(57)【要約】本開示は、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子と、これら分子を用いた、肝臓組織においてＷｎｔシグナル伝達を増加させる関連の方法とを提供する。
2021530223.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織特異性Ｗｎｔ（「ウイングレス関連統合部位」又は「ウイングレス及びＩｎｔ−１」又は「ウイングレス−Ｉｎｔ」）シグナル増強分子又はその薬理学的に許容可能な塩であって、亜鉛ＲＩＮＧフィンガー３（ＺＮＲＦ３）及びＲＩＮＧフィンガータンパク質４３（ＲＮＦ４３）から選択される１又は複数の膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに特異的に結合する第１のドメインと、アシアロ糖蛋白受容体１（ＡＳＧＲ１）及び／又はアシアロ糖蛋白受容体２（ＡＳＧＲ２）に特異的に結合する第２のドメインとを含み、
（ａ）前記第１のドメインは、
（ｉ）表２Ａの抗体のいずれかに記載のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３の配列；及び／もしくは  
（ｉｉ）表２Ａの抗体のいずれかに記載のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３の配列を含む、抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、
もしくは１もしくは複数のアミノ酸改変を含む、前記抗体もしくはその抗原結合性フラグメントのバリアントを含み、前記バリアントは、当該ＣＤＲ配列において８未満のアミノ酸置換を含み；ならびに／又は、
（ｂ）前記第２のドメインは、
（ｉ）表３Ａの抗体のいずれかに記載のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３の配列；及び／もしくは  
（ｉｉ）表３Ａの抗体のいずれかに記載のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３の配列を含む、抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、
もしくは１もしくは複数のアミノ酸改変を含む前記抗体もしくはその抗原結合性フラグメントのバリアントを含み、前記バリアントは、当該ＣＤＲ配列において８未満のアミノ酸置換を含む、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子又はその薬理学的に許容可能な塩。
【請求項２】
当該分子は、肝臓特異性Ｗｎｔシグナル増強分子であり、また前記第２のドメインは、
（ｉ）表３Ａの抗体のいずれかに記載のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３の配列；ならびに／もしくは  
（ｉｉ）表３Ａの抗体のいずれかに記載のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３の配列を含む、抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、
又は１もしくは複数のアミノ酸改変を含む前記抗体もしくはその抗原結合性フラグメントのバリアントを含み、前記バリアントは、当該ＣＤＲ配列において８未満のアミノ酸置換を含む、請求項１記載の分子。
【請求項３】
前記第１のドメインは、
（ｉ）表２Ａの抗体のいずれかに記載のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３の配列；ならびに／もしくは  
（ｉｉ）表２Ａの抗体のいずれかに記載のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３の配列を含む、抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、
又は１もしくは複数のアミノ酸改変を含む前記抗体もしくはその抗原結合性フラグメントのバリアントを含み、前記バリアントは、当該ＣＤＲ配列において８未満のアミノ酸置換を含む、請求項１記載の分子。
【請求項４】
前記第１のドメインはＲ−ｓｐｏｎｄｉｎポリペプチド配列又はそのフラグメントもしくはバリアントを含み、前記Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎは、随意にＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ−１、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ−２、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ−３又はＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ−４である、請求項１又は２に記載の分子。
【請求項５】
前記第１のドメインはＲ−ｓｐｏｎｄｉｎフューリンドメイン１配列、及び随意に野生型又は変異したフューリンドメイン２又はそのフラグメントもしくはバリアントを含み、第１のポリペプチド配列は随意に、全長Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎと比較して、高ロイシン反復含有Ｇ−タンパク質結合受容体４〜６（ＬＧＲ４〜６）との結合が低下している、請求項４記載の分子。
【請求項６】
前記Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎフューリンドメイン１は、配列番号１〜４で表すフューリン１ドメインのいずれかに対して少なくとも９０％の同一性を有する、請求項４又は５に記載の分子。
【請求項７】
当該分子は、融合タンパク質であり、前記第１のドメイン及び前記第２のドメインは、リンカー部分を介して連結していてもよいポリペプチドである、請求項１から６のいずれか一項に記載の分子。
【請求項８】
前記リンカー部分は、ペプチジルリンカー配列である、請求項７記載の分子。
【請求項９】
当該リンカー配列は、グリシン、アスパラギン、セリン、トレオニン及びアラニンからなる群から選択される１又は複数のアミノ酸を含む、請求項８記載の分子。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか一項に記載の分子の少なくとも前記第１のドメイン又は前記第２のドメインをコードする、核酸配列。
【請求項１１】
前記核酸配列はＤＮＡ又はｍＲＮＡである、請求項１０記載の核酸配列。
【請求項１２】
請求項１１の核酸配列を含む、ベクター。
【請求項１３】
前記ベクターは、前記核酸配列に作動的に連結したプロモーター配列を含む発現ベクターである、請求項１２記載のベクター。
【請求項１４】
前記ベクターは、前記核酸配列に作動的に連結したプロモーター配列を含むウイルスである、請求項１３記載のベクター。
【請求項１５】
請求項１４のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１６】
請求項７から９のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドの産生方法であって、前記融合ポリペプチドが前記発現ベクターによって発現する条件下で請求項１５に記載の前記宿主細胞を培養することを含む、方法。
【請求項１７】
産生した前記融合ポリペプチドを単離するステップをさらに含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
ａ）有効量の、請求項１から９のいずれか一項に記載の分子、請求項１０から１１のいずれか一項に記載の核酸配列、請求項１２から１４のいずれか一項に記載のベクター、又は請求項１５に記載の宿主細胞と、
ｂ）薬理学的に許容可能な希釈剤、アジュバント又は担体とを含む、医薬組成物。
【請求項１９】
前記有効量の、請求項１から９のいずれか一項に記載の前記分子と、有効量の、Ｗｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド又はＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子とを含む、請求項１８記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記有効量の、請求項１０から１１のいずれか一項に記載の前記核酸配列と、Ｗｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド又はＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする有効量の核酸配列とを含み、前記Ｗｎｔポリペプチド、前記Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド又は前記Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする前記核酸配列は随意にＤＮＡ又はｍＲＮＡである、請求項１８記載の医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１３から１４のいずれかに記載の前記核酸配列、及び／又は前記Ｗｎｔポリペプチド、前記Ｎｏｒｒｉｎポリペプチドもしくは前記Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする前記核酸配列は、改変されたｍＲＮＡである、請求項２０記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記有効量の、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の前記ベクターと、Ｗｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド又はＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列を含む有効量のベクターとを含み、前記Ｗｎｔポリペプチド、前記Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド又は前記Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする前記核酸配列を含む前記ベクターは随意に発現ベクターである、請求項１８記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２Ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５Ａ、Ｗｎｔ５Ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７Ａ、Ｗｎｔ７Ｂ、Ｗｎｔ８Ａ、Ｗｎｔ８Ｂ、Ｗｎｔ９Ａ、Ｗｎｔ９Ｂ、Ａｎｔ１０Ａ、Ｗｎｔ１０Ｂ、Ｗｎｔ１１、ならびにＷｎｔ１６、ならびに先述のいずれかの機能バリアント及びフラグメントから選択される哺乳動物Ｗｎｔポリペプチドである、請求項１９から２２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記Ｎｏｒｒｉｎポリペプチドは、哺乳動物のＮｏｒｒｉｎポリペプチド又はその機能バリアントもしくはフラグメントである、請求項１９から２２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト分子は、Ｌｒｐ５／６と共にＦｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚ）受容体を二量体形成する水溶性Ｗｎｔシグナル伝達アゴニストである、請求項１９から２２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト分子はポリペプチドを含む、請求項２５記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記ポリペプチドは、１又は複数のＦｚｄタンパク質に対して親和性を有する結合ドメインと、Ｌｒｐ５／Ｌｒｐ６タンパク質に対して親和性を有する結合ドメインとを含み、また当該結合ドメインは、直接連結又はリンカーを介して連結していてもよい、請求項２６記載の医薬組成物。
【請求項２８】
標的組織においてＷｎｔ（「ウイングレス関連統合部位」又は「ウイングレス及びＩｎｔ−１」又は「ウイングレス−Ｉｎｔ」）シグナル伝達を増加させる方法であって、前記標的組織を、
ａ）請求項１から９のいずれか一項に記載の分子、請求項１０から１１のいずれか一項に記載の核酸、請求項１２から１４のいずれか一項に記載のベクター、もしくは請求項１５に記載の宿主細胞であって、第２のドメインが前記標的組織の細胞特異性表面分子に特異的に結合し、また請求項１から１２のいずれか一項に記載の前記分子が前記標的組織に結合して、前記標的組織において亜鉛ＲＩＮＧフィンガー３（ＺＮＲＦ３）及びＲＩＮＧフィンガータンパク質４３（ＲＮＦ４３）から選択された１もしくは複数の膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼを取り込むかもしくはそのエンドサイトーシスを増加させるものである、当該請求項１から９のいずれか一項に記載の分子、請求項１０から１１のいずれか一項に記載の核酸、請求項１２から１４のいずれか一項に記載のベクター、もしくは請求項１５に記載の宿主細胞、ならびに／又は
ｂ）Ｗｎｔポリペプチド、ＮｏｒｒｉｎポリペプチドもしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子；Ｗｎｔポリペプチド、ＮｏｒｒｉｎポリペプチドもしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列；Ｗｎｔポリペプチド、ＮｏｒｒｉｎポリペプチドもしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列を含むベクター；もしくはＷｎｔポリペプチド、ＮｏｒｒｉｎポリペプチドもしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含む宿主細胞であって、前記Ｗｎｔポリペプチド、前記Ｎｏｒｒｉｎポリペプチドもしくは前記Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする前記核酸配列は随意にＤＮＡ、もしくはｍＲＮＡ、随意に改変されたｍＲＮＡである、当該Ｗｎｔポリペプチド、ＮｏｒｒｉｎポリペプチドもしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子；Ｗｎｔポリペプチド、ＮｏｒｒｉｎポリペプチドもしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列；Ｗｎｔポリペプチド、ＮｏｒｒｉｎポリペプチドもしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列を含むベクター；もしくはＷｎｔポリペプチド、ＮｏｒｒｉｎポリペプチドもしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含む宿主細胞、と接触させることを含む、方法。
【請求項２９】
前記標的組織を請求項１から９のいずれか一項に記載の分子と接触させることを含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記標的組織を請求項１０から１１のいずれか一項に記載の核酸と接触させることを含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
前記標的組織を請求項１２から１４のいずれか一項に記載のベクターと接触させることを含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３２】
前記標的組織を、前記Ｗｎｔポリペプチド、前記Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド又は前記Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする前記核酸配列と接触させることを含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３３】
それを必要とする対象において、肝疾患又は肝臓の症状であってＷｎｔ（「ウイングレス関連統合部位」又は「ウイングレス及びＩｎｔ−１」又は「ウイングレス−Ｉｎｔ」）シグナル伝達の低下と関連するか又はＷｎｔシグナル伝達の増加が有益となることとなる当該肝疾患又は肝臓障害を治療又は予防する方法であって、前記対象に、有効量の、請求項１８から２７のいずれか一項に記載の医薬組成物を提供することを含み、随意に当該分子が請求項２に記載の分子である、方法。
【請求項３４】
薬理学的に許容可能な希釈剤、アジュバント又は担体と、有効量の、
ａ）Ｗｎｔポリペプチド、ＮｏｒｒｉｎポリペプチドもしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子；
ｂ）Ｗｎｔポリペプチド、ＮｏｒｒｉｎポリペプチドもしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列であって、随意にＤＮＡもしくはｍＲＮＡである、前記Ｗｎｔポリペプチド、前記Ｎｏｒｒｉｎポリペプチドもしくは前記Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする前記核酸配列；
ｃ）Ｗｎｔポリペプチド、ＮｏｒｒｉｎポリペプチドもしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列を含むベクターであって、随意に発現ベクターである、前記Ｗｎｔポリペプチド、前記Ｎｏｒｒｉｎポリペプチドもしくは前記Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列を含む前記ベクター；又は
ｄ）Ｗｎｔポリペプチド、ＮｏｒｒｉｎポリペプチドもしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含む宿主細胞とを含む医薬組成物を前記対象に提供することをさらに含む、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
有効量の請求項１から９のいずれか一項に記載の分子を含む医薬組成物と、有効量のＷｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド又はＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子を含む医薬組成物とを、前記対象に提供することを含む、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
有効量の、請求項１０から１１のいずれか一項に記載の核酸配列を含む医薬組成物と、Ｗｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド又はＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列であって、前記核酸配列の一方又は両方が随意にＤＮＡ、又はｍＲＮＡ、随意に改変されたｍＲＮＡである、有効量の当該核酸配列を含む医薬組成物とを、前記対象に提供することを含む、請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
有効量の、請求項１２から１４のいずれか一項に記載のベクターを含む医薬組成物と、Ｗｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド又はＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列を含むベクターであって、前記ベクターの一方又は両方が随意に発現ベクター、又は発現ウイルスベクターである、有効量の当該ベクターを含む医薬組成物とを、前記対象に提供することを含む、請求項３４記載の方法。
【請求項３８】
前記Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２Ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５Ａ、Ｗｎｔ５Ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７Ａ、Ｗｎｔ７Ｂ、Ｗｎｔ８Ａ、Ｗｎｔ８Ｂ、Ｗｎｔ９Ａ、Ｗｎｔ９Ｂ、Ｗｎｔ１０Ａ、Ｗｎｔ１０Ｂ、Ｗｎｔ１１、ならびにＷｎｔ１６、ならびに先述のいずれかの機能バリアント及びフラグメントから選択される哺乳動物Ｗｎｔポリペプチドである、請求項３４から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記Ｎｏｒｒｉｎポリペプチドは、哺乳動物のＮｏｒｒｉｎポリペプチド又はその機能バリアントもしくはフラグメントである、請求項３４から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト分子は、Ｌｒｐ５／６と共にＦｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚｄ）受容体を二量体形成する水溶性Ｗｎｔシグナル伝達アゴニストである、請求項３４から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト分子はポリペプチドを含む、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
前記ポリペプチドは、１又は複数のＦｚｄタンパク質に対して親和性を有する結合ドメインと、Ｌｒｐ５／Ｌｒｐ６タンパク質に対して親和性を有する結合ドメインとを含み、また当該結合ドメインは、直接連結又はリンカーを介して連結していてもよい、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
肝疾患又は肝臓の症状は、あらゆる原因の急性肝不全、薬物誘発性の急性肝不全、アルコール性肝疾患、あらゆる原因の慢性肝不全、肝硬変、あらゆる原因の肝線維症、門脈圧亢進、あらゆる原因の慢性肝不全、末期肝疾患（ＥＳＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）（脂肪肝）、アルコール性肝炎、Ｃ型肝炎ウイルス誘発性の肝疾患（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス誘発性の肝疾患（ＨＢＶ）、他のウイルス性肝炎（例えば、Ａ型肝炎ウイルス誘発性の肝疾患（ＨＡＶ）及びＤ型肝炎ウイルス誘発性の肝疾患（ＨＤＶ））、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、肝臓の（ｌｉｖｅｒｙ）外科手術、肝損傷、肝移植、肝臓の外科手術及び移植における「過小グラフト（ｓｍａｌｌ  ｆｏｒ  ｓｉｚｅ）」症候群、先天性の肝疾患及び肝障害、その他の、遺伝性疾患、変性、加齢、薬物又は損傷によりもたらされる、肝臓の障害又はデテクト（ｄｅｔｅｃｔ）からなる群から選択される、請求項３３から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記医薬組成物は、非経口的に、経口的に、筋肉内に、又は局所的に、肝臓に提供される、請求項３３から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記対象は、哺乳動物、随意にヒトである、請求項３３から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
ＲＮＦ４３又はＺＮＲＦ３ポリペプチドに結合する単離された抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、（ｉ）表２Ａの抗体のいずれかに記載のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３の配列、ならびに／もしくは（ｉｉ）表２Ａの抗体のいずれかに記載のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３の配列、を含む配列を含む当該抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、又は１もしくは複数のアミノ酸改変を含む前記抗体もしくはその抗原結合性フラグメントのバリアントであり、前記バリアントは、当該ＣＤＲ配列において８未満のアミノ酸置換を含む、当該単離された抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項４７】
表２Ｂもしくは配列番号７８〜１５０又は１６５〜１７０に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含む、請求項４６記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項４８】
表２Ｂもしくは配列番号７８〜１５０又は１６５〜１７０に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含む、請求項４７記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項４９】
ＡＳＧＲ１又はＡＳＧＲ２ポリペプチドに結合する単離された抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、（ｉ）表３Ａの抗体のいずれかに記載のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３の配列、ならびに／もしくは（ｉｉ）表３Ａの抗体のいずれかに記載のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３の配列、を含む配列を含む当該抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、又は１もしくは複数のアミノ酸改変を含む前記抗体もしくはその抗原結合性フラグメントのバリアントであり、前記バリアントは、当該ＣＤＲ配列において８未満のアミノ酸置換を含む、当該単離された抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項５０】
表３Ｂもしくは配列番号４７〜７７、１５１〜１５４、１７１〜１７９又は２７４〜３０５に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含む、請求項４９記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項５１】
表３Ｂもしくは配列番号４７〜７７、１５１〜１５４、１７１〜１７９又は２７４〜３０５に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含む、請求項５０記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項５２】
表３Ｃもしくは配列番号１８０〜１８５に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域又は軽鎖可変領域、又はそのフラグメントもしくはバリアントを含む、抗体。
【請求項５３】
抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、請求項４６から５２のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメントとの結合を競合する、抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項５４】
請求項４６から５３のいずれか一項に記載の抗体を含む、医薬組成物。
【請求項５５】
肝臓の体重に対する比を増加させる、肝臓再生を促進する、肝細胞の増殖もしくは有糸分裂を増加させる、随意に慢性肝損傷の後で、肝線維症を減少させる、肝細胞機能を増加させる、又は肝臓における凝固時間を減少させるための方法であって、対象に、請求項５３に記載の有効量の医薬組成物を提供することを含み、当該抗体又はその抗原結合性フラグメントは、ＡＳＧＲ１又はＡＳＧＲ２ポリペプチドに結合するものである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２０１８年７月９日出願の米国仮出願第６２／６９５，５０９号、２０１８年１１月２０日出願の米国仮出願第６２／７７０，０２６号、及び２０１９年３月２２日出願の米国仮出願第６２／８２２，７３１号の優先権を請求し、そのそれぞれを全体として、本明細書において参照により援用する。
【０００２】
配列表に関する記載
本願と関連する配列表は、紙の写しの代わりにテキスト形式で提供され、またここで本明細書に参照により援用する。配列表を含有するこのテキストファイルの名称は、ＳＲＺＮ＿０１０＿０３ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは６６１ＫＢ、また２０１９年７月９日に作成されたものであり、そしてＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で電子的に提出する。
【０００３】
本開示は、例えば融合タンパク質である、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子であって、Ｅ３ユビキチンリガーゼＺＮＲＦ３又はＲＮＦ４３に結合するドメインと組織特異性細胞表面受容体結合ドメインとを含む当該組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子に関するのみならず、当該Ｅ３リガーゼＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３の組織特異的なインターナリゼーション又は取り込み（ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ）を介在し、それによってＷｎｔ受容体を安定化して組織特異的にＷｎｔシグナル伝達を増強するため、ならびに種々の疾患及び障害を治療及び予防するために、当該組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子を使用する関連の方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
Ｗｎｔ（「ウイングレス関連統合部位」又は「ウイングレス及びＩｎｔ−１」又は「ウイングレス−Ｉｎｔ」）リガンド及びそれらのシグナルは、骨、肝臓、皮膚、胃、腸、腎臓、中枢神経系、乳腺、口腔粘膜、味蕾、卵巣、蝸牛及び多数の他の組織を含めた、多数の重要な器官及び組織の発達、ホメオスタシス、ならびに再生の制御において重要な役割を果たす（例えば、Ｃｌｅｖｅｒｓ，Ｌｏｈ，ａｎｄ  Ｎｕｓｓｅ，２０１４；３４６：１２４８０１２により概説される）。Ｗｎｔシグナル伝達経路の調節は、退行性の疾患及び組織損傷を治療する可能性を有する。この目的を達成するために、望まれない影響を回避するように、組織特異的に又は細胞型特異的にＷｎｔシグナル伝達活性を調節するという方策を立てることが望まれる。治療としてＷｎｔシグナル伝達を調節するための課題のひとつとして、多数の組織が複数の重複するＦｚｄを発現する状態で、複数のＷｎｔリガンド及びＷｎｔ受容体Ｆｒｉｚｚｌｅｄ１〜１０（Ｆｚｄ１〜１０）が存在することがある。古典的Ｗｎｔシグナルはまた、共受容体として低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体関連タンパク質５（ＬＲＰ５）又は低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）に関与し、これらは、Ｆｚｄに加えて、種々の組織において広く発現する。
【０００５】
Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ１〜４は、Ｗｎｔシグナルを増幅するリガンドの群である。Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎのそれぞれは、亜鉛ＲＩＮＧフィンガー３（ＺＮＲＦ３）又はＲＩＮＧフィンガータンパク質４３（ＲＮＦ４３）を一端に含有し、かつ、高ロイシン反復含有Ｇ−タンパク質結合受容体４〜６（ＬＧＲ４〜６）を他端に含有する受容体複合体を介して作用する（例えば、Ｋｎｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｈａｎｋｅｎｓｏｎ  ２０１４，Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；３７：１５７−１６１により概説される）。Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎはまた、さらなる作用機序を介しても作用し得る。ＺＮＲＦ３及びＲＮＦ４３は、分解のためにＷｎｔ受容体（Ｆｚｄ１〜１０及びＬＲＰ５又はＬＲＰ６）を特異的に標的とする２つの膜結合Ｅ３リガーゼである。Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎがＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３及びＬＧＲ４〜６に結合することにより、Ｗｎｔ受容体からＥ３リガーゼを除去してＷｎｔ受容体を安定化させる三元複合体のクリアランス又は取り込みが生じ、結果的にＷｎｔシグナルの増強をもたらす。各Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎは、２つのフューリン（Ｆｕｒｉｎ）ドメイン（１及び２）であって、フューリンドメイン１はＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に結合し、またフューリンドメイン２はＬＧＲ４〜６に結合する当該２つのフューリンドメインを含有する。フューリンドメイン１及び２を含有するＲ−ｓｐｏｎｄｉｎのフラグメントは、Ｗｎｔシグナル伝達を増幅するのに十分である。Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎの影響は、Ｗｎｔシグナルに依存するが、ＬＧＲ４〜６及びＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３はどちらも種々の組織において広く発現することから、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎの影響は組織特異的でない。
【０００６】
特定の疾患及び障害を治療及び予防する組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子が、当技術において、明らかに要望されている。本発明は、組織特異的にＷｎｔ活性を増強するのに有用な組成物及び方法を提供することによって、この要望に対処する。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、例えば標的組織におけるＷｎｔシグナル伝達を増加して、Ｗｎｔシグナル伝達の増加が有益となることとなる疾患及び症状を治療する際における、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子及びその使用に関する。特定の実施形態においては、当該組織は肝臓である。
【０００８】
一実施形態においては、本発明は、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子又はその薬理学的に許容可能な塩であって、ＺＮＲＦ３及びＲＮＦ４３から選択される１又は複数の膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに特異的に結合する第１のドメインと、組織特異性細胞表面分子に特異的に結合する第２のドメインとを含み、当該分子が、当該組織におけるＷｎｔシグナル伝達を増加させる、当該組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子又はその薬理学的に許容可能な塩を提供する。ある実施形態においては、Ｗｎｔシグナル増強分子は肝臓特異的であり、また第２のドメインは、肝臓特異性細胞表面分子に特異的に結合して肝臓又は肝細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を増加させる。様々な実施形態においては、第１のドメイン及び第２のドメインのいずれか又は両方が、ポリペプチド、抗体、小分子、天然リガンド、非天然リガンド、又はそのバリアントである。
【０００９】
Ｗｎｔシグナル増強分子の特定の実施形態においては、第１のドメインは第１のポリペプチド配列を含み、及び／又は、第２のドメインは第２のポリペプチド配列を含む。特定の実施形態においては、当該分子は、第１のポリペプチド配列及び第２のポリペプチド配列を含む融合タンパク質である。ある実施形態においては、第１のポリペプチド配列は、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ配列又はそのフラグメントもしくはバリアントを含む。特定の実施形態においては、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎは、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ−１、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ−２、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ−３、又はＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ−４であり、例えばヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ−１〜４である。ある実施形態においては、第１のポリペプチド配列は、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎフューリンドメイン１又はそのフラグメントもしくはバリアントを含む。特定の実施形態においては、第１のポリペプチド配列は、野生型のＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ由来の配列又は改変配列である。さらに、第１のポリペプチド配列は、対応する天然の全長Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎと比較して、ＬＧＲ４〜６との結合が増加させるか、同様であるか又は減少させることができた。一部の実施形態においては、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ又はＲ−ｓｐｏｎｄｉｎフューリンドメイン１は、配列番号１〜４で表すＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ又はＲ−ｓｐｏｎｄｉｎフューリン１ドメインのいずれかに対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の同一性を有する。ある実施形態においては、第１のポリペプチドは、ＺＮＲＦ３及び／又はＲＮＦ４３に特異的に結合する抗体又はその抗原結合性フラグメントである。特定の実施形態においては、第１のポリペプチドは、ａ）表２Ａの抗体のいずれかに記載のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３の配列、ならびに／もしくはｂ）表２Ａの抗体のいずれかに記載のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３の配列を含む、抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、又は１もしくは複数のアミノ酸改変を含む当該抗体もしくはその抗原結合性フラグメントのバリアントであり、当該バリアントは、当該ＣＤＲ配列において８未満のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態においては、第１のポリペプチドは、表２Ｂ又は配列番号７８〜１５０もしくは１６５〜１７０に記載のナノボディ、ＶＨ又はＶＬの配列を含む、抗体もしくはその抗原結合性フラグメント又はそのフラグメントもしくはバリアントである。
【００１０】
ある実施形態においては、第２のポリペプチド配列は、ポリペプチド、抗体もしくはそのフラグメントもしくはバリアント、又はリガンドもしくはそのフラグメントもしくはバリアントである。ある実施形態においては、第２のポリペプチドは、ＡＳＧＲ１及び／又はＡＳＧＲ２に特異的に結合する抗体又はその抗原結合性フラグメントである。特定の実施形態においては、第２のポリペプチドは、ａ）表３Ａの抗体のいずれかに記載のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３の配列、ならびに／もしくはｂ）表３Ａの抗体のいずれかに記載のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３の配列を含む、抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、又は１もしくは複数のアミノ酸改変を含む当該抗体もしくはその抗原結合性フラグメントのバリアントであり、当該バリアントは、当該ＣＤＲ配列において８未満のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態においては、第１のポリペプチドは、表３Ｂ又は配列番号４７〜７７、１５１〜１５４、１７１〜１７９もしくは２７４〜３０５に記載のナノボディ、ＶＨ又はＶＬの配列を含む、抗体もしくはその抗原結合性フラグメント又はそのフラグメントもしくはバリアントである。
【００１１】
本明細書に開示する組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子のある説明的な実施形態においては、組織が骨組織であり、かつ、細胞表面受容体が副甲状腺ホルモン受容体１（ＰＴＨ１Ｒ）であるか、組織が肝臓組織であり、かつ、細胞表面受容体がアシアロ糖蛋白受容体１（ＡＳＧＲ１）、アシアロ糖蛋白受容体２（ＡＳＧＲ２）、トランスフェリン受容体２（ＴＦＲ２）もしくは溶質輸送体ファミリー１０メンバー１（ＳＬＣ１０Ａ１）であるか、又は、組織が口腔粘膜組織であり、かつ、細胞表面受容体がＬＹ６／ＰＬＡＵＲドメイン含有３（ＬＹＰＤ３）もしくはデスモグレイン３（ＤＳＧ３）である。特定の実施形態においては、第２のポリペプチドは、表３Ｃ又は配列番号１８０〜１８６に記載のナノボディ、ＶＨ又はＶＬの配列を含む、抗体もしくはその抗原結合性フラグメント又はそのフラグメントもしくはバリアントである。
【００１２】
本明細書に開示する組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子のある説明的な実施形態においては、細胞表面分子がＰＴＨ１であり、かつ、第２のポリペプチド配列がＰＴＨ１Ｒに特異的に結合するか、細胞表面分子がＡＳＧＲ１であり、かつ、第２のポリペプチド配列がＡＳＧＲ１に特異的に結合するか、細胞表面分子がＡＳＧＲ２であり、かつ、第２のポリペプチド配列がＡＳＧＲ２に特異的に結合するか、細胞表面分子がＳＬＣ１０Ａ１であり、かつ、第２のポリペプチド配列がＳＬＣ１０Ａ１に特異的に結合するか、細胞表面分子がＴＦＲ２であり、かつ、第２のポリペプチド配列がＴＦＲ２に特異的に結合するか、細胞表面分子がＬＹＰＤ３であり、かつ、第２のポリペプチド配列がＬＹＰＤ３に特異的に結合するか、又は、細胞表面分子がＤＳＧ３であり、かつ、第２のポリペプチド配列がＤＳＧ３に特異的に結合するものであり、第２のポリペプチドは、細胞表面分子の、抗体もしくはそのフラグメント、小分子、又はリガンドもしくはそのフラグメントもしくはバリアントである。
【００１３】
本明細書に記載する組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子の特定の実施形態においては、第１のドメイン及び第２のドメインが、リンカー部分によって連結する。ある実施形態においては、リンカー部分は、ペプチジルリンカー配列である。特定の実施形態においては、ペプチジルリンカー配列は、グリシン、アスパラギン、セリン、トレオニン及びアラニンからなる群から選択される１又は複数のアミノ酸を含む。
【００１４】
特定の実施形態においては、本明細書に記載する組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子は、単一のポリペプチド、例えば第１のドメイン及び第２のドメインを含む融合タンパク質、からなる。ある実施形態においては、本明細書に記載する組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子は、第１のドメイン及び第２のドメインをそれぞれが含む、２以上の融合タンパク質を含む二量体又は多量体等の２以上のポリペプチドを含むものであり、当該２以上のポリペプチドは、例えばリンカー部分を介して、又は２以上のポリペプチドのそれぞれにおけるアミノ酸残基間の結合、例えばシステイン残基間の分子間ジスルフィド結合を介して、連結する。特定の実施形態においては、本明細書に記載の組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子は、２以上のポリペプチド配列を含む。例えば、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子は、第１のドメイン又は第２のドメインのいずれかを構成する抗体の重鎖及び軽鎖（又はその抗原結合性フラグメント）を含み得、当該他方のドメイン（すなわち、第２のドメイン又は第１のドメイン）は、融合タンパク質として又はリンカー部分を介してのいずれかで、抗体の重鎖又は軽鎖に連結する。特定の実施形態においては、当該他方のドメインは、重鎖のＮ末端、重鎖のＣ末端、軽鎖のＮ末端、又は軽鎖のＣ末端に連結する。こうした構造は、付加したＩｇＧ足場又はフォーマットとして本明細書において言及し得る。
【００１５】
関連する実施形態においては、本発明は、本明細書に開示する組織特異性Ｗｎｔシグナル増強融合タンパク質をコードする核酸配列又はそのサブユニット、例えば付加した又は融合した第１のドメイン又は第２のドメインを有する抗体の重鎖又は軽鎖、を含む。さらなる関連の実施形態においては、本発明は、核酸配列を含むベクターを含む。一部の実施形態においては、ベクターは、例えば細菌細胞又は真核細胞での発現に好適な様式で、核酸配列に作動的に連結したプロモーター配列を含む発現ベクターである。別の実施形態においては、ベクターは、機能的ｍＲＮＡのインビトロでの翻訳及び改変のために操作される。さらなる関連の実施形態においては、本発明は、ベクターを含む宿主細胞を含む。また別のさらなる関連の実施形態においては、本発明は、本明細書に記載する組織特異性Ｗｎｔシグナル増強融合タンパク質を産生する方法であって、融合ポリペプチドが発現ベクターによって発現する条件下で宿主細胞を培養することを含む、当該方法を含む。一部の実施形態においては、当該方法は、産生された融合ポリペプチドを単離するステップをさらに含む。
【００１６】
別の実施形態においては、本発明は、本明細書に記載する組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子又はその薬理学的に許容可能な塩と、薬理学的に許容可能な希釈剤、アジュバント又は担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００１７】
別の実施形態においては、本発明は、本明細書に記載する組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子又はその薬理学的に許容可能な塩をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドと、薬理学的に許容可能な希釈剤、アジュバント又は担体とを含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態においては、核酸配列は、ＤＮＡ、又はｍＲＮＡ、随意に改変ｍＲＮＡを含む。
【００１８】
別の実施形態においては、本発明は、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子又はその薬理学的に許容可能な塩をコードする核酸配列を含むベクターと、薬理学的に許容可能な希釈剤、アジュバント又は担体とを含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態においては、ベクターは、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子の発現を駆動する、核酸配列に作動的に連結したプロモーターを含む。ある実施形態においては、ベクターは、発現ベクター又はウイルスベクターである。
【００１９】
別の実施形態においては、本発明は、本明細書に記載する組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子又はその薬理学的に許容可能な塩と；Ｗｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド又はＷｎｔシグナル伝達アゴニスト又はその薬理学的に許容可能な塩と；薬理学的に許容可能な希釈剤、アジュバント又は担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００２０】
別の実施形態においては、本発明は、本明細書に記載する組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子又はその薬理学的に許容可能な塩をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドと；Ｗｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド又はＷｎｔシグナル伝達アゴニスト又はその薬理学的に許容可能な塩をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドと；薬理学的に許容可能な希釈剤、アジュバント又は担体とを含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態においては、核酸配列は、ＤＮＡ、又はｍＲＮＡ、随意に改変ｍＲＮＡを含む。
【００２１】
別の実施形態においては、本発明は、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子又はその薬理学的に許容可能な塩をコードする核酸配列を含むベクターと；Ｗｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド又はＷｎｔシグナル伝達アゴニスト又はその薬理学的に許容可能な塩をコードする核酸配列を含むベクターと；薬理学的に許容可能な希釈剤、アジュバント又は担体とを含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態においては、ベクターは、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子の発現を駆動する、核酸配列に作動的に連結したプロモーターを含む。ある実施形態においては、ベクターは、発現ベクター又はウイルスベクターである。
【００２２】
さらなる実施形態においては、本発明は、標的組織におけるＷｎｔシグナル伝達を増加させる方法であって、当該標的組織を本明細書に記載する組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子と接触させることを含み、第２のドメインが当該標的組織上の細胞特異性表面分子に特異的に結合し、また組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子が当該標的組織に結合して、そして当該標的組織においてＺＮＲＦ３及びＲＮＦ４３から選択される１又は複数の膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼを取り込む（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒ）又はそのエンドサイトーシスを増加する、当該方法を含む。
【００２３】
本明細書に記載の方法のいずれかのある実施形態においては、組織が骨組織であり、かつ、細胞表面分子がＰＴＨ１Ｒであるか、組織が肝臓組織であり、かつ、細胞表面分子がＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２、ＴＦＲ２もしくはＳＬＣ１０Ａ１であるか、又は組織が口腔粘膜組織であり、かつ、細胞表面受容体がＬＹＰＤ３もしくはＤＳＧ３である。特定の実施形態においては、標的の組織又は細胞を、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドと、又は組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列を含むベクター、例えば発現ベクター又はウイルスベクター、と接触させる。
【００２４】
さらなる実施形態においては、本発明は、標的組織におけるＷｎｔシグナル伝達を増加させる方法であって、当該標的組織を、本明細書に記載する組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子であって、第２のドメインが当該標的組織上の細胞特異性表面分子に特異的に結合し、また組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子が当該標的組織に結合して、そして当該標的組織においてＺＮＲＦ３及びＲＮＦ４３から選択される１もしくは複数の膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼを取り込む（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒ）もしくはそのエンドサイトーシスを増加する、当該組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子、及びＷｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド、又はＷｎｔシグナル伝達アゴニスト、又はその薬理学的に許容可能な塩、と接触させることを含む、当該方法を含む。特定の実施形態においては、標的の組織又は細胞を、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列と、Ｗｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド又はＷｎｔシグナル伝達アゴニストをコードする核酸とを含むポリヌクレオチドと接触させる。他の実施形態においては、標的の組織又は細胞を、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列を含むベクターと、Ｗｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド又はＷｎｔシグナル伝達アゴニストをコードするベクターと接触させる。
【００２５】
さらに別の関連の実施形態においては、本発明は、それを必要とする対象において疾患又は症状を治療又は予防する方法であって、当該疾患又は症状がＷｎｔシグナル伝達の低下と関連する又はＷｎｔシグナル伝達の増加が有益であることとなるものであり、当該対象に、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子又はその薬理学的に許容可能な塩を含む有効量の医薬組成物を、単独で又はＷｎｔ、Ｎｏｒｒｉｎ、もしくはＷｎｔ活性化／模倣分子と組み合わせて提供することを含む、当該方法を含む。特定の実施形態においては、当該方法は、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ又はｍＲＮＡ）、又は組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列を含むベクター（例えば、発現ベクター又はウイルスベクター）を含む医薬組成物を、単独で用いて、又はＷｎｔポリペプチド、ＮｏｒｒｉｎポリペプチドもしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ又はｍＲＮＡ）もしくはＷｎｔポリペプチド、ＮｏｒｒｉｎポリペプチドもしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列を含むベクター（例えば、発現ベクター又はウイルスベクター）を含む医薬組成物と組み合わせて用いて実施する。
【００２６】
本明細書に記載する治療方法のいずれかの特定の実施形態においては、疾患又は障害は、あらゆる原因の急性肝不全、薬物誘発性の急性肝不全、アルコール性肝疾患、あらゆる原因の慢性肝不全、肝硬変、あらゆる原因の肝線維症、門脈圧亢進、あらゆる原因の慢性肝不全、末期肝疾患（ＥＳＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）（脂肪肝）、アルコール性肝炎、Ｃ型肝炎ウイルス誘発性の肝疾患（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス誘発性の肝疾患（ＨＢＶ）、他のウイルス性肝炎（例えば、Ａ型肝炎ウイルス誘発性の肝疾患（ＨＡＶ）及びＤ型肝炎ウイルス誘発性の肝疾患（ＨＤＶ））、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、肝臓の（ｌｉｖｅｒｙ）外科手術、肝損傷、肝移植、肝臓の外科手術及び移植における「過小グラフト（ｓｍａｌｌ  ｆｏｒ  ｓｉｚｅ）」症候群、先天性の肝疾患及び肝障害、その他の、遺伝性疾患、変性、加齢、薬物又は損傷によりもたらされる、肝臓の障害又はデテクト（ｄｅｔｅｃｔ）からなる群から選択される組織の肝臓の疾患又は障害である。本明細書に記載する治療又は予防方法のいずれかの特定の実施形態においては、医薬組成物は、全身的に、非経口的に、経口的に、筋肉内に、局在的に、又は局所的に、提供される。特定の実施形態においては、対象は、哺乳動物、随意にヒトである。
【００２７】
別の実施形態においては、本開示は、ＲＮＦ４３又はＺＮＲＦ３ポリペプチドに結合する単離された抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、（ｉ）表２Ａの抗体のいずれかに記載のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３の配列、ならびに／もしくは（ｉｉ）表２Ａの抗体のいずれかに記載のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３の配列を含む、当該抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、又は１もしくは複数のアミノ酸改変を含む当該抗体もしくはその抗原結合性フラグメントのバリアントであり、当該バリアントは、当該ＣＤＲ配列において８未満のアミノ酸置換を含む。ある実施形態においては、抗体又はその抗原結合性フラグメントは、表２Ｂもしくは配列番号７８〜１５０もしくは１６５〜１７０に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、又は表２Ｂもしくは配列番号７８〜１５０もしくは１６５〜１７０に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。特定の実施形態においては、抗体又はその抗原結合性フラグメントは、表２Ｂもしくは配列番号７８〜１５０もしくは１６５〜１７０に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は表２Ｂもしくは配列番号７８〜１５０もしくは１６５〜１７０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００２８】
別の実施形態においては、本開示は、ＡＳＧＲ１又はＡＳＧＲ２ポリペプチドに結合する単離された抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、（ｉ）表３Ａの抗体のいずれかに記載のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３の配列、ならびに／もしくは（ｉｉ）表３Ａの抗体のいずれかに記載のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３の配列を含む、当該抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、又は１もしくは複数のアミノ酸改変を含む当該抗体もしくはその抗原結合性フラグメントのバリアントを提供するものであり、当該バリアントは、当該ＣＤＲ配列において８未満のアミノ酸置換を含む。ある実施形態においては、抗体又はその抗原結合性フラグメントは、表３Ｂもしくは配列番号４７〜７７、１５１〜１５４、１７１〜１７９もしくは２７４〜３０５に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、又は表３Ｂもしくは配列番号４７〜７７、１５１〜１５４、１７１〜１７９もしくは２７４〜３０５に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。ある実施形態においては、抗体又はその抗原結合性フラグメントは、表３Ｂもしくは配列番号４７〜７７、１５１〜１５４、１７１〜１７９もしくは２７４〜３０５に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は表３Ｂもしくは配列番号４７〜７７、１５１〜１５４、１７１〜１７９もしくは２７４〜３０５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００２９】
特定の実施形態においては、抗体又はその抗原結合性フラグメントは、表３Ｃもしくは配列番号１８０〜１８５に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域又は軽鎖可変領域、又はそのフラグメントもしくはバリアントを含む。
【００３０】
本開示はまた、本明細書に開示する抗体又はその抗原結合性フラグメントのいずれかとの結合を競合する抗体及びその抗原結合性フラグメントも提供する。
【００３１】
関連の実施形態においては、本開示は、本明細書に開示する抗体又はその抗原結合性フラグメントのいずれかを含む医薬組成物を提供する。
【００３２】
さらなる実施形態においては、本開示は、肝臓の体重に対する比を増加させる、肝臓再生を促進する、肝細胞の増殖もしくは有糸分裂を増加させる、随意に慢性肝損傷の後で、肝線維症を減少させる、肝細胞機能を増加させる、又は肝臓における凝固時間を減少させるための方法であって、それを必要とする対象に、ＡＳＧＲ１又はＡＳＧＲ２ポリペプチドに結合する本明細書に開示する抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む有効量の医薬組成物を提供することを含む、当該方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
この特許又は出願書類は、色付きで作成された少なくとも１つの図面を含有する。色付きの図面を伴ったこの特許又は特許出願の公開公報の写しは、申請及び必要な料金の支払いをすると特許庁により提供されることとなる。
【００３４】
本開示の特徴は、特に、添付の特許請求の範囲に記載されている。当該特徴のよりよい理解と本発明の利点は、本発明の原理を利用する、説明的な実施形態を記載する以下の発明の詳細な説明と、添付の図面とを参照することにより得られることとなる。
【００３５】
【図１Ａ】図１Ａから１Ｄは、組織特異性Ｗｎｔシグナル伝達エンハンサー分子の設計である。（図１Ａ）４つのヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎタンパク質全てのアラインメント（Ｒｓｐｏ１（配列番号１）、Ｒｓｐｏ２（配列番号２）、Ｒｓｐｏ３（配列番号３）及びＲｓｐｏ４（配列番号４）、フューリンドメイン１（Ｆｕ１）及び２（Ｆｕ２）は、それぞれ明るい影と暗い影をつけた。Ｆｕ１ドメインは、概して、配列番号１のアミノ酸残基３８〜９４辺り、配列番号２のアミノ酸残基３７〜９３辺り、配列番号３のアミノ酸残基３９〜９５辺り、及び配列番号４のアミノ酸残基３２〜８８に対応する。Ｆｕ２ドメインは、概して、配列番号１のアミノ酸残基９７〜１４４辺り、配列番号２のアミノ酸残基９６〜１４３辺り、配列番号３のアミノ酸残基９８〜１４４辺り、及び配列番号４のアミノ酸残基９１〜１３７に対応する。（図１Ｂ）説明的な設計された分子の図。Ｆｕ１ドメイン及びＦｕ２ドメイン（作用モジュール）にわたるＲＳＰＯ２のフラグメントを、ｓｃＦｖ抗体（ターゲティングモジュール）のＣ末端に融合させ、配列番号５〜１６に記載のポリヌクレオチド及びポリペプチドの配列に相当する図１Ｂに示すコンストラクトを生成した。Ｆｕ１ドメイン及びＦｕ２ドメインにおける特異的変異を示す。（図１Ｃ）図示される融合タンパク質の抗ＧＦＰ系列及び抗ＡＳＧＲ１系列に結合するＬＧＲ５のバイオレイヤー干渉法解析。１１１ｎＭのＲＳＰＯ２由来融合タンパク質での結合アッセイのステップ全体を、上図に示している。会合段階及び解離段階から構成される結合反応を、挿入したボックス内に別個に示している。７つの異なる濃度よりの会合段階の１４０〜１４５秒の間における平均反応を、定常状態解析で解析して、ＫＤ値を求めた（下図）。（図１Ｄ）図示される、ＲＮＦ４３及びＺＮＲＦ３への図示したコンストラクト（配列番号４３〜４６）の結合の解析。
【図１Ｂ】同上。
【図１Ｃ−１】同上。
【図１Ｃ−２】同上。
【図１Ｄ−１】同上。
【図１Ｄ−２】同上。
【図１Ｄ−３】同上。
【図１Ｄ−４】同上。
【図２Ａ】図２Ａから２Ｃは、肝細胞特異性Ｗｎｔシグナル伝達エンハンサー分子のインビトロ活性である。（図２Ａ）ＨＥＫ２９３細胞、Ｈｕｈ−７細胞及びＡ４３１細胞におけるＡＳＧＲ１及びＡＳＧＲ２（上）ならびにＴＦＲＣ（下）の遺伝子発現レベルの半定量ＰＣＲ解析（遺伝子毎に左から右に向かって示されている）。信号は、ＡＣＴＢで正規化した。（図２Ｂ）外因性Ｗｎｔ源（３０％  Ｗｎｔ３ａ馴化培地）の存在下（左グラフ）又は不在下（右グラフ）での、ＨＥＫ２９３（上方グラフ）又はＨｕｈ−７（下方グラフ）における特定のタンパク質（配列番号５〜１６）のＳｕｐｅｒＴＯＰ  Ｆｌａｓｈ（ＳＴＦ）レポーター活性。（図２Ｃ）Ｈｕｈ−７細胞におけるＬＲＰ６受容体及びリン酸化ＤＶＬ２におけるウエスタンブロット解析。星印は、使用した抗体によってＨｕｈ−７において検出された非特異的結合を示す。矢印で示した下方のバンドは、リン酸化を伴う又は伴わないＤＶＬ２に相当する。ローディングコントロールとして、チューブリン（ＴＵＢ）を用いる。
【図２Ｂ】同上。
【図２Ｃ】同上。
【図３Ａ】図３Ａから３Ｃは、標的受容体に対する特異性Ｗｎｔシグナルエンハンサー活性の依存性である。（図３Ａ）外因性Ｗｎｔ源（３０％  Ｗｎｔ３ａ馴化培地）の存在下（左）又は不在下（右）のいずれかで、ＴＦＲＣ（対照としてのトランスフェリン受容体ＴＦＲ１をコードする。上）、ＡＳＧＲ１（中）、及びＡＳＧＲ２を伴うＡＳＧＲ１（下）により一過性導入したＨＥＫ２９３細胞におけるＳＴＦ活性。（図３Ｂ）特定された発現に対する、ＴＦＲＣ又はＡＳＧＲ１によるＡ４３１細胞におけるＳＴＦ活性。（図３Ｃ）Ｆｚｄタンパク質の細胞表面レベルのフローサイトメトリー解析。ＨＥＫ２９３細胞を、ＺＮＲＦ３単独（上）又はＡＳＧＲ１及びＺＮＲＦ３（下）のいずれかで一過性導入して、１０ｎＭで特定した融合タンパク質により処理して、次いでｐａｎ−Ｆｚｄ抗体１８Ｒ５で染色した。
【図３Ｂ】同上。
【図３Ｃ】同上。
【図４Ａ】図４Ａから４Ｅは、異なる受容体ＴＦＲ１を標的とする別の分子による機序の検証である。（図４Ａ）バイオレイヤー干渉法解析による、抗ＴＦＲ１系列の融合コンストラクト（配列番号１７〜２２）のＬＧＲ５結合。１１１ｎＭのＲＳＰＯ２由来融合タンパク質での結合アッセイのステップ全体を、上図に示している。会合段階及び解離段階からなる結合反応を、挿入したボックス内に別個に示している。７つの異なる濃度よりの会合段階の１４０〜１４５秒の間における平均反応を、定常状態解析で解析して、ＫＤ値を求めた（下図）。（図４Ｂ）左から右に向けて下方グラフに示したαＴＦＲ−ＲＳＰＯ２、αＴＦＲ−ＲＳＰＯ２−ＲＡ及びαＴＦＲ−ＲＰＯＳ−５ｍｕｔに関する定常状態フィッティング解析による、ＲＮＦ４３（左）及びＺＮＲＦ３（右）への抗ＴＦＲ１系列の融合コンストラクトの結合の解析。（図４Ｃ）外因性Ｗｎｔ源（３０％  Ｗｎｔ３ａ馴化培地）の存在下（左）又は不在下（右）での、ＨＥＫ２９３（上）又はＨｕｈ−７（下）の特定されたタンパク質のＳＴＦ活性。（図４Ｄ）ＨＥＫ２９３細胞におけるＬＲＰ６受容体及びリン酸化ＤＶＬ２におけるウエスタンブロット解析。ローディングコントロールとして、チューブリン（ＴＵＢ）を用いる。（図４Ｅ）融合タンパク質又は対照での処理後のＦｚｄタンパク質の細胞表面レベルのフローサイトメトリー解析。ＨＥＫ２９３細胞を、ＺＮＲＦ３で一過性導入して、１０ｎＭで特定した融合タンパク質により処理して、次いでｐａｎ−Ｆｚｄ抗体１８Ｒ５で染色した。
【図４Ｂ】同上。
【図４Ｃ】同上。
【図４Ｄ】同上。
【図４Ｅ】同上。
【図５Ａ】図５Ａから５Ｄは、肝細胞特異性Ｗｎｔシグナル増強分子による、Ｗｎｔ反応遺伝子Ａｘｉｎ２の誘発である。（図５Ａ）外因性Ｗｎｔ源（３０％  Ｗｎｔ３ａ馴化培地）の存在下（左）又は不在下（右）での、ＨＥＫ２９３（上）又はＨｕｈ−７（下）におけるＩｇＧ形態の標的Ｗｎｔシグナル増強分子（配列番号２３〜３４）のＳＴＦ活性。（図５Ｂ）実験設計。α−ＧＦＰ−ＩｇＧ（配列番号２５〜２６及び３３〜３４）、Ｆｃ−ＲＳＰＯ２−ＷＴ（配列番号２３〜２４）、αＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ（配列番号２５〜２８）又はαＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ（配列番号２９〜３１）（一群当たりｎ＝８マウス）の腹腔内注射８時間後の、（図５Ｃ）肝臓及び（図５Ｄ）小腸のＡｘｉｎ２の発現。統計解析は１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡで行った：（ｎｓ）有意でない（ｎｏｔ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）、（＊）ｐ＜０．０５、（＊＊）ｐ＜０．０１、（＊＊＊）ｐ＜０．００１。
【図５Ｂ】同上。
【図５Ｃ】同上。
【図５Ｄ】同上。
【図６Ａ】図６Ａから６Ｅは、肝細胞特異性Ｗｎｔシグナル増強分子による（配列番号２５〜３４）、増殖マーカーＫｉ−６７の肝臓特異的誘発である。（図６Ａ）実験設計。（図６Ｂ）特定された、処理４８時間後のＭｋｉ６７の肝臓発現の半定量ＰＣＲ解析（一群当たりｎ＝１０マウス）。（図６Ｃ）処理後の１０倍（１０×）対物レンズ下の視野ごとの、肝臓におけるＫｉ−６７＋実質細胞核の平均数。統計解析は１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡで行った：（＊＊）ｐ＜０．０１、（＊＊＊＊）ｐ＜０．０００１。（図６Ｄ）Ｋｉ６７タンパク質のために染色した肝臓切片の代表的な画像。（図６Ｅ）小腸におけるＭｋｉ６７発現の半定量ＰＣＲ解析。
【図６Ｂ】同上。
【図６Ｃ】同上。
【図６Ｄ】同上。
【図６Ｅ】同上。
【図７Ａ】図７Ａから７Ｃは、ｈＡＳＧＲ１／２に対するバインダーの特性決定の例である。（図７Ａ）ファージディスプレイ法で同定した３つのＦａｂ抗体（０２４Ｓ−Ｄ０３、−Ｅ０３、及び−Ａ０４；配列番号４７〜５２）のｈＡＳＧＲ１結合のバイオレイヤー干渉法解析。上図はセンサーグラムであり、また下図は、ＫＤを求めるための定常状態フィッティング解析である。（図７Ｂ）ハイブリドーマ成長よりのｈＡＳＧＲ２に対する２つのＦａｂの結合（ＡＢＶ−３Ｄ１１及び−１０Ｂ８；配列番号１５１〜１５４）。（図７Ｃ）ハイブリドーマ成長よりのｈＡＳＧＲ１に対する２つのＦａｂの結合（ＬＰ１−２Ｉ１３及びＬＰ１−８Ｍ２４；配列番号２８４〜２８５及び２９８〜２９９）。
【図７Ｂ】同上。
【図７Ｃ】同上。
【図８】図８は、説明的な肝臓特異性Ｗｎｔシグナル伝達エンハンサーの図である。ある実施形態においては、ターゲティングモジュールは、ｈＡＳＧＲ１もしくはｈＡＳＧＲ２に対するＩｇＧ抗体であり得、及び／又は、作用モジュールは、野生型のもしくは変異の活性をもつＲＳＰＯ誘導体であることが可能である。ＲＳＰＯ誘導体は、ＩｇＧの異なる位置（軽鎖又は重鎖のＮ末端又はＣ末端）に付加することが可能である。ある実施形態においては、活性化ドメインは、例えばナノボディ（ｎＡｂ）、単鎖可変領域（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂフラグメント又は完全ＩｇＧの形態でヒトＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に結合する抗体又はその抗原結合性フラグメントであり得る。ｎＡｂ及びｓｃＦｖと異なり、Ｆａｂは２つのポリペプチド鎖を含有するが、このいずれもが、例えば共有結合的に、ターゲティングモジュールに結合し得る。複合型ＩｇＧは、ターゲティングモジュールとしての１つのＦａｂと、作用モジュールとしての別のＦａｂとを含有する、別の随意の構成である。さらに、ある構成においては、ターゲティングモジュールはｎＡｂ／ｓｃＦｖ／Ｆａｂ形態であり得る一方で、作用モジュールは、ＩｇＧ形態である（図示せず）。
【図９Ａ】図９Ａから９Ｄは、未感作健常マウスにおける肝臓特異性Ｗｎｔシグナル伝達エンハンサーの用量漸増（Ｄｏｓｅ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）である。（図９Ａ）αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ（Ｆａｂとして発現、配列番号２９〜３０及び１６１〜１６２）を構築するために用いたＡＳＧＲ１抗体の異種間反応性のバイオレイヤー干渉法解析。ヒト及びマウスのＡＳＧＲ１  ＥＣＤ（配列番号３５〜３６及び１６３〜１６４）を用いた。曲線モデルフィッティングで求めたＫｄを示した。肝臓（上方パネル）及び小腸（下方パネル）における（図９Ｂ）Ａｘｉｎ２及び（図９Ｃ）Ｋｉ６７の発現を、特定されたタンパク質の腹腔内注射４８時間後の半定量ＰＣＲによって解析した（一群当たりｎ＝８マウス）。統計解析は１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡで行った：（ｎｓ）有意でない（ｎｏｔ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）、（＊）ｐ＜０．０５、（＊＊）ｐ＜０．０１、（＊＊＊）ｐ＜０．００１。（図９Ｄ）１０ｍｇ／ｋｇの処理群よりの肝臓試料の免疫組織化学染色。抗β−ガラクトシダーゼ（α−β−Ｇａｌ−ＩｇＧ、配列番号１５５〜１５８）は、対照として用いた中性抗体であった。試験した他のタンパク質の配列番号は、図５の凡例に記載するとおりである。
【図９Ｂ】同上。
【図９Ｃ】同上。
【図９Ｄ】同上。
【図１０Ａ】図１０Ａから１０Ｄは、慢性肝疾患のＴＡＡマウスモデルにおける標的ＲＳＰＯ模倣性の効能である。（図１０Ａ）正常マウス及びＴＡＡ処理マウスにおけるＷｎｔリガンド、及びＲｓｐｏ遺伝子の半定量ＰＣＲ解析。（図１０Ｂ）実験設計。（図１０Ｃ）肝臓（上方）及び小腸（下方）での、Ａｘｉｎ２（左）及びＫｉ６７（右）の遺伝子発現の半定量ＰＣＲ解析（一群当たりｎ＝１０マウス）。（図１０Ｄ）処理中のプロトロンビン時間の国際標準比（ＩＮＲ）。統計解析は１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡで行った：（＊＊）ｐ＜０．０１、（＊＊＊＊）ｐ＜０．０００１（一群当たりｎ＝１０マウス）。抗β−ガラクトシダーゼ（α−β−Ｇａｌ−ＩｇＧ、配列番号１５５〜１５６及び１５９〜１６０）は、対照として用いた中性抗体であった。試験した他のタンパク質の配列番号は、図５の凡例に記載するとおりである。
【図１０Ｂ】同上。
【図１０Ｃ】同上。
【図１０Ｄ】同上。
【図１１Ａ】図１１Ａから１１ＢＲは、Ｗｎｔシグナルエンハンサー成分の配列である。
【図１１Ｂ】同上。
【図１１Ｃ】同上。
【図１１Ｄ】同上。
【図１１Ｅ】同上。
【図１１Ｆ】同上。
【図１１Ｇ】同上。
【図１１Ｈ】同上。
【図１１Ｉ】同上。
【図１１Ｊ】同上。
【図１１Ｋ】同上。
【図１１Ｌ】同上。
【図１１Ｍ】同上。
【図１１Ｎ】同上。
【図１１Ｏ】同上。
【図１１Ｐ】同上。
【図１１Ｑ】同上。
【図１１Ｒ】同上。
【図１１Ｓ】同上。
【図１１Ｔ】同上。
【図１１Ｕ】同上。
【図１１Ｖ】同上。
【図１１Ｗ】同上。
【図１１Ｘ】同上。
【図１１Ｙ】同上。
【図１１Ｚ】同上。
【図１１ＡＡ】同上。
【図１１ＡＢ】同上。
【図１１ＡＣ】同上。
【図１１ＡＤ】同上。
【図１１ＡＥ】同上。
【図１１ＡＦ】同上。
【図１１ＡＧ】同上。
【図１１ＡＨ】同上。
【図１１ＡＩ】同上。
【図１１ＡＪ】同上。
【図１１ＡＫ】同上。
【図１１ＡＬ】同上。
【図１１ＡＭ】同上。
【図１１ＡＮ】同上。
【図１１ＡＯ】同上。
【図１１ＡＰ】同上。
【図１１ＡＱ】同上。
【図１１ＡＲ】同上。
【図１１ＡＳ】同上。
【図１１ＡＴ】同上。
【図１１ＡＵ】同上。
【図１１ＡＶ】同上。
【図１１ＡＷ】同上。
【図１１ＡＸ】同上。
【図１１ＡＹ】同上。
【図１１ＡＺ】同上。
【図１１ＢＡ】同上。
【図１１ＢＢ】同上。
【図１１ＢＣ】同上。
【図１１ＢＤ】同上。
【図１１ＢＥ】同上。
【図１１ＢＦ】同上。
【図１１ＢＧ】同上。
【図１１ＢＨ】同上。
【図１１ＢＩ】同上。
【図１１ＢＪ】同上。
【図１１ＢＫ】同上。
【図１１ＢＬ】同上。
【図１１ＢＭ】同上。
【図１１ＢＮ】同上。
【図１１ＢＯ】同上。
【図１１ＢＰ】同上。
【図１１ＢＱ】同上。
【図１１ＢＲ】同上。
【図１２】図１２は、説明的なＣＣｌ４誘発性肝線維症マウスモデル及び処理プロトコールの図である。８〜９週齢Ｃ５７ＢＬ／６の雄（ジャクソン研究所（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を、はじめの１０日間は断続的にＣＣｌ４（１、４、７、１０日目に０．５ｍＬ／ｋｇ、青矢印）と合わせてアリルアルコール（０．０１２５ｍＬ／ｋｇで、２、５、８日目の黄色矢印）で、その後８週間、２回／週でＣＣｌ４処理（０．５ｍＬ／ｋｇ、青矢印）した。ＣＣｌ４処理後、マウスに、２週間タンパク質を投与した。処理群は以下のとおりである：タンパク質なし対照、ｎ＝８；１０ｍｐｋ  抗βＧａｌ、ｎ＝８（２回／週の投与）；４．６ｍｐｋ  ＲＳＰＯ２、ｎ＝７（２回／週の投与）；１０ｍｐｋ  抗ｅＧＦＰ−ｍｕｔＲｓｐｏ２、ｎ＝８（毎日投与）；１０ｍｐｋ  αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ２、ｎ＝８（毎日投与）。ＣＣｌ４処理なし（オリーブ油担体、０．５ｍＬ／ｋｇ）、ｎ＝８；未感作対照、ｎ＝７を、さらなる対照群に含めた。ＩＮＲ（国際標準比）試験のために、６９、７２、７６日目にマウスを採血した。全てのマウスを、８３日目に終了処置した。
【図１３】図１３は、ＣＣｌ４誘発性線維症モデルの様々な処理群のシリウスレッド染色率である。図１３は、示したタンパク質処理の２週間後のマウス肝臓におけるコラーゲンのシリウスレッド染色を示すグラフである。＊はαＡＳＧＲ−１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ対αｅＧＦＰ−ｍｕｔＲＳＰＯ２の統計学的有意性を表し（ｐ＜０．０５）、＊＊はＦｃ−ＲＳＰＯ２−ＷＴ対αｅＧＦＰ−ｍｕｔＲＳＰＯ２の統計学的有意性を表し、＊＊＊はαＡＳＧＲ−１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ対αβｇａｌの統計学的有意性を表し、＊＊＊＊はＦｃ−ＲＳＰＯ２−ＷＴ対αβｇａｌの統計学的有意性を表す。
【図１４Ａ】図１４Ａから１４Ｄは、内部的なハイブリドーマ由来ＡＳＧＲ１バインダーにより構築されたＲＳＰＯ模倣分子のインビトロ肝細胞特異性活性である。融合タンパク質（配列番号１９０〜２７１）は、ＡＳＧＲ１バインダーの、ＩｇＧ２重鎖のＣ末端に（図１４Ａ及び図１４Ｂ）、又はＩｇＧ１（Ｎ２９７Ｇ）重鎖のＮ末端に（図１４Ｃ及び図１４Ｄ）に、変異体ＲＳＰＯ２を連結することによって構築した。精製したタンパク質は、外因性Ｗｎｔ代替分子（１００ｐＭのＲ２Ｍ３−２６、国際公開第２０１９１２６３９８号に記載）の存在下で、ＨＥＫ２９３（上方グラフ）又はＨｕｈ-７（下方グラフ）におけるそれらのＳｕｐｅｒＴｏｐ  Ｆｌａｓｈ（ＳＴＦ）レポーター活性を試験した。用いた対照は以下のものである：Ｆｃ-ＲＳＰＯ２-ＷＴ（配列番号２３〜２４）、αＧＦＰ-ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ（重鎖のＮ末端に付加したＲＳＰＯ２、配列番号２５〜２８；又は重鎖のＣ末端に付加したＲＳＰＯ２、配列番号２５〜２６及び１８８〜１８９）、又はα−β−Ｇａｌ−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ（重鎖のＣ末端に付加したＲＳＰＯ２、配列番号１５５〜１５６及び１８６〜１８７）。各パネルに、Ｆｃ−ＲＳＰＯ陽性対照と比較したＥＣ５０及びＥｍａｘをまとめた表を示した。
【図１４Ｂ】同上。
【図１４Ｃ】同上。
【図１４Ｄ】同上。
【図１５Ａ】図１５は、内部ハイブリドーマバインダーより誘導したＲＳＰＯ模倣分子による、Ｗｎｔ反応遺伝子、肝臓Ａｘｉｎ２、の誘発である。マウスに、タンパク質投与の５日前に、それぞれＡＡＶ−ＴＢＧ−ｈＡＳＧＲ１及びＡＡＶ−ＴＢＧ−ｈＡＳＧＲ２の１×１０１１個のゲノム粒子を注射した。タンパク質投与の２４時間後に、肝臓試料を採取して、半定量ＰＣＲ解析のために処理した。（Ａ）当該実験で用いた、配列番号、名称、投与量及びマウスの数。（Ｂ）腹腔内注射後の、Ａｘｉｎ２の肝臓発現。統計解析は１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡで行った：（＊＊）ｐ＜０．０１、（＊＊＊）ｐ＜０．００１。
【図１５Ｂ】同上。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本開示は、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子を提供するものであり、ある実施形態においては、当該分子は、１）組織もしくは細胞に特異的な細胞表面受容体に選択的に結合する、２）標的の組織もしくは細胞型におけるＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３のインターナリゼーションもしくは取り込み（ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ）を介在する、及び／又は３）組織特異性的にＷｎｔシグナル伝達を増強する。ある実施形態においては、当該分子は、融合タンパク質である。ある実施形態においては、当該分子は、さらなる付加した結合ドメインを有する抗体である。例えば疾患又は障害の治療又は予防のために、標的の組織又は細胞型におけるＷｎｔシグナル伝達を増強、すなわち増加させるために本明細書に開示する組成物のいずれかの、医薬組成物及びその使用方法もまた提供する。特定の実施形態においては、分子は、肝臓組織に結合し、また肝臓組織又は肝細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を増加させるために用いられ得る。本発明の、これらの他の目的、利点及び特徴は、以下により完全に記載される組成物及び方法の詳細を一読すれば、当業者には明らかになることとなる。
【００３７】
定義
本明細書で用いる場合、「ベクター」は、ポリヌクレオチドを含む又はポリヌクレオチドと結合する巨大分子又は巨大分子の会合を指し、またそれを用いて、当該ポリヌクレオチドの細胞への送達を介在することが可能である。説明的なベクターには、例えば、プラスミド、ウイルスベクター、リポソーム、及び他の遺伝子送達ビヒクルが挙げられる。
【００３８】
「ポリヌクレオチド」の語は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、又はその類似体を含む、任意の長さのヌクレオチドの多量体形態を指す。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体等の改変ヌクレオチドを含み得、また非ヌクレオチド要素によって中断されていてもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する改変は、ポリマーの構築前又は構築後になされ得る。本明細書で用いる場合、ポリヌクレオチドの語は、区別なく、二本鎖及び一本鎖の分子を指す。別段に特定又は要求されない限り、ポリヌクレオチドである本明細書に記載の発明のいずれの実施形態も、二本鎖の形態と、二本鎖形態を作ることがわかっている又は予測される２つの相補的な一本鎖形態のそれぞれとの両方を包含する。
【００３９】
ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、別のポリヌクレオチド又はポリペプチドに対するある特定のパーセント「配列同一性」を有し、これは、アラインしたときに、２つの配列を比較して同一である塩基又はアミノ酸の百分率を意味する。配列類似性は、いくつかの異なるやり方で決定することが可能である。配列同一性を決定するために、ワールドワイドウェブを介してｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／で利用可能であるＢＬＡＳＴを含めた方法及びコンピュータプログラムを用いて、配列をアラインすることが可能である。別のアラインメントアルゴリズムはＦＡＳＴＡであり、これはＯｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐ社の完全所有子会社である、米国ウィスコンシン州マディソンのＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）のパッケージで利用可能である。アラインメントのための他の技術は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２６６：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（１９９６），ｅｄ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ａ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈａｒｃｏｕｒｔ  Ｂｒａｃｅ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡに記載されている。配列内のギャップを許容するアラインメントプログラムが特に関心のものである。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列アラインメント内のギャップを許容するアルゴリズムの１つのタイプである。Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３−１８７（１９９７）を参照されたい。またＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアラインメント法を用いたＧＡＰプログラムを利用して配列をアラインすることも可能である。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）を参照されたい。
【００４０】
ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１））の配列同一性を決定するための局所的相同性アルゴリズムを用いたＢｅｓｔＦｉｔプログラムも関心のものである。ギャップ生成ペナルティは、概して、１から５の範囲に及ぶこととなり、通常は２から４であり、また多くの実施形態においては３となることとなる。ギャップ伸長ペナルティは、概して、約０．０１から０．２０の範囲に及ぶこととなり、また多くの実施例においては０．１０となることとなる。プログラムは、比較対象である入力された配列によって決定されるデフォルトパラメータを有する。好ましくは、配列同一性は、プログラムによって決定されるデフォルトパラメータを用いて決定する。このプログラムもまた、米国ウィスコンシン州マディソンのＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）のパッケージから利用可能である。
【００４１】
別の関心のプログラムは、ＦａｓｔＤＢアルゴリズムである。ＦａｓｔＤＢは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．１２７−１４９，１９８８，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．に記載されている。パーセント配列同一性は、以下のパラメータに基づいてＦａｓｔＤＢで算出される：ミスマッチペナルティ：１．００；ギャップペナルティ：１．００；ギャップサイズペナルティ：０．３３；及びジョイニングペナルティ（Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｐｅｎａｌｔｙ）：３０．０。
【００４２】
ポリヌクレオチドに用いる場合、「組換え」は、当該ポリヌクレオチドが、クローニング、制限、又は連結のステップと、天然に存在するポリヌクレオチドとは区別されるコンストラクトを結果的にもたらす他の手順との様々な組み合わせの産物であることを意味する。
【００４３】
「制御因子」又は「制御配列」は、ポリヌクレオチドの複製、重複、転写、スプライシング、翻訳又は分解を含めた、ポリヌクレオチドの機能調節に寄与する分子の相互作用に関与するヌクレオチド配列である。当該調節は、プロセスの頻度、速度又は特異性に影響を及ぼし得、また実際は増強すること又は抑制であり得る。当技術で公知の制御因子は、例えば、プロモーター及びエンハンサー等である、転写調節配列が挙げられる。プロモーターは、ある条件下でＲＮＡポリメラーゼに結合して、プロモーターから下流（３’方向に）に通常位置するコード領域の転写を開始することが可能であるＤＮＡ領域である。
【００４４】
「作動的に連結した（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」又は「操作可能に連結した（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」は、遺伝因子が近位であることを指すものであって、当該因子同士が、それらを予想される様式で作動することを許容する関係にある。例えば、プロモーターは、当該プロモーターがコード配列の転写の開始を促進するならば、コード領域に作動的に連結している。プロモーターとコード領域との間には、その機能的関係が維持される限り、その間に入る残基が存在してもよい。
【００４５】
「発現ベクター」は、関心の遺伝子産物をコードする領域を含むベクターであり、また意図した標的細胞において当該遺伝子産物の発現を生じさせるために用いられる。発現ベクターはまた、コード領域に作動的に連結した制御因子を含み、標的において遺伝子産物の発現を促進する。発現のためにそれらが操作可能に連結する、制御因子と遺伝子との組み合わせは、「発現カセット」と呼ぶこともあり、当技術で大量の発現カセットが公知で利用可能であるか、又は当技術で利用可能である構成要素から容易に構築可能である。
【００４６】
本明細書で用いる場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」の語は、任意の長さのアミノ酸の高分子を指す。当該語はまた、例えばジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、リン酸化、又は標識成分との結合を含めるように、改変されたアミノ酸高分子を包含する。
【００４７】
本明細書で用いる場合、「抗体」の語は、抗原性エピトープに特異的に結合する必要な可変領域配列を含む、単離された又は組換えの結合剤を意味する。したがって、抗体は、例えば特定の標的抗原に結合する、所望の生物学的活性を呈する抗体又はそのフラグメントの任意の形態である。すなわち、それは最も広義で用いて、特にモノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ナノボディ、ダイアボディ、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ならびに所望の生物学的活性を呈する限り、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ及びＦａｂ２を含むがこれに限定されない抗体フラグメントをカバーする。
【００４８】
「抗体フラグメント」は、例えばインタクトな抗体の抗原結合性領域又は可変領域である、インタクトな抗体の部分を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント；ダイアボディ；線状抗体（例えば、Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５））；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）及び抗体フラグメントから形成される多特異性抗体が挙げられる。抗体のパパイン消化により、それぞれが単一抗原結合部位をもつ「Ｆａｂ」フラグメントと、容易に結晶化する能力を反映した命名である、残りの「Ｆｃ」フラグメントと呼ばれる、２つの同一の抗原結合性フラグメントが産生される。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有してそれでもなお抗原を架橋結合することが可能である、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントが生じる。
【００４９】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、記載した要素が、例えば組成物、方法、キット等において必要であるが、特許請求の範囲の範囲内で、他の要素を含んで、例えば組成物、方法、キット等を形成してもよいということを意味する。例えば、プロモーターに操作可能に連結した治療用ポリペプチドをコードする遺伝子を「含む」発現カセットは、例えばポリアデニル化配列、エンハンサー要素、他の遺伝子、リンカードメイン等の遺伝子及びプロモーターに加えて他の要素を含んでもよい発現カセットである。
【００５０】
「実質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、例えば組成物、方法、キット等の基本的かつ新規の特性に実質的に影響を及ぼさない特定された材料又はステップに対して記載された、例えば組成物、方法、キット等の範囲の限定を意味する。例えば、「実質的に」プロモーターに操作可能に連結した治療用ポリペプチドをコードする遺伝子及びポリアデニル化配列「からなる」発現カセットは、それらが遺伝子の転写又は翻訳に実質的に影響を及ぼさない限り、例えばリンカー配列であるさらなる配列を含んでもよい。別の例としては、「実質的に」記載の配列「からなる」バリアント又は変異体、ポリペプチドフラグメントは、その由来である全長の未感作ポリペプチドに基づいて、配列の境界において約１０個のアミノ酸残基を足した又は引いた、当該記載の配列のアミノ酸配列を有し、例えば記載の境界のアミノ酸残基よりも１０、９、８、７、６、５、４、３、２もしくは１個の残基が少ない又は記載の境界のアミノ酸残基よりも１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個の残基が多い。
【００５１】
「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、特許請求の範囲において特定されていない任意の要素、ステップ又は成分を、組成物、方法又はキットから除外することを意味する。例えば、記載の配列「からなる」ポリペプチド又はポリペプチドのドメインは、当該記載の配列のみを含有する。
【００５２】
本明細書で用いる場合、「発現ベクター」は、関心の遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを含む、例えば本明細書で述べた又は当技術で公知のプラスミド、ミニサークル、ウイルスベクター、リポソーム等であるベクターを包含し、そして意図した標的細胞における遺伝子産物の発現を生じさせるために用いる。発現ベクターはまた、コード領域に作動的に連結した制御因子を含み、標的において遺伝子産物の発現を促進する。例えばプロモーター、エンハンサー、ＵＴＲ、ｍｉＲＮＡ標的配列等である制御因子と、それらが発現のために操作可能に連結する遺伝子との組み合わせを、「発現カセット」と呼ぶことがある。こうした制御因子の多数が当技術で公知であり利用可能であるか、又は当技術で利用可能である構成要素から容易に構築することが可能である。
【００５３】
本明細書で用いる場合「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を司りそれによってＲＮＡ合成を促進するＤＮＡ配列、すなわち転写を司るのに十分である最小限の配列、を包含する。プロモーター及び対応するタンパク質又はポリペプチドの発現は遍在性であり得、細胞、組織及び種の広い範囲において又は細胞型特異的、組織特異的又は種特異的な、強い活性を意味する。プロモーターは、絶えず活性であることを意味する「恒常的」であり得るか、又は生物的要因又は非生物的要因の存在又は不在によって、プロモーターが活性化する又は非活性化することが可能であることを意味する「誘発的」であり得る。また本発明の核酸コンストラクト又はベクターには、プロモーター配列と近接し得る又は近接し得ないエンハンサー配列が含まれる。エンハンサー配列は、プロモーター依存性遺伝子発現に影響し、また天然遺伝子の５’又は３’領域に位置し得る。
【００５４】
本明細書で用いる場合、「天然（ｎａｔｉｖｅ）」又は「野生型」の語は、野生型の細胞、組織、器官又は有機体に存在する、例えば遺伝子であるヌクレオチド配列又は例えばＲＮＡもしくはタンパク質である遺伝子産物を指す。本明細書で用いる場合、「バリアント」の語は、例えば天然のポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列である、参照のポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列の変異体を指し、すなわち、当該参照のポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列と１００％未満の配列同一性を有する。言い換えれば、バリアントは、例えば天然のポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列である参照ポリヌクレオチド配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸の相違（例えば、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失）を含む。例えば、バリアントは、全長天然ポリヌクレオチド配列と５０％以上、６０％以上、又は７０％以上の配列同一性、例えば全長天然ポリヌクレオチド配列と、例えば８５％、９０％又は９５％又はそれ以上等である７５％又は８０％又はそれ以上の同一性、例えば９８％又は９９％の同一性、を有するポリヌクレオチドであり得る。別の例としては、バリアントは、全長天然ポリペプチド配列と７０％以上の配列同一性、例えば全長天然ポリペプチド配列と、例えば８５％、９０％又は９５％又はそれ以上等である７５％又は８０％又はそれ以上の同一性、例えば９８％又は９９％の同一性、を有するポリペプチドであり得る。バリアントはまた、例えば天然である参照配列のフラグメントと７０％以上の配列同一性、例えば、天然配列と８５％、９０％又は９５％又はそれ以上等である７５％又は８０％又はそれ以上の同一性、例えば９８％又は９９％の同一性、を共有する例えば天然である参照配列のバリアントフラグメントを含み得る。
【００５５】
本明細書で用いる場合、「生物学的活性」及び「生物学的に活性である」の語は、細胞における特定の生物学的要素によって生じる活性を指す。例えば、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ又はそのフラグメントもしくはバリアントの「生物学的活性」は、Ｗｎｔシグナルを増強する能力を指す。別の例としては、ポリペプチド又はその機能フラグメントもしくはバリアントの生物学的活性は、当該ポリペプチド又はその機能フラグメントもしくはバリアントの、例えば結合、酵素的活性等であるそれがもつ本来の機能を実行する能力を指す。第３の例としては、例えばプロモーター、エンハンサー、Ｋｏｚａｋ配列等である遺伝子調節因子の生物学的活性は、調節因子又はその機能フラグメントもしくはバリアントの、それが操作可能に連結されている遺伝子の発現を調節する、すなわちそれぞれ当該遺伝子の翻訳を促進、増強又は活性化する、能力を指す。
【００５６】
本明細書で用いる場合、「投与すること」又は「導入すること」又は「提供すること」の語は、組成物を、対象の、ある細胞へ、細胞へ、組織へ及び／又は器官へ、又は対象へ送達することを指す。こうした投与すること又は導入することは、インビボで、インビトロで、又はエキソビボで実施され得る。
【００５７】
「治療」、「治療すること」等の語は、概して、所望の薬理学的効果及び／又は生理的効果を獲得することを意味するために本明細書で用いる。当該効果は、疾患もしくはその症状が対象において発症する可能性を軽減することである、当該疾患もしくはその症状を完全にもしくは部分的に予防する点において予防的であり得、ならびに／又は、疾患及び／もしくは疾患に帰する悪影響の部分的もしくは完全な治癒の点で治療的であり得る。本明細書で用いる場合、「治療」は、哺乳動物における疾患のあらゆる治療をカバーし、また（ａ）疾患にかかり易い可能性があるがまだ罹患していると診断されていない対象において疾患が生じるのを予防すること、（ｂ）疾患を阻害すること、すなわちその成長を抑制すること、又は（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち疾患の退行を引き起こすこと、を含む。治療薬は、疾患又は障害の発症前、発症中又は発症後に投与され得る。患者の望ましくない臨床症状が治療により安定化する又は軽減するような、進行中の疾患の治療が、特に関心のものである。こうした治療は、影響を受ける組織における機能の喪失が完了する前に実施することが望ましい。主題の療法は、疾患の徴候段階の間に、また一部の場合では疾患の徴候段階の後で、投与することが望ましいこととなる。
【００５８】
「個体」、「宿主」、「対象」、及び「患者」の語は、本明細書で区別なく用いられ、サル及びヒトを含むヒト及び非ヒト霊長類；スポーツ用哺乳動物（例えば、ウマ）；家畜哺乳動物（例えば、ヒツジ、ヤギ等）；愛玩用哺乳動物（イヌ、ネコ等）ならびにげっ歯類（例えば、マウス、ラット等）を含むがこれに限定されない、哺乳動物を指す。
【００５９】
本発明の様々な組成物及び方法を、以下に記載する。特定の組成物及び方法について本明細書において例示するが、本発明を実施する際の使用に、いくつかの代替的な組成物及び方法のいずれかが利用可能及び適しているということが理解される。本発明の発現コンストラクト及び方法の評価は、当技術での標準手順を用いて実施してもよいということもまた理解されるであろう。
【００６０】
本発明の実施では、別段に示さない限り、当業者の範囲の範囲内にある、細胞生物学、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、生化学、及び免疫学の従来の技術を採用する。こうした技術は、例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ＆Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）；“Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ”（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ＆Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）；及び“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）等の文献において完全に説明されており、そのそれぞれが本明細書において参照によって明示的に援用される。
【００６１】
本発明のいくつかの態様は、説明のために例示的な用途を参照しながら以下に説明する。本発明の完全な理解をもたらすために、いくつかの特定の詳細、関係性及び方法を記載するということを理解されたい。しかしながら関連技術の当業者であれば、特定の詳細のうちの１もしくは複数がなくとも、又は他の方法を伴っても、本発明は実施可能であるということを容易に認識するであろう。本発明は、一部の動作は、異なる順序で及び／又は他の動作もしくは事象と同時に発生してもよいため、説明された動作又は事象の順序によって制限されない。さらに、本発明に従ってある方法論を実施するために、説明された動作又は事象の全てが必要であるとは限らない。
【００６２】
本明細書で用いる専門用語は、特定の実施形態を記述することのみを目的としており、発明を限定することを意図していない。本明細書で用いる場合、文脈で別段に明示されていない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、同様に複数形を含めることを意図している。さらに、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む」、「有すること」、「有する」、「伴う」又はその変化形の語は、発明の詳細な説明及び／又は特許請求の範囲のいずれにおいても用いられる程度まで、こうした語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の語と同様の様式で包括的であることを意図する。
【００６３】
「約」又は「およそ」の語は、ある特定の値を測定又は決定する方法に一部依存することとなる、すなわち測定系の制限である、当業者によって決定された当該値に関する許容可能な誤差範囲の範囲を意味する。例えば、「約」は、当技術の通例によって、１又は１以上の標準偏差の範囲内を意味することが可能である。あるいは、「約」は、所与の値の、最大２０％、好ましくは最大１０％、より好ましくは最大５％、さらによりこのましくは最大１％である範囲を意味することが可能である。あるいは、特に生物学的な系又はプロセスに関して、当該語は、好ましくは５倍以内、またより好ましくは２倍以内の、ある値の倍率の程度の範囲内を意味することが可能である。本願及び特許明細書において特定の値が記載されている場合、別段に「約」の語が記載されていない限り、特定の値の許容可能な誤差範囲の範囲内の意味と仮定されたい。
【００６４】
本明細書で言及した全ての公報が、それに関して公報が引用されている方法及び／又は材料を開示及び記載するために本明細書に参照によって援用される。援用した公報の、矛盾が生じる程度のいずれの開示は、本開示が代わることを理解されたい。
【００６５】
特許請求の範囲は、任意の選択的な要素を除外するように立案されている可能性があるということにさらに留意されたい。このように、こうした記述は、例えば「単独」、「〜のみ」等の除外的な語を請求項の構成要素の記載と組み合わせて使用するため、又は「否定的な」限定を使用するために、先行詞として機能することが意図される。
【００６６】
別段に示さない限り、本明細書で用いる全ての語は、当業者及び採用されることとなる本発明の通例にとって、当業者の知識の範囲内にある、微生物学及び組換えＤＮＡ技術の従来技術のものと同じ意味を有するものである。
【００６７】
組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子
ある態様においては、本開示は、組織又は細胞特異的にＷｎｔ活性を増強することが可能である新規の組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子を提供する。ある実施形態においては、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子は、１又は複数のＺＮＲＦ３及び／又はＲＮＦ４３リガーゼに結合する第１のドメインと、１又は複数の標的の組織又は細胞型に組織又は細胞特異的に結合する第２のドメインとを含む、二機能性分子である。第１のドメイン及び第２のドメインのそれぞれは、リガーゼ複合体又は標的の組織もしくは細胞にそれぞれ結合することができる任意の部分であり得る。例えば、第１のドメイン及び第２のドメインのそれぞれは、ポリペプチド（例えば、抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、又は抗体とは異なるペプチドもしくはポリペプチド）、小分子、及び天然のリガンド又はそのバリアント、フラグメントもしくは誘導体、から選択される部分であり得るがこれに限定されない。ある実施形態においては、天然リガンドは、ポリペプチド、小分子、イオン、アミノ酸、脂質又は糖分子である。第１のドメイン及び第２のドメインは、互いに同一のタイプの部分であり得るか、又はそれらは異なるタイプの部分であり得る。ある実施形態においては、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子は、組織又は細胞特異性の細胞表面受容体に結合する。特定の実施形態においては、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子は、例えば陰性対照と比較して、少なくとも５０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、又は少なくとも５０倍、Ｗｎｔシグナル伝達が増加又は増強する。
【００６８】
組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子は、様々な形態を有し得る。説明的な形態を図１Ａ及び図８に示す。特定の実施形態においては、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子は、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に結合する第１のポリペプチド配列と、１又は複数の標的の組織又は細胞型に、組織又は細胞特異的に結合する第２のポリペプチド配列とを含む融合タンパク質である（例えば、図１Ａを参照）。ある実施形態においては、２つのポリペプチド配列は、直接又はリンカーを介して融合し得る。ある実施形態においては、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子は、第１のドメイン及び第２のドメインをそれぞれが含む、２以上の融合タンパク質を含む二量体又は多量体等の２以上のポリペプチドを含むものであり、当該２以上のポリペプチドは、例えばリンカー部分を介して、又は２以上のポリペプチドのそれぞれにおけるアミノ酸残基間の結合、例えばシステイン残基間の分子間ジスルフィド結合を介して、連結する。特定の実施形態においては、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子は、第１のドメイン又は第２のドメインのいずれかを構成する抗体の重鎖及び軽鎖（又はその抗原結合性フラグメント）を含む抗体であり、当該他方のドメイン（すなわち、第２のドメイン又は第１のドメイン）は、融合タンパク質として又はリンカー部分を介してのいずれかで、抗体の重鎖又は軽鎖に連結する。特定の実施形態においては、当該他方のドメインは、重鎖のＮ末端、重鎖のＣ末端、軽鎖のＮ末端、又は軽鎖のＣ末端に連結する。こうした構造は、付加したＩｇＧ足場又はフォーマットとして本明細書において言及し得る。例えば、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子は、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に結合する抗体であり得、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に結合する当該抗体の重鎖又は軽鎖のいずれかに、組織又は細胞特異性の受容体に結合する結合ドメインが融合又は付加する。別の例では、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子は、組織又は細胞特異性受容体に結合する抗体であり得、組織又は細胞特異性の受容体に結合する当該抗体の重鎖又は軽鎖のいずれかに、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に結合する結合ドメインが融合又は付加する。特定の実施形態においては、肝臓特異性Ｗｎｔシグナル増強分子は、ＡＳＧＲ１又はＡＳＧＲ２に結合する抗体又はその抗原結合性フラグメントであり、当該抗体又はその抗原結合性フラグメントの重鎖又は軽鎖のいずれかに、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に結合する結合ドメインが融合又は付加する（例えば、図８を参照）。特定の実施形態においては、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に結合する結合ドメインが、Ｆｕ１ドメイン及びＦｕ２ドメインを含み、当該Ｆｕ１ドメイン及びＦｕ２ドメインは、例えばＦ１０５Ｒ及び／又はＦ１０９Ａである、本明細書に開示するもののいずれかを含む１又は複数のアミノ酸改変を随意に含む。
【００６９】
ある実施形態においては、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子は、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に結合する第１のドメイン（「作用モジュール」）と、例えば高い親和性で、組織又は細胞特異性の受容体に結合する第２のドメイン（「ターゲティングモジュール」）とを含む。ある実施形態においては、これら２つのドメインのそれぞれは、活性を実質的に低下させるか、又は単独ではＷｎｔシグナルを増強させるのに不活性である。しかしながら、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子は、組織特異性受容体を発現する標的組織と結合する場合に、Ｅ３リガーゼＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３が組織特異性受容体との三元複合体に取り込まれ、それらが、受容体介在性のエンドサイトーシスを介して細胞表面から取り込む及び／又は除去されるように誘導する。最終的には、組織特異的にＷｎｔシグナルを増強することがもたらされる。
【００７０】
ある実施形態においては、作用モジュールは、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３のＥ３リガーゼに対するバインダーであり、またそれは例えばＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ１〜４であり、ヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ１〜４を含むがこれに限定されない、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎに基づいて設計可能である。ある実施形態においては、作用モジュールは、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ、例えば野生型Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ１〜４、随意にヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ１〜４であり、又はそのバリアントもしくはフラグメントである。特定の実施形態においては、それは、対応する野生型Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ１〜４配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ１〜４のいずれかのバリアントである。ある実施形態においては、作用モジュールは、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に結合する、例えばＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ１〜４のいずれかであるＲ−ｓｐｏｎｄｉｎのフューリンドメイン１を含むか又は当該フューリンドメイン１からなる。フューリンドメイン１の伸長したバージョン（もはやＬＧＲ４〜６に結合しない又はＬＧＲ４〜６への結合が低下した、変異したフューリンドメイン２を伴うものを含むがこれに限定されない）、又はＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に特異的に結合することが可能である抗体とは異なる、操作された抗体もしくはその他の誘導体もしくは任意の操作されたポリペプチドもまた、使用することが可能である。ある実施形態においては、作用モジュールは、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎの１又は複数のフューリンドメイン１を含む。ある実施形態においては、それは、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎのフューリンドメイン２を含まない、又は例えば野生型フューリンドメイン２と比較して活性が低下したフューリンドメイン２である、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎの改変されたもしくはバリアントのフューリンドメイン２を含む。ある実施形態においては、作用モジュールは、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎの、フューリンドメイン１を含むが、フューリンドメイン２は含まない。ある実施形態においては、作用モジュールは、２以上のフューリンドメイン１、又はフューリンドメイン１の多量体を含む。作用ドメインは、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎの１又は複数の野生型フューリンドメイン１を含み得る。特定の実施形態においては、作用モジュールは、野生型フューリンドメイン１と比較して、例えばＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に結合する、増加した活性を有するＲ−ｓｐｏｎｄｉｎの改変された又はバリアントのフューリンドメイン１を含む。ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に対する結合が増加したバリアントは、例えば、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎフューリンドメイン１のバリアントを含むファージディスプレイ又はイーストディスプレイのライブラリをスクリーニングすることによって特定することができる。Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎフューリンドメイン１に関連しないが、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に対する結合が増加したペプチド又はポリペプチドもまた、スクリーニングを経て特定することができる。作用モジュールは、それが存在している場所において作用モジュール又は組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子の構造を安定化する、例えばさらなるアミノ酸残基である、さらなる部分又はポリペプチド配列をさらに含み得る。
【００７１】
ある実施形態においては、作用モジュールは、ＺＮＲＦ３及び／又はＲＮＦ４３に特異的に結合する抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む。特定の実施形態においては、作用モジュールは、ａ）表２Ａの抗体のいずれかに記載のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３の配列、ならびに／もしくはｂ）表２Ａの抗体のいずれかに記載のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３の配列を含む、抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、又は１もしくは複数のアミノ酸改変を含む当該抗体もしくはその抗原結合性フラグメントのバリアントであり、当該バリアントは、当該ＣＤＲ配列において８未満のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態においては、作用モジュールは、表２Ｂ又は配列番号７８〜１５０に記載のナノボディ、ＶＨ又はＶＬの配列を含む、抗体もしくはその抗原結合性フラグメント又はそのフラグメントもしくはバリアントである。
【００７２】
さらなる実施形態においては、作用モジュールは、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３の活性又は発現を低下又は防止する、例えば核酸分子等である別の阻害部分を含み、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド；低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）；ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）；又はリボザイム等である。本明細書で用いる場合、「アンチセンス」は、長さにかかわらず、核酸配列に相補的である核酸配列を指す。ある実施形態においては、アンチセンスＲＮＡは、個々の細胞、組織又は対象に導入することが可能であり、必ずしも内因性遺伝子サイレンシング経路を当てにしない機序を介して標的遺伝子の発現の低下を結果的にもたらす、一本鎖ＲＮＡ分子を指す。アンチセンス核酸は、改変された骨格、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、もしくは当技術で公知のその他、を含有することが可能であり、又は非天然のヌクレオシド間結合を含有してもよい。アンチセンス核酸は、例えばロック核酸（ＬＮＡ）を含むことが可能である。特定の実施形態においては、別の阻害部分が、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３の一方もしくは両方の活性を阻害するか、又はＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３の一方もしくは両方の遺伝子、ｍＲＮＡもしくはタンパク質の発現を阻害する。ある実施形態においては、阻害部分は、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３遺伝子又はｍＲＮＡ又はその補体に結合する核酸分子である。
【００７３】
本明細書で用いる場合、「ＲＮＡ干渉」は、内在性遺伝子サイレンシング経路を介して標的ｍＲＮＡの分解によって標的遺伝子の発現を低下させる薬剤の使用を指す（例えば、Ｄｉｃｅｒ及びＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ））。ＲＮＡ干渉は、ｓｈＲＮＡ及びｓｉＲＮＡを含めた、様々な薬剤を使用することにより達成され得る。「低分子ヘアピン型ＲＮＡ」又は「ｓｈＲＮＡ」は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介して標的遺伝子の発現を停止するために用いることが可能である、Ｕ字型カーブをもつ二本鎖の人工ＲＮＡ分子を指す。細胞におけるｓｈＲＮＡの発現は、典型的には、プラスミドの送達、又はウイルスもしくは細菌のベクターを介して、達成される。ｓｈＲＮＡは、比較的遅い分解速度と代謝回転速度を有する、ＲＮＡｉの有利な伝達物質である。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、ｍｉＲＮＡと同様に、通常２０〜２５塩基対の長さであり、またＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路内で動作する、二本鎖ＲＮＡ分子のクラスである。それは、転写後に、ｍＲＮＡを分解して翻訳を防止することによって、相補的なヌクレオチド配列を伴う特異的な遺伝子の発現を干渉する。ある実施形態においては、ｓｉＲＮＡは、長さが１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４ヌクレオチドであり、またその３’末端において２塩基のオーバーハングを有する。ｓｉＲＮＡを個々の細胞及び／又は培養系に導入して、標的のｍＲＮＡ配列の分解を結果的にもたらすことが可能である。本明細書で用いる場合、「モルホリノ」は改変された核酸オリゴマーであって、そこで標準の核酸塩基がモルホリン環に結合してホスホロジアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄａｔｅ）の結合を介して連結し合うものである、改変された核酸オリゴマーを指す。ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡと同様に、モルホリノは相補ｍＲＮＡ配列に結合する。しかしながら、モルホリノは、分解するために相補ｍＲＮＡ配列を標的にするのではなく、ｍＲＮＡ翻訳の立体阻害と、ｍＲＮＡスプライシングの改変とを介して機能する。
【００７４】
ある実施形態においては、ターゲティングモジュールは、例えば細胞特異性表面受容体である細胞特異性表面分子に特異的に結合し、また例えば天然リガンド、抗体、又は合成化学物質であり得る。特定の実施形態においては、細胞特異性表面分子は、標的の器官、組織又は細胞型、例えば疾患又は障害を治療又は予防するために、Ｗｎｔシグナル伝達を増強することが望まれる例えば器官、組織又は細胞型、において優先的に発現する。特定の実施形態においては、細胞特異性表面分子は、標的の器官、組織又は細胞型において、例えば疾患又は障害を治療又は予防するために、Ｗｎｔシグナル伝達を増強することが望まれる例えば器官、組織又は細胞型において、例えば１又は複数の他の標的でない器官、組織又は細胞型と比較して、増加又は増強した発現を有する。ある実施形態においては、細胞特異性表面分子は、１又は複数の他の器官、組織又は細胞型とそれぞれ比較して、標的の器官、組織又は細胞型の表面で優先的に発現する。例えば、特定の実施形態においては、細胞表面受容体は、１以上の、５以上の、全ての他の器官、組織もしくは細胞において発現するよりも、又は全ての他の器官、組織もしくは細胞それぞれの平均よりも、標的の器官、組織又は細胞において、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、又は少なくとも１０００倍高いレベルで発現されるのであれば、組織特異性又は細胞特異性の細胞表面分子であると考えられる。ある実施形態においては、組織特異性又は細胞特異性の細胞表面分子は、細胞表面受容体であり、例えば、ターゲティングモジュールが結合することができる細胞表面膜及び細胞外領域の範囲内に位置する領域を含むポリペプチド受容体である。様々な実施形態においては、本明細書に記載する方法は、標的組織もしくは標的組織を含む組織のサブセットにおいてのみ発現する細胞表面分子を特異的に標的にすることによって、又は、全ての、大多数のもしくは相当な数の他の組織と比較して標的組織においてより高いレベルの発現、例えば少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、又は少なくとも２０の他の組織におけるよりも、標的組織においてより高い発現、を有する細胞表面分子を特異的に標的にすることによって、実行され得る。
【００７５】
組織特異性及び細胞特異性の細胞表面受容体は、当技術で公知である。組織及び細胞特異性の表面受容体の例としては、ＡＳＧＲ１（肝臓特異性のため）、ＡＳＧＲ２（肝臓特異性のため）、ＴＦＲ２（肝臓特異性のため）、ＳＬＣ１０Ａ１（肝臓特異性のため）、ＰＴＨ１Ｒ（骨及び腎臓の特異性のため）、ＬＹＰＤ３（口腔粘膜特異性のため）、ＤＳＧ３（口腔粘膜特異性のため）等が挙げられるがこれに限定されない。肝臓送達のためのさらなる受容体は、例えばＹａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｕｍｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１５；３６：５５−６７によって記載されている。
【００７６】
ある実施形態においては、ターゲティングモジュールは、ＡＳＧＲ１及び／又はＡＳＧＲ２に特異的に結合する抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む。特定の実施形態においては、第２のポリペプチドは、ａ）表３Ａの抗体のいずれかに記載のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３の配列、ならびに／もしくはｂ）表３Ａの抗体のいずれかに記載のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３の配列を含む、抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、又は１もしくは複数のアミノ酸改変を含む当該抗体もしくはその抗原結合性フラグメントのバリアントであり、当該バリアントは、当該ＣＤＲ配列において８未満のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態においては、作用モジュールは、表３Ｂ又は配列番号４７〜７７もしくは１５１〜１５４に記載のナノボディ、ＶＨ又はＶＬの配列を含む、抗体もしくはその抗原結合性フラグメント又はそのフラグメントもしくはバリアントである。
【００７７】
特定の実施形態においては、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子又はその薬理学的に許容可能な塩は、亜鉛ＲＩＮＧフィンガー３（ＺＮＲＦ３）及びＲＩＮＧフィンガータンパク質４３（ＲＮＦ４３）から選択される１又は複数の膜貫通Ｅ３ユビキチンリガーゼに特異的に結合する第１のドメインと、アシアロ糖蛋白受容体１（ＡＳＧＲ１）及び／又はアシアロ糖蛋白受容体２（ＡＳＧＲ２）に特異的に結合する第２のドメインとを含み、（ａ）第１のドメインは、（ｉ）表２Ａの抗体のいずれかに記載のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３の配列；及び／もしくは（ｉｉ）表２Ａの抗体のいずれかに記載のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３の配列を含む抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、もしくは１もしくは複数のアミノ酸改変を含む、当該抗体もしくはその抗原結合性フラグメントのバリアントを含み、当該バリアントは、当該ＣＤＲ配列において８未満のアミノ酸置換を含み；ならびに／又は、（ｂ）第２のドメインは、（ｉ）表３Ａの抗体のいずれかに記載のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３の配列；及び／もしくは（ｉｉ）表３Ａの抗体のいずれかに記載のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３の配列を含む、抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、もしくは１もしくは複数のアミノ酸改変を含む当該抗体もしくはその抗原結合性フラグメントのバリアントを含み、当該バリアントは、当該ＣＤＲ配列において８未満のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態においては、それは、配列番号４７〜７７又は１５１〜１５４のいずれかに対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドを含む。特定の実施形態においては、それは、（ｉ）表３Ａの抗体のいずれかに記載のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３の配列；及び／又は（ｉｉ）表３Ａの抗体のいずれかに記載のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３の配列を含む、抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、又は１もしくは複数のアミノ酸改変を含む当該抗体もしくはその抗原結合性フラグメントのバリアントを含む肝臓特異性Ｗｎｔシグナル増強分子であり、当該バリアントは、当該ＣＤＲ配列において８未満のアミノ酸置換を含む。
【００７８】
特定の細胞表面ポリペプチドもしくは受容体に「特異的に結合する」又は特定の細胞表面ポリペプチドもしくは受容体に「対して特異的である」、例えば抗体又はその抗原結合性フラグメントである作用モジュール又はターゲティングモジュールは、その他のポリペプチド又はポリペプチドのエピトープに実質的に結合することなく、その特定のポリペプチド又は受容体に結合するものである。一部の実施形態においては、本開示の作用モジュール及びターゲティングモジュールは、約４℃、２５℃、３７℃、又は４２℃の温度で測定したときに、１０００ｎＭ以下の、１００ｎＭ以下の、１０ｎＭ以下の、１ｎＭ以下の、０．５ｎＭ以下の、０．１ｎＭ以下の、０．０１ｎＭ以下の、０．００５ｎＭ以下の、０．００１ｎＭ以下の、又は０．０００５ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）で、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３又は組織特異性細胞表面分子（例えば、受容体）にそれぞれ特異的に結合する。例えば抗体であるバインダーの親和性は、従来の技術、例えばＳｃａｔｃｈａｒｄらにより記載のもの  （Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ５１：６６０（１９４９）、ＥＬＩＳＡアッセイ、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）アッセイ、及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ）を用いて容易に求めることが可能である。抗体のその抗原、細胞又は組織への結合特性は、概して、免疫組織化学検査（ＩＨＣ）及び／又は蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）等、例えば免疫蛍光法に基づくアッセイを含めた免疫検出法を用いて求めて評価することができる。
【００７９】
ある実施形態においては、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子の作用モジュール及び／又はターゲティングモジュールは、ポリペプチドであり、一方で他の実施形態においては、組織特異性Ｗｎｔシグナル伝達分子の作用モジュール及び／又はターゲティングモジュールは、有機小分子である。ある実施形態においては、作用モジュール及びターゲティングモジュールは、いずれも、例えば抗体又はその抗原結合性フラグメントであるポリペプチドである。ある実施形態においては、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子の作用モジュール及びターゲティングモジュールは、互いに共有結合している。ある実施形態においては、組織特異性Ｗｎｔシグナル融合分子の作用モジュール及びターゲティングモジュールは、互いに非共有結合的に結合している。ある実施形態においては、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子の作用モジュール及びターゲティングモジュールは、同一の融合タンパク質内に存在している。他の実施形態においては、作用モジュールは、第１の結合ドメインをさらに含む第１のポリペプチド内に存在し、またターゲティングモジュールは、第２の結合ドメインをさらに含む第２のポリペプチド内に存在するものであり、第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインは互いに結合している。一部の実施形態においては、第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインは、同一又はそのバリアントであり、例えばＦｃポリペプチド等である。一部の実施形態においては、第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインは、互いに異なる。特定の実施形態においては、本発明は、参照分子の機能フラグメント又はバリアントを含めた、本明細書に記載するターゲティングモジュール又は作用モジュールのいずれかのフラグメント又はバリアントの使用を含む。
【００８０】
ある実施形態においては、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子（例えば、融合タンパク質）は、以下より選択された一般式を有する：Ｒ１−Ｌ−Ｒ２及びＲ２−Ｌ−Ｒ１、式中Ｒ１はＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に結合する作用モジュールであり、Ｒ２は組織特異性細胞表面受容体に結合するターゲティングモジュールであり、またＬはリンカーであって、Ｌは不在であっても存在していてもよい。Ｒ１及びＲ２のそれぞれは、それぞれ本明細書に記載する種々の作用モジュール及びターゲティングモジュールのいずれかであり得る。Ｒ１及びＲ２のそれぞれは、Ｅ３リガーゼ（ＺＮＲＦ３又はＲＮＦ４３）又は標的の組織もしくは細胞のうちの１又は複数にそれぞれ結合することができる任意の部分であり得る。例えば、Ｒ１及びＲ２のそれぞれは、ポリペプチド（例えば、抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、又は抗体とは異なるペプチドもしくはポリペプチド）、小分子、及び天然のリガンド又はそのバリアント、フラグメントもしくは誘導体、から選択される部分であり得るがこれに限定されない。ある実施形態においては、天然リガンドは、ポリペプチド、小分子、イオン、アミノ酸、脂質又は糖分子である。作用モジュール及びターゲティングモジュール（すなわち、Ｒ１及びＲ２）は、互いと同一のタイプの部分であり得るか、又は異なるタイプの部分であり得る。特定の実施形態においては、Ｒ２はその抗原結合性フラグメントの抗体であり、またある実施形態においては、Ｒ２はＦｃタンパク質又はその類似体を含む。
【００８１】
ある実施形態においては、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子は、単一の分子（例えば、ポリペプチド）を含み、一方で他の実施形態においては、Ｗｎｔシグナル増強融合分子は、互いに結合、例えば互いに非共有結合的に結合する、２以上の分子（例えば、ポリペプチド）を含む。例えば、一実施形態においては、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強融合体は、それぞれ一般式Ｒ３−Ｌ１及びＲ４−Ｌ２を有する２つの分子を含み、式中Ｒ３は作用モジュールであり、Ｒ４はターゲティングモジュールであり、またＬ１及びＬ２の基は互いに結合して、例えば二量体を形成する。様々な実施形態においては、Ｌ１及びＬ２の基は、互いに同一であるか、又は互いに異なる。Ｌ１又はＬ２の基の一例は、Ｆｃ配列であり、例えばマウスＦｃ２ｂ又はヒトＦｃ１であり、そのそれぞれは当技術で公知である。Ｒ３及びＲ４のそれぞれは、それぞれ本明細書に記載する種々の作用モジュール及びターゲティングモジュールのいずれかであり得る。Ｒ３及びＲ４のそれぞれは、Ｅ３リガーゼ（ＺＮＲＦ３又はＲＮＦ４３）又は標的の組織もしくは細胞のうちの１又は複数にそれぞれ結合することができる任意の部分であり得る。特定の実施形態においては、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子は、Ｅ３リガーゼ（ＺＮＲＦ３及び／又はＲＮＦ４３）のうちの１又は複数に結合する抗体又はその結合性フラグメントを含み、当該抗体の重鎖及び／又は抗体の軽鎖は、標的の組織又は細胞に結合する付加した結合ドメインを含む。特定の実施形態においては、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子は、標的の組織又は細胞に結合する抗体又はその結合性フラグメントを含み、当該抗体の重鎖及び／又は抗体の軽鎖は、Ｅ３リガーゼ（ＺＮＲＦ３及び／又はＲＮＦ４３）のうちの１又は複数に結合する付加した結合ドメインを含む。付加した結合ドメインは、例えば重鎖もしくは軽鎖の融合タンパク質として、抗体のＮ末端もしくはＣ末端に直接融合し得るか、又はリンカー部分を介して、重鎖もしくは軽鎖に、例えば重鎖もしくは軽鎖のＮ末端、Ｃ末端もしくは内部アミノ酸に、付加し得る。ある実施形態においては、抗体はＩｇＧである。
【００８２】
ある実施形態においては、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子（例えば、融合タンパク質）は、融合タンパク質と接触した肝臓組織又は肝細胞において、Ｗｎｔシグナル伝達を増加させる。特定の実施形態においては、肝臓の組織又は細胞型におけるＷｎｔシグナル伝達が、少なくとも５０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍、増加する。
【００８３】
組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子は、当技術で公知で利用可能である、有機合成及び分子生物学の標準の方法で生成され得る。例えば、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強融合タンパク質は、ターゲティングモジュール（例えば、ＡＳＧＲ１又はＡＳＧＲ２に結合する抗体又はその抗原結合性フラグメント）を作用モジュール（例えば、アミノ酸残基Ｎ３７〜Ｒ９５に相当するヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ２フューリンドメイン１単独、又はフューリンドメイン２が続くヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ２フューリンドメイン１、ここでＬＧＲタンパク質とのフューリンドメイン２の相互作用は、例えばＦ１０５Ａ及びＦ１０９Ａである、単独又は組み合わせでの点変異によって無効にされる又は失われる）と融合することによって生成され得る。ある実施形態においては、ターゲティングモジュール及び作用モジュールは、いずれかのドメインが組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子のＮ末端に位置している状態で、例えばグリシン−セリンリンカーであるリンカーによって融合される。ある実施形態においては、ターゲティングモジュール及び作用モジュールは、タンパク質リンカー（例えば、アルブミン）で融合する。ターゲティングモジュールを作用モジュールと「融合させる」さらなる方法としては、例えば「ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ」又はロイシンジッパーによる二量体形成が挙げられるがこれに限定されない。ターゲティングモジュール、作用モジュール（及び随意にリンカー）をコードするＤＮＡ配列は、所望の融合タンパク質をコードするように遺伝子操作されてもよい。
【００８４】
抗体の重鎖及び軽鎖を含む組織特異性Ｗｎｔシグナル増強融合分子に関して、融合タンパク質の異なる部分をコードするＤＮＡ配列は、標準の分子クローニング技術を用いて、細菌の又は真核生物の発現ベクター内に挿入されて、適切な宿主細胞において発現し得る。発現した融合タンパク質は、タンパク質科学の標準技術、例えばアフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、及びサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、均質に精製され得る。本開示はまた、本明細書に記載する作用モジュール、ターゲティングモジュール又は融合タンパク質に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％のポリペプチド配列同一性を有するバリアントを含めた、本明細書に記載するポリペプチドの作用モジュール、ターゲティングモジュール及び融合タンパク質のいずれかの機能フラグメント及びバリアントを含む。こうしたバリアントは、本明細書に開示する配列のいずれかと比較して、例えば１又は複数のアミノ酸の欠失、挿入又は置換である１又は複数のアミノ酸改変を含み得る。特定の実施形態においては、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強融合タンパク質の機能フラグメント及びバリアントは、それらの誘導元である組織特異性Ｗｎｔシグナル増強融合タンパク質と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、又はそれ以上のＷｎｔシグナル増強活性を有する。ある実施形態においては、ポリペプチド作用モジュールの機能フラグメント及びバリアントは、それらの誘導元である作用モジュールと比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、又はそれ以上のＷｎｔシグナル増強活性を有する（組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子全体の文脈で測定した場合）。ある実施形態においては、ターゲティングモジュールの機能フラグメント及びバリアントは、それらの誘導元であるターゲティングモジュールと比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、又はそれ以上の結合活性を有する。
【００８５】
本開示はまた、例えば本明細書に記載する融合タンパク質又はそのバリアントである、１又は複数の組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子又はその成分をコードするポリヌクレオチド又は核酸配列、ならびに、発現ベクターを含めた、これらポリヌクレオチドを含むベクター、ならびにこれらベクターを含む細胞を含む。ある実施形態においては、ポリヌクレオチド又は核酸配列は、ＤＮＡ又はＲＮＡである。特定の実施形態においては、ＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。ある実施形態においては、ＲＮＡは、１又は複数の改変されたヌクレオシドを含む改変されたｍＲＮＡである。１又は複数の改変ヌクレオシドを含む改変ｍＲＮＡは、安定性の増加、より高い発現レベル及び免疫原性の低下を含めた、改変されていないｍＲＮＡを超える利点を有することが記載されている。本発明により用いられ得る改変ｍＲＮＡの非限定的な例が、例えばＰＣＴ特許出願公開公報、国際公開第２０１１／１３０６２４号、国際公開第２０１２／１３８４５３号、国際公開第２０１３０５２５２３号、国際公開第２０１３１５１６６６号、国際公開第２０１３／０７１０４７号、国際公開第２０１３／０７８１９９号、国際公開第２０１２０４５０７５号、国際公開第２０１４０８１５０７号、国際公開第２０１４０９３９２４号、国際公開第２０１４１６４２５３号、米国特許第  ８，２７８，０３６号（プソイドウリジンを含む改変ｍＲＮＡを記載）、米国特許第８，６９１，９６６号（プソイドウリジン及び／又はＮ１−メチルプソイドウリジンを含む改変ｍＲＮＡを記載）、米国特許第８，８３５，１０８号（５−メチルシチジンを含む改変ｍＲＮＡを記載、米国特許第８，７４８，０８９号（プソイドウリジン又は１−メチルプソイドウリジンを含む改変ｍＲＮＡを記載）に記載されている。特定の実施形態においては、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強ポリペプチドをコードする改変ｍＲＮＡ配列は、改変されていないＡ、Ｇ、Ｕ又はＣリボヌクレオシドと比較して、少なくとも１つの改変を含む。特定の実施形態においては、少なくとも１つの改変ヌクレオシドは、Ｎ１−メチルプソイドウリジン及び／又は５−メチルシチジンを含む。特定の実施形態においては、改変ｍＲＮＡは、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強ポリペプチドをコードする配列が続き、例えばポリＡ又はポリＡ−Ｇ配列等である３’テール（ｔａｉｌｉｎｇ）配列が続く、５’末端キャップ配列を含む。
【００８６】
特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドは、例えば発現ベクターであるベクターであり、また発現ベクターは、例えば細胞においてポリヌクレオチドの発現を駆動するプロモーター配列であるプロモーター配列に操作可能に連結した本明細書に記載の組織特異性Ｗｎｔシグナル増強融合分子（例えば、融合タンパク質、又は付加した抗体の一方もしくは両方の鎖）をコードするポリヌクレオチド配列を含む。ある実施形態においては、ベクターはウイルスベクターであり、例えば、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強ポリペプチドをコードするＤＮＡ又はＲＮＡ配列に操作可能に連結したプロモーターを含む発現カセットを含むポリヌクレオチドを含むウイルスである。特定の実施形態においては、発現カセットは、５’及び／又は３’の細胞ＵＴＲ又はウイルスＵＴＲ又はその誘導体を含む。
【００８７】
本開示はまた、本明細書に記載するポリヌクレオチドに対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％のポリヌクレオチド配列同一性を有するバリアントを含めた、本明細書に記載するポリヌクレオチドの機能フラグメント及びバリアントを含む。こうしたバリアントは、本明細書に開示する配列のいずれかと比較して、例えば１又は複数のヌクレオチドの欠失、挿入又は置換である、１又は複数のヌクレオチド又はヌクレオシドの改変を含み得る。特定の実施形態においては、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、例えば宿主細胞においてコードされたポリペプチドの発現を増強するように、コドン最適化される。特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドバリアントは、１又は複数の改変されたヌクレオチド又はヌクレオシドを含む。
【００８８】
本開示はまた、本明細書に記載の、例えば融合タンパク質である、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子をコードするポリヌクレオチド又はベクターを含む細胞を含む。ある実施形態においては、細胞は宿主細胞であり、例えば組織特異性Ｗｎｔシグナル増強融合タンパク質を産生するために用いられ得るＨＥＫ２９３細胞等である。主題の組成物を調製する際に、例えば哺乳動物細胞（例えば、２９３細胞）、昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）、微生物及び酵母を含めるがこれに限定されない、任意の宿主細胞を採用することができる。ある実施形態においては、細胞は、本明細書に記載する組織特異性Ｗｎｔシグナル増強ポリペプチドにより治療する対象に対して異種又は自己由来である。特定の実施形態においては、当該細胞は、対象から取得して、本明細書に記載するウイルスベクターにより形質導入された。特定の実施形態においては、形質導入された細胞は、治療のために対象に送達される。
【００８９】
本開示はまた、１もしくは複数の組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子（例えば、融合タンパク質）、又は組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする配列を含む１もしくは複数のポリヌクレオチドもしくはベクターを含む、医薬組成物を含む
【００９０】
Ｗｎｔシグナル伝達は、当技術で公知で利用可能である技術及びアッセイを用いて測定することができる。ある実施形態においては、Ｗｎｔシグナル伝達の増加は、標的の組織又は細胞型に対応する細胞株を用いて決定する。特定の実施形態においては、細胞株は、Ｗｎｔシグナル反応性プロモーターの制御下で、標識遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ遺伝子）を伴うレポータープラスミドを含有する。陰性対照としてのフューリンドメイン１単独（又はＦ１０５Ａ及び／又はＦ１０９Ａ点変異を伴うフューリンドメイン２と共に）か又は陽性対照としての機能Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ（全長の又はフューリンドメイン１及び２）のいずれかを添加することによって、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ３ａ馴化培地又はＷｎｔ３ａの組換え源への反応として増強した細胞のレポーター活性を求めることができる。組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子に対するレポーター活性はまた、レポーター細胞株を組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子と接触させることによって求めることもできる。陰性対照は、レポーター活性に対して、実質的に、有意に又は完全に陰性であり得、また組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子及び陽性対照は、レポーター活性の増加としてＷｎｔシグナル伝達反応が増加するはずである。さらなる対照としては、抗ＡＳＧＲ１抗体単独（陰性）、抗ＡＳＧＲ１抗体の代わりに抗ＧＦＰ抗体を用いた融合タンパク質（陰性）、及びインタクトなフューリンドメイン１−フューリンドメイン２タンパク質（陽性）を挙げることができる。組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子の組織特異性は、標的のもの意外の細胞型又は組織における組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子による処理への反応としてレポーター活性を同様に測定することによって求めることができる。ある実施形態においては、レポーター活性は、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子が結合した標的組織では、標的でない組織と比較して、例えば少なくとも５０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍、高い。
【００９１】
特定の実施形態においては、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強ポリペプチドは、本明細書に記載する作用モジュール及びターゲティングモジュールのいずれかの任意の組み合わせを含めた、作用モジュール及びターゲティングモジュールの任意の組み合わせを含む。特定の実施形態においては、それらは、例えばアルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）であるリンカー、ペプチジルリンカー、又は非ペプチジルリンカーによって連結するものであり、当該ターゲティングモジュール及び作用モジュールは、例えばＦｃもしくはアルブミン、ペプチジルリンカー又は非ペプチジルリンカーである、リンカーのＮ末端及びＣ末端上にある。
【００９２】
組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子はまた、インビボでの安定性を増強するために、当技術で公知である、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｆｃ、アルブミン等の部分に連結可能である。
【００９３】
組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子の説明的な、非限定的な例としては、以下が挙げられる：
【００９４】
ａ）Ｗｎｔシグナル伝達を増強する能力が低下したＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ（例えば、ヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ２）のバリアントもしくはフラグメントを含む作用モジュールと、ＰＴＨ１Ｒに特異的に結合するターゲティングモジュールとを含む骨組織特異性Ｗｎｔシグナル増強ポリペプチドであって、骨組織のＷｎｔシグナル伝達を増加させて、また骨組織の疾患もしくは症状を治療するために用いられ得る、当該組織特異性Ｗｎｔシグナル増強ポリペプチド；
【００９５】
ｂ）Ｗｎｔシグナル伝達を増強する能力が低下したＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ（例えば、ヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ２）のバリアントもしくはフラグメントを含む作用モジュールと、ＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２、ＴＦＲ２もしくはＳＬＣ１０Ａ１に特異的に結合するターゲティングモジュールとを含む肝臓組織特異性Ｗｎｔシグナル増強ポリペプチドであって、肝臓組織のＷｎｔシグナル伝達を増加させて、また肝臓組織の疾患もしくは症状を治療するために用いられ得る、当該組織特異性Ｗｎｔシグナル増強ポリペプチド；又は、
【００９６】
ｃ）Ｗｎｔシグナル伝達を増強する能力が低下したＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ（例えば、ヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ２）のバリアントもしくはフラグメントを含む作用モジュールと、ＬＹＰＤＳ３もしくはＤＳＧ３に特異的に結合するターゲティングモジュールとを含む口腔粘膜組織特異性Ｗｎｔシグナル増強ポリペプチドであって、口腔粘膜組織のＷｎｔシグナル伝達を増加させて、また口腔粘膜組織の疾患もしくは症状を治療するために用いられ得る、当該組織特異性Ｗｎｔシグナル増強ポリペプチド。
【００９７】
組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子の説明的な、非限定的な例としては、添付の実施例及び配列に記載のものを含み、表１に記載のものを含むがこれに限定されない。特定の実施形態においては、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子は、例えば付加したＩｇＧ又は抗体フォーマット内に、本明細書に開示する２以上のポリペプチド配列を含む。本明細書に開示するポリペプチドは、表１に記載の配列のいずれかならびにそのフラグメント及びバリアントに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む又は当該配列からなるポリペプチドを含むが、これに限定されない。特定の実施形態においては、ポリペプチドは、表１に記載の配列（例えば、それらはタグ（例えばＨｉｓタグ又はＦｌａｇタグ）又は他の追加的な配列を欠いていてもよい）のいずれかならびにそのフラグメント及びバリアント内に存在する作用モジュール又はターゲティングモジュールを含む。ある実施形態においては、ポリペプチドが、作用モジュール及び／又はターゲティングモジュールとしての活性を有する。
【００９８】
本明細書に開示するポリヌクレオチドの説明的な、非限定的な例としては、上記に記載したものを含めた、本明細書に記載するポリペプチド、バリアント及びフラグメントのいずれかをコードする任意のものを含む。ある実施形態においては、ポリヌクレオチドが、機能ドメイン及び／又はターゲティングモジュールとしての活性を有するポリペプチドをコードする。
【表１−１】
2021530223.tif 000003
【表１−２】
2021530223.tif 000004
【表１−３】
2021530223.tif 000005
【表１−４】
2021530223.tif 000006
【００９９】
作用モジュール
Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎは、Ｗｎｔシグナルを増幅することが可能である。Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎの最小機能単位は、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３のＥ３リガーゼに結合するフューリンドメイン１及びＬＧＲ４〜６に結合するフューリンドメイン２である２つのフューリンドメインから構成され、一緒になってＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ、ＬＧＲ及びＥ３リガーゼの三元複合体をもたらす。これにより、複合体全体のインターナリゼーションと、それらの破壊の標的から離れるようにＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３を除去することとが結果的にもたらされる。フューリンドメイン１は単独では機能的でないが、ＺＮＲＦ３及びＲＮＦ４３の両方に結合することが可能である。
【０１００】
本明細書に記載する組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子の作用モジュールは、例えばポリペプチド又は有機化合物である、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３のリガーゼに結合することが可能である任意の機能部分であり得るが、これに限定されない。特定の実施形態においては、作用モジュール、例えば単独か又はターゲティングモジュールを伴うかのいずれかでＲ−ｓｐｏｎｄｉｎのフューリンドメイン１を含むポリペプチドは、潜在的なオフターゲット効果を最小限にするように、標的でない組織において実質的に不活性である。作用モジュールは、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子の文脈でターゲティングモジュールに融合又は結合するものであり、また組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子が組織特異性受容体を発現する標的組織と結合する場合に、Ｅ３リガーゼＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３が組織特異性受容体との三元複合体に取り込まれて、それらが、細胞表面上に再配置される、細胞表面から取り込まれる及び／又は除去されるように誘導する。
【０１０１】
ある実施形態においては、作用モジュールは、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎポリペプチド（例えば、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ１〜４のいずれか）のフラグメントもしくはバリアント、又はその機能フラグメントもしくはバリアントを含む。特定の実施形態においては、作用モジュールは、野生型Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎのフラグメントを含み、また他の実施形態においては、作用モジュールは、１又は複数のアミノ酸改変を含むＲ−ｓｐｏｎｄｉｎのフラグメントを含む。Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎは、当技術で公知の任意のＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ又はその相同体であり得、例えばヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ等の哺乳動物種を含むがこれに限定されない任意の動物種よりのＲ−ｓｐｏｎｄｉｎを含む。Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎは、特定及び記載されており、またそれらのポリペプチド及びコードポリヌクレオチド配列は、当技術で公知で利用可能である。特定の実施形態においては、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎポリペプチドは、ヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ、又は例えばマウスＲ−ｓｐｏｎｄｉｎである、他の脊椎動物もしくは非脊椎動物に存在する相同体である。ヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ１、ヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ２、ヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ３及びヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ４及びそのフューリンドメイン１のアミノ酸配列を、それぞれ図１及び配列番号１〜４で提供する。それらの相同体及びバリアントは、全般的なデータベース検索で利用可能であり、例えばｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｏｔ．ｎｃｂｉ．ｄｏｔ．ｎｌｍ．ｄｏｔ．ｎｉｈ．ｄｏｔ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／等である。本発明は、これら又は他のＲ−ｓｐｏｎｄｉｎにいずれかのフラグメント及びバリアントを含む又は当該フラグメント及びバリアントからなる作用モジュールを含む（がこれに限定されない）。様々な実施形態においては、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎポリペプチド及びそのフラグメントのいずれかのバリアントは、野生型Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎポリペプチドと比較して、例えば欠失、付加又は置換である、１又は複数のアミノ酸改変を含む。当該改変は、フューリンドメイン１及び／又はフューリンドメイン２を含むがこれに限定されない、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ又はそのフラグメントのバリアントの任意の領域に存在し得る。フューリンドメイン１又はフューリンドメイン２の外側のアミノ酸改変は、得られるバリアントが野生型Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ又はそのフラグメントと比較してＬＧＲ４〜６結合活性が低下するように、得られるバリアントを変更してよいということを理解されたい。
【０１０２】
ある実施形態においては、作用モジュールは、例えば全長もしくは野生型のＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ−１、−２、−３もしくは−４、随意にヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ−１、−２、−３もしくは−４、又はそのバリアントもしくはフラグメントである、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ配列を含む又は当該Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ配列からなる。特定の実施形態においては、それは、対応する野生型Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ１〜４配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ１〜４のいずれかのバリアントである。ある実施形態においては、作用モジュールは、本明細書に開示するもののいずれかを含むがこれに限定されない、１又は複数のアミノ酸改変を含む全長Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ（例えば、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ１〜４のいずれか）を含む又は当該全長Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎからなる。ある実施形態においては、作用モジュールは、野生型又は改変されたＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ（例えば、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ１〜４のいずれか）のフラグメントを含む又は当該フラグメントからなる。特定の実施形態においては、当該フラグメントは、ＺＮＲＦ３及び／又はＲＮＦ４３に結合することが可能である。ある実施形態においては、作用モジュールは、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎタンパク質のフューリンドメイン１、又はＲ−ｓｐｏｎｄｉｎタンパク質のフラグメントもしくはバリアントを含む。ある実施形態においては、作用モジュールは、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎフューリンドメイン１に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎタンパク質（例えば、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ１〜４）の１もしくは複数の（例えば、１、２、もしくは３もしくはそれ以上の、フューリンドメイン１もしくはそのバリアントを含む又は当該フューリンドメイン１もしくはそのバリアントからなる。ある実施形態においては、作用モジュールは、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎフューリン１ドメイン又はそのバリアントもしくはフラグメントと、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎフューリン２ドメイン又はそのバリアントもしくはフラグメントとを含む。ある実施形態においては、作用モジュールは、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に結合する抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む。特定の実施形態においては、作用モジュールは、ＺＮＲＦ３又はＲＮＦ４３のいずれかに特異的に結合する。
【０１０３】
ある実施形態においては、作用モジュールは、例えばヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ１又はヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ２であるＲ−ｓｐｏｎｄｉｎの１又は複数のフューリンドメイン１又はそのバリアントを含む。ある実施形態においては、作用モジュールは、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎの１又は複数のフューリンドメイン１を含むが、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎのフューリンドメイン２は含まない。ある実施形態においては、作用モジュールは、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎの１又は複数のフューリンドメイン１を含み、また例えば野生型フューリンドメイン２と比較して活性が低下したフューリンドメイン２である、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎの改変された又はバリアントのフューリンドメイン２を含む。ある実施形態においては、作用モジュールは、例えば野生型フューリンドメイン２と比較して活性が低下したフューリンドメイン２である、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎの改変された又はバリアントのフューリンドメイン２を有するＲ−ｓｐｏｎｄｉｎタンパク質を含む。ある実施形態においては、作用モジュールは、２以上のフューリンドメイン１もしくはそのバリアント、又はフューリンドメイン１の多量体もしくはそのバリアントを含む。ある実施形態においては、作用モジュールは、例えばヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ２のＫ５８、Ｈ７６、Ｓ７７、Ｒ８６及び／又はＮ９１に対応するアミノ酸残基において、１又は複数の点変異を含むバリアントＲ−ｓｐｏｎｄｉｎフューリン１ドメインを含む。ある実施形態においては、作用モジュールは、例えばヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ２のＦ１０５、Ｆ１０９及び／又はＫ１２１に対応するアミノ酸残基において、１又は複数の点変異を含むバリアントＲ−ｓｐｏｎｄｉｎフューリン２ドメインを含む。特定の実施形態においては、作用モジュールは、野生型フューリンドメイン１と比較して、例えばＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に結合する、増加した活性を有するＲ−ｓｐｏｎｄｉｎの改変された又はバリアントのフューリンドメイン１を含む。作用モジュールは、それが存在している場所において作用モジュール又は組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子の構造を安定化する、例えばさらなるアミノ酸残基である、さらなる部分又はポリペプチド配列をさらに含み得る。ある実施形態においては、作用モジュールは、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎに対して明白な／強い配列相同性を含まないペプチド又はポリペプチドを含むが、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎのＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に対する結合親和性に匹敵する又は当該結合親和性より高い、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に対する結合親和性を有する。
【０１０４】
ある実施形態においては、作用モジュールは、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎポリペプチド（例えば、ヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ）のフューリンドメイン１又はそのフラグメントもしくはバリアントと、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎポリペプチド（例えば、ヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ）の改変された又はバリアントのフューリンドメイン２とを含むものであり、当該改変されたフューリンドメイン２は、対応する野生型フューリンドメイン２と比較して、ＬＧＲ４〜６に対する結合親和性が低下している（図１及び４を参照）。ある実施形態においては、フューリンドメイン２は、例えばヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ２のＦ１０５及び／又はＦ１０９に対応するアミノ酸残基において、１又は複数の点変異を含む。当業者は、他のＲ−ｓｐｏｎｄｉｎポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基を、それらのアミノ酸配列をヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ２と比較することによって、容易に決定することができる。ある実施形態においては、作用モジュールは、フューリンドメイン１又はそのバリアントと、フューリンドメイン２又はそのバリアントとを含むものであり、フューリンドメイン１及び／又はフューリンドメイン２は、１又は複数の点変異を含む。作用モジュール内の１又は複数の点変異（対応する野生型Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ配列と比較して）は、フューリンドメイン１及び／又はフューリンドメイン２内の任意のアミノ酸残基において生じてよく、例えば、アミノ酸残基Ｋ５８、Ｈ７６、Ｓ７７、Ｒ８６、Ｎ９１、Ｆ１０５、Ｆ１０９又はＫ１２１、及びＬＧＲ４〜６に対する結合親和性を低下させるように改変することが可能である他の残基におけるものを含むがこれに限定されない。保存された親水性残基Ｓ４８、Ｎ５１、Ｒ６６、Ｒ７０及びＱ７１、ならびにあまり保存されていない疎水性残基Ｌ４６、Ｌ５４、Ｉ６２及びＬ６４を含めて、その機能的活性のために重要であるヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ１のフューリンドメイン１及びフューリンドメイン２の領域は特定されており、これらはＥ３リガーゼとの結合に重要である。さらに、ヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ１フューリンドメイン１において、アミノ酸残基Ｋ５９、Ｓ７８、Ｄ８５、Ｒ８７、Ｎ８８及びＮ９２が、ＬＧＲ５との親水性相互作用表面を形成し、またＦＳＨＮＦアミノ酸配列は、疎水性表面に重要なループとして特定されている。特定の実施形態においては、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎフューリンドメイン１及び／又はフューリンドメイン２を含む作用モジュールは、これら領域、表面又はアミノ酸残基のいずれかの範囲内における１又は複数の変異を含み得る。特定の実施形態においては、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎフューリンドメイン１及び／又はフューリンドメイン２を含む作用モジュールは、これら領域、表面又はアミノ酸残基を超えた、１又は複数の変異又はは他の交代（ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ）を含み得、これらは、結合表面の構造及び／又は安定性に影響を及ぼすことによって、ＬＧＲ４〜６結合を間接的に無効にする。ある実施形態においては、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎフューリンドメイン１及び／又はフューリンドメイン２を含む作用モジュールは、添付の実施例において示すもののいずれかを含むがこれに限定されない、任意のアミノ酸残基における１又は複数の変異を含み得る。特定の実施形態においては、作用モジュールは、アミノ酸残基Ｆ１０５及び／又はＦ１０９におけるアミノ酸置換を含む改変されたフューリンドメイン２を含む。特定の実施形態においては、作用モジュールは、フューリンドメイン１と、アミノ酸残基Ｆ１０５及び／又はＦ１０９におけるアミノ酸置換を含む改変されたフューリンドメイン２とを含む。特定の実施形態においては、作用モジュールは、改変されたフューリン１ドメイン及び改変されたフューリン２ドメインを含むものであって、ある実施形態においては、改変されたフューリン１ドメインはアミノ酸Ｒ６５、Ｒ６９及び／又はＱ７０において１又は複数のアミノ酸改変を含み、また改変されたフューリンドメインはアミノ酸Ｆ１０５及び／又はＦ１０９において１又は複数のアミノ酸改変を含む。特定の実施形態においては、改変されたフューリンドメイン２は、例えば全長Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎタンパク質の文脈で、ＬＧＲ４〜６に対して、対応する野生型フューリンドメイン２の結合の８０％未満、５０％未満、２０％未満、又は１０％未満の結合親和性を有する。
【０１０５】
ある実施形態においては、作用モジュールは、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎポリペプチド（例えば、ヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ）のフューリンドメイン１又はその機能フラグメントもしくはバリアントと、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎポリペプチド（例えば、ヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ）の改変されていないフューリンドメイン２とを含む。ある実施形態においては、対応する野生型フューリンドメイン２と比較してＬＧＲ４〜６に対する結合親和性が低下している改変されたフューリンドメイン２は、組織ターゲティングの特異性を増加させるのにより望ましいが、特定の実施形態においては、ターゲティングモジュールと組み合わせた改変されていないフューリンドメイン２が、ターゲティングモジュールのない野生型Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎよりも組織ターゲティングを向上させて、ある文脈において有用性をもつ。
【０１０６】
ある実施形態においては、作用モジュールは、例えばＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ−１、−２、−３、−４のいずれか、随意にヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ−１、−２、−３又は−４よりの、野生型又は改変されたＲ−ｓｐｏｎｄｉｎフューリンドメイン１を含む。特定の実施形態においては、作用モジュールは、例えばＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ−１、−２、−３、−４のいずれか、随意にヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ−１、−２、−３又は−４よりの、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎフューリン１ドメインと、野生型又は改変されたＲ−ｓｐｏｎｄｉｎフューリン２ドメインとを含む。特定の実施形態においては、作用モジュールは、例えばＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ−１、−２、−３、−４のいずれか、随意にヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ−１、−２、−３又は−４よりの、第１のＲ−ｓｐｏｎｄｉｎフューリン１ドメインと、野生型又は改変された第２のＲ−ｓｐｏｎｄｉｎフューリン１ドメインとを含む。特定の実施形態においては、改変されたフューリンドメイン２は、例えば全長Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎタンパク質の文脈で、対応する野生型フューリンドメイン２の結合に匹敵するＬＧＲ４〜６に対する結合親和性を有するか、又はＬＧＲ４〜６に対して、当該対応する野生型フューリンドメイン２の結合の８０％未満、５０％未満、２０％未満、もしくは１０％未満の結合親和性を有する。
【０１０７】
ある実施形態においては、作用モジュールは、ＺＮＲＦ３及び／又はＲＮＦ４３に特異的に結合する抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む。特定の実施形態においては、作用モジュールは、ヒトＲＮＦ４３（ｈＲＮＦ４３、ＮＣＢＩ参照配列ＸＰ＿０１１５２３２５７．１、残基４４〜１９８；配列番号４３〜４４）又はヒトＺＮＲＦ３（ｈＺＮＲＦ３；ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１９３９２７．１、残基５６〜２１９；配列番号４５〜４６）に結合する抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む。特定の実施形態においては、作用モジュールは、ａ）表２Ａの抗体のいずれかに記載のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３の配列、ならびに／もしくはｂ）表２Ａの抗体のいずれかに記載のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３の配列を含む、抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、又は１もしくは複数のアミノ酸改変を含む当該抗体もしくはその抗原結合性フラグメントのバリアントであり、当該バリアントは、当該ＣＤＲ配列において８未満のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態においては、単離された抗体又はその抗原結合性フラグメントは、これら抗体のいずれかの重鎖可変領域、軽鎖、ナノボディ又はｓｃＦｖに対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域、軽鎖、ナノボディ又はｓｃＦｖ配列、例えば配列番号７８〜１５４又は１６５〜１７０のいずれか、を含む。ＶＬは、可変軽鎖を示し、またＶＨは、可変重鎖配列を示す。
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【表２−７】
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【表２−８】
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【表２−９】
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＊はＫＤ≧１ｕＭを示し、＊＊は１ｕＭ＞ＫＤ≧１００ｎＭを示し、＊＊＊は１００ｎＭ＞ＫＤを示し、
ＮＢは結合なし（Ｎｏｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ）を示す。
結合特異性は、ＥＬＩＳＡで求めた。
【０１０８】
ターゲティングモジュール
特定の組織内で特異的な細胞型及び細胞は、細胞表面受容体等である１又は複数の細胞又は組織特異性の表面分子を含み得る。本明細書において用いる場合、特定の細胞又は組織型上に、１もしくは複数の他の細胞もしくは組織型又はその他の細胞もしくは組織型と比較してより大量の分子が存在している場合、その分子を、細胞又は組織特異的であるという。ある実施形態においては、より大量とは、上記１もしくは複数の他の細胞もしくは組織型又はその他の細胞もしくは組織型での量と比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、又は少なくとも１００倍である。特定の実施形態においては、細胞特異性表面分子は、標的の器官、組織又は細胞型において、例えば疾患又は障害を治療又は予防するために、Ｗｎｔシグナル伝達を増強することが望まれる例えば器官、組織又は細胞型において、例えば１又は複数の他の標的でない器官、組織又は細胞型と比較して、増加又は増強した発現を有する。ある実施形態においては、細胞特異性表面分子は、１又は複数の他の器官、組織又は細胞型とそれぞれ比較して、標的の器官、組織又は細胞型の表面で優先的に発現する。例えば、特定の実施形態においては、細胞表面受容体は、１以上の、５以上の、全ての他の器官、組織もしくは細胞において発現するよりも、又は全ての他の器官、組織もしくは細胞それぞれの平均よりも、標的の器官、組織又は細胞において、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、又は少なくとも１０００倍高いレベルで発現されるのであれば、組織特異性又は細胞特異性の細胞表面分子であると考えられる。ある実施形態においては、組織特異性又は細胞特異性の細胞表面分子は、細胞表面受容体であり、例えば、ターゲティングモジュールが結合することができる細胞表面膜及び細胞外領域の範囲内に位置する領域を含むポリペプチド受容体である。様々な実施形態においては、本明細書に記載する方法は、標的組織もしくは標的組織を含む組織のサブセットにおいてのみ発現する細胞表面分子を特異的に標的にすることによって、又は、全ての、大多数のもしくは相当な数の他の組織と比較して標的組織においてより高いレベルの発現、例えば少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、又は少なくとも２０の他の組織におけるよりも、標的組織においてより高い発現、を有する細胞表面分子を特異的に標的にすることによって、実行され得る。
【０１０９】
特定の実施形態においては、ターゲティングモジュールは、関心の標的の細胞又は組織型、すなわちＷｎｔシグナル伝達活性が増強又は増加することが望まれる細胞又は組織型、において発現した組織特異性表面分子に結合する。各組織特異性表面分子に結合するターゲティングモジュールは、組織又は細胞特異性受容体の、抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、ペプチド、天然リガンド、又はそれらの誘導体及び合成小分子等であり得るがこれに限定されない。
【０１１０】
ターゲティングモジュールが結合した標的組織は、例えば任意の哺乳動物の組織又は細胞型である、任意の組織であり得る。ある実施形態においては、標的組織は、任意の器官に存在し得る。ある実施形態においては、標的組織は、骨組織、肝臓組織、皮膚組織、胃組織、腸組織、口腔粘膜組織、腎臓組織、中枢神経系組織、乳腺組織、味蕾組織、卵巣組織、内耳組織（蝸牛及び前庭組織を含む）、毛包、膵臓組織、網膜組織、角膜組織、心臓組織又は肺組織であり、またターゲティングモジュールは、骨組織、肝臓組織、皮膚組織、胃組織、腸組織、口腔粘膜組織、腎臓組織、中枢神経系組織、乳腺組織、味蕾組織、卵巣組織、内耳組織（蝸牛及び前庭組織を含む）、毛包、膵臓組織、網膜組織、角膜組織、心臓組織又は肺組織のそれぞれで優先的に発現した組織特異性細胞表面分子（例えば、細胞表面受容体）に結合する。
【０１１１】
ターゲティングモジュールは、任意の組織、器官、又は例えばヒト等の哺乳動物を含めるがこれに限定されない動物、の中の例えば任意の細胞である、任意の細胞型に結合し得る。ある実施形態においては、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子は、例えば標的組織と結合した特異的な細胞型である、特異的な細胞型に結合する。例えば、肝臓組織においては、ターゲティングモジュールは、肝細胞、肝細胞の前駆体及び幹細胞、胆道細胞、ならびに／又は内皮細胞もしくは他の血管細胞に結合し得る。例えば、骨組織においては、ターゲティングモジュールは、骨芽細胞、骨芽細胞の前駆体、間葉系幹細胞、骨を生じる幹細胞及び前駆細胞、軟骨細胞ならびに／又は骨組織に存在する他の細胞に結合し得る。本明細書に記載する組織を含むがこれに限定されない様々な組織に存在する細胞型は、当技術で公知であり、また様々な実施形態においては、本明細書に記載する組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子は、それらのいずれかに結合し得る。ある実施形態においては、ターゲティングモジュールは、肝臓組織又は肝細胞に結合する。
【０１１２】
アシアロ糖蛋白受容体（ＡＳＧＰＲ）は、ＡＳＧＲ１及びＡＳＧＲ２から構成される（例えば、Ｓｔｏｃｋｅｒｔ，Ｍｏｒｅｌｌ  ａｎｄ  Ａｓｈｗｅｌｌ，１９９１，Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：４１〜６４により概説される）。この受容体は、露出した末端ガラクトース残基又はＮ−アセチルガラクトサミン残基を伴う糖タンパク質のエンドサイトーシス及びリソソーム分解を介在することによって血清糖タンパク質の恒常性に重要な役割を果たす膜貫通タンパク質である。すなわち、ＡＧＰＲの天然リガンド及び合成リガンドは、ガラクトシル化したコリンエステラーゼ、ガラクトース（Ｇａｌ）及びＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、例えばＧａｌＮＡｃ末端の糖タンパク質等のＧａｌＮＡｃ含有分子、ならびにモノ−、オリゴ−又はポリ−サッカライドを含有する分子又はナノ粒子を含むがこれに限定されない（例えば、Ｄ’Ｓｏｕｚａ  ａｎｄ  Ｄｅｖａｒａｊａｎ  ２０１５，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２０３：１２６〜１３９により概説される）。
【０１１３】
ＳＬＣ１０ファミリーは、ナトリウム依存的な様式で、胆汁酸、硫酸化溶液、及び他の生体異物を輸送する。その原型メンバー（ｆｏｕｎｄｉｎｇ  ｍｅｍｂｅｒ）、ＳＬＣ１０Ａ１（ＮＴＣＰ）及びＳＬＣ１０Ａ２（ＡＳＢＴ）は、胆汁酸の腸肝循環を維持する働きをする。ＳＬＣ１０Ａの天然リガンド及び合成リガンドの例としては、コール酸塩、Ｎａ（＋）／胆汁酸、Ｎａ（＋）／タウロコール酸塩、及びＢ型肝炎ウイルスのｐｒｅＳ１ドメイン及びそのフラグメント又はバリアントが挙げられるがこれに限定されない（例えば、Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２  ｅＬｉｆｅ，１：ｅ０００４９により報告された）。
【０１１４】
トランスフェリン受容体２（ＴＦＲ２）は、トランスフェリン受容体１（ＴＦＲ１）、二鉄トランスフェリン（Ｆｅ２ＴＦ）の受容体介在性のエンドサイトーシスを介して細胞に鉄を送達するタンパク質、の相同体である。またＴＦＲ２はＦｅ２ＴＦに結合するが、全身的な鉄恒常性の調節において主に機能するようである（例えば、Ｗｏｒｔｈｅｎ  ａｎｄ  Ｅｎｎｓ，２０１４，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ５：３４により概説される）。ＴＦＲ２の天然リガンド及び合成リガンド及び結合の相手方の例としては、例えば二鉄トランスフェリン等のトランスフェリン、ならびにヘモクロマトーシス（ＨＦＥ）タンパク質及びそのフラグメント及びバリアントを含むが、これに限定されない。
【０１１５】
副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）の１型受容体（ＰＴＨ１Ｒ）及びＰＴＨ関連ペプチド（ＰＴＨｒＰ）は、骨及び腎臓において高度に発現する（例えば、Ｍａｎｎｓｔａｄｔ，Ｊｕｐｐｎｅｒ，ａｎｄ  Ｇａｒｄｅｌｌａ，１９９９，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２７７：Ｆ６６５−Ｆ６７５により概説される）。副甲状腺ホルモン受容体１（ＰＴＨ１Ｒ）の天然リガンド及び合成リガンドは、ＰＴＨ、ＰＴＨｒＰならびにそのフラグメント及びバリアントを含むがこれに限定されない。
【０１１６】
Ｌｙ６／ＰＬＡＵＲドメイン含有タンパク質３（ＬＹＰＤ３）は、例えば口腔粘膜、皮膚及び食道等である組織に存在する重層扁平上皮において非常に特異的な発現を呈するＧＰＩアンカー型タンパク質である。ＬＹＰＤ３発現はまた、創傷治癒中の遊走ケラチノサイトのみならず種々のがんにおいて発現上昇が見られた（例えばＪａｃｏｂｓｅｎ，Ｋｒｉｅｇｂａｕｍ，Ｓａｎｔｏｎｉ−Ｒｕｇｉｕ  ａｎｄ  Ｐｌｏｕｇ，２０１４，Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，５（４）：６２１−３２により概説される）。ＬＹＰＤ３発現は報告されていたが、その正確な機能は不明なままであり、これはＬＹＰＤ３遺伝子を欠いている動物が、生存可能で、繁殖性であり、また扁平上皮の発育に明らかな欠陥がないからである。ＬＹＰＤ３の結合の相手方として、様々な分子が特定されてきた。ラミニン１、ラミニン５及びガレクチン−３はＬＹＰＤ３と結合して、細胞遊走を促進する（Ｐａｒｅｔ，Ｂｏｕｒｏｕｂａ，Ｂｅｅｒ，Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，Ｆｉｅｄｌｅｒ  ａｎｄ  Ｚｏｌｌｅｒ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ．２００５  Ｊｕｌ  １０；１１５（５）：７２４−３３）。Ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ２、ＡＧＲ２は、ＬＹＰＤ３と相互作用して、膵管腺がん（ＰＤＡＣ）においてがんの成長、転移及び治療抵抗性を促進する（Ａｒｕｍｕｇａｍ，Ｄｅｎｇ，Ｂｏｖｅｒ，Ｗａｎｇ，Ｌｏｇｓｄｏｎ  ａｎｄ  Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．２０１５  Ａｐｒ；１４（４）：９４１−５１）。ＬＹＰＤ３は、限局したラミニン３３２の分解を介してがん細胞の運動性を促進する、α６β４インテグリン及びマトリックスメタロプロテアーゼ１４（ＭＭＰ１４）との複合体を低酸素状態下で形成する  （Ｎｇｏｒａ，Ｇａｌｌｉ，Ｍｉｙａｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｚｏｌｌｅｒ．Ｎｅｏｐｌａｓｉａ．２０１２  Ｆｅｂ；１４（２）：９５−１０７）。
【０１１７】
デスモグレイン３（ＤＳＧ３）は、タンパク質のカドヘリン細胞接着分子スーパーファミリーのメンバーであるカルシウム結合膜貫通糖タンパク質をコードする。ＤＳＧ３は、上皮及び粘膜における細胞間接着に関する特別な構造である接着斑において発現する。ＤＳＧ３は、ＤＳＧ３細胞間相互作用に必要なＣａ２＋結合部位を含有する５つの細胞外カドヘリンドメイン（ＥＣＤ）を有する（例えば、Ｔｈｏｍａｓｏｎ，Ｓｃｏｔｈｅｒｎ，ＭｃＨａｒｇ  ａｎｄ  Ｇａｒｒｏｄ，２０１０，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，４２９（３）：４１９−４３３により概説される）。ＤＳＧ３細胞間相互作用は、それらのＮ−末端近傍の同種親和性のトランス相互作用が介在する。動物におけるＤＳＧ３の喪失は、口腔粘膜の非常に深刻なびらん及び離乳（ｗｅａｎｉｎｇ）時の脱毛を引き起こすものであり、この遺伝子が、これら組織における上皮細胞の完全性にとってどれほど重要であるかを示している。単一分子の原子間力顕微鏡実験により、細胞外カドヘリンドメインを介した同種親和性トランスＤＳＧ３結合が示されている（Ｈｅｕｐｅｌ，Ｚｉｌｌｉｋｅｎｓ，Ｄｒｅｎｃｋｈａｈｎ  ａｎｄ  Ｗａｓｃｈｋｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ａｕｇｕｓｔ  １，２００８，１８１（３）１８２５−１８３４）。
【０１１８】
様々な実施形態においては、組織特異性表面分子は、組織特異性細胞表面受容体である。肝臓に関しては、これらは、ＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２、ＴＦＲ２、ＳＬＣ１０Ａ１等を含むがこれに限定されない。ある実施形態においては、ターゲティングモジュールは、ＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２、ＴＦＲ２、ＳＬＣ１０Ａ１、ＬＹＰＤ３又はＤＳＧ３に結合する、天然リガンド、もしくはその機能バリアントもしくはフラグメント、又は抗体もしくはその抗原結合性フラグメントである。骨又は腎臓に関しては、こうした組織特異性細胞表面受容体は、副甲状腺ホルモン受容体１（ＰＴＨ１Ｒ）等を含むがこれに限定されない。ある実施形態においては、ターゲティングモジュールは、ＰＴＨ１Ｒに結合する、天然リガンド、もしくはその機能バリアントもしくはフラグメント、又は抗体もしくはその抗原結合性フラグメントである。口腔粘膜に関しては、こうした組織特異性細胞表面受容体は、ＬＹＰＤ３及びＤＳＧ３を含むがこれに限定されない。ある実施形態においては、ターゲティングモジュールは、ＬＹＰＤ３又はＤＳＧ３に結合する、天然リガンド、もしくはその機能バリアントもしくはフラグメント、又は抗体もしくはその抗原結合性フラグメントである。
【０１１９】
特定の実施形態においては、ターゲティングモジュールは、ヒトＡＳＧＲ１（ｈＡＳＧＲ１；ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１６６２．１、残基６２〜２９１；配列番号３５〜３６）、ヒトＡＳＧＲ２（ｈＡＳＧＲ２；ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿５５０４３６．１、残基６６〜２９２；配列番号３７〜３８）、カニクイザルＡＳＧＲ１（ｃｙｎｏＡＳＧＲ１、配列ＩＤ  ＸＰ＿００５５８２７５５．１、残基６２〜２９１；配列番号３９〜４０）、又はカニクイザルＡＳＧＲ２（ｃｙｎｏＡＳＧＲ２；配列番号４１〜４２）に結合する。
ある実施形態においては、ターゲティングモジュールは、表３Ａに列記した抗体のいずれかに記載のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３の配列、ならびに／もしくは表３Ａの抗体のいずれかに記載のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３の配列を含む、抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、又は１もしくは複数のアミノ酸改変を含む当該抗体もしくはその抗原結合性フラグメントのバリアントを含むものであり、当該バリアントは、当該ＣＤＲ配列において８未満のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態においては、単離された抗体又はその抗原結合性フラグメントは、これら抗体のいずれかの重鎖可変領域、軽鎖、ナノボディ又はｓｃＦｖに対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域、軽鎖、ナノボディ又はｓｃＦｖ配列を含み、例えば配列番号４７〜７７、１５１〜１５４、１７１〜１７９、１８０〜１８５又は２７４〜３０５のいずれかである（例えば、表３Ｂ又は３Ｃを参照）。
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【表３−７】
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【表３−８】
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【表３−９】
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【表３−１０】
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【０１２０】
組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子の説明的な、非限定的な例としては、以下を含む融合タンパク質が挙げられる：１）Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎフューリンドメイン１又はそのバリアントを含む第１のドメイン、及びＡＳＧＲ１又はＡＳＧＲ２に特異的に結合する抗体又はそのフラグメントを含む第２のドメイン、２）Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎフューリンドメイン１又はそのバリアントを含む第１のドメイン、及びＳＬＣ１０Ａ１に特異的に結合する抗体又はそのフラグメントを含む第２のドメイン、３）Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎフューリンドメイン１又はそのバリアントを含む第１のドメイン、及びＴＦＲ２に特異的に結合する抗体又はそのフラグメントを含む第２のドメイン、４）Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎフューリンドメイン１又はそのバリアントを含む第１のドメイン、及びＰＴＨ１Ｒに特異的に結合する、リガンド誘導体、抗体又はそのフラグメントを含む第２のドメイン、５）Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎフューリンドメイン１又はそのバリアントを含む第１のドメイン、及びＬＹＰＤ３に特異的に結合する、リガンド誘導体、抗体又はそのフラグメントを含む第２のドメイン、６）Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎフューリンドメイン１又はそのバリアントを含む第１のドメイン、及びＤＳＧ３に特異的に結合する、リガンド融合体、抗体又はそのフラグメントを含む第２のドメイン、ならびに７）Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎフューリンドメイン１又はそのバリアントを含む第１のドメイン、及びＴＦＲ１に特異的に結合する、リガンド誘導体、抗体又はそのフラグメントを含む第２のドメイン。組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子のさらなる説明的な、非限定的な例としては、以下を含む融合タンパク質が挙げられる：１）ＺＮＲＦ３及び／又はＲＮＦ４３に特異的に結合する抗体又はそのフラグメントを含む第１のドメイン、及びＡＳＧＲ１又はＡＳＧＲ２に特異的に結合する抗体又はそのフラグメントを含む第２のドメイン；２）ＺＮＲＦ３及び／又はＲＮＦ４３に特異的に結合する抗体又はそのフラグメントを含む第１のドメイン、及びＳＬＣ１０Ａ１に特異的に結合する抗体又はそのフラグメントを含む第２のドメイン；３）ＺＮＲＦ３及び／又はＲＮＦ４３に特異的に結合する抗体又はそのフラグメントを含む第１のドメイン、及びＴＦＲ２に特異的に結合する抗体又はそのフラグメントを含む第２のドメイン；４）ＺＮＲＦ３及び／又はＲＮＦ４３に特異的に結合する抗体又はそのフラグメントを含む第１のドメイン、及びＰＴＨ１Ｒに特異的に結合する、リガンド誘導体、抗体又はそのフラグメントを含む第２のドメイン；５）ＺＮＲＦ３及び／又はＲＮＦ４３に特異的に結合する抗体又はそのフラグメントを含む第１のドメイン、及びＬＹＰＤ３に特異的に結合する、リガンド誘導体、抗体又はそのフラグメントを含む第２のドメイン；６）ＺＮＲＦ３及び／又はＲＮＦ４３に特異的に結合する抗体又はそのフラグメントを含む第１のドメイン、及びＤＳＧ３に特異的に結合する、リガンド誘導体、抗体又はそのフラグメントを含む第２のドメイン；ならびに、７）ＺＮＲＦ３及び／又はＲＮＦ４３に特異的に結合する抗体又はそのフラグメントを含む第１のドメイン、及びＴＦＲ１に特異的に結合する、リガンド誘導体、抗体又はそのフラグメントを含む第２のドメイン。特定の実施形態においては、当該第１のドメインは、表２に記載の重鎖もしくは軽鎖のＣＤＲ配列の組のいずれかを含む抗体を含み、及び／又は、当該第２のドメインは、表３に記載の重鎖もしくは軽鎖のＣＤＲ配列の組のいずれかを含む抗体を含む。特定の実施形態においては、当該２つのドメインは、例えばポリペプチドリンカーであるリンカーを介して連結する。ある実施形態においては、リンカーは、例えばヒト血清アルブミンであるアルブミンであって、ターゲティングモジュール及び作用モジュールが、アルブミンのＮ末端及びＣ末端上にある。特定の実施形態においては、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子は、抗体の重鎖及び抗体の軽鎖（又は当該鎖のいずれかもしくは両方のそのフラグメントもしくはバリアント）を含む付加した抗体（例えば、ＩｇＧ）の形態を有するものであって、一方又は両方の鎖が、１又は複数のさらなる結合ドメインをさらに含む。特定の実施形態においては、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子は、付加した抗体（例えば、ＩｇＧ）の形態を有するものであって、第２のドメインが抗体の重鎖及び抗体の軽鎖（又は当該鎖のいずれかもしくは両方のそのフラグメントもしくはバリアント）を含み、またＲ−ｓｐｏｎｄｉｎフューリンドメイン１又はバリアントを含む第１のドメインが、例えばいずれか又は両方の鎖のＮ末端及び／又はＣ末端のいずれか又は両方において、抗体の重鎖及び／又は軽鎖の一方又は両方に付加する。特定の実施形態においては、第１のドメインは、例えばＮ末端又はＣ末端のいずれかにおいて、重鎖に付加又は融合する。特定の実施形態においては、第１のドメインは、例えばＮ末端又はＣ末端）のいずれかにおいて、軽鎖に付加又は融合する。
【０１２１】
リンカー
ある実施形態においては、ターゲティングモジュール及び作用モジュールは、互いに直接結合又は融合し、一方で他の実施形態においては、それらは、例えばポリペプチドリンカー又は非ペプチジルリンカー等である、リンカーによって離間する。特定の実施形態においては、リンカーはＦｃリンカーであり、例えば抗体のＦｃドメインの領域であって例えば１又は複数のジスルフィド結合を介して別のＦｃリンカーと二量体形成することが可能である抗体のＦｃドメインの領域である。別の特定の実施形態においては、リンカーは、例えばヒト血清アルブミンであるアルブミンであって、ターゲティングモジュール及び作用モジュールが、アルブミンのＮ末端及びＣ末端上にある。
【０１２２】
ある実施形態においては、特に２つのポリペプチドを連結する場合に、リンカーは、ペプチド結合によって一緒になって連結されたアミノ酸で構成される。特定の実施形態においては、リンカーは、長さが、１から最大で約４０のアミノ酸残基、１から最大で約２０のアミノ酸残基、又は１から最大で約１０のアミノ酸残基である。ある実施形態においては、リンカー内のアミノ酸残基は、２０種の標準アミノ酸よりのものであり、またある実施形態においては、システイン、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン及び／又はセリンから選択される。ある実施形態においては、リンカーは１又は複数の非天然アミノ酸を含む。一部の実施形態においては、ペプチジルリンカーは、ペプチド結合で連結した例えばグリシン、セリン及びアラニン等である、立体障害のない大多数のアミノ酸から構成される。あるリンカーは、ポリグリシン、ポリセリン、及びポリアラニン、又はこれらのいずれかの組み合わせを含む。一部の例示的なペプチジルリンカーは、ポリ（Ｇｌｙ）１〜８、特に（Ｇｌｙ）３、（Ｇｌｙ）４（配列番号６９８）、（Ｇｌｙ）５（配列番号６９９）及び（Ｇｌｙ）７（配列番号７００）のみならずポリ（Ｇｌｙ）４  Ｓｅｒ（配列番号７０１）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）２〜４及びポリ（Ａｌａ）１〜８である。ペプチジルリンカーの他の特定の例としては、（Ｇｌｙ）５Ｌｙｓ（配列番号７０２）及び（Ｇｌｙ）５ＬｙｓＡｒｇ（配列番号７０３）が挙げられる。上記命名を説明すると、例えば（Ｇｌｙ）３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）４（配列番号７０４）は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号７０４）を意味する。Ｇｌｙ及びＡｌａの他の組み合わせもまた有用である。さらに、ペプチジルリンカーはまた、例えば一般式−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−の６炭素脂肪族分子等である非ペプチジル部分を含むことが可能である。ペプチジルリンカーは、本明細書に記載するような誘導体を形成するように変更可能である。
【０１２３】
説明的な非ペプチジルリンカーとしては、例えば式中ｓ＝２〜２０である、−−ＮＨ−−（ＣＨ２）ｓ−−Ｃ（Ｏ）−−等の、例えばアルキルリンカーが挙げられる。これらアルキルリンカーは、例えば低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ６）、低級アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニル等である、任意の立体障害のない基によってさらに置換されていてもよい。例えば非ペプチジルリンカー又は非ペプチドの半減期延長部分等の、本発明の組成物の要素の非ペプチド部分は、従来の有機化学反応によって合成可能である。結合ドメインの連結での使用が見出される化学基としては、当技術において公知の、カルバミン酸塩；アミド（アミンとカルボン酸）；エステル（アルコールとカルボン酸）、チオエーテル（ハロアルカンとスルフヒドリル；マレイミドとスルフヒドリル）、シッフ塩基（アミンとアルデヒド）、尿素（アミンとイソシアン酸塩）、チオ尿素（アミンとイソチオシアン酸塩）、スルホンアミド（アミンと塩化スルフォニル）、ジスルフィド；ヒドラゾン、脂質等が挙げられる。
【０１２４】
ドメイン間の結合は、例えばアルキルスペーサー等のスペーサーを含んでもよく、当該スペーサーは、直鎖又は分枝であり得、通常直鎖であり、また１又は複数の不飽和結合を含み得、通常は１から約３００個の炭素原子を有し；さらに通常は約１から２５個の炭素原子を有し、また約３から１２個の炭素原子であってもよい。このタイプのスペーサーはまた、アミン、エーテル、リン酸ジエステル等を含む、ヘテロ原子又は官能基を含んでもよい。特定の関心の構造には、式中ｎが１から約１２である、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ；式中ｎが１から約１２である、（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎ；式中ｎ及びｍが１から約６、かつｚが１から約１０である、［（ＣＨ２）ｎ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍ］ｚ；式中ｎ及びｍが１から約６、かつｚが１から約１０である、［（ＣＨ２）ｎＯＰＯ３（ＣＨ２）ｍ］ｚが含まれる。こうしたリンカーは、直鎖又は分枝であり得る、ポリエチレングリコールが含まれ得る。
【０１２５】
ある実施形態においては、ドメインは、ホモ又はヘテロの二官能性リンカーを介して連結してもよい。説明的な実体としては、アジドベンゾイルヒドラジド、Ｎ−［４−ｐ−アジドサリチルアミノ）ブチル］−３’−［２’−ピリジルジチオ］プロピオンアミド）、ビス−スルホスクシンイミジルスベレート、アジプイミド酸ジメチル、酒石酸ジスクシンイミジル、Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジド安息香酸塩、［４−アジドフェニル］−１，３’−ジチオプロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル、［４−ヨードアセチル］アミノ安息香酸Ｎ−スクシンイミジル、グルタルアルデヒド、ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ；４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミジル；３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＰＤＰ）；Ｎ，Ｎ’−１，３−フェニレン）ビスマレイミド；Ｎ，Ｎ’−エチレン−ビス−（ヨードアセトアミド）；又は４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＭＣＣ）；ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、及び４−（ｐ−マレイミドフェニル）酪酸スクシンイミド（ＳＭＰＢ）、ＭＢＳの伸びきり鎖類似体、が挙げられる。ある実施形態においては、これら架橋リンカーのスクインイミジル基は一級アミンと反応し、またチオール反応性マレイミドは、システイン残基のチオールと共有結合を形成する。
【０１２６】
他の有用な試薬としては、ビスマレイミドヘキサン（“ＢＭＨ”）；ｐ，ｐ’−ジフルオロ−ｍ，ｍ’−ジニトロジフェニルスルホン（アミノ基とフェノール基と共に不可逆架橋結合を形成する）；アジプイミド酸ジメチル（アミノ基に特異的である）；フェノール−１，４−ジスルホニルクロリド（主にアミノ基と反応する）；ヘキサメチレンジイソシアン酸塩又はイソチオシアン酸塩、又はアゾフェニル−ｐ−ジイソシアン酸塩（主にアミノ基と反応する）；ジスジアゾベンジジン（ｄｉｓｄｉａｚｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）（主にチロシン及びヒスチジンと反応する）；Ｏ−ベンゾトリアゾリルオキシテトラメスルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＨＡＴＵ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ブロモ−トリス（ピロリジノ）ホスホニウムブロミド（ＰｙＢｒｏＰ）；Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）；４−ピロリジノピリジン；Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール；等を含めた、ホモ二官能性架橋剤が挙げられる。
【０１２７】
抗体及びその使用
様々な実施形態においては、本発明は、抗ＲＮＦ４３抗体、抗ＺＮＲＦ３抗体、及び抗ＡＳＧＲ１／２抗体、及びその抗原結合性フラグメント、ならびに関連する使用方法を提供する。
【０１２８】
一実施形態においては、本開示は、ＲＮＦ４３、ＺＮＲＦ３、ＡＳＧＲ１又はＡＳＧＲ２（随意に、ヒト）に結合する単離された抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、（ｉ）表２Ａもしくは３Ａの抗体のいずれかに記載のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３の配列、ならびに／もしくは（ｉｉ）表２Ａもしくは３Ａの抗体のいずれかに記載のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３の配列、を含む配列を含む当該抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、又は１もしくは複数のアミノ酸改変を含む当該抗体もしくはその抗原結合性フラグメントのバリアントを提供するものであり、当該バリアントは、当該ＣＤＲ配列において８未満のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態においては、抗体又はその抗原結合性フラグメントは、表２Ｂもしくは表３Ｂに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、又は表２Ｂもしくは表３Ｂに記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。特定の実施形態においては、抗体又はその抗原結合性フラグメントは、表２Ｂもしくは表３Ｂに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は表２Ｂもしくは表３Ｂに記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１２９】
特定の実施形態においては、当該抗体又はその抗原結合性フラグメントのいずれかは、ヒト化される。ある実施形態においては、当該抗体又はその抗原結合性フラグメントのいずれかは、単鎖抗体、ｓｃＦｖ、ヒンジ領域を欠いた一価抗体、ナノボディ又はミニボディである。特定の実施形態においては、当該抗体又はその抗原結合性フラグメントのいずれかは、ＶＨＨナノボディである  特定の実施形態においては、当該抗体又はその抗原結合性フラグメントのいずれかは、Ｆａｂ又はＦａｂ’フラグメントである。
【０１３０】
ある実施形態においては、当該抗体又はその抗原結合性フラグメントのいずれかは、融合タンパク質である。
【０１３１】
関連の実施形態においては、本開示は、その標的ＺＮＲＦ３、ＲＮＦ４３又はＡＳＧＲ１／２への結合を、本明細書に開示する抗体のいずれかと競合する、単離された抗体又はその抗原結合性フラグメントを提供する。特定の実施形態においては、抗体又はその抗原結合性フラグメントのいずれかは、その標的に、５０μＭ以下のＫＤで結合する。
【０１３２】
一実施形態においては、本発明は、ヒトＡＳＧＲに結合して、ＡＳＧＲのリガンドとの結合を阻害する、単離された抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む。別の実施形態においては、本発明は、ヒトＡＳＧＲ−１に結合して、ＡＳＧＲ−１のリガンドとの結合及び／又はＡＳＧＲ−１のＡＳＧＲ−２との相互作用を阻害する、単離された抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む。別の実施形態においては、本発明は、ヒトＡＳＧＲ−２に結合して、ＡＳＧＲ−２のリガンドとの結合及び／又はＡＳＧＲ−２のＡＳＧＲ−１との相互作用を阻害する、単離された抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む。さらに別の実施形態においては、本発明は、ヒトＡＳＧＲ−１及びヒトＡＳＧＲ−２に結合して、ＡＳＧＲ−１及び／又はＡＳＧＲ−２のリガンドとの結合を阻害する、単離された抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む。一部の実施形態においては、単離された抗体又はその抗原結合性フラグメントは、ヒトＡＳＧＲ、ＡＳＧＲ−１及び／又はＡＳＧＲ−２に特異的に結合する。
【０１３３】
特定の実施形態においては、抗体又はその抗原結合性フラグメントのいずれかは、細胞において、随意に哺乳動物細胞において、Ｗｎｔシグナル伝達経路を調節する。特定の実施形態においては、抗体又はその抗原結合性フラグメントのいずれかは、細胞において、Ｗｎｔシグナル伝達経路を介したシグナル伝達を増加させる。特定の実施形態においては、抗体又はその抗原結合性フラグメントのいずれかは、細胞において、Ｗｎｔシグナル伝達経路を介したシグナル伝達を減少させる。ある実施形態においては、Ｗｎｔシグナル伝達経路は、古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路又は非古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路である。
【０１３４】
さらなる関連の実施形態においては、本開示は、本明細書に開示される、抗体又はその抗原結合性フラグメントをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。ある実施形態においては、本開示は、単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、当該発現ベクターを含む単離された宿主細胞とを提供する。
【０１３５】
別の実施形態においては、本開示は、本明細書に開示する、生理学的に許容可能な賦形剤、希釈剤又は担体と、治療有効量の単離された抗体又はその抗原結合性フラグメントとを含む医薬組成物を提供する。
【０１３６】
本開示は、例えば生体試料（例えば、細胞又は組織）中のＺＮＲＦ３、ＲＮＦ４３又はＡＳＧＲ１／２のポリペプチドの存在又は発現レベルを検出する方法であって、当該生体試料を、標的ポリペプチドに特異的に結合する本明細書に開示する抗体又はその抗原結合性フラグメントと接触させることを含む、当該方法を提供する。ある実施形態においては、抗体又はその抗原結合性フラグメントは、例えば蛍光タグによって、検出可能に標識されている。したがって、抗体を、抗体標的ポリペプチドを発現する細胞を染色するために用いてもよい。例えば、抗ＡＳＧＲ１／２抗体及びその抗原結合性フラグメントを、肝細胞を検出又は染色するために用いてもよい。
【０１３７】
本明細書に開示する抗体又はその抗原結合性フラグメントはまた、それらが結合する細胞に薬剤を送達するために用いることができる。例えば、抗ＡＳＧＲ１／２抗体及びその抗原結合性フラグメントは、治療薬と結合して、例えば正常な又はがんの肝細胞である、肝細胞に当該治療薬を送達することができる。
【０１３８】
さらなる実施形態においては、本開示は、細胞においてＷｎｔシグナル伝達経路を作動（ａｇｏｎｉｚｉｎｇ）する方法であって、当該細胞を、Ｗｎｔシグナル伝達を増加させる、本明細書に開示する単離された抗体又はその抗原結合性フラグメントと接触させることを含む、当該方法を提供する。別の実施形態においては、本開示は、細胞においてＷｎｔシグナル伝達経路を阻害する方法であって、当該細胞を、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害させる、本明細書に開示する単離された抗体又はその抗原結合性フラグメントと接触させることを含む、当該方法を提供する。
【０１３９】
別の実施形態においては、本開示は、Ｗｎｔシグナル伝達の低下と関連する疾患又は障害を有する対象を治療する方法であって、Ｗｎｔシグナル伝達経路のアゴニストである、本明細書に開示する単離された抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む医薬組成物の有効量を当該対象に投与することを含む、当該方法を含む。特定の実施形態においては、当該疾患又は障害は、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子によって治療される、本明細書に記載するもののうちのいずれかである。
【０１４０】
一部の実施形態においては、本開示は、冠動脈疾患を患う又はＭＩを有するリスクを減少させる方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に開示する抗ＡＳＧＲ抗体又はその抗原結合性フラグメントの治療有効量を投与することを含む、当該方法を含む。一部の実施形態においては、抗体はＡＳＧＲ−１に結合し、また一部の実施形態においては、抗体はＡＳＧＲ−２に結合する。一部の実施形態においては、抗体はＡＳＧＲ−１及び／又はＡＳＧＲ−２の阻害剤である。一部の実施形態においては、冠動脈疾患又はＭＩの相対リスク減少率は、未治療の対象と比較して、治療した対象において少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％である。
【０１４１】
一部の実施形態においては、本開示は、対象において血中ＬＤＬコレステロールレベルを減少させる方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に開示する、治療有効量の抗ＡＳＧＲ抗体又はその抗原結合性フラグメントを投与することを含む、当該方法を提供する。一部の実施形態においては、抗体はＡＳＧＲ−１に結合し、また一部の実施形態においては、抗体はＡＳＧＲ−２に結合する。一部の実施形態においては、抗体はＡＳＧＲ−１及び／又はＡＳＧＲ−２の阻害剤である。一部の実施形態においては、治療した対象における血中ＬＤＬコレステロールレベルは、対象における投与前の血中ＬＤＬコレステロールレベルと比較して、少なくとも約１５％減少する。本発明のこの態様の一部の実施形態においては、当該対象の血中ＬＤＬコレステロールレベルは、対象における投与前の血中ＬＤＬコレステロールレベルと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、又は少なくとも約９０％低下する。
【０１４２】
一部の実施形態においては、本開示は、対象において非ＨＤＬコレステロールレベルを減少させる方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に開示する、治療有効量の抗ＡＳＧＲ抗体又はその抗原結合性フラグメントを投与することを含む、当該方法を提供する。一部の実施形態においては、抗体はＡＳＧＲ−１に結合し、また一部の実施形態においては、抗体はＡＳＧＲ−２に結合する。一部の実施形態においては、抗体はＡＳＧＲ−１及び／又はＡＳＧＲ−２の阻害剤である。一部の実施形態においては、対象における非ＨＤＬコレステロールレベルは、対象における投与前の非ＨＤＬコレステロールレベルと比較して、少なくとも約５％減少する。本発明のこの態様の一部の実施形態においては、当該患者の非ＨＤＬコレステロールレベルは、患者における投与前の非ＨＤＬコレステロールレベルと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、又は少なくとも約９０％低下する。
【０１４３】
一部の実施形態においては、本開示は、患者においてＡＳＧＲ活性の阻害を介してＡＬＰレベルを増加させる方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に開示する、治療有効量の抗ＡＳＧＲ抗体又はその抗原結合性フラグメントを投与することを含む、当該方法を提供する。一部の実施形態においては、抗体はＡＳＧＲ−１に結合し、また一部の実施形態においては、抗体はＡＳＧＲ−２に結合する。一部の実施形態においては、抗体はＡＳＧＲ−１及び／又はＡＳＧＲ−２の阻害剤である。一部の実施形態においては、患者におけるＡＬＰレベルは、当該患者における投与前のＡＬＰレベルと比較して、少なくとも約３０％増加する。本発明のこの態様の一部の実施形態においては、当該対象のＡＬＰレベルは、対象における投与前のＡＬＰレベルと比較して、少なくとも約、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、又は少なくとも約９０％増加する。一部の実施形態においては、ＡＬＰレベルは、治療前に対して、少なくとも約１．２５倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、及び５倍、増加する。
【０１４４】
一部の実施形態においては、本開示は、対象においてＡＳＧＲ、ＡＳＧＲ−１及び／又はＡＳＧＲ−２を作動する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に開示する、治療有効量の抗ＡＳＧＲ抗体又はその抗原結合性フラグメントを投与することを含む、当該方法を提供する。一部の実施形態においては、抗体はＡＳＧＲ−１に結合し、また一部の実施形態においては、抗体はＡＳＧＲ−２に結合する。一部の実施形態においては、抗体はＡＳＧＲ−１及び／又はＡＳＧＲ−２の阻害剤である。
【０１４５】
一部の実施形態においては、循環器疾患を治療又は予防する方法を提供し、またそれを必要とする対象に、本明細書に開示する、治療有効量の抗ＡＳＧＲ抗体又はその抗原結合性フラグメントを投与することを含む。一部の実施形態においては、抗体はＡＳＧＲ−１に結合し、また一部の実施形態においては、抗体はＡＳＧＲ−２に結合する。一部の実施形態においては、抗体はＡＳＧＲ−１及び／又はＡＳＧＲ−２の阻害剤である。一部の実施形態においては、循環器事象の相対リスク減少率は、患者において少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％である。
【０１４６】
Ｗｎｔ分子、Ｎｏｒｒｉｎ分子及びＷｎｔシグナル増強分子
本開示は、Ｗｎｔシグナル伝達を増加させて、本明細書に記載するものを含めたＷｎｔ関連疾患又は障害を治療又は予防する、Ｗｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド及びＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子ならびにそれらの使用にさらに関する。ある実施形態においては、Ｗｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド及びＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子を、単独で、又は本明細書に記載する１又は複数の組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子と組み合わせて、対象に提供する。
【０１４７】
Ｗｎｔポリペプチド及びＷｎｔコードポリヌクレオチド配列は、当技術で公知であり、また例えばヒトＷｎｔポリペプチド及びポリヌクレオチド等である、哺乳動物Ｗｎｔポリペプチド及びポリヌクレオチドを含めた、任意の及び全ての種のものを含めた、任意の及び全てのＷｎｔポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む。説明的なＷｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２Ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５Ａ、Ｗｎｔ５Ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７Ａ、Ｗｎｔ７Ｂ、Ｗｎｔ８Ａ、Ｗｎｔ８Ｂ、Ｗｎｔ９Ａ、Ｗｎｔ９Ｂ、Ｗｎｔ１０Ａ、Ｗｎｔ１０Ｂ、Ｗｎｔ１１、ならびにＷｎｔ１６、ならびに先述のいずれかの機能バリアント及びフラグメントを含む。Ｗｎｔポリペプチドには、天然のＷｎｔポリペプチド、Ｗｎｔポリペプチドバリアント、Ｗｎｔポリペプチドフラグメント、及びキメラＷｎｔポリペプチドを包含する。特定の実施形態においては、Ｗｎｔポリペプチドは、天然のヒト完全長成熟Ｗｎｔタンパク質である。
【０１４８】
例えば、本願において関心のヒト天然配列のＷｎｔタンパク質は、以下のものを含むがこれに限定されない：Ｗｎｔ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５４３０）；Ｗｎｔ−２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３３９１）；Ｗｎｔ２Ｂ（Ｗｎｔ−１３）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４１８５（アイソフォーム１）、ＮＭ＿０２４４９４．２（アイソフォーム２））、Ｗｎｔ３（ＲｅｆＳｅｑ．：ＮＭ＿０３０７５３）、Ｗｎｔ３Ａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３３１３１）、Ｗｎｔ４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３０７６１）、Ｗｎｔ５Ａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３３９２）、Ｗｎｔ５Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２６４２）、Ｗｎｔ６（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００６５２２）、Ｗｎｔ７Ａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４６２５）、Ｗｎｔ７Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０５８２３８）、Ｗｎｔ８Ａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０５８２４４）、Ｗｎｔ８Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３３９３）、Ｗｎｔ９Ａ（Ｗｎｔ−１４）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３３９５）、Ｗｎｔ９Ｂ（Ｗｎｔ１５）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３３９６）、Ｗｎｔ１ＯＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０２５２１６）、Ｗｎｔ１０Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３３９４）、Ｗｎｔ１１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４６２６）、Ｗｎｔ１６（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６０８７））。各メンバーは、ファミリーとの様々な程度の配列同一性を有するが、その間隔が高度に保存されている２３〜２４個の保存されたシステイン残基を含有する小分子の（すなわち、３９〜４６ｋＤ）、アシル化され、パルミトイル化され、分泌された糖タンパク質を、全てのメンバーがコードする（ＭｃＭａｈｏｎ，Ａ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１９９２；８：２３６−２４２；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ  Ｒ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．２００２；３（１）：３００１．１−３００１．１５）。関心の他の天然配列のＷｎｔポリペプチドは、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、カエル、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ、虫（ｗｏｒｍ）等の、家畜、及び動物園動物、実験動物又は愛玩動物を含む、任意の哺乳動物よりの上記のオルソログを含む。
【０１４９】
Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド及びＮｏｒｒｉｎコードポリヌクレオチド配列もまた、当技術で公知であり、また例えばヒトＮｏｒｒｉｎポリペプチド及びポリヌクレオチド等である、哺乳動物Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド及びポリヌクレオチドを含めた、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド又はポリヌクレオチドの任意の種、ならびにその機能バリアント及びフラグメントを含む。
【０１５０】
Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト分子は、Ｗｎｔシグナル伝達を作動する任意のタイプの分子を含む。特定の実施形態においては、Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト分子は、ＰＣＴ特許出願公開公報の国際公開第２０１６／０４０８９５号に記載されている。Ｗｎｔシグナル伝達アゴニストは、例えばタンパク質又は医薬分子（例えば、有機小分子）であり、ある実施形態においては水溶性である、任意の分子とすることが可能であり、これは１又は複数のＦｚｄタンパク質への及びＬｒｐ５／６への結合を介して古典的Ｗｎｔシグナル伝達を直接活性化する。特定の実施形態においては、それらは小分子であり、約１５Ｋｄ未満であり得る。他の実施形態においては、それらはポリペプチドである。さらに、あるＷｎｔシグナル伝達アゴニストは、ポリペプチドの領域又はドメインと、非ポリペプチドの領域又はドメインとの両方を含み得る。
【０１５１】
本発明の一部の実施形態においては、Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト分子は、ポリペプチドであり、Ｆｚｄ及びＬｒｐ５／６のための離間した又は隣接し合う結合ドメイン又は要素を含むことが可能である。ポリペプチドＷｎｔシグナル伝達アゴニストは、単鎖、二量体、又はより高次の多量体であり得る。Ｆｚｄ結合ドメイン／要素及びＬｒｐ５／６結合ドメイン／要素は、直接連結してもよく、又は、例えばポリペプチドリンカー又は非ペプチドリンカー等のリンカーにより離間していてもよい。
【０１５２】
ポリペプチドの実施形態においては、Ｆｚｄ結合ドメインは、例えばＫＤが少なくとも約１×１０−７Ｍ、少なくとも約１×１０−８Ｍ、少なくとも約１×１０−９Ｍ、又は少なくとも約１×１０−１０Ｍである、高い親和性でＦｚｄに結合する任意のドメインから選択され得る。好適なＦｚｄ結合ドメインは、デノボ設計のＦｚｄ結合タンパク質、例えばｓｃＦｖ、Ｆａｂ等である抗体由来の結合タンパク質、ならびに１又は複数のＦｚｄタンパク質に特異的に結合する抗体の他の部分；ナノボディ由来の結合ドメイン；ｋｎｏｔｔｉｎ系の改変足場；Ｎｏｒｒｉｎ及びそれに由来する遺伝子操作された結合フラグメント、天然のＦｚｄ結合ドメイン等を含むがこれに限定されない。
【０１５３】
一部の実施形態においては、Ｆｚｄ結合ドメインは、１、２、３、４、５又はそれ以上の異なるＦｒｉｚｚｌｅｄタンパク質、例えばヒトＦｒｉｚｚｌｅｄタンパク質Ｆｚ１、Ｆｚ２、Ｆｚ３、Ｆｚ４、Ｆｚ５、Ｆｚ６、Ｆｚ７、Ｆｚ８、Ｆｚ９、Ｆｚ１０のうちの１又は複数、に結合する。一部の実施形態においては、抗体系のシグナル伝達アゴニストが、Ｆｚ１、Ｆｚ２、Ｆｚ５、Ｆｚ７及びＦｚ８に結合する。他の実施形態においては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ結合部分は、関心の１又は複数のＦｒｉｚｚｌｅｄタンパク質に対して選択的であり、例えば、他のＦｒｉｚｚｌｅｄタンパク質と比較して、少なくとも１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍又はそれ以上である１又は複数の所望のＦｒｉｚｚｌｅｄタンパク質に対する特異性を有する。
【０１５４】
ある実施形態においては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ結合ドメインは、ｐａｎ抗体であるＦｒｉｚｚｌｅｄ抗体（ｐａｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）ＯＭＰ−１８Ｒ５（バンチクツマブ（ｖａｎｔｉｃｔｕｍａｂ））の６つのＣＤＲ領域を含む。ある実施形態においては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ結合ドメインは、ｐａｎ抗体であるＦｒｉｚｚｌｅｄ抗体ＯＭＰ−１８Ｒ５（バンチクツマブ）の６つのＣＤＲ領域を含むｓｃＦｖである。例えば、本明細書において参照により詳細に援用される、米国特許第８５０７４４２号を参照されたい。例えば、ＯＭＰ−１８Ｒ５のＣＤＲ配列は、ＧＦＴＦＳＨＹＴＬＳ（配列番号７０５）を含む重鎖ＣＤＲ１、ＶＩＳＧＤＧＳＹＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７０６）を含む重鎖ＣＤＲ２、及びＮＦＩＫＹＶＦＡＮ（配列番号７０７）を含む重鎖ＣＤＲ３と、（ｉｉ）ＳＧＤＫＬＧＫＫＹＡＳ（配列番号７０８）又はＳＧＤＮＩＧＳＦＹＶＨ（配列番号７０９）を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＥＫＤＮＲＰＳＧ（配列番号７１０）又はＤＫＳＮＲＰＳＧ（配列番号７１１）を含む軽鎖ＣＤＲ２、及びＳＳＦＡＧＮＳＬＥ（配列番号７１２）又はＱＳＹＡＮＴＬＳＬ（配列番号７１３）を含む軽鎖ＣＤＲ３とを含む。特定の実施形態においては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ結合ドメインは、抗体又はその誘導体であり、限定するものではないが、ＳｃＦｖ、ミニボディ、ナノボディ、及びＯＭＰ−１８Ｒ５のＣＤＲ配列を含む様々な抗体模倣物を含む。ある実施形態においては、これらＣＤＲ配列は、ＯＭＰ−１８Ｒ５のＣＤＲ配列と比較して１又は複数のアミノ酸改変を含む。
【０１５５】
他の実施形態においては、Ｆｚｄ結合ドメインは、いくつかのＦｒｉｚｚｌｅｄ特異性抗体のいずれかよりの、可変領域配列又はそのＣＤＲを含むが、これは当技術で公知であり、かつ、市販されているか、又はデノボで生成可能である。Ｆｒｉｚｚｌｅｄポリペプチドのいずれかを、免疫原として、又は抗体を開発するための選別アッセイにおいて、用いることが可能である。「Ｆｚ」、「Ｆｚタンパク質」及び「Ｆｚ受容体」は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体ファミリーのタンパク質を指すために本明細書で用いる。これらタンパク質は、あるＣＲＤドメインを含む７回膜貫通型タンパク質である（Ｉｎｇｈａｍ，Ｐ．Ｗ．（１９９６）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１２：３８２−３８４；Ｙａｎｇ−Ｓｎｙｄｅｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１３０２−１３０６；Ｂｈａｎｏｔ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  Ｎａｔｕｒｅ  ３８２：２２５−２３０）。Ｆｚファミリー（Ｆｚ１からＦｚ１０）は既知のメンバーが１０個あり、そのいずれもが、Ｗｎｔの受容体として機能することができる。ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ参照配列のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号は、以下のとおりである：ＦＺＤ１（ＮＭ＿００３５０５）；ＦＺＤ２（ＮＭ＿００１４６６）；ＦＺＤ３（ＮＭ＿１４５８６６）;  ＦＺＤ４（ＮＭ＿０１２１９３）；ＦＺＤ５（ＮＭ＿００３４６８）；ＦＺＤ６（ＮＭ＿００３５０６）；ＦＺＤ７（ＮＭ＿００３５０７）；ＦＺＤ８（ＮＭ＿０３１８６６）；ＦＺＤ９（ＮＭ＿００３５０８）；ＦＺＤ１０（ＮＭ＿００７１９７）。［００７６］Ｆｒｉｚｚｌｅｄ結合ドメインの非限定的な例としては、例えばヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ４に特異的なクローンＣＨ３Ａ４Ａ７（ＣＤ３４４）；ヒトＦｚ９に特異的なクローンＷ３Ｃ４Ｅ１１（ＣＤ３４９）である、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社より利用可能な抗体；例えばＦｚ７に特異的なａｂ６４６３６；ヒトＦｚ４に特異的なａｂ８３０４２；ヒトＦｚ７に特異的なａｂ７７３７９；ヒトＦｚ８に特異的なａｂ７５２３５；ヒトＦｚ９に特異的なａｂ１０２９５６である、Ａｂｅａｍ社より利用可能な抗体等が挙げられる。好適な抗体の他の例は、とりわけ、米国特許出願第２０１４０１０５９１７号；米国特許出願第２０１３０２３０５２１号；米国特許出願第２００８０２６７９５５号；米国特許出願第２００８００３８２７２号；米国特許出願第２００３００４４４０９号に記載されている。
【０１５６】
代替物のＦｒｉｚｚｌｅｄ結合部分は、Ｗｎｔタンパク質のＦｒｉｚｚｌｅｄ結合領域に対する構造的相同性のために選択される遺伝子操作されたタンパク質であり得る。こうしたタンパク質は、相同性に関する構造データベースをスクリーニングすることによって特定可能である。すなわち、特定される最初のタンパク質は、例えば、微生物Ｂｈ１４７８タンパク質である。当該天然タンパク質は、その後遺伝子操作されて、親和性を増加させるアミノ酸置換がもたらされて、そして所望のＦｒｉｚｚｌｅｄタンパク質への結合における親和性及び選択性を増加させるために親和性成熟によってさらに選択され得る。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ結合部分の非限定的な例としては、ＰＣＴ特許出願公開公報である国際公開第２０１６／０４０８９５号の図１に示されるＦｚ２７及びＦｚ２７−Ｂ１２タンパク質が挙げられる。
【０１５７】
あるポリペプチドの実施形態においては、Ｌｒｐ５／６結合ドメイン又は要素は、例えばＫＤが少なくとも約１×１０”７Ｍ、少なくとも約１×１０”８Ｍ、少なくとも１×１０”９Ｍ、少なくとも１×１０”１０Ｍである高親和性でＬｒｐ５／６に結合する任意のドメインから選択され得る。好適なＬｒｐ５／６結合ドメインは、デノボ設計のＬｒｐ５／６結合タンパク質、例えばｓｃＦｖ、Ｆａｂ等である抗体由来の結合タンパク質、ならびに１又は複数のＦｚｄタンパク質；ナノボディ由来の結合ドメイン；ｋｎｏｔｔｉｎ系の改変足場；Ｎｏｒｒｉｎ、ＤＫＫ１、ＤＫＫ２、ＤＫＫ３、ＤＫＫ４、スクレロスチン（ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ）を含むがこれに限定されない天然Ｌｒｐ５／６結合タンパク質又はポリペプチド等に特異的に結合する抗体の他の部分、を含むがこれに限定されない。ある実施形態においては、Ｌｒｐ５／６結合ドメインは、ＤＫＫ１のＣ末端部分である。
【０１５８】
Ｌｒｐ５／６結合ドメインは、例えばＫＤが少なくとも約１×１０”７Ｍ、少なくとも約１×１０”８Ｍ、少なくとも１×１０”９Ｍ、少なくとも１×１０”１０Ｍ１で、高親和性でＬｒｐ５又はＬｒｐ６に結合する任意のドメインから選択され得る。「ＬＲＰ」、「ＬＲＰタンパク質」及び「ＬＲＰ受容体」は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質ファミリーのタンパク質を指すために本明細書で用いる。これら受容体は、受容体介在性のエンドサイトーシスの過程で、リガンドを結合して内在化する１回膜貫通型タンパク質である。ＬＲＰタンパク質ＬＲＰ５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ００２３３５．２）及びＬＲＰ６（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ００２３３６．２）が、Ｗｎｔ受容体複合体に含まれる。
【０１５９】
好適なＬＲＰ５／６結合ドメインは、限定するものではないが、デノボ設計のＬｒｐ５／６結合タンパク質、例えばｓｃＦｖ、Ｆａｂ等である抗体由来の結合タンパク質、ならびに１又は複数のＦｚｄタンパク質；ナノボディ由来の結合ドメイン；ｋｎｏｔｔｉｎ系の改変足場；限定するものではないがＤＫＫ１、ＤＫＫ２、ＤＫＫ３、ＤＫＫ４、スクレロスチンを含む天然のＬｒｐ５／６；Ｗｉｓｅ；上記のいずれかを含む融合タンパク質；上記のいずれかの誘導体；上記のいずれかのバリアント；及び上記のいずれかの生物学的活性なフラグメント等に特異的に結合する抗体の他の部分、を含む。Ｌｒｐ５／６結合ドメインは、結合を増強するように選択された親和性であり得る。
【０１６０】
Ｄｉｃｋｋｏｐｆ（Ｄｋｋ）遺伝子ファミリーのメンバー（Ｋｒｕｐｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  Ｇｅｎｅ  ２３８（２）：３０１−１３を参照）は、Ｄｋｋ−１、Ｄｋｋ−２、Ｄｋｋ−３及びＤｋｋ−４、ならびにＤｋｋ−３関連タンパク質Ｓｏｇｇｙ（Ｓｇｙ）を含む。ｈＤｋｋ１〜４は、１０個のシステイン残基の位置をファミリーメンバー間で高度に保存しているものである２つの別個の高システインドメインを含有する。ヒトＤｋｋの遺伝子及びタンパク質の例示的な配列は、公に利用可能であり、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１４４１９（ｓｏｇｇｙ−１）；ＮＭ＿０１４４２０（ＤＫＫ４）；ＡＦ１７７３９４（ＤＫＫ−１）；ＡＦ１７７３９５（ＤＫＫ−２）；ＮＭ＿０１５８８１（ＤＫＫ３）；及びＮＭ＿０１４４２１（ＤＫＫ２）である。本発明の一部の実施形態においてはＬｒｐ６結合部分は、ＤＫＫ１ペプチドであって、限定するものではないがヒトＤＫＫ１のＣ末端ドメインを含む。図５に示すように、Ｃ末端ドメインは、配列ＫＭＹＨＴＫＧＱＥＧＳＶＣＬＲＳＳＤＣＡＳＧＬＣＣＡＲＨＦＷＳＫＩＣＫＰＶＬＫＥＧＱＶＣＴＫＨＲＲＫＧＳＨＧＬＥＩＦＱＲＣ  ＹＣＧＥＧＬＳＣＲＩＱＫＤＨＨＱＡＳＮＳＳＲＬＨＴＣＱＲＨ（配列番号７１４）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０３６３７４を参照）又はその生物学的活性フラグメントを含み得る。
【０１６１】
ＤＫＫタンパク質のＬＲＰ５／６への結合は、Ｂｒｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｏｋｏｌ  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２２（１７），６１００−６１１０（２００２）；及びＬｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（８），５９７７−５９８１（２００２）で議論されており、それぞれ、参照により本明細書において詳細に援用される。ヒトＤＫＫ２の対応する領域（Ｇｅｎｂａｎｋ参照ＮＰ＿０５５２３６）は、配列ＫＭＳＨＩＫＧＨＥＧＤＰＣＬＲＳＳＤＣＩＥＧＦＣＣＡＲＨＦＷＴＫＩＣＫＰＶＬＨＱＧＥＶＣＴＫＱＲＫＫＧＳＨＧＬＥＩＦＱＲＣＤＣＡＫＧＬＳＣＫＶＷＫＤＡＴＹＳＳＫＡＲＬＨＶＣＱＫ（配列番号７１５）又はその生物学的活性フラグメントを含み得る。
【０１６２】
Ｌｒｐ５又はＬｒｐ６に特異的に結合する抗体は、当技術において公知であり、また市販されており、又はデノボで生成可能である。Ｌｒｐ５、Ｌｒｐ６又はそのフラグメントは、免疫原として、又は抗体を開発するための選別アッセイにおいて、用いることが可能である。公知の抗体の例としては、Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．５（９）：ｅ１２６８２；Ｅｔｔｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１０７（３５）：１５４７３−８に開示されるもの、ならびにヒト起源の合成ＬＲＰ５／６に対して生じてマウス及びヒト起源のＬＲＰ６及びＬＲＰ５の完全長かつタンパク質分解性のフラグメントの両方に結合する、例えばＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社の抗体クローン１Ａ１２；モノクローナル抗体２Ｂ１１；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のＬＲＰ５に特異的な抗体（Ｄ８０Ｆ２）、カタログ番号５７３１等、市販のものが挙げられるがこれに限定されない。
【０１６３】
ポリペプチド及び結合ドメインはまた、上記に記載したポリペプチドの、誘導体、バリアント及び生物学的活性フラグメントを含み得る。「バリアント」ポリペプチドは、提供した配列と１００％未満の配列同一性を有する、以下に規定する生物学的活性ポリペプチドを意味する。こうしたバリアントには、提供された配列と比較して例えば挿入、欠失又は置換である１又は複数のアミノ酸改変を含むポリペプチドであって、例えば１又は複数のアミノ酸残基が、天然配列のＮ末端もしくはＣ末端に又は天然配列内に付加され；約１から４０個のアミノ酸残基が欠失し、また随意に１又は複数の残基により置換された、当該ポリペプチドと、上記ポリペプチドの誘導体であって、得られる産物が非天然のアミノ酸を有するようにアミノ酸残基が共有結合的に改変された、当該誘導体とが含まれる。ある実施形態においては、生物学的活性バリアントは、天然配列ポリペプチドと少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有することとなる。配列の「機能バリアント」は、最初の配列と同じような定性的な生物学的特徴を有する化合物である。「機能バリアント」には、配列のフラグメント及び配列のバリアントであって、ただしそれらは共通の生物学的活性を有するものである、配列のフラグメント及び配列のバリアントが含まれるがこれに限定されない。「バリアント」の語は、ポリペプチド及びその共有結合的な改変の両方のアミノ酸配列バリアントを包含する。
【０１６４】
Ｆｚｄ結合ドメイン及びＬｒｐ５／６結合ドメインは、１つの球状ドメイン内で隣接し得るか、又は例えばポリペプチドリンカー又は非ペプチドリンカー等であるリンカーによって離間され得、本明細書に記載のもののいずれかを含むがこれに限定されない。リンカーの長さ、すなわち結合ドメイン間の間隔は、シグナル強度を調節するために用いることが可能であり、またＷｎｔシグナル伝達アゴニストの所望の使用に応じて選択可能である。実施される結合ドメイン間の距離は、変動可能であるが、ある実施形態においては、約１００オングストローム未満、約９０オングストローム未満、約８０オングストローム未満、約７０オングストローム未満、約６０オングストローム未満、又は約５０オングストローム未満であり得る。
【０１６５】
一部の実施形態においては、リンカーは、剛直なリンカーであり、他の実施形態においては、リンカーは、フレキシブルなリンカーである。リンカーがペプチドリンカーである場合、ある実施形態においては、それは、長さが約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０  ２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個又はそれ以上のアミノ酸よりであり得、また結合ドメイン間の距離を保つのに十分である長さかつアミノ酸組成のものである。一部の実施形態においては、リンカーは、１もしくは複数のグリシン及び／もしくはセリンの残基を含むか、又は１もしくは複数のグリシン及び／もしくはセリンの残基からなる。
【０１６６】
本開示はまた、１又は複数のＷｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド又はＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードするポリヌクレオチド又は核酸配列と、発現ベクターを含む、これらポリヌクレオチドを含むベクターと、これらベクターを含む細胞とを含む。ある実施形態においては、ポリヌクレオチド又は核酸配列は、ＤＮＡ又はＲＮＡである。特定の実施形態においては、ＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。ある実施形態においては、ＲＮＡは、１又は複数の改変されたヌクレオシドを含む改変されたｍＲＮＡである。１又は複数の改変ヌクレオシドを含む改変ｍＲＮＡは、安定性の増加、より高い発現レベル及び免疫原性の低下を含めた、改変されていないｍＲＮＡを超える利点を有することが記載されている。本発明により用いられ得る改変ｍＲＮＡの非限定的な例が、例えばＰＣＴ特許出願公開公報、国際公開第２０１１／１３０６２４号、国際公開第２０１２／１３８４５３号、国際公開第２０１３０５２５２３号、国際公開第２０１３１５１６６６号、国際公開第２０１３／０７１０４７号、国際公開第２０１３／０７８１９９号、国際公開第２０１２０４５０７５号、国際公開第２０１４０８１５０７号、国際公開第２０１４０９３９２４号、国際公開第２０１４１６４２５３号、米国特許第  ８，２７８，０３６号（プソイドウリジンを含む改変ｍＲＮＡを記載）、米国特許第８，６９１，９６６号（プソイドウリジン及び／又はＮ１−メチルプソイドウリジンを含む改変ｍＲＮＡを記載）、米国特許第８，８３５，１０８号（５−メチルシチジンを含む改変ｍＲＮＡを記載、米国特許第８，７４８，０８９号（プソイドウリジン又は１−メチルプソイドウリジンを含む改変ｍＲＮＡを記載）に記載されている。特定の実施形態においては、Ｗｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド、又はＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする改変ｍＲＮＡ配列は、改変されていないＡ、Ｇ、Ｕ又はＣリボヌクレオシドと比較して、少なくとも１つの改変を含む。特定の実施形態においては、少なくとも１つの改変ヌクレオシドは、Ｎ１−メチルプソイドウリジン及び／又は５−メチルシチジンを含む。特定の実施形態においては、改変ｍＲＮＡは、Ｗｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド、又はＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする配列が続き、例えばポリＡ又はポリＡ−Ｇ配列等である３’テール（ｔａｉｌｉｎｇ）配列が続く、５’末端キャップ配列を含む。
【０１６７】
特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドは、例えば発現ベクターであるベクターであり、また発現ベクターは、例えば細胞においてポリヌクレオチドの発現を駆動するプロモーター配列であるプロモーター配列に操作可能に連結した本明細書に記載の、Ｗｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド、又はＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードするポリヌクレオチド配列を含む。ある実施形態においては、ベクターはウイルスベクターであり、例えば、Ｗｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド、又はＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ配列に操作可能に連結したプロモーターを含む発現カセットを含むポリヌクレオチドを含むウイルスである。特定の実施形態においては、発現カセットは、５’及び／又は３’の細胞ＵＴＲ又はウイルスＵＴＲを含む。
【０１６８】
本開示はまた、本明細書に記載するポリヌクレオチドに対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％のポリヌクレオチド配列同一性を有するバリアントを含めた、本明細書に記載するポリヌクレオチドの機能フラグメント及びバリアントを含む。こうしたバリアントは、本明細書に開示する配列のいずれかと比較して、例えば１又は複数のヌクレオチドの欠失、挿入又は置換である、１又は複数のヌクレオチド又はヌクレオシドの改変を含み得る。特定の実施形態においては、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、例えば宿主細胞においてコードされたポリペプチドの発現を増強するように、コドン最適化される。特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドバリアントは、１又は複数の改変されたヌクレオチド又はヌクレオシドを含む。
【０１６９】
本開示はまた、本明細書に記載するＷｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド又はＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードするポリヌクレオチド又はベクターを含む細胞を含む。ある実施形態においては、細胞は、Ｗｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド又はＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子を産生するために用いられ得る、例えばＨＥＫ２９３細胞等である宿主細胞である。主題の組成物を調製する際に、例えば哺乳動物細胞（例えば、２９３細胞）、昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）、微生物及び酵母を含めるがこれに限定されない、任意の宿主細胞を採用することができる。ある実施形態においては、細胞は、本明細書に記載するＷｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド又はＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子により治療する対象に対して異種又は自己由来である。特定の実施形態においては、当該細胞は、対象から取得して、本明細書に記載するウイルスベクターにより形質導入された。特定の実施形態においては、形質導入された細胞は、治療のために対象に送達される。本開示はまた、１もしくは複数のＷｎｔポリペプチド、ＮｏｒｒｉｎポリペプチドもしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子を含む医薬組成物、又はＷｎｔポリペプチド、ＮｏｒｒｉｎポリペプチドもしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする配列を含む１もしくは複数のポリヌクレオチドもしくはベクターを含む。
【０１７０】
医薬組成物
本明細書に記載する組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子、又は抗体もしくはその抗原結合性フラグメントと、１又は複数の薬理学的に許容可能な希釈剤、担体、又は賦形剤とを含む医薬組成物もまた開示する。特定の実施形態においては、医薬組成物は、本明細書に記載する１又は複数のＷｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド又はＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をさらに含む。
【０１７１】
さらなる実施形態においては、本明細書に記載する本明細書に記載する組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子、又は抗体もしくはその抗原結合性フラグメントをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドと、１又は複数の薬理学的に許容可能な希釈剤、担体、又は賦形剤とを含む医薬組成物もまた開示する。特定の実施形態においては、医薬組成物は、本明細書に記載するＷｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド又はＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列を含む１又は複数のポリヌクレオチドをさらに含む。ある実施形態においては、ポリヌクレオチドはＤＮＡ又はｍＲＮＡであって、例えば改変されたｍＲＮＡである。特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドは、５’キャップ配列及び／又は３’テール（ｔａｉｌｉｎｇ）配列、例えばポリＡ尾部、をさらに含む改変ｍＲＮＡである。他の実施形態においては、ポリヌクレオチドは、コード配列と作動的に連結したプロモーターを含む発現カセットである。ある実施形態においては、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列と、Ｗｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド又はＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列とが、同一のポリヌクレオチド内に存在する。
【０１７２】
さらなる実施形態においては、本明細書に記載する本明細書に記載する組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子、又は抗体もしくはその抗原結合性フラグメントをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む、例えばウイルスベクターである発現ベクターと、１又は複数の薬理学的に許容可能な希釈剤、担体、又は賦形剤とを含む医薬組成物もまた開示する。特定の実施形態においては、医薬組成物は、本明細書に記載するＷｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド又はＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む、例えばウイルスベクターである発現ベクターをさらに含む。ある実施形態においては、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列と、Ｗｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド又はＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列とが、例えば発現カセットである、同一のポリヌクレオチド内に存在する。
【０１７３】
本発明は、本明細書に記載する本明細書に記載する組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子、又は抗体もしくはその抗原結合性フラグメントをコードする核酸に作動的に連結したプロモーターを含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む細胞と、１又は複数の薬理学的に許容可能な希釈剤、担体、又は賦形剤とを含む医薬組成物をさらに検討する。特定の実施形態においては、医薬組成物は、本明細書に記載するＷｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド又はＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列に作動的に連結したプロモーターを含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む細胞をさらに含む。ある実施形態においては、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列と、Ｗｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド又はＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列とが、例えば発現カセットである同一のポリヌクレオチド内に及び／又は同一の細胞内に、存在する。特定の実施形態においては、細胞は、異種細胞であるか、又は処置しようとする対象から取得した自己細胞である。特定の実施形態においては、細胞は、幹細胞であり、例えば脂肪由来の幹細胞又は造血幹細胞である。
【０１７４】
本開示は、第１の活性薬剤として組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子を送達するための第１の分子と、第２の活性薬剤としてＷｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド又はＷｎｔシグナル伝達アゴニストを送達するための第２の分子とを含む医薬組成物を検討する。第１の分子及び第２の分子は、同一の種類の分子であってもよく、又は異なる種類の分子であってもよい。例えば、ある実施形態においては、第１の分子及び第２の分子は、以下の種類の分子からそれぞれ独立に選択され得る：ポリペプチド、有機小分子、第１の活性薬剤又は第２の活性薬剤をコードする核酸（随意にＤＮＡ、又はｍＲＮＡ、随意に改変ＲＮＡ）、第１の活性薬剤又は第２の活性薬剤をコードする核酸配列を含むベクター（随意に、発現ベクター又は発現ウイルスベクター）、及び第１の活性薬剤又は第２の活性薬剤をコードする核酸配列を含む細胞（随意に発現カセット）。
【０１７５】
主題の分子は、単独で又は組み合わせて、概して安全で、無毒性で及び所望であり、また例えばヒト又は霊長類である哺乳動物での使用に容認可能である賦形剤を含む製剤を調製する際に有用である、薬理学的に許容可能な担体、希釈剤、ならびに薬剤と組み合わせることが可能である。こうした賦形剤は、固体、液体、半固体、又はエアロゾル組成物である場合には気体のものとすることが可能である。こうした担体又は希釈剤の例としては、水、生理食塩水、リンゲル液、ブドウ糖液、及び５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これに限定されない。補足的に活性化合物を、製剤中に取り入れることも可能である。製剤に用いる溶液又は懸濁剤としては、例えば注射用蒸留水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒等である滅菌希釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベン等である抗菌化合物；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム等である抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等であるキレート化合物；酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩等の緩衝剤；凝集を防止する、Ｔｗｅｅｎ２０等である界面活性剤；及び、塩化ナトリウム、又はブドウ糖等である張度調整用の化合物を挙げることができる。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウム等である酸又は塩基で調節可能である。特定の実施形態においては、医薬組成物は無菌である。
【０１７６】
医薬組成物は、滅菌の水溶液又は分散剤（ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ）と、滅菌の注射可能な水溶液又は分散剤の即時調製のため滅菌粉末とをさらに含み得る。静脈内投与に関して、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。一部の例においては、組成物は滅菌であり、また容易な通針性が存在する程度に流動的である必要がある。ある実施形態においては、当該組成物は、製造及び保存条件下で安定であり、また例えば細菌及びカビ等の微生物の汚染作用に対抗して保存される。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）及びそれらの好適な混合物を含有する、例えば溶媒又は分散媒であり得る。例えば、レシチン等のコーティングを用いることによって、分散の場合は必要な粒径を保持することによって、及び界面活性剤を用いることによって、適切な流動性を維持することが可能である。例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等である様々な抗菌剤及び抗真菌剤によって、微生物の作用を防止することが可能である。多くの場合においては、例えば糖類、マンニトール、ソルビトール等である多価アルコール、塩化ナトリウムである等張剤を組成物中に含むことが好ましいこととなる。例えばステアリン酸アルミニウム及びゼラチンである、吸収を遅延させる薬剤を組成物中に含ませることによって、体内での組成物の吸収を長引かせることが可能である。
【０１７７】
滅菌溶液は、適切な溶媒中で必要量の組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子に上記の列挙した成分のうちの１つ又は組み合わせと合わせて、必要であればその後に濾過滅菌することにより、調製することが可能である。概して、分散剤は、基礎分散媒と、上記に列挙したものよりの必要な他の成分とを含有する滅菌ビヒクル内に、活性化合物を合わせることによって調製可能である。滅菌注射液の調製のための滅菌粉剤の場合、調製方法は、予め濾過滅菌したその溶液から、いずれかのさらなる所望の成分が加わった活性成分の粉末を生じるものである、真空乾燥及び凍結乾燥である。
【０１７８】
一実施形態においては、医薬組成物は、体からの急速な排除から融合タンパク質を保護することとなるような担体と共に調製され、例えば、植込錠及びマイクロカプセル化送達システムを含めた放出制御製剤等である。例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸等である、生分解性の、生体適合性の高分子を用いることが可能である。こうした製剤の調製方法は、当業者にとって明らかであろう。物質はまた、市販のものを取得することもできる。リポソーム懸濁液もまた、薬理学的に許容可能な担体として使用可能である。これらは、当業者にとって公知である方法に従って調製可能である。
【０１７９】
投与し易さ及び投与量の均一性のために、投与単位形態で医薬組成物を製剤化することが有利であり得る。本明細書で用いる場合、投与単位形態は、処置しようとする対象に対して、単位投薬量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位が、必要な医薬担体と関連して所望の治療効果を生じるように計算された活性化合物の所定の量を含有する。本発明の投与単位形態に関する規格は、活性化合物の固有の特性及び達成しようとする特定の治療効果、ならびに個体の治療のためのこうした活性化合物を調剤する技術が本来もつ制限によって決まり、またこれらに直接依存する。
【０１８０】
医薬組成物は、投与指示書と共に、容器、パック、又は例えばシリンジ、例えば事前充填シリンジである分注器の中に含めることが可能である。
【０１８１】
本発明の医薬組成物は、任意の薬理学的に許容可能な塩、エステル、もしくは当該エステルの塩、又はヒトを含めた動物に投与すると生物学的に活性である組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子を提供（直接又は間接的に）することが可能である任意の他の化合物を包含する。
【０１８２】
本発明は、本明細書に記載する組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子の薬理学的に許容可能な塩を含む。「薬理学的に許容可能な塩」の語は、本発明の化合物の生理学的及び薬理学的に許容可能な塩を指し、すなわち、親化合物の所望の生物学的活性を保持して、それに対して望まない毒性効果は与えない塩である。様々な薬理学的に許容可能な塩が当技術で公知であり、例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，１７ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｅｄ．），Ｍａｒｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ，１９８５（及びそのより最近の版）に、“Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊａｍｅｓ  Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ（Ｅｄ．），Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＳＡ（Ｉｎｃ．），ＮＹ，ＵＳＡ，２００７に、及びＪ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：２（１９７７）に記載されている。また、好適な塩の検討のためには、Ｓｔａｈｌ及びＷｅｒｍｕｔｈによる“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｕｓｅ”（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００２）を参照されたい。
【０１８３】
薬理学的に許容可能な塩基添加塩は、アルカリ金属及びアルカリ土類金属もしくは有機アミン等の金属又はアミンにより形成される。陽イオンとして用いられる金属には、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等が含まれる。アミンには、Ｎ−Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジクロロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、及びプロカインが含まれる（例えば、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ”、Ｊ．Ｐｈａｒｍａ  Ｓｃｉ．，１９７７，６６，１１９を参照）。当該酸性化合物の塩基添加塩は、遊離酸形態を、従来の方法で塩を生じるのに十分な量の所望の塩基と接触させることによって調製される。この遊離酸形態は、当該塩形態をある酸と接触させて、従来の方法で遊離酸を単離することによって元に戻すことができる。遊離酸形態は、例えば極性溶媒中での溶解度等である特定の物性がそれらのそれぞれの塩形態といくらか相違するが、当該塩は、本発明の目的でのそれらのそれぞれの遊離酸と等価である。
【０１８４】
一部の実施形態においては、本明細書で提供する医薬組成物は、例えば生理食塩水、リン酸緩衝食塩水、リン酸塩及びアミノ酸、ポリマー、ポリオール、糖、緩衝液、防腐剤及び他のタンパク質である薬理学的に許容可能な担体、希釈剤ならびに／又は賦形剤との混合物中に、本明細書に記載する治療有効量の組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子を含む。例示的なアミノ酸、ポリマー及び糖等には、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール化合物、ポリエチレングリコールモノステアレート化合物、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖、果糖、ブドウ糖、マルトース、グルコース、マンニトール、デキストラン、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、キシリトール、乳糖、トレハロース、ウシ又はヒト血清アルブミン、クエン酸塩、酢酸塩、リンゲル液及びハンクス液、システイン、アルギニン、カルニチン、アラニン、グリシン、リシン、バリン、ロイシン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン及びグリコールがある。この製剤は、４℃で少なくとも６ヶ月間安定であることが好ましい。
【０１８５】
一部の実施形態においては、本明細書で提供する医薬組成物は、例えばリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）又はリン酸ナトリウム／硫酸ナトリウム、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、滅菌水、及び例えばＧｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９６６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５：４６７に記載のもの等の当業者に公知である他の緩衝液である、緩衝液を含む。緩衝液のｐＨは、６．５から７．７５、好ましくは７から７．５、及び最も好ましくは７．２から７．４の範囲内にあり得る。
【０１８６】
Ｗｎｔ活性又はＷｎｔ受容体細胞表面発現を増加させる方法
融合タンパク質に関して本明細書において例示された、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子を、標的の組織又は細胞型におけるＷｎｔシグナル伝達を増加させるのに用いることができる。特定の実施形態においては、Ｗｎｔシグナル伝達は、古典的Ｗｎｔシグナル伝達である。すなわち、一部の態様においては、本発明は、標的組織又は細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を増加又は増強する方法であって、当該標的組織又は細胞を本明細書に開示する有効量の組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子と接触させることを含み、当該分子は、組織又は細胞特異的に標的組織又は細胞における細胞表面受容体に結合するターゲティングモジュールを含む、当該方法を提供する。一部の実施形態においては、接触させることは、インビトロ、エキソビボ、又はインビボで生じ、例えば主題の組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子が対象に投与又は提供される。特定の実施形態においては、細胞は、培養細胞であり、また接触させることはインビトロで生じる。
【０１８７】
ある実施形態においては、方法は、標的組織又は細胞を、本明細書に記載する１又は複数のＷｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド又はＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子とさらに接触させることを含む。本開示は、第１の活性薬剤として組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子を送達するための第１の分子と、及び第２の活性薬剤としてＷｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド又はＷｎｔシグナル伝達アゴニストを送達するための第２の分子と、標的組織又は細胞を接触させることを検討する。第１の分子及び第２の分子は、同一の種類の分子であってもよく、又は異なる種類の分子であってもよい。例えば、ある実施形態においては、第１の分子及び第２の分子は、以下の種類の分子からそれぞれ独立に選択され得る：ポリペプチド、有機小分子、第１の活性薬剤又は第２の活性薬剤をコードする核酸（随意にＤＮＡ、又はｍＲＮＡ、随意に改変ＲＮＡ）、第１の活性薬剤又は第２の活性薬剤をコードする核酸配列を含むベクター（随意に、発現ベクター又は発現ウイルスベクター）、及び第１の活性薬剤又は第２の活性薬剤をコードする核酸配列を含む細胞（随意に発現カセット）。
【０１８８】
関連の態様においては、本発明は、標的組織又は細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を増加させる方法であって、当該標的組織又は細胞を本明細書に開示する組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列を含む有効量のポリヌクレオチドと接触させることを含み、当該分子は、組織又は細胞特異的に標的組織又は細胞上の細胞表面受容体に結合するターゲティングモジュールを含む、当該方法を提供する。ある実施形態においては、標的の組織又は細胞はまた、Ｗｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド又はＷｎｔシグナル伝達アゴニストをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドと接触させる。ある実施形態においては、ポリヌクレオチドはＤＮＡ又はｍＲＮＡであって、例えば改変されたｍＲＮＡである。特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドは、５’キャップ配列及び／又は３’テール（ｔａｉｌｉｎｇ）配列、例えばポリＡ尾部、をさらに含む改変ｍＲＮＡである。他の実施形態においては、ポリヌクレオチドは、コード配列と作動的に連結したプロモーターを含む発現カセットである。ある実施形態においては、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列と、Ｗｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド又はＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列とが、同一のポリヌクレオチド内に存在する。
【０１８９】
関連の態様においては、本発明は、標的組織又は細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を増加させる方法であって、当該標的組織又は細胞を本発明の組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列を含む有効量のベクターと接触させることを含み、当該分子は、組織又は細胞特異的に標的組織又は細胞上の細胞表面受容体に結合するターゲティングモジュールを含む、当該方法を提供する。ある実施形態においては、標的の組織又は細胞はまた、Ｗｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド又はＷｎｔシグナル伝達アゴニストをコードする核酸配列を含むベクターと接触させる。ある実施形態においては、ベクターは発現ベクターであり、また核酸配列と作動的に連結したプロモーターを含み得る。特定の実施形態においては、ベクターはウイルスベクターである。ある実施形態においては、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列と、Ｗｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド又はＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列とが、例えば同一の発現カセット内である、同一のベクター内に存在する。
【０１９０】
関連の態様においては、本発明は、標的組織におけるＷｎｔシグナル伝達を増加させる方法であって、当該標的組織を本発明の組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列を含む有効量の細胞と接触させることを含み、当該分子は、組織又は細胞特異的に標的組織又は細胞上の細胞表面受容体に結合するターゲティングモジュールを含む、当該方法を提供する。ある実施形態においては、標的組織はまた、Ｗｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド又はＷｎｔシグナル伝達アゴニストをコードする核酸配列を含む細胞と接触させる。ある実施形態においては、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列と、Ｗｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド又はＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列とが、同一の細胞内に存在する。特定の実施形態においては、細胞は、異種細胞であるか、又は処置しようとする対象から取得した自己細胞である。ある実施形態においては、細胞は、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子又はＷｎｔポリペプチド、ＮｏｒｒｉｎポリペプチドもしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする発現カセットを含むベクターにより形質導入された。特定の実施形態においては、細胞は、幹細胞であり、例えば脂肪由来の幹細胞又は造血幹細胞である。
【０１９１】
Ｗｎｔシグナル伝達を増加させる本明細書に記載する方法のいずれかを、例えば肝臓組織細胞である、標的細胞の表面上のＦｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚ）受容体の数を増加させるのに用いることもできる。ある実施形態においては、標的細胞の表面のＦｚ受容体の数が、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも２倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍、増加する。特定の実施形態においては、Ｆｚ受容体は、ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄタンパク質Ｆｚ１、Ｆｚ２、Ｆｚ３、Ｆｚ４、Ｆｚ５、Ｆｚ６、Ｆｚ７、Ｆｚ８、Ｆｚ９、Ｆｚ１０のうちの１又は複数を含む。例えば、本開示は、標的細胞の表面上のＦｚ受容体を増加させる方法であって、当該細胞を本明細書に開示する有効量の組織又は細胞特異性Ｗｎｔシグナル増強分子と接触させることを含み、当該分子は、組織又は細胞特異的に標的組織又は細胞における細胞表面受容体に結合するターゲティングモジュールを含む、当該方法を提供する。特定の実施形態においては、細胞は肝細胞であり、またターゲティングモジュールは、ＡＳＧＲ１又はＡＳＧＲ２に結合する。ある実施形態においては、ターゲティングモジュールは、本明細書に開示する抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む。一部の実施形態においては、接触させることは、インビトロ、エキソビボ、又はインビボで生じ、例えば組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子が対象に投与又は提供される。特定の実施形態においては、細胞は、培養細胞であり、また接触させることはインビトロで生じる。ある実施形態においては、標的細胞又は組織は、最初に、Ｗｎｔシグナル増強分子に直接接触し、一方で他の関連の実施形態においては、細胞は、それによって細胞がポリヌクレオチドを取り込みＷｎｔシグナル増強分子を発現するものである、Ｗｎｔシグナル増強分子をコードするポリヌクレオチド、例えば発現ベクター、と最初に接触する。ある実施形態においては、方法は、標的の組織又は細胞を、本明細書に記載する１又は複数のＷｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド又はＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子とさらに接触させることを含む。
【０１９２】
Ｗｎｔシグナル伝達を増加させる本明細書に記載する方法のいずれかを、例えば肝臓組織細胞である、標的細胞上のＫｉ−６７を増加させるのに用いることもできる。
疾患及び障害を治療する方法
【０１９３】
融合タンパク質に関して本明細書において例示された、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子を、例えば標的の細胞、組織又は器官におけるＷｎｔシグナル伝達を増加させることによって、疾患、障害又は症状を治療することに用いることができる。すなわち、一部の態様においては、本発明は、それを必要とする対象において、例えばＷｎｔシグナル伝達の低下と関連する、又はそれに対してＷｎｔシグナル伝達の増加が治療効果をもたらすことになるような疾患又は障害である、疾患又は症状を治療する方法であって、当該対象を、本開示の有効量の組成物と接触させることを含む、当該方法を提供する。特定の実施形態においては、組成物は、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子であって、例えば小分子又はポリペプチド；組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド、例えばＤＮＡ又はｍＲＮＡ、随意に改変ｍＲＮＡ；組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列を含むベクターであって、例えば発現ベクターもしくは発現ウイルスベクター；又は、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列を含む細胞であって、例えば組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする発現ベクターもしくは発現ウイルスベクターにより形質導入した細胞、のうちのいずれかを含む医薬組成物である。特定の実施形態においては、疾患又は症状は、病理学的な疾患もしくは障害であるか、又は、損傷であって、例えば負傷の結果による損傷である。ある実施形態においては、当該負傷は、別の治療的な処置の結果であり得る。ある実施形態においては、疾患又は症状は、組織の修復、治癒もしくは再生の不良を含むか、又は組織の修復、治癒もしくは再生を増すことが有益となることとなる。一部の実施形態においては、接触させることはインビボで生じるものであり、すなわち主題の組成物を対象に投与する。
【０１９４】
ある実施形態においては、方法は、対象を、本明細書に記載する１又は複数のＷｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド又はＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子を含む医薬組成物とさらに接触させることを含む。本開示は、第１の活性薬剤として組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子を送達するための第１の分子と、及び第２の活性薬剤としてＷｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド又はＷｎｔシグナル伝達アゴニストを送達するための第２の分子と、対象を接触させることを検討する。第１の分子及び第２の分子は、同一の種類の分子であってもよく、又は異なる種類の分子であってもよい。例えば、ある実施形態においては、第１の分子及び第２の分子は、以下の種類の分子からそれぞれ独立に選択され得る：ポリペプチド、有機小分子、第１の活性薬剤又は第２の活性薬剤をコードする核酸（随意にＤＮＡ、又はｍＲＮＡ、随意に改変ＲＮＡ）、第１の活性薬剤又は第２の活性薬剤をコードする核酸配列を含むベクター（随意に、発現ベクター又は発現ウイルスベクター）、及び第１の活性薬剤又は第２の活性薬剤をコードする核酸配列を含む細胞（随意に発現カセット）。
【０１９５】
関連の態様においては、本発明は、例えばＷｎｔシグナル伝達の低下と関連する、又はそれに対してＷｎｔシグナル伝達の増加が治療効果をもたらすことになるような疾患又は障害である、疾患又は症状を治療する方法であって、それを必要とする対象を、本発明の組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列を含む有効量のポリヌクレオチドを含む医薬組成物と接触させることを含み、当該分子が、組織又は細胞特異的に標的組織又は細胞における細胞表面受容体に結合するターゲティングモジュールを含む、当該方法を提供する。ある実施形態においては、当該対象はまた、Ｗｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド又はＷｎｔシグナル伝達アゴニストをコードする核酸配列を含む有効量のポリヌクレオチドを含む医薬組成物と接触させる。ある実施形態においては、ポリヌクレオチドはＤＮＡ又はｍＲＮＡであって、例えば改変されたｍＲＮＡである。特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドは、５’キャップ配列及び／又は３’テール（ｔａｉｌｉｎｇ）配列、例えばポリＡ尾部、をさらに含む改変ｍＲＮＡである。他の実施形態においては、ポリヌクレオチドは、コード配列と作動的に連結したプロモーターを含む発現カセットである。ある実施形態においては、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列と、Ｗｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド又はＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列とが、同一のポリヌクレオチド内に存在する。
【０１９６】
関連の態様においては、本発明は、例えばＷｎｔシグナル伝達の低下と関連する、又はそれに対してＷｎｔシグナル伝達の増加が治療効果をもたらすことになるような疾患又は障害である、疾患又は症状を治療する方法であって、それを必要とする対象を、本発明の組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列を含む有効量のベクターを含む医薬組成物と接触させることを含み、当該分子が、組織又は細胞特異的に標的組織又は細胞における細胞表面受容体に結合するターゲティングモジュールを含む、当該方法を提供する。ある実施形態においては、当該対象はまた、Ｗｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド又はＷｎｔシグナル伝達アゴニストをコードする核酸配列を含む有効量のベクターを含む医薬組成物と接触させる。ある実施形態においては、ベクターは発現ベクターであり、また核酸配列と作動的に連結したプロモーターを含み得る。特定の実施形態においては、ベクターはウイルスベクターである。ある実施形態においては、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列と、Ｗｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド又はＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列とが、例えば同一の発現カセット内である、同一のベクター内に存在する。
【０１９７】
関連の態様においては、本発明は、例えばＷｎｔシグナル伝達の低下と関連する、又はそれに対してＷｎｔシグナル伝達の増加が治療効果をもたらすことになるような疾患又は障害である、疾患又は症状を治療する方法であって、それを必要とする対象を、本発明の組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列を含む有効量の細胞を含む医薬組成物と接触させることを含み、当該分子が、組織又は細胞特異的に標的組織又は細胞における細胞表面受容体に結合するターゲティングモジュールを含む、当該方法を提供する。ある実施形態においては、対象はまた、Ｗｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド又はＷｎｔシグナル伝達アゴニストをコードする核酸配列を含む細胞と接触させる。ある実施形態においては、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列と、Ｗｎｔポリペプチド、Ｎｏｒｒｉｎポリペプチド又はＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列とが、同一の細胞内に存在する。特定の実施形態においては、細胞は、異種細胞であるか、又は処置しようとする対象から取得した自己細胞である。ある実施形態においては、細胞は、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子又はＷｎｔポリペプチド、ＮｏｒｒｉｎポリペプチドもしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする発現カセットを含むベクターにより形質導入された。特定の実施形態においては、細胞は、幹細胞であり、例えば脂肪由来の幹細胞又は造血幹細胞である。
【０１９８】
Ｗｎｔシグナル伝達は、幹細胞の発達プロセスと維持において重要な役割を担う。損傷及び疾患の後の大部分の組織の再生と修復に、Ｗｎｔシグナルの再活性化が関連する。組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子が、損傷及び疾患に対して治癒及び組織修復の利益を提供し得る。組織の損傷及び喪失の原因には、加齢、変性、遺伝性疾患、感染及び炎症、外傷、毒素／代謝による毒性、又は他の病状が挙げられるが、これに限定されない。Ｗｎｔシグナル及びＷｎｔシグナルのエンハンサーが、成人の組織常在性の幹細胞を活性化することが示されている。一部の実施形態においては、本発明の化合物は、疾患の又は損傷した組織の治療での使用、組織の再生での使用、及び細胞成長及び増殖での使用、ならびに／又はティッシュエンジニアリングでの使用のために、投与される。
【０１９９】
Ｗｎｔ経路の変異と関連するヒトの疾患が、疾患の治療及び予防におけるＷｎｔシグナルの増強に関して大きなエビデンスを提供する。インビボ及びインビトロでの前臨床試験により、多数の病状におけるＷｎｔシグナルの関与のさらなるエビデンスが提供され、また種々のヒト疾患における組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子の利用がさらに裏付けられる。例えば、本発明の組成物を用いて、骨の成長又は再生、骨移植、骨折の治癒、骨粗しょう症及び骨粗しょう症性骨折の治療、脊椎融合症、整形外科的デバイスの骨結合（ｏｓｓｅｏｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）、腱−骨の統合、歯の成長及び再生、歯科インプラント、歯周病、顎顔面の再建、ならびに顎の骨壊死、を促進又は増加させることができる。それらはまた、脱毛症の治療で；例えば内耳及び外耳の聴毛細胞の再生を含めた聴覚障害の治療、前庭機能不全の治療、黄斑変性の治療、硝子体網膜症、糖尿病性網膜症、又は網膜変性の他の疾患、フックスジストロフィー、他の角膜疾患等を含めた網膜症の治療、感覚器官の再生の増強で；脳卒中、外傷性脳障害、アルツハイマー病、多発性硬化症、及び血液脳関門の変性又は完全性に影響を及ぼす他の症状の治療で；脊髄損傷、他の脊髄疾患の治療で、用いてもよい。本発明の組成物は、口腔粘膜炎、黄斑変性症の治療、クローン病（ＣＤ）及び潰瘍性大腸炎（ＵＣ）であって特に瘻孔形成を伴うＣＤ及びＵＣを含めるがこれに限定されない、短腸症候群、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の治療で；他の胃腸障害；メタボリックシンドロームの治療で；糖尿病の治療、膵炎、膵外分泌部又は膵内分泌部の組織の損傷の症状の治療で；表皮再生の増強が望まれる症状で、例えば上皮の創傷治癒、糖尿病性足部潰瘍、歯、爪又は皮膚の形成不全等に関与する症候群、血管新生が有効である症状の治療；心筋梗塞、冠動脈疾患、心不全の治療；造血細胞の増殖の増強、例えば骨髄、誘導末梢血（ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ）からの造血幹細胞移植の増強、免疫不全症、移植片対宿主病等の治療；急性腎損傷、慢性腎臓病の治療；肺疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特発性肺線維症の治療、特に幹細胞（例えばＡＴ２及びＡＴ１細胞）の増殖及び分化である肺組織の再生の増強で、用いてもよい。本発明の組成物はまた、肝細胞の再生の増強、例えば肝再生、肝硬変の治療、肝移植の増強、急性肝不全の治療、肝炎（Ａ、Ｂ又はＣ）ウイルス感染による又は抗ウイルス薬療法後の慢性肝疾患、アルコール性肝炎を含めたアルコール性肝疾患、脂肪肝又は脂肪性肝炎による非アルコール性肝疾患等の治療で、用いてもよい。本発明の組成物は、新生細胞の増殖が望まれる症状を含むがこれに限定されない疾患及び障害を治療することができる。
【０２００】
Ｗｎｔシグナル伝達成分における機能喪失型変異又は機能獲得型変異に関与するヒトの遺伝学により、骨成長のためにＷｎｔシグナルが増強されることを裏付ける大きなエビデンスが示される。骨成長の増強が望まれる症状には、骨折、移植、人工装具周辺の内方成長、骨粗しょう症、骨粗しょう症性骨折、脊椎融合症、顎の骨壊死、歯科インプラント、歯周病、顎顔面の再建等を挙げることができるがこれに限定されない。組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子は、骨再生を促進するのに重要であるＷｎｔシグナルを増強及び促進する。骨組織の再生方法は、本発明の化合物の投与により利益を受けるものであり、当該投与は、全身的又は局所的とすることが可能である。一部の実施形態においては、骨髄細胞を、本発明の分子に曝露することで、骨髄内の幹細胞が活性化することとなる。
【０２０１】
一部の実施形態においては、骨再生は、例えば骨髄、骨前駆細胞、骨幹細胞等の反応性細胞集団を、有効量の本発明の分子と接触させることによって増強される。骨組織の再生方法は、本発明の化合物の投与により利益を受けるものであり、当該投与は、全身的又は局所的とすることが可能である。一部のこうした実施形態においては、接触させることは、インビボで実施する。他のこうした実施形態においては、接触させることは、エキソビボで実施する。分子は、例えば、随意に生分解性であり、また随意に活性薬剤の徐放をもたらすような基剤に充填することによって、作用部位に局在化させてもよい。基剤担体としては、吸収性コラーゲンスポンジ、セラミックス、ハイドロゲル、重合体ミクロスフェア、ナノ粒子、骨セメント等が挙げられるが、これに限定されない。
【０２０２】
本発明の分子の１又は複数を含む組成物は、骨格組織欠乏症のインビボでの治療に用いることが可能である。「骨格組織欠乏症」は、例えば外科手術的介入の結果、腫瘍の除去、潰瘍、植込み、骨折、又は他の外傷的もしくは変性による症状のいずれであるかのような、どのように欠乏症が発生したかにかかわらず、骨又は結合組織を修復することが望まれる任意の部位での骨又は他の骨格の結合組織における欠乏症を意味する。本発明の組成物は、変性性の磨耗及び関節炎、組織に対する外傷、半月板断裂の置換、半月板切除、靱帯損傷による関節脱臼、関節のアラインメント不良、骨折等の、又は遺伝性疾患による、軟骨組織における欠陥又は損傷の修復のため、結合細胞に軟骨機能を修復するためのレジメンの一部として用いることが可能である。
【０２０３】
本発明の組成物はまた、歯周病の治療で用いてもよい。歯周病は、歯の喪失の主要原因であり、また複数の全身症状に関連する。一部の実施形態においては、歯の再生又は根底にある骨の再生は、反応性細胞集団を接触させることによって増強される。一部のこうした実施形態においては、接触させることは、インビボで実施する。他のこうした実施形態においては、接触させることは、エキソビボで実施し、その後、活性化された幹細胞又は前駆細胞の植込みを伴う。分子は、例えば、随意に生分解性であり、また随意に活性薬剤の徐放をもたらすような基剤に充填することによって、作用部位に局在化させてもよい。基剤担体としては、吸収性コラーゲンスポンジ、セラミックス、ハイドロゲル、骨セメント、重合体ミクロスフェア、ナノ粒子等が挙げられるが、これに限定されない。
【０２０４】
Ｗｎｔシグナル伝達及びＲ−ｓｐｏｎｄｉｎの生物学は、損傷、加齢又は変性の後に内耳の感覚有毛細胞の再生を促進することができるということが研究により示されてきた。聴覚障害又は前庭機能不全に関与する内耳の感覚有毛細胞の喪失もまた、本発明の組成物により利益を受け得る。内耳においては、聴覚器官が、音の振動を電気インパルスに変換するために必要な機械受容性の有毛細胞を収容する。半規管（ＳＳＣ）、卵形嚢及び球形嚢からなる前庭の器官もまた、頭部の位置及び動作を感知するための感覚有毛細胞を含有する。本発明の組成物は、聴覚の再生を増強するために、耳への、例えば注入、基剤もしくは他の徐放性製剤の系、又は他の局所的な適用、で用いることが可能である。
【０２０５】
本発明の組成物はまた、網膜組織の再生に用いてもよい。成人哺乳動物の網膜においては、例えばインビボでの神経毒性の損傷の後で、ミューラーグリア細胞は視細胞を含めて網膜細胞を再生することが可能である。Ｗｎｔシグナル伝達及びＷｎｔシグナルのエンハンサーにより、損傷後又は変性中のミューラーグリア細胞由来の網膜前駆細胞の増殖を促進することが可能である。本発明の組成物はまた、目の組織及び他の細胞型の再生で用いてもよい。例えば、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、他の網膜変性疾患、角膜の疾患、フックスジストロフィー、硝子体網膜症、遺伝性疾患等は、本発明の組成物より利益を受けることが可能である。ＡＭＤは、中心視覚及び視力の進行性低下を特徴とする。フックスジストロフィーは、角膜の内皮細胞の進行性喪失を特徴とする。Ｗｎｔシグナルと、Ｗｎｔシグナルの増強とにより、目の組織において、角膜の内皮細胞、網膜の上皮細胞等の再生を促進することが可能である。他の実施形態においては、本発明の組成物を、網膜の再生及び黄斑変性の治療のために、目への、例えば注入、基剤もしくは他の徐放性製剤の系、又は他の局所的な適用、で用いることが可能である。
【０２０６】
肝細胞の恒常的再生のための増殖細胞の特定の集団は、系列追跡研究を通して特定されており、例えば、中心静脈周囲（ｐｅｒｉ−ｃｅｎｔｒａｌ）領域におけるＡｘｉｎ２陽性細胞である。系列追跡研究によれば、さらなる潜在的な肝前駆細胞も特定されており、Ｌｇｒ−陽性細胞が含まれるがこれに限定されない。Ｌｇｒ５−陽性細胞及びＡｘｉｎ２−陽性細胞を含む、自己再生性の肝細胞及び潜在的な他の前駆細胞の集団は、損傷後にＷｎｔシグナル及び／又はＲ−ｓｐｏｎｄｉｎに応答して再生することが可能であることが特定されている。急性の肝損傷及び肝不全ならびに慢性の肝疾患の多数の前臨床モデルが、Ｗｎｔシグナルの増強により利益を受ける肝細胞の回復と再生とを見せた。ある実施形態においては、本発明の組成物は、例えば、急性肝不全（あらゆる原因の）、急性アルコール性肝損傷、Ｃ型肝炎もしくはＢ型肝炎ウイルス感染による又は抗ウイルス薬療法後の慢性肝疾患、慢性アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）（脂肪肝）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、あらゆる原因の重度の慢性肝疾患、あらゆる原因の急性肝不全、薬物誘発性の急性肝不全、アルコール性肝疾患、慢性肝不全（あらゆる原因の）、あらゆる原因の肝線維症、門脈圧亢進、あらゆる原因の慢性肝不全、アルコール性肝炎、Ｃ型肝炎ウイルス誘発性の肝疾患（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス誘発性の肝疾患（ＨＢＶ）、他のウイルス性肝炎（例えば、Ａ型肝炎ウイルス誘発性の肝疾患（ＨＡＶ）及びＤ型肝炎ウイルス誘発性の肝疾患（ＨＤＶ））、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、肝臓の（ｌｉｖｅｒｙ）外科手術、肝損傷、肝移植、肝臓の外科手術及び移植における「過小グラフト（ｓｍａｌｌ  ｆｏｒ  ｓｉｚｅ）」症候群、先天性の肝疾患及び肝障害、その他の、遺伝性疾患、変性、加齢、薬物又は損傷によりもたらされる、肝臓の障害又は異常、の治療に用いることができる。それらはまた、インビボ又はインビトロにおける、肝細胞の再生を増強するのに用いてもよい。肝組織の再生方法は、本発明の化合物の投与により利益を受けるものであり、当該投与は、全身的又は局所的とすることが可能である。これらには、例えば肝細胞への注入による、肝臓に至る静脈又は血管への注入による、徐放性製剤の植込みによる等、全身的投与方法及び局所的投与方法が含まれるが、これに限定されない。
【０２０７】
本発明の組成物は、末期肝疾患（ＥＳＬＤ）の治療に用いてもよい。ＥＳＬＤ又は慢性肝不全は、重度の肝硬変及びその結果生じる肝線維症の結果であることが多い。ＥＳＬＤは、腹水症、静脈瘤出血、肝性脳症及び／又は肝機能障害（例えば、非代償性肝疾患）の発達によって現れる。ＥＳＬＤに関連するよくある疾患又は障害には、アルコール性肝炎、慢性Ｃ型肝炎感染症、慢性Ｂ型肝炎感染症、慢性Ｄ型肝炎感染症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を含めた非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、ならびに嚢胞性線維症、アルファ−１アンチトリプシン欠損症、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、ガラクトース血症及び糖原病等の遺伝病が含まれる。薬物、毒性化学物質、寄生虫感染症に長期的に曝露すること、及びうっ血肝を伴う繰り返す心不全もまた、結果的にＥＳＬＤを生じ得る。
【０２０８】
Ｗｎｔシグナルは、種々の上皮組織の再生において重要な役割を果たす。種々の上皮の症状は、本発明の化合物による治療により利益を得る。胃腸管内を被覆する急速に分化した上皮細胞の崩壊があったときに粘膜炎が発生するが、これは粘膜組織を潰瘍及び感染を受けやすいままにさせる。口腔粘膜と呼ばれる口腔内を覆う上皮被覆層の一部は、身体のうちで最も感度が高い部分のひとつであり、特に化学療法及び放射線に対して脆弱である。口腔粘膜炎は、特に化学療法及び放射線であるガン治療の、おそらく最もよくある消耗性の合併症である。さらに、本発明の組成物はまた、腸内粘膜炎、短腸症候群、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）又は他の胃腸障害の治療に有益であり得る。他の上皮の症状には、表皮の創傷治癒、糖尿病性足部潰瘍、歯、爪又は皮膚の形成不全を伴う症候群等が含まれる。本発明の分子は、これら全ての症状で用いられてよいものであり、再生性の細胞を、本発明の化合物と接触させる。上皮組織の再生方法は、本発明の化合物の投与により利益を受けるものであり、当該投与は、全身的又は局所的とすることが可能である。接触させることは、ゲル、ローション、クリーム等で、例えば、皮内、皮下的に、標的部位に適用する等を含めて局所的とすることが可能である。
【０２０９】
ＷｎｔシグナルならびにＷｎｔシグナルの増強及び促進はまた、皮膚及び胃腸管に加えて、前臨床モデルの膵臓、腎臓及び肺を含めた、組織の修復ならびに再生で重要な役割を果たす。組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子は、膵外分泌部及び膵内分泌部、腎臓又は肺に関与する種々の病状に有益であり得る。本発明の組成物は、メタボリックシンドロームの治療；糖尿病の治療、急性又は慢性の膵炎、膵外分泌不全の治療、急性腎損傷、慢性腎臓病の治療、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を含めるがこれに限定されない肺疾患、特発性肺線維症、肺上皮組織喪失が原因の他の症状の治療で用いることができる。これら組織の再生方法は、本発明の化合物の投与により利益を受けるものであり、当該投与は、全身的又は局所的とすることが可能である。
【０２１０】
上皮のＷｎｔシグナル伝達は、他の発生因子を介したシグナル伝達と協働して、成人の毛包再生に重要である。脱毛はよくある問題であり、しばしば男性型禿頭症と呼ばれる男性型脱毛症は、男性における脱毛の最もよくある形態である。一部の実施形態においては、毛包再生は、反応性細胞集団を本発明の分子と接触させることによって増強される。一部のこうした実施形態においては、接触させることは、インビボで実施する。他のこうした実施形態においては、接触させることは、エキソビボで実施する。分子は、例えば外用のローション、ゲル、クリーム等、作用部位に局在化させてもよい。
【０２１１】
脳卒中、外傷性脳障害、アルツハイマー病、多発性硬化症、及び、血液脳関門（ＢＢＢ）に影響を及ぼす他の症状を、本発明の組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子で治療することができる。血管新生は、全身にわたって多数の組織への酸素及び栄養素の供給を確実にするために重要であり、また神経組織は低酸素症及び虚血に対して極めて敏感であるため、ＣＮＳにとって特に重要である。ＢＢＢを形成するＣＮＳ内皮細胞は、接着結合により共に結合している非常に分極した細胞であって、特異的なトランスポーターを発現するという点で、非神経組織における内皮細胞と異なる。Ｗｎｔシグナル伝達は、ＣＮＳの血管形成及び／又は機能を調節する。ＢＢＢが危険に晒される症状は、本発明の化合物の投与により利益を受けることが可能であり、当該投与は、例えば直接の注入、くも膜下腔内注射、徐放性製剤の植込み等による、全身的又は局所的とすることが可能である。さらに、Ｗｎｔシグナルは、神経形成に積極的に関与し、損傷後の神経保護という重要な役割を果たす。本発明の組成物はまた、脊髄損傷、他の脊髄疾患、脳卒中、外傷性脳障害等の治療で用いてもよい。
【０２１２】
Ｗｎｔシグナルはまた、血管新生に役立つ。組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子は、血管新生が心筋梗塞、冠動脈疾患、心不全等の有益な治療となるような症状、及び遺伝性疾患の症状、に有益であり得る。これら組織の再生方法は、本発明の化合物の投与により利益を受けるものであり、当該投与は、全身的又は局所的とすることが可能である。
【０２１３】
ある実施形態においては、本発明の方法が、例えば、損傷又は組織もしくは細胞の減少もしくは喪失を被った組織において、組織の再生を促進する。喪失又は損傷は、疾患又は傷害を含めて、細胞数を減少させるあらゆるものである得る。例えば、事故、自己免疫障害、治療の副作用、又は心的外傷を構成する可能性がある病状である。組織の再生により、組織内の細胞数を増加させて、また好ましくは再び樹立しようする組織の細胞間の結合を可能にし、またより好ましくは、組織の機能性を取り戻させることを可能にする。
【０２１４】
特定の実施形態においては、組成物は、例えば静脈内に非経口的に、口腔内に、直腸に、又は注入によって、投与される。一部の実施形態においては、例えば局所に又は筋肉内に、局所的に投与される。一部の実施形態においては、組成物は、例えば骨、関節、耳の組織、目の組織、胃腸管、皮膚、創傷部位、又は脊髄である、標的組織に投与される。本発明の方法は、インビボ又はエキソビボで実施され得る。一部の実施形態においては、標的の細胞又は組織を組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子と接触させることは、エキソビボで実施されて、その後に、例えば活性化された幹細胞又は前駆細胞である当該細胞又は組織の、対象への植込みが続く。当業者は、治療する疾患又は障害に基づいて、適切な投与部位及び投与経路を決定することが可能である。
【０２１５】
用法及び投与計画は、例えば疾患又は障害の性質、対象の特性、及び対象の病歴等である、医師によって容易に決定される種々の因子に依存し得る。特定の実施形態においては、対象に投与又は提供される、例えば融合タンパク質である組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子の量は、対象の体重に対して約０．０１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇ、又は約０．１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇの範囲にある。
【０２１６】
ある実施形態においては、対象は、例えばヒト、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、スナネズミ）、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、又は霊長類である任意の哺乳動物であり得る。
【０２１７】
一部の実施形態においては、主題の方法は治療効果を結果的にもたらすものであり、例えば障害の発達を予防する、障害の進行を止める、障害の進行を退行させること等である。一部の実施形態においては、主題の方法は、治療効果が達成されたことを検出するステップを含む。当業者によれば、治療効果のこうした測定が、改変しようとする特定の疾患に適用可能であるだろうということを理解することとなり、また治療効果を測定するために用いる適切な検出方法を認識することとなる。
【０２１８】
ある実施形態においては、本開示は、例えば骨成長が望まれる本明細書に開示する症状のいずれかである、骨組織における、Ｗｎｔシグナル伝達の低下と関連する又はＷｎｔシグナル伝達活性の増加が有益となることとなる疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、それを必要とする対象に、例えばＰＴＨ１Ｒに特異的に結合するターゲティングモジュールである、骨組織に結合するターゲティングモジュールを含むＷｎｔシグナル増強分子を含む医薬組成物を提供することを含み、当該Ｗｎｔシグナル増強分子が対象の骨組織におけるＷｎｔシグナル伝達を増加又は増強する、当該方法を提供する。ある実施形態においては、医薬組成物は、経口で、又は全身的に、例えば非経口的に、投与される。特定の実施形態においては、Ｗｎｔシグナル増強分子は、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎフューリンドメイン１又はそのフラグメントもしくはバリアントと、随意に変異フューリンドメイン２又はそのフラグメントもしくはバリアントとを含む、作用モジュールを含む。
【０２１９】
ある実施形態においては、本開示は、例えば肝臓再生により利益を受けることとなる本明細書に開示する疾患又は障害のいずれかである、肝臓組織における、Ｗｎｔシグナル伝達の低下と関連する又はＷｎｔシグナル伝達活性の増加が有益となることとなる疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、それを必要とする対象に、例えばＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２、ＴＦＲ２又はＳＬＣ１０Ａ１に特異的に結合するターゲティングモジュールである、肝臓組織に結合するターゲティングモジュールを含むＷｎｔシグナル増強分子を含む医薬組成物を提供することを含み、当該Ｗｎｔシグナル増強分子が対象の肝臓組織におけるＷｎｔシグナル伝達を増加又は増強する、当該方法を提供する。ある実施形態においては、医薬組成物は、経口で、又は全身的に、例えば非経口的に、投与される。特定の実施形態においては、Ｗｎｔシグナル増強分子は、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎフューリンドメイン１又はそのフラグメントもしくはバリアントと、随意に変異フューリンドメイン２又はそのフラグメントもしくはバリアントとを含む、作用モジュールを含む。
【０２２０】
ある実施形態においては、本開示は、例えば口腔粘膜等である口腔粘膜組織における、Ｗｎｔシグナル伝達の低下と関連する又はＷｎｔシグナル伝達活性の増加が有益となることとなる疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、それを必要とする対象に、例えばＬＹＰＤ３又はＤＳＧ３に特異的に結合するターゲティングモジュールである、口腔粘膜組織に結合するターゲティングモジュールを含むＷｎｔシグナル増強分子を含む医薬組成物を提供することを含み、当該Ｗｎｔシグナル増強分子が対象の口腔粘膜組織におけるＷｎｔシグナル伝達を増加又は増強する、当該方法を提供する。ある実施形態においては、医薬組成物は、経口で、又は全身的に、例えば非経口的に、投与される。特定の実施形態においては、Ｗｎｔシグナル増強分子は、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎフューリンドメイン１又はそのフラグメントもしくはバリアントと、随意に変異フューリンドメイン２又はそのフラグメントもしくはバリアントとを含む、作用モジュールを含む。
【０２２１】
本明細書で言及した、ならびに／又は出願データシートに列記した、上記した米国特許、米国特許出願公開公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、及び非特許出版物の全ては、それらの全体として、参照により本明細書で援用する。
【０２２２】
先述より、本発明の特定の実施形態を説明の目的で本明細書に記載してきたが、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく様々な変形がなされ得る、ということが理解されるであろう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲以外によっては、限定されない。
【実施例】
【０２２３】
以下の実施例は、完全な開示と本発明がどのようになされて使用されるかについての記載とを当業者に提供するために提案され、そして発明者が彼らの発明とみなしているものの範囲を限定する意図はなく、また以下の実験が全てである又はこれら実験のみを行ったということを示す意図もない。用いた数字（例えば、量、温度等）に関して、正確性を確実にする努力はなされたが、一部は実験的誤差及び偏差が占めているはずである。別段に示さない限り、部分は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度はセ氏であり、また圧力は大気又はほぼ大気である。
【０２２４】
分子生物学、細胞生物学及び生化学の全般的な方法は、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．”  （Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１）；“Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄ．”  （Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  １９９９）；“Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ”（Ｂｏｌｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  １９９６）；“Ｎｏｎｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ”（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９９）；“Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ”（Ｋａｐｌｉｆｔ＆Ｌｏｅｗｙ  ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）；“Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ”（Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ  ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７）；及び、“Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”（Ｄｏｙｌｅ＆Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  １９９８）、のような標準的な教科書に見ることができ、その開示は、参照により本明細書で援用する。本開示で言及した試薬、クローニングベクター、及び遺伝子操作用キットは、例えばバイオラッド社（ＢｉｏＲａｄ）、ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、シグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、及びクロンテック社（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）等の商業的な売主より利用可能である。
【０２２５】
以下の実施形態において採用した材料及び方法には、以下を含める。
【０２２６】
公開されたＡＳＧＲ１バインダー：原型的な抗ＡＳＧＲ１バインダー（ＲＯ−０１）及びいくつかのその他のもの（ＲＯ−０２、−０３及び−０４）を、ＰＣＴ特許出願公開公報の国際公開第２０１４／０２３７０９号から選択した。抗ＴＦＲ１配列は、ＰＣＴ特許出願公開公報の国際公開第２０１６／０８１６４０号から選択した。抗ＬＹＰＤ３配列は、ＰＣＴ特許出願公開公報の国際公開第２０１７／０１５８７７５号から選択した。抗ＤＳＧ３配列は、ＰＣＴ特許出願公開公報の国際公開第２０１０／０９２４５７号から選択した。ＺＮＲＦ３バインダーＳＣ−０１及びＳＣ−０２は、ＰＣＴ特許出願公開公報の国際公開第２０１５／１６４３９２号から選択した  ＲＮＦ４３バインダーＮＶ−０１は、ＰＣＴ特許出願公開公報の国際公開第２０１３／０５４３０７号から選択した。
【０２２７】
タンパク質産物：全ての組換えタンパク質は、別段に特定しない限り、一過性導入により、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）において産生した。全てのｓｃＦｖ含有融合体は、ＦＬＡＧ−Ｈｉｓタグを含有しており、またはじめにメーカー推奨の手順に従って、ｃＯｍｐｌｅｔｅ  ｈｉｓタグ精製用樹脂（ｃＯｍｐｌｅｔｅ  ｈｉｓ−ｔａｇ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｅｓｉｎ）（シグマアルドリッチ社）を用いて精製した。全てのＩｇＧ系コンストラクト及びＦｃ含有コンストラクトは、まず、プロテインＡ樹脂で精製し、０．１Ｍのグリシン、ｐＨ３．５で溶出した。次いで全てのタンパク質を、ＨＢＳ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．２、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中でサイズ排除カラムで精製した。タンパク質を、−８０℃での長期保存のため、１０％までグリセリンを補足した。インビトロ受容体結合解析のため、ヒトＲＮＦ３（Ｑ４４−Ｄ１９８）及びＺＮＲＦ３（Ｋ５６−Ｍ２１９）及びＡＳＧＲ１（Ｑ６２−Ｌ２９１）の細胞外ドメインを、Ｎ末端におけるＨｉｓ−Ａｖｉタグを付けて発現し、またマウスＡＳＧＲ１（Ｑ６１−Ｎ２８４）は、Ｃ末端におけるＨｉｓ−Ａｖｉタグを付けて発現した。それらを、Ｈｉｓタグ樹脂により精製し、記載のとおりにビオチン化し（Ｊａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７；Ｎａｔｕｒｅ  ５４５：２３４）、次いでサイズ排除クロマトグラフィーでさらに精製した。親和性測定のため、ＡＳＧＲ１バインダーのＦａｂバージョンを、５−ｍｅｒリンカー（ＧＳＧＳＧ）に続くヒトＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインのＣ末端に（Ｈｉｓ）６タグを付けて生成し、Ｈｉｓタグ樹脂で精製し、その後にサイズ排除クロマトグラフィーを続けた。試験した全てのタンパク質を、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法で調べ、少なくとも９０％の純度であると推定された。
【０２２８】
ＳｕｐｅｒＴｏｐ  Ｆｌａｓｈ（ＳＴＦ）アッセイ：Ｗｎｔシグナル伝達活性を、報告されているように（Ｊａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７；Ｎａｔｕｒｅ  ５４５：２３４）、Ｗｎｔ反応性プロモーターによって制御したルシフェラーゼ遺伝子を含有する細胞株を用いて測定した（Ｓｕｐｅｒ  Ｔｏｐ  Ｆｌａｓｈレポーターアッセイ、ＳＴＦ）。簡潔には、細胞を、処理の２４時間前に、９６ウェルプレート中で、１ウェル当たり１０，０００個の密度で播種して、次いで、単独で又は３０％のＷｎｔ３ａ馴化培地と共にのいずれかで、一晩、ＲＳＰＯ又は模倣タンパク質で処理した。Ｗｎｔ３ａ馴化培地は、メーカーの推奨条件に従って、ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−２６４７  Ｗｎｔ３ａ分泌Ｌ細胞から調製した。細胞は、ルシフェラーゼ細胞培養溶解試薬（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ）（プロメガ社）で溶解させて、そして活性を、メーカーが提案する手順を用いて、ルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ社）で測定した。データは、３つ組みの平均−／＋標準偏差としてプロットし、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ社のソフトウェア）を用いて非線形回帰で当てはめた。外因性受容体の過剰発現に関して、細胞は、真核生物発現プロモーターのもとで、関心の受容体を含有するプラスミドで一過性導入して（ＡＳＧＲ１はＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社のクローンＯＨＵ０３６５８Ｄ、ＡＳＧＲ２はインハウスでクローン化したアイソフォームｄ／ＮＰ＿００１１８８２８１．１であり、またＴＦＲＣはＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社よりのクローンＨＧ１１０２０−ＵＴであった）、次いでトランスフェクトの２４時間後にＳＴＦアッセイのために９６ウェルプレートに分割（１ウェル当たり２０，０００細胞）した。
【０２２９】
親和性測定：ＲＳＰＯ由来のタンパク質のＬＧＲ５、ＲＮＦ４３又はＺＮＲＦ３に対する結合動態と、ヒト及び／又はマウスＡＳＧＲ１に対する抗ＡＳＧＲ  Ｆａｂの結合とを、Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ  ９６（ＰＡＬＬ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ社、カリフォルニア州フリーモント）機器を、３０℃、１０００ｒｐｍで用いて、ストレプトアビジン（ＳＡ）又は抗ｈＩｇＧ  Ｆｃ捕捉（ＡＨＣ）のいずれかのバイオセンサーを用いて、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）により求めた。ＲＮＦ４３又はＺＮＲＦ３又はＡＳＧＲ１のビオチン化細胞外ドメイン（ＥＣＤ）と、ヒトＩｇＧ１融合ＬＧＲ５−ＥＣＤのＦｃ部分（Ｒ＆Ｄシステムズ社）とを、ランニング緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．５％ＢＳＡ、ｐＨ７．２）中に５０ｎＭに希釈して、結合レベルが約１．０ｎｍに到達するまで、それぞれＳＡバイオセンサー、及びＡＨＣバイオセンサーに捕捉させる。ＲＮＦ４３、ＺＮＲＦ３又はＬＧＲ５のＥＣＤの捕捉後、バイオセンサーを、ランニング緩衝液中に７つの異なる濃度で関連する試験分子を含有するウェル中と、参照チャネルとしてランニング緩衝液のみを含んだウェル中とに、浸漬させた。ＫＤは、ＬＧＲ５、ＲＮＦ４３及びＺＮＲＦ３への結合に関して、会合段階の１４０〜１４５秒の間における平均反応に基づいて定常状態解析によって求めた。ＡＳＧＲに対する結合に関しては、ＫＤは、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）Ｒｅｄデータ解析ソフトウェア（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ社）を用いて曲線モデルフィッティングで求めた。
【０２３０】
細胞フローサイトメトリー：ＨＥＫ２９３細胞を、ＺＮＲＦ３を過剰発現するプラスミド（ジェンスクリプト社（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）  ＯＨｕ２２９７７）単独で又はＡＳＧＲ１と共に一過性導入して、そして１０％のＷｎｔ３ａ馴化培地を含んで又は含まずに１０ｎＭの最終濃度でＲＳＰＯ誘導体分子で２４時間処理した。細胞は、Ｇｉｂｃｏの無酵素解離培地を用いて解離させ、ＦＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡを含み、０．０２％アジ化ナトリウムを含む、１×ＰＢＳ）中で洗浄及び再懸濁させた。細胞を、１ｎＭの１８Ｒ５  ＩｇＧ（ｐａｎ−Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）で１時間、インキュベートした。洗浄後、細胞を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で４０分間、インキュベートした。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄して、ＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６  Ｐｌｕｓフローサイトメーターを用いてマルチチャネル解析に供した。データを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで処理して、蛍光信号を、ヒストグラムプロットで表示した。
【０２３１】
細胞タンパク質のウエスタンブロット解析：細胞を、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤を補足したＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ６３０、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ及び１ｍＭのＥＤＴＡ）により溶解した。細胞溶解液を１５，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離して、上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離して、ニトロセルロース膜に移して、一次抗体で探索して、その後にＨＲＰ結合した二次抗体と、ＥＣＬフィルム検出が続いた。抗ＬＲＰ６抗体、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＬＲＰ６抗体（Ｓｅｒ  １４９０）及び抗ＤＬＶ２一次抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社よりであった。抗αチューブリン抗体は、シグマアルドリッチ社よりであった。
【０２３２】
遺伝子発現の半定量ＰＣＲ解析：ヒト細胞培養液からのＲＮＡ（ＨＥＫ２９３、Ｈｕｈ−７及びＡ４３１）を、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏキット（キアゲン社、７４００４）を用いて抽出した。ｃＤＮＡは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）  ＶＩＬＯ（商標）  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、１１７５４０５０）を用いて産生した。ヒトＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２及びＴＦＲＣ発現は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）  Ｆａｓｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、４４４４９６３）と、Ｈｓ０１００５０１９＿ｍ１  ＡＳＧＲ１、Ｈｓ００１５４１６０＿ｍ１  ＡＳＧＲ２及びＨｓ００９５１０８３＿ｍ１  ＴＦＲＣのプローブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、４３３１１８２）とを用いて測定した。値は、Ｈｓ０１０６０６６５＿ｍ１プローブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、４３３１１８２）を用いて恒常的なＡｃｔｉｎ  Ｂ遺伝子の発現で正規化した。マウス組織（肝臓及び小腸の試料）よりのＲＮＡを、ＭａｇＭＡＸ（商標）  ｍｉｒＶａｎａ（商標）  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、Ａ２７８２８）を用いて抽出した。ｃＤＮＡは、ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、４３−６８８−１４）又はＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ  ＶＩＬＯ（商標）Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、カタログ番号１１７５６０５０）を用いて産生した。マウスＡｘｉｎ２及びＫｉ６７のｍＲＮＡ発現は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、４４４４９６３）、ならびにＭｍ００４４３６１０＿ｍ１  Ａｘｉｎ２、Ｍｍ０１２７８６１７＿ｍ１  Ｋｉ６７、Ｍｍ０１３００５５５＿ｇ１  ｗｎｔ１、Ｍｍ００４７００１８＿ｍ１  ｗｎｔ２、Ｍｍ００４３７３３６＿ｍ１  ｗｎｔ３、Ｍｍ０１１９４００３＿ｍ１  ｗｎｔ４、Ｍｍ００４３７３４７＿ｍ１  ｗｎｔ５ａ、Ｍｍ０１１８３９８６＿ｍ１  ｗｎｔ５ｂ、Ｍｍ００４３７３５３＿ｍ１  ｗｎｔ６、Ｍｍ００４３７３５６＿ｍ１  ｗｎｔ７ａ、Ｍｍ０１３０１７１７＿ｍ１  ｗｎｔ７ｂ、Ｍｍ０１１５７９１４＿ｇ１  ｗｎｔ８ａ、Ｍｍ００４５７１０２＿ｍ１  ｗｎｔ９ｂ、Ｍｍ００４４２１０４＿ｍ１  ｗｎｔ１０ｂ、Ｍｍ００４３７３２７＿ｇ１  ｗｎｔ１１、Ｍｍ００４４６４２０＿ｍ１  ｗｎｔ１６、Ｍｍ００５０７０７７＿ｍ１  ｒｓｐｏ１、Ｍｍ００５５５７９０＿ｍ１  ｒｓｐｏ２、Ｍｍ０１１８８２５１＿ｍ１  ｒｓｐｏ３、及びＭｍ００６１５４１９＿ｍ１  ｒｓｐｏ４  のプローブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、４３３１１８２）を用いて測定した。値は、Ｍｍ０２６１９５８０＿ｇ１プローブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、４３５１３６８）を用いて恒常的なＡｃｔｉｎ  Ｂ遺伝子の発現で正規化した。
【０２３３】
動物実験：６週齢のＣ５７Ｂｌ／６Ｊ雄マウスを、ジャクソン研究所（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（米国メイン州バーハーバー）より取得して、グループ飼育した。全ての動物実験は、米国科学アカデミーによる“Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ”の基準に従った。動物実験のプロトコールは、Ｓｕｒｒｏｚｅｎ社の動物実験委員会で承認された。マウスは、最低でも実験開始２日前に気候順応させた。マウスは、精製された実験室グレードの酸性化水が無制限に与えられ、また自由に給餌された（２０１８  Ｔｅｋｌａｄ  ｇｌｏｂａｌの１８％タンパク質げっ歯類用飼料）。マウスは、３０％〜７０％湿度環境及び２０℃〜２６℃の室温で、１２／１２時間の明／暗サイクルに保たれた。
【０２３４】
ヒトＡＳＧＲ遺伝子発現のためにマウスをヒト化した場合において、各マウスに、１×１０１１個のｓｓＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｈＡＳＧＲ１ゲノムコピー（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、ペンシルベニア州モルバーン）を０日目に静脈内に投与した。７日目に、マウスを、αＧＦＰ、Ｆｃ−ＲＳＰＯ２−ＷＴ、αＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＲＡ又はαＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡで腹腔内（ｉ．ｐ．）に注射した。タンパク質投与後の示した時点において、マウスをイソフルランで麻酔して、心穿刺により血液を取り出した。肝左葉及び十二指腸の一部を、解析のために採取した。
【０２３５】
実施例１
組織特異性Ｗｎｔシグナル伝達増強分子の特性決定
組織特異性ＲＳＰＯ様Ｗｎｔシグナル伝達増強分子を生成するために、アシアロ糖蛋白受容体（ＡＳＧＲ）を標的化した。ＡＳＧＲは、肝細胞上で主として発現する２つのポリペプチド、ＡＳＧＲ１及びＡＳＧＲ２から構成されるヘテロオリゴマーであり、急速なエンドサイトーシスを経る。ＡＳＧＲ１抗体（例えば、ＲＯ−０１）は、ｓｃＦｖ形態に変換されて、それを異なるＲＳＰＯ２バリアントのＮ末端に融合して、αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＷＴ、αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ又はαＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−５ｍｕｔ（配列番号１１〜１６、図１Ｂ、右図）を生成した。この設計において、融合体の抗体部分は、細胞／組織特異性を導く「ターゲティングモジュール」として機能し、一方でＲＳＰＯ２成分は、Ｅ３リガーゼと相互作用する「作用モジュール」として機能する（図１Ｂ）。ＬＧＲ結合を無効にするために、導入されたＬＧＲタンパク質、Ｆ１０５Ｒ及びＦ１０９Ａに結合するために重要であることが報告されているＲＳＰＯ２のＦｕ２ドメイン内の２つの高度に保存された疎水性残基内に点変異を導入した（図１Ｂ、αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡという名称）。Ｅ３リガーゼの相互作用におけるＦｕ１ドメインの関与を検証するために、この相互作用に重要であることが報告されているＦｕ１ドメイン内にさらなる点変異（Ｒ６５Ａ／Ｒ６９Ａ／Ｑ７０Ａ）をまた付加した（図１Ｂ、Ｆｕ１及びＦｕ２の両方において５つ全ての変異Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ／Ｒ６５Ａ／Ｒ６９Ａ／Ｑ７０Ａを含有するαＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−５ｍｕｔ）。ターゲティングモジュール用の陰性対照として、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に対するｓｃＦｖ抗体を、同一のヒトＲｓｐｏ２フラグメントと変異体（α−ＧＦＰ−Ｒｓｐｏ２−ＷＴ、α−ＧＦＰ−Ｒｓｐｏ２−ＲＡ、及びα−ＧＦＰ−Ｒｓｐｏ２−５ｍｕｔ；配列番号５〜１０、図１Ｂ；左パネル）に融合した。
【０２３６】
ＬＧＲとＥ３リガーゼの結合に対するＦｕ１及びＦｕ２変異の影響を、Ｏｃｔｅｔシステムにおけるバイオレイヤー干渉法を用いて検証した。野生型（αＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＷＴ）又は変異体（αＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＲＡ又はαＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−５ｍｕｔ）の組換えＬＧＲ５タンパク質への結合を測定して、野生型の結合は観察されたが、２つのＦｕ２変異体ＲＳＰＯバリアントは観察されなかった（図１Ｃ）。Ｆｕ２変異の影響は、Ｅ３リガーゼＺＮＲＦ３及びＲＮＦ３へのαＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＲＡの結合が影響を受けなかったことから、ＬＧＲ相互作用に特異的である（図１Ｄ）が、一方でＦｕ１ドメインに変異を含有するαＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−５ｍｕｔは、Ｅ３リガーゼとの相互作用にさらに影響を及ぼした（図１Ｄ）。
【０２３７】
Ｆｕ１及びＦｕ２の変異の、ＲＳＰＯ２のＷｎｔシグナル伝達を増強する能力への影響を、ＨＥＫ２９３及びＨｕｈ−７のＷｎｔ反応性ＳＴＦ細胞において試験した。図２Ｂ、右パネルに示すように、Ｗｎｔの添加が何もない場合では、ＲＳＰＯ２タンパク質はＷｎｔシグナル伝達を活性化しなかった。Ｗｎｔ３ａ馴化培地（ＣＭ）の存在下では、用量反応性物質において、αＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＷＴがＷｎｔ３ａ活性を増強したが、Ｆｕ１（αＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＲＡ）又はＦｕ１＋Ｆｕ２（αＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−５ｍｕｔ）のいずれかにおける変異は、完全に不活性であり、ＲＳＰＯ２活性がＥ３リガーゼ及びＬＧＲタンパク質の両方と結合する能力に依存するという予想と一致した。
【０２３８】
ターゲティングモジュールを抗ＧＦＰから抗ＡＳＧＲ１に切り替えることで、ＲＳＰＯ２のＥ３リガーゼ又はＬＧＲ５タンパク質に対する相互作用への影響は見られなかった。αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＷＴはＥ３リガーゼ及びＬＧＲ５の両方に結合し、αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡは、ＬＧＲ５と相互作用する能力を失い、またαＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−５ｍｕｔは、ＬＧＲ５及びＥ３リガーゼの両方と相互作用する能力を失った（図１Ｃ及び１Ｄ）。
【０２３９】
これら分子の、Ｗｎｔシグナル伝達を調節する能力もまた、ＨＥＫ２９３  ＳＴＦ及びＨｕｈ−７  ＳＴＦのＷｎｔ反応性レポーター細胞両方において評価した。ＨＥＫ２９３  ＳＴＦ細胞においては、それらはＡＳＧＲ１を発現しないため（半定量ＰＣＲ解析によって検証されたように。図２Ａ）、抗ＡＳＧＲ１-ＲＳＰＯ２融合タンパク質は、それらの抗ＧＦＰ抗体の相手方とほぼ同様に振る舞った（図２Ｂ）。添加されたＷｎｔの不在下では、αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２タンパク質はＷｎｔシグナル伝達を活性化しなかった（図２Ｂの右パネル）。Ｗｎｔ３ａ馴化培地（ＣＭ）の存在下では、αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＷＴが、αＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＷＴと同様に用量反応性物質においてＷｎｔ３ａ活性を増強したが、一方でαＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ及びαＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−５ｍｕｔは不活性であった（図２Ｂ）。対照的に、Ｈｕｈ−７  ＳＴＦ細胞、ＡＳＧＲ１を発現するヒト肝細胞腫細胞株においては、αＡＳＧＲ１  ｓｃＦｖの融合が、ＲＳＰＯ２−ＲＡ変異体のＷｎｔ３ａ誘発性のシグナル伝達を増強する能力を有意に回復させた（図２Ｂ、下方左パネル）。αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−５ｍｕｔは不活性のままであったが、これはαＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡで観察された活性がそのＥ３リガーゼに結合する能力に依存していることを表す。興味深いことに、ＷＴ  ＲＳＰＯ２、αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＷＴに対するαＡＳＧＲ１  ｓｃＦｖ融合もまた、αＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＷＴと比較して用量反応曲線において、有意な、約６倍の左方シフトを示したが（図２Ｂ）、これは新規のターゲティングモジュール、αＡＳＧＲ１  ｓｃＦｖの結合が、ＬＧＲと相乗作用してＷＴ  ＲＳＰＯ２機能をさらに増強し得たことを示唆する。
【０２４０】
ＳＴＦレポーター系に加えて、Ｗｎｔシグナル伝達活性もまた、ウエスタンブロット解析で直接調べた。図２Ｃに示すように、１０％のＷｎｔ３ａ  ＣＭでのＨｕｈ−７細胞の処理により、有意な変化は誘発されなかったが、αＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＷＴの添加により、Ｗｎｔ３ａ反応が増強され、またＬＲＰ６タンパク質の全体のレベルが増加したことに加えて、リン酸化されたＬＲＰ６及びＤＶＬ２タンパク質の両方を有意に増加させた。Ｆｕ２における変異は、αＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＲＡで処理した細胞で見られたように、この増強活性（ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を無効にした。しかしながら、αＡＳＧＲ  ｓｃＦｖ、αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡへの融合が、αＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＲＡを伴う機能表現型の喪失を回復させ、全ＬＲＰ６タンパク質をわずかに増加させただけでなく、リン酸化されたＬＲＰ６のレベルを有意に増加させ、またそれほどではないにせよＤＶＬ２を増加させた（図２Ｃ）。
【０２４１】
標的の受容体ＡＳＧＲの存在に依存する抗ＡＳＧＲ１  ＲＳＰＯ２−ＲＡ融合タンパク質の細胞型特異的な活性をさらに確認するために、全長ヒトＡＳＧＲ１  ｃＤＮＡをコードするプラスミドでＨＥＫ２９３細胞を一過性導入した。ＡＳＧＲ１及びＡＳＧＲ２が複合体を形成するため、陰性対照として無関連受容体、ヒトトランスフェリン受容体１（ＴＦＲ１。ＴＦＲＣ遺伝子によりコードされた）のトランスフェクションに加えて、ＡＳＧＲ  ｃＤＮＡの両方の同時トランスフェクションも実施した。トランスフェクトされなかった親ＨＥＫ２９３細胞と同様に、αＧＦＰ−又はαＡＳＧＲ１−のいずれかを伴うＲＳＰＯ２−ＷＴ融合タンパク質のみが、ＴＦＲＣでトランスフェクトした細胞においてＷｎｔ依存的にＷｎｔシグナル伝達を増強した（図２Ｂの上図と図３Ａの上図とを比較）。対照的に、ＡＳＧＲ１単独でトランスフェクト又はＡＳＧＲ１及びＡＳＧＲ２の両方により同時トランスフェクトした細胞において、αＡＳＧＲ１  ｓｃＦｖの融合が、機能ＲＳＰＯ２−ＲＡ変異体の、Ｗｎｔシグナル伝達を増強する能力の喪失を一部回復させた。αＡＳＧＲ１の融合もまた、Ｈｕｈ−７細胞において観察されたものと同様に、ＲＳＰＯ２−ＷＴタンパク質の用量反応を左方シフトさせた（図２Ｂの下方パネルと、図３Ａの中央及び下方パネルとを比較）。αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ融合分子の活性もまた、Ｗｎｔリガンドの存在に完全に依存した（図３Ａの右図）。
【０２４２】
ＡＳＧＲ１依存性活性はまた、別のＡＳＧＲ１陰性細胞株、Ａ４３１において確認されたが、これはヒト類表皮がんに由来し、またＡＳＧＲ遺伝子を発現しない（図２Ａ）。ＨＥＫ２９３トランスフェクション実験と同様に、αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡのみが、ＡＳＧＲ１発現Ａ４３１細胞においてＲＳＰＯ２−ＲＡ活性を回復させたが、陰性対照受容体、ＴＦＲ１を発現するＡ４３１細胞においてはしなかった（図３Ｂ）。さらに、αＡＳＧＲ１  ｓｃＦｖもまた、ＲＳＰＯ２−ＷＴ用量反応曲線を左方シフトさせ、また全てのＲＳＰＯ誘導体の活性が、Ｗｎｔリガンドの存在に完全に依存した（図３Ｂ、右パネル）。図２及び３からの全ての結果を合わせて、ＲＳＰＯ介在性のＷｎｔシグナル増強活性は、ＬＧＲの代わりに異なる細胞表面受容体、ＡＳＧＲ１を標的にすることによって置き換えることが可能である、ということを示した。得られたＲＳＰＯ模倣分子は、Ｗｎｔ依存性とそのＥ３リガーゼを介した作用とがＷＴ  ＲＳＰＯに似ているが、そのＷｎｔシグナル伝達増強が細胞型特異的である点で異なる。
【０２４３】
ＲＳＰＯ誘導体分子の作用の機序をさらに検証するために、細胞表面におけるＦｒｉｚｚｌｅｄ（ＦＺＤ）受容体レベルを調べた。系を感作するために、処理前に一過性導入によりＺＮＲＦ３を過剰発現した。ｐａｎ−Ｆｒｉｚｚｌｅｄ抗体１８Ｒ５（欧州特許第ＥＰ２３３１１３６Ａ４号に基づいてクローン化）を用いて、細胞を染色し、未処理細胞と比較してαＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＷＴが信号を明らかに増加させたことが発見されたが（予想されたとおり）、こうしたシフトはαＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＲＡ又はαＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡでの処理では観察されなかった（図３Ｃ、上図）。このことは、ＨＥＫ２９３細胞においてこれら２つのＲＳＰＯ−ＲＡコンストラクトの活性が欠如していることと一貫している。一方、細胞をＺＮＲＦ３及びＡＳＧＲ１の両方で同時トランスフェクトした場合、αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡが、ちょうどαＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＷＴのようにｐａｎ−ＦＺＤ染色を増加させ、αＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＲＡは未処理細胞と同様のままであった（図３Ｃ、底図）。このことは、ＲＳＰＯ又はＲＳＰＯ模倣体によるＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３のＥ３リガーゼの除去と一貫しており、これはＷｎｔ受容体の安定化を招く。
【０２４４】
さらなる細胞型において組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子の、Ｗｎｔシグナル伝達を増強する能力を検証するために、異なる細胞表面受容体トランスフェリン受容体１（ＴＦＲ１）を標的とする第２の新規二重特異性コンストラクトを試験した。ＴＦＲ１は、ＴＦＲＣ遺伝子によりコードされ、また多数の細胞型において広く発現される。連続的なエンドサイトーシスを受けることが報告されている。ヒトＴＦＲ１、ＲＳＰＯ２−ＷＴ、ＲＳＰＯ２−ＲＡ又はＲＳＰＯ２−５ｍｕｔ（配列番号１７〜２２）に対するｓｃＦｖバインダーを含有する融合タンパク質を構築して、特性決定した。図１Ｂと同様の設計を有するが、抗ＧＦＰ又は抗ＡＳＧＲ１成分を抗ＴＦＲ１  ｓｃＦｖで置換したことが異なる。抗ＧＦＰ又は抗ＡＳＧＲ１融合タンパク質と同様に、αＴＦＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡタンパク質は、ＬＧＲ５と相互作用する能力を喪失しており、またαＴＦＲ１−ＲＳＰＯ２−５ｍｕｔは、ＬＧＲ５及びＥ３リガーゼの両方と相互作用する能力を喪失していた（図４Ａ〜Ｂ）。Ｗｎｔ源の存在下でＨＥＫ２９３  ＳＴＦレポーターアッセイで試験した場合に、ＴＦＲ１標的ＲＳＰＯ２−ＲＡ（αＴＦＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ）がＷｎｔシグナル伝達を刺激して、野生型ＲＳＰＯ（αＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＷＴ）と比較して約２０倍高い効力を呈した  （図４Ｃ）。抗ＴＦＲ１  ＲＳＰＯ２−ＷＴ融合体、αＴＦＲ１−ＲＳＰＯ２−ＷＴは、さらに約２０倍、ＥＣ５０をさらに向上させて、これはαＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＷＴと比較してほぼ４００倍改善された効力である。同様の結果がＨｕｈ−７  ＳＴＦ細胞でも得られたが、これは両細胞株における標的受容体の発現と一貫していた（図２Ａ）。ＲＳＰＯの機序と一貫して、抗ＴＦＲ１  ＲＳＰＯ模倣分子ではＷｎｔリガンドの不在下では、Ｗｎｔシグナル伝達は観察されなかった（図４Ｃ、右パネル）。より有力な活性が抗ＴＦＲ１  ＲＳＰＯ２融合タンパク質で観察されたことにより、受容体及びバインダーの特定の組み合わせが、組織特異性Ｗｎｔシグナル増強分子の活性において重要な役割を果たし得ることが示される。
【０２４５】
αＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＷＴ、αＴＦＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡで見られ、αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡでは見られなかったように、ＨＥＫ２９３  ＳＴＦ細胞においてＷｎｔ刺激の存在下でＬＲＰ６及びＤＶＬ２のリン酸化が刺激され、そして全ＬＲＰ６タンパク質レベルが増加した（図４Ｄ）。細胞表面上のＦＺＤ受容体レベルに対するＲＳＰＯ模倣分子の影響もまた、フローサイトメトリー解析で調べた。図４Ｅに示すように、ＨＥＫ２９３細胞のαＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＷＴ、αＴＦＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡでの処理が、ｐａｎ−ＦＺＤ抗体により測定されたこれら細胞のＦＺＤ受容体レベルを増加させたが、ＨＥＫ２９３細胞のαＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＲＡでの処理では増加しなかった。
【０２４６】
実施例２
原型的な肝臓特異性Ｗｎｔシグナル伝達増強分子を用いたインビボでの肝臓効果
αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡがインビボで組織特異的なＷｎｔシグナル伝達経路を活性化することが可能であることを示すために、マウスをαＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ及び対照タンパク質で処理した。ｓｃＦｖ−ＲＳＰＯ２融合タンパク質の分子量は約４０ｋＤａの範囲であるため、それらの血漿内半減期を伸ばすために、バインダーのｓｃＦｖを、ＲＳＰＯ２がＩｇＧ重鎖のＮ末端に融合しているＩｇＧ形態に切り替えた。αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ（配列番号２９〜３２）は、ＨＥＫ２９３細胞においてαＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ（配列番号２５〜２８）と同様の効力を有していたが、Ｈｕｈ−７細胞においては後者よりもはるかに有力で有効であった（図５Ａ）。実際、１００ｐＭでのαＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧの活性は、１０ｎＭでのαＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧのものに匹敵し（図５Ａの左下図）、これは強いターゲティング効果がＩｇＧ形態内に保存されていることを示唆する。
【０２４７】
マウス肝臓におけるヒトＡＳＧＲ１の発現は、１マウス当たり１×１０１１個のゲノム粒子を用いて、ｓｓＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｈＡＳＧＲ１の静脈内注射で誘発し、組換えタンパク質での処理の７日前に、内因性肝臓Ａｓｇｒ１  ｍＲＮＡと同等の導入遺伝子発現レベルを達成する投与量がわかった（データは図示せず）。
【０２４８】
第１の実験において（図５Ｂ）、マウスを、等モル用量のαＧＦＰ−ＩｇＧ（配列番号２５〜２６及び３３〜３４）（１ｍｇ／ｋｇ）、Ｆｃ−ＲＳＰＯ２−ＷＴ（配列番号２３〜２４）（０．４６ｍｇ／ｋｇ）、αＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ（配列番号２５〜２８）（１ｍｇ／ｋｇ）、又はαＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ（配列番号２９〜３２）（１ｍｇ／ｋｇ）の組換えタンパク質（概ね対応したモル濃度で。一群当たりｎ＝８マウス）で、腹腔内注射した。肝臓及び小腸の試料を、発現解析のために８時間後に採取した。Ｆｃ−ＲＳＰＯ２−ＷＴ及びαＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧでの処理により、αＧＦＰ又はαＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ陰性対照のいずれかで処理されたマウスにおける肝臓Ａｘｉｎ２発現と比較して、肝臓Ａｘｉｎ２発現が有意に誘発された（図５Ｃ）。対照的に、Ｆｃ−ＲＳＰＯ２−ＷＴでの処理により、小腸Ａｘｉｎ２発現が有意に増加したが、αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧでは有意に増加しなかった（図５Ｄ）。これら結果は、αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧがインビボで組織特異的にＷｎｔ経路を活性化することができることを示唆する。
【０２４９】
第２の実験において（図６Ａ）、マウスを、αＧＦＰ−ＩｇＧ（１ｍｇ／ｋｇ）、αＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ（１ｍｇ／ｋｇ）又はαＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ（１ｍｇ／ｋｇ）の組換えタンパク質（一群当たりｎ＝１０マウス）で、腹腔内注射した。肝臓及び小腸の試料を、発現解析及びヒストイムノケミストリー（ｈｉｓｔｏｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）のために４８時間後に採取した。αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧによる処理が、細胞増殖マーカー遺伝子Ｍｋｉ６７の発現を誘発し（図６Ｂ）、またαＧＦＰ−ＩｇＧ又はαＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧの陰性対照のいずれかにより処理したマウスと比較した場合に肝臓におけるＫｉ−６７陽性細胞数を有意に増加させた（図６Ｃ〜Ｄ）。対照的に、このαＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧによるＭｋｉ６７の発現の誘発は、小腸では観察されなかった（図５Ｅ）。これら結果は、αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧが、組織特異的に、肝実質細胞における増殖を刺激することができることを示唆する。
【０２５０】
実施例３
抗体の生成
ＡＳＧＲ、ＺＮＲＦ３及びＲＮＦ４３のポリペプチド配列に対する抗体を特定した。抗体のスクリーニング及び免疫化のための組換えタンパク質を産生するために、以下のタンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をＨｉｓ／Ａｖｉタグを伴うｐｃＤＮＡ真核生物発現ベクターにクローン化した：ヒトＡＳＧＲ１（ｈＡＳＧＲ１、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１６６２．１、残基６２〜２９１；配列番号３５〜３６（それぞれ、ポリヌクレオチド及びポリペプチド））、ヒトＡＳＧＲ２（ｈＡＳＧＲ２、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿５５０４３６．１、残基６６〜２９２；配列番号３７〜３８（それぞれ、ポリヌクレオチド及びポリペプチド））、カニクイザルＡＳＧＲ１（ｃｙｎｏＡＳＧＲ１、配列ＩＤ  ＸＰ＿００５５８２７５５．１、残基６２〜２９１；配列番号３９〜４０（それぞれ、ポリヌクレオチド及びポリペプチド））、カニクイザルＡＳＧＲ２（ｃｙｎｏＡＳＧＲ２、Ｆｉｓｈｅｒ／Ｚｙａｇｅｎ  Ｌａｂｓ社よりのカニクイザル肝臓ｃＤＮＡサンプルからクローン化された配列；配列番号４１〜４２（それぞれ、ポリヌクレオチド及びポリペプチド））、ヒトＲＮＦ４３（ｈＲＮＦ４３、ＮＣＢＩ参照配列ＸＰ＿０１１５２３２５７．１、残基４４〜１９８；配列番号４３〜４４（それぞれ、ポリヌクレオチド及びポリペプチド））、ＺＮＲＦ３（ｈＺＮＲＦ３；ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１９３９２７．１、残基５６〜２１９；配列番号４５〜４６（それぞれ、ポリヌクレオチド及びポリペプチド））。コンストラクトは、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で発現し、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂で精製し、その後にサイズ排除クロマトグラフィーを続けた。ファージディスプレイ法のために、タンパク質は、公開されている方法に従ってビオチン化した（Ｊａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ；５４５：２３４）。
【０２５１】
ビオチン化した抗原は、ファージディスプレイライブラリーに対してパニングするために固定化して、そして陽性クローンを配列決定した。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞における発現と抗原結合のための特性決定とを含めた、さらなる解析を行った。
【０２５２】
非ビオチン化抗原もまた、マウスを免疫するために用いて、ハイブリドーマを生成した。ハイブリドーマ系統を、対照として同一の精製タグを含有する対照タンパク質と共に免疫原に対してＥＬＩＳＡによってスクリーニングして、フローサイトメトリー解析した（試験系統としてのＡＳＧＲを発現するＨｕｈ−７と、対照としてのＡＳＧＲ非発現ＨＥＫ２９３）。選択されたハイブリドーマ系統を配列決定し、そしてその結果として組換えＦａｂ又はＩｇＧをさらなる結合特性決定のために生成した。
【０２５３】
組換えＦａｂ又はＩｇＧの結合特性決定は、ストレプトアビジン（ＳＡ）被覆バイオセンサー（ＰＡＬＬ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ社）を伴って、Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ  ９６プラットフォーム（ＰＡＬＬ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ社、カリフォルニア州フリーモント）を用いて、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）により実施した。ビオチン化抗原を、センサー上への固定化のために５０ｎＭに希釈した。固定化後、センサーを、７つの濃度で試験分子を含有するサンプル中に浸漬させた。ＫＤに関する値を、得られたデータを１：１結合モデルでフィッティングすることによって求めた。表２Ｃは、クローン選択のための結合データを提供する。
【０２５４】
図７は、ｈＡＳＧＲ１（図７Ａ及び７Ｃ）又はｈＡＳＧＲ２（図７Ｂ）に対して特定された説明的な抗体の結合を示すデータを提供する。
【０２５５】
実施例４
未感作健常マウスにおける、抗ＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡのインビボでの用量漸増（ｄｏｓｅ−ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）及び組織特異性
ＩｇＧ形態のＡＳＧＲ１標的分子及び対照分子の活性を、健常な未感作マウスにおいてさらに調べた。これら実験で用いたαＡＳＧＲ１抗体（例えば、ＲＯ−０１）は、ヒト及びマウスのＡＳＧＲ１受容体の両方に対して同様の親和性を有した（図９Ａ）。
【０２５６】
この実験において、６週齢のＣ５７Ｂｌ／６Ｊ雄マウスに、示した投与量で、α−β−Ｇａｌ−ＩｇＧ、Ｆｃ−ＲＳＰＯ２−ＷＴ、αＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＲＡ又はαＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡを腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した（一群当たりｎ＝８）。タンパク質投与の４８時間後、マウスをイソフルランで麻酔して、心穿刺により血液を取り出した。肝左葉及び十二指腸の一部を採取して、ｑＰＣＲ解析のために急速凍結するか又は２４時間ホルマリンで固定するかのいずれかとし、次いで免疫組織化学解析のために７０％エタノールに移した。
【０２５７】
用量反応は、αＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ（配列番号２５〜２８）とＷｎｔ標的遺伝子Ａｘｉｎ２誘発を調べるための他の対照と比較して、αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ（配列番号２９〜３２）に対して実施した。マウスは、試験タンパク質を０．１から３０ｍｇ／ｋｇの範囲で腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。肝臓及び小腸の試料を、遺伝子発現解析のために４８時間後に採取した。Ｆｃ−ＲＳＰＯ２−ＷＴ（配列番号２３〜２４）により、肝臓及び小腸の両方における１及び１０ｍｇ／ｋｇの処理で、Ａｘｉｎ２発現を増加させた（図９Ｂ）。対照的に、１０及び３０ｍｇ／ｋｇでのαＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧは、肝臓のみでＡｘｉｎ２発現を誘発させたが、小腸では見られなかった。重要なことには、この特異性は、αＡＳＧＲ１ターゲティングモジュールに依存するが、これは標的でない分子αＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧが、最大３０ｍｇ／ｋｇでの処理でいずれかの組織におけるＡｘｉｎ２発現にインビボで影響を何も示さなかったからである（図９Ｂ）。対照抗体の抗β−ガラクトシダーゼ（α−β−Ｇａｌ−ＩｇＧ、配列番号１５５〜１５８）による影響は、０．０１及び１０ｍｇ／ｋｇでは何も観察されなかった。
【０２５８】
αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧの類似の組織特異性及びターゲティングモジュールへの依存性もまた、増殖マーカーＫｉ６７遺伝子の発現において観察された（図９Ｃ）。肝細胞において増殖が発生するか否かを調べるために、Ｋｉ６７タンパク質に対して特異的な抗体と、成熟肝細胞標識ＨＮＦ４αのうちの１つとで肝臓試料を同時染色した。αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ及びＦｃ−ＲＳＰＯ２−ＷＴにより処理した肝臓は、ＨＮＦ４αと共局在化したＫｉ６７陽性核の数を増加させたようであったが、一方でαＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ又はα−β−Ｇａｌ−ＩｇＧで処理した肝臓は、Ｋｉ６７染色がずっと少ないようであった（図９Ｄ）。これら結果を合わせると、αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧは、インビボで、肝臓特異的にＷｎｔ経路を活性化することが可能であること、及び肝細胞がこの刺激に反応する初代細胞集団であることを示唆した。
【０２５９】
実施例５
肝線維症の慢性のチオアセタミド誘発性マウスモデルにおける組織標的ＲＳＰＯ模倣体の肝機能への影響
６週齢のＣ５７Ｂｌ／６Ｊ雄マウスを、チオアセタミド（ＴＡＡ）で処理した。実験＃１（Ｗｎｔ及びＲｓｐｏの遺伝子発現プロファイリング）において、ＴＡＡを、２７週間、２００ｍｇ／Ｌの濃度で飲料水に加えて、肝線維症を誘発した。さらに、ＴＡＡ馴化の最後の４週間、マウスにＴＡＡを週に３回腹腔内投与した。実験＃２（３日目及び７日目における肝臓及び小腸のＡｘｉｎ２及びＫｉ６７の発現（ｅｐｒｅｓｓｉｏｎ））において、ＴＡＡを、２０週間、２００ｍｇ／Ｌの濃度で飲料水に加えて、肝線維症を誘発した。さらに、ＴＡＡ馴化の最後の６週間、マウスにＴＡＡを週に３回腹腔内投与した。実験＃３（３日目、７日目及び１４日目におけるＩＮＲ解析）において、ＴＡＡを１８週間飲料水に加えた。マウスはまた、ＴＡＡ曝露の最後の９週間、２００ｍｇ／ｋｇのＴＡＡを週に３回腹腔内投与した。ＴＡＡ処理は、組換えタンパク質の投与２日前に中断して、マウスは、精製された、実験室グレードの酸性化飲料水に戻した。マウスは、組換えα−β−ｇａｌ−ＩｇＧ（１０ｍｐｋ）又はＦｃ−ＲＳＰＯ２−ＷＴ（１０ｍｐｋ）を週に２回、又はαＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ（１０ｍｐｋ）を毎日、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。示した時点において、Ｒｏｃｈｅ社のＣｏａｇｕＣｈｅｋ−ＸＳ  Ｐｌｕｓを用いてＩＮＲを測定した。投与開始の３日後、７日後又は１４日後に、マウスをイソフルランで麻酔して、心穿刺により血液を取り出した。肝左葉及び十二指腸の一部を、解析のために採取した。ホルマリン固定し、パラフィン包埋した肝臓サンプルを切片にして、抗Ｋｉ−６７ウサギ抗体（Ａｂｃａｍ社、ａｂ１５５８０）により染色した。無作為に選択した視野（１０倍（１０×）対物レンズを用いた１００倍（１００×）の倍率で）当たりのＫｉ−６７−陽性核数を、Ｉｍａｇｅ  Ｊを用いて計数した。
【０２６０】
αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧの活性及び有効性を、慢性チオアセタミド（ＴＡＡ）モデルで調べたが、当該モデルにおいては、大規模な肝線維症が観察され、肝機能が損なわれていた。このモデルにおいて、多数のＷｎｔリガンドをコードする遺伝子を含むＷｎｔシグナル伝達経路の成分が、発現上昇した（図１０Ａ）。対照的に、４つのＲ−ｓｐｏｎｄｉｎの発現は変化しないままであるか、又はＲｓｐｏ２の場合においては減少すらしていた。Ｒｓｐｏ４は、マウス肝臓においてほとんど検出可能でなかった（図１０Ａ）。したがって、肝臓特異性ＲＳＰＯ模倣体の投与は有益であり得る（図１０Ａ）。
【０２６１】
ＴＡＡ前処理及びその後のタンパク質処理（αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ及び対照タンパク質、配列番号２３〜２４、２９〜３２、１５５〜１５６及び１５９〜１６０）の期間を概略する実験計画を、図１０Ｂに概説している。類似の設計の２つの実験を行った。１つ目の実験においては、マウスは、タンパク質処理開始の０日後、３日後及び７日後に終了処置した。２つ目の実験においては、マウスは、タンパク質処理開始の０日後及び１４日後に終了処置した（図１０Ｂ）。肝臓及び小腸のサンプルを採取して、遺伝子発現の変化を評価した。予想されたとおり、αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧは３日目及び７日目にＡｘｉｎ２発現の肝臓特異的な増加を招き、一方でＦｃ−ＲＳＰＯ−ＷＴは肝臓及び小腸の両方でＡｘｉｎ２を誘発した（図１０Ｃ）。α−β−Ｇａｌ−ＩｇＧ対照での処理により観察された変化はなかった。αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧはまた、肝臓特異的にＫｉ６７発現を増加させた（図１０Ｃ）。
【０２６２】
肝機能を観察するために、処理中の示した時点において、血液サンプルを取り出して、プロトロンビン時間の国際標準比（ＩＮＲ）を測定するために用いた。正常マウスは、ＩＮＲがおよそ０．９であった。ＴＡＡ処理により、重篤な肝障害に起因してＩＮＲが１．１に増加した（図１０Ｄ）。ＴＡＡが除かれると、マウスは肝障害の一部の自然な回復を見せることがわかり、これは未処理動物で０日目の１．１から１４日目の＜１．０へとＩＮＲの低下が観察されたことと一貫する。しかしながら、αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧで処理したマウスの１００％が、３日目までにＩＮＲが０．９であったように、αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧはＩＮＲの回復を加速させた。Ｆｃ−ＲＳＰＯ２−ＷＴで処理したマウスは、７日目に、α−β−Ｇａｌで処理したマウスと比較してＩＮＲが低く、また１４日目にαＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧと同様の効果に達した。したがって、肝臓特異性αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ分子は、慢性肝臓疾患モデルにおいて肝臓の合成機能を向上させることが可能である。
【０２６３】
実施例６
肝線維症の慢性のＣＣｌ４誘発性マウスモデルにおける組織標的ＲＳＰＯ模倣体の肝機能への影響
αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧの活性及び有効性を、ＣＣｌ４とアリルアルコールとで発生させた肝線維症の第２のマウスモデルで調べた。５４匹の８〜９週齢のＣ５７ＢＬ／６の雄（ジャクソン研究所（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を、断続的に、ＣＣｌ４（１、４、７、１０日目に０．５ｍＬ／ｋｇ）とアリルアルコール（２、５、８日目に０．０１２５ｍＬ／ｋｇ）とで１０日間処理し、次いで８週間のＣＣｌ４処理（０．５ｍＬ／ｋｇ、２回／週）を続けた。処理プロトコールを図１２に示している。ＣＣｌ４処理後、マウスに、断続的なＣＣｌ４処理と共に２週間タンパク質を投与した。処理群は以下のとおりである：１０ｍｇ／ｋｇのαＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ２、ｎ＝８（毎日投与）；１０ｍｇ／ｋｇのαＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ、ｎ＝８（毎日投与）；４．６ｍｇ／ｋｇのＦｃ−ＲＳＰＯ２−ＷＴ、ｎ＝７（２回／週の投与）；１０ｍｇ／ｋｇのα−β−Ｇａｌ−ＩｇＧ、ｎ＝８（２回／週の投与）；タンパク質なし対照、ｎ＝８。ＣＣｌ４処理なし（オリーブ油担体（０．５ｍＬ／ｋｇ）、ｎ＝８；未感作対照、ｎ＝７を、さらなる対照群に含めた。ＩＮＲ（国際標準比）試験のために、０、３、７日目（タンパク質投与のはじめの日を０日目と表す）にマウスを採血した。全てのマウスを、１４日目に終了処置した。
【０２６４】
屠殺したら、全体重と肝臓の重量を測定し、血液、肝臓及び小腸の組織を回収して試験のために保存した。肝臓の重量は、ＲＳＰＯ２陽性対照で処理した群においてのみならずＲＳＰＯ模倣体αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ２で処理した群において、上昇傾向を示した。肝臓の重量／体重の比を測定した場合、ＲＳＰＯ２のみで処理したマウスは、統計学的に有意に増加していた。
【０２６５】
組織の修復及び線維形成の測定として、マウス血液中のプロコラーゲンＩＩＩ型のＮ末端ペプチド（Ｐ３ＮＰ）を、タンパク質処理の０日目、７日目及び１４日目に測定した。オリーブ油処理及び未感作対照と比較して、ＣＣｌ４で処理した全ての群で、有意な増加が観察されて、標識された肝線維症と一貫した。Ｐ３ＮＰが低下して未感作マウスでのレベルに戻った（データは図示せず）αＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧで処理した動物（肝臓を標的とする組織を欠いている）と比較して、ＲＳＰＯ模倣体αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ２で処理した動物におけるＰ３ＮＰレベルは高いままであり、これは組織修復と、細胞外基質の代謝回転が進行中であることを示していた。
【０２６６】
タンパク質処理の２週間後、血液凝固時間の測定としてのプロトロンビン時間（ＰＴ）は、確認された時間において増加がないこと、及びＲＳＰＯ２タンパク質で処理した動物においてその時間が実際に有意に減少したこと（データは図示せず）を示した。
【０２６７】
タンパク質処理の１週後及び２週後の時点において、標準の肝臓パネル測定を血清中で行った。マウス血清を、７日目の尾部出血と、１４日目の最終放血とより採取した。肝臓パネル血清化学測定のために、血清をＩＤＥＸＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（カリフォルニア州フリーモント）に送った。各群は６〜８匹のマウスを含有し、そのデータは平均±ＳＥＭとして表４及び５に表す。
【表４】
2021530223.tif 000026
＊α−β−Ｇａｌ−ＩｇＧ及びαＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧで処理した群とは統計学的に異なる、ｐ＜０．０００１；＊＊α−β−Ｇａｌ−ＩｇＧ（ｐ＝０．００１２）及びαＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ（ｐ＜０．０００１）で処理した群とは統計学的に異なる；Ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ（一元配置分散分析）。
表４に示すように、ＡＬＴ及びＡＳＴの値は、タンパク質処理したもの及び対照のいずれかと統計学的に相違しない。しかしながら、ＡＬＰは、１週目及び２週目の両方の時点で統計学的により高く、これはＡＳＧＲ１  ＫＯマウスモデルで記載されたとおり、ＡＳＧＲ受容体の除去に起因する、アルカリホスファターゼタンパク質レベルの発現上昇と一貫している（例えば、Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ．２０１８  Ｏｃｔ  １０；２４（４）：５００−５１３を参照）。
【表５】
2021530223.tif 000027
＊α−β−Ｇａｌ−ＩｇＧで処理した群とは統計的に異なる、Ｆｃ−ＲＳＰＯ２−ＷＴに関してはｐ＜０．０００１及びαＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ２に関してはｐ＝０．０００９；＊＊  α−β−Ｇａｌ−ＩｇＧ（ｐ＜０．０００１）及びαＧＦＰ−ＲＳＰＯ２＿ＲＡ−ＩｇＧ（ｐ＜０．０００９）で処理した群とは統計学的に異なる；Ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ（一元配置分散分析）。
【０２６８】
処理１週後のアルブミン、ビリルビンのレベルに対して有意な影響はなかったが、ＲＳＰＯ２陽性対照及びＲＳＰＯ模倣体（αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ２）処理群の両方におけるタンパク質処理の２週後で、α−β−Ｇａｌ−ＩｇＧ及びα−ＧＦＰ−ＲＳＰＯ２＿ＲＡ−ＩｇＧタンパク質対照と比較して、血液中のアルブミンが有意に少ないことが観察された。この結果は、Ｗｎｔシグナル伝達の増加によって誘発される、中心静脈周囲（ｐｅｒｉｃｅｎｔｒａｌ）肝細胞の拡大の増加に起因した、門脈周囲肝細胞の機能の予想される一時的な停止を示唆する。
【０２６９】
半定量ＰＣＲを用いて、タンパク質処理した肝臓及び小腸の遺伝子発現の変化を測定した（表６）。
【表６】
2021530223.tif 000028
＊統計学的に異なる変化を太字で示す。Ａｘｉｎ２：αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ２対α−ＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ、ｐ＝０．００９２。Ｈａｌ：Ｆｃ−ＲＳＰＯ２−ＷＴ対α−βＧａｌ−ＩｇＧ、ｐ＝０．０２５９；αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ２対α−−Ｇａｌ−ＩｇＧ、ｐ＝０．００４２；αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ２対α−ＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ、ｐ＝０．００１８。Ｋｉ６７：Ｆｃ−ＲＳＰＯ２−ＷＴ対α−βＧａｌ−ＩｇＧ、ｐ＝０．００１０；αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ２対α−βＧａｌ−ＩｇＧ、ｐ＝０．０１３５。Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１：ＦｃＲＳＰＯ２−ＷＴ対α−βＧａｌ−ＩｇＧ、ｐ＝０．０００４。Ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡで計算した。
【０２７０】
Ｆｃ−ＲＳＰＯ２−ＷＴ陽性対照タンパク質又はＲＰＳＯ模倣タンパク質、αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ２によるマウスの処理により、いずれも、肝臓において、Ｗｎｔ誘発性Ａｘｉｎ２遺伝子の発現の増加と、Ｗｎｔ抑制可能（ｒｅｐｒｅｓｓａｂｌｅ）なＨａｌ遺伝子の発現の低下を招く。統計学的に有意であった測定された変化を、表６に太字で示している。小腸におけるＡｘｉｎ２発現には、有意な変化はなかった。これらデータは、組織特異的にＷｎｔシグナル伝達が誘発されたことを示す。
【０２７１】
またＦｃ−ＲＰＳＯ２−ＷＴ及びαＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ２による処理により、Ｋｉ６７及びＣｙｃｌｉｎ  Ｄ１増殖マーカーの増加が、肝臓では見られたが、小腸では見られなかった。統計学的有意性に達した変化を太字で示している。いずれの処理においても小腸では有意な変化は見られなかった（表６）。これらデータは、組織特異性的に増殖が誘発されたことを示す。
【０２７２】
肝細胞、胆管細胞（ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃｙｔｅ）、未熟肝細胞及び卵形細胞を含めた、特定の肝臓細胞型における変化を測定するために、さらなるｑＰＣＲ解析がなされた（表７）。
【表７】
2021530223.tif 000029
＊統計学的に異なる変化を太字で示す。ＣＫ８：αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ２対α−βＧａｌ−ＩｇＧ、ｐ＝０．０００１；αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ２対α−ＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ、ｐ＜０．０００１。Ａｆｐ：Ｆｃ−ＲＳＰＯ２−ＷＴ対α−βＧａｌ−ＩｇＧ、ｐ＝０．０００２；αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ２対α−βＧａｌ−ＩｇＧ、ｐ＜０．０００１；αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ２対α−ＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ、ｐ＝０．０００１。Ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡで計算した。
【０２７３】
胆管細胞マーカーＣＫ１９では見られなかったが肝細胞マーカーＣＫ８での統計学的に有意な変化を評価すると、肝臓における増殖性の反応は肝細胞に限られるということが示される。さらに、Ａｆｐの統計学的有意な増加は、未熟肝細胞の変動（ｓｕｒｇｅ）を示している（表７）。卵形細胞においては有意な変化はなかった。
【表８】
2021530223.tif 000030
＊統計学的に異なる変化を太字で示す。Ｆａｃｔｏｒ  Ｘ：Ｆｃ−ＲＳＰＯ２−ＷＴ対α−β−Ｇａｌ−ＩｇＧ、ｐ＝０．０４６３。Ｃｙｐ１ａ２：αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ２対α−βＧａｌ−ＩｇＧ、ｐ＝０．００４４；αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ２対αＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ、ｐ＝０．０００１。Ｃｙｐ２ｅ１：αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ２対α−β−Ｇａｌ−ＩｇＧ、ｐ＜０．０００１；αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ２対αＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ、ｐ＜０．０００１。Ｃｙｐ２ｆ２：Ｆｃ  ＲＳＰＯ２−ＷＴ対α−βＧａｌ−ＩｇＧ、ｐ＜０．０００１；αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ２対α−βＧａｌ−ＩｇＧ、ｐ＜０．０００１；αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ２対αＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ、ｐ＜０．０００１。Ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡで計算した。
【０２７４】
Ｗｎｔシグナル伝達は、主として中心静脈周囲肝細胞において２つのＣｙｐＰ４５０酵素、Ｃｙｐ２ｅ１及びＣｙｐ１ａ２の発現を制御する（ｒｅｆ）。ＲＳＰＯ模倣体でのマウスの処理が、これら２つの酵素に関して遺伝子の発現を有意に増加させた（表ｘｘ）。さらに、有意により低いＣｙｐ２ｆ２が、中心静脈周囲領域の一次的な拡大に起因して、中心静脈周囲肝細胞機能の一次的な低下を示している。
【０２７５】
タンパク質処理の２週後、マウス肝臓をシリウスレッド（Ｓｉｒｉｕｓ  ｒｅｄ）で染色して、全てのマウスにおいてシリウスレッド染色コラーゲン含量のレベルを測定した（図１３及び表９）。マウスをイソフルラン吸入により麻酔し、心臓放血、及びその後に頚椎脱臼した。肝臓は、新鮮に採取して、一晩のインキュベーションのために、即座に１０％中性緩衝ホルマリンに浸漬した。翌日、肝臓を７０％エタノールに移して、パラフィン包埋のために調製した。肝臓組織は、５μｍの厚さに切り出し、脱蝋して、アルコール勾配により水和した。このスライドを、ピクロシリウスレッド溶液（シグマアルドリッチ社）で染色して、酸性化水で洗浄した。１００％エタノールを３回変えて脱水し、キシレン中で洗浄し、風乾して、カバーガラスを載せた。シリウスレッドで染色した範囲は、Ｉｍａｇｅ  Ｊ（ＮＩＨ）で定量化され、抗βｇａｌ対照で処理したＣＣｌ４マウスよりの肝臓で正規化した（１００％として設定）。各群は７〜８匹のマウスを含有し、そのデータは平均±ＳＤとして表す。
【表９】
2021530223.tif 000031
＊統計学的に異なる変化を太字で示す。Ｆｃ−ＲＳＰＯ２−ＷＴ対α−β−Ｇａｌ−ＩｇＧ、ｐ＜０．０００１；Ｆｃ−ＲＳＰＯ２−ＷＴ対αＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ、ｐ＝０．００５９；α−ＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ２対α−β−Ｇａｌ−ＩｇＧ、ｐ＝０．０００３；α−ＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ２対αＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ、ｐ＝０．０４１０；Ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡで計算した。
【０２７６】
処理後、シリウスレッド染色を用いて、この実験における全てのマウスの肝線維症の量を定量化した。この方法のために、マウスをイソフルラン吸入により麻酔し、心臓放血、及びその後に頚椎脱臼した。肝臓は、新鮮に採取して、一晩のインキュベーションのために、即座に１０％中性緩衝ホルマリンに浸漬した。翌日、肝臓を７０％エタノールに移して、パラフィン包埋のために調製した。肝臓組織は、５μｍの厚さに切り出し、脱蝋して、アルコール勾配により水和した。このスライドを、ピクロシリウスレッド溶液（シグマアルドリッチ社）で染色して、酸性化水で洗浄した。１００％エタノールを３回変えて脱水し、キシレン中で洗浄し、風乾して、カバーガラスを載せた。シリウスレッドで染色した範囲は、Ｉｍａｇｅ  Ｊ（ＮＩＨ）で定量化され、α−β−Ｇａｌ−ＩｇＧ対照で処理したＣＣｌ４マウスよりの肝臓で正規化した（１００％として設定）。各群は７〜８匹のマウスを含有し、そのデータは平均±ＳＤとして表す。
【０２７７】
Ｆｃ−ＲＳＰＯ２−ＷＴ又はＲＰＳＯ模倣体、αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ２での処理の２週後、ＣＣｌ４処理マウスは、対照タンパク質で処理したマウスで見られたよりもシリウスレッド染色が約４０％減少していたが、これは、これらマウスにおいては、対照タンパク質で処理したマウスにおけるよりもより速く肝線維症が回復していたことを示す（図１３及び表９）。
【０２７８】
この実験の全ての動物よりのパラフィン固定肝臓組織における、ＨＮＦ４α及びＫｉ６７に対する免疫組織化学染色により、さらなる実験を行った。Ｆｃ−ＲＳＰＯ２−ＷＴ及びαＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ２の両方で処理したマウスにおいて、ＨＮＦ４α肝細胞マーカー及びＫｉ６７増殖マーカーの有意な共局在が、肝臓全体にわたって見られた（データは図示せず）。対照的に、α−β−Ｇａｌ−ＩｇＧ処理した対照マウスにおいては、二重に染色された細胞はかなり少なかった。これらの結果により、Ｆｃ−ＲＳＰＯ２−ＷＴ及びαＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ２が、これらマウスにおいて肝細胞増殖を誘発することが可能であることが確認された。
【０２７９】
合わせて、これらデータは、ＲＳＰＯ模倣体、αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ２が、線維性肝疾患のこのモデルのマウスが線維症を回復して機能的な肝細胞を再生することが可能である速度に有意な影響を有することを示唆する。
【０２８０】
実施例７
新規ＡＳＧＲ１バインダーを用いた肝臓標的ＲＳＰＯ模倣分子の構築
ヒトＡＳＧＲ１に対する新規バインダーを、ヒトＡＳＧＲ１に対して生じさせて、またヒト及びカニクイザルの組換えＡＳＧＲ１  ＥＣＤドメインに対する交差反応性に基づいて選択されたハイブリドーマとして開発した。当該ハイブリドーマは、フローサイトメトリーによりＨｕｈ−７細胞の特異的染色でさらにランク付けされた（対照としてＨＥＫ２９３を用いて）。選択されたヒットがサブクローニングされて、それらのＶＨ及びＶＬ配列を推定するためにランク付けされた（配列番号２７４〜３０５）。肝臓特異性ＲＳＰＯ模倣体を生成するために、エフェクタなし変異Ｎ２９７Ｇを含有するヒトＩｇＧ２又はヒトＩｇＧ１として発現した、ＡＳＧＲ１バインダーを伴う融合タンパク質を生成し、一方で、変異体ＲＳＰＯモジュールを、リンカーを介して重鎖のＮ末端又はＣ末端に融合した（配列番号１９０〜２７１）。組換えタンパク質を、一過性導入によりＥｘｐｉ２９３細胞中で発現して、プロテインＡ樹脂と、その後に続くサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。肝細胞特異性Ｗｎｔシグナル増強は、ルシフェラーゼアッセイにおいて解析され、組換えＷＮＴ代替物Ｒ２Ｍ３−２６（例えば、国際公開第２０１９／１２６３９８号を参照）の存在下でのＨｕｈ−７及びＨＥＫ２９３  ＳＴＦレポーター細胞株における活性を比較した。図１２は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ２での融合として、Ｈｕｈ−７細胞における１６個の新規ＡＳＧＲ１標的ＲＳＰＯ模倣分子の特異的な活性を示している。
【０２８１】
実施例８
マウス肝臓における組織標的ＲＳＰＯ模倣体の薬力学（ＰＤ）解析
肝臓標的ＲＳＰＯ模倣体のインビボでの活性を測定するために、５〜６週齢のＣ５７ＢＬ／６雄ＪＡＸ（合計５６匹のマウス）を、ヒトＡＳＧＲ遺伝子発現のためにヒト化した。マウスは、ｈＡＳＧＲ１及びｈＡＳＧＲ２遺伝子を発現するＡＡＶ８ベクター（１×１０１１ゲノムコピー／マウス）で注射（ＩＶ）したマウスであった。
【０２８２】
６日後、複数のＡＳＧＲ１標的ＲＳＰＯ模倣体を、５ｍｇ／ｋｇ投与量の腹腔内注射により、対照と共にマウスに投与した（図１５Ａ）。
【０２８３】
２４時間後、マウスを安楽死させ、肝臓をばらばらにして、ＲＮＡ単離のために急速凍結した。Ａｘｉｎ２の相対的発現を求めるために、ｍＲＮＡ解析を行った。半定量ＰＣＲを用いて、処理したマウスよりの肝臓組織において相対的な遺伝子発現を測定した。値は、恒常的なＡｃｔｉｎ  Ｂ遺伝子発現の発現に対して正規化した（図１５Ｂ）。
【０２８４】
α−β−Ｇａｌ−ＩｇＧと比較して、αＡＳＧＲ１−ＩｇＧ（ＲＯ−０１）は、Ａｘｉｎ２発現を誘発しなかったが、これはこのバインダーがＷｎｔシグナル伝達に対してそれ単独では影響しないことを示唆する。同様に、αＧＦＰ−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧは、Ａｘｉｎ２を誘発せず、変異体ＲＳＰＯ２モジュールが単独でいずれの活性も有していないことが確認された。対照的に、αＡＳＧＲ１−ＲＳＰＯ２−ＲＡ−ＩｇＧ（バインダーＲＯ−０１を伴って構築した原型的な肝臓標的ＲＳＰＯ模倣体）が、肝臓において有力なＡｘｉｎ２誘発を示したが、これはターゲティングモジュールの要件と一貫した。
【０２８５】
さらなるＡＳＧＲ１標的ＲＳＰＯ模倣分子（インハウスでレイズしたバインダーを伴って構築した）の全てが、Ａｘｉｎ２発現の誘発の傾向又は有意な誘発のいずれかを見せた。７Ｂ１３、８Ｍ２４、２Ｉ１３及び９Ｍ１６系のＲＳＰＯ模倣分子が、Ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡにより、α−β−Ｇａｌ−ＩｇＧ対照と比較してＡｘｉｎ２発現の刺激を統計学的に有意に増加させたが、一方で３Ａ２４、２Ｉ２２、１Ｐ１３、１Ｎ１５、３Ｅ２０は、Ａｘｉｎ２発現を刺激する傾向を見せた（図１５Ｂ）。
【０２８６】
上記に記載した様々な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することが可能である。本明細書で言及した、ならびに／又は出願データシートに列記した、米国特許、米国特許出願公開公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願及び非特許出版物の全ては、それらの全体として、参照により本明細書で援用する。実施形態の態様は、様々な特許、出願及び公開公報の概念を採用するために必要であれば、変形して、さらなる実施形態を提供することが可能である。
【０２８７】
上記の詳細な説明を踏まえて、実施形態に対してこれら変更及び他の変更をなすことが可能である。概して、以下の特許請求の範囲において用いた語は、明細書及び特許請求の範囲に開示する特定の実施形態に請求項を限定するように解釈されるべきではないが、当該請求項に与えられるものと均等の全範囲に加えて、全てのあり得る実施形態を含めるように解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。
参考文献
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【図１Ａ】
2021530223.tif 000032
【図１Ｂ】
2021530223.tif 000033
【図１Ｃ−１】
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【図１Ｃ−２】
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【図１Ｄ−１】
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【図１Ｄ−２】
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【図１Ｄ−３】
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【図１Ｄ−４】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
2021530223.tif 000049
【図４Ｅ】
2021530223.tif 000050
【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2021530223.tif 000052
【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
2021530223.tif 000054
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2021530223.tif 000056
【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
2021530223.tif 000060
【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９Ａ】
2021530223.tif 000064
【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
2021530223.tif 000067
【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
2021530223.tif 000071
【図１１Ａ】
2021530223.tif 000072
【図１１Ｂ】
2021530223.tif 000073
【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
2021530223.tif 000077
【図１１Ｇ】
2021530223.tif 000078
【図１１Ｈ】
2021530223.tif 000079
【図１１Ｉ】
2021530223.tif 000080
【図１１Ｊ】
2021530223.tif 000081
【図１１Ｋ】
2021530223.tif 000082
【図１１Ｌ】
2021530223.tif 000083
【図１１Ｍ】
2021530223.tif 000084
【図１１Ｎ】
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【図１１Ｏ】
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【図１１Ｐ】
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【図１１Ｑ】
2021530223.tif 000088
【図１１Ｒ】
2021530223.tif 000089
【図１１Ｓ】
2021530223.tif 000090
【図１１Ｔ】
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【図１１Ｕ】
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【図１１Ｖ】
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【図１１Ｗ】
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【図１１Ｘ】
2021530223.tif 000095
【図１１Ｙ】
2021530223.tif 000096
【図１１Ｚ】
2021530223.tif 000097
【図１１ＡＡ】
2021530223.tif 000098
【図１１ＡＢ】
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【図１１ＡＣ】
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【図１１ＡＤ】
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【図１１ＡＥ】
2021530223.tif 000102
【図１１ＡＦ】
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【図１１ＡＧ】
2021530223.tif 000104
【図１１ＡＨ】
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【図１１ＡＩ】
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【図１１ＡＪ】
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【図１１ＡＫ】
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【図１１ＡＬ】
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【図１１ＡＭ】
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【図１１ＡＮ】
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【図１１ＡＯ】
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【図１１ＡＰ】
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【図１１ＡＱ】
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【図１１ＡＲ】
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【図１１ＡＳ】
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【図１１ＡＴ】
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【図１１ＡＵ】
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【図１１ＡＶ】
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【図１１ＡＷ】
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【図１１ＡＸ】
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【図１１ＡＹ】
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【図１１ＡＺ】
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【図１１ＢＡ】
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【図１１ＢＢ】
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【図１１ＢＣ】
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【図１１ＢＤ】
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【図１１ＢＥ】
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【図１１ＢＦ】
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【図１１ＢＧ】
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【図１１ＢＨ】
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【図１１ＢＩ】
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【図１１ＢＪ】
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【図１１ＢＫ】
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【図１１ＢＬ】
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【図１１ＢＭ】
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【図１１ＢＮ】
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【図１１ＢＯ】
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【図１１ＢＰ】
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【図１１ＢＱ】
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【図１１ＢＲ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
2021530223.tif 000147
【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
2021530223.tif 000149
【配列表】
2021530223000001.app
【国際調査報告】
2021530223.tif 000150
2021530223.tif 000151
2021530223.tif 000152
2021530223.tif 000153
2021530223.tif 000154