(57)【要約】単離又は精製されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ分子によって提示される突然変異ＲＡＳアミノ酸配列に対して抗原特異性を有する、ＴＣＲが開示される。関連するポリペプチド及びタンパク質、並びに関連する核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団、及び医薬組成物も提供される。哺乳動物におけるがんの存在を検出する方法、及び哺乳動物におけるがんを治療又は予防する方法も開示される。【選択図】図１Ａ
2021505136.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）配列番号１〜３、（ｉｉ）配列番号４〜６、又は（ｉｉｉ）配列番号１〜６のアミノ酸配列を含む単離又は精製されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、
ＴＣＲが、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ分子によって提示される突然変異ヒトＲＡＳアミノ酸配列に対して抗原特異性を有し、
突然変異ヒトＲＡＳアミノ酸配列が、突然変異ヒトキルステンラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、突然変異ヒトハーベイラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ（ＨＲＡＳ）、又は突然変異ヒト神経芽腫ラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ（ＮＲＡＳ）のアミノ酸配列である、ＴＣＲ。
【請求項２】
ＨＬＡクラスＩ分子がＨＬＡ−Ａ分子である、請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項３】
ＨＬＡクラスＩ分子がＨＬＡ−Ａ１１分子である、請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項４】
ＨＬＡクラスＩ分子がＨＬＡ−Ａ＊１１：０１分子である、請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項５】
突然変異ヒトＲＡＳアミノ酸配列が、１２位のグリシンの置換を含む、野生型ヒトＫＲＡＳ、野生型ヒトＨＲＡＳ、又は野生型ヒトＮＲＡＳのアミノ酸配列を含み、１２位は、それぞれ、野生型ヒトＫＲＡＳ、野生型ヒトＨＲＡＳ、又は野生型ヒトＮＲＡＳタンパク質を基準にして定義される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
【請求項６】
置換が、１２位のグリシンの、バリンでの置換である、請求項５に記載のＴＣＲ。
【請求項７】
ヒト可変領域を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
【請求項８】
（ｉ）配列番号７
（ｉｉ）配列番号８、又は
（ｉｉｉ）配列番号７〜８の両方
のアミノ酸配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
【請求項９】
（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むα鎖定常領域であって：
（ｉ）配列番号１７の４８位のＸが、Ｔｈｒ又はＣｙｓであり；
（ｉｉ）配列番号１７の１１２位のＸが、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＴｒｐであり；
（ｉｉｉ）配列番号１７の１１４位のＸが、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、又はＴｒｐであり；及び
（ｉｖ）配列番号１７の１１５位のＸが、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＴｒｐである、α鎖定常領域；
（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むβ鎖定常領域であって、配列番号１８の５７位のＸが、Ｓｅｒ又はＣｙｓである、β鎖定常領域；又は
（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方
を更に含む、請求項１〜８のいずれか１項のＴＣＲ。
【請求項１０】
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むα鎖であって：
（ｉ）配列番号２１の１８５位のＸがＴｈｒ又はＣｙｓであり；
（ｉｉ）配列番号２１の２４９位のＸが、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＴｒｐであり；
（ｉｉｉ）配列番号２１の２５１位のＸが、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、又はＴｒｐであり；及び
（ｉｖ）配列番号２１の２５２位のＸが、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＴｒｐである、α鎖；
（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むβ鎖であって、配列番号２２の１９０位のＸが、Ｓｅｒ又はＣｙｓである、β鎖；又は
（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方
を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の単離又は精製されたＴＣＲ。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項のＴＣＲの機能的部分を含む単離又は精製されたポリペプチドであって、機能的部分が： 
（ａ）配列番号１〜３のすべて；
（ｂ）配列番号４〜６のすべて；又は
（ｃ）配列番号１〜６のすべて
のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項１２】
機能的部分が： 
（ｉ）配列番号７
（ｉｉ）配列番号８、又は
（ｉｉｉ）配列番号７〜８の両方
のアミノ酸配列（複数可）を含む、請求項１１に記載の単離又は精製されたポリペプチド。
【請求項１３】
（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列であって：
（ｉ）配列番号１７の４８位のＸが、Ｔｈｒ又はＣｙｓであり；
（ｉｉ）配列番号１７の１１２位のＸが、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＴｒｐであり；
（ｉｉｉ）配列番号１７の１１４位のＸが、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、又はＴｒｐであり；及び
（ｉｖ）配列番号１７の１１５位のＸが、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＴｒｐである、アミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列であって、配列番号１８の５７位のＸが、Ｓｅｒ又はＣｙｓである、アミノ酸配列；又は
（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方
を更に含む、請求項１１又は１２の単離又は精製されたポリペプチド。
【請求項１４】
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列であって：
（ｉ）配列番号２１の１８５位のＸが、Ｔｈｒ又はＣｙｓであり；
（ｉｉ）配列番号２１の２４９位のＸが、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＴｒｐであり；
（ｉｉｉ）配列番号２１の２５１位のＸが、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、又はＴｒｐであり；及び
（ｉｖ）配列番号２１の２５２位のＸが、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＴｒｐである、アミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列であって、配列番号２２の１９０位のＸが、Ｓｅｒ又はＣｙｓである、アミノ酸配列；又は
（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方
を含む、請求項１１〜１３のいずれか１項の単離又は精製されたポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１１〜１４のいずれか１項のポリペプチドの少なくとも１を含む、単離又は精製されたタンパク質。
【請求項１６】
配列番号１〜３のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号４〜６のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖を含む、請求項１５に記載の単離又は精製されたタンパク質。
【請求項１７】
配列番号７のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号８のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖を含む、請求項１５又は１６に記載の単離又は精製されたタンパク質。
【請求項１８】
（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖であって：
（ｉ）配列番号１７の４８位のＸが、Ｔｈｒ又はＣｙｓであり；
（ｉｉ）配列番号１７の１１２位のＸが、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＴｒｐであり；
（ｉｉｉ）配列番号１７の１１４位のＸが、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、又はＴｒｐであり；及び
（ｉｖ）配列番号１７の１１５位のＸが、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＴｒｐである、第一のポリペプチド鎖；
（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖であって、配列番号１８の５７位のＸが、Ｓｅｒ又はＣｙｓである、第二のポリペプチド鎖；又は
（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方
を更に含む、請求項１５〜１７のいずれか１項の単離又は精製されたタンパク質。
【請求項１９】
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖であって：
（ｉ）配列番号２１の１８５位のＸが、Ｔｈｒ又はＣｙｓであり；
（ｉｉ）配列番号２１の２４９位のＸが、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＴｒｐであり；
（ｉｉｉ）配列番号２１の２５１位のＸが、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、又はＴｒｐであり；及び
（ｉｖ）配列番号２１の２５２位のＸが、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＴｒｐである、第一のポリペプチド鎖；
（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖であって、配列番号２２の１９０位のＸが、Ｓｅｒ又はＣｙｓである、第二のポリペプチド鎖；又は
（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方
を含む、請求項１５〜１８のいずれか１項の単離又は精製されたタンパク質。
【請求項２０】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＴＣＲ、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のポリペプチド、又は請求項１５〜１９のいずれか１項に記載のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離又は精製された核酸。
【請求項２１】
請求項２０に記載の核酸を含む、組換え発現ベクター。
【請求項２２】
請求項２１に記載の組換え発現ベクターを含む、単離又は精製された宿主細胞。
【請求項２３】
請求項２２に記載の宿主細胞を含む、単離又は精製された細胞集団。
【請求項２４】
（ａ）請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＴＣＲ、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載のタンパク質、請求項２０に記載の核酸、請求項２１に記載の組換え発現ベクター、請求項２２に記載の宿主細胞、又は請求項２３に記載の細胞集団、及び（ｂ）医薬的に許容可能な担体、を含む、医薬組成物。
【請求項２５】
哺乳動物におけるがんの存在を検出する方法であって：
（ａ）がんの細胞を含む試料と、請求項１〜１０いずれか１項に記載のＴＣＲ、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載のタンパク質、請求項２０に記載の核酸、請求項２１に記載の組換え発現ベクター、請求項２２に記載の宿主細胞、請求項２３に記載の宿主細胞集団又は請求項２４に記載の医薬組成物とを接触させ、それにより複合体を形成すること；及び
（ｂ）複合体を検出すること
を含み、複合体の検出が哺乳動物におけるがんの存在を示す、方法。
【請求項２６】
哺乳動物におけるがんの治療又は予防における使用のための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＴＣＲ、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載のタンパク質、請求項２０に記載の核酸、請求項２１に記載の組換え発現ベクター、請求項２２に記載の宿主細胞、請求項２３に記載の細胞集団、又は請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
がんが突然変異ヒトＲＡＳアミノ酸配列を発現し、突然変異ヒトＲＡＳアミノ酸配列が、突然変異ヒトＫＲＡＳ、突然変異ヒトＨＲＡＳ、又は突然変異ヒトＮＲＡＳのアミノ酸配列である、請求項２５に記載の方法、又は請求項２６の、使用のためのＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団、又は医薬組成物。
【請求項２８】
突然変異ヒトＲＡＳアミノ酸配列が、１２位のグリシンの置換を含む野生型ヒトＫＲＡＳ、野生型ヒトＨＲＡＳ、又は野生型ヒトＮＲＡＳのアミノ酸配列を含み、１２位が、それぞれ野生型ヒトＫＲＡＳ、野生型ヒトＨＲＡＳ、又は野生型ヒトＮＲＡＳのアミノ酸配列を基準にして定義される、請求項２７に記載の方法、又は請求項２７の、使用のためのＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団、又は医薬組成物。
【請求項２９】
置換が、１２位のグリシンの、バリンによる置換である、請求項２８に記載の方法、又は請求項２８の、使用のためのＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団、又は医薬組成物。
【請求項３０】
突然変異ヒトＲＡＳアミノ酸配列が、突然変異ヒトキルステンラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）のアミノ酸配列である、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の方法、又は請求項２７〜２９のいずれか１項の、使用のためのＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団、又は医薬組成物。
【請求項３１】
突然変異ヒトＲＡＳアミノ酸配列が、突然変異ヒト神経芽細胞腫ラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ（ＮＲＡＳ）のアミノ酸配列である、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の方法、又は請求項２７〜２９のいずれか１項の、使用のためのＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団、又は医薬組成物。
【請求項３２】
突然変異ヒトＲＡＳアミノ酸配列が、突然変異ヒトハーベイラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ（ＨＲＡＳ）のアミノ酸配列である、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の方法、又は請求項２７〜２９のいずれか１項の、使用のためのＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団、又は医薬組成物。
【請求項３３】
がんが膵臓がん、結腸直腸がん、肺がん、子宮内膜がん、卵巣がん、又は前立腺がんである、請求項２５〜３２のいずれか１項に記載の方法、又は請求項２６〜３２のいずれか１項の、使用のためのＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団、又は医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、２０１７年１２月４日に出願された米国仮特許出願番号第６２／５９４，２４４号（参照によりその全体が本明細書に組込まれる）の利益を主張する。
【０００２】
連邦によって支援された研究開発に関する陳述
本発明は、連邦政府の支援を受け、プロジェクト番号ＢＣ０１０９８５の下、米国国立衛生研究所、米国国立がん研究所によりなされた。本発明において、連邦政府は一定の権利を有する。
【０００３】
電子的に提出された物件の参照による組込み
本明細書と同時に提出され、以下の通り識別される、コンピューターで読み取り可能なヌクレオチド／アミノ酸の配列表は、参照により、その全体が本明細書に組込まれる：２０１８年１２月３日付の「７４１０３９＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名前の３７，０９８バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル１件。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
ある種のがんは、特に、がんが転移性で切除不能になった場合、治療選択肢が非常に限られる場合がある。例えば、手術、化学療法、及び放射線療法等の治療における進歩にもかかわらず、例えば膵臓がん、結腸直腸がん、肺がん、子宮内膜がん、卵巣がん及び前立腺がん等の多くのがんの予後は、不良な場合がある。従って、がんに対する更なる治療について、満たされていないニーズが存在する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の一実施形態は、（ｉ）配列番号１〜３、（ｉｉ）配列番号４〜６、又は（ｉｉｉ）配列番号１〜６のアミノ酸配列を含む単離又は精製されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、ＴＣＲが、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ分子によって提示される突然変異ヒトＲＡＳアミノ酸配列に対して抗原特異性を有し、突然変異ヒトＲＡＳアミノ酸配列が、突然変異ヒトキルステンラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、突然変異ヒトハーベイラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ（ＨＲＡＳ）、又は突然変異ヒト神経芽腫ラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ（ＮＲＡＳ）のアミノ酸配列である、ＴＣＲを提供する。
【０００６】
本発明の別の実施形態は、本発明のＴＣＲの機能的部分を含む単離又は精製されたポリペプチドであって、機能的部分が、（ａ）配列番号１〜３のすべて、（ｂ）配列番号４〜６のすべて、又は（ｃ）配列番号１〜６のすべてのアミノ酸配列を含む、ポリペプチドを提供する。
【０００７】
本発明のさらに別の実施形態は、少なくとも１の本発明のポリペプチドを含む、単離または精製されたタンパク質を提供する。
【０００８】
本発明の更なる実施形態は、本発明のＴＣＲ、ポリペプチド及びタンパク質に関連する、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団及び医薬組成物を提供する。
【０００９】
本発明の実施形態により、哺乳動物におけるがんの存在を検出する方法、及び哺乳動物におけるがんを治療又は予防する方法が、更に提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】図１Ａは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）又はＫＲＡＳ  ＷＴ  ２４マーペプチド若しくはＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ  ２４マーペプチドでパルスした自己ＤＣとの共培養後の末梢血ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＣＤ１３７発現を説明するグラフを表す。枠内の数字は、各共培養条件でＣＤ１３７を発現するＴ細胞の割合を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、Ｔ細胞の、ＤＭＳＯ、ＫＲＡＳ  ＷＴ  ２４マーペプチド又はＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ  ２４マーペプチドでパルスした自己ＤＣとの共培養後の２×１０４細胞当たりのＩＦＮ−γスポットの数を示すグラフである。ＰＭＡ：イオノマイシンと培養したＴ細胞及びＤＭＳＯでパルスしたＤＣと培養したＴ細胞がコントロールとして機能した。
【図２】図２は、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ四量体−アロフィコシアニン（ＡＰＣ）又はＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ四量体−フィコエリトリン（ＰＥ）に結合したＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ  ２４マーペプチドで既にＩＶＳを受けたＣＤ８＋末梢血細胞のパーセンテージを説明する実験データ（ドットプロット）を表すグラフを示す（右のプロット）。左のプロットは、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ四量体−ＡＰＣ又はＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ四量体−ＰＥに結合したＨＬＡ−Ａ＊１１：０１に関連してＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ  １０マーを認識するＴＣＲを発現するよう改変しているＴ細胞を示す。
【図３】図３は、フローサイトメトリーにより、マウスＴＣＲベータ鎖定常領域（ｍＴＣＲベータ）発現についての染色によって測定した、実施例２のＴＣＲで形質導入した第一及び第二のドナー（それぞれ左及び右パネル）からの同種異系Ｔ細胞の表面上のＴＣＲの発現を示すグラフを表す。枠内の数字は、ｍＴＣＲベータ発現について陽性であった細胞の割合を示す。
【図４】図４は、異なるＫＲＡＳＧ１２突然変異を発現するがん細胞株と一晩共培養した後の、実施例２のＴＣＲで形質導入した、２人の異なるドナー（ドナー１及びドナー２）からのＴ細胞による、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（２Ｅ４細胞あたりのＩＦＮ−γスポット）により測定したＩＦＮ−γ産生及び４−１ＢＢ発現（％ｍＴＣＲβ＋ＣＤ１３７＋）を示すグラフである。各標的がん細胞株は、形質導入しなかったか、又はＨＬＡ−Ａ＊１１：０１で形質導入した。「＞」は５００スポット超を示す。
【図５】図５Ａは、実施例２のＴＣＲで形質導入したＴ細胞の、表示した濃度（ｎｇ／ｍＬ）のＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ  ９マーペプチド（黒丸）又はＫＲＡＳ  ＷＴ  ９マーペプチド（白丸）でパルスした標的細胞との共培養後に分泌されたＩＦＮ−γの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示すグラフである。図５Ｂは、実施例２のＴＣＲで形質導入したＴ細胞の、表示した濃度（ｎｇ／ｍＬ）のＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ  １０マーペプチド（黒丸）又はＫＲＡＳ  ＷＴ  １０マーペプチド（白丸）でパルスした標的細胞との共培養後に分泌されたＩＦＮ−γの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
ＲＡＳファミリーのタンパク質は、低分子量ＧＴＰアーゼの大ファミリーに属する。特定の理論又はメカニズムには縛られないが、突然変異すると、ＲＡＳタンパク質は多くのヒトがんの発がんの初期において、シグナル伝達に関与し得ると考えられている。単一のアミノ酸置換がタンパク質を活性化し得る。突然変異ＲＡＳタンパク質産物は、構成的に活性化され得る。突然変異ＲＡＳタンパク質は、例えば、膵臓がん（例、膵臓がん（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ））、結腸直腸がん、肺がん（例、肺腺がん）、子宮内膜がん、卵巣がん（例、上皮性卵巣がん）、及び前立腺がん等の種々のヒトのがんのいずれかで発現し得る。ヒトＲＡＳファミリーのタンパク質としては、キルステンラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、ハーベイラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ（ＨＲＡＳ）、及び神経芽細胞腫ラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ（ＮＲＡＳ）が挙げられる。
【００１２】
ＫＲＡＳは、ＧＴＰアーゼＫＲａｓ、Ｖ−Ｋｉ−Ｒａｓ２キルステンラット肉腫ウイルスがん遺伝子、又はＫＲＡＳ２とも称される。２のＫＲＡＳ転写産物変異体：ＫＲＡＳ変異体Ａ及びＫＲＡＳ変異体Ｂがある。野生型（ＷＴ）ＫＲＡＳ変異体Ａは、配列番号９のアミノ酸配列を有する。野生型（ＷＴ）ＫＲＡＳ変異体Ｂは配列番号１０のアミノ酸を有する。以下、「ＫＲＡＳ」（突然変異又は非突然変異（ＷＴ））への言及は、特に明記しない限り、変異体Ａ及び変異体Ｂの両方を指す。活性化されると、突然変異ＫＲＡＳはグアノシン５’−三リン酸（ＧＴＰ）に結合し、ＧＴＰをグアノシン５’−二リン酸（ＧＤＰ）に変換する。
【００１３】
ＨＲＡＳは、ＲＡＳタンパク質ファミリーの別のメンバーである。ＨＲＡＳは、ハーベイラット肉腫ウイルスがんタンパク質、Ｖ−Ｈａ−Ｒａｓハーベイラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ、又はＲａｓファミリー低分子量ＧＴＰ結合タンパク質Ｈ−Ｒａｓとも称される。ＷＴ  ＨＲＡＳは、配列番号１１のアミノ酸配列を有する。
【００１４】
ＮＲＡＳは、ＲＡＳタンパク質ファミリーの更に別のメンバーである。ＮＲＡＳは、ＧＴＰａｓｅ  ＮＲａｓ、Ｖ−Ｒａｓ神経芽細胞種ＲＡＳウイルスがん遺伝子ホモログ、又はＮＲＡＳ１とも称される。ＷＴ  ＮＲＡＳは、配列番号１２のアミノ酸配列を有する。
【００１５】
本発明の一実施形態は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ分子によって提示される突然変異ヒトＲＡＳアミノ酸配列（以下、「突然変異ＲＡＳ」）に対して抗原特異性を有する単離又は精製されたＴＣＲを提供し、突然変異ヒトＲＡＳアミノ酸配列は、突然変異ヒトＫＲＡＳ、突然変異ヒトＨＲＡＳ、又は突然変異ヒトＮＲＡＳのアミノ酸配列である。以下、「ＴＣＲ」への言及は、特に明記しない限り、ＴＣＲの機能的部分及び機能的変異体も指す。
【００１６】
本発明のＴＣＲは、任意の突然変異ヒトＲＡＳタンパク質、ポリペプチド又はペプチドのアミノ酸配列に対して抗原特異性を有し得る。本発明の一実施形態においては、突然変異ヒトＲＡＳアミノ酸配列は、突然変異ヒトＫＲＡＳアミノ酸配列、突然変異ヒトＨＲＡＳアミノ酸配列、又は突然変異ヒトＮＲＡＳアミノ酸配列である。ＷＴヒトＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、及びＨＲＡＳのタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ１８８〜１８９アミノ酸残基の長さを有し、互いに高度な同一性を有している。例えば、ＷＴヒトＮＲＡＳタンパク質のアミノ酸配列は、ＷＴヒトＫＲＡＳタンパク質のそれと８６．８％同一である。ＷＴヒトＮＲＡＳタンパク質及びＷＴヒトＫＲＡＳタンパク質のアミノ酸残基１〜８６は、１００％同一である。ＷＴヒトＨＲＡＳタンパク質のアミノ酸配列は、ＷＴヒトＫＲＡＳタンパク質のそれと８６．３％同一である。ＷＴヒトＨＲＡＳタンパク質及びＷＴヒトＫＲＡＳタンパク質のアミノ酸残基１〜９４は、１００％同一である。以下、「ＲＡＳ」（突然変異又は非突然変異（ＷＴ））への言及は、特に明記しない限り、集合的にＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、及びＮＲＡＳを指す。
【００１７】
本発明の一実施形態においては、突然変異ヒトＲＡＳアミノ酸配列は、１２位のグリシンの置換を含むＷＴ  ＲＡＳアミノ酸配列を含み、１２位は、ＷＴ  ＲＡＳタンパク質をそれぞれ基準にして定義される。上記説明の通り、ＷＴヒトＮＲＡＳタンパク質及びＷＴヒトＫＲＡＳタンパク質のアミノ酸残基１〜８６は１００％同一であり、ＷＴヒトＨＲＡＳタンパク質及びＷＴヒトＫＲＡＳタンパク質のアミノ酸残基１〜９４は１００％同一であるため、ＷＴ  ＲＡＳタンパク質は、ＷＴ  ＫＲＡＳタンパク質（配列番号９又は１０）、ＷＴ  ＨＲＡＳタンパク質（配列番号１１）、又はＷＴ  ＮＲＡＳタンパク質（配列番号１２）のいずれであってもよい。従って、ＷＴ  ＫＲＡＳ、ＷＴ  ＨＲＡＳ、及びＷＴ  ＮＲＡＳタンパク質のそれぞれの１２位のアミノ酸残基は同一、即ちグリシンである。
【００１８】
ＷＴ  ＲＡＳアミノ酸配列の１２位のグリシンは、グリシン以外の任意のアミノ酸残基で置換されてもよい。本発明の一実施形態においては、置換は、ＷＴ  ＲＡＳアミノ酸配列の１２位のグリシンのバリンでの置換である。これに関して、本発明の実施形態は、Ｇ１２Ｖ突然変異を含む任意のＷＴ  ＲＡＳタンパク質、ポリペプチド又はペプチドのアミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴＣＲを提供する。
【００１９】
ＲＡＳの突然変異及び置換は、本明細書において、ＷＴ  ＲＡＳタンパク質のアミノ酸配列を基準にして定義される。従って、ＲＡＳの突然変異及び置換は、ＷＴ  ＲＡＳタンパク質中の特定の位置に存在するアミノ酸残基、次に位置番号、次に、その残基が、検討中の特定の突然変異又は置換において置換されたアミノ酸残基を基準にして、本明細書に記載される。ＲＡＳアミノ酸配列（例、ＲＡＳペプチド）は、全長のＷＴ  ＲＡＳタンパク質の全部に満たない、アミノ酸残基を含み得る。従って、１２位は、本明細書において、ＲＡＳアミノ酸配列の特定の例における対応する残基の実際の位置が異なる場合があるという理解の下で、ＷＴ全長ＲＡＳタンパク質（即ち、配列番号９〜１２のいずれか１つ）を基準にして定義される。位置が配列番号９〜１２のいずれか１つで定義される通りである場合、用語「Ｇ１２」は、配列番号９〜１２のいずれか１つの１２位に通常存在するグリシンを指し、「Ｇ１２Ｖ」は、配列番号９〜１２のいずれか１つの１２位に通常存在するグリシンはバリンにより置換されていることを示す。例えば、ＲＡＳアミノ酸配列の特定の例が、例、
【００２０】
【化１】
2021505136.tif 000003
【００２１】
（配列番号２８）（配列番号９の連続するアミノ酸残基２〜２４に対応する例示的なＷＴ  ＫＲＡＳペプチド）である場合、「Ｇ１２Ｖ」は、たとえ配列番号２８の下線付きグリシンの実際の位置が１１であるとしても、配列番号２８の下線付きグリシンのバリンでの置換を指す。
【００２２】
Ｇ１２Ｖ突然変異を含む全長ＲＡＳタンパク質の例を、以下の表１に示す。
【００２３】
【表１】
2021505136.tif 000004
【００２４】
本発明の一実施形態においては、ＴＣＲは、上記のＧ１２Ｖ突然変異を含むＲＡＳペプチドに対して抗原特異性を有し、突然変異ＲＡＳペプチドは任意の長さを有する。本発明の一実施形態においては、突然変異ＲＡＳペプチドは、本明細書に記載のＨＬＡクラスＩ分子のいずれかへの結合に好適な任意の長さを有する。例えば、ＴＣＲは、Ｇ１２Ｖ突然変異を含むＲＡＳペプチドに対して抗原特異性を有し得、ＲＡＳペプチドは、約９〜約１０アミノ酸残基の長さを有する。突然変異ＲＡＳペプチドは、Ｇ１２Ｖ突然変異を含む突然変異ＲＡＳタンパク質の任意の連続するアミノ酸残基を含み得る。本発明の一実施形態においては、ＴＣＲは、Ｇ１２Ｖ突然変異を含むＲＡＳペプチドに対して抗原特異性を有し得、突然変異ＲＡＳペプチドは、約９アミノ酸残基又は約１０アミノ酸残基の長さを有する。本発明のＧ１２Ｖ  ＴＣＲによって認識され得る、それぞれＧ１２Ｖ突然変異を含む特定のペプチドの例は、９マーのＶＶＧＡＶＧＶＧＫ（配列番号２９）及び１０マーのＶＶＶＧＡＶＧＶＧＫである。
【００２５】
本発明の一実施形態においては、本発明のＴＣＲは、ＨＬＡクラスＩ分子によって提示される突然変異ＲＡＳを認識することができる。これに関して、ＴＣＲは、突然変異ＲＡＳへの結合に際して、ＨＬＡクラスＩ分子の関連内で、免疫応答を誘発し得る。本発明のＴＣＲは、突然変異ＲＡＳに加え、ＨＬＡクラスＩ分子に結合し得る。
【００２６】
本発明の一実施形態においては、ＨＬＡクラスＩ分子は、ＨＬＡ−Ａ分子である。ＨＬＡ−Ａ分子は、α鎖とβ２マイクログロブリンのヘテロ二量体である。ＨＬＡ−Ａα鎖は、ＨＬＡ−Ａ遺伝子によってコードされ得る。β２マイクログロブリンは、アルファ鎖のアルファ１、アルファ２、アルファ３ドメインに非共有結合的に結合して、ＨＬＡ−Ａ複合体を構築する。ＨＬＡ−Ａ分子は、任意のＨＬＡ−Ａ分子であり得る。本発明の一実施形態においては、ＨＬＡクラスＩ分子は、ＨＬＡ−Ａ１１分子である。ＨＬＡ−Ａ１１分子は、任意のＨＬＡ−Ａ１１分子であり得る。ＨＬＡ−Ａ１１分子の例としては、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０２、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０３、又はＨＬＡ−Ａ＊１１：０４が挙げられ得るが、これらに限定されない。好ましくは、ＨＬＡクラスＩ分子は、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１分子である。
【００２７】
本発明のＴＣＲは、養子細胞移入のために用いられる細胞によって発現される場合を含め、種々の利点のいずれか１以上を提供し得る。突然変異ＲＡＳはがん細胞によって発現され、健常な非がん細胞によっては発現されない。特定の理論又はメカニズムには縛られないが、本発明のＴＣＲは、健常な非がん細胞の破壊を最小化又は排除し、それにより毒性を、例えば最小化又は排除することによって低減しながら、がん細胞の破壊を好都合に目的とすると考えられる。更に、本発明のＴＣＲは、例えば、化学療法、手術又は放射線療法等の他のタイプの治療に応答しない突然変異ＲＡＳ陽性がんを、首尾よく好都合に治療又は予防し得る。ＲＡＳＧ１２突然変異は、多くのがんの種類で見られる最も一般的なホットスポット突然変異の１つである。たとえば、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ突然変異は、膵臓がん及び結腸直腸がんの患者のそれぞれ約２７％及び約９％に発現する。更に、ＲＡＳファミリーのメンバーは、様々な種類のがん（例、メラノーマにおけるＮＲＡＳ）でＧ１２ホットスポット突然変異を共有する。追加的に、本発明のＴＣＲは、親和性の高い突然変異ＲＡＳの認識を提供し、これは、操作されていない腫瘍細胞（例、インターフェロン（ＩＦＮ）γで処理されていない、突然変異ＲＡＳ及びＨＬＡ−Ａ＊１１：０１の一方若しくは両方をコードするベクターでトランスフェクションされていない、Ｇ１２Ｖ突然変異を含むＲＡＳペプチドでパルスされていない、又はそれらの組合せの腫瘍細胞）を認識する能力を提供し得る。更に、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１アレルは、コーカサス及びヒスパニックの民族の概ね１４％及び概ね９％でそれぞれ発現する。ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１アレルは、合衆国におけるアジア系民族の最大約４５％で発現する。従って、本発明のＴＣＲは、他のＭＨＣ分子によって提示されたＲＡＳを認識するＴＣＲを用いた免疫療法に適していない場合があるＨＬＡ−Ａ＊１１：０１アレルを発現する患者を含む、免疫療法に適格ながん患者数を増加させ得る。更に、本発明のＴＣＲ、ポリペプチド及びタンパク質は、ヒトアミノ酸配列を含み、これは、例、マウスアミノ酸配列を含むＴＣＲ、ポリペプチド及びタンパク質と比較して、ヒト免疫系による拒絶のリスクを低減し得る。
【００２８】
本明細書で用いられる場合、語句「抗原特異性」は、ＴＣＲが高いアビディティーで突然変異ＲＡＳに特異的に結合し得、免疫学的に認識し得ることを意味する。例えば、（ａ）低濃度の突然変異ＲＡＳペプチド（例、約０．０５ｎｇ／ｍＬ〜約１０ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、又は前記値の任意の２つによって定義される範囲）でパルスした抗原陰性ＨＬＡクラスＩ分子陽性標的細胞、又は（ｂ）標的細胞が突然変異ＲＡＳを発現するよう、突然変異ＲＡＳをコードするヌクレオチド配列が導入されている抗原陰性ＨＬＡクラスＩ分子陽性標的細胞、との共培養に際して、ＴＣＲを発現する約１×１０４〜約１×１０５のＴ細胞が、少なくとも約２００ｐｇ／ｍＬ以上（例、２００ｐｇ／ｍＬ以上、３００ｐｇ／ｍＬ以上、４００ｐｇ／ｍＬ以上、５００ｐｇ／ｍＬ以上、６００ｐｇ／ｍＬ以上、７００ｐｇ／ｍＬ以上、１０００ｐｇ／ｍＬ以上、５，０００ｐｇ／ｍＬ以上、７，０００ｐｇ／ｍＬ以上、１０，０００ｐｇ／ｍＬ以上、２０，０００ｐｇ／ｍＬ以上、又は前記値の任意の２つによって定義される範囲）のＩＦＮ−γを分泌する場合、ＴＣＲは突然変異ＲＡＳに対して「抗原特異性」を有すると考えられ得る。本発明のＴＣＲを発現する細胞はまた、より高濃度の突然変異ＲＡＳペプチドでパルスした抗原陰性ＨＬＡクラスＩ分子陽性標的細胞との共培養に際しても、ＩＦＮ−γを分泌し得る。ＨＬＡクラスＩ分子は、本明細書に記載のＨＬＡクラスＩ分子のいずれであってもよい（例、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１分子）。
【００２９】
代替的に又は追加的に、（ａ）低濃度の突然変異ＲＡＳペプチドでパルスした抗原陰性ＨＬＡ−クラスＩ分子陽性標的細胞、又は（ｂ）標的細胞が、突然変異ＲＡＳを発現するよう、突然変異ＲＡＳをコードするヌクレオチド配列が導入されている抗原陰性ＨＬＡクラスＩ分子陽性標的細胞、との共培養に際して、ＴＣＲを発現するＴ細胞が、ネガティブコントロールによって発現されるＩＦＮ−γの量と比べて少なくとも２倍の多さのＩＦＮ−γを分泌する場合、ＴＣＲは突然変異ＲＡＳに対して「抗原特異性」を有すると考えられ得る。ネガティブコントロールは、例えば、（ｉ）（ａ）同じ濃度の関係性のないペプチド（例、突然変異ＲＡＳペプチドとは異なる配列を含む幾つかの他のペプチド）でパルスした抗原陰性ＨＬＡクラスＩ分子陽性標的細胞、若しくは（ｂ）標的細胞が関係性のないペプチドを発現するよう、関係性のないペプチドをコードするヌクレオチド配列が導入されている抗原陰性ＨＬＡクラスＩ分子陽性標的細胞、と共培養された、ＴＣＲを発現するＴ細胞、又は（ｉｉ）（ａ）同じ濃度の突然変異ＲＡＳペプチドでパルスされた抗原陰性ＨＬＡクラスＩ分子陽性標的細胞、若しくは（ｂ）標的細胞が突然変異ＲＡＳを発現するよう、突然変異ＲＡＳをコードするヌクレオチド配列が導入されている抗原陰性ＨＬＡクラスＩ分子陽性標的細胞、と共培養された、非形質導入Ｔ細胞（例、ＴＣＲを発現しないＰＢＭＣ由来）であり得る。ネガティブコントロールの標的細胞によって発現されるＨＬＡクラスＩ分子は、試験されるＴ細胞と共培養される標的細胞によって発現されるＨＬＡクラスＩ分子と同じである。ＨＬＡクラスＩ分子は、本明細書に記載のＨＬＡクラスＩ分子のいずれであってもよい（例、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１分子）。ＩＦＮ−γ分泌は、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）等の当該技術分野において公知の方法によって測定され得る。
【００３０】
代替的に又は追加的に、（ａ）低濃度の突然変異ＲＡＳペプチドでパルスされた抗原陰性ＨＬＡクラスＩ分子陽性標的細胞、又は（ｂ）標的細胞が突然変異ＲＡＳを発現するよう、突然変異ＲＡＳをコードするヌクレオチド配列が導入されている抗原陰性ＨＬＡクラスＩ分子陽性標的細胞、との共培養に際して、ＩＦＮ−γを分泌するネガティブコントロールＴ細胞の数と比べて、少なくとも２倍の多さの数の、ＴＣＲを発現するＴ細胞がＩＦＮ−γを分泌する場合、ＴＣＲは突然変異ＲＡＳに対して「抗原特異性」を有すると考えられ得る。ＨＬＡクラスＩ分子、ペプチドの濃度及びネガティブコントロールは、本発明の他の態様に関して明細書に記載される通りであり得る。ＩＦＮ−γを分泌する細胞の数は、例えば、例、ＥＬＩＳＰＯＴ等の当該技術分野において公知の方法によって測定され得る。
【００３１】
代替的に又は追加的に、ＴＣＲを発現するＴ細胞が、例えば、突然変異ＲＡＳを発現する標的細胞で刺激後にフローサイトメトリーによって測定された、１以上のＴ細胞活性化マーカーの発現を上方制御する場合、ＴＣＲは突然変異ＲＡＳに対して「抗原特異性」を有すると考えられ得る。Ｔ細胞活性化マーカーの例としては、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ６９、及び抗原刺激に際して上方制御されるサイトカイン（例、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン（ＩＬ）−２等）が挙げられる。
【００３２】
本発明の一実施形態は、ＴＣＲのアルファ（α）鎖、ＴＣＲのベータ（β）鎖、ＴＣＲのガンマ（γ）鎖、ＴＣＲのデルタ（δ）鎖又はそれらの組合せ等の、２のポリペプチド（即ち、ポリペプチド鎖）を含むＴＣＲを提供する。本発明のＴＣＲのポリペプチドは、ＴＣＲが突然変異ＲＡＳに対して抗原特異性を有するという条件で、任意のアミノ酸配列を含み得る。
【００３３】
本発明の一実施形態においては、ＴＣＲは２のポリペプチド鎖を含み、そのそれぞれが、ＴＣＲの相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む可変領域を含む。本発明の一実施形態においては、ＴＣＲは、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１（α鎖のＣＤＲ１）、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２（α鎖のＣＤＲ２）、及び配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３（α鎖のＣＤＲ３）を含む第一のポリペプチド鎖、並びに配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１（β鎖のＣＤＲ１）、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２（β鎖のＣＤＲ２）、及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３（β鎖のＣＤＲ３）を含む第二のポリペプチド鎖を含む。これに関して、本発明のＴＣＲは、配列番号１〜６からなる群から選択されるアミノ酸配列のいずれか１以上を含み得る。本発明の一実施形態においては、ＴＣＲは、（ａ）配列番号１〜３のすべて、（ｂ）配列番号４〜６のすべて、又は（ｃ）配列番号１〜６のすべて、のアミノ酸配列を含む。特に好ましい実施形態においては、ＴＣＲは、配列番号１〜６のすべてのアミノ酸配列を含む。
【００３４】
本発明の一実施形態においては、ＴＣＲは、上記のＣＤＲを含むＴＣＲの可変領域のアミノ酸配列を含む。ＴＣＲは、ヒト可変領域、例、ヒトα鎖可変領域及びヒトβ鎖可変領域、を含み得る。これに関して、ＴＣＲは：配列番号７（α鎖の可変領域）；配列番号８（β鎖の可変領域）；又は配列番号７及び８の両方、のアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、ＴＣＲは、配列番号７及び８の両方のアミノ酸配列を含む。
【００３５】
本発明のＴＣＲは、α鎖定常領域及びβ鎖定常領域を更に含み得る。定常領域は、例、ヒト又はマウス等の任意の好適な種に由来し得る。本発明の一実施形態においては、ＴＣＲは、マウスα鎖及びβ鎖定常領域又はヒトα鎖及びβ鎖定常領域を更に含む。本明細書で用いられる場合、用語「マウス」又は「ヒト」は、本明細書に記載のＴＣＲ又はＴＣＲの任意の構成要素（例、相補性決定領域（ＣＤＲ）、可変領域、定常領域、α鎖、及び／又はβ鎖）に言及する場合は、それぞれマウス又はヒトに由来するＴＣＲ（又はその構成要素）、即ち、それぞれマウスＴ細胞又はヒトＴ細胞起源であるか、又はかつてそれに発現したＴＣＲ（又はその構成要素）を意味する。
【００３６】
本発明の一実施形態は、ヒト可変領域及びマウス定常領域を含むキメラＴＣＲであって、ＨＬＡクラスＩ分子によって提示される突然変異ヒトＲＡＳアミノ酸配列に対して抗原特異性を有する、ＴＣＲを提供する。マウス定常領域は、任意の１以上の利点を提供し得る。例えば、マウス定常領域は、本発明のＴＣＲの、本発明のＴＣＲが導入される宿主細胞の内因性ＴＣＲとの誤対合を減少させ得る。代替的に又は追加的に、マウス定常領域は、ヒト定常領域を含む同じＴＣＲと比較して、本発明のＴＣＲの発現を増大させ得る。キメラＴＣＲは、配列番号１９（野生型（ＷＴ）マウスα鎖定常領域）、配列番号２０（ＷＴマウスβ鎖定常領域）、又は配列番号１９及び２０の両方、のアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、本発明のＴＣＲは、配列番号１９及び２０の両方のアミノ酸配列を含む。キメラＴＣＲは、本発明の他の態様に関して本明細書に記載される通りのＣＤＲ領域のいずれかと組合せて、本明細書に記載のマウス定常領域のいずれかを含み得る。これに関して、ＴＣＲは：（ａ）配列番号１〜３及び１９のすべて；（ｂ）配列番号４〜６及び２０のすべて；又は（ｃ）配列番号１〜６及び１９〜２０のすべて、のアミノ酸配列を含み得る。本発明の別の実施形態においては、キメラＴＣＲは、本発明の他の態様に関して本明細書に記載される可変領域のいずれかと組合せて、本明細書に記載のマウス定常領域のいずれかを含み得る。これに関して、ＴＣＲは：（ｉ）配列番号７及び１９の両方；（ｉｉ）配列番号８及び２０の両方；又は（ｉｉｉ）配列番号７〜８及び１９〜２０のすべて、のアミノ酸配列を含み得る。
【００３７】
本発明の別の実施形態においては、ＴＣＲは：配列番号２３（ＷＴマウス定常領域を含むα鎖）、配列番号２４（ＷＴマウス定常領域を含むβ鎖）又は配列番号２３〜２４の両方、のアミノ酸配列（複数可）を含む。
【００３８】
本発明の一実施形態においては、ＴＣＲは置換定常領域を含む。これに関して、ＴＣＲは、α鎖及びβ鎖の一方又は両方の定常領域に１、２、３、又は４アミノ酸の置換（複数可）を含む、本明細書に記載のＴＣＲのいずれかのアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、ＴＣＲは、α鎖及びβ鎖の一方又は両方のマウス定常領域において１、２、３、又は４アミノ酸の置換（複数可）を含むマウス定常領域を含む。特に好ましい実施形態においては、ＴＣＲは、α鎖のマウス定常領域に１、２、３、又は４アミノ酸の置換（複数可）及びβ鎖のマウス定常領域に１のアミノ酸置換を含むマウス定常領域を含む。いくつかの実施形態においては、置換定常領域を含むＴＣＲは、非置換（野生型）定常領域を含む親ＴＣＲと比較して、好都合に、突然変異ＲＡＳ＋標的の認識の増大、宿主細胞による発現の増大、内因性ＴＣＲとの誤対合の減少、及び抗腫瘍活性の増大のうちの１以上を提供する。一般に、ＴＣＲα鎖及びβ鎖のマウス定常領域の置換アミノ酸配列、それぞれ配列番号１７及び１８は、非置換マウス定常領域アミノ酸配列のすべて又は一部に対応し、配列番号１７は、配列番号１９と比較した場合に、１、２、３、又は４アミノ酸の置換（複数可）を有し、配列番号１８は、配列番号２０と比較した場合に、１のアミノ酸置換を有する。これに関して、本発明の一実施形態は、（ａ）配列番号１７（α鎖の定常領域）であって；（ｉ）４８位のＸが、Ｔｈｒ又はＣｙｓであり；（ｉｉ）１１２位のＸが、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＴｒｐであり；（ｉｉｉ）１１４位のＸが、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、又はＴｒｐであり；及び（ｉｖ）１１５位のＸが、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＴｒｐである、配列番号１７；（ｂ）配列番号１８（β鎖の定常領域）であって、５７位のＸが、Ｓｅｒ又はＣｙｓである、配列番号１８；又は（ｃ）配列番号１７及び１８の両方、のアミノ酸配列を含む、ＴＣＲを提供する。本発明の一実施形態においては、配列番号１７を含むＴＣＲは、配列番号１９（α鎖の非置換マウス定常領域）を含まない。本発明の一実施形態においては、配列番号１８を含むＴＣＲは、配列番号２０（β鎖の非置換マウス定常領域）を含まない。
【００３９】
本発明の一実施形態においては、ＴＣＲは、可変領域及び定常領域を含むα鎖、並びに可変領域及び定常領域を含むβ鎖を含む。これに関して、ＴＣＲは、（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むα鎖であって、（ｉ）配列番号２１の１８５位のＸが、Ｔｈｒ又はＣｙｓであり；（ｉｉ）配列番号２１の２４９位のＸが、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＴｒｐであり；（ｉｉｉ）配列番号２１の２５１位のＸが、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、又はＴｒｐであり；及び（ｉｖ）配列番号：２１の２５２位のＸが、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＴｒｐである、α鎖；（ｂ）配列番号：２２のアミノ酸配列を含むβ鎖であって、配列番号２２の１９０位のＸが、Ｓｅｒ又はＣｙｓである、β鎖；又は（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方を含み得る。本発明の一実施形態においては、配列番号２１を含むＴＣＲは、配列番号２３（非置換α鎖）を含まない。本発明の一実施形態においては、配列番号２２を含むＴＣＲは、配列番号２４（非置換β鎖）を含まない。
【００４０】
本発明の一実施形態においては、置換定常領域は、α鎖及びβ鎖の一方又は両方の定常領域におけるシステイン置換を含み、システイン置換ＴＣＲを提供する。α鎖とβ鎖の対向するシステインは、非置換マウス定常領域を含むＴＣＲには存在しない、置換ＴＣＲのα鎖及びβ鎖の定常領域を相互に連結するジスルフィド結合を提供する。これに関して、ＴＣＲは、配列番号１９の４８位のネイティブのＴｈｒ（Ｔｈｒ４８）及び配列番号２０の５７位のネイティブのＳｅｒ（Ｓｅｒ５７）の一方又は両方がＣｙｓで置換されてもよいシステイン置換ＴＣＲであり得る。好ましくは、配列番号１９のネイティブのＴｈｒ４８及び配列番号２０のネイティブのＳｅｒ５７の両方がＣｙｓで置換される。システイン置換ＴＣＲ定常領域配列の例を表２に示す。本発明の一実施形態においては、システイン置換ＴＣＲは、（ｉ）配列番号１７、（ｉｉ）配列番号１８、又は（ｉｉｉ）配列番号１７及び１８の両方を含み、配列番号１７及び１８の両方は、表２に定義される通りである。本発明のシステイン置換ＴＣＲは、本明細書に記載のＣＤＲのいずれか又は可変領域に加えて置換定常領域を含み得る。
【００４１】
本発明の一実施形態においては、システイン置換キメラＴＣＲは、全長アルファ鎖及び全長ベータ鎖を含む。システイン置換キメラＴＣＲのアルファ鎖及びベータ鎖の配列の例を表２に示す。本発明の一実施形態においては、ＴＣＲは、（ｉ）配列番号２１、（ｉｉ）配列番号２２、又は（ｉｉｉ）配列番号２１及び２２の両方を含み、配列番号２１〜２２は表２に定義される通りである。
【００４２】
【表２】
2021505136.tif 000005
【００４３】
本発明の一実施形態においては、置換されたアミノ酸配列は、α鎖及びβ鎖の一方又は両方の定常領域の膜貫通（ＴＭ）ドメインにおける１、２、又は３アミノ酸の、疎水性アミノ酸による置換を含み、疎水性アミノ酸置換ＴＣＲを提供する（本明細書中、「ＬＶＬ改変ＴＣＲ」とも呼ばれる）。ＴＣＲのＴＭドメインにおける疎水性アミノ酸置換（複数可）は、ＴＭドメイン中に疎水性アミノ酸置換（複数可）を欠くＴＣＲと比較して、ＴＣＲのＴＭドメインの疎水性を増大させ得る。これに関して、ＴＣＲはＬＶＬ改変ＴＣＲであり、配列番号１９のネイティブのＳｅｒ１１２、Ｍｅｔ１１４、及びＧｌｙ１１５のうちの１つ、２つ、又は３つが独立して、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＴｒｐで；好ましくは、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、又はＶａｌで置換され得る。好ましくは、配列番号１９のネイティブのＳｅｒ１１２、Ｍｅｔ１１４、及びＧｌｙ１１５の３つすべてが、独立して、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＴｒｐで；好ましくはＬｅｕ、Ｉｌｅ、又はＶａｌで置換され得る。本発明の一実施形態においては、ＬＶＬ改変ＴＣＲは、（ｉ）配列番号１７、（ｉｉ）配列番号１８、又は（ｉｉｉ）配列番号１７及び１８の両方を含み、配列番号１７及び１８の両方は、表３に定義される通りである。本発明のＬＶＬ改変ＴＣＲは、本明細書に記載のＣＤＲ又は可変領域のいずれかに加えて、置換定常領域を含み得る。
【００４４】
本発明の一実施形態においては、ＬＶＬ改変ＴＣＲは、全長アルファ鎖及び全長ベータ鎖を含む。ＬＶＬ改変ＴＣＲのアルファ鎖及びベータ鎖の配列の例を表３に示す。本発明の一実施形態においては、ＬＶＬ改変ＴＣＲは、（ｉ）配列番号２１、（ｉｉ）配列番号２２、又は（ｉｉｉ）配列番号２１及び２２の両方を含み、配列番号２１〜２２は、表３に定義される通りである。
【００４５】
【表３】
2021505136.tif 000006
【００４６】
本発明の一実施形態においては、置換されたアミノ酸配列は、α鎖及びβ鎖の一方又は両方の定常領域の膜貫通（ＴＭ）ドメインにおける１、２、又は３アミノ酸の、疎水性アミノ酸による置換（複数可）と組合せて、α鎖及びβ鎖の一方又は両方の定常領域に、システイン置換を含む（本明細書では「システイン置換、ＬＶＬ改変ＴＣＲ」とも呼ばれる）。これに関して、ＴＣＲは、配列番号１９のネイティブのＴｈｒ４８がＣｙｓで置換される、システイン置換、ＬＶＬ改変、キメラＴＣＲである。配列番号１９のネイティブのＳｅｒ１１２、Ｍｅｔ１１４、及びＧｌｙ１１５のうちの１つ、２つ、又は３つが、独立して、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＴｒｐで；好ましくは、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、又はＶａｌで；置換され；配列番号２０のネイティブのＳｅｒ５７が、Ｃｙｓで置換される。好ましくは、配列番号１９のネイティブのＳｅｒ１１２、Ｍｅｔ１１４、及びＧｌｙ１１５の３つすべてが、独立して、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＴｒｐで；好ましくは、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、又はＶａｌで；置換され得る。本発明の一実施形態においては、システイン置換、ＬＶＬ改変ＴＣＲは、（ｉ）配列番号１７、（ｉｉ）配列番号１８、又は（ｉｉｉ）配列番号１７及び１８の両方を含み、配列番号１７及び１８の両方は、表４に定義される通りである。本発明のシステイン置換、ＬＶＬ改変ＴＣＲは、本明細書に記載のＣＤＲ又は可変領域のいずれかに加えて、置換定常領域を含み得る。
【００４７】
一実施形態においては、システイン置換、ＬＶＬ改変ＴＣＲは、全長アルファ鎖及び全長ベータ鎖を含む。本発明の一実施形態においては、システイン置換、ＬＶＬ改変ＴＣＲは、（ｉ）配列番号２１、（ｉｉ）配列番号２２、又は（ｉｉｉ）配列番号２１及び２２の両方を含み、配列番号２１〜２２は表４に定義される通りである。
【００４８】
【表４】
2021505136.tif 000007
【００４９】
本発明の一実施形態によって、本明細書に記載のＴＣＲのいずれかの機能的部分を含むポリペプチドも提供される。本明細書で用いられる場合、用語「ポリペプチド」は、オリゴペプチドを含み、１以上のペプチド結合によって連結した一本のアミノ酸鎖を指す。
【００５０】
本発明のポリペプチドに関して、機能的部分が突然変異ＲＡＳに特異的に結合するという条件で、機能的部分はＴＣＲの一部である連続するアミノ酸を含む任意の部分であり得る。ＴＣＲに関連して用いられる場合、用語「機能的部分」は、本発明のＴＣＲの任意の部分又はフラグメントを指し、そしてその部分又はフラグメントは、それが一部であるところのＴＣＲ（親ＴＣＲ）の生物学的活性を保持する。機能的部分は、例えば、突然変異ＲＡＳに特異的に結合する能力（例、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１分子の関連内で）、又は親ＴＣＲと類似する程度、同じ程度、又はより高い程度にがんを検出、治療若しくは予防する能力、を保持するＴＣＲの部分を包含する。親ＴＣＲに関連して、機能的部分は、例えば、親ＴＣＲの約１０％、約２５％、約３０％、約５０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％以上を含み得る。
【００５１】
機能的部分は、該部分のアミノ末端若しくはカルボキシ末端、又は両方の末端に、追加的なアミノ酸を含み得る。該追加的なアミノ酸は、親ＴＣＲのアミノ酸配列中には見られない。望ましくは、追加のアミノ酸は、機能的部分の生物学的機能、例、突然変異ＲＡＳに特異的に結合すること；及び／又はがんを検出し、がんを治療し若しくは予防する能力を有すること等と干渉しない。より望ましくは、追加のアミノ酸は、親ＴＣＲの生物学的活性と比較して、その生物学的活性を増強する。
【００５２】
ポリペプチドは、本発明のＴＣＲのα鎖及び／又はβ鎖の可変領域（複数可）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の１以上を含む機能的部分等の、本発明のＴＣＲのα鎖及びβ鎖のいずれか又は両方の機能的部分を含み得る。本発明の一実施形態においては、ポリペプチドは配列番号１（α鎖のＣＤＲ１）、配列番号２（α鎖のＣＤＲ２）、配列番号３（α鎖のＣＤＲ３）、配列番号４（β鎖のＣＤＲ１）、配列番号５（β鎖のＣＤＲ２）、配列番号６（β鎖のＣＤＲ３）又はそれらの組合せのアミノ酸配列を含み得る。
【００５３】
これに関して、本発明のポリペプチドは、配列番号１〜６からなる群から選択される任意の１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。本発明の一実施形態においては、ＴＣＲは、（ａ）配列番号１〜３のすべて、（ｂ）配列番号４〜６のすべて、又は（ｃ）配列番号１〜６のすべてのアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態においては、ポリペプチドは、配列番号１〜６のすべてのアミノ酸配列を含む。
【００５４】
本発明の一実施形態においては、本発明のポリペプチドは、例えば、上記のＣＤＲ領域の組合せを含む本発明のＴＣＲの可変領域を含み得る。これに関して、ポリペプチドは、（ｉ）配列番号７（α鎖の可変領域）、（ｉｉ）配列番号８（β鎖の可変領域）、又は（ｉｉｉ）配列番号７及び８の両方、のアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、ポリペプチドは、配列番号７及び８の両方のアミノ酸配列を含む。
【００５５】
本発明の一実施形態においては、本発明のポリペプチドは、上記の本発明のＴＣＲの定常領域を更に含み得る。これに関して、ポリペプチドは、配列番号１９（α鎖のＷＴマウス定常領域）、配列番号２０（β鎖のＷＴマウス定常領域）、配列番号１７（α鎖の置換マウス定常領域）、配列番号１８（β鎖の置換マウス定常領域）、配列番号１９及び２０の両方、又は配列番号１７及び１８の両方のアミノ酸配列を更に含み得る。好ましくは、ポリペプチドは、本発明の他の態様に関して本明細書に記載されるＣＤＲ領域又は可変領域のいずれかとの組合せで、配列番号１９及び２０の両方、又は配列番号１７及び１８の両方のアミノ酸配列を更に含む。
【００５６】
本発明の一実施形態においては、ポリペプチドは：（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列であって、（ｉ）配列番号１７の４８位のＸが、Ｔｈｒ又はＣｙｓであり；（ｉｉ）配列番号１７の１１２位のＸが、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＴｒｐであり；（ｉｉｉ）配列番号１７の１１４位のＸが、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、又はＴｒｐであり；及び（ｉｖ）配列番号１７の１１５位のＸが、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＴｒｐである、アミノ酸配列；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列であって、配列番号１８の５７位のＸが、Ｓｅｒ又はＣｙｓである、アミノ酸配列；又は（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方を含む。本発明の一実施形態においては、ポリペプチドの、配列番号１７及び１８の一方又は両方は、表２〜４のいずれか１つに定義される通りである。
【００５７】
本発明の一実施形態においては、本発明のポリペプチドは、本明細書に記載のＴＣＲのα鎖又はβ鎖の全長を含み得る。これに関して、本発明のポリペプチドは、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２１及び２２の両方、又は配列番号２３及び２４の両方のアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、ポリペプチドは、配列番号２１及び２２の両方、又は配列番号２３及び２４の両方のアミノ酸配列を含む。
【００５８】
本発明の一実施形態においては、ポリペプチドは：（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列であって、（ｉ）配列番号２１の１８５位のＸが、Ｔｈｒ又はＣｙｓであり；（ｉｉ）配列番号２１の２４９位のＸが、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＴｒｐでり；（ｉｉｉ）配列番号２１の２５１位のＸが、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、又はＴｒｐであり；及び（ｉｖ）配列番号：２１の２５２位のＸが、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＴｒｐである、アミノ酸配列；（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列であって、配列番号２２の１９０位のＸが、Ｓｅｒ又はＣｙｓである、アミノ酸配列；又は（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方を含む。本発明の一実施形態においては、ポリペプチドの、配列番号２１〜２２のいずれか１つ以上は、表２〜４のいずれか１つで定義される通りである。
【００５９】
本発明の一実施形態は、本明細書に記載の少なくとも１のポリペプチドを含むタンパク質を更に提供する。「タンパク質」は、１以上のポリペプチド鎖を含む分子を意味する。
【００６０】
一実施形態においては、本発明のタンパク質は、配列番号１〜３のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号４〜６のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖を含み得る。
【００６１】
本発明の別の実施形態においては、タンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号８のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖を含み得る。
【００６２】
本発明のタンパク質は、本発明の他の態様に関して本明細書に記載される定常領域のいずれかを更に含み得る。これに関して、本発明の一実施形態においては、第一のポリペプチド鎖は、配列番号１７のアミノ酸配列を更に含み得、第二のポリペプチド鎖は、配列番号１８のアミノ酸配列を更に含み得る。本発明の一実施形態においては、第一のポリペプチド鎖は、配列番号１９のアミノ酸配列を更に含み得、第二のポリペプチド鎖は、配列番号２０のアミノ酸配列を更に含み得る。
【００６３】
本発明の一実施形態においては、タンパク質は：（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖であって、（ｉ）配列番号１７の４８位のＸが、Ｔｈｒ又はＣｙｓであり；（ｉｉ）配列番号１７の１１２位のＸが、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＴｒｐであり；（ｉｉｉ）配列番号１７の１１４位のＸが、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、又はＴｒｐであり；及び（ｉｖ）配列番号１７の１１５位のＸが、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＴｒｐである、第一のポリペプチド鎖；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖であって、配列番号１８の５７位のＸが、Ｓｅｒ又はＣｙｓである、第二のポリペプチド鎖；又は（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方を含む。本発明の一実施形態においては、タンパク質の、配列番号１７及び１８の一方又は両方は、表２〜４のいずれか１つに定義される通りである。
【００６４】
代替的に又は追加的に、本発明の一実施形態のタンパク質は：（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖であって、（ｉ）配列番号２１の１８５位のＸが、Ｔｈｒ又はＣｙｓであり；（ｉｉ）配列番号２１の２４９位のＸが、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＴｒｐであり；（ｉｉｉ）配列番号２１の２５１位のＸが、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、又はＴｒｐであり；及び（ｉｖ）配列番号２１の２５２位のＸが、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＴｒｐである、第一のポリペプチド鎖；（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖であって、配列番号２２の１９０位のＸが、Ｓｅｒ又はＣｙｓである、第二のポリペプチド鎖；又は（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方を含み得る。本発明の一実施形態においては、タンパク質は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖を含み得る。本発明の一実施形態においては、配列番号２１〜２２の一方又は両方は、表２〜４のいずれか１つに定義される通りである。
【００６５】
本発明のタンパク質はＴＣＲであり得る。代替的には、例えば、タンパク質が、配列番号２１及び２２の両方、配列番号２３及び２４の両方のアミノ酸配列を含む単一のポリペプチド鎖を含む場合、又はタンパク質の第一及び／若しくは第二のポリペプチド鎖（複数可）が他のアミノ酸配列、例、免疫グロブリン又はその部分をコードするアミノ酸配列を更に含む場合、本発明のタンパク質は融合タンパク質であり得る。これに関して、本発明の一実施形態は、少なくとも１の他のポリペプチドと共に、本明細書に記載の本発明のポリペプチドの少なくとも１を含む融合タンパク質も提供する。他のポリペプチドは、融合タンパク質の別のポリペプチドとして存在し得、又は本明細書に記載の本発明のポリペプチドの１つとインフレームで（ｉｎ  ｆｒａｍｅ）（タンデムで）発現されるポリペプチドとして存在し得る。他のポリペプチドは、免疫グロブリン、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＭＨＣ分子、ＣＤ１分子、例、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ等を含むがそれらに限定されない、任意のペプチド性若しくはタンパク質性の分子、又はそれらの部分をコードし得る。
【００６６】
融合タンパク質は、本発明のポリペプチドの１以上のコピー及び／又は他のポリペプチドの１以上のコピーを含み得る。例えば、融合タンパク質は、本発明のポリペプチド及び／又は他のポリペプチドの１、２、３、４、５以上のコピーを含み得る。融合タンパク質を作製する好適な方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、組換え法が挙げられる。
【００６７】
本発明の幾つかの実施形態においては、本発明のＴＣＲ、ポリペプチド及びタンパク質は、α鎖及びβ鎖を連結するリンカーペプチドを含む単一のタンパク質として発現され得る。これに関して、本発明のＴＣＲ、ポリペプチド及びタンパク質はリンカーペプチドを更に含み得る。リンカーペプチドは、宿主細胞内で、組換えＴＣＲ、ポリペプチド及び／又はタンパク質の発現を好都合に容易にし得る。リンカーペプチドは、任意の好適なアミノ酸配列を含み得る。例えば、リンカーペプチドは、配列番号２５のアミノ酸配列を含むフューリン−ＳＧＳＧ−Ｐ２Ａリンカーであり得る。宿主細胞によるリンカーペプチドを含むコンストラクトの発現に際して、リンカーペプチドは切断され得、結果として分離したα鎖及びβ鎖となる。本発明の一実施形態においては、ＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質は、全長α鎖、全長β鎖、並びにα鎖とβ鎖との間に位置するリンカーペプチドを含むアミノ酸配列を含み得る。
【００６８】
本発明のタンパク質は、本明細書に記載の本発明のポリペプチドの少なくとも１を含む組換え抗体又はその抗原結合部分であり得る。本明細書で用いられる場合、「組換え抗体」は、本発明のポリペプチド、抗体のポリペプチド鎖又はその抗原結合部分の少なくとも１を含む組換え（例、遺伝学的に操作された）タンパク質を指す。抗体のポリペプチド又はその抗原結合部分は、抗体の重鎖、軽鎖、重鎖若しくは軽鎖の可変領域若しくは定常領域、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、又はＦｃ、Ｆａｂ若しくはＦ（ａｂ）２’フラグメント等であり得る。抗体のポリペプチド鎖又はその抗原結合部分は、組換え抗体の別のポリペプチドとして存在し得る。代替的には、抗体のポリペプチド鎖又はその抗原結合部分は、本発明のポリペプチドとインフレームで（タンデムで）で発現されるポリペプチドとして存在し得る。抗体のポリペプチド又はその抗原結合部分は、本明細書に記載の抗体及び抗体フラグメントのいずれかを含む、任意の抗体又は任意の抗体フラグメントのポリペプチドであり得る。
【００６９】
本発明の範囲内には、本明細書に記載の本発明のＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質の機能的変異体が含まれる。本明細書で用いられる場合、用語「機能的変異体」は、機能的変異体が、それが変異体であるところのＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質の生物学的活性を保持している、親ＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質に対する実質的又は有意な配列同一性又は類似性を有するＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質を指す。機能的変異体は、例えば、親ＴＣＲが抗原特異性を有するか、又は親ポリペプチド若しくはタンパク質が、特異的に結合する突然変異ＲＡＳに、親ＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質と類似する程度、同じ程度若しくはより高い程度に特異的に結合する能力を保持する、本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質（親ＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質）の変異体を包含する。親ＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質に関連して、例えば、機能的変異体は、親ＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質のそれぞれに対して、アミノ酸配列で、少なくとも、約３０％、約５０％、約７５％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％以上同一であり得る。
【００７０】
例えば、機能的変異体は、少なくとも１の保存的アミノ酸置換を含む親ＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列を含み得る。保存的アミノ酸置換は当該技術分野において公知であり、特定の物理的及び／又は化学的特性を有する１のアミノ酸が、同じ化学的又は物理的特性を有する別のアミノ酸に置き換えられるアミノ酸置換が挙げられる。例えば、保存的アミノ酸置換は、酸性アミノ酸の別の酸性アミノ酸（例、Ａｓｐ又はＧｌｕ）への置換、非極性側鎖を含むアミノ酸の非極性側鎖を含む別のアミノ酸（例、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ等）への置換、塩基性アミノ酸の別の塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ等）への置換、極性側鎖を含むアミノ酸の極性側鎖を含む別のアミノ酸（Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ等）への置換等であり得る。
【００７１】
代替的に又は追加的に、機能的変異体は、少なくとも１の非保存的アミノ酸置換を含む親ＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列を含み得る。この場合においては、非保存的アミノ酸置換が、機能的変異体の生物学的活性と干渉しないか又は阻害しないことが好ましい。好ましくは、非保存的アミノ酸置換は、機能的変異体の生物学的活性が、親ＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質と比較して増大するよう、機能的変異体の生物学的活性を増強する。
【００７２】
ＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質の他の構成要素、例、他のアミノ酸が、ＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質の生物学的活性を実質的に変化させないよう、ＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質は、本明細書に記載の特定のアミノ酸配列の一つ又は複数（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）から実質的になり得る。これに関して、例えば、本発明のＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質は、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２１〜２２の両方又は配列番号２３〜２４の両方のアミノ酸配列から実質的になり得る。また、例えば、本発明のＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質は、（ｉ）配列番号７、（ｉｉ）配列番号８、又は（ｉｉｉ）配列番号７及び８の両方のアミノ酸配列（複数可）から実質的になり得る。更に、本発明のＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質は、（ａ）配列番号１〜６のいずれか１以上；（ｂ）配列番号１〜３のすべて；（ｃ）配列番号４〜６のすべて；又は（ｄ）配列番号１〜６のすべてのアミノ酸配列から実質的になり得る。
【００７３】
本発明のＴＣＲ、ポリペプチド及びタンパク質は、ＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質が、それらの生物学的活性、例、突然変異ＲＡＳに特異的に結合し；哺乳動物におけるがんを検出し；又は哺乳動物におけるがんを治療若しくは予防する能力等を保持するという条件で、任意の長さであり得、即ち、任意の数のアミノ酸を含み得る。例えば、ポリペプチドは、約５０、約７０、約７５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００以上のアミノ酸長等の約５０〜約５０００アミノ酸長の範囲であり得る。これに関して、本発明のポリペプチドはオリゴペプチドも含む。
【００７４】
本発明のＴＣＲ、ポリペプチド及びタンパク質は、天然で生じた１以上のアミノ酸の代わりに合成アミノ酸を含み得る。かかる合成アミノ酸は、当該技術分野において公知であり、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸（ａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ノルロイシン（ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ）、α−アミノ−ｎ−デカン酸（α−ａｍｉｎｏ  ｎ−ｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、ホモセリン（ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ）、Ｓ−アセチルアミノメチル−システイン（Ｓ−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、トランス−３−及びトランス−４−ヒドロキシプロリン（ｔｒａｎｓ−３−  ａｎｄ  ｔｒａｎｓ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ）、４−アミノフェニルアラニン（４−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）、４−ニトロフェニルアラニン（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）、４−クロロフェニルアラニン（４−ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）、４−カルボキシフェニルアラニン（４−ｃａｒｂｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）、β−フェニルセリン（β−ｐｈｅｎｙｌｓｅｒｉｎｅ）  β−ヒドロキシフェニルアラニン（β−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）、フェニルグリシン（ｐｈｅｎｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）、α−ナフチルアラニン（α−ｎａｐｈｔｈｙｌａｌａｎｉｎｅ）、シクロヘキシルアラニン（ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌａｌａｎｉｎｅ）、シクロヘキシルグリシン（ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）、インドリン−２−カルボン酸（ｉｎｄｏｌｉｎｅ−２−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（１，２，３，４−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、アミノマロン酸（ａｍｉｎｏｍａｌｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、アミノマロン酸モノアミド（ａｍｉｎｏｍａｌｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｏｎｏａｍｉｄｅ）、Ｎ’−ベンジル−Ｎ’−メチル−リジン（Ｎ’−ｂｅｎｚｙｌ−Ｎ’−ｍｅｔｈｙｌ−ｌｙｓｉｎｅ）、Ｎ’，Ｎ’−ジベンジルリジン（Ｎ’，Ｎ’−ｄｉｂｅｎｚｙｌ−ｌｙｓｉｎｅ）、６−ヒドロキシリジン（６−ｈｙｄｒｏｘｙｌｙｓｉｎｅ）、オルニチン（ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）、α−アミノシクロペンタンカルボン酸（α−ａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｐｅｎｔａｎｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、α−アミノシクロヘキサンカルボン酸（α−ａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、α−アミノシクロヘプタンカルボン酸（α−ａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｈｅｐｔａｎｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、α−（２−アミノ−２−ノルボルナン）−カルボン酸（α−（２−ａｍｉｎｏ−２−ｎｏｒｂｏｒｎａｎｅ）−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、α，γ−ジアミノ酪酸（α，γ−ｄｉａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ）、α，β−ジアミノプロピオン酸（α，β−ｄｉａｍｉｎｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ホモフェニルアラニン（ｈｏｍｏｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）及びα−ｔｅｒｔ−ブチルグリシン（α−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）が挙げられる。
【００７５】
本発明のＴＣＲ、ポリペプチド及びタンパク質は、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、Ｎ−アシル化、（例、ジスルフィド架橋を介した）環化、若しくは酸付加塩への変換、及び／或いは必要に応じて二量体化若しくは重合化、又はコンジュゲート化され得る。
【００７６】
本発明のＴＣＲ、ポリペプチド及び／又はタンパク質は、例えば、例、デノボ合成等の当該技術分野で公知の方法によって得られ得る。また、ポリペプチド及びタンパク質は、標準的な組換え法を用い、本明細書に記載の核酸を用いて、組換えにより作製され得る。例えば、Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第４版）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照。代替的には、本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド及び／又はタンパク質は、Ｓｙｎｐｅｐ（Ｄｕｂｌｉｎ，ＣＡ）、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）及びＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）等の企業によって商業的に合成され得る。これに関して、本発明のＴＣＲ、ポリペプチド及びタンパク質は、合成、組換え、単離及び／又は精製され得る。
【００７７】
本発明の範囲には、本発明のＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質（それらの機能的部分又は変異体のいずれかを含む）、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、宿主細胞集団、又は抗体若しくはその抗原結合部分のいずれかを含む、コンジュゲート、例、バイオコンジュゲートが含まれる。コンジュゲート及びコンジュゲートを合成する方法は、一般的に、当該技術分野において公知である。
【００７８】
本発明の一実施形態は、本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本明細書で用いられる場合、「核酸」は「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「核酸分子」を含み、一般にＤＮＡ又はＲＮＡの重合体を意味し、一本鎖又は二本鎖であり得、天然、非天然又は改変されたヌクレオチドを含有し得、天然、非天然又は改変されたヌクレオチド間結合、例えば、未修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間にみられるホスホジエステルの代わりに、ホスホロアミデート結合又はホスホロチオエート結合等を含有し得る。一実施形態においては、核酸は相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含む。一般的には、核酸が、挿入、欠失、逆位及び／又は置換を何ら含まないことが好ましい。しかし、本明細書で検討される通り、幾つかの例においては核酸が１以上の挿入、欠失、逆位、及び／又は置換を含むことが、好適であり得る。
【００７９】
好ましくは、本発明の核酸は組換え体である。本明細書で用いられる場合、用語「組換え体」は、（ｉ）天然又は合成の核酸セグメントを、生細胞内で複製できる核酸分子に接合することによって、生細胞外で構築される分子、又は（ｉｉ）上記（ｉ）に記載されたものの複製から生じる分子を指す。本明細書における目的のためには、複製はｉｎ  ｖｉｔｒｏ複製、又はｉｎ  ｖｉｖｏ複製であり得る。
【００８０】
核酸は、当該技術分野で公知の手順を用いて、化学合成及び／又は酵素的ライゲーション反応に基づいて構築され得る。例えば、上記のＧｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．を参照。例えば、核酸は、天然で生じたヌクレオチド、又は分子の生物学的安定性を増大させるよう、若しくはハイブリダイゼーション時に形成される二本鎖の物理的安定性を増大させるよう設計された、様々に修飾されたヌクレオチド（例、ホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチド）を用いて化学的に合成され得る。核酸を生成するために用いられ得る修飾ヌクレオチドの例としては、５−フルオロウラシル（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、５−ブロモウラシル（５−ｂｒｏｍｏｕｒａｃｉｌ）、５−クロロウラシル（５−ｃｈｌｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、５−ヨードウラシウル（５−ｉｏｄｏｕｒａｃｉｌ）、ヒポキサンチン（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ）、キサンチン（ｘａｎｔｈｉｎｅ）、４−アセチルシトシン（４−ａｃｅｔｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ）、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル（５−（ｃａｒｂｏｘｙｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｕｒａｃｉｌ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン（５−ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉｏｕｒｉｄｉｎｅ）、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル（５−ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌｕｒａｃｉｌ）、ジヒドロウラシル（ｄｉｈｙｄｒｏｕｒａｃｉｌ）、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキューオシン（ｂｅｔａ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン（ｉｎｏｓｉｎｅ）、Ｎ６−イソペンテニルアデニン（Ｎ６−ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌａｄｅｎｉｎｅ）、１−メチルグアニン（１−ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ）、１−メチルイノシン（１−ｍｅｔｈｙｌｉｎｏｓｉｎｅ）、２，２−ジメチルグアニン（２，２−ｄｉｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ）、２−メチルアデニン（２−ｍｅｔｈｙｌａｄｅｎｉｎｅ）、２−メチルグアニン（２−ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ）、３−メチルシトシン（３−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ）、５−メチルシトシン（５−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ）、Ｎ６−置換アデニン（Ｎ６−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ａｄｅｎｉｎｅ）、７−メチルグアニン（７−ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ）、５−メチルアミノメチルウラシル（５−ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌｕｒａｃｉｌ）、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル（５−ｍｅｔｈｏｘｙａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉｏｕｒａｃｉｌ）、ベータ−Ｄ−マンノシルキューオシン（ｂｅｔａ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル（５’−ｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｕｒａｃｉｌ）、５−メトキシウラシル（５−ｍｅｔｈｏｘｙｕｒａｃｉｌ）、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン（２−ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏ−Ｎ６−ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌａｄｅｎｉｎｅ）、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）（ｕｒａｃｉｌ−５−ｏｘｙａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ｖ））、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）、キューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン（２−ｔｈｉｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）、５−メチル−２−チオウラシル（５−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉｏｕｒａｃｉｌ）、２−チオウラシル（２−ｔｈｉｏｕｒａｃｉｌ）、４−チオウラシル（４−ｔｈｉｏｕｒａｃｉｌ）、５−メチルウラシル（５−ｍｅｔｈｙｌｕｒａｃｉｌ）、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル（ｕｒａｃｉｌ−５−ｏｘｙａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒ）、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル（３−（３−ａｍｉｎｏ−３−Ｎ−２−ｃａｒｂｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）ｕｒａｃｉｌ）及び２，６−ジアミノプリン（２，６−ｄｉａｍｉｎｏｐｕｒｉｎｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。代替的には、本発明の核酸の１以上は、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（Ｆｏｒｔ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）及びＳｙｎｔｈｅｇｅｎ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）等の企業から購入され得る。
【００８１】
核酸は、本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質のいずれかをコードする、任意のヌクレオチド配列を含み得る。本発明の一実施形態においては、核酸は、配列番号３１〜３２のいずれか１つのヌクレオチド配列を含み得る（表５）。本発明の一実施形態においては、核酸は配列番号３１〜３２の両方のヌクレオチド配列を含む。
【００８２】
【表５】
2021505136.tif 000008
【００８３】
本発明の一実施形態においては、核酸は、本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質のいずれかをコードする、コドンを最適化したヌクレオチド配列を含む。如何なる特定の理論又はメカニズムにも縛られないが、ヌクレオチド配列のコドンの最適化は、ｍＲＮＡ転写産物の翻訳効率を増大させると考えられる。ヌクレオチド配列のコドンの最適化は、ネイティブのコドンを、同じアミノ酸をコードするが、細胞内でより容易に利用できるｔＲＮＡによって翻訳され得る、別のコドンに置換することを含み得、従って、翻訳効率が上昇する。ヌクレオチド配列の最適化は、翻訳に干渉するｍＲＮＡの二次構造も減少させ得、従って、翻訳効率が上昇する。
【００８４】
本発明は、本明細書に記載の核酸のいずれかのヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列、又は本明細書に記載の核酸のいずれかのヌクレオチド配列に対し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、核酸も提供する。
【００８５】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列は、好ましくは、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。「高ストリンジェンシー条件」とは、ヌクレオチド配列が、非特異的ハイブリダイゼーションよりも検出可能に強い量で標的配列（本明細書に記載の核酸のいずれかのヌクレオチド配列）に特異的にハイブリダイズすることを意味する。高ストリンジェンシー条件としては、正確に相補的な配列を有するポリヌクレオチド、又は散らばったミスマッチを少しだけ含有するポリヌクレオチドを、ヌクレオチド配列にマッチしたいくつかの小領域（例、３〜１０塩基）を偶然有するランダム配列から識別する条件が挙げられる。かかる相補的な小領域は、１４〜１７又はそれ以上の塩基の全長相補体よりも容易に融解され、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションにより、それらが容易に識別可能となる。比較的高ストリンジェンシーの条件としては、例えば、低塩及び／又は高温条件（約０．０２〜０．１ＭのＮａＣｌ又は当量によって、約５０〜７０℃の温度で提供される等）が挙げられる。かかる高ストリンジェンシー条件は、許容したとしても、ヌクレオチド配列とテンプレート鎖若しくは標的鎖との間のミスマッチをほとんど許容せず、本発明のＴＣＲのいずれかの発現を検出するのに特に好適である。条件は、漸増量のホルムアミドの添加によって、よりストリンジェントになり得ることが、一般的に理解される。
【００８６】
本発明は、本明細書に記載の核酸のいずれかと、少なくとも約７０％以上、例、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸も提供する。これに関して、核酸は、本明細書に記載のヌクレオチド配列のいずれかから実質的になり得る。
【００８７】
本発明の核酸は、組換え発現ベクターに組込まれ得る。これに関して、本発明は、本発明の核酸のいずれかを含む組換え発現ベクターを提供する。本発明の一実施形態においては、組換え発現ベクターは、α鎖、β鎖及びリンカーペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００８８】
本明細書における目的のためには、用語「組換え発現ベクター」とは、宿主細胞によるｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドの発現を可能にする、遺伝学的に改変されたオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドコンストラクトを意味し、この場合、コンストラクトは、ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ベクターは、細胞内でｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを発現させるのに十分な条件下で細胞と接触させられる。本発明のベクターは、全体としては天然には存在しない。しかし、該ベクターの一部は天然に存在し得る。本発明の組換え発現ベクターは、ＤＮＡ及びＲＮＡ（一本鎖又は二本鎖であり得、合成され得るか、又は一部が天然のソースから得られ得、天然、非天然又は改変されたヌクレオチドを含有し得る）を含む（がこれらに限定されない）、任意のタイプのヌクレオチドを含み得る。組換え発現ベクターは、天然に存在するヌクレオチド間結合、天然に存在しないヌクレオチド間結合、又は両方のタイプの結合を含み得る。好ましくは、天然に存在しない又は改変されたヌクレオチド又はヌクレオチド間結合は、ベクターの転写や複製を妨害しない。
【００８９】
本発明の組換え発現ベクターは、任意の好適な組換え発現ベクターであり得、任意の好適な宿主細胞を形質転換又はトランスフェクションするために用いられ得る。好適なベクターとしては、プラスミド及びウイルス等の増殖及び増幅のため、若しくは発現のため、又は両方のために設計されたベクターが挙げられる。ベクターは、ｐＵＣシリーズ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ｐＧＥＸシリーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、及びｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）から成る群から選択され得る。λＧＴ１０、λＧＴ１１、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、λＥＭＢＬ４及びλＮＭ１１４９等のバクテリオファージベクターも用いられ得る。植物発現ベクターの例としては、ｐＢＩ０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩ１２１及びｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。動物発現ベクターの例としては、ｐＥＵＫ−Ｃｌ、ｐＭＡＭ及びｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。好ましくは、組換え発現ベクターは、ウイルスベクター、例、レトロウイルスベクターである。特に好ましい実施形態においては、組換え発現ベクターはＭＳＧＶ１ベクターである。
【００９０】
本発明の組換え発現ベクターは、例えば、Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（上記）に記載の標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて調製され得る。環状又は線状の発現ベクターのコンストラクトは、原核又は真核の宿主細胞において機能する複製系を含有するように調製され得る。複製系は、例、ＣｏｌＥｌ、２μプラスミド、λ、ＳＶ４０、ウシ乳頭腫ウイルス等に由来し得る。
【００９１】
望ましくは、組換え発現ベクターは、適宜、ベクターがＤＮＡベースであるかＲＮＡベースであるかを考慮して、ベクターが導入される宿主細胞の種類（例、細菌、真菌、植物、又は動物）に特異的な、転写、並びに翻訳の開始及び終止コドン等の調節配列を含む。
【００９２】
組換え発現ベクターは、形質転換又はトランスフェクションされた宿主細胞の選択を可能にする、１以上のマーカー遺伝子を含み得る。マーカー遺伝子は、殺生物剤耐性、例、抗生物質、重金属などに対する耐性、原栄養性を提供するための栄養要求性宿主細胞における補完等を含む。本発明の発現ベクターに好適なマーカー遺伝子としては、例えば、ネオマイシン／Ｇ４１８耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子及びアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。
【００９３】
組換え発現ベクターは、ＴＣＲ、ポリペプチド、若しくはタンパク質をコードするヌクレオチド配列に、又は、ＴＣＲ、ポリペプチド、若しくはタンパク質をコードするヌクレオチド配列に相補的であるか、又はハイブリダイズするヌクレオチド配列に作動可能に結合したネイティブの、又は非ネイティブのプロモーターを含み得る。プロモーター、例、強力なプロモーター、弱いプロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター及び発生特異的（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）プロモーターの選択は、当業者の通常の技術の範囲内である。同様に、ヌクレオチド配列をプロモーターと組合せることも、当業者の技術の範囲内である。プロモーターは、非ウイルスプロモーター、又はウイルスプロモーター、例、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター、及びマウス幹細胞ウイルス長鎖末端反復配列（ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）において見受けられるプロモーターであり得る。
【００９４】
本発明の組換え発現ベクターは、一過性の発現のため、安定した発現のためのいずれか、又はその両方のために設計され得る。また、組換え発現ベクターは、構成的発現のため、又は誘導性発現のために作製され得る。
【００９５】
更に、組換え発現ベクターは、自殺遺伝子を含むように作製され得る。用語「自殺遺伝子」は、本明細書で用いられる場合、自殺遺伝子を発現する細胞を死に至らしめる遺伝子を指す。自殺遺伝子は、その遺伝子を発現する細胞に対し物質、例、薬物に対する感受性を付与し、細胞が該物質と接触するとき又は該物質に曝露されるときに細胞を死に至らしめる遺伝子であり得る。自殺遺伝子は、当該技術分野において公知であり、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、ニトロレダクターゼ及び誘導性カスパーゼ９遺伝子の系が挙げられる。
【００９６】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載の組換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を更に提供する。用語「宿主細胞」は、本明細書で用いられる場合、本発明の組換え発現ベクターを含有し得る任意の種類の細胞を指す。宿主細胞は、真核細胞、例、植物、動物、真菌又は藻類であり得、又は、原核細胞、例、細菌若しくは原生動物であり得る。宿主細胞は、培養細胞、又は、初代細胞であり得、即ち、生物、例、ヒトから直接単離され得る。宿主細胞は、接着細胞、又は、浮遊細胞、即ち、懸濁物中で増殖する細胞であり得る。好適な宿主細胞は、当該技術分野において公知であり、例えば、ＤＨ５α  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、サルＶＥＲＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞等が挙げられる。組換え発現ベクターを増幅又は複製する目的のためには、宿主細胞は、好ましくは、原核細胞、例、ＤＨ５α細胞である。組換えＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質を産生する目的のためには、宿主細胞は、好ましくは、哺乳動物細胞である。最も好ましくは、宿主細胞はヒト細胞である。宿主細胞は任意の種類の細胞であり得、任意の種類の組織由来であり得、任意の発生段階のものであり得るが、宿主細胞は、好ましくは、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）又は末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。より好ましくは、宿主細胞は、Ｔ細胞である。
【００９７】
本明細書における目的のためには、Ｔ細胞は、任意のＴ細胞（培養Ｔ細胞（例、初代Ｔ細胞）、若しくは培養Ｔ細胞株（例、Ｊｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴ１など）由来のＴ細胞、又は哺乳動物から得られたＴ細胞等）であり得る。哺乳動物から得られる場合、Ｔ細胞は、多数のソース（血液、骨髄、リンパ節、胸腺又は他の組織若しくは体液が含まれるが、これらに限定されない）から得られ得る。Ｔ細胞は、濃縮又は精製もされ得る。好ましくは、Ｔ細胞はヒトＴ細胞である。Ｔ細胞は、任意の種類のＴ細胞であり得、任意の発生段階のものであり得る（ＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、例、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例、細胞傷害性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、メモリーＴ細胞（例、セントラルメモリーＴ細胞及びエフェクターメモリーＴ細胞）、ナイーブＴ細胞等が挙げられるが、これらに限定されない）。
【００９８】
本明細書に記載の、少なくとも１の宿主細胞を含む細胞集団も本発明により提供される。細胞集団は、記載された組換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を、いずれの組換え発現ベクターも含まない、少なくとも１の他の細胞、例、宿主細胞（例、Ｔ細胞）、又はＴ細胞以外の細胞、例、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球、赤血球、肝細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋肉細胞、脳細胞等に加えて含む不均一集団であり得る。代替的には、細胞集団は、実質的に均一な集団であって、組換え発現ベクターを含む宿主細胞を主に含む（例、実質的にそれからなる）集団であり得る。集団はまた、集団のすべての細胞が組換え発現ベクターを含むように、集団のすべての細胞が、組換え発現ベクターを含む単一の宿主細胞のクローンである、細胞のクローン集団でもあり得る。本発明の一実施形態においては、細胞集団は、本明細書に記載の通りの組換え発現ベクターを含む宿主細胞を含むクローン集団である。
【００９９】
本発明の一実施形態においては、集団中の細胞数が急速に増幅され得る。Ｔ細胞数の増幅は、例えば、米国特許第８，０３４，３３４号；米国特許第８，３８３，０９９号；米国特許出願公開番号第２０１２／０２４４１３３号；Ｄｕｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２６：３３２−４２（２００３）；及びＲｉｄｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１２８：１８９−２０１（１９９０）に記載の通りの、当該技術分野で公知の多くの方法のいずれかによって達成され得る。一実施形態においては、Ｔ細胞数の増幅は、Ｔ細胞をＯＫＴ３抗体、ＩＬ−２、及びフィーダーＰＢＭＣ（例、放射線照射された同種異系ＰＢＭＣ）と共に培養することによって行われる。
【０１００】
本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、及び宿主細胞（その集団を含む）は、単離及び／又は精製され得る。用語「単離された」は、本明細書で用いられる場合、その自然環境から取り出されたことを意味する。用語「精製された」は、本明細書で用いられる場合、純度が増したことを意味するが、「純度」は、相対的な用語であって、必ずしも絶対的純度として解釈されるべきでない。例えば、純度は、少なくとも約５０％であり得、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％を超え得、又は約１００％であり得る。
【０１０１】
本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、及び宿主細胞（その集団を含む）は、これらすべてが、以降、「本発明のＴＣＲ材料」と総称されるものであるが、医薬組成物等の、組成物へと製剤化され得る。これに関して、本発明は、本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、発現ベクター、及び宿主細胞（その集団を含む）のいずれか、並びに医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。本発明のＴＣＲ材料のいずれかを含有する本発明の医薬組成物は、１超の本発明のＴＣＲ材料、例、ポリペプチド及び核酸、又は２以上の異なるＴＣＲを含み得る。代替的には、医薬組成物は、化学療法剤等、別の医薬的に活性な物質（複数可）又は薬物（複数可）、例、アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）など）と組合せて、本発明のＴＣＲ材料を含み得る。
【０１０２】
好ましくは、担体は医薬的に許容可能な担体である。医薬組成物に関して、担体は、考慮中の特定の本発明のＴＣＲ材料のために従来用いられているもののいずれかであり得る。投与できる組成物を調製するための方法は、当業者に公知又は明らかであり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，第２２版，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ（２０１２）においてより詳細に記載されている。医薬的に許容可能な担体は、使用条件下で有害な副作用又は毒性を有さないものであることが好ましい。
【０１０３】
担体の選択は、特定の本発明のＴＣＲ材料によって、及び本発明のＴＣＲ材料を投与するために用いられる特定の方法によってある程度決定される。従って、多様な、本発明の医薬組成物の好適な製剤がある。好適な製剤としては、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、腫瘍内及び腹腔内投与のための、いずれかの製剤が挙げられ得る。本発明のＴＣＲ材料を投与するために、１超の経路が用いられ得、特定の例においては、特定の経路が、別の経路よりも迅速且つ効果的な反応をもたらし得る。
【０１０４】
好ましくは、本発明のＴＣＲ材料は、注射により、例、静脈内に投与される。本発明のＴＣＲ材料が、本発明のＴＣＲを発現する宿主細胞（その集団を含む）である場合には、注射用の細胞のための医薬的に許容可能な担体としては、任意の等張性の担体、例えば、通常の生理食塩水（水中約０．９０％  ｗ／ｖのＮａＣｌ、水中約３００ｍＯｓｍ／ＬのＮａＣｌ、又は水１リットル当たり約９．０ｇのＮａＣｌ）、ＮＯＲＭＯＳＯＬ  Ｒ電解質溶液（Ａｂｂｏｔｔ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）、ＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ  Ａ（Ｂａｘｔｅｒ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）、水中約５％のデキストロース、又は乳酸リンゲル液等が挙げられ得る。一実施形態においては、医薬的に許容可能な担体には、ヒト血清アルブミンが補充される。
【０１０５】
本発明の目的のためには、投与される本発明のＴＣＲ材料の量又は用量（例、本発明のＴＣＲ材料が１以上の細胞の場合、細胞数）は、被験者又は動物において、適切な期間にわたって、例、治療的又は予防的応答をもたらすのに十分でなければならない。例えば、本発明のＴＣＲ材料の用量は、がん抗原（例、突然変異ＲＡＳ）と結合するのに、又は、投与時から約２時間以上、例、１２〜２４時間以上という期間でがんを検出、治療若しくは予防するのに十分でなければならない。特定の実施形態においては、期間は、もっと長くなり得る。用量は、特定の本発明のＴＣＲ材料の有効性、及び動物（例、ヒト）の状態と、治療する動物（例、ヒト）の体重とによって決定される。
【０１０６】
投与される用量を決定するための多くのアッセイが当該技術分野において公知である。本発明の目的のためには、それぞれが異なる用量のＴ細胞を与えられる１組の哺乳動物のうち、１匹の哺乳動物への、ある特定の用量のかかるＴ細胞の投与の際の、本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質を発現するＴ細胞によって標的細胞が溶解される程度、又は、ＩＦＮ−γが分泌される程度を比較することを含むアッセイが、哺乳動物に投与する開始用量を決定するために用いられ得る。一定用量の投与の際の、標的細胞が溶解する程度、又はＩＦＮ−γが分泌される程度は、当該技術分野において公知の方法によってアッセイされ得る。
【０１０７】
本発明のＴＣＲ材料の用量は、特定の本発明のＴＣＲ材料の投与に伴い得る任意の有害な副作用の存在、性質及び程度によっても決定される。典型的には、主治医が、年齢、体重、全般的健康、食習慣、性別、投与する本発明のＴＣＲ材料、投与経路、及び治療されるがんの重篤度等、様々な要因を考慮に入れて、各個々の患者を治療するための本発明のＴＣＲ材料の用量を決定する。本発明のＴＣＲ材料が細胞集団である実施形態においては、注入あたりで投与される細胞の数は、例、約１×１０６から約１×１０１２細胞又はより多くまで変動し得る。特定の実施形態においては、１×１０６未満の細胞が投与され得る。
【０１０８】
当業者は、本発明のＴＣＲ材料の治療効力又は予防効力が修飾によって増大するよう、本発明のＴＣＲ材料（ｉｎｖｅｎｔｉｖｅ  ＴＣＲ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）が、いくつもの形に修飾され得ることを、容易に理解する。例えば、本発明のＴＣＲ材料は、直接的又は化学療法剤への架橋物（ｂｒｉｄｇｅ）を介する間接的のいずれかでコンジュゲート化され得る。化合物を化学療法剤にコンジュゲート化する実務は、当該技術分野において公知である。当業者は、本発明のＴＣＲ材料の機能には必要でない、本発明のＴＣＲ材料における部位が、架橋物及び／又は化学療法剤を結合させるのに好適な部位であると認識する（但し、架橋物及び／又は化学療法剤は、本発明のＴＣＲ材料に結合して、本発明のＴＣＲ材料の機能（即ち、突然変異ＲＡＳに結合する能力、又はがんを検出、治療若しくは予防する能力）を妨害しないものとする）。
【０１０９】
本発明の医薬組成物、ＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞及び細胞集団が、がんを治療又は予防する方法において用いられ得ることが企図される。特定の理論には縛られないが、本発明のＴＣＲは、突然変異ＲＡＳに特異的に結合すると考えられ、その結果、ＴＣＲ（又は関連する本発明のポリペプチド又はタンパク質）が、細胞に発現すると、突然変異ＲＡＳを発現する標的細胞に対する免疫反応を調節することができる。これに関して、本発明は、哺乳動物におけるがんを治療又は予防する方法であって、本明細書に記載の医薬組成物、ＴＣＲ、ポリペプチド、若しくはタンパク質のいずれか、本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む、任意の核酸又は組換え発現ベクター、又は本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド若しくはタンパク質のいずれかをコードする組換えベクターを含む、任意の宿主細胞又は細胞集団を、哺乳動物におけるがんを治療又は予防するのに有効な量で、哺乳動物に投与することを含む、方法を提供する。
【０１１０】
本発明の一実施形態は、哺乳動物におけるがんの治療又は予防において用いるための、本明細書に記載の医薬組成物、ＴＣＲ、ポリペプチド、若しくはタンパク質のいずれか、本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む、任意の核酸若しくは組換え発現ベクター、又は本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、若しくはタンパク質のいずれかをコードする組換えベクターを含む、任意の宿主細胞又は細胞集団を提供する。
【０１１１】
用語「治療する」及び「予防する」並びにそれらの派生語は、本明細書で用いられる場合、１００％の、又は完全な治療若しくは予防を必ずしも意味しない。むしろ、当業者が潜在的な利益又は治療効果を有すると認識する、様々な程度の治療又は予防が存在する。これに関して、本発明の方法は、任意のレベルの任意の量の、哺乳動物におけるがんの治療又は予防を提供し得る。更に、本発明の方法により提供される治療又は予防は、治療又は予防される１以上の、がんの状態又は症状の治療又は予防を含み得る。例えば、治療又は予防は、腫瘍の退行を促進することを含み得る。また、本明細書における目的のためには、「予防」は、がん、又はその症状若しくは状態の発症を遅延させることを包含し得る。代替的に又は追加的に、「予防」は、がん、又はその症状若しくは状態の再発を予防又は遅延させることを包含し得る。
【０１１２】
哺乳動物におけるがんの存在を検出する方法も提供される。該方法は、（ｉ）哺乳動物由来の１以上の細胞を含む試料と、本明細書に記載の、本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団、又は医薬組成物のいずれかとを接触させ、それにより複合体を形成すること、及び（ｉｉ）該複合体を検出することを含み、該複合体の検出が哺乳動物におけるがんの存在を示す。
【０１１３】
本発明の、哺乳動物におけるがんを検出する方法に関して、細胞の試料は、全細胞、その溶解物、又は全細胞溶解物の画分、例、核若しくは細胞質画分、全タンパク質画分、又は核酸画分を含む試料であり得る。
【０１１４】
本発明のがんを検出する方法の目的のためには、接触は、哺乳動物に関してインビトロ又はインビボで行い得る。好ましくは、接触はインビトロである。
【０１１５】
また、複合体の検出は、当該技術分野で公知の、任意の数の方法によって行われ得る。例えば、本明細書に記載の本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、又は細胞集団は、例えば、放射性同位体、蛍光色素（例、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ））、酵素（例、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ）、及び元素粒子（例、金粒子）等の検出可能な標識で標識され得る。
【０１１６】
宿主細胞又は細胞集団が投与される、本発明の方法の目的のためには、細胞は、哺乳動物に対して同種異系又は自己の細胞であり得る。好ましくは、細胞は哺乳動物に対して自己である。
【０１１７】
本発明の方法に関して、がんは、急性リンパ球性がん、急性骨髄性白血病、肺胞横紋筋肉腫、骨がん、脳がん、乳がん、肛門、肛門管又は肛門直腸のがん、眼のがん、肝内胆管のがん、関節のがん、頸部、胆嚢又は胸膜のがん、鼻、鼻腔、又は中耳のがん、口腔のがん、膣のがん、外陰のがん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、子宮頸がん、胃腸カルチノイド腫瘍、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、肝臓がん、肺がん、悪性中皮腫、黒色腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、中咽頭のがん、卵巣がん、陰茎のがん、膵臓がん、腹膜がん、大網がん及び腸間膜がん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎臓がん、皮膚がん、小腸がん、軟部組織がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、子宮のがん、尿管がん及び膀胱がんのいずれかを含む、任意のがんであり得る。好ましいがんは、膵臓がん、結腸直腸がん、肺がん、子宮内膜がん、卵巣がん、又は前立腺がんである。好ましくは、肺がんは肺腺がんであり、卵巣がんは上皮性卵巣がんであり、膵臓がんは膵臓腺がんである。本発明の一実施形態においては、がんは、突然変異ヒトＲＡＳアミノ酸配列であって、突然変異ヒトＫＲＡＳ、突然変異ヒトＨＲＡＳ、又は突然変異ヒトＮＲＡＳのアミノ酸配列である、突然変異ヒトＲＡＳアミノ酸配列を発現する。がんによって発現される突然変異ヒトＫＲＡＳ、突然変異ヒトＨＲＡＳ、及び突然変異ヒトＮＲＡＳは、本発明の他の態様に関して本明細書に記載される通りであり得る。
【０１１８】
本発明の方法において言及される哺乳動物は、任意の哺乳動物であり得る。用語「哺乳動物」は、本明細書で用いられる場合、マウス及びハムスター等、ネズミ目の哺乳動物、及びウサギ等、ウサギ目の哺乳動物を含むが、これらに限定されない、任意の哺乳動物を指す。哺乳動物が、ネコ科の動物（ネコ）及びイヌ科の動物（イヌ）を含むネコ目由来であることが好ましい。哺乳動物が、ウシ科の動物（ウシ）及びイノシシ科の動物（ブタ）を含むウシ目、又はウマ科の動物（ウマ）を含むウマ目（Ｐｅｒｓｓｏｄａｃｔｙｌａ）由来であることが、より好ましい。哺乳動物が、霊長目、セボイド（Ｃｅｂｏｉｄｓ）目若しくはシモイド（Ｓｉｍｏｉｄｓ）目（サル）又は、類人（Ａｎｔｈｒｏｐｏｉｄｓ）目（ヒト及び類人猿）であることが、最も好ましい。特に好ましい哺乳動物は、ヒトである。
【０１１９】
以下の実施例は、本発明を更に説明するが、もちろん、決してその範囲を限定するものとして解釈すべきではない。
【実施例】
【０１２０】
実施例１
本実施例は、Ｇ１２Ｖ突然変異を含むヒトＫＲＡＳに対して抗原特異性を有するＴＣＲであって、突然変異ＫＲＡＳが、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１分子によって提示される、ＴＣＲの単離を実例で示す。
【０１２１】
ＴＣＲを、インビトロ感作（ＩＶＳ）後の子宮内膜がん患者の末梢血から同定及び単離した。患者のがん細胞は、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ突然変異を発現していることが判明した。簡単に言うと、自己のＤＣを突然変異ペプチド（ＭＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡＶＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩ）（配列番号２６）でパルスし、患者の末梢血から選別したＣＤ８  Ｔ細胞と１０日間共培養した。
【０１２２】
次に、Ｔ細胞の反応性を、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ突然変異（ＭＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡＶＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩ）（配列番号２６）又は対応するＷＴペプチド（ＭＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡＧＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩ）（配列番号２７）を包含する２４マーペプチドでパルスした自己ＤＣに対して試験した。ペプチドをＤＭＳＯに再懸濁する。ＤＭＳＯでパルスしたＤＣと培養したＴ細胞をネガティブコントロールとして用いた。Ｔ細胞の反応性は、ＣＤ１３７発現とＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定したＩＦＮ−γ産生に基づいて測定した。次いで、反応性Ｔ細胞をＣＤ１３７発現に基づいて選別し、選別したＴ細胞の数を増幅し、選別し増幅した数の細胞を、本実施例に記載の通り再度試験した。結果を図１Ａ及び１Ｂに示す。図１Ａ及び１Ｂに示す通り、Ｔ細胞は、ＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶペプチドでパルスしたＤＣとの共培養後にのみ、ＣＤ１３７発現を上方制御し（図１Ａ）、ＩＦＮ−γ産生を増大させた（図１Ｂ）。
【０１２３】
患者はＨＬＡ−Ａ＊１１：０１陽性であったので、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ  ９マー及び１０マーペプチドは、高親和性でこの対立遺伝子に結合すると予測された。従って、四量体染色技術を利用して、Ｔ細胞がＨＬＡ−Ａ＊１１：０１に関連してＫＲＡＳＧ１２Ｖに対して反応性であるかどうかを試験した。ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ  ２４マーペプチドによるＩＶＳを経た末梢血ＣＤ８＋Ｔ細胞を、四量体（９マー  ＶＶＧＡＶＧＶＧＫ（配列番号２９）又は１０マー  ＶＶＶＧＡＶＧＶＧＫ（配列番号３０））で染色した。ＰＥとＡＰＣはどちらも蛍光色素分子である。四量体を、これらの蛍光色素分子の一方又は他方にコンジュゲート化した。両方の四量体で細胞を染色すると、特異性の信頼度が増大する。結果を図２に示す（右のプロット）。ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１に関連してＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ  １０マーを認識するＴＣＲを発現するように改変したＴ細胞を、ネガティブコントロールとして用いた。ネガティブコントロールについての結果を図２に示す（左のプロット）。図２に示す通り、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ  ２４マーペプチドによるＩＶＳを経たＣＤ８  Ｔ細胞は、ＫＲＡＳＧ１２Ｖ−ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１四量体で染色されたが、ネガティブコントロールＴ細胞はされなかった。
【０１２４】
単一細胞配列決定法を用いて、四量体で選別した細胞を配列決定すると、１のベータ鎖及び１のアルファ鎖が明らかになった（表６）。ＴＣＲアルファ鎖及びベータ鎖可変領域のヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号３１及び３２であった。
【０１２５】
【表６】
2021505136.tif 000009
【０１２６】
実施例２
本実施例は、システイン置換、ＬＶＬ改変マウス定常領域を含む実施例１のＴＣＲをコードする発現カセットの調製及びレトロウイルスベクターへの発現カセットのクローニングを実例で示す。
【０１２７】
実施例１のＴＣＲを、ＭＳＧＶ１レトロウイルスベクターにクローニングした。実施例１の単離したＧ１２Ｖ反応性ＴＣＲをコードし（配列番号３１及び配列番号３２のヌクレオチド配列を含む）、システイン置換、ＬＶＬ改変マウス定常領域を含む核酸配列をレトロウイルスベクターにクローニングした。α鎖マウス定常領域は、配列番号１７のアミノ酸配列であって、４８位のＸがＣｙｓであり、１１２位のＸがＬｅｕであり、１１４位のＸがＩｌｅであり、１１５位のＸがＶａｌであるアミノ酸配列で構成された。β鎖定常領域は、配列番号１８のアミノ酸配列であって、５７位のＸがＣｙｓであるアミノ酸配列で構成された。配列番号２５のアミノ酸配列を含むＰ２Ａリンカー（Ｗａｒｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，５８（３）：３８３−９４（２００９））を、α鎖定常領域とβ鎖可変領域の間に配置した。レトロウイルスベクターには、５’末端から３’末端にかけて、ＴＣＲβ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列、続いて改変β鎖マウス定常領域、続いてＰ２Ａリンカー配列、続いてＴＣＲα鎖可変領域、続いて改変α鎖マウス定常領域が含まれた。
【０１２８】
実施例３
本実施例は、実施例２のＴＣＲで形質導入した末梢血同種異系Ｔ細胞が、Ｇ１２Ｖ突然変異を含むヒトＫＲＡＳであって、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１分子によって提示される突然変異ＫＲＡＳを特異的に認識することを実証する。
【０１２９】
実施例２のＴＣＲをコードするレトロウイルスを作製し、２人のドナーからの末梢血同種異系Ｔ細胞を形質導入するために使用した（Ｔｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３７５：２２５５−２２６２（２０１６）に記載の通りの方法））。細胞の表面でのＴＣＲの発現をフローサイトメトリーによって測定した。結果を図３に示す。図３に示す通り、マウスＴＣＲベータ鎖定常領域（ｍＴＣＲベータ）の発現が細胞の表面で検出された。
【０１３０】
実施例２のＴＣＲで形質導入した同種異系細胞を、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｃ、又はＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖを発現する標的がん細胞株に対する反応性について試験した。図４に示す通り、標的がん細胞株はＨＬＡ−Ａ１１発現について陽性又は陰性であった。反応性はＩＦＮ−γ産生（ＥＬＩＳＰＯＴ）及びＣＤ１３７上方制御（フローサイトメトリー）により測定した。結果を図４に示す。図４に示す通り、形質導入した細胞は、ＫＲＡＳＧ１２Ｖ及びＨＬＡ−Ａ＊１１：０１を発現するがん細胞株に対して特異的な反応性があることが判明した。
【０１３１】
実施例４
本実施例は、実施例２のＴＣＲがＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ  ９マーペプチド
【０１３２】
【化２】
2021505136.tif 000010
【０１３３】
（配列番号２９）及びＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ  １０マーペプチド（ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ  １０マー  ｐｅｐｔｉｄｅ  ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ  １０マー  ｐｅｐｔｉｄｅ）
【０１３４】
【化３】
2021505136.tif 000011
【０１３５】
（配列番号３０）のそれぞれを特異的に認識することを実証する。
【０１３６】
実施例３に記載の通り、同種異系Ｔ細胞を実施例２のＴＣＲで形質導入した。ＣＯＳ７／Ａ１１標的細胞を、様々な濃度のＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ  ９マーペプチド
【０１３７】
【化４】
2021505136.tif 000012
【０１３８】
（配列番号２９）、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ  １０マーペプチド
【０１３９】
【化５】
2021505136.tif 000013
【０１４０】
（配列番号３０）、ＫＲＡＳ  ＷＴ  ９マーペプチド
【０１４１】
【化６】
2021505136.tif 000014
【０１４２】
（配列番号３３）、又はＫＲＡＳ  ＷＴ  １０マーペプチド
【０１４３】
【化７】
2021505136.tif 000015
【０１４４】
（配列番号３４）でパルスした。形質導入したＴ細胞を、パルスした標的細胞と共培養した。ＩＦＮ−γ分泌を測定した。結果を図５Ａ（９マー）及び図５Ｂ（１０マー）に示す。図５Ａ〜５Ｂに示す通り、ＴＣＲは、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ  ９マーペプチド及びＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ  １０マーペプチドのそれぞれを特異的に認識した。
【０１４５】
刊行物、特許出願及び特許を含む、本明細書に引用したすべての参考文献は、それぞれの参考文献が参照によって組込まれることが個々に且つ具体的に示されているのと同程度及びその全体が本明細書に記載されているのと同程度まで、参照によって本明細書に組込まれる。
【０１４６】
本発明の説明に関して（特に、以下の特許請求の範囲に関して）、用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び「少なくとも１」並びに同様の指示対象の使用は、本明細書に特記しないか文脈と明らかに矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方をカバーすると解釈すべきである。１以上の事項の列挙の後での用語「少なくとも１」の使用（例えば、「Ａ及びＢのうち少なくとも１」）は、本明細書に特記しないか又は文脈と明らかに矛盾しない限り、列挙した事項から選択された１の事項（Ａ若しくはＢ）又は列挙した事項のうち２以上の任意の組合せ（Ａ及びＢ）を意味すると解釈すべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特記しない限り、オープンエンドの用語（即ち、「〜を含むがそれらに限定されない」を意味する）と解釈すべきである。本明細書の値の範囲の記述は、本明細書に特記しない限り、その範囲内に入る各個別の値に個々に言及する省略方法として働くことのみを意図しており、各個別の値は、それが本明細書に個々に記述されているかのように本明細書に組込まれる。本明細書に記載のすべての方法は、本明細書に特記しないか又は文脈と特に明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施できる。本明細書に提供される任意の及びすべての例又は例示的語句（例、「等（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）の使用は、本発明をよりよく説明することのみを意図しており、特段特許請求されない限り、本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書のすべての語句は、特許請求されていない任意の要素を本発明の実施に必須のものとして示していると解釈すべきではない。
【０１４７】
発明を実施するための、発明者が知る最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載される。これらの好ましい実施形態のバリエーションは、上述の説明を読めば当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者がかかるバリエーションを適宜使用することを予期しており、本発明者らは、本明細書に具体的に記載されたのとは異なる方法で本発明が実施されることを意図している。従って、本発明は、適用法によって許容されるとおり、本明細書に添付した特許請求の範囲に記載の主題のすべての改変及び均等物を含む。更に、そのすべての可能なバリエーションでの上記要素の任意の組合せが、本明細書に特記しないか又は文脈と特に明らかに矛盾しない限り、本発明によって包含される。
【図１Ａ】
2021505136.tif 000016
【図１Ｂ】
2021505136.tif 000017
【図２】
2021505136.tif 000018
【図３】
2021505136.tif 000019
【図４】
2021505136.tif 000020
【図５】
2021505136.tif 000021
【配列表】
2021505136000001.app
【国際調査報告】
2021505136.tif 000022
2021505136.tif 000023
2021505136.tif 000024