(57)【要約】  本発明は、より短期間でＴＩＬの有効性の改善、表現型の改善及び代謝的健康の増加をもたらす一方、微生物汚染の低減及びコストの削減を可能にする、閉鎖系でＴＩＬ集団を拡大培養する新規方法を含む、ＴＩＬを拡大培養し、且つ治療用ＴＩＬ集団を生じさせるための改善及び／又は短縮された方法を提供する。かかるＴＩＬは、治療用処置レジメンでの使用を見出す。
2021519582.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法であって、
（ａ）患者から切除された腫瘍からの処理された腫瘍断片を閉鎖系に加えて、第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）ＩＬ−２及び任意選択でＯＫＴ−３を含む細胞培養培地で前記第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、前記第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、前記第１の拡大培養は、前記第２のＴＩＬ集団を得るために約３〜１４日間にわたって実施され、前記第２のＴＩＬ集団は、前記第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ａ）からステップ（ｂ）への移行は、前記系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｃ）前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、任意選択でＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、前記第２の拡大培養は、前記第３のＴＩＬ集団を得るために約７〜１４日間にわたって実施され、前記第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団であり、前記第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は、前記系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｄ）ステップ（ｃ）から得られた前記治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、前記系を開放せずに発生する、回収すること；及び
（ｅ）ステップ（ｄ）からの前記回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｄ）から（ｅ）への移行は、前記系を開放せずに発生する、移すこと
を含む方法。
【請求項２】
ステップ（ｄ）で回収された前記治療用ＴＩＬ集団は、治療上有効な投薬量の前記ＴＩＬのために十分なＴＩＬを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
治療上有効な投薬量のために十分なＴＩＬの数は、約２．３×１０１０〜約１３．７×１０１０個である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
凍結保存プロセスを使用して、前記回収されたＴＩＬ集団を含む前記輸注バッグを凍結保存するステップを更に含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記凍結保存プロセスは、回収されたＴＩＬ集団と凍結保存培地との１：１比を使用して実施される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記抗原提示細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＰＢＭＣは、照射され、且つ同種異系である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＰＢＭＣは、ステップ（ｃ）において９〜１４日目のいずれかに細胞培養物に加えられる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記抗原提示細胞は、人工抗原提示細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｄ）の前記回収は、LOVO細胞処理系を使用して実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記複数の断片は、約４〜約５０個の断片を含み、各断片は、約２７ｍｍ３の容積を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記複数の断片は、約３０〜約６０個の断片を含み、総容積は、約１３００ｍｍ３〜約１５００ｍｍ３である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記複数の断片は、約５０個の断片を含み、総容積は、約１３５０ｍｍ３である、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記複数の断片は、約５０個の断片を含み、総質量は、約１グラム〜約１．５グラムである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記複数の断片は、約４個の断片を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記第２の細胞培養培地は、Ｇコンテナ及びXuri細胞培養バッグからなる群から選択される容器内に提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ｅ）の前記輸注バッグは、HypoThermosol含有輸注バッグである、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ｂ）の前記第１の期間及びステップ（ｃ）の前記第２の期間は、１０日、１１日又は１２日の期間内にそれぞれ個別に実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ｂ）の前記第１の期間及びステップ（ｃ）の前記第２の期間は、１１日の期間内にそれぞれ個別に実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ａ）〜（ｅ）は、約１０日〜約２２日の期間内に実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ａ）〜（ｅ）は、約１０日〜約２０日の期間内に実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ａ）〜（ｅ）は、約１０日〜約１５日の期間内に実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
ステップ（ａ）〜（ｅ）は、２２日以内に実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
ステップ（ａ）〜（ｅ）及び凍結保存は、２２日以内に実施される、請求項４に記載の方法。
【請求項２５】
ステップ（ｂ）〜（ｅ）は、単一の容器内で実施され、ステップ（ｂ）〜（ｅ）を単一の容器内で実施することは、ステップ（ｂ）〜（ｅ）を２つ以上の容器内で実施することと比較して、切除された腫瘍毎のＴＩＬ収量の増加をもたらす、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗原提示細胞は、前記系を開放せずにステップ（ｃ）の前記第２の期間中に前記ＴＩＬに加えられる、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
ステップ（ｄ）の前記第３のＴＩＬ集団は、前記第２のＴＩＬ集団に対して、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加したサブ集団を含む治療用ＴＩＬ集団であり、前記治療用ＴＩＬ集団において得られる前記エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、前記第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞に対して、ＣＤ２７＋を発現すること、ＣＤ２８＋を発現すること、より長いテロメア、増加したＣＤ５７発現及び減少したＣＤ５６発現からなる群から選択される１つ以上の特徴を呈する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記治療用ＴＩＬ集団において得られる前記エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、前記第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞に対して、増加したＣＤ５７発現及び減少したＣＤ５６発現を呈する、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
微生物汚染のリスクは、開放系と比較して低減される、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
ステップ（ｅ）からの前記ＴＩＬは、患者に注入される、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記閉鎖型容器は、単一のバイオリアクターを含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記閉鎖型容器は、G-REX-10を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記閉鎖型容器は、G-REX-100を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
ステップ（ｄ）において、前記抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、２５：１〜１００：１のＡＰＣ：ＴＩＬ比で前記第２のＴＩＬ集団の細胞培養物に加えられる、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞培養物は、２．５×１０９個のＡＰＣ対１００×１０６個のＴＩＬの比を有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ステップ（ｃ）において、前記抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、２５：１〜１００：１のＡＰＣ：ＴＩＬ比で前記第２のＴＩＬ集団の細胞培養物に加えられる、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞培養物は、２．５×１０９個のＡＰＣ対１００×１０６個のＴＩＬの比を有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
癌を有する対象の処置に使用するための拡大培養ＴＩＬ集団であって、
（ａ）患者から得られた腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することにより、対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）前記腫瘍断片を閉鎖系に加えること；
（ｃ）ＩＬ−２及び任意選択でＯＫＴ−３を含む細胞培養培地で前記第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、前記第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、前記第１の拡大培養は、前記第２のＴＩＬ集団を得るために約３〜１４日間にわたって実施され、前記第２のＴＩＬ集団は、前記第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は、前記系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｄ）前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、任意選択でＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、前記第２の拡大培養は、前記第３のＴＩＬ集団を得るために約７〜１４日間にわたって実施され、前記第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団であり、前記第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、前記系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｅ）ステップ（ｄ）から得られた前記治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、前記系を開放せずに発生する、回収すること；及び
（ｆ）ステップ（ｅ）からの前記回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、前記系を開放せずに発生する、移すこと；並びに
（ｇ）任意選択で、凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）からの前記回収されたＴＩＬ集団を含む前記輸注バッグを凍結保存すること
を含む方法によって得ることができる第３のＴＩＬ集団である、拡大培養ＴＩＬ集団。
【請求項３９】
前記ＴＩＬを生じさせる前記方法は、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の特徴の１つ以上を更に含む、請求項３８に記載のＴＩＬ集団。
【請求項４０】
請求項３８に記載のＴＩＬ集団、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む凍結保護培地及び電解質溶液を含む凍結保存組成物。
【請求項４１】
１つ以上の安定剤及び１つ以上のリンパ球成長因子を更に含む、請求項４０に記載の凍結保存組成物。
【請求項４２】
前記１つ以上の安定剤は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含み、及び前記１つ以上のリンパ球成長因子は、ＩＬ−２を含む、請求項４１に記載の凍結保存組成物。
【請求項４３】
任意選択でＯＫＴ−３を含む、請求項４２に記載の凍結保存組成物。
【請求項４４】
ＤＭＳＯを含む前記凍結保護培地及び前記電解質溶液は、約１．１：１〜約１：１．１の比で存在する、請求項４０に記載の凍結保存組成物。
【請求項４５】
ＤＭＳＯを含む前記凍結保護培地及び前記電解質溶液は、約１：１の比で存在する、請求項４４に記載の凍結保存組成物。
【請求項４６】
１００ｍＬの前記組成物は、約１×１０６〜約９×１０１４個の量の前記ＴＩＬ集団；約３０ｍＬ〜約７０ｍＬの量の、ＤＭＳＯを含む前記凍結保護培地、約３０ｍＬ〜約７０ｍＬの量の前記電解質溶液；約０．１ｇ〜約１．０ｇの量のＨＳＡ；及び約０．００１ｍｇ〜約０．００５ｍｇの量のＩＬ−２を含む、請求項４０に記載の凍結保存組成物。
【請求項４７】
１００ｍＬの前記組成物は、約１×１０７〜約１×１０１１個の量の前記ＴＩＬ集団；約１０％のＤＭＳＯを含む、約３０ｍＬ〜約７０ｍＬの量の前記凍結保護培地；約３０ｍＬ〜約７０ｍＬの量の前記電解質溶液；約０．３ｇ〜約０．７ｇの量のＨＳＡ；及び約０．００１ｍｇ〜約０．００３ｍｇの量のＩＬ−２を含む、請求項４０に記載の凍結保存組成物。
【請求項４８】
１００ｍＬの前記組成物は、約１×１０７〜約１×１０１１個の量の前記ＴＩＬ集団；約１０％のＤＭＳＯから本質的になる、約３０ｍＬ〜約７０ｍＬの量の前記凍結保護培地；約３０ｍＬ〜約７０ｍＬの量の前記電解質溶液；約０．３ｇ〜約０．７ｇの量のＨＳＡ；及び約０．００１ｍｇ〜約０．００３ｍｇの量のＩＬ−２から本質的になる、請求項４０に記載の凍結保存組成物。
【請求項４９】
癌を有する対象を処置することにおける使用のためのものである、請求項４０に記載の凍結保存組成物。
【請求項５０】
ＴＩＬ集団、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む凍結保護培地及び電解質溶液を含む凍結保存組成物であって、１００ｍＬの前記組成物は、約１×１０７〜約１×１０１１個の量の前記ＴＩＬ集団；約１０％のＤＭＳＯを含む、約３０ｍＬ〜約７０ｍＬの量の前記凍結保護培地；約３０ｍＬ〜約７０ｍＬの量の前記電解質溶液；約０．３ｇ〜約０．７ｇの量のＨＳＡ；及び約０．００１ｍｇ〜約０．００３ｍｇの量のＩＬ−２を含む、凍結保存組成物。
【請求項５１】
ＴＩＬ集団、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む凍結保護培地及び電解質溶液から本質的になる凍結保存組成物であって、１００ｍＬの前記組成物は、約１×１０７〜約１×１０１１個の量の前記ＴＩＬ集団；約１０％のＤＭＳＯから本質的になる、約３０ｍＬ〜約７０ｍＬの量の前記凍結保護培地；約３０ｍＬ〜約７０ｍＬの量の前記電解質溶液；約０．３ｇ〜約０．７ｇの量のＨＳＡ；及び約０．００１ｍｇ〜約０．００３ｍｇの量のＩＬ−２から本質的になる、凍結保存組成物。
【請求項５２】
請求項４０〜５１のいずれか一項に記載の凍結保存組成物を含む輸注バッグ。
【請求項５３】
HypoThermosol含有輸注バッグである、請求項５２の輸注バッグ。
【請求項５４】
請求項４０〜５１のいずれか一項に記載の凍結保存組成物を含む貯蔵バッグ。
【請求項５５】
CryoStore CS750冷凍バッグである、請求項５４に記載の貯蔵バッグ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[0001]  本願は、２０１８年３月２９日に出願された米国特許出願公開第１５／９４０，９０１号に対する優先権を主張するものであり、この特許出願は、全体として参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
[0002]  腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の養子移入を用いた大型の難治性癌の治療は、予後不良の患者に対する強力な治療手法を表す。Gattinoni, et al., Nat. Rev. Immunol. 2006, 6, 383-393。免疫療法の成功には多量のＴＩＬが必要であり、商業化に向けてロバストで信頼性のある方法が求められている。これは、細胞拡大培養に伴う技術上、物流上及び規制上の問題に起因して、実現が課題となっている。ＩＬ−２ベースのＴＩＬ拡大培養と、それに続く「迅速拡大培養法」（ＲＥＰ）が、その速さ及び効率から、ＴＩＬ拡大培養に好ましい方法となりつつある。Dudley, et al., Science 2002, 298, 850-54；Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-57；Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-39；Riddell, et al., Science 1992, 257, 238-41；Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42。ＲＥＰは１４日の期間でＴＩＬの１，０００倍の拡大をもたらすことができるが、それにはフィーダー細胞として、多くの場合に複数のドナーからの、大過剰の（例えば２００倍の）照射した同種異系末梢血単核球（ＰＢＭＣ、単核細胞（ＭＮＣ）としても知られている）並びに抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）及び高用量のＩＬ−２が必要である。Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
[0003]  現在のＴＩＬ製造工程は、長さ、経費、無菌性の懸念及び本明細書中に記載される他の要因によって制限されるため、かかる工程を商業化する可能性は大幅に制限されており、これら及び他の理由により、現時点では利用できる商業工程は無い。商業規模の製造及び複数の臨床センターのヒト患者に使用する規制当局の承認に適したＴＩＬ製造工程及びかかる工程に基づく治療法を提供する必要性が急務である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
[0004]  本発明は、ＴＩＬを拡大培養し、治療用ＴＩＬ集団を産生するための改善及び／又は短縮方法を提供する。
【０００５】
[0005]  本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法も提供し、この方法は、
（ａ）患者から得られた腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に加えること；
（ｃ）ＩＬ−２及び任意選択でＯＫＴ−３を含む細胞培養培地で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約３〜１４日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｄ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、任意選択でＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を入手するために約７〜１４日間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器で実施され、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｅ）ステップ（ｄ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生する、回収すること；及び
（ｆ）ステップ（ｅ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放せずに発生する、移すこと
を含む。
【０００６】
[0006]  一部の実施形態において、本方法は、凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）で回収したＴＩＬ集団を含む輸注バッグを凍結保存するステップを更に含む。
【０００７】
[0007]  一部の実施形態において、凍結保存プロセスは、回収したＴＩＬ集団と凍結保存培地との１：１比を使用して実施される。
【０００８】
[0008]  一部の実施形態において、抗原提示細胞は末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは照射され、且つ同種異系である。一部の実施形態において、ＰＢＭＣはステップ（ｄ）において９〜１４日目のいずれかに細胞培養物に加えられる。一部の実施形態において、抗原提示細胞は人工抗原提示細胞である。
【０００９】
[0009]  一部の実施形態において、ステップ（ｅ）の回収は、膜ベースの細胞処理系を使用して実施される。
【００１０】
[0010]  一部の実施形態において、ステップ（ｅ）の回収は、LOVO細胞処理系を使用して実施される。
【００１１】
[0011]  一部の実施形態において、複数の断片は、約４〜約５０個の断片を含み、各断片は約２７ｍｍ３の容積を有する。
【００１２】
[0012]  一部の実施形態において、複数の断片は、約１３００ｍｍ３〜約１５００ｍｍ３の総容積を有する約３０〜約６０個の断片を含む。
【００１３】
[0013]  一部の実施形態において、複数の断片は、約１３５０ｍｍ３の総容積を有する約５０個の断片を含む。
【００１４】
[0014]  一部の実施形態において、複数の断片は、約１ｇ〜約１．５ｇの総質量を有する約５０個の断片を含む。
【００１５】
[0015]  一部の実施形態において、細胞培養培地は、Ｇコンテナ及びXuri細胞培養バッグからなる群から選択される容器内に提供される。
【００１６】
[0016]  一部の実施形態において、ステップ（ｄ）の細胞培養培地は、ＩＬ−１５及び／又はＩＬ−２１を更に含む。
【００１７】
[0017]  一部の実施形態において、ＩＬ−２濃度は、約１０，０００ＩＵ／ｍＬ〜約５，０００ＩＵ／ｍＬである。
【００１８】
[0018]  一部の実施形態において、ＩＬ−１５濃度は、約５００ＩＵ／ｍＬ〜約１００ＩＵ／ｍＬである。
【００１９】
[0019]  一部の実施形態において、ＩＬ−２１濃度は、約２０ＩＵ／ｍＬ〜約０．５ＩＵ／ｍＬである。
【００２０】
[0020]  一部の実施形態において、ステップ（ｆ）の輸注バッグは、HypoThermosol含有輸注バッグである。
【００２１】
[0021]  一部の実施形態において、凍結保存培地は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む。一部の実施形態において、凍結保存培地は、７％〜１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む。
【００２２】
[0022]  一部の実施形態において、ステップ（ｃ）の第１の期間及びステップ（ｅ）の第２の期間は、１０日、１１日又は１２日の期間内にそれぞれ個別に実施される。
【００２３】
[0023]  一部の実施形態において、ステップ（ｃ）の第１の期間及びステップ（ｅ）の第２の期間は、１１日の期間内にそれぞれ個別に実施される。
【００２４】
[0024]  一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｆ）は約１０日〜約２２日の期間内に実施される。
【００２５】
[0025]  一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｆ）は約２０日〜約２２日の期間内に実施される。
【００２６】
[0026]  一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｆ）は約１５日〜約２０日の期間内に実施される。
【００２７】
[0027]  一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｆ）は約１０日〜約２０日の期間内に実施される。
【００２８】
[0028]  一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｆ）は約１０日〜約１５日の期間内に実施される。
【００２９】
[0029]  一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｆ）は、２２日以内に実施される。
【００３０】
[0030]  一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｆ）は、２０日以内に実施される。
【００３１】
[0031]  一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｆ）は、１５日以内に実施される。
【００３２】
[0032]  一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｆ）は、１０日以内に実施される。
【００３３】
[0033]  一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｆ）及び凍結保存は２２日以内に実施される。
【００３４】
[0034]  一部の実施形態において、ステップ（ｅ）で回収した治療用ＴＩＬ集団は、治療上有効な投薬量のＴＩＬとなるのに十分なＴＩＬを含む。
【００３５】
[0035]  一部の実施形態において、治療上有効な投薬量となるのに十分なＴＩＬの数は約２．３×１０１０〜約１３．７×１０１０個である。
【００３６】
[0036]  一部の実施形態において、ステップ（ｂ）〜（ｅ）は、単一の容器で実施され、ステップ（ｂ）〜（ｅ）を単一の容器で実施すると、ステップ（ｂ）〜（ｅ）を２つ以上の容器で実施した場合に比べ切除された腫瘍毎のＴＩＬ収量が増加する結果となる。
【００３７】
[0037]  一部の実施形態において、抗原提示細胞は、系を開放せずにステップ（ｄ）の第２の期間中にＴＩＬに追加される。
【００３８】
[0038]  一部の実施形態において、ステップ（ｄ）の第３のＴＩＬ集団は、対象に投与されたとき、有効性の増加、インターフェロンガンマ産生の増加、ポリクローナル性の増加、平均ＩＰ−１０の増加及び／又は平均ＭＣＰ−１の増加を提供する。
【００３９】
[0039]  一部の実施形態において、ステップ（ｄ）の第３のＴＩＬ集団は、対象に投与されたとき、少なくとも５倍以上のインターフェロンガンマ産生を提供する。
【００４０】
[0040]  一部の実施形態において、ステップ（ｄ）の第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団に比べて、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の亜集団の増加を含む治療用ＴＩＬ集団であり、治療用ＴＩＬ集団中のエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ２７＋の発現、ＣＤ２８＋の発現、より長いテロメア、ＣＤ５７発現の増加及びＣＤ５６発現の減少からなる群から選択される１つ以上の特徴を呈する。
【００４１】
[0041]  一部の実施形態において、第３のＴＩＬ集団から得られたエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ５７発現の増加及びＣＤ５６発現の減少を呈する。
【００４２】
[0042]  一部の実施形態において、微生物汚染のリスクは、開放系と比較して低減される。
【００４３】
[0043]  一部の実施形態において、ステップ（ｇ）からのＴＩＬは、患者に注入される。
【００４４】
[0044]  一部の実施形態において、複数の断片は、約４個の断片を含む。
【００４５】
[0045]  本発明は、拡大培養した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を投与することを含む癌を有する対象の処置方法も提供し、この方法は、
（ａ）対象から得られた腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に加えること；
（ｃ）ＩＬ−２任意選択でＯＫＴ−３を含む細胞培養培地で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約３〜１４日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｄ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、任意選択でＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を入手するために約７〜１４日間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｅ）ステップ（ｄ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生する、回収すること；及び
（ｆ）ステップ（ｅ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放せずに発生する、移すこと；
（ｇ）凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）からの回収されたＴＩＬ集団を含む輸注バッグを任意選択で凍結保存すること；並びに
（ｈ）ステップ（ｇ）における輸注バッグから治療上有効な投薬量の第３のＴＩＬ集団を患者に投与すること
を含む。
【００４６】
[0046]  一部の実施形態において、ステップ（ｅ）で回収した治療用ＴＩＬ集団は、ステップ（ｈ）の治療上有効な投薬量のＴＩＬを投与するのに十分なＴＩＬを含む。
【００４７】
[0047]  一部の実施形態において、ステップ（ｈ）における治療上有効な投薬量の投与に十分なＴＩＬの数は約２．３×１０１０〜約１３．７×１０１０個である。
【００４８】
[0048]  一部の実施形態において、抗原提示細胞（ＡＰＣ）はＰＢＭＣである。
【００４９】
[0049]  一部の実施形態において、ＰＢＭＣはステップ（ｄ）において９〜１４日目のいずれかに細胞培養物に加えられる。
【００５０】
[0050]  一部の実施形態において、ステップ（ｈ）で治療上有効な投薬量のＴＩＬ細胞を投与する前に、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが患者に投与されている。
【００５１】
[0051]  一部の実施形態において、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間のシクロホスファミドの投与ステップと、それに続く２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間のフルダラビンの投与ステップを含む。
【００５２】
[0052]  一部の実施形態において、本方法は、ステップ（ｈ）で患者にＴＩＬ細胞を投与した翌日に始まる高用量ＩＬ−２レジメンで患者を処置するステップを更に含む。
【００５３】
[0053]  一部の実施形態において、高用量ＩＬ−２レジメンは、忍容量まで８時間毎に１５分ボーラス静脈内注入として投与される６００，０００又は７２０，０００ＩＵ／ｋｇを含む。
【００５４】
[0054]  一部の実施形態において、ステップ（ｄ）の第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団に比べて、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の亜集団の増加を含む治療用ＴＩＬ集団であり、治療用ＴＩＬ集団中のエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ２７＋の発現、ＣＤ２８＋の発現、より長いテロメア、ＣＤ５７発現の増加及びＣＤ５６発現の減少からなる群から選択される１つ以上の特徴を呈する。
【００５５】
[0055]  一部の実施形態において、治療用ＴＩＬ集団のエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ５７発現の増加及びＣＤ５６発現の減少を呈する。
【００５６】
[0056]  一部の実施形態において、癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、腎癌及び腎細胞癌からなる群から選択される。
【００５７】
[0057]  一部の実施形態において、癌は、黒色腫、ＨＮＳＣＣ、子宮頸癌及びＮＳＣＬＣからなる群から選択される。
【００５８】
[0058]  一部の実施形態において、癌は黒色腫である。
【００５９】
[0059]  一部の実施形態において、癌はＨＮＳＣＣである。
【００６０】
[0060]  一部の実施形態において、癌は子宮頸癌である。
【００６１】
[0061]  一部の実施形態において、癌はＮＳＣＬＣである。
【００６２】
[0062]  本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法も提供し、この方法は、
（ａ）患者から切除された腫瘍からの処理された腫瘍断片を閉鎖系に加えて、第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）ＩＬ−２及び任意選択でＯＫＴ−３を含む細胞培養培地で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約３〜１４日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ａ）からステップ（ｂ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｃ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、任意選択でＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を入手するために約７〜１４日間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｄ）ステップ（ｃ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放せずに発生する、回収すること；及び
（ｅ）ステップ（ｄ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｄ）から（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生する、移すこと
を含む。
【００６３】
[0063]  一部の実施形態において、ステップ（ｄ）で回収した治療用ＴＩＬ集団は、治療上有効な投薬量のＴＩＬとなるのに十分なＴＩＬを含む。
【００６４】
[0064]  一部の実施形態において、治療上有効な投薬量となるのに十分なＴＩＬの数は約２．３×１０１０〜約１３．７×１０１０個である。
【００６５】
[0065]  一部の実施形態において、本方法は、凍結保存プロセスを使用して、回収したＴＩＬ集団を含む輸注バッグを凍結保存するステップを更に含む。
【００６６】
[0066]  一部の実施形態において、凍結保存プロセスは、回収したＴＩＬ集団と凍結保存培地との１：１比を使用して実施される。
【００６７】
[0067]  一部の実施形態において、抗原提示細胞は末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。
【００６８】
[0068]  一部の実施形態において、ＰＢＭＣは照射され、且つ同種異系である。
【００６９】
[0069]  前記ＰＢＭＣがステップ（ｃ）において９〜１４日目のいずれかに前記細胞培養物に加えられる、請求項６８に記載の方法。
【００７０】
[0070]  一部の実施形態において、抗原提示細胞は人工抗原提示細胞である。
【００７１】
[0071]  一部の実施形態において、ステップ（ｄ）の回収は、LOVO細胞処理系を使用して実施される。
【００７２】
[0072]  一部の実施形態において、複数の断片は、約４〜約５０個の断片を含み、各断片は約２７ｍｍ３の容積を有する。
【００７３】
[0073]  一部の実施形態において、複数の断片は、約１３００ｍｍ３〜約１５００ｍｍ３の総容積を有する約３０〜約６０個の断片を含む。
【００７４】
[0074]  一部の実施形態において、複数の断片は、約１３５０ｍｍ３の総容積を有する約５０個の断片を含む。
【００７５】
[0075]  一部の実施形態において、複数の断片は、約１ｇ〜約１．５ｇの総質量を有する約５０個の断片を含む。
【００７６】
[0076]  一部の実施形態において、複数の断片は、約４個の断片を含む。
【００７７】
[0077]  一部の実施形態において、第２の細胞培養培地は、Ｇコンテナ及びXuri細胞培養バッグからなる群から選択される容器内に提供される。
【００７８】
[0078]  一部の実施形態において、ステップ（ｅ）の輸注バッグは、HypoThermosol含有輸注バッグである。
【００７９】
[0079]  一部の実施形態において、ステップ（ｂ）の第１の期間及びステップ（ｃ）の第２の期間は、１０日、１１日又は１２日の期間内にそれぞれ個別に実施される。
【００８０】
[0080]  一部の実施形態において、ステップ（ｂ）の第１の期間及びステップ（ｃ）の第２の期間は、１１日の期間内にそれぞれ個別に実施される。
【００８１】
[0082]  一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｅ）は約１０日〜約２２日の期間内に実施される。
【００８２】
[0082]  一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｅ）は約１０日〜約２０日の期間内に実施される。
【００８３】
[0083]  一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｅ）は約１０日〜約１５日の期間内に実施される。
【００８４】
[0084]  一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｅ）は、２２日以内に実施される。
【００８５】
[0085]  一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｅ）及び凍結保存は２２日以内に実施される。
【００８６】
[0086]  一部の実施形態において、ステップ（ｂ）〜（ｅ）は、単一の容器で実施され、ステップ（ｂ）〜（ｅ）を単一の容器で実施すると、ステップ（ｂ）〜（ｅ）を２つ以上の容器で実施した場合に比べ切除された腫瘍毎のＴＩＬ収量が増加する結果となる。
【００８７】
[0087]  一部の実施形態において、抗原提示細胞は、系を開放せずにステップ（ｃ）の第２の期間中にＴＩＬに追加される。
【００８８】
[0088]  一部の実施形態において、ステップ（ｄ）の第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団に比べて、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の亜集団の増加を含む治療用ＴＩＬ集団であり、治療用ＴＩＬ集団中で得られたエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ２７＋の発現、ＣＤ２８＋の発現、より長いテロメア、ＣＤ５７発現の増加及びＣＤ５６発現の減少からなる群から選択される１つ以上の特徴を呈する。
【００８９】
[0089]  一部の実施形態において、治療用ＴＩＬ集団で得られたエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ５７発現の増加及びＣＤ５６発現の減少を呈する。
【００９０】
[0090]  一部の実施形態において、微生物汚染のリスクは、開放系と比較して低減される。
【００９１】
[0091]  一部の実施形態において、ステップ（ｅ）からのＴＩＬは、患者に注入される。
【００９２】
[0092]  一部の実施形態において、閉鎖型容器は単一のバイオリアクターを含む。
【００９３】
[0093]  一部の実施形態において、閉鎖型容器はG-REX-10を含む。
【００９４】
[0094]  一部の実施形態において、閉鎖型容器はG-REX-100を含む。
【００９５】
[0095]  一部の実施形態において、ステップ（ｄ）で、抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、２５：１〜１００：１のＡＰＣ：ＴＩＬ比で第２のＴＩＬ集団の細胞培養物に加えられる。
【００９６】
[0096]  一部の実施形態において、細胞培養物は、２．５×１０９ＡＰＣ対１００×１０６ＴＩＬの比を有する。
【００９７】
[0097]  一部の実施形態において、ステップ（ｃ）で、抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、２５：１〜１００：１のＡＰＣ：ＴＩＬ比で第２のＴＩＬ集団の細胞培養物に加えられる。
【００９８】
[0098]  一部の実施形態において、細胞培養物は、２．５×１０９ＡＰＣ対１００×１０６ＴＩＬの比を有する。
【００９９】
[0099]  本発明は、癌を有する対象の処置に使用するための拡大培養ＴＩＬの集団も提供し、拡大培養ＴＩＬの集団は、
（ａ）対象から得られた腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に加えること；
（ｃ）ＩＬ−２を含む細胞培養培地で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせることすることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約３〜１４日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｄ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、任意選択でＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を入手するために約７〜１４日間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｅ）ステップ（ｄ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生する、回収すること；及び
（ｆ）ステップ（ｅ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放せずに発生する、移すこと；並びに
（ｇ）凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）からの回収されたＴＩＬ集団を含む輸注バッグを任意選択で凍結保存すること
を含む方法によって得ることができる第３のＴＩＬ集団である。
【０１００】
[00100]  一部の実施形態において、ＴＩＬの集団は、上記及び本明細書に記載の方法に従って癌を有する対象を処置するために使用され、この方法は、上記及び本明細書に列挙される特徴の１つ以上を更に含む。一部の実施形態において、ＴＩＬ集団は、上記及び本明細書に記載の方法に従う、癌を有する対象の処置における使用のためのものであり、この方法は、上記及び本明細書に列挙される特徴の１つ以上を更に含む。
【０１０１】
[00101]  本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法も提供し、この方法は、
（ａ）患者から得られた腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に加えること；
（ｃ）ＩＬ−２、任意選択でＯＫＴ−３及び任意選択で腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）アゴニストを含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約３〜１４日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｄ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、任意選択でＯＫＴ−３及び任意選択で腫瘍壊死因子スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）アゴニスト並びに抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約７〜１４日間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｅ）ステップ（ｄ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生する、回収すること；及び
（ｆ）ステップ（ｅ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放せずに発生する、移すこと
を含む。
【０１０２】
[00102]  本発明は、拡大培養された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を投与することを含む、癌を有する対象を処置する方法も提供し、この方法は、
（ａ）患者から得られた腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することにより、対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に加えること；
（ｃ）ＩＬ−２、任意選択でＯＫＴ−３及び任意選択で腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）アゴニストを含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約３〜１４日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｄ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、任意選択でＯＫＴ−３及び任意選択で腫瘍壊死因子スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）アゴニスト並びに抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約７〜１４日間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｅ）ステップ（ｄ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生する、回収すること；及び
（ｆ）ステップ（ｅ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放せずに発生する、移すこと；
（ｇ）任意選択で、凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）からの回収されたＴＩＬ集団を含む輸注バッグを凍結保存すること；並びに
（ｈ）ステップ（ｇ）における輸注バッグから治療上有効な投薬量の第３のＴＩＬ集団を患者に投与すること
を含む。
【０１０３】
[00103]  一部の実施形態において、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）アゴニストは、４−１ＢＢ抗体である。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、４−１ＢＢアゴニストであり、４−１ＢＢアゴニストは、ウレルマブ、ウトミルマブ、ＥＵ−１０１、融合タンパク質並びにその断片、誘導体、変異体、バイオシミラー及び組み合わせからなる群から選択される。
【０１０４】
[00104]  本発明は、上記及び本明細書に記載のＴＩＬ集団、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む凍結保護培地及び電解質溶液を含む凍結保存組成物も提供する。
【０１０５】
[00105]  一部の実施形態において、凍結保存組成物は、１つ以上の安定剤及び１つ以上のリンパ球成長因子を更に含む。一部の実施形態において、１つ以上の安定剤は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含み、及び１つ以上のリンパ球成長因子は、ＩＬ−２を含む。一部の実施形態において、組成物は、任意選択でＯＫＴ−３を含む。
【０１０６】
[00106]  一部の実施形態において、ＤＭＳＯ及び電解質溶液は、約１．１：１〜約１：１．１の比で存在する。一部の実施形態において、ＤＭＳＯ及び電解質溶液は、約１：１の比で存在する。
【０１０７】
[00107]  一部の実施形態において、１００ｍＬの凍結保存組成物は、約１×１０６〜約９×１０１４個の量のＴＩＬ集団、約３０ｍＬ〜約７０ｍＬの量の、ＤＭＳＯを含む凍結保護培地、約３０ｍＬ〜約７０ｍＬの量の電解質溶液、約０．１ｇ〜約１．０ｇの量のＨＳＡ及び約０．００１ｍｇ〜約０．００５ｍｇの量のＩＬ−２を含む。
【０１０８】
[00108]  一部の実施形態において、１００ｍＬの凍結保存組成物は、約１×１０７〜約１×１０１１個の量のＴＩＬ集団；約１０％のＤＭＳＯを含む、約３０ｍＬ〜約７０ｍＬの量の凍結保護培地；約３０ｍＬ〜約７０ｍＬの量の電解質溶液；約０．３ｇ〜約０．７ｇの量のＨＳＡ；及び約０．００１ｍｇ〜約０．００３ｍｇの量のＩＬ−２を含む。
【０１０９】
[00109]  一部の実施形態において、１００ｍＬの凍結保存組成物は、約１×１０７〜約１×１０１１個の量のＴＩＬ集団；約１０％のＤＭＳＯから本質的になる、約３０ｍＬ〜約７０ｍＬの量の凍結保護培地；約３０ｍＬ〜約７０ｍＬの量の電解質溶液；約０．３ｇ〜約０．７ｇの量のＨＳＡ；及び約０．００１ｍｇ〜約０．００３ｍｇの量のＩＬ−２から本質的になる。
【０１１０】
[00110]  一部の実施形態において、組成物は、癌を有する対象を処置することにおける使用のためのものである。
【０１１１】
[00111]  本発明は、ＴＩＬ集団、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む凍結保護培地及び電解質溶液を含む凍結保存組成物も提供し、ここで、１００ｍＬの組成物は、約１×１０７〜約１×１０１１個の量のＴＩＬ集団；約１０％のＤＭＳＯを含む、約３０ｍＬ〜約７０ｍＬの量の凍結保護培地；約３０ｍＬ〜約７０ｍＬの量の電解質溶液；約０．３ｇ〜約０．７ｇの量のＨＳＡ；及び約０．００１ｍｇ〜約０．００３ｍｇの量のＩＬ−２を含む。
【０１１２】
[00112]  本発明は、ＴＩＬ集団、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む凍結保護培地及び電解質溶液から本質的になる凍結保存組成物も提供し、ここで、１００ｍＬの組成物は、約１×１０７〜約１×１０１１個の量のＴＩＬ集団；約１０％のＤＭＳＯから本質的になる、約３０ｍＬ〜約７０ｍＬの量の凍結保護培地；約３０ｍＬ〜約７０ｍＬの量の電解質溶液；約０．３ｇ〜約０．７ｇの量のＨＳＡ；及び約０．００１ｍｇ〜約０．００３ｍｇの量のＩＬ−２から本質的になる。
【０１１３】
[00113]  本発明は、上記及び本明細書に記載されるような凍結保存組成物を含む輸注バッグも提供する。
【０１１４】
[00114]  一部の実施形態において、輸注バッグは、HypoThermosol含有輸注バッグである。
【０１１５】
[00115]  本発明は、上記及び本明細書に記載されるような凍結保存組成物を含む貯蔵バッグも提供する。
【０１１６】
[00116]  いくつかの実施形態では、請求項５４に記載の貯蔵バッグであって、CryoStore CS750冷凍バッグである貯蔵バッグである。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
図面の簡単な説明
【図１】[00117]プロセス２Ａ、ＴＩＬ製造の２２日間プロセスの実施形態の概略図を示す。
【図２】[00118]ＴＩＬ製造のための１Ｃプロセス及び２Ａプロセスの実施形態の比較を示す。
【図３】[00119]１Ｃプロセスのタイムラインを示す。
【図４】[00120]より高い細胞数のために、投与及び共療法ステップを含む、ＴＩＬ製造のためのプロセス２Ａを使用したＴＩＬ療法の実施形態のプロセスを示す。
【図５】[00121]より低い細胞数のために、投与及び共療法ステップを含む、ＴＩＬ製造のためのプロセス２Ａを使用したＴＩＬ療法の実施形態のプロセスを示す。
【図６】[00122]２Ａプロセスの実施形態の詳細な概略図を示す。
【図７】[00123]新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬ間のインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）の発現を比較することにより、２Ａプロセスの実施形態を使用して調製されたＴＩＬの特性を示す。
【図８】[00124]新鮮ＴＩＬと解凍ＴＩＬのＣＤ３を調べることにより、２Ａプロセスの実施形態を使用して調製されたＴＩＬの特性を示す。
【図９】[00125]新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬ間の回復を調べることにより、２Ａプロセスの実施形態を使用して調製されたＴＩＬの特性を示す。
【図１０】[00126]新鮮ＴＩＬと解凍ＴＩＬの生存率を調べることにより、２Ａプロセスの実施形態を使用して調製されたＴＩＬの特性を示す。
【図１１Ａ】[00127]凍結保存ステップを含む２Ａプロセスの実施形態の主要なステップを示す。
【図１１Ｂ】[00127]凍結保存ステップを含む２Ａプロセスの実施形態の主要なステップを示す。
【図１１Ｃ】[00127]凍結保存ステップを含む２Ａプロセスの実施形態の主要なステップを示す。
【図１２】[00128]１Ｃプロセス及び２Ａプロセスの実施形態から得られた細胞数を示す。
【図１３】[00129]１Ｃプロセス及び２Ａプロセスの実施形態から得られた細胞生存率を示す。
【図１４】[00130]１Ｃプロセス及び２Ａプロセスの実施形態で得られたＴＩＬのフローサイトメトリーにより測定されたＣＤ４５及びＣＤ３細胞（すなわちＴ細胞）の割合を示す。
【図１５】[00131]図８０及び９８データの生成に使用されたアッセイとは異なるアッセイにより測定された、１Ｃプロセス及び２Ａプロセスの実施形態で得られたＩＦＮ−γ遊離を示す。
【図１６】[00132]図８０及び９８データの生成に使用されたアッセイとは異なるアッセイにより測定された、１Ｃプロセス及び２Ａプロセスの実施形態で得られたＩＦＮ−γ遊離を示す。
【図１７】[00133]１Ｃプロセス及び２Ａプロセスの実施形態から得られたＴＣＲａ／ｂ及びＮＫ細胞の割合を示す。
【図１８】[00134]１Ｃプロセス及び２Ａプロセスの実施形態により得られたＴＩＬのフローサイトメトリーにより測定されたＣＤ８＋及びＣＤ４＋細胞の割合並びに各サブセット間の比率を示す。
【図１９】[00135]１Ｃプロセス及び２Ａプロセスの実施形態から得られたＴＩＬのフローサイトメトリーにより測定されたメモリーサブセットの割合を示す。
【図２０】[00136]１Ｃプロセス及び２Ａプロセスの実施形態から得られたＴＩＬのフローサイトメトリーによるＰＤ−１、ＬＡＧ−３及びＴＩＭ−３発現の割合を示す。
【図２１】[00137]１Ｃプロセス及び２Ａプロセスの実施形態から得られたＴＩＬのフローサイトメトリーによる４ー１ＢＢ、ＣＤ６９及びＫＬＲＧ１発現の割合を示す。
【図２２】[00138]１Ｃプロセス及び２Ａプロセスの実施形態から得られたＴＩＬのフローサイトメトリーによるＴＩＧＩＴ発現の割合を示す。
【図２３】[00139]１Ｃプロセス及び２Ａプロセスの実施形態から得られたＴＩＬのフローサイトメトリーによるＣＤ２７及びＣＤ２８発現の割合を示す。
【図２４】[00140]フローＦＩＳＨテロメア長分析の結果を示す。
【図２５】[00141]（外れ値データポイントの削除後の）フローＦＩＳＨテロメア長分析の結果を示す。
【図２６】[00142]プロセス１Ｃ及びプロセス２Ａの実施形態で処理されたコホートを含む臨床試験デザインを示す。
【図２７】[00143]ステップＡ〜Ｆの概要を提供する例示的な２Ａプロセスチャート。
【図２８Ａ】[00144]プロセス２Ａのプロセスフローチャート。
【図２８Ｂ】[00144]プロセス２Ａのプロセスフローチャート。
【図２８Ｃ】[00144]プロセス２Ａのプロセスフローチャート。
【図２９】[00145]プロセス２Ａデータ収集計画のプロセスフローチャート
【図３０】[00146]新鮮ＴＩＬと解凍ＴＩＬの生存率
【図３１】[00147]ｒｅ−ＲＥＰ培養での新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬの拡大培養
【図３２】[00148]血液代謝産物の通常の検査値。
【図３３Ａ】[00149]プロセス２ＡのプレＲＥＰ  ＴＩＬの代謝物分析。
【図３３Ｂ】[00149]プロセス２ＡのプレＲＥＰ  ＴＩＬの代謝物分析。
【図３４】[00150]プロセス２ＡのプレＲＥＰ  ＴＩＬ細胞培養におけるＩＬ−２の定量。
【図３５】[00151]ＴＩＬの抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８及び抗４−１ＢＢ刺激による細胞傷害性サイトカインＩＦＮ−γの遊離。
【図３６】[00152]抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８及びＴＩＬの抗４−１ＢＢ刺激に続くグランザイムＢ遊離。
【図３７Ａ】[00153]ＴＣＲ  αβ＋ＴＩＬ。ほとんどのヒトＣＤ３＋Ｔ細胞は、ＭＨＣを抑制した方法で、抗原を認識するα及びβ鎖によって形成される受容体を発現する。Ｍ１０６１を除き、新鮮ＴＩＬ産物及び解凍ＴＩＬ産物には、ＴＩＬを発現するＴＣＲ  αβ＋が８０％以上含まれていた。新鮮ＴＩＬ及び解凍したＴＩＬの両方で、ＴＣＲ  αβの同等の発現が見られた（Ｐ値  −０．９５８２）。Ｒｅ−ＲＥＰ後にＴＩＬを発現するＴＣＲ  αβ＋の減少が観察されたにもかかわらず、この減少はＲｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬ内では有意ではなかった（ｐ＝０．２４）。
【図３７Ｂ】[00153]ＴＣＲ  αβ＋ＴＩＬ。ほとんどのヒトＣＤ３＋Ｔ細胞は、ＭＨＣを抑制した方法で、抗原を認識するα及びβ鎖によって形成される受容体を発現する。ＴＣＲ  αβを発現する新鮮ＲＥ−ＲＥＰ及び解凍ＲＥ−ＲＥＰ  ＴＩＬには、それぞれ新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬと比べて９．２％及び１５．７％の減少があった。
【図３８Ａ】[00154]ＴＣＲ  αβーＣＤ５６＋。腫瘍浸潤ナチュラルキラー（ＮＫ）及びＮＫＴ細胞は、ＭＨＣ発現を欠く細胞並びにＣＤ１提示脂質抗原を溶解し、免疫調節性サイトカインを提供する能力も有する。ただし、強力なＮＫ細胞浸潤は進行疾患と関連しており、癌の発生を促進する可能性がある。Ｍ１０６３を除く全ての例で、新鮮ＴＩＬと比較して、解凍ＴＩＬのＮＫ集団の減少は有意ではないものの、わずかにあったことを示している（ｐ＝０．２７）。ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬ集団間に有意な差は認められなかった（ｐ＝０．８８）。
【図３８Ｂ】[00154]ＴＣＲ  αβーＣＤ５６＋。腫瘍浸潤ナチュラルキラー（ＮＫ）及びＮＫＴ細胞は、ＭＨＣ発現を欠く細胞並びにＣＤ１提示脂質抗原を溶解し、免疫調節性サイトカインを提供する能力も有する。ただし、強力なＮＫ細胞浸潤は進行疾患と関連しており、癌の発生を促進する可能性がある。新鮮ＴＩＬ、新鮮ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬ及び解凍ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬは、示すようにＣＤ５６の同様の発現を実証する。解凍ＴＩＬ産物は、おそらく冷凍保存手順の結果として、新鮮ＴＩＬ（３．０±２．２）よりＮＫ発現細胞が少なかった（１．９±１．３）。
【図３９Ａ】[00155]ＣＤ４＋細胞。個々の条件では、ＣＤ４集団に実質的な差は観察されなかった。各条件での平均ＣＤ４集団を表す。
【図３９Ｂ】[00155]ＣＤ４＋細胞。個々の条件では、ＣＤ４集団に実質的な差は観察されなかった。表は、ＳＤ値及びＳＥＭ値を示す。新鮮ｒｅ−ＲＥＰ集団のＣＤ４集団にわずかな減少があり、これはＥＰ１１００１Ｔの新鮮ｒｅ−ＲＥＰ集団のＣＤ４の減少が主な原因である。
【図４０Ａ】[00156]ＣＤ８＋細胞。ＥＰ１１００１Ｔを除く全てで、新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬの両方が同等のＣＤ８＋集団を示した（Ｐ＝０．１０、有意な差なし）。ほとんどの実験で、新鮮ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬ産物でＴＩＬを発現するＣＤ８＋がわずかに減少した（Ｍ１０６１Ｔ及びＭ１０６５Ｔは例外）。解凍ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬのＣＤ８＋個体数は約１０〜３０％減少した。新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬの両方からのｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬの比較は、有意な差を示した（ｐ＝０．０３、スチューデントのｔ検定）。
【図４０Ｂ】[00156]ＣＤ８＋細胞。全ての条件でＴＩＬを発現するＣＤ８＋の平均値を示す。新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬの両方が同様の結果を示す。ただし、解凍したｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬ産物では、新鮮ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬと比較して、ＣＤ８＋集団が１０．８％減少した。
【図４１Ａ】[00157]ＣＤ４＋ＣＤ１５４＋細胞。ＣＤ１５４は、ＣＤ４０Ｌとしても知られ、活性化Ｔ細胞のマーカーである。異なる条件でＣＤ４＋ＣＤ１５４＋集団に実質的な差は観察されなかったが、ＥＰ１１００１Ｔの新鮮ｒｅ−ＲＥＰ  ＣＤ４＋ＴＩＬでは３４．１％の減少が観察された。ＣＤ１５４発現は、Ｍ１０６１Ｔ及びＭ１０６２Ｔでは測定されなかった。これらの実験は、拡大表現型パネルが配置される前に実施されたためである。
【図４１Ｂ】[00157]ＣＤ４＋ＣＤ１５４＋細胞。ＣＤ１５４は、ＣＤ４０Ｌとしても知られ、活性化Ｔ細胞のマーカーである。解凍ＴＩＬ状態のわずかな減少は、Ｍ１０６１Ｔ及びＭ１０６２Ｔで測定されなかったＣＤ１５４に起因する可能性がある。全ての条件は、ＣＤ４集団で非常に近いＣＤ１５４発現を示しており、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞を示唆している。
【図４２Ａ】[00158]ＣＤ８＋ＣＤ１５４＋細胞。ＣＤ８＋ＴＩＬに発現した活性化マーカーＣＤ１５４も分析された。Ａ）全体として、新鮮ＴＩＬ産物と解凍ＴＩＬ産物のＣＤ８＋集団のＣＤ１５４発現は低かった。ＣＤ１５４は主に活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞で発現するため、これは当然である。新鮮ＴＩＬ産物と解凍ＴＩＬ産物の両方でＣＤ１５４の発現を測定した場合、解凍ＴＩＬ産物でＣＤ１５４の発現に差は認められないか、増加したことが観察された。スチューデントのｔ検定は、２つの条件間に有意な差がないことを示した。新鮮ｒｅ−ＲＥＰと比較した解凍ｒｅ−ＲＥＰのＣＤ１５４発現の増加が、全ての実験で示された（ｐ＝０．０２）。
【図４２Ｂ】[00158]ＣＤ８＋ＣＤ１５４＋細胞。ＣＤ８＋ＴＩＬに発現した活性化マーカーＣＤ１５４も分析された。Ｂ）ＣＤ１５４発現の増加は、対応する産物と比較して、解凍ＴＩＬ及び解凍ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬ産物の両方で観察された。解凍ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬは、新鮮ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬと比較して、ＣＤ１５４発現の２９．１％の増加を示した。
【図４３Ａ】[00159]ＣＤ４＋ＣＤ６９＋細胞。ＣＤ６９は、刺激又は活性化後のＴ細胞の初期活性化マーカーである。Ａ）ＥＰ１１００１Ｔを除く全てのＴＩＬで、おそらくｒｅ−ＲＥＰ長（１１日ではなく７日）により、新鮮ｒｅ−ＲＥＰ及び解凍ｒｅ−ＲＥＰの両方がＣＤ６９発現のわずかな増加を示した。新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬ間に差は観察されなかった（ｐ＝０．８９）。新鮮ｒｅ−ＲＥＰ及び解凍ｒｅ−ＲＥＰにも差は観察されなかった（ｐ＝０．８２）。
【図４３Ｂ】[00159]ＣＤ４＋ＣＤ６９＋細胞。ＣＤ６９は、刺激又は活性化後のＴ細胞の初期活性化マーカーである。Ｂ）ＣＤ６９発現のわずかな増加がｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬ産物で観察される。（注記：Ｍ１０６１Ｔ及びＭ１０６２Ｔ解凍ＴＩＬ産物のいずれについてもＣＤ６９染色は実施されなかった。Ｍ１０６１Ｔ新鮮ＴＩＬ産物のＣＤ６９発現は３３．９％であった）。
【図４４Ａ】[00160]ＣＤ８＋ＣＤ６９＋細胞。ＣＤ４＋集団で観察されたように、図ＡはＣＤ８＋ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬのＣＤ６９発現の増加を示す。ＣＤ６９の発現は、新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬ（ｐ＝０．６８）又は新鮮ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬ及び解凍ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬ（ｐ＝０．７６）との間に有意な差を示さなかった。
【図４４Ｂ】[00160]ＣＤ８＋ＣＤ６９＋細胞。図Ｂは、ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬ産物のＣＤ６９発現にわずかな増加があるという観察結果を裏付けている。
【図４５Ａ】[00161]ＣＤ４＋ＣＤ１３７＋細胞。ＣＤ１３７（４ー１１３１３）は、ＴＣＲの活性化により誘導されるＴ細胞共刺激受容体である。これは、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞で活性化される。Ａ）ＣＤ１３７発現は、７日間の刺激後、ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬ集団の大幅な増加を示した。ただし、新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬ又は新鮮ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬ及び解凍ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬ間に差は観察されなかった（図Ｂの両方のケースでｐ＜０．０５は、この観察結果を裏付けている）。また、解凍ＴＩＬはＣＤ１３７発現のわずかな減少を示した。ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬのＣＤ１３７発現の増加は、２回目の７日間のｒｅ−ＲＥＰ刺激に起因すると考えられる。
【図４５Ｂ】[00161]ＣＤ４＋ＣＤ１３７＋細胞。ＣＤ１３７（４ー１１３１３）は、ＴＣＲの活性化により誘導されるＴ細胞共刺激受容体である。これは、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞で活性化される。
【図４６Ａ】[00162]ＣＤ８＋ＣＤ１３７＋細胞。Ａ）ＣＤ８＋集団はｒｅ−ＲＥＰ産物の全体的な増加を示した。
【図４６Ｂ】[00162]ＣＤ８＋ＣＤ１３７＋細胞。Ｂ）新鮮ｒｅ−ＲＥＰ産物は、新鮮ＴＩＬ産物と比較して、ＣＤ８＋ＣＤ１３７＋発現が３３．４％増加した。解凍ｒｅ−ＲＥＰ産物は、解凍ＴＩＬと比較して、ＣＤ８＋集団におけるＣＤ１３７発現の３３．１５％の増加も示した。新鮮ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬ及び解凍ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬ間に有意な差は観察されなかった。新鮮ＴＩＬを解凍ＴＩＬ産物と比較すると、同様の観察結果が見られる。ＣＤ１３７発現のこの増加は、ｒｅ−ＲＥＰの２回目の活性化に起因するものである可能性がある。（ＣＤ１３７発現は３回の実験では測定されなかったため、分析には６個のＴＩＬのみを使用したことに留意されたい。）
【図４７Ａ】[00163]ＣＤ４＋ＣＭ細胞。中央記憶（ＣＭ）集団は、ＣＤ４５ＲＡ−（陰性）及びＣＣＲ７＋（陽性）の発現によって定義される。Ａ）ｒｅ−ＲＥＰ条件でＣＭ集団の増加が観察された。Ｍ１０６３Ｔ及びＭ１０６４Ｔは、新鮮ＴＩＬ産物と比較して、解凍ＴＩＬから得られたＣＤ４＋集団でＣＭ発現の減少を示した。新鮮ＴＩＬ産物及び解凍ＴＩＬ産物（ｐ＝０．１６５８）も、新鮮ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬ及び解凍ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬ（ｐ＝０．５５３５）もＣＭ集団に有意な差を示さなかった。
【図４７Ｂ】[00163]ＣＤ４＋ＣＭ細胞。中央記憶（ＣＭ）集団は、ＣＤ４５ＲＡ−（陰性）及びＣＣＲ７＋（陽性）の発現によって定義される。Ｂ）ＣＭ集団の１４．４％及び１５．４％の増加が、それぞれ新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬと比較して、新鮮ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬ及び解凍ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬで観察された。
【図４８Ａ】[00164]ＣＤ８＋ＣＭ細胞。Ａ）ＣＤ８＋集団では、新鮮ＴＩＬ産物でＣＭ発現の劇的な増加が見られた。これはＴＩＬ産物には見られない。この増加は有意性に影響せず（ｐ＝０．３０８６）、新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬ間に差がないことを示唆している。同様の傾向がｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬ産物でも見られた。
【図４８Ｂ】[00164]ＣＤ８＋ＣＭ細胞。図４８Ｂ）解凍ＴＩＬと比較して、新鮮ＴＩＬのＣＭ集団の全体的な増加が観察された。数値は、新鮮ＴＩＬ及び新鮮ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬの差がわずか約２％であることを示している。新鮮ＴＩＬは、Ｍ１０６４Ｔに起因する非常に高い標準偏差を示した。Ｍ１０６４ＴのＣＭ発現を除外すると、新鮮ＴＩＬ産物及び解凍ＴＩＬ産物間で非常によく似たＣＭ発現が生じた（図示せず）。
【図４９Ａ】[00165]ＣＤ４＋ＥＭ細胞。エフェクターメモリー（ＥＭ）集団は、ＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＡの発現の欠如によって定義される。Ａ）予想どおり、新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬのＣＤ４＋集団は、高いレベルのエフェクターメモリー表現型を有していた。エフェクターメモリー発現の劇的な減少が、Ｍ１０５６Ｔ  ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬ集団で見つかった。また、他の５つの実験では、新鮮ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬ及び解凍ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬの両方でエフェクターメモリー表現型の減少が示された。
【図４９Ｂ】[00165]ＣＤ４＋ＥＭ細胞。エフェクターメモリー（ＥＭ）集団は、ＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＡの発現の欠如によって定義される。Ｂ）新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬの両方が、同様のエフェクターメモリー表現型の発現を示した。新鮮Ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬ及び新鮮Ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬの比較では、後者で１６％の減少が示された。解凍ＴＩＬと比較した場合、解凍Ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬ（９％）で同様の減少が観察された。
【図５０Ａ】[00166]ＣＤ８＋ＥＭ細胞。Ａ）新鮮ＴＩＬにおけるエフェクターメモリーの増加の同様のパターンが、ＣＤ８＋集団でも見られた。Ｍ１０６４Ｔには例外があり、新鮮ＴＩＬのエフェクターメモリプロファイルはわずか２０％であった。これは、Ａ及びＢに記載されているように、これらのＴＩＬの７３％がＣＭ表現型を有することに起因する。ｒｅ−ＲＥＰ産物からのＣＤ４＋ＴＩＬのエフェクターメモリー集団の減少を示す全ての試料は、ＣＤ８＋ＴＩＬの傾向と同じ傾向を示した。
【図５０Ｂ】[00166]ＣＤ８＋ＥＭ細胞。Ｂ）ＣＤ４＋ＴＩＬ集団とは異なり、ＣＤ８＋ＴＩＬは、新鮮ＴＩＬ、解凍ＴＩＬ及びｒｅ−ＲＥＰ産物で同様のエフェクターメモリー表現型を示した。（新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬの標準偏差が高いことに注意されたい。これは、Ｍ１０６４Ｔの新鮮ＴＩＬのエフェクターメモリー集団が少なく、Ｍ１０６１Ｔの解凍ＴＩＬ試料では発現がないことに起因する。）
【図５１Ａ】[00167]ＣＤ４＋ＣＤ２８＋細胞。ＣＤ２８発現は、幼若ＴＩＬが年齢とともに減少することと相関する。Ａ）ＣＭ集団の増加がｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬで観察されたにもかかわらず、ＣＤ２８発現の減少は、ＣＭ状態のみではＴＩＬの動態を決定できないことを示唆する傾向として見られた。Ｍ１０６１Ｔ  ＣＤ４＋  ＴＩＬを除き、−ｒｅ−ＲＥＰ産物ではＣＤ２８発現の減少が観察された。
【図５１Ｂ】[00167]ＣＤ４＋ＣＤ２８＋細胞。ＣＤ２８発現は、幼若ＴＩＬが年齢とともに減少することと相関する。Ｂ）新鮮ＴＩＬ産物及び解凍ＴＩＬ産物と比較して、それぞれ新鮮ＴＩＬで８．８９％、解凍ＴＩＬで５．７１％の減少が見られた。
【図５２Ａ】[00168]ＣＤ８＋ＣＤ２８＋細胞。Ａ）ＣＤ８＋  ＴＩＬ集団におけるＣＤ２８発現は、ｒｅ−ＲＥＰ産物よりも新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬで高かった。ほとんどの場合、解凍ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬは、解凍ＴＩＬ及び新鮮ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬと比較した場合、劇的な減少を示した。ただし、スチューデントｔ検定は、新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬ（ｐ＝０．３６６８）間及び新鮮ｒｅ−ＲＥＰ産物及び解凍ｒｅ−ＲＥＰ産物（ｐ−＝０．７９４０）間にも有意な差を示さなかった。
【図５２Ｂ】[00168]ＣＤ８＋ＣＤ２８＋細胞。Ｂ）ＣＤ４＋  ＴＩＬ集団で見られるように、再刺激されていないものと比較した場合、新鮮ｒｅ−ＲＥＰ（２１．５％）及び解凍ｒｅ−ＲＥＰ（１８．２％）でＣＤ８＋ＣＤ２８＋集団で減少した。
【図５３Ａ】[00169]ＣＤ４＋ＰＤ−１＋細胞。ＴＩＬのＰＤ−１発現は、抗原反応性及び消耗Ｔ細胞に相関する。すなわち、１１日間ＲＥＰを受けたＴＩＬで消耗表現型が観察されることは驚くに値しない。Ａ）この消耗表現型は、解凍ＴＩＬ産物（具体的には、ＥＰ１１００１Ｔ及びＭ１０５６Ｔ）で維持又は増加された。新鮮ＴＩＬ産物及び解凍ＴＩＬ産物間に有意な差は見られなかった（ｐ＝０．９８０９）。解凍ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬと比較して、同様の傾向が新鮮ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬに示された（ｐ＝０．０９１２）。
【図５３Ｂ】[00169]ＣＤ４＋ＰＤ−１＋細胞。ＴＩＬのＰＤ−１発現は、抗原反応性及び消耗Ｔ細胞に相関する。すなわち、１１日間ＲＥＰを受けたＴＩＬで消耗表現型が観察されることは驚くに値しない。Ｂ）新鮮ｒｅ−ＲＥＰは、ＣＤ４＋  ＴＩＬ集団におけるＰＤ−１発現のわずかな減少を示した。他の全ての条件で、同等のＰＤ−１発現パターンを維持した。ＰＤ−１発現の減少又は変化は、他の全ての条件と比較して新鮮ｒｅ−ＲＥＰ産物で観察された。ＰＤ−１発現の増加は、解凍ｒｅ−ＲＥＰ産物のＭ１０６２Ｔ、Ｍ１０６３Ｔ（ＣＤ４＋）及びＥＰ１１００１Ｔ（ＣＤ８＋）で見られた。他の全ての解凍ｒｅ−ＲＥＰ産物は、解凍ｒｅ−ＲＥＰ産物に匹敵する結果を示した。
【図５４Ａ】[00170]ＣＤ８＋ＰＤ−１＋細胞。Ａ）新鮮ＴＩＬ産物からのＣＤ８＋集団は、ＰＤ−１発現の増加に関連するより消耗表現型を示した。ＥＰ１１００１Ｔで例外が観察され、ＣＤ８＋解凍ＴＩＬ産物では、新鮮ＴＩＬ産物と比較してＰＤ−１発現がわずかに増加した。解凍ＴＩＬと比較して、新鮮ＴＩＬのＰＤ−１発現にはわずかな差はあったが、有意な差はなかった（ｐ＝０．３１４４）。
【図５４Ｂ】[00170]ＣＤ８＋ＰＤ−１＋細胞。Ｂ）新鮮ＴＩＬ産物はわずかな増加を示したが、解凍ＴＩＬと比較して有意ではないＰＤ−１発現（６．７４％又は解凍ＴＩＬの１．２倍以上の倍率）は、解凍ＴＩＬ産物が表現型パターンに基づいて同等であることを示唆していた。
【図５５Ａ】[00171]ＣＤ４＋ＬＡＧ３＋細胞。消耗Ｔ細胞は、ＰＤ−１とともに高レベルの阻害性受容体ＬＡＧ３を発現する。Ａ）ＣＤ４＋解凍ＴＩＬは、新鮮ＴＩＬと比較してＬＡＧ３発現レベルがわずかに高いが有意なものではないことを示した（ｐ＝０．５２）。Ｍ１０６３Ｔで例外が観察された。ＣＤ４＋新鮮ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬ及び新鮮ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬのＬＡＧ３発現が測定された実験では、新鮮ＴＩＬと比較して、新鮮ｒｅ−ＲＥＰ試料でＬＡＧ３＋発現の減少が観察された。
【図５５Ｂ】[00171]ＣＤ４＋ＬＡＧ３＋細胞。消耗Ｔ細胞は、ＰＤ−１とともに高レベルの阻害性受容体ＬＡＧ３を発現する。Ｂ）全体的に、新鮮ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬ産物ではＬＡＧ３発現がわずかに減少している。図Ｂの一貫性を維持するため、ＬＡＧ３発現が新鮮産物で測定されなかったため、Ｍ１０６１Ｔ、Ｍ１０６２Ｔ及びＭ１０６４Ｔは除外されていることに注意されたい。
【図５６Ａ】[00172]ＣＤ８＋ＬＡＧ３＋細胞。Ａ）ＴＩＬ発現するＣＤ８＋  ＬＡＧ３は、新鮮ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬでＬＡＧ３発現の顕著な減少が見られたＭ１０６３Ｔを除き、本実験でわずかな減少を示した。全体として、ＬＡＧ３発現に関して、解凍ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬは新鮮ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬと比較して１．５倍の有意な増加を示した（ｐ＝０．０１５４）。ただし、新鮮ＴＩＬ産物及び解凍ＴＩＬ産物間に有意な差は認められなかった（ｐ＝０．０８８４）。
【図５６Ｂ】[00172]ＣＤ８＋ＬＡＧ３＋細胞。Ｂ）解凍ＴＩＬ産物と比較して、新鮮ｒｅ−ＲＥＰからのＣＤ８＋  ＴＩＬでのＬＡＧ３発現の約３０％の減少が観察された。新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬは、解凍ＴＩＬに匹敵し、わずかな増加を示した。（本図では、新鮮ＴＩＬ試料又は新鮮ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬ試料のいずれかでＬＡＧ３発現が測定されなかったため、Ｍ１０６１Ｔ、Ｍ１０６２Ｔ及びＭ１０６４Ｔは除外されている。）
【図５７Ａ】[00173]ＣＤ４＋ＴＩＭ−３＋細胞。Ａ）ＰＤ−１及びＬＡＧ３の場合に以前観察されたように、解凍ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬと比較して、新鮮ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬでＴＩＭ−３発現の減少が見られた。それにもかかわらず、新鮮ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬ及び解凍ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬ（ｐ＝０．２００７）間に有意な差はなかった。
【図５７Ｂ】[00173]ＣＤ４＋ＴＩＭ−３＋細胞。Ｂ）ＴＩＭ−３発現の大きい変化は、解凍ＴＩＬ及び解凍ｒｅＲＥＰ  ＴＩＬ産物では見られなかった。解凍ｒｅ−ＲＥＰ産物と比較して、新鮮ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬでＴＩＭ−３発現の９．２％のわずかな減少が観察された。
【図５８Ａ】[00174]ＣＤ８＋ＴＩＭ−３＋細胞。Ａ）ＣＤ４＋集団で見られたＴＩＭ−３発現の同様の傾向は、ＣＤ８＋  ＴＩＬでも見られた。新鮮ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬ表現型は最も少なく、ＴＩＭ−３発現が低く、解凍ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬと比較して有意な差があった（ｐ＝０．０１４７）。ＰＤ−１、ＬＡＧ３及びＴＩＭ−３の比較は、新鮮ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬ表現型が網羅的ではなく、ＣＭ表現型が増加していることを示唆している。
【図５８Ｂ】[00174]ＣＤ８＋ＴＩＭ−３＋細胞。Ｂ）解凍ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬ産物と比較して、新鮮ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬはＴＩＭ−３発現の２２％の有意な減少を示した。新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬの両方が同様のＴＩＭ−３発現パターンを示す。
【図５９】[00175]Ｐ８１５標的細胞株に対するＴＩＬの細胞傷害能。
【図６０】[00176]新鮮ＴＩＬ、新鮮ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬ及び解凍ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬの代謝呼吸プロファイル。基礎ＯＣＲ（Ａ）、顕在ＳＲＣ（Ｂ）、ＳＲＣ２ＤＧ（Ｃ）、潜在ＳＲＣ（Ｄ）、基礎ＥＣＡＲ（Ｅ）及び解糖予備能（Ｆ）。
【図６１Ａ】[00177]フローＦＩＳＨテクノロジーを使用して、ポストＲＥＰプロセス２Ａで解凍した９つのＴＩＬ産物のテロメアリピートの平均長を測定した。Ａ）データは、ｑＰＣＲでＴＩＬを１３０１の細胞と比較して測定したテロメア長を表す。
【図６１Ｂ】[00177]フローＦＩＳＨテクノロジーを使用して、ポストＲＥＰプロセス２Ａで解凍した９つのＴＩＬ産物のテロメアリピートの平均長を測定した。Ｂ）データは、ＴＩＬのフローＦＩＳＨアッセイで１３０１の細胞と比較して測定したテロメア長を示す。グラフに使用されるデータは、附属セクション１０の表形式（表２５）で提供されている。全体として、２つのテロメア長アッセイの結果のパターンには大まかな類似性があったが、実験ではＴＩＬの実際のテロメア長をより正確に反映する方法を決定し続ける。この技術を将来の臨床試料に適用し、テロメア長とＴＩＬ療法に対する患者の応答との関係を判断することができる。
【図６２Ａ】[00178]無血清培地提供者の選択（血清代替物）。各断片は、G-Rex２４ウェルプレートの単一ウェルで４回ずつ培養した。１１日目に、ＲＥＰは、４５  ＴＩＬ及び１０６フィーダーを使用して開始され、２Ａプロセスを模した。Ａ）各条件について１１日目（プレＲＥＰ）に記録された平均生細胞数を示す棒グラフ。
【図６２Ｂ】[00178]無血清培地提供者の選択（血清代替物）。各断片は、G-Rex２４ウェルプレートの単一ウェルで４回ずつ培養した。１１日目に、ＲＥＰは、４５  ＴＩＬ及び１０６フィーダーを使用して開始され、２Ａプロセスを模した。Ｂ）２２日目（ポストＲＥＰ）に記録された平均生細胞数を示す棒グラフ。Ｐ値は、スチューデントの「ｔ」検定を使用して計算された。それぞれ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１である。
【図６３Ａ】[00179]無血清培地提供者の選択（血小板ライセート血清）。各断片は、G-Rex２４ウェルプレートの単一ウェルで３回ずつ培養した。１１日目に、ＲＥＰは、４ｅ５  ＴＩＬ及び１０ｅ６フィーダーを使用して開始され、２Ａプロセスを模した。Ａ）各条件について１１日目（プレＲＥＰ）に記録された平均生細胞数を示す棒グラフ。
【図６３Ｂ】[00179]無血清培地提供者の選択（血小板ライセート血清）。各断片は、G-Rex２４ウェルプレートの単一ウェルで３回ずつ培養した。１１日目に、ＲＥＰは、４ｅ５  ＴＩＬ及び１０ｅ６フィーダーを使用して開始され、２Ａプロセスを模した。Ｂ）２２日目（ポストＲＥＰ）に記録された平均生細胞数を示す棒グラフ。Ｐ値は、スチューデントの「ｔ」検定を使用して計算された。それぞれ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１である。「＃」腫瘍断片不足。
【図６４Ａ−１】[00180]小規模２Ａプロセス（G-Rex  ５Ｍ）を使用して、CTS Optimizerの有効性と標準条件を比較する。２つの断片／G-Rex  ５Ｍを３回培養し、２Ａプロセスを模するために５０６フィーダーで２６  ＴＩＬを使用してＲＥＰを開始した。上記の数値は、１１日目（Ａ）又は２２日目（Ｂ）に得られた平均生細胞数である。
【図６４Ａ−２】[00180]小規模２Ａプロセス（G-Rex  ５Ｍ）を使用して、CTS Optimizerの有効性と標準条件を比較する。２つの断片／G-Rex  ５Ｍを３回培養し、２Ａプロセスを模するために５０６フィーダーで２６  ＴＩＬを使用してＲＥＰを開始した。上記の数値は、１１日目（Ａ）又は２２日目（Ｂ）に得られた平均生細胞数である。
【図６４Ｂ−１】[00180]小規模２Ａプロセス（G-Rex  ５Ｍ）を使用して、CTS Optimizerの有効性と標準条件を比較する。２つの断片／G-Rex  ５Ｍを３回培養し、２Ａプロセスを模するために５０６フィーダーで２６  ＴＩＬを使用してＲＥＰを開始した。上記の数値は、１１日目（Ａ）又は２２日目（Ｂ）に得られた平均生細胞数である。
【図６４Ｂ−２】[00180]小規模２Ａプロセス（G-Rex  ５Ｍ）を使用して、CTS Optimizerの有効性と標準条件を比較する。２つの断片／G-Rex  ５Ｍを３回培養し、２Ａプロセスを模するために５０６フィーダーで２６  ＴＩＬを使用してＲＥＰを開始した。上記の数値は、１１日目（Ａ）又は２２日目（Ｂ）に得られた平均生細胞数である。
【図６５Ａ】[00181]標準条件及びCTS Optimizerを比較して推定されるＴＩＬ拡大培養の前後の概要。Ａ）プレＲＥＰ。
【図６５Ｂ】[00181]標準条件及びCTS Optimizerを比較して推定されるＴＩＬ拡大培養の前後の概要。Ｂ）ポストＲＥＰ。
【図６５Ｃ】[00181]標準条件及びCTS Optimizerを比較して推定されるＴＩＬ拡大培養の前後の概要。Ｃ）実際どおりに実施するため外挿されたＴＩＬ拡大培養の概要（標準条件とCTS Optimizer＋ＳＲ）。
【図６６】[00182]ＣＤ８＋は、生細胞でゲーティングされた。９つの腫瘍の７つは、ＣＴＳ＋ＳＲ状態で絶対ＣＤ８＋集団の増加を示す。
【図６７】[00183]インターフェロンガンマの比較可能性。インターフェロンガンマＥＬＩＳＡ（Quantikine）。ＩＦＮ−ｙの産生は、R＆D SystemsのQuantikine ELISAキットを使用して測定した。ＣＴＳ＋ＳＲは、標準条件と比較した場合、同量のＩＦＮーｙを産生した。
【図６８】[00184]迅速拡大培養プロトコル（ＲＥＰ）の例示的な実施形態のスキーム。到着すると、腫瘍は断片化され、１１日間、ＴＩＬ拡大培養（プレＲＥＰ拡大培養）を行うためＩＬ−２を含むG-Rexフラスコに入れられる。トリプルカクテル研究では、プレＲＥＰの開始時にＩＬ−２／ＩＬ−１５／ＩＬ−２１が追加される。迅速拡大培養プロトコル（ＲＥＰ）の場合、ＴＩＬは更に１１日間のＲＥＰ拡大培養のためにフィーダーとＯＫＴ３で培養される。
【図６９Ａ】[00185]黒色腫由来のＴＩＬ（ｎ＝４）及び肺（ｎ＝７）は、ポストプレＲＥＰのフローサイトメトリーを使用して、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の表現型を評価した。＊Ｐ値は、スチューデントの非対応ｔ検定を使用したＣＤ８＋細胞におけるＩＬ−２及びＩＬ−１２／ＩＬ−１５／ＩＬ−２１の差を表す。
【図６９Ｂ】[00185]黒色腫由来のＴＩＬ（ｎ＝４）及び肺（ｎ＝７）は、ポストプレＲＥＰのフローサイトメトリーを使用して、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の表現型を評価した。＊Ｐ値は、スチューデントの非対応ｔ検定を使用したＣＤ８＋細胞におけるＩＬ−２及びＩＬ−１２／ＩＬ−１５／ＩＬ−２１の差を表す。
【図７０Ａ】[00186]黒色腫由来のＴＩＬ（ｎ＝４）及び肺（ｎ＝７）は、ポストプレＲＥＰのフローサイトメトリーを使用して、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞のＣＤ２７＋及びＣＤ２８＋の表現型を評価した。
【図７０Ｂ】[00186]黒色腫由来のＴＩＬ（ｎ＝４）及び肺（ｎ＝７）は、ポストプレＲＥＰのフローサイトメトリーを使用して、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞のＣＤ２７＋及びＣＤ２８＋の表現型を評価した。
【図７１Ａ】[00187]ＴＩＬは、ＣＤ８＋細胞のエフェクター／メモリーサブセット（ＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７）及び黒色腫（ｎ＝４）（Ａ）及び肺（ｎ＝８）（Ｂ）のＣＤ４＋（データに示さず）の表現型で評価された。ＣＸＣＲ３発現は、黒色腫と肺で評価された。表現型発現は全て、ポストプレＲＥＰのフローサイトメトリーを使用して評価された。ＴＣＭ＝セントラルメモリー、ＴＳＣＭ＝幹細胞様メモリー、ＴＥＭＲＡ（エフェクターＴ細胞）、ＴＥＭ＝エフェクターメモリー。
【図７１Ｂ】[00187]ＴＩＬは、ＣＤ８＋細胞のエフェクター／メモリーサブセット（ＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７）及び黒色腫（ｎ＝４）（Ａ）及び肺（ｎ＝８）（Ｂ）のＣＤ４＋（データに示さず）の表現型で評価された。ＣＸＣＲ３発現は、黒色腫と肺で評価された。表現型発現は全て、ポストプレＲＥＰのフローサイトメトリーを使用して評価された。ＴＣＭ＝セントラルメモリー、ＴＳＣＭ＝幹細胞様メモリー、ＴＥＭＲＡ（エフェクターＴ細胞）、ＴＥＭ＝エフェクターメモリー。
【図７１Ｃ】[00187]ＴＩＬは、ＣＤ８＋細胞のエフェクター／メモリーサブセット（ＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７）及び黒色腫（ｎ＝４）（Ａ）及び肺（ｎ＝８）（Ｂ）のＣＤ４＋（データに示さず）の表現型で評価された。ＣＸＣＲ３発現は、黒色腫と肺で評価された。表現型発現は全て、ポストプレＲＥＰのフローサイトメトリーを使用して評価された。ＴＣＭ＝セントラルメモリー、ＴＳＣＭ＝幹細胞様メモリー、ＴＥＭＲＡ（エフェクターＴ細胞）、ＴＥＭ＝エフェクターメモリー。
【図７２Ａ】[00188]（Ａ）黒色腫（ｎ＝４）及び（Ｂ）肺（ｎ＝５）に由来するＴＩＬを、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞における４時間のＰＭＡ刺激に応答したＣＤ１０７ａ＋発現について、フローサイトメトリーにより評価した。
【図７２Ｂ】[00188]（Ａ）黒色腫（ｎ＝４）及び（Ｂ）肺（ｎ＝５）に由来するＴＩＬを、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞における４時間のＰＭＡ刺激に応答したＣＤ１０７ａ＋発現について、フローサイトメトリーにより評価した。
【図７２Ｃ】[00188]（Ｃ）プレＲＥＰ  ＴＩＬ（ｎ＝５）を可溶性ＯＫＴ３（３０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間刺激し、上清をＥＬＩＳＡによりＩＦｎγについて評価した。
【図７３Ａ】[00189]ＴＣＲｖβレパートリー（２４の特異性）は、フローサイトメトリー用のBeckman Coulterキットを使用して、黒色腫（Ａ）及び肺（Ｂ）に由来するＴＩＬで評価された。
【図７３Ｂ】[00189]ＴＣＲｖβレパートリー（２４の特異性）は、フローサイトメトリー用のBeckman Coulterキットを使用して、黒色腫（Ａ）及び肺（Ｂ）に由来するＴＩＬで評価された。
【図７４】[00190]凍結保存ＴＩＬの代表的な製造プロセス（約２２日間）。
【図７５Ａ】[00191]２２日目に、洗浄及び製剤化前に培養細胞の性能を決定するため、容積が減少した細胞産物をプールしてサンプリングする。試料は、前述のようにNC-200自動セルカウンターで分析される。総生細胞密度は、４つの独立した試料からの重複カウントの総平均によって決定される。ジェネレーション２（Ｇｅｎ２）プロセスでは、ジェネレーション１（Ｇｅｎ１；Ｇｅｎ１の平均＝４．１０×１０１０±２．９２×１０１０、第２世代の平均＝３．１２×１０１０±２．１９×１０１０）と同様の用量のＴＩＬ産物が産生される。
【図７５Ｂ】[00191]Ｂ）拡大倍数は、ＲＥＰ段階について、初期の生ＴＩＬ播種密度に対する最終的な生細胞密度の被除数として計算される。Ｇｅｎ２のＴＩＬ産物は、Ｇｅｎ１に比べて拡大倍数が低くなっている（Ｇｅｎ１の平均＝１．４０×１０３±９．８６×１０２、Ｇｅｎ２の平均＝５．１１×１０２±２．９５×１０２）。
【図７６】[00192]遊離のためのフローサイトメトリーにより、新鮮な調剤済製剤産物を同一性のためにアッセイした。Ｇｅｎ１及びＧｅｎ２プロセスは、ＣＤ４５、ＣＤ３二重陽性表現型（Ｇｅｎ１＃±ＳＤ、Ｇｅｎ２＃±ＳＤ）で定義される高純度のＴ細胞培養物を産生する。Ｐ値は、Mann-Whitneyの「ｔ」検定を使用して計算された。
【図７７Ａ】[00193]調剤済製剤産物の凍結保存サテライトのバイアルを解凍し、前述のようにフローサイトメトリーにより拡大培養表現型についてアッセイした。Ｇｅｎ１及びＧｅｎ２産物は、ＣＤ８  Ｔ細胞サブタイプとＣＤ４  Ｔ細胞サブタイプの同様の比率を表す。Ｐ値は、Mann-Whitneyの「ｔ」検定を使用して計算された。
【図７７Ｂ】[00193]調剤済製剤産物の凍結保存サテライトのバイアルを解凍し、前述のようにフローサイトメトリーにより拡大培養表現型についてアッセイした。Ｇｅｎ１及びＧｅｎ２産物は、ＣＤ８  Ｔ細胞サブタイプとＣＤ４  Ｔ細胞サブタイプの同様の比率を表す。Ｐ値は、Mann-Whitneyの「ｔ」検定を使用して計算された。
【図７８Ａ】[00194]調剤済製剤産物の凍結保存サテライトのバイアルを解凍し、前述のようにフローサイトメトリーにより拡大培養表現型についてアッセイした。Ｇｅｎ１及びＧｅｎ２産物は、Ｔ細胞サブセット上で同レベルの共刺激分子ＣＤ２７及びＣＤ２８を発現する。Ｐ値は、Mann-Whitneyの「ｔ」検定を使用して計算された。ＣＤ２７及びＣＤ２８などの共刺激分子は、Ｔ細胞受容体の関与時にエフェクター細胞の成長に必要な二次及び三次シグナルを供給するために必要である。
【図７８Ｂ】[00194]調剤済製剤産物の凍結保存サテライトのバイアルを解凍し、前述のようにフローサイトメトリーにより拡大培養表現型についてアッセイした。Ｇｅｎ１及びＧｅｎ２産物は、Ｔ細胞サブセット上で同レベルの共刺激分子ＣＤ２７及びＣＤ２８を発現する。Ｐ値は、Mann-Whitneyの「ｔ」検定を使用して計算された。ＣＤ２７及びＣＤ２８などの共刺激分子は、Ｔ細胞受容体の関与時にエフェクター細胞の成長に必要な二次及び三次シグナルを供給するために必要である。
【図７９】[00195]フローＦＩＳＨテクノロジーを使用して、前述のようにテロメアの反復の平均長を測定した。上記のＲＴＬ値は、対照細胞株のＧｅｎ１（１Ｃプロセスの実施形態）の１染色体／ゲノムあたりの平均テロメア蛍光が＃％±ＳＤ％であり、Ｇｅｎ２が１染色体／ゲノムあたりのテロメア蛍光が＃％±ＳＤ％であることを示す（１３０１白血病細胞株）。データは、Ｇｅｎ２産物が、平均してＧｅｎ１産物と少なくとも同等のテロメア長を有していることを示す。テロメア長は、エキソビボ細胞培養物の長さの代替測定値である。
【図８０】[00196]Ｇｅｎ２（プロセスの実施形態２Ａ）製剤産物は、Ｇｅｎ１製剤産物と比較したＩＦＮ−γの産生能力の増加を示す。製剤産物が再活性化され、サイトカインを分泌する能力は、ＨＬＡのコンテキストで同種抗原にＴＣＲが結合した際のインビボ機能の代替手段である。
【図８１Ａ】[00197]Ｔ細胞受容体の多様性：Ｇｅｎ１（プロセス１Ｃの実施形態）及びＧｅｎ２（２Ａプロセスの実施形態）製剤産物の１０×１０６  ＴＩＬからのＲＮＡをアッセイして、各製品に存在する固有のＣＤＲ３配列の総数と頻度を決定した。各産物に存在する一意のＣＤＲ３配列の総数（Ｇｅｎ１  ｎ＝＃、平均値±ＳＤ、Ｇｅｎ２  ｎ＝＃、平均値±ＳＤ）。
【図８１Ｂ】[00197]Ｔ細胞受容体の多様性：Ｇｅｎ１（プロセス１Ｃの実施形態）及びＧｅｎ２（２Ａプロセスの実施形態）製剤産物の１０×１０６  ＴＩＬからのＲＮＡをアッセイして、各製品に存在する固有のＣＤＲ３配列の総数と頻度を決定した。Ｂ）固有のＣＤＲ３配列には、産物内のＴ細胞受容体の相対的な多様性を表すスコアを得るため、各産物における頻度に対してインデックスを付した。両方のプロセスのＴＩＬ産物は、異なる抗原特異性と結合活性を持つＴ細胞のポリクローナル集団で構成されている。総Ｔ細胞レパートリーの幅は、腫瘍細胞上の作用可能なエピトープの数の指標である場合がある。
【図８２】[00198]プロセス２Ａ、ＴＩＬ製造の２２日間プロセスの実施形態の概略図を示す。
【図８３】[00199]プロセス１Ｃ及びプロセス２Ａの例示的な実施形態からのステップＡ〜Ｆの比較表。
【図８４】[00200]プロセス１Ｃの実施形態とプロセス２Ａの実施形態の詳細な比較。
【図８５】[00201]ＴＩＬ療法プロセスの実施形態の詳細なスキーム。
【図８６Ａ】[00202]１０色フローサイトメトリーアッセイを使用したＴＩＬ産物の表現型の特性評価。（Ａ）Ｔ細胞及び非Ｔ細胞サブセットの割合は、それぞれＣＤ４５＋ＣＤ３＋及びＣＤ４５−（非リンパ球）／ＣＤ４５＋ＣＤ３−（非Ｔ細胞リンパ球）によって定義される。全体として、検定されたＴＩＬ産物の＞９９％がＴ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３＋）で構成されていた。示されているのは、ＴＩＬ産物の平均である（ｎ＝１０）。
【図８６Ｂ】[00202]１０色フローサイトメトリーアッセイを使用したＴＩＬ産物の表現型の特性評価。（Ｂ）ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋（青い白抜きの丸）及びＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋（ピンクの白抜きの丸）を含む２つのＴ細胞サブセットの割合。スチューデントの非対Ｔ検定を使用しても、両方のサブセットの割合に統計的な差は認められない（Ｐ＝０．６８）。
【図８６Ｃ】[00202]１０色フローサイトメトリーアッセイを使用したＴＩＬ産物の表現型の特性評価。（Ｃ）非Ｔ細胞集団は、以下を含む４つの異なるサブセットで特徴付けられた。１）非リンパ球（ＣＤ４５−）、２）ＮＫ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３−ＣＤ１６＋／５６＋）、３）Ｂ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ１９＋）、及び４）非ＮＫ／Ｂ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３−ＣＤ１６−ＣＤ５６−ＣＤ１９−）。
【図８７Ａ】[00203]ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋及びＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞集団のＴ細胞サブセットの特徴付け。ナイーブ、セントラルメモリー（ＴＣＭ）、エフェクターメモリー（ＴＥＦ）及びエフェクターメモリーＲＡ＋（ＥＭＲＡ）Ｔ細胞サブセットは、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７を使用して定義された。図は、ＣＤ４＋（Ａ）及びＣＤ８＋（Ｂ）の両方の細胞集団における１０の最終ＴＩＬ産物からの代表的なＴ細胞サブセットを示す。エフェクターメモリーＴ細胞サブセット（青い白抜き丸）は、最終ＴＩＬ産物のＣＤ４＋及びＣＤ８＋サブセットの両方で主要な集団（＞９３％）である。ＴＩＬ産物の７％未満の細胞がセントラルメモリーサブセットである（ピンクの白抜き丸）。ＥＭＲＡ（灰色の白抜き丸）及びナイーブ（黒の白抜き丸）サブセットは、ＴＩＬ産物ではほとんど検出されない（＜０．０２％）。Ｐ値は、スチューデントの非対応Ｔ検定を使用したＥＭ及びＣＭの差を表す。
【図８７Ｂ】[00203]ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋及びＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞集団のＴ細胞サブセットの特徴付け。ナイーブ、セントラルメモリー（ＴＣＭ）、エフェクターメモリー（ＴＥＦ）及びエフェクターメモリーＲＡ＋（ＥＭＲＡ）Ｔ細胞サブセットは、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７を使用して定義された。図は、ＣＤ４＋（Ａ）及びＣＤ８＋（Ｂ）の両方の細胞集団における１０の最終ＴＩＬ産物からの代表的なＴ細胞サブセットを示す。エフェクターメモリーＴ細胞サブセット（青い白抜き丸）は、最終ＴＩＬ産物のＣＤ４＋及びＣＤ８＋サブセットの両方で主要な集団（＞９３％）である。ＴＩＬ産物の７％未満の細胞がセントラルメモリーサブセットである（ピンクの白抜き丸）。ＥＭＲＡ（灰色の白抜き丸）及びナイーブ（黒の白抜き丸）サブセットは、ＴＩＬ産物ではほとんど検出されない（＜０．０２％）。Ｐ値は、スチューデントの非対応Ｔ検定を使用したＥＭ及びＣＭの差を表す。
【図８８Ａ】[00204]黒色腫腫瘍細胞におけるＭＣＳＰ及びＥｐＣＡＭ発現の検出。黒色腫腫瘍細胞株（ＷＭ３５、５２６及び８８８）、患者由来の黒色腫細胞株（１０２８、１０３２及び１０４１）、結腸直腸腺腫がん細胞株（陰性対照としてＨＴ２９）は、ＭＣＳＰ（黒色腫（コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）及びＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）マーカーによって特徴付けられた。（Ａ）黒色腫腫瘍細胞の平均９０％がＭＣＳＰを発現している。
【図８８Ｂ】[00204]黒色腫腫瘍細胞におけるＭＣＳＰ及びＥｐＣＡＭ発現の検出。黒色腫腫瘍細胞株（ＷＭ３５、５２６及び８８８）、患者由来の黒色腫細胞株（１０２８、１０３２及び１０４１）、結腸直腸腺腫がん細胞株（陰性対照としてＨＴ２９）は、ＭＣＳＰ（黒色腫（コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）及びＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）マーカーによって特徴付けられた。（Ｂ）ＥｐＣＡＭ＋腫瘍細胞株である陽性対照ＨＴ２９と比較して、黒色腫腫瘍細胞株ではＥｐＣＡＭ発現は検出されなかった。
【図８９Ａ】[00205]腫瘍検出精度を決定するための混入対照の検出。アッセイは、既知量の腫瘍細胞をＰＢＭＣ懸濁液（ｎ＝１０）に混入させることによって実施された。ＭＣＳＰ＋５２６黒色腫腫瘍細胞を１：１０、１：１００及び１：１，０００の比率で希釈し、その後、ＰＢＭＣと混合し、抗ＭＣＳＰ及び抗ＣＤ４５抗体と生／死染料で染色し、フローサイトメトリーで分析した。（Ａ）約３０００、３００及び３０の細胞がそれぞれ１：１０、１：１００及び１：１０００の希釈で検出された。
【図８９Ｂ】[00205]腫瘍検出精度を決定するための混入対照の検出。アッセイは、既知量の腫瘍細胞をＰＢＭＣ懸濁液（ｎ＝１０）に混入させることによって実施された。ＭＣＳＰ＋５２６黒色腫腫瘍細胞を１：１０、１：１００及び１：１，０００の比率で希釈し、その後、ＰＢＭＣと混合し、抗ＭＣＳＰ及び抗ＣＤ４５抗体と生／死染料で染色し、フローサイトメトリーで分析した。（Ｂ）各条件で取得された細胞の平均（ＡＶ）及び標準偏差（ＳＤ）を使用して、基準の上限及び下限を定義した。
【図９０Ａ】[00206]混入対照の上限と下限の再現性研究。混入アッセイの再現性を決定するため、３つの独立した実験を３回繰り返し実施した。（Ａ）ＭＣＳＰ＋で検出された腫瘍細胞の数は、一貫して基準の上限から下限の範囲内であった。
【図９０Ｂ】[00206]混入対照の上限と下限の再現性研究。混入アッセイの再現性を決定するため、３つの独立した実験を３回繰り返し実施した。（Ｂ）線形回帰図は、ＭＣＳＰ＋細胞及び混入希釈（Ｒ２＝０．９９）の相関関係を示しており、黒実線が最適値を実証する。緑色と灰色の破線は、それぞれ標準曲線と試料（Ｅｘｐ＃１〜３）の９５％の予測限界を表す。
【図９１Ａ】[00207]ＴＩＬ産物中の残存黒色腫腫瘍の検出。ＴＩＬ産物を、開発されたアッセイを使用して残った腫瘍汚染について評価した（ｎ＝１５）。（Ａ及びＢ）検出可能なＭＣＳＰ＋事象の中央値及び割合は、それぞれ２及び０．０００２％であった。
【図９１Ｂ】[00207]ＴＩＬ産物中の残存黒色腫腫瘍の検出。ＴＩＬ産物を、開発されたアッセイを使用して残った腫瘍汚染について評価した（ｎ＝１５）。（Ａ及びＢ）検出可能なＭＣＳＰ＋事象の中央値及び割合は、それぞれ２及び０．０００２％であった。
【図９２】[00208]Ｔ細胞活性化後のＴＩＬ産物の効力評価。ＥＬＩＳＡで重複して評価されたＴＩＬ産物中の抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ１３７による再刺激後のＩＦＮγ分泌（ｎ＝５）。ＴＩＬ産物によるＩＦＮγの分泌は、ウィルコクソンの符号付き順位検定を使用した非刺激対照よりも有意に高く（Ｐ＝０．０２）、一貫して＞１０００ｐｇ／ｍｌであった。＞２００ｐｇ／ｍｌのＩＦＮγ分泌は効力があると考えられている。ｐ値＜０．０５は統計的に有意と見なされる。
【図９３】[00209]凍結保存ＴＩＬ製造プロセスの実施形態の説明（２２日間）。
【図９４】[00210]Ｇｅｎ１からＧｅｎ２へのプロセス改善の表。
【図９５Ａ】[00211]総生細胞、成長率及び生存率。２２日目に、洗浄及び製剤化前に培養細胞の性能を決定するため、容積が減少した細胞産物をプールしてサンプリングする。（Ａ）試料は、前述のようにNC-200自動セルカウンターで分析される。総生細胞密度は、４つの独立した試料からの重複カウントの総平均によって決定される。Ｇｅｎ２プロセスでは、Ｇｅｎ１と同等用量のＴＩＬ産物が産生される（Ｇｅｎ１平均＝４．１０×１０１０±２．８×１０１０、Ｇｅｎ２平均＝４．１２×１０１０±２．５×１０１０）。
【図９５Ｂ】[00211]総生細胞、成長率及び生存率。２２日目に、洗浄及び製剤化前に培養細胞の性能を決定するため、容積が減少した細胞産物をプールしてサンプリングする。（Ｂ）ＲＥＰ段階の成長率は、ｇｒ＝ｌｎ（Ｎ（ｔ）／Ｎ（０）／ｔとして計算される。
【図９５Ｃ】[00211]総生細胞、成長率及び生存率。２２日目に、洗浄及び製剤化前に培養細胞の性能を決定するため、容積が減少した細胞産物をプールしてサンプリングする。（Ｃ）前述のように、Cellometer K2を使用して、９つのプロセス開発ロットから細胞生存率を評価した。製剤化された産物の単一の凍結融解サイクル後、細胞生存率の有意な減少は観察されなかった。解凍及びサンプリング時の生存率の平均低下は２．１９％である。
【図９６Ａ】[00212]Ｇｅｎ２産物は、Ｇｅｎ１と同等のレベルで共刺激分子を発現する高純度のＴ細胞培養物である。（Ａ）遊離のためのフローサイトメトリーにより、新鮮な調剤済製剤産物を同一性のためにアッセイした。Ｇｅｎ１及びＧｅｎ２プロセスは、ＣＤ４５＋、ＣＤ３＋（二重陽性）表現型で定義される高純度のＴ細胞培養物を産生する。
【図９６Ｂ】[00212]Ｇｅｎ２産物は、Ｇｅｎ１と同等のレベルで共刺激分子を発現する高純度のＴ細胞培養物である。（Ｂ及びＣ）調剤済製剤産物の凍結保存サテライトのバイアルを解凍し、前述のようにフローサイトメトリーにより拡大培養表現型についてアッセイした。Ｇｅｎ１及びＧｅｎ２産物は、Ｔ細胞サブセット上で同レベルの共刺激分子ＣＤ２７及びＣＤ２８を発現する。ＣＤ２７及びＣＤ２８などの共刺激分子は、Ｔ細胞受容体の関与時にエフェクター細胞の成長に必要な二次及び三次シグナルを供給するために必要である。Ｐ値は、Mann-Whitneyの「ｔ」検定を使用して計算された。
【図９６Ｃ】[00212]Ｇｅｎ２産物は、Ｇｅｎ１と同等のレベルで共刺激分子を発現する高純度のＴ細胞培養物である。（Ｂ及びＣ）調剤済製剤産物の凍結保存サテライトのバイアルを解凍し、前述のようにフローサイトメトリーにより拡大培養表現型についてアッセイした。Ｇｅｎ１及びＧｅｎ２産物は、Ｔ細胞サブセット上で同レベルの共刺激分子ＣＤ２７及びＣＤ２８を発現する。ＣＤ２７及びＣＤ２８などの共刺激分子は、Ｔ細胞受容体の関与時にエフェクター細胞の成長に必要な二次及び三次シグナルを供給するために必要である。Ｐ値は、Mann-Whitneyの「ｔ」検定を使用して計算された。
【図９７】[00213]Ｇｅｎ２産物は同様のテロメア長を示す。ただし、一部のＴＩＬ集団は、相対テロメアが長くなる傾向があり得る。
【図９８】[00214]Ｇｅｎ２製剤産物は、ＣＤ３、ＣＤ２８及びＣＤ１３７の関与に応じてＩＦＮγを分泌する。
【図９９Ａ】[00215]Ｔ細胞受容体の多様性。（Ａ）固有のＣＤＲ３配列には、産物内のＴ細胞受容体の全体的な多様性を表すスコアを得るため、各産物における頻度に対してインデックスを付した。
【図９９Ｂ】[00215]Ｔ細胞受容体の多様性。（Ｂ）各注入製品に存在するユニークなＣＤＲ３配列の平均総数。
【図１００】[00216]本発明のＴＩＬ製造プロセスの実施形態。
【図１０１】[00217]複数の腫瘍組織におけるＩＬ−２／ＩＬ−１５／ＩＬ−２１によるプレＲＥＰ中の拡大培養の亢進。
【図１０２Ａ】[00218]ＩＬ−２／ＩＬ−１５／ＩＬ−２１は、肺癌ではＣＤ８＋細胞の割合を増加させたが、黒色腫では増加しなかった。（Ａ）黒色腫（ｎ＝４）及び（Ｂ）肺（ｎ＝７）に由来するＴＩＬは、ポストプレＲＥＰのフローサイトメトリーを使用して、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の表現型を評価した。
【図１０２Ｂ】[00218]ＩＬ−２／ＩＬ−１５／ＩＬ−２１は、肺癌ではＣＤ８＋細胞の割合を増加させたが、黒色腫では増加しなかった。（Ａ）黒色腫由来のＴＩＬ（ｎ＝４）、及び（Ｂ）肺（ｎ＝７）は、ポストプレＲＥＰのフローサイトメトリーを使用して、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の表現型を評価した。
【図１０３Ａ】[00219]ＣＤ２７の発現は、ＩＬ−２／ＩＬ−１５／ＩＬ−２１で処理した培養物のＣＤ８＋細胞でわずかに亢進した。（Ａ）黒色腫由来のＴＩＬ（ｎ＝４）、及び（Ｂ）肺（ｎ＝７）は、ポストプレＲＥＰのフローサイトメトリーを使用して、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞のＣＤ２７＋及びＣＤ２８＋の表現型を評価した。
【図１０３Ｂ】[00219]ＣＤ２７の発現は、ＩＬ−２／ＩＬ−１５／ＩＬ−２１で処理した培養物のＣＤ８＋細胞でわずかに亢進した。（Ａ）黒色腫由来のＴＩＬ（ｎ＝４）、及び（Ｂ）肺（ｎ＝７）は、ポストプレＲＥＰのフローサイトメトリーを使用して、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞のＣＤ２７＋及びＣＤ２８＋の表現型を評価した。
【図１０４Ａ】[00220]Ｔ細胞サブセットは、ＩＬ−１５／ＩＬ−２１の添加では変化しなかった。ＴＩＬは、（Ａ）黒色腫（ｎ＝４）からのＣＤ８＋及びＣＤ４＋（データに示さず）細胞のエフェクター／メモリーサブセット（ＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７）、及びフローサイトメトリーポストプレＲＥＰを介して（Ｂ）肺（ｎ＝８）の表現型で評価された。
【図１０４Ｂ】[00220]Ｔ細胞サブセットは、ＩＬ−１５／ＩＬ−２１の添加では変化しなかった。ＴＩＬは、（Ａ）黒色腫（ｎ＝４）からのＣＤ８＋及びＣＤ４＋（データに示さず）細胞のエフェクター／メモリーサブセット（ＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７）、及びフローサイトメトリーポストプレＲＥＰを介して（Ｂ）肺（ｎ＝８）の表現型で評価された。
【図１０５Ａ】[00221]ＴＩＬの機能的能力は、ＩＬ−２／ＩＬ−１５／ＩＬ−２１で差別的に強化された。（Ａ）黒色腫（ｎ＝４）及び（Ｂ）肺（ｎ＝５）に由来するＴＩＬを、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞における４時間のＰＭＡ刺激に応答したＣＤ１０７ａ＋発現について、フローサイトメトリーにより評価した。
【図１０５Ｂ】[00221]ＴＩＬの機能的能力は、ＩＬ−２／ＩＬ−１５／ＩＬ−２１で差別的に強化された。（Ａ）黒色腫（ｎ＝４）及び（Ｂ）肺（ｎ＝５）に由来するＴＩＬを、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞における４時間のＰＭＡ刺激に応答したＣＤ１０７ａ＋発現について、フローサイトメトリーにより評価した。
【図１０５Ｃ】[00221]ＴＩＬの機能的能力は、ＩＬ−２／ＩＬ−１５／ＩＬ−２１で差別的に強化された。（Ｃ）黒色腫及び肺に由来するプレＲＥＰ  ＴＩＬを可溶性抗ＣＤ３抗体で２４時間刺激し、上清をＥＬＩＳＡによりＩＦＮγについて評価した。
【図１０６Ａ】[00222]ＴＣＲｖβレパートリー（２４の特異性）は、フローサイトメトリー用のBeckman Coulterキットを使用して、（Ａ）黒色腫及び（Ｂ）肺腫瘍に由来するＴＩＬで評価された。
【図１０６Ｂ】[00222]ＴＣＲｖβレパートリー（２４の特異性）は、フローサイトメトリー用のBeckman Coulterキットを使用して、（Ａ）黒色腫及び（Ｂ）肺腫瘍に由来するＴＩＬで評価された。
【図１０７】[00223]Ｇｅｎ２凍結保存ＬＮ−１４４製造プロセスのスキーム。
【図１０８】[00224]転移性黒色腫患者に投与される新規凍結保存ＴＩＬの多施設第２段階臨床試験の研究計画のスキーム。
【図１０９】[00225]コホート１（ＡＳＣＯ２０１７）とコホート２の患者特性の比較を示す表。
【図１１０】[00226]処置の緊急有害事象を示す表（≧３０％）。
【図１１１】[00227]注入製品及びＴＩＬ療法の有効性。
【図１１２】[00228]ＳＤ又はより良い応答を示す評価可能な患者の応答の臨床状態。
【図１１３】[00229]直径の合計の変化率。
【図１１４】[00230]ＨＭＧＢ１レベルの増加が、ＴＩＬ処置時に観察された。
【図１１５】[00231]バイオマーカーＩＬ−１０の増加がＬＮ−１４４注入後に観察された。
【図１１６】[00232]２番目のデータカットからの転移性黒色腫の第２段階臨床試験のコホート２の更新された患者特性（Ｎ＝１７患者）。
【図１１７】[00233]２番目のデータカットからのコホート２（≧３０％）の処置上の有害事象（Ｎ＝１７患者）。
【図１１８】[00234]２番目のデータカットからのコホート２の評価可能な患者（病状が安定しているか又はそれより良好）の応答時間（Ｎ＝１７患者）。有効性セットの１０人の患者のうち、１人の患者（患者１０）は、図に示さない最初の腫瘍評価前に黒色腫関連で死亡したため評価できなかった。
【図１１９】[00235]２番目のデータカットからのコホート２の更新された有効性データ（Ｎ＝１７患者）。注入されるＴＩＬの平均数は３４×１０９である。前回の治療の中央値は４．５であった。ＢＲＡＦ変異がある患者は、野生型ＢＲＡＦを有する患者と同様に応答した（＊はＢＲＡＦ変異を有する患者を指す）。１人の患者（患者１０）は、最初の腫瘍評価前に黒色腫関連で死亡したために評価されなかったが、有効性セットではなおも考慮されていた。略称；ＰＲ、部分応答；ＳＤ、病状が安定している疾患；ＰＤ、進行性疾患。
【図１２０】[00236]２番目のデータカットからのコホート２からの評価可能な患者の更新された有効性データ（Ｎ＝１７患者）。＊は、最初の評価に到達しなかった評価不可能な患者を示す。全ての有効性評価可能な患者は、以前に抗ＰＤ−１及び抗ＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害薬治療を受けていた。
【図１２１】[00237]コホート２からのＰＲを持つ患者（００３−０１５）の代表的なコンピュータ断層撮影、２番目のデータカット。
【図１２２】[00238]注入前のＴＩＬ産物によるＩＦＮ−γ誘導と、ＴＩＬ注入後４２日目の腫瘍サイズの臨床的縮小との相関関係。
【図１２３】[00239]Ｇｅｎ２  ＴＩＬ産物の実施形態の注入前後のＩＰ−１０（ＣＸＣＬ１０）レベル（ｐｇ／ｍＬ、ｌｏｇ１０）。ＩＰ−１０は、細胞接着及びホーミングのマーカーである。
【図１２４】[00240]Ｇｅｎ１  ＴＩＬ産物の実施形態の注入前後のＩＰ−１０（ＣＸＣＬ１０）レベル（ｐｇ／ｍＬ、ｌｏｇ１０）。
【図１２５】[00241]Ｇｅｎ２  ＴＩＬ産物の実施形態の注入前後のＭＣＰ−１レベル（ｐｇ／ｍＬ、ｌｏｇ１０）。ＭＣＰ−１は、細胞接着及びホーミングのマーカーである。
【図１２６】[00242]Ｇｅｎ１  ＴＩＬ産物の実施形態の注入前後のＭＣＰ−１レベル（ｐｇ／ｍＬ、ｌｏｇ１０）。
【図１２７】[00243]子宮頸癌及び頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）の第２段階試験のデータ。ＳＤ＝病状が安定した疾患。ＰＲ＝進行性疾患。ＰＲ＝部分応答。
【図１２８】[00244]プロセス２Ａ、ＴＩＬ製造の２２日間プロセスの実施形態の概略図を示す。
【図１２９】[00245]重力血液フィルターの下部（単一ライン）へのＴＩＬ懸濁液移送パックの無菌溶接（実施例３０のプロセスノート５．１１を参照）の概略図を示す。
【図１３０】[00245]GRex100MCSから「上清」移送パックへの赤い培地の取り出しラインの無菌溶接（実施例３０のプロセスノート５．１１を参照）の概略図を示す。
【図１３１】[00245]セルコネクト装置の単一スパイク（Ｂ）を（Ｇ）で4S-4M60マニホールドの４スパイク端に置き換える、4S-4M60のCC2セルコネクトへの溶接（実施例３０のプロセスノート５．１１を参照）の概略図を示す。
【図１３２】[00246]4S-4M60のオスのルアーエンドの１つへのリピーター流体移送セットの溶接（実施例３０のプロセスノート５．１１を参照）の概略図を示す。
【図１３３】[00247]LOVO原料バッグへの重力血液フィルターの長い終端の無菌溶接（実施例３０のプロセスノート５．１１を参照）の概略図を示す。
【図１３４】[00248]フィルターの２つの供給源ラインの１つの、「プールされたＴＩＬ懸濁液」収集バッグへの無菌溶接（実施例３０のプロセスノート５．１１を参照）の概略図を示す。
【図１３５】[00249]セルコネクト装置の単一スパイク（Ｂ）を（Ｇ）で4S-4M60マニホールドの４スパイク端に置き換える、4S-4M60のCC2セルコネクトへの滅菌溶接（実施例３０のプロセスノート５．１１を参照）の概略図を示す。
【図１３６】[00250]４つのオスルアーエンド（Ｅ）の１つを各バッグに交換する、ステップ８．１４．８で準備したハーネスへのCS750クライオバッグの滅菌溶接（実施例３０のプロセスノート５．１１を参照）の概略図を示す。
【図１３７】[00251]4S-4M60のスパイクへのCS-10バッグの溶接（実施例３０のプロセスノート５．１１を参照）の概略図を示す。
【図１３８】[00252]ステップ８．１４．１０で準備した装置における残りのスパイク（Ａ）への「製剤化されたＴＩＬ」バッグの溶接（実施例３０のプロセスノート５．１１を参照）の概略図を示す。
【図１３９】[00253]空の保持液バッグ及びCS-10バッグを取り外す、Ｆでのヒートシール（実施例３０のプロセスノート５．１２参照）の図を示す。
【図１４０】[00254]構造Ｉ−Ａ及びＩ−Ｂを示し、円柱は個々のポリペプチド結合ドメインを指す。構造Ｉ−Ａ及びＩ−Ｂは、例えば、４−１ＢＢＬ又は４−１ＢＢに結合する抗体に由来する、３つの直鎖状に連結されたＴＮＦＲＳＦ結合ドメインを含み、これは折り畳まれて三価タンパク質を形成し、次いで、ＩｇＧ１−Ｆｃ（ＣＨ３及びＣＨ２ドメインを含む）を介して第２の三価タンパク質に連結され、次いで、これはジスルフィド結合（小さい細長い楕円形）を介して２つの三価タンパク質を連結するために使用され、構造を安定化し、６つの受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン及びシグナル伝達タンパク質を合わせてシグナル伝達複合体を形成できるアゴニストを提供する。
【図１４１】[00255]実施例２１で考察したような３段階の実験の概要を示すチャートを提供する。
【発明を実施するための形態】
【０１１８】
配列表の簡単な説明
[00256]  配列番号１は、ムロモナブの重鎖のアミノ酸配列である。
【０１１９】
[00257]  配列番号２は、ムロモナブの軽鎖のアミノ酸配列である。
【０１２０】
[00258]  配列番号３は、組換えヒトＩＬ−２タンパク質のアミノ酸配列である。
【０１２１】
[00259]  配列番号４は、アルデスロイキンのアミノ酸配列である。
【０１２２】
[00260]  配列番号５は、組換えヒトＩＬ−４タンパク質のアミノ酸配列である。
【０１２３】
[00261]  配列番号６は、組換えヒトＩＬ−７タンパク質のアミノ酸配列である。
【０１２４】
[00262]  配列番号７は、組換えヒトＩＬ−１５タンパク質のアミノ酸配列である。
【０１２５】
[00263]  配列番号８は、組換えヒトＩＬ−２１タンパク質のアミノ酸配列である。
【０１２６】
[00264]  配列番号９は、ヒト４−１ＢＢのアミノ酸配列である。
【０１２７】
[00265]  配列番号１０は、マウス４−１ＢＢのアミノ酸配列である。
【０１２８】
[00266]  配列番号１１は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ−０５０８２５６６）の重鎖である。
【０１２９】
[00267]  配列番号１２は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ−０５０８２５６６）の軽鎖である。
【０１３０】
[00268]  配列番号１３は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ−０５０８２５６６）の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
【０１３１】
[00269]  配列番号１４は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ−０５０８２５６６）の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
【０１３２】
[00270]  配列番号１５は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ−０５０８２５６６）の重鎖ＣＤＲ１である。
【０１３３】
[00271]  配列番号１６は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ−０５０８２５６６）の重鎖ＣＤＲ２である。
【０１３４】
[00272]  配列番号１７は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ−０５０８２５６６）の重鎖ＣＤＲ３である。
【０１３５】
[00273]  配列番号１８は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ−０５０８２５６６）の軽鎖ＣＤＲ１である。
【０１３６】
[00274]  配列番号１９は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ−０５０８２５６６）の軽鎖ＣＤＲ２である。
【０１３７】
[00275]  配列番号２０は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ−０５０８２５６６）の軽鎖ＣＤＲ３である。
【０１３８】
[00276]  配列番号２１は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３）の重鎖である。
【０１３９】
[00277]  配列番号２２は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３）の軽鎖である。
【０１４０】
[00278]  配列番号２３は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３）の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
【０１４１】
[00279]  配列番号２４は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３）の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
【０１４２】
[00280]  配列番号２５は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３）の重鎖ＣＤＲ１である。
【０１４３】
[00281]  配列番号２６は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３）の重鎖ＣＤＲ２である。
【０１４４】
[00282]  配列番号２７は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３）の重鎖ＣＤＲ３である。
【０１４５】
[00283]  配列番号２８は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３）の軽鎖ＣＤＲ１である。
【０１４６】
[00284]  配列番号２９は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３）の軽鎖ＣＤＲ２である。
【０１４７】
[00285]  配列番号３０は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３）の軽鎖ＣＤＲ３である。
【０１４８】
[00286]  配列番号４６は、４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）アミノ酸配列である。
【０１４９】
[00287]  配列番号４７は、４−１ＢＢＬポリペプチドの可溶性部分である。
【０１５０】
[00288]  配列番号４８は、４−１ＢＢアゴニスト抗体４Ｂ４−１−１バージョン１の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
【０１５１】
[00289]  配列番号４９は、４−１ＢＢアゴニスト抗体４Ｂ４−１−１バージョン１の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
【０１５２】
[00290]  配列番号５０は、４−１ＢＢアゴニスト抗体４Ｂ４−１−１バージョン２の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
【０１５３】
[00291]  配列番号５１は、４−１ＢＢアゴニスト抗体４Ｂ４−１−１バージョン２の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
【０１５４】
[00292]  配列番号５２は、４−１ＢＢアゴニスト抗体Ｈ３９Ｅ３−２の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
【０１５５】
[00293]  配列番号５３は、４−１ＢＢアゴニスト抗体Ｈ３９Ｅ３−２の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
【０１５６】
発明の詳細な説明
Ｉ．序論
[00294]  迅速拡大培養プロトコル（ＲＥＰ）によってエキソビボで培養したＴＩＬを利用する養子細胞療法は、黒色腫患者において宿主免疫抑制後に養子細胞療法の成功を生み出している。現行の注入適合パラメータは、ＴＩＬの組成（例えば、ＣＤ２８、ＣＤ８又はＣＤ４陽性）の読み取り並びにＲＥＰ産物の拡大倍数及び生存率の数値に頼っている。
【０１５７】
[00295]  現行のＲＥＰプロトコルは、患者に注入されることになるＴＩＬの健康に関しては見識をほとんど与えない。Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞からエフェクターＴ細胞へのその成熟の過程で顕著な代謝シフトを起こす（Chang, et al., Nat. Immunol. 2016, 17, 364（本明細書によって全体として明示的に援用される）及び特に嫌気的及び好気的代謝の考察及びマーカーについて参照のこと）。例えば、ナイーブＴ細胞はＡＴＰの産生をミトコンドリア呼吸に頼る一方、ＴＩＬなどの成熟した健康なエフェクターＴ細胞は高度に解糖性であり、それが増殖、遊走、活性化及び抗腫瘍有効性に必要とするバイオエナジェティクス基質の供給を好気的解糖に頼る。
【０１５８】
[00296]  先行論文の報告によれば、重度に解糖に頼る細胞は養子移入時に栄養枯渇を被り、その結果、移入細胞の大部分が死滅することになるため、移入前にＴＩＬの解糖を制限し、ミトコンドリア代謝を促進することが望ましい。従って、当技術分野では、ミトコンドリア代謝を促進すればインビボ寿命が促進される可能性があると教示され、実際、免疫応答の誘導前に解糖の阻害薬を使用することが提案されている。Chang et al.（Chang, et al., Nat. Immunol. 2016, 17(364)）を参照のこと。
【０１５９】
[00297]  本発明は更に、一部の実施形態において、この代謝的健康の増加を判定及び定量化する方法に関する。従って、本発明は、限定はされないが、解糖の速度及び量、酸化的リン酸化、予備呼吸容量（ＳＲＣ）及び解糖予備能を含めた１つ以上の一般的な代謝判定を用いてＴＩＬ集団の相対的健康をアッセイする方法を提供する。
【０１６０】
[00298]  その上、本発明は更に、一部の実施形態において、この代謝的健康の増加を判定及び定量化する方法に関する。従って、本発明は、限定はされないが、解糖の速度及び量、酸化的リン酸化、予備呼吸容量（ＳＲＣ）及び解糖予備能を含めた１つ以上の一般的な代謝判定を用いてＴＩＬ集団の相対的健康をアッセイする方法を提供する。
【０１６１】
[00299]  加えて、任意選択の追加的な判定としては、限定はされないが、ＡＴＰ産生、ミトコンドリア質量及びグルコース取込みが挙げられる。
【０１６２】
ＩＩ．定義
[00300]  他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で言及された全ての特許及び刊行物は、全体として参照により本明細書において援用される。
【０１６３】
[00301]  用語「インビボ」は、対象の体内で起こる事象を指す。
【０１６４】
[00302]  用語「インビトロ」は、対象の体外で起こる事象を指す。インビトロアッセイは、生細胞又は死細胞を利用した細胞ベースのアッセイを包含し、また、インタクトな細胞を利用しない無細胞アッセイも包含し得る。
【０１６５】
[00303]  用語「エキソビボ」は、対象の体から摘出された細胞、組織及び／又は臓器の処置又は処置の実施を含む事象を指す。適切には、細胞、組織及び／又は臓器は、手術又は処置の方法で対象の体に戻される。
【０１６６】
[00304]  用語「迅速拡大培養」は、１週間の期間で少なくとも約３倍（又は４倍、５倍、６倍、７倍、８倍又は９倍）、より好ましくは１週間の期間で少なくとも約１０倍（又は２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍又は９０倍）又は最も好ましくは１週間の期間で少なくとも約１００倍の抗原特異的ＴＩＬ数の増加を意味する。複数の迅速拡大培養プロトコルが以下に記載される。
【０１６７】
[00305]  本明細書において「腫瘍浸潤リンパ球」又は「ＴＩＬ」とは、対象の血流を離れて腫瘍中に遊走した、当初白血球細胞として得られた細胞の集団を意味する。ＴＩＬとしては、限定はされないが、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（リンパ球）、Ｔｈ１及びＴｈ１７  ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞及びＭ１マクロファージが挙げられる。ＴＩＬには、初代ＴＩＬ及び二次ＴＩＬの両方が含まれる。「初代ＴＩＬ」は、本明細書に概説されるとおり患者組織試料から得られるものであり（「新鮮に採取した」と称されることもある）及び「二次ＴＩＬ」は、限定はされないが、バルクＴＩＬ、拡大培養ＴＩＬ（「ＲＥＰ  ＴＩＬ」又は「ポストＲＥＰ  ＴＩＬ」）を含め、本明細書で考察するとおり拡大培養された又は増殖した任意のＴＩＬ細胞集団である。ＴＩＬ細胞集団は、遺伝子修飾ＴＩＬを含み得る。
【０１６８】
[00306]  本明細書において「細胞集団」（ＴＩＬを含む）は、共通の形質を共有する多数の細胞を意味する。一般に、集団は、概して数が１×１０６〜１×１０１０個の範囲であり、異なるＴＩＬ集団は異なる数を含む。例えば、ＩＬ−２の存在下での初代ＴＩＬの初期成長は、およそ１×１０８個の細胞のバルクＴＩＬ集団をもたらす。ＲＥＰ拡大培養は、概して１．５×１０９〜１．５×１０１０個の注入用の細胞集団が提供されるように行われる。
【０１６９】
[00307]  本明細書において「凍結保存ＴＩＬ」とは、初代、バルク又は拡大培養（ＲＥＰ  ＴＩＬ）のいずれかのＴＩＬが約−１５０℃〜−６０℃の範囲で処理及び保存されることを意味する。一般的な凍結保存方法は、実施例を含め、本明細書の他の部分にも記載される。明確にするために言えば、「凍結保存ＴＩＬ」は、初代ＴＩＬの供給源として用いられ得る凍結組織試料と区別可能なものである。
【０１７０】
[00308]  本明細書において「解凍した凍結保存ＴＩＬ」とは、かつて凍結保存されていたが、次に処理により、限定はされないが細胞培養温度又はＴＩＬを患者に投与し得る温度を含め、室温以上に戻されたＴＩＬ集団を意味する。
【０１７１】
[00309]  ＴＩＬは、概して、細胞表面マーカーを使用して生化学的に定義することも、又は腫瘍に浸潤して処置を達成するその能力によって機能的に定義することもできる。ＴＩＬは、一般に、以下のバイオマーカーの１つ以上を発現することによって分類することができる：ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲαβ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５６、ＣＣＲ７、ＣＤ４５Ｒａ、ＣＤ９５、ＰＤ−１及びＣＤ２５。加えて及び代わりに、ＴＩＬは、患者への再導入時に固形腫瘍に浸潤するその能力によって機能的に定義することができる。
【０１７２】
[00310]  用語「凍結保存培地（cryopreservation media）」又は「凍結保存培地（cryopreservation medium）」は、細胞の凍結保存に使用できる任意の培地を指す。かかる培地には、７％〜１０％のＤＭＳＯを含む培地が含まれ得る。例示的媒体には、CryoStor CS10、Hyperthermasol及びそれらの組み合わせが含まれる。用語「CS10」は、Stemcell Technologies又はBiolife Solutionsから入手した凍結保存培地を指す。CS10倍地は、商品名「CryoStor（登録商標）CS10」と称される場合がある。CS10培地は、ＤＭＳＯを含む無血清、無動物成分培地である。
【０１７３】
[00311]  用語「セントラルメモリーＴ細胞」は、ヒトではＣＤ４５Ｒ０＋であり、且つＣＣＲ７（ＣＣＲ７ｈｉ）及びＣＤ６２Ｌ（ＣＤ６２ｈｉ）を構成的に発現するＴ細胞のサブセットを指す。セントラルメモリーＴ細胞の表面表現型には、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤ１２７（ＩＬ−７Ｒ）及びＩＬ−１５Ｒも含まれる。セントラルメモリーＴ細胞の転写因子には、ＢＣＬ−６、ＢＣＬ−６Ｂ、ＭＢＤ２及びＢＭＩ１が含まれる。セントラルメモリーＴ細胞はＴＣＲ惹起後にエフェクター分子としてＩＬ−２及びＣＤ４０Ｌを主に分泌する。セントラルメモリーＴ細胞は血中のＣＤ４コンパートメントにおいて優勢であり、ヒトではリンパ節及び扁桃腺に比例的に高濃度化する。
【０１７４】
[00312]  用語「エフェクターメモリーＴ細胞」は、セントラルメモリーＴ細胞と同様にＣＤ４５Ｒ０＋であるが、ＣＣＲ７の構成的発現が欠損しており（ＣＣＲ７ｌｏ）、且つＣＤ６２Ｌ発現が不均一であるか又は低い（ＣＤ６２Ｌｌｏ）、ヒト又は哺乳類Ｔ細胞のサブセットを指す。セントラルメモリーＴ細胞の表面表現型には、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤ１２７（ＩＬ−７Ｒ）及びＩＬ−１５Ｒも含まれる。セントラルメモリーＴ細胞の転写因子には、ＢＬＩＭＰ１が含まれる。エフェクターメモリーＴ細胞は抗原刺激後、インターフェロン−γ、ＩＬ−４及びＩＬ−５を含め、高レベルの炎症性サイトカインを急速に分泌する。エフェクターメモリーＴ細胞は血中のＣＤ８コンパートメントにおいて優勢であり、ヒトでは肺、肝臓及び腸に比例的に高濃度化する。ＣＤ８＋  エフェクターメモリーＴ細胞は多量のパーフォリンを有する。
【０１７５】
[00313]  用語「閉鎖系」は、外部環境に対して閉鎖されている系を指す。本発明の方法では、細胞培養方法に適切な任意の閉鎖系を用いることができる。閉鎖系としては、例えば、限定はされないが、閉鎖型Ｇコンテナが挙げられる。閉鎖系に腫瘍セグメントが加えられた後は、ＴＩＬの患者への投与直前までこの系は外部環境に対して開放されない。
【０１７６】
[00314]  用語「断片化する」、「断片」及び「断片化された」は、腫瘍の破壊プロセスを記載するために本明細書で使用されるとき、腫瘍組織を押しつぶすこと、スライスすること、分割すること及び細切することなど、機械的断片化方法並びに腫瘍組織の物理的構造を破壊する任意の他の方法を含む。
【０１７７】
[00315]  用語「末梢血単核球」及び「ＰＢＭＣ」は、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）及び単球を含めた、円形の核を有する末梢血細胞を指す。好ましくは、末梢血単核球は、照射された同種異系末梢血単核球である。ＰＢＭＣは抗原提示細胞の一種である。
【０１７８】
[00316]  用語「抗ＣＤ３抗体」は、抗体又はその変異体、例えばモノクローナル抗体であって、成熟Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体におけるＣＤ３受容体に対するヒト、ヒト化、キメラ又はマウス抗体を含むものを指す。抗ＣＤ３抗体には、ムロモナブとしても知られるＯＫＴ−３が含まれる。抗ＣＤ３抗体には、Ｔ３及びＣＤ３εとしても知られるＵＨＣＴ１クローンも含まれる。他の抗ＣＤ３抗体には、例えば、オテリキシズマブ、テプリズマブ及びビジリズマブが含まれる。
【０１７９】
[00317]  用語「ＯＫＴ−３」（本明細書では「ＯＫＴ３」とも称される）は、成熟Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体におけるＣＤ３受容体に対する、ヒト、ヒト化、キメラ若しくはマウス抗体を含めたモノクローナル抗体又はそのバイオシミラー若しくは変異体を指し、ＯＫＴ−３（３０ｎｇ／ｍＬ、MACS GMP CD3 pure、Miltenyi Biotech,Inc.、San Diego, CA, USA）及びムロモナブ又はその変異体、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム若しくはバイオシミラーなど、市販されている形態を含む。ムロモナブの重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を表１に提供する（配列番号１及び配列番号２）。ＯＫＴ−３の産生能を有するハイブリドーマが米国培養細胞系統保存機関に寄託されており、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ  ８００１が付与されている。ＯＫＴ−３の産生能を有するハイブリドーマは、欧州認証細胞培養株保存機関（ＥＣＡＣＣ）にも寄託されており、カタログ番号８６０２２７０６が付与されている。
【０１８０】
【表１】
2021519582.tif 000003
【０１８１】
[00318]  用語「ＩＬ−２」（本明細書では「ＩＬ２」とも称される）は、インターロイキン−２として知られるＴ細胞成長因子を指し、そのヒト及び哺乳類形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー及び変異体を含め、あらゆる形態のＩＬ−２が含まれる。ＩＬ−２については、例えば、Nelson, J. Immunol. 2004, 172, 3983-88及びMalek, Annu. Rev. Immunol. 2008, 26, 453-79（これらの開示は参照により本明細書に援用される）に記載される。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ−２のアミノ酸配列を表２に提供する（配列番号３）。例えば、用語ＩＬ−２には、ヒトの組換え形態のＩＬ−２、例えばアルデスロイキン（PROLEUKIN、１つの使い捨てバイアルあたり２２００万ＩＵで複数の供給業者から市販されている）並びにCellGenix, Inc.、Portsmouth, NH, USA（CELLGRO GMP）又はProSpec-Tany TechnoGene Ltd.、East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号CYT-209-b）によって商業的に供給されている組換えＩＬ−２の形態及び他の販売業者からの他の市販の均等物が包含される。アルデスロイキン（ｄｅｓ−アラニル−１，セリン−１２５ヒトＩＬ−２）は、分子量が約１５ｋＤａの非グリコシル化ヒト組換え形態のＩＬ−２である。本発明での使用に好適なアルデスロイキンのアミノ酸配列を表２に提供する（配列番号４）。用語ＩＬ−２には、Nektar Therapeutics、South San Francisco, CA, USAから入手可能なペグ化ＩＬ２プロドラッグNKTR-214を含め、本明細書に記載されるとおりの、ペグ化形態のＩＬ−２も包含される。本発明での使用に好適なNKTR-214及びペグ化ＩＬ−２が米国特許出願公開第２０１４／０３２８７９１  Ａ１号及び国際公開第２０１２／０６５０８６  Ａ１号（これらの開示は参照により本明細書に援用される）に記載されている。本発明での使用に好適な別の形態のコンジュゲート型ＩＬ−２が、米国特許第４，７６６，１０６号、同第５，２０６，３４４号、同第５，０８９，２６１号及び同第４９０２，５０２号（これらの開示は参照により本明細書に援用される）に記載されている。本発明での使用に好適なＩＬ−２の製剤が米国特許第６，７０６，２８９号（この開示は参照により本明細書に援用される）に記載されている。
【０１８２】
【表２】
2021519582.tif 000004
【０１８３】
[00319]  用語「ＩＬ−４」（本明細書では「ＩＬ４」とも称される）は、インターロイキン４として知られるサイトカインを指し、これはＴｈ２  Ｔ細胞によって産生され、且つ好酸球、好塩基球及びマスト細胞によって産生される。ＩＬ−４は、ナイーブヘルパーＴ細胞（Ｔｈ０細胞）のＴｈ２  Ｔ細胞への分化を調節する。Steinke and Borish, Respir. Res. 2001, 2, 66-70。ＩＬ−４によって活性化されると、続いてＴｈ２  Ｔ細胞はポジティブフィードバックループで更なるＩＬ−４を産生する。ＩＬ−４は、Ｂ細胞増殖及びクラスＩＩ  ＭＨＣ発現も刺激し、Ｂ細胞からのＩｇＥ及びＩｇＧ１発現へのクラススイッチも誘導する。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ−４は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.、East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号CYT-211）及びThermoFisher Scientific, Inc.、Waltham, MA, USA（ヒトＩＬ−１５組換えタンパク質、カタログ番号Gibco CTP0043）を含め、複数の供給業者から市販されている。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ−４のアミノ酸配列を表２に提供する（配列番号５）。
【０１８４】
[00320]  用語「ＩＬ−７」（本明細書では「ＩＬ７」とも称される）は、インターロイキン７として知られるグリコシル化組織由来サイトカインを指し、これは間質及び上皮細胞並びに樹状細胞から入手し得る。Fry and Mackall, Blood 2002, 99, 3892-904。ＩＬ−７はＴ細胞の発達を刺激することができる。ＩＬ−７は、ＩＬ−７受容体αと共通γ鎖受容体とからなるヘテロ二量体のＩＬ−７受容体に結合し、それが胸腺内でのＴ細胞発達及び末梢内での生存にとって重要な一連のシグナルとなる。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ−７は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.、East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号CYT-254）及びThermoFisher Scientific, Inc.、Waltham, MA, USA（ヒトＩＬ−１５組換えタンパク質、カタログ番号Gibco PHC0071）を含め、複数の供給業者から市販されている。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ−７のアミノ酸配列を表２に提供する（配列番号６）。
【０１８５】
[00321]  用語「ＩＬ−１５」（本明細書では「ＩＬ１５」とも称される）は、インターロイキン−１５として知られるＴ細胞成長因子を指し、そのヒト及び哺乳類形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー及び変異体を含め、あらゆる形態のＩＬ−２が含まれる。ＩＬ−１５については、例えば、Fehniger and Caligiuri, Blood 2001, 97, 14-32（この開示は参照により本明細書に援用される）に記載されている。ＩＬ−１５はβ及びγシグナル伝達受容体サブユニットをＩＬ−２と共有している。組換えヒトＩＬ−１５は、分子質量が１２．８ｋＤａの、１１４アミノ酸（及びＮ末端メチオニン）を含む単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖である。組換えヒトＩＬ−１５は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.、East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号CYT-230-b）及びThermoFisherScientific, Inc.、Waltham, MA, USA（ヒトＩＬ−１５組換えタンパク質、カタログ番号34-8159-82）を含め、複数の供給業者から市販されている。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ−１５のアミノ酸配列を表２に提供する（配列番号７）。
【０１８６】
[00322]  用語「ＩＬ−２１」（本明細書では「ＩＬ２１」とも称される）は、インターロイキン−２１として知られるプレイオトロピックサイトカインタンパク質を指し、そのヒト及び哺乳類形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー及び変異体を含め、あらゆる形態のＩＬ−２１が含まれる。ＩＬ−２１については、例えば、Spolski and Leonard, Nat. Rev. Drug. Disc. 2014, 13, 379-95（この開示は参照により本明細書に援用される）に記載されている。ＩＬ−２１は、主としてナチュラルキラーＴ細胞及び活性化ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞によって産生される。組換えヒトＩＬ−２１は、分子質量が１５．４ｋＤａの、１３２アミノ酸を含む単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖である。組換えヒトＩＬ−２１は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.、East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号CYT-408-b）及びThermoFisherScientific, Inc.、Waltham, MA, USA（ヒトＩＬ−２１組換えタンパク質、カタログ番号14-8219-80）を含め、複数の供給業者から市販されている。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ−２１のアミノ酸配列を表２に提供する（配列番号８）。
【０１８７】
[00323]  「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」又は「治療量」が指示されるとき、本発明の組成物の正確な投与量は、医師が、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染又は転移の程度及び患者（対象）の状態の個体差を考慮して決定することができる。概して、本明細書に記載される腫瘍浸潤リンパ球（例えば、二次ＴＩＬ又は遺伝子修飾された細胞傷害性リンパ球）を含む医薬組成物は１０４〜１０１１細胞／ｋｇ体重（例えば、１０５〜１０６、１０５〜１０１０、１０５〜１０１１、１０６〜１０１０、１０６〜１０１１、１０７〜１０１１、１０７〜１０１０、１０８〜１０１１、１０８〜１０１０、１０９〜１０１１又は１０９〜１０１０細胞／ｋｇ体重）（これらの範囲内にある全ての整数値を含む）の投薬量で投与され得ると言うことができる。腫瘍浸潤リンパ球（場合によっては遺伝子修飾された細胞傷害性リンパ球を含む）組成物はまた、これらの投薬量で複数回投与され得る。腫瘍浸潤リンパ球（ある場合には遺伝子的なものを含む）は、免疫療法で一般に公知の注入技法を用いることにより投与し得る（例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988を参照のこと）。特定の患者に最適な投薬量及び処置レジームは、医学分野の当業者が疾患の徴候に関して患者をモニターし及びそれに応じて処置を調整することにより、容易に決定することができる。
【０１８８】
[00324]  用語「血液学的悪性腫瘍」は、限定はされないが、血液、骨髄、リンパ節及びリンパ系の組織を含め、哺乳類における造血及びリンパ系組織の癌及び腫瘍を指す。血液学的悪性腫瘍は「液性腫瘍」とも称される。血液学的悪性腫瘍としては、限定はされないが、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）、急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫が挙げられる。用語「Ｂ細胞血液学的悪性腫瘍」は、Ｂ細胞を冒す血液学的悪性腫瘍を指す。
【０１８９】
[00325]  用語「固形腫瘍」は、通常嚢胞又は液体範囲を含まない異常な組織塊を指す。固形腫瘍は良性又は悪性であり得る。用語「固形腫瘍癌」は、悪性、新生物性又は癌性の固形腫瘍を指す。固形腫瘍癌としては、限定はされないが、肺癌、乳癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌及び膀胱癌など、肉腫、癌腫及びリンパ腫が挙げられる。固形腫瘍の組織構造は、実質（癌細胞）と、癌細胞が分散するところであって支持微小環境をもたらし得る支持間質細胞とを含む相互依存的組織コンパートメントを含む。
【０１９０】
[00326]  用語「液性腫瘍」は、事実上流体である異常な細胞塊を指す。液性腫瘍癌としては、限定はされないが、白血病、骨髄腫及びリンパ腫並びに他の血液学的悪性腫瘍が挙げられる。液性腫瘍から入手されるＴＩＬは、本明細書において骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）とも称され得る。
【０１９１】
[00327]  用語「微小環境」は、本明細書で使用されるとき、固形腫瘍又は血液学的腫瘍の微小環境全体又は微小環境内の個々の細胞サブセットを指し得る。腫瘍微小環境は、本明細書で使用されるとき、Swartz, et al., Cancer Res., 2012, 72, 2473に記載されるとおり、「新生物形質転換を促進し、腫瘍成長及び浸潤を支援し、腫瘍を宿主免疫から保護し、治療抵抗性を助長し、且つ顕性転移が発育するためのニッチを提供する細胞、可溶性因子、シグナル伝達分子、細胞外マトリックス及び機械的キュー」の複合混合物を指す。腫瘍は、Ｔ細胞によって認識されるはずの抗原を発現するが、微小環境による免疫抑制のため、免疫系による腫瘍クリアランスはまれである。
【０１９２】
[00328]  ある実施形態において、本発明は、ＴＩＬ集団で癌を治療する方法を含み、ここで患者は本発明に係るＴＩＬの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。一部の実施形態において、ＴＩＬ集団が提供され得、ここで、患者は、本発明に係るＴＩＬの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。ある実施形態において、骨髄非破壊的化学療法は、２日間（ＴＩＬ注入前２７日目及び２６日目）のシクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日及び５日間（ＴＩＬ注入前２７〜２３日目）のフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２／日である。ある実施形態において、骨髄非破壊的化学療法及び本発明に係るＴＩＬ注入（０日目）後、患者は生理学的忍容量まで８時間毎に静脈内に７２０，０００ＩＵ／ｋｇのＩＬ−２の静脈内注入を受ける。
【０１９３】
[00329]  実験的知見から、腫瘍特異的Ｔリンパ球の養子移入前のリンパ球枯渇が、調節性Ｔ細胞及び免疫系の競合エレメント（「サイトカインシンク」）の除去により、治療有効性の増強において重要な役割を果たすことが指摘される。従って、本発明の一部の実施形態は、本発明のｒＴＩＬを導入する前に患者に対してリンパ球枯渇ステップ（「免疫抑制コンディショニング」とも称される）を利用する。
【０１９４】
[00330]  用語「共投与」、「共投与する」、「〜と併用して投与される」、「〜と併用して投与する」、「同時の」及び「並行した」は、本明細書で使用されるとき、両方の医薬品有効成分及び／又はその代謝産物が対象に同じ時点で存在するような対象への２つ以上の医薬品有効成分（本発明の好ましい実施形態において、例えば、複数のＴＩＬとの併用での少なくとも１つのカリウムチャネル作動薬）の投与を包含する。共投与には、別個の組成物での同時投与、別個の組成物での異なる時点における投与又は２つ以上の医薬品有効成分が存在する組成物での投与が含まれる。別個の組成物での同時投与及び両方の薬剤が存在する組成物での投与が好ましい。
【０１９５】
[00331]  用語「有効量」又は「治療有効量」は、限定はされないが疾患治療を含めた、意図した適用を達成するのに十分な本明細書に記載されるとおりの化合物又は化合物の組み合わせの量を指す。治療有効量は、意図した適用（インビトロ又はインビボ）又は治療下の対象及び疾患病態（例えば、対象の体重、年齢及び性別）、疾患病態の重症度又は投与方法に応じて異なり得る。この用語は、標的細胞において特定の応答（例えば、血小板粘着及び／又は細胞遊走の低減）を生じさせるであろう用量にも適用される。具体的な用量は、選択した詳細な化合物、従うべき投与レジメン、化合物が他の化合物と併用して投与されるかどうか、投与タイミング、その投与先の組織及び化合物を運ぶ物理的デリバリーシステムに応じて異なることになる。
【０１９６】
[00332]  用語「治療」、「治療している」、「治療する」などは、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を達成することを指す。効果は、疾患又はその症状を完全に又は部分的に防ぐという意味で予防的であり得、及び／又は疾患及び／又は疾患に起因する有害作用を部分的に又は完全に治癒するという意味で治療的であり得る。「治療」は、本明細書で使用されるとき、哺乳類、特にヒトにおける疾患の任意の治療を包含し、（ａ）疾患の素因があり得るが、依然としてそれを有するとは診断されてない対象において疾患の発生を防ぐこと；（ｂ）疾患を阻害すること、すなわちその発症又は進行を止めること；及び（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち疾患の退縮を生じさせること及び／又は１つ以上の疾患症状を軽減することが含まれる。「治療」は、疾患又は病態がない場合でも、薬理学的効果を提供するための薬剤の送達を包含することも意図される。例えば、「治療」は、例えばワクチンの場合、疾患状態がない中で免疫応答を誘発し又は免疫を付与することのできる組成物の送達を包含する。
【０１９７】
[00333]  用語「異種」は、核酸又はタンパク質の一部分に関連して使用されるとき、その核酸又はタンパク質が、自然中では互いに同じ関係で見出されない２つ以上の部分配列を含むことを示す。例えば、核酸は、典型的には組換え産生されて、新規の機能性核酸を作り出すように編成された無関係の遺伝子からの２つ以上の配列、例えば、ある供給源からのプロモーターと別の供給源からのコード領域又は異なる供給源からのコード領域を有する。同様に、異種タンパク質とは、タンパク質が、自然中では互いに同じ関係で見出されない２つ以上の部分配列（例えば、融合タンパク質）を含むことを示す。
【０１９８】
[00334]  ２つ以上の核酸又はポリペプチドの文脈で用語「配列同一性」、「パーセント同一性」及び「配列パーセント同一性」（又はこれらの同義語、例えば「９９％同一」）は、いかなる保存的アミノ酸置換も配列同一性の一部として考慮せず、対応が最大となるように比較及びアラインメント（必要に応じてギャップを導入する）したときに同じであるか、又は同じであるヌクレオチド若しくはアミノ酸残基を特定の割合のみ有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。パーセント同一性は、配列比較ソフトウェア又はアルゴリズムを用いるか、又は目視検査によって測定することができる。アミノ酸又はヌクレオチド配列のアラインメントを達成するために使用し得る様々なアルゴリズム及びソフトウェアが当技術分野において公知である。パーセント配列同一性の決定に好適なプログラムとしては、例えば、米国政府の国立バイオテクノロジー情報センターBLASTウェブサイトから利用可能なBLASTプログラムスイートが挙げられる。２つの配列間の比較は、BLASTN又はBLASTPのいずれかのアルゴリズムを使用して行うことができる。BLASTNは核酸配列の比較に使用され、一方、BLASTPはアミノ酸配列の比較に使用される。ALIGN、ALIGN-2（Genentech、South San Francisco, California）又はDNASTARから利用可能なMegAlignが、配列のアラインメントに使用し得る更なる公的に利用可能なソフトウェアプログラムである。当業者は、特定のアラインメントソフトウェアによるアラインメントを最大化するための適切なパラメータを決定することができる。特定の実施形態では、アラインメントソフトウェアのデフォルトパラメータが使用される。
【０１９９】
[00335]  本明細書で使用されるとき、用語「変異体」は、限定はされないが、参照抗体のアミノ酸配列の範囲内の又はそれに隣接する特定の位置における１つ以上の置換、欠失及び／又は付加の点で参照抗体のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含む抗体又は融合タンパク質を包含する。変異体は、参照抗体のアミノ酸配列と比較して、そのアミノ酸配列に１つ以上の保存的置換を含み得る。保存的置換は、例えば、同様の荷電又は非荷電アミノ酸の置換を含み得る。変異体は、参照抗体の抗原に特異的に結合する能力を保持している。変異体という用語は、ペグ化抗体又はタンパク質も含む。
【０２００】
[00336]  本明細書において「腫瘍浸潤リンパ球」又は「ＴＩＬ」とは、対象の血流を離れて腫瘍中に遊走した、当初白血球細胞として得られた細胞の集団を意味する。ＴＩＬとしては、限定はされないが、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（リンパ球）、Ｔｈ１及びＴｈ１７  ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞及びＭ１マクロファージが挙げられる。ＴＩＬには、初代ＴＩＬ及び二次ＴＩＬの両方が含まれる。「初代ＴＩＬ」は、本明細書に概説されるとおり患者組織試料から得られるものであり（「新鮮に採取した」と称されることもある）、及び「二次ＴＩＬ」は、限定はされないが、バルクＴＩＬ、拡大培養ＴＩＬ（「ＲＥＰ  ＴＩＬ」）並びに本明細書で考察するとおりの「ｒｅＲＥＰ  ＴＩＬ」を含め、本明細書で考察するとおり拡大培養された又は成長した任意のＴＩＬ細胞集団である。ｒｅＲＥＰ  ＴＩＬは、例えば、第２の拡大培養ＴＩＬ又は第２追加拡大培養ＴＩＬ（例えば、ｒｅＲＥＰ  ＴＩＬと称されるＴＩＬを含む、図２７のステップＤに記載されたものなど）を含み得る。
【０２０１】
[00337]  ＴＩＬは、概して、細胞表面マーカーを使用して生化学的に定義することも、又は腫瘍に浸潤して処置を達成するその能力によって機能的に定義することもできる。ＴＩＬは、一般に、以下のバイオマーカーの１つ以上を発現することによって分類することができる：ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲαβ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５６、ＣＣＲ７、ＣＤ４５Ｒａ、ＣＤ９５、ＰＤ−１及びＣＤ２５。加えて及び代わりに、ＴＩＬは、患者への再導入時に固形腫瘍に浸潤するその能力によって機能的に定義することができる。ＴＩＬは、更に効力によって特徴付けられ得、−  例えば、ＴＩＬは、例えばインターフェロン（ＩＦＮ）遊離が約５０ｐｇ／ｍＬより高い、約１００ｐｇ／ｍＬより高い、約１５０ｐｇ／ｍＬより高い又は約２００ｐｇ／ｍＬより高い場合に効力があると見なすことができる。
【０２０２】
[00338]  用語「薬学的に許容される担体」又は「薬学的に許容される賦形剤」は、ありとあらゆる溶媒、分散剤、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤並びに不活性成分を含むものとする。活性医薬成分のためのかかる薬学的に許容される担体又は薬学的に許容される賦形剤の使用は当技術分野において周知である。任意の従来の薬学的に許容される担体又は薬学的に許容される賦形剤が活性医薬成分と適合しない場合を除き、本発明の治療用組成物におけるその使用が企図される。他の薬物などの追加的な活性医薬成分も記載の組成物及び方法に援用され得る。
【０２０３】
[00339]  用語「約」及び「およそ」は、統計的に意味のある値の範囲内を指す。かかる範囲は、所定の値又は範囲の一桁以内、好ましくは５０％以内、より好ましくは２０％以内、更により好ましくは１０％以内、更により好ましくは５％以内であり得る。用語「約」又は「およそ」に含まれる許容変動は、研究中の特定の系に依存し、当業者には容易に理解できる。更に、本明細書で使用される場合、用語「約」及び「およそ」は、寸法、サイズ、配合、パラメータ、形状及び他の量及び特性が正確ではないことを意味するが、近似及び／又はより大きい又はより小さい場合があり、必要に応じて、公差、変換係数、四捨五入、測定誤差など、及び当業者に公知の他の因子を反映する。一般に、寸法、サイズ、配合、パラメータ、形状又は他の量若しくは特性は、明示的にそうであると明記されているか否かにかかわらず、「約」又は「およそ」である。大きく異なるサイズ、形状及び寸法の実施形態が、記載された用語を採用する場合があることに留意されたい。
【０２０４】
[00340]  添付の特許請求の範囲で使用される場合、「を含む」、「から本質的になる」及び「からなる」という移行用語は、記載されていない追加的な請求要素又はステップがある場合、それらが特許請求の範囲から除外されることに関して、元の形式及び修正された形式で、特許請求の範囲を定義する。用語「を含む」は、包括的又は無制限であることを意図しており、追加的な引用されていない要素、方法、ステップ又は材料を除外するものではない。用語「からなる」は、特許請求の範囲で指定されたもの以外の要素、ステップ又は材料を除外し、後者の場合、指定された材料に関連する通常の不純物を除外する。用語「から本質的になる」は、特許請求の範囲を特定の要素、ステップ又は材料及び請求された発明の基本的及び新規の特性に実質的に影響しないものに限定する。本発明を具体化する本明細書に記載の全ての組成物、方法及びキットは、代替実施形態において、「を含む」、「から本質的になる」及び「からなる」という移行用語のいずれかによってより具体的に定義され得る。
【０２０５】
４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト
[0001]  一実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストである。４−１ＢＢアゴニストは、当技術分野で公知の任意の４−１ＢＢ結合分子であり得る。４−１ＢＢ結合分子は、ヒト又は哺乳類４−１ＢＢに結合できるモノクローナル抗体又は融合タンパク質であり得る。４−１ＢＢアゴニスト又は４−１ＢＢ結合分子は、免疫グロブリン分子の任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスの免疫グロブリン重鎖を含み得る。４−１ＢＢアゴニスト又は４−１ＢＢ結合分子は、重鎖及び軽鎖の両方を有し得る。本明細書で使用される場合、結合分子という用語は、抗体（全長抗体を含む）、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体並びに抗体断片、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生される断片、上記のいずれかのエピトープ結合断片及び４−１ＢＢに結合する抗体の操作された形態、例えばｓｃＦｖ分子も含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、完全ヒト抗体である抗原結合タンパク質である。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、ヒト化抗体である抗原結合タンパク質である。一部の実施形態において、本開示の方法及び組成物における使用のための４−１ＢＢアゴニストは、抗４−１ＢＢ抗体、ヒト抗４−１ＢＢ抗体、マウス抗４−１ＢＢ抗体、哺乳動物抗４−１ＢＢ抗体、モノクローナル抗４−１ＢＢ抗体、ポリクローナル抗４−１ＢＢ抗体、キメラ抗４−１ＢＢ抗体、抗４−１ＢＢアドネクチン、抗４−１ＢＢドメイン抗体、単鎖抗４−１ＢＢ断片、重鎖抗４−１ＢＢ断片、軽鎖抗４−１ＢＢ断片、抗４−１ＢＢ融合タンパク質及びそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体若しくはバイオシミラーを含む。アゴニスト性抗４−１ＢＢ抗体は、強い免疫応答を誘導することが知られている。Lee, et al., PLOS One 2013, 8, e69677。好ましい実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、アゴニスト性、抗４−１ＢＢヒト化又は完全ヒトモノクローナル抗体（すなわち単一細胞株に由来する抗体）である。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、ＥＵ−１０１（Eutilex Co. Ltd.）、ウトミルマブ若しくはウレルマブ又はそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体若しくはバイオシミラーである。好ましい一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、ウトミルマブ若しくはウレルマブ又はそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体若しくはバイオシミラーである。
【０２０６】
[0002]  好ましい実施形態において、４−１ＢＢアゴニスト又は４−１ＢＢ結合分子は、融合タンパク質でもあり得る。好ましい実施形態において、三量体又は六量体４−１ＢＢアゴニスト（３つ又は６つのリガンド結合ドメインを有する）などの多量体４−１ＢＢアゴニストは、典型的には２つのリガンド結合ドメインを保有するアゴニスト性モノクローナル抗体と比較して、優れた受容体（４−１ＢＢＬ）のクラスター化及び内部細胞シグナル伝達複合体形成を誘導し得る。３つのＴＮＦＲＳＦ結合ドメイン及びＩｇＧ１−Ｆｃを含み、任意選択でこれらの融合タンパク質の２つ以上を更に連結する、三量体（三価）又は六量体（又は六価）又はそれより大きい融合タンパク質は、例えば、Gieffers, et al., Mol. Cancer Therapeutics 2013, 12, 2735-47に記載される。
【０２０７】
[0003]  アゴニスト性４−１ＢＢ抗体及び融合タンパク質は、強い免疫応答を誘導することが知られている。好ましい実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、毒性を低減するのに十分な方法で４−１ＢＢ抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、例えばＮＫ細胞の細胞傷害性を抑制する、アゴニスト性４−１ＢＢモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を抑制する、アゴニスト性４−１ＢＢモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を抑制する、アゴニスト性４−１ＢＢモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、Ｆｃ領域機能性を抑制する、アゴニスト性４−１ＢＢモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。
【０２０８】
[0004]  一部の実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、高い親和性及びアゴニスト活性でヒト４−１ＢＢ（配列番号９）に結合することを特徴とする。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、ヒト４−１ＢＢ（配列番号９）に結合する結合分子である。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、マウス４−１ＢＢ（配列番号１０）に結合する結合分子である。４−１ＢＢアゴニスト又は結合分子が結合する４−１ＢＢ抗原のアミノ酸配列を表３に概括する。
【０２０９】
【表３】
2021519582.tif 000005
【０２１０】
[0005]  一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス及び方法は、約１００ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約９０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約８０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約７０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約６０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約５０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約４０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、又は約３０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合する、４−１ＢＢアゴニストを含む。
【０２１１】
[0006]  一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス及び方法は、約７．５×１０５  １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約７．５×１０５  １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約８×１０５  １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約８．５×１０５  １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約９×１０５  １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約９．５×１０５  １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、又は約１×１０６  １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合する、４−１ＢＢアゴニストを含む。
【０２１２】
[0007]  一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス及び方法は、約２×１０−５  １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約２．１×１０−５  １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約２．２×１０−５  １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約２．３×１０−５  １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約２．４×１０−５  １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約２．５×１０−５  １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約２．６×１０−５  １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、又は約２．７×１０−５  １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約２．８×１０−５  １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約２．９×１０−５  １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、又は約３×１０−５  １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合する、４−１ＢＢアゴニストを含む。
【０２１３】
[0008]  一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス及び方法は、約１０ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約９ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約８ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約７ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約６ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約５ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約４ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約３ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約２ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、又は約１ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４−１ＢＢに結合する、４−１ＢＢアゴニストを含む。
【０２１４】
[0009]  好ましい実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、ＰＦ−０５０８２５６６又はＭＯＲ−７４８０としても知られるウトミルマブ又はその断片、誘導体、変異体若しくはバイオシミラーである。ウトミルマブはPfizer, Inc.から入手できる。ウトミルマブは、免疫グロブリンＧ２−ラムダ、抗［ヒト（Homo sapiens）ＴＮＦＲＳＦ９（腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー９、４−１ＢＢ、Ｔ細胞抗原ＩＬＡ、ＣＤ１３７）］、ヒト（Homo sapiens）（完全ヒト）モノクローナル抗体である。ウトミルマブのアミノ酸配列を表４に示す。ウトミルマブは、Ａｓｎ５９及びＡｓｎ２９２のグリコシル化部位；位置２２−９６（ＶＨ−ＶＬ）、１４３−１９９（ＣＨ１−ＣＬ）、２５６−３１６（ＣＨ２）及び３６２−４２０（ＣＨ３）の重鎖内ジスルフィド架橋；位置２２’−８７’（ＶＨ−ＶＬ）及び１３６’−１９５’（ＣＨ１−ＣＬ）の軽鎖内ジスルフィド架橋；ＩｇＧ２Ａアイソフォーム位置２１８−２１８、２１９−２１９、２２２−２２２及び２２５−２２５、ＩｇＧ２Ａ／Ｂアイソフォーム位置２１８−１３０、２１９−２１９、２２２−２２２及び２２５−２２５並びにＩｇＧ２Ｂアイソフォーム位置２１９−１３０（２）、２２２−２２２及び２２５−２２５の鎖内重鎖−重鎖ジスルフィド架橋；ＩｇＧ２Ａアイソフォーム位置１３０−２１３’（２）、ＩｇＧ２Ａ／Ｂアイソフォーム位置２１８−２１３’及び１３０−２１３’並びにＩｇＧ２Ｂアイソフォーム位置２１８−２１３’（２）の鎖内重鎖−軽鎖ジスルフィド架橋を含む。ウトミルマブ並びにその変異体及び断片の調製並びに特性は、米国特許第８，８２１，８６７号；同第８，３３７，８５０号；及び同第９，４６８，６７８号並びに国際公開第２０１２／０３２４３３  Ａ１号に記載され、これらのそれぞれの開示は参照により本明細書に組み込まれる。ウトミルマブの前臨床的特徴は、Fisher, et al., Cancer Immunolog. & Immunother. 2012, 61, 1721-33に記載される。様々な血液学的及び固形腫瘍の適応症におけるウトミルマブの現在の臨床試験には、米国国立衛生研究所Clinicaltrials.gov識別子ＮＣＴ０２４４４７９３、ＮＣＴ０１３０７２６７、ＮＣＴ０２３１５０６６及びＮＣＴ０２５５４８１２が含まれる。
【０２１５】
[0010]  一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、配列番号１１で示される重鎖及び配列番号１２で示される軽鎖を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２に示される配列を有する重鎖及び軽鎖又は抗原結合断片、Ｆａｂ断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、その変異体若しくはコンジュゲートを含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。
【０２１６】
[0011]  一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、ウトミルマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域（ＶＲ）を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニスト重鎖可変領域（ＶＨ）は配列番号１３に示される配列を含み、４−１ＢＢアゴニスト軽鎖可変領域（ＶＬ）は配列番号１４に示される配列及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１３及び配列番号１４に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１３及び配列番号１４に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１３及び配列番号１４に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１３及び配列番号１４に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１３及び配列番号１４に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、配列番号１３及び配列番号１４に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖ抗体を含む。
【０２１７】
[0012]  一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７に記載の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換と、それぞれ配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０に記載の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換とを含む。
【０２１８】
[0013]  一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、ウトミルマブに関して薬物規制当局によって承認された４−１ＢＢアゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して１つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含む４−１ＢＢ抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウトミルマブである。一部の実施形態において、１つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化及び切断の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された又は認可のために提出された４−１ＢＢアゴニスト抗体であり、４−１ＢＢアゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウトミルマブである。４−１ＢＢアゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／又は欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可されていることができる。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウトミルマブである。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウトミルマブである。
【０２１９】
【表４】
2021519582.tif 000006
【０２２０】
[0014]  好ましい実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、ＢＭＳ−６６３５１３及び２０Ｈ４．９．ｈ４ａとしても知られるモノクローナル抗体ウレルマブ又はその断片、誘導体、変異体若しくはバイオシミラーである。ウレルマブは、Bristol-Myers Squibb, Inc.及びCreative Biolabs, Inc.から入手できる。ウレルマブは、免疫グロブリンＧ４−カッパ、抗［ヒト（Homo sapiens）ＴＮＦＲＳＦ９（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９、４−１ＢＢ、Ｔ細胞抗原ＩＬＡ、ＣＤ１３７）］、ヒト（Homo sapiens）（完全ヒト）モノクローナル抗体である。ウレルマブのアミノ酸配列を表５に示す。ウレルマブは、位置２９８（及び２９８’’）のＮ−グリコシル化部位；位置２２−９５（ＶＨ−ＶＬ）、１４８−２０４（ＣＨ１−ＣＬ）、２６２−３２２（ＣＨ２）及び３６８−４２６（ＣＨ３）（並びに位置２２’’−９５’’、１４８’’−２０４’’、２６２’’−３２２’’及び３６８’’−４２６’’）の重鎖内ジスルフィド架橋；位置２３’−８８’（ＶＨ−ＶＬ）及び１３６’−１９６’（ＣＨ１−ＣＬ）（並びに位置２３’’’−８８’’’及び１３６’’’−１９６’’’）の軽鎖内ジスルフィド架橋；位置２２７−２２７’’及び２３０−２３０’’の鎖内重鎖−重鎖ジスルフィド架橋；並びに位置１３５−２１６’及び１３５’’−２１６’’’の鎖内重鎖−軽鎖ジスルフィド架橋を含む。ウレルマブ並びにその変異体及び断片の調製及び特性は、米国特許第７，２８８，６３８号及び同第８，９６２，８０４号に記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。ウレルマブの前臨床的及び臨床的特徴は、http:/dx.doi.org/ 10.1158/1078-0432.CCR-16-1272で入手可能なSegal, et al., Clin.Cancer Res. 2016に記載される。様々な血液学的及び固形腫瘍の適応症におけるウレルマブの現在の臨床試験には、米国国立衛生研究所Clinicaltrials.gov識別子ＮＣＴ０１７７５６３１、ＮＣＴ０２１１００８２、ＮＣＴ０２２５３９９２及びＮＣＴ０１４７１２１０が含まれる。
【０２２１】
[0015]  一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、配列番号２１で示される重鎖及び配列番号２２で示される軽鎖を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２１及び配列番号２２に示される配列を有する重鎖及び軽鎖又は抗原結合断片、Ｆａｂ断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、その変異体若しくはコンジュゲートを含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２１及び配列番号２２に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２１及び配列番号２２に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２１及び配列番号２２に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２１及び配列番号２２に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２１及び配列番号２２に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。
【０２２２】
[0016]  一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、ウレルマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域（ＶＲ）を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニスト重鎖可変領域（ＶＨ）は配列番号２３に示される配列を含み、４−１ＢＢアゴニスト軽鎖可変領域（ＶＬ）は配列番号２４に示される配列及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２３及び配列番号２４に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２３及び配列番号２４に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２３及び配列番号２４に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２３及び配列番号２４に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２３及び配列番号２４に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、配列番号２３及び配列番号２４に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖ抗体を含む。
【０２２３】
[0017]  一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７に記載の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換と、それぞれ配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０に記載の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換とを含む。
【０２２４】
[0018]  一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、ウレルマブに関して薬物規制当局によって承認された４−１ＢＢアゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して１つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含む４−１ＢＢ抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウレルマブである。一部の実施形態において、１つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化及び切断の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された又は認可のために提出された４−１ＢＢアゴニスト抗体であり、４−１ＢＢアゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウレルマブである。４−１ＢＢアゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／又は欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可されていることができる。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウレルマブである。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウレルマブである。
【０２２５】
【表５】
2021519582.tif 000007
【０２２６】
[0019]  一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、１Ｄ８、３Ｅｌｏｒ、４Ｂ４（BioLegend 309809）、Ｈ４−１ＢＢ−Ｍ１２７（BD Pharmingen 552532）、ＢＢＫ２（Thermo Fisher MS621PABX）、１４５５０１（Leinco Technologies B591）、ＡＴＣＣ番号ＨＢ−１１２４８として寄託され、米国特許第６，９７４，８６３号に開示されている細胞株によって産生される抗体、５Ｆ４（BioLegend 31 1503）、Ｃ６５−４８５（BD Pharmingen 559446）、米国特許出願公開第２００５／００９５２４４号に開示されている抗体、米国特許第７，２８８，６３８号に開示されている抗体（２０Ｈ４．９−ＩｇＧｌ（ＢＭＳ−６６３０３１）など）、米国特許第６，８８７，６７３号に開示されている抗体（４Ｅ９又はＢＭＳ−５５４２７１など）、米国特許第７，２１４，４９３号に開示されている抗体、米国特許第６，３０３，１２１号に開示されている抗体、米国特許第６，５６９，９９７号に開示されている抗体、米国特許第６，９０５，６８５号に開示されている抗体（４Ｅ９又はＢＭＳ−５５４２７１など）、米国特許第６，３６２，３２５号に開示されている抗体（１Ｄ８又はＢＭＳ−４６９４９２；３Ｈ３又はＢＭＳ−４６９４９７；又は３Ｅｌなど）、米国特許第６，９７４，８６３号に開示されている抗体（５３Ａ２など）；米国特許第６，２１０，６６９号に開示されている抗体（１Ｄ８、３Ｂ８又は３Ｅｌなど）、米国特許第５，９２８，８９３号に記載されている抗体、米国特許第６，３０３，１２１号に開示されている抗体、米国特許第６，５６９，９９７号に開示されている抗体、国際公開第２０１２／１７７７８８号、国際公開第２０１５／１１９９２３号及び国際公開第２０１０／０４２４３３号に開示されている抗体並びにその断片、誘導体、コンジュゲート、変異体又はバイオシミラーからなる群から選択され、ここで、前述の特許又は特許出願公開のそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２２７】
[0020]  一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、国際公開第２００８／０２５５１６  Ａ１号、同第２００９／００７１２０  Ａ１号、同第２０１０／００３７６６  Ａ１号、同第２０１０／０１００５１  Ａ１号及び同第２０１０／０７８９６６  Ａ１号；米国特許出願公開第２０１１／００２７２１８  Ａ１号、同第２０１５／０１２６７０９  Ａ１号、同第２０１１／０１１１４９４  Ａ１号、同第２０１５／０１１０７３４  Ａ１号及び同第２０１５／０１２６７１０  Ａ１号；並びに米国特許第９，３５９，４２０号、同第９，３４０，５９９号、同第８，９２１，５１９号及び同第８，４５０，４６０号に記載されている４−１ＢＢアゴニスト性融合タンパク質であり、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０２２８】
[0021]  一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、構造Ｉ−Ａ（Ｃ末端Ｆｃ抗体断片融合タンパク質）又は構造Ｉ−Ｂ（Ｎ末端Ｆｃ抗体断片融合タンパク質）に示される４−１ＢＢアゴニスト性融合タンパク質又はその断片、誘導体、コンジュゲート、変異体若しくはバイオシミラーである：
構造Ｉ−Ａ及びＩ−Ｂにおいて、円柱は個々のポリペプチド結合ドメインを指す（図１４０を参照）。構造Ｉ−Ａ及びＩ−Ｂは、例えば、４−１ＢＢＬ又は４−１ＢＢに結合する抗体に由来する、３つの直鎖状に連結されたＴＮＦＲＳＦ結合ドメインを含み、これは折り畳まれて三価タンパク質を形成し、次いで、ＩｇＧ１−Ｆｃ（ＣＨ３及びＣＨ２ドメインを含む）を介して第２の三価タンパク質に連結され、次いで、これはジスルフィド結合（小さい細長い楕円形）を介して２つの三価タンパク質を連結するために使用され、構造を安定化し、６つの受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン及びシグナル伝達タンパク質を合わせてシグナル伝達複合体を形成できるアゴニストを提供する。円柱として示されるＴＮＦＲＳＦ結合ドメインは、例えば、親水性残基並びに柔軟性のためのＧｌｙ及びＳｅｒ配列並びに溶解性のためのＧｌｕ及びＬｙｓを含み得るリンカーにより接続されたＶＨ及びＶＬ鎖を含む、ｓｃＦｖドメインであり得る。de Marco, Microbial Cell Factories, 2011, 10, 44；Ahmad, et al., Clin. & Dev.Immunol. 2012, 980250；Monnier, et al., Antibodies, 2013, 2, 193-208；又は本明細書の別の箇所に組み込まれた参考文献に記載されているものなどの任意のｓｃＦｖドメイン設計が使用され得る。この形態の融合タンパク質構造は、米国特許第９，３５９，４２０号、同第９，３４０，５９９号、同第８，９２１，５１９号及び同第８，４５０，４６０号に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０２２９】
[0022]  構造Ｉ−Ａの他のポリペプチドドメインのアミノ酸配列を表６に示す。Ｆｃドメインは、好ましくは、完全定常ドメイン（配列番号３１のアミノ酸１７〜２３０）、完全ヒンジドメイン（配列番号３１のアミノ酸１〜１６）又はヒンジドメインの一部（例えば、配列番号３１のアミノ酸４〜１６）を含む。Ｃ末端Ｆｃ抗体を接続するための好ましいリンカーは、追加的なポリペプチドの融合に適したリンカーを含む、配列番号３２〜配列番号４１に示される実施形態から選択され得る。
【０２３０】
【表６】
2021519582.tif 000008
【０２３１】
[0023]  構造Ｉ−Ｂの他のポリペプチドドメインのアミノ酸配列を表７に示す。構造Ｉ−ＢのようにＦｃ抗体断片がＴＮＲＦＳＦ融合タンパク質のＮ末端に融合される場合、Ｆｃモジュールの配列は好ましくは配列番号４２に示されるものであり、リンカー配列は好ましくは配列番号４３〜配列番号４５に示される実施形態から選択される。
【０２３２】
【表７】
2021519582.tif 000009
【０２３３】
[0024]  一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−Ｂによる４−１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、ウトミルマブの可変重鎖及び可変軽鎖、ウレルマブの可変重鎖及び可変軽鎖、ウトミルマブの可変重鎖及び可変軽鎖、表８に記載されている可変重鎖及び可変軽鎖から選択される可変重鎖及び可変軽鎖、上記の可変重鎖及び可変軽鎖の任意の組み合わせ並びにその断片、誘導体、コンジュゲート、変異体及びバイオシミラーからなる群から選択される１つ以上の４−１ＢＢ結合ドメインを含む。
【０２３４】
[0025]  一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−Ｂによる４−１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、４−１ＢＢＬ配列を含む１つ以上の４−１ＢＢ結合ドメインを含む。一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−Ｂによる４−１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、配列番号４６による配列を含む１つ以上の４−１ＢＢ結合ドメインを含む。一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−Ｂによる４−１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、可溶性４−１ＢＢＬ配列を含む１つ以上の４−１ＢＢ結合ドメインを含む。一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−Ｂによる４−１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、配列番号４７による配列を含む１つ以上の４−１ＢＢ結合ドメインを含む。
【０２３５】
[0026]  一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−Ｂによる４−１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号１３及び配列番号１４に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上の４−１ＢＢ結合ドメインを含み、ここで、ＶＨ及びＶＬドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−Ｂによる４−１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号２３及び配列番号２４に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上の４−１ＢＢ結合ドメインを含み、ここで、ＶＨ及びＶＬドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−Ｂによる４−１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、表８に示されるＶＨ及びＶＬ配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上の４−１ＢＢ結合ドメインを含み、ここで、ＶＨ及びＶＬドメインはリンカーによって接続されている。
【０２３６】
【表８】
2021519582.tif 000010
【０２３７】
[0027]  一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、（ｉ）第１の可溶性４−１ＢＢ結合ドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性４−１ＢＢ結合ドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性４−１ＢＢ結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、Ｎ末端及び／又はＣ末端に追加的なドメインを更に含み、ここで、追加的なドメインは、Ｆａｂ又はＦｃ断片ドメインである。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、（ｉ）第１の可溶性４−１ＢＢ結合ドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性４−１ＢＢ結合ドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性４−１ＢＢ結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、Ｎ末端及び／又はＣ末端に追加的なドメインを更に含み、ここで、追加的なドメインは、Ｆａｂ又はＦｃ断片ドメインであり、可溶性４−１ＢＢドメインのそれぞれは、ストーク領域（三量体化に寄与し、細胞膜まで一定の距離を提供するが、４−１ＢＢ結合ドメインの一部ではない）を欠き、第１及び第２のペプチドリンカーは、独立して３〜８アミノ酸長を有する。
【０２３８】
[0028]  一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、（ｉ）第１の可溶性腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーサイトカインドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、ここで、可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインのそれぞれは、ストーク領域を欠き、第１及び第２のペプチドリンカーは、独立して３〜８アミノ酸長を有し、各ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインは４−１ＢＢ結合ドメインである。
【０２３９】
[0029]  一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、前述のＶＬドメインのいずれかに連結された前述のＶＨドメインのいずれかを含む４−１ＢＢアゴニスト性ｓｃＦｖ抗体である。
【０２４０】
[0030]  一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストアゴニストは、BPS Bioscience  ４−１ＢＢアゴニスト抗体カタログ番号７９０９７−２であり、これはBPS Bioscience, San Diego, CA, USAから市販されている。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストアゴニストは、Creative Biolabs４−１ＢＢアゴニスト抗体カタログ番号ＭＯＭ−１８１７９であり、これはCreative Biolabs, Shirley, NY, USAから市販されている。
【０２４１】
ＩＩＩ．ＴＩＬの製造方法
[00341]  これらの特徴のいくつかを含むプロセス２Ａとして知られるＴＩＬプロセスの例を図１に示し、プロセス１Ｃに対する本発明の本実施形態の利点のいくつかを、図８４と同様に図２に示す。プロセス１Ｃを、図３に比較のために示す。プロセス２Ａに基づくＴＩＬ治療の２つの代替タイムラインを図４（細胞数が多い）と図５（細胞数が少ない）に示す。プロセス２Ａの実施形態を図６並びに図２７に示す。図８３及び図８４は、例示的な１Ｃプロセスと比較した例示的な２Ａプロセスを更に提供する。
【０２４２】
[00342]  本明細書において考察されるとおり、本発明は、患者への移植前に凍結保存ＴＩＬを再刺激することによりその代謝活性、ひいては相対的健康を増加させることに関するステップ及び前記代謝的健康の試験方法を含み得る。概して本明細書に概説されるとおり、ＴＩＬは概して患者試料から採取し、操作することにより、患者への移植前にその数が拡大される。一部の実施形態において、ＴＩＬは任意選択で以下に考察するとおり遺伝的に操作され得る。
【０２４３】
[00343]  一部の実施形態において、ＴＩＬは凍結保存され得る。解凍後、ＴＩＬは、患者への注入前に、その代謝を高めるために再刺激され得る。
【０２４４】
[00344]  一部の実施形態において、以下並びに実施例及び図で詳細に考察するとおり、第１の拡大培養（プレＲＥＰと称されるプロセス及び図２７にステップＡとして示されるプロセスを含む）は、３〜１４日間に短縮され、第２の拡大培養（ＲＥＰと称されるプロセス及び図２７にステップＢとして示されるプロセスを含む）は、７〜１４日間に短縮される。一部の実施形態において、実施例で考察され、図４、５及び２７に示すとおり、第１の拡大培養（例えば、図２７のステップＢとして記載される拡大培養）は１１日間に短縮され、第２の拡大培養（例えば、図２７のステップＤに記載される拡大培養）は１１日間に短縮される。一部の実施形態において、以下並びに実施例及び図で詳細に考察するように、第１の拡大培養及び第２の拡大培養（例えば、図２７のステップＢ及びステップＤとして記載される拡大培養）の組み合わせは２２日間に短縮される。
【０２４５】
[00345]  以下の「ステップ」名Ａ、Ｂ、Ｃ等は、図２７を参照し、且つ本明細書に記載の実施形態を参照する。以下及び図２７におけるステップの順序は例示であり、ステップの任意の組み合わせ又は順序並びに追加的なステップ、ステップの繰り返し及び／又はステップの省略が、本願及び本明細書に開示される方法によって企図される。
【０２４６】
Ａ．ステップＡ：患者腫瘍試料を入手する
[00346]  一般に、ＴＩＬは、初めに患者腫瘍試料から入手され（「初代ＴＩＬ」）、次に本明細書に記載されるとおりの更なる操作のためより大きい集団へと拡大培養され、任意選択で凍結保存され、本明細書に概説されるとおり再刺激され、且つ任意選択でＴＩＬの健康の指標として表現型及び代謝パラメータが判定される。
【０２４７】
[00347]  患者腫瘍試料は当技術分野において公知の方法を用いて、概して、外科的切除、針生検又は他の、腫瘍とＴＩＬ細胞との混合物を含む試料を入手するための手段によって入手され得る。一般に、腫瘍試料は、原発腫瘍、浸潤性腫瘍又は転移性腫瘍を含めた任意の固形腫瘍からのものであり得る。腫瘍試料は、血液学的悪性腫瘍から入手された腫瘍などの液性腫瘍でもあり得る。固形腫瘍は、限定はされないが、乳癌、膵癌、前立腺癌、結腸直腸癌、肺癌、脳癌、腎癌、胃癌及び皮膚癌（限定はされないが、扁平上皮癌、基底細胞癌及び黒色腫を含む）を含めた任意の癌型のものであり得る。一部の実施形態において、有用なＴＩＬは、特に高レベルのＴＩＬを有すると報告されていることに伴い悪性黒色腫腫瘍から入手される。
【０２４８】
[00348]  用語「固形腫瘍」は、通常嚢胞又は液体範囲を含まない異常な組織塊を指す。固形腫瘍は良性又は悪性であり得る。用語「固形腫瘍癌」は、悪性、新生物性又は癌性の固形腫瘍を指す。固形腫瘍癌としては、限定はされないが、肺癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌及び膀胱癌など、肉腫、癌腫及びリンパ腫が挙げられる。一部の実施形態において、癌は、子宮頸癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、膠芽腫、卵巣癌、肉腫、膵癌、膀胱癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌及び非小細胞肺癌から選択される。固形腫瘍の組織構造は、実質（癌細胞）と、癌細胞が分散するところであって支持微小環境をもたらし得る支持間質細胞とを含む相互依存的組織コンパートメントを含む。
【０２４９】
[00349]  用語「血液学的悪性腫瘍」は、限定はされないが、血液、骨髄、リンパ節及びリンパ系の組織を含め、哺乳類における造血及びリンパ系組織の癌及び腫瘍を指す。血液学的悪性腫瘍は「液性腫瘍」とも称される。血液学的悪性腫瘍としては、限定はされないが、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）、急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫が挙げられる。用語「Ｂ細胞血液学的悪性腫瘍」は、Ｂ細胞を冒す血液学的悪性腫瘍を指す。
【０２５０】
[00350]  入手後、腫瘍試料は概して鋭的剥離を用いて１〜約８ｍｍ３の小片に断片化され、約２〜３ｍｍ３が特に有用である。ＴＩＬは酵素的腫瘍消化物を使用してこれらの断片から培養される。かかる腫瘍消化物は、酵素培地（例えば、ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）１６４０緩衝液、２ｍＭグルタミン酸塩、１０ｍｃｇ／ｍＬゲンタマイシン、３０単位／ｍＬのＤＮアーゼ及び１．０ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ）中でのインキュベーションと、それに続く機械的解離（例えば、組織解離装置を用いる）によって作製され得る。腫瘍消化物は、腫瘍を酵素培地中に置き、腫瘍を約１分間機械的に解離した後、続いて５％ＣＯ２下３７℃で３０分間インキュベートし、続いてごく小さい組織片のみが存在するまで前述の条件下で機械的解離及びインキュベーションのサイクルを繰り返すことにより作製され得る。この処理の終了時、細胞懸濁液が多数の赤血球又は死細胞を含有する場合、FICOLL分枝状親水性多糖を使用した密度勾配分離を実施して、それらの細胞を除去し得る。米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３  Ａ１号（この開示は参照により本明細書に援用される）に記載されるものなど、当技術分野において公知の代替的な方法を用い得る。前述の方法のいずれも、ＴＩＬの拡大培養方法又は癌の治療方法に関して本明細書に記載される任意の実施形態において用いることができる。
【０２５１】
[00351]  一般に、採取された細胞懸濁液は「初代細胞集団」又は「新鮮に採取した」細胞集団と呼ばれる。
【０２５２】
[00352]  一部の実施形態において、断片化は、例えば剥離並びに消化を含めた物理的断片化を含む。一部の実施形態において、断片化は物理的断片化である。一部の実施形態において、断片化は剥離である。一部の実施形態において、断片化は消化による。一部の実施形態において、ＴＩＬは初めに、患者から入手された酵素的腫瘍消化物及び腫瘍断片から培養することができる。一実施形態において、ＴＩＬは初めに、患者から入手された酵素的腫瘍消化物及び腫瘍断片から培養することができる。
【０２５３】
[00353]  一部の実施形態において、腫瘍が固形腫瘍である場合、例えばステップＡ（図２７に提供される）における腫瘍試料の入手後、腫瘍は物理的断片化を受ける。一部の実施形態において、断片化は凍結保存前に行われる。一部の実施形態において、断片化は凍結保存後に行われる。一部の実施形態において、断片化は、腫瘍の入手後、いかなる凍結保存もなしに行われる。一部の実施形態において、腫瘍は断片化され、第１の拡大培養用の各容器に１０、２０、３０、４０個又はそれを超える数の断片又は小片が置かれる。一部の実施形態において、腫瘍は断片化され、第１の拡大培養用の各容器に３０又は４０個の断片又は小片が置かれる。一部の実施形態において、腫瘍は断片化され、第１の拡大培養用の各容器に４０個の断片又は小片が置かれる。一部の実施形態において、複数の断片は、約４〜約５０個の断片を含み、各断片は約２７ｍｍ３の容積を有する。一部の実施形態において、複数の断片は、約１３００ｍｍ３〜約１５００ｍｍ３の総容積を有する約３０〜約６０個の断片を含む。一部の実施形態において、複数の断片は、約１３５０ｍｍ３の総容積を有する約５０個の断片を含む。一部の実施形態において、複数の断片は、約１ｇ〜約１．５ｇの総質量を有する約５０個の断片を含む。一部の実施形態において、複数の断片は、約４個の断片を含む。
【０２５４】
[00354]  一部の実施形態において、ＴＩＬは腫瘍断片から入手される。一部の実施形態において、腫瘍断片は鋭的剥離で入手される。一部の実施形態において、腫瘍断片は約１ｍｍ３〜１０ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約１ｍｍ３〜８ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約１ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約２ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約３ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約４ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約５ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約６ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約７ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約８ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約９ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約１０ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍は１〜４ｍｍ×１〜４ｍｍ×１〜４ｍｍである。一部の実施形態において、腫瘍は１ｍｍ×１ｍｍ×１ｍｍである。一部の実施形態において、腫瘍は２ｍｍ×２ｍｍ×２ｍｍである。一部の実施形態において、腫瘍は３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍである。一部の実施形態において、腫瘍は４ｍｍ×４ｍｍ×４ｍｍである。
【０２５５】
[00355]  一部の実施形態において、各断片上の出血、壊死及び／又は脂肪組織の量を最小限にするために、腫瘍が切除される。一部の実施形態において、各断片上の出血組織の量を最小限にするために、腫瘍が切除される。一部の実施形態において、各断片上の壊死組織の量を最小限にするために、腫瘍が切除される。一部の実施形態において、各断片上の脂肪組織の量を最小限にするために、腫瘍が切除される。
【０２５６】
[00356]  一部の実施形態において、腫瘍の内部構造を維持するために、腫瘍の断片化が実施される。一部の実施形態において、腫瘍の断片化は、メスでの鋸引き運動を実施することなく実施される。一部の実施形態において、ＴＩＬは腫瘍消化物から入手される。一部の実施形態では、腫瘍消化物は、酵素培地中、例えば限定はされないが、ＲＰＭＩ  １６４０、２ｍＭ  GlutaMAX、１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン、３０Ｕ／ｍＬ  ＤＮアーゼ及び１．０ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ中におけるインキュベーションと、それに続く機械的解離（GentleMACS、Miltenyi Biotec、Auburn, CA）によって作成した。腫瘍を酵素培地に置いた後、腫瘍を約１分間機械的に解離し得る。次に溶液を５％ＣＯ２下３７℃で３０分間インキュベートし、次にそれを再び約１分間機械的に破壊し得る。再び５％ＣＯ２下３７℃で３０分間インキュベートした後、腫瘍を３度目に約１分間機械的に破壊し得る。一部の実施形態において、３度目の機械的破壊後に大型の組織片が存在した場合、５％ＣＯ２下３７℃での更に３０分間のインキュベーションを伴う又は伴わない１回又は２回の更なる機械的解離を試料に適用した。一部の実施形態において、最終回のインキュベーションの終了時に細胞懸濁液が多数の赤血球又は死細胞を含有した場合、Ficollを使用した密度勾配分離を実施して、そうした細胞を除去し得る。
【０２５７】
[00357]  一部の実施形態において、第１の拡大培養ステップ前の採取された細胞懸濁液は、「初代細胞集団」又は「新鮮に採取した」細胞集団と呼ばれる。
【０２５８】
[00358]  一部の実施形態において、細胞は、以下に更に詳細に記載する、同様に図２７に例示するステップＢに記載の拡大培養に進む前に、任意選択で試料採取後に凍結され、凍結貯蔵され得る。
【０２５９】
Ｂ．ステップＢ：第１の拡大培養
１．幼若ＴＩＬ
[00359]  一部の実施形態において、本方法は、対象／患者への投与時に複製サイクルを増加させることができる幼若ＴＩＬを得ることを提供し、したがって、成熟ＴＩＬ（すなわち被験者／患者への投与前に更に多くの回数の複製を受けたＴＩＬ）を超える追加的な治療上の利点を提供し得る。幼若ＴＩＬの特徴が、文献に記載されている。例えば、Donia, at al., Scandinavian Journal of Immunology, 75:157-167 (2012)、Dudley et al., Clin Cancer Res, 16:6122-6131 (2010)、Huang et al., J Immunother, 28(3):258-267 (2005)、Besser et al., Clin Cancer Res, 19(17):OF1-OF9 (2013)、Besser et al., J Immunother 32:415-423 (2009)、Robbins, et al., J Immunol 2004; 173:7125-7130、Shen et al., J Immunother, 30:123-129 (2007)、Zhou, et al., J Immunother, 28:53-62 (2005)及びTran, et al., J Immunother, 31:742-751 (2008)であり、これらは全て、全体として参照により本明細書に援用される。
【０２６０】
[00360]  Ｔ及びＢリンパ球の多様な抗原受容体は、限られているが多数の遺伝子セグメントの体細胞組換えによって産生される。これらの遺伝子セグメントＶ（可変）、Ｄ（多様性）、Ｊ（結合）及びＣ（定数）は、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の結合特異性及び下流側での適用を決定する。本発明は、Ｔ細胞レパートリーの多様性を示し、増加させるＴＩＬを生成する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法により得られたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、本方法によって得られたＴＩＬは、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、図８３に例示されているように、本方法によって得られたＴＩＬは、新鮮に回収したＴＩＬ及び／又はプロセス１Ｃと称される方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、第１の拡大培養で得られたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、多様性の増加は、免疫グロブリンの多様性及び／又はＴ細胞受容体の多様性の増加である。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン重鎖にある。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン軽鎖にある。一部の実施形態において、多様性はＴ細胞受容体にある。一部の実施形態において、多様性は、アルファ、ベータ、ガンマ及びデルタ受容体からなる群から選択されるＴ細胞受容体の１つにある。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及び／又はベータの発現が増加する。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファの発現が増加する。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベータの発現が増加する。一部の実施形態において、ＴＣＲａｂ（すなわちＴＣＲα／β）の発現が増加する。
【０２６１】
[00361]  腫瘍断片の剥離又消化後、例えば、図２７のステップＡに記載れたように、得られた細胞は、腫瘍及び他の細胞よりもＴＩＬの成長に有利な条件下で血清含有ＩＬ−２において培養される。一部の実施形態において、腫瘍消化物は、２ｍＬウェルにおいて、不活性化ヒトＡＢ血清を６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２と共に含む培地中でインキュベートされる。この初代細胞集団は、数日、概して３〜１４日の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、７〜１４日の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、１０〜１４日の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、約１１日の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。
【０２６２】
[00362]  好ましい実施形態において、以下及び本明細書で説明するように、初期バルクＴＩＬ拡大培養ステップ（例えば、プレＲＥＰと称されるプロセスを含み得る図２７のステップＢで説明したものなど）、その後の、以下ステップＤの下及び本明細書に記載されているように、第２の拡大培養（ステップＤ、高速拡大培養プロトコル（ＲＥＰ）ステップと称されるプロセスを含む）、その後の、任意選択の凍結保存及びその後の第２のステップＤ（再刺激ＲＥＰステップと称されるプロセスを含む）を使用してＴＩＬの拡大培養を実施することができる。このプロセスによって得られたＴＩＬは、任意選択で、本明細書に記載されるとおり表現型特徴及び代謝パラメータが特徴付けられ得る。
【０２６３】
[00363]  実施形態において、ＴＩＬ培養が２４ウェルプレートで、例えばCostar２４ウェル細胞培養クラスター、平底（Corning Incorporated、Corning, NYを使用して開始される場合、各ウェルには、ＩＬ−２（６０００ＩＵ／ｍＬ；Chiron Corp.、Emeryville, CA）を含む２ｍＬの完全培地（ＣＭ）中、１×１０６個の腫瘍消化物細胞又は１個の腫瘍断片を播種することができる。一部の実施形態において、腫瘍断片は約１ｍｍ３〜１０ｍｍ３である。
【０２６４】
[00364]  一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は、培養培地の略称である「ＣＭ」と称される。一部の実施形態において、ステップＢのＣＭは、１０％ヒトＡＢ血清、２５ｍＭヘペス及び１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシンを添加したGlutaMAX含有ＲＰＭＩ  １６４０からなる。培養が、４０ｍＬ容量及び１０ｃｍ２ガス透過性シリコン底のガス透過性フラスコ（例えば、G-Rex10; Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN）内で開始される実施形態では（図１）、各フラスコに、１０〜４０ｍＬのＩＬ−２含有ＣＭ中の１０〜４０×１０６個の腫瘍消化物生細胞又は５〜３０個の腫瘍断片をロードした。G-Rex10及び２４ウェルプレートのいずれも、加湿インキュベーターにおいて５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートし、培養開始から５日後に培地の半分を取り出して、新鮮なＣＭ及びＩＬ−２を補充し、５日目以降は２〜３日毎に培地の半分を交換した。
【０２６５】
[00365]  腫瘍断片の調製後、得られた細胞（すなわち断片）は、腫瘍及び他の細胞よりもＴＩＬの成長に有利な条件下で血清含有ＩＬ−２において培養される。一部の実施形態において、腫瘍消化物は、２ｍＬウェルにおいて、不活性化ヒトＡＢ血清を６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２と共に含む培地中で（又はある場合には本明細書に概説されるとおりａＡＰＣ細胞集団の存在下で）インキュベートされる。この初代細胞集団は、数日、概して１０〜１４日の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、第１の拡大培養中の成長培地はＩＬ−２又はその変異体を含む。一部の実施形態において、ＩＬは組換えヒトＩＬ−２（ｒｈＩＬ−２）である。一部の実施形態においてＩＬ−２ストック溶液は、１ｍｇバイアルにつき２０〜３０×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態において、ＩＬ−２ストック溶液は１ｍｇバイアルにつき２０〜×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態においてＩＬ−２ストック溶液は１ｍｇバイアルにつき２５×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態においてＩＬ−２ストック溶液は１ｍｇバイアルにつき３０×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態において、ＩＬ−２ストック溶液は４〜８×１０６ＩＵ／ｍｇのＩＬ−２の最終濃度を有する。一部の実施形態において、ＩＬ−２ストック溶液は５〜７×１０６ＩＵ／ｍｇのＩＬ−２の最終濃度を有する。一部の実施形態において、ＩＬ−２ストック溶液は６×１０６ＩＵ／ｍｇのＩＬ−２の最終濃度を有する。一部の実施形態において、ＩＬ−２ストック溶液は実施例４に記載されるとおり調製される。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約１０，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２、約９，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２、約８，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２、約７，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２、約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２又は約５，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は、約９，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２、乃至約５，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は、約８，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２、乃至約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は、約７，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２、乃至約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。ある実施形態において、細胞培養培地はＩＬ−２を更に含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。ある実施形態において、細胞培養培地はＩＬ−２を更に含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。ある実施形態において、細胞培養培地は、約１０００ＩＵ／ｍＬ、約１５００ＩＵ／ｍＬ、約２０００ＩＵ／ｍＬ、約２５００ＩＵ／ｍＬ、約３０００ＩＵ／ｍＬ、約３５００ＩＵ／ｍＬ、約４０００ＩＵ／ｍＬ、約４５００ＩＵ／ｍＬ、約５０００ＩＵ／ｍＬ、約５５００ＩＵ／ｍＬ、約６０００ＩＵ／ｍＬ、約６��００ＩＵ／ｍＬ、約７０００ＩＵ／ｍＬ、約７５００ＩＵ／ｍＬ又は約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。ある実施形態において、細胞培養培地は、１０００〜２０００ＩＵ／ｍＬ、２０００〜３０００ＩＵ／ｍＬ、３０００〜４０００ＩＵ／ｍＬ、４０００〜５０００ＩＵ／ｍＬ、５０００〜６０００ＩＵ／ｍＬ、６０００〜７０００ＩＵ／ｍＬ、７０００〜８０００ＩＵ／ｍＬ又は約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。
【０２６６】
[00366]  一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、約１６０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、約１４０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、約１２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５又は約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５〜約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５〜約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５〜約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５を含む。ある実施形態において、細胞培養培地はＩＬ−１５を更に含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５を含む。
【０２６７】
[00367]  一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約４ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約３ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１又は約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１〜約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１〜約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１〜約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１〜約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１〜約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。ある実施形態において、細胞培養培地はＩＬ−２１を更に含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。
【０２６８】
[00368]  一実施形態において、細胞培養培地は、ＯＫＴ−３抗体を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ−３抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約７．５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ及び約１μｇ／ｍＬのＯＫＴ−３抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、０．１ｎｇ／ｍＬ〜１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ〜５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ〜４０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬ及び５０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ−３抗体を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地はＯＫＴ−３抗体を含まない。
【０２６９】
[00369]  一部の実施形態において、細胞培養培地は、細胞培養培地中に１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストを含む。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは４−１ＢＢアゴニストを含む。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは４−１ＢＢアゴニストであり、４−１ＢＢアゴニストは、ウレルマブ、ウトミルマブ、ＥＵ−１０１、融合タンパク質並びにその断片、誘導体、変異体、バイオシミラー及び組み合わせからなる群から選択される。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、細胞培養培地中、０．１μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬの濃度を達成するのに十分な濃度で添加される。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、細胞培養培地中、２０μｇ／ｍＬ〜４０μｇ／ｍＬの濃度を達成するのに十分な濃度で添加される。
【０２７０】
[00370]  一部の実施形態において、１つ以上のＴＮＦＲＳＦに加えて、細胞培養培地は、初期濃度約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２及び初期濃度約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ−３抗体を更に含み、１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストは、４−１ＢＢアゴニストを含む。
【０２７１】
[00371]  一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は、培養培地の略称である「ＣＭ」と称される。一部の実施形態において、これはＣＭ１（培養培地１）と称される。一部の実施形態において、ＣＭは、１０％ヒトＡＢ血清、２５ｍＭヘペス及び１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシンを添加したGlutaMAX含有ＲＰＭＩ  １６４０からなる。培養が、４０ｍＬ容量及び１０ｃｍ２ガス透過性シリコン底のガス透過性フラスコ（例えば、G-Rex10；Wilson Wolf Manufacturing、New Brighton, MN）内で開始される実施形態では（図１）、各フラスコに、１０〜４０ｍＬのＩＬ−２含有ＣＭ中の１０〜４０×１０６個の腫瘍消化物生細胞又は５〜３０個の腫瘍断片をロードした。G-Rex10及び２４ウェルプレートのいずれも、加湿インキュベーターにおいて５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートし、培養開始から５日後に培地の半分を取り出して、新鮮なＣＭ及びＩＬ−２を補充し、５日目以降は２〜３日毎に培地の半分を交換した。一部の実施形態において、ＣＭは、実施例に記載されるＣＭ１であり、実施例５を参照のこと。一部の実施形態において、第１の拡大培養は初期細胞培養培地又は第１の細胞培養培地中で行われる。一部の実施形態において、初期細胞培養培地又は第１の細胞培養培地はＩＬ−２を含む。
【０２７２】
[00372]  一部の実施形態において、実施例及び図で考察されているように、第１の拡大培養（例えば、プレＲＥＰと称されることもあるものを含み得る、図２７のステップＢに記載されるプロセスなどを含む）プロセスは３〜１４日間に短縮される。一部の実施形態において、実施例で考察し、図４及び５並びに例えば図２７のステップＢに記載されている拡大培養を含む、第１の拡大培養（例えば、プレＲＥＰと称されることもあるものを含み得る、図２７のステップＢに記載されるプロセスなどを含む）は７〜１４日間に短縮される。一部の実施形態において、実施例で考察し、図４及び５に示すように、ステップＢの第１の拡大培養は１０〜１４日間に短縮される。一部の実施形態において、実施例で考察し、図４及び５並びに例えば図２７のステップＢに記載されている拡大培養を含む、第１の拡大培養は１１日間に短縮される。
【０２７３】
[00373]  一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日又は１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１日〜１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は２日〜１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は３日〜１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は４日〜１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は５日〜１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は６日〜１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は７日〜１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は８日〜１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は９日〜１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１０日〜１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１１日〜１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１２日〜１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１３日〜１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１日〜１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は２日〜１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は３日〜１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は４日〜１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は５日〜１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は６日〜１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は７日〜１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は８日〜１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は９日〜１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１０日〜１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１１日間続行され得る。
【０２７４】
[00374]  一部の実施形態において、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５及び／又はＩＬ−２１の組み合わせが、第１の拡大培養中の組み合わせとして用いられる。一部の実施形態において、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５及び／又はＩＬ−２１並びにそれらの任意選択の組み合わせは、例えば、図２７による且つ本明細書に記載されているとおり、ステップＢプロセス中を含む、第１の拡大培養中に含められ得る。一部の実施形態において、ＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１の組み合わせが、第１の拡大培養中の組み合わせとして用いられる。一部の実施形態において、ＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１並びにそれらの任意選択の組み合わせは、例えば、図２７による且つ本明細書に記載されているとおりステップＢプロセス中に含められ得る。
【０２７５】
[00375]  一部の実施形態において、実施例及び図で考察されているように、第１の拡大培養（例えば、プレＲＥＰと称される、図２７のステップＢに記載されるプロセスなどを含む）プロセスは３〜１４日間に短縮される。一部の実施形態において、実施例で考察し、図４及び５に示すように、ステップＢの第１の拡大培養は７〜１４日間に短縮される。一部の実施形態において、実施例で考察し、図４、５及び２７に示すように、ステップＢの第１の拡大培養は１０〜１４日間に短縮される。一部の実施形態において、実施例で考察し、図４、５及び２７に示すように、第１の拡大培養は１１日間に短縮される。
【０２７６】
[00376]  一部の実施形態において、第１の拡大培養、例えば、図２７によるステップＢは、閉鎖系バイオリアクターで実施される。一部の実施形態において、本明細書で記載されるとおり、ＴＩＬ拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、単一のバイオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、G-REX-10又はG-REX-100である。一部の実施形態において、閉鎖系バイオリアクターは単一のバイオリアクターである。
【０２７７】
Ｃ．ステップＣ：第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行
[00377]  ある場合には、例えば、図２７に示されるように、例えばステップＢから得られるＴＩＬ集団を含む、第１の拡大培養から得られるバルクＴＩＬ集団は、以下本明細書で考察されるプロトコルを使用して、直ちに凍結保存され得る。代わりに、第２のＴＩＬ集団と称される第１の拡大培養から得られたＴＩＬ集団は、第２の拡大培養（ＲＥＰと呼ばれることがある拡大培養を含み得る）に供され、その後、以下で考察するように凍結保存され得る。同様に、遺伝子修飾ＴＩＬが治療に使用される場合、第１のＴＩＬ集団（バルクＴＩＬ集団と称されることもある）又は第２のＴＩＬ集団（一部の実施形態において、ＲＥＰ  ＴＩＬ集団と称される集団を含み得る）は、拡大培養前又は第１の拡大培養後で第２の拡大培養前に適切な処置のために遺伝子修飾に供され得る。
【０２７８】
[00378]  一部の実施形態において、第１の拡大培養から（例えば、図２７に示されるとおりのステップＢから）入手されたＴＩＬは、選択のためのフェノタイピングまで貯蔵される。一部の実施形態において、第１の拡大培養から（例えば、図２７に示されるとおりのステップＢから）入手されたＴＩＬは、貯蔵されず第２の拡大培養に直接進む。一部の実施形態において、第１の拡大培養から入手されたＴＩＬは、第１の拡大培養後、第２の拡大培養前に凍結保存されない。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日又は１４日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約３日〜１４日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約４日〜１４日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約４日〜１０日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約７日〜１４日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約１４日の時点で行われる。
【０２７９】
[00379]  一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日又は１４日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１日〜１４日で行われる。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は２日〜１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから３日〜１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから４日〜１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから５日〜１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから６日〜１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから７日〜１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから８日〜１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから９日〜１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１０日〜１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１１日〜１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１２日〜１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１３日〜１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１日〜１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから２日〜１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから３日〜１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから４日〜１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから５日〜１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから６日〜１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから７日〜１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから８日〜１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから９日〜１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１０日〜１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１１日で行われる。
【０２８０】
[00380]  一部の実施形態において、ＴＩＬは第１の拡大培養後、第２の拡大培養前に貯蔵されず、ＴＩＬは第２の拡大培養に直接進む（例えば、一部の実施形態において、図２７に示すように、ステップＢからステップＤへの移行中に貯蔵は行われない）。一部の実施形態において、本明細書に記載されるとおり、移行は閉鎖系で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養からのＴＩＬは、第２のＴＩＬ集団からのＴＩＬであり、移行期間を伴わず第２の拡大培養に直接進む。
【０２８１】
[00381]  一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、例えば、図２７によるステップＣは、閉鎖系バイオリアクターで実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載されるとおり、ＴＩＬ拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、単一のバイオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、G-REX-10又はG-REX-100である。一部の実施形態において、閉鎖系バイオリアクターは単一のバイオリアクターである。
【０２８２】
Ｄ．ステップＤ：第２の拡大培養
[00382]  一部の実施形態において、ＴＩＬ細胞集団は、例えば、図２７に記載のとおり、ステップＡ及びステップＢ並びにステップＣと称される移行後、回収及び初期バルク処理後、数が増加する）。この更なる増加は、本明細書では第２の拡大培養と称され、これは、当技術分野で一般に迅速拡大培養プロセスと称される拡大培養プロセス（ＲＥＰ並びに図２７のステップＤに示されるプロセス）を含み得る。第２の拡大培養は、概して、フィーダー細胞、サイトカイン源及び抗ＣＤ３抗体を含め、幾つもの成分を含むガス透過性容器内の培養培地を使用して達成することができる。
【０２８３】
[00383]  一部の実施形態において、ＴＩＬの第２の拡大培養又は第２のＴＩＬ拡大培養（これはＲＥＰと称されることもある拡大培養；並びに図２７のステップＤに示されるプロセスを含み得る）は、当業者に公知の任意のＴＩＬフラスコ又は容器を使用して実施することができる。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日又は１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は約７日〜約１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は約８日〜約１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は約９日〜約１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は約１０日〜約１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は約１１日〜約１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は約１２日〜約１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は約１３日〜約１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は約１４日間続行し得る。
【０２８４】
[00384]  ある実施形態において、第２の拡大培養は、本開示の方法（例えば、ＲＥＰと呼ばれる拡大培養並びに図２７のステップＤに示されるプロセスを含む）を使用して、ガス透過性容器内で実施することができる。例えば、ＴＩＬは、インターロイキン−２（ＩＬ−２）又はインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）の存在下で非特異的Ｔ細胞受容体刺激を用いて迅速に拡大培養することができる。非特異的Ｔ細胞受容体刺激としては、例えば、約３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３などの抗ＣＤ３抗体、マウスモノクローナル抗ＣＤ３抗体（Ortho-McNeil, Raritan, NJ又はMiltenyi Biotech, Auburn, CAから市販されている）又はＵＨＣＴ−１（BioLegend, San Diego, CA, USAから市販されている）を挙げることができる。ＴＩＬは、任意選択で３００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２又はＩＬ−１５など、Ｔ細胞成長因子の存在下で、ヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ−Ａ２）結合ペプチド、例えば、０．３μΜ  ＭＡＲＴ−１：２６−３５（２７Ｌ）又はｇｐｌ  ００：２０９−２１７（２１０Ｍ）など、任意選択でベクターから発現させることのできる、１つ又は複数のエピトープなど、その抗原性部分を含めた癌の１つ以上の抗原を、第２の拡大培養中に含めることにより、インビトロでのＴＩＬの更なる刺激を誘発するように拡大培養することができる。他の好適な抗原としては、例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ癌抗原、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＳＳＸ−２及びＶＥＧＦＲ２又はその抗原性部分を挙げることができる。ＴＩＬは、ＨＬＡ−Ａ２発現抗原提示細胞にパルスした癌の同じ１つ又は複数の抗原による再刺激によっても迅速に拡大培養し得る。代わりに、ＴＩＬは、例えば照射自己リンパ球によるか、又は照射ＨＬＡ−Ａ２＋同種異系リンパ球及びＩＬ−２によって更に再刺激することができる。一部の実施形態において、再刺激は、第２の拡大培養の一部として生じる。一部の実施形態において、照射された自己リンパ球の存在下で、又は照射されたＨＬＡ−Ａ２＋同種リンパ球及びＩＬ−２とともに第２の拡大培養が発生する。
【０２８５】
[00385]  ある実施形態において、細胞培養培地はＩＬ−２を更に含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。ある実施形態において、細胞培養培地はＩＬ−２を更に含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。ある実施形態において、細胞培養培地は、約１０００ＩＵ／ｍＬ、約１５００ＩＵ／ｍＬ、約２０００ＩＵ／ｍＬ、約２５００ＩＵ／ｍＬ、約３０００ＩＵ／ｍＬ、約３５００ＩＵ／ｍＬ、約４０００ＩＵ／ｍＬ、約４５００ＩＵ／ｍＬ、約５０００ＩＵ／ｍＬ、約５５００ＩＵ／ｍＬ、約６０００ＩＵ／ｍＬ、約６５００ＩＵ／ｍＬ、約７０００ＩＵ／ｍＬ、約７５００ＩＵ／ｍＬ又は約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。ある実施形態において、細胞培養培地は、１０００〜２０００ＩＵ／ｍＬ、２０００〜３０００ＩＵ／ｍＬ、３０００〜４０００ＩＵ／ｍＬ、４０００〜５０００ＩＵ／ｍＬ、５０００〜６０００ＩＵ／ｍＬ、６０００〜７０００ＩＵ／ｍＬ、７０００〜８０００ＩＵ／ｍＬ又は８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。
【０２８６】
[00386]  ある実施形態において、細胞培養培地はＯＫＴ−３抗体を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ−３抗体を含む。ある実施形態において、細胞培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約７．５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ及び約１μｇ／ｍＬのＯＫＴ−３抗体を含む。ある実施形態において、細胞培養培地は、０．１ｎｇ／ｍＬ〜１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ〜５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ〜４０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬ及び５０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ−３抗体を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地はＯＫＴ−３抗体を含まない。
【０２８７】
[00387]  一部の実施形態において、細胞培養培地は、細胞培養培地中に１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストを含む。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは４−１ＢＢアゴニストを含む。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは４−１ＢＢアゴニストであり、４−１ＢＢアゴニストは、ウレルマブ、ウトミルマブ、ＥＵ−１０１、融合タンパク質並びにその断片、誘導体、変異体、バイオシミラー及び組み合わせからなる群から選択される。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、細胞培養培地中、０．１μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬの濃度を達成するのに十分な濃度で添加される。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、細胞培養培地中、２０μｇ／ｍＬ〜４０μｇ／ｍＬの濃度を達成するのに十分な濃度で添加される。
【０２８８】
[00388]  一部の実施形態において、１つ以上のＴＮＦＲＳＦに加えて、細胞培養培地は、初期濃度約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２及び初期濃度約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ−３抗体を更に含み、１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストは、４−１ＢＢアゴニストを含む。
【０２８９】
[00389]  一部の実施形態において、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５及び／又はＩＬ−２１の組み合わせが、第２の拡大培養中の組み合わせとして用いられる。一部の実施形態において、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５及び／又はＩＬ−２１並びにそれらの任意選択の組み合わせは、例えば、図２７による且つ本明細書に記載されているとおり、ステップＤプロセス中を含む、第２の拡大培養中に含められ得る。一部の実施形態において、ＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１の組み合わせが、第２の拡大培養中の組み合わせとして用いられる。一部の実施形態において、ＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１並びにそれらの任意の組み合わせは、例えば、図２７による且つ本明細書に記載されているとおり、ステップＤプロセス中に含められ得る。
【０２９０】
[00390]  一部の実施形態において、第２の拡大培養は、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３、抗原提示フィーダー細胞及び任意選択でＴＮＦＲＳＦアゴニストを含む添加細胞培養培地で実施され得る。一部の実施形態において、第２の拡大培養は添加細胞培養培地で行われる。一部の実施形態において、添加細胞培養培地は、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、第２の細胞培養培地は、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ；抗原提示フィーダー細胞とも称される）を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養は、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び抗原提示フィーダー細胞を含む細胞培養培地で生じる（すなわち抗原提示細胞）。
【０２９１】
[00391]  一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、約１６０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、約１４０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、約１２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５又は約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５〜約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５〜約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５〜約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５を含む。ある実施形態において、細胞培養培地はＩＬ−１５を更に含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５を含む。
【０２９２】
[00392]  一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約４ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約３ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１又は約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１〜約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１〜約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１〜約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１〜約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１〜約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。ある実施形態において、細胞培養培地はＩＬ−２１を更に含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。
【０２９３】
[00393]  一部の実施形態において、抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）はＰＢＭＣである。ある実施形態において、迅速拡大培養及び／又は第２の拡大培養におけるＴＩＬとＰＢＭＣ及び／又は抗原提示細胞との比は、約１対２５、約１対５０、約１対１００、約１対１２５、約１対１５０、約１対１７５、約１対２００、約１対２２５、約１対２５０、約１対２７５、約１対３００、約１対３２５、約１対３５０、約１対３７５、約１対４００又は約１対５００である。ある実施形態において、迅速拡大培養及び／又は第２の拡大培養におけるＴＩＬとＰＢＭＣとの比は１対５０〜１対３００である。ある実施形態において、迅速拡大培養及び／又は第２の拡大培養におけるＴＩＬとＰＢＭＣとの比は１対１００〜１対２００である。
【０２９４】
[00394]  一実施形態において、ＲＥＰ及び／又は第２の拡大培養は、バルクＴＩＬを１５０ｍｌ培地中の１００倍又は２００倍過剰の不活性化フィーダー細胞、３０ｍｇ／ｍＬ  ＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２と混合してフラスコ内で実施される。細胞を別の成長チャンバに移すまで培地補充が行われる（概して新鮮培地による呼吸を介した３分の２の培地補充）。別の成長チャンバには、以下に更に十分に考察するとおりのG-REXフラスコ及びガス透過性容器が含まれる。
【０２９５】
[00395]  一部の実施形態において、第２の拡大培養（ＲＥＰプロセスと称されるプロセスを含み得る）は、実施例及び図で考察されるように、７〜１４日間に短縮される。一部の実施形態において、第２の拡大培養は１１日間に短縮される。
【０２９６】
[00396]  ある実施形態において、ＲＥＰ及び／又は第２の拡大培養は、前述のように（Tran, et al., J. Immunother.2008, 31, 742-51; Dudley, et al., J. Immunother.2003, 26, 332-42）Ｔ−１７５フラスコ及びガス透過性バッグ又はガス透過性培養器具（G-Rexフラスコ）を使用して実施され得る。一部の実施形態において、第２の拡大培養（迅速拡大培養と称される拡大培養を含む）は、Ｔ−１７５フラスコで実施され、１５０ｍＬの培地に懸濁した約１×１０６個のＴＩＬを各Ｔ−１７５フラスコに加えられ得る。ＴＩＬは、ＩＬ−２の３０００ＩＵ／ｍＬ及び抗ＣＤ３の３０ｎｇ／ｍＬを添加したＣＭ及びAIM-V培地の１対１の混合物で培養され得る。Ｔ−１７５フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートされ得る。培地の半分は、５日目に、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む５０／５０培地を使用して交換され得る。一部の実施形態において、７日目に、２つのＴ−１７５フラスコからの細胞を３Ｌバッグに合わせることができ、その３００ｍＬのＴＩＬ懸濁液に、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含む３００ｍＬのAIM Vを加えた。毎日又は２日毎に各バッグの細胞数をカウントし、新鮮培地を加えて細胞数を０．５〜２．０×１０６細胞／ｍＬに保った。
【０２９７】
[00397]  一実施形態において、第２の拡大培養（これはＲＥＰと称される拡大培養；並びに図２７のステップＤに称されるものを含み得る）は、１００ｃｍガス透過性シリコン底の５００ｍＬ容量ガス透過性フラスコ（G-Rex 100、Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USAから市販されている）において実施され得、５％ヒトＡＢ血清、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２及び３０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）を添加した４００ｍＬの５０／５０培地中で５×１０６又は１０×１０６個のＴＩＬをＰＢＭＣと培養し得る。G-Rex 100フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートし得る。５日目、２５０ｍＬの上清を取り出して遠心ボトルに入れ、１５００ｒｐｍ（４９１×ｇ）で１０分間遠心し得る。５％ヒトＡＢ血清、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む１５０ｍＬの新鮮培地にＴＩＬペレットを再懸濁し、元のG-Rex 100フラスコに戻し加え得る。G-Rex 100フラスコ内でＴＩＬを連続的に拡大培養するときは、７日目に各G-Rex 100のＴＩＬを各フラスコ内に存在する３００ｍＬの培地に懸濁し得、且つ細胞懸濁液を３つの１００ｍＬアリコートに分割し得、それらを３つのG-Rex 100フラスコの播種に使用し得る。次に、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む１５０ｍＬのAIM-Vを各フラスコに加え得る。G-Rex 100フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートし得、４日後、各G-Rex100フラスコに３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む１５０ｍＬのAIM-Vを加え得る。細胞は培養１４日目に回収し得る。
【０２９８】
[00398]  一実施形態において、第２の拡大培養（ＲＥＰと称される拡大培養を含む）は、バルクＴＩＬを１５０ｍｌ培地中の１００倍又は２００倍過剰の不活性化フィーダー細胞、３０ｍｇ／ｍＬ  ＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２と混合してフラスコ内で実施される。一部の実施形態において、細胞が別の成長チャンバに移されるまで培地交換が行われる。一部の実施形態において、培地の２／３が新鮮培地による呼吸に置き換えられる。一部の実施形態において、別の成長チャンバには、以下に更に十分に考察するとおりのG-REXフラスコ及びガス透過性容器が含まれる。
【０２９９】
[00399]  一実施形態において、第２の拡大培養（ＲＥＰと称される拡大培養を含む）が実施され、これは優れた腫瘍応答性に関してＴＩＬを選択するステップを更に含む。当技術分野において公知の任意の選択方法を用いることができる。例えば、米国特許出願公開第２０１６／００１００５８  Ａ１号（この開示は参照により本明細書に援用される）に記載される方法が、優れた腫瘍応答性に関するＴＩＬの選択に用いられ得る。
【０３００】
[00400]  任意選択で、第２の拡大培養（ＲＥＰ拡大培養と称される拡大培養を含む）後、当技術分野において公知の標準アッセイを用いて細胞生存率アッセイを実施することができる。例えば、バルクＴＩＬの試料に対してトリパンブルー色素排除アッセイを行うことができ、これは死細胞を選択的に標識して生存率の評価を可能にするものである。一部の実施形態では、Cellometer K2自動セルカウンター（Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA）を使用してＴＩＬ試料をカウントし、生存率を決定することができる。一部の実施形態では、生存率は、例えば実施例１５に記載されるCellometer K2 Image Cytometer自動セルカウンタープロトコルに従い決定される。
【０３０１】
[00401]  一部の実施形態において、ＴＩＬの第２の拡大培養（ＲＥＰと称される拡大培養を含む）は、先述のとおりＴ−１７５フラスコ及びガス透過性バッグ（Tran KQ, Zhou J, Durflinger KH, et al., 2008, J Immunother., 31:742-751及びDudley ME, Wunderlich JR, Shelton TE, et al. 2003, J Immunother., 26:332-342）又はガス透過性G-Rexフラスコを使用して実施することができる。一部の実施形態において、第２の拡大培養はフラスコを使用して実施される。一部の実施形態において、第２の拡大培養はガス透過性G-Rexフラスコを使用して実施される。一部の実施形態において、Ｔ−１７５フラスコで実施される第２の拡大培養及び約１×１０６個のＴＩＬを約１５０ｍＬの培地中に懸濁し、これを各Ｔ−１７５フラスコに加える。ＴＩＬは、「フィーダー」細胞としての照射（５０Ｇｙ）された同種異系ＰＢＭＣと１対１００の比で培養し、及び細胞は、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３を添加したＣＭとAIM-V培地との１対１混合物（５０／５０培地）で培養した。Ｔ−１７５フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートする。一部の実施形態において、培地の半分は、５日目に３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む５０／５０培地を使用して交換される。一部の実施形態において、７日目、２つのＴ−１７５フラスコからの細胞を３Ｌバッグに合わせ、その３００ｍＬのＴＩＬ懸濁液に、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む３００ｍＬのAIM-Vを加える。毎日又は２日毎に各バッグの細胞数をカウントし得、新鮮培地を加えて細胞数を約０．５〜約２．０×１０６細胞／ｍＬに保ち得る。
【０３０２】
[00402]  一部の実施形態において、第２の拡大培養（ＲＥＰと称される拡大培養を含む）は、１００ｃｍ２ガス透過性シリコン底の５００ｍＬ容量フラスコ（G-Rex 100, Wilson Wolf）において実施され（図１）、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３を添加した４００ｍＬの５０／５０培地中で約５×１０６又は１０×１０６個のＴＩＬを照射同種異系ＰＢＭＣと１対１００の比で培養する。G-Rex100フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートされる。一部の実施形態において、５日目に、２５０ｍＬの上清を取り出して遠心ボトルに入れ、１５００ｒｐｍ（４９１ｇ）で１０分間遠心する。次に３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む１５０ｍＬの新鮮５０／５０培地にＴＩＬペレットを再懸濁し、元のG-Rex100フラスコに加え戻し得る。ＴＩＬがG-Rex100フラスコ内で連続的に拡大培養される実施形態では、７日目に各G-Rex100内のＴＩＬを各フラスコ内に存在する３００ｍＬの培地に懸濁し、且つ細胞懸濁液を３つの１００ｍＬアリコートに分割しており、それらを３つのG-Rex100フラスコの播種に使用される。次に、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む１５０ｍＬのAIM-Vを各フラスコに加える。G-Rex100フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートされ、４日後、各G-Rex100フラスコに３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む１５０ｍＬのAIM-Vを加える。細胞は培養１４日目に回収される。
【０３０３】
[00403]  Ｔ及びＢリンパ球の多様な抗原受容体は、限られているが多数の遺伝子セグメントの体細胞組換えによって産生される。これらの遺伝子セグメントＶ（可変）、Ｄ（多様性）、Ｊ（結合）及びＣ（定数）は、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の結合特異性及び下流側での適用を決定する。本発明は、Ｔ細胞レパートリーの多様性を示し、増加させるＴＩＬを生成する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法により得られたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、第２の拡大培養で得られたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、多様性の増加は、免疫グロブリンの多様性及び／又はＴ細胞受容体の多様性の増加である。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン重鎖にある。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン軽鎖にある。一部の実施形態において、多様性はＴ細胞受容体にある。一部の実施形態において、多様性は、アルファ、ベータ、ガンマ及びデルタ受容体からなる群から選択されるＴ細胞受容体の１つにある。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及び／又はベータの発現が増加する。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファの発現が増加する。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベータの発現が増加する。一部の実施形態において、ＴＣＲａｂ（すなわちＴＣＲα／β）の発現が増加する。
【０３０４】
[00404]  一部の実施形態において、第２の拡大培養培地（例えば、ＣＭ２又は第２の細胞培養培地と称されることもある）は、以下で更に詳細に考察するとおり、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３並びに抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）を含む。
【０３０５】
[00405]  一部の実施形態において、第２の拡大培養、例えば、図２７によるステップＤは、閉鎖系バイオリアクターで実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載されるとおり、ＴＩＬ拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、単一のバイオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、G-REX-10又はG-REX-100である。一部の実施形態において、閉鎖系バイオリアクターは単一のバイオリアクターである。
【０３０６】
１．フィーダー細胞及び抗原提示細胞
[00406]  一実施形態では、本明細書に記載の第２の拡大培養手順（例えば、図２７のステップＤに記載された拡大培養並びにＲＥＰと称される拡大培養を含む）は、ＲＥＰ  ＴＩＬ拡大培養中及び／又は第２の拡大培養中に過剰量のフィーダー細胞が必要である。多くの実施形態において、フィーダー細胞は、健常供血者からの標準的な全血ユニットから入手される末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣは、Ficoll-Paque勾配分離などの標準方法を用いて入手される。
【０３０７】
[00407]  一般に、同種異系ＰＢＭＣは、照射又は熱処理のいずれかにより不活性化され、実施例、特に照射された同種異系ＰＢＭＣの複製不能性を評価するための例示的なプロトコルを提供する実施例１４に記載されるように、ＲＥＰ手順で使用される。
【０３０８】
[00408]  一部の実施形態において、１４日目の生細胞の総数がＲＥＰの０日目及び／又は第２の拡大培養の０日目に培養（すなわち第２の拡大培養の開始日）に移行した初期の生細胞数より少ない場合、ＰＢＭＣは複製不能とみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養手順での使用が認められる。例えば、実施例１４を参照のこと。
【０３０９】
[00409]  一部の実施形態において、ＯＫＴ３及びＩＬ−２の存在下で培養された生細胞の総数が、７日目及び１４日目に、ＲＥＰの０日目及び／又は第２の拡大培養の０日目（すなわち第２の拡大培養の開始日）に培養に移行した初期の生細胞数から増加していない場合、ＰＢＭＣは複製不能とみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養手順での使用が認められる。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で培養される。例えば、実施例１３を参照のこと。
【０３１０】
[00410]  一部の実施形態において、ＯＫＴ３及びＩＬ−２の存在下で培養された生細胞の総数が、７日目及び１４日目に、ＲＥＰの０日目及び／又は第２の拡大培養の０日目（すなわち第２の拡大培養の開始日）に培養に移行した初期の生細胞数から増加していない場合、ＰＢＭＣは複製不能とみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養手順での使用が認められる。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、５〜６０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び１０００〜６０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、１０〜５０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び２０００〜５０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、２０〜４０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び２０００〜４０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、２５〜３５ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び２５００〜３５００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で培養される。
【０３１１】
[00411]  一部の実施形態において、抗原提示フィーダー細胞はＰＢＭＣである。一部の実施形態において、抗原提示フィーダー細胞は人工抗原提示フィーダー細胞である。ある実施形態において、第２の拡大培養におけるＴＩＬと抗原提示フィーダー細胞との比は、約１対２５、約１対５０、約１対１００、約１対１２５、約１対１５０、約１対１７５、約１対２００、約１対２２５、約１対２５０、約１対２７５、約１対３００、約１対３２５、約１対３５０、約１対３７５、約１対４００又は約１対５００である。ある実施形態において、第２の拡大培養におけるＴＩＬと抗原提示フィーダー細胞との比は１対５０〜１対３００である。ある実施形態において、第２の拡大培養におけるＴＩＬと抗原提示フィーダー細胞との比は１対１００〜１対２００である。
【０３１２】
[00412]  ある実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順は、約２．５×１０９個のフィーダー細胞と約１００×１０６個のＴＩＬとの比を必要とする。別の実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順は、約２．５×１０９個のフィーダー細胞と約５０×１０６個のＴＩＬとの比を必要とする。更に別の実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順は、約２．５×１０９個のフィーダー細胞と約２５×１０６個のＴＩＬを必要とする。
【０３１３】
[00413]  ある実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順は、第２の拡大培養中に過剰量のフィーダー細胞を必要とする。多くの実施形態において、フィーダー細胞は、健常供血者からの標準的な全血ユニットから入手される末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣは、Ficoll-Paque勾配分離などの標準方法を用いて入手される。ある実施形態では、ＰＢＭＣの代わりに人工抗原提示（ａＡＰＣ）細胞が使用される。
【０３１４】
[00414]  一般に、同種異系ＰＢＭＣは、照射又は熱処理のいずれかによって不活性化され、図４、５及び２７に記載された例示的な手順を含む、本明細書に記載されたＴＩＬ拡大培養手順で使用される。
【０３１５】
[00415]  ある実施形態において、人工抗原提示細胞は、ＰＢＭＣの代替として又はそれと組み合わせて、第２の拡大培養で使用される。
【０３１６】
２．サイトカイン
[00416]  本明細書に記載の拡大培養方法は、一般に、当技術分野において公知のとおり、高用量のサイトカイン、特にＩＬ−２を含む培養培地を使用する。
【０３１７】
[00417]  代わりに、ＴＩＬの迅速拡大培養又は第２の拡大培養にサイトカインの組み合わせを使用することが更に可能であり、ＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１の２つ以上の組み合わせについては、概して国際公開第２０１５／１８９３５６号及び国際公開第２０１５／１８９３５７号（本明細書によって全体として参照により明示的に援用される）に概説されるとおりである。従って、可能な組み合わせとしては、ＩＬ−２とＩＬ−１５、ＩＬ−２とＩＬ−２１、ＩＬ−１５とＩＬ−２１とＩＬ−２、ＩＬ−１５とＩＬ−２１が挙げられ、後者には多くの実施形態において特定の使用が見出される。これらの明細書に記載されるとおり、サイトカインの組み合わせを使用することは、特にリンパ球、詳細にはＴ細胞の生成に有利である。
【０３１８】
３．抗ＣＤ３抗体
[00418]  一部の実施形態において、本明細書に記載の拡大培養方法で使用される培養培地（ＲＥＰと称されるものを含み、例えば、図２７を参照のこと）は、抗ＣＤ３抗体も含む。抗ＣＤ３抗体をＩＬ−２と併用すると、ＴＩＬ集団においてＴ細胞活性化及び細胞分裂が誘導される。この効果は完全長抗体並びにＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片で見ることができ、前者が概して好ましい；例えば、Tsoukas et al., J.Immunol.1985, 135, 1719（本明細書によって全体として参照により援用される）を参照のこと。
【０３１９】
[00419]  当業者は理解するであろうとおり、本発明において使用が見出される好適な抗ヒトＣＤ３抗体は、限定はされないが、ネズミ科動物、ヒト、霊長類、ラット及びイヌ科動物抗体を含めた、様々な哺乳類からの抗ヒトＣＤ３ポリクローナル及びモノクローナル抗体を含め、幾つも存在する。詳細な実施形態では、ＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体が使用される（Ortho-McNeil, Raritan, NJ又はMiltenyi Biotech, Auburn, CAから市販されている）。
【０３２０】
Ｅ．ステップＥ：ＴＩＬを回収する
[00420]  第２の拡大培養ステップ後、細胞は回収することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは、例えば、図２７に提供されるとおり、１、２、３、４回又はそれ以上の拡大培養ステップ後に回収される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、例えば、図２７に提供されるとおり、２回の拡大培養ステップ後に回収される。
【０３２１】
[00421]  ＴＩＬは、例えば遠心によることを含め、任意の適切な且つ無菌の方法で回収することができる。ＴＩＬ回収方法は当技術分野において周知であり、本プロセスと共に任意のかかる公知の方法を用いることができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは自動化系を使用して回収される。
【０３２２】
[00422]  セルハーベスター及び／又は細胞処理系は、例えば、Fresenius Kabi、Tomtec Life Science、Perkin Elmer及びInotech Biosystems International, Inc.を含む様々な供給源から市販されている。任意の細胞ベースのハーベスターを本方法で使用することができる。一部の実施形態において、セルハーベスター及び／又は細胞処理系は、膜ベースの細胞ハーベスターである。一部の実施形態において、細胞回収は、LOVO系（Fresenius Kabi製）などの細胞処理系を介して行われる。用語「LOVO細胞処理系」は、滅菌及び／又は閉鎖系環境で、回転膜又は回転フィルターなどの膜又はフィルターを通して細胞を含む溶液を送り出すことができ、ペレット化せず上清又は細胞培養液を除去する連続フロー及び細胞処理を可能にする、あらゆる販売業者によって製造された機器又は装置も指す。一部の実施形態において、セルハーベスター及び／又は細胞処理系は、閉鎖、無菌系で細胞分離、洗浄、流体交換、濃縮及び／又は他の細胞処理ステップを実施することができる。
【０３２３】
[00423]  一部の実施形態において、回収、例えば、図２７によるステップＥは、閉鎖系バイオリアクターから実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載されるとおり、ＴＩＬ拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、単一のバイオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、G-REX-10又はG-REX-100である。一部の実施形態において、閉鎖系バイオリアクターは単一のバイオリアクターである。
【０３２４】
[00424]  一部の実施形態において、図２７によるステップＥは、実施例３０に記載のプロセスに従って実施される。一部の実施形態において、系の無菌性及び閉鎖性を維持するために、閉鎖系は滅菌条件下でシリンジを介してアクセスされる。一部の実施形態において、実施例３０に記載されるような閉鎖系が使用される。
【０３２５】
[00425]  一部の実施形態において、実施例３０に記載された方法に従ってＴＩＬが回収される。一部の実施形態において、セクション８．５（実施例３０では、１１日目のＴＩＬ回収と称される）に記載されるような方法を使用して、１日目〜１１日目のＴＩＬが回収される。一部の実施形態において、セクション８．１２（実施例３０では、２２日目のＴＩＬ回収と称される）に記載されるような方法を使用して、１２日目〜２２日目のＴＩＬが回収される。
【０３２６】
Ｆ．ステップＦ：最終的な製剤化及び／又は輸注バッグに移す
[00426]  図２７に例示的順序で提供されるとおりの、且つ上記及び本明細書に詳細に概説されるとおりのステップＡ〜Ｅが完了した後、細胞は患者への投与における使用のため容器に移される。一部の実施形態において、上記に記載される拡大培養方法を用いて治療上十分な数のＴＩＬが入手されると、ＴＩＬは患者への投与における使用のため容器に移される。
【０３２７】
[00427]  ある実施形態において、本開示のＡＰＣを使用して拡大培養したＴＩＬは、医薬組成物として患者に投与される。ある実施形態において、医薬組成物は滅菌緩衝液中のＴＩＬの懸濁液である。本開示のＰＢＭＣを使用して拡大培養したＴＩＬは、当技術分野において公知のとおりの任意の好適な経路によって投与され得る。一部の実施形態において、Ｔ細胞は単回動脈内又は静脈内注入として投与され、これは好ましくは約３０〜６０分間継続される。他の好適な投与経路としては、腹腔内、髄腔内及びリンパ内が挙げられる。
【０３２８】
１．医薬組成物、投薬量及び投与レジメン
[00428]  ある実施形態において、本開示の方法を使用して拡大培養したＴＩＬは、医薬組成物として患者に投与される。ある実施形態において、医薬組成物は滅菌緩衝液中のＴＩＬの懸濁液である。本開示のＰＢＭＣを使用して拡大培養したＴＩＬは、当技術分野において公知のとおりの任意の好適な経路によって投与され得る。一部の実施形態において、Ｔ細胞は単回動脈内又は静脈内注入として投与され、これは好ましくは約３０〜６０分間継続される。他の好適な投与経路としては、腹腔内、髄腔内及びリンパ内投与が挙げられる。
【０３２９】
[00429]  任意の好適な用量のＴＩＬを投与することができる。一部の実施形態において、約２．３×１０１０〜約１３．７×１０１０個のＴＩＬが投与され、特に癌が黒色腫である場合、平均約７．８×１０１０個のＴＩＬである。ある実施形態において、約１．２×１０１０〜約４．３×１０１０個のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約３×１０１０〜約１２×１０１０個のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約４×１０１０〜約１０×１０１０個のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約５×１０１０〜約８×１０１０個のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約６×１０１０〜約８×１０１０個のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約７×１０１０〜約８×１０１０個のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、治療上有効な投薬量は約２．３×１０１０〜約１３．７×１０１０個である。一部の実施形態において、治療上有効な投薬量は、特に癌が黒色腫である場合、約７．８×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療上有効な投薬量は約１．２×１０１０〜約４．３×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療上有効な投薬量は約３×１０１０〜約１２×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療上有効な投薬量は約４×１０１０〜約１０×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療上有効な投薬量は約５×１０１０〜約８×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療上有効な投薬量は約６×１０１０〜約８×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療上有効な投薬量は約７×１０１０〜約８×１０１０個のＴＩＬである。
【０３３０】
[00430]  一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの数は、約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３及び９×１０１３個である。ある実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの数は、１×１０６〜５×１０６、５×１０６〜１×１０７、１×１０７〜５×１０７、５×１０７〜１×１０８、１×１０８〜５×１０８、５×１０８〜１×１０９、１×１０９〜５×１０９、５×１０９〜１×１０１０、１×１０１０〜５×１０１０、５×１０１０〜１×１０１１、５×１０１１〜１×１０１２、１×１０１２〜５×１０１２及び５×１０１２〜１×１０１３個の範囲である。
【０３３１】
[00431]  一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、例えば、医薬組成物の１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％又は０．０００１％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖ未満である。
【０３３２】
[00432]  一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、医薬組成物の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１９．７５％、１９．５０％、１９．２５％、１９％、１８．７５％、１８．５０％、１８．２５％、１８％、１７．７５％、１７．５０％、１７．２５％、１７％、１６．７５％、１６．５０％、１６．２５％、１６％、１５．７５％、１５．５０％、１５．２５％、１５％、１４．７５％、１４．５０％、１４．２５％、１４％、１３．７５％、１３．５０％、１３．２５％、１３％、１２．７５％、１２．５０％、１２．２５％、１２％、１１．７５％、１１．５０％、１１．２５％、１１％、１０．７５％、１０．５０％、１０．２５％、１０％、９．７５％、９．５０％、９．２５％、９％、８．７５％、８．５０％、８．２５％、８％、７．７５％、７．５０％、７．２５％、７％、６．７５％、６．５０％、６．２５％、６％、５．７５％、５．５０％、５．２５％、５％、４．７５％、４．５０％、４．２５％、４％、３．７５％、３．５０％、３．２５％、３％、２．７５％、２．５０％、２．２５％、２％、１．７５％、１．５０％、１２５％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％又は０．０００１％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖ超である。
【０３３３】
[00433]  一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、医薬組成物の約０．０００１％〜約５０％、約０．００１％〜約４０％、約０．０１％〜約３０％、約０．０２％〜約２９％、約０．０３％〜約２８％、約０．０４％〜約２７％、約０．０５％〜約２６％、約０．０６％〜約２５％、約０．０７％〜約２４％、約０．０８％〜約２３％、約０．０９％〜約２２％、約０．１％〜約２１％、約０．２％〜約２０％、約０．３％〜約１９％、約０．４％〜約１８％、約０．５％〜約１７％、約０．６％〜約１６％、約０．７％〜約１５％、約０．８％〜約１４％、約０．９％〜約１２％又は約１％〜約１０％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖの範囲である。
【０３３４】
[00434]  一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、医薬組成物の約０．００１％〜約１０％、約０．０１％〜約５％、約０．０２％〜約４．５％、約０．０３％〜約４％、約０．０４％〜約３．５％、約０．０５％〜約３％、約０．０６％〜約２．５％、約０．０７％〜約２％、約０．０８％〜約１．５％、約０．０９％〜約１％、約０．１％〜約０．９％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖの範囲である。
【０３３５】
[00435]  一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの量は、１０ｇ、９．５ｇ、９．０ｇ、８．５ｇ、８．０ｇ、７．５ｇ、７．０ｇ、６．５ｇ、６．０ｇ、５．５ｇ、５．０ｇ、４．５ｇ、４．０ｇ、３．５ｇ、３．０ｇ、２．５ｇ、２．０ｇ、１．５ｇ、１．０ｇ、０．９５ｇ、０．９ｇ、０．８５ｇ、０．８ｇ、０．７５ｇ、０．７ｇ、０．６５ｇ、０．６ｇ、０．５５ｇ、０．５ｇ、０．４５ｇ、０．４ｇ、０．３５ｇ、０．３ｇ、０．２５ｇ、０．２ｇ、０．１５ｇ、０．１ｇ、０．０９ｇ、０．０８ｇ、０．０７ｇ、０．０６ｇ、０．０５ｇ、０．０４ｇ、０．０３ｇ、０．０２ｇ、０．０１ｇ、０．００９ｇ、０．００８ｇ、０．００７ｇ、０．００６ｇ、０．００５ｇ、０．００４ｇ、０．００３ｇ、０．００２ｇ、０．００１ｇ、０．０００９ｇ、０．０００８ｇ、０．０００７ｇ、０．０００６ｇ、０．０００５ｇ、０．０００４ｇ、０．０００３ｇ、０．０００２ｇ又は０．０００１ｇ以下である。
【０３３６】
[00436]  一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの量は、０．０００１ｇ、０．０００２ｇ、０．０００３ｇ、０．０００４ｇ、０．０００５ｇ、０．０００６ｇ、０．０００７ｇ、０．０００８ｇ、０．０００９ｇ、０．００１ｇ、０．００１５ｇ、０．００２ｇ、０．００２５ｇ、０．００３ｇ、０．００３５ｇ、０．００４ｇ、０．００４５ｇ、０．００５ｇ、０．００５５ｇ、０．００６ｇ、０．００６５ｇ、０．００７ｇ、０．００７５ｇ、０．００８ｇ、０．００８５ｇ、０．００９ｇ、０．００９５ｇ、０．０１ｇ、０．０１５ｇ、０．０２ｇ、０．０２５ｇ、０．０３ｇ、０．０３５ｇ、０．０４ｇ、０．０４５ｇ、０．０５ｇ、０．０５５ｇ、０．０６ｇ、０．０６５ｇ、０．０７ｇ、０．０７５ｇ、０．０８ｇ、０．０８５ｇ、０．０９ｇ、０．０９５ｇ、０．１ｇ、０．１５ｇ、０．２ｇ、０．２５ｇ、０．３ｇ、０．３５ｇ、０．４ｇ、０．４５ｇ、０．５ｇ、０．５５ｇ、０．６ｇ、０．６５ｇ、０．７ｇ、０．７５ｇ、０．８ｇ、０．８５ｇ、０．９ｇ、０．９５ｇ、１ｇ、１．５ｇ、２ｇ、２．５、３ｇ、３．５、４ｇ、４．５ｇ、５ｇ、５．５ｇ、６ｇ、６．５ｇ、７ｇ、７．５ｇ、８ｇ、８．５ｇ、９ｇ、９．５ｇ又は１０ｇ超である。
【０３３７】
[00437]  本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬは、広い投薬量範囲にわたって有効である。正確な投薬量は、投与経路、化合物の投与形態、治療対象の性別及び年齢、治療対象の体重並びに主治医の優先的選択及び経験に依存することになる。臨床的に確立されたＴＩＬの投薬量も適宜用いられ得る。ＴＩＬの投薬量など、本明細書の方法を用いて投与される医薬組成物の量は、治療下のヒト又は哺乳類、障害又は病態の重症度、投与速度、医薬品有効成分の性質及び処方医師の裁量に依存することになる。
【０３３８】
[00438]  一部の実施形態において、ＴＩＬは単回用量で投与され得る。かかる投与は、注射、例えば静脈内注射によるものであり得る。一部の実施形態において、ＴＩＬは複数回用量で投与され得る。投与は、年１回、２回、３回、４回、５回、６回又は６回超であり得る。投与は、月１回、２週間に１回、週１回又は隔日１回であり得る。ＴＩＬの投与は必要な限り継続され得る。
【０３３９】
[00439]  一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投薬量は、約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３及び９×１０１３個である。一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投薬量は、１×１０６〜５×１０６、５×１０６〜１×１０７、１×１０７〜５×１０７、５×１０７〜１×１０８、１×１０８〜５×１０８、５×１０８〜１×１０９、１×１０９〜５×１０９、５×１０９〜１×１０１０、１×１０１０〜５×１０１０、５×１０１０〜１×１０１１、５×１０１１〜１×１０１２、１×１０１２〜５×１０１２及び５×１０１２〜１×１０１３個の範囲である。
【０３４０】
[00440]  一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投薬量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約４．３ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ〜約３．６ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約３．２ｍｇ／ｋｇ、約０．３５ｍｇ／ｋｇ〜約２．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ〜約２．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ〜約２．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ〜約１．７ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ〜約１．３ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約１．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．５５ｍｇ／ｋｇ〜約０．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．６５ｍｇ／ｋｇ〜約０．８ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ〜約０．７５ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ〜約２．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．８５ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１．８５ｍｇ／ｋｇ、約１．１５ｍｇ／ｋｇ〜約１．７ｍｇ／ｋｇ、約１．３ｍｇ／ｋｇｍｇ〜約１．６ｍｇ／ｋｇ、約１．３５ｍｇ／ｋｇ〜約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２．１５ｍｇ／ｋｇ〜約３．６ｍｇ／ｋｇ、約２．３ｍｇ／ｋｇ〜約３．４ｍｇ／ｋｇ、約２．４ｍｇ／ｋｇ〜約３．３ｍｇ／ｋｇ、約２．６ｍｇ／ｋｇ〜約３．１５ｍｇ／ｋｇ、約２．７ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ、約２．８ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ又は約２．８５ｍｇ／ｋｇ〜約２．９５ｍｇ／ｋｇの範囲である。
【０３４１】
[00441]  一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投薬量は、約１ｍｇ〜約５００ｍｇ、約１０ｍｇ〜約３００ｍｇ、約２０ｍｇ〜約２５０ｍｇ、約２５ｍｇ〜約２００ｍｇ、約１ｍｇ〜約５０ｍｇ、約５ｍｇ〜約４５ｍｇ、約１０ｍｇ〜約４０ｍｇ、約１５ｍｇ〜約３５ｍｇ、約２０ｍｇ〜約３０ｍｇ、約２３ｍｇ〜約２８ｍｇ、約５０ｍｇ〜約１５０ｍｇ、約６０ｍｇ〜約１４０ｍｇ、約７０ｍｇ〜約１３０ｍｇ、約８０ｍｇ〜約１２０ｍｇ、約９０ｍｇ〜約１１０ｍｇ又は約９５ｍｇ〜約１０５ｍｇ、約９８ｍｇ〜約１０２ｍｇ、約１５０ｍｇ〜約２５０ｍｇ、約１６０ｍｇ〜約２４０ｍｇ、約１７０ｍｇ〜約２３０ｍｇ、約１８０ｍｇ〜約２２０ｍｇ、約１９０ｍｇ〜約２１０ｍｇ、約１９５ｍｇ〜約２０５ｍｇ又は約１９８〜約２０７ｍｇの範囲である。
【０３４２】
[00442]  有効量のＴＩＬは、鼻腔内及び経皮経路、動脈内注射によること、静脈内、腹腔内、非経口的、筋肉内、皮下、局所、移植によること又は吸入によることを含め、同様の有用性を有する薬剤について一般に認められている任意の投与方式により、単回用量又は複数回用量のいずれで投与され得る。
【０３４３】
Ｇ．任意選択の細胞生存率分析
[00443]  任意選択で、ステップＢの第１の拡大培養後、当技術分野において公知の標準アッセイを用いて細胞生存率アッセイを実施することができる。例えば、バルクＴＩＬの試料に対してトリパンブルー色素排除アッセイを行うことができ、これは死細胞を選択的に標識して生存率の評価を可能にするものである。生存率の試験に用いられる他のアッセイとしては、限定はされないが、アラマーブルーアッセイ；及びＭＴＴアッセイを挙げることができる。
【０３４４】
１．細胞数、生存率、フローサイトメトリー
[00444]  一部の実施形態において、細胞数及び／又は生存率が測定される。限定はされないが、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８及びＣＤ５６などのマーカー並びに本明細書に開示又は記載される任意の他のものの発現を抗体によるフローサイトメトリー、例えば限定はされないが、FACSCanto（商標）フローサイトメーター（BD Biosciences）を使用してBD Bio-sciences（BD Biosciences、San Jose, CA）から市販されているものによって測定することができる。細胞は、ディスポーザブルc-chip血球計算盤（VWR、Batavia, IL）を使用して手動でカウントすることができ、及び生存率は、限定はされないがトリパンブルー染色を含め、当技術分野において公知の任意の方法を用いて評価することができる。
【０３４５】
[00445]  一部の実施形態において、ＴＩＬは、ＣＤ３＋細胞集団のパーセンテージについて分析される。一部の実施形態において、処置における使用のためのＴＩＬは、ＣＤ３＋細胞集団のパーセンテージについて分析される。一部の実施形態において、ＴＩＬはＣＤ３＋／ＣＤ４５＋ＴＩＬである。一部の実施形態において、ＣＤ３＋のパーセンテージは約７０％〜約９９．９％である。一部の実施形態において、ＣＤ３＋のパーセンテージは約７４％〜約９９．９％である。一部の実施形態において、ＣＤ３＋のパーセンテージは約７４％〜約９９．９％である。一部の実施形態において、ＣＤ３＋のパーセンテージは約７４％〜約９７．１％である。一部の実施形態において、ＣＤ３＋のパーセンテージは約８０％〜約９９．９％である。一部の実施形態において、ＣＤ３＋のパーセンテージは約８５％〜約９９．９％である。一部の実施形態において、ＣＤ３＋のパーセンテージは約９０％〜約９９．９％である。一部の実施形態において、ＣＤ３＋のパーセンテージは約８５％〜約９５％である。一部の実施形態において、ＣＤ３＋のパーセンテージは約８０％〜約９５％である。一部の実施形態において、ＣＤ３＋のパーセンテージは約９５％〜約９９．９％である。一部の実施形態において、ＣＤ３＋／ＣＤ４５＋のパーセンテージは約７０％〜約９９．９％である。一部の実施形態において、ＣＤ３＋／ＣＤ４５＋のパーセンテージは約７４％〜約９９．９％である。一部の実施形態において、ＣＤ３＋／ＣＤ４５＋のパーセンテージは約７４％〜約９９．９％である。一部の実施形態において、ＣＤ３＋／ＣＤ４５＋のパーセンテージは約７４％〜約９７．１％である。一部の実施形態において、ＣＤ３＋／ＣＤ４５＋のパーセンテージは約８０％〜約９９．９％である。一部の実施形態において、ＣＤ３＋／ＣＤ４５＋のパーセンテージは約８５％〜約９９．９％である。一部の実施形態において、ＣＤ３＋／ＣＤ４５＋のパーセンテージは約９０％〜約９９．９％である。一部の実施形態において、ＣＤ３＋／ＣＤ４５＋のパーセンテージは約８５％〜約９５％である。一部の実施形態において、ＣＤ３＋／ＣＤ４５＋のパーセンテージは約８０％〜約９５％である。一部の実施形態において、ＣＤ３＋／ＣＤ４５＋のパーセンテージは約９５％〜約９９．９％である。
【０３４６】
[00446]  ある場合には、バルクＴＩＬ集団は、以下で考察するプロトコルを用いて直ちに凍結保存することができる。代わりに、バルクＴＩＬ集団は、以下で考察するとおり、ＲＥＰに供され、次に凍結保存され得る。同様に、療法において遺伝子修飾ＴＩＬが使用されることになる場合、バルク又はＲＥＰ  ＴＩＬ集団を好適な治療のための遺伝子修飾に供し得る。
【０３４７】
２．細胞培養
[00447]  ある実施形態において、ＴＩＬの拡大培養方法は、約５，０００ｍＬ〜約２５，０００ｍＬの細胞培地、約５，０００ｍＬ〜約１０，０００ｍＬの細胞培地又は約５，８００ｍＬ〜約８，７００ｍＬの細胞培地を使用することを含み得る。ある実施形態において、ＴＩＬ数の拡大には１種類以下の細胞培養培地が使用される。任意の好適な細胞培養培地、例えば、AIM-V細胞培地（Ｌ−グルタミン、５０μＭ硫酸ストレプトマイシン及び１０μＭ硫酸ゲンタマイシン）細胞培養培地（Invitrogen、Carlsbad CA）を使用し得る。この点に関して、本発明の方法では有利には、ＴＩＬ数の拡大に必要な培地の量及び培地の種類の数が減少する。ある実施形態において、ＴＩＬ数の拡大は、２日又は３日おき以下の頻度で細胞に新鮮細胞培養培地を加える（細胞をフィードするとも称される）ことを含み得る。ガス透過性容器内で細胞の数を拡大すると、細胞の拡大培養に必要なフィーディング頻度が減少することにより細胞の数の拡大に必要な手順が簡便になる。
【０３４８】
[00448]  ある実施形態において、第１及び／又は第２のガス透過性容器内の細胞培地はろ過されていない。ろ過されていない細胞培地を使用すると、細胞の数の拡大に必要な手順が簡便になり得る。ある実施形態において、第１及び／又は第２のガス透過性容器内の細胞培地はβ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）を含まない。
【０３４９】
[00449]  ある実施形態において、哺乳類から腫瘍組織試料を入手すること；細胞培地が中に入った第１のガス透過性容器内で腫瘍組織試料を培養すること；腫瘍組織試料からＴＩＬを入手すること；ａＡＰＣを使用して細胞培地が中に入った第２のガス透過性容器内でＴＩＬ数を約１４〜約４２日間、例えば約２８日間拡大することを含む本方法の所要期間。
【０３５０】
[00450]  ある実施形態において、ＴＩＬはガス透過性容器内で拡大培養される。ガス透過性容器は、米国特許出願公開第２００５／０１０６７１７  Ａ１号（この開示は参照により本明細書に援用される）に記載されるものを含め、当技術分野において公知の方法、組成物及び装置を用いたＰＢＭＣを使用したＴＩＬの拡大培養に用いられている。ある実施形態において、ＴＩＬはガス透過性バッグ内で拡大培養される。ある実施形態において、ＴＩＬは、Xuri Cell Expansion System W25（GE Healthcare）など、ガス透過性バッグ内でＴＩＬを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。ある実施形態において、ＴＩＬは、Xuri Cell Expansion System W5（GE Healthcare）としても知られるWAVE Bioreactor Systemなど、ガス透過性バッグ内でＴＩＬを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。ある実施形態において、細胞拡大培養システムは、約１００ｍＬ、約２００ｍＬ、約３００ｍＬ、約４００ｍＬ、約５００ｍＬ、約６００ｍＬ、約７００ｍＬ、約８００ｍＬ、約９００ｍＬ、約１Ｌ、約２Ｌ、約３Ｌ、約４Ｌ、約５Ｌ、約６Ｌ、約７Ｌ、約８Ｌ、約９Ｌ及び約１０Ｌからなる群から選択される容積を有するガス透過性細胞バッグを含む。ある実施形態において、ＴＩＬはG-Rexフラスコ（Wilson Wolf Manufacturingから市販されている）において拡大培養することができる。かかる実施形態は、細胞集団を約５×１０５細胞／ｃｍ２から１０×１０６〜３０×１０６細胞／ｃｍ２へと拡大培養することを可能にする。ある実施形態において、この拡大培養は、細胞に新鮮な細胞培養培地を加える（細胞をフィードするとも称される）ことなく行われる。ある実施形態において、これは、GRexフラスコ内に約１０ｃｍの高さの培地がある限りフィーディングなしである。ある実施形態において、これにフィーディングはないが、１つ以上のサイトカインが加えられる。ある実施形態において、サイトカインは、サイトカインを培地と混合する必要は一切なしにボーラスとして加えることができる。かかる容器、装置及び方法は当技術分野において公知で、ＴＩＬの拡大培養に用いられており、米国特許出願公開第２０１４／０３７７７３９Ａ１号、国際公開第２０１４／２１００３６  Ａ１号、米国特許出願公開第２０１３／０１１５６１７  Ａ１号、国際公開第２０１３／１８８４２７  Ａ１号、米国特許出願公開第２０１１／０１３６２２８  Ａ１号、米国特許第８，８０９，０５０  Ｂ２号、国際公開第２０１１／０７２０８８  Ａ２号、米国特許出願公開第２０１６／０２０８２１６  Ａ１号、米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３  Ａ１号、国際公開第２０１２／１２９２０１  Ａ１号、米国特許出願公開第２０１３／０１０２０７５  Ａ１号、米国特許第８，９５６，８６０  Ｂ２号、国際公開第２０１３／１７３８３５  Ａ１号、米国特許出願公開第２０１５／０１７５９６６  Ａ１号（これらの開示は参照により本明細書に援用される）に記載されるものが含まれる。かかるプロセスは、Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35:283-292にも記載されている。
【０３５１】
任意選択のＴＩＬ遺伝子改変
[00451]  一部の実施形態において、ＴＩＬは任意選択で、限定はされないが、高親和性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、ＭＡＧＥ−１、ＨＥＲ２若しくはＮＹ−ＥＳＯ−１などの腫瘍関連抗原を標的とするＴＣＲ又は腫瘍関連細胞表面分子（例えばメソテリン）若しくは系統限定的細胞表面分子（例えばＣＤ１９）に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含め、追加的な機能性を含むように遺伝子改変される。
【０３５２】
Ｈ．任意選択のＴＩＬ凍結保存
[00452]  上記で考察したとおり、且つ図２７に提供したとおりステップＡ〜Ｅにおいて例示したとおり、ＴＩＬ拡大培養プロセス全体を通じて数々の時点で凍結保存を行うことができる。一部の実施形態において、（例えば、図２７のステップＤに係るとおり）第２の拡大培養後の拡大培養ＴＩＬ集団が凍結保存され得る。凍結保存は、概して、凍結溶液、例えば８５％補体不活性化ＡＢ血清及び１５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の中にＴＩＬ集団を置くことにより達成し得る。この溶液中の細胞を極低温バイアルに入れ、−８０℃で２４時間貯蔵し、任意選択で凍結保存のため気体窒素フリーザーに移す。Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986を参照のこと。一部の実施形態において、ＴＩＬは５％ＤＭＳＯに凍結保存される。一部の実施形態において、ＴＩＬは細胞培養培地＋５％ＤＭＳＯに凍結保存される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、実施例８及び９に提供される方法に従い凍結保存される。
【０３５３】
[00453]  適切な場合、細胞をフリーザーから取り出し、３７℃の水浴中で溶液の約５分の４が解凍されるまで解凍する。細胞は概して完全培地中に再懸濁され、任意選択で１回以上洗浄される。一部の実施形態では、当技術分野において公知のとおり解凍ＴＩＬをカウントし、生存率に関して評価することができる。
【０３５４】
Ｉ．拡大培養したＴＩＬの表現型特徴
[00454]  一部の実施形態において、ＴＩＬは、拡大培養後、本明細書及び実施例に記載されるものを含め、多数の表現型マーカーの発現に関して分析される。ある実施形態では、１つ以上の表現型マーカーの発現が調べられる。一部の実施形態において、ＴＩＬの表現型特徴は、ステップＢの第１の拡大培養後に分析される。一部の実施形態において、ＴＩＬの表現型特徴は、ステップＣの移行中に分析される。一部の実施形態において、ＴＩＬの表現型特徴は、ステップＣに係る移行中且つ凍結保存後に分析される。一部の実施形態において、ＴＩＬの表現型特徴は、ステップＤに係る第２の拡大培養後に分析される。一部の実施形態において、ＴＩＬの表現型特徴は、ステップＤに係る２回以上の拡大培養後に分析される。一部の実施形態において、マーカーは、ＴＣＲａｂ（すなわちＴＣＲα／β）、ＣＤ５７、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ５６、ＣＤ８ａ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ８ａ、ＣＣＲ７、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ３８及びＨＬＡ−ＤＲからなる群から選択される。一部の実施形態において、マーカーは、ＴＣＲａｂ（すなわちＴＣＲα／β）、ＣＤ５７、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ５６及びＣＤ８ａからなる群から選択される。ある実施形態において、マーカーは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ８ａ、ＣＣＲ７、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ３８及びＨＬＡ−ＤＲからなる群から選択される。一部の実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４個のマーカーの発現が調べられる。一部の実施形態では、各群から１つ以上のマーカーからの発現が調べられる。一部の実施形態では、解凍ＴＩＬと比較したとき新鮮ＴＩＬにおいてＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ３８及びＣＤ６９発現の１つ以上が維持される（すなわち統計的に有意な差を呈しない）。一部の実施形態では、解凍ＴＩＬにおいてＴＩＬの活性化状態が維持される。
【０３５５】
[00455]  ある実施形態において、１つ以上の調節マーカーの発現が測定される。一部の実施形態において、調節マーカーは、ＣＤ１３７、ＣＤ８ａ、Ｌａｇ３、ＣＤ４、ＣＤ３、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＣＤ６９、ＣＤ８ａ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ４、ＣＤ３、ＫＬＲＧ１及びＣＤ１５４からなる群から選択される。一部の実施形態において、調節マーカーは、ＣＤ１３７、ＣＤ８ａ、Ｌａｇ３、ＣＤ４、ＣＤ３、ＰＤ−１及びＴＩＭ−３からなる群から選択される。一部の実施形態において、調節マーカーは、ＣＤ６９、ＣＤ８ａ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ４、ＣＤ３、ＫＬＲＧ１及びＣＤ１５４からなる群から選択される。一部の実施形態において、調節分子発現は新鮮ＴＩＬと比較したとき解凍ＴＩＬにおいて低下する。一部の実施形態において、調節分子ＬＡＧ−３及びＴＩＭ−３の発現は新鮮ＴＩＬと比較したとき解凍ＴＩＬにおいて低下する。一部の実施形態において、ＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ、ＴＣＲαβ発現に有意な差はない。一部の実施形態において、解凍ＴＩＬと比較したとき新鮮ＴＩＬにおいてＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ、ＴＣＲαβ発現及び／又はメモリーマーカーに有意な差はない。一部の実施形態において、例えば図２７に例示されているように、本明細書で提供される方法によって作製されるＴＩＬ及び／又は例えば、図２７で具体化されているもの以外の方法を含む本明細書で提供する以外の他の方法を使用して調製されたＴＩＬ間のＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ、ＴＣＲαβ発現には有意な差は無い。
【０３５６】
[00456]  一部の実施形態において、第１のＴＩＬ集団、第２のＴＩＬ集団、第３のＴＩＬ集団、回収したＴＩＬ集団、及び／又はＣＤ４、ＣＤ８、及び／又はＮＫ、ＴＣＲαβ発現に基づく治療用ＴＩＬ集団の選択は、上記で考察したか又は図２７の例を含むあらゆるステップ中には実施されない。一部の実施形態において、ＣＤ４、ＣＤ８及び／又はＮＫ、ＴＣＲαβに基づく第１のＴＩＬ集団の選択は実施されない。一部の実施形態において、ＣＤ４、ＣＤ８及び／又はＮＫ、ＴＣＲαβ発現に基づく第２のＴＩＬ集団の選択は実施されない。一部の実施形態において、ＣＤ４、ＣＤ８及び／又はＮＫ、ＴＣＲαβ発現に基づく第３のＴＩＬ集団の選択は実施されない。一部の実施形態において、ＣＤ４、ＣＤ８及び／又はＮＫ、ＴＣＲαβ発現に基づく回収したＴＩＬ集団の選択は実施されない。一部の実施形態において、ＣＤ４、ＣＤ８及び／又はＮＫ、ＴＣＲαβ発現に基づく治療用ＴＩＬ集団の選択は実施されない。
【０３５７】
[00457]  ある実施形態において、第１のＴＩＬ集団、第２のＴＩＬ集団、第３のＴＩＬ集団又はＣＤ４、ＣＤ８及び／又はＮＫ、ＴＣＲαβ発現に基づく回収ＴＩＬの選択は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法のステップ（ａ）〜（ｆ）のいずれの間も実施されず、このステップは
（ａ）患者から得られた腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に加えること；
（ｃ）ＩＬ−２を含む細胞培養培地で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約３〜１４日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｄ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を入手するために約７〜１４日間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団に対して、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加したサブ集団を含む治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｅ）ステップ（ｄ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生する、回収すること；及び
（ｆ）ステップ（ｅ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放せずに発生する、移すこと
を含む。
【０３５８】
[00458]  ある実施形態において、第１のＴＩＬ集団、第２のＴＩＬ集団、第３のＴＩＬ集団又はＣＤ４、ＣＤ８及び／又はＮＫ、ＴＣＲαβ発現に基づく回収ＴＩＬの選択は、癌を有する対象の処置を行う方法のステップ（ａ）〜（ｈ）のいずれの間も実施されず、この拡大培養した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を投与することを含む方法は、
（ａ）対象から得られた腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に加えること；
（ｃ）ＩＬ−２を含む細胞培養培地で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約３〜１４日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｄ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を入手するために約７〜１４日間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団に対して、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加したサブ集団を含む治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｅ）ステップ（ｄ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生する、回収すること；及び
（ｆ）ステップ（ｅ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放せずに発生する、移すこと；
（ｇ）凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）からの回収されたＴＩＬ集団を含む輸注バッグを任意選択で凍結保存すること；並びに
（ｈ）ステップ（ｇ）における輸注バッグから治療上有効な投薬量の第３のＴＩＬ集団を患者に投与すること
を含む。
【０３５９】
[00459]  一部の実施形態において、メモリーマーカーは、ＣＣＲ７及びＣＤ６２Ｌからなる群から選択される。
【０３６０】
[00460]  一部の実施形態において、解凍ＴＩＬと比較したときの新鮮ＴＩＬの生存率は、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９８％である。一部の実施形態において、新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬの両方の生存率が、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超又は９８％超である。一部の実施形態において、新鮮産物及び解凍産物の両方の生存率が、８０％超、８１％超、８２％超、８３％超、８４％超、８５％超、８６％超、８７％超、８８％超、８９％超又は９０％超である。一部の実施形態において、新鮮産物及び解凍産物の両方の生存率が８６％超である。
【０３６１】
[00461]  ある実施形態において、再刺激ＴＩＬは、サイトカイン遊離アッセイを用いてサイトカイン遊離に関しても判定することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは、ＯＫＴ３か又は自己腫瘍消化物との共培養かのいずれかによる刺激に応答したインターフェロン−７（ＩＦＮ−７）分泌に関して判定することができる。例えば、ＯＫＴ３刺激を用いる実施形態では、ＴＩＬを広範に洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水で希釈した０．１又は１．０μｇ／ｍＬのＯＫＴ３をプレコートした９６ウェル平底プレートに０．２ｍＬ  ＣＭ中１×１０５細胞でデュプリケートウェルを調製する。一晩インキュベートした後、上清を回収し、上清中のＩＦＮ−７をＥＬＩＳＡ（Pierce/Endogen、Woburn, MA）によって測定する。共培養アッセイについては、１×１０５個のＴＩＬ細胞を９６ウェルプレートに自己腫瘍細胞と共に（１：１比）置く。２４時間のインキュベーション後、上清を回収し、ＩＦＮ−７遊離を例えばＥＬＩＳＡによって定量化することができる。
【０３６２】
[00462]  細胞表面バイオマーカーのフローサイトメトリー分析：細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析のため、ＴＩＬ試料をアリコートに分けた。例えば実施例７、８及び９を参照のこと。
【０３６３】
[00463]  一部の実施形態において、ＴＩＬは様々な調節マーカーに関して判定されるものである。一部の実施形態において、調節マーカーは、ＴＣＲα／β、ＣＤ５６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５７、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒ−、ＣＣＲ７、ＣＤ６２Ｌ、ＫＬＲＧ１及びＣＤ１２２からなる群から選択される。一部の実施形態において、調節マーカーはＴＣＲα／βである。一部の実施形態において、調節マーカーはＣＤ５６である。一部の実施形態において、調節マーカーはＣＤ２７である。一部の実施形態において、調節マーカーはＣＤ２８である。一部の実施形態において、調節マーカーはＣＤ５７である。一部の実施形態において、調節マーカーはＣＤ４５ＲＡである。一部の実施形態において、調節マーカーはＣＤ４５ＲＯである。一部の実施形態において、調節マーカーはＣＤ２５である。一部の実施形態において、調節マーカーはＣＤ１２７である。一部の実施形態において、調節マーカーはＣＤ９５である。一部の実施形態において、調節マーカーはＩＬ−２Ｒ−である。一部の実施形態において、調節マーカーはＣＣＲ７である。一部の実施形態において、調節マーカーはＣＤ６２Ｌである。一部の実施形態において、調節マーカーはＫＬＲＧ１である。一部の実施形態において、調節マーカーはＣＤ１２２である。
【０３６４】
[00464]  一実施形態において、拡大培養されたＴＩＬは、本明細書及び実施例に記載されるものを含め、多数の表現型マーカーの発現に関して分析される。ある実施形態では、１つ以上の表現型マーカーの発現が調べられる。一部の実施形態において、マーカーは、ＴＣＲａｂ（すなわちＴＣＲα／β）、ＣＤ５７、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ５６、ＣＤ８ａ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ８ａ、ＣＣＲ７、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ３８及びＨＬＡ−ＤＲからなる群から選択される。一部の実施形態において、マーカーは、ＴＣＲａｂ（すなわちＴＣＲα／β）、ＣＤ５７、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ５６及びＣＤ８ａからなる群から選択される。ある実施形態において、マーカーは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ８ａ、ＣＣＲ７、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ３８及びＨＬＡ−ＤＲからなる群から選択される。一部の実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４個のマーカーの発現が調べられる。一部の実施形態では、各群から１つ以上のマーカーからの発現が調べられる。一部の実施形態では、解凍ＴＩＬと比較したとき新鮮ＴＩＬにおいてＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ３８及びＣＤ６９発現の１つ以上が維持される（すなわち統計的に有意な差を呈しない）。一部の実施形態では、解凍ＴＩＬにおいてＴＩＬの活性化状態が維持される。
【０３６５】
[00465]  ある実施形態において、１つ以上の調節マーカーの発現が測定される。一部の実施形態において、調節マーカーは、ＣＤ１３７、ＣＤ８ａ、Ｌａｇ３、ＣＤ４、ＣＤ３、ＰＤ１、ＴＩＭ−３、ＣＤ６９、ＣＤ８ａ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ４、ＣＤ３、ＫＬＲＧ１及びＣＤ１５４からなる群から選択される。一部の実施形態において、調節マーカーは、ＣＤ１３７、ＣＤ８ａ、Ｌａｇ３、ＣＤ４、ＣＤ３、ＰＤ１及びＴＩＭ−３からなる群から選択される。一部の実施形態において、調節マーカーは、ＣＤ６９、ＣＤ８ａ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ４、ＣＤ３、ＫＬＲＧ１及びＣＤ１５４からなる群から選択される。一部の実施形態において、調節分子発現は新鮮ＴＩＬと比較したとき解凍ＴＩＬにおいて低下する。一部の実施形態において、調節分子ＬＡＧ−３及びＴＩＭ−３の発現は新鮮ＴＩＬと比較したとき解凍ＴＩＬにおいて低下する。一部の実施形態において、ＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ、ＴＣＲαβ発現に有意な差はない。一部の実施形態において、解凍ＴＩＬと比較したとき新鮮ＴＩＬにおいてＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ、ＴＣＲαβ発現及び／又はメモリーマーカーに有意な差はない。
【０３６６】
[00466]  一部の実施形態において、メモリーマーカーは、ＣＣＲ７及びＣＤ６２Ｌからなる群から選択される。
【０３６７】
[00467]  一部の実施形態において、解凍ＴＩＬと比較したときの新鮮ＴＩＬの生存率は、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９８％である。一部の実施形態において、新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬの両方の生存率が、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超又は９８％超である。一部の実施形態において、新鮮産物及び解凍産物の両方の生存率が、８０％超、８１％超、８２％超、８３％超、８４％超、８５％超、８６％超、８７％超、８８％超、８９％超又は９０％超である。一部の実施形態において、新鮮産物及び解凍産物の両方の生存率が８６％超である。
【０３６８】
[00468]  ある実施形態において、再刺激ＴＩＬは、サイトカイン遊離アッセイを用いてサイトカイン遊離に関しても判定することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは、ＯＫＴ３か又は自己腫瘍消化物との共培養かのいずれかによる刺激に応答したインターフェロン−７（ＩＦＮ−７）分泌に関して判定することができる。例えば、ＯＫＴ３刺激を用いる実施形態では、ＴＩＬを広範に洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水で希釈した０．１又は１．０μｇ／ｍＬのＯＫＴ３をプレコートした９６ウェル平底プレートに０．２ｍＬ  ＣＭ中１×１０５細胞でデュプリケートウェルを調製する。一晩インキュベートした後、上清を回収し、上清中のＩＦＮ−７をＥＬＩＳＡ（Pierce/Endogen、Woburn, MA）によって測定する。共培養アッセイについては、１×１０５個のＴＩＬ細胞を９６ウェルプレートに自己腫瘍細胞と共に置く（１：１の比率）。２４時間のインキュベーション後、上清を回収し、ＩＦＮ−７遊離を例えばＥＬＩＳＡによって定量化することができる。
【０３６９】
[00469]  一部の実施形態において、表現型の特徴付けは、凍結保存後に調べられる。
【０３７０】
Ｊ．拡大培養したＴＩＬの代謝的健康
[00470]  再刺激したＴＩＬは、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は解凍後のＴＩＬのいずれと比較したときも、基礎解糖の有意な亢進によって特徴付けられる。ある実施形態において、第１のＴＩＬ集団、第２のＴＩＬ集団、第３のＴＩＬ集団、回収ＴＩＬ集団及び／又はＣＤ８発現に基づく治療用ＴＩＬ集団の選択は、上記で考察したか又は図２７の例を含むあらゆるステップ中には実施されない。一部の実施形態において、ＣＤ８発現に基づく第１のＴＩＬ集団の選択は実施されない。一部の実施形態において、ＣＤ８発現に基づく第２のＴＩＬ集団の選択は実施されない。一部の実施形態において、ＣＤ８発現に基づく第３のＴＩＬ集団の選択は実施されない。一部の実施形態において、ＣＤ８発現に基づく回収ＴＩＬ集団の選択は実施されない。一部の実施形態において、ＣＤ８発現に基づく治療用ＴＩＬ集団の選択は実施されない。
【０３７１】
[00471]  ある実施形態において、第１のＴＩＬ集団、第２のＴＩＬ集団、第３のＴＩＬ集団又はＣＤ８発現に基づく回収ＴＩＬの選択は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法のステップ（ａ）〜（ｆ）のいずれの間も実施されず、このステップは、
（ａ）患者から得られた腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に加えること；
（ｃ）ＩＬ−２を含む細胞培養培地で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１ガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約３〜１４日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｄ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を入手するために約７〜１４日間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団に対して、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加したサブ集団を含む治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｅ）ステップ（ｄ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生する、回収すること；及び
（ｆ）ステップ（ｅ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放せずに発生する、移すこと
を含む。
【０３７２】
[00472]  ある実施形態において、第１のＴＩＬ集団、第２のＴＩＬ集団、第３のＴＩＬ集団又はＣＤ８発現に基づく回収ＴＩＬの選択は、癌を有する対象の処置を行う方法のステップ（ａ）〜（ｈ）のいずれの間も実施されず、この拡大培養した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を投与することを含む方法は、
（ａ）対象から得られた腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に加えること；
（ｃ）ＩＬ−２を含む細胞培養培地で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約３〜１４日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｄ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を入手するために約７〜１４日間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団に対して、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加したサブ集団を含むＴ細胞治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｅ）ステップ（ｄ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生する、回収すること；及び
（ｆ）ステップ（ｅ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放せずに発生する、移すこと；
（ｇ）凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）からの回収されたＴＩＬ集団を含む輸注バッグを任意選択で凍結保存すること；並びに
（ｈ）ステップ（ｇ）における輸注バッグから治療上有効な投薬量の第３のＴＩＬ集団を患者に投与すること
を含む。
【０３７３】
[00473]  本明細書に記載された方法によって調製されたＴＩＬは、例えば、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して、基礎解糖の有意な差に特徴付けられる。ある実施形態において、第１のＴＩＬ集団、第２のＴＩＬ集団、第３のＴＩＬ集団、回収ＴＩＬ集団及び／又はＣＤ８発現に基づく治療用ＴＩＬ集団の選択は、上記で考察したか又は図２７の例を含むあらゆるステップ中には実施されない。一部の実施形態において、ＣＤ８発現に基づく第１のＴＩＬ集団の選択は実施されない。一部の実施形態において、ＣＤ８発現に基づく第２のＴＩＬ集団の選択は実施されない。一部の実施形態において、ＣＤ８発現に基づく第３のＴＩＬ集団の選択は実施されない。一部の実施形態において、ＣＤ８発現に基づく回収ＴＩＬ集団の選択は実施されない。一部の実施形態において、ＣＤ８発現に基づく治療用ＴＩＬ集団の選択は実施されない。ある実施形態において、第１のＴＩＬ集団、第２のＴＩＬ集団、第３のＴＩＬ集団又はＣＤ８発現に基づく回収ＴＩＬの選択は、ステップ（ａ）〜（ｈ）のいずれの間も実施されない。
【０３７４】
[00474]  本開示の異なる方法で拡大培養したＴＩＬについて、予備呼吸容量（ＳＲＣ）及び解糖予備能を判定することができる。Seahorse XF細胞ミトストレステストは、ミトコンドリアにおける電子伝達鎖の成分を標的にする呼吸調節因子を用いて細胞の酸素消費速度（ＯＣＲ）を直接測定することによりミトコンドリア機能を測定する。試験化合物（オリゴマイシン、ＦＣＣＰ及びロテノンとアンチマイシンＡとの混合物、以下に記載する）を連続的に注入して、それぞれ、ＡＴＰ産生、最大呼吸及び非ミトコンドリア呼吸を測定する。次にこれらのパラメータ及び基礎呼吸を使用してプロトンリーク及び予備呼吸容量を計算する。各調節因子が電子伝達鎖の特異的成分を標的にする。オリゴマイシンはＡＴＰシンターゼ（複合体Ｖ）を阻害し、オリゴマイシン注射後のＯＣＲの低下は、細胞性ＡＴＰ産生に関連するミトコンドリア呼吸と相関する。カルボニルシアニド−４（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）は、プロトン勾配を破綻させてミトコンドリア膜電位を破壊する脱共役剤である。結果として、電子伝達鎖を通じた電子流が抑制されず、複合体ＩＶによって酸素が最大限に消費される。ひいてはＦＣＣＰの刺激を受けたＯＣＲを使用して、最大呼吸と基礎呼吸との差として定義される予備呼吸容量を計算することができる。予備呼吸容量（ＳＲＣ）は、細胞がエネルギー要求の増加に応答する能力の尺度である。第３の注射は、複合体Ｉ阻害薬であるロテノンと、複合体ＩＩＩ阻害薬であるアンチマイシンＡとの混合物である。この組み合わせはミトコンドリア呼吸を遮断し、ミトコンドリア外部の過程によってドライブされる非ミトコンドリア呼吸の計算を可能にする。一部の実施形態において、比較は、例えば、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬに対するものである。
【０３７５】
[00475]  一部の実施形態において、代謝アッセイは基礎呼吸である。一般に、第２の拡大培養ＴＩＬは、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの基礎呼吸速度の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の基礎呼吸速度を有する。一部の実施形態において、基礎呼吸速度は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの基礎呼吸速度の約５０％〜約９９％である。一部の実施形態において、基礎呼吸速度は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの基礎呼吸速度の約６０％〜約９９％である。一部の実施形態において、基礎呼吸速度は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの基礎呼吸速度の約７０％〜約９９％である。一部の実施形態において、基礎呼吸速度は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの基礎呼吸速度の約８０％〜約９９％である。一部の実施形態において、基礎呼吸速度は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの基礎呼吸速度の約９０％〜約９９％である。一部の実施形態において、基礎呼吸速度は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの基礎呼吸速度の約９５％〜約９９％である。一部の実施形態において、第２の拡大培養ＴＩＬ又は第２の追加的な拡大培養ＴＩＬ（例えば、ｒｅＲＥＰ  ＴＩＬと称されるＴＩＬを含め、図２７のステップＤに記載されるものなど）は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの基礎呼吸速度と統計的に有意な差のない基礎呼吸速度を有する。一部の実施形態において、比較は、例えば新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬに対するものである。
【０３７６】
[00476]  一部の実施形態において、代謝アッセイは予備呼吸容量である。一般に、第２の拡大培養ＴＩＬ又は第２の追加的な拡大培養ＴＩＬ（例えば、ｒｅＲＥＰ  ＴＩＬと称されるＴＩＬを含め、図２７のステップＤに記載されるものなど）は、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度及び／又は例えば図２７に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供するもの以外の他の方法を使用して調整したＴＩＬの少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の予備呼吸容量を有する。一部の実施形態において、予備呼吸容量は、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度の約５０％〜約９９％である。一部の実施形態において、予備呼吸容量は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの約５０％〜約９９％の基礎呼吸速度である。一部の実施形態において、予備呼吸容量は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの約６０％〜約９９％の基礎呼吸速度である。一部の実施形態において、予備呼吸容量は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの約７０％〜約９９％の基礎呼吸速度である。一部の実施形態において、予備呼吸容量は、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度の約８０％〜約９９％である。一部の実施形態において、予備呼吸容量は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの約９０％〜約９９％の基礎呼吸速度である。一部の実施形態において、予備呼吸容量は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの約９５％〜約９９％の基礎呼吸速度である。一部の実施形態において、第２の拡大培養ＴＩＬ又は第２の追加的な拡大培養ＴＩＬ（例えば、ｒｅＲＥＰ  ＴＩＬと称されるＴＩＬを含め、図２７のステップＤに記載されるものなど）は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば図２７に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供するもの以外の他の方法を使用して調整したＴＩＬの基礎呼吸速度とは統計的に有意な差を呈しない予備呼吸容量を有する。
【０３７７】
[00477]  一般に、第２の拡大培養ＴＩＬ又は第２の追加的な拡大培養ＴＩＬ（例えば、ｒｅＲＥＰ  ＴＩＬと称されるＴＩＬを含め、図２７のステップＤに記載されるものなど）は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの基礎呼吸速度の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の予備呼吸容量を有する。一部の実施形態において、測定される代謝アッセイは解糖予備能である。一部の実施形態において、代謝アッセイは予備呼吸容量である。細胞（呼吸）代謝を測定するため、細胞をミトコンドリア呼吸及び解糖の阻害薬で処理して、以下の尺度からなるＴＩＬの代謝プロファイルを決定した：ベースライン酸化的リン酸化（ＯＣＲによる測定時）、予備呼吸容量、ベースライン解糖活性（ＥＣＡＲによる測定時）及び解糖予備能。代謝プロファイルは、ミトコンドリアＡＴＰ産生の遮断時に細胞が解糖を遂行する能力を決定することが可能な、Seahorseコンビネーションミトコンドリア／解糖ストレステストアッセイ（Agilent（登録商標）から市販されているキットを含む）を用いて実施した。一部の実施形態において、細胞がグルコース飢餓状態にあり、次にグルコースを注入し、続いてストレス作用剤を注入する。一部の実施形態において、ストレス作用剤は、オリゴマイシン、ＦＣＣＰ、ロテノン、アンチマイシンＡ及び／又は２−デオキシグルコース（２−ＤＧ）並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される。一部の実施形態において、オリゴマイシンは１０ｍＭで加えられる。一部の実施形態において、ＦＣＣＰは１０ｍＭで加えられる。一部の実施形態において、ロテノンは２．５ｍＭで加えられる。一部の実施形態において、アンチマイシンＡは２．５ｍＭで加えられる。一部の実施形態において、２−デオキシグルコース（２−ＤＧ）は５００ｍＭで加えられる。一部の実施形態において、解糖能、解糖予備能及び／又は非解糖酸性化が測定される。一般に、ＴＩＬは、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの基礎呼吸速度の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の解糖予備能を有する。一部の実施形態において、解糖予備能は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの基礎呼吸速度の約５０％〜約９９％である。一部の実施形態において、解糖予備能は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの約６０％〜約９９％の基礎���吸速度である。一部の実施形態において、解糖予備能は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの約７０％〜約９９％の基礎呼吸速度である。一部の実施形態において、解糖予備能は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの約８０％〜約９９％の基礎呼吸速度である。一部の実施形態において、解糖予備能は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの約９０％〜約９９％の基礎呼吸速度である。一部の実施形態において、解糖予備能は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの約９５％〜約９９％の基礎呼吸速度である。
【０３７８】
[00478]  一部の実施形態において、代謝アッセイは基礎解糖である。一部の実施形態において、第２の拡大培養ＴＩＬ又は第２の追加的な拡大培養ＴＩＬ（例えば、ｒｅＲＥＰ  ＴＩＬと称されるＴＩＬを含め、図２７のステップＤに記載されるものなど）は、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度及び／又は例えば図２７に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供するもの以外の他の方法を使用して調整したＴＩＬに比べて少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍又は少なくとも１０倍の基礎解糖の増加を有する。一部の実施形態において、第２の拡大培養ＴＩＬ又は第２の追加的な拡大培養ＴＩＬ（例えば、ｒｅＲＥＰ  ＴＩＬと称されるＴＩＬを含め、図２７のステップＤに記載されるものなど）は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば図２７に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供するもの以外の他の方法を使用して調整したＴＩＬと比べて約２倍〜約１０倍の基礎解糖の増加を有する。一部の実施形態において、第２の拡大培養ＴＩＬ又は第２の追加的な拡大培養ＴＩＬ（例えば、ｒｅＲＥＰ  ＴＩＬと称されるＴＩＬを含め、図２７のステップＤに記載されるものなど）は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば図２７に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供するもの以外の他の方法を使用して調整したＴＩＬと比べて約２倍〜約８倍の基礎解糖の増加を有する。一部の実施形態において、第２の拡大培養ＴＩＬ又は第２の追加的な拡大培養ＴＩＬ（例えば、ｒｅＲＥＰ  ＴＩＬと称されるＴＩＬを含め、図２７のステップＤに記載されるものなど）は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば図２７に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供するもの以外の他の方法を使用して調整したＴＩＬと比べて約３倍〜約７倍の基礎解糖の増加を有する。一部の実施形態において、第２の拡大培養ＴＩＬ又は第２の追加的な拡大培養ＴＩＬ（例えば、ｒｅＲＥＰ  ＴＩＬと称されるＴＩＬを含め、図２７のステップＤに記載されるものなど）は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば図２７に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供するもの以外の他の方法を使用して調整したＴＩＬと比べて約２倍〜約４倍の基礎解糖の増加を有する。一部の実施形態において、第２の拡大培養ＴＩＬ又は第２の追加的な拡大培養ＴＩＬ（例えば、ｒｅＲＥＰ  ＴＩＬと称されるＴＩＬを含め、図２７のステップＤに記載されるものなど）は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば図２７に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供するもの以外の他の方法を使用して調整したＴＩＬと比べて約２倍〜約３倍の基礎解糖の増加を有する。
【０３７９】
[00479]  一般に、第２の拡大培養ＴＩＬ又は第２の追加的な拡大培養ＴＩＬ（例えば、ｒｅＲＥＰ  ＴＩＬと称されるＴＩＬを含め、図２７のステップＤに記載されるものなど）は、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度及び／又は例えば図２７に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供するもの以外の他の方法を使用して調整したＴＩＬの少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の解糖予備能を有する。一部の実施形態において、解糖予備能は、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度の約５０％〜約９９％である。一部の実施形態において、解糖予備能は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの約６０％〜約９９％の基礎呼吸速度である。一部の実施形態において、解糖予備能は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの約７０％〜約９９％の基礎呼吸速度である。一部の実施形態において、解糖予備能は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの約８０％〜約９９％の基礎呼吸速度である。一部の実施形態において、解糖予備能は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬの約９０％〜約９９％の基礎呼吸速度である。一部の実施形態において、解糖予備能は、新鮮に採取したＴＩＬの基礎呼吸速度の約９５％〜約９９％である。
【０３８０】
[00480]  グランザイムＢ産生：グランザイムＢは、ＴＩＬが標的細胞を死滅させる能力の別の尺度である。ＣＤ３、ＣＤ２８及びＣＤ１３７／４−１ＢＢに対する抗体を使用して上記に記載したとおり再刺激した培地上清について、そのグランザイムＢレベルも、Human Granzyme B DuoSet ELISA Kit（R&D Systems、Minneapolis, MN）を製造者の指示に従い使用して評価した。一部の実施形態において、第２の拡大培養ＴＩＬ又は第２の追加的な拡大培養ＴＩＬ（例えば、ｒｅＲＥＰ  ＴＩＬと称されるＴＩＬを含め、図２７のステップＤに記載されるものなど）はグランザイムＢ産生が増加する。一部の実施形態において、第２の拡大培養ＴＩＬ又は第２の追加的な拡大培養ＴＩＬ（例えば、ｒｅＲＥＰ  ＴＩＬと称されるＴＩＬを含め、図２７のステップＤに記載されるものなど）は細胞傷害活性が増加する。
【０３８１】
[00481]  一部の実施形態において、テロメア長は、細胞生存率及び／又は細胞機能の尺度として使用することができる。一部の実施形態において、テロメアは、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して、驚くべきことに、本発明によって作製されたＴＩＬと同一の長さであった。テロメア長の測定：ゲノムＤＮＡ及び細胞学的調製物中のテロメア長を測定するために、様々な方法が使用されてきた。テロメア制限フラグメント（ＴＲＦ）分析は、テロメア長を測定するための究極の判断基準である（de Lange et al., 1990）。ただし、ＴＲＦの主な制限は、大量のＤＮＡ（１．５＾ｇ）を必要とすることである。テロメア長の測定に広く使用されている２つの技術、すなわち蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ；Agilent Technologies、Santa Clara、CA）及び定量的ＰＣＲを本発明で用い得る。一部の実施形態において、ステップＡで初めに回収したＴＩＬと、例えば図２７に提供されたステップＤから拡大培養したＴＩＬとの間でテロメア長に変化はない。
【０３８２】
[00482]  一部の実施形態において、ＴＩＬの健康はＩＦＮ−ガンマ（ＩＦＮ−γ）分泌によって測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γ分泌は活性ＴＩＬの指標である。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γ産生の効力アッセイが用いられる。ＩＦＮ−γ産生は、細胞傷害能のもう１つの尺度である。ＩＦＮ−γ産生は、ＣＤ３、ＣＤ２８及びＣＤ１３７／４−１ＢＢに対する抗体で刺激されたＴＩＬの培地中のサイトカインＩＦＮ−γのレベルを決定することで測定できる。これらの刺激したＴＩＬからの培地中のＩＦＮ−γレベルは、ＩＦＮ−γ遊離を測定することにより決定できる。一部の実施形態において、例えば図２７に示されるステップＡにおける初めに収穫されたＴＩＬに比べて例えば図２７に示されるＴＩＬはステップＤのＩＦＮ−γ産生の増加は、ステップＤのＴＩＬの細胞傷害能の増加の指標である。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γ分泌は１倍、２倍、３倍、４倍又は５倍以上増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γ分泌は１倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γ分泌は２倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γ分泌は３倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γ分泌は４倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γ分泌は５倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γはQuantikine ELISA kitを使用して測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γはＴＩＬエキソビボで測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γは、例えば図２７の方法を含む本発明の方法によって作製されるＴＩＬ並びに例えば図８３（実施例プロセス１ＣのＴＩＬなど）に実施例が提供されているものなど新鮮に採取したＴＩＬ又は他の方法によって作製されるＴＩＬを含む、ＴＩＬエキソビボで測定される。
【０３８３】
[00483]  一部の実施形態において、標的細胞を溶解するＴＩＬの細胞傷害能は、高感度の用量依存的方法でＴＩＬの細胞傷害能を測定するＴＩＬアッセイのための生物発光リダイレクト溶解アッセイ（効力アッセイ）に従って、生物発光細胞株Ｐ８１５（クローンＧ６）とのＴＩＬの共培養アッセイを使用して評価された。
【０３８４】
[00484]  一部の実施形態において、本方法は、上記に記載したとおりの方法を用いた、ＴＩＬ生存率を評価するためのアッセイを含む。一部の実施形態において、ＴＩＬは、例えば図２７に提供されるとおりのものを含め、上記で考察したとおり拡大培養される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、生存率の評価前に凍結保存される。一部の実施形態において、生存率評価は、第１の拡大培養、第２の拡大培養及び追加的な第２の拡大培養の実施前にＴＩＬを解凍することを含む。一部の実施形態において、本方法は、ＴＩＬ集団の細胞増殖、細胞毒性、細胞死及び／又は他の生存率に関連する事項を評価するためのアッセイを提供する。生存率は、上記に記載されるＴＩＬ代謝アッセイのいずれか並びに当技術分野において公知の細胞生存率の評価について公知の任意の方法によって測定することができる。一部の実施形態において、本方法は、図２７に例示されるものを含め、本明細書に記載される方法を用いて拡大培養されたＴＩＬの細胞増殖、細胞毒性、細胞死及び／又は他の生存率に関連する事項を評価するためのアッセイを提供する。
【０３８５】
[00485]  本発明は、ＴＩＬ生存率を決定するためのアッセイ方法も提供する。一部の実施形態において、ＴＩＬは、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して同等の生存率を有する。一部の実施形態において、ＴＩＬは、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して生存率が増加した。本開示は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）をより大きいＴＩＬ集団に拡大培養することによりＴＩＬの生存率をアッセイする方法も提供し、この方法は、
（ｉ）予め拡大培養された第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｉｉ）ＩＬ−２を含む細胞培養培地中で前記第１のＴＩＬ集団を培養することにより第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせること；及び
（ｉｉｉ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも１００倍多く、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を入手するために少なくとも１４日間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団に対して、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加したサブ集団を含み、第３の集団は、生存率に関して更にアッセイされる、生じさせること
を含む。
【０３８６】
[00486]  一部の実施形態において、本方法は、
（ｉｖ）第３のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、追加的なＯＫＴ−３及び追加的なＡＰＣを添加することにより追加的な第２の拡大培養を実施することを更に含み、ここで追加的な第２の拡大培養は、ステップ（ｉｉｉ）で入手されたよりも大きいＴＩＬ集団を入手するため少なくとも１４日間にわたって実施され、より大きいＴＩＬ集団は第３のＴＩＬ集団と比べて増加したエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞サブ集団を含み、第３の集団は生存率に関して更にアッセイされる。
【０３８７】
[00487]  一部の実施形態において、ステップ（ｉ）前に、細胞は凍結保存される。
【０３８８】
[00488]  一部の実施形態において、細胞はステップ（ｉ）の実施前に解凍される。
【０３８９】
[00489]  一部の実施形態において、分析に十分なＴＩＬを入手するため、ステップ（ｉｖ）が１〜４回繰り返される。
【０３９０】
[00490]  一部の実施形態において、ステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）は約４０日〜約５０日の期間内に実施される。
【０３９１】
[00491]  一部の実施形態において、ステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）は約４２日〜約４８日の期間内に実施される。
【０３９２】
[00492]  一部の実施形態において、ステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）は約４２日〜約４５日の期間内に実施される。
【０３９３】
[00493]  一部の実施形態において、ステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）は約４４日以内に実施される。
【０３９４】
[00494]  一部の実施形態において、ステップ（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）からの細胞は、ＣＤ４、ＣＤ８及びＴＣＲαβを新鮮採取細胞と同程度に発現する。
【０３９５】
[00495]  一部の実施形態において、抗原提示細胞は末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。
【０３９６】
[00496]  一部の実施形態において、ＰＢＭＣはステップ（ｉｉｉ）において９〜１７日目のいずれかに細胞培養物に加えられる。
【０３９７】
[00497]  一部の実施形態において、ステップ（ｉｖ）のより大きいＴＩＬ集団中のエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、第３の細胞集団中のエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ２７の発現、ＣＤ２８の発現、より長いテロメア、ＣＤ５７発現の増加及びＣＤ５６発現の減少からなる群から選択される１つ以上の特徴を呈する。
【０３９８】
[00498]  一部の実施形態において、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞はＣＤ５７発現の増加及びＣＤ５６発現の減少を呈する。
【０３９９】
[00499]  一部の実施形態において、ＡＰＣは人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）である。
【０４００】
[00500]  一部の実施形態において、本方法は、高親和性Ｔ細胞受容体をコードする核酸を含む発現ベクターで第１のＴＩＬ集団を形質導入するステップを更に含む。
【０４０１】
[00501]  一部の実施形態において、形質導入ステップはステップ（ｉ）前に行われる。
【０４０２】
[00502]  一部の実施形態において、本方法は、Ｔ細胞シグナル伝達分子の少なくとも１つのエンドドメインに融合した単鎖可変断片抗体を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む発現ベクターで第１のＴＩＬ集団を形質導入するステップを更に含む。
【０４０３】
[00503]  一部の実施形態において、形質導入ステップはステップ（ｉ）前に行われる。
【０４０４】
[00504]  一部の実施形態において、ＴＩＬは生存率に関してアッセイされる。
【０４０５】
[00505]  一部の実施形態において、ＴＩＬは凍結保存後に生存率に関してアッセイされる。
【０４０６】
[00506]  一部の実施形態において、ＴＩＬは凍結保存後及びステップ（ｉｖ）後に生存率に関してアッセイされる。
【０４０７】
[00507]  Ｔ及びＢリンパ球の多様な抗原受容体は、限られているが多数の遺伝子セグメントの体細胞組換えによって産生される。これらの遺伝子セグメントＶ（可変）、Ｄ（多様性）、Ｊ（結合）及びＣ（定数）は、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の結合特異性及び下流側での適用を決定する。本発明は、Ｔ細胞レパートリーの多様性を示し、増加させるＴＩＬを生成する方法を提供する（ポリクローナル性と称されることがある）。一部の実施形態において、Ｔ細胞レパートリーの多様性の増加は、新鮮に採取したＴＩＬ及び／又は例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して生存率が増加した。一部の実施形態において、本方法により得られたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、第１の拡大培養で得られたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、多様性の増加は、免疫グロブリンの多様性及び／又はＴ細胞受容体の多様性の増加である。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン重鎖にある。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン軽鎖にある。一部の実施形態において、多様性はＴ細胞受容体にある。一部の実施形態において、多様性は、アルファ、ベータ、ガンマ及びデルタ受容体からなる群から選択されるＴ細胞受容体の１つにある。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及び／又はベータの発現が増加する。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファの発現が増加する。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベータの発現が増加する。一部の実施形態において、ＴＣＲａｂ（すなわちＴＣＲα／β）の発現が増加する。
【０４０８】
[00508]  本開示によれば、ＴＩＬの生存率をアッセイする方法及び／又は対象への投与における更なる使用。一部の実施形態において、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）をアッセイする方法は、
（ｉ）第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｉｉ）ＩＬ−２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせること；及び
（ｉｉｉ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団より数において少なくとも５０倍多い、生じさせること；
（ｉｖ）第３のＴＩＬ集団を回収、洗浄及び凍結保存すること；
（ｖ）凍結保存ＴＩＬを極低温で貯蔵すること；
（ｖｉ）第３のＴＩＬ集団を解凍して解凍された第３のＴＩＬ集団を提供すること；及び
（ｖｉｉ）第３の集団の細胞培養培地にＩＬ−２、ＯＫＴ−３及びＡＰＣを添加することにより、解凍された第３のＴＩＬ集団の一部の追加的な第２の拡大培養を少なくとも３日の追加的な拡大培養期間（ｒｅＲＥＰ期間と称されることがある）にわたって実施することであって、この第３の拡大培養を実施して第４のＴＩＬ集団を入手し、第４のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数を第３のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と比較して比を求めること；
（ｖｉｉｉ）ステップ（ｖｉｉ）の比に基づき、解凍されたＴＩＬ集団が患者への投与に好適かどうかを決定すること；
（ｉｘ）ステップ（ｖｉｉｉ）において第４のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第３のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数との比が５：１より大きいと決定されるとき、治療上有効な投薬量の解凍された第３のＴＩＬ集団を患者に投与すること
を含む。
【０４０９】
[00509]  一部の実施形態において、追加的な拡大培養期間（ｒｅＲＥＰ期間と称されることがある）は、第４のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第３のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数との比が５０：１より大きくなるまで実施される。
【０４１０】
[00510]  一部の実施形態において、治療上有効な投薬量となるのに十分なＴＩＬの数は約２．３×１０１０〜約１３．７×１０１０個である。
【０４１１】
[00511]  一部の実施形態において、ステップ（ｉ）〜（ｖｉｉ）は約４０日〜約５０日の期間内に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ｉ）〜（ｖｉｉ）は約４２日〜約４８日の期間内に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ｉ）〜（ｖｉｉ）は約４２日〜約４５日の期間内に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ｉ）〜（ｖｉｉ）は約４４日以内に実施される。
【０４１２】
[00512]  一部の実施形態において、ステップ（ｉｉｉ）又は（ｖｉｉ）からの細胞は、ＣＤ４、ＣＤ８及びＴＣＲαβを新鮮採取細胞と同程度に発現する。一部の実施形態において細胞はＴＩＬである。
【０４１３】
[00513]  一部の実施形態において、抗原提示細胞は末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。一部の実施形態において、ＰＢＭＣはステップ（ｉｉｉ）において９〜１７日目のいずれかに細胞培養物に加えられる。
【０４１４】
[00514]  一部の実施形態において、ステップ（ｉｉｉ）又は（ｖｉｉ）のより大きいＴＩＬ集団中のエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、第３の細胞集団中のエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ２７の発現、ＣＤ２８の発現、より長いテロメア、ＣＤ５７発現の増加及びＣＤ５６発現の減少からなる群から選択される１つ以上の特徴を呈する。
【０４１５】
[00515]  一部の実施形態において、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞はＣＤ５７発現の増加及びＣＤ５６発現の減少を呈する。
【０４１６】
[00516]  一部の実施形態において、ＡＰＣは人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）である。
【０４１７】
[00517]  一部の実施形態において、高親和性Ｔ細胞受容体をコードする核酸を含む発現ベクターで第１のＴＩＬ集団を形質導入するステップ。
【０４１８】
[00518]  一部の実施形態において、形質導入ステップはステップ（ｉ）前に行われる。
【０４１９】
[00519]  一部の実施形態において、Ｔ細胞シグナル伝達分子の少なくとも１つのエンドドメインに融合した単鎖可変断片抗体を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む発現ベクターで第１のＴＩＬ集団を形質導入するステップ。
【０４２０】
[00520]  一部の実施形態において、形質導入ステップはステップ（ｉ）前に行われる。
【０４２１】
[00521]  一部の実施形態において、ＴＩＬはステップ（ｖｉｉ）後に生存率に関してアッセイされる。
【０４２２】
[00522]  本開示は、更なるＴＩＬのアッセイ方法も提供する。一部の実施形態において、本開示は、ＴＩＬのアッセイ方法を提供し、この方法は、
（ｉ）第１の凍結保存ＴＩＬ集団の一部を得ること；
（ｉｉ）第１の凍結保存ＴＩＬ集団の一部を解凍すること；
（ｉｉｉ）ＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団の一部を少なくとも３日の追加的な拡大培養期間（（ｒｅＲＥＰ期間と称されることがある）にわたって培養することにより第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１のＴＩＬ集団からの一部を第２のＴＩＬ集団と比較してＴＩＬ数の比を求め、第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第１のＴＩＬ集団の一部のＴＩＬ数との比が５：１より大きい、生じさせること；
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の比に基づき、第１のＴＩＬ集団が患者への治療的投与における使用に好適かどうかを決定すること；
（ｖ）ステップ（ｉｖ）において第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第１のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数との比が５：１より大きいと決定されるとき、第１のＴＩＬ集団が治療的投与における使用に好適であると決定すること
を含む。
【０４２３】
[00523]  一部の実施形態において、第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第１のＴＩＬ集団の一部のＴＩＬ数との比は５０：１より大きい。
【０４２４】
[00524]  一部の実施形態において、本方法は、本明細書に提供される任意の実施形態に記載されるとおりの方法によりステップ（ｉ）からの第１の凍結保存ＴＩＬ集団全体の拡大培養を実施することを更に含む。
【０４２５】
[00525]  一部の実施形態において、本方法は、ステップ（ｉ）からの第１の凍結保存ＴＩＬ集団全体を患者に投与することを更に含む。
【０４２６】
Ｋ．ＴＩＬ製造用閉鎖系
[00526]  本発明は、ＴＩＬ培養プロセス中の閉鎖系の使用を提供する。かかる閉鎖系は、微生物汚染の防止及び／又は削減を可能にし、使用するフラスコの数が少なくなり、コスト削減が可能となる。一部の実施形態において、閉鎖系は２つの容器を使用する。
【０４２７】
[00527]  かかる閉鎖系は、当技術分野で公知であり、例えば、http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm及びhttps://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Blood/ucm076779.htm.に記載されている。
【０４２８】
[00528]  一部の実施形態において、閉鎖系は、例えば実施例３０に記載されるようなルアーロック及びヒートシール系を含む。一部の実施形態において、系の無菌性及び閉鎖性を維持するために、閉鎖系は滅菌条件下でシリンジを介してアクセスされる。一部の実施形態において、実施例３０に記載されるような閉鎖系が使用される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、セクション８．１４「最終製剤及び充填」の実施例３０に記載される方法に従って最終製品製剤容器中に製剤化される。
【０４２９】
[00529]  ＦＤＡのウェブサイトで提供されているように、滅菌方法を備えた閉鎖系は公知であり、詳細に記載されている。https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Blood/ucm076779.htmを参照のこと。上記で参照され、以下の関連箇所にて提供されている。
【０４３０】
序論
[00530]  滅菌接続装置（ＳＴＣＤ）は、互換性のある２つの配管間に滅菌溶接を産生する。この手順により、様々な直径の容器及びチューブを滅菌接続できる。このガイダンスでは、これらの装置の使用に関する推奨管理基準と手順について記載する。このガイダンスは、滅菌接続装置の製造業者がマーケティングの承認又は認可を得るためにＦＤＡに提出しなければならないデータ又は情報は取り扱っていない。また、表示方法において許可されていない目的で承認又は認可された滅菌接続装置を使用すると、米連邦食品医薬品化粧品法下で、装置が粗悪品及び不正表示品と見なされる可能性があることに注意することも重要である。
【０４３１】
１．ＦＤＡ推奨事項
[00531]  ＦＤＡ認可のＳＴＣＤを日常的に使用することを提案する血液製剤の製造業者は、各血液製剤の標準操作手順（ＳＯＰ）マニュアルに、かかる使用に関する情報を組み込む必要がある。これらの記載には、記録管理、製品追跡、チューブ溶接品質管理、ソフトウェア及び使い捨て用品のロット番号（追加する要素の販売業者を含む）が含まれていなければならない。品質管理手順には、各溶接の完全性試験を含めなくてはならない。
【０４３２】
２．ＳＴＣＤの適用
[00532]  ユーザは、装置の使用により、安全性と有効性が実証されていない規制製品の新製品を作成したり、構成を大幅に変更したりする可能性があることに注意する必要がある。ライセンスの対象となる「新製品」については、ＳＯＰの提出に加え、申請書又は申請書の補足資料をＦＤＡに提出する必要がある。一般に、細胞組成を含むプーリング又は混合は、ライセンス適用又は適用の追加的な提出及び承認を必要とする製品の変更を表す。かかる適用及び適用の追加には、「新製品」が提案された日付の期間全体にわたって意図された使用に対して安全且つ効果的であることを実証するデータ及び製造手順の説明を含める必要がある。
【０４３３】
[00533]  以下の論評は、ＦＤＡが認可又は承認したＳＴＣＤのより一般的な使用に関するガイダンスとして提供されている。
【０４３４】
Ｌ．血液採血セットへの新しい針又は小さい針の追加
[00534]  手順の開始前にＳＴＣＤを使用して針を追加すること（全血液採取、血小板フェレーシス又は元血漿採取）は、機能的に閉鎖系を開放するものとは見なされない。手順中に針を追加する場合、液体充填チューブの溶接が承認されているＳＴＣＤのみを使用する必要がある。溶接の完全性試験を満たす場合、ＳＴＣＤの使用は機能的に閉鎖系を開放するものとは見なされない。
【０４３５】
[00535]  血小板、開放系で調製されたフェレーシスには２４時間の期限が表示され、機能的閉鎖系で調製された血小板、フェレーシス製品には５日間の期限が表示される必要がある（Revised Guideline for Collection of Platelets, Pheresis, October 7, 1988を参照のこと）。
【０４３６】
[00536]  追加されたチューブと針の販売業者と仕様は、血液センターのＳＯＰと記録に記載する必要がある。針を追加するためのＳＴＣＤの使用は、認可された施設が事前承認を必要とする製造の大きい変化を表すものではない。
【０４３７】
Ｍ．成分の調製のためのＳＴＣＤの使用
[00537]  ＳＴＣＤを使用して追加する成分調製バッグを取り付ける場合、移送パックの販売業者を特定し、血液ユニット番号とＡＢＯ／Ｒｈの適切な検証を識別する記録を適切に維持する必要がある。全ての血液及び血液成分に適切な表示をする必要がある（21 CFR 606.121）。
例：
・新鮮凍結血漿からクリオプレシピテート抗血友病因子を産生するため、４枚目のバッグを全血採取トリプルパックに追加する。
・赤血球ユニットへの添加剤溶液の接続。
・成分の製造での使用のためにＦＤＡで認可されたインラインフィルターの追加。
・血小板フェレーシスハーネスへの第３の保管容器の追加。
・上記の用途では、手順を作成して記録を保持する必要があるが、手順を決めるために使用権者がＦＤＡの承認を得る必要はない。
【０４３８】
１．血液製剤をプールするためのＳＴＣＤの使用
[00538]  全血採取から調製された血小板をプールするためにＳＴＣＤを適切に使用することにより、一般的に使用されるスパイク及びポートの入り口からの潜在的な汚染を取り除くことができる。輸血の直前実施されるプーリングは、かかる適切な使用の例である。プールされた血小板は、プール後４時間以内に投与しなくてはならない（21 CFR 606.122(l)(2)を参照）。
【０４３９】
[00539]  ただし、プーリング及びその後の保管は、無作為のドナーユニットの管理と比較してリスクを高める可能性があり、ある汚染されたユニットが投与前に他のユニットと共にプールされ、貯蔵される場合、投与される総細菌接種量は、追加量における複製の結果として増加する可能性がある。したがって、血小板を、４時間を超えてプール及び貯蔵するためのＳＴＣＤの推奨使用は、かかるプーリングがリスク増加と関連しているか否かを十分に解決するデータによって裏付けられるべきである。
【０４４０】
[00540]  かかる血小板のプーリングは、新製品の製造を構成する。
【０４４１】
[00541]  血小板を含むプーリング又は混合は、保管期間が４時間を超える場合、新製品の製造と見なされ、ライセンス申請又は申請補足資料の提出と承認が必要となる。
【０４４２】
２．小児用の使用及び分割ユニット用のアリコートを調製するためのＳＴＣＤの使用
[00542]  ＳＴＣＤを使用して調製された全血、赤血球、新鮮凍結血漿の小児用ユニット及び分割ユニットは、以下の条件を満たす場合、生物製剤承認申請（ＢＬＡ）の補足資料が必要な新製品とは見なさない。
製造業者は、使用する各抗凝固剤の承認を含む、元の（すなわち分割されていない）製品について、承認された生物製剤承認又は追加ライセンスを有している必要がある。
表示は、配布前に確認及び承認のために提出する必要がある。表記は、FDA Form 2567、Transmittal of Labels and Circularsの所見欄に基づいて行う必要がある。
準備中の成分の保管が承認された最終産物容器を使用する必要がある。
【０４４３】
[00543]  認可を受けて製造された血小板には、少なくとも５．５×（１０）１０個の血小板が含まれていなくてはならない（21 CFR 640.24(c)）。免許で製造された血小板、フェレーシスには、少なくとも３．０×（１０）１１の血小板が含まれていなくてはならない（Revised Guideline for the Collection of Platelets, Pheresis, October 7, 1988を参照）。
【０４４４】
[00544]  ＳＴＣＤを使用して全血採取及び自動化されたヘマフェレーシス手順によって調製された血漿及び血小板から分割された製品を調製する場合に従うべき手順には、以下の説明を含める必要がある。
・ＦＤＡが認可したＳＴＣＤでアフェレーシスハーネス又は収集容器を改良する方法。
・スプリット血漿又は全血製剤の最小量。
・スプリット血小板フェレーシス製剤の容積及び血小板濃度。
・製剤の保管時間。製剤は承認された容器に入れ、かかる容器の表示に記載されている保管時間に合わせる必要がある。
・血液センターの記録において分割された製品に表示を付けて追跡するために使用する方法。
【０４４５】
[00545]  注記：アリコートの表示手順は、必要に応じて、全ての成分の追跡及び不良品回収を許可するのに十分な手順記帳に明確に記載する必要がある。
【０４４６】
３．自動化された血漿交換手順中の追加的なの生理食塩水ライン又は抗凝固剤ラインの接続のためのＳＴＣＤの使用
[00546]  手順を作成して機器製造業者の使用指示に従って記録を保持する必要があるが、手順を決めるために使用権者がＦＤＡの承認を得る必要はない。
【０４４７】
４．処理液の取り付けのためのＳＴＣＤの使用
[00547]  ＳＴＣＤを使用して、洗浄液又は凍結赤血球製剤に処理液の入った容器を取り付ける場合、得られた産物の定められた期日期間は２４時間であるが、より長い期間をサポートするＣＢＥＲへの承認申請書又は申請補足資料の書式で提供される場合に限る（21 CFR 610.53(c)）。免除又は変更は、ＣＢＥＲセンター長から書面で承認されなければならない（21 CFR 610.53(d)）。
【０４４８】
５．ＦＤＡ認可済み白血球除去フィルターを追加するためのＳＴＣＤの使用
[00548]  一部の白血球除去フィルターは、全血採取系に一体的に取り付けられていない。保管前ろ過にＳＴＣＤを使用する手順は、フィルター製造業者の使用指示に従わなくてはならない。
【０４４９】
[00549]  交付前に白血球が減少した場合、製造上の重要な変化と見なされる。したがって、ＳＴＣＤを使用して調製された新しい白血球削減製品の場合、製造業者は生物製剤承認申請（21 CFR 601.2）又は事前承認申請補足資料をＦＤＡ（21 CFR 601.12）に提出する必要がある。
【０４５０】
[00550]  血液製剤容器から試験用試料を取り出すためのＳＴＣＤの使用（例えば、血小板又は血小板の容器から血小板の試料を取り出すためのＳＴＣＤの使用、交差適合用のフェレーシスなど）。
【０４５１】
[00551]  試料回収後の産物の容積及び／又は細胞数が元の表示又は情報の回状に記載されているものと異なる場合、製剤の表示は新しい容積及び／又は細胞数を反映すべく修正しなくてはならない。例えば、血小板１単位中の血小板数を５．５×（１０）１０未満に減少させる試料は取り出してはならない（21 CFR 640.24 (c)）。
【０４５２】
６．ＦＤＡガイダンスからの追加情報
[00552]  ＳＴＣＤガイダンスでは、一般的なガイダンスに加え、ＳＴＣＤ使用を申し入れるＦＤＡへの申請書及び申請補足資料の提出のための仕様に関する具体的な情報及び例を示す。ＳＴＣＤの適切な使用に関して更なる疑問が生じた場合、ＦＤＡ生物製剤評価センター血液研究・審査課まで質問すること。
【０４５３】
[00553]  一部の実施形態において、閉鎖系は、腫瘍断片が得られた時点からＴＩＬが患者への投与又は凍結保存の準備が整うまで１つの容器を使用する。一部の実施形態において、２つの容器が使用される場合、第１の容器は閉鎖型Ｇコンテナであり、ＴＩＬ集団は遠心され、第１の閉鎖型Ｇコンテナを開放せずに輸注バッグに移される。一部の実施形態において、２つの容器が使用される場合、輸注バッグは、HypoThermosol含有輸注バッグである。閉鎖系又は閉鎖ＴＩＬ細胞培養系は、腫瘍試料及び／又は腫瘍断片が追加されると、系が外側からしっかりと密閉され、細菌、真菌及び／又は他の微生物汚染がない閉鎖環境を形成する。
【０４５４】
[00554]  一部の実施形態において、微生物汚染の減少は約５％〜約１００％である。一部の実施形態において、微生物汚染の減少は約５％〜約９５％である。一部の実施形態において、微生物汚染の減少は約５％〜約９０％である。一部の実施形態において、微生物汚染の減少は約１０％〜約９０％である。一部の実施形態において、微生物汚染の減少は約１５％〜約８５％である。一部の実施形態において、微生物汚染の減少は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、約９９％又は約１００％である。
【０４５５】
[00555]  閉鎖系は、微生物汚染の不在下及び／又は大幅に減少させＴＩＬを成長させる。
【０４５６】
[00556]  更に、ＴＩＬ細胞培養環境のｐＨ、二酸化炭素分圧及び酸素分圧は、細胞が培養されるにつれてそれぞれ変化する。したがって、たとえ細胞培養に適した培地が流通していても、ＴＩＬ成長に最適な環境として閉鎖環境を常に維持する必要がある。このため、閉鎖環境の培養液内のｐＨ、二酸化炭素分圧及び酸素分圧の物理的要因は、センサーによって監視され、そのセンサーの信号は、培養環境の入口に設置されたガス交換器の制御に使用され、閉鎖環境のガス分圧は、細胞培養環境を最適化するため、培養液の変化に従ってリアルタイムで調整されることが望ましい。一部の実施形態において、本発明は、閉鎖環境への入口に、閉鎖環境のｐＨ、二酸化炭素分圧及び酸素分圧を測定し、監視装置からの信号に基づいてガス濃度を自動的に調整することにより、細胞培養環境を最適化する監視装置を備えたガス交換器を一体化した閉鎖細胞培養系を提供する。
【０４５７】
[00557]  一部の実施形態において、閉鎖環境内の圧力は連続的又は断続的に制御される。すなわち、閉鎖環境内の圧力は、例えば、圧力維持装置によって変化させることができ、すなわち空間が、陽圧状態のＴＩＬの成長に適していることを保証するか又は陰圧状態の流体の滲出を促進し、ひいては、細胞成長を促進することを確実にする。更に、断続的に負圧を加えることにより、閉鎖環境の容積の一時的な収縮によって閉鎖環境内の循環液を均一且つ効率的に交換することが可能である。
【０４５８】
[00558]  一部の実施形態において、ＴＩＬの成長に最適な培養成分を置換又は追加することができ、ＩＬ−２及び／又はＯＫＴ３などの要因並びに組み合わせを追加し得る。
【０４５９】
Ｃ．細胞培養
[00559]  ある実施形態において、ＴＩＬの拡大培養方法は、上記で考察され図２７で例示されているものを含み、約５，０００ｍＬ〜約２５，０００ｍＬの細胞培地、約５，０００ｍＬ〜約１０，０００ｍＬの細胞培地又は約５，８００ｍＬ〜約８，７００ｍＬの細胞培地を使用することを含み得る。一部の実施形態において、培地は、例えば、実施例２１に記載されるように、無血清培地である。一部の実施形態において、第１の拡大培養の培地は無血清である。一部の実施形態において、第２の拡大培養の培地は無血清である。一部の実施形態において、第１及び第２の拡大培養の培地は双方とも無血清である。ある実施形態において、ＴＩＬ数の拡大には１種類以下の細胞培養培地が使用される。任意の好適な細胞培養培地、例えば、AIM-V細胞培地（Ｌ−グルタミン、５０μＭ硫酸ストレプトマイシン及び１０μＭ硫酸ゲンタマイシン）細胞培養培地（Invitrogen、Carlsbad CA）を使用し得る。この点に関して、本発明の方法では有利には、ＴＩＬ数の拡大に必要な培地の量及び培地の種類の数が減少する。ある実施形態において、ＴＩＬ数の拡大は、３日又は４日に１回以下の頻度で細胞をフィードすることを含み得る。ガス透過性容器内で細胞の数を拡大すると、細胞の拡大培養に必要なフィーディング頻度が減少することにより細胞の数の拡大に必要な手順が簡便になる。
【０４６０】
[00560]  ある実施形態において、第１及び／又は第２のガス透過性容器内の細胞培地はろ過されていない。ろ過されていない細胞培地を使用すると、細胞の数の拡大に必要な手順が簡便になり得る。ある実施形態において、第１及び／又は第２のガス透過性容器内の細胞培地はβ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）を含まない。
【０４６１】
[00561]  ある実施形態において、哺乳類から腫瘍組織試料を入手すること；細胞培地が中に入った第１のガス透過性容器内で腫瘍組織試料を培養すること；腫瘍組織試料からＴＩＬを入手すること；細胞培地を含有する第２のガス透過性容器内でＴＩＬ数を約７〜１４日間、例えば約１１日間拡大することを含む本方法の所要期間。一部の実施形態において、プレＲＥＰは約７〜１４日間、例えば、約１１日間である。一部の実施形態において、ＲＥＰは約７〜１４日間、例えば、約１１日間である。
【０４６２】
[00562]  ある実施形態において、ＴＩＬはガス透過性容器内で拡大培養される。ガス透過性容器は、米国特許出願公開第２００５／０１０６７１７  Ａ１号（この開示は参照により本明細書に援用される）に記載されるものを含め、当技術分野において公知の方法、組成物及び装置を用いたＰＢＭＣを使用したＴＩＬの拡大培養に用いられている。ある実施形態において、ＴＩＬはガス透過性バッグ内で拡大培養される。ある実施形態において、ＴＩＬは、Xuri Cell Expansion System W25（GE Healthcare）など、ガス透過性バッグ内でＴＩＬを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。ある実施形態において、ＴＩＬは、Xuri Cell Expansion System W5（GE Healthcare）としても知られるWAVE Bioreactor Systemなど、ガス透過性バッグ内でＴＩＬを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。ある実施形態において、細胞拡大培養システムは、約１００ｍＬ、約２００ｍＬ、約３００ｍＬ、約４００ｍＬ、約５００ｍＬ、約６００ｍＬ、約７００ｍＬ、約８００ｍＬ、約９００ｍＬ、約１Ｌ、約２Ｌ、約３Ｌ、約４Ｌ、約５Ｌ、約６Ｌ、約７Ｌ、約８Ｌ、約９Ｌ及び約１０Ｌからなる群から選択される容積を有するガス透過性細胞バッグを含む。
【０４６３】
[00563]  ある実施形態において、ＴＩＬはG-Rexフラスコ（Wilson Wolf Manufacturingから市販されている）において拡大培養することができる。かかる実施形態は、細胞集団を約５×１０５細胞／ｃｍ２から１０×１０６〜３０×１０６細胞／ｃｍ２へと拡大培養することを可能にする。一実施形態では、これはフィーディングを伴わない。ある実施形態において、これは、G-Rexフラスコ内に約１０ｃｍの高さの培地がある限りフィーディングなしである。ある実施形態において、これにフィーディングはないが、１つ以上のサイトカインが加えられる。ある実施形態において、サイトカインは、サイトカインを培地と混合する必要は一切なしにボーラスとして加えることができる。かかる容器、装置及び方法は当技術分野において公知で、ＴＩＬの拡大培養に用いられており、米国特許出願公開第２０１４／０３７７７３９Ａ１号、国際公開第２０１４／２１００３６  Ａ１号、米国特許出願公開第２０１３／０１１５６１７  Ａ１号、国際公開第２０１３／１８８４２７  Ａ１号、米国特許出願公開第２０１１／０１３６２２８  Ａ１号、米国特許第８，８０９，０５０  Ｂ２号、国際公開第２０１１／０７２０８８  Ａ２号、米国特許出願公開第２０１６／０２０８２１６  Ａ１号、米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３  Ａ１号、国際公開第２０１２／１２９２０１  Ａ１号、米国特許出願公開第２０１３／０１０２０７５  Ａ１号、米国特許第８，９５６，８６０  Ｂ２号、国際公開第２０１３／１７３８３５  Ａ１号、米国特許出願公開第２０１５／０１７５９６６  Ａ１号（これらの開示は参照により本明細書に援用される）に記載されるものが含まれる。かかるプロセスは、Jin et al., J.Immunotherapy, 2012, 35:283-292にも記載されている。
【０４６４】
Ｄ．任意選択のＴＩＬ遺伝子改変
[00564]  一部の実施形態において、ＴＩＬは任意選択で、限定はされないが、高親和性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、ＭＡＧＥ−１、ＨＥＲ２若しくはＮＹ−ＥＳＯ−１などの腫瘍関連抗原を標的とするＴＣＲ又は腫瘍関連細胞表面分子（例えばメソテリン）若しくは系統限定的細胞表面分子（例えばＣＤ１９）に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含め、追加的な機能性を含むように遺伝子改変される。
【０４６５】
Ｅ．任意選択のＴＩＬ凍結保存
[00565]  バルクＴＩＬ集団又はＴＩＬの拡大培養集団のいずれかを、必要に応じて凍結保存できる。一部の実施形態において、治療用ＴＩＬ集団で凍結保存が行われる。一部の実施形態において、凍結保存は、第２の拡大培養後に回収したＴＩＬで生じる。一部の実施形態において、図２７の例示的ステップＦのＴＩＬで凍結保存が行われる。一部の実施形態において、ＴＩＬは輸注バッグ中に凍結保存される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、輸注バッグでの置換前に凍結保存される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、凍結保存されるが輸注バッグ中には置かれない。一部の実施形態において、凍結保存は凍結保存培地を使用して実施される。一部の実施形態において、凍結保存培地は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する。これは、概して、凍結溶液、例えば８５％補体不活性化ＡＢ血清及び１５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の中にＴＩＬ集団を入れることにより達成される。この溶液中の細胞を極低温バイアルに入れ、−８０℃で２４時間貯蔵し、任意選択で凍結保存のため気体窒素フリーザーに移す。Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986を参照のこと。
【０４６６】
[00566]  適切な場合、細胞をフリーザーから取り出し、３７℃の水浴中で溶液の約５分の４が解凍されるまで解凍する。細胞は概して完全培地中に再懸濁され、任意選択で１回以上洗浄される。一部の実施形態では、当技術分野において公知のとおり解凍ＴＩＬをカウントし、生存率に関して評価することができる。
【０４６７】
[00567]  好ましい実施形態において、ＴＩＬの集団はCS10凍結保存培地（CryoStor 10、BioLife Solutions）を用いて凍結保存される。好ましい実施形態において、ＴＩＬの集団は凍結保存培地（ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する）を用いて凍結保存される。好ましい実施形態において、ＴＩＬの集団は、１：１（容積：容積）の比のCS10及び細胞培養培地を用いて凍結保存される。好ましい実施形態において、ＴＩＬの集団は、約１：１（容積：容積）の比のCS10及び細胞培養培地を使用し、更に追加的なＩＬ−２を含んで凍結保存される。
【０４６８】
[00568]  上記でステップＡ〜Ｅにおいて考察したとおり、ＴＩＬ拡大培養プロセス全体を通じて数々の時点で凍結保存を行うことができる。一部の実施形態において、ステップＢに係る第１の拡大培養後のバルクＴＩＬ集団又はステップＤに係る１回以上の第２の拡大培養後の拡大培養ＴＩＬ集団が凍結保存され得る。凍結保存は、概して、凍結溶液、例えば８５％補体不活性化ＡＢ血清及び１５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の中にＴＩＬ集団を置くことにより達成し得る。この溶液中の細胞を極低温バイアルに入れ、−８０℃で２４時間貯蔵し、任意選択で凍結保存のため気体窒素フリーザーに移す。Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986を参照のこと。
【０４６９】
[00569]  適切な場合、細胞をフリーザーから取り出し、３７℃の水浴中で溶液の約５分の４が解凍されるまで解凍する。細胞は概して完全培地中に再懸濁され、任意選択で１回以上洗浄される。一部の実施形態では、当技術分野において公知のとおり解凍ＴＩＬをカウントし、生存率に関して評価することができる。
【０４７０】
[00570]  ある場合には、ステップＢのＴＩＬ集団は、以下で考察するプロトコルを用いて直ちに凍結保存することができる。代わりに、バルクＴＩＬ集団にステップＣ及びステップＤを施し、ステップＤ後に凍結保存することができる。同様に、遺伝子修飾ＴＩＬを治療に使用する場合、ステップＢ又はステップＤのＴＩＬ集団は、適切な処置のため遺伝子修飾の対象となり得る。
【０４７１】
Ｆ．任意選択の細胞生存率分析
[00571]  任意選択で、第１の拡大培養（初めのバルク拡大培養と称されることがある）後、当技術分野において公知の標準アッセイを用いて細胞生存率アッセイを実施することができる。例えば、バルクＴＩＬの試料に対してトリパンブルー色素排除アッセイを行うことができ、これは死細胞を選択的に標識して生存率の評価を可能にするものである。生存率の試験に用いられる他のアッセイとしては、限定はされないが、アラマーブルーアッセイ；及びＭＴＴアッセイを挙げることができる。
【０４７２】
１．細胞数、生存率、フローサイトメトリー
[00572]  一部の実施形態において、細胞数及び／又は生存率が測定される。限定はされないが、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８及びＣＤ５６などのマーカー並びに本明細書に開示又は記載される任意の他のものの発現を抗体によるフローサイトメトリー、例えば限定はされないが、FACSCanto（商標）フローサイトメーター（BD Biosciences）を使用してBD Bio-sciences（BD Biosciences、San Jose, CA）から市販されているものによって測定することができる。細胞は、ディスポーザブルc-chip血球計算盤（VWR、Batavia, IL）を使用して手動でカウントすることができ、生存率は、限定はされないがトリパンブルー染色を含め、当技術分野において公知の任意の方法を用いて評価することができる。
【０４７３】
[00573]  ある場合には、バルクＴＩＬ集団は、以下で考察するプロトコルを用いて直ちに凍結保存することができる。代わりに、バルクＴＩＬ集団は、以下で考察するとおり、ＲＥＰに供され、次に凍結保存され得る。同様に、療法において遺伝子修飾ＴＩＬが使用されることになる場合、バルク又はＲＥＰ  ＴＩＬ集団を好適な処置のための遺伝子修飾に供し得る。
【０４７４】
２．細胞培養
[00574]  ある実施形態において、ＴＩＬの拡大培養方法は、約５，０００ｍＬ〜約２５，０００ｍＬの細胞培地、約５，０００ｍＬ〜約１０，０００ｍＬの細胞培地又は約５，８００ｍＬ〜約８，７００ｍＬの細胞培地を使用することを含み得る。ある実施形態において、ＴＩＬ数の拡大には１種類以下の細胞培養培地が使用される。任意の好適な細胞培養培地、例えば、AIM-V細胞培地（Ｌ−グルタミン、５０μＭ硫酸ストレプトマイシン及び１０μＭ硫酸ゲンタマイシン）細胞培養培地（Invitrogen、Carlsbad CA）を使用し得る。この点に関して、本発明の方法では有利には、ＴＩＬ数の拡大に必要な培地の量及び培地の種類の数が減少する。ある実施形態において、ＴＩＬ数の拡大は、３日又は４日に１回以下の頻度で細胞をフィードすることを含み得る。ガス透過性容器内で細胞の数を拡大すると、細胞の拡大培養に必要なフィーディング頻度が減少することにより細胞の数の拡大に必要な手順が簡便になる。
【０４７５】
[00575]  ある実施形態において、第１及び／又は第２のガス透過性容器内の細胞培地はろ過されていない。ろ過されていない細胞培地を使用すると、細胞の数の拡大に必要な手順が簡便になり得る。ある実施形態において、第１及び／又は第２のガス透過性容器内の細胞培地はβ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）を含まない。
【０４７６】
[00576]  ある実施形態において、哺乳類から腫瘍組織試料を入手すること；細胞培地が中に入った第１のガス透過性容器内で腫瘍組織試料を培養すること；腫瘍組織試料からＴＩＬを入手すること；ａＡＰＣを使用して細胞培地が中に入った第２のガス透過性容器内でＴＩＬ数を約１４〜約４２日間、例えば約２８日間拡大することを含む本方法の所要期間。
【０４７７】
[00577]  ある実施形態において、ＴＩＬはガス透過性容器内で拡大培養される。ガス透過性容器は、米国特許出願公開第２００５／０１０６７１７  Ａ１号（この開示は参照により本明細書に援用される）に記載されるものを含め、当技術分野において公知の方法、組成物及び装置を用いたＰＢＭＣを使用したＴＩＬの拡大培養に用いられている。ある実施形態において、ＴＩＬはガス透過性バッグ内で拡大培養される。ある実施形態において、ＴＩＬは、Xuri Cell Expansion System W25（GE Healthcare）など、ガス透過性バッグ内でＴＩＬを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。ある実施形態において、ＴＩＬは、Xuri Cell Expansion System W5（GE Healthcare）としても知られるWAVE Bioreactor Systemなど、ガス透過性バッグ内でＴＩＬを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。ある実施形態において、細胞拡大培養システムは、約１００ｍＬ、約２００ｍＬ、約３００ｍＬ、約４００ｍＬ、約５００ｍＬ、約６００ｍＬ、約７００ｍＬ、約８００ｍＬ、約９００ｍＬ、約１Ｌ、約２Ｌ、約３Ｌ、約４Ｌ、約５Ｌ、約６Ｌ、約７Ｌ、約８Ｌ、約９Ｌ及び約１０Ｌからなる群から選択される容積を有するガス透過性細胞バッグを含む。
【０４７８】
[00578]  ある実施形態において、ＴＩＬはG-Rexフラスコ（Wilson Wolf Manufacturingから市販されている）において拡大培養することができる。かかる実施形態は、細胞集団を約５×１０５細胞／ｃｍ２から１０×１０６〜３０×１０６細胞／ｃｍ２へと拡大培養することを可能にする。一実施形態では、これはフィーディングを伴わない。ある実施形態において、これは、G-Rexフラスコ内に約１０ｃｍの高さの培地がある限りフィーディングなしである。ある実施形態において、これにフィーディングはないが、１つ以上のサイトカインが加えられる。ある実施形態において、サイトカインは、サイトカインを培地と混合する必要は一切なしにボーラスとして加えることができる。かかる容器、装置及び方法は当技術分野において公知で、ＴＩＬの拡大培養に用いられており、米国特許出願公開第２０１４／０３７７７３９Ａ１号、国際公開第２０１４／２１００３６  Ａ１号、米国特許出願公開第２０１３／０１１５６１７  Ａ１号、国際公開第２０１３／１８８４２７  Ａ１号、米国特許出願公開第２０１１／０１３６２２８  Ａ１号、米国特許第８，８０９，０５０  Ｂ２号、国際公開第２０１１／０７２０８８  Ａ２号、米国特許出願公開第２０１６／０２０８２１６  Ａ１号、米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３  Ａ１号、国際公開第２０１２／１２９２０１  Ａ１号、米国特許出願公開第２０１３／０１０２０７５  Ａ１号、米国特許第８，９５６，８６０  Ｂ２号、国際公開第２０１３／１７３８３５  Ａ１号、米国特許出願公開第２０１５／０１７５９６６  Ａ１号（これらの開示は参照により本明細書に援用される）に記載されるものが含まれる。かかるプロセスは、Jin et al., J.Immunotherapy, 2012, 35:283-292にも記載されている。
【０４７９】
任意選択のＴＩＬ遺伝子改変
[00579]  一部の実施形態において、ＴＩＬは任意選択で、限定はされないが、高親和性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、ＭＡＧＥ−１、ＨＥＲ２若しくはＮＹ−ＥＳＯ−１などの腫瘍関連抗原を標的とするＴＣＲ又は腫瘍関連細胞表面分子（例えばメソテリン）若しくは系統限定的細胞表面分子（例えばＣＤ１９）に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含め、追加的な機能性を含むように遺伝子改変される。
【０４８０】
ＩＶ．患者の処置方法
[00580]  処置方法は、最初のＴＩＬ収集及びＴＩＬの培養から始まる。かかる方法については、両方ともに当技術分野において、例えばJin et al., J.Immunotherapy, 2012, 35(3):283-292（全体として参照により本明細書に援用される）により記載されている。処置方法の実施形態は、実施例を含む以下のセクション全体で説明される。
【０４８１】
[00581]  本明細書に記載の方法、例えば上記のステップＡ〜Ｆに記載の方法を含むか、又は上記のステップＡ〜Ｆに記載の方法（又、図２７に示すものなど）に従って作製された拡大培養ＴＩＬは、癌患者の処置における特定の使用（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Goff, et al., J. Clinical Oncology, 2016, 34(20):2389-239並びに補足内容）が見出される。一部の実施形態では、ＴＩＬは、先述のとおり転移性黒色腫の寄託切除物から成長させた（Dudley, et al., J Immunother., 2003, 26:332-342を参照のこと；全体として参照により本明細書に援用される）。新鮮腫瘍は無菌条件下で剥離し得る。正式な病理解析のため、代表試料を収集し得る。２ｍｍ３〜３ｍｍ３の単一の断片が使用され得る。一部の実施形態において、患者１人あたり５、１０、１５、２０、２５又は３０の試料を入手する。一部の実施形態において、患者１人あたり２０、２５又は３０の試料を入手する。一部の実施形態において、患者１人あたり２０、２２、２４、２６又は２８の試料を入手する。一部の実施形態において、患者１人あたり２４の試料を入手する。試料を２４ウェルプレートの個々のウェルに置き、高用量ＩＬ−２（６，０００ＩＵ／ｍＬ）を含む成長培地中に維持し、腫瘍の破壊及び／又はＴＩＬの増殖に関してモニターし得る。処理後に生細胞が残っている任意の腫瘍を酵素消化して単一細胞懸濁液にし、本明細書に記載されるとおり凍結保存し得る。
【０４８２】
[00582]  一部の実施形態において、表現型分析（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８及びＣＤ５６）のため拡大培養ＴＩＬをサンプリングし、利用可能な場合には自己腫瘍に対して試験し得る。ＴＩＬは、一晩の共培養によりインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）レベル＞２００ｐｇ／ｍＬ及びバックグラウンドの２倍となった場合に応答性であると見なすことができる。（Goff, et al., J Immunother., 2010, 33:840-847；全体として参照により本明細書に援用される）。一部の実施形態において、自己応答性又は十分な成長パターンのエビデンスを有する培養物が、迅速拡大培養（ＲＥＰ）と称されることもある第２の拡大培養を含め、第２の拡大培養（例えば、図２７のステップＤにおいて提供されるとおりの第２の拡大培養）に選択され得る。一部の実施形態において、高い自己応答性（例えば、第２の拡大培養中の高い増殖）を有する拡大培養ＴＩＬが、追加的な第２の拡大培養に選択される。一部の実施形態において、自己応答性（例えば、図２７のステップＤに提供されるとおりの第２の拡大培養中の高い増殖）を有するＴＩＬが、図２７のステップＤに係る追加的な第２の拡大培養に選択される。
【０４８３】
[00583]  一部の実施形態において、患者はＡＣＴ（養子細胞移入）に直接移されず、例えば、一部の実施形態において、腫瘍採取後及び／又は第１の拡大培養後、細胞は、直ちには利用されない。一部の実施形態において、ＴＩＬは凍結保存し、患者への投与の２日前に解凍することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは凍結保存し、患者への投与の１日前に解凍することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは凍結保存し、患者への投与の直前に解凍することができる。
【０４８４】
[00584]  輸注バッグＴＩＬの凍結保存試料の細胞表現型は、表面マーカーＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＡ（BD BioSciences）に関するフローサイトメトリー（例えば、FlowJo）並びに本明細書に記載される方法のいずれかによって分析することができる。血清サイトカインは標準的な酵素結合免疫吸着アッセイ法を用いることにより測定した。血清ＩＦＮ−ｇの上昇は、＞１００ｐｇ／ｍＬ及び４  ３ベースラインレベル超と定義した。
【０４８５】
[00585]  一部の実施形態において、本明細書で提供される方法、例えば図２７に例示される方法により作製されるＴＩＬは、ＴＩＬの臨床有効性の驚くべき改善を提供する。一部の実施形態において、本明細書で提供される方法、例えば図２７に例示される方法により作製されるＴＩＬは、例えば図２７に例示される方法以外の方法を含む、本明細書に記載されるもの以外の方法により作製されるＴＩＬに比べて臨床有効性が増加する。一部の実施形態において、本明細書に記載されているもの以外の方法は、プロセス１Ｃ及び／又はジェネレーション１（Ｇｅｎ１）と称される方法を含む。一部の実施形態において、有効性の増加は、ＤＣＲ、ＯＲＲ及び／又は他の臨床応答によって測定される。一部の実施形態において、本明細書で提供される方法、例えば図２７に例示される方法により作製されるＴＩＬは、例えば図２７に例示される方法以外の、例えばＧｅｎ１プロセスを含む、本明細書に記載されるもの以外の方法により作製されるＴＩＬと同様の応答時間及び安全プロファイルを示す。
【０４８６】
[00586]  一部の実施形態において、ＩＦＮ−ガンマ（ＩＦＮ−γ）は、処置有効性及び／又は臨床有効性の増加の指標である。一部の実施形態において、ＴＩＬで処置された被験者の血液中のＩＦＮ−γは、活性ＴＩＬの指標である。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γ産生の効力アッセイが用いられる。ＩＦＮ−γ産生は、細胞傷害能のもう１つの尺度である。ＩＦＮ−γ産生は、本発明の方法、例えば、図２７に例示されるものを含む方法により調製されたＴＩＬで処置された対象の血液、血清又はＴＩＬエキソビボ中のサイトカインＩＦＮ−γのレベルを決定することにより測定できる。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γの増加は、本発明の方法により作製されたＴＩＬで処置された患者における処置有効性の指標である。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γは、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍、２倍、３倍、４倍又は５倍以上増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して２倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して３倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して４倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して５倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γはQuantikine ELISA kitを使用して測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γは、例えば図２７に記載されるものを含む、本発明の方法により調製されたＴＩＬで処置された対象のＴＩＬエキソビボで測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γは、例えば図２７に記載されるものを含む、本発明の方法により調製されたＴＩＬで処置された対象の血液で測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γは、例えば図２７に記載されるものを含む、本発明の方法により調製されたＴＩＬで処置された対象のＴＩＬ血清で測定される。
【０４８７】
[00587]  一部の実施形態において、より高い平均ＩＰ−１０は、処置有効性及び／又は臨床有効性の増加の指標である。一部の実施形態において、ＴＩＬで処置された被験者の血液中のより高い平均ＩＰ−１０は、活性ＴＩＬの指標である。ＩＰ−１０産生は、本発明の方法、例えば、図２７に例示されるものを含む方法により調製されたＴＩＬで処置された対象の血液のＩＰ−１０のレベルを決定することにより測定できる。一部の実施形態において、より高い平均ＩＰ−１０は、本発明の方法により作製されたＴＩＬで処置された患者における処置有効性の指標である。一部の実施形態において、より高い平均ＩＰ−１０は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍、２倍、３倍、４倍又は５倍以上の増加と相関する。一部の実施形態において、より高い平均ＩＰ−１０は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍の増加と相関する。一部の実施形態において、より高い平均ＩＰ−１０は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、２倍の増加と相関する。一部の実施形態において、より高い平均ＩＰ−１０は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、３倍の増加と相関する。一部の実施形態において、より高い平均ＩＰ−１０は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、４倍の増加と相関する。一部の実施形態において、より高い平均ＩＰ−１０は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、５倍の増加と相関する。一部の実施形態において、ＩＰ−１０は、例えば図２７に記載されるものを含む、本発明の方法により調製されたＴＩＬで処置された対象の血液で測定される。一部の実施形態において、ＩＰ−１０は、例えば図２７に記載されるものを含む、本発明の方法により調製されたＴＩＬで処置された対象のＴＩＬ血清で測定される。
【０４８８】
[00588]  一部の実施形態において、より高い平均ＭＣＰ−１は、処置有効性及び／又は臨床有効性の増加の指標である。一部の実施形態において、ＴＩＬで処置された被験者の血液中のより高い平均ＭＣＰ−１は、活性ＴＩＬの指標である。ＭＣＰ−１産生は、本発明の方法、例えば、図２７に例示されるものを含む方法により調製されたＴＩＬで処置された対象の血液のＭＣＰ−１のレベルを決定することにより測定できる。一部の実施形態において、より高い平均ＭＣＰ−１は、本発明の方法により作製されたＴＩＬで処置された患者における処置有効性の指標である。一部の実施形態において、より高い平均ＭＣＰ−１は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍、２倍、３倍、４倍又は５倍以上の増加と相関する。一部の実施形態において、より高い平均ＭＣＰ−１は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍の増加と相関する。一部の実施形態において、より高い平均ＭＣＰ−１は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、２倍の増加と相関する。一部の実施形態において、より高い平均ＭＣＰ−１は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、３倍の増加と相関する。一部の実施形態において、より高い平均ＭＣＰ−１は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、４倍の増加と相関する。一部の実施形態において、より高い平均ＭＣＰ−１は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、５倍の増加と相関する。一部の実施形態において、ＭＣＰ−１は、例えば図２７に記載されるものを含む、本発明の方法により調製されたＴＩＬで処置された対象の血液で測定される。一部の実施形態において、ＭＣＰ−１は、例えば図２７に記載されるものを含む、本発明の方法により調製されたＴＩＬで処置された対象のＴＩＬ血清で測定される。
【０４８９】
[00589]  一部の実施形態において、例えば図２７に記載されるものを含む本発明の方法により調製されたＴＩＬは、例えば図２７に例示されない、例えばプロセス１Ｃメソッドと称されるものを含む他の方法により作製されるＴＩＬと比較してポリクローナル性の増加を示す。一部の実施形態において、有意に改善されたポリクローナル性及び／又は増加したポリクローナル性は、処置有効性及び／又は臨床有効性の増加の指標である。一部の実施形態において、ポリクローナル性とは、Ｔ細胞レパートリーの多様性を指す。一部の実施形態において、ポリクローナル性の増加は、本発明の方法に作製されたＴＩＬを投与された患者に関する処置有効性の指標である。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して１倍、２倍、１０倍、１００倍、５００倍又は１０００倍が増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、２倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１０倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１００倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、５００倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１０００倍増加する。
【０４９０】
[00590]  有効性の尺度には、当技術分野において公知であり、実施例２８を含む本明細書に提供される実施例に記載されるように、疾患制御率（ＤＣＲ）測定値並びに全奏効率（ＯＲＲ）が含まれ得る。
【０４９１】
１．癌及び他の疾患の処置方法
[00591]  本明細書に記載の組成物及び方法は、疾患の処置方法で使用することができる。一実施形態において、それらは過剰成長性障害の処置に使用するためのものである。それらは、本明細書及び以下の段落に記載されているとおり他の障害の処置にも使用され得る。
【０４９２】
[00592]  一部の実施形態において、過剰成長性障害は癌である。一部の実施形態において、過剰成長性障害は固形腫瘍癌である。一部の実施形態において、固形腫瘍癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、腎癌及び腎細胞癌からなる群から選択される。一部の実施形態において、過剰成長性障害は血液学的悪性腫瘍である。一部の実施形態において、固形腫瘍癌は、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫及びマントル細胞リンパ腫からなる群から選択される。
【０４９３】
[00593]  ある実施形態において、本発明は、ＴＩＬ集団で癌を処置する方法を含み、ここで患者は本開示に係るＴＩＬの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。ある実施形態において、骨髄非破壊的化学療法は、２日間（ＴＩＬ注入前２７日目及び２６日目）のシクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日及び５日間（ＴＩＬ注入前２７〜２３日目）のフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２／日である。ある実施形態において、骨髄非破壊的化学療法及び本開示に係るＴＩＬ注入（０日目）後、患者は生理学的忍容量まで８時間毎に静脈内に７２０，０００ＩＵ／ｋｇのＩＬ−２の静脈内注入を受ける。
【０４９４】
[00594]  示された疾患又は障害の処置、予防及び／又は管理における本明細書に記載の化合物及び化合物の組み合わせの有効性は、ヒト疾患の処置のためのガイダンスを提供する当技術分野でにおいて公知の様々なモデルを使用して試験することができる。例えば、卵巣癌の処置の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Mullany, et al., Endocrinology 2012, 153, 1585-92;及びFong, et al., J. Ovarian Res.2009, 2, 12に記載がある。膵臓癌の処置の有効性を決定するためのモデルは、Herreros-Villanueva, et al., World J. Gastroenterol.2012, 18, 1286-1294に記載がある。乳癌の処置の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Fantozzi, Breast Cancer Res.2006, 8, 212に記載がある。黒色腫の処置の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Damsky, et al., Pigment Cell&Melanoma Res.2010, 23, 853-859に記載がある。肺癌の処置の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Meuwissen, et al., Genes&Development, 2005, 19, 643-664に記載がある。肺癌処置の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Kim, Clin.Exp.Otorhinolaryngol.2009, 2, 55-60;及びSano, Head Neck Oncol.2009, 1, 32に記載がある。
【０４９５】
[00595]  一部の実施形態において、ＩＦＮ−ガンマ（ＩＦＮ−γ）は、過剰成長性傷害の処置有効性の指標である。一部の実施形態において、ＴＩＬで処置された被験者の血液中のＩＦＮ−γは、活性ＴＩＬの指標である。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γ産生の効力アッセイが用いられる。ＩＦＮ−γ産生は、細胞傷害能のもう１つの尺度である。ＩＦＮ−γ産生は、本発明の方法、例えば、図２７に例示されるものを含む方法により調製されたＴＩＬで処置された対象の血液中のサイトカインＩＦＮ−γのレベルを決定することにより測定できる。一部の実施形態において、本方法で得られたＴＩＬは、図８３に例示されるように、プロセス１Ｃと称される方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された被験者と比較して、本方法のＴＩＬで処置された対象の血液中のＩＦＮ−γの増加をもたらす。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γの増加は、本発明の方法により作製されたＴＩＬで処置された患者における処置有効性の指標である。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γは、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍、２倍、３倍、４倍又は５倍以上増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して２倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して３倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して４倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して５倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γはQuantikine ELISA kitを使用して測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γはQuantikine ELISA kitを使用して測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γは、本発明の方法により作製されたＴＩＬで処置された患者からのＴＩＬエキソビボにおいて測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γは、本発明の方法により作製されたＴＩＬで処置された患者の血液において測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γは、本発明の方法により作製されたＴＩＬで処置された患者の血清において測定される。
【０４９６】
[00596]  一部の実施形態において、より高い平均ＩＰ−１０は、過剰成長性傷害処置の処置有効性及び／又は臨床有効性の増加の指標である。一部の実施形態において、ＴＩＬで処置された被験者の血液中のより高い平均ＩＰ−１０は、活性ＴＩＬの指標である。一部の実施形態において、本方法で得られたＴＩＬは、図８３に例示されるように、プロセス１Ｃと称される方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された被験者と比較して、本方法のＴＩＬで処置された対象の血液中のより高い平均ＩＰ−１０をもたらす。ＩＰ−１０産生は、本発明の方法、例えば、図２７に例示されるものを含む方法により調製されたＴＩＬで処置された対象の血液のＩＰ−１０のレベルを決定することにより測定できる。一部の実施形態において、より高い平均ＩＰ−１０は、本発明の方法により作製されたＴＩＬで処置された患者における処置有効性の指標である。一部の実施形態において、より高い平均ＩＰ−１０は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍、２倍、３倍、４倍又は５倍以上の増加と相関する。一部の実施形態において、より高い平均ＩＰ−１０は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍の増加と相関する。一部の実施形態において、より高い平均ＩＰ−１０は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、２倍の増加と相関する。一部の実施形態において、より高い平均ＩＰ−１０は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、３倍の増加と相関する。一部の実施形態において、より高い平均ＩＰ−１０は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、４倍の増加と相関する。一部の実施形態において、より高い平均ＩＰ−１０は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、５倍の増加と相関する。
【０４９７】
[00597]  一部の実施形態において、より高い平均ＭＣＰ−１は、過剰成長性傷害処置の処置有効性及び／又は臨床有効性の増加の指標である。一部の実施形態において、ＴＩＬで処置された被験者の血液中のより高い平均ＭＣＰ−１は、活性ＴＩＬの指標である。一部の実施形態において、本方法で得られたＴＩＬは、図８３に例示されるように、プロセス１Ｃと称される方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された被験者と比較して、本方法のＴＩＬで処置された対象の血液中のより高い平均ＭＣＰ−１をもたらす。ＭＣＰ−１産生は、本発明の方法、例えば、図２７に例示されるものを含む方法により調製されたＴＩＬで処置された対象の血液のＭＣＰ−１のレベルを決定することにより測定できる。一部の実施形態において、より高い平均ＭＣＰ−１は、本発明の方法により作製されたＴＩＬで処置された患者における処置有効性の指標である。一部の実施形態において、より高い平均ＭＣＰ−１は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍、２倍、３倍、４倍又は５倍以上の増加と相関する。一部の実施形態において、より高い平均ＭＣＰ−１は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍の増加と相関する。一部の実施形態において、より高い平均ＭＣＰ−１は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、２倍の増加と相関する。一部の実施形態において、より高い平均ＭＣＰ−１は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、３倍の増加と相関する。一部の実施形態において、より高い平均ＭＣＰ−１は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、４倍の増加と相関する。一部の実施形態において、より高い平均ＭＣＰ−１は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、５倍の増加と相関する。
【０４９８】
[00598]  一部の実施形態において、例えば図２７に記載されるものを含む本発明の方法により調製されたＴＩＬは、例えば図２７に例示されない、例えばプロセス１Ｃメソッドと称されるものを含む他の方法により作製されるＴＩＬと比較してポリクローナル性の増加を示す。一部の実施形態において、有意に改善されたポリクローナル性及び／又は増加したポリクローナル性は、癌処置の処置有効性及び／又は臨床有効性の増加の指標である。一部の実施形態において、ポリクローナル性とは、Ｔ細胞レパートリーの多様性を指す。一部の実施形態において、ポリクローナル性の増加は、本発明の方法に作製されたＴＩＬを投与された患者に関する処置有効性の指標である。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、例えば、図２７に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して１倍、２倍、１０倍、１００倍、５００倍又は１０００倍が増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、２倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１０倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１００倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、５００倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は例えば図２７で具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１０００倍増加する。
【０４９９】
２．共投与方法
[00599]  一部の実施形態において、例えば、図２７のステップＡ〜Ｆに記載される方法に由来するＴＩＬを含む、本明細書に記載されるとおり作製されるＴＩＬは、以下に記載する抗体など、１つ以上の免疫チェックポイント調節因子と併用して投与することができる。例えば、ＰＤ−１を標的とする、且つ本発明のＴＩＬと共投与し得る抗体としては、例えば、限定はされないが、ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８、Bristol-Myers Squibb；Opdivo（登録商標））、ペンブロリズマブ（ランブロリズマブ、ＭＫ０３４７５又はＭＫ−３４７５、Merck；Keytruda（登録商標））、ヒト化抗ＰＤ−１抗体ＪＳ００１（ShangHai JunShi）、モノクローナル抗ＰＤ−１抗体ＴＳＲ−０４２（Tesaro, Inc.）、ピジリズマブ（抗ＰＤ−１  ｍＡｂ  ＣＴ−０１１、Medivation）、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体ＢＧＢ−Ａ３１７（BeiGene）及び／又は抗ＰＤ−１抗体ＳＨＲ−１２１０（ShangHai HengRui）、ヒトモノクローナル抗体ＲＥＧＮ２８１０（Regeneron）、ヒトモノクローナル抗体ＭＤＸ−１１０６（Bristol-Myers Squibb）及び／又はヒト化抗ＰＤ１  ＩｇＧ４抗体ＰＤＲ００１（Novartis）が挙げられる。一部の実施形態において、ＰＤ−１抗体は、クローン：ＲＭＰ１−１４（ラットＩｇＧ）−BioXcellカタログ番号BP0146からのものである。本明細書に記載されるとおりのステップＡ〜Ｆにより作製されるＴＩＬとの共投与方法における使用に好適な他の好適な抗体は、米国特許第８，００８，４４９号（本明細書において参照により援用される）に開示される抗ＰＤ−１抗体である。一部の実施形態において、抗体又はその抗原結合部分はＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し、ＰＤ−１とのその相互作用を阻害し、それにより免疫活性を増加させる。ＰＤ−Ｌ１に結合してＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用を破壊し、且つ抗腫瘍免疫応答を刺激する当技術分野において公知の任意の抗体が、本明細書に記載されるとおりのステップＡ〜Ｆにより作製されるＴＩＬとの共投与方法における使用に好適である。例えば、ＰＤ−Ｌ１を標的とする臨床試験中の抗体としては、ＢＭＳ−９３６５５９（Bristol-Myers Squibb）及びＭＰＤＬ３２８０Ａ（Genentech）が挙げられる。ＰＤ−Ｌ１を標的とする他の好適な抗体は、米国特許第７，９４３，７４３号（本明細書において参照により援用される）に開示される。当業者は、ＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１に結合し、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を破壊し、且つ抗腫瘍免疫応答を刺激する任意の抗体が、本明細書に記載されるとおりのステップＡ〜Ｆにより作製されるＴＩＬとの共投与方法における使用に好適であることを理解するであろう。一部の実施形態において、ステップＡ〜Ｆにより作製されるＴＩＬの組み合わせを投与される対象は、患者が抗ＰＤ−１抗体単独の投与に不応性の癌型を有するとき抗ＰＤ−１抗体と共投与される。一部の実施形態において、患者が難治性黒色腫を有するとき、患者はＴＩＬを抗ＰＤ−１と併用して投与される。一部の実施形態において、患者が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有するとき、患者はＴＩＬを抗ＰＤ−１と併用して投与される。
【０５００】
３．任意選択での患者のリンパ球枯渇プレコンディショニング
[00600]  ある実施形態において、本発明は、ＴＩＬ集団で癌を処置する方法を含み、ここで患者は本開示に係るＴＩＬの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。ある実施形態において、本発明は、骨髄非破壊的化学療法で前処置された患者の癌処置に使用するためのＴＩＬの集団を含む。ある実施形態において、ＴＩＬの集団は注入による投与用である。ある実施形態において、骨髄非破壊的化学療法は、２日間（ＴＩＬ注入前２７日目及び２６日目）のシクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日及び５日間（ＴＩＬ注入前２７〜２３日目）のフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２／日である。ある実施形態において、骨髄非破壊的化学療法及び本開示に係るＴＩＬ注入（０日目）後、患者は生理学的忍容量まで８時間毎に静脈内に７２０，０００ＩＵ／ｋｇのＩＬ−２（アルデスロイキン、PROLEUKINとして市販）の静脈内注入を受ける。特定の実施形態では、ＴＩＬの集団は、ＩＬ−２と組み合わせて癌を処置するのに使用され、ＩＬ−２はＴＩＬの集団の後に投与される。
【０５０１】
[00601]  実験的知見から、腫瘍特異的Ｔリンパ球の養子移入前のリンパ球枯渇が、調節性Ｔ細胞及び免疫系の競合エレメント（「サイトカインシンク」）の除去により、処置有効性の増強において重要な役割を果たすことが指摘される。従って、本発明の一部の実施形態は、本発明のＴＩＬを導入する前に患者に対してリンパ球枯渇ステップ（「免疫抑制コンディショニング」とも称される）を利用する。
【０５０２】
[00602]  一般に、リンパ球枯渇はフルダラビン又はシクロホスファミド（その活性型はマホスファミドと称される）及びこれらの組み合わせの投与を使用して行われる。かかる方法については、Gassner, et al., Cancer Immunol.Immunother.2011, 60, 75-85, Muranski, et al., Nat.Clin.Pract.Oncol., 2006, 3, 668-681, Dudley, et al., J. Clin.Oncol.2008, 26, 5233-5239及びDudley, et al., J. Clin.Oncol.2005, 23, 2346-2357（これらは全て、本明細書において全体として参照により援用される）に記載されている。
【０５０３】
[00603]  一部の実施形態において、フルダラビンは０．５μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍＬフルダラビンの濃度で投与される。一部の実施形態において、フルダラビンは１μｇ／ｍＬフルダラビンの濃度で投与される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は１日、２日、３日、４日、５日、６日又は７日間又はそれ以上にわたり投与される。一部の実施形態において、フルダラビンは、１０ｍｇ／ｋｇ／日、１５ｍｇ／ｋｇ／日、２０ｍｇ／ｋｇ／日、２５ｍｇ／ｋｇ／日、３０ｍｇ／ｋｇ／日、３５ｍｇ／ｋｇ／日、４０ｍｇ／ｋｇ／日又は４５ｍｇ／ｋｇ／日の投薬量で投与される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は３５ｍｇ／ｋｇ／日で２〜７日間にわたり投与される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は３５ｍｇ／ｋｇ／日で４〜５日間にわたり投与される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は２５ｍｇ／ｋｇ／日で４〜５日間にわたり投与される。
【０５０４】
[00604]  一部の実施形態において、活性型のシクロホスファミドであるマホスファミドは、シクロホスファミドの投与による０．５μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬの濃度で得られる。一部の実施形態において、活性型のシクロホスファミドであるマホスファミドは、シクロホスファミドの投与による１μｇ／ｍＬの濃度で得られる。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は１日、２日、３日、４日、５日、６日又は７日間又はそれ以上にわたり投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミドは、１００ｍｇ／ｍ２／日、１５０ｍｇ／ｍ２／日、１７５ｍｇ／ｍ２／日、２００ｍｇ／ｍ２／日、２２５ｍｇ／ｍ２／日、２５０ｍｇ／ｍ２／日、２７５ｍｇ／ｍ２／日又は３００ｍｇ／ｍ２／日の投薬量で投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミドは静脈内に（すなわちｉ．ｖ．）投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は３５ｍｇ／ｋｇ／日で２〜７日間にわたり投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は２５０ｍｇ／ｍ２／日、ｉ．ｖ．で４〜５日間にわたり投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は２５０ｍｇ／ｍ２／日、ｉ．ｖ．で４日間にわたり投与される。
【０５０５】
[00605]  一部の実施形態において、リンパ球枯渇は、フルダラビン及びシクロホスファミドの患者に併せて投与することで実施される。一部の実施形態において、４日間にわたってフルダラビンは２５ｍｇ／ｍ２／日、ｉ．ｖ．で投与され、シクロホスファミドは２５０ｍｇ／ｍ２／日、ｉ．ｖ．で投与される。
【０５０６】
[00606]  ある実施形態において、リンパ球枯渇は、６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間のシクロホスファミドの投与ステップと、それに続く２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間のフルダラビンの投与により実施される。
【０５０７】
４．ＩＬ−２レジメン
[00607]  ある実施形態において、ＩＬ−２レジメンは、高用量ＩＬ−２レジメンを含み、治療用ＴＩＬ集団の治療有効部分を投与した１日後から静脈内投与され始めた、高用量ＩＬ−２レジメンはアルデスロイキン又はそのバイオシミラー若しくはそれらの変異体を含み、アルデロイキン又はそのバイオシミラー若しくは変異体が忍容量まで８時間毎に１５分ボーラス静脈内注入を使用して、最大１４用量で、０．０３７ｍｇ／ｋｇ又は０．０４４ｍｇ／ｋｇ  ＩＵ／ｋｇ（患者の体重）の用量で投与される。９日間の休息後、このスケジュールを更に１４回、合計で最大２８回まで繰り返し得る。
【０５０８】
[00608]  ある実施形態において、ＩＬ−２レジメンは、漸減性ＩＬ−２レジメンを含む。漸減性ＩＬ−２レジメンは、O’Day, et al., J. Clin.Oncol.1999, 17, 2752-61及びEton, et al., Cancer 2000, 88, 1703-9に記載されており、これらの開示は参照により本明細書に援用される。ある実施形態において、漸減性ＩＬ−２レジメンは、１８×１０６ＩＵ／ｍ２の６時間にわたる静脈内投与、それに続く１８×１０６ＩＵ／ｍ２の１２時間にわたる静脈内投与、その後、１８×１０６ＩＵ／ｍ２の２４時間にわたる静脈内投与、その後、４．５×１０６ＩＵ／ｍ２の７２時間にわたる静脈内投与を含む。この処置サイクルは、最大４サイクル、２８日毎に繰り返され得る。ある実施形態において、漸減性ＩＬ−２レジメンは、１日目の１８，０００，０００ＩＵ／ｍ２、２日目の９，０００，０００ＩＵ／ｍ２、３日目及び４日目の４，５００，０００ＩＵ／ｍ２を含む。
【０５０９】
[00609]  ある実施形態において、ＩＬ−２レジメンは、０．１０ｍｇ／日〜５０ｍｇ／日の用量で、１、２、４、６、７、１４又は２１日毎にペグ化ＩＬ−２を投与することを含む。
【０５１０】
５．養子細胞移入
[00610]  養子細胞移入（ＡＣＴ）は極めて有効な形態の免疫療法であり、抗腫瘍活性を有する免疫細胞を癌患者に移入することを含む。ＡＣＴは、抗腫瘍活性を有するリンパ球のインビトロ同定、それらの細胞の数を増やすインビトロ拡大培養及び癌担持宿主へのその注入を伴う治療手法である。養子移入に使用されるリンパ球は、切除された腫瘍の間質に由来し得る（腫瘍浸潤リンパ球又はＴＩＬ）。ＡＣＴ用のＴＩＬは、本明細書に記載されるとおり調製することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは、例えば図２７に記載されるとおりの方法により調製される。ＴＩＬはまた、抗腫瘍Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変されている場合には血液から誘導され得るか、混合リンパ球腫瘍細胞培養物（ＭＬＴＣ）でエンリッチされ得るか、又は自己抗原提示細胞及び腫瘍由来ペプチドを使用してクローニングされ得る。注入しようとする癌担持宿主にリンパ球が由来するＡＣＴは、自家ＡＣＴと称される。米国特許出願公開第２０１１／００５２５３０号は、主に転移性黒色腫に罹患している患者の治療に向けた、癌退縮を促進するため養子細胞療法を実施する方法に関する（これらの方法に関して全体として参照により援用される）。一部の実施形態において、ＴＩＬは、本明細書に記載されるとおり投与することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは単回用量で投与することができる。かかる投与は、注射、例えば静脈内注射によるものであり得る。一部の実施形態において、ＴＩＬ及び／又は細胞傷害性リンパ球は複数回用量で投与され得る。投与は、年１回、２回、３回、４回、５回、６回又は６回超であり得る。投与は、月１回、２週間に１回、週１回又は隔日１回であり得る。ＴＩＬ及び／又は細胞傷害性リンパ球の投与は必要な限り継続され得る。
【０５１１】
６．例示的処置の実施形態
[00611]  一部の実施形態において、本開示は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団によって癌を処置する方法を提供し、この方法は、（ａ）患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を入手するステップ；（ｂ）第１の細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団の初期拡大培養を実施することにより、第２のＴＩＬ集団を入手するステップであって、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５倍多く、第１の細胞培養培地は、ＩＬ−２を含む、ステップ；（ｃ）第２の細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞（骨髄系ａＡＰＣ）集団を使用して第２のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を実施することにより、第３のＴＩＬ集団を入手するステップであって、迅速拡大培養の開始から７日後、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く；第２の細胞培養培地は、ＩＬ−２及びＯＫＴ−３を含む、ステップ；（ｄ）癌を有する患者に治療上有効な分量の第３のＴＩＬ集団を投与するステップを含む。一部の実施形態において、本開示は、癌の処置における使用のための腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団であり、ＴＩＬ集団は、（ｂ）第１の細胞培養培地中で患者から切除された腫瘍から入手した第１のＴＩＬ集団の初期拡大培養を実施することにより、第２のＴＩＬ集団を入手するステップであって、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５倍多く、第１の細胞培養培地は、ＩＬ−２を含む、ステップ；（ｃ）第２の細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞（骨髄系ａＡＰＣ）集団を使用して第２のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を実施することにより、第３のＴＩＬ集団を入手するステップであって、迅速拡大培養の開始から７日後、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く；第２の細胞培養培地は、ＩＬ−２及びＯＫＴ−３を含む、ステップ；（ｄ）癌を有する患者に治療上有効な分量の第３のＴＩＬ集団を投与するステップを含む方法によって入手可能である。一部の実施形態において、本方法は、患者から切除された腫瘍からＴＩＬの第１の集団を得る第１のステップ（ａ）を含む。一部の実施形態において、第２の細胞培養培地中にＩＬ−２は約３０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度で存在し、及びＯＫＴ−３抗体は約３０ｎｇ／ｍＬの初期濃度で存在する。一部の実施形態において、第１の拡大培養は１４日以下の期間にわたって実施される。一部の実施形態において、第１の拡大培養はガス透過性容器を使用して実施される。一部の実施形態において、第２の拡大培養はガス透過性容器を使用して実施される。一部の実施形態において、迅速拡大培養における第２のＴＩＬ集団とａＡＰＣ集団との比は１対８０〜１対４００である。一部の実施形態において、迅速拡大培養における第２のＴＩＬ集団とａＡＰＣ集団との比は約１対３００である。一部の実施形態において、処置される癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、腎癌及び腎細胞癌からなる群から選択される。一部の実施形態において、処置される癌は、黒色腫、卵巣癌及び子宮頸癌からなる群から選択される。一部の実施形態において、処置される癌は黒色腫である。一部の実施形態において、処置される癌は卵巣癌である。一部の実施形態において、処置される癌は子宮頸癌である。一部の実施形態において、癌の処置方法は、患者に第３のＴＩＬ集団を投与する前に骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンによって患者を処置するステップを更に含む。一部の実施形態において、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間のシクロホスファミドの投与ステップと、それに続く２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間のフルダラビンの投与ステップを含む。一部の実施形態において、高用量ＩＬ−２レジメンは、忍容量まで８時間毎に１５分ボーラス静脈内注入として投与される６００，０００又は７２０，０００ＩＵ／ｋｇのアルデスロイキン又はそのバイオシミラー若しくは変異体を含む。
【０５１２】
Ｖ．例示的実施形態
[00612]  一部の実施形態において、本発明は、拡大培養した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を投与することを含む癌を有する対象の処置方法も提供し、この方法は、
（ａ）対象から得られた腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に加えること；
（ｃ）ＩＬ−２を含む細胞培養培地で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約１１日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｄ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を入手するために約１１日間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｅ）ステップ（ｄ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生する、回収こと；及び
（ｆ）ステップ（ｅ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放せずに発生する、移すこと；
（ｇ）凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）からの回収されたＴＩＬ集団を含む輸注バッグを凍結保存すること；並びに
（ｈ）ステップ（ｇ）における輸注バッグから治療上有効な投薬量の第３のＴＩＬ集団を患者に投与すること
を含む。
【０５１３】
[00613]  一部の実施形態において、凍結保存プロセスは、ＤＭＳＯを含む培地での凍結保存を含む。一部の実施形態において、凍結保存培地は、７％〜１０％のＤＭＳＯを含む。一部の実施形態において、凍結保存培地は、CS10に存在する。
【０５１４】
[00614]  一部の実施形態において、ステップ（ｅ）で回収した治療用ＴＩＬ集団は、ステップ（ｈ）の治療上有効な投薬量のＴＩＬを投与するのに十分なＴＩＬを含む。
【０５１５】
[00615]  一部の実施形態において、ステップ（ｈ）における治療上有効な投薬量の投与に十分なＴＩＬの数は約２．３×１０１０〜約１３．７×１０１０個である。
【０５１６】
[00616]  一部の実施形態において、抗原提示細胞（ＡＰＣ）はＰＢＭＣである。
【０５１７】
[00617]  一部の実施形態において、ＰＢＭＣはステップ（ｄ）において９〜１１日目のいずれかに細胞培養物に加えられる。
【０５１８】
[00618]  一部の実施形態において、ステップ（ｈ）で治療上有効な投薬量のＴＩＬ細胞を投与する前に、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが患者に投与されている。
【０５１９】
[00619]  一部の実施形態において、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間のシクロホスファミドの投与ステップと、それに続く２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間のフルダラビンの投与ステップを含む。
【０５２０】
[00620]  一部の実施形態において、本方法は、ステップ（ｈ）で患者にＴＩＬ細胞を投与した翌日に始まる高用量ＩＬ−２レジメンで患者を処置するステップを更に含む。
【０５２１】
[00621]  一部の実施形態において、高用量ＩＬ−２レジメンは、忍容量まで８時間毎に１５分ボーラス静脈内注入として投与される６００，０００又は７２０，０００ＩＵ／ｋｇを含む。
【０５２２】
[00622]  一部の実施形態において、ステップ（ｄ）の第３のＴＩＬ集団は、対象に投与されたとき、有効性の増加、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）産生の増加、ポリクローナル性の増加、平均ＩＰ−１０の増加及び／又は平均ＭＣＰ−１の増加を提供する。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γの増加、平均ＩＰ−１０の増加及び／又は平均ＭＣＰ−１の増加は、ＴＩＬで処置された対象の血液で測定される。
【０５２３】
[00623]  一部の実施形態において、癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、腎癌及び腎細胞癌からなる群から選択される。一部の実施形態において、癌は、黒色腫、ＨＮＳＣＣ、子宮頸癌及びＮＳＣＬＣからなる群から選択される。一部の実施形態において、癌は黒色腫である。一部の実施形態において、癌はＨＮＳＣＣである。一部の実施形態において、癌は子宮頸癌である。一部の実施形態において、癌はＮＳＣＬＣである。
【０５２４】
[00624]  ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を拡大培養する方法を提供する。
【０５２５】
[00625]  本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を拡大培養する方法を提供し、その方法は、（ａ）患者から腫瘍試料を得るステップであって、前記腫瘍試料は、ＴＩＬの第１の集団を含む、ステップ；（ｂ）前記腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理するステップ；（ｃ）前記腫瘍断片を閉鎖型容器に加えるステップ；（ｄ）第２のＴＩＬ集団を得るために第１の細胞培養培地で前記第１のＴＩＬ集団の初めの拡大培養を実施するステップであって、前記第１の細胞培養培地は、ＩＬ−２を含み、前記初めの拡大培養は、ガス透過性表面積が少なくとも１００ｃｍ２の前記閉鎖型容器で実施され、前記初めの拡大培養は、約７〜１４日間の第１の期間内に初めの拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を得、前記第２のＴＩＬ集団は、前記第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放せずに発生する、ステップ；（ｅ）前記第２のＴＩＬ集団を第２の細胞培養培地で拡大培養するステップであって、前記第２の細胞培養培地は、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び末梢血単核球（ＰＢＭＣ、単核球（ＭＮＣ）としても知られる）を含み、前記拡大培養は、約７〜１４日間の第２の期間内に実施されて第３のＴＩＬ集団を得、前記第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団に対して、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加したサブ集団を呈し、前記拡大培養は、少なくとも５００ｃｍ２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生する、ステップ；（ｆ）ステップ（ｅ）から得られた前記第３のＴＩＬ集団を回収するステップであって、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）への移行は、系を開放せずに発生する、ステップ；及び（ｇ）前記回収したＴＩＬ集団をステップ（ｆ）から輸注バッグに移すステップであって、ステップ（ｆ）から（ｇ）への前記移行は、系を開放せずに発生する、ステップを含む。一部の実施形態において、この方法は、インビトロ又はエキソビボ方法である。
【０５２６】
[00626]  一部の実施形態において、この方法は、更に、ステップ（ｆ）でのFresenius Kabi製のLOVO系などの細胞処理系を介する回収を含む。用語「LOVO細胞処理系」は、滅菌及び／又は閉鎖系環境で、回転膜又は回転フィルターなどの膜又はフィルターを通して細胞を含む溶液を送り出すことができ、ペレット化せず上清又は細胞培養液を除去する連続フロー及び細胞処理を可能にする、あらゆる販売業者によって製造された機器又は装置も指す。ある場合には、細胞処理系は、閉鎖、無菌系で細胞分離、洗浄、流体交換、濃縮及び／又は他の細胞処理ステップを実施することができる。
【０５２７】
[00627]  一部の実施形態において、閉鎖型容器は、Ｇコンテナ及びXuri細胞培養バッグからなる群から選択される。
【０５２８】
[00628]  一部の実施形態において、ステップ（ｇ）の輸注バッグは、HypoThermosol含有輸注バッグである。
【０５２９】
[00629]  一部の実施形態において、ステップ（ｄ）の第１の期間及び前記ステップ（ｅ）の第２の期間は、１０日、１１日又は１２日の期間内にそれぞれ個別に実施される。
【０５３０】
[00630]  一部の実施形態において、ステップ（ｄ）の第１の期間及び前記ステップ（ｅ）の第２の期間は、１１日の期間内にそれぞれ個別に実施される。
【０５３１】
[00631]  一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｇ）は約２５日〜約３０日の期間内に実施される。
【０５３２】
[00632]  一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｇ）は約２０日〜約２５日の期間内に実施される。
【０５３３】
[00633]  一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｇ）は約２０日〜約２２日の期間内に実施される。
【０５３４】
[00634]  一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｇ）は、２２日以内に実施される。
【０５３５】
[00635]  一部の実施形態において、ステップ（ｃ）〜（ｆ）は、単一の容器で実施され、ステップ（ｃ）〜（ｆ）を単一の容器で実施すると、ステップ（ｃ）〜（ｆ）を２つ以上の容器で実施した場合に比べ切除された腫瘍毎のＴＩＬ収量が増加する結果となる。
【０５３６】
[00636]  一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、系を開放せずにステップ（ｅ）の第２の期間中にＴＩＬに加えられる。
【０５３７】
[00637]  一部の実施形態において、前記第３のＴＩＬ集団から得られたエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、前記第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ２７＋の発現、ＣＤ２８＋の発現、より長いテロメア、ＣＤ５７発現の増加及びＣＤ５６発現の減少からなる群から選択される１つ以上の特徴を呈する。
【０５３８】
[00638]  一部の実施形態において、前記第３のＴＩＬ集団から得られたエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、前記第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ５７発現の増加及びＣＤ５６発現の減少を呈する。
【０５３９】
[00639]  一部の実施形態において、微生物汚染のリスクは、開放系と比較して低減される。
【０５４０】
[00640]  一部の実施形態において、ステップ（ｇ）からのＴＩＬは、患者に注入される。
【０５４１】
[00641]  本発明は、また、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団で患者にある癌を処置する方法を提供し、その方法は、（ａ）患者から腫瘍試料を得るステップであって、前記腫瘍試料は、ＴＩＬの第１の集団を含む、ステップ；（ｂ）前記腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理するステップ；（ｃ）前記腫瘍断片を閉鎖型容器に加えるステップ；（ｄ）第２のＴＩＬ集団を得るために第１の細胞培養培地で前記第１のＴＩＬ集団の初めの拡大培養を実施するステップであって、前記第１の細胞培養培地は、ＩＬ−２を含み、前記初めの拡大培養は、ガス透過性表面積が少なくとも１００ｃｍ２の前記閉鎖型容器で実施され、前記初めの拡大培養は、約７〜１４日間の第１の期間内に初めの拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を得、前記第２のＴＩＬ集団は、前記第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放せずに発生する、ステップ；（ｅ）第２のＴＩＬ集団を第２の細胞培養培地で拡大培養するステップであって、前記第２の細胞培養培地は、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を含み、前記拡大培養は、約７〜１４日間の第２の期間内に実施されて第３のＴＩＬ集団を得、前記第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団に対して、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加したサブ集団を呈し、前記拡大培養は、少なくとも５００ｃｍ２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生する、ステップ；（ｆ）ステップ（ｅ）から得られた前記第３のＴＩＬ集団を回収するステップであって、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）への移行は、系を開放せずに発生する、ステップ；（ｇ）回収したＴＩＬ集団をステップ（ｆ）から輸注バッグに移すステップであって、ステップ（ｆ）から（ｇ）への前記移行は、系を開放せずに発生する、ステップ；及び（ｈ）ステップ（ｇ）の前記輸注バッグからＴＩＬ細胞の有効量を前記患者へ静脈内投与するステップを含む。
【０５４２】
[00642]  一部の実施形態において、本発明は、また、癌処置における使用のための腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を含み、そのＴＩＬの集団は、（ｂ）患者から得た腫瘍試料を処理するステップであって、前記腫瘍試料は、複数の腫瘍断片に切除されるＴＩＬの第１の集団を含む、ステップ；（ｃ）前記腫瘍断片を閉鎖型容器に加えるステップ；（ｄ）第２のＴＩＬ集団を得るために第１の細胞培養培地で前記第１のＴＩＬ集団の初めの拡大培養を実施するステップであって、前記第１の細胞培養培地は、ＩＬ−２を含み、前記初めの拡大培養は、ガス透過性表面積が少なくとも１００ｃｍ２の前記閉鎖型容器で実施され、前記初めの拡大培養は、約７〜１４日間の第１の期間内に初めの拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を得、前記第２のＴＩＬ集団は、前記第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放せずに発生する、ステップ；（ｅ）前記第２のＴＩＬ集団を第２の細胞培養培地で拡大培養するステップであって、前記第２の細胞培養培地は、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を含み、前記拡大培養は、約７〜１４日間の第２の期間内に実施されて第３のＴＩＬ集団を得、前記第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団に対して、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加したサブ集団を呈し、前記拡大培養は、少なくとも５００ｃｍ２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生する、ステップ；（ｆ）ステップ（ｅ）から得られた前記第３のＴＩＬ集団を回収するステップであって、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）への移行は、系を開放せずに発生する、ステップ；（ｇ）前記回収したＴＩＬ集団をステップ（ｆ）から輸注バッグに移すステップであって、ステップ（ｆ）から（ｇ）への前記移行は、系を開放せずに発生する、ステップを含む方法から得られる。一部の実施形態において、本方法は、患者から腫瘍試料を得るステップであって、前記腫瘍試料は第１のＴＩＬ集団を含む第１のステップ（ａ）を含む。一部の実施形態において、ＴＩＬの集団は、ステップ（ｇ）の前記輸注バッグから治療有効量で投与するためのものである。
【０５４３】
[00643]  一部の実施形態において、ステップ（ｈ）で治療上有効な投薬量のＴＩＬ細胞を投与する前に、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが前記患者に投与されている。一部の実施形態において、ＴＩＬの集団は、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンを受けた患者への投与用である。
【０５４４】
[00644]  一部の実施形態において、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間のシクロホスファミドの投与ステップと、それに続く２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間のフルダラビンの投与ステップを含む。
【０５４５】
[00645]  一部の実施形態において、本方法は、ステップ（ｈ）で前記患者に前記ＴＩＬ細胞を投与した翌日に始まる高用量ＩＬ−２レジメンで前記患者を処置するステップを更に含む。一部の実施形態において、ＴＩＬの集団は、高用量ＩＬ−２レジメン前の投与用である。一部の実施形態において、ＴＩＬの集団は、高用量ＩＬ−２レジメンの開始１日前の投与用である。
【０５４６】
[00646]  一部の実施形態において、高用量ＩＬ−２レジメンは、忍容量まで８時間毎に１５分ボーラス静脈内注入として投与される６００，０００又は７２０，０００ＩＵ／ｋｇを含む。
【０５４７】
[00647]  一部の実施形態において、前記第３のＴＩＬ集団から得られたエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、前記第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ２７＋の発現、ＣＤ２８＋の発現、より長いテロメア、ＣＤ５７発現の増加及びＣＤ５６発現の減少からなる群から選択される１つ以上の特徴を呈する。
【０５４８】
[00648]  一部の実施形態において、前記第３のＴＩＬ集団から得られたエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、前記第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ５７発現の増加及びＣＤ５６発現の減少を呈する。
【０５４９】
[00649]  本発明は、また、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を拡大培養する方法を提供し、その方法は、（ａ）処理した腫瘍断片を閉鎖系に加えるステップ；（ｂ）第２のＴＩＬ集団を得るために第１の細胞培養培地での前記第１のＴＩＬ集団の第１の拡大培養で実施するステップであって、前記第１の細胞培養培地は、ＩＬ−２を含み、前記第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器で実施され、前記第１の拡大培養は、約３〜１４日間の第１の期間内に初めの拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を得、前記第２のＴＩＬ集団は、前記第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ａ）からステップ（ｂ）への移行は、系を開放せずに発生する、ステップ；（ｃ）前記第２のＴＩＬ集団を第２の細胞培養培地で拡大培養するステップであって、前記第２の細胞培養培地は、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び抗原提示細胞を含み、前記拡大培養は、約７〜１４日間の第２の期間内に実施されて第３のＴＩＬ集団を得、前記第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団に対して、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加したサブ集団を呈し、前記拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は、系を開放せずに発生する、ステップ；（ｄ）ステップ（ｃ）から得られた前記第３のＴＩＬ集団を回収するステップであって、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放せずに発生する、ステップ；及び（ｅ）回収したＴＩＬ集団をステップ（ｄ）から前記輸注バッグに移すステップであって、ステップ（ｄ）から（ｅ）への前記移行は、系を開放せずに発生する、ステップを含む。
【０５５０】
[00650]  一部の実施形態において、本方法は、凍結保存プロセスを使用して、回収したＴＩＬ集団を含む輸注バッグを凍結保存するステップを更に含む。一部の実施形態において、凍結保存プロセスは、回収したＴＩＬ集団とCS10培地との１：１比を使用して実施される。
【０５５１】
[00651]  一部の実施形態において、抗原提示細胞は末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。一部の実施形態において、抗原提示細胞は人工抗原提示細胞である。
【０５５２】
[00652]  一部の実施形態において、ステップ（ｄ）の採取は、LOVO細胞処理系を使用して実施される。
【０５５３】
[00653]  一部の実施形態において、複数の断片は、約５０個の断片を含み、各断片は約２７ｍｍ３の容積を有する。一部の実施形態において、複数の断片は、約１３００ｍｍ３〜約１５００ｍｍ３の総容積を有する約３０〜約６０個の断片を含む。一部の実施形態において、複数の断片は、約１３５０ｍｍ３の総容積を有する約５０個の断片を含む。一部の実施形態において、複数の断片は、約１ｇ〜約１．５ｇの総質量を有する約５０個の断片を含む。
【０５５４】
[00654]  一部の実施形態において、第２の細胞培養培地は、Ｇコンテナ及びXuri細胞培養バッグからなる群から選択される容器内に提供される。
【０５５５】
[00655]  一部の実施形態において、ステップ（ｅ）の輸注バッグは、HypoThermosol含有輸注バッグである。
【０５５６】
[00656]  一部の実施形態において、ステップ（ｂ）の第１の期間及び前記ステップ（ｃ）の第２の期間は、１０日、１１日又は１２日の期間内にそれぞれ個別に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ｂ）の第１の期間及び前記ステップ（ｃ）の第２の期間は、１１日の期間内にそれぞれ個別に実施される。
【０５５７】
[00657]  一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｅ）は約２５日〜約３０日の期間内に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｅ）は約２０日〜約２５日の期間内に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｅ）は約２０日〜約２２日の期間内に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｅ）は、２２日以内に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｅ）及び凍結保存は２２日以内に実施される。
【０５５８】
[00658]  一部の実施形態において、ステップ（ｂ）〜（ｅ）は、単一の閉鎖系で実施され、ステップ（ｂ）〜（ｅ）を単一の容器で実施すると、ステップ（ｂ）〜（ｅ）を２つ以上の容器で実施した場合に比べ切除された腫瘍毎のＴＩＬ収量が増加する結果となる。
【０５５９】
[00659]  一部の実施形態において、抗原提示細胞は、系を開放せずにステップ（ｃ）の第２の期間中にＴＩＬに追加される。
【０５６０】
[00660]  一部の実施形態において、前記第３のＴＩＬ集団から得られたエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、前記第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ２７＋の発現、ＣＤ２８＋の発現、より長いテロメア、ＣＤ５７発現の増加及びＣＤ５６発現の減少からなる群から選択される１つ以上の特徴を呈する。
【０５６１】
[00661]  一部の実施形態において、前記第３のＴＩＬ集団から得られたエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、前記第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ５７発現の増加及びＣＤ５６発現の減少を呈する。
【０５６２】
[00662]  一部の実施形態において、微生物汚染のリスクは、開放系と比較して低減される。
【０５６３】
[00663]  一部の実施形態において、ステップ（ｅ）からのＴＩＬは、患者に注入される。
【０５６４】
[00664]  一部の実施形態において、閉鎖型容器は単一のバイオリアクターを含む。一部の実施形態において、閉鎖型容器はG-REX-10を含む。一部の実施形態において、閉鎖型容器はG-REX-100を含む。一部の実施形態において、閉鎖型容器はG-Rex 500を含む。一部の実施形態において、閉鎖型容器はXuri又はWave bioreactorガス透過性バッグを含む。
【０５６５】
[00665]  一部の実施形態において、本開示は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法も提供し、この方法は、
（ｂ）腫瘍断片が第１のＴＩＬ集団を含む閉鎖系に腫瘍断片を加えること；
（ｃ）ＩＬ−２を含む細胞培養培地で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約３〜１４日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｄ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を入手するために約７〜１４日間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団に対して、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加したサブ集団を含む治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｅ）ステップ（ｄ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生する、回収すること；及び
（ｆ）ステップ（ｅ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放せずに発生する、移すこと
を含む。
【０５６６】
[00666]  一部の実施形態において、本方法は、第１のステップとして
（ａ）患者から得られた腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること
も含む。
【０５６７】
[00667]  ある実施形態において、本方法は、インビトロ又はエキソビボ方法である。
【０５６８】
[00668]  一部の実施形態において、本開示は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法を提供し、この方法は、
（ａ）患者から得られた腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に加えること；
（ｃ）ＩＬ−２を含む細胞培養培地で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約３〜１４日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｄ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を入手するために約７〜１４日間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団に対して、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加したサブ集団を含むＴ細胞治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｅ）ステップ（ｄ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生する、回収すること；及び
（ｆ）ステップ（ｅ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放せずに発生する、移すこと
を含む。
【０５６９】
[00669]  ある実施形態において、本方法は、インビトロ又はエキソビボ方法である。
【０５７０】
[00670]  一部の実施形態において、本方法は、凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）で回収したＴＩＬ集団を含む輸注バッグを凍結保存するステップを更に含む。
【０５７１】
[00671]  一部の実施形態において、凍結保存プロセスは、回収したＴＩＬ集団と凍結保存培地との１：１比を使用して実施される。一部の実施形態において、凍結保存培地は、ジメチルスルホキシドを含む。一部の実施形態において、凍結保存培地は、Cryostor CS10、HypoThermasol又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【０５７２】
[00672]  一部の実施形態において、抗原提示細胞は末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。
【０５７３】
[00673]  一部の実施形態において、ＰＢＭＣは照射され、且つ同種異系である。
【０５７４】
[00674]  一部の実施形態において、ＰＢＭＣはステップ（ｄ）において９〜１４日目のいずれかに細胞培養物に加えられる。
【０５７５】
[00675]  一部の実施形態において、抗原提示細胞は人工抗原提示細胞である。
【０５７６】
[00676]  一部の実施形態において、ステップ（ｅ）の回収は、LOVO細胞処理系を使用して実施される。
【０５７７】
[00677]  一部の実施形態において、腫瘍断片は複数の断片であり、約４〜約５０個の断片を含み、各断片は約２７ｍｍ３の容積を有する。一部の実施形態において、複数の断片は、約１３００ｍｍ３〜約１５００ｍｍ３の総容積を有する約３０〜約６０個の断片を含む。一部の実施形態において、複数の断片は、約１３５０ｍｍ３の総容積を有する約５０個の断片を含む。一部の実施形態において、複数の断片は、約１ｇ〜約１．５ｇの総質量を有する約５０個の断片を含む。
【０５７８】
[00678]  一部の実施形態において、細胞培養培地は、Ｇコンテナ及びXuri細胞培養バッグからなる群から選択される容器内に提供される。
【０５７９】
[00679]  一部の実施形態において、ステップ（ｆ）の輸注バッグは、HypoThermosol含有輸注バッグである。
【０５８０】
[00680]  一部の実施形態において、ステップ（ｃ）の第１の期間及びステップ（ｅ）の第２の期間は、１０日、１１日又は１２日の期間内にそれぞれ個別に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ｃ）の第１の期間及びステップ（ｅ）の第２の期間は、１１日の期間内にそれぞれ個別に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｆ）は約２５日〜約３０日の期間内に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｆ）は約２０日〜約２５日の期間内に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｆ）は約２０日〜約２２日の期間内に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｆ）は、２２日以内に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｆ）及び凍結保存は２２日以内に実施される。
【０５８１】
[00681]  一部の実施形態において、ステップ（ｅ）で回収した治療用ＴＩＬ集団は、治療上有効な投薬量のＴＩＬとなるのに十分なＴＩＬを含む。一部の実施形態において、治療上有効な投薬量となるのに十分なＴＩＬの数は約２．３×１０１０〜約１３．７×１０１０個である。
【０５８２】
[00682]  一部の実施形態において、ステップ（ｂ）〜（ｅ）は、単一の容器で実施され、ステップ（ｂ）〜（ｅ）を単一の容器で実施すると、ステップ（ｂ）〜（ｅ）を２つ以上の容器で実施した場合に比べ切除された腫瘍毎のＴＩＬ収量が増加する結果となる。
【０５８３】
[00683]  一部の実施形態において、抗原提示細胞は、系を開放せずにステップ（ｄ）の第２の期間中にＴＩＬに追加される。
【０５８４】
[00684]  一部の実施形態において、治療用ＴＩＬ集団中のエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ２７＋の発現、ＣＤ２８＋の発現、より長いテロメア、ＣＤ５７発現の増加及びＣＤ５６発現の減少からなる群から選択される１つ以上の特徴を呈する。
【０５８５】
[00685]  一部の実施形態において、第３のＴＩＬ集団から得られたエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ５７発現の増加及びＣＤ５６発現の減少を呈する。
【０５８６】
[00686]  一部の実施形態において、微生物汚染のリスクは、開放系と比較して低減される。
【０５８７】
[00687]  一部の実施形態において、ステップ（ｆ）からのＴＩＬは、患者に注入される。
【０５８８】
[00688]  一部の実施形態において、複数の断片は、約４個の断片を含む。一部の実施形態において、４つの断片は、G-REX-100に入れられる。一部の実施形態において、４つの断片は、直径約０．５ｃｍである。一部の実施形態において、４つの断片は、G-REX-100に入れられる。一部の実施形態において、４つの断片は、直径が約０．１ｃｍ、０．２ｃｍ、０．３ｃｍ、０．４ｃｍ、０．５ｃｍ、０．６ｃｍ、０．７ｃｍ、０．８ｃｍ、０．９ｃｍ又は１ｃｍである。一部の実施形態において、４つの断片は、直径が約０．１ｃｍ、０．２ｃｍ、０．３ｃｍ、０．４ｃｍ、０．５ｃｍ、０．６ｃｍ、０．７ｃｍ、０．８ｃｍ、０．９ｃｍ又は１ｃｍであり、G-REX-100に置かれる。一部の実施形態において、４つの断片は、直径が約０．１ｃｍ、０．２ｃｍ、０．３ｃｍ、０．４ｃｍ、０．５ｃｍ、０．６ｃｍ、０．７ｃｍ、０．８ｃｍ、０．９ｃｍ又は１ｃｍであり、G-REX-100と同等の容積の容器に置かれる。一部の実施形態において、４つの断片は、直径約０．５ｃｍであり、G-REX-100に置かれる。一部の実施形態において、４つの断片は、直径が約０．５ｃｍであり、G-REX-100と同等の容積の容器に置かれる。
【０５８９】
[00689]  ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）の更なる詳細は、本明細書以下に提供され、例えば限定はされないが、「ステップＡ：患者腫瘍試料を入手する」、「ステップＢ：第１の拡大培養」、「ステップＣ：第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行」、「ステップＤ：第２の拡大培養」、「ステップＥ：ＴＩＬを回収する」及び「ステップＦ：最終的な製剤／輸注バッグに移す」の見出しで記載される実施例を含む。
【０５９０】
[00690]  一部の実施形態において、本開示は、拡大培養した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を投与することを含む癌を有する対象の処置方法を提供し、この方法は、
（ａ）対象から得られた腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に加えること；
（ｃ）ＩＬ−２を含む細胞培養培地で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約３〜１４日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｄ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を入手するために約７〜１４日間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団に対して、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加したサブ集団を含むＴ細胞治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｅ）ステップ（ｄ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生する、回収すること；及び
（ｆ）ステップ（ｅ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放せずに発生する、移すこと；
（ｇ）凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）からの回収されたＴＩＬ集団を含む輸注バッグを任意選択で凍結保存すること；並びに
（ｈ）ステップ（ｇ）における輸注バッグから治療上有効な投薬量の第３のＴＩＬ集団を患者に投与すること
を含む。
【０５９１】
[00691]  一部の実施形態において、本発明は、癌の処置に使用するための腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療集団を提供し、その集団は、
（ｂ）腫瘍断片が第１のＴＩＬ集団を含む閉鎖系に腫瘍断片を加えること；
（ｃ）ＩＬ−２を含む細胞培養培地で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約３〜１４日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｄ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を入手するために約７〜１４日間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団に対して、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加したサブ集団を含むＴ細胞治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｅ）ステップ（ｄ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生する、回収すること；及び
（ｆ）ステップ（ｅ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放せずに発生する、移すこと；並びに
（ｇ）凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）からの回収されたＴＩＬ集団を含む輸注バッグを任意選択で凍結保存すること
のステップを含む方法から入手可能である。
【０５９２】
[00692]  一部の実施形態において、その集団は、第１のステップとして
（ａ）患者から得られた腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること
を含む方法によって得ることもできる。
【０５９３】
[00693]  ある実施形態において、本方法は、インビトロ又はエキソビボ方法である。
【０５９４】
[00694]  一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｆ）のいずれかは、本明細書で開示される１つ以上の特徴、例えば、「ステップＡ：患者腫瘍試料を入手する」、「ステップＢ：第１の拡大培養」、「ステップＣ：第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行」、「ステップＤ：第２の拡大培養」、「ステップＥ：ＴＩＬを回収する」及び「ステップＦ：最終的な製剤／輸注バッグに移す」という見出しで開示される１つ以上特徴を含む。
【０５９５】
[00695]  一部の実施形態において、ステップ（ｇ）は、本明細書に開示される１つ以上の特徴、例えば、「ステップＨ：任意選択のＴＩＬ凍結保存」という見出しで開示される１つ以上の特徴を含む。一部の実施形態において、ステップ（ｈ）は、本明細書に開示される１つ以上の特徴、例えば、「ステップＦ：医薬組成物、投薬量及び投与レジメン」という見出しで開示される１つ以上の特徴を含む。
【０５９６】
[00696]  一部の実施形態において、ステップ（ｅ）で回収した治療用ＴＩＬ集団は、ステップ（ｈ）の治療上有効な投薬量のＴＩＬを投与するのに十分なＴＩＬを含む。
【０５９７】
[00697]  一部の実施形態において、ステップ（ｈ）における治療上有効な投薬量の投与に十分なＴＩＬの数は約２．３×１０１０〜約１３．７×１０１０個である。
【０５９８】
[00698]  一部の実施形態において、抗原提示細胞（ＡＰＣ）はＰＢＭＣである。
【０５９９】
[00699]  一部の実施形態において、ＰＢＭＣはステップ（ｄ）において９〜１４日目のいずれかに細胞培養物に加えられる。
【０６００】
[00700]  一部の実施形態において、ステップ（ｈ）で治療上有効な投薬量のＴＩＬ細胞を投与する前に、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが患者に投与されている。
【０６０１】
[00701]  一部の実施形態において、癌を処置する際及び骨髄非破壊的リンパ枯渇レジメンと組み合わせて使用するための、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療集団が提供される。一部の実施形態において、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療集団を投与する前に、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが投与される。
【０６０２】
[00702]  一部の実施形態において、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間のシクロホスファミドの投与ステップと、それに続く２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間のフルダラビンの投与ステップを含む。
【０６０３】
[00703]  一部の実施形態における、ステップ（ｈ）で患者にＴＩＬ細胞を投与した翌日に始まる高用量ＩＬ−２レジメンで患者を処置するステップ。
【０６０４】
[00704]  一部の実施形態において、癌処置及び高用量ＩＬ−２レジメンと組み合わせて使用するための、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療集団が提供される。一部の実施形態において、高用量ＩＬ−２レジメンは、ＴＩＬ細胞の治療集団の投与の翌日に始まる。
【０６０５】
[00705]  一部の実施形態において、高用量ＩＬ−２レジメンは、忍容量まで８時間毎に１５分ボーラス静脈内注入として投与される６００，０００又は７２０，０００ＩＵ／ｋｇを含む。
【０６０６】
[00706]  一部の実施形態において、治療用ＴＩＬ集団中のエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ２７＋の発現、ＣＤ２８＋の発現、より長いテロメア、ＣＤ５７発現の増加及びＣＤ５６発現の減少からなる群から選択される１つ以上の特徴を呈する。
【０６０７】
[00707]  一部の実施形態において、治療用ＴＩＬ集団のエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ５７発現の増加及びＣＤ５６発現の減少を呈する。
【０６０８】
[00708]  本開示は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法も提供し、この方法は、
（ａ）患者から切除された腫瘍からの処理された腫瘍断片を閉鎖系に加えて、第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）ＩＬ−２を含む細胞培養培地で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約３〜１４日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ａ）からステップ（ｂ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｃ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を入手するために約７〜１４日間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団に対して、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加したサブ集団を含むＴ細胞治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｄ）ステップ（ｃ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放せずに発生する、回収すること；及び
（ｅ）ステップ（ｄ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｄ）から（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生する、移すこと
を含む。
【０６０９】
[00709]  一部の実施形態において、ステップ（ｄ）で回収した治療用ＴＩＬ集団は、治療上有効な投薬量のＴＩＬとなるのに十分なＴＩＬを含む。
【０６１０】
[00710]  一部の実施形態において、治療上有効な投薬量となるのに十分なＴＩＬの数は約２．３×１０１０〜約１３．７×１０１０個である。
【０６１１】
[00711]  一部の実施形態において、本方法は、凍結保存プロセスを使用して、回収したＴＩＬ集団を含む輸注バッグを凍結保存するステップを更に含む。
【０６１２】
[00712]  一部の実施形態において、凍結保存プロセスは、回収したＴＩＬ集団とCS10培地との１：１比を使用して実施される。
【０６１３】
[00713]  一部の実施形態において、本開示は、拡大培養した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を投与することを含む癌を有する対象の処置方法も提供し、この方法は、
（ａ）対象から得られた腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に加えること；
（ｃ）ＩＬ−２を含む細胞培養培地で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約３〜１４日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｄ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を入手するために約７〜１４日間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団に対して、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加したサブ集団を含むＴ細胞治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｅ）ステップ（ｄ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生する、回収すること；及び
（ｆ）ステップ（ｅ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放せずに発生する、移すこと；
（ｇ）凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）からの回収されたＴＩＬ集団を含む輸注バッグを任意選択で凍結保存すること；並びに
（ｈ）ステップ（ｇ）における輸注バッグから治療上有効な投薬量の第３のＴＩＬ集団を患者に投与すること
を含み、ＴＩＬ集団の選択は、ステップ（ａ）から（ｈ）のいずれの間も実施されない。ある実施形態において、表現型に基づく第２のＴＩＬ集団（プレＲＥＰ集団）の選択は、ステップ（ｄ）の第２の拡大培養を実施する前には実施されない。ある実施形態において、第１のＴＩＬ集団、第２のＴＩＬ集団、第３のＴＩＬ集団又はＣＤ８発現に基づく回収ＴＩＬの選択は、ステップ（ａ）〜（ｈ）のいずれの間も実施されない。
【０６１４】
[00714]  一部の実施形態において、本開示は、拡大培養した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を投与することを含む癌を有する対象の処置方法も提供し、この方法は、
（ａ）対象から得られた腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に加えること；
（ｃ）ＩＬ−２を含む細胞培養培地で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約３〜１４日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｄ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を入手するために約７〜１４日間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団に対して、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加したサブ集団を含むＴ細胞治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｅ）ステップ（ｄ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生する、回収すること；及び
（ｆ）ステップ（ｅ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放せずに発生する、移すこと；
（ｇ）凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）から回収したＴＩＬ集団を含む輸注バッグを凍結保存することであって、凍結保存プロセスは、回収したＴＩＬ集団で凍結保存培地の混合を含む、凍結保存すること；
（ｈ）ステップ（ｇ）における輸注バッグから治療上有効な投薬量の第３のＴＩＬ集団を患者に投与すること
を含み、ＴＩＬ集団の選択は、ステップ（ａ）から（ｈ）のいずれの間も実施されない。ある実施形態において、表現型に基づく第２のＴＩＬ集団（例えば、プレＲＥＰ集団）の選択は、ステップ（ｄ）の第２の拡大培養を実施する前には実施されない。ある実施形態において、第１のＴＩＬ集団、第２のＴＩＬ集団、第３のＴＩＬ集団又はＣＤ８発現に基づく回収ＴＩＬの選択は、ステップ（ａ）〜（ｈ）のいずれの間も実施されない。一部の実施形態において、回収ＴＩＬ集団を投与する前に、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが投与される。一部の実施形態において、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間のシクロホスファミドの投与ステップと、それに続く２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間のフルダラビンの投与ステップを含む。
【０６１５】
[00715]  一部の実施形態において、抗原提示細胞は末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは照射され、且つ同種異系である。一部の実施形態において、ＰＢＭＣはステップ（ｃ）において９〜１４日目のいずれかに細胞培養物に加えられる。
【０６１６】
[00716]  一部の実施形態において、抗原提示細胞は人工抗原提示細胞である。
【０６１７】
[00717]  一部の実施形態において、ステップ（ｄ）の回収は、LOVO細胞処理系を使用して実施される。
【０６１８】
[00718]  一部の実施形態において、この方法は、ステップ（ｄ）は、Fresenius Kabi製のLOVO系などのLOVO細胞処理系を介する回収を含む。用語「LOVO細胞処理系」は、滅菌及び／又は閉鎖系環境で、回転膜又は回転フィルターなどの膜又はフィルターを通して細胞を含む溶液を送り出すことができ、ペレット化せず上清又は細胞培養液を除去する連続フロー及び細胞処理を可能にする、機器又は装置も指す。ある場合には、細胞処理系は、閉鎖、無菌系で細胞分離、洗浄、流体交換、濃縮及び／又は他の細胞処理ステップを実施することができる。
【０６１９】
[00719]  一部の実施形態において、腫瘍断片は複数の断片であり、約４〜約５０個の断片を含み、各断片は約２７ｍｍ３の容積を有する。一部の実施形態において、複数の断片は、約１３００ｍｍ３〜約１５００ｍｍ３の総容積を有する約３０〜約６０個の断片を含む。一部の実施形態において、複数の断片は、約１３５０ｍｍ３の総容積を有する約５０個の断片を含む。一部の実施形態において、複数の断片は、約１ｇ〜約１．５ｇの総質量を有する約５０個の断片を含む。
【０６２０】
[00720]  一部の実施形態において、複数の断片は、約４個の断片を含む。一部の実施形態において、４つの断片は、G-REX-100に入れられる。一部の実施形態において、４つの断片は、直径が約０．１ｃｍ、０．２ｃｍ、０．３ｃｍ、０．４ｃｍ、０．５ｃｍ、０．６ｃｍ、０．７ｃｍ、０．８ｃｍ、０．９ｃｍ又は１ｃｍである。一部の実施形態において、４つの断片は、直径が約０．１ｃｍ、０．２ｃｍ、０．３ｃｍ、０．４ｃｍ、０．５ｃｍ、０．６ｃｍ、０．７ｃｍ、０．８ｃｍ、０．９ｃｍ又は１ｃｍであり、G-REX-100に入れられる。一部の実施形態において、４つの断片は、直径が約０．１ｃｍ、０．２ｃｍ、０．３ｃｍ、０．４ｃｍ、０．５ｃｍ、０．６ｃｍ、０．７ｃｍ、０．８ｃｍ、０．９ｃｍ又は１ｃｍであり、G-REX-100と同等の容積の容器に入れられる。一部の実施形態において、４つの断片は、直径約０．５ｃｍであり、G-REX-100に入れられる。一部の実施形態において、４つの断片は、直径が約０．５ｃｍであり、G-REX-100と同等の容積の容器に入れられる。
【０６２１】
[00721]  一部の実施形態において、細胞培養培地は、Ｇコンテナ及びXuri細胞培養バッグからなる群から選択される容器内に提供される。
【０６２２】
[00722]  一部の実施形態において、ステップ（ｅ）の輸注バッグは、HypoThermosol含有輸注バッグである。
【０６２３】
[00723]  一部の実施形態において、ステップ（ｂ）の第１の期間及びステップ（ｃ）の第２の期間は、１０日、１１日又は１２日の期間内にそれぞれ個別に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ｂ）の第１の期間及びステップ（ｃ）の第２の期間は、１１日の期間内にそれぞれ個別に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｅ）は約２５日〜約３０日の期間内に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｅ）は約２０日〜約２５日の期間内に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｅ）は約２０日〜約２２日の期間内に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｅ）は、２２日以内に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｅ）及び凍結保存は２２日以内に実施される。
【０６２４】
[00724]  一部の実施形態において、ステップ（ｂ）〜（ｅ）は、単一の容器で実施され、ステップ（ｂ）〜（ｅ）を単一の容器で実施すると、ステップ（ｂ）〜（ｅ）を２つ以上の容器で実施した場合に比べ切除された腫瘍毎のＴＩＬ収量が増加する結果となる。
【０６２５】
[00725]  一部の実施形態において、抗原提示細胞は、系を開放せずにステップ（ｃ）の第２の期間中にＴＩＬに追加される。
【０６２６】
[00726]  一部の実施形態において、治療用ＴＩＬ集団で得られたエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ２７＋の発現、ＣＤ２８＋の発現、より長いテロメア、ＣＤ５７発現の増加及びＣＤ５６発現の減少からなる群から選択される１つ以上の特徴を呈する。
【０６２７】
[00727]  一部の実施形態において、治療用ＴＩＬ集団で得られたエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞と比べて、ＣＤ５７発現の増加及びＣＤ５６発現の減少を呈する。
【０６２８】
[00728]  一部の実施形態において、微生物汚染のリスクは、開放系と比較して低減される。
【０６２９】
[00729]  一部の実施形態において、ステップ（ｅ）からのＴＩＬは、患者に注入される。
【０６３０】
[00730]  一部の実施形態において、閉鎖型容器は単一のバイオリアクターを含む。一部の実施形態において、閉鎖型容器はG-REX-10を含む。一部の実施形態において、閉鎖型容器はG-REX-100を含む。
【０６３１】
ＶＩ．更なる例示的な実施形態
１．腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法であって、
（ａ）患者から得られた腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に加えること；
（ｃ）ＩＬ−２及び任意選択でＯＫＴ−３を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約３〜１４日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｄ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、任意選択でＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約７〜１４日間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｅ）ステップ（ｄ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生する、回収すること；及び
（ｆ）ステップ（ｅ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放せずに発生する、移すこと
を含む方法。
２．凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）からの回収されたＴＩＬ集団を含む輸注バッグを凍結保存するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
３．凍結保存プロセスは、回収されたＴＩＬ集団と凍結保存培地との１：１比を使用して実施される、請求項１記載の方法。
４．抗原提示細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である、請求項１に記載の方法。
５．ＰＢＭＣは、照射され、且つ同種異系である、請求項４に記載の方法。
６．ＰＢＭＣは、ステップ（ｄ）において９〜１４日目のいずれかに細胞培養物に加えられる、請求項４に記載の方法。
７．抗原提示細胞は、人工抗原提示細胞である、請求項１に記載の方法。
８．ステップ（ｅ）の回収は、膜ベースの細胞処理系を使用して実施される、請求項１に記載の方法。
９．ステップ（ｅ）の回収は、LOVO細胞処理系を使用して実施される、請求項１に記載の方法。
１０．複数の断片は、約４〜約５０個の断片を含み、各断片は、約２７ｍｍ３の体積を有する、請求項１に記載の方法。
１１．複数の断片は、約３０〜約６０個の断片を含み、総容積は、約１３００ｍｍ３〜約１５００ｍｍ３である、請求項１に記載の方法。
１２．複数の断片は、約５０個の断片を含み、総容積は、約１３５０ｍｍ３である、請求項９に記載の方法。
１３．複数の断片は、約５０個の断片を含み、総質量は、約１グラム〜約１．５グラムである、請求項１に記載の方法。
１４．細胞培養培地は、Ｇコンテナ及びXuri細胞培養バッグからなる群から選択される容器内に提供される、請求項１に記載の方法。
１５．ステップ（ｄ）の細胞培養培地は、ＩＬ−１５及び／又はＩＬ−２１を更に含む、請求項１に記載の方法。
１６．ＩＬ−２濃度は、約１０，０００ＩＵ／ｍＬ〜約５，０００ＩＵ／ｍＬである、先の請求項のいずれかに記載の方法。
１７．ＩＬ−１５濃度は、約５００ＩＵ／ｍＬ〜約１００ＩＵ／ｍＬである、請求項１５に記載の方法。
１８．ＩＬ−２１濃度は、約２０ＩＵ／ｍＬ〜約０．５ＩＵ／ｍＬである、請求項１に記載の方法。
１９．ステップ（ｆ）の輸注バッグは、HypoThermosol含有輸注バッグである、請求項１に記載の方法。
２０．凍結保存培地は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む、請求項３に記載の方法。
２１．凍結保存培地は、７％〜１０％のＤＭＳＯを含む、請求項１７に記載の方法。
２２．ステップ（ｃ）の第１の期間及びステップ（ｅ）の第２の期間は、１０日、１１日又は１２日の期間内にそれぞれ個別に実施される、請求項１に記載の方法。
２３．ステップ（ｃ）の第１の期間及びステップ（ｅ）の第２の期間は、１１日の期間内にそれぞれ個別に実施される、請求項１に記載の方法。
２４．ステップ（ａ）〜（ｆ）は、約１０日〜約２２日の期間内に実施される、請求項１に記載の方法。
２５．ステップ（ａ）〜（ｆ）は、約２０日〜約２２日の期間内に実施される、請求項１に記載の方法。
２６．ステップ（ａ）〜（ｆ）は、約１５日〜約２０日の期間内に実施される、請求項１に記載の方法。
２７．ステップ（ａ）〜（ｆ）は、約１０日〜約２０日の期間内に実施される、請求項１に記載の方法。
２８．ステップ（ａ）〜（ｆ）は、約１０日〜約１５日の期間内に実施される、請求項１に記載の方法。
２９．ステップ（ａ）〜（ｆ）は、２２日以内に実施される、請求項１に記載の方法。
３０．ステップ（ａ）〜（ｆ）は、２０日以内に実施される、請求項１に記載の方法。
３１．ステップ（ａ）〜（ｆ）は、１５日以内に実施される、請求項１に記載の方法。
３２．ステップ（ａ）〜（ｆ）は、１０日以内に実施される、請求項１に記載の方法。
３３．ステップ（ａ）〜（ｆ）は、２２日以内に実施される、請求項２に記載の方法。
３４．ステップ（ｅ）で回収された治療用ＴＩＬ集団中は、治療上有効な投薬量のＴＩＬのために十分なＴＩＬを含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
３５．治療上有効な投薬量のために十分なＴＩＬの数は、約２．３×１０１０〜約１３．７×１０１０個である、請求項３４に記載の方法。
３６．ステップ（ｂ）〜（ｅ）は、単一の容器内で実施され、ステップ（ｂ）〜（ｅ）を単一の容器内で実施することは、ステップ（ｂ）〜（ｅ）を２つ以上の容器内で実施することと比較して、切除された腫瘍毎のＴＩＬ収量の増加をもたらす、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
３７．抗原提示細胞は、系を開放せずにステップ（ｄ）の第２の期間中にＴＩＬに加えられる、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
３８．ステップ（ｄ）の第３のＴＩＬ集団は、対象に投与されたとき、有効性の増加、インターフェロンガンマ産生の増加、ポリクローナル性の増加、平均ＩＰ−１０の増加及び／又は平均ＭＣＰ−１の増加を提供する、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
３９．ステップ（ｄ）の第３のＴＩＬ集団は、対象に投与されたとき、少なくとも５倍以上のインターフェロンガンマ産生を提供する、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
４０．ステップ（ｄ）の第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団に対して、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加したサブ集団を含む治療用ＴＩＬ集団であり、治療用ＴＩＬ集団において得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞に対して、ＣＤ２７＋を発現すること、ＣＤ２８＋を発現すること、より長いテロメア、増加したＣＤ５７発現及び減少したＣＤ５６発現からなる群から選択される１つ以上の特徴を呈する、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
４１．第３のＴＩＬ集団において得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞に対して、増加したＣＤ５７発現及び減少したＣＤ５６発現を呈する、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
４２．微生物汚染のリスクは、開放系と比較して低減される、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
４３．ステップ（ｇ）からのＴＩＬは、患者に注入される、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
４４．複数の断片は、約４個の断片を含む、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
４５．拡大培養された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を投与することを含む、癌を有する対象を処置する方法であって、
（ａ）患者から得られた腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することにより、対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に加えること；
（ｃ）ＩＬ−２及び任意選択でＯＫＴ−３を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約３〜１４日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｄ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、任意選択でＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約７〜１４日間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｅ）ステップ（ｄ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生する、回収すること；及び
（ｆ）ステップ（ｅ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放せずに発生する、移すこと；
（ｇ）任意選択で、凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）からの回収されたＴＩＬ集団を含む輸注バッグを凍結保存すること；並びに
（ｈ）ステップ（ｇ）における輸注バッグから治療上有効な投薬量の第３のＴＩＬ集団を患者に投与すること
を含む方法。
４６．ステップ（ｅ）で回収された治療用ＴＩＬ集団中は、治療上有効な投薬量のＴＩＬのために十分なステップ（ｈ）のＴＩＬを含む、請求項４５に記載の方法。
４７．ステップ（ｈ）における治療上有効な投薬量の投与に十分なＴＩＬの数は、約２．３×１０１０〜約１３．７×１０１０個である、請求項４６に記載の方法。
４８．抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、ＰＢＭＣである、請求項４７に記載の方法。
４９．ＰＢＭＣは、ステップ（ｄ）において９〜１４日目のいずれかに細胞培養物に加えられる、請求項４８に記載の方法。
５０．ステップ（ｈ）で治療上有効な投薬量のＴＩＬ細胞を投与する前に、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、患者に投与されている、請求項４５〜４９のいずれか一項に記載の方法。
５１．骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間のシクロホスファミドの投与ステップと、それに続く２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間のフルダラビンの投与ステップとを含む、請求項５０に記載の方法。
５２．ステップ（ｈ）で患者にＴＩＬ細胞を投与した翌日に始まる高用量ＩＬ−２レジメンで患者を処置するステップを更に含む、請求項４５〜５１のいずれかに記載の方法。
５３．高用量ＩＬ−２レジメンは、忍容量まで８時間毎に１５分ボーラス静脈内注入として投与される６００，０００又は７２０，０００ＩＵ／ｋｇを含む、請求項５２に記載の方法。
５４．ステップ（ｄ）の第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団に対して、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加したサブ集団を含む治療用ＴＩＬ集団であり、治療用ＴＩＬ集団において得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞に対して、ＣＤ２７＋を発現すること、ＣＤ２８＋を発現すること、より長いテロメア、増加したＣＤ５７発現及び減少したＣＤ５６発現からなる群から選択される１つ以上の特徴を呈する、先の請求項のいずれかに記載の方法。
５５．治療用ＴＩＬ集団のエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞に対して、増加したＣＤ５７発現及び減少したＣＤ５６発現を呈する、先の請求項のいずれかに記載の方法。
５６．癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、腎癌及び腎細胞癌からなる群から選択される、先の請求項のいずれかに記載の方法。
５７．癌は、黒色腫、ＨＮＳＣＣ、子宮頸癌及びＮＳＣＬＣからなる群から選択される、先の請求項のいずれかに記載の方法。
５８．癌は、黒色腫である、先の請求項のいずれかに記載の方法。
５９．癌は、ＨＮＳＣＣである、先の請求項のいずれかに記載の方法。
６０．癌は、子宮頸癌である、先の請求項のいずれかに記載の方法。
６１．癌は、ＮＳＣＬＣである、先の請求項のいずれかに記載の方法。
６２．腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法であって、
（ａ）患者から切除された腫瘍からの処理された腫瘍断片を閉鎖系に加えて、第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）ＩＬ−２及び任意選択でＯＫＴ−３を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約３〜１４日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ａ）からステップ（ｂ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｃ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、任意選択でＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約７〜１４日間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｄ）ステップ（ｃ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放せずに発生する、回収すること；及び
（ｅ）ステップ（ｄ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｄ）から（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生する、移すこと
を含む方法。
６３．ステップ（ｄ）で回収された治療用ＴＩＬ集団は、治療上有効な投薬量のＴＩＬのために十分なＴＩＬを含む、請求項６２に記載の方法。
６４．治療上有効な投薬量のために十分なＴＩＬの数は、約２．３×１０１０〜約１３．７×１０１０個である、請求項６３に記載の方法。
６５．凍結保存プロセスを使用して、回収されたＴＩＬ集団を含む輸注バッグを凍結保存するステップを更に含む、請求項６４に記載の方法。
６６．凍結保存プロセスは、回収されたＴＩＬ集団と凍結保存培地との１：１比を使用して実施される、請求項６５に記載の方法。
６７．抗原提示細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である、請求項６２に記載の方法。
６８．ＰＢＭＣは、照射され、且つ同種異系である、請求項６７に記載の方法。
６９．ＰＢＭＣは、ステップ（ｃ）において９〜１４日目のいずれかに細胞培養物に加えられる、請求項６８に記載の方法。
７０．抗原提示細胞は、人工抗原提示細胞である、請求項６２に記載の方法。
７１．ステップ（ｄ）の回収は、LOVO細胞処理系を使用して実施される、請求項６２に記載の方法。
７２．複数の断片は、約４〜約５０個の断片を含み、各断片は、約２７ｍｍ３の容積を有する、請求項６２に記載の方法。
７３．複数の断片は、約３０〜約６０個の断片を含み、総容積は、約１３００ｍｍ３〜約１５００ｍｍ３である、請求項６２に記載の方法。
７４．複数の断片は、約５０個の断片を含み、総容積は、約１３５０ｍｍ３である、請求項６３に記載の方法。
７５．複数の断片は、約５０個の断片を含み、総質量は、約１グラム〜約１．５グラムである、請求項６２に記載の方法。
７６．複数の断片は、約４個の断片を含む、請求項６２に記載の方法。
７７．第２の細胞培養培地は、Ｇコンテナ及びXuri細胞培養バッグからなる群から選択される容器内に提供される、請求項６２に記載の方法。
７８．ステップ（ｅ）の輸注バッグは、HypoThermosol含有輸注バッグである、請求項６２に記載の方法。
７９．ステップ（ｂ）の第１の期間及びステップ（ｃ）の第２の期間は、１０日、１１日又は１２日の期間内にそれぞれ個別に実施される、請求項６２に記載の方法。
８０．ステップ（ｂ）の第１の期間及びステップ（ｃ）の第２の期間は、１１日の期間内にそれぞれ個別に実施される、請求項６２に記載の方法。
８１．ステップ（ａ）〜（ｅ）は、約１０日〜約２２日の期間内に実施される、請求項６２に記載の方法。
８２．ステップ（ａ）〜（ｅ）は、約１０日〜約２０日の期間内に実施される、請求項６２に記載の方法。
８３．ステップ（ａ）〜（ｅ）は、約１０日〜約１５日の期間内に実施される、請求項６２に記載の方法。
８４．ステップ（ａ）〜（ｅ）は、２２日以内に実施される、請求項６２に記載の方法。
８５．ステップ（ａ）〜（ｅ）は、２２日以内に実施される、請求項６５に記載の方法。
８６．ステップ（ｂ）〜（ｅ）は、単一の容器内で実施され、ステップ（ｂ）〜（ｅ）を単一の容器内で実施することは、ステップ（ｂ）〜（ｅ）を２つ以上の容器内で実施することと比較して、切除された腫瘍毎のＴＩＬ収量の増加をもたらす、請求項６２〜８５のいずれか一項に記載の方法。
８７．抗原提示細胞は、系を開放せずにステップ（ｃ）の第２の期間中にＴＩＬに加えられる、請求項６２〜８６のいずれか一項に記載の方法。
８８．ステップ（ｄ）の第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団に対して、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加したサブ集団を含む治療用ＴＩＬ集団であり、治療用ＴＩＬ集団において得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞に対して、ＣＤ２７＋を発現すること、ＣＤ２８＋を発現すること、より長いテロメア、増加したＣＤ５７発現及び減少したＣＤ５６発現からなる群から選択される１つ以上の特徴を呈する、請求項６２〜８７のいずれか一項に記載の方法。
８９．治療用ＴＩＬ集団において得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞に対して、増加したＣＤ５７発現及び減少したＣＤ５６発現を呈する、請求項６２〜８８のいずれか一項に記載の方法。
９０．微生物汚染のリスクは、開放系と比較して低減される、請求項６２〜８９のいずれか一項に記載の方法。
９１．ステップ（ｅ）からのＴＩＬは、患者に注入される、請求項６２〜９０のいずれか一項に記載の方法。
９２．閉鎖型容器は、単一のバイオリアクターを含む、先の請求項のいずれかに記載の方法。
９３．閉鎖型容器は、G-REX-10を含む、請求項９２に記載の方法。
９４．閉鎖型容器は、G-REX-100を含む、請求項９２に記載の方法。
９５．ステップ（ｄ）において、抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、２５：１〜１００：１のＡＰＣ：ＴＩＬ比で第２のＴＩＬ集団の細胞培養物に加えられる、請求項１〜６１のいずれか一項に記載の方法。
９６．細胞培養物は、２．５×１０９個のＡＰＣ対１００×１０６個のＴＩＬの比を有する、請求項９５に記載の方法。
９７．ステップ（ｃ）において、抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、２５：１〜１００：１のＡＰＣ：ＴＩＬ比で第２のＴＩＬ集団の細胞培養物に加えられる、請求項６２〜９４のいずれか一項に記載の方法。
９８．細胞培養物は、２．５×１０９個のＡＰＣ対１００×１０６個のＴＩＬの比を有する、請求項９７に記載の方法。
９９．癌を有する対象の処置に使用するための拡大培養ＴＩＬ集団であって、
（ａ）患者から得られた腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することにより、対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に加えること；
（ｃ）ＩＬ−２及び任意選択でＯＫＴ−３を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約３〜１４日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｄ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、任意選択でＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約７〜１４日間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｅ）ステップ（ｄ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；及び
（ｆ）ステップ（ｅ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放せずに発生する、移すこと；並びに
（ｇ）任意選択で、凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）からの回収されたＴＩＬ集団を含む輸注バッグを凍結保存すること
を含む方法によって得ることができる第３のＴＩＬ集団である、拡大培養ＴＩＬ集団。
１００．方法は、請求項１〜９９のいずれかに列挙される特徴の１つ以上を更に含む、請求項９９に記載の癌を有する対象の処置に使用するためのＴＩＬ集団。
１０１．腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法であって、
（ａ）患者から得られた腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に加えること；
（ｃ）ＩＬ−２、任意選択でＯＫＴ−３及び任意選択で腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）アゴニストを含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約３〜１４日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｄ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、任意選択でＯＫＴ−３及び任意選択で腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）アゴニスト並びに抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約７〜１４日間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｅ）ステップ（ｄ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生する、回収すること；及び
（ｆ）ステップ（ｅ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放せずに発生する、移すこと
を含む方法。
１０２．凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）からの回収されたＴＩＬ集団を含む輸注バッグを凍結保存するステップを更に含む、請求項１０１に記載の方法。
１０３．凍結保存プロセスは、回収されたＴＩＬ集団と凍結保存培地との１：１比を使用して実施される、請求項１０１記載の方法。
１０４．抗原提示細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である、請求項１０１に記載の方法。
１０５．ＰＢＭＣは、照射され、且つ同種異系である、請求項１０４に記載の方法。
１０６．ＰＢＭＣは、ステップ（ｄ）において９〜１４日目のいずれかに細胞培養物に加えられる、請求項１０４に記載の方法。
１０７．抗原提示細胞は、人工抗原提示細胞である、請求項１０１に記載の方法。
１０８．ステップ（ｅ）の回収は、膜ベースの細胞処理系を使用して実施される、請求項１０１に記載の方法。
１０９．ステップ（ｅ）の回収は、LOVO細胞処理系を使用して実施される、請求項１０１に記載の方法。
１１０．複数の断片は、約４〜約５０個の断片を含み、各断片は、約２７ｍｍ３の体積を有する、請求項１０１に記載の方法。
１１１．複数の断片は、約３０〜約６０個の断片を含み、総容積は、約１３００ｍｍ３〜約１５００ｍｍ３である、請求項１０１に記載の方法。
１１２．複数の断片は、約５０個の断片を含み、総容積は、約１３５０ｍｍ３である、請求項１０９に記載の方法。
１１３．複数の断片は、約５０個の断片を含み、総質量は、約１グラム〜約１．５グラムである、請求項１０１に記載の方法。
１１４．細胞培養培地は、Ｇコンテナ及びXuri細胞培養バッグからなる群から選択される容器内に提供される、請求項１０１に記載の方法。
１１５．ステップ（ｄ）の細胞培養培地は、ＩＬ−１５及び／又はＩＬ−２１を更に含む、請求項１０１に記載の方法。
１１６．ＩＬ−２濃度は、約１０，０００ＩＵ／ｍＬ〜約５，０００ＩＵ／ｍＬである、請求項１０１〜１１５のいずれかに記載の方法。
１１７．ＩＬ−１５濃度は、約５００ＩＵ／ｍＬ〜約１００ＩＵ／ｍＬである、請求項１１５に記載の方法。
１１８．ＩＬ−２１濃度は、約２０ＩＵ／ｍＬ〜約０．５ＩＵ／ｍＬである、請求項１０１に記載の方法。
１１９．ステップ（ｆ）の輸注バッグは、HypoThermosol含有輸注バッグである、請求項１０１に記載の方法。
１２０．凍結保存培地は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む、請求項１０３に記載の方法。
１２１．凍結保存培地は、７％〜１０％のＤＭＳＯを含む、請求項１１７に記載の方法。
１２２．ステップ（ｃ）の第１の期間及びステップ（ｅ）の第２の期間は、１０日、１１日又は１２日の期間内にそれぞれ個別に実施される、請求項１０１に記載の方法。
１２３．ステップ（ｃ）の第１の期間及びステップ（ｅ）の第２の期間は、１１日の期間内にそれぞれ個別に実施される、請求項１０１に記載の方法。
１２４．ステップ（ａ）〜（ｆ）は、約１０日〜約２２日の期間内に実施される、請求項１０１に記載の方法。
１２５．ステップ（ａ）〜（ｆ）は、約２０日〜約２２日の期間内に実施される、請求項１０１に記載の方法。
１２６．ステップ（ａ）〜（ｆ）は、約１５日〜約２０日の期間内に実施される、請求項１０１に記載の方法。
１２７．ステップ（ａ）〜（ｆ）は、約１０日〜約２０日の期間内に実施される、請求項１０１に記載の方法。
１２８．ステップ（ａ）〜（ｆ）は、約１０日〜約１５日の期間内に実施される、請求項１０１に記載の方法。
１２９．ステップ（ａ）〜（ｆ）は、２２日以内に実施される、請求項１０１に記載の方法。
１３０．ステップ（ａ）〜（ｆ）は、２０日以内に実施される、請求項１０１に記載の方法。
１３１．ステップ（ａ）〜（ｆ）は、１５日以内に実施される、請求項１０１に記載の方法。
１３２．ステップ（ａ）〜（ｆ）は、１０日以内に実施される、請求項１０１に記載の方法。
１３３．ステップ（ａ）〜（ｆ）及び凍結保存は、２２日以内に実施される、請求項１０２に記載の方法。
１３４．ステップ（ｅ）で回収された治療用ＴＩＬ集団は、治療上有効な投薬量のＴＩＬのために十分なＴＩＬを含む、請求項１０１〜１３３のいずれか一項に記載の方法。
１３５．治療上有効な投薬量のために十分なＴＩＬの数は、約２．３×１０１０〜約１３．７×１０１０個である、請求項１３４に記載の方法。
１３６．ステップ（ｂ）〜（ｅ）は、単一の容器内で実施され、ステップ（ｂ）〜（ｅ）を単一の容器内で実施することは、ステップ（ｂ）〜（ｅ）を２つ以上の容器内で実施することと比較して、切除された腫瘍毎のＴＩＬ収量の増加をもたらす、請求項１０１〜１３５のいずれか一項に記載の方法。
１３７．腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）アゴニストは、４−１ＢＢ抗体である、請求項１０１〜１３６のいずれか一項に記載の方法。
１３８．抗原提示細胞は、系を開放せずにステップ（ｄ）の第２の期間中にＴＩＬに加えられる、請求項１０１〜１３７のいずれか一項に記載の方法。
１３９．ステップ（ｄ）の第３のＴＩＬ集団は、対象に投与されたとき、有効性の増加、インターフェロンガンマ産生の増加、ポリクローナル性の増加、平均ＩＰ−１０の増加及び／又は平均ＭＣＰ−１の増加を提供する、請求項１０１〜１３８のいずれか一項に記載の方法。
１４０．ステップ（ｄ）の第３のＴＩＬ集団は、対象に投与されたとき、少なくとも５倍以上のインターフェロンガンマ産生を提供する、請求項１０１〜１３９のいずれか一項に記載の方法。
１４１．ステップ（ｄ）の第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団に対して、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加したサブ集団を含む治療用ＴＩＬ集団であり、治療用ＴＩＬ集団において得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞に対して、ＣＤ２７＋を発現すること、ＣＤ２８＋を発現すること、より長いテロメア、増加したＣＤ５７発現及び減少したＣＤ５６発現からなる群から選択される１つ以上の特徴を呈する、請求項１０１〜１４０のいずれか一項に記載の方法。
１４２．第３のＴＩＬ集団において得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞に対して、増加したＣＤ５７発現及び減少したＣＤ５６発現を呈する、請求項１０１〜１４１のいずれか一項に記載の方法。
１４３．微生物汚染のリスクは、開放系と比較して低減される、請求項１０１〜１４２のいずれか一項に記載の方法。
１４４．ステップ（ｇ）からのＴＩＬは、患者に注入される、請求項１０１〜１４３のいずれか一項に記載の方法。
１４５．複数の断片は、約４個の断片を含む、請求項１０１〜１４４のいずれか一項に記載の方法。
１４６．拡大培養された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を投与することを含む、癌を有する対象を処置する方法であって、
（ａ）患者から得られた腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することにより、対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に加えること；
（ｃ）ＩＬ−２、任意選択でＯＫＴ−３及び任意選択で腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）アゴニストを含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約３〜１４日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｄ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、任意選択でＯＫＴ−３及び任意選択で腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）アゴニスト並びに抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約７〜１４日間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放せずに発生する、生じさせること；
（ｅ）ステップ（ｄ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生する、回収すること；及び
（ｆ）ステップ（ｅ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放せずに発生する、移すこと；
（ｇ）任意選択で、凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）からの回収されたＴＩＬ集団を含む輸注バッグを凍結保存すること；並びに
（ｈ）ステップ（ｇ）における輸注バッグから治療上有効な投薬量の第３のＴＩＬ集団を患者に投与すること
を含む方法。
１４７．ステップ（ｅ）で回収された治療用ＴＩＬ集団中は、治療上有効な投薬量のＴＩＬのために十分なステップ（ｈ）のＴＩＬを含む、請求項１４６に記載の方法。
１４８．ステップ（ｈ）における治療上有効な投薬量の投与に十分なＴＩＬの数は、約２．３×１０１０〜約１３．７×１０１０個である、請求項１４７に記載の方法。
１４９．抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、ＰＢＭＣである、請求項１４８に記載の方法。
１５０．ＰＢＭＣは、ステップ（ｄ）において９〜１４日目のいずれかに細胞培養物に加えられる、請求項１４９に記載の方法。
１５１．腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）アゴニストは、４−１ＢＢ抗体である、請求項１４６〜１５０のいずれか一項に記載の方法。
１５２．ステップ（ｈ）で治療上有効な投薬量のＴＩＬ細胞を投与する前に、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、患者に投与されている、請求項１４６〜１５１のいずれかに記載の方法。
１５３．骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間のシクロホスファミドの投与ステップと、それに続く２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間のフルダラビンの投与ステップとを含む、請求項１５２に記載の方法。
１５４．ステップ（ｈ）で患者にＴＩＬ細胞を投与した翌日に始まる高用量ＩＬ−２レジメンで患者を処置するステップを更に含む、請求項１４６〜１５３のいずれかに記載の方法。
１５５．高用量ＩＬ−２レジメンは、忍容量まで８時間毎に１５分ボーラス静脈内注入として投与される６００，０００又は７２０，０００ＩＵ／ｋｇを含む、請求項１５４に記載の方法。
１５６．ステップ（ｄ）の第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団に対して、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加したサブ集団を含む治療用ＴＩＬ集団であり、治療用ＴＩＬ集団において得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞に対して、ＣＤ２７＋を発現すること、ＣＤ２８＋を発現すること、より長いテロメア、増加したＣＤ５７発現及び減少したＣＤ５６発現からなる群から選択される１つ以上の特徴を呈する、請求項１４６〜１５５のいずれかに記載の方法。
１５７．治療用ＴＩＬ集団におけるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞は、第２の細胞集団から得られるエフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞に対して、増加したＣＤ５７発現及び減少したＣＤ５６発現を呈する、請求項１４６〜１５６のいずれかに記載の方法。
１５８．癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、腎癌及び腎細胞癌からなる群から選択される、請求項１４６〜１５７のいずれかに記載の方法。
１５９．癌は、黒色腫、ＨＮＳＣＣ、子宮頸癌及びＮＳＣＬＣからなる群から選択される、請求項１４６〜１５８のいずれかに記載の方法。
１６０．癌は、黒色腫である、請求項１４６〜１５９のいずれかに記載の方法。
１６１．癌は、ＨＮＳＣＣである、請求項１４６〜１６０のいずれかに記載の方法。
１６２．癌は、子宮頸癌である、請求項１４６〜１６１のいずれかに記載の方法。
１６３．癌は、ＮＳＣＬＣである、請求項１４６〜１６２のいずれかに記載の方法。
１６４．先の請求項のいずれか一項に記載のＴＩＬ集団、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む凍結保護培地及び電解質溶液を含む凍結保存組成物。
１６５．１つ以上の安定剤及び１つ以上のリンパ球成長因子を更に含む、請求項１６４に記載の凍結保存組成物。
１６６．１つ以上の安定剤は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含み、及び１つ以上のリンパ球成長因子は、ＩＬ−２を含む、請求項１６５に記載の凍結保存組成物。
１６７．任意選択でＯＫＴ−３を含む、請求項１６６に記載の凍結保存組成物。
１６８．ＤＭＳＯを含む凍結保護培地及び電解質溶液は、約１．１：１〜約１：１．１の比で存在する、請求項１６４に記載の凍結保存組成物。
１６９．ＤＭＳＯを含む凍結保護培地及び電解質溶液は、約１：１の比で存在する、請求項１６８に記載の凍結保存組成物。
１７０．１００ｍＬの組成物は、約１×１０６〜約９×１０１４個の量のＴＩＬ集団；約３０ｍＬ〜約７０ｍＬの量の、ＤＭＳＯを含む凍結保護培地；約３０ｍＬ〜約７０ｍＬの量の電解質溶液；約０．１ｇ〜約１．０ｇの量のＨＳＡ；及び約０．００１ｍｇ〜約０．００５ｍｇの量のＩＬ−２を含む、請求項１６４に記載の凍結保存組成物。
１７１．１００ｍＬの組成物は、約１×１０７〜約１×１０１１個の量のＴＩＬ集団；約１０％のＤＭＳＯを含む、約３０ｍＬ〜約７０ｍＬの量の凍結保護培地；約３０ｍＬ〜約７０ｍＬの量の電解質溶液；約０．３ｇ〜約０．７ｇの量のＨＳＡ；及び約０．００１ｍｇ〜約０．００３ｍｇの量のＩＬ−２を含む、請求項１６４に記載の凍結保存組成物。
１７２．１００ｍＬの組成物は、約１×１０７〜約１×１０１１個の量のＴＩＬ集団；約１０％のＤＭＳＯから本質的になる、約３０ｍＬ〜約７０ｍＬの量の凍結保護培地；約３０ｍＬ〜約７０ｍＬの量の電解質溶液；約０．３ｇ〜約０．７ｇの量のＨＳＡ；及び約０．００１ｍｇ〜約０．００３ｍｇの量のＩＬ−２から本質的になる、請求項１６４に記載の凍結保存組成物。
１７３．癌を有する対象を処置することにおける使用のためのものである、請求項１６４に記載の凍結保存組成物。
１７４．ＴＩＬ集団、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む凍結保護培地及び電解質溶液を含む凍結保存組成物であって、１００ｍＬの組成物は、約１×１０７〜約１×１０１１個の量のＴＩＬ集団；約１０％のＤＭＳＯを含む、約３０ｍＬ〜約７０ｍＬの量の凍結保護培地；約３０ｍＬ〜約７０ｍＬの量の電解質溶液；約０．３ｇ〜約０．７ｇの量のＨＳＡ；及び約０．００１ｍｇ〜約０．００３ｍｇの量のＩＬ−２を含む、凍結保存組成物。
１７５．ＴＩＬ集団、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む凍結保護培地及び電解質溶液から本質的になる凍結保存組成物であって、１００ｍＬの組成物は、約１×１０７〜約１×１０１１個の量のＴＩＬ集団；約１０％のＤＭＳＯから本質的になる、約３０ｍＬ〜約７０ｍＬの量の凍結保護培地；約３０ｍＬ〜約７０ｍＬの量の電解質溶液；約０．３ｇ〜約０．７ｇの量のＨＳＡ；及び約０．００１ｍｇ〜約０．００３ｍｇの量のＩＬ−２から本質的になる、凍結保存組成物。
１７６．請求項１６４〜１７５のいずれか一項に記載の凍結保存組成物を含む輸注バッグ。
１７７．輸注バッグは、HypoThermosol含有輸注バッグである、請求項１７６の輸注バッグ。
１７８．請求項１６４〜１７５のいずれか一項に記載の凍結保存組成物を含む貯蔵バッグ。
１７９．CryoStore CS750冷凍バッグである、請求項１７８に記載の貯蔵バッグ。
【実施例】
【０６３２】
実施例
[00731]  本明細書に包含される実施形態は、以下の実施例を参照して説明される。これらの実施例は説明のみを目的として提供され、本明細書に包含される開示は決してこれらの実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ本明細書に提供される教示の結果として明らかになるありとあらゆる変形を包含すると解釈されるべきである。
実施例１：閉鎖系アッセイ
【０６３３】
[00732]  本明細書で考察されるように、閉鎖系で患者の腫瘍からＴＩＬを開発するためのプロトコル及びアッセイが開発された。
【０６３４】
[00733]  この実施例では、G-REX装置で患者の切除腫瘍組織から臨床的に重要な数のＴＩＬを産生し、最終細胞製品を凍結保存するための新規簡略手順について説明する。この手順の追加的な側面については、実施例２〜８で説明する。
【０６３５】
定義／略称
ＢＳＣ−生物学的安全キャビネット
℃−摂氏
ＣＯ２−二酸化炭素
ＣＤ３−分化クラスター３
ＣＭ１−完全培地１
ＣＭ２−完全培地２
ＴＩＷＢ−腫瘍分離洗浄バッファー
ＣＭ４−完全培地４
ＣＲＦ−コントロールレートフリーザー
ＥｔＯＨ−エタノール
ＧＭＰ−医薬品の製造管理及び品質管理に関する基準
ＩＬ−２、ｒＩＬ−２−インターロイキン−２、組換えヒトインターロイキン−２、
ＩＵ−国際単位
Ｌ−リットル
ＬＮ２−液体窒素
ｍＬ−ミリリットル
μｌ−マイクロリットル
ｍＭ−ミリモル濃度
μｍ−マイクロメートル
ＮＡ−該当なし
ＰＢＭＣ−末梢血単核球
ＰＰＥ−個人用防護装備
プレＲＥＰ−腫瘍断片に由来する初めのＴＩＬ培養
ＲＥＰ−迅速拡大培養プロトコル
ＴＩＬ−腫瘍浸潤リンパ球
ＴＩＷＢ−ＴＩＬ分離洗浄バッファー
ＳＯＰ−標準実施要領
【０６３６】
手順
１．高度な調製：０日目（最大３６時間前に実施）
１．１  ５００ｍＬのハンクス平衡塩類溶液に５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを添加して、ＴＩＬ分離洗浄バッファー（ＴＩＷＢ）を調製した。１０ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシンストック溶液には、２．５ｍＬをＨＢＳＳに移した。５０ｍｇ／ｍＬのストック溶液には、０．５ｍＬをＨＢＳＳに移した。
１．２．ＣＭ２の手順については、ＬＡＢ−００５「プレＲＥＰ及びＲＥＰの培地の調製」に従ってGlutaMax（商標）でＣＭ１培地を調製した。４℃で最大２４時間貯蔵。使用前に少なくとも１時間、３７℃で温めた。
１．３．ＩＬ−２アリコートを−２０℃の冷凍庫から取り出し、２〜８℃の冷蔵庫に入れた。
【０６３７】
２．腫瘍組織の受領
２．１．腫瘍組織とともに受け取った書類を全て保管し、輸送容器及び腫瘍組織の写真を入手した。
２．２．TempTaleが提供され、関連する書類が印刷及び保存された場合、ＰＤＦを保存した。
２．３．腫瘍標本及び第２の容器（ジップトップバッグ）を梱包から取り出し、処理の準備ができるまで４℃で貯蔵した。
２．４  HypoThermasol又はCryoStor CS10（いずれもBioLife Solutions、Inc.から市販されている）で凍結断片として未使用腫瘍を出荷した。
【０６３８】
３．ＴＩＬの腫瘍処理
３．１．必要に応じて、以下の材料を無菌的にＢＳＣに移し、以下の表３に従って表示を付した。
【０６３９】
【表９】
2021519582.tif 000011
【０６４０】
３．２．腫瘍断片皿の円に文字Ａ〜Ｊの表示を付した。
３．３．好ましい組織の皿のウェルの下側に文字Ａ〜Ｊの表示を付した。
３．４．５ｍＬのゲンタマイシンをＨＢＳＳボトルに移した。ＴＩＷＢと表示を付した。
３．５．混ざるように撹拌した。
３．６．５０ｍＬのＴＩＷＢを以下の各々にピペットした。
１．洗浄１皿
２．洗浄２皿
３．洗浄３皿
４．洗浄４皿
３．７．２ｍＬのＴＩＷＢを好ましい組織の皿のウェルＡ〜Ｊにピペットした。
３．８．好ましい組織の皿（６ウェルプレートの下部）を対応する腫瘍断片皿（６ウェルプレートの蓋）で覆った。
３．９．長鉗子を使用し、標本ボトルから腫瘍を取り出し、洗浄１皿に移した。
３．１０．洗浄１皿で、周囲温度で３分間腫瘍をインキュベートした。
３．１１．インキュベート中、標本ボトル「Bioburden」の表示を再作成し、試験のために品質管理に提出するまで２〜８℃で貯蔵した。
３．１２．長鉗子を破棄し、更なる操作には短鉗子を使用した。
３．１３．鉗子を使用して腫瘍を洗浄２皿に移した。
３．１４．洗浄２皿で、周囲温度で３分間腫瘍をインキュベートした。
３．１５．鉗子を使用して腫瘍を洗浄３皿に移した。
３．１６．洗浄３皿で、周囲温度で３分間腫瘍をインキュベートした。
３．１７．腫瘍組織片（６ウェルプレートの蓋）を好ましい組織の皿（６ウェルプレートの下部）から取り外し、腫瘍片を逆さまにしてＢＳＣ表面に置いた。
３．１８．ホールピペットを使用して、腫瘍断片皿の各円にＴＩＷＢを約４個、均等に間隔を空けて加えた。
３．１９．剥離皿の下に定規を置いた。
３．２０．鉗子を使用して腫瘍を剥離皿に移した。
３．２１．剥離皿の下の定規を使用して、腫瘍の長さを測定及び記録した。
３．２２．１ｃｍを超える腫瘍については、追加的な好ましい組織の皿を用意した。
３．２３．剥離皿の腫瘍片を初めに１０の中間片に剥離し、各中間片の腫瘍構造を保つように注意を払った。
３．２４．積極的に断片に剥離されていない中間腫瘍片を洗浄４皿に移し、全剥離手順中に組織が水和したままであることを確認した。
３．２５．参考として、皿の下にある定規を使用して、一度に１つの中間腫瘍片を使用して、剥離皿で腫瘍を最大３×３×３ｍｍの断片に慎重に薄切りにした。メスが鈍くなった場合、新しいメスに交換した。
３．２６．中間片の全ての組織が判定されるまで、中間腫瘍片から断片を剥離し続けた。
３．２７．好ましい断片を選択し、ホールピペットを使用して、腫瘍断片皿の１つの円でＴＩＷＢの滴に最大４つの好ましい断片を移した。
３．２８．ホールピペットを使用して、残っている好ましい断片を腫瘍片から、あれば、好ましい組織の皿の対応するウェルに移した。
３．２９．ホールピペットを使用して、剥離皿をきれいにするため、好ましくない組織及び廃棄物をできる限り多く好ましくない組織の皿に移した。黄色の脂肪組織又は壊死組織により、好ましくない組織が示された。
３．３０．残りの中間腫瘍片に対してステップ７．３．２５〜７．３．３０を繰り返し、全ての腫瘍が処理されるまで一度に１つの中間片を処理することにより、処理を継続した。
３．３１．腫瘍断片皿の対応する円で利用可能な腫瘍断片が４つ未満の場合、４０の断片の目標を達成するために利用可能な、好ましい組織の皿の対応しないウェルからの断片を使用することが許容された。４０個未満の断片の場合、１０〜４０個を単一のG-Rex 100Mフラスコに入れた。
【０６４１】
４．G-Rex 100Mフラスコを播種する
４．１．必要に応じて、以下の材料を無菌的にＢＳＣに移し、以下の表４に従って表示を付した。
【０６４２】
【表１０】
2021519582.tif 000012
【０６４３】
４．２．ＣＭ１にリットル毎に１ｍＬのＩＬ−２ストック溶液（６×１０６ＩＵ／ｍＬ）を添加した。
４．３．以下の表５で決定されるように、必要な各G-REX 100Mバイオリアクターに６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む１０００ｍＬの予め温めたＣＭ１を入れた。
４．４．ホールピペットを使用して、適切な数の腫瘍断片を各G-Rex 100Mフラスコに移し、表５に従って断片を分配した。
４．５．G-Rex 100Mフラスコに移した１つ以上の腫瘍断片が浮かんでいる場合好ましい組織の皿から入手可能な場合には追加的な腫瘍断片を１つ取得し、G-Rex 100Mフラスコに移した。
４．６．各フラスコに加えられた断片の総数を記録した。
４．７．好ましくない組織の皿を廃棄した。
４．８．各G-REX 100Mバイオリアクターを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに入れた。
４．９．４０を超える断片が利用可能な場合：
４．９．１．＞４１の断片が得られた場合、１０００ｍＬの予め温めた完全なＣＭ１を第２のG-REX 100Mバイオリアクターに入れた。
【０６４４】
【表１１】
2021519582.tif 000013
【０６４５】
５．高度な調製：１１日目（最大２４時間前に調製）
５．１．GlutaMaxで６ＬのＣＭ２を調製した。ＣＭ２の手順については、「プレＲＥＰ及びＲＥＰの培地の調製」の参考検査手順を使用した。使用の１時間前に３７℃で加温した。
５．２．ＩＬ−２アリコートを解凍した：冷凍庫からＩＬ−２アリコートを取り出し、４℃に置いた。
【０６４６】
６．ＴＩＬを回収する（１１日目）
６．１．インキュベーターからG-REX-100Mフラスコを慎重に取り外し、ＢＳＣ２に入れた。フラスコの底にある細胞を乱さないように注意した。
６．２．GatherRex又は蠕動式ポンプを使用して、フラスコから約９００ｍＬの細胞培養上清を吸引した。
６．３．フラスコを静かに旋回させてＴＩＬを再懸濁した。全ての細胞が膜から遊離していることが観察された。
６．４．蠕動式ポンプ又はGatherRexを使用して、残留細胞懸濁液を適切なサイズの血液移送パック（３００〜１０００ｍＬ）に移した。断片が血液移送パックに移らよう注意した。
６．５．移送パックに４インチ血漿移送セットを固定した（クランプが閉じていることを確認すること）。
６．６．パックを揉み、細胞懸濁液が十分に混合されていることを確認し、３ｍＬシリンジを使用して、細胞カウントのために１ｍＬのＴＩＬ懸濁液を取り出した。チューブを固定し、新しい滅菌ルアーキャップでメスルアーコネーに再び蓋をした。
６．７．移送パックをプラスチック製のジップトップバッグに入れ、使用する準備ができるまでインキュベーターに戻した。
【０６４７】
７．培地の調製
７．１．培地を３７℃で＞１時間温めた。
７．２．３ｍＬの６×１０６ＩＵ／ｍＬストックｒｈＩＬ−２を６ＬのＣＭ２に加え、最終濃度３，０００ＩＵ／ｍＬ  ｒｈＩＬ−２にした。「完全ＣＭ２」という表示を付す。
７．３．メスルアー付きの４インチ血漿移送セットを１Ｌ移送パックに滅菌溶接した。
７．４．５００ｍＬの完全ＣＭ２を１Ｌ移送パックに移した。液体トランスファーセット又はシリンジを取り外し、滅菌ルアープラグをメスルアーポートに取り付けた。
７．５．試料サイトカプラーでパックを固定した。
７．６．針付きの１．０ｍＬシリンジを使用して、１５０μＬの１ｍｇ／ｍＬ抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）を吸い上げ、試料サイトカプラーを介して５００ｍＬの「完全ＣＭ２」に移した。全ての試薬がラインから洗い流されるように、シリンジを引き戻した。使用するまで３７℃で貯蔵した。
【０６４８】
８．フラスコの調製
８．１．参照用にフラスコの目盛りを使用して、４．５Ｌの「完全なＣＭ２」をG-REX-500Mフラスコに移した。
８．２．準備ができるまでフラスコを３７℃のインキュベーターに入れた。
【０６４９】
９．照射フィーダーを解凍する
９．１．２人以上のドナーからの５．０×１０９の同種異系照射フィーダーを使用した。
９．２．ＬＮ２冷凍庫からフィーダーを取り外し、バイオハザード移送バッグに入れた。
９．３．バイオハザード移送バッグのフィーダーバッグで、３７℃のインキュベーター又はビーズ浴中でフィーダーを解凍した。バッグは静的で浸水しないように保った。ほぼ完全に解凍されたが、依然として冷えているときにフィーダーを浴から取り出した。
９．４．フィーダーバッグに７０％ＥｔＯＨを噴霧するか又はそれで拭き取り、ＢＳＣ２に入れた。十分な数の照射細胞（５×１０９個の細胞、＋／−２０％）を確保するため、各フィーダーバッグをオープンG-Rex 500Mに直接加えた。
９．５．オスルアーロック付きFenwalＹタイプコネクタの両方のクランプを閉じた。
９．６．各フィーダーバッグにＹコネクタの脚を取り付けた。
９．７．５００ｍＬの「完全ＣＭ２」＋ＯＫＴ３を含む１Ｌ移送パックを取り外し、ＢＳＣに移した。
９．８．６０ｍＬシリンジを三方活栓に無菌的に取り付け、移送パックを活栓のオス側に無菌的に取り付けた。
９．９．Ｙコネクタを三方活栓に無菌的に取り付けた。
９．１０．フィーダーバッグの内容物全体をシリンジに引き込み、容積を記録し、５．０×１０９個の同種異系照射フィーダーを移送パックに分配した。
９．１１．移送パックを装置に固定及び装置から取り外し、メスルアーロックを新しい滅菌ルアープラグで差し込んだ。
９．１２．針及び３ｍＬシリンジを使用して、試料サイトカプラーから１ｍＬを細胞カウントのため引き出した。
９．１３．標的細胞数の＋／−１０％（５．０×１０９）に＞７０％の生存率で到達した場合には続行した。
９．１４．標的細胞数の９０％未満（５．０×１０９）に＞７０％の生存率で到達した場合、別のバッグを解凍し、７．９．４〜７．９．１２を繰り返した。標的細胞数の１１０％超が達成された場合、所望の細胞用量に必要な適切容積を計算して進めた。
【０６５０】
１０．G-REX 500MフラスコでのＴＩＬ及びフィーダーの共培養
１０．１．インキュベーターから調製済み培地を含むG-REX 500Mフラスコを取り外し、ＢＳＣ２に入れた。
１０．２．フィーダー移送パックをG-REX-500Mに取り付け、バッグの内容物を500Mに排出できるようにした。
１０．３．インキュベーターからＴＩＬ懸濁液を取り出し、ＢＳＣに入れた。
１０．４．合計２００×１０６の生細胞を達成するために追加するＴＩＬ懸濁液の量を計算した。
（ＴＶＣ／ｍＬ）／２００×１０６＝ｍＬ
１０．５．ＴＩＬが５〜２００×１０６の合計生細胞の場合、全てのＴＩＬ（全量）をG-REX-500Mに加えた。ＴＩＬカウントが生細胞総数２００×１０６を超えた場合、２００×１０６個のＴＩＬを個々のG-REX-500Mに分配するのに必要な量計算して加えた。残りのＴＩＬをスピンダウンし、CS10で最大１０８／ｍＬの少なくとも２つのクライオバイアルで凍結し、ＴＩＬ識別表示及び凍結日付の表示を付した。
１０．６．G-REX-500Mを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに５日間入れた。
【０６５１】
１１．高度な調製：１６〜１８日目
１１．１．５０×１０６個未満のＴＩＬで開始した培養用のAIM Vの１０Ｌバッグ１つ、５０×１０６個を超えるＴＩＬで開始したバッグ２つを３７℃で少なくとも１時間又は使う準備が整うまで温めた。
【０６５２】
１２．ＴＩＬ細胞カウントを実施する：１６〜１８日目
１２．１．インキュベーターからG-REX-500Mフラスコを取り外し、ＢＳＣ２に入れた。フラスコの底にある細胞培養物を乱さないように注意した。
１２．２．G-REX-500Mフラスコから４Ｌの細胞培養培地を無菌的に取り出し、滅菌容器に入れた。
１２．３．全てのＴＩＬが膜から再懸濁されるまで、G-REX-500Mを旋回させた。
１２．４．GatherRex又は蠕動式ポンプを使用して、細胞懸濁液を２Ｌ移送パックに移した。後で使用するために500Mフラスコを保持した。ＴＩＬの損失を防ぐため、試料サイトカプラーでポートを密閉した。
１２．５．移送パックに試料サイトカプラーを固定し、３ｍＬシリンジ及び針を使用して、細胞カウントのために２×１ｍＬの独立した試料を取り出した。
１２．６．以下の式に従って、継代培養に必要なフラスコの総数を計算した。端数は切り上げた。
総生細胞／１．０×１０９＝フラスコ数
【０６５３】
１３．ＣＭ４を調製する
１３．１．必要な500Mフラスコ２本ごとに１０ＬのAIM-Vバッグを準備した。必要に応じて追加的な培地を温めた。
１３．２．AIM-Vが１０Ｌ必要になる毎に、１００ｍＬのGlutaMAXを加えてＣＭ４を作成した。
１３．３．３，０００ＩＵ／ｍＬ  ｒｈＩＬ−２の最終濃度のために、ＣＭ４培地にｒｈＩＬ−２を添加した。
【０６５４】
１４．細胞培養を分割する
１４．１．フラスコの目盛りを使用して、重力で各G-REX-500Mを５Ｌまで満たした。
１４．２．計算した数のG-REX-500MでＴＩＬ量を均等に分配した。
１４．３．ＲＥＰの２２日目に回収するまで、フラスコを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに入れた。
【０６５５】
１５．高度な調製：２２〜２４日目
１５．１．PlasmaLyte A 7.4の２つの１Ｌバッグに４０ｍＬの２５％ＨＳＡを加え、２Ｌの１％ＨＳＡ洗浄バッファーを調製した。LOVO補助バッグにプールする。
１５．２．６００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２で２００ｍＬのCS10を添加した。
１５．３．４つの７５０ｍＬアルミニウム冷凍庫キャニスターを４℃で予め冷却した。
【０６５６】
１６．ＴＩＬを回収する：２２〜２４日目
１６．１．３７℃インキュベーターからG-REX-500Mフラスコを取り外し、ＢＳＣ２に入れた。フラスコの底にある細胞培養物を乱さないように注意した。
１６．２．各フラスコから細胞培養上清４．５Ｌを吸引して廃棄した。
１６．３．G-REX-500Mフラスコを旋回させて、ＴＩＬを完全に再懸濁した。
１６．４．使用前に３〜５Ｌのバイオプロセスバッグの重量を測定した。
１６．５．GatherRex又は蠕動式ポンプを使用して、ＴＩＬをバイオプロセスバッグに回収した。
１６．６．バッグをよく混合し、３ｍＬシリンジを使用して、細胞カウントのためにシリンジ試料ポートから２×２ｍＬの試料を採取する。
１６．７．バッグの重量を量り、初期重量と最終重量に差を発見した。以下の計算を使用して、細胞懸濁液の量を決定した。
細胞懸濁液の正味重量（ｍＬ）／１．０３＝容積（ｍＬ）
【０６５７】
１７．ＴＩＬをろ過してLOVOソースバッグを準備する
１７．１．細胞培養物を含むバッグをＢＳＣ２に入れた。
１７．２．１７０μｍの血液フィルターをＢＳＣ２に置き、全てのクランプを閉じた。
１７．３．フィルターのソース脚を細胞懸濁液に滅菌溶接した。
１７．４．適切なサイズの新しいバイオプロセスバッグの重量を量った（これをLOVOソースバッグと称した）。
１７．５．フィルターの端部をLOVOソースバッグに滅菌溶接した。
１７．６．ＩＶポールに細胞を掛け、細胞の重力流移動を作ることにより、細胞懸濁液を上昇させた。
注記：（ソースバッグをろ過装置には下げないようにした。）
１７．７．必要な全てのクランプを開き、ＴＩＬが細胞懸濁液バッグからフィルターを通ってLOVOソースバッグに排出されるようにした。
１７．８．全細胞がLOVOソースバッグに移ったら、全てのクランプを閉じ、LOVOソースバッグのチューブを密閉してフィルターを取り外した。
１７．９．LOVOソースバッグの重量を量り、容積を計算した。
１７．１０．LOVOソースバッグはLOVOを入れる準備ができていた。
１７．１１．バッグの近くのチューブを密封することにより、その使い捨てキットからLOVO最終産物バッグを取り外した。
【０６５８】
１８．６００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ−２を添加した冷温のCS10でＴＩＬ１：１を処方する
１８．１．必要なクライオバッグの必要数を計算した。
（細胞製品の容積×２）／１００＝必要バッグ数（切り捨て）
１８．２．各バッグに分注する容積を計算した。
（細胞製品の容積×２）／必要バッグ数＝各バッグに加える容積
１８．３．表６の以下の材料をＢＳＣに無菌的に移した。
【０６５９】
【表１２】
2021519582.tif 000014
【０６６０】
１９．ＴＩＬの調剤
１９．１．Cell Connect CC1の全てのクランプを閉じた。
１９．２．細胞結合装置には、LOVO最終物、CS10バッグルアーロック及び適切な数のクライオバッグが無菌的に取り付けられた。６０ｍＬシリンジを１００ｍＬシリンジに交換した。
１９．３．必要なCS10容積は、LOVO最終物バッグの容積と同等であった。
１９．４．活栓経路を開き、LOVO最終物バッグ及びシリンジ間のラインのクランプを解除し、CS10をシリンジに引き込み、CS10パスのクランプを再び閉じた。細胞バッグへの経路を開放し、CS10をLOVO最終物バッグに押し込んだ。シリンジを使用して、LOVO最終物バッグに加えられた容量を測定した。必要な量のCS10が移るまで、必要に応じて新しいシリンジを使用して繰り返した。
１９．５．反転によりLOVO最終物バッグを混合した。
１９．６．１００ｍＬシリンジを交換した
１９．７．７５０ｍＬクライオバッグのクランプを一度に１つずつ開けた
１９．８．製剤化された産物及び使用中のクライオバッグに直接関連するクランプのみ開いた。
１９．９．１００ｍＬシリンジを使用して、クライオバッグにつながる調合製品の量を測定した。
１９．１０．製剤化された産物１００ｍＬを各凍結バッグに移した。
１９．１１．各バッグに加えた後、シリンジを引き戻し、クライオバッグから全ての気泡を取り除き、関連するラインのクランクを再び閉じた。
１９．１２．最終バッグで、ＱＣ試験用に１０ｍＬ保持して聞き戻す。
１９．１３．各クライオバッグを密閉し、チューブをできるだけ少なくした。
１９．１４．保持された試料を含むシリンジを取り外し、５０ｍＬコニカルチューブに移した；１．５ｍｌを個々のクリオバイアルに移し、制御された速度の冷凍庫に凍結した。
１９．１５．表示の準備中に、密封したバッグを４℃にした。
１９．１６．各クライオバッグに産物説明、名前及び日付、容量、細胞カウント、生存率の表示を付した。
１９．１７．各クライオバッグを、予め冷却したアルミニウム製冷凍キャニスターに置いた。
【０６６１】
２０．コントロールレートフリーザー（ＣＲＦ）を使用したＴＩＬの凍結保存
２０．１．速度を制御された冷凍庫の標準手順に従った。
２０．２．ＣＲＦを使用した後、液体窒素（ＬＮ２）にクリオバッグを貯蔵した。
【０６６２】
２１．予想される結果及び適合基準
【０６６３】
実施例２：８人の患者の腫瘍で実施されるプロセス
[00734]  実施例１のプロセスは、８人の患者の腫瘍を使用して実施され、８バッチのＴＩＬを産生した。以下の表７及び図７から図１０に示すように、培養、生存率、細胞カウント、ＣＤ３＋（％Ｔ細胞含有量を示す）及びＩＦＮ−γ（ＩＦＮーｇ又はＩＦＮ−γ）遊離から良好な回復が得られた。
【０６６４】
【表１３】
2021519582.tif 000015
【０６６５】
実施例３：修飾ＴＩＬプロセスのスケーラビリティ
[00735]  ここに示す研究はプロセス開発（ＰＤ）研究所で実施され、その後、エンジニアリングランを利用したプロセス認定（ＰＱ）の研究が製造施設のＧＭＰ無菌室で行われた。ＧＭＰ施設の無菌室では、認定プロトコルに従って、３つのＰＱ／エンジニアリングランが完了し、ここに示されているＰＤ研究に基づいたバッチ記録が作成された。エンジニアリングランの適合基準は、前向き研究として設定された。ＰＱ研究の詳細を以下に要約し、試作バッチで得られた試験結果を以下のセクションで提供する。
【０６６６】
[00736]  プレ迅速拡大培養プロトコル（プレＲＥＰ）の培養物から生成された細胞の数は、しばしば１００×１０６の生細胞を超えた。更に、プレＲＥＰ培養ステップ及びＲＥＰ培養ステップ間に凍結融解サイクルを含めると、生細胞の収量が減少した。プロセス内凍結保存ステップを排除することにより、ＲＥＰは、ＴＩＬの数を増やして確実且つ定期的に開始できた。この変更により、ＲＥＰの期間を、細胞の量に影響を与えることなく、細胞の倍増時間に比例しておよそ１１日間短縮することができた。加えて、活性化から回収までの培養時間の短縮により、製品の差別化が少なくなり、インビボ持続性が向上する可能性がある（Tran 2008）。
【０６６７】
[00737]  ＰＤ研究では、固定数のフィーダー細胞で最大２００×１０６個の細胞でＲＥＰ培養の開始が実証された。次に、ＲＥＰ培養を回収する最適な時間を９〜１４日間にわたって判定した。培養物は、１００：１〜２５：１の範囲のＴＩＬ比に対してフィーダーで播種された。総細胞数、生存率、免疫表現型、培地消費、代謝産物分析、インターロイキン−２（ＩＬ−２）分析及び以下の機能分析を測定することにより、回収時間の最適化を決定した。
【０６６８】
[00738]  ＲＥＰ培養終了時の細胞の免疫表現型検査は、以下の表８に記載されているマーカーに基づいて判定された。細胞の表現型の活性化及び分化状態を判定した。表現型の統計的な差は、いずれの実験条件でも観察されなかった。
【０６６９】
【表１４】
2021519582.tif 000016
【０６７０】
[00739]  略称ＰＥ／Ｃｙ７＝フィコエリトリン：Ｃｙ−７タンデム共役体；ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５＝ペリジニン・クロロフィル・タンパク質複合体：ＣＹ５．５コンジュゲート；ＰＥ＝フィコエリトリン；ＦＩＴＣ＝フルオレセインイソチオシアネート共役体；ＡＰＣ−Ｈ７＝アロフィコシアニン：Ｈ７タンデム共役体；ＡＰＣ＝アロフィコシアニン；ＰＢ＝Pacific Blue（商標）
【０６７１】
[00740]  培地消費及び代謝産物生産は、試験した全ての条件で許容範囲内にとどまった。ＩＬ−２レベルは、培養上清１５０ＩＵ／ｍＬを超えたままであった（データに示さず）。
【０６７２】
[00741]  Ｔ細胞による腫瘍細胞の死滅は、腫瘍細胞の表面に出現したペプチドに応答したエフェクターＴ細胞上のＴ細胞受容体の活性化によって媒介されると理解される。エキソビボ拡大培養Ｔ細胞は、注入時にインビボ持続し、腫瘍退縮を媒介する場合、ＴＣＲ活性化に応答して活性化及び成長する能力を保持する必要がある。
【０６７３】
[00742]  培養細胞の活性化の可能性を評価するため、異なる時点で回収したＴＩＬを、ＯＫＴ３をロードした照射同種異系ＰＢＭＣで再活性化した。ＴＩＬ培養物を７日後に回収し、拡大倍数についてアッセイした。この研究の結果は表９にまとめられている。
【０６７４】
【表１５】
2021519582.tif 000017
【０６７５】
[00743]  この研究は、このアッセイでＴＩＬが活性化する可能性が培養の各日から１１日目（回収９〜１１日目）まで増加することを実証した。変更されたプロセスの１１日目に回収した細胞は、現在のプロセスと同様に１４日間培養物で維持されたＴＩＬを制御するのと同様の働きをした。
【０６７６】
[00744]  これらの研究は、変更ＴＩＬプロセスのスケーラビリティを実証し、フィーダー細胞に対するＴＩＬの播種比の許容範囲を確立した。加えて、培養条件は培養１４日目まで持続することが分かったが、培養条件は１１日目まで最適なままであった。試験された条件は、ＴＩＬ表現型に測定可能な影響を示さなかった。ＲＥＰ培養１１日目に回収した細胞は、細胞培養条件が許容範囲内にとどまっている間、再活性化に応答する最高能力を実証する。これらの変化は、５日目の培養物の分割、１１日目の回収で、本格的に採用及び検証された。
【０６７７】
[00745]  患者に投与するための自己ＴＩＬ産物のＧＭＰ製造に先立って、ＴＩＬ産物の製造及び試験の経験を積むため、エンジニアリングランがプロセス開発施設で実施された。エンジニアリングランに使用される製造手順は、ＧＭＰ  ＴＩＬ製品の製造に使用されるものと同様の規模であった。黒色腫、乳房、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、子宮頸癌及び肺癌の転移を含む様々な種類の腫瘍からＴＩＬを成長させた経験により、転移性腫瘍試料からのＴＩＬの剥離及び成長はこれらの癌に類似していることが判明した（Sethuraman 2016, JITC P42）。腫瘍断片の初めの分離とリンパ球の成長は腫瘍組織間で類似しているように見えるため、これらのエンジニアリングランは、ＨＮＳＣＣ、子宮頸部及び黒色腫腫瘍からのＴＩＬの生産のプロセスに十分適格である。
【０６７８】
[00746]  表１０は、エンジニアリングランに使用された腫瘍試料の提供元及び特性を示す。
【０６７９】
【表１６】
2021519582.tif 000018
【０６８０】
[00747]  プロセス開発施設でのＴＩＬの３つのエンジニアリングランの遊離試験は、以下に説明するとおり完了した（表１１）。産物は１６日目及び２２日目に試験された。ＩＦＮ−γ分泌は、他の場所で詳述されているように、３回のエンジニアリングラン（表１２）でも測定された。
【０６８１】
【表１７】
2021519582.tif 000019
【０６８２】
【表１８】
2021519582.tif 000020
【０６８３】
[00748]  結論として、エンジニアリングランからのデータは、患者への自己投与を目的としてＴＩＬ製剤産物を製造できることを実証する。
【０６８４】
実施例４：リンパ枯渇
[00749]  細胞は、７日目及びリンパ球減少前にカウントできる。最終細胞製品には、Plasma-Lyte A（商標）の最小５０％のHypoThermosol（商標）（容積／容積）及び３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ２を含む最大０．５％ＨＳＡ（ヒト注入に適合）で製剤化された最大約１５０×１０９個の生細胞が含まれる。最終産物は、注入用の２つの容積のいずれかで投与に使用できた。
１）総ＴＩＬが≦７５×１０９個の場合、２５０ｍＬ（容量３００ｍＬの輸注バッグ内）、又は
２）総ＴＩＬが＜１５０×１０９個の場合、５００ｍＬ（容量６００ｍＬの輸注バッグ内）
【０６８５】
[00750]  ＲＥＰステップ中のＴ細胞拡大培養率に患者間で差があるため、各患者の最終ＴＩＬ注入産物用に産生される可能性のある細胞の総数は予測できない。３〜１４日間のＲＥＰの３、４、５、６、７日目の細胞の下限は、シクロホスファミドとフルダラビンの化学療法レジメンを使用して患者をリンパ球枯渇させる判断を下すために必要な最小細胞数に基づいて設定される。この最小到達細胞数に基づいてリンパ枯渇を開始すると、３日目から１４日目及び多くの場合に７日目までに、ＲＥＰで生成されるＴＩＬの利用可能な数で患者を処置することが約束される。注入の範囲の上限（１５０×１０９個の生細胞）は、臨床応答が達成された場合に安全に注入された公知の公開上限に基づいている。Radvanyi, et al., Clin Cancer Res 2012, 18, 6758-6770。
【０６８６】
実施例５：プロセス２Ａ−０日目
[00751]  この実施例では、実施例１〜４で説明した２Ａプロセスの詳細な０日目のプロトコルについて説明する。
【０６８７】
[00752]  調製。
１．腫瘍洗浄液、ＣＭ１及びＩＬ−２は有効期限内であることを確認した。
２．インキュベーターにＣＭ１（細胞培地１）を入れた。
【０６８８】
[00753]  方法。
１．生物学的安全キャビネット（ＢＳＣ）を洗浄した。
２．プロセス内の監視プレートをセットアップし、手順中に１〜２時間バイオセーフティキャビネットに置いた。
３．ＴＩＬ培地ＣＭ１を生物学的安全キャビネットに置いた。
４．６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含むＴＩＬ培地ＣＭ１を調整した：
４．１．１ＬのＣＭ１
４．２．１ｍＬのＩＬ−２（６，０００，０００ＩＵ／ｍＬ）
４．３．G-REXに加えるときに断片に使用するため、２５ｍＬのＣＭ１＋ＩＬ２を５０ｍｌのコニカルに入れた。
４．４．予温のため３７℃のインキュベーターに入れた
５．G-REX 100MCSパッケージを７０％アルコールで拭き取り、バイオセーフティキャビネットに入れた。フィルターラインを除く全てのクランプを閉じた。
６．アカシアポンプのキャリブレーションを実施した。
７．G-REX 100MCSフラスコの赤ラインをアカシアポンプブーツの排出ラインに取り付けた。
８．ポンプブートの吸入ラインにPumpmaticを取り付け、培地を入れたボトルに入れた。ポンプブートへのクランプを開放した。
９．各G-REX 100MCSバイオリアクターに６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む、予め温めた残りの９７５ｍｌのＣＭ１を注入した。
１０．赤ラインをヒートシールし、ポンプブートから外した。
１１．G-REXに表示を付した。
１２．必要になるまでインキュベーターにG-REX 100MCSを入れた。
【０６８９】
[00754]  組織剥離
１．腫瘍処理の開始時間を記録した。
２．腫瘍洗浄培地をＢＳＣに移した。
３．５つの１００ｍｍペトリ皿をバイオセーフティキャビネットに入れ、３つは洗浄用、１つは保持用、１つは好ましくない組織用とした。それぞれ皿に表示を付した。黄色の脂肪組織又は壊死組織により、好ましくない組織が示された。
４．３つの６ウェルプレートをバイオセーフティキャビネットに入れた。
５．過剰な腫瘍片のために、３〜５ｍＬの腫瘍洗浄培地を１つの６ウェルプレートの各ウェルにピペットで入れた。
６．５０ｍＬの腫瘍洗浄液をピペットで移し、皿１〜３と保持皿を洗浄した。
７．２つの１５０ｍｍ剥離皿をバイオセーフティキャビネットに入れた。
８．３本の滅菌５０ｍＬコニカルチューブをＢＳＣに入れた。
９．１つに鉗子腫瘍洗浄液、２つ目にメス腫瘍洗浄液、３つ目に蓋への滴下に使用する腫瘍洗浄液として表示を付した。
１０．５〜２０ｍＬの腫瘍洗浄培地を各コニカルに追加した。腫瘍の洗浄及び剥離プロセス中に、必要に応じて、鉗子及びメスを腫瘍洗浄媒体に浸した。
１１．メス及び鉗子を適切なチューブに入れた。
１２．長鉗子を使用し、標本ボトルから腫瘍を取り出し、洗浄１皿に移した。
１３．洗浄１皿で、周囲温度で≧３分間腫瘍をインキュベートした。
１４．インキュベーション中、標本ボトル「Bioburden」に表示を付し直し、最終回収又は更なる無菌試験が必要になるまで２〜８℃で貯蔵した。
１５．鉗子を使用して腫瘍を洗浄２皿に移した。
１６．洗浄２皿で、周囲温度で≧３分間腫瘍をインキュベートした。
１７．インキュベーション中に、ホールピペットを使用して、腫瘍断片皿に指定された６ウェルプレートの蓋の各円に腫瘍洗浄培地を約４等分間隔で個別に滴下した。
１８．鉗子を使用して腫瘍を洗浄３皿に移した。
１９．洗浄３皿で、周囲温度で≧３分間腫瘍をインキュベートした。
２０．剥離には１５０ｍｍの皿蓋を使用した。下に定規を置いた。
２１．調子を使用して、剥離皿に腫瘍を移し、腫瘍の長さを測定及び記録した。
２２．腫瘍の写真を撮った。
２３．各中間片の腫瘍構造を保つように注意を払いながら、剥離皿の腫瘍片を初めに中間片に剥離した。
２４．全剥離手順中に組織が水和したままにあるように皿を保持しながら、積極的に断片に剥離されていない中間腫瘍片を組織に移した。
２５．参考として、皿の下にある定規を使用して、一度に１つの中間腫瘍片を使用して、剥離皿で腫瘍をおよそ３×３×３ｍｍの断片に慎重に薄切りにした。
２６．中間片の全ての組織が判定されるまで、中間腫瘍片から断片を剥離し続けた。
２７．好ましい断片を選択し、ホールピペットを使用して、腫瘍断片皿の１つの円で洗浄培地の滴に最大４つの好ましい断片を移した。ホールピペット、メス又は調子を使用して、剥離皿をきれいにするため、好ましくない組織及び廃棄物をできる限り多く好ましくない組織の皿に移した。残りの全ての組織は、６ウェルプレートのウェルの１つに入れた。（黄色の脂肪組織又は壊死組織により、好ましくない組織が示された。）
２８．残りの中間腫瘍片に対してステップ２３〜２６を繰り返し、全ての腫瘍が処理されるまで一度に１つの中間片を処理することにより、処理を継続した。（必要に応じて、処理技術者の判断で、新らたなメス又は鉗子を入手した。）
２９．断片プレートをフードの後ろに移した。
３０．ホールピペット、メス又は鉗子を使用して、最高５０個の最良の腫瘍断片を、ＣＭ１を含む腫瘍断片と表示が付された５０ｍＬコニカルチューブに移した。
３１．ホールピペットで５０ｍＬコニカルから浮遊物を取り除いた。断片及び浮遊物の数を記録した。
３２．フードから不要な物品を全て取り除き、余分な断片が含まれている場合には好ましい組織プレートを保持した。アルコールワイプでフードを拭き取った。
３３．インキュベーターからG-REX 100MCSを取り出し、７０％アルコールで拭き取り、バイオセーフティキャビネットに入れた。
３４．腫瘍断片の入ったコニカルを旋回させ、５０ｍＬコニカルの内容物をG-Rex 100MCSフラスコに注いだ。
３５．G-Rex 100Mフラスコに移した１つ以上の腫瘍断片が浮かんでいる場合好ましい組織の皿から入手可能な場合には追加的な腫瘍断片を１つ取得し、G-Rex 100Mフラスコに移した。
３６．インキュベーター数及び各フラスコに加えられた断片の総数を記録した。
３７．G-REX 100Mバイオリアクターを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに入れた。
３８．未使用の腫瘍は全て１００ｍＬのHypoThermosolに入れ、研究室に届た。
３９．腫瘍処理の終了時間を記録した。
４０．ＩＬ−２及びＩＬ−２の未使用アリコートを含む未使用のＴＩＬ完全培地を廃棄した。
４１．生物学的安全キャビネットを洗浄した。
４２．Bioburdenの試料を適切な貯蔵条件下に置いた。
４３．データを記録した。
４４．画像をファイル標本ＩＤ番号腫瘍プロセスデータとして準備された患者のファイルに保存した。
４５．沈降プレートの注文をし、その微生物学研究室への配送を確実にした。
【０６９０】
実施例６：プロセス２Ａ−１１日目
[00755]  この実施例では、実施例１〜４で説明した２Ａプロセスの詳細な１１日目のプロトコルについて説明する。
【０６９１】
[00756]  前回の調製
１．処理の前日：
１．１．ＣＭ２は、処理が行われる前日に準備できた。４℃に置いた。
２．処理の日。
２．１．フィーダーセルハーネスを準備した。
２．１．１．ＣＣ２及び４Ｓ−４Ｍ６０コネクタセットの全てのクランプを閉した。
２．１．２．スパイクを取り除きながら、４Ｓ−４Ｍ６０ハーネスの４つのスパイクをＣＣ２のスパイクラインに滅菌溶接した。
２．１．３．フィーダー細胞プーリングのために取っておいた。
２．２．CTF-FORM-318毎に５ｍＬの凍結保存培地を準備し、必要になるまで４℃に置く。
【０６９２】
[00757]  無菌室環境監視−前処理
１．無菌室情報を記録した。
２．バイオセーフティキャビネット（ＢＳＣ）は、大きい飽和アルコールワイプ又はアルコールスプレーで洗浄した。
３．処理を開始する前に１０分間の粒子数を確認した。
４．プロセス内の監視プレートをセットアップし、手順中に１〜２時間バイオセーフティキャビネットに置いた。
【０６９３】
[00758]  G-Rex 500MCSフラスコを準備する：
１．１０ｍＬシリンジを使用して、ＣＭ２（細胞培地２）１リットルあたり０．５ｍＬのＩＬ−２（ストックは６×１０６ＩＵ／ｍＬ）を、未使用の滅菌メスルアーコネクタを通してバイオプロセスバッグに無菌的に移した。
２．シリンジ内の過剰な空気を使用してラインをきれいにし、バッグからいくつかの培地を吸い上げて、元に戻した。これにより、全てのＩＬ−２が培地と確実に混合された。十分に混合した。
３．外装を開き、G-Rex 500MCSをＢＳＣに入れた。大きいフィルターラインを除く、装置の全てのクランプを閉じた。
４．G-Rex 500MCSからの赤い回収ラインをポンプチューブの排出ラインに滅菌溶接した。
５．バイオプロセスバッグのメスルアーをポンプブーツのオスルアーに接続した。
６．ＩＶポールにバイオプロセスバッグを掛け、クランプを開き、４．５リットルのＣＭ２培地をG-Rex 500MCSに送り込んだ。ライン、クランプ及びヒートシールをクリアにした。
７．ポンプから培地までのラインを保持した。これはフィーダー細胞の調製に使用された。
８．G-Rex 500MCSをインキュベーターに入れた。
【０６９４】
[00759]  照射フィーダー細胞を準備する
１．ＩＬ  ＴＰからスパイクを密閉及び取り除いた。両方のラインを固定した。
２．１Ｌ移送パック（ＴＰ）の乾燥重量を記録した。
３．１Ｌ移送パックをバッグからアカシアポンプブーツに約１２インチの位置に滅菌溶接した。
４．ポンプチューブのもう一端は、依然として１０Ｌのlabtainerに接続されていた。
５．重量で５００ｍＬのＣＭ２をＴＰに注入した。
６．クランプを閉じ、溶接継手の近くで密閉した。
７．インキュベーターに入れた。
８．フィーダー細胞バッグの確認及び終了作業を行った。
９．使用したフィーダーロットを記録した。
１０．アルコールでバッグを拭き取った。
１１．ジップロック(登録商標）バッグに入れた。
１２．３７℃（＋／−１℃）の水浴中でフィーダー細胞を解凍した。水浴の温度を記録した。
１３．ガーゼを取り除き乾燥させた。
１４．フィーダー細胞を準備室に渡した。
１５．無菌室のＢＳＣに移した。
１６．予め準備したフィーダーハーネスを使用して、１Ｌ  ＴＰを三方活栓のサンプルポート側の未使用ラインの１つに、シールジャンクションに可能な限り近づけて、チューブをできるだけ少なくして溶接した。
１７．フィーダーハーネスをＢＳＣに入れた。
１８．３つのフィーダーバッグの各々に、フィーダーハーネスからのスパイクをフィーダーバッグの単一ポートに固定した。
１９．１Ｌ  ＴＰが「オフ」位置になるように、活栓バルブを回転させた。
２０．一度に１つのバッグで作業し、フィーダーバッグへのラインのクランプを開き、シリンジ内の空気を排出して、フィーダーバッグの内容物をシリンジに引き込んだ。シリンジから排出された空気は、細胞の回収を補助した。フィーダーバッグへのクランプを閉じた。
２１．各バッグの解凍フィーダー細胞の回収量を記録した。
２２．フィーダーバッグが「オフ」位置になるように、活栓バルブを回転させた。
２３．ＴＰのクランプを開き、シリンジの内容物をＴＰに分配した。
２４．ラインがクリアされていることを確認し、ＴＰのクランプを再び閉じた。ラインをクリアする際に使用するため、ＴＰからシリンジに空気を吸引する必要がある場合がある。
２５．細胞をよく混ぜた。
２６．フィーダーバッグへのクランプを閉じた。
２７．シリンジポートが「オフ」の位置になるように活栓を回転した。６０ｍＬシリンジを活栓から外した。
２８．フィーダーバッグ毎に新しいシリンジと交換した。
２９．最終バッグの後、シリンジをオンのままにしておいた。
３０．最終フィーダー配合物をよく混合した。
３１．フィーダー細胞懸濁液が「オフ」の位置にあるように活栓を回転した。
３２．細胞を混ぜ、５ｍＬシリンジ及び不要なポートを使用して、１ｍｌの細胞を確実にサンプリング及び除去できるようにポートを細胞溶液で洗浄し、カウント用の表示が付されたチューブに入れた。
３３．第２のシリンジで繰り返した。これらの２つの独立した試料は、それぞれ一回の細胞カウントを実施した。
３４．フィーダー懸濁液が「ＯＰＥＮ」位置になるように活栓を回し、ハーネスに取り付けられた６０ｍｌシリンジを使用して、空気をＴＰに送ってラインをクリアにした。
３５．シリンジを取り外し、ルアーポートを新しい滅菌キャップで覆った。
３６．ＴＰを溶接継手の近くでヒートシールし、ハーネスを取り外した。
３７．細胞懸濁液を含む移送パックの質量を記録し、細胞懸濁液の容積を計算した。
３８．インキュベーターに入れた。
３９．フィーダー細胞試料及び記録データに対し一度の細胞カウントを実施し、バッチ記録に生データのカウントを添付した。
４０．Cellometerカウントプログラムを文書化した。
４１．正しい希釈がCellometerに入力されたことを確認した。
４２．フィーダー移送パックの総生細胞密度を計算した。
４３．細胞数が＜５×１０９の場合、より多くの細胞を解凍してカウントし、フィーダー細胞に加えた。
４４．フィーダーバッグの容積を再計量し容積を計算した。
４５．取り除く細胞の容積を計算した。
【０６９５】
[00760]  G-REXへのフィーダーの追加
１．フィーダーＴＰに４インチトランスファーセットを滅菌溶接した。
２．ＢＳＣに、フィーダー移送パックに溶接されたメスルアーに適切なサイズのシリンジを取り付けた。
３．細胞をよく混合し、ステップ４０又は４１で計算した容積を取り除き、５．０×１０９個の細胞を達成した。不要な細胞を廃棄した。
４．１ｍＬシリンジと１８Ｇ針を使用して、０．１５０ｍＬのＯＫＴ３を吸引し、針を取り外し、メスルアーを介してフィーダーＴＰに移した。
５．フィーダー細胞及び混合バッグが付いたチューブ及びシリンジをすすいだ。シリンジからの空気でラインをクリアした。
６．インキュベーターからG-Rex 500MCSを取り除き、アルコールワイプで拭き取りＳＣＤの横に置いた。
７．フィーダーバッグをG-Rex 500MCSの赤ラインに滅菌溶接した。ラインのクランプを外し、重力によりフィーダー細胞がフラスコに流れ込むようにした。
８．ラインが完全にクリアされていることを確認してから、ラインを元の溶接部の近くでヒートシールし、フィーダーバッグを取り外した。
９．G-Rex 500MCSをインキュベーターに戻し、時間を記録した。
【０６９６】
[00761]  ＴＩＬを調整する：ＴＩＬ回収の開始時間を記録する
１．インキュベーターからG-Rex 100MCSを慎重に取り外し、大きいフィルターラインを除く全てのクランプを閉じた。
２．G-REX 100MCSの赤ラインに１Ｌ移送パックを溶接した。
３．３００ｍｌのＴＰのクランプを閉じた。スパイクを取り除き、バッグから約１２インチをヒートシールした。乾燥重量／質量を記録した。
４．３００ｍＬ移送パックを、ヒートシールに近い１００ＭＣＳの細胞収集ラインに滅菌溶接した。ラインのクランプを閉じた。
５．１Ｌ  ＴＰにつながる全てのクランプを開放した。
６．GatheRexを使用して、約９００ｍＬの培養上清を１Ｌ移送パックに移した。空気がラインに入ると、Gatherexは停止した。ラインとヒートシールを固定した。
７．全ての細胞が膜から剥離するまでフラスコを旋回した。膜を確認し、全ての細胞が剥離していることを確認した。
８．収集チューブから離してフラスコを傾け、腫瘍破片を縁に沿って沈降させた。
９．断片がフラスコの反対側に残るように、収集チューブに向かってゆっくりとフラスコを傾けた。
１０．GatheRexを使用して、残留細胞懸濁液を、腫瘍破片を避けて３００ｍＬの移動パックに移した。
１１．全ての細胞が膜から離れたことを再確認した。
１２．必要に応じて、GatheRexのクランプを開放して逆洗し、重力によって一部の培地をG-Rex 100MCSフラスコに流入させた。
１３．フラスコを激しく叩いて細胞を遊離させ、３００ｍｌ  ＴＰに注入した。
１４．収集が完了した後、赤ラインとヒートシールを閉じた。
１５．乾燥重量が記録されたときとほぼ同じ長さのチューブを残して、収集ラインをヒートシールした。
１６．細胞懸濁液を含む３００ｍｌ  ＴＰの記録質量（乾燥質量を含む）及び細胞懸濁液の容積を計算した。
１７．ＢＳＣスパイクでは、３００ｍＬ  ＴＰに４インチの血漿移送セットを固定した。細胞をよく混合した。５ｍＬシリンジドロー１ｍＬを無菌的に取り付け、冷凍保存バイアルに入れた。第２のシリンジで繰り返した。これらは、細胞、生存率のカウントに使用された。
１８．ルアーキャップを再クランプし、新しい滅菌ルアーキャップに交換した。
１９．インキュベーターに入れ、インキュベーターで時間及び場所を記録した。
２０．各試料及び記録データに対し一度の細胞カウントを実施し、バッチ記録に生データのカウントを添付した。
２１．Cellometerカウントプログラムを文書化した。
２２．正しい希釈がCellometerに入力されたことを確認した。
２３．必要に応じて、総生細胞ＴＩＬ密度を≦２×１０８個以下の生細胞に調整した。
２４．削除する容積を計算又は不要な調整を記録した。
２５．ＢＳＣ内で、適切なサイズのシリンジを３００ｍＬ  ＴＰに無菌的に取り付けた。
２６．必要に応じて、「削除する容積の計算」表で計算された細胞の計算された容積を取り除いた。
２７．３００ｍｌ  ＴＰをクランプ及びヒートシールした。
２８．過剰な細胞を適切なサイズのコニカルチューブに移し、後に凍結保存するためにキャップを緩めてインキュベーターに入れた。
２９．インキュベーターからG-Rex 500MCSを取り出し、ＳＣＤの横に置いた。
３０．３００ｍｌ  ＴＰをアカシアポンプの吸入ラインに滅菌溶接した。
３１．G-Rex 500MCSフラスコの赤ラインをアカシアポンプの排出ラインに滅菌溶接した。
３２．フラスコに細胞を注入した。
３３．ラインが完全にクリアされていることを確認してから、赤ラインを元の溶接部の近くでヒートシールした。
３４．大きいフィルターラインを除き、G-Rex 500MCSの全てのクランプが閉じていることを確認した。
３５．G-Rex 500MCSをインキュベーターに戻し、G-Rexインキュベーターに置かれた時間を記録した。
３６．沈降プレートの注文をし、その微生物学研究室への配送を確実にした。
【０６９７】
過剰の凍結保存
[00762]  細胞に加える凍結培地の計算量：
【０６９８】
【表１９】
2021519582.tif 000021
【０６９９】
３７．ＴＩＬを４００×ｇで、２０℃で５分間、最大減速及び最大加速で沈下させた。
３８．無菌的に上清を吸引した。
３９．チューブの底を軽く叩き、残った液体に細胞を再懸濁した。
４０．チューブを軽く叩きながら、準備した凍結培地をゆっくりと加えた。
４１．適切なサイズの冷凍保存チューブに分注し、細胞を−８０℃に入れた時間を記録した。
【０７００】
実施例７：プロセス２Ａ−１６日目
[00763]  この実施例では、実施例１〜４で説明した２Ａプロセスの詳細な１６日目のプロトコルについて説明する。
【０７０１】
[00764]  無菌室環境監視−前処理。
１．バイオセーフティキャビネットは、大きい飽和アルコールワイプ又はアルコールスプレーで洗浄した。
２．処理を開始する前に１０分間の粒子数を確認した。
３．プロセス内の監視プレートをセットアップし、手順中に１〜２時間バイオセーフティキャビネットに置いた。
【０７０２】
[00765]  ＴＩＬの回収及びカウント。
１．５０×１０６個未満のＴＩＬで開始した培養物のＣＭ４の１０Ｌバッグ１つを３７℃のインキュベーターで少なくとも３０分又は使用準備が整うまで温めた。
２．ＢＳＣ内で、１０ＬのLabtainerバッグにBaxterエクステンションセットを無菌的に取り付けた。
３．G-Rex 500MCSフラスコをインキュベーターから取り外し、GatheRexに隣接するベンチトップに置いた。大きいフィルターラインを除く、装置の全てのクランプを閉じたことを確認した。クイック接続ラインのクランプを「Ｔ」ジャンクションの近くに移動した。
４．Baxterエクステンションの溶接可能なチューブを介して、１０ＬのLabtainerをG-Rex 500MCSの赤回収ラインに滅菌溶接した。
５．スパイク及び記録された乾燥重量を除去する”Ｙの下に２Ｌ移送パック２”をヒートシールした。２Ｌ  ＴＰをG-Rex 500MCSのクリア収集ラインに滅菌溶接した。
６．G-Rex 500MCSを水平面に置いた。
７．１０ＬのLabtainerに向かう全てのクランプを開放し、GatheRexを使用して、約４Ｌの培養上清を１０ＬのLabtainerに移した。
８．適切なGatheRex回収指示に従って回収した。
９．赤ラインをクランプし、ＴＩＬの回収開始時間を記録した。
１０．空気がラインに入ると、Gatherexは停止した。赤ラインをクランプした。
１１．上清を除去した後、全ての細胞が膜から剥離するまでフラスコを旋回した。フラスコを傾けて、ホースがフラスコの端にくるようにした。
１２．２Ｌ  ＴＰに向かう全てのクランプを開放し、GatheRexを使用して、残留細胞懸濁液を２Ｌ  ＴＰに移し、全ての細胞が収集されるまで端を傾斜したまま維持した。
１３．付着した細胞について膜を検査した。
１４．必要に応じて、赤ラインのクランプを開放して逆洗し、重力によって一部の培地をフラスコに流入させた。
１５．赤ライン及びトリプルヒートシールを閉じた。
１６．フラスコを激しく叩いて細胞を遊離させた。
１７．２Ｌ  ＴＰに細胞を加えた。
１８．乾燥重量が記録されたときとほぼ同じ長さのチューブを残して、２Ｌ移送パックをヒートシールした。
１９．G-Rex 500MCSを保持し、スプリットで再使用した。
２０．細胞懸濁液を含む移送パックの質量を記録し、細胞懸濁液の容積を計算した。
２１．乾燥質量を含む、細胞懸濁液量を決定した。
２２．細胞懸濁液バッグに４インチトランスファーセットを滅菌溶接した。
２３．ＢＳＣ内で、細胞を静かに混合し、２０ｃｃシリンジで１１ｍｌを吸い上げ、表１４に示すように分注した：
【０７０３】
【表２０】
2021519582.tif 000022
【０７０４】
２４．ヒートシールした。クランプを保持しているルアー接続を閉じた
２５．細胞懸濁液に表示を付してインキュベーターに入れ、インキュベーターに入れた時間を記録した。
２６．新たな容積を計算した。
２７．細胞懸濁液量及びＱＣ用に除去された量に基づいた２Ｌ移送パック内の量を記録した（１１ｍＬ）。
２８．植菌及び指示された無菌試験。
２９．マイコプラズマ試験のため、保留中のラックに４℃でマイコプラズマ試料を貯蔵した。
３０．ＴＩＬが播種されるまで取っておいた。
【０７０５】
[00766]  細胞カウント：
[00767]  記録データに対し一度の細胞カウントを実施し、バッチ記録に生データのカウントを添付した。文書化された希釈。Cellometerカウントプログラムを文書化した。正しい希釈がCellometerに入力されたことを確認した。
【０７０６】
[00768]  続く方法：
３１．継代培養に必要なフラスコの総数を計算した。
＊＊元の容器を再利用し、追加的な容器の端数を切り上げた。
【０７０７】
[00769]  ＣＭへのＩＬ−２の追加
１．Aim Vの１０Ｌバッグ及びGlutamaxをＢＳＣに入れた。
２．培地バッグに４インチの血漿移送セットを固定した。
３．１８Ｇ針を１０ｍＬシリンジに取り付け、５ｍＬのＩＬ−２をシリンジに引き込んだ（最終濃度は３０００ＩＵ／ｍＬ）。
４．針を取り外し、シリンジを無菌的に血漿移送セットに取り付け、ＩＬ−２をバッグに分注した。
５．ラインを空気で洗い流し、培地を吸い上げてバッグに分注した。これにより、全てのＩＬ−２が培地に含まれる。
６．Aim Vの残りのバッグについても繰り返した。
【０７０８】
[00770]  G-Rex 500MCSフラスコを調製する：
１．フラスコに加えるＣＭ４の量を決定した。フラスコ毎に加えられた細胞の容積及びＣＭ４の５０００ｍＬ−Ａの容積を記録した。
２．大きいフィルターラインを除く全てのクランプを閉じた。
３．アカシアポンプの吸入ラインを、ＣＭ４を含む培地バッグの４インチ血漿移送セットに滅菌溶接した。
４．ポンプの排出ラインをG-Rex 500MCSに赤収集ラインを介して滅菌溶接した。
５．フラスコのラインをガイドとして使用して、決定された量のＣＭ４をG-Rex 500MCSに注入した。
６．G-Rex 500MCSの赤ラインをヒートシールした。
７．各フラスコについてステップ４〜６を繰り返した。重力充填又は複数のポンプを使用して、複数のフラスコに同時に充填できた。「Ｙ」コネクタをポンプの排出ラインに溶接し、２本のアームを２本のG-Rex 500MCSフラスコに溶接し、両方を同時に充填した。
８．フラスコを３７℃、５％ＣＯ２に入れた。
【０７０９】
[00771]  ＴＩＬの入ったフラスコを播種する
１．大きいフィルターラインを除いて、G-Rex 500MCSの全てのクランプを閉じた。
２．細胞産物バッグをアカシアポンプの吸入ラインに滅菌溶接した。
３．アカシアポンプの端をG-Rex 500MCSの赤ラインに滅菌溶接した。
４．ポンプブーツをポンプに入れた。
５．細胞産物バッグを化学天秤に置き、G-REXフラスコにＴＩＬを加えた時間を記録した。
６．化学天秤の目盛りをゼロに戻した。
７．ラインのクランプを開放し、１ｇ＝１ｍｌの仮定重量でG-Rex 500MCSに必要な量の細胞を注入した。
８．細胞バッグを逆さまにして、空気を送ってラインをクリアにした。G-Rex 500MCSの赤ラインをヒートシールした。フラスコをインキュベーターに入れた。
９．ポンプの排出ラインを以下のG-Rex 500MCSに赤収集ラインを介して滅菌溶接した。
１０．細胞をよく混合した。
１１．全てのフラスコで細胞の移動を繰り返した。
１２．フラスコを３７℃、５％ＣＯ２に置き、ＴＩＬをG_REXフラスコに加えた時間を記録した。
１３．微生物学研究室へ沈降プレートの試験指示をした。
１４．受託番号を記録した。
１５．好気的及び嫌気的無菌性の試験の指示をした。
１６．プレート及びボトルの微生物学研究室への配送を確実にした。
【０７１０】
[00772]  流動性又は過剰細胞の凍結保存：
１．必要な凍結培地の計算量：
ａ．標的細胞濃度は１×１０８／ｍｌであった。除去されたセルの総量を記録した。標的細胞濃度は１×１０８細胞／ｍＬであった。加える凍結培地の総量を計算した。
２．凍結保存培地を調製し、必要になるまで４０℃に置いた。
３．ＴＩＬを４００×ｇで、２０℃で５分間、最大減速及び最大加速で沈下させた。
４．無菌的に上清を吸引した。
５．チューブの底を軽く叩き、残った液体に細胞を再懸濁した。
６．チューブを軽く叩きながら、準備した凍結培地をゆっくりと加えた。
７．適切なサイズの表示が付されたクライオチューブに分注した。
８．バイアルをMr. Frosty又は同等品に入れ、−８０℃の冷凍庫に入れた。
９．７２時間以内に恒久的な貯蔵場所に移し、−８０℃の冷凍庫に入れた日時を文書化して記録した。
【０７１１】
実施例８：プロセス２Ａ−２２日目
[00773]  この実施例では、実施例１〜４で説明した２Ａプロセスの詳細な２２日目のプロトコルについて説明する。
【０７１２】
[00774]  否定的なプロセス内滅菌結果を文書化する
[00775]  回収を開始する前に、微生物学研究室から１６日目の予備無菌結果を取得した。結果が肯定的である場合、更なる指示について研究室長又は指定者に連絡した。
【０７１３】
[00776]  無菌室環境監視−前処理
１．処理を開始する前に１０分間の粒子数を確認した。
２．バイオセーフティキャビネットは、大きい飽和アルコールワイプ又はアルコールスプレーで洗浄した。
３．プロセス内の監視プレートをセットアップし、手順中に１〜２時間バイオセーフティキャビネットに置いた。
【０７１４】
[00777]  高度な調製
１．ＢＳＣ内で、１０ＬのLabtainerバッグ又は同等品にBaxterエクステンションセットを無菌的に取り付けた。LOVOろ液バッグに表示を付した。
２．PlasmaLyte Aの３つの１ＬバッグをＢＳＣに入れた。
３．プールの準備し、PlasmaLyte Aバッグに１％ＨＳＡの表示を付した。
３．１．４Ｓ−４Ｍ６０コネクタセットの全てのクランプを閉じ、各PlasmaLyteバッグを固定した。
３．２．４Ｓ−４Ｍ６０のオス端部の１つをアカシアポンプブーツの吸入ラインに溶接した。
３．３．ポンプブーツの排出ラインを３リットル収集バッグに溶接した。ポンプするラインを除く３Ｌバッグの全てのクランプを閉じた。
３．４．３リットルのPlasmalyteを３リットルのバッグに注入した。必要に応じて、ポンプを逆転させて３Ｌバッグから空気を抜いた。
３．５．メスルアーのラインを除く全てのクランプを閉じた。
３．６．２つの１００ｍＬシリンジと１６〜１８Ｇ針を使用して、１２０ｍＬの２５％ＨＳＡをロードした。シリンジに赤いキャップを付けた。
３．７．３リットルバッグのメスルアーにシリンジを１つ取り付け、ＨＳＡを３ＬのPlasmaLyteバッグに移した。よく混合した。
３．８．第２のシリンジで繰り返した。
３．９．十分に混合した。
３．１０．全てのクランプを閉じた。
３．１１．１０ｍＬシリンジを使用して、３リットルバッグの無針ポートから５ｍＬの１％ＨＳＡのPlasmaLyteを取り出した。
３．１２．ＩＬ−２希釈のためにキャップを付けたシリンジをＢＳＣで維持した。
３．１３．全てのクランプを閉じた。
３．１４．ポンプブーツからメスルアーラインを取り外しヒートシールした。
３．１５．LOVO洗浄バッファーに表示と日付を付した。周囲温度で、２４時間以内で期限切れとした。
【０７１５】
[00778]  ＩＬ−２調製
１．５ｍＬシリンジから表示が付された５０ｍｌの滅菌コニカルチューブにPlasmalyte／１％ＨＳＡを分配した。
２．PlasmaLyteを含むチューブに０．０５ｍＬのＩＬ−２ストックを加えた。
３．ＩＬ−２、６×１０４個に表示を付した
４．ラベルをキャップし、２〜８℃で貯蔵した。容積を記録した。
【０７１６】
[00779]  細胞の調製
１．１０ＬのLabtainerbagの全てのクランプを閉じた。ルアーの接続を介してBaxter延長セットを１０Ｌバッグに取り付けた。
２．３７℃からG-REX 500Mフラスコを取り外した。
３．G-Rex 500MCSからの赤培地除去ラインを１０Ｌのバイオプロセスバッグの延長セットに滅菌溶接した。
４．G-Rex 500MCSからのクリア細胞除去ラインを３Ｌの収集バッグに滅菌溶接し、「pooled cell suspension」と表示を付した。
５．赤ライン及び１０Ｌのバッグのクランプを開放した。
６．GatheRexポンプを使用すると、第１のフラスコの容積が減少した。
注記：気泡が検出された場合、ポンプが途中で停止する可能性がある。完全に容積減少が完了しなかった場合、GatheRexポンプを再起動した。
７．上清バッグ及び赤ラインのクランプを閉じた。
８．飛散や泡立ちを避けながらＴＩＬが完全に再懸濁されるまで、G-REX 500Mフラスコを旋回させた。全ての細胞が膜から乖離していることを確認した。
９．クリアラインと３Ｌセルバッグのクランプを開いた。
１０．G-Rexフラスコを傾けて、細胞懸濁液が収集ストローのあるフラスコの側面に溜まるようにした。
１１．細胞懸濁液を収集するためにGatherRexを開始した。注記：細胞収集ストローが壁面及び底膜の接合部にない場合、ストローを適切に配置するには、通常、４５°の角度でフラスコを傾けたまま軽く叩くのみで十分であった。
１２．全ての細胞がフラスコから取り除かれるようにした。
１３．細胞がフラスコに残っている場合、１００ｍＬの上清をフラスコに戻し、旋回させて、細胞懸濁液バッグに集めた。
１４．細胞収集バッグへのラインのクランプを閉じた。GatheRexのクランプを開放した。
１５．G-Rex 500MCSのクリアラインをヒートシールした。
１６．G-Rex 500MCSの赤ラインをヒートシールした。
１７．追加的なフラスコに対してステップ３〜１６を繰り返した。
１８．２フラスコごとに、必要に応じて１０Ｌの上清バッグを交換する必要があった。
１９．複数のGatherRexが使用できた。
２０．G-Rex 500MCSの処理数を文書化した。
２１．細胞収集バッグをヒートシールした。G-REXの回収数を記録した。
２２．新しい３リットル収集バッグのメスルアーコネクタの１つから、マーカーで約２インチに印を付した。
２３．ヒートシールし、印の直下のメスルアーを取り外した。
２４．LOVO原料バッグと表示を付した。
２５．乾燥重量を記録した。
２６．１７０μｍの血液フィルターの全てのクランプを閉じた。
２７．フィルターの端部をLOVO原料バッグの印の直下に滅菌溶接した。
２８．フィルターのソースラインを、細胞懸濁液を含むバッグに滅菌溶接した。
２９．ＩＶポールに細胞を掛け、細胞の重力流移動を開始して、細胞懸濁液を上昇させた。（注記：ソースバッグをろ過装置には下げないようにした。）
３０．必要な全てのクランプを開き、ＴＩＬが細胞懸濁液バッグからフィルターを通ってLOVOソースバッグに排出されるようにした。
３１．全細胞がLOVOソースバッグに移ったら、全てのクランプを閉じ、印の直上をヒートシールし取り外しフィルターを取り外した。
３２．バッグをよく混合し、２つの３ｍＬシリンジを使用して、細胞及び生存率のカウントのためにシリンジ試料ポートから２つの独立した２ｍＬの試料を採取した。
３３．バッグの重量を量り、初期重量と最終重量に差を判定した。
３４．乾燥質量を含むデータを記録しインキュベーターに入れた。
【０７１７】
[00780]  細胞カウント。
[00781]  各試料及び記録データに対し一度の細胞カウントを実施し、バッチ記録に生データのカウントを添付した。Cellometerカウントプログラムを文書化した。正しい希釈がCellometerに入力されたことを確認した。有核細胞の総数を決定した。除去するＴＮＣの数を決定し、LOVO処理用に＝１．５×１０１１個の細胞を保持した。取り出した細胞を適切なサイズの容器に入れて廃棄した。
【０７１８】
[00782]  LOVOの回収
[00783]  事前準備で設定されたBaxter延長セットを備えた１０ＬLabtainerは、後にLOVOキットに溶接された交換用ろ液バッグであった。LOVOをオンにして、画面表示に従った。
【０７１９】
[00784]  重量計及び圧力センサーを確認する
【０７２０】
[00785]  機器操作プロファイルにアクセスするには：
１．情報ボタンに触れた。
２．機器設定タブに触れた。
３．機器操作プロファイルボタンに触れた。
４．機器操作プロファイルが表示された。
【０７２１】
[00786]  重量計を確認する
１．重量計に何も掛かっていないことを確認し、各重量計の測定値を確認した。
２．重量計のいずれかが０＋／−２ｇの範囲外で読み取られた場合、製造元の重量計校正マニュアルに記載されている重量計校正を実施した。
３．全ての重量計が、重量が掛かっていないのに許容範囲内にある場合、各重量計に１ｋｇの重量を掛け（番号１〜４）、測定値を確認した。
４．重量計のいずれかが、１−ｋｇの重量が掛かっている場合に１０００＋／−１０ｇの範囲外で読み取られた場合、製造元のLOVO使用取扱説明書に記載されている重量計校正を実施した。
【０７２２】
[00787]  圧力センサーを確認する
１．機器操作プロファイルスクリーンで圧力センサーの読み取り値を確認した。
２．該当なし：圧力センサーの測定値が０＋／−１０ｍｍＨｇの外にあった場合、製造元のLOVO使用取扱説明書に記載されているように、サービスモードで新しい大気圧設定を貯蔵した。
ａ．機器操作プロファイル画面の確認ボタンに触れた。
ｂ．機器設定の確認ボタンに触れた。
３．重量計の校正が実施された場合又は新しい大気圧設定が保存された場合、関連するセクションを繰り返した。
【０７２３】
[00788]  手順を開始するため、プロトコル選択画面のドロップダウンメニューから「TIL G-Rex Harvest」プロトコルを選択し、スタートを押した。
１．手順設定画面が表示された。
２．溶液情報ボタンに触れた。
３．溶液１画面が表示された。溶液１に必要な洗浄バッファーの種類を確認した。（PlasmaLyteと表示されていなくてはならない。）
４．次へボタンに触れ、溶液２画面に進んだ。溶液２に必要な洗浄バッファーの種類を確認した。（「なし」と表示されていなくてはならない。これは、１種類の洗浄バッファー（PlasmaLyte）のみを使用するようにプロトコルが構成されていたことを示す）
５．溶液２情報画面の確認ボタンに触れ、手順設定画面に戻った。
６．手順情報ボタンに触れた。
７．手順情報画面が表示された。
８．ユーザＩＤ入力欄に触れた。キーパッドが表示された。実施者及び検証者の頭文字を入力した。ボタンに触れ、入力を受諾した。
９．原料ＩＤ入力欄に触れた。キーパッドが表示された。製品ロット番号を入力した。ボタンに触れ、入力を受諾した。
１０．手順ＩＤ入力欄に触れた。キーパッドが表示された。「TIL Harvest」と入力した。ボタンに触れ、入力を受諾した。
１１．記録する追加的な注記がある場合、手順注記入力欄に触れた。キーパッドが表示された。注記を入力した。ボタンに触れ、入力を受諾した。
注記：手順注記の入力欄は任意選択であり、空白のままにされ得る。
１２．手順情報画面の確認ボタンに触れ、手順設定画面に戻った。
１３．手順情報ボタンに「確認」が表示されることを確認した。「確認」が表示されない場合、手順情報ボタンにもう一度触れ、ユーザＩＤ、原料ＩＤ及び手順ＩＤが全て入力されていることを確認した。
１４．パラメータ設定ボタンに触れた。
１５．一般手順情報画面が表示された。
１６．原料量（ｍＬ）入力欄に触れた。テンキーが表示された。表１から計算された細胞懸濁液の容積（ｍＬ）を入力した。
１７．ボタンに触れ、入力を受諾した。
１８．原料ＰＣＶ（％）入力欄に触れた。ＴＩＬ（生＋死）画面が表示された。
１９．セル濃度入力欄に触れた。テンキーが表示された。「×１０６ｍＬ」の単位で、原料産物に表１４の総細胞濃度／ｍＬを入力した。入力範囲は００．０〜９９．９である。ボタンに触れて入力を受諾し、一般手順情報画面に戻った。注記：細胞濃度が受諾されると、一般手順情報画面の原料ＰＣＶ（％）入力欄には、作業者が行った細胞濃度入力に基づいて、LOVOによって計算されたＰＣＶ％が表示された。
２０．一般手順画面で、次へボタンに触れ、画面４／８の最終物量（保持量）画面に進んだ。注記：画面２及び３には、作業者が入力する入力欄がなかった。
２１．最終産物量（保持量）画面が表示された。
２２．表１５の総有核細胞（ＴＮＣ）値を使用して、以下の表（表１６）で最終産物の標的容積を決定した。LOVO手順の設定中に、その細胞範囲に関連付けられた最終産物容積（ｍＬ）を入力した。
【０７２４】
【表２１】
2021519582.tif 000023
【０７２５】
【表２２】
2021519582.tif 000024
【０７２６】
２３．表１６から指定された容積を標的にするため、最終産物容積（ｍＬ）入力欄に触れた。テンキーが表示された。ｍＬ単位で所望の最終産物量を入力した。ボタンに触れ、入力を受諾した。
２４．最終産物量（保持量）画面に触れ、手順設定画面に戻った。注記：画面５〜８には、作業者が入力する入力欄がなかった。
２５．パラメータ設定ボタンに「確認」が表示されることを確認した。「確認」が表示されない場合、手順情報ボタンにもう一度触れ、ページ１の原料容積及び原料ＰＣＶが入力されていることを確認した。また、標的最小最終産物量チェックボックスがチェックされていること又はページ４の最終産物量（ｍＬ）欄が入力されていることを確認した。
２６．画面の右上隅にある推定ボタンに触れた。
２７．推定概要画面が表示された。原料及びPlasmaLyte洗浄バッファーの十分且つ正確な値を確認した。
２８．使い捨てキットをロードした：ヘルプボタン「（？）」を選択して、キットをロードする画面の指示に従った。
２９．ろ液及び溶液１に表示される容積を書き留めた（PlasmaLyteを読まれたい）。
３０．ろ液及び溶液１に表示される容積を書き留めた（PlasmaLyteを読まれたい）。
３１．使い捨てキットのロード手順については、ヘルプボタンにふれるか、詳細な手順についての使用取扱説明書の手順に従った。
３２．標準のLOVO使い捨てキットがロードされたら、次へボタンに触れた。容器情報及び場所情報画面が表示された。スケール＃３からろ液バッグを取り外した。
３３．このプロトコルでは、ろ液容器は新しく、新しく測定上限を超えていた。
３４．ろ液容器がすでに新規及び測定上限超と表示された場合、変更は行われなかった。
３５．ろ液の種類が元のと表示されている場合、元のボタンに触れ新規に切り替えた。
３６．ろ液の位置が測定範囲内と表示されている場合、測定範囲内ボタンに触れ測定上限超に切り替えた。
３７．生成されるろ液の量が≦２５００ｍＬの場合、ろ液容器の位置は、実施中のものの一貫性を図るため、測定範囲内と表示され、ろ液容器の位置は測定上限超に変更され、容器の種類は「新規」であった。
３８．測定範囲内ボタンに触れ、測定上限超に切り替えた。移送セットを、滅菌溶接技術を使用して取り付け、LOVO使い捨てキットのろ液容器を１０−Ｌバッグに交換した。溶接部を開いた。
３９．ベンチトップにろ液容器を置いた。重量計＃３にろ液バッグを掛けなかった。手順中に計量計＃３は空だった。
４０．ろ液容器に通じるチューブのプラスチック製クランプを開放した。注記：溶接中にチューブがＦクランプから外れた場合、クランプで交換した。
４１．ろ液容器容量入力欄に触れた。テンキーが表示された。新規合計ろ液容量（１０，０００ｍＬ）を入力した。「確認」ボタンに触れ、入力を受諾した。
４２．滅菌溶接技術を使用して取り付け、LOVO使い捨てキットのろ液容器を１０−Ｌバッグに交換した。溶接部を開いた。注記：溶接中にチューブがＦクランプから外れた場合、クランプで交換した。
４３．ベンチトップに新規ろ液容器を置いた。重量計＃３にろ液バッグを掛けなかった。手順中に計量計＃３は空だった。
４４．ろ液容器に通じるチューブのプラスチック製クランプを開放した。
４５．保持容器の場合、画面には元の測定範囲内が表示された。
４６．保持容器は変更されなかった。
４７．ろ液容器に全ての変更が加えられ、適切な情報が入力されたら、次へボタンに触れた。
４８．使い捨てキットドライチェックオーバーレイが表示された。キットが適切にロードされたことを確認し、はいボタンを押した。
４９．全てのLOVO臨床クランプが自動的に閉じ、使い捨てキットの取り付け確認画面が表示された。LOVOには、キットを確認するために一連の加圧手順が実施された。
５０．使い捨てキットのチェックに合格すると、溶液の接続画面が表示された。
５１．３Ｌは洗浄量であった。画面にこの値を入力した。
５２．滅菌溶接技術を使用して、PlasmaLyteの３Ｌバッグを、クランプ１を通過するチューブに取り付けた。溶接部を開いた。
５３．PlasmaLyteバッグをＩＶポールに掛け、
５４．PlasmaLyteバッグに通じるチューブのプラスチック製クランプを開放した。
５５．溶液量の入力が３０００ｍＬであることを確認した。これは以前に入力されたものであった。
５６．次へボタンに触れた。使い捨てキット準備オーバーレイが表示された。PlasmaLyteが取り付けられ、PlasmaLyteにつながるチューブの溶接部及びプラスチック製のクランプが開いていることを確認し、はいボタンに触れた。注記：LOVO手順では１種類の洗浄バッファー（PlasmaLyte）のみが使用されたため、クランプ２を通るチューブに溶液は付着しなかった。このチューブのRobertsクランプは、処置中は閉じたままであった。
５７．使い捨てキット準備が開始され、使い捨てキット準備中画面が表示された。PlasmaLyteのバッグに接続されたチューブを介して、PlasmaLyteが移動することを視覚的に観察した。流体が動いていない場合、画面上の一時停止ボタンを押して、クランプ又は溶接が依然として閉じているか否かを確認した。問題が解決したら、画面の再開ボタンを押し、使い捨てキット準備を再開した。
５８．使い捨てキット準備が正常に終了すると、原料接続画面が表示された。
５９．このプロトコルでは、原料容器は新しく測定上限を超えていた。
６０．原料容器がすでに新規及び測定上限超と表示された場合、変更は行われなかった。
６１．原料の位置が測定範囲内と表示されている場合、測定範囲内ボタンに触れ測定上限超に切り替えた。
６２．原料容量（ｍＬ）入力欄に触れた。テンキーが表示された。原料産物を保持した容器の容量を入力した。確認ボタンに触れ、入力を受諾した。注記：原料容量の入力は、原料準備段階中にバッグに加えられた追加的な溶液をソースバッグが保持できるようにするために使用された。
６３．滅菌溶接技術を使用して、原料容器を、クランプＳを通過するチューブに取り付けた。溶接部を開いた。必要に応じて、クランプからチューブを取り外した。
６４．必ずソースチューブをＳクランプに取り付けた。
６５．次へボタンに触れた。原料準備オーバーレイが表示された。原料が使い捨てキットに取り付けられ、原料につながるチューブの溶接部及びプラスチック製のクランプが開いていることを確認し、はいボタンに触れた。
６６．原料準備が開始され、原料準備中画面が表示された。原料バッグに取り付けられたチューブを介して、PlasmaLyteが移動しているのを視覚的に観察した。流体が動いていない場合、画面上の一時停止ボタンを押して、クランプ又は溶接が依然として閉じているか否かを確認した。問題が解決したら、画面の再開ボタンを押し、原料準備を再開した。
６７．原料の準備が正常に終了すると、手順開始画面が表示された。
６８．開始ボタンを押した。「前洗浄サイクル１」の一時停止画面が表示され、「ＩＰを塗布、原料を混合する」の指示が表示された。
６９．ＩＰバッグを前塗布した。
７０．開始ボタンを押す前に、重量計＃２からＩＰバッグを取り外し（ＩＰトップポートチューブガイドからチューブを取り外すこともできた）、手動で反転させ、使い捨てキットの準備ステップ中に加えた洗浄バッファーがバッグの全内部表面に塗布されるようにした。
７１．ＩＰバッグを重量計”＃２（左に面したバッグの表示）に再び掛けた。チューブガイドのトップポートチューブが外れた場合には交換した。
７２．原料バッグを混合した。
７３．開始ボタンを押す前に、重量計＃１から原料バッグを取り出し、数回反転させて均一な細胞懸濁液を作製した。
７４．原料バッグを重量計＃１又はＩＶポールに再び掛けた。バッグが揺れていないことを確認した。
７５．開始ボタンを押した。
７６．LOVOは原料バッグからの流動を開始し、洗浄サイクル１画面が表示された。
【０７２７】
[00789]  LOVO手順中、系は自動的に一時停止して、作業者が異なるバッグを確認できるようにした。一時停止中に異なる画面が表示された。各画面に対応する指示に従った。
【０７２８】
[00790]  原料洗滌一時停止
[00791]  原料バッグを排出させた後、LOVOが原料バッグに洗浄バッファーを加えバッグをすすいだ。設定量の洗浄バッファーが原料バッグに加えられた後、LOVOは自動的に一時停止し、原料洗滌一時停止画面を表示した。
【０７２９】
[00792]  原料洗滌一時停止画面が表示されたら、作業者は以下のことを行いった。
１．原料バッグを重量計＃１から取り外した。
１．原料バッグを数回反転させ、洗浄バッファーがバッグ内部全体に触れるようにした。
２．原料バッグを重量計＃１に再び掛けた。原料バッグが重量計＃１で揺れていないことを確認した。
３．再開ボタンを押した。
【０７３０】
[00793]  LOVOは原料バッグからの洗滌液を処理し、自動化手順を続けた。
【０７３１】
[00794]  ＩＰバッグ混合の一時停止
[00795]  スピナを通過させる別の細胞を準備するため、ＩＰバッグを洗浄バッファーで希釈した。ＩＰバッグに洗浄バッファーを追加すると、LOVOは自動的に一時停止し、「ＩＰバッグ混合」一時停止画面が表示された。
【０７３２】
[00796]  「ＩＰバッグ混合」一時停止画面が表示されたら、作業者は以下のことを行った。
１．ＩＰバッグを重量計＃２から取り外した。ＩＰトップポートチューブガイドからチューブを取り外すこともできた。
２．細胞懸濁液を完全に混合するため、ＩＰバッグを数回反転させた。
３．ＩＰバッグを重量計＃２に再び掛けた。また、チューブガイドのＩＰトップポートチューブが外れた場合には交換した。ＩＰバッグが重量計＃２で揺れていないことを確認した。
４．再開ボタンを押した。LOVOはＩＰバッグからの液体の処理を開始した。
【０７３３】
[00797]  ＩＰの角を揉む際の一時停止
[00798]  LOVO手順の最終洗浄サイクル中に、細胞をＩＰバッグからスピナを介して保持液（最終産物））バッグに注入した。ＩＰバッグが空になったら、１０ｍＬの洗浄バッファーをＩＰバッグの底部ポートに加え、バッグをすすいだ。洗滌液を追加した後、LOVOは自動的に一時停止し、「ＩＰバッグの角を揉む」一時停止画面が表示された。
【０７３４】
[00799]  「ＩＰバッグの角を揉む」一時停止画面が表示されたら、作業者は以下のことを行った。
１．ＩＰバッグを重量計＃２から決して取り外さなかった。
２．ＩＰバッグを重量計＃２に掛けたまま、バッグの角を揉み、残っている細胞を浮遊させた。
３．ＩＰバッグが重量計＃２で揺れていないことを確認した。
４．再開ボタンを押した。
５．LOVOはＩＰバッグから洗滌液をポンプで排出し始めた。
【０７３５】
[00800]  LOVO手順の最後に産物除去画面が表示された。この画面が表示されたら、LOVOキットの全てのバッグが操作できた。
注記：産物除去画面が表示されるまで、バッグに触れなかった。
【０７３６】
[00801]  保持バッグのポートに非常に近いチューブに止血剤を入れ、細胞懸濁液がチューブに落ちないようにし、止血剤の下でトリプルヒートシールした。
【０７３７】
[00802]  中間シールを破って保持液バッグを取り外し、ＢＳＣに移した。
【０７３８】
[00803]  産物除去画面の指示に従った。
【０７３９】
[00804]  次へボタンに触れた。全てのLOVO臨床クランプが開放され、キット除去画面が表示された。
【０７４０】
[00805]  キット除去画面の指示に従った。完了後次に進んだ。
【０７４１】
[00806]  次へボタンに触れた。全てのLOVO臨床クランプが閉鎖され、結果概要画面が表示された。表１７の結果概要画面のデータを記録した。全てのポンプを閉じ、支持剤をろ過した。
【０７４２】
【表２３】
2021519582.tif 000025
【０７４３】
[00807]  次へボタンに触れた。プロトコル選択画面が表示された。
【０７４４】
[00808]  LOVO終了手順
１．全てのクランプが閉鎖され、フィルターサポートが直立位置にあることを確認した。
２．LOVOの前面にある停止ボタンに触れた。
３．停止ボタン決定オーバーレイが表示された。
４．終了確認オーバーレイが表示された。
５．はいボタンに触れた。終了中画面が表示された。
６．数秒後、電源オフ画面が表示された。この画面が表示されたら、機器の左後部にあるスイッチを使用してLOVOの電源を切った。
【０７４５】
[00809]  最終的な製剤化された産物量を表に記録した。
【０７４６】
[00810]  最終産物表から必要なＩＬ−２の量を計算した。
【０７４７】
【表２４】
2021519582.tif 000026
【０７４８】
[00811]  Cryobagの数と保持量を判定した
【０７４９】
[00812]  標的容積に印を付け、凍結保存バッグの数と産物の保持試料の容積の下の表を保持した。
【０７５０】
[00813]  標的容積／バッグ計算：（最終製剤量−１００％回収率が得られないための量調整＝１０ｍＬ）／バッグの数。
【０７５１】
[00814]  １：１（容積：容積）のCS10（CryoStor 10、BioLife Solutions）及びＩＬ−２で細胞を調製した。
１．接続装置の組み立て
１．１．CS750クライオバッグをCC2 Cell Connect装置に滅菌溶接し、各バッグの遠位オスルアーエンドの１つを交換した。
１．２．クランプを閉鎖位置で保持した。
１．３．バッグ１〜４に表示を付した。
２．ＩＬ−２及び接続装置で細胞を調整した。
２．１．ＢＳＣ内で、細胞産物バッグに、メスルアーコネクタ付き４インチ血漿移送セットを取り付けた。移送セットのクランプが閉鎖されていることを確認した。
２．２．適切なサイズのシリンジを使用して、最終産物表から判定されたＩＬ−２作用希釈液の容積を調製した。
２．３．LOVO産物に分配した。
２．４．LOVO産物バッグをＣＣ２シングルスパイクラインに滅菌溶接し、スパイクを取り除いた。
２．５．細胞及び装置を移送バッグに入れ、２〜８℃で≦１５分間置いた。
３．CS10の追加
３．１．ＢＳＣ内で、冷却CS10バッグのオスルアーに三方活栓を取り付けた。
３．２．活栓のメスルアーに適切なサイズのシリンジを取り付けた。
３．３．バッグのクランプを開放し、「最終製剤産物量」表で決定されたCS10の量を調製した。
３．４．シリンジを取り外し、赤キャップをした。
３．５．複数のシリンジが必要な場合には繰り返した。
３．６．２〜８℃の冷蔵庫から細胞／ＣＣ２装置を取り出し、ＢＳＣに入れた。
３．７．CS10を含む第１のシリンジを活栓の中央のルアーに取り付けた。活栓を回して、CS750バッグへのラインが「オフ）」の位置になるようにした。
３．８．ゆっくりと穏やかに混合しながら、CS10（１：１、容積：容積）を細胞に加えた。
３．９．CS10の追加的なシリンジについても繰り返した。
【０７５２】
[00815]  製剤細胞産物のCryobagへの追加
１．各凍結バッグに入れる細胞の量に合わせて、シリンジを適切なサイズのシリンジに交換した。
２．細胞産物を混合した。
３．細胞産物バッグに通じるクランプを開放し、適切な量を引き出した。
４．細胞産物バッグが「オフ」の位置になるように活栓を回し、シリンジの内容物をCryobag＃１に分配した。シリンジからの空気でラインをクリアした。
【０７５３】
[00816]  最終産物の量を記録した
１．不要なポート及び適切なサイズのシリンジを使用して、事前に決定した保持量を調製した。
２．「保持」と表示を付した５０ｍＬコニカルチューブに保持した。
３．ハーネスに取り付けられたシリンジを使用して、細胞を約１インチまでチューブに吸い上げながらバッグから全ての空気を取り除いた。クランプを閉鎖しヒートシールした。２〜８℃に置いた。
４．活栓を回して、Cryobagが「オフ」の位置にあるようにした。
５．細胞産物バッグ内の細胞を混合し、活栓上の新しいシリンジを使用して残りのCS７５０バッグに対してステップ３〜８を繰り返して、細胞を保持した。
６．産物がＣＲＦに入ったら、処理のために取っておいた。
【０７５４】
[00817]  制御速度フリーザー（ＣＲＦ）手順（実施例９も参照のこと）
１．ＣＲＦ（CryoMed Controlled Rate Freezer、Model 7454）及び関連するラップトップコンピューターの電源を入れた。
２．アカウントとパスワードを使用してコンピュータにログオンした。
３．デスクトップにある制御速度フリーザーアイコンを開いた。
４．主画面で実施ボタンをクリックした。
５．プロファイルを開くをクリックし、開くをクリックした。
６．実施ファイル名を入力し、続けて、runMMDDYYYYの形式で日付を入力した。
７．MMDDYYYのようにダッシュなしで日付としてデータタグを入力した。
８．ＣＲＦの扉を閉じた。
９．実施の開始をクリックした。
１０．プルダウンメニューで「COM 6」を選択した。
１１．OKをクリックした。約３０秒待った。
１２．「プロファイルをダウンロードする」がポップアップしたら、「OK」をクリックした。保存をクリックした。（制御速度の凍結プロファイルの詳細については、実施例９を参照のこと。）
１３．試料がＣＲＦに入るまで、緑色のボタンを押すのを待った。冷凍庫は、それらを追加する準備ができるまで４℃で保持された。
１４．ＣＲＦに試料を加えた。
１５．ＣＲＦが４℃に戻るまで待った。温度が達したら、緑色の続行ボタンをクリックした。これにより、プログラム内の以下のステップに進むプログラムが開始された。
１６．容器の完全性、ポートの完全性、シールの完全性、細胞集塊の存在及び粒子の存在について、Cryobagの目視検査を実施した（注：過剰又は不足検査は実施しなかった）。
１７．承認済みの掛札表示を各バッグに付した。
１８．検証済みの最終産物表示：ロット番号、産物名、製造日、産物量、他の添加物、保管温度、有効期限。
１９．各々のCryobag（掛札付き）をオーバーバッグに入れた。
２０．ヒートシールした。
２１．冷温カセットに入れた。
２２．バッグ毎に繰り返した。
２３．表示を付したCryobagを予め調整したカセットに入れ、ＣＲＦに移した。
２４．カセットをＣＲＦの棚に均等に並べた。
２５．リボン熱電対を中央カセットに使用するか、ダミーバッグを中央位置に置いた。
２６．ＣＲＦの扉を閉じた。
２７．チャンバ温度が４℃＋／−１．５℃に達したら、ＰＣインターフェースソフトウェアの実施を押した。
２８．産物をＣＲＦに移した時間及びチャンバ温度を記録した。
【０７５５】
[00818]  品質管理試料の処理
１．必要に応じて、以下の材料を無菌的にＢＳＣに移し、以下の表に従って表示を付した。
２．以下のピペットに新しいピペットを使用した。
ＱＣ及び保持表
３．ＱＣに配送：１−細胞カウントチューブ、１−エンドトキシンチューブ、１−マイコプラズマチューブ、１−グラム染色チューブ、１チューブ再刺激チューブ及び１−迅速な試験のためのＱＣへのフローチューブ。残りの複製チューブを制御速度フリーザーに入れた。
４．ＱＣ監督者に連絡し、必要な試験を通知した。
５．試験及び保管の手順については、表１８を参照のこと。
【０７５６】
【表２５】
2021519582.tif 000027
【０７５７】
[00819]  細胞カウント
[00820]  各試料及び記録データに対し１度の細胞カウントを実施し、バッチ記録に生データのカウントを添付した。Cellometerカウントプログラムを文書化した。正しい希釈がCellometerに入力されたことを確認した。
【０７５８】
[00821]  製剤後の保持細胞の凍結保存：
１．バイアルをＣＲＦに入れた。
２．凍結完了後に貯蔵場所に移し、ＣＦＲに入れた日時を記録した。ＬＮ２に移した日時を記録した。
【０７５９】
[00822]  微生物検査
１．微生物学研究室へ沈降プレートの試験指示をした。
２．受託番号を記録した。
３．好気的及び嫌気的無菌性の試験の指示をした。
４．プレート及びボトルの微生物学研究室への配送を確実にした。
【０７６０】
[00823]  細胞産物バッグの凍結保存後
１．実施完了後にフリーザーを停止した。停止ボタンをクリックするか、フリーザーキーパッドの戻るキーを押すと、実施を停止できた。
２．カセットからCryobagを取り外した。
３．カセットを気相ＬＮ２に移した。
４．貯蔵場所を記録した。
５．テキスト入力ウィンドウが再び開いたときに追加的なコメントを入力した。このウィンドウは、実施停止方法に関係なく表示された。
６．プロファイルレポートを印刷し、実施した産物のロット番号の表示を付したバッチ記録に添付した。
７．温モードを終了し、終了ボタンで実施画面を閉じた。
実施例９：凍結保存プロセス
【０７６１】
[00824]  この実施例では、CryoMed Controlled Rate Freezer、Model 7454（Thermo Scientific）を使用して、上記の実施例８で説明した短縮閉鎖手順で調製したＴＩＬの凍結保存プロセス方法について説明する。
【０７６２】
[00825]  使用した機器は、実施例９で説明したものに加え、アルミニウム製カセットホルダーラック（CS750冷凍バッグと互換性あり）、７５０ｍＬバッグ用の低温保存カセット、低圧（２２ｐｓｉ）液体窒素タンク、冷蔵庫、熱電対センサー（バッグ用のリボンタイプ）及びCryoStore CS750凍結バッグ（OriGenScientific）である。
【０７６３】
[00826]  凍結プロセスは、核形成から−２０℃まで０．５℃の速度及び最終温度−８０℃まで１分間に１℃の冷却速度を提供する。プログラムパラメータ、ステップ１ー４℃で待機；ステップ２：１．０℃／分（試料温度）から−４℃；ステップ３：２０．０℃／分（チャンバ温度）から−４５℃；ステップ４：１０．０℃／分（チャンバ温度）から−１０．０℃；ステップ５：０．５℃／分（チャンバ温度）から−２０℃；及びステップ６：１．０℃／分（試料温度）−８０℃まで、である。
【０７６４】
[00827]  この実施例の手順を、実施例１〜８のプロセスと組み合わせて図１１に示す。
【０７６５】
実施例１０：プロセス２ＡのＴＩＬの特徴付け
この実施例では、上記の短縮閉鎖手順で作製されたＴＩＬの特性付について説明する。要約すると、短縮閉鎖手順（プロセス２Ａ、実施例１〜９に記載）は、表１９に示した従来のＴＩＬ製造プロセスよりも優れていた。プレＲＥＰの利点には、フラスコ毎の腫瘍断片の増加、培養時間の短縮、ステップ数の削減及び／又は閉鎖系に適していることが含まれ得る。プレＲＥＰからＲＥＰへの移行の利点には、プレＲＥＰからＲＥＰへのプロセスの短縮、ステップ数の削減、表現型の選択の排除及び／又は閉鎖系に適していることが含まれ得る。ＲＥＰの利点には、ステップ数の削減、ＲＥＰ期間の短縮、フラスコ間のＴＩＬの閉鎖系移送及び／又は閉鎖系培地交換が含まれ得る。回収の利点には、ステップ数の削減、自動細胞洗浄、閉鎖系及び洗浄中の産物損失の減少が含まれ得る。最終製剤及び／又は産物の利点には、出荷の柔軟性が含まれ得る。
【０７６６】
【表２６】
2021519582.tif 000028
【０７６７】
[00828]  表２０に記載されている９つの腫瘍に由来するＴＩＬを使用して、合計９つの実験を実施した。ここに示されている全てのデータは、プロセス１Ｃ及びプロセス２Ａの実施形態からの解凍された凍結ＴＩＬ産物から測定された。
【０７６８】
【表２７】
2021519582.tif 000029
【０７６９】
[00829]  プロセス２Ａついてここで説明した手順を使用して、この実施例の特性評価用ＴＩＬを作製した。簡潔に言えば、ＲＥＰの場合、１１日目に、３０００ＩＵ／ｍｌのｒｈｉＬ−２、３０ｎｇ／ｍＬ抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）及び５×１０９照射同種異系フィーダーＰＢＭＣ細胞を添加した５ＬのＣＭ２を含む１つのG-REX-500Mフラスコが調製された。減容後のプレＲＥＰG-REX-100Mフラスコから回収したＴＩＬをカウントし、５×１０６及び２００×１０６個の細胞の範囲の密度でG-REX-500Mフラスコに播種した。次に、フラスコを５日間、加湿した３７℃、５％ＣＯ２の組織培養インキュベーターに入れた。１６日目に、G-REX-500Mフラスコの容量を減らし、ＴＩＬをカウントし、その生存率を判定した。この時点で、ＴＩＬは複数のG-REX-500Mフラスコ（最大６つのフラスコ）に拡大培養され、それぞれ１×１０９個のＴＩＬ／フラスコの播種密度を有した。その後、全てのフラスコを加湿した３７℃、５％ＣＯ２の組織培養インキュベーターに更に６日間入れた。２２日目、回収の日に、各フラスコの容積を９０％減らし、細胞をプールし、１７０μｍの血液フィルターでろ過し、３ＬのOrigin EV3000バッグ又は同等品に収集し、LOVOを使用して自動洗浄の準備をした。ＴＩＬは、細胞培養培地の９９．９９％を、１％ＨＳＡを添加したPlasmaLyte-Aからなる洗浄バッファーで置き換えたLOVO自動細胞処理系を使用して洗浄した。LOVOは、ＴＩＬの９２％以上を回収しながら、血清、成長因子及びサイトカイン並びに他の破片及び微粒子を含む残留組織培養成分を事実上排除する回転ろ過膜技術を使用して動作する。洗浄完了後、細胞数を測定して、ＴＩＬの拡大率及び回収時の生存率を判定した。プロセス２Ａの最終産物を達成するために、CS10を洗浄したＴＩＬに１：１の容積：容積比で加えた。最終製剤産物を凍結保存バッグに分注し、密封し、予め冷却したアルミニウムカセットに入れた。次に、実施例９を含む本明細書に記載の手順に従って、ＴＩＬを含む凍結保存バッグをCryoMed Controlled Rate Freezer（ThermoFisher Scientific、Waltham, MA）を使用して凍結した。
【０７７０】
[00830]  ９回の実施における細胞数及び生存率を図１２及び１３で比較した。
【０７７１】
[00831]  以下の結果に示す細胞表面マーカーは、適切な市販試薬を使用して、フローサイトメトリー（Canto II flow cytometer, Becton, Dickinson, and Co., Franklin Lakes, NJ, USA）を使用して分析した。目的のマーカーの結果を図１４から図２３に示す。
【０７７２】
[00832]  ゲノムＤＮＡ及び細胞学的調製物中のテロメア長を測定するために、様々な方法が使用されてきた。テロメア制限フラグメント（ＴＲＦ）分析は、テロメア長を測定するための究極の判断基準である（de Lange et al., 1990）。ただし、ＴＲＦの主な制限は、大量のＤＮＡ（１．５μｇ）を必要とすることである。ここでは、テロメア長の測定に広く使用されている２つの手法、すなわち蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ：Fluorescence in situ Hybridization）及び定量的ＰＣＲが適用された。
【０７７３】
[00833]  フローＦＩＳＨは、Dakoキット（フローサイトメトリー用K532711-8 RUO Code K5327 Telomere PNA Kit/FITC、PNA FISH Kit/FITC。フロー、２０回の試験）及び製造元の指示に従って、テロメアの反復の平均長を測定した。簡潔に言えば、細胞の表面を４℃で２０分間ＣＤ３のＡＰＣで染色し、続いて２０分間GAM Alexa 546で染色した。次に、抗原抗体複合体を２ｍＭのＢＳ３（Fisher Scientific）化学架橋剤で架橋した。長テロメアを有するＴ細胞の標準集団であるＰＮＡ−テロメアプローブ結合、Jurkat 1301 Ｔ白血病細胞株（１３０１の細胞）は、各アッセイで内部参照標準として使用された。抗体のインキュベーション後に個々のＴＩＬをカウントし、１：１の細胞比で１３０１の細胞（ＡＴＣＣ）と混合した。５×１０５のＴＩＬを５×１０５の１３０１細胞と混合した。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション溶液（７０％ホルムアミド、１％ＢＳＡ、２０ｍＭのTris、ｐＨ７．０）で、ＦＩＴＣ結合テロメアＰＮＡプローブ（Panagene）が在るものと無いもので複製され、ＦＩＴＣ−００−ＣＣＣ−ＴＡＡ−ＣＣＣ−ＴＡＡ−ＣＣＣ−ＴＡＡ、最終濃度６０ｎＭのテロメア反復配列を補足して実施された。テロメアＰＮＡプローブの追加後、細胞を振動水浴中８１℃で１０分間インキュベートした。次に、細胞を室温で一晩暗所に置いた。翌朝、４０℃に予熱したＰＢＳで２回洗浄することにより、過剰なテロメアプローブを除去した。洗浄後、ＤＡＰＩ（Invitrogen、Carlsbad, CA）を最終濃度７５ｎｇ／ｍＬで加えた。ＤＡＰＩによるＤＮＡ染色を使用して、Ｇ０／Ｇ１集団の細胞をゲーティングした。試料分析は、当社のフローサイトメーター（BD Canto II、Mountain View, CA）を使用して実施した。試験試料のテロメア蛍光は、以下の式に従って１３０１の細胞の蛍光（ｆｌ）の割合として表された。相対テロメア長＝［（平均ＦＩＴＣ  ｆｌ試験細胞ｗ／プローブ平均ＦＩＴＣ  ｆｌ試験細胞ｗ／ｏプローブ）×ＤＮＡ指標１３０１細胞×１００］／［（平均ＦＩＴＣ  ｆｌ  １３０１細胞ｗ／プローブ−平均ＦＩＴＣ  ｆｌ  １３０１細胞ｗ／ｏプローブ）×ＤＮＡ指標試験細胞。
【０７７４】
[00834]  リアルタイムｑＰＣＲは、相対テロメア長の測定にも使用された（Nucleic Acids Res.2002 May 15; 30(10): e47., 20, Leukemia, 2013, 27, 897-906）。簡潔に言えば、９６ウェル形式のBioRad PCRサーマルサイクラー（Hercules、CA）を使用して、テロメアの反復複製数と単一遺伝子複製数（Ｔ／Ｓ）の比率を決定した。１０ｎｇのゲノムＤＮＡがテロメア又はヘモグロビン（ｈｇｂ）ＰＣＲ反応に使用され、使用されたプライマーは以下のとおりであった。ＴｅＬ−１ｂプライマー（ＣＧＧ  ＴＴＴ  ＧＴＴ  ＴＧＧ  ＧＴＴ  ＴＧＧ  ＧＴＴ  ＴＧＧ  ＧＴＴ  ＴＧＧ  ＧＴＴ  ＴＧＧ  ＧＴＴ）、ＴｅＬ−２ｂプライマー（ＧＧＣ  ＴＴＧ  ＣＣＴ  ＴＡＣ  ＣＣＴ  ＴＡＣ  ＣＣＴ  ＴＡＣ  ＣＣＴ  ＴＡＣ  ＣＣＴ  ＴＡＣ  ＣＣＴ）、ｈｇｂ１プライマー（ＧＣＴＴＣＴＧＡＣＡＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＣＡＣＴＡＧＣ）及びｈｇｂ２プライマー（ＣＡＣＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴＣＡＣＣ）。全試料は、テロメア反応とヘモグロビン反応の両方によって分析され、分析は同じプレート上で３回実施された。試験試料に加えて、各９６ウェルプレートには、１３０１細胞株から分離されたゲノムＤＮＡを使用した０．０８ｎｇから２５０ｎｇの５点標準曲線が含まれていた。各試料のＴ／Ｓ比（−ｄＣｔ）は、テロメアＣｔ値の中央値からヘモグロビン閾値サイクル（Ｃｔ）の値を差し引くことによって計算された。相対Ｔ／Ｓ比（−ｄｄＣｔ）は、未知の各試料のＴ／Ｓ比から１０．０ｎｇの標準曲線点のＴ／Ｓ比を差し引くことで決定した。
【０７７５】
[00835]  フローＦＩＳＨの結果は図２４及び２５に示されているが、プロセス１Ｃ及びプロセス２Ａ間に有意な差は観察されず、プロセス２Ａによって産生されたＴＩＬの驚くべき特性はＴＩＬのみの年齢からは予測できないことが示唆された。
【０７７６】
[00836]  結論として、プロセス２Ａは、高レベルの共刺激分子、低レベルの消耗マーカー及び再活性化時にサイトカインを分泌する能力の増加によって定義される「若い」表現型を持つ強力なＴＩＬ産物を産生した。短縮された２２日間の拡大培養プラットフォームにより、治療が緊急に必要な患者のために、ＴＩＬの臨床規模の用量を迅速に生成できる。凍結保存された製剤産物は、重要な物流効率をもたらし、急速な製造と流通の柔軟性を可能にする。この拡大培養方法は、ＴＩＬ療法のより広範な適用に対する従来の障壁を克服する。
【０７７７】
実施例１１：ＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１サイトカインカクテルの使用
[00837]  この実施例では、追加的なＴ細胞成長因子として機能するＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１サイトカインの使用を、実施例１〜１０のＴＩＬプロセスと組み合わせて説明する。
【０７７８】
[00838]  実施例１〜１０のプロセスを使用して、実験の片腕で、ＩＬ−２の存在下で、結腸直腸、黒色腫、子宮頸、三種陰性乳房、肺及び腎臓の腫瘍から、もう一方で、培養の開始時にＩＬ−２の代わりにＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１の組み合わせで、ＴＩＬを成長させた。プレＲＥＰの完了時に、培養物の拡大率、表現型、機能（ＣＤ１０７ａ＋及びＩＦＮ−γ）及びＴＣＲ  Ｖβレパートリーを評価した。ＩＬ−１５及びＩＬ−２１は、本明細書の他の箇所及びGruijl, et al.,に記載されているとおり、ＩＬ−２１は、ＣＤ２７＋ＣＤ２８＋腫瘍浸潤リンパ球の成長を促進し、細胞傷害能が高く、制御性Ｔ細胞の副次的成長が少ない。Santegoets, S. J., J Transl Med., 2013, 11:37（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3626797/）。
【０７７９】
[00839]  結果は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１で処理した条件のＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の両方で、ＩＬ−２のみの条件と比較して複数の組織でＴＩＬ拡大培養の増強（＞２０％）が観察されたことを示した。ＩＬ−２のみの培養物に比べて、ＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１で処理した培養物から得られたＴＩＬには、偏ったＴＣＲ  Ｖβレパートリーを含むＣＤ８＋集団が主に偏っていた。ＩＦＮ−γ及びＣＤ１０７ａは、ＩＬ−２のみで処理したＴＩＬと比較して、ＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１で処理したＴＩＬで上昇した。
【０７８０】
実施例１２：第２段階、多施設、黒色腫における３コホート研究
[00840]  この第２段階の多施設３コホート研究は、転移性黒色腫患者のプロセス１Ｃ（本明細書に記載されるとおり）に従って製造されたＴＩＬ療法の安全性及び有効性を評価するよう設計されている。コホート１及び２は、それぞれ最大３０人の患者を登録し、コホート３は最大１０人の患者への第２のＴＩＬ注入用の再処置コホートである。第１の２つのコホートは、２つの異なる製造プロセス（プロセス１Ｃ及びプロセス２Ａの実施形態（それぞれ実施例１〜１０で説明））を評価している。コホート１の患者は新鮮な非凍結保存ＴＩＬを受け取り、コホート２の患者は実施例１〜１０で説明したプロセスで製造された産物を受け取り、凍結保存製品を産生する。研究設計を図２６に示す。この研究は、転移性黒色腫患者のサブ集団の処置のための自己ＴＩＬの安全性及び有効性を評価する第２段階、多施設、３コホート研究である。主要な選択基準には、測定可能な転移性黒色腫及びＴＩＬ生成のために切除可能な病変が≧１；全身療法の少なくとも１つの前の段階；年齢≧１８歳；０〜１のＥＣＯＧパフォーマンスステータス、が含まれる。処置コホートには、非凍結保存ＴＩＬ産物（プロセス１Ｃを使用して調製）、凍結保存ＴＩＬ産物（プロセス２Ａの実施形態を使用して調製）及び無応答又は初期応答後に進行する患者に対するＴＩＬ産物による再処置が含まれる。主要終了点は安全性であり、副次終了点は有効性であり、客観的奏効率（ＯＲＲ）、完全寛解率（ＣＲＲ）、無増悪生存率（ＰＦＳ）、奏効期間（ＤＯＲ）及び全生存期間（ＯＳ）で定義される。
【０７８１】
実施例１３：ガンマ線照射末梢単核球の個々のロットの適格性
[00841]  本実施例は、γ線照射した末梢単核球（ＰＢＭＣ、別名ＭＮＣ）の個々のロットが本明細書に記載される例示的方法における同種異系フィーダー細胞としての使用に適格か判定するための新規簡略手順について説明する。
【０７８２】
[00842]  各照射ＭＮＣフィーダーロットは個別のドナーから調製した。精製抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）抗体及びインターロイキン−２（ＩＬ−２）の存在下におけるＲＥＰでＴＩＬを拡大培養するその能力に関して各ロット又はドナーを個別にスクリーニングした。加えて、フィーダー細胞の各ロットを、ＴＩＬを加えずに試験して、受けたガンマ線線量がそれらを複製不能にするのに十分であったことを確認した。
【０７８３】
定義／略称
ＢＳＣ−生物学的安全キャビネット
ＣＤ３−分化クラスター３；表面マーカータンパク質Ｔリンパ球
ＣＦ−遠心力
ＣＭ２−ＴＩＬ＃用の完全培地
ＣＭＯ−医薬品製造受託機関
ＣＯ２−二酸化炭素
ＥｔＯＨ−エチルアルコール
ＧＭＰ−医薬品の製造管理及び品質管理に関する基準
ＩＬ−２−インターロイキン２
ＩＵ−国際単位
ＬＮ２−液体窒素
ミニＲＥＰ−ミニ迅速拡大培養プロトコル
ｍＬ−ミリリットル
ＭＮＣ−単核球
ＮＡ−該当なし
ＯＫＴ３−MACS GMP CD3純粋（クローンＯＫＴ３）抗体
ＰＰＥ−個人用防護装備
プレＲＥＰ−迅速拡大培養プロトコル前
ＱＳ−適量；この量まで充填
ＲＥＰ−迅速拡大培養プロトコル
ＴＩＬ−腫瘍浸潤リンパ球
Ｔ２５−２５ｃｍ２組織培養フラスコ
μｇ−マイクログラム
μＬ−マイクロリットル
【０７８４】
手順
背景
７．１．１  ＴＩＬのＲＥＰには、γ線照射した増殖が止まったＭＮＣフィーダー細胞が必要であった。ＲＥＰフラスコ内でフィーダーＭＮＣ上の膜受容体が抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）抗体に結合し、ＴＩＬに架橋することにより、ＴＩＬが拡大するように刺激される。フィーダーロットは、個別のドナーから採取された全血の白血球アフェレーシスから調製した。白血球アフェレーシス産物をFicoll-Hypaqueで遠心に供し、洗浄し、照射し、且つＧＭＰ条件下で凍結保存した。
７．１．２  移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を引き起こし得るため、ＴＩＬ療法を受ける患者が生細胞のフィーダー細胞を注入されないことが重要である。従って、フィーダー細胞は、ガンマ線照射を細胞に与え、その結果二本鎖ＤＮＡ切断が生じて再培養時にＭＮＣ細胞が細胞生存能力を失うことにより、増殖が止められる。
【０７８５】
判定基準及び実験セットアップ
[00843]  フィーダーロットは２つの基準で判定された。１）共培養においてＴＩＬを＞１００倍に拡大するその能力、及び２）その複製不能性。
７．２．２  直立Ｔ２５組織培養フラスコ内で成長させた２つの初代プレＲＥＰ  ＴＩＬ株を利用するミニＲＥＰフォーマットでフィーダーロットを試験した。
７．２．３  各ＴＩＬ株がＲＥＰにおいて活性化に応答して増殖するその能力はユニークであるため、フィーダーロットは２つの異なるＴＩＬ株に対して試験した。
７．２．４  対照として、後ろ向き的に７．２．１の基準に適合することが示されている照射ＭＮＣフィーダー細胞の１ロットを、実験ロットと並行して実施した。
７．２．５  単一の実験で試験した全てのロットが等価な試験を受けることを確実にするため、全ての条件及び全てのフィーダーロットの試験に同じプレＲＥＰ  ＴＩＬ株の十分なストックが利用可能であった。
７．２．６  試験したフィーダー細胞の各ロットにつき、合計６つのＴ２５フラスコがあった：
７．２．６．１  プレＲＥＰ  ＴＩＬ株＃１（２フラスコ）
７．２．６．２  プレＲＥＰ  ＴＩＬ株＃２（２フラスコ）
７．２．６．３  フィーダー対照（２フラスコ）
注記：ＴＩＬ株＃１及び＃２が入ったフラスコは、フィーダーロットがＴＩＬを拡大させる能力を判定した。フィーダー対照フラスコは、フィーダーロットの複製不能性を判定した。
【０７８６】
[00844]  実験プロトコル
７．３．１  ２／３日目、ＴＩＬ株の解凍
７．３．１．１  ＣＭ２培地を調整した。
７．３．１．２  ３７℃の水浴中でＣＭ２を加温した。
７．３．１．３  ３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を添加した４０ｍｌのＣＭ２を調製した。使用時まで保温する。
７．３．１．４  使用したＴＩＬ株の名前の表示を付した２つの５０ｍｌコニカルチューブの各々に、ＩＬ−２を含まない２０ｍｌの予め加温したＣＭ２を入れた。
７．３．１．５  ＬＮ２貯蔵庫から２つの指定のプレＲＥＰ  ＴＩＬ株を取り出し、バイアルを組織培養室に移した。
７．３．１．６  ＴＩＬ株識別を記録した。
７．３．１．７  残りの氷が少量になるまでバイアルを３７℃の水浴中の密封されたジッパー式貯蔵用バッグの内部に置くことにより、バイアルを解凍した。
７．３．１．８  解凍したバイアルは７０％エタノールを噴霧するか又はそれで拭き取り、バイアルをＢＳＣに移す。
７．３．１．９  滅菌ホールピペットを使用してバイアルの内容物を直ちに表示を付した調製済み５０ｍｌコニカルチューブ内の２０ｍｌのＣＭ２中に移した。
７．３．１．１０  ＩＬ−２を含まないＣＭ２を使用して４０ｍｌまでＱＳして細胞を洗浄した。
７．３．１．１１  ４００×ＣＦで５分間遠心した。
７．３．１．１２  上清を吸引し、３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を添加した５ｍｌの温ＣＭ２に再懸濁した。
７．３．１．１３  少量のアリコート（２０μｌ）をデュプリケートで取り出し、自動セルカウンターを使用して細胞をカウントした。カウントを記録した。
７．３．１．１４  カウントする一方で、ＴＩＬ細胞が入った５０ｍｌコニカルチューブは、キャップを緩めてガス交換を可能にして、加湿した３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに置いた。
７．３．１．１５  細胞濃度を決定し、３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を添加したＣＭ２でＴＩＬを１×１０６細胞／ｍｌに希釈した。
７．３．１．１６  加湿した３７℃インキュベーター内で必要に応じた数のウェルにおいて２４ウェル組織培養プレートの１ウェルあたり２ｍｌでミニＲＥＰの０日目まで培養した。
７．３．１．１７  混同及び潜在的な交差汚染を避けるため、異なるＴＩＬ株は別個の２４ウェル組織培養プレートにおいて培養した。
【０７８７】
７．３．２  ０日目、ミニＲＥＰを開始する
７．３．２．１  試験するフィーダーロットの数に十分なＣＭ２培地を調製した（例えば、１回に４つのフィーダーロットを試験するために、８００ｍｌのＣＭ２培地を調製した）。
７．３．２．２  ７．３．２．１で調製したＣＭ２の一部をアリコートに分け、細胞の培養のため、それに３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を添加する（例えば、１回に４つのフィーダーロットを試験するために、５００ｍｌの３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２含有ＣＭ２培地を調製する）。
７．３．２．３  ＩＬ−２を含まない残りのＣＭ２は、以下に記載するとおり細胞の洗浄に使用される。
７．３．２．４  各ＴＩＬ株を別々に作業して交差汚染を防ぎながら、ＴＩＬ培養物が入った２４ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、ＢＳＣに移した。
７．３．２．５  滅菌ホールピペット又は１００〜１０００μｌピペッター及びチップを使用して、使用するＴＩＬの各ウェルから約１ｍｌの培地を取り出し、２４ウェル組織培養プレートの使用されていないウェルに入れた。これは洗浄ウェルに使用した。
７．３．２．６  新鮮な滅菌ホールピペット又は１００〜１０００μｌピペッター及びチップを使用して、ウェル内で残りの培地をＴＩＬと混合して細胞を再懸濁し、次にＴＩＬ名が表示された５０ｍｌコニカルチューブに細胞懸濁液を移し、容積を記録した。
７．３．２．７  確保しておいた培地でウェルを洗浄し、その容積を同じ５０ｍｌコニカルチューブに移した。
７．３．２．８  細胞を４００×ＣＦでスピンして細胞ペレットを収集した。
７．３．２．９  培地上清を吸引して取り除き、３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を含有する２〜５ｍｌのＣＭ２培地中に細胞ペレットを再懸濁した；使用される容積は、回収されるウェルの数及びペレットのサイズに基づく（容積は＞１．３×１０６細胞／ｍｌの濃度を確保するのに十分であろう）。
７．３．２．１０  血清用ピペットを使用して、細胞懸濁液を完全に混合し、容積を記録した。
７．３．２．１１  ２００μｌを取り出し、自動セルカウンターを使用して細胞をカウントした。
７．３．２．１２  カウントする一方で、ＴＩＬ細胞が入った５０ｍｌコニカルチューブは、キャップを緩めてガス交換を可能にして、加湿した、５％ＣＯ２、３７℃のインキュベーターに置いた。
７．３．２．１３  カウントを記録した。
７．３．２．１４  ＴＩＬ細胞が入った５０ｍｌコニカルチューブをインキュベーターから取り出し、３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を添加した温ＣＭ２中にそれらの細胞を１．３×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。キャップを緩めたまま、５０ｍｌコニカルチューブをインキュベーターに戻した。
７．３．２．１５  必要に応じて、元の２４ウェルプレートは残りのＴＩＬの再培養用にそのままにしておいた。
７．３．２．１６  第２のＴＩＬ株についてステップ７．３．２．４〜７．３．２．１５を繰り返した。
７．３．２．１７  実験用のＴ２５フラスコにＴＩＬをプレーティングする直前に、ＴＩＬは以下のステップ７．３．２．３５に従い１．３×１０５細胞／ｍｌの最終濃度に１：１０希釈した。
【０７８８】
[00845]  MACS GMP CD3純粋（ＯＫＴ３）作業溶液を調製する
７．３．２．１８  ４℃の冷蔵庫からＯＫＴ３のストック溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を取り出し、ＢＳＣに置いた。
７．３．２．１９  ミニＲＥＰの培地中には３０ｎｇ／ｍｌ  ＯＫＴ３の最終濃度を使用した。
７．３．２．２０  実験の各Ｔ２５フラスコ内の２０ｍｌにつき６００ｎｇのＯＫＴ３が必要であった；これは各２０ｍｌにつき６０μｌの１０μｇ／ｍｌ溶液又は各フィーダーロットについて試験する６つ全てのフラスコにつき３６０μｌの相当量であった。
７．３．２．２１  試験する各フィーダーロットについて、１０μｇ／ｍｌの作業濃度に対して４００μｌの１：１００希釈の１ｍｇ／ｍｌのＯＫＴ３を作成した（例えば、１回に４つのフィーダーロットを試験するために、１６００μｌの１：１００希釈の１ｍｇ／ｍｌのＯＫＴ３：１６μｌの１ｍｇ／ｍｌのＯＫＴ３＋１．５８４ｍｌの３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２含有ＣＭ２培地を作成した）。
【０７８９】
[00846]  Ｔ２５フラスコを調製する
７．３．２．２２  各フラスコに、試験したＴＩＬ株の名前、フラスコレプリケート番号、フィーダーロット番号、日付及び分析者のイニシャルの表示を付した。
７．３．２．２３  フィーダー細胞を調製する前にフラスコにＣＭ２培地を充填した。
７．３．２．２４  フラスコを３７℃の加湿された５％ＣＯ２インキュベーターに置くことにより、残りの構成成分を加えるまでの間、培地を保温した。
７．３．２．２５  フィーダー細胞を調製し終えたら、各フラスコ内のＣＭ２に構成成分を加える。
【０７９０】
[00847]  MACS GMP CD3純粋（ＯＫＴ３）作業溶液を調製する。
【０７９１】
【表２８】
2021519582.tif 000030
【０７９２】
[00848]  フィーダー細胞を調製する
７．３．２．２６  本プロトコルについては、試験した１ロットあたり最低７８×１０６個のフィーダー細胞が必要であった。ＳＤＢＢによって凍結された各１ｍｌバイアルは、凍結時に１００×１０６個の生細胞を有した。ＬＮ２貯蔵庫からの解凍時に５０％回収率と仮定すると、各ＲＥＰにつき推定１００×１０６個の生細胞を所与として、１ロットあたりフィーダー細胞の１ｍｌバイアルを少なくとも２本解凍することが推奨された。代わりに、１．８ｍｌバイアルで供給される場合、１本のバイアルのみで十分なフィーダー細胞が提供された。
７．３．２．２７  フィーダー細胞の解凍前に、試験しようとする各フィーダーロットにつき約５０ｍｌのＩＬ−２を含まないＣＭ２を予め加温した。
７．３．２．２８  ＬＮ２貯蔵庫から指定のフィーダーロットバイアルを取り出し、ジッパー式貯蔵用バッグに入れ、氷上に置いた。バイアルを組織培養室に移した。
７．３．２．２９  ３７℃の水浴に浸すことにより、閉じたジッパー式貯蔵用バッグ内でバイアルを解凍した。
７．３．２．３０  ジッパー式バッグからバイアルを取り出し、７０％ＥｔＯＨを噴霧するか又はそれで拭き取り、バイアルをＢＳＣに移した。
７．３．２．３１  ホールピペットを使用して、フィーダーバイアルの内容物を５０ｍｌコニカルチューブ内の３０ｍｌの温ＣＭ２中に直ちに移した。バイアルを少量のＣＭ２で洗浄してバイアル内に残った細胞を全て取り出した。
７．３．２．３２  ４００×ＣＦで５分間遠心した。
７．３．２．３３  上清を吸引し、４ｍｌ温ＣＭ２＋３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２に再懸濁した。
７．３．２．３４  ２００μｌを取り出し、自動セルカウンターを使用して細胞をカウントした。カウントを記録した。
７．３．２．３４  細胞を温ＣＭ２＋３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２中に１．３×１０７細胞／ｍｌで再懸濁した。
７．３．２．３４  ＴＩＬ細胞を１．３×１０６細胞／ｍｌ〜１．３×１０５細胞／ｍｌに希釈した。交差汚染を防ぐため、各ＴＩＬ株は独立に作業した。
【０７９３】
[00849]  共培養をセットアップする
７．３．２．３６  ＴＩＬ細胞を１．３×１０６細胞／ｍｌ〜１．３×１０５細胞／ｍｌに希釈した。交差汚染を防ぐため、各ＴＩＬ株は独立に作業した。
７．３．２．３６．１  １５ｍｌコニカルチューブに４．５ｍｌのＣＭ２培地を加えた。
７．３．２．３６．２  インキュベーターからＴＩＬ細胞を取り出し、１０ｍｌ血清用ピペットを使用して十分に再懸濁した。
７．３．２．３６．３  １．３×１０６細胞／ｍｌ  ＴＩＬ懸濁液から０．５ｍｌの細胞を取り出し、１５ｍｌコニカルチューブ内の４．５ｍｌの培地に加えた。ＴＩＬストックバイアルをインキュベーターに戻した。
７．３．２．３６．４  十分に混合した。
７．３．２．３６．５  第２のＴＩＬ株についてステップ７．３．２．３６．１〜７．３．２．３６．４を繰り返した。
７．３．２．３６．６  １回に２つ以上のフィーダーロットを試験する場合、各フィーダーロットについてＴＩＬのプレーティング直前にＴＩＬをより低い濃度に希釈した。
７．３．２．３７  単一のフィーダーロットについての予め加温した培地が入ったフラスコをインキュベーターからＢＳＣに移した。
７．３．２．３８  １ｍｌピペットチップで上下に数回ピペッティングすることによりフィーダー細胞を混合し、１ｍｌ（１．３×１０７細胞）をそのフィーダーロットの各フラスコに移した。
７．３．２．３９  各フラスコに６０μｌのＯＫＴ３作業ストック（１０μｇ／ｍｌ）を加えた。
７．３．２．４０  ２つの対照フラスコをインキュベーターに戻した。
７．３．２．４１  １ｍｌ（１．３×１０５）の各ＴＩＬロットを対応する表示のＴ２５フラスコに移した。
７．３．２．４２  フラスコをインキュベーターに戻し、直立でインキュベートした。５日目まで手を加えなかった。
７．３．２．４３  試験した全てのフィーダーロットについて７．３．２．３６〜７．３．２．４２を繰り返した。
【０７９４】
[00850]  ５日目、培地交換
７．３．３．１  ３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２でＣＭ２を調製した。各フラスコに１０ｍｌ必要である。
７．３．３．２  交差汚染を防ぐため、一度に単一のフィーダーロットのフラスコを取り扱った。インキュベーターからフラスコを取り出してＢＳＣに移し、フラスコの底にある細胞層を乱さないよう注意を払った。
７．３．３．３  対照フラスコを含む全てのフラスコについて繰り返した。
７．３．３．４  １０ｍｌピペットで、３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を含む１０ｍｌ温ＣＭ２を各フラスコに移した。
７．３．３．５  フラスコをインキュベーターに戻し、７日目まで直立でインキュベートした。試験した全てのフィーダーロットについて７．３．３．１〜７．３．３．６を繰り返した。
【０７９５】
[00851]  ７日目、回収
７．３．４．１  交差汚染を防ぐため、一度に単一のフィーダーロットのフラスコを取り扱った。
７．３．４．２  インキュベーターからフラスコを取り出してＢＳＣに移し、フラスコの底にある細胞層を乱さないよう注意を払った。
７．３．４．３  フラスコの底に成長する細胞を乱すことなく、各試験フラスコから１０ｍｌの培地及び対照フラスコの各々から１５ｍｌの培地を取り出した。
７．３．４．４  １０ｍｌ血清用ピペットを使用して、残りの培地に細胞を再懸濁し、十分に混合して細胞集塊を全て壊した。
７．３．４．５  各フラスコの容積を記録した。
７．３．４．６  ピペッティングにより細胞懸濁液を完全に混合した後、２００μｌを取り出して細胞をカウントした。
７．３．４．７  適切な標準実施要領を自動セルカウンター装置と併せて用いてＴＩＬをカウントした。
７．３．４．８  ７日目のカウントを記録した。
７．３．４．９  試験した全てのフィーダーロットについて７．３．４．１〜７．３．４．８を繰り返した。
７．３．４．１０  表２１（下記）に挙げる基準に従い、フィーダー対照フラスコについて複製不能性を判定し、且つＴＩＬが入ったフラスコについて０日目からの拡大倍数を判定した。
【０７９６】
[00852]  ７日目、１４日目までのフィーダー対照フラスコの継続
７．３．５．１  ７日目にフィーダー対照フラスコをカウントし終えた後、対照フラスコの各々に、３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を含有する新鮮ＣＭ２培地１５ｍｌを加えた。
７．３．５．２  対照フラスコをインキュベーターに戻し、１４日目まで直立位置でインキュベートした。
【０７９７】
[00853]  １４日目、フィーダー対照フラスコの非増殖の延長
７．３．６．１  交差汚染を防ぐため、一度に単一のフィーダーロットのフラスコを取り扱った。
７．３．６．２  インキュベーターからフラスコを取り出してＢＳＣに移し、フラスコの底にある細胞層を乱さないよう注意を払った。
７．３．６．３  フラスコの底に成長する細胞を乱すことなく、各対照フラスコから約１７ｍｌの培地を取り出した。
７．３．６．４  ５ｍｌ血清用ピペットを使用して、残りの培地に細胞を再懸濁し、十分に混合して細胞集塊を全て壊した。
７．３．６．５  各フラスコの容積を記録した。
７．３．６．６  ピペッティングにより細胞懸濁液を完全に混合した後、２００μｌを取り出して細胞をカウントした。
７．３．６．７  適切な標準実施要領を自動セルカウンター装置と併せて用いてＴＩＬをカウントした。
７．３．６．８  カウントを記録した。
７．３．６．９  試験した全てのフィーダーロットについて７．３．４．１〜７．３．４．８を繰り返した。
【０７９８】
結果及び適合基準
[00854]  結果
１０．１．１  ガンマ線照射の線量はフィーダー細胞を複製不能にするのに十分であった。全てのロットが判定基準に適合するものと予想され、また、０日目と比較してＲＥＰ培養の７日目に残る生存フィーダー細胞総数の減少も実証された。
１０．１．２  全てのフィーダーロットが、ＲＥＰ培養の７日目までにＴＩＬ成長の１００倍の拡大という判定基準に適合するものと予想された。
１０．１．３  フィーダー対照フラスコの１４日目のカウントは、７日目に見られた非増殖傾向が続くものと予想された。
【０７９９】
[00855]  適合基準
１０．２．１  フィーダー細胞の各ロットについて試験した各レプリケートＴＩＬ株は、以下の適合基準を満たしていた。
１０．２．２  以下のとおり（以下の表に概説する）、適合は２倍であった。
【０８００】
【表２９】
2021519582.tif 000031
【０８０１】
１０．２．２．１  ３０ｎｇ／ｍｌ  ＯＫＴ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２の存在下で培養したとき放射線量がＭＮＣフィーダー細胞を複製不能にするのに十分であったかどうかを判定した。
１０．２．２．１．１  複製不能かどうかは、ＲＥＰの７日目及び１４日目に自動細胞カウントによって決定したときの総生細胞数（ＴＶＣ）によって判定した。
１０．２．２．１．２  適合基準は「成長なし」であったが、これは、ＲＥＰの０日目に培養を開始した初期生細胞数から７日目及び１４日目に総生細胞数が増加しなかったことを意味する。
１０．２．２．２  フィーダー細胞がＴＩＬ拡大培養を支持する能力を判定した。
１０．２．２．２．１  ＲＥＰの０日目の培養開始からＲＥＰの７日目までの生細胞の拡大倍数の点でＴＩＬ成長を測定した。
１０．２．２．２．１  ７日目、自動細胞カウントによって判定したとき、ＴＩＬ培養物は最低でも１００倍の拡大（すなわちＲＥＰ  ０日目に培養を開始した総ＴＩＬ生細胞数の１００倍より多い）を実現した。
１０．２．２．３  ロットが上記の２つの基準に適合しない場合、そのロットは、以下のセクション１０．３に概説するコンティンジェンシープランに従い再試験した。
１０．２．２．４  不適合ロットの再試験後、当初の判定及びコンティンジェンシーテストの両方で２つの適合基準を満たさなかったＭＮＣフィーダーロットはいずれも除外した。
１０．２．２．５  適合基準を満たしたが、同じプレＲＥＰ  ＴＩＬ株で並行して試験したそれまでの他のフィーダーロットと比べてＴＩＬの拡大培養能力に関して性能が低いと判断されたＭＮＣフィーダーロットはいずれも除外した。
【０８０２】
[00856]  適合基準を満たさないＭＮＣフィーダーロットのコンティンジェンシーテスト
１０．３．１  ＭＮＣフィーダーロットが上記のセクション１０．２に概説される適合基準のいずれかを満たさなかった場合、その原因として単純な実験者エラーを排除するため以下のステップを行ってロットを再試験する。
１０．３．２  ロットのサテライトの試験バイアルが２つ以上残っている場合、そのロットは再試験した。ロットのサテライトの試験バイアルが１つ残っているか又は残っていなかった場合、上記のセクション１０．２に挙げる適合基準に基づきそのロットは不適合とした。
１０．３．３  問題のロットを判定した当初の人を含め、２人の訓練された担当者が、両者ともロットを同時に試験した。
１０．３．４  セクション７．２〜７．３の繰り返しを行い、問題のロットを再判定した。
１０．３．５  各自が問題のロット並びに対照ロット（上記のセクション７．２．４に定義されるとおり）を試験した。
１０．３．６  適格とされるには、コンティンジェンシーテストを行う担当者の両方について、問題のロット及び対照ロットがセクション１０．２の適合基準を達成しなければならなかった。
１０．３．７  これらの基準に適合すると、次にはそのロットは、上記のセクション１０．２に概説したとおりのＣＭＯ使用にリリースされた。
【０８０３】
実施例１４：ガンマ線照射末梢血単核球の個々のロットの適格性
[00857]  本実施例は、ガンマ線照射末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の個々のロットが本明細書に記載される例示的方法における同種異系フィーダー細胞としての使用に適格か判定するための新規簡略手順について記載する。本例は、臨床用ＴＩＬロットの生産における使用に関する照射ＰＢＭＣ細胞ロットの判定プロトコルを提供する。個別のドナーから各照射ＰＢＭＣロットを調製した。１００を超える適格性判定プロトコルを通して、いずれの場合にも、ＳＤＢＢ（サンディエゴ血液バンク）からの照射ＰＢＭＣロットはＲＥＰの７日目にＴＩＬを＞１００倍に拡大することが示された。この改良された適格性判定プロトコルは、受けたガンマ線線量がそれらを複製不能にするのに十分であったことを確認するため更に試験されたＳＤＢＢからの照射ドナーＰＢＭＣロットに適用することが意図された。それが１４日間にわたって複製不能を維持することが実証されると、ドナーＰＢＭＣロットは、臨床用ＴＩＬロットの生産への使用に「適格である」と見なした。
【０８０４】
[00858]  キーワード及び定義
μｇ−マイクログラム
μｌ−マイクロリットル
AIM-V−市販の細胞培養培地、生物学的安全キャビネット
ＢＳＣ−分化クラスター
ＣＤ−ＴＩＬ用の完全培地＃２
ＣＭ２−３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を添加したＣＭ２
ＣＭ２ＩＬ２−医薬品製造受託機関
ＣＯ２−二酸化炭素
ＥｔＯＨ−エタノール
ＧＭＰ−医薬品の製造管理及び品質管理に関する基準
Ｇｙ−グレイ
ＩＬ−インターロイキン
ＩＵ−国際単位
ＬＮ２−液体窒素
ＭＩ−ミリリットル
ＮＡ−該当なし
ＯＫＴ３−抗ＣＤ３モノクローナル抗体名
Ｐ２０−２〜２０μｌピペッター
Ｐ２００−２０〜２００μｌピペッター
ＰＢＭＣ−末梢血単核球
Ｐ１０００−１００〜１０００μｌピペッター
ＰＰＥ−個人用防護装備
ＲＥＰ−迅速拡大培養プロトコル
ＳＤＢＢ−サンディエゴ血液バンク
ＴＩＬ−腫瘍浸潤リンパ球
Ｔ２５−２５ｃｍ２組織培養フラスコ
×ｇ−「重力の〜倍」−相対遠心力の尺度
【０８０５】
[00859]  標本には照射ドナーＰＢＭＣ（ＳＤＢＢ）が含まれる。
【０８０６】
手順
背景
７．１．１  ＴＩＬの現行の標準ＲＥＰには、ガンマ線照射した増殖が止まったＰＢＭＣが必要であった。培養下でＰＢＭＣ上の膜受容体が抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）抗体に結合し、ＴＩＬに架橋することにより、ＴＩＬが拡大するように刺激される。ＰＢＭＣロットは、個別のドナーから採取された全血の白血球アフェレーシスから調製した。白血球アフェレーシス産物をFicoll-Hypaqueで遠心に供し、洗浄し、照射し、且つＧＭＰ条件下で凍結保存した。
移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を引き起こし得るため、ＴＩＬ療法を受けた患者が生細胞ＰＢＭＣを注入されないことが重要である。従ってドナーＰＢＭＣは、ガンマ線照射を細胞に与え、その結果二本鎖ＤＮＡ切断が生じて再培養時にＰＢＭＣが細胞生存能力を失うことにより、増殖が止められる。
【０８０７】
判定基準
７．２．１  照射ＰＢＭＣロットの判定基準はその複製不能性であった。
【０８０８】
実験セットアップ
７．３．１  直立Ｔ２５組織培養フラスコを使用して、フィーダーロットをＴＩＬと共培養したかのようにミニＲＥＰフォーマットで試験した。
７．３．１．１  対照ロット：歴史的に７．２．１の基準に適合することが示されている照射ＰＢＭＣの１つのロットを、対照として実験ロットと並行して実行した。
７．３．２  試験する照射ドナーＰＢＭＣの各ロットについて、デュプリケートのフラスコを実行した。
【０８０９】
実験プロトコル
[00860]  本プロトコルにおける全ての組織培養作業は、ＢＳＣにおいて無菌法を用いて行った。
【０８１０】
０日目
７．４．１  試験しようとするドナーＰＢＭＣの各ロットにつき約９０ｍｌのＣＭ２培地を調製した。ＣＭ２は３７℃の水浴中に保温した。
７．４．２  ６×１０６ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２のアリコートを解凍した。
７．４．３  ＣＭ２培地をＢＳＣに戻し、７０％ＥｔＯＨで拭き取った後、フードに置いた。試験するＰＢＭＣの各ロットについて、約６０ｍｌのＣＭ２を別個の滅菌ボトルに取り出した。解凍した６×１０６ＩＵ／ｍｌストック溶液からのＩＬ−２を３０００ＩＵ／ｍｌの最終濃度でこの培地に加えた。このボトルに「ＣＭ２／ＩＬ２」（又は類似）の表示を付して、それを無添加のＣＭ２と区別した。
７．４．４  試験しようとするＰＢＭＣの各ロットにつき２つのＴ２５フラスコに表示を付した。表示には最低限、以下が含まれた：
７．４．４．１  ロット番号
７．４．４．２  フラスコ番号（１又は２）
７．４．４．３  培養開始日（０日目）
【０８１１】
ＯＫＴ３を調製する
７．４．５  ４℃の冷蔵庫から抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）のストック溶液を取り出し、ＢＳＣに置いた。
７．４．６  ミニＲＥＰの培地中には３０ｎｇ／ｍｌ  ＯＫＴ３の最終濃度を使用した。
７．４．７  １ｍｇ／ｍｌストック溶液からの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）の１０μｇ／ｍｌ作業溶液を調製した。必要になるまで冷蔵庫に置いた。
７．４．７．１  試験した各ＰＢＭＣロットにつき、１５０μｌの１：１００希釈の抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）ストックを調製する。
例えば、１回に４つのＰＢＭＣロットを試験するために、３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を添加した５９４μｌのＣＭ２に６μｌの１ｍｇ／ｍｌストック溶液を加えることにより、６００μｌの１０μ／ｍｌ抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）を調製する。
【０８１２】
フラスコを調製する
７．４．８  表示を付したＴ２５フラスコに、１フラスコあたり１９ｍｌのＣＭ２／ＩＬ−２を加え、細胞を調製する間、フラスコを加湿した３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに置いた。
【０８１３】
照射ＰＢＭＣを調製する
７．４．９  ロットの潜在的な交差汚染を防ぐため、ドナーＰＢＭＣロット毎に個別に作業した。
７．４．１０  試験しようとするＰＢＭＣロットのバイアルをＬＮ２貯蔵庫から取り出した。それらのバイアルは解凍時まで−８０℃に置くか又はドライアイス上に保った。
７．４．１１  解凍しようとする各ロットにつき３０ｍｌのＣＭ２（ＩＬ−２の添加なし）を５０ｍｌコニカルチューブに入れた。各チューブに解凍しようとするＰＢＭＣの異なるロット番号の表示を付した。使用時まで、チューブのキャップをしっかりと閉めて３７℃の水浴中に置いた。必要に応じて、５０ｍｌコニカルチューブをＢＳＣに戻し、７０％ＥｔＯＨで拭き取った後、フードに置いた。
７．４．１２  低温貯蔵庫からバイアルＰＢＭＣを取り出し、３７℃の水浴中のフローティングチューブラックに置いて解凍した。解凍は、バイアル内に少量の氷が残るまで進行させた。
７．４．１３  解凍したバイアルは７０％ＥｔＯＨを噴霧するか又はそれで拭き取り、ＢＳＣに移した。
７．４．１４  滅菌ホールピペットを使用して、バイアルの内容物を５０ｍｌコニカルチューブ内の３０ｍｌのＣＭ２中に直ちに移した。チューブから約１ｍｌの培地を取り出してバイアルをリンスした；リンス液を５０ｍｌコニカルチューブに戻した。キャップをしっかりと閉め、静かに回して細胞を洗浄した。
７．４．１５  室温において４００×ｇで５分間遠心した。
７．４．１６  上清を吸引し、１０００μｌピペットチップを使用して１ｍｌの温ＣＭ２／ＩＬ−２中に細胞ペレットを再懸濁した。代わりに、培地を加える前に、キャップを閉めたチューブを空のチューブラックに沿って引きずることにより細胞ペレットを再懸濁した。細胞ペレットの再懸濁後、ＣＭ２／ＩＬ−２培地を使用して容積を４ｍｌにした。容積を記録した。
７．４．１７  少量のアリコート（例えば１００μｌ）を取り出し、自動セルカウンターを使用して細胞をカウントした。
７．４．１７．１  カウントは、詳細な自動セルカウンターＳＯＰに基づきデュプリケートで実施した。細胞カウントの実施前にＰＢＭＣの希釈を実施する必要がある可能性が最も高かった。推奨される出発希釈は１：１０であったが、これは使用するセルカウンターのタイプに応じて異なっていた。
７．４．１７．２  カウントを記録した。
７．４．１８  ステップ７．４．１５．２のワークシートに従いＣＭ２／ＩＬ−２培地を使用してＰＢＭＣの濃度を１．３×１０７細胞／ｍｌに調整した。静かに回すことによるか、又は血清用ピペットを使用して静かに上下に吸引することにより十分に混合した。
【０８１４】
培養フラスコをセットアップする
７．４．１９  ２つの表示を付したＴ２５フラスコを組織培養インキュベーターからＢＳＣに戻した。
７．４．２０  抗ＣＤ３／ＯＫＴ３の１０μｇ／ｍｌバイアルをＢＳＣに戻した。
７．４．２１  各フラスコに１ｍｌの１．３×１０７ＰＢＭＣ細胞懸濁液を加えた。
７．４．２２  各フラスコに６０μｌの１０μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３／ＯＫＴ３を加えた。
７．４．２３  キャップを閉めたフラスコを組織培養インキュベーターに戻し、手を加えることなく１４日間成長させた。
７．４．２４  次のロットに必要になるまで抗ＣＤ３／ＯＫＴ３バイアルを冷蔵庫に入れ戻した。
７．４．２５  判定しようとするＰＢＭＣのロット毎にステップ７．４．９〜７．４．２４を繰り返した。
【０８１５】
１４日目、ＰＢＭＣの非増殖性の測定
７．４．２６  ロット毎に独立に作業して、デュプリケートＴ２５フラスコをＢＳＣに慎重に戻した。
７．４．２７  各フラスコについて、新鮮な１０ｍｌ血清用ピペットを使用してフラスコの各々から約１７ｍｌを取り出し、次に残りの培地を慎重に抜き取って、フラスコ内に残る容積を測定した。容積を記録した。
７．４．２８  同じ血清用ピペットを使用して上下にピペッティングすることにより試料を十分に混合した。
７．４．２９  カウントのため各フラスコから２００μｌ試料を取り出した。
７．４．３０  自動セルカウンターを使用して細胞をカウントした。
７．４．３１  判定しようとするＰＢＭＣのロット毎にステップ７．４．２６〜７．４．３１を繰り返した。
【０８１６】
結果及び適合基準
結果
１０．１．１  ガンマ線照射の線量はフィーダー細胞を複製不能にするのに十分であると予想された。全てのロットが判定基準に適合するものと予想され、０日目と比較してＲＥＰ培養の１４日目に残る生存フィーダー細胞総数の減少が実証された。
【０８１７】
適合基準
１０．２．１  試験した各照射ドナーＰＢＭＣロットについて、以下の適合基準が満たされた：
１０．２．２  「成長なし」−１４日目の総生細胞数が、ＲＥＰの０日目に培養を開始した初期生細胞数より少なかったことを意味した。
１０．２．３  ロットが上記の基準に適合しなかった場合、そのロットは、セクション１０．４に概説するコンティンジェンシーテスト手順に従い再試験した。
１０．２．４  不適合ロットの再試験後、当初の判定及びコンティンジェンシーテストの両方で適合基準を満たさなかったＭＮＣフィーダーロットは、いずれも除外した。
【０８１８】
適合基準を満たさないＰＢＭＣロットのコンティンジェンシーテスト
１０．４．１  照射ドナーＰＢＭＣロットが上記の適合基準を満たさなかった場合、その不適合の原因として単純な実験者エラーを排除するため以下のステップを行ってロットを再試験した。
１０．４．２  ロットのサテライトのバイアルが２つ以上残っていた場合、そのロットは再試験した。ロットのサテライトのバイアルが１つ残っているか又は残っていない場合、上記のセクション１０．２の適合基準に基づきそのロットは不適合とした。
１０．４．３  可能な場合には常に、２人の訓練された担当者（好ましくは問題のロットを判定した当初の人を含む）が２つの別個のバイアルの試験を独立に行った。これが好ましいコンティンジェンシーテスト方法であった。ＰＢＭＣの別個のバイアルの他に、両方の担当者が同じ試薬を使用することもできた。
１０．４．３．１．２人の担当者が利用可能でない場合、１人が不適合とされたロットについての２つのＰＢＭＣバイアルの試験を、各バイアルを独立に作業して行った。
１０．４．４  セクション７．４「実験プロトコル」の繰り返しを行い、問題のロットを再判定した。
１０．４．５  問題のロットに加えて、コンティンジェンシーテストの実行者各々が対照ロットを試験した。
１０．４．５．１  ２人の担当者がコンティンジェンシーテストを実施する場合、両方の担当者が対照ロットを独立に試験した。
１０．４．５．２  コンティンジェンシーテストの実施に１人のみが利用可能である場合、対照ロットについて必ずしもデュプリケートで実行する必要はない。
１０．４．５．３  適格とされるには、コンティンジェンシーテストを受けるＰＢＭＣロットが、セクション１０．２の適合基準への合格に達する対照ロットと問題のロットの両方のレプリケートとの両方を有していた。
１０．４．５．４  この基準を満たしたとき、次にはそのロットをセクション１０．２に概説するとおりのＣＭＯ使用にリリースした。
【０８１９】
実施例１５：Cellometer IC2 Image Cytometer自動セルカウンター
[00861]  本例は、Cellometer K2 Image Cytometer自動セルカウンターの操作手順を説明する。
【０８２０】
１．定義
μｌ  マイクロリットル
ＡＯＰＩ  アクリジンオレンジヨウ化プロピジウム
ＢＳＣ  生物学的安全キャビネット
ＤＰＢＳ  ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水
ｍｌ  ミリリットル
ＭＮＣ  単核血球
ＮＡ  該当なし
ＰＢＭＣ  末梢血単核球
ＰＰＥ  個人用防護装備
プレＲＥＰ  培養物の迅速拡大培養プロトコル前の初期ＴＩＬ培養
ＲＥＰ  迅速拡大培養プロトコル
ＴＩＬ  腫瘍浸潤リンパ球
【０８２１】
７．手順
７．１  細胞懸濁液調製
７．１．１  トリパンブルー調製
最終トリパンブルー濃度は０．１％であった。製造者は０．２％のストック溶液を調製することを推奨した。
７．１．１．１  Cellometer K2でトリパンブルーを使用するときは、ストック（０．４％）をＰＢＳで０．２％に希釈した。
７．１．１．２  トリパンブルーは０．２〜０．４ミクロンフィルターでろ過し、少量ずつアリコートに分けて、表示を付したキャップ付きのチューブに入れた。
７．１．１．３  細胞懸濁液を０．２％トリパンブルーと１：１で混合した。
７．１．２  ＡＯＰＩ調製
７．１．２．１  Cellometer K2でＡＯＰＩを使用するときは、ＡＯＰＩ溶液を入手した。
７．１．２．２  細胞試料をＡＯＰＩ溶液によって１：１で染色した。
注記：高濃度培養物をカウントする際は、トリパンブルー又はＡＯＰＩとの最終的な１：１希釈前に細胞試料を細胞培養培地で希釈した。
製造者の推奨するカウント範囲を使用して、使用するのに最良の希釈を決定した。
【０８２２】
７．２  Cellometer K2セットアップ
７．２．１  Cellometer K2装置の電源を入れた。
７．２．２  関連するコンピュータモニタ上でCellometer Image Cytometerアイコンを選択した。
７．２．３  ソフトウェアのメイン画面上で、ドロップダウンボックスのリストにあるアッセイの１つを選択した。
７．２．３．１  適切なアッセイを選択すると、細胞型及びイメージモードが自動で取り込まれた。
７．２．３．２  「試料」セクションで、ユーザ／試料ＩＤを設定するをクリックして、標本に作業者の情報を入力する別画面を開いた。
７．２．３．２．１  「ユーザＩＤ」を入力した。これはユーザの３文字のイニシャルからなる。
７．２．３．２．２  「試料ＩＤ」を入力した。試料ＩＤは、受け取った標本情報に基づく。
７．２．３．３  希釈パラメータをセットアップした。
７．２．３．３．１  １：１の混合を除いて他の希釈を行わなかった場合、希釈係数は２であった。
７．２．３．３．２  最終的な１：１混合前に希釈を行った場合、希釈係数は前の希釈の２倍であった。
７．２．３．３．３  希釈係数は、画面の希釈セクションにおいて使用した混合物に応じて更新した。鉛筆のアイコンをクリックしてダイアログ画面を立ち上げた。
７．２．３．３．４  Ｆｌ画像及びＦ２画像セクションが互いに同じであることを確認した。
７．２．３．３．５  セットアップの完了後に「保存する」ボタンをクリックした。
【０８２３】
７．３細胞カウント
７．３．１  Cellometerカウントチャンバスライド（SD100）の両側からプラスチックの裏当て材を取り外し、清浄なリントフリーワイプの上に置いた。
７．３．２  細胞懸濁液の調製後、試料の少量のアリコートを取り出し、マルチウェル細胞培養プレートのウェル又はチューブに移した。
７．３．３  試料を希釈する場合、希釈は細胞培養培地を使用して実施した。
７．３．４  マルチウェル細胞培養プレートのウェル又はチューブに２０Ｉｌｌの細胞懸濁液を加えた。
７．３．５  ２０  １１１の細胞懸濁液に２０１１１の０．２％トリパンブルー又はＡＯＰＩ溶液を加え、試料を完全に混合した。
７．３．６  ２０ＩＡの１：１溶液を測定し、それをカウントチャンバの片側に移した。
注記：スライドの透明な領域には触れなかった。
７．３．７  必要に応じて、試料をスライドの他方の側で繰り返した。７．３．８．Cellometerの前面にあるスロットにチャンバを挿入した。
７．３．８  ＡＯＰＩ細胞カウントについては、メイン画面上で「プレビュー蛍光」をクリックして緑色蛍光像（生細胞）画像をプレビューした。トリパンブルーカウントについては、「プレビュー明視野」をクリックした。
７．３．９  ピント合わせホイールを使用して画像の焦点を最適にした。細胞は明るい中心及びはっきりと画定された輪郭線を有した。
７．３．１０  「カウント」をクリックしてカウントプロセスを開始した。
７．３．１１  コンピュータ画面上のカウント結果のポップアップボックス内に結果が表示され、カウントプロセスの結果を示した。
【０８２４】
実施例１６：ＩＬ−２ストック溶液の調製（CellGenix）
[00862]  この実施例は、精製され凍結乾燥された組換えヒトインターロイキン−２を、ｒｈＩＬ−２の使用を含むものを含む本願及び実施例に記載されたものを全て含む更なる組織培養プロトコルでの使用に適したストック試料に溶解するプロセスを説明する。
【０８２５】
３．定義／略称
μｌ：マイクロリットル
ＢＳＣ：生物学的安全キャビネット
ＢＳＬ２：バイオセーフティレベル２
Ｄ−ＰＢＳ：ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水
Ｇ：ゲージ
ＧＭＰ：医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理の基準
ＨＡｃ：酢酸
ＨＳＡ：ヒト血清アルブミン
ｍＬ：ミリリットル
ＮＡ：該当なし
ＰＰＥ：個人用防護装備
ｒｈＩＬ−２、ＩＬ−２：組換えヒトインターロイキン−２
ＣＯＡ：分析証明書
【０８２６】
６．手順
６．１  ０．２％酢酸溶液（ＨＡｃ）を調製する。
６．１．１  ２９ｍＬ滅菌水を５０ｍＬコニカルチューブに移した。
６．１．２  １ｍＬの１Ｎ酢酸を５０ｍＬのコニカルチューブに加えた。
６．１．３  チューブを２〜３回反転させることにより十分に混合した。
６．１．４  Steriflipフィルターを使用してろ過することによりＨＡｃ溶液を滅菌した。
６．１．５  キャップを閉め、日付を付し、溶液に「滅菌０．２％酢酸溶液」の表示を付した。
６．１．６  溶液は２ヵ月後に期限切れとした。室温で貯蔵した。
６．２  ＰＢＳ中で１％ＨＳＡを調製した。
６．２．１  １５０ｍＬ滅菌フィルタユニット内の９６ｍＬ  ＰＢＳに４ｍＬの２５％ＨＳＡストック溶液を加えた。
６．２．２  溶液をろ過した。
６．２．３  キャップを閉め、日付を付し、溶液に「ＰＢＳ中１％ＨＳＡ」の表示を付した。
６．２．４  溶液は２ヵ月後に期限切れとした。４℃で貯蔵した。
６．３  調製したｒｈＩＬ−２の各バイアルについて、書式に記入した。
６．４  ｒｈＩＬ−２ストック溶液（６×１０６ＩＵ／ｍＬ最終濃度）を調製した
６．４．１  ｒｈ１Ｌ−２はロット毎に異なり、製造者の分析証明書（ＣＯＡ）に掲載されている以下のような情報が必要であった：
６．４．１．１  バイアル１本あたりのｒｈＩＬ−２の質量（ｍｇ）
６．４．１．２  ｒｈＩＬ−２の比活性（ＩＵ／ｍｇ）
６．４．１．３  推奨される０．２％ＨＡｃ再構成容積（ｍＬ）
６．４．２  ｒｈＩＬ−２ロットに必要な１％ＨＳＡの容積は、以下の式を用いて計算した：
【数１】
2021519582.tif 000032
６．４．２．１  例えば、CellGenixのｒｈＩＬ−２ロット１０２００１２１  ＣＯＡによれば、１ｍｇバイアルの比活性は２５×１０６ｌＵ／ｍｇである。２ｍＬの０．２％ＨＡｃ中にｒｈＩＬ−２を再構成することが推奨されている。
【数２】
2021519582.tif 000033
６．４．３  ＩＬ−２バイアルのゴム栓をアルコールワイプで拭き取った。
６．４．４  ３ｍＬシリンジに取り付けた１６Ｇ針を使用して、推奨容積の０．２％ＨＡｃをバイアルに注入した。針を引き抜くときに栓が外れないよう注意を払った。
６．４．５  バイアルを３回反転させて、粉末が全て溶解するまで回した。
６．４．６  栓を慎重に取り外し、アルコールワイプ上に置いておいた。
６．４．７  計算した容積の１％ＨＳＡをバイアルに加えた。
６．４．８  バイアルにゴム栓をした。
６．５  ｒｈＩＬ−２溶液の貯蔵
６．５．１  短期貯蔵（＜７２時間）の場合、バイアルを４℃で貯蔵した。
６．５．２  長期貯蔵（＞７２時間）については、バイアルを少量のアリコートに分け、使用直前まで−２０℃でクライオバイアルに貯蔵した。凍結／解凍サイクルを避けた。調製日から６ヵ月後に期限切れとした。
６．５．３  Ｒｈ−ＩＬ−２表示には、販売業者及びカタログ番号、ロット番号、有効期限、作業者イニシャル、アリコートの濃度及び容積が含まれた。
【０８２７】
実施例１７：プレＲＥＰ及びＲＥＰプロセス用の培地調製
[00863]  本例は、限定はされないが、転移性黒色腫、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、卵巣癌、トリプルネガティブ乳癌及び肺腺癌を含めた様々な腫瘍型に由来する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の培養が関わるプロトコルに用いられる組織培養培地の調製手順について説明する。本願及び実施例に記載される任意のＴＩＬの調製にこの培地を使用することができる。
【０８２８】
３．定義
μｇ  マイクログラム
μｍ  マイクロメートル
μＭ  マイクロモル
AIM-V（登録商標）無血清組織培養培地（Thermo Fisher Scientific）
ＢＳＣ  生物学的安全キャビネット
ＣＭ１  完全培地＃１
ＣＭ２  完全培地＃２
ＣＭ３  完全培地＃３
ＣＭ４  完全培地＃４
ＩＵ又はＵ  国際単位
ｍｌ  ミリリットル
ｍＭ  ミリモル
ＮＡ  該当なし
ＰＰＥ  個人用防護装備
プレＲＥＰ  プレ迅速拡大培養プロセス
ＲＥＰ  迅速拡大培養プロセス
ｒｈＩＬ−２、ＩＬ−２  組換えヒトインターロイキン−２
ＲＰＭＩ１６４０  ロズウェルパーク記念研究所培地、配合１６４０
ＳＯＰ  標準実施要領
ＴＩＬ  腫瘍浸潤リンパ球
【０８２９】
７．手順
７．１  手順は全て、ＢＳＣ（クラスＩＩ、タイプＡ２）において無菌法を用いて行われる。
７．１．１  使用前にフードの表面に７０％エタノールを噴霧した。
７．１．２  物品及び試薬は全て、組織培養フード内に置く前に７０％エタノールを噴霧した。
７．２  ２００ｍＭ  Ｌ−グルタミンのアリコート分注
７．２．１  Ｌ−グルタミンは、血清の調製に必要な容積よりも大きい容積で供給された（例えば、１００ｍｌ又は５００ｍｌ容積）。
７．２．２  Ｌ−グルタミンのボトルを３７℃の水浴中で解凍した。
７．２．３  Ｌ−グルタミンは解凍後に沈殿するため、解凍後、Ｌ−グルタミンを十分に混合した。アリコートに分ける前に、沈殿物が全て溶液に戻ったことを確認した。
７．２．４  Ｌ−グルタミンの５〜１０ｍｌアリコートを滅菌１５ｍｌコニカルチューブに入れた。
７．２．５  チューブに、濃度、販売業者、ロット番号、アリコート分注日及び有効期限の表示を付す。
７．２．６  その後、チューブを−２０℃で貯蔵し、必要に応じて培地調製のため抜き取った。
７．３  ＣＭ１の調製
７．３．１  低温貯蔵庫から以下の試薬を取り出し、３７℃の水浴中で加温した：
７．３．１．１  ＲＰＭＩ１６４０
７．３．１．２  ヒトＡＢ血清
７．３．１．３  ２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン
７．３．２  ４℃の貯蔵庫からＢＭＥを取り出し、組織培養フードに置いた。
７．３．３  ゲンタマイシンストック溶液を室温貯蔵庫から組織培養フードに入れた。
７．３．４  以下の表２３に従い、ろ過される容積に適切な０．２μｍフィルタユニットの上部に成分の各々を加えることによりＣＭ１培地を調製した。
【０８３０】
【表３０】
2021519582.tif 000034
【０８３１】
７．３．５  ＣＭ１培地ボトルに、その名前、調製者のイニシャル、それがろ過／調製された日付、２週間の有効期限の表示を付し、組織培養に必要になるまで４℃で貯蔵した。必要に応じて培地をアリコートに分け、少容量ボトルに入れることができる。
７．３．６  残ったＲＰＭＩ１６４０、ヒトＡＢ血清又はＬ−グルタミンは全て、次回の培地調製まで４℃で貯蔵した。
７．３．７  ＢＭＥのストックボトルは４℃の貯蔵庫に戻した。
７．３．８  ゲンタマイシンのストックボトルはその適切な室温貯蔵場所に戻した。
７．３．９  培地の緩衝能力は限られているため、ＣＭ１は調製後２週間以内に、又はフェノールレッドｐＨ指示薬がｐＨの極端なシフトを示したこと（明るい赤色乃至ピンクの呈色）に伴い廃棄した。
７．３．１０  使用当日、所要量のＣＭ１を３７℃の水浴中で予め加温し、６０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を加えた。
７．３．１１  追加的な添加−必要に応じて
７．３．１１．１  ＣＭ１にGlutaMAX（登録商標）を添加した
７．３．１１．１．１  ２ｍＭグルタミン（最終濃度、表２を参照）の代わりに２ｍＭのGlutaMAX（商標）を用いることによりＣＭ１を調製することができた。それが終わると、標準配合のＣＭ１との混同を防ぐため、上記ステップ７．３．５のように、培地ボトルに「２ｍＭ  GlutaMAX」を追加して表示を付した。
７．３．１１．２  ＣＭ１に追加的な抗生物質／抗真菌薬を添加した
７．３．１１．２．１  一部のＣＭ１配合物は、ある種の腫瘍型から成長させるプレＲＥＰ  ＴＩＬの汚染を防ぐため、追加的な抗生物質又は抗真菌薬が必要であった。
７．３．１１．２．２  以下の表２４に示す最終濃度となるように抗生物質／抗真菌薬を加えた。
７．３．１１．２．３  それが終わると、標準配合のＣＭ１との混同を防ぐため、上記ステップ７．３．１のように、追加的な抗生物質／抗真菌薬の名前を追加して培地ボトルに表示を付した。
【０８３２】
【表３１】
2021519582.tif 000035
【０８３３】
７．４  ＣＭ２の調製
７．４．１  冷蔵庫から調製済みのＣＭ１を取り出したか又は上記セクション７．３に従い新鮮なＣＭ１を調製する。
７．４．２  冷蔵庫からAIM-V（登録商標）を取り出した。
７．４．３  滅菌培地ボトル内に調製済みＣＭ１を等容積のAIM-V（登録商標）と混合することにより、必要な量のＣＭ２を調製した。
７．４．４  使用当日、ＣＭ２培地に３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を加えた。
７．４．５  使用当日、十分な量の３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２含有ＣＭ２を作成した。
７．４．６  ＣＭ２培地ボトルに、その名前、調製者のイニシャル、それがろ過／調製された日付、２週間の有効期限の表示を付し、組織培養に必要になるまで４℃で貯蔵した。必要に応じて培地をアリコートに分け、より小さい容量のボトルに入れた。
７．４．７  ＩＬ−２を含まないＣＭ２は全て冷蔵庫に戻し、そこで最長２週間にわたり、又はフェノールレッドｐＨ指示薬がｐＨの極端なシフト（明るい赤色乃至ピンクの呈色）を示すまで貯蔵することができる。
７．５  ＣＭ３の調製
７．５．１  使用が必要になった当日に、ＣＭ３を調製した。
７．５．２  ＣＭ３はAIM-V（登録商標）培地と同じであり、使用当日に３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を添加した。
７．５．３  AIM-Vのボトル又はバッグにＩＬ−２ストック溶液を直接加えることにより、実験の必要上十分な量のＣＭ３を調製した。軽く振盪することにより十分に混合した。AIM-Vに加えた直後にボトルに「３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２」の表示を付す。過剰なＣＭ３がある場合、これを培地名、調製者のイニシャル、培地の調製日及びその有効期限（調製後７日）を表示したボトルに４℃で貯蔵した。
７．５．４  ＩＬ−２を添加した培地は４℃で７日間の貯蔵後に廃棄した。
７．６  ＣＭ４の調製
７．６．１  ＣＭ４はＣＭ３と同じであり、加えて２ｍＭのGlutaMAX（商標）（最終濃度）を添加した。
７．６．１．１  １ＬのＣＭ３につき１０ｍｌの２００ｍＭ  GlutaMAX（商標）を加えた。
７．６．２  AIM-Vのボトル又はバッグにＩＬ−２ストック溶液及びGlutaMAX（商標）ストック溶液を直接加えることにより、実験の必要上十分な量のＣＭ４を調製した。軽く振盪することにより十分に混合した。
７．６．３  AIM-Vに加えた直後にボトルに「３０００ＩＬ／ｎｉｌ  ＩＬ−２及びGlutaMAX」の表示を付した。
７．６．４  過剰なＣＭ４がある場合、これを培地名、「GlutaMAX」、調製者のイニシャル、培地の調製日及びその有効期限（調製後７日）を表示したボトルに４℃で貯蔵した。
７．６．５  ＩＬ−２を添加した培地は４℃で７日間の貯蔵後に廃棄した。
【０８３４】
実施例１８：ポストＲＥＰ  ＴＩＬの表面抗原染色
１．目的
[00864]  この実施例は、フローサイトメトリーによるポストＲＥＰ  ＴＩＬの細胞表面染色の手順を説明する。この手順は、本願及び実施例で説明されている任意のＴＩＬに適用され得る。
【０８３５】
[00865]  キーワード及び定義
α：アルファ
β：ベータ
μｌ：マイクロリットル
ＡＰＣ：アロフィコシアニン
Ａｘ６４７：Alex Fluor 647
ＢＤ：Becton Dickinson Company
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＢＳＣ：生物学的安全キャビネット
ＢＶ４２１:Brilliant Violet 421
ＣＤ：分化クラスター
ＣＳＴ：サイトメーターのセットアップ及び追跡
Ｃｙ：シアニン
ＤＰＢＳ：ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水
ＦＡＣＳ：蛍光活性化細胞ソーター
ＦＢＳ：胎児ウシ血清
ＦＩＴＣ：フルオレセインイソチオシアネート
ＦＭＯ：蛍光マイナス１
Ｇ：グラム
Ｈ７：Ｃｙ７の類似物
Ｍｌ：ミリリットル
ＰＥ：フィコエリトリン
ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５：ペリジニン・クロロフィル・タンパク質
ＰＰＥ：個人用防護装備
ＲＥＰ：迅速拡大培養プロトコル
ＳＩＴ：試料注入チューブ
ＴＣＲ：Ｔ細胞受容体
ｗ／ｖ：容積に対する重量
【０８３６】
フローサイトメトリー抗体及び染色
【０８３７】
【表３２】
2021519582.tif 000036
【０８３８】
７．手順
７．１  試薬調製
７．１．１  ＦＡＣＳ洗浄バッファー
７．１．１．１  ２％（ｗ／ｖ）熱不活性化ＦＢＳをＤＰＢＳに加えた（１０ｍｌのＦＢＳを４９０ｍＬの１×ｄＰＢＳに追加）。
７．１．１．２  ０．１％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３（５００ｍＬボトルに７６．９ｕｌ）を加えた。
７．１．１．３  溶液は４０℃で貯蔵された。３０日後に破棄した。
７．１．２  Aqua色素
７．１．２．１  反応性色素のバイアルに５０μｌのＤＭＳＯを加えた。
７．１．２．２  よく混合し、色素が全て溶解したことを視覚的に確認した。
７．１．２．３  手順に使用しなかった色素を等分し、次の使用まで２０℃で凍結した。二度目の凍結／解凍はしなかった。
７．１．３  抗体カクテルの調製。
７．１．３．１  カクテルは、Eppendorfチューブなどのポリプロピレン製チューブで構成されていた。
７．１．３．２  カクテルは最大６ヶ月貯蔵された。
【０８３９】
【表３３】
2021519582.tif 000037
【０８４０】
【表３４】
2021519582.tif 000038
【０８４１】
【表３５】
2021519582.tif 000039
【０８４２】
【表３６】
2021519582.tif 000040
【０８４３】
７．２  フローサイトメトリーアッセイ要件
７．２．１  フローサイトメーターキャリブレーション
７．２．１．１  フローサイトメーターは、製造業者の指示に従ってＣＳＴビーズを使用して、アッセイの日に較正された。
７．２．１．２  作業者は、フローサイトメーターが較正に合格したことを確認した。較正は、パフォーマンス及びベースラインのチェックが有効である。
７．２．２  コンペンセーション／ＦＭＯコントロール
７．２．２．１  ＢＤコンペンセーションビーズ及びArCTM Amine Reactive Compensation Bead Kitを使用して、単色コンペンセーション試料を調製した。
７．２．２．２  ＦＭＯコントロール、試料を含む細胞は、以下の単一抗体コンジュゲート、ＣＤ２７、ＣＤ２８及びＣＤ５７を差し引いた抗体のカクテルで染色された。
７．２．３  ＭＦＩ標準化
７．２．３．１  サイトメーターの電圧は、ビーズコントロール及び目標電圧値で毎日判定された。
７．３  試料染色
７．３．１  試料ＩＤ−ＤＦ１、試料ＩＤ−ＤＦ２、試料ＩＤ−Ｔ１、試料ＩＤ−Ｔ２の表示をＦＡＣＳチューブに付した。
７．３．２  １組のＦＭＯコントロールにＣＤ２７−ＡＰＣ−Ｈ７、ＣＤ２８−ＰＥ、ＣＤ５７−ＰｅｒＣＰＣｙ５．５、ＣＤ４５ＲＡ−ＰＥＣｙ７、ＣＣＲ７−ＰＥ、ＣＤ３８−ＡＰＣ、ＣＤ１３７−ＰＥ７、Ｌａｇ３−ＰＥ、ＰＤ１  ＡＰＣ、Ｔｉｍ３−ＢＶ４２１、ＣＤ６９−ＰＥ７、ＴＩＧＩＴ−ＰＥ、ＫＬＲＧ１−Ａｘ６４７及びＣＤ１５４−ＢＶ４２１の表示を付した。
７．３．３  各チューブに５０万〜２００万個の細胞を加えた。
７．３．４  各チューブに３ｍＬの１×ＰＢＳをＱＳした。
７．３．５  チューブを４００×ｇ、高加速及び減速で５分間回転させた。
７．３．６  試料が遠心分離されている間に、Aqua色素の表示を付して死細胞を調製した。
７．３．７  冷凍庫からAquaアリコートを取り出し、ＰＢＳ中で１／２００に希釈した。暗所に置いた。２ｕＬの色素を１９８ｕＬのＤＰＢＳに加えた。
７．３．８  ステップ７．３．５の上清を静かに移す又は吸引した。
７．３．９  上記の２５ｕＬのAqua溶液を試料及びＦＭＯコントロールに加えた。
７．３．１０  暗所で、室温（ＲＴ）で１５分間インキュベートした。
７．３．１１  注記：細胞を無タンパク質培地で初めに貯蔵した場合、５ｕＬのTruStainなどのブロッキングステップを室温で１０分間追加する必要があった。
７．３．１２  ５０ｕＬの抗体カクテルを適切なチューブに加えた。
７．３．１３  チューブラックを振って混合した。
７．３．１４  暗所で、ＲＴで１５分間インキュベートした。
７．３．１５  開始時間と終了時間を記録した。３ｍＬのＦＡＣＳ洗浄バッファーを加えた。
７．３．１６  チューブを４００×ｇ、高加速及び減速で５分間回転させた。
７．３．１７  遠心回転が完了したら、上清を静かに移す又は吸引した。
７．３．１８  空のラックに沿ってチューブをスライドさせて、細胞を再懸濁した。
７．３．１９  各チューブに１００ｕＬの１％のParaFormaldehydeを加えた。
７．３．２０  フローサイトメーターで収集する準備ができるまで、暗所で、４０℃で貯蔵した。
注記：試料は最大７２時間貯蔵できた。
７．４  Ｌ／Ｄ  Aquaコンペンセーションコントロール。
７．４．１  ＦＡＣＳチューブにＬ／Ｄ  Aquaコンペンセーションコントロールと表示を付した。
７．４．２  １滴のArcビーズをチューブに加えた。
７．４．３  ３μｌのＬ／Ｄ  Aquaをビーズに直接加えた。
７．４．４  チューブを室温で、暗所で１０〜３０分間インキュベートした。
７．４．５  ワークシートにインキュベーションの開始及び終了時間を記録した。
７．４．６  インキュベーション後、３ｍｌのＦＡＣＳ洗浄液を各チューブに加えた。
７．４．７  チューブを４００×ｇ、高加速及び減速で５分間回転させた。
７．４．８  上清を静かに移す又は吸引した。
７．４．９  ５００μｌの１％ＰＦＡ溶液でチューブを再懸濁した。１滴の陰性ビーズを加えた。回収するまで、４０℃で暗所に置いた。
７．５  コンペンセーションコントロール染色。
７．５．１  ポストＲＥＰ  ＴＩＬ表現型ワークシートに示されているとおりＦＡＣＳチューブに表示を付した。
７．５．２  ポストＲＥＰ  ＴＩＬ表現型ワークシートに示されているとおり抗体を加えた。
７．５．３  インキュベーション後、３ｍＬのＦＡＣＳバッファーを各チューブに加えた。
７．５．４  チューブを５００ｇ、高加速及び減速で２分間回転させた。
７．５．５  上清を静かに移す又は吸引した。
７．５．６  ＰＢＳ中で、５００μｌの１％ＰＦＡでチューブを再懸濁し、暗所で２〜８０℃で貯蔵した。
７．６  データ収集
７．６．１  FACSDivaソフトウェアを開いてログインした。
７．６．２  サイトメーター不一致ダイアログで、「ＣＳＴ設定を使用」をクリックした。
７．６．３  「実験」タブをクリックし、「拡大表現型）」テンプレートを選択して、新規実験を作成した。
７．６．４  目標値実験をダブルクリックし、手順中心作業者が決定した目標値に達するように電圧を調整した。
７．６．５  機器の設定を複写して、新規実験に貼り付けた。
７．６．６  個体毎に標本を作成し、適切な名称を付けた。
７．６．７  チューブの表示に従って試料の名称を作成した。
７．６．８  チューブをＳＩＴに入れる前に、静かにボルテックスするか又は指で弾いた。
７．６．９  収集ボードのＲＥＣＯＲＤ（記録）の下にデータを収集した。
７．６．１０  １秒あたり７，５００事象未満の速度で試料に実施した。
７．６．１１．破片を除く５０，０００〜１００，０００の生事象を収集した。
【０８４４】
実施例１９：プロセス２Ａ検証プロセスの開発
[00866]  この実施例の実験は、黒色腫の患者由来の腫瘍からのＴＩＬの製造及びプレＲＥＰの手順の腫瘍からのＴＩＬの成長を含む単一乳癌、その後の修正ＲＥＰについてプロセス２Ａを分析すべく完了した。凍結ＴＩＬ産物の確立及び凍結ＴＩＬ産物の現在の新鮮ＴＩＬ産物プロセス（プロセス１Ｃ）に対する性能の比較に特に重点が置かれた。この報告は、同様のプロファイルが新鮮及び解凍されたものの重要な品質属性（細胞数、生存率、ＣＤ３＋Ｔ細胞の割合、ビーズ刺激ガンマインターフェロン（ＩＦＮ−ｙ）生産）並びに同一のＴＩＬが新鮮か凍結かを問わず再刺激拡大表現型手順（ｒｅＲＥＰ）の評価において観察されることを実証する。この結論を裏付けるために提示されたデータには、成長、生存率、表現型、ＩＦＮ−ｙ遊離、効力、テロメア長及び代謝活性が含まれる。結果は、プロセス２Ａ、ＴＩＬの凍結保存前の短縮プレＲＥＰ／ＲＥＰプロセスを特徴付けるとともに、本明細書に記載されるとおり２Ａプロセスをより長い１Ｃプロセスと比較する。
【０８４５】
[00867]  腫瘍提供者の説明、処理日及び処理場所は、以下の表１に記載されている（＊ＲＥＰが凍結ＲＥＰ  ＴＩＬ株を使用して開始されたことを示す）。
【０８４６】
【表３７】
2021519582.tif 000041
【０８４７】
３．背景情報
３．１  ＬＮ−１４４は、転移性黒色腫の患者を処置するための免疫療法製品である。本製品は、腫瘍の外科的切除後の個々の患者から得られた自己腫瘍浸潤Ｔリンパ球（ＴＩＬ）で構成され、細分化された腫瘍断片の細胞培養（プレＲＥＰ）を介してエキソビボで拡大培養され、その後、高用量のＩＬ−２、抗ＣＤ３及び共刺激ＡＰＣの存在下でＴＩＬが急速に拡大培養された。骨髄非破壊リンパ枯渇の事前調整に続き、患者は自身のＴＩＬの１回の注入を受け、その後、８時間毎にアルデスロイキン（ＩＬ−２）の静脈内注入を最大６回投与された。腫瘍内微小環境（ＴＮＥ）内の損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）の設定のＴＩＬ拡大培養の代替方法を含む研究も、治療に役立つＴ細胞の効果的な拡大培養を実証した（Donia 2014; Sommerville, 2012）。
ＴＩＬの商業生産に使用されているプロセス１Ｃには、２４時間以内に免疫枯渇患者へ送達される注入可能なＴＩＬ産物を生産するのに約４５〜５５日かかり得る生産スケジュールが含まれる。受容体である患者の免疫枯渇は、現在のＴＩＬ産物の回収にタイミングを正確に合わせなければならない。新鮮産物の回収又は送達の遅れは、注入を待つ免疫枯渇患者に悪影響を及ぼす可能性がある。プロセス２Ａは、プロセス１Ｃを改良し、プレＲＥＰ及びＲＥＰの両方の手順が短縮されたため、製造リードタイムと材料が減少した。更に、プロセス２Ａにより、産物の出荷時間の柔軟性が向上した。プレＲＥＰ、ＲＥＰ及びプロセス回収（表２を参照のこと）におけるプロセス１Ｃ及びプロセス２Ａの差には、以下が含まれる：
３．１．１  プレＲＥＰの手順で使用されるフラスコは、腫瘍断片容量が増加し、より大きい。
３．１．２  閉鎖系を使用したステップ又は閉鎖系の将来的な適応に適したステップ。
３．１．３  プレＲＥＰの手順及びＲＥＰの手順の両方で日数が減少した。
３．１．４  ＲＥＰへの直接アプローチにより、ＲＥＰに進むプレＲＥＰ  ＴＩＬの特定集団を選択する前に、プレＲＥＰ集団の表現型分類の必要がなくなった。
３．１．５  ＴＩＬの十分な拡大培養について計算された、抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）と組み合わせた、予め設定された数の照射同種異系ＰＢＭＣ  ＡＰＣとの共培養。
３．１．６  回収のための自動細胞洗浄系。
３．１．７  出荷前に極低温保存されたCS10ベースの最終製剤。
【０８４８】
【表３８】
2021519582.tif 000042
【０８４９】
４．略称
μｇ    マイクログラム
μｌ    マイクロリットル
μｍ    マイクロメートル
ＡＰＣ    抗原提示細胞
ＣＤ    分化クラスター
ＣＭ    セントラルメモリー
ＣＭ１，ＣＭ２，    培養培地１、２
ＣＯ２    二酸化炭素
ＣＳ１０    CryoStor（登録商標）CS10凍結保存培地（BioLife Solutions）
Ｃｔ    ＰＣＲ閾値サイクル
ＤＡＭＰｓ    損傷関連分子パターン分子
ｄＣｔ    参照Ｃｔ値と試験Ｃｔ値の違い
ｄｄＣｔ    ｄＣｔと１０ｎｇの標準Ｃｔ値の違い
ＥＣＡＲ    細胞外酸性化率（解糖の尺度）
ＥＭ    エフェクターメモリー
ＥＲ＋／ＰＲ＋    エストロゲン受容体＋／プロゲステロン受容体＋
ＧＭＰ    医薬品の製造管理及び品質管理に関する基準
ＨＢＳＳ    ハンクスバランス塩溶液
ＨＳＡ    ヒト血清アルブミン
ＩＦＮ−γ    インターフェロンガンマ
ＩＬ    インターロイキン
ＩＵ    国際単位
ＬＮ２    液体窒素
Ｍｌ    ミリリットル
Ｍｍ    ミリメートル
ＮＤ    測定されず
Ｎｇ    ナノグラム
℃    摂氏
ＯＣＲ    酸素消費率（酸化的リン酸化の尺度）
ＯＫＴ３    抗ＣＤ３モノクローナル抗体のクローン名
ＰＢＭＣ    末梢血単核球
ＰＤ    プロセス開発
ＲＥＰ    迅速拡大培養プロトコル
Ｒｈ    組換えヒト
ＳＯＰ    標準実施要領
Ｔ／Ｓ    テロメアの反復コピー数と単一遺伝子コピー数の比率
ＴＩＬ    腫瘍浸潤リンパ球
ＶＤＪ    Ｔ細胞受容体の可変、多様性及び結合セグメント
Ｖα，Ｖβ    優勢な腫瘍浸潤リンパ球における成熟Ｔ細胞受容体可変領域セグメント
μｇ    マイクログラム
μｌ    マイクロリットル
μｍ    マイクロメートル
ＡＰＣ    抗原提示細胞
ＣＤ    分化クラスター
ＣＭ    セントラルメモリー
ＣＭ１，ＣＭ２，    培養培地１、２
ＣＯ２    二酸化炭素
ＣＳ１０    CryoStor（登録商標）CS10凍結保存培地（BioLife Solutions）
Ｃｔ    ＰＣＲ閾値サイクル
ＤＡＭＰｓ    損傷関連分子パターン分子
ｄＣｔ    参照Ｃｔ値と試験Ｃｔ値の違い
ｄｄＣｔ    ｄＣｔと１０ｎｇの標準Ｃｔ値の違い
ＥＣＡＲ    細胞外酸性化率（解糖の尺度）
ＥＭ    エフェクターメモリー
ＥＲ＋／ＰＲ＋    エストロゲン受容体＋／プロゲステロン受容体＋
ＧＭＰ    医薬品の製造管理及び品質管理に関する基準
ＨＢＳＳ    ハンクスバランス塩溶液
ＨＳＡ    ヒト血清アルブミン
ＩＦＮ−γ    インターフェロンガンマ
ＩＬ    インターロイキン
ＩＵ    国際単位
ＬＮ２    液体窒素
Ｍｌ    ミリリットル
Ｍｍ    ミリメートル
ＮＤ    測定されず
Ｎｇ    ナノグラム
℃    摂氏
ＯＣＲ    酸素消費率（酸化的リン酸化の尺度）
ＯＫＴ３    抗ＣＤ３モノクローナル抗体のクローン名
ＰＢＭＣ    末梢血単核球
ＰＤ    プロセス開発
ＲＥＰ    迅速拡大培養プロトコル
Ｒｈ    組換えヒト
ＳＯＰ    標準実施要領
Ｔ／Ｓ    テロメアの反復コピー数と単一遺伝子コピー数の比率
ＴＩＬ    腫瘍浸潤リンパ球
ＶＤＪ    Ｔ細胞受容体の可変、多様性及び結合セグメント
Ｖα，Ｖβ    優勢な腫瘍浸潤リンパ球における成熟Ｔ細胞受容体可変領域セグメント
【０８５０】
５．実験設計
５．１  プロセス２Ａ
５．１．１  プレＲＥＰ：受領後、腫瘍は生物学的安全キャビネット（クラスＩＩ、タイプＡ２）に移された。滅菌技術を使用して、腫瘍を輸送用容器から取り出し、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを含むＨＢＳＳで洗浄した。技術者は腫瘍を４０×３×３×３ｍｍの断片に細分化し、６０００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ−２を添加した予め温めたＣＭ１培地を含むG-REX-100Mフラスコに移した。フラスコを３７℃、５％ＣＯ２の加湿組織培養インキュベーターに１１日間入れた。腫瘍が４０を超える断片を生成する場合、２つ以上のG-REX-100Mをセットアップし得る。次に、細胞を回収し、ＲＥＰ用に調製した。
５．１．２  ＲＥＰ：１１日目に、３０００ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ−２、３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）及び５×１０９照射同種異系フィーダーＰＢＭＣ細胞を添加した５ＬのＣＭ２を含む１つのG-REX-500Mフラスコが調製される。減容後のプレＲＥＰG-REX-100Mフラスコから回収したＴＩＬをカウントし、５×１０６及び２００×１０６個の細胞の範囲であり得る密度でG-REX-500Mフラスコに播種した。次に、フラスコを５日間、加湿した３７℃、５％ＣＯ２の組織培養インキュベーターに入れる。１６日目に、G-REX-500Mフラスコの容量を減らし、ＴＩＬをカウントし、その生存率を判定する。この時点で、ＴＩＬは複数のG-REX-500Mフラスコ（最大６つのフラスコ）に拡大培養され、それぞれ１×１０９個のＴＩＬ／フラスコの播種密度を有する。その後、全てのフラスコを加湿した３７℃、５％ＣＯ２の組織培養インキュベーターに更に６日間入れる。２２日目、回収の日に、各フラスコの容積を９０％減らし、細胞をプールし、１７０μｍの血液フィルターでろ過し、３ＬのOrigin EV3000バッグ又は同等品に収集し、LOVOを使用して自動洗浄の準備をする。
５．１．３  回収及び最終製剤：ＴＩＬは、細胞培養培地の９９．９９％を、１％ＨＳＡを添加したPlasmaLyte-Aからなる洗浄バッファーで置き換えたLOVO自動細胞処理系を使用して洗浄する。LOVOは、ＴＩＬの９２％超を回収しながら、血清、成長因子及びサイトカイン並びに他の破片及び微粒子を含む残留組織培養成分を事実上排除する回転ろ過膜技術を使用して動作する。洗浄完了後、細胞数を測定して、ＴＩＬの拡大率及び回収時の生存率を判定する。プロセス２Ａの最終産物を達成するために、CS10を洗浄したＴＩＬに１：１の容積：容積比で加える。最終製剤産物を凍結保存バッグに分注し、密封し、予め冷却したアルミニウムカセットに入れる。次に、SOP LAB-018 Rev 000制御速度フリーザーの操作に従って、ＴＩＬを含む凍結保存バッグをCryoMed Controlled Rate Freezer（ThermoFisher Scientific、Waltham, MA）を使用して凍結する。
５．２  ＴＩＬ試料：特徴付け比較のために、４つの状態のＴＩＬが収集された。
５．２．１  新鮮回収ＴＩＬ（１％ＨＳＡ洗浄バッファーを含むPlasmaLyte-Aから直接）解凍ＴＩＬ（解凍最終製品バッグから直接）
５．２．２  新鮮拡大培養表現型ＲｅＲＥＰ  ＴＩＬ（ＩＬ−２、ＰＢＭＣフィーダー及び抗ＣＤ３クローンＯＫＴ３で７〜１４日間培養した新鮮収穫ＴＩＬ）
５．２．３  解凍拡大培養表現型ＴＩＬ（ＩＬ−２、ＰＢＭＣフィーダー及び抗ＣＤ３クローンＯＫＴ３で７〜１４日間培養した解凍ＴＩＬ）
５．３  試験概要（図２を参照のこと）
５．３．１  プレＲＥＰ試験には、ＩＬ−２の量の評価及びプレＲＥＰ全体のグルコース、乳酸、Ｌ−グルタミン及びアンモニアなどの細胞培養代謝物の分析が含まれる。
５．３．１．１  ＩＬ−２の定量化：プレＲＥＰ培養から培地を定期的に除去し、ＩＬ−２の定量化についてＥＬＩＳＡで試験した。R＆D Systems Human IL-2 Quantikine ELISA Kitの製造者の指示を参照のこと。
５．３．１．２  細胞培養代謝物の分析：培地は、プレＲＥＰ培養から定期的に除去され、以下の代謝物について試験された：グルコース、乳酸、Ｌ−グルタミン及びアンモニア。手順については、Roche Cedex Bioanalyzerユーザマニュアルを参照のこと。
５．３．２  ＲＥＰ試験には、細胞数、％生存率、細胞表面分子のフローサイトメトリー分析、効力（ＩＦＮ−γ産生）、生物発光リダイレクト溶解アッセイ、グランザイムＢ産生、細胞代謝、テロメア長測定などの拡大アッセイが含まれる。
５．３．２．１  細胞数及び生存率：ＴＩＬ試料をカウントし、SOP LAB-003 Rev 000 Cellometer K2 Image Cytometer Automatic Cell Counterに従ってCellometer K2自動セルカウンター（Nexcelom Bioscience、Lawrence, MA）を使用して生存率を測定した。
５．３．２．２  細胞表面バイオマーカーのフローサイトメトリー分析：ポストＲＥＰ  ＴＩＬのWRK LAB-041 Rev 000表面抗原染色に概説されている手順を使用して、細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析用にＴＩＬ試料を分けた。
５．３．２．３  効力アッセイ（ＩＦＮ−γ産生）：ＣＤ３、ＣＤ２８及びＣＤ１３７／４−１ＢＢに対する抗体で刺激されたＴＩＬの培地中のサイトカインＩＦＮ−γのレベルを決定することで細胞傷害能の測定値を測定した。これらの刺激ＴＩＬからの培地中のＩＦＮ−γレベルは、ＩＦＮ−γ遊離測定のためのＴＩＬのWRK LAB-016 Rev 000刺激を使用して決定した。
５．３．２．４  生物発光リダイレクト溶解アッセイ：標的細胞を溶解するＴＩＬの細胞傷害能は、ＴＩＬのためのWRK LAB-040生物発光リダイレクト溶解アッセイ（効力アッセイ）に概説されているＳＯＰに従って、生物発光細胞株Ｐ８１５（クローンＧ６）とのＴＩＬの共培養アッセイを使用して評価した。
５．３．２．５  グランザイムＢ産生：グランザイムＢは、ＴＩＬが標的細胞を死滅させる能力の別の尺度である。５．２．５．３に記載したとおり再刺激した培地上清について、そのグランザイムＢレベルも、Human Granzyme B DuoSet ELISA Kit（R&D Systems、Minneapolis, MN）を製造者の指示に従い使用して評価した。
５．３．２．６  細胞（呼吸）代謝：細胞をミトコンドリア呼吸及び解糖の阻害薬で処理して、以下の尺度からなるＴＩＬの代謝プロファイルを決定した：ベースライン酸化的リン酸化（ＯＣＲによる測定時）、予備呼吸容量、ベースライン解糖活性（ＥＣＡＲによる測定時）及び解糖予備能。代謝プロファイルは、WRK LAB-029 Seahorseコンビネーションミトコンドリア／解糖ストレステストアッセイで概説された手順を使用して実施した。
５．３．２．７  テロメア長の測定：ゲノムＤＮＡ及び細胞学的調製物中のテロメア長を測定するために、様々な方法が使用されてきた。テロメア制限フラグメント（ＴＲＦ）分析は、テロメア長を測定するための究極の判断基準である（de Lange et al., 1990）。ただし、ＴＲＦの主な制限は、大量のＤＮＡ（１．５＾ｇ）を必要とすることである。テロメア長の測定に広く使用されている２つの技術、すなわち蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ；Agilent Technologies、Santa Clara, CA）及び定量的ＰＣＲ。
５．３．３  以下の試験のために追加試料が採取され、必要に応じて将来分析される可能性があった：
５．３．３．１  サイトカイン分析の詳細
５．３．３．２  ＴＣＲの配列
【０８５１】
６．達成した結果
セクション２．３で説明した腫瘍に由来するＴＩＬ、セクション５．１での実験設計及び回収条件を使用して、合計９回の実験を実施した。プロセス２Ａを使用して回収したＴＩＬは、その拡大能力、生存率、表現型、細胞傷害能及び代謝プロファイルを理解するために、セクション５．３．２で概説された試験に供した。新鮮回収ＴＩＬ産物と解凍した凍結ＴＩＬ産物に対して全ての測定を行った（プロセス２Ａ）。
６．１  細胞数及び生存率
６．１．１  プレＲＥＰ、ＲＥＰの５日目又は６日目（拡大培養の日）及びLOVO洗浄前及びLOVO洗浄後のＲＥＰの終了時に細胞数をカウントした。次に、その細胞数を使用して、ＲＥＰ中のＴＩＬの拡大培養及びLOVOの洗浄後のＴＩＬの回復を判定した。解凍後、細胞を再度カウントし、解凍後の回復（ＴＩＬを凍結した時点の濃度に基づく）及び他の分析アッセイに進む前の解凍後生存率を判定した。表３は、９回のプロセス２Ａの実施に関するこれらの結果を全てまとめたものである。
【０８５２】
【表３９】
2021519582.tif 000043
【０８５３】
６．１．２  プロセス２Ａ  ＳＯＰは、ＲＥＰのＴＩＬの開始番号を５  ２００×１０６  ＴＩＬの範囲で定義する。プロセス２Ａ  ＲＥＰを開始するために使用された９つのＴＩＬ試料の範囲は４．１×１０６（Ｍ１０６５Ｔ）−１．８×１０８（Ｍ１０６４Ｔ）で、平均開始ＴＩＬ番号は６．５８×１０７であった。興味深いことに、最小数のＴＩＬとともにプレートに入れたＲＥＰは、ＲＥＰ回収時に最大限まで拡大した（９回のＲＥＰ全ての拡大範囲：１３０〜１９００倍；平均拡大率、８４０倍）。これら９回のプロセス２Ａ  ＲＥＰの終了時に回収したＴＩＬの平均数は、４．４９×１０１０（範囲７．８×１０９〜６．７×１０１０）であった。
６．１．３  プロセス１Ｃの比較統計については、ＬＮ１４４／ＬＮ−１４５の治験薬（ＩＮＤ：Investigational New Drug）適用の化学、製造及び管理（ＣＭＣ：Chemistry, Manufacturing, and Controls）セクションを参照のこと。
６．１．４  プロセス１Ｃでは、手動操作及び遠心分離を利用してＴＩＬ産物を洗浄する。これには時間がかかるが、更に重要なことに、回収から最終製剤までの間に産物の最大２５％が失われる可能性がある。自動細胞洗浄LOVO系は、細胞損失を最小限に抑える方法を提供し、閉鎖系洗浄を導入し、洗浄ステップ中の産物の汚染のリスクを低減している。プロトコルのLOVO洗浄ステップ後の産物の回収率は、洗浄ステップに入るＴＩＬ産物の平均９３．８±１０．４％を示した。この統計には、Ｍ１０６２ＴのＴＩＬ産物が含まれており、このLOVOの回復率は６８％であり、その間にLOVOの操作中の作業者の過失により、試料を遠心分離してからLOVO手順をやり直さなければならなかった（セクション７、偏差及び不一致を参照））。これは、ＲＥＰ回収日のプロセス１Ｃ洗浄ステップでの非常に好ましい改善を示している。
６．１．５  解凍後のＴＩＬの回復も、凍結ＴＩＬ産物の主要懸念事項である。凍結保存前に各凍結バッグに入れた細胞の数と比較して、解凍後にバッグから回収した細胞の数を測定することにより、産物の回収を判定した。解凍からの回復範囲は７８〜１０３％で、平均回復率は８８．２±８．６％であった。
６．１．６  解凍前又は解凍後の試料の生存率には有意な差があるが、平均して、解凍時の生存率の損失はわずか２％である。凍結保存に入るＴＩＬの生存率は８４．３±４．７％で、解凍後の同じＴＩＬの生存率は８２．１±４．４％であった（ｐ＝０．０７４２、対のスチューデントのｔ検定、ノンパラメトリック）。新鮮臨床ＴＩＬプロセス１Ｃ産生の遊離基準には、最低７０％の生存率が必要である。解凍時の生存率のわずかな損失に関わらず、プロセス２Ａの９回の実施は全て、極低温産物の解凍後にこの放出基準を満たした。表４及び図３は、凍結保存（新鮮＋CS10）に移行するＴＩＬの生存率と、解凍時のＴＩＬの生存率を示す。
【０８５４】
【表４０】
2021519582.tif 000044
【０８５５】
６．２  ＴＩＬのＲｅ−ＲＥＰ拡大培養。ＲＥＰで拡大培養する新鮮な産物の能力を調べることに加え、新鮮な照射異系同種ＰＢＭＣフィーダーＡＰＣ及び新鮮抗ＣＤ３で再刺激による新鮮ＴＩＬ産物と解凍ＴＩＬ産物の両方の拡大培養の能力を判定した。７日後、これらの再刺激されたＴＩＬ産物の、初めの培養状態からの拡大培養能力について分析した。図４及び表５は、７日間培養して成長させた後のｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬ細胞の平均拡大率を示している。対のスチューデントのｔ検定を使用したデータの分析により、ＴＩＬがｒｅ−ＲＥＰで拡大する能力は、ＲＥＰを新鮮ＴＩＬ産物から開始しても解凍ＴＩＬ産物から開始しても有意な差はないことを示している（ｐ＝０．８１）。
【０８５６】
【表４１】
2021519582.tif 000045
【０８５７】
６．３  細胞培養代謝産物。Ｌｉｏｎ  ２Ａの主要な前提の１つは、技術時間及びプロセス移行が少なくなると、経費が削減され、ばらつきが制限されることである。これにより起こり得る悪影響は、望ましくない代謝産物の増加と栄養源の減少であった。図５に示すように、電解質（ナトリウム及びカリウム）、栄養素（グルタミン及びグルコース）及び代謝産物（乳酸及びアンモニア）の正常な血液値は、プレＲＥＰ１１日の結果を評価する際の参照範囲を提供する。図６に示すように、３回のＴＩＬ（Ｍ１０６１Ｔ、Ｍ１０６２Ｔ及びＭ１０６４Ｔ）が順次判定された。この設定では、カリウム及びナトリウムは正常レベルに維持され、グルコースは＞１．０ｇ／Ｌ、グルタミンは＞０．３ｍｍｏｌ／Ｌを超えており、正常血中値よりもかなり高くなった。予測どおり、乳酸塩は、通常の血液に見られるレベルの約５倍である０．８ｇ／Ｌ、アンモニアは３ｍｍｏｌ／Ｌに上昇にまで上昇し、これは急速に拡大した細胞であることから予想され、また、通常の血液に見られる値よりも大幅に高くなった。
６．４  ＩＬ−２の定量化。
６．４．１  補足グルコース、グルタミン及び十分な酸素化に加えて、プレＲＥＰにおけるＴＩＬ成長の主な駆動要因は、高レベルのｒｈＩＬ−２の提供である。血清含有培地への添加後、ＩＬ−２レベルは２〜３．５×１０３ＩＵ／ｍＬと測定され、培養１１日間で約１．０×１０３ＩＵ／ｍＬに低下したのみであった。これは、Ｔ細胞の成長を維持するのに必要な３０〜１００ＩＵ／ｍＬを大きく上回っている。ＩＬ−２の異なる材料（Prometheus、Akron、Cellgenix）を使用したＩＬ−２濃度の評価が現在、個別の実験（QP-17-010：Cellgenix、Akron、PrometheusからのＩＬ−２の認定）がLion Biotechnologies、Tampaで行われている。
６．５  ＩＦＮ−γ産生
６．５．１  セクション５．３．５．３で説明したように、磁気抗ＣＤ３、ＣＤ２８及び4-1BB DynabeadsでＴＩＬを２４時間刺激した後、培養物の上清を収集し、ＥＬＩＳＡキットを使用してＩＦＮ−γについて分析した。全ての再刺激されたＴＩＬは、刺激されていない物よりも多くのＩＦＮ−γを産生し、ＴＩＬの刺激がそれらの活性化をもたらしたことを示している。図８は、再刺激時に周囲の培地にＩＦＮ−γを遊離させる４つの異なるＴＩＬ組成物（新鮮、解凍、新鮮ｒｅ−ＲＥＰ及び解凍ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬ）の試験結果を示している。
表６及び７は、９回のプロセス２Ａ実施におけるＩＦＮ−γ分泌の平均値を示している。再刺激時の周囲の培地へのＩＦＮ−γ分泌は、新鮮ＴＩＬ産物と解凍され、凍結保存されたＴＩＬ間で差はない。表６は、新鮮産物が平均４１４３±２２８５ｐｇ  ＩＦＮ−γ／１０６ＴＩＬを産生したのに対し、解凍産物は３９１０±１４８７ｐｇ  ＩＦＮ−γ／１０６ＴＩＬを産生したことを示している（対のスチューデントのｔ検定を使用してｐ＝０．５５）。総ＴＩＬ産物（表７）に基準を合わせると、平均して、刺激された新鮮ＴＩＬは８６±６１ｇのＩＦＮ−γを産生し、解凍して刺激されたＴＩＬは６８±４０ｇのＩＦＮ−γを産生した（ｐ＝０．１３）。これらの発見は、新鮮ＴＩＬ産物と解凍ＴＩＬ産物の両方がＩＦＮ−γを産生し、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８／抗４−１ＢＢで刺激すると、新鮮又は解凍した一致するＴＩＬがＩＦＮ−γを産生する能力に差がないことを示している。
【０８５８】
【表４２】
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【０８５９】
【表４３】
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【０８６０】
６．６  グランザイムＢ産生
６．６．１  セクション５．２．５．３で説明したように、磁気抗ＣＤ３、ＣＤ２８及び4-1BB DynabeadsでＴＩＬを２４時間刺激し、２４時間後に収集した培養物の上清を、ＥＬＩＳＡによりグランザイムＢレベルについて分析した。全ての再刺激されたＴＩＬは、刺激されていない物よりも多くのグランザイムＢを産生し、ＴＩＬの刺激がそれらの活性化をもたらしたことを示している。図９は、サイトカインカクテルで再刺激すると、周囲の培地にグランザイムＢを遊離させる新鮮ＴＩＬ、新鮮ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬ及び解凍ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬの能力を示している。
【０８６１】
[00868]  全産物は、９１９０ｐｇ／１０６生細胞から２６２０００ｐｇ／１０６生細胞までの範囲のグランザイムＢ産生を示した（表８）。表６は、新鮮産物が平均６０６４４＋４２９５９を産生し、新鮮及び再解凍ｒｅ−ＲＥＰがそれぞれ９３６００＋６７５５８お及び１０３８７８＋８４５１５を産生したことを示す。新鮮ｒｅ−ＲＥＰ及び解凍ｒｅ−ＲＥＰの比較により、どちらの条件から得られたＴＩＬの能力にも差がないことが示された（ｐ＝０．７）。解凍産物にはグランザイムＢの測定値がないため、新鮮ＴＩＬ産物を使用した統計分析は実施しなかった。
【０８６２】
【表４４】
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【０８６３】
６．７細胞表面バイオマーカーのフローサイトメトリー分析
[00869]  ＴＩＬの表現型プロファイリング：Ｔ細胞の機能的プロファイルを広く特徴付けるために、ＬＩＯＮでは４つの抗体パネルを標準化してきた。これらのパネルを使用して、新鮮ＴＩＬ、解凍ＴＩＬ、新鮮ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬ及び解凍ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬの免疫表現型を評価した。このセクションの画像表示に使用される全てのデータは、付録セクション１０の表形式（表１４〜２４）でも提供されている。
６．８  生物発光リダイレクト溶解アッセイ
６．８．１  プロセス２Ａ  ＴＩＬの標的腫瘍細胞を死滅させる潜在能力を決定するために、セクション５．３．２．４に記載されているとおり、生物発光代替標的細胞株Ｐ８１５を伴うＴＩＬの共培養を含む潜在アッセイを開発した。抗ＣＤ３刺激の存在下でＰ８１５を伴う、異なるＴＩＬ組成物を４時間共培養すると、標的細胞の５０％の死滅に必要なＴＩＬ数として定義できる溶解単位ＬＵ５０で表されるＴＩＬ細胞の細胞傷害能の尺度が得られる。この測定値はＬＵ５０／１０６ＴＩＬとして表される。下の図３２は、新鮮産物及び２つのｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬ条件、新鮮ｒｅ−ＲＥＰ及び解凍ｒｅ−ＲＥＰからのＴＩＬの細胞傷害能を示す。
６．８．２  新鮮ｒｅ−ＲＥＰ及び解凍ｒｅ−ＲＥＰ比較により、ＴＩＬが標的細胞の死滅能力にも有意な差がないことが示される（ｐ＝０．３１２６）。このデータは、ＴＩＬ産物の細胞傷害能に関して、新鮮産物及び解凍産物間に差がないという結論を裏付ける。ＴＩＬを解凍した直後に細胞傷害能が測定されなかったため、新鮮な細胞間の比較は実施しなかった。表９は、Ｐ８１５標的細胞株の５０％の死滅に必要なＴＩＬの溶解単位を示す。
【０８６４】
【表４５】
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【０８６５】
６．９  ＴＩＬの細胞代謝プロファイル
６．９．１  ポストＲＥＰ  ＴＩＬの代謝的健康を評価するため、セクション５．３．２．６で概説したプロトコルに従って、Agilent Technologies (Santa Clara, CA)のSeahorse代謝分析装置（XFp及びXFe96）を使用した。簡潔に言えば、酸化的リン酸化又は解糖のいずれかの特定の側面を標的とする阻害剤で細胞を処理することにより、細胞にかかるＳＲＣ及び解糖予備能の判定を可能にする方法でストレスをかける。更に、酸化的リン酸化（基礎ＯＣＲ）及び解糖（基礎ＥＣＡＲ）の両方の基礎レベルを判定できる。最後に、酸化的リン酸化と解糖の阻害剤が同じ試験で組み合わされるため、細胞が、２−デオキシグルコース（２−Ｄ）のＧ拮抗阻害剤（ＳＲＣ２ＤＧと表示が付された）で処理された場合にのみ明らかな、ＳＲＣの潜在的な隠れた予備能を識別することができ、結果としてともすれば隠れたままのＳＲＣの増加をもたらす。この余分な呼吸容量は、「Covert」ＳＲＣと表示が付された。表９に、細胞で実施された代謝ストレス試験から得られた、新鮮回収ＴＩＬ、新鮮ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬ及び解凍ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬの代謝プロファイルを示す。
６．９．２  図５５Ａ〜Ｆ、表３８のデータを画像形式で示している。新鮮回収ＲＥＰ産物は、新鮮ｒｅ−ＲＥＰ及び解凍ｒｅ−ＲＥＰ産物との統計的な差を示している。ｒｅ−ＲＥＰ産物は、ＲＥＰ直後又は解凍時に、新鮮照射ＰＢＭＣ  ＡＰＣ及び新鮮抗ＣＤ３抗体で再刺激されているため、これは驚くべきことではない。ただし、全ての場合において、生製品及び解凍産物の両方がｒｅ−ＲＥＰ手順で再刺激された場合、有意な差はない（表９のｐ値を参照のこと）。これは、凍結保存プロセスがＴＩＬ産物に悪影響を及ぼさないことを示している。最も注目すべきは、酸化的リン酸化の場合、ｒｅ−ＲＥＰ産物は一致する新鮮回収ＲＥＰ産物よりも高いＳＲＣを有していることである。解糖の場合、ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬは、新鮮ＲＥＰ産物よりも、解糖の基礎レベルが統計的に有意に高く、逆に解糖予備能のレベルが統計的に低くなる。注目に値するのは、活性化された健康なＴＩＬが高レベルの解糖活性を持つことが報告されているとおり、ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬが新鮮に回収したＴＩＬよりも高度に活性化されることを示す可能性があることである（Buck et al., JEM 212:1345-1360; 2015）。
【０８６６】
【表４６】
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【０８６７】
６．９．３  ｒｅ−ＲＥＰ手順を使用した新鮮産物及び凍結産物の直接比較により、同一の刺激条件では新鮮ＴＩＬ産物及び凍結ＴＩＬ産物の両方が統計的に不明瞭な代謝プロファイルをもたらすことが確認できた。新鮮ｒｅ−ＲＥＰ及び解凍ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬの両方が、同様のレベルの基礎呼吸（図６０Ａ、３６．７±１０．６及び４４．８±１２．９ｐｍｏｌ／分；それぞれｐ＝０．１１）及び同様の（明白な）ＳＲＣ（図６０Ｂ、４１．６±２７．２及び６２．７±３０．８；ｐ＝０．１２）を有する。これらのｒｅ−ＲＥＰ細胞を、解糖の阻害をもたらす結果をもたらす２−ＤＧ、グルコースの拮抗阻害剤で処理すると、新鮮及び解凍ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬの両方が、回収新鮮ＴＩＬ試料にほとんど含まれていないか、存在しない余分な「隠れた」予備呼吸容量（ＳＲＣ２ＤＧ；Covert  ＳＲＣ）を示すことが分かる（図６０Ｃ）；回収新鮮ＴＩＬでＳＲＣ２ＤＧのレベルが高かったのは１試料のみで（図６０Ｃ）、逆に、試験した７試料の１つのみがｒｅ−ＲＥＰでCovert  ＳＲＣの欠如を示した。新鮮ｒｅ−ＲＥＰのCovert  ＳＲＣ（図６０Ｄ）は平均２０．７±２０．１であったが、解凍ｒｅ−ＲＥＰのCovert  ＳＲＣ（図６０Ｄ）は２７．８±１６．１であった。ｐ＝０．５２）。
６．９．４  拡大表現型（ｒｅ−ＲＥＰ）ＴＩＬの最も顕著な代謝読み取りは、拡大表現型（ｒｅ−ＲＥＰ）試料の一貫した高レベルの基礎解糖である。基礎解糖（図６０Ｅ）はｒｅ−ＲＥＰ試料で一貫して高く、新鮮ｒｅ−ＲＥＰでは平均１１８．７±４４．２ｍｐＨ／分、解凍ｒｅ−ＲＥＰでは平均１３２．０±４３．２±ｍｐＨ／分である。これらの試料は、互いに統計的差がない（ｐ＝０．３８）。しかし、上記のように、新鮮回収試料は、解糖のかかる高基礎レベルを有していない。新鮮ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬと比較すると、この差はかなり大きいが、有意ではない（ｐ＝０．１０）；ただし、解凍ｒｅ−ＲＥＰ試料と比較すると、その差は有意である（ｐ  ０．０１）。これらのｒｅ−ＲＥＰ細胞は、Seahorse代謝試験でストレスを受けた場合解糖予備能がほとんど残っていないため、エネルギーの必要性のため解糖に大きく依存しているようである（図６０Ｆ）：新鮮ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬ平均１２．９±１４．９ｍｐＨ／分；解凍ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬ平均、３．３５±２３．８ｍｐＨ／分）。これらのｒｅ−ＲＥＰは互いに差はないが（ｐ＝０．４７）、両方とも新鮮回収ＴＩＬ試料に見られる解糖予備能の貯蔵量とは統計的に異なり、平均４０．８±１７．６ｍｐＨ／分である（新鮮ｒｅ−ＲＥＰ及び解凍ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬと比較してそれぞれ、ｐ＝０．００３及び０．０１）。これらの新鮮回収試料及びｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬ試料の解糖で見られる差の背後にある原因を特定するため、更なる研究を実施する必要がある。
６．１０．テロメア長の測定
６．１０．１  フローＦＩＳＨ及びｑＰＣＲによるポストＲＥＰ  ＴＩＬのテロメア長の測定。
６．１０．１．１  Dako/Agilent Pathology Solutions（フローサイトメトリー用テロメアＰＮＡ／ＦＩＴＣ）キットを使用してフローＦＩＳＨを実施し、製造者の指示に従ってテロメア反復の平均長を測定した。１３０１  Ｔ細胞白血病細胞株（Sigma-Aldrich、St. Louis, MO）を各アッセイの内部参照標準として使用した。個々のＴＩＬをカウントし、１：１の細胞比で１３０１細胞と混合した。２×１０６  ＴＩＬを２×１０６の１３０１細胞と混合した。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション溶液（７０％ホルムアミド、１％ＢＳＡ、２０ｍＭのTris、ｐＨ７．０）で、ＦＩＴＣ結合テロメアＰＮＡプローブ（ＦＩＴＣ−００−ＣＣＣＴＡＡ−ＣＣＣ−ＴＡＡ−ＣＣＣ−ＴＡＡ）が在るものと無いもので複製され、最終濃度６０ｎＭのテロメア反復配列を補足して実施された。テロメアＰＮＡプローブの追加後、細胞をヒートブロックで、８２℃で１０分間インキュベートした。次に、細胞を室温で一晩暗所に置いた。翌朝、４０℃のヒートブロック上で洗浄溶液を用いて１０分間ずつ２回洗浄することにより、過剰なテロメアプローブを除去した。洗浄後、ＤＡＰＩ（Invitrogen、Carlsbad, CA）を最終濃度７５ｎｇ／ｍｌで加えた。ＤＡＰＩによるＤＮＡ染色を使用して、Ｇ０／Ｇ１集団の細胞をゲーティングした。Yetiフローサイトメーター（Propel-Labs、Fort Collins, CO）を使用して試料分析を実施した。試験試料のテロメア蛍光は、以下の式に従って１３０１細胞の蛍光（ｆｌ）の割合として表された：相対テロメア長＝［（平均ＦＩＴＣ  ｆｌ試験細胞ｗ／プローブ−平均ＦＩＴＣ  ｆｌ試験細胞ｗ／ｏプローブ）×１３０１細胞のＤＮＡ指標×１００］／［（平均ＦＩＣＴ  ｆｌ  １３０１細胞ｗ／プローブ−平均ＦＩＴＣ  ｆｌ  １３０１細胞ｗ／プローブ）×試験細胞のＤＮＡ指標。
６．１０．１．２  ｑＰＣＲ：相対テロメア長を測定するために、リアルタイムｑＰＣＲが使用された。簡潔に言えば、９６ウェル形式のBio-Rad PCRサーマルサイクラー（Bio-Rad Laboratories、Hercules, CA）を使用して、テロメアの反復複製数と単一遺伝子複製数（Ｔ／Ｓ）の比率を決定した。１０ｎｇのゲノムＤＮＡがテロメア（Ｔｅｌ）又はヘモグロビン（ｈｇｂ）ＰＣＲ反応に使用され、使用されたプライマーは以下のとおりであった。ＴｅＬ−１ｂプライマー（ＣＧＧ  ＴＴＴ  ＧＴＴ  ＴＧＧ  ＧＴＴ  ＴＧＧ  ＧＴＴ  ＴＧＧ  ＧＴＴ  ＴＧＧ  ＧＴＴ  ＴＧＧ  ＧＴＴ）、ＴｅＬ−２ｂプライマー（ＧＧＣ  ＴＴＧ  ＣＣＴ  ＴＡＣ  ＣＣＴ  ＴＡＣ  ＣＣＴ  ＴＡＣ  ＣＣＴ  ＴＡＣ  ＣＣＴ  ＴＡＣ  ＣＣＴ）、ｈｇｂ１プライマー（ＧＣＴＴＣＴＧＡＣＡＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＣＡＣＴＡＧＣ）及びｈｇｂ２プライマー（ＣＡＣＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴＣＡＣＣ）。全試料は、テロメア反応とヘモグロビン反応の両方によって分析され、分析は同じプレート上で３回実施された。試験試料に加えて、各９６ウェルプレートには、１３０１細胞から分離されたゲノムＤＮＡを使用した０．０８ｎｇから２５０ｎｇの５点標準曲線が含まれていた。各試料のＴ／Ｓ比（−ｄＣｔ）は、テロメアＣｔ値の中央値からヘモグロビン閾値サイクル（Ｃｔ）の値を差し引くことによって計算された。相対Ｔ／Ｓ比（−ｄｄＣｔ）は、未知の各試料のＴ／Ｓ比から１０ｎｇの標準曲線点のＴ／Ｓ比を差し引くことで決定した。
６．１０．１．３  テロメア長の結果と考察：テロメアは、完全な染色体複製を促進する上で重要な役割を果たす線形染色体の端部のキャップ（反復ヌクレオチド配列）である。テロメア測定は、変性疾患、癌及び老化などの状態の研究における新たなツールである。ＮＩＨの以前の研究（J Immunol.2005, Nov 15;175(10):7046-52; Clin Cancer Res.2011, Jul 1; 17(13):4550-4557）は、ＴＩＬのより長いテロメア長が臨床応答に関連していることを示している。一方、Radvanyiのグループは、レスポンダーと非レスポンダーとの間でＴＩＬのテロメア長に有意な差がないことを発見した（Clin Cancer Res; 18(24); 6758-70）。これまでのところ、テロメア長がｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔ細胞培養の長さに関連していることを証明する証拠は無い。プロセス２Ａ（２２日間培養）で培養されたポストＲＥＰ  ＴＩＬは、プロセス１Ｃプロセス（２５〜３６日間培養）で培養されたＴＩＬと比較して、テロメア長が長くなる可能性がある。
【０８６８】
７．差及び偏差
７．１  プロセス偏差
７．１．１  Ｍ１０６１Ｔ：ＲＥＰ細胞を６日目に４つのG-Rex500Mフラスコに分割した。
７．１．２  Ｍ１０６２Ｔ：ＲＥＰ細胞を６日目に４つのG-Rex500Mフラスコに分割した。LOVOろ過系のオペレーターエラーにより、処置中に緊急停止が発生し、使い捨てキットからＴＩＬを手動で収集する必要があった。ＴＩＬは、２回目のLOVO実施中に正常にろ過された。
７．１．３  Ｍ１０６３Ｔ：偏差なし  Ｍ１０６４Ｔ：偏差なし
７．１．４  Ｍ１０６５Ｔ：プレＲＥＰ細胞は、１１日目の細胞カウント仕様を下回っていた（＜５×１０６個の細胞）が、ＲＥＰまで継続された。ＲＥＰ６日目に、細胞を数え、G-Rex500Mに戻し、４．５Ｌの新鮮培地を与えた。ＴＩＬは、細胞数が不十分（ＲＥＰ６日目で＜１×１０９個の細胞）のため、この日は拡大培養しなかった。
７．１．５  ＥＰ１１００１Ｔ：偏差なし
７．１．６  Ｍ１０５６Ｔ：プレＲＥＰ細胞は、G-Rex 100フラスコ内のＬＩＯＮで最大２１日間培養した。プレＲＥＰ１１日目に腫瘍断片をろ過除去し、回収日には１．５ｍｌバイアルあたり３０×１０６個の細胞の１００％CS10でＴＩＬを凍結した。凍結ＴＩＬを６０００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ−２を添加したＣＭ１のMoffitt PDで解凍し、ＲＥＰ０日目を開始する前に３日間休ませた。ＲＥＰ６日目に、ＴＩＬは４つのフラスコに拡大培養され、ＲＥＰ１１日目に回収に進んだ。
７．１．７  Ｍ１０５８Ｔ：プレＲＥＰ細胞は、G-Rex 100フラスコ内のＬＩＯＮで最大２１日間培養した。プレＲＥＰ１１日目に腫瘍断片をろ過除去し、回収日には１．５ｍｌバイアルあたり３０×１０６個の細胞の１００％CS10でＴＩＬを凍結した。凍結ＴＩＬを６０００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ−２を添加したＣＭ１のMoffitt PDで解凍し、ＲＥＰ０日目を開始する前に３日間休ませた。ＲＥＰ６日目に、細胞は４つのフラスコに分割され、ＲＥＰ１１日目に回収に進んだ。
７．１．８  Ｍ１０２３Ｔ：プレＲＥＰ細胞は、G-Rex 10フラスコ内のＬＩＯＮで最大２１日間培養した。プレＲＥＰ１１日目に腫瘍断片をろ過除去し、回収日には１．５ｍｌバイアルあたり３０×１０６個の細胞の１００％CS10でＴＩＬを凍結した。凍結ＴＩＬを６０００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ−２を添加したＣＭ１のMoffitt PDで解凍し、ＲＥＰ０日目を開始する前に３日間休ませた。ＲＥＰ６日目に、細胞は４つのフラスコに拡大培養され、ＲＥＰ１１日目に回収に進んだ。
７．２  偏差の試験
７．２．１  詳細なサイトカイン分析及びＴＣＲシーケンスは実施されなかった。
【０８６９】
８．結論及び提言
８．１  より堅牢なプロセスの開発。Ｌｉｏｎの課題は、処理時間が長い初期のＬｉｏｎプロセス１Ｃを、より短い処理時間及びＴＩＬ産物の凍結保存最終製剤をもたらす改良版を使用した、より商業化可能な可能性のあるＬｉｏｎプロセス２Ａに変えることであった。この目的のために、９回のプロセス開発を実施し、古いプロセス及び新しいプロセスが同等の細胞収量並びに同等のＴＩＬ効力及び表現型を実証したことを確認した。特に注目すべきは、プロセス全体の複雑さが著しく減少し、結果としてプレＲＥＰ及びＲＥＰプロセス全体の長さが５０％短縮され、なおかつ現在、当社の契約製造業者で実施されている従来のＬｉｏｎプロセス１Ｃと比較して同等のＴＩＬ収量（７．８×１０９〜６７×１０９個の細胞）が得られたことである。これは、２０１７年６月のＡＳＣＯプレゼンテーション用に更新された（平均：１．２〜９６×１０９個の細胞の範囲で４１．０４×１０９個の細胞）。更に、Ｌｉｏｎは凍結保存ＴＩＬ産物の開発に成功し、これは、現在のプロセス１Ｃリリース基準と一致するＴＩＬの生存率は＞７０％であり、解凍後の回復が７８〜１０３％であることを実証した（表２を参照のこと）。
８．２  拡大表現型分析（ｒｅ−ＲＥＰ）の役割。分裂刺激に応答して成長する能力（本報告書に示されている実験的なｒｅ−ＲＥＰように）は、ＴＩＬの重要な品質属性である。ここで紹介する実験では、８／９の解凍ＴＩＬ産物が７／９の一致した新鮮ＴＩＬ産物と比較して１週間で＞１００倍拡大培養でき、解凍ＴＩＬ産物と新鮮ＴＩＬ産物の比較可能性を裏付けている（表２）。ＴＩＬの２つの追加的な重要な品質特性は、サイトカイン（ＣＤ３／ＣＤ２８／４−１ＢＢ）刺激後にＩＦＮ−γ及び／又はグランザイムＢを遊離させる能力である。新鮮産物及び解凍産物の両方のサイトカイン刺激により、７／９の新鮮産物と全ての解凍産物で２ｎｇ／１０６個の細胞／２４時間を超えるＩＦＮ−γ遊離が生じた（図３５）（本報告書のセクション６．２を参照のこと）。グランザイムＢの遊離（図３６）は、９つの全てのプロセスで観察された。ＣＤ４及びＣＤ８レベル（図３９及び図４０）は、新鮮ＴＩＬ産物及び解凍ＴＩＬ産物間で顕著な内部一貫性を実証する。更に、代理腫瘍標的細胞株を死滅させるＴＩＬの能力の分析（Ｐ８１５、図５９）は、新鮮ＴＩＬ及び解凍ＴＩＬが同様の細胞傷害能を有することを示した。
８．３  ＴＩＬ代謝ストレス試験は、堅牢な生体エネルギーを明らかにする。ｒｅ−ＲＥＰで刺激された新鮮及び解凍ＴＩＬ産物の代謝プロファイルの分析は、新鮮及び解凍ＴＩＬの両方が代謝ストレス試験に同様に反応し、代謝特性のパネルに実質的な違いを示さなかったことを実証した（表３９）。したがって、凍結保存されたプロセス２ＡのＴＩＬ産物は、本報告書に記載されている同一性、効力、細胞数及び生存率の４つの品質属性に基づいて、新鮮プロセス１Ｃ産物と同等であると見なすことができる。一致した新鮮細胞と解凍細胞を比較するアッセイは、本報告書で概説した全てのアッセイで非常に同等であった。
８．４  適合基準：各患者に合わせた個別療法のＴＩＬ産物の固有の不均一性は、以下を反映する：（１）分子を制限する独自の主要組織適合性複合体（ヒト生物学で最も多型の遺伝子産物）；（２）ゲノムの不安定性及びユニークな個々のドライバー及びパッセンジャー変異を伴う腫瘍微小環境で生じる個々の腫瘍のユニークな進化の軌跡；及び（３）ネオエピトープの認識に使用されるＴ細胞受容体を定義する＼／α及び＼／βセグメントの対立遺伝子変異、Ｎ領域の多様性及びＶＤＪ再配列によって付与される不均一性並びに腫瘍にコードされた産物。したがって、プロセス変更の結果として発生する追加変動を評価することは困難な作業であり、本質的に不均質な材料の「比較可能性」をできる限り確保するため、できるだけ多くのパラメータの評価が必要である。これは、以下の表４０に詳述されているように、実現可能性及び比較可能性に関するいくつかの適合基準を忠実に検査することによって達成された。
【０８７０】
【表４７】
2021519582.tif 000051
【０８７１】
表１１に挙げた実施可能性基準に基づいて、ＴＩＬは要件が満たされているか否かで判定される。各実験及び各ＴＩＬ株で全ての個々の基準が満たされた（ｎ＝９）。スチューデントｔ−検定を統計分析に使用した。生存率の尺度はガウス分布ではないため、ノンパラメトリックスチューデントＴ−検定を使用して、％生存率のｐ値を計算した。以下の表４１を参照のこと。
【０８７２】
【表４８】
2021519582.tif 000052
【０８７３】
[00870]  表４０に挙げた適合基準に基づいて、新鮮及び凍結ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬは要件が満たされているか否かで判定される。（ｒｅ−ＲＥＰの期間は７日間であり、残存照射ＰＢＭＣはＴＩＬと区別できなかったため、生存率は報告していない。）括弧内の数字は、満たされなかった基準を示す。ＣＤ３＋発現を使用して測定された純度基準に基づいて、６／９の新しいＲｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬ産物は厳しい＞９０％基準を満たし（Ｍ１０６１、Ｍ１０６５及びＥＰ１１００１は満たさなかった）、８／９の解凍産物はＲｅ−ＲＥＰ後も適合基準を満たした。ＥＰ１１００１Ｔの新しいｒｅ−ＲＥＰのＣＤ３＋  ＴＩＬが低数であるのは、Ｔ細胞受容体の極端な発現低下に起因する可能性がある。純度の尺度としてのＣＤ３  ＴＩＬの測定は、Ｍ１０２３Ｔ解凍ｒｅ−ＲＥＰ  ＴＩＬについては判定しなかった。このＴＩＬ組成では、純度はＴＣＲａｐ染色を使用して推定され、アスタリスク（＊）で示す。スチューデント−ｔ検定を統計分析に使用した。以下の表４２を参照のこと。
【０８７４】
【表４９】
2021519582.tif 000053
【０８７５】
書誌
Goff SL, Dudley ME, Citrin DE, Somerville RP, Wunderlich JR, Danforth DN, Zlott DA, Yang JC, Sherry RM, Kammula US, Klebanoff CA, Hughes MS, Restifo NP, Langhan MM, Shelton TE, Lu L, Kwong ML, Ilyas S, Klemen ND, Payabyab EC, Morton KE, Toomey MA, Steinberg SM, White DE, Rosenberg SA.Randomized, Prospective Evaluation Comparing Intensity of Lymphodepletion Before Adoptive Transfer of Tumor-Infiltrating Lymphocytes for Patients With Metastatic Melanoma.J Clin Oncol.2016 Jul 10;34(20):2389-97. doi:10.1200/JCO.2016.66.7220.Epub 2016 May 23.PubMed PMID:27217459; PubMed Central PMCID:PMC4981979.
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【０８７６】
９．追加的な表
【０８７７】
【表５０】
2021519582.tif 000054
【０８７８】
【表５１】
2021519582.tif 000055
【０８７９】
【表５２】
2021519582.tif 000056
【０８８０】
【表５３】
2021519582.tif 000057
【０８８１】
【表５４】
2021519582.tif 000058
【０８８２】
【表５５】
2021519582.tif 000059
【０８８３】
【表５６】
2021519582.tif 000060
【０８８４】
【表５７】
2021519582.tif 000061
【０８８５】
【表５８】
2021519582.tif 000062
【０８８６】
【表５９】
2021519582.tif 000063
【０８８７】
【表６０】
2021519582.tif 000064
【０８８８】
【表６１】
2021519582.tif 000065
【０８８９】
実施例２０：転移性黒色腫の患者に投与される新規凍結保存腫瘍浸潤リンパ球（ＬＮ−１４４）
[00871]  転移性黒色腫患者に投与された新規凍結保存腫瘍浸潤リンパ球（ＬＮ−１４４）は、多施設第２相臨床試験で有効性と忍容性を実証する。
【０８９０】
序論：
[00872]  非凍結保存腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を用いた養子細胞療法（ＡＣＴ）の安全性及び有効性は、何百人もの転移性黒色腫患者で研究された。この多施設臨床試験は、非凍結保存及び凍結保存の注入産物として、集中的に製造されたＴＩＬ（ＬＮ−１４４）で開始された。非凍結保存ＬＮ−１４４の新規製造プロセスはコホート１で使用され、短縮された３週間の凍結保存ＬＮ−１４４はコホート２で使用される。コホート２の製造は、患者のスケジューリングと投与の柔軟性を可能にする凍結保存ＴＩＬ産物と相まって、有意的に短いプロセスを提供する。製造プロセスの短縮により、患者がＴＩＬ産物を受け取るまでの待ち時間が短縮され、凍結保存により、物流及び臨床現場への配送が便利になる。
【０８９１】
方法：
[00873]  Ｃ−１４４−０１は、ＬＮ−１４４を投与された転移性黒色腫患者を評価する前向き多施設共同研究である。Ｃｙ／Ｆｌｕプレコンディショニングレジメンによる骨髄非破壊的リンパ球除去後、患者は１回のＬＮ−１４４注入を受け、その後、６回までＩＬ−２（６００，０００ＩＵ／ｋｇ）の投与を受ける。患者は、最大２４か月の主要エンドポイントとして客観的な応答について判定される。
【０８９２】
結果：
[00874]  コホート１で使用したのと同じプレ及びポストＴＩＬ注入処置レジメンに従って、患者の第２のコホート、コホート２（Ｎ＝１０）に投与された凍結保存ＬＮ−１４４を特徴付ける。
【０８９３】
[00875]  コホート２の患者は、全ての患者が抗ＣＴＬＡ−４及び抗ＰＤ−１療法を受けており、腫瘍の負担がより大きく（コホート２、１の平均ＳＯＤ：１５．３、１０．９ｃｍ）、以前の株数を増やして重度に前処置された。以前の全身療法の中央値は、コホート２、１でそれぞれ４、３である。安全性データの初期分析は、凍結保存ＬＮ−１４４と同等の忍容性を実証する。凍結保存されていないＬＮ−１４４を投与されたコホート１の患者の安全性プロファイルは、この後期患者集団に対して引き続き許容可能である。頻度によって両方のコホートで観察される最も一般的なＴＥＡＥは、悪心、貧血、発熱性好中球減少症、好中球数の減少、血小板数の減少である。有効性データの早期評価は、コホート２で処置された患者で観察されたＴＩＬ療法に対するＰＲを含む抗腫瘍活性を示す。
【０８９４】
結論：
[00876]  これは、有意に短いプロセス（約３週間）で凍結保存された自己由来産物の新規プロセスを評価する、集中的に製造されたＴＩＬを使用した多施設環境での初の臨床試験である。予備的な結果として、凍結保存ＬＮ−１４４が、チェックポイント阻害剤を含む複数の以前の治療に失敗した転移性黒色腫患者の安全で耐容性のある治療選択肢であることが示される。凍結保存ＬＮ−１４４は、患者と介護者により大きい柔軟性を提供し、医学的必要性が高く満たされていない患者に対するより迅速な処置を可能にする。NCT02360579。
【０８９５】
実施例２１：２Ａプロセスで使用する無血清培地の評価
[00877]  この例実施では、２Ａプロセスで現在使用されている標準ＣＭ１、ＣＭ２及びＣＭ４培地の代替としての無血清培地の有効性の評価を示すデータを提供する。この研究では、３つの段階の代替として利用可能な無血清培地（ＳＦＭ）及び無血清代替品の有効性を試験した。
【０８９６】
[00878]  段階−１：標準対CTS Optimizer又はPrime T CDM又はXvivo-20無血清培地と、血清代替物又は血小板溶解物の有無を使用して、ＴＩＬ拡大培養（ｎ＝３）の有効性を比較した。
【０８９７】
[00879]  段階−２：G-Rex 5M（ｎ＝３）を使用して、ミニスケール２Ａプロセスで無血清培地条件の候補を試験した。
【０８９８】
背景情報
[00880]  プレ及びポストＲＥＰ培養で使用されている現在の培地の組み合わせは効果的であることが証明されているが、AIM-VではＲＥＰ障害が発生する可能性がある。効果的な無血清代替物が特定された場合、使用する培地の種類の数を３から１に減らすことで、ＣＭＯで実施するプロセスをより容易且つ単純にすることができる。更に、ＳＦＭは、ヒト血清の使用を排除することにより、外因性疾患の可能性を減らす。この実施例は、２Ａプロセスでの無血清培地の使用を裏付けるデータを提供する。
【０８９９】
略称
μｌ    マイクロリットル
ＣＭ１，２，４    完全培地１，２，４
CTS OpTimizer SFM    細胞治療システムOpTimizer無血清培地
ｇ    グラム
Ｈｒ    時間
ＩＦＵ    使用説明書
ＩＬ−２    インターロイキン−２サイトカイン
Ｍｉｎ    分
ｍＬ    ミリリットル
℃    摂氏
ＰｒｅＲＥＰ    プレ迅速拡大培養プロトコル
ＲＥＰ    迅速拡大培養プロトコル
ＲＴ    室温
ＳＲ    血清補充
ＴＩＬ    腫瘍浸潤リンパ球
【０９００】
実験設計
[00881]  プレＲＥＰ及びＲＥＰは、LAB-008で述べたとおり開始された。この３つの段階の実験概要を図１５０に示す。
【０９０１】
[00882]  図１５０で提供されているとおり、このプロジェクトは、２つのステップで無血清培地及び添加物を試験するため詳細に実施された。
【０９０２】
[00883]  ステップ１：無血清培地提供者の選択。プレＲＥＰ及びポストＲＥＰは、G-Rex２４ウェルプレートで２Ａプロセスを模倣するよう設定された。プレＲＥＰは、G-Rex２４ウェルプレートの各断片／ウェルを条件ごとに３回又は４回培養することにより開始された。ＲＥＰは、１１日目にG-Rex２４ウェルの４×１０ｅ５ＴＩＬ／ウェルを培養して開始し、１６日目に分割し、２２日目に回収した。CTS OpTimizer、X-Vivo 20及びPrime T-CDMは、プレＲＥＰ及びＲＥＰで使用できる無血清培地の代替候補として使用された。CTS Immune SR血清代替品（Life Technologies）又は血小板溶解物血清（ＳＤＢＢ）をＳＦＭに３％加えた。各条件は、プレＲＥＰ及びポストＲＥＰの両方で少なくとも３つの腫瘍で試験し、２Ａプロセスを模倣するように計画された。
【０９０３】
[00884]  ステップ２：特定された候補者を、プロトコル（ＴＰ−１７−００７）毎にミニスケール２Ａプロセスで更に試験した。簡潔に言えば、プレＲＥＰは、条件ごとに２断片／G-Rex 5Mフラスコを３回培養することによって開始された。ＲＥＰは、１１日目に２×１０ｅ６／G-Rex 5Mフラスコを使用して開始され、１６日目に分割され、２２日目に回収された。
【０９０４】
[00885]  注記：いくつかの腫瘍は処理され、１実験で複数のパラメータを測定するためにセットアップされた。
【０９０５】
観察
[00886]  無血清培地を２Ａプロセスで使用される標準と比較した場合、同等又は統計的に優れた細胞成長の結果が観察された。
【０９０６】
[00887]  ２Ａプロセスで使用される標準培地で成長したＴＩＬと比較した場合、無血清培地で成長したＴＩＬから同様の表現型、ＩＦＮ−ｙ産生及び代謝物分析が観察された。
【０９０７】
結果
プレ及びポストＲＥＰ  ＴＩＬ拡大培養の無血清培地の有効性を試験する。
【０９０８】
[00888]  CTS Optimizer + SR（血清交換）は、増強したプレＲＥＰ  ＴＩＬ拡大培養と同等のＲＥＰ  ＴＩＬ拡大培養を示した。CTS OpTimizer、X-Vivo 20及びPrime T-CDMは、３％ＣＴＳ免疫ＣＴＳ  ＳＲの有無にかかわらず追加され、標準条件に対して試験された。Ｍ１０７９及びＬ４０２６では、CTS OpTimizer + CSR条件は、標準条件（ＣＭ１、ＣＭ２、ＣＭ４）と比較した場合、プレＲＥＰ  ＴＩＬの有意な増強（ｐ＜０．０５）を示した（図６２Ａ）。一方、ＣＳＲを使用しないCTS OptimizerはプレＲＥＰ  ＴＩＬの拡大培養に役立たなかった（付録−１，２、３）。CTS Optimizer + CSRは、試験された３つの腫瘍の２つでポストＲＥＰに匹敵するＴＩＬ拡大培養を示した（図２Ｂ）。X-Vivo 20及びPrime T-CDM条件では、プレ及びポストＲＥＰで大きいばらつきが発生したが、CTS Optimizerは４組間で比較的一貫性があった。更に、血小板溶解物を加えたＳＦＭは、標準と比較した場合、プレＲＥＰ及びポストＲＥＰ  ＴＩＬの拡大培養を促進しなかった（図６２Ａ）。この調査結果は、当社の標準に匹敵する成長を提供するために血清置換が確かに必要であることを示唆しており、CTS optimizer +CSRが候補となり得る。
【０９０９】
[00889]  G-Rex 5Mミニスケールで候補条件を試験する（図６４を参照のこと）。
【０９１０】
[00890]  ポストＲＥＰ  ＴＩＬの表現型分析。以下の図６６及び表５６を参照のこと。
【０９１１】
【表６２】
2021519582.tif 000066
【０９１２】
[00891]  インターフェロンガンマの比較可能性
[00892]  インターフェロンガンマＥＬＩＳＡ（Quantikine）。ＩＦＮ−ｙの産生は、R&D SystemsのQuantikine ELISA kitを使用して測定した。ＣＴＳ＋ＳＲは、標準条件と比較した場合、同量のＩＦＮーｙを産生した。図６７を参照のこと。
【０９１３】
実施例２２：Ｔ細胞成長因子カクテルＩＬ−２／ＩＬ−１５／ＩＬ−２１は、腫瘍浸潤Ｔ細胞の拡大培養とエフェクター機能を増強する
[00893]  自己腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を用いた養子Ｔ細胞療法は、転移性黒色腫及び子宮頸癌の患者で臨床的有効性を実証している。いくつかの研究では、より良い臨床結果では、注入された細胞の総数及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞の割合と正の相関を示している。現在のほとんどの生産計画では、ＴＩＬの成長を促進するためにＩＬ−２のみを使用している。ＩＬ−１５及びＩＬ−２１を含むレジメンを使用すると、リンパ球の成長が促進されることが報告されている。この研究では、最近診療所で実施された第２のジェネレーションＩＬ−２  ＴＩＬプロトコルにＩＬ−１５及びＩＬ−２１を加えることの前向きな効果について説明する。
【０９１４】
材料及び方法
[00894]  ＴＩＬを生成するプロセスには、１〜３ｍｍ３サイズの腫瘍断片を、ＩＬ−２を含む培地に配置する、プレ迅速拡大培養プロトコル（プレＲＥＰ）が含まれる。プレＲＥＰ間に、ＴＩＬは腫瘍断片から移り、ＩＬ−２刺激に応じて拡大培養する。
【０９１５】
[00895]  ＴＩＬの成長を更に促進するために、ＴＩＬは、照射ＰＢＭＣフィーダー、ＩＬ−２及び抗ＣＤ３を含む迅速拡大培養プロトコル（ＲＥＰ）と呼ばれる二次培養期間を通して拡大培養される。この研究では、最終的なＴＩＬ産物の表現型と機能の属性を維持しながらＴＩＬを拡大培養するために、短縮プレＲＥＰ及びＲＥＰ拡大培養プロトコルが開発された。
【０９１６】
[00896]  この短縮ＴＩＬ産生プロトコルを使用し、ＩＬ−２単独とＩＬ−２／ＩＬ−１５／ＩＬ−２１の組み合わせの影響を評価した。これらの２つの培養レジメンは、結腸直腸癌、黒色腫、子宮頸癌、トリプルネガティブ乳癌、肺癌及び腎癌から成長したＴＩＬの産生について比較された。プレＲＥＰの完了時に、培養ＴＩＬの拡大率、表現型、機能（ＣＤ１０７ａ＋及びＩＦＮγ）及びＴＣＲ  Ｖβレパートリーを評価した。
【０９１７】
[00897]  プレＲＥＰ培養は、標準ＩＬ−２（６００ＩＵ／ｍＬ）プロトコルを使用して又はＩＬ−２に加えてＩＬ−１５（１８０ＩＵ／ｍＬ）及びＩＬ−２１（ＩＵ／ｍＬ）で開始した。プレＲＥＰの完了時に細胞の拡大を評価した。全体の成長が少なくとも２０％向上した場合、培養はＩＬ−２に比べて拡大が増加していると分類された。黒色腫及び肺癌の表現型及び機能についての研究をここに示す。以下の表５７を参照のこと。
【０９１８】
【表６３】
2021519582.tif 000067
【０９１９】
[00898]  これらのデータは、肺癌の表現型及び機能の違いに加え、ＩＬ−２単独と比較してＴＩＬをＩＬ−２／ＩＬ−１５／ＩＬ−２１とともに培養した場合のＴＩＬ産物収量の増加を実証する。
【０９２０】
[00899]  ＴＩＬの拡大に対するトリプルカクテルの効果は適応症に特異的であり、ほとんどの低収量腫瘍に利益をもたらした。
【０９２１】
[00900]  ＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞比は、ＮＳＣＬＣ  ＴＩＬ産物での処理により増加した。
【０９２２】
[00901]  Ｔ細胞活性は、黒色腫及びＮＳＣＬＣの両方でのＣＤ１０７ａ発現レベルによって評価されるように、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１をＩＬ−２に加えることにより増強されるようであった。
【０９２３】
[00902]  ここで提供されるデータは、本願明細書や他の実施例で説明している２Ａプロセスなど、より短く、より堅牢なプロセスを使用したＴＩＬ拡大培養を、ＩＬ−２／ＩＬ−１５／ＩＬ−２１サイトカインカクテルの包含に適応できることを示しており、これにより、特に特定の適応症においてＴＩＬ拡大培養を更に促進する手段を提供する。
【０９２４】
[00903]  進行中の実験は、ＴＩＬ機能に対するＩＬ−２／ＩＬ−１５／ＩＬ−２１の効果を更に評価している。
【０９２５】
[00904]  追加的な実験では、ＲＥＰ（第１の拡大培養）中のトリプルカクテルの効果を判定する。
【０９２６】
[00905]  これらの観察結果は、主流の抗癌療法に必要な幅広い適用性及び可用性を備えたＴＩＬの大規模な製造に必要なＴＩＬ培養レジメンの最適化及び標準化に特に関連する。
【０９２７】
実施例２３：短縮方法で生成された凍結保存ＴＩＬ
背景
[00906]  この実施例では、ＬＮ−１４４の凍結保存腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）産物に関連するデータを提供し、これは、高生産性の商業生産に適した簡略化された方法で産生され、養子細胞移植（ＡＣＴ）に適した品質属性を示す。
【０９２８】
[00907]  臨床ＴＩＬ産物を産生する既存の方法は、作業者の介入に対して開放的であり、それに続く治療産物を産生するためのインキュベーション期間が長くなる。ジェネレーション１プロセスには約６週間かかり、新鮮産物が得られる。その可能性から恩恵を受ける可能性のある全ての患者にＴＩＬ療法をもたらすため、遠方の臨床現場に出荷可能な凍結保存製剤産物を使用した集中型製造に適した、２２日間の短縮培養法、ジェネレーション２が開発された。ジェネレーション２は、商業規模での高生産性製造に適した柔軟性があり、堅牢で、閉鎖的、且つ半自動化された細胞生産プロセスを表す。この方法で産生された製剤産物は、ジェネレーション１プロセスで産生されたものと同等の品質属性を有する。
【０９２９】
研究の目的：
[00908]  ジェネレーション１（プロセス１Ｃの実施形態）及びジェネレーション２（プロセス２Ａの実施形態）プロセスによって産生された製剤産物をアッセイし、以下の品質属性に関する比較可能性を判断した。
投与量及び拡大倍数。
Ｔ細胞の純度及びＴ細胞サブセットの割合。
Ｔ細胞サブセット上の共刺激分子の表現型発現。
テロメア反復の平均相対長。
ＴＣＲの再活性化に応答してサイトカインを分泌する能力。
Ｔ細胞受容体の多様性。
【０９３０】
ＴＩＬ治療プロセスの概要：
[00909]  抽出：患者のＴＩＬは抑制性腫瘍微小環境から除去される（病変の外科的切除を介して）
【０９３１】
[00910]  拡大培養：ＴＩＬを、ＩＬ−２を含む培養で指数関数的に拡大し、１０９〜１０１１個のＴＩＬを生成した後、患者に注入する
【０９３２】
[00911]  調製：患者は、潜在的に抑制性腫瘍微小環境を排除し、ＴＩＬ療法の生着と効力を最大化するため、ＮＭＡ−Ｄ（骨髄非破壊的リンパ球枯渇、シクロホスファミド：６０ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ×２用量及びフルダラビン：２５ｍｇ／ｍ２×５用量）を投与される
【０９３３】
[00912]  注入：ＴＩＬの活性化、成長及び抗腫瘍細胞溶解活性を促進するため、患者に拡大ＴＩＬ（ＬＮ−１４４）及び高用量のＩＬ−２を短時間（６００，０００Ｉｕ／ｋｇ、最大６回）注入する
【０９３４】
【表６４】
2021519582.tif 000068
【０９３５】
分析方法及び計装：
[00913]  用量及び生存率：最終製剤産物をサンプリングし、NC-200自動細胞カウンターを使用して、アクリジンオレンジ／ＤＡＰＩ対比染色によって判定された全有核細胞、総生細胞及び生存率についてアッセイした。
【０９３６】
[00914]  フローサイトメトリー：製剤済製剤産物をサンプリングし、ＦＡＣＳによって同一性をアッセイした。Ｔ細胞の割合は、生細胞のＣＤ４５、ＣＤ３二重陽性集団として判定された。各プロセスの凍結サテライト又はセンチネルバイアルを解凍し、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８などの拡大表現型マーカーについてアッセイした。
【０９３７】
[00915]  テロメア反復の平均相対長：フローＦＩＳＨテクノロジーを使用して、テロメアの反復の平均長を測定した。このアッセイは、DAKO（登録商標）Telomere PNA Kit/FITC for Flow Cytometryプロトコルの説明に従って完了した。簡潔に言えば、２×１０６個のＴＩＬ細胞を２×１０６個の１３０１白血病細胞と組み合わせた。ＤＮＡを８２℃で１０分間変性させ、PNA-FITCプローブを暗所で、室温で一晩ハイブリダイズさせた。ヨウ化プロピジウムを使用して、Ｇ０／１期の細胞を特定した。
【０９３８】
[00916]  免疫学的検査：再活性化時にサイトカインを分泌する製剤産物の能力を、ｍＡｂコーティングビーズ（Life Technologies、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ１３７）との共培養後に測定した。２４時間後、培養上清を回収し、凍結、解凍し、製造者の指示に従ってQuantikine IFNγ  ELISAキット（R&D systems）を使用してＥＬＩＳＡでアッセイした。
【０９３９】
[00917]  Ｔ細胞受容体の多様性：最終製剤産物からのＲＮＡを分離し、ＶＤＪ特異的プライマーを用いた多重ＰＣＲに供した。ＴＩＬ産物内で発現したＣＤＲ３配列を半定量的に増幅し、ユニークなＴＩＬクローンの頻度及び有病率を判定した。Illumina MiSeqベンチトップシーケンサーで配列決定を実施した。値には、産物内のＴ細胞受容体の相対的な多様性を表すスコアを得るため、インデックスを付した。
【０９４０】
結果及び結論：
[00918]  結果を図７５〜８１に示す。
【０９４１】
[00919]  ジェネレーション２プロセスは、ジェネレーション１と同等の品質属性を持つＴＩＬ産物を産生する。
【０９４２】
[00920]  ジェネレーション２は、Ｇｅｎ１と比較して同程度のレベルの共刺激分子を発現するＴ細胞サブセットの同じ割合で構成される、同量の高純度のＴＩＬ産物を産生する。
【０９４３】
[00921]  ジェネレーション２のＴＩＬは、ＴＣＲ受容体の多様性の上昇を示し、関与した場合、サイトカインの強力な分泌を開始する。
【０９４４】
[00922]  凍結保存された製剤産物は、重要な物流効率をもたらし、流通の柔軟性を可能にする。
【０９４５】
[00923]  従来のプロセスとは異なり、ジェネレーション２の短縮された２２日間拡大培養プラットフォームは、治療が緊急に必要な患者の臨床規模の線量を迅速に生成できる、スケーラブル且つ物流上実施可能なＴＩＬ製造プラットフォームを提供する。
【０９４６】
[00924]  ジェネレーション２のＴＩＬ製造プロトコルは、これまでＴＩＬ療法の幅広い適用を妨げてきた多くの障壁に対処する。
【０９４７】
実施例２４：同種異系フィーダー細胞の範囲を評価する：ＴＩＬ比率１００：１から２５：１まで
[00925]  この研究では、プロセス１Ｃで現在利用されているＴＩＬに対する１００：１の同種異系フィーダー細胞のコントロールに対して、２５：１及び５０：１でＴＩＬの成長を試験した。
【０９４８】
[00926]  国立癌研究所の外科部門が発表した研究では、ＲＥＰ（１）の開始時に１ｃｍ２あたり５×１０６個の同種異系フィーダー細胞でG-Rex 100フラスコのＴＩＬの最適な活性化の閾値が示された。これは数学的モデリングを通じて検証されており、同モデルで、単位面積あたりの細胞：細胞接触に最適化されたフィーダー層を使用すると、ＴＩＬの活性化及び拡大への影響は最小限で、ＴＩＬに対する同種異系フィーダー細胞の割合は２５：１に減少することが予測された。
【０９４９】
[00927]  この研究では、ＲＥＰ開始時に単位面積あたりのフィーダー細胞の最適密度を確立し、１臨床ロットあたりの使用フィーダー細胞の量を減らして正規化するために必要なＲＥＰ開始時の同種異系フィーダー比の有効範囲を検証した。本研究では、固定数のフィーダー細胞で最大２００×１０６個未満の共培養されたＴＩＬを伴うＲＥＰ培養の開始も実証された。
【０９５０】
[00928]  Ａ．Ｔ細胞の容積（直径１０μｍ）：Ｖ＝（４／３）πｒ３＝５２３．６μｍ３
[00929]  Ｂ．高さ４０μｍ（４細胞）のG-Rex 100（Ｍ）の円柱フラスコ：Ｖ＝（４／３）πｒ３＝４×１０１２μｍ３
[00930]  Ｃ．円柱フラスコＢを満たすために必要な細胞数：４×１０１２μｍ３／５２３．６μｍ３＝７．６×１０８μｍ３＊０．６４＝４．８６×１０８
[00931]  Ｄ．４Ｄ空間で最適に活性化できる細胞数：４．８６×１０８／２４＝２０．２５×１０６
[00932]  Ｅ．G-Rex 500に外挿されたフィーダー及びＴＩＬの数：ＴＩＬ：１００×１０６及びフィーダー：２．５×１０９
【０９５１】
[00933]  式１。１００ｃｍ２ベースのシリンダー内でＴＩＬを活性化するための正二十面体ジオメトリを提供するために必要な単核細胞の数の概算。この計算は、ＮＣＩの実験データを厳密に反映したＴ細胞の閾値活性化の約５×１０８の実験結果を導き出す。（１）（Ｃ）乗数（０．６４）は、１９９２年にJaeger及びNagelによって計算された等価球のランダムデータ密度である（２）。（Ｄ）除数２４は、４次元空間の「ニュートン数」（３）で同様のオブジェクトに接触する可能性のある等価球の数である。
参照資料
【０９５２】
[00934]  (1)  Jin, Jianjian, et.al., Simplified Method of the Growth of Human Tumor Infiltrating Lymphocytes (TIL) in Gas-Permeable Flasks to Numbers Needed for Patient Treatment.J Immunother.2012 Apr; 35(3):283-292。
[00935]  (2)  Jaeger HM, Nagel SR.Physics of the granular state.Science.1992 Mar 20;255(5051):1523-31。
[00936]  (3)  O. R.Musin (2003).“The problem of the twenty-five spheres”.Russ.Math.Surv.58 (4):794-795。
【０９５３】
実施例２５：ＴＩＬ産物の主要品質属性の研究
背景
[00937]  自己腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を用いた養子Ｔ細胞療法は、転移性黒色腫及び他の癌患者で臨床的有効性を実証している１〜３。
【０９５４】
[00938]  臨床研究のほとんどの報告が、製品の有効性及び／又は安全性に関連する可能性のある無菌性、同一性、純度及び効力などの品質属性を特定することを目的とした、注入されたＴＩＬ産物の探索的分析を含んでいる。４、５
【０９５５】
[00939]  ここでは、ＴＩＬの商業生産で使用するための将来の品質管理プラットフォームに貢献する可能性があるＴＩＬ産物の３つの主要な製品パラメータの評価を示す。
【０９５６】
ＴＩＬ治療プロセスの概要
[00940]  １．腫瘍が患者から切除され、ＧＭＰ製造施設に運ばれた。
[00941]  ２．到着すると、腫瘍は断片化され、プレ迅速拡大培養プロトコル（ＲＥＰ）のためにＩＬ−２とともにフラスコに入れられる。
[00942]  ３．プレＲＥＰ  ＴＩＬは、照射ＰＢＭＣ、抗ＣＤ３抗体（３０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−２（３０００ＩＵ／ｍＬ）の存在下で、ＲＥＰプロトコルで更に成長された。
[00943]  ４．ＴＩＬ産物製品は、次を含む重要品質属性について評価された：（１）同一性、（２）純度、及び（３）効力。
[00944]  ５．拡大培養ＴＩＬ（ＬＮ−１４４）の注入前に、患者はシクロホスファミド及びフルダラビンからなる骨髄非破壊的リンパ球枯渇療法を受けた。ＴＩＬの注入後、移植されたＴＩＬの成長及び生着のサポートのため、患者は短期間（最大６回用量）の高用量ＩＬ−２（６００，０００ＩＵ／ｋｇ）を受けた。
【０９５７】
研究の目的
[00945]  目標：ＴＩＬ産物の同一性、純度及び効力を完全に特徴付けることにより、（ａ）重要品質属性の定義を導き、（ｂ）ＴＩＬ産物の商業生産で実装される正式なリリース基準の確立をサポートする。
【０９５８】
[00946]  戦略：ＴＩＬ産物の特性評価をサポートするため、以下の分析手法を開発する。特に、以下の方法を実施した：同一性及び純度評価のためのフローサイトメトリーによる表現型分析、純度測定のための残留腫瘍細胞検出アッセイ及び効力評価のためのインターフェロンガンマ遊離アッセイ。
【０９５９】
材料及び方法
同一性及び純度
[00947]  表現型の特徴付け：ＴＩＬ産物は、抗ＣＤ４５、抗ＣＤ３、抗ＣＤ８、抗ＣＤ４、抗ＣＤ４５ＲＡ、抗ＣＣＲ７、抗ＣＤ６２Ｌ、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ１６及び抗ＣＤ５６抗体で染色され、Ｔ及び非Ｔ細胞サブセットの定量化のためフローサイトメトリーにより分析された。
【０９６０】
純度
[00948]  残存腫瘍検出アッセイ：ＴＩＬ産物は、抗ＭＣＳＰ（黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）及び抗ＣＤ４５抗体、Live/Dead fixable Aqua色素で染色され、その後、黒色腫細胞の検出のためにフローサイトメトリーで分析された。混入対照を使用して、腫瘍検出の精度を評価し、データ分析のゲーティング基準を確立した。
【０９６１】
効力
[00949]  ＩＦＮγ遊離アッセイ：ＴＩＬ産物を抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ１３７コーティングビーズで１８〜２４時間再刺激した後、ＥＬＩＳＡアッセイを使用してＩＦＮγ分泌の評価のために上清を回収した。
【０９６２】
結果
[00950]  同一性：黒色腫ＴＩＬ産物の大部分（＞９９％）は、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋細胞で構成されていた
【０９６３】
[00951]  図８６Ａ〜８６Ｃは、１０色フローサイトメトリーアッセイを使用したＴＩＬ産物の表現型の特性評価を示す。（Ａ）Ｔ細胞及び非Ｔ細胞サブセットの割合は、それぞれＣＤ４５＋ＣＤ３＋及びＣＤ４５−（非リンパ球）／ＣＤ４５＋ＣＤ３−（非Ｔ細胞リンパ球）によって定義された。全体として、検定されたＴＩＬ産物の＞９９％がＴ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３＋）で構成されていた。示されているのは、ＴＩＬ産物の平均である（ｎ＝１０）。（Ｂ）ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋（青い白抜きの丸）及びＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋（ピンクの白抜きの丸）を含む２つのＴ細胞サブセットの割合。スチューデントの非対Ｔ検定を使用しても、両方のサブセットの割合に統計的な差は認められなかった（Ｐ＝０．６８）。（Ｃ）非Ｔ細胞集団は、以下を含む４つの異なるサブセットで特徴付けられた。１）非リンパ球（ＣＤ４５−）、２）ＮＫ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３−ＣＤ１６＋／５６＋）、３）Ｂ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ１９＋）、及び４）非ＮＫ／Ｂ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３−ＣＤ１６−ＣＤ５６−ＣＤ１９−）。
【０９６４】
[00952]  同一性：黒色腫ＴＩＬ産物の大部分は、Ｔ細胞の細胞傷害機能に関連するエフェクター又はメモリーＴ細胞の表現型を示した。
【０９６５】
[00953]  図８７Ａ及び８７Ｂは、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋及びＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞集団のＴ細胞サブセットの特徴付けを示す。ナイーブ、セントラルメモリー（ＴＣＭ）、エフェクターメモリー（ＴＥＦ）及びエフェクターメモリーＲＡ＋（ＥＭＲＡ）Ｔ細胞サブセットは、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７を使用して定義された。図８７Ａ及び８７Ｂは、ＣＤ４＋（Ａ）及びＣＤ８＋（Ｂ）の両方の細胞集団における１０の最終ＴＩＬ産物からの代表的なＴ細胞サブセットを示す。エフェクターメモリーＴ細胞サブセット（青い白抜き丸）は、最終ＴＩＬ産物のＣＤ４＋及びＣＤ８＋サブセットの両方で主要な集団（＞９３％）であった。ＴＩＬ産物の７％未満の細胞がセントラルメモリーサブセットであった（ピンクの白抜き丸）。ＥＭＲＡ（灰色の白丸）及びナイーブ（黒の白丸）サブセットは、ＴＩＬ産物でほとんど検出されなかった（＜０．０２％）。ｐ値は、スチューデントの対になっていないＴ検定を使用したＥＭ及びＣＭの差を表す。
【０９６６】
[00954]  純度：ＭＣＳＰは、純度アッセイに適したメラノーマ腫瘍マーカーである。
【０９６７】
[00955]  図８８Ａ及び８８Ｂは、黒色腫腫瘍細胞におけるＭＣＳＰ及びＥｐＣＡＭ発現の検出を示す。黒色腫腫瘍細胞株（ＷＭ３５、５２６及び８８８）、患者由来の黒色腫細胞株は、本明細書に記載された方法に従って生成され（１０２８、１０３２及び１０４１）、結腸直腸腺腫がん細胞株（陰性対照としてＨＴ２９）は、ＭＣＳＰ（黒色腫（コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）及びＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）マーカーにより特徴付けられた。（Ａ）黒色腫腫瘍細胞の平均９０％がＭＣＳＰを発現した。（Ｂ）ＥｐＣＡＭ＋腫瘍細胞株である陽性対照ＨＴ２９と比較して、黒色腫腫瘍細胞株ではＥｐＣＡＭ発現は検出されなかった。
【０９６８】
[00956]  純度：ＴＩＬ産物中の残留腫瘍細胞を検出するためのフローサイトメトリーベースのアッセイの開発。
【０９６９】
[00957]  図８９Ａ及び８９Ｂは、腫瘍検出精度を決定するための混入対照の検出を示す。アッセイは、既知量の腫瘍細胞をＰＢＭＣ懸濁液（ｎ＝１０）に混入させることによって実施された。ＭＣＳＰ＋５２６黒色腫腫瘍細胞を１：１０、１：１００及び１：１，０００の比率で希釈し、その後、ＰＢＭＣと混合し、抗ＭＣＳＰ及び抗ＣＤ４５抗体と生／死染料で染色し、フローサイトメトリーで分析した。（Ａ）約３０００、３００及び３０の細胞がそれぞれ１：１０、１：１００及び１：１０００の希釈で検出された。（Ｂ）各条件で取得された細胞の平均（ＡＶ）及び標準偏差（ＳＤ）を使用して、基準の上限及び下限を定義した。
【０９７０】
[00958]  純度：混入対照を使用した残留腫瘍検出アッセイの適格性
【０９７１】
[00959]  図９０Ａ及び９０Ｂは、混入対照の上限と下限の再現性研究を示す。混入アッセイの再現性を決定するため、３つの独立した実験を３回繰り返し実施した。（Ａ）ＭＣＳＰ＋で検出された腫瘍細胞の数は、一貫して基準の上限から下限の範囲内であった。（Ｂ）線形回帰図は、ＭＣＳＰ＋細胞及び混入希釈（Ｒ２＝０．９９）の相関関係を示しており、黒実線が最適値を実証する。緑色と灰色の破線は、それぞれ標準曲線及び試料（Ｅｘｐ＃１〜３）の９５％の予測限界を表す。
【０９７２】
[00960]  純度：メラノーマ腫瘍細胞の混入物は、最終ＴＩＬ産物のアッセイ検出限界を下回っていた。
【０９７３】
[00961]  図９１Ａ及び９１Ｂは、ＴＩＬ産物中の残存黒色腫腫瘍の検出を示す。ＴＩＬ産物を、開発されたアッセイを使用して残った腫瘍汚染について評価した（ｎ＝１５）。検出可能なＭＣＳＰ＋事象の中央値及び割合は、それぞれ２及び０．０００２％であった。
【０９７４】
[00962]  効力：ＴＩＬによるＩＦＮγの分泌（一貫して＞１０００ｐｇ／ｍｌ）は、ＴＩＬ産物のエフェクター機能を実証した。
【０９７５】
[00963]  図９２は、Ｔ細胞活性化後のＴＩＬ産物の効力評価を示す。ＥＬＩＳＡで重複して評価されたＴＩＬ産物中の抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ１３７による再刺激後のＩＦＮγ分泌（ｎ＝５）。ＴＩＬ産物によるＩＦＮγの分泌は、ウィルコクソンの符号付き順位検定を使用した非刺激対照よりも有意に高く（Ｐ＝０．０２）、一貫して＞１０００ｐｇ／ｍｌであった。２００ｐｇ／ｍｌより大きいＩＦＮγ分泌は効力があると考えられている。ｐ値＜０．０５は統計的に有意と見なされた。
【０９７６】
結論：
[00964]  ＴＩＬ産物の同一性、純度及び効力の主要な製品パラメータが判定された。本明細書に記載の方法に従って製造されたＴＩＬ産物は、９９％を超えるＣＤ４５＋ＣＤ３＋Ｔ細胞で構成されていた。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ＴＩＬ産物の大部分は、Ｔ細胞の細胞傷害機能に関連するエフェクターメモリー表現型を示した。最終的なＴＩＬ産物中の汚染黒色腫腫瘍細胞を検出するフローサイトメトリーに基づいたアッセイの開発と認定に成功した。このアッセイを適用すると、最終ＴＩＬ産物中の汚染黒色腫腫瘍細胞がアッセイ検出の限界を下回ることが示された。抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ１３７再刺激後の最終ＴＩＬ産物によるＩＦＮγ分泌は、市販のＴＩＬの効力アッセイとして働く可能性がある。これらのデータは、ＴＩＬ産物の商業生産のための重要品質属性の更なる開発をサポートする品質管理プラットフォームの基盤を提供する。
【０９７７】
実施例２６：高生産性の商業生産に適した簡略化された方法で産生された凍結保存ＴＩＬ産物は、養子細胞移植に適した品質属性を示す。
背景
[00965]  養子細胞移植（ＡＣＴ）のために腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を産生する旧知の方法には、新鮮（凍結保存されていない）注入産物を得るための複数のインビボインキュベーションステップが含まれる。
【０９７８】
[00966]  第１の世代（Ｇｅｎ１）プロセスでは、約６週間で新鮮ＴＩＬが投与された。エキソビボでの培養期間を２２日に短縮する第２の世代（Ｇｅｎ２）ＴＩＬ製造プロセスが開発された（図９３）。
【０９７９】
[00967]  Ｇｅｎ２プロセスは、集中型製造に適しており、凍結保存ＴＩＬ注入産物を産生し、臨床現場に対するスケジュール、物流及び配送に便宜性をもたらす。Ｇｅｎ２プロセスによって製造されたＬＮ−１４４の凍結保存ＴＩＬ注入産物は、Ｇｅｎ１方法によって産生されたＴＩＬの凍結保存されていないＴＩＬ注入産物と同等の品質属性を有する。Ｇｅｎ２ＴＩＬ製造方法は、商業規模での高生産性ＴＩＬ製造に適した柔軟性があり、堅牢で、閉鎖的、且つ半自動化された細胞生産プロセスを表す。
【０９８０】
研究の目的
[00968]  Ｇｅｎ１及びＧｅｎ２の製造プロセスで産生されたＴＩＬ注入産物を評価し、以下の品質属性の観点から比較可能性を判断した。（１）細胞数（用量）、生存率、ＲＥＰ期の成長率、（２）Ｔ細胞サブセット上の共刺激分子のＴ細胞純度及び表現型発現、（３）テロメア反復の平均相対長さ、（４）ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ１３７関与に応答してＩＦＮγを分泌する能力、及び（５）最終注入産物に存在するＴ細胞受容体の多様性（図９４）。
【０９８１】
分析方法及び計装
[00969]  細胞数及び生存率：最終製剤注入産物をサンプリングし、NC-200自動細胞カウンターを使用して、アクリジンオレンジ／ＤＡＰＩ対比染色によって判定された全有核細胞、総生細胞及び生存率についてアッセイした。プロセス開発ロットは、アクリジンオレンジ／ヨウ化プロピジウムデュアル蛍光染色を使用して、Nexcellom Cellometer K2セルバイアビリティーカウンターでアッセイした。
【０９８２】
[00970]  表現型マーカー：製剤された注入産物をサンプリングし、免疫蛍光染色により同一性をアッセイした。Ｔ細胞の割合は、生細胞のＣＤ４５＋、ＣＤ３＋（二重陽性）集団として判定された。各プロセスの凍結サテライト又はセンチネルバイアルを解凍し、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８などの拡大表現型マーカーについてアッセイした。BD FACS Canto IIで新鮮な注入産物を取得し、Bio-Rad ZE5セルアナライザーで解凍した注入産物の拡大表現型マーカーを取得した。
【０９８３】
[00971]  テロメア反復の平均相対長：フローＦＩＳＨテクノロジーを使用して、テロメアの反復の平均長を測定した。このアッセイは、DAKO（登録商標）Telomere PNA Kit/FITC for Flow Cytometryプロトコルの説明に従って完了した。簡潔に言えば、２．０×１０６個のＴＩＬ細胞を２．０×１０６個のヒト細胞株（１３０１）白血病Ｔ細胞と組み合わせた。ＤＮＡを８２℃で１０分間変性させ、PNA-FITCプローブを暗所で、室温で一晩ハイブリダイズさせた。ヨウ化プロピジウムを使用して、Ｇ０／１期の細胞を特定した。
【０９８４】
[00972]  免疫機能：再活性化時にＩＦＮγを分泌する注入産物の能力を、抗体コーティングビーズ（Life Technologies、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ１３７）との共培養後に測定した。２４時間後、培養上清を回収し、凍結、解凍し、製造者の指示に従ってQuantikine IFNγ  ELISAキット（R&D systems）を使用してＥＬＩＳＡでアッセイした。
【０９８５】
[00973]  Ｔ細胞受容体の多様性：注入産物からのＲＮＡを分離し、ＶＤＪ特異的プライマーを用いた多重ＰＣＲに供した。ＴＩＬ産物内で発現したＣＤＲ３配列を半定量的に増幅しディープシーケンスして、ユニークなＴＩＬクローンの頻度及び有病率を判定した。Illumina MiSeqベンチトップシーケンサーで配列決定を実施した。値には、産物内のＴ細胞受容体の相対的な多様性を表すスコアを得るため、インデックスを付した。
【０９８６】
結果
[00974]  ２２日目に、洗浄及び製剤化前に培養細胞の性能を決定するため、容積が減少した細胞産物をプールしてサンプリングした。図９５Ａ〜９５Ｃは、総生細胞、成長率及び生存率を示す。（Ａ）試料は、前述のようにNC-200自動セルカウンターで分析された。総生細胞密度は、４つの独立した試料からの重複カウントの総平均によって決定される。Ｇｅｎ２プロセスでは、Ｇｅｎ１（Ｇｅｎ１の平均＝４．１０×１０１０±２．８×１０１０、Ｇｅｎ２の平均＝４．１２×１０１０±２．５×１０１０）と同様の用量のＴＩＬ産物が産生された。（Ｂ）ＲＥＰ段階の成長率が計算された。（Ｃ）前述のように、Cellometer K2を使用して、９つのプロセス開発ロットから細胞生存率を評価した。製剤化された産物の単一の凍結融解サイクル後、細胞生存率の有意な減少は観察されなかった。解凍及びサンプリング時の生存率の平均低下は２．１９％であった。
【０９８７】
[00975]  図９６Ａ〜９６Ｃは、Ｇｅｎ２産物は、Ｇｅｎ１と同等のレベルで共刺激分子を発現する高純度のＴ細胞培養物であることを示す。（図９６Ａ）遊離のためのフローサイトメトリーにより、新鮮な調剤済製剤産物を同一性のためにアッセイした。Ｇｅｎ１及びＧｅｎ２プロセスは、ＣＤ４５＋、ＣＤ３＋（二重陽性）表現型で定義される高純度のＴ細胞培養物を産生する。（図９６Ｂ及び９６Ｃ）調剤済製剤産物の凍結保存サテライトのバイアルを解凍し、前述のようにフローサイトメトリーにより拡大培養表現型についてアッセイした。Ｇｅｎ１及びＧｅｎ２産物は、Ｔ細胞サブセット上で同レベルの共刺激分子ＣＤ２７及びＣＤ２８を発現した。ＣＤ２７及びＣＤ２８などの共刺激分子は、Ｔ細胞受容体の関与時にエフェクター細胞の成長に必要な二次及び三次シグナルを供給するために必要でる場合がある。Ｐ値は、Mann-Whitneyの「ｔ」検定を使用して計算された。
【０９８８】
[00976]  図９７は、Ｇｅｎ２産物がより長い相対テロメア長に向かう傾向を示している。フローＦＩＳＨテクノロジーを使用して、前述のようにテロメアの反復の平均長を測定した。ＲＴＬ値は、対照細胞株のＧｅｎ１の１染色体／ゲノムあたりの平均テロメア蛍光が７．５％±２．１％であり、Ｇｅｎ２が１染色体／ゲノムあたりのテロメア蛍光が８．４％±１．８％であることを示す（１３０１白血病細胞株）。データは、Ｇｅｎ２産物が、平均してＧｅｎ１産物と同等のテロメア長を有していることを示す。テロメア長は、エキソビボ細胞培養物の長さの代替測定値である。
【０９８９】
[00977]  図９８は、Ｇｅｎ２製剤産物は、ＣＤ３、ＣＤ２８及びＣＤ１３７の関与に応じてＩＦＮγを分泌することを示す。凍結保存製剤産物を解凍し、前述のように抗体コーティングビーズと共にインキュベートした。データは、２４時間で５×１０５個の生存細胞によって産生されるＩＦＮγの量として表される。Ｇｅｎ２製剤産物は、Ｇｅｎ１製剤産物と比較して、再活性化時にＩＦＮγを産生する能力の増加を示した。製剤産物が再活性化され、サイトカインを分泌する能力は、ＨＬＡのコンテキストで同種抗原にＴＣＲが結合した際のインビボ機能の代替手段である。
【０９９０】
[00978]  図９９Ａ及び９９Ｂは、Ｇｅｎ２製剤産物のユニークＴ細胞受容体の多様性が増加していることを示す。Ｔ細胞受容体の多様性は以下のように評価された。Ｇｅｎ１及びＧｅｎ２からの１０×１０６個のＴＩＬからのＲＮＡをアッセイして、各製品に存在するユニークＣＤＲ３配列の総数と頻度を決定した。（図９９Ａ）固有のＣＤＲ３配列には、産物内のＴ細胞受容体の全体的な多様性を表すスコアを得るため、各産物における頻度に対してインデックスを付した。（図９９Ｂ）各注入製品に存在するユニークなＣＤＲ３配列の平均総数。両方のプロセスのＴＩＬ産物は、異なる抗原特異性と結合活性を持つＴ細胞のポリクローナル集団で構成されていた。総Ｔ細胞レパートリーの幅は、腫瘍細胞上に現れる作用可能なエピトープの数の指標である場合がある。
【０９９１】
結論
[00979]  Ｇｅｎ２の製造プロセスでは、Ｇｅｎ１と同等の品質特性を持つＴＩＬ注入産物（ＬＮ−１４４）が産生された。Ｇｅｎ２は、同様の用量の高純度ＴＩＬを産生した。Ｔ細胞サブセットは同様の割合であり、Ｇｅｎ１と比較して同程度のレベルで共刺激分子を発現した。Ｇｅｎ２ＴＩＬは、エキソビボでの培養期間の短縮に対応し、相対テロメア長が長くなる傾向があった。Ｇｅｎ２ＴＩＬは、ＴＣＲ受容体の多様性の増加を示し、関与すると、細胞溶解性エフェクター機能の尺度であるＩＦＮ−γの強力な分泌を開始した。すなわち、Ｇｅｎ２の、凍結保存注入産物を伴う短縮された２２日間閉鎖拡大培養プロセスは、新規の療法選択肢が直ちに必要な癌患者の臨床規模の線量を迅速に生成できる、スケーラブル且つ物流上実施可能なＴＩＬ製造プラットフォームを提供する。
【０９９２】
参照資料
[00980]  1Dudley,M.E.et al.Adoptive cell transfer therapy following non-myeloablative but lymphodepleting chemotherapy for the treatment of patients with refractory metastatic melanoma.J Clin Oncol 23,2346-2357,doi:10.1200/JCO.2005.00.240(2005).
[00981]  2Chandran,S.S.et al.Treatment of metastatic uveal melanoma with adoptive transfer of tumour-infiltrating lymphocytes:a single-centre,two-stage,single-arm,phase 2 study.Lancet Oncol,doi:10.1016/S1470-2045(17)30251-6(2017).
[00982]  3Stevanovic,S.et al.Complete regression of metastatic cervical cancer after treatment with human papillomavirus-targeted tumor-infiltrating T cells.J Clin Oncol 33,doi:10.1200/jco.2014.58.9093(2015).
[00983]  4FDA Reviewers and Sponsors:Content and Review of Chemistry,Manufacturing,and Control(CMC)Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs),21 CFR 610.3(r),2008.
[00984]  5Richards JO,Treisman J,Garlie N,Hanson JP,Oaks MK.Flow cytometry assessment of residual melanoma cells in tumor-infiltrating lymphocyte cultures.Cytometry A 2012;81:374-81.
【０９９３】
実施例２７：Ｔ細胞成長因子カクテルＩＬ−２／ＩＬ−１５／ＩＬ−２１は、本明細書に記載された新規のプロセスで腫瘍浸潤Ｔ細胞の拡大培養及びエフェクター機能を増強した
背景
[00985]  自己ＴＩＬを用いた養子Ｔ細胞療法は、転移性黒色腫及び子宮頸癌の患者で臨床的有効性を実証している。いくつかの研究では、より良い臨床結果では、注入された細胞の総数及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞の割合と正の相関を示している。現在のほとんどの生産計画では、ＴＩＬの成長を促進するためにＩＬ−２のみを使用している。ＩＬ−１５及びＩＬ−２１を含むレジメンを使用すると、リンパ球の成長が促進されることが報告されている。この研究では、プロセス２Ａ及びジェネレーション２のＴＩＬ製造プロセスの実施形態にＩＬ−１５及びＩＬ−２１を追加することのプラスの効果と相乗効果について説明する。
【０９９４】
本明細書に記載の新規プロセスを使用したＴＩＬの産生
[00986]  腫瘍が患者から切除され、研究目的でＧＭＰ製造施設又は研究室に運ばれる。到着すると、腫瘍は断片化され、プレ迅速拡大培養プロトコル（プレＲＥＰ）のためにＩＬ−２とともにフラスコに１１日間入れられた。トリプルカクテル研究では、プレＲＥＰの開始時にＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１（ＩＬ−２／ＩＬ−１５／ＩＬ−２１）が追加される。迅速拡大培養プロトコル（ＲＥＰ）の場合、ＴＩＬは更に１１日間のＲＥＰ拡大培養のためにフィーダー及び抗ＣＤ３で培養された（図１００）。
【０９９５】
材料及び方法
[00987]  ＴＩＬを生成するプロセスには、１〜３ｍｍ３サイズの腫瘍断片を、ＩＬ−２を含む培地に配置する、プレ迅速拡大培養プロトコル（プレＲＥＰ）が含まれた。プレＲＥＰ間に、ＴＩＬは腫瘍断片から移り、ＩＬ−２刺激に応じて拡大培養した。
【０９９６】
[00988]  ＴＩＬの成長を更に促進するために、ＴＩＬは、照射ＰＢＭＣフィーダー、ＩＬ−２及び抗ＣＤ３抗体を含む迅速拡大培養プロトコル（ＲＥＰ）と呼ばれる二次培養期間を通して拡大培養された。最終的なＴＩＬ産物の表現型と機能の属性を維持しながらＴＩＬを拡大培養するために、短縮プレＲＥＰ及びＲＥＰ拡大培養プロトコルが開発された。この短縮ＴＩＬ生成プロトコルを使用し、プレＲＥＰステップに加えられるＩＬ−２単独とＩＬ−２／ＩＬ−１５／ＩＬ−２１の組み合わせの影響を評価した。これらの２つの培養レジメンは、結腸直腸癌、黒色腫、子宮頸癌、トリプルネガティブ乳癌、肺癌及び腎癌から成長したＴＩＬの生成について比較された。プレＲＥＰの完了時に、培養ＴＩＬの拡大率、表現型、機能（ＣＤ１０７ａ＋及びＩＦＮγ）及びＴＣＲ  Ｖβレパートリーを評価した。
【０９９７】
[00989]  本研究は、複数の腫瘍組織におけるＩＬ−２／ＩＬ−１５／ＩＬ−２１によるプレＲＥＰ中の拡大培養の亢進を示す。プレＲＥＰ培養は、標準ＩＬ−２（６０００ＩＵ／ｍＬ）プロトコルを使用して又はＩＬ−２に加えてＩＬ−１５（１８０ＩＵ／ｍＬ）及びＩＬ−２１（１ＩＵ／ｍＬ）で開始した（図１０１）。プレＲＥＰの完了時に細胞の拡大を評価した。全体の成長が少なくとも２０％向上した場合、培養はＩＬ−２に比べて拡大が増加していると分類された。黒色腫及び肺癌の表現型及び機能研究については、以下の段落で更に考察する（図１０１の太字）。
【０９９８】
[00990]  ＩＬ−２／ＩＬ−１５／ＩＬ−２１は、肺癌ではＣＤ８＋細胞の割合を増加させたが、黒色腫では増加しなかった。図１０２Ａ及び１０２Ｂにおいて、（Ａ）黒色腫由来のＴＩＬ（ｎ＝４）、及び（Ｂ）肺（ｎ＝７）は、ポストプレＲＥＰのフローサイトメトリーを使用して、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の表現型を評価した。ｐ値は、スチューデントの非対応ｔ検定を使用した条件におけるＩＬ−２及びＩＬ−１２／ＩＬ−１５／ＩＬ−２１の差を表す。
【０９９９】
[00991]  ＣＤ２７の発現は、ＩＬ−２／ＩＬ−１５／ＩＬ−２１で処理した培養物のＣＤ８＋細胞でわずかに亢進した。図１０３Ａ及び１０３Ｂにおいて、（Ａ）黒色腫由来のＴＩＬ（ｎ＝４）、及び（Ｂ）肺（ｎ＝７）は、ポストプレＲＥＰのフローサイトメトリーを使用して、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞のＣＤ２７＋及びＣＤ２８＋の表現型を評価した。養子Ｔ細胞療法の結果と相関しているより若い表現型に関連する細胞マーカーであるＣＤ２７の発現は、ＩＬ−２／ＩＬ−１５／ＩＬ−２１対ＩＬ−２単独の培養に由来するＣＤ８＋ＴＩＬでわずかに増強された。
【１０００】
[00992]  Ｔ細胞サブセットは、ＩＬ−１５／ＩＬ−２１の添加では変化しなかった。図１０４Ａ及び１０４Ｂにおいて、ＴＩＬは、（Ａ）黒色腫（ｎ＝４）からのＣＤ８＋及びＣＤ４＋（データに示さず）のエフェクター／メモリーサブセット（ＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７）及びフローサイトメトリーポストプレＲＥＰを介して（Ｂ）肺（ｎ＝８）の表現型で評価された。ＴＥＭ＝エフェクターメモリー（ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＣＲ７−）、ＴＣＭ＝セントラルメモリー（ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＣＲ７＋）、ＴＳＣＭ＝幹細胞様メモリー（ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＣＲ７＋）、ＴＥＭＲＡ＝エフェクターＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＣＲ７−）。
【１００１】
[00993]  ＴＩＬの機能的能力は、ＩＬ−２／ＩＬ−１５／ＩＬ−２１で差別的に強化された。図１０５Ａ及び１０５Ｂにおいて、（Ａ）黒色腫（ｎ＝４）及び（Ｂ）肺（ｎ＝５）に由来するＴＩＬを、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞における４時間のＰＭＡ刺激に応答したＣＤ１０７ａ＋発現について、フローサイトメトリーにより評価した。（Ｃ）黒色腫及び肺に由来するプレＲＥＰ  ＴＩＬを可溶性抗ＣＤ３抗体で２４時間刺激し、上清をＥＬＩＳＡによりＩＦＮγについて評価した。
【１００２】
[00994]  ＴＣＲｖβレパートリーの相対頻度は、肺癌ではＩＬ−２／ＩＬ−１５／Ｌ−２１に応答して変化したが、黒色腫では変化しなかった。図１０６Ａ及び１０６Ｂにおいて、ＴＣＲｖβレパートリー（２４の特異性）は、フローサイトメトリー用のBeckman Coulterキットを使用して、（Ａ）黒色腫及び（Ｂ）肺腫瘍に由来するＴＩＬで評価された。
【１００３】
概要
[00995]  この研究は、表現型及び機能特性に影響を与えることに加え、ジェネレーション２プロセスでＩＬ−２単独（＞２０％）と比較してＴＩＬ数を高めるＩＬ−２／ＩＬ−１５／ＩＬ−２１カクテルの能力を実証する。
【１００４】
[00996]  ＴＩＬの拡大培養に対するトリプルカクテルの効果は、組織学に依存するものであった。ＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞比は、肺腫瘍にＩＬ−２／ＩＬ−１５／ＩＬ−２１を加えることで増加した。ＩＬ−１５及びＩＬ−２１の添加により、肺腫瘍由来のＴＩＬでのＣＤ１０７ａ発現及びＩＦＮγ産生が増強された。ＩＬ−２／ＩＬ−１５／ＩＬ−２１を追加すると、肺のＴＣＲｖβレパートリーが変化した。ジェネレーション２ＴＩＬ拡大培養プロセスは、ＩＬ−２／ＩＬ−１５／ＩＬ−２１サイトカインカクテルを包含するために使用され、それにより肺及び結腸直腸腫瘍などの特定の腫瘍組織におけるＴＩＬ拡大培養を更に促進する手段を提供した。これらの観察結果は、主流の抗癌療法に必要な幅広い適用性及び可用性を備えたＴＩＬの大規模な製造に必要なＴＩＬ培養レジメンの最適化及び標準化に特に関連する。
【１００５】
実施例２８：転移性黒色腫患者に投与された新規凍結保存腫瘍浸潤リンパ球（ＬＮ−１４４）は、多施設第２相臨床試験で有効性と忍容性を実証した
背景
[00997]  腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を利用した養子細胞療法（ＡＣＴ）の安全性及び有効性は、何百人もの転移性黒色腫患者で研究され、有意且つ永続的な客観的応答率（ＯＲＲ）を実証している。１進行中のフェーズ２試用では、ＴＩＬの集中ＧＭＰ製造を利用するＣ−１４４−０１が、非凍結保存ジェネレーション１（Ｇｅｎ１）及び凍結保存ジェネレーション２（Ｇｅｎ２）ＴＩＬ製造プロセスの両方を評価した。
【１００６】
[00998]  Ｇｅｎ１は、製造期間が約５〜６週間（Ｃ−１４４−０１研究のコホート１で投与）であるのに対し、Ｇｅｎ２は、製造期間が２２日間である（プロセス２Ａ、Ｃ−１４４−０１研究のコホート２で投与）。Ｇｅｎ１のＬＮ−１４４製造製品を注入したコホート１患者からの予備データは、ＴＩＬ療法が応答を生じたため、ポストＰＤ−１の転移性黒色腫患者の処置に有望であった。２Ｇｅｎ２の利点は以下のとおりである。（Ａ）患者にＴＩＬを注入するのを待つ患者及び医師の時間の短縮；（Ｂ）凍結保存により、スケジューリング、販売及び配送の柔軟性が得られる；及び（Ｃ）製造コストの削減。コホート２からの予備データを以下に示す。図１０７は、Ｇｅｎ２凍結保存ＬＮ−１４４製造プロセス（プロセス２Ａ）の実施形態を示す。
【１００７】
研究設計：Ｃ−１４４−０１転移性黒色腫へのフェーズ２試用
[00999]  転移性黒色腫患者の処置のための自己腫瘍浸潤リンパ球（ＬＮ−１４４）の有効性及び安全性を評価するフェーズ２、多施設共同３コホート研究。
【１００８】
[001000]  主要包含基準：（１）測定可能な転移性黒色腫及びＴＩＬ生成のために切除可能な病変が≧１；（２）全身療法の少なくとも１つの前の段階までの進歩；（３）年齢≧１８歳；及び（４）ＥＣＯＧ  ＰＳ０〜１。
【１００９】
[001001]  処置コホート：（１）非凍結保存ＬＮ−１４４産物；（２）凍結保存ＬＮ−１４４産物；（３）応答のない患者又は初期応答後に進行した患者に対するＬＮ−１４４による再処置。図１０８に研究設計を示す。
【１０１０】
[001002]  エンドポイント：（１）初代：ＯＲＲとして定義された有効性、及び（２）二次：安全性及び有効性。
【１０１１】
方法
[001003]  コホート２安全セット：ＴＩＬ生成の目的で切除を受け、試験処置のなんらかの成分を投与された１３人の患者。
【１０１２】
[001004]  コホート２の有効性セット：ＮＭＡ−ＬＤプレコンディショニング、ＬＮ−１４４注入及び少なくとも１回のＩＬ−２投与を受け、少なくとも１回の有効性評価を受けた９人の患者。４人の患者は、データカットの時点で有効性評価を受けていなかった。
【１０１３】
[001005]  データカットの日付までに読み取られた全ての利用可能なデータのバイオマーカーデータが表示されていた。
【１０１４】
結果
[001006]  図１０９は、コホート１（ＡＳＣＯ２０１７）とコホート２の患者特性の比較を示す表を提供する。コホート２には以下のようなものがある：療法前の４つの中央値；全ての患者は、事前に抗ＰＤ−１及び抗ＣＴＬＡ−４を受けていた；及び標的病変の直径の合計（ＳＯＤ）が大きいことと、ベースラインでの平均ＬＤＨが高いことにより、腫瘍量が増加した。図１１０は、処置による有害事象（≧３０％）を示す表である。
【１０１５】
[001007]  コホート２（凍結保存ＬＮ−１４４）の場合、注入産物及びＴＩＬ療法の特性は、（１）注入されたＴＩＬ細胞の平均数：３７×１０９、及び（２）ＩＬ−２投与回数の中央値は４．５であった。図１１１は、患者＃１〜＃８に対する注入産物及びＴＩＬ療法の有効性を示す。
【１０１６】
[001008]  図１１２は、症状が安定した疾病（ＳＤ）又はより良い応答を示す評価可能な患者の応答の臨床状態を示す。患者６の部分奏効（ＰＲ）は、患者が依然として第２の有効性評価に達していないため、確認しなかった。１人の患者（患者９）は、第１の評価前に死亡した（依然として有効性セットで考慮されている）。
【１０１７】
[001009]  有効性セットの９人の患者のうち、１人の患者（患者９）は、図１１２に示さない最初の腫瘍評価前に黒色腫関連で死亡したため評価できなかった（ＮＥ）。応答は、Ｇｅｎ２で処置された患者で見られた。疾病制御率（ＤＣＲ）は７８％であった。応答までの時間はコホート１に類似していた。最良の反応として進行性疾患（ＰＤ）を有する１人の患者（患者３）は、スイムレーンプロットに含まれていなかった。
【１０１８】
[001010]  図１１３は、直径の合計の変化率を示す。患者９は、４２日目の前のメラノーマに関連する死亡によりポストＬＮ−１４４の疾患評価がなかった。−１４日目：スクリーニングからベースラインへの直径の合計の％変化（−１４日目）。−１４日目から１２６日目：ベースラインからのＳＯＤの％変化。−１４日目＝ベースライン。０日目＝ＬＮ−１４４注入。
【１０１９】
[001011]  ＴＩＬ処置を行うと、ＨＭＧＢ１の増加が観察された（図１１４）。HMGB1 ELISA kit（Tecan US, Inc）を使用して、血漿ＨＭＧＢ１レベルを測定した。示されているデータは、コホート１及びコホート２の患者におけるＬＮ−１４４注入前（７日目）及び後（４日目及び１４日目）のＨＭＧＢ１レベルの倍数変化を表す（ｐ値は、対数変換データに基づいた両側対応ｔ検定を使用して計算された）。サンプルサイズ（太字及び斜体）及び平均値（斜体）は、各時点の括弧内に示されている。ＨＭＧＢ１は、活性化された免疫細胞から分泌され、損傷した腫瘍細胞から遊離する。したがって、ＬＮ−１４４での処置後に観察されたＨＭＧＢ１レベルの増加は、抗腫瘍活性の免疫媒介メカニズムを示唆している。
【１０２０】
[001012]  Luminexアッセイを使用して、血漿ＩＰ−１０レベルを測定した。図１１５に示されているデータは、コホート１及びコホート２の患者におけるＬＮ−１４４注入前（−７日目）及び後（４日目及び１４日目）のＩＰ−１０レベルの倍数変化を表す（ｐ値は、対数変換データに基づいた両側対応ｔ検定を使用して計算された）。サンプルサイズ（太字及び斜体）及び平均値（斜体）は、各時点の括弧内に示されている。ＩＰ−１０でのＬＮ−１４４注入後の増加は、ＴＩＬ持続性との可能な相関を理解するために監視されている。
【１０２１】
[001013]  コホート２（ｎ＝１７患者）からの更新データは、図１１６から図１２１に報告されている。コホート１と、６４％のＤＣＲ及び２９％（Ｎ＝１４）の全体的な応答率（ＯＲＲ）を示したＧｅｎ１プロセスの実施形態に対し、コホート２及びＧｅｎ２プロセスの実施形態は、ＤＣＲ８０％及びＯＲＲ４０％（Ｎ＝１０）を示した。
【１０２２】
結論
[001014]  既存データからの予備的結果は、Ｇｅｎ１及びＧｅｎ２のＬＮ−１４４のＴＩＬ産物間で同等の安全性を示す。Ｇｅｎ２プロセス（本明細書に記載する、プロセス２Ａ）で製造されたＴＩＬを投与すると、進行転移性黒色腫患者で見られる臨床反応が驚くほど増加し、療法前の抗ＰＤ−１及び抗ＣＴＬＡ−４について全てが進行した。コホート２のＤＣＲは７８％であった。
【１０２３】
[001015]  予備的なバイオマーカーデータは、ＴＩＬ療法に提案されている細胞溶解作用のメカニズムを裏付けるものである。
【１０２４】
[001016]  本明細書に記載されているＧｅｎ２製造プロセスの実施には２２日を要す。このプロセスは、患者がＴＩＬを受け取るまでに待機する時間を大幅に短縮し、患者に投与するタイミングの柔軟性を提供し、製造コストの削減につながる一方で、商業化及び健康規制機関への登録を可能にする従来のアプローチに勝る他の利点を提供している。Ｇｅｎ２製造プロセスの実施形態を使用した転移性黒色腫の予備的な臨床データは、Ｇｅｎ１プロセスを使用して製造されたＴＩＬに比較して、同様の応答時間及び安全性プロファイルと共に、ＤＣＲ、ＯＲＲ及び他の臨床反応によって測定されるＴＩＬの臨床効果の驚くべき改善を示す。Ｇｅｎ２  ＴＩＬ産物の予想外に改善された効率は、ＩＦＮ−γ産物の５倍以上の増加によっても実証され（図９８）、これは一般的な効力の改善（図１２２）、有意に改善されたポリクローナル性（図９９Ａ及び図９９Ｂ）及びより高い平均ＩＰ−１０及びＭＣＰ−１産物（図１２３〜図１２６）と相関関係がある。驚くべきことに、Ｇｅｎ２はプロセスがはるかに短いにもかかわらず、ＴＩＬ産物の他の多くの重要な特性が、相対テロメア長（図９７）及びＣＤ２７及びＣＤ２８発現（図９６Ｂ及び図９６Ｃ）を含む、より伝統的な製造プロセスを使用して観察されたものと類似している。
【１０２５】
参照資料
[001017]  1Goff,et al.Randomized,Prospective Evaluation Comparing Intensity of Lymphodepletion Before Adoptive Transfer of Tumor-Infiltrating Lymphocytes for Patients With Metastatic Melanoma.J Clin Oncol.2016 Jul 10;34(20):2389-97.
[001018]  2Sarnaik A,Kluger H,Chesney J,et al. Efficacy of single administration of tumor-infiltrating lymphocytes(TIL)in heavily pretreated patients with metastatic melanoma following checkpoint therapy.J Clin Oncol.2017;35[suppl;abstr 3045].
【１０２６】
実施例２９：ＨＮＳＣＣ及び子宮頸癌のフェーズ２研究
[001019]  ＨＮＳＣＣ（頭頸部扁平上皮癌；Ｃ−１４５−０３）フェーズ２研究への登録。１３人の患者が研究に同意し、１０人の患者からＴＩＬが回収され、最終的に７人の患者に注入され、更にもう１人が進行中であった。
【１０２７】
[001020]  子宮頸癌のフェーズ２研究への登録（Ｃ−１４５−０４）。８人の患者が研究に同意し、４人の患者からＴＩＬが回収され、最終的に２人の患者に注入され、更にもう２人が進行中であった。
【１０２８】
[001021]  進行中の研究の初期データを図１２７に示す。症状が安定した疾患（ＳＤ）及び／又は進行性の反応が、８４日までにＴＩＬ療法で処置されたＨＣＮＳＣＣ及び子宮頸癌患者の両方で観察された。
【１０２９】
実施例３０：凍結保存ＴＩＬ細胞療法の生産
[001022]  この実施例では、現行ヒト細胞・組織医薬品の製造・品質管理基準及び現行医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理に関する基準に従ったG-RexフラスコでのIovance Biotherapeutics, IncのＴＩＬ細胞療法プロセスのｃＧＭＰ製造について説明する。
【１０３０】
[001023]  この材料は、米国ＦＤＡ医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理に関する基準（21 CFR Part 210、211、1270及び1271）並びにフェーズＩから商用材料まで適用されるＩＣＨ  Ｑ７基準に基づいて製造される。
【１０３１】
【表６５】
2021519582.tif 000069
【１０３２】
【表６６】
2021519582.tif 000070
【１０３３】
４．３  検査手順
４．３．１  製造担当者は、充填プロセス中に最終産物バッグの１００％検査を実施する。
４．３．２  「最終産物検査落ち」とラベルを付した容器を準備する。
４．３．３  次の拒絶可能な属性につき検査する。
４．３．３．１  全可視粒子（繊維、懸濁液と同色でない粒子など）（注記：細胞／組織の凝集は、粒子状の拒絶対象とは見なされない）。
４．３．３．２  漏れのある縫い目／ポートなどのバッグの完全性の欠陥。
４．３．３．３  不完全なオーバーラップバッグシール。
４．３．３．４  漏れのあるシール。
４．３．３．５  凝集の兆候。
４．３．４  次の許容可能な属性につき検査する。
４．３．４．１  インタクトなバッグ
４．３．４．２  凝集の兆候がない
４．３．５  拒絶可能な属性が観察されない場合、最終産物バッグをロットに戻す。
４．３．６  拒絶可能な属性が観察された場合、バッグに「拒絶産物」ラベルでラベルを付し、バッグを「拒絶」貯蔵容器に入れる。
４．４  プロセスフロー図（図１２８を参照）
５．０  プロセスノート
５．１  最終報告されたデータ結果を含むプリントアウトは、指定エリアのこのバッチ記録に添付される。各プリントアウトには、ロット番号、ステップ番号（該当する場合）並びにイニシャル及び日付のラベルを付さなければならない。プリントアウトが利用できない場合、プリントアウトの代わりに、コメントセクションのコメントを参照して、読み取り値を手動で記録しなければならない。セカンドアソシエイトはデータを検証しなければならない。
５．２  プロセスステップは、材料を入手するとき、セットアップ中、処理活動後又は他ステップの説明に記載されているように同時に実施され得る。
５．３  他に指定がない限り、このバッチ記録全体を通して、１．０ｍＬ／Ｌ＝１．０ｇ／ｋｇを前提としている。
５．４  重要な材料／消耗品をセクション７．１で代替しなければならない場合、セクション１０．０でコメントを作成し、適切な担当者に連絡する。
５．５  バッチ記録を通して他に記載のない限り、全てのデータを１０分の１の小数点（ｘｘ．ｘ）に丸めるか、使用する機器の許容範囲内（プリントアウトデータを除く）に丸める。
５．６  機器が２つ以上のパラメータの較正を必要とし、それらの校正期日が異なる場合、最も早い期日が記録される。
５．７  このバッチ記録に記録された全てのＣＯ２測定値は、League Island 1のVaisalaＣＯ２アナライザーから読み取られる。このバッチ記録に記録された全てのＣＯ２測定値は、Commerce Center 3のＬＥＤディスプレイから読み取られる。
５．８  League Island 1の全てのインキュベーターは加湿される。Commerce Center 3の全てのインキュベーターは加湿されない。
５．９  開封後、２〜８℃で次の期限が適用される。ヒト血清、タイプＡＢ（ＨＩ）ジェミニ、１ヶ月；２−メルカプトエタノール、１か月。硫酸ゲンタマイシン、５０ｍｇ／ｍｌ原料は、室温で１か月間保管し得る。１０ＬのAIM-V培地を含む袋は、使用前に最大２４時間、１度のみ室温で温め得る。
５．１０  Great Plainsの受領番号及びロット番号は、WuXi AppTecロット番号が材料に割り当てられていない場合、セクション７．１  重要な材料／消耗品に記録される。Great Plainsシステムの実装及び検証の一環として、受領番号及びロット番号の組み合わせにより、今後調達される新しい材料のWuXi AppTecロット番号が置換される。
５．１１  ＴＳＣＤ溶接機を接続に使用する場合、機械の前面に印刷されている指示に従う。機械に示されているように、チューブが適切に挿入されていることを確認する。チューブを装着するときは、前の溶接が溶接機のクランプの下に配置されないように（可能な場合）、チューブが挿入されていることを確認する。また、溶接後のステップに十分なチューブが残っていることを確認する。溶接プロセスを開始する前に、止血鉗子をチューブのいずれかの側に配置する必要がある。溶接が完了したら、溶接部を検査して、チューブの周囲が密閉され、均一であることを確認する。接続に沿って指でつまむか又は転がして溶接部を開き、止血鉗子を取り外す。
５．１２  毎日、SEBRA（登録商標）ハンドヘルドチューブシーラーを使用する前に、シーリングヘッドを清掃及び検査して、適切に機能することを確認する。SEBRA（登録商標）ハンドヘルドチューブシーラーを使用してチューブを分離する場合、互いに近接した３つのシールを作製する。アーク放電を防ぐために、チューブの外側が乾燥していることを確認する。他に指示がない限り、中央のシールを破ってチューブを分離又は取り外す。シーリング中にチューブが早期に分離するのを防ぐために、チューブに反力を加えない。最初の試行が失敗した場合、シールを再封しようとしない。必要に応じて、ハンドヘルドシーラーを使用して「試験溶接」を実施し、必要に応じてハンドヘルドシーラーを評価する。
５．１３  全てのクランプ及び止血鉗子に、フローを適切に停止する能力が損なわれるか又はチューブが損傷する可能性があることにつながり得る、欠陥又は損傷がないか、十分に検査する。
５．１４  Nucelocounter通知が、カウント１及び／又は２が最適なカウント範囲（希釈考慮前で５×１０４〜５×１０６）を超えていることを示している場合、残りの細胞カウントページはＮ／Ａとする。適切な希釈係数（［新しい希釈係数］＝［以前の希釈係数］×［報告された細胞カウント］÷［５×１０５］）で希釈した別の細胞溶液サンプルを準備して、最適範囲内のＶＣＤ又は「生細胞」を得る。細胞カウント１及び／又は２が最適範囲を下回っている（希薄すぎる）場合、エリア管理者に連絡し、「生細胞」カウントを記録し、計算を進めた。いずれの状況でも、脚注の最適範囲から外れる細胞カウントを記録するようにする。
５．１５  腫瘍の受領情報を記録するときは、患者からの腫瘍の除去時刻が東部標準時（ＥＳＴ）に変換されていることを確認し、依然として変換されていない場合、腫瘍輸送バッチ記録にそのように記録した。患者から腫瘍を除去してから実験室で腫瘍を受領するまでの経過時間は、ＥＳＴで計算する必要がある。
５．１６  ２２日目の回収中に、G-Rex500MCSフラスコからＴＩＬを回収するために２つのGatherex（商標）を使用し得る。両方のユニットを使用して上清を除去し、２つのユニットの１つを使用してＴＩＬを収集し得る。
５．１７  全てのプロセスステップ中、グレードＢのプロセス室内に許可される人員の最小数は２人で、最大数は１０人である（環境プロセス人員を含む）。
５．１８  培地試薬を１．０ｍＬ以下の体積で分注する場合、分注後にピペットをすすぐ。
５．１９  フラスコは、培地の加温中及び積極的に処理されていない他の場合、再インキュベートされる。インキュベーションステップは、該当する場合、各セクションの始めと終わりにのみ記録される。予定外の処理日には、部屋の消毒又は機器のモニタリングを行わずに、エリア管理者又はクライアントに従い、情報のみを目的としてフラスコを観察し得る。
５．２０  ０日目の処理、腫瘍の解剖、播種及びフラスコのインキュベーションが完了した後、残っている腫瘍の断片及び部分は全て適切に廃棄される。
６．０  機器
【１０３４】
[001024]  機器リスト：０日目  ＣＭ１培地の調製／腫瘍洗浄の準備／腫瘍の解剖：
・マグネヘリックゲージ
・生物学的安全キャビネット（ＢＳＣ）
・インキュベーター
・ＣＯ２アナライザー
・マイクロピペッター（１００〜１０００μＬ）
・ピペットエイド
・Baxaリピーターポンプ
・Sebraチューブシーラー
・２〜８℃冷蔵庫
・−８０℃冷凍庫
・−２０℃冷凍庫
・タイマー
【１０３５】
[001025]  機器リスト：ＣＭ２調製／１１日目ＲＥＰ播種
・マグネヘリックゲージ
・生物学的安全キャビネット（ＢＳＣ）
・インキュベーター
・インキュベーター
・ＣＯ２アナライザー
・ドライバス
・ウォーターバス
・CytoTherm
・溶接機
・Gatherex
・NC200 NucleoCounter
・Baxaリピーターポンプ
・Sebraチューブシーラーバランス
【１０３６】
[001026]  機器リスト：ＣＭ２調製／１１日目ＲＥＰ播種
・遠心分離機
・マイクロピペッター（１００〜１０００μＬ）
・ピペットエイド
・タイマー
・２〜８℃冷蔵庫
・−８０℃冷凍庫
・制御速度冷凍庫
・ＬＮ２貯蔵冷凍庫（隔離）
・−２０℃冷凍庫
【１０３７】
[001027]  機器リスト：ＣＭ４調製／１６日目
・マグネヘリックゲージ
・生物学的安全キャビネット（ＢＳＣ）
・インキュベーター
・インキュベーター
・ＣＯ２アナライザー
・溶接機
・溶接機
・Gatherex
・NC200 NucleoCounter
・Baxaリピーターポンプ
・Sebraチューブシーラーバランス
・マイクロピペッター（１００〜１０００μＬ）
・ピペットエイド
・２〜８℃冷蔵庫
・−８０℃冷凍庫
【１０３８】
[001028]  機器リスト：２２日目製剤、充填、凍結保存
・マグネヘリックゲージ
・生物学的安全キャビネット（ＢＳＣ）
・インキュベーター
・インキュベーター
・ＣＯ２アナライザー
・溶接機
・Gatherex
・NC200 NucleoCounter
・Baxaリピーターポンプ
・Sebraチューブシーラーバランス
・マイクロピペッター（２０〜２００μＬ）ピペットエイド
【１０３９】
[001029]  機器リスト：２２日目製剤、充填、凍結保存
・ピペットエイド
・２〜８℃冷蔵庫
・−８０℃冷凍庫
・制御速度冷凍庫
・ＬＮ２貯蔵冷凍庫
・ＬＮ２貯蔵冷凍庫（隔離）
・LOVO細胞処理システム
７．０  材料表
【１０４０】
[001030]  材料：０日目  ＣＭ１培地の調製／腫瘍洗浄の準備／腫瘍
【１０４１】
[001031]  解剖
・使い捨てメス、滅菌
・５０ｍＬ血清用ピペット、滅菌
・１ｍＬ血清用プラスチックピペット、滅菌
・１０ｍＬ血清用ピペット、滅菌
・遠心分離管、５０ｍＬ、２８×１１４ｍｍ、コニカルベース、スクリューキャップ、ＰＰ、滅菌
・２５ｍＬ血清用ピペット、滅菌
・５ｍＬ血清用ピペット、滅菌
・MF75シリーズ、使い捨て組織培養フィルター、１０００ｍＬ、ＰＥＳフィルター、０．２μｍ、滅菌
・ピペット、血清用１００ｍＬ
・２−メルカプトエタノール１０００Ｘ、液体、Ｄ−ＰＢＳ中５５ｍＭ
・Hank’s平衡塩溶液（１Ｘ）、液体、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウムなし
・GlutaMAX  １〜２００ｍＭ（１００Ｘ）、液体
・ARTバリアピペットチップ、１０００μＬ、個包装、滅菌
・１５０ｍｍペトリ皿、特深、滅菌
・６ウェル、超低アタッチメントプレート、９．５ｃｍ２ウェル増殖領域、ＰＳ、滅菌
・Thermo Scientific Samco汎用移送ピペット。７．７ｍＬ、滅菌
・リピーターポンプ流体移送セットオスルアーロックエンド
・長鉗子８インチ、滅菌
・硫酸ゲンタマイシン、５０ｍｇ／ｍＬストック
・使い捨て科学鉗子、４．５インチ、ステンレス鋼、滅菌
・１００ｍｍペトリ皿、滅菌、特深
・Pumpmatic液体分注システム
・硫酸ゲンタマイシン、５０ｍｇ／ｍＬストック
・シリンジキャップ・二機能、赤
・RPMI-1640、１Ｌボトル
・G-Rex100Mフラスコ閉鎖系
・滅菌定規
・再構成されたＩＬ−２
・ヒト腫瘍サンプル、頭頸部  ・該当なし
・ヒト腫瘍サンプル、子宮頸部  ・該当なし
・GemCellヒト血清ＡＢ、熱不活性化  ・該当なし
・ヒト腫瘍サンプル、黒色腫
・GemCellヒト血清ＡＢ、熱不活性化
【１０４２】
[001032]  材料：ＣＭ２調製／１１日目ＲＥＰ播種
・ルアーロックシリンジ、６０ｍＬ、滅菌針１６Ｇｘ１．５インチ、滅菌
・５０ｍＬ血清用ピペット、滅菌
・１ｍＬ血清用プラスチック、ピペット、滅菌
・Nunc雌ネジ式クライオチューブバイアル、滅菌
・１０ｍＬ血清用ピペット、滅菌
・遠心分離管、１５ｍＬ
・遠心分離管、５０ｍＬ
・ピペット、血清用１００ｍＬ
・シリンジ、１ｃｃ、滅菌ルアーロック
・３ｍＬシリンジ、ルアーロックチップ、滅菌
・５ｍＬ血清用ピペット、滅菌
・Nalgene *MF75*シリーズフィルターユニットレシーバー、２５０ｍＬ、滅菌
・Nalgene MF75シリーズフィルターユニットレシーバー、５００ｍＬ、滅菌
・１０００ｍＬ  Nalgene Rapid-Flow滅菌使い捨てフィルタユニット、０．２２μｍ、ＰＥＳ
・CryoStor CS-10
・２−メルカプトエタノール１０００Ｘ、液体、Ｄ−ＰＢＳ中５５ｍＭ
・GlutaMAX  １〜２００ｍＭ（１００Ｘ）、液体
・１，０００μＬ  ARTバリア滅菌ピペットチップ、個包装
・VIA1カセット
・移送パック容器、１０００ｍＬ、カプラー付き、滅菌
・移送パック３００ｍＬカプラー付き
・滅菌アルコールパッド
・リピーターポンプ流体移送セットオスルアーロックエンド
・CTS AIM V  １Ｌボトル
・MACS GMP CD3純粋（ＯＫＴ−３）
・硫酸ゲンタマイシン、５０ｍｇ／ｍＬストック
・４インチチューブ、穿孔ピン及びシリンジアダプター付き
・シリンジのみルアーロック１０ｍＬ
・チューブ、４スパイク・オスルアー・マニホールド
・重力血液投与セットＹ型、注入サイトなし、１７０μｍ血液フィルター
・Pumpmatic液体分注システム
・１０Ｌ  Labtainer  ３ポートバッグ
・硫酸ゲンタマイシン、５０ｍｇ／ｍＬストック
・１００ｍＬシリンジ
・３０００ｍＬ培養バッグ
・Origen Cell Connect CC2
・シリンジキャップ・二機能・赤
・RPMI-1640、１Ｌボトル
・G-Rex500Mフラスコ閉鎖系
・再構成されたＩＬ−２
・同種異系照射フィーダー細胞
・同種異系照射フィーダー細胞
・ヒト血清、タイプＡＢ（ＨＩ）ジェミニ
・ヒト血清、タイプＡＢ（ＨＩ）ジェミニ
・
【１０４３】
[001033]  材料：ＣＭ４調製／１６日目
・ルアーロックシリンジ、６０ｍＬ滅菌
・１ｍＬ血清用プラスチックピペット、滅菌
・Nunc雌ネジ式クライオチューブバイアル、滅菌
・１０ｍＬ血清用ピペット、滅菌
・遠心分離管、１５ｍＬ
・遠心分離管、５０ｍＬ
・ピペット、血清用１００ｍＬ
・ルアーロック付きシリンジ、滅菌、３ｍＬ
・５ｍＬ血清用ピペット、滅菌
・シリンジのみルアーロック１０ｍＬ
・Nalgene *MF75*シリーズ
・フィルターユニットレシーバー、２５０ｍＬ、滅菌
・GlutaMAX  １〜２００ｍＭ（１００Ｘ）、液体
・ARTバリアピペットチップ、１０００μＬ、個包装、滅菌
・VIA1カセット
【１０４４】
[001034]  材料：ＣＭ４調製／１６日目
・移送パック容器、１０００ｍＬカプラー付き、滅菌
・滅菌アルコールパッド
・リピーターポンプ流体移送セットオスルアーロックエンド
・CTS AIM-V  １０００ｍＬ  ・該当なし
・血漿移送セット４インチチューブ、メスルアーアダプター付き
・３０ｍＬルアーロック滅菌シリンジ
・CTS AIM V  １０Ｌバッグ
・Pumpmatic液体分注システム
・10L Labtainer  ３ポートバッグ
・シリンジキャップ・二機能・赤
・G-Rex500Mフラスコ閉鎖系
・再構成されたＩＬ−２
【１０４５】
[001035]  材料：２２日目製剤、充填、凍結保存
・ルアーロックシリンジ、６０ｍＬ滅菌
・針、１６Ｇｘ１．５インチ、滅菌
・５０ｍＬ血清用ピペット、滅菌
・Nunc雌ネジ式クライオチューブバイアル、滅菌
・１０ｍＬ血清用ピペット、滅菌
・遠心分離管、１５ｍＬ
・遠心分離管、５０ｍＬ
・シリンジ、１ｃｃ、滅菌ルアーロック
・３ｍＬシリンジ、ルアーロックチップ、滅菌
・２５ｍＬ血清用ピペット、滅菌
・５ｍＬ血清用ピペット、滅菌
・シリンジのみルアーロック１０ｍＬ
・ピペット、血清用１００ｍＬ
・ARTバリア滅菌ピペットチップ、２００μＬ個包装
・VIA1−カセット
・Plasma-Lyte A注入１Ｌ
・LOVO細胞洗浄使い捨てセット
・LOVO補助バッグキット
・滅菌アルコールパッド
・リピーターポンプ流体移送セットオスルアーロックエンド
・CTS AIM V  １Ｌボトル
・ヒトアルブミン２５％
・血漿移送セット４インチチューブ、メスルアーアダプター付き
・チューブ、４オスルアー・マニホールド
・重力血液投与
・セットＹ型、注入サイトなし、１７０μｍ血液フィルター
・Pumpmatic液体分注システム
・１０Ｌ  Labtainer  ３ポートバッグ
・１００ｍＬシリンジ
・クライオバッグCS750
・３Ｌ培地バッグ
・Origen Cell Connect CC2
・シリンジキャップ・二機能・赤
・Cryostor CS10、１００ｍＬバッグ
・分注スパイク、ベント付き
・再構成されたＩＬ−２
８．０  プロセス
【１０４６】
[001036]  ステップの説明    プロセス情報  一次
８．１  ０日目ＣＭ１培地の調製
８．１．１  部屋の衛生化、ラインクリアランス及び材料を確認した。部屋の衛生化を確認した。
８．１．２  前処理表の完了を確認した。
８．１．３  環境モニタリング。処理前に前処理環境モニタリングが開始されたことを確認した。
８．１．４  RPMI 1640培地を調製した。ＢＳＣ中で、適切なサイズのピペットを使用して、１０００ｍＬ  RPMI 1640培地から１００．０ｍＬを取り出し、「廃棄物」とラベル付けされた適切なサイズの容器に入れた。
８．１．５  ＢＳＣ中で、RPMI 1640培地ボトルに試薬を追加した。表に示すように、RPMI 1640培地ボトルに次の試薬を追加した。追加された体積を記録した。
ボトルごとの追加量：熱不活性化ヒトＡＢ血清（１００．０ｍＬ）；GlutaMax（１０．０ｍＬ）；硫酸ゲンタマイシン、５０ｍｇ／ｍＬ（１．０ｍＬ）；２−メルカプトエタノール（１．０ｍＬ）
８．１．６  培地を混合した。試薬が完全に混合されるように、ステップ８．１．５からのRPMI 1640培地ボトルにキャップを付け、ボトルを回旋した。
８．１．７  RPMI培地をろ過した。ステップ８．１．６から１Ｌ  ０．２２−ミクロンフィルターユニットを通してRPMI 1640培地をろ過した。
８．１．８  ろ過された培地をラベル付けした。ろ過された培地に無菌的に蓋をし、以下の情報をラベル付けした。
８．１．９  ＢＳＣから不要な材料を取り出した。セクション８．２の配合された洗浄培地の調製のために、ＢＳＣから培地試薬を移し、硫酸ゲンタマイシン及びＨＢＳＳをＢＳＣ中に残した。
８．１．１０  未使用の消耗品を保管した。残りの開封／解凍した培地試薬を適切な保管条件に移すか又は廃棄した。
注記：プロセスノート５．９に従って、適切な開封有効期限を培地試薬に割り当て、バッチ記録ロット番号でラベルを付した。
８．１．１１  ＩＬ−２アリコートを解凍した。全ての氷が溶けるまで、１つの１．１ｍＬ  ＩＬ−２アリコート（６×１０６ＩＵ／ｍＬ）（ＢＲ７１４２４）を解凍した。ＩＬ−２を記録した。ロット番号及び有効期限（注記：ＩＬ−２ラベルが添付されていることを確認した）。
８．１．１２  ＩＬ−２原料溶液を培地に移した。ＢＳＣ中で、１．０ｍＬのＩＬ−２原料溶液を、ステップ８．１．８で調製したＣＭ１  ０日目培地ボトルに移した。ＣＭ１  ０日目培地１ボトル及びＩＬ−２（６×１０６ＩＵ／ｍＬ）１．０ｍＬを追加した。
８．１．１３  混合し、ラベルを付け直した。ＩＬ−２を含む培地を混合するために、ボトルに蓋をして回旋した。「完全ＣＭ１  ０日目培地」というラベルを付し、新しいロット番号を割り当てた。
８．１．１４  サンプルプランに従うサンプル培地。適切なサイズのピペットを使用して２０．０ｍＬの培地を取り出し、５０ｍＬのコニカルチューブに分注した。
８．１．１５  ラベルを付し、保存した。サンプルをサンプルプラン在庫ラベルとラベル付けし、サンプルプランに従い試験用にログインのために提出するまで、「培地参考品」サンプルを２〜８℃で保存した。
８．１．１６  サンプリングのためにサインした。サンプルを取り出すためのＬＩＭＳサンプルプランシートが完成していることを確認した。
８．１．１７  「組織片」コニカルチューブを準備した。ＢＳＣにて、２５．０ｍＬの「完全ＣＭ１  ０日目培地」（ステップ８．１．１３で調製した）を５０ｍＬのコニカルチューブに移した。チューブに「組織片」及びバッチ記録ロット番号のラベルを付した。
８．１．１８  G-Rex100MCSをＢＳＣ中に移した。G-Rex100MCS（Ｗ３０１３１３０）を無菌的にＢＳＣに入れた。
８．１．１９  G-Rex100MCSを準備した。ＢＳＣ中で、ベントフィルタークランプを開いたままにし、G-Rex100MCSの全てのクランプを閉じた。
８．１．２０  G-Rex100MCSを準備した。ルアー接続を介して、G-Rex100MCSフラスコの赤い線をリピーターポンプ流体移送セット（Ｗ３００９４９７）の長径端に接続した。
８．１．２１  Baxaポンプを準備した。ＢＳＣに隣接しているBaxaポンプを実行した。ＢＳＣからリピーターポンプ流体移送セットのポンプチューブセクションを取り外し、リピーターポンプに取り付けた。
８．１．２２  培地を汲み上げる準備。ＢＳＣ内で、Pumpmatic溶液分注システム（ＰＬＤＳ）（Ｗ３０１２７２０）からシリンジを取り外し、廃棄した。
注記：ＰＬＤＳピペットの無菌性を損なわないようにした。
８．１．２３  培地を汲み上げる準備。ＰＬＤＳピペットを、ルアー接続を介してリピーターポンプ流体移送セットの小径端に接続し、吸引のために「完全ＣＭ１  ０日目培地」（ステップ８．１．１３で調製した）にピペットチップを取り付けた。
培地とG-Rex100MCSとの間の全てのクランプを開けた。
８．１．２４  完全ＣＭ１培地をG-Rex100MCSフラスコに送り込んだ。ポンプ速度を「高」及び「９」に設定し、全ての完全ＣＭ１  ０日目培地をG-Rex100MCSフラスコに送り込んだ。全ての培地が送り込まれた時点で、ラインをクリアにし、ポンプを停止した。
８．１．２５  フラスコからポンプを取り外した。ベントフィルターを除き、フラスコの全てのクランプが閉じていることを確認した。赤い培地ラインからリピーターポンプ流体移送セットを取り外し、赤い培地ラインに赤いキャップ（Ｗ３０１２８４５）を取り付けた。
８．１．２６  ヒートシールした。ＢＳＣからG-Rex100MCSフラスコを取り出し、ターミナルルアー近くの赤いラインから赤いキャップをヒートシール（プロセスノート５．１２に従う）した。
８．１．２７  G-Rex100MCSにラベルを付した。ＱＡが用意したG-Rex100MCSフラスコにインプロセス「０日目」ラベルを付けた。サンプルに以下の「０日目」ラベルを添付した。
８．１．２８  インキュベーターをモニターした。インキュベーターのパラメータ：温度ＬＥＤディスプレイ：３７．０±２．０℃；ＣＯ２パーセンテージ：５．０±１．５％ＣＯ２。
８．１．２９  培地を温めた。ステップ８．１．１７で準備した「組織断片」とラベルの付いた５０ｍＬコニカルチューブ及びステップ８．１．２７で準備したG-Rex100MCSを、３０分以上加温するためにインキュベーターに入れた。
以下の加温時間を記録した。加温時間が３０分以上であったか（はい／いいえ）を記録した。
［組織断片コニカル又はGRex100MCS］
８．１．３０  セクション８．１をレビューした。
８．２  ０日目腫瘍洗浄培地の調製
８．２．１  ゲンタマイシンをＨＢＳＳに追加した。ＢＳＣ中で、５．０ｍＬのゲンタマイシン（Ｗ３００９８３２又はＷ３０１２７３５）を１×５００ｍＬ  ＨＢＳＳ培地（Ｗ３０１３１２８）ボトルに追加した。体積を記録した。ボトルごとの追加量：ＨＢＳＳ（５００．０ｍＬ）；硫酸ゲンタマイシン、５０ｍｇ／ｍｌ（５．０ｍＬ）。
８．２．２  ＨＢＳＳボトルに蓋をして、回旋した。ステップ８．２．１で調製したゲンタマイシンを含有するＨＢＳＳにキャップを付け、ボトルを回旋して試薬が完全に混合されていることを確認した。
８．２．３  溶液をろ過した。ステップ８．２．１で調製したゲンタマイシンを含むＨＢＳＳを１Ｌ  ０．２２ミクロンフィルターユニット（Ｗ１２１８８１０）でろ過した。
８．２．４  ろ過された培地に無菌的に蓋をし、ラベルを付した。ろ過された培地に無菌的に蓋をし、以下の情報をラベル付けした。セクション８．３に進んだ。
８．２．５  セクション８．２をレビューした。
８．３  ０日目の腫瘍処置
８．３．１  腫瘍を入手した。ＱＡＲから腫瘍標本を入手し、処理のために直ちに２〜８℃の部屋に移した。必要な全ての情報が腫瘍輸送バッチ記録に記録されていることを確認した。
８．３．２  腫瘍情報を記録した。
８．３．３  腫瘍ラベルを貼付した。腫瘍アタッチメントを貼付した。以下のQARリリースステッカー。腫瘍輸送バッチ記録に＃５を添付した。
８．３．４  腫瘍解剖に必要な材料をＢＳＣ中に移した。
８．３．５  材料を開封した。物品の無菌性を損なわないようにして、ＢＳＣ内の全ての材料を開封した。
８．３．６  材料にラベルを付した。３本の５０ｍｌコニカルチューブにラベルを付けた。１つ目は「鉗子」、２つ目は「メス」、３つ目は「新鮮な腫瘍洗浄培地」。５×１００ｍｍのペトリ皿に「洗浄１」、「洗浄２」、「洗浄３」、「保持」及び「良好でない」というラベルを付けた。１つの６ウェルプレートに「好ましい中間断片」というラベルを付けた。
８．３．７  分割された腫瘍洗浄培地。適切なサイズのピペットを使用して、５．０ｍＬのステップ８．２．４で調製された「腫瘍洗浄培地」を１つの６ウェルプレートの各ウェルの良好な中間腫瘍断片（合計３０．０ｍＬ）に移した。注記：腫瘍の洗浄及び解剖プロセス中に、必要に応じて、鉗子及びメスをそれぞれの腫瘍洗浄培地コニカルに保管した。
８．３．８  分割された腫瘍洗浄培地。適切なサイズのピペットを使用して、ステップ８．２．４で調製した５０．０ｍＬの「腫瘍洗浄培地」を「洗浄１」、「洗浄２」、「洗浄３」、「保持」の各１００ｍｍペトリ皿に移した（合計２００．０ｍＬ）。
８．３．９  分割された腫瘍洗浄培地。適切なサイズのピペットを使用して、ステップ８．２．４で準備した２０．０ｍＬの「腫瘍洗浄培地」を各５０ｍＬコニカル（合計６０．０ｍＬ）に移した。
８．３．１０  腫瘍片用に蓋を準備した。２つの６ウェルプレートから蓋を無菌的に取り外した。蓋は、選択された腫瘍片に利用された。注記：腫瘍処理を通して、開いた組織培養プレート及び蓋の上を横切らなかった。
８．３．１１  腫瘍をＢＳＣ中に移した。無菌的に腫瘍はＢＳＣに移された。処理開始時間が記録された。
８．３．１２  腫瘍洗浄１  ８インチ鉗子（Ｗ３００９７７１）を使用し、標本ボトルから腫瘍を取り出し、ステップ８．３．８で準備した「洗浄１」皿に移した。
注記：検体ボトルに溶液を保持した。
８．３．１３  腫瘍洗浄１。鉗子を使用して、以下のタイマーからの時間、腫瘍を穏やかに洗浄した。標本を採取し、３分以上放置した。洗浄時間を記録した（分：秒）。
８．３．１４  サンプルプランに従いバイオバーデンサンプルを準備した。サンプルプランごとに、腫瘍検体ボトルから２０．０ｍＬ（又は利用可能な体積）の溶液を５０ｍＬのコニカルに移した。
８．３．１５  サンプルにラベルを付し、保存した。ステップ８．３．１４で収集したバイオバーデンサンプルにサンプルプラン在庫ラベルでラベルを付し、試験用に提出するまで２〜８℃で保存した。
８．３．１６  サンプリングのためにサインした。サンプルを取り出すためのＬＩＭＳサンプルプランシートが完成していることを確認した。
８．３．１７  腫瘍洗浄２。新しい鉗子セットを使用し、「洗浄１」皿から腫瘍を取り出し、ステップ８．３．８で調製された「洗浄２」皿に移した。
８．３．１８  腫瘍洗浄２。ピンセットを使用して、３分以上静かに撹拌して腫瘍標本を洗浄し、その後、静置した。時間を記録した。
８．３．１９  所望の腫瘍片につき腫瘍洗浄培地を数滴準備した。移送ピペットを使用して、ステップ８．３．９で準備したコニカルから腫瘍洗浄培地を４滴ずつ、６ウェルプレートの裏返した蓋のそれぞれの６つの円に入れた（２つの蓋）。２つの円に追加で滴下し、合計で５０滴入れた。
８．３．２０  腫瘍線状３。鉗子を使用し、「洗浄２」皿から腫瘍を取り出し、ステップ８．３．８で準備した「洗浄３」皿に移した。
８．３．２１  腫瘍線状３。鉗子を使用し、静かに撹拌して腫瘍標本を洗浄し、その後、３分以上静置した。時間を記録した。
８．３．２２  腫瘍解剖皿を準備した。１５０ｍｍ皿の蓋の下に定規を置いた。
８．３．２３  腫瘍を解剖皿に移した。ピンセットを使用して、無菌的に腫瘍標本を１５０ｍｍ解剖皿の蓋に移した。
８．３．２４  腫瘍を測定した。腫瘍標本の全ての断片を端から端まで配置し、おおよその全長と断片の数を記録した。各腫瘍標本の鮮明な写真を撮影した。
８．３．２５  腫瘍を評価した。壊死／脂肪組織の腫瘍を評価した。腫瘍領域全体の３０％超が壊死組織及び／又は脂肪組織であると観察されたかどうかを評価した。はいの場合、エリア管理者に連絡して腫瘍全体が適切な大きさであることを確認し、ステップ８．３．２６に進んだ。腫瘍領域全体の３０％未満が壊死組織又は脂肪組織であることが観察されたかどうかを評価した。はいの場合、ステップ８．３．２７に進み、クリーンアップ解剖は実施されなかった。
８．３．２６  該当する場合：解剖物の処理。腫瘍が大きく、組織外部の３０％超が壊死／脂肪質が観察された場合、メス及び／又は鉗子の組み合わせを用いて、腫瘍の内部構造を維持しつつ、壊死／脂肪組織を取り除くことにより「解剖の処理」が行われた。注記：腫瘍の内部構造を維持するために、垂直切断圧のみを使用した。メスによる鋸引き運動での切断はしなかった。注記：脂肪組織、壊死組織及び無関係の組織は、好ましくない皿に置いた。
８．３．２７  腫瘍を解剖する。メス及び／又は鉗子の組み合わせを使用して、腫瘍標本を均一で適切なサイズの断片（最大６個の中間断片）に切断する。注記：腫瘍の内部構造を維持するために、垂直切断圧のみを使用する。メスによる鋸引き運動での切断はしなかった。注記：解剖されていない中間断片が（ステップ８．２．４で準備された）「腫瘍洗浄培地」に完全に沈んだままであることを確認した。
８．３．２８  中間腫瘍断片を移送した。各中間断片をステップ８．３．８からの“保持”皿に移した。
８．３．２９  腫瘍断片を解剖した。一度に１つの中間断片を操作し、解剖皿の腫瘍中間断片を約３×３×３ｍｍのサイズの断片に解剖し、各断片の出血、壊死及び／又は脂肪組織の量を最小限にした。注記：腫瘍の内部構造を維持するために、垂直切断圧のみを使用した。メスによる鋸引き運動での切断はしなかった。
８．３．３０  腫瘍片を選択した。出血、壊死及び／又は脂肪組織のない最大８個の腫瘍片を選択した。参考として、定規を使用した。８個の良好な断片を得られるまで又は中間断片全体が解剖されるまで解剖を続けた。選択した各断片をステップ８．３．１９で調製した「腫瘍洗浄培地」の１滴に移した。
８．３．３１  乾燥を防ぐために中間断片を保管した。中間断片から最大８個を選択した後、中間断片の残りをステップ８．３．７で準備した「好ましい中間断片」の６ウェルプレートの新しいシングルウェルに入れた。注記：脂肪組織又は壊死組織を「好ましくない」皿（ステップ８．３．６で準備した）に入れた。
８．３．３２  中間断片の解剖を繰り返した。次の中間断片に進み、全ての中間断片が処理されるまでステップ８．３．２９〜８．３．３１を繰り返し、必要に応じて新しいメス及び鉗子を得た。
８．３．３３  収集した断片数を決定した。望ましい組織が残っている場合、最大５０断片を滴下で充填するために、「好ましい中間断片」６ウェルプレートから追加的な好ましい腫瘍片を選択した。作成された解剖断片の総数を記録した。注記：解剖を通して、必要に応じて腫瘍中間断片を洗浄培地で水和させておくようにした。収集した解剖片の総量を記録した。
８．３．３４  インキュベーターからコニカルチューブを取り出した。インキュベーターから「組織片」５０ｍＬコニカルチューブを取り出した。ステップ８．１．２９の時間を記録した。コニカルチューブが３０分以上加温されたことを確認した。
８．３．３５  コニカルチューブを準備した。「組織片」５０ｍＬコニカルをＢＳＣに移し、開放処理表面の無菌性を損なわないようにする。
８．３．３６  腫瘍片を５０ｍＬコニカルチューブに移した。移送ピペット、メス、鉗子又は組み合わせを使用して、良好な皿の蓋から選択された５０個の最良の腫瘍断片を「組織片」５０ｍＬコニカルチューブに移した。
注記：移動中に腫瘍片を落とし、望ましい組織が残っている場合、好ましい腫瘍中間断片ウェルから追加的な断片が加えられた。断片数を記録した。
８．３．３７  G-REX100MCS用にＢＳＣを準備した。容器に播種するためにＢＳＣから不要な物品を全て取り出し、余分な断片が含まれている場合には好ましい組織プレートを保持した。
８．３．３８  インキュベーターからG-REX100MCSを取り出した。インキュベーターから培地を含むG-Rex100MCSを取り出した。ステップ８．１．２９を完了した。
８．３．３９  フラスコをＢＳＣに移した。G-Rex100MCSフラスコを無菌的にＢＳＣに入れた。注記：フラスコを移す時、蓋又は容器の底から手に持たない。両サイドから手に持ち容器を移動した。注記：G-Rexフラスコを取り扱う場合ＩＰＡワイプのみ使用した。
８．３．４０  G-Rex100MCSフラスコに腫瘍断片を追加した。ＢＳＣでは、G-Rex100MCSフラスコキャップを持ち上げて、チューブ内部の無菌性が維持されるようにした。
懸濁するために腫瘍片の入ったコニカルチューブを回旋し、内容物を素早くG-Rex100MCSフラスコに注いだ。
８．３．４１  断片を均等に分散させた。腫瘍片がフラスコの膜全体に均一に分布するように確認した。必要に応じてフラスコを前後に静かに傾けて、腫瘍片を均等に配置した。
８．３．４２  容器内の腫瘍断片の総数を記録した。容器の底膜の腫瘍断片の数及び容器内確認できる浮遊物の数を記録した。注記：播種された断片の数がステップ８．３．３６Ｈで収集された数と同等でない場合、エリア管理に連絡し、セクション１０．０の文書を作成した。
８．３．４３  G-Rexフラスコをインキュベートする。以下のパラメータでG-Rex100MCSをインキュベートした：インキュベートしたG-Rexフラスコ：温度ＬＥＤディスプレイ：３７．０±２．０℃；ＣＯ２パーセンテージ：５．０±１．５％ＣＯ２。
８．３．４４  インキュベーションウィンドウを計算した。１１日目にG-Rex100MCSを取り出す適切な時間を決定するための計算を実行した。計算：インキュベーション時間；下限＝インキュベーション時間＋２５２時間；上限＝インキュベーション時間＋２７６時間。
８．３．４５  環境モニタリング。処理後、ＢＳＣを検証し、担当者によるモニタリングが実施された。
８．３．４６  材料を廃棄した。残りの非加温培地を２〜８℃で保存し、ラベルを付した。プロセスが完了した後、残りの加温培地を廃棄し、ＩＬ−２のアリコートを解凍した。
８．３．４７  サンプルの提出。全ての０日目のサンプルがログインのために送られ、ＬＩＭＳに移送されたことを確認した。
８．３．４８  セクション８．３をレビューする。
８．４  １１日目−培地の調製
８．４．１  部屋、衛生化、ラインクリアランス及び材料を確認した。部屋の衛生化、ラインクリアランス及び材料が有効期限内であることを確認した。
８．４．２  前処理表。機器リスト：ＢＳＣ；バランス；Sebraチューブシーラー；Gatherex（商標）培地取り出し及び細胞回収装置；ＱＡ提供のプラカードが適切なＢＳＣに配置されていることを確認する；ＱＡ提供のプラカードのロット番号及び患者ＩＤの表示がこのバッチ記録のロット番号及び患者ＩＤと一致していることを確認する。
８．４．３  インキュベーターをモニターした。インキュベーターをモニターした。インキュベーターのパラメータ：
温度ＬＥＤディスプレイ：３７．０±２．０℃；ＣＯ２パーセンテージ：５．０±１．５％  ＣＯ２。注記：セクション８．４はセクション８．５と同時に実行され得る。
８．４．４  培地を温めた。インキュベーターで３０分以上温めた１０００ｍＬ  RPMI 1640培地（Ｗ３０１３１１２）ボトル３本及び１０００  ｍＬAIM-V（Ｗ３００９５０１）ボトル３本。時間を記録した。培地：RPMI 1640及びAIM-V。注記：ステップ８．５．３４における使用のために、追加的な１×１０００ｍｌボトルのAIM-V培地（Ｗ３００９５０１）を室温に置いた。ボトルに「細胞カウント希釈のみ」及びバッチ記録ロット番号のラベルを付した。
８．４．５  環境モニタリング。処理前にＳＯＰ−００３４４に従って前処理環境モニタリングが実施されたことを確認した。
８．４．６  インキュベーターからRPMI 1640培地を取り出した。時間に達した時にRPMI 1640培地を取り出した。ステップ８．４．４でインキュベーション終了時間を記録した。培地が３０分以上加温されたことを確認する。
８．４．７  RPMI 1640培地を調製した。ＢＳＣ中で、３本のあらかじめ温めておいた１０００ｍＬ  RPMI 1640培地ボトルのそれぞれから１００．０ｍＬを取り出し、「廃棄物」というラベルが付いた適切なサイズの容器に入れた。
８．４．８  ＢＳＣ中で、RPMI 1640培地ボトルに試薬を追加する。ＢＳＣ中で、３本のRPMI 1640培地ボトルそれぞれに以下の試薬を加えた。各ボトルに追加した体積を記録した。GemCellヒト血清、Heat InactivatedタイプAB（１００．０ｍＬ）、GlutaMax（１０．０ｍＬ）、硫酸ゲンタマイシン５０ｍｇ／ｍＬ（１．０ｍＬ）、２−メルカプトエタノール（１．０ｍＬ）。
８．４．９  培地をろ過した。試薬が完全に混合されるように、ステップ８．４．８からのボトルに蓋をし、回旋した。培地の各ボトルを個別の１Ｌ  ０．２２ミクロンフィルターユニットでろ過した。
８．４．１０  ろ過された培地とラベル付けした。ろ過した培地を、無菌的に蓋をし、各ボトルにＣＭ１  １１日目培地ラベル付けした。
８．４．１１  ＩＬ−２アリコートを解凍した。全ての氷が溶けるまでＩＬ−２の３×１．１ｍＬアリコート（６×１０６ＩＵ／ｍＬ）（ＢＲ７１４２４）を解凍し、ＩＬ２ロット番号と有効期限を記録した。
注記：ＩＬ−２ラベルが添付されていることを確認する。
８．４．１２  インキュベーターからAIM-V培地を取り出した。インキュベーターから３本のAIM-V培地を取り出した。ステップ８．４．４のインキュベーション終了時間を記録した。３０分以上培地を温めたか確認した。
８．４．１３  AIM-VにＩＬ−２を添加する。ＢＳＣ中で、マイクロピペットを使用して、解凍したＩＬ−２  ３．０ｍＬを事前に温めたAIM-V培地の１Ｌボトル１本に加えた。ＩＬ−２を分注した後、マイクロピペットチップを培地で洗浄する。各アリコートに新しい滅菌マイクロピペットチップを使用する。追加された総体積を記録した。「ＩＬ−２含有AIM-V」とボトルにラベルを付けた。
８．４．１４  材料を移した。１０ＬのLabtainerバッグとリピーターポンプ移送セットをＢＳＣに無菌的に移した。
８．４．１５  １０ＬのLabtainer培地バッグを準備した。１０ＬのLabtainerバッグの全てのラインを閉じた。ルアーロック接続を介して、リピーターポンプ移送セットの長径のチューブの端を１０ＬのLabtainerバッグの中央メスポートに取り付けた。
８．４．１６  Baxaポンプを準備する。ＢＳＣに隣接しているBaxaポンプを実行した。ＢＳＣの外側に位置するBaxaポンプに移送セットチュービングを通した。Baxaポンプを「高」及び「９」に設定する。
８．４．１７  １０ＬのLabtainer培地バッグを準備した。ＢＳＣ内で、Pumpmatic溶液分注システム（ＰＬＤＳ）からシリンジを取り外し、廃棄した。注記：ＰＬＤＳピペットの無菌性を損なわないようにした。
８．４．１８  １０ＬのLabtainer培地バッグを準備した。ルアー接続を介してＰＬＤＳピペットをリピーターポンプ流体移送セットの小径端に接続し、吸引のためＩＬ−２ボトル（ステップ８．４．１３で調製した）を含むAIM-V培地にピペットの先端を入れた。培地ボトルと１０ＬのLabtainer間の全てのクランプを開いた。
８．４．１９  培地を１０Ｌ  Labtainerに注入した。ＢＳＣ中、ＰＬＤＳを使用して、ステップ８．４．１３で調製したＩＬ−２を含むあらかじめ温めておいたAIM-V培地を２本の追加的なAIM-Vボトルと同様に１０ＬのLabtainerバッグに移す。ステップ８．４．１０のろ過されたＣＭ１  １１日目培地の３本のボトルを追加した。最終ボトルの追加後、バッグのラインをクリアにした。注記：培地の各ボトルの追加間でポンプを停止した。
８．４．２０  Labtainerバッグからpumpmaticを取り出した。移送セットからＰＬＤＳを取り出し、ＢＳＣのラインのルアーに赤いキャップを取り付けた。
８．４．２１  培地を混合した。バッグを穏やかに揉んで混合した。
８．４．２２  培地にラベルを付した。ＢＳＣ中で、以下の情報を培地バッグにラベル付けした。有効期限は調製日から２４時間であった。
８．４．２３  サンプルプランに従うサンプル培地。ＢＳＣ中で、ステップ８．４．２２で準備した「完全ＣＭ２  １１日目培地」バッグの利用可能なメスポートに６０ｍＬシリンジを取り付けた。２０．０ｍＬの培地を取り出し、５０ｍＬのコニカルチューブに入れた。
「完全ＣＭ２  １１日目培地」バッグのメスポートに赤いキャップを取り付けた。
８．４．２４  サンプルにラベルを付し、保存した。サンプルプラン在庫ラベルとラベル付けし、試験用にログインするために提出するまで、培地参考品サンプルを２〜８℃で保存した。
８．４．２５  サンプリングのためにサインする。サンプルを取り出すためのＬＩＭＳサンプルプランシートが完成していることを確認した。
８．４．２６  移送セットラインをシールした。ＢＳＣの外で、移送セットラインの赤いキャップを、赤いキャップの近くでヒートシール（プロセスノート５．１２に従う）した。移送セットをバッグに接続したままにした。
８．４．２７  細胞カウント希釈チューブを準備した。ＢＳＣ中で、「細胞カウント希釈用」とロット番号でラベル付けされた４．５ｍＬのAIM-V培地を４本の１５ｍＬコニカルチューブに追加した。ロット番号とチューブ番号（１〜４）をチューブにラベル付けした。４つのクライオバイアル「フィーダー」とバイアル番号（１〜４）とラベル付けした。ステップ８．５．３０で使用するためにバイアルをＢＳＣ下に保管した。
８．４．２８  ＢＳＣから２〜８℃に試薬を移した。残りの２−メルカプトエタノール、GlutaMax及びヒト血清をＢＳＣから２〜８℃に移した。全ての試薬に、バッチ記録ロット番号及びプロセスノート５．９に従う適切な開封有効期限のラベルが付されていることを確認した。
８．４．２９  １Ｌ移送パックを用意した。ＢＳＣの外で、ステップ８．４．２２で準備した「ＣＭ２  １１日目培地」バッグに取り付けられた移送セットに１Ｌ移送パックを溶接（プロセスノート５．１１に従う）した。「フィーダー細胞ＣＭ２」及びロット番号を移送パックにラベル付けした。
８．４．３０  １Ｌ移送パックを用意した。バッグから数インチ離れた場所に１Ｌの移送パックチューブのチューブに、マークを付けた。チューブがマークの位置までスケール上にあるように、空の移送パックをスケールの上に置いた。
８．４．３１  スケールを風袋引きした。スケールを風袋引きし、スケールに空の移送パックを置いた。
８．４．３２  フィーダー細胞移送パックを準備した。Baxaポンプを「中」及び「４」に設定する。ステップ８．４．２２で調製した「完全ＣＭ２  １１日目」培地５００．０±５．０ｍＬを細胞ＣＭ２培地移送パックに注入した。重量で測定し、移送パックに追加された完全ＣＭ２培地の体積を記録した。
８．４．３３  ラインをヒートシールした。充填したら、プロセスノート５．１２に従いラインをヒートシールした。フィーダー細胞培地移送パックから移送セット付きのＣＭ２  １１日目の培地バッグを離し、１Ｌ移送パックに溶接したままにした。
８．４．３４  該当する場合：フィーダー細胞培地移送パックをインキュベートした。該当する場合、ステップ８．６．６で使用するまで、「フィーダー細胞ＣＭ２培地」移送パックをインキュベーターに入れた。
８．４．３５  完全ＣＭ２  １１日目培地をインキュベートした。ステップ８．４．２２で調製した「完全ＣＭ２  １１日目培地」をステップ８．７．２で使用するまでインキュベーターに入れた。
８．４．３６  セクション８．４をレビューした。
８．５  １１日目−ＴＩＬ回収
８．５．１  前処理表。インキュベーターをモニターした。インキュベーターのパラメータ：温度ＬＥＤディスプレイ：３７．０±２．０℃；ＣＯ２パーセンテージ：５．０±１．５％  ＣＯ２。
注記：セクション８．５は、セクション８．４及び８．６と同時に実行され得る。
８．５．２  インキュベーターからG-Rex100MCSを取り出した。G-Rex100MCSをインキュベーターから取り外す前に、インキュベーションパラメータが満たされていることを確認するための以下のチェックを実施した。ステップ８．３．４４Ｂからの下限。ステップ８．３．４４Ｃからの上限。
インキュベーターからの取り出し時間を記録した。以下を決定した：８．３．４４Ｂ≦インキュベーターからの取り出し時間＜ステップ８．３．４４Ｃか？＊いいえの場合、エリア管理者に連絡する。インキュベーターからG-Rex 100MCSを慎重に取り外し、大きいフィルターラインを除く全てのクランプを閉じたことを確認した。処理開始時間が記録された。
８．５．３  ３００ｍＬの移送パックを準備した。３００ｍＬ移送パックに「ＴＩＬ懸濁液」のラベルを付けた。
８．５．４  ３００ｍＬの移送パックを準備した。重力血液フィルターのＴＩＬ懸濁液移送（シングルライン）を滅菌溶接（プロセスノート５．１１に従う）した。例えば、図１２９を参照。
８．５．５  ３００ｍＬの移送パックを準備した。３００ｍＬ移送パックをはかりに置き、乾燥重量を記録した。
８．５．６  １Ｌ移送パックを用意した。１Ｌ移送パックに「上清」及びロット番号でラベル付けした。
８．５．７  G-Rex100MCSへ移送パックを溶接した。G-Rex100MCSからの赤い培地取り出しラインを「上清」移送パックに滅菌溶接（プロセスノート５．１１に従う）した。ステップ８．５．４で準備した「ＴＩＬ懸濁液」移送パックに接続された血液フィルターの上部の２つのスパイクラインの１つにG-Rex100MCSからの透明細胞取り出しラインを滅菌溶接した。例えば、図１３０を参照。
８．５．８  GatheRexのセットアップ。G-Rex100MCSをGatheRexの左側に配置し、「上清」及び「ＴＩＬ懸濁液」移送パックを右側に配置した。
８．５．９  GatheRexのセットアップ。G Rex100MCSから赤い培地取り出しラインをGatheRexのクランプ上部（赤い線でマーク）及びチューブガイドに取り付けた。G-Rex100MCSからのクリアハーベストラインをGatheRexのクランプ底部（青い線でマーク）及びチューブガイドに取り付けた。
８．５．１０  GatheRexのセットアップ。GatheRexからG-Rex100MCSフラスコの滅菌フィルターにガスラインを取り付けた。注記：G-Rex100MCSフラスコから上清を除去する前に、細胞取り出しラインの全てのクランプが閉じていることを確認した。
８．５．１１  G-Rex100MCSの減容。G-Rex100MCSから１Ｌ移送パックに約９００ｍＬの培地上清を移した。フラスコが水平であり、吸引ディップチューブの端まで培地が減少していることを確認するためにG-Rex100MCSフラスコを目視で検査する。注記：Gatherexが途中で停止した場合、右向きの矢印があるボタンを再度押して再起動させた。
８．５．１２  ＴＩＬ回収用にフラスコを準備する。上清を取り除いた後、赤いラインへのクランプを全て閉じた。
８．５．１３  ＴＩＬ回収の開始。ＴＩＬ回収開始時間を記録した。
８．５．１４  ＴＩＬ回収の開始。フラスコを激しく叩いて細胞を遊離させるために培地を回旋した。全ての細胞が離れたことを確認するためにフラスコの検査を実施した。注記：細胞が離れなかった場合、エリア管理に連絡した。
８．５．１５  ＴＩＬ回収の開始。収集チューブから離してフラスコを傾け、腫瘍片を縁に沿って沈降させる。断片がフラスコの反対側に残るように、収集チューブに向かってゆっくりとフラスコを傾けた。注記：細胞収集ストローが壁面及び底膜の接合部にない場合、ストローを適切に配置するには、通常、４５°の角度でフラスコを傾けたまま軽く叩くのみで十分である。
８．５．１６  ＴＩＬを回収した。ＴＩＬ懸濁液移送パックにつながる全てのクランプを解放した。
８．５．１７  ＴＩＬを回収した。GatheRexを使用して、血液フィルターから細胞懸濁液を３００ｍＬ移送パックに移した。注記：全ての細胞と培地が収集されるまで、エッジを傾斜し続けることを確認する。
８．５．１８  ＴＩＬを回収した。付着した細胞について膜を検査した。
８．５．１９  フラスコ膜をすすいだ。G-Rex100MCSの底をすすいだ。ガス交換膜の約１／４をリンス培地で覆う。注記：腫瘍片が回収ラインを妨害する場合、細胞収集ラインの「Ｘ」を押して収集を一時停止する。Gatherexの「クランプ解放」ボタンを押し、移送パックを持ち上げ、断片が取り出されるまで圧力を上げながら穏やかに圧迫する。ライン又はバッグが破裂する可能性があるため、バッグを強く圧迫しすぎない。障害物が取り除かれたら、収集を再開する。
８．５．２０  G-Rex100MCSのクランプを閉じた。全てのクランプが閉じていることを確認した。
８．５．２１  ヒートシールした。チューブ全体の長さがほぼ同じになるように、できる限り溶接部の近くでＴＩＬ懸濁液移送パックをヒートシール（プロセスノート５．１２に従う）した。
８．５．２２  ヒートシールした。プロセスノート５．１２に従い、「上清」移送パックをヒートシールした。溶接のための十分なラインを維持した。
８．５．２３  ＴＩＬ懸濁液の体積を計算した。ＴＩＬ懸濁液移送パックの質量記録し、細胞懸濁液の体積を計算した。
８．５．２４  サンプリング用に上清移送パックを準備した。４インチ血漿移送セットを「上清」移送パックに溶接（プロセスノート５．１１に従う）し、４インチ血漿移送セットのルアー接続を保持し、ＢＳＣに移した。
８．５．２５  サンプリング用にＴＩＬ懸濁液移送パックを準備した。４インチ血漿移送セットを３００ｍＬの「ＴＩＬ懸濁液」移送パックに溶接（プロセスノート５．１１に従う）し、４インチ血漿移送セットのルアー接続を保持し、ＢＳＣに移した。
８．５．２６  Bac-Tサンプルを引き上げた。ＢＳＣ中で、適切なサイズのシリンジを使用して、１Ｌの「上清」移送パックから約２０．０ｍＬの上清を吸い上げ、「Bac-T」とラベル付けした滅菌５０ｍＬコニカルチューブに分注する。ステップ８．５．２７で使用するためにＢＳＣ中に保管する。
８．５．２７  サンプルプランごとにＢａｃＴを接種した。適切なサイズのシリンジを使用して、ステップ８．５．２６で調製したＢａｃＴとラベル付けされた５０ｍＬのコニカルから１．０ｍＬのサンプルを取り出し、嫌気性ボトルに播種した。ボトルのラベルに提供されたスペースを使用して、ボトルに接種された時間を記録した。好気性ボトルについて上記を繰り返した。注記：このステップは、順番どおりでなく実施され得る。
８．５．２８  サンプルにラベルを付し、保存した。サンプルプランの在庫ラベルでラベルを付し、サンプルプランに従う試験用にログインのために送信されるまで、Bac-Tサンプルを室温で、光から保護して保存した。注記：ボトルのバーコードをラベルで覆わないようにした。
８．５．２９  サンプリングのためにサインした。サンプルを取り出すためのＬＩＭＳサンプルプランシートが完成していることを確認した。
８．５．３０  ＴＩＬ細胞カウントサンプル。バイアル番号（１〜４）と４つのクライオバイアルにラベル付けした。別の３ｍＬシリンジを使用して、ルアー接続を使用してＴＩＬ懸濁液移送パックから４×１．０ｍＬの細胞カウントサンプルを引き出し、それぞれのクライオバイアルに入れた。
８．５．３１  ルアー接続を閉じた。ラインに赤いキャップ（Ｗ３０１２８４５）を取り付けた。
８．５．３２  ＴＩＬをインキュベートした。必要になるまで、ＴＩＬ移送パックをインキュベーターに入れた。
８．５．３３  細胞カウントを実施する。NC-200及びプロセスノート５．１４を使用して、細胞カウント及び計算を実行する。希釈していない初期細胞カウントを実行した。
８．５．３４  細胞カウントサンプル体積を記録した。注記：希釈が不要な場合、「サンプル［μＬ］」＝２００、「希釈［μＬ］」＝０。
８．５．３５  増倍係数を決定した。総細胞カウントサンプル体積：８．５．３４Ａ＋８．５．３４Ｂ。増倍係数Ｃ÷８．５．３４Ａ。
８．５．３６  プロトコルを選択し、増倍係数を入力した。「生細胞カウントアッセイ」プロトコルが選択され、全ての増倍係数、サンプル及び希釈剤の体積が入力されていることを確認した。注記：希釈が不要な場合、「サンプル［μＬ］」＝２００、「希釈［μＬ］」＝０と入力する。
８．５．３７  Nucleoviewからファイル名、生存率及び細胞カウントを記録した。
８．５．３８  生細胞濃度の平均と実施された細胞カウントの生存率を決定した。生存率（８．５．３７Ａ＋８．５．３７Ｂ）÷２。生細胞濃度（８．５．３７Ｃ＋８．５．３７Ｄ）÷２
８．５．３９  カウントの上限及び下限を決定した。下限：８．５．３８Ｆ×０．９。上限：８．５．３８Ｆ×１．１。
８．５．４０  両方のカウントは許容範囲内であったか？下限：８．５．３７Ｃ及びＤ≧８．５．３９Ｇ。上限：８．５．３７Ｃ及びＤ≦８．５．３９Ｈ。＊いずれかの結果が「いいえ」の場合、ステップ８．５．４１〜８．５．４８で２番目のカウントのセットを実施した＊。
８．５．４１  該当する場合：細胞カウントを実施した。NC-200及びプロセスノート５．１４を使用して、細胞カウント及び計算を実行した。注記：希釈は、期待される細胞濃度に基づいて調整された。実施した。
８．５．４２  該当する場合：細胞カウントサンプル体積を記録した。
８．５．４３  該当する場合：増倍係数を決定した。総細胞カウント試料体積：８．５．４２Ａ＋８．５．４２Ｂ。増倍係数  Ｃ÷８．５．４２Ａ  Ｄ
８．５．４４  該当する場合：プロトコルを選択し、増倍係数を入力した。「生細胞カウントアッセイ」プロトコルが選択され、全ての増倍係数、サンプル及び希釈剤の体積が入力されたことを確認した。注記：希釈が不要な場合、「サンプル［μＬ］」＝２００、「希釈［μＬ］」＝０と入力する。
８．５．４５  該当する場合：Nucleoviewから細胞カウントを記録した。
８．５．４６  該当する場合：生細胞濃度の平均と実施された細胞カウントの生存率を決定した。平均生細胞濃度を決定した。
８．５．４７  該当する場合：カウントの上限及び下限を決定した。下限：８．５．４６Ｆｘ０．９。上限：８．５．４６Ｆｘ１．１。
８．５．４８  該当する場合：カウントは許容範囲内であったか？下限：８．５．４５Ｃ及びＤ≧８．５．４７Ｇ。上限：８．５．４５Ｃ及びＤ≦８．５．４７Ｈ。注記：いずれかの結果が「いいえ」の場合、ステップ８．５．４９に進んで平均を決定する。
８．５．４９  該当する場合：実施された４カウント全てから平均生細胞濃度を決定した。平均生細胞濃度（Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ）÷４＝平均
８．５．５０  ＴＩＬ懸濁液の体積を調整した。細胞カウントサンプルを取り出した後のＴＩＬ懸濁液の調整された体積を計算する。ステップ８．５．２３Ｃ（Ａ）からの総ＴＩＬ細胞体積。取り出された細胞カウントサンプルの体積（４．０ｍｌ）（Ｂ）、調整された総ＴＩＬ細胞体積Ｃ＝Ａ−Ｂ。
８．５．５１  総生存ＴＩＬ細胞を計算した。平均生細胞濃度＊：８．５．３８Ｆ＊又は８．５．４６Ｆ＊又は＊８．５．４９Ｅ＊；総体積：８．５．５０；総生細胞：Ｃ＝Ａ×Ｂ。＊生細胞濃度を決定するために循環参照ステップを使用した。注記：総生存ＴＩＬ細胞が５×１０６細胞未満の場合、エリア管理者に連絡し、ステップ８．７．１に進む。総生存ＴＩＬ細胞が５×１０６を超える場合、ステップ８．５．５２に進む。
８．５．５２  フローサイトメトリーで計算。ステップ８．５．５１Ｃからの総生存ＴＩＬ細胞カウントが４．０×１０７以上の場合、フローサイトメトリーサンプル用に１．０×１０７個の細胞を得るために体積を計算した。＊細胞が４．０ｘ１０７未満である場合、表の残りのフィールドはＮ／Ａとする。ステップ８．７．１に進む。フローサイトメトリーに必要な総生細胞：１．０×１０７個の細胞。フローサイトメトリーに必要な細胞の体積：８．５．５１からの生細胞濃度を１．０×１０７細胞Ａで割った値。
８．５．５３  該当する場合：インキュベーターからＴＩＬを取り出した。インキュベーターからＴＩＬ懸濁液を取り出し、ステップ８．５．３２のインキュベーション終了時間を記録した。
８．５．５４  該当する場合：サンプルプランに従いフローサイトメトリーサンプルを取り出した。適切なサイズのシリンジを使用して、表現型サンプルの計算された体積（８．５．５２Ｃ）をＴＩＬ懸濁液移送パックから取り出し、５０ｍＬコニカルチューブに入れる。
８．５．５５  該当する場合：フローサイトメトリーサンプルにラベルを付し、保存した。サンプルプラン在庫ラベルとラベル付けし、サンプリングプランに従い試験用にログインのために提出するまで、フローサイトメトリーサンプルを２〜８℃で保存した。
８．５．５６  サンプリングのためにサインした。サンプルを取り出すためのＬＩＭＳサンプルプランシートが完成していることを確認する。
８．５．５７  該当する場合：総生細胞及び体積のフローを再計算した。以下のサイトメトリーのサンプルを除去した後の残りの総生細胞と残りの体積を計算した。
【１０４７】
【表６７】
2021519582.tif 000071
【１０４８】
８．５．５８  該当する場合：ＴＩＬ体積を計算した。２．０×１０８の生細胞に等しいＴＩＬ懸濁液の体積を計算した。
【１０４９】
【表６８】
2021519582.tif 000072
【１０５０】
８．５．５９  該当する場合：取り出すＴＩＬ体積を計算した。取り出すＴＩＬ細胞の過剰体積を計算する。
【１０５１】
【表６９】
2021519582.tif 000073
【１０５２】
８．５．６０  該当する場合：過剰のＴＩＬを取り出した。ＢＳＣ中で、適切なサイズのシリンジを使用して、ＴＩＬ懸濁液移送パックから計算された体積（ステップ８．５．５９Ｃ）を取り出した。注記：シリンジを複数回使用しない。該当する場合、複数のシリンジを使用する。適切なサイズの滅菌容器に入れ、日付及びロット番号のラベルを付す。「ＴＩＬ懸濁液」移送パックラインに赤いキャップを取り付けた。
８．５．６１  該当する場合：ＴＩＬをインキュベーターに入れた。必要になるまで、ＴＩＬ懸濁液移送パックをインキュベーターに入れた。時間を記録した。
８．５．６２  該当する場合：計算。取り出された総過剰ＴＩＬを計算した。
ステップ８．５．５１Ａ  ステップ８．５．５９Ｃからの取り出すＴＩＬの体積  取り出された総過剰ＴＩＬを計算した。
【１０５３】
【表７０】
2021519582.tif 000074
【１０５４】
８．５．６３  該当する場合：計算。ステップ８．５．６２Ｃからの過剰のＴＩＬ細胞に添加するＣＳ−１０培地の量を計算した。凍結のための目標細胞濃度は１．０×１０８細胞／ｍｌである。
【１０５５】
【表７１】
2021519582.tif 000075
【１０５６】
８．５．６４  該当する場合：過剰のＴＩＬを遠心分離した。過剰のＴＩＬ細胞懸濁液を遠心分離した。速度：３５０ｘｇ。時間：１０：００分。温度：環境
ブレーキ：フル（９）。加速：フル（９）。
８．５．６５  該当する場合：コニカルチューブを観察した。観察を記録した：沈殿物が観察されたか？上清は透明であったか？＊注記：いずれかの答えが「いいえ」の場合、エリア管理者に連絡する。
８．５．６６  該当する場合：ＣＳ−１０を追加した。ＢＳＣにて、無菌的に上清を吸引した。チューブの底を軽く叩き、残った流体に細胞を再懸濁した。
８．５．６７  該当する場合：ＣＳ−１０を追加した。ステップ８．５．６３Ｃで計算した体積のＣＳ１０をゆっくりと添加する。
８．５．６８  該当する場合：バイアルにラベルを付した。バイアルにＱＡ提供のラベルを付した。サンプルラベルを添付した。
８．５．６９  該当する場合：バイアルを充填した。適切なサイズのクライオバイアルに１．０ｍＬの細胞懸濁液を分注した。注記：１０本を超える過剰ＴＩＬのバイアルを充填しなかった。
８．５．７０  該当する場合：バイアルを充填した。SOP-00242に従い、適切なサイズのクライオバイアルに残りの体積を分注した。体積が０．５ｍＬ以下の場合、体積が０．５ｍＬになるまでＣＳ１０をバイアルに追加する。
８．５．７１  該当する場合：バイアルを充填した。１つのバイアルに１．０ｍＬのＣＳ１０を充填し、「ブランク」のラベルを付す。
８．５．７２  該当する場合：充填されたバイアルの数を記録した。以下に充填されたバイアルの数（ブランクを含まない）を記録した。
８．５．７３  該当する場合：環境モニタリング。処理後、ＢＳＣを検証し、担当者によるモニタリングが実施された。
サンプルのＴＩＬ凍結保存
８．５．７４  該当する場合：凍結保存のための体積を計算した。凍結保存用に１×１０７個の細胞を得るために必要な細胞の体積を計算した。
【１０５７】
【表７２】
2021519582.tif 000076
【１０５８】
８．５．７５  該当する場合：凍結保存用のサンプルを取り出した。ＢＳＣ中で、適切なサイズのシリンジを使用して、ＴＩＬ懸濁液移送パックから計算された体積（ステップ８．５．７４Ｃ）を取り出した。適切なサイズのコニカルチューブに入れ、「凍結保存サンプル１×１０７細胞」、日付及びロット番号をラベル付けした。ＴＩＬ懸濁液移送パックに赤いキャップ（Ｗ３０１２８４５）を取り付けた。
８．５．７６  該当する場合：ＴＩＬをインキュベーターに入れた。必要になるまで、ＴＩＬ懸濁液移送パックをインキュベーターに入れた。
８．５．７７  該当する場合：凍結保存サンプル。次のパラメータに従って「凍結保存サンプル１×１０７細胞」を遠心分離した。
速度：３５０×ｇ、時間：１０：００分、温度：外気温度、ブレーキ：フル（９）；加速：フル（９）。
注記：遠心分離機の速度及び時間に適切な単位が設定されていることを確認する。
８．５．７８  該当する場合：コニカルチューブを観察した。観察を記録した：沈殿物が観察されたか？上清は透明であるか？＊注記：いずれかの答えが「いいえ」の場合、エリア管理者に連絡する。
８．５．７９  該当する場合：ＣＳ−１０を追加した。ＢＳＣにて、無菌的に上清を吸引した。チューブの底を軽く叩き、残った流体に細胞を再懸濁した。
８．５．８０  該当する場合：ＣＳ−１０を追加した。ゆっくりと添加した。０．５ｍＬのＣＳ１０。追加した体積を記録した。
８．５．８１  該当する場合：バイアルにラベルを付した。バイアルにＱＡ発行のラベルを付した。
８．５．８２  該当する場合：バイアルを充填した。再懸濁した体積をラベル付きクライオバイアルに分注した。
８．５．８３  該当する場合：ブランクを充填した。別のバイアルに０．５ｍＬのＣＳ１０を充填し、「ブランク」のラベルを付した。
８．５．８４  該当する場合：充填したバイアルの数（「ブランク」を含まない）を記録した。凍結保存サンプルバイアルは、約０．５ｍＬで充填した。
８．５．８５  該当する場合：環境モニタリング。処理後、ＢＳＣを検証し、担当者によるモニタリングが実施された。
８．５．８６  セクション８．５をレビューする。
８．６  １１日目−フィーダー細胞
８．６．１  フィーダー細胞を入手した。ＬＮ２冷凍庫から少なくとも２つの異なるロット番号を有するフィーダー細胞のバッグを３つ入手した。解凍の準備ができるまで、ドライアイス上に細胞を置いた。注記：セクション８．６はセクション８．５と同時に実行することができた。
８．６．２  フィーダー細胞を入手した。フィーダー細胞情報を記録した。少なくとも２つの異なるロッ番号のフィーダー細胞が得られたことを確認した。
８．６．３  ウォーターバス又はCryothermを準備した。フィーダー細胞の解凍のために、ウォーターバス又はCytothermを準備した。
８．６．４  フィーダー細胞を解凍した。フィーダー細胞バッグをロット番号に基づいて個々のジップトップバッグに入れ、３７．０±２．０℃のウォーターバス又はCytothermで約３〜５分又は氷が消えるまで解凍した。タイマーからの以下の解凍時間を記録した。
８．６．５  フィーダー細胞ハーネスの準備。4S-4M60をCC2セルコネクト（Ｗ３０１２８２０）に溶接（プロセスノート５．１１に従う）し、セルコネクト装置（Ｂ）の単一スパイクを（Ｇ）で4S-4M60マニホールドの４スパイク端に置き換えた。ＨをＧに溶接した（例えば、図１３１を参照）。
８．６．６  該当する場合：インキュベーターから培地を取り出した。ステップ８．４．３４で準備したフィーダー細胞ＣＭ２培地移送パックをインキュベーターから取り出した。
８．６．７  培地移送パックを添付した。「フィーダー細胞ＣＭ２培地」移送パックをCC2ルアーに溶接（プロセスノート５．１１に従う）する。注記：バッグは、ニードルレス注入ポートを有するハーネスの側面に取り付けられた。
８．６．８  ハーネスを移す。完全ＣＭ２  １１日目培地を含む部品をＢＳＣに移した。
８．６．９  解凍したフィーダー細胞をプールする。ＢＳＣ内で、１００ｍＬシリンジに１０ｍＬの空気を引き込んだ。これを使用して、CC2の６０ｍＬシリンジを交換した。
８．６．１０  解凍したフィーダー細胞をプールする。カバーを取り外す前に、アルコールパッドでフィーダー細胞バックのポートを拭いた。CC2の３つのスパイクを使用して、３つのフィーダーバッグをスパイクする。注記：スパイクを一方向に回しながら一定の圧力を維持した。ポートの側面に穴を開けないようにする。
８．６．１１  解凍したフィーダー細胞をプールした。フィーダー細胞バッグからのラインが開き、ニードルレス注入ポートへのラインが閉じるように、活栓を開いた。
８．６．１２  解凍したフィーダー細胞をプールした。フィーダー細胞バッグの内容物をシリンジに入れた。３つのバッグは全て一度に排水された。シリンジの圧力を維持しながら、フィーダー細胞バッグから排水した時点で、フィーダー細胞バッグのラインを遮断した。
８．６．１３  フィーダー細胞の体積を記録した。下のシリンジを取り外さなかった。ハーネスからのシリンジ。シリンジ内のフィーダー細胞の総体積を記録した。
８．６．１４  移送パックにフィーダー細胞が追加された。フィーダー細胞バッグのラインが閉じ、培地移送パックのラインが開くように、活栓を回した。培地移送パックへのラインがクランプ解除されていることを確認した。
８．６．１５  移送パックにフィーダー細胞を添加した。フィーダー細胞をシリンジから「フィーダー細胞ＣＭ２培地」移送パックに分注した。フィーダー細胞を含む移送パックのラインのクランプを開放し、シリンジはハーネスに取り付けたままにした。
８．６．１６  プールしたフィーダー細胞を混合した。移送パックにプールされたフィーダー細胞を混合するためにバッグを揉んだ。
８．６．１７  移送パックにラベルを付した。「フィーダー細胞懸濁液」及びロット番号をバッグにラベル付けした。
８．６．１８  移送パック中の総体積を計算した。フィーダー細胞懸濁液の総体積を計算した。
８．６．１９  細胞カウントサンプルを取り出した。各サンプルに個別の３ｍＬシリンジを使用し、ニードルレス注入ポートを使用してフィーダー細胞懸濁液移送パックから４×１．０ｍＬの細胞カウントサンプルを引き出した。ステップ８．４．２７でラベルを付したクライオバイアルに各サンプルを分注した。注記：滅菌アルコールパッド（Ｗ３００９４８８）でニードルレス注入ポートを拭き、細胞カウントのための各サンプリング間でフィーダー細胞懸濁液を混合した。
８．６．２０  細胞カウントを実行した。NC-200及びプロセスノート５．１４を使用して、細胞カウント及び計算を実行した。０．５ｍＬの細胞懸濁液を、ロット番号及び「細胞カウント希釈用」でラベル付けされた４．５ｍＬのAIM-V培地に加えることにより、細胞カウントサンプルを希釈した。これにより１：１０希釈となる。必要に応じて調整した。
８．６．２１  細胞カウントを記録した。サンプル体積：
８．６．２２  増倍係数を決定した。
【１０５９】
【表７３】
2021519582.tif 000077
【１０６０】
８．６．２３  プロトコルを選択し、増倍係数を入力した。「生細胞カウントアッセイ」プロトコルが選択され、全ての増倍係数、サンプル及び希釈剤の体積が入力されていることを確認した。
８．６．２４  Nucleoviewからファイル名、生存率及び細胞カウントを記録した。
８．６．２５  生細胞濃度の平均と実施された細胞カウントの生存率を決定した。
【１０６１】
【表７４】
2021519582.tif 000078
【１０６２】
８．６．２６  カウントの上限及び下限を決定した。
【１０６３】
【表７５】
2021519582.tif 000079
【１０６４】
８．６．２７  両方のカウントは許容範囲内であったか？
【１０６５】
【表７６】
2021519582.tif 000080
【１０６６】
注記：いずれかの結果が「いいえ」の場合、ステップ８．６．２８〜８．６．３５で２番目のカウントのセットを実施した。
８．６．２８  該当する場合：細胞カウントを実施した。ＳＯＰ−００３１４に従い、NC-200及びプロセスノート５．１４を使用して、細胞カウント及び計算を実施する。注記：希釈は、期待される細胞濃度に基づいて調整することができた。
８．６．２９  該当する場合：細胞カウント、サンプル体積を記録した。注記：希釈が不要な場合、「サンプル［μＬ］」＝２００、「希釈［μＬ］」＝０と入力する。
８．６．３０  該当する場合：増倍係数を決定した。
【１０６７】
【表７７】
2021519582.tif 000081
【１０６８】
８．６．３１  プロトコルを選択し、増倍係数を入力する。「生細胞カウントアッセイ」プロトコルが選択され、全ての増倍係数、サンプル及び希釈剤の体積が入力されたことを確認する。注記：希釈が不要な場合、「サンプル［μＬ］」＝２００、「希釈［μＬ］」＝０と入力する。
８．６．３２  該当する場合：Nucleoviewから細胞カウントを記録した。
８．６．３３  該当する場合：生細胞濃度の平均と実施された細胞カウントの生存率を決定した。
【１０６９】
【表７８】
2021519582.tif 000082
【１０７０】
８．６．３４  該当する場合：カウントの上限及び下限を決定した。
【１０７１】
【表７９】
2021519582.tif 000083
【１０７２】
８．６．３５  該当する場合：カウントは許容範囲内であったか？
【１０７３】
【表８０】
2021519582.tif 000084
【１０７４】
注記：  いずれかの結果が「いいえ」の場合、ステップ８．６．３６に進んで、平均総生細胞濃度を求め、計算を進めた。
８．６．３６  該当する場合：実施された４カウント全てから平均生細胞濃度を決定した。
８．６．３７  フィーダー細胞懸濁液の体積を調整した。細胞カウントサンプルを取り出した後のフィーダー細胞懸濁液の調整された体積を計算した。ステップ８．６．１８Ｃからの総フィーダー細胞体積マイナス４．０ｍｌを取り出した。
８．６．３８  総生存フィーダー細胞を計算した。
【１０７５】
【表８１】
2021519582.tif 000085
【１０７６】
総生細胞が５×１０９未満の場合、ステップ８．６．３９に進む。総生細胞が５×１０９以上の場合、ステップ８．５．７０に進む。
８．６．３９  該当する場合：追加的なフィーダー細胞を入手した。ＬＮ２冷凍庫からフィーダー細胞の追加バッグを入手した。解凍の準備ができるまで、ドライアイス上に細胞を置いた。
８．６．４０  該当する場合：追加的なフィーダー細胞を入手した。フィーダー細胞情報を記録した。
８．６．４１  該当する場合：追加的なフィーダー細胞を解凍した。４番目のフィーダー細胞バッグをジップトップバッグに入れ、３７．０±２．０℃のウォーターバス又はcytothermで約３〜５分又は氷が消えるまで解凍した。解凍時間を記録した。
８．６．４２  該当する場合：追加的なフィーダー細胞をプールした。ＢＳＣ中で、新しい１００ｍＬシリンジに１０ｍＬの空気を引き込んだ。これを使用してハーネス上のシリンジを交換した。
８．６．４３  該当する場合：追加的なフィーダー細胞をプールした。カバーを取り外す前に、アルコールパッドでフィーダー細胞バックのポートを拭いた。ステップ８．６．７で準備したハーネスの残りのスパイクの１つを使用して、フィーダー細胞バッグをスパイクした。注記：スパイクを一方向に回しながら一定の圧力を維持した。ポートの側面に穴を開けないようにした。
８．６．４４  該当する場合：追加的なフィーダー細胞をプールした。フィーダー細胞バッグからのラインが開き、ニードルレス注入ポートへのラインが閉じるように、活栓を開いた。
８．６．４５  該当する場合：追加的なフィーダー細胞をプールした。フィーダー細胞バッグの内容物をシリンジに吸い上げた。体積を記録した。
８．６．４６  該当する場合：体積を測定した。シリンジ内のフィーダー細胞の体積を測定し、以下に記録した（Ｂ）。フィーダー細胞の新しい総体積を計算した。
【１０７７】
【表８２】
2021519582.tif 000086
【１０７８】
８．６．４７  該当する場合：移送パックにフィーダー細胞を添加した。活栓を回し、フィーダー細胞バッグのラインを閉じ、「フィーダー細胞懸濁液」移送パックへのラインを開けた。移送パックへのラインのクランプが外されていることを確認した。フィーダー細胞をシリンジから「フィーダー細胞懸濁液」移送パックに分注した。ラインを移送パックにクランプし、シリンジをハーネスに取り付けたままにした。
８．６．４８  該当する場合：移送パックにフィーダー細胞を添加した。フィーダー細胞懸濁液移送パック中のプールされたフィーダー細胞を混合するためにバッグを揉んだ。
８．６．４９  該当する場合：希釈物を調製した。ＢＳＣ中で、「細胞カウント希釈用」とロット番号でラベル付けされた４．５ｍＬのAIM-V培地を４本の１５ｍＬコニカルチューブに添加する。ロット番号とチューブ番号（１〜４）をチューブにラベル付けをする。４つのクライオバイアルに「追加的なフィーダー」及びバイアル番号（１〜４）のラベルを付した。
８．６．５０  該当する場合：細胞カウントを準備した。各サンプルに個別の３ｍＬシリンジを使用し、ニードルレス注入ポートを使用して、フィーダー細胞懸濁液移送パックから４×１．０ｍＬの細胞カウントサンプルを取り出した。ステップ８．６．４９でラベルを付したクライオバイアルに各サンプルを分注した。注記：滅菌アルコールパッドでニードルレス注入ポートを拭き、細胞カウントのための各サンプリング間でフィーダー細胞懸濁液を混合した。
８．６．５１  該当する場合：細胞カウントを実行した。NC-200及びプロセスノート５．１４を使用して、細胞カウント及び計算を実行した。０．５ｍＬの細胞懸濁液を、ロット番号及び「細胞カウント希釈用」でラベル付けされた４．５ｍＬのAIM-V培地に加えることにより、細胞カウントサンプルを希釈した。これにより１：１０希釈となる。必要に応じて調整した。
８．６．５２  該当する場合：細胞カウントサンプル体積を記録した。
８．６．５３  該当する場合：増倍係数を決定した。
【１０７９】
【表８３】
2021519582.tif 000087
【１０８０】
８．６．５４  該当する場合：プロトコルを選択し、増倍係数を入力した。「生細胞カウントアッセイ」プロトコルが選択され、全ての増倍係数、サンプル及び希釈剤の体積が入力されていることを確認した。
８．６．５５  該当する場合：Nucleoviewからファイル名、生存率及び細胞カウントを記録した。
８．６．５６  該当する場合：実施された細胞カウントの生細胞濃度の平均及び生存率を決定する。
【１０８１】
【表８４】
2021519582.tif 000088
【１０８２】
８．６．５７  該当する場合：カウントの上限及び下限を決定する。
【１０８３】
【表８５】
2021519582.tif 000089
【１０８４】
両方のカウントは許容範囲内であるか？注記：いずれかの結果が「いいえ」の場合、ステップ８．５．５９〜８．５．６５で２番目のカウントのセットを実施する。
８．６．５９  該当する場合：細胞カウントを実施した。NC-200及びプロセスノート５．１４を使用して、細胞カウント及び計算を実行した。注記：希釈は、期待される細胞濃度に基づいて調整することができた。
８．６．６０  該当する場合：細胞カウントサンプル体積を記録した。注記：希釈が不要な場合、「サンプル［μＬ］」＝２００、「希釈［μＬ］」＝０と入力した。
８．６．６１  該当する場合：増倍係数を決定した。
【１０８５】
【表８６】
2021519582.tif 000090
【１０８６】
８．６．６２  該当する場合：プロトコルを選択し、増倍係数を入力する。「生細胞カウントアッセイ」プロトコルが選択され、全ての増倍係数、サンプル及び希釈剤の体積が入力されていることを確認する。
注記：希釈が不要な場合、「サンプル［μＬ］」＝２００、「希釈［μＬ］」＝０と入力した。
８．６．６３  該当する場合：Nucleoviewから細胞カウントを記録した。
８．６．６４  該当する場合：生細胞濃度の平均と実施された細胞カウントの生存率を決定した。
【１０８７】
【表８７】
2021519582.tif 000091
【１０８８】
８．６．６５  該当する場合：カウントの上限及び下限を決定した
【１０８９】
【表８８】
2021519582.tif 000092
【１０９０】
８．６．６６  該当する場合：カウントは許容範囲内であったか？
【１０９１】
【表８９】
2021519582.tif 000093
【１０９２】
注記：いずれかの結果が「いいえ」の場合、ステップ８．６．６７に進んで、平均総生細胞濃度を求め、計算を進めた。
８．６．６７  該当する場合：実施された４カウント全てから平均生細胞濃度を決定した。
８．６．６８  該当する場合：フィーダー細胞懸濁液の体積を調整した。細胞カウントサンプルを取り出した後のフィーダー細胞懸濁液の調整された体積を計算した。ステップ８．６．４６Ｃからの総フィーダー細胞体積マイナス４．０ｍＬを取り出した。
８．６．６９  該当する場合：総生存フィーダー細胞を計算した。
【１０９３】
【表９０】
2021519582.tif 000094
【１０９４】
８．６．７０  フィーダー細胞の体積を計算した。生存可能な５×１０９のフィーダー細胞を得るために必要なフィーダー細胞懸濁液の体積を計算した。
【１０９５】
【表９１】
2021519582.tif 000095
【１０９６】
８．６．７１  過剰のフィーダー細胞の体積を計算した。取り出す過剰分のフィーダー細胞の体積を計算した。最も近い整数に切り捨て。
【１０９７】
【表９２】
2021519582.tif 000096
【１０９８】
８．６．７２  過剰のフィーダー細胞を取り出した。新しい１００ｍＬシリンジで、１０ｍＬの空気を吸い上げ、シリンジをハーネスに取り付けた。
８．６．７３  過剰のフィーダー細胞を取り出した。「フィーダー細胞懸濁液」移送パックへのラインを開いた。シリンジを使用して、ステップ８．６．７１Ｃで計算されたフィーダー細胞の体積と移送パックからの追加的な１０．０ｍＬを１００ｍＬシリンジに入れた。フィーダー細胞の体積を取り出したら、フィーダー細胞懸濁液移送パックのラインを閉じた。最終シリンジは取り外さなかった。注記：シリンジが満たされたら、新しいシリンジと交換した。複数のシリンジを使用して、総体積を取り出した。新しいシリンジごとに、１０ｍＬの空気を引き込んだ。
８．６．７４  体積を記録した。取り出されたフィーダー細胞の総体積（追加的な１０ｍＬを含む）を記録した。
８．６．７５  ＯＫＴ３を加えた。ＢＳＣ中で、１．０ｍＬシリンジと１６Ｇ針を使用して、０．１５ｍＬのＯＫＴ３を吸い上げた。
８．６．７６  ＯＫＴ３を加えたシリンジから針を無菌的に取り外し、シリンジをニードルレス注入ポートに取り付けた。ＯＫＴ３を注入した。
８．６．７７  ＯＫＴ３を加えた「フィーダー細胞懸濁液」移送パックの活栓を開き、ステップ８．６．７３で取り出したフィーダー細胞１０ｍＬを追加して、ラインを通してＯＫＴ３を洗い流した。
８．６．７８  ＯＫＴ３を加えたシリンジを逆さまにして、空気を押し通してフィーダー細胞懸濁液移送パックへのラインをクリアにした。
８．６．７９  ＯＫＴ３を加えた残りのフィーダー細胞懸濁液をシリンジに残した。全てのクランプを閉じ、ハーネスをＢＳＣから取り外した。
８．６．８０  ヒートシールした。溶接に十分なチューブを残し、フィーダー細胞懸濁液移送パックをヒートシール（プロセスノート５．１２に従う）した。ハーネスを廃棄した。
８．６．８１  セクション８．６をレビューする。
８．７  １１日目のG-Rexの充填及び播種
８．７．１  G-Rex500MCSのセットアップ。ＢＳＣの外で、梱包からG-Rex500MCSを取り出し、フラスコに亀裂やチューブにねじれがないか検査した。全てのルアー接続と閉鎖がしっかりしていることを確認した。ベントフィルターラインを除くG-Rex500MCSラインの全てのクランプを閉じた。マーカーを使用して、４．５Ｌグラデーションで線を引き込んだ。
８．７．２  インキュベーターから培地を取り出した。インキュベーターからステップ８．４．３５で調製した「完全ＣＭ２  １１日目培地」を取り出した。
８．７．３  培地を汲み上げる準備。G-Rex500MCSの赤い線を、完全ＣＭ２  １１日目培地に接続されたリピーターポンプ移送セットに溶接（プロセスノート５．１１に従う）した。
８．７．４  培地を汲み上げる準備をする。「完全ＣＭ２  １１日目培地」バッグをIVポールに掛けた。ポンプチュービングをBaxaポンプに通した。
８．７．５  G-Rex500MCSに培地を注入した。Baxaポンプを「高」及び「９」に設定する。４．５Ｌの培地をG-Rex500MCSに注入し、ステップ８．７．１のフラスコにマークされた線まで満たした。
８．７．６  ヒートシールした。ステップ８．７．３で作製した溶接部の近くにあるG-Rex500MCSの赤い線をヒートシール（プロセスノート５．１２に従う）した。
８．７．７  フラスコにラベルを付した。フラスコにサンプルに「１１日目  ＱＡ提供のプロセス内の「１１日目」ラベルを添付のラベルを付した。
８．７．８  該当する場合：フラスコをインキュベートした。ＴＩＬを播種するのを待つ間、フラスコをインキュベーターで保存した。
８．７．９  フィーダー細胞の溶接：懸濁液移送パックをフラスコへ。G-Rex500MCSの赤い線を「フィーダー細胞懸濁液」移送パックに滅菌溶接（プロセスノート５．１１に従う）した。
８．７．１０  フィーダー細胞をG-Rex500MCSに加えた。フィーダー細胞懸濁液とG-Rex500MCSとの間の全てのクランプを開き、重力供給方式によりフラスコにフィーダー細胞懸濁液を追加した。ラインが完全にクリアされていることを確認した。
８．７．１１  ヒートシールした。ステップ８．７．９で作製された溶接部の近くの赤い線をヒートシール（プロセスノート５．１２に従う）した。
８．７．１２  ＴＩＬ懸濁液移送パックをフラスコに溶接した。G-Rex500MCSの赤い線を「ＴＩＬ懸濁液」移送パックに滅菌溶接（プロセスノート５．１１に従う）する。
８．７．１３  ＴＩＬをG-Rex500MCSに追加した。ＴＩＬ懸濁液とG-Rex500MCSとの間の全てのクランプを開き、重力供給方式によりフラスコにＴＩＬ懸濁液を追加した。ラインが完全にクリアされていることを確認した。
８．７．１４  ヒートシールした。ステップ８．７．１２で作製された溶接部の近くの赤い線をヒートシール（プロセスノート５．１２に従う）して、ＴＩＬ懸濁液バッグを取り外した。
８．７．１５  G-Rex500MCSをインキュベートした。大きいフィルターラインを除き、G-Rex 500MCSの全てのクランプが閉じていることを確認し、インキュベーターに置いた。インキュベーターのパラメータ：温度ＬＥＤディスプレイ：３７．０±２．０℃；ＣＯ２パーセント：５．０±１．５％  ＣＯ２。
８．７．１６  インキュベーションウィンドウを計算した。インキュベーション１６日目にG-Rex500MCSを取り出す適切な時間を決定するための計算を実行した。インキュベーション時間（ステップ８．７．１５）。下限：インキュベーション時間＋１０８時間。上限：インキュベーション時間＋１３２時間。
８．７．１７  環境モニタリング。処理後、ＢＳＣを検証し、担当者によるモニタリングが実施された。
８．７．１８  サンプルを提出する。ログインのためにサンプルを提出する。
８．７．１９  セクション８．７をレビューする。
８．８  １１日目、過剰ＴＩＬ凍結保存
８．８．１  該当する場合：過剰なＴＩＬバイアルを冷凍した。凍結する前にＣＲＦがセットアップされたことを確認した。凍結保存を実施する。
８．８．２  該当する場合：ＣＲＦを開始した。ＣＲＦに配置されたバイアルの総数（ブランクを含まない）を記録した。ＣＲＦに移送されたバイアルの数が、ステップ８．５．７２又はステップ８．５．８４で準備したバイアルの総数と一致することを確認する。
ステップ８．５．７２Ｃ又はステップ８．５．８４
８．８．３  該当する場合：凍結プロファイルの自動化部分を開始した。凍結プロファイルの自動化部分の開始の開始時間を記録した。
８．８．４  該当する場合：バイアルを制御速度冷凍庫から適切な保存場所に移送した。冷却が完了したら、バイアルをＣＲＦから適切な保存容器に移す。
８．８．５  該当する場合：バイアルを適切な保存場所に移した。ＬＮ２中の保存場所を記録した。
８．８．６  セクション８．８をレビューする。
８．９  １６日目培地の調製
８．９．１  事前に温められたAIM-V培地。使用の少なくとも１２時間前までに２〜８℃から３つのＣＴＳ  AIM V  １０Ｌ培地バッグを取り外し、光から保護して室温に置いた。各バッグが有効期限内であることを確認する。各バッグに、バッグ番号（１〜３）、ロット番号、日付及び「加温開始時間ＨＨＭＭ」のラベルを付した。温め開始時刻と日付の記録。
８．９．２  ステップ８．９．１からの培地が温められる時間を計算した。ステップ８．９．１からの培地バッグ１、２及び３の加温時間を計算した。全てのバッグが１２〜２４時間温められていることを確認した。
８．９．３  部屋の衛生化、ラインクリアランス及び材料を確認した。部屋、衛生化、ラインクリアランス及び材料を確認した。
８．９．４  前処理表の完了を確認した。
８．９．５  環境モニタリング。処理前に前処理環境モニタリングが開始されたことを確認した。
８．９．６  上清用に１０ＬのLabtainerを準備した。ＢＳＣ中、ルアー接続を使用して、１０ＬのLabtainerバッグのメスポートの１つに、リピーターポンプ流体移送セットの長径端を接続した。
８．９．７  上清用に１０ＬのLabtainerを準備した。「上清（Supernatant）」及びロット番号のラベルを付した。
８．９．８  上清用に１０ＬのLabtainerを準備した。ＢＳＣから取り外す前に、全てのクランプが閉じられていることを確認する。注記：上清バッグはＴＩＬ回収（セクション８．１０）中に使用され、これは、培地の調製と同時に実施することができた。
８．９．９  ＩＬ−２の解凍。全ての氷が溶けるまで、ＣＴＳ  AIM V培地の１袋あたりＩＬ−２（６×１０６ＩＵ／ｍＬ）（ＢＲ７１４２４）の５×１．１ｍＬアリコートを解凍した。
ＩＬ−２のロット番号及び有効期限を記録した。ＩＬ−２ラベルを貼付した。
８．９．１０  GlutaMaxを分注した。ＢＳＣ中、Glutamax１００．０ｍＬを適切なサイズのレシーバーに分注した。各レシーバーに追加された体積を記録した。
注記：  ステップ８．９．１０〜ステップ８．９．２８に従い、最初に１つのAIM-V培地のバッグを準備した。必要とされる追加的なバッグは、ステップ８．１０．５９で決定された。
８．９．１１  レシーバーにラベルを付した。各レシーバーに「GlutaMax」とラベルを付した。
８．９．１２  ＩＬ−２をGlutaMaxに追加した。マイクロピペットを使用して、各GlutaMaxレシーバーに５．０ｍＬのＩＬ−２を追加した。プロセスノート５．１８ごとにチップをすすぐことを確認し、追加した各ｍＬに新しいピペットチップを使用した。以下の各Glutamaxレシーバーに追加された体積を記録した。
８．９．１３  レシーバーにラベルを付した。各レシーバーに「GlutaMax＋ＩＬ−２」及びレシーバー番号のラベルを付した。
８．９．１４  製剤用にＣＴＳ  AIM V培地バッグを準備した。ＣＴＳ  AIM V  １０Ｌ培地バッグ（Ｗ３０１２７１７）が室温で温められ、使用前に１２〜２４時間遮光されていることを確認した。ステップ８．９．２のインキュベーション終了時間を記録した。
８．９．１５  製剤用にＣＴＳ  AIM V培地バッグを準備した。ＢＳＣ中で、４インチ血漿移送セットのクランプを閉じ、スパイクポートを使用しバッグと接続した。注記：スパイクを一方向に回しながら一定の圧力を維持した。ポートの側面に穴を開けないようにした。
８．９．１６  製剤用にＣＴＳ  AIM V培地バッグを準備した。ルアーを通じて、リピーターポンプ流体移送セットの長径端を４インチ血漿移送セットに接続した。
８．９．１７  Baxaポンプを実施する。ＢＳＣに隣接しているBaxaポンプを実施する。ＢＳＣからリピーターポンプ流体移送セットのポンプチューブセクションを取り外し、リピーターポンプに取り付けた。
８．９．１８  製剤用培地を準備した。ＢＳＣ内で、Pumpmatic溶液分注システム（ＰＬＤＳ）からシリンジを取り外し、廃棄した。注記：ＰＬＤＳピペットの無菌性を損なわないようにした。
８．９．１９  製剤用培地を準備した。ＰＬＤＳピペットを、ルアー接続を介してリピーターポンプ流体移送セットの小径端に接続し、吸引のためにステップ８．９．１３で準備した「GlutaMax＋ＩＬ−２」にピペットチップを取り付けた。
レシーバー及び１０Ｌバッグ間の全てのクランプを開く。
８．９．２０  GlutaMax＋ＩＬ−２をバッグに注入した。ポンプ速度を「中」と「３」に設定し、全ての「GlutaMax＋ＩＬ−２」を１０Ｌ  ＣＴＳ  AIM V培地バッグに送った。溶液が残っていない場合、ラインをクリアにし、ポンプを停止する。以下の各Aim Vバッグに追加されたＩＬ−２を含むGlutaMaxの体積を記録した。記録した／
８．９．２１  ＰＬＤＳを取り外した全てのクランプが閉じていることを確認し、リピーターポンプ流体移送セットからＰＬＤＳピペットを取り外した。リピーターポンプ流体移送セットを取り外し、４インチの血漿移送セットに赤いキャップを付けた。
８．９．２２  バッグにラベルを付した。調製した「完全ＣＭ４  １６日目培地」の各バッグにラベルを付した。
８．９．２３  サンプルプランごとの培地参考品を取り出した。３０ｍＬシリンジを使用して、シリンジを４インチ血漿移送セットに取り付けて２０．０ｍＬの「完全ＣＭ４  １６日目培地」取り出し、５０ｍＬコニカルチューブにサンプルを分注した。
注記：調製した最初のバッグの培地からのみ、培地参考品サンプルを取り出した。注記：シリンジを取り外した後、４インチ血漿移送セットが固定されているか又は赤いキャップが付いているか確認する。
８．９．２４  新しいリピーターポンプ流体移送セットを取り付けた。「完全ＣＭ４  １６日目培地」バッグに接続された４インチ血漿移送セットに新しいリ流体ポンプ移送セットの長径端を取り付けた。
８．９．２５  サンプルにラベルを付し、保存した。サンプルプラン在庫ラベルとラベル付けし、サンプルプランに従い試験用にログインのために提出するまで、培地参考品サンプルを２〜８℃で保存した。
８．９．２６  サンプリングのためにサインした。サンプルを取り出すためのＬＩＭＳサンプルプランシートが完成していることを確認した。
８．９．２７  インキュベーターをモニターする。インキュベーターをモニターした。該当する場合、ステップ８．９．１０に従い、準備された追加的なバッグをモニターする。インキュベーターのパラメータ：
温度ＬＥＤディスプレイ：３７．０±２．０℃；ＣＯ２パーセント：５．０±１．５％  ＣＯ２。
８．９．２８  完全ＣＭ４  １６日目培地を温めた。インキュベーター内の完全ＣＭ４  １６日目培地の最初のバッグを、使用準備が整うまで３０分以上温めた。該当する場合、ステップ８．１０．５９に従い、追加的なバッグを温めた。
８．９．２９  希釈の準備をした。ＢＳＣ中で、バッチ記録ロット番号及び「細胞カウント希釈用」のラベルを付されたAIM-V培地の４．５ｍＬを各４×１５ｍＬコニカルチューブに加えた。ロット番号とチューブ番号（１〜４）をコニカルチューブにラベル付けした。バイアル番号（１〜４）と４つのクライオバイアルにラベル付けした。
ステップ８．１０．３１で使用するためにバイアルをＢＳＣ下に保管した。
８．９．３０  セクション８．９をレビューした。
８．１０  １６日目のＲＥＰ流出
８．１０．１  前処理表。
８．１０．２  インキュベーターをモニターした。インキュベーターをモニターした。インキュベーターのパラメータ：
温度ＬＥＤ  ディスプレイ：３７．０±２．０℃；ＣＯ２パーセンテージ：５．０±１．５％  ＣＯ２。
８．１０．３  インキュベーターからG-Rex500MCSを取り出した。G-Rex500MCSをインキュベーターから取り外す前に、インキュベーションパラメータが満たされていることを確認するための以下のチェックを実施した。
【１０９９】
【表９３】
2021519582.tif 000097
【１１００】
インキュベーターからG-Rex500MCSを取り出した。
８．１０．４  １Ｌ移送パックをセットアップした。約１２インチのラインを残し、プロセスノート５．１２に従い、１Ｌの移送パック（Ｗ３００６６４５）をヒートシールした。
８．１０．５  １Ｌ移送パックを用意した。１Ｌ移送パックに「ＴＩＬ懸濁液」のラベルを付けた。
８．１０．６  １Ｌ移送パックを秤量した。ライン全体を含む１Ｌの移送パックをはかりの上に置き、乾燥重量を記録した。
８．１０．７  GatheRexのセットアップ。G-Rex500MCSからの赤色の培地取り出しラインを、ステップ８．９．８で準備した１０Ｌのlabtainerバッグ「上清」のリピーターポンプ移送セットに滅菌溶接（プロセスノート５．１１に従う）した。G-Rex500MCSからクリア細胞取り出しラインを、ステップ８．１０．５で準備したＴＩＬ懸濁液移送パックに滅菌溶接した。
８．１０．８  GatheRexのセットアップ。G-Rex500MCSフラスコをGatheRexの左側に配置した。上清labtainerバッグを置き、その右側に及びＴＩＬ懸濁液移送パックを配置した。
８．１０．９  GatheRexのセットアップ。G-Rex500MCSからの赤い培地取り出しラインをGatheRexのクランプ上部（赤い線でマーク）及びチューブガイドに取り付けた。G-Rex500MCSからのクリアハーベストラインをクランプ底部（青い線でマーク）及びGatheRexのチューブガイドに取り付けた。
８．１０．１０  GatheRexのセットアップ。GatheRexからガスラインをG-Rex500MCSの滅菌フィルターに取り付けた。注記：G-Rex500MCSから上清を除去する前に、細胞取り出しラインの全てのクランプが閉じていることを確認した。
８．１０．１１  G-Rex500MCSの減容。ＳＯＰ−０１７７７に従って、G-Rex500MCSから１０ＬのLabtainerに約４．５Ｌの培養上清を移した。フラスコが水平であり、吸引ディップチューブの端まで培地が減少していることを確認するためにG-Rex500MCSフラスコを目視で検査した。注記：GatheRexが途中で停止した場合、右向きの矢印があるボタンを再度押して再起動することができた。
８．１０．１２  ＴＩＬ回収用にフラスコを準備した。上清を取り除いた後、赤いラインへのクランプを全て閉じた。
８．１０．１３  ＴＩＬ回収の開始。ＴＩＬ回収の開始時間を記録した。
８．１０．１４  ＴＩＬ回収の開始。フラスコを激しく叩き細胞を遊離させるために培地を回旋した。全ての細胞が離れたことを確認するためにフラスコの検査を実施した。注記：細胞が離れなかった場合、エリア管理者に連絡する。
８．１０．１５  ＴＩＬ回収の開始。フラスコを傾けて、ホースがフラスコの端にくるようにした。注記：細胞収集ストローが壁面及び底膜の接合部にない場合、ストローを適切に配置するには、通常、４５°の角度でフラスコを傾けたまま軽く叩くのみで十分である。
８．１０．１６  ＴＩＬの回収。ＴＩＬ懸濁液移送パックにつながる全てのクランプを解放した。
８．１０．１７  ＴＩＬの回収。GatheRexを使用して、細胞懸濁液をＴＩＬ懸濁液移送パックに移した。注記：全ての細胞と培地が収集されるまで、エッジを傾斜し続けることを確認する。
８．１０．１８  ＴＩＬの回収。付着した細胞について膜を検査した。
８．１０．１９  フラスコ膜をすすぐ。G-Rex500MCSの底をすすぐ。ガス交換膜の約１／４をリンス培地で覆う。
８．１０．２０  G-Rex500MCSのクランプを閉じた。G-Rex500MCSの全てのクランプが閉じていることを確認した。
８．１０．２１  ヒートシールした。チューブ全体の長さがほぼ同じになるように、できる限り溶接部の近くでＴＩＬ含有移送パックをヒートシール（プロセスノート５．１２に従う）した。
８．１０．２２  ヒートシールした。上清を含む１０ＬのLabtainerをヒートシール（プロセスノート５．１２に従う）し、ステップ８．１０．２５でのサンプル収集のためにＢＳＣに移した。
８．１０．２３  ＴＩＬ懸濁液の体積を計算した。細胞懸濁液を含む移送パックの質量を記録し、細胞懸濁液の体積を計算した。
８．１０．２４  サンプル取り出しのための移送パックを準備した。４インチ血漿移送セットを、ステップ８．１０．２１からのＴＩＬ懸濁液移送パックに溶接（プロセスノート５．１１に従う）し、バッグの出来る限り近くにメスルアー端を取り付けたままにした。
８．１０．２５  細胞上清から試験サンプルを取り出した。ＢＳＣ中で、メスのルアーポートと適切なサイズのシリンジを使用して、１０ＬのLabtainerから１０．０ｍＬの上清を取り除く。１５ｍＬのコニカルチューブに入れて「ＢａｃＴ」とラベルを付け、ステップ８．１０．２８のＢａｃＴサンプル用にチューブを保持した。
８．１０．２６  細胞上清から試験サンプルを取り出した。別のシリンジを使用して、１０．０ｍＬの上清を取り出し、１５ｍＬコニカルチューブに入れた。ステップ８．１０．３２で使用するために、マイコプラズマサンプル用のチューブを保持した。チューブに「マイコプラズマ希釈剤」とラベルを付した。
８．１０．２７  上清バッグを閉じた。ルアーポートに赤いキャップを付けてバッグを閉じ、ＢＳＣから外した。
８．１０．２８  無菌性及びＢａｃＴ試験サンプリング。ＢＳＣ中で、適切なサイズのシリンジを使用して、ステップ８．１０．２５で調製したＢａｃＴとラベル付けされた１５ｍＬのコニカルから１．０ｍＬのサンプルを取り出し、嫌気性ボトルに播種した。
好気性ボトルについて上記を繰り返す。注記：このステップは、順番どおりでなく実施され得る。
８．１０．２９  サンプルを、ラベルを付し及び保存した。サンプルプランの在庫ラベルでラベルを付し、サンプルプランに従う試験用にログインのために送信されるまで、Bac-Tサンプルを室温で、光から保護して保存した。注記：ボトルのバーコードをラベルで覆わないようにした。
８．１０．３０  サンプリングのためにサインした。サンプルを取り出すためのＬＩＭＳサンプルプランシートが完成していることを確認する。
８．１０．３１  細胞カウントサンプルを取り出した。ＢＳＣ中で、各サンプルに個別の３ｍＬシリンジを使用して、ルアー接続を使用し「ＴＩＬ懸濁液」移送パックから４×１．０ｍＬ細胞カウントサンプルを取り出した。ステップ８．９．２９で準備したクライオバイアルにサンプルを入れた。
８．１０．３２  マイコプラズマサンプルを取り出した。３ｍＬシリンジを使用し、ＴＩＬ懸濁液移送パックから１．０ｍＬ取り出し、ステップ８．１０．２６で調製した「マイコプラズマ希釈液」とラベル付けした１５ｍＬコニカルに入れた。
８．１０．３３  サンプルを、ラベルを付し及び保存する。サンプルプラン在庫ラベルとラベル付けし、サンプルプランに従い試験用にログインのために提出するまで、マイコプラズマサンプルを２〜８℃で保存した。
８．１０．３４  サンプリングのためにサインした。サンプルを取り出すためのＬＩＭＳサンプルプランシートが完成していることを確認した。
８．１０．３５  播種用の移送パックを準備した。ＢＳＣ中で、リピーターポンプ流体移送セットの長径チューブ端を、ＴＩＬを含む移送パックのルアーアダプターに取り付けた。止血鉗子を使用して、移送パックの近くのラインを遮断した。移送セットの端に赤いキャップをした。
８．１０．３６  ＴＩＬをインキュベーターに入れた。ＢＳＣから細胞懸濁液を取り出し、必要になるまでインキュベーターに入れた。時間を記録した。
８．１０．３７  細胞カウントを実行した。NC-200及びプロセスノート５．１４を使用して、細胞カウント及び計算を実行した。０．５ｍＬの細胞懸濁液をステップ８．９．２９で調製した４．５ｍＬのAIM-V培地に加えて、最初に細胞カウントサンプルを希釈した。これにより、１：１０希釈になった。
８．１０．３８  細胞カウントサンプル体積を記録した。
８．１０．３９  増倍係数を決定した。
【１１０１】
【表９４】
2021519582.tif 000098
【１１０２】
８．１０．４０  プロトコルを選択し、増倍係数を入力した。「生細胞カウントアッセイ」プロトコルが選択され、全ての増倍係数、サンプル及び希釈剤の体積が入力されていることを確認した。
８．１０．４１  Nucleoviewからファイル名、生存率及び細胞カウントを記録した。
８．１０．４２  生細胞濃度の平均と実施された細胞カウントの生存率を決定した。
【１１０３】
【表９５】
2021519582.tif 000099
【１１０４】
８．１０．４３  カウントの上限及び下限を決定した。
【１１０５】
【表９６】
2021519582.tif 000100
【１１０６】
８．１０．４４  両方のカウントは許容範囲内であったか？
【１１０７】
【表９７】
2021519582.tif 000101
【１１０８】
８．１０．４５  該当する場合：細胞カウントを実施した。NC-200及びプロセスノート５．１４を使用して、細胞カウント及び計算を実行した。注記：希釈は、期待される細胞濃度に基づいて調整され得る。
８．１０．４６  該当する場合：細胞カウントサンプル体積を記録した。注記：希釈が不要な場合、「サンプル［μＬ］」＝２００、「希釈［μＬ］」＝０と入力する。
８．１０．４７  該当する場合：増倍係数を決定した。
【１１０９】
【表９８】
2021519582.tif 000102
【１１１０】
８．１０．４８  該当する場合：プロトコルを選択し、増倍係数を入力する。「生細胞カウントアッセイ」プロトコルが選択され、全ての増倍係数、サンプル及び希釈剤の体積が入力されていることを確認する。
注記：希釈が不要な場合、「サンプル［μＬ］」＝２００、「希釈［μＬ］」＝０と入力する。
８．１０．４９  該当する場合：Nucleoviewから記録された細胞カウント
８．１０．５０  該当する場合：生細胞濃度の平均と実施された細胞カウントの生存率を決定した。
【１１１１】
【表９９】
2021519582.tif 000103
【１１１２】
８．１０．５１  該当する場合：カウントの上限及び下限を決定した。
【１１１３】
【表１００】
2021519582.tif 000104
【１１１４】
８．１０．５２  該当する場合：カウントは許容範囲内であったか？
【１１１５】
【表１０１】
2021519582.tif 000105
【１１１６】
注記：いずれかの結果が「いいえ」の場合、ステップ８．１０．５３に進み、収集された全ての細胞カウントの平均を決定する。
８．１０．５３  該当する場合：実施された４カウント全てから平均生細胞濃度を決定した。
８．１０．５４  ＴＩＬ懸濁液の体積を調整した。細胞カウントサンプルを取り出した後のＴＩＬ懸濁液の調整された体積を計算した。試験のために、ステップ８．１０．２３Ｃからの総ＴＩＬ細胞体積マイナス５．０ｍＬを取り出した。
８．１０．５５  総生存ＴＩＬ細胞を計算した。
【１１１７】
【表１０２】
2021519582.tif 000106
【１１１８】
８．１０．５６  継代培養用のフラスコを計算した。播種に必要なフラスコの総数を計算した。注記：G-Rex500MCSフラスコの数を四捨五入して、近い整数に表示した。
【１１１９】
【表１０３】
2021519582.tif 000107
【１１２０】
注記：播種のためのG-Rex500MCSフラスコの最大数は５であった。播種するフラスコの計算数が５個を超えた場合、利用可能な全量の細胞懸濁液を使用して、５個のみを播種した。
８．１０．５７  継代培養用のフラスコの数を計算する。
【１１２１】
【表１０４】
2021519582.tif 000108
【１１２２】
８．１０．５８  細胞カウント計算のＱＡレビューは、ステップ８．１０．３８〜８．１０．５７で実施された。
８．１０．５９  必要とする追加的な培地バッグの数を決定した。ステップ８．９．２８で準備したバッグに加えて必要とする培地バッグの数を計算した。
【１１２３】
【表１０５】
2021519582.tif 000109
【１１２４】
８．１０．６０  該当する場合：追加的な培地を調製した。ステップ８．１０．５９Ｄで計算したG-Rex-500Mフラスコが２つ必要なたびに、「ＣＭ４  １６日目培地」の１０Ｌバッグを１つ準備した。ステップ８．１０．６２に進み、追加的な培地を準備し温めながら、最初のGREX-500Mフラスコに播種した。
８．１０．６１  該当する場合：追加的な培地バッグを調製した。ステップ８．９．１０〜ステップ８．９．２８を繰り返し、ステップ８．１０．５９Ｄで決定した追加的な培地バッグの計算された数を準備し、温めた。
８．１０．６２  G-Rex500MCSを満たした。ベンチトップでG-Rex500MCSを開き、容器の亀裂やチューブのねじれを検査した。全てのルアー接続と閉鎖がしっかりしていることを確認した。フラスコの外側の４５００ｍＬラインにマーカーでマークを付けた。大きいフィルターラインを除いて、G-Rex 500MCSの全てのクランプを閉じた。
８．１０．６３  G-Rex500MCSを満たした。G-Rex500MCSの赤い培地ラインを、ステップ８．９．２８で準備した培地バッグの流体移送セットに滅菌溶接（プロセスノート５．１１に従う）した。
８．１０．６４  培地を汲み上げる準備。IVポールに「ＣＭ４  １６日目培地」を掛けた。ポンプチュービングをBaxaポンプに通した。
８．１０．６５  G-Rex500MCSに培地を注入する。Baxaポンプを「高」及び「９」に設定し、４５００ｍＬの培地をフラスコに注入する。４．５Ｌの「ＣＭ４  １６日目培地」をG-Rex500MCSに注入し、ステップ８．１０．６２のフラスコにマークされた線まで満たした。４．５Ｌの培地が移されたら直ちにポンプを停止した。
８．１０．６６  ヒートシールした。G-Rex500MCSの赤い培地ラインを、ステップ８．１０．６３で作製された溶接部の近くでヒートシール（プロセスノート５．１２に従う）し、培地バッグを取り外した。
８．１０．６７  充填の繰り返し。培地が温められ、使用する準備ができたら、ステップ８．１０．５６Ｃで計算された各フラスコについて、ステップ８．１０．６２〜８．１０．６６を繰り返す。
注記：重力充填又は複数のポンプを使用して、複数のフラスコに同時に充填し得る。注記：培地１バッグにつき２つのフラスコのみを充填する。
８．１０．６８  満たされたフラスコを記録しラベル付けした。充填時に各フラスコにアルファベット順にラベルを付し、ＱＡ提供のプロセス内「１６日目」ラベルを付した。
８．１０．６９  サンプルにラベルを付した。サンプルに以下の「１６日目」ラベルを添付した。
８．１０．７０  該当する場合：フラスコをインキュベートした。ＴＩＬを播種するのを待つ間、フラスコをインキュベーターで保存した。
８．１０．７１  充填されたフラスコの数を確認した。充填されたフラスコの総数を記録した。
８．１０．７２  追加する細胞懸濁液の体積を計算した。新しいG-Rex500MCSフラスコに追加するＴＩＬ懸濁液の目標量を計算した。
【１１２５】
【表１０６】
2021519582.tif 000110
【１１２６】
８．１０．５６Ｃが５個を超える場合、細胞懸濁液の全量を使用して、５個のみが播種される。
８．１０．７３  播種のためにフラスコを準備した。インキュベーターからステップ８．１０．７０よりG-Rex500MCSを取り出した。
８．１０．７４  ポンピングの準備。大きいフィルターライン以外のG-Rex 500MCSの全てのクランプを閉じた。ポンプチュービングをBaxaポンプに通した。
８．１０．７５  インキュベーターからＴＩＬを取り出した。インキュベーターから「ＴＩＬ懸濁液」移送パックを取り出し、ステップ８．１０．３６のインキュベーション終了時間を記録した。
８．１０．７６  播種のために細胞懸濁液を調製した。ステップ８．１０．７５からの「ＴＩＬ懸濁液」移送パックを、ポンプ入口ラインへ滅菌溶接（プロセスノート５．１１に従う）した。
８．１０．７７  スケールを風袋引きした。スケール上にＴＩＬ懸濁液バッグを置いた。「低」及び「２」に設定されたBaxaポンプを使用して、ＴＩＬ懸濁液バッグから溶接までのラインをプライミングした。スケールを風袋引きした。
８．１０．７８  ＴＩＬ懸濁液をフラスコに播種した。Baxaポンプを「中」及び「５」と設定する。ステップ８．１０．７２Ｃで計算したＴＩＬ懸濁液の体積をフラスコに注入する。各フラスコに加えたＴＩＬ懸濁液の体積を記録する。
８．１０．７９  ヒートシールした。次のフラスコを溶接するのに十分なチューブを残し、「ＴＩＬ懸濁液」移送パックをヒートシール（プロセスノート５．１２に従う）した。
ラインストリッパーを使用して、容器へのG-Rexフラスコライン中の残留ＴＩＬ懸濁液をクリアした。
８．１０．８０  残りのフラスコを充填した。播種した各フラスコ間で「ＴＩＬ懸濁液」移送パックを混合したことを確認し、残りの全てのフラスコに播種するためにステップ８．１０．７６〜８．１０．７９を繰り返した。フラスコをアルファベット順に充填した。
８．１０．８１  インキュベーターをモニターした。注記：フラスコが２つのインキュベーターに分けて入れられた場合、両方を確実にモニターする。インキュベーターのパラメータ：温度ＬＥＤディスプレイ：３７．０±２．０℃；ＣＯ２パーセント：５．０±１．５％  ＣＯ２。
８．１０．８２  フラスコをインキュベートした。各フラスコがインキュベーターに置かれた時間を記録した。
８．１０．８３  インキュベーションウィンドウを計算した。インキュベーション２２日目にG-Rex500MCSを取り出す時間範囲を決定するために以下の計算を実行した。
【１１２７】
【表１０７】
2021519582.tif 000111
【１１２８】
８．１０．８４  環境モニタリング。処理後、ＢＳＣを検証し、担当者によるモニタリングが実施された。
８．１０．８５  サンプルの提出。全ての１６日目のサンプルがログインのために送られたことを確認した。
８．１０．８６  セクション８．１０をレビューした。
８．１１  ２２日目の洗浄バッファーの調製
８．１１．１  部屋の衛生化、ラインクリアランス及び材料を確認した。
８．１１．２  前処理チェックリストの完了を確認した。
８．１１．３  環境モニタリング。処理前に前処理環境モニタリングが実施されたことを確認した。
８．１１．４  １０ＬのLabtainerバッグを準備した。ＢＳＣで、ルアー接続を介して４インチ血漿移送セットを１０ＬのLabtainerバッグに取り付ける。
８．１１．５  １０ＬのLabtainerバッグを準備した。「上清」、ロット番号及び開始／日付のラベルを付した。
８．１１．６  １０ＬのLabtainerバッグを準備した。ＢＳＣから取り出し移す前に、全てのクランプを閉じた。注記：回収するG-Rex500MCSフラスコ２本ごとに１つの１０ＬのLabtainerバッグを準備した。注記：上清バッグはセクション８．１２で使用され、セクション８．１１と同時に実行することができた。
８．１１．７  流体移送セットを溶接した。BSCの外側で、4S-4M60の全てのクランプを閉じた。4S-4M60のオスルアーエンドの１つにセットされたリピーター流体移送セットを溶接（プロセスノート５．１１に従う）した。（例えば、図１３２を参照。）
８．１１．８  材料をＢＣＳ中に移した。Plasmalyte-A及びヒトアルブミンを２５％ＢＳＣに移した。4S-4M60及びリピーター移送セットの部品をＢＳＣに移す。
【１１２９】
【表１０８】
2021519582.tif 000112
【１１３０】
８．１１．９  Plasmalyteを３０００ｍＬバッグに注入した。Plasmalyte-Aの３袋を4S-4M60コネクタセットにスパイクした。注記：取り外す前にアルコール綿棒（Ｗ３００９４８８）でポートカバーを拭いた。注記：スパイクを一方向に回しながら一定の圧力を維持する。ポートの側面に穴を開けないようにする。
８．１１．１０  Plasmalyteを３０００ｍＬバッグに注入した。Origen  ３０００ｍＬ収集バッグを、ルアー接続を介して、リピーターポンプ移送セットの長径端に接続した。
８．１１．１１  Plasmalyteを３０００ｍＬバッグに注入した。３０００ｍＬのOrigenの未使用ラインのクランプを閉じた。
８．１１．１２  Plasmalyteを３０００ｍＬバッグに注入した。ＢＳＣに隣接しているBaxaポンプを実行した。ＢＳＣの外側に位置するBaxaポンプに移送セットチュービングを通した。ポンプを「高」及び「９」に設定した。
８．１１．１３  Plasmalyteを３０００ｍＬバッグに注入した。Plasmalyte-Aから３０００ｍＬ  Origenバッグまでの全てのクランプを開いた。
８．１１．１４  Plasmalyteを３０００ｍＬバッグに注入する。３０００ｍＬ  Origenバッグに全てのPlasmalyte-Aを注入した。全てのPlasmalyte-Aが移されたら直ちにポンプを停止した。
８．１１．１５  Plasmalyteを３０００ｍＬバッグに注入した。必要に応じて、ポンプを逆転させてバッグの位置を操作することにより、３０００ｍＬ  Origenバッグから空気を取り除いた。
８．１１．１６  Plasmalyteを３０００ｍＬバッグに注入した。全てのクランプを閉じた。ルアー接続を介してリピーターポンプ流体移送セットから３０００ｍＬバッグを取り外し、バッグへのラインに赤いキャップ（Ｗ３０１２８４５）を取り付けた。
８．１１．１７  ３０００ｍＬバッグにヒトアルブミン２５％を追加した。ベント付きミニスパイクを開いた。スパイクの無菌性を損なうことなく、青いキャップを確実に締めた。
８．１１．１８  ３０００ｍＬバッグにヒトアルブミン２５％を追加した。ベント付きのミニスパイクで、ヒトアルブミン２５％ボトルのセプタムをスパイクした。注記：スパイクの無菌性を損なわないようにした。
８．１１．１９  ３０００ｍＬバッグにヒトアルブミン２５％を追加した。ステップ８．１１．１７〜ステップ８．１１．１８を、合計３回スパイクされたヒトアルブミン２５％ボトルで２回繰り返した。
８．１１．２０  ３０００ｍＬバッグにヒトアルブミン２５％を追加した。１つのベント付きミニスパイクから青いキャップを取り外し、６０ｍＬシリンジをヒト血清アルブミン２５％ボトルに取り付けた。
８．１１．２１  ３０００ｍＬバッグにヒトアルブミン２５％を追加した。２５％のヒト血清アルブミン６０ｍＬを調整する。注記：２５％ヒト血清アルブミンを２本以上使用する必要があり得る。必要に応じて、ベント付きミニスパイクからシリンジを外し、ヒト血清アルブミン２５％ボトルの次のベント付きミニスパイクに接続する。ヒト血清アルブミン２５％ボトルからベント付きミニスパイクを取り外さない。
８．１１．２２  ３０００ｍＬバッグにヒトアルブミン２５％を追加した。６０ｍＬが得られたら直ちにベント付きミニスパイクからシリンジを取り外す。
８．１１．２３  ３０００ｍＬバッグにヒトアルブミン２５％を追加した。ステップ８．１１．１６のPlasmalyte-Aで満たされた３０００ｍＬ  Origenバッグのニードルレスインジェクションポートにシリンジを取り付ける。全ての２５％ヒトアルブミンを分注した。注記：使用する前に、毎回アルコールパッドでニードルレス注入ポートを拭いた。
８．１１．２４  ３０００ｍＬバッグにヒトアルブミン２５％を追加した。ステップ８．１１．２０〜ステップ８．１１．２３を繰り返して、最終体積１２０．０ｍＬのヒトアルブミン２５％を得た。
８．１１．２５  バッグを混合した。全ての２５％ヒトアルブミンを追加した後、バッグを静かに混合した。
８．１１．２６  バッグにラベルを付した。「LOVO洗浄バッファー」及びロット番号のラベルを付し、２４時間の有効期限を割り当てた。
８．１１．２７  ＩＬ−２希釈液を調製した。１０ｍＬシリンジを使用し、LOVO洗浄緩衝液バッグのニードルレスインジェクションポートを使用して、５．０ｍＬのLOVO洗浄バッファーを取り出した。LOVO洗浄バッファーを５０ｍＬコニカルチューブに分注し、「ＩＬ−２希釈液」及びロット番号でラベル付けした。注記：使用する前に、毎回アルコールパッドでニードルレス注入ポートを拭いた。
８．１１．２８  ＣＲＦブランクバッグLOVO洗浄バッファーを分注。１００ｍＬシリンジを使用して、ニードレスインジェクションポートから７０．０ｍＬのLOVO洗浄バッファーを吸い上げた。注記：使用する前に、毎回アルコールパッドでニードルレス注入ポートを拭いた。
８．１１．２９  ＣＲＦブランクバッグLOVO洗浄バッファーを分注。シリンジに赤いキャップをし、「ブランククライオバッグ」及びロット番号とラベル付けした。注記：ステップ８．１４．３で必要になるまで、シリンジを室温で保持した。
８．１１．３０  洗浄バッファーの準備完了。LOVO洗浄バッファーバッグの全てのクランプを閉じた。
８．１１．３１  ＩＬ−２の解凍。全ての氷が溶けるまで、１つの１．１ｍＬのＩＬ−２（６×１０６ＩＵ／ｍＬ）を解凍した。ＩＬ−２のロット番号と有効期限を記録した。注記：ＩＬ−２ラベルが添付されていることを確認した。
８．１１．３２  ＩＬ−２調製。「ＩＬ−２希釈液」とラベル付けされた５０ｍＬコニカルチューブに５０μＬ  ＩＬ−２ストック（６×１０６ＩＵ／ｍＬ）を追加した。
８．１１．３３  ＩＬ−２調製。「ＩＬ−２  ６×１０４」、日付、ロット番号及び２４時間の有効期限としてコニカルのラベルを変更した。２〜８℃で蓋をして保管する。
８．１１．３４  凍結保存の準備。最終産物の凍結保存のために、２〜８℃で５個の凍結カセットを置き、事前調整した。
８．１１．３５  細胞カウント希釈を準備した。ＢＳＣ中で、ロット番号及び「細胞カウント希釈用」とラベル付けされた４．５ｍＬのAIM-V培地を４本の１５ｍＬコニカルチューブに添加した。チューブにバッチ記録ロット番号及びチューブ番号（１〜４）のラベルを付した。ステップ８．１２．３４で使用するために取っておいた。
８．１１．３６  細胞カウントの準備  バイアル番号（１〜４）と４つのクライオバイアルにラベル付けした。ステップ８．１２．３３で使用するためにバイアルをＢＳＣ下に保管した。
８．１１．３７  セクション８．１１をレビューした。
８．１２  ２２日目  ＴＩＬ回収
８．１２．１  インキュベーターをモニターする。インキュベーターをモニターした。インキュベーターのパラメータ温度ＬＥＤディスプレイ：３７±２．０℃、ＣＯ２パーセンテージ：５％±１．５％。注記：セクション８．１２は、セクション８．１１と同時に実行することができた。
８．１２．２  インキュベーターからG-Rex500MCSフラスコを取り出した。G-Rex500MCSをインキュベーターから取り外す前に、インキュベーションパラメータが満たされていることを確認するための以下のチェックを実施した。
【１１３１】
【表１０９】
2021519582.tif 000113
【１１３２】
注記：このステップは、各フラスコがインキュベーターから取り出されるときに実行する必要があった。
８．１２．３  ＴＩＬ収集バッグを準備した。３０００ｍＬ収集バッグに「ＴＩＬ懸濁液」、ロット番号及び開始／日付のラベルを付した。
８．１２．４  余分な接続を封鎖した。プロセスノート５．１２に従い、各接続の端近くにある収集バッグの２つのルアー接続をヒートシールした。
８．１２．５  GatheRexのセットアップ。G-Rex500MCSからの赤い培地取り出しラインをステップ８．１１．５で準備した１０ＬのLabtainerバッグに滅菌溶接（プロセスノート５．１１に従う）した。注記：複数のGatheRexデバイスの使用についてはプロセスノート５．１６を参照。
８．１２．６  GatheRexのセットアップ。G-Rex500MCSからのクリア細胞取り出しラインを、ステップ８．１２．３で準備したＴＩＬ懸濁液収集バッグに滅菌溶接（プロセスノート５．１１に従う）した。注記：複数のGatheRexデバイスの使用についてはプロセスノート５．１６を参照。
８．１２．７  GatheRexのセットアップ。G-Rex500MCSフラスコをGatheRexの左側に配置した。上清Labtainerバッグ及びその右側にプールされたＴＩＬ懸濁液収集バッグを配置した。
８．１２．８  GatheRexのセットアップ。G-Rex500MCSからの赤い培地取り出しラインをGatheRexのクランプ上部（赤い線でマーク）及びチューブガイドに取り付けた。G-Rex500MCSからのクリアハーベストラインをクランプ底部（青い線でマーク）及びGatheRexのチューブガイドに取り付けた。
８．１２．９  GatheRexのセットアップGatheRexからのガスラインとG-Rex500MCSの滅菌フィルターを接続した。注記：G-Rex500MCSから上清を除去する前に、細胞取り出しラインの全てのクランプが閉じていることを確認した。
８．１２．１０  減容。G-Rex500MCSから約４．５Ｌの上清を上清バッグに移した。フラスコが水平であり、吸引ディップチューブの端まで培地が減少していることを確認するためにG-Rex500MCSを目視で検査した。必要に応じてステップを繰り返す。注記：GatheRexが途中で停止した場合、右向きの矢印があるボタンを再度押して再起動し得る。
８．１２．１１  ＴＩＬ回収用にフラスコを準備した。上清を取り除いた後、赤いラインへのクランプを全て閉じた。
８．１２．１２  ＴＩＬの収集を開始した。ＴＩＬ回収開始時間を記録した。
８．１２．１３  ＴＩＬの収集を開始した。フラスコを激しく叩き細胞を遊離させるために培地を回旋した。全ての細胞が離れたことを確認するためにフラスコの検査を実施した。「ＴＩＬ懸濁液」３０００ｍＬ収集バッグを平らな表面の乾いたワイプの上に置いた。注記：細胞が離れなかった場合、エリア管理に連絡した。
８．１２．１４  ＴＩＬの収集を開始した。フラスコを傾けて、ホースがフラスコの端にくるようにした。注記：細胞収集ホースが壁面及び底膜の接合部にない場合、ホースを適切に配置するには、通常、４５°の角度でフラスコを傾けたまま軽く叩くのみで十分であった。
８．１２．１５  ＴＩＬの回収。ＴＩＬ懸濁液収集バッグにつながる全てのクランプを解放した。
８．１２．１６  ＴＩＬの回収。GatheRexを使用して、ＴＩＬ懸濁液を３０００ｍＬ収集バッグに移した。注記：全ての細胞と培地が収集されるまで、エッジを傾斜し続けた。
８．１２．１７  ＴＩＬの回収。付着した細胞について膜を検査した。
８．１２．１８  フラスコ膜をすすいだ。G-Rex500MCSの底をすすいだ。ガス交換膜の約１／４をリンス培地で覆った。
８．１２．１９  G-Rex500MCSのクランプを閉じた。全てのクランプが閉じていることを確認する。
８．１２．２０  ヒートシールした。チューブ全体の長さがほぼ同じになるように、できる限り溶接部の近くでＴＩＬを含む収集バッグをヒートシール（プロセスノート５．１２に従う）する。
８．１２．２１  ヒートシールした。上清バッグをヒートシール（プロセスノート５．１２に従う）した。
８．１２．２２  残りのG-Rex 500 MCSフラスコの収穫が完了した。ステップ８．１２．２及び８．１２．５〜８．１２．２１の手順を繰り返し、全てのＴＩＬを同じ収集バッグにプールする。
注記：２フラスコごとに、１０Ｌの上清バッグを交換する必要があった。注記：複数のGatheRexデバイスの使用についてはプロセスノート５・１６を参照。
８．１２．２３  LOVO原料バッグを準備した。新しい３０００ｍＬ収集バッグを入手した。「LOVO原料バッグ」、ロット番号及び開始／日付としてラベル付けされた。
８．１２．２４  LOVO原料バッグを準備した。「LOVO原料バッグ」のチューブをヒートシール（プロセスノート５．１２に従う）し、メスルアーを取り外して、溶接に十分なラインを残した。
８．１２．２５  LOVO原料バッグを計量した。適切なサイズのプラスチック容器をスケールの上に置き風袋引きした。ポートとラインを含むLOVO原料バッグをビンに入れ、乾燥重量を記録する。
８．１２．２６  細胞懸濁液をLOVO原料バッグに移した。１７０μｍの重量血液フィルターの全てのクランプを閉じた。
８．１２．２７  細胞懸濁液をLOVO原料バッグに移した。重力血液フィルターの長い終末端をLOVO原料バッグに滅菌溶接（プロセスノート５．１１に従う）した。
８．１２．２８  細胞懸濁液をLOVO原料バッグに移した。「プールされたＴＩＬ懸濁液」収集バッグにフィルターの２つの供給源ラインの１つを滅菌溶接（プロセスノート５．１１に従う）した。
８．１２．２９  細胞懸濁液をLOVO原料バッグに移した。溶接が完了すると、フィルター上の使用していないラインをヒートシール（プロセスノート５．１２に従う）して取り外した。
８．１２．３０  細胞懸濁液をLOVO原料バッグに移した。必要なクランプを全て開き、IVポールに収集バッグをぶら下げてＴＩＬ懸濁液を引き上げ、血液フィルターを介してLOVO原料バッグにＴＩＬの重力フロー移行を開始する。排出中、ＴＩＬを均一な懸濁液に保つために、ＴＩＬ懸濁液バッグを穏やかに回転させるか又は揉んだ。
注記：LOVO原料バッグをろ過装置からぶら下がらないようにした。LOVO原料バッグを平面上の乾いたワイプの上に置いた。
８．１２．３１  全てのクランプを閉じた。全てのＴＩＬがLOVO原料バッグに移されたら、全てのクランプを閉じた。
８．１２．３２  ヒートシールした。重力血液フィルターを取り出すために、できる限り溶接の近くでヒートシール（プロセスノート５．１２に従う）した。
８．１２．３３  細胞カウントサンプルを取り出した。ＢＳＣ中で、各サンプルに個別の３ｍＬシリンジを使用して、ニードルレス注入ポートを使用しLOVO原料バッグから４×１．０ｍＬ細胞カウントサンプルを取り出した。ステップ８．１１．３６で準備したクライオバイアルにサンプルを入れた。注記：ニードルレス注入ポートをアルコールパッドで拭き、各サンプル間のLOVO原料バッグを混合した。
８．１２．３４  細胞カウントを実行した。NC-200及びプロセスノート５．１４を使用して、細胞カウント及び計算を実行した。０．５ｍＬの細胞懸濁液をステップ８．１１．３５で調製した４．５ｍＬのAIM-V培地に加えて、最初に細胞カウントサンプルを希釈した。これにより、１：１０希釈になった。
８．１２．３５  細胞カウントサンプル体積を記録した。
８．１２．３６  増倍係数を決定した。
【１１３３】
【表１１０】
2021519582.tif 000114
【１１３４】
８．１２．３７  プロトコルを選択し、増倍係数を入力した。「生細胞カウントアッセイ」プロトコルが選択され、全ての増倍係数、サンプル及び希釈剤の体積が入力されていることを確認した。注記：希釈が不要な場合、「サンプル［μＬ］」＝２００、「希釈［μＬ］」＝０と入力する。
８．１２．３８  Nucleoviewから細胞カウントを記録する
８．１２．３９  実施された細胞カウントの平均生存率、生細胞濃度及び総有核細胞濃度を決定した。
【１１３５】
【表１１１】
2021519582.tif 000115
【１１３６】
８．１２．４０  カウントの上限及び下限を決定した
【１１３７】
【表１１２】
2021519582.tif 000116
【１１３８】
８．１２．４１  両方のカウントは許容範囲内であったか？
【１１３９】
【表１１３】
2021519582.tif 000117
【１１４０】
注記：いずれかの結果が「いいえ」の場合、ステップ８．１２．４２〜８．１２．４９で２番目のカウントのセットを実施した。
８．１２．４２  該当する場合：細胞カウントを実施した。NC-200及びプロセスノート５．１４を使用して、細胞カウント及び計算を実行した。注記：希釈は、期待される細胞濃度に基づいて調整され得る。
８．１２．４３  該当する場合：細胞カウントサンプル体積を記録した。
８．１２．４４  該当する場合：増倍係数を決定した。
【１１４１】
【表１１４】
2021519582.tif 000118
【１１４２】
８．１２．４５  該当する場合：プロトコルを選択し、増倍係数を入力した。「生細胞カウントアッセイ」プロトコルが選択され、全ての増倍係数、サンプル及び希釈剤の体積が入力されていることを確認する。
注記：希釈が不要な場合、「サンプル［μＬ］」＝２００、「希釈［μＬ］」＝０と入力する。
８．１２．４６  該当する場合：Nucleoviewから細胞カウントを記録する
８．１２．４７  該当する場合：実施された細胞カウントの平均生存率、生細胞濃度及び総有核細胞濃度を決定する。
【１１４３】
【表１１５】
2021519582.tif 000119
【１１４４】
８．１２．４８  該当する場合：カウントの上限及び下限を決定した
【１１４５】
【表１１６】
2021519582.tif 000120
【１１４６】
８．１２．４９  該当する場合：カウントは許容範囲内であったか？
【１１４７】
【表１１７】
2021519582.tif 000121
【１１４８】
注記：いずれかの結果が「いいえ」の場合、ステップ８．１２．５０に進んで平均を決定した。
８．１２．５０  該当する場合：実施された４カウント全てからの平均、平均生細胞濃度及び平均総有核細胞濃度を決定した。
８．１２．５１  細胞カウントのＱＡレビュー。ＱＡ担当者は、ステップ８．１２．３８〜８．１２．５０で実施された計算をレビューする。
８．１２．５２  LOVO原料バッグと表示を付した。適切なサイズのプラスチック容器をスケールの上に置き風袋引きした。充填されたLOVO原料バッグをビンに入れ、重量を記録した。細胞懸濁液の体積を計算した。
８．１２．５３  総生存ＴＩＬ細胞を計算する。
【１１４９】
【表１１８】
2021519582.tif 000122
【１１５０】
８．１２．５４  総有核細胞の計算。
【１１５１】
【表１１９】
2021519582.tif 000123
【１１５２】
８．１２．５５  マイコプラズマ希釈剤を準備した。ＢＳＣでは、ルアーサンプルポートを介して１つの上清バッグから１０．０ｍＬを取り出し、１５ｍＬコニカルに入れた。
１５ｍＬのコニカル「マイコプラズマ希釈液」にラベルを付し、ステップ８．１４．６９で使用するためにＢＳＣに保管する。
８．１２．５６  セクション８．１２をレビューする。
８．１３  LOVO
８．１３．１  機器の左後部にあるスイッチを使用してLOVOの電源を入れた。注記：ステップ８．１３．１〜８．１３．１３はセクション８．１１〜８．１２と同時に実施され得る。
８．１３．２  重量計及び圧力センサーを確認した。
８．１３．３  重量計に何も掛かっていないことを確認し、各重量計の測定値をレビューした。ステップ８．１３．５の値を記録した。注記：重量計のいずれかが０＋／−２ｇの範囲外で読み取られた場合、重量計較正を実施した。
８．１３．４  全ての重量計が許容範囲内にあり、重量が掛かっていない場合、各重量計に１ｋｇの重量を掛けることに進み（番号１〜４）、測定値をレビューした。ステップ８．１３．５の値を記録した。
８．１３．５  スケールをチェックした。各スケールの表示値を記録した。値が範囲内にあった場合、処理を続行する。値が範囲内になかった場合、較正を実施する。
８．１３．６  機器操作プロファイルスクリーンで圧力センサーの読み取り値をレビューし、記録した。圧力読み取り値の許容範囲は０＋／−１０ｍｍＨｇであった。
表示された値がこの範囲外である場合、機械の指示に従い、新しい大気圧設定を保存した。
８．１３．７  ステップを繰り返した。新しい重量計の較正が実施された場合又は新しい大気圧設定が保存された場合、ステップ８．１３．３〜８．１３．６を繰り返した。
８．１３．８  ドロップダウンメニューから「ＴＩＬG-Rex回収」プロトコルを開始した。
８．１３．９  溶液１画面が表示された。バッファータイプの読み取りはPlasmaLyteであった。
８．１３．１０〜８．１３．１６  LOVOタッチスクリーンプロンプトに従った。
８．１３．１７  最終産物目標量の決定。
注記：ステップ８．１２．５４Ｃからの総有核細胞（ＴＮＣ）値及び以下のチャートを使用して、最終産物の目標体積を決定した。最終産物体積（ｍＬ）を記録した。
【１１５３】
【表１２０】
2021519582.tif 000124
【１１５４】
注記：ステップ８．１２．５３ＣからのＴＶＣが１．５×１０１１を超える場合、エリア管理者に連絡した。
８．１３．１８〜８．１３．２２  LOVOタッチスクリーンプロンプトに従った。
８．１３．２３  使い捨てキットをロードした：使い捨てキットをロードする前に、アルコールワイプ、その後、糸くずの出ないワイプで圧力センサーポートを拭く。使い捨てキットをロードする：使い捨てキットのロードに関する画面の指示に従う。
８．１３．２４  ろ過バッグを取り外した。標準のLOVO使い捨てキットがロードされたら、次へボタンに触れた。容器情報及び場所情報画面が表示された。スケールからろ液バッグを取り外した。
８．１３．２５  ろ液容器は新しいこと及び測定限界の確認をした。
８．１３．２６  ろ液体積を入力した。既存のろ液バッグのオスルアーにLOVO Ancillary Bagを滅菌溶接した。全てのクランプが開いており、流路が開いていることを確認した。ろ液容器体積入力欄に触れる。テンキーが表示される。新規合計ろ液体積（５，０００ｍＬ）を入力する。ボタンに触れ、入力を受諾する。注記：推定ろ過量は５０００ｍＬを超えてはならない。
８．１３．２７  ベンチトップにろ液容器を置いた。注記：溶接中にチューブがＦクランプから外れた場合、チューブをクランプに戻した。ベンチトップに新規ろ液容器を置いた。重量計＃３にろ液バッグを掛けなかった。手順中に計量計＃３は空になる。
８．１３．２８  ろ液容器の変更後、LOVOタッチスクリーンのプロンプトに従った。
８．１３．２９  キットが正しくロードされたことを確認した。使い捨てキットドライチェックオーバーレイが表示された。キットが適切にロードされ、全てのクランプが開いていることを確認した。全てのチューブにねじれや他の障害物がないか確認し、可能であれば直す。キットが正しく取り付けられていることを確認し、全てのロバートクランプを確認した。はいボタンを押した。全てのLOVOメカニカルクランプが自動的に閉じ、使い捨てキットの取付確認画面が表示される。LOVOには、キットを確認するために一連の加圧ステップが実施された。
８．１３．３０  キットチェック結果。キットチェックに合格した場合、次のステップに進んだ。＊いいえの場合、チェックが完了した後、２回目のキットチェックを実施することができた。＊いいえの場合、全てのチューブにねじれや他の障害物がないか確認し、直す。＊いいえの場合、キットが正しく取り付けられていることを確認し、全てのロバートクランプを確認した。２回目のキットチェックに失敗した場合：エリア管理に連絡し、セクション１０．０の新しいキットのインストールの準備をする。必要なステップ８．１３．２３〜ステップ８．１３．３０を繰り返す。
８．１３．３１  Plasmalyteの接続。接続解決画面が表示された。洗浄値は常に３０００ｍＬであるはずである。画面にこの値を入力した。
プロセスノート５．１１に従い、PlasmaLyteの３０００ｍＬバッグを、クランプ１を通過するチューブに滅菌溶接した。IVポールにPlasmaLyteのバッグをぶら下げ、バッグの両角のループをフックに取り付けた。
８．１３．３２  PlasmaLyteが接続されていることを確認した。全てのプラスチック製クランプを開けた。溶液量の入力が３０００ｍＬであったことを確認した。「次へ」ボタンに触れた。使い捨てキット準備オーバーレイが表示された。PlasmaLyteが取り付けられ、PlasmaLyteバッグにつながるチューブの全ての溶接部及びプラスチック製のクランプが開いていることを確認し、その後、はいボタンに触れた。
８．１３．３３  Plasmalyteが動いていることが観察された。使い捨てキット準備が開始され、使い捨てキット準備中画面が表示される。PlasmaLyteのバッグに接続されたチューブを介して、PlasmaLyteが移動することを視覚的に観察した。
流体が動いていない場合、画面上の一時停止ボタンを押して、クランプ又は溶接が依然として閉じているか否かを確認した。問題が解決したら、画面の再開ボタンを押し、使い捨てキット準備を再開した。使い捨てキット準備が正常に終了すると、原料接続画面が表示された。
８．１３．３４〜８．１３．３５  LOVOタッチスクリーンプロンプトに従った。
８．１３．３６  チューブに原料容器を接続した。ステップ８．１２．３１で準備したLOVO原料バッグを、プロセスノート５．１１に従ってクランプＳを通過するチューブに滅菌溶接する。クランプからチューブを取り外す必要がある場合があり得た。注記：取り外す場合、原料チューブをＳクランプに取り変えることを確認する。
８．１３．３７  原料容器をぶら下げた。原料容器をIVポールにぶら下げ、バッグの両角のループをフックにぶら下げた。原料を重量計＃１にぶら下げなかった。原料バッグへの全てのクランプを開いた。
８．１３．３８  原料容器が取り付けられていることを検証した。次へボタンに触れた。原料準備オーバーレイが表示された。原料が使い捨てキットに取り付けられ、原料につながるチューブの全ての溶接部及びプラスチック製のクランプが開いていることを確認した。はいボタンに触れた。
８．１３．３９  Plasmalyteが動いていたことを確認する。原料準備が開始され、原料準備中画面が表示された。原料バッグに取り付けられたチューブを介して、PlasmaLyteが移動しているのを視覚的に観察した。流体が動いていない場合、画面上の一時停止ボタンを押して、クランプ又は溶接部が依然として閉じているか否かを確認する。問題が解決したら、画面上の再開ボタンを押し、原料準備を再開した。
８．１３．４０  手順画面を開始した。原料の準備が正常に終了すると、手順開始画面が表示される。スタートを押した。スタートを押すと直ちに「プレウォッシュサイクル１）」一時停止画面が表示された。
８．１３．４１  プロセスバッグ内で反転した。重量計＃２からプロセスバッグを取り外し（プロセストップポートチューブガイドからチューブを取り外すこともできる）、それを手動で反転させ、使い捨てキットの準備ステップ中に加えた洗浄バッファーがバッグの全内部表面に塗布されるようにした。重量計＃２のプロセスバッグを再びぶら下げた（バックのラベルは左側を向いていた）。チューブガイドのトップポートチューブが外れた場合には交換する。
８．１３．４２  原料バッグを反転した。スタートボタンを押す前に、バッグの角を揉み、細胞を静かに撹拌して均質な細胞懸濁液を作成することにより、IVポールからそれを取り外すことなく原料バッグを混合した。
再開ボタンを押した。LOVOは原料バッグからの流動を開始し、洗浄サイクル１画面が表示される。
８．１３．４３  原料すすぎを一時停止する。原料容器が空になり、LOVOが原料バッグに洗浄バッファーを追加すると、原料すすぎ一時停止画面が表示される。原料バッグをIVポールから取り外すことなく、角を揉んでよく混ぜた。再開を押した。
８．１３．４４  インプロセスバッグの混合を一時停止する。スピナを通過させる別の細胞を準備するため、インプロセスバッグを洗浄バッファーで希釈した。インプロセスバッグに洗浄バッファーを加えた後、LOVOを自動的に一時停止し、「インプロセスバッグの混合」一時停止画面が表示された。重量計からバッグを取り出さずに、バッグを穏やかに圧迫して産物をよく混ぜた。再開を押した。
８．１３．４５  インプロセス角の揉みを一時停止する。インプロセスバッグが空になったら、洗浄バッファーをインプロセスバッグの底部ポートに加え、バッグをすすいだ。すすぎ液を追加した後、LOVOは自動的に一時停止し、「ＩＰバッグの角を揉む」一時停止画面が表示された。「ＩＰバッグの角を揉む」一時停止画面が表示されたら、重量計＃２からバッグを取り外さない。インプロセスバッグを重量計＃２に掛けたまま、バッグの角を揉み、残っている細胞を懸濁液にした。バッグが重量計の上で揺れていないことを確認し、再開ボタンを押した。
８．１３．４６  産物取り出し画面を待つ。LOVO手順の最後に産物取り出し画面が表示された。この画面が表示されると、LOVOキットの全てのバッグが操作でき得た。注記：産物取り出しが表示されるまで、いかなるバッグにも触れなかった。
８．１３．４７  保持液バッグを取り外した。保持液バッグのポートに非常に近いチューブに止血剤を入れ、細胞懸濁液がチューブに落ちないようにした。ステップ８．１３．４８で溶接するのに十分なラインを維持するように、止血剤の下にヒートシール（プロセスノート５．１２に従う）した。保持液バッグを取り外した。
８．１３．４８  製剤用の保持液バッグを準備した。４インチ血漿移送セットのメスルアーロックエンドを保持液バッグに溶接（プロセスノート５．１１に従う）した。ステップ８．１４．１１で使用するために保持液バッグをＢＳＣに移した。
８．１３．４９  産物を取り出した。産物取り出し画面の指示に従った。流体の移動を防ぐため、LOVOキットの全てのクランプを閉じた。
８．１３．５０  産物を取り出した。次へボタンに触れた。全てのLOVO臨床クランプが開放され、キット取外画面が表示された。
８．１３．５１  データを記録した。キット取り出し画面の指示に従った。「次へ」ボタンに触れた。全てのLOVO臨床クランプが閉鎖され、結果概要画面が表示される。結果概要画面のデータを、表示されているとおりに表に記録した。全てのポンプを閉じ、支持剤をろ過した。LOVOから要求されたときにキットを取り外した。＊注記：記録された時間は全て、該当する場合、ＨＨ：ＭＭ：ＳＳ形式及び（ＨＨ：ＭＭ：ＳＳ）形式で、LOVO結果概要画面から直接記録された。
８．１３．５２〜８．１３．５４  LOVOシャットダウンを通したプロトコル選択。LOVO画面のプロンプトに従う。
８．１３．５５  セクション８．１３をレビューする。
８．１４  最終製剤及び充填
８．１４．１  目標体積／バッグ計算。下の表から、充填するＣＳ７５０バッグの数、バッグごとの目標充填量、バッグごとに参考品として取り出す量及びステップ８．１３．２２のLOVO保持液の量に対応するバッグごとの最終目標量を選択した。
【１１５５】
【表１２１】
2021519582.tif 000125
【１１５６】
８．１４．２  ＣＲＦブランクを準備した。空のバッグを作成するためＣＳ−１０及びLOVO洗浄バッファーの量を計算した。
【１１５７】
【表１２２】
2021519582.tif 000126
【１１５８】
８．１４．３  ＣＲＦブランクを準備した。ＢＳＣの外側で、ステップ８．１１．２９で準備したLOVO洗浄バッファーのシリンジを使用して、ステップ８．１４．２Ｂで計算された体積を、ルアー接続を介して空のＣＳ７５０バッグに追加した。注記：ブランクＣＳ７５０バッグ製剤は、無菌で行う必要はない。
８．１４．４  ＣＲＦブランクを調製した。適切なサイズのシリンジを使用して、ステップ８．１４．２計算したＣＳ−１０の体積をステップ８．１４．３で準備した同じＣＳ７５０バッグに追加した。ＣＳ７５０バッグに赤いキャップを付けた。
８．１４．５  ＣＲＦブランクを準備した。ＣＳー７５０バッグから可能な限り多くの空気を取り除いた。ＣＳ７５０バッグをできる限りバッグの近くでヒートシール（プロセスノート５．１２に従う）し、チューブを取り外した。
８．１４．６  ＣＲＦブランクを準備した。ＣＳ７５０バッグに「ＣＲＦブランク」、ロット番号及び開始／日付のラベルを付す。ＣＲＦに置くまで、ＣＲＦブランクをコールドパックの上に置いた。
８．１４．７  ＩＬ−２の必要量を計算した。最終産物に追加するＩＬ−２の量を計算した。
【１１５９】
【表１２３】
2021519582.tif 000127
【１１６０】
８．１４．８  接続装置を組み立てた。4S-4M60をCC２セルコネクトに滅菌溶接（プロセスノート５．１１に従う）し、セルコネクト装置（Ｂ）の単一スパイクを（Ｇ）で4S-4M60マニホールドの４スパイク端に置き換えた。（例えば、図１３５を参照。）
８．１４．９  接続された装置を組み立てた。ＣＳ７５０クライオバッグをステップ８．１４．８準備したハーネスに滅菌溶接（プロセスノート５．１１に従う）し、４つのオスルアーエンド（Ｅ）の１つを各バッグに置き換えた。ステップ８．１４．１を参照して、必要なバッグの数を決定する。（例えば、図１３６を参照。）
８．１４．１０  接続された装置を組み立てた。4S-4M60のスパイクにＣＳ−１０バッグを溶接（プロセスノート５．１１に従う）した。２〜８℃に調整された２つのコールドパック間にバッグを置くことによりＣＳ−１０を低温に保った。（例えば、図１３７を参照。）
８．１４．１１  材料をＢＣＳ中に移した。
【１１６１】
【表１２４】
2021519582.tif 000128
【１１６２】
８．１４．１２  ＩＬ−２を保持するＴＩＬを準備した。適切なサイズのシリンジを使用して、「ＩＬ−２  ６×１０４」アリコートからステップ８．１４．７で決定した量のＩＬ−２を取り出した。
８．１４．１３  ＩＬ−２を保持するＴＩＬを準備した。ルアー接続を介してステップ８．１３．４８で準備した保持液バッグにシリンジを接続し、ＩＬ−２を注入する。
８．１４．１４  ＩＬ−２を伴うＴＩＬを準備する。シリンジからラインを通して空気を押してラインをクリアする。
８．１４．１５  製剤化されたＴＩＬバッグにラベルを付した。移送セットのクランプを閉じ、「製剤化ＴＩＬ」としてバッグにラベルを付け、バッグをＢＳＣから取り出した。
８．１４．１６  該当する場合：サンプルプランに従いサンプリングする。ステップ８．１１．３３で調製した「ＩＬ−２  ６ｘ１０４」アリコートが残っている場合、適切なサイズのシリンジを使用してサンプルプランに従い、約５ｍＬのサンプル参考品を取り出し、５０ｍＬのコニカルチューブに分注した。
８．１４．１７  該当する場合：サンプルプランごとにサンプリングした。サンプルプラン在庫ラベルとラベル付けし、サンプルプランに従い試験用にログインのために提出するまで、２〜８℃で保存した。
８．１４．１８  該当する場合：サンプルプランごとにサンプリングした。サンプルを取り出すためのＬＩＭＳサンプルプランシートに記入されていることを確認した。
８．１４．１９  製剤化されたＴＩＬバッグを装置に追加した。ＩＬ−２が添加されると、ステップ８．１４．１０で準備した装置における残りのスパイク（Ａ）へ「製剤化されたＴＩＬ」バッグを溶接（プロセスノート５．１１に従う）した。（例えば、図１３８を参照。）
８．１４．２０  ＣＳ−１０を追加した。組み立てられた装置を、付属の製剤化ＴＩＬ、ＣＳ−７５０バッグ及びＣＳ−１０とともにＢＳＣに移した。注記：ＣＳ−１０バッグ及び全てのＣＳ−７５０バッグは、２〜８℃で事前調整された２つのコールドパック間に置かれた。製剤化ＴＩＬバッグはコールドパック上に置かなかった。
８．１４．２１  ＣＳ−１０を追加した。装置の全てのクランプが閉じていることを確認した。
活栓を回し、シリンジを閉じた。
８．１４．２２  シリンジの交換。約１０ｍＬの空気を１００ｍＬシリンジに引き込み、装置の６０ｍＬシリンジと交換した。
８．１４．２３  ＣＳ−１０を追加した。ＣＳ７５０バッグへのラインが閉じるように活栓を回した。ＣＳ−１０バッグのクランプを開き、ステップ８．１４．１Ｂで計算した体積をシリンジに引き込んだ。注記：適切な体積のＣＳ−１０を追加するには、複数のシリンジが使用される。注記：ステップ８．１４．２６の各シリンジからの体積を記録する。
８．１４．２４  ＣＳ−１０を追加した。ＣＳ−１０のクランプを閉じ、製剤化ＴＩＬバッグのクランプを開いて、ＣＳ−１０を追加する。注記：およそ１０．０ｍＬ／分で最初の１０．０ｍＬのＣＳ１０を追加する。残りのＣＳ−１０をおよそ１．０ｍＬ／秒の速度で追加する。注記：複数のシリンジを使用して、ＣＳ−１０の適切な量を追加した。一度分注したシリンジは再利用しなかった。
８．１４．２５  ＣＳ−１０を追加した。時間を記録した。注記：ＣＳ−１０の最初の添加から凍結の開始までの目標時間は３０である。
８．１４．２６  ＣＳ−１０を追加した。各ＣＳ１０追加の体積と追加された合計体積を記録した。総体積はステップ８．１４．１Ｂからの計算された体積と一致する。
８．１４．１Ｂ
８．１４．２７  ＣＳ−１０を追加した。ＣＳ１０バッグの全てのクランプを閉じた。
８．１４．２８  ＣＳ−７５０バッグを準備した。活栓を回し、シリンジを開けた。製剤化ＴＩＬバッグのクランプを開き、懸濁液が活栓に達する直前に懸濁液を引き込んだ。
８．１４．２９  ＣＳ−７５０バッグを準備した。製剤化ＴＩＬバッグのクランプを閉じた。空のＣＳ７５０最終産物バッグが開くように活栓を回した。
８．１４．３０  ＣＳ−７５０バッグを準備した。新しいシリンジを使用して、空気を抜いてＣＳ７５０最終産物バッグから可能な限り多くの空気を取り除いた。
シリンジのプランジャーに圧力をかけながら、バッグを締めて閉じた。
８．１４．３１  ＣＳ−７５０バッグを準備した。約２０ｍＬの空気を新しい１００ｍＬシリンジに引き込み、装置に接続する。
注記：製剤化ＴＩＬ懸濁液を低温に保つために、各ＣＳ７５０最終産物バッグは２つのコールドパック間にある必要がある。
８．１４．３２  細胞を分注した。最終産物バッグへのラインが閉じられるように活栓を回した。ステップ８．１４．１で計算された量を、製剤化ＴＩＬバッグからシリンジに引き込んだ。注記：複数のシリンジを使用して、正しい量を得た。
８．１４．３３  細胞を分注した。製剤化されたＴＩＬバッグへのラインが閉じられるように活栓を回した。一度に１つの最終産物バッグで作業し、細胞を最終産物バッグに分注した。ステップ８．１４．３５の各ＣＳ７５０バッグに添加された細胞の量を記録した。
８．１４．３４  細胞を分注した。細胞がスパイクポートの上部に均一であるようにシリンジから空気でラインをクリアした。満たされたバッグのクランプを閉じた。最終産物バッグごとにステップ８．１４．２９〜ステップ８．１４．３４を繰り返し、それぞれの間に製剤化ＴＩＬバッグを静かに混合した。
８．１４．３５  細胞を分注した。以下の各最終産物バッグに入れられたＴＩＬの量を記録する。
８．１４．３６  最終産物バッグから空気を取り除き、参考品を保持した。最後の最終産物バッグが満たされた直後に全てのクランプを閉じた。
８．１４．３７  最終産物バッグから空気を取り除き、参考品を保持した。１０ｍＬの空気を新しい１００ｍＬシリンジに引き込み、装置のシリンジと交換する。
８．１４．３８  最終産物バッグから空気を取り除き、参考品を保持した。一度に１つのバッグを操作し、各産物バッグから全ての空気と、ステップ８．１４．１Ｄで決定した参考品の産物の体積を引き出した。注記：サンプル量を取り出したら、シリンジを逆さにし空気を利用して、産物バッグの上部ポートのラインをクリアにした。保持体積と空気が除去された直後にラインをバッグにクランプした。
８．１４．３９  取り出された体積を記録した。各バッグからの参考品の体積を記録した。
８．１４．４０  分配された参考品。５０ｍＬのコニカルチューブに参考品を分配し、チューブに「参考品」及びロット番号を表示した。各バッグにつきステップ８．１４．３７〜ステップ８．１４．３９を繰り返す。
８．１４．４１  凍結保存用の最終産物を準備した。止血剤を使用して、バッグの近くでラインをクランプした。シリンジ及びシリンジが装着されていた装置の赤いキャップのルアー接続を取り除いた。ＢＳＣから装置を移した。
８．１４．４２  凍結保存用の最終産物を準備した。Ｆでヒートシール（プロセスノート５．１２に従う）し、空の保持液バッグ及びＣＳ−１０バッグを取り外した。
注記：装置上のシリンジのルアー接続を保持した。空の保持液及びＣＳ−１０バッグを廃棄した。（例えば、図１３９を参照。）
８．１４．４３  目視検査を実施した。注記：ステップ８．１４．４３〜ステップ８．１４．４６は、ステップ８．１４．４７〜ステップ８．１４．６８と同時に実施され得る。
８．１４．４４  最終産物ラベルのサンプル。最終産物バッグをラベル付けした。サンプルに以下の最終産物ラベルを添付した。
８．１４．４５  凍結保存用の最終産物を準備した。凍結保存するまで、コールドパック又は２〜８℃でクライオバッグを保持した。
８．１４．４６  外部ラベルを準備した。カセットラベルに添付されるＱＡ発行の外部ラベルが、対応する最終産物ラベルと一致することを確認した。カセットにＱＡ発行の外部ラベルを添付した。サンプルに以下の外部ラベルを添付した。
８．１４．４７  細胞カウントサンプルを取り出した。適切なサイズのピペットを使用して、ステップ８．１４．３８で取り出された参考品２．０ｍＬを取り出し、細胞カウントに使用するために１５ｍＬコニカルチューブに入れる。
８．１４．４８  細胞カウントを実行した。ＳＯＰ−００３１４に従い、NC-200及びプロセスノート５．１４を使用して、細胞カウント及び計算を実行した。注記：１つのサンプルのみを適切な希釈に希釈して、希釈が十分であることを確認する。追加的なサンプルを適切な希釈係数に希釈し、カウントを続行する。
８．１４．４９  細胞カウントサンプル体積を記録した。注記：希釈が不要な場合、「サンプル［μＬ］」＝２００、「希釈［μＬ］」＝０。
８．１４．５０  増倍係数を決定した。
【１１６３】
【表１２５】
2021519582.tif 000129
【１１６４】
８．１４．５１  プロトコルを選択し、増倍係数を入力する。「生細胞カウントアッセイ」プロトコルが選択され、全ての増倍係数、サンプル及び希釈剤の体積がＳＯＰ−００３１４に従って入力されていることを確認する。
注記：希釈が不要な場合、「サンプル［μＬ］」＝２００、「希釈［μＬ］」＝０と入力する。
８．１４．５２  Nucleoviewからファイル名、生存率及び細胞カウントを記録した。
８．１４．５３  生細胞濃度の平均と実施された細胞カウントの生存率を決定した。
【１１６５】
【表１２６】
2021519582.tif 000130
【１１６６】
８．１４．５４  カウントの上限及び下限を決定した。
【１１６７】
【表１２７】
2021519582.tif 000131
【１１６８】
８．１４．５５  両方のカウントは許容範囲内であったか？
【１１６９】
【表１２８】
2021519582.tif 000132
【１１７０】
注記：いずれかの結果が「いいえ」の場合、ステップ８．１４．５６〜８．１４．６３で２番目のカウントのセットを実施する。
８．１４．５６  該当する場合：細胞カウントを実施した。ＳＯＰ−００３１４に従い、NC-200及びプロセスノート５．１４を使用して、細胞カウント及び計算を実行した。注記：希釈は、期待される細胞濃度に基づいて調整され得る。
８．１４．５７  該当する場合：細胞カウントサンプル体積を記録した。
８．１４．５８  該当する場合：増倍係数を決定した。
【１１７１】
【表１２９】
2021519582.tif 000133
【１１７２】
８．１４．５９  該当する場合：プロトコルを選択し、増倍係数を入力した。
「生細胞カウントアッセイ」プロトコルが選択され、全ての増倍係数、サンプル及び希釈剤の体積が入力されていることを確認した。注記：希釈が不要な場合、「サンプル［μＬ］」＝２００、「希釈［μＬ］」＝０と入力する。
８．１４．６０  該当する場合：Nucleoviewから記録された細胞カウント
８．１４．６１  該当する場合：生細胞濃度の平均と実施された細胞カウントの生存率を決定した。
【１１７３】
【表１３０】
2021519582.tif 000134
【１１７４】
８．１４．６２  該当する場合：カウントの上限及び下限を決定した。
【１１７５】
【表１３１】
2021519582.tif 000135
【１１７６】
８．１４．６３  該当する場合：カウントは許容範囲内であったか？
【１１７７】
【表１３２】
2021519582.tif 000136
【１１７８】
注記：いずれかの結果が「いいえ」の場合、ステップ８．１４．６４に進んで平均を決定する。
８．１４．６４  該当する場合：実施された４カウント全てから平均生細胞濃度を決定した。
８．１４．６５  フローを計算した。サイトメトリーサンプル。フローサイトメトリーのサンプリングに十分な細胞濃度を確保するために計算を実行した。
【１１７９】
【表１３３】
2021519582.tif 000137
【１１８０】
８．１４．６６  ＩＦＮ−γを計算した。ＩＦＮ−γサンプリングに十分な細胞濃度を確保するためにサンプルの計算を実行した。
【１１８１】
【表１３４】
2021519582.tif 000138
【１１８２】
８．１４．６７  結果を報告した。サンプルを提出するためのフォームに記入した。
８．１４．６８  ヒートシールした。サンプル量が決定されたら、最終産物バッグを可能な限りバッグの近くにヒートシール（プロセスノート５．１２に従う）して、装置から取り出す。
８．１４．６９  サンプルプランに従い、サンプルにラベルを付し、収集した。
【１１８３】
【表１３５】
2021519582.tif 000139
【１１８４】
８．１４．７０  無菌及びＢａｃＴ。試験サンプリング。ＢＳＣ中で、適切なサイズのシリンジを使用してステップ８．１４．３８で参考品として収集した細胞懸濁液から１．０ｍＬのサンプルを取り出し、嫌気性ボトルに播種する。好気性ボトルについて上記を繰り返す。注記：Bac-Tボトルは、室温で、光から保護して保管する。
８．１４．７１  サンプルのラベルを付け及び保存した。全てのサンプルにサンプルプラン在庫ラベルのラベルを付し、ログインのために移送まで適切に保管する。注記：最終産物及びサンプルの凍結保存のため、セクション８．１５に進んだ。
８．１４．７２  サンプリングのためにサインした。サンプルを取り出すためのＬＩＭＳサンプルプランシートが完成していることを確認する。
８．１４．７３  サンプルの提出。２２日目の試験サンプルを全てログインのために提出した。
８．１４．７４  環境モニタリング。処理後、ＢＳＣを検証し、担当者によるモニタリングが実施された。
８．１４．７５  セクション８．１４をレビューする。
８．１５  最終産物の凍結保存
８．１５．１  制御速度冷凍庫を準備した。凍結する前にＣＲＦがセットアップされたことを確認した。ＣＲＦ機器を記録した。凍結保存が実行される。
８．１５．２  ＣＲＦプローブをセットアップする。ＣＲＦブランクバッグのセプタムに穴を開けた。６ｍＬバイアル温度プローブを挿入した。
８．１５．３  最終産物とサンプルをＣＲＦに入れた。ブランクバッグを事前調整済みカセットに入れ、ＣＲＦラックのおよそ中央に移した。最終産物カセットをＣＲＦラックに移し、バイアルをＣＲＦバイアルラックに移した。
８．１５．４  最終産物とサンプルをＣＲＦに入れた。産物ラック及びバイアルラックをＣＲＦに移した。産物がＣＲＦに移された時間及びステップ８．１５．５のチャンバ温度を記録した。注記：カセット及びバイアルラックをＣＲＦに均等に配置し、各棚間にできるだけ多くのスペースを確保した。
８．１５．５  ４℃±１．５℃に達し、ＣＲＦの実行を続行するのに必要な時間を決定した。
チャンバの温度が４℃±１．５℃に達したら、分析を開始した。時間を記録した。
【１１８５】
【表１３６】
2021519582.tif 000140
【１１８６】
８．１５．６  ＣＲＦを完了し、貯蔵した。実施完了後にＣＲＦを停止した。ＣＲＦからカセット及びバイアルを取り出す。カセット及びバイアルを保管のために気相ＬＮ２に移した。保管場所を記録した。
後処理の概要
【１１８７】
・後処理：最終医薬品
○（２２日目）フローサイトメトリーによる２２日目ＲＥＰでのＣＤ３＋細胞の決定
○（２２日目）グラム染色法（ＧＭＰ）
○（２２日目）ゲルクロットＬＡＬアッセイ（ＧＭＰ）による細菌エンドトキシン試験
○（１６日目）ＢａｃＴ無菌アッセイ（ＧＭＰ）
○（１６日目）ＴＤ−ＰＣＲ（ＧＭＰ）によるマイコプラズマＤＮＡ検出
○許容可能な外観属性（ステップ８．１４．４３）
○（２２日目）ＢａｃＴ無菌アッセイ（ＧＭＰ）
○（２２日目）ＩＦＮ−γアッセイ
【１１８８】
[001037]  上記に示す例は、本発明の組成物、システム及び方法の実施形態をどのように作成及び使用し得るかについて当業者に完全な開示及び説明を付与するために提供され、本発明者らがその発明と見なすものの範囲を限定することは意図されない。当業者には明らかな本発明を実施するための上述の態様の変形例は、以下の特許請求の範囲内にあることが意図される。本明細書において言及される全ての特許及び刊行物は、本発明が関係する技術分野の当業者の技能水準の指標である。
【１１８９】
[001038]  全ての見出し及びセクション表示は、明確にするために、且つあくまでも参考として使用され、いかなる形であっても限定するものと考えられてはならない。例えば、当業者は、異なる見出し及びセクションからの様々な態様を本明細書に記載される本発明の趣旨及び範囲に従い適宜組み合わせることの有用性を理解するであろう。
【１１９０】
[001039]  本明細書に引用する全ての参考文献は、各個別の刊行物又は特許又は特許出願があらゆる目的から全体として参照により援用されると具体的且つ個別的に指示されたものとみなすのと同程度に、本明細書によって全体として及びあらゆる目的から参照により本明細書に援用される。
【１１９１】
[001040]  当業者には明らかであろうとおり、本願の多くの改良及び変形をその趣旨及び範囲から逸脱することなく行うことができる。本明細書に記載される具体的な実施形態及び例は単に例として提供され、本願は、特許請求の範囲に認められる均等物の全範囲と共に、添付の特許請求の範囲の用語によってのみ限定されるべきである。
【１１９２】
配列表：
配列番号１は、ムロモナブの重鎖のアミノ酸配列である。
配列番号２は、ムロモナブの軽鎖のアミノ酸配列である。
配列番号３は、組換えヒトＩＬ−２タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号４は、アルデスロイキンのアミノ酸配列である。
配列番号５は、組換えヒトＩＬ−４タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号６は、組換えヒトＩＬ−７タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号７は、組換えヒトＩＬ−１５タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号８は、組換えヒトＩＬ−２１タンパク質のアミノ酸配列である。
【１１９３】
【表１３７】
2021519582.tif 000141
【１１９４】
【表１３８】
2021519582.tif 000142
【図１】
2021519582.tif 000143
【図２】
2021519582.tif 000144
【図３】
2021519582.tif 000145
【図４】
2021519582.tif 000146
【図５】
2021519582.tif 000147
【図６】
2021519582.tif 000148
【図７】
2021519582.tif 000149
【図８】
2021519582.tif 000150
【図９】
2021519582.tif 000151
【図１０】
2021519582.tif 000152
【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
2021519582.tif 000157
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2021519582.tif 000160
【図１７】
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【図１８】
2021519582.tif 000162
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
2021519582.tif 000179
【図３３Ｂ】
2021519582.tif 000180
【図３４】
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【図３５】
2021519582.tif 000182
【図３６】
2021519582.tif 000183
【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
2021519582.tif 000199
【図４５Ａ】
2021519582.tif 000200
【図４５Ｂ】
2021519582.tif 000201
【図４６Ａ】
2021519582.tif 000202
【図４６Ｂ】
2021519582.tif 000203
【図４７Ａ】
2021519582.tif 000204
【図４７Ｂ】
2021519582.tif 000205
【図４８Ａ】
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【図４８Ｂ】
2021519582.tif 000207
【図４９Ａ】
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【図４９Ｂ】
2021519582.tif 000209
【図５０Ａ】
2021519582.tif 000210
【図５０Ｂ】
2021519582.tif 000211
【図５１Ａ】
2021519582.tif 000212
【図５１Ｂ】
2021519582.tif 000213
【図５２Ａ】
2021519582.tif 000214
【図５２Ｂ】
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【図５３Ａ】
2021519582.tif 000216
【図５３Ｂ】
2021519582.tif 000217
【図５４Ａ】
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【図５４Ｂ】
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【図５５Ａ】
2021519582.tif 000220
【図５５Ｂ】
2021519582.tif 000221
【図５６Ａ】
2021519582.tif 000222
【図５６Ｂ】
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【図５７Ａ】
2021519582.tif 000224
【図５７Ｂ】
2021519582.tif 000225
【図５８Ａ】
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【図５８Ｂ】
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【図５９】
2021519582.tif 000228
【図６０】
2021519582.tif 000229
【図６１Ａ】
2021519582.tif 000230
【図６１Ｂ】
2021519582.tif 000231
【図６２Ａ】
2021519582.tif 000232
【図６２Ｂ】
2021519582.tif 000233
【図６３Ａ】
2021519582.tif 000234
【図６３Ｂ】
2021519582.tif 000235
【図６４Ａ−１】
2021519582.tif 000236
【図６４Ａ−２】
2021519582.tif 000237
【図６４Ｂ−１】
2021519582.tif 000238
【図６４Ｂ−２】
2021519582.tif 000239
【図６５Ａ】
2021519582.tif 000240
【図６５Ｂ】
2021519582.tif 000241
【図６５Ｃ】
2021519582.tif 000242
【図６６】
2021519582.tif 000243
【図６７】
2021519582.tif 000244
【図６８】
2021519582.tif 000245
【図６９Ａ】
2021519582.tif 000246
【図６９Ｂ】
2021519582.tif 000247
【図７０Ａ】
2021519582.tif 000248
【図７０Ｂ】
2021519582.tif 000249
【図７１Ａ】
2021519582.tif 000250
【図７１Ｂ】
2021519582.tif 000251
【図７１Ｃ】
2021519582.tif 000252
【図７２Ａ】
2021519582.tif 000253
【図７２Ｂ】
2021519582.tif 000254
【図７２Ｃ】
2021519582.tif 000255
【図７３Ａ】
2021519582.tif 000256
【図７３Ｂ】
2021519582.tif 000257
【図７４】
2021519582.tif 000258
【図７５Ａ】
2021519582.tif 000259
【図７５Ｂ】
2021519582.tif 000260
【図７６】
2021519582.tif 000261
【図７７Ａ】