(57)【要約】  半減期が延長された、ポリアルキレングリコールと結合した血液凝固第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質及びその製造方法、並びに応用であって、血液凝固第ＶＩＩＩ因子の活性化部分は、融合パートナーに直接的に連結されるか、又はペプチドリンカーによって間接的に連結され、また、前記融合タンパク質は、さらにポリアルキレングリコールと結合されている。ポリアルキレングリコールで修飾されていないＦＶＩＩＩ融合タンパク質と比較して、その半減期は、顕著に向上している。
2021530437.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリアルキレングリコールと結合する血液凝固第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質であって、血液凝固第ＶＩＩＩ因子の活性化部分（ＦＶＩＩＩ）は、半減期を延長させる融合パートナーと直接的に連結されるか、又はペプチドリンカーで間接的に連結されて前記融合タンパク質を形成し、前記融合タンパク質は、さらに、ポリアルキレングリコールに結合される、融合タンパク質。
【請求項２】
前記血液凝固第ＶＩＩＩ因子の活性化部分は、ヒトに由来し、例えば、全長型または切断型ヒト血液凝固第ＶＩＩＩ因子であり、例えば、Ｂドメイン欠失型ヒト血液凝固第ＶＩＩＩ因子であり、前記全長型または切断型ヒト血液凝固第ＶＩＩＩ因子は、そのＦＶＩＩＩ活性が維持される条件で、１つ又は複数のアミノ酸突然変異を含んでもよく、例えば、前記血液凝固第ＶＩＩＩ因子の活性化部分は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又は２に示されるアミノ酸配列を含み、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又は２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％又はそれ以上の相同性を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記融合パートナーは、免疫グロブリンＦｃ断片、アルブミン、トランスフェリン又はＸＴＥＮであり、これらの融合パートナーは、例えば、ヒトに由来し、好ましくは、ＩｇＧ  Ｆｃ断片であり、例えば、前記ＩｇＧ  Ｆｃ断片は、低下したＡＤＣＣ効果及び／又はＣＤＣ効果、及び／又はＦｃＲｎ受容体との強化された結合親和性を有し、より好ましくは、前記ＩｇＧ  Ｆｃ断片は、
（ｉ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列、
（ｉｉ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列、又は
（ｉｉｉ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を有する、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記ポリアルキレングリコールは、ポリプロピレングリコール又はポリエチレングリコールであり、前記ポリアルキレングリコールは、末端がエンドキャップされてもよく、例えば、アルコキシ基、例えば、メトキシ基でエンドキャップされ、及び／又は、前記ポリアルキレングリコールは、直鎖状又は分岐鎖状であり、好ましくは、前記ポリアルキレングリコールは、分岐鎖状であり、例えば、分岐型ポリエチレングリコール、特に、メトキシ基でエンドキャップされた分岐型ポリエチレングリコールであり、前記ポリアルキレングリコールの分子量は、１ｋＤａ以上、１０ｋＤａ以上、２０ｋＤａ以上、３０ｋＤａ以上、４０ｋＤａ以上、５０ｋＤａ以上、６０ｋＤａ以上、７０ｋＤａ以上、８０ｋＤａ以上、９０ｋＤａ以上、１００ｋＤａ以上、１１０ｋＤａ以上、１２０ｋＤａ以上、１３０ｋＤａ以上、１４０ｋＤａ以上、１５０ｋＤａ以上又は１６０ｋＤａ以上、例えば、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、７０ｋＤａ、８０ｋＤａ、９０ｋＤａ又は１００ｋＤａであり、又は上記のいずれか２つの数値の間の値である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記融合タンパク質とポリアルキレングリコールの結合はランダムな結合又は部位特異的結合であり、前記結合部位は、遊離アミノ基、チオール基、グリコシル基及び／又はカルボキシル基から選ばれ、好ましくは、遊離アミノ基である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
任意の適合な修飾剤を使用し前記結合を達成し、前記修飾剤は、活性化エステル形態の修飾剤又は他のメカニズムによる修飾剤であってもよく、例えば、以下の式（１）、（２）又は（３）に示される修飾剤から選ばれる、請求項５に記載の融合タンパク質。
【化１】
2021530437.tif 000021
式（１）
（ここで、０≦ｍ１≦６、ｍ１は５であることが好ましく、ｍＰＥＧはメトキシ基で片末端がエンドキャップされたポリエチレングリコール基を示す。）
【化２】
2021530437.tif 000022
又は
式（２）
（ここで、０≦ｍ２≦６、ｍ２は２であることが好ましく、０≦ｍ３≦６、ｍ３は１であることが好ましく、ｍＰＥＧはメトキシ基で片末端がエンドキャップされたポリエチレングリコール基を示す。）
【化３】
2021530437.tif 000023
式（３）
（ここで、０≦ｍ４≦６、ｍ４は２であることが好ましく、ｍＰＥＧはメトキシ基で片末端がエンドキャップされたポリエチレングリコール基を示す。）
【請求項７】
前記血液凝固第ＶＩＩＩ因子の活性化部分は、前記融合パートナーとペプチドリンカーによって連結され、前記ペプチドリンカーは、可撓性ペプチドリンカー及び／又は剛性単位を含み、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上の前記剛性単位を含んでもよい、請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記可撓性ペプチドリンカーは、グリシン、セリン、アラニン及びスレオニンから選ばれるアミノ酸残基の２つ又はそれ以上を含み、
好ましくは、前記可撓性ペプチドリンカーは、一般式（ＧＳ）ａ（ＧＧＳ）ｂ（ＧＧＧＳ）ｃ（ＧＧＧＧＳ）ｄで表される配列を有し、
（ここで、ａ、ｂ、ｃ及びｄは、０以上の整数であり、且つａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ≧１。）
より好ましくは、前記可撓性ペプチドリンカーは、
（ｉ）ＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６）、
（ｉｉ）ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７）、
（ｉｉｉ）ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８）、
（ｉｖ）ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９）、又は
（ｖ）ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０）からなる群より選ばれる配列を有する、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記剛性単位は、ヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのカルボキシ末端ペプチドであるか、又はヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのカルボキシ末端ペプチドのアミノ酸配列と７０％、８０％、９０％、９５％又はそれ以上の相同性を有し、前記剛性単位は、１つ、２つ又はそれ以上のグリコシル化部位を含んでもよく、
好ましくは、前記剛性単位は、
（ｉ）  ＰＲＦＱＤＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１）、
（ｉｉ）  ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２）、
（ｉｉｉ）  ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １３）、又は
（ｉｖ）  ＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １４）から選ばれるアミノ酸配列を含み、
より好ましくは、前記ペプチドリンカーは  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １５に示されるアミノ酸配列を含む、請求項７又は８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
有効量の請求項１〜９中のいずれか１項に記載の融合タンパク質、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１１】
出血性疾患の予防及び／又は治療方法であって、それを必要とする対象へ請求項１〜９中のいずれか１項に記載の融合タンパク質又は請求項１０に記載の医薬組成物を投与することを含み、前記出血性疾患は、ＦＶＩＩＩ先天性又は後天性欠乏症患者の出血性疾患、及び血友病Ａ患者の自発性または手術出血から選ばれることが好ましい、出血性疾患の予防及び／又は治療方法。
【発明の詳細な説明】
【相互参照】
【０００１】
本願は、２０１８年５月１８日に中国特許庁へ提出された、発明の名称が「改良されたＦＶＩＩＩ融合タンパク質及びその応用」、出願番号が２０１８１０４８１９４１．Ｘである中国特許出願に基づき優先権を主張し、その全内容は、援用により本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、組換えヒト凝固因子ＶＩＩＩ融合タンパク質の分野に関し、特に、半減期が延長された融合ポリペプチド及びその製造方法、並びにその応用に関する。
【背景技術】
【０００３】
血友病Ａは、血液凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）活性の欠如または機能不全によって引き起こされる遺伝性出血性障害症である。活性型ＦＶＩＩＩの補給は、血友病Ａを治療するための効果的な手段である。ＦＶＩＩＩ分子は、今までにクローン化された最長の遺伝子断片の１つであり、臨床的に使用される最大の分子量を持つタンパク質医薬品である。３つのＡドメイン（Ａ１、Ａ２、Ａ３）、１つの必須ではない中央ドメイン（Ｂ−ドメイン）及び２つのＣドメイン（Ｃ１、Ｃ２）という６つのドメインに分けられる。しかしながら、ＦＶＩＩＩの体外での組換え発現量は、他の性質が類似する遺伝子よりも明らかに低く、例えば、ＦＶＩＩＩの発現レベルはＦＩＸのわずか１％である。さらに、ＦＶＩＩＩの血液における半減期が相対的に短く、わずか８〜１２時間であるため、重篤な血友病Ａ患者は予防的治療を受ける場合、週に約３回静脈内（ｉ．ｖ．）注射を行わなければならない。
【０００４】
米国Ｂｉｏｖｅｒａｔｉｖ社により開発された単量体−二量体ハイブリッド型の組換えＦＶＩＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質（Ｅｌｏｃｔａｔｅ）：２０１４年６月に米国ＦＤＡによって発売が許可された。臨床データによれば、ヒト体内で半減期が１．５〜１．７倍しか延長されず（Ｄｕｍｏｎｔ  Ｊ  Ａら、Ｂｌｏｏｄ、  ２０１２、１１９：３０２４−３０３０；Ｐｏｗｅｌｌ  ＪＳ等、  Ｂｌｏｏｄ、  ２０１２、  １１９：３０３１−３０３７）、３〜５日ごとに１回注射する必要があることが示された。しかしながら、Ｂｉｏｖｅｒａｔｉｖ社が構築したｒＦＶＩＩＩ  Ｆｃ及びＦｃ二重発現ベクターをＨＥＫ−２９３細胞にトランスフェクトし、その発現産物には、ｒＦＶＩＩＩＦｃホモ二量体の形式の融合体が検出されることを予期せず、単量体−二量体ハイブリッド型のｒＦＶＩＩＩＦｃ融合タンパク質及びＦｃ二量体しか発現されなかった。該社の研究者は、採用した発現システムはホモ二量体型の分子量が大きすぎるため、宿主細胞は分子量が約４００ｋＤａのｒＦＶＩＩＩＦｃホモ二量体タンパク質を分泌することができず、またはｒＦＶＩＩＩＦｃ単量体間の立体障害効果により重合できないことを可能な原因として推測した（  Ｐｅｔｅｒｓ  ＲＴら、Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  、２０１３  、１１（１  ）：１３２−４１）、これにより、ホモ二量体型ＦＶＩＩＩ融合タンパク質の発現はかなり難しいことが分かった。
【０００５】
タンパク類医薬品の長時間作用型製剤の調製には、通常、溶解度の高いポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を使用してタンパク類医薬品の表面を化学的に修飾する。一般的には、修飾率が高いほど、タンパク質の抗原性の低下が明らかになり、活性の損失も大きくなる。現在、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でＦＶＩＩＩの半減期が延長されることが報告されており、Ｎｏｖｏｎｏｒｄｉｓｋ（Ｎ８−ＧＰ）、Ｂａｙｅｒ（ＢＡＹ９４−９０２７）及びＢａｘｔｅｒ（Ｂａｘ  ８５５）社は、いずれもＰＥＧ化した長時間作用型ＦＶＩＩＩ製品を開発し、且つ臨床研究に入った。しかしながら、薬物動態学的研究データによれば、ＰＥＧ化したＦＶＩＩＩが著しく延長された半減期を取得していない（Ｔｉｅｄｅ  Ａら、Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．  ２０１３；１１：６７０−６７８）；  （Ｃｏｙｌｅ  Ｔら、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ．  ２０１２；１８（Ｓｕｐｐｌ  ３）：２２）；（Ｔｕｒｅｃｅｋ  ＰＬら、Ｈａｍｏｓｔａｓｅｏｌｏｇｉｅ、２０１２、３２  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ２９−３８）ことが示された。
【０００６】
長時間作用型タンパク質薬物を達成するための戦略には、グリコシル化改造、ＰＥＧ化、アルブミン融合、トランスフェリン融合、Ｆｃ融合、ＸＴＥＮ融合などが含まれる。市販されている長時間作用型医薬品は、半減期を延長するための上記戦略の１つのみを使用する。上記戦略の２つ以上を組み合わせる、特に、ＰＥＧ化と融合タンパク質を組み合わせることに関する文献報告はなく、上記策略の２つ以上を使用すると、単一戦略よりも半減期をさらに延長させることができるという文献報告もない。
血友病患者は、止血又は出血予防のために凝固因子の生涯にわたる注射を必要とし、従って、研究者は、投与回数を減らすために、より長い半減期の凝固因子を継続的に探す必要がある。また、半減期を延長しながら良好な生物活性を維持する方法は、研究者が直面する困難な問題になる。
【発明の概要】
【０００７】
発明者は、長年研究及び長期実験を行った結果、凝血因子ＶＩＩＩを融合パートナー（例えば、Ｆｃ領域、アルブミン、ＸＴＥＮ又はトランスフェリン）と融合し、同時にコンジュゲート（例えば、ポリアルキレングリコール、さらに、ｍＰＥＧを含むＰＥＧ）と結合する修飾手段により、例えば、ＰＥＧ（ｍＰＥＧを含む）修飾法は、ｉｎｖｉｖｏでのポリペプチドの安定性を効果的に改善でき、ポリペプチドの生体内安定性を効果的に向上でき、結合部分に分岐鎖構造（又は、分岐構造と呼ばれる）を有する場合、特に、結合部分の分子量が３５ＫＤ以上、例えば、４０ＫＤである場合には、タンパク質の生体内安定性を顕著に向上できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の実施形態を提供する。
１．ポリアルキレングリコールと結合する血液凝固第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質であって、血液凝固第ＶＩＩＩ因子の活性化部分（ＦＶＩＩＩ）が半減期を延長させる融合パートナーに直接的に連結されるか、又はペプチドリンカーで間接的に連結されて融合タンパク質を形成し、且つ前記融合タンパク質がさらにポリアルキレングリコールと結合する、融合タンパク質。
２．前記血液凝固第ＶＩＩＩ因子の活性化部分はヒトに由来し、例えば、全長型または切断型ヒト血液凝固第ＶＩＩＩ因子、例えば、Ｂドメイン欠失型ヒト血液凝固第ＶＩＩＩ因子であり、前記全長型または切断型ヒト血液凝固第ＶＩＩＩ因子はそのＦＶＩＩＩ活性が維持される条件で１つ又は複数のアミノ酸突然変異を含んでもよく、例えば、前記血液凝固第ＶＩＩＩ因子の活性化部分はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又は２に示されるアミノ酸配列を含むか、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又は２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％又はそれ以上の相同性を有する、実施形態１に記載の融合タンパク質。
３．前記融合パートナーは、免疫グロブリンＦｃ断片、アルブミン、トランスフェリン又はＸＴＥＮであり、これらの融合パートナーは、例えば、ヒトに由来し、好ましくはＩｇＧ  Ｆｃ断片であり、例えば、前記ＩｇＧ  Ｆｃ断片は低下したＡＤＣＣ効果及び／又はＣＤＣ効果、及び／又はＦｃＲｎ受容体との強化された結合親和性を有し、より好ましくは、前記ＩｇＧ  Ｆｃ断片は、
（ｉ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列、
（ｉｉ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列、又は
（ｉｉｉ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示されるアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有する、実施形態１又は２に記載の融合タンパク質。
４．前記ポリアルキレングリコールは、ポリプロピレングリコール又はポリエチレングリコールであり、前記ポリアルキレングリコールは、末端がエンドキャップされてもよく、例えば、アルコキシ基、例えばメトキシ基でエンドキャップされ、及び／又は前記ポリアルキレングリコールは、直鎖状又は分岐鎖状であり、好ましくは、前記ポリアルキレングリコールは分岐鎖状であり、例えば、分岐型ポリエチレングリコール、特に、メトキシ基でエンドキャップされた分岐型ポリエチレングリコールであり、前記ポリアルキレングリコールの分子量は、１ｋＤａ以上、１０ｋＤａ以上、２０ｋＤａ以上、３０ｋＤａ以上、４０ｋＤａ以上、５０ｋＤａ以上、６０ｋＤａ以上、７０ｋＤａ以上、８０ｋＤａ以上、９０ｋＤａ以上、１００ｋＤａ以上、１１０ｋＤａ以上、１２０ｋＤａ以上、１３０ｋＤａ以上、１４０ｋＤａ以上、１５０ｋＤａ以上又は１６０ｋＤａ以上であってもよく、例えば、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、７０ｋＤａ、８０ｋＤａ、９０ｋＤａ又は１００ｋＤａであり、或いは上記のいずれか２つの数値の間の値である、実施形態１〜３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
５．前記融合タンパク質とポリアルキレングリコールの結合はランダムな結合又は部位特異的結合であり、前記結合部位は、遊離アミノ基、チオール基、グリコシル基及び／又はカルボキシル基から選ばれ、好ましくは、遊離アミノ基である、実施形態１〜４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
６．任意の活性化エステルの形態の修飾剤を使用して前記結合を達成し、例えば、以下の式（１）、（２）又は（３）に示される修飾剤から選ばれ、本明細書におけるポリアルキレングリコール又は修飾ポリアルキレングリコールである修飾剤を使用して前記結合を達成する、実施形態５に記載の融合タンパク質。
【０００９】
【化１】
2021530437.tif 000003
【００１０】
（ここで、０≦ｍ１≦６、ｍ１は５であることが好ましく、ｍＰＥＧはメトキシ基で片末端がエンドキャップされたポリエチレングリコール基を示す。）
【００１１】
【化２】
2021530437.tif 000004
【００１２】
（ここで、０≦ｍ２≦６、ｍ２は２であることが好ましく、０≦ｍ３≦６、ｍ３は１であることが好ましく、ｍＰＥＧはメトキシ基で片末端がエンドキャップされたポリエチレングリコール基を示す。）
【００１３】
【化３】
2021530437.tif 000005
【００１４】
（ここで、０≦ｍ４≦６、ｍ４は２であることが好ましく、ｍＰＥＧはメトキシ基で片末端がエンドキャップされたポリエチレングリコール基を示す。）
７．前記血液凝固第ＶＩＩＩ因子の活性化部分と前記融合パートナーは、ペプチドリンカーによって連結され、前記ペプチドリンカーは可撓性ペプチドリンカー及び／又は剛性単位を含み、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上の前記剛性単位を含んでもよい、実施形態１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
８．可撓性ペプチドリンカーは、グリシン、セリン、アラニン及びスレオニンから選ばれるアミノ酸残基の２つ又はそれ以上を含み、
好ましくは、前記可撓性ペプチドリンカーは、一般式（ＧＳ）ａ（ＧＧＳ）ｂ（ＧＧＧＳ）ｃ（ＧＧＧＧＳ）ｄで表される配列を有し、
（ここで、ａ、ｂ、ｃ及びｄは、０以上の整数であり、且つａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ≧１）、
より好ましくは、前記可撓性ペプチドリンカーは、
（ｉ）ＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６）、
（ｉｉ）ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７）、
（ｉｉｉ）ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８）、
（ｉｖ）ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９）、又は
（ｖ）ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０）からなる群より選ばれる配列を有する、実施形態７に記載の融合タンパク質。
９．前記剛性単位は、ヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのカルボキシ末端ペプチドであり、或いはヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのカルボキシ末端ペプチドのアミノ酸配列と７０％、８０％、９０％、９５％又はそれ以上の相同性を有し、前記剛性単位は、１つ、２つ又はそれ以上のグリコシル化部位を含んでもよく、
好ましくは、前記剛性単位は、
（ｉ）  ＰＲＦＱＤＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１）、
（ｉｉ）  ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２）、
（ｉｉｉ）  ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １３）、又は
（ｉｖ）  ＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １４）から選ばれるアミノ酸配列を含む、
より好ましくは、前記ペプチドリンカーは  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １５に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態７又は８に記載の融合タンパク質。
【００１５】
１０．有効量の実施形態１〜９のいずれか１項に記載の融合タンパク質、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
１１．出血性疾患の予防及び／又は治療方法であって、それを必要とする対象へ実施形態１〜９のいずれか１項に記載の融合タンパク質又は実施形態１０に記載の医薬組成物を投与することを含み、前記出血性疾患は、ＦＶＩＩＩ先天性又は後天性欠乏症患者の出血性疾患及び血友病Ａ患者の自発性または手術出血から選ばれることが好ましい、出血性疾患の予防及び／又は治療方法。
【００１６】
１２．血液凝固第ＶＩＩＩ因子の活性化部分を、半減期を延長させる融合パートナーと直接的に連結するか、又はペプチドリンカーで間接的に連結し、さらにポリアルキレングリコールと結合する、血液凝固第ＶＩＩＩ因子の半減期を改良する方法。
１３．前記融合パートナーは、免疫グロブリンＦｃ断片、アルブミン、ＸＴＥＮ又はトランスフェリンであり、これらの融合パートナーは、例えば、ヒトに由来し、好ましくは、ＩｇＧ  Ｆｃ断片であり、例えば、前記ＩｇＧ  Ｆｃ断片は、低下したＡＤＣＣ効果及び／又はＣＤＣ効果、及び／又はＦｃＲｎ受容体との強化された結合親和性を有し、より好ましくは、前記ＩｇＧ  Ｆｃ断片は、
（ｉ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列、
（ｉｉ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列、又は
（ｉｉｉ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を有する、実施形態１２に記載の方法。
１４．前記ポリアルキレングリコールは、ポリプロピレングリコール又はポリエチレングリコールであり、前記ポリアルキレングリコールは、末端がエンドキャップされてもよく、例えば、アルコキシ基、例えばメトキシ基でエンドキャップされ、及び／又は前記ポリアルキレングリコールは、直鎖状又は分岐鎖状であり、好ましくは、前記ポリアルキレングリコールは分岐鎖状であり、例えば、分岐型ポリエチレングリコール、特に、メトキシ基でエンドキャップされた分岐型ポリエチレングリコールであり、前記ポリアルキレングリコールの分子量は、１ｋＤａ以上、１０ｋＤａ以上、２０ｋＤａ以上、３０ｋＤａ以上、４０ｋＤａ以上、５０ｋＤａ以上、６０ｋＤａ以上、７０ｋＤａ以上、８０ｋＤａ以上、９０ｋＤａ以上、１００ｋＤａ以上、１１０ｋＤａ以上、１２０ｋＤａ以上、１３０ｋＤａ以上、１４０ｋＤａ以上、１５０ｋＤａ以上又は１６０ｋＤａ以上、例えば、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、７０ｋＤａ、８０ｋＤａ、９０ｋＤａ又は１００ｋＤａであり、又はそれらのいずれか２つの数値の間の値である、実施形態１２又は１３に記載の方法。
１５．前記融合タンパク質とポリアルキレングリコールの結合はランダムな結合又は部位特異的結合であり、前記結合部位は、遊離アミノ基、チオール基、グリコシル基及び／又はカルボキシル基から選ばれ、例えば、遊離アミノ基である、実施形態１２〜１４中のいずれか１項に記載の方法。
１６．修飾剤を使用して前記結合を達成し、前記修飾剤は、好ましくは、活性化エステルの形態の修飾剤であり、より好ましくは、以下の式（１）、（２）又は（３）から選ばれ、本明細書におけるポリアルキレングリコール又は修飾ポリアルキレングリコールである修飾剤である、実施形態１２〜１５中のいずれか１項に記載の方法。
【００１７】
【化４】
2021530437.tif 000006
【００１８】
（ここで、０≦ｍ１≦６、ｍ１は５であることが好ましく、ｍＰＥＧ−はメトキシ基で片末端がエンドキャップされたポリエチレングリコール基を示し、式（１）に示される修飾剤の分子量は、５ＫＤ〜６０ＫＤである。）
【００１９】
【化５】
2021530437.tif 000007
【００２０】
（ここで、０≦ｍ２≦６、ｍ２は２であることが好ましく、０≦ｍ３≦６、ｍ３は１であることが好ましく、ｍＰＥＧ−はメトキシ基で片末端がエンドキャップされたポリエチレングリコール基を示し、式（２）に示される修飾剤の分子量は、５ＫＤ〜１００ＫＤ、好ましくは、４０ＫＤ、５０ＫＤ、６０ＫＤ、最も好ましくは、４０ＫＤである。）
【００２１】
【化６】
2021530437.tif 000008
【００２２】
（ここで、０≦ｍ４≦６、ｍ４は２であることが好ましく、ｍＰＥＧ−はメトキシ基で片末端がエンドキャップされたポリエチレングリコール基を示し、式（３）に示される修飾剤の分子量は、５ＫＤ〜１００ＫＤである。）
１７．前記血液凝固第ＶＩＩＩ因子は、前記融合パートナーとペプチドリンカーによって連結され、前記ペプチドリンカーは、可撓性ペプチドリンカー及び／又は剛性単位を含み、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上の前記剛性単位を含んでもよく、実施形態１２〜１６のいずれか１項に記載の方法。
１８．前記可撓性ペプチドリンカーは、グリシン、セリン、アラニン及びスレオニンから選ばれるアミノ酸残基の２つ又はそれ以上を含み、
好ましくは、前記可撓性ペプチドリンカーは、一般式（ＧＳ）ａ（ＧＧＳ）ｂ（ＧＧＧＳ）ｃ（ＧＧＧＧＳ）ｄで表される配列を有し、
（ここで、ａ、ｂ、ｃ及びｄは、０以上の整数であり、且つａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ≧１。）
より好ましくは、前記可撓性ペプチドリンカーは、
（ｉ）ＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６）、
（ｉｉ）ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７）、
（ｉｉｉ）ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８）、
（ｉｖ）ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９）、又は
（ｖ）ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０）からなる群より選ばれる配列を有する、実施形態１７に記載の方法。
１９．前記剛性単位は、ヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのカルボキシ末端ペプチドであり、又はヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのカルボキシ末端ペプチドのアミノ酸配列と７０％、８０％、９０％、９５％又はそれ以上の相同性を有し、前記剛性単位は、１つ、２つ又はそれ以上のグリコシル化部位を含んでもよく、
好ましくは、前記剛性単位は、
（ｉ）  ＰＲＦＱＤＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１）、
（ｉｉ）  ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２）、
（ｉｉｉ）  ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １３）、又は
（ｉｖ）  ＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １４）から選ばれるアミノ酸配列を含み、
より好ましくは、前記ペプチドリンカーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １５に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１７又は１８に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
以下、本発明の実施形態及び先行技術に係る技術案をより明確に説明するために、実施形態及び先行技術に必要な図面を簡単に紹介するが、以下の説明の図面は単に本発明の幾つかの実施形態に過ぎず、当業者にとっては、他の実施形態でも創造的な労働をせずこれらの図面に基づいて取得できることは自明である。
【００２４】
【図１ａ】図１ａは、ｍＰＥＧで修飾されていないＦＶＩＩＩ−Ｆｃ（ＦＦ−０）のＳＥＣ−ＨＰＬＣプロフィールである。
【図１ｂ】図１ｂは、分子量５ＫのｍＰＥＧで修飾されているＦＶＩＩＩ−Ｆｃ（ＦＦ−５Ｌ）のＳＥＣ−ＨＰＬＣプロフィールである。
【図１ｃ】図１ｃは、分子量１０ＫのｍＰＥＧで修飾されているＦＶＩＩＩ−Ｆｃ（ＦＦ−１０Ｌ）のＳＥＣ−ＨＰＬＣプロフィールである。
【図１ｄ】図１ｄは、分子量２０ＫのｍＰＥＧで修飾されているＦＶＩＩＩ−Ｆｃ（ＦＦ−２０Ｌ）のＳＥＣ−ＨＰＬＣプロフィールである。
【図１ｅ】図１ｅは、分子量３０ＫのｍＰＥＧで修飾されているＦＶＩＩＩ−Ｆｃ（ＦＦ−３０Ｌ）のＳＥＣ−ＨＰＬＣプロフィールである。
【図１ｆ】図１ｆは、分子量４０ＫのｍＰＥＧで修飾されているＦＶＩＩＩ−Ｆｃ（ＦＦ−４０Ｌ）のＳＥＣ−ＨＰＬＣプロフィールである。
【図２ａ】図２ａは、ｍＰＥＧで修飾されていないＦＶＩＩＩ−Ｌｉｎｋｅｒ１−Ｆｃ（ＦＬ１Ｆ−０）のＳＥＣ−ＨＰＬＣプロフィール（純度＞９９％、重合体＜１％）である。
【図２ｂ】図２ｂは、分子量２０ＫのｍＰＥＧで修飾されているＦＶＩＩＩ−Ｌ１−Ｆｃ（ＦＬ１Ｆ−２０Ｌ）のＳＥＣ−ＨＰＬＣプロフィール（純度＞９５％、重合体＜５％、非架橋＜１％）である。
【図２ｃ】図２ｃは、直鎖状、分子量３０ＫのｍＰＥＧで修飾されているＦＶＩＩＩ−Ｌ１−Ｆｃ（ＦＬ１Ｆ−３０Ｌ）のＳＥＣ−ＨＰＬＣプロフィール（純度＞９５％、重合体＜５％、非架橋＜１％）である。
【図２ｄ】図２ｄは、直鎖状、分子量４０ＫのｍＰＥＧで修飾されているＦＶＩＩＩ−Ｌ１−Ｆｃ（ＦＬ１Ｆ−４０Ｌ）のＳＥＣ−ＨＰＬＣプロフィール（純度＞９５％、重合体＜５％、非架橋＜１％）である。
【図２ｅ】図２ｅは、直鎖状、分子量５０ＫのｍＰＥＧで修飾されているＦＶＩＩＩ−Ｌ１−Ｆｃ（ＦＬ１Ｆ−５０Ｌ）のＳＥＣ−ＨＰＬＣプロフィール（純度＞９５％、重合体＜５％、非架橋＜１％）である。
【図２ｆ】図２ｆは、分子量４０ＫのＹ字型ｍＰＥＧで修飾されているＦＶＩＩＩ−Ｌ１−Ｆｃ（ＦＬ１Ｆ−４０Ｙ）のＳＥＣ−ＨＰＬＣプロフィール（純度＞９５％、重合体＜５％、非架橋＜１％）である。
【図３ａ】図３ａは、ｍＰＥＧで修飾されていないｈＦＶＩＩＩ−Ｆｃ（ＦＦ−０）ストック溶液のＧ２５によるバッファー交換前後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動図（Ｈは還元を表し、Ｆは非還元を表す）。
【図３ｂ】図３ｂは、ｈＦＶＩＩＩ−Ｆｃと異なる分子量のｍＰＥＧとの架橋（ＦＦ−５Ｌ〜ＦＦ−４０Ｌ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動図（非還元）である。
【図３ｃ】図３ｃは、ｈＦＶＩＩＩ−Ｆｃと異なる分子量のｍＰＥＧとの架橋（ＦＦ−５Ｌ〜ＦＦ−４０Ｌ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動図（還元）である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明の目的、技術案、及び利点をより明確にするために、図面及び実施形態により本発明をさらに詳細に説明する。記載された実施例は、全ての実施例ではなく、本発明の実施例の一部にすぎない。当業者は、本発明に係る実施例に基づいて、創造的な労働をせずに得られる他の実施形態も本発明の保護範囲に含まれる。
【００２６】
「血液凝固第ＶＩＩＩ因子」という用語は、第ＶＩＩＩ因子又はＦＶＩＩＩとも呼ばれ、主に肝細胞によって産生される大きくて複雑な糖タンパク質である。「血液凝固第ＶＩＩＩ因子の活性化部分」という用語は、本発明の融合タンパク質のＦＶＩＩＩ活性を示す部分である。天然ヒトＦＶＩＩＩは、２３５１個のアミノ酸からなり、シグナルペプチドを含み、同一性によって限定される若干の異なるドメインを含む。３つのＡドメイン、１つの特定のＢドメイン及び２つのＣドメインを備える。ドメインの順序は、ＮＨ２−Ａ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２−ＣＯＯＨのように列挙することができる。ＦＶＩＩＩは、Ｂ-Ａ３ボーダーで分離される２つの鎖として血漿中を循環する。これらの２つの鎖は二価の金属イオン結合により連結されている。Ａ１−Ａ２−Ｂ鎖は、重鎖（ＨＣ）と称されるが、Ａ３−Ｃ１−Ｃ２は、軽鎖（ＬＣ）と称される。
内在性第ＶＩＩＩ因子分子は、異なるサイズのＢドメインを有する分子のプールとして生体内で循環する。生体内でおそらく生じているものは、Ｂドメインの漸進的酵素切断であり、異なるサイズのＢドメインを有する分子のプールが生じる。７４０位での切断（それによりＢドメインの最後の部分は切断される）の発生がトロンビン活性化に関連して生じると一般に考えられている。
【００２７】
本発明に係る「血液凝固第ＶＩＩＩ因子」とは、その天然野生型配列（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を指し、その突然変異、例えば、血液凝固第ＶＩＩＩ因子の活性を維持しながら、１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は挿入の後に得られた変異体タンパク質も含まれる。
一つの実施形態において、血液凝固第ＶＩＩＩ因子は、Ｂドメイン切断型第ＶＩＩＩ因子分子であり、但し、残存するドメインは、基本的にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸番号１−７４５及び１６４０−２３３２に示される配列に対応する。さらに、本発明のＢドメイン切断型第ＶＩＩＩ因子分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示される配列とわずかに変異することが可能であり、即ち、残存するドメイン（即ち、３つのＡドメイン及び２つのＣドメイン）はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２に示されるアミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸が置換、付加又は欠失され、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０つ又はそれ以上のアミノ酸が異なり、或いは約１％、２％、３％、４％又は５％異なることを意味し、第ＶＩＩＩ因子の基本的な活性を維持する場合には、第ＶＩＩＩ因子と種々の他の成分（例えば、ＬＲＰ、複数の受容体、他の凝固因子、細胞表面）の結合能を改変し、グリコシル化部位などを導入及び／又は除去する。
【００２８】
「融合パートナー」という用語は、目的とするポリペプチド（即ち、半減期の延長が望まれるポリペプチド）と融合する他のポリペプチドを意味し、前記融合パートナーは、さまざまな異なるメカニズムを通じて融合タンパク質の機能を変え、例えば、生体内での目的とするポリペプチドの半減期を延長させることができる。
【００２９】
一つの実施形態において、融合パートナーは、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）と相互作用することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＦＶＩＩＩのクリアランスを遅延させる。一つの実施形態において、融合パートナーは、免疫グロブリンＦｃ領域（Ｆｃ領域）、アルブミン、トランスフェリン、ＸＴＥＮ又はその一部である。好ましい実施形態において、ＩｇＧ抗体は長い半減期があるため、ＩｇＧ  Ｆｃドメインであることが好ましい。
Ｆｃドメインは、他の機能を改善させるために、補体への結合及び／又は特定のＦｃ受容体への結合などの修飾を行うこともできる。ＩｇＧ  Ｆｃドメインの２３４、２３５及び２３７位での突然変異は、通常、ＦｃγＲＩ受容体との結合の低下をもたらし、ＦｃγＲＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩ受容体との結合の低下につながる可能性もある。これらの突然変異は、ＦｃＲｎ受容体への結合を変化させず、エンドサイトーシス再循環経路により、循環における半減期の延長を促進する。好ましくは、本発明の融合タンパク質の修飾ＩｇＧ  Ｆｃドメインは、以下の突然変異のうちの１または複数を含み、かかる突然変異は、それぞれ特定のＦｃ受容体に対する親和性の低下（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、及びＧ２３７Ａ）、及びＣ１ｑを介する補体結合性の低減（Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓ）をもたらす。
【００３０】
「ポリアルキレングリコール」は、親水性ポリマーであり、本発明では血液凝固第ＶＩＩＩ因子及び／又は融合パートナー上の特定の位置に結合する。ポリアルキレングリコールは、直鎖状又は分岐鎖状であり、且つ１つ又は複数の独立して選択された重合部分を含み、好ましくは、ポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコール（そのメトキシ基でエンドキャップされた形態のｍ−ＰＥＧを含む）、ポリプロピレングリコール（ｍＰＰＧを含む）などである。
【００３１】
本発明に係るポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であってもよく、それは、直鎖状又は分岐鎖状であってもよい。分岐鎖状のポリマーの主鎖は、当分野で周知であり、一般に、分岐鎖状ポリマーは、中央の分枝コア部分と、中央の分枝コアに結合する複数の直鎖状ポリマー鎖を有する。本発明では、分岐鎖状のＰＥＧを使用することが好ましい。１つの実施例において、分岐型ポリエチレングリコールは、一般式Ｒ（−ＰＥＧ−ＯＨ）ｍで表されることができ、ここで、Ｒは、コア部分、例えば、グリセロール又はペンタエリトリトールを表し、ｍはアームの数を表す。
一つの実施形態において、分岐鎖状のＰＥＧ（例えば、ｍＰＥＧ）中の分岐鎖の数は２であり、その場合には、「Ｙ字型」ＰＥＧ（例えば、ｍＰＥＧ）とも称され、２つのＰＥＧ又は直鎖状のメトキシＰＥＧを含む分岐型ＰＥＧを意味する。
他の適切なポリマーの実例は、他のポリアルキレングリコール（例えば、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、エチレングリコールとプロピレングリコールなどのコポリマー）、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリオレフィンアルコール（ｏｌｅｆｍｉｃ  ａｌｃｏｈｏｌ）、ポリビニルピロリドン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリ（［α］−ヒドロキシ酸）、ポリビニルアルコール、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）及びそのコポリマー、テルポリマー、及びこれらの混合物を含むが、これらに限定されない。
本発明のある実施形態において、ＰＥＧ修飾（即ち、結合）を使用し、より好ましくは、ｍＰＥＧ修飾を使用し、中でも、前記修飾は、ランダム修飾又は部位特異的修飾であり、前記修飾の部位は、遊離アミノ基、チオール基、グリコシル基及び／又はカルボキシル基を含むが、例えば、遊離アミノ基である。
【００３２】
本発明の具体的な実施形態において、遊離アミノ基のランダム修飾で使用され、本明細書におけるポリアルキレングリコールまたは修飾ポリアルキレングリコールである修飾剤は、ｍＰＥＧ−ＳＳ（メトキシポリエチレングリコール−こはく酸スクシンイミジル）、ｍＰＥＧ−ＳＣ（メトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルカーボネート）、ｍＰＥＧ−ＳＰＡ（メトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルプロピオネート）及びｍＰＥＧ−ＳＧ（メトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルグルタレート）などの１つを選択してもよい。Ｎ末端の修飾は、ｍＰＥＧ−ＡＬＤ（メトキシポリエチレングリコール−アセトアルデヒド）、ｍＰＥＧ−ｐＡＬＤ（メトキシポリエチレングリコール−プロピオンアルデヒド）及びｍＰＥＧ−ｂＡＬＤ（メトキシポリエチレングリコール−ブチルアルデヒド）などの１つから選ばれる。前記修飾剤ｍＰＥＧ−ＳＳ、ｍＰＥＧ−ＳＣ、ｍＰＥＧ−ＳＰＡ、ｍＰＥＧ−ＳＧ、ｍＰＥＧ−ＡＬＤ、ｍＰＥＧ−ｐＡＬＤ、ｍＰＥＧ−ｂＡＬＤは、直鎖又は分枝状である。
本発明の具体的な実施形態において、遊離チオール基のランダム修飾で用いられる修飾剤は、ｍＰＥＧ−ｍａｌ（メトキシポリエチレングリコール−マレイミド）、ｍＰＥＧ−ＯＰＳＳ（メトキシポリエチレングリコール−オルトピリジルジスルフィド）、ｍＰＥＧ−Ｖｉｎｙｌｓｕｌｆｏｎｅ（メトキシポリエチレングリコール−ビニルスルホン）及びｍＰＥＧ−Ｔｈｉｏｌ（メトキシポリエチレングリコール−メルカプタン）などの１つである。
【００３３】
本発明の具体的な実施形態において、前記のグリコシル基及び／又はカルボキシル基のランダム修飾で使用される修飾剤は、ｍＰＥＧ−ＺＨ（メトキシポリエチレングリコール−ヒドラジド）である。
本発明のある実施形態において、前記修飾の修飾剤の構造は、式（１）で表される。
【００３４】
【化７】
2021530437.tif 000009
【００３５】
ここで、０≦ｍ１≦６、ｍ１は５であることが好ましく、ｍＰＥＧ−はメトキシ基で片末端がエンドキャップされたポリエチレングリコール基を示し、式（１）に示される修飾剤の分子量は、５ｋＤ〜６０ｋＤ（ｋＤ、キロダルトン）、好ましくは４０ｋＤである。より好ましくは、本発明のある実施形態において、式（１）で表される修飾剤で遊離アミノ基のｍＰＥＧランダム修飾を行う。
【００３６】
本発明のある実施形態において、前記修飾の修飾剤の構造は、式（２）で表される。
【００３７】
【化８】
2021530437.tif 000010
【００３８】
ここで、０≦ｍ２≦６、ｍ２は２であることが好ましく、０≦ｍ３≦６、ｍ３は１であることが好ましく、ｍＰＥＧ−はメトキシ基で片末端がエンドキャップされたポリエチレングリコール基を示し、式（２）に示される修飾剤の分子量は５ｋＤ〜６０ｋＤ、好ましくは、４０ｋＤである。より好ましくは、本発明のある実施形態において、式（２）で表される修飾剤で遊離アミノ基のｍＰＥＧランダム修飾を行う。
【００３９】
本発明のある実施形態において、前記修飾の修飾剤の構造は、式（３）で表される。
【００４０】
【化９】
2021530437.tif 000011
【００４１】
ここで、０≦ｍ４≦６、ｍ４は２であることが好ましく、ｍＰＥＧ−はメトキシ基で片末端がエンドキャップされたポリエチレングリコール基を示し、式（３）に示される修飾剤の分子量は５ｋＤ〜６０ｋＤ、好ましくは４０ｋＤである。本発明のある実施形態において、式（３）で表される修飾剤で遊離チオール基のｍＰＥＧランダム修飾を行う。
【００４２】
ポリマーの主鎖のサイズは、変更できるが、ポリマー（例えば、ＰＥＧ、ｍＰＥＧ、ＰＰＧ又はｍＰＰＧ）の典型的な範囲は、約０．５ＫＤ〜約１６０ＫＤであり、例えば、約１ＫＤ〜約１００ＫＤである。より具体的には、本発明で結合された各親水性ポリマーのサイズは、主に、約１ＫＤ〜約８０ＫＤ、約２ＫＤ〜約７０ＫＤ、約５ＫＤ〜約７０ＫＤ、約１０ＫＤ〜約６０ＫＤ、約２０ＫＤ〜約５０ＫＤ、約３０ＫＤ〜約５０ＫＤ又は約３０ＫＤ〜４０ＫＤの範囲で変化する。これらのサイズは、正確な測定値ではなく、概算値を表すことを理解すべきである。これは、当技術分野で認められている慣行である。
ある具体的な実施形態において、本発明で使用されるＰＥＧ又はｍＰＥＧのサイズは、３５ＫＤ以上（即ち、３５ＫＤ未満ではない）、好ましくは、４０ＫＤ以上、４５ＫＤ以上、５０ＫＤ以上、５５ＫＤ以上、６０ＫＤ以上、６５ＫＤ以上又は７０ＫＤ以上であり、例えば、具体的な分子量は、４０ＫＤ、５０ＫＤ、６０ＫＤ、７０ＫＤ、８０ＫＤ、９０ＫＤ、１００ＫＤ、１１０ＫＤ、１２０ＫＤ、１３０ＫＤ、１４０ＫＤ、１５０ＫＤ又は１６０ＫＤである。
【００４３】
「改良された半減期」という用語とは、野生型第ＶＩＩＩ因子分子と比較しては、本発明に係る分子が改変された半減期、好ましくは、延長された半減期を有することを意味する。半減期は、好ましくは少なくとも１０％、好ましくは少なくとも１５％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２５％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３５％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも４５％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５５％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも１００％、より好ましくは少なくとも１２５％、より好ましくは少なくとも１５０％、より好ましくは少なくとも１７５％、より好ましくは少なくとも２００％、及び最も好ましくは少なくとも２５０％又は３００％延長する。さらにより好ましくは、前記分子は少なくとも４００％、５００％、６００％、又はさらには７００％延長された循環半減期を有する。
【００４４】
「薬学的に許容される担体」という用語は、食塩水、緩衝液、グルコース、水、グリセロール、アルコール、及びその組み合わせを含んでもよいが、それらに限定されない。
医薬製剤は通常の投与方式に適合すべきであり、本発明の医薬組成物は注射剤形態として作製することができ、例えば、生理食塩水またはグルコース及び他の補助剤を含む水溶液を用いて通常の方法により調製される。前記医薬組成物は無菌の条件で製造することが好ましい。活性成分の投与量は治療的有効量である。本発明の医薬製剤は徐放性製剤に作製することができる。
【実施例】
【００４５】
実施例１  ｍＰＥＧで修飾されているｈＦＶＩＩＩ融合タンパク質の調製及び精製
１．１  ｍＰＥＧで修飾されているｈＦＶＩＩＩ融合タンパク質の調製
１．１．１  まず、当業者に周知の分子クローニング技術に従って一連のｈＦＶＩＩＩ融合タンパク質発現プラスミドを構築し、発現プラスミドをそれぞれＤＨＦＲ欠乏型ＣＨＯ細胞にトランスフェクトし（米国特許ＵＳ４、８１８、６７９を参照）、各ｈＦＶＩＩＩ融合タンパク質（表１）を発現させた。融合タンパク質の具体的な調製手順は、中国特許ＺＬ２０１６１０６９２８３８．０を参照し、その特許が全体として援用により本明細書に組み込まれる。
【００４６】
【表１】
2021530437.tif 000012
【００４７】
注：＊  Ｂドメイン欠乏型ｈＦＶＩＩＩは、単にＢＤＤ  ＦＶＩＩＩと称され、９０ｋＤのＡ１−Ａ２重鎖と８０ｋＤの軽鎖からなる。
＊＊  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２は、リンカーがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２に示される剛性単位をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７に示される可撓性ペプチドリンカーのＣ末端に連結して形成されることを意味し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１は、リンカーがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１に示される剛性単位をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６に示される可撓性ペプチドリンカーのＣ末端に連結して形成されることを意味する。
【００４８】
１．１．２  ステップ１．１．１における各融合タンパク質の発酵ブロスをそれぞれ遠心分離し、ろ過し、順にアフィニティークロマトグラフィー（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）／疎水性相互作用クロマトグラフィー（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）／イオン交換クロマトグラフィー（Ｉｏｎ−Ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）／サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）に通し、それぞれ５つのｈＦＶＩＩＩ融合タンパク質ＦＦ−０、ＦＬ１Ｆ−０、ＦＬ２Ｆ−０、Ｆ（全長）Ｌ１Ｆ’−０及びＦ（全長）Ｌ２Ｆ’’−０を得、ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより重合体が５％未満を検出し。５つのｈＦＶＩＩＩ融合タンパク質をそれぞれタンパク質の濃度が０．９５ｍｇ／ｍｌであるｈＦＶＩＩＩ融合タンパク質のストック溶液を調製した。
【００４９】
１．１．３  ステップ１．１．２で調製された５つのｈＦＶＩＩＩ融合タンパク質のストック溶液をそれぞれ５ｍｌ採取し、Ｇ２５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）分子篩クロマトグラフィーを実行した。具体的な手順は、以下の通りである。
緩衝液の調製：２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、５．０ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ８．０、ｐＨ  ７．０、
クロマトグラフィープロセス：
（１）平衡化：カラム容量の３倍の結合緩衝液（Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ）でカラムを平衡化し、ｐＨ及び電気伝導率が緩衝液と同じになるまで平衡化すればよく、流速は１５０ｃｍ／ｈである。
（２）サンプルローディング：サンプルローディング流速は１５０ｃｍ／ｈである。
（３）平衡化：カラム容量の３倍の緩衝液でカラムを平衡化し、ｐＨ及び電気伝導率が緩衝液と同じになるまで平衡化すればよく、流速は１５０ｃｍ／ｈである。
（４）平衡化：緩衝液でカラムを平衡化し、Ａ２８０／Ａ２６０が１．８を超えるピークを収集した。
（５）カラムのクリーニング・ イン・プレイス（ＣＩＰ，ｃｌｅａｎｉｎｇ  ｉｎ  ｐｌａｃｅ）：カラム容量の１．５倍量の０．２Ｍ  ＮａＯＨを６０ｃｍ／ｈの流速で逆洗し、緩衝液で中和した。
（６）カラムの保管：実験終了後、カラム容量の３倍量の精製水を１００ｃｍ／ｈの流速でカラムを洗浄した後、カラム容量の２倍量の２０％エタノールでカラムを保管した。
限外ろ過による濃縮：Ｇ２５バッファー交換後の５つのｈＦＶＩＩＩ融合タンパク質（ＦＦ−０、ＦＬ１Ｆ−０、ＦＬ２Ｆ−０、Ｆ（全長）Ｌ１Ｆ’−０及びＦ（全長）Ｌ１Ｆ’’−０  ）ストック溶液を５０ｋＤの限外ろ過チューブで限外ろ過により濃縮し、４℃、３８００ｒｐｍの条件下で遠心分離して濃縮し、好ましくはタンパク質の濃度が１．５ｍｇ／ｍｌであるまで濃縮した。
【００５０】
１．１．４  ｈＦＶＩＩＩ融合タンパク質とｍＰＥＧ−ＳＣ（北京鍵凱科技有限公司から購入される）のモル（ｍｏｌ）比の１：１０〜１：１００でｍＰＥＧ−ＳＣ（分子量がそれぞれ５ｋＤ、１０ｋＤ、２０ｋＤ、３０ｋＤ、４０ｋＤであり、構造が式（１）で表される直鎖Ｌ字型ｍＰＥＧ−ＳＣ、及び分子量は４０ｋＤであり、構造は如式（２）に示される分岐鎖Ｙ字型ｍＰＥＧ−ＳＣ）を秤量し、ステップ１．１．３での限外ろ過による濃縮後のｈＦＶＩＩＩ融合タンパク質を加え、４時間反応させ、ヒスチジンを基質であるｈＦＶＩＩＩ融合タンパク質の１０倍モル（ｍｏｌ）量加えて該反応を停止し、異なる分子量の的ｍＰＥＧ−ＳＣで修飾されるｈＦＶＩＩＩ融合タンパク質を得、一部の修飾産物の番号及びその構成は表２に示した。
【００５１】
【表２】
2021530437.tif 000013
【００５２】
１．２  ｍＰＥＧで修飾されているｈＦＶＩＩＩ融合タンパク質の精製
１．２．１、実施例１の「１．１．４」項で調製された各ｍＰＥＧで修飾されているｈＦＶＩＩＩ融合タンパク質をそれぞれＳ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）分子篩クロマトグラフィーを実行した。具体的には、
緩衝液調製：２０ｍＭ  ヒスチジン、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、５．０ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ８．０、ｐＨ  ７．０、
クロマトグラフィープロセス：
（１）平衡化：カラム容量の３倍量の結合緩衝液（Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ）でカラムを平衡化し、ｐＨ及び電気伝導率が緩衝液と同じになるまで平衡化すればよく、流速は１５０ｃｍ／ｈである。
（２）サンプルローディング：サンプルローディング流速は１５０ｃｍ／ｈである。
（３）平衡化：カラム容量の３倍の緩衝液でカラムを平衡化し、ｐＨ及び電気伝導率が緩衝液と同じになるまで平衡化すればよく、流速は１５０ｃｍ／ｈである。
（４）平衡化：緩衝液でカラムを平衡化し、Ａ２８０／Ａ２６０が１．８を超えるピークを収集した。
（５）カラムのクリーニング・イン・プレイス：カラム容量の１．５倍量の０．２Ｍ  ＮａＯＨを６０ｃｍ／ｈの流速で逆洗し、緩衝液で中和した。
（６）カラムの保管：実験終了後、カラム容量の３倍量の精製水を使用して１００ｃｍ／ｈの流速でカラムを洗浄した後、カラム容量の２倍量の２０％エタノールでカラムを保管した。
【００５３】
１．２．２、「１．２．１」の項で得られた目的溶出液をＳｏｕｒｃｅ  １５Ｑ  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）陰イオン交換クロマトグラフィーにかけた。
緩衝液の調製：
結合緩衝液：２０ｍＭ  ヒスチジン、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、５．０ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ８．０、ｐＨ  ７．０、溶出緩衝液：２０ｍＭ  ヒスチジン、２．０Ｍ  ＮａＣｌ、５．０ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ８．０、ｐＨ  ７．０、  ＣＩＰ：０．５Ｍ  ＮａＯＨ、
クロマトグラフィープロセス：
（１）平衡化：カラム容量の３倍量の結合緩衝液でカラムを平衡化し、ｐＨ及び電気伝導率が緩衝液と同じになるまで平衡化すればよく、流速は１５０ｃｍ／ｈである。
（２）サンプルローディング：サンプルローディング流速は１５０ｃｍ／ｈである。
（３）平衡化：カラム容量の３倍量の結合緩衝液でカラムを平衡化し、ｐＨ及び電気伝導率が緩衝液と同じになるまで平衡化すればよく、流速は１５０ｃｍ／ｈである。
（４）溶出：０〜１００％緩衝液Ｂの線形勾配に従ってカラム容量の２０倍量でサンプルを溶出し、溶出流速は１００ｃｍ／ｈであり、Ａ２８０／Ａ２６０が１．８を超える溶出ピークをチューブで段階的に収集し、各チューブのサンプルはいずれにもＳＥＣ−ＨＰＬＣにより検出した。
（５）カラムのクリーニング・イン・プレイス：カラム容量の１．５倍量の０．５Ｍ  ＮａＯＨを６０ｃｍ／ｈの流速で逆洗し、結合緩衝液で中和した。
（６）カラムの保管：実験終了後、カラム容量の３倍量の精製水を使用して１００ｃｍ／ｈの流速でカラムを洗浄した後、カラム容量の２倍量の２０％エタノールでカラムを保管した。
【００５４】
１．２．３、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる検出
「１．２．２」の項で得られた溶出液をＳＥＣ−ＨＰＬＣによって検出し、ここで、
カラム：Ｇ３０００／Ｇ４０００、流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長：２８０ｎｍ、カラム温度：２５℃、注入量：１００μＬ（ローディング量２０μｇ）、移動相：０．３０Ｍ塩化ナトリウム、０．０２Ｍイミダゾール、０．０１Ｍ塩化カルシウム、２５ｐｐｍ  Ｔｗｅｅｎ８０、１０％エタノール、ｐＨ７．０、実行時間：３５〜５０ｍｉｎ、
ＦＦ−０乃至ＦＦ−４０Ｌの検出結果は、図１ａ−１ｆに示した。ＦＬ１Ｆ−０ないしＦＬ１Ｆ−５０Ｌ及びＦＬ１Ｆ−４０Ｙの検出結果は、図２ａ−２ｆに示し、結果は、ＦＬ１Ｆ−０乃至ＦＬ１Ｆ−６０Ｌの純度＞９５％、重合体＜５％、非架橋＜１％であることを示した。
【００５５】
１．２．４  タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動
「１．２．２」の項で得られた溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出し、ここで、
（１）泳動用ゲルの作製：１×Ｔｒｉｓ−グリシン電気泳動用バッファー：ＳＤＳ  ０．４ｇ、Ｔｒｉｓ  ｂａｓｅ  １．２１ｇ、グリシン７．５ｇ、再蒸留水で４００ｍＬにメスアップした。
５％濃縮ゲル：再蒸留水（Ｄｏｕｂｌｅ−ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ）４．１ｍＬ、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）０．７５ｍＬ、３０％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミド  １ｍＬ、１０％（ｗ／ｖ）過硫酸アンモニウム６０μＬ、１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ  ６０μＬ、ＴＥＭＥＤ  ６μＬ。
６％分離ゲル：再蒸留水４．９ｍＬ、１．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）３．８ｍＬ、３０％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミド６ｍＬ、１０％（ｗ／ｖ）過硫酸アンモニウム１５０μＬ、１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ  １５０μＬ、ＴＥＭＥＤ  ６μＬ。
（２）５×タンパク質サンプルローディングバッファー：グリセロール５ｍＬ、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）２．５ｍＬ、ブロモフェノールブルー０．０５ｇ、ＳＤＳ  １ｇ、再蒸留水で１０ｍＬにメスアップし、４℃で保管し、使用前にβ−メルカプトエタノール０．５ｍＬを加えた。
（３）サンプル調製：被験サンプルと同容量のサンプルローディング緩衝液を混合し、還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、サンプルと同容量の０．１ｍｇ／ｍＬ  ２−メルカプトエタノールを添加するが、非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥは２−メルカプトエタノールを添加しなかった。サンプルとサンプルローディング緩衝液を混合した後、沸騰水浴中で１０分間放置した。
（４）電気泳動：沸騰済み被験サンプル及びタンパク質マーカーをそれぞれ１０μｌ採取してスポッティングホールに順に加え、６０Ｖの電圧で濃縮電気泳動を行い、観察により、指示薬としてブロモフェノールブルー染料が分離ゲルに濃縮された後、電圧を１２０Ｖまで上げ、ブロモフェノールブルー染料が分離ゲルの底部に達するまで、電気泳動による分離を行い、電源を切った。
（５）染色：ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを注意深く取り出し、クーマシーブリリアントブルー染色液が入ったプラスチックボックスに入れ、マイクロ波オーブンに入れて１分間加熱した。
（６）脱色：染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを取り出して脱色液に入れ、振盪して脱色し、２時間あたり１回脱色液を交換し、肉眼ではっきりと見えるバンドを観察して停止した。
（７）記録：完成したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルについて写真を撮って記録するか、又は乾燥させて保管した。図３ａ−３ｃには、ＦＦ−５Ｌ乃至ＦＦ−４０ＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動図を示した。
【００５６】
実施例２  発色基質法によるｍＰＥＧで修飾されているｈＦＶＩＩＩ融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ活性の間接的な測定
発色基質法（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ａｓｓａｙ）を使用して実施例１で調製されたｍＰＥＧで修飾されているｈＦＶＩＩＩ融合タンパク質の活性を測定した。ＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘＣｏａｔｅｓｔ  ＳＰ  ＦＶＩＩＩ  キット（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ、Ｒｅｆ．  Ｋ８２４０８６）を使用して測定し、その測定原理は、以下の通りである。トロンビンによって活性化された後、ＦＶＩＩＩａは、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下でＦＩＸａと結合して酵素複合体を形成し、次に因子Ｘを活性化してその活性型Ｘａに変換することができた。活性化された因子Ｘａは、その特異的発色基質（Ｓ−２７６５）を分解させ、発色団ｐＮＡを放出した。４０５ｎｍで生成したｐＮＡの量を測定すると、その量に直接比例するＦＸａの活性を確認し、系内の第ＩＸａ因子及び第Ｘ因子の含有量は一定で過剰であり、ＦＸａの活性はＦＶＩＩＩａの含有量に直接関係した。発色基質法によりＦＶＩＩＩの生物学的活性を間接的に測定した。結果は、表３に示した。
【００５７】
【表３】
2021530437.tif 000014
2021530437.tif 000015
【００５８】
実施例３  ヒト血液凝固第ＶＩＩＩ因子の力価測定法
本発明で使用されるヒト血液凝固第ＶＩＩＩ因子の力価測定法は、「一期法」とも呼ばれ、具体的には、中華人民共和国薬典（２０１０年版）第３部を参照した。一期法によるＦＶＩＩＩの生物学的活性の測定はＦＶＩＩＩ因子の血漿欠乏による凝固時間の延長する能力を補正することにより取得される。ドイツのＳｉｅｍｅｎｓ社で製造されるＣｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｐｌａｓｍａ  （Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ＯＴＸＷ１７）キットを用いる。方法は、まず、力価が知られているＦＶＩＩＩ活性標準品ＷＨＯ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ８ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ０７／３５０）を４ＩＵ／ｍｌに希釈し、さらに、異なる力価（ＩＵ／ｍｌ）に段階希釈し、ＦＶＩＩＩ欠乏基質血漿と混合し、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を測定し、ＦＶＩＩＩ活性標準品溶液の力価（ＩＵ／ｍｌ）の対数がその対応する凝固時間（ｓ）の対数に対応することで線形回帰し、検量線を作成した。さらに、被験サンプルを適度に希釈した後、ＦＶＩＩＩ欠乏基質血漿と混合し、ＡＰＴＴ測定を行った。検量線方程式に代入することにより、被験サンプルＦＶＩＩＩの力価を算出することができ、これにより、被験サンプルＦＶＩＩＩの比活性を求めることができ、単位がＩＵ／ｍｇである。結果は表４に示した。
【００５９】
【表４】
2021530437.tif 000016
【００６０】
表３及び表４に示されるように、発色基質法及び一期法で測定されたＦＬ１Ｆ−４０Ｙ、ＦＬ２Ｆ−４０Ｙ、Ｆ（全長）Ｌ１Ｆ’−４０Ｙ及びＦ（全長）Ｌ２Ｆ’’−４０Ｙの生物学的活性は、ｍＰＥＧで架橋されていないＥｌｏｃｔａｔｅ／ＦＬ１Ｆ−０／ＦＬ２Ｆ−０実験群よりも低く、これは、ｍＰＥＧで修飾された後、修飾タンパク質の立体構造に与える影響によるものである。類似する現象は、先行技術の他のｍＰＥＧ修飾タンパク質（例えば、ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ、Ｐｅｇｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ）にも存在した。予想外には、本発明の融合タンパク質は、４０ｋＤ又はそれ以上のｍＰＥＧで修飾されても高い活性を維持でき、同時に、その後の実験は、その半減期が大幅に延長されたことをさらに確認した。
【００６１】
実施例４  血友病Ａマウス尾静脈切断モデルによる予防的薬力学的実験
本実施例は、尾静脈切断（ｔａｉｌ  ｖｅｉｎ  ｔｒａｎｓｅｃｔｉｏｎ、単にＴＶＴと称される）実験により各ｍＰＥＧで修飾されているｈＦＶＩＩＩ融合タンパク質の血友病Ａマウス（ＨＡマウス）における活性半減期を比較した。
４．１  文献に報告されている方法に従い、１０〜１２週齢の雄性ＨＡマウス（上海南方モデル生物研究センタ−から購入される）を選択し、１群あたり１２匹としてランダムに分けし、本発明の各ｍＰＥＧで修飾されている融合タンパク質又は陽性対照薬であるＥｌｏｃｔａｔｅをそれぞれ用量１５  ＩＵ／ｋｇで尾静脈に投与した。投与４８時間後に、尾を内径２．７ｍｍのカニューレで取って印を付け、片側の尾静脈をフェザースカルペル  Ｎｏ．１１で切断した後、ラットの尾を約１３ｍｌの予備加熱された生理食塩水チューブに素早く入れ、出血時間を記録した。出血が止められた（切開部からの明らかな血流がない）後、ラットの尾を生理食塩水チューブから取り出し、その後、マウス置于３７℃の加熱パッドにマウスを置いて体温を維持し、傷に触れないようにした。マウスが目覚めた後、Ａ４ホワイトペーパーを詰めたリスケージに入れ、単一のケージで飼育し、出血の程度を簡単に判断するために、毎回観察後にホワイトペーパーまたはリスケージを交換した。尻尾切断後に、４８時間以内のマウスの生存率及び尻尾切断後１２時間以内の再出血数をカウントした（合計１２時間、１時間以内の複数回出血を１回としてカウントする）。結果は、表５に示した。
【００６２】
再出血率の統計は、統計期間中に再出血したマウスの比率を意味し、重篤な出血率は、１２時間以内の再出血の統計における重度出血（＋＋＋）現象又は複数の中程度出血（＋＋）現象のあるマウスの比率である。ここで、中程度出血（＋＋）とは、Ａ４ホワイトペーパーに多くの血痕があり、被覆面積が３０％以上で、血痕が中程度の色であるが、大きな領域の血液プール（面積＞３ｃｍ2）がないことを指し、重度出血（＋＋＋）とは、Ａ４ホワイトペーパーに血痕が多く、被覆面積が３０％以上で、血痕の色が濃く、大きな領域の血液プールがあることを指し、被覆面積が小さくても、重度の出血と見なすことができる（マウスは大量の血液を失い、運動範囲が狭くなり、血液はホワイトペーパーにひどく浸された）。
【００６３】
【表５】
2021530437.tif 000017
【００６４】
結果は、ｍＰＥＧで修飾されていないＥｌｏｃｔａｔｅ／ＦＬ１Ｆ−０／ＦＬ２Ｆ−０実験群と比較しては、ＦＬ１Ｆ−４０Ｙ実験群の生存率（８３．３％）、ＦＬ２Ｆ−４０Ｙ実験群の生存率（７５．０％）、Ｆ（全長）Ｌ１Ｆ’−４０Ｙ実験群の生存率（８３．３％）及びＦ（全長）Ｌ２Ｆ’’−４０Ｙ実験群の生存率（８３．３％）はいずれも他の群よりも有意に高くなった。これらの実験群に対応する１２ｈ再出血率及び重篤な出血率は他の群よりも有意に低減したことを示した。ＦＬ１Ｆ−４０Ｙ、ＦＬ２Ｆ−４０Ｙ、Ｆ（全長）Ｌ１Ｆ’−４０Ｙ、Ｆ（全長）Ｌ２Ｆ’’−４０Ｙは、血友病Ａマウス尾静脈切断モデルによる予防的薬力学においてさらに長い保護時間を有することを示した。
【００６５】
４．２  ４．１と同じ方法を使用し、１０〜１２週齢の雄性ＨＡマウス、１群１２匹について、投与８４時間後にＴＶＴ実験を行った。結果は、表６に示した。
【００６６】
【表６】
2021530437.tif 000018
【００６７】
結果は、ＰＥＧが架橋されていないＥｌｏｃｔａｔｅ及び他の実験群よりも、ＦＬ１Ｆ−４０Ｙ実験群の生存率（６６．７％）、ＦＬ２Ｆ−４０Ｙ実験群の生存率（７５．０％）、Ｆ（全長）Ｌ１Ｆ’−４０Ｙ実験群の生存率（７５．０％）及びＦ（全長）Ｌ２Ｆ’’−４０Ｙ実験群の生存率（７５．０％）はいずれも有意に高くなり、対応する再出血率は有意に低減した。ＦＬ１Ｆ−４０Ｙ、ＦＬ２Ｆ−４０Ｙ、Ｆ（全長）Ｌ１Ｆ’−４０Ｙ、Ｆ（全長）Ｌ２Ｆ’’−４０Ｙは、投与８４時間後に血友病Ａマウス尾静脈切断モデルによる予防的薬力学において一定の優位性を有したことを示した。
【００６８】
４．３、  ４．１と同じ方法を使用し、１０〜１２週齢のＨＡマウス、雄雌それぞれ１０匹、１群２０匹について、投与９０時間後にＴＶＴ実験を行った。結果は、表７に示した。
【００６９】
【表７】
2021530437.tif 000019
【００７０】
結果は、ＦＬ１Ｆ−５０Ｌは、ＰＥＧが架橋されていないＥｌｏｃｔａｔｅ実験群に近い生存率及び再出血率を有しており、本実験動物が単一性別ではないため、実験結果は他の単一性別の実験結果と比較することはない。
【００７１】
４．４、  ４．１と同じ方法を使用し、１０〜１２週齢の雄性ＨＡマウス、１群１２匹に、投与９６時間後にＴＶＴ実験を行った。結果は、表８に示した。
【００７２】
【表８】
2021530437.tif 000020
【００７３】
結果は、ＦＬ１Ｆ−４０Ｙ／ＦＬ２Ｆ−４０Ｙは、ＰＥＧが架橋されていないＥｌｏｃｔａｔｅ実験群よりも、生存率で優位性が小さくなるが、１２ｈ再出血率が有意に低減したことを示した。生存率は、ＦＬ１Ｆ−４０Ｙ／ＦＬ２Ｆ−４０Ｙがいずれも他の群よりも有意に向上し、１２ｈ再出血率は他の群よりも有意に低減した。ＦＬ１Ｆ−４０Ｙ／ＦＬ２Ｆ−４０Ｙは、他の群よりも血友病Ａマウス尾静脈切断モデルによる予防時間がより長くなることを示した。
【００７４】
以上の記載は、本発明の好ましい実施例に過ぎず、本発明を限定することを意図するものではない。本発明の精神及び原理から逸脱せずに加える任意の修正、同等の置換、改良などは、いずれも本発明の保護範囲に含まれることを理解すべきである。
【図１ａ】
2021530437.tif 000024
【図１ｂ】
2021530437.tif 000025
【図１ｃ】
2021530437.tif 000026
【図１ｄ】
2021530437.tif 000027
【図１ｅ】
2021530437.tif 000028
【図１ｆ】
2021530437.tif 000029
【図２ａ】
2021530437.tif 000030
【図２ｂ】
2021530437.tif 000031
【図２ｃ】
2021530437.tif 000032
【図２ｄ】
2021530437.tif 000033
【図２ｅ】
2021530437.tif 000034
【図２ｆ】
2021530437.tif 000035
【図３ａ】
2021530437.tif 000036
【図３ｂ】
2021530437.tif 000037
【図３ｃ】
2021530437.tif 000038
【配列表】
2021530437000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年11月19日(2020.11.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリアルキレングリコールと結合する血液凝固第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質であって、血液凝固第ＶＩＩＩ因子の活性化部分（ＦＶＩＩＩ）は、半減期を延長させる融合パートナーと直接的に連結されるか、又はペプチドリンカーで間接的に連結されて前記融合タンパク質を形成し、前記融合タンパク質は、さらに、ポリアルキレングリコールと結合しており、前記血液凝固第ＶＩＩＩ因子の活性化部分は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又は２に示されるアミノ酸配列を有する、融合タンパク質。
【請求項２】
前記融合パートナーは、免疫グロブリンＦｃ断片、アルブミン、トランスフェリン又はＸＴＥＮであり、これらの融合パートナーは、ヒトに由来するものである、請求項１に記載のポリアルキレングリコールと結合する血液凝固第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
【請求項３】
前記融合パートナーは、
（ｉ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列、
（ｉｉ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列、及び
（ｉｉｉ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を有するＩｇＧ  Ｆｃ断片である、請求項２に記載のポリアルキレングリコールと結合する血液凝固第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
【請求項４】
前記ポリアルキレングリコールは、ポリプロピレングリコール又はポリエチレングリコールであり、前記ポリアルキレングリコールは、アルコキシ基でエンドキャップされており、及び前記ポリアルキレングリコールは、直鎖状又は分岐鎖状である、請求項１に記載のポリアルキレングリコールと結合する血液凝固第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
【請求項５】
前記ポリアルキレングリコールは、分岐型ポリエチレングリコールである、請求項４に記載のポリアルキレングリコールと結合する血液凝固第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
【請求項６】
前記ポリアルキレングリコールの分子量は、１ｋＤａ以上、１０ｋＤａ以上、２０ｋＤａ以上、３０ｋＤａ以上、４０ｋＤａ以上、５０ｋＤａ以上、６０ｋＤａ以上、７０ｋＤａ以上、８０ｋＤａ以上、９０ｋＤａ以上、１００ｋＤａ以上、１１０ｋＤａ以上、１２０ｋＤａ以上、１３０ｋＤａ以上、１４０ｋＤａ以上、１５０ｋＤａ以上又は１６０ｋＤａ以上である、請求項４に記載のポリアルキレングリコールと結合する血液凝固第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
【請求項７】
前記融合タンパク質とポリアルキレングリコールの結合はランダムな結合又は部位特異的結合であり、前記結合部位は、遊離アミノ基、チオール基、グリコシル基及び／又はカルボキシル基から選ばれる基である、請求項１に記載のポリアルキレングリコールと結合する血液凝固第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
【請求項８】
前記ポリアルキレングリコールとの結合に修飾剤が使用され、前記修飾剤は、以下の式（１）、（２）及び（３）に示される修飾剤から選ばれる、請求項５に記載のポリアルキレングリコールと結合する血液凝固第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
【化１】
2021530437.tif 000039
式（１）
（ここで、０≦ｍ１≦６であり、ｍＰＥＧはメトキシ基で片末端がエンドキャップされたポリエチレングリコール基を示す。）
【化２】
2021530437.tif 000040
式（２）
（ここで、０≦ｍ２≦６、０≦ｍ３≦６であり、ｍＰＥＧはメトキシ基で片末端がエンドキャップされたポリエチレングリコール基を示す。）
【化３】
2021530437.tif 000041
式（３）
（ここで、０≦ｍ４≦６であり、ｍＰＥＧはメトキシ基で片末端がエンドキャップされたポリエチレングリコール基を示す。）
【請求項９】
前記血液凝固第ＶＩＩＩ因子の活性化部分は、前記融合パートナーとペプチドリンカーによって連結され、前記ペプチドリンカーは、可撓性ペプチドリンカー及び／又は剛性単位を含む、請求項１に記載のポリアルキレングリコールと結合する血液凝固第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
【請求項１０】
前記可撓性ペプチドリンカーは、一般式（ＧＳ）ａ（ＧＧＳ）ｂ（ＧＧＧＳ）ｃ（ＧＧＧＧＳ）ｄで表される配列（ここで、ａ、ｂ、ｃ及びｄは、０以上の整数であり、且つａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ≧１。）を有する、請求項９に記載のポリアルキレングリコールと結合する血液凝固第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
【請求項１１】
前記可撓性ペプチドリンカーは、
（ｉ）ＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６）、
（ｉｉ）ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７）、
（ｉｉｉ）ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８）、
（ｉｖ）ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９）、及び
（ｖ）ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０）からなる群より選ばれる配列を有する、請求項１０に記載のポリアルキレングリコールと結合する血液凝固第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質
【請求項１２】
前記剛性単位は、ヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのカルボキシ末端ペプチドであり、
（ｉ）  ＰＲＦＱＤＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１）、
（ｉｉ）  ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２）、
（ｉｉｉ）  ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １３）、及び
（ｉｖ）  ＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １４）から選ばれるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のポリアルキレングリコールと結合する血液凝固第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
【請求項１３】
前記ペプチドリンカーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １５に示されるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のポリアルキレングリコールと結合する血液凝固第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
【請求項１４】
有効量の請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリアルキレングリコールと結合する血液凝固第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１５】
出血性疾患の予防及び／又は治療用組成物であって、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリアルキレングリコールと結合する血液凝固第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質を含み、前記出血性疾患は、ＦＶＩＩＩ先天性又は後天性欠乏症患者の出血性疾患、及び血友病Ａ患者の自発性または手術出血から選ばれる出血性疾患である組成物。
【国際調査報告】
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