(57)【要約】化合物の官能基に依存せずに有機化合物を標識する方法を開示する。いくつかの実施形態において、該方法において有用な二官能性リンカーを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第1の官能基および第2の官能基を含むリンカー前駆体分子Cであって、 前記第1の官能基は有機化合物Aと反応可能なカルベンまたはニトレンまたはフリーラジカルを生成可能であり、前記第2の官能基は前記第1の官能基が前記有機化合物Aと反応する場合の条件下では反応しないが、第2の有機化合物Bと反応可能でリンカー前駆体分子C。
【請求項２】
Rが第1の官能基であり、Mが第2の官能基であり、Lが任意選択で置換されたアルキレン、任意選択で置換されたアルケニレン、任意選択で置換されたアルキニレン、任意選択で置換されたヘテロアルキレン、任意選択で置換されたシクロアルキレン、任意選択で置換されたヘテロシクロアルキレン、任意選択で置換されたアリーレン、および任意選択で置換されたヘテロアリーレンから独立して選択される部分の1つまたは複数を含むリンカー部分で式R?L?Mのリンカー前駆体分子C。
【請求項３】
前記第1の官能基が、ジアジリン、アジ化アリール、ベンゾフェノン、またはジアゾを含む、請求項1または2に記載のリンカー前駆物質C。
【請求項４】
第1の官能基がからなる群から選択される、請求項1または2に記載のリンカー前駆体分子C
【化１】
2021530235.tif 000041
は、リンカー前駆体分子Cの残りの部分への結合点を表す。
【請求項５】
第2の官能基が、アジド、アルキン、エン、または?C(O)?O?を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載のリンカー前駆体分子C。
【請求項６】
前記第2の官能基が、前記リンカー前駆体分子の残りの部分への結合点を表す
2021530235.tif 000042
からなる群から選択される、請求項1〜4のいずれか一項に記載のリンカー前駆体分子C。
【化２】
2021530235.tif 000043
【請求項７】
Lがアルキレンであり、アルキレンのメチレン単位の1つ以上が、NR1, O, S, CO, SO, SO2, NR1 C(O), C(O)NR1, シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、およびヘテロアリーレンからなる群から独立して選択される部分で任意に置換され、R1がHまたはアルキルで請求項2〜6のいずれか1項に記載のリンカー前駆物質分子C。
【請求項８】
Lがアルキレンであり、アルキレンのメチレン単位の1つ以上が、O、NHC(O)およびC(O)NHから独立して選択される部分で置換されている、請求項2〜6のいずれか1項に記載のリンカー前駆体分子C。
【請求項９】
リンカー前駆体分子Cはからなる群から選択される
【化３】
2021530235.tif 000044
【請求項１０】
リンカー前駆体分子Cはからなる群から選択される
【化４】
2021530235.tif 000045
【請求項１１】
表3から選択される化合物、またはその立体異性体もしくは立体異性体の混合物。
【請求項１２】
以下を含む方法によって製造される標識有機化合物E:
(1)      
(2)    請求項1〜10のいずれか1項に記載のリンカー前駆体分子Cの第1の官能基を有機化合物Aとカルベンまたはニトロンまたはフリーラジカル反応条件下で反応させて、請求項1〜10のいずれか1項に記載のリンカー前駆体分子Cの第2の官能基を有する中間体Dを形成し、第2の官能基を標識を含む標識分子Bと反応させる。
【請求項１３】
有機化合物Aが反応性官能基を含まない、請求項12に記載の標識有機化合物E。
【請求項１４】
標識がユニーク配列、または蛍光タグ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項12または13に記載の標識有機化合物E。
【請求項１５】
固有の配列が、一本鎖DNAまたはRNA、二本鎖DNAまたはRNA、三重鎖DNAまたはRNA、多本鎖天然または人工オリゴヌクレオチド、または化学修飾オリゴヌクレオチドを含む、請求項14に記載の標識有機化合物E。
【請求項１６】
ユニーク配列がオリゴヌクレオチドを含む、請求項13に記載の標識有機化合物E。
【請求項１７】
表4から選択される化合物、またはその立体異性体もしくは立体異性体の混合物。
【請求項１８】
標識部分、リンカー、および有機化合物部分を含む異性体である標識有機化合物のセットであって、各異性体は同一の標識部分、同一のリンカーおよび同一の有機化合物部分を有し、標識部分は、各異なる異性体中のリンカーを介して有機化合物部分の異なる部位に結合される、標識有機化合物のセット。
【請求項１９】
(1)有機化合物Aと請求項1〜10のいずれか1項に記載のリンカー前駆体分子Cとのカルベンまたはニトレンまたはフリーラジカル反応によって異性体化合物が生成される複数の異性体化合物、および/または(2)有機化合物Aとリンカー前駆体分子Cとのカルベンまたはニトレンまたはフリーラジカル反応によって生成される化合物Dの不均化反応の生成物である化合物の1つ以上の一対を含む混合物。
【請求項２０】
有機化合物Aが反応性官能基を含まない、請求項19に記載の混合物。
【請求項２１】
不均化反応生成物の一対が、カルベンまたはニトレンまたはフリーラジカル反応によって生成される化合物Dの分子量プラス2である分子量を有する化合物Fと、カルベンまたはニトレンまたはフリーラジカル反応によって生成される化合物Dの分子量マイナス2である分子量を有する化合物F'とを含む、請求項19または20に記載の混合物。
【請求項２２】
以下を含む方法によって製造される、複数の異性体標識化合物の混合物:
(1) 請求項1〜10のいずれか1項に記載のリンカー前駆体分子の第1の官能基を有機化合物Aとカルベンまたはニトロンまたはフリーラジカル反応条件下で反応させて、請求項1〜10のいずれか1項に記載のリンカー前駆体分子の第2の官能基を有する中間体Dを形成し、
(2)第2の官能基を標識を含む標識分子Bと反応させる。
【請求項２３】
標識が、ユニーク配列、または蛍光タグ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項22に記載の混合物。
【請求項２４】
固有の配列が、一本鎖DNAもしくはRNA、二本鎖DNAもしくはRNA、三重鎖DNAもしくはRNA、または多本鎖天然もしくは人工オリゴヌクレオチドもしくは化学修飾オリゴヌクレオチドを含む、請求項23に記載の混合物。
【請求項２５】
ユニーク配列がオリゴヌクレオチドを含む、請求項23に記載の混合物。
【請求項２６】
(1)    
(2)  有機化合物Aを標識する方法であって、請求項1〜10のいずれか1項に記載のリンカー前駆体分子Cの第1の官能基を有機化合物Aとカルベンまたはニトロンまたはフリーラジカル反応条件下で反応させて、請求項1〜10のいずれか1項に記載のリンカー前駆体分子の第2の官能基を有する中間体Dを形成することと、第2の官能基を標識を含む標識分子Bと反応させることとを含む方法。
【請求項２７】
有機化合物Aが反応性官能基を含まない、請求項24に記載の方法。
【請求項２８】
リンカー前駆体分子Cの第1の官能基が、有機化合物Aの複数の部位と反応して、複数の異性体生成物の混合物を形成する、請求項26または27に記載の方法。
【請求項２９】
標識が、ユニーク配列、または蛍光タグ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項26〜28のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ユニークな配列が、一本鎖DNAまたはRNA、二本鎖DNAまたはRNA、三本鎖DNAまたはRNA、多本鎖天然オリゴヌクレオチド、多本鎖人工オリゴヌクレオチド、または化学修飾オリゴヌクレオチドなどを含む、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
前記ユニークな配列がオリゴヌクレオチドを含む、請求項29に記載の方法。
【請求項３２】
固有の有機化合物が固有の標識で標識されている、請求項26〜30のいずれか1項に記載の方法に従って各製造された少なくとも2つの標識有機化合物を含む標識有機化合物のライブラリー。
【請求項３３】
各々が固有の標識で標識された少なくとも10個の固有の有機化合物を含む、請求項32に記載のライブラリー。
【請求項３４】
各々が固有の標識で標識された少なくとも50の固有の有機化合物を含む、請求項32に記載のライブラリー。
【請求項３５】
固有の標識がユニーク配列を有するオリゴヌクレオチドで請求項32〜34のいずれか1項に記載のライブラリー。
【請求項３６】
標的に結合する有機化合物を同定する方法であって、請求項32〜35のいずれか1項に記載のライブラリーをアッセイし、それらの標識に従って標的に結合する有機化合物を同定することを含む、方法。
【請求項３７】
(1) 2つの共役二重結合を有する化合物を同定するための方法であって、該方法は請求項1〜10のいずれか1項に記載のリンカー前駆体分子Cの第1の官能基を有機化合物Aと、カルベンまたはニトレンまたはフリーラジカル反応条件下で反応させて、
(2)リンカー前駆体分子の第2の官能基が未反応のままである生成物または生成物の混合物を形成することと、生成物または生成物の混合物を分析することとを含み、一対の不均化反応生成物の存在は有機化合物Aが2つの共役二重結合を有することを示し、不均化反応生成物の対は、カルベンまたはニトレンまたはフリーラジカル反応の生成物Dの分子量に2を加えたものである分子量を有する化合物Fと、カルベンまたはニトレンまたはフリーラジカル反応の生成物Dの分子量に2を加えたものである分子量を有する化合物F'とを含む。
【請求項３８】
ルテオリン、ナリンギン、ヒエロシド、リキリチン、エピカテキン、エピガロカテキン、ダフネチン、F001、F002、F003もしくはF006、またはそれらの誘導体の治療的に有効な量を被検者に投与することを含む、癌、脳卒中、心筋梗塞、神経変性疾患またはそれを必要とする被検者における炎症を治療するための方法。
【請求項３９】
被検者が、BRCA1、BRCA2、PALB2またはPTENT変異を有するがん細胞を有する、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
前記突然変異が不活性化突然変異で請求項39に記載の方法。
被検者が、対応する正常細胞と比較してPARPタンパク質を過剰発現するがん細胞を有する、請求項38記載の方法。
【請求項４１】
神経変性疾患が、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、萎縮性脊髄炎、助剤認知症、および血管性認知症、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項38記載の方法。
【請求項４２】
炎症が、パーキンソン病、関節リウマチ、関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、乾癬性関節炎、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、ループス、全身性エリテマトーデス、若年性関節リウマチ、若年性特発性関節リウマチ、グレーブス病、橋本病、アジソン病、セリアック病、皮膚筋炎、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、シェーグレン症候群、I型糖尿病、血管炎、ブドウ膜炎、アテローム性動脈硬化症および強直性脊椎炎からなる群より選択される疾患または状態と関連している、請求項38記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は一般に、化学的および生体情報、特に、天然産物の標識およびスクリーニングに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、天然産物の標的同定は典型的にはアフィニティータグおよび断面タグなどの適切なタグを導入するために、構造活性相関(SAR)について多くの作業を必要とする。このような作業は、通常、試行錯誤の手順である。タグは不適切な部位にある場合、化合物と標的との相互作用に空間的障害をもたらし、生物学的スクリーニングにおいて偽陰性の結果を引き起こす。従って、標的同定は偽陰性結果を減少させるために、異なる部位標識を有する種々の薬物-タグ共役を必要とする。しかしながら、複数の部位標識は新しい官能基を導入するために、天然産物上の官能基または全合成に依存する。天然産物の構造は複雑であり、全合成は化学者にとって困難である。従って、このようなアプローチは時間がかかり、非効率的である。
【０００３】
化学の発展に伴い、より多くの新規な天然産物が単離される。化学物質をハイスループットスクリーニングするために、いくつかの機関がコンビナトリアルケミストリーおよびDNA符号化技術を使用する方策を提案した(例えば、US5565324、EP0643778、US7935658、WO/2010/094036、およびCN103882531を参照のこと)。
【０００４】
これらのアプローチはコンビナトリアルケミストリーを使用して化学ライブラリーを確立し、小さな化学フラグメントを使用して大きな化学物質を構築する。しかし、これらの化学反応はDNA安定性によって制限され、強塩基、強還元試薬などを含む多くの一般的な試薬は除外される。従って、多くの複雑な天然産物は、コンビナトリアル化学ライブラリーに含まれない。
【発明の概要】
【０００５】
本開示は、より大きな化学空間をカバーするための新規な標識戦略を提供する。従って、本明細書では、オリゴヌクレオチド、方法に有用な化合物、ならびに標識化合物、標識化合物を含むライブラリー、およびそれらの使用を使用する、有機化学物質の部位非選択的標識のための方法が提供される。
【０００６】
いくつかの実施形態において、有機化合物を標識するための方法が提供され、この方法は以下を含む:
(1)リンカー前駆体分子を、部位非選択的反応条件下で有機化合物と接触させること、例えば、カルベンまたはニトレンまたはフリーラジカル反応条件下で、リンカー前駆体分子は2つの官能基、第1の官能基Rおよび第2の官能基Mを有し、ここで、リンカー前駆体分子の第1の官能基Rは有機化合物と反応する部位非選択的反応条件下で、部位非選択的反応基、例えば、カルベンまたはニトレンまたはフリーラジカルを生成し、第2の官能基は第1の官能基が反応する場合の条件下で非反応性であり、リンカー前駆体分子と有機化合物との接触は、リンカー前駆体分子の第2の官能基Mを有する中間体を形成する
(2)(1)の中間体を標識分子と接触させることにより、リンカー前駆体分子の第2の官能基Mが標識分子と反応して標識された有機化合物を形成し、標識分子が標識を含む。
【０００７】
いくつかの実施形態では第1の官能基および第2の官能基を含むリンカー前駆体分子が提供され、ここで、第1の官能基は部位非選択的様式で有機化合物と反応することができる部位非選択的反応基、例えば、カルベン、ニトレンまたはフリーラジカルを生成することができ、第2の官能基は第1の官能基が有機化合物と反応する場合の条件下では非反応性であるが、標識分子と反応することができる。
【０００８】
いくつかの実施形態において、以下を含む方法によって産生される標識有機化合物が提供される:
(1)リンカー前駆体分子を、部位非選択的反応条件、例えば、カルベンまたはニトレンまたはフリーラジカル反応条件下で有機化合物と接触させ、ここで、リンカー前駆体分子は2つの官能基、第1の官能基Rおよび第2の官能基Mを有し、ここで、リンカー前駆体分子の第1の官能基Rは有機化合物と反応する部位非選択的反応条件下で、部位非選択的反応基、例えば、カルベンまたはニトレンまたはフリーラジカルを生成し、第2の官能基は第1の官能基が有機化合物と反応する場合の条件下で非反応性であり、リンカー前駆体分子と有機化合物との接触は、リンカー前駆体分子の第2の官能基Mを有する中間体を形成する
(2)(1)の中間体を標識分子と接触させることにより、リンカー前駆体分子の第2の官能基Mが標識分子と反応して標識された有機化合物を形成し、標識分子が標識を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では位置異性体を含む標識有機化合物のセットが提供され、その各々は標識部分、リンカー、および有機化合物部分を含み、異性体は標識部分がリンカーを介して結合される有機化合物部分の部位が異なる。
【００１０】
いくつかの実施形態では、少なくとも2つの標識有機化合物(または2組の異性体標識有機化合物)を含む標識有機化合物のライブラリーであって、固有の有機化合物が固有の標識で標識されているライブラリーが提供される。
【００１１】
いくつかの実施形態では、標的に結合する有機化合物を同定する方法であって、標識された有機化合物、一組の異性体標識された有機化合物、または本明細書に記載される標識された有機化合物のライブラリーをアッセイし、それらの標識に従って標的に結合する有機化合物を同定することを含む方法が提供される。
【００１２】
これらおよび他の実施形態は、以下の本文でさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図1は、実施例5におけるオリドニンリンカーIのHPLCおよび質量スペクトルを示す。
【図２】図2は、実施例6における化合物8の質量スペクトルを示す。
【図３】図3は、実施例7における標識化合物9の質量スペクトルを示す。
【図４】図4は、実施例8における標識化合物8の質量スペクトルを示す。
【図５】図5は、実施例9のオリドニン-リンカーII結合体化合物のHPLCおよび質量スペクトルを示す。
【図６】図6は、実施例9のオリドニン-リンカーII結合体化合物のHPLCおよび質量スペクトルを示す。
【図７】図7は、実施例10のセレストロール-リンカーII結合体化合物のHPLCおよび質量スペクトルを示す。
【図８】図8は、実施例10のセレストロール-リンカーII結合体化合物のHPLCおよび質量スペクトルを示す。
【図９】図9は、実施例11のタキソール-リンカーII結合体化合物のHPLCおよび質量スペクトルを示す。
【図１０】図10は、実施例11のタキソール-リンカーII結合体化合物のHPLCおよび質量スペクトルを示す。
【図１１】図11は、実施例12のトリプトフェノリド-リンカーII結合体化合物のHPLCおよび質量スペクトルを示す。
【図１２】図12は、実施例12のトリプトフェノリド-リンカーII結合体化合物のHPLCおよび質量スペクトルを示す。
【図１３】図13は、実施例13のメイタンシノール-リンカーII結合体化合物のHPLCおよび質量スペクトルを示す。
【図１４】図14は、実施例13のメイタンシノール-リンカーII結合体化合物のHPLCおよび質量スペクトルを示す。
【図１５】図15、実施例14のデヒドロアビエチン酸リンカーII共役(A)およびヒドロアビエチン酸リンカーII共役(B)化合物のHPLCおよび質量スペクトルを示す。
【図１６】図16は、実施例14のデヒドロアビエチン酸リンカーII共役(A)およびヒドロアビエチン酸リンカーII共役(B)化合物のHPLCおよび質量スペクトルを示す。
【図１７】図17は、4つの試料:1のアガロースゲル電気泳動におけるDNA移動を示す。化合物6は、オリゴヌクレオチドと結合体である;2。化合物7は、オリゴヌクレオチドと結合体である;3。4.未反応オリゴヌクレオチド。リンカーIIを有するヘッドピースDNA 4を紫外線時間照射し、次いでオリゴヌクレオチドと連結した。
【図１８】図18は、真空なしでリンカーIVで標識された粗照射生成物2,4-ジヒドロキシアセトフェノン;およびii)真空後のリンカーIVで標識された2,4-ジヒドロキシアセトフェノンの粗生成物の1 H NMRを示す。リンカーIV-2,4-ジヒドロキシアセトフェノン結合体は矢印で同定された。
【図１９】図19は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)および配列決定による天然産物-DNA結合の定量化のための一般的なスキームを示す。
【図２０】図20(a)は、熱ショック70kDaタンパク質(HSP70)についてのDEL選択フィンガープリントを示す。図20(b)は、ポリ[ADP-リボース]ポリメラーゼ1(PARP1)についてのDEL選択フィンガープリントを示す。図20では、赤い破線がヒット選択のカットオフである。対応する化学構造を図21に示す。
【図２１】図21は、PAPR1についてのDEL選択からの選択されたバインダーの化学構造を示す。
【図２２】図22は、nDEL選択PARP1バインダーのヒット検証を示す。ルテオリン(図22(a))およびF003(図22(b))によるヒトPARP1の酵素活性の阻害。ヒトPARP1の活性部位におけるルテオリンの分子ドッキング図22(c)に示す。
【００１４】
図面の一部または全部は、説明の目的のための概略的な表現であることが理解されるのであろう。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（定義）
【００１６】
以下、本技術の実施の形態について説明する。しかしながら、そのような説明は本開示の範囲に対する限定として意図されておらず、代わりに、例示的な実施形態の説明として提供されることが認識されるべきである。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、以下の定義は、特に明確に示されない限り適用される:
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「a」、「an」、および「the」は文脈が明らかにそわないことを示さない限り、複数の指示対象を含み、したがって、例えば、「生成物」への言及は、異性体などの複数の生成物を含む。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、用語「含む」または「含む」は組成物および方法が列挙された要素を含むが、他を排除しないことを意味することが意図される。組成物および方法を定義するために使用される場合、「本質的に構成する」は記載された目的のための組み合わせに本質的に重要な任意の他の要素を排除することを意味する。したがって、本明細書中で定義される要素から本質的になる組成物は特許請求される基本的および新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない他の材料または工程を排除しない。「構成する」が他の成分の微量要素および本質的な方法工程を排除することを意味する。各転移用語のそれぞれによって定義される実施形態は、本開示の範囲内である。
【００１９】
用語「約」は数値表示、例えば、温度、時間、量、および濃度(範囲を含む)の前に使用される場合、(+)または(-)10%、5%または1%変化し得る近似を示す。
【００２０】
「アルキル」は、一価の飽和直鎖または分岐脂肪族ヒドロカルビル基を指す。いくつかの実施形態では、アルキルが1〜30個の炭素原子(すなわち、C1-30アルケニル)、1〜20個の炭素原子(すなわち、C1-20アルケニル)、1〜8個の炭素原子(すなわち、C1-8アルケニル)、1〜6個の炭素原子(C1-6アルキル)、または1〜4個の炭素原子(すなわち、C1-4アルケニル)を有する。例えば、この語は例えば、線形および分岐したハイドロカルビル群、例えば、methyl(CH3 -)、ethyl(CH3 CH2 -)、n-propyl(CH3 CH2 CH2 -)、isopyl(CH3)2 CH-)、n-butyl(CH3 CH2 CH2CH2 -)、isobutyl(CH3)2CHCH2 -)、sec-butyl(CH3)(CH-)、およびt-butyl(CH3)3 C-を含む。「アルキレン」とは、二価の直鎖または分岐の飽和脂肪族ヒドロカルビル基をいう。
【００２１】
「アルケニル」は少なくとも1つの炭素炭素二重結合を含むアルキル基を指す。いくつかの実施形態ではアルケニルが2〜30個の炭素原子(すなわち、C2-30アルケニル)、2〜20個の炭素原子(すなわち、C2-20アルケニル)、2〜8個の炭素原子(すなわち、C2-8アルケニル)、2〜6個の炭素原子(すなわち、C2-6アルケニル)、または2〜4個の炭素原子(すなわち、C2-4アルケニル)を有する。アルケニル基の例としてはエテニル、プロペニル、ブタジエニル(1,2-ブタジエニルおよび1,3-ブタジエニルを含む)が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
「アルキニル」とは少なくとも1つの炭素炭素三重結合を含むアルキル基をいい、いくつかの実施形態ではアルケニルが2〜30個の炭素原子(すなわち、C2-30アルキニル)、2〜20個の炭素原子(すなわち、C2-20アルキニル)、2〜8個の炭素原子(すなわち、C2-8アルキニル)、2〜6個の炭素原子(すなわち、C2-6アルキニル)、または2〜4個の炭素原子(すなわち、C2-4アルキニル)を有する。用語「アルキニル」には1つの三重結合および1つの二重結合を有する基も含まれる。「アルキニレン」とは二価アルキニル基をいう。
【００２３】
「アルコキシ」は、「アルキル-O-」基を指す。アルコキシ基の実施例としてはメトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、イソ-プロポキシ、n-ブトキシ、tert-ブトキシ、sec-ブトキシ、n-ペントキシ、n-ヘキソキシ、および1,2-ジメチルブトキシが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
「ハロアルコキシ」は、1個以上の水素原子がハロゲンで置換されている、上記で定義したアルコキシ基を指す。
【００２５】
「アルキルチオ」は、「アルキル-S-」基を指す。
【００２６】
「アシル」は基-C(O)Rを指し、式中、Rは水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアルキル、またはヘテロアリールであり、それらの各々は本明細書で定義されるように、任意に置換されていてもよい。アシルの実施例としては以下に限定されるものではないが、フォルミル、アセチル、シルコヘキシルカルボニル基、シクロヘキシルメチルカルボニル基、およびベンゾイルが挙げられる。
【００２７】
「アミド」とは基-C(O)NR y R zを指す「C-アミド」基および基-NR y C(O)R zを指す「N-アミド」基の両方を指し、ここで、R yおよびR zは水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアルキル、またはヘテロアリールからなる群から独立して選択され、その各々は置換されていてもよい。
【００２８】
「アミノ」とはR yおよびR zが水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールからなる群から独立して選択される基-NR y R zをいい、その各々は置換されていてもよい。
【００２９】
「アミジノ」は、-C(NH)(NH2)を指す。
【００３０】
「アリール」は縮合系を含む単一環(例えば、単環式)または多環(例えば、二環式または三環式)を有する一価芳香族炭素環基を指す。いくつかの実施形態において、アリールは6〜20個の環炭素原子(すなわち、C 6-20アリール)、6〜14個の炭素環原子(すなわち、C 6-14アリール)、6〜12個の炭素環原子(すなわち、C 6-12アリール)、または6〜10個の炭素環原子(すなわち、C 6-10アリール)を有する。アリール基の例としてはフェニル、ナフチル、フルオレニル、およびアントリルが挙げられるが、これらに限定されない。しかしながら、アリールは、以下に定義されるヘテロアリールを方法包含または重複しない。1つ以上のアリール基がヘテロアリールと融合している場合、得られる環系はヘテロアリールである。1つ以上のアリール基がヘテロシクロアルキルと融合する場合、得られる環系はヘテロシクロアルキルである。「アリーレン」は、二価アリール基を指す。
【００３１】
「O-カルバモイル」は基-O-C(O)NR y R zを指し、「N-カルバモイル」基は基-NR yC(O)OR zを指し、ここで、R yおよびR zは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールからなる群から独立して選択され、それらの各々は置換されていてもよい。
【００３２】
「カルボキシル」は、-C(O)OHを指す。
【００３３】
「カルボキシルエステル」は-OC(O)Rおよび-C(O)ORの両方を指し、式中、Rは水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、これらの各々は本明細書中で定義されるように、任意に置換されていてもよい。
【００３４】
「シアノ」または「カルボニトリル」は基-CNを指す。
【００３５】
「シクロアルキル」とは縮合、架橋、およびスピロ環系を含む単一環または複数環を有する一価飽和または部分不飽和非芳香族環状アルキル基をいう。「シクロアルキル」とはシクロアルキル基(すなわち、少なくとも1つの二重結合を有する非芳香族炭素環基)を含む。いくつかの実施形態ではシクロアルキルが3〜20個の環炭素原子(すなわち、C3-20シクロアルキル)、3〜12個の環炭素原子(すなわち、C3-12シクロアルキル)、3〜10個の環炭素原子(すなわち、C3-10シクロアルキル)、3〜8個の環炭素原子(すなわち、C3-8シクロアルキル)、または3〜6個の環炭素原子(すなわち、C3-6シクロアルキル)を有する。シクロアルキル基の例としてはシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルが挙げられるが、これらに限定されない。「シクロアルキレン」とは二価飽和または部分不飽和環状アルキル基をいう。
【００３６】
「グアニジノ」は、-NHC(NH)(NH2)を指す。
【００３７】
「ヒドラジノ」は、-NHNH2を指す。
【００３８】
「イミノ」は基-C(NR)Rを指し、ここで、各Rはアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それらの各々は本明細書中で定義されるように、任意に置換されていてもよい。
【００３９】
「ハロゲン」または「ハロ」には、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードが含まれる。
【００４０】
「ハロアルキル」とは1個以上の水素原子がハロゲンで置換されている、上で定義したアルキル基をいい、例えば、残基が2個以上のハロゲンで置換されている場合、結合しているハロゲン部分の数に対応する接頭辞を使用することによって言及することができる。ジハロアルキルおよびトリハロアルキルとは2個(「ジ」)または3個(「トリ」)のハロ基で置換されているアルキルをいい、これらは同じハロゲンであってもよいが、必ずしも同じハロゲンでなくてもよい。ハロアルキルの実施例としては、ジフルオロメチル(-CHF2)およびトリフルオロメチル(-CF3)が挙げられる。
【００４１】
「ハロアルケニル」は、1個以上の水素原子がハロゲンで置換されている、上記で定義したアルケニル基を指す。
【００４２】
「ハロアルキニル」は、1個以上の水素原子がハロゲンで置換されている、上記で定義したアルキニル基を指す。
【００４３】
「ヘテロアルキル」とは1個以上の炭素原子(及び関連する水素原子)がそれぞれ独立して同一又は異なるヘテロ原子基で置換されたアルキル基をいい、「ヘテロアルキル」とは炭素原子及びヘテロ原子を有する非分岐又は分岐飽和鎖を含む。例として、1、2または3個の炭素原子は、独立して、同じまたは異なるヘテロ原子基で置換されてもよい。ヘテロ原子基としてはこれらに限定されないが、to, -NR-, -O-, -S-, -S(O)-, -S(O)2 -, などが挙げられ、ここで、RはH、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、これらの各々は任意に置換されていてもよい。ヘテロアルキグループの実施例としては、-OCH3, -CH2 OCH3, -SCH3, -CH2 SCH3, -NHCH3、および-CH2 NRCH3が挙げられる。いくつかの実施形態では、ヘテロアルキルが1〜10個の炭素原子、1〜8個の炭素原子、または1〜4個の炭素原子;および1〜3個のヘテロ原子、1〜2個のヘテロ原子、または1個のヘテロ原子を含む。「ヘテロアルキレン」は、2価のヘテロアルキル基を指す。
【００４４】
「ヘテロアリール」は、窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される1つ以上の環ヘテロ原子を有する、単一環、複数環、または複数の縮合環を有する芳香族基を指す。いくつかの実施形態において、ヘテロアリールは5〜24個の環原子(すなわち、5〜24員ヘテロアリール)、または5〜14個の環原子(すなわち、5〜14員ヘテロアリール)、5〜10個の環原子(すなわち、5〜10員ヘテロアリール)、または5または6個の環原子(すなわち、5または6員ヘテロアリール)を含む。いくつかの実施形態において、ヘテロアリールは1〜20個の環炭素原子(すなわち、C1-20ヘテロアリール)、5〜14個の環炭素原子(すなわち、C5-14 ヘテロアリール)、3〜12個の環炭素原子(すなわち、C3-12ヘテロアリール)、または3〜8個の炭素環原子(すなわち、C3-8 ヘテロアリール);および1〜5個のヘテロ原子、1〜4個のヘテロ原子、1〜3個の環ヘテロ原子、1〜2個の環ヘテロ原子、または窒素、酸素およびイオウから独立して選択される1個の環ヘテロ原子を含む。ヘテロアリール基の例としてはピリミジニル、プリニル、ピリジル、ピリダジニル、ベンゾチアゾリル、ピラゾリル、ベンゾ[d]チアゾリル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾ[b]チオフェニル、インダゾリル、ベンゾ[d]イミダゾリル、ピラゾロ[1,5-a]ピリジニル、およびイミダゾ[1,5-a]ピリジニルが挙げられるが、これらに限定されない。少なくとも1つのヘテロ原子を含有する、単一または複数の縮合環を有する任意の芳香環は分子の残りの部分への取付部材にかかわらず(すなわち、縮合環のいずれか1つを介して)、ヘテロアリールと考えられる。ヘテロアリールは、上記で定義したアリールを包含または重複しない。「ヘテロアリーレン」は、二価のヘテロアリール基を指す。
【００４５】
「ヘテロシクロアルキル」とは窒素、酸素及び硫黄から独立して選択される1個以上の環ヘテロ原子を有する飽和又は不飽和の非芳香族環状アルキル基をいい、「ヘテロシクロアルキル」とはヘテロシクロアルケニル基(すなわち、少なくとも1個の二重結合を有するヘテロシクロアルキル基)、架橋ヘテロシクロアルキル基、縮合ヘテロシクロアルキル基及びスピロヘテロシクロアルキル基を含む。ヘテロシクロアルキルは単一の環または複数の環であってもよく、ここで、複数の環は縮合、架橋、またはスピロであってもよい。少なくとも1つのヘテロ原子を含有する任意の非芳香族環は取付部材にかかわらず、ヘテロシクロアルキルと考えられる(すなわち、炭素原子またはヘテロ原子を介して取付部材され得る)。さらに、ヘテロシクロアルキルという語は少なくとも1個のヘテロ原子を含む任意の非芳香族環を包含することを意図し、この環は、分子の残部への取付部材にかかわらず、アリールまたはヘテロアリール環に縮合され得る。いくつかの実施形態では、ヘテロシクロアルキルが3〜24個の環原子(すなわち、3〜24員ヘテロシクロアルキル)、または3〜14個の環原子(すなわち、3〜14員ヘテロシクロアルキル)、3〜10個の環原子(すなわち、3〜10員ヘテロシクロアルキル)、または5または6個の環原子(すなわち、5または6員ヘテロシクロアルキル)を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロシクロアルキルが2〜20個の環炭素原子(すなわち、C2-20ヘテロシクロアルキル)、2〜12個の環炭素原子(すなわち、C2-12ヘテロシクロアルキル)、2〜10個の環炭素原子(すなわち、C2-10ヘテロシクロアルキル)、2〜8個の環炭素原子(すなわち、C2-8ヘテロシクロアルキル)、3〜12個の環炭素原子(すなわち、C3-12ヘテロシクロアルキル)、3〜8個の環炭素原子(すなわち、C3-8ヘテロシクロアルキル)、または3〜6個の環炭素原子(すなわち、C3-6ヘテロシクロアルキル)を有し、1〜5個の環ヘテロ原子、1〜4個の環ヘテロ原子、1〜3個の環ヘテロ原子、1〜2個の環ヘテロ原子、または窒素、硫黄または酸素から独立して選択される1。ヘテロシクロアルキル基の実施例にはピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、オキセタニル、ジオキソラニル、アゼチジニル、モルホリニル、2-オキサ-7-アザスピロ[3.5]ノナニル、2-オキサ-6-アザスピロ[3.4]オクタニル、6-オキサ-1-アザスピロ[3.3]ヘプタニル、1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリニル、4,5,6,7-テトラヒドロチエノ[2,3-c]ピリジニル、インドリニルおよびイソインドリニルが含まれるが、これらに限定されない。「ヘテロシクロアルキレン」は、二価のヘテロシクロアルキル基を指す。
【００４６】
「ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」とは、-OH基をいう。
【００４７】
「オキソ」は、基(=O)または(O)を指す。
【００４８】
グループ-NO2を「ニトロ」と呼ぶ。
【００４９】
「スルホニル」は基-S(O)2 Rを指し、式中、Rは、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールである。スルホニルの実施例としてはメチルスルホニル、エチルスルホニル、フェニルスルホニル、およびトルエンスルホニルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
「アルキルスルホニル」は基-S(O)2 Rをいい、ここでRはアルキルである。
【００５１】
「スルホン酸」は、基-SO3 Hを指す。
【００５２】
「アルキルスルフィニル」は、基-S(O)R(式中、Rはアルキル)を指す。
【００５３】
「チオシアン酸」は、基-SCNを指す。
【００５４】
「チオール」とは、-SH基をいう。
【００５５】
「チオキソ」または「チオン」は、基(=S)または(S)を指す。
【００５６】
特定の一般的に使用される代替化学名を使用することができる。例えば、2上記の「アルキル」基、2上記の「アリール」基などのような2上記の基は、それぞれ、「アルキレン」基、「アリーレン」基と呼ばれることもある。また、特に明記しない限り、本明細書において基の組み合わせが1つの部分、例えばアリールアルキルと呼ばれる場合、最後に言及した基は、その部分が分子の残りの部分に結合する原子を含む。
【００５７】
用語「随意」または「随意」は、後に記載される事象または状況が起こっても起こらなくてもよいこと、および記載が前記事象または状況が起こる事例および起こらない事例を含むことを手段し、また、用語「随意に置換された」は指定された原子または基上の任意の1つ以上の水素原子を指し、水素以外の部分によって置換されてもよく、または置換されなくてもよい。
【００５８】
「置換された」とは、指定された原子または基上の任意の1つ以上の水素原子が指定された原子の通常の原子価を超えない限り、水素以外の1つ以上の置換基で置換されることを手段する。1つ以上の置換基としてはアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アシル、アミノ、アミジノ、アリール、N 3、O-アミド、N-アミド、カルボキシル、カルボキシルエステル、シアノ、グアニジノ、ハロ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、水酸基、ヒドラジノ、イミノ、オキソ、ニトロ、アルキルスルフィニル、スルホン酸、アルキルスルホニル、チオシアン酸、チオール、チオン、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。無限に付加されたさらなる置換基を有する置換基(例えば、置換されたアリール基で自体が置換されており、置換されたヘテロアルキル基でさらに置換されている置換アルキルを有する置換アリールなど)を定義することによって到達した重合体または同様の無限の構造は、本明細書中に含まれることを意図しない。特に断らない限り、本明細書に記載の化合物における連続置換の最大数は3である。例えば、2 つの他の置換アリール基との置換アリール基のシリアル置換は、(置換アリール)置換アリールに制限されている。同様に、上記の定義は許容できない置換パターン(例えば、5個のフッ素で置換されたメチル、または2個の隣接する酸素環原子を有するヘテロアリール基)を含むことを意図しない。このような許容できない置換パターンは、当業者に周知である。化学基を修飾するために使用される場合、用語「置換された」は本明細書で定義される他の化学基を記載してもよい。いくつかの実施形態では基が任意に置換されていると記載され、基の任意の置換基はそれ自体が置換されていない。例えば、いくつかの実施形態では用語「置換されたアルキル」が水酸基、ハロ、アルコキシ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールを含む1つ以上の置換基を有するアルキル基を指す。他の実施形態では、1つ以上の置換基がハロ、アルキル、ハロアルキル、水酸基、アルコキシ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールでさらに置換されていてもよく、これらは各置換されている。他の実施形態では、置換基がハロ、アルキル、ハロアルキル、アルコキシ、水酸基、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールでさらに置換されていてもよく、それらの各々は非置換である。
【００５９】
本明細書中で使用される場合、用語「溶媒」は、固体、液体、または気体溶質を溶解して溶液を形成する液体を指す。共通溶媒は当技術分野で周知であり、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、および他の軽質石油などの飽和脂肪族炭化水素基、ベンゼン、トルエン、キシレンなどの芳香族炭化水素、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素などのハロゲン化炭化水素、メタノール、エタノール、プロパノールなどの脂肪族アルコール、ジエチルエーテル、ジブチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサンなどのエーテル、アセトン、エチルメチルケトンなどのケトン、ジメチルアセトアミド、ホルムアミド、N, N-ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、N-メチルピロリドン、キノリン、ニトロベンゼンなどの窒素含有溶媒が挙げられるが、これらに限定されない。二硫化炭素、ジメチルスルホキシド、スルホラン等;ヘキサメチルリントリアミド等のリン含有溶媒。溶媒という用語は特に明確に示されない限り、2つ以上の溶媒の組み合わせを含む。適当な溶媒の特定の選択は溶剤の性質および溶解される溶質、ならびに意図される目的、例えば、溶液中でどのような化学反応が起こるかなど、多くの要因に依存し、当技術分野で一般的に知られている。
本明細書中で使用される場合、用語「接触する」は2つ以上の化学分子間の化学反応が起こり得るように、2つ以上の化学分子を近接させることをいう。例えば、接触させることは、化学物質を混合し、任意に連続的に混合することを含んでもよい。接触は、1つ以上の溶媒中に2つ以上の化学物質を完全に上記部分的に溶解上記懸濁させること、溶媒中の化学物質を固相および/上記気相中の別の化学物質と混合すること、上記樹脂などの固相保持体上に付着させること、上記気相上記固相中および/上記固相保持体上で2つ以上の化学物質を混合することによって行われてもよく、これらは当業者に一般に知られている。
【００６０】
本明細書で使用される「有機化合物」とは1つ以上の標的との結合活性についてスクリーニングされ得るように標識される化合物をいい、「薬剤」、TCM、および天然産物(NP)という用語は本明細書で定義されるように標識される有機化合物をいうために使用される。
【００６１】
本明細書中で使用される場合、「リンカー前駆体分子」は2つの官能基を有する分子をいい、その各々は反応し、それによって分子と結合し、その結果、反応後、リンカー前駆体分子の残渣は、生成物のリンカーとなる。
【００６２】
本明細書中で使用される場合、「標識分子」は、分析方法によって検出され得る、オリゴヌクレオチドなどの標識を有する分子を指す。
【００６３】
本明細書中で使用される場合、「部位非選択的反応」、「部位非選択的標識」などにおける「部位非選択的」という用語は、分子の官能基に依存する必要がないかもしれない分子の多数の異なる部位で起こり得る反応または標識などを指す。「部位非選択的反応」の例としては化合物X-Y(Yはカルベン、ニトレンまたはフリーラジカル基などの部位非選択的反応基)が化合物Zの異なる部位と反応して化合物X-Zを形成するカルベン、ニトレンおよびフリーラジカル反応が挙げられる。このような部位非選択的反応は、典型的にはXがZの異なる部位に結合しているいくつかの位置異性体X〜Zを生成する。
【００６４】
本明細書中で使用される場合、「異性体化合物」または「異性体生成物」などは部位非選択的反応、例えば、部位非選択的反応基を有するリンカー前駆体分子を有機化合物または対応する標識異性体生成物と反応させることによって生成される異性体をいい、適切な場合、「異性体生成物のセット」は1つの独特の有機化合物から生成される異性体化合物の混合物をいう。
【００６５】
本明細書で使用される「不均化反応生成物」は不均化反応によって生成される2つの生成物を指し、不均化反応は、時に不均化と呼ばれ、中間酸化状態の化合物が2つの異なる化合物、すなわち、高酸化状態の化合物および低酸化状態の化合物に変換する酸化還元反応である。不均化反応は、以下のように表すことができる:
2P → P' + P"
ここで、P、P'およびP"はすべて異なる化学種であり、P'およびP"は不均化反応生成物である。
【００６６】
本明細書に記載される式内で、提供される構造内で、または構造に関連する変数の定義内で指定されるすべての原子は反対に明確に示されない限り、その任意の同位体を含むことが意図される。任意の所与の原子について、同位体は本質的に、それらの天然の出現に従って比率で存在し得るか、または1つ以上の特定の原子は、当業者に公知の合成方法を使用して、1つ以上の同位体に関して増強され得ることが理解される。したがって、例えば、1 H、2 H、3 Hを含み、たとえば、11 C, 12 C, 13C, 14 CHを含み、また、COnはたとえば、COOOEを含み、Nはたとえば、Oを含み、また、Nはたとえば、NはN、15はNはたとえば、13 N、14を含み、Sはたとえば、17 F、18 F、16 Fを含み、また、クロールはたとえば、17 Cl、18 Cl、37 Cl、38 Clなどを含む。
【００６７】
本明細書中に記載される化合物は任意の互変異性形態を含むが、所与の化合物の互変異性形態のうちの1つのみの式が本明細書中に提供され得る。
【００６８】
本明細書中で使用される場合、用語「塩」は、酸付加塩および塩基付加塩をいう。酸付加塩の実施例としては、硫酸塩、塩化物、塩酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リン酸塩、スルファミン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩、シクロヘキシルスルファミン酸塩およびキネートを含有するものが挙げられる。塩は、塩酸、マレイン酸、硫酸、リン酸、スルファミン酸、酢酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、マロン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、シクロヘキシルスルファミン酸、フマル酸、およびキナ酸などの酸から得ることができる。基本付加塩としては、カルボン酸またはフェノールなどの酸性官能基が存在する場合、ベンザチン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エタノールアミン、t-ブチルアミン、エチレンジアミン、メグルミン、プロカイン、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、アンモニウム、アルキルアミン、および亜鉛を含有するものが挙げられる。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, Vol. 2, p. 1457, 1995を参照されたい。塩には、治療される疾患または条件およびそれぞれの投与経路を考慮して、合理的に慎重な医師に患者への物質の投与を回避させる特性を有さない薬学的に許容される塩が含まれる。本明細書に記載の化合物、中間体または生成物には、それらの塩が含まれる。
【００６９】
また、ここでいう略語とは、それぞれ次のような意味を有する:
【００７０】
略語・略語一覧
【００７１】
【表１】
2021530235.tif 000002
【００７２】
化合物
【００７３】
本明細書では2つの官能基を含む二官能性リンカーが提供され、ここで、官能基のうちの1つはカルベンまたはニトレンまたはフリーラジカルなどの高反応性化学種を生成することができる化学基であり、これはカルベンまたはニトレンまたはフリーラジカルの高い反応性を利用して、空間構造的多様性を有する異性体化合物の集合体を生成することによって、化合物を標識するために使用することができる。リンカーの他の官能基は標識分子(例えば、特定のオリゴヌクレオチド)と連結するために使用され、そして異性体アセンブリの合成は、オリゴヌクレオチドの配列を使用してコードされる。最後に、種々の化合物をこのような二官能性リンカーおよび標識分子によって標識して標識された生成物を生成することができ、これを一緒に混合して化合物ライブラリーを構築することができる。本開示では、オリゴヌクレオチド標識と適合するカルベンまたはニトレンまたはフリーラジカル化学反応が最適化され、例えば、溶媒、反応の順序、触媒の組成などが最適化される。この方法は化合物機能の研究における複雑な構造-活性関係実験を回避し、これは、操作が単純かつ迅速であり、スクリーニング効率が高い。
【００７４】
オリゴヌクレオチド、方法に有用な化合物、ならびに標識化合物、標識化合物を含むライブラリー、およびそれらの使用を使用する、有機化学物質の部位非選択的標識のための方法が本明細書に提供される。
【００７５】
標識方法
【００７６】
本明細書中に記載される方法はカルベンまたはニトレンまたはフリーラジカル反応などの部位非選択的反応を利用し、化合物の官能基とは独立異なる部位上の有機化合物を同時に標識することができ、したがって偽陰性結果を最小限にする。この方法は、官能基を有さない有機化合物を標識するのにも有用である。さらに、この方法はオリゴヌクレオチドタグが安定でない試薬(例えば、強塩基または強還元試薬)を使用しない。
【００７７】
いくつかの実施形態では、この方法がスキーム1に示されるように描写され得る:
スキーム1
【００７８】
【化１−１】
2021530235.tif 000003
【００７９】
いくつかの実施形態において、方法が含む有機化合物Aを標識するための方法が提供される:
(1)非選択的反応条件、例えば、カルベンまたはニトレンまたはフリーラジカル反応条件下で、リンカー前駆体分子Cと有機化合物Aとを接触させること、ここで、リンカー前駆体分子Cは2つの官能基、第1の官能基Rおよび第2の官能基Mを有し、ここで、リンカー前駆体分子Cの第1の官能基Rは有機化合物Aと反応する部位非選択的反応条件下で、部位非選択的反応基、例えば、カルベンまたはニトレンまたはフリーラジカルを生成し、第2の官能基は第1の官能基が有機化合物Aと反応する条件下で非反応性であり、リンカー前駆体分子Cと有機化合物Aとの接触がリンカー前駆体分子Cの第2の官能基Mを有する中間体Dを形成し、リンカー前駆体分子Cと有機化合物Aとの反応によって、部位非選択的反応条件下で2つ以上の異性体が生成する場合、本明細書で使用される「中間体D」は、すべてを指してもよい。異性体、または異性体の1つまたはいくつか。
【００８０】
いくつかの実施形態では、本方法はさらに以下を含む:
(2)それによって、中間体Dを標識分子Bと接触させ、それによって、リンカー前駆体分子Cの第2の官能基Mを標識分子Bと反応させて、標識された有機化合物Eを形成し、ここで、標識分子Bは標識を含む。本方法によって2つ以上の異性体が生成される場合、本明細書で使用される「標識有機化合物E」は、異性体のすべて、または異性体の1つもしくはいくつかを指し得る。
【００８１】
いくつかの実施形態では部位非選択的反応条件はカルベン反応条件であり、リンカー前駆体分子Cの第1の官能基Rはカルベン反応条件下でカルベンを生成する。いくつかの実施形態では部位非選択的反応条件はニトレン反応条件であり、リンカー前駆体分子Cの第1の官能基Rはニトレン反応条件下でニトレンを生成する。いくつかの実施形態において、部位非選択的反応条件はフリーラジカル反応条件であり、リンカー前駆体分子Cの第1の官能基Rは、フリーラジカル反応条件下でフリーラジカルを生成する。
【００８２】
本明細書で提供される方法は、有機化合物上の任意の官能基とは無関係に有機化合物を標識する。したがって、いくつかの実施形態では、リンカー前駆体分子Cの第1の官能基Rが有機化合物Aの複数の部位と反応して、複数の異性体生成物の混合物を形成することができる。いくつかの実施形態では、有機化合物Aが反応性官能基を含まない。
【００８３】
いくつかの実施形態では、中間体Dが複数の異性体の混合物である。
【００８４】
いくつかの実施形態では、標識有機化合物Eが複数の異性体の混合物である。
【００８５】
いくつかの実施形態において、標識は化学標識のためのユニーク配列、または蛍光タグ(例えば、フルオロフォアまたはGFP)もしくはビオチン標識、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、固有の配列が一本鎖DNAまたはRNA、二本鎖DNAまたはRNA、多本鎖DNAまたはRNA、または他の化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標識はオリゴヌクレオチドを含む。
【００８６】
いくつかの実施形態では、ユニーク配列が天然ヌクレオチドまたは任意の他の人工ヌクレオチドまたは両者の混合物を含む化学修飾オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、化学修飾オリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチド上のアミノ基を介して修飾される。いくつかの態様において、化学修飾オリゴヌクレオチドは、アセチレニル(C CH)基を含む。いくつかの実施形態において、アセチルエニル基は、リンカーを介してオリゴヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態において、リンカーは、nが0から10、または1から5の整数である-CH2 -(OCH2 CH2)n-O-CH2 -, を含む。
【００８７】
いくつかの実施形態では、カルベンまたはニトレンまたはフリーラジカル反応条件などの部位非選択的反応条件が有機化合物Aおよびリンカー前駆体分子Cを溶媒に溶解して反応混合物を形成することを含む。いくつかの実施形態では、フリーラジカル反応条件が周囲温度で、1〜5時間または約3時間以上などの期間、反応混合物のUV(例えば、365nm)照射を含む。いくつかの実施形態では、カルベンまたはニトレンまたはフリーラジカル反応条件などの部位非選択的反応条件が過酸化物(過酸化物結合(-O-O-)を有する化合物、例えば、ジ-tert-ブチルペルオキシド、ベンゾイルパーオキサイド、メチルエチルケトンペルオキシド、およびペルオキシジスルフェート)などのラジカル開始剤、または遷移金属錯体を含む。他のラジカル開始剤は当該分野で一般に公知であり、例えば、Denisovら、Handbook of Free Radical Initiators, Wiley-Interscience;第1版(2003年4月4日)(これは、その全体が参照により本明細書中に援用される)を参照のこと。
【００８８】
いくつかの実施形態において、本方法は、上記工程(1)の中間体Dおよび/または上記工程(2)の標識有機化合物Eを単離することをさらに含む。溶剤、試薬、副生物等のような反応混合物中の他の物質から反応の所望の生成物を分離する単離手段。この方法が複数の異性体および/または不均化反応生成物を生成する場合、このような生成物は、混合物として、または個別化合物として単離され得る。
【００８９】
リンカー前駆体分子
【００９０】
本明細書に記載の方法は、リンカー前駆体分子を使用して、標識分子で標識されている有機分子を、リンカー前駆体分子のリンカーを通して接続する。リンカー前駆体分子は、有機化合物の任意の官能基とは無関係に有機化合物と反応することができるカルベンまたはニトレンまたはフリーラジクルを生成することができる官能基を有する。
【００９１】
いくつかの実施形態では第1の官能基および第2の官能基を含むリンカー前駆体分子Cが提供され、第1の官能基は有機化合物Aと反応することができるカルベンまたはニトロンまたはフリーラジカルなどの部位非選択的反応基を生成することができ、第2の官能基は第1の官能基が有機化合物Aと反応するが標識分子Bと反応することができる条件下で有機化合物Aと反応しない。
【００９２】
いくつかの実施形態ではリンカー前駆体分子Cが式R-L-M(式中、Rは第1の官能基であり、Mは第2の官能基であり、Lはリンカー部分であり、Lは置換されていてもよいアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、およびヘテロアリーレンから独立して選択される1つ以上の部分を含む)のものである。
【００９３】
いくつかの実施形態ではLはアルキレンであり、アルキレンのメチレン単位の1つ以上は任意選択で、NR1, O, S, SO, SO2, CO, NR1 C(O), C(O)NR1, シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、およびヘテロアリーレンからなる群から独立して選択される部分で置換され、それぞれのR1は独立してHまたはアルキルである。
【００９４】
いくつかの実施形態ではLはアルキレンであり、アルキレンのメチレン単位の1つ以上はフェニレン基、O、NHC(O)およびC(O)NHから独立して選択される部分で置換される。
【００９５】
いくつかの実施形態では、Lはフェニレン基を含む。
【００９６】
いくつかの実施形態では、リンカー前駆体分子Cの第1の官能基またはRがカルベンまたはニトレン基またはフリーラジカル(ジアゾ、ケテン、イソシアネート、またはアジド上記)を生成することができる基を含む。いくつかの実施形態において、リンカー前駆体分子Cの第1の官能基またはRは、ジアジリン、アジ化アリール、ベンゾフェノン、またはジアゾを含む。
【００９７】
いくつかの実施形態では、第1の官能基またはRがアリーレン基を含み、フェニレン基などのアリーレン基を介してリンカー前駆体分子Cの残りの部分に結合される。
【００９８】
いくつかの実施形態では、リンカー前駆体分子Cの第1の官能基またはRはからなる群から選択される
【化１】
2021530235.tif 000004
ここで、
2021530235.tif 000005
は、リンカー前駆体分子Cの残りの部分への結合点を表す。
【００９９】
いくつかの実施形態では、リンカー前駆体分子Cの第2の官能基またはMがアジド(例えば、アルキルアジド)、アルキン、エン、または-C(O)-O-を含む。
【０１００】
いくつかの実施形態では、第2の官能基またはMがアルキレン基を含み、アルキレン基を介してリンカー前駆体分子Cの残りの部分に結合される。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、リンカー前駆体分子Cの第2の官能基またはMはからなる群から選択される
【化２】
2021530235.tif 000006
ここで、
2021530235.tif 000007
は、リンカー前駆体分子Cの残りの部分への結合点を表す。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、リンカー前駆体分子Cはからなる群から選択される
【化３】
2021530235.tif 000008
【０１０３】
いくつかの実施形態では、リンカー前駆体分子Cはからなる群から選択される
【化４】
2021530235.tif 000009
【０１０４】
いくつかの実施形態では、リンカー前駆体分子Cはからなる群から選択される
【化５】
2021530235.tif 000010
【０１０５】
いくつかの実施形態では、リンカー前駆体分子Cはからなる群から選択される
【化６】
2021530235.tif 000011
【０１０６】
いくつかの実施形態では、リンカー前駆体分子Cが
2021530235.tif 000012
【０１０７】
標識有機化合物
【０１０８】
いくつかの実施形態において、以下を含む方法によって産生される標識有機化合物Eが提供される:
(1)リンカー前駆体分子Cを、カルベンまたはニトロンまたはフリーラジカル反応条件のような部位非選択的反応条件下で有機化合物Aと接触させ、リンカー前駆体分子Cは2つの官能基、第1の官能基Rおよび第2の官能基Mを有し、リンカー前駆体分子Cの第1の官能基Rはカルベンまたはニトロンまたはフリーラジカルのような部位非選択的反応基を生成し、これは部位非選択的反応条件下で有機化合物Aと反応し、第2の官能基は第1の官能基が有機化合物Aと反応する条件下で非反応性であり、リンカー前駆体分子Cと有機化合物Aとの接触はリンカー前駆体分子Cの第2の官能基Mを有する中間体Dを形成する
(2)それによって、中間体Dを標識分子Bと接触させ、それによって、リンカー前駆体分子Cの第2の官能基Mを標識分子Bと反応させて、標識された有機化合物Eを形成し、ここで、標識分子Bは標識を含む。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、有機化合物Aが反応性官能基を含まない。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、中間体Dが複数の異性体の混合物である。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、標識有機化合物Eが複数の異性体の混合物である。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、標識は化学標識のためのユニーク配列、または蛍光タグ(例えば、フルオロフォアまたはGFP)もしくはビオチン標識、またはそれらの組み合わせを含む。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、固有の配列が一本鎖DNAまたはRNA、二本鎖DNAまたはRNA、化学修飾オリゴヌクレオチド、多本鎖天然または人工オリゴヌクレオチド、または人工オリゴヌクレオチドを含む。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、ユニーク配列はオリゴヌクレオチドを含む。
【０１１５】
いくつかの実施形態では標識部分および有機化合物部分を含む異性体標識有機化合物のセットが提供され、ここで、標識部分はリンカーを介して有機化合物部分の異なる部位に結合される。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、(1)有機化合物Aと本明細書に記載のリンカー前駆体分子Cとのカルベン、ニトレン、またはフリーラジカル反応などの部位非選択的反応によって異性体化合物が生成される複数の異性体化合物、および/または(2)(1)のフリーラジカル反応によって生成される異性体化合物の不均化反応の生成物である1つ以上の化合物一対を含む混合物が提供される。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、不均化反応生成物一対は、部位非選択的反応によって生成される異性体化合物Eの分子量である分子量プラス2を有する化合物F、および部位非選択的反応によって生成される異性体化合物Eの分子量である分子量マイナス2を有する化合物F'を含む。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、以下を含む方法によって生成される、複数の異性体標識化合物の混合物が提供される:
(1)2.本明細書に記載の第1および第2の官能基を有するリンカー前駆体分子Cの第1の官能基を、カルベンまたはニトロンまたはフリーラジカル反応条件などの部位非選択的反応条件下で有機化合物Aと反応させて、リンカー前駆体分子Cの第2の官能基を有する中間体Dを形成する
(2)第2の官能基を標識を含む標識分子Bと反応させること。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、標識は化学標識のためのユニーク配列、または蛍光タグ(例えば、フルオロフォアまたはGFP)もしくはビオチン標識、またはそれらの組み合わせを含む。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、ユニークな配列は一本鎖DNAまたはRNA、二本鎖DNAまたはRNA、他の化学修飾オリゴヌクレオチド、または他の人工オリゴヌクレオチド(例えば、多本鎖天然または人工オリゴヌクレオチド)を含む。いくつかの実施形態では、ユニーク配列はオリゴヌクレオチドを含む。
【０１２１】
いくつかの実施形態ではリンカー前駆体分子Cの第1の官能基が有機化合物Aの複数の部位と反応して、複数の異性体中間体Dの混合物を形成し、これらは標識分子Bと反応して、複数の異性体標識有機化合物Eを形成する。いくつかの実施形態ではそれぞれが本明細書に記載の方法に従って生成される少なくとも2つの標識有機化合物(または2組の異性体標識有機化合物)を含む標識有機化合物のライブラリーが提供され、ここで、独特の有機化合物は独特の標識で標識される。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、ライブラリーがそれぞれ固有の標識で標識された、少なくとも5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、または500の固有の標識有機化合物(または5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、または500セットの異性体標識有機化合物)を含む。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、固有の標識がユニーク配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【０１２４】
スクリーニング方法
【０１２５】
いくつかの実施形態では、標的分子に結合する有機化合物を同定する方法であって、標識された有機化合物、一組の異性体標識された有機化合物、または本明細書に記載の標識された有機化合物のライブラリーをアッセイし、それらの標識に従って標的に結合する有機化合物を同定することを含む方法が提供される。このようなアッセイは当技術分野で一般的に知られており、例えば、DNA符号化学ライブラリーを用いた小さな有機リガンドの自動スクリーニングについては、HANA DBOOK FOR DNA-ENCODED CHEMISTRY, Goodnow Jr., Wiley, 1 edition(2014)およびDecurtins, W., et al.の第13章および第16章を参照のこと。Nat Protoc. 2016; 11(4):764-80(これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、有機化合物は、本明細書に記載される標識有機分子と試験される標的分子との間の親和性によってスクリーニングされる。試験される標的としては、タンパク質分子、電池、電池オルガネラ(核、ミトコンドリア、ゴルジ、ペルオキシソーム、リソソーム、エキソソームなど)、電池骨格(微小管、中間径フィラメント、ミクロフィラメント)、DNA、RNA、糖、リン脂質分子、リン脂質タンパク質複合体、または上記の複合体などが挙げられる。このようなスクリーニング方法は当技術分野で一般的に知られており、試験される特定の標的などの特定の使用に応じて変化上記。
【０１２７】
ある態様において、標的分子と結合親和性を有する標識有機化合物は、識別のために選択される。いくつかの実施形態において、選択された標識有機化合物はその標識のシーケンシング反応に供されて、コードされたオリゴヌクレオチド配列を解釈し(例えば、サンガー配列決定、第2発電配列決定など)、標的に結合する有機化合物を同定する。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、2つの共役二重結合を有する化合物を同定するための方法が提供される
(1)本明細書に記載のリンカー前駆体分子Cの第1の官能基を、カルベンまたはニトロンまたはフリーラジカル反応条件などの部位非選択的反応条件下で有機化合物Aと反応させて、生成物または生成物Dの混合物を形成し、リンカー前駆体分子Cの第2の官能基は未反応のままである
(2)生成物または生成物Dの混合物を分析することであって、一対の不均化反応生成物の存在は有機化合物Aが2つの共役二重結合を有することを示し、ここで、不均化反応生成物の対は、部位非選択的反応の生成物Dの分子量プラス2である分子量を有する化合物F、および部位非選択的反応の生成物Dの分子量マイナス2である分子量を有する化合物Fを含む。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、2つの共役二重結合のうちの少なくとも1つは、環系(例えば、シクロアルキル環)にある。
【０１３０】
生成物または生成物の混合物は、質量分析と組み合わせた液体クロマトグラフィーなどの当技術分野で一般的に知られている方法によって分析することができる。
【０１３１】
治療方法
【０１３２】
いくつかの実施形態では本明細書で提供されるのはそれを必要とする被検者における疾患または状態の治療に使用するための化合物であり、ここで、疾患または状態は所定の生物学的標的の活性によって調節または影響される。いくつかの実施形態において、化合物は本明細書に記載されるスクリーニング方法によって同定され、場合によりさらに修飾され、例えば、所定の生物学的標的への結合効力を増強する。特定の実施形態では、化合物が本明細書に記載されるような標識有機化合物に由来する。所定の生物学的標的は、タンパク質、酵素、電池、電池オルガネラ(核、ミトコンドリア、ゴルジ、ペルオキシソーム、リソソーム、エキソソームなど)、電池骨格(微小管、中間径フィラメント、ミクロフィラメント)、DNA、RNA、糖、リン脂質分子、リン脂質タンパク質複合体、または上記の複合体などを含むがこれらに限定されない任意のものであり得る。
【０１３３】
特定の実施形態において、所定の生物学的標的は、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ(PARP)である。ポリ(ADP‐ADP-リボース)ポリメラーゼ(PARP)は、DNA修復、ゲノム安定性、プログラム細胞死などの多くの細胞過程に関与するタンパク質ファミリーである。PARP家庭は、PARP1、PARP2、VPARP(PARP4)、タンキラーゼ-1および-2(PARP-5aまたはTNKS、およびPARP-5bまたはTNKS2)、PARP3、PARP6、TIPARP(または「PARP7」)、PARP8、PARP9、PARP10、PARP11、PARP12、PARP14、PARP15、およびPARP16のような17のメンバーを含む。
【０１３４】
特定の実施形態では、所定の生物学的標的はPARP1である。PARP1は一本鎖切断の修復に重要なタンパク質である。PARP1を阻害する薬剤は複数の二本鎖切断を形成させ、BRCA1、BRCA2またはPALB2変異を有する腫瘍ではこれらの二本鎖切断を効率的に修復することができず、腫瘍細胞を死に至らしめる。癌抑制因子PTENを欠く癌細胞の中には、Rad51のダウンレギュレーションのためにPARP阻害剤に感受性を示すものがあるかもしれない。したがって、PARP阻害剤はPTEN欠陥腫瘍に対して有効である可能性がある。
【０１３５】
PARP阻害剤は、癌治療への使用に加えて、脳卒中、心筋梗塞、神経変性疾患の潜在的な治療薬と考えられている。
【０１３６】
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のスクリーニング方法によってPARP1に結合または阻害することができると同定された化合物の治療的に有効な量を被検者に投与することを含む、それを必要とする被検者におけるがん、脳卒中、心筋梗塞、神経変性疾患または炎症を治療するための方法が提供される。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、癌、脳卒中、心筋梗塞、それを必要とする被検者における神経変性疾患または炎症を治療するための方法であって、治療的に有効な量のルテオリン、ナリンギン、ヒエロシド、リキリチン、エピカテキン、エピガロカテキン、ダフネチン、F001、F002、F003もしくはF006、またはそれらの誘導体を被検者に投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、治療的に有効な量のルテオリンまたはその誘導体を被検者に投与することを含む、がん、脳卒中、心筋梗塞、それを必要とする被検者における変性疾患または炎症を治療するための方法が提供される。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、処理を必要とする被検者はがんを有する。いくつかの実施形態において、被検者は、BRCA1、BRCA2、PALB2またはPTENT変異を有するがん細胞を有する。特定の実施形態では、突然変異は不活性化突然変異である。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、被検者が対応する正常細胞と比較してPARPタンパク質を過剰発現するがん細胞を有する。いくつかの実施形態では、PARPタンパク質はPARP1である。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、処理を必要とする被検者が変性疾患を有する。いくつかの実施形態において、神経変性疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、萎縮性脊髄炎、助剤認知症、血管性認知症、およびそれらの組合せからなる群より選択される。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、処理を必要とする被検者は脳卒中を患っている。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、処理を必要とする被検者はパーキンソン病、関節リウマチ、関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、乾癬性関節炎、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、ループス、全身性エリテマトーデス、若年性関節リウマチ、若年性特発性関節炎、グレーブ病性関節炎、グレーブ病、橋本病、アジソン病、セリアック病、皮膚筋炎、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、シェーグレン症候群、I型糖尿病、血管炎、ブドウ膜炎、アテローム性動脈硬化症および強直性脊椎炎からなる群より選択される疾患または状態に関連する炎症を被るが、これらに限定されない。
【０１４３】
「処置」または「処置」は、臨床結果を含む有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチである。有益なまたは所望の臨床結果は以下のうちの1つ以上を含み得る: a)疾患または状態を阻害すること(例えば、疾患または状態から生じる1つ以上の症状を減少させること、および/または疾患または状態の程度を減少させること); b)疾患または状態に関連する1つ以上の臨床症状の発生を遅らせるかまたは停止させること(例えば、疾患または状態を安定させること、疾患または状態の悪化または進行を予防または遅延させること、および/または疾患または状態の広がり(例えば、転移)を予防または遅延させること);および/またはc)疾患を軽減すること、すなわち、臨床症状の退行を引き起こすこと(例えば、疾患状態を改善すること、疾患または状態の部分的または全寛解を提供すること、別の薬物の効果を増強すること、疾患の進行を遅延させること、生活の質を増加させること、および/または条件。
【０１４４】
病気や病態の臨床症状を引き起こすような病気や病態の治療を手段する「予防」または「予防」。いくつかの実施形態では、化合物が危険にさらされているか、または疾病または状態の家族歴を有する被検者(ヒトを含む)に投与されてもよい。
【０１４５】
「被検者」とは、処理、観測または試験の対象であった、または対象となる哺乳動物(ヒトを含む)などの動物をいう。本明細書中に記載される方法は、ヒト治療および/または獣医学的適用において有用であり得る。いくつかの実施形態では、被検者は哺乳動物である。一実施形態では、被検者はヒトである。
【０１４６】
本明細書に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩、互変異性体、立体異性体、立体異性体、プロドラッグ、または重水素化アナログの「治療有効量」または「有効量」という語は症状の改善または疾病の進行の遅延などの治療的利益を提供するために、被検者に投与された場合に治療を実施するのに充分な量を手段する。例えば、治療有効量は限定されるものではないが、PARPタンパク質などの所定の生物学的標的の疾患または状態の症状を減少させるのに十分な量であり得る。治療有効量は被検者、および治療される疾患または状態、被検者の体重および年齢、疾患または状態の重症度、および投与方法に依存して変化し得、これは当業者によって容易に決定され得る。
【０１４７】
本明細書に記載の方法は、in vivoまたはex vivoで細胞集団に適用することができる。個体内の「インビボ」手段は動物またはヒト内のように、生きている個体内で、この文脈において、本明細書に記載される方法は、個体内で治療的に使用され得る。「エクスビボ」手段が生きている個体外で使用され得る。ex vivo細胞集団の実施例としては、in vitro細胞培養物、および個体から得られた流体または組織サンプルを含む生物学的サンプルが挙げられる。このような試料は、当技術分野で周知の方法によって得ることができる。例示的な生体液試料には、血液、脳脊髄液、尿、および唾液が含まれる。この文脈において、本明細書中に記載される化合物および組成物は、治療目的および実験目的を含む、種々の目的のために使用され得る。例えば、本明細書中に記載される化合物および組成物は所定の適応症、細胞型、個体、および他のパラメーターについて、本開示の化合物の投与の最適なスケジュールおよび/または投薬を決定するために、ex vivoで使用され得る。このような使用から収集された情報は実験目的のために、または臨床において、インビボ処置のためのプロトコールを設定するために使用され得る。本明細書中に記載される化合物および組成物が適し得る他のex vivo使用は、以下に記載されるか、または当業者に明らかになる。選択された化合物は、ヒトまたは非ヒト被検者における安全性または耐性投薬量を試験するためにさらに特徴付けられ得る。このような特性は、当業者に一般的に公知方法を用いて調べることができる。
【０１４８】
前記の反応規準のいずれかにおける改善は、本開示の方法によって具体的に提供される。
【実施例】
【０１４９】
以下の実施例は、本開示の特定の実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示される技術は本開示の実施において良好に機能する技術を表し、したがって、その実施のための特定の形態を構成すると考えることができることを当業者は理解されたい。しかしながら、当業者は本開示に照らして、開示された特定の実施形態において多くの変更を行うことができ、それでも、本開示の精神および範囲から逸脱することなく、同様のまたは同様の結果を得ることができることを理解すべきである。
【０１５０】
（実施例１）
【化７】
2021530235.tif 000013
化合物1(200mg)を10mLのジクロロメタンに溶解し、次いで化合物2(200mg)、EDCI(416mg)およびDMAP(10mg)と撹拌しながら混合した。室温で3時間撹拌した後、混合物をジクロロメタンで抽出し、食塩水で洗浄し、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーで精製して、リンカーI(210mg、70.4%)を生成した。1 H NMR (500MHz、クロロホルム-d)δ7.82(d、J = 8.5Hz、2H)、7.25(d、J = 8.2Hz、2H)、6.63(s、1H)、3.79〜3.62(M、6H)、3.45〜3.36(M、2H);C13 H9 F3N6 O2について計算したHRMS-ESI(M/z)[m + H]+、343.1130、実測値、343.1133。
【０１５１】
（実施例２）
【化８】
2021530235.tif 000014
化合物3(200mg)をジクロロメタン10mLに溶解し、次いで化合物2(513mg)、EDCI(405mg)およびDMAP(10mg)と撹拌しながら混合した。室温で3時間撹拌した後、混合物をジクロロメタンで抽出し、食塩水で洗浄し、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製して、リンカーII(283mg、75.6%)を生成した。1 H NMR (500MHz、クロロホルム‐d)δ5.93(s、1H)、3.72〜3.66(M、2H)、3.57(t、J = 5.0Hz、2H)、3.48(t、J = 5.1Hz、2H)、3.41〜3.35(M、2H)、2.06〜1.98(M、2H)、1.82〜1.67(M、2H)、1.03(s、3H);C9 H17 N6 O2について計算したHRMS‐ESI(M/z)[m + H]+、241.1413、found、241.1417。
【０１５２】
（実施例３）
【化９】
2021530235.tif 000015
化合物4(50mg)を5mLのジクロロメタン5mLに溶解し、次いで化合物5(25μL)、HATU(150mg)およびDIPEA(138μL)と混合し、室温で3時間撹拌した後、混合物をジクロロメタンで抽出し、食塩水で洗浄し、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製して、リンカーIII(49mg、79.1%)を得た。1 H NMR (500MHz、クロロホルム-d)δ7.81(d、J = 8.5Hz、2H)、7.26(d、J = 8.5Hz、2H)、6.23(s、1H)、4.26(dd、J = 5.2、2.6Hz、2H)、2.30(t、J = 2.6Hz、1H)。HRMS-ESI (M/z)[M + H]+は、C12 H9 F3 N3 O, 268.0698, found, 268.0699 に対して計算された。
【０１５３】
（実施例４）
【化１０】
2021530235.tif 000016
3-(2-アジドエチル)-3-メチル-3H-ジアジリン(リンカーIV)を、Liangら(Angew Chem Int Ed Engl(2017)56(10):2744-2748)に従って、溶媒N, N-ジメチルホルムアミドをアセトニトリルでスイッチングすることによって調製した。1 H NMR (500MHz、クロロホルム-d)=1.05(s、3H)、1.60(t、2H、J = 5.4Hz)、3.18(t、2H、J = 5.4Hz)。
【０１５４】
（実施例５）
【化１１】
2021530235.tif 000017
オリドニン(2mg、0.0054mM)を1mLのジクロロメタンに溶解し、二官能性リンカーI(3.3mg、0.011mM)と混合した。室温で3時間紫外線(365nm)を照射して、MS(ESI(M/z)[M + H]+)679.27を有する少なくとも5つの異性体生成物を混合物オリドニンリンカーI複合体を生成した(図1)。
【０１５５】
（実施例６）
【化１２】
2021530235.tif 000018
最初のDNA 7(50μL、ホウ酸緩衝液(pH 9.4)中の1mM)を、500μLチューブ中の渦を介して化合物6(5μL、DMSO中の200mM)と混合し、次いでローテーターで10時間回転させた。混合物に5M NaCl(5.5μL)、続いてエタノール(160μL)を添加した。内容物を短時間ボルテックスし、フリーザー中で-20℃で20分間インキュベートした。次いで、懸濁液を1万×gで5分間遠心分離し、上清を廃棄し、微量のエタノールを真空下で除去した。ペレットをH2 O(50μL)に溶解して、化合物8の1mM溶液を作製した(図2)。
【０１５６】
（実施例７）
【化１３】
2021530235.tif 000019
化合物8(20μL、H2 O中1mM)をリンカーI(4μL、100mM)、硫酸銅(II)五水和物(4μL、100mM)、アスコルビン酸ナトリウム(4μL、200mM)およびTHTPA(4μL、100mM)と混合した。混合物をボルテックスで混合し、続いて回転体上で5時間回転させた。次に、混合物に5M NaCl(3.6μL)、続いてエタノール(100μL)を加えた。内容物を短時間ボルテックスし、-20℃で20分間インキュベートした。次いで、懸濁液を1万×gで5分間遠心分離し、上清を廃棄し、微量のエタノールを真空下で除去して標識化合物9を生成した(図3)。
【０１５７】
（実施例８）
【化１４】
2021530235.tif 000020
化合物8(20μL、H2 O中1mM)を、オリドニン-リンカーIコンジュゲート(4μL、100mM)、硫酸銅(II)五水和物(4μL、100mM)、アスコルビン酸ナトリウム(4μL、200mM)およびTHTPA(4μL、100mM)と混合した。混合物を渦により混合し、回転体機上で5時間回転体させた。次に、混合物に5M NaCl(3.6μL)、続いてエタノール(100μL)を加えた。混合物を短時間ボルテックスし、-20℃で20分間インキュベートした。次いで、懸濁液を1万×gで5分間遠心分離し、上清を廃棄し、微量のエタノールを真空下で除去して標識化合物10を生成した(図4)。
【０１５８】
（実施例９）
【化１５】
2021530235.tif 000021
オリドニン(2mg、0.0054mM)をアセトニトリル1mLに溶解し、次に二官能性リンカーII(2.6mg、0.011mM)と混合した。紫外線(365nm)を室温で3時間照射して、MS(ESI(M/z)[M + H]+)577.3を有する少なくとも5つの異性体化合物を混合物オリドニン-リンカーII結合体化合物を生成した(図5および図6)。
【０１５９】
（実施例１０）
【化１６】
2021530235.tif 000022
セレストロール(2mg、0.0044mM)を1mLのアセトニトリルに溶解し、次いで二官能性リンカーII(2.1mg、0.009mM)と混合した。紫外線(365nm)を室温で3時間照射して、MS(ESI(M/z)[M + H]+)が663.38の異性体化合物を少なくとも3種含むセレストロール-リンカーII複合体を生成した(図7および図8)。
【０１６０】
（実施例１１）
【化１７】
2021530235.tif 000023
タキソール(2mg、0.0047mM)をアセトニトリル1mLに溶解し、次いで二官能性リンカーII(2.3mg、0.0094mM)と混合した。紫外線(365nm)を室温で3時間照射して、MS(ESI(M/z)[M + H]+)が1066.46の異性体化合物を少なくとも3種含むタキソール-リンカーII複合体を生成した(図9および図10)。
【０１６１】
（実施例１２）
【化１８】
2021530235.tif 000024
トリプトフェノリド(2mg、0.0064mM)を1mLのアセトニトリルに溶解し、次いで二官能性リンカーII(3.1mg、0.0128mM)と混合した。混合物を、室温で3時間、紫外線使用して照射し、トリプトフェノリドリンカーII共役を生成した(図11および図12)。
【０１６２】
（実施例１３）
【化１９】
2021530235.tif 000025
メイタンシノール(4mg、0.0071mM)をアセトニトリル1mLに溶解し、次いで二官能性リンカーII(3.4mg、0.0142mM)と混合した。紫外線(365nm)を室温で3時間照射して、777.3のMS(ESI(M/z)[M + H]+)を有する少なくとも2つの異性体化合物を混合物メイタンシノール-リンカーIIコンジュゲートを生成した(図13および図14)。
【０１６３】
（実施例１４）
【化２０】
2021530235.tif 000026
アビエチン酸(2mg、0.0066mM)を1mLのアセトニトリルに溶解し、次いで二官能性リンカーII(3.1mg、0.013mM)と混合した。混合物に紫外線室温で3時間照射した。2つのタイプのコンジュゲートを生成した(513.37のMS(ESI(M/z)[M + H]+)を有するデヒドロアビエチン酸リンカーIIコンジュゲート(A)、および517.40のMS(ESI(M/z)[M + H]+)を有するヒドロアビエチン酸リンカーIIコンジュゲート(B))。(図15および図16)。
【０１６４】
（実施例１５）
オリゴヌクレオチドとの反応:化合物6および7を、リガーゼを用いてオリゴヌクレオチドと連結した。ヘッドピース-DNA共役4を感光性リンカー2と混合した。混合物に紫外線時間照射した。産物をオリゴヌクレオチドと連結し、バンドを塗抹し、複数の連結産物が生成したことを示した(図17)。
【０１６５】
（実施例１６）
標識として使用することができるオリゴヌクレオチドには、一本鎖DNA(ssDNA)、二本鎖DNA(dsDNA)、一本鎖RNA(ssRNA)、二本鎖RNA(dsRNA)、化学修飾オリゴヌクレオチド、およびアンチセンスRNA(asRNA)などのいくつかの機能種が含まれる。
【０１６６】
標識のためのいくつかのオリゴヌクレオチドの例の配列を以下に列挙する:
ssDNA: 5'-AATAAATT、5'アミノ修飾
ssRNA: 5'AUUUAUUUU、5'アミノ修飾
ssDNA: 5'-AATAAATT、3'アミノ修飾
ssRNA: 5'AUUUAUUUU、3'アミノ修飾ssDNA: 5'-AAATAAATT、ホスホロチオエート結合で修飾された5'アミノ(ヌクレアーゼによる分解に抵抗性)。
ssDNA: 5'-GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG、ホスホロチオエート結合で修飾された5'アミノ(ヌクレアーゼによる分解に抵抗性)。
【０１６７】
（実施例１７）
DNAコード化学ライブラリー(DEL)は、組合せ最適化を介して遺伝学および化学合成の力を結びつける。コンビナトリアルケミストリーにより、DELは、生物学的および医薬品研究のためのリッチ化学的多様性を提供する、前例のない規模の数十億から数兆まで成長することができる。ほとんどの場合、分子レベルでは多様性がDNA両立化学反応の利用可能な構成単位に限定されるが、現在、現代の化学的方法が多様性を増加させるために使用されている。DELアプローチを十分に活用するために、遺伝学の力を化学構造に直接結びつけることは、有限の化学世界において、さらに大きな多様性を提供するのであろう。天然産物はそれらの生物学的進化と共に、信じられないほどの構造的多様性を進化させてきた。
【０１６８】
以下は天然産物、FDA承認薬物、臨床試験における化合物、およびコンビナトリアル合成からの化合物を使用する、例示的なDNAコード化学ライブラリー(DEL)を提供し、これは、本明細書中に記載される方法に従って調製された。以下の実施例において、揮発性二官能性リンカー(リンカーIV)は、自動パラレル合成器上での「ポッティング」反応を可能にした。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は以下の基準を示す:(1)部位選択性、(2)化学非選択的、(3)生物学的両立(例えば、DNA両立)、および(4)小さい反応規模(例えば、マイクログラム)と両立である。従来の化学選択的反応は空間的遮蔽の試験結果として、1つの特定の原子上の天然産物を改変し、目的タンパク質の機能を調節する電位結合ポケットが見逃され得る。化学および部位非選択的反応を用いて、全てのアクセス可能原子を標的とする後期段階改質方法を設計した。このような後期段階の修飾は特異なDNAタグを有する異性体のクラスターを生じ、これは目的タンパク質への複数の立体アクセシビリティーを提供した。
【０１７０】
一般的な方法
【０１７１】
全ての市販の有機化合物およびDNAヘッドピース(HP-NH2、5'-/5phos/GAGTCA/iSp9/iUniAmM/iSp9/TGACTCCC-3')は特に断らない限り、市販の供給源から入手した。特に明記しない限り、全ての市販の試薬および溶媒を、さらなる精製なしで使用した。NMRスペクトルは、Bruker AM-500 NMR分光計で記録した。化学シフトをδ(ppm)として報告し、カップリング定数をJ(ヘルツ)として報告した。テトラメチルシラン(TMS)を1 H NMRの内部参照として使用し、CDCl3 を13 C NMR(δ77.0ppm)の内部参照として使用した。質量スペクトルは、AB SCIEX 4600質量分析計またはwaters SQD 2質量分析計で記録した。リンカーIVを実施例4に従って調製した。
【０１７２】
リンカースクリーニング
【０１７３】
本明細書中に記載されるような種々の二官能性リンカーを試験して、天然産物のためのハイスループットDNAアノテーション方策を開発した。リンカー上の官能基の反応性は直交性であり、ここで、一方の端子は化学および部位非選択的反応のために設計され、他方は本明細書に記載されるように、銅(I)触媒アジド-アルキン環状付加(CuAAC)を介してDNAタグを結合させるために使用された。
【０１７４】
例示的な二官能性リンカーを、モデル基質としてオリドニンを使用して試験し(表1A)、ここでオリドニン(1当量)および二官能性リンカー(2当量)をアセトニトリルに溶解し、室温でUV照射に供した。
【０１７５】
表1Aに示すように、3-(トリフルオロメチル)-3H-ジアジリン-3-イル含有リンカーIIIは、(オリドニン濃度に基づいて)20%の収率で3つの異性体を生じた。3‐メチル‐3H‐ジアジリン‐3‐イル含有リンカーIIは6標識オリドニン異性体を69%の標識効率で与え、そのうちの2つは2分子のリンカーIIで標識したオリドニンを有する。3‐メチル‐3H‐ジアジリン‐3‐イル含有リンカー、3‐(2‐アジドエチル)‐3‐メチル‐3H‐ジアジリン(リンカーIV)は1つの異性体を生成した。リンカーIVとオリドニンとの間の反応終了後、未反応リンカーIVおよび/またはリンカーIVの副産物を、1 H-NMRによって示されるように減圧によって除去した。
【０１７６】
【表２】
2021530235.tif 000027
乾燥アセトニトリル0.5mL(0.1mM)中のオリドニンのaに、相対二官能性リンカー1mL(0.1mM)を添加し、得られた混合物を365 nMランプで30分間照射し、次いで混合物をLC-MSによって分析した。
bオリドニンは1つのリンカーで標識した。
cオリドニンは2つのリンカーで標識した。
d応答なし。
【０１７７】
表1Bに示すように、リンカーIVと2,4-ジヒドロキシアセトフェノンとを5当量の濃度で反応させることにより、リンカーIVはアジド官能基と反応しなかった。図18に示すように、反応終了後、未反応のリンカーIVおよび/またはリンカーIVの副生成物は1 H-NMR(矢印で同定されたリンカーIV-2,4-ジヒドロキシアセトフェノンコンジュゲート)によって示されるように、減圧によって容易に除去された。微量の残存リンカーIVは、CuAACベースのクリック化学および酵素DNA連結を介するその後のDNA結合との干渉を有さないことが示された。
【０１７８】
表1B. リンカーIVの標識効率
【０１７９】
【化２１】
2021530235.tif 000028
【０１８０】
【表３】
2021530235.tif 000029
乾燥アセトニトリル0.5ml(0.1mM)中の2,4-ジヒドロキシアセトフェノンのaに、相対量の二官能性リンカーIVを添加し、得られた混合物を365 nMUVランプ分間照射し、次いで混合物をLC-MSおよび1 H NMRによって分析した。
b2,4-ジヒドロキシアセトフェノンは1つのリンカーIVで標識した。
c2,4-ジヒドロキシアセトフェノンを2つのリンカーIVで標識した。
【０１８１】
表2に示すリンカー結合体を、リンカーIVを用いて調製した。
【０１８２】
[表４]

a収率を液晶によって測定した。
b標識異性体をLCおよびMS-MSによって決定した。
【０１８３】
スキーム2は、薬剤および天然産物と反応するためにDMTMMによって促進されるアミドカップリングケミストリーによるプロピン-(PEG)5 -CH2 CH2 COOHからのプロピン-HP-DNAの調製を示す。
【０１８４】
反応図式2:プロピン-HP-DNAの合成
【０１８５】
【化２２】
2021530235.tif 000030
【０１８６】
反応式2において、pH 9.5のホウ酸ナトリウム緩衝液(250mM)中のHP-DNA(1mM)を、40当量のプロピン-(PEG)5-CH2 CH2 COOH(DMF中200mM)、続いて50当量のDMTMM(水中200mM)を添加した。室温で18時間撹拌した後、反応混合物に5M NaCl溶液(10容量%)および冷エタノール(2.5倍容量、エタノールを-20℃で保存)を加えた。混合物を-80℃で30分以上貯蔵した。その後、混合物を12000rpmの微量遠心機中で4℃で15分間遠心分離した。上清を除去し、ペレットを最終濃度1mMまで水に溶解し、さらに精製することなくクリックカップリング反応の次の工程に直接使用した。計算正確質量: 5267.07。実測質量: 5266.46。
【０１８７】
二官能性リンカーIVを使用する種々の薬物の標識のための一般的な手順は、スキーム3において以下の通りである。スキーム3において、NPは薬剤または天然産物であり、プロピン-HP-DNAは上記の通りである。表3および表4の化合物は、これらの方法を用いて調製した。
【０１８８】
スキーム3:リンカー-IV共役および標識化合物の合成
【０１８９】
【化２３】
2021530235.tif 000031
【０１９０】
簡潔には、CH3 CN(100μL)を、各ウェル中の化合物(1μmol)およびリンカーIV(5μmol)を含む96ウェルプレートの各ウェルに添加した。プレートを、UV下、365nmの波長で30分間、室温で照射した。生成物および収率をLC-MSによって評価した。CH3CNは相対NP-N3を生成するために、一晩、空中で揮発された。その後、化合物(NP-N3)をDMSO(30μL)に溶解し、プロピン-HP-DNA(10μL、水中1mM)、THPTA(10μL、DMSO中80mM)、CuSO4・5H2 O(10μL、水中80mM)およびアスコルビン酸ナトリウム(20μL、水中80mM)と混合した。得られた混合物を室温で一晩振盪し、反応終了時に生成物および収率をLC-MSによって評価した。その後、スカベンジャーナトリウムジエチルジチオカルバミン酸(12μL、水中160mM)を添加した。次いで、全てのHP-DNA結合化合物(NP-HP-DNA)を収集し、5M NaCl溶液(10容量%)および冷エタノール(2.5倍容量、エタノールを-20℃で保存)を添加した。混合物を-80℃のフリーザー中で30分以上貯蔵した。混合物を、12000rpmの微量遠心機中で4℃で15分間遠心分離した。上清を除去し、ペレットを水に溶解した。
【０１９１】
DNA符号化は、本明細書に記載のように「ポッティング」段階的合成を用いて96ウェルプレート中で行った。表3および表4に示す薬物-リンカーIV結合体および標識化合物を、上記の手順に従って調製した。合計110個のDNAコードされた最終産物が得られた(表4)。化合上記番号17、25、74、82、108、91、99、および114などの、水酸基、カルボキシル、アミンなどの1つまたは複数を含む複数の官能基を有する化合上記については同じ分子量を示す異なる保持時間でHPLC画分によって示されるように、DNA共役が複数の部位で容易に生じたが、単一官能基を有する化合上記についてはシングルサイトでのDNA共役が一般に観察された。
【０１９２】
[表５]
【０１９３】
[表６]
（実施例１８）
コンビナトリアル合成建設
【０１９４】
DNAコード化学ライブラリー(DEL)を単一の試験管でスクリーニングできるという事実を利用するために、後期変性反応によって合成された選択DELを、スクリーニングのためにDELライブラリーフォーマットに組み込んだ。この目的のために、後期段階の注釈付きDEL(臨床試験における、伝統的な中国医学天然産物(TCM)、FDA承認薬物、および対照化合物を含む)と、大きさが104の小さなコンビナトリアルDELライブラリーの両方を調製し、次いで1:10の比率(単一化合物濃度)で組み合わせた。炭酸脱水酵素II(CAII)、カルゼニドおよびブリンゾラミドの2つの既知の阻害剤を使用して、後期段階標識DELの濃縮に対する異なる混合比の効果を試験した。2つのCAIIインヒビターを最初にコードし、0.05 pM、0.5 pM、および5 pMの最終濃度で104コンビナトリアルDEL(0.5 pM /分子)中にスパイクした。0.05 pM濃度の後期標識DEL(1:10比)の混合は、ブリンゾラミドおよびカルゼニドについてそれぞれ300倍および410倍の最も高い濃縮を示した(表5)。
【０１９５】
表5:炭酸脱水酵素バインダー選択のための濃縮倍率
【０１９６】
【表７】
2021530235.tif 000032
【０１９７】
スパイクされた天然産物-DNAコンジュゲーションの量を、定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)によって定量し、次いで、示された比率でDELライブラリーと混合した。パイロットDELライブラリーは、6個のアミン-(PEG)n-酸(構成単位1)、46個のアミノ酸(構成単位2)、および46個のカルボン酸(構成単位3)のカップリングによって構築された12696個の化合物を含む。
【０１９８】
DNAを符号化するフレームワークは、ヘッドピースの構造および文献中の他のバー符号化に基づいて設計された。ヘッドピースはDNAヘッドピース(5'-/5 phos/GAGTCA/iSp9/iUniAmM/iSp9/TGACTCCC-3')である。DNAオリゴバーコードを、ライゲーション緩衝液およびT4 DNAリガーゼ(NEB、カタログ番号Z1811S)中で酵素的にライゲーションした。反応混合物を16℃で16時間インキュベートし、LCMSおよびゲルによって分析した。配列決定プライマーは5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGおよび5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTCGTGATGTGACTGGAGTTCであり、そして一般的なスキームは、図19に示されるとおりである。
【０１９９】
hisタグ融合組換えヒトPARP-1(Sino Biological、カタログ番号11040-H08B)およびヒト-HSP70(Sino Biological、カタログ番号11660-H07H)は、市販供給源から入手した。これらの2つの可溶性タンパク質のパニング手順は同じであった。5 μgの標的タンパク質を、Ni荷電MagBeads(GenScript、カタログ番号L00295)、5 nM DELライブラリーおよび10μg/mLサケ精子DNAと混合した。最終容量を100μLに調整した。混合物を室温で1.5時間回転させた。0.05% Tween-20(PBST)を補充したリン酸緩衝生理食塩水で5回洗浄した後、目的タンパク質結合化学DNA共役を、50μLの溶出緩衝液(20mM Tris、pH 7.4、100mM NaCl)中、95 o℃で10分間加温することによって溶出した。溶出したDEL化合物を、Takara PrimerSTAR Max DNAポリメラーゼ(Takara、カタログ番号R045A)を用いたPCRによって増幅した。次に、過剰のプライマーをHieff NGSTMスマートDNAクリーニングビーズ(Yeasen、カタログ番号12600ES03)によって除去し、4% DNAアガロースゲル上で評価した。増幅産物を、Illumina HiSeq X10 Analyzerを用いたハイスループット配列決定に供した。アフィニティー選択および異なるターゲットのためのオリゴヌクレオチドタグのPCR増幅を表6にまとめた。
【０２００】
【表８】
2021530235.tif 000033
1. Sino Biological, Cat. #11660-H07H
2. Sino Biological, Cat. #11040-H08B
3. GenScript, Cat. #L00295
4. タカラ、カタログ番号R045A
【０２０１】
コンビナトリアル化学ライブラリーは、第1、第2、および第3の構成単位ライブラリーについてそれぞれ6、46、および46の化学構成単位を含む3つの構成単位サブライブラリーによって構築した。各構成単位は10塩基対(bp)のDNA配列によりコードされていた。天然産物は、コンビナトリアル化学ライブラリーDNAコードと同じ長さの30bpのDNA配列によってコードされた。これらの3つのサブライブラリー間の全ての可能な組み合わせ(コンビナトリアル化合物)は、12696のDNAをコードする配列を含む参照DNAをコードするライブラリーを作製した、社内のjavaプログラムによって作製した。配列決定後、DNAコード配列の周りのIlluminaアダプターを、CLCゲノミクスワークベンチバージョン12(Qiagen)によってトリミングした。左側のDNAコード配列は、3回の「分割プール」反復において、構成単位の3つのDNA配列に対応する30bpの長さであった。各サンプルについて、DNAコード配列を、化合物ライブラリーをコードする参照DNAにマッピングした。マッピングにおいて不整合は許容されなかった。コード配列を、異なる試料にわたる全ての化合物についてカウントした。所与の試料中の全ての化合物の合計読取りカウントを計算した。各個別化合物の読み取りカウントを合計数で割り、100000の定数を掛けた。
【０２０２】
[数1]
2021530235.tif 000034
【０２０３】
参照ライブラリーと比較した後選択ライブラリー中の各化合物の倍率変化を計算した。例えば、サンプルAおよび参照ライブラリーを比較した場合、化合物Mの変化倍率は、以下のように計算された:
【０２０４】
[数2]
2021530235.tif 000035
【０２０５】
nDELスクリーニングのヒット基準は、正規化濃縮倍率値(y軸)および深い配列決定読み取りカウント(x軸)の両方を考慮に入れる。10未満の読み取りカウントを有する化合物は信頼できないと考えられ、したがって、オンターゲットスクリーニングの前にDELから直ちに排除される。各DELライブラリーについて、目的タンパク質の非存在下でベースライン濃縮倍率を記録し、ライブラリー中の各DEL化合物について正規化濃縮倍率値を計算することができる。ヒット同定のためのカットオフは、ライブラリー全体の濃縮倍数(μ)+標準偏差(σ)の3倍の平均値の合計で非常に多様なデータ集団の単純化された統計分析に基づく。μ+3σを超える濃縮倍数を示す任意のDEL化合物をヒットとみなす。
【０２０６】
PARP-1 酵素アッセイ。
【０２０７】
PARP-1 オートリボシル化に基づくアッセイ(BPS、カタログ番号80580)を、提供されたプロトコールに従って行った。化合物をDMSOに溶解した。種々の範囲の化合物を有するタンパク質を予備インキュベーションすることによって、室温で15分間、異なる化合物(DMSOの最終濃度は、すべての試料において1%であった)に依存して、実験反応を3回繰り返して設定した。次に、ADP-リボシル化反応物を、基材被覆アッセイプレート中で2倍希釈することによって調製し、室温で1時間インキュベートした。マイコプレートリーダー(EnVision, PerkinElmer)を用いて化学発光を検出した。得られたデーターを、GraphPadを用いてシングルサイト用量反応モデルに適合させ、実験例IC50値を抽出した。報告された誤差は、各実験についての適合パラメータの標準誤差を表す。
【０２０８】
分子モデル
【０２０９】
in silicoでの分子ドッキングを用いて、PARP1の触媒ドメイン(残渣660〜1011)に対するルテオリンの可能な結合様式を調べた。PARP1(PDB 4pjt)およびリガンド調製のためにAutoDock Tools(版4.2.6)を使用して、pdbqtファイルを生成した。PARP1 PDBファイルから水分子およびインヒビターを除去し、極性水素およびガスタイガー部分電荷を添加した。x, y,z軸で60×60×40点の格子と0.375Åの空間がインヒビター結合部位の中心にあった。合計200回の実験を、最大250万回のエネルギー評価で行った。結合の最低自由エネルギーを有するルテオリン結合様式を、さらなる分子動力学シミュレーションのために選択した。
【０２１０】
ルテオリン分子の分子動力学シミュレーションのためのパラメータおよびトポロジーは、半経験的量子化学プログラム(SQM)および一般化アンバー力場(GAFF)を用いて、ANTECHAMBERソフトウェアおよびACPYPEスクリプトによって導かれた。ルテオリン‐PARP1錯体を短エネルギー最小化し、続いて100ns分子動力学シミュレーションを行い、錯体の相互作用を緩和し、構造を安定化した。Gromacs 4.6.7パッケージおよびAmber14ffSB力場を用いてシミュレーションを行った。システムを、生理学的イオン強度を模倣するために、0.13 MのCl-およびK+イオンを含む全原子TIP3P水で溶媒和した。Berendsenサーモスタットとバロスタットを用いて、温度Tと圧力Pをそれぞれ300 Kと1atmに一定に保った。高速平滑粒子‐メッシュEwald加算を長距離静電相互作用に使用し、直接的な相互作用のカットオフは1.0nmであった。PARP-1残基は、化学物質とのそれらの距離が分子動力学弾道に沿った時間の90%を超える間、3.0オングストロームのカットオフ未満である場合、Leutolinと安定に相互作用すると考えられる。これらの残基を表7に列挙する。
【０２１１】
【表９】
2021530235.tif 000036
【０２１２】
熱ショック70kDa(HSP70)蛋白質およびポリ[ADP-リボース]ポリメラーゼ1(PARP1)に対するnDELのスクリーニング
【０２１３】
異なる細胞位置および生物物理学的特性を有する2つの標的タンパク質を、nDEL画面において使用した。これらには細胞質ゾル中のHSP70および核中のPARP1が含まれ、これらの各々は小分子リガンドに対して異なる親和性嗜好を有する。これらの標的のための既知の機能的バインダーは内部陽性対照としてnDELに含まれ、例えば、HSP70のためのオリドニンおよびPARP-1のためのポーラパリブの誘導体(F001、F002、F003およびF006)であった。nDEL中のDNAバーコードの不均一な分布を説明するために、目的タンパク質の非存在下であるが固定化マトリックスビードの存在下でのnDELのブランク画面を最初に行い、続いて深い配列決定を行って、ライブラリー中のバーコードのベースライン分布を確立した。全てのスクリーニングデータを、Decurtinsら、Nat Protocによって記載される方法を使用して分析した。2016; 11(4): 764-80. 各nDEL化合物の対応するDNA配列を、その配列決定カウントに基づいて集計した。濃縮倍率は、目的タンパク質の存在下および非存在下での正規化配列決定カウントの比として計算される。濃縮倍率を以下の表に示す。
【０２１４】
【表１０−１】
2021530235.tif 000037
【表１０−２】
2021530235.tif 000038
【０２１５】
【表１１】
2021530235.tif 000039
【０２１６】
nDELのスクリーニングフィンガープリントを、図20に示すように、濃縮倍数対正規化配列決定カウントとしてプロットし、内部参照として既知のバインダーを使用して、nDELスクリーニングのヒットを、陽性対照化合物の濃縮倍数に基づいて同定した。
【０２１７】
nDELスクリーニングを、HSP70およびPARP-1の精製ヒトタンパク質に対して行った。親和性捕捉nDELは、深部配列決定および解読分析に被検者であった。成績を表9にまとめた。全ての対照化合物をnDELスクリーニングで濃縮し、ヒット率は0.15%〜0.47%の範囲であった(図20)。HSP70について観察されたより高いヒット率は、HSP70タンパク質の粘着性と関連し得る。最初の2つの画分を回収し、2つの独特なDNA配列N055およびN056でコードした。特に、オルトリオン標識化合物N055およびN056の2つの立体異性体は、それぞれ5.3倍および2.3倍濃縮され(図20(a)および表8A)、異なる立体異性体に対するHSP70の構造的嗜好を示した。
【０２１８】
【表１２】
2021530235.tif 000040
【０２１９】
PARP-1スクリーニングでは、34個のnDELが濃縮され(図20(b))、そのうちの4個は陽性対照化合物を含んでいることが確認された(図21)。nDEL中の公知化合物を用いた内部制御は、リアル陽性ヒットの選択を大いに可能にするようであった。興味深いことに、類似の構造を有するフラボノイドが濃縮化学物質中にクラスター化され、特に、TCM化合物、ルテオリンおよびそのグリコシル酸類似体ナリンギンおよびハイパーオシドも選択された。
【０２２０】
PARP-1酵素阻害におけるnDELヒットの生化学的特徴
【０２２１】
PARP-1, 癌治療における検証済みの標的はNAD+から受容体タンパク質へのADP-リボースフラグメントの迅速な移動を触媒し、自体は、DNA損傷および修理の細胞シグナルに応じて、タンパク質結合線状および分岐ホモ-ADP-リボース重合体の形成をもたらす。酵素活性を、剪断DNAの存在下でのPARP-1の自己リボシル化に基づいて測定した。
【０２２２】
濃縮nDELの阻害活性をPARP‐1自己リボシル化アッセイにより特性化した。陽性対照ポーラパリブの誘導体であるF003は、2.5 nMのIC50で強力なPARP-1阻害を示した(図22(b))。TCM nDEL、ルテオリンはPARP‐1の酵素活性を7.5μMのIC50で阻害した(図22(a))。PARP-1とルテオリンとの間の相互作用を理解するために、分子モデリングに基づく一連のインシリコ分析を行った。分子ドッキングを使用することによって、最低自由エネルギー結合様式において、ルテオリンがPARP-1の触媒ドメインを占めたことが見出された。このモードの安定性をさらに評価し、相互作用の分子の詳細を理解するために、予測ドッキングモデルから出発して、100 nsの分子動力学シミュレーションを行った。複合体はシミュレートされた時間ウィンドウにおいて安定であるように見え、タンパク質中のいくつかの残基はルテオリンと実質的な期間相互作用した。特に、D766、H862、Y896およびE988は、シミュレートされた弾道の90パーセントを超える間、ルテオリンとの接触を維持した。PARP-1の触媒部位におけるルテオリンはG863、E988およびD766残渣の側鎖と形成される水素結合のために安定化されているよい、これらはまた、NAD+結合における重要な残渣である(図22(c))。
【０２２３】
議論
【０２２４】
DELは、DNAの存在下で複数の複雑な変態を必要とする反復過程であるスプリットプール合成を含むコンビナトリアル方法を用いて合成した。天然産物のような高度に複雑な立体構造を有する化合物は、それらの合成がより洗練された化学変換を必要とするので、通常、DELに含まれない。経時的な自然の選択と、多数を使用するDELの選択との相対的な利点は、まだ決定されていない。しかしながら、今回の研究は、単一の試験管内で両方のシステムを同時に研究する方法を初めて提供する。同一の環境条件下でDEL画面を使用可能にすることにより、異なるDELおよびそれらの用途に対するより多くの洞察が提供された。さらに、nDELでは目的タンパク質の公知のバインダーまたはインヒビターが内部制御として役立ち得、これはDELスクリーニングにおける確認速度およびヒット選択を大幅に改善する。重要なことに、天然産物は単一の目的に向かって進化した可能性があり、他の目的には有用でない可能性がある。nDELの使用は、標的を潜在的なリガンドの膨大なコレクションに曝すことによって、この制限を克服する。
【０２２５】
本明細書に記載されるプロトコルの特別な特徴は、DNAと有機化合物との間の揮発性リンカーの使用である。不完全な化学合成および望ましくない副生成物はDEL画面を損ない得る(例えば、過剰のリンカーが生物学的標的と反応し得る)ことが実証されている。揮発性リンカーは未反応リンカー分子の容易な除去を可能にし、その結果、複数の反応を、リンカーの修飾に関する懸念なしに、単一のサンプル中で実行することができる。従って、その後の分析はリンカー修飾によって混乱されない。ジアジリンの標識効率は、多くの天然産物のC-H結合へのカルベン挿入が問題となり得るので、種の化合物、特にC-Hのみの化学物質について低いことが見出された。nDELアプローチを拡張するために、新しい後期段階改質方法が必要である。4‐((トリメチルシリル)エチニル)フェニルスルファメートと7‐アジド‐1,1‐ジフルオロヘプタン‐1‐スルフィナートにより生成したニトレンと炭素ラジカルのC‐H挿入は、補完ツールとして非常に有望であった。これらの修飾はまた、単一の官能基を有する化合物においてさらなる幾何異性体を生成するための代替的な標識方法として役立ち得る。
【０２２６】
開発の初期段階にもかかわらず、限られた数のnDELは、異なるカテゴリーの標的に対するヒット同定において有望な可能性を既に示した。PARP-1酵素の阻害剤としてのルテオリンの発見は、nDELの力を強調する。ルテオリンは、ニンジン、ブロッコリ、タマネギの葉、パセリ、セロリ、スイートベルペッパー、およびキクの花などの多くの果物および野菜に見出される天然フラボノイドである。また、ルテオリンは、Lonicera japonica、chrysanthemum、Herba unripe、Prunella vulgaris、artichoke、perilla、Scutellaria、紫花などの漢方薬の多くの薬草の有効成分である。伝統的に、これらのハーブは咳を和らげ、痰を減らし、血管心臓症や肝炎などの疾患を治療するために、抗炎症剤として複雑な処方で使用されていた。ルテオリンは、広いスペクトルの癌細胞型に対するその強力な抗癌活性のため、広範囲に研究されてきた。さらに重要なことに、多薬剤耐性癌細胞(MDR)の成長を逆転させる有効性を示した。ルテオリンは、アポトーシスと細胞周期調節を介してその抗癌活性を発揮すると考えられている。ルテオリンにはJNK, NF‐κB, IGF‐1などの複数の分子標的が示唆されている。しかしながら、定義された結合ポケットとの直接的な相互作用の証拠は、いかなる提案された標的についても依然として欠如している。さらに、列挙された標的の1つまたはすべては、ルテオリンの薬理学的挙動のすべてを調和させることができない。天然産物の研究における一般的なフラストレーションである多薬理学は、これらの活性天然化合物の臨床開発を大きく制限する。nDELスクリーニングによるルテオリンのPARP‐1の同定は、天然産物の多剤併用解剖におけるnDELの可能性を実証する。ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ1(PARP-1)は、DNA修復、複製、組換え、遺伝子再編成などのさまざまな生物学的過程によって引き起こされる細胞内の過渡的なで局所的なDNA鎖切断に応答してDNAに結合する。
【０２２７】
臨床的に証明された化学療法標的として、PARP‐1阻害はルテオリンに対して観察されたものと同様のアポトーシス、細胞周期停止などにおける調節パターンを示した。PARPはルテオリンの重要な標的の1つ可能性があり、これは多剤併用薬理学的効果を調整すると思われる。nDELは数、多様性、および情報を統合する可能性があり、生物医学的問題の治療法および解決法を見つけるための我々の努力において貴重であり得る。
【０２２８】
別途定義されないかぎり、本明細書に用いられるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の技術者により一般に理解されるのと同じ意味をもつ。
【０２２９】
本明細書に例示的に記載される発明は本明細書に特に開示されていない任意の元素または元素、限定または限定が存在しない場合に、適切に実施され得る。したがって、例えば、用語「備える」、「含む」、「含む」などは、拡張的に、限定なしに読まれるものとする。さらに、本明細書で使用される用語および表現は限定ではなく説明の用語として使用されており、そのような用語および表現の使用において、示され、説明された特徴またはその一部の任意の均等物を排除する意図はないが、特許請求される本発明の範囲内で種々の変形が可能であることが認識される。
【０２３０】
したがって、本発明は好ましい実施形態および任意選択の特徴によって具体的に開示されてきたが、本明細書に開示された本発明の修正、向上および変形は当業者に頼ることができ、上記修正、向上および変形は本発明の範囲内であると考えられることを理解されたい。本明細書で提供される材料、方法、および実施例は好ましい実施形態を代表するものであり、例示的なものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【０２３１】
本発明は、本明細書において広くかつ一般的に記載されてきた。包括的開示内に入るより狭い種および亜包括的グループの各々もまた、本発明の一部を形成する。これは、切除された物質が本明細書に特に記載されているか否かにかかわらず、属から被検者な物質を除去するという条件または否定的な限定を伴う、本発明の一般的な記載を含む。
【０２３２】
さらに、本発明の特徴または態様がマーカッシュグループに関して記載されている場合、当業者は、本発明がマーカッシュグループの部材の任意の個々の部材またはサブグループに関しても記載されていることを認識するのであろう。
【０２３３】
本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献はそれぞれが個々に参照により援用されるのと同じ程度に、それらの全体が参照により明示的に援用される。矛盾がある場合、定義を含む本明細書が優先される。
【０２３４】
上記の実施形態に関連して本開示を説明したが、前記の説明および実施例は本開示の範囲を例示することを意図したものであり、限定することを意図したものではないことを理解されたい。本開示の範囲内の他の態様、利点、および修正は、本開示が関係する当業者には明らかであろう。
【図１】
2021530235.tif 000046
【図２】
2021530235.tif 000047
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2021530235.tif 000058
【図１４】
2021530235.tif 000059
【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2021530235.tif 000062
【図１８】
2021530235.tif 000063
【図１９】
2021530235.tif 000064
【図２０（ａ）】
2021530235.tif 000065
【図２０（ｂ）】
2021530235.tif 000066
【図２１】
2021530235.tif 000067
【図２２ａ）】
2021530235.tif 000068
【図２２ｂ）】
2021530235.tif 000069
【図２２ｃ）】
2021530235.tif 000070
【誤訳訂正書】
【提出日】令和3年7月9日(2021.7.9)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【優先権主張】
【０００１】
本発明は、２０１８年７月１８日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／０９６０５２号、及び２０１９年４月２４日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＣＮ２０１９／０８４０３１号の優先権を主張し、それらの内容全体が本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本開示は、概して、化学物質及び生物学的物質に関し、特に、天然物の標識及びスクリーニングに関する。
【背景技術】
【０００３】
現在、天然物の標的同定は、一般に、アフィニティータグ及び架橋タグ等の適切なタグを導入するために、構造活性相関（ＳＡＲ）について多くの作業を必要とする。このような作業は、通常、試行錯誤の手順である。タグは、不適切な部位にある場合、化合物と標的との相互作用に空間的障害をもたらし、生物学的スクリーニングにおいて偽陰性の結果に繋がる。従って、標的同定は、偽陰性結果を減少させるために、異なる部位標識を有する種々の薬物−タグ結合体を必要とする。しかしながら、複数の部位標識は、天然物上の官能基、又は新しい官能基を導入するための全合成に依存する。天然物の構造は複雑であり、全合成は化学者にとって困難である。従って、このようなアプローチは時間がかかり、非効率的である。
【０００４】
化学の発展に伴い、より多くの新規な天然物が単離されている。化学物質をハイスループットスクリーニングするために、いくつかの機関が組み合わせ化学及びＤＮＡコード化技術を使用する戦略を提案した（例えば、米国特許第５５６５３２４号明細書、欧州特許出願公開第０６４３７７８号明細書、米国特許第７９３５６５８号明細書、国際公開第２０１０／０９４０３６号、及び中国特許出願公開第１０３８８２５３１号明細書を参照）。
【０００５】
これらのアプローチは、組み合わせ化学を使用して化学ライブラリーを確立し、小さな化学フラグメントを用いて大きな化学物質を構築する。しかしながら、これらの化学反応は、ＤＮＡの安定性によって制限され、強塩基、強還元試薬等を含む多くの一般的な試薬が除外される。従って、複雑な天然物の多くは組み合わせ化学ライブラリーに含まれない。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、より大きな化学空間をカバーする新規の標識戦略を提供する。従って、本明細書では、オリゴヌクレオチドを用いた有機化学物質の部位非選択的標識のための方法、該方法に有用な化合物、並びに標識化合物、標識化合物を含むライブラリー、及びそれらの使用が提供される。
【０００７】
いくつかの実施形態において、有機化合物を標識するための方法が提供され、該方法は以下を含む。
（１）リンカー前駆体分子を、部位非選択的反応条件下で、例えば、カルベン又はニトレン又はフリーラジカル反応条件下で有機化合物と接触させることであって、リンカー前駆体分子は２つの官能基、第１の官能基Ｒ及び第２の官能基Ｍを有し、リンカー前駆体分子の第１の官能基Ｒは、部位非選択的反応条件下で、有機化合物と反応する部位非選択的反応基、例えば、カルベン又はニトレン又はフリーラジカルを生成し、第２の官能基は、第１の官能基が反応する条件下で非反応性であり、リンカー前駆体分子と有機化合物との接触により、リンカー前駆体分子の第２の官能基Ｍを有する中間体が形成されること、及び
（２）（１）の中間体を標識分子と接触させることにより、リンカー前駆体分子の第２の官能基Ｍが標識分子と反応して標識有機化合物を形成することであって、標識分子が標識を含むこと。
【０００８】
いくつかの実施形態において、第１の官能基及び第２の官能基を含むリンカー前駆体分子であって、第１の官能基は部位非選択的な様式で有機化合物と反応することができる部位非選択的反応基、例えば、カルベン、ニトレン又はフリーラジカルを生成することができ、第２の官能基は第１の官能基が有機化合物と反応する条件下では非反応性であるが、標識分子と反応することができる、リンカー前駆体分子が提供される。
【０００９】
いくつかの実施形態において、以下を含む方法により製造される標識有機化合物が提供される。
（１）リンカー前駆体分子を、部位非選択的反応条件下で、例えば、カルベン又はニトレン又はフリーラジカル反応条件下で有機化合物と接触させることであって、リンカー前駆体分子は２つの官能基、第１の官能基Ｒ及び第２の官能基Ｍを有し、リンカー前駆体分子の第１の官能基Ｒは、部位非選択的反応条件下で、有機化合物と反応する部位非選択的反応基、例えば、カルベン又はニトレン又はフリーラジカルを生成し、第２の官能基は、第１の官能基が有機化合物と反応する条件下で非反応性であり、リンカー前駆体分子と有機化合物との接触により、リンカー前駆体分子の第２の官能基Ｍを有する中間体が形成されること、及び
（２）（１）の中間体を標識分子と接触させることにより、リンカー前駆体分子の第２の官能基Ｍが標識分子と反応して標識有機化合物を形成することであって、標識分子が標識を含むこと。
【００１０】
いくつかの実施形態において、位置異性体を含む標識有機化合物のセットであって、その各々は標識部分、リンカー、及び有機化合物部分を含み、異性体は、標識部分がリンカーを介して結合する有機化合物部分の部位の点で異なる、セットが提供される。
【００１１】
いくつかの実施形態において、少なくとも２つの標識有機化合物（又は２セットの異性体標識有機化合物）を含む標識有機化合物のライブラリーであって、固有の有機化合物が固有の標識で標識されている、ライブラリーが提供される。
【００１２】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される標識有機化合物、異性体標識有機化合物のセット、又は標識有機化合物のライブラリーをアッセイすること、及びそれらの標識に従って標的に結合する有機化合物を同定することを含む、標的に結合する有機化合物を同定する方法が提供される。
【００１３】
これらの及び他の実施形態は、以下でさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、実施例５におけるオリドニンリンカーＩのＨＰＬＣ及び質量スペクトルを示す。
【図２】図２は、実施例６における化合物８の質量スペクトルを示す。
【図３】図３は、実施例７における標識化合物９の質量スペクトルを示す。
【図４】図４は、実施例８における標識化合物８の質量スペクトルを示す。
【図５】図５及び６は、実施例９のオリドニン−リンカーＩＩ結合体化合物のＨＰＬＣ及び質量スペクトルを示す。
【図６】図５及び６は、実施例９のオリドニン−リンカーＩＩ結合体化合物のＨＰＬＣ及び質量スペクトルを示す。
【図７】図７及び８は、実施例１０のセラストロール−リンカーＩＩ結合体化合物のＨＰＬＣ及び質量スペクトルを示す。
【図８】図７及び８は、実施例１０のセラストロール−リンカーＩＩ結合体化合物のＨＰＬＣ及び質量スペクトルを示す。
【図９】図９及び１０は、実施例１１のタキソール−リンカーＩＩ結合体化合物のＨＰＬＣ及び質量スペクトルを示す。
【図１０】図９及び１０は、実施例１１のタキソール−リンカーＩＩ結合体化合物のＨＰＬＣ及び質量スペクトルを示す。
【図１１】図１１及び１２は、実施例１２のトリプトフェノリド−リンカーＩＩ結合体化合物のＨＰＬＣ及び質量スペクトルを示す。
【図１２】図１１及び１２は、実施例１２のトリプトフェノリド−リンカーＩＩ結合体化合物のＨＰＬＣ及び質量スペクトルを示す。
【図１３】図１３及び１４は、実施例１３のメイタンシノール−リンカーＩＩ結合体化合物のＨＰＬＣ及び質量スペクトルを示す。
【図１４】図１３及び１４は、実施例１３のメイタンシノール−リンカーＩＩ結合体化合物のＨＰＬＣ及び質量スペクトルを示す。
【図１５】図１５及び１６は、実施例１４のデヒドロアビエチン酸リンカーＩＩ結合体（Ａ）化合物及びヒドロアビエチン酸リンカーＩＩ結合体（Ｂ）化合物のＨＰＬＣ及び質量スペクトルを示す。
【図１６】図１５及び１６は、実施例１４のデヒドロアビエチン酸リンカーＩＩ結合体（Ａ）化合物及びヒドロアビエチン酸リンカーＩＩ結合体（Ｂ）化合物のＨＰＬＣ及び質量スペクトルを示す。
【図１７】図１７は、４つのサンプル：１．オリゴヌクレオチドと結合した化合物６、２．オリゴヌクレオチドと結合した化合物７、３．未反応オリゴヌクレオチド、及び４．紫外線を２時間照射し、次いでオリゴヌクレオチドと結合させたリンカーＩＩを有するヘッドピースＤＮＡ４、のアガロースゲル電気泳動におけるＤＮＡ移動を示す。
【図１８】図１８は、真空なしでリンカーＩＶで標識した粗照射生成物２，４−ジヒドロキシアセトフェノン、及びｉｉ）真空後にリンカーＩＶで標識した２，４−ジヒドロキシアセトフェノンの粗生成物の１Ｈ  ＮＭＲを示す。リンカーＩＶ−２，４−ジヒドロキシアセトフェノン結合体は矢印により示される。
【図１９】図１９は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）及び配列決定による天然物−ＤＮＡ結合の定量化のための一般的なスキームを示す。
【図２０ａ】図２０（ａ）は、熱ショック７０ｋＤａタンパク質（ＨＳＰ７０）についてのＤＥＬ選択フィンガープリントを示す。図２０（ｂ）は、ポリ［ＡＤＰ−リボース］ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ１）についてのＤＥＬ選択フィンガープリントを示す。図２０において、赤い破線はヒット選択のカットオフである。対応する化学構造を図２１に示す。
【図２０ｂ】図２０（ａ）は、熱ショック７０ｋＤａタンパク質（ＨＳＰ７０）についてのＤＥＬ選択フィンガープリントを示す。図２０（ｂ）は、ポリ［ＡＤＰ−リボース］ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ１）についてのＤＥＬ選択フィンガープリントを示す。図２０において、赤い破線はヒット選択のカットオフである。対応する化学構造を図２１に示す。
【図２１】図２１は、ＰＡＰＲ１についてのＤＥＬ選択から選択されたバインダーの化学構造を示す。
【図２２】図２２は、ｎＤＥＬ選択ＰＡＲＰ１バインダーのヒット検証を示す。ルテオリン（図２２（ａ））及びＦ００３（図２２（ｂ））によるヒトＰＡＲＰ１の酵素活性の阻害。ヒトＰＡＲＰ１の活性部位におけるルテオリンの分子ドッキングを図２２（ｃ）に示す。
【００１５】
図面の一部又は全部は、説明のための概略図であることが理解されるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（定義）
以下、本技術の例示的な実施形態について記載する。しかしながら、該記載は、本開示の範囲の限定を意図したものではなく、例示的な実施形態の説明として提供されることが認識されるべきである。
【００１７】
本明細書で使用される場合、以下の定義は、特に明確に示されない限り適用される。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに決定しない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「生成物」への言及は、異性体等の複数の生成物を含む。
【００１８】
本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、組成物及び方法が列挙された要素を含むが、他を排除しないことを意味することが意図される。組成物及び方法を定義するために使用される場合、「から本質的になる」は、記載された目的のための組み合わせに本質的に重要な任意の他の要素を排除することを意味する。従って、本明細書で定義される要素から本質的になる組成物は、特許請求される基本的及び新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない他の材料又は工程を排除しない。「からなる」は、他の成分の微量要素及び本質的な方法工程を排除することを意味する。これらの移行用語（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｔｅｒｍ）のそれぞれによって定義される実施形態は、本開示の範囲内である。
【００１９】
用語「約」は、数値表示、例えば、温度、時間、量、及び濃度（範囲を含む）の前に使用される場合、（＋）又は（−）１０％、５％又は１％変化し得る近似を示す。
【００２０】
「アルキル」は、一価の飽和直鎖又は分岐脂肪族ヒドロカルビル基を指す。いくつかの実施形態において、アルキルは１〜３０個の炭素原子（すなわち、Ｃ１−３０アルケニル）、１〜２０個の炭素原子（すなわち、Ｃ１−２０アルケニル）、１〜８個の炭素原子（すなわち、Ｃ１−８アルケニル）、１〜６個の炭素原子（Ｃ１−６アルキル）、又は１〜４個の炭素原子（すなわち、Ｃ１−４アルケニル）を有する。この用語は、例として、直鎖及び分岐ヒドロカルビル基、例えば、メチル（ＣＨ３−）、エチル（ＣＨ３ＣＨ２−）、ｎ−プロピル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２−）、イソプロピル（（ＣＨ３）２ＣＨ−）、ｎ−ブチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、イソブチル（（ＣＨ３）２ＣＨＣＨ２−）、ｓｅｃ−ブチル（（ＣＨ３）（ＣＨ３ＣＨ２）（ＣＨ−）、及びｔ−ブチル（（ＣＨ３）３Ｃ−）を含む。「アルキレン」は、二価の直鎖又は分岐飽和脂肪族ヒドロカルビル基を指す。
【００２１】
「アルケニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含むアルキル基を指す。いくつかの実施形態において、アルケニルは２〜３０個の炭素原子（すなわち、Ｃ２−３０アルケニル）、２〜２０個の炭素原子（すなわち、Ｃ２−２０アルケニル）、２〜８個の炭素原子（すなわち、Ｃ２−８アルケニル）、２〜６個の炭素原子（すなわち、Ｃ２−６アルケニル）、又は２〜４個の炭素原子（すなわち、Ｃ２−４アルケニル）を有する。アルケニル基の例としては、エテニル、プロペニル、ブタジエニル（１，２−ブタジエニル及び１，３−ブタジエニルを含む）が挙げられるが、これらに限定されない。「アルケニレン」は、二価のアルケニル基を指す。
【００２２】
「アルキニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含むアルキル基を指す。いくつかの実施形態において、アルケニルは２〜３０個の炭素原子（すなわち、Ｃ２−３０アルキニル）、２〜２０個の炭素原子（すなわち、Ｃ２−２０アルキニル）、２〜８個の炭素原子（すなわち、Ｃ２−８アルキニル）、２〜６個の炭素原子（すなわち、Ｃ２−６アルキニル）、又は２〜４個の炭素原子（すなわち、Ｃ２−４アルキニル）を有する。用語「アルキニル」は、１つの三重結合及び１つの二重結合を有する基も含む。「アルキニレン」は、二価のアルキニル基を指す。
【００２３】
「アルコキシ」は、「アルキル−Ｏ−」基を指す。アルコキシ基の例としては、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、ｎ−ヘキソキシ、及び１，２−ジメチルブトキシが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
「ハロアルコキシ」は、１個又は複数の水素原子がハロゲンで置換されている、上記で定義したアルコキシ基を指す。
【００２５】
「アルキルチオ」は、「アルキル−Ｓ−」基を指す。
【００２６】
「アシル」は、−Ｃ（Ｏ）Ｒ基を指し、Ｒは水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアルキル、又はヘテロアリールであり、これらの各々は、本明細書で定義されるように、任意に置換されていてもよい。アシルの実施例としては、以下に限定されるものではないが、フォルミル、アセチル、シルコヘキシルカルボニル、シクロヘキシルメチル−カルボニル、及びベンゾイルが挙げられる。
【００２７】
「アミド」は、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｙＲｚ基を指す「Ｃ−アミド」基、及び−ＮＲｙＣ（Ｏ）Ｒｚ基を指す「Ｎ−アミド」基の両方を指し、Ｒｙ及びＲｚは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアルキル、又はヘテロアリールからなる群から独立して選択され、これらの各々は任意に置換されていてもよい。
【００２８】
「アミノ」は、−ＮＲｙＲｚ基を指し、Ｒｙ及びＲｚは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールからなる群から独立して選択され、これらの各々は任意に置換されていてもよい。
【００２９】
「アミジノ」は、−Ｃ（ＮＨ）（ＮＨ２）を指す。
【００３０】
「アリール」は、縮合系を含む単一環（例えば、単環式）又は多環（例えば、二環式又は三環式）を有する一価芳香族炭素環基を指す。いくつかの実施形態において、アリールは、６〜２０個の環炭素原子（すなわち、Ｃ６−２０アリール）、６〜１４個の炭素環原子（すなわち、Ｃ６−１４アリール）、６〜１２個の炭素環原子（すなわち、Ｃ６−１２アリール）、又は６〜１０個の炭素環原子（すなわち、Ｃ６−１０アリール）を有する。アリール基の例としては、フェニル、ナフチル、フルオレニル、及びアントリルが挙げられるが、これらに限定されない。しかしながら、アリールは、以下に定義されるヘテロアリールを全く包含又は重複しない。１つ又は複数のアリール基がヘテロアリールと融合している場合、得られる環系はヘテロアリールである。１つ又は複数のアリール基がヘテロシクロアルキルと融合している場合、得られる環系はヘテロシクロアルキルである。「アリーレン」は、二価のアリール基を指す。
【００３１】
「Ｏ−カルバモイル」は−Ｏ−Ｃ（Ｏ）ＮＲｙＲｚ基を指し、「Ｎ−カルバモイル」基は−ＮＲｙＣ（Ｏ）ＯＲｚ基を指し、Ｒｙ及びＲｚは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールからなる群から独立して選択され、これらの各々は任意に置換されていてもよい。
【００３２】
「カルボキシル」は、−Ｃ（Ｏ）ＯＨを指す。
【００３３】
「カルボキシルエステル」は、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ及び−Ｃ（Ｏ）ＯＲの両方を指し、Ｒは水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールであり、これらの各々は、本明細書で定義されるように、任意に置換されていてもよい。
【００３４】
「シアノ」又は「カルボニトリル」は−ＣＮ基を指す。
【００３５】
「シクロアルキル」は、縮合、架橋、及びスピロ環系を含む単一環又は多環を有する一価の飽和又は部分不飽和非芳香族環状アルキル基を指す。用語「シクロアルキル」は、シクロアルケニル基（すなわち、少なくとも１つの二重結合を有する非芳香族炭素環基）を含む。いくつかの実施形態において、シクロアルキルは３〜２０個の環炭素原子（すなわち、Ｃ３−２０シクロアルキル）、３〜１２個の環炭素原子（すなわち、Ｃ３−１２シクロアルキル）、３〜１０個の環炭素原子（すなわち、Ｃ３−１０シクロアルキル）、３〜８個の環炭素原子（すなわち、Ｃ３−８シクロアルキル）、又は３〜６個の環炭素原子（すなわち、Ｃ３−６シクロアルキル）を有する。シクロアルキル基の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、及びシクロヘキシルが挙げられるが、これらに限定されない。「シクロアルキレン」は、二価の飽和又は部分不飽和環状アルキル基を指す。
【００３６】
「グアニジノ」は、−ＮＨＣ（ＮＨ）（ＮＨ２）を指す。
【００３７】
「ヒドラジノ」は、−ＮＨＮＨ２を指す。
【００３８】
「イミノ」は−Ｃ（ＮＲ）Ｒ基を指し、各Ｒは、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールであり、これらの各々は本明細書で定義されるように、任意に置換されていてもよい。
【００３９】
「ハロゲン」又は「ハロ」には、フルオロ、クロロ、ブロモ、及びヨードが含まれる。
【００４０】
「ハロアルキル」は、１個又は複数の水素原子がハロゲンで置換されている、上記で定義したアルキル基を指す。例えば、残基が２個以上のハロゲンで置換されている場合、結合しているハロゲン部分の数に対応する接頭辞を使用することにより示されてもよい。ジハロアルキル及びトリハロアルキルは、２個（「ジ」）又は３個（「トリ」）のハロ基で置換されているアルキルを指し、これらは同じハロゲンであってもよいが、必ずしも同じハロゲンでなくてもよい。ハロアルキルの例としては、ジフルオロメチル（−ＣＨＦ２）及びトリフルオロメチル（−ＣＦ３）が挙げられる。
【００４１】
「ハロアルケニル」は、１個又は複数の水素原子がハロゲンで置換されている、上記で定義したアルケニル基を指す。
【００４２】
「ハロアルキニル」は、１個又は複数の水素原子がハロゲンで置換されている、上記で定義したアルキニル基を指す。
【００４３】
「ヘテロアルキル」は、１個又は複数の炭素原子（及び任意の関連する水素原子）がそれぞれ独立して同じ又は異なるヘテロ原子基で置換されたアルキル基を指す。用語「ヘテロアルキル」は、炭素原子及びヘテロ原子を有する非分岐又は分岐飽和鎖を含む。例として、１、２又は３個の炭素原子は、独立して、同じ又は異なるヘテロ原子基で置換されていてもよい。ヘテロ原子基としては、以下に限定されるものではないが、−ＮＲ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−等が挙げられ、Ｒは、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールであり、これらの各々は任意に置換されていてもよい。ヘテロアルキル基の例としては、−ＯＣＨ３，−ＣＨ２ＯＣＨ３，−ＳＣＨ３，−ＣＨ２ＳＣＨ３，−ＮＨＣＨ３、及び−ＣＨ２ＮＲＣＨ３が挙げられる。いくつかの実施形態において、ヘテロアルキルは、１〜１０個の炭素原子、１〜８個の炭素原子、又は１〜４個の炭素原子；及び１〜３個のヘテロ原子、１〜２個のヘテロ原子、又は１個のヘテロ原子を含む。「ヘテロアルキレン」は、２価のヘテロアルキル基を指す。
【００４４】
「ヘテロアリール」は、窒素、酸素、及び硫黄から独立して選択される１つ又は複数の環ヘテロ原子を有する、単一環、複数環、又は複数の縮合環を有する芳香族基を指す。いくつかの実施形態において、ヘテロアリールは、５〜２４個の環原子（すなわち、５〜２４員ヘテロアリール）、又は５〜１４個の環原子（すなわち、５〜１４員ヘテロアリール）、５〜１０個の環原子（すなわち、５〜１０員ヘテロアリール）、又は５又は６個の環原子（すなわち、５又は６員ヘテロアリール）を含む。いくつかの実施形態において、ヘテロアリールは、１〜２０個の環炭素原子（すなわち、Ｃ１−２０ヘテロアリール）、５〜１４個の環炭素原子（すなわち、Ｃ５−１４ヘテロアリール）、３〜１２個の環炭素原子（すなわち、Ｃ３−１２ヘテロアリール）、又は３〜８個の炭素環原子（すなわち、Ｃ３−８ヘテロアリール）；及び窒素、酸素及び硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子、１〜４個のヘテロ原子、１〜３個の環ヘテロ原子、１〜２個の環ヘテロ原子、又は１個の環ヘテロ原子を含む。ヘテロアリール基の例としては、ピリミジニル、プリニル、ピリジル、ピリダジニル、ベンゾチアゾリル、ピラゾリル、ベンゾ［ｄ］チアゾリル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾ［ｂ］チオフェニル、インダゾリル、ベンゾ［ｄ］イミダゾリル、ピラゾロ［１，５−ａ］ピリジニル、及びイミダゾ［１，５−ａ］ピリジニルが挙げられるが、これらに限定されない。少なくとも１つのヘテロ原子を含有する、単一又は複数の縮合環を有する任意の芳香環は、分子の残りの部分への結合にかかわらず（すなわち、縮合環のいずれか１つによって）、ヘテロアリールとみなされる。ヘテロアリールは、上記で定義したアリールを包含又は重複しない。「ヘテロアリーレン」は、二価のヘテロアリール基を指す。
【００４５】
「ヘテロシクロアルキル」は、窒素、酸素及び硫黄から独立して選択される１個又は複数の環ヘテロ原子を有する飽和又は不飽和の非芳香族環状アルキル基を指す。用語「ヘテロシクロアルキル」は、ヘテロシクロアルケニル基（すなわち、少なくとも１つの二重結合を有するヘテロシクロアルキル基）、架橋ヘテロシクロアルキル基、縮合ヘテロシクロアルキル基及びスピロヘテロシクロアルキル基を含む。ヘテロシクロアルキルは、単一の環又は複数の環であってもよく、複数の環は、縮合、架橋、又はスピロであってもよい。少なくとも１つのヘテロ原子を含む任意の非芳香族環は、結合にかかわらず、ヘテロシクロアルキルとみなされる（すなわち、炭素原子又はヘテロ原子を介して結合され得る）。さらに、用語ヘテロシクロアルキルは、少なくとも１個のヘテロ原子を含む任意の非芳香族環を包含することを意図し、該環は、分子の残部への結合にかかわらず、アリール又はヘテロアリール環に縮合されていてもよい。いくつかの実施形態において、ヘテロシクロアルキルは、３〜２４個の環原子（すなわち、３〜２４員ヘテロシクロアルキル）、又は３〜１４個の環原子（すなわち、３〜１４員ヘテロシクロアルキル）、３〜１０個の環原子（すなわち、３〜１０員ヘテロシクロアルキル）、又は５個又は６個の環原子（すなわち、５員又は６員ヘテロシクロアルキル）を含む。いくつかの実施形態において、ヘテロシクロアルキルは、２〜２０個の環炭素原子（すなわち、Ｃ２−２０ヘテロシクロアルキル）、２〜１２個の環炭素原子（すなわち、Ｃ２−１２ヘテロシクロアルキル）、２〜１０個の環炭素原子（すなわち、Ｃ２−１０ヘテロシクロアルキル）、２〜８個の環炭素原子（すなわち、Ｃ２−８ヘテロシクロアルキル）、３〜１２個の環炭素原子（すなわち、Ｃ３−１２ヘテロシクロアルキル）、３〜８個の環炭素原子（すなわち、Ｃ３−８ヘテロシクロアルキル）、又は３〜６個の環炭素原子（すなわち、Ｃ３−６ヘテロシクロアルキル）を有し、窒素、硫黄又は酸素から独立して選択される、１〜５個の環ヘテロ原子、１〜４個の環ヘテロ原子、１〜３個の環ヘテロ原子、１個又は２個の環ヘテロ原子、又は１個の環ヘテロ原子を有する。ヘテロシクロアルキル基の例としては、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、オキセタニル、ジオキソラニル、アゼチジニル、モルホリニル、２−オキサ−７−アザスピロ［３．５］ノナニル、２−オキサ−６−アザスピロ［３．４］オクタニル、６−オキサ−１−アザスピロ［３．３］ヘプタニル、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリニル、４，５，６，７−テトラヒドロチエノ［２，３−ｃ］ピリジニル、インドリニル及びイソインドリニルが挙げられるが、これらに限定されない。「ヘテロシクロアルキレン」は、二価のヘテロシクロアルキル基を指す。
【００４６】
「ヒドロキシ」又は「ヒドロキシル」は−ＯＨ基を指す。
【００４７】
「オキソ」は（＝Ｏ）又は（Ｏ）基を指す。
【００４８】
「ニトロ」は−ＮＯ２基を指す。
【００４９】
「スルホニル」は−Ｓ（Ｏ）２Ｒ基を指し、Ｒは、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールである。スルホニルの例としては、メチルスルホニル、エチルスルホニル、フェニルスルホニル、及びトルエンスルホニルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
「アルキルスルホニル」は−Ｓ（Ｏ）２Ｒ基を指し、Ｒはアルキルである。
【００５１】
「スルホン酸」は−ＳＯ３Ｈ基を指す。
【００５２】
「アルキルスルフィニル」は−Ｓ（Ｏ）Ｒ基を指し、Ｒはアルキルである。
【００５３】
「チオシアン酸」は−ＳＣＮ基を指す。
【００５４】
「チオール」は−ＳＨ基を指す。
【００５５】
「チオキソ」又は「チオン」は（＝Ｓ）又は（Ｓ）基を指す。
【００５６】
特定の一般的に使用される代替化学名を使用することができる。例えば、二価の「アルキル」基、二価の「アリール」基等の二価の基は、それぞれ、「アルキレン」基、「アリーレン」基と称されてもよい。また、特に明記されない限り、基の組み合わせが１つの部分、例えばアリールアルキルと本明細書で称される場合、最後に言及した基は、その部分を分子の残りの部分に結合させる原子を含む。
【００５７】
用語「任意の」又は「任意に」は、続いて記載される事象又は状況が起こっても起こらなくてもよいこと、及び記載が上記事象又は状況が起こる事例及び起こらない事例を含むことを意味する。また、用語「任意に置換された」は、指定された原子又は基上の任意の１つ又は複数の水素原子を指し、水素以外の部分によって置換されていても、置換されていなくてもよい。
【００５８】
用語「置換（された）」は、指定された原子又は基上の任意の１つ又は複数の水素原子が、指定された原子の通常の原子価を超えない限り、水素以外の１つ又は複数の置換基で置き換えられていることを意味する。１つ又は複数の置換基としては、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アシル、アミノ、アミジノ、アリール、Ｎ３、Ｏ−カルバモイル、Ｎ−カルバモイル、カルボキシル、カルボキシルエステル、シアノ、グアニジノ、ハロ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、ヒドロキシ、ヒドラジノ、イミノ、オキソ、ニトロ、アルキルスルフィニル、スルホン酸、アルキルスルホニル、チオシアン酸エステル、チオール、チオン、又はこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。無限に付加されたさらなる置換基を有する置換基を定義することにより到達したポリマー又は同様の無限の構造（例えば、置換アリール基でそれ自体が置換されており、置換ヘテロアルキル基でさらに置換されている置換アルキルを有する置換アリール等）が本明細書に含まれることは意図しない。特に断らない限り、本明細書に記載の化合物における連続置換の最大数は３である。例えば、２つの他の置換アリール基を有する置換アリール基の連続置換は、（（置換アリール）置換アリール）置換アリールに制限される。同様に、上記の定義は、許容できない置換パターン（例えば、５個のフッ素で置換されたメチル、又は２個の隣接する酸素環原子を有するヘテロアリール基）を含むことを意図しない。このような許容できない置換パターンは、当業者に周知である。化学基を修飾するために使用される場合、用語「置換（された）」は、本明細書で定義される他の化学基を記載してもよい。いくつかの実施形態において、基は任意に置換されていると記載され、基の任意の置換基それ自体は置換されていない。例えば、いくつかの実施形態において、用語「置換アルキル」は、ヒドロキシル、ハロ、アルコキシ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、及びヘテロアリールを含む１つ又は複数の置換基を有するアルキル基を指す。他の実施形態では、１つ又は複数の置換基は、ハロ、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、又はヘテロアリールでさらに置換されていてもよく、これらの各々は置換されている。他の実施形態では、置換基は、ハロ、アルキル、ハロアルキル、アルコキシ、ヒドロキシル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、又はヘテロアリールでさらに置換されていてもよく、これらの各々は置換されていない。
【００５９】
本明細書で使用される場合、用語「溶媒」は、固体、液体、又は気体溶質を溶解して溶液を形成する液体を指す。一般的な溶媒は当該技術分野で周知であり、水；ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、及び他の軽油等の飽和脂肪族炭化水素；ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素；ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素；メタノール、エタノール、プロパノール等の脂肪族アルコール；ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジブチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル；アセトン、エチルメチルケトン等のケトン；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル；ジメチルアセトアミド、ホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ピリジン、Ｎ−メチルピロリドン、キノリン、ニトロベンゼン等の窒素含有溶媒；二硫化炭素、ジメチルスルホキシド、スルホラン等の硫黄含有溶媒；ヘキサメチルリン酸トリアミド等のリン含有溶媒が挙げられるが、これらに限定されない。用語溶媒は、特に明確に示されない限り、２つ以上の溶媒の組み合わせを含む。適当な溶媒の特定の選択は、溶媒の性質及び溶解される溶質、ならびに意図される目的、例えば、溶液中でどのような化学反応が起こるかを含め、多くの要因に依存し、当該技術分野で一般に知られている。
【００６０】
本明細書で使用される場合、用語「接触させる」は、２つ以上の化学分子間の化学反応が起こり得るように、２つ以上の化学分子を近接させることをいう。例えば、接触させることは、化学物質を混合し、任意に連続的に混合することを含んでもよい。接触させることは、１つ又は複数の溶媒中に２つ以上の化学物質を完全に又は部分的に溶解又は懸濁させること、溶媒中の化学物質を固相及び／又は気相中の別の化学物質と混合すること、又は樹脂などの固体支持体上に結合させること、又は気相又は固相中及び／又は固体支持体上で２つ以上の化学物質を混合することにより行われてもよく、これらは当業者に一般に知られている。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「有機化合物」は、１つ又は複数の標的との結合活性についてスクリーニングされ得るように標識される化合物を指し、用語「薬物」、ＴＣＭ、及び天然物（ＮＰ）は、本明細書で定義されるように、標識される有機化合物を指すために使用される。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「リンカー前駆体分子」は、２つの官能基を有する分子を指し、その各々は反応し、それにより分子と結合し、その結果、反応後、リンカー前駆体分子の残基は生成物のリンカーとなる。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「標識分子」は、分析方法により検出することができる、オリゴヌクレオチド等の標識を有する分子を指す。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「部位非選択的反応」、「部位非選択的標識」等における用語「部位非選択的」は、分子の官能基に依存していなくてもよい分子の多数の異なる部位で起こり得る反応又は標識等を指す。「部位非選択的反応」の例としては、化合物Ｘ−Ｙ（Ｙはカルベン、ニトレン又はフリーラジカル基等の部位非選択的反応基である）が化合物Ｚの種々の部位と反応して化合物Ｘ−Ｚを形成するカルベン、ニトレン及びフリーラジカル反応が挙げられる。このような部位非選択的反応は、典型的にはＸがＺの異なる部位に結合しているいくつかの位置異性体Ｘ〜Ｚを生成する。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「異性体化合物」又は「異性体生成物」等は、部位非選択的反応、例えば、部位非選択的反応基を有するリンカー前駆体分子を有機化合物、又は必要に応じて対応する標識異性体生成物と反応させることにより生成される異性体を指す。「異性体生成物のセット」は、１つの固有の有機化合物から生成される異性体化合物の混合物を指す。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「不均化反応生成物」は、不均化（ｄｉｓｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｔｉｏｎ）反応によって生成される２つの生成物を指し、不均化反応は、時に不均化（ｄｉｓｍｕｔａｔｉｏｎ）と呼ばれ、中間酸化状態の化合物が２つの異なる化合物、すなわち、高酸化状態の化合物及び低酸化状態の化合物に変換する酸化還元反応である。不均化反応は、以下のように表すことができる。
２Ｐ→Ｐ’＋Ｐ’’
（Ｐ、Ｐ’及びＰ’’は、すべて異なる化学種であり、Ｐ’及びＰ’’は不均化反応生成物である。）
【００６７】
本明細書に記載される式内、提供される構造内、又は構造に関連する変数の定義内で指定されるすべての原子は、反対に明確に示されない限り、その任意の同位体を含むことが意図される。任意の所与の原子について、同位体は本質的にそれらの天然の出現に従った比率で存在していてもよく、又は１つ若しくは複数の特定の原子は、当業者に公知の合成方法を用いて、１つ又は複数の同位体に関して増強されていてもよいことが理解される。従って、水素は、例えば１Ｈ、２Ｈ、３Ｈを含み、炭素は、例えば１１Ｃ、１２Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃを含み、酸素は、例えば１６Ｏ、１７Ｏ、１８Ｏを含み、窒素は、例えば１３Ｎ、１４Ｎ、１５Ｎを含み、硫黄は、例えば３２Ｓ、３３Ｓ、３４Ｓ、３５Ｓ、３６Ｓ、３７Ｓ、３８Ｓを含み、フルオロは、例えば１７Ｆ、１８Ｆ、１９Ｆを含み、クロロは、例えば３５Ｃｌ、３６Ｃｌ、３７Ｃｌ、３８Ｃｌ、３９Ｃｌを含む等である。
【００６８】
本明細書に記載される化合物は、任意の互変異性型を含むが、所与の化合物の互変異性型のうちの１つのみの式が本明細書で提供される可能性がある。
【００６９】
本明細書で使用される場合、用語「塩」は、酸付加塩及び塩基付加塩を指す。酸付加塩の例としては、硫酸塩、塩化物、塩酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リン酸塩、スルファミン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、シクロヘキシルスルファミン酸塩及びキナ酸塩を含有するものが挙げられる。塩は、塩酸、マレイン酸、硫酸、リン酸、スルファミン酸、酢酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、マロン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シクロヘキシルスルファミン酸、フマル酸、及びキナ酸等の酸から得ることができる。塩基付加塩としては、カルボン酸又はフェノール等の酸性官能基が存在する場合、ベンザチン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エタノールアミン、ｔ−ブチルアミン、エチレンジアミン、メグルミン、プロカイン、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、アンモニウム、アルキルアミン、及び亜鉛を含有するものが挙げられる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，Ｖｏｌ．２，ｐ．１４５７，１９９５を参照。塩としては、治療される疾患又は病態及びそれぞれの投与経路を考慮して、分別のある慎重な医師に患者への物質の投与を回避させるような特性を有しない薬学的に許容される塩が挙げられる。本明細書に記載の化合物、中間体又は生成物には、それらの塩が含まれる。
【００７０】
また、本明細書で使用される略語は、それぞれ以下のような意味を有する。
【表１】
2021530235.tif 000071
【００７１】
（化合物）
本明細書では２つの官能基を含む二官能性リンカーが提供され、官能基のうちの１つはカルベン又はニトレン又はフリーラジカルなどの高反応性化学種を生成することができる化学基であり、これは、カルベン又はニトレン又はフリーラジカルの高い反応性を利用して、空間構造的多様性を有する異性体化合物の集合体を生成することにより、化合物を標識するために使用することができる。リンカーのもう一方の官能基は、特定のオリゴヌクレオチド等の標識分子と連結するために使用され、異性体アセンブリの合成は、オリゴヌクレオチドの配列を用いてコードされる。最後に、種々の化合物をこのような二官能性リンカー及び標識分子で標識することにより、標識された生成物を製造することができ、これらを混合して化合物ライブラリーを構築することができる。本開示では、オリゴヌクレオチド標識と適合するカルベン又はニトレン又はフリーラジカル化学反応が最適化され、例えば、溶媒、反応の順序、触媒の組成等が最適化される。この方法は、化合物機能の研究における複雑な構造−活性関係実験を回避し、操作が単純かつ迅速であり、スクリーニング効率が高い。
【００７２】
本明細書において、オリゴヌクレオチドを用いた有機化学物質の部位非選択的標識のための方法、該方法に有用な化合物、並びに標識化合物、標識化合物を含むライブラリー、及びそれらの使用が提供される。
【００７３】
標識方法
本明細書に記載される方法は、カルベン又はニトレン又はフリーラジカル反応等の部位非選択的反応を利用するものであり、有機化合物を、該化合物の官能基とは無関係の種々の部位で同時に標識することができ、その結果、偽陰性結果を最小限にする。この方法は、官能基を有しない有機化合物を標識するのにも有用である。さらに、この方法は、オリゴヌクレオチドタグが安定でない試薬（例えば、強塩基又は強還元試薬）を使用しない。
【００７４】
いくつかの実施形態において、方法は、スキーム１に示されるように表すことができる。
【化１】
2021530235.tif 000072
【００７５】
いくつかの実施形態において、有機化合物Ａを標識するための方法が提供され、方法は以下を含む。
（１）部位非選択的反応条件、例えば、カルベン又はニトレン又はフリーラジカル反応条件下で、リンカー前駆体分子Ｃと有機化合物Ａとを接触させることであって、リンカー前駆体分子Ｃは２つの官能基、第１の官能基Ｒ及び第２の官能基Ｍを有し、リンカー前駆体分子Ｃの第１の官能基Ｒは、部位非選択的反応条件下で、有機化合物Ａと反応する部位非選択的反応基、例えば、カルベン又はニトレン又はフリーラジカルを生成し、第２の官能基は、第１の官能基が有機化合物Ａと反応する条件下で非反応性であり、リンカー前駆体分子Ｃと有機化合物Ａとの接触によりリンカー前駆体分子Ｃの第２の官能基Ｍを有する中間体Ｄが形成されること。リンカー前駆体分子Ｃと有機化合物Ａとの反応により部位非選択的反応条件下で２つ以上の異性体が生成される場合、本明細書で使用される「中間体Ｄ」は、異性体のすべて、又は異性体の１つ若しくはいくつかを指してもよい。
【００７６】
いくつかの実施形態において、方法はさらに以下を含む。
（２）中間体Ｄを標識分子Ｂと接触させ、それによりリンカー前駆体分子Ｃの第２の官能基Ｍを標識分子Ｂと反応させて標識有機化合物Ｅを形成することであって、標識分子Ｂは標識を含むこと。該方法により２つ以上の異性体が生成される場合、本明細書で使用される「標識有機化合物Ｅ」は、異性体のすべて、又は異性体の１つ若しくはいくつかを指してもよい。
【００７７】
いくつかの実施形態において、部位非選択的反応条件はカルベン反応条件であり、リンカー前駆体分子Ｃの第１の官能基Ｒはカルベン反応条件下でカルベンを生成する。いくつかの実施形態において、部位非選択的反応条件はニトレン反応条件であり、リンカー前駆体分子Ｃの第１の官能基Ｒはニトレン反応条件下でニトレンを生成する。いくつかの実施形態において、部位非選択的反応条件はフリーラジカル反応条件であり、リンカー前駆体分子Ｃの第１の官能基Ｒはフリーラジカル反応条件下でフリーラジカルを生成する。
【００７８】
本明細書で提供される方法は、有機化合物上のいずれの官能基とも無関係に有機化合物を標識する。従って、いくつかの実施形態において、リンカー前駆体分子Ｃの第１の官能基Ｒは、有機化合物Ａの複数の部位と反応して複数の異性体生成物の混合物を形成することができる。いくつかの実施形態において、有機化合物Ａは反応性官能基（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）を含まない。
【００７９】
いくつかの実施形態において、中間体Ｄは複数の異性体の混合物である。
【００８０】
いくつかの実施形態において、標識有機化合物Ｅは複数の異性体の混合物である。
【００８１】
いくつかの実施形態において、標識は、化学標識のための固有の配列又は蛍光タグ（例えば、フルオロフォア又はＧＦＰ）又はビオチン標識又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、固有の配列は、一本鎖ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、多本鎖ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又は他の化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、標識はオリゴヌクレオチドを含む。
【００８２】
いくつかの実施形態において、固有の配列は、天然ヌクレオチド又は任意の他の人工ヌクレオチド又は両者の混合物を含む化学修飾オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、化学修飾オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド上のアミノ基を介して修飾される。いくつかの態様において、化学修飾オリゴヌクレオチドは、アセチレニル（Ｃ≡ＣＨ）基を含む。いくつかの実施形態において、アセチレニル基は、リンカーを介してオリゴヌクレオチドに結合している。いくつかの実施形態において、リンカーは、−ＣＨ２−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＣＨ２−（ｎは０〜１０又は１〜５の整数である）を含む。
【００８３】
いくつかの実施形態において、カルベン又はニトレン又はフリーラジカル反応条件等の部位非選択的反応条件は、有機化合物Ａ及びリンカー前駆体分子Ｃを溶媒に溶解して反応混合物を形成することを含む。いくつかの実施形態において、フリーラジカル反応条件は、周囲温度で、１〜５時間又は約３時間以上等の時間、反応混合物のＵＶ（例えば、３６５ｎｍ）照射を含む。いくつかの実施形態において、カルベン又はニトレン又はフリーラジカル反応条件等の部位非選択的反応条件は、過酸化物（過酸化物結合（−Ｏ−Ｏ−）を有する化合物、例えば、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシド、ベンゾイルペルオキシド、メチルエチルケトンペルオキシド、及びペルオキシジスルフェート）等のラジカル開始剤、又は遷移金属錯体を含む。他のラジカル開始剤は、当該技術分野で一般に知られている。例えば、Ｄｅｎｉｓｏｖら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｉｎｉｔｉａｔｏｒｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｐｒｉｌ  ４，２００３）（これは、その全体が参照により本明細書に援用される）を参照。
【００８４】
いくつかの実施形態において、方法は、上記ステップ（１）の中間体Ｄ及び／又は上記ステップ（２）の標識有機化合物Ｅを単離することをさらに含む。単離は、溶剤、試薬、副生物等の反応混合物中の他の物質から反応の所望の生成物を分離することを意味する。該方法により複数の異性体及び／又は不均化反応生成物が生成される場合、該生成物は、混合物として単離されても、又は個々の化合物として単離されてもよい。
【００８５】
（リンカー前駆体分子）
本明細書に記載の方法は、リンカー前駆体分子を用いて、標識分子で標識されている有機分子を、リンカー前駆体分子のリンカーを介して結合する。リンカー前駆体分子は、有機化合物のいずれの官能基とも無関係に有機化合物と反応することができる、カルベン又はニトレン又はフリーラジクルを生成することができる官能基を有する。
【００８６】
いくつかの実施形態において、第１の官能基及び第２の官能基を含むリンカー前駆体分子Ｃが提供され、第１の官能基は、有機化合物Ａと反応することができるカルベン又はニトレン又はフリーラジカル等の部位非選択的反応基を生成することができ、第２の官能基は、第１の官能基が有機化合物Ａと反応する条件下で有機化合物Ａと反応しないが、標識分子Ｂと反応することができる。
【００８７】
いくつかの実施形態において、リンカー前駆体分子Ｃは式Ｒ−Ｌ−Ｍ（式中、Ｒは第１の官能基であり、Ｍは第２の官能基であり、Ｌは、任意に置換されたアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、及びヘテロアリーレンから独立して選択される１つ又は複数の部分を含む、リンカー部分である）である。
【００８８】
いくつかの実施形態において、Ｌはアルキレンであり、アルキレンの１つ又は複数のメチレン単位は、ＮＲ１、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、ＣＯ、ＮＲ１Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、及びヘテロアリーレンからなる群から独立して選択される部分で任意に置換され、各Ｒ１は独立してＨ又はアルキルである。
【００８９】
いくつかの実施形態において、Ｌはアルキレンであり、アルキレンの１つ又は複数のメチレン単位は、フェニレン、Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）及びＣ（Ｏ）ＮＨから独立して選択される部分で置換される。
【００９０】
いくつかの実施形態において、Ｌはフェニレンを含む。
【００９１】
いくつかの実施形態において、リンカー前駆体分子Ｃの第１の官能基又はＲは、カルベン又はニトレン基又はフリーラジカル（ジアゾ、ケテン、イソシアネート、又はアジド基等）を生成することができる基を含む。いくつかの実施形態において、リンカー前駆体分子Ｃの第１の官能基又はＲは、ジアジリン、アリールアジド、ベンゾフェノン、又はジアゾを含む。
【００９２】
いくつかの実施形態において、第１の官能基又はＲはアリーレン基を含み、フェニレン基等のアリーレン基を介してリンカー前駆体分子Ｃの残りの部分に結合される。
【００９３】
いくつかの実施形態において、リンカー前駆体分子Ｃの第１の官能基又はＲは、
【化２】
2021530235.tif 000073
（式中、
【化３】
2021530235.tif 000074
はリンカー前駆体分子Ｃの残りの部分への結合点を表す）
からなる群から選択される。
【００９４】
いくつかの実施形態において、リンカー前駆体分子Ｃの第２の官能基又はＭは、アジド（例えば、アルキルアジド）、アルキン、エン、又は−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−を含む。
【００９５】
いくつかの実施形態において、第２の官能基又はＭはアルキレン基を含み、アルキレン基を介してリンカー前駆体分子Ｃの残りの部分に結合される。
【００９６】
いくつかの実施形態において、リンカー前駆体分子Ｃの第２の官能基又はＭは、
【化４】
2021530235.tif 000075
（式中、
【化５】
2021530235.tif 000076
はリンカー前駆体分子Ｃの残りの部分への結合点を表す）
からなる群から選択される。
【００９７】
いくつかの実施形態において、リンカー前駆体分子Ｃは、
【化６】
2021530235.tif 000077
からなる群から選択される。
【００９８】
いくつかの実施形態において、リンカー前駆体分子Ｃは、
【化７】
2021530235.tif 000078
からなる群から選択される。
【００９９】
いくつかの実施形態において、リンカー前駆体分子Ｃは、
【化８】
2021530235.tif 000079
からなる群から選択される。
【０１００】
いくつかの実施形態において、リンカー前駆体分子Ｃは、
【化９】
2021530235.tif 000080
からなる群から選択される。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、リンカー前駆体分子Ｃは、
【化１０】
2021530235.tif 000081
である。
【０１０２】
（標識有機化合物）
いくつかの実施形態において、以下を含む方法により製造される標識有機化合物Ｅが提供される。
（１）リンカー前駆体分子Ｃを、カルベン又はニトレン又はフリーラジカル反応条件等の部位非選択的反応条件下で有機化合物Ａと接触させることであって、リンカー前駆体分子Ｃは、２つの官能基、第１の官能基Ｒ及び第２の官能基Ｍを有し、リンカー前駆体分子Ｃの第１の官能基Ｒは、カルベン又はニトレン又はフリーラジカル等の部位非選択的反応基を生成し、これは部位非選択的反応条件下で有機化合物Ａと反応し、第２の官能基は、第１の官能基が有機化合物Ａと反応する条件下で非反応性であり、リンカー前駆体分子Ｃと有機化合物Ａとの接触によりリンカー前駆体分子Ｃの第２の官能基Ｍを有する中間体Ｄが形成されること、及び
（２）中間体Ｄを標識分子Ｂと接触させることにより、リンカー前駆体分子Ｃの第２の官能基Ｍが標識分子Ｂと反応して標識有機化合物Ｅを形成することであって、標識分子Ｂは標識を含むこと。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、有機化合物Ａは反応性官能基を含まない。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、中間体Ｄは複数の異性体の混合物である。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、標識有機化合物Ｅは複数の異性体の混合物である。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、標識は、化学標識のための固有の配列又は蛍光タグ（例えば、フルオロフォア又はＧＦＰ）又はビオチン標識又はそれらの組み合わせを含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、固有の配列は、一本鎖ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、化学修飾オリゴヌクレオチド、多本鎖天然若しくは人工オリゴヌクレオチド、又は人工オリゴヌクレオチドを含む。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、固有の配列は、オリゴヌクレオチドを含む。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、標識部分と有機化合物部分とを含む異性体標識有機化合物のセットが提供され、標識部分はリンカーを介して有機化合物部分の種々の部位に結合している。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、（１）有機化合物Ａと本明細書に記載のリンカー前駆体分子Ｃとのカルベン、ニトレン、又はフリーラジカル反応等の部位非選択的反応により製造される複数の異性体化合物、及び／又は（２）（１）のフリーラジカル反応により製造される異性体化合物の不均化反応の生成物である一対又は複数対の化合物を含む混合物が提供される。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、一対の不均化反応生成物は、部位非選択的反応によって製造される異性体化合物Ｅの分子量プラス２である分子量を有する化合物Ｆと、部位非選択的反応によって製造される異性体化合物Ｅの分子量マイナス２である分子量を有する化合物Ｆ’とを含む。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、以下を含む方法により製造される複数の異性体標識化合物の混合物が提供される。
（１）本明細書に記載の第１及び第２の官能基を有するリンカー前駆体分子Ｃの第１の官能基を、カルベン又はニトレン又はフリーラジカル反応条件等の部位非選択的反応条件下で有機化合物Ａと反応させて、リンカー前駆体分子Ｃの第２の官能基を有する中間体Ｄを形成すること、及び
（２）第２の官能基を、標識を含む標識分子Ｂと反応させること。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、標識は、化学標識のための固有の配列又は蛍光タグ（例えば、フルオロフォア又はＧＦＰ）又はビオチン標識又はそれらの組み合わせを含む。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、固有の配列は、一本鎖ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、他の化学修飾オリゴヌクレオチド、又は他の人工オリゴヌクレオチド（例えば、多本鎖天然又は人工オリゴヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態において、固有の配列はオリゴヌクレオチドを含む。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、リンカー前駆体分子Ｃの第１の官能基が有機化合物Ａの複数の部位と反応して、複数の異性体中間体Ｄの混合物を形成し、これらは標識分子Ｂと反応して、複数の異性体標識有機化合物Ｅを形成する。いくつかの実施形態において、それぞれが本明細書に記載の方法に従って製造される少なくとも２つの標識有機化合物（又は２セットの異性体標識有機化合物）を含む標識有機化合物のライブラリーが提供され、固有の有機化合物が固有の標識で標識される。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、ライブラリーは、それぞれ固有の標識で標識された、少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、又は５００個の固有の標識有機化合物（又は５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、又は５００セットの異性体標識有機化合物）を含む。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、固有の標識は、固有の配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【０１１８】
（スクリーニング方法）
いくつかの実施形態において、標的分子に結合する有機化合物を同定する方法であって、本明細書に記載の標識有機化合物、異性体標識有機化合物のセット、又は標識有機化合物のライブラリーをアッセイし、それらの標識に従って標的に結合する有機化合物を同定することを含む方法が提供される。このようなアッセイは当該技術分野で一般に知られている。例えば、Ａ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＦＯＲ  ＤＮＡ−ＥＮＣＯＤＥＤ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，Ｇｏｏｄｎｏｗ  Ｊｒ．，Ｗｉｌｅｙ，１  ｅｄｉｔｉｏｎ  （２０１４）の第１３及び１６章、及びＤｅｃｕｒｔｉｎｓ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ｓｍａｌｌ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｕｓｉｎｇ  ＤＮＡ−ｅｎｃｏｄｅｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２０１６；１１（４）：７６４−８０（これらは、その全体が参照により本明細書に援用される）を参照。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、有機化合物は、本明細書に記載される標識有機分子と試験される標的分子との間の親和性によりスクリーニングされる。試験される標的としては、タンパク質分子、細胞、細胞オルガネラ（核、ミトコンドリア、ゴルジ、ペルオキシソーム、リソソーム、エキソソーム等）、細胞骨格（微小管、中間径フィラメント、ミクロフィラメント）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、リン脂質分子、リン脂質タンパク質複合体、又は上記の複合体等が挙げられる。このようなスクリーニング方法は、当技術分野で一般に知られており、試験される特定の標的等の特定の使用に応じて変化してもよい。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、標的分子と結合親和性を有する標識有機化合物は、同定のために選択される。いくつかの実施形態において、選択された標識有機化合物は、コードされたオリゴヌクレオチド配列を解釈し（例えば、サンガー配列決定、第２世代配列決定等）、標的に結合する有機化合物を同定するために、その標識のシークエンシング反応に供される。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、２つの共役二重結合を有する化合物を同定するための方法が提供される。該方法は、以下を含む。
（１）本明細書に記載のリンカー前駆体分子Ｃの第１の官能基と有機化合物Ａとをカルベン又はニトレン又はフリーラジカル反応条件等の部位非選択的反応条件下で反応させて、リンカー前駆体分子Ｃの第２の官能基は未反応のままである生成物Ｄ又は生成物Ｄの混合物を形成すること、及び
（２）生成物Ｄ又は生成物Ｄの混合物を分析することであって、一対の不均化反応生成物の存在は有機化合物Ａが２つの共役二重結合を有することを示し、該一対の不均化反応生成物は、部位非選択的反応の生成物Ｄの分子量プラス２である分子量を有する化合物Ｆと、部位非選択的反応の生成物Ｄの分子量マイナス２である分子量を有する化合物Ｆ’とを含むこと。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、２つの共役二重結合のうちの少なくとも１つは、環系、例えば、シクロアルキル環にある。
【０１２３】
生成物又は生成物の混合物は、質量分析と組み合わせた液体クロマトグラフィー等の当技術分野で一般的に知られている方法により分析することができる。
【０１２４】
（治療方法）
いくつかの実施形態において、それを必要とする被検体における疾患又は病態の治療に使用するための化合物が本明細書で提供され、疾患又は病態は所定の生物学的標的の活性により調節又は影響される。いくつかの実施形態において、化合物は、本明細書に記載されるスクリーニング方法により同定され、任意でさらに修飾され、例えば、所定の生物学的標的への結合効力を増強する。特定の実施形態では、化合物は本明細書に記載される標識有機化合物に由来する。所定の生物学的標的としては、タンパク質、酵素、細胞、細胞オルガネラ（核、ミトコンドリア、ゴルジ、ペルオキシソーム、リソソーム、エキソソーム等）、細胞骨格（微小管、中間径フィラメント、ミクロフィラメント）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、リン脂質分子、リン脂質タンパク質複合体、又は上記の複合体等が挙げられるが、これらに限定されない任意のものとすることができる。
【０１２５】
特定の実施形態において、所定の生物学的標的は、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）である。ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）は、ＤＮＡ修復、ゲノム安定性、プログラム細胞死等の多くの細胞過程に関与するタンパク質ファミリーである。ＰＡＲＰファミリーは、ＰＡＲＰ１、ＰＡＲＰ２、ＶＰＡＲＰ（ＰＡＲＰ４）、タンキラーゼ−１及び−２（ＰＡＲＰ−５ａ又はＴＮＫＳ、及びＰＡＲＰ−５ｂ又はＴＮＫＳ２）、ＰＡＲＰ３、ＰＡＲＰ６、ＴＩＰＡＲＰ（又は「ＰＡＲＰ７」）、ＰＡＲＰ８、ＰＡＲＰ９、ＰＡＲＰ１０、ＰＡＲＰ１１、ＰＡＲＰ１２、ＰＡＲＰ１４、ＰＡＲＰ１５、及びＰＡＲＰ１６等の１７のメンバーを含む。
【０１２６】
特定の実施形態では、所定の生物学的標的はＰＡＲＰ１である。ＰＡＲＰ１は、一本鎖切断の修復に重要なタンパク質である。ＰＡＲＰ１を阻害する薬剤は、複数の二本鎖切断を形成させ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２又はＰＡＬＢ２変異を有する腫瘍では、これらの二本鎖切断を効率的に修復することができず、腫瘍細胞を死に至らしめる。腫瘍抑制因子ＰＴＥＮを欠くがん細胞のいくつかは、Ｒａｄ５１のダウンレギュレーションによりＰＡＲＰ阻害剤に感受性を示す可能性がある。従って、ＰＡＲＰ阻害剤は、ＰＴＥＮ欠陥腫瘍に対して有効である可能性がある。
【０１２７】
ＰＡＲＰ阻害剤は、がん治療での使用に加えて、脳卒中、心筋梗塞、及び神経変性疾患の治療の可能性があると考えられる。
【０１２８】
従って、いくつかの実施形態において、本明細書に記載のスクリーニング方法によってＰＡＲＰ１に結合又は阻害することができると同定された化合物の治療有効量を、それを必要とする被検体に投与することを含む、被検体におけるがん、脳卒中、心筋梗塞、神経変性疾患又は炎症を治療するための方法が提供される。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、治療有効量のルテオリン、ナリンギン、ヒエロシド、リキリチン、エピカテキン、エピガロカテキン、ダフネチン、Ｆ００１、Ｆ００２、Ｆ００３もしくはＦ００６、又はそれらの誘導体を、それを必要とする被検体に投与することを含む、被検体におけるがん、脳卒中、心筋梗塞、神経変性疾患又は炎症を治療するための方法が提供される。いくつかの実施形態において、治療有効量のルテオリン又はその誘導体を、それを必要とする被検体に投与することを含む、被検体におけるがん、脳卒中、心筋梗塞、変性疾患又は炎症を治療するための方法が提供される。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、治療を必要とする被検体はがんを有する。いくつかの実施形態において、被検体は、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＡＬＢ２又はＰＴＥＮＴ変異を有するがん細胞を有する。特定の実施形態では、変異は不活性化変異である。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、被検体は、対応する正常細胞と比較してＰＡＲＰタンパク質を過剰発現するがん細胞を有する。いくつかの実施形態において、ＰＡＲＰタンパク質はＰＡＲＰ１である。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、治療を必要とする被検体は神経変性疾患を有する。いくつかの実施形態において、神経変性疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、萎縮性脊髄炎、エイズによる認知症、血管性認知症、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、治療を必要とする被検体は、脳卒中に罹患している。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、治療を必要とする被検体は、パーキンソン病、関節炎、関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、乾癬性関節炎、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、ループス、全身性ループス紅斑、若年性関節リウマチ、若年性特発性関節炎、グレーブ病、橋本病、アジソン病、セリアック病、皮膚筋炎、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、シェーグレン症候群、Ｉ型糖尿病、血管炎、ブドウ膜炎、アテローム性動脈硬化症及び強直性脊椎炎からなる群より選択される疾患又は病態に関連する炎症等の炎症に罹患しているが、これらに限定されない。
【０１３５】
「治療」又は「治療する」は、臨床結果を含む有益な又は所望の結果を得るためのアプローチである。有益な又は所望の臨床結果は、以下のうちの１つ又は複数を含み得る：ａ）疾患又は病態を阻害すること（例えば、疾患又は病態から生じる１つ又は複数の症状を減少させること、及び／又は疾患又は病態の程度を軽減させること）；ｂ）疾患又は病態に関連する１つ又は複数の臨床症状の発生を遅らせるか又は停止させること（例えば、疾患又は病態を安定させること、疾患又は病態の悪化又は進行を予防又は遅延させること、及び／又は疾患又は病態の広がり（例えば、転移）を予防又は遅延させること）；及び／又はｃ）疾患を軽減すること、すなわち、臨床症状の退行を引き起こすこと（例えば、疾患状態を改善すること、疾患又は病態の部分的又は全寛解を提供すること、別の薬物の効果を増強すること、疾患の進行を遅延させること、生活の質を増加させること、及び／又は生存期間を延長させること。
【０１３６】
「予防」又は「予防する」は、疾患や病態の臨床症状が発現しないようにする疾患や病態のあらゆる治療を意味する。いくつかの実施形態において、危険にさらされているか、又は疾患又は病態の家族歴を有する被検体（ヒトを含む）に化合物が投与されてもよい。
【０１３７】
「被検体」は、治療、観察又は試験の対象となっている、又は対象となる哺乳動物（ヒトを含む）等の動物を指す。本明細書に記載される方法は、ヒト治療及び／又は獣医学的適用において有用である可能性がある。いくつかの実施形態において、被検体は哺乳動物である。１つの実施形態において、被検体はヒトである。
【０１３８】
本明細書に記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩、互変異性体、立体異性体、立体異性体の混合物、プロドラッグ、若しくは重水素化類似体の「治療有効量」又は「有効量」という用語は、症状の改善又は疾患の進行の遅延等の治療的利益を提供するために、被検体に投与された場合に、治療をもたらすのに十分な量を意味する。例えば、治療有効量は、限定されるものではないが、ＰＡＲＰタンパク質等の所定の生物学的標的の疾患又は病態の症状を低減させるのに十分な量であり得る。治療有効量は、被検体、及び治療される疾患又は病態、被検体の体重及び年齢、疾患又は病態の重症度、及び投与方法に応じて異なることがあり、これは当業者が容易に決定することができる。
【０１３９】
本明細書に記載される方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏで細胞集団に適用することができる。「ｉｎ  ｖｉｖｏ」は、動物内又はヒト内のような生体内を意味する。この状況では、本明細書に記載される方法は、個体内で治療的に使用され得る。「ｅｘ  ｖｉｖｏ」は、生体の外を意味する。ｅｘ  ｖｉｖｏ細胞集団の例としては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養物、及び個体から得られた流体又は組織サンプルを含む生物学的サンプルが挙げられる。このようなサンプルは、当該技術分野で周知の方法により得ることができる。例示的な生物学的液体サンプルとしては、血液、脳脊髄液、尿、及び唾液が挙げられる。この状況では、本明細書に記載される化合物及び組成物は、治療目的及び実験目的を含む種々の目的のために使用され得る。例えば、本明細書に記載される化合物及び組成物は、所定の兆候、細胞型、個体、及び他のパラメータについて、本開示の化合物の投与の最適なスケジュール及び／又は投与量を決定するために、ｅｘ  ｖｉｖｏで使用され得る。このような使用から収集された情報は、実験目的のために、又は臨床において、ｉｎ  ｖｉｖｏ治療のためのプロトコルを設定するために使用され得る。本明細書に記載される化合物及び組成物が適し得る他のｅｘ  ｖｉｖｏ使用は、以下に記載されるか、又は当業者に明らかになる。選択された化合物は、ヒト又は非ヒト被検体における安全性又は耐性投薬量を試験するためにさらに特徴付けられてもよい。このような特性は、当業者に一般的に知られている方法を用いて調べることができる。
【０１４０】
前述の反応規準のいずれかにおける改善は、本開示の方法により具体的に提供される。
【実施例】
【０１４１】
以下の実施例は、本開示の特定の実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示される技術は、本開示の実施において良好に機能する技術を表し、従って、その実施のための特定の態様を構成すると考えることができることを当業者は理解されたい。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示された特定の実施形態において多くの変更を行うことができ、それでも、本開示の精神及び範囲から逸脱することなく、同様の又は類似の結果を得ることができることを理解すべきである。
【０１４２】
実施例１
【化１１】
2021530235.tif 000082
化合物１（２００ｍｇ）を１０ｍＬのジクロロメタンに溶解し、次いで化合物２（２００ｍｇ）、ＥＤＣＩ（４１６ｍｇ）及びＤＭＡＰ（１０ｍｇ）と撹拌しながら混合した。室温で３時間撹拌した後、混合物をジクロロメタンで抽出し、食塩水で洗浄し、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーで精製して、リンカーＩ（２１０ｍｇ、７０．４％）を生成した。1H NMR (500 MHz, クロロホルム−ｄ) δ 7.82 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.25 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.63 (s, 1H), 3.79 - 3.62 (m, 6H), 3.45 - 3.36 (m, 2H); HRMS-ESI (m/z) [M + H]+ C13H9F3N6O2について計算, 343.1130, 実測値（found）, 343.1133.
【０１４３】
実施例２
【化１２】
2021530235.tif 000083
化合物３（２００ｍｇ）を１０ｍＬのジクロロメタンに溶解し、次いで化合物２（５１３ｍｇ）、ＥＤＣＩ（４０５ｍｇ）及びＤＭＡＰ（１０ｍｇ）と撹拌しながら混合した。室温で３時間撹拌した後、混合物をジクロロメタンで抽出し、食塩水で洗浄し、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーで精製して、リンカーＩＩ（２８３ｍｇ、７５．６％）を生成した。1H NMR (500 MHz, クロロホルム−ｄ) δ 5.93 (s, 1H), 3.72 - 3.66 (m, 2H), 3.57 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 3.48 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 3.41 - 3.35 (m, 2H), 2.06-1.98 (m, 2H), 1.82 - 1.67 (m, 2H), 1.03 (s, 3H); HRMS-ESI (m/z) [M + H]+ C9H17N6O2について計算, 241.1413, 実測値, 241.1417.
【０１４４】
実施例２
【化１３】
2021530235.tif 000084
化合物４（５０ｍｇ）を５ｍＬのジクロロメタン５ｍＬに溶解し、次いで化合物５（２５μＬ）、ＨＡＴＵ（１５０ｍｇ）及びＤＩＰＥＡ（１３８μＬ）と混合し、室温で３時間撹拌した後、混合物をジクロロメタンで抽出し、食塩水で洗浄し、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーで精製して、リンカーＩＩＩ（４９ｍｇ、７９．１％）を得た。1H NMR (500 MHz, クロロホルム−ｄ) δ 7.81 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.26 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.23 (s, 1H), 4.26 (dd, J = 5.2, 2.6 Hz, 2H), 2.30 (t, J = 2.6 Hz, 1H). HRMS-ESI (m/z) [M + H]+ C12H9F3N3Oについて計算, 268.0698, 実測値, 268.0699.
【０１４５】
実施例４
【化１４】
2021530235.tif 000085
３−（２−アジドエチル）−３−メチル−３Ｈ−ジアジリン（リンカーＩＶ）を、Ｌｉａｎｇら（Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ（２０１７）５６（１０）：２７４４−２７４８）に従って、溶媒Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドをアセトニトリルに替えることにより調製した。1H NMR (500 MHz, クロロホルム−ｄ) = 1.05 (s, 3H), 1.60 (t, 2H, J = 5.4 Hz), 3.18 (t, 2H, J = 5.4 Hz).
【０１４６】
実施例５
【化１５】
2021530235.tif 000086
オリドニン（２ｍｇ、０．００５４ｍＭ）を１ｍＬのジクロロメタンに溶解し、二官能性リンカーＩ（３．３ｍｇ、０．０１１ｍＭ）と混合した。混合物に紫外線（３６５ｎｍ）を室温で３時間照射して、MS (ESI (m/z) [M + H]+)が６７９．２７の少なくとも５つの異性体生成物を含むオリドニンリンカーＩ複合体を生成した（図１）。
【０１４７】
実施例６
【化１６】
2021530235.tif 000087
最初のＤＮＡ７（５０μＬ、ホウ酸バッファー（ｐＨ９．４）中の１ｍＭ）を、５００μＬチューブ中でボルテックスにより化合物６（５μＬ、ＤＭＳＯ中の２００ｍＭ）と混合し、次いでローテーターで１０時間回転させた。混合物に５Ｍ  ＮａＣｌ（５．５μＬ）、続いてＥｔＯＨ（１６０μＬ）を添加した。内容物を短時間ボルテックスし、フリーザー中で−２０℃で２０分間インキュベートした。次いで、懸濁液を１０，０００×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄し、微量のＥｔＯＨを真空下で除去した。ペレットをＨ２Ｏ（５０μＬ）に溶解して、化合物８の１ｍＭ溶液を作製した（図２）。
【０１４８】
実施例７
【化１７】
2021530235.tif 000088
化合物８（２０μＬ、Ｈ２Ｏ中の１ｍＭ）をリンカーＩ（４μＬ、１００ｍＭ）、硫酸銅（ＩＩ）五水和物（４μＬ、１００ｍＭ）、アスコルビン酸ナトリウム（４μＬ、２００ｍＭ）及びＴＨＴＰＡ（４μＬ、１００ｍＭ）と混合した。混合物をボルテックスで混合し、続いてローテーター上で５時間回転させた。次に、混合物に５Ｍ  ＮａＣｌ（３．６μＬ）、続いてＥｔＯＨ（１００μＬ）を加えた。内容物を短時間ボルテックスし、−２０℃で２０分間インキュベートした。次いで、懸濁液を１０，０００×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄し、微量のＥｔＯＨを真空下で除去して標識化合物９を生成した（図３）。
【０１４９】
実施例８
【化１８】
2021530235.tif 000089
化合物８（２０μＬ、Ｈ２Ｏ中の１ｍＭ）を、オリドニン−リンカーＩ結合体（４μＬ、１００ｍＭ）、硫酸銅（ＩＩ）五水和物（４μＬ、１００ｍＭ）、アスコルビン酸ナトリウム（４μＬ、２００ｍＭ）及びＴＨＴＰＡ（４μＬ、１００ｍＭ）と混合した。混合物をボルテックスで混合し、ローテーター上で５時間回転させた。次に、混合物に５Ｍ  ＮａＣｌ（３．６μＬ）、続いてＥｔＯＨ（１００μＬ）を加えた。混合物を短時間ボルテックスし、−２０℃で２０分間インキュベートした。次いで、懸濁液を１０，０００×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄し、微量のＥｔＯＨを真空下で除去して標識化合物１０を生成した（図４）。
【０１５０】
実施例９
【化１９】
2021530235.tif 000090
オリドニン（２ｍｇ、０．００５４ｍＭ）をアセトニトリル１ｍＬに溶解し、次に二官能性リンカーＩＩ（２．６ｍｇ、０．０１１ｍＭ）と混合した。混合物に紫外線（３６５ｎｍ）を室温で３時間照射して、MS (ESI (m/z) [M + H]+)が５７７．３の少なくとも５つの異性体化合物を含むオリドニン−リンカーＩＩ結合体化合物を生成した（図５及び図６）。
【０１５１】
実施例１０
【化２０】
2021530235.tif 000091
セラストロール（２ｍｇ、０．００４４ｍＭ）を１ｍＬのアセトニトリルに溶解し、次いで二官能性リンカーＩＩ（２．１ｍｇ、０．００９ｍＭ）と混合した。混合物に紫外線（３６５ｎｍ）を室温で３時間照射して、MS (ESI (m/z) [M + H]+)が６６３．３８の少なくとも３つの異性体化合物を含むセラストロール−リンカーＩＩ結合体を生成した（図７及び図８）。
【０１５２】
実施例１１
【化２１】
2021530235.tif 000092
タキソール（２ｍｇ、０．００４７ｍＭ）を１ｍＬのアセトニトリルに溶解し、次いで二官能性リンカーＩＩ（２．３ｍｇ、０．００９４ｍＭ）と混合した。混合物に紫外線（３６５ｎｍ）を室温で３時間照射して、MS (ESI (m/z) [M + H]+)が１０６６．４６の少なくとも３つの異性体化合物を含むタキソール−リンカーＩＩ結合体を生成した（図９及び図１０）。
【０１５３】
実施例１２
【化２２】
2021530235.tif 000093
トリプトフェノリド（２ｍｇ、０．００６４ｍＭ）を１ｍＬのアセトニトリルに溶解し、次いで二官能性リンカーＩＩ（３．１ｍｇ、０．０１２８ｍＭ）と混合した。混合物に紫外線（３６５ｎｍ）を室温で３時間照射して、トリプトフェノリドリンカーＩＩ結合体を生成した（図１１及び図１２）。
【０１５４】
実施例１３
【化２３】
2021530235.tif 000094
メイタンシノール（４ｍｇ、０．００７１ｍＭ）を１ｍＬのアセトニトリルに溶解し、次いで二官能性リンカーＩＩ（３．４ｍｇ、０．０１４２ｍＭ）と混合した。混合物に紫外線（３６５ｎｍ）を室温で３時間照射して、MS (ESI (m/z) [M + H]+)が７７７．３の少なくとも２つの異性体化合物を含むメイタンシノール−リンカーＩＩ結合体を生成した（図１３及び図１４）。
【０１５５】
実施例１４
【化２４】
2021530235.tif 000095
アビエチン酸（２ｍｇ、０．００６６ｍＭ）を１ｍＬのアセトニトリルに溶解し、次いで二官能性リンカーＩＩ（３．１ｍｇ、０．０１３ｍＭ）と混合した。混合物に紫外線（３６５ｎｍ）を室温で３時間照射した。２種類の結合体を生成した（MS (ESI (m/z) [M + H]+)が５１３．３７のデヒドロアビエチン酸リンカーＩＩ結合体（Ａ）、及びMS (ESI (m/z) [M + H]+)が５１７．４０のヒドロアビエチン酸リンカーＩＩ結合体（Ｂ））。（図１５及び図１６）。
【０１５６】
実施例１５
オリゴヌクレオチドとの反応：化合物６及び７を、リガーゼを用いてオリゴヌクレオチドと連結した。ヘッドピース−ＤＮＡ結合体４を感光性リンカー２と混合した。混合物に紫外線（３６５ｎｍ）を２時間照射した。生成物はオリゴヌクレオチドと連結し、バンドはスメアになり、複数の連結生成物が生成したことを示した（図１７）。
【０１５７】
実施例１６
標識として使用することができるオリゴヌクレオチドには、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、化学修飾オリゴヌクレオチド、及びアンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）等のいくつかの機能種が含まれる。
【０１５８】
標識のためのいくつかのオリゴヌクレオチドの例の配列を以下に列挙する：
ssDNA: 5’ -AAATAAATT、修飾された5’アミノ
ssRNA: 5’ -AUUUAUUUU、修飾された5’アミノ
ssDNA: 5’ -AAATAAATT、修飾された3’アミノ
ssRNA: 5’ -AUUUAUUUU、修飾された3’アミノ
ssDNA: 5’ -AAATAAATT、ホスホロチオエート結合で修飾された5’アミノ（ヌクレアーゼによる分解に抵抗性）。
ssDNA: 5’ -GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG、ホスホロチオエート結合で修飾された５’アミノ（ヌクレアーゼによる分解に抵抗性）。
【０１５９】
実施例１７
ＤＮＡコード化化学ライブラリー（ＤＥＬ）は、組み合わせ最適化を介して遺伝学及び化学合成の力を結びつける。組み合わせ化学により、ＤＥＬは、数十億から数兆の前例のないサイズにまでなることができ、生物学的及び薬学的研究のための豊富な化学的多様性を提供する。分子レベルでは、ほとんどの場合、多様性はＤＮＡ適合性化学反応の利用可能な構成単位に限定されるが、現在、現代の化学的方法を用いて多様性を増加させている。ＤＥＬアプローチを十分に活用するために、遺伝学の力を化学構造に直接結びつけることは、有限の化学世界において、さらに大きな多様性を提供するであろう。天然物は、それらの生物学的進化と共に、信じられないほどの構造的多様性を進化させてきた。
【０１６０】
以下に、天然物、ＦＤＡ承認薬物、臨床試験における化合物、及び組み合わせ合成による化合物を用いる例示的なＤＮＡコード化化学ライブラリー（ＤＥＬ）を提供するが、これは、本明細書中に記載される方法に従って調製された。以下の例において、揮発性二官能性リンカー（リンカーＩＶ）は、自動パラレル合成装置上での「ワンポット」反応を可能にした。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は以下の基準を示す：（１）部位非選択性、（２）化学非選択性、（３）生物学的適合性（例えば、ＤＮＡ適合性）、及び（４）小さい反応規模（例えば、マイクログラム）への適合性。従来の化学選択的反応では、空間的遮蔽の結果として、１つの特定の原子上で天然物を修飾し、標的タンパク質の機能を調節する結合ポケット候補が見逃される可能性がある。化学及び部位非選択的反応を用いて、全てのアクセス可能な原子を標的とする後期修飾方法を設計した。該後期修飾は、固有のＤＮＡタグを有する異性体のクラスターを生じ、標的タンパク質への複数の立体接近性（ｓｔｅｒｉｃ  ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）を提供した。
【０１６２】
一般的な方法
すべての市販の有機化合物及びＤＮＡヘッドピース（ＨＰ−ＮＨ２、５’−／５ｐｈｏｓ／ＧＡＧＴＣＡ／ｉＳｐ９／ｉＵｎｉＡｍＭ／ｉＳｐ９／ＴＧＡＣＴＣＣＣ−３’）は、特に明記しない限り、市販の供給源から入手した。特に明記しない限り、全ての市販の試薬及び溶媒は、さらに精製することなく使用した。ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＭ−５００  ＮＭＲ分光計で記録した。化学シフトはδ（ｐｐｍ）で報告し、カップリング定数はＪ（ヘルツ）で報告した。テトラメチルシラン（ＴＭＳ）を１Ｈ  ＮＭＲの内部参照として使用し、ＣＤＣｌ３を１３Ｃ  ＮＭＲ（δ７７．０ｐｐｍ）の内部参照として使用した。質量スペクトルは、ＡＢ  ＳＣＩＥＸ  ４６００質量分析計又はｗａｔｅｒｓ  ＳＱＤ２質量分析計で記録した。リンカーＩＶを実施例４に従って調製した。
【０１６３】
（リンカースクリーニング）
本明細書に記載される種々の二官能性リンカーを試験して、天然物のためのハイスループットＤＮＡアノテーション戦略を開発した。リンカー上の官能基の反応性は直交性であり、一方の末端は化学反応及び部位非選択的反応のために設計され、他方は本明細書に記載されるように、銅（Ｉ）触媒アジド−アルキン環状付加（ＣｕＡＡＣ）を介してＤＮＡタグを結合させるために使用された。
【０１６４】
例示的な二官能性リンカーを、モデル基質としてオリドニンを使用して試験し（テーブル１Ａ）、オリドニン（１当量）及び二官能性リンカー（２当量）をアセトニトリルに溶解して室温でＵＶ照射に供した。
【０１６５】
テーブル１Ａに示すように、３−（トリフルオロメチル）−３Ｈ−ジアジリン−３−イル含有リンカーＩＩＩは、（オリドニン濃度に基づいて）２０％の収率で３つの異性体を生成した。３−メチル−３Ｈ−ジアジリン−３−イル含有リンカーＩＩは、６つの標識オリドニン異性体を６９％の標識効率で与え、そのうちの２つは２分子のリンカーＩＩで標識した１つのオリドニンを有していた。３−メチル−３Ｈ−ジアジリン−３−イル含有リンカー、３−（２−アジドエチル）−３‐メチル−３Ｈ−ジアジリン（リンカーＩＶ）は、１つの異性体を生成した。リンカーＩＶとオリドニンとの反応終了後、未反応リンカーＩＶ及び／又はリンカーＩＶの副産物を、１Ｈ−ＮＭＲにより示されるように減圧によって除去した。
【０１６６】
【表２】
2021530235.tif 000096
【０１６７】
テーブル１Ｂに示すように、リンカーＩＶと２，４−ジヒドロキシアセトフェノンとを５当量の濃度で反応させても、リンカーＩＶはアジド官能基と反応しなかった。図１８に示すように、反応終了後、未反応のリンカーＩＶ及び／又はリンカーＩＶの副生成物は、１Ｈ−ＮＭＲで示されるように（矢印で示されたリンカーＩＶ−２，４−ジヒドロキシアセトフェノン結合体）、減圧により容易に除去された。微量の残存リンカーＩＶは、ＣｕＡＡＣベースのクリック化学及び酵素ＤＮＡライゲーションを介したその後のＤＮＡ結合と干渉しないことが示された。
【０１６８】
【表３】
2021530235.tif 000097
【０１６９】
【０１７０】
テーブル２に示すリンカー結合体を、リンカーＩＶを用いて調製した。
【表４−１】
2021530235.tif 000098
【０１７１】
【表４−２】
2021530235.tif 000099
【０１７２】
スキーム２は、薬剤及び天然物と反応させるための、ＤＭＴＭＭにより促進されたアミドカップリング化学によるプロピン−（ＰＥＧ）５−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨからのプロピン−ＨＰ−ＤＮＡの調製を示す。
【０１７３】
【化２５】
2021530235.tif 000100
【０１７４】
スキーム２において、ｐＨ９．５のホウ酸ナトリウムバッファー（２５０ｍＭ）中のＨＰ−ＤＮＡ（１ｍＭ）に、４０当量のプロピン−（ＰＥＧ）５−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ（ＤＭＦ中２００ｍＭ）、続いて５０当量のＤＭＴＭＭ（水中２００ｍＭ）を添加した。室温で１８時間撹拌した後、反応混合物に５Ｍ  ＮａＣｌ溶液（１０容量％）及び冷エタノール（２．５倍容量、エタノールを−２０℃で保存）を加えた。混合物を−８０℃で３０分以上保管した。その後、混合物を１２０００ｒｐｍの微量遠心機中で４℃で１５分間遠心分離した。上清を除去し、ペレットを最終濃度１ｍＭまで水に溶解し、さらに精製することなくクリックカップリング反応の次のステップに直接使用した。計算精密質量：５２６７．０７。実測質量（Ｆｏｕｎｄ  Ｍａｓｓ）：５２６６．４６。
【０１７５】
二官能性リンカーＩＶを使用する種々の薬物の標識のための一般的な手順は、以下のスキーム３のとおりである。スキーム３において、ＮＰは薬物又は天然物であり、プロピン−ＨＰ−ＤＮＡは上記のとおりである。テーブル３及びテーブル４の化合物は、これらの方法を用いて調製した。
【０１７６】
【化２６】
2021530235.tif 000101
【０１７７】
簡潔には、ＣＨ３ＣＮ（１００μＬ）を、各ウェル中の化合物（１μｍｏｌ）及びリンカーＩＶ（５μｍｏｌ）を含む９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。プレートを、ＵＶ下、３６５ｎｍの波長で３０分間、室温で照射した。生成物及び収率をＬＣ−ＭＳにより評価した。ＣＨ３ＣＮを一晩、真空中で蒸発させて相対ＮＰ−Ｎ３を生成した。その後、化合物（ＮＰ−Ｎ３）をＤＭＳＯ（３０μＬ）に溶解し、プロピン−ＨＰ−ＤＮＡ（１０μＬ、水中１ｍＭ）、ＴＨＰＴＡ（１０μＬ、ＤＭＳＯ中８０ｍＭ）、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（１０μＬ、水中８０ｍＭ）及びアスコルビン酸ナトリウム（２０μＬ、水中８０ｍＭ）と混合した。得られた混合物を室温で一晩振盪し、反応終了時に生成物及び収率をＬＣ−ＭＳで評価した。その後、捕捉剤ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム（１２μＬ、水中１６０ｍＭ）を添加した。次いで、すべてのＨＰ−ＤＮＡ結合化合物（ＮＰ−ＨＰ−ＤＮＡ）を収集し、５Ｍ  ＮａＣｌ溶液（１０容量％）及び冷エタノール（２．５倍容量、エタノールを−２０℃で保存）を添加した。混合物を−８０℃のフリーザー中で３０分以上保存した。混合物を１２０００ｒｐｍの微量遠心機中で４℃で１５分間遠心分離した。上清を除去し、ペレットを水に溶解した。
【０１７８】
ＤＮＡコード化は、本明細書に記載の「ワンポット」段階的合成を用いて９６ウェルプレート中で行った。テーブル３及びテーブル４に示す薬物−リンカーＩＶ結合体及び標識化合物を、上記の手順に従って調製した。合計１１０個のＤＮＡコード化最終産物が得られた（テーブル４）。化合物番号１７、２５、７４、８２、１０８、９１、９９、及び１１４等の、１つ又は複数のヒドロキシル、カルボキシル、アミン等を含む複数の官能基を有する化合物については、異なる保持時間でＨＰＬＣ画分により示されるように、ＤＮＡ結合体が複数の部位で容易に生じ、同じ分子量を示したが、単一官能基を有する化合物については、単一の部位でのＤＮＡ結合体が概して観察された。
【０１７９】
【表５−１】
2021530235.tif 000102
【０１８０】
【表５−２】
2021530235.tif 000103
【０１８１】
【表５−３】
2021530235.tif 000104
【０１８２】
【表５−４】
2021530235.tif 000105
【０１８３】
【表５−５】
2021530235.tif 000106
【０１８４】
【表５−６】
2021530235.tif 000107
【０１８５】
【表５−７】
2021530235.tif 000108
【０１８６】
【表５−８】
2021530235.tif 000109
【０１８７】
【表５−９】
2021530235.tif 000110
【０１８８】
【表５−１０】
2021530235.tif 000111
【０１８９】
【表５−１１】
2021530235.tif 000112
【０１９０】
【表５−１２】
2021530235.tif 000113
【０１９１】
【表６−１】
2021530235.tif 000114
【０１９２】
【表６−２】
2021530235.tif 000115
【０１９３】
【表６−３】
2021530235.tif 000116
【０１９４】
【表６−４】
2021530235.tif 000117
【０１９５】
【表６−５】
2021530235.tif 000118
【０１９６】
【表６−６】
2021530235.tif 000119
【０１９７】
【表６−７】
2021530235.tif 000120
【０１９８】
【表６−８】
2021530235.tif 000121
【０１９９】
【表６−９】
2021530235.tif 000122
【０２００】
【表６−１０】
2021530235.tif 000123
【０２０１】
【表６−１１】
2021530235.tif 000124
【０２０２】
【表６−１２】
2021530235.tif 000125
【０２０３】
実施例１８：組み合わせ合成構築
ＤＮＡコード化化学ライブラリー（ＤＥＬ）を単一の試験管でスクリーニングできることを利用するために、後期修飾反応により合成された選択ＤＥＬを、スクリーニングのためにＤＥＬライブラリーフォーマットに組み込んだ。この目的のために、後期アノテーション化（ａｎｎｏｔａｔｅｄ）ＤＥＬ（伝統的な漢方薬天然物（ＴＣＭ）、ＦＤＡ承認薬物、及び臨床試験における対照化合物を含む）と、サイズが１０４の小さな組み合わせＤＥＬライブラリーとを調製し、次いで１：１０の比（単一化合物濃度）で組み合わせた。炭酸脱水酵素ＩＩ（ＣＡＩＩ）の２つの既知の阻害剤、カルゼニド及びブリンゾラミドを用いて、後期標識ＤＥＬの濃縮に対する種々の混合比の効果を試験した。２つのＣＡＩＩ阻害剤を最初にＤＮＡコード化し、０．０５ｐＭ、０．５ｐＭ、及び５ｐＭの最終濃度で１０４組み合わせＤＥＬ（０．５ｐＭ／分子）中にスパイクした。０．０５ｐＭ濃度の後期標識ＤＥＬ（１：１０比）の混合は、ブリンゾラミド及びカルゼニドについてそれぞれ３００倍及び４１０倍の最も高い濃縮を示した（テーブル５）。
【０２０４】
【表７】
2021530235.tif 000126
【０２０５】
スパイクされた天然物−ＤＮＡ結合の量を定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）により定量し、次いで、示された比率でＤＥＬライブラリーと混合した。パイロットＤＥＬライブラリーは、６個のアミン−（ＰＥＧ）ｎ−酸（構成単位１）、４６個のアミノ酸（構成単位２）、及び４６個のカルボン酸（構成単位３）のカップリングにより構築された１２６９６個の化合物を含む。
【０２０６】
フレームワークをコードするＤＮＡは、文字通りヘッドピースの構造及び他のバーコードに基づいて設計された。ヘッドピースは、ＤＮＡヘッドピース（５’−／５ｐｈｏｓ／ＧＡＧＴＣＡ／ｉＳｐ９／ｉＵｎｉＡｍＭ／ｉＳｐ９／ＴＧＡＣＴＣＣＣ−３’）である。ＤＮＡオリゴバーコードを、ライゲーションバッファー及びＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｚ１８１１Ｓ）中で酵素的にライゲーションした。反応混合物を１６℃で１６時間インキュベートし、ＬＣＭＳ及びゲルにより分析した。配列決定プライマーは、５’−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧ及び５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＧＴＣＧＴＧＡＴＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣであり、一般的なスキームは、図１９に示されるとおりである。
【０２０７】
ｈｉｓタグ融合組み換えヒトＰＡＲＰ−１（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号１１０４０−Ｈ０８Ｂ）及びヒト−ＨＳＰ７０（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号１１６６０−Ｈ０７Ｈ）を、市販供給源から入手した。これらの２つの可溶性タンパク質のパニング手順は同じであった。５μｇの標的タンパク質を、Ｎｉ荷電ＭａｇＢｅａｄｓ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、カタログ番号Ｌ００２９５）、５ｎＭ  ＤＥＬライブラリー及び１０μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡと混合した。最終容量を１００μＬに調製した。混合物を室温で１．５時間回転させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）を補充したリン酸緩衝生理食塩水で５回洗浄した後、標的タンパク質結合化学ＤＮＡ結合体を、５０μＬの溶出バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）中、９５℃で１０分間加温することにより溶出した。溶出したＤＥＬ化合物を、Ｔａｋａｒａ  ＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ、カタログ番号Ｒ０４５Ａ）を用いたＰＣＲにより増幅した。次いで、過剰のプライマーをＨｉｅｆｆ  ＮＧＳＴＭスマーターＤＮＡクリーンビーズ（Ｙｅａｓｅｎ、カタログ番号１２６００ＥＳ０３）により除去し、４％ＤＮＡアガロースゲル上で評価した。増幅産物を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  Ｘ１０  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いたハイスループットシークエンシングに供した。アフィニティー選択及び異なる標的用のオリゴヌクレオチドタグのＰＣＲ増幅をテーブル６にまとめた。
【０２０８】
【表８】
2021530235.tif 000127
【０２０９】
組み合わせ化学ライブラリーを、第１、第２、及び第３の構成単位ライブラリーについて、それぞれ６個、４６個、及び４６個の化学構成単位を含む３つの構成単位サブライブラリーにより構築した。各構成単位は、１０塩基対（ｂｐ）のＤＮＡ配列によりコードされた。天然物は、組み合わせ化学ライブラリーＤＮＡコードと同じ長さの３０ｂｐのＤＮＡ配列によりコードされた。これらの３つのサブライブラリー間のすべての可能な組み合わせ（組み合わせ化合物）を、１２６９６のＤＮＡコード化配列を含む参照ＤＮＡコード化ライブラリーを作製した、インハウスｊａｖａプログラムにより作製した。シークエンシング後、ＤＮＡコード化配列の周りのＩｌｌｕｍｉｎａアダプターを、ＣＬＣゲノミクスワークベンチバージョン１２（Ｑｉａｇｅｎ）によりトリミングした。残ったＤＮＡコード化配列は、３回の「分割プール」反復において構成単位の３つのＤＮＡ配列に対応する３０ｂｐの長さであった。各サンプルについて、ＤＮＡコード化配列を、参照ＤＮＡコード化化合物ライブラリーにマッピングした。マッピングにおいて不整合は許容しなかった。コード化配列を、種々のサンプルにわたるすべての化合物についてカウントした。所与のサンプル中の全ての化合物の合計リードカウントを計算した。各個々の化合物のリードカウントを合計カウントで除し、定数１０００００を乗じた。
【０２１０】
正規化カウント化合物Ｍ、サンプルＡ＝カウント化合物Ｍ、サンプルＡ／（合計カウントサンプルＡ）＊１０００００
参照ライブラリーと比較した選択後ライブラリー中の各化合物の倍率変化を計算した。例えば、サンプルＡと参照ライブラリーとを比較した場合、化合物Ｍの倍率変化は、以下のように計算された。
倍率変化化合物Ｍ＝正規化カウント化合物Ｍ、サンプルＡ／正規化カウント化合物Ｍ、参照
【０２１１】
ｎＤＥＬスクリーニングのヒット基準は、正規化濃縮倍率値（ｙ軸）及びディープシークエンシングリードカウント（ｘ軸）の両方を考慮に入れる。１０未満のリードカウントを有する化合物は信頼できないと考えられ、従って、オンターゲットスクリーニングの前にＤＥＬから直ちに排除される。各ＤＥＬライブラリーについて、標的タンパク質の非存在下でベースライン濃縮倍率を記録し、ライブラリー中の各ＤＥＬ化合物について正規化濃縮倍率値を計算することができる。ヒット同定のためのカットオフは、非常に多様なデータ集団の単純統計分析に基づき、ライブラリー全体の濃縮倍数の平均値（μ）＋標準偏差（σ）の３倍の合計である。μ＋３σを超える濃縮倍数を示す任意のＤＥＬ化合物をヒットとみなす。
【０２１２】
（ＰＡＲＰ−１酵素アッセイ）
ＰＡＲＰ−１自己リボシル化に基づくアッセイ（ＢＰＳ、カタログ番号８０５８０）を、提供されたプロトコルに従って行った。化合物をＤＭＳＯに溶解した。種々の化合物（ＤＭＳＯの最終濃度は、すべてのサンプルにおいて１％であった）に応じて、種々の範囲の化合物とタンパク質とを室温で１５分間、予備インキュベーションすることにより、実験反応を３回繰り返して設定した。次いで、ＡＤＰ−リボシル化反応物を、基材被覆アッセイプレート中で２倍希釈することにより調製し、室温で１時間インキュベートした。マイコプレートリーダー（ＥｎＶｉｓｉｏｎ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて化学発光を検出した。得られたデータを、ＧｒａｐｈＰａｄを用いて単一部位用量反応モデルに適合させ、実験ＩＣ５０値を抽出した。報告された誤差は、各実験についての適合パラメータの標準誤差を表す。
【０２１３】
（分子モデル）
ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでの分子ドッキングを用いて、ＰＡＲＰ１の触媒ドメイン（残基６６０〜１０１１）に対するルテオリンの可能な結合様式を調べた。ＰＡＲＰ１（ＰＤＢ  ４ｐｊｔ）及びリガンド調製のためにＡｕｔｏＤｏｃｋ  Ｔｏｏｌｓ（バージョン４．２．６）を使用して、ｐｄｂｑｔファイルを作製した。ＰＡＲＰ１  ＰＤＢファイルから水分子及び阻害剤を除去し、極性水素及びガスタイガー部分電荷を添加した。ｘ、ｙ、ｚ軸における６０×６０×４０点の格子と０．３７５Åの空間は、阻害剤結合部位を中心とした。合計２００回の実験を、最大２５０万回のエネルギー評価で行った。結合の最低自由エネルギーを有するルテオリンの結合様式を、さらなる分子動力学シミュレーションのために選択した。
【０２１４】
ルテオリン分子の分子動力学シミュレーションのためのパラメータ及びトポロジーは、半経験的量子化学プログラム（ＳＱＭ）及び一般的なアンバー力場（ＧＡＦＦ）を用いて、ＡＮＴＥＣＨＡＭＢＥＲソフトウェア及びＡＣＰＹＰＥスクリプトにより得た。ルテオリン−ＰＡＲＰ１複合体を短期エネルギー最小化し、続いて１００ｎｓ分子動力学シミュレーションにより、複合体の相互作用を緩和し、構造を安定化した。Ｇｒｏｍａｃｓ４．６．７パッケージ及びＡｍｂｅｒ１４ｆｆＳＢ力場を用いてシミュレーションを行った。システムを、生理学的イオン強度を模倣するために、０．１３Ｍの濃度でＣｌ−及びＫ＋イオンを含む全原子ＴＩＰ３Ｐ水で溶媒和した。Ｂｅｒｅｎｄｓｅｎサーモスタット及びバロスタットを用いて、温度Ｔと圧力Ｐをそれぞれ３００Ｋと１ａｔｍに一定に保った。高速平滑粒子−メッシュＥｗａｌｄ加算を長距離静電相互作用に使用し、直接的な相互作用のカットオフを１．０ｎｍとした。ＰＡＲＰ−１残基は、化学物質との距離が、分子動力学軌道に沿った時間の９０％を超える間、３．０オングストロームのカットオフ未満である場合、ルテオリンと安定に相互作用すると考えられる。これらの残基をテーブル７に列挙する。
【０２１５】
【表９】
2021530235.tif 000128
【０２１６】
（熱ショック７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）タンパク質及びポリ［ＡＤＰ−リボース］ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ１）に対するｎＤＥＬのスクリーニング）
異なる細胞位置及び生物物理学的特性を有する２つの標的タンパク質を、ｎＤＥＬスクリーンにおいて使用した。これらには細胞質ゾル中のＨＳＰ７０及び核中のＰＡＲＰ１が含まれ、これらの各々は小分子リガンドに対して異なる親和性選択（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を有する。これらの標的のための既知の機能的バインダーは内部陽性対照としてｎＤＥＬに含まれ、例えば、ＨＳＰ７０のためのオリドニン及びＰＡＲＰ−１のためのオラパリブの誘導体（Ｆ００１、Ｆ００２、Ｆ００３及びＦ００６）であった。ｎＤＥＬ中のＤＮＡバーコードの不均一な分布を説明するために、標的タンパク質の非存在下であるが固定化マトリックスビーズの存在下でのｎＤＥＬのブランクスクリーンを最初に行い、続いてディープシークエンシングにより、ライブラリー中のバーコードのベースライン分布を確立した。すべてのスクリーニングデータを、Ｄｅｃｕｒｔｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２０１６；１１（４）：７６４−８０に記載の方法を用いて分析した。各ｎＤＥＬ化合物の対応するＤＮＡ配列を、そのスクリーニングカウントに基づいて集計した。濃縮倍率は、標的タンパク質の存在下及び非存在下での正規化スクリーニングカウントの比として計算される。濃縮倍率を以下の表に示す。
【０２１７】
【表１０−１】
2021530235.tif 000129
【０２１８】
【表１０−２】
2021530235.tif 000130
【０２１９】
【表１０−３】
2021530235.tif 000131
【０２２０】
【表１１】
2021530235.tif 000132
【０２２１】
ｎＤＥＬのスクリーニングフィンガープリントを、図２０に示すように濃縮倍率対正規化スクリーニングカウントとしてプロットした。内部参照として既知のバインダーを使用し、ｎＤＥＬスクリーニングのヒットを、陽性対照化合物の濃縮倍率に基づいて同定した。
【０２２２】
ｎＤＥＬスクリーニングを、ＨＳＰ７０及びＰＡＲＰ−１の精製ヒトタンパク質に対して行った。親和性捕捉ｎＤＥＬは、ディープスクリーニング及び解読分析に供した。結果をテーブル９にまとめた。すべての対照化合物をｎＤＥＬスクリーニングで濃縮し、ヒット率は０．１５％〜０．４７％の範囲であった（図２０）。ＨＳＰ７０について観察された高ヒット率は、ＨＳＰ７０タンパク質の粘着性と関連し得る。最初の２つの画分を回収し、２つの固有のＤＮＡ配列Ｎ０５５及びＮ０５６でコードした。特に、オルドリオン（ｏｒｄｏｒｉｏｎ）標識化合物Ｎ０５５及びＮ０５６の２つの立体異性体を、それぞれ５．３倍及び２．３倍濃縮し（図２０（ａ）及びテーブル８Ａ）、異なる立体異性体に対するＨＳＰ７０の構造的嗜好性を示した。
【０２２３】
【表１２】
2021530235.tif 000133
【０２２４】
ＰＡＲＰ−１スクリーニングでは、３４個のｎＤＥＬを濃縮し（図２０（ｂ））、そのうちの４個は陽性対照化合物を含んでいることを確認した（図２１）。ｎＤＥＬ中の公知化合物を用いた内部制御は、リアル陽性ヒットの選択を大いに可能にするようであった。興味深いことに、類似の構造を有するフラボノイドが濃縮化学物質中にクラスター化され、特に、ＴＣＭ化合物、ルテオリン及びそのグリコシル酸類似体ナリンギン及びハイパーオシドも選択された。
【０２２５】
ＰＡＲＰ−１酵素阻害におけるｎＤＥＬヒットの生化学的特徴
がん治療における有効な標的であるＰＡＲＰ−１は、ＮＡＤ＋から受容体タンパク質へのＡＤＰ−リボースフラグメントの迅速な移行を触媒し、それ自体は、ＤＮＡ損傷及び修理の細胞シグナルに応じて、タンパク質結合線状及び分岐状ホモ−ＡＤＰ−リボース重合体の形成をもたらす。酵素活性を、剪断ＤＮＡの存在下でのＰＡＲＰ−１の自己リボシル化に基づいて測定した。
【０２２６】
濃縮ｎＤＥＬの阻害活性をＰＡＲＰ−１自己リボシル化アッセイにより特徴づけた。陽性対照オラパリブの誘導体であるＦ００３は、２．５ｎＭのＩＣ５０値で強力なＰＡＲＰ−１阻害を示した（図２２（ｂ））。ＴＣＭ  ｎＤＥＬ、ルテオリンは、ＰＡＲＰ−１の酵素活性を７．５μＭのＩＣ５０で阻害した（図２２（ａ））。ＰＡＲＰ−１とルテオリンとの間の相互作用を理解するために、分子モデリングに基づく一連のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析を行った。分子ドッキングを用いることにより、最低自由エネルギー結合モードにおいて、ルテオリンがＰＡＲＰ−１の触媒ドメインを占めたことが確認された。このモードの安定性をさらに評価し、相互作用の分子詳細を理解するために、予測ドッキングモデルから出発して、１００ｎｓの分子動力学シミュレーションを行った。複合体はシミュレートされた時間ウィンドウにおいて安定であるように見え、タンパク質中のいくつかの残基はルテオリンと実質的な期間、相互作用した。特に、Ｄ７６６、Ｈ８６２、Ｙ８９６及びＥ９８８は、シミュレートされた軌道の９０パーセントを超える間、ルテオリンとの接触を維持した。ＰＡＲＰ−１の触媒部位におけるルテオリンは、Ｇ８６３、Ｅ９８８及びＤ７６６残基の側鎖と形成される水素結合のために安定化されているように見え、これらはまた、ＮＡＤ＋結合における重要な残基である（図２２（ｃ））。
【０２２７】
（考察）
【０２２８】
ＤＥＬは、基本的にはＤＮＡの存在下で複数の複合体変換を必要とする反復処理である、スプリットプール合成を含む組み合わせ方法を用いて合成した。天然物等の高度に複雑な立体構造を有する化合物は、それらの合成にはより複雑な化学変換が必要とされるため、通常、ＤＥＬに含まれない。経時的な自然の選択と、多数を使用するＤＥＬの選択との相対的な利点は、まだ決定されていない。しかしながら、今回の研究は、単一の試験管内で両方のシステムを同時に研究する方法を初めて提供する。同一の環境条件下でＤＥＬスクリーンを可能にすることにより、種々のＤＥＬ及びそれらの用途に対するより多くの洞察が提供された。さらに、ｎＤＥＬでは、標的タンパク質の既知のバインダー又は阻害剤が内部制御として機能することができ、これによりＤＥＬスクリーンにおける確認速度及びヒット選択を大幅に改善する。重要なことに、天然物は単一の目的に向かって進化した可能性があり、他の目的には有用でない可能性がある。ｎＤＥＬの使用は、標的を膨大な潜在的リガンドに曝すことにより、この制限を克服する。
【０２２９】
本明細書に記載されるプロトコルの特別な特徴は、ＤＮＡと有機化合物との間の揮発性リンカーの使用である。不完全な化学合成及び望ましくない副生成物はＤＥＬスクリーンに支障をきたす可能性がある（例えば、過剰のリンカーが生物学的標的と反応する可能性がある）ことが実証された。揮発性リンカーは、未反応リンカー分子の除去を容易にし、その結果、複数の反応を、リンカーの修飾に関する懸念なしに、単一のサンプル中で実行することができる。従って、その後の分析はリンカー修飾により混乱されない。ジアジリンの標識効率は、多くの天然産物のＣ−Ｈ結合へのカルベン挿入が問題となり得るため、特定の化合物、特にＣ−Ｈのみの化学物質については低いことが分かった。ｎＤＥＬアプローチを拡張するために、新しい後期修飾方法が必要である。４−（（トリメチルシリル）エチニル）フェニルスルファメートと７−アジド−１，１−ジフルオロヘプタン−１−スルフィナートにより生成したニトレンと炭素ラジカルのＣ−Ｈ挿入は、補完ツールとして非常に有望であった。これらの修飾はまた、単一の官能基を有する化合物においてさらなる幾何異性体を生成するための代替的な標識方法として役立つ可能性がある。
【０２３０】
開発の初期段階にもかかわらず、限られた数のｎＤＥＬは、異なるカテゴリーの標的に対するヒット同定において有望な可能性を既に示した。ＰＡＲＰ−１酵素の阻害剤としてのルテオリンの発見は、ｎＤＥＬの力を強調する。ルテオリンは、ニンジン、ブロッコリ、タマネギの葉、パセリ、セロリ、パプリカ、及びキクの花等の多くの果物及び野菜に含まれる天然フラボノイドである。また、ルテオリンは、スイカズラ、菊、Ｈｅｒｂａ  ｕｎｒｉｐｅ、セイヨウウツボグサ、アーティチョーク、エゴマ、タツナミソウ属、紫花等の漢方薬の多くの薬草の有効成分である。従来、これらのハーブは咳を和らげ、痰を減らし、血管心臓障害や肝炎等の疾患を治療するために、抗炎症剤として複雑な処方で使用されていた。ルテオリンは、広範囲のがん細胞型に対するその強力な抗がん活性のため、広く研究されてきた。さらに重要なことに、多剤耐性がん細胞（ＭＤＲ）の成長を逆転させる効果を示した。ルテオリンは、アポトーシス及び細胞周期調節を介してその抗がん活性を発揮すると考えられている。ルテオリンに対しては、ＪＮＫ、ＮＦ‐κＢ、ＩＧＦ‐１等の複数の分子標的が示唆されている。しかしながら、明白な結合ポケットとの直接的な相互作用の証拠は、いかなる提案された標的についても依然として欠如している。さらに、列挙された標的の１つ又はすべては、ルテオリンの薬理学的挙動のすべてを調整することができるわけではない。天然物の研究における一般的なフラストレーションである複合薬理学（ｐｏｌｙｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）は、これらの活性天然化合物の臨床開発を大きく制限する。ｎＤＥＬスクリーニングによるルテオリンに対するＰＡＲＰ−１の同定は、天然物の複合薬理学的解剖におけるｎＤＥＬの可能性を実証する。ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ−１）は、ＤＮＡ修復、複製、組換え、遺伝子再構成等のさまざまな生物学的処理により引き起こされる細胞内の一時的で局所的なＤＮＡ鎖切断に応答してＤＮＡに結合する。
【０２３１】
臨床的に証明された化学療法標的として、ＰＡＲＰ−１阻害は、ルテオリンに対して観察されたものと同様のアポトーシス、細胞周期停止等における調節パターンを示した。ＰＡＲＰはルテオリンの重要な標的の１つ可能性があり、これは複合薬理学的効果を調整すると思われる。ｎＤＥＬは、数、多様性、及び情報を統合する可能性があり、生物医学的問題の治療法及び解決法を見つけるための我々の努力において貴重であり得る。
【０２３２】
別途定義されないかぎり、本明細書で用いられるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味をもつ。
【０２３３】
本明細書に例示的に記載される発明は、本明細書に特に開示されていない任意の要素（単数又は複数）、限定（単数又は複数）が存在しない場合に、適切に実施され得る。従って、例えば、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」等は、拡張的に、限定なしに読まれるものとする。さらに、本明細書で使用される用語及び表現は、限定ではなく説明の用語として使用されており、そのような用語及び表現の使用において、示され、説明された特徴又はその一部の任意の均等物を排除する意図はないが、特許請求される本発明の範囲内で種々の変形が可能であることが認識される。
【０２３４】
従って、本発明は、好ましい実施形態及び任意の特徴により具体的に開示されてきたが、本明細書に開示された本発明の修飾、改良及び変更が当業者に用いられてよく、上記修飾、改良及び変更は本発明の範囲内であると考えられることを理解されたい。本明細書で提供される材料、方法、及び実施例は、好ましい実施形態を代表するものであり、例示的なものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【０２３５】
本発明は、本明細書において広くかつ一般的に記載されてきた。包括的開示内に入るより狭い種及び亜種グループの各々もまた、本発明の一部を形成する。これは、削除された物質が本明細書に具体的に記載されているか否かにかかわらず、属から対象物を除去するという条件又は否定的な限定を伴う、本発明の一般的な記載を含む。
【０２３６】
また、本発明の特徴又は態様がマーカッシュグループに関して記載されている場合、当業者は、本発明がマーカッシュグループの要素の任意の個々の要素又はサブグループに関しても記載されていることを認識するであろう。
【０２３７】
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、それぞれが個々に参照により援用されるのと同じ程度に、それらの全体が参照により明示的に援用される。矛盾がある場合、定義を含めて本明細書が優先される。
【０２３８】
上記の実施形態とともに本開示を説明したが、前記の説明及び実施例は本開示の範囲を例示することを意図したものであり、限定することを意図したものではないことを理解されたい。本開示の範囲内の他の態様、利点、及び修正は、本開示が関係する当業者には明らかであろう。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の官能基及び第２の官能基を含むリンカー前駆体分子Ｃであって、前記第１の官能基は、有機化合物Ａと反応可能なカルベン又はニトレン又はフリーラジカルを生成することができ、前記第２の官能基は、前記第１の官能基が前記有機化合物Ａと反応する条件下では反応しないが、第２の有機化合物Ｂと反応することができる、リンカー前駆体分子Ｃ。
【請求項２】
式Ｒ−Ｌ−Ｍ（式中、Ｒは前記第１の官能基であり、Ｍは前記第２の官能基であり、Ｌは任意に置換されたアルキレン、任意に置換されたアルケニレン、任意に置換されたアルキニレン、任意に置換されたヘテロアルキレン、任意に置換されたシクロアルキレン、任意に置換されたヘテロシクロアルキレン、任意に置換されたアリーレン、及び任意に置換されたヘテロアリーレンから独立して選択される１つ又は複数の部分を含むリンカー部分である）である、請求項１に記載のリンカー前駆体分子Ｃ。
【請求項３】
前記第１の官能基が、ジアジリン、アリールアジド、ベンゾフェノン、又はジアゾを含む、請求項１又は２に記載のリンカー前駆体分子Ｃ。
【請求項４】
前記第１の官能基が、
【化１】
2021530235.tif 000134
（式中、
【化２】
2021530235.tif 000135
は前記リンカー前駆体分子Ｃの残りの部分への結合点を表す）
からなる群から選択される、請求項１又は２に記載のリンカー前駆体分子Ｃ。
【請求項５】
前記第２の官能基が、アジド、アルキン、エン、又は−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のリンカー前駆体分子Ｃ。
【請求項６】
前記第２の官能基が、
【化３】
2021530235.tif 000136
（式中、
【化４】
2021530235.tif 000137
は前記リンカー前駆体分子Ｃの残りの部分への結合点を表す）
からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のリンカー前駆体分子Ｃ。
【請求項７】
Ｌがアルキレンであり、前記アルキレンのメチレン単位の１つ又は複数が、ＮＲ１、Ｏ、Ｓ、ＣＯ、ＳＯ、ＳＯ２、ＮＲ１Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、及びヘテロアリーレンからなる群から独立して選択される部分で任意に置換され、Ｒ１がＨ又はアルキルである、請求項２〜６のいずれか一項に記載のリンカー前駆物質分子Ｃ。
【請求項８】
Ｌがアルキレンであり、前記アルキレンのメチレン単位の１つ又は複数が、Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）及びＣ（Ｏ）ＮＨから独立して選択される部分で置換されている、請求項２〜６のいずれか一項に記載のリンカー前駆体分子Ｃ。
【請求項９】
【化５】
2021530235.tif 000138
からなる群から選択される、リンカー前駆体分子Ｃ。
【請求項１０】
【化６】
2021530235.tif 000139
からなる群から選択される、リンカー前駆体分子Ｃ。
【請求項１１】
テーブル３から選択される化合物、又はその立体異性体若しくはその立体異性体の混合物。
【請求項１２】
（１）請求項１〜１０のいずれか一項に記載のリンカー前駆体分子Ｃの第１の官能基と有機化合物Ａとをカルベン又はニトレン又はフリーラジカル反応条件下で反応させて、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のリンカー前駆体分子Ｃの第２の官能基を有する中間体Ｄを形成すること、及び
（２）前記第２の官能基と標識を含む標識分子Ｂとを反応させること
を含む方法により製造される、標識有機化合物Ｅ。
【請求項１３】
前記有機化合物Ａが反応性官能基を含まない、請求項１２に記載の標識有機化合物Ｅ。
【請求項１４】
前記標識が、固有の配列又は蛍光タグ又はそれらの組み合わせを含む、請求項１２又は１３に記載の標識有機化合物Ｅ。
【請求項１５】
前記固有の配列が、一本鎖ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、三重ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、多本鎖天然若しくは人工オリゴヌクレオチド、又は化学修飾オリゴヌクレオチドを含む、請求項１４に記載の標識有機化合物Ｅ。
【請求項１６】
前記固有の配列がオリゴヌクレオチドを含む、請求項１３に記載の標識有機化合物Ｅ。
【請求項１７】
テーブル４から選択される化合物、又はその立体異性体若しくはその立体異性体の混合物。
【請求項１８】
標識部分、リンカー、及び有機化合物部分を含む異性体である標識有機化合物のセットであって、各異性体は同一の標識部分、同一のリンカー及び同一の有機化合物部分を有し、各異なる異性体において、前記標識部分は前記リンカーを介して前記有機化合物部分の異なる部位に結合している、標識有機化合物のセット。
【請求項１９】
（１）有機化合物Ａと請求項１〜１０のいずれか一項に記載のリンカー前駆体分子Ｃとのカルベン又はニトレン又はフリーラジカル反応により製造される複数の異性体化合物、及び／又は（２）前記有機化合物Ａと前記リンカー前駆体分子Ｃとの前記カルベン又はニトレン又はフリーラジカル反応により製造される化合物Ｄの不均化反応の生成物である一対又は複数対の化合物を含む、混合物。
【請求項２０】
前記有機化合物Ａが反応性官能基を含まない、請求項１９に記載の混合物。
【請求項２１】
前記不均化反応生成物の一対が、前記カルベン又はニトレン又はフリーラジカル反応により製造される前記化合物Ｄの分子量プラス２である分子量を有する化合物Ｆと、前記カルベン又はニトレン又はフリーラジカル反応により製造される前記化合物Ｄの分子量マイナス２である分子量を有する化合物Ｆ’とを含む、請求項１９又は２０に記載の混合物。
【請求項２２】
（１）請求項１〜１０のいずれか一項に記載のリンカー前駆体分子Ｃの第１の官能基と有機化合物Ａとをカルベン又はニトレン又はフリーラジカル反応条件下で反応させて、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のリンカー前駆体分子の第２の官能基を有する中間体Ｄを形成すること、及び
（２）前記第２の官能基と標識を含む標識分子Ｂとを反応させること
を含む方法により製造される、複数の異性体標識化合物の混合物。
【請求項２３】
前記標識が、固有の配列又は蛍光タグ又はそれらの組み合わせを含む、請求項２２に記載の混合物。
【請求項２４】
前記固有の配列が、一本鎖ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、三重ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、多本鎖天然若しくは人工オリゴヌクレオチド、又は化学修飾オリゴヌクレオチドを含む、請求項２３に記載の混合物。
【請求項２５】
前記固有の配列がオリゴヌクレオチドを含む、請求項２３に記載の混合物。
【請求項２６】
（１）請求項１〜１０のいずれか一項に記載のリンカー前駆体分子Ｃの第１の官能基と有機化合物Ａとをカルベン又はニトレン又はフリーラジカル反応条件下で反応させて、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のリンカー前駆体分子の第２の官能基を有する中間体Ｄを形成すること、及び
（２）前記第２の官能基と標識を含む標識分子Ｂとを反応させること
を含む、有機化合物Ａを標識する方法。
【請求項２７】
前記有機化合物Ａが反応性官能基を含まない、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記リンカー前駆体分子Ｃの第１の官能基と前記有機化合物Ａの複数の部位とが反応して、複数の異性体生成物の混合物を形成する、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記標識が、固有の配列又は蛍光タグ又はそれらの組み合わせを含む、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記固有の配列が、一本鎖ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、三重ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、多本鎖天然オリゴヌクレオチド、多本鎖人工オリゴヌクレオチド、又は化学修飾オリゴヌクレオチド等を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記固有の配列がオリゴヌクレオチドを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
固有の有機化合物が固有の標識で標識されている、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の方法に従って各々製造された少なくとも２つの標識有機化合物を含む、標識有機化合物のライブラリー。
【請求項３３】
各々が固有の標識で標識された少なくとも１０個の固有の有機化合物を含む、請求項３２に記載のライブラリー。
【請求項３４】
各々が固有の標識で標識された少なくとも５０個の固有の有機化合物を含む、請求項３２に記載のライブラリー。
【請求項３５】
固有の標識が固有の配列を有するオリゴヌクレオチドである、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載のライブラリー。
【請求項３６】
請求項３２〜３５のいずれか一項に記載のライブラリーをアッセイすること、及びそれらの標識に従って標的に結合する有機化合物を同定することを含む、標的に結合する有機化合物を同定する方法。
【請求項３７】
（１）請求項１〜１０のいずれか一項に記載のリンカー前駆体分子Ｃの第１の官能基と有機化合物Ａとをカルベン又はニトレン又はフリーラジカル反応条件下で反応させて、前記リンカー前駆体分子の第２の官能基が未反応のままである生成物又は生成物の混合物を形成すること、及び
（２）前記生成物又は生成物の混合物を分析することであって、一対の不均化反応生成物の存在は前記有機化合物Ａが２つの共役二重結合を有することを示し、前記一対の不均化反応生成物は、前記カルベン又はニトレン又はフリーラジカル反応の生成物Ｄの分子量プラス２である分子量を有する化合物Ｆと、前記カルベン又はニトレン又はフリーラジカル反応の生成物Ｄの分子量マイナス２である分子量を有する化合物Ｆ’とを含むこと
を含む、２つの共役二重結合を有する化合物を同定するための方法。
【請求項３８】
ルテオリン、ナリンギン、ヒエロシド、リキリチン、エピカテキン、エピガロカテキン、ダフネチン、Ｆ００１、Ｆ００２、Ｆ００３もしくはＦ００６、又はそれらの誘導体の治療有効量を、それを必要とする被検体に投与することを含む、前記被検体におけるがん、脳卒中、心筋梗塞、神経変性疾患又は炎症を治療するための方法。
【請求項３９】
前記被検体が、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＡＬＢ２又はＰＴＥＮＴ変異を有するがん細胞を有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記変異が不活性化変異である、請求項３９に記載の方法。
前記被検体が、対応する正常細胞と比較してＰＡＲＰタンパク質を過剰発現するがん細胞を有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記神経変性疾患が、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、萎縮性脊髄炎、エイズによる認知症、及び血管性認知症、又はそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記炎症が、パーキンソン病、関節炎、関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、乾癬性関節炎、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、ループス、全身性ループス紅斑、若年性関節リウマチ、若年性特発性関節炎、グレーブ病、橋本病、アジソン病、セリアック病、皮膚筋炎、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、シェーグレン症候群、Ｉ型糖尿病、血管炎、ブドウ膜炎、アテローム性動脈硬化症及び強直性脊椎炎からなる群より選択される疾患又は病態と関連している、請求項３８に記載の方法。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】全図
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2021530235.tif 000149
【図１１】
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【図１２】
2021530235.tif 000151
【図１３】
2021530235.tif 000152
【図１４】
2021530235.tif 000153
【図１５】
2021530235.tif 000154
【図１６】
2021530235.tif 000155
【図１７】
2021530235.tif 000156
【図１８】
2021530235.tif 000157
【図１９】
2021530235.tif 000158
【図２０ａ】
2021530235.tif 000159
【図２０ｂ】
2021530235.tif 000160
【図２１】
2021530235.tif 000161
【図２２】
2021530235.tif 000162
【国際調査報告】
2021530235.tif 000163
2021530235.tif 000164
2021530235.tif 000165
2021530235.tif 000166
2021530235.tif 000167