントを含み得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
がん、感染症、または免疫障害の処置を必要とする患者におけるがん、感染症、または免疫障害を処置する方法であって、１つまたは複数の用量の、ヒトプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）に対して特異性を有する単離された抗体またはその断片を前記患者に投与するステップを含み、各用量が約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである、方法。
【請求項２】
各用量が、約１ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
各用量が３ｍｇ／ｋｇである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体またはその断片が、
重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３が、
（ａ）ＨＣＤＲ１：ＧＦＴＦＳＳＹＴ（配列番号１）、ＨＣＤＲ２：ＩＳＨＧＧＧＤＴ（配列番号２）、ＨＣＤＲ３：ＡＲＨＳＧＹＥＲＧＹＹＹＶＭＤＹ（配列番号３）、ＬＣＤＲ１：ＥＳＶＤＹＹＧＦＳＦ（配列番号４）、ＬＣＤＲ２：ＡＡＳ（配列番号５）、ＬＣＤＲ３：ＱＱＳＫＥＶＰＷ（配列番号６）；
（ｂ）ＨＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＳＹＴ（配列番号７）、ＨＣＤＲ２：ＩＮＰＴＴＧＹＴ（配列番号８）、ＨＣＤＲ３：ＡＲＤＤＡＹＹＳＧＹ（配列番号９）、ＬＣＤＲ１：ＥＮＩＹＳＮＬ（配列番号１０）、ＬＣＤＲ２：ＡＡＫ（配列番号１１）、ＬＣＤＲ３：ＱＨＦＷＧＴＰＷＴ（配列番号１２）；および
（ｃ）ＨＣＤＲ１：ＧＦＡＦＳＳＹＤ（配列番号１３）、ＨＣＤＲ２：ＩＴＩＧＧＧＴＴ（配列番号１４）、ＨＣＤＲ３：ＡＲＨＲＹＤＹＦＡＭＤＮ（配列番号１５）、ＬＣＤＲ１：ＥＮＶＤＮＹＧＩＮＦ（配列番号１６）、ＬＣＤＲ２：ＶＳＳ（配列番号１７）、ＬＣＤＲ３：ＱＱＳＫＤＶＰＷ（配列番号１８）
からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体またはその断片が、重鎖定常領域、軽鎖定常領域、Ｆｃ領域、またはその組合せをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体またはその断片が、軽鎖定常領域を含み、前記軽鎖定常領域がカッパまたはラムダ鎖定常領域である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体またはその断片が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＤのアイソタイプのものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記アイソタイプが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体またはその断片が、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全なヒト抗体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体またはその断片が、ヒト化抗体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体またはその断片が、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９のアミノ酸配列、または配列番号３５、配列番号３７、もしくは配列番号３９と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体またはその断片が、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５のアミノ酸配列、または配列番号４１、配列番号４３、もしくは配列番号４５と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体またはその断片が、
重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３が、
（ａ）ＨＣＤＲ１：ＧＦＴＦＳＳＹＴ（配列番号１）、ＨＣＤＲ２：ＩＳＨＧＧＧＤＴ（配列番号２）、ＨＣＤＲ３：ＡＲＨＳＧＹＥＲＧＹＹＹＶＭＤＹ（配列番号３）、ＬＣＤＲ１：ＥＳＶＤＹＹＧＦＳＦ（配列番号４）、ＬＣＤＲ２：ＡＡＳ（配列番号５）、ＬＣＤＲ３：ＱＱＳＫＥＶＰＷ（配列番号６）；
（ｂ）ＨＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＳＹＴ（配列番号７）、ＨＣＤＲ２：ＩＮＰＴＴＧＹＴ（配列番号８）、ＨＣＤＲ３：ＡＲＤＤＡＹＹＳＧＹ（配列番号９）、ＬＣＤＲ１：ＥＮＩＹＳＮＬ（配列番号１０）、ＬＣＤＲ２：ＡＡＫ（配列番号１１）、ＬＣＤＲ３：ＱＨＦＷＧＴＰＷＴ（配列番号１２）；
（ｃ）ＨＣＤＲ１：ＧＦＡＦＳＳＹＤ（配列番号１３）、ＨＣＤＲ２：ＩＴＩＧＧＧＴＴ（配列番号１４）、ＨＣＤＲ３：ＡＲＨＲＹＤＹＦＡＭＤＮ（配列番号１５）、ＬＣＤＲ１：ＥＮＶＤＮＹＧＩＮＦ（配列番号１６）、ＬＣＤＲ２：ＶＳＳ（配列番号１７）、ＬＣＤＲ３：ＱＱＳＫＤＶＰＷ（配列番号１８）；および
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３であって、ただしそのうちの少なくとも１つが、１つ、２つ、または３つのアミノ酸付加、欠失、保存的アミノ酸置換、またはその組合せを含む、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３
からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３が、（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つに示されるとおりであるが、そのうちの１つが保存的アミノ酸置換を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３が、（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つに示されるとおりであるが、そのうちの２つが、各々保存的アミノ酸置換を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３が、（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つに示されるとおりであるが、そのうちの３つが各々保存的アミノ酸置換を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法ががんを処置するためであり、前記がんが、膀胱がん、肝臓がん、結腸がん、直腸がん、子宮内膜がん、白血病、リンパ腫、膵臓がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、乳がん、尿道がん、頭頸部がん、消化器がん、胃がん、食道がん、卵巣がん、腎臓がん、黒色腫、前立腺がん、および甲状腺がんからなる群より選択される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法が感染症を処置するためであり、前記感染症が、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、または寄生生物による感染症である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記方法が免疫障害を処置するためであり、前記免疫障害が、感染症、感染症に関連するエンドトキシンショック、関節炎、関節リウマチ、喘息、ＣＯＰＤ、骨盤腹膜炎、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ペロニー病、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣病、腹膜炎、乾癬、血管炎、外科的癒着、卒中、Ｉ型糖尿病、ライム病、関節炎、髄膜脳炎、自己免疫性ぶどう膜炎、中枢および末梢神経系の免疫媒介性炎症障害、多発性硬化症、狼瘡およびギラン・バレー症候群、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維化肺胞炎、グレーヴス病、ＩｇＡ腎症、特発性血小板減少性紫斑病、メニエール病、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、サルコイドーシス、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、膵炎、外傷、移植片対宿主病、移植片の拒絶、虚血疾患、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症、血管内凝固、骨吸収、骨粗鬆症、変形性関節炎、歯周炎、低塩酸症、および母子間免疫寛容の欠如に関連する不妊症からなる群より選択される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法が感染症を処置するためであり、前記感染症が肝炎である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記肝炎が、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、およびＥ型肝炎から選択される、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１８年７月１９日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／０９６２０６号の優先権の恩典および優先権を主張する。本出願の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０００２】
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出物の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている：コンピューター読み取り可能な形態（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：７９２５７２０００９４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０１９年７月１７日、サイズ：３６ＫＢ）。
【背景技術】
【０００３】
プログラム細胞死１（ＰＤ−１）のｃＤＮＡは、１９９２年にマウスＴ細胞ハイブリドーマおよびアポトーシスを受けつつある造血前駆細胞株から単離された。遺伝的アブレーション試験により、ＰＤ−１の欠損が様々なマウス系統において異なる自己免疫表現型をもたらすことが示された。トランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＰＤ−１欠損同種異系Ｔ細胞は、アロ抗原に対して増強された応答を示し、このことは、Ｔ細胞上のＰＤ−１が抗原に対する応答において負の制御的役割を果たすことを示している。
【０００４】
いくつかの研究が、ＰＤ−１と相互作用する分子の発見に寄与した。１９９９年に、Ｂ７ホモログ１（Ｂ７−Ｈ１、プログラム細胞死リガンド１［ＰＤ−Ｌ１］とも呼ばれる）が、分子クローニング、およびＢ７ファミリー分子とのその相同性に基づくヒトの発現された配列タグデータベース検索を使用してＰＤ−１とは独立して同定され、Ｂ７−Ｈ１が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒトＴ細胞応答の阻害剤として作用することが示された。これらの２つの独立した系統の研究は、１年後にＦｒｅｅｍａｎ、Ｗｏｏｄ、およびＨｏｎｊｏの研究所が、Ｂ７−Ｈ１（本明細書において以降、ＰＤ−Ｌ１と呼ぶ）がＰＤ−１の結合および機能的パートナーであることを示したことから１つにまとまった。次いで、ＰＤ−Ｌ１欠損マウス（ＰＤ−Ｌ１  ＫＯマウス）は、この系統のマウスがそのような疾患を自然発症しなかったにもかかわらず、自己免疫疾患を誘導する傾向があったことが決定された。ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用が、ｉｎ  ｖｉｖｏで、特に腫瘍の微小環境でのＴ細胞応答の抑制において主要な役割を果たすことは後に明白となっている。
【０００５】
その最初の試験は、腫瘍関連ＰＤ−Ｌ１が活性化Ｔ細胞のアポトーシスを促進し（Dong  H.  et  al.  Tumor-associated  B7-H1  promotes  T-cell  apoptosis:  a  potential  mechanism  of  immune  evasion.  Nature  medicine.  2002;8(8):793-800）、またヒト末梢血Ｔ細胞におけるＩＬ−１０産生を刺激して（Dong  H,  et  al.,  B7-H1,  a  third  member  of  the  B7  family,  co-stimulates  T-cell  proliferation  and  interleukin-10  secretion.  Nature  medicine.  1999;5(12):1365-9）免疫抑制を媒介することを示した。現在では、免疫抑制に及ぼすＰＤ−Ｌ１の効果がさらにより複雑であることは公知である。Ｔ細胞のアポトーシスおよびＩＬ−１０誘導に加えて、ＰＤ−Ｌ１はまた、多様な機構を通してＴ細胞機能障害を誘導することができる。ＰＤ経路はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでＴ細胞アネルギーを促進することも示された。
【０００６】
最近、ＦＤＡは、２つのＰＤ−１  ｍＡｂをヒトがんの処置のために承認し、１つはＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  ＳｑｕｉｂｂのｍＡｂ（Ｏｐｄｉｖｏ、ニボルマブ、ＭＤＸ−１１０６、ＢＭＳ−９３６５５８、ＯＮＯ−４５３８）であり、他方はＭｅｒｃｋ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ、ペンブロリズマブ、ランブロリズマブ、ＭＫ−３４７５）のｍＡｂであった。加えて、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１のいずれかに対する複数のｍＡｂが、何千人もの患者を必要とする何百もの臨床試験において活発に開発中である。これまで、抗ＰＤ治療は、進行腫瘍および転移腫瘍の退縮ならびに生存の改善を誘導することによって有意な臨床利益を生成する。より重要なことに、抗ＰＤ治療は、持続的な効果、忍容可能な毒性を有し得、広いスペクトルのがんのタイプ、特に固形腫瘍に適用可能であることを示し得る。これらの臨床知見から、ＰＤ経路遮断の原理がさらに確証され、抗ＰＤ治療は、個別化または腫瘍タイプ特異的治療とは異なる独自のカテゴリーに入る。他のがん治療とのその独自の重複しない機構により、治療有効性をさらに増幅する試みで、抗ＰＤ治療をほぼ全てのがんの処置方法と組み合わせることが進行中である。がんワクチン、同時刺激および同時阻害抗体ならびに養子細胞治療などの様々ながん免疫療法のアプローチと組み合わせることに加えて、抗ＰＤ治療を化学療法、放射線療法、および標的化治療と組み合わせるために様々な臨床試験がまた開始されている。
抗ＰＤ治療は、ヒトがん、特に固形腫瘍に対する免疫療法において中心的な位置を占めている。この治療は、全身免疫応答をブーストすること、またはがんに対するｄｅ  ｎｏｖｏ免疫を生成することを主にねらいとするこれまでの免疫療法剤とは異なる；その代わりに、抗ＰＤ治療は腫瘍部位での免疫応答を調節し、腫瘍誘導性の免疫欠損を標的とし、進行中の免疫応答を修復する。多様なヒトがんの処置に関して抗ＰＤ治療が臨床で成功していることからこのアプローチが確証されているが、本発明者らはなおもこの経路および関連する免疫応答を研究中であり、これは、がん免疫療法における新規の臨床応用可能なアプローチの発見および設計を助けるであろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｄｏｎｇ  Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００２）８（８）：７９３〜８００
【非特許文献２】Ｄｏｎｇ  Ｈ，ら、Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９９）５（１２）：１３６５〜９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、ＰＤ−１タンパク質に対して優れた結合および阻害活性を示す抗ＰＤ−１抗体を提供する。試験した抗体の１つは、規制当局に承認された２つの抗ＰＤ−１抗体製品より強い結合活性をさらに示した。
【０００９】
したがって、本開示の一実施形態に従って、ヒトプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）に対して特異性を有する単離された抗体またはその断片であって、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３が、（ａ）ＨＣＤＲ１：ＧＦＴＦＳＳＹＴ（配列番号１）、ＨＣＤＲ２：ＩＳＨＧＧＧＤＴ（配列番号２）、ＨＣＤＲ３：ＡＲＨＳＧＹＥＲＧＹＹＹＶＭＤＹ（配列番号３）、ＬＣＤＲ１：ＥＳＶＤＹＹＧＦＳＦ（配列番号４）、ＬＣＤＲ２：ＡＡＳ（配列番号５）、ＬＣＤＲ３：ＱＱＳＫＥＶＰＷ（配列番号６）；（ｂ）ＨＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＳＹＴ（配列番号７）、ＨＣＤＲ２：ＩＮＰＴＴＧＹＴ（配列番号８）、ＨＣＤＲ３：ＡＲＤＤＡＹＹＳＧＹ（配列番号９）、ＬＣＤＲ１：ＥＮＩＹＳＮＬ（配列番号１０）、ＬＣＤＲ２：ＡＡＫ（配列番号１１）、ＬＣＤＲ３：ＱＨＦＷＧＴＰＷＴ（配列番号１２）；および（ｃ）ＨＣＤＲ１：ＧＦＡＦＳＳＹＤ（配列番号１３）、ＨＣＤＲ２：ＩＴＩＧＧＧＴＴ（配列番号１４）、ＨＣＤＲ３：ＡＲＨＲＹＤＹＦＡＭＤＮ（配列番号１５）、ＬＣＤＲ１：ＥＮＶＤＮＹＧＩＮＦ（配列番号１６）、ＬＣＤＲ２：ＶＳＳ（配列番号１７）、ＬＣＤＲ３：ＱＱＳＫＤＶＰＷ（配列番号１８）からなる群より選択される、単離された抗体またはその断片を提供する。
【００１０】
一部の実施形態では、本開示の抗体または断片は、重鎖定常領域、軽鎖定常領域、Ｆｃ領域、またはその組合せをさらに含む。一部の実施形態では、軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ鎖定常領域である。
【００１１】
抗体またはその断片は、一部の実施形態では、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＤのアイソタイプであり得る。一部の実施形態では、アイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。一部の実施形態では、抗体またはその断片は、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全なヒト抗体である。
【００１２】
一部の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９のアミノ酸配列、または配列番号３５、配列番号３７、もしくは配列番号３９と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５のアミノ酸配列、または配列番号４１、配列番号４３、もしくは配列番号４５と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００１３】
別の実施形態では、本開示は、ヒトプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）に対して特異性を有する単離された抗体またはその断片であって、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３が、（ａ）ＨＣＤＲ１：ＧＦＴＦＳＳＹＴ（配列番号１）、ＨＣＤＲ２：ＩＳＨＧＧＧＤＴ（配列番号２）、ＨＣＤＲ３：ＡＲＨＳＧＹＥＲＧＹＹＹＶＭＤＹ（配列番号３）、ＬＣＤＲ１：ＥＳＶＤＹＹＧＦＳＦ（配列番号４）、ＬＣＤＲ２：ＡＡＳ（配列番号５）、ＬＣＤＲ３：ＱＱＳＫＥＶＰＷ（配列番号６）；（ｂ）ＨＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＳＹＴ（配列番号７）、ＨＣＤＲ２：ＩＮＰＴＴＧＹＴ（配列番号８）、ＨＣＤＲ３：ＡＲＤＤＡＹＹＳＧＹ（配列番号９）、ＬＣＤＲ１：ＥＮＩＹＳＮＬ（配列番号１０）、ＬＣＤＲ２：ＡＡＫ（配列番号１１）、ＬＣＤＲ３：ＱＨＦＷＧＴＰＷＴ（配列番号１２）；（ｃ）ＨＣＤＲ１：ＧＦＡＦＳＳＹＤ（配列番号１３）、ＨＣＤＲ２：ＩＴＩＧＧＧＴＴ（配列番号１４）、ＨＣＤＲ３：ＡＲＨＲＹＤＹＦＡＭＤＮ（配列番号１５）、ＬＣＤＲ１：ＥＮＶＤＮＹＧＩＮＦ（配列番号１６）、ＬＣＤＲ２：ＶＳＳ（配列番号１７）、ＬＣＤＲ３：ＱＱＳＫＤＶＰＷ（配列番号１８）；および（ｄ）（ａ）〜（ｃ）に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３であって、ただしそのうちの少なくとも１つが、１つ、２つ、または３つのアミノ酸付加、欠失、保存的アミノ酸置換、またはその組合せを含む、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３からなる群より選択される、単離された抗体またはその断片を提供する。
【００１４】
一部の実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３は、（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つに示されるとおりであるが、そのうちの１つが保存的アミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３は、（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つに示されるとおりであるが、そのうちの２つが、各々保存的アミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３は、（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つに示されるとおりであるが、そのうちの３つが各々保存的アミノ酸置換を含む。
【００１５】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載される抗体またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される抗体またはその断片の重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。例えば、重鎖は、配列番号１９、２３、２７、３１、３５、３７、および３９からなる群より選択されるアミノ酸配列またはそのバリアントを含み得る。例えば、ヌクレオチド配列は、２０、２４、２８、３２、３６、３８、および４０からなる群より選択されるヌクレオチド配列またはそのバリアントを含み得る。
【００１６】
あるいは、一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される抗体またはその断片の軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。例えば、軽鎖は、配列番号２１、２５、２９、３３、４１、４３、および４５からなる群より選択されるアミノ酸配列またはそのバリアントを含み得る。例えば、ヌクレオチド配列は、２２、２６、３０、３４、４２、４４、および４６からなる群より選択されるヌクレオチド配列またはそのバリアントを含み得る。
【００１７】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１〜１８からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００１８】
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含む核酸構築物も提供する。一部の実施形態では、核酸構築物は、ポリヌクレオチドに作動可能に連結された１つまたは複数の制御配列をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の制御配列は、適した宿主において本明細書に記載される抗体またはその断片の産生を方向付ける。一部の実施形態では、１つまたは複数の制御配列は、プロモーター、エンハンサー、終止シグナル、シグナルペプチド、リーダー、転写ターミネーター、およびその任意の組合せから選択される。例えば、１つまたは複数の制御配列はプロモーターであり得る。
【００１９】
一実施形態では、本明細書に記載される核酸構築物を含むベクターも提供する。一部の実施形態では、ベクターは発現ベクターである。一部の実施形態では、ベクターは、プラスミド、コスミド、ウイルス、ミニ染色体、および人工染色体から選択される。
【００２０】
一実施形態では、本明細書に記載される核酸構築物または本明細書に記載されるベクターを含む宿主細胞も提供する。一部の実施形態では、核酸構築物またはベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。一部の実施形態では、核酸構築物またはベクターは、染色体外実体として存在する。宿主細胞は原核細胞であり得る。宿主細胞は真核宿主細胞であり得る。例えば、宿主細胞は哺乳動物細胞であり得る。例えば、宿主細胞はヒト細胞であり得る。
【００２１】
一実施形態では、本明細書に記載される抗体またはその断片、本明細書に記載されるポリヌクレオチド、本明細書に記載される核酸構築物、本明細書に記載されるベクター、または本明細書に記載される宿主細胞を含む発酵培地も提供する。
【００２２】
一実施形態では、本開示の抗体またはその断片および薬学的に許容される担体を含む組成物も提供する。なおさらに、一実施形態では、抗体またはその断片をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む単離された細胞も提供する。
【００２３】
使用および方法も提供する。一実施形態では、がんの処置のための医薬を製造するための、本開示の抗体またはその断片の使用を提供する。がんは、膀胱がん、肝臓がん、結腸がん、直腸がん、子宮内膜がん、白血病、リンパ腫、膵臓がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、乳がん、尿道がん、頭頸部がん、消化器がん、胃がん、食道がん、卵巣がん、腎臓がん、黒色腫、前立腺がん、および甲状腺がんからなる群より選択することができる。それを必要とする患者におけるがんを処置する方法であって、本開示の抗体またはその断片を患者に投与するステップを含む方法も提供する。
【００２４】
別の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者におけるがんまたは感染症を処置する方法であって、（ａ）細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで本開示の抗体またはその断片によって処置するステップ；および（ｂ）処置した細胞を患者に投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、細胞はＴ細胞である。
【００２５】
別の実施形態では、感染症の処置のための医薬を製造するための本開示のいずれか１つの抗体またはその断片の使用を提供する。一部の実施形態では、感染症は、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、または寄生生物による感染症である。
【００２６】
なお別の実施形態では、免疫障害の処置のための医薬を製造するための本開示の抗体またはその断片の使用を提供する。一部の実施形態では、免疫障害は、感染症、感染症に関連するエンドトキシンショック、関節炎、関節リウマチ、喘息、ＣＯＰＤ、骨盤腹膜炎、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ペロニー病、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣病、腹膜炎、乾癬、血管炎、外科的癒着、卒中、Ｉ型糖尿病、ライム病、関節炎、髄膜脳炎、自己免疫性ぶどう膜炎、中枢および末梢神経系の免疫媒介性炎症障害、多発性硬化症、狼瘡およびギラン・バレー症候群、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維化肺胞炎、グレーヴス病、ＩｇＡ腎症、特発性血小板減少性紫斑病、メニエール病、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、サルコイドーシス、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、膵炎、外傷、移植片対宿主病、移植片の拒絶、虚血疾患、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症、血管内凝固、骨吸収、骨粗鬆症、変形性関節炎、歯周炎、低塩酸症、および母子間免疫寛容の欠如に関連する不妊症からなる群より選択される。
【００２７】
一部の態様では、それを必要とする患者におけるがん、感染症、または免疫障害を処置する方法であって、１つまたは複数の用量の、ヒトプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）に対して特異性を有する単離された抗体またはその断片を患者に投与するステップを含み、各用量が、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである、方法を提供する。一部の実施形態では、各用量は、約１ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇである。一部の実施形態では、各用量は３ｍｇ／ｋｇである。
【００２８】
本明細書に記載される方法のいずれか１つに従う一部の実施形態では、抗体またはその断片は、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３は、（ａ）ＨＣＤＲ１：ＧＦＴＦＳＳＹＴ（配列番号１）、ＨＣＤＲ２：ＩＳＨＧＧＧＤＴ（配列番号２）、ＨＣＤＲ３：ＡＲＨＳＧＹＥＲＧＹＹＹＶＭＤＹ（配列番号３）、ＬＣＤＲ１：ＥＳＶＤＹＹＧＦＳＦ（配列番号４）、ＬＣＤＲ２：ＡＡＳ（配列番号５）、ＬＣＤＲ３：ＱＱＳＫＥＶＰＷ（配列番号６）；（ｂ）ＨＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＳＹＴ（配列番号７）、ＨＣＤＲ２：ＩＮＰＴＴＧＹＴ（配列番号８）、ＨＣＤＲ３：ＡＲＤＤＡＹＹＳＧＹ（配列番号９）、ＬＣＤＲ１：ＥＮＩＹＳＮＬ（配列番号１０）、ＬＣＤＲ２：ＡＡＫ（配列番号１１）、ＬＣＤＲ３：ＱＨＦＷＧＴＰＷＴ（配列番号１２）；および（ｃ）ＨＣＤＲ１：ＧＦＡＦＳＳＹＤ（配列番号１３）、ＨＣＤＲ２：ＩＴＩＧＧＧＴＴ（配列番号１４）、ＨＣＤＲ３：ＡＲＨＲＹＤＹＦＡＭＤＮ（配列番号１５）、ＬＣＤＲ１：ＥＮＶＤＮＹＧＩＮＦ（配列番号１６）、ＬＣＤＲ２：ＶＳＳ（配列番号１７）、ＬＣＤＲ３：ＱＱＳＫＤＶＰＷ（配列番号１８）からなる群より選択される。本明細書に記載される方法のいずれか１つに従う一部の実施形態では、抗体またはその断片は、重鎖定常領域、軽鎖定常領域、Ｆｃ領域、またはその組合せをさらに含む。一部の実施形態では、抗体またはその断片は、軽鎖定常領域を含み、軽鎖定常領域はカッパまたはラムダ鎖定常領域である。一部の実施形態では、アイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。一部の実施形態では、抗体またはその断片は、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全なヒト抗体である。一部の実施形態では、抗体またはその断片は、ヒト化抗体である。
【００２９】
本明細書に記載される方法のいずれか１つに従う一部の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９のアミノ酸配列、または配列番号３５、配列番号３７、もしくは配列番号３９と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５のアミノ酸配列、または配列番号４１、配列番号４３、もしくは配列番号４５と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００３０】
本明細書に記載される方法のいずれか１つに従う一部の実施形態では、抗体またはその断片は、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３は、（ａ）ＨＣＤＲ１：ＧＦＴＦＳＳＹＴ（配列番号１）、ＨＣＤＲ２：ＩＳＨＧＧＧＤＴ（配列番号２）、ＨＣＤＲ３：ＡＲＨＳＧＹＥＲＧＹＹＹＶＭＤＹ（配列番号３）、ＬＣＤＲ１：ＥＳＶＤＹＹＧＦＳＦ（配列番号４）、ＬＣＤＲ２：ＡＡＳ（配列番号５）、ＬＣＤＲ３：ＱＱＳＫＥＶＰＷ（配列番号６）；（ｂ）ＨＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＳＹＴ（配列番号７）、ＨＣＤＲ２：ＩＮＰＴＴＧＹＴ（配列番号８）、ＨＣＤＲ３：ＡＲＤＤＡＹＹＳＧＹ（配列番号９）、ＬＣＤＲ１：ＥＮＩＹＳＮＬ（配列番号１０）、ＬＣＤＲ２：ＡＡＫ（配列番号１１）、ＬＣＤＲ３：ＱＨＦＷＧＴＰＷＴ（配列番号１２）；（ｃ）ＨＣＤＲ１：ＧＦＡＦＳＳＹＤ（配列番号１３）、ＨＣＤＲ２：ＩＴＩＧＧＧＴＴ（配列番号１４）、ＨＣＤＲ３：ＡＲＨＲＹＤＹＦＡＭＤＮ（配列番号１５）、ＬＣＤＲ１：ＥＮＶＤＮＹＧＩＮＦ（配列番号１６）、ＬＣＤＲ２：ＶＳＳ（配列番号１７）、ＬＣＤＲ３：ＱＱＳＫＤＶＰＷ（配列番号１８）；および（ｄ）（ａ）〜（ｃ）に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３であって、ただしそのうちの少なくとも１つが、１つ、２つ、または３つのアミノ酸付加、欠失、保存的アミノ酸置換、またはその組合せを含む、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３からなる群より選択される。一部の実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３は、（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つに示されるとおりであるが、そのうちの１つが保存的アミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３は、（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つに示されるとおりであるが、そのうちの２つが、保存的アミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３は、（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つに示されるとおりであるが、そのうちの３つが保存的アミノ酸置換を含む。
【００３１】
本明細書に記載される方法のいずれか１つに従う一部の実施形態では、方法はがんを処置するためであり、がんは、膀胱がん、肝臓がん、結腸がん、直腸がん、子宮内膜がん、白血病、リンパ腫、膵臓がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、乳がん、尿道がん、頭頸部がん、消化器がん、胃がん、食道がん、卵巣がん、腎臓がん、黒色腫、前立腺がん、および甲状腺がんからなる群より選択される。
【００３２】
本明細書に記載される方法のいずれか１つに従う一部の実施形態では、方法は、感染症を処置するためであり、感染症は、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、または寄生生物による感染症である。一部の実施形態では、感染症は肝炎である。一部の実施形態では、肝炎は、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、およびＥ型肝炎から選択される。
【００３３】
本明細書に記載される方法のいずれか１つに従う一部の実施形態では、方法は、免疫障害を処置するためであり、免疫障害は、感染症、感染症に関連するエンドトキシンショック、関節炎、関節リウマチ、喘息、ＣＯＰＤ、骨盤腹膜炎、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ペロニー病、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣病、腹膜炎、乾癬、血管炎、外科的癒着、卒中、Ｉ型糖尿病、ライム病、関節炎、髄膜脳炎、自己免疫性ぶどう膜炎、中枢および末梢神経系の免疫媒介性炎症障害、多発性硬化症、狼瘡およびギラン・バレー症候群、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維化肺胞炎、グレーヴス病、ＩｇＡ腎症、特発性血小板減少性紫斑病、メニエール病、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、サルコイドーシス、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、膵炎、外傷、移植片対宿主病、移植片の拒絶、虚血疾患、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症、血管内凝固、骨吸収、骨粗鬆症、変形性関節炎、歯周炎、低塩酸症、および母子間免疫寛容の欠如に関連する不妊症からなる群より選択される。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、５つ全てのｈＰＤ−１  ｍＡｂアイソタイプが、高い特異性でｈＰＤ−１に結合することができることを示す図である。
【００３５】
【図２】図２は、抗ｈＰＤ−１がｈＢ７−１、ｈＰＤ−Ｌ１、ｈＢ７−Ｈ３、ｈＢ７−Ｈ４、およびｈＣＤ１３７に結合しないことを示す図である。
【００３６】
【図３】図３は、ｈＰＤ−１  ｍＡｂが、ｍＰＤ−１に対して交叉結合を示すことなく、ヒトおよびカニクイザル両方の細胞ＰＤ−１タンパク質に結合することができることを示す図である。
【００３７】
【図４】図４は、ｈＰＤ−１  ｍＡｂが、ｈＰＤ−１のｈＰＤ−Ｌ１に対する結合に対して投薬量に応じて遮断効果を有し得ることを示す図である。
【００３８】
【図５−１】図５Ａおよび図５Ｂは、競合的結合環境下で観察した場合のｈＰＤ−１  ｍＡｂの抑制効果および遮断効果を示す図である。
【図５−２】図５Ａおよび図５Ｂは、競合的結合環境下で観察した場合のｈＰＤ−１  ｍＡｂの抑制効果および遮断効果を示す図である。
【００３９】
【図６】図６は、ＲＡＣＥ産物を確認するゲル電気泳動分析の結果を示す図である。
【００４０】
【図７】図７は、組換えＤＮＡ抗体がＰＤ−１に結合する能力（Ａ）、およびＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１に対する結合能に及ぼすその遮断効果（Ｂ）を示す図である。
【００４１】
【図８】図８は、９つのヒト化抗体が、親抗体より高いおよび低い親和性の両方を含む、ＰＤ−１に対する様々な結合親和性を示すことを示す図である。
【００４２】
【図９】図９は、ヒト化抗体が、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１に対する結合能に対して遮断効果を有し得ることを示す図である。
【００４３】
【図１０−１】図１０Ａおよび図１０Ｂは、ヒト化抗体が、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ２に対する結合能に対して遮断効果を有し得ることを示す図である。
【図１０−２】図１０Ａおよび図１０Ｂは、ヒト化抗体が、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ２に対する結合能に対して遮断効果を有し得ることを示す図である。
【００４４】
【図１１】図１１は、ヒト化ｍＡｂが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでがん細胞に対するアロＣＤ８＋  ＣＴＬ細胞の細胞傷害を増強することを示す図である。
【００４５】
【図１２】図１２は、抗ｈＰＤ−１抗体に対するＭＬＲの増殖応答を示す図である。
【００４６】
【図１３】図１３は、ＭＬＲ培養上清におけるＩＬ−２およびＩＦＮγ発現プロファイルを示す図である。
【００４７】
【図１４−１】図１４Ａおよび図１４Ｂは、リンパ球上のＰＤ−Ｌ１の発現がＰＤ−１  ｍＡｂによって阻害されたことを示す図である。
【図１４−２】図１４Ａおよび図１４Ｂは、リンパ球上のＰＤ−Ｌ１の発現がＰＤ−１  ｍＡｂによって阻害されたことを示す図である。
【００４８】
【図１５】図１５は、ヒト化ＰＤ−１抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を示す図である。
【００４９】
【図１６】図１６は、抗体結合親和性および動態の比較を表す図である。
【００５０】
【図１７】図１７は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断におけるＰＤ−１抗体の比較を示す図である。
【００５１】
【図１８】図１８は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでがん細胞に対するアロＣＤ８＋  ＣＴＬ細胞の細胞傷害の増強に関するｍＡｂの比較を示す図である。
【００５２】
【図１９】図１９は、ｈＰＤ−１またはｍＰＤ−１に対する試験物質の結合を示す図である（ＥＬＩＳＡアッセイ）。
【００５３】
【図２０】図２０は、フローサイトメトリーを使用した、ｈＰＤ−１発現またはｃＰＤ−１発現ＣＨＯＫ１細胞に対する試験物質の結合を示す図である。
【００５４】
【図２１】図２１は、ｈＰＤ−Ｌ１（左）およびｈＰＤ−Ｌ２（右）のｈＰＤ−１発現ＣＨＯＫ１細胞に対する結合に及ぼす試験物質の遮断活性を示す図である。
【００５５】
【図２２】図２２は、ヒトＭＬＲアッセイにおけるＩＬ−２（左）およびＩＦＮ−γ（右）レベルを示す図である。
【００５６】
【図２３】図２３は、操作された腫瘍とＴ細胞の同時培養アッセイにおけるＩＦＮ−γレベルを示す図である。
【００５７】
【図２４】図２４は、ＥＬＩＳＡ結果によるエピトープ結合（上のパネル）および異なる試験物質のエピトープ重複の概略図（下のパネル）を示す図である。
【００５８】
【図２５】図２５は、ニボルマブ（上のパネル）またはＴＹ１０１−０４−Ｔ３−０５（下のパネル）抗体の、低い固定レベル（６０ＲＵ、左のパネル）および高い固定レベル（９６０ＲＵ、右のパネル）での組換えｈＰＤ−１に対する結合を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
定義
用語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」実体は、その実体の１つまたは複数を指すことに注意すべきである；例えば「１つの抗体」は、１つまたは複数の抗体を表すと理解される。そのため、用語「１つの（または１つの（ａｎ））」、「１つまたは複数」、および「少なくとも１つ」は、本明細書において互換的に使用することができる。
【００６０】
本明細書において使用する場合、用語「ポリペプチド」は、単数の「ポリペプチド」ならびに複数の「ポリペプチド」を包含すると意図され、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって直線状に連結された単量体（アミノ酸）で構成される分子を指す。用語「ポリペプチド」は、２つまたはそれより多いアミノ酸の任意の鎖（単数または複数）を指し、その産物の特定の長さを指すのではない。このため、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２つもしくはそれより多いアミノ酸の鎖（単数もしくは複数）を指すために使用される他の任意の用語が、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかの代わりにまたはこれらの用語のいずれかと互換的に使用することができる。用語「ポリペプチド」はまた、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、または天然に存在しないアミノ酸による修飾を含むがこれらに限定されないポリペプチドの発現後修飾の産物を指すことも意図される。ポリペプチドは、天然の生物資源から誘導してもよく、または組換え技術によって産生してもよいが、指定された核酸配列から必ずしも翻訳されるわけではない。これは、化学合成による方法を含む任意の方法で生成することができる。
【００６１】
細胞、核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡに関して本明細書で使用される場合、用語「単離された」は、高分子の天然資源に存在する他のＤＮＡまたはＲＮＡからそれぞれ分離された分子を指す。本明細書で使用される場合、用語「単離された」はまた、組換えＤＮＡ技術によって産生された場合に、細胞材料、ウイルス材料、もしくは培養培地を実質的に含まない、または化学合成された場合には化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない核酸またはペプチドも指す。その上、「単離された核酸」は、断片として天然に存在せず、天然の状態で見出されない核酸断片を含むことを意味する。用語「単離された」はまた、本明細書において他の細胞タンパク質または組織から単離された細胞またはポリペプチドを指すためにも使用される。単離されたポリペプチドは、精製されたポリペプチドおよび組換えポリペプチドの両方を包含することを意味する。
【００６２】
本明細書で使用される場合、用語「組換え」は、それがポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関する場合、天然に存在しないポリペプチドまたはポリヌクレオチドの形態を意図し、その非制限的な例は、通常、共に存在しないポリヌクレオチドまたはポリペプチドを組み合わせることによって作製することができる。
【００６３】
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２つのペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較目的で整列させることができる各配列における位置を比較することによって決定することができる。比較した配列における位置が同じ塩基またはアミノ酸によって占有されている場合、分子はその位置で相同である。配列間の相同性の程度は、配列によって共有されるマッチするまたは相同な位置の数の関数である。「無関係な」または「非相同な」配列は、本開示の配列の１つと４０％未満の同一性、好ましくは２５％未満の同一性を共有する。
【００６４】
ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）が、別の配列に対してある特定のパーセンテージ（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％）の「配列同一性」を有することは、整列させた場合に、塩基（またはアミノ酸）のそのパーセンテージが、２つの配列を比較する場合に同じであることを意味する。このアライメントおよびパーセント相同性または配列同一性は、当技術分野で公知のソフトウェアプログラム、例えばAusubel  et  al.  eds.  (2007)  Current  Protocols  in  Molecular  Biologyに記載されるプログラムを使用して決定することができる。好ましくは、アライメントのためにデフォルトパラメーターを使用する。１つのアライメントプログラムは、デフォルトパラメーターを使用するＢＬＡＳＴである。特に、プログラムは、以下のデフォルトパラメーターを使用するＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；説明＝５０配列；選別＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。生物学的に等価のポリヌクレオチドは、上記の指定されたパーセント相同性を有し、同じまたは類似の生物活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００６５】
用語「等価な核酸またはポリヌクレオチド」は、核酸またはその相補体のヌクレオチド配列とある特定の程度の相同性または配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を指す。二本鎖核酸のホモログは、その相補体とある特定の程度の相同性を有するまたはその相補体を有するヌクレオチド配列を有する核酸を含むと意図される。一態様では、核酸のホモログは、核酸またはその相補体とハイブリダイズすることが可能である。同様に、「等価なポリペプチド」は、参照ポリペプチドのアミノ酸配列とある特定の程度の相同性または配列同一性を有するポリペプチドを指す。一部の態様では、配列同一性は、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％である。一部の態様では、等価なポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと比較して１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの付加、欠失、置換、およびその組合せを有する。一部の態様では、等価な配列は、参照配列の活性（例えば、エピトープ結合）または構造（例えば、塩橋）を保持する。
【００６６】
ハイブリダイゼーション反応は、異なる「ストリンジェンシー」の条件下で実施することができる。一般的に、低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション反応は、約１０×ＳＳＣまたは同等のイオン強度／温度の溶液中、約４０℃で行われる。中等度ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、典型的に約６×ＳＳＣ中、約５０℃で実施され、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション反応は、一般的に約１×ＳＳＣ中、約６０℃で実施される。ハイブリダイゼーション反応はまた、当業者に周知である「生理的条件」下で実施することができる。生理的条件の非制限的な例は、温度、イオン強度、ｐＨ、および通常細胞において見出されるＭｇ２＋の濃度である。
【００６７】
ポリヌクレオチドは、４種のヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；チミン（Ｔ）；およびポリヌクレオチドがＲＮＡの場合にはチミンの代わりにウラシル（Ｕ）の特定の配列で構成される。このため、用語「ポリヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表記である。このアルファベット表記を、中央処理装置を有するコンピューターにおいてデータベースに入力し、機能的ゲノム学および相同性検索などのバイオインフォマティクス適用に使用することができる。用語「多型」は、遺伝子またはその一部の１つより多い形態が同時に存在することを指す。少なくとも２つの異なる形態、すなわち２つの異なるヌクレオチド配列が存在する遺伝子の部分は、「遺伝子の多型領域」と呼ばれる。多型領域は、異なる対立遺伝子でその同一性が異なる単一のヌクレオチドであり得る。
【００６８】
用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、またはそのアナログいずれかである任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することができ、公知のまたは未知の任意の機能を実施し得る。以下はポリヌクレオチドの非制限的な例である：遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴ、またはＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、改変ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド、およびヌクレオチドアナログを含むことができる。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する改変を、ポリヌクレオチドのアセンブリの前または後に付与することができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、標識成分とのコンジュゲーションなどによって重合後にさらに改変することができる。用語はまた、二本鎖および一本鎖分子の両方を指す。特に明記されているかまたは必要である場合を除き、ポリヌクレオチドである本開示の任意の実施形態は、二本鎖形態と、二本鎖形態を構成することが公知であるかまたは構成すると予想される２つの相補的な一本鎖形態の各々の両方を包含する。
【００６９】
ポリヌクレオチドに適用される場合の用語「コードする」は、それがその天然の状態にある場合、または当業者に周知の方法によって操作される場合、それを転写および／または翻訳してポリペプチドおよび／またはその断片のｍＲＮＡを産生することができる場合に、ポリペプチドを「コードする」と言われるポリヌクレオチドを指す。アンチセンス鎖は、そのような核酸の相補体であり、コードする配列をそこから推定することができる。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「抗体」または「抗原結合性ポリペプチド」は、抗原を特異的に認識して結合するポリペプチドまたはポリペプチド複合体を指す。抗体は、完全な抗体およびその任意の抗原結合性断片またはその一本鎖であり得る。このように、用語「抗体」は、抗原に結合する生物活性を有する免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含む分子を含有する任意のタンパク質またはペプチドを含む。そのような例には、重鎖もしくは軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）、またはそのリガンド結合部分、重鎖もしくは軽鎖可変領域、重鎖もしくは軽鎖定常領域、フレームワーク（ＦＲ）領域、またはその任意の部分、または結合タンパク質の少なくとも１つの部分を含むがこれらに限定されない。
【００７１】
本明細書で使用される場合、用語「抗体断片」または「抗原結合性断片」は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等などの抗体の一部である。構造にかかわらず、抗体断片は、インタクト抗体によって認識される同じ抗原に結合する。用語「抗体断片」は、アプタマー、スピーゲルマー(ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ)、およびダイアボディ（diabody）を含む。用語「抗体断片」はまた、特異的抗原に結合して複合体を形成することによって抗体のように挙動する任意の合成または遺伝子操作タンパク質を含む。
【００７２】
「一本鎖可変断片」または「ｓｃＦｖ」は、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質を指す。一部の態様では、領域は、１０〜約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドによって接続される。リンカーは、可撓性のためにグリシンに富み、ならびに溶解度のためにセリンまたはトレオニンに富むことができ、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に、またはその逆に接続することができる。このタンパク質は、定常領域が除去され、リンカーが導入されているにもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。ＳｃＦｖ分子は当技術分野で公知であり、例えば米国特許第５，８９２，０１９号に記載されている。
【００７３】
用語抗体は、生化学的に区別することができる様々な広いクラスのポリペプチドを包含する。当業者は、重鎖がガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）に分類され、その中にいくつかのサブクラス（例えば、γ１〜γ４）があることを認識している。抗体の「クラス」を、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＥであるとそれぞれ決定するのはこの鎖の性質である。免疫グロブリンサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ５等は、十分に特徴付けされており、機能的特殊化を付与することが公知である。これらのクラスおよびアイソタイプの各々の改変型は、本開示を考慮して当業者に容易に区別可能であり、したがって本開示の範囲内である。全ての免疫グロブリンクラスが明白に本開示の範囲内であるが、以下の考察は、一般的に免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスを対象とする。ＩｇＧに関して、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量およそ２３，０００ダルトンの２つの同一の軽鎖ポリペプチド、および分子量５３，０００〜７０，０００の２つの同一の重鎖ポリペプチドを含む。４つの鎖は、典型的には、ジスルフィド結合によって「Ｙ」字形状で結合し、軽鎖は、「Ｙ」字の口部分から始まり可変領域にわたり続く重鎖部分に取り付けられる。
【００７４】
本開示の抗体、抗原結合性ポリペプチド、バリアント、またはその誘導体は、ポリクローナル、モノクローナル、多特異性、ヒト、ヒト化、霊長類化、またはキメラ抗体、一本鎖抗体、エピトープ結合性断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖｓ、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＫまたはＶＨドメインのいずれかを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生された断片、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書に開示されるＬＩＧＨＴ抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）を含むがこれらに限定されない。本開示の免疫グロブリンまたは抗体分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１（IgGl）、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１（IgAl）、およびＩｇＡ２）、または免疫グロブリン分子のサブクラスの分子であり得る。
【００７５】
軽鎖は、カッパまたはラムダ（Ｋ、λ）のいずれかとして分類される。各々の重鎖クラスは、カッパまたはラムダ軽鎖のいずれかに結合し得る。一般的に、軽鎖および重鎖は、互いに共有結合し、２つの重鎖の「テール」部分は、免疫グロブリンがハイブリドーマ、Ｂ細胞、または遺伝子操作された宿主細胞のいずれかによって生成される場合、共有結合性のジスルフィド結合または非共有結合性の結合によって互いに結合する。重鎖では、アミノ酸配列は、Ｙ字形状のフォーク状の末端でのＮ末端から各鎖の底部のＣ末端に伸びる。
【００７６】
軽鎖および重鎖はいずれも、構造的および機能的相同性の領域に分割される。用語「定常」および「可変」は、機能的に使用される。この点において、軽鎖（ＶＫ）および重鎖（ＶＨ）部分の両方の可変ドメインが、抗原認識および特異性を決定すると認識される。逆に、軽鎖（ＣＫ）および重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３）の定常ドメインは、分泌、経胎盤移行能（ｔｒａｎｓｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ）、Ｆｃ受容体結合、補体結合等などの重要な生物特性を付与する。慣例により、定常領域ドメインのナンバリングは、それが抗体の抗原結合部位またはアミノ末端から遠位になるにつれて増加する。Ｎ末端部分は可変領域であり、Ｃ末端部分は定常領域であり；ＣＨ３およびＣＫドメインは実際に、重鎖および軽鎖のカルボキシ末端をそれぞれ含む。
【００７７】
上記で示したように、可変領域によって、抗体は、抗原上のエピトープを選択的に認識して特異的に結合することができる。すなわち、抗体のＶＫドメインおよびＶＨドメイン、または相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットが結合して、三次元抗原結合部位を定義する可変領域を形成する。この四次抗体構造は、Ｙの各アームの末端に存在する抗原結合部位を形成する。より詳しくは、抗原結合部位は、ＶＨおよびＶＫ鎖の各々における３つのＣＤＲ（すなわち、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３）によって定義される。一部の例、例えばラクダ種に由来するまたはラクダ免疫グロブリンに基づいて操作されたある特定の免疫グロブリン分子では、完全な免疫グロブリン分子は、重鎖のみからなり得、軽鎖を含まない。例えば、Hamers-Casterman  et  al.,  Nature  363:446-448  (1993)を参照されたい。
【００７８】
天然に存在する抗体において、各々の抗原結合ドメインに存在する６つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、抗体が水性環境中でその三次元立体配置をとると仮定して、抗原結合ドメインを形成するように特に位置するアミノ酸の短い、非連続配列である。抗原結合ドメインにおけるアミノ酸の残りは、「フレームワーク」領域と呼ばれ、より少ない分子間変動を示す。フレームワーク領域は主としてβ−シートコンフォメーションをとり、ＣＤＲは、β−シート構造を接続し、一部の例ではβ−シート構造の一部を形成するループを形成する。このように、フレームワーク領域は、鎖間の非共有結合性の相互作用によって、正しい方向でのＣＤＲの配置を提供する足場を形成するように作用する。配置されたＣＤＲによって形成される抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原上のエピトープと相補的である表面を定義する。この相補的表面は、抗体のその同起源のエピトープに対する非共有結合性の結合を促進する。ＣＤＲおよびフレームワーク領域を含むアミノ酸はそれぞれ、それらが正確に定義されていることから、任意の所与の重鎖または軽鎖可変領域に関して当業者によって容易に同定され得る（"Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest,"  Kabat,  E.,  et  al.,  U.S.  Department  of  Health  and  Human  Services,  (1983)；およびChothia  and  Lesk,  J.  Mol.  Biol.,  196:901-917  (1987)を参照されたい）。
【００７９】
当技術分野で使用および／または容認されている用語の２つまたはそれより多い定義が存在する場合、本明細書で使用される用語の定義は、明白に逆であることが述べられていない限り、そのような全ての意味を含むと意図される。特定の例は、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内で見出される不連続な抗原結合部位を記載するための用語「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）の使用である。この特定の領域は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Kabat  et  al.,  U.S.  Dept.  of  Health  and  Human  Services,  "Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest"  (1983)およびChothia  et  al.,  J.  Mol.  Biol.  196:901-917  (1987)によって記載されている。ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａに従うＣＤＲの定義は、互いに比較した場合に、重複するアミノ酸残基またはアミノ酸残基のサブセットを含む。それにもかかわらず、抗体またはそのバリアントのＣＤＲを指すためのいずれの定義の適用も、本明細書に定義され、使用される用語の範囲内であると意図される。上記で引用した参考文献の各々によって定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基を、比較として以下の表に記載する。特定のＣＤＲを包含する正確な残基の数は、ＣＤＲの配列およびサイズに応じて変化する。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列を考慮してどの残基が特定のＣＤＲを構成するかを慣例的に決定することができる。
【００８０】
重鎖および軽鎖可変ドメインを、様々な対の組合せによって組み合わせていくつかの抗ＰＤ−Ｌ１抗体部分を生成することができる。抗ＰＤ−Ｌ１抗体の例示的な配列を、表１および３Ｃに提供する。表１に示す例示的なＣＤＲ、ＶＨ、およびＶＫ配列は、ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＧＥＮＥＴＩＣＳ  ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＯＮ  ＳＹＳＴＥＭ（登録商標）（ＩＭＧＴ）に従って範囲が定められる。例えば、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれている、Lefranc,  MP  et  al.,  Nucleic  Acids  Res.,  43:D413-422  (2015)を参照されたい。当業者は、抗体重鎖および軽鎖可変領域におけるＣＤＲ位置の予測のための多くのアルゴリズムが公知であること、ならびに本明細書に記載される抗体からのＣＤＲを含むがＩＭＧＴ以外の予測アルゴリズムに基づく抗体作用剤が本発明の範囲内であることを認識するであろう。表３Ｃは、様々な他のナンバリングスキームおよび／または定義下での例示的なＣＤＲ配列を記載する。
【００８１】
【表５】
2021530511.tif 000002
【００８２】
Ｋａｂａｔらはまた、任意の抗体に適用可能である可変ドメイン配列に関するナンバリングシステムも定義した。当業者は、配列そのもの以上のいかなる実験データにも頼ることなく、任意の可変ドメイン配列にこの「Ｋａｂａｔナンバリング」システムを明確に割付することができる。本明細書で使用される場合、「Ｋａｂａｔナンバリング」は、Kabat  et  al.,  U.S.  Dept.  of  Health  and  Human  Services,  "Sequence  of  Proteins  of  Immunological  Interest"  (1983)によって記載されるナンバリングシステムを指す。
【００８３】
上記の表に加えて、Ｋａｂａｔの番号システムは、ＣＤＲ領域を以下のように記載する：ＣＤＲ−Ｈ１はおよそアミノ酸３１（すなわち、第１のシステイン残基後のおよそ９残基）で始まり、およそ５〜７アミノ酸を含み、次のトリプトファン残基で終止する。ＣＤＲ−Ｈ２は、ＣＤＲ−Ｈ１の末端後の１５番目の残基で始まり、およそ１６〜１９アミノ酸を含み、次のアルギニンまたはリシン残基で終止する。ＣＤＲ−Ｈ３は、ＣＤＲ−Ｈ２の末端後のおよそ３３番目のアミノ酸残基で始まり、３〜２５アミノ酸を含み、Ｘが任意のアミノ酸である配列Ｗ−Ｇ−Ｘ−Ｇで終止する。ＣＤＲ−Ｌ１は、およそ残基２４（すなわち、システイン残基の後）で始まり、およそ１０〜１７残基を含み、次のトリプトファン残基で終止する。ＣＤＲ−Ｌ２は、ＣＤＲ−Ｌ１の末端後およそ１６番目の残基で始まり、およそ７残基を含む。ＣＤＲ−Ｌ３は、ＣＤＲ−Ｌ２の末端後およそ３３番目の残基で始まり（すなわち、システイン残基の後）、およそ７〜１１残基を含み、配列Ｆ、またはＸが任意のアミノ酸であるＷ−Ｇ−Ｘ−Ｇで終止する。
【００８４】
本明細書に開示される抗体は、鳥類および哺乳動物を含む任意の動物起源に由来し得る。好ましくは、抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ、またはニワトリ抗体である。別の実施形態では、可変領域は、軟骨魚綱（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）起源（例えば、サメ由来）であり得る。
【００８５】
本明細書で使用される場合、用語「重鎖定常領域」は、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を含む。重鎖定常領域を含むポリペプチドは、以下の少なくとも１つを含む：ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、上部、中央部、および／または下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはそのバリアントもしくは断片。例えば、本開示において使用するための抗原結合性ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、およびＣＨ２ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、およびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖、またはＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含み得る。別の実施形態では、本開示のポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。さらに、本開示において使用するための抗体は、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部（例えば、ＣＨ２ドメインの全てまたは一部）を欠如し得る。上記で記載したように、重鎖定常領域を、天然に存在する免疫グロブリン分子からのアミノ酸配列が変化するように、改変してもよいことは当業者によって理解されるであろう。
【００８６】
本明細書に開示の抗体の重鎖定常領域は、異なる免疫グロブリン分子に由来し得る。例えば、ポリペプチドの重鎖定常領域は、ＩｇＧｌ分子に由来するＣＨ１ドメインおよびＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含み得る。別の例では、重鎖定常領域は、ＩｇＧｌ分子に部分的に由来し、およびＩｇＧ３分子に部分的に由来するヒンジ領域を含み得る。別の例では、重鎖部分は、ＩｇＧｌ分子に部分的に由来し、およびＩｇＧ４分子に部分的に由来するキメラヒンジを含み得る。
【００８７】
本明細書で使用される場合、用語「軽鎖定常領域」は、抗体軽鎖に由来するアミノ酸配列を含む。好ましくは、軽鎖定常領域は、定常カッパドメインまたは定常ラムダドメインのうちの少なくとも１つを含む。
【００８８】
「軽鎖−重鎖対」は、軽鎖のＣＬドメインと重鎖のＣＨ１ドメインとの間のジスルフィド結合を通して二量体を形成することができる軽鎖および重鎖のコレクションを指す。
【００８９】
既に示したように、様々な免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造および三次元立体配置が周知である。本明細書で使用される場合、用語「ＶＨドメイン」は、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインを含み、用語「ＣＨ１ドメイン」は、免疫グロブリン重鎖の第１の（最もアミノ末端の）定常領域ドメインを含む。ＣＨ１ドメインはＶＨドメインに隣接し、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域に対してアミノ末端にある。
【００９０】
本明細書で使用される場合、用語「ＣＨ２ドメイン」は、例えば慣例的なナンバリングスキームを使用して抗体の残基約２４４から残基３６０に伸びる重鎖分子の一部を含む（残基２４４〜３６０、Ｋａｂａｔナンバリングシステム、および残基２３１〜３４０、ＥＵナンバリングシステム；Kabat  et  al.,  U.S.  Dept.  of  Health  and  Human  Services,  "Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest"  (1983)を参照されたい）。ＣＨ２ドメインは、それが別のドメインと厳密に対を形成しないという点において独自である。むしろ、２つのＮ結合分岐炭化水素鎖が、インタクトの天然のＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に介在する。ＣＨ３ドメインが、ＩｇＧ分子のＣＨ２ドメインからＣ末端まで伸び、およそ１０８残基を含むことも十分に報告されている。
【００９１】
本明細書で使用される場合、用語「ヒンジ領域」は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに結合する重鎖分子の部分を含む。このヒンジ領域はおよそ２５残基を含み、可撓性であり、このため、２つのＮ末端抗原結合領域が独立して移動することができる。ヒンジ領域は３つの別個のドメイン：上部、中央部、および下部ヒンジドメインに細分することができる（Roux  et  al.,  J.  Immunol  161:4083  (1998)）。
【００９２】
本明細書で使用される場合、用語「ジスルフィド結合」は、２つの硫黄原子間で形成される共有結合を含む。アミノ酸システインは、第２のチオール基とジスルフィド結合または架橋を形成することができるチオール基を含む。ほとんどの天然に存在するＩｇＧ分子では、ＣＨ１およびＣＫ領域は、ジスルフィド結合によって連結され、２つの重鎖は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムを使用して２３９および２４２（２２６または２２９位、ＥＵナンバリングシステム）に対応する位置で、２つのジスルフィド結合によって連結される。
【００９３】
本明細書で使用される場合、用語「キメラ抗体」は、免疫反応性領域または部位が、第１の種から得られるかまたはそれに由来し、定常領域（インタクト、部分的、または本開示に従って改変されていてもよい）が第２の種から得られる任意の抗体を意味すると考えられる。ある特定の実施形態では、標的結合領域または部位は、非ヒト起源（例えば、マウスまたは霊長類）に由来し、定常領域はヒトのものである。
【００９４】
本明細書で使用される場合、「パーセントヒト化」は、ヒト化ドメインと生殖系列ドメインとの間のフレームワークアミノ酸の差（すなわち、非ＣＤＲの差）の数を決定し、その数をアミノ酸の総数から減算し、次いでそれをアミノ酸の総数で除算して、１００を乗算することによって計算される。
【００９５】
「特異的に結合する」または「特異性を有する」とは、一般的に抗体がその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合すること、および結合が抗原結合ドメインとエピトープとの間に何らかの相補性を必要とすることを意味する。この定義に従って、抗体は、ランダムで無関係なエピトープに結合するより容易にその抗原結合ドメインを介してそのエピトープに結合する場合、エピトープに「特異的に結合する」と言われる。用語「特異性」は、本明細書においてある特定の抗体がある特定のエピトープに結合する相対的親和性を認定するために使用される。例えば、抗体「Ａ」は、抗体「Ｂ」より所与のエピトープに対して高い特異性を有するように思われ得るか、または抗体「Ａ」は、関連するエピトープ「Ｄ」に関してそれが有するより高い特異性でエピトープ「Ｃ」に結合すると言うことができる。
【００９６】
本明細書で使用される場合、用語「処置する」または「処置」は、その目的が、望ましくない生理的変化または障害、例えばがんの進行を防止するまたは遅らせる（弱める）ことである治療的処置および予防的または防止的手段の両方を指す。有益なまたは望ましい臨床結果は、検出可能であるか検出不能であるかによらず、症状の軽減、疾患の程度の減少、疾患状態の安定化（すなわち、悪化しない）、疾患進行の遅延または遅らせること、疾患状態の改善または緩和、および寛解（部分的または完全）を含むがこれらに限定されない。「処置」はまた、処置を受けていない場合に予想される生存と比較して生存の延長を意味し得る。処置を必要とする人は、状態または障害を既に有する人ならびに状態もしくは障害を有する傾向がある人、または状態もしくは障害を防止すべき人を含む。
【００９７】
「被験体」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」は、診断、予後判定、または治療が望まれる任意の被験体、特に哺乳動物被験体を意味する。哺乳動物被験体は、ヒト、家畜動物、農場動物、および動物園、競技用、またはペット動物、例えばイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛、ウシ等を含む。
【００９８】
本明細書で使用される場合、「処置を必要とする患者に」または「処置を必要とする被験体」などの句は、例えば検出のために、診断手順のために、および／または処置のために使用される本開示の抗体または組成物の投与から利益が得られる哺乳動物被験体などの被験体を含む。
【００９９】
抗ＰＤ−１抗体
本開示は、ヒトＰＤ−１タンパク質に対して高い親和性を有する抗ＰＤ−１抗体を提供する。試験される抗体は、強力な結合活性および阻害活性を示し、治療的使用および診断的使用にとって有用である。さらに、試験したヒト化抗体の１つ（ＴＹ１０１）は、ＦＤＡが承認した２つの抗ｈＰＤ−１抗体より有意に高い結合親和性を示した。
【０１００】
したがって、本開示の一実施形態は、ヒトプログラム細胞死１（ＰＤ−１）タンパク質に特異的に結合することができる抗ＰＤ−１抗体またはその断片を提供する。
【０１０１】
本開示の一実施形態に従って、表１のＣＤＲ群の１つとしてＣＤＲ領域を有する重鎖および軽鎖可変ドメインを含む抗体を提供する。
表1.  CDR領域の配列
【表１】
2021530511.tif 000003
【０１０２】
例として、一実施形態では、ヒトプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）に対して特異性を有する単離された抗体またはその断片であって、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３が、ＨＣＤＲ１：ＧＦＴＦＳＳＹＴ（配列番号１）、ＨＣＤＲ２：ＩＳＨＧＧＧＤＴ（配列番号２）、ＨＣＤＲ３：ＡＲＨＳＧＹＥＲＧＹＹＹＶＭＤＹ（配列番号３）、ＬＣＤＲ１：ＥＳＶＤＹＹＧＦＳＦ（配列番号４）、ＬＣＤＲ２：ＡＡＳ（配列番号５）、ＬＣＤＲ３：ＱＱＳＫＥＶＰＷ（配列番号６）である、単離された抗体またはその断片を提供する。
【０１０３】
例として、一実施形態では、ヒトプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）に対して特異性を有する単離された抗体またはその断片であって、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３が、ＨＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＳＹＴ（配列番号７）、ＨＣＤＲ２：ＩＮＰＴＴＧＹＴ（配列番号８）、ＨＣＤＲ３：ＡＲＤＤＡＹＹＳＧＹ（配列番号９）、ＬＣＤＲ１：ＥＮＩＹＳＮＬ（配列番号１０）、ＬＣＤＲ２：ＡＡＫ（配列番号１１）、ＬＣＤＲ３：ＱＨＦＷＧＴＰＷＴ（配列番号１２）である、単離された抗体またはその断片を提供する。
【０１０４】
例として、一実施形態では、ヒトプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）に対して特異性を有する単離された抗体またはその断片であって、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３が、ＨＣＤＲ１：ＧＦＡＦＳＳＹＤ（配列番号１３）、ＨＣＤＲ２：ＩＴＩＧＧＧＴＴ（配列番号１４）、ＨＣＤＲ３：ＡＲＨＲＹＤＹＦＡＭＤＮ（配列番号１５）、ＬＣＤＲ１：ＥＮＶＤＮＹＧＩＮＦ（配列番号１６）、ＬＣＤＲ２：ＶＳＳ（配列番号１７）、ＬＣＤＲ３：ＱＱＳＫＤＶＰＷ（配列番号１８）である、単離された抗体またはその断片を提供する。
【０１０５】
実験例において実証するように、これらのＣＤＲ領域を含有する抗体は、マウス、ヒト化、またはキメラであるか否かによらず、強力なＰＤ−１結合活性および阻害活性を有した。さらなるコンピューターモデリングにより、ＣＤＲ内のある特定の残基を改変させて抗体の特性を保持または改善することができることが示された。一部の実施形態では、本開示の抗ＰＤ−１抗体は、１つ、２つ、または３つのさらなる改変を有する、表１に記載されるＶＨおよびＶＬ  ＣＤＲを含む。そのような改変は、アミノ酸の付加、欠失、または置換（substation）であり得る。
【０１０６】
一部の実施形態では、改変は、ＣＤＲの各々からの１つ以下のホットスポット位置での置換である。一部の実施形態では、改変は、１つ、２つ、または３つのそのようなホットスポット位置での置換である。一実施形態では、改変は、ホットスポット位置の１つでの置換である。そのような置換は、一部の実施形態では保存的置換である。
【０１０７】
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基に交換されている置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当技術分野において定義されており、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。このように、免疫グロブリンポリペプチドにおける非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基に交換される。別の実施形態では、アミノ酸の列を、側鎖ファミリーメンバーの順序および／または組成が異なる構造的に類似の列に交換することができる。
【０１０８】
保存的アミノ酸置換の非制限的な例を以下の表に提供し、この中で、０またはそれより高い類似性スコアは、２つのアミノ酸間での保存的置換を示す。
アミノ酸類似性マトリックス
【表６】
2021530511.tif 000004
保存的アミノ酸置換
【表７】
2021530511.tif 000005
【０１０９】
ＶＨの非制限的な例を、配列番号２７、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３７、および配列番号３９に提供する。配列番号２７はマウスＶＨである。配列番号３１は、キメラ抗体のＶＨであり、配列番号３５、配列番号３７、および配列番号３９はヒト化されている。
【０１１０】
ＶＬの非制限的な例を、配列番号２９、配列番号３３、配列番号４１、配列番号４３、および配列番号４５に提供する。配列番号２９はマウスＶＬである。配列番号３３は、キメラ抗体のＶＬであり、配列番号４１、配列番号４３、および配列番号４５はヒト化されている。
【０１１１】
一部の実施形態では、本開示の抗ＰＤ−１抗体は、配列番号２７、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３７、もしくは配列番号３９のＶＨ、配列番号２９、配列番号３３、配列番号４１、配列番号４３、もしくは配列番号４５のＶＬ、またはそのそれぞれの生物学的等価物を含む。ＶＨまたはＶＬの生物学的等価物は、指定されたアミノ酸を含むが、全体で８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列である。例として配列番号２７の生物学的等価物は、配列番号２７と全体で８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するがＣＤＲを保持するＶＨであり得る。
【０１１２】
本明細書に開示される抗体を、それらが由来する天然に存在する結合ポリペプチドからアミノ酸配列が変化するように改変してもよいこともまた、当業者によって理解されるであろう。例えば、指定されたタンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は類似し得、例えば出発配列とある特定のパーセント同一性を有し、例えば出発配列と６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一であり得る。
【０１１３】
ある特定の実施形態では、抗体は、抗体に通常会合しないアミノ酸配列または１つもしくは複数の部分を含む。例示的な改変を以下により詳細に記載する。例えば、本開示の抗体は、可撓性リンカー配列を含んでもよく、または機能的部分（例えば、ＰＥＧ、薬物、毒素、または標識）を付加するように改変してもよい。
【０１１４】
本開示の抗体、そのバリアント、または誘導体は、すなわち共有結合によって、抗体とエピトープとの結合が防止されないように、抗体に対する任意のタイプの分子の共有結合によって改変された誘導体を含む。例えば、限定ではないが、抗体は、例えばグリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質との結合等によって改変することができる。多数の化学的改変のいずれも、特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成等を含むがこれらに限定されない、公知の技術によって実行され得る。加えて、抗体は、１つまたは複数の非古典的アミノ酸を含有してもよい。
【０１１５】
一部の実施形態では、抗体は、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物応答調節剤、医薬品、またはＰＥＧにコンジュゲートされ得る。
【０１１６】
抗体は、放射性標識、免疫調節剤、ホルモン、酵素、オリゴヌクレオチド、光活性治療剤または診断剤、薬物または毒素であり得る細胞傷害剤、超音波増強剤、非放射性標識、その組合せ、ならびに当技術分野で公知の他のそのような作用剤などの検出可能な標識を含み得る治療剤にコンジュゲートまたは融合され得る。
【０１１７】
抗体は、それを化学発光化合物にカップリングさせることによって検出可能に標識することができる。次いで、化学発光タグを付けた抗原結合性ポリペプチドの存在を、化学反応の過程で生じる発光の存在を検出することによって決定する。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、セロマティック（theromatic）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびシュウ酸エステルである。
【０１１８】
抗体はまた、１５２Ｅｕまたはランタニド系列の他の金属などの蛍光放出金属を使用して検出可能に標識することもできる。これらの金属を、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート基を使用して抗体に結合させることができる。様々な部分を抗体にコンジュゲートする技術は周知であり、例えば、Arnon  et  al.,  "Monoclonal  Antibodies  For  Immunotargeting  Of  Drugs  In  Cancer  Therapy",  in  Monoclonal  Antibodies  And  Cancer  Therapy,  Reisfeld  et  al.  (eds.),  pp.  243-56  (Alan  R.  Liss,  Inc.  (1985)；Hellstrom  et  al.,  "Antibodies  For  Drug  Delivery",  in  Controlled  Drug  Delivery  (2nd  Ed.),  Robinson  et  al.,  (eds.),  Marcel  Dekker,  Inc.,  pp.  623-53  (1987)；Thorpe,  "Antibody  Carriers  Of  Cytotoxic  Agents  In  Cancer  Therapy:  A  Review",  in  Monoclonal  Antibodies  ‘84:  Biological  And  Clinical  Applications,  Pinchera  et  al.  (eds.),  pp.  475-506  (1985)；"Analysis,  Results,  And  Future  Prospective  Of  The  Therapeutic  Use  Of  Radiolabeled  Antibody  In  Cancer  Therapy",  in  Monoclonal  Antibodies  For  Cancer  Detection  And  Therapy,  Baldwin  et  al.  (eds.),  Academic  Press  pp.  303-16  (1985)、およびThorpe  et  al.,  "The  Preparation  And  Cytotoxic  Properties  Of  Antibody-Toxin  Conjugates",  Immunol.  Rev.  (52:119-58  (1982))を参照されたい。
【０１１９】
二機能性分子
ＰＤ−１は、免疫チェックポイント分子であり、腫瘍抗原でもある。腫瘍抗原標的化分子として、ＰＤ−１に特異的な抗体または抗原結合性断片を、免疫細胞に特異的な第２の抗原結合性断片と組み合わせて、二特異性抗体を生成することができる。
【０１２０】
一部の実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、食細胞、ナチュラルキラー細胞、好酸球、好塩基球、および肥満細胞からなる群より選択される。標的化され得る免疫細胞上の分子は、例えば、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２８、およびＣＤ６４を含む。他の例には、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３（ＣＤ２２３としても公知）、ＣＤ２８、ＣＤ１２２、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７としても公知）、ＴＩＭ３、ＯＸ−４０、またはＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＩＣＯＳ／ＩＣＯＳＬ、ＧＩＴＲ／ＧＩＴＲＬ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ２７、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＨＥＶＭまたはＢＴＬＡ（ＣＤ２７２としても公知）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲｓ）、およびＣＤ４７が挙げられる。二特異性の特定の例には、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１、ＰＤ−１／ＬＡＧ３、ＰＤ−１／ＴＩＧＩＴ、およびＰＤ−１／ＣＤ４７が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２１】
免疫チェックポイント阻害剤として、ＰＤ−１に特異的な抗体または抗原結合性断片を、腫瘍抗原に特異的な第２の抗原結合性断片と組み合わせて、二特異性抗体を生成することができる。「腫瘍抗原」は、腫瘍細胞において産生された抗原性物質であり、すなわちこれは宿主において免疫応答を誘発する。腫瘍抗原は、腫瘍細胞を同定するのに有用であり、がん治療において使用するための潜在的な候補体である。体における通常のタンパク質は抗原性ではない。しかし、ある特定のタンパク質は、腫瘍形成の際に産生または過剰発現され、このため、体に対して「異物」となるように思われる。これは、免疫系から十分に隔離されている正常なタンパク質、極めて少量で通常産生されるタンパク質、発達のある特定の段階に限って通常産生されるタンパク質、または変異によりその構造が改変されているタンパク質を含み得る。
【０１２２】
多数の腫瘍抗原が当技術分野で公知であり、新規腫瘍抗原を、スクリーニングによって容易に同定することができる。腫瘍抗原の非制限的な例には、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ１３３、ＣＤ７３、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ−７２、ＣＩＸ、ＰＳＭＡ、葉酸結合タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、インテグリン、αＶβ３、α５β１、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ３、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ、およびテナシンが挙げられる。
【０１２３】
一部の態様では、一価の単位が、対応する非腫瘍細胞と比較して腫瘍細胞上で過剰発現されるタンパク質に対して特異性を有する。本明細書で使用される「対応する非腫瘍細胞」は、腫瘍細胞の起源と同じ細胞タイプの細胞である非腫瘍細胞を指す。そのようなタンパク質は、必ずしも腫瘍抗原と異なるわけではないことに注意されたい。非制限的な例には、ほとんどの結腸癌、直腸癌、乳癌、肺癌、膵臓癌、および消化管癌において過剰発現される癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；乳がん、卵巣がん、結腸がん、肺がん、前立腺がん、および子宮頸がんにおいてしばしば過剰発現されるヘレグリン受容体（ＨＥＲ−２、ｎｅｕまたはｃ−ｅｒｂＢ−２）；乳房、頭頸部、非小細胞肺、および前立腺の固形腫瘍を含む広範囲の固形腫瘍において高度に発現される上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）；アシアロ糖タンパク質受容体；トランスフェリン受容体；肝細胞において発現されるセルピン酵素複合体受容体；膵管腺癌細胞において過剰発現される線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）；抗血管新生遺伝子治療のための血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）；粘液非産生性卵巣癌の９０％において選択的に過剰発現される葉酸受容体；細胞表面グリコカリックス；炭水化物受容体；ならびに呼吸上皮細胞への遺伝子送達にとって有用であり、嚢胞性線維症などの肺疾患の処置にとって魅力的であるポリマーの免疫グロブリン受容体が挙げられる。この点における二特異性の非制限的な例には、ＰＤ−１／ＥＧＦＲ、ＰＤ−１／Ｈｅｒ２、ＰＤ−１／ＣＤ３３、ＰＤ−１／ＣＤ１３３、ＰＤ−１／ＣＥＡ、およびＰＤ−１／ＶＥＧＦが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２４】
異なるフォーマットの二特異性抗体もまた提供する。一部の実施形態では、抗ＰＤ−１断片の各々および第２の断片の各々は、Ｆａｂ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、またはシングルドメイン抗体から独立して選択される。一部の実施形態では、二特異性抗体は、Ｆｃ断片をさらに含む。
【０１２５】
ただ抗体または抗原結合性断片を含むだけではない二機能性分子も提供する。腫瘍抗原標的化分子として、例えば本明細書に記載されるものなどのＰＤ−１に特異的な抗体または抗原結合性断片を、必要に応じてペプチドリンカーを通して免疫サイトカインまたはリガンドと組み合わせることができる。連結される免疫サイトカインまたはリガンドには、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＬＩＧＨＴ、およびＧＩＴＲＬが挙げられるがこれらに限定されない。そのような二機能性分子は、免疫チェックポイント遮断効果を腫瘍部位局所免疫調節と組み合わせることができる。
【０１２６】
抗体およびその断片をコードするポリヌクレオチド
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載される抗体またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
【０１２７】
本出願は、本明細書に記載される抗体（例えば、抗ＰＤ−１抗体）の１つまたは複数の鎖をコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。一部の実施形態では、核酸分子は、抗体（例えば、抗ＰＤ−１抗体）の重鎖または軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸分子は、抗体（例えば、抗ＰＤ−１抗体）の重鎖をコードするポリヌクレオチドおよび軽鎖をコードするポリヌクレオチドの両方を含む。一部の実施形態では、第１の核酸分子は、重鎖をコードする第１のポリヌクレオチドを含み、第２の核酸分子は軽鎖をコードする第２のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、断片（例えば、抗ＰＤ−１断片）をコードする核酸分子を提供する。
【０１２８】
一部のそのような実施形態では、重鎖および軽鎖は、１つの核酸分子からまたは２つの個別の核酸分子から２つの個別のポリペプチドとして発現される。したがって、一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される抗体またはその断片の重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。例えば、重鎖は、配列番号１９、２３、２７、３１、３５、３７、および３９からなる群より選択されるアミノ酸配列またはそのバリアントを含み得る。例えば、ヌクレオチド配列は、２０、２４、２８、３２、３６、３８、および４０からなる群より選択されるヌクレオチド配列またはそのバリアントを含み得る、例えば、重鎖は、配列番号１９、２３、２７、３１、３５、３７、および３９からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。例えば、ヌクレオチド配列は、２０、２４、２８、３２、３６、３８、および４０からなる群より選択されるヌクレオチド配列、またはそのバリアントと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含み得る。一部の実施形態では、バリアントは、ＣＤＲの外部の部分が本明細書に記載される配列とは異なる。
【０１２９】
あるいは、一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される抗体またはその断片の軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。例えば、軽鎖は、配列番号２１、２５、２９、３３、４１、４３、および４５からなる群より選択されるアミノ酸配列またはそのバリアントを含み得る。例えば、ヌクレオチド配列は、２２、２６、３０、３４、４２、４４、および４６からなる群より選択されるヌクレオチド配列またはそのバリアントを含み得る。例えば、軽鎖は、配列番号２１、２５、２９、３３、４１、４３、および４５からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。例えば、ヌクレオチド配列は、２２、２６、３０、３４、４２、４４、および４６からなる群より選択されるヌクレオチド配列またはそのバリアントと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含み得る。一部の実施形態では、バリアントは、ＣＤＲの外部の部分が本明細書に記載される配列とは異なる。
【０１３０】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列を含む。例えば、一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１〜１８からなる群より選択されるアミノ酸配列またはそのバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。例えば、一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１〜１８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１３１】
一部の実施形態では、抗体（例えば、抗ＰＤ−１抗体）の重鎖または軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、翻訳されると重鎖または軽鎖のＮ末端に位置するリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含む。リーダー配列は、天然の重鎖もしくは軽鎖リーダー配列であってもよく、または別の異種リーダー配列であってもよい。
【０１３２】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含む核酸構築物を提供する。核酸構築物は、ポリヌクレオチドに作動可能に連結された１つまたは複数の制御配列をさらに含み得る。
【０１３３】
核酸分子は、当技術分野で慣例的な組換えＤＮＡ技術を使用して構築することができる。一部の実施形態では、核酸分子は、選択した宿主細胞における発現にとって適した発現ベクターである。
【０１３４】
したがって、本開示はまた、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含む核酸構築物も提供する。核酸構築物は、本明細書に記載される任意の方法を使用して調製され得る。
【０１３５】
一部の実施形態では、核酸構築物は、ポリヌクレオチドに作動可能に連結された１つまたは複数の制御配列をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の制御配列は、適した宿主における本明細書に記載される抗体またはその断片の産生を方向付ける。一部の実施形態では、１つまたは複数の制御配列は、プロモーター、エンハンサー、終止シグナル、シグナルペプチド、リーダー、転写ターミネーター、およびその任意の組合せから選択される。例えば、１つまたは複数の制御配列はプロモーターであり得る。
【０１３６】
一部の実施形態では、核酸構築物は、ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、遺伝子に対応し、プロモーターはその遺伝子の野生型プロモーターである。
【０１３７】
本開示は、本明細書に記載される核酸構築物を含むベクターをさらに提供する。
【０１３８】
本明細書に記載される抗体（例えば、抗ＰＤ−１抗体）のいずれか１つの重鎖および／または軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。本明細書に記載される抗体断片のいずれかをコードするポリヌクレオチドを含むベクターも提供する。そのようなベクターは、ＤＮＡベクター、ファージベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター等を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、ベクターは、ベクター、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、Ｓ因子、レトロエレメント、レトロウイルス、ウイルス、人工染色体（ＹＡＣ、ＢＡＣ、またはＭＡＣ）、ミニ染色体、および染色体からなる群より選択される。
【０１３９】
一部の実施形態では、ベクターは、重鎖をコードする第１のポリヌクレオチド配列および軽鎖をコードする第２のポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、重鎖および軽鎖は、２つの個別のポリペプチドとしてベクターから発現される。一部の実施形態では、重鎖および軽鎖は、例えば抗体がｓｃＦｖである場合、単一のポリペプチドの一部として発現される。
【０１４０】
一部の実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド（または活性誘導体もしくはその断片）をコードする核酸配列を含有する発現ベクターは、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結される。多くの発現ベクターが市販されており、他の適したベクターは、当業者によって容易に調製することができる。「作動可能に連結された」は、ヌクレオチド配列が、核酸配列の発現を可能にする様式で調節配列に連結されることを意味すると意図される。調節配列は、当技術分野で認識され、ポリペプチドまたはその活性誘導体もしくは断片を産生するように選択される。したがって、用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御エレメントを含み、これらは、Goeddel,  Gene  Expression  Technology:  Methods  in  Enzymology  185,  Academic  Press,  San  Diego,  CA  (1990)に記載されている。例えば、天然の調節配列または生物に対して天然である調節配列を使用することができる。
【０１４１】
一部の実施形態では、第１のベクターは重鎖をコードするポリヌクレオチドを含み、第２のベクターは軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、第１のベクターおよび第２のベクターは、類似の量（例えば、類似のモル量または類似の質量）で宿主細胞にトランスフェクトされる。一部の実施形態では、５：１〜１：５の間のモル比または質量比の第１のベクターおよび第２のベクターが宿主細胞にトランスフェクトされる。一部の実施形態では、重鎖をコードするベクターと軽鎖をコードするベクターの１：１〜１：５の間の質量比を使用する。一部の実施形態では、重鎖をコードするベクターと軽鎖をコードするベクターの１：２の質量比を使用する。
【０１４２】
一部の実施形態では、ベクターは、ＣＨＯもしくはＣＨＯ由来細胞、またはＮＳＯ細胞などの宿主細胞においてポリペプチドの発現に関して最適化されるように選択される。例示的なベクターは、例えば、Running  Deer  et  al.,  Biotechnol.  Prog.  20:880-889  (2004)に記載される。
【０１４３】
したがって、本開示はまた、本明細書に記載される核酸構築物または本明細書に記載されるベクターを含む宿主細胞も提供する。
【０１４４】
一部の実施形態では、核酸構築物またはベクターは宿主細胞ゲノムに組み込まれる。一部の実施形態では、核酸構築物またはベクターは、染色体外実体として存在する。宿主細胞は原核細胞であり得る。宿主細胞は真核宿主細胞であり得る。例えば、宿主細胞は哺乳動物細胞であり得る。例えば、宿主細胞はヒト細胞であり得る。
【０１４５】
一部の実施形態では、本明細書に記載される抗体（例えば、抗ＰＤ−１抗体）は、原核細胞、例えば細菌細胞において；または真核細胞、例えば真菌細胞（例えば、酵母）、植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞において発現され得る。そのような発現は、例えば当技術分野で公知の手順に従って行われ得る。ポリペプチドを発現させるために使用され得る例示的な真核細胞には、ＣＯＳ７細胞を含むＣＯＳ細胞；２９３−６Ｅ細胞を含む２９３細胞；ＣＨＯ−Ｓ、ＤＧ４４．Ｌｅｃ１３  ＣＨＯ細胞、およびＦＵＴ８  ＣＨＯ細胞を含むＣＨＯ細胞；ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（Ｃｒｕｃｅｌｌ）；ならびにＮＳＯ細胞が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、本明細書に記載される抗体（例えば、抗ＰＤ−１抗体）は、酵母において発現され得る。例えば、米国公開第ＵＳ２００６／０２７００４５Ａ１号を参照されたい。一部の実施形態では、特定の真核宿主細胞は、抗体の重鎖および／または軽鎖に対して所望の翻訳後改変を行うその能力に基づいて選択される。例えば、一部の実施形態では、ＣＨＯ細胞は、２９３細胞において産生される同じポリペプチドより高いレベルのシアリル化を有するポリペプチドを産生する。
【０１４６】
１つまたは複数の核酸を所望の宿主細胞に導入することは、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、電気穿孔、形質導入、感染等が挙げられるがこれらに限定されない任意の方法によって達成され得る。非制限的な例示的な方法は、例えばSambrook  et  al.,  Molecular  Cloning,  A  Laboratory  Manual,  3rd  ed.  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press  (2001)に記載されている。核酸は、任意の適した方法に従って所望の宿主細胞において一過性または安定にトランスフェクトされ得る。
【０１４７】
本発明はまた、本明細書に記載されるポリヌクレオチドまたはベクターのいずれかを含む宿主細胞も提供する。一部の実施形態では、本発明は、抗ＰＤ−１抗体を含む宿主細胞を提供する。異種ＤＮＡを過剰発現させることが可能な任意の宿主細胞を、目的の抗体、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする遺伝子を単離する目的のために使用することができる。哺乳動物宿主細胞の非制限的な例には、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、およびＣＨＯ細胞が挙げられるがこれらに限定されない。ＰＣＴ公開第ＷＯ８７／０４４６２号も参照されたい。適した非哺乳動物宿主細胞には、原核生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＢ．ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）および酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ；またはＫ．ｌａｃｔｉｓ）が挙げられる。一部の実施形態では、宿主細胞は原核細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は細菌細胞である。一部の実施形態では、細胞は真核細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は酵母細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は動物細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。
【０１４８】
一部の実施形態では、抗体は、無細胞システムで産生される。非制限的で例示的な無細胞システムは、例えばSitaraman  et  al.,  Methods  Mol.  Biol.  498:  229-44  (2009)；Spirin,  Trends  Biotechnol.  22:  538-45  (2004)；Endo  et  al.,  Biotechnol.  Adv.  21:  695-713  (2003)に記載される。
【０１４９】
抗体（例えば、抗ＰＤ−１抗体）は、任意の適した方法によって精製され得る。そのような方法には、アフィニティマトリックスまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーの使用が挙げられるがこれらに限定されない。適した親和性リガンドは、ＲＯＲ１  ＥＣＤおよび抗体定常領域に結合するリガンドを含む。例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、または抗体アフィニティカラムを使用して定常領域を結合させ、Ｆｃ断片を含む抗体を精製してもよい。疎水性相互作用クロマトグラフィー、例えばブチルまたはフェニルカラムもまた、抗体などの一部のポリペプチドを精製するために適し得る。イオン交換クロマトグラフィー（例えば、アニオン交換クロマトグラフィーおよび／またはカチオン交換クロマトグラフィー）もまた、抗体などの一部のポリペプチドを精製するために適し得る。混合型クロマトグラフィー（例えば、逆相／アニオン交換、逆相／カチオン交換、親水性相互作用／アニオン交換、親水性相互作用／カチオン交換等）もまた、抗体などの一部のポリペプチドを精製するために適し得る。ポリペプチドを精製する多くの方法が当技術分野で公知である。
【０１５０】
本開示は、本明細書に記載される任意の抗体またはその断片、ポリヌクレオチド、核酸構築物、ベクター、および／または宿主細胞を含む培養培地をさらに提供する。一部の実施形態では、本明細書に記載されるいずれかの方法を使用して調製された培養培地を提供する。
【０１５１】
一部の実施形態では、培地は、ヒポキサンチン、アミノプテリン、および／またはチミジン（例えば、ＨＡＴ培地）を含む。一部の実施形態では、培地は血清を含まない。一部の実施形態では、培地は血清を含む。一部の実施形態では、培地はＤ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地である。
【０１５２】
抗体を作製する方法は、当技術分野で周知であり、本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合性ポリペプチドの可変領域および定常領域の両方が、完全なヒトのものである。完全なヒト抗体は、当技術分野で記載され、本明細書に記載される技術を使用して作製することができる。例えば、特異的抗原に対する完全なヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してそのような抗体を産生するように改変されているが、その内因性の遺伝子座が無効化されているトランスジェニック動物に抗原を投与することによって調製することができる。そのような抗体を作製するために使用することができる例示的な技術は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第６，１５０，５８４号；第６，４５８，５９２号；第６，４２０，１４０号に記載されている。
【０１５３】
ある特定の実施形態では、調製された抗体は、処置される動物、例えばヒトにおいて有害な免疫応答を誘発しない。一実施形態では、本開示の抗原結合性ポリペプチド、そのバリアント、または誘導体は、当技術分野で認識された技術を使用してその免疫原性を低減させるように改変される。例えば、抗体をヒト化、霊長類化、脱免疫を行うことができ、またはキメラ抗体を作製することができる。これらのタイプの抗体は、親抗体の抗原結合特性を保持するかまたは実質的に保持するが、ヒトにおいて免疫原性がより低い非ヒト抗体、典型的にはマウスまたは霊長類抗体に由来する。これは、（ａ）非ヒト可変ドメイン全体をヒト定常領域にグラフトしてキメラ抗体を生成するステップ；（ｂ）非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）の１つまたは複数の少なくとも一部を、肝要なフレームワーク残基を保持したままもしくは保持せずに、ヒトフレームワークおよび定常領域にグラフトするステップ；または（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、それらを表面残基の交換によってヒト様区分によって「隠す」ステップを含む様々な方法によって達成され得る。そのような方法は、その全ての全体が参照により本明細書に組み込まれている、Morrison  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  57:6851-6855  (1984)；Morrison  et  al.,  Adv.  Immunol.  44:65-92  (1988)；Verhoeyen  et  al.,Science  239:1534-1536  (1988)；Padlan,  Molec.  Immun.  25:489-498  (1991)；Padlan,  Molec.  Immun.  31:169-217  (1994)、ならびに米国特許第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号、および第６，１９０，３７０号に開示されている。
【０１５４】
脱免疫もまた使用して抗体の免疫原性を減少させることができる。本明細書で使用される場合、用語「脱免疫」は、Ｔ細胞エピトープを改変するための抗体の変化を含む（例えば、国際出願公開第ＷＯ／９８５２９７６Ａ１号およびＷＯ／００３４３１７Ａ２号を参照されたい）。例えば、出発抗体の可変重鎖および可変軽鎖配列を分析し、配列内の相補性決定領域（ＣＤＲ）および他の重要な残基に関連してエピトープの位置を示す各Ｖ領域からのヒトＴ細胞エピトープ「マップ」を作製する。Ｔ細胞エピトープマップからの個々のＴ細胞エピトープを、最終抗体の活性を変化させるリスクが低い代替のアミノ酸置換を同定するために分析する。アミノ酸置換の組合せを含む広範囲の代替の可変重鎖および可変軽鎖配列を設計し、これらの配列をその後、広範囲の結合ポリペプチドに組み入れる。典型的に、１２〜２４個のバリアント抗体を生成し、結合および／または機能に関して試験する。次いで、改変された可変領域およびヒト定常領域を含む完全な重鎖および軽鎖遺伝子を発現ベクターにクローニングし、その後抗体全体を産生するためにプラスミドを細胞株に導入する。次いで、抗体を適切な生化学アッセイおよび生物アッセイにおいて比較し、最適なバリアントを同定する。
【０１５５】
本開示の抗原結合性ポリペプチドの結合特異性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、例えば免疫沈降、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定することができる。
【０１５６】
あるいは、一本鎖単位の産生について記載される技術（米国特許第４，６９４，７７８号；Bird,  Science  242:423-442  (1988)；Huston  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  55:5879-5883  (1988)；およびWard  et  al.,  Nature  334:544-554  (1989)）を、本開示の一本鎖単位を産生するように適合させることができる。一本鎖単位は、アミノ酸架橋を介してＦｖ領域の重鎖および軽鎖断片を連結し、一本鎖融合ペプチドをもたらすことによって形成される。Ｅ．ｃｏｌｉにおける機能的Ｆｖ断片のアセンブリのための技術も使用してもよい（Skerra  et  al.,  Science  242:  1038-1041  (1988)）。
【０１５７】
一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）および抗体を産生するために使用することができる技術の例は、米国特許第４，９４６，７７８号および第５，２５８，４９８号；Huston  et  al.,  Methods  in  Enzymology  203:46-88  (1991)；Shu  et  al.,  Proc.  Natl.  Sci.  USA  90:1995-1999  (1993)；ならびにSkerra  et  al.,  Science  240:1038-1040  (1988)に記載される例を含む。ヒトにおける抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの使用およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出アッセイを含む一部の使用では、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体を使用することが好ましい場合がある。キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体などの、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。キメラ抗体を産生する方法は、当技術分野で公知である。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Morrison,  Science  229:1202  (1985)；Oi  et  al.,  BioTechniques  4:214  (1986)；Gillies  et  al.,  J.  Immunol.  Methods  125:191-202  (1989)；米国特許第５，８０７，７１５号；第４，８１６，５６７号；および第４，８１６３９７号を参照されたい。
【０１５８】
ヒト化抗体は、非ヒト種からの１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を有する、所望の抗原に結合する非ヒト種抗体に由来する抗体分子である。しばしば、ヒトフレームワーク領域におけるフレームワーク残基を、抗原結合を変化させるために、好ましくは改善するためにＣＤＲドナー抗体からの対応する残基で置換する。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法によって、例えば特定の位置で異常なフレームワーク残基を同定するために抗原結合および配列比較にとって重要であるフレームワーク残基を同定するためにＣＤＲおよびフレームワーク残基の相互作用のモデリングによって同定される（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれている、Queen  et  al.、米国特許第５，５８５，０８９号；Riechmann  et  al.,  Nature  332:323  (1988)を参照されたい）。抗体は、例えばＣＤＲグラフティング（ＥＰ２３９，４００；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５３０，１０１号；および第５，５８５，０８９号）、ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（ＥＰ５９２，１０６；ＥＰ５１９，５９６；Padlan,  Molecular  Immunology  28(4/5):489-498  (1991)；Studnicka  et  al.,  Protein  Engineering  7(6):805-814  (1994)；Roguska.  et  al.,  Proc.  Natl.  Sci.  USA  91:969-973  (1994)）、ならびにチェーンシャッフリング（その全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，５６５，３３２号）を含む当技術分野で公知の多様な技術を使用してヒト化することができる。
【０１５９】
完全なヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置にとって特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用するファージディスプレイ法を含む当技術分野で公知の多様な方法によって作製することができる。その各々の全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第４，４４４，８８７号および第４，７１６，１１１号；ならびにＰＣＴ公開ＷＯ９８／４６６４５、ＷＯ９８／５０４３３、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５、およびＷＯ９１／１０７４１も参照されたい。
【０１６０】
ヒト抗体はまた、機能的な内因性の免疫グロブリンを発現することが不可能であるがヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを使用して産生することもできる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体を、ランダムにまたは相同組換えによってマウス胚性幹細胞に導入してもよい。あるいは、ヒト可変領域、定常領域、および多様性領域を、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えてマウス胚性幹細胞に導入してもよい。マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子を、相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入と個別にまたは同時に非機能的にしてもよい。特に、ＪＨ領域のホモ接合欠失は、内因性の抗体産生を防止する。改変された胚性幹細胞を増大させて、胚盤胞にマイクロインジェクションし、キメラマウスを産生する。次いでキメラマウスを交配させて、ヒト抗体を発現するホモ接合子孫を産生する。トランスジェニックマウスを、選択された抗原、例えば所望の標的ポリペプチドの全てまたは一部によって通常の様式で免疫する。抗原に対するモノクローナル抗体を、慣例的なハイブリドーマ技術を使用して、免疫したトランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスが有するヒト免疫グロブリントランスジーンは、Ｂ細胞分化の際に再構成し、その後クラススイッチおよび体細胞変異を受ける。このため、そのような技術を使用して、治療的に有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＥ抗体を産生することが可能である。ヒト抗体を産生するためのこの技術の概要に関しては、Lonberg  and  Huszar  Int.  Rev.  Immunol.  73:65-93  (1995)を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術ならびにそのような抗体を産生するプロトコールの詳細な考察に関しては、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；米国特許第５，４１３，９２３号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，５６９，８２５号；第５，６６１，０１６号；第５，５４５，８０６号；第５，８１４，３１８号；および第５，９３９，５９８号を参照されたい。加えて、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆ．）およびＧｅｎＰｈａｒｍ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、Ｃａｌｉｆ．）などの企業は、上記の技術と類似の技術を使用して選択された抗原に対するヒト抗体の提供に携わることができる。
【０１６１】
選択されたエピトープを認識する完全なヒト抗体はまた、「誘導選択」と呼ばれる技術を使用して生成することもできる。このアプローチでは、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス抗体を使用して、同じエピトープを認識する完全なヒト抗体の選択を誘導する（Jespers  et  al.,  Bio/Technology  72:899-903  (1988)、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，５６５，３３２号も参照されたい）。
【０１６２】
別の実施形態では、所望のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、慣例的な手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離およびシークエンシングすることができる。単離およびサブクローニングされたハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい起源としての役目を果たす。単離後、ＤＮＡを発現ベクターに入れて、次いでこれを、他に免疫グロブリンを産生しない原核または真核宿主細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または骨髄腫細胞にトランスフェクトする。より詳しくは、単離されたＤＮＡ（本明細書に記載されるように合成であり得る）を使用して、参照により本明細書に組み込まれている、１９９５年１月２５日に出願された、Newman  et  al.の米国特許第５，６５８，５７０号に記載されるように抗体を製造するために定常領域および可変領域配列をクローニングしてもよい。本質的に、これは選択された細胞からのＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡへの変換、およびＩｇ特異的プライマーを使用するＰＣＲによる増幅を伴う。この目的のために適したプライマーもまた、米国特許第５，６５８，５７０号に記載される。以下により詳細に考察するように、所望の抗体を発現する形質転換細胞は、免疫グロブリンの臨床的および商業的供給を提供するために比較的大量に成長させることができる。
【０１６３】
加えて、慣例的な組換えＤＮＡ技術を使用して、本開示の抗原結合性ポリペプチドのＣＤＲの１つまたは複数を、フレームワーク領域内に、例えばヒトフレームワーク領域内に挿入して非ヒト抗体をヒト化することができる。フレームワーク領域は、天然に存在するまたはコンセンサスフレームワーク領域、好ましくはヒトフレームワーク領域であり得る（例えば、ヒトフレームワーク領域の記載に関しては、Chothia  et  al.,  J.  Mol.  Biol.  278:457-479  (1998)を参照されたい）。好ましくは、フレームワーク領域およびＣＤＲの組合せによって生成されるポリヌクレオチドは、所望のポリペプチド、例えばＬＩＧＨＴの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは、１つまたは複数のアミノ酸置換をフレームワーク領域内に行うことができ、好ましくはアミノ酸置換は、抗体のその抗原に対する結合を改善する。加えて、そのような方法を使用して、鎖内ジスルフィド結合に関与する１つまたは複数の可変領域システイン残基のアミノ酸置換または欠失を作製し、１つまたは複数の鎖内ジスルフィド結合を欠如する抗体分子を生成することができる。ポリヌクレオチドに対する他の変化は、本開示によって包含され、当技術分野の技能の範囲内である。
【０１６４】
加えて、適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子からの遺伝子を、適切な生物活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子と共にスプライシングすることによって「キメラ抗体」を産生するために開発された技術（Morrison  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA:851-855  (1984)；Neuberger  et  al.,  Nature  372:604-608  (1984)；Takeda  et  al.,  Nature  314:452-454  (1985)）を使用することができる。本明細書で使用される場合、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子、例えばマウスモノクローナル抗体に由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する分子である。
【０１６５】
組換え抗体を生成するためのなお別の非常に効率的な手段は、Newman,  Biotechnology  10:  1455-1460  (1992)によって開示される。具体的には、この技術は、サル可変ドメインおよびヒト定常配列を含有する霊長類化抗体の生成をもたらす。この参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。その上、この技術はまた、その各々が参照により本明細書に組み込まれている、同一出願人による米国特許第５，６５８，５７０号、第５，６９３，７８０号および第５，７５６，０９６号に記載されている。
【０１６６】
あるいは、抗体産生細胞株を、当業者に周知の技術を使用して選択および培養することができる。そのような技術は、多様な実験マニュアルおよび主要な刊行物に記載されている。この点において、以下に記載される本開示において使用するために適した技術は、補足を含むその全体が参照により本明細書に組み込まれている、Current  Protocols  in  Immunology,  Coligan  et  al.,  Eds.,  Green  Publishing  Associates  and  Wiley-Interscience,  John  Wiley  and  Sons,  New  York  (1991)に記載されている。
【０１６７】
加えて、アミノ酸置換をもたらす部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発を含むがこれらに限定されない、当業者に公知の標準的な技術を使用して、本開示の抗体をコードするヌクレオチド配列に変異を導入することができる。好ましくは、バリアント（誘導体を含む）は、参照の重鎖可変領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、可変軽鎖領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、またはＣＤＲ−Ｌ３と比較して、５０個未満のアミノ酸置換、４０個未満のアミノ酸置換、３０個未満のアミノ酸置換、２５個未満のアミノ酸置換、２０個未満のアミノ酸置換、１５個未満のアミノ酸置換、１０個未満のアミノ酸置換、５個未満のアミノ酸置換、４個未満のアミノ酸置換、３個未満のアミノ酸置換、または２個未満のアミノ酸置換をコードする。あるいは、変異は、飽和変異誘発などのコード配列の全てまたは一部に沿って無作為に導入することができ、得られた変異体を生物活性に関してスクリーニングして、活性を保持する変異体を同定することができる。
【０１６８】
がんの処置
本明細書に記載されるように、本開示の抗体、バリアント、または誘導体は、ある特定の処置および診断方法において使用することができる。
【０１６９】
本開示は、本明細書に記載される障害または状態の１つまたは複数を処置するために、本開示の抗体を、動物、哺乳動物、およびヒトなどの患者に投与するステップを伴う抗体に基づく治療をさらに対象とする。本開示の治療化合物は、本開示の抗体（本明細書に記載されるそのバリアントおよび誘導体を含む）および本開示の抗体をコードする核酸またはポリヌクレオチド（本明細書に記載されるそのバリアントおよび誘導体を含む）を含むがこれらに限定されない。
【０１７０】
本開示の抗体はまた、がんを処置または阻害するためにも使用することができる。ＰＤ−１は、腫瘍細胞において過剰発現され得る。腫瘍由来ＰＤ−１は、免疫細胞上のＰＤ−Ｌ１に結合することができ、それによって抗腫瘍Ｔ細胞免疫を制限し得る。マウス腫瘍モデルにおけるＰＤ−１を標的とする低分子阻害剤またはモノクローナル抗体による結果は、標的化ＰＤ−１治療が腫瘍成長の有効な制御に対する重要な代替の現実的なアプローチであることを示している。実験例において実証されるように、抗ＰＤ−１抗体は、養子免疫応答機構を活性化し、これはがん患者における生存の改善をもたらし得る。
【０１７１】
したがって、一部の実施形態では、それを必要とする患者においてがんを処置する方法を提供する。一実施形態では、方法は、有効量の本開示の抗体を患者に投与するステップを伴う。一部の実施形態では、患者におけるがん細胞の少なくとも１つ（例えば、間質細胞）は、ＰＤ−１を発現する、過剰発現する、または発現するように誘導される。ＰＤ−１発現の誘導は、例として、腫瘍ワクチンの投与または放射線療法によって行うことができる。
【０１７２】
ＰＤ−１タンパク質を発現する腫瘍は、膀胱がん、非小細胞肺がん、腎臓がん、乳がん、尿道がん、結腸直腸がん、頭頸部がん、扁平上皮がん、メルケル細胞癌、消化器がん、胃がん、食道がん、卵巣がん、腎臓がん、および小細胞肺がんの腫瘍を含む。したがって、本開示の抗体は、任意の１つまたは複数のそのようながんを処置するために使用することができる。
【０１７３】
細胞治療、例えばキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞治療もまた、本開示に提供する。本開示の抗ＰＤ−１抗体と接触する（または代わりに本開示の抗ＰＤ−１抗体を発現するように操作された）適した細胞を使用することができる。そのような接触または操作によって、次いで細胞を、処置を必要とするがん患者に導入することができる。がん患者は、本明細書に開示されるタイプのいずれかのがんを有し得る。細胞（例えば、Ｔ細胞）は、例として腫瘍浸潤Ｔリンパ球、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、またはその組合せであり得るがこれらに限定されない。
【０１７４】
一部の実施形態では、細胞は、がん患者自身から単離された。一部の実施形態では、細胞は、ドナーまたは細胞バンクから提供された。細胞ががん患者から単離される場合、望ましくない免疫反応を最小限にすることができる。
【０１７５】
本開示の抗体またはバリアントまたはその誘導体によって処置、防止、診断、および／または予後判定され得る、細胞生存の増加に関連する追加の疾患または状態には、悪性疾患および関連する障害、例えば白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、および赤白血病を含む））、および慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、および慢性リンパ球性白血病）を含む）、真性赤血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、ならびに肉腫および癌腫、例えば線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓がん、乳がん、甲状腺がん、子宮内膜がん、黒色腫、前立腺がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝腫、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星細胞腫、髄膜芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫（menangioma）、黒色腫、神経芽腫、および網膜芽腫を含むがこれらに限定されない固形腫瘍の進行および／または転移が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１７６】
感染症および免疫障害の処置
実験例において実証するように、本開示の抗体は、感染症を処置するために有用であり得る免疫応答を活性化することができる。
【０１７７】
感染症は、病原体による生物の体組織の侵入、その増殖およびこれらの生物に対する宿主組織の反応、ならびにそれらが産生する毒素である。感染症は、ウイルス、ビロイド、プリオン、細菌、寄生性の回虫および蟯虫などの線虫、マダニ、ダニ、ノミ、およびシラミなどの節足動物、白癬などの真菌、ならびに条虫および他の蠕虫などの他の大寄生生物などの感染性因子によって引き起こされ得る。一態様では、感染性因子は、細菌、例えばグラム陰性菌である。一態様では、感染性因子は、ウイルス、例えばＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルス、および逆転写ウイルスである。ウイルスの非制限的な例には、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、エプスタイン−バーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、サイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス８型、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、パラインフルエンザウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＲＳウイルス、風疹ウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルスが挙げられる。
【０１７８】
一部の実施形態では、免疫障害を処置するための抗体またはその断片の方法または使用も提供する。免疫障害の非制限的な例には、感染症、感染症に関連するエンドトキシンショック、関節炎、関節リウマチ、喘息、ＣＯＰＤ、骨盤腹膜炎、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ペロニー病、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣病、腹膜炎、乾癬、血管炎、外科的癒着、卒中、Ｉ型糖尿病、ライム病、関節炎、髄膜脳炎、自己免疫性ぶどう膜炎、中枢および末梢神経系の免疫媒介性炎症障害、多発性硬化症、狼瘡およびギラン・バレー症候群、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維化肺胞炎、グレーヴス病、ＩｇＡ腎症、特発性血小板減少性紫斑病、メニエール病、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、サルコイドーシス、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、膵炎、外傷、移植片対宿主病、移植片の拒絶、虚血疾患、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症、血管内凝固、骨吸収、骨粗鬆症、変形性関節炎、歯周炎、低塩酸症、および母子間免疫寛容の欠如に関連する不妊症が挙げられる。
【０１７９】
本開示の抗体はまた、微生物および免疫細胞を標的化して微生物の除去を行うことによって、微生物によって引き起こされる感染疾患を処置するために、または微生物を殺滅するために使用することもできる。一態様では、微生物は、ＲＮＡおよびＤＮＡウイルスを含むウイルス、グラム陽性菌、グラム陰性菌、原虫、または真菌である。
【０１８０】
例えば、微生物は肝炎ウイルスである。肝炎ウイルスの非制限的な例には、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、およびＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）が挙げられ得る。
【０１８１】
いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、本明細書に記載される抗体またはその断片は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸の免疫チェックポイントを遮断し、このため、肝炎患者における免疫抑制からＴ細胞を救うことができる。
【０１８２】
一部の実施形態では、本明細書に記載される抗体またはその断片は、肝炎ウイルス感染を有する被験体においてＴ細胞増殖を誘導する。
【０１８３】
一部の実施形態では、本明細書に記載される抗体またはその断片は、肝炎ウイルス感染を有する被験体においてＴ細胞によるサイトカイン産生を誘導する。Ｔ細胞によって産生され得る非制限的なサイトカインは、ＩＬ−１、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−アルファ、ＣＤ７０、ＩＬ−２、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＩＬ−３１、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、およびＴＧＦ−ベータを含む。一部の実施形態では、サイトカインはＩＬ−２である。一部の実施形態では、サイトカインはＩＦＮ−ガンマである。
【０１８４】
一部の実施形態では、本明細書に記載される抗体またはその断片は、肝炎ウイルス感染を有する被験体におけるＴ細胞の細胞傷害を増加させる。
【０１８５】
一部の実施形態では、本明細書に記載される抗体またはその断片は、肝炎ウイルス感染を有する被験体における１つまたは複数の血清学的指標を低減させる。任意の適した血清学的指標を使用してもよい。例えば、ＨＡＶの場合、血清学的指標は、抗ＨＡＶ  ＩｇＭであり得る。ＨＢＶの場合、血清学的指標は、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、または抗ＨＢｃ  ＩｇＭであり得る。ＨＣＶの場合、血清学的指標は、抗ＨＣＶであり得る。ＨＤＶの場合、血清学的指標は、抗ＨＤＶ  ＩｇＭまたは抗ＨＤＶ  ＩｇＧであり得る。ＨＥＶの場合、血清学的指標は、抗ＨＥＶ  ＩｇＭであり得る。
【０１８６】
一部の実施形態では、本明細書に記載される抗体またはその断片は、肝炎ウイルス感染を有する被験体におけるウイルス量を低減させる。例えば、ウイルス量は、被験体におけるウイルスＤＮＡまたはＲＮＡの量として測定され得る。一部の実施形態では、本明細書に記載される抗体またはその断片は、ＨＢＶ感染を有する被験体におけるＨＢＶ  ＤＮＡを低減させる。一部の実施形態では、本明細書に記載される抗体またはその断片は、ＨＣＶ感染を有する被験体におけるＨＣＶ  ＲＮＡを低減させる。
【０１８７】
一部の実施形態では、本明細書に記載される抗体またはその断片は、肝炎ウイルス感染を有する被験体におけるアミノトランスフェラーゼ活性を低減させる。アミノトランスフェラーゼは、その増加が肝炎または肝炎ウイルス感染を示す限り、任意の適したアミノトランスフェラーゼであり得る。例えば、アミノトランスフェラーゼは、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）であり得る。例えば、アミノトランスフェラーゼは、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）であり得る。
【０１８８】
一部の実施形態では、増加は約１％〜約５０倍の増加であり得る。一部の実施形態では、増加は少なくとも約１％の増加であり得る。一部の実施形態では、増加は、最大で約５０倍の増加であり得る。一部の実施形態では、増加は、約１％〜約２％、約１％〜約５％、約１％〜約１０％、約１％〜約２０％、約１％〜約５０％、約１％〜約２倍、約１％〜約３倍、約１％〜約５００％、約１％〜約１０倍、約１％〜約５０倍、約２％〜約５％、約２％〜約１０％、約２％〜約２０％、約２％〜約５０％、約２％〜約２倍、約２％〜約３倍、約２％〜約５倍、約２％〜約１０倍、約２％〜約５０倍、約５％〜約１０％、約５％〜約２０％、約５％〜約５０％、約５％〜約２倍、約５％〜約３倍、約５％〜約５倍、約５％〜約１０倍、約５％〜約５０倍、約１０％〜約２０％、約１０％〜約５０％、約１０％〜約２倍、約１０％〜約３倍、約１０％〜約５倍、約１０％〜約１０倍、約１０％〜約５０倍、約２０％〜約５０％、約２０％〜約２倍、約２０％〜約３倍、約２０％〜約５倍、約２０％〜約１０倍、約２０％〜約５０倍、約５０％〜約２倍、約５０％〜約３倍、約５０％〜約５倍、約５０％〜約１０倍、約５０％〜約５０倍、約２倍〜約３倍、約２倍〜約５倍、約２倍〜約１０倍、約２倍〜約５０倍、約３倍〜約５倍、約３倍〜約１０倍、約３倍〜約５０倍、約５倍〜約１０倍、約５倍〜約５０倍、または約１０倍〜約５０倍の増加であり得る。一部の実施形態では、増加は、約１％、約２％、約５％、約１０％、約２０％、約５０％、約２倍、約３倍、約５倍、約１０倍、または約５０倍の増加であり得る。一部の実施形態では、増加は、約１％、約２％、約５％、約１０％、約２０％、約５０％、約２倍、約３倍、約５倍、約１０倍、または約５０倍より多い増加であり得る。
【０１８９】
一部の実施形態では、低減は約１％〜約９０％の低減であり得る。一部の実施形態では、低減は、少なくとも約１％の低減であり得る。一部の実施形態では、低減は、最大で約９０％の低減であり得る。一部の実施形態では、低減は、約１％〜約２％、約１％〜約５％、約１％〜約１０％、約１％〜約１５％、約１％〜約２０％、約１％〜約３０％、約１％〜約４０％、約１％〜約５０％、約１％〜約７０％、約１％〜約８０％、約１％〜約９０％、約２％〜約５％、約２％〜約１０％、約２％〜約１５％、約２％〜約２０％、約２％〜約３０％、約２％〜約４０％、約２％〜約５０％、約２％〜約７０％、約２％〜約８０％、約２％〜約９０％、約５％〜約１０％、約５％〜約１５％、約５％〜約２０％、約５％〜約３０％、約５％〜約４０％、約５％〜約５０％、約５％〜約７０％、約５％〜約８０％、約５％〜約９０％、約１０％〜約１５％、約１０％〜約２０％、約１０％〜約３０％、約１０％〜約４０％、約１０％〜約５０％、約１０％〜約７０％、約１０％〜約８０％、約１０％〜約９０％、約１５％〜約２０％、約１５％〜約３０％、約１５％〜約４０％、約１５％〜約５０％、約１５％〜約７０％、約１５％〜約８０％、約１５％〜約９０％、約２０％〜約３０％、約２０％〜約４０％、約２０％〜約５０％、約２０％〜約７０％、約２０％〜約８０％、約２０％〜約９０％、約３０％〜約４０％、約３０％〜約５０％、約３０％〜約７０％、約３０％〜約８０％、約３０％〜約９０％、約４０％〜約５０％、約４０％〜約７０％、約４０％〜約８０％、約４０％〜約９０％、約５０％〜約７０％、約５０％〜約８０％、約５０％〜約９０％、約７０％〜約８０％、約７０％〜約９０％、または約８０％〜約９０％の低減であり得る。一部の実施形態では、低減は、約１％、約２％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約７０％、約８０％、または約９０％の低減であり得る。一部の実施形態では、約１％、約２％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約７０％、約８０％、または約９０％より多い低減であり得る。
【０１９０】
任意の特定の患者に関する特定の投薬量および処置レジメンは、使用される特定の抗体、そのバリアント、または誘導体、患者の年齢、体重、全身健康、性別、および食事、ならびに投与時期、排泄速度、薬物の組み合わせ、および処置される特定の疾患の重症度を含む多様な要因に依存する。医療従事者によるそのような要因の判断は、当技術分野の通常の技能の範囲内である。量はまた、処置される個々の患者、投与経路、製剤のタイプ、使用される化合物の特徴、疾患の重症度、および所望の効果にも依存する。使用される量は、当技術分野で周知の薬理学的および薬物動態原理によって決定することができる。
【０１９１】
抗体またはバリアントの投与方法は、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路を含むがこれらに限定されない。抗原結合性ポリペプチドまたは組成物は、任意の簡便な経路によって、例えば注入またはボーラス注射によって、表皮または粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜等）を通しての吸収によって投与してもよく、他の生物活性剤と共に投与してもよい。このため、本開示の抗原結合性ポリペプチドを含有する医薬組成物は、経口、直腸、非経口、槽内（intracistemally）、膣内、腹腔内、局所（散剤、軟膏、滴剤、または経皮パッチによる）、頬側、または経口もしくは点鼻スプレーとして投与され得る。
【０１９２】
用語「非経口」は、本明細書で使用される場合、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下、および関節内注射および注入を含む投与様式を指す。
【０１９３】
投与は全身または局所であり得る。加えて、本開示の抗体を脳室内および髄腔内注射を含む任意の適した経路によって中枢神経系に導入することが望ましいであろう；脳室内注射は、例えばリザーバー、例えばＯｍｍａｙａリザーバーに取り付けた脳室内カテーテルによって容易となり得る。肺投与もまた、例えばインヘラーまたはネブライザーおよびエアロゾル化剤を含む製剤を使用することによって使用することができる。
【０１９４】
本開示の抗体ポリペプチドまたは組成物を、処置を必要とする領域に局所投与することは望ましいであろう；これは、例えば、限定ではないが手術中の局所注入、局所適用、例えば手術後の創傷包帯と共に、注射によって、カテーテルによって、坐剤によって、またはインプラントによって達成され得るが、前記インプラントは、膜、例えばシラスティック（sialastic）膜または線維を含む、多孔性、非多孔性、またはゼラチン様材料である。好ましくは、抗体を含む本開示のタンパク質を投与する場合、タンパク質を吸収しない材料を使用するように配慮しなければならない。
【０１９５】
別の実施形態では、抗体または組成物は、小胞、特にリポソーム中で送達することができる（Langer,  1990,  Science  249:1527-1533；Treat  et  al.,  in  Liposomes  in  the  Therapy  of  Infectious  Disease  and  Cancer,  Lopez-Berestein  and  Fidler  (eds.),  Liss,  New  York,  pp.  353-365  (1989)；Lopez-Berestein,  ibid.,  pp.  317-327を参照されたい；一般的には同書を参照されたい）。
【０１９６】
なお別の実施形態では、抗原結合性ポリペプチドまたは組成物は、制御放出システムで送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用してもよい（Sefton,  1987,  CRC  Crit.  Ref.  Biomed.  Eng.  14:201；Buchwald  et  al.,  1980,  Surgery  88:507；Saudek  et  al.,  1989,  N.  Engl.  J.  Med.  321:574を参照されたい）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる（Medical  Applications  of  Controlled  Release,  Langer  and  Wise  (eds.),  CRC  Pres.,  Boca  Raton,  Fla.  (1974)；Controlled  Drug  Bioavailability,  Drug  Product  Design  and  Performance,  Smolen  and  Ball  (eds.),  Wiley,  New  York  (1984)；Ranger  and  Peppas,  J.,  1983,  Macromol.  Sci.  Rev.  Macromol.  Chem.  23:61を参照されたい；Levy  et  al.,  1985,  Science  228:190；During  et  al.,  1989,  Ann.  Neurol.  25:351；Howard  et  al.,  1989,  J.  Neurosurg.  71:105も参照されたい）。なお別の実施形態では、制御放出システムは、治療標的、すなわち脳の近位に配置することができ、このため必要量は全身用量の一部のみである（例えば、Goodson,  in  Medical  Applications  of  Controlled  Release,  supra,  vol.  2,  pp.  115-138  (1984)を参照されたい）。他の制御放出システムがLanger（1990,  Science  249:1527-1533）による総説において考察されている。
【０１９７】
本開示の組成物がタンパク質をコードする核酸またはポリヌクレオチドを含む特定の実施形態では、それを適切な核酸発現ベクターの一部として構築すること、およびそれを例えばレトロウイルスベクターを使用することによって（米国特許第４，９８０，２８６号を参照されたい）、または直接注射によって、または微粒子衝突の使用によって（例えば、遺伝子銃、微粒子銃（Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）、Ｄｕｐｏｎｔ）、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクト剤によるコーティングによって、または核に入ることがわかっているホメオボックス様ペプチドにそれを連結して投与することによって（例えば、Joliot  et  al.,  1991,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  88:1864-1868を参照されたい）細胞内となるように投与することによって、核酸をｉｎ  ｖｉｖｏで投与してそのコードされるタンパク質の発現を促進することができる。あるいは、核酸を、相同組換えによって、細胞内に導入して発現のために宿主細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる。
【０１９８】
炎症、免疫または悪性疾患、障害、または状態の処置、阻害、および防止において有効である本開示の抗体の量は、標準的な臨床技術によって決定することができる。加えて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを、最適な投薬量範囲を同定するために役立つように必要に応じて使用してもよい。製剤において使用される正確な用量はまた、投与経路、および疾患、障害、または状態の重篤さにも依存し、医療提供者の判断および各患者の状況に従って決定すべきである。有効用量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験システムから導出される用量反応曲線から外挿することができる。
【０１９９】
一部の態様では、それを必要とする患者におけるがん、感染症、または免疫障害を処置する方法であって、患者に、１つまたは複数の用量の、ヒトプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）に対して特異性を有する単離された抗体またはその断片を投与するステップを含み、各用量が約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである、方法を提供する。一部の実施形態では、投薬量は約１ｍｇ／ｋｇである。一部の実施形態では、投薬量は約１０ｍｇ／ｋｇである。一部の実施形態では、投薬量は約３ｍｇ／ｋｇである。一部の実施形態では、ヒトプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）に対して特異性を有する単離された抗体またはその断片は、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３は、（ａ）ＨＣＤＲ１：ＧＦＴＦＳＳＹＴ（配列番号１）、ＨＣＤＲ２：ＩＳＨＧＧＧＤＴ（配列番号２）、ＨＣＤＲ３：ＡＲＨＳＧＹＥＲＧＹＹＹＶＭＤＹ（配列番号３）、ＬＣＤＲ１：ＥＳＶＤＹＹＧＦＳＦ（配列番号４）、ＬＣＤＲ２：ＡＡＳ（配列番号５）、ＬＣＤＲ３：ＱＱＳＫＥＶＰＷ（配列番号６）；（ｂ）ＨＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＳＹＴ（配列番号７）、ＨＣＤＲ２：ＩＮＰＴＴＧＹＴ（配列番号８）、ＨＣＤＲ３：ＡＲＤＤＡＹＹＳＧＹ（配列番号９）、ＬＣＤＲ１：ＥＮＩＹＳＮＬ（配列番号１０）、ＬＣＤＲ２：ＡＡＫ（配列番号１１）、ＬＣＤＲ３：ＱＨＦＷＧＴＰＷＴ（配列番号１２）；（ｃ）ＨＣＤＲ１：ＧＦＡＦＳＳＹＤ（配列番号１３）、ＨＣＤＲ２：ＩＴＩＧＧＧＴＴ（配列番号１４）、ＨＣＤＲ３：ＡＲＨＲＹＤＹＦＡＭＤＮ（配列番号１５）、ＬＣＤＲ１：ＥＮＶＤＮＹＧＩＮＦ（配列番号１６）、ＬＣＤＲ２：ＶＳＳ（配列番号１７）、ＬＣＤＲ３：ＱＱＳＫＤＶＰＷ（配列番号１８）；および（ｄ）（ａ）〜（ｃ）に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３であって、ただしそのうちの少なくとも１つが、１つ、２つ、または３つのアミノ酸付加、欠失、保存的アミノ酸置換、またはその組合せを含む、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３からなる群より選択される。
【０２００】
一般的な提案として、患者に投与される本開示の抗原結合性ポリペプチドの投薬量は、典型的には、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ患者体重、０．１ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇ患者体重の間、または１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ患者体重である。
【０２０１】
例えば、一部の実施形態では、投薬量は、０．１ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇ患者体重の間、または１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ患者体重である。一部の実施形態では、投薬量は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約４ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約６ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ〜約７ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ〜約８ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ〜約９ｍｇ／ｋｇ、または約９ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである。一部の実施形態では、投薬量は、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇである。一部の実施形態では、投薬量は約１ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇである。一部の実施形態では、投薬量は約３ｍｇ／ｋｇである。
【０２０２】
例えば、一部の実施形態では、投薬量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１，０００ｍｇ／ｋｇである。一部の実施形態では、投薬量は、少なくとも約０．００１ｍｇ／ｋｇである。一部の実施形態では、投薬量は、最大で約１，０００ｍｇ／ｋｇである。一部の実施形態では、投薬量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１，０００ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１，０００ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１，０００ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１，０００ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１，０００ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１，０００ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１，０００ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１，０００ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ〜約１，０００ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ〜約１，０００ｍｇ／ｋｇ、または約５００ｍｇ／ｋｇ〜約１，０００ｍｇ／ｋｇである。一部の実施形態では、投薬量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ、約５００ｍｇ／ｋｇ、または約１，０００ｍｇ／ｋｇである。一部の実施形態では、投薬量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ、約５００ｍｇ／ｋｇ、または約１，０００ｍｇ／ｋｇより多い。
【０２０３】
例えば、一部の実施形態では、投薬量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇである。一部の実施形態では、投薬量は、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇである。一部の実施形態では、投薬量は、最大で約１００ｍｇ／ｋｇである。一部の実施形態では、投薬量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．０２ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、または約５０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇである。一部の実施形態では、投薬量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、または約１００ｍｇ／ｋｇである。一部の実施形態では、投薬量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、または約１００ｍｇ／ｋｇより多い。
【０２０４】
本開示の抗原結合性ポリペプチドは、本開示の抗原結合性ポリペプチドの重量で０．５ｍｇ〜５０００ｍｇ、１ｍｇ〜１０００ｍｇ、または５ｍｇ〜１００ｇの単位剤形で製剤化され得る。
【０２０５】
一部の実施形態では、本開示の抗原結合性ポリペプチドは、約０．１ｍｇ〜約１０，０００ｍｇの単位剤形で製剤化され得る。一部の実施形態では、本開示の抗原結合性ポリペプチドは、少なくとも約０．１ｍｇの単位剤形で製剤化され得る。一部の実施形態では、本開示の抗原結合性ポリペプチドは、最大で約１０，０００ｍｇの単位剤形で製剤化され得る。一部の実施形態では、本開示の抗原結合性ポリペプチドは、約０．１ｍｇ〜約０．５ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約１ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約５ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約５０ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約１００ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約５００ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約１，０００ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約５，０００ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約１０，０００ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約１ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約５ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約５０ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約１００ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約５００ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約１，０００ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約５，０００ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約１０，０００ｍｇ、約１ｍｇ〜約５ｍｇ、約１ｍｇ〜約１０ｍｇ、約１ｍｇ〜約５０ｍｇ、約１ｍｇ〜約１００ｍｇ、約１ｍｇ〜約５００ｍｇ、約１ｍｇ〜約１，０００ｍｇ、約１ｍｇ〜約５，０００ｍｇ、約１ｍｇ〜約１０，０００ｍｇ、約５ｍｇ〜約１０ｍｇ、約５ｍｇ〜約５０ｍｇ、約５ｍｇ〜約１００ｍｇ、約５ｍｇ〜約５００ｍｇ、約５ｍｇ〜約１，０００ｍｇ、約５ｍｇ〜約５，０００ｍｇ、約５ｍｇ〜約１０，０００ｍｇ、約１０ｍｇ〜約５０ｍｇ、約１０ｍｇ〜約１００ｍｇ、約１０ｍｇ〜約５００ｍｇ、約１０ｍｇ〜約１，０００ｍｇ、約１０ｍｇ〜約５，０００ｍｇ、約１０ｍｇ〜約１０，０００ｍｇ、約５０ｍｇ〜約１００ｍｇ、約５０ｍｇ〜約５００ｍｇ、約５０ｍｇ〜約１，０００ｍｇ、約５０ｍｇ〜約５，０００ｍｇ、約５０ｍｇ〜約１０，０００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約５００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約１，０００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約５，０００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約１０，０００ｍｇ、約５００ｍｇ〜約１，０００ｍｇ、約５００ｍｇ〜約５，０００ｍｇ、約５００ｍｇ〜約１０，０００ｍｇ、約１，０００ｍｇ〜約５，０００ｍｇ、約１，０００ｍｇ〜約１０，０００ｍｇ、または約５，０００ｍｇ〜約１０，０００ｍｇの単位剤形で製剤化され得る。一部の実施形態では、本開示の抗原結合性ポリペプチドは、約０．１ｍｇ、約０．５ｍｇ、約１ｍｇ、約５ｍｇ、約１０ｍｇ、約５０ｍｇ、約１００ｍｇ、約５００ｍｇ、約１，０００ｍｇ、約５，０００ｍｇ、または約１０，０００ｍｇの単位剤形で製剤化され得る。一部の実施形態では、本開示の抗原結合性ポリペプチドは、約０．１ｍｇ、約０．５ｍｇ、約１ｍｇ、約５ｍｇ、約１０ｍｇ、約５０ｍｇ、約１００ｍｇ、約５００ｍｇ、約１，０００ｍｇ、約５，０００ｍｇ、または約１０，０００ｍｇより多い単位剤形で製剤化され得る。
【０２０６】
一部の実施形態では、本開示の抗原結合性ポリペプチドは、約０．５ｍｇ〜約５，０００ｍｇの単位剤形で製剤化され得る。一部の実施形態では、本開示の抗原結合性ポリペプチドは、少なくとも約０．５ｍｇの単位剤形で製剤化され得る。一部の実施形態では、本開示の抗原結合性ポリペプチドは、最大で約５，０００ｍｇの単位剤形で製剤化され得る。一部の実施形態では、本開示の抗原結合性ポリペプチドは、約０．５ｍｇ〜約１ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約２ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約５ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約２０ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約５０ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約１００ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約２００ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約１，０００ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約２，０００ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約５，０００ｍｇ、約１ｍｇ〜約２ｍｇ、約１ｍｇ〜約５ｍｇ、約１ｍｇ〜約１０ｍｇ、約１ｍｇ〜約２０ｍｇ、約１ｍｇ〜約５０ｍｇ、約１ｍｇ〜約１００ｍｇ、約１ｍｇ〜約２００ｍｇ、約１ｍｇ〜約１，０００ｍｇ、約１ｍｇ〜約２，０００ｍｇ、約１ｍｇ〜約５，０００ｍｇ、約２ｍｇ〜約５ｍｇ、約２ｍｇ〜約１０ｍｇ、約２ｍｇ〜約２０ｍｇ、約２ｍｇ〜約５０ｍｇ、約２ｍｇ〜約１００ｍｇ、約２ｍｇ〜約２００ｍｇ、約２ｍｇ〜約１，０００ｍｇ、約２ｍｇ〜約２，０００ｍｇ、約２ｍｇ〜約５，０００ｍｇ、約５ｍｇ〜約１０ｍｇ、約５ｍｇ〜約２０ｍｇ、約５ｍｇ〜約５０ｍｇ、約５ｍｇ〜約１００ｍｇ、約５ｍｇ〜約２００ｍｇ、約５ｍｇ〜約１，０００ｍｇ、約５ｍｇ〜約２，０００ｍｇ、約５ｍｇ〜約５，０００ｍｇ、約１０ｍｇ〜約２０ｍｇ、約１０ｍｇ〜約５０ｍｇ、約１０ｍｇ〜約１００ｍｇ、約１０ｍｇ〜約２００ｍｇ、約１０ｍｇ〜約１，０００ｍｇ、約１０ｍｇ〜約２，０００ｍｇ、約１０ｍｇ〜約５，０００ｍｇ、約２０ｍｇ〜約５０ｍｇ、約２０ｍｇ〜約１００ｍｇ、約２０ｍｇ〜約２００ｍｇ、約２０ｍｇ〜約１，０００ｍｇ、約２０ｍｇ〜約２，０００ｍｇ、約２０ｍｇ〜約５，０００ｍｇ、約５０ｍｇ〜約１００ｍｇ、約５０ｍｇ〜約２００ｍｇ、約５０ｍｇ〜約１，０００ｍｇ、約５０ｍｇ〜約２，０００ｍｇ、約５０ｍｇ〜約５，０００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約２００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約１，０００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約２，０００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約５，０００ｍｇ、約２００ｍｇ〜約１，０００ｍｇ、約２００ｍｇ〜約２，０００ｍｇ、約２００ｍｇ〜約５，０００ｍｇ、約１，０００ｍｇ〜約２，０００ｍｇ、約１，０００ｍｇ〜約５，０００ｍｇ、または約２，０００ｍｇ〜約５，０００ｍｇの単位剤形で製剤化され得る。一部の実施形態では、本開示の抗原結合性ポリペプチドは、約０．５ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約５ｍｇ、約１０ｍｇ、約２０ｍｇ、約５０ｍｇ、約１００ｍｇ、約２００ｍｇ、約１，０００ｍｇ、約２，０００ｍｇ、または約５，０００ｍｇの単位剤形で製剤化され得る。一部の実施形態では、本開示の抗原結合性ポリペプチドは、約０．５ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約５ｍｇ、約１０ｍｇ、約２０ｍｇ、約５０ｍｇ、約１００ｍｇ、約２００ｍｇ、約１，０００ｍｇ、約２，０００ｍｇ、または約５，０００ｍｇより多い単位剤形で製剤化され得る。
【０２０７】
単位剤形は、１日１、２、３、４、５回、またはそれより多く、毎日、２日毎、３日毎、週に２回、４日毎、５日毎、６日毎、毎週、２週間毎、３週間毎、毎月、またはより高頻度でもしくはより低頻度で、またはその間の任意の間隔で投与され得る。
【０２０８】
一般的に、ヒト抗体は、異物ポリペプチドに対する免疫応答により他の種からの抗体より長いヒト体内での半減期を有する。このため、ヒト抗体のより低い投薬量およびより低頻度の投与がしばしば可能である。さらに、本開示の抗体の投薬量および投与頻度は、例えば脂質付加などの改変によって抗体の取り込みおよび組織浸透（例えば、脳への）を増強することによって低減させることができる。
【０２０９】
本開示の抗体、そのバリアント、または誘導体の投与を含む、感染または悪性疾患、状態、または障害を処置する方法は、典型的にヒトでの使用前に、所望の治療活性または予防活性に関してｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験後、許容される動物モデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで試験される。トランスジェニック動物を含む適した動物モデルが、当業者に周知である。例えば、本明細書に記載される抗原結合性ポリペプチドの治療有用性を実証するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、細胞株または患者組織試料に対する抗原結合性ポリペプチドの効果を含む。細胞株および／または組織試料に対する抗原結合性ポリペプチドの効果は、当業者に公知の技術、例えば本明細書において他所で開示されるアッセイを利用して決定することができる。本開示に従って、特異的抗原結合性ポリペプチドの投与が適応されるか否かを決定するために使用することができるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、患者の組織試料を培養において成長させ、化合物に曝露するかまたは他の方法で化合物を投与し、そのような化合物が組織試料に及ぼす効果を観察するｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養アッセイを含む。
【０２１０】
様々な送達システムが公知であり、本開示の抗体または本開示の抗体をコードするポリヌクレオチドを投与するために使用することができ、それらは例えばリポソーム、微粒子、マイクロカプセルへのカプセル化、化合物を発現することが可能な組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシス（例えば、Wu  and  Wu,  1987,  J.  Biol.  Chem.  262:4429-4432を参照されたい）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築等である。
【０２１１】
診断方法
ＰＤ−１の過剰発現は、ある特定の腫瘍試料において観察され、ＰＤ−１過剰発現細胞を有する患者は、本開示の抗ＰＤ−１抗体による処置に応答する可能性が高い。したがって、本開示の抗体はまた、診断目的および予後判定目的のために使用することもできる。
【０２１２】
好ましくは細胞を含む試料を、がん患者であり得る患者、または診断を望んでいる患者から得ることができる。細胞は、腫瘍組織または腫瘍ブロックの細胞、血液試料、尿試料、および患者からの任意の試料であり得る。必要に応じて試料を前処置した後、試料を、抗体が、試料中におそらく存在するＰＤ−１タンパク質と相互作用することができる条件下で、本開示の抗体と共にインキュベートすることができる。抗ＰＤ−１抗体を利用して、ＥＬＩＳＡなどの方法を使用して、試料中のＰＤ−１タンパク質の存在を検出することができる。
【０２１３】
試料中のＰＤ−１タンパク質の存在（必要に応じて量または濃度で）を、患者が抗体による処置にとって適していることの指標として、または患者ががんの処置に応答している（または応答していない）ことの指標として、がんの診断のために使用することができる。予後判定方法の場合、ある特定の段階で、処置の進行を示すためにがんの処置の開始時に検出を１回、２回またはそれより多く行うことができる。
【０２１４】
組成物
本開示はまた、医薬組成物も提供する。そのような組成物は、有効量の抗体および許容される担体を含む。一部の実施形態では、組成物は、第２の抗がん剤（例えば、免疫チェックポイント阻害剤）をさらに含む。
【０２１５】
特定の実施形態では、用語「薬学的に許容される」は、動物、より特にヒトにおいて使用するために連邦政府もしくは州政府の規制当局によって承認された、または米国薬局方もしくは他の一般的に認識された薬局方に記載されていることを意味する。さらに、「薬学的に許容される担体」は、一般的に非毒性の固体、半固体、または液体増量剤、希釈剤、カプセル化材料または任意のタイプの製剤補助剤である。
【０２１６】
用語「担体」は、それと共に治療剤が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような薬学的担体は、滅菌液体、例えば水、および石油、動物、植物または合成起源の油、例えば落花生油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油等を含む油であり得る。水は、医薬組成物を静脈内に投与する場合に好ましい担体である。食塩水溶液およびデキストロース水溶液およびグリセロール溶液もまた、液体担体として、特に注射用溶液として使用することができる。適した薬学的賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等を含む。望ましければ、組成物はまた、微量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝化剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩、もしくはリン酸塩を含有し得る。ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張度を調整するための作用物質も企図される。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤等の形態をとることができる。組成物は、従来の結合剤および担体（トリグリセリドなど）と共に坐剤として製剤化することができる。経口製剤は、薬学等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等などの標準的な担体を含み得る。適した薬学的担体の例は、参照により本明細書に組み込まれている、Remington's  Pharmaceutical  Sciences  by  E.  W.  Martinに記載されている。そのような組成物は、患者に適切な投与のための剤形を提供するために、治療有効量の、好ましくは精製された形態での抗原結合性ポリペプチドを、適した量の担体と共に含有する。製剤は、投与様式に適合すべきである。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または多用量バイアルに封入することができる。
【０２１７】
一実施形態では、組成物は、ヒトに静脈内投与するように適合される医薬組成物として慣例的な手順に従って製剤化される。典型的には、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要であれば、組成物はまた、可溶化剤、および注射部位での疼痛を緩和するためのリグノカインなどの局所麻酔薬も含み得る。一般的に、成分は、個別にまたは共に混合して単位剤形で、例えば気密容器中、例えば活性剤の量を示すアンプルまたは小袋中の乾燥凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として供給される。組成物を注入によって投与する場合、これは滅菌薬学等級の水または食塩水を含有する注入ボトルによって配布することができる。組成物を注射によって投与する場合、成分が投与前に混合され得るように、滅菌注射用水または食塩水のアンプルを提供することができる。
【０２１８】
本開示の化合物は、中性または塩の形態で製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等に由来する塩などのアニオンと共に形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等に由来する塩などのカチオンと共に形成される塩を含む。
【実施例】
【０２１９】
（実施例１：ヒトＰＤ−１に対するヒトモノクローナル抗体の生成）
全長のヒトＰＤ−１  ｃＤＮＡのクローニング
ヒトＴリンパ球を、ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ）からＭＡＣＳビーズ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）によって単離した。総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）によってヒトＴ細胞から抽出し、ｃＤＮＡを、逆転写ＰＣＲ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって得た。ｈＰＤ−１をコードする全長のｃＤＮＡを、ヒトＴ細胞ｍＲＮＡからのセンスプライマー（５’−ＣＴＧＴＣＴＡＧＡＡＴＧＣＡＧＡＴＣＣＣＡＣＡＧＧＣＧＣＣ、配列番号４７）およびアンチセンスプライマー（５’−ＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＡＧＧＧＧＣＣＡＡＧＡＧＣＡＧＴ、配列番号４８）を使用してＲＴ−ＰＣＲによって生成した。配列を、ＤＮＡシークエンシング、およびＮＣＢＩデータベース（ＮＭ−００５０１８．２）との比較によって確認した。
【０２２０】
ｈＰＤ−１安定発現細胞株の樹立：ＸｂａｌおよびＢａｍＨ  Ｉによる消化後、ｈＰＤ−１  ＰＣＲ断片をｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）においてクローニングした。次いでｐｃＤＮＡ−ｈＰＤ−１全長プラスミドを、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞にトランスフェクトした。ｈＰＤ−１を安定に発現する細胞株（ＣＨＯ／ｈＰＤ−１）をＧ４１８によって選択し、フローサイトメトリーによってスクリーニングした。
【０２２１】
ヒトＰＤ−１Ｉｇ融合タンパク質の産生：ｈＰＤ−１の細胞外ドメインを含有するｈＰＤ−１ｍＩｇおよびｈＰＤ−１ｈＩｇ融合タンパク質のｃＤＮＡを、特異的プライマーによってｐｃＤＮＡ−ｈＰＤ−１全長からＰＣＲによって増幅した。ＥｃｏＲ  ＩおよびＢｇｌ  ＩＩによって消化したＰＣＲ断片を、発現プラスミドｐｍＩｇＧにおけるマウスＩｇＧ２ａ重鎖または発現プラスミドｐｈＩｇＧにおけるヒトＩｇＧ１重鎖のＣＨ２−ＣＨ３ドメインに融合した（H  Dong  et  al.  Nat  Med.  1999;  5:1365-1369）。培養上清中のタンパク質を、プロテインＡセファロースカラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＨＰ、ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製した。精製タンパク質をＳＤＡ−ＰＡＧＥ電気泳動によって確認した。
【０２２２】
モノクローナル抗体の生成：８〜１０週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスに、ｈＰＤ−１ｍＩｇ融合タンパク質１００μｇおよびフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む乳剤２００μｌを複数の部位に皮下（ｓ．ｃ．）免疫した。３週間後、マウスに、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と共にタンパク質５０〜１００μｇをｓ．ｃ．によって全体で３回免疫した。血清中力価の検査のために各免疫の２週間後にマウスから採血した。力価が十分であれば、マウスを、ＰＢＳ中のタンパク質６０μｇで腹腔内注射（ｉ．ｐ．）によってブーストした。免疫したマウス脾細胞とＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞株（ＡＴＣＣから）とを融合させることによってハイブリドーマを得た。ブーストしたマウスを二酸化炭素によって屠殺し、脾臓を無菌的に回収した。脾臓全体を単細胞懸濁物に解離させ、赤血球をＡＣＫ緩衝液によって溶解した。ＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫および脾細胞を、５０ｍｌの円錐遠心チューブ中、１：１の比率で混合した。遠心分離後、上清を捨て、細胞融合を５０％ポリエチレングリコール（Ｒｏｃｈｅ）によって実施した。融合した細胞をＨＡＴ選択培地中で８〜１０日間培養し、ハイブリドーマ培養上清を、ハイスループットトランスフェクションおよびスクリーニングシステム（S  Yao  et  al.  Immunity.  2011;  34(5):729-40）によってｈＰＤ−１発現細胞に対する結合に関してスクリーニングし、陽性クローンをフローサイトメトリー分析によって確認した。陽性ハイブリドーマのサブクローニングは、純粋に単クローン性の培養物を達成するために限界希釈技術を少なくとも５回使用して実施した。
【０２２３】
（実施例２：ＰＤ−１モノクローナル抗体の特徴付け）
ＭＡｂのアイソタイプ：マウス免疫グロブリンアイソタイピングキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してｍＡｂのアイソタイプを同定した。５つ全てのＰＤ−１  ｍＡｂが、ＩｇＧ１アイソタイプおよびκ鎖であることが同定された。
【０２２４】
抗ｈＰＤ−１の結合特異性：表面にｈＰＤ−１を発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ｈＰＤ−１）を使用して、ＰＤ−１  ｍＡｂの特異性をフローサイトメトリーによって決定した。ＣＨＯ／ｈＰＤ−１細胞を、氷上で抗ＰＤ−１  ｍＡｂと共にインキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、抗ｍＩｇＧ−ＡＰＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共にさらにインキュベートした。フローサイトメトリー分析を、ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して実施した。データは、５つ全てのｈＰＤ−１  ｍＡｂがｈＰＤ−１に対して高い特異性で結合したことを示した（図１）。ｈＰＤ−１  ｍＡｂが他のタンパク質に結合する可能性を除外するために、ｈＢ７−１、ｈＰＤ−Ｌ１、ｈＢ７−Ｈ３、ｈＢ７−Ｈ４、ｈＣＤ１３７、または他のタンパク質分子をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、フローサイトメトリー分析によって抗ｈＰＤ−１  ｍＡｂによって染色した。これらの細胞をまた、陽性対照としてその各々の陽性抗体によっても各々染色した。データは、抗ＰＤ−１  ｍＡｂが、これらの試験したタンパク質に結合しなかったことを実証した（図２）。
【０２２５】
種交差反応性：抗ｈＰＤ−１ｍＡｂの種特異性を評価するために、カニクイザル（Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ  ｌａｎｄａｕ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｍｐａｎｙから）の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）によって末梢血から単離した。ＰＢＭＣを、１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ  １６４０培地中に懸濁し、１μｇ／ｍｌの抗ｈＣＤ３を予めコーティングした２４ウェルプレートに入れた。細胞を２日間培養した。細胞を最初に抗ｈＰＤ−１によって染色した。洗浄後、細胞を、フローサイトメトリー分析のために抗ｍＩｇＧ−ＡＰＣおよびＣＤ３−ＦＩＴＣ、ＣＤ８−ＰｅｒＣＰによって染色した。加えて、ｍＡｂとマウスＰＤ−１との交差反応性を、マウスＰＤ−１トランスフェクトＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ｍＰＤ−１）を使用してフローサイトメトリーによって決定した。
【０２２６】
データは、抗ｈＰＤ−１ｍＡｂがヒトおよびカニクイザルＴ細胞の両方におけるＰＤ−１タンパク質に結合することができ、マウスＰＤ−１に対する交差結合が見出されなかったことを実証した（図３）。
【０２２７】
リガンドの遮断：リガンド結合の遮断を調べるために、ｈＰＤ１ｈＩｇ融合タンパク質１００ｎｇを、表記の用量のｍＡｂ（４００、３００、２００、１００、５０ｎｇ／１０μｌ）または対照Ｉｇと共に４℃で３０分間プレインキュベートした後、ＣＨＯ／ｈＢ７−Ｈ１細胞を染色するために使用した。細胞を洗浄し、ヤギ抗ｈＩｇＧ−ＡＰＣによってさらに染色した。遮断効果をフローサイトメトリーによって評価した。
【０２２８】
データは、抗ｈＰＤ−１ｍＡｂ１および２（Ａｂ１およびＡｂ２）が、リガンドの遮断に対して作用を有しないことを実証した。Ａｂ３、Ａｂ４、およびＡｂ５は、ｈＰＤ−１融合タンパク質のｈＰＤ−Ｌ１に対する結合を、用量依存的に遮断することができる（図４）。
【０２２９】
競合的結合アッセイ：競合的結合アッセイを実施して、これらのｍＡｂがｈＰＤ−１タンパク質の同じまたは異なる結合部位を認識するか否かを調べた。ＣＨＯ／ｈＰＤ−１細胞を、過剰量（１０μｇ）の５つのＰＤ−１  ｍＡｂと共にそれぞれ、４℃で３０分間プレインキュベートした。洗浄後、細胞を、異なるビオチン標識ｍＡｂ  ５０ｎｇと共に４℃で２０分間インキュベートした。ｍＡｂの結合効果を、フローサイトメトリー分析を使用して測定した。
【０２３０】
フローサイトメトリー分析は、Ａｂ４およびＡｂ５がｈＰＤ−１タンパク質に対する結合を互いに完全に抑止し、飽和用量のＡｂ３がＡｂ４およびＡｂ５結合に対して部分的に遮断効果を有し、Ａｂ１およびＡｂ２が、Ａｂ４およびＡｂ５のｈＰＤ−１に対する結合に対して遮断効果を有しなかったことを示した（図５Ａおよび図５Ｂ）。したがって、Ａｂ４およびＡｂ５に関するＰＤ−１上の結合部位は重複し得る。Ａｂ１またはＡｂ２、およびＡｂ４またはＡｂ５は、異なる界面を通してＰＤ−１に結合し、このことはまたリガンド遮断試験によっても確認された。
【０２３１】
（実施例３：抗ＰＤ−１抗体産生ハイブリドーマのシークエンシングおよび抗体のヒト化）
抗ＰＤ−１抗体産生ハイブリドーマのシークエンシング：１×１０７個のハイブリドーマ細胞を回収してＰＢＳによって洗浄した。メッセンジャーＲＮＡを、ＲＡｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してハイブリドーマから抽出した。ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ第１鎖ｃＤＮＡを、ＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して合成した。逆転写後、５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲ反応を、鋳型としてのｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ、ならびにキットによって供給された５’ユニバーサルプライマー（ＵＰＭ）、ならびにマウスＩｇＧ重鎖可変領域およびκ軽鎖遺伝子配列によって設計された３’遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ１）によって実施した。ＲＡＣＥ産物を、ゲル電気泳動分析によって決定した（図６）。ＰＣＲ産生物を、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＴベクターにクローニングした。形質転換後、プラスミドをシークエンシング分析によって確認した。抗体遺伝子断片を、ＶＢＡＳＥ２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｂａｓｅ２．ｏｒｇ）を使用して分析した。配列を（表２）に開示する。
表2.マウス抗体の配列
【表２−１】
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【表２−２】
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【０２３２】
組換え抗体のタンパク質発現および機能の決定：組換え抗体配列の正確性を確保するために、組換え抗体重鎖および軽鎖の全長の配列を、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターにそれぞれクローニングし、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に一過性にトランスフェクトした。細胞培養上清からのタンパク質を、機能的評価のためにプロテインＧセファロースカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製した。
【０２３３】
サイトメトリー分析データは、組換え抗体がｈＰＤ−１タンパク質に結合することができ、ｈＰＤ−１融合タンパク質のＰＤ−Ｌ１タンパク質に対する結合を遮断することができることを実証した（図７、パネルＡ、Ｂ）。
【０２３４】
抗ヒトＰＤ−１抗体のヒト化：ヒト化は、抗ｈＰＤ−１ハイブリドーマの可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）配列に基づいて実施した。一般的に、親マウスＶＨおよびＶＬ配列ならびにヒトＩｇＧ４−Ｓ２２８Ｐ定常領域およびヒトκ鎖で構成されるマウス−ヒトキメラｍＡｂを最初に構築した。キメラ抗体の特徴を同定した後、３つのＶＬおよび３つのＶＬヒト化配列を設計し、これを使用して９個のヒト化抗体を作製した。配列を（表３Ａおよび３Ｂ）に記載する。
表3A.キメラ抗体(ヒトIgG4-S228P骨格)
【表３Ａ−１】
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【表３Ａ−２】
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表3B.ヒト化重鎖および軽鎖可変領域
【表３Ｂ−１】
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【表３Ｂ−２】
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表3C.様々なCDR定義での例示的な抗PD-1  CDR
【表３Ｃ−１】
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【表３Ｃ−２】
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【０２３５】
（実施例４：ヒト化抗体の特徴および機能）
ヒト化抗体の結合活性：ＣＨＯ／ｈＰＤ−１細胞を、連続希釈したｍＡｂと共にインキュベートした。９つのヒト化抗体のＰＤ−１タンパク質に対する結合効果を、フローサイトメトリー分析を使用して評価し、キメラ親抗体と比較した。
【０２３６】
フローサイトメトリー分析結果は、一部の変異体の組合せの結合活性が、その親抗体より高く、一部は親抗体と同じであるか、またはわずかに低いことを示した（図８）。変異体の組合せを以下の表４に記載する。
【表４−１】
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【表４−２】
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【０２３７】
ヒト化抗体の遮断能力：ヒト化抗体が、ｈＰＤ−１のｈＰＤ−Ｌ１に対する結合を遮断する能力を測定した。ｈＰＤ１ｍＩｇ  １００ｎｇを、ＰＢＳ  １０μｌ中で異なる用量のヒト化抗体と共に４℃で３０分間プレインキュベートした後、これを使用してＣＨＯ／ｈＢ７−Ｈ１細胞を染色した。細胞を洗浄し、ヤギ抗ｍＩｇＧ−ＡＰＣによってさらに染色した。遮断効果を、フローサイトメトリーによって評価した。類似の方法を使用して、ヒト化抗体がｈＰＤ−１のｈＰＤ−Ｌ２に対する結合を遮断する能力を測定した。
【０２３８】
結果は、ｈＰＤ−１ｍＩｇのＣＨＯ／ｈＰＤ−Ｌ１細胞に対する結合が、全てのヒト化抗体によって用量依存的に阻害されたことを示した。一部の変異体の組合せは、キメラ親抗体より高い遮断能力を有する（図９）。結果はまた、ｈＰＤ−１ｍＩｇのＣＨＯ／ｈＰＤ−Ｌ２細胞に対する結合も遮断されたことを示した（図１０Ａおよび図１０Ｂ）。
【０２３９】
ヒト化抗体の結合親和性および動態の決定：ｈＰＤ−１タンパク質と相互作用するヒト化ＰＤ−１  ｍＡｂの結合親和性および動態を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって評価した。ｈＰＤ−１ｍＩｇタンパク質を、アミンカップリングによってセンサーチップＣＭ５に固定した。濾過したヒト化抗体を、ＨＢＳ−ＥＰ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ７．４（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって希釈し、その後ｈＰＤ−１ｍＩｇ固定（immibilised）表面上に注入した。各試料に関して、９つの異なる濃度を試験した。詳細な結合動態パラメーター（結合速度、Ｋａ、解離速度、Ｋｄ、および親和性定数、ＫＤ）を、完全な動態分析によって決定することができる。
【０２４０】
分析データは、変異体の組合せとキメラ親抗体との間で結合速度（Ｋａ）に有意差がなかったことを示した。３つの変異体の組合せ（３、６、９）は、解離速度（Ｋｄ）がキメラ親抗体に近かった。ヒト化抗体は全て、低いナノモル濃度範囲（１０−１０Ｍ）のＫＤ値で強い親和性を有する。２つの変異体の組合せ（３、６）のＫＤ値は、キメラ親抗体（９．８９×１０−１１Ｍ）と近かった（表４）。
表4.ヒト化抗体の結合親和性および動態の決定
【表４−３】
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【０２４１】
アロＣＤ８＋  ＣＴＬのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞の殺滅に及ぼす抗ＰＤ−１の増強効果：抗ＰＤ−１抗体の抗腫瘍機構に基づき、本実施例は、ヒト同種異系ＣＤ８＋細胞傷害性リンパ球（アロＣＤ８＋  ＣＴＬ）による腫瘍細胞殺滅に対する抗ＰＤ−１抗体の増強効果を決定するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを設計した。最初に、ＣＤ８＋リンパ球をヒトＰＢＭＣから単離して、ｈＢ７−１をトランスフェクトした放射線照射ヒト黒色腫細胞（６２４Ｍｅｌ／Ｂ７−１）と共に培養し、アロＣＤ８＋ｃｙｔｏ  ＣＴＬを産生した。次いで、アロＣＤ８＋  ＣＴＬ細胞をヒト化抗体または対照Ｉｇの存在下で９６ウェルプレートにおいて、一晩培養した６２４Ｍｅｌ／ｈＰＤ−Ｌ１腫瘍細胞と５日間同時培養した。プレートウェル中の細胞を、０．５％クリスタルバイオレットによって染色し、プレートをＥＬＩＳＡリーダーによって５４０ｎｍで読み取った。殺滅活性は、腫瘍細胞の生存に基づいて計算した。
【化１】
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【０２４２】
結果は、一部の変異体の組合せが、アロＣＴＬ細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏで腫瘍細胞を殺滅する能力を増強し得ることを実証した（図１１）。
【０２４３】
変異体の組合せ（バリアント３）の最善のセットを選択し、タンパク質コード配列を適した発現ベクターにクローニングし、ＣＨＯ細胞に移入してＴＹ１０１とも呼ばれる抗ｈＰＤ−１抗体を産生した。
【０２４４】
（実施例５：がん免疫療法におけるＴＹ１０１の特徴）
ＰＢＭＣにおけるサイトカイン増強混合リンパ球反応（ＭＲＬ）。健康な個体からのヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅを使用する密度勾配遠心分離によって単離した。健康なドナー１からのＰＢＭＣに、４０Ｇｙの線量のＸ線を照射し、スティミュレーター細胞とした。Ｔリンパ球を、ヒト汎Ｔ細胞単離キット（ＭｉｌｔｅｎｙｌＢｉｏｔｅｃ）によって健康なドナー２から単離し、レスポンダー細胞とした。レスポンダー細胞およびスティミュレーター細胞を、１０％ＦＣＳを含有する完全ＲＰＭＩ培地に再懸濁し、ＴＹ１０１またはｈＩｇＧ対照の連続希釈物の存在下で、９６ウェルプレートにウェルあたり２．５×１０５個のレスポンダー細胞および１．２５×１０５個のスティミュレーター細胞（Ｒ／Ｓ＝２）を播種した。細胞を、５％ＣＯ２の湿潤インキュベーター内で、３７℃で５日間培養した。Ｔ細胞の増殖活性を、５日目に細胞計数キット−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ）によって評価した。サイトカインを検出するために、培養上清を３日目および５日目に収集した。サイトカイン分析を、ヒトＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７細胞測定ビーズアレイキット（ＣＢＡ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して実施した。
【０２４５】
結果は、ＴＹ１０１に対するＴ細胞増殖応答が、ｈＩｇＧと類似であったことを実証した（図１２）。興味深いことに、サイトカインＩＬ−２およびＩＦＮγ産生は、ｈＩｇＧと比較して、ＴＹ１０１を投与したＭＬＲの培養上清において有意に増加した（図１３）。
【０２４６】
Ｔリンパ球におけるＰＤ−１の発現の遮断。腫瘍細胞におけるＰＤ−Ｌ１の発現は、腫瘍の微小環境において腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）においてＰＤ−１発現を誘導することができ、ＰＤ−１依存的免疫抑制を誘発することができる。本実施例は、ＴＹ１０１がｈＰＤ−Ｌ１トランスフェクト腫瘍細胞と共に培養した場合にヒトリンパ球におけるｈＰＤ−１発現を阻害できるか否かを決定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを設計した。ヒトＰＢＭＣから単離したヒトＴリンパ球を、１０μｇ／ｍｌのＴＹ１０１または対照ＩｇＧの存在下、ｈＰＤ−Ｌ１をトランスフェクトしたヒト黒色腫（６２４／ｈＰＤ−Ｌ１）細胞と共に４日間培養した。リンパ球におけるｈＰＤ−１の発現をフローサイトメトリーによって検出した。
【０２４７】
結果は、リンパ球におけるＰＤ−１の発現が培地のみおよびｈＩｇＧ対照と比較してＴＹ１０１の添加によって完全に阻害されたことを実証した（図１４Ａおよび図１４Ｂ）。
【０２４８】
ヒト化ＰＤ−１抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性：ＴＹ１０１のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果を調べた。８週齢の雌性ヒトＰＤ−１ノックインマウス（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｍｏｄｅｌ  Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．から購入）に、ｈＰＤ−Ｌ１をトランスフェクトしたＭＣ３８（ＭＣ３８／ｈＰＤ−Ｌ１）腫瘍細胞（１×１０６／マウス）を０日目に右脇腹の皮下（ｓ．ｃ．）に移植した。ＴＹ１０１または対照Ｉｇを６日目、９日目、および１３日目にｉ．ｐ．注射によって投与した（１０ｍｇ／ｋｇ）。腫瘍サイズおよび生存をモニターした。
【０２４９】
全ての動物は最初、検出可能な腫瘍（６日目までに４〜５ｍｍ）を有した。しかし、ＭＣ３８／ｈＰＤ−Ｌ１腫瘍を有するマウスをＴＹ１０１によって処置すると、完全な応答が１００％のマウスに起こった。ＴＹ１０１によって処置した５匹全てのマウスにおける腫瘍は２５日目までに完全に退縮した。これに対し、対照ＩｇＧによって処置したマウス５匹中２匹が次第に成長する腫瘍を発症した。対照ＩｇＧによって処置した別の３匹のマウスでは、腫瘍は３２日目に退縮もしたが、２匹のマウスでは腫瘍がまもなく再発した（図１５）。結果は、ＴＹ１０１がｉｎ  ｖｉｖｏで抗腫瘍有効性を増強することができることを示した。
【０２５０】
（実施例６：ＴＹ１０１と市販のＰＤ−１抗体の機能の比較）
本実施例は、ＴＹ１０１と比較するために、がん患者の臨床的処置のために現在承認されている２つの抗ｈＰＤ−１抗体を選択した：ＭｅｒｃｋのＫｅｙｔｒｕｄａ（ペンブロリズマブ）およびＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  ＳｑｕｉｂｂのＯｐｄｉｖｏ（ニボルマブ）。
【０２５１】
抗体結合親和性および動態：ＴＹ１０１の親和性および動態を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析し、２つの市販の抗体と比較した。ｈＰＤ−１ｍＩｇタンパク質を、センサーチップＣＭ５上に低濃度（３３ＲＵ）で固定し、抗体を検体（移動相）として、相互作用を検出した。データは、３つの抗体の結合速度Ｋａに有意差がないことを示した。ＴＹ１０１は、市販の抗体よりわずかに低い。ＴＹ１０１の解離速度Ｋｄは、２つの市販の抗体より１０倍遅く、ＴＹ１０１の親和性ＫＤは、市販の抗体より４〜７倍強い。結果は、ＴＹ１０１が、より強い結合を示していることを示した（図１６）。
【０２５２】
ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断におけるＰＤ−１抗体の比較：ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断バイオアッセイを、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断バイオアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してアッセイした。Ｊｕｒｋａｔ−ＰＤ１細胞１×１０５個／ウェルを、不透明な９６ウェルＴＣプレートにおいて、ＴＹ１０１、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、または陰性対照ｈＩｇＧ４の連続希釈物（０〜３０μｇ／ｍｌ）の存在下で、一晩培養したＣＨＯ−ＰＤ−Ｌ１細胞（培養を５×１０４個／ウェルで開始）と共に５時間刺激した。５時間インキュベーション後、Ｊｕｒｋａｔ−ＰＤ−１細胞の活性化を、ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ  Ｌルミノメーターにおける相対光単位（ＲＬＵ）に関してＯＮＥ−Ｇｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）によってルシフェラーゼ活性を測定することによって検出した。
【０２５３】
分析データは、ＴＹ１０１および２つの市販の抗体が、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路を遮断できることを示した。ＴＹ１０１の遮断効果は、ペンブロリズマブの効果と類似であり、ニボルマブの効果より良好である（図１７）。
【０２５４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの腫瘍細胞成長の阻害効果の比較：既に記載したように、アロＣＤ８＋  ＣＴＬ細胞を、異なるｍＡｂおよび対照ＩｇＧの存在下で、９６ウェルプレートにおいて、一晩培養した６２４Ｍｅｌ／ＰＤ−Ｌ１腫瘍細胞と共に５日間同時培養した。細胞を、０．５％クリスタルバイオレットによって染色し、プレートをＥＬＩＳＡリーダーによって５４０ｎｍで読み取った。殺滅活性を、腫瘍細胞の生存に基づいて計算した。
【０２５５】
結果は、３つ全ての抗ＰＤ−１ｍＡｂが、アロＣＤ８＋  ＣＴＬの腫瘍の殺滅能を増強することができることを示した。ＴＹ１０１の増強効果は、２つの市販の抗体の効果より高かった（図１８）。
【０２５６】
（実施例７：ＴＹ１０１のクローンの生成およびその活性）
ＴＹ１０１の配列を、専売の発現ベクターにクローニングし、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。単クローン性の細胞株を、ＣｌｏｎｅＰｉｘおよび／または限界希釈を使用して樹立した。複数のクローンを樹立し、そのような３つのクローンによって産生された抗体（ＴＹ１０１−０１−０９、ＴＹ１０１−０４−Ｔ３−０５、およびＴＹ１０１−４Ｇ１）を特徴付けした。
【０２５７】
ｈＰＤ−１またはｍＰＤ−１タンパク質に対する試験抗体の結合（ＥＬＩＳＡ）
抗体のｈＰＤ−１に対する結合およびｍＰＤ−１タンパク質に対する交差反応性を、ＥＬＩＳＡによって試験した。試験抗体の連続希釈物を、１μｇ／ｍｌ  ｈＰＤ−１またはｍＰＤ−１を予めコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに添加した。次いで、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧまたはヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を添加した後、基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ，ＬＬＣ．、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）によって４５０ｎｍの波長で定量した。試験したＴＹ１０１クローン、ＴＹ１０１−０１−０９、ＴＹ１０１−０４−Ｔ３−０５、およびＴＹ１０１−４Ｇ１は、０．０１〜０．１５ｎＭの範囲のＥＣ５０でｈＰＤ−１タンパク質に対して良好な結合を示した。抗体は、ｍＰＤ−１タンパク質に対する結合を示さなかった（図１９）。
【０２５８】
ｈＰＤ−１およびｃＰＤ−１発現ＣＨＯＫ１細胞に対する試験抗体の結合（フローサイトメトリー）
抗体のｈＰＤ−１に対する結合およびカニクイザルＰＤ−１（ｃＰＤ−１）に対する交差反応性を、フローサイトメトリーによって、ｈＰＤ−１またはｃＰＤ−１発現ＣＨＯＫ１細胞を使用して試験した。ＣＨＯＫ１−ｈＰＤ−１、ＣＨＯＫ１−ｃＰＤ−１、およびＣＨＯＫ１ブランク細胞を、試験物質の連続希釈物と共にインキュベートし、その後にＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体と共にインキュベートし、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して分析した。試験したＴＹ１０１クローン、ＴＹ１０１−０１−０９、ＴＹ１０１−０４−Ｔ３−０５、およびＴＹ１０１−４Ｇ１は、ＣＨＯＫ１−ｈＰＤ−１に対してナノモル濃度より低いＥＣ５０で良好な結合を示し、ＣＨＯＫ１−ｃＰＤ−１細胞に対して一桁のナノモル濃度ＥＣ５０で良好な結合を示した（図２０）。
【０２５９】
ｈＰＤ−１／ｈＰＤ−Ｌ１またはｈＰＤ−１／ｈＰＤ−Ｌ２結合に対する試験抗体の遮断活性（フローサイトメトリー）
これらの抗体を、がん患者の処置における潜在的有効性の鍵となる、ｈＰＤ−１／ｈＰＤ−Ｌ１ならびにｈＰＤ−１／ｈＰＤ−Ｌ２結合を遮断する能力に関してさらに試験した。ＣＨＯＫ１−ｈＰＤ−１細胞を、ビオチン−ｈＰＤ−Ｌ１またはビオチン−ｈＰＤ−Ｌ２と混合した試験物質の連続希釈物と共にインキュベートした。次いで、細胞をＡｌｅｘａ  ４８８標識ストレプトアビジンと共にインキュベートし、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩを使用して分析した。抗ｈＰＤ−１抗体ＴＹ１０１−０１−０９、ＴＹ１０１−０４−Ｔ３−０５、およびＴＹ１０１−４Ｇ１は、ｈＰＤ−Ｌ１のｈＰＤ−１発現ＣＨＯＫ１細胞に対する結合を１．１５〜１．４７ｎＭのＩＣ５０で遮断した。それらはまた、ｈＰＤ−Ｌ２のｈＰＤ−１発現ＣＨＯＫ１細胞に対する結合を１．５２〜２．３３ｎＭのＩＣ５０で遮断した（図２１）。
【０２６０】
Ｔ細胞に及ぼす抗体の効果を試験するためのヒト混合白血球反応（ＭＬＲ）アッセイ
これらの抗体がＴ細胞機能に及ぼす効果を、２人のドナーから単離されたＴ細胞によるヒトＭＬＲアッセイにおいて試験した。接着ＰＢＭＣ（ほとんどが単球；ドナー１から単離され、細胞培養皿に播種して接着させたもの）を、１００ｎｇ／ｍＬの組換えヒト（ｒｈ）ＧＭ−ＣＳＦおよび５０ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ−４の存在下で５日間培養し、培地の半分の体積を３日後に新しくし、１μｇ／ｍＬ  ＬＰＳを６日目に添加した。７日目に、得られた細胞（ほとんどが成熟ＤＣ）を回収し、マイトマイシンＣによって処置した。ＣＤ３＋  Ｔ細胞を、ドナー２および３からＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＴ細胞単離キット（ネガティブセレクション、ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって単離した。ＤＣおよびＴ細胞を、試験抗体の３つの濃度（５、０．５、０．０５μｇ／ｍｌ）の存在下で５日間同時培養した。上清を３日後に回収して、ＩＬ−２レベルを決定し、５日後（１００μＬ）にＩＦＮ−γレベルを決定した。抗ｈＰＤ−１抗体ＴＹ１０１−０１−０９、ＴＹ１０１−０４−Ｔ３−０５、およびＴＹ１０１−４Ｇ１は、アイソタイプ対照ｈＩｇＧ４と比較した場合に、用量依存的に両方のドナーからの細胞によるＩＬ−２およびＩＦＮ−γの分泌を促進した（図２２）。
【０２６１】
Ｔ細胞に及ぼす抗体の効果を試験するための操作された腫瘍細胞−ヒトＴ細胞同時培養アッセイ
これらの抗体がＴ細胞機能に及ぼす効果もまた、４人の異なるドナーから単離したＴ細胞を使用して、操作された腫瘍細胞−ヒトＴ細胞同時培養アッセイにおいて試験した。ＣＤ３＋  Ｔ細胞を、４人のドナーのＰＢＭＣからＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＴ細胞単離キットによって単離した。ＯＳ８（抗ＣＤ３一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ））ならびにｈＰＤ−Ｌ１を安定に発現するように操作されたＨｅｐ３Ｂ細胞（ＫＣＬＢ、カタログ番号：８８０６４）である操作された腫瘍細胞Ｈｅｐ３Ｂ−ＯＳ８−ｈＰＤＬ１を、マイトマイシンＣによって処置し、試験抗体の３つの濃度（５、０．５、０．０５μｇ／ｍｌ）の存在下でＣＤ３＋  Ｔ細胞と共に３日間同時培養し、培養上清を回収してＩＦＮ−γレベルを決定した。抗ｈＰＤ−１抗体ＴＹ１０１−０１−０９、ＴＹ１０１−０４−Ｔ３−０５、およびＴＹ１０１−４Ｇ１は、アイソタイプ対照ｈＩｇＧ４と比較した場合に４人全てのドナーからの細胞によるＩＦＮ−γの分泌を用量依存的に促進した（図２３）。
【０２６２】
（実施例８：ＴＹ１０１クローンは、ＦＤＡが承認した抗ｈＰＤ−１抗体と比較して良好な結合親和性を示した）
抗体エピトープ重複を試験するための競合的ＥＬＩＳＡ
これらの抗体がＦＤＡ承認抗ｈＰＤ−１抗体であるニボルマブまたはペンブロリズマブと同じエピトープに結合するか否かを、競合的ＥＬＩＳＡアッセイにおいて試験した。競合抗体の連続希釈物およびビオチン−ｈＰＤ−１を、１μｇ／ｍｌの試験抗体によって予めコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに添加した。次いで、ＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンを添加し、その後、基質ＴＭＢを添加し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４マイクロプレートリーダーによって波長４５０ｎｍで定量した。抗ｈＰＤ−１抗体ＴＹ１０１−０１−０９、ＴＹ１０１−０４−Ｔ３−０５、およびＴＹ１０１−４Ｇ１は、ｈＰＤ−１に対する互いの結合をほぼ完全に遮断し、それらが類似のエピトープを共有することを示唆する。３つの抗体はまた、ニボルマブおよびペンブロリズマブのｈＰＤ−１に対する結合もほぼ完全に（９３％〜９４％）遮断したが、ニボルマブおよびペンブロリズマブは、これらの抗体のｈＰＤ−１に対する結合をごく部分的に遮断した（ニボルマブに関して７７％〜７８％、ペンブロリズマブに関して４６％〜４９％）。これらのデータは、ＴＹ１０１−０１−０９、ＴＹ１０１−０４−Ｔ３−０５、およびＴＹ１０１−４Ｇ１抗体が、ニボルマブおよびペンブロリズマブとは異なるエピトープに結合し、それらがｈＰＤ−１に対してニボルマブおよびペンブロリズマブより高い親和性を有し得ることを示唆している（図２４）。
【０２６３】
ＳＰＲによって決定した試験抗体のｈＰＤ−１に対する結合親和性
ｈＰＤ−１に対する結合親和性の正確な測定を得るために、抗体ＴＹ１０１−０１−０９、ＴＹ１０１−０４−Ｔ３−０５およびＴＹ１０１−４Ｇ１、ならびにニボルマブおよびペンブロリズマブを、ＳＰＲによって分析した。ヒトＰＤ−１  ＥＣＤタンパク質を、フローセル３において低い固定レベル（６０ＲＵ）およびフローセル４において高い固定レベル（９６０ＲＵ）を達成するために異なる長さの時間、ＣＭ５センサーチップ上に固定した。連続希釈した（０、１．５６２５、３．１２５、６．２５、１２．５、２５、および５０ｎＭ）抗体を、フローセルに注入した。結合時間は１８０秒であり、解離時間は６００秒（ニボルマブおよびペンブロリズマブに関して）または１５００秒（ＴＹ１０１−０１−０９、ＴＹ１０１−０４−Ｔ３−０５、およびＴＹ１０１−４Ｇ１に関して）であった。参照（フローセル１）およびゼロ濃度の両方のシグナルを試料のシグナルから差し引いた後、結合動態を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウェアバージョン１．０およびカーブフィッティングのために１：１結合モデルを使用して計算した。対照ヒトＩｇＧ４のｈＰＤ−１に対する結合は認められなかった。ｈＰＤ−１の低い固定レベル（約６０ＲＵ；表３；図２３）からのデータに基づき、抗ｈＰＤ−１抗体ＴＹ１０１−０１−０９、ＴＹ１０１−０４−Ｔ３−０５、およびＴＹ１０１−４Ｇ１によるヒトＰＤ−１に対する結合速度は、ニボルマブおよびペンブロリズマブの結合速度よりわずかに低かった（１／２〜１／４）。これら３つの抗体のヒトＰＤ−１からの解離速度は、ニボルマブおよびペンブロリズマブの１／１２〜１／３０であり、ニボルマブおよびペンブロリズマブの親和性より４〜８倍良好な親和性をもたらした（より低いＫＤは、より良好な親和性に対応し、その逆も同様である；表３）。抗ｈＰＤ−１抗体ＴＹ１０１−０１−０９、ＴＹ１０１−０４−Ｔ３−０５、およびＴＹ１０１−４Ｇ１のｈＰＤ−１に対する結合親和性をまた、ｈＰＤ−１の高い固定レベルでも試験した。抗体ＴＹ１０１−０１−０９、ＴＹ１０１−０４−Ｔ３−０５、およびＴＹ１０１−４Ｇ１は、非常に遅い解離速度を示し、最小の解離は、１５００秒の解離時間後でさえ観察された（図２３）。データは、ＴＹ１０１−０１−０９、ＴＹ１０１−０４−Ｔ３−０５、およびＴＹ１０１−４Ｇ１の結合親和性が、主に遅い解離速度によりニボルマブおよびペンブロリズマブの結合親和性より良好であったことを示唆した（図２５）。
【０２６４】
（実施例９：カニクイザルにおけるＴＹ１０１の投薬試験および薬物動態）
ＴＹ１０１の薬物動態を評価するために、全体で１８匹のカニクイザルを、３匹／性別／群で３つの群に割付した。ＴＹ１０１をそれぞれ、１、３、および１０ｍｇ／ｋｇの用量レベルで静脈内注入によって注射した。各投薬は、注射ポンプを使用して右後肢を通して投与した。注入速度は、３０ｍＬ／ｋｇ／ｈであった。用量体積は１０ｍＬ／ｋｇであった。確証されたＥＬＩＳＡ法を、動物血漿中でのＴＹ１０１の定量のために使用した。薬物動態分析のためにＥＤＴＡ−Ｋ２抗凝固剤を有するおよそ１ｍＬの血液試料を、群１〜３において、投与前、注入終了の直前直後（±１分）、ならびに注入開始後２、６、２４（Ｄ２）、４８（Ｄ３）、７２（Ｄ４）、９６（Ｄ５）、１２０（Ｄ６）、１６８（Ｄ８）、２４０（Ｄ１１）、３３６（Ｄ１５）、４０８（Ｄ１８）、５０４（Ｄ２２）、５７６（Ｄ２５）、および６７２（Ｄ２９）時間に左後肢の皮下静脈から収集した。血液試料を、薬物動態分析のための血漿の調製のために使用した。
【０２６５】
ＴＹ１０１のＰＫパラメーターを以下の表に示す。
【表８】
2021530511.tif 000018
【０２６６】
Ｃｍａｘ比＝中用量または高用量での平均Ｃｍａｘ／低用量での平均Ｃｍａｘ
【０２６７】
＃７  曲線下面積（ＡＵＣ）比＝中用量または高用量での平均ＡＵＣ（０−６７２ｈ）／低用量での平均ＡＵＣ（０−６７２ｈ）
【０２６８】
ＴＹ１０１は、基本的に、１、３、および１０ｍｇ／ｋｇの１回静脈内注入後にカニクイザルにおいて線形の動力学的特徴を表した。平均ＣｍａｘおよびＡＵＣ（０−６７２ｈ）値は、一般的に１〜１０ｍｇ／ｋｇの間で用量に比例して増加した。１回静脈内注入後の１〜１０ｍｇ／ｋｇのＴＹ１０１の薬物動態特徴に明白な性差は認められなかった。
【０２６９】
類似の条件下で、本発明者らはまた、ＴＹ１０１およびＯＰＤＩＶＯ（登録商標）（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）の３ｍｇ／ｋｇのＰＫプロファイルを比較した。データを以下の表に要約する。
【表９】
2021530511.tif 000019
Cmax  比=TY101の平均Cmax  /OPDIVO(登録商標)の平均Cmax
AUC比=TY101の平均AUC(0-672h)/OPDIVO(登録商標)の平均AUC(0-672h)
【０２７０】
ＴＹ１０１およびＯＰＤＩＶＯ（登録商標）は、３ｍｇ／ｋｇで同等のＰＫプロファイルを実証した。
【０２７１】
本開示は、本開示の個々の態様の単なる例として意図される記載される特定の実施形態によって範囲を限定されず、機能的に等価である任意の組成物または方法は本開示の範囲内である。本開示の精神または範囲から逸脱することなく、様々な改変および変化を本開示の方法および組成物に行うことができることは当業者に明らかであろう。このように、本開示は、添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内に入る限り、本開示の改変および変化形を含むことが意図される。
【０２７２】
本明細書において言及される全ての刊行物および特許出願は、各々の個々の刊行物または特許出願が、参照により本明細書に組み込まれることが具体的および個々に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
2021530511.tif 000020
【図２】
2021530511.tif 000021
【図３】
2021530511.tif 000022
【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
2021530511.tif 000025
【図６】
2021530511.tif 000026
【図７】
2021530511.tif 000027
【図８】
2021530511.tif 000028
【図９】
2021530511.tif 000029
【図１０−１】
2021530511.tif 000030
【図１０−２】
2021530511.tif 000031
【図１１】
2021530511.tif 000032
【図１２】
2021530511.tif 000033
【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
2021530511.tif 000036
【図１５】
2021530511.tif 000037
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
2021530511.tif 000047
【配列表】
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【国際調査報告】
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