(57)【要約】  本発明は、式Ｉの構造を有する化合物又はその薬学的に許容可能な塩に関し、式中、Ｒ１は、水素、フッ素、塩素から選択され、Ｒ２及びＲ３は、独立して水素、アルキル基、置換アルキル基、アルケニル基若しくは置換アルケニル基、アルキニル基若しくは置換アルキニル基、アリール基から選択され、或いは、Ｒ２及びＲ３は連結して環を形成し、前記環は、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、芳香族複素環又は非芳香族複素環であってよく、Ｒ４は、水素、シアノ基、アルキル基、置換アルキル基、アルケニル基若しくは置換アルケニル基、アルキニル基若しくは置換アルキニル基、アリール基から選択され、Ｒ５は、水素、ハロゲン、ハロアルキル基から選択される。本発明は、さらに、該化合物を含有する医薬組成物に関する。本発明に係る化合物及び組成物は、前立腺癌の治療に対して顕著な活性を示す。  ［式Ｉ］2021529204.tif 000038【選択図】なし
2021529204.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの構造を有する医薬化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
［式Ｉ］
2021529204.tif 000035
（式中、Ｒ１は、水素、フッ素、塩素から選択され、Ｒ２及びＲ３は、独立して水素、アルキル基、置換アルキル基、アルケニル基若しくは置換アルケニル基、アルキニル基若しくは置換アルキニル基、アリール基から選択され、或いは、Ｒ２及びＲ３は連結して環を形成し、前記環は、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、芳香族複素環又は非芳香族複素環であり、Ｒ４は、水素、シアノ基、アルキル基、置換アルキル基、アルケニル基若しくは置換アルケニル基、アルキニル基若しくは置換アルキニル基、アリール基から選択され、Ｒ５は、水素、ハロゲン、ハロアルキル基から選択される。）
【請求項２】
Ｒ１は水素又はフッ素である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ２及びＲ３は、独立してＣ１−Ｃ３アルキル基であるか又は連結してＣ３−Ｃ６シクロアルキル基を形成する、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ４はシアノ基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ５はトリハロメタン基であり、好ましくはトリフルオロメチル基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
治療有効量の請求項１の化合物又はその薬学的に許容可能な塩、及び薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項７】
治療有効量の請求項１の化合物又はその薬学的に許容可能な塩、及び薬学的に許容可能な希釈剤を含む、医薬組成物。
【請求項８】
治療有効量の請求項１の化合物又はその薬学的に許容可能な塩、及び薬学的に許容可能な補助剤を含む、医薬組成物。
【請求項９】
前記化合物は、下記化合物又はその薬学的に許容可能な塩である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
2021529204.tif 000036
【請求項１０】
前記化合物は、下記化合物又はその薬学的に許容可能な塩である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
2021529204.tif 000037
【請求項１１】
静脈内注射、組織内注射、腹腔内注射、経口又は経鼻により投与される、請求項６〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１の化合物又はその薬学的に許容可能な塩の、前立腺癌を治療するための医薬組成物の製造における用途。
【請求項１３】
前記前立腺癌は、ホルモン感受性前立腺癌又はホルモン抵抗性前立腺癌である、請求項１２に記載の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンドロゲン受容体の新しい拮抗薬化合物、アンドロゲン受容体に関連する疾患、例えば前立腺癌を治療するときにこのような化合物を使用する方法、及びこれらの化合物を含有する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
アンドロゲン受容体（ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＡＲ）は、リガンド依存性の転写調節タンパク質であり、核内受容体スーパーファミリーのメンバーである。アンドロゲン受容体は、アンドロゲン、例えばテストステロン又はより有効なジヒドロテストステロン（ＤＴＨ）と結合して、立体構造の変化をもたらし、アンドロゲン受容体の活性化を引き起こす。活性化したアンドロゲン受容体は、二量体として標的細胞核中の特定のＤＮＡ配列−アンドロゲン応答エレメント（ＡＲＥ）と結合して、標的遺伝子の発現を調節し、細胞の増殖、生存及び分化には対応する生物学的効果を生じる。アンドロゲン受容体は、多くの男性ホルモンに関連する疾患、例えば前立腺癌などで重要な役割を果たす。前立腺癌はアンドロゲンに対して高い感受性を示し、前立腺癌細胞はアンドロゲン受容体の高発現によって特徴付けられる。
【０００３】
前立腺癌は、男性の生殖システムの最も一般的な悪性腫瘍であり、多くの高齢男性は、最終的に軽微な症状を伴う前立腺癌を発症する。他の悪性腫瘍と比べて、前立腺癌の成長はかなりゆっくりであり、９０％の前立腺癌患者は、前立腺癌が数十年に潜伏状態を維持し、明らかな臨床症状がない。多くの他の癌と同様に、初期段階で治療を行わないで進行していくと、最終的に血液又はリンパ液を介して他の組織に運ばれる。
【０００４】
現在、アンドロゲン受容体拮抗薬（ＡＲ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）は、前立腺癌を治療する主な化学的薬物であり、臨床的使用が承認されているアンドロゲン受容体拮抗薬（ＡＲ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ、例えばビカルタミド、エンザルタミド、アパルタミド）は、臨床的治療応用において前立腺癌の進行を遅らせることができ、テストステロン又はジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）とアンドロゲン受容体との結合を直接阻止してアンドロゲンを阻害する生理作用である。しかし、上記いくつかの薬物は、前立腺癌細胞を直接死滅させる能力が高くなく、細胞生物学的実験では、そのＩＣ５０が１０ｕＭ以上である。
【０００５】
したがって、本分野では、ホルモン抵抗性前立腺癌を治療し、ホルモン感受性前立腺癌の進行を予防又は遅延するために、アンドロゲン受容体を高発現可能な前立腺癌細胞に対して選択的死滅能力を有する化合物を探し続ける必要がある。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、核ホルモン受容体、特にアンドロゲン受容体の機能を調節する化合物を提供する。これらの化合物は、前立腺癌細胞及び腫瘍を消失させることができる。
【０００７】
本発明に係る化合物は、式Ｉの構造を有する。
［式Ｉ］
2021529204.tif 000003
式中、Ｒ１は、水素、フッ素、塩素から選択され、Ｒ２及びＲ３は、独立して水素、アルキル基、置換アルキル基、アルケニル基若しくは置換アルケニル基、アルキニル基若しくは置換アルキニル基、アリール基から選択され、或いは、Ｒ２及びＲ３は連結して環を形成し、前記環は、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、芳香族複素環又は非芳香族複素環であり、Ｒ４は、水素、シアノ基、アルキル基、置換アルキル基、アルケニル基若しくは置換アルケニル基、アルキニル基若しくは置換アルキニル基、アリール基から選択され、Ｒ５は、水素、ハロゲン、ハロアルキル基から選択される。
【０００８】
１つの具体的な実施形態において、Ｒ１は水素又はフッ素である。
【０００９】
１つの具体的な実施形態において、Ｒ２及びＲ３は、独立してＣ１−Ｃ３アルキル基であるか又は連結してＣ３−Ｃ６シクロアルキル基を形成する。
【００１０】
１つの具体的な実施形態において、Ｒ４はシアノ基である。
【００１１】
１つの具体的な実施形態において、Ｒ５はトリハロメタン基であり、好ましくはトリフルオロメチル基である。
【００１２】
本発明の合成実施例において、下記化合物を合成した：
４−（３−（４−シアノ−３−（トリフルオロメチル）フェニル）−５，５−ジメチル−４−オキソ−２−チオキソイミダゾリジン−１−イル）−２−フルオロ−Ｎ−ヒドロキシベンズアミド
2021529204.tif 000004
４−（３−（６−シアノ−５−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル）−５，５−ジメチル−４−オキソ−２−チオキソイミダゾリジン−１−イル）−２−フルオロ−Ｎ−ヒドロキシベンズアミド
2021529204.tif 000005
４−（３−（３−クロロ−４−シアノフェニル）−５，５−ジメチル−４−オキソ−２−チオキソイミダゾリジン−１−イル）−２−フルオロ−Ｎ−ヒドロキシベンズアミド
2021529204.tif 000006
４−（７−（４−シアノ−３−（トリフルオロメチル）フェニル）−８−オキソ−６−チオ−５，７−ジアザスピロ［３．４］オクタン−５−イル）−２−フルオロ−Ｎ−ヒドロキシベンズアミド
2021529204.tif 000007
４−（７−（６−シアノ−５−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル）−８−オキソ−６−チオ−５，７−ジアザスピロ［３．４］オクタン−５−イル）−２−フルオロ−Ｎ−ヒドロキシベンズアミド
2021529204.tif 000008
【００１３】
実施形態において、医薬組成物は、治療有効量の式Ｉの化合物又はその薬学的に許容可能な塩と、薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は補助剤とを含む。
【００１４】
医薬組成物は、ジメチルスルホキシド、カルボキシメチルセルロース、ポリソルベート及び水の溶液を含んでよい。医薬組成物は、ジメチルスルホキシド、カルボキシメチルセルロース、ポリソルベート及び水を含んでよい。
【００１５】
方法の実施形態は、過剰増殖性障害、例えばホルモン感受性前立腺癌又はホルモン抵抗性前立腺癌を予防又は治療する方法を含み、該方法は、それを必要とする患者に式Ｉの化合物又はその薬学的に許容可能な塩を投与することにより、過剰増殖性障害を予防又は治療することを含んでよい。化合物は、静脈内注射、組織内注射、腹腔内注射、経口により投与することができる。
【００１６】
実施形態において、式Ｉの化合物は、アンドロゲン受容体（ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＡＲ）に対して高い親和性を有し、ＡＲ経路の下流タンパク質の発現を阻害することができる。式Ｉの化合物は、顕著なヒストンデアセチラーゼ阻害活性を有する。アンドロゲン受容体を高発現可能な腫瘍細胞の増殖に対して顕著な阻害作用を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】薬物とＡＲ−ＬＢＤが結合したＩＣ５０の結果を示す図である。
【図２】薬物のルシフェラーゼレポーター遺伝子の実験結果のグラフである。
【図３】薬物による、ＶＣａＰ細胞におけるＡＲ活性化下流タンパク質の発現結果である。
【図４】薬物によるｔｕｂｕｌｉｎタンパク質のアセチル化の影響である。
【図５】薬物によるヒストンＨ３のアセチル化の影響である。
【図６】薬物によるＶＣａＰ細胞増殖阻害作用である。
【図７】４日間処理後のＺｅｔａ  ５５による３種類の細胞の増殖阻害の選択性である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明に係る化合物は、式Ｉの構造を有する。
［式Ｉ］
2021529204.tif 000009
式中、Ｒ１は、水素、フッ素、塩素から選択され、Ｒ２及びＲ３は、独立して水素、アルキル基、置換アルキル基、アルケニル基若しくは置換アルケニル基、アルキニル基若しくは置換アルキニル基、アリール基から選択され、或いは、Ｒ２及びＲ３は連結して環を形成し、前記環は、シクロアルキル基、置換シクロアルキル基、芳香族複素環又は非芳香族複素環であり、Ｒ４は、水素、シアノ基、アルキル基、置換アルキル基、アルケニル基若しくは置換アルケニル基、アルキニル基若しくは置換アルキニル基、アリール基から選択され、Ｒ５は、水素、ハロゲン、ハロアルキル基から選択される。
【００１９】
本明細書で使用される用語「アルキル基」とは、分岐状又は直鎖状の炭化水素鎖、好ましくは、約１〜５個の炭素を有するもの、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、２−メチルペンチル基、ペンチル基などを意味する。「置換アルキル基」とは、１つ以上の基、例えばヒドロキシ基、臭素、フッ素、塩素、ヨウ素、メルカプト基又はチオ、シアノ基、アルキルチオ、複素環基、アリール基、ヘテロアリール基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基（ｃａｒｂａｌｋｏｙｌ）、アルキル基、アルケニル基、ニトロ基、アミノ基、アルコキシ基、アシルアミノ基などで任意に置換されて、トリフルオロメチル基、３−ヒドロキシヘキシル基、２−カルボキシプロピル基、２−フルオロエチル基、カルボキシメチル基、シアノブチル基などを形成するアルキル基を意味する。
【００２０】
特に断りのない限り、本明細書で単独で又は別の基の一部分として使用される用語「シクロアルキル基」は、１〜２個の環を含む飽和又は部分不飽和（１つ以上の二重結合を含む）の環式炭化水素基を含み、好ましくは、３〜１０個の炭素を有するもの、例えばシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、シクロデシル基などを含む。「置換シクロアルキル基」は、ハロゲン、アルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシ基、アリール基、アリールオキシ基、アリールアルキル基、シクロアルキル基、アルキルアシルアミノ基、アルカノイルアミノ基、オキソ、アシル基、アリールカルボニルアミノ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、チオール及び／又はアルキルチオなどの１つ以上の置換基、及び／又は「置換アルキル基」の定義に含まれる任意の置換基で任意に置換されたシクロアルキル基を含む。
【００２１】
特に断りのない限り、本明細書で単独で又は別の基の一部分として使用される用語「アルケニル基」とは、主鎖（ｎｏｒｍａｌ  ｃｈａｉｎ）に２〜１０個の炭素、好ましくは２〜８個の炭素、より好ましくは２〜５個の炭素を有し、かつ主鎖に１つ以上の二重結合を有する直鎖状又は分岐状の基、例えばビニル基、２−プロペニル基、３−ブテニル基、２−ブテニル基、４−ペンテニル基、３−ペンテニル基、２−ヘキセニル基、３−ヘキセニル基、２−ヘプテニル基、３−ヘプテニル基、４−ヘプテニル基、３−オクテニル基、３−ノネニル基、４−デセニル基を意味する。「置換アルケニル基」は、１つ以上の置換基、例えば以上の「置換アルキル基」及び「置換シクロアルキル基」の定義に含まれる置換基で任意に置換されたアルケニル基を含む。
【００２２】
特に断りのない限り、本明細書で単独で又は別の基の一部分として使用される用語「アルキニル基」とは、主鎖に２〜８個の炭素を有し、かつ主鎖に１つ以上の三重結合を有する直鎖状又は分岐状の基、例えば２−プロピニル基、３−ブチニル基、２−ブチニル基、４−ペンチニル基、３−ペンチニル基、２−ヘキシニル基、３−ヘキシニル基、２−ヘプチニル基、３−ヘプチニル基、４−ヘプチニル基、３−オクチニル基を意味する。「置換アルキニル基」は、１つ以上の置換基、例えば以上の「置換アルキル基」及び「置換シクロアルキル基」の定義に含まれる置換基で任意に置換されたアルキニル基を含む。
【００２３】
特に断りのない限り、本明細書で単独で又は別の基の一部分として使用される用語「アリール基」又は「Ａｒ」とは、環部分に６〜１０個の炭素を含む単環又は多環芳香族基（例えばフェニル基、又は１−ナフチル基及び２−ナフチル基を含むナフチル基）であり、炭素環又は複素環（例えばアリール基、シクロアルキル基、ヘテロアリール基又はシクロヘテロアルキル環）に縮合した１〜３個の追加の環を任意に含む。
【００２４】
「置換アリール基」は、１つ以上の官能基、例えばハロゲノ、アルキル基、ハロアルキル基、アルコキシ基、ハロアルコキシ基、アルケニル基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルキルアルキル基、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、アミノ基（アミノ基は１つ又は２つのアルキル置換アミノ基を含む）で任意に置換された上記アリール基を含む。
【００２５】
特に断りのない限り、本明細書で使用される用語「複素環式」又は「複素環」とは、飽和でも不飽和でもよく、炭素原子及びＮ、Ｏ又はＳから選択される１〜４個のヘテロ原子からなり、窒素及び硫黄へテロ原子が任意に酸化されてもよく、窒素ヘテロ原子が任意に四級化されてもよい非置換又は置換の安定な５〜１０員の単環式環系を意味する。このような複素環基の例としては、ピペリジニル基、ピペラジニル基、オキソピペラジニル基、ピロリル基、ピロリジニル基、フリル基、チエニル基、ピラゾリル基、ピラゾリジニル基、イミダゾリル基などを含む。
【００２６】
式Ｉの化合物は、薬学的に許容可能な塩として存在することができ、これも本発明の範囲内である。式Ｉの化合物は、例えば、少なくとも１つの塩基性中心を有する場合、酸付加塩を形成することができる。これらは、例えば、無機強酸、有機強カルボン酸又は有機スルホン酸で形成され、該無機強酸は、例えば、鉱酸（例えば、硫酸、リン酸又はハロゲン化水素酸）であり、該有機強カルボン酸は、例えば、１〜４個の炭素原子を有する非置換又は置換の（例えば、ハロゲンにより置換された）アルカンカルボン酸（例えば、酢酸）、飽和又は不飽和のジカルボン酸（例えば、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸又はテレフタル酸）、ヒドロキシカルボン酸（例えば、アスコルビン酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸又はクエン酸）、アミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン又はアルギニン）、又は安息香酸であり、該有機スルホン酸は、例えば、非置換又は置換の（例えば、ハロゲンにより置換された）（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基又はアリールスルホン酸（例えば、メチル基又はｐ−トルエン−スルホン酸）である。所望ならば、対応する酸付加塩を形成するために、さらに１つの塩基性中心を生成することもできる。
【００２７】
本発明に係る化合物は、医薬組成物として使用することができ、治療有効量の本明細書で定義される本発明に係る化合物、及び薬学的に許容可能な担体又は希釈剤を含む。
【００２８】
本発明に係る医薬組成物の形態は、様々な投与経路、例えば、経口投与、鼻内投与、腹腔内投与、又は静脈内、筋肉内、局所若しくは皮下経路、又は組織内への注射による非経口投与で治療を必要とする患者、例えば人などの哺乳動物に投与するのに適するように調節することができる。このような組成物及び製剤は、少なくとも０．０１％の１種以上の本発明に係る化合物を含有する必要がある。組成物及び製剤の百分率は、当然のことながら変化してもよく、例えば所定の単位剤形の重量の約０．０５％〜約２％であってもよい。このような治療に有用な組成物における化合物の量は、有効な用量レベルが得られるようなものとする。
【００２９】
本発明に係る化合物は、例えば、不活性希釈剤又は同化できる食用担体などの薬学的に許容可能な担体と組み合わせて経口的に、又は吸入若しくはガス注入により全身に投与することができる。それらは、ハード又はソフトシェルゼラチンカプセルに封入されてもよく、錠剤に圧縮されてもよく、患者の食事の食物に直接混入されてもよい。経口治療投与に関して、本発明に係る化合物は、１種以上の賦形剤と組み合わせて、摂取可能な錠剤、バッカル錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハー（ｗａｆｅｒ）などの形態で使用することができる。該化合物は、不活性微粉末担体と組み合わせて、患者により吸入されてもよく、ガス注入されてもよい。このような組成物及び製剤は、少なくとも０．１％の１種以上の本発明に係る化合物を含有する必要がある。
【００３０】
錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などには、トラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチ又はゼラチンなどの結合剤、リン酸二カルシウムなどの賦形剤、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、ショ糖、フルクトース、乳糖又はアスパルテームなどの甘味剤が含有されてもよく、ペパーミント、冬緑油、チェリー調味料などの芳香剤を添加してもよい。単位剤形がカプセル剤である場合、以上のタイプの材料に加えて、液体担体、例えば植物油又はポリエチレングリコールが含有されてもよい。様々な他の材料は、コーティング剤として存在してもよく、他の方法で固形単位剤形の物理的形態（ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｆｏｒｍ）を改変してもよい。例えば、錠剤、丸剤、又はカプセル剤は、ゼラチン、ワックス、セラック、糖などでコーティングすることができる。シロップ剤又はエリキシル剤は、活性化合物、甘味剤としてのショ糖又はフルクトース、防腐剤としてのパラオキシ安息香酸メチル及びパラオキシ安息香酸プロピル、染料、及びサクラ又はオレンジなどの調味料を含有することができる。もちろん、任意の単位剤形を調製するためのいずれの材料は、薬学的に許容可能であり、使用される量で実質的に非毒性である必要がある。また、本発明に係る化合物は、徐放性製剤及びデバイスに組み込むことができる。例えば、化合物は、限時放出（ｔｉｍｅ  ｒｅｌｅａｓｅ）カプセル剤、限時放出錠剤及び限時放出丸剤に組み込むことができる。
【００３１】
本発明に係る化合物は、注入又は注射により静脈内又は腹膜内に投与することもできる。化合物の溶液は、水中で調製することができ、非毒性界面活性剤と任意に混合することができる。注射又は注入に適する薬物剤形は、無菌の水溶液若しくは分散液、又は無菌粉末を含んでよい。液体担体は、例えば、水、エタノール、多価アルコール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、植物油、非毒性グリセリルエステル、及びこれらの適切な混合物を含む溶媒又は液体媒体であってよい。
【００３２】
局所投与に関して、本発明に係る化合物は、純粋形態で使用することができる。しかし、一般的には、これらを、組成物又は製剤として、固体であっても液体であってもよい皮膚薬として許容可能な担体と組み合わせて皮膚に投与することが望ましい。
【００３３】
有用な固体担体は、微粉化した固体、例えばタルク、粘土、微結晶セルロース、シリカ、アルミナなどを含む。他の固体担体は、非毒性ポリマーナノ粒子又は微粒子を含む。有用な液体担体は、水、アルコール、グリコール、又は水／アルコール／グリコールの混合物を含み、本発明に係る化合物は、非毒性界面活性剤を任意に用いて有効なレベルで溶解又は分散することができる。補助剤、例えば香料及び他の抗微生物剤を添加して所定の用途に応じて性能を最適化することができる。得られた液体組成物を、吸収性パッドにより適用するか、絆創膏及び他の包帯を含浸させるために使用するか、又はポンプタイプ若しくはエアゾール噴霧器を用いて患部にスプレーすることができる。
【００３４】
増粘剤、例えば合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩及びエステル、脂肪アルコール、変性セルロース、又は変性鉱物材料も液体担体と共に用いて、使用者の皮膚に直接適用するための塗布可能なペースト、ゲル、軟膏、石鹸などを形成することができる。
【００３５】
液体組成物、例えばローション中の化合物濃度は、約０．１〜約２５重量％であってもよく、約０．５〜１０重量％であってもよい。半固体又は固体組成物、例えばゲル又は粉末中の濃度は、約０．１〜約５重量％であってもよく、約０．５〜約２．５重量％であってもよい。
【００３６】
治療使用に必要な本発明に係る化合物の量は、選択された個々の塩によってのみならず、投与経路、治療中の病態の性質、並びに患者の年齢及び病態によって異なり、最終的に担当医又は臨床医の判断により決定される。
【００３７】
本発明に係る試薬の有効投与量及び投与経路は標準的である。試薬の正確な量（有効量）は、患者によって異なり、例えば、患者の種類、年齢、体重、一般的又は臨床状態、治療中のいずれの病態の重篤性又はメカニズム、使用される特定の試薬又は担体、投与方法及び進捗などに依存する。治療有効量は、当業者に知られている従来法によって経験的に決定することができる。
【００３８】
一般的には、適切な用量は、受容者の体重に対して、１日あたり約０．０１〜約５００ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．１〜約５００ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．１〜約１００ｍｇ／ｋｇであってよい。例えば、適切な用量は、１日あたり約１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ又は５０ｍｇ／ｋｇ体重であってよい。
【００３９】
本発明に係る化合物は、好適には単位剤形で投与することができ、例えば、単位剤形あたり、約０．０００５〜約５００ｍｇ、約０．０１〜約５０ｍｇ、約０．０５〜約１０ｍｇ、又は約５ｍｇの活性成分を含む。
【００４０】
本発明に係る化合物を投与することにより、例えば、約０．５〜約７５μＭ、約１〜５０μＭ、約２〜約３０μＭ、又は約５〜約２５μＭの血漿濃度ピークを実現することができる。例示的な望ましい血漿濃度は、少なくとも０．２５、０．５、１、５、１０、２５、５０、７５、１００又は２００μＭ、又はそれ以下を含む。これは、例えば、本発明に係る化合物の０．０５〜５％溶液を（任意に塩水中に）静脈注射するか、又は約１〜１０００ｍｇの該化合物を含有する丸薬として経口投与することにより実現することができる。望ましい血液レベルは、連続的注入により約０．０００５〜約２５ｍｇ／ｋｇ体重／ｈで提供することができ、例えば、少なくとも０．０００５、０．００５、０．０５、０．５、５又は２５ｍｇ／ｋｇ／ｈ、又はそれ以下で保持することができる。或いは、このようなレベルは、約０．００２〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、少なくとも０．００２、０．０２、０．２、２、２０、５０又は１００ｍｇの化合物／ｋｇ体重、又はそれ以下で断続的注入により得られる。
【００４１】
本発明に係る化合物は、好適には単一用量で供給するか、又は適切な間隔、例えば１日あたり２回、３回、４回又はそれ以上の副用量（ｓｕｂ−ｄｏｓｅ）として供給することができる。副用量自体を、例えば、注入器からの複数回吸入などの、多くの離散的で大雑把な間隔での投与にさらに分けることができる。
【００４２】
（合成実施例１）
４−（３−（４−シアノ−３−（トリフルオロメチル）フェニル）−５，５−ジメチル−４−オキソ−２−チオキソイミダゾリジン−１−イル）−２−フルオロ−Ｎ−ヒドロキシベンズアミド（化合物Ｚｅｔａ  ３２）の合成
2021529204.tif 000010
【００４３】
（１）４−（２−カルボキシプロピル−２−イル）アミノ）−２−フルオロ安息香酸１５の合成
2021529204.tif 000011
１５０ｍＬの二口フラスコに化合物２−フルオロ−４−ブロモ安息香酸（４．００ｇ、１８ｍｍｏｌ）、２−メチル−２−アミノプロピオン酸（２．７８ｇ、２７ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（６．６７ｇ、４８ｍｍｏｌ）、ＣｕＩ（０．４５ｇ、２．４ｍｍｏｌ）、アセチルアセトン（１．４４ｇ、１４．４ｍｍｏｌ）、３０ｍＬのＤＭＦ、２ｍＬの水及び３滴のトリエチルアミンを順に添加し、窒素保護装置で、１４０℃で２４ｈ反応させ、ＴＬＣで反応（酢酸エチル：石油エーテル＝１：１）を監視し、反応終了後、２０ｍＬの水を添加し、濃塩酸を添加してＰｈを４に調節し、酢酸エチル（３０×３ｍＬ）で抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧して溶媒を取り除き、残渣に２０ｍＬのイソプロパノールを添加して加熱溶解し、冷却しながら結晶化し、ろ過して化合物１５（３．４７ｇ、褐色固体、収率８０．１％）を得た。
【００４４】
（２）２−フルオロ−４−（（１−メトキシ−２−メチル−１−オキソプロピル−２−イル）アミノ）安息香酸メチルエステル１６の合成
2021529204.tif 000012
１５０ｍＬの二口フラスコに化合物１５（５．００ｇ、２０．７ｍｍｏｌ）及び４０ｍＬのメタノールを添加し、氷浴下で４．２ｍＬの塩化チオニル（５８ｍｍｏｌ）を滴下した後、８０℃まで昇温させて還流下で撹拌し、２時間反応させ、反応液を室温まで冷却し、２０％炭酸ナトリウム溶液を添加して溶液のｐＨを８に調節し、酢酸エチル（３０×３ｍＬ）で抽出し、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧して溶媒を取り除いて、化合物１６（４．９７ｇ、褐色固体、収率９５．６％）を得た。
【００４５】
（３）４−（３−（４−シアノ−３−（トリフルオロメチル）フェニル）−５，５−ジメチル−４−オキソ−２−チオキソイミダゾリジン−１−イル）−２−フルオロ安息香酸メチルエステル１７の合成
2021529204.tif 000013
５０ｍＬの二口フラスコに化合物１６（１．００ｇ、４．０ｍｍｏｌ）、４−イソチオシアナト−２−トリフルオロメチルベンゾニトリル（１ｇ、５７．６ｍｍｏｌ）、１ｍＬのＤＭＳＯ及び１０ｍＬの酢酸エチルを順に添加し、８５℃で１８ｈ反応させ、ＴＬＣで反応（石油エーテル：酢酸エチル＝３：１）を監視し、反応終了後、１０ｍＬの水を添加し、酢酸エチル（２０×３ｍＬ）で抽出し、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧して溶媒を取り除き、残渣に１０ｍＬのイソプロパノールを添加して加熱溶解し、冷却しながら結晶化し、ろ過して化合物１７（１．１ｇ、淡黄色固体、収率６０．１％）を得た。
【００４６】
（４）４−（３−（４−シアノ−３−（トリフルオロメチル）フェニル）−５，５−ジメチル−４−オキソ−２−チオキソイミダゾリジン−１−イル）−２−フルオロ安息香酸１９の合成
2021529204.tif 000014
１５０ｍＬの二口フラスコに化合物１７（３ｇ、６．４５ｍｍｏｌ）、２５ｍＬのメタノール及び２５ｍＬの１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液を添加し、２０℃で４ｈ撹拌し、反応終了後、２ｍｏｌ／Ｌ希塩酸を添加してｐＨを４に調節し、酢酸エチル（５０×３ｍＬ）で抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧して溶媒を取り除いて、化合物１１（淡黄色固体、２．８６ｇ、収率９８．２％）を得た。
【００４７】
（５）４−（３−（４−シアノ−３−（トリフルオロメチル）フェニル）−５，５−ジメチル−４−オキソ−２−チオキソイミダゾリジン−１−イル）−２−フルオロ−Ｎ−ヒドロキシベンズアミド２０の合成
2021529204.tif 000015
２５ｍＬの二口フラスコに化合物１９（０．５ｇ、１．１ｍｍｏｌ）、８ｍＬのＴＨＦ及びＣＤＩ（０．３５７ｇ、２．２ｍｍｏｌ）を添加し、３０℃で１０ｈ撹拌した後、塩酸ヒドロキシルアミン（０．２３０ｇ、３．３ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１０ｈ反応させ、ＴＬＣで反応（酢酸エチル：石油エーテル：メタノール＝２０：５：２）を監視し、反応終了後、８ｍＬの水を添加し、酢酸エチル（１０×３ｍＬ）で抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧して溶媒を取り除き、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、化合物Ｚｅｔａ  ３２（０．１４４ｇ、淡黄色固体、収率２８．１％）を得た。
Ｍ．Ｗ．：  ４６６．４１；  １Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δ  １１．１６  （ｓ，  １Ｈ），  ９．３４  （ｓ，  １Ｈ），  ８．４１  （ｄ，  Ｊ＝１０．０Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．３０  （ｓ，  １Ｈ），  ８．０９  （ｄ，  Ｊ＝５．０Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．７５  （ｔ，  Ｊ＝５．０Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．４３  （ｄ，  Ｊ＝５．０Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．３５  （ｓ，  １Ｈ），  ２．５１  （ｓ，  ６Ｈ）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （１２５  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δ  １８０．５５，  １７５．１８，  １６０．９８，  １６０．４０，  １５８．４１，  １３８．９４，  １３８．４０，  １３６．７４，  １３４．４２，  １３１．３１，  １２８．４８，  １２６．６７，  １２３．９６，  １１８．６１，  １１８．４２，  １１５．４７，  １０９．２１，  ６７．０８，  ２３．４２。
【００４８】
（合成実施例２）
４−（３−（６−シアノ−５−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル）−５，５−ジメチル−４−オキソ−２−チオキソイミダゾリジン−１−イル）−２−フルオロ−Ｎ−ヒドロキシベンズアミド（化合物Ｚｅｔａ  ３３）の合成
2021529204.tif 000016
【００４９】
（１）４−（３−（６−シアノ−５−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル）−５，５−ジメチル−４−オキソ−２−チオキソイミダゾリジン−１−イル）−２−フルオロ安息香酸メチルエステル２５の合成
2021529204.tif 000017
２５ｍＬの二口フラスコに化合物２１（０．６０ｇ、２．５ｍｍｏｌ）、３−クロロ−４−シアノアニリン（０．５６１ｇ、３ｍｍｏｌ）、８ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド及びチオホスゲン（０．３５ｍｌ、３．８ｍｍｏｌ）を添加し、７０℃まで昇温させて２４ｈ反応させ、室温まで冷却した後、４ｍＬのメタノール、１ｍＬの濃塩酸及び２ｍＬの水を添加し、２ｈ還流下で撹拌し、室温まで冷却した後、酢酸エチル（２０×３ｍＬ）で抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧して溶媒を取り除き、残渣をカラムクロマトグラフィーで精製して、化合物２５（０．３５５ｇ、黄色固体、収率３０．５％）を得た。
【００５０】
（２）４−（３−（６−シアノ−５−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル）−５，５−ジメチル−４−オキソ−２−チオキソイミダゾリジン−１−イル）−２−フルオロ安息香酸２６の合成
2021529204.tif 000018
２５ｍＬの二口フラスコに化合物２５（０．２３０ｇ、０．５ｍｍｏｌ）を２ｍＬのメタノールに溶解し、この混合物に２ｍＬの１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムを添加し、２０℃で４ｈ撹拌し、反応終了後、２ｍｏｌ／Ｌ希塩酸を添加してｐＨを４に調節し、酢酸エチル（２０ｍＬ×３ｍＬ）で抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧して溶媒を取り除いて、化合物２６（０．２２０ｇ、淡黄色固体、収率９８．１％）を得た。
【００５１】
（３）４−（３−（６−シアノ−５−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル）−５，５−ジメチル−４−オキソ−２−チオキソイミダゾリジン−１−イル）−２−フルオロ−Ｎ−ヒドロキシベンズアミド２７の合成
2021529204.tif 000019
２５ｍＬの二口フラスコに化合物２６（０．２００ｇ、０．４４ｍｍｏｌ）、４ｍＬのＴＨＦ及びＣＤＩ（０．１４３ｇ、０．８８ｍｍｏｌ）を順に添加し、３０℃で１０ｈ撹拌した後、塩酸ヒドロキシルアミン（０．０９２ｇ、１．３２ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１０ｈ反応させ、ＴＬＣで反応（酢酸エチル：石油エーテル：メタノール＝２０：５：２）を監視し、反応終了後、４ｍＬの水を添加し、酢酸エチル（１０×３ｍＬ）で抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧して溶媒を取り除き、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、化合物Ａ８（０．０６４ｇ、淡黄色固体、収率３１．６％）を得た。
Ｍ．Ｗ．：  ４６７．４０；  １Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ８．９５  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．４６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．８５  （ｔ，  Ｊ  ＝  ９．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．３８  （ｔ，  Ｊ  ＝  ９．５  Ｈｚ  ２Ｈ），  １．６１  （ｓ，  １Ｈ）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （１２５  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＯＤ）：  δ  １８０．６３，  １７５．２６，  １６２．１６，  １５８．７７，  １５１．３１，  １３９．５９，  １３５．８７，  １３０．８５，  １２６．２５，  １２３．７６，  １１２．２１，  １２２．０９，  １１８．３４，  １１８．１５，  ６６．７８，  ２２．３４。
【００５２】
（合成実施例３）
４−（３−（３−クロロ−４−シアノフェニル）−５，５−ジメチル−４−オキソ−２−チオキソイミダゾリジン−１−イル）−２−フルオロ−Ｎ−ヒドロキシベンズアミド（Ｚｅｔａ  ３４）の合成
2021529204.tif 000020
【００５３】
（１）４−（（２−シアノプロピル−２−イル）アミノ）−２−フルオロ安息香酸メチルエステル２１の合成
2021529204.tif 000021
１５０ｍＬの二口フラスコに室温で２−フルオロ−４−アミノ安息香酸エステル２（４．５ｇ、２６．６ｍｍｏｌ）、アセトン（２．９９ｇ、４２．７ｍｍｏｌ）、シアン化カリウム（２．６ｇ、４０ｍｍｏｌ）及び４６ｍＬの酢酸を順に添加し、この混合液を７５℃で昇温させて２４ｈ反応させ、ＴＬＣで反応（石油エーテル：酢酸エチル＝２０：３）を監視し、反応終了後、反応液に２０ｍＬの水を添加し、酢酸エチル（４０×３ｍＬ）で抽出し、減圧して溶媒を取り除き、残渣に６ｍＬのエタノールと５ｍＬの水との混合溶媒を添加して加熱溶解し、冷却し結晶化し、ろ過して化合物２１（３．１３ｇ、黄色固体、収率５０．２％）を得た。
【００５４】
（２）４−（３−（３−クロロ−４−シアノフェニル）−５，５−ジメチル−４−オキソ−２−チオキソイミダゾリジン−１−イル）−２−フルオロ安息香酸メチルエステル２２の合成
2021529204.tif 000022
２５ｍＬの二口フラスコに化合物２１（０．５００ｇ、２．１ｍｍｏｌ）、３−クロロ−４−シアノアニリン（０．３８ｇ、２．５ｍｍｏｌ）及び８ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドを添加し、この混合液にチオホスゲン（０．２５ｍｌ、３．８９ｍｍｏｌ）を滴下し、９５℃まで昇温させて２４ｈ反応させ、室温まで冷却した後、２ｍＬのメタノール、０．５ｍＬの濃塩酸及び２ｍＬの水を添加し、２ｈ還流下で撹拌し、室温まで冷却した後、酢酸エチル（１０×３ｍＬ）で抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧して溶媒を取り除き、残渣をカラムクロマトグラフィーで精製して、化合物２２（０．２５７ｇ、黄色固体、収率２８．８％）を得た。
【００５５】
（３）４−（３−（３−クロロ−４−シアノフェニル）−５，５−ジメチル−４−オキソ−２−チオキソイミダゾリジン−１−イル）−２−フルオロ安息香酸２３の合成
2021529204.tif 000023
２５ｍＬの二口フラスコに化合物２２（０．１２０ｇ、０．２８ｍｍｏｌ）、１ｍＬのメタノール及び１ｍＬの１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液を添加し、２０℃で４ｈ撹拌し、反応終了後、２ｍｏｌ／Ｌ希塩酸を添加してｐＨを４に調節し、酢酸エチル（１０×３ｍＬ）で抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧して溶媒を取り除いて、化合物２３（０．１４０ｇ、淡黄色固体、収率９８．２％）を得た。
【００５６】
（４）４−（３−（３−クロロ−４−シアノフェニル）−５，５−ジメチル−４−オキソ−２−チオキソイミダゾリジン−１−イル）−２−フルオロ−Ｎ−ヒドロキシベンズアミド２４の合成
2021529204.tif 000024
２５ｍＬの二口フラスコに化合物２３（０．１２０ｇ、０．２９ｍｍｏｌ）、４ｍＬのＴＨＦ及びＣＤＩ（０．０９３ｇ、０．５８ｍｍｏｌ）を添加し、３０℃で１０ｈ撹拌した後、塩酸ヒドロキシルアミン（０．０６０ｇ、０．８７ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１０ｈ反応させ、ＴＬＣで反応（酢酸エチル：石油エーテル：メタノール＝２０：５：２）を監視し、反応終了後、４ｍＬの水を添加し、酢酸エチル（１０×３ｍＬ）で抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧して溶媒を取り除き、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、化合物Ａ７（０．０３８ｇ、淡黄色固体、収率３０．５％）を得た。
Ｍ．Ｗ．，  ４３２．８５；  １Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＯＤ）：  δ  ７．９７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．８２  （ｄ，  Ｊ＝９．０  Ｈｚ  １Ｈ），  ７．６７  （ｓ，  １Ｈ），  ７．６５  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  １．５Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．３７  （ｔ，  Ｊ＝１０．０Ｈｚ，  ２Ｈ），  １．６０  （ｓ，  ６Ｈ）  ；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （１２５  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＯＤ）：  δ  １８０．４６，  １７５．１０，  １６２．２４，  １６０．７６，  １３８．５３，  １３６．１４，  １３４．１２，  １３０．７７，  １３０．３９，  １２８．１３，  １２６．１６，  １２２．４７，  １１９．９４，  １１８．３０，  １１４．８７，  １１３．０２，  ６６．５７，  ２２．３２。
【００５７】
（合成実施例４）
４−（７−（４−シアノ−３−（トリフルオロメチル）フェニル）−８−オキソ−６−チオ−５，７−ジアザスピロ［３．４］オクタン−５−イル）−２−フルオロ−Ｎ−ヒドロキシベンズアミド（化合物Ｚｅｔａ  ５５）の合成
2021529204.tif 000025
【００５８】
（１）２−フルオロ−４−アミノ安息香酸メチルエステル２の合成
2021529204.tif 000026
１００ｍＬの二口フラスコに２−フルオロ−４−アミノ安息香酸１（１０．００ｇ、６４．５ｍｍｏｌ）及び３０ｍＬのメタノールを添加し、氷浴下でこの溶液に６．７ｍＬの塩化チオニル（９２．０ｍｍｏｌ）を滴下した後、還流まで昇温させ、３時間反応させ、反応液を室温まで冷却した後、２０％炭酸ナトリウム溶液を添加して溶液のｐＨを８に調節し、酢酸エチル（３０×３ｍＬ）で抽出し、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧して溶媒を取り除いて、化合物２（１０．３６ｇ、褐色固体、収率９５．５％）を得た。
【００５９】
（２）４−（（１−シアノシクロブチル）アミノ）−２−フルオロ安息香酸メチルエステル３の合成
2021529204.tif 000027
２５０ｍＬの二口フラスコに２−フルオロ−４−アミノ安息香酸メチルエステル２（３．７０ｇ、２１．８ｍｍｏｌ）、シクロブタノン（２．４４ｇ、３４．８ｍｍｏｌ）、シアン化カリウム（２．１２ｇ、３２．６ｍｍｏｌ）及び３７ｍＬの酢酸を添加し、８０℃まで昇温させて１２ｈ反応させ、ＴＬＣで反応（石油エーテル：酢酸エチル＝２０：３）を監視し、反応終了後、反応液に２０ｍＬの水を添加し、酢酸エチル（３０×３ｍＬ）で抽出し、減圧して溶媒を取り除いて、化合物３（５．０１ｇ、赤褐色固体、収率９２．５％）を得た。
【００６０】
（３）（７−（４−シアノ−３−（トリフルオロメチル）フェニル）−８−オキソ−６−チオ−５，７−ジアザスピロ［３．４］オクタン−５−イル）−２−フルオロ安息香酸メチルエステル４の合成
2021529204.tif 000028
２５ｍＬの二口フラスコに化合物３（０．４８５ｇ、１．９５ｍｍｏｌ）、３−トリフルオロメチル−４−シアノアニリン（０．４３５ｇ、２．３４ｍｍｏｌ）及び６ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドを添加し、撹拌溶解後、チオホスゲン（０．２５ｍｌ、２．９６ｍｍｏｌ）を滴下し、７０℃まで昇温させて２４ｈ反応させ、室温まで冷却した後、２ｍＬのメタノール、０．５ｍＬの濃塩酸及び２ｍＬの水を添加し、２ｈ還流下で撹拌し、室温まで冷却した後、酢酸エチル（１０×３ｍＬ）で抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧して溶媒を取り除き、残渣をカラムクロマトグラフィーで精製して、化合物５（０．２８１ｇ、黄色固体、収率３０．２％）を得た。
【００６１】
（４）（７−（４−シアノ−３−（トリフルオロメチル）フェニル）−８−オキソ−６−チオ−５，７−ジアザスピロ［３．４］オクタン−５−イル）−２−フルオロ安息香酸５の合成
2021529204.tif 000029
２５ｍＬの二口フラスコに化合物４（０．３０ｇ、０．６２ｍｍｏｌ）及び２．５ｍＬのメタノールを添加し、この混合物に２．５ｍＬの１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液を添加し、２０℃で４ｈ撹拌し、反応終了後、２ｍｏｌ／Ｌ希塩酸を添加してｐＨを４に調節し、酢酸エチル（２０×３ｍＬ）で抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧して溶媒を取り除いて、化合物５（０．２８１ｇ、淡黄色固体、収率９８．２％）を得た。
【００６２】
（５）４−（７−（４−シアノ−３−（トリフルオロメチル）フェニル）−８−オキソ−６−チオ−５，７−ジアザスピロ［３．４］オクタン−５−イル）−２−フルオロ−Ｎ−ヒドロキシベンズアミド６の合成
2021529204.tif 000030
２５ｍＬの二口フラスコに化合物５（０．１８１ｇ、０．４ｍｍｏｌ）、ＣＤＩ（０．１３０ｇ、０．８ｍｍｏｌ）及び１０ｍＬのＴＨＦを順に添加し、３０℃で１０ｈ撹拌した後、塩酸ヒドロキシルアミン（０．０８３ｇ、１．２ｍｍｏｌ）を添加して２５℃で１０ｈ反応させ、ＴＬＣで反応（酢酸エチル：石油エーテル：メタノール＝２０：５：２）を監視し、反応終了後、５ｍＬの水を添加し、酢酸エチル（１０×３ｍＬ）で抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧して溶媒を取り除き、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、化合物Ａ５（０．５７９ｇ、淡黄色固体、収率３０．３％）を得た。
Ｍ．Ｗ．，  ４７８．４２；１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＯＤ）：  δ  ８．１５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ５．０  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．９８−７．９６  （ｍ，  １Ｈ），  ７．８８  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．３９  （ｔ，  Ｊ＝５．０Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．７１−２．６６  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．５９−２．５３  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．１５−２．０９  （ｍ，  １Ｈ），１．６６−１．６０  （ｍ，  １Ｈ）  １３Ｃ  ＮＭＲ  （１２５  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＯＤ）：  δ  １８０．４８，  １７５．００，  １６２．１７，  １５８．９０，  １３９．７０，  １３７．９８，  １３５．３９，  １３３．４２，  １３２．９８，  １３１．０１，  １２７．３４，  １２６．７０，  １１８．７４，  １１８．５４，  １１４．５９，  １０９．２８，  １０８．９１，  ６７．７４，  ３１．１９。
【００６３】
（合成実施例５）
４−（７−（６−シアノ−５−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル）−８−オキソ−６−チオ−５，７−ジアザスピロ［３．４］オクタン−５−イル）−２−フルオロ−Ｎ−ヒドロキシベンズアミド（Ｚｅｔａ  ５７）
2021529204.tif 000031
【００６４】
（１）４−（７−（６−シアノ−５−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル）−８−オキソ−６−チオ−５，７−ジアザスピロ［３．４］オクタン−５−イル）−２−フルオロ安息香酸メチルエステル１０の合成
2021529204.tif 000032
２５ｍＬの二口フラスコに化合物３（０．５０ｇ、２．０ｍｍｏｌ）、３−トリフルオロメチル−４−シアノアニリン（０．４４８ｇ、２．４０ｍｍｏｌ）及び６．５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドを添加し、この溶液にチオホスゲン（０．２８ｍｌ、３．２０ｍｍｏｌ）を滴下し、７０℃まで昇温させて２４ｈ反応させ、室温まで冷却した後、２ｍＬのメタノール、０．５ｍＬの濃塩酸及び２ｍＬの水を添加し、２ｈ還流下で撹拌し、室温まで冷却した後、酢酸エチル（１０×３ｍＬ）で抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧して溶媒を取り除き、残渣をカラムクロマトグラフィーで精製して、化合物５（０．２８６ｇ、淡黄色固体、収率２９．９％）を得た。
【００６５】
（２）４−（７−（６−シアノ−５−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル）−８−オキソ−６−チオ−５，７−ジアザスピロ［３．４］オクタン−５−イル）−２−フルオロ安息香酸１１の合成
2021529204.tif 000033
２５ｍＬの二口フラスコに化合物１０（０．１２ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）及び１ｍＬのメタノールを添加し、この混合物に１ｍＬのＬ１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムを添加し、２０℃で一晩撹拌し、２ｍｏｌ／Ｌ希塩酸を添加してｐＨを４に調節し、酢酸エチル（１０×３ｍＬ）で抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧して溶媒を取り除いて、化合物１１（０．１１３ｇ、淡黄色固体、収率９７．１％）を得た。
【００６６】
（３）４−（７−（６−シアノ−５−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル）−８−オキソ−６−チオ−５，７−ジアザスピロ［３．４］オクタン−５−イル）−２−フルオロ−Ｎ−ヒドロキシベンズアミド１２の合成
2021529204.tif 000034
２５ｍＬの二口フラスコに化合物１２（０．０９７ｇ、０．２１ｍｍｏｌ）、２ｍＬのＴＨＦ及びＣＤＩ（０．０６８ｇ、０．４２ｍｍｏｌ）を添加し、３０℃で１０ｈ撹拌した後、塩酸ヒドロキシルアミン（０．０４４ｇ、０．６２ｍｍｏｌ）を添加し、２５℃で１０ｈ反応させ、ＴＬＣで反応（酢酸エチル：石油エーテル：メタノール＝２０：５：２）を監視し、反応終了後、２ｍＬの水を添加し、酢酸エチル（５×３ｍＬ）で抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧して溶媒を取り除き、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、化合物Ａ６（０．０３１ｇ、淡黄色固体、収率３１．２％）を得た。
Ｍ．Ｗ．，  ４７９，４１；１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＯＤ）：  δ  ８．９３  （ｓ，  １Ｈ），  ８．４２  （ｓ，  １Ｈ），  ７．８８  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．４０（ｔ，  Ｊ  ＝  １０．５  Ｈｚ，２Ｈ），  ２．６９  （ｓ，  ２Ｈ），  ２．５６  （ｄ，  Ｊ  ＝  １０．０  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．１５−２．１０  （ｄ，  １Ｈ），１．６３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ９．５  Ｈｚ  １Ｈ）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （１２５  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＯＤ）：  δ  １８０．７４，  １７５．１８，  １６２．１６，  １５８．９１，  １５１．２６，  １５０．８６，  １４９．３６，  １３９．７０，  １３５．７４，  １３１．０３，  １２６．６７，  １２５．７４，  １２２．３７，  １２２．２４，  １１８．７０，  １１８．５１，  ６７．８６，  ３１．１９，  １３．１４。
【００６７】
以下、本発明に係る一部分の化合物の生体活性試験結果について説明する。
【００６８】
使用試薬：
ＤＨＴ（ジヒドロテストステロン）、米国Ｓｉｇｍａ社により提供され、
ＡＲＮ５０９、発明者により合成され、
ＭＤＶ３１００、発明者により合成される。
【００６９】
１、ＡＲ拮抗活性の検出
１．１  拮抗薬とＡＲの結合実験
ＰｏｌａｒＳｃｒｅｅｎＴＭ  Ａｎｄｒｏｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  （ＡＲ）  Ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ  Ａｓｓａｙ、  Ｇｒｅｅｎキット（米国ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、拮抗薬とＡＲ−ＬＢＤ（ＧＳＴ）との親和性を検出した。実験原理は、ＡＲ−ＬＢＤと小分子蛍光ケトントレーサー（Ｆｌｕｏｒｍｏｎｅ  Ｔｒａｃｅｒ）が結合し、拮抗薬が添加された後にＡＲ−ＬＢＤとの結合を蛍光ケトントレーサーと競合して、蛍光ケトントレーサーを置き換え、置き換えられた蛍光ケトントレーサーが蛍光偏光を発生し、蛍光偏光値が置き換えられたトレーサーの数に反比例する。
【００７０】
具体的な過程は、以下のとおりである。薬物をＤＭＳＯで５００μＭに溶解した後、９６ウェルプレートで２倍希釈濃度勾配で２４４ｎＭに希釈し、３８４ウェルプレートで１０μＬの反応系ＡＲ−ＬＢＤ＋Ｔｒａｃｅｒを調製して１０μＬの薬物を添加し、陽性対照として１０μＬのＡＲ−ＬＢＤ＋Ｔｒａｃｅｒに１０μＬのＤＨＴを添加し、スズ箔紙で３８４ウェルプレートを包んで６時間暗所でインキュベートした後、多機能マイクロプレートリーダーから蛍光偏光値を読み取り、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて薬物濃度を横座標とし、蛍光偏光値を縦座標としてプロットした。図１は、薬物とＡＲ−ＬＢＤが結合したＩＣ５０の結果を示す図である。ＤＨＴ、ＭＤＶ３１００、ＡＲＮ５０９は陽性対照である。
【００７１】
図１から分かるように、合成された薬物は、いずれもＡＲと異なる程度で結合することができ、Ｚｅｔａ  ３２、Ｚｅｔａ  ３３、Ｚｅｔａ  ５５の結合力が最も高く、それらのＩＣ５０はそれぞれ２５．０５、２７．５４、２９．８０μＭである。
【００７２】
１．２  ルシフェラーゼレポーター遺伝子の実験
９６ウェルプレートで２９３Ｔ細胞を培養し、２９３Ｔ細胞中でＡＲプラスミドとＡＲ標的プロモーター付きルシフェラーゼ遺伝子をコトランスフェクトし、ＡＲ標的プロモーターを活性化することによりルシフェラーゼを発現し、ルシフェラーゼの発現量がＡＲ活性に比例する。細胞中にＤＨＴを添加すると、ＡＲを活性化し、ルシフェラーゼを発現することができ、検出可能な蛍光シグナルが増強する。添加された薬物について、蛍光シグナルを検出することによりそれがＡＲ拮抗薬活性を有するか否かを測定することができる。
【００７３】
アンドロゲン受容体（ＡＲ）標的プロモーターを含有するルシフェラーゼレポーター遺伝子プラスミドＭＭＴＶ−ＬＵＣとアンドロゲン受容体（ＡＲ）を発現するプラスミドｐＳＶ−ＡＲを構築した。９６ウェルプレートで２９３Ｔ細胞を１ウェルあたり１×１０４個接種し、一晩インキュベートして細胞を付着させ、２日目にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）３０００（米国ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いてプラスミドをトランスフェクトして細胞に入り、１ウェルあたり１８０ｎｇのＭＭＴＶ−ＬＵＣプラスミドと２０ｎｇのｐＳＶ−ＡＲプラスミドを添加した。３日目に１ウェルあたりそれぞれ１０ｎＭのＤＨＴと１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、２５μＭ、５０μＭの異なる濃度の薬物とを添加し、対照として１０ｎＭのＤＨＴを採用し、５日目にルシフェラーゼレポーター遺伝子検出キット（中国、碧云天公司）を用いて細胞を処理し、１００μＬの細胞溶解液を９６ウェルプレートに添加し、２０ｍｉｎ溶解した後、４℃で１００００ｇで３ｍｉｎ遠心し、５０μＬの上清に１００μＬのルシフェラーゼ検出試薬を添加し、均一に混合した直後に多機能マイクロプレートリーダーで化学発光を検出した。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、薬物濃度を横座標とし、薬物蛍光値／陽性対照蛍光値を縦座標としてプロットした。ＭＤＶ３１００は陽性対照である。
【００７４】
図２から分かるように、合成された薬物は、ＡＲにいずれも拮抗薬の役割を果たし、その拮抗能力は、高い方から順に、Ｚｅｔａ  ３２＞Ｚｅｔａ  ５５＞Ｚｅｔａ  ３４＞Ｚｅｔａ  ５７＞Ｚｅｔａ  ３３である。
【００７５】
１．３  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＢｌｏｔによるＡＲ及びＰＳＡ発現の検出
ＶＣａＰ細胞を６ウェルプレートに播種し、１ウェルあたり５×１０５個の細胞を接種し、一晩インキュベートして細胞を付着させ、２日目に１０μＭの薬物を添加し、２４ｈインキュベートした後に細胞を収集し、細胞を溶解して総タンパク質を抽出し、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ方法を採用して、異なる薬物を添加した細胞中のＰＳＡの発現量を検出し、結果を図３に示す。
【００７６】
図３から分かるように、合成された薬物は、いずれもＡＲ経路の下流タンパク質（ＰＳＡ）の発現を顕著に阻害することができ、合成された薬物がＡＲを阻害できる機能が示唆されている。
【００７７】
２、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）の阻害活性
６ウェルプレートでＶＣａＰ細胞を培養し、ＶＣａＰ細胞に２４ｈ薬物投与処理を行った後、ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔを用いて細胞質中のｔｕｂｕｌｉｎと細胞核中のＨ３タンパク質のアセチル化レベルを検出した。実験過程は以下のとおりである。
【００７８】
ＶＣａＰ細胞を６ウェルプレートに播種し、１ウェルあたり５×１０５個の細胞を接種し、一晩インキュベートして細胞を付着させ、２日目に１０μＭの薬物を添加し、２４ｈインキュベートした後に細胞を収集し、細胞を溶解して細胞の総タンパク質を抽出し、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ方法を採用して、異なる薬物を添加した細胞中のＫａｃ−ｔｕｂｉｌｉｎ（位置決め細胞質）の発現量を検出した。図４は実験結果を示し、図中のＫａｃはリジンのアセチル化を表す。
【００７９】
ＶＣａＰ細胞を６ウェルプレートに播種し、１ウェルあたり５×１０５個の細胞を接種し、一晩インキュベートして細胞を付着させ、２日目に１０μＭの薬物を添加し、２４ｈインキュベートした後に細胞を収集し、ＥｐｉＱｕｉｋ  Ｔｏｔａｌ  Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｎ  ｋｉｔ（米国、Ｅｐｉｇｅｎｔｅｋ）を採用してヒストンを抽出し、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ方法を採用して、異なる薬物を添加した細胞中のＫａｃ−Ｈ３（位置決め細胞核）の発現量を検出した。図５は実験結果を示す。
【００８０】
図４、図５から分かるように、合成された薬物は、いずれも一定のヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害活性を有し、ｔｕｂｕｌｉｎタンパク質及びヒストンのアセチル化を向上させることができる。細胞質中のｔｕｂｕｌｉｎアセチル化に対して、Ｚｅｔａ  ３２、Ｚｅｔａ  ５５は活性が高く（図４）、細胞核中のＨ３アセチル化に対して、Ｚｅｔａ  ３２、Ｚｅｔａ  ５５、Ｚｅｔａ  ５７及びＺｅｔａ  ３４は活性が高い（図５）。
【００８１】
３、細胞増殖阻害活性の検出
３．１  薬物によるＶＣａＰ細胞増殖阻害作用
９６ウェルプレートでアンドロゲン感受性前立腺癌細胞ＶＣａＰ細胞を培養し、１０ｎＭのＤＨＴを添加した培地でＶＣａＰ細胞が増殖し、薬物を添加して４日間処理することにより薬物による前立腺癌細胞増殖作用を検出した。
【００８２】
５％ＣＳＳとフェノールレッドフリーの１６４０培地でＶＣａＰ細胞を培養し、９６ウェルプレートに接種し、１ウェルあたりに１×１０４個の細胞を添加し、一晩インキュベートして細胞を付着させ、２日目に異なる濃度の薬物を添加し、４日間薬物処理した後にＭＴＳ試薬キット（米国、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞の活性を検出し、１ウェルあたりに１０％のＭＴＳ試薬を添加し、２時間インキュベートした後、多機能マイクロプレートリーダーで４９０ｎＭの吸光度値を検出した。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、薬物濃度を横座標とし、薬物処理後の吸光度値／ブランク処理後の細胞吸光度値を縦座標としてプロットした。
【００８３】
図６から分かるように、合成された薬物は、ＶＣａｐ細胞にいずれも増殖阻害作用を有し、阻害作用は、高い方から順に、Ｚｅｔａ  ５５＞Ｚｅｔａ  ３２＞Ｚｅｔａ  ３３＞Ｚｅｔａ  ３４＞Ｚｅｔａ  ５７である。薬物Ｚｅｔａ  ５５、Ｚｅｔａ  ３２及びＺｅｔａ  ３３の細胞増殖阻害作用は、陽性対照薬物ＭＤＶ３１００よりも高い。
【００８４】
３．２  薬物の細胞への選択性
２９３Ｔ細胞は、ＡＲ陰性ヒト胚腎細胞であり、ＤＵ１４５は、ＡＲ陰性前立腺癌細胞であり、ＶＣａＰは、ＡＲ陽性前立腺癌細胞である。９６ウェルプレートでこの３種類の細胞を培養し、それぞれ薬物を添加して（濃度勾配を設定する）４日間処理した後に、薬物による細胞増殖阻害作用をＭＴＳ検出した。具体的な過程は、以下のとおりである。
【００８５】
５％ＣＳＳとロフェノールレッドの１６４０培地でＶＣａＰ細胞を培養し、９６ウェルプレートに接種し、１ウェルあたり１×１０４個の細胞を添加した。１０％ＦＢＳと１６４０培地で２９３Ｔ細胞及びＤＵ１４５細胞を培養し、９６ウェルプレートに接種し、１ウェルあたり２×１０３個の細胞を添加した。一晩インキュベートして細胞を付着させ、２日目に異なる濃度の薬物を添加し、４日間薬物処理した後にＭＴＳ試薬キット（米国、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞の活性を検出し、１ウェルあたりに１０％体積のＭＴＳ試薬を添加し、２時間インキュベートした後、多機能マイクロプレートリーダーで４９０ｎＭの吸光度値を検出した。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、薬物濃度を横座標とし、薬物処理後の吸光度値／ブランク処理後の細胞吸光度値を縦座標としてプロットした。
【００８６】
図７から分かるように、Ｚｅｔａ  ５５は、ＡＲ陽性細胞ＶＣａＰ細胞に選択的な増殖阻害作用を有し、Ｚｅｔａ  ５５によるＡＲ陽性細胞ＶＣａＰの増殖阻害作用は、ＡＲ陰性細胞（２９３Ｔ及びＤＵ１４５）の増殖阻害作用の２０倍以上であり、Ｚｅｔａ  ５５は、ＡＲ陰性細胞への毒性が低いことが示唆されている。
【００８７】
以上より、実験効果が最も優れている薬物はＺｅｔａ  ５５であり、Ｚｅｔａ  ３２がそれに続く。Ｚｅｔａ  ５５による細胞増殖阻害作用は、既に市販されているＭＤＶ３１００及びＳＡＨＡよりも良好であり、ＡＲ陽性細胞に対する作用は、ＡＲ陰性細胞に対する作用よりもはるかに高く、該薬物はより良好な治療効果及びより低い副作用を有する可能性があることが示唆されている。
【図１】
2021529204.tif 000039
【図２】
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【図３】
2021529204.tif 000041
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2021529204.tif 000045
【国際調査報告】
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2021529204.tif 000047
2021529204.tif 000048
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