(57)【要約】  本発明は、動物細胞、好ましくは初代肝細胞を培養する方法であって、非接着性培養容器、好ましくは低接着性または超低接着性培養容器において動物細胞を培養する第１のステップと、コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスに動物細胞を埋め込む第２のステップと、コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスに埋め込まれた動物細胞を培養することにより、増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物、好ましくは増殖性初代肝細胞を含むスフェロイドを得る第３のステップとを含む、方法に関する。本発明はまた、人工肝臓モデルまたは人工肝臓臓器を操作するため、および薬物または化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの肝毒性、遺伝毒性、および／または効果を評価するための、増殖性初代肝細胞を含むスフェロイド、およびその使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物細胞を培養して増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物を得る方法であって、
ａ）まず、非接着性培養容器、好ましくは低接着性または超低接着性培養容器中で前記動物細胞を培養することと、
ｂ）次に、コラーゲンまたは切り詰め型コラーゲン、すなわちゼラチンを含む培養培地に前記動物細胞を移し、それによりコラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックス中に前記動物細胞を埋め込むことと、
ｃ）前記コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックス中に埋め込まれた動物細胞を培養し、それにより増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物を得ること
を含む、方法。
【請求項２】
ａ）まず、非接着性培養容器、好ましくは低接着性または超低接着性培養容器中で前記動物細胞を培養することと、
ｂ）次に、コラーゲン、好ましくは線維性コラーゲンを含む培養培地に前記動物細胞を移し、それによりコラーゲンマトリックス、好ましくは線維性コラーゲンマトリックス中に前記動物細胞を埋め込むことと、
ｃ）前記コラーゲンマトリックス中に埋め込まれた動物細胞を培養し、それにより増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物を得ること
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップｂ）で前記動物細胞が、約０．２５ｍｇ／ｍＬ〜約３ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で、コラーゲン、好ましくは線維性コラーゲンを含む培養培地に移される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップｂ）で前記動物細胞が、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン、ＸＩ型コラーゲン、ＸＸＩＶ型コラーゲン、ＸＸＶＩＩ型コラーゲンおよびそれらのいずれかの混合物を含む群から選択される線維性コラーゲンを含む培養培地移される、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
ａ）まず、非接着性培養容器、好ましくは低接着性または超低接着性培養容器中で前記動物細胞を培養することと、
ｂ）次に、メタクリル酸修飾ゼラチン（ＧｅｌＭａ）を含む培養培地に前記動物細胞を移し、それによりＧｅｌＭａマトリックス中に前記動物細胞を埋め込むことと、
ｃ）前記ＧｅｌＭａマトリックス中に埋め込まれた動物細胞を培養し、それにより増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物を得ること
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ステップｂ）で前記動物細胞が、約１（ｗ／ｖ）％〜約２０（ｗ／ｖ）％の範囲の濃度でメタクリル酸修飾ゼラチン（ＧｅｌＭａ）を含む培養培地に移される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ステップａ）で前記動物細胞が、約１ｈ〜約９６ｈの範囲の期間の間、非接着性培養容器、好ましくは低接着性または超低接着性培養容器中で培養される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ｄ）前記コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックス中に埋め込まれた動物細胞の培養物にＭＡＰＫ  ＭＥＫ１／２−ＥＲＫ１／２経路の阻害剤を添加し、それにより前記動物細胞の１つ以上のさらなる増殖の波を誘導すること
をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ｅ）コラゲナーゼまたはコラーゲン分解活性を有する酵素混合物と前記コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックス中に埋め込まれた増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物をインキュベートし、それにより前記コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスから増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物を単離すること
をさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記動物細胞が、初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞であり、かつ前記増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物が、スフェロイドであり、好ましくは前記スフェロイドが、中空内腔を有する腺房様構造を有し、増殖性初代肝細胞、好ましくは増殖性初代ヒト肝細胞を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックス中に埋め込まれた増殖性初代肝細胞を含むスフェロイドであって、中空内腔を有する腺房様構造を有する、スフェロイド。
【請求項１２】
前記増殖性初代肝細胞が、増殖性初代ヒト肝細胞である、請求項１１に記載のスフェロイド。
【請求項１３】
人工肝臓モデルまたは人工肝臓臓器を操作するための増殖性初代ヒト肝細胞を含むスフェロイドの使用であって、前記スフェロイドが、中空内腔を有する腺房様構造を有する、使用。
【請求項１４】
薬物または化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの肝毒性、特に肝臓の遺伝毒性、および／または効果を評価するための増殖性初代ヒト肝細胞を含むスフェロイドの使用であって、前記スフェロイドが、中空内腔を有する腺房様構造を有する、使用。
【請求項１５】
薬物または化合物の毒性および／または効果を評価するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法であって、
ａ）請求項１〜１０のいずれか１項の方法により、増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物、好ましくは増殖性初代ヒト肝細胞を含むスフェロイドを得ることと、
ｂ）薬物または化合物と、前記増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物、好ましくは増殖性初代ヒト肝細胞を含むスフェロイドを接触させることと、
ｃ）前記増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物、好ましくは増殖性初代ヒト肝細胞を含むスフェロイドに対する前記薬物または化合物の毒性、遺伝毒性、および／または効果を評価すること
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養、好ましくは肝細胞培養、特には３Ｄ細胞培養、好ましくは３Ｄ肝細胞培養の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞は、肝臓の主要な実質細胞であり、肝臓の質量の最大７０〜８５％を担う。肝細胞は、大部分の肝機能を行う著しく分化された細胞であり、特に代謝、解毒、および全身のホメオスタシスに関与する。肝臓において、肝細胞は通常、寿命の長い静止細胞である。しかしながら、損傷または機能的な質量の喪失を受けると、肝細胞は増殖でき、よって肝臓の再生を可能にする。
【０００３】
肝細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の確立は、重要な肝機能を忠実に再現できるｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを開発する目的で長い間追求されてきた。このようなモデルは、正常な肝機能を理解および試験するための研究で使用できる。またこれらは、肝臓の病態、たとえばウイルス性肝炎を理解および試験するために、および肝機能を回復させる候補薬物の特性を評価するために使用できる。さらに、代謝および解毒における肝臓の中心的な役割を考慮すると、肝細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物は、新規薬物の代謝および毒性を予測するための重要なモデルである。特に、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）の培養物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの薬物の代謝、薬物間の相互作用、および肝毒性を評価することに関する代表的なモデルとみなされている。最後に、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物はまた、たとえば臓器移植の代替案としての体外装置の開発、肝細胞移植、または３次元（３Ｄ）肝細胞構造物の移植を介する、肝臓の疾患または障害の処置において見込みのあるアプローチを表している。
【０００４】
よって、多くの肝細胞培養系が、初代肝細胞、特に初代ヒト肝細胞の従来の２次元（２Ｄ）単分子層培養物を始まりとして設計されてきた。しかしながら、このような培養物では、初代肝細胞は脱分化し、肝細胞に特異的な機能を急速に失う。さらに、従来の２Ｄ単分子層培養物は、初代肝細胞を長期間生存させることができない。より複雑な培養系、特により長い生存および肝細胞に特異的な機能の良好な維持を可能にするための培養系が開発されている。たとえば、初代肝細胞は、サンドイッチ構成において、ゲル状の細胞外マトリックスタンパク質である２つの層の間で培養されている。また肝細胞は、たとえば非実質性肝細胞（Ｂａｆｆｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１）、肝細胞癌（ＨＣＣ）細胞（Ｊａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６）、または３Ｔ３線維芽細胞（Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６）と共培養されている。さらに最近では、３次元（３Ｄ）培養物が、形態、バイアビリティ、および肝細胞に特異的な機能を保持できる安定な表現型を有する肝細胞を得るために特に適していることが示されている。特に、たとえば肝細胞を超低接着性プレートで培養する場合（Ｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６）、または肝細胞をマトリックスもしくはスキャフォールド、たとえばアルギン酸塩といった多糖類のスキャフォールドなどにカプセル化するまたは埋め込む場合（国際特許公開公報第２０１３／０８７８４３号）に、初代ヒト肝細胞遊離型の球状の凝集体を得ることができる。重要なことに、上述の培養系はいずれも、培養された初代ヒト肝細胞の増殖を可能にできない。
【０００５】
増殖は、腫瘍を起源とするもしくは発がん性の不死化により（すなわち細胞の形質転換により）得られる肝細胞様細胞株または幹細胞由来の肝細胞様細胞などの、別の細胞系を使用して観察され得る。たとえば、ＨｕＨ−７およびＨｅｐＧ２は、ほとんど分化しない機能を有するヒト肝細胞癌由来の肝細胞様細胞株である。Ｆａ２Ｎ−４およびＨｅｐａ  ＲＧは、ヒトの不死化細胞株であり、後者は、初代ヒト肝細胞の多くの特徴を保持している。しかしながら、これらの代替的な細胞系を用いる場合であっても、通常、増殖および分化は相互排他的である。さらに、がん細胞株および不死化細胞株は、生理的なヒト肝臓の生物学を再現するために最適なｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを構成しない。
【０００６】
今日まで、培養された初代肝細胞の増殖は、げっ歯類の肝細胞でのみ観察されている。自発的な増殖が、マウスの肝細胞で観察されており（Ｆｒｅｍｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）、増殖因子での刺激により、ラット肝細胞の増殖を誘導できた。たとえば、米国特許公開公報第２００５／０２４４９５９号は、少なくとも１つのサイトカインおよび１つの増殖因子、好ましくはＴＮＦαおよびＥＧＦの添加を介してラットの肝細胞の能動的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖を誘導するための方法を記載している。しかしながら、がん細胞株および不死化細胞株と同様に、げっ歯類肝細胞培養物は、生理的なヒト肝臓の生物学を再現するための最適なｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを構成しない。
【０００７】
よって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルの使用を介して薬学的または治療上の適応について肝細胞の増殖性の能力を試験および利用することは、未だ主要な課題であり続けている。特に、ヒト初代肝細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖を可能にする３Ｄ培養モデルが依然として必要とされている。
【０００８】
これを受けて、本発明は、増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物を得ることを可能にする動物細胞を培養する方法であって、上記増殖性動物細胞が、それらの表現型、たとえばそれらの分化状態およびそれらの機能を維持している、方法に関する。本発明の方法は、非接着性培養容器、好ましくは低接着性または超低接着性培養容器において動物細胞を培養する第１のステップと、コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックス、特にＧｅｌＭａマトリックスに動物細胞を埋め込む第２のステップと、コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックス、特にＧｅｌＭａマトリックスに埋め込まれた動物細胞を培養する第３のステップとを含む、方法に関する。本発明の方法は、初代ヒト肝細胞の培養に特に適しており、増殖性ＰＨＨスフェロイド、すなわち増殖性初代ヒト肝細胞を含む、中空内腔を有する腺房様構造を得ることを可能にする。また本発明は、人工肝臓モデルもしくは人工肝臓臓器を操作するための、または薬物もしくは化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの毒性および／もしくは効果を評価するための、増殖性初代ヒト肝細胞を含むスフェロイドおよびその使用に関する。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、動物細胞を培養して増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物を得る方法であって、
ａ）まず、非接着性培養容器、好ましくは低接着性または超低接着性培養容器において上記動物細胞を培養することと、
ｂ）次に、コラーゲンまたは切り詰め型コラーゲン、すなわちゼラチンを含む培養培地に上記動物細胞を移すことにより、コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスに上記動物細胞を埋め込むことと、
ｃ）上記コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスに埋め込まれた動物細胞を培養することにより、増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物を得ること
を含む、方法に関する。
【００１０】
一実施形態では、本発明は、動物細胞を培養して増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物を得る方法であって、
ａ）まず、非接着性培養容器、好ましくは低接着性または超低接着性培養容器において上記動物細胞を培養することと、
ｂ）次に、コラーゲン、好ましくは線維性コラーゲンを含む培養培地に上記動物細胞を移すことにより、コラーゲンマトリックス、好ましくは線維性コラーゲンマトリックスに上記動物細胞を埋め込むことと、
ｃ）上記コラーゲンマトリックスに埋め込まれた動物細胞を培養することにより、増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物を得ること
を含む、方法に関する。
【００１１】
一実施形態では、本明細書中上述される方法のステップｂ）で、動物細胞を約０．２５ｍｇ／ｍＬ〜約３ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度でコラーゲン、好ましくは線維性コラーゲンを含む培養培地に移す。一実施形態では、上記線維性コラーゲンは、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン、ＸＩ型コラーゲン、ＸＸＩＶ型コラーゲン、ＸＸＶＩＩ型コラーゲン、およびそれらのいずれかの混合物を含むかまたはそれらからなる群から選択される。
【００１２】
一実施形態では、本発明は、動物細胞を培養して増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物を得る方法であって、
ａ）まず、非接着性培養容器、好ましくは低接着性または超低接着性培養容器において上記動物細胞を培養することと、
ｂ）次に、メタクリル酸修飾ゼラチン（ＧｅｌＭａ）を含む培養培地に上記動物細胞を移すことにより、ＧｅｌＭａマトリックスに上記動物細胞を埋め込むことと、
ｃ）上記ＧｅｌＭａマトリックスに埋め込まれた動物細胞を培養することにより、増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物を得ること
を含む、方法に関する。
【００１３】
一実施形態では、本明細書中上述される方法のステップｂ）で、動物細胞を約１（ｗ／ｖ）％〜約２０（ｗ／ｖ）％の範囲の濃度でメタクリル酸修飾ゼラチン（ＧｅｌＭａ）を含む培養培地に移す。
【００１４】
一実施形態では、本明細書中上述される方法のステップａ）で、動物細胞を約１時間〜約９６時間の範囲の期間の間、非接着性培養容器、好ましくは低接着性または超低接着性培養容器において培養する。
【００１５】
一実施形態では、本明細書中上述される方法のステップｃ）で、コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスに埋め込まれた動物細胞を、少なくとも約２日間、培養する。
【００１６】
一実施形態では、本明細書で上述される方法は、
ｄ）コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスに埋め込まれた動物細胞の培養物に、ＭＡＰＫ  ＭＥＫ１／２−ＥＲＫ１／２経路の阻害剤を添加することにより、動物細胞の１つ以上のさらなる増殖の波（ｗａｖｅ（ｓ）  ｏｆ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を誘導すること
をさらに含む。
【００１７】
一実施形態では、本明細書で上述される方法は、
ｅ）コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスに埋め込まれた増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物を、コラゲナーゼまたはコラーゲン分解活性を有する酵素混合物と共にインキュベートすることにより、コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスから増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物を単離すること
をさらに含む。
【００１８】
一実施形態では、本明細書で上述される動物細胞は、初代動物細胞である。一実施形態では、本明細書で上述される動物細胞は、初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞であり、本明細書で上述される増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物は、スフェロイドであり、好ましくは上記スフェロイドは、中空内腔を有する腺房様構造を有し、増殖性初代肝細胞、好ましくは増殖性初代ヒト肝細胞を含む。
【００１９】
また本発明は、コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスに埋め込まれた増殖性初代肝細胞を含むスフェロイドに関し、好ましくは上記スフェロイドは、中空内腔を有する腺房様構造を有する。一実施形態では、上記スフェロイドは、メタクリル酸修飾ゼラチン（ＧｅｌＭａ）に埋め込まれている。一実施形態では、上記増殖性初代肝細胞は、増殖性初代ヒト肝細胞である。
【００２０】
また本発明は、人工肝臓モデルまたは人工肝臓臓器を操作するための、増殖性初代ヒト肝細胞を含むスフェロイドの使用に関し、好ましくは上記スフェロイドは、中空内腔を有する腺房様構造を有する。
【００２１】
また本発明は、薬物または化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの肝毒性、特に肝臓の遺伝毒性、および／または効果を評価するための、増殖性初代ヒト肝細胞を含むスフェロイドの使用に関し、好ましくは上記スフェロイドは、中空内腔を有する腺房様構造を有する。一実施形態では、上記使用は、薬物または化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの肝臓の遺伝毒性を評価するためであり、好ましくは上記スフェロイドは、中空内腔を有する腺房様構造を有する。
【００２２】
また本発明は、薬物または化合物の毒性および／または効果を評価するｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、
ａ）本明細書で上述される方法により、増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物、好ましくは増殖性初代ヒト肝細胞を含むスフェロイドを得ることと、
ｂ）増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物、好ましくは増殖性初代ヒト肝細胞を含むスフェロイドを、薬物または化合物と接触させることと、
ｃ）増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物、好ましくは増殖性初代ヒト肝細胞を含むスフェロイドに及ぼす薬物または化合物の毒性、遺伝毒性、および／または効果を評価すること
を含む、方法に関する。
【００２３】
定義
本発明において、以下の用語は以下の意味を有する。
【００２４】
数字に先行する「約」は、当該数字の値の±１０％またはそれ以下を包有する。用語「約」が指す値もそれ自体が具体的であり、好ましくは開示されていることを理解されたい。
【００２５】
「動物細胞」は、後生動物を起源とする細胞を指す。一実施形態では、動物細胞は、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、または哺乳類であり得る脊椎動物を起源とする細胞である。特定の実施形態では、動物細胞は、哺乳類細胞、好ましくはヒト細胞である。
【００２６】
「コラーゲン」は、一般に超分子ネットワークの形成に関与する細胞外マトリックス糖タンパク質の不均一なスーパーファミリーを指す。コラーゲンは、同一であり得るかまたは同一ではなくてよい、３つのα鎖の存在を特徴とする。この３つのα鎖は、三重のらせんドメインを形成し、ここで３重のらせん構造は、上記３つのα鎖のコラーゲン性ドメインの結びつきからもたらされる右巻きのスーパーヘリックスに対応し、それぞれは、ポリプロリンＩＩ様の左巻きの立体構造を採用する。本明細書で使用される場合、用語「コラーゲン」は、限定するものではないが、線維性コラーゲン；非線維性コラーゲン、たとえば線維付随性コラーゲンおよび関連するコラーゲン；ビーズ状フィラメント形成コラーゲン；短鎖コラーゲンおよび関連するタンパク質；基底膜コラーゲンおよび関連するコラーゲン；膜貫通型コラーゲンおよびコラーゲン様タンパク質；ならびに他のコラーゲンおよびコラーゲン様タンパク質を含む、コラーゲンの異なるサブファミリーを包有する。本明細書で使用される場合、用語「コラーゲン」はまた、切り詰め型コラーゲンを包有する。切り詰め型コラーゲンは特に、より短いペプチドへと加水分解されたコラーゲンを包有し、これはゼラチンとも呼ばれ得る。
【００２７】
「コラーゲンマトリックス」は、架橋した構造の形成からもたらされる３次元マトリックス、すなわちコラーゲン、特に線維性コラーゲンの重合により作製されるハイドロゲルを指す。よって、一実施形態では、線維性コラーゲンマトリックスは、線維性コラーゲンの重合により作製される架橋した構造の形成からもたらされる３次元マトリックスである。本明細書で使用される場合、用語「コラーゲンマトリックス」はまた、切り詰め型コラーゲン、すなわちゼラチンから作製される３次元マトリックスを指す。あるいは、切り詰め型コラーゲン、すなわちゼラチンから作製される３次元マトリックスは、「ゼラチンマトリックス」と呼ばれ得る。
【００２８】
「単離されたスフェロイド」に関する「単離された」は、その培養環境から分離されているスフェロイドを指す。よって一実施形態では、単離されたスフェロイドは、コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスに埋め込まれていないスフェロイドを指す。
【００２９】
「ゼラチン」は、コラーゲン誘導体、すなわち、切り詰め型コラーゲンに対応する、より短いペプチドに加水分解されたコラーゲンを指す。またゼラチンは、変性されたコラーゲンとして定義され得る。ゼラチンは、コラーゲンの３重らせん構造をアンフォールディングし短いペプチドの形成をもたらす、Ｉ型コラーゲンなどのコラーゲンの加水分解、特に酸性またはアルカリ性の加水分解により得られる。よって、ゼラチンは、コラーゲンの化学組成と非常に類似する化学組成を有するが、より少ない位数の高分子構造を有する。特定の実施形態では、本発明のゼラチンは、メタクリル酸修飾ゼラチン（ＧｅｌＭａ）である。
【００３０】
「ゼラチンマトリックス」は、ゼラチンの重合、すなわち切り詰め型コラーゲンの重合により作製される、架橋された構造、すなわちハイドロゲルの形成からもたらされる３次元マトリックスを指す。特定の実施形態では、本発明のゼラチンは、メタクリル酸修飾ゼラチン（ＧｅｌＭａ）であり、本発明のゼラチンマトリックスは、ＧｅｌＭａマトリックスである。
【００３１】
「ＧｅｌＭａ」、「Ｇｅｌ−ＭＡａ」、または「Ｇｅｌ−Ｍａ」は、メタクリロイルゼラチン、ゼラチンメタクリラート、またはゼラチンメタクリルアミドとしても知られている、メタクリル酸修飾ゼラチンを指す。ＧｅｌＭａは、メタクリルアミドおよびメタクリラートの側鎖基でのリジンおよびヒドロキシル残基の修飾をもたらす、無水メタクリル酸とゼラチンの直接的な反応により得られる（Ｙｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．  ２０１５  Ｄｅｃ；７３：２５４−７１）。
【００３２】
「ＧｅｌＭａマトリックス」は、光重合開始剤により誘導されるメタクリル酸修飾ゼラチンの重合により作製される、架橋された構造、すなわちハイドロゲルの形成からもたらされる３次元マトリックスを指す。
【００３３】
「ハイドロゲル」は、架橋された親水性ポリマーの水膨潤性（ｗａｔｅｒ−ｓｗｏｌｌｅｎ）ネットワークを指す。本明細書で使用される場合、本発明に係るハイドロゲルは、ネイティブな細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の顕著なエレメントを模倣し、よって、動物細胞を培養する方法での使用に適している。
【００３４】
「初代細胞」は、生きた、非がん性の組織から直接採取された細胞、たとえば対象の組織サンプルからまたは対象の生検から得られた細胞を指す。
【００３５】
「増殖マーカー」は、細胞分裂を経る動物細胞、すなわち増殖性動物細胞で特異的に検出されるマーカーを指す。増殖マーカーの例として、限定するものではないが、ＤＮＡ複製の間に新規に合成されたＤＮＡにおけるＢｒｄＵ（５−ブロモ−２’−デオキシウリジン）またはＥｄＵ（５−エチニル−２’−デオキシウリジン）などのヌクレオシド類縁体の組み込み、増殖性動物細胞に特異的に存在するタンパク質、たとえば核タンパク質（たとえばＫｉ６７、ＰＣＮＡ）、細胞周期タンパク質（たとえばサイクリンＤ１、Ｃｄｋ２、ＰＣＮＡ、Ｐ２１、Ｐ２７）の発現が挙げられる。一実施形態では、増殖は、ＤＮＡにおけるＢｒｄＵまたはＥｄＵなどのヌクレオシド類縁体の組み込みの検出を介して評価される。本明細書で使用される場合、ＢｒｄＵまたはＥｄＵ陽性動物細胞（ＢｒｄＵまたはＥｄＵ＋動物細胞）は、ＢｒｄＵまたはＥｄＵの組み込みが検出された動物細胞を指す。動物細胞におけるヌクレオシド類縁体の組み込みを検出するための方法は、当業者によく知られている。一実施形態では、増殖は、増殖性動物細胞に特異的に存在するタンパク質の発現の検出を介して評価される。本明細書で使用される場合、あるタンパク質について陽性の動物細胞は、上記タンパク質を発現する動物細胞である。たとえば、サイクリンＤ１について陽性の動物細胞（サイクリンＤ１＋細胞）は、サイクリンＤ１の発現が、それぞれで検出された動物細胞である。動物細胞におけるタンパク質の発現を検出するための方法は、当業者によく知られており、たとえばＲＴ−ＰＣＴまたはＲＴ−ｑＰＣＲによる、ｍＲＮＡレベルを測定するための方法、およびたとえばウェスタンブロッティングおよび免疫局在決定によるか、または免疫組織化学検査による、タンパク質の発現および／またはレベルを測定するための方法を含む。
【００３６】
「増殖性初代肝細胞」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分裂でき、よって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖できる初代肝細胞を指す。一実施形態では、初代肝細胞は、培養物中の初代肝細胞の総数の少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％，好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約３０％、さらにより好ましくは少なくとも約４０％が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、たとえば以降の本明細書で定義される改変Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ  Ｅ培地（ＷＥ  ＨＨ）において、約３７℃、約５％のＣＯ２、８０〜１００％、好ましくは８５〜９５％の湿度で増殖できる場合に、増殖性である。一実施形態では、本発明の方法に係る培養物中の初代肝細胞の増殖は、ＢｒｄＵもしくはＥｄＵの組み込みの測定、および／またはＫｉ６７陽性（Ｋｉ６７＋）初代肝細胞、すなわちＫｉ６７を発現する初代肝細胞の検出を介して、評価され得る。あるいは、一実施形態において、本発明の方法に係る培養物中の初代肝細胞の増殖は、Ｃｄｋ２、サイクリンＤ１、Ｐ２１、および／またはＰ２７などの細胞周期マーカーの発現の測定を介して評価され得る。一実施形態では、培養物中の初代肝細胞の総数は、初代肝細胞とみなされる、アルブミンを発現する細胞、すなわちアルブミン陽性細胞（Ａｌｂ＋）でのアルブミンの検出を介して評価される。特定の実施形態では、初代肝細胞は、培養物中のＡｌｂ＋初代肝細胞の総数の少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％が、たとえばＢｒｄＵの組み込み、ＥｄＵの組み込み、Ｋｉ６７の発現、またはサイクリンＤ１の発現などの増殖マーカーに対して陽性である場合、増殖性である。一実施形態では、増殖性初代肝細胞は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５日間、好ましくは少なくとも２日間の本発明の方法に係るコラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスにおける３Ｄ培養の後に、得られる。一実施形態では、増殖性初代肝細胞は、２日間〜少なくとも１５日間の本発明の方法に係るコラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスにおける３Ｄ培養で得られる。一実施形態では、本発明の方法に係るコラーゲンマトリックスにおける３Ｄ培養での増殖性初代肝細胞は、好ましくは３Ｄ培養の２日目〜７日目に第１の波および３Ｄ培養の８日目〜１５日目に第２の波を伴う、少なくとも２つの増殖の波を経ることができる。一実施形態では、１つ以上のさらなる増殖の波が、本発明に係るコラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスに埋め込まれた初代肝細胞の培養物へＭＡＰＫ  ＭＥＫ１／２−ＥＲＫ１／２経路の阻害剤を添加することにより誘導される。
【００３７】
「スフェロイド」は、自己集合する動物細胞による培養物で形成される非接着性の複数の細胞の３Ｄ構造物を指す。本発明では、動物細胞による培養物で形成される３Ｄ構造は、「オルガノイド」とも呼ばれ得る。本明細書で使用される場合、用語「スフェロイド」は、動物細胞の球状の凝集体を指す。一実施形態では、本発明の方法に係る培養物中の肝細胞、特に初代ヒト肝細胞は、中空内腔を有する腺房様構造を有するスフェロイドを形成し、また、ヘパトスフィア（ｈｅｐａｔｏｓｐｈｅｒｅ）またはオルガノイドとも呼ばれ得る。よって一実施形態では、本発明に係るスフェロイドは、中空内腔を有する腺房様構造を形成する、良好に編成された動物細胞、特に初代肝細胞、好まししくは初代ヒト肝細胞の単層により区切られた球体として見える。一実施形態では、本発明に係るスフェロイドは、約５０μｍ〜約１５０μｍの範囲の直径を有する。
【００３８】
「３Ｄ培養」は、本発明の方法に係るコラーゲンマトリックス、またはゼラチンマトリックス、特にＧｅｌＭａマトリックスに埋め込まれた動物細胞の培養を指す。本発明では、動物細胞は、非接着性培養容器、たとえば低接着性または超低接着性培養容器でまずインキュベートされ、次にコラーゲンまたは切り詰め型コラーゲン、すなわちゼラチンを含む培養培地に移された後に、コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスで培養される。よって、本明細書で使用される場合、「３Ｄ培養」は、本発明の方法の第３のステップに対応する。
【００３９】
「増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物」は、増殖性動物細胞、すなわち本発明の方法によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖できる動物細胞の３Ｄ凝集体を指す。一実施形態では、３Ｄ動物細胞構造物は、スフェロイドである。
【００４０】
詳細な説明
本発明は、動物細胞を培養する方法であって、
ａ）まず、非接着性培養容器において動物細胞を培養することと、
ｂ）次に、コラーゲンまたは切り詰め型コラーゲン、すなわちゼラチンを含む培養培地に動物細胞を移すことにより、コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスに動物細胞を埋め込むことと、
ｃ）コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスに埋め込まれた動物細胞を培養することにより、増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物を得ること
を含む、方法に関する。
【００４１】
一実施形態では、本発明は、動物細胞を培養する方法であって、
ａ）まず、非接着性培養容器において動物細胞を培養することと、
ｂ）次に、コラーゲンを含む培養培地に動物細胞を移すことにより、コラーゲンマトリックスに動物細胞を埋め込むことと、
ｃ）コラーゲンマトリックスに埋め込まれた動物細胞を培養することにより、増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物を得ること
を含む、方法に関する。
【００４２】
一実施形態では、本発明は、動物細胞を培養する方法であって、
ａ）まず、非接着性培養容器において動物細胞を培養することと、
ｂ）次に、切り詰め型コラーゲン、すなわちゼラチンを含む培養培地に動物細胞を移すことにより、ゼラチンマトリックスに動物細胞を埋め込むことと、
ｃ）ゼラチンマトリックスに埋め込まれた動物細胞を培養することにより、増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物を得ること
を含む、方法に関する。
【００４３】
一実施形態では、本発明は、動物細胞を培養する方法であって、
ａ）まず、非接着性培養容器において動物細胞を培養することと、
ｂ）次に、メタクリル酸修飾ゼラチン（ＧｅｌＭａ）を含む培養培地に動物細胞を移すことにより、ＧｅｌＭａマトリックスに動物細胞を埋め込むことと、
ｃ）ＧｅｌＭａマトリックスに埋め込まれた動物細胞を培養することにより、増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物を得ること
を含む、方法に関する。
【００４４】
一実施形態では、動物細胞は、動物細胞の総数の少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％が、たとえばＢｒｄＵの組み込みについて陽性（ＢｒｄＵ＋）、ＥｄＵの組み込みに対して陽性（ＥｄＵ＋）、Ｋｉ６７の発現に対して陽性（Ｋｉ６７＋）、またはサイクリンＤ１の発現について陽性（サイクリンＤ１＋）などの、増殖マーカーについて陽性である場合、増殖性である。
【００４５】
本発明の方法は、生存および分化するために細胞間相互作用を必要とする実質的に任意の種の動物細胞の培養に適している。
【００４６】
一実施形態では、本発明の方法により培養される動物細胞は、初代動物細胞である。
【００４７】
一実施形態では、本明細書で上述される動物細胞は、哺乳類細胞である。別の実施形態では、本明細書で上述される動物細胞は、霊長類細胞である。別の実施形態では、本明細書で上述される動物細胞は、ヒト細胞である。
【００４８】
一実施形態では、本明細書で上述される動物細胞は、体細胞系であるかまたは分化した動物細胞である。別の実施形態では、本明細書で上述される動物細胞は、幹細胞、特に体性幹細胞である。
【００４９】
一実施形態では、本明細書で上述される動物細胞は、ヒト胚性幹細胞ではない。
【００５０】
本発明の方法により培養され得る動物細胞の例としては、限定するものではないが、実質性肝臓細胞、たとえば肝細胞；非実質性肝臓細胞、たとえばクッパー細胞、胆管細胞、線維芽細胞、類洞内皮細胞、および星細胞；肺細胞；心臓細胞；腎臓細胞；結腸細胞；皮膚細胞；精巣細胞；眼細胞；脳細胞；ならびにそれらの混合物が挙げられる。
【００５１】
一実施形態では、本明細書で上述される動物細胞は、肝臓細胞、たとえば実質性肝臓細胞（たとえば肝細胞）および非実質性肝臓細胞（たとえばクッパー細胞、胆管細胞、線維芽細胞、類洞内皮細胞、および星細胞）；肺細胞、たとえば肺細胞（ｐｎｅｕｍｏｃｙｔｅ）；心臓細胞、たとえば心筋細胞、結節細胞、および心筋内分泌細胞；結腸細胞、たとえばエンテロサイト、杯細胞（ゴブレット細胞とも呼ばれる）、パネート細胞、および腸内分泌細胞；皮膚細胞、たとえばケラチノサイト、メラニン形成細胞、角質細胞；腎臓細胞、たとえば腎臓上皮細胞；精巣細胞、たとえばライディッヒ細胞およびセルトリ細胞；眼細胞、たとえば光受容細胞、眼性細胞、および角膜実質細胞；脳細胞、たとえば神経細胞およびグリア細胞；ならびにそれらの混合物を含むかまたはそれらからなる群から選択される。
【００５２】
一実施形態では、本明細書で上述される動物細胞は、肝細胞、クッパー細胞、胆管細胞、線維芽細胞、類洞内皮細胞、星細胞、肺細胞、心筋細胞、結節細胞、心筋内分泌細胞、エンテロサイト、杯細胞（ゴブレット細胞とも呼ばれる）、パネート細胞、腸内分泌細胞、ケラチノサイト、メラニン形成細胞、角質細胞、腎臓上皮細胞、ライディッヒ細胞、セルトリ細胞、光受容細胞、角膜実質細胞、神経細胞、グリア細胞，およびそれらの混合物を含むかまたはそれらからなる群から選択される。
【００５３】
一実施形態では、本発明の方法で培養される動物細胞は、肝細胞、クッパー細胞、胆管細胞、線維芽細胞、類洞内皮細胞、星細胞、およびそれらの混合物を含むかまたはそれらからなる群から選択され、好ましくは、上記動物細胞は、初代動物細胞、より好ましくはヒト初代細胞である。
【００５４】
一実施形態では、本発明の方法で培養される動物細胞は、肝細胞、好ましくは初代肝細胞、より好ましくは初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）である。
【００５５】
一実施形態では、本発明の方法で培養される動物細胞は、単離された動物細胞である。一実施形態では、本発明の方法で培養される動物細胞は、以前に対象から採取された組織のサンプルから、たとえば以前に採取された生検から得られる。一実施形態では、本発明の方法で培養される動物細胞は、以前に対象から採取した肝臓のサンプルから得た後に凍結保存される。
【００５６】
一実施形態では、本発明の方法で培養される初代ヒト肝細胞は、以前に対象から採取した肝臓組織のサンプルから得られる。一実施形態では、本発明の方法で培養される初代ヒト肝細胞は、以前に対象から採取した肝臓のサンプルから得られた後に凍結保存される。
【００５７】
本発明の方法では、動物細胞を、まず非接着性培養容器で培養する。いずれの理論にも拘束されることを望むものではないが、本出願人は、非接着性培養容器での動物細胞の最初の培養が、動物細胞の凝集体の形成を可能にし、よって細胞間相互作用を高めることを示唆する。細胞間相互作用は、たとえばスフェロイドなどの増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物のその後の発達、構造化、および成長に重要である。
【００５８】
実際に本出願人は、非接着性培養容器において最初に動物細胞を培養することなく、コラーゲンを含む培養培地に動物細胞を直接添加し、これによりコラーゲンマトリックスに埋め込まれた動物細胞を培養することが、増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物を得ることを可能にしなかったことを示した。特に本出願人は、増殖性初代ヒト肝細胞を含むスフェロイドを得るために、初代ヒト細胞を、コラーゲンまたはゼラチン、特にメタクリル酸修飾ゼラチン（ＧｅｌＭａ）を含む培養培地に移し、コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックス、特にＧｅｌＭａマトリックスで培養する前に、まず非接着性培養容器で培養しなければならないことを示した。
【００５９】
本明細書で使用される場合、用語「非接着性培養容器」は、上記容器に対する、細胞の、特に動物細胞の接着に対して伝導性でない、培養容器を指す。言い換えると、非接着性培養容器で培養される細胞、特に動物細胞は、上記培養容器の内面（すなわち上記培養容器の壁および／または底）に接着しないか、またはごくわずか接着するか、または拡散しない。
【００６０】
非接着性培養容器としては、限定するものではないが、ガラスから作製された培養容器、未処理の培養容器、低接着性培養容器、および超低接着性培養容器が挙げられる。
【００６１】
本明細書で使用される場合、用語「未処理の培養容器」は、培養容器への細胞の接着を高めるために培養容器に一般に適用される化学処理またはコーティングを経ていない培養容器を指す。細胞培養の分野では、一般に「処理された培養容器」は、培養容器の内面に対する細胞、特に動物細胞の接着を高めるための化学処理またはコーティングを経た、通常ポリスチレンから作製されたプレートまたはディッシュなどの培養容器を指す。実際に、ポリスチレンは、それに対し細胞が、特に動物細胞が接着することが非常に困難である、著しく疎水性のポリマーである。
【００６２】
一実施形態では、本明細書で上述される非接着性培養容器は、ガラスから作製された培養容器、未処理の培養容器、低接着性培養容器、および超低接着性培養容器を含むかまたはそれらからなる群から選択され；好ましくは、上記非接着性培養容器は、低接着性または超低接着性培養容器である。
【００６３】
低接着性培養容器および超低接着性培養容器の例としては、限定するものではないが、低接着性ディッシュおよび超低接着性ディッシュ、低接着性フラスコおよび超低接着性フラスコ、ならびに低接着性プレートおよび超低接着性プレート、たとえば低接着性マルチウェルプレートおよび超低接着性マルチウェルプレート、または低接着性マイクロプレートおよび超低接着性マイクロプレートが挙げられる。
【００６４】
低接着性培養容器および超低接着性培養容器は、培養容器の内面に共有結合されたコーティング、通常は親水性ゲルの存在を特徴とする。上記コーティングは、特異的な固定化および非特異的な固定化を阻害し、よって、培養容器の内面への細胞接着を妨げ、それにより細胞を懸濁した状態に維持する。
【００６５】
低接着性培養容器および超低接着性培養容器、特に低接着性プレート（ＬＡＰ）および超低接着性プレート（ＵＬＡ）は、供給者から容易に入手可能であり、たとえばＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）、ＩｎＳｐｈｅｒｏ（登録商標）、Ｓ−Ｂｉｏ（登録商標）、またはＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（登録商標）の低接着性プレートおよび超低接着性プレートを含む。
【００６６】
あるいは、低接着性培養容器、特に低接着性プレートを調製するための方法は、当業者によく知られている。このような方法としては、限定するものではないが、１％のアガロースでのコーティング未処理の培養容器、またはポリ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ポリ−ＨＥＭＡとも呼ばれる）でのコーティング未処理の培養容器が挙げられる。
【００６７】
一実施形態では、本発明の方法で培養される動物細胞は、凍結保存されていた。よって一実施形態では、本発明の方法で培養される動物細胞は、最初に解凍される
【００６８】
以前に凍結された動物細胞を解凍するための方法は、動物細胞培養の分野でよく知られている。
【００６９】
一実施形態では、本発明の方法で培養される動物細胞は、まず、たとえばＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）、ＩｎＳｐｈｅｒｏ（登録商標）、Ｓ−Ｂｉｏ（登録商標）、またはＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（登録商標）の低接着性プレートまたは超低接着性プレートなどの低接着性プレート（ＬＡＰ）または超低接着性プレート（ＵＬＡ）で培養される。
【００７０】
一実施形態では、動物細胞は、少なくとも約１ｈ、２ｈ、３ｈ、４ｈ、５ｈ、６ｈ、７ｈ、８ｈ、９ｈ、１０ｈ、１１ｈ、１２ｈ、１３ｈ、１４ｈ、または１５ｈの間、上述される非接着性培養容器で培養される。
【００７１】
一実施形態では、動物細胞は、最大約９６ｈ、８４ｈ、７２ｈ、６０ｈ、４８ｈ、３６ｈ、２４ｈ、２３ｈ、２２ｈ、２１ｈ、または２０ｈの間、上述される非接着性培養容器で培養される。
【００７２】
一実施形態では、動物細胞は、約１ｈ〜約９６ｈ、好ましくは約５ｈ〜約４８ｈ、より好ましくは約１０ｈ〜約２０ｈの範囲の期間の間、上述される非接着性培養容器で培養される。
【００７３】
一実施形態では、動物細胞は、少なくとも約１０２、５×１０２、または１０３個の細胞／ｃｍ２の濃度で、上述される非接着性培養容器で培養される。
【００７４】
一実施形態では、動物細胞は、最大約１０６、５×１０５、または１０５個の細胞／ｃｍ２の濃度で、上述される非接着性培養容器で培養される。
【００７５】
一実施形態では、動物細胞は、約１０２〜約１０６個の細胞／ｃｍ２、好ましくは約１０３〜約１０５個の細胞／ｃｍ２、より好ましくは約１×１０４〜約９×１０４個の細胞／ｃｍ２の範囲の濃度で、上述される非接着性培養容器で培養される。
【００７６】
一実施形態では、動物細胞は、約１０５〜約５×１０５個の細胞／ｃｍ２、好ましくは約２×１０５〜約２．５×１０５個の細胞／ｃｍ２の範囲の濃度で、上述される非接着性培養容器で培養される。一実施形態では、動物細胞は、約１０６〜約５×１０６個の細胞／ウェル、好ましくは約２×１０６〜約２．５×１０６個の細胞／ウェル（上記ウェルは、好ましくは約１０ｃｍ２の表面を有する）の範囲の濃度で、低接着性または超低接着性プレートで培養される。
【００７７】
一実施形態では、動物細胞は、約１０２、１０３、１０４、１０５、または１０６個の細胞／ｃｍ２の濃度で、上述される非接着性培養容器で培養される。
【００７８】
一実施形態では、動物細胞は、約１×１０４、２×１０４、３×１０４、４×１０４、５×１０４、６×１０４、７×１０４、８×１０４、または９×１０４個の細胞／ｃｍ２の濃度で、上述される非接着性培養容器で培養される。
【００７９】
一実施形態では、動物細胞は、少なくとも約５×１０３、１０４、または５×１０４個の細胞／ｍｌ（培養培地）の濃度で、上述される非接着性培養容器で培養される。
【００８０】
一実施形態では、動物細胞は、最大約２×１０７、１０７、または５×１０６個の細胞／ｍｌ（培養培地）の濃度で、上述される非接着性培養容器で培養される。
【００８１】
一実施形態では、動物細胞は、約５×１０３〜約２×１０７個の細胞／ｍｌ（培養培地）、好ましくは約１０４〜約１０７個の細胞／ｍｌ（培養培地）、より好ましくは約１０５〜約１０６個の細胞／ｍｌ（培養培地）の範囲の濃度で、上述される非接着性培養容器で培養される。
【００８２】
一実施形態では、動物細胞は、約１０４、１０５、１０６、または１０７個の細胞／ｍｌ（培養培地）の濃度で、上述される非接着性培養容器で培養される。
【００８３】
動物細胞の培養に適切な条件を選択することは、当業者によく知られている。よって、本発明の方法に係る上述される非接着性培養容器で動物細胞を培養するために使用される培養条件、たとえば培養培地、温度、湿度、およびＣＯ２のレベルなどは、当業者に明らかであり、培養される動物細胞に応じて変化する。
【００８４】
本発明の方法で使用され得る培養培地としては、たとえば血清含有培地、血清フリー培地、特にヒト細胞培養用のゼノフリー培地、タンパク質フリー培地、合成培地（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｍｅｄｉａ）などの、天然の培地および合成の培地が挙げられる。
【００８５】
培養培地の例としては、限定するものではないが、Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ  Ｅ培地、ＢＭＥ（Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ）、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１０、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地、Ｋａｉｇｈｎ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地、およびＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ培地が挙げられる。
【００８６】
また本発明に係る培養培地は、特定の種類の動物細胞の培養に適した培地、たとえば、肝細胞の培養に適した培養培地（たとえばＷｉｌｌｉａｍ’ｓ  Ｅ培地）も含む。
【００８７】
本発明では、培養培地は、塩、炭素供給源、アミノ酸、血清および血清成分、ビタミン、ミネラル、還元剤、緩衝剤、脂質、ヌクレオシド、抗菌剤、サイトカイン、および増殖因子などのさらなる物質を補充され得る。
【００８８】
一実施形態では、本発明の方法で培養される動物細胞は、初代動物細胞、好ましくは初代ヒト細胞であり、これらは、初代動物細胞、好ましくは初代ヒト細胞の培養に適した培地において、上述される非接着性培養容器で培養される。
【００８９】
初代動物細胞の培養に適した培地は、市販されている。初代動物細胞、好ましくは初代ヒト細胞の培養に適した培地は、当業者に明らかであり、培養される初代動物細胞（たとえば肝細胞、肺細胞、心筋細胞、ケラチノサイト、メラニン形成細胞、角質細胞、または神経細胞）に応じて変化する。
【００９０】
一実施形態では、本発明の方法で培養される動物細胞は、肝細胞、特に初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞であり、これらは、肝細胞、特に初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞に適した培地において、上述される非接着性培養容器で培養される。
【００９１】
肝細胞、特に初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞の培養に適した培地の例としては、限定するものではないが、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ  Ｅ培地、肝細胞培養培地、Ｂａｓａｌ  ＨｅｐａＲＧ培地、ＨＢＭ基本培地、および肝細胞基本培地が挙げられる。
【００９２】
本発明では、上記肝細胞、特に初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞の培養に適した培地は、たとえばＬ−グルタミン、アルブミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、インスリン、トランスフェリン、ピルビン酸ナトリウム、亜セレン酸ナトリウム、ヒドロコルチゾンもしくはデキサメタゾン、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）、ＥＧＦ（上皮増殖因子）および／またはＦＢＳ（ウシ胎児血清）とも呼ばれるＦＣＳ（ウシ胎仔血清）などを補充され得る。
【００９３】
一実施形態では、上記肝細胞、特に初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞の培養に適した培地は、たとえばゲンタマイシン、Ｌ−グルタミン、アルブミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、インスリン、トランスフェリン、ピルビン酸ナトリウム、亜セレン酸ナトリウム、ヒドロコルチゾンもしくはデキサメタゾン、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）、ＥＧＦ（上皮増殖因子）、および／またはＦＢＳ（ウシ胎児血清）とも呼ばれるＦＣＳ（ウシ胎仔血清）などを補充され得る。
【００９４】
一実施形態では、本発明の方法により培養される動物細胞は、肝細胞、特に初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞であり、これらは、ペニシリン、ストレプトマイシン、インスリン、グルタミン（Ｌ−グルタミン）およびアルブミンを補充され、任意選択でトランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、ヒドロコルチゾン、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）、ＥＧＦ（上皮増殖因子）、および／またはＦＢＳ（ウシ胎児血清）とも呼ばれるＦＣＳ（ウシ胎仔血清）を補充された、ＷＥ  ＨＨ（（Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ  Ｅ  ｍｅｄｉｕｍ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）とも呼ばれるＷｉｌｌｉａｍ’ｓ  Ｅ培地において、低接着性または超低接着性培養容器、好ましくは低接着性または超低接着性プレートで、培養される。
【００９５】
一実施形態では、本発明の方法により培養される動物細胞は、肝細胞、特に初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞であり、これらは、ペニシリン、ストレプトマイシン、インスリン、グルタミン（Ｌ−グルタミン）、アルブミンを含み、任意選択でＦＣＳ（ウシ胎仔血清）を含むＷＥ  ＨＨ培地において、低接着性または超低接着性培養容器、好ましくは低接着性または超低接着性プレートで、培養される。
【００９６】
一実施形態では、本発明のＷＥ  ＨＨ培地は、約５０〜約２００Ｕ／ｍＬ、好ましくは約１００Ｕ／ｍＬの範囲の濃度でペニシリン；約５０〜約２００μｇ／ｍＬ、好ましくは１００μｇ／ｍＬの範囲の濃度でストレプトマイシン；約５〜約３０μｇ／ｍＬ、好ましくは約５μｇ／ｍＬ、または約１５μｇ／ｍＬの範囲の濃度でインスリン；約１〜約１０ｍＭ、好ましくは約２ｍＭの範囲の濃度でグルタミン（Ｌ−グルタミン）；約０．０１〜約１（ｗ／ｖ）％、好ましくは約０．１（ｗ／ｖ）％の範囲の濃度でアルブミン；および約０〜約２０（ｖ／ｖ）％、または１％〜約２０（ｖ／ｖ）％、好ましくは約１０（ｖ／ｖ）％の範囲の濃度でＦＣＳ（ウシ胎仔血清）を含む。
【００９７】
一実施形態では、本発明の方法で培養される動物細胞は、肝細胞、特に初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞であり、これらは、ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）を含まないかまたはこれを補充されていない培養培地、好ましくはＷｉｌｌｉａｍ’ｓ  Ｅ培地において、低接着性または超低接着性培養容器、好ましくは低接着性または超低接着性プレートで培養される。
【００９８】
一実施形態では、本発明の方法で培養される動物細胞は、肝細胞、特に初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞であり、これらは、ペニシリン、ストレプトマイシン、インスリン、グルタミン（Ｌ−グルタミン）、アルブミン、およびヒドロコルチゾンを補充され、任意選択でトランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）、ＥＧＦ（上皮増殖因子）、および／またはＦＣＳ（ウシ胎仔血清）を補充されるＷＥ  ＨＨ培地において、低接着性または超低接着性培養容器、好ましくは低接着性または超低接着性プレートで培養される。
【００９９】
一実施形態では、本発明のＷＥ  ＨＨ培地は、ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）を伴うかまたは伴わずに、ペニシリン、ストレプトマイシン、インスリン、グルタミン（Ｌ−グルタミン）、およびアルブミンを補充される。
【０１００】
一実施形態では、本発明のＷＥ  ＨＨ培地は、ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）を伴うかまたは伴わずに、ペニシリン、ストレプトマイシン、インスリン、グルタミン（Ｌ−グルタミン）、アルブミン、ヒドロコルチゾン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）、およびＥＧＦ（上皮増殖因子）を補充される。
【０１０１】
一実施形態では、本発明のＷＥ  ＨＨ培地は、約５〜約３０μｇ／ｍＬ、好ましくは約５〜約１５μｇ／ｍＬ、より好ましくは約５μｇ／ｍＬまたは約１５μｇ／ｍＬの範囲の濃度でインスリン；約０〜約１０μｇ／ｍＬ、または約０．１〜約１０μｇ／ｍＬ、好ましくは約５．５μｇ／ｍＬの範囲の濃度でトランスフェリン；約０〜約１０μｇ／ｍＬ、または約０．１〜約１０μｇ／ｍＬ、好ましくは約５μｇ／ｍＬの範囲の濃度で亜セレン酸ナトリウム；約０．１〜約５０μＭ、好ましくは約１μｍの範囲の濃度でヒドロコルチゾン；約０〜約１０ｎｇ／ｍＬ、または約０．１〜約１０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約２．５ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度でｒｈＨＧＦ（組み換え型ヒト肝細胞増殖因子）；約０〜約１ｎｇ／μＬ、または約０．０１〜約１ｎｇ／μＬ、好ましくは約０．０５ｎｇ／μＬの範囲の濃度でｒｈＥＧＦ（組み換え型ヒト上皮増殖因子）；約０〜約２０（ｖ／ｖ）％、または約１（ｖ／ｖ）％〜約２０（ｖ／ｖ）％、好ましくは約１０（ｖ／ｖ）％の範囲の濃度でＦＣＳ（ウシ胎仔血清）；約１〜約１０ｍＭ、好ましくは約２ｍＭの範囲の濃度でグルタミン（Ｌ−グルタミン）；約０．０１〜約１（ｗ／ｖ）％、好ましくは約０．１（ｗ／ｖ）％の範囲の濃度でアルブミン；約５０〜約２００Ｕ／ｍＬ、好ましくは約１００Ｕ／ｍＬの範囲の濃度でペニシリン；約５０〜約２００μｇ／ｍＬ、好ましくは１００μｇ／ｍＬの範囲の濃度でストレプトマイシンを含む。
【０１０２】
一実施形態では、本明細書で上述されるＷＥ  ＨＨ培地は、ゲンタマイシンをさらに含む。
【０１０３】
よって、一実施形態では、本発明の方法により培養される動物細胞は、肝細胞、特に初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞であり、これらは、ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）を伴うかまたは伴わずに、ゲンタマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、インスリン、グルタミン（Ｌ−グルタミン）、アルブミン、およびヒドロコルチゾンで補充されているＷＥ  ＨＨ培地において、低接着性または超低接着性培養容器、好ましくは低接着性または超低接着性プレートで培養される。
【０１０４】
一実施形態では、本明細書で上述されるＷＥ  ＨＨ培地は、約１〜約１００μｇ／ｍＬ、好ましくは約５０μｇ／ｍＬの範囲の濃度でゲンタマイシンを含む。
【０１０５】
よって一実施形態では、本発明の方法により培養される動物細胞は、肝細胞、特に初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞であり、これらは、約１（ｖ／ｖ）％〜約２０（ｖ／ｖ）％、好ましくは約１０（ｖ／ｖ）％の範囲の濃度でＦＣＳ（ウシ胎仔血清）を伴うかまたは伴わずに、約１〜約１００μｇ／ｍＬ、好ましくは約５０μｇ／ｍＬの範囲の濃度でゲンタマイシン；約５０〜約２００Ｕ／ｍＬ、好ましくは約１００Ｕ／ｍＬの範囲の濃度でペニシリン；約５０〜約２００μｇ／ｍＬ、好ましくは１００μｇ／ｍＬの範囲の濃度でストレプトマイシン；約５〜約３０μｇ／ｍＬ、好ましくは約５〜約１５μｇ／ｍＬ、より好ましくは約５μｇ／ｍＬの範囲の濃度でインスリン；約１〜約１０ｍＭ、好ましくは約２ｍＭの範囲の濃度でグルタミン（Ｌ−グルタミン）；約０．０１〜約１（ｗ／ｖ）％、好ましくは約０．１（ｗ／ｖ）％の範囲の濃度でアルブミンを補充されるＷＥ  ＨＨ培地において、低接着性または超低接着性培養容器、好ましくは低接着性または超低接着性プレートで培養される。
【０１０６】
一実施形態では、本発明の方法により培養される動物細胞は、ヒト細胞、好ましくは初代ヒト細胞、たとえば初代ヒト肝細胞などであり、これらは、約３７℃、約５％のＣＯ２において、非接着性培養容器、好ましくは低接着性または超低接着性培養容器で培養される。
【０１０７】
本発明の方法では、上述される非接着性培養容器において動物細胞を培養することは、上記動物細胞の凝集体を得ることを可能にする。
【０１０８】
一実施形態では、上述される非接着性培養容器において動物細胞を培養した後に、動物細胞の少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％、好ましくは少なくとも約５０％が、凝集する。
【０１０９】
細胞凝集体の形成を観察するための方法は、当業者によく知られておりたとえば、２光子励起蛍光（ＴＰＥＦ）顕微鏡などの蛍光顕微鏡を含む。
【０１１０】
本発明の方法では、最初に上述される非接着性培養容器において動物細胞を培養した後に、動物細胞は、コラーゲンまたは切り詰め型コラーゲン、すなわちゼラチンを含む培養培地に移され、したがってコラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスに埋め込まれる。いずれの理論によっても拘束されることを望まないが、本出願人は、コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスに動物細胞を埋め込むことが、動物細胞の増殖および増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物の形成を可能にする微小環境を動物細胞に提供することを示唆する。特に本出願人は、コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックス、特にメタクリル酸修飾ゼラチン（ＧｅｌＭａ）に初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）を埋め込むことが、ＰＨＨの増殖および本発明に係るＰＨＨスフェロイド、すなわち中空内腔を有する腺房様構造を形成する良好に編成されたＰＨＨの単層により区切られた球体の形成を可能にする微小環境を、ＰＨＨに提供することを示唆する。
【０１１１】
実際に、本出願人は、コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスに動物細胞を埋め込むことなく上述される非接着性培養容器で動物細胞を継続して培養することが、増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物を得ることを可能にしなかったことを示した。特に本出願人は、増殖性初代ヒト肝細胞を含むスフェロイド（上記スフェロイドは、良好に編成されたＰＨＨ形成の単層により区切られた中空内腔を有する腺房様構造である）を得るために、低接着性プレートなどの非接着性培養容器でまず培養された初代ヒト肝細胞が、コラーゲンまたはゼラチン、特にメタクリル酸修飾ゼラチン（ＧｅｌＭａ）を含む培地に移され、かつコラーゲンマトリックス、ゼラチンマトリックス、特にＧｅｌＭａマトリックスに埋め込まれなければならないことを示した。
【０１１２】
本発明では、コラーゲンを含む培養培地を得るため、よって上記コラーゲンを含む培養培地において非接着性培養容器でまず培養された動物細胞を移すために、コラーゲンが、本明細書で上述される培養培地に添加される。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、用語「コラーゲン」は、コラーゲンの異なるサブファミリーおよびゼラチンとも呼ばれる切り詰め型コラーゲンを包有する。
【０１１４】
よって一実施形態では、動物細胞は、切り詰め型コラーゲン、すなわちゼラチンを含む培養培地に移される。
【０１１５】
一実施形態では、動物細胞は、線維性コラーゲンを含む培養培地に移される。
【０１１６】
一実施形態では、動物細胞は、線維性コラーゲンに由来するゼラチンを含む培養培地に移される。
【０１１７】
線維性コラーゲンの例としては、限定するものではないが、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン、ＸＩ型コラーゲン、ＸＸＩＶ型コラーゲン、およびＸＸＶＩＩ型コラーゲンが挙げられる。
【０１１８】
一実施形態では、動物細胞は、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン、ＸＩ型コラーゲン、ＸＸＩＶ型コラーゲン、ＸＸＶＩＩ型コラーゲン、およびそれらのいずれかの混合物を含むかまたはそれらからなる群から選択される線維性コラーゲンを含む培養培地に移される。
【０１１９】
一実施形態では、動物細胞は、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン、ＸＩ型コラーゲン、ＸＸＩＶ型コラーゲン、ＸＸＶＩＩ型コラーゲン、およびそれらのいずれかの混合物を含むかまたはそれらからなる群から選択される線維性コラーゲンに由来するゼラチンを含む培養培地に移される。
【０１２０】
一実施形態では、動物細胞は、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、およびそれらのいずれかの混合物を含むかまたはそれらからなる群から選択される線維性コラーゲンを含む培養培地に移される。
【０１２１】
一実施形態では、動物細胞は、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、およびそれらのいずれかの混合物を含むかまたはそれらからなる群から選択される線維性コラーゲンに由来するゼラチンを含む培養培地に移される。
【０１２２】
一実施形態では、動物細胞は、Ｉ型コラーゲンを含む培養培地に移される。
【０１２３】
一実施形態では、動物細胞は、Ｉ型コラーゲンに由来するゼラチンを含む培養培地に移される。一実施形態では、動物細胞は、Ａ型ゼラチン、特にＩ型コラーゲンに由来するＡ型ゼラチンを含む培養培地に移される。
【０１２４】
本発明の方法で使用され得るＩ型コラーゲンの例としては、限定するものではないが、ラットのＩ型コラーゲン、ウシのＩ型コラーゲン、ブタのＩ型コラーゲン、ヒト胎盤由来のヒトＩ型コラーゲン、組み換え型ヒトＩ型コラーゲン、ウサギの皮膚由来のＩ型コラーゲン、ヒツジのＩ型コラーゲン、ならびにクラゲおよび海洋物質由来のＩ型関連線維性コラーゲンが挙げられる。
【０１２５】
一実施形態では、動物細胞は、少なくとも約０．２５ｍｇ／ｍＬ、０．３０ｍｇ／ｍＬ、０．３５ｍｇ／ｍＬ、０．４０ｍｇ／ｍＬ、０．４５ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、０．５５ｍｇ／ｍＬ、０．６ｍｇ／ｍＬ、０．６５ｍｇ／ｍＬ、０．７ｍｇ／ｍＬ、または０．７５ｍｇ／ｍＬの濃度にて本明細書で上述されるコラーゲンを含む培養培地に移される。別の実施形態では、動物細胞は、少なくとも約０．７０ｍｇ／ｍＬ、０．７１ｍｇ／ｍＬ、０．７２ｍｇ／ｍＬ、０．７３ｍｇ／ｍＬ、０．７４ｍｇ／ｍＬ、または０．７５ｍｇ／ｍＬの濃度にて本明細書で上述されるコラーゲンを含む培養培地に移される。
【０１２６】
一実施形態では、動物細胞は、最大約４ｍｇ／ｍＬ、３．７５ｍｇ／ｍＬ、３．５ｍｇ／ｍＬ、３．２５ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、２．７５ｍｇ／ｍＬ、２．５ｍｇ／ｍＬ、２．２５ｍｇ／ｍＬ、または２ｍｇ／ｍＬの濃度にて本明細書で上述されるコラーゲンを含む培養培地に移される。別の実施形態では、動物細胞は、最大約４ｍｇ／ｍＬ、３．９ｍｇ／ｍＬ、３．８ｍｇ／ｍＬ、３．７ｍｇ／ｍＬ、３．６ｍｇ／ｍＬ、３．５ｍｇ／ｍＬ、３．４ｍｇ／ｍＬ、３．３ｍｇ／ｍＬ、３．２ｍｇ／ｍＬ、３．１ｍｇ／ｍＬ、または３ｍｇ／ｍＬの濃度にて本明細書で上述されるコラーゲンを含む培養培地に移される。別の実施形態では、動物細胞は、最大約３ｍｇ／ｍＬ、２．９ｍｇ／ｍＬ、２．８ｍｇ／ｍＬ、２．７ｍｇ／ｍＬ、２．６ｍｇ／ｍＬ、２．５ｍｇ／ｍＬ、２．４ｍｇ／ｍＬ、２．３ｍｇ／ｍＬ、２．２ｍｇ／ｍＬ、２．１ｍｇ／ｍＬ、または２ｍｇ／ｍＬの濃度にて本明細書で上述されるコラーゲンを含む培養培地に移される。
【０１２７】
一実施形態では、動物細胞は、約０．２５ｍｇ／ｍＬ〜約３ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約２．５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約０．７５ｍｇ／ｍＬ〜約１．５ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度にて本明細書で上述されるコラーゲンを含む培養培地に移される。
【０１２８】
一実施形態では、動物細胞は、約０．７５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、１．２５ｍｇ／ｍＬ、または１．５ｍｇ／ｍＬの濃度にて本明細書で上述されるコラーゲンを含む培養培地に移される。
【０１２９】
一実施形態では、動物細胞は、少なくとも約１５（ｗ／ｖ）％、２０（ｖ／ｗ）％、２５（ｗ／ｖ）％、３０（ｗ／ｖ）％、３５（ｗ／ｖ）％、４０（ｗ／ｖ）％、４５（ｗ／ｖ）％、または５０（ｗ／ｖ）％の濃度にて本明細書で上述されるゼラチンを含む培養培地に移される。よって一実施形態では、動物細胞は、少なくとも約１５０ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、２５０ｍｇ／ｍＬ、３００ｍｇ／ｍＬ、３５０ｍｇ／ｍＬ、４００ｍｇ／ｍＬ、４５０ｍｇ／ｍＬ、または５００ｍｇ／ｍＬの濃度にて本明細書で上述されるゼラチンを含む培養培地に移される。
【０１３０】
一実施形態では、動物細胞は、最大約６０（ｗ／ｖ）％、５５（ｗ／ｖ）％、５０（ｗ／ｖ）％、４５（ｗ／ｖ）％、または４０（ｗ／ｖ）％の濃度にて本明細書で上述されるゼラチンを含む培養培地に移される。よって一実施形態では、動物細胞は、最大約６００ｍｇ／ｍＬ、５５０ｍｇ／ｍＬ、５００ｍｇ／ｍＬ、４５０ｍｇ／ｍＬ、または４００ｍｇ／ｍＬの濃度にて本明細書で上述されるゼラチンを含む培養培地に移される。
【０１３１】
一実施形態では、動物細胞は、約１５（ｗ／ｖ）％〜約６０（ｗ／ｖ）％、好ましくは約２０（ｗ／ｖ）〜約５０（ｗ／ｖ）％の範囲の濃度にて本明細書で上述されるゼラチンを含む培養培地に移される。よって一実施形態では、動物細胞は、約１５０ｍｇ／ｍＬ〜約６００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約２００ｍｇ／ｍＬ〜約５００ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度にて本明細書で上述されるゼラチンを含む培養培地に移される。
【０１３２】
特定の実施形態では、動物細胞は、メタクリル酸修飾ゼラチン（ＧｅｌＭａ）を含む培養培地に移される。
【０１３３】
一実施形態では、ＧｅｌＭａは、無水メタクリル酸での本明細書で上述されるゼラチンのメタクリル化（ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｉｏｎ）により得られる。一実施形態では、ＧｅｌＭａは、無水メタクリル酸でのＩ型コラーゲンに由来するゼラチンのメタクリル化により得られる。一実施形態では、ＧｅｌＭａは、Ａ型ゼラチンのメタクリル化により得られる。一実施形態では、無水メタクリル酸でのＩ型コラーゲンに由来するＡ型ゼラチンのメタクリル化により得られる。
【０１３４】
一実施形態では、動物細胞は、少なくとも約１（ｗ／ｖ）％、２（ｗ／ｖ）％、２．５（ｗ／ｖ）％、３（ｗ／ｖ）％、４（ｗ／ｖ）％、または５（ｗ／ｖ）％の濃度にて本明細書で上述されるＧｅｌＭａを含む培養培地に移される。よって一実施形態では、動物細胞は、少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、または５０ｍｇ／ｍＬの濃度にて本明細書で上述されるＧｅｌＭａを含む培養培地に移される。
【０１３５】
一実施形態では、動物細胞は、最大約２０（ｗ／ｖ）％、１５（ｗ／ｖ）％、１０（ｗ／ｖ）％、９（ｗ／ｖ）％、８（ｗ／ｖ）％、７（ｗ／ｖ）％、７．５（ｗ／ｖ）％、６（ｗ／ｖ）％、または５（ｗ／ｖ）％の濃度にて本明細書で上述されるＧｅｌＭａを含む培養培地に移される。よって一実施形態では、動物細胞は、最大約２００ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、または５０ｍｇ／ｍＬの濃度にて本明細書で上述されるＧｅｌＭａを含む培養培地に移される。
【０１３６】
一実施形態では、動物細胞は、約１（ｗ／ｖ）％〜約２０（ｗ／ｖ）％、好ましくは約２．５（ｗ／ｖ）％〜約１０（ｗ／ｖ）％、より好ましくは約４（ｗ／ｖ）％〜約６（ｗ／ｖ）％の範囲の濃度にて本明細書で上述されるＧｅｌＭａを含む培養培地に移される。よって一実施形態では、動物細胞は、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約２５ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約４０ｍｇ／ｍＬ〜約６０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度にて本明細書で上述されるＧｅｌＭａを含む培養培地に移される。
【０１３７】
一実施形態では、動物細胞は、約５（ｗ／ｖ）％、すなわち約５０ｍｇ／ｍＬの濃度でＧｅｌＭａを含む培養培地に移される。
【０１３８】
一実施形態では、本明細書で上述される培養培地に含まれるコラーゲン、切り詰め型コラーゲン（すなわちゼラチン）、またはメタクリル酸修飾ゼラチンの濃度は、培養培地におけるコラーゲン、切り詰め型コラーゲン（すなわちゼラチン）、またはメタクリル酸修飾ゼラチンの最終濃度として表される。
【０１３９】
一実施形態では、動物細胞は、本明細書で上述されるＧｅｌＭａを含み、光の曝露の後に重合を誘導するための光重合開始剤をさらに含む培養培地に移される。
【０１４０】
光重合開始剤の例としては、限定するものではないが、２，２’−アゾビス［２−メチル−ｎ−（２−ヒドロキシエチル）プロピオンアミド］（ＶＡ−０８６としても知られている）、１−［４−（２−ヒドロキシエトキシ）−フェニル］−２−ヒドロキシ−２−メチル−１−プロパノン（Ｉｒｇａｃｕｒｅ  ２９５９としても知られている）、リチウム  フェニル−２，４，６−トリメチルベンゾイルホスフィナート（ＬＡＰまたはＢｉｏＫｅｙとしても知られている）、２’，４’，５’，７’−テトラブロモフルオレセイン二ナトリウム塩（エオシンＹまたはＥＹとしても知られている）が挙げられる。
【０１４１】
一実施形態では、光重合開始剤は、２，２’−アゾビス［２−メチル−ｎ−（２−ヒドロキシエチル）プロピオンアミド］（ＶＡ−０８６としても知られている）、１−［４−（２−ヒドロキシエトキシ）−フェニル］−２−ヒドロキシ−２−メチル−１−プロパノン（Ｉｒｇａｃｕｒｅ  ２９５９としても知られている）、リチウム  フェニル−２，４，６−トリメチルベンゾイルホスフィナート（ＬＡＰまたはＢｉｏＫｅｙとしても知られている）、および２’，４’，５’，７’−テトラブロモフルオレセイン二ナトリウム塩（エオシンＹまたはＥＹとしても知られている）を含むかまたはそれらからなる群から選択され、好ましくは光重合開始剤は、リチウム  フェニル−２，４，６−トリメチルベンゾイルホスフィナート（ＬＡＰまたはＢｉｏＫｅｙとしても知られている）である。
【０１４２】
一実施形態では、動物細胞は、本明細書で上述されるＧｅｌＭａを含み、少なくとも約０．０１（ｗ／ｖ）％、０．０５（ｗ／ｖ）％、０．０７５（ｗ／ｖ）％、０．１（ｗ／ｖ）％、０．２５（ｗ／ｖ）％、または０．５（ｗ／ｖ）％の濃度にて本明細書で上述される光重合開始剤をさらに含む培養培地に移される。よって一実施形態では、動物細胞は、本明細書で上述されるＧｅｌＭａを含み、少なくとも約０．１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、０．７５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、２．５ｍｇ／ｍＬ、または５ｍｇ／ｍＬの濃度にて本明細書で上述される光重合開始剤をさらに含む培養培地に移される。
【０１４３】
一実施形態では、動物細胞は、本明細書で上述されるＧｅｌＭａを含み、最大約２（ｗ／ｖ）％、１．５（ｗ／ｖ）％、１（ｗ／ｖ）％、０．７５（ｗ／ｖ）％、０．５（ｗ／ｖ）％、０．２５（ｗ／ｖ）％、０．１（ｗ／ｖ）％、または０，０５（ｗ／ｖ）％の濃度にて本明細書で上述される光重合開始剤をさらに含む培養培地に移される。よって一実施形態では、動物細胞は、本明細書で上述されるＧｅｌＭａを含み、最大約２０ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、７．５ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、２．５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、または０，５ｍｇ／ｍＬの濃度にて本明細書で上述される光重合開始剤をさらに含む培養培地に移される。
【０１４４】
一実施形態では、動物細胞は、本明細書で上述されるＧｅｌＭａを含み、約０．０１（ｗ／ｖ）％〜約２（ｗ／ｖ）％の範囲の濃度にて本明細書で上述される光重合開始剤をさらに含む培養培地に移される。よって一実施形態では、動物細胞は、本明細書で上述されるＧｅｌＭａを含み、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度にて本明細書で上述される光重合開始剤をさらに含む培養培地に移される。
【０１４５】
一実施形態では、動物細胞は、本明細書で上述されるＧｅｌＭａを含み、約１（ｗ／ｖ）％の濃度、すなわち約１ｍｇ／ｍＬの濃度にて本明細書で上述される光重合開始剤をさらに含む培養培地に移される。
【０１４６】
一実施形態では、コラーゲンまたはゼラチンを含む培養培地を得るためにコラーゲンまたはゼラチンが添加される培養培地、および本明細書で上述される非接着性培養容器で動物細胞を培養するために先に使用される培養培地は、異なる培地である。別の実施形態では、コラーゲンまたはゼラチンを含む培養培地を得るためにコラーゲンまたはゼラチンを添加する培養培地、および本明細書で上述される非接着性培養容器で動物細胞を培養するために先に使用される培養培地は、同じ培地である。
【０１４７】
本明細書で上述されるように、本発明の方法により使用される培養培地は、当業者に明らかであり、培養される動物細胞に応じて変化する。本発明の方法により使用され得る培養培地は、本明細書で上述される。
【０１４８】
一実施形態では、本発明の方法で培養される動物細胞は、肝細胞、特に初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞であり、これらは、肝細胞、特に初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞の培養に適する培地に移され、上記の培養培地は、本明細書で上述されるコラーゲンまたはゼラチンをさらに含む。
【０１４９】
肝細胞、特に初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞の培養に適切な培地の例は、本明細書で上に列挙される。
【０１５０】
一実施形態では、本発明の方法により培養される動物細胞は、肝細胞、特に初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞であり、これらは、本明細書で上に定義されるＷＥ  ＨＨに移され、上記のＷＥ  ＨＨは、本明細書で上述されるコラーゲンまたはゼラチンをさらに含む。一実施形態では、本発明の方法により培養される動物細胞は、肝細胞、特に初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞であり、これらは、本明細書で上に定義されるＷＥ  ＨＨに移され、上記のＷＥ  ＨＨは、本明細書で上述されるメタクリル酸修飾ゼラチンンをさらに含む。一実施形態では、本発明の方法により培養される動物細胞は、肝細胞、特に初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞であり、これらは、本明細書で上記に定義されるＷＥ  ＨＨに移され、上記のＷＥ  ＨＨは、本明細書で上述されるメタクリル酸修飾ゼラチンおよび光重合開始剤、好ましくはリチウム  フェニル−２，４，６−トリメチルベンゾイルホスフィナートをさらに含む。
【０１５１】
一実施形態では、ＷＥ  ＨＨ培地は、ペニシリン、ストレプトマイシン、インスリン、グルタミン（Ｌ−グルタミン）、アルブミン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、ヒドロコルチゾン、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）、およびＥＧＦ（上皮増殖因子）、ならびに任意選択でゲンタマイシンおよび／またはＦＣＳ（ウシ胎仔血清）を補充される。
【０１５２】
一実施形態では、ＷＥ  ＨＨ培地は、約５０〜約２００Ｕ／ｍＬ、好ましくは約１００Ｕ／ｍＬの範囲の濃度でペニシリン；約５０〜約２００μｇ／ｍＬ、好ましくは１００μｇ／ｍＬの範囲の濃度でストレプトマイシン；約５〜約３０μｇ／ｍＬの範囲、好ましくは約５〜約１５μｇ／ｍＬの範囲、好ましくは約１５μｇ／ｍＬの濃度でインスリン；約１〜約１０ｍＭの範囲、好ましくは約２ｍＭの濃度でグルタミン（Ｌ−グルタミン）；約０．０１〜約１（ｗ／ｖ）％の範囲、好ましくは約０．１（ｗ／ｖ）％の濃度でアルブミン；約０〜約１０μｇ／ｍＬ、または約０．１〜約１０μｇ／ｍＬ、好ましくは約５．５μｇ／ｍＬの範囲の濃度でトランスフェリン；約０〜約１０μｇ／ｍＬ、または約０．１〜約１０μｇ／ｍＬ、好ましくは約５μｇ／ｍＬの範囲の濃度で亜セレン酸ナトリウム；約０．１〜約５０μＭ、好ましくは約１μｍの範囲の濃度でヒドロコルチゾン；約０〜約１０ｎｇ／ｍＬ、または約０．１〜約１０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約２．５ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度でｒｈＨＧＦ（組み換え型ヒト肝細胞増殖因子）；約０〜約１ｎｇ／μＬ、または約０．０１〜約１ｎｇ／μＬ、好ましくは約０．０５ｎｇ／μＬの範囲の濃度でｒｈＥＧＦ（組み換え型ヒト上皮増殖因子）；ならびに約０〜約２０（ｖ／ｖ）％、または約１（ｖ／ｖ）％〜約２０（ｖ／ｖ）％、好ましくは約１０（ｖ／ｖ）％の範囲の濃度でＦＣＳ（ウシ胎仔血清）；ならびに任意選択で約１〜約１００μｇ／ｍＬ、好ましくは約５０μｇ／ｍＬの範囲の濃度でゲンタマイシンを含む。
【０１５３】
一実施形態では、動物細胞は、少なくとも約１０３、５．１０３、または１０４個の細胞／ｍｌ（コラーゲンまたはゼラチンを含む培養培地）の濃度にて本明細書で上述されるコラーゲンまたはゼラチンを含む培養培地に移される。
【０１５４】
一実施形態では、動物細胞は、最大約１０７、５×１０６、または１０６個の細胞／ｍｌ（コラーゲンまたはゼラチンを含む培養培地）の濃度にて本明細書で上述されるコラーゲンまたはゼラチンを含む培養培地に移される。
【０１５５】
一実施形態では、動物細胞は、約１０３個の細胞／ｍＬ〜約１０７個の細胞／ｍＬ、好ましくは約１０４個の細胞／ｍＬ〜約１０６個の細胞／ｍＬ、より好ましくは約１×１０５〜約９×１０５個の細胞／ｍｌ（コラーゲンまたはゼラチンを含む培養培地）の濃度にて本明細書で上述されるコラーゲンまたはゼラチンを含む培養培地に移される。
【０１５６】
別の実施形態では、動物細胞は、約３×１０５個の細胞／ｍＬ〜約４．５×１０５個の細胞／ｍＬ、好ましくは約３．２５×１０５個の細胞／ｍＬ〜約４×１０５個の細胞／ｍＬ、より好ましくは約３．５×１０５個の細胞／ｍＬ〜約３．７５×１０５個の細胞／ｍｌ（コラーゲンまたはゼラチンを含む培養培地）の濃度にて本明細書で上述されるコラーゲンまたはゼラチンを含む培養培地に移される。
【０１５７】
一実施形態では、動物細胞は、約３×１０５、３．２５×１０５、３．５×１０５、３．６５×１０５、３．７５×１０５、４×１０５、４．２５×１０５、または４．５×１０５個の細胞／ｍｌ（コラーゲンまたはゼラチンを含む培養培地）の濃度にて本明細書で上述されるコラーゲンまたはゼラチンを含む培養培地に移される。別の実施形態では、動物細胞は、約３．６５×１０５個の細胞／ｍｌ（コラーゲンまたはゼラチンを含む培養培地）の濃度にて本明細書で上述されるコラーゲンを含む培養培地に移される。
【０１５８】
一実施形態では、本明細書で上述されるコラーゲンまたはゼラチンを含む培養培地に動物細胞を移した後に、得られる混合物のｐＨを、約７〜約８の範囲の値、好ましくは約７．４の値に調節する。培養培地のｐＨを調節するための方法は、当業者によく知られている。たとえば、培養培地のｐＨは、適切な容量のＮａＯＨ溶液の添加を用いて必要に応じて増大させてよい。あるいは、培養培地のｐＨは、適切な容量のＨＣｌ溶液の添加を用いて必要に応じて低下させてよい。
【０１５９】
動物細胞の培養に適した条件を選択することは、当業者によく知られている。よって、本発明の方法により使用される培養条件、たとえば培養容器、温度、湿度、およびＣＯ２のレベルなどは、当業者に明らかであり、培養される動物条件に応じて変化する。
【０１６０】
一実施形態では、本明細書で上述されるコラーゲンまたはゼラチンを含む培養培地に動物細胞を移すことからもたらされる混合物は、プレートまたはマルチウェルプレート、たとえば２４ウェルプレート、４８ウェルプレート、または９６ウェルプレートなどの培養容器に注がれる。培養容器に注がれる容量が、培養容器の大きさ、たとえばプレートの大きさに応じて変化することは当業者に明らかである。マルチウェルプレートの場合、ウェルあたりに注がれる容量はウェルの大きさに、よってマルチウェルプレートの大きさに応じて変化する。
【０１６１】
よって、一実施形態では、本明細書で上述されるコラーゲンまたはゼラチンを含む培養培地に動物細胞を移すことからもたらされる混合物は、９６ウェルプレートのウェルあたり約１００μｌ注がれ、４８ウェルプレートのウェルあたり約３００μｌ注がれ、２４ウェルプレートのウェルあたり約４００μｌ注がれる。
【０１６２】
本発明の方法の一実施形態では、本明細書で上述されるコラーゲンまたはゼラチンを含む培養培地に動物細胞を移すことからもたらされる混合物は、少なくとも約１０分、２０分、３０分、４５分、１ｈ、２ｈ、３ｈ、または４ｈ、好ましくは少なくとも約２ｈの間、培養容器、好ましくはマルチウェルプレートでインキュベートされる。
【０１６３】
一実施形態では、本発明の方法により培養される動物細胞は、ヒト細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞であり、コラーゲンを含む培養培地に上記ヒト細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞を移すことからもたらされる混合物は、約３７℃、約５％のＣＯ２、湿度８０〜１００％、好ましくは８５〜９５％で、本明細書で上述されるようにインキュベートされる。
【０１６４】
本発明の方法の一実施形態では、少なくとも約１０分、２０分、３０分、４５分、１ｈ、２ｈ、３ｈ、または４ｈ、好ましくは少なくとも約２ｈの３７℃でのインキュベーションの後、本明細書で上述される培養培地に含まれるコラーゲンは重合され、よって動物細胞は、コラーゲンマトリックスに埋め込まれる。
【０１６５】
本発明の方法の別の実施形態では、本明細書で上述されるメタクリル酸修飾ゼラチン（ＧｅｌＭａ）を含む培養培地に動物細胞を移すことからもたらされる混合物は、約２５０ｎｍ〜約５３０ｎｍ、好ましくは約３６５〜約４０５ｎｍの範囲の波長を有する光で照射される。一実施形態では、本明細書で上述されるメタクリル酸修飾ゼラチン（ＧｅｌＭａ）を含む培養培地に動物細胞を移すことからもたらされる混合物は、約３６５ｎｍまたは４０５ｎｍの波長を有する光で照射される。
【０１６６】
一実施形態では、本明細書で上述されるメタクリル酸修飾ゼラチン（ＧｅｌＭａ）を含む培養培地に動物細胞を移すことからもたらされる混合物は、約１０秒〜約１０分、好ましくは約３０秒〜約５分の範囲の時間の間、本明細書で上述されるように照射される。
【０１６７】
照射の時間が光の波長および強度に応じて変化することは、この分野でよく知られている。よって、光の強度は、光の波長および照射の時間に応じて変化する。
【０１６８】
光強度の例としては、約１ｍＷ／ｃｍ２〜約１５０ｍＷ／ｃｍ２の範囲の強度が挙げられる。
【０１６９】
本発明の方法では、照射の後に、好ましくは約６０秒間、約３６５ｎｍまたは約４０５ｎｍの波長を有する光を用いた照射の後に、本明細書で上述される培養培地に含まれるタクリル酸修飾ゼラチン（ＧｅｌＭａ）は、重合され、よって動物細胞は、ＧｅｌＭａマトリックスに埋め込まれる。
【０１７０】
本発明の方法は、本明細書で上述されるコラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスに埋め込まれた動物細胞を培養し、よって増殖性動物細胞を含む、３Ｄ動物細胞構造物、好ましくはスフェロイドを得ることを可能にする第３のステップを含む。
【０１７１】
本発明の方法では、培養培地は、本明細書で上述されるコラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスを含む培養容器に添加される。
【０１７２】
一実施形態では、培養培地は、本明細書で上述されるコラーゲンまたはゼラチンを含む培養培地に動物細胞を移すことからもたらされる混合物の以前に添加された容量に対し約１．５：１〜約１：１．５の範囲の比率で、本明細書で上述されるコラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスを含む培養容器に添加される。一実施形態では、培養培地は、本明細書で上述されるコラーゲンまたはゼラチンを含む培養培地に動物細胞を移すことからもたらされる混合物の以前に添加された容量に対し約１．５：１、１．４：１、１．３：１、１．２：１、１．１：１、１：１、１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、または１：１．５の比率、好ましくは約１：１の比率で、本明細書で上述されるコラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスを含む培養容器に添加される。
【０１７３】
一実施形態では、本明細書で上述されるように添加される培養培地、および本発明のコラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスを得るために使用される培養培地は、異なる培地である。別の実施形態では、本明細書で上述されるように添加される培養培地、および本発明のコラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスを得るために使用される培養培地は、同じ培地である。好ましくは、同じ培地が、本発明の第２のステップおよび第３のステップにおいて使用される。
【０１７４】
本明細書で上述されるように、本発明の方法により使用される培養培地は、当業者に明らかであり、培養される動物細胞に応じて変化する。本発明の方法により使用され得る培養培地は、本明細書で上述されている。
【０１７５】
一実施形態では、本発明に係るコラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスに埋め込まれた動物細胞は、肝細胞、特に初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞であり、これらは、肝細胞、特に初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞の培養に適した培地で培養される。
【０１７６】
肝細胞、特に初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞の培養に適した培地の例は、本明細書で上に列挙される。
【０１７７】
一実施形態では、肝細胞、特に初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞は、本発明において、コラーゲンマトリックスにまたはゼラチンマトリックスに、特にＧｅｌＭａマトリックスに埋め込まれ、本明細書で上に定義されるＷＥ  ＨＨで培養される。
【０１７８】
一実施形態では、ＷＥ  ＨＨ培地は、ペニシリン、ストレプトマイシン、インスリン、グルタミン（Ｌ−グルタミン）、アルブミン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、ヒドロコルチゾン、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）、およびＥＧＦ（上皮増殖因子）、ならびに任意選択でゲンタマイシンおよび／またはＦＣＳ（ウシ胎仔血清）を補充される。
【０１７９】
一実施形態では、ＷＥ  ＨＨ培地は、約５０〜約２００Ｕ／ｍＬ、好ましくは約１００Ｕ／ｍＬの範囲の濃度でペニシリン；約５０〜約２００μｇ／ｍＬ、好ましくは１００μｇ／ｍＬの範囲の濃度でストレプトマイシン；約５〜約３０μｇ／ｍＬ、好ましくは約５〜約１５μｇ／ｍＬ、好ましくは約１５μｇ／ｍＬの範囲の濃度でインスリン；約１〜約１０ｍＭ、好ましくは約２ｍＭの範囲の濃度でグルタミン（Ｌ−グルタミン）；約０．０１〜約１（ｗ／ｖ）％、好ましくは約０．１（ｗ／ｖ）％の範囲の濃度でアルブミン；約０〜約１０μｇ／ｍＬ、または約０．１〜約１０μｇ／ｍＬ、好ましくは約５．５μｇ／ｍＬの範囲の濃度でトランスフェリン；約０〜約１０μｇ／ｍＬ、または約０．１〜約１０μｇ／ｍＬ、好ましくは約５μｇ／ｍＬの範囲の濃度で亜セレン酸ナトリウム；約０．１〜約５０μＭ、好ましくは約１μｍの範囲の濃度でヒドロコルチゾン；約０〜約１０ｎｇ／ｍＬ、または約０．１〜約１０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約２．５ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度でｒｈＨＧＦ（組み換え型ヒト肝細胞増殖因子）；約０〜約１ｎｇ／μＬ、または約０．０１〜約１ｎｇ／μＬ、好ましくは約０．０５ｎｇ／μＬの範囲の濃度でｒｈＥＧＦ（組み換え型ヒト上皮増殖因子）；約０〜約２０（ｖ／ｖ）％、または約１（ｖ／ｖ）％〜約２０（ｖ／ｖ）％、好ましくは約１０（ｖ／ｖ）％の範囲の濃度でＦＣＳ（ウシ胎仔血清）；ならびに任意選択で約１〜約１００μｇ／ｍＬ、好ましくは約５０μｇ／ｍＬの範囲の濃度でゲンタマイシンを含む。
【０１８０】
動物細胞の培養に適した条件を選択することは、当業者によく知られている。よって、本発明の方法によりコラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスに埋め込まれた動物細胞を培養するために使用される培養条件、たとえば培地交換（ｍｅｄｉｕｍ  ｒｅｎｅｗａｌ）、温度、湿度、およびＣＯ２のレベルなどは、当業者に明らかであり、培養される動物細胞に応じて変化する。
【０１８１】
一実施形態では、本明細書で上述されるコラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスを含む培養容器に添加される培養培地は、１、２、３、４日、またはそれを超える日数ごとに、好ましくは２日ごとに交換（ｃｈａｎｇｅ）される。
【０１８２】
一実施形態では、本明細書で上述されるコラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスを含む培養容器に添加される培養培地は、２４ｈ、３６ｈ、４８ｈ、６０ｈ、７２ｈ、またはそれを超える時間ごとに、好ましくは２８ｈごとに交換される。
【０１８３】
培養培地を交換する頻度は、当業者に明らかであり、培養の目的に応じて変化する。
【０１８４】
一実施形態では、本発明の方法に係るコラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスに埋め込まれた動物細胞は、ヒト細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞であり、これらは、約３７℃、約５％のＣＯ２、湿度８０〜９０％、好ましくは８５〜９５％で培養される。
【０１８５】
一実施形態では、本発明の方法に係るコラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスに埋め込まれた動物細胞は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、または３５日間、培養される。
【０１８６】
一実施形態では、本発明の方法に係るコラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスに埋め込まれた動物細胞は、少なくとも約１、２、３、４、５、または６週間、培養される。
【０１８７】
一実施形態では、本発明に係る、コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックス、特にＧｅｌＭａマトリックスに埋め込まれた動物細胞は、肝細胞、特に初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞であり、これらは、増殖性肝細胞を含む、３Ｄ動物構造物、好ましくはスフェロイドを得るために、少なくとも約２日間培養される。
【０１８８】
一実施形態では、初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞は、初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞の総数の少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約３０％、さらにより好ましくは少なくとも約４０％が増殖マーカーについて陽性、たとえばＢｒｄＵの組み込みについて陽性（ＢｒｄＵ＋）、ＥｄＵの組み込みについて陽性（ＥｄＵ＋）、Ｋｉ６７発現について陽性（Ｋｉ６７＋）、またはサイクリンＤ１発現について陽性（サイクリンＤ１＋）である場合、増殖性である。
【０１８９】
一実施形態では、初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞の総数は、たとえばアルブミン（ａｌｂ）発現などの肝細胞マーカーの検出を介して評価される。
【０１９０】
一実施形態では、初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞は、Ａｌｂ＋初代肝細胞の総数の少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、または４５％、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約３０％、さらにより好ましくは少なくとも約４０％が増殖マーカーについて陽性、たとえばＢｒｄＵの組み込みについて陽性（ＢｒｄＵ＋）、ＥｄＵの組み込みについて陽性（ＥｄＵ＋）、Ｋｉ６７発現について陽性（Ｋｉ６７＋）、またはサイクリンＤ１発現について陽性（サイクリンＤ１＋）である場合、増殖性である。
【０１９１】
一実施形態では、初代肝細胞、特にＡｌｂ＋初代肝細胞の総数は、たとえばｍＲＮＡ発現またはタンパク質の発現および／もしくはレベルの測定を介して、増殖マーカーを評価する際に観察または考慮される初代肝細胞、特にＡｌｂ＋初代肝細胞の総数に対応する。
【０１９２】
一実施形態では、本発明の方法は、本明細書で上述されるコラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスでの培養において動物細胞の１つ以上のさらなる増殖の波を誘導するステップをさらに含む。
【０１９３】
一実施形態では、本発明の方法は、本明細書で上述されるコラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスでの培養において動物細胞のＭＡＰＫ  ＭＥＫ１／２−ＥＲＫ１／２経路を一時的に阻害するステップをさらに含む。
【０１９４】
実際に本出願人は、本明細書で上述されるコラーゲンマトリックスでの培養において動物細胞のＭＡＰＫ  ＭＥＫ１／２−ＥＲＫ１／２経路を一時的に阻害することが、上記動物細胞のさらなる増殖の波を誘導したことを示した。特に、本出願人は、初代ヒト肝細胞が、培養物にＭＡＰＫ  ＭＥＫ１／２−ＥＲＫ１／２経路の阻害剤を添加することにより誘導されるさらなる増殖の波を経たことを示した。
【０１９５】
本発明で使用される場合、ＭＡＰＫ  ＭＥＫ１／２−ＥＲＫ１／２経路の阻害剤は、ＭＥＫ１／２阻害剤、ＭＥＫ１阻害剤、ＭＥＫ２阻害剤、ＥＲＫ１／２阻害剤、ＥＲＫ１阻害剤、およびＥＲＫ２阻害剤を包有する。
【０１９６】
よって、一実施形態では、本発明の方法は、本明細書で上述されるように、コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックス、特にＧｅｌＭａマトリックスに埋め込まれた動物細胞の培養物にＭＥＫ１／２阻害剤、ＭＥＫ１阻害剤、ＭＥＫ２阻害剤、ＥＲＫ１／２阻害剤、ＥＲＫ１阻害剤、またはＥＲＫ２阻害剤を添加する第４のステップ（すなわちステップｄ））をさらに含む。
【０１９７】
ＭＥＫ阻害剤の例としては、限定するものではないが、Ｕ０１２６、ＰＤ９８０５９、ＰＤ１８４３５２、ＣＬ−１０４０、ＦＲ１８０２０４、およびＢＵＤ−５２３が挙げられる。
【０１９８】
一実施形態では、上述されるＭＡＰＫ  ＭＥＫ１／２−ＥＲＫ１／２経路の阻害剤は、本発明に係るコラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスに埋め込まれた動物細胞の培養の開始から少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日後、またはそれを超える日数の後に、コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスに埋め込まれた動物細胞の培養物に添加される。
【０１９９】
一実施形態では、上述されるＭＡＰＫ  ＭＥＫ１／２−ＥＲＫ１／２経路の阻害剤は、約２４ｈ、３６ｈ、４８ｈ、６０ｈ、または７２ｈ、好ましくは約４８ｈ、本明細書で上述されるコラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスに埋め込まれた動物細胞の培養物に添加される。
【０２００】
よって一実施形態では、上述されるＭＡＰＫ  ＭＥＫ１／２−ＥＲＫ１／２経路の阻害剤を含む培養培地は、約２４ｈ、３６ｈ、４８ｈ、６０ｈ、または７２ｈ後、好ましくは約４８ｈ後に、ＭＡＰＫ  ＭＥＫ１／２−ＥＲＫ１／２経路の阻害剤を含まない培養培地と交換される。
【０２０１】
一実施形態では、上述されるＭＡＰＫ  ＭＥＫ１／２−ＥＲＫ１／２経路の阻害剤の添加は、必要に応じてさらなる増殖の波を誘導するために反復される。
【０２０２】
一実施形態では、本発明の方法により得られる増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物、好ましくはスフェロイドは、コラーゲンマトリックスにまたはゼラチンマトリックスに、特にＧｅｌＭａマトリックスに埋め込まれる。
【０２０３】
一実施形態では、本発明の方法は、コラーゲンマトリックスからまたはゼラチンマトリックスから、特にＧｅｌＭａマトリックスから増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物、好ましくはスフェロイドを単離するステップをさらに含む。
【０２０４】
一実施形態では、増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物、好ましくはスフェロイドは、コラーゲンの酵素消化の後に、コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスから単離される。よって一実施形態では、増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物、好ましくはスフェロイドは、コラゲナーゼまたはコラーゲン分解活性を有する酵素混合物とのインキュベーション後に、コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスから単離される。
【０２０５】
一実施形態では、本発明の方法は、コラゲナーゼまたはコラーゲン分解活性を有する酵素混合物と、コラーゲンマトリックスにまたはゼラチンマトリックスに、特にＧｅｌＭａマトリックスに埋め込まれた増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物、好ましくはスフェロイドをインキュベートする最後のステップ（たとえばステップｅ））をさらに含む。
【０２０６】
コラーゲン分解活性を有する酵素混合物の例としては、限定するものではないが、リベラーゼ（登録商標）およびＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）が挙げられる。
【０２０７】
よって本発明は、動物細胞、好ましくは初代動物細胞を培養する方法であって、
ａ）まず、本明細書で上述される非接着性培養容器において動物細胞を培養することと、
ｂ）次に、コラーゲンまたは切り詰め型コラーゲン、すなわちゼラチンを含む培養培地に動物細胞を移すことにより、コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスに動物細胞を埋め込むことと、
ｃ）コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスに埋め込まれた動物細胞を培養することにより、増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物を得ることと、
ｄ）任意選択で、コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスに埋め込まれた動物細胞の培養物に、上述されるＭＡＰＫ  ＭＥＫ１／２−ＥＲＫ１／２経路の阻害剤を添加することにより、動物細胞の１つ以上のさらなる増殖の波（ｗａｖｅ（ｓ）  ｏｆ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を誘導することと、
ｅ）任意選択で、コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスに埋め込まれた増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物を、コラゲナーゼまたはコラーゲン分解活性を有する酵素混合物とインキュベートすることにより、コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックスから増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物を単離すること
を含む、方法に関する。
【０２０８】
また本発明は、動物細胞、好ましくは初代動物細胞を培養する方法であって、
ａ）まず、本明細書で上述される非接着性培養容器において動物細胞を培養することと、
ｂ）次に、コラーゲン、好ましくは線維性コラーゲンを含む培養培地に動物細胞を移すことにより、コラーゲンマトリックス、好ましくは線維性コラーゲンマトリックスに動物細胞を埋め込むことと、
ｃ）コラーゲンマトリックスに埋め込まれた動物細胞を培養することにより、増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物を得ることと、
ｄ）任意選択で、コラーゲンマトリックスに埋め込まれた動物細胞の培養物に、上述されるＭＡＰＫ  ＭＥＫ１／２−ＥＲＫ１／２経路の阻害剤を添加することにより、動物細胞の１つ以上のさらなる増殖の波（ｗａｖｅ（ｓ）  ｏｆ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を誘導することと、
ｅ）任意選択で、コラーゲンマトリックスに埋め込まれた増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物を、コラゲナーゼまたはコラーゲン分解活性を有する酵素混合物と共にインキュベートすることにより、コラーゲンマトリックスから増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物を単離すること
を含む、方法に関する。
【０２０９】
一実施形態では、本発明は、動物細胞、好ましくは初代動物細胞を培養する方法であって、
ａ）まず、低接着性または超低接着性培養容器、好ましくは低接着性または超低接着性プレートにおいて動物細胞を培養することと、
ｂ）次に、約０．２５ｍｇ／ｍＬ〜約３ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約２．５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約０．７５ｍｇ／ｍＬ〜約１．５ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で線維性コラーゲン、好ましくはＩ型コラーゲンを含む培養培地に動物細胞を移すことにより、線維性コラーゲンマトリックスに動物細胞を埋め込むことと、
ｃ）コラーゲンマトリックスに埋め込まれた動物細胞を培養することにより、増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物を得ることと、
ｄ）任意選択で、コラーゲンマトリックスに埋め込まれた動物細胞の培養物に、上述されるＭＡＰＫ  ＭＥＫ１／２−ＥＲＫ１／２経路の阻害剤を添加することにより、動物細胞の１つ以上のさらなる増殖の波（ｗａｖｅ（ｓ）  ｏｆ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を誘導することと、
ｅ）任意選択で、コラーゲンマトリックスに埋め込まれた増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物を、コラゲナーゼまたはコラーゲン分解活性を有する酵素混合物とインキュベートすることにより、コラーゲンマトリックスから増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物を単離することを含む、方法に関する。
【０２１０】
また本発明は、動物細胞、好ましくは初代動物細胞を培養する方法であって、
ａ）まず、本明細書で上述される非接着性培養容器において動物細胞を培養することと、
ｂ）次に、メタクリル酸修飾ゼラチン（ＧｅｌＭａ）を含む培養培地に動物細胞を移すことにより、ＧｅｌＭａマトリックスに動物細胞を埋め込むことと、
ｃ）ＧｅｌＭａマトリックスに埋め込まれた動物細胞を培養することにより、増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物を得ることと、
ｄ）任意選択で、ＧｅｌＭａトリックスに埋め込まれた動物細胞の培養物に、上述されるＭＡＰＫ  ＭＥＫ１／２−ＥＲＫ１／２経路の阻害剤を添加することにより、動物細胞の１つ以上のさらなる増殖の波（ｗａｖｅ（ｓ）  ｏｆ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を誘導することと、
ｅ）任意選択で、ＧｅｌＭａマトリックスに埋め込まれた増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物を、コラゲナーゼまたはコラーゲン分解活性を有する酵素混合物とインキュベートすることにより、ＧｅｌＭａマトリックスから増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物を単離すること
を含む、方法に関する。
【０２１１】
一実施形態では、本発明は、動物細胞、好ましくは初代動物細胞を培養する方法であって、
ａ）まず、低接着性または超低接着性培養容器、好ましくは低接着性または超低接着性プレートにおいて動物細胞を培養することと、
ｂ）次に、約１（ｗ／ｖ）％〜約２０（ｗ／ｖ）％、好ましくは約２．５（ｗ／ｖ）％〜約１０（ｗ／ｖ）％、より好ましくは約５（ｗ／ｖ）％の範囲の濃度でメタクリル酸修飾ゼラチンを含む培養容器に動物細胞を移すことにより、ＧｅｌＭａマトリックスに動物細胞を埋め込むことと、
ｃ）ＧｅｌＭａマトリックスに埋め込まれた動物細胞を培養することにより、増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物を得ることと、
ｄ）任意選択で、ＧｅｌＭａトリックスに埋め込まれた動物細胞の培養物に、上述されるＭＡＰＫ  ＭＥＫ１／２−ＥＲＫ１／２経路の阻害剤を添加することにより、動物細胞の１つ以上のさらなる増殖の波（ｗａｖｅ（ｓ）  ｏｆ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を誘導することと、
ｅ）任意選択で、ＧｅｌＭａマトリックスに埋め込まれた増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物を、コラゲナーゼまたはコラーゲン分解活性を有する酵素混合物とインキュベートすることにより、ＧｅｌＭａマトリックスから増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物を単離すること
を含む、方法に関する。
【０２１２】
一実施形態では、本発明の方法で培養される動物細胞は、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）であり、ステップｃ）で得られる増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物は、増殖性ＰＨＨを含むスフェロイドである。
【０２１３】
一実施形態では、本発明の方法で培養される動物細胞は、初代動物細胞、特に初代ヒト細胞であり、本発明の方法は、増殖性初代動物細胞、特に初代ヒト細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物を得ることを可能にする。
【０２１４】
一実施形態では、本発明の方法で培養される動物細胞は、肝細胞、特に初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞であり、本発明の方法は、増殖性肝細胞、特に増殖性初代肝細胞、好ましくは増殖性初代ヒト肝細胞を含むスフェロイドを得ることを可能にする。
【０２１５】
一実施形態では、本発明の方法で培養される動物細胞は、肝細胞、特に初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞であり、本発明の方法は、増殖性肝細胞、特に増殖性初代肝細胞、好ましくは増殖性初代ヒト肝細胞を含むスフェロイド（ここで上記スフェロイドは、中空内腔を有する腺房様構造を有する）を得ることを可能にする。
【０２１６】
また本発明は、初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖を誘導するための方法であって、
ａ）まず、非接着性培養容器、好ましくは低接着性または超低接着性プレートにおいて初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞を培養することと、
ｂ）次に、本明細書で上述されるコラーゲンまたはゼラチン、特にメタクリル酸修飾ゼラチン（ＧｅｌＭａ）を含む培養培地に初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞を移すことにより、コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックス、特にＧｅｌＭａマトリックスに初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞を埋め込むことと、
ｃ）コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックス、特にＧｅｌＭａマトリックスに埋め込まれた初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞を培養することにより、増殖性初代肝細胞、好ましくは増殖性初代ヒト肝細胞を含むスフェロイドを得ることと、
ｄ）任意選択で、コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックス、特にＧｅｌＭａマトリックスに埋め込まれた初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞の培養物に、上述されるＭＡＰＫ  ＭＥＫ１／２−ＥＲＫ１／２経路の阻害剤を添加することにより、初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞の１つ以上のさらなる増殖の波（ｗａｖｅ（ｓ）  ｏｆ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を誘導すること
を含む、方法に関する。
【０２１７】
本発明の別の目的は、初代肝細胞、好ましくは増殖性初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）を含むスフェロイドである。
【０２１８】
本発明の一実施形態では、上記スフェロイドは、本明細書で上述されるコラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックス、特にＧｅｌＭａマトリックスでの培養時間にわたり、それらの分化した状態および肝機能を保持する初代肝細胞を含む。
【０２１９】
本発明の一実施形態では、本発明の初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞を含むスフェロイドは、中空内腔を有する腺房様構造を有する。
【０２２０】
よって、一実施形態では、本発明に係るスフェロイドは、中空内腔を有する腺房様構造を形成する、良好に編成された初代肝細胞、好ましくは初代ヒト肝細胞の単層により区切られた球体として見える。
【０２２１】
初代肝細胞の分化した状態を評価するための方法としては、限定するものではないが、Ｅ−カドヘリンなどの上皮マーカーの検出および細胞内局在化；ならびにＮ−カドヘリン、ビメンチン、サイトケラチン８、およびサイトケラチン１８などの間葉系マーカーの検出および細胞内局在化が挙げられる。
【０２２２】
本明細書で使用される場合、「肝機能」は、肝細胞に特異的な極性化、タンパク質発現、タンパク質分泌、および酵素活性を包有する。
【０２２３】
よって肝機能は、たとえば、フェトプロテイン、アルブミンおよび／またはアルドラーゼＢの発現の決定；アルブミンの分泌の決定；フェーズＩ、フェーズＩＩ、および／またはフェーズＩＩＩの酵素などの異物代謝酵素の発現、細胞内局在化、および／または活性の決定；ＭＲＰ２および／またはＭＲＰ３などの薬物輸送体の発現、細胞内局在化、および／または活性の決定を介して、評価され得る。
【０２２４】
一実施形態では、本発明のスフェロイドは、少なくとも以下の：
極性化した増殖性初代肝細胞、好ましくは極性化した増殖性ＰＨＨ；
フェトプロテイン、アルブミン、および／またはアルドラーゼＢ、好ましくはアルブミン、および／またはアルドラーゼＢを発現する、増殖性初代肝細胞、好ましくは増殖性ＰＨＨ；
アルブミンを分泌する、増殖性初代肝細胞、好ましくは増殖性ＰＨＨ；
フェーズＩ、フェーズＩＩ、および／またはフェーズＩＩＩの代謝酵素を発現する、増殖性初代肝細胞、好ましくは増殖性ＰＨＨ；ならびに／または
ＭＲＰ２および／またはＭＲＰ３などの薬物輸送体を発現する、増殖性初代肝細胞、好ましくは増殖性ＰＨＨ；
の少なくとも１つであるとさらに特徴づけられる、増殖性初代肝細胞、好ましくは増殖性ＰＨＨを含む。
【０２２５】
一実施形態では、本発明のスフェロイドは、極性化した増殖性初代肝細胞、好ましくは極性化した増殖性ＰＨＨを含む。一実施形態では、本発明のスフェロイドは、フェトプロテイン、アルブミン、および／またはアルドラーゼを発現する、増殖性初代肝細胞、好ましくは増殖性ＰＨＨを含む。一実施形態では、本発明のスフェロイドは、アルブミンを分泌する、増殖性初代肝細胞、好ましくは増殖性ＰＨＨを含む。一実施形態では、本発明のスフェロイドは、フェーズＩ、フェーズＩＩ、および／またはフェーズＩＩＩの代謝酵素を発現する、増殖性初代肝細胞、好ましくは増殖性ＰＨＨを含む。一実施形態では、本発明のスフェロイドは、ＭＲＰ２および／またはＭＲＰ３などの薬物輸送体を発現する、増殖性初代肝細胞、好ましくは増殖性ＰＨＨを含む。
【０２２６】
一実施形態では、本発明のスフェロイドは、コラーゲンマトリックスにまたはゼラチンマトリックスに、特にＧｅｌＭａマトリックスに埋め込まれる。別の実施形態では、本発明のスフェロイドは、コラーゲンマトリックスにまたはゼラチンマトリックスに、特にＧｅｌＭａマトリックスに埋め込まれない。よって、一実施形態では、本発明のスフェロイドは、増殖性初代肝細胞を含む単離されたスフェロイドである。一実施形態では、本発明のスフェロイドは、初代肝細胞の培養に適した培地中の懸濁物である。
【０２２７】
一実施形態では、本発明のスフェロイドは、本明細書で上述される方法により得られるかまたは得られやすい。よって一実施形態では、本発明のスフェロイドは、
ａ）まず、低接着性または超低接着性培養容器、好ましくは低接着性または超低接着性プレートにおいて初代肝細胞を培養することと、
ｂ）次に、本明細書で上述されるコラーゲンまたはゼラチン、特にメタクリル酸修飾ゼラチン（ＧｅｌＭａ）を含む培養培地に初代肝細胞を移すことにより、コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックス、特にＧｅｌＭａマトリックスに初代肝細胞を埋め込むことと、
ｃ）コラーゲンマトリックスにまたはゼラチンマトリックスに、特にＧｅｌＭａマトリックスに埋め込まれた初代肝細胞を培養することにより、増殖性初代肝細胞を含むスフェロイドを得ることと、
ｄ）任意選択で、コラーゲンマトリックスにまたはゼラチンマトリックスに、特にＧｅｌＭａマトリックスに埋め込まれた増殖性初代肝細胞を含むスフェロイドを、コラゲナーゼまたはコラーゲン分解活性を有する酵素混合物とインキュベートすることにより、コラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックス、特にＧｅｌＭａマトリックスから、増殖性初代肝細胞を含むスフェロイドを単離すること
を含む、方法に関する。
【０２２８】
一実施形態では、本明細書で上述される本発明のスフェロイドは、増殖性初代ヒト肝細胞を含む。
【０２２９】
一実施形態では、本発明のスフェロイドは、約５０μｍ〜約１５０μｍの範囲の直径を有する。
【０２３０】
一実施形態では、本発明のスフェロイドは、約２０μｍ〜約１３０μｍ、好ましくは約３０μｍ〜約１００μｍ、より好ましくは約４０μｍ〜約９０μｍ、さらにより好ましくは約４５μｍ〜約８０μｍの範囲の直径を有する。
【０２３１】
一実施形態では、本発明のスフェロイドは、約４ｐＬ〜約２０００ｐＬ、好ましくは約１００ｐＬ〜約６００ｐＬの範囲の体積を有する。
【０２３２】
一実施形態では、本発明のスフェロイドは、約２〜約１５０個の増殖性初代肝細胞、好ましくは約５〜約１００個の増殖性初代肝細胞、より好ましくは約５〜約５０個の増殖性初代肝細胞を含む。
【０２３３】
また本発明は、人工肝臓モデルまたは人工肝臓臓器を操作するための、本明細書で上述される増殖性初代肝細胞を含むスフェロイドの使用に関する。
【０２３４】
また本発明は、薬物または化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの毒性および／または効果を評価するための、本明細書で上述される増殖性初代肝細胞を含むスフェロイドの使用に関する。
【０２３５】
薬物または化合物の毒性および／または効果を評価するために試験され得るパラメータの例としては、限定するものではないが、細胞の形態および運動性、マトリックスの再編成およびコラーゲンの合成、細胞死、細胞増殖、細胞代謝、細胞の極性、ならびに細胞の分化が挙げられる。
【０２３６】
肝細胞の形態および運動性を評価するための方法の例としては、限定するものではないが、光学位相差顕微鏡（ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｌｉｇｈｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、共焦点顕微鏡、２光子励起顕微鏡でのイメージングによる肝細胞または肝細胞スフェロイドの自己蛍光イメージング；低速度撮影による運動性のイメージング、およびインベードソーム／ｐＭＬＣ、ＭＬＣＫ／ＲｈｏＫｉｎａｓｅの免疫局在性が挙げられる。
【０２３７】
マトリックスの再編成およびコラーゲンの合成を評価するための例としては、限定するものではないが、第二次高調波発生（ＳＨＧ）顕微鏡を用いた肝細胞スフェロイドのイメージングが挙げられる。
【０２３８】
細胞死を評価するための方法の例としては、限定するものではないが、核断片化のイメージング（ＴＵＮＥＬアッセイ）、カスパーゼイメージングアッセイおよびカスパーゼ活性アッセイなどの肝細胞のアポトーシスを評価するための方法、ならびに肝細胞のネクローシスを評価するための方法（ＹＯＹＯでの染色）が挙げられる。
【０２３９】
肝細胞の増殖を評価するための方法の例としては、限定するものではないが、３Ｄ  ｚスタック画像の二光子細胞の計算、ＢｒｄＵ組み込みの決定、ＥｄＵ組み込みの決定、有糸分裂指数の決定、ならびにＫｉ６７、β−チューブリン、サイクリンＤ１、サイクリンＤ２、サイクリンＤ３、サイクリンＥ、サイクリンＡ２、サイクリンＢ、Ｃｄｋ１、Ｃｄｋ２、および／またはＡｕｒｏｒａ  Ａの発現の免疫組織化学染色または測定が挙げられる。
【０２４０】
肝細胞の異物代謝または肝機能を評価するための方法の例としては、限定するものではないが、ＣＹＰ、ＧＳＴ、ＵＧＴ、ＮＡＴなどのフェーズＩおよびフェーズＩＩの異物代謝酵素、および関連する核因子ＣＡＲ、ＰＸＲ、ＡｈＲの酵素活性、タンパク質およびｍＲＮＡの発現、調節を決定するためのアッセイ；ＦＤＡ（蛍光性二酢酸塩）の処理を介したＭＲＰ２活性（胆汁うっ滞状態に関連）；ならびにオイルレッド染色またはｂｏｄｉｐｙ  ４９３／５０３標識などの脂質含有量を決定するためのアッセイが挙げられる。
【０２４１】
一実施形態では、本明細書で上述される増殖性初代肝細胞を含むスフェロイドは、薬物または化合物の肝臓遺伝毒性を評価するために使用される。
【０２４２】
薬物または化合物の肝臓遺伝毒性を評価するために試験され得るパラメータの例としては、限定するものではないが、肝細胞増殖、ＤＮＡ複製、染色体異常（たとえば一本鎖および二本鎖の切断、喪失、微小核の形成など）、ＤＮＡ損傷の存在、および変異の存在が挙げられる。
【０２４３】
よって、たとえば、薬物または化合物の肝臓遺伝毒性は、本発明に係る増殖性ＰＨＨを含むスフェロイドで行われる微小核形成の検出、コメットアッセイ、ヒストンＨ２Ａｘのリン酸化の検出、およびエキソンのシーケンシング（たとえば異物曝露に関連するホットスポットのシグネチャーを確立するためのシーケンシング）を介して評価され得る。
【０２４４】
また本発明は、薬物または化合物の毒性および／または効果を評価するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法であって、
ａ）本明細書で上述される増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物を得ることと、
ｂ）増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物を、薬物または化合物と接触させることと、
ｃ）増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物に及ぼす薬物または化合物の毒性および／または効果を評価すること
を含む、方法に関する。
【０２４５】
１つの好ましい実施形態では、上記ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法は、
ａ）本明細書で上述される方法により増殖性初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）を含むスフェロイドを得ることと、
ｂ）増殖性ＰＨＨを含むスフェロイドを、薬物または化合物と接触させることと、
ｃ）増殖性ＰＨＨを含むスフェロイドに及ぼす薬物または化合物の毒性および／または効果を評価すること
を含む、方法に関する。
【０２４６】
本明細書で上述されるように、増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物、特に増殖性ＰＨＨを含むスフェロイドに及ぼす薬物または化合物の毒性および／または効果を評価するために試験され得るパラメータとしては、限定するものではないが、細胞の形態および運動性、マトリックスの再編成およびコラーゲンの合成、細胞死、細胞の増殖、細胞の代謝、細胞の極性、および細胞の分化が挙げられる。
【０２４７】
一実施形態では、本発明の方法は、薬物または化合物の肝臓遺伝毒性を評価するためである。
【０２４８】
本明細書で上述されるように、増殖性ＰＨＨを含むスフェロイドに及ぼす薬物または化合物の肝臓遺伝毒性を評価するために試験され得るパラメータとしては、限定するものではないが、肝細胞増殖、ＤＮＡ複製、染色体異常の存在（たとえば一本鎖および二本鎖の切断、喪失、微小核の形成など）、ＤＮＡ損傷の存在、および変異の存在が挙げられる。
【０２４９】
よって、薬物または化合物の肝臓遺伝毒性は、本発明に係る増殖性ＰＨＨを含むスフェロイドで行われる微小核の検出、コメットアッセイ、ヒストンＨ２Ａｘリン酸化の存在の検出、およびエキソンのシーケンシング（たとえば異物曝露に関連するシグネチャーを確立するためのシーケンシング）を介して評価され得る。
【０２５０】
一実施形態では、増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物、好ましくは増殖性ＰＨＨを含むスフェロイドは、本明細書で上述されるコラーゲンマトリックスまたはゼラチンマトリックス、特にＧｅｌＭａマトリックスに埋め込まれる。
【０２５１】
一実施形態では、増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物、好ましくは増殖性ＰＨＨを含むスフェロイドは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５日間のコラーゲンマトリックスでのまたはゼラチンマトリックスでの、特にＧｅｌＭａマトリックスでの培養の後に、薬物または化合物と接触される。別の実施形態では、増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物、好ましくは増殖性ＰＨＨを含むスフェロイドは、最大１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２日間のコラーゲンマトリックスでのまたはゼラチンマトリックスでの、特にＧｅｌＭａマトリックスでの培養の後に、薬物または化合物と接触される。
【０２５２】
動物細胞を培養するための本発明の方法は、増殖性動物細胞を含む３Ｄ動物細胞構造物を得ることを可能にし、ここで上記増殖動物細胞は、それらの表現型、たとえばそれらの分化状態、および機能を保持している。
【０２５３】
以下の実施例に示されるように、本出願人は、本発明の方法が、初代ヒト肝細胞の培養に特に適しており、増殖性初代ヒト肝細胞を含むスフェロイドを得ることを可能にすることを示した。特に興味深いことに、本発明の方法は、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）および／またはＥＧＦ（上皮増殖因子）などの増殖因子が存在しない場合であっても、増殖性初代ヒト肝細胞を含むスフェロイドを得ることを可能にする。また本発明の方法は、ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）が存在しない場合であっても、増殖性初代ヒト肝細胞を含むスフェロイドを得ることを可能にする。
【０２５４】
特に、本出願人は驚くべきことに、初代ヒト肝細胞がそれらの分化状態およびそれらの肝機能を保持し、本発明の方法によるコラーゲンマトリックスでのまたはゼラチンマトリックス、特にＧｅｌＭａマトリックスでの培養の最初の週の間に、少なくとも２回の細胞周期を含む第１の増殖の波を経ることができることを見出した。また本出願人は、初代ヒト肝細胞が、本発明の方法によるコラーゲンマトリックスでの培養の第２週の間に第２の増殖の波を経ることができることを見出した。さらなる増殖の波が、ＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６などの阻害剤でＭＥＫ／ＥＲＫが一時的に阻害される場合に起こり得る。
【０２５５】
特に本出願人は、初代ヒト肝細胞が、本明細書で上述される本発明の方法により、コラーゲンマトリックスにまたはゼラチンマトリックス、特にＧｅｌＭａマトリックスに埋め込まれ培養される前に、まず低接着性培養容器などの非接着性培養容器で培養される場合にのみ、初代ヒト肝細胞の増殖が起こることを示した。これまでにコラーゲンマトリックスにまたはゼラチンマトリックス、特にＧｅｌＭａマトリックスに埋め込まれることなく、低接着性培養容器で継続的に同様の時間、同じ培養培地で培養した初代ヒト肝細胞は、増殖できなかった。また、同様の時間、同じ培養培地で、コラーゲンマトリックスに直接埋め込まれ培養された初代ヒト肝細胞も、増殖できなかった。
【０２５６】
よって本発明は、治療的適用および薬学的適用の両方でのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルのさらなる開発のために重要な、形質転換されていない増殖性ヒト肝細胞を得ることを可能にする。たとえば、初代ヒト肝細胞を増殖させる特質は、対象において肝機能を回復させることを目的とする肝細胞スフェロイドまたはオルガノイドの移殖の発展に最も影響を与えるであろう。初代ヒト肝細胞を増殖させる特質はまた、候補薬物および環境上の混入物の肝毒性、特に肝臓遺伝毒性を予測するために使用されるｉｎ  ｖｉｔｒｏのＰＨＨを改善するであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２５７】
【図１】図１は、肝細胞などの動物細胞を培養するための本発明の方法を示す図である。（Ａ）本発明の方法の第１のステップの実例：動物細胞を、低接着性または超低接着性プレートなどの非接着性培養容器で培養する。（Ｂ）本発明の方法の第２および第３のステップの実例：最初に非接着性培養容器で培養した動物細胞を、コラーゲンマトリックスにまたはゼラチンマトリックス、特にＧｅｌＭａマトリックスに埋め込み（第２のステップ）、上記マトリックス内で培養する（第３のステップ）。
【図２】図２は、コラーゲンマトリックスでの３Ｄ培養における初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）のスフェロイドの形成を示す写真のグループである。写真を、本発明の方法により確立された２日間（Ａ、Ｂ）または７日間（Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）の３Ｄ培養後に、２光子励起蛍光（ＴＰＥＦ）顕微鏡を使用して撮影した。１００μＭの深度の画像スタック（ＴＰＥＦスタック）を、３Ｄの再構築に使用した（Ｂ、Ｄ、Ｆ）。第二次高調波発生（ＳＨＧ）顕微鏡を、ＰＨＨスフェロイドの周辺（ＣＳ１）および間（ＣＳ２）のコラーゲンのシグネチャー（ＣＳ）を解析するために、本発明の方法により確立された１５日間の３Ｄ培養の後に使用した（Ｇ、Ｈ）。Ａ、Ｃ  バーの尺度＝１００μＭ；Ｅ  バーの尺度＝２０μＭ、Ｈ  バーの尺度＝５０μＭ。
【図３】図３は、対照の２Ｄ培養（２Ｄ）またはコラーゲンマトリックスで本発明の方法により確立された３Ｄ培養（３Ｄ）における２、５、１０、および１５日間の培養後の（Ａ）アポトーシス促進性因子（ホスホ−ＢＡＤ、ＢＡＸ、ＢＡＫ、ＢＩＤ、ＢＩＭ、およびＰＵＭＡ）、ならびに（Ｂ）生存促進性因子（ＭＣＬ１、ＢＣＬ２ＸＬ、ＢＣＬ２）のＰＨＨでの発現を示すウェスタンブロットのグループである。βアクチンを、ローディング対照として使用する。データは、少なくとも３つの独立した実験の代表である。
【図４】図４は、間葉−上皮転換（ＭＥＴ）で実施される因子の発現を示すヒストグラム（Ａ）およびウェスタンブロット（Ｂ）のグループである。（Ａ）対照の２Ｄ培養（白色）でのまたはコラーゲンマトリックスで本発明の方法により確立された３Ｄ培養（黒色）における４日間および１５日間の培養の後のＰＨＨでのＥ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン、ビメンチン、サイトケラチン８およびサイトケラチン１８のｍＲＮＡ発現を示すヒストグラム。ｍＲＮＡ発現は、対照２Ｄ培養での４日間の培養の発現レベルに対する比率に対応する。（Ｂ）対照の２Ｄ培養（２Ｄ）でのまたはコラーゲンマトリックスで本発明の方法により確立された３Ｄ培養（３Ｄ）における２、５、１０、および１５日間の培養の後のＰＨＨにおけるビメンチン、Ｎ−カドヘリン、およびＥ−カドヘリンの発現を示すウェスタンブロット。βアクチンを、ローディング対照として使用する。
【図５】図５は、対照の２Ｄ培養（白色）でのまたはコラーゲンマトリックスで本発明の方法により確立された３Ｄ培養（黒色）における４日間、１５日間、および２８日間（ＨＮＦ４αのみ後期）の培養の後のＰＨＨにおける肝細胞分化マーカー（Ａ）、薬物を代謝するフェーズＩの酵素（Ｂ）、薬物を代謝するフェーズＩＩの酵素（Ｃ）、薬物輸送体（Ｄ）、ＣＹＰ制御因子（Ｅ）、２４時間の３−ＭＣ誘導後のＣＹＰ１Ａ２（５μＭ）（Ｆ）、およびＨＮＦ４α（Ｇ）のｍＲＮＡ発現を示すヒストグラムのグループである。ｍＲＮＡ発現は、対照２Ｄ培養での４日間の培養後の発現レベルに対する比率に対応する。示された値は、少なくとも３つの独立した実験の１つの実験代表であった（平均±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。（Ｈ）対照の２Ｄ培養（白色）でのまたはコラーゲンマトリックスで本発明の方法により確立された３Ｄ培養（黒色）における４日間および１５日間の培養後のＰＨＨにおける２４時間の３−ＭＣの誘導後のＣＹＰ１Ａ（ＥＲＯＤ）の活性（５μＭ）および基礎のＣＹＰ１Ａ２（ＭＲＯＤ）活性を示すヒストグラム。
【図６】図６は、コラーゲンマトリックスで本発明の方法により確立された３Ｄ培養において４日間、１５日間、および２８日後のＰＨＨスフェロイドでの薬物輸送体ＭＲＰ２およびＭＲＰ３、アルブミン、および核の局在化を示す蛍光顕微鏡で得られた写真のグループである。ＭＲＰ２の機能的活性を、コラーゲンマトリックスで本発明の方法により確立された３Ｄ培養において４日間、１５日間、および２８日後のＰＨＨスフェロイドの中心内腔での物質の明確な排出を示す、ＦＤＡ  ＣＤＦＤＡアッセイを使用して評価する。バーの尺度＝２５μｍ。
【図７Ａ】図７Ａは、コラーゲンマトリックスで本発明の方法により確立された３Ｄ培養において２、４、６、１０、および１５日後のＰＨＨスフェロイドを示すＨＥＳ染色後に得られた写真のグループである。バーの尺度＝２５μｍ。
【図７Ｂ−Ｃ】図７Ｂ〜Ｃは、培養時間の関数としてのＰＨＨスフェロイドの平均直径（μｍ）（Ｂ）および培養時間の関数としての６０μｍ超の直径を有するＰＨＨスフェロイドの数（Ｃ）の発展を示すグラフのグループである。
【図８】図８は、（Ａ）核における増殖マーカーＫｉ６７およびアルブミンの発現の定量化に基づく、コラーゲンマトリックスで本発明の方法により確立された３Ｄ培養におけるＰＨＨの経時的な増殖（Ｋｉ６７＋およびＡｌｂ＋である核のパーセンテージとして表現される）；（Ｂ）対照の２Ｄ培養（白色）におけるまたはコラーゲンマトリックスで本発明の方法により確立された３Ｄ培養（黒色）における２日間および４日間の培養後のＰＨＨでの増殖マーカーＣｄｋ２、サイクリンＤ１、ＰＣＮＡ、Ｐ２１、Ｐ２７のｍＲＮＡ発現を示すグラフのグループである。ｍＲＮＡ発現は、対照２Ｄ培養における２日間の培養での発現レベルに対する比率に対応する。
【図９】図９は、（Ａ）コラーゲンマトリックスで本発明の方法により確立された３Ｄ培養におけるＢｒｄＵの組み込みの定量化；（Ｂ）増殖マーカーＫｉ６７（灰色のボックス）およびＢｒｄＵの組み込み（黒色の線）の同時の定量化に基づく、コラーゲンマトリックスで本発明の方法により確立された３Ｄ培養におけるＰＨＨの経時的な増殖（増殖している細胞のパーセンテージとして表現）；（Ｃ）示されるようにＫｉ６７染色およびＢｒｄＵの組み込みを介して検出される異なるドナーの肝細胞由来のコラーゲンマトリックスで本発明の方法により確立された８つの３Ｄ培養における２日目〜７日目での増殖の波の提示：を示すグラフのグループである。
【図１０】図１０は、（Ａ）コラーゲンマトリックスで本発明の方法により確立された３Ｄ培養の１３日間にわたるＫｉ６７＋／Ａｌｂ＋核のパーセンテージの定量化；（Ｂ）コラーゲンマトリックスで本発明の方法により確立された３Ｄ培養の１５日間のにわたるサイクリンＤ１＋／Ａｌｂ＋核のパーセンテージの定量化；（Ｃ）コラーゲンマトリックスで本発明の方法により確立された３Ｄ培養の１５日間にわたるＢｒｄＵの組み込みの定量化、を介するコラーゲンマトリックスで本発明の方法により確立された３Ｄ培養でのＰＨＨにおける２つの増殖の波の存在を示すヒストグラムのグループである。
【図１１】図１１Ａは、培養の最初の週の間（第１の増殖の波；平均して３日目〜７日目）および培養の第２週の間（第２の増殖の波；平均して９日目〜１４日目）に、異なるドナーの肝細胞からコラーゲンマトリックスで本発明の方法により確立された３Ｄ培養で起こる増殖の波を示す図である。図１１Ｂは、コラーゲンマトリックスで本発明の方法により確立された３Ｄ培養における１０日後のＰＨＨスフェロイドでの細胞周期のＭ期のマーカーであるホスホ−ヒストンＨ３、アルブミン、および核の免疫染色の図である。バーの尺度＝２５μｍ。図１１Ｃは、コラーゲンマトリックスで本発明の方法により確立された３Ｄ培養の１５日にわたるホスホ−ヒストンＨ３＋／Ａｌｂ＋核の定量化である。
【図１２】図１２は、ＭＥＫ−ＥＲＫ経路の一時的阻害の後にＰＨＨで観察される増殖を示す。（Ａ）１２日目〜１４日目にＵ０１２６（＋）またはＤＭＳＯ（−）を添加した、対照の２Ｄ培養（２Ｄ）でのまたはコラーゲンマトリックスで本発明の方法により確立された３Ｄ培養（３Ｄ）における培養の１４日後のＥＲＫリン酸化の阻害を示すウェスタンブロット。（Ｂ）１２日目〜１４日目にＵ０１２６でＭＥＫ阻害した後のコラーゲンマトリックスで本発明の方法により確立された３Ｄ培養におけるＰＨＨの１２日目〜１８日目の増殖。増殖を、増殖マーカーＫｉ６７の定量化（Ｋｉ６７＋およびＡｌｂ＋である核のパーセンテージとして表現される）を介して評価する。陰性対照を、Ｕ０１２６の代わりにＤＭＳＯを使用して行った。（Ｃ）１５日目〜１７日目にＵ０１２６でＭＥＫ阻害した後のコラーゲンマトリックスで本発明の方法により確立された３Ｄ培養におけるＰＨＨの１３日目〜２１日目の増殖。増殖を、増殖マーカーサイクリンＤ１の定量化（サイクリンＤ１＋およびＡｌｂ＋である核のパーセンテージとして表現される）を介して評価する。陰性対照を、Ｕ０１２６の代わりにＤＭＳＯを使用して行った。
【図１３】図１３は、対照の２Ｄ培養（２Ｄ）におけるまたはコラーゲンマトリックスで本発明の方法により確立された３Ｄ培養（３Ｄ）における指定された濃度での指定された遺伝毒性薬物とのインキュベーションの９日後の、個別のＰＨＨにおけるｔａｉｌ  ＤＮＡのパーセンテージにより評価されるＤＮＡ損傷を示すヒストグラムである。対照：非遺伝毒性薬物；ＡＦＢ１  １：０．１μｍ；ＡＦＢ１  ２：０．５μＭ；４−ＡＢＰ  １：１μｍ；４−ＡＢＰ  ２：１０μＭ。
【図１４】図１４は、コラーゲンマトリックスで本発明の方法により確立された３Ｄ培養（３Ｄ）における指定された濃度での指定された遺伝毒性薬物とのインキュベーションの９日後の免疫染色により評価されるγＨ２Ａｘ陽性ＰＨＨの数の定量化を示すヒストグラムである。Ｔ：非遺伝毒性薬物；ＣＩＳ  １：５μｇ／ｍＬのシスプラチン；ＣＩＳ  ２：１０μｇ／ｍＬのシスプラチン；ＡＦＢ１  １：０．１μｍのＡＦＢ１；ＡＦＢ１  ２：０．５μＭ；４−ＡＢＰ  １：１μｍ；４−ＡＢＰ  ２：１０μＭ。
【図１５】図１５は、メタクリル酸修飾ゼラチン（ＧｅｌＭａ）マトリックスで本発明の方法により確立された３Ｄ培養（３Ｄ）において５、１０、および１５日後のＰＨＨスフェロイドを示すＨＥＳ染色後に得られる写真のグループである。バーの尺度＝５０μＭ。データは、３つの独立した実験の代表である。
【図１６】図１６は、メタクリル酸修飾ゼラチン（ＧｅｌＭａ）マトリックスで本発明の方法により確立された３Ｄ培養（３Ｄ）において１０日後のＰＨＨスフェロイドでのＮ−カドヘリン、アルブミン、および核の局在化を示す蛍光顕微鏡で得られた写真のグループである。バーの尺度＝５０μＭ。データは、３つの独立した実験の代表である。
【図１７】図１７は、ＰＨＨにおける増殖マーカーサイクリンＤ１およびアルブミンの発現の定量化に基づく、メタクリル酸修飾ゼラチン（ＧｅｌＭａ）マトリックスで本発明の方法により確立された３Ｄ培養（３Ｄ）におけるＰＨＨの経時的な増殖を示すヒストグラムである（サイクリンＤ１＋およびＡｌｂ＋である細胞のパーセンテージとして表現される）。
【発明を実施するための形態】
【０２５８】
実施例
本発明を、以下の実施例によりさらに例示する。
【０２５９】
実施例１：
材料および方法
材料
細胞
ヒト肝臓サンプルを、Ｃｅｎｔｒｅ  ｄｅ  Ｒｅｓｓｏｕｒｃｅｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｑｕｅｓ（ＣＲＢ）−Ｓａｎｔｅ  ｏｆ  Ｒｅｎｎｅｓ（ＣＨＲＵ  Ｐｏｎｔｃｈａｉｌｌｏｕ，  Ｒｅｎｎｅｓ，  Ｆｒａｎｃｅ）を介して、原発性肝細胞癌または肝臓転移のため肝臓切除術を受ける患者から入手した。研究プロトコルを、フランス政府のガイドラインおよび地方制度の倫理委員会の下で行った。ヒト肝臓サンプルの臨床的な特徴を、以下の表１に詳述する。
【０２６０】
【表１】
2021525100.tif 000002
【０２６１】
ヒト肝細胞を、２つのステップのコラゲナーゼ灌流手法により単離し、実質細胞を、ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）（１０（ｖ／ｖ）％）を伴いまたは伴わずに、ペニシリン（１００Ｕ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、インスリン（１５μｇ／ｍＬ）、グルタミン（２ｍＭ）、アルブミン（０．１（ｗ／ｖ）％）、トランスフェリン（５．５μｇ／ｍＬ）、亜セレン酸ナトリウム（５μｇ／ｍＬ）、ヒドロコルチゾン（１μｍ）、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）（２．５ｎｇ／ｍＬ）、ＥＧＦ（上皮増殖因子）（０．０５ｎｇ／μＬ）を含むＷＥ  ＨＨ（ヒト肝細胞）と呼ばれる改変Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ  Ｅ培地で維持した。
【０２６２】
試薬
細胞増殖試薬ＷＳＴ−１、リベラ―ゼ（１０μｇ／ｍＬ）およびコルセミド（１μｍ）を、Ｒｏｃｈｅから入手した。シスプラチンを、Ｍｙｌａｎから入手した。Ｉ型コラーゲン、エトキシレゾルフィン、メトキシレゾルフィン、ヘキスト、５（６）−カルボキシ−２’，７’−ジクロロＦＤＡ（ＣＤＦＤＡ、１０μＭ）、１×ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン、セレン）、および抗βアクチン抗体（Ａ−５４４１、１／１０００）を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。ＢｒｄＵ（ＲＰＮ２０１Ｖ、１：１０００）および抗−ＢｒｄＵ抗体（ＲＰＮ２０２、１：１００）は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｃｈｉｃａｇｏ，  ＵＳＡ）から入手した。ｒｈＥＧＦを、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｆｉｔｃｈｂｕｒｇ，  ＵＳＡ）から入手し、ｒｈＨＧＦを、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手した。抗ＨＳＣ−７０抗体（ｓｃ−７２９８、１：５０００）を、Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈnoｌｏｇｙから入手した。抗Ｋｉ６７（ＭＡ５−１４５２０、１：４００）抗体を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。ホスホ−ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）（９１０６、１：１０００）、Ｅ−カドヘリン（３１９５、１：１００）、アポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリー（１：５００）、および生存促進性Ｂｃｌ−２ファミリー（１：５００）に対する抗体を、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇから入手した。抗Ｎカドヘリン抗体（６１０９２１、１：１００）は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。ＭＲＰ２（ａｂ３３７３、１：１００）およびサイクリンＤ１（ａｂ１６６６３、１：１００）に対する抗体を、Ａｂｃａｍから入手した。抗ビメンチン抗体（Ｍ０７２５、１：１０００）を、Ｄａｋｏから入手した。抗ホスホ−ヒストンＨ３（Ｓｅｒ１０）抗体（０６−５７０、１：１００）を、Ｍｅｒｋから入手し、抗アルブミン抗体（Ａ８０−２２９Ａ、１：１００）を、Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．から入手した。ＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６（５０μＭ）は、Ｐｒｏｍｅｇａから入手した。
【０２６３】
方法
初代ヒト肝細胞２Ｄ培養
対照として、後述される低接着性プレートで形成される初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）の凝集体を、標準的なマルチウェルプレートに播種し、同じ培地、すなわち本明細書で上述のＷＥ  ＨＨ培地で培養した。
【０２６４】
初代ヒト肝細胞３Ｄ培養
図１に示されるように、上述のように単離された初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）を、まず低接着性プレートで培養した（図１Ａ）。次に、これにより得られたＰＨＨの凝集体を、コラーゲンマトリックス（コラーゲンゲルとも呼ばれる）に埋め込み、コラーゲンマトリックスでさらに培養した（図１Ｂ）。
【０２６５】
低接着性プレートでの培養：単離したヒト肝細胞を、６ウェルの低接着性プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）、Ｃｏｓｔａｒ（登録商標））において、３７℃、５％のＣＯ２、湿度８５〜９５％で一晩（約１５〜２０ｈ）、ＷＥまたはＷＥ  ＨＨにおいて、２×１０６〜２．５×１０６個の細胞／ウェルの濃度でインキュベートした。
【０２６６】
コラーゲンマトリックス中の包含、続いてコラーゲンマトリックスに埋め込まれた肝細胞の培養：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製の３ｍｇ／ｍＬまたは６ｍｇ／ｍＬのＩ型コラーゲンを、ＷＥ  ＨＨ培養培地に希釈して、所望の濃度のコラーゲン溶液を得た。ヒト肝細胞を、３．６５×１０５個の細胞／ｍＬの濃度でコラーゲンを含むＷＥ  ＨＨに添加し、ｐＨを、０．１ＮのＮａＯＨを用いて７．４に調節した。ヒト肝細胞とコラーゲンを含むＤＭＥＭ  ＨＨの得られる混合物を、９６ウェルプレート（１００μｌ）または４８ウェルプレート（３００μｌ）に注ぎ、３７℃、５％のＣＯ２、湿度８５〜９５％でインキュベートした。少なくとも２時間後に、ゲルを重合し、ゲルの体積に相当する体積のＷＥ  ＨＨ培地を添加した。ゲルマトリックスに埋め込まれた肝細胞を、３７℃、５％のＣＯ２、湿度８５〜９５％で、少なくとも２時間、上述の改変ＷＥ  ＨＨで培養した。このように、コラーゲンマトリックスへの肝細胞の包含は、肝細胞の３Ｄ培養を可能にした。
【０２６７】
本明細書で以降では、実施例１において、用語「３Ｄ培養」は、本発明の方法による低接着性プレートにおけるＰＨＨの最初のインキュベーション（または培養）、続くコラーゲンマトリックス中のＰＨＨの包含を用いて、本明細書で上述されるように確立されたＰＨＨの培養を指す。
【０２６８】
しかしながら、培養時間のいずれかの言及、たとえば５日目の培養、はコラーゲンマトリックス（または２Ｄ対照では標準的なマルチウェルプレート）における培養の時間を指す。言い換えると、本明細書にて以降で言及されるいずれかの培養時間は、低接着性プレートでのインキュベーション（または培養）の時間を含まない。
【０２６９】
パラフィン中のコラーゲンゲルの包含
ホルモル（ホルムアルデヒドとして知られている）での固定の後に、４％のコラーゲンゲルを、増加する濃度のアルコールおよびキシレン槽で連続してインキュベーションすることにより脱水した後、ＥＸＣＥＬＳＩＯＲ  ＥＳツール（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｗａｌｔｈａｍ，  ＵＳＡ）を使用してパラフィンに含侵させた。含侵の後、ゲルを、パラフィンブロックに包含し、４μｍの切片を作製した。
【０２７０】
肝細胞ＤＮＡ合成
チミジン類縁体ＢｒｄＵの組み込みを、細胞増殖の指標として使用した。２４時間の組み込みの後、コラーゲンゲル中の細胞を、エタノール−グリシンで固定し、上述のようにパラフィンに包含した。ＢｒｄＵ陽性細胞を、抗ＢｒｄＵ抗体（ＲＰＮ２０２、１：１００）を使用して検出した。
【０２７１】
免疫組織化学的検査
免疫組織化学染色を、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ｋｉｔ（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｔｕｃｓｏｎ，  ＵＳＡ）を使用して、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＩＨＣ  ｓｔａｉｎｅｒで行った。７５℃で８分間のＶｅｎｔａｎａ  ＥＺ  Ｐｒｅｐ溶液での脱パラフィン化の後、抗原賦活化（ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）を、Ｔｒｉｓベースのバッファー溶液ＣＣ１（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｔｕｃｓｏｎ，  ＵＳＡ）を使用して９５℃〜１００℃で３６分間行った。内因性（Ｅｎｄｏｇｅｎ）ペルオキシダーゼを、３％のＨ２Ｏ２（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｔｕｃｓｏｎ，  ＵＳＡ）を用いて３７℃で８分間阻害した。反応バッファー（Ｒｏｃｈｅ，  Ｂａｓｅｌ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）ですすいだ後、スライドを、所望の一次抗体の適切な希釈物と、３７℃で６０分間インキュベートした。すすいだ後、シグナルの亢進を、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｒｈｏｄａｍｉｎｅキットを使用して行い、二次抗体抗ウサギＨＲＰ（Ｒｏｃｈｅ，  Ｂａｓｅｌ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）とのインキュベーションを、１６分間行った。器具から取り出した後、スライドを手ですすぎ、アルブミン（１：１００）、アルブミン検出のため二次抗体（ロバ抗ヤギ６５５。１：２５０）、およびヘキスト（１：１５００）で染色し、カバーガラスをかけた。
【０２７２】
ＲＴ−ｑＰＣＲ分析
細胞を、３７℃、１５分間のリベラーゼ酵素混合物１０μｇ／ｍＬ（Ｒｏｃｈｅ，  Ｂａｓｅｌ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の作用によりコラーゲンゲルから抽出した。次に、総ＲＮＡを、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，  Ｈｏｅｒｄｔ，  Ｆｒａｎｃｅ）を使用して細胞のペレットから抽出し、総ＲＮＡの濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，  ＵＳＡ）で測定した。総ＲＮＡを、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｓａｉｎｔ  Ａｕｂｉｎ，  Ｆｒａｎｃｅ）を使用するｃＤＮＡ合成に使用した。すべての遺伝子についてのリアルタイムＰＣＲを、製造社の推奨に従いＰｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｓａｉｎｔ  Ａｕｂｉｎ，  Ｆｒａｎｃｅ）およびＣＦＸ３８４  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏｒａｄ）を用いるＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ技術を使用して行った。使用されるプライマー配列を、以下の表２および３に記載する。
【０２７３】
増殖曲線を、比較回帰法を使用するＢｉｏｒａｄ  ＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒを用いて解析した。ＧＡＰＤＨを発現データの正規化に使用した。サンプル中の測定されたｍＲＮＡの相対量を、２−ΔΔＣＴ法（ここでΔΔＣＴ＝（ＣＴ標的−ＣＴＧＡＰＤＨ）サンプル−（ＣＴ標的−ＣＴＧＡＰＤＨ）標準物質）を使用して決定した。最終的な結果を、試験されるサンプルにおける標的遺伝子発現の標準物質の平均発現値と比較する際のｎ倍差として表した。値を、少なくとも３回の独立した実験の１つの実験代表として提供する。
【０２７４】
【表２】
2021525100.tif 000003
【０２７５】
【表３】
2021525100.tif 000004
【０２７６】
イムノブロッティング解析
細胞を、３７℃で１５分間、リベラーゼ酵素混合物１０μｇ／ｍＬ（Ｒｏｃｈｅ，  Ｂａｓｅｌ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の作用によりコラーゲンから抽出した。タンパク質サンプルを、細胞のペレットから抽出し、用量設定（ｄｏｓｅ）した。タンパク質サンプルを次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分離し、転写バッファー（２５ｍＭのＴｒｉｓ、２００ｍＭのグリシン、エタノール２０％）中でニトロセルロース膜に移した。ブロットを、トリスバッファー生理食塩水（６５ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ、７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中５％の低脂肪ミルクで、室温で１時間ブロッキングした。このブロットを、所望の一次抗体と４℃で一晩インキュベートした。ブロットをＴＢＳで洗浄し、ＴＢＳ中５％の低脂肪ミルク中で、マウス―ＩｇＧ  ＨＲＰまたはウサギＩｇＧ  ＨＲＰ二次抗体（１：１００００）と室温で１時間インキュベートした。これらのブロットを次に、ＴＢＳで洗浄した。免疫複合体を、イモビロン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ）ウェスタン化学発光ＨＲＰ基質（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｍｅｒｃｋ，  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用する化学発光反応の後にＦｕｊｉｆｉｌｍ  ＬＡＳ−３０００撮像装置（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）を使用して視覚化した。バンドの濃度測定解析を、ＭｕｌｔｉＧａｕｇｅソフトウェア（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）を使用して行った。
【０２７７】
ＭＲＰ２の輸送体活性
蛍光ベースの排出アッセイを使用して、３Ｄ  初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）培養におけるＭＲＰ２の輸送体活性を調査した。膜透過性および非蛍光性の基質５−（および−６）−カルボキシ−２’，７’−ジクロロＦＤＡ（ＣＤＦＤＡ）は、肝細胞の中に進み、ここで細胞内の非特異的なエラスターゼによるこの物質の加水分解は蛍光産物をもたらす。膜輸送体ＭＲＰ−２の基質であるこの産物は、肝細胞から毛細胆管中に排出される。
【０２７８】
３Ｄ培養を、ＣＤＦＤＡ（１０μＭ）と１０分間インキュベートした。色素溶液を次に、２時間にわたり血清フリーの培地に交換した。培養物を、ＰＢＳ溶液で２回洗浄した後、蛍光顕微鏡を使用して評価した。
【０２７９】
ＣＶＰ活性の測定
それぞれＣＹＰ  １Ａ１／２および１Ａ２活性に関連するエトキシレゾルフィンＯ−脱エチル（ＥＲＯＤ）およびメトキシレゾルフィン  Ｏ−脱エチル（ＭＲＯＤ）を、ＢｕｒｋｅおよびＭａｙｅｒ（Ｂｕｒｋｅ  ａｎｄ  Ｍａｙｅｒ，  １９８３）が記載するように培養された肝細胞で測定した。簡潔に述べると、細胞を、３７℃にてリン酸塩バッファー生理食塩水で洗浄した後に、サリチルアミド（１．５ｍＭ）とインキュベートして、フェーズＩＩの結合酵素を阻害した。７−エトキシレゾルフィンまたは７−メトキシレゾルフィンを１分後に添加し、基質の酸化を、３７℃にて２０分間、２分ごとに蛍光検出により測定した。反応速度は時間と線形であった。Ｐ４５０  １Ａ１／２および１Ａ２の活性の評価の後、比色分析のＷＳＴ−１ベースのアッセイを、生細胞の量で上記活性を正規化するために行った。値（ｐｍｏｌ／分／ＯＤ）は、３連の測定値の平均値±標準偏差に対応する。
【０２８０】
有糸分裂指数
本発明の方法により確立された３Ｄ培養で培養されたＰＨＨの有糸分裂指数を測定するために、微小管を脱重合する薬物のコルセミドを使用して中期の細胞を停止させた。細胞を、コルセミドで２４時間処理した後、ホルモル４％で固定した。有糸分裂指数の定量化を、リン酸化したヒストンＨ３の免疫染色により行った。
【０２８１】
イメージング
培養した肝細胞の観察およびイメージングを、２光子励起蛍光（ＴＰＥＦ）顕微鏡（非線形、多光子、または２光子のレーザー走査顕微鏡とも呼ばれる）を使用して行った。ＴＰＥＦ顕微鏡は、深く解像度の高い３次元のイメージングに特に適している共焦点およびデコンボリューション顕微鏡の代替である。ＴＰＥＦは、内在性の自己蛍光する染色されていないまたは染色されたサンプルの観察を可能にする。１型または３型のコラーゲンなどの過分極線維性タンパク質の観察を可能にする第二次高調波発生（ＳＨＧ）と共に、これらの方法は、細胞およびコラーゲンマトリックスの空間的に解像された３次元構造の画像を提供する。ＳＨＧイメージングシステムは、ＤＭＩ  ６０００倒立顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）上に搭載され、ＭＡＩＴＡＩフェムト秒レーザー（Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，  Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，  ＣＡ）を備えるｃｏｎｆｏｃａｌ  ＳＰ５  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｈｅａｄ（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）からなった。高いＮＡ水浸対物レンズ（ＬＵＭＦＬ  ６０Ｗ×１．１ＮＡ；Ｏｌｙｍｐｕｓ，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）を使用した。ＳＨＧシグナルを、水浸コンデンサー（Ｓ１，ＮＡ＝０．９；Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して順方向で収集した。４０５−２０バンドパスフィルターを、光電子増倍管および油浸対物レンズ１０ｘ／０．４ＨＣ  ＰＬ  ＡＰＯ  ｏｉｌまたは２０ｘ／０．７  ＨＣ  ＰＬ  ＡＰＯ  ｏｉｌの前に載置した。
【０２８２】
統計解析
結果を、平均値±標準偏差として表す。データを、両側スチューデントｔ検定で解析した。差異を、ｐ＜０．０５（＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）、またはｐ＜０．００１（＊＊＊）である場合、有意であるとみなした。すべての実験を、少なくとも３回行った。
【０２８３】
結果
ＬＡＰでの前培養後のコラーゲンマトリックスでの３Ｄ培養は、成年初代ヒト肝細胞の長期間の生存を可能にする。
本明細書で上述されるように、まず、初代ヒト肝細胞を、１５時間低接着性プレートで培養した後、適切な増殖因子／サイトカインカクテルの存在下にてコラーゲンゲルに埋め込んだ。図２Ａ〜２Ｂに示されるように、コラーゲンゲルへの包含から２日後（ｄ２）に、初代ヒト肝細胞は、膜の伸長を全く示さずかついずれの特定の編成も伴わない、単離された細胞または円形の細胞の小さなクラスターとして出現した（３Ｄ再構築に関しては図２Ｂを参照）。これらのクラスターは、著しく不均一な大きさを有し、良好に編成されなかった。しかしながら、図２Ｃ〜Ｄに示されるように、コラーゲンゲルへの包含から７日後（ｄ７）に、初代ヒト肝細胞のクラスターの数は多く、上記クラスターはより大きく、よって、コラーゲンマトリックスが培養時間にわたりクラスター形成に影響を与え得ることを示した。図２Ｅ〜Ｆで例示されるように、７日目に行われたＴＰＥＦイメージングおよびＺスタックの再構築は、初代ヒト肝細胞のクラスターが、中空内腔を有する異なる大きさの腺房様構造に編成されたことを示した。これらの腺房様構造は、ヘパトスフィアまたはスフェロイドとも呼ばれ、コラーゲンマトリックスに埋め込まれた良好に編成された肝細胞の１つの層の存在を特徴とした。コラーゲンゲルへの包含から１５日後（ｄ１５）に、ＳＨＧ顕微鏡は、スフェロイドから少し離れて、コラーゲン線維が、平滑であり無作為に配向されたナノ線維を伴い弛緩して現れたことを示した（図２Ｇ）。これらのコラーゲン線維は、スフェロイドの密接した微小環境中でより濃縮されかつまた伸長されるように現れることから、スフェロイドの体積を抑制している（図２Ｈ上のコラーゲンシグネチャーＣＳ−１を参照）。特に、コラーゲン線維の平行線維束が、密接したスフェロイドと平行に分布した（図２Ｈ上のコラーゲンシグネチャーＣＳ−２を参照）。よって、これらの全ての知見は、成年の初代ヒト肝細胞が、コラーゲンゲルに埋め込まれると、腺房様の構造、すなわちスフェロイドを形成し得ることを証明した。このプロセスは、動的であるように見え、スフェロイドは、経時的にコラーゲンマトリックスをリモデル化できるようである。
【０２８４】
次に、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）の長期間の生存を、アポトーシス促進性因子および生存促進性因子のパネルを解析することにより評価した。図３に示されるように、アポトーシス促進性因子（ホスホ−ＢＡＤ、ＢＡＸ、ＢＡＫ、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＰＵＭＡ）（図３Ａ）および生存促進性因子（ＭＣＬ１、ＢＣＬ２ＸＬ、ＢＣＬ２）（図３Ｂ）の培養時間にわたる発現を、対照２Ｄ培養でまたは本明細書で上述されるように確立された３Ｄ培養でのいずれかにおいて、ＰＨＨで評価した。評価された最もアポトーシス促進性の高いタンパク質の発現は、対照２Ｄ培養におけるＰＨＨおよび３Ｄ培養におけるＰＨＨで同様のように見えた。Ｐ−ＢＡＤのみが、対照２Ｄ培養におけるＰＨＨよりも３Ｄ培養におけるＰＨＨで少なくリン酸化された。対照的に、生存促進性タンパク質の発現は、２Ｄ培養におけるＰＨＨで顕著に減少し、３Ｄ培養におけるＰＨＨでは、それらの発現は維持され、いくつかでは実際にアップレギュレートされた（ＢＣＬ２ＸＬ、ＢＣＬ２）。生存促進性タンパク質発現の差異は、５日目に明確にみられはじめ、その後、少なくとも培養の１５日目まで増加した。さらに、切断されたカスパーゼ３は、３Ｄ培養におけるＰＨＨでは検出できなかったが、カスパーゼ依存性アポトーシスは、シスプラチン処理により３Ｄ培養におけるＰＨＨで誘導できた（データ不図示）。まとめると、これらのデータは、３Ｄ培養におけるＰＨＨが、アポトーシスを経験しないことを示している。
【０２８５】
ＬＡＰにおける前培養後のコラーゲンマトリックスでの３Ｄ培養は、成年初代肝細胞の安定な分化を可能にする。
図４に示されるように、ＲＴ−ｑＰＣＲおよびウェスタンブロッティングによる解析は、３Ｄ培養におけるＰＨＨの長期間の生存が、上皮マーカー（Ｅ−カドヘリン）の発現の増加および間葉系マーカー（Ｎ−カドヘリン、ビメンチン、サイトケラチン８、サイトケラチン１８）の発現の減少に関連していたことを示した。Ｎ−カドヘリンおよびビメンチンの発現は、ｍＲＮＡレベル（図４Ａ）およびタンパク質レベル（図４Ｂ）の両方で、対照２Ｄ培養におけるＰＨＨよりも３Ｄ培養におけるＰＨＨ（これらは同じ増殖因子／サイトカインにより刺激された）で有意に低かった。特に、Ｎ−カドヘリンの発現は、対照２Ｄ培養でのＰＨＨにおいて、培養の２日目からおよびそれ以降、迅速に増加した。ｍＲＮＡレベルでのＥ−カドヘリンは、３Ｄ培養におけるＰＨＨで著しく発現され、この発現は経時的にさらに増加した。さらに、ＰＨＨスフェロイドにおける免疫検出は、頂端膜、側膜、および基底膜でＮ−カドヘリンおよびＥ−カドヘリンの明確に異なる局在化を示した。より正確には、Ｅ−カドヘリン標識の増大が、頂端膜および側膜にて、５日目〜１５日目で明確にみることができ、一方でＮ−カドヘリンは、ヒト肝臓の肝細胞におけるそれらの特異的な局在化と一致して側膜および基底膜に優先的に位置していた（データ不図示）。興味深いことに、力を介して依存性（ｆｏｒｃｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）であることが記載されている（Ｗｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７；  Ｆｌｏｕｒｉｏｔ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１４）、ＭＫＬ１／ＭＲＴＦ−Ａ  転写因子（巨核芽球性白血病１／ミオカルディン−関連転写因子）は、３Ｄ培養におけるＰＨＨでのみ核局在化を示した。この転写因子は、核でも細胞質でも、２Ｄ培養におけるＰＨＨでは検出できなかった（データ不図示）。
【０２８６】
まとめると、これらのデータは、本明細書で上述されるように確立された３Ｄ培養におけるＰＨＨでのタンパク質発現が、対照２Ｄ培養におけるＰＨＨの発現と顕著に異なり、ｉｎ  ｓｉｔｕでの肝細胞の発現と非常に類似していることを示す。
【０２８７】
ＬＡＰでの前培養後のコラーゲンマトリックスでの３Ｄ培養における成年初代ヒト肝細胞は、肝機能を呈する。
ヒト肝細胞の分化に及ぼす３Ｄ培養の影響を確認するために、ＲＴ−ｑＰＣＲによる解析を行って、α−フェトプロテイン、アルブミン、アルドラーゼＢ、およびフェーズＩ−ＩＩ−ＩＩＩの異物代謝酵素（解毒酵素とも呼ばれる）のｍＲＮＡ発現レベルを調査した。図５Ａに示されるように、αフェトプロテイン、アルブミン、およびアルドラーゼＢのｍＲＮＡ発現は、対照２Ｄ培養におけるＰＨＨよりも３Ｄ培養におけるＰＨＨで有意に高かった（これらは同じ増殖因子／サイトカインカクテルにより刺激された）。図５Ｂ〜Ｄに示されるように、フェーズＩ（ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｅ１）、フェーズＩＩ（ＧＳＴＡ１／２、ＵＧＴ１Ａ１、ＮＡＴ２）、およびフェーズＩＩＩ（ＭＲＰ２、ＯＣＴ１）の解毒酵素もまた、３Ｄ培養におけるＰＨＨで著しく発現された。
【０２８８】
ＲＴ−ｑＰＣＲ解析はまた、３Ｄ培養におけるＰＨＨでの解毒経路の制御に関与する転写因子（ＣＡＲ、ＰＸＲ、およびＡｈＲ）の発現の、対照２Ｄ培養におけるＰＨＨのものと比較して強力な誘導を示した（図５Ｅ）。ＣＹＰ１Ａ２（ＭＲＯＤ）活性は、３Ｄ培養におけるＰＨＨにおいて有意に増大し、興味深いことに、ＣＹＰ１Ａ（ＥＲＯＤ）活性の３−メチルコラントレン（３−ＭＣ）誘導の相乗作用は、３Ｄ培養におけるＰＨＨでのみ観察された（図５Ｈ）。上記相乗作用は、本明細書で上述される方法によりコラーゲンマトリックスに埋め込まれた初代ヒト肝細胞の高い解毒能力を示している。３Ｄ培養におけるＰＨＨでのＣＹＰ１Ａ活性の顕著な３−ＭＣの誘導が、対照２Ｄ培養でのＰＨＨのものと比較して有意に増大された３Ｄ培養におけるＰＨＨにおけるＣＹＰ１Ａ２  ｍＲＮＡ発現の観察で確認された（図５Ｆ）（これらは同じ増殖因子／サイトカインカクテルにより刺激された）。また核受容体ＨＮＦ４αのｍＲＮＡ発現も、４日目、１５日目、および２８日目で、２Ｄ培養におけるＰＨＨのものと比較して３Ｄ培養におけるＰＨＨで高かった（図５Ｇ）。
【０２８９】
図６に示されるように、薬物輸送体ＭＲＰ２は、頂底−側膜領域および頂端／胆細管ドメインで排他的に局在した。さらに、ＦＤＡ  ＣＤＦＤＡアッセイを使用したＭＲＰ２機能的活性の評価は、４日目、１０日目、２８日目に、ＰＨＨスフェロイドの中心内腔での明確な排出を示した。薬物輸送体  ＭＲＰ３は、頂端ドメインおよび側膜ドメインの両方で局在した。
【０２９０】
ＬＡＰでの前培養の後のコラーゲンマトリックスでの３Ｄ培養におけるＰＨＨスフェロイドの形成
へパトスフェロイドの大きさおよび形態を、２週間の培養にわたり評価した（図７）。細胞を、ヘマトキシリン−エオジン−サフラン（ＨＥＳ）染色の後に観察し、スフェロイドの直径の平均を定量化した。２週間の培養にわたり、すべてのスフェロイドは、１層の細胞のみを示し、中空内腔を有する腺房様構造を呈した（図６および７Ａ参照）。
【０２９１】
上述されるように、スフェロイドを形成するＰＨＨは、特に頂底−側膜領域および頂端−胆細管ドメインで薬物輸送体ＭＲＰ２の排他的な局在を伴い観察され得たため、極性化していた。さらに、上述されるように、スフェロイドを形成するＰＨＨは、それらの分化した状態および肝機能を保持していた。
【０２９２】
低酸素および／またはアポトーシスのマーカーの発現は、本発明の方法で得られたスフェロイドで検出されなかった。さらに、スフェロイドの大きさは、３Ｄ培養の間経時的に減少しなかった。対照的に、図７Ａ〜Ｂに示されるように、スフェロイドの大きさは、経時的に徐々に増加した。
【０２９３】
ＬＡＰでの前培養の後のコラーゲンマトリックスでの３Ｄ培養における成年初代ヒト肝細胞の増殖
上述されるように、スフェロイドの大きさは、経時的に徐々に増加した。特に、６０μｍ未満の直径を有する肝細胞−スフェロイドの数は減少し、一方で６０μｍを超える直径を有するスフェロイドの数は、漸進的に増加した（図７Ｃ）。以下の表４に示されるように、大きさの定量化は、２日目の４７．６２μｍ±１．６１μｍから、１０日目の７２．０４μｍ±６．９２μｍへと、スフェロイドの平均直径の増加を示し、これは、スフェロイドの体積のおよそ３倍の増加に対応する。１５日目に、スフェロイドの大きさは安定化し、またはわずかに減少し、それ以降一定した状態を保っていた（表４および結果は示されない）。
【０２９４】
【表４】
2021525100.tif 000005
【０２９５】
次に、Ｋｉ６７およびＢｒｄＵ陽性細胞の数を、培養の最初の８日間にわたり定量化した。Ｋｉ６７およびＢｒｄＵの両方は細胞増殖のマーカーであり、Ｋｉ６７およびＢｒｄＵ陽性細胞は、Ｓ期を経た細胞である。肝細胞を、８名の異なる患者（表１参照）から単離し、Ｋｉ６７染色またはＢｒｄＵ標識化を、３Ｄ培養および２Ｄ培養で解析した。アルブミンは、成熟した肝細胞の機能のマーカーであり、Ａｌｂ＋肝細胞を定量化するための陽性対照として検出された。図８Ａおよび９Ａ〜Ｂに示されるように、２日目〜７日目に観察される多数のＫｉ６７＋／Ａｌｂ＋および／またはＢｒｄＵ＋／Ａｌｂ＋肝細胞は、本明細書で上述されるように確立された３Ｄ培養での増殖性初代ヒト肝細胞の存在を示した。Ｋｉ６７＋肝細胞は、同じ増殖因子／サイトカインカクテルにより刺激された対照２Ｄ培養では検出できなかった。細胞周期マーカーＣｄｋ２、サイクリンＤ１、ＰＣＮＡ、Ｐ２１、およびＰ２７の発現のＲＴ−ｑＰＣＲ解析は、上記細胞周期マーカーが、２日目の３Ｄならびに２日目および４日目の２Ｄと比較して４日目の３Ｄ培養で最も高く発現されたことを示した（図８Ｂ）。まとめると、８名の異なる患者由来の初代ヒト肝細胞の３Ｄ培養の解析は、著しく類似する結果を提供し（図９Ｃ）、マーカー発現の動態のわずかなバリエーションのみを伴う、多数のＫｉ６７＋／Ａｌｂ＋およびＢｒｄＵ＋／Ａｌｂ＋肝細胞の存在を示した。対照的に、対照２Ｄ培養におけるＡｌｂ＋肝細胞は、常にＫｉ６７−およびＢｒｄＵ−であった（データ不図示）。全ての実験からのＫｉ６７＋／Ａｌｂ＋肝細胞の累積／付加指標は、２８０％（±６０％）に達し、初代ヒト肝細胞が、本明細書で上述されるように確立された３Ｄ培養の最初の週の間に少なくとも２回の細胞周期を経ることができたことを示した。
【０２９６】
これらの結果は初めて、本明細書で上述されるように確立されたコラーゲンゲルでの３Ｄ培養が、特に増殖因子カクテルの存在下で、成年初代ヒト肝細胞を増殖させることができる微小環境を提供することを明確に示す。対照的に、対照２Ｄ培養におけるＰＨＨは、同じ増殖因子カクテルの存在下であっても増殖しなかった。
【０２９７】
Ｋｉ６７の発現（図１０Ａ）およびサイクリンＤ１の発現（図１０Ｂ）、およびＢｒｄＵの組み込み（図１０Ｃ）の解析を、７名の異なるドナーから本明細書で上述されるように確立した初代ヒト肝細胞の３Ｄ培養での播種後最初の１５日の間行った。図１１Ａに示されるように、上記３Ｄ培養での初代ヒト肝細胞は、ドナーに応じて８日目〜１５日目の間、培養の第２週の間に第２の増殖の波を経験できた。これらの２つの連続した増殖の波はまた、ホスホ−ヒストンＨ３免疫染色により検出され（図１１Ｂ）、コルセミドでの２４時間の処理の後の細胞周期のＭ期で阻害された細胞の比率の定量化を可能にした。累積的な有糸分裂指数（図１１Ｃ）は、細胞の約３００％が培養の第１の週の間Ｍ期にあり、約２００％が第２の週の間Ｍ期にあることを示した。その後、Ｋｉ６７、サイクリンＤ１、およびＢｒｄＵ陽性細胞はもはや検出できなかった（結果不図示）。
【０２９８】
一時的なＭＥＫ／ＥＲＫ経路の阻害は、新規の増殖の波を誘導する。
本明細書で上述されるように、異なるドナー（ＨＬ−ａ〜ＨＬ−ｊ、表１参照）から単離した肝細胞由来の本発明の方法により確立された全ての３Ｄ培養の解析は、ドナーに応じた増殖応答のわずかなバリエーションを伴う、２日目〜１５日目の成年ヒト肝細胞の増殖能力を示した。培養の２週間後には、さらなる増殖は検出できなかった。ＭＥＫ／ＥＲＫ経路の一時的な活性化がげっ歯類の肝細胞でＤＮＡの複製を刺激すること、およびＭＥＫ／ＥＲＫ経路の阻害がげっ歯類肝細胞の増殖を阻害することが、以前に示された。ＭＥＫ／ＥＲＫ経路の持続される活性化がラットの肝細胞の増殖に負の役割を有し得ること（Ｆｒｅｍｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）およびカスケードの過剰な活性化もヒト肝細胞癌細胞株ＨｕＨ−７で細胞の複製を阻害し得ること（Ｇｕｅｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５）もまた示された。初代ヒト肝細胞の増殖を、１２日目または１５日目に本明細書で上述されるように確立された３Ｄ培養においてＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６でＭＡＰＫ  ＭＥＫ１／２−ＥＲＫ１／２経路を４８時間一時的に阻害した後に、評価した。ＥＲＫ１／２リン酸化の対照は、すべての培養条件でＵ０１２６の終了時にＥＲＫ１／２活性の強力な阻害を確認した（図１２Ａ）。ＭＥＫ阻害剤を除去した後、累積的なＫｉ６７（図１２Ｂ）およびサイクリンＤ１（図１２Ｃ）陽性細胞は、細胞の５０％〜７０％が新規細胞周期を経験し得た（Ｋｉ６７＋／Ａｌｂ＋およびサイクリンＤ１＋／Ａｌｂ＋）ことを示した。陽性細胞は、同様の一時的なＭＥＫ／ＥＲＫ阻害の後のＤＭＳＯ対照実験でまたは対照２Ｄ培養で検出できなかった（データ不図示）。
【０２９９】
実施例２
材料および方法
細胞
初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）を、本明細書で上述されるように入手した。
【０３００】
方法
初代ヒト肝細胞培養
初代ヒト肝細胞の３Ｄ培養を、本明細書で上述されるように（実施例１参照）設定した。簡潔に述べると、ＰＨＨをまず、低接着性プレートで培養した。次に、その結果得られるＰＨＨの凝集体をコラーゲンマトリックスに埋め込み、コラーゲンマトリックスでさらに培養した。
【０３０１】
培養培地
ＰＨＨを、本明細書で上記に定義されるＷＥ  ＨＨ培地（実施例１参照）で培養した。
【０３０２】
免疫組織化学的検査
ＰＨＨの増殖を評価するために、免疫組織化学染色を本明細書で上述されるように行った。
【０３０３】
結果
本発明に係る３Ｄ培養におけるＰＨＨの増殖での増殖因子の刺激の重要性を、さらに試験した。コラーゲンマトリックスにおけるＰＨＨを、ＥＧＦ、ＨＧＦ、および／またはＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン、および亜セレン酸ナトリウム）を欠くＷＥ  ＥＥ培地中で、本明細書で上述されるように培養した。またコラーゲンマトリックス中のＰＨＨを、ＦＣＳを欠くＷＥ  ＨＨ培地中にて本明細書で上述されるように培養した。以下の表５に示されるように、異なる培養培地で培養したＰＨＨの増殖を、培養対照（ＷＥ  ＨＨ培地）中の陽性細胞のパーセンテージに対するサイクリンＤ１＋／Ａｌｂ＋細胞の数の定量化により評価し、検出された細胞数に関連させた。
【０３０４】
【表５】
2021525100.tif 000006
データは、３つ実験の実験代表の１つに由来する。
【０３０５】
５０μＭの濃度のヒドロコルチゾン（「Ｈｙｄｒｏ  Ｎ」）、すなわち対照条件よりも５０倍高い濃度のヒドロコルチゾンを含むＷＥ  ＨＨ培地で増殖される場合、ＰＨＨは、対照条件で増殖された場合に観察されるものと同様の増殖のパーセンテージを呈した。カクテルに存在する増殖因子（「−ＥＧＦ」、「−ＨＧＦ」、または「−ＩＴＳ」）のそれぞれの単一の欠失は、ＰＨＨ増殖の部分的な減少（最大３０％の減少）のみをもたらした。さらに、ＥＧＦ、ＨＧＦ、およびＩＴＳの同時欠失（「−ＥＧＦ／−ＨＧＦ／−ＩＴＳ」）もウシ胎仔血清（「−ＦＣＳ」）の単一の欠失も、ＰＨＨの増殖を消失させなかった。よってこれらの結果は、ＰＨＨが、ＥＧＦの不存在下、ＨＧＦの不存在下、および／またはＩＴＳの不存在下であっても、本発明に係る３Ｄ培養で増殖できることを示した。注目すべきことに、観察された結果はまた、ＰＨＨが、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）の不存在下であっても本発明に係る３Ｄ培養で増殖できることを証明した。
【０３０６】
また、ＰＨＨの増殖に及ぼすコラーゲンの剛性の作用を評価した。以下の表６に示すように、表記されたコラーゲンマトリックスで培養されたＰＨＨの増殖を、コラーゲンマトリックス対照（１．５ｍｇ／ｍＬ）中の陽性細胞のパーセンテージに対するサイクリンＤ１＋／Ａｌｂ＋細胞の数の定量化により評価し、検出される細胞の数に関連させた。１．５ｍｇ／ｍＬから３ｍｇ／ｍＬまたは４ｍｇ／ｍＬへのＩ型コラーゲン濃度の増加は、それぞれ約５０％および８０％のＰＨＨ増殖の減少を誘導した。対照的に、１．５ｍｇ／ｍＬから０．７５ｍｇ／ｍＬへのＩ型コラーゲン濃度の減少は、ＰＨＨ増殖の減少を誘導しなかった。よってこれらの結果は、３Ｄマトリックスのコラーゲン濃度の増加、よってマトリックスの剛性が、濃度依存的に肝細胞の増殖を阻害することを証明している。
【０３０７】
【表６】
2021525100.tif 000007
【０３０８】
注目すべきことに、低接着性プレートでの前インキュベーションを行うことなく３Ｄコラーゲンゲルに直接埋め込まれＷＥ  ＨＨ培地で培養されたＰＨＨは、非常に低い比率の増殖を呈した（１６．９％、表６参照）。同様に、これまでに３Ｄコラーゲンマトリックスに埋め込まれることなく、ＷＥＨＨ培地中にて低接着性プレートで培養されたＰＨＨは、非常に低い比率の増殖を呈した（１１．７％、表６参照）。
【０３０９】
まとめると、これらの結果は、３Ｄ微小環境および制御されたコラーゲンの剛性が、ヒト成年初代肝細胞の増殖の誘導にとって主要な因子であることを示している。さらにこれらの結果は、非接着性培養容器、たとえば低接着性プレートでのＰＨＨの最初のインキュベーション（または培養）、およびその後のコラーゲンマトリックスへのＰＨＨの包含が、成年ＰＨＨの増殖を誘導するために必要であることを示している。
【０３１０】
実施例３
材料および方法
細胞
初代ヒト肝細胞３Ｄ培養を、本明細書で上述されるように設定した（実施例１参照）。
【０３１１】
方法
初代ヒト肝細胞の培養
コラーゲンマトリックスにおける初代ヒト肝細胞の２Ｄ培養および３Ｄ培養を、本明細書で上述されるように（実施例１参照）設定した。ＰＨＨを本明細書で上述されるようにＷＥ  ＨＨ培地で培養した。
【０３１２】
コメットアッセイ
対照２Ｄ培養（２Ｄ）でまたはコラーゲンマトリックスで本発明の方法により確立された３Ｄ培養（３Ｄ）でのいずれかにおけるＰＨＨを、培養の開始から、表記された濃度の表記された遺伝毒性薬物（表７参照）とインキュベートした。９日後に、ＰＨＨを、精製したコラゲナーゼの作用によりコラーゲンマトリックスから抽出した。細胞のペレットを、０．５％の低融点のアガロースに再懸濁し、通常のアガロースで覆われた従来の顕微鏡スライド上に載置した。電気泳動を処理し、ヨウ化プロピジウムで染色した後に、少なくとも１００枚の画像を、蛍光顕微鏡を使用して獲得した。画像を、Ｃｏｍｅｔ  Ａｓｓａｙ  ＩＶソフトウェアを使用して解析した。個々の細胞におけるＤＮＡ損傷の度合いを、ｔａｉｌ  ＤＮＡのパーセンテージにより評価した。
【０３１３】
【表７】
2021525100.tif 000008
【０３１４】
ＰＨＨの処理の後のγＨ２Ａｘ免疫染色
本発明の方法により確立されたコラーゲンマトリックスでの３Ｄ培養（３Ｄ）でのＰＨＨを、培養の開始から、表記の濃度の表記の遺伝毒性薬物（表７参照）とインキュベートした。９日後に、免疫組織化学染色を、本明細書で上述されるように行って、ＰＨＨ中の、ＤＮＡ二本鎖切断のマーカーであるリン酸化Ｈ２ＡＸ（すなわちγＨ２Ａｘ）の存在を検出した。
【０３１５】
結果
薬物により誘導される遺伝毒性を試験するためのモデルとしての増殖性ＰＨＨを含むスフェロイドの感受性を評価するために、上記スフェロイドに及ぼす２つのクラスの化合物：代謝されることなくＤＮＡに直接的な作用を発揮する、アルカリ化剤、すなわちシスプラチン（リン酸化ヒストンγＨ２Ａｘアッセイ、図１４参照）：代謝的活性化後にのみ遺伝毒性となる、２つの証明されている発がん物質、すなわち４−ＡＢＰ（４−アミノビフェニル）およびＡＦＢ−１（アフラトキシンＢ１）（図１３および図１４）、の作用を試験した。初代ヒト肝細胞を、３Ｄ培養の開始から、増殖する期間の間、遺伝毒性薬物と９日間インキュベートした。
【０３１６】
対照２Ｄ培養、またはコラーゲンマトリックスで本発明の方法により確立された３Ｄ培養（３Ｄ）におけるこれらの化合物の誘導される遺伝毒性を比較するために、コメットアッセイを行った。２Ｄ培養では、４−ＡＢＰおよびＡＦＢ１は、非常に低レベル（約３％）の損傷のみをもたらした。対照的に、コラーゲンマトリックスで本発明の方法により確立された３Ｄ培養（３Ｄ）では、ＡＦＢ−１は、高く用量依存的なレベル（最大約２５％）のＤＮＡ損傷をもたらし、４−ＡＢＰ  １は、より高い（約２倍の）用量依存的なレベルのＤＮＡ損傷をもたらした（図１３）。
【０３１７】
これらの結果を確認するために、コラーゲンマトリックスで本発明の方法により確立された３Ｄ培養におけるγＨ２Ａｘ陽性細胞の数を、免疫染色により定量化した。これにより非常に高いレベルのＤＮＡ損傷が、３つの試験した薬物で観察された：シスプラチンは、ＰＨＨの約９０％にＤＮＡ損傷を誘導し、４−ＡＢＰはＰＨＨの約５０％で、およびＡＦＢ１は、ＰＨＨの約３５％においてＤＮＡ損傷を誘導した。
【０３１８】
よってこれらの結果は、それらの非常に分化され増殖する状態で、増殖性ＰＨＨを含むスフェロイドが、環境上の化合物および化学化合物の遺伝毒性を試験するために重要なモデルを構成することを示す。
【０３１９】
実施例４
材料および方法
材料
細胞
初代ヒト肝細胞３Ｄ培養を、本明細書で上述されるように設定した（実施例１参照）。
【０３２０】
試薬
メタクリル酸修飾ゼラチンを、ＡＲＴ  Ｂｉｏ−ｅｎｃｒｅｓ（Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｕｒ  ｄｅ  Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｑｕｅｓ  ｄｅ  ｌ’Ｉｎｓｅｒｍ，  Ｂｏｒｄｅａｕｘ）から入手した。リチウム  フェニル−２，４，６−トリメチルベンゾイルホスフィナート（ＬＡＰ）を、ＴＣＩから入手した。
【０３２１】
方法
ゼラチンメタクリラート（ＧｅｌＭａ）での初代ヒト肝細胞の培養
図１に示される方法と同様の方法で、上述（実施例１参照）のように単離した初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）を、まず、低接着性プレートで培養した（図１Ａ）。次に、これにより得られるＰＨＨの凝集体を、ＧｅｌＭａマトリックス（ＧｅｌＭａハイドロゲルとも呼ばれる）に埋め込み、ＧｅｌＭａマトリックスでさらに培養した（図１Ｂ）。
【０３２２】
低接着性プレートでの培養：上述のように（実施例１参照）、単離したヒト肝細胞を、６ウェルの低接着性プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標），Ｃｏｓｔａｒ（登録商標））において、ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）（１０（ｖ／ｖ）％）を伴いまたは伴わずに、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、インスリン（５μｇ／ｍＬ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、アルブミン（０．１（ｗ／ｖ）％）を含む改変Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ  Ｅ培地中で、約３×１０６個の細胞／ウェルの濃度で、３７℃、５％のＣＯ２、湿度１００％で２日間（約４８時間）インキュベートした。
【０３２３】
５％のＧｅｌＭａを含む培地の調製：凍結乾燥したＧｅｌＭａの小さく粉砕したフラグメント（最大長２ｍｍ）を、ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）（１０（ｖ／ｖ）％）を伴いまたは伴わずに、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍＬ）、インスリン（１５μｇ／ｍＬ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、アルブミン（０．１（ｗ／ｖ）％）、トランスフェリン（５．５μｇ／ｍＬ）、亜セレン酸ナトリウム（５μｇ／ｍＬ）、ヒドロコルチゾン（１μｍ）、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）（２．５ｎｇ／ｍＬ）、ＥＧＦ（上皮増殖因子）（０．０５ｎｇ／μＬ）を含む改変Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ  Ｅ培地中で、最小８時間、３７℃で溶解した。１０ｍｇ／ｍＬの濃度の容量のリチウム  フェニル−２，４，６−トリメチルベンゾイルホスフィナート（ＬＡＰ）を添加して、５ｇ／１００ｍＬのＧｅｌＭａの濃度、すなわち最終濃度５％のＧｅｌＭａ、および１００ｍｇ／ｍＬの最終濃度のリチウム  フェニル−２，４，６−トリメチルベンゾイルホスフィナート、すなわち最終濃度０．１％のＬＡＰを含む改変Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ  Ｅ培地を得た。使用の前に、５％のＧｅｌＭａおよび０．１％のＬＡＰを含む培地を、３７℃に保ち、光から保護した。
【０３２４】
ＧｅｌＭａマトリックス中の包含、次いでコラーゲンマトリックスに埋め込まれた肝細胞の培養：ヒト肝細胞を、エッペンドルフチューブ（１．５または２ｍＬ）またはＦａｌｃｏｎチューブ（１５ｍＬ）などの適切な容器に移し、２００ｇで２分間遠心した。この上清を除去し、５％のＧｅｌＭａおよび０．１％のＬＡＰを含む培地を添加して、ＧｅｌＭａマトリックス、すなわち５％のＧｅｌＭａおよび０．１％のＬＡＰを含む培地１ｍＬあたり約１０６個のヒト肝細胞の濃度を得た。５％のＧｅｌＭａ、０．１％のＬＡＰ、およびヒト肝細胞を含む培地１００μｌを、９６ウェルプレートのウェルに添加した。あるいは、５％のＧｅｌＭａ、０．１％のＬＡＰ、およびヒト肝細胞を含む培地３００μｌを、４８ウェルプレートのウェルに添加した。ＧｅｌＭａマトリックスの重合を、３６５、４０５ｎｍまたは５３０ｎｍのＬＥＤによる照射により３０秒〜１０分間、好ましくは４０５ｎｍｍのＬＥＤによる照射により６０秒間、誘導した。ＧｅｌＭａマトリックスの重合の後、ＧｅｌＭａマトリックスの容量に相当する容量の同じ改変Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ  Ｅ培地を添加した。ＧｅｌＭａマトリックスに埋め込まれた肝細胞を、上述のように改変Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ  Ｅ培地中で２日間、３７℃、５％のＣＯ２、湿度１００％で培養した。培地を、４８時間ごとに変えた。
【０３２５】
結果
ＬＡＰでの前培養後のＧｅｌＭａマトリックスでの３Ｄ培養におけるＰＨＨスフェロイドの形成
へパトスフェロイドの大きさおよび形態を、２週間の培養にわたり評価した（図１５）。これらの細胞を、ヘマトキシリン−エオジン−サフラン（ＨＥＳ）染色の後に観察した。２週間の培養にわたり、すべてのスフェロイドは、細胞の１層のみを示し、中空内腔を有する腺房様構造を呈した（図１５および１６参照）。
【０３２６】
コラーゲンマトリックスで培養したＰＨＨスフェロイドと同様に、ＧｅｌＭａマトリックスで培養されたスフェロイドを形成するＰＨＨは、特に頂底−側膜領域および頂端／胆細管ドメインで薬物輸送体ＭＲＰ２の排他的な局在化を伴い観察され得るため、極性化されていた。
【０３２７】
ＬＡＰでの前培養後のＧｅｌＭａマトリックスにおける成年初代ヒト肝細胞の増殖
ＧｅｌＭａマトリックスにおける初代ヒト肝細胞の増殖を、ＧｅｌＭａマトリックスで本発明の方法により確立された３Ｄ培養へ播種後３０日間にわたるサイクリンＤ１およびアルブミン（Ａｌｂ）の発現の解析を介して評価した（図１７）。
【０３２８】
Ａｌｂ＋／サイクリンＤ１＋ＰＨＨは、２日目から検出することができ、ＰＨＨが、ＧｅｌＭａマトリックスで本発明の方法により確立された３Ｄ培養で増殖できたことを示す。図１７に示されるように、増殖の波の間、約６０％の最大レベルの増殖が観察された。
【図１】
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【図２Ａ−Ｂ】
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【図２Ｃ−Ｈ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ−Ｃ】
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【図５Ｄ−Ｅ】
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【図５Ｆ−Ｈ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ−Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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