(57)【要約】本明細書では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を生成するための改善された方法が提供される。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子を生成する方法は、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤の存在下で、ｒＡＡＶ粒子を生成可能な細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子を生成する方法は、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤と増加した量のナトリウム塩との存在下で、ｒＡＡＶ粒子を生成可能な細胞を培養することを含む。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｒＡＡＶ粒子を生成する方法であって、
（ａ）細胞を含む細胞培養物を準備することと、
（ｂ）前記細胞に、以下：
ｉ．パッケージング対象のｒＡＡＶゲノム、
ｉｉ．パッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能、
ｉｉｉ．パッケージングするのに十分なＡＡＶ  ｒｅｐタンパク質、及び
ｉｖ．パッケージングするのに十分なＡＡＶ  ｃａｐタンパク質
のうちの少なくとも１つをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを導入することと、
（ｃ）前記細胞培養物に、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間の最終濃度までＨＤＡＣ阻害剤を添加することと、
（ｄ）（ｂ）の後に約２日から約１５日の間にわたり、前記ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下で前記細胞培養物を維持することと
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記ＨＤＡＣ阻害剤が、短鎖脂肪酸またはその塩である、請求項２に記載の方法。
【請求項３】
前記ＨＤＡＣ阻害剤が、バルプロ酸、プロピオン酸、酪酸、またはこれらの塩である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＨＤＡＣ阻害剤がバルプロ酸ナトリウムである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＨＤＡＣ阻害剤がプロピオン酸ナトリウムである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞培養物が、約０．５ｍＭから約５ｍＭの間の最終ＨＤＡＣ阻害剤濃度を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞培養物が、約０．５ｍＭから約３ｍＭの間の最終ＨＤＡＣ阻害剤濃度を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＨＤＡＣ阻害剤がステップｂ）の後に添加される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＨＤＡＣ阻害剤が、ステップｂ）の約１時間後から約４８時間後に添加される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＨＤＡＣ阻害剤が、ステップｂ）の約１２時間後から約３６時間後に添加される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＨＤＡＣ阻害剤が、ステップｂ）の約１８時間後から約３０時間後に添加される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＨＤＡＣ阻害剤が、ステップｂ）の約４８時間後より前に添加される、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＨＤＡＣ阻害剤が、ステップｂ）の約３６時間後より前に添加される、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＨＤＡＣ阻害剤が、ステップｂ）の少なくとも約６時間後に添加される、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＨＤＡＣ阻害剤が、ステップｂ）の少なくとも約１２時間後に添加される、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＨＤＡＣ阻害剤が、ステップｂ）の約６時間後、約９時間後、約１２時間後、約１８時間後、約２０時間後、約２４時間後、約３０時間後、約３６時間後、または約４８時間後に添加される、請求項８に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＨＤＡＣ阻害剤が、ステップｂ）の約２０時間後に添加される、請求項８に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＨＤＡＣ阻害剤が、ステップｂ）の約２４時間後に添加される、請求項８に記載の方法。
【請求項１９】
前記培養物に、ナトリウム塩の最終濃度を約２０ｍＭから約１５０ｍＭの間だけ増加させるのに十分な量の前記ナトリウム塩を添加することをさらに含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ナトリウム塩の最終濃度が、約２０ｍＭから約５０ｍＭの間、約４０ｍＭから約８０ｍＭの間、または約７０ｍＭから約１２０ｍＭの間だけ増加する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ナトリウム塩の最終濃度が、約４０ｍＭから約１４０ｍＭの間だけ増加する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記培養物に、ナトリウム塩の最終濃度を約１２０ｍＭから約２５０ｍＭの間まで増加させるのに十分な量の前記ナトリウム塩を添加することをさらに含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ナトリウム塩の最終濃度が、約１３０ｍＭから約１６０ｍＭの間、約１５０ｍＭから約１９０ｍＭの間、または約１８０ｍＭから約２４０ｍＭの間である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ナトリウム塩の最終濃度が、約１５０ｍＭから約２４０ｍＭの間である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記ナトリウム塩を添加する前に、前記細胞培養物が約９０ｍＭから約１２０ｍＭの間のＮａＣｌを含んでいる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記ナトリウム塩が塩化ナトリウムである、請求項１９〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＨＤＡＣ阻害剤及び前記ナトリウム塩が、任意の順序で別々に添加される、請求項１９〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ナトリウム塩がｂ）の前に添加される、請求項１９〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ナトリウム塩がｂ）の後に添加される、請求項１９〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ナトリウム塩が、前記ＨＤＡＣ阻害剤を添加した後に添加される、請求項１９〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ナトリウム塩が、前記ＨＤＡＣ阻害剤を添加してから約５分後から約６時間後に添加される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ナトリウム塩が、前記ＨＤＡＣ阻害剤を添加してから約２０分後から約２時間後に添加される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記ナトリウム塩が、前記ＨＤＡＣ阻害剤を添加してから約２時間後より前に添加される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記ナトリウム塩が、前記ＨＤＡＣ阻害剤を添加してから約１時間後より前に添加される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記ナトリウム塩が、前記ＨＤＡＣ阻害剤を添加してから少なくとも約５分後に添加される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記ナトリウム塩が、前記ＨＤＡＣ阻害剤を添加してから少なくとも約２０分後に添加される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞培養物が、ｂ）の後に約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、または約７日間維持される、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞培養物が、ｂ）の後に約５日間維持される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞に、以下：
ｉ．パッケージング対象のｒＡＡＶゲノム、
ｉｉ．パッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能、
ｉｉｉ．パッケージングするのに十分なＡＡＶ  ｒｅｐタンパク質、及び
ｉｖ．パッケージングするのに十分なＡＡＶ  ｃａｐタンパク質
をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを導入することを含む、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記アデノウイルスヘルパー機能が、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子のうちの少なくとも１つを含む、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記１つ以上のポリヌクレオチドを前記細胞に導入することが、形質移入により行われる、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞が哺乳類細胞である、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞が昆虫細胞である、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ由来細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ由来細胞、ＨｅＬａ細胞、ＳＦ−９細胞、ＢＨＫ細胞、ベロ細胞、またはＰｅｒＣ６細胞である、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞がＨＥＫ２９３細胞である、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞培養物が浮遊培養物である、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記ｒＡＡＶ粒子を回収することをさらに含む、請求項１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記細胞培養物が、５×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌを超えるｒＡＡＶ粒子を生成する、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞培養物が、前記ＨＤＡＣ阻害剤及びナトリウム塩を添加しない培養物よりも、ＧＣ／ｍｌとしての測定で少なくとも約２倍多いｒＡＡＶ粒子を生成する、請求項１〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞培養物が、約５０リットルから約２０，０００リットルの間の体積を有する、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
ｒＡＡＶ粒子を生成するための方法であって、
（ａ）ｒＡＡＶを生成可能な細胞を含む細胞培養物を準備することと、
（ｂ）前記細胞培養物に、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間の最終濃度までＨＤＡＣ阻害剤を添加することと、
（ｃ）前記ｒＡＡＶ粒子の生成が可能な条件下で前記細胞培養物を維持することと
を含む、前記方法。
【請求項５２】
前記ＨＤＡＣ阻害剤が、短鎖脂肪酸またはその塩である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＨＤＡＣ阻害剤が、バルプロ酸、プロピオン酸、酪酸、またはこれらの塩である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＨＤＡＣ阻害剤がプロピオン酸ナトリウムである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＨＤＡＣ阻害剤がバルプロ酸ナトリウムである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記細胞培養物が、約０．５ｍＭから約５ｍＭの間の最終ＨＤＡＣ阻害剤濃度を有する、請求項５１〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記細胞培養物が、約０．５ｍＭから約３ｍＭの間の最終ＨＤＡＣ阻害剤濃度を有する、請求項５１〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記培養物に、ナトリウム塩の最終濃度を約２０ｍＭから１５０ｍＭの間だけ増加させるのに十分な量の前記ナトリウム塩を添加することをさらに含む、請求項５１〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記ナトリウム塩の最終濃度が、約２０ｍＭから約５０ｍＭの間、約４０ｍＭから約８０ｍＭの間、または約７０ｍＭから約１２０ｍＭの間だけ増加する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記ナトリウム塩の最終濃度が、約４０ｍＭから約１４０ｍＭの間だけ増加する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記培養物に、ナトリウム塩の最終濃度を約１２０ｍＭから約２５０ｍＭの間まで増加させるのに十分な量の前記ナトリウム塩を添加することをさらに含む、請求項５１〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記ナトリウム塩の最終濃度が、約１３０ｍＭから約１６０ｍＭの間、約１５０ｍＭから約１９０ｍＭの間、または約１８０ｍＭから約２４０ｍＭの間である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ナトリウム塩の最終濃度が、約１５０ｍＭから約２４０ｍＭの間である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記ナトリウム塩を添加する前に、前記細胞培養物が約９０ｍＭから約１２０ｍＭの間のＮａＣｌを含んでいる、請求項５１〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記ナトリウム塩が塩化ナトリウムである、請求項５１〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＨＤＡＣ阻害剤及び前記ナトリウム塩が、任意の順序で別々に添加される、請求項５１〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記ナトリウム塩が、前記ＨＤＡＣ阻害剤を添加した後に添加される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記ナトリウム塩が、前記ＨＤＡＣ阻害剤を添加してから約５分後から約６時間後に添加される、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記ナトリウム塩が、前記ＨＤＡＣ阻害剤を添加してから約２０分後から約２時間後に添加される、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記ナトリウム塩が、前記ＨＤＡＣ阻害剤を添加してから約２時間後より前に添加される、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
前記ナトリウム塩が、前記ＨＤＡＣ阻害剤を添加してから約１時間後より前に添加される、請求項６７に記載の方法。
【請求項７２】
前記ナトリウム塩が、前記ＨＤＡＣ阻害剤を添加してから少なくとも約５分後に添加される、請求項６７に記載の方法。
【請求項７３】
前記ナトリウム塩が、前記ＨＤＡＣ阻害剤を添加してから少なくとも約２０分後に添加される、請求項６７に記載の方法。
【請求項７４】
前記細胞培養物が、ｂ）の後に約２日から約１０日の間にわたりまたは約５日から１４日の間にわたり、前記ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下で維持される、請求項５１〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記細胞培養物が、ｂ）の後に約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、または約７日間維持される、請求項５１〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記細胞培養物が、ｂ）の後に約５日間維持される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
ｒＡＡＶ粒子を生成するための方法であって、ｒＡＡＶ粒子を生成可能な細胞を、前記ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＨＤＡＣ阻害剤を含む培地中で培養することを含む、前記方法。
【請求項７８】
前記ＨＤＡＣ阻害剤が、短鎖脂肪酸またはその塩である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記ＨＤＡＣ阻害剤が、バルプロ酸、プロピオン酸、酪酸、またはこれらの塩である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記ＨＤＡＣ阻害剤がバルプロ酸ナトリウムである、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記ＨＤＡＣ阻害剤がプロピオン酸ナトリウムである、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
前記培地が、約０．５ｍＭから約５ｍＭの間の前記ＨＤＡＣ阻害剤を含む、請求項７７〜８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
前記培地が、約０．５ｍＭから約３ｍＭの間の前記ＨＤＡＣ阻害剤を含む、請求項７７〜８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記培地が、約１２０ｍＭから約２５０ｍＭの間の塩化ナトリウムをさらに含む、請求項７７〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
前記培地が、約１３０ｍＭから約１６０ｍＭの間、約１５０ｍＭから約１９０ｍＭの間、または約１８０ｍＭから約２４０ｍＭの間のＮａＣｌ塩化ナトリウムをさらに含む、請求項７７〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
前記培地が、約１５０ｍＭから約２４０ｍＭの間の塩化ナトリウムをさらに含む、請求項７７〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
ｒＡＡＶを生成可能な前記細胞に、以下：
（ａ）パッケージング対象のｒＡＡＶゲノム、
（ｂ）パッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能、
（ｃ）パッケージングするのに十分なＡＡＶ  ｒｅｐタンパク質、及び
（ｄ）パッケージングするのに十分なＡＡＶ  ｃａｐタンパク質
のうちの少なくとも１つをコードする１つ以上のポリヌクレオチドが形質移入されている、請求項５１〜８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
ｒＡＡＶを生成可能な前記細胞に、以下：
（ａ）パッケージング対象のｒＡＡＶゲノム、
（ｂ）パッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能、
（ｃ）パッケージングするのに十分なＡＡＶ  ｒｅｐタンパク質、及び
（ｄ）パッケージングするのに十分なＡＡＶ  ｃａｐタンパク質
をコードする１つ以上のポリヌクレオチドが形質移入されている、請求項５１〜８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
前記細胞が、哺乳類細胞または昆虫細胞である、請求項５１〜８８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９０】
前記細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＳＦ−９細胞、ＢＨＫ細胞、ベロ細胞、またはＰｅｒＣ６細胞であり、任意選択で、前記細胞がＨＥＫ２９３細胞である、請求項５１〜８８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９１】
前記細胞培養物が浮遊培養物である、請求項５１〜９０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９２】
前記ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下での前記培養することが、約２日から約１０日の間にわたりまたは約５日から１４日の間にわたり行われる、請求項７７〜９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９３】
前記ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下での前記培養することが、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、または約７日間行われる、請求項７７〜９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９４】
前記ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下での前記培養することが約５日間行われる、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記ｒＡＡＶ粒子を回収することをさらに含む、請求項５１〜９４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９６】
前記細胞培養物が、約５×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌから約１×１０ｅ＋１２ＧＣ／ｍｌの間のｒＡＡＶ粒子を生成する、請求項５１〜９５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９７】
前記細胞培養物が、前記ＨＤＡＣ阻害剤及びナトリウム塩を添加しない培養物よりも、ＧＣ／ｍｌとしての測定で少なくとも約２倍多いｒＡＡＶ粒子を生成する、請求項５１〜９６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９８】
ｒＡＡＶ粒子の生成を増加させる方法であって
（ａ）細胞を含む細胞培養物を準備することと、
（ｂ）前記細胞に、以下：
ｉ．パッケージング対象のｒＡＡＶゲノム、
ｉｉ．パッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能、
ｉｉｉ．パッケージングするのに十分なＡＡＶ  ｒｅｐタンパク質、及び
ｉｖ．パッケージングするのに十分なＡＡＶ  ｃａｐタンパク質
のうちの少なくとも１つをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを導入することと、
（ｃ）前記細胞培養物に、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間の最終濃度までＨＤＡＣ阻害剤を添加することと、
（ｄ）（ｂ）の後に約２日から約１５日の間にわたり、前記ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下で前記細胞培養物を維持することと
を含む、前記方法。
【請求項９９】
前記ＨＤＡＣ阻害剤がバルプロ酸ナトリウムである、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記ＨＤＡＣ阻害剤がプロピオン酸ナトリウムである、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０１】
前記培養物に、ナトリウム塩の最終濃度を約４０ｍＭから約１５０ｍＭの間だけ増加させるのに十分な量の前記ナトリウム塩を添加することをさらに含む、請求項９８〜１００のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記ナトリウム塩が塩化ナトリウムである、請求項９８〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０３】
ｒＡＡＶ粒子の生成を増加させる方法であって
（ａ）ｒＡＡＶを生成可能な細胞を含む細胞培養物を準備することと、
（ｂ）前記細胞培養物に、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間の最終濃度までＨＤＡＣ阻害剤を添加することと、
（ｃ）前記ｒＡＡＶ粒子の生成が可能な条件下で前記細胞培養物を維持することと
を含む、前記方法。
【請求項１０４】
前記ＨＤＡＣ阻害剤がバルプロ酸ナトリウムである、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記ＨＤＡＣ阻害剤がプロピオン酸ナトリウムである、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０６】
前記培養物に、ナトリウム塩の最終濃度を約１２０ｍＭから約２５０ｍＭの間まで増加させるのに十分な量の前記ナトリウム塩を添加することをさらに含む、請求項１０３〜１０５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記ナトリウム塩が塩化ナトリウムである、請求項１０３〜１０６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記細胞培養物が、ｂ）の後に約２日から約１０日の間にわたりまたは約５日から１４日の間にわたり、前記ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下で維持される、請求項１０３〜１０７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記細胞培養物が、ｂ）の後に約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、または約７日間維持される、請求項１０３〜１０７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記細胞培養物が、ｂ）の後に約５日間維持される、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
ｒＡＡＶ粒子の生成を増加させる方法であって、ｒＡＡＶ粒子を生成可能な細胞を、前記ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＨＤＡＣ阻害剤を含む培地中で培養することを含む、前記方法。
【請求項１１２】
前記ＨＤＡＣ阻害剤がバルプロ酸ナトリウムである、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記ＨＤＡＣ阻害剤がプロピオン酸ナトリウムである、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１４】
前記培地が、約１２０ｍＭから約２５０ｍＭの間の塩化ナトリウムをさらに含む、請求項１１１〜１１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６血清型のカプシドタンパク質を含む、請求項１〜１１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、またはＡＡＶ．ｈｕ３７血清型のカプシドタンパク質を含む、請求項１〜１１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含む、請求項１〜１１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記細胞培養物が、約５０リットルから約２０，０００リットルの間の体積を有する、請求項１〜１１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１９】
前記細胞培養物が、約５０リットルから約５，０００リットルの間の体積を有する、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記細胞培養物が、約５０リットルから約２，０００リットルの間の体積を有する、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２１】
前記細胞培養物が、約５０リットルから約１，０００リットルの間の体積を有する、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２２】
前記細胞培養物が、約５０リットルから約５００リットルの間の体積を有する、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２３】
請求項１〜１２２のいずれか１項に記載の方法によって生成された、単離されたｒＡＡＶ粒子を含む、組成物。
【請求項１２４】
前記パッケージングされたｒＡＡＶゲノムが導入遺伝子を含む、請求項１〜５０または９８〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２５】
前記導入遺伝子が、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作用可能に接続した調節エレメントを含む、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
前記調節エレメントが、エンハンサー、プロモーター、及びポリＡ領域のうちの１つ以上を含む、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
前記調節エレメントと、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとが、異種である、請求項１２５または請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
前記導入遺伝子が、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ、イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）、イズロン酸２−スルファターゼ（ＩＤＳ）、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）、またはＶＥＧＦ受容体１（ｓＦｌｔ−１）の非膜結合型スプライスバリアントをコードする、請求項１２４〜１２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２９】
前記導入遺伝子が、ガンマ−サルコグリカン、Ｒａｂエスコートタンパク質１（ＲＥＰ１／ＣＨＭ）、レチノイドイソメロヒドロラーゼ（ＲＰＥ６５）、環状ヌクレオチドゲートチャネルアルファ３（ＣＮＧＡ３）、環状ヌクレオチドゲートチャネルベータ３（ＣＮＧＢ３）、芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、リソソーム関連膜タンパク質２アイソフォームＢ（ＬＡＭＰ２Ｂ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、網膜色素変性ＧＴＰアーゼ制御因子（ＲＰＧＲ）、レチノスキシン（ＲＳ１）、筋小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ２ａ）、アフリベルセプト、バッテニン（ＣＬＮ３）、膜貫通ＥＲタンパク質（ＣＬＮ６）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、アクアポリン１（ＡＱＰ１）、ジストロフィン、ミオチューブラリン１（ＭＴＭ１）、フォリスタチン（ＦＳＴ）、グルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ６Ｐアーゼ）、アポリポタンパク質Ａ２（ＡＰＯＡ２）、ウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼ１Ａ１（ＵＧＴ１Ａ１）、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、Ｎ−アセチル−アルファ−グルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、アルファ−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、アルファ−ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）、ベータ−ガラクトシダーゼ（ＧＬＢ１）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、アルファ１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、ホスホジエステラーゼ６Ｂ（ＰＤＥ６Ｂ）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ９ＯＴＣ）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ１）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ２）、ニュールツリン（ＮＲＴＮ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３／ＮＴＦ３）、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ（ＰＢＧＤ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ミトコンドリアコードＮＡＤＨ：ユビキノンオキシドレダクターゼコアサブユニット４（ＭＴ−ＮＤ４）、保護タンパク質カテプシンＡ（ＰＰＣＡ）、ジスフェリン、ＭＥＲがん原遺伝子チロシンキナーゼ（ＭＥＲＴＫ）、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）、または腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）−免疫グロブリン（ＩｇＧ１）Ｆｃ融合体をコードする、請求項１２４〜１２７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年８月１０日出願の米国仮出願第６２／７１７，２１２号の優先権を主張し、当該出願の全体は本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベースベクターは、現在最も広く使用されている開発中の遺伝子療法製品である。ｒＡＡＶベクター系の使用が好まれる理由は、部分的には、野生型ウイルスに関連する疾患がないこと、ＡＡＶの形質導入が非分裂細胞にも分裂細胞にも可能であること、及び臨床試験で結果的に長期のロバストな導入遺伝子発現が観察されていることによるものであり、このことは、遺伝子療法の適応症における送達の大きな可能性を示している。加えて、種々の天然ＡＡＶ及び組換えＡＡＶベクター血清型は、種々の組織、器官、及び細胞を特異的に標的化し、ベクターに対する任意の既存の免疫を回避するのに役立ち、そのためＡＡＶベース遺伝子療法の治療応用を拡大する。
【０００３】
ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤は、組換え動物細胞培養でタンパク質を発現させるための形質移入プロトコルで使用されている。例えば、Ｖａｚｑｕｅｚ−Ｌｏｍｂａｒｄｉは、ＩｇＧを発現するプラスミドと共に同時形質移入試薬としてのＨＤＡＣ阻害剤（「エンハンサー１及び２」）を使用することを例示し、加えて、２日目にエンハンサーを培養物に添加した（Ｖａｚｑｕｅｚ−Ｌｏｍｂａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，１３（１）：９９−１１７（２０１８）（非特許文献1）、２０１７年１２月１４日にオンライン公開）。ＷＯ２０１３１６６３３９Ａ１では、エンハンサー１（バルプロ酸）及びエンハンサー２（プロピオン酸ナトリウム）を５０Ｌ未満の小規模培養条件で使用することが説明されており、エンハンサー２は単独では強い効果を有しないが、エンハンサー１と組み合わせると組換えＩｇＧ生成に利益をもたらし得ることが観察されている。Ｃｈｕｎは、プロピオン酸及び酪酸を使用することでＣＨＯ細胞による組換えＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子の生成が促進され、ただし両方のアルカン酸が細胞成長を阻害し、ｒＦＶＩＩＩ生成は約３．５日で最大となったことを報告している（Ｃｈｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２５：３１５−３１９（２００３）（非特許文献2））。Ｃｅｒｖｅｒａは、ＨＥＫ２９３浮遊細胞培養で単一の組換えポリペプチドを含むウイルス様粒子（例えば、Ｇａｇ様ウイルス様粒子）の生成を増加させるためにトランスフェクションエンハンサーの混合物を使用することについて報告している（Ｃｅｒｖｅｒａ  ｅｔ  ａｌ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，９９：９９３５−９９４９（２０１５）（非特許文献3））。しかしながら、これらの報告はいずれも、ゲノムをカプシド形成するウイルス粒子の組換え生成（例えば、培養細胞が複数のポリペプチド及びヌクレオチドゲノムを含むｒＡＡＶ粒子を発現させる）を増加させるためのヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤の使用については開示していない。
【０００４】
Ｔｉｅｒｎａｎ及びＴｉｐｐｅｒは、ｒＡＡＶ導入遺伝子を含む安定した細胞株を産生するための方法におけるＨＤＡＣ阻害剤トリコスタチンＡの使用について開示している（ＷＯ２０１８／１７５７７５（特許文献1））。Ｔｉｅｒｎａｎ及びＴｉｐｐｅｒは、組換えウイルスベクター及びＨＤＡＣ阻害剤の同時トランスフェクションを含む方法が、ウイルスベクターの宿主細胞ゲノムへの組み込みを強化し、宿主細胞から収集されるウイルスベクターの収量を増加させ得ることについて開示している。Ｔｉｅｒｎａｎ及びＴｉｐｐｅｒは、ｒＡＡＶ粒子の生成で安定した細胞株を使用することについて開示しているが、ｒＡＡＶ粒子の生成培養物でＨＤＡＣ阻害剤を使用することについては教示も示唆もしていない。
【０００５】
ＡＡＶベース遺伝子療法を後期臨床段階及び商業的使用により広く採用できるようになる前には、ＧＭＰに準拠して大規模にｒＡＡＶ粒子を生成するための新たな方法を開発する必要がある。上流処理の開発における主な課題は、ｒＡＡＶを生成するためのスケーラブルかつコスト効果的なＧＭＰに準拠した方法を確立することである。１つの単位用量のｒＡＡＶ粒子を製造するには、現在承認されている方法を使用すると、数十万ドルのコストがかかり得る。したがって、ｒＡＡＶ粒子を生成するためのＧＭＰに準拠したスケーラブルな処理が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２０１８／１７５７７５
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｖａｚｑｕｅｚ−Ｌｏｍｂａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，１３（１）：９９−１１７（２０１８）
【非特許文献２】Ｃｈｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２５：３１５−３１９（２００３）
【非特許文献３】Ｃｅｒｖｅｒａ  ｅｔ  ａｌ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，９９：９９３５−９９４９（２０１５）
【発明の概要】
【０００８】
本開示は、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子を生成する方法であって、ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下、有効量のヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤の存在下でｒＡＡＶ粒子を生成可能な細胞を培養することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、細胞は、ＨＤＡＣ阻害剤及び約１１０ｍＭから２５０ｍＭの間の濃度のナトリウム塩の存在下で培養される。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、本明細書で開示される方法に従って生成されたｒＡＡＶ粒子を単離することを包含する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、細胞培養物の収集、（例えば、遠心分離もしくは深層濾過による）収集した細胞培養物の清澄化、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、無菌濾過、またはこれらの任意の組合せ（複数可）を包含する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、遠心分離を含まない。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、細胞培養物の収集、深層濾過による収集した細胞培養物の清澄化、第１の無菌濾過、第１のタンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー）、第２のタンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法に従って生成されたｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、深層濾過による収集した細胞培養物の清澄化、第１の無菌濾過、第１のタンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー）、第２のタンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、本開示は以下を提供する。
［１．］ｒＡＡＶ粒子を生成する方法であって、
（ａ）細胞を含む細胞培養物を準備することと、
（ｂ）前記細胞に、以下：
ｉ．パッケージング対象のｒＡＡＶゲノム、
ｉｉ．パッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能、
ｉｉｉ．パッケージングするのに十分なＡＡＶ  ｒｅｐタンパク質、及び
ｉｖ．パッケージングするのに十分なＡＡＶ  ｃａｐタンパク質
のうちの少なくとも１つをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを導入することと、
（ｃ）前記細胞培養物に、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間の最終濃度までＨＤＡＣ阻害剤を添加することと、
（ｄ）（ｂ）の後に約２日から約１５日の間にわたり、前記ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下で前記細胞培養物を維持することと
を含む、前記方法。
［２．］前記ＨＤＡＣ阻害剤が、短鎖脂肪酸またはその塩である、［２］に記載の方法。
［３．］前記ＨＤＡＣ阻害剤が、バルプロ酸、プロピオン酸、酪酸、またはこれらの塩である、［１］または［２］に記載の方法。
［４．］前記ＨＤＡＣ阻害剤がバルプロ酸ナトリウムである、［３］に記載の方法。
［５．］前記ＨＤＡＣ阻害剤がプロピオン酸ナトリウムである、［３］に記載の方法。
［６．］前記細胞培養物が、約０．５ｍＭから約５ｍＭの間の最終ＨＤＡＣ阻害剤濃度を有する、［１］〜［５］のいずれか１つに記載の方法。
［７．］前記細胞培養物が、約０．５ｍＭから約３ｍＭの間の最終ＨＤＡＣ阻害剤濃度を有する、［１］〜［５］のいずれか１つに記載の方法。
［８．］前記ＨＤＡＣ阻害剤がステップｂ）の後に添加される、［１］〜［７］のいずれか１つに記載の方法。
［９．］前記ＨＤＡＣ阻害剤が、ステップｂ）の約１時間後から約４８時間後に添加される、［８］に記載の方法。
［１０．］前記ＨＤＡＣ阻害剤が、ステップｂ）の約１２時間後から約３６時間後に添加される、［８］に記載の方法。
［１１．］前記ＨＤＡＣ阻害剤が、ステップｂ）の約１８時間後から約３０時間後に添加される、［８］に記載の方法。
［１２．］前記ＨＤＡＣ阻害剤が、ステップｂ）の約４８時間後より前に添加される、［８］に記載の方法。
［１３．］前記ＨＤＡＣ阻害剤が、ステップｂ）の約３６時間後より前に添加される、［８］に記載の方法。
［１４．］前記ＨＤＡＣ阻害剤が、ステップｂ）の少なくとも約６時間後に添加される、［８］に記載の方法。
［１５．］前記ＨＤＡＣ阻害剤が、ステップｂ）の少なくとも約１２時間後に添加される、［８］に記載の方法。
［１６．］前記ＨＤＡＣ阻害剤が、ステップｂ）の約６時間後、約９時間後、約１２時間後、約１８時間後、約２０時間後、約２４時間後、約３０時間後、約３６時間後、または約４８時間後に添加される、［８］に記載の方法。
［１７．］前記ＨＤＡＣ阻害剤が、ステップｂ）の約２０時間後に添加される、［８］に記載の方法。
［１８．］前記ＨＤＡＣ阻害剤が、ステップｂ）の約２４時間後に添加される、［８］に記載の方法。
［１９．］前記培養物に、ナトリウム塩の最終濃度を約２０ｍＭから約１５０ｍＭの間だけ増加させるのに十分な量の前記ナトリウム塩を添加することをさらに含む、［１］〜［１８］のいずれか１つに記載の方法。
［２０．］前記ナトリウム塩の最終濃度が、約２０ｍＭから約５０ｍＭの間、約４０ｍＭから約８０ｍＭの間、または約７０ｍＭから約１２０ｍＭの間だけ増加する、［１９］に記載の方法。
［２１．］前記ナトリウム塩の最終濃度が、約４０ｍＭから約１４０ｍＭの間だけ増加する、［１９］に記載の方法。
［２２．］前記培養物に、ナトリウム塩の最終濃度を約１２０ｍＭから約２５０ｍＭの間まで増加させるのに十分な量の前記ナトリウム塩を添加することをさらに含む、［１］〜［２１］のいずれか１つに記載の方法。
［２３．］前記ナトリウム塩の最終濃度が、約１３０ｍＭから約１６０ｍＭの間、約１５０ｍＭから約１９０ｍＭの間、または約１８０ｍＭから約２４０ｍＭの間である、［２２］に記載の方法。
［２４．］前記ナトリウム塩の最終濃度が、約１５０ｍＭから約２４０ｍＭの間である、［２２］に記載の方法。
［２５．］前記ナトリウム塩を添加する前に、前記細胞培養物が約９０ｍＭから約１２０ｍＭの間のＮａＣｌを含んでいる、［２２］に記載の方法。
［２６．］前記ナトリウム塩が塩化ナトリウムである、［１９］〜［２５］のいずれか１つに記載の方法。
［２７．］前記ＨＤＡＣ阻害剤及び前記ナトリウム塩が、任意の順序で別々に添加される、［１９］〜［２６］のいずれか１つに記載の方法。
［２８．］前記ナトリウム塩がｂ）の前に添加される、［１９］〜［２７］のいずれか１つに記載の方法。
［２９．］前記ナトリウム塩がｂ）の後に添加される、［１９］〜［２７］のいずれか１つに記載の方法。
［３０．］前記ナトリウム塩が、前記ＨＤＡＣ阻害剤を添加した後に添加される、［１９］〜［２９］のいずれか１つに記載の方法。
［３１．］前記ナトリウム塩が、前記ＨＤＡＣ阻害剤を添加してから約５分後から約６時間後に添加される、［３０］に記載の方法。
［３２．］前記ナトリウム塩が、前記ＨＤＡＣ阻害剤を添加してから約２０分後から約２時間後に添加される、［３０］に記載の方法。
［３３．］前記ナトリウム塩が、前記ＨＤＡＣ阻害剤を添加してから約２時間後より前に添加される、［３０］に記載の方法。
［３４．］前記ナトリウム塩が、前記ＨＤＡＣ阻害剤を添加してから約１時間後より前に添加される、［３０］に記載の方法。
［３５．］前記ナトリウム塩が、前記ＨＤＡＣ阻害剤を添加してから少なくとも約５分後に添加される、［３０］に記載の方法。
［３６．］前記ナトリウム塩が、前記ＨＤＡＣ阻害剤を添加してから少なくとも約２０分後に添加される、［３０］に記載の方法。
［３７．］前記細胞培養物が、ｂ）の後に約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、または約７日間維持される、［１］〜［３６］のいずれか１つに記載の方法。
［３８．］前記細胞培養物が、ｂ）の後に約５日間維持される、［３７］に記載の方法。
［３９．］前記細胞に、以下：
ｉ．パッケージング対象のｒＡＡＶゲノム、
ｉｉ．パッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能、
ｉｉｉ．パッケージングするのに十分なＡＡＶ  ｒｅｐタンパク質、及び
ｉｖ．パッケージングするのに十分なＡＡＶ  ｃａｐタンパク質
をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを導入することを含む、［１］〜［３８］のいずれか１つに記載の方法。
［４０．］前記アデノウイルスヘルパー機能が、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子のうちの少なくとも１つを含む、［１］〜［３９］のいずれか１つに記載の方法。
［４１．］前記１つ以上のポリヌクレオチドを前記細胞に導入することが、形質移入により行われる、［１］〜［４０］のいずれか１つに記載の方法。
［４２．］前記細胞が哺乳類細胞である、［１］〜［４１］のいずれか１つに記載の方法。
［４３．］前記細胞が昆虫細胞である、［１］〜［４１］のいずれか１つに記載の方法。
［４４．］前記細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ由来細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ由来細胞、ＨｅＬａ細胞、ＳＦ−９細胞、ＢＨＫ細胞、ベロ細胞、またはＰｅｒＣ６細胞である、［１］〜［４１］のいずれか１つに記載の方法。
［４５．］前記細胞がＨＥＫ２９３細胞である、［１］〜［４１］のいずれか１つに記載の方法。
［４６．］前記細胞培養物が浮遊培養物である、［１］〜［４５］のいずれか１つに記載の方法。
［４７．］前記ｒＡＡＶ粒子を回収することをさらに含む、［１］〜［４６］のいずれか１つに記載の方法。
［４８．］前記細胞培養物が、５×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌを超えるｒＡＡＶ粒子を生成する、［１］〜［４７］のいずれか１つに記載の方法。
［４９．］前記細胞培養物が、前記ＨＤＡＣ阻害剤及びナトリウム塩を添加しない培養物よりも、ＧＣ／ｍｌとしての測定で少なくとも約２倍多いｒＡＡＶ粒子を生成する、［１］〜［４８］のいずれか１つに記載の方法。
［５０．］前記細胞培養物が、約５０リットルから約２０，０００リットルの間の体積を有する、［１］〜［４９］のいずれか１つに記載の方法。
［５１．］ｒＡＡＶ粒子を生成するための方法であって、
（ａ）ｒＡＡＶを生成可能な細胞を含む細胞培養物を準備することと、
（ｂ）前記細胞培養物に、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間の最終濃度までＨＤＡＣ阻害剤を添加することと、
（ｃ）前記ｒＡＡＶ粒子の生成が可能な条件下で前記細胞培養物を維持することと
を含む、前記方法。
［５２．］前記ＨＤＡＣ阻害剤が、短鎖脂肪酸またはその塩である、［５１］に記載の方法。
［５３．］前記ＨＤＡＣ阻害剤が、バルプロ酸、プロピオン酸、酪酸、またはこれらの塩である、［５２］に記載の方法。
［５４．］前記ＨＤＡＣ阻害剤がプロピオン酸ナトリウムである、［５３］に記載の方法。
［５５．］前記ＨＤＡＣ阻害剤がバルプロ酸ナトリウムである、［５３］に記載の方法。
［５６．］前記細胞培養物が、約０．５ｍＭから約５ｍＭの間の最終ＨＤＡＣ阻害剤濃度を有する、［５１］〜［５５］のいずれか１つに記載の方法。
［５７．］前記細胞培養物が、約０．５ｍＭから約３ｍＭの間の最終ＨＤＡＣ阻害剤濃度を有する、［５１］〜［５５］のいずれか１つに記載の方法。
［５８．］前記培養物に、ナトリウム塩の最終濃度を約２０ｍＭから１５０ｍＭの間だけ増加させるのに十分な量の前記ナトリウム塩を添加することをさらに含む、［５１］〜［５７］のいずれか１つに記載の方法。
［５９．］前記ナトリウム塩の最終濃度が、約２０ｍＭから約５０ｍＭの間、約４０ｍＭから約８０ｍＭの間、または約７０ｍＭから約１２０ｍＭの間だけ増加する、［５８］に記載の方法。
［６０．］前記ナトリウム塩の最終濃度が、約４０ｍＭから約１４０ｍＭの間だけ増加する、［５８］に記載の方法。
［６１．］前記培養物に、ナトリウム塩の最終濃度を約１２０ｍＭから約２５０ｍＭの間まで増加させるのに十分な量の前記ナトリウム塩を添加することをさらに含む、［５１］〜［６０］のいずれか１つに記載の方法。
［６２．］前記ナトリウム塩の最終濃度が、約１３０ｍＭから約１６０ｍＭの間、約１５０ｍＭから約１９０ｍＭの間、または約１８０ｍＭから約２４０ｍＭの間である、［６１］に記載の方法。
［６３．］前記ナトリウム塩の最終濃度が、約１５０ｍＭから約２４０ｍＭの間である、［６１］に記載の方法。
［６４．］前記ナトリウム塩を添加する前に、前記細胞培養物が約９０ｍＭから約１２０ｍＭの間のＮａＣｌを含んでいる、［５１］〜［６３］のいずれか１つに記載の方法。
［６５．］前記ナトリウム塩が塩化ナトリウムである、［５１］〜［６４］のいずれか１つに記載の方法。
［６６．］前記ＨＤＡＣ阻害剤及び前記ナトリウム塩が、任意の順序で別々に添加される、［５１］〜［６５］のいずれか１つに記載の方法。
［６７．］前記ナトリウム塩が、前記ＨＤＡＣ阻害剤を添加した後に添加される、［６６］に記載の方法。
［６８．］前記ナトリウム塩が、前記ＨＤＡＣ阻害剤を添加してから約５分後から約６時間後に添加される、［６７］に記載の方法。
［６９．］前記ナトリウム塩が、前記ＨＤＡＣ阻害剤を添加してから約２０分後から約２時間後に添加される、［６７］に記載の方法。
［７０．］前記ナトリウム塩が、前記ＨＤＡＣ阻害剤を添加してから約２時間後より前に添加される、［６７］に記載の方法。
［７１．］前記ナトリウム塩が、前記ＨＤＡＣ阻害剤を添加してから約１時間後より前に添加される、［６７］に記載の方法。
［７２．］前記ナトリウム塩が、前記ＨＤＡＣ阻害剤を添加してから少なくとも約５分後に添加される、［６７］に記載の方法。
［７３．］前記ナトリウム塩が、前記ＨＤＡＣ阻害剤を添加してから少なくとも約２０分後に添加される、［６７］に記載の方法。
［７４．］前記細胞培養物が、ｂ）の後に約２日から約１０日の間にわたりまたは約５日から１４日の間にわたり、前記ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下で維持される、［５１］〜［７３］のいずれか１つに記載の方法。
［７５．］前記細胞培養物が、ｂ）の後に約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、または約７日間維持される、［５１］〜［７３］のいずれか１つに記載の方法。
［７６．］前記細胞培養物が、ｂ）の後に約５日間維持される、［７５］に記載の方法。
［７７．］ｒＡＡＶ粒子を生成するための方法であって、ｒＡＡＶ粒子を生成可能な細胞を、前記ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＨＤＡＣ阻害剤を含む培地中で培養することを含む、前記方法。
［７８．］前記ＨＤＡＣ阻害剤が、短鎖脂肪酸またはその塩である、［７７］に記載の方法。
［７９．］前記ＨＤＡＣ阻害剤が、バルプロ酸、プロピオン酸、酪酸、またはこれらの塩である、［７８］に記載の方法。
［８０．］前記ＨＤＡＣ阻害剤がバルプロ酸ナトリウムである、［７９］に記載の方法。
［８１．］前記ＨＤＡＣ阻害剤がプロピオン酸ナトリウムである、［７９］に記載の方法。
［８２．］前記培地が、約０．５ｍＭから約５ｍＭの間の前記ＨＤＡＣ阻害剤を含む、［７７］〜［８１］のいずれか１つに記載の方法。
［８３．］前記培地が、約０．５ｍＭから約３ｍＭの間の前記ＨＤＡＣ阻害剤を含む、［７７］〜［８１］のいずれか１つに記載の方法。
［８４．］前記培地が、約１２０ｍＭから約２５０ｍＭの間の塩化ナトリウムをさらに含む、［７７］〜［８３］のいずれか１つに記載の方法。
［８５．］前記培地が、約１３０ｍＭから約１６０ｍＭの間、約１５０ｍＭから約１９０ｍＭの間、または約１８０ｍＭから約２４０ｍＭの間のＮａＣｌ塩化ナトリウムをさらに含む、［７７］〜［８３］のいずれか１つに記載の方法。
［８６．］前記培地が、約１５０ｍＭから約２４０ｍＭの間の塩化ナトリウムをさらに含む、［７７］〜［８３］のいずれか１つに記載の方法。
［８７．］ｒＡＡＶを生成可能な前記細胞に、以下：
（ａ）パッケージング対象のｒＡＡＶゲノム、
（ｂ）パッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能、
（ｃ）パッケージングするのに十分なＡＡＶ  ｒｅｐタンパク質、及び
（ｄ）パッケージングするのに十分なＡＡＶ  ｃａｐタンパク質
のうちの少なくとも１つをコードする１つ以上のポリヌクレオチドが形質移入されている、［５１］〜［８６］のいずれか１つに記載の方法。
［８８．］ｒＡＡＶを生成可能な前記細胞に、以下：
（ａ）パッケージング対象のｒＡＡＶゲノム、
（ｂ）パッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能、
（ｃ）パッケージングするのに十分なＡＡＶ  ｒｅｐタンパク質、及び
（ｄ）パッケージングするのに十分なＡＡＶ  ｃａｐタンパク質
をコードする１つ以上のポリヌクレオチドが形質移入されている、［５１］〜［８６］のいずれか１つに記載の方法。
［８９．］前記細胞が、哺乳類細胞または昆虫細胞である、［５１］〜［８８］のいずれか１つに記載の方法。
［９０．］前記細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＳＦ−９細胞、ＢＨＫ細胞、ベロ細胞、またはＰｅｒＣ６細胞であり、任意選択で、前記細胞がＨＥＫ２９３細胞である、［５１］〜［８８］のいずれか１つに記載の方法。
［９１．］前記細胞培養物が浮遊培養物である、［５１］〜［９０］のいずれか１つに記載の方法。
［９２．］前記ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下での前記培養することが、約２日から約１０日の間にわたりまたは約５日から１４日の間にわたり行われる、［７７］〜［９１］のいずれか１つに記載の方法。
［９３．］前記ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下での前記培養することが、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、または約７日間行われる、［７７］〜［９１］のいずれか１つに記載の方法。
［９４．］前記ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下での前記培養することが、約５日間行われる、［９３］に記載の方法。
［９５．］前記ｒＡＡＶ粒子を回収することをさらに含む、［５１］〜［９４］のいずれか１つに記載の方法。
［９６．］前記細胞培養物が、約５×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌから約１×１０ｅ＋１２ＧＣ／ｍｌの間のｒＡＡＶ粒子を生成する、［５１］〜［９５］のいずれか１つに記載の方法。
［９７．］前記細胞培養物が、前記ＨＤＡＣ阻害剤及びナトリウム塩を添加しない培養物よりも、ＧＣ／ｍｌとしての測定で少なくとも約２倍多いｒＡＡＶ粒子を生成する、［５１］〜［９６］のいずれか１つに記載の方法。
［９８．］ｒＡＡＶ粒子の生成を増加させる方法であって
（ａ）細胞を含む細胞培養物を準備することと、
（ｂ）前記細胞に、以下：
ｉ．パッケージング対象のｒＡＡＶゲノム、
ｉｉ．パッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能、
ｉｉｉ．パッケージングするのに十分なＡＡＶ  ｒｅｐタンパク質、及び
ｉｖ．パッケージングするのに十分なＡＡＶ  ｃａｐタンパク質
のうちの少なくとも１つをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを導入することと、
（ｃ）前記細胞培養物に、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間の最終濃度までＨＤＡＣ阻害剤を添加することと、
（ｄ）（ｂ）の後に約２日から約１５日の間にわたり、前記ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下で前記細胞培養物を維持することと
を含む、前記方法。
［９９．］前記ＨＤＡＣ阻害剤がバルプロ酸ナトリウムである、［９８］に記載の方法。
［１００．］前記ＨＤＡＣ阻害剤がプロピオン酸ナトリウムである、［９８］に記載の方法。
［１０１．］前記培養物に、ナトリウム塩の最終濃度を約４０ｍＭから約１５０ｍＭの間だけ増加させるのに十分な量の前記ナトリウム塩を添加することをさらに含む、［９８］〜［１００］のいずれか１つに記載の方法。
［１０２．］前記ナトリウム塩が塩化ナトリウムである、［９８］〜［１０１］のいずれか１つに記載の方法。
［１０３．］ｒＡＡＶ粒子の生成を増加させる方法であって
（ａ）ｒＡＡＶを生成可能な細胞を含む細胞培養物を準備することと、
（ｂ）前記細胞培養物に、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間の最終濃度までＨＤＡＣ阻害剤を添加することと、
（ｃ）前記ｒＡＡＶ粒子の生成が可能な条件下で前記細胞培養物を維持することと
を含む、前記方法。
［１０４．］前記ＨＤＡＣ阻害剤がバルプロ酸ナトリウムである、［１０３］に記載の方法。
［１０５．］前記ＨＤＡＣ阻害剤がプロピオン酸ナトリウムである、［１０３］に記載の方法。
［１０６．］前記培養物に、ナトリウム塩の最終濃度を約１２０ｍＭから約２５０ｍＭの間まで増加させるのに十分な量の前記ナトリウム塩を添加することをさらに含む、［１０３］〜［１０５］のいずれか１つに記載の方法。
［１０７．］前記ナトリウム塩が塩化ナトリウムである、［１０３］〜［１０６］のいずれか１つに記載の方法。
［１０８．］前記細胞培養物が、ｂ）の後に約２日から約１０日の間にわたりまたは約５日から１４日の間にわたり、前記ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下で維持される、［１０３］〜［１０７］のいずれか１つに記載の方法。
［１０９．］前記細胞培養物が、ｂ）の後に約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、または約７日間維持される、［１０３］〜［１０７］のいずれか１つに記載の方法。
［１１０．］前記細胞培養物が、ｂ）の後に約５日間維持される、［１０９］に記載の方法。
［１１１．］ｒＡＡＶ粒子の生成を増加させる方法であって、ｒＡＡＶ粒子を生成可能な細胞を、前記ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＨＤＡＣ阻害剤を含む培地中で培養することを含む、前記方法。
［１１２．］前記ＨＤＡＣ阻害剤がバルプロ酸ナトリウムである、［１１１］に記載の方法。
［１１３．］前記ＨＤＡＣ阻害剤がプロピオン酸ナトリウムである、［１１１］に記載の方法。
［１１４．］前記培地が、約１２０ｍＭから約２５０ｍＭの間の塩化ナトリウムをさらに含む、［１１１］〜［１１３］のいずれか１つに記載の方法。
［１１５．］前記ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６血清型のカプシドタンパク質を含む、［１］〜［１１４］のいずれか１つに記載の方法。
［１１６．］前記ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、またはＡＡＶ．ｈｕ３７血清型のカプシドタンパク質を含む、［１］〜［１１４］のいずれか１つに記載の方法。
［１１７．］前記ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含む、［１］〜［１１４］のいずれか１つに記載の方法。
［１１８．］前記細胞培養物が、約５０リットルから約２０，０００リットルの間の体積を有する、［１］〜［１１７］のいずれか１つに記載の方法。
［１１９．］前記細胞培養物が、約５０リットルから約５，０００リットルの間の体積を有する、［１１８］に記載の方法。
［１２０．］前記細胞培養物が、約５０リットルから約２，０００リットルの間の体積を有する、［１１８］に記載の方法。
［１２１．］前記細胞培養物が、約５０リットルから約１，０００リットルの間の体積を有する、［１１８］に記載の方法。
［１２２．］前記細胞培養物が、約５０リットルから約５００リットルの間の体積を有する、［１１８］に記載の方法。
［１２３．］［１］〜［１２２］のいずれか１つに記載の方法によって生成された、単離されたｒＡＡＶ粒子を含む、組成物。
［１２４．］前記パッケージングされたｒＡＡＶゲノムが導入遺伝子を含む、［１］〜［５０］または［９８］〜［１０２］のいずれか１つに記載の方法。
［１２５．］前記導入遺伝子が、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作用可能に接続した調節エレメントを含む、［１２４］に記載の方法。
［１２６．］前記調節エレメントが、エンハンサー、プロモーター、及びポリＡ領域のうちの１つ以上を含む、［１２５］に記載の方法。
［１２７．］前記調節エレメントと、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとが、異種である、［１２５］または［１２６］に記載の方法。
［１２８．］前記導入遺伝子が、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ、イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）、イズロン酸２−スルファターゼ（ＩＤＳ）、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）、またはＶＥＧＦ受容体１（ｓＦｌｔ−１）の非膜結合型スプライスバリアントをコードする、［１２４］〜［１２７］のいずれか１つに記載の方法。
［１２９．］前記導入遺伝子が、ガンマ−サルコグリカン、Ｒａｂエスコートタンパク質１（ＲＥＰ１／ＣＨＭ）、レチノイドイソメロヒドロラーゼ（ＲＰＥ６５）、環状ヌクレオチドゲートチャネルアルファ３（ＣＮＧＡ３）、環状ヌクレオチドゲートチャネルベータ３（ＣＮＧＢ３）、芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、リソソーム関連膜タンパク質２アイソフォームＢ（ＬＡＭＰ２Ｂ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、網膜色素変性ＧＴＰアーゼ制御因子（ＲＰＧＲ）、レチノスキシン（ＲＳ１）、筋小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ２ａ）、アフリベルセプト、バッテニン（ＣＬＮ３）、膜貫通ＥＲタンパク質（ＣＬＮ６）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、アクアポリン１（ＡＱＰ１）、ジストロフィン、ミオチューブラリン１（ＭＴＭ１）、フォリスタチン（ＦＳＴ）、グルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ６Ｐアーゼ）、アポリポタンパク質Ａ２（ＡＰＯＡ２）、ウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼ１Ａ１（ＵＧＴ１Ａ１）、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、Ｎ−アセチル−アルファ−グルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、アルファ−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、アルファ−ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）、ベータ−ガラクトシダーゼ（ＧＬＢ１）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、アルファ１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、ホスホジエステラーゼ６Ｂ（ＰＤＥ６Ｂ）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ９ＯＴＣ）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ１）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ２）、ニュールツリン（ＮＲＴＮ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３／ＮＴＦ３）、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ（ＰＢＧＤ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ミトコンドリアコードＮＡＤＨ：ユビキノンオキシドレダクターゼコアサブユニット４（ＭＴ−ＮＤ４）、保護タンパク質カテプシンＡ（ＰＰＣＡ）、ジスフェリン、ＭＥＲがん原遺伝子チロシンキナーゼ（ＭＥＲＴＫ）、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）、または腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）−免疫グロブリン（ＩｇＧ１）Ｆｃ融合体をコードする、［１２４］〜［１２７］のいずれか１項に記載の方法。
【００１０】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法はさらに、［１］〜［１２９］のいずれか１つの方法に従って生成されたｒＡＡＶ粒子の下流処理を含む。いくつかの実施形態において、下流処理は、細胞培養物の収集、（例えば、遠心分離または深層濾過による）収集した細胞培養物の清澄化、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、無菌濾過のうちの少なくとも１つである。さらなる実施形態において、上流処理は、細胞培養物の収集、（例えば、遠心分離または深層濾過による）収集した細胞培養物の清澄化、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、及び無菌濾過のうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つを含む。いくつかの実施形態において、下流処理は、収集した細胞培養物の遠心分離を含まない。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】塩化ナトリウム、酪酸ナトリウム、及び／またはバルプロ酸ナトリウムの添加後に得られる組換えウイルスの収量。添加した試薬の最終濃度を示す。基本培地には約１００ｍＭの塩化ナトリウムが含まれていたが、酪酸ナトリウムまたはバルプロ酸ナトリウムは含まれていなかった。
【図２】塩化ナトリウム及び／またはバルプロ酸ナトリウムの添加後に得られる組換えウイルスの収量。添加した試薬の最終濃度を示す。基本培地には約１００ｍＭの塩化ナトリウムが含まれていたが、バルプロ酸ナトリウムは含まれていなかった。
【図３】ＮａＣｌ及びプロピオン酸ナトリウムを用いたｒＡＡＶ８粒子の大規模生産からのウイルスの収量。
【図４】塩化ナトリウム及び／またはプロピオン酸ナトリウムの添加後に得られるｒＡＡＶ９の収量。
【図５】塩化ナトリウム及び／またはプロピオン酸ナトリウムの添加後に得られるｒＡＡＶ９の収量。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
詳細な説明
いくつかの実施形態において、本開示は、ｒＡＡＶ粒子が産生される条件下、有効量のヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤の存在下でｒＡＡＶ粒子を生成可能な細胞を培養することにより、ｒＡＡＶ粒子を生成するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、細胞は、ＨＤＡＣ阻害剤及び約１１０ｍＭから２５０ｍＭの間の濃度のナトリウム塩の存在下で培養される。本明細書で開示される方法によって生成されたｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶ粒子を収集及び精製することによってさらに下流処理を行って、例えば、単離されたｒＡＡＶ粒子及びそれを含む組成物、例えば、医薬組成物を生成するのに適している。説明される方法は、遺伝子療法用途で使用するためのｒＡＡＶ粒子の生成に関するＧＭＰ規制要件と一致する、柔軟で費用効果が高く商業的にスケーラブルなプロセスを提供する。本明細書で説明される方法は、限定されるものではないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６を含めた任意のｒＡＡＶ血清型、ならびにこれらの派生物、修飾物、またはシュードタイプに適している。いくつかの実施形態において、当該方法は、ｒＡＡＶ８粒子を生成するために使用される。いくつかの実施形態において、当該方法は、ｒＡＡＶ８派生物粒子、ｒＡＡＶ８修飾物粒子、またはｒＡＡＶ８シュードタイプ粒子を生成するために使用される。いくつかの実施形態において、当該方法は、ｒＡＡＶ９粒子を生成するために使用される。いくつかの実施形態において、当該方法は、ｒＡＡＶ９派生物粒子、ｒＡＡＶ９修飾物粒子、またはｒＡＡＶ９シュードタイプ粒子を生成するために使用される。
【００１３】
発明者らは、驚くべきことに、本明細書で開示される方法がｒＡＡＶ収量を２倍以上増加させることを発見した。このような結果は、ＨＤＡＣ阻害剤が形質移入細胞の組換えポリペプチド発現を増加させ得るという以前の知見に基づいて予測することはできなかったと考えられる。細胞がＡＡＶ粒子を生成するには、３つのキャプシドタンパク質及び１本鎖ヌクレオチドゲノムを集合させて機能的ウイルス単位にする必要がある。ＨＤＡＣ阻害剤が、ＡＡＶゲノムの生成を含めて全てのＡＡＶ構成要素の生成を同時に増加させ得ると考える理由は存在しなかった。また、ＨＤＡＣ阻害剤がウイルスポリペプチドの生成を増加させるとしても、宿主細胞機構が数の増加したＡＡＶ粒子を集合可能であると考える理由は存在しなかった。また、トランスフェクションエンハンサーがウイルス様粒子（ＶＬＰ）の生成を増加させ得るというＣｅｒｖｅｒａの報告も、ＶＬＰが単一のｇａｇタンパク質を含みゲノムは含まないため、ＨＤＡＣ阻害剤が宿主細胞内でのｒＡＡＶ粒子生成を増加させ得ると考える理由をもたらさなかった（Ｃｅｒｖｅｒａ  ｅｔ  ａｌ，Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，９９：  ９９３５−９９４９（２０１５））。このように、ＶＬＰの生成には、複数のポリペプチド及びヌクレオチドゲノムを集合させる必要がなかった。
【００１４】
１つの単位用量を調製するのに極めて多数のｒＡＡＶ粒子が必要であることを考えると、ｒＡＡＶ収量が２倍以上増加すれば単位用量当たりの製品コストが顕著に低減する。ウイルス収量が増加すれば、それに応じて、ＡＡＶ粒子の生成に必要な消耗品のコストだけでなく、工業用ウイルス精製施設の建設に関連する設備投資のコストも低減することができる。
【００１５】
定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的用語及び科学的用語は、本開示が関連する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本開示の方法の理解を容易にするため、以下に複数の用語及び表現を定義する。
【００１６】
例えば、組成物中の成分の量、組成物中の成分の濃度、流量、ｒＡＡＶ粒子収量、フィード体積、塩濃度、類似の値、及びこれらの範囲を修飾し、本明細書で提供される方法で用いられる「約」とは、例えば、濃縮物もしくは使用溶液を作製するために使用される典型的な測定及び取扱い手順によって；これらの手順における偶発性のエラーによって；組成物の作製もしくは方法の実行に用いられる製造、供給源、もしくは成分の純度の違いによって；及び類似の考慮事項によって生じ得る、数値的量のバリエーションを意味する。「約」という用語は、特定の初期濃度を有する組成物または混合物が老化することによって相違する量も包含する。「約」という用語は、特定の初期濃度を有する組成物または混合物を混合または処理することによって相違する量も包含する。「約」という用語で修飾されているかどうかにかかわらず、請求項は、その量の等価物を含む。いくつかの実施形態において、「約」という用語は、示された数または範囲よりも約１０〜２０％多いまたは少ない範囲を意味する。さらなる実施形態において、「約」とは、示された数または範囲のプラスマイナス１０％を意味する。例えば、「約１０％」は９％〜１１％の範囲を示す。
【００１７】
「ＡＡＶ」とはアデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）の省略形であり、このウイルス自体またはその修飾物、派生物、もしくはシュードタイプを意味するように使用することができる。当該用語は、別段に要求される場合を除いて、全てのサブタイプ、ならびに天然の形態及び組換え形態両方を包含する。省略形「ｒＡＡＶ」とは、組換えアデノ随伴ウイルスを意味する。「ＡＡＶ」という用語は、１型ＡＡＶ（ＡＡＶ１）、２型ＡＡＶ（ＡＡＶ２）、３型ＡＡＶ（ＡＡＶ３）、４型ＡＡＶ（ＡＡＶ４）、５型ＡＡＶ（ＡＡＶ５）、６型ＡＡＶ（ＡＡＶ６）、７型ＡＡＶ（ＡＡＶ７）、８型ＡＡＶ（ＡＡＶ８）、９型ＡＡＶ（ＡＡＶ９）、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、及びヒツジＡＡＶ、ならびにこれらの修飾物、派生物、またはシュードタイプを含む。「霊長類ＡＡＶ」は霊長類に感染するＡＡＶを意味し、「非霊長類ＡＡＶ」は非霊長類哺乳類に感染するＡＡＶを意味し、「ウシＡＡＶ」はウシ哺乳類に感染するＡＡＶを意味する、などとなる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６の派生物、修飾物、またはシュードタイプである。
【００１８】
ＡＡＶ粒子に適用される「組換え」とは、ＡＡＶ粒子が、本質的にＡＡＶ粒子とは異なるＡＡＶ粒子コンストラクトをもたらす１つ以上の手順の生成物であることを意味する。
【００１９】
組換えアデノ随伴ウイルス粒子「ｒＡＡＶ粒子」とは、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質と、異種ポリヌクレオチド（すなわち、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド、例えば、哺乳類細胞に送達させる導入遺伝子）を含むカプシド化ポリヌクレオチドｒＡＡＶベクターとから構成されるウイルス粒子を意味する。ｒＡＡＶ粒子は、任意の修飾物、派生物、またはシュードタイプを含めた任意のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、もしくはＡＡＶ１０、またはこれらの派生体／修飾物／シュードタイプ）とすることができる。このようなＡＡＶ血清型及び派生物／修飾物／シュードタイプ、ならびにこのような血清型／派生物／修飾物／シュードタイプを生成する方法は、当技術分野で知られている（例えば、Ａｓｏｋａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０（４）：６９９−７０８（２０１２）を参照）。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６カプシドタンパク質の派生物、修飾物、またはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。
【００２０】
本開示のｒＡＡＶ粒子は、任意の血清型、または血清型の任意の組合せ（例えば、２つ以上の血清型を含む（例えば、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ８、及びｒＡＡＶ９粒子のうちの２つ以上を含む）ｒＡＡＶ粒子集団）とすることができる。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ｒＡＡＶ４、ｒＡＡＶ５、ｒＡＡＶ６、ｒＡＡＶ７、ｒＡＡＶ８、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ１０、もしくはその他のｒＡＡＶ粒子、またはこれらの２つ以上の組合せである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶ８またはｒＡＡＶ９粒子である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択される２つ以上の血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６カプシドタンパク質から選択される２つ以上の血清型の派生物、修飾物、またはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、またはこれらの派生物、修飾物、もしくはシュードタイプからなる群より選択される血清型のＡＡＶカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはこれらの派生物、修飾物、もしくはシュードタイプの血清型のＡＡＶカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択される血清型のＡＡＶカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を有する。
【００２２】
「細胞培養物」という用語は、接着してまたは浮遊液中で成長させる細胞、バイオリアクター、ローラーボトル、ハイパースタック、ミクロスフェア、マクロスフェア、フラスコなどに加えて、上清または浮遊液自体の構成成分を意味し、このような構成成分としては、限定されるものではないが、ｒＡＡＶ粒子、細胞、細胞デブリ、細胞混入物、コロイド粒子、生体分子、宿主細胞タンパク質、核酸、脂質、及び凝集剤が挙げられる。また、バイオリアクターなどの大規模アプローチ（浮遊培養物、及び撹拌バイオリアクター内のマイクロキャリアまたはマクロキャリアに付着して成長させる付着細胞が含まれる）も「細胞培養物」という用語に包含される。タンパク質の大規模生産及び小規模生産いずれのための細胞培養手順も、本開示に包含される。
【００２３】
本明細書で使用する場合、「精製すること」、「精製」、「分離」、「分離すること」、「分離」、「単離する」、「単離すること」、または「単離」という用語は、ターゲット生成物と１つ以上の不純物とを含む試料からのｒＡＡＶ粒子に対する純度の程度を高めることを意味する。典型的には、ターゲット生成物の純度の程度は、試料から少なくとも１つの不純物を（完全にまたは不完全に）除去することによって高められる。いくつかの実施形態において、試料中のｒＡＡＶの純度の程度は、本明細書で説明される方法を使用することにより、試料から１つ以上の不純物を（完全にまたは不完全に）除去することによって増加する。
【００２４】
本開示及び請求項で使用する場合、単数形「ａ」「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈による明確な別段の定めがない限り、複数形を含む。
【００２５】
諸実施形態が「〜を含む」という語を用いて本明細書で説明されている場合は常に、「〜からなる」及び／または「本質的に〜からなる」という観点から説明されている別の類似の実施形態も提供されるものと理解されたい。また、諸実施形態が「本質的に〜からなる」という語を用いて本明細書で説明されている場合は常に、「〜からなる」という観点から説明されている別の類似の実施形態も提供されるものと理解されたい。
【００２６】
「及び／または」という用語は、本明細書で「Ａ及び／またはＢ」などの表現で使用される場合、Ａ及びＢの両方、ＡまたはＢ、Ａ（単独）、ならびにＢ（単独）を含むように意図されている。同様に、「及び／または」という用語は、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」のような表現で使用される場合、以下の実施形態の各々を包含するように意図されている：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）。
【００２７】
本開示の実施形態がマーカッシュグループまたはその他の代替のグループに関して説明される場合、本開示の方法は、全体として挙げられたグループ全体を包含するだけでなく、グループの各メンバーも個別に包含し、メイングループの全ての可能なサブグループも包含し、さらにグループメンバーの１つ以上不在のメイングループも包含する。また、本開示の方法は、本開示の方法におけるグループメンバーのいずれかの１つ以上が明示的に除外されることも想定している。
【００２８】
ｒＡＡＶ生成のための方法
いくつかの実施形態において、本開示は、ｒＡＡＶ粒子の生成のための方法であって、（ａ）ｒＡＡＶを生成可能な細胞を含む細胞培養物を準備することと、（ｂ）当該細胞培養物に、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間の最終濃度までヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を添加することと、（ｃ）当該ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下で当該細胞培養物を維持することとを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、短鎖脂肪酸またはその塩を含む。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、酪酸（例えば、酪酸ナトリウム）、バルプロ酸（例えば、バルプロ酸ナトリウム）、プロピオン酸（例えば、プロピオン酸ナトリウム）、またはこれらの組合せを含む。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤を添加した後、細胞培養物は、約０．５ｍＭから約１０ｍＭの間の酪酸（例えば、酪酸ナトリウム）、バルプロ酸（例えば、バルプロ酸ナトリウム）、またはプロピオン酸（例えば、プロピオン酸ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約０．５ｍＭから約５ｍＭの間の酪酸（例えば、酪酸ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約０．５ｍＭから約５ｍＭの間のバルプロ酸（例えば、バルプロ酸ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約０．５ｍＭから約５ｍＭの間のプロピオン酸（例えば、プロピオン酸ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約０．５ｍＭから約３ｍＭの間のバルプロ酸（例えば、バルプロ酸ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約０．５ｍＭから約３ｍＭの間のプロピオン酸（例えば、プロピオン酸ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、ステップｂ）の約１２時間後から約３６時間後に添加される。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、培養物に、ナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）の最終濃度を約２０ｍＭから１５０ｍＭの間だけ増加させるのに十分な量のナトリウム塩を添加することを含む。いくつかの実施形態において、ナトリウム塩の最終濃度は、約４０ｍＭから１４０ｍＭの間だけ増加する。いくつかの実施形態において、ナトリウム塩の最終濃度は、約１５０ｍＭから約２４０ｍＭの間である。いくつかの実施形態において、ナトリウム塩は、塩化ナトリウムである。いくつかの実施形態において、ナトリウム塩は、ＨＤＡＣ阻害剤を添加した後に添加される。いくつかの実施形態において、ナトリウム塩は、ＨＤＡＣ阻害剤を添加してから少なくとも約２０分後に添加される。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、ｒＡＡＶ粒子を回収することを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子を生成可能な細胞は、（ｉ）パッケージング対象のｒＡＡＶゲノム、（ｉｉ）パッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能、（ｉｉｉ）パッケージングするのに十分なＡＡＶ  ｒｅｐタンパク質、及び（ｉｖ）パッケージングするのに十分なＡＡＶ  ｃａｐタンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチドが形質移入されたＨＥＫ２９３細胞である。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、浮遊��養物である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子を生成可能な細胞は、（ｉ）パッケージング対象のｒＡＡＶゲノム、（ｉｉ）パッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能、（ｉｉｉ）パッケージングするのに十分なＡＡＶ  ｒｅｐタンパク質、及び（ｉｖ）パッケージングするのに十分なＡＡＶ  ｃａｐタンパク質のうちの少なくとも１つをコードする１つ以上のポリヌクレオチドが形質移入されたＨＥＫ２９３細胞である。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、浮遊培養物である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９粒子である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択される血清型のＡＡＶカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、ステップｂ）の後に約２日から約１０日の間にわたり、ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下で維持される。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、ステップｂ）の後に約５日から約１４日またはそれ以上の間にわたり、ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下で維持される。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、継続的な収集のためのｒＡＡＶ粒子の生成が可能な条件下で維持される。
【００２９】
いくつかの実施形態において、本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子の生成のための方法であって、（ａ）細胞を含む細胞培養物を準備することと、（ｂ）当該細胞に、以下：（ｉ）パッケージング対象のｒＡＡＶゲノム、（ｉｉ）パッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能、（ｉｉｉ）パッケージングするのに十分なＡＡＶ  ｒｅｐタンパク質、及び（ｉｖ）パッケージングするのに十分なＡＡＶ  ｃａｐタンパク質のうちの少なくとも１つをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを導入することと、（ｃ）当該細胞培養物に、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間の最終濃度までＨＤＡＣ阻害剤を添加することと、（ｄ）当該ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下で当該細胞培養物を維持することとを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、短鎖脂肪酸またはその塩を含む。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、酪酸（例えば、酪酸ナトリウム）、バルプロ酸（例えば、バルプロ酸ナトリウム）、プロピオン酸（例えば、プロピオン酸ナトリウム）、またはこれらの組合せを含む。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤を添加した後、細胞培養物は、約０．５ｍＭから約１０ｍＭの間の酪酸（例えば、酪酸ナトリウム）、バルプロ酸（例えば、バルプロ酸ナトリウム）、またはプロピオン酸（例えば、プロピオン酸ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約０．５ｍＭから約５ｍＭの間の酪酸（例えば、酪酸ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約０．５ｍＭから約５ｍＭの間のバルプロ酸（例えば、バルプロ酸ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約０．５ｍＭから約５ｍＭの間のプロピオン酸（例えば、プロピオン酸ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約０．５ｍＭから約５ｍＭの間の酪酸（例えば、酪酸ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約０．５ｍＭから約３ｍＭの間のバルプロ酸（例えば、バルプロ酸ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約０．５ｍＭから約３ｍＭの間のプロピオン酸（例えば、プロピオン酸ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、ステップｂ）の約１２時間後から約３６時間後に添加される。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、培養物に、ナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）の最終濃度を約２０ｍＭから１５０ｍＭの間だけ増加させるのに十分な量のナトリウム塩を添加することを含む。いくつかの実施形態において、ナトリウム塩の最終濃度は、約４０ｍＭから１４０ｍＭの間だけ増加する。いくつかの実施形態において、ナトリウム塩の最終濃度は、約１５０ｍＭから約２４０ｍＭの間である。いくつかの実施形態において、ナトリウム塩は、塩化ナトリウムである。いくつかの実施形態において、ナトリウム塩は、ＨＤＡＣ阻害剤を添加した後に細胞培養物に添加される。いくつかの実施形態において、ナトリウム塩は、ＨＤＡＣ阻害剤を添加してから少なくとも約２０分後に添加される。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、ｒＡＡＶ粒子��回収することを含む。いくつかの実施形態において、細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、浮遊培養物である。いくつかの実施形態において、細胞には、（ｉ）パッケージング対象のｒＡＡＶゲノム、（ｉｉ）パッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能、（ｉｉｉ）パッケージングするのに十分なＡＡＶ  ｒｅｐタンパク質、及び（ｉｖ）パッケージングするのに十分なＡＡＶ  ｃａｐタンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチドが形質移入される。いくつかの実施形態において、細胞には、（ｉ）パッケージング対象のｒＡＡＶゲノム、（ｉｉ）パッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能、（ｉｉｉ）パッケージングするのに十分なＡＡＶ  ｒｅｐタンパク質、及び（ｉｖ）パッケージングするのに十分なＡＡＶ  ｃａｐタンパク質のうちの少なくとも１つをコードする１つ以上のポリヌクレオチドが形質移入される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９粒子である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択される血清型のＡＡＶカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、ステップｂ）の後に約２日から約１０日の間にわたり、ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下で維持される。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、ステップｂ）の後に約５日から約１４日またはそれ以上の間にわたり、ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下で維持される。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、継続的な収集のためのｒＡＡＶ粒子の生成が可能な条件下で維持される。
【００３０】
いくつかの実施形態において、本開示は、ｒＡＡＶ粒子を生成するための方法であって、ｒＡＡＶ粒子を生成可能な細胞を、ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＨＤＡＣ阻害剤を含む培地中で培養することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、短鎖脂肪酸またはその塩を含む。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、酪酸（例えば、酪酸ナトリウム）、バルプロ酸（例えば、バルプロ酸ナトリウム）、プロピオン酸（例えば、プロピオン酸ナトリウム）、またはこれらの組合せを含む。いくつかの実施形態において、培地は、約０．５ｍＭから約１０ｍＭの間の酪酸（例えば、酪酸ナトリウム）、バルプロ酸（例えば、バルプロ酸ナトリウム）、またはプロピオン酸（例えば、プロピオン酸ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、培地は、約０．５ｍＭから約５ｍＭの間の酪酸（例えば、酪酸ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、培地は、約０．５ｍＭから約５ｍＭの間のバルプロ酸（例えば、バルプロ酸ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、培地は、約０．５ｍＭから約５ｍＭの間のプロピオン酸（例えば、プロピオン酸ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、培地はさらに、約１２０ｍＭから２５０ｍＭの間のＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態において、培地は、約１５０ｍＭから約１９０ｍＭの間または約１８０ｍＭから約２４０ｍＭの間のＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、ｒＡＡＶ粒子を回収することを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子を生成可能な細胞は、（ｉ）パッケージング対象のｒＡＡＶゲノム、（ｉｉ）パッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能、（ｉｉｉ）パッケージングするのに十分なＡＡＶ  ｒｅｐタンパク質、及び（ｉｖ）パッケージングするのに十分なＡＡＶ  ｃａｐタンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチドが形質移入されたＨＥＫ２９３細胞である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子を生成可能な細胞は、（ｉ）パッケージング対象のｒＡＡＶゲノム、（ｉｉ）パッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能、（ｉｉｉ）パッケージングするのに十分なＡＡＶ  ｒｅｐタンパク質、及び（ｉｖ）パッケージングするのに十分なＡＡＶ  ｃａｐタンパク質のうちの少なくとも１つをコードする１つ以上のポリヌクレオチドが形質移入されたＨＥＫ２９３細胞である。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、浮遊培養物である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９粒子である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択される血清型のＡＡＶカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４���ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養は、約２日から約１０日の間にわたり、ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下にある。いくつかの実施形態において、細胞培養は、約５日から約１４日またはそれ以上の間にわたり、ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下にある。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、継続的な収集のためのｒＡＡＶ粒子の生成が可能な条件下で維持される。
【００３１】
いくつかの実施形態において、本開示は、ｒＡＡＶ粒子の生成を増加させるための方法を提供する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ生成を増加させる方法は、（ａ）細胞を含む細胞培養物を準備することと、（ｂ）当該細胞に、以下：（ｉ）パッケージング対象のｒＡＡＶゲノム、（ｉｉ）パッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能、（ｉｉｉ）パッケージングするのに十分なＡＡＶ  ｒｅｐタンパク質、及び（ｉｖ）パッケージングするのに十分なＡＡＶ  ｃａｐタンパク質のうちの少なくとも１つをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを導入することと、（ｃ）当該細胞培養物に、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間の最終濃度までＨＤＡＣ阻害剤を添加することと、（ｄ）当該ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下で当該細胞培養物を維持することとを含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、ステップｂ）の後に約２日から約１０日の間にわたり、ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下で維持される。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、ステップｂ）の後に約５日から約１４日またはそれ以上の間にわたり、ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下で維持される。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、継続的な収集のためのｒＡＡＶ粒子の生成が可能な条件下で維持される。
【００３２】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ生成を増加させる方法は、ｒＡＡＶ粒子を生成可能な細胞を、ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＨＤＡＣ阻害剤を含む培地中で培養することを含む。いくつかの実施形態において、細胞培養は、約２日から約１０日の間にわたり、ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下にある。いくつかの実施形態において、細胞培養は、ステップｂ）の後に約５日から約１４日またはそれ以上の間にわたり、ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下にある。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、継続的な収集のためのｒＡＡＶ粒子の生成が可能な条件下で維持される。
【００３３】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ生成を増加させる方法は、（ａ）ｒＡＡＶを生成可能な細胞を含む細胞培養物を準備することと、（ｂ）当該細胞培養物に、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間の最終濃度までＨＤＡＣ阻害剤を添加することと、（ｃ）当該ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下で当該細胞培養物を維持することとを含む。いくつかの実施形態において、細胞培養は、約２日から約１０日の間にわたり、ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下にある。いくつかの実施形態において、細胞培養は、約５日から約１４日またはそれ以上の間にわたり、ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下にある。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、継続的な収集のためのｒＡＡＶ粒子の生成が可能な条件下で維持される。
【００３４】
当業者は、任意のヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤化合物が、本明細書で開示される方法で使用することができることを理解する。ＨＤＡＣ阻害剤は、当技術分野で認識されている化合物クラスである。例えば、Ｅｃｋｓｃｈｌａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．１８，１４１４；ｄｏｉ：１０．３３９０／ｉｊｍｓ１８０７１４１４（２０１７）；Ｈｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８６（２５）：２２２１１−２２２１８（２０１１）を参照。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、ＨＤＡＣアイソフォーム選択的阻害剤を含む。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、１つ以上のクラスＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＶのＨＤＡＣの活性を選択的に阻害する。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、クラスＩ及びクラスＩＩからの１つ以上のＨＤＡＣの活性を阻害する。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、汎阻害剤を含む。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、ヒドロキサム酸、短鎖脂肪酸、ベンズアミド、環状テトラペプチド、またはサーチュイン阻害剤を含む。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、短鎖脂肪酸またはその塩を含む。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、ヒドロキサム酸を含む。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、ヒドロキサム酸、例えば、トリコスタチンＡ、スベラニロヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１）、パナビオスタット、ジビノスタット、レスミノスタット、アベキシノスタット、キシノスタット、ロシリノスタット、プラクチノスタット、及びＣＨＲ−３９９６を含む。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、短鎖脂肪酸またはその塩、例えば、バルプロ酸、プロピオン酸、酪酸、２，２−ジメチル酪酸、２−エチル酪酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、フェニル酪酸、及びこれらの塩を含む（Ｓｔｅｌｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｐｅｎ  Ａｃｃｅｓｓ，Ｖｏｌ．１，Ｉｓｓｕｅ  ４，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０８９／ｂｉｏｒｅｓ．２０１２．０２２３（２０１２））。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、バルプロ酸またはその塩（例えば、バルプロ酸ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、酪酸またはその塩（例えば、酪酸ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、プロピオン酸またはその塩（例えば、プロピオン酸ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、ベンズアミド、例えば、エンチノスタット、タセジナリン、４ＳＣ２０２、及びモセチノスタットを含む。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、環状テトラペプチド、例えば、ロミデプシンを含む。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、サーチュイン阻害剤、例えば、ニコチンアミド、シルチノール、カンビノール、及びＥＸ−５２７を含む。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、［４−（２−アミノ−フェニルカルバモイル）−ベンジル］カルバミン酸ピリジン−３−イルメチルエステル及���その誘導体、ピロキサミド、オキサムフラチン、アピシジン、デプシペプチド、デプデシン、トラポキシン、Ｍ３４４、スクリプタイド、ＭＣ  １２９３、１−ナフトエ酸ナトリウム、ＣＡＹ１０３９８、フェニル酪酸ナトリウム、スベロイルビス−ヒドロキサム酸（ＳＢＨＡ）、ＣＡＹ１０４３３、オキサムフラチン、またはＨＣ毒素を含む。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、ピルビン酸またはその塩を含まない。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、ニコチンアミドを含まない。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、２つ以上のＨＤＡＣ阻害剤の組合せを含む。
【００３５】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、細胞培養物に、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間の最終濃度までＨＤＡＣ阻害剤を添加することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、ｒＡＡＶを生成可能な細胞を、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＨＤＡＣ阻害剤を含む培地中で培養することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される細胞培養物は、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＨＤＡＣ阻害剤を含む。例えば、２ｍＭのＨＤＡＣ阻害剤を含む細胞培養物は、細胞と、２ｍＭのＨＤＡＣ阻害剤を含む培地とを含むものと理解されたい。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤の濃度は、約０．５ｍＭから約１０ｍＭの間である。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤の濃度は、約０．５ｍＭから約５ｍＭの間である。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤の濃度は、約０．５ｍＭから約３ｍＭの間である。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤の濃度は、約０．５ｍＭ、約１ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２ｍＭ、約２．５ｍＭ、約３ｍＭ、約３．５ｍＭ、約４ｍＭ、約４．５ｍＭ、または約５ｍＭである。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤の濃度は、約１．５ｍＭである。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤の濃度は、約２ｍＭである。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤の濃度は、約３ｍＭである。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤の濃度は、約４ｍＭである。
【００３６】
いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約０．５ｍＭから約１０ｍＭの間のバルプロ酸またはその塩（例えば、バルプロ酸ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約０．５ｍＭから約５ｍＭの間のバルプロ酸またはその塩（例えば、バルプロ酸ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約０．５ｍＭから約３ｍＭの間のバルプロ酸またはその塩（例えば、バルプロ酸ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約０．５ｍＭ、約１ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２ｍＭ、約２．５ｍＭ、約３ｍＭ、約３．５ｍＭ、約４ｍＭ、約４．５ｍＭ、または約５ｍＭのバルプロ酸またはその塩（例えば、バルプロ酸ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約１．５ｍＭのバルプロ酸またはその塩（例えば、バルプロ酸ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約２ｍＭのバルプロ酸またはその塩（例えば、バルプロ酸ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約３ｍＭのバルプロ酸またはその塩（例えば、バルプロ酸ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約４ｍＭのバルプロ酸またはその塩（例えば、バルプロ酸ナトリウム）を含む。
【００３７】
いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約０．５ｍＭから約１０ｍＭの間の酪酸またはその塩（例えば、酪酸ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約０．５ｍＭから約５ｍＭの間の酪酸またはその塩（例えば、酪酸ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約０．５ｍＭから約３ｍＭの間の酪酸またはその塩（例えば、酪酸ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約０．５ｍＭ、約１ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２ｍＭ、約２．５ｍＭ、約３ｍＭ、約３．５ｍＭ、約４ｍＭ、約４．５ｍＭ、または約５ｍＭの酪酸またはその塩（例えば、酪酸ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約１．５ｍＭの酪酸またはその塩（例えば、酪酸ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約２ｍＭの酪酸またはその塩（例えば、酪酸ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約３ｍＭの酪酸またはその塩（例えば、酪酸ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約４ｍＭの酪酸またはその塩（例えば、酪酸ナトリウム）を含む。
【００３８】
いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約０．５ｍＭから約１０ｍＭの間のプロピオン酸またはその塩（例えば、プロピオン酸ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約０．５ｍＭから約５ｍＭの間のプロピオン酸またはその塩（例えば、プロピオン酸ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約０．５ｍＭから約３ｍＭの間のプロピオン酸またはその塩（例えば、プロピオン酸ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約０．５ｍＭ、約１ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２ｍＭ、約２．５ｍＭ、約３ｍＭ、約３．５ｍＭ、約４ｍＭ、約４．５ｍＭ、または約５ｍＭのプロピオン酸またはその塩（例えば、プロピオン酸ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約１．５ｍＭのプロピオン酸またはその塩（例えば、プロピオン酸ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約２ｍＭのプロピオン酸またはその塩（例えば、プロピオン酸ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約３ｍＭのプロピオン酸またはその塩（例えば、プロピオン酸ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約４ｍＭのプロピオン酸またはその塩（例えば、プロピオン酸ナトリウム）を含む。
【００３９】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、細胞を含む細胞培養物を準備することと、当該細胞に１つ以上のポリヌクレオチドを導入することと、当該細胞培養物にＨＤＡＣ阻害剤を添加することとを含む。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、細胞に１つ以上のポリヌクレオチドを導入する前に添加される。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、細胞に１つ以上のポリヌクレオチドを導入した後に添加される。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、細胞に１つ以上のポリヌクレオチドを導入してから約１時間から約４８時間後または約１２時間後から約３６時間後に添加される。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、細胞に１つ以上のポリヌクレオチドを導入してから約１６時間後から約３０時間後に添加される。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、細胞に１つ以上のポリヌクレオチドを導入してから約１８時間後から約２６時間後に添加される。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、細胞に１つ以上のポリヌクレオチドを導入してから約１８時間後から約２２時間後に添加される。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、細胞に１つ以上のポリヌクレオチドを導入してから約２２時間後から約２６時間後に添加される。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、細胞に１つ以上のポリヌクレオチドを導入してから約４８時間後より前または約３６時間後より前に添加される。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、細胞に１つ以上のポリヌクレオチドを導入してから少なくとも約６時間後、少なくとも約９時間後、少なくとも約１２時間後、少なくとも約１８時間後、少なくとも約２０時間後に添加される。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、細胞に１つ以上のポリヌクレオチドを導入してから約６時間後、約９時間後、約１２時間後、約１８時間後、約２０時間後、約２２時間後、約２４時間後、約３０時間後、約３６時間後、または約４８時間後に添加される。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、細胞に１つ以上のポリヌクレオチドを導入してから約１８時間後に添加される。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、細胞に１つ以上のポリヌクレオチドを導入してから約２０時間後に添加される。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、細胞に１つ以上のポリヌクレオチドを導入してから約２２時間後に添加される。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、細胞に１つ以上のポリヌクレオチドを導入してから約２４時間後に添加される。いくつかの実施形態において、細胞に１つ以上のポリヌクレオチドを導入することは、細胞に１つ以上のポリヌクレオチドを形質移入することを含む。
【００４０】
いくつかの実施形態において、細胞培地は、細胞に１つ以上のポリヌクレオチドを導入することと、細胞培養物にＨＤＡＣ阻害剤を添加することとの間で置き換えられる。いくつかの実施形態において、細胞培地は、細胞に１つ以上のポリヌクレオチドを導入することと、細胞培養物にＨＤＡＣ阻害剤を添加することとの間で補充される。いくつかの実施形態において、細胞培地は、細胞に１つ以上のポリヌクレオチドを導入することと、細胞培養物にＨＤＡＣ阻害剤を添加することとの間で、１つ以上の栄養素、塩、緩衝剤、及び添加物（例えば、消泡剤）を補充される。いくつかの実施形態において、細胞に１つ以上のポリヌクレオチドを導入することは、細胞に１つ以上のポリヌクレオチドを形質移入することを含む。
【００４１】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、細胞培養物にナトリウム塩を添加することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、ナトリウム塩を含む培地中で細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される細胞培養物は、ナトリウム塩を含む。ナトリウム塩を含む細胞培養物は、細胞と、ナトリウム塩剤を含む培地とを含むものと理解されたい。
【００４２】
いくつかの実施形態において、ナトリウム塩は、無機塩である。いくつかの実施形態において、ナトリウム塩は、有機塩である。いくつかの実施形態において、ナトリウム塩は、ハロゲン（例えば、フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素）を含むハロゲン化ナトリウムである。いくつかの実施形態において、ナトリウム塩は、塩化ナトリウムまたは臭化ナトリウムである。いくつかの実施形態において、ナトリウム塩は、塩化ナトリウム、炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、または硫酸ナトリウムである。いくつかの実施形態において、ナトリウム塩は、塩化ナトリウムである。
【００４３】
いくつかの実施形態において、細胞培養物または細胞培地は、約１２０ｍＭから約２５０ｍＭの間のナトリウム塩を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物または細胞培地は、約１３０ｍＭから約１６０ｍＭの間、約１５０ｍＭから約１９０ｍＭの間、または約１８０ｍＭから約２４０ｍＭの間のナトリウム塩を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物または細胞培地は、約１５０ｍＭから約２４０ｍＭの間のナトリウム塩を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物または細胞培地は、約１５０ｍＭから約１９０ｍＭの間のナトリウム塩を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物または細胞培地は、約１８０ｍＭから約２４０ｍＭの間のナトリウム塩を含む。いくつかの実施形態において、ナトリウム塩は、塩化ナトリウムである。
【００４４】
いくつかの実施形態において、細胞培養物または細胞培地は、約１２０ｍＭから約２５０ｍＭの間の塩化ナトリウムを含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物または細胞培地は、約１３０ｍＭから約１６０ｍＭの間、約１５０ｍＭから約１９０ｍＭの間、または約１８０ｍＭから約２４０ｍＭの間の塩化ナトリウムを含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物または細胞培地は、約１５０ｍＭから約２４０ｍＭの間の塩化ナトリウムを含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物または細胞培地は、約１５０ｍＭから約１９０ｍＭの間の塩化ナトリウムを含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物または細胞培地は、約１８０ｍＭから約２４０ｍＭの間の塩化ナトリウムを含む。いくつかの実施形態において、ナトリウム塩は、塩化ナトリウムである。いくつかの実施形態において、ナトリウム塩の最終濃度は、約１４０ｍＭの塩化ナトリウムまで増加する。いくつかの実施形態において、ナトリウム塩の最終濃度は、約１７０ｍＭの塩化ナトリウムまで増加する。いくつかの実施形態において、ナトリウム塩の最終濃度は、約２００ｍＭの塩化ナトリウムまで増加する。
【００４５】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、細胞培養物に、ナトリウム塩の最終濃度を約２０ｍＭから約１５０ｍＭの間だけ増加させるのに十分な量のナトリウム塩を添加することを含む。いくつかの実施形態において、ナトリウム塩の最終濃度は、約２０ｍＭから約５０ｍＭの間だけ増加する。いくつかの実施形態において、ナトリウム塩の最終濃度は、約４０ｍＭから約８０ｍＭの間だけ増加する。いくつかの実施形態において、ナトリウム塩の最終濃度は、約７０ｍＭから約１２０ｍＭの間だけ増加する。いくつかの実施形態において、ナトリウム塩の最終濃度は、約４０ｍＭから約１４０ｍＭの間だけ増加する。いくつかの実施形態において、ナトリウム塩の最終濃度は、約３０ｍＭだけ増加する。いくつかの実施形態において、ナトリウム塩の最終濃度は、約６０ｍＭだけ増加する。いくつかの実施形態において、ナトリウム塩の最終濃度は、約９０ｍＭだけ増加する。いくつかの実施形態において、ナトリウム塩は、塩化ナトリウムである。
【００４６】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、細胞培養物に、塩化ナトリウムの最終濃度を約２０ｍＭから約１５０ｍＭの間だけ増加させるのに十分な量の塩化ナトリウムを添加することを含む。いくつかの実施形態において、塩化ナトリウムの最終濃度は、約２０ｍＭから約５０ｍＭの間だけ増加する。いくつかの実施形態において、塩化ナトリウムの最終濃度は、約４０ｍＭから約８０ｍＭの間だけ増加する。いくつかの実施形態において、塩化ナトリウムの最終濃度は、約７０ｍＭから約１２０ｍＭの間だけ増加する。いくつかの実施形態において、塩化ナトリウムの最終濃度は、約４０ｍＭから約１４０ｍＭの間だけ増加する。いくつかの実施形態において、塩化ナトリウムの最終濃度は、約３０ｍＭだけ増加する。いくつかの実施形態において、塩化ナトリウムの最終濃度は、約６０ｍＭだけ増加する。いくつかの実施形態において、塩化ナトリウムの最終濃度は、約９０ｍＭだけ増加する。
【００４７】
いくつかの実施形態において、ナトリウム塩の濃度を、例えば９０ｍＭだけさらに増加させるためにナトリウム塩を添加する前に、細胞培養物は、ナトリウム塩を含んでいる。いくつかの実施形態において、ナトリウム塩の濃度をさらに増加させるために細胞培養物にナトリウム塩が添加される前に、細胞培養物は、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、または約１１０ｍＭのナトリウム塩を含む。細胞培養物が約１１０ｍＭの塩化ナトリウムを含み、ナトリウム塩の濃度を約９０ｍＭだけ増加させるのに十分な量の塩化ナトリウムが細胞培養物に添加される場合、塩化ナトリウムの最終濃度は約２００ｍＭであるものと理解されたい。いくつかの実施形態において、ナトリウム塩は、塩化ナトリウムである。
【００４８】
いくつかの実施形態において、塩化ナトリウムの濃度をさらに増加させるために細胞培養物に塩化ナトリウムが添加される前に、細胞培養物は、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、または約１１０ｍＭの塩化ナトリウムを含む。
【００４９】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、細胞培養物に、ナトリウム塩の最終濃度を約１２０ｍＭから約２５０ｍＭの間まで増加させるのに十分な量のナトリウム塩を添加することを含む。いくつかの実施形態において、ナトリウム塩の最終濃度は、約１３０ｍＭから約１６０ｍＭの間まで増加する。いくつかの実施形態において、ナトリウム塩の最終濃度は、約１５０ｍＭから約１９０ｍＭの間まで増加する。いくつかの実施形態において、ナトリウム塩の最終濃度は、約１８０ｍＭから約２４０ｍＭの間まで増加する。いくつかの実施形態において、ナトリウム塩の最終濃度は、約１５０ｍＭから約２４０ｍＭの間まで増加する。いくつかの実施形態において、ナトリウム塩の最終濃度は、約１４０ｍＭまで増加する。いくつかの実施形態において、ナトリウム塩の最終濃度は、約１７０ｍＭまで増加する。いくつかの実施形態において、ナトリウム塩の最終濃度は、約２００ｍＭまで増加する。いくつかの実施形態において、ナトリウム塩は、塩化ナトリウムである。
【００５０】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、細胞培養物に、塩化ナトリウムの最終濃度を約１２０ｍＭから約２５０ｍＭの間まで増加させるのに十分な量の塩化ナトリウムを添加することを含む。いくつかの実施形態において、塩化ナトリウムの最終濃度は、約１３０ｍＭから約１６０ｍＭの間まで増加する。いくつかの実施形態において、塩化ナトリウムの最終濃度は、約１５０ｍＭから約１９０ｍＭの間まで増加する。いくつかの実施形態において、塩化ナトリウムの最終濃度は、約１８０ｍＭから約２４０ｍＭの間まで増加する。いくつかの実施形態において、塩化ナトリウムの最終濃度は、約１５０ｍＭから約２４０ｍＭの間まで増加する。いくつかの実施形態において、塩化ナトリウムの最終濃度は、約１４０ｍＭまで増加する。いくつかの実施形態において、塩化ナトリウムの最終濃度は、約１７０ｍＭまで増加する。いくつかの実施形態において、塩化ナトリウムの最終濃度は、約２００ｍＭまで増加する。
【００５１】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、（ａ）細胞を含む細胞培養物を準備することと、（ｂ）当該細胞に１つ以上のポリヌクレオチドを導入することと、（ｃ）当該細胞培養物にＨＤＡＣ阻害剤を添加することと、（ｄ）当該細胞培養物にナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を添加することとを含む。（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）が任意の順序で実施されてもよいことを理解されたい。いくつかの実施形態において、（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）は、（ｂ）−（ｃ）−（ｄ）の順序で実施される。いくつかの実施形態において、（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）は、（ｂ）−（ｄ）−（ｃ）の順序で実施される。いくつかの実施形態において、（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）は、（ｄ）−（ｃ）−（ｂ）の順序で実施される。いくつかの実施形態において、（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）は、（ｄ）−（ｂ）−（ｃ）の順序で実施される。いくつかの実施形態において、（ｃ）及び（ｄ）は、（ｂ）の後、同時に実施される。いくつかの実施形態において、（ｃ）及び（ｄ）は、細胞培養物に、ＨＤＡＣ阻害剤及びナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を含む組成物を添加することにより、同時に実施される。いくつかの実施形態において、（ｃ）及び（ｄ）は、細胞培養物に、ＨＤＡＣ阻害剤を含む第１の組成物と、ナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を含む第２の組成物とを添加することにより、同時に実施される。いくつかの実施形態において、細胞に１つ以上のポリヌクレオチドを導入することは、細胞に１つ以上のポリヌクレオチドを形質移入することを含む。
【００５２】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、（ａ）細胞を含む細胞培養物を準備することと、（ｂ）当該細胞に１つ以上のポリヌクレオチドを導入することと、（ｃ）当該細胞培養物にＨＤＡＣ阻害剤を添加することと、（ｄ）当該細胞培養物にナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を添加することとを含み、このとき、（ｃ）は（ｂ）の後に実施される。いくつかの実施形態において、（ｃ）は、（ｂ）の約１時間から約４８時間後または約１２時間後から約３６時間後に実施される。いくつかの実施形態において、（ｃ）は、（ｂ）の約４８時間後より前または約３６時間後より前に実施される。いくつかの実施形態において、（ｃ）は、（ｂ）の少なくとも約６時間後、少なくとも約９時間後、少なくとも約１２時間後、または少なくとも約１８時間後に実施される。いくつかの実施形態において、（ｃ）は、（ｂ）の約６時間後、約９時間後、約１２時間後、約１８時間後、約２０時間後、約２２時間後、約２４時間後、約３０時間後、約３６時間後、または約４８時間後に添加される。いくつかの実施形態において、（ｃ）は、（ｂ）の約２４時間後に実施される。いくつかの実施形態において、（ｃ）は、（ｂ）の約２０時間後に実施される。いくつかの実施形態において、細胞に１つ以上のポリヌクレオチドを導入することは、細胞に１つ以上のポリヌクレオチドを形質移入することを含む。
【００５３】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、（ａ）細胞を含む細胞培養物を準備することと、（ｂ）当該細胞に１つ以上のポリヌクレオチドを導入することと、（ｃ）当該細胞培養物にＨＤＡＣ阻害剤を添加することと、（ｄ）当該細胞培養物にナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を添加することとを含み、このとき、（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）は、（ｂ）−（ｃ）−（ｄ）の順序で実施される。いくつかの実施形態において、（ｄ）は、（ｃ）の約５分後から約６時間後に実施される。いくつかの実施形態において、（ｄ）は、（ｃ）の約２０分後から約２時間後に実施される。いくつかの実施形態において、（ｄ）は、（ｃ）の約２時間後より前または約１時間後より前に実施される。いくつかの実施形態において、（ｄ）は、（ｃ）の少なくとも約５分後、少なくとも約１０分後、少なくとも約２０分後、少なくとも約３０分後、少なくとも約４０分後、少なくとも約５０分後に実施される。いくつかの実施形態において、（ｄ）は、（ｃ）の少なくとも約３０分後に実施される。いくつかの実施形態において、（ｄ）は、（ｃ）の約１０分後、約２０分後、約３０分後、約４０分後、約５０分後、または約６０分後に実施される。いくつかの実施形態において、（ｄ）は、（ｃ）の約４０分後に実施される。いくつかの実施形態において、細胞に１つ以上のポリヌクレオチドを導入することは、細胞に１つ以上のポリヌクレオチドを形質移入することを含む。
【００５４】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、（ａ）細胞を含む細胞培養物を準備することと、（ｂ）当該細胞に１つ以上のポリヌクレオチドを導入することと、（ｃ）当該細胞培養物にＨＤＡＣ阻害剤を添加することと、（ｄ）当該細胞培養物にナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を添加することとを含み、このとき、（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）は、（ｂ）−（ｃ）−（ｄ）の順序で実施される。いくつかの実施形態において、（ｃ）は、（ｂ）の約１時間から約４８時間後または約１２時間後から約３６時間後に実施される。いくつかの実施形態において、（ｃ）は、（ｂ）の約４８時間後より前または約３６時間後より前に実施される。いくつかの実施形態において、（ｃ）は、（ｂ）の少なくとも約６時間後、少なくとも約９時間後、少なくとも約１２時間後、または少なくとも約１８時間後に実施される。いくつかの実施形態において、（ｃ）は、（ｂ）の約６時間後、約９時間後、約１２時間後、約１８時間後、約２０時間後、約２２時間後、約２４時間後、約３０時間後、約３６時間後、または約４８時間後に添加される。いくつかの実施形態において、（ｃ）は、（ｂ）の約２４時間後に実施される。いくつかの実施形態において、（ｃ）は、（ｂ）の約２０時間後に実施される。いくつかの実施形態において、（ｄ）は、（ｃ）の約５分から約６時間後に実施される。いくつかの実施形態において、（ｄ）は、（ｃ）の約２０分から約２時間後に実施される。いくつかの実施形態において、（ｄ）は、（ｃ）の約２時間後より前または約１時間後より前に実施される。いくつかの実施形態において、（ｄ）は、（ｃ）の少なくとも約５分後、少なくとも約１０分後、少なくとも約２０分後、少なくとも約３０分後、少なくとも約４０分後、少なくとも約５０分後に実施される。いくつかの実施形態において、（ｄ）は、（ｃ）の少なくとも約３０分後に実施される。いくつかの実施形態において、（ｄ）は、（ｃ）の約１０分後、約２０分後、約３０分後、約４０分後、約５０分後、または約６０分後に実施される。いくつかの実施形態において、（ｄ）は、（ｃ）の約４０分後に実施される。
【００５５】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、細胞を含む細胞培養物を準備することと、当該細胞に１つ以上のポリヌクレオチドを導入することと、当該細胞培養物にＨＤＡＣ阻害剤を添加することと、当該細胞培養物にナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を添加することと、ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下で当該細胞培養物を維持することとを含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、細胞に１つ以上のポリヌクレオチドを導入した後、約２日から約１０日の間にわたり維持される。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、細胞に１つ以上のポリヌクレオチドを導入した後、約５日から約１４日またはそれ以上の間にわたり維持される。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、細胞に１つ以上のポリヌクレオチドを導入した後、約２日から約７日の間にわたり維持される。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、細胞に１つ以上のポリヌクレオチドを導入した後、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、または約７日間維持される。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、細胞に１つ以上のポリヌクレオチドを導入した後、約５日間維持される。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、細胞に１つ以上のポリヌクレオチドを導入した後、約６日間維持される。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、継続的な収集のためのｒＡＡＶ粒子の生成が可能な条件下で維持される。いくつかの実施形態において、細胞に１つ以上のポリヌクレオチドを導入することは、細胞に１つ以上のポリヌクレオチドを形質移入することを含む。
【００５６】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、細胞培養物へのＨＤＡＣ阻害剤の添加またはナトリウム塩の添加を含まない方法と比較して、ｒＡＡＶ粒子の生成を増加させる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、ｒＡＡＶの生成を少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％増加させる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、ｒＡＡＶの生成を少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、または少なくとも約５倍増加させる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、ｒＡＡＶの生成を少なくとも約２倍増加させる。いくつかの実施形態において、生成の増加は、生成培養物のｒＡＡＶ力価を比較することによって定量される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ力価は、生成培養物のミリリットル当たりのゲノムコピー（ＧＣ）として測定される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９から選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８のＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９のＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択されるカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を有する。
【００５７】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、ｒＡＡＶ粒子及びそれを含む組成物の品質属性を維持または改善しながら、ｒＡＡＶ粒子の生成を増加させる。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子及びそれを含む組成物の品質は、ｒＡＡＶ粒子の濃度（例えば、ＧＣ／ｍｌ）、ｒＡＡＶゲノムのコピーを含む粒子のパーセンテージ、ゲノムを含まない粒子の比率、ｒＡＡＶ粒子の感染性、ｒＡＡＶ粒子の安定性、残留する宿主細胞タンパク質の濃度または残留する宿主細胞核酸の濃度（例えば、宿主細胞ゲノムＤＮＡ、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードするプラスミド、ヘルパー機能をコードするプラスミド、ｒＡＡＶゲノムをコードするプラスミド）を定量することにより、評価される。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法によって生成されたｒＡＡＶ粒子またはそれを含む組成物の品質は、細胞培養物へのＨＤＡＣ阻害剤の添加またはナトリウム塩の添加を含まない方法によって生成されたｒＡＡＶ粒子または組成物の品質と同じである。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法によって生成されたｒＡＡＶ粒子またはそれを含む組成物の品質は、細胞培養物へのＨＤＡＣ阻害剤の添加またはナトリウム塩の添加を含まない方法によって生成されたｒＡＡＶ粒子または組成物の品質よりも良好である。
【００５８】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、約１×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌから約１×１０ｅ＋１３ＧＣ／ｍｌの間のｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、約１×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌから約１×１０ｅ＋１１ＧＣ／ｍｌの間のｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、約５×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌから約１×１０ｅ＋１２ＧＣ／ｍｌの間のｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、約５×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌから約１×１０ｅ＋１３ＧＣ／ｍｌの間のｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、約１×１０ｅ＋１１ＧＣ／ｍｌから約１×１０ｅ＋１３ＧＣ／ｍｌの間のｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、約５×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌから約５×１０ｅ＋１２ＧＣ／ｍｌの間のｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、約１×１０ｅ＋１１ＧＣ／ｍｌから約５×１０ｅ＋１２ＧＣ／ｍｌの間のｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、約１×１０ｅ＋１１ＧＣ／ｍｌ超のｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、約５×１０ｅ＋１１ＧＣ／ｍｌ超のｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、約１×１０ｅ＋１２ＧＣ／ｍｌ超のｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９から選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８のＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９のＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を含む。
【００５９】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、少なくとも約５×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌのｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、少なくとも約１×１０ｅ＋１１ＧＣ／ｍｌのｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、少なくとも約５×１０ｅ＋１１ＧＣ／ｍｌのｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、少なくとも約１×１０ｅ＋１２ＧＣ／ｍｌのｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、少なくとも約５×１０ｅ＋１２ＧＣ／ｍｌのｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、少なくとも約１×１０ｅ＋１３ＧＣ／ｍｌのｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、少なくとも約５×１０ｅ＋１３ＧＣ／ｍｌのｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９から選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８のＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９のＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を含む。
【００６０】
ｒＡＡＶ粒子を生成するための多数の細胞培養に基づく系が当技術分野で知られており、これらはいずれも本明細書に開示される方法を実施するために使用することができる。細胞培養に基づく系としては、形質移入、安定細胞株生成、及び感染性ハイブリッドウイルス生成系（アデノウイルス−ＡＡＶハイブリッド、ヘルペスウイルス−ＡＡＶハイブリッド、及びバキュロウイルス−ＡＡＶハイブリッドを含む）が挙げられる。ｒＡＡＶウイルス粒子を生成するためのｒＡＡＶ生成培養物はいずれも、（１）好適な宿主細胞（バキュロウイルス生成系の場合では、例えば、ヒト由来細胞株（例えば、ＨｅＬａ、Ａ５４９、またはＨＥＫ２９３細胞及びその派生物（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞））、哺乳類細胞株（例えば、ベロ）、ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ由来細胞、または昆虫由来細胞株（例えば、ＳＦ−９）を含む）；（２）野生型もしくは変異型アデノウイルス（例えば、温度感受性アデノウイルス）、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、またはヘルパー機能を提供するプラスミドコンストラクトによって提供される、好適なヘルパーウイルス機能；（３）ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子ならびに遺伝子産物；（４）ＡＡＶ  ＩＴＲ配列に隣接する導入遺伝子（例えば、治療用導入遺伝子）；ならびに（５）ｒＡＡＶ生成を支持するための好適な培地及び培地構成成分を必要とする。
【００６１】
１つの態様において、本明細書では、ｒＡＡＶを生成する方法であって、（ａ）昆虫細胞を含む細胞培養物を準備することと、（ｂ）当該細胞に、以下：ｉ．パッケージング対象のｒＡＡＶゲノム、ｉｉ．パッケージングするのに十分なＡＡＶ  ｒｅｐタンパク質、及びｉｉｉ．パッケージングするのに十分なＡＡＶ  ｃａｐタンパク質のうちの少なくとも１つをコードする１つ以上のバキュロウイルスベクターを導入することと、（ｃ）当該細胞培養物に、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間の最終濃度までＨＤＡＣ阻害剤を添加することと、（ｂ）の後に約２日から約１５日またはそれ以上の間にわたり、当該ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下で当該細胞培養物を維持することとを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、当該方法は、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする第１のバキュロウイルスベクターと、ｒＡＡＶゲノムをコードする第２のバキュロウイルスベクターとを使用することを含む。いくつかの実施形態において、当該方法は、ｒＡＡＶゲノムをコードするバキュロウイルスと、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を発現する昆虫細胞とを使用することを含む。いくつかの実施形態において、当該方法は、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子とｒＡＡＶゲノムとをコードするバキュロウイルスベクターを使用することを含む。いくつかの実施形態において、昆虫細胞は、Ｓｆ−９細胞である。いくつかの実施形態において、昆虫細胞は、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする１つ以上の安定的に組み込まれた異種ポリヌクレオチドを含むＳｆ−９細胞である。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、培養物に、ナトリウム塩の最終濃度を約２０ｍＭから約１５０ｍＭの間だけ増加させるのに十分な量のナトリウム塩を添加することを含む。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、バルプロ酸、プロピオン酸、酪酸、またはこれらの塩である。
【００６２】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、バキュロウイルス生成系を使用する。いくつかの実施形態において、バキュロウイルス生成系は、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする第１のバキュロウイルスと、ｒＡＡＶゲノムをコードする第２のバキュロウイルスとを使用する。いくつかの実施形態において、バキュロウイルス生成系は、ｒＡＡＶゲノムをコードするバキュロウイルスと、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を発現する宿主細胞とを使用する。いくつかの実施形態において、バキュロウイルス生成系は、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子とｒＡＡＶゲノムとをコードするバキュロウイルスを使用する。いくつかの実施形態において、バキュロウイルス生成系は、Ｓｆ−９細胞を使用する。
【００６３】
当業者は、ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ＡＡＶヘルパー遺伝子（例えば、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子）、ならびにｒＡＡＶゲノム（逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接する１つ以上の目的遺伝子を含む）を細胞に導入して、ｒＡＡＶを生成またはパッケージングすることができる多数の方法を認識している。「アデノウイルスヘルパー機能」という表現は、ＡＡＶが細胞内で効率的に成長するように細胞内で（ＲＮＡまたはタンパク質として）発現する複数のウイルスヘルパー遺伝子を意味する。当業者は、アデノウイルス及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を含めたヘルパーウイルスがＡＡＶ複製を促進すること、そして、必須機能を提供するある特定の遺伝子が同定されており、例えば、ヘルパーが、このようなＡＡＶ遺伝子発現及び複製を促進する細胞環境への変化を誘導し得ることを理解している。本明細書で開示される方法のいくつかの実施形態において、ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ヘルパー遺伝子、ならびにｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ヘルパー遺伝子、ならびにｒＡＡＶゲノムをコードする１つ以上のプラスミドベクターの形質移入により、細胞に導入される。本明細書で開示される方法のいくつかの実施形態において、ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ヘルパー遺伝子、ならびにｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ヘルパー遺伝子、ならびにｒＡＡＶゲノムをコードするウイルスベクター、例えばｒＨＳＶベクターを用いた形質導入により、細胞に導入することができる。本明細書で開示される方法のいくつかの実施形態において、ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ヘルパー遺伝子、ならびにｒＡＡＶゲノムのうちの１つ以上が、ｒＨＳＶベクターを用いた形質導入により、細胞に導入される。いくつかの実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする。いくつかの実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ヘルパー遺伝子をコードする。いくつかの実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ｒＡＡＶゲノムをコードする。いくつかの実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする。いくつかの実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ヘルパー遺伝子及びｒＡＡＶゲノムをコードする。いくつかの実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ヘルパー遺伝子ならびにＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする。
【００６４】
１つの態様において、本明細書では、ｒＡＡＶを生成する方法であって、（ａ）細胞を含む細胞培養物を準備することと、（ｂ）当該細胞に、以下：ｉ．パッケージング対象のｒＡＡＶゲノム、ｉｉ．当該ｒＡＡＶをパッケージングするのに必要なヘルパー機能、ｉｉｉ．パッケージングするのに十分なＡＡＶ  ｒｅｐタンパク質、及びｉｖ．パッケージングするのに十分なＡＡＶ  ｃａｐタンパク質のうちの少なくとも１つをコードする１つ以上のｒＨＳＶベクターを導入することと、（ｃ）当該細胞培養物に、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間の最終濃度までＨＤＡＣ阻害剤を添加することと、（ｂ）の後に約２日から約１５日またはそれ以上の間にわたり、当該ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下で当該細胞培養物を維持することとを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする。いくつかの実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ヘルパー機能をコードする。いくつかの実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ヘルパー機能をコードする１つ以上の内在的遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ヘルパー機能をコードする１つ以上の異種遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ｒＡＡＶゲノムをコードする。いくつかの実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする。いくつかの実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ヘルパー機能及びｒＡＡＶゲノムをコードする。いくつかの実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ヘルパー機能ならびにＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする。いくつかの実施形態において、当該細胞は、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする１つ以上の安定的に組み込まれた異種ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、培養物に、ナトリウム塩の最終濃度を約２０ｍＭから約１５０ｍＭの間だけ増加させるのに十分な量のナトリウム塩を添加することを含む。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、バルプロ酸、プロピオン酸、酪酸、またはこれらの塩である。
【００６５】
１つの態様において、本明細書では、ｒＡＡＶを生成する方法であって、（ａ）哺乳類細胞を含む細胞培養物を準備することと、（ｂ）当該細胞に、以下：ｉ．パッケージング対象のｒＡＡＶゲノム、ｉｉ．当該ｒＡＡＶをパッケージングするのに必要なヘルパー機能、ｉｉｉ．パッケージングするのに十分なＡＡＶ  ｒｅｐタンパク質、及びｉｖ．パッケージングするのに十分なＡＡＶ  ｃａｐタンパク質のうちの少なくとも１つをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを導入することと、（ｃ）当該細胞培養物に、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間の最終濃度までＨＤＡＣ阻害剤を添加することと、（ｂ）の後に約２日から約１５日またはそれ以上の間にわたり、当該ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下で当該細胞培養物を維持することとを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、ヘルパー機能は、アデノウイルス遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、哺乳類細胞は、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする１つ以上の安定的に組み込まれた異種ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、培養物に、ナトリウム塩の最終濃度を約２０ｍＭから約１５０ｍＭの間だけ増加させるのに十分な量のナトリウム塩を添加することを含む。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、バルプロ酸、プロピオン酸、酪酸、またはこれらの塩である。
【００６６】
ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ヘルパー遺伝子、及び／またはｒＡＡＶゲノムをコードするプラスミドまたはウイルスベクターを開発するための分子生物学の技法は、当技術分野で一般的に知られている。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、１つのプラスミドベクターによってコードされる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶヘルパー遺伝子（例えば、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子）は、１つのプラスミドベクターによってコードされる。いくつかの実施形態において、Ｅ１ａ遺伝子またはＥ１ｂ遺伝子は、宿主細胞によって安定的に発現し、残りのＡＡＶヘルパー遺伝子は、１つのウイルスベクターによる形質移入によって細胞に導入される。いくつかの実施形態において、Ｅ１ａ遺伝子及びＥ１ｂ遺伝子は、宿主細胞によって安定的に発現し、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子は、１つのプラスミドベクターによる形質移入によって細胞に導入される。いくつかの実施形態において、１つ以上のヘルパー遺伝子は、宿主細胞によって安定的に発現し、１つ以上のヘルパー遺伝子は、１つのプラスミドベクターによる形質移入によって細胞に導入される。いくつかの実施形態において、ヘルパー遺伝子は、宿主細胞によって安定的に発現する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、１つのウイルスベクターによってコードされる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶヘルパー遺伝子（例えば、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子）は、１つのウイルスベクターによってコードされる。いくつかの実施形態において、Ｅ１ａ遺伝子またはＥ１ｂ遺伝子は、宿主細胞によって安定的に発現し、残りのＡＡＶヘルパー遺伝子は、１つのウイルスベクターによる形質移入によって細胞に導入される。いくつかの実施形態において、Ｅ１ａ遺伝子及びＥ１ｂ遺伝子は、宿主細胞によって安定的に発現し、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子は、１つのウイルスベクターによる形質移入によって細胞に導入される。いくつかの実施形態において、１つ以上のヘルパー遺伝子は、宿主細胞によって安定的に発現し、１つ以上のヘルパー遺伝子は、１つのウイルスベクターによる形質移入によって細胞に導入される。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、パッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能、及びパッケージング対象のｒＡＡＶゲノムは、１つ以上のポリヌクレオチド、例えばベクターを用いた形質移入によって細胞に導入される。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、３つのポリヌクレオチドの混合物（１つはｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子をコードし、１つはパッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能（例えば、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子）をコードし、１つはパッケージング対象のｒＡＡＶゲノムをコードする）を細胞に形質移入することを含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９  ｃａｐ遺伝子である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、またはＡＡＶ．７ｍ８  ｃａｐ遺伝子である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７をコードする。いくつかの実施形態において、パッケージング対象のｒＡＡＶゲノムをコードするベクターは、ＡＡＶ  ＩＴＲに隣接する目的遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、またはその他のＡＡＶ血清型からのものである。
【００６７】
任意のベクターの組合せを使用して、ｒＡＡＶ粒子が生成またはパッケージングされる細胞に、ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ＡＡＶヘルパー遺伝子、ならびにｒＡＡＶゲノムを導入することができる。本明細書で開示される方法のいくつかの実施形態において、ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接する対象遺伝子を含むｒＡＡＶゲノムをコードする第１のプラスミドベクターと、ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする第２のベクターと、ヘルパー遺伝子をコードする第３のベクターとを使用することができる。いくつかの実施形態において、３つのベクターの混合物を細胞内に同時形質移入することができる。
【００６８】
いくつかの実施形態において、プラスミドベクターに加えてウイルスベクターを共に使用することにより、形質移入及び感染の組合せが使用される。
【００６９】
いくつかの実施形態において、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子のうちの１つ以上ならびにＡＡＶヘルパー遺伝子は、細胞によって構成的に発現し、細胞に形質移入または形質導入する必要がない。いくつかの実施形態において、細胞は、ｒｅｐ及び／またはｃａｐ遺伝子を構成的に発現する。いくつかの実施形態において、細胞は、１つ以上のＡＡＶヘルパー遺伝子を構成的に発現する。いくつかの実施形態において、細胞は、Ｅ１ａを構成的に発現する。いくつかの実施形態において、細胞は、ｒＡＡＶゲノムをコードする安定的な導入遺伝子を含む。
【００７０】
いくつかの実施形態において、ＡＡＶ  ｒｅｐ、ｃａｐ、及びヘルパー遺伝子（例えば、Ｅｌａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、またはＶＡ遺伝子）は、任意のＡＡＶ血清型とすることができる。同様に、ＡＡＶ  ＩＴＲも、任意のＡＡＶ血清型とすることができる。例えば、いくつかの実施形態において、ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、またはその他のＡＡＶ血清型（例えば、２つ以上の血清型からの配列を有するハイブリッド血清型）からのものである。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ９またはＡＡＶ８  ｃａｐ遺伝子からのものである。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、またはその他のＡＡＶ血清型（例えば、２つ以上の血清型からの配列を有するハイブリッド血清型）からのものである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子生成のためのＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、異なる血清型からのものである。例えば、ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ２からのものであり、一方ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ９からのものである。
【００７１】
細胞の形質移入のために使用することができる当技術分野で知られている任意の好適な方法を、本明細書で開示される方法に従うｒＡＡＶ粒子生成のために使用することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、化学ベースの形質移入法を用いて細胞に形質移入することを含む。いくつかの実施形態において、化学ベースの形質移入法は、リン酸カルシウム、高度に分岐した有機化合物（デンドリマー）、カチオン性ポリマー（例えば、ＤＥＡＥデキストランまたはポリエチレンイミン（ＰＥＩ））、リポフェクションを使用する。いくつかの実施形態において、化学ベースの形質移入法は、カチオン性ポリマー（例えば、ＤＥＡＥデキストランまたはポリエチレンイミン（ＰＥＩ））を使用する。いくつかの実施形態において、化学ベースの形質移入法は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用する。いくつかの実施形態において、化学ベースの形質移入法は、ＤＥＡＥデキストランを使用する。いくつかの実施形態において、化学ベースの形質移入法は、リン酸カルシウムを使用する。
【００７２】
当技術分野で知られている任意の好適な培地を、本明細書で開示される方法に従ってｒＡＡＶ粒子生成のために使用することができる。このような培地としては、限定されるものではないが、変法イーグル培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、及び米国特許第６，７２３，５５１号（参照によりその全体が本明細書に援用される）で説明されているようなＳｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地を含めたＨｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ及びＪＲＨが生産する培地が挙げられる。いくつかの実施形態において、培地は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製のＤｙｎａｍｉｓ（商標）培地、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地、またはＥｘｐｉ２９３（商標）発現培地を含む。いくつかの実施形態において、培地は、Ｄｙｎａｍｉｓ（商標）培地を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、無血清培地、動物成分フリー培地、または化学的に定義された培地を含む細胞培養物を使用する。いくつかの実施形態において、培地は、動物成分フリー培地である。いくつかの実施形態において、培地は、血清を含む。いくつかの実施形態において、培地は、ウシ胎児血清を含む。いくつかの実施形態において、培地は、無グルタミン培地である。いくつかの実施形態において、培地は、グルタミンを含む。いくつかの実施形態において、培地には、栄養素、塩、緩衝剤、及び添加物（例えば、消泡剤）のうちの１つ以上が補充される。いくつかの実施形態において、培地には、グルタミンが補充される。いくつかの実施形態において、培地には、血清が補充される。いくつかの実施形態において、培地には、ウシ胎児血清が補充される。いくつかの実施形態において、培地には、ポロキサマー、例えば、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ  １８８  Ｂｉｏが補充される。いくつかの実施形態において、培地は、基本培地である。いくつかの実施形態において、培地は、フィード培地である。
【００７３】
ｒＡＡＶ生成培養物は、利用されている特定の宿主細胞に適した様々な条件下で（広い温度範囲にわたり、様々な長さの時間で、など）ルーチン的に成長させることができる。当技術分野で知られているように、ｒＡＡＶ生成培養物は、好適な付着依存性容器（例えば、ローラーボトル、中空繊維フィルター、多層またはマルチトレイ組織培養フラスコ（すなわちスタック、例えばハイパースタック）、マイクロキャリア、及び充填床または流動床バイオリアクター）中で培養することができる付着依存性の培養物を含む。また、ｒＡＡＶベクター生成培養物は、浮遊適応性の宿主細胞、例えば、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３由来細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞）、ベロ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ由来細胞、ＥＢ６６細胞、ＢＳＣ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＬＬＣ−ＭＫ細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＲＡＦ細胞、ＲＫ細胞、ＴＣＭＫ−１細胞、ＬＬＣＰＫ細胞、ＰＫ１５細胞、ＬＬＣ−ＲＫ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＢＨＫ−２１細胞、ＮＳ−１細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＷＩ−３８細胞、ＢＨＫ細胞、３Ｔ３細胞、２９３細胞、ＲＫ細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、ニワトリ胚細胞、及びＳＦ−９細胞も含むことができ、これらは、例えば、スピナーフラスコ、撹拌タンクバイオリアクター、及びＷａｖｅバッグシステムなどの使い捨てシステムを含めた様々な方法で培養することができる。ｒＡＡＶ粒子を生成するための多数の浮遊培養物が当技術分野で知られており、これには例えば、米国特許第６，９９５，００６号、第９，７８３，８２６号、及び米国特許出願公開第２０１２０１２２１５５号（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている培養物が含まれる。
【００７４】
当技術分野でｒＡＡＶ粒子を生成することが知られている任意の細胞または細胞株を、本明細書で開示される方法のいずれか１つで使用することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるｒＡＡＶ粒子を生成するまたはｒＡＡＶ粒子の生成を増加させる方法は、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３由来細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞）、ベロ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ由来細胞、ＥＢ６６細胞、ＢＳＣ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＬＬＣ−ＭＫ細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＲＡＦ細胞、ＲＫ細胞、ＴＣＭＫ−１細胞、ＬＬＣＰＫ細胞、ＰＫ１５細胞、ＬＬＣ−ＲＫ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＢＨＫ−２１細胞、ＮＳ−１細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＷＩ−３８細胞、ＢＨＫ細胞、３Ｔ３細胞、２９３細胞、ＲＫ細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、ニワトリ胚細胞、またはＳＦ−９細胞を使用する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、哺乳類細胞を使用する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、昆虫細胞、例えばＳＦ−９細胞を使用する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、ＨＥＫ２９３細胞を使用する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、浮遊培養での成長に適応したＨＥＫ２９３細胞を使用する。
【００７５】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される細胞培養物は、浮遊培養物である。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される細胞培養物は、ＨＥＫ２９３を含む浮遊培養物である。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される細胞培養物は、浮遊培養での成長に適応したＨＥＫ２９３細胞を含む浮遊培養物である。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される細胞培養物は、無血清培地、動物成分フリー培地、または化学的に定義された培地を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される細胞培養物は、無血清培地を含む。いくつかの実施形態において、浮遊適応性の細胞は、振とうフラスコ、スピナーフラスコ、細胞バッグ、またはバイオリアクター中で培養される。
【００７６】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される細胞培養物は、それ自体が培地中で浮遊状態にある基質（例えば、マイクロキャリア）に付着した細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。
【００７７】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される細胞培養物は、接着培養物である。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される細胞培養物は、ＨＥＫ２９３を含む接着培養物である。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される細胞培養物は、無血清培地、動物成分フリー培地、または化学的に定義された培地を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される細胞培養物は、無血清培地を含む。
【００７８】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される細胞培養物は、高密度細胞培養物を含む。いくつかの実施形態において、培養物は、約１×１０Ｅ＋０６細胞／ｍｌから約３０×１０Ｅ＋０６細胞／ｍｌの間の総細胞密度を有する。いくつかの実施形態において、細胞の約５０％超が生細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３由来細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞）、ベロ細胞、またはＳＦ−９細胞である。さらなる実施形態において、細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。さらなる実施形態において、細胞は、浮遊培養での成長に適応したＨＥＫ２９３細胞である。
【００７９】
本明細書で開示される方法は、任意のＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子の生成で使用することができる。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６カプシドタンパク質の派生物、修飾物、またはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。
【００８０】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９から選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８のＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９のＡＡＶカプシド血清型を有する。
【００８１】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を含む。
【００８２】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９カプシドタンパク質の派生物、修飾物、またはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％同一のＡＡＶ８カプシドタンパク質を有する、カプシドタンパク質を含む。
【００８３】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質の派生物、修飾物、またはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％同一のＡＡＶ９カプシドタンパク質を有する、カプシドタンパク質を含む。
【００８４】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、またはＡＡＶ．７ｍ８カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上の同一性、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％の同一性を有するカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上の同一性、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％の同一性を有するカプシドタンパク質を含む。
【００８５】
追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、モザイクカプシドを含む。追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、シュードタイプのｒＡＡＶ粒子を含む。追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、２つ以上のＡＡＶカプシド血清型のカプシドタンパク質キメラを含むカプシドを含む。
【００８６】
本明細書で開示される方法のいくつかの実施形態において、（例えば、商業的製造プロセス中に）大量の細胞培養物が存在してもよい。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、ｒＡＡＶ粒子を含む大量の細胞培養物の処理に適している。「大量」という用語は、ｒＡＡＶ粒子の商業的及び／または工業的生産に関連する量を意味する。いくつかの実施形態において、「大量」という用語は、約２０リットルから約２００００リットルの間、約５０リットルから約２００００リットルの間、約１００リットルから約２００００リットルの間、約５００リットルから約２００００リットルの間、約１０００リットルから約２００００リットルの間、約２０リットルから約５０００リットルの間、約５０リットルから約５０００リットルの間、約１００リットルから約３０００リットルの間、約５００リットルから約３０００リットルの間、約１５００リットルから約２５００リットルの間を意味する。いくつかの実施形態において、「大量」という用語は、約５０リットルから約２，０００リットルの間を意味する。いくつかの実施形態において、「大量」という用語は、約５０リットルから約３，０００リットルの間を意味する。いくつかの実施形態において、「大量」という用語は、約５０リットルから約５，０００リットルの間を意味する。いくつかの実施形態において、「大量」という用語は、約２００リットルを意味する。いくつかの実施形態において、「大量」という用語は、約５００リットルを意味する。いくつかの実施形態において、「大量」という用語は、約１０００リットルを意味する。いくつかの実施形態において、「大量」という用語は、約１５００リットルを意味する。いくつかの実施形態において、「大量」という用語は、約２０００リットルを意味する。いくつかの実施形態において、「大量」という用語は、約２５００リットルを意味する。いくつかの実施形態において、「大量」という用語は、約３０００リットルを意味する。いくつかの実施形態において、「大量」という用語は、約５０００リットルを意味する。いくつかの実施形態において、「大量」という用語は、約１００００リットルを意味する。いくつかの実施形態において、「大量」という用語は、約１５０００リットルを意味する。いくつかの実施形態において、「大量」という用語は、約２００００リットルを意味する。いくつかの実施形態において、「大量」という用語は、約１０リットルから１０００リットルの間、約１０リットルから１００リットルの間、約２０リットルから５００リットルの間、約５０リットルから５００リットルの間、約１００リットルから１０００リットルの間、または約１００リットルから５００リットルの間を意味する。
【００８７】
ｒＡＡＶ粒子
提供される方法は、任意の単離された組換えＡＡＶ粒子の生成で使用するのに適している。そのため、本開示の方法に従って生成されたｒＡＡＶは、当技術分野で知られている任意の血清型、修飾物、もしくは派生物、またはこれらの任意の組合せ（例えば、２つ以上の血清型を含むｒＡＡＶ粒子の集団、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７，ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、または他のｒＡＡＶ粒子のうちの２つ以上を含む集団、あるいはこれらの２つ以上の組合せ）とすることができる。
【００８８】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、またはこれらの派生物、修飾物、もしくはシュードタイプから選択されるＡＡＶ血清型からのカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ｒＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶカプシド血清型のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上同一である、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち最大１００％同一である、カプシドタンパク質を含む。
【００８９】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、またはこれらの派生物、修飾物、もしくはシュードタイプから選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶカプシド血清型のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上同一である、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち最大１００％同一である、カプシドタンパク質を含む。
【００９０】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、Ｚｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．１２（６）：１０５６−１０６８（参照によりその全体が援用される）で説明されているように、Ａｎｃ８０またはＡｎｃ８０Ｌ６５のカプシドを含む。ある特定の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第９，１９３，９５６号、第９４５８５１７号、及び第９，５８７，２８２号、ならびに米国特許出願公開第２０１６／０３７６３２３号（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）で説明されているように、アミノ酸挿入物：ＬＧＥＴＴＲＰまたはＬＡＬＧＥＴＴＲＰのうちの１つを有するカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第９，１９３，９５６号、第９，４５８，５１７号、及び第９，５８７，２８２号、ならびに米国特許出願公開第２０１６／０３７６３２３号（これらの各々は、参照によりその全体が明細書に援用される）で説明されているように、ＡＡＶ．７ｍ８のカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第９，５８５，９７１号で開示されている任意のＡＡＶカプシド、例えばＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第９，８４０，７１９号及びＷＯ２０１５／０１３３１３（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている任意のＡＡＶカプシド、例えば、ＡＡＶ．Ｒｈ７４及びＲＨＭ４−１を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＷＯ２０１４／１７２６６９（参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている任意のＡＡＶカプシド、例えばＡＡＶ  ｒｈ．７４を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、Ｇｅｏｒｇｉａｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２３：８５７−８６２及びＧｅｏｒｇｉａｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２５：４５０（これらの各々は、参照によりその全体が援用される）で説明されているように、ＡＡＶ２／５のカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＷＯ２０１７／０７０４９１（参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている任意のＡＡＶカプシド、例えばＡＡＶ２ｔＹＦを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、Ｐｕｚｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．  Ｍｅｄ．２９（９）：４１８で説明されているようなＡＡＶＬＫ０３またはＡＡＶ３Ｂのカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第８，６２８，９６６号、第ＵＳ８，９２７，５１４号、第ＵＳ９，９２３，１２０号、及びＷＯ２０１６／０４９２３０で開示されている任意のＡＡＶカプシド、例えば、ＨＳＣ１、ＨＳＣ２、ＨＳＣ３、ＨＳＣ４、ＨＳＣ５、ＨＳＣ６、ＨＳＣ７、ＨＳＣ８、ＨＳＣ９、ＨＳＣ１０、ＨＳＣ１１、ＨＳＣ１２、ＨＳＣ１３、ＨＳＣ１４、ＨＳＣ１５、またはＨＳＣ１６を含む（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。
【００９１】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、以下の特許及び特許出願（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）：米国特許第７，２８２，１９９号、第７，９０６，１１１号、第８，５２４，４４６号、第８，９９９，６７８号、第８，６２８，９６６号、第８，９２７，５１４号、第８，７３４，８０９号、第ＵＳ９，２８４，３５７号、第９，４０９，９５３号、第９，１６９，２９９号、第９，１９３，９５６号、第９４５８５１７、及び第９，５８７，２８２号、米国特許出願公開第２０１５／０３７４８０３号、第２０１５／０１２６５８８号、第２０１７／００６７９０８号、第２０１３／０２２４８３６号、第２０１６／０２１５０２４号、第２０１７／００５１２５７号、ならびに国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４７９９号、第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３３５のいずれかで開示されているＡＡＶカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、以下の特許及び特許出願（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）のいずれかで開示されているＡＡＶカプシドのＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上同一である、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち最大１００％同一であるカプシドタンパク質を有する：米国特許第７，２８２，１９９号、第７，９０６，１１１号、第８，５２４，４４６号、第８，９９９，６７８号、第８，６２８，９６６号、第８，９２７，５１４号、第８，７３４，８０９号、第ＵＳ９，２８４，３５７号、第９，４０９，９５３号、第９，１６９，２９９号、第９，１９３，９５６号、第９４５８５１７号、及び第９，５８７，２８２号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１５／０３７４８０３号、第２０１５／０１２６５８８号、第２０１７／００６７９０８号、第２０１３／０２２４８３６号、第２０１６／０２１５０２４号、第２０１７／００５１２５７、ならびに国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４７９９号、第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３３５号。
【００９２】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、国際特許出願公開第ＷＯ２００３／０５２０５１号（例えば、配列番号２を参照）、第ＷＯ２００５／０３３３２１号（例えば、配列番号１２３及び８８を参照）、第ＷＯ０３／０４２３９７号（例えば、配列番号２、８１、８５、及び９７を参照）、第ＷＯ２００６／０６８８８８号（例えば、配列番号１及び３〜６を参照）、第ＷＯ２００６／１１０６８９号（例えば、配列番号５〜３８を参照）、第ＷＯ２００９／１０４９６４号（例えば、配列番号１〜５、７、９、２０、２２、２４、及び３１を参照）、第ＷＯ２０１０／１２７０９７号（例えば、配列番号５〜３８を参照）、ならびに第ＷＯ２０１５／１９１５０８号（例えば、配列番号８０〜２９４を参照）、ならびに米国特許出願公開第２０１５００２３９２４号（例えば、配列番号１、５〜１０を参照）（これらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されているカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、以下で開示されているＡＡＶカプシドのＶＰ１、ＶＰ２及び／またはＶＰ３配列に対し、少なくとも８０％以上同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％同一であるカプシドタンパク質を有する：国際特許出願公開第ＷＯ２００３／０５２０５１号（例えば、配列番号２を参照）、第ＷＯ２００５／０３３３２１号（例えば、配列番号１２３及び８８を参照）、第ＷＯ０３／０４２３９７号（例えば、配列番号２、８１、８５、及び９７を参照）、第ＷＯ２００６／０６８８８８号（例えば、配列番号１及び３〜６を参照）、第ＷＯ２００６／１１０６８９号（例えば、配列番号５〜３８を参照）、第ＷＯ２００９／１０４９６４号（例えば、配列番号１〜５、７、９、２０、２２、２４、及び３１を参照）、第ＷＯ２０１０／１２７０９７号（例えば、配列番号５〜３８を参照）、ならびに第ＷＯ２０１５／１９１５０８号（例えば、配列番号８０〜２９４を参照）、ならびに米国特許出願公開第２０１５００２３９２４号（例えば、配列番号１、５〜１０を参照）。
【００９３】
ＡＡＶベースウイルスベクターの核酸配列、ならびに組換えＡＡＶ及びＡＡＶカプシドを作製する方法は、例えば、以下で教示されている：米国特許第７，２８２，１９９号、第７，９０６，１１１号、第８，５２４，４４６号、第８，９９９，６７８号、第８，６２８，９６６号、第８，９２７，５１４号、第８，７３４，８０９号、第ＵＳ９，２８４，３５７号、第９，４０９，９５３号、第９，１６９，２９９号、第９，１９３，９５６号、第９４５８５１７号、及び第９，５８７，２８２号、米国特許出願公開第２０１５／０３７４８０３号、第２０１５／０１２６５８８号、第２０１７／００６７９０８号、第２０１３／０２２４８３６号、第２０１６／０２１５０２４号、第２０１７／００５１２５７号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４７９９号、第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３３５号、第ＷＯ２００３／０５２０５１号、第ＷＯ２００５／０３３３２１号、第ＷＯ０３／０４２３９７号、第ＷＯ２００６／０６８８８８号、第ＷＯ２００６／１１０６８９号、第ＷＯ２００９／１０４９６４号、第ＷＯ２０１０／１２７０９７号、及び第ＷＯ２０１５／１９１５０８号、ならびに米国特許出願公開第２０１５００２３９２４号。
【００９４】
提供される方法は、導入遺伝子をコードする組換えＡＡＶの生成で使用するのに適している。ある特定の実施形態において、導入遺伝子は表１Ａ〜１Ｃからのものである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、以下の構成要素：（１）発現カセットに隣接するＡＡＶ逆方向末端反復と、（２）調節制御要素、例えば、ａ）プロモーター／エンハンサー、ｂ）ポリＡシグナル、及びｃ）任意選択でイントロンと、（３）導入遺伝子をコードする核酸配列とを含む、ベクターを含む。インタクトなまたは実質的にインタクトなモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を発現させるための他の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、以下の構成要素：（１）発現カセットに隣接するＡＡＶ逆方向末端反復と、（２）調節制御要素、例えば、ａ）プロモーター／エンハンサー、ｂ）ポリＡシグナル、及びｃ）任意選択でイントロンと、（３）抗体の軽鎖Ｆａｂ及び重鎖Ｆａｂ、または少なくとも重鎖または軽鎖Ｆａｂ、ならびに任意選択で重鎖Ｆｃ領域をコードする核酸配列とを含む、ベクターを含む。インタクトまたは実質的にインタクトなｍＡｂを発現させるためのさらに他の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、以下の構成要素を含むベクターを含む：（１）発現カセットに隣接するＡＡＶ逆方向末端反復；（２）調節制御エレメント、例えば、ａ）プロモーター／エンハンサー、ｂ）ポリＡシグナル、及びｃ）任意選択でイントロン；ならびに（３）以下のものの重鎖Ｆａｂをコードする核酸配列：抗ＶＥＧＦ（例えば、セバシズマブ、ラニビズマブ、ベバシズマブ、及びブロルシズマブ）、抗ＥｐｏＲ（例えば、ＬＫＡ−６５１）、抗ＡＬＫ１（例えば、アスクリンバクマブ）、抗Ｃ５（例えば、テシドルマブ及びエクリズマブ）、抗ＣＤ１０５（例えば、カロツキシマブ）、抗ＣＣ１Ｑ（例えば、ＡＮＸ−００７）、抗ＴＮＦα（例えば、アダリムマブ、インフリキシマブ、及びゴリムマブ）、抗ＲＧＭａ（例えば、エレザヌマブ）、抗ＴＴＲ（例えば、ＮＩ−３０１及びＰＲＸ−００４）、抗ＣＴＧＦ（例えば、パムレブルマブ）、抗ＩＬ６Ｒ（例えば、サトラリズマブ及びサリルマブ）、抗ＩＬ４Ｒ（例えば、デュピルマブ）、抗ＩＬ１７Ａ（例えば、イキセキズマブ及びセクキヌマブ）、抗ＩＬ−５（例えば、メポリズマブ）、抗ＩＬ１２／ＩＬ２３（例えば、ウステキヌマブ）、抗ＣＤ１９（例えば、イネビリズマブ）、抗ＩＴＧＦ７  ｍＡｂ（例えば、エトロリズマブ）、抗ＳＯＳＴ  ｍＡｂ（例えば、ロモソズマブ）、抗ｐＫａｌ  ｍＡｂ（例えば、ラナデルマブ）、抗ＩＴＧＡ４（例えば、ナタリズマブ）、抗ＩＴＧＡ４Ｂ７（例えば、ベドリズマブ）、抗ＢＬｙＳ（例えば、ベリムマブ）、抗ＰＤ−１（例えば、ニボルマブ及びペムブロリズマブ）、抗ＲＡＮＫＬ（例えば、デンソマブ）、抗ＰＣＳＫ９（例えば、アリロクマブ及びエボロクマブ）、抗ＡＮＧＰＴＬ３（例えば、エビナクマブ＊）、抗ＯｘＰＬ（例えば、Ｅ０６）、抗ｆＤ（例えば、ラムパリズマブ）、または抗ＭＭＰ９（例えば、アンデカリキシマブ）；任意選択で、治療抗体のネイティブ形態と同じアイソタイプのＦｃポリペプチド、例えば、ＩｇＧアイソタイプアミノ酸配列ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、もしくはＩｇＧ４、またはこれらの修���Ｆｃ；ならびに以下のものの軽鎖をコードする核酸配列：抗ＶＥＧＦ（例えば、セバシズマブ、ラニビズマブ、ベバシズマブ、及びブロルシズマブ）、抗ＥｐｏＲ（例えば、ＬＫＡ−６５１）、抗ＡＬＫ１（例えば、アスクリンバクマブ）、抗Ｃ５（例えば、テシドルマブ及びエクリズマブ）、抗ＣＤ１０５もしくは抗ＥＮＧ（例えば、カロツキシマブ）、抗ＣＣ１Ｑ（例えば、ＡＮＸ−００７）、抗ＴＮＦα（例えば、アダリムマブ、インフリキシマブ、及びゴリムマブ）、抗ＲＧＭａ（例えば、エレザヌマブ）、抗ＴＴＲ（例えば、ＮＩ−３０１及びＰＲＸ−００４）、抗ＣＴＧＦ（例えば、パムレブルマブ）、抗ＩＬ６Ｒ（例えば、サトラリズマブ及びサリルマブ）、抗ＩＬ４Ｒ（例えば、デュピルマブ）、抗ＩＬ１７Ａ（例えば、イキセキズマブ及びセクキヌマブ）、抗ＩＬ−５（例えば、メポリズマブ）、抗ＩＬ１２／ＩＬ２３（例えば、ウステキヌマブ）、抗ＣＤ１９（例えば、イネビリズマブ）、抗ＩＴＧＦ７  ｍＡｂ（例えば、エトロリズマブ）、抗ＳＯＳＴ  ｍＡｂ（例えば、ロモソズマブ）、抗ｐＫａｌ  ｍＡｂ（例えば、ラナデルマブ）、抗ＩＴＧＡ４（例えば、ナタリズマブ）、抗ＩＴＧＡ４Ｂ７（例えば、ベドリズマブ）、抗ＢＬｙＳ（例えば、ベリムマブ）、抗ＰＤ−１（例えば、ニボルマブ及びペムブロリズマブ）、抗ＲＡＮＫＬ（例えば、デンソマブ）、抗ＰＣＳＫ９（例えば、アリロクマブ及びエボロクマブ）、抗ＡＮＧＰＴＬ３（例えば、エビナクマブ）、抗ＯｘＰＬ（例えば、Ｅ０６）、抗ｆＤ（例えば、ラムパリズマブ）、または抗ＭＭＰ９（例えば、アンデカリキシマブ）。このとき、重鎖（Ｆａｂ及び任意選択でＦｃ領域）ならびに軽鎖は、自己切断フリン（Ｆ）／Ｆ２Ａまたはフレキシブルリンカーによって分離され、重鎖及び軽鎖ポリペプチドが等しい量で発現するのを確実にする。
【００９５】
（表１Ａ）
2021533757.tif 000003
2021533757.tif 000004
2021533757.tif 000005
2021533757.tif 000006
2021533757.tif 000007
【００９６】
（表１Ｂ）
2021533757.tif 000008
2021533757.tif 000009
2021533757.tif 000010
【００９７】
（表１Ｃ）
2021533757.tif 000011
2021533757.tif 000012
2021533757.tif 000013
【００９８】
いくつかの実施形態において、本明細書では、抗ＶＥＧＦ  ＦａｂをコードするｒＡＡＶウイルスベクターが提供される。具体的な実施形態において、本明細書では、抗ＶＥＧＦ  ＦａｂをコードするｒＡＡＶ８ベースウイルスベクターが提供される。より具体的な実施形態において、本明細書では、ラニビズマブをコードするｒＡＡＶ８ベースウイルスベクターが提供される。いくつかの実施形態において、本明細書では、イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）をコードするｒＡＡＶウイルスベクターが提供される。具体的な実施形態において、本明細書では、ＩＤＵＡをコードするｒＡＡＶ９ベースウイルスベクターが提供される。いくつかの実施形態において、本明細書では、イズロン酸２−スルファターゼ（ＩＤＳ）をコードするｒＡＡＶウイルスベクターが提供される。具体的な実施形態において、本明細書では、ＩＤＳをコードするｒＡＡＶ９ベースウイルスベクターが提供される。いくつかの実施形態において、本明細書では、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）をコードするｒＡＡＶウイルスベクターが提供される。具体的な実施形態において、本明細書では、ＬＤＬＲをコードするｒＡＡＶ８ベースウイルスベクターが提供される。いくつかの実施形態において、本明細書では、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）タンパク質をコードするｒＡＡＶウイルスベクターが提供される。具体的な実施形態において、本明細書では、ＴＰＰ１をコードするｒＡＡＶ９ベースウイルスベクターが提供される。いくつかの実施形態において、本明細書では、ＶＥＧＦ受容体１（ｓＦｌｔ−１）の非膜結合型スプライスバリアントをコードするｒＡＡＶウイルスベクターが提供される。いくつかの実施形態において、本明細書では、ガンマ−サルコグリカン、Ｒａｂエスコートタンパク質１（ＲＥＰ１／ＣＨＭ）、レチノイドイソメロヒドロラーゼ（ＲＰＥ６５）、環状ヌクレオチドゲートチャネルアルファ３（ＣＮＧＡ３）、環状ヌクレオチドゲートチャネルベータ３（ＣＮＧＢ３）、芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、リソソーム関連膜タンパク質２アイソフォームＢ（ＬＡＭＰ２Ｂ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、網膜色素変性ＧＴＰアーゼ制御因子（ＲＰＧＲ）、レチノスキシン（ＲＳ１）、筋小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ２ａ）、アフリベルセプト、バッテニン（ＣＬＮ３）、膜貫通ＥＲタンパク質（ＣＬＮ６）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、アクアポリン１（ＡＱＰ１）、ジストロフィン、ミオチューブラリン１（ＭＴＭ１）、フォリスタチン（ＦＳＴ）、グルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ６Ｐアーゼ）、アポリポタンパク質Ａ２（ＡＰＯＡ２）、ウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼ１Ａ１（ＵＧＴ１Ａ１）、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、Ｎ−アセチル−アルファ−グルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、アルファ−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、アルファ−ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）、ベータ−ガラクトシダーゼ（ＧＬＢ１）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、アルファ１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、ホスホジエステラーゼ６Ｂ（ＰＤＥ６Ｂ）、オルニチンカル��モイルトランスフェラーゼ９ＯＴＣ）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ１）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ２）、ニュールツリン（ＮＲＴＮ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３／ＮＴＦ３）、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ（ＰＢＧＤ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ミトコンドリアコードＮＡＤＨ：ユビキノンオキシドレダクターゼコアサブユニット４（ＭＴ−ＮＤ４）、保護タンパク質カテプシンＡ（ＰＰＣＡ）、ジスフェリン、ＭＥＲがん原遺伝子チロシンキナーゼ（ＭＥＲＴＫ）、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）、または腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）−免疫グロブリン（ＩｇＧ１）Ｆｃ融合体をコードするｒＡＡＶウイルスベクターが提供される。
【００９９】
追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、シュードタイプＡＡＶカプシドを含む。いくつかの実施形態において、シュードタイプＡＡＶカプシドは、ｒＡＡＶ２／８またはｒＡＡＶ２／９シュードタイプＡＡＶカプシドである。シュードタイプｒＡＡＶ粒子を生成し使用するための方法は、当技術分野で知られている（例えば、Ｄｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５：７６６２−７６７１（２００１）；Ｈａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：１５２４−１５３２（２０００）；Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８：１５８−１６７（２００２）；及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．  Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５−３０８１，（２００１）を参照）。
【０１００】
追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、２つ以上のＡＡＶカプシド血清型のキメラであるカプシドタンパク質を含むカプシドを含む。いくつかの実施形態において、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶ血清型からの２つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質のキメラである。
【０１０１】
ある特定の実施形態において、１本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）を使用することができる。ある特定の実施形態において、自己相補的ベクター、例えばｓｃＡＡＶを使用することができる（例えば、Ｗｕ，２００７，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１８（２）：１７１−８２；ＭｃＣａｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ，２００１，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．８，Ｎｕｍｂｅｒ  １６：１２４８−１２５４；ならびに米国特許第６，５９６，５３５号、第７，１２５，７１７号、及び第７，４５６，６８３号（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）を参照）。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９から選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、またはその派生物、修飾物、もしくはシュードタイプのＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ４、またはその派生物、修飾物、もしくはシュードタイプのＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ５、またはその派生物、修飾物、もしくはシュードタイプのＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８、またはその派生物、修飾物、もしくはシュードタイプのＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９、またはその派生物、修飾物、もしくはシュードタイプのＡＡＶカプシド血清型を有する。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９カプシドタンパク質の派生物、修飾物、またはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％同一のＡＡＶ８カプシドタンパク質を有する、カプシドタンパク質を含む。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質の派生物、修飾物、またはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％同一のＡＡＶ８カプシドタンパク質を有する、カプシドタンパク質を含む。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、またはＡＡＶ．７ｍ８カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上の同一性、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％の同一性を有するカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上の同一性、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％の同一性を有するカプシドタンパク質を含む。
【０１０６】
追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、モザイクカプシドを含む。モザイクＡＡＶ粒子は、ＡＡＶの異なる血清型からのウイルスカプシドタンパク質の混合物から構成される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ならびにＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択される血清型のカプシドタンパク質を含むモザイクカプシドを含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ．８、及びＡＡＶｒｈ．１０から選択される血清型のカプシドタンパク質を含むモザイクカプシドを含む。
【０１０８】
追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、シュードタイプｒＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態において、シュードタイプｒＡＡＶ粒子は、（ａ）ＡＡＶ  ＩＴＲを含む核酸ベクターと、（ｂ）ＡＡＶｘ（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６）に由来するカプシドタンパク質から構成されるカプシドとを含む。追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質から構成されるシュードタイプｒＡＡＶ粒子を含む。追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質を含むシュードタイプｒＡＡＶ粒子を含む。追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質から構成されるシュードタイプｒＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態において、シュードタイプｒＡＡＶ８またはｒＡＡＶ９粒子は、ｒＡＡＶ２／８またはｒＡＡＶ２／９シュードタイプ粒子である。シュードタイプｒＡＡＶ粒子を生成し使用するための方法は、当技術分野で知られている（例えば、Ｄｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５：７６６２−７６７１（２００１）；Ｈａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：１５２４−１５３２（２０００）；Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８：１５８−１６７（２００２）；及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．  Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５−３０８１，（２００１）を参照）。
【０１０９】
追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、２つ以上のＡＡＶカプシド血清型のキメラであるカプシドタンパク質を含むカプシドを含む。さらなる実施形態において、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ｒＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶ血清型からの２つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質のキメラである。さらなる実施形態において、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ．８、及びＡＡＶｒｈ．１０から選択されるＡＡＶ血清型からの２つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質のキメラである。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質と、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶ血清型からの１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質とのキメラである、ＡＡＶカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質と、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ．８、及びＡＡＶｒｈ．１０から選択されるＡＡＶ血清型からの１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質とのキメラである、ＡＡＶカプシドタンパク質を含む。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質と、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択される１つ以上のＡＡＶカプシド血清型のカプシドタンパク質とのキメラである、ＡＡＶカプシドタンパク質を含む。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質と、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．８、及びＡＡＶｒｈ．１０から選択される１つ以上のＡＡＶカプシド血清型のカプシドタンパク質とのキメラである、ＡＡＶカプシドタンパク質を含む。
【０１１３】
ｒＡＡＶ粒子を単離するための方法
【０１１４】
本明細書で開示されるｒＡＡＶ粒子を生成する方法（例えば、［１］〜［１２９］のいずれか１つの方法）は、ｒＡＡＶ粒子を単離するための上流処理と組み合わせて使用することができる。
【０１１５】
本明細書で開示される方法（例えば、［１］〜［１２９］のいずれか１つの方法）に従って生成されたｒＡＡＶ粒子は、当技術分野で知られている方法を用いて単離することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法に従って生成されたｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、下流処理、例えば、細胞培養物の収集、（例えば、遠心分離または深層濾過による）収集した細胞培養物の清澄化、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、無菌濾過、またはこれらの任意の組合せ（複数可）を含む。いくつかの実施形態において、下流処理は、細胞培養物の収集、（例えば、遠心分離または深層濾過による）収集した細胞培養物の清澄化、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、及び無菌濾過のうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つを含む。いくつかの実施形態において、下流処理は、細胞培養物の収集、（例えば、深層濾過による）収集した細胞培養物の清澄化、無菌濾過、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、及びアニオン交換クロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態において、下流処理は、収集した細胞培養物の清澄化、無菌濾過、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、及びアニオン交換クロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態において、下流処理は、深層濾過による収集した細胞培養物の清澄化、無菌濾過、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、及びアニオン交換クロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物の清澄化は、無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、下流処理は、遠心分離を含まない。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含む。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法に従うｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、細胞培養物の収集、（例えば、深層濾過による）収集した細胞培養物の清澄化、第１の無菌濾過、第１のタンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、４級アミンリガンドを用いたモノリスアニオン交換クロマトグラフィーまたはＡＥＸクロマトグラフィー）、第２のタンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、細胞培養物の収集、（例えば、深層濾過による）収集した細胞培養物の清澄化、第１の無菌濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、４級アミンリガンドを用いたモノリスアニオン交換クロマトグラフィーまたはＡＥＸクロマトグラフィー）、タンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法に従って生成されたｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、収集した細胞培養物の清澄化、第１の無菌濾過、第１のタンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、４級アミンリガンドを用いたモノリスアニオン交換クロマトグラフィーまたはＡＥＸクロマトグラフィー）、第２のタンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、収集した細胞培養物の清澄化、第１の無菌濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、４級アミンリガンドを用いたモノリスアニオン交換クロマトグラフィーまたはＡＥＸクロマトグラフィー）、タンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法に従って生成されたｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、深層濾過による収集した細胞培養物の清澄化、第１の無菌濾過、第１のタンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、４級アミンリガンドを用いたモノリスアニオン交換クロマトグラフィーまたはＡＥＸクロマトグラフィー）、第２のタンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、深層濾過による収集した細胞培養物の清澄化、第１の無菌濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、４級アミンリガンドを用いたモノリスアニオン交換クロマトグラフィーまたはＡＥＸクロマトグラフィー）、タンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、当該方法は、遠心分離を含まない。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物の清澄化は、無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含む。
【０１１７】
ｒＡＡＶ粒子の生成方法については、形質移入、安定細胞株生成、及び感染性ハイブリッドウイルス生成系（アデノウイルス−ＡＡＶハイブリッド、ヘルペスウイルス−ＡＡＶハイブリッド、及びバキュロウイルス−ＡＡＶハイブリッドを含む）を含めた多数の方法が当技術分野で知られている。ｒＡＡＶウイルス粒子を生成するためのｒＡＡＶ生成培養物はいずれも、（１）好適な宿主細胞（バキュロウイルス系の場合では、例えば、ヒト由来細胞株（例えば、ＨｅＬａ、Ａ５４９、またはＨＥＫ２９３細胞及びその派生物（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞））、哺乳類細胞株（例えば、ベロ）、または昆虫由来細胞株（例えば、ＳＦ−９）を含む）；（２）野生型もしくは変異型アデノウイルス（例えば、温度感受性アデノウイルス）、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、またはヘルパー機能を提供するプラスミドコンストラクトによって提供される、好適なヘルパーウイルス機能；（３）ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子ならびに遺伝子産物；（４）ＡＡＶ  ＩＴＲ配列に隣接する導入遺伝子（例えば、治療用導入遺伝子）；ならびに（５）ｒＡＡＶ生成を支持するための好適な培地及び培地構成成分を必要とする。当技術分野で知られている好適な培地をｒＡＡＶベクターの生成に使用することができる。このような培地としては、限定されるものではないが、変法イーグル培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、及び米国特許第６，７２３，５５１号（参照によりその全体が本明細書に援用される）で説明されているようなＳｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地を含めたＨｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ及びＪＲＨが生産する培地が挙げられる。
【０１１８】
ｒＡＡＶ生成培養物は、利用されている特定の宿主細胞に適した様々な条件下で（広い温度範囲にわたり、様々な長さの時間で、など）ルーチン的に成長させることができる。当技術分野で知られているように、ｒＡＡＶ生成培養物は、好適な付着依存性容器（例えば、ローラーボトル、中空繊維フィルター、マイクロキャリア、及び充填床または流動床バイオリアクター）中で培養することができる付着依存性の培養物を含む。また、ｒＡＡＶベクター生成培養物は、浮遊適応性の宿主細胞、例えば、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３由来細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞）、ベロ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ由来細胞、ＥＢ６６細胞、ＢＳＣ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＬＬＣ−ＭＫ細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＲＡＦ細胞、ＲＫ細胞、ＴＣＭＫ−１細胞、ＬＬＣＰＫ細胞、ＰＫ１５細胞、ＬＬＣ−ＲＫ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＢＨＫ−２１細胞、ＮＳ−１細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＷＩ−３８細胞、ＢＨＫ細胞、３Ｔ３細胞、２９３細胞、ＲＫ細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、ニワトリ胚細胞、またはＳＦ−９細胞も含むことができ、これらは、例えば、スピナーフラスコ、撹拌タンクバイオリアクター、及びＷａｖｅバッグシステムなどの使い捨てシステムを含めた様々な方法で培養することができる。いくつかの実施形態において、細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、浮遊培養での成長に適応したＨＥＫ２９３細胞である。ｒＡＡＶ粒子を生成するための多数の浮遊培養物が当技術分野で知られており、これには例えば、米国特許第６，９９５，００６号、第９，７８３，８２６号、及び米国特許出願公開第２０１２０１２２１５５号（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている培養物が含まれる。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ生成培養物は、高密度細胞培養物を含む。いくつかの実施形態において、培養物は、約１×１０Ｅ＋０６細胞／ｍｌから約３０×１０Ｅ＋０６細胞／ｍｌの間の総細胞密度を有する。いくつかの実施形態において、細胞の約５０％超が生細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３由来細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞）、ベロ細胞、またはＳＦ−９細胞である。さらなる実施形態において、細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。さらなる実施形態において、細胞は、浮遊培養での成長に適応したＨＥＫ２９３細胞である。
【０１２０】
提供される方法の追加の実施形態において、ｒＡＡＶ生成培養物は、ｒＡＡＶ粒子を含む浮遊培養物を含む。ｒＡＡＶ粒子を生成するための多数の浮遊培養物が当技術分野で知られており、これには例えば、米国特許第６，９９５，００６号、第９，７８３，８２６号、及び米国特許出願公開第２０１２０１２２１５５号（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている培養物が含まれる。いくつかの実施形態において、浮遊培養物は、哺乳類細胞または昆虫細胞の培養物を含む。いくつかの実施形態において、浮遊培養物は、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３由来細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞）、ベロ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ由来細胞、ＥＢ６６細胞、ＢＳＣ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＬＬＣ−ＭＫ細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＲＡＦ細胞、ＲＫ細胞、ＴＣＭＫ−１細胞、ＬＬＣＰＫ細胞、ＰＫ１５細胞、ＬＬＣ−ＲＫ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＢＨＫ−２１細胞、ＮＳ−１細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＷＩ−３８細胞、ＢＨＫ細胞、３Ｔ３細胞、２９３細胞、ＲＫ細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、ニワトリ胚細胞、またはＳＦ−９細胞の培養物を含む。いくつかの実施形態において、浮遊培養物は、ＨＥＫ２９３細胞の培養物を含む。
【０１２１】
組換えＡＡＶ粒子は、インタクトな宿主細胞から培地中へのｒＡＡＶ粒子放出を引き起こすことが当技術分野で知られている条件下で細胞が培養されることを条件に、宿主細胞を含む生成培養物を収集することにより、または生成培養物から消費培地を収集することにより、ｒＡＡＶ生成培養物から収集することができる。また、組換えＡＡＶ粒子は、生成培養物の宿主細胞を溶解することによってｒＡＡＶ生成培養物から収集することもできる。細胞を溶解する好適な方法も当技術分野で知られており、例えば、複数の凍結／解凍サイクル、超音波処理、マイクロ流動化、ならびに化学物質（例えば、界面活性剤及び／またはプロテアーゼ）による処理が挙げられる。
【０１２２】
収集時に、ｒＡＡＶ生成培養物は、以下：（１）宿主細胞タンパク質；（２）宿主細胞ＤＮＡ；（３）プラスミドＤＮＡ；（４）ヘルパーウイルス；（５）ヘルパーウイルスタンパク質；（６）ヘルパーウイルスＤＮＡ；ならびに（７）培地構成成分（例えば、血清タンパク質、アミノ酸、トランスフェリン、及び他の低分子量タンパク質を含む）のうちの１つ以上を含むことができる。ｒＡＡＶ生成培養物はさらに、生成物関連不純物、例えば、不活性なベクター形態、空のウイルスカプシド、凝集したウイルス粒子またはカプシド、ミスフォールドしたウイルスカプシド、分解されたウイルス粒子を含むことができる。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ生成培養物収集物は、宿主細胞デブリを除去するように清澄化される。いくつかの実施形態において、生成培養物収集物は、一連の深層フィルターによる濾過によって清澄化される。また、清澄化は、当技術分野で知られている他の様々な標準的技法により、例えば、遠心分離、または当技術分野で知られている０．２ｍｍ以上の細孔サイズの任意の酢酸セルロースフィルターによる濾過により、達成することができる。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物の清澄化は、無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、生成培養物収集物は、遠心分離によって清澄化される。いくつかの実施形態において、生成培養物収集物の清澄化は、遠心分離を含まない。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物は、濾過を用いて清澄化される。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物の清澄化は、深層濾過を含む。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物の清澄化はさらに、深層濾過及び無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物は、１つ以上の異なる濾過媒体を含むフィルタートレインを用いて清澄化される。いくつかの実施形態において、フィルタートレインは、１つの深層濾過媒体を含む。いくつかの実施形態において、フィルタートレインは、１つ以上の深層濾過媒体を含む。いくつかの実施形態において、フィルタートレインは、２つの深層濾過媒体を含む。いくつかの実施形態において、フィルタートレインは、１つの無菌濾過媒体を含む。いくつかの実施形態において、フィルタートレインは、２つの深層濾過媒体及び１つの無菌濾過媒体を含む。いくつかの実施形態において、深層フィルター媒体は、多孔質深層フィルターである。いくつかの実施形態において、フィルタートレインは、Ｃｌａｒｉｓｏｌｖｅ（登録商標）２０ＭＳ、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）Ｃ０ＨＣ、及び無菌グレード濾過媒体を含む。いくつかの実施形態において、フィルタートレインは、Ｃｌａｒｉｓｏｌｖｅ（登録商標）２０ＭＳ、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）Ｃ０ＨＣ、及びＳａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）２  ＸＬＧ  ０．２μｍを含む。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物は、深層フィルターに接触させる前に前処理される。いくつかの実施形態において、前処理は、収集した細胞培養物に塩を添加することを含む。いくつかの実施形態において、前処理は、収集した細胞培養物に化学凝集剤を添加することを含む。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物は、深層フィルターに接触させる前に前処理されない。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、生成培養物収集物は、２０１９年４月２７日に出願された“ＳＣＡＬＡＢＬＥ  ＣＬＡＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＰＲＯＣＥＳＳ  ＦＯＲ  ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ  ＡＡＶ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ”という表題のＰＣＴ国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２９５３９号（参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている濾過によって清澄化される。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ生成培養物収集物は、生成培養物中に存在する高分子量ＤＮＡを消化するようにヌクレアーゼ（例えば、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標））またはエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ由来のエンドヌクレアーゼ）で処理される。ヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼ消化は、当技術分野で知られている標準的な条件下でルーチン的に実施することができる。例えば、ヌクレアーゼ消化は、周囲温度から３７℃までの範囲の温度の最終濃度１〜２．５単位／ｍｌのベンゾナーゼ（登録商標）で、３０分〜数時間の間実施される。
【０１２７】
無菌濾過は、無菌グレードフィルター媒体を用いた濾過を包含する。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、０．２または０．２２μｍの細孔フィルターである。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）を含む。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を含む。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、親水性の不均一な二重層設計を有する。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、０．８μｍのプレフィルター及び０．２μｍの最終フィルター膜の親水性の不均一な二重層設計を有する。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、１．２μｍのプレフィルター及び０．２μｍの最終フィルター膜の親水性の不均一な二重層設計を有する。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、０．２または０．２２μｍの細孔フィルターである。さらなる実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、０．２μｍの細孔フィルターである。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）２  ＸＬＧ  ０．２μｍ、Ｄｕｒａｐｏｒｅ（商標）ＰＶＤＦ膜０．４５μｍ、またはＳａｒｔｏｇｕａｒｄ（登録商標）ＰＥＳ  １．２μｍ＋０．２μｍの名目孔径の組合せである。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）２  ＸＬＧ  ０．２μｍである。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、清澄化されたフィードは、クロマトグラフィー媒体、例えば、アフィニティークロマトグラフィー媒体に適用される前に、タンジェンシャルフロー濾過（「ＴＦＦ」）を介して濃縮される。ＴＦＦ限外濾過を用いたウイルスの大規模用濃度は、Ｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：６０９−６１５（１９９３）で説明されている。清澄化フィードのＴＦＦ濃度により、技術的に管理可能な量の清澄化フィードをクロマトグラフィーにかけることが可能になり、また、長い再循環時間を必要とせずにカラムをより合理的にサイジングすることが可能になる。いくつかの実施形態において、清澄化されたフィードは、少なくとも２倍から少なくとも１０倍の間で濃縮される。いくつかの実施形態において、清澄化されたフィードは、少なくとも１０倍から少なくとも２０倍の間で濃縮される。いくつかの実施形態において、清澄化されたフィードは、少なくとも２０倍から少なくとも５０倍の間で濃縮される。いくつかの実施形態において、清澄化されたフィードは、約２０倍に濃縮される。また、当業者は、透析濾過を介して清澄化されたフィードから小分子不純物（例えば、培地成分、血清アルブミン、または他の血清タンパク質を含む細胞培養不純物）を除去するためにＴＦＦが使用されてもよいことも認識するであろう。いくつかの実施形態において、清澄化されたフィードは、小分子不純物を除去するために透析濾過に供される。いくつかの実施形態において、透析濾過は、約３から約１０の間の透析濾過体積の緩衝液を使用することを含む。いくつかの実施形態において、透析濾過は、約５透析濾過体積の緩衝液を使用することを含む。また、当業者は、精製処理における次のステップを実施する前に緩衝液の交換が望ましい場合における精製プロセスの任意のステップでＴＦＦが使用されてもよいことも認識するであろう。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される清澄化されたフィードからｒＡＡＶを単離するための方法は、緩衝液を交換するためのＴＦＦの使用を含む。
【０１２９】
アフィニティークロマトグラフィーを使用して、組成物からｒＡＡＶ粒子を単離することができる。いくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィーを使用して、清澄化されたフィードからｒＡＡＶ粒子を単離する。いくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィーを使用して、タンジェンシャルフロー濾過に供されて清澄化されたフィードからｒＡＡＶ粒子を単離する。好適なアフィニティークロマトグラフィー媒体は当技術分野で知られており、限定されるものではないが、ＡＶＢ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶＸアフィニティー樹脂、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ９アフィニティー樹脂、及びＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ８アフィニティー樹脂が挙げられる。いくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィー媒体は、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ９アフィニティー樹脂である。いくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィー媒体は、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ８アフィニティー樹脂である。いくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィー媒体は、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶＸアフィニティー樹脂である。
【０１３０】
アニオン交換クロマトグラフィーを使用して、組成物からｒＡＡＶ粒子を単離することができる。いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィーは、最終濃縮及び研磨ステップとしてアフィニティークロマトグラフィーの後に使用される。好適なアニオン交換クロマトグラフィー媒体は当技術分野で知られており、限定されるものではないが、Ｕｎｏｓｐｈｅｒｅ  Ｑ（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．）、及びＮ荷電アミノもしくはイミノ樹脂、例えば、ＰＯＲＯＳ  ５０  ＰＩ、または任意のＤＥＡＥ、ＴＭＡＥ、３級もしくは４級アミン、または当技術分野で知られているＰＥＩベース樹脂が挙げられる（米国特許第６，９８９，２６４号；Ｂｒｕｍｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ  ６（５）：６７８−６８６（２００２）；Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １１：２０７９−２０９１（２０００））。いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィー媒体は、４級アミンを含む。いくつかの実施形態において、アニオン交換媒体は、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー樹脂である。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、グリシジルメタクリレート−エチレンジメタクリレートポリマーまたはスチレン−ジビニルベンゼンポリマーを含む。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標）ＱＡ−１アドバンストコンポジットカラム（４級アミン）、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標）ＤＥＡＥ−１アドバンストコンポジットカラム（ジエチルアミノ）、ＣＩＭ（登録商標）ＱＡディスク（４級アミン）、ＣＩＭ（登録商標）ＤＥＡＥ、及びＣＩＭ（登録商標）ＥＤＡディスク（エチレンジアミノ）からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標）ＱＡ−１アドバンストコンポジットカラム（４級アミン）である。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、ＣＩＭ（登録商標）ＱＡディスク（４級アミン）である。いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィー媒体は、ＣＩＭ  ＱＡ（ＢＩＡ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｓｌｏｖｅｎｉａ）である。いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィー媒体は、ＢＩＡ  ＣＩＭ（登録商標）ＱＡ−８０（カラム体積８０ｍＬ）である。当業者は、ｒＡＡＶが樹脂との結合を保ちながら不純物（限定されるものではないが、上流精製ステップによって導入され得る不純物を含む）が除去されるように、好適なイオン強度の洗浄緩衝液が特定され得ることを理解することができる。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィーは、２０１８年６月１４日に出願された“Ａｎｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｆｏｒ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＡＡＶ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”という表題の米国仮特許出願第６２／６８４，８３５号（参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている方法に従って実施される。
【０１３２】
追加の実施形態において、本開示は、本明細書で開示される方法に従って生成された、単離されたｒＡＡＶ粒子を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、組成物は、医薬的に許容される担体を含む医薬組成物である。
【０１３３】
本明細書で使用する場合、「医薬的に許容される」という用語は、１つ以上の投与経路、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達または接触に適した、生物学的に許容される製剤、気体、液体、もしくは固体、またはこれらの混合物を意味する。「医薬的に許容される」組成物は、生物学的または他の点で望ましくないものではない材料であり、例えば、この材料は、実質的な望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく対象に投与することができる。したがって、このような医薬組成物は、例えば、本開示の方法に従って単離されたｒＡＡＶを対象に投与する際に使用することができる。このような組成物としては、医薬投与またはｉｎ  ｖｉｖｏでの接触または送達と適合性である、溶媒（水性または非水性）、溶液（水性または非水性）、エマルジョン（例えば、水中油または油中水）、懸濁液、シロップ、エリキシル、分散及び懸濁媒体、コーティング、等張性及び吸収の促進剤または遅延剤が挙げられる。水性及び非水性の溶媒、溶液、及び懸濁液は、懸濁剤及び増粘剤を含むことができる。このような医薬的に許容される担体としては、錠剤（コーティングされたまたはコーティングされていない）、カプセル（ハードまたはソフト）、マイクロビーズ、粉末、顆粒、及び結晶が挙げられる。補足活性化合物（例えば、防腐剤、抗微生物剤、抗ウイルス剤、及び抗真菌剤）も、組成物に組み込むことができる。医薬組成物は、本明細書で記載のように、または当業者に知られているように、特定の投与経路または送達経路と適合性であるように製剤化することができる。したがって、医薬組成物には、様々な経路による投与に適した担体、希釈剤、または賦形剤が含まれる。本発明のｒＡＡＶ粒子ならびに方法及び使用に適切な医薬組成物及び送達系は、当技術分野で知られている（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２００３）２０ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）１８ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．；Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ（１９９６）１２ｔｈ  ｅｄ．，Ｍｅｒｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ，Ｎ．Ｊ．；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｓｏｌｉｄ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ（１９９３），Ｔｅｃｈｎｏｎｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｐａ．；Ａｎｓｅｌ  ａｎｄ  Ｓｔｏｋｌｏｓａ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（２００１）１１ｔｈ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．；及びＰｏｚｎａｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  （１９８０），Ｒ．Ｌ．Ｊｕｌｉａｎｏ，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．２５３−３１５を参照）。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、組成物は、医薬単位用量である。「単位用量」とは、治療される対象のための単位薬用量として適した物理的に別々の単位を意味する。各単位は、任意選択で医薬担体（賦形剤、希釈剤、ビヒクル、または充填剤）と共に所定の量を含み、１回以上の用量で投与されたときに所望の効果（例えば、予防または治療効果）をもたらすように計算される。単位剤形は、例えば、アンプル及びバイアル内にあってもよく、これらは液体組成物、またはフリーズドライもしくは凍結乾燥状態の組成物を含むことができ、例えば、無菌液体担体をｉｎ  ｖｉｖｏでの投与または送達の前に添加してもよい。個々の単位剤形は、多回用量キットまたは容器に含めることができる。組換えベクター（例えば、ＡＡＶ）配列、プラスミド、ベクターゲノム、及び組換えウイルス粒子、ならびにこれらの医薬組成物は、投与を容易にし、投薬量を均一にするために、単一または複数の単位用量形態でパッケージ化することができる。いくつかの実施形態において、組成物は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４−１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶカプシド血清型からのＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシド血清型は、ＡＡＶ８である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシド血清型は、ＡＡＶ９である。
【実施例】
【０１３５】
実施例１．塩化ナトリウム、酪酸ナトリウム、及び／またはバルプロ酸ナトリウムがｒＡＡＶ収量にもたらす効果。
ＨＥＫ２９３浮遊細胞ベースプロセスにおいて、塩化ナトリウム、酪酸ナトリウム、及び／またはバルプロ酸ナトリウムがｒＡＡＶ収量にもたらす効果について試験した。１×１０ｅ６生細胞／ｍｌ密度のＨＥＫ２９３細胞をアドバンストマイクロスケールバイオリアクターに播種した。培地には、１００ｍＭのＮａＣｌが含まれていた。４８時間ＥＣＤ（培養経過期間）時に、ポリエチレンイミンと、アデノウイルスヘルパー機能、導入遺伝子、及びＡＡＶ  ２／８  Ｒｅｐ／Ｃａｐをコードする３つのプラスミドとの混合物を細胞に形質移入した。形質移入から２４時間後、ＮａＣｌ、酪酸Ｎａ、及び／またはバルプロ酸Ｎａを培養物に添加した。試験条件は、０、２５ｍＭ、及び９０ｍＭのＮａＣｌ、０、２ｍＭ、及び４ｍＭの酪酸Ｎａ、ならびに０、１．５ｍＭ、及び３ｍＭのバルプロ酸Ｎａとした。３６の反応条件を用いて、条件の完全な要因組み合わせを試験した。１６８時間ＥＣＤ時、すなわち形質移入から５日後に培養物の上清を収集した。得られたｒＡＡＶ収量を図１に示す。形質移入から１日後に、６０ｍＭの塩化ナトリウムと４ｍＭの酪酸ナトリウムまたは３ｍＭのバルプロ酸ナトリウムのいずれかとを添加することにより、ウイルス収量が著しく改善した。
【０１３６】
実施例２．塩化ナトリウム及び／またはバルプロ酸ナトリウムがｒＡＡＶ収量にもたらす効果。
ＨＥＫ２９３浮遊細胞ベースプロセスにおいて、塩化ナトリウム、バルプロ酸ナトリウム、及びこれらの組合せを異なる時間に添加することがｒＡＡＶ収量にもたらす効果について試験した。１×１０ｅ６生細胞／ｍｌ密度のＨＥＫ２９３浮遊細胞をアドバンストマイクロスケールバイオリアクターに播種した。培地には、１００ｍＭのＮａＣｌが含まれていた。４８時間ＥＣＤ（培養経過期間）時に、ポリエチレンイミンと、アデノウイルスヘルパー機能、導入遺伝子、及びＡＡＶ  ２／８  Ｒｅｐ／Ｃａｐをコードする３つのプラスミドとの混合物を細胞に形質移入した。形質移入から４時間、２４時間、または４８時間時に、ＮａＣｌ及び／またはバルプロ酸Ｎａを培養物に添加した。試験したＮａＣｌ及びバルプロ酸Ｎａの濃度は、０、３０ｍＭ、及び６０ｍＭのＮａＣｌ、ならびに０、１ｍＭ、及び２ｍＭのバルプロ酸Ｎａとした。１６８時間ＥＣＤ時、すなわち形質移入から５日後に培養物の上清を収集した。得られたｒＡＡＶ収量を図２に示す。実験計画法戦略を用いて、２４の異なる条件を試験し解析した。２４条件によるＤＯＥ（実験計画法）試験から作成されたモデルにより、形質移入から４時間後に２ｍＭのバルプロ酸Ｎａを添加し、次いで形質移入から２４時間後に３０ｍＭのＮａＣｌを添加することでウイルス収量が顕著に増強されることが予測された。
【０１３７】
実施例３．ＮａＣｌエンハンサーを用いたｒＡＡＶの大規模生産。
導入遺伝子をカプシド形成するＡＡＶ８粒子を発現するＨＥＫ２９３細胞の５０リットル培養物で、ＮａＣｌがｒＡＡＶ収量にもたらす効果について試験した。標準的なプロセスを用いて、ＨＥＫ浮遊培養物を成長させた。細胞を約４×１０ｅ６生細胞まで希釈した。使用した培地には、１００ｍＭのＮａＣｌが含まれていた。希釈から２４時間後、ポリエチレンイミンと、アデノウイルスヘルパー機能、導入遺伝子、及びＡＡＶ  Ｃａｐ／Ｒｅｖをコードする３つのプラスミドとの混合物を細胞に形質移入した。形質移入から２４時間後に、十分なＮａＣｌを添加して最終ＮａＣｌ濃度を６０ｍＭだけ増加させた（すなわち、最終ＮａＣｌ濃度を約１６０ｍＭとした）。形質移入から４日後に上清を収集した。これらの処理により、１×１０ｅ＋１１ゲノムコピー（ＧＣ）／ｍｌ及び９×１０ｅ＋１０が得られた。これは、形質移入後にＮａＣｌ濃度を増加させない同じプロセスで得られる収量よりも約２倍高い。
【０１３８】
実施例４．ＮａＣｌ及びプロピオン酸ナトリウムを用いたＡＡＶの大規模生産。
導入遺伝子をカプシド形成するＡＡＶ８粒子を発現するＨＥＫ２９３細胞の５０リットル培養物で、ＮａＣｌがｒＡＡＶ収量にもたらす効果について試験した。標準的なプロセスを用いて、ＨＥＫ浮遊培養物を成長させた。細胞を約４×１０ｅ６生細胞まで希釈した。使用した培地には、１００ｍＭのＮａＣｌが含まれていた。希釈から２４時間後、ポリエチレンイミンと、アデノウイルスヘルパー機能、導入遺伝子、及びＡＡＶ  ２／８  Ｒｅｐ／Ｃａｐをコードする３つのプラスミドとの混合物を細胞に形質移入した。形質移入から２４時間後に、十分なＮａＣｌを添加して最終ＮａＣｌ濃度を３０ｍＭだけ増加させた（すなわち、最終ＮａＣｌ濃度を約１３０ｍＭとした）。そして、十分なプロピオン酸ナトリウム（ＮａＰｒ）を添加して、最終ＮａＰｒ濃度を２ｍＭまで増加させた（開始時ＮａＰｒは培地中に存在しない）。形質移入から４日後に上清を収集した。これらの処理により、１×１０ｅ＋１１ゲノムコピー（ＧＣ）／ｍｌが得られた。これは、形質移入後にＮａＣｌ及びＮａＰｒの濃度を増加させない同じプロセスで得られる収量よりも約１．７倍高いものであった。図３。また、力価が質を損なうことなく顕著に上昇した。生成物品質、例えば、完全カプシド％、フラグメント化ｒＡＡＶ％、及び残存ＤＮＡ、例えば、残存１８Ｓ（残存哺乳類ゲノムＤＮＡを推定するために使用される１８Ｓ  ＲＮＡ遺伝子）、残存Ｅ１ａ、及び残存プラスミドは、エンハンサーを伴わない類似のプロセスと比較すると、エンハンサーを含むスケールアップ生成プロセスによる負の影響を受けなかった。
【０１３９】
実施例５．塩化ナトリウム及び／またはプロピオン酸ナトリウムがｒＡＡＶ収量にもたらす効果。
導入遺伝子をカプシド形成するｒＡＡＶ９粒子を発現するＨＥＫ２９３細胞の浮遊培養において、塩化ナトリウム及びプロピオン酸ナトリウム（ＮａＰｒ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）がｒＡＡＶ収量にもたらす効果。１×１０ｅ６生細胞／ｍｌ密度のＨＥＫ２９３細胞をアドバンストマイクロスケールバイオリアクターに播種した。培地には、１００ｍＭのＮａＣｌが含まれていた。４８時間ＥＣＤ（培養経過期間）時に、ポリエチレンイミンと、アデノウイルスヘルパー機能、導入遺伝子、及びＡＡＶ  ２／９  Ｒｅｐ／Ｃａｐをコードする３つのプラスミドとの混合物を細胞に形質移入した。形質移入から４、２０、または３６時間後、ＮａＣｌ、ＮａＰｒ、抗凝集剤、ＥＦＣ＋、及び／またはバルプロ酸Ｎａを培養物に添加した。試験条件は、０、３０ｍＭ、及び６０ｍＭのＮａＣｌ、０、２ｍＭ、及び４ｍＭのＮａＰｒとした。実験計画法アプローチを用いて複数の条件を試験した。１６８時間ＥＣＤ時、すなわち形質移入から５日後に培養物の上清を収集し、ｒＡＡＶ収量を得た。形質移入から２０時間後に３０ｍＭの塩化ナトリウム及び２ｍＭのプロピオン酸ナトリウムの両方を添加することにより、ウイルス収量が著しくかつ相乗的に改善した。ＮａＣｌ及び／またはＮａＰｒを添加することによって得られる力価の改善を図４（他の試験条件の効果を平均している）に示す。ＮａＣｌの増加なしで２ｍＭのプロピオン酸ナトリウムを投与した結果、力価が約１．５倍増加した。プロピオン酸ナトリウムなしでＮａＣｌを増加させた結果、力価が約１．２倍増加した。一方、２ｍＭプロピオン酸ナトリウムとＮａＣｌ増加とを組み合わせた結果、形質移入後のＮａＣｌ及びＮａＰｒ濃度の増加を伴わない同じプロセスのベースライン収量よりも収量が約２倍高くなった。観察された約２倍の増加は、ＮａＰｒ及びＮａＣｌ増加の効果が相加的である場合に予想される増加よりも高い。
【０１４０】
実施例６．塩化ナトリウム及び／またはプロピオン酸ナトリウムがｒＡＡＶ収量にもたらす効果。
導入遺伝子をカプシド形成するｒＡＡＶ９粒子を発現するＨＥＫ２９３細胞の浮遊培養において、塩化ナトリウム及びプロピオン酸ナトリウム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）がｒＡＡＶ収量にもたらす効果。１×１０ｅ６生細胞／ｍｌ密度のＨＥＫ２９３細胞をアドバンストマイクロスケールバイオリアクターに播種した。培地には、１００ｍＭのＮａＣｌが含まれていた。４８時間ＥＣＤ（培養経過期間）時に、ポリエチレンイミンと、アデノウイルスヘルパー機能、導入遺伝子、及びＡＡＶ  ２／９  Ｒｅｐ／Ｃａｐをコードする３つのプラスミドとの混合物を細胞に形質移入した。形質移入から２０時間後、ＮａＣｌ及びプロピオン酸ナトリウム（ＮａＰｒ）を培養物に添加した。試験条件は、０及び３０ｍＭのＮａＣｌ、０及び２ｍＭのＮａＰｒとした。実験計画法戦略を用いて、条件の組合せを複数の反応条件で試験した。１６８時間ＥＣＤ時、すなわち形質移入から５日後に培養物の上清を収集し、ｒＡＡＶ収量を得た。形質移入から２０時間後に３０ｍＭの塩化ナトリウム及び２ｍＭのプロピオン酸ナトリウムの両方を添加することにより、ウイルス収量が著しく改善した。ＮａＣｌ及び／またはＮａＰｒを添加することによる力価の改善を図５（他の試験条件の効果を平均している）に示す。これは、形質移入後にＮａＣｌ及びＮａＰｒの濃度を増加させない同じプロセスで得られる収量よりも約１．６倍高い。
【０１４１】
本開示の方法は、現在最も実用的で好ましい実施形態であると考えられるものと共に説明してきたが、本開示に包含される方法は、開示された実施形態に限定されるべきではなく、逆に、添付の請求項の趣旨及び範囲に含まれる様々な変更及び同等のアレンジを網羅するように意図されていることを理解されたい。
【０１４２】
本明細書で引用された全ての刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、及びアクセッション番号／データベースの配列（ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の両方を含む）は、各々の個別の刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、またはアクセッション番号／データベースの配列が、具体的かつ個別に参照によって援用されるのと同程度に、あらゆる目的において、参照によりこれらの全体が本明細書に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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