(57)【要約】本発明は化学療法−誘発末梢神経病症を治療する方法に関するものである。特に、前記方法はヒトＨＧＦ蛋白質をコーディングする核酸コンストラクトを投与することによって化学療法により誘発された末梢神経病症と関連した神経病症性痛みを減少させる新規な方法を提供する。本出願は、神経病症性痛みを治療することに効果的な核酸コンストラクト、薬理学的組成物、及び核酸コンストラクトの投与方法を追加で提供する。
2021523212.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次のステップを含む化学療法薬物に対する露出と関連した神経病症性痛み（neuropathic pain）を治療する方法：
化学療法薬物に以前に露出した対象体（subject）にヒトＨＧＦ蛋白質の２つの異型体（isoform）を発現できる第１治療的有効量の核酸コンストラクトを投与するステップであって、
前記核酸コンストラクトは次を含む：
ヒトＨＧＦ遺伝子のエクソン１〜４を含む第１配列または前記第１配列の縮退性配列、
ヒトＨＧＦ遺伝子のイントロン４を含む第２配列または前記第２配列の断片、及び
ヒトＨＧＦ遺伝子のエクソン５〜１８を含む第３配列または前記第３配列の縮退性配列。
【請求項２】
前記化学療法薬物は、 植物アルカロイド（plant alkaloid）、タキサン（taxane）、エポチロン（epothilone）、プロテアソーム阻害剤（proteasome inhibitor）、免疫調節剤（immunomodulator）、及び抗腫瘍生物学的製剤（antineoplastic biologic）からなる群より選択されるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記化学療法薬物は、ビンクリスチン（vincristine）、ボルテゾミブ（bortezomib）、パクリタキセル（paclitaxel）、またはシスプラチン（cisplatin）である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記化学療法薬物はパクリタキセル（paclitaxel）である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記化学療法薬物はビンクリスチン（vincristine）である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記化学療法薬物はボルテゾミブ（bortezomib）である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記化学療法薬物はシスプラチン（cisplatin）である、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記対象体（subject）はヒト患者である、請求項１〜７のうち、いずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記対象体（subject）は癌（cancer）を病んでいるものである、請求項１〜８のうち、いずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法は第１治療的有効量の核酸コンストラクトを投与するステップ後、１週以上後に核酸コンストラクトを対象体（subject）に再投与するステップを追加的に含むものである、請求項１〜９のうち、いずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記再投与するステップは、第１治療的有効量の核酸コンストラクトを投与するステップ後、少なくとも２週、３週、４週、５週、または１０週後に遂行されるものである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記再投与するステップは、第１治療的有効量の核酸コンストラクトを投与するステップ後、少なくとも１０日、１５日、２０日、３０日、４０日、５０日、または１００日後に遂行されるものである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記対象体（subject）は第１治療的有効量の核酸コンストラクトを投与するステップ及び前記再投与するステップの間に核酸コンストラクトの投与を受けないものである、請求項１０〜１２のうち、いずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１配列及び前記第３配列はイントロンのないものである、請求項１〜１３のうち、いずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＨＧＦの２つの異型体（isoform）は全長ＨＧＦ（full-length HGF、ｆｌＨＧＦ）及び欠失された変異型ＨＧＦ（deleted variant HGF、ｄＨＧＦ）を含むものである、請求項１〜１４のうち、いずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記全長ＨＧＦ（ｆｌＨＧＦ）は配列番号１のポリペプチドを含み、欠失された変異型ＨＧＦ（ｄＨＧＦ）は配列番号２のポリペプチドを含むものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１配列は配列番号３のポリヌクレオチドを含むものである、請求項１〜１６のうち、いずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記第２配列は配列番号６のポリヌクレオチドまたはその断片を含むものである、請求項１〜１７のうち、いずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記第３配列は配列番号４のポリヌクレオチドを含むものである、請求項１〜１８のうち、いずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記核酸コンストラクトは配列番号１３のポリヌクレオチドを含むものである、請求項１〜１９のうち、いずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記核酸コンストラクトはｐＣＫベクターを追加的に含むものである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記核酸コンストラクトはＶＭ２０２である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１治療的有効量の核酸コンストラクトを投与するステップまたは前記再投与するステップは、核酸コンストラクトの筋肉内注射を１つ以上含むものである、請求項１〜２２のうち、いずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１治療的有効量の核酸コンストラクトは１μｇ〜１００ｍｇの間、１０μｇ〜５０ｍｇの間、１００μｇ〜１０ｍｇの間、１ｍｇ〜２５ｍｇの間、または１ｍｇ〜１０ｍｇの間である、請求項１〜２３のうち、いずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
化学療法薬物に対する露出と関連した神経病症性痛み（neuropathic pain）を治療するためのヒトＨＧＦ蛋白質の２つの異型体（isoform）を発現できる核酸コンストラクトを含む薬剤学的組成物であって、
前記核酸コンストラクトは次を含むものである、薬剤学的組成物：
ヒトＨＧＦ遺伝子のエクソン１〜４を含む第１配列または前記第１配列の縮退性配列、
ヒトＨＧＦ遺伝子のイントロン４を含む第２配列または前記第２配列の断片、及び
ヒトＨＧＦ遺伝子のエクソン５〜１８を含む第３配列または前記第３配列の縮退性配列。
【請求項２６】
前記化学療法薬物は、 植物アルカロイド（plant alkaloid）、タキサン（taxane）、エポチロン（epothilone）、プロテアソーム阻害剤（proteasome inhibitor）、免疫調節剤（immunomodulator）、及び抗腫瘍生物学的製剤（antineoplastic biologic）からなる群より選択されるものである、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記化学療法薬物は、ビンクリスチン（vincristine）、ボルテゾミブ（bortezomib）、パクリタキセル（paclitaxel）、またはシスプラチン（cisplatin）である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記ヒトＨＧＦ蛋白質の２つの異型体（isoform）は全長ＨＧＦ（full-length HGF、ｆｌＨＧＦ）及び欠失された変異型ＨＧＦ（deleted variant HGF、ｄＨＧＦ）を含むものである、請求項２５〜２７のうち、いずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
前記全長ＨＧＦ（ｆｌＨＧＦ）は配列番号１のポリペプチドを含み、欠失された変異型ＨＧＦ（ｄＨＧＦ）は配列番号２のポリペプチドを含むものである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記核酸コンストラクトは配列番号１３のポリヌクレオチドを含むものである、請求項２５〜２９のうち、いずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学療法により誘発された末梢神経病症を治療する方法に関するものである。
【０００２】
関連出願に対する交差参照
本出願は２０１８年５月１７日付で出願された米国仮出願第６２／６７３，０４８号に対して利益及び優先権を主張し、これは全ての目的のためにその全文が本願に参照として含まれる。
【０００３】
配列目録
本出願はＥＦＳ−Ｗｅｂを通じて提出された配列目録を含み、その全文が本願に参照として含まれる。２０１９年５月１４日に作成されたASCII写本の名称は37238US_CRF_sequencelisting.txtであり、大きさは８１，９２０バイトである。
【背景技術】
【０００４】
化学療法−誘発末梢神経病症（Chemotherapy-induced peripheral neuropathy、ＣＩＰＮ）は特定癌治療のありふれた副作用であり、患者の長期的な生活の質に相当な影響を及ぼす。ＣＩＰＮの症状には非正常的な感覚（異常感覚）、無感覚、均衡問題、及び痛みがある。具体的な症状は投与される化学療法の種類によって異なるが、ＣＩＰＮにより苦痛を受ける患者に神経病症性痛み（neuropathic pain）が発生する危険は一般的に高い。
【０００５】
ＣＩＰＮ及び関連痛みを誘発すると知られた化学療法剤は白金類似体（platinum analog）、抗チュブリン（タキサン（taxane）、ビンカアルカロイド（vinca alkaloid）、エリブリン（eribulin））、プロテアソーム阻害剤（ボルテゾミブ（bortezomib）、カルフィルゾミブ（carfilzomib））、免疫調節剤（サリドマイド（thalidomide）、レナリドマイド（lenalidomide）、ポマリドマイド（pomalidomide））及び甚だしくは、通常的に化学療法剤に見なされない新たな生物学的製剤（アレムツズマブ（alemtuzumab）、イピリムマブ（ipilimumab）、ブレンツキシマブ（brentuximab））の一部を含む。このような製剤のうちの一部、例えば、オキサリプラチン（oxaliplatin）、シスプラチン（cisplatin）、及びビンクリスチン（vincristine）は治療が終わった後にも続けて進行される症状を誘発することと知られている。
【０００６】
ＣＩＰＮを管理するに当たって、主要課題の１つは正確な病態生理学がよく知られていないことである。さらに、多様な化学療法剤は相異する病態生理学的機転によりＣＩＰＮを誘発する可能性がある。正確な病態生理学を明らかにしようとする持続的な努力にもかかわらず、臨床的に適切な治療的介入は可能でない。
【０００７】
ＣＩＰＮと関連した神経病症性痛みは他の種類の神経病症性痛みと類似の方式で、即ち物理療法、マッサージ及び針術のような補完療法（complementary therapy）及び薬物治療の組合せで管理されてきた。ガバペンチン（gabapentin）、プレガバリン（pregabalin）、カルバマゼピン（carbamazepine）、三環系抗うつ薬（tricyclic antidepressant）、オキシコドン（oxycodone）、モルヒネ（morphine）、メタドン（methadone）、トラマドール（tramadol）、デュロキセチン（duloxetine）、及びベンラファキシン（venlafaxine）のような多様な薬物が使われるか、または使用に提案された。しかしながら、このような治療法のうち、いずれもＣＩＰＮの痛みを減らすことに真の効能が立証されたところがなく、薬物自体に副作用がある。
【０００８】
最近、Kesslerと同僚らは糖尿病性末梢神経病症で非ウイルス性ＨＧＦ遺伝子治療に対する成功的な二重−盲検の偽薬−対照されたヒト２相臨床試験を報告した（Kessler et al., Annals Clin. Transl. Neurology2(5): 4650478 (2015)）。ヒトＨＧＦの２つの異型体を発現するプラスミドＶＭ２０２（ｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７）を糖尿病性末梢神経病症患者のふくらはぎ筋肉に注入すれば痛みが有意に減少し、２日の治療は３ケ月間、生活の質の向上と共に症状緩和を提供することに充分であった。しかしながら、この治療法はまだＣＩＰＮの痛みを減らすことに効果的であると見えない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、病因機転と病態生理学的機転が十分に知られていないＣＩＰＮと関連した痛みを治療することに効果的な薬物の開発が必要である。特に、ＶＭ２０２（ｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７）がＣＩＰＮの痛みを減らすことに効果的であるか否かを評価する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
一部の態様によれば、本発明はヒトＨＧＦ蛋白質をコーディングする核酸コンストラクト（construct）を投与することによって、神経病症−誘発治療剤に対する露出と関連した神経病症性痛みを治療する方法に関するものである。
【００１１】
前記方法は、以前に治療剤に露出した対象体（subject）にヒトＨＧＦ蛋白質の２つの異型体（isoform）をコーディングする第１治療的有効量（first therapeutically effective amount）の核酸コンストラクト（nucleic acid construct）を投与するステップを含むことができ、前記核酸コンストラクトは次を含む：ヒトＨＧＦ遺伝子のエクソン（exon）１〜４を含む第１配列または第１配列の縮退性配列（degenerate sequence）、ヒトＨＧＦ遺伝子のイントロン（intron）４を含む第２配列または第２配列の断片（fragment）、及びヒトＨＧＦ遺伝子のエクソン５〜１８を含む第３配列または第３配列の縮退性配列。
【００１２】
一部の具現例において、前記神経病症−誘発治療剤は化学療法薬物である。前記化学療法薬物は、植物アルカロイド（plant alkaloid）、タキサン（taxane）、エポチロン（epothilone）、プロテアソーム阻害剤（proteasome inhibitor）、免疫調節剤（immunomodulator）、及び抗腫瘍生物学的製剤（antineoplastic biologic）からなる群より選択される。一部の具現例において、化学薬物はビンクリスチン（vincristine）、ボルテゾミブ（bortezomib）、パクリタキセル（paclitaxel）、またはシスプラチン（cisplatin）である。
【００１３】
一部の具現例において、前記対象体（subject）はヒト患者である。一部の具現例において、前記対象体（subject）は癌（cancer）を病んでいる。
【００１４】
一部の具現例において、前記方法は第１治療的有効量の核酸コンストラクトを投与するステップ後、１週以上の後に核酸コンストラクトを対象体に再投与するステップを追加的に含む。一部の具現例において、前記再投与するステップは第１治療的有効量の核酸コンストラクトを投与するステップの後、少なくとも２週、３週、４週、５週、または１０週後に遂行される。一部の具現例において、前記再投与するステップは第１治療的有効量の核酸コンストラクトを投与するステップ後、少なくとも１０日、１５日、２０日、３０日、４０日、５０日、または１００日後に遂行される。一部の具現例において、前記対象体は第１治療的有効量の核酸コンストラクトを投与するステップ及び前記再投与するステップの間に核酸コンストラクトの投与を受けない。
【００１５】
一部の具現例において、前記第１配列及び前記第３配列にはイントロンがない。一部の具現例において、ＨＧＦの２つの異型体は全長ＨＧＦ（full-length HGF、ｆｌＨＧＦ）及び欠失された変異型ＨＧＦ（deleted  variant  ＨＧＦ、ｄＨＧＦ）を含む。全長ＨＧＦ（ｆｌＨＧＦ）は配列番号１のポリペプチドを含むことができ、欠失された変異型ＨＧＦ（ｄＨＧＦ）は配列番号２のポリペプチドを含むことができる。
【００１６】
一部の具現例において、前記第１配列は配列番号３のポリヌクレオチドを含む。一部の具現例において、前記第２配列は配列番号６のポリヌクレオチドを含む。一部の具現例において、前記第３配列は配列番号４のポリヌクレオチドを含む。
【００１７】
一部の具現例において、前記核酸コンストラクトは配列番号１３のポリヌクレオチドを含む。一部の具現例において、前記核酸コンストラクトはｐＣＫベクターを追加的に含む。
【００１８】
一部の具現例において、前記第１治療的有効量の核酸コンストラクトを投与するステップまたは前記再投与するステップは、核酸コンストラクトの筋肉出注射（intramuscular injection）を１つ以上含む。一部の具現例において、前記核酸コンストラクトの第１治療的有効量は１μｇ〜１００ｍｇの間、１０μｇ〜５０ｍｇの間、１００μｇ〜１０ｍｇの間、１ｍｇ〜２５ｍｇの間、または１ｍｇ〜１０ｍｇの間である。
【００１９】
一部の他の態様によれば、本発明は神経病症−誘発治療剤に対する露出と関連した神経病症性痛みを治療するためのヒトＨＧＦをコーディングする核酸コンストラクトに関するものである。前記核酸コンストラクトは次を含むことができる：ヒトＨＧＦ遺伝子のエクソン１〜４を含む第１配列または前記第１配列の縮退性配列、ヒトＨＧＦ遺伝子のイントロン４を含む第２配列または前記第２配列の断片、及びヒトＨＧＦ遺伝子のエクソン５〜１８を含む第３配列または前記第３配列の縮退性配列。他の態様によれば、本発明は神経病症−誘発治療剤に対する露出と関連した神経病症性痛みを治療するためのヒトＨＧＦをコーディングする核酸コンストラクトを含む薬剤学籍組成物を提供する。
【００２０】
詳細な説明
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、核酸コンストラクトである、ＶＭ２０２としても知られたｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７の構造を示す。ｐＣＫベクターは（１）ＨＣＭＶ  ＩＥ遺伝子から由来したプロモーター／エンハンサー及び５’ＵＴＲ（エクソン１、イントロンＡ及び一部分のエクソン２）（“ＨＣＭＶ  ＩＥプロモーター”）、（２）ＣｏｌＥ１複製原点（“ＣｏｌＥ１”）、及び（３）カナマイシン耐性遺伝子（“Ｋａｎｒ”）を含む。ＨＧＦ−Ｘ７挿入物（“ＨＧＦ−Ｘ７”）はヒトＨＧＦのエクソン１〜１８及びヒトＨＧＦ遺伝子のイントロン４の断片を含むｃＤＮＡである。ＨＧＦ−Ｘ７挿入物の３’末端を有するフレーム−内融合された配列要素はポリ−Ａテール（ｐｏｌｙ−Ａ  ｔａｉｌ、“ｐＡ”）をコーディングする。ｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７は選択的スプライシング（alternative splicing）を通じてＨＧＦ７２３（ｄＨＧＦ）及びＨＧＦ７２８（ｆｌＨＧＦ）を全て発現する。
【図２】図２ａは、パクリタキセル−誘発神経病症性痛みに対するｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７の効果を実験するための実験手続きの概要を示す。具体的に、９週齢のＢａｌｂ／ｃ雌マウスに１ｍｇ／ｋｇパクリタキセルを１週間、毎日腹腔内（intraperitoneal、i. p.）注射を通じて投与した。１週次に２００μｇのプラスミドＤＮＡ、ｐＣＫ、またはｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７を筋肉内に注射した。痛み症状の重症度は毎週ボンフレイのフィラメント（Von Frey's filament）を使用して機械的異質痛（mechanical allodynia）を検査して決定した。図２ｂは、図２ａで簡略に示した実験から得たデータを提供する。具体的に、図２ｂはパクリタキセルを投与したマウスから測定された足撤退（paw withdrawal）反応（頻度（％））データを提供する。足撤退頻度（paw withdrawal frequency）はｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７を投与した群で有意に減少したが、ＨＧＦ−Ｘ７挿入物のないｐＣＫベクターを投与した対照群では減少しなかった。
【図３】図３ａは、ビンクリスチン−誘発神経病症性痛みに対するｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７の効果を実験するための実験手続きの概要を示す。具体的に、５週齢のＢａｌｂ／ｃ雄マウスに２００μｇ／ｋｇビンクリスチンを２週間、毎日、ｉ．ｐ．注射を通じて投与し、１週次に２００μｇ  ｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７を投与した。これらの痛み水準は毎週ボンフレイのフィラメントテストにより決定された。図３ｂは、図３ａで簡略に示した実験から得たデータを提供する。具体的に、図３ｂはビンクリスチンを投与したマウスで測定された足撤退反応（頻度（％））データを提供する。足撤退頻度はｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７を投与した群で有意に減少したが、ＨＧＦ−Ｘ７挿入物のないｐＣＫベクターを投与した対照群では減少しなかった。
【図４】図４ａは、ボルテゾミブ−誘発神経病症性痛みに対するｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７の効果を実験するための実験手続きの概要を示す。具体的に、７−週齢のＣ５７ＢＬ６雄マウスに０．４ｍｇ／ｋｇボルテゾミブを２週間、週３回、ｉ．ｐ．注射を通じて投与し、２週次に２００μｇ  ｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７を投与した。これらの痛み水準は毎週ボンフレイのフィラメントテストにより決定された。図４ｂは、図４ａで簡略に示した実験から得たデータを提供する。具体的に、図４ｂはボルテゾミブを投与したマウスで測定された足撤退反応（頻度（％））データを提供する。足撤退頻度はｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７を投与した群で有意に減少したが、ＨＧＦ−Ｘ７挿入物のないｐＣＫベクターを投与した対照群では減少しなかった。
【図５】図５ａは、シスプラチン−誘発神経病症性痛みに対するｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７の効果を実験するための実験手続きの概要を示す。具体的に、９−週齢のＣ５７ＢＬ６雄マウスに２．３ｍｇ／ｋｇシスプラチンを２週間、２日に１回、ｉ．ｐ．注射を通じて投与し、１週次に２００μｇ  ｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７を投与した。これらの痛み水準は毎週ボンフレイのフィラメントテストにより決定された。図５ｂは、図５ａで簡略に示した実験から得たデータを提供する。具体的に、図５ｂは、シスプラチンを投与したマウスで測定された足撤退反応（頻度（％））データを提供する。足撤退頻度はｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７を投与した群で有意に減少したが、ＨＧＦ−Ｘ７挿入物のないｐＣＫベクターを投与した対照群では減少しなかった。
【００２２】
前記の図面は単に例示の目的に本発明の多様な実施例を示す。当業者は本明細書で説明された本発明の原理から逸脱することなく、本明細書に例示された構造及び方法の代案的な実施例が使われることができるということを次の説明から容易に認識する。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
１．定義
【００２４】
異に定義されない限り、本明細書で使われる全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の熟練者により一般的に理解される意味を有する。本明細書で使われたように、次の用語は次のような意味を有する。
【００２５】
本明細書に使われた用語“ＨＧＦの異型体（isoform of HGF）”は動物で自然的に発生するＨＧＦポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。前記用語は任意の全長（full length）野生型ＨＧＦポリペプチドと少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、自然的に発生するＨＧＦ対立遺伝子変異型、スプライス変異型、または欠失変異型と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。本発明で使用することに好ましいＨＧＦの異型体は全長ＨＧＦ（full-length HGF、ｆｌＨＧＦ）（同義語、ｆＨＧＦ）、欠失された変異型ＨＧＦ（deleted variant、ｄＨＧＦ）、ＮＫ１、ＮＫ２、及びＮＫ４からなる群より選択される２つ以上の異型体を含む。本発明のより好ましい具現例によれば、本明細書に記載された方法に使われるＨＧＦの異型体はｆｌＨＧＦ及びｄＨＧＦを含む。
【００２６】
本発明の用語“ヒトｆｌＨＧＦ”、“ｆｌＨＧＦ”、及び“ｆＨＧＦ”はヒトＨＧＦ蛋白質のアミノ酸１〜７２８からなる蛋白質を称するために本願で相互交換的に使われる。ｆｌＨＧＦの配列は配列番号１に提示されている。
【００２７】
本発明の用語“ヒトｄＨＧＦ”及び“ｄＨＧＦ”はヒトＨＧＦ遺伝子の選択的スプライシングにより生成されたＨＧＦ蛋白質の欠失された変異型を称するために本願で相互交換的に使われる。具体的に、“ヒトｄＨＧＦ”または“ｄＨＧＦ”は全長ＨＧＦ配列からアルファ鎖の最初のクリングルドメイン（kringle domain）で５個のアミノ酸（Ｆ、Ｌ、Ｐ、Ｓ、及びＳ）が欠失されたヒトＨＧＦ蛋白質を意味する。ヒトｄＨＧＦは７２３個アミノ酸長さである。ヒトｄＨＧＦのアミノ酸配列は配列番号２に提示されている。
【００２８】
本明細書に使われた用語“治療”は（ａ）神経病症性痛みの抑制；（ｂ）神経病症性痛みの緩和；及び（ｃ）神経病症性痛みの除去の全ての行為を意味する。一部の具現例において、本発明の組成物は神経細胞の成長または神経細胞死滅の抑制を通じて神経病症性痛みを治療することができる。
【００２９】
本明細書に使われた用語“治療的有効容量（therapeutically effective dose）”または“有効量（effective amount）”は投与されて所望の効果を生成する容量または量を意味する。本発明の方法の脈絡で、治療的有効量はＣＩＰＮと関連した神経病症性痛みを減少させることに効果的な量である。
【００３０】
本明細書に使われた用語“充分な量”は所望の効果を生成することに十分な量を意味する。
【００３１】
本明細書に使われた用語“縮退性配列（degenerate sequence）”は参照核酸配列から翻訳されたことと同一のアミノ酸配列を提供するために翻訳できる核酸配列を意味する。
【００３２】
２．他の解析規則（Other interpretational conventions）
【００３３】
本明細書に言及された範囲は言及された終点を含んで範囲内の全ての値に対する略称であると理解される。例えば、１〜５０の範囲は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、及び５０からなる群から任意の数字、数字の組合せ、または下位−範囲を含むことと理解される。
【００３４】
異に指示されない限り、１つ以上の立体中心を有する化合物に対する言及は各々の立体異性質体及びその立体異性質体の全ての組合せを意図する。
【００３５】
３．ＣＩＰＮと関連した神経病症性痛みを治療する方法
【００３６】
最初の態様によれば、本発明の方法は化学療法−誘発末梢神経病症と関連した神経病症性痛みを治療するために提示される。典型的な具現例において、前記方法は末梢神経病症を誘発する治療剤に露出した対象体にヒトＨＧＦ蛋白質の２つの異型体を発現する核酸コンストラクトの治療的有効量を投与するステップを含む。
【００３７】
３．１．  ２つの肝細胞成長因子（hepatocyte growth factor、ＨＧＦ）異型体を発現する核酸コンストラクト
【００３８】
本明細書に記載された方法で、核酸コンストラクトはヒトＨＧＦ蛋白質の少なくとも２つの異型体を発現する。一部の具現例において、前記核酸コンストラクトは２つの異型体を発現する。典型的な具現例において、前記核酸コンストラクトはｆｌＨＧＦ及びｄＨＧＦのうち、少なくとも１つを発現する。特定の具現例において、前記核酸コンストラクトはｆｌＨＧＦ及びｄＨＧＦ全てを発現する。
【００３９】
ｆｌＨＧＦ及びｄＨＧＦはいろいろな生物学的機能を共有するが、免疫学的特性といろいろな生物学的特性の観点では異なる。例えば、ｆｌＨＧＦはヒト臍帯静脈内皮細胞、動脈平滑筋細胞、及びＮＳＦ−６０（ミューライン骨髄母細胞）でＤＮＡ合成を促進するに当たって、ｄＨＧＦより各々約２０倍、１０倍、及び２倍より高い活性を示す。一方、ｄＨＧＦはＬＬＣ−ＰＫ１（豚腎臓上皮細胞）、及びＯＫ（米国オポッサム腎臓上皮細胞）、及びマウス間質細胞のＤＮＡ合成促進において、ｆｌＨＧＦより各々約３倍及び２倍より高い活性を示す。また、ｆｌＨＧＦはｄＨＧＦよりＰＢＳで７０倍より高い溶解度を示す。幾つかの抗−ｄＨＧＦ単一クローン抗体はｄＨＧＦのみを認識するが、これはｆｌＨＧＦとｄＨＧＦの３次元構造が相異するということを意味する。
【００４０】
３．１．１．発現配列
【００４１】
一部の具現例において、コンストラクトは各々の異型体（isoform）コーディング配列（coding sequence、ＣＤＳ）に対する発現調節配列を含むことによってＨＧＦの２つ以上の異型体を発現する。一部の具現例において、前記コンストラクトは、例えば（１）発現調節配列−（２）第１アイソマー（isomer）のコーディング配列−（３）ＩＲＥＳ（internal ribosomal entry site）−（４）第２アイソマー（isomer）のコーディング配列−（５）転写終結配列の順序で２つのコーディング配列の間にＩＲＥＳを含む。ＩＲＥＳはＩＲＥＳ配列で翻訳が始まるようにして単一コンストラクトで関心のある２つの遺伝子の発現を許容する。より追加的な具現例において、ＨＧＦの単一異型体を各々コーディングする複数のコンストラクトは投与される対象体でＨＧＦの１つ以上の異型体の発現を誘導するために共に使われる。
【００４２】
好ましい具現例において、本発明の方法は選択的スプライシング部位を含むことによってＨＧＦの２つ以上の相異する類型の異型体、即ちｆｌＨＧＦ及びｄＨＧＦを同時に発現するコンストラクトを使用する。本明細書に参照として含まれた米国特許第７，８１２，１４６号で選択的スプライシングを通じてＨＧＦの２つの異型体（ｆｌＨＧＦ及びｄＨＧＦ）をコーディングするコンストラクトがＨＧＦの１つの異型体（ｆｌＨＧＦまたはｄＨＧＦのうちの１つ）をコーディングするコンストラクトより発現効率が遥かに高い（ほぼ２５０倍より高い）ということを既に立証した。典型的な具現例において、前記コンストラクトは（i）ヒトＨＧＦ遺伝子のエクソン１〜４を含む第１配列または前記第１配列の縮退性配列；（ii）ヒトＨＧＦ遺伝子のイントロン４を含む第２配列または前記第２配列の断片；及び（iii）ヒトＨＧＦ遺伝子のエクソン５〜１８を含む第３配列または前記第３配列の縮退性配列を含む。前記コンストラクトからエクソン４とエクソン５との間の選択的スプライシングによりＨＧＦの２つの異型体（ｆｌＨＧＦ及びｄＨＧＦ）が生成できる。
【００４３】
一部の具現例において、前記コンストラクトはイントロン４の全体配列を含む。一部の具現例において、前記コンストラクトはイントロン４の断片を含む。好ましい具現例において、前記コンストラクトは配列番号７〜配列番号１４からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。配列番号７のヌクレオチド配列は７１１３ｂｐであり、イントロン４の全体配列を含むコンストラクトに相応する。配列番号８〜１４のヌクレオチド配列はイントロン４の多様な断片を含むコンストラクトに相応する。
【００４４】
イントロン４の多様な断片はｆｌＨＧＦ及びｄＨＧＦ全ての発現を誘導するためにエクソン４とエクソン５との間に挿入できる。例えば、（i）配列番号７のヌクレオチド４８３−２２４４及びヌクレオチド３１６８−５４３８；（ii）配列番号７のヌクレオチド４８３−２２４４及びヌクレオチド４１６８−５４３８；（iii）配列番号７のヌクレオチド４８３−２２４４及びヌクレオチド５１１７−５４３８；（iv）配列番号７のヌクレオチド４８３−７２８及びヌクレオチド２２４０−５４３８；（v）配列番号７のヌクレオチド４８３−７２８及びヌクレオチド３１６８−５４３８；（vi）配列番号７のヌクレオチド４８３−７２８及びヌクレオチド４１６８−５４３８、または（vii）配列番号７のヌクレオチド４８３−７２８及びヌクレオチド５１１７−５４３８が使われることができる。
【００４５】
したがって、本発明の方法で使われたコンストラクトは、次を含むことができる：（i）（エクソン１〜エクソン４）−（配列番号７のヌクレオチド４８３−５４３８）−（エクソン５〜エクソン１８）；（ii）（エクソン１〜エクソン４）−（配列番号７のヌクレオチド４８３−２２４４ヌクレオチド３１６８−５４３８）−（エクソン５〜エクソン１８）；（iii）（エクソン１〜エクソン４）−（配列番号７のヌクレオチド４８３−２２４４ヌクレオチド４１６８−５４３８）−（エクソン５〜エクソン１８）；（iv）（エクソン１〜エクソン４）−（配列番号７のヌクレオチド４８３−２２４４ヌクレオチド５１１７−５４３８）−（エクソン５〜エクソン１８）；（v）（エクソン１〜エクソン４）−（配列番号７のヌクレオチド４８３−７２８ヌクレオチド２２４０−５４３８）−（エクソン５〜エクソン１８）；（vi）（エクソン１〜エクソン４）−（配列番号７のヌクレオチド４８３−７２８ヌクレオチド３１６８−５４３８）−（エクソン５〜エクソン１８）；（vii）（エクソン１〜エクソン４）−（配列番号７のヌクレオチド４８３−７２８ヌクレオチド４１６８−５４３８）−（エクソン５〜エクソン１８）；または（viii）（エクソン１〜エクソン４）−（配列番号７のヌクレオチド４８３−７２８ヌクレオチド５１１７−５４３８）−（エクソン５〜エクソン１８）。
【００４６】
ヒトＨＧＦのエクソン１〜１８及びヒトＨＧＦ遺伝子のイントロン４に相応するｃＤＮＡまたはその断片を含む多様な核酸コンストラクトは“ＨＧＦ−Ｘ”と命名され、その後に固有番号が付く。出願人により生成され試験されたＨＧＦ−Ｘは、以下の表１に要約されたように、配列番号７〜配列番号１４のヌクレオチド配列を有するＨＧＦ−Ｘ１、ＨＧＦ−Ｘ２、ＨＧＦ−Ｘ３、ＨＧＦ−Ｘ４、ＨＧＦ−Ｘ５、ＨＧＦ−Ｘ６、ＨＧＦ−Ｘ７、及びＨＧＦ−Ｘ８を含むが、これに制限されない。
【００４７】
【表１】
2021523212.tif 000003
【００４８】
出願人はその全文が本願に参照として含まれている米国特許第７，８１２，１４６号に開示されたようにＨＧＦ−Ｘ７が最も高い発現効率を示したことを以前に立証した。したがって、ＨＧＦ−Ｘ７を含む核酸コンストラクトは本発明の方法の好ましい具現例で使われることができる。
【００４９】
本発明で使われるＨＧＦ異型体のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列は野生型ヒトＨＧＦ異型体の配列と実質的に同一のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を追加的に含むことができる。実質的同一性は野生型ヒトＨＧＦ異型体のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列が１つの配列と最大に整列される時、少なくとも８０％同一性、より好ましくは少なくとも９０％同一性、そして最も好ましくは少なくとも９５％同一性を有する配列を含む。比較のための配列整列方法は当業界によく公知されている。多様なプログラム及び整列アルゴリズムが次に記載されている：Smith及びWaterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981); Needleman及びWunsch, J. Mol. Bio. 48: 443 (1970); Pearson及びLipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31 (1988); Higgins及びSharp, Gene 73: 15237-44 (1988); Higgins及びSharp, CABIOS 5: 151-3 (1989), Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16: 10881-90 (1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8: 155-65 (1992);及びPearson et al., Meth. Mol. Biol. 24: 307-31 (1994). NCBI BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)[Altschul 20 et al., J. Mol. Biol. 215: 403-10 (1990)]は配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｍ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、及びｔｂｌａｓｔｘと連結のためのインターネット上とＮＣＢＩ（National Center for Biological Information, Bethesda, Md.）を含んだいろいろな出処で利用可能である。ＢＬＡＳＴ及びプログラムを使用して配列識別を決定する方法に対する説明はＮＩＨ（National Institute of Health）傘下ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）の公式ウェブサイトから探すことができる。
【００５０】
３．１．２．ベクター（vector）
【００５１】
本発明の方法で使われるコンストラクトは発現された配列に作動可能に連結された１つ以上の調節配列（例えば、プロモーターまたはエンハンサー）を有するベクターを典型的に含む。調節配列はＨＧＦの異型体の発現を調節する。
【００５２】
ＨＧＦ蛋白質の１つ以上の異型体をコーディングするポリヌクレオチドは発現コンストラクトでプロモーターに作動可能に連結されることが好ましい。前記用語“作動可能に連結された（operatively linked）”は核酸発現調節配列（例えば、プロモーター、信号配列、または転写因子結合部位のアレイ）と第２核酸配列との間の機能的連結を意味し、前記発現調節配列は第２配列に相応する核酸の転写及び／又は翻訳に影響を与える。
【００５３】
典型的な具現例において、ポリヌクレオチドの転写を調節するためにポリヌクレオチドに連結されたプロモーターは、好ましくは動物で、より好ましくは哺乳動物細胞で作動可能であり、哺乳動物細胞のゲノム（genome）または哺乳動物ウイルスから由来したプロモーター、例えばＣＭＶ（cytomegalovirus）プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクチニアウイルス（vaccinia virus）７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶ  ｔｋプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ１アルファプロモーター、メタロチオネイン（metallothionein）プロモーター、ベータ−アクチンプロモーター、ヒトＩＬ−２遺伝子プロモーター、ヒトＩＦＮ遺伝子プロモーター、ヒトＩＬ−４遺伝子プロモーター、ヒトリンパ毒素遺伝子プロモーター、及びヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子プロモーターを含むが、これに制限されない。より好ましくは、本発明に有用なプロモーターはヒトＣＭＶ（ｈＣＭＶ）のＩＥ（immediate early）遺伝子またはＥＦ１アルファプロモーター、最も好ましくはＡＴＧ開始コドン直前の配列に亘ったエクソン１及びエクソン２配列の全体配列を含むｈＣＭＶ  ＩＥ遺伝子−由来プロモーター／エンハンサー及び５’−ＵＴＲ（非翻訳部位、untranslated region）から由来したプロモーターである。
【００５４】
本発明で使われる発現カセットはホリアデニル化配列、例えば牛成長ホルモン終結子（Gimmi, ER, et al., Nucleic Acids Res. 17: 6983-6998 (1989)）、ＳＶ４０−由来ホリアデニル化配列（Schek, N, et al., Mol. Cell Biol. 12: 5386-5393 (1992)）、ＨＩＶ−１ポリＡ（Klasens, BIF, et al., Nucleic Acids Res. 26: 1870-1876 (1998)）、β−グロビンポリＡ（Gil, A. et al., Cell 49: 399-406 (1987)）、ＨＳＶ  ＴＫポリＡ（Cole, CN及びTP Stacy, Mol. Cell. 5 Biol. 5: 2104-2113 (1985)）またはポリオーマウイルスポリＡ（Batt, D. Band GG Carmichael, Mol. Cell. Biol. 15: 4783-4790 (1995)）を含むが、これに制限されない。
【００５５】
３．１．２．１．比−ウイルスベクター（Non-viral Vector）
【００５６】
一部の具現例において、核酸コンストラクトはＨＧＦの２つ以上の異型体を発現することができる比−ウイルスベクター（non−viralvector）である。
【００５７】
典型的な具現例において、非−ウイルス性ベクターはプラスミドである。一般に好ましい具現例において、前記プラスミドはｐＣＫ、ｐＣＰ、ｐＶＡＸ１、またはｐＣＹである。特に好ましい具現例において、前記プラスミドはｐＣＫであり、その細部事項はＷＯ２０００／０４０７３７及び Lee et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 272: 230−235(2000)から探すことができ、その全ては本願にその全文が参照として含まれる。前記ｐＣＫベクターは配列番号５のポリヌクレオチドを有している。ｐＣＫに形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は２００３年３月２１日ブダペスト条約の条項によって韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms、ＫＣＣＭ）に寄託された（受託番号：ＫＣＣＭ−１０４７６）。
【００５８】
特に好ましい具現例において、ＨＧＦ−Ｘ７発現配列を含むｐＣＫプラスミドは本発明の方法で核酸コンストラクトとして使われる。好ましい一具現例において、ｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７（ＶＭ２０２ともいう）は受託番号ＫＣＣＭ−１０３６１としてＫＣＣＭにブダペスト条約の条項によって寄託された（前記プラスミドに形質転換された大腸菌菌株の形態に）。
【００５９】
３．１．２．２．ウイルスベクター（viral vector）
【００６０】
他の具現例において、当業界に公知された多様なウイルスベクターは本発明のＨＧＦ蛋白質の１つ以上の異型体を伝達し発現することに使われることができる。例えば、レトロウイルス（retrovirus）、レンチウイルス（lentivirus）、アデノウイルス（adenovirus）、またはアデノ−関連ウイルス（adeno-associated virus）を使用して開発されたベクターは本発明の一部の具現例で使われることができる。
【００６１】
（ａ）レトロウイルス
【００６２】
比較的大きい外因性遺伝子を運搬することができるレトロウイルスはそのゲノムを宿主ゲノムに統合し、広い宿主スペクトルを有するという点でウイルス遺伝子伝達ベクターに使われてきた。
【００６３】
レトロウイルスベクターを構築するために、本発明のポリヌクレオチドは複製−欠陥（replication-defective）があるウイルスを生成するために特定ウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入される。ビリオン（virion）を生産するために、ＬＴＲ（long terminal repeat）及びＷ成分無しでｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子を含むパッケージング（packaging）細胞株が構築される（Mann et al., Cell, 33: 153-159 (1983)）。本発明のポリヌクレオチドを含む組み換えプラスミドの場合、ＬＴＲ及びＷはこの細胞株に導入され、Ｗ配列は組み換えプラスミドのＲＮＡ転写体がウイルス粒子にパッケージングされるようにして、その後、培養培地（Nicolas及びRubinstein "Retroviral vectors", In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, 494-513(1988)）に分泌される。その後、組み換えレトロウイルスを含む培地は収集され、選択的に濃縮されて遺伝子伝達に使われる。
【００６４】
２世代のレトロウイルスベクターを使用した成功的な遺伝子伝達が報告されている。Kasahara et al.(Science, 266: 1373-1376 (1994))はＥＰＯ（erythropoietin）配列が外皮（envelope）部位に挿入されて、結果的に新たな結合特性を有するキメラ蛋白質を生成する、モロニーマウス白血病ウイルス（moloney murine leukemia virus）の変異型を製作した。恐らく、本遺伝子伝達システムは２−世代のレトロウイルスベクターに対する構築戦略によって構築できる。
【００６５】
（ｂ）レンチウイルス
【００６６】
また、レンチウイルスは本発明の一部の具現例で使われることができる。レンチウイルスはレトロウイルスの亜綱（subclass）である。しかしながら、レンチウイルスは非−分裂細胞（non-dividing cell）のゲノムに統合できる一方、レトロウイルスは分裂細胞のみ感染させることができる。
【００６７】
レンチウイルスベクターは普通いろいろなプラスミドに形質転換されたパッケージング細胞株、一般的にＨＥＫ２９３で生産される。前記プラスミドには（１）カプシド（capsid）及び逆転写酵素（reverse transcriptase）のようなビリオン（virion）蛋白質をコーディングするパッケージングプラスミドと、（２）標的に伝達される外因性遺伝子を含むプラスミドが含まれる。
【００６８】
ウイルスが細胞に入る時、ＲＮＡ形態のウイルスゲノム（viral genome）が逆転写されてＤＮＡを生成した後、ウイルスインテグレース（integrase）酵素によりゲノムに挿入される。したがって、レンチウイルスベクターと共に伝達された外因性物質はゲノムに残っていることがあり、分裂する時、細胞の子孫に伝達される。
【００６９】
（ｃ）アデノウイルス
【００７０】
アデノウイルスは中間−サイズのゲノム、操作の容易性、高い力価（titer）、広い標的−細胞範囲及び高い感染性のため、普通遺伝子伝達システムに使われている。ウイルスゲノムの両側末端にはウイルスＤＮＡ複製及びパッケージングに必要なシス（cis）要素である１００−２００ｂｐ ＩＴＲ（inverted terminal repeat）が含まれる。Ｅ１領域（Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ）はウイルスゲノムの転写調節を担当する蛋白質と幾つの細胞遺伝子をコーディングする。Ｅ２領域（Ｅ２Ａ及びＥ２Ｂ）の発現はウイルスＤＮＡ複製のための蛋白質の合成をもたらす。
【００７１】
現在まで開発されたアデノウイルスベクターのうち、Ｅ１領域が欠失された複製不能（replication incompetent）アデノウイルスが一般的に使われる。アデノウイルスベクターで欠失されたＥ３領域は転移遺伝子（transgene）に対する挿入部位を提供することができる（Thimmappaya, B. et al., Cell, 31: 543-551 (1982);及びRiordan, JR et al., Science, 245: 1066-1073 (1989)）。したがって、デコリン（decroin）−コーディングヌクレオチド配列は欠失されたＥ１領域（Ｅ１Ａ領域及び／又はＥ１Ｂ  ５領域、好ましくはＥ１Ｂ領域）または欠失されたＥ３領域のうちの１つに挿入されることが好ましい。本発明のポリヌクレオチドは欠失されたＥ４領域に挿入できる。ウイルスゲノム配列で言及される用語“欠失（deletion）”は全体欠失及び部分欠失も含む。自然でアデノウイルスは野生型ゲノムの約１０５％をパッケージングすることができるので、約２ｋｂの追加ＤＮＡに対する容量を提供することができる（Ghosh-Choudhury et al., EMBO J.' 6: 1733-1739 (1987)）。これと関連して、アデノウイルスに挿入された前記外来配列はアデノウイルス野生型ゲノムに追加で挿入できる。
【００７２】
前記アデノウイルスは公知された血清型（serotype）または亜群（subgroup）Ａ−Ｆのうち、任意のものでありうる。亜群Ｃのアデノウイルス５型は本発明のアデノウイルス遺伝子伝達システムを構築するための最も好ましい出発物質である。アデノウイルス５型に対する多い生化学的及び遺伝的情報が公知されている。アデノウイルス遺伝子伝達システムにより伝達される外来遺伝子はエピソーム（episome）であり、宿主細胞に対して遺伝毒性（genotoxicity）がある。したがって、アデノウイルス遺伝子伝達システムを用いた遺伝子治療はだいぶ安定でありうる。
【００７３】
（ｄ）アデノ−関連ウイルス（adeno-associated virus、ＡＡＶ）
【００７４】
アデノ−関連ウイルスは非−分裂細胞及び多様な類型の細胞を感染させることができるので、本発明の遺伝子伝達システムを構築することに有用である。ＡＡＶベクターの使用及び製造に対する詳細な説明は米国特許第５，１３９，９４１号及び第４，７９７，３６８号にある。
【００７５】
遺伝子伝達システムとしてＡＡＶに対する研究結果はLaFace et al., Viology, 162: 483486(1988), Zhou et al., Exp. Hematol. (NY), 21: 928-933(1993), Walsh et al, J. Clin. Invest., 94: 1440-1448(1994)及びFlotte et al., Gene Therapy, 2: 29-37(1995)に開示されている。一般に、組み換えＡＡＶウイルスは２つのＡＡＶ末端反復（terminal repeat）（McLaughlin et al., 1988; Samulski et al., 1989）が側面にある関心遺伝子（即ち、伝達される関心ヌクレオチド配列及びデコリン遺伝子）を含むプラスミド及び末端反復のない野生型ＡＡＶコーディング配列を含む発現プラスミド（McCarty et al., J. Viral., 65: 2936-2945 (1991)）を共同形質感染（cotransfection）して作られる。
【００７６】
（ｅ）他のウイルスベクター
【００７７】
他のウイルスベクターが本発明で遺伝子伝達システムとして使われることができる。ワクチニアウイルス（vaccinia virus）（ Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10: 649-657 (1999); Ridgeway, "Mammalian expression vectors,"In: Vectors: A survey of molecule cloning vector and its uses. Rodriguez及びDenhardt, eds. Stoneham: Butterworth, 467-492 (1988); Baichwal及びSugden, "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes" In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press, 117-148 (1986)及びCoupar et al., Gene, 68: 1-10 (1988)）、レンチウイルス（Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104 (11): RS 5-62 (1999)）及び単純ヘルペスウイルス（Chamber R., et al., Proc. Natl. 10 15 Acad. Sci USA 92: 1411-1415 (1995)）のようなウイルスから由来したベクターは本発明のポリヌクレオチド全てを細胞に伝達するために本発明の伝達システムで使われることができる。
【００７８】
３．２．ＣＩＰＮ−誘発治療剤
【００７９】
多様な具現例において、哺乳動物が露出した神経病症−誘発治療剤は化学療法薬物である。
【００８０】
特定の具現例において、化学療法薬物は白金（platinum）類似体である。特定具現例において、前記薬物はシスプラチン（cisplatin）、カルボプラチン（carboplatin）、またはオキサリプラチン（oxaliplatin）である。特定の具現例において、前記化学療法薬物は抗−有糸分裂剤（anti-mitotic agent）である。特定の具現例において、前記薬物はタキサン（taxane）である。特定の具現例において、前記タキサンはパクリタキセル（paclitaxel、Taxol（R））、ドセタキセル（docetaxel、Taxotere（R））、またはカバジタキセル（cabazitaxel、Jevtana（R））である。特定の具現例において、前記薬物はエリブリン（eribulin、Halaven（R））である。特定の具現例において、前記化学療法薬物は植物アルカロイド（plant alkaloid）である。特定の具現例において、前記薬物はビンブラスチン（vinblastine）、ビンクリスチン（vincristine）、ビノレルビン（vinorelbine）、またはエトポシド（etoposide）（ＶＰ−１６）である。特定の具現例において、前記化学療法薬物はプロテアソーム阻害剤（proteasome inhibitor）である。特定の具現例において、前記薬物はボルテゾミブ（bortezomib、Velcade（R））またはカルフィルゾミブ（carfilzomib、Kyprolis（R））である。特定の具現例において、前記化学療法薬物は免疫調節剤である。特定の具現例において、前記薬物はサリドマイド（thalidomide、Thalomid（R））、レナリドマイド（lenalidomide、Revlimid（R））、またはポマリドマイド（pomalidomide、Pomalyst（R））である。特定の具現例において、前記化学療法薬物はエポチロン（epothilone）である。特定の具現例において、前記薬物はイクサベピロン（ixabepilone、Ixempra（R））である。特定の具現例において、哺乳動物が以前に露出した神経病症−誘発治療剤は抗腫瘍生物学的製剤（antineoplastic biologic）である。
【００８１】
対象体（subject）は化学療法薬物に露出されたか、または露出される非−ヒト哺乳動物及びヒト全てを含む。
【００８２】
３．３．投与順序
【００８３】
典型的な具現例において、核酸コンストラクトは以前に神経病症−誘発治療剤に露出したことがある対象体（subject）に投与される。一部の具現例において、核酸コンストラクトは神経病症−誘発治療剤と同時に対象体に投与される。一部の具現例において、核酸コンストラクトは対象体が神経病症−誘発治療剤に露出される前に投与される。一部の具現例において、核酸コンストラクトは化学療法薬物に露出される前と後の全てに投与される。
【００８４】
一部の具現例において、前記方法は投与するステップの後、１週以上後にＤＮＡを哺乳動物に再投与するステップを追加的に含む。一部の具現例において、再投与するステップは投与するステップの後、少なくとも２週、３週、４週、５週、または１０週後に遂行される。一部の具現例において、再投与するステップは投与するステップの後、少なくとも１０日、１５日、２０日、３０日、４０日、５０日、または１００日後に遂行される。一部の具現例において、哺乳動物は投与するステップと再投与するステップの間に核酸コンストラクトの投与を受けない。
【００８５】
３．４．伝達方法
【００８６】
本明細書に記載された方法で、ＨＧＦの１つ以上の異型体を発現するポリヌクレオチドコンストラクトを投与するために多様な伝達方法が使われることができる。
【００８７】
３．４．１．注射（Injection）
【００８８】
典型的な具現例において、核酸コンストラクトは液体薬剤学的組成物の注射により投与される。
【００８９】
一般に好ましい具現例において、ポリヌクレオチドコンストラクトは筋肉内注射（intramuscular injection）により投与される。典型的に、ポリヌクレオチドコンストラクトは痛み部位または患者が−認知する痛み部位と近い個所に筋肉内注射により投与される。一部の具現例において、ポリヌクレオチドコンストラクトは対象体の手、足、脚、または腕の筋肉に投与される。
【００９０】
一部の具現例において、コンストラクトは皮下（subcutaneously）または皮内（intradermally）注射される。
【００９１】
一部の具現例において、ポリヌクレオチドコンストラクトは血管内（intravascular）伝達により投与される。特定の具現例において、コンストラクトは逆行性静脈注射（retrograde intravenous injection）により注射される。
【００９２】
３．４．２．電気穿孔法（Electroporation）
【００９３】
プラスミドＤＮＡの細胞in vivoへの形質転換効率は一部の場合に注入後電気穿孔（electroporation）を遂行することによって改善できる。したがって、一部の具現例において、ポリヌクレオチドは注射後、電気穿孔により投与される。特定の具現例において、電気穿孔は TriGridTM Delivery System(Ichor Medical Systems, Inc., San Diego, USA)を使用して投与される。
【００９４】
３．４．３．超音波穿孔法（Sonoporation）
【００９５】
一部の具現例において、超音波穿孔法（sonoporation）は本発明のコンストラクトの形質転換効率を向上させるために使われる。超音波穿孔法は超音波を使用して細胞膜を一時的に透過性に作ってＤＮＡの細胞内の吸収を許容する。ポリヌクレオチドコンストラクトはマイクロバブル内に統合されることができ、全身循環により投与された後、超音波の外部適用が繋がることができる。超音波は標的組織内のマイクロバブルの空洞化（cavitation）を誘導してコンストラクトの放出及び形質感染（transfection）をもたらす。
【００９６】
３．４．４．磁気注入法（Magnetofection）
【００９７】
一部の具現例において、磁気注入法（magnetofection）は本発明のコンストラクトの形質転換効率を向上させるために使われる。前記コンストラクトは磁性（magnetic）ナノ粒子にカップリングされた後、投与される。高い勾配の外部磁石を適用すれば、複合物がターゲットに捕捉され固定される。ポリヌクレオチドコンストラクトは架橋分子の酵素切断、電荷相互作用、またはマトリックスの分解により放出できる。
【００９８】
３．４．５．リポソーム（Liposome）
【００９９】
一部の具現例において、本発明のポリヌクレオチドはリポソーム（liposome）により伝達できる。リポソームは燐脂質が過量の水性媒質で懸濁される時、自発的に形成される。リポソーム−媒介核酸伝達はNicolau and Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721: 185-190(1982)及びNicolau et al., Methods Enzymol., 149: 157-176(1987) に記述されたように非常に成功的であった。リポソームを使用して動物細胞を形質感染させるための市販する試薬の例にはリポフェクタミン（Lipofectamine、Gibco BRL）が含まれる。本発明のポリヌクレオチドを捕獲するリポソームはエンドサイトシス（endocytosis）、吸着（adsorption）及び融合（fusion）のような機作により細胞と相互作用した後、配列（sequence）を細胞内に伝達する。
【０１００】
３．４．６．形質感染（Transfection）
【０１０１】
ＨＧＦをコーディングするポリヌクレオチドを伝達するためにウイルスベクターを使用する場合、ポリヌクレオチド配列は当業界に公知された多様なウイルス感染方法により細胞内に伝達できる。ウイルスベクターを使用した宿主細胞の感染は前述した参照された文献に記述されている。
【０１０２】
好ましくは、本発明の薬剤学的組成物は非経口的に投与できる。非−経口投与の場合、静脈注射（intravenous injection）、腹腔注射（intraperitoneal injection）、筋肉注射（intramuscular injection）、皮下注射（subcutaneous injection）、または局所注射（local injection）が利用できる。例えば、前記薬剤学的組成物は逆行性静脈注射（retrograde intravenous injection）により注射できる。
【０１０３】
好ましくは、本発明の薬剤学的組成物は筋肉内に投与できる。一部の具現例において、前記投与は神経病症性痛みにより影響を受ける筋肉をターゲットとする。
【０１０４】
３．５．容量（Dose）
【０１０５】
ポリヌクレオチドコンストラクトは治療的有効容量で投与される。本明細書に記載された方法において、前記治療的有効容量は対象体で神経病症性痛みを減少させることに効果的な容量である。
【０１０６】
本明細書に記載された方法の一部の具現例において、ポリヌクレオチドコンストラクトは１μｇ〜２００ｍｇ、１ｍｇ〜２００ｍｇ、１ｍｇ〜１００ｍｇ、１ｍｇ〜５０ｍｇ、１ｍｇ〜２０ｍｇ、または５ｍｇ〜１０ｍｇの総容量で投与される。一部の具現例において、ポリヌクレオチドコンストラクトは２ｍｇ、４ｍｇ、８ｍｇ、１６ｍｇ、３２ｍｇ、または６４ｍｇの総容量で投与される。
【０１０７】
多様な具現例において、前記総容量は複数の個別注射容量に分割される。一部の具現例において、前記総容量は複数の同一の注射容量に分割される。一部の具現例において、前記総容量は同一でない注射容量に分割される。多様な分割された容量の具現例において、前記総容量は４、８、１６、２４、３２、または６４個の相異する注射部位に投与される。一部の具現例において、注射部位当たり注射容量は０．１ｍｇ〜５ｍｇの間である。特定の具現例において、注射部位当たり注射容量は０．１ｍｇ、０．１５ｍｇ、０．２ｍｇ、０．２５ｍｇ、０．３ｍｇ、０．３５ｍｇ、０．４ｍｇ、０．４５ｍｇ、０．５ｍｇ、または１ｍｇである。
【０１０８】
典型的な分割された容量の具現例において、複数の注射容量全ては互いに１時間以内に投与される。一部の具現例において、複数の注射容量全ては互いに１．５時間、２時間、２．５時間、または３時間以内に投与される。
【０１０９】
前記方法の多様な具現例において、ポリヌクレオチドコンストラクトの総容量は１つの単一容量で投与されるか、または複数の注射容量に分割されて対象体に１回のみ投与される。他の具現例において、ポリヌクレオチドコンストラクトは、初期投与後、数日後に再−投与される。一部の具現例において、ポリヌクレオチドコンストラクトは、初期投与後、約３、５、１０、１５、２０、２５、３０、または３５日後に再−投与される。一部の具現例において、ポリヌクレオチドコンストラクトは初期投与後、１／２、１、２、３、４、５、７、９、または１０週後に再投与される。一部の具現例において、ポリヌクレオチドは、初期投与後、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ケ月後に再−投与される。一部の具現例において、後続総容量は初期総容量と同一である。一部の具現例において、後続容量は初期総容量と相異する。一部の具現例において、薬剤学的組成物は２ケ月に１回、１ケ月に１回、１ケ月に２−４回、週１回、または２週に１回投与される。
【０１１０】
一部の具現例において、１回、２回、３回、または４回の訪問に亘って総容量のポリヌクレオチドコンストラクトを複数の注射部位に投与するステップは単一周期（cycle）を含むことができる。特に、２回の訪問に亘って３２ｍｇ、１６ｍｇ、８ｍｇ、または４ｍｇのポリヌクレオチドコンストラクトを複数の注射部位に投与するステップは単一周期を含むことができる。２回の訪問は３日、５日、７日、１４日、２１日、または２８日の間隔でありうる。
【０１１１】
一部の具現例において、前記周期は反復できる。前記周期は２回、３回、４回、５回、６回、またはその以上反復できる。一部の具現例において、前記の周期は以前の周期後、１ケ月、２ケ月、３ケ月、４ケ月、５ケ月、６ケ月、７ケ月、８ケ月、９ケ月、１０ケ月、１１ケ月、１２ケ月、またはその以上反復できる。
【０１１２】
一部の具現例において、後続周期に投与される総容量は以前周期に投与された総容量と同一である。一部の具現例において、後続周期に投与される総容量は以前周期に投与された総容量と相異する。
【０１１３】
一部の具現例において、ポリヌクレオチドコンストラクトは患部（affected site）（例えば、影響を受けた四肢（affected limb））当たり８ｍｇの容量で投与され、複数の注射及び複数の訪問に同一に分割され、任意の単一訪問で複数の注射の各々は別途の注射部位で遂行される。特定の具現例において、ＤＮＡコンストラクトは患部当たり８ｍｇの容量で投与され、０日に部位当たり４ｍｇの第１容量と１４日に部位当たり４ｍｇの第２容量に同等に分割され、各々第１及び第２容量は複数の注射容量に同一に分割される。一部の具現例において、患部当たり８ｍｇの投与は周期を構成することができ、前記周期は１回、２回、３回、またはその以上反復できる。
【０１１４】
投与される実際量、投与の速度、及び時間−過程は治療される痛みの性質及び重症度によって変わる。典型的な具現例において、ポリヌクレオチドコンストラクトは神経病症性痛みを減少させることに効果的な量（amount）で投与される。一部の具現例において、前記量（amount）は投与１週以内に神経病症性痛みを減少させることに効果的である。一部の具現例において、前記量は投与２週、３週、または４週以内に神経病症性痛みを減少させることに効果的である。
【０１１５】
一部の具現例において、ＨＧＦの２つの異型体、即ちｆｌＨＧＦをコーディングする第１コンストラクト及びｄＨＧＦをコーディングする第２コンストラクトの発現を誘導するために２つの相異する類型のコンストラクトが共に投与される。一部の具現例において、ｆｌＨＧＦ及びｄＨＧＦ全ての発現を誘導するためにｆｌＨＧＦ及びｄＨＧＦ全てをコーディングする単一コンストラクトが伝達される。
【０１１６】
当業者に公知された通常的な技術によれば、薬剤学的組成物は前述したように薬剤学的に許容可能な担体及び／又はビヒクル（vehicle）と共に剤形化されることができ、最終的にいろいろな形態の単位容量形態及び多重容量形態を提供することができる。剤形（formulation）の非−制限的な例はオイルまたは水性媒質のうちの溶液（solution）、懸濁液（suspension）、または油剤（emulsion）、抽出物（extract）、エリキシル（elixir）、粉末（powder）、顆粒（granule）、錠剤（tablet）、及びカプセル（capsule）を含むが、これに制限されず、追加で分散剤（dispersion agent）または安定剤（stabilizer）を含むことができる。
【０１１７】
３．６．変異型（Variation）
【０１１８】
最適の容量範囲を確認することに助けになるようにin vivo及び／又はin vitro分析を選択的に使用することができる。剤形に使われる正確な容量はまた関連化学療法薬物、投与経路及び状態の深刻度によって変わり、医者の判断と各対象体の状況によって決定されなければならない。効果的な容量はin vitroまたは動物モデルテストシステムから由来した容量−反応曲線から外挿法（extrapolation）により推定できる。
【０１１９】
一部の具現例において、前記方法はＣＩＰＮ及び痛み状態を診断する追加的なステップを含む。診断は神経伝導研究を通じての筋電図検査、皮膚神経の神経分布を評価するための皮膚生検、及び組織病理学的評価のための神経及び筋肉生検を含むことができる。
【０１２０】
ポリヌクレオチドコンストラクトは治療される状態によって同時に、または順次に、単独で、または他の治療と組合せて投与できる。
【０１２１】
４．薬剤学的組成物
【０１２２】
典型的な具現例において、核酸コンストラクトは液体薬剤学的組成物で投与される。
【０１２３】
４．１．注射に適合した薬剤学的組成物及び単位容量形態
【０１２４】
静脈内（intravenous）、筋肉内（intramuscular）、皮内（intradermal）、または皮下（subcutaneous）注射のために、核酸コンストラクトは発熱源のない（pyrogen-free）適切なｐＨ、等張性及び安定性を有する非経口的に許容可能な水溶液の形態である。当業者は、例えば塩化ナトリウム注射剤（Sodium Chloride Injection）、リンゲル注射剤（Ringer’s Injection）、乳酸化リンゲル注射剤（Lactated Ringer’s Injection）のような等張性ビヒクルを使用して適合した溶液を容易に製造することができる。必要によって保存剤（preservative）、安定剤（stabilizer）、緩衝剤（buffer）、抗酸化剤（antioxidant）及び／又はその他の添加剤（additive）が含まれることができる。
【０１２５】
多様な具現例において、核酸コンストラクトは０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、または１ｍｇ／ｍｌの濃度で液体組成物に存在する。一部の具現例において、単位容量形態は０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、または１ｍｇ／ｍｌの濃度の２ｍｌの薬剤学的組成物を含むバイアル（vial）である。
【０１２６】
一部の具現例において、単位容量形態はバイアル、アンプル、瓶、または予め−充填された注射器である。一部の具現例において、単位容量形態は０．０１ｍｇ、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．２５ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、２．５ｍｇ、５ｍｇ、８ｍｇ、１０ｍｇ、１２．５ｍｇ、１６ｍｇ、２４ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、７５ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、または２００ｍｇの本発明のポリヌクレオチドを含有する。
【０１２７】
典型的な具現例において、単位容量形態の薬剤学的組成物は液体形態である。多様な具現例において、単位容量形態は０．１ｍｌ〜５０ｍｌの間の薬剤学的組成物を含有する。一部の具現例において、単位容量形態は０．２５ｍｌ、０．５ｍｌ、１ｍｌ、２．５ｍｌ、５ｍｌ、７．５ｍｌ、１０ｍｌ、２５ｍｌ、または５０ｍｌの薬剤学的組成物を含有する。
【０１２８】
特定の具現例において、単位容量形態は皮下（subcutaneous）、皮内（intradermal）、または筋肉内（intramuscular）投与に適合した単位容量形態の具現例で１ｍｌの薬剤学的組成物を含有するバイアルであり、予めローディングされた注射器（preloaded syringe）、自動−注射器（auto-injector）及び自動−注射ペン（auto-inject pen）を含み、各々は前記記載された薬剤学的組成物の予め決定された量を含有する。
【０１２９】
多様な具現例において、単位容量形態は注射器及び予め決定された量の薬剤学的組成物を含む予めローディングされた注射器である。特定の予めローディングされた注射器の具現例において、注射器は皮下投与に適している。特定の具現例において、注射器は自家−投与（self-administration）に適している。特定の具現例において、予めローディングされた注射器は使い捨て注射器である。
【０１３０】
多様な具現例において、予めローディングされた注射器は約０．１ｍｌ〜約０．５ｍｌの薬剤学的組成物を含有する。特定の具現例において、注射器は約０．５ｍｌの薬剤学的組成物を含有する。具体的な具現例において、注射器は約１．０ｍｌの薬剤学的組成物を含有する。特定の具現例において、注射器は約２．０ｍｌの薬剤学的組成物を含有する。
【０１３１】
特定の具現例において、単位容量形態は自動−注射ペンである。自動−注射ペンは本明細書に記載された薬剤学的組成物を含有する自動−注射ペンを含む。一部の具現例において、自動−注射ペンは予め決定された体積の薬剤学的組成物を伝達する。他の具現例において、自動−注射ペンは使用者により設定された体積の薬剤学的組成物を伝達するように構成される。
【０１３２】
多様な具現例において、自動−注射ペンは約０．１ｍｌ〜約５．０ｍｌの薬剤学的組成物を含有する。具体的な具現例において、自動−注射ペンは約０．５ｍｌの薬剤学的組成物を含有する。特定の具現例において、自動−注射ペンは約１．０ｍｌの薬剤学的組成物を含有する。他の具現例において、自動−注射ペンは約５．０ｍｌの薬剤学的組成物を含有する。
【０１３３】
４．２．凍結乾燥されたＤＮＡ剤形
【０１３４】
一部の具現例において、本発明の核酸コンストラクトは凍結乾燥された剤形から再構成された液体組成物として投与される。具体的な具現例において、本願にその全文が参照により含まれている米国特許第８，３８９，４９２号に開示された凍結乾燥されたＤＮＡ剤形は再構成後に使われる。
【０１３５】
一部の具現例において、本発明の核酸コンストラクトは凍結乾燥前に炭水化物及び塩を含む特定賦形剤（excipient）と共に剤形化される。診断剤または治療剤に活用されるＤＮＡの凍結乾燥された剤形の安定性は安定化量の炭水化物を含む水溶液で、凍結乾燥前にＤＮＡを剤形化することによって増加できる。
【０１３６】
本発明のＤＮＡ剤形の炭水化物はスクロース（sucrose）、グルコース（glucose）、ラクトース（lactose）、トレハロース（trehalose）、アラビノース（arabinose）、ペントース（pentose）、リボース（ribose）、キシロース（xylose）、ガラクトース（galactose）、ヘキソース（hexose）、アイドース（idose）、マンノース（mannose）、タロース（talose）、ヘプトース（heptose）、果糖（fructose）、グルコン酸 （gluconic acid）、ソルビトール（sorbitol）、マンニトール （mannitol）、メチルα−グルコピラノサイド（methyl a-glucopyranoside）、マルトース（maltose）、イソアスコルブ酸（isoascorbic acid）、アスコルブ酸 （ascorbic acid）、ラクトン（lactone）、ソルボス（sorbose）、グルカル酸（glucaric acid）、エリトロース（erythrose）、トレオース （threose）、アロース （allose）、アルトロース（altrose）、グロース（gulose）、エリトルロース（erythrulose）、リブロース （ribulose）、キシルロース（xylulose）、サイコース（psicose）、タガトース （tagatose）、グルクロン酸 （glucuronic acid）、ガラクツロン酸 （galacturonic acid）、マンヌロン酸（mannuronic acid）、グルコサミン（glucosamine）、ガラクトサミン（galactosamine）、ニュラミン酸（neuraminic acid）、アラビナン（arabinan）、フラクタン（fructan）、フカン（fucan）、ガラクタン （galactan）、ガラクツロナン（galacturonan）、グルカン（glucan）、マンナン（mannan）、キシラン（xylan）、レバン（levan）、フコイダン（fucoidan）、カラギナン（carrageenan）、ガラクトカロロース（galactocarolose）、ペクチン（pectin）、ペクチン酸（pectic acid）、アミロース（amylose）、プルラン（pullulan）、グリコーゲン（glycogen）、アミロペクチン（amylopectin）、セルロース（cellulose）、デキストラン（dextran）、サイクロデキストリン（cyclodextrin）、プスツラン（pustulan）、キチン（chitin）、アガロース（agarose）、ケラチン（keratin）、コンドロイチン（chondroitin）、デルマタン（dermatan）、ヒアルロン酸（hyaluronic acid）、アルギン酸（alginic acid）、ザンサンガム（xantham gum）、または澱粉（starch）のような単糖類、オリゴ糖類、または多糖類である。
【０１３７】
一連の一具現例において、炭水化物はマンニトールまたはスクロースである。
【０１３８】
凍結乾燥前の炭水化物溶液は水単独内の炭水化物に相応できるか、または緩衝液が含まれることができる。このような緩衝液の例はＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＳ、またはＴＲＩＳ／ＥＤＴＡを含む。典型的に、炭水化物溶液は約０．０５％〜約３０％スクロース、典型的に０．１％〜約１５％スクロース、例えば０．２％〜約５％、１０％、または１５％スクロース、好ましくは約０．５％〜１０％スクロースの間、１％〜５％スクロース、１％〜３％スクロース、及び最も好ましくは約１．１％スクロースの最終濃度でＤＮＡと結合される。
【０１３９】
本発明のＤＮＡ剤形の塩はＮａＣｌまたはＫＣｌである。特定の態様によれば、前記塩はＮａＣｌである。追加的な態様によれば、ＤＮＡ剤形の塩は約０．００１％〜約１０％の間、約０．１％〜５％の間、約０．１％〜４％の間、約０．５％〜約２％の間、約０．８％〜１．５％の間、約０．８％〜１．２％ｗ／ｖの間からなる群より選択された量で存在する。特定の具現例において、ＤＮＡ剤形の塩は約０．９％ｗ／ｖの量で存在する。
【０１４０】
凍結乾燥された剤形から再構成された液体組成物の最終濃度は、約１ｎｇ／ｍＬ〜約３０ｍｇ／ｍＬのプラスミドである。例えば、本発明の剤形は約１ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ、約５００μｇ／ｍＬ、約６００μｇ／ｍＬ、約８００μｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ、約２．５ｍｇ／ｍＬ、約３ｍｇ／ｍＬ、約３．５ｍｇ／ｍＬ、約４ｍｇ／ｍＬ、約４．５ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ、約５．５ｍｇ／ｍＬ、約６ｍｇ／ｍＬ、約７ｍｇ／ｍＬ、約８ｍｇ／ｍＬ、約９ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ、または約３０ｍｇ／ｍＬのプラスミドの最終濃度を有することができる。本発明の特定の具現例において、ＤＮＡの最終濃度は約１００μｇ／ｍＬ〜約２．５ｍｇ／ｍＬである。本発明の特定の具現例において、ＤＮＡの最終濃度は約０．５ｍｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬである。
【０１４１】
本発明のＤＮＡ剤形は当業界に公知された標準条件下で凍結乾燥される。本発明のＤＮＡ剤形の凍結乾燥方法は、（ａ）ＤＮＡ剤形、例えばプラスミドＤＮＡ、塩及び炭水化物を含むＤＮＡ剤形が盛られた容器（container）、例えばバイアルを凍結乾燥器にローディングするステップであって、前記プラスミドＤＮＡはＨＧＦ遺伝子またはその変異体を含み、前記凍結乾燥器は約５℃〜約−５０℃の開始温度を有することであるステップ；（ｂ）ＤＮＡ剤形を零下の温度（例：−１０℃〜−５０℃）で冷却させるステップ；及び（ｃ）ＤＮＡ剤形を実質的に乾燥させるステップを含むことができる。本発明のＤＮＡ剤形の凍結乾燥条件、例えば温度及び持続時間は凍結乾燥媒介変数、例えば使われた凍結乾燥機械の類型、使われたＤＮＡ量、及び使われた容器のサイズに影響を及ぼす要因を考慮して当業者により調整できる。
【０１４２】
凍結乾燥されたＤＮＡ剤形を盛り込んだ容器は、その後、多様な温度（例えば、室温〜約−１８０℃、好ましくは約２−８℃〜約−８０℃、より好ましくは約−２０℃〜約−８０℃、及び最も好ましくは約−２０℃）で長時間の間封入され保管できる。特定の態様によれば、凍結乾燥されたＤＮＡ剤形は有意な活性を失わないで、少なくとも６ケ月の期間の間、約２−８℃から約−８０℃までの範囲内で好ましくは安定である。また、プラスミドＤＮＡ剤形の安定した貯蔵は研究またはプラスミド−基盤治療のような使用前に長期間安定した形態にプラスミドＤＮＡを貯蔵することに相応することができる。貯蔵期間は数ケ月、１年、５年、１０年、１５年、または最大２０年でありうる。好ましくは、製剤は少なくとも約３年の期間の間、安定である。
【０１４３】
本発明の方法で再構成された凍結乾燥されたＤＮＡの濃度は伝達される剤形の量、対象体の年齢及び体重、伝達方法及び経路、そして伝達される抗原の免疫原性を含む多い要因によって調整される。
【実施例】
【０１４４】
次の実施例は本発明を製造し使用する方法に対する完全な開示及び説明を当業者に提供するために提示されたものであり、本発明者らが彼らの発明と見なす範囲を制限しようとする意図でなく、次の実験が全てのまたは唯一の遂行された実験であることを示すための意図でもない。使われた数字（例：量、温度など）と関連して正確性を保証するために努力したが、一部の実験的な誤謬及び偏差が考慮されなければならない。異に表示されない限り、部分（parts）は重量部（parts by weight）であり、分子量（molecular weight）は重量平均分子量（weight average molecular weight）であり、温度は摂氏温度（degrees Celsius）であり、圧力は大気圧または周辺大気圧（near atmospheric）である。標準略語は例えば、ｂｐ、塩基対（base pair）；ｋｂ、キロベース（kilobase）；ｐｌ、ピコリットル（picoliter）；ｓまたはｓｅｃ、秒（second）；ｍｉｎ、分（minute）；ｈまたはｈｒ、時間（hour）；ａａ、アミノ酸（amino acid）；ｎｔ、ヌクレオチド（nucleotide）；などのように使われることができる。
【０１４５】
異に指示されない限り、本発明の実施は当業界技術内の蛋白質化学、生化学、組み換えＤＮＡ技術、及び薬理学の通常的な方法を使用する。
【０１４６】
実施例１：ＨＧＦの異型体をコーディングする核酸コンストラクトの製造
【０１４７】
米国特許第７，８１２，１４６号に記載されたＨＧＦの異型体をコーディングする多様なコンストラクトが使われた。
【０１４８】
要するに、ｐＣＫベクターはＨＧＦの異型体が発現できるベクターに使われた。両方ともその全文が参照により含まれた Lee et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 272: 230 (2000); WO 2000/040737に詳細に開示されたように、遺伝子、例えばＨＧＦ遺伝子の発現がＨＣＭＶ（human cytomegalovirus）のエンハンサー／プロモーター下で調節されるようにｐＣＫベクターは構成される。さらに、ＶＥＧＦをコーディングするｃＤＮＡをｐＣＫベクターにクローニングしてｐＣＫ−ＶＥＧＦを作っており、ｐＣＫ−ＶＥＧＦに形質転換された大腸菌は１９９９年１２月２７日に韓国微生物貯蔵センター（受託番号：ＫＣＣＭ−１０１７９）に寄託された。ｐＣＫベクターは配列番号５のポリヌクレオチドを含む。ｐＣＫベクターは人体臨床試験に使われ、その安定性と効能が確認された（Henry et al., Gene Ther. 18:788 (2011)）。
【０１４９】
ＨＧＦの異型体をコーディングする多様な配列はＨＧＦコンストラクトを生成するために使われた。特に、ヒトＨＧＦのエクソン１〜１８及びヒトＨＧＦ遺伝子のイントロン４に該当するｃＤＮＡまたはその断片を含むコンストラクトが生成された。前記コンストラクトで、イントロン４はｃＤＮＡのエクソン４とエクソン５の間に挿入される。
【０１５０】
一部の場合、コンストラクトはイントロン４の全体配列を含む。一部の場合、コンストラクトはイントロン４の断片を含む。例えば、コンストラクトは配列番号７〜配列番号１４からなる群より選択されたヌクレオチド配列を含むことができる。配列番号７のヌクレオチド配列は７１１３ｂｐであり、イントロン４の全体配列を含むコンストラクトに該当する。配列番号８〜１４のヌクレオチド配列はイントロン４の断片を含むコンストラクトに該当する。
【０１５１】
したがって、本願で提供される方法で使われることができるコンストラクトは次のような構造を有する：（i）（エクソン１〜エクソン４）−（配列番号７のヌクレオチド４８３−５４３８）−（エクソン５〜エクソン１８）；（ii）（エクソン１〜エクソン４）−（配列番号７のヌクレオチド４８３−２２４４ヌクレオチド３１６８−５４３８）−（エクソン５〜エクソン１８）；（iii）（エクソン１〜エクソン４）−（配列番号７のヌクレオチド４８３−２２４４ヌクレオチド４１６８−５４３８）−（エクソン５〜エクソン１８）；（iv）（エクソン１〜エクソン４）−（配列番号７のヌクレオチド４８３−２２４４ヌクレオチド５１１７−５４３８ of ８）−（エクソン５〜エクソン１８）；（v）（エクソン１〜エクソン４）−（配列番号７のヌクレオチド４８３−７２８ヌクレオチド２２４０−５４３８）−（エクソン５〜エクソン１８）；（vi）（エクソン１〜エクソン４）−（配列番号７のヌクレオチド４８３−７２８ヌクレオチド３１６８−５４３８）−（エクソン５〜エクソン１８）；（vii）（エクソン１〜エクソン４）−（配列番号７のヌクレオチド４８３−７２８ヌクレオチド４１６８−５４３８）−（エクソン５〜エクソン１８）；または（viii）（エクソン１〜エクソン４）−（配列番号７のヌクレオチド４８３−７２８ヌクレオチド５１１７−５４３８）−（エクソン５〜エクソン１８）。
【０１５２】
本明細書で、ヒトＨＧＦのイントロン４またはその断片を含むハイブリッドＨＧＦ遺伝子は“ＨＧＦ−Ｘ”と命名される。ＨＧＦ−Ｘは各々配列番号７〜配列番号１４のヌクレオチド配列を有するＨＧＦ−Ｘ１、ＨＧＦ−Ｘ２、ＨＧＦ−Ｘ３、ＨＧＦ−Ｘ４、ＨＧＦ−Ｘ５、ＨＧＦ−Ｘ６、ＨＧＦ−Ｘ７、及びＨＧＦ−Ｘ８を含む（前記表１参照）。
【０１５３】
ＨＧＦの２つの異型体（即ち、ｆｌＨＧＦ及びｄＨＧＦ）は各々のコンストラクトからエクソン４とエクソン５の間の選択的スプライシングにより生成できるということが以前に立証された。また、多様なＨＧＦコンストラクトのうち、ＨＧＦ−Ｘ７はＨＧＦの２つの異型体（即ち、ｆｌＨＧＦ及びｄＨＧＦ）の最も高い水準の発現を示した。
【０１５４】
ｐＣＫベクターでクローニングされたＨＧＦ−Ｘ７は本出願に提供された治療方法の効能をテストするために使われた。米国特許第７，８１２，１４６号に開示されたように、ｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７に形質転換された大腸菌（Escherichia coli）Ｔｏｐ１０Ｆ’は２００２年３月１２日受託番号ＫＣＣＭ−１０３６１で寄託された。
【０１５５】
実施例２：パクリタキセル（タキサン）により誘発された末梢神経病症のマウスモデルに対するｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７の治療効果
【０１５６】
パクリタキセル（paclitaxel、ＰＴＸ）は特にタキソル（Taxol）というブランド名で販売される化学療法薬物である。パクリタキセルは卵巣癌（ovarian  cancer）、乳癌（breast  cancer）、肺癌（lung cancer）、カポジ肉腫（Kaposi sarcoma）、子宮頸癌（cervical cancer）及び膵癌（pancreatic cancer）を含んだいろいろな類型の癌を治療することに使われる。パクリタキセルはタキサン（taxane）系列薬物に属し、細胞分裂中に微細小管（microtubule）の正常な機能を妨害して作用する。薬物のありふれた副作用には末梢神経病症（peripheral neuropathy）と神経病症性痛み（neuropathic pain）が含まれる。
【０１５７】
パクリタキセルにより誘発された神経病症性痛みに対するｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７の治療効果はマウスモデルを使用して研究された。図２ａに示したように、パクリタキセルを９−週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスに１週間、毎日、腹腔内注射を通じて投与した。化学療法注射開始後、１週間後、ボンフレイのフィラメントテスト（Von Frey’s filament test）を通じて異質痛（allodynia）水準を評価し、３５％以上の足撤退頻度（paw withdrawal frequency）反応を示すマウスを研究の実験対象に選択した。０週次に化学療法剤を受けないsham−処理された動物（sham-treated animal）を対照群に使用した。
【０１５８】
実験動物に（i）２００μｇのｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７または（ii）対照群としてＨＧＦ−Ｘ７ペイロード（payload）のない２００μｇのｐＣＫベクター２つのうちの１つを筋肉内注射により投与した。機械的異質痛（mechanical allodynia）は次の５週間、毎週、テストされた。また、本明細書に提供された実験プロトコルは図２ａに要約されている。
【０１５９】
図２ｂに示すように、sham−処理された動物（Sham）は実験中ずっと低い水準の痛みを示した。一方、パクリタキセルを処理した動物は１週次に増加した足撤退頻度（paw withdrawal frequency）を示しており、研究期間中ずっと足撤退頻度は高く維持された（データは表示されない）。１週次にパクリタキセルを処理した動物を２群に分けて、一群にはｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７を注射し、対照群として他の群にはｐＣＫベクターを注射した。
【０１６０】
ｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７を注射した場合、パクリタキセル−処理された動物の足撤退頻度は有意に減少したが、ｐＣＫを注射した場合には足撤退頻度に変化がなかった。この結果はｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７を処理した動物が対照群動物（ShamまたはｐＣＫ）に比べて痛みが減少したことを示唆する。このようなデータはｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７の筋肉内投与がパクリタキセル−誘発神経病症性痛みで有意な痛み緩和効果を有することができることを示唆した。
【０１６１】
実施例３：ビンクリスチン（植物アルカロイド）により誘発された末梢神経病症のマウスモデルに対するｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７の治療効果
【０１６２】
ロイロクリスチン（leurocristine）とも知られているビンクリスチン（vincristine）は、特にオンコビン（Oncovin）というブランド名で販売される化学療法薬物である。ビンクリスチンは植物アルカロイド（plant alkaloid）に分類される。ビンクリスチンは急性リンパ球性白血病（acute lymphocytic leukemia）、急性骨髄性白血病（acute myeloid leukemia）、ホジキン病 （Hodgkin’s disease）、神経芽細胞腫（neuroblastoma）及び小細胞肺癌（small cell lung cancer）を始めとするいろいろな類型の癌を治療することに使われる。ビンクリスチンは部分的にチューブリン蛋白質に結合して、中期（metaphase）の間、細胞が染色体を分離できないようにする。その後、細胞は細胞死滅（apoptosis）を経る。また、ビンクリスチンは白血球生成と成熟を抑制することと公知されている。薬物のありふれた副作用には神経病症性痛みが含まれる。
【０１６３】
ビンクリスチンにより誘発された神経病症性痛みに対するｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７の治療効果はマウスモデルを使用して研究された。図３ａに示すように、ビンクリスチンを５−週齢の雄Ｂａｌｂ／ｃマウスに２週間、毎日、腹腔内注射を通じて投与した。化学療法注射開始後、１週間後に、ボンフレイのフィラメントテスト（Von Frey’s filamenttest）を通じて異質痛水準を評価し、３５％以上の足撤退頻度反応を示すマウスを研究の実験対象に選択した。０週次に化学療法剤を受けないsham−処理された動物（Sham-treated animal）を対照群に使用した。
【０１６４】
実験動物に（i）２００μｇのｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７または（ii）対照群としてＨＧＦ−Ｘ７ペイロード（payload）がない２００μｇのｐＣＫベクター２つのうちの１つを筋肉内注射により投与した。機械的異質痛は次の４週間、毎週、テストされた。また、本明細書で提供された実験プロトコルは図３ａに要約されている。
【０１６５】
図３ｂに示すように、sham−処理された動物（Sham）は実験中ずっと低い水準の痛みを示した。一方、ビンクリスチンを処理した動物は１週次に足撤退頻度が増加しており、研究期間中ずっと足撤退頻度が高く維持された（データは表示されないこと）。１週次にビンクリスチンを処理した動物を２群に分けて、一群にはｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７を注射し、対照群として他の群にはｐＣＫベクターを注射した。
【０１６６】
ビンクリスチン−処理された動物の足撤退頻度はｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７を注射した場合、有意に減少したが、ｐＣＫを注射した場合には足撤退頻度は変わらなかった。この結果はｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７を処理した動物が対照群動物（ｐＣＫベクターだけ）に比べて痛みが減少したことを示唆する。このようなデータはｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７の筋肉内投与がビンクリスチン−誘発神経病症性痛みで有意な痛み緩和効果があることを示唆した。
【０１６７】
実施例４：ボルテゾミブ（プロテアソーム阻害剤）により誘発された末梢神経病症のマウスモデルに対するｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７の治療効果
【０１６８】
ボルテゾミブ（Bortezomib）は癌治療のためにヒトに使われる最初の治療用プロテアソーム阻害剤（proteasome inhibitor）である。ボルテゾミブは３０％の患者で痛みを伴う末梢神経病症と関連がある。
【０１６９】
ボルテゾミブにより誘発された神経病症性痛みに対するｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７の治療効果をマウスモデルを使用して研究した。図４ａに示すように、ボルテゾミブを７−週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに２週間、週３回、ｉ．ｐ．注射した。化学療法注射開始後、１週間後に、ボンフレイのフィラメントテストを通じて異質痛水準を評価し、３５％以上の足撤退頻度反応を示すマウスを研究の実験対象に選択した。０週次に化学療法剤を受けないsham−処理された動物（Sham-treated animal）を対照群に使用した。
【０１７０】
実験動物に（i）２００μｇのｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７または（ii）対照群としてＨＧＦ−Ｘ７ペイロード（payload）のない２００μｇのｐＣＫベクターのうちの１つを筋肉内注射により投与した。機械的異質痛は化学療法注射開始後、１週間後に始めて毎週テストされた。また、本明細書に提供された実験プロトコルは図４ａに要約されている。
【０１７１】
図４ｂに示すように、sham−処理された動物（Sham）は実験中ずっと低い水準の痛みを示した。一方、ボルテゾミブを処理した動物は１週次に増加された足撤退頻度を示し、研究期間中ずっと足撤退頻度は高く維持された（データは表示されない）。２週次にボルテゾミブを処理した動物を２群に分けて、一群にはｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７を注射し、対照群として他の群にはｐＣＫベクターを注射した。
【０１７２】
ボルテゾミブ−処理された動物の足撤退頻度はｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７を注射した場合、有意に減少したが、ｐＣＫを注射した場合には足撤退頻度は変わらなかった。このようなデータはｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７の筋肉内投与がボルテゾミブ−誘発神経病症性痛みで有意な痛み緩和効果を提供することを示唆した。
【０１７３】
実施例５：シスプラチン（白金類似体）により誘発された末梢神経病症のマウスモデルに対するｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７の治療効果
【０１７４】
シスプラチン（Cisplatin）は皐丸癌（testicular cancer）、卵巣癌（ovarian cancer）、子宮頚癌（cervical cancer）、乳癌（breast cancer）、膀胱癌.（bladder cancer）、頭頚部癌（head and neck cancer）、食道癌（esophageal cancer）、肺癌（lung cancer）、中皮腫（mesothelioma）、脳腫瘍（brain tumor）、及び神経芽細胞腫（neuroblastoma）を始めとする多数の癌を治療することに使われる化学療法薬物である。末梢神経病症はシスプラチンの深刻な副作用であるが、他の化学療法薬物に比べてありふれない。
【０１７５】
シスプラチンにより誘発された神経病症性痛みに対するｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７の治療効果はマウスモデルを使用して研究された。図５ａに示すように、シスプラチンを９−週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに２週間、２日に１回、腹腔内注射により投与した。化学療法注射開始後、１週間後にボンフレイのフィラメントテストを通じて異質痛水準を評価し、３５％以上の足撤退頻度反応を示すマウスを研究の実験対象に選択した。０週次に化学療法剤を受けないsham−処理された動物（Sham-treated animal）を対照群に使用した。
【０１７６】
実験動物に（i）２００μｇのｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７または（ii）対照群としてＨＧＦ−Ｘ７ペイロード（payload）のない２００μｇのｐＣＫベクターのうちの１つを筋肉内注射により投与した。機械的異質痛は次の３週間、毎週、テストされた。また、本明細書に提供された実験プロトコルは図５ａに要約されている。
【０１７７】
図５ｂに示すように、sham−処理された動物（Sham）は実験中ずっと低い水準の痛みを示した。一方、シスプラチンを処理した動物は１週次に増加した足撤退頻度を示し、研究期間中ずっと足撤退頻度は高く維持された（データは表示されない）。１週次にシスプラチンを処理した動物を２群に分けて、一群にはｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７を注射し、対照群として他の群にはｐＣＫベクターを注射した。
【０１７８】
ｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７を注射した場合、シスプラチン−処理された動物の足撤退頻度は有意に減少したが、ｐＣＫを注射した場合には足撤退頻度は変わらなかった。このようなデータはｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７の筋肉内投与がシスプラチン−誘発神経病症性痛みで有意な痛み緩和効果を有するということを立証する。
【０１７９】
配列
【０１８０】
【表２】
2021523212.tif 000004
【０１８１】
文献の援用（INCORPORATION BY REFERENCE）
【０１８２】
本出願で引用された全ての刊行物、特許、特許出願書、及びその他の文書は、各々の個別刊行物、特許、特許出願書、またはその他の文書が全ての目的で参照により含まれることと個別的に表示されることと同一の程度に、全ての目的でその全文が参照により本願に含まれる。
【０１８３】
均等物（EQUIVALENTS）
【０１８４】
多様な具体的な実施例が例示及び説明されたが、前記明細書は制約的でない。本発明の思想（spirit）及び範囲を逸脱することなく多様な変更がなされることができることが理解できる。本明細書を検討すれば、多い変形が当業者に明白である。
【図１】
2021523212.tif 000005
【図２】
2021523212.tif 000006
【図３】
2021523212.tif 000007
【図４】
2021523212.tif 000008
【図５】
2021523212.tif 000009
【配列表】
2021523212000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年11月17日(2020.11.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学療法薬物に対する露出と関連した神経病症性痛み（neuropathic pain）を治療するためのヒトＨＧＦ蛋白質の２つの異型体（isoform）を発現できる核酸コンストラクトを含む薬剤学的組成物であって、
前記核酸コンストラクトは次を含むものである、薬剤学的組成物 ：
ヒトＨＧＦ遺伝子のエクソン１〜４を含む第１配列または前記第１配列の縮退性配列、
ヒトＨＧＦ遺伝子のイントロン４を含む第２配列または前記第２配列の断片、及び
ヒトＨＧＦ遺伝子のエクソン５〜１８を含む第３配列または前記第３配列の縮退性配列。
【請求項２】
前記化学療法薬物は、 植物アルカロイド（plant alkaloid）、タキサン（taxane）、エポチロン（epothilone）、プロテアソーム阻害剤（proteasome inhibitor）、免疫調節剤（immunomodulator）、及び抗腫瘍生物学的製剤（antineoplastic biologic）からなる群より選択されるものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記化学療法薬物は、ビンクリスチン（vincristine）、ボルテゾミブ（bortezomib）、パクリタキセル（paclitaxel）、またはシスプラチン（cisplatin）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ヒトＨＧＦ蛋白質の２つの異型体（isoform）は全長ＨＧＦ（full-length HGF、ｆｌＨＧＦ）及び欠失された変異型ＨＧＦ（deleted variant HGF、ｄＨＧＦ）を含むものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記全長ＨＧＦ（ｆｌＨＧＦ）は配列番号１のポリペプチドを含み、欠失された変異型ＨＧＦ（ｄＨＧＦ）は配列番号２のポリペプチドを含むものである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸コンストラクトは配列番号１３のポリヌクレオチドを含むものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記第１配列及び前記第３配列はイントロンのないものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記第１配列は配列番号３のポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記第２配列は配列番号６のポリヌクレオチドまたはその断片を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記第３配列は配列番号４のポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記核酸コンストラクトはｐＣＫベクターをさらに含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項１２】
前記核酸コンストラクトはＶＭ２０２である、請求項１１に記載の組成物。
【国際調査報告】
2021523212.tif 000010
2021523212.tif 000011
2021523212.tif 000012