(57)【要約】  例えば、対象の１つ以上の細胞において自己免疫疾患に対する感受性に関連する１種以上の遺伝子バリアントの量を減少させること、および／または当該対象の１つ以上の細胞において自己免疫疾患に対して保護的な１種以上の遺伝子バリアントの量を増加させることを含む、自己免疫疾患を有する対象を治療する方法を提供する。当該対象において自己免疫疾患に対する感受性に関連する１種以上の遺伝子バリアントを有する細胞の数を減少させるため、および／または当該対象において自己免疫疾患に対して保護的な１種以上の遺伝子バリアントを有する細胞の数を増加させるための方法も提供する。本方法に従って使用するための組成物および単離された細胞も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）対象の１つ以上の細胞において自己免疫疾患に対する感受性に関連する１種以上の遺伝子バリアント（「感受性遺伝子バリアント」）の量を減少させること、および／または
（ｂ）前記対象の１つ以上の細胞において自己免疫疾患に対して保護的な１種以上の遺伝子バリアント（「保護的遺伝子バリアント」）の量を増加させること
を含む、自己免疫疾患を有する対象を治療する方法。
【請求項２】
前記対象の１つ以上の免疫細胞および／または１つ以上の造血幹細胞において前記感受性遺伝子バリアントの量を減少させること、および
前記対象の１つ以上の免疫細胞および／または１つ以上の造血幹細胞において前記保護的遺伝子バリアントの量を増加させること
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ａ）前記対象において自己免疫疾患に対する感受性に関連する１種以上の遺伝子バリアントを有する細胞の数を減少させること、および／または
（ｂ）前記対象において自己免疫疾患に対して保護的な１種以上の遺伝子バリアントを有する細胞の数を増加させること
を含む、自己免疫疾患を有する対象を治療する方法。
【請求項４】
前記細胞は免疫細胞および／または造血幹細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記免疫細胞は、白血球、食細胞、マクロファージ、好中球、樹状細胞、自然リンパ球、好酸球、好塩基球、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞およびＴ細胞のうちの１つ以上を含む、請求項２または４に記載の方法。
【請求項６】
前記保護的遺伝子バリアントを含む免疫細胞および／または造血幹細胞、および／または
前記保護的遺伝子バリアントを含み、かつ前記感受性遺伝子バリアントを含んでいない免疫細胞および／または造血幹細胞
を前記対象に投与することを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記対象における保護的タンパク質バリアント：感受性タンパク質バリアントの割合を増加させる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
第１の対象から免疫細胞および／または造血幹細胞を得ること、
前記得られた免疫細胞および／または造血幹細胞を変化させて前記感受性遺伝子バリアントの量を減少させること、および／または前記保護的遺伝子バリアントの量を増加させること、および
前記変化させた免疫細胞および／または造血幹細胞を治療を必要とする前記対象に投与すること
をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記免疫細胞および／または造血幹細胞は前記対象の血液または骨髄から得る、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の対象は治療を必要とする前記対象である、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記変化させた免疫細胞および／または造血幹細胞は静脈投与または骨髄移植によって投与する、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記免疫細胞および／または造血幹細胞の投与前に前記対象の前記造血幹細胞の少なくとも一部を除去することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記除去することは、前記対象に化学療法薬または放射線を投与すること、前記対象に抗ｃ−Ｋｉｔモノクローナル抗体を投与すること、および／または前記対象にＣＤ４７遮断薬を投与することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）前記対象の１つ以上の細胞において前記感受性遺伝子バリアントの量を減少させ、かつ／または（ｂ）前記対象の１つ以上の細胞において前記保護的遺伝子バリアントの量を増加させる遺伝子改変剤を前記対象に投与することを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記遺伝子改変剤はヌクレアーゼを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ヌクレアーゼは（１）ヌクレアーゼ関連クラス２のＣＲＩＳＰＲ、（２）ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、（３）転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、または（４）メガヌクレアーゼである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ヌクレアーゼは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｐｆ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３またはＣｓｆ４を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）（ｉ）自己免疫疾患を治療するための特定の薬物に対する抵抗性または（ｉｉ）自己免疫疾患に対する高い感受性に関連する前記対象の腸内での細菌の分布に関連する１種以上の遺伝子バリアントの量を減少させ、かつ／または
（ｂ）（ｉ）自己免疫疾患を治療するための特定の薬物に対する高い感度または（ｉｉ）自己免疫疾患に対して保護的な前記対象の腸内での細菌の分布に関連する１種以上の遺伝子バリアントの量を増加させる
ために前記対象の免疫細胞および／または造血幹細胞のＤＮＡを編集することを含む、自己免疫疾患を有する対象を治療する方法。
【請求項２０】
前記遺伝子バリアントは、ＩＬ２３Ｒバリアント、ＣＡＲＤ９バリアント、ＮＯＤ１／２バリアント、ＰＴＰＮ２２バリアント、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ複合体遺伝子バリアント、ＴＴＣ７Ａバリアント、ＸＩＡＰバリアント、ＩＬ−１０バリアント、ＩＬ−１０ＲＡバリアント、ＩＬ−１０ＲＢバリアント、ＲＰＬ７バリアント、ＣＰＡＭＤ８バリアント、ＰＲＧ２バリアント、ＰＲＧ３バリアント、ＨＥＡＴＲ３バリアント、ＡＴＧ１６Ｌ１バリアント、ＴＮＦｓｆ１５バリアント、ＭＨＣＩＩバリアント、ＥＬＦ１バリアント、ＨＬＡ−ＤＢ１＊０１：０３バリアント、ＨＬＡ−ＢＴＮＬ２バリアント、ＡＲＰＣ２バリアント、ＩＬ１２Ｂバリアント、ＳＴＡＴ１バリアント、ＩＲＧＭバリアント、ＩＲＦ８バリアント、ＴＹＫ２バリアント、ＳＴＡＴ３バリアント、ＩＦＮＧＲ２バリアント、ＩＦＮＧＲ１バリアント、ＲＩＰＫ２バリアント、ＬＲＲＫ２バリアント、Ｃ１３ｏｒｆ３１バリアント、ＥＣＭ１バリアント、ＮＫＸ２−３バリアント、ＴＮＦバリアント、ＪＡＫ１バリアント、ＪＡＫ２バリアント、ＪＡＫ３バリアント、ＴＰＭＴバリアント、ＮＵＤＴ１５バリアント、ＬＯＣ４４１１０８バリアント、ＰＲＤＭ１バリアント、ＩＲＧＭバリアント、ＭＡＧＩ１バリアント、ＣＬＣＡ２バリアント、２ｑ２４．１バリアント、ＬＹ７５バリアントあるいは上記の組み合わせである、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
自己免疫疾患は炎症性腸疾患を含み、ここでは前記保護的遺伝子バリアントは、ＩＬ２３Ｒタンパク質におけるＲ３８１Ｑ突然変異、Ｇ１４９Ｒ突然変異およびＶ３６２Ｉ突然変異のうちの１つ以上をコードする、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記保護的遺伝子バリアントは、ｒｓ１１２０９０２６におけるＧからＡへの突然変異を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記感受性遺伝子バリアントおよび前記保護的遺伝子バリアントは、
（ａ）１人以上の家族構成員の表現型、１人以上の家族構成員の遺伝子パネルのシークエンシング、１人以上の家族構成員の全エクソームシークエンシング、および／または１人以上の家族構成員の全ゲノムシークエンシング、
（ｂ）細胞シグナル伝達および／または免疫系応答のコンピューターシミュレーション、
（ｃ）線形および／または非線形回帰モデルなどによる表現型に影響を与える突然変異の機械モデル化、ニューラルネットワーク、
（ｄ）遺伝子発現および／または遺伝子シグナル伝達を記述しているデータ、および
（ｅ）動物モデル（例えばブタ）
のうちの１つ以上に基づいて決定する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
その細胞のＤＮＡが、（ａ）自己免疫疾患に対する感受性に関連する１種以上の遺伝子バリアントの量を減少させ、かつ／または（ｂ）自己免疫疾患に対して保護的な１種以上の遺伝子バリアントの量を増加させるために遺伝子編集によって改変されている、単離された免疫細胞または造血幹細胞。
【請求項２５】
その集団中の細胞の少なくとも約１０％が、（ａ）自己免疫疾患に対する感受性に関連する１種以上の遺伝子バリアントの量を減少させ、かつ（ｂ）自己免疫疾患に対して保護的な１種以上の遺伝子バリアントの量を増加させるために遺伝子編集により改変されている、免疫細胞または造血幹細胞集団。
【請求項２６】
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸、（ｉｉ）自己免疫疾患に対する感受性に関連する遺伝子バリアントをコードする細胞のゲノムＤＮＡ内の標的配列とハイブリッド形成するガイドＲＮＡまたは前記ガイドＲＮＡをコードする核酸、および（ｉｉｉ）自己免疫疾患に対する感受性に関連していない遺伝子バリアントをコードするＤＮＡ修復テンプレートを含む組成物。
【請求項２７】
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸、（ｉｉ）自己免疫疾患の非保護的遺伝子バリアントをコードする細胞のゲノムＤＮＡ内の標的配列とハイブリッド形成するガイドＲＮＡまたは前記ガイドＲＮＡをコードする核酸、および（ｉｉｉ）前記標的配列の位置において自己免疫疾患の保護的遺伝子バリアントをコードするＤＮＡ修復テンプレートを含む組成物。
【請求項２８】
（ａ）（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸、（ｉｉ）自己免疫疾患に対する感受性に関連する遺伝子バリアントをコードする細胞のゲノムＤＮＡ内の標的配列とハイブリッド形成するガイドＲＮＡまたは前記ガイドＲＮＡをコードする核酸、および（ｉｉｉ）自己免疫疾患に対する感受性に関連していない遺伝子バリアントをコードするＤＮＡ修復テンプレート、ならびに
（ｂ）（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸、（ｉｉ）自己免疫疾患の非保護的遺伝子バリアントをコードする細胞のゲノムＤＮＡ内の標的配列とハイブリッド形成するガイドＲＮＡまたは前記ガイドＲＮＡをコードする核酸、および（ｉｉｉ）前記標的配列の位置において自己免疫疾患の保護的遺伝子バリアントをコードするＤＮＡ修復テンプレート
を含む組成物。
【請求項２９】
２つ以上のガイドＲＮＡを含み、前記ガイドＲＮＡはまとめて２つ以上の標的配列とハイブリッド形成する、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３０】
前記遺伝子バリアントは、ＩＬ２３Ｒバリアント、ＣＡＲＤ９バリアント、ＮＯＤ１／２バリアント、ＰＴＰＮ２２バリアント、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ複合体遺伝子バリアント、ＴＴＣ７Ａバリアント、ＸＩＡＰバリアント、ＩＬ−１０バリアント、ＩＬ−１０ＲＡバリアント、ＩＬ−１０ＲＢバリアント、ＲＰＬ７バリアント、ＣＰＡＭＤ８バリアント、ＰＲＧ２バリアント、ＰＲＧ３バリアント、ＨＥＡＴＲ３バリアント、ＡＴＧ１６Ｌ１バリアント、ＴＮＦｓｆ１５バリアント、ＭＨＣＩＩバリアント、ＥＬＦ１バリアント、ＨＬＡ−ＤＢ１＊０１：０３バリアント、ＨＬＡ−ＢＴＮＬ２バリアント、ＡＲＰＣ２バリアント、ＩＬ１２Ｂバリアント、ＳＴＡＴ１バリアント、ＩＲＧＭバリアント、ＩＲＦ８バリアント、ＴＹＫ２バリアント、ＳＴＡＴ３バリアント、ＩＦＮＧＲ２バリアント、ＩＦＮＧＲ１バリアント、ＲＩＰＫ２バリアント、ＬＲＲＫ２バリアント、Ｃ１３ｏｒｆ３１バリアント、ＥＣＭ１バリアント、ＮＫＸ２−３バリアント、ＴＮＦバリアント、ＪＡＫ１バリアント、ＪＡＫ２バリアント、ＪＡＫ３バリアント、ＴＰＭＴバリアント、ＮＵＤＴ１５バリアント、ＬＯＣ４４１１０８バリアント、ＰＲＤＭ１バリアント、ＩＲＧＭバリアント、ＭＡＧＩ１バリアント、ＣＬＣＡ２バリアント、２ｑ２４．１バリアントまたはＬＹ７５バリアントあるいは上記の組み合わせである、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１８年５月１４日に出願された米国仮出願第６２／７６２，７０８号の利益を主張し、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（配列表）
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０１９年５月１４日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーの名前はＭ１０７３８５＿１０１０ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、サイズは１３６，５９６バイトである。
【背景技術】
【０００３】
自己免疫疾患および免疫介在疾患は、健康な体組織の死滅を引き起こす体内に正常に存在する物質および組織に対する体の異常な免疫応答を特徴とする。従って自己免疫疾患は、体の免疫系が誤って健康な体組織を攻撃した際に生じる。多発性硬化症（「ＭＳ」）、関節リウマチ（「ＲＡ」）、１型糖尿病（「Ｔ１Ｄ」）、潰瘍性大腸炎（「ＵＣ」）、クローン病（「ＣＤ」）、好酸球性食道炎、セリアック病、乾癬および狼瘡を含む８０種を超える自己免疫疾患が存在する。自己免疫疾患の正確な原因は完全には分かっていないが、多くは遺伝および環境要素の両方を有していると考えられている。自己免疫疾患の治療のための薬物開発の既存のパラダイムは特定のシグナル伝達経路を標的にする。しかしそのような疾患の複雑性によりこれらの経路をモデル化することが難しくなり、得られる治療は望まれているほど有効なものではない。そのため当該技術分野において自己免疫疾患の治療に関連する新しいパラダイムが必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
対象の１つ以上の細胞において自己免疫疾患に対する感受性に関連する１種以上の遺伝子バリアントの量を減少させること、および／または当該対象の１つ以上の細胞において自己免疫疾患に対して保護的な１種以上の遺伝子バリアントの量を増加させることを含む、自己免疫疾患を有する対象を治療する方法を提供する。いくつかの態様では、本方法は、当該対象の１つ以上の免疫細胞および／または１つ以上の造血幹細胞において感受性遺伝子バリアントの量を減少させること、および当該対象の１つ以上の免疫細胞および／または１つ以上の造血幹細胞において保護的遺伝子バリアントの量を増加させることを含む。
【０００５】
対象において自己免疫疾患に対する感受性に関連する１種以上の遺伝子バリアントを有する細胞の数を減少させること、および／または当該対象において自己免疫疾患に対して保護的な１種以上の遺伝子バリアントを有する細胞の数を増加させることを含む、自己免疫疾患を有する対象を治療する方法も提供する。
【０００６】
いくつかの態様では、当該細胞は免疫細胞および／または造血幹細胞である。いくつかの態様では、当該免疫細胞は、白血球、食細胞、マクロファージ、好中球、樹状細胞、自然リンパ球、好酸球、好塩基球、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞およびＴ細胞のうちの１つ以上を含む。
【０００７】
いくつかの態様は、保護的遺伝子バリアントを含む免疫細胞および／または造血幹細胞、および／または保護的遺伝子バリアントを含み、かつ感受性遺伝子バリアントを含んでいない免疫細胞および／または造血幹細胞を当該対象に投与することを含む。いくつかの態様では、当該対象（または当該対象の細胞または細胞集団）における保護的タンパク質バリアント：感受性タンパク質バリアントの割合を増加させる。すなわち、保護的タンパク質バリアントの量を感受性タンパク質バリアントの量に対して増加させる。
【０００８】
いくつかの態様は、第１の対象から免疫細胞および／または造血幹細胞を得ること、得られた免疫細胞および／または造血幹細胞を変化させて感受性遺伝子バリアントの量を減少させること、および／または保護的遺伝子バリアントの量を増加させること、および変化させた免疫細胞および／または造血幹細胞を治療を必要とする対象に投与することを含む。いくつかの態様では、当該免疫細胞および／または造血幹細胞は当該対象の血液または骨髄から得る。いくつかの態様では、第１の対象は治療を必要とする対象である。いくつかの態様では、変化させた免疫細胞および／または造血幹細胞は静脈投与または骨髄移植によって投与する。
【０００９】
いくつかの態様は、免疫細胞および／または造血幹細胞の投与前に当該対象の造血幹細胞の少なくとも一部を除去することを含む。いくつかの態様では、除去することは、当該対象に化学療法薬または放射線を投与すること、当該対象に抗ｃ−Ｋｉｔモノクローナル抗体を投与すること、および／または当該対象にＣＤ４７遮断薬を投与することを含む。
【００１０】
いくつかの態様は、当該対象に遺伝子改変剤を投与することを含み、この遺伝子改変剤は、（ａ）当該対象の１つ以上の細胞において感受性遺伝子バリアントの量を減少させ、かつ／または（ｂ）当該対象の１つ以上の細胞において保護的遺伝子バリアントの量を増加させる。いくつかの態様では、遺伝子改変剤はヌクレアーゼを含む。いくつかの態様では、当該ヌクレアーゼは、（１）クラス２のＣＲＩＳＰＲ（ｒｅｇｕｌａｒｌｙ−ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔ（クラスター化された規則的な間隔の短い回文反復））関連ヌクレアーゼ、（２）ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、（３）転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、または（４）メガヌクレアーゼである。例えばいくつかの態様では、当該ヌクレアーゼは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｐｆ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３またはＣｓｆ４を含む。いくつかの態様では、当該ヌクレアーゼはＣａｓ９またはＣｐｆ１を含む。
【００１１】
（ａ）（ｉ）自己免疫疾患を治療するための特定の薬物に対する抵抗性または（ｉｉ）自己免疫疾患に対する高い感受性に関連する当該対象の腸内での細菌の分布に関連する１種以上の遺伝子バリアントの量を減少させ、かつ／または（ｂ）（ｉ）自己免疫疾患を治療するための特定の薬物に対する高い感度または（ｉｉ）自己免疫疾患に対して保護的な当該対象の腸内での細菌の分布に関連する１種以上の遺伝子バリアントの量を増加させるために対象の免疫細胞および／または造血幹細胞のＤＮＡを編集することを含む、自己免疫疾患を有する対象を治療する方法も提供する。
【００１２】
いくつかの態様では、当該遺伝子バリアントは、ＩＬ２３Ｒバリアント、ＣＡＲＤ９バリアント、ＮＯＤ１／２バリアント、ＰＴＰＮ２２バリアント、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ複合体遺伝子バリアント、ＴＴＣ７Ａバリアント、ＸＩＡＰバリアント、ＩＬ−１０バリアント、ＩＬ−１０ＲＡバリアント、ＩＬ−１０ＲＢバリアント、ＲＰＬ７バリアント、ＣＰＡＭＤ８バリアント、ＰＲＧ２バリアント、ＰＲＧ３バリアント、ＨＥＡＴＲ３バリアント、ＡＴＧ１６Ｌ１バリアント、ＴＮＦｓｆ１５バリアント、ＭＨＣＩＩバリアント、ＥＬＦ１バリアント、ＨＬＡ−ＤＢ１＊０１：０３バリアント、ＨＬＡ−ＢＴＮＬ２バリアント、ＡＲＰＣ２バリアント、ＩＬ１２Ｂバリアント、ＳＴＡＴ１バリアント、ＩＲＧＭバリアント、ＩＲＦ８バリアント、ＴＹＫ２バリアント、ＳＴＡＴ３バリアント、ＩＦＮＧＲ２バリアント、ＩＦＮＧＲ１バリアント、ＲＩＰＫ２バリアント、ＬＲＲＫ２バリアント、Ｃ１３ｏｒｆ３１バリアント、ＥＣＭ１バリアント、ＮＫＸ２−３バリアント、ＴＮＦバリアント、ＪＡＫ１バリアント、ＪＡＫ２バリアント、ＪＡＫ３バリアント、ＴＰＭＴバリアント、ＮＵＤＴ１５バリアント、ＬＯＣ４４１１０８バリアント、ＰＲＤＭ１バリアント、ＩＲＧＭバリアント、ＭＡＧＩ１バリアント、ＣＬＣＡ２バリアント、２ｑ２４．１バリアントまたはＬＹ７５バリアントである。いくつかの態様では自己免疫疾患は炎症性腸疾患を含み、ここでは保護的遺伝子バリアントは、ＩＬ２３Ｒタンパク質におけるＲ３８１Ｑ突然変異、Ｇ１４９Ｒ突然変異およびＶ３６２Ｉ突然変異のうちの１つ以上をコードする。いくつかの態様では、保護的遺伝子バリアントは、ｒｓ１１２０９０２６におけるＧからＡへの突然変異を含む。
【００１３】
いくつかの態様では、感受性遺伝子バリアントおよび保護的遺伝子バリアントは、（ａ）１人以上の家族構成員の表現型、１人以上の家族構成員の遺伝子パネルのシークエンシング、１人以上の家族構成員の全エクソームシークエンシングおよび／または１人以上の家族構成員の全ゲノムシークエンシング、（ｂ）細胞シグナル伝達および／または免疫系応答のコンピューターシミュレーション、（ｃ）線形および／または非線形回帰モデルなどによる表現型に影響を与える突然変異の機械モデル化、ニューラルネットワーク、（ｄ）遺伝子発現および／または遺伝子シグナル伝達を記述しているデータ、ならびに（ｅ）動物モデル（例えばブタ）のうちの１つ以上に基づいて決定する。
【００１４】
その細胞のＤＮＡが、（ａ）自己免疫疾患に対する感受性に関連する１種以上の遺伝子バリアントの量を減少させ、かつ／または（ｂ）自己免疫疾患に対して保護的な１種以上の遺伝子バリアントの量を増加させるために遺伝子編集によって改変されている、単離された免疫細胞または造血幹細胞も提供する。
【００１５】
その集団中の細胞の少なくとも約１０％が、（ａ）自己免疫疾患に対する感受性に関連する１種以上の遺伝子バリアントの量を減少させ、かつ（ｂ）自己免疫疾患に対して保護的な１種以上の遺伝子バリアントの量を増加させるために遺伝子編集により改変されている、免疫細胞または造血幹細胞の集団も提供する。
【００１６】
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸、（ｉｉ）自己免疫疾患に対する感受性に関連する遺伝子バリアントをコードする細胞のゲノムＤＮＡ内の標的配列とハイブリッド形成するガイドＲＮＡまたはそのガイドＲＮＡをコードする核酸、および（ｉｉｉ）自己免疫疾患に対する感受性に関連していない遺伝子バリアントをコードするＤＮＡ修復テンプレートを含む組成物も提供する。
【００１７】
いくつかの態様では、本組成物は、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸、（ｉｉ）自己免疫疾患の非保護的遺伝子バリアントをコードする細胞のゲノムＤＮＡ内の標的配列とハイブリッド形成するガイドＲＮＡまたはそのガイドＲＮＡをコードする核酸、および（ｉｉｉ）その標的配列の位置において自己免疫疾患の保護的遺伝子バリアントをコードするＤＮＡ修復テンプレートを含む。
【００１８】
いくつかの態様では、本組成物は、（ａ）（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸、（ｉｉ）自己免疫疾患に対する感受性に関連する遺伝子バリアントをコードする細胞のゲノムＤＮＡ内の標的配列とハイブリッド形成するガイドＲＮＡまたはそのガイドＲＮＡをコードする核酸、および（ｉｉｉ）自己免疫疾患に対する感受性に関連していない遺伝子バリアントをコードするＤＮＡ修復テンプレート、ならびに（ｂ）（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸、（ｉｉ）自己免疫疾患の非保護的遺伝子バリアントをコードする細胞のゲノムＤＮＡ内の標的配列とハイブリッド形成するガイドＲＮＡまたはそのガイドＲＮＡをコードする核酸、および（ｉｉｉ）その標的配列の位置において自己免疫疾患の保護的遺伝子バリアントをコードするＤＮＡ修復テンプレートを含む。
【００１９】
いくつかの態様では、本組成物は２つ以上のガイドＲＮＡを含み、このガイドＲＮＡはまとめて２つ以上の標的配列とハイブリッド形成する。
【００２０】
いくつかの態様では、本組成物は、ＩＬ２３Ｒバリアント、ＣＡＲＤ９バリアント、ＮＯＤ１／２バリアント、ＰＴＰＮ２２バリアント、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ複合体遺伝子バリアント、ＴＴＣ７Ａバリアント、ＸＩＡＰバリアント、ＩＬ−１０バリアント、ＩＬ−１０ＲＡバリアント、ＩＬ−１０ＲＢバリアント、ＲＰＬ７バリアント、ＣＰＡＭＤ８バリアント、ＰＲＧ２バリアント、ＰＲＧ３バリアント、ＨＥＡＴＲ３バリアント、ＡＴＧ１６Ｌ１バリアント、ＴＮＦｓｆ１５バリアント、ＭＨＣＩＩバリアント、ＥＬＦ１バリアント、ＨＬＡ−ＤＢ１＊０１：０３バリアント、ＨＬＡ−ＢＴＮＬ２バリアント、ＡＲＰＣ２バリアント、ＩＬ１２Ｂバリアント、ＳＴＡＴ１バリアント、ＩＲＧＭバリアント、ＩＲＦ８バリアント、ＴＹＫ２バリアント、ＳＴＡＴ３バリアント、ＩＦＮＧＲ２バリアント、ＩＦＮＧＲ１バリアント、ＲＩＰＫ２バリアント、ＬＲＲＫ２バリアント、Ｃ１３ｏｒｆ３１バリアント、ＥＣＭ１バリアント、ＮＫＸ２−３バリアント、ＴＮＦバリアント、ＪＡＫ１バリアント、ＪＡＫ２バリアント、ＪＡＫ３バリアント、ＴＰＭＴバリアント、ＮＵＤＴ１５バリアント、ＬＯＣ４４１１０８バリアント、ＰＲＤＭ１バリアント、ＩＲＧＭバリアント、ＭＡＧＩ１バリアント、ＣＬＣＡ２バリアント、２ｑ２４．１バリアントまたはＬＹ７５バリアントのうちの１つ以上あるいは上記の組み合わせを標的にするための薬剤を含む。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本明細書において引用または参照されている全ての文献（「本明細書において引用されている文献」）、および本明細書において引用されている文献において引用または参照されている全ての文献は、本明細書または参照により本明細書に組み込まれるあらゆる文献において言及されているあらゆる製品のための製造業者の説明書、記載、製品仕様および製品シートと共に参照により本明細書に組み込まれ、かつ本発明の実施において用いることができる。より具体的には、全ての参照されている文献は、各個々の文献が参照により組み込まれることが具体的かつ個々に示されているのと同程度に参照により本明細書に組み込まれる。
【００２２】
特に定義しない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。分子生物学における一般的な用語および技術の定義は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８９）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第４版（２０１２）（ＧｒｅｅｎおよびＳａｍｂｒｏｏｋ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９５５）（Ｃｏｌｏｗｉｃｋ編）；ＰＣＲ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９５）（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編）：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８）（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（２０１３）（Ｅ．Ａ．Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ編）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（１９８７）（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編）；Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  ＩＸ（２００８），Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｋｅｎｄｅｗら編），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（１９９５）（Ｍｅｙｅｒｓ編）；Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  第２版（１９９４）（Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ編），Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  第４版（１９９２）（Ｍａｒｃｈ編）；ならびにＴｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，第２版（２０１１）（ＨｏｆｋｅｒおよびＤｅｕｒｓｅｎ編）のうちの１つ以上に記載されている。
【００２３】
本明細書で使用される単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（前記）（ｔｈｅ）」はその文脈が明らかに別の意を示していない限り単数および複数の指示対象の両方を含む。
【００２４】
「任意の」または「任意に」という用語は、その後に記載されている事象、状況および置換基が生じても生じなくてもよく、かつその記載はその事象または状況が生じる場合およびそれらが生じない場合を含むことを意味する。
【００２５】
端点による数値範囲の記載は、全ての数およびそれぞれの範囲内の包含される分数ならびに記載されている端点を含む。
【００２６】
パラメータ、量および一時的な持続期間などの測定可能な値を参照する場合に本明細書で使用される「約」または「およそ」という用語は、開示されている発明において実施する上でそのようなばらつきが適当である限り、指定されている値からの＋／−１０％以下、＋１〜５％以下、＋／−１％以下、および＋／−０．１％以下のばらつきなどの、指定されている値からのばらつきを包含することが意図されている。当然のことながら、修飾語の「約」または「およそ」が指している値はそれ自体も具体的かつ好ましくは開示されている。
【００２７】
本明細書で使用される「造血幹細胞」または「ＨＳＣ」または「造血骨髄幹細胞」という用語は、リンパ球系、赤血球系もしくは骨髄系細胞系統の造血前駆細胞（ＨＰＣ）に分化するかさらなる分化の開始を伴わずに幹細胞集団として増殖することができる多能性幹細胞または多分化能性幹細胞またはリンパ球系もしくは骨髄系（骨髄由来の）細胞である造血細胞を指す。ＨＳＣは例えば骨髄、末梢血、臍帯血、羊水または胎盤血または胚性幹細胞から得ることができる。ＨＳＣは自己複製し、かつ造血プロセスを通して成熟した血液細胞、例えば赤血球、血小板、顆粒球（好中球、好塩基球および好酸球など）、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球およびナチュラルキラー細胞に分化するかそれらになるための経路を開始することができる。「造血幹細胞」という用語は、「原始造血幹細胞」すなわち長期造血幹細胞（ＬＴ−ＨＳＣ）、短期造血幹細胞（ＳＴ−ＨＳＣ）および多分化能性前駆細胞（ＭＰＰ）を包含する。
【００２８】
本明細書で使用される「免疫細胞」という用語は一般に、免疫応答に関与する造血幹細胞由来のあらゆる細胞を包含する。免疫細胞としては、限定されるものではないが、Ｔ細胞およびＢ細胞などのリンパ球、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、樹状細胞、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、肥満細胞、好塩基球、好酸球または好中球ならびにそのような細胞のあらゆる前駆細胞が挙げられる。特定の好ましい態様では、当該免疫細胞はＴ細胞であってもよい。本明細書で使用される「Ｔ細胞」（すなわちＴリンパ球）という用語は、胸腺細胞、未成熟Ｔ細胞および成熟Ｔ細胞などを含むＴ細胞系統内の全ての細胞を含むことが意図されている。「Ｔ細胞」という用語は、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞、例えばＴｈ１、Ｔｈ２およびＴｈ１７細胞ならびにＴ調節性（Ｔｒｅｇ）細胞を含んでもよい。
【００２９】
本明細書で使用される「改変された」という用語は、免疫細胞またはＨＳＣが人工の分子もしくは細胞生物学プロセスなどの人工のプロセスに供されているかそれによって操作され、当該細胞の少なくとも１つ特性の改変が得られることを広く意味する。そのような人工のプロセスは、例えばインビトロまたはインビボで行うことができる。
【００３０】
「発現変化」という用語は、免疫細胞またはＨＳＣの改変により、記載されている遺伝子またはポリペプチドの発現が変化、すなわち変更または調節されていることを意味する。「発現変化」という用語は前記変化のあらゆる方向およびあらゆる程度を包含する。故に「発現変化」は発現の定性的および／または定量的変化を反映していてもよく、かつ具体的には発現の増加（例えば活性化または刺激）あるいは減少（例えば阻害）の両方を包含する。
【００３１】
本明細書で使用される「増加された」または「増加する」あるいは「上方制御された」または「上方制御する」という用語は一般に、統計学的に有意な量の増加を意味する。疑義を避けるために付言すると、「増加された」は、参照レベルと比較した場合に少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％またはそれ以上の増加、例えば少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍またはそれ以上の増加などの、参照レベルと比較した場合に少なくとも１０％の統計的に有意な増加を包含する。
【００３２】
本明細書で使用される「減少された」または「減少する」あるいは「低下する」または「低下された」あるいは「下方制御する」または「下方制御された」という用語は一般に、参照に対して統計的に有意な量の減少を意味する。疑義を避けるために付言すると、「減少された」は、参照レベルと比較した場合に少なくとも１０％の統計的に有意な減少、例えば少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれ以上の減少、最大で１００％の減少（１００％を含む）（すなわち参照試料と比較した場合に存在しないレベル）、または参照レベルと比較した場合に１０〜１００％のあらゆる減少を包含する。「消失する」または「消失された」という用語は、特に１００％の減少、すなわち参照試料と比較した場合に存在しないレベルを指してもよい。
【００３３】
「量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）」、「量（ａｍｏｕｎｔ）」および「レベル」という用語は同義であり、一般に当該技術分野においてよく理解されている。これらの用語は特に、被験対象（例えば、細胞、細胞集団、組織、臓器または生物の中または表面、例えば対象の生体試料中）のマーカーの絶対的定量化、あるいは被験対象のマーカーの相対的定量化、すなわち参照値などの別の値または当該マーカーのベースラインを示すある範囲の値に対する定量化を指してもよい。例えばベースラインまたは参照値は、自己免疫疾患を有するか自己免疫疾患を有していない対象（または当該対象からの細胞もしくは細胞集団）、あるいは自己免疫疾患を発症するリスクがあるか自己免疫疾患を発症するリスクがない対象（または当該対象からの細胞もしくは細胞集団）における遺伝子バリアントの量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、レベルまたは量（ａｍｏｕｎｔ）の決定に基づいて得ることができる。そのような値または範囲は従来から知られているとおりに得てもよい。場合によっては、量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、量（ａｍｏｕｎｔ）またはレベルは測定された濃度である。量はＰＣＲ、ＵＶ吸収、熱量測定、蛍光に基づく測定、ジフェニルアミン反応法およびそれ以外などの公知の技術を用いて定量化することができる。例えば、Ｌｉ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４５１：１８−２４（２０１４）；Ｆｉｇｕｅｒｏａ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｏｎｃｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１３（６）：３９８２−８８（２０１７）；Ｐｓｉｆｉｄｉ，ＰＬＯＳＥ  ＯＮＥ，１０（１）：ｅ０１１５９６０（１８頁）（２０１５）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９６）（Ｃｏｌｉｇａｎら編）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００３）（Ａｕｓｕｂｅｌら編）を参照されたい。
【００３４】
所与の遺伝子またはポリペプチドの発現に関与するいくつかの連続的分子機序のいずれか１つ以上を免疫細胞またはＨＳＣの改変によって標的にしてもよい。限定されるものではないがこれらは、遺伝子配列を標的にすること（例えば遺伝子配列のポリペプチドコード、非コードもしくは調節部分を標的にすること）、遺伝子のＲＮＡへの転写、ポリアデニル化および該当する場合はＲＮＡのスプライシングおよび／またはｍＲＮＡへの他の転写後修飾、ｍＲＮＡの細胞質内への局在化、該当する場合はｍＲＮＡの他の転写後修飾、ｍＲＮＡのポリペプチド鎖への翻訳、該当する場合はポリペプチドの翻訳後修飾および／またはポリペプチド鎖のポリペプチドの成熟した立体構造への折り畳みを含んでもよい。分泌型ポリペプチドおよび膜貫通ポリペプチドなどの区画化されたポリペプチドの場合、これはポリペプチドの輸送、すなわちポリペプチドを適当な細胞下区画または細胞小器官、膜、例えば血漿膜または細胞外に輸送する細胞機構を標的にすることをさらに含んでもよい。
【００３５】
故に「発現変化」は、改変された免疫細胞またはＨＳＣによる記載されている遺伝子産物の産生変化を特に意味してもよい。本明細書で使用される「遺伝子産物」という用語は、遺伝子から転写されたＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）または遺伝子によってコードされたかＲＮＡから翻訳されたポリペプチドを含む。
【００３６】
本明細書で使用される「遺伝子」という用語は、エクソンおよび（任意に）イントロン配列の両方を含むポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を指す。「遺伝子」は、遺伝子産物の５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲ領域、イントロンおよびプロモーターを含む遺伝子産物のコード配列ならびに遺伝子産物の非コード領域を指す。遺伝子のコード領域は、アミノ酸配列またはｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡなどの機能性ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列であってもよい。また遺伝子はそこに結合された５’もしくは３’非翻訳配列を任意に含むコード領域（例えばエクソンおよびｍｉＲＮＡ）に対応するｍＲＮＡまたはｃＤＮＡであってもよい。核酸は単鎖分子または分子を含む特定の配列の１つ以上の相補的な鎖すなわち「相補鎖」を含む二本鎖分子を包含してもよい。本明細書で使用される「単鎖核酸」は接頭辞「ｓｓ」によって、二本鎖核酸は接頭辞「ｄｓ」によって示されている場合がある。「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖を産生することに関与するＤＮＡのセグメントを指してもよく、これはコード領域の前後の領域ならびに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロンおよび非翻訳配列、例えば５’および３’非翻訳配列ならびに調節配列）を含む。また遺伝子はコード領域の全てもしくは一部および／またはそこに結合された５’もしくは３’非翻訳配列を含むインビトロで産生された増幅された核酸分子であってもよい。「遺伝子バリアント」という用語は、野生型、突然変異型または単一ヌクレオチド多型などの遺伝子の型を指すために使用される。いくつかの遺伝子バリアントは自己免疫疾患に対する感受性の増加に関連していてもよい。いくつかの遺伝子バリアントは自己免疫疾患に対して保護的であってもよい。
【００３７】
本明細書で使用される「ヌクレアーゼ」という用語は、核酸分子内でヌクレオチド残基を結合しているリン酸ジエステル結合を切断することができる物質、例えばタンパク質または小分子を広く指す。いくつかの態様ではヌクレアーゼは、核酸分子に結合し、かつ核酸分子内でヌクレオチド残基を結合しているリン酸ジエステル結合を切断することができるタンパク質、例えば酵素であってもよい。ヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖内のリン酸ジエステル結合を切断するエンドヌクレアーゼ、またはポリヌクレオチド鎖の末端でリン酸ジエステル結合を切断するエキソヌクレアーゼであってもよい。好ましくは、当該ヌクレアーゼはエンドヌクレアーゼである。好ましくはヌクレアーゼは、「認識配列」、「ヌクレアーゼ標的部位」または「標的部位」と呼ぶことができる特異的ヌクレオチド配列内の特異的リン酸ジエステル結合に結合し、かつ／またはそれを切断する部位特異的ヌクレアーゼである。いくつかの態様では、ヌクレアーゼは単鎖標的部位を認識することができ、他の態様ではヌクレアーゼは二本鎖標的部位、例えば二本鎖ＤＮＡ標的部位を認識することができる。いくつかのエンドヌクレアーゼは二本鎖核酸標的部位を対称的に切断し、すなわちその末端が塩基対ヌクレオチド（鈍端としても知られている）を含むように両方の鎖を同じ位置で切断する。他のエンドヌクレアーゼは二本鎖核酸標的部位を非対称的に切断し、すなわちその末端が不対ヌクレオチドを含むように各鎖を異なる位置で切断する。二本鎖ＤＮＡ分子の末端にある不対ヌクレオチドは「オーバーハング」ともいい、例えば不対ヌクレオチドがそれぞれのＤＮＡ鎖の５’もしくは５’末端のどちらを形成しているかに応じて「５’オーバーハング」または「３’オーバーハング」ともいう。
【００３８】
標的集団
対象における自己免疫疾患を治療または予防するための方法および組成物を提供する。いくつかの態様では、当該対象は自己免疫疾患であると診断されている。いくつかの態様では、当該対象は自己免疫疾患を発症するリスクがある。いくつかの態様は、そのリスクまたは症状が、保護的突然変異を追加するため、および／または感受性突然変異を除去するために当該疾患を引き起こすプロセスに関与する関連する組織を編集することによって減少するあらゆる疾患の治療のための方法および組成物に関する。そのような疾患としては、限定されるものではないが、好酸球性食道炎（Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１４８（６）：１１４３−５７（２０１５）を参照）、セリアック病（Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ−Ａｃｈｕｒｙ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４７（６）：５７７−７８（２０１５）を参照）、乾癬（Ｔｓｏｉ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，８：論文１５３８２（８頁）（２０１７）を参照）、１型糖尿病（Ｂｏｎｉｆａｃｉｏ，Ａｃｔａ  Ｄｉａｂｅｔｏｌ．５１（３）：４０３−１１（２０１４）を参照）、関節リウマチ（Ｅｙｒｅｌ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，４４（１２）：１３３６−１３４０（２０１２）を参照）、および炎症性腸疾患（Ｈｕａｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ，５４７：１７３−１７８（２０１７）を参照）が挙げられる。列挙されている参考文献は、上記表現型のための感受性または保護に関連する遺伝子の非限定的なセットについて記述している。
【００３９】
いくつかの態様では、自己免疫疾患は炎症性腸疾患である。炎症性腸疾患は潰瘍性大腸炎およびクローン病を含むように広く分類されている。潰瘍性大腸炎は大腸を冒し、かつ主に粘膜を侵して糜爛および潰瘍を頻繁に引き起こす未知の病因のびまん性かつ非特異的な炎症である。通常この疾患は、血性下痢および様々な程度の一般症状を示す。一般にこの疾患は、症状の広がり（汎大腸炎、左側大腸炎、直腸炎または右側もしくは区域性大腸炎）、疾患段階（活動期または寛解期など）、重症度（軽度、中度、重度）または臨床経過（再発寛解型、慢性持続型、急性劇症型または初回発作型）に従って分類される。他方、クローン病は潰瘍形成および線維形成を伴う肉芽腫性病変が口腔から肛門まで消化管を通して不連続的に生じる疾患である。病変の部位および範囲に従って異なるが症状としては熱、栄養障害および貧血が挙げられ、関節炎、虹彩炎または肝臓疾患などの全身合併症が生じる可能性もある。一般に、この疾患は例えば病変の位置（小腸型、小腸−大腸型、直腸型または胃十二指腸型）あるいは疾患段階（活動期または非活動期など）に従って分類される。さらに、潰瘍性大腸炎およびクローン病は未知の原因を有し、根本的な治療法が存在せず、かつ完全な治癒を達成するのは難しい。従って再発および寛解を繰り返し、それにより当該対象の生活の質はかなり損われる。
【００４０】
いくつかの態様では、当該対象は炎症性腸疾患などの自己免疫疾患に遺伝的に罹患しやすい。例えばいくつかの態様では、当該対象は自己免疫疾患を有するか発症する高いリスクに関連する１つ以上の対立遺伝子（すなわち感受性遺伝子バリアント）を有する。自己免疫疾患に対するそのような高い感受性が原因で、自己免疫疾患を有したりそれを発症する高いリスクを有したりしない対象と比較した場合に、当該対象は自己免疫疾患に関連する多量の１種以上のタンパク質バリアント（すなわち感受性タンパク質バリアント）を有している可能性がある。
【００４１】
感受性遺伝子は自己免疫疾患の発症に直接影響を与える遺伝子に限定されない。例えばいくつかの態様では、感受性遺伝子は特定の治療法に対する当該対象の応答に関連している。いくつかの態様では、感受性遺伝子は当該対象の微生物叢（例えば腸内微生物叢）に関連しており、微生物叢は理論によって縛られるものではないが、自己免疫疾患の発症および進行に影響を与えると考えられている。
【００４２】
感受性遺伝子は、当該技術分野で知られている手段などのあらゆる手段によって同定することができる。例えばいくつかの態様では、感受性遺伝子は自己免疫疾患に直接または間接的に関連していることが当該技術分野で知られている。いくつかの態様では感受性遺伝子は、特定の表現型を示すかそれによって冒されている親類を含む家系図に基づいて同定される。いくつかの態様では感受性遺伝子は、１人以上の家族構成員の全エクソームもしくは全ゲノムシークエンシングによって同定される。いくつかの態様では、感受性遺伝子は細胞シグナル伝達のコンピューターシミュレーションおよび／または免疫系応答のコンピューターシミュレーションによって同定される。いくつかの態様では、感受性遺伝子は、ニューラルネットワークまたは他の線形および非線形回帰モデルなどを用いる機械モデル化および／または特定の突然変異が遺伝子シグナル伝達を乱すことが分かっている遺伝子シグナル伝達ネットワークを用いて同定される。いくつかの態様では、感受性遺伝子は動物モデル（例えばブタまたはマウス）を用いて同定される。いくつかの態様では、感受性遺伝子を同定する様々な方法（例えば、公知の感受性遺伝子を同定すること、家系図を参照して特定の表現型を同定すること、および全エクソームもしくは全ゲノム解析のうちの１つ以上）を組み合わせて治療を必要とする個人を特定する。すなわちいくつかの態様では、自己免疫疾患（例えば、潰瘍性大腸炎またはクローン病などの特定の自己免疫疾患）を有する家族構成員に共通する遺伝子は感受性遺伝子であると決定される。
【００４３】
非限定的な感受性遺伝子としては、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ複合体遺伝子（例えば、ＮＣＦ２、アネキシンＡ１）、ＴＴＣ７Ａ、ＸＩＡＰ、ＮＯＤ１／２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１０ＲＡ、ＩＬ−１０ＲＢ、アシュケナージ系ユダヤ人遺伝子（ＲＰＬ７、ＣＰＡＭＤ８、ＰＲＧ２、ＰＲＧ３、ＨＥＡＴＲ３）、ＡＴＧ１６Ｌ１（例えば、Ｔ３００Ａは微生物叢における変化に関連している）、アジア人の感受性遺伝子（ＴＮＦｓｆ１５、ＭＨＣＩＩ）、ＥＬＦ１、ＨＬＡ−ＤＢ１＊０１：０３、ＨＬＡ−ＢＴＮＬ２、ＡＲＰＣ２、ＩＬ１２Ｂ、ＳＴＡＴ１、ＩＲＧＭ、ＩＲＦ８、ＴＹＫ２、ＳＴＡＴ３、ＩＦＮＧＲ２、ＩＦＮＧＲ１、ＲＩＰＫ２、ＬＲＲＫ２、ＩＬ２３Ｒ、Ｃ１３ｏｒｆ３１、ＥＣＭ１、ＮＫＸ２−３、ＴＮＦ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＣＡＲＤ９、ＮＯＤ１／２、ＰＴＰＮ２２、ＴＰＭＴ、ＮＵＤＴ１５、ＬＯＣ４４１１０８、ＰＲＤＭ１、ＩＲＧＭ、ＭＡＧＩ１、ＣＬＣＡ２、２ｑ２４．１およびＬＹ７５のうちの１つ以上のバリアントを挙げることができる。
【００４４】
いくつかの態様では、遺伝子間相互作用は自己免疫疾患に対する対象の感受性に影響を与える。例示的な相互作用としては、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＲＩＴ１／ＵＢＱＬＮ４、ＩＦＮＧ／ＩＬ２６／ＩＬ２２が挙げられる。さらなる例として小児科のＣＤ患者は、ＴＬＲ４、ＰＳＭＧ１、ＴＮＦＲｓｆ６ＢおよびＩＲＧＭを含む相加的な遺伝子間相互作用を有する。
【００４５】
いくつかの感受性遺伝子は環境的影響という観点から同定することができる。例えば、ＣＹＰ２Ａ６のＳＮＰは喫煙者の中でＣＤの発生を増加させる場合がある。他方、ＧＳＴＰ１遺伝子のＳＮＰは元喫煙者におけるＵＣの高いリスクに関連している。
【００４６】
いくつかの態様では、感受性遺伝子は薬物への対象の応答に影響を与える。例えば白血球減少症は、チオプリンを服用しているＩＢＤ患者にとっては命にかかわる病気になる場合があり、これは少なくとも部分的に、チオプリンＳ−メチルトランスフェラーゼをコードするＴＰＭＴにおける遺伝的変異に起因している。低頻度のＴＰＭＴ突然変異を有する患者集団（アジア人）において、ＮＵＤＴ１５のＳＮＰはチオプリン関連の白血球減少症に関連している。なおさらに、ＩＬ−１０Ｒ欠損を有する早期発症型ＩＢＤ患者は同種異系の幹細胞移植により恩恵を得ることができる。
【００４７】
いくつかの態様では、感受性遺伝子はＩＢＤの管理に影響を与える。例えばＮＯＤ２遺伝子における感受性遺伝子座は、回腸位置、狭窄および瘻孔挙動ならびに外科手術の必要性に関連している。同様にＣＤでは、瘻孔を伴う疾患はＩＬ２３Ｒ、ＬＯＣ４４１１０８、ＰＲＤＭ１、ＮＯＤ２に関連しており、外科手術の必要性はＩＲＧＭ、ＴＮＦＳＦ１５、Ｃ１３ＯＲＦ３１およびＮＯＤ２に関連している。狭窄表現型はＮＯＤ２、ＪＡＫ２およびＡＴＧ１６Ｌ１に関連している。ＭＡＧＩ１バリアント（腸管上皮密着結合に関与するタンパク質をコードする）は複雑な構造化表現型に関連しており、ＣＬＣＡ２、２ｑ２４．１およびＬＹ７５遺伝子座におけるバリアントは回腸病変、軽度疾患経過および結節性紅斑の存在に関連している。ＵＣでは、４６種のＳＮＰを含むＳＮＰベースのリスクスコアリングシステムにより医学的に難治性のＵＣを有する患者を医学的に非難治性の患者と識別することができ、従って外科手術の必要性を予測することができる。さらにＭＨＣは重度ＵＣのための遺伝的決定因子であるとも考えられている。
【００４８】
治療方法
いくつかの態様は、潰瘍性大腸炎および／またはクローン病などの炎症性腸疾患を含む自己免疫疾患を治療するためのパラダイムを変える方法および組成物を含む。いくつかの態様は、炎症性免疫応答を引き起こす免疫細胞または造血により免疫細胞を産生する組織の遺伝子を編集するための遺伝子編集の使用を含む。原因となっている遺伝子を変化させてリスク対立遺伝子を除去すること、および／または保護的対立遺伝子を作り出すことにより、自己免疫表現型の重症度を排除または低減するために複雑な遺伝子シグナル伝達経路を正確に理解する必要はない。
【００４９】
いくつかの態様では、当該対象に自己免疫疾患に対する感受性に関連する１種以上のタンパク質バリアントの量を減少させる治療薬を投与する。そのような減少は対象または当該対象の１つ以上の細胞において行うことができる。いくつかの態様では、当該対象において１種以上の感受性遺伝子バリアントを有する細胞の数を減少させる。例えばいくつかの態様では、インビボで遺伝子バリアントを改変し、かつ／または感受性タンパク質バリアントの発現を減少させる治療薬（例えば遺伝子改変剤）を当該対象に投与する。いくつかの態様では当該治療薬は、例えば遺伝子編集または遺伝子サイレンシング技術により感受性遺伝子を標的にする。いくつかの態様は、感受性遺伝子（限定されるものではないが環境的に媒介される感受性遺伝子、薬物応答に影響を与える感受性遺伝子、および自己免疫疾患の管理に影響を与える感受性遺伝子が挙げられる）および感受性遺伝子と相互作用する遺伝子のうちの１つ以上を標的にすることを含む。
【００５０】
いくつかの態様では、本方法は自己免疫疾患に対して保護的な１種以上の遺伝子バリアントの量を増加させることを含む。そのような増加は対象または当該対象の１つ以上の細胞において行うことができる。いくつかの態様では、当該対象において１種以上の保護的遺伝子バリアントを有する細胞の数を増加させる。例えばいくつかの態様では、当該対象において保護的タンパク質バリアントの発現の割合を増加させる。いくつかの態様では、感受性遺伝子を遺伝子改変剤により野生型バリアントに突然変異させる。いくつかの態様では、感受性遺伝子を自己免疫疾患に対して保護的な遺伝子（すなわち保護的遺伝子）に突然変異させる。いくつかの態様では、非保護的遺伝子バリアント（例えば、非保護的野生型遺伝子バリアント）を自己免疫疾患に対して保護的な遺伝子に突然変異させる。
【００５１】
いくつかの態様では、感受性遺伝子および保護的遺伝子は同じタンパク質のバリアントをコードする。いくつかの態様では、感受性遺伝子および保護的遺伝子は異なるタンパク質のバリアントをコードする。
【００５２】
いくつかの態様は、遺伝子における保護的バリアントを同定することを含む。保護的遺伝子バリアントは、感受性遺伝子バリアントを同定することに関して上で考察されている同じ技術を用いて同定することができる。いくつかの態様では、保護的遺伝子バリアントはＩＬ２３Ｒ遺伝子内のｒｓ１１２０９０２６におけるＧ→Ａ突然変異を含む。理論によって縛られるものではないが、そのような保護的ＩＬ２３Ｒ突然変異はＣＤおよびＵＣではおよそ１／３のオッズ比を有し、かつＩＢＤの症状を除去または改善させるのに十分な程に免疫応答を減少させると考えられている。例えば、Ｄｕｅｒｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１４（５８０４）：１４６１−６３（２００６）を参照されたく、Ｓｉｖａｎｅｓａｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２９１（１６）：８６７３−８６８５（２０１６）も参照されたい。いくつかの態様では保護的遺伝子バリアントは、野生型ＩＬ２３Ｒに対する以下の突然変異：Ｒ３８１Ｑ（例えば、ｒｓ１１２０９０２６、ｃ．１１４２Ｇ＞Ａに対応する）、Ｇ１４９ＲおよびＶ３６２Ｉのうちの１つ以上を有するＩＬ２３Ｒバリアントをコードする。代わりまたは追加として、いくつかの態様では、保護的突然変異（例えばＩＢＤのため）は、ＣＡＲＤ９、ＮＯＤ２、ＰＴＰＮ２２およびＳＬＣ１１Ａ１のうちの１つ以上において行う。理論によって縛られるものではないが、ＮＯＤ２およびＰＴＰＮ２２は、ＵＣには保護的であるがクローン病には感受性遺伝子であると考えられている。これも理論によって縛られるものではないが、ＰＴＰＮ２２では、Ｒ６２０Ｗ機能獲得バリアントはＣＤに関連しているが、Ｒ２６３Ｑ機能喪失バリアントはＵＣに関連していると考えられている。ＳＬＣ１１Ａ１では、ＳＮＰ  ｒｓ７５７３０６５における−２３７Ｃ／Ｔ多型は、炎症性腸疾患ではおよそ２／３のオッズ比を有する。例えば、Ａｒｃｈｅｒ，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１６（４）：２７５−２８３（２０１５）を参照されたい。いくつかの態様では、当該保護的バリアントは、対立遺伝子Ｐ１１０４Ａ（ｒｓ３４５３６４４３、ＯＲ＝０．６６）、Ａ９２８Ｖ（ｒｓ３５０１８８００、ＯＲ＝０．５３）、およびＩ６８４Ｓ（ｒｓ１２７２０３５６、ＯＲ＝０．８６、Ｐ＝４．６×１０−７）を含む関節リウマチのために保護的であるＴＹＫ２（チロシンキナーゼ２）バリアントをコードする。例えば、Ｄｉｏｇｏ，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  １０（４）：ｅ０１２２２７１（２１頁）（２０１５）を参照されたい。別の例として、いくつかの態様では、当該保護的バリアントは、Ｅ６２７Ｘなどの対立遺伝子を含む０．５１〜０．７４の範囲のオッズ比を有する１型糖尿病のために保護的であるＩＦＩＨ１バリアントをコードする。例えば、Ｎｅｊｅｎｔｓｅｖ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２４（５９２５）：３８７−８９（２００９）を参照されたい。ＨＳＣに対する遺伝子改変によって改善させることができるいくつかの疾患にまたがる保護的バリアントのさらに多くの例が存在する。例えば、Ｈａｒｐｅｒ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６（１２）：６８９−７０１（２０１５）を参照されたい。
【００５３】
いくつかの態様では、免疫細胞および／または造血骨髄幹細胞中の１種以上の感受性遺伝子バリアントおよび／または１種以上の保護的遺伝子バリアントを標的にする薬剤を当該対象に投与する。いくつかの態様では、遺伝子改変剤を当該対象に投与して、当該対象における感受性遺伝子バリアントの量を減少させ、かつ／または当該対象における保護的タンパク質バリアントの量を増加させる。いくつかの態様では、改変された免疫細胞および／またはＨＳＣを当該対象に投与して、感受性遺伝子バリアントの量を減少させ、かつ／または保護的遺伝子バリアントの量を増加させる。
【００５４】
いくつかの態様では、保護的遺伝子バリアント：感受性遺伝子バリアントの割合を当該対象または当該対象の細胞もしくは細胞集団において増加させる。いくつかの態様では、保護的タンパク質バリアント：感受性タンパク質バリアントの比を当該対象または当該対象の細胞もしくは細胞集団において増加させる。
【００５５】
いくつかの態様では、ＨＳＣ細胞を血液または骨髄から採取し、次いで採取した細胞に対してエクスビボで遺伝子改変剤を使用する。いくつかの態様では、免疫磁気または免疫蛍光法を用いて血液試料からＣＤ３４＋細胞を単離する（ＣＤ３４タンパク質は、早期造血および血管関連組織上に発現される１回膜貫通シアロムチンタンパク質ファミリーのメンバーである）。それは細胞表面糖タンパク質であり、細胞間接着因子として機能し、かつ造血幹細胞が骨髄細胞外マトリックス（または直接に間質細胞）に接着するのを媒介することができる。ＣＤ３４＋はＨＳＣにユビキタスに関連づけられているが、他の細胞型にも存在する。例えば、Ｓｉｄｎｅｙ，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．，３２（６）：１３８０−９（２０１４）を参照されたい。臨床的には、それは骨髄移植のために造血幹細胞を選択および濃縮するために使用することができる。ＣＤ３４＋細胞は、ＣＤ３４に結合し、かつ磁気ビーズまたは蛍光マーカーに取り付けられてこの細胞のその後の単離およびその後の遺伝子編集を可能にする抗体を用いて血液から採取することができる。またこの細胞を遺伝子編集の前または後に培養してもよい。次いでこの細胞を輸血または注射によって当該対象に戻してもよい。いくつかの態様では、編集されたＨＳＣまたはＣＤ３４＋細胞を血液に戻す前に、当該対象を化学療法薬または放射線に供して対象の骨髄ＨＳＣのかなりの部分を除去するため、骨髄は編集されたＨＳＣのかなりの部分により再コロニー形成化される。いくつかの態様では、本出願は、（例えば、宿主ＨＳＣを枯渇させるがＨＳＣ集団全体を除去しないために）骨髄癌患者のために使用される致死的な線量よりも低線量の放射線または低用量の化学療法薬を使用する。いくつかの態様では、編集されたＨＳＣの注入前に、ＨＳＣの機能を乱し、かつ宿主ＨＳＣ枯渇を引き起こす抗体を宿主に投与する。例えばＨＳＣはｃ−Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）、すなわちＨＳＣ機能に関与する二量体膜貫通受容体チロシンキナーゼを発現する。抗ｃ−Ｋｉｔモノクローナル抗体は、ＨＳＣを骨髄ニッチから枯渇させるための免疫抑制と共に使用することができ、編集されたＨＳＣ生着を可能にする。いくつかの態様では宿主ＨＳＣの枯渇は、例えば他の抗体と共にＨＳＣ機能を乱し、かつＨＳＣを枯渇させる抗体を投与して宿主ＨＳＣをより脆弱にさせることにより、放射線もしくは化学療法薬による免疫抑制を必要とすることなく達成することができる。例えば宿主ＨＳＣの排除はＦｃ媒介性抗体エフェクター機能に依存していること、およびＨＳＣは「死滅させるな」というシグナルを発生し、かつＳＩＲＰαに結合するＣＤ４７すなわち骨髄特異的免疫チェックポイントを発現することが分かっている。Ｃｈｈａｂｒａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，８（３５１）：３５１ｒａ１０５（１０頁）（２０１６）を参照されたい。従って、ＣＤ４７の遮断によりエフェクター活性を高めることは、抗ｃ−Ｋｉｔ調節を十分に免疫適格性の対象に広げる。ＣＤ４７抗体によるＣＤ４７−ＳＩＲＰα軸の妨害と共にｃ−Ｋｉｔ抗体を用いる治療により、宿主ＨＳＣの＞９９％の除去およびＨＳＣ移植後のロバストな多系列の血液再構成��得られる。従って、いくつかの態様では、ＣＤ４７の遮断と共に抗ｃ−Ｋｉｔモノクローナル抗体を使用して、編集されたＨＳＣの注入前に対象のＨＳＣを排除する。
【００５６】
いくつかの態様では、例えばリンパ球（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞および／またはナチュラルキラー細胞）、単球および／または樹状細胞などの体の免疫応答に直接に関与する細胞を血液から採取する。血液から採取したら、これらの免疫細胞をインビトロで編集し、任意に培養し、かつ次いで当該対象の血流に戻してもよい。理論によって縛られるものではないが、多くのそのような細胞はおよそ１年の半減期を有すると考えられている。製造業者の説明書に従ってこれらの細胞を単離するためのいくつかの方法としては、例えばＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製のヘパリンナトリウムを含む細胞調製チューブ（ＣＰＴ：ｃｅｌｌ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｔｕｂｅ）、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製のＦｉｃｏｌｌＰａｑｕｅ  Ｐｒｅｍｉｕｍ（密度：１．０７７ｇ／ｍＬ）、およびＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＳｅｐＭａｔｅチューブを用いるＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐが挙げられる。細胞単離効率および細胞生存度に関する異なる手法の長所および短所については、例えばＧｒｉｅｖｉｎｋ，Ｂｉｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｂａｎｋｉｎｇ，１４（５）：４１０−４１５（２０１６）を参照されたい。
【００５７】
保護的遺伝子バリアントをコードし、かつ／または感受性遺伝子バリアントをコードしない細胞は、任意の公知の方法によって（例えば静脈投与または移植によって）当該対象に投与することができる。
【００５８】
いくつかの態様は、血液細胞を造る骨髄幹細胞の編集を含む。いくつかの態様では、遺伝子改変剤を骨髄の中に送達させる。いくつかの態様では、この送達としては、中性の電荷および好適なサイズ（例えば約１５０ｎｍ）のポリマーを介した受動的標的化、マクロファージによる選択的取込みにより骨髄の中への分布を増加させ、かつ肝臓および脾臓における分布を大きく減少させるためにアニオン性グルタミン酸により表面改質されたリポソーム、および／または骨形成表面に特異的に結合するビスフォスフォネートなどの分子が挙げられる。例えば、Ｃｈａｏ−Ｆｅｎｇ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，１５５：１９１−２０２（２０１７）を参照されたい。例えばポリマーラッパーを含んでいてもよいこれらの送達機序を使用して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９または他の遺伝子編集複合体を骨髄に送達することができる。
【００５９】
いくつかの態様は、元の生殖系列対立遺伝子を含む骨髄幹細胞集団を減少させるために放射線を用いて／用いずに編集された幹細胞により骨髄内に直接幹細胞移植を行うことを含む。いくつかの態様は、骨髄幹細胞を患者の血流内に配置する（例えば、当該細胞が骨髄に再び辿り着くのを可能にする）方法を含む。
【００６０】
いくつかの態様では、当該対象から得た後、感受性遺伝子バリアントの量を減少させ、かつ／または保護的遺伝子バリアントの量を増加させるように遺伝子改変した細胞を、治療を必要とする対象に投与する。いくつかの態様では、別個の対象から得た細胞（例えば、遺伝子改変したか所望の遺伝子バリアントを自然にコードする別個の対象からの細胞）を、治療を必要とする対象に投与する。
【００６１】
遺伝子改変剤
例えば遺伝子改変剤を使用して所望の遺伝子改変を行うために使用することができる方法および組成物を提供する。遺伝子改変剤は、ＣＲＩＳＰＲシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼシステム、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼまたはＲＮＡｉシステムなどのヌクレアーゼを含んでもよい。
【００６２】
ＣＲＩＳＰＲシステム
いくつかの態様では、遺伝子改変剤はＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓまたはＣＲＩＳＰＲシステムであり、これは、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性な部分的ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒメイト配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈では「直接反復配列」およびｔｒａｃｒＲＮＡ処理された部分的直接反復配列を包含する）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈では「スペーサ」ともいう）、または「ＲＮＡ」（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓをガイドするためのＲＮＡ、例えばＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡおよびトランス活性化（ｔｒａｃｒ）ＲＮＡまたは単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（キメラＲＮＡ））あるいはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列および転写物などの、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現に関与するかその活性を導く転写物および他のエレメントをまとめて指す。一般にＣＲＩＳＰＲシステムは、標的配列の部位においてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメント（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈ではプロトスペーサともいう）を特徴とする。例えば、Ｓｈｍａｋｏｖ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ，６０（３）：３８５−９７（２０１５）；Ｚｅｔｓｃｈｅ，Ｃｅｌｌ，１６３（３）：Ｐ７５９−７７１（２０１５）；国際公開第２０１４／０９３６２２号（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４６６７号）を参照されたい。
【００６３】
ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成の文脈では、「標的配列」はそれに対してガイド配列が相補性を有するように設計されている配列を指し、ここでは標的配列とガイド配列とのハイブリッド形成はＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。標的配列は、ＤＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡポリヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの態様では、標的配列は細胞の核内に位置している。いくつかの態様では、標的配列は細胞の細胞質内に位置している。
【００６４】
特定の例示的態様では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質はＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードする核酸分子を用いて送達してもよい。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードする核酸分子は有利にはコドン最適化ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば真核生物、例えばヒト（すなわちヒトにおける発現のために最適化されている）または別の真核生物、動物または哺乳類における発現のために最適化されている配列）であってもよい。例えば、国際公開第２０１４／０９３６２２号（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４６６７号）を参照されたい。
【００６５】
Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（ＣｓｎｌおよびＣｓｘ１２としても知られている）、Ｃａｓ１０、Ｃｐｆ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらの相同体、またはそれらの改変体が挙げられる。Ｃａｓ９は最も広く使用されているＣａｓタンパク質であるが、他の複合体を使用してＣａｓ９と比較して恐らく改良されている方法でＤＮＡを編集することもできる。例えばＣｐｆ１は、ＤＮＡの１つの鎖上により特異的なＤＮＡ再構築を可能にするオーバーハングが存在する標的ＤＮＡにおいて互い違いの切断を行う。さらに、Ｃｐｆ１は標的化のために１つのＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を必要とし、Ｃａｓ９はｃｒＲＮＡおよびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の両方を必要とする。より小さいｃｒＲＮＡは、それらのうちのより多くを単一のベクターにパッケージングすることができるので、多重ゲノム編集を可能にする。さらに、Ｃａｓ９は３ヌクレオチド塩基上流で標的ＤＮＡを切断するが、Ｃｐｆ１は標的部位から１８〜２３塩基下流で標的ＤＮＡを切断し、標的領域をインタクトなままにするのを可能にし、かつ標的遺伝子座における複数回の切断を可能にして特定の編集の機会を増加させる。本発明は、本明細書において考察されている全ての編集方法ならびにそれ以外を包含し、かつ使用される特定の編集方法に依存していない。
【００６６】
いくつかの態様は、例えばＣａｓおよび／またはＣａｓを標的遺伝子座にガイドすることができるＲＮＡ（すなわちガイドＲＮＡ）を細胞内に送達または導入するためだけでなく、これらの構成要素を伝播させるためのものでもあるベクターを含む。本明細書で使用される「ベクター」は、ある環境から別の環境への実体の移動を可能または容易にするツールである。ベクターは、挿入されたセグメントの複製をもたらすためにその中に別のＤＮＡセグメントを挿入することができるプラスミド、ファージまたはコスミドなどのレプリコンである。一般にベクターは、適切な調節エレメントに結合されている場合に複製が可能である。一般に「ベクター」という用語はそこに連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターとしては、限定されるものではないが、単鎖、二本鎖または部分的に二本鎖である核酸分子；１つ以上の遊離末端を含む、遊離末端を含まない（例えば環状）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡまたは両方を含む核酸分子；および当該技術分野で知られている他の変種のポリヌクレオチドが挙げられる。ベクターの１つの型は「プラスミド」であり、これは標準的な分子クローニング技術などによりさらなるＤＮＡセグメントを挿入することができる環状の二本鎖ＤＮＡループを指す。ベクターの別の型はウイルスベクターであり、ここではウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ））の中にパッケージングするためのウイルス由来のＤＮＡもしくはＲＮＡ配列がベクター中に存在する。ウイルスベクターは宿主細胞内へのトランスフェクションのためにウイルスによって運ばれるポリヌクレオチドも含む。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律複製可能である（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は宿主細胞の中に導入されると宿主細胞のゲノムの中に組み込まれ、それにより宿主ゲノムと共に複製される。さらに特定のベクターは、それらが機能的に連結されている遺伝子の発現を導くことができる。そのようなベクターを本明細書では「発現ベクター」と呼ぶ。組換えＤＮＡ技術において有用な一般的な発現ベクターはプラスミドの形態であることが多い。
【００６７】
組換え発現ベクターは、宿主細胞において核酸の発現に好適な形態の核酸を含むことができ、これは組換え発現ベクターが、発現される核酸配列に機能的に連結された、発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択することができる１つ以上の調節エレメントを含むことを意味する。組換え発現ベクター内で「機能的に連結された」とは、ヌクレオチド配列の発現を可能にするように（例えばインビトロ転写／翻訳システム、またはベクターが宿主細胞の中に導入されている場合は宿主細胞において）目的のヌクレオチド配列が調節エレメントに連結されていることを意味するものである。
【００６８】
このベクターは調節エレメント、例えばプロモーターを含むことができる。このベクターはＣａｓコード化配列および／または単一のガイドＲＮＡ（例えばｓｇＲＮＡ）コード化配列を含むことができる（但し場合により、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、３〜６、３〜７、３〜８、３〜９、３〜１０、３〜８、３〜１６、３〜３０、３〜３２、３〜４８、３〜５０個のＲＮＡ（例えばｓｇＲＮＡ）などの少なくとも３または８または１６または３２または４８または５０個のガイドＲＮＡ（例えばｓｇＲＮＡ））コード化配列を含むことができる）。単一のベクターでは、有利には最大約１６個のＲＮＡが存在する場合には各ＲＮＡ（例えばｓｇＲＮＡ）のためにプロモーターが存在することができ、かつ単一のベクターが１６超のＲＮＡを提供する場合には、１つ以上のプロモーターが２つ以上のＲＮＡの発現をドライブすることができ、例えば３２個のＲＮＡが存在する場合には、各プロモーターは２つのＲＮＡの発現をドライブすることができ、４８個のＲＮＡが存在する場合には、各プロモーターは３つのＲＮＡの発現をドライブすることができる。
【００６９】
ガイド分子
「ガイド配列」および「ガイド分子」という用語は、標的核酸配列とハイブリッド形成し、かつ核酸標的複合体の標的核酸配列への配列特異的結合を導くのに十分な標的核酸配列との相補性を有するあらゆるポリヌクレオチド配列を包含する。本明細書に開示されている方法を用いて調製されたガイド配列は、完全長ガイド配列、切断型ガイド配列、完全長ｓｇＲＮＡ配列、切断型ｓｇＲＮＡ配列、またはＥ＋Ｆ  ｓｇＲＮＡ配列であってもよい。いくつかの態様では、所与の標的配列へのガイド配列の相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを用いて最適にアラインメントされている場合、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％またはそれ以上あるいは約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％超である。特定の例示的態様では、ガイド分子は、ガイド配列と標的配列との間にＲＮＡ二本鎖が形成されるように、標的配列との少なくとも１つのミスマッチを有するように設計することができるガイド配列を含む。いくつかの態様ではガイド配列は、ガイド配列全体に対する相補性の程度をさらに低下させるために２つ以上の隣接するマッチしていないヌクレオチドのストレッチを有するように設計されている。最適なアラインメントは、配列をアラインメントするためのあらゆる好適なアルゴリズムの使用により決定してもよく、その非限定的な例としては、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍに基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ  Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ａｌｉｇｎｅｒ）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社、カリフォルニア州サンディエゴ）、ＳＯＡＰおよびＭａｑが挙げられる。核酸標的複合体の標的核酸配列への配列特異的結合を導くためのガイド配列（核酸標的ガイドＲＮＡ内）の能力は、任意の好適なアッセイによって評価してもよい。例えば、試験されるガイド配列を含む核酸標的複合体を形成するのに十分な核酸標的ＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素は、核酸標的複合体の構成要素をコードするベクターを用いるトランスフェクションなどによって対応する標的核酸配列を有する宿主細胞に提供してもよく、次いで本明細書に記載されているようにＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイなどによって標的核酸配列内での優先的標的化（例えば切断）の評価を行ってもよい。同様に、標的核酸配列、試験されるガイド配列および試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列などの核酸標的複合体の構成要素を提供し、かつ試験配列と対照ガイド配列との反応間で標的配列またはその近くでの結合または切断率を比較することにより、試験管の中で標的核酸配列（またはその近くの配列）の切断を評価してもよい。ガイド配列および故に核酸標的ガイドＲＮＡは、あらゆる標的核酸配列を標的にするように選択してもよい。
【００７０】
特定の態様では、ガイド分子のガイド配列またはスペーサの長さは１５〜５０ヌクレオチド（ｎｔ）である。特定の態様では、ガイドＲＮＡのスペーサの長さは少なくとも１５ヌクレオチドである。特定の態様では、スペーサの長さは１５〜１７ｎｔ、例えば１５、１６または１７ｎｔ、１７〜２０ｎｔ、例えば１７、１８、１９または２０ｎｔ、２０〜２４ｎｔ、例えば２０、２１、２２、２３または２４ｎｔ、２３〜２５ｎｔ、例えば２３、２４または２５ｎｔ、２４〜２７ｎｔ、例えば２４、２５、２６または２７ｎｔ、２７〜３０ｎｔ、例えば２７、２８、２９または３０ｎｔ、３０〜３５ｎｔ、例えば３０、３１、３２、３３、３４または３５ｎｔまたは３５ｎｔ以上である。特定の例示的な態様では、ガイド配列は１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００ｎｔである。
【００７１】
特定の態様では、ガイド分子は、直接反復配列がガイド配列の上流（すなわち５’）に位置するように、（１）標的遺伝子座とハイブリッド形成することができるガイド配列と、（２）ｔｒａｃｒメイトまたは直接反復配列とを含む。いくつかの態様では、ガイド配列のシード配列（すなわち、標的遺伝子座にある配列の認識および／またはそれとのハイブリッド形成に関与する配列）は、ガイド配列のおよそ最初の１０ヌクレオチド以内にある。
【００７２】
特定の態様では、ガイド分子は直接反復配列に連結されているガイド配列を含み、ここでは直接反復配列は１つ以上のステムループまたは最適化二次構造を含む。特定の態様では、直接反復配列は１６ｎｔｓの最小長さおよび単一のステムループを有する。さらなる態様では、直接反復配列は１６ｎｔｓ超、好ましくは１７ｎｔｓ超の長さを有し、かつ２つ以上ステムループまたは最適化二次構造を有する。特定の態様では、ガイド分子は、天然の直接反復配列の全てまたは一部に連結されているガイド配列を含むかそれからなる。典型的なＶ型もしくはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓガイド分子は（３’→５’方向または５’→３’方向に）、ガイド配列、第１の相補ストレッチ（「反復配列」）、ループ（典型的には４もしくは５ヌクレオチド長である）、第２の相補ストレッチ（「抗反復配列」は反復配列に相補的である）、およびポリＡ（多くの場合、ＲＮＡ中のポリＵ）テール（ターミネーター）を含む。特定の態様では、直接反復配列はその天然構造を保持し、かつ単一のステムループを形成する。特定の態様では、例えば特徴の付加、削除または置換によってガイド構造の特定の側面を改変することができるが、ガイド構造の特定の他の側面は維持される。限定されるものではないが、挿入、欠失および置換などの操作されたガイド分子改変のための好ましい位置としては、ガイド末端と、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質および／または標的、例えば直接反復配列のステムループと複合体化された場合に露出されるガイド分子の領域とが挙げられる。
【００７３】
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲシステムエフェクタータンパク質はＲＮＡ標的化エフェクタータンパク質である。特定の態様では、ＣＲＩＳＰＲシステムエフェクタータンパク質は、ＲＮＡを標的にするＶＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃまたはＣａｓ１３ｄ）である。例示的なＲＮＡ標的化エフェクタータンパク質としては、Ｃａｓ１３ｂおよびＣ２ｃ２（Ｃａｓ１３ａとしても知られている）が挙げられる。本明細書で使用される「Ｃａｓ１３」という用語は、ＲＮＡを標的にするあらゆるＶＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃまたはＣａｓ１３ｄ）を指す。ＣＲＩＳＰＲタンパク質がＣ２ｃ２タンパク質である場合、ｔｒａｃｒＲＮＡは必要とされない。Ｃ２ｃ２またはＣａｓ１３は、Ａｂｕｄａｙｙｅｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５３（６２９９）：ａａｆ５５７３−１−ａａｆ５５７３−９（２０１６）；Ｓｈｍａｋｏｖ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ，６０（３）：３８５−９７（２０１５）；およびＳｍａｒｇｏｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ，６５：６１８−３０（２０１７）に記載されている。
【００７４】
いくつかの態様では、核酸標的システムの１つ以上のエレメントは、内因性ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ標的化システムを含む特定の生物に由来している。特定の例示的態様では、エフェクタータンパク質ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ標的化システムは、少なくとも１つのＨＥＰＮドメインを含む。特定の例示的態様では、エフェクタータンパク質は単一のＨＥＰＮドメインを含む。特定の他の例示的態様では、エフェクタータンパク質は２つのＨＥＰＮドメインを含む。
【００７５】
特定の他の例示的態様では、ＣＲＩＳＰＲシステムエフェクタータンパク質はＣ２ｃ２ヌクレアーゼである。Ｃ２ｃ２の活性は２つのＨＥＰＮドメインの存在に依存していてもよい。これらはリボヌクレアーゼドメイン、すなわちＲＮＡを切断するヌクレアーゼ（特にエンドヌクレアーゼ）であることが分かっている。またＣ２ｃ２  ＨＥＰＮは標的ＤＮＡまたは潜在的にＤＮＡおよび／またはＲＮＡであってもよい。Ｃ２ｃ２のＨＥＰＮドメインはそれらの野生型の形態で少なくともＲＮＡに結合して切断することができるという前提で、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質はリボヌクレアーゼ機能を有していることが好ましい。Ａｂｕｄａｙｙｅｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５３（６２９９）：ａａｆ５５７３−１−ａａｆ５５７３−９（２０１６）を参照されたい。
【００７６】
ＴＡＬＥシステム
いくつかの態様では、遺伝子改変は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システムにより行う。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は実際にあらゆる所望のＤＮＡ配列に結合するように操作することができる。ＴＡＬＥＮシステムを用いるゲノム編集の例示的な方法は、例えば、Ｃｅｒｍａｋ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３９（２１）：ｅ８２（２０１１）；Ｚｈａｎｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２９：１４９−１５３（２０１１）ならびに米国特許第８，４５０，４７１号、第８，４４０，４３１号および第８，４４０，４３２号に記載されている。
【００７７】
いくつかの態様は、向上した効率および拡張された特異性を有する核酸配列の標的化を可能にする、それらの組織構造の一部としてＴＡＬＥモノマーを含む単離された天然に存在しない組換え、すなわち操作されたＤＮＡ結合タンパク質を使用することを含む。ＴＡＬＥの構造および機能は、例えば、Ｍｏｓｃｏｕ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２６：１５０１（２００９）；Ｂｏｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２６：１５０９−１５１２（２００９）；およびＺｈａｎｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２９：１４９−１５３（２０１１）にさらに記載されている。
【００７８】
Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ
いくつかの態様では、遺伝子改変剤はジンクフィンガーシステムを含む。プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインの１種は人工Ｚｎフィンガー（ＺＦ）技術によって提供され、これはゲノム内の新しいＤＮＡ結合部位を標的にするためのＺＦモジュールのアレイを含む。ＺＦアレイ内の各フィンガーモジュールは３つのＤＮＡ塩基を標的にする。個々のジンクフィンガードメインのカスタマイズされたアレイは、ＺＦタンパク質（ＺＦＰ）の中に組み立てられている。
【００７９】
ＺＦＰは機能性ドメインを含むことができる。最初の合成ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ＺＦタンパク質をＩＩＳ型制限酵素Ｆｏｋｌの触媒ドメインに融合させることによって開発された（Ｋｉｍ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９１，８８３−８８７（１９９４）；Ｋｉｍ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９３，１１５６−１１６０（１９９６））。高い切断特異性は、それぞれが短いスペーサによって分離された異なるヌクレオチド配列を標的にする対のＺＦＮヘテロ二量体の使用により低下したオフターゲット活性により達成することができる（Ｄｏｙｏｎ，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，８：７４−７９（２０１１））。ＺＦＰは転写活性化因子およびリプレッサーとして設計することもでき、多種多様な生物の多くの遺伝子を標的にするために使用されている。ＺＦＮを用いたゲノム編集の例示的な方法は、例えば米国特許第６，５３４，２６１号、第６，６０７，８８２号、第６，７４６，８３８号、第６，７９４，１３６号、第６，８２４，９７８号、第６，８６６，９９７号、第６，９３３，１１３号、第６，９７９，５３９号、第７，０１３，２１９号、第７，０３０，２１５号、第７，２２０，７１９号、第７，２４１，５７３号、第７，２４１，５７４号、第７，５８５，８４９号、第７，５９５，３７６号、第６，９０３，１８５号および第６，４７９，６２６号に記載されている。
【００８０】
メガヌクレアーゼ
本明細書に開示されている「編集」は、大きい認識部位（１２〜４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列）を特徴とするエンドデオキシリボヌクレアーゼであるメガヌクレアーゼにより行うことができる。メガヌクレアーゼを使用するための例示的な方法は、米国特許第８，１６３，５１４号、第８，１３３，６９７号、第８，０２１，８６７号、第８，１１９，３６１号、第８，１１９，３８１号、第８，１２４，３６９号および第８，１２９、１３４号に記載されている。
【００８１】
ＲＮＡｉ
特定の態様では、遺伝子改変剤はＲＮＡｉ（例えばｓｈＲＮＡ）である。ＲＮＡｉ分子、例えばｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの活性を参照して本明細書で使用される「遺伝子サイレンシング」または「サイレンシングされた遺伝子」は、ｍｉＲＮＡもしくはＲＮＡ干渉分子の非存在下で細胞中に認められるｍＲＮＡレベルの少なくとも約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、約１００％の標的遺伝子の細胞中のｍＲＮＡレベルの減少を指す。好ましい一態様では、ｍＲＮＡレベルは少なくとも約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、約１００％減少する。
【００８２】
本明細書で使用される「ＲＮＡｉ」という用語は、限定されるものではないが、ｓｉＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡｉ、内因性マイクロＲＮＡおよび人工マイクロＲＮＡなどの任意の種類の干渉ＲＮＡを指す。例えばこの用語は、ＲＮＡの下流プロセシングの機序に関わらずｓｉＲＮＡとして以前に同定された配列を含む（すなわち、ｓｉＲＮＡはｍＲＮＡの切断をもたらすインビボプロセシングの特異的な方法を有すると考えられているが、そのような配列は本明細書に記載されているフランキング配列の文脈ではベクターの中に組み込むことができる）。また「ＲＮＡｉ」という用語は、遺伝子サイレンシングＲＮＡｉ分子および遺伝子の発現を活性化させるＲＮＡｉエフェクター分子の両方を含むことができる。
【００８３】
本明細書で使用される「ｓｉＲＮＡ」は二本鎖ＲＮＡを形成する核酸を指し、二本鎖ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡが標的遺伝子と同じ細胞中に存在するかそこで発現される場合に遺伝子または標的遺伝子の発現を減少させるか阻害する能力を有する。二本鎖ＲＮＡ  ｓｉＲＮＡは相補鎖によって形成することができる。一態様では、ｓｉＲＮＡは二本鎖ｓｉＲＮＡを形成することができる核酸を指す。ｓｉＲＮＡの配列は完全長の標的遺伝子またはその部分配列に対応することができる。典型的には、ｓｉＲＮＡは少なくとも約１５〜５０ヌクレオチド長である（例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡの各相補的な配列は約１５〜５０ヌクレオチド長であり、かつ二本鎖ｓｉＲＮＡは約１５〜５０塩基対長、好ましくは約１９〜３０塩基ヌクレオチド、好ましくは約２０〜２５ヌクレオチド長、例えば２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチド長である）。
【００８４】
本明細書で使用される「ｓｈＲＮＡ」または「短いヘアピンＲＮＡ」（ステムループとも呼ぶ）はｓｉＲＮＡの１種である。一態様では、これらのｓｈＲＮＡは短い、例えば約１９〜約２５ヌクレオチドのアンチセンス鎖、その後の約５〜約９ヌクレオチドのヌクレオチドループおよび類似したセンス鎖からなる。あるいは、センス鎖はヌクレオチドループ構造の前にあってもよく、かつアンチセンス鎖がその後にあってもよい。
【００８５】
「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」という用語は、本明細書では内因性ＲＮＡと同義で使用されており、そのうちのいくつかは転写後レベルにおいてタンパク質コード遺伝子の発現を調節することが知られている。内因性マイクロＲＮＡは、ｍＲＮＡの生産的利用を調節することができるゲノム中に天然に存在する短いＲＮＡである。「人工マイクロＲＮＡ」という用語は、ｍＲＮＡの生産的利用を調節することができる内因性マイクロＲＮＡ以外の任意の種類のＲＮＡ配列を含む。マイクロＲＮＡ配列については、Ｌｉｍ，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１７：９９１−１００８（２００３）、Ｌｉｍ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９９，１５４０（２００３）、ＬｅｅおよびＡｍｂｒｏｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４，８６２（２００１）、Ｌａｕ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４，８５８−８６１（２００１）、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２：７３５−７３９（２００２）、Ｌａｇｏｓ  Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４，８５３−８５７（２００１）およびＬａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，ＲＮＡ，９：１７５−１７９（２００３）などの刊行物に記載されている。複数のマイクロＲＮＡを前駆体分子の中に組み込むこともできる。さらにｍｉＲＮＡ様ステムループは、ｍｉＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉ経路により内因性遺伝子の発現を調節するために人工ｍｉＲＮＡおよび短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を送達するための媒体として細胞において発現させることができる。
【００８６】
本明細書で使用される「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」は二本鎖からなるＲＮＡ分子を指す。二本鎖分子は、それ自身の上に折り返して二重鎖構造を形成する単一のＲＮＡ分子からなるものを含む。例えば、前駆体ｍｉＲＮＡと呼ばれる（Ｂａｒｔｅｌ，．Ｃｅｌｌ，１１６（２）：２８１−２９７（２００４））そこから単鎖ｍｉＲＮＡが得られる前駆体分子のステムループ構造はｄｓＲＮＡ分子を含む。
【００８７】
いくつかの態様は、改変または編集された遺伝子を含む真核細胞を産生する方法を含む。いくつかの態様では、本方法は、（ａ）１つ以上のベクターを真核細胞の中に導入する工程であって、この１つ以上のベクターはＣａｓエフェクターモジュールおよび直接反復配列に連結されているガイド配列のうちの１つ以上の発現をドライブし、このＣａｓエフェクターモジュールは塩基編集を媒介する１つ以上のエフェクタードメインに会合する工程と、（ｂ）前記疾患遺伝子内で標的ポリヌクレオチドの塩基編集を行うためにＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエフェクターモジュール複合体が標的ポリヌクレオチドに結合するのを可能にする工程であって、このＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエフェクターモジュール複合体は標的ポリヌクレオチド内の標的配列とハイブリッド形成されるガイド配列と複合体化されているＣａｓエフェクターモジュールを含む工程とを含む。
【００８８】
さらなる態様は、本明細書に記載されている組成物または前記改変された細胞の子孫を含む、本明細書に記載されている方法により得られるか得ることが可能な単離された細胞に関する。特定の態様では、当該細胞は真核細胞、好ましくはヒトもしくは非ヒト動物細胞である。いくつかの態様では、当該細胞は免疫細胞である。いくつかの態様では、当該細胞はＨＳＣである。
【００８９】
いくつかの態様は、その細胞のＤＮＡが、（ａ）自己免疫疾患に対する感受性に関連する１種以上の遺伝子バリアントの量を減少させ、かつ／または（ｂ）自己免疫疾患に対して保護的な１種以上の遺伝子バリアントの量を増加させるために遺伝子編集によって改変されている、単離された免疫細胞または造血幹細胞を含む。いくつかの態様は、その集団中の細胞の少なくとも約１０％は、（ａ）自己免疫疾患に対する感受性に関連する１種以上の遺伝子バリアントの量を減少させ、かつ／または（ｂ）自己免疫疾患に対して保護的な１種以上の遺伝子バリアントの量を増加させるために遺伝子編集により改変されている免疫細胞または造血幹細胞の集団を含む。
【００９０】
本発明はさらに、それを必要とする患者に本明細書に記載されている改変された細胞を投与することを含む細胞療法のための方法であって、改変された細胞の存在により患者における疾患を治療する方法に関する。
【００９１】
以下の実施例は、本明細書に記載されている組成物および方法の例示として含められている。これらの実施例は決して本発明の範囲を限定するものではない。他の態様は当業者に明らかであろう。
【実施例】
【００９２】
実施例１：遺伝子編集による免疫疾患の対処
この実施例は、当該技術分野において理解されているＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を使用する。ＣＲＩＳＰＲは、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓの略である。ＣＲＩＳＰＲ配列は、細胞を攻撃したウイルスからのＤＮＡのセグメントを含み、同様のウイルスからのＤＮＡを検出し、かつＣａｓタンパク質と共にそれを破壊することができるＲＮＡを産生するために細胞によって使用される。ＣＡＳはＣＲＩＳＰＲ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＲＩＳＰＲ関連システム）の略であり、Ｃａｓタンパク質をコードする遺伝子は細胞のＤＮＡにおいてＣＲＩＳＰＲ配列の近くに認められる。合成的に改変され、かつガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と一体化されたＣａｓ９タンパク質は、ｇＲＮＡに対応する特定の標的ＤＮＡに結合して両鎖においてＤＮＡを切断することができる。この二本鎖切断は、標的ＤＮＡを置換ＤＮＡで置き換えるか細胞における相同な修復プロセスを開始し、そこでは相同な染色体またはテンプレートＤＮＡ内の対応するＤＮＡを複製して切断されたＤＮＡを修復する。
【００９３】
さらにこの実施例は、ＩＢＤのそれらの症状を改善させることができることを実証するためにマウスのモデルに対して行った実験を説明する。マウスにおける結腸の炎症は化学的および／または遺伝的に誘発させる。特に、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）をエタノールと共に直腸内に投与し、オキサゾロンを直腸内に投与するか、あるいは硫酸化多糖であるデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を飲料水を介して経口投与する。例えば、Ｗｉｒｔｚ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，１２（７）：１２９５−１３０９（２０１７）を参照されたい。代わりまたは追加として、炎症性腸疾患を誘発するようにマウスを遺伝子改変する。例えばＮＯＤ１および／またはＮＯＤ２をノックアウト（ＫＯ）するようにマウスを遺伝子改変する。例えば、Ｎａｔｉｖｉｄａｄ，Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，１８（８）：１４３４−４６（２０１２）；Ｚｅｎｅｗｉｃｚ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２９（６）：９４７−５７（２００８）を参照されたい。代わりまたは追加として、ＩＬ−１０  ＫＯ、ＩＬ−２  ＫＯ、ＴＣＲａ  ＫＯ、ＴＧＦｂ  ＫＯ、ＴＡＫ１  ＫＯ、ＷＡＳＰ  ＫＯまたはＭＤＲ１Ａ  ＫＯなどに関するモデルに基づいてマウスを遺伝子改変する。例えば、Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｓｃｉ．，１０５：２６３−３２０（２０１２）；Ｗｉｒｔｚ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，５９（１１）：１０７３−８３（２００７）を参照されたい。
【００９４】
より詳細には、本発明者らは２種類の突然変異を検討する。１つ目はＩＢＤに対する感受性突然変異、例えば１１３Ｇｌｙ→Ａｒｇなどの例えばＩＬ−１０に対する機能喪失突然変異であり、これにより、理論によって縛られるものではないが、ＩＬ−１０がＳＴＡＴ３リン酸化を誘導すること、または末梢血単核細胞においてリポ多糖類（ＬＰＳ）媒介性ＴＮＦ放出を阻害することができなくなると考えられている。例えば、Ｇｌｏｃｋｅｒ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１２４６：１０２−０７（２０１１）を参照されたい。２つ目は、上で考察したＩＬ２３Ｒに対するＩＢＤのための保護的突然変異（Ｒ３８１Ｑはｒｓ１１２０９０２６、ｃ．１１４２Ｇ＞Ａに対応する）である。
【００９５】
標準系統の胚を遺伝子編集することによって４つの異なる群のマウス、すなわちヘテロ接合型ＩＬ−１０感受性突然変異を有し、かつＩＬ２３Ｒ保護的突然変異を有しないＡ群、ＩＬ１０および／またはＩＬ２３Ｒ突然変異のいずれも有しないＢ群、ＩＬ１０突然変異を有し、かつＩＬ２３Ｒ保護的突然変異を有するＣ群、およびＩＬ１０突然変異を有さず、かつＩＬ２３Ｒ保護的突然変異を有するＤ群を使用する。
【００９６】
これらのマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６などの一般的なマウス系統をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集することにより作成する。代わりに、マウスは例えばＮａｖ１．７ＫＯマウスなどの疼痛に対して感受性が低い系統から作成することもできる。例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，３８（４７）：１０１８０−１０２０１（２０１８）を参照されたい。この実験はヒト化マウス、すなわち機能性のヒト免疫系が移植された免疫疾患マウスを用いる場合と概念的に類似していてもよい。例えば、Ｋｅｎｎｅｙ，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．，１６（２）：３８９−９７（２０１６）を参照されたい。さらにこの実験は、例えばＩｌ１０座（近位のプロモーターおよびＵＴＲを含むエクソン１〜５）を削除するためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介遺伝子編集を用いて標準的なＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ系統から編集されたＴａｃｏｎｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製のＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ−Ｉｌ１０ｅｍ８Ｔａｃマウスモデルを用いるなどの特定の編集を必要としない既存のマウスモデルを用いる場合と概念的に類似しているであろう。
【００９７】
ＨＳＣが編集されているマウスにおいて、ＣＤ３４＋細胞を捕捉することによりＨＳＣを骨または血液から採取する（ＣＤ３４はほぼ全てのヒトのＨＳＣで発現されるが、マウスのＨＳＣのおよそ２０％で発現されることに留意されたい。Ｏｇａｗａ，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，９３８：１３９−４５（２００１）を参照されたい。但し、ＣＤ３４を発現するマウスのＨＳＣの割合を変えるために、マウスの発現を刺激して回復させて採取することができる。Ｔａｊｉｍａ，Ｂｌｏｏｄ，９６（５）：１９８９−９３（２０００）を参照されたい。
【００９８】
次いで、採取した細胞をエクスビボで編集し、それらの体内で生じたＨＳＣ集団を実質的に枯渇させたマウスの血流に戻す。これは、ＡＣＫ２などの抗ｃ−Ｋｉｔ抗体ならびにマウスＣＤ４７を標的にするためにヒトＣＤ４７を有効に標的にするＣＶ１から改変されたＣＶ１ｍｂなどの抗ＣＤ４７抗体を投与する非放射線すなわち非化学療法技術を用いて達成することができ、これは宿主ＨＳＣを実質的に枯渇させることが分かっており、骨における６０％超のドナー由来のＨＳＣキメラ現象ならびにドナー由来の骨髄系細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞およびＴ細胞のそれぞれにおける血中のおよそ６０％、４５％、６０％および３０％のキメラ現象を有するコンジェニックドナーマウスから注射によって送達されたＨＳＣのロバストな生着を達成する。Ｃｈｈａｂｒａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，８（３５１）：３５１ｒａ１０５（１０頁）（２０１６）を参照されたい。マウスは１日目に５００ｍｇのＡＣＫ２、１日目に開始して毎日５日間にわたって５００ｍｇのＣＶ１ｍｂの注射によって治療することができる。移植は３日間毎日およそ１００万個の編集されたＨＳＣを注射により移すことによる治療から６日後に開始することができる。移植からおよそ２４週間後に、宿主の元の細胞と比較して関連する編集を有するＢ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、顆粒球（好中球、好酸球、好塩基球および肥満細胞）の数を数えて、編集されたＨＳＣの生着が成功しているか否かを決定してもよい。
【００９９】
この実験は、ＣＶ１、ＭＩＡＰ４１０またはＨｕ５Ｆ９Ｇ４などの他の抗ＣＤ４７抗体で置き換えるかそれにより増強した場合と概念的に類似していることに留意されたく、これは固体癌および血液癌に使用するために、ヒトにおいて現在臨床試験が行われている（臨床試験ＮＣＴ０２２１６４０９およびＮＣＴ０２３６７１９６）。さらにこの実験は、さらに多くの生着手順を行うか、あるいは抗ｃ−Ｋｉｔ抗体および抗ＣＤ４７抗体治療を放射線または化学療法薬により増強させた場合と概念的に類似している。
【０１００】
遺伝子編集はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介した相同組換え修復（ＨＤＲ：ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒｅｐａｉｒ）によって達成することができ、ここでは未編集ＤＮＡの領域内の相同体に対応するが新しい配列を有するテンプレートＤＮＡを複製してその鎖が切断された後にＤＮＡを置き換える。特にＡ群中のマウスの４分の１（Ａ１群）を遺伝子編集に供してＩＬ１０感受性突然変異を除去し、Ａ群中のマウスの４分の１（Ａ２群）を遺伝子編集に供して保護的ＩＬ２３Ｒ突然変異を追加し、Ａ群中のマウスの４分の１（Ａ３群）を遺伝子編集に供して保護的ＩＬ２３Ｒ突然変異を追加し、かつＩＬ１０突然変異を除去する。Ｂ群中のマウスの２分の１（Ｂ２群）を遺伝子編集に供してＩＬ２３Ｒ突然変異を追加する。Ｃ群中のマウスの２分の１（Ｃ２群）を遺伝子編集に供してＩＬ１０突然変異を除去する。Ａ群、Ｂ群およびＣ群中の残数をＡ１群、Ａ２群、Ａ３群、Ｂ２群、Ｃ２群、Ｄ群中の残数と同様にするために、本発明者らはＡ群、Ｂ群、Ｃ群およびＣ群のそれぞれにおいて４：２：２：１の比のマウス数を用いて開始することができる。
【０１０１】
編集されたＨＳＣが免疫細胞を産生するのを待った後（例えば約６ヶ月後）であって、編集された群における生着が成功しているとみなした後に、上記方法のうちの１つを用いてこれらのマウスを大腸炎になるように化学的に誘発する。次いでＡ群、Ｂ群、Ｃ群、Ｄ群、Ａ１群、Ａ２群、Ａ３群、Ｂ２群およびＣ２群の全てにわたって体重減少、出血および下痢に関する表現型の重症度を比較する。以下の表（表１）は、開始時の遺伝子状態、理論的に編集された遺伝子状態、および症状レベルの１つの可能な分類を示す。理論によって縛られるものではないが、ＨＳＣ編集が完全に効率的であれば、本発明者らは、Ａ３群とＢ２群とＣ２群とＤ群との間、Ａ２群とＣ群の間、ならびにＡ１群とＢ群との間でそれらの症状が類似することを期待する。ＩＬ２３Ｒバリアントの保護的効果がＩＬ１０バリアントの感受性効果よりも大きく上回っている場合、本発明者らはそれらの症状がＡからＤに向かって最悪から最低になるように順序づけられることを期待する。
【表１】
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【０１０２】
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と共にＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を使用して保護的突然変異を遺伝子ＩＬ２３Ｒに与える。より詳細には、ｇＲＮＡは、以下に記載されているＩＬ２３Ｒアミノ酸配列をコードするＤＮＡに付着するように設計されている。
ＭＮＱＶＴＩＱＷＤＡＶＩＡＬＹＩＬＦＳＷＣＨＧＧＩＴＮＩＮＣＳＧＨＩＷＶＥＰＡＴＩＦＫＭＧＭＮＩＳＩＹＣＱＡＡＩＫＮＣＱＰＲＫＬＨＦＹＫＮＧＩＫＥＲＦＱＩＴＲＩＮＫＴＴＡＲＬＷＹＫＮＦＬＥＰＨＡＳＭＹＣＴＡＥＣＰＫＨＦＱＥＴＬＩＣＧＫＤＩＳＳＧＹＰＰＤＩＰＤＥＶＴＣＶＩＹＥＹＳＧＮＭＴＣＴＷＮＡＧＫＬＴＹＩＤＴＫＹＶＶＨＶＫＳＬＥＴＥＥＥＱＱＹＬＴＳＳＹＩＮＩＳＴＤＳＬＱＧＧＫＫＹＬＶＷＶＱＡＡＮＡＬＧＭＥＥＳＫＱＬＱＩＨＬＤＤＩＶＩＰＳＡＡＶＩＳＲＡＥＴＩＮＡＴＶＰＫＴＩＩＹＷＤＳＱＴＴＩＥＫＶＳＣＥＭＲＹＫＡＴＴＮＱＴＷＮＶＫＥＦＤＴＮＦＴＹＶＱＱＳＥＦＹＬＥＰＮＩＫＹＶＦＱＶＲＣＱＥＴＧＫＲＹＷＱＰＷＳＳＬＦＦＨＫＴＰＥＴＶＰＱＶＴＳＫＡＦＱＨＤＴＷＮＳＧＬＴＶＡＳＩＳＴＧＨＬＴＳＤＮＲＧＤＩＧＬＬＬＧＭＩＶＦＡＶＭＬＳＩＬＳＬＩＧＩＦＮＲＳＦＲＴＧＩＫＲＲＩＬＬＬＩＰＫＷＬＹＥＤＩＰＮＭＫＮＳＮＶＶＫＭＬＱＥＮＳＥＬＭＮＮＮＳＳＥＱＶＬＹＶＤＰＭＩＴＥＩＫＥＩＦＩＰＥＨＫＰＴＤＹＫＫＥＮＴＧＰＬＥＴＲＤＹＰＱＮＳＬＦＤＮＴＴＶＶＹＩＰＤＬＮＴＧＹＫＰＱＩＳＮＦＬＰＥＧＳＨＬＳＮＮＮＥＩＴＳＬＴＬＫＰＰＶＤＳＬＤＳＧＮＮＰＲＬＱＫＨＰＮＦＡＦＳＶＳＳＶＮＳＬＳＮＴＩＦＬＧＥＬＳＬＩＬＮＱＧＥＣＳＳＰＤＩＱＮＳＶＥＥＥＴＴＭＬＬＥＮＤＳＰＳＥＴＩＰＥＱＴＬＬＰＤＥＦＶＳＣＬＧＩＶＮＥＥＬＰＳＩＮＴＹＦＰＱＮＩＬＥＳＨＦＮＲＩＳＬＬＥＫ（配列番号１）
対応するＤＮＡ配列は配列表の中の配列番号２に記載されている。
【０１０３】
Ｃｒｉｓｐｒ−ＣＡＳ９複合体は３８１位のＲの領域においてＤＮＡを切断するように設計されており、テンプレートＤＮＡは３８１位のＲをＱに変換させるか、あるいはヌクレオチド位置１１４２ＡのＧをＡに変換させるような相同な修復を達成するように設計されている。この目的を達成することができるテンプレートＤＮＡは参照ＤＮＡ（配列番号２）の１１４２位の周りのＤＮＡ配列に対応する。
【０１０４】
ガイドＲＮＡテンプレートは、ＩＬ２３Ｒ遺伝子の特定の領域を標的にするように設計されている。
【０１０５】
ガイドＲＮＡ配列を構築するために使用される例示的なマウスのＩＬ２３Ｒ標的配列としては、
ＡＴＡＧＡＡＣＡＡＣＡＧＣＴＣＧＧＡＴＴ（配列番号３）
ＡＣＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＣＧＴＣＣＡＴＣ（配列番号４）
ＣＣＣＴＴＡＡＧＣＡＣＴＧＣＣＧＡＣＣＡ（配列番号５）
ＴＧＴＧＴＣＡＴＴＴＡＴＧＡＡＴＡＣＴＣ（配列番号６）
ＡＣＣＡＴＣＴＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＴＡＡ（配列番号７）
ＡＴＣＴＣＣＡＣＴＧＡＣＴＣＡＣＴＧＣＡ（配列番号８）
が挙げられる。
【０１０６】
マウスのＩＬ２３Ｒを標的にする例示的なガイドＲＮＡ配列は、
ＡＵＡＧＡＡＣＡＡＣＡＧＣＵＣＧＧＡＵＵ（配列番号９）
ＡＣＡＡＣＡＡＣＵＡＣＡＣＧＵＣＣＡＵＣ（配列番号１０）
ＣＣＣＵＵＡＡＧＣＡＣＵＧＣＣＧＡＣＣＡ（配列番号１１）
ＵＧＵＧＵＣＡＵＵＵＡＵＧＡＡＵＡＣＵＣ（配列番号１２）
ＡＣＣＡＵＣＵＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＵＡＡ（配列番号１３）
ＡＵＣＵＣＣＡＣＵＧＡＣＵＣＡＣＵＧＣＡ（配列番号１４）
を含む。
【０１０７】
ガイドＲＮＡ配列を構築するために使用される例示的なヒトＩＬ２３Ｒ標的配列としては、
ＧＴＧＣＡＧＴＡＣＡＴＡＧＡＡＧＣＡＴＧ（配列番号１５）
ＡＣＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＣＧＴＣＣＡＴＣ（配列番号１６）
ＣＴＡＣＡＴＡＧＡＣＡＣＡＡＡＡＴＡＣＧ（配列番号１７）
ＡＣＣＡＧＣＴＧＡＡＧＡＧＴＡＴＧＴＡＡ（配列番号１８）
ＣＣＣＴＴＴＡＣＡＴＡＣＴＣＴＴＣＡＧＣ（配列番号１９）
ＡＣＴＴＣＡＴＣＡＧＧＡＡＴＡＴＣＴＧＧ（配列番号２０）
が挙げられる。
【０１０８】
ヒトＩＬ２３Ｒを標的にする例示的なガイドＲＮＡ配列は、
ＧＵＧＣＡＧＵＡＣＡＵＡＧＡＡＧＣＡＵＧ（配列番号２１）
ＡＣＡＡＣＡＡＣＵＡＣＡＣＧＵＣＣＡＵＣ（配列番号２２）
ＣＵＡＣＡＵＡＧＡＣＡＣＡＡＡＡＵＡＣＧ（配列番号２３）
ＡＣＣＡＧＣＵＧＡＡＧＡＧＵＡＵＧＵＡＡ（配列番号２４）
ＣＣＣＵＵＵＡＣＡＵＡＣＵＣＵＵＣＡＧＣ（配列番号２５）
ＡＣＵＵＣＡＵＣＡＧＧＡＡＵＡＵＣＵＧＧ（配列番号２６）
を含む。
【０１０９】
ヒトＩＬ２３ＲにおけるＧ１１４２Ａを標的にするガイドＲＮＡ配列を構築するために使用される例示的な標的配列としては、
ＴＧＴＣＡＡＴＴＣＴＴＴＣＴＴＴＧＡＴＴ（配列番号２７）
ＴＴＴＡＡＣＡＧＡＴＣＡＴＴＣＣＧＡＡＣ（配列番号２８）
ＴＴＡＡＣＡＧＡＴＣＡＴＴＣＣＧＡＡＣＴ（配列番号２９）
ＣＡＧＡＴＣＡＴＴＣＣＧＡＡＣＴＧＧＧＴ（配列番号３０）
ＣＴＧＣＡＡＡＡＡＣＣＴＡＣＣＣＡＧＴＴ（配列番号３１）
が挙げられる。
【０１１０】
ヒトＩＬ２３ＲにおけるＧ１１４２Ａを標的にする例示的なガイドＲＮＡ配列は、
ＵＧＵＣＡＡＵＵＣＵＵＵＣＵＵＵＧＡＵＵ（配列番号３２）
ＵＵＵＡＡＣＡＧＡＵＣＡＵＵＣＣＧＡＡＣ（配列番号３３）
ＵＵＡＡＣＡＧＡＵＣＡＵＵＣＣＧＡＡＣＵ（配列番号３４）
ＣＡＧＡＵＣＡＵＵＣＣＧＡＡＣＵＧＧＧＵ（配列番号３５）
ＣＵＧＣＡＡＡＡＡＣＣＵＡＣＣＣＡＧＵＵ（配列番号３６）
を含む。
野生型のヒトＩＬ−１０配列が以下に記載されている。
ＭＨＳＳＡＬＬＣＣＬＶＬＬＴＧＶＲＡＳＰＧＱＧＴＱＳＥＮＳＣＴＨＦＰＧＮＬＰＮＭＬＲＤＬＲＤＡＦＳＲＶＫＴＦＦＱＭＫＤＱＬＤＮＬＬＬＫＥＳＬＬＥＤＦＫＧＹＬＧＣＱＡＬＳＥＭＩＱＦＹＬＥＥＶＭＰＱＡＥＮＱＤＰＤＩＫＡＨＶＮＳＬＧＥＮＬＫＴＬＲＬＲＬＲＲＣＨＲＦＬＰＣＥＮＫＳＫＡＶＥＱＶＫＮＡＦＮＫＬＱＥＫＧＩＹＫＡＭＳＥＦＤＩＦＩＮＹＩＥＡＹＭＴＭＫＩＲＮ（配列番号３７）
【０１１１】
ヒトＩＬ１０を標的にするガイドＲＮＡ配列を構築するために使用される例示的な標的配列としては、
ＧＡＡＣＣＡＡＧＡＣＣＣＡＧＡＣＡＴＣＡ（配列番号３８）
ＣＡＡＧＧＣＧＣＡＴＧＴＧＡＡＣＴＣＣＣ（配列番号３９）
ＡＡＧＧＣＧＣＡＴＧＴＧＡＡＣＴＣＣＣＴ（配列番号４０）
ＡＧＧＣＧＣＡＴＧＴＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧ（配列番号４１）
ＧＧＣＧＣＡＴＧＴＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧＧ（配列番号４２）
ＧＧＧＡＧＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＣＣＣＴＣ（配列番号４３）
ＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＧＴＣＴＴＣ（配列番号４４）
ＧＧＧＴＣＴＴＣＡＧＧＴＴＣＴＣＣＣＣＣ（配列番号４５）
ＧＧＴＣＴＴＣＡＧＧＴＴＣＴＣＣＣＣＣＡ（配列番号４６）
が挙げられる。
【０１１２】
ヒトＩＬ−１０におけるＧ１１３Ｒアミノ酸突然変異を標的にする例示的なガイドＲＮＡ配列は、
ＧＡＡＣＣＡＡＧＡＣＣＣＡＧＡＣＡＵＣＡ（配列番号４７）
ＣＡＡＧＧＣＧＣＡＵＧＵＧＡＡＣＵＣＣＣ（配列番号４８）
ＡＡＧＧＣＧＣＡＵＧＵＧＡＡＣＵＣＣＣＵ（配列番号４９）
ＡＧＧＣＧＣＡＵＧＵＧＡＡＣＵＣＣＣＵＧ（配列番号５０）
ＧＧＣＧＣＡＵＧＵＧＡＡＣＵＣＣＣＵＧＧ（配列番号５１）
ＧＧＧＡＧＡＡＣＣＵＧＡＡＧＡＣＣＣＵＣ（配列番号５２）
ＧＣＣＵＣＡＧＣＣＵＧＡＧＧＧＵＣＵＵＣ（配列番号５３）
ＧＧＧＵＣＵＵＣＡＧＧＵＵＣＵＣＣＣＣＣ（配列番号５４）
ＧＧＵＣＵＵＣＡＧＧＵＵＣＵＣＣＣＣＣＡ（配列番号５５）
を含む。
【０１１３】
実施例２：編集のために遺伝子突然変異を選択する機械学習手法
どの遺伝子またはバリアントを編集するべきかを決定するために、機械学習技術を使用して遺伝子突然変異に基づく表現型を発症する確率を説明する。そのような技術としては、例えば線形回帰モデル、ロジスティック回帰モデル、遺伝子もしくは遺伝子バリアント相互作用を含む非線形回帰モデル、多すぎる可能な遺伝子または少なすぎる患者データにより劣決定されるかノイズが多い場合に主成分分析または回帰問題に対する制約を多くするために制約関数を用いる回帰モデルが挙げられる。回帰パラメータに対する制約関数は、リッジ回帰で使用されるＬ２正則化またはラッソ回帰で使用されるＬ１正則化を含むことができる。独立した遺伝子変数を論理的または数学的に組み合わせて線形モデルで使用される新しい変数を作り出すことにより、回帰パラメータにおいてモデル線形をなお維持しながら当該遺伝子の中での非線形相互作用を捉えることができる。非線形相互作用は、ディープラーニングニューラルネットワークまたはサポートベクターマシンを含むニューラルネットワークなどのパラメータにおいて非線形であるモデルを用いて捉えることもできる。これらの方法のいくつかは、例えばＲａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２２：５４１−５４９（２００６）に記載されている。線形モデルにとって特に単純な回帰パラメータの大きさを見ること、あるいは異なるデータをシミュレートし、かつそれを非線形モデルに与えることにより、疾患表現型または疾患表現型のリスクに対して最も大きい影響を有する遺伝子または遺伝子突然変異を決定する。どのバリアントが疾患に関連しているかを同定するための他の技術としては、遺伝子機能および遺伝子シグナル伝達経路データを使用して、ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）から表現型を引き起こす可能性が最も高いリスク遺伝子座の近くの遺伝子を同定するツールが挙げられる。例えば、Ｐｅｒｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，６，論文５８９０（９頁）（２０１５）を参照されたい。
【０１１４】
既に言及した参考文献に加えて、以下の参考文献：Ｓａｎｄｓ，Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓ．，２３（１）：９７−１０６（２０１７）；Ｊｉｎｅｋ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７：８１６−８２１（２０１２）；Ｓａｌｅｒｎｏ，ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５（１２）：ｅ１２４０８５７−１−ｅ１２４０８５７−１４（２０１６）；Ｓｉｖａｎｅｓａｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２９１：８６７３−８５（２０１６）；Ｐｉｄａｓｈｅｖａ，ＰＬＯＳ  ＯＮＥ，６（１０）：ｅ２５０３８（２０１１）；ＳＮＰｅｄｉａ，ｒｓ１１２０９０２６；ＵＳ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｄｐＳＮＰ：ｒｓ１１２０９０２６；Ｄｕｅｒｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１４（５８０４）：１４６１−６３（２００６）；Ｈａｚｌｅｔｔ，Ｇｅｎｅｓ＆Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１３：２８２−８７（２０１２）；Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，論文ＩＤ５３９４６１（１２頁）（２０１０）；Ｍｕ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，１５５：１９１−２０２（２０１８）；Ａｎｇｅｒｍａｎｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，９：２８３−８９（２０１２）；Ｇｏｎｇ，Ｊ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ，１４：２０１７０３２０（１３頁）（２０１７）；Ｌｕ，Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ，１５（６）：５６５−７２（２０１４）；Ｂａｓｓａｇａｎｙａ−Ｒｉｅｒａ，Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，２５（３）：４５４−６５（２００６）も有名である。
【手続補正書】
【提出日】令和3年1月26日(2021.1.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021523943000001.app
【国際調査報告】
2021523943.tif 000003
2021523943.tif 000004
2021523943.tif 000005