(57)【要約】本発明は、同種異系細胞療法と抗-CD137抗体薬物コンジュゲート(ADC)とを組み合わせることによる、治療において同種異系細胞を使用する方法を提供する。同種異系細胞療法を受けているヒト対象における宿主対移植片(host versus graft (HvG))拒絶を、抗-CD137 ADCを前記ヒト対象に投与することによって、治療する又は予防する方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト対象に移植された同種異系細胞の拒絶を治療する又は予防するための方法、ここで、前記方法は、前記ヒト対象において、同種異系細胞の拒絶を治療する又は予防するように、以下を含む、
(a) 前記ヒト対象に、第1の量の同種異系細胞を投与すること、ここで、第1の量は、前記ヒト対象中の同種異系細胞に対するプライミング応答を誘発するのに十分である；
(b) 内因性のCD137+活性化T細胞が減少するように、前記ヒト対象に、抗-CD137抗体薬物コンジュゲート(ADC)を投与すること、ここで、前記抗-CD137 ADCは、リンカーを介して細胞毒素にコンジュゲートした抗-CD137抗体又はその抗原結合フラグメントを含む；並びに、
(c) 前記ヒト対象に、治療有効量のCARを発現する同種異系細胞を投与すること、ここで、前記同種異系細胞は、(a)で投与される同種異系細胞と同じタイプである、及び、前記CARは、腫瘍抗原に結合する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナリング・ドメインを含む。
【請求項２】
請求項１に記載の方法、ここで、前記方法は、ステップ(b)の約48時間~約7日前に、前記ヒト対象に、第1の量の同種異系細胞を投与することを含む。
【請求項３】
請求項１に記載の方法、ここで、前記方法は、ステップ(b)の約48時間~約7日前に、前記ヒト対象に、治療有効量の前記CARを発現する同種異系細胞を投与することを含む。
【請求項４】
ヒト対象に移植された同種異系細胞の拒絶を治療する又は予防するための方法、ここで、前記方法は、前記ヒト対象において、同種異系細胞の拒絶を治療する又は予防するように、以下を含む、
(a) 前記ヒト対象に、抗-CD137抗体薬物コンジュゲート(ADC)を投与すること、ここで、前記抗-CD137 ADCは、リンカーを介して細胞毒素にコンジュゲートした抗-CD137抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、及びここで、前記ヒト対象は、前記ヒト対象に以前に投与された同種異形細胞に対する活性化T細胞を有する；並びに、
(b) 前記ヒト対象に、治療有効量のCARを発現する同種異系細胞を投与すること、ここで、前記同種異系細胞は、(a)で記載される同種異系細胞と同じタイプである、及び、前記CARは、腫瘍抗原に結合する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナリング・ドメインを含む。
【請求項５】
請求項４に記載の方法、ここで、前記方法は、ステップ(a)の約24時間~約14日後に、前記ヒト対象に、治療有効量の前記CARを発現する同種異系細胞を投与することを含む。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか一項に記載の方法、ここで、前記同種異系細胞は、同種異系T細胞又は同種異系NK細胞である。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか一項に記載の方法、ここで、前記治療有効量の前記CARを発現する同種異系細胞は、約2×106~約3.0×108 細胞/kgである。
【請求項８】
請求項１〜７の何れか一項に記載の方法、ここで、同種異系細胞の拒絶は、サイトカイン放出症候群(CRS)を特徴とする。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか一項に記載の方法、ここで、前記ヒト対象は、がん又は自己免疫疾患を有する。
【請求項１０】
請求項１〜９の何れか一項に記載の方法、ここで、前記抗-CD137抗体又はその抗原結合フラグメントは、それぞれ、配列番号(SEQ ID NO) 19、20、及び21に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2、及びCDR3を含む重鎖可変領域を含む、並びに、それぞれ、配列番号(SEQ ID NO)23、24、及び25に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2、及びCDR3を含む軽鎖可変領域を含む。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法、ここで、前記抗-CD137抗体又はその抗原結合フラグメントは、キメラ化又はヒト化されている。
【請求項１２】
請求項１〜１１の何れか一項に記載の方法、ここで、前記抗-CD137抗体又はその抗原結合フラグメントは、IgG1アイソタイプ又はIgG4アイソタイプである。
【請求項１３】
請求項１〜１２に記載の方法、ここで、前記細胞毒素は、抗有糸分裂薬剤又はRNAポリメラーゼ阻害剤である。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法、ここで、前記RNAポリメラーゼ阻害剤は、アマトキシンである。
【請求項１５】
請求項１３に記載の方法、ここで、前記RNAポリメラーゼ阻害剤は、アマニチンである。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法、ここで、前記アマニチンは、α-アマニチン、β-アマニチン、γ-アマニチン、ε-アマニチン、アマニン、アマニンアミド、アマヌリン、アマヌリン酸、及びプロアマヌリンからなる群から選択される。
【請求項１７】
請求項１４に記載の方法、ここで、前記アマトキシンにコンジュゲートした抗-CD137抗体又はその抗原結合フラグメントは、式Ab-Z-L-Amによって表される、ここで、Abは抗体又はその抗原結合フラグメントである、Lはリンカーである、Zは化学的な部分構造である、及びAmは式(III)によって表されるアマトキシンである、
【化１】
2021530546.tif 000054
ここで、R1は、H、OH、ORA、又はORCである；
R2は、H、OH、ORB、又はORCである；
RA 及びRBは、存在する場合、それらが結合している酸素原子と一緒になって、任意選択的に置換された5員ヘテロシクロルアルキル基を形成する；
R3は、H、RC、又はRDである；
R4、R5、R6、及びR7は、それぞれ独立してH、OH、ORC、ORD、RC、又はRDである；
R8は、OH、NH2、ORC、ORD、NHRC、又はNRCRDである；
R9は、H、OH、ORC、又はORDである；
Qは、-S-、-S(O)-、又は-SO2-である；
RCは、-L-Zである；
RDは、任意選択的に置換されたC1-C6アルキル、任意選択的に置換されたC1-C6ヘテロアルキル、任意選択的に置換されたC2-C6アルケニル、任意選択的に置換されたC2-C6ヘテロアルケニル、任意選択的に置換されたC2-C6アルキニル、任意選択的に置換されたC2-C6ヘテロアルキニル、任意選択的に置換されたシクロアルキル、任意選択的に置換されたヘテロシクロアルキル、任意選択的に置換されたアリール、又は任意選択的に置換されたヘテロアリールである；
Lは、リンカーである；及び、
Zは、L上に存在する反応性置換基と、抗-CD137抗体又はその抗原結合フラグメント内に存在する反応性置換基との間のカップリング反応から形成される化学的な部分構造である、ここで、Amは正確に1つのRc置換基を含む。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法、ここで、前記リンカーは、任意選択的に置換されたC1-C6アルキル、任意選択的に置換されたC1-C6ヘテロアルキル、任意選択的に置換されたC2-C6アルケニル、任意選択的に置換されたC2-C6ヘテロアルケニル、任意選択的に置換されたC2-C6アルキニル、任意選択的に置換されたC2-C6ヘテロアルキニル、任意選択的に置換されたシクロアルキル、任意選択的に置換されたヘテロシクロアルキル、任意選択的に置換されたアリール、任意選択的に置換されたヘテロアリール、ジペプチド、-(C=O)-、-(CH2)mO)n(CH2)m-、ここでm及びnは、それぞれ独立して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10から選択されたものである；又はそれらの組み合わせ、である。
【請求項１９】
請求項１３に記載の方法、ここで、前記抗有糸分裂薬剤は、メイタンシン、カリケアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、インドリノベンゾジアゼピン又はアウリスタチンである。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法、ここで、前記アウリスタチンは、モノメチル・アウリスタチンF(MMAF)又はモノメチル・アウリスタチンE(MMAE)である。
【請求項２１】
請求項１〜２０の何れか一項に記載の方法、ここで、前記ADCのリンカーは、N-ベータ-マレイミドプロピオニル-Val-Ala-パラ-アミノベンジル(BMP-Val-Ala-PAB)である。
【請求項２２】
請求項１〜５の何れか一項に記載の方法、ここで、前記ADCは、以下の構造の何れか1つによって表される：
【化２】
2021530546.tif 000055
。
【請求項２３】
請求項１〜５の何れか一項に記載の方法、ここで、前記ADCは、以下によって表される：
【化３】
2021530546.tif 000056
又は、
【化４】
2021530546.tif 000057
。
【請求項２４】
請求項１〜２３の何れか一項に記載の方法、ここで、前記ADCは、3日以下の血清半減期を有する。
【請求項２５】
請求項１〜２４の何れか一項に記載の方法、ここで、前記細胞外ドメインは、scFv抗体又は単鎖T細胞レセプター(scTCR)を含む。
【請求項２６】
請求項１〜２４の何れか一項に記載の方法、ここで、前記細胞外ドメインは、非-免疫グロブリン・スキャフォールド・タンパク質(scaffold protein)を含む。
【請求項２７】
請求項１から２６の何れか一項に記載の方法、ここで、前記CARの細胞外ドメインは、CD19、CD22、CD30、CD7、BCMA、CD137、CD22、CD20、AFP、GPC3、MUC1、メソテリン、CD38、PD1、EGFR(例えば、EGFRvIII)、MG7、BCMA、TACI、CEA、PSCA、CEA、HER2、MUC1、CD33、ROR2、NKR-2、PSCA、CD28、TAA、NKG2D、又はCD123からなる群より選択される腫瘍抗原に結合する。
【請求項２８】
請求項１から２７の何れか一項に記載の方法、ここで、前記CARの細胞質シグナリング・ドメインは、CD28細胞内シグナリング・ドメイン、CD3ゼータ細胞内シグナリング・ドメイン、OX40細胞内シグナリング・ドメイン、及び／又はCD137細胞内シグナリング・ドメインを含む。
【請求項２９】
請求項１〜２８の何れか一項に記載の方法、ここで、前記CARの細胞内シグナリング・ドメインは、CD3ゼータ細胞内シグナリング・ドメインを含む。
【請求項３０】
請求項９に記載の方法、ここで、前記がんは、白血病、成人進行がん、膵臓がん、切除不能な膵臓がん、結腸直腸がん、転移性結腸直腸がん、卵巣がん、トリプル-ネガティブ乳がん、造血系／リンパ系がん、大腸がん肝臓転移、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、B細胞リンパ腫、再発性又は難治性B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞リンパ腫、再発性又は難治性びまん性大細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、原発性縦隔B細胞リンパ腫、再発性縦隔、難治性縦隔大細胞型B細胞リンパ腫、大細胞型B細胞リンパ腫、ホジキン・リンパ腫、非-ホジキン・リンパ腫、再発又は難治性非-ホジキンリンパ腫、難治性進行性非-ホジキンリンパ腫、B細胞性非-ホジキン・リンパ腫、難治性非-ホジキンリンパ腫、結腸直腸がん腫(colorectal carcinoma)、胃がん(gastric carcinoma)、膵がん(pancreatic carcinoma)、トリプルネガティブ浸潤性乳がん(triple-negative invasive breast carcinoma)、腎細胞がん(renal cell carcinoma)、肺扁平上皮がん(lung squamous cell carcinoma)、肝細胞がん(hepatocellularcarcinoma)、尿路上皮がん(urothelial carcinoma)、白血病、B細胞性白血病、B細胞性急性リンパ球性白血病（B-cell acute lymphocytic leukemia）、B細胞性急性リンパ芽球性白血病（B-cell acute lymphoblastic leukemia）、成人急性リンパ芽球性白血病、B細胞性前リンパ球性白血病（B-cell prolymphocytic leukemia）、小児急性リンパ芽球性白血病(childhood acute lymphoblastic leukemia)、難治性小児急性リンパ芽球性白血病(refractory childhood acute lymphoblastic leukemia)、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ球性白血病、前リンパ球性白血病(prolymphocytic leukemia)、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、再発性プラズマ細胞性骨髄腫(recurrent plasma cell myeloma)、難治性プラズマ細胞性骨髄腫(refractory plasma cell myeloma)、多発性骨髄腫、再発性又は難治性多発性骨髄腫、骨の多発性骨髄腫、脳の悪性神経膠腫(malignant glioma of brain)、骨髄異形成症候群、EGFR陽性結腸直腸がん、多形性膠芽腫(glioblastoma multiforme)、新生物、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍(blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm)、肝臓転移、固形腫瘍、進行性固形腫瘍(advanced solid tumor)、メソテリン陽性腫瘍(mesothelin positive tumor)、血液悪性腫瘍、及びその他の進行した悪性腫瘍、である。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は2018年7月23日に出願された米国仮特許出願第62/702292号に対し、35 U.S.C§119(e)に基づく優先権の利益を主張する。上記出願の含有量は、参照により本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
方法治療の拒絶を媒介することに関与する宿主免疫システムの細胞によって発現される抗原に結合する抗体-薬物結合体(ADC)の投与による、ヒト対象、例えばキメラ抗原レセプター(chimeric antigen receptor)(CAR)細胞治療における同種細胞治療の拒絶の治療または予防のための細胞を提供する。
【背景技術】
【０００３】
同種細胞療法とは、移植された細胞が患者以外のドナー(donor)に由来する、患者への細胞の移植を含む。同種ドナー(donor)で同種細胞療法に用いられる一般的な種類には、HLA適合同胞、適合非血縁ドナー(donor)、部分的に適合した家系員ドナー(donor)、血縁臍帯血ドナー(donor)、および非血縁臍帯血ドナー(donor)がある。細胞療法における最終目標は、「大陸棚」製品の基礎を形成することができる同種細胞療法を同定することである(ブランデンバーガーら(2011))。バイオプロセス・インターナショナル。9(補遺I):30-37)同種細胞療法の使用を拡大する。
【０００４】
同種細胞療法に莫大な可能性を抱える治療領域の一つにキメラ抗原レセプター(chimeric antigen receptor)(CAR)療法がある。CAR処理は、体内の免疫システムを利用して、がんなど一定の病気に関連する特異抗原を発現している細胞を破壊する免疫学的治処理である。例えば、腫瘍において、CAR治療は腫瘍を攻撃する免疫システムの力を強化し、強化する。CAR治療はT細胞のような免疫細胞に基づいており、一般に、scFvのような細胞外抗原結合ドメインと、細胞質活性シグナル伝達および表面レセプターから細胞をシグナル伝達する「共刺激」ドメインとを結合する膜貫通融合タンパク質であるCARを発現する。したがって、T-細胞のような免疫細胞がCARを発現すると、免疫細胞はCARの抗原結合ドメイン(例えば、腫瘍関連抗原)が標的とする抗原を発現する細胞を認識し、それを殺すことができる(ゲイヤーとブレンツェンス(2016)サイトセラピー18(11):1393-1409)。
【０００５】
現在まで、承認されているCAR療法は患者から自家細胞を入手し、患者自身の細胞をCAR発現細胞に変換することに依存しており、その後、これらを治療に用いる。しかしながら、CAR療法の課題は、自家細胞がしばしば個別のプロトコルを必要とするため、自家細胞を得るのに伴う期間とコストである。同種細胞の使用は、CAR治療に関連する時間および費用を減少させるのであろう。
【０００６】
その有望性にもかかわらず、現在のところ同種細胞の治療的使用は、この治療を困難にすることがある。免疫応答性ホストでは、移植された同種細胞は速やかに拒絶され、ホスト対移植片拒絶(HvG)と呼ばれる過程を経る。HvGは移入された細胞の有効性を実質的に低下させることができ、レシピエント(recipient)において有害事象を引き起こし、同種細胞の使用を制限することができる。同種細胞療法の可能性をさらに高めるために、HvG拒絶を克服できる方法が依然として必要である。
【発明の概要】
【０００７】
ヒト対象における移植された同種細胞の拒絶を予防または治療するための方法を提供する。特に、本明細書中に開示される方法は、同種細胞療法を受けている患者において宿主対移植片(HvG)を処置または予防するために使用され得る。同種細胞療法の投与を容易にするために、CD137を発現する活性化T細胞などの免疫細胞の集団を枯渇させるように、抗-CD137抗体-薬物結合体(ADC)を投与する方法を特徴とする。このCD137+細胞の免疫システム、例えば活性化T細胞の選択的除去は、細胞療法の拒絶の危険性を防止するか、または有意に減少させる。
【０００８】
第1の局面において、本発明は(a)同種細胞の第1の量をヒト対象に投与することによって、ヒト対象に移植された同種細胞の拒絶を処置または予防するための方法を特徴とし、ここで、第1の量はヒト対象において同種細胞に対するプライミング応答を誘発するのに充分である;(b)抗-CD137抗体薬物コンジュゲート(ADC)を、内因性CD137+活性化方法が枯渇するようにヒト対象に投与すること(ここで、抗-CD137+活性化方法はヒト対象を介して細胞毒素に結合された抗-CD137細胞またはそのヒト対象を含む);および(c)細胞を発現する同種細胞の治療有効量をヒト対象に投与すること(ここで、同種抗体薬物コンジュゲートは上記で投与された同種ヒト対象の同じ型であり、そして方法は腫瘍抗原、ヒト対象、およびヒト対象に結合する細胞を含む;同種細胞拒絶が細胞において処置または予防される)。ある実施形態に、この方法は工程(b)の約48時間~約7日前に、同種異系細胞の第1の量をヒト対象に投与することを含む。別の実施形態では、本方法がCARを発現する同種異系細胞の治療有効量を、工程(b)の約24時間~約14日間の間にヒト対象に投与することを含む。
【０００９】
別の局面において、本発明は(a)抗-CD137 ADCをヒト対象に投与することによって、ヒト対象に移植された同種細胞の拒絶を処置または予防する方法を特徴とし、ここで、抗-CD137 ADCはリンカーを介して細胞毒素に結合された抗-CD137抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、ヒト対象はヒト対象に以前に投与された同種細胞に向けられた活性化T細胞を有することを特徴とし、そして(b)CARを発現する同種細胞の治療的有効量をヒト対象に投与することであって、同種細胞は(a)に記載される同種細胞の同じ型であり、そしてCARは移植された同種細胞の拒絶がヒト対象において処置または予防されるように、腫瘍抗原、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナリング・ドメインに結合する細胞外ドメインを含む。ある実施形態に、この方法は工程(a)の約24時間~約14日後に、CARを発現する同種異系細胞の有効量をヒト対象に投与することを含む。
【００１０】
ある特定の実施形態に、同種細胞は、同種T細胞または同種NK細胞である。他の実施形態では、CARを発現する同種異系細胞の実効量が約2×106~約3.0×108細胞/kgである。さらに別の実施形態において、同種細胞拒絶は、サイトカイン放出症候群(cytokine release syndrome)(CRS)によって特徴付けられる。他の実施形態では、ヒト対象ががんまたは自己免疫疾患を有する。別の実施形態では、抗-CD137抗体またはその抗原結合フラグメントがそれぞれ配列番号(SEQ ID NO): 19、20、および21に示すアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2、およびCDR3を含む重鎖可変領域を含み、それぞれ配列番号(SEQ ID NO): 23、24、および25に示すアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2、およびCDR3を含む軽鎖可変領域を含む。他の実施形態では、抗-CD137抗体またはその抗原結合フラグメントがキメラまたはヒト化されている。
【００１１】
さらに他の実施形態では、抗-CD137抗体またはその抗原結合フラグメントがIgG1アイソタイプまたはIgG4アイソタイプである。他の実施形態では、細胞毒素は抗有糸分裂薬またはRNAポリメラーゼ阻害剤である。
【００１２】
他の実施形態では、細胞毒素がメイタンシン、カリケアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、インドリノベンゾジアゼピン、またはアウリスタチンである。ある実施形態に、アウリスタチンはモノメチル・アウリスタチンF(MMAF)またはモノメチル・アウリスタチンE(MMAE)である。ある実施形態に、細胞毒素はメイタンシンである。ある実施形態に、細胞毒素はピロロベンゾジアゼピン(PBD)である。例えば、いくつかの実施形態に、PBDは、テシリンまたはタリリンから選択され得る。いくつかの実施形態に、細胞毒素はカリケアマイシンであってもよい。例えば、いくつかの実施形態に、カリケアマイシンはオゾガミシンであってもよい。
【００１３】
別の実施形態では、RNAポリメラーゼ阻害剤はアマトキシンである。さらに別の実施形態では、RNAポリメラーゼ阻害剤はアマニチンである。更なる実施形態に、アマニチンは、α-アマニチン、βアマニチン、γアマニチン、εアマニチン、アマニン、アマニンアミド, アマヌリン,アマヌリン酸、およびプロアマヌリンからなる群から選択される。さらに別の実施形態では、抗-CD137 ADCがAbがCD137に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであり、Lがリンカーであり、Zが化学的な部分構造であり、Amがアマトキシンで式Ab-Z-L-Amによって表される。ある特定の実施形態において、リンカーアマトキシン共役Am-L-Zは、式(III)で表される
【化１】
2021530546.tif 000002
(III)
ここで、R1は、H、OH、ORA、またはORCである;
R2はH、OH、ORB、またはORC;
RA およびRBは、存在する場合、それらが結合する酸素原子と一緒になって、結合して、任意に置換された5員ヘテロシクロアルキル基を形成する;
R3はH、RC、またはRD;
R4、R5、R6, とR7はそれぞれ個別にH、OH、ORC、ORD、RC、またはRD;
R8はOH、NH2、ORC、ORD、NHRC、またはNRC RD;
R9はH、OH、ORC、またはORD;
Qは-S-、-S(O)-、または-SO2 -;
RCは-L-Z;
RDは、任意選択的に置換されたC 1 -C 6アルキ、任意選択的に置換されたC 1 -C 6ヘテロアルキ、任意選択的に置換されたC 2 -C 6アルケニル、任意選択的に置換されたC 2 -C 6ヘテロアルケニール、任意選択的に置換されたC 2 -C 6アルキニル、任意選択的に置換されたC 2 -C 6ヘテロアルキニール、任意選択的に置換されたシクロアルキ、任意選択的に置換されたヘテロシクロアルキ、任意選択的に置換されたアリール、または任意選択的に置換されたヘテロアルイルである;
Lは任意選択的に置換されたC 1 -C 6アーキテク、任意選択的に置換されたC 1 -C 6ヘテロアルケニール、任意選択的に置換されたC 2 -C 6アルケニルのC 2 -C 6へテロアルケニール、任意選択的に置換されたC 2 -C 6アルキニル、任意選択的に置換されたC 2 -C 6へテロアルキニール、任意選択的に置換されたヘテロシクロアルキル、任意選択的に置換されたアリール、任意選択的に置換されたヘテロアリール;またはジペプチド;(CH 2)O)n(CH 2)-を含む。ここで、mおよびnはそれぞれ個別に1、2、3、4、5、6、7、8、9および10から選択される;またはそれらの組合せを含む
Zは、L上に存在する反応性置換基と、抗-CD137抗体またはその抗原結合フラグメント内に存在する反応性置換基との間のカップリング反応から形成される化学的な部分構造である。
【００１４】
ある特定の実施形態において、リンカーアマトキシン共役Am-L-Zは、式(III)で表される
【化２】
2021530546.tif 000003
(III)
ここで、R1は、H、OH、ORA、またはORCである;
R2はH、OH、ORB、またはORC;
RA およびRBは、存在する場合、それらが結合する酸素原子と一緒になって、結合して、任意に置換された5員ヘテロシクロアルキル基を形成する;
R3はH、RC、またはRD;
R4、R5、R6, とR7はそれぞれ個別にH、OH、ORC、ORD、RC、またはRD;
R8はOH、NH2、ORC、ORD、NHRC、またはNRC RD;
R9はH、OH、ORC、またはORD;
Qは-S-、-S(O)-、または-SO2 -;
RCは-L-Z;
RDは、任意選択的に置換されたC 1 -C 6アルキ、任意選択的に置換されたC 1 -C 6ヘテロアルキ、任意選択的に置換されたC 2 -C 6アルケニル、任意選択的に置換されたC 2 -C 6ヘテロアルケニール、任意選択的に置換されたC 2 -C 6アルキニル、任意選択的に置換されたC 2 -C 6ヘテロアルキニール、任意選択的に置換されたシクロアルキ、任意選択的に置換されたヘテロシクロアルキ、任意選択的に置換されたアリール、または任意選択的に置換されたヘテロアルイルである;
Lはリンカーである
Zは、L上に存在する反応性置換基と、抗-CD137抗体またはその抗原結合フラグメント内に存在する反応性置換基との間のカップリング反応から形成される化学的な部分構造である。
【００１５】
式(III)のある実施形態、Lはリンカーを含むペプチドである。
【００１６】
いくつかの実施形態に、本リンカーはジペプチド、p-アミノベンジル(PAB)基、置換されていてもよいC 1 -C 6 アルキル、置換されていてもよいC 1 -C 6ヘテロアルキル、置換されていてもよいC 2 -C 6アルケニル、置換されていてもよいC 2 -C 6 ヘテロアルケニル、置換されていてもよいC 2 -C 6 アルキニル、置換されていてもよいC 2 -C 6 ヘテロアルキニル、置換されていてもよいC 3 -C 6 シクロアルキル、置換されていてもよいヘテロシクロアルキル、置換されていてもよいアリール、可溶性増強基、-(C=O)-、-(CH 2 CH 2O)p-基のうちの1つ以上を含み、ここでpは1-6からの整数、(CH 2)m O) n(CH 2)m-であり、ここでnおよびmはそれぞれ独立して、1、2、3、4、5、6、7、8、9および10から選択される。
【００１７】
いくつかの実施形態に、リンカーは(CH 2)m(n)m - groupおよびヘテロアリール基を含み、ヘテロアリール基はトリアゾールである。いくつかの実施形態では、(CH 2)m(m O) n - groupとトリアゾール は一緒に構成される
【化３】
2021530546.tif 000004
, 
ここで、nは1~10であり、波線は、追加のリンカー成分、化学的な部分構造Z、またはアマトキシンへの付着点を示す。
【００１８】
いくつかの実施形態に、Amは正確に1個のR C置換基を含む。
【００１９】
他の実施形態では、抗有糸分裂薬がメイタンシン、カリケアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、インドリノベンゾジアゼピン、またはアウリスタチンである。別の実施形態では、アウリスタチンがモノメチル・アウリスタチンF(MMAF)またはモノメチル・アウリスタチンE(MMAE)である。
【００２０】
ある特定の実施形態に、ADCのリンカーは、N-ベータマレイミドプロピオニル-Val-Ala-パラアミノベンジル(BMP-Val-Ala-PAB)である。ある実施形態に、ADCのリンカーは、N-ベータマレイミドプロピオニル-Val-Ala-パラアミノベンジル(BMP-Val-Ala-PAB)である。いくつかの実施形態に、リンカーL及び化学的な部分構造Zは、L-Zとして一緒になって、
【化４】
2021530546.tif 000005
ここで、Sは(例えば、システイン残基の-SH基からの)CD5に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメント内に存在する反応性置換基を表す硫黄原子である。
【００２１】
いくつかの実施形態に、L-Zはである
【化５】
2021530546.tif 000006
.
【００２２】
ある実施形態に、ADCは、以下の構造のいずれかによって表される:
【化６】
2021530546.tif 000007
.
【００２３】
ある実施形態に、ADCは、以下の構造のうちの1つによって表される:
【化７】
2021530546.tif 000008
又は
【化８】
2021530546.tif 000009
.
【００２４】
他の実施形態では、ADCが3日以下の血清半減期を有する。他の実施形態では、細胞外ドメインがscFv抗体または単鎖T細胞レセプター(scTCR)を含む。さらに別の実施形態では、細胞外ドメインは非免疫グロブリン・スキャフォールド・タンパク質(scaffold protein)を含む。他の実施形態では、CARの細胞外ドメインがCD19、CD22、CD30、CD7、BCMA、CD137、CD22、CD20、AFP、GPC3、MUC1、メソテリン、CD38、PD1、EGFR(例えば、EGFRvIII)、MG7、BCMA、TACI、CEA、PSCA、CEA、HER2、MUC1、CD33、ROR2、NKR-2、PSCA、CD28、TAA、NKG2D、またはCD123からなる群より選択される腫瘍抗原に結合する。他の実施形態では、CD28細胞内シグナリング・ドメイン、CD3ゼータ細胞内シグナリング・ドメイン、OX40細胞内シグナリング・ドメイン、および/またはCD137を本CARの細胞内シグナリング・ドメインは含む。さらに別の実施形態では、本CARの細胞内シグナリング・ドメインがCD3ゼータ細胞内シグナリング・ドメインを含む。或る実施態様では、癌は白血病、成人進行性癌、膵臓癌、切除不能な膵臓癌、結腸直腸癌、転移性結腸直腸癌、トリプルネガティブ乳癌、結腸肝臓癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、B細胞リンパ腫、再発又は難治性B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、再発又は難治性びまん性大細胞リンパ腫、原発性縦隔B細胞リンパ腫、再発性縦隔大細胞型B細胞リンパ腫、大細胞型B細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、再発又は難治性非ホジキンリンパ腫、難治性アグレッシブ非ホジキンリンパ腫、B細胞非ホジキンリンパ腫、難治性非ホジキンリンパ腫、結腸直腸癌である。胃癌、膵癌、腎細胞癌、肺扁平上皮癌、肝細胞癌、尿路上皮癌、白血病、B細胞性白血病 急性リンパ性白血病、B細胞性急性リンパ性白血病、成人急性リンパ芽球性白血病、B細胞性前リンパ性白血病、小児急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ性白血病、前リンパ球性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、再発性形質細胞性骨髄腫、難治性形質細胞性骨髄腫、多発性骨髄腫、骨の多発性骨髄腫、脳の悪性神経膠腫、骨髄異形成症候群、EGFR陽性結腸直腸癌、多形性膠芽腫、新生物、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、肝転移、固形腫瘍、進行性固形腫瘍、中皮陽性腫瘍、血液悪性腫瘍又はその他の進行性悪性腫瘍。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図1Aおよび1Bはネガティブ・コントロール(すなわち、「hIgG-アマニチン」)と比較して、抗-CD137-アマニチンADC(すなわち、「CD137-アマニチン」)および抗T細胞特異的アマニチンADC(すなわち、「抗Tcell-アマニチン」)を含むインビトロT細胞殺傷アッセイの結果をグラフで示す。この結果は、ADCの生存活性化細胞(図1A)または生存非活性化細胞(図1B)の番号(y軸)をADC濃度(x軸)に応じて示している。
【図２】図2は、制御PBS、抗-CD137抗体(裸)、およびNSGマウスxeno-GvHDモデルにおけるアイソタイプアマニチンと比較した、抗-CD137-アマニチンADCについて、移植後の日数(x軸)に応じたマウスの生存率(y軸)を比較するインビボアッセイの結果をグラフで示す。
【図３】図3は、制御PBS、抗-CD137抗体(裸)、およびNSGマウスxeno-GvHDモデルにおけるアイソタイプ-アマニチンと比較した、抗-CD137-アマニチンADCについての移植後の日数(x軸)に応じて、末梢血中で検出されたヒトT細胞の数(y軸)を比較するインビボアッセイの結果をグラフで示す。
【図４】Figs. 4A and 4B graphically depict the results of in vivo assays for determining engraftment rates ( Fig. 4A) and T cell frequency ( Fig. 4B) in a humanized NSG-SGM3 mouse model where engraftment and T cell frequency were measured at day 5, day 9, day 14, day 22  and at day 27 posttransplant for an anti-CD137-amanitin ADC in comparison to controls PBS, an anti-CD137-BBK antibody ( naked), an isotype-amanitin, and an anti-Tcell-Amanitin ADC in a NSG mouse xeno-GvHD model.
【発明を実施するための形態】
【００２６】
ヒト対象における移植された同種異系細胞の拒絶、すなわち宿主対移植片(HvG)疾患の治療または予防を治療または予防する方法が本明細書に開示される。本明細書中に開示される方法は抗-CD137抗体薬物コンジュゲート(ADC)(内因性CD137+免疫細胞(例えば、活性化T細胞)に結合する)および同種細胞療法の両方の投与を含む。同種細胞移植を受けたヒトに抗-CD137 ADCを投与することにより、内因性CD137+ T細胞を枯渇させ、同種細胞療法に対する内因性細胞による反応の危険性を減少させる。本明細書に開示される方法は、抗-CD137 ADCおよびCARを発現する同種細胞の併用がレシピエント(recipient)患者における同種細胞の受理を提供し、CAR発現細胞を無効にし得る宿主対移植片(HvG)反応の危険性を減少させるので、同種キメラ抗原レセプター(chimeric antigen receptor)(CAR)療法と併用して使用され得る。
【００２７】
（I. 定義）
本明細書中で使用される場合、用語「約」は、記載される値より5%高いかまたは低い値をいう。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、「同種異系」という語は移植の文脈において使用される場合、ドナー(donor)からレシピエント(recipient)に移植される細胞(または組織もしくは臓器)を定義するために使用され、ここで、ドナー(donor)およびレシピエント(recipient)は同じ種の異なった個体である。
【００２９】
本明細書で使用される「自己」という語は、ドナー(donor)およびレシピエント(recipient)が同じ対象である細胞またはグラフトを指す。
【００３０】
本明細書で使用される「異種」という語は、ドナー(donor)およびレシピエント(recipient)種が異なっている細胞を指す。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、「免疫細胞」という語は造血起源であり、そして免疫反応において役割を果たす細胞を含むことが意図されるが、これに限定されない。免疫細胞にはT細胞およびナチュラルキラー(NK)細胞が含まれるが、これらに限定されない。ナチュラル・キラー細胞は、当技術分野で周知である。ある実施形態に、ナチュラル・キラー細胞は、NK-92細胞などの細胞系を含む。NK細胞系のさらなる例としては、NKG、YT、NK-YS、HANK-1、YTS細胞、およびNKL細胞が挙げられる。An 免疫細胞には同種または自己がある。
【００３２】
「操作された細胞」は、遺伝子、DNAもしくはRNA配列、またはタンパク質もしくはポリぺポリペプチドの付加もしくは改変によって改変され、形質転換され、または操作される任意の生物の任意の細胞を手段する。本開示の単離された細胞、宿主細胞、および遺伝子操作された細胞には、CARをコードするDNAまたはRNA配列を含み、細胞表層にCARを発現するNK細胞およびT細胞などの単離された免疫細胞が含まれる。単離された宿主細胞および操作された細胞は例えば、NK細胞活性またはTリンパ球活性の増強、ガンの処理、および自己免疫疾患の処理のために使用され得る。一実施形態では、操作された細胞が免疫細胞、例えば、T-細胞またはナチュラルキラー(NK細胞)を含む。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、「抗体」という語は、特定の抗原に特異的に結合するか、または特定の抗原と免疫学的に反応性である免疫グロブリン分子をいう。抗体はそれらが所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、マルチスペシフィック抗体(multispecific antibody)(例えば、バイスペシフィック抗体(bispecific antibody))、および抗体フラグメントを含むが、これらに限定されない。
【００３４】
一般に、抗体は、抗原結合領域を含む重鎖および軽鎖を含む。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域(本明細書ではHCVRまたはVHと略される)および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、3つのドメイン、CH1、CH2およびCH3からなる。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書ではLCVRまたはVLと略す)および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、1つのドメインCLから構成される。VHおよびVL領域は、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分され得、より保存された領域(フレームワーク領域(FR)と呼ばれる)が点在する。各VHおよびVLは、3つのCDRおよび4つのFRから構成され、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順序でアミノ末端からカルボキシル末端に配列される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。本抗体の定常領域は免疫システム(例えば、エフェクター細胞)および古典的補体システムの第1の構成要素(CIq)の種々の細胞を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、用語「抗原結合フラグメント」は標的抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の1つ以上の部分をいう。抗体の抗原結合機能が全長抗体のフラグメントによって実施され得る。抗体フラグメントが例えば、Fab、F(ab')2、scFv、ダイアボディ、トリアボディ、アフィボディ、ナノボディ、アプタマー、またはドメイン抗体であり得る。抗体の用語「抗原結合フラグメント」に包含される結合フラグメントの例としては(i)Fabフラグメント、VL、VH、CL、およびCH1ドメインからなる一価フラグメント;(ii)F(ab')2フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された2つのFabフラグメントを含む二価フラグメント;(iii)VHおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント;(iv)単一のVLおよびVHドメインからなるFvフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。(v)抗体のアーム;(v)VHドメインおよびVLドメインを含むdAbフラグメント;(v)VHドメインからなるdAbフラグメント(例えば、Wardら、Nature 341:544-546、1989を参照のこと);(vii)VHドメインまたはVLドメインからなるdAb;(viii)単離された相補性決定領域(CDR);および(ix)合成リンカーによって任意に連結され得る2つ以上(例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つ)の単離されたCDRの組み合わせ。さらに、Fvフラグメントの2つのドメイン、VLおよびVHは別々の遺伝子によってコードされるが、それらは組換え方法を使用して、VLおよびVH領域が一対になって一価分子(単鎖Fv(scFv)として公知である;例えば、鳥ら、Science 242:423-426、1988およびHustonら、Procを参照のこと)を形成する単一のタンパク質鎖として作製されることを可能にするリンカーによって、連結され得る。Natl. Acad. Sci. 米国85:5879-5883, 1988). これらの抗体フラグメントは当業者に公知の従来の技術を使用して得ることができ、フラグメントは、無傷の抗体と同じ様式で有用性についてスクリーニングすることができる。抗原結合フラグメントは組換えDNA技術、完全な免疫グロブリンの酵素的または化学的切断によって、またはある場合には当該分野で公知の化学的ペプチド合成手順によって産生され得る。
【００３６】
本明細書で使用される「完全である」または「全長」抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続された2つの重(H)鎖ポリペプチドおよび2つの光(L)鎖ポリペプチドを有する抗体を指す。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、「抗-CD137抗体」または「CD137に結合する抗体」または「抗-CD137 ADC」または「CD137に結合するADC」という語は、CD137がT細胞などの細胞の細胞表面上に見出されるときにヒトCD137に特異的に結合する抗体またはADCを指す。人間CD137細胞外ドメインのアミノ酸配列を以下の配列番号(SEQ ID NO):1に記載する。
NVLLVANCCPNSQGNSCPNSCPNSQGNSCPNSQNDFCTFCCPGNSQGNSCPNSQGNSCPNSQGNSCFCTRQCKGCKGQKGCKGCKGTKGNDGRKGNDNGTNCKGNDGNVSLDVGSVGSSPPADLGSPAREPAREPAFFISLALFFLSTALLFLFLTRFSVKRGRKKLYIFKKQPFQPFPQPFPQTQEEDGCSCREEGCEL(OB1)KKKLLYIFKQKKPQPFQPFPQTQTQEETQEEDGCSCREEGCEL(OB1)KGCRKKKKLLYIFKKQPFQPFPQTQTQEETQEEDGCSCREEGCEL(OB1) 
【００３８】
「特異的に結合する」という用語は本明細書で使用される場合、抗体(またはADC)が一般にタンパク質ではなく特異的なタンパク質構造(エピトープ)を認識し、結合する能力を指す。抗体がエピトープ「A」に特異的である場合、標識された「A」および抗体を含む反応物中のエピトープA(または遊離の非標識A)を含む分子の存在は抗体に結合する標識Aの量を減少させる。例えば、抗体は標識された場合、対応する非標識抗体によってその標的から競合して離れることができる場合、標的に「特異的に結合する」。ある実施形態に、抗体は、抗体が少なくとも約10-4 M、10-5 M、10-6 M、10-7 M、10-8 M、10-9 M、10-10 M、10-11 M、10K D M以下(10-12未満、例えば10-13以下の数値を意味する)の標的に対する-12を有する場合、標的、例えばCD137に特異的に結合する。ある実施形態に、本明細書で使用される「CD137への特異的結合」または「CD137に特異的に結合する」という語は抗体またはCD137に結合し、表面プラズモン共鳴によって決定されるように、1.0×10-7 M以下の酸解離定数(K D)を有するものを指す。ある実施形態では、K Dは標準バイオ層干渉法(BLI)に従って決定される。しかし、抗体は、配列が関連する2つ以上の抗原に特異的に結合することができることを理解されたい。例えば、ある実施形態において、抗体はCD137のヒトおよび非ヒト(例えば、マウスまたは非ヒト霊長類)オルソログの両方に特異的に結合し得る。
【００３９】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という語は、ハイブリドーマ技術によって産生される抗体に限定されない。モノクローナル抗体は任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを含む単一のクローンから、当技術分野で入手可能な、または公知の任意の手段によって誘導される。本発明で有効なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレイ技術、またはそれらの組合せの使用を含む、当技術分野で公知の多種多様な技術を使用して調製することができる。
【００４０】
本明細書で使用される「キメラ」抗体という語は、ラットまたはマウス抗体などの非ヒト免疫グロブリンに由来する可変配列を有する抗体、および典型的にはヒト免疫グロブリンテンプレートから選択されるヒト免疫グロブリン定常領域を指す。キメラ抗体を産生するための方法は、当該分野で公知である。例えば、Morrison,1985、Science 229(4719):1202-7; Oiら、1986、BioTechniques 4:214-221; Gilliesら、1985、JImmunolを参照のこと。方法125:191-202;米国特許。番号。5,807,715; 4,816,567; 4,816,567、4,816,397。
【００４１】
本明細書で使用される「半減期」という語は、体内の抗体薬物の血漿中濃度が半分または50%低下するのにかかる時間を指す。この血清濃度の50%の低下は、循環する薬物の量を反映する。
【００４２】
本明細書中で使用される、「宿主対移植片病」または「HvG」という言葉は、同種細胞、組織、または臓器がレシピエント(recipient)の免疫システムによって拒絶される移植拒絶を意味する
【００４３】
非ヒト(例えば、マウス)抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ免疫グロブリンである。概して、ヒト化抗体は少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ここで、CDR領域のすべてまたは実質的にすべては非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、FR領域のすべてまたは実質的にすべてはヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリン共通配列の少なくとも一部を含むことができる。抗体ヒト化の方法は、当該分野で公知である。例えば、Riechmannら、1988、Nature 332:323-7;米国特許を参照のこと。番号。5,530,101; 5,585,089; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762;および6,180,370(Queenら);EP239400; PCT公開WO 91/09967;米国特許。No。5,225,539; EP592106; EP519596; Padlan、1991、Mol. Immunol、28:489-498; Studnicka et al、1994、Prot. Eng. 7:805-814; Roguska et al、1994、Proc. Natl. Acad. Sci. 91:969-973; 米国特許。有しない. 5,565,332。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、用語「キメラ抗原レセプター(chimeric antigen receptor)」または「CAR」は、抗原、膜貫通ドメイン、および少なくとも1つの細胞内シグナリング・ドメインに特異的に結合し得る少なくとも1つの細胞外ドメインを含む組換えポリぺプチドをいう。一般に、CARは、免疫エフェクター細胞の細胞毒性を所定の抗原を提示する細胞に向けるように遺伝子操作されたレセプターである。CARは所望の抗原(例えば、腫瘍抗原)に対する抗体ベースの特異性をT細胞受容体活性化細胞内ドメインと組み合わせて、特異的な細胞性免疫活性を示すキメラタンパク質を生成する分子である。特定の実施形態では、CARが細胞外ドメイン(結合ドメインまたは抗原特異的結合ドメインとも呼ばれる)、膜貫通ドメイン、および細胞内(細胞質)シグナリング・ドメインを含む。本CARの抗原結合ドメインとターゲット細胞の表面上の標的抗原との結合はCARのクラスター化をもたらし、活性化刺激をCAR含有細胞に送達する。CAR主要な特徴は免疫エフェクター細胞特異性を方向転換する能力であり、それにより、主要組織適合性(MHC)非依存的に細胞を発現する標的抗原の細胞死滅を媒介することができる分子の増殖、サイトカイン産生、ファゴサイトーシスまたは産生を誘発し、モノクローナル抗体、可溶性リガンドまたは細胞特異的共レセプターの細胞特異的ターゲティング能力を利用する。いくつかの実施形態に、CARは、腫瘍抗原に特異的に結合する細胞外結合ドメイン;膜貫通ドメイン;および1つ以上の細胞内シグナリング・ドメインを含む。様々な実施形態において、CARは、ヒトCD137に特異的に結合する細胞外結合ドメイン;膜貫通ドメイン;および1つ以上の細胞内シグナリング・ドメインを含む。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、用語「CAR治療」はCARを発現するように操作された免疫細胞の、所与の疾患(例えば、癌または自己免疫疾患)の治療のためのヒト対象への投与をいい、CAR治療は操作された免疫細胞での患者の比治療をいい、そしてCAR細胞治療(例えば、リンパ節転移化学治療)と併せて一般的に使用される治療を含むことを意図されず、特に、用語「細胞」が全体を通して使用される場合、細胞の集団もまた、特に明記されない限り、この用語に含まれる。例えば、CAR治療は人工細胞の集団の投与を必要とするので。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、用語「組み合わせ」または「組み合わせ治療」は、単一のヒト患者における2つ(またはそれ以上)の治療の使用をいう。これらの用語は、組み合わせ組成物を指すことを意図していない。例えば、本明細書に記載されるのは、抗-CD137 ADCを投与することおよび同種異系CAR治療を含む併用治療である。
【００４７】
「プライミング応答」とは本明細書中で使用される場合、被験体の免疫システムが最初に抗原と提示される場合にヒト対象において誘発される免疫反応をいう。TまたはB細胞と特異的抗原との最初の接触はプライミングと呼ばれ、活性化された同種抗原T細胞を引き起こす。プライミング用量は応答を誘発するために必要な単回用量または複数回用量であり得る。「プライミング量」がプライミング応答を誘発するために使用される抗原(例えば、同種細胞)の量である。プライミング量は一般に、治療的に有効な量ではなく、むしろ、対象のT細胞を活性化するために使用される量である。いくつかの実施形態に、同種異系細胞のプライミング量は、同種異系細胞の治療有効量未満である。ある実施形態に、プライミング応答はCD137+ T細胞が活性化されるように、ヒト対象への同種異系細胞の投与時に誘発される。
【００４８】
用語「枯渇」は、CD137発現細胞に対する抗-CD137抗体またはADCの作用との関連において、CD137発現細胞の数の減少または除去を意味する。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、用語「有効量」または「治療有効量」は所望の結果を達成するために、または自己免疫疾患もしくは癌に対する効果を有するために十分な量をいう。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、用語「対象」および「患者」は、本明細書中に記載されるような特定の疾患または状態のための処置を受ける、ヒトのような生物をいう。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、「処理する」または「処理」は疾患の任意の結果の任意の向上(例えば、延長された生存、より少ない罹患率、および/または代替の治療様式の副産物である副作用の減少)をいい;当該分野で容易に認識されるように、疾患の完全な根絶は好ましいが、処理行為の必要条件ではない。有益なまたは所望の結果としては免疫細胞を発現する同種CARの受理を促進することが挙げられるが、これらに限定されない。障害を防止することを方法とする限り、「防止する」という語は、病態が完全に阻止されることを必要としないことが理解される。むしろ、本明細書中で使用される場合、用語「予防する」は本発明の化合物の投与が疾患の発症前に起こり得るように、障害に感受性である集団を同定する当業者の能力をいう。この用語は、病態が完全に回避されていることを意味するものではない。
【００５２】
本明細書で使用される「ベクター」という語は、プラスミド、DNAベクター、プラスミド、RNAベクター、ウイルス、または他の好適なレプリコンなどの核酸ベクターを含む。本明細書中に記載される発現ベクターはポリヌクレオチド配列、ならびに、例えば、タンパク質の発現および/または哺乳動物細胞のゲノムへのこれらのポリヌクレオチド配列の集積のために使用されるさらなる配列エレメントを含み得る。CARの発現に用いることができるある種のベクター、または遺伝子転写を指令するプロモーター領域およびエンハンサー領域のような調節配列を含むプラスミドを含む。抗体またはCAR発現のための他の有益なベクターは、これらの遺伝子の翻訳速度を高めるか、または遺伝子転写に起因するmRNAの安定性または核外輸送を改善するポリヌクレオチド配列を含む。これらの配列要素は例えば、発現ベクター上に担持される遺伝子の効率的な転写を指示するために、5'および3'非翻訳領域、ならびにポリアデニル化シグナル部位を含み得る。本明細書中に記載される発現ベクターはまた、そのようなベクターを含有する細胞の選択のためのマーカーを符号化するポリヌクレオチドを含有し得る。適切なマーカーの例には、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、およびノウルセオスリシンなどの抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子が含まれる。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体薬物コンジュゲート」または「ADC」は細胞毒に連結される抗体をいう。ADCが1つの分子(例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント)の反応性官能基と、本明細書中に記載される別の分子(例えば、細胞毒)の適切に反応性の官能基との化学結合によって形成される。結合体は互いに結合した2つの分子間(例えば、抗体と細胞毒との間)のリンカーを含み得る。特に、用語「結合体」(化合物をいう場合)はまた、本明細書中で、「薬物結合体」、「抗体薬物コンジュゲート」または「ADC」と互換的に称される。コンジュゲートの形成に用いることができるリンカーの例には、ペプチド含有リンカー、例えば、D-アミノ酸のような天然に存在する又は天然に存在しないアミノ酸を含有するものが含まれる。リンカーは、本明細書中に記載され、そして当該分野で公知の種々の方策を使用して調製され得る。その中の反応性成分に依存して、リンカーは例えば、酵素的加水分解、光分解、酸性条件下での加水分解、基本条件加水分解、酸化、ジスルフィド還元、求核切断、または有機金属切断によって切断され得る(例えば、Lericheら、Bioorg.Med.Chem.,20:571-582,2012を参照のこと)。
【００５４】
本明細書で使用される「カップリング反応」という語は互いに反応するのに適した2つ以上の置換基が反応して、それぞれの置換基に結合した分子フラグメントを結合する(例えば、共有結合する)化学的な部分構造を形成する化学反応を指す。カップリング反応は細胞毒素であるフラグメントに結合した反応性置換基(例えば、当該分野で公知であるかまたは本明細書中に記載される細胞毒素)が抗体であるフラグメント、またはその抗原結合フラグメント(例えば、抗体、その抗原結合フラグメント)に結合した適切な反応性置換基、または当該分野で公知であるかまたは本明細書中に記載されるCD137に結合する特異的抗-CD137抗体と反応する反応性置換基を含む。適切な反応性置換基の例としては、求核/求電子対(例えば、特に、チオール/ハロアルキル対、アミン/カルボニル対、またはチオール/α, β-不飽和カルボニル対)、ジエン/ジエノフィル対(例えば、とりわけ、アジド/アルキン対)などが挙げられる。連結反応としてはチオールアルキル化、ヒドロキシルアルキル化、アミンアルキル化、アミン縮合、アミド化、エステル化、ジスルフィド形成、環化付加(例えば、とりわけ、[4+2]Diels-Alder環化付加、[3+2]Huisgen環化付加)、芳香族求核置換、アミン縮合、芳香族求電子置換、および当技術分野で公知であるか、または本明細書に記載される他の反応様式が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で使用される場合、「微小管結合剤」という語は、細胞における有糸分裂および間期細胞機能に必須である微小管網状組織を破壊することによって作用する化合物をいう。微小管結合剤の例にはメイタシン、メイタンシノイド、およびそれらの誘導体、例えば本明細書に記載されるか、または当技術分野で公知のもの、ビンカ・アルカロイド、例えばビンブラスチン、ビンブラスチン硫酸塩、ビンクリスチン、ビンクリスチン硫酸塩、ビンデシン、およびビノレルビン、タキサン、例えばドセタキセルおよびパクリタキセル、マクロライド、例えばディスコデルモリド、コキシン、およびエポチロン、ならびにそれらの誘導体、例えばエポチロンBまたはそれらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】
本明細書中で使用される場合、「アマトキシン」という語は、Amanita phalloides mushroomsによって産生されるペプチドのアマトキシンファミリーの部材、またはRNAポリメラーゼII活性を阻害することができるその変形例もしくは誘導体などのその誘導体を指す。アマトキシンは種々のキノコ種(例えば、Amanita phalloides、Galerina marginata、Lepiota brunneo-incarnata)から単離することができ、または半合成的または合成的に調製することができる。このファミリーの一員であるα-amanitinは、Wieland、Intに記載されている。J. Pept. タンパク質Res.1983,22(3):257-276. アマトキシンの誘導体は天然に存在する化合物の化学修飾(「半合成」)によって得ることができ、または完全に合成の供給源から得ることができる。種々のアマトキシン誘導体への合成経路は例えば、米国特許第9,676,702号およびPerrinら、JAmに開示されている。化学協会。2018, 140, 140頁、6513~6517頁(これらの各々は、アマトキシンを調製および誘導体化するための合成方法に関して、その全体が本明細書中に参考として援用される)。
【００５６】
本明細書に記載の組成物および方法と併せて有効なアマトキシンには式(II)の化合物、例えばα-アマニチン、βアマニチン、γアマニチン、εアマニチン、アマニン、アマニンアミド, アマヌリン,アマヌリン酸、またはプロアマヌリンなどの化合物が含まれるが、これらに限定されない。本明細書中に記載されるように、アマトキシンは例えば、リンカー部分(L)によって、抗体またはその抗原結合フラグメントに結合体化され得る(したがって、ADCを形成する)。このようなプロセスに有効なアマトキシン結合体およびリンカーの例示的な方法を以下に記載する。例示的なアマトキシンリンカー複合体の構造は、式(III)、(IIIA)、および(IIIB)によって表される。組成物および方法に従って、抗体または抗原結合フラグメントへの共役に有用な例示的なリンカー含有アマトキシンもまた、本明細書に記載される。
【００５７】
本明細書で使用される「アシル」という語は-C(=O)Rを指し、ここで、Rは本明細書で定義されるように、H(「アルデヒド」)、C 1 -C 12アルキル、C 2 -C 12アルケニル、C 2 -C 12アルキニル、C 3 -C 7カルボシクリル、C 6 -C 20アリール、5-10メンバーヘテロアリール、または5-10メンバーヘテロシクリルである。非限定的な例としては、ホルミル基、アセチル、プロパノイル、ベンゾイル、およびアクリロイルが挙げられる。
【００５８】
本明細書で使用される「C 1 -C 12アルキル」という語は、1~12個の炭素原子を有する直鎖または分岐の飽和炭化水素を指す。代理人C1 -C12アルキル基としてはメチル、-エチル、-n-プロピル、-n-ブチル、-n-ペンチル、および-n-ヘキシルが挙げられるが、これらに限定されないが、分岐C1 -C12アルキルとしてはイソプロピル、-sec-ブチル、-イソブチル、-tert-ブチル、-イソペンチル、および2-メチルブチルが挙げられる。C1 -C12のアルキル基は、置換されないか、または置換されることができる。
【００５９】
本明細書で使用される「アルケニル」という語は、不飽和の少なくとも1つの部位、すなわち炭素-炭素、sp 2二重結合を有する、通常、第2級、または第3級炭素原子を含むC 2 -C 12炭化水素を指す。例としてはエチレンまたはビニル、-アリル、-1-ブテニル、-2-ブテニル、-イソブチレニル、-1-ペンテニル、-2-ペンテニル、-3-メチル-1-ブテニル、-2-メチル-2-ブテニル、-2,3-ジメチル-2-ブテニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。アルケニル基は、置換されていなくても置換されていてもよい。
【００６０】
本明細書で使用される「アルキニル」は、不飽和の少なくとも1つの部位、すなわち炭素-炭素、sp三重結合を有する、正常、二次、または三次炭素原子を含むC 2 -C 12炭化水素を指す。例としてはアセチレンおよびプロパルギルが挙げられるが、これらに限定されない。アルキニル基は、置換されていなくても置換されていてもよい。
【００６１】
「アリール」は、本明細書中で使用される場合、C 6 -C 20炭素環芳香族基を指す。アリール基の例としてはフェニル、ナフチルおよびアントラセニルが挙げられるが、これらに限定されない。アリール基は、置換されていなくても置換されていてもよい。
【００６２】
本明細書で使用される「アリールアルキル」は、炭素原子に結合した水素原子の1つ、典型的には端末装置またはsp 3 炭素原子がアリール基で置換されている非環状アルキル基を指す。代表的なアリールアルキル基としてはベンジル、2-フェニルエタン-1-イル、2-フェニルエテン-1-イル、ナフチルメチル、2-ナフチルエタン-1-イル、2-ナフチルエテン-1-イル、ナフトベンジル、2-ナフトフェニルエタン-1-イルなどが挙げられるが、これらに限定はされない。アリールアルキル基は6~20個の炭素原子を含み、例えば、アリールアルキル基のアルカニル、アルケニルまたはアルキニル基を含むアルキル部分は1~6個の炭素原子であり、アリール部分は、5~14個の炭素原子である。アルカリル基は、置換されていなくても置換されていてもよい。
【００６３】
本明細書で使用される「シクロアルキル」は飽和炭素環式基を指し、これは単環式または二環式であってもよい。シクロアルキル基は、単環として3~7個の炭素原子を有する環、または自転車として7~12個の炭素原子を有する環を含む。単環式シクロアルキル基の例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルが含まれる。シクロアルキル基は、置換されていなくても置換されていてもよい。
【００６４】
本明細書で使用される「シクロアルケニル」は不飽和炭素環式基を指し、これは単環式でも二環式でもよい。シクロアルケニル基は、単環として3~6個の炭素原子を有する環、または自転車として7~12個の炭素原子を有する環を含む。単環式シクロアルケニル基の例には、1-シクロペント-1-エニル、1-シクロペント-2-エニル、1-シクロペント-3-エニル、1-シクロヘキサ-1-エニル、1-シクロヘキサ-2-エニル、および1-シクロヘキサ-3-エニルが含まれる。シクロアルケニル基は、置換されていなくても置換されていてもよい。
【００６５】
「ヘテロアラルキル」は、本明細書中で使用される場合、炭素原子、典型的には末端またはsp3炭素原子に結合した水素原子の1つがヘテロアリールラジカルで置き換えられた非環式アルキルラジカルを指す。典型的なヘテロアリールアルキル基は限定されるものではないが、2-ベンズイミダゾリルメチル、2-フリルエチル等を含む。ヘテロアリールアルキル基は6~20個の炭素原子、例えばヘテロアリールアルキル基のアルキル部分(アルカニル、アルケニルまたはアルキニル基を含む)を含み、ヘテロアリール部分は1~6個の炭素原子であり、ヘテロアリール部分は5~14個の炭素原子であり、N、O、P、およびSから選択される1~3個のヘテロ原子は、3~7個の環員(2~6個の炭素原子、または7~10個の環員(4~9個の炭素原子およびN、O、P、およびSから選択される1~3個のヘテロ原子)を有する単環であってもよく、例えば:ビシクロ[4,5]、[5,5]、[5,6]、または[6,6]システム。
【００６６】
本明細書で使用される「ヘテロアリール」および「ヘテロシクロアルキル」はそれぞれ、1個以上の環原子がヘテロ原子、例えば、窒素、酸素、およびイオウである芳香族または非芳香族環システムを指す。ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルラジカルは、2~20個の炭素原子およびN、O、P、およびSから選択される1~3個のヘテロ原子を含む。Aヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルは3~7個の環員(2~6個の炭素原子およびN、O、P、およびSから選択される1~3個のヘテロ原子)を有する単環、または7~10個の環員(4~9個の炭素原子およびN、O、P、およびSから選択される1~3個のヘテロ原子)を有する自転車、例えば、二環式[4,5]、[5,5]、[5,6]、または[6,。ヘテロアリールおよびヘテロシクロアルキルは、置換されていなくても置換されていてもよい。
【００６７】
ヘテロアリールおよびヘテロシクロアルキル基は、Paquette、Leo A.;「現代のヘテロ環状化学の原理」(WABenjamin、New York、1968)、特に第1章、3章、4章、6章、7および9;「複素環化合物の化学、A一連のモノグラフ」(John Wiley & Sons、New York、1950年から現在まで)、特に巻13、14、16、19および28;およびJAmに記載されている。化学協会。(1960)82:5566.
【００６８】
ヘテロアリール基の例としては例えば、ピリジル、チアゾリル、ピリミジニル、フラニル、チエニル、ピラゾリル、イミダゾリル、ベンゾフラニル、チアナフタレニル、インドレニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンズイミダゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、インドリル、イソインドリル、3H-インダリル、プリニル、4H-キノリジニル、フタラジニル、キナゾリニル、シンノリニル、プテリジニル、4aH-カルバゾリル、カルバゾリル、フェナントリジニル、アクリジニル、ピリミジニル、フェナンスロリニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フラジニルが挙げられるが、これらに限定されない。フェノキサジニル、イソクロマニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、イサチノイル。
【００６９】
ヘテロシクロアルキルの例としてはジヒドロピリジル、テトラヒドロピリジル(ピペリジル)、テトラヒドロチオフェニル、ピペリジニル、4-ピペリドニル、ピロリジニル、2-ピロリドニル、テトラヒドロフランイル、テトラヒドロピラニル、ビス-テトラヒドロピラニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、デカヒドロキノリニル、オクタヒドロイソキノリニル、ピペラジニル、キヌクリジニル、およびモルホリニルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
限定ではなく例として、炭素結合ヘテロアリールおよびヘテロシクロアルキルは、ピリジンの2、3、4、5、もしくは6位、ピリダジンの3、4、5、もしくは6位、ピリダジンの2、4、5、もしくは6位、ピリダジンの2、3、4、5、もしくは6位、フランの2、3、5、4、もしくは5位、テトラヒドロフラン、チオファレン、チオファレン、ピロールもしくはテトラヒドロピロール、オキサゾール、イミダゾールもしくはチアゾールの2、4、もしくは5位、イソオキサゾール、ピラゾール、もしくはイソチアゾールの3、4、もしくは5位、アジリジンの2、3、もしくは4位、キノリンの2、3、4、5、6、7、もしくは8位、またはイソキノリンの1、3、4、5、6、7、もしくは8位に結合される。更に典型的には、炭素結合ヘテロシクリルは2-ピリジル、3-ピリジル、4-ピリジル、5-ピリジル、6-ピリジル、3-ピリダジニル、4-ピリダジニル、5-ピリダジニル、6-ピリダジニル、2-ピリミジニル、4-ピリミジニル、5-ピリミジニル、6-ピリミジニル、2-ピラジニル、3-ピラジニル、5-ピラジニル、6-ピラジニル、2-チアゾリル、4-チアゾリル、又は5-チアゾリルを包含する。
【００７１】
限定ではなく例示として、窒素結合ヘテロアリールおよびヘテロシクロアルキルは、アジリジン、アゼチジン、ピロール、ピロリジン、2-ピロリン、3-ピロリン、イミダゾール、イミダゾリン、2-イミダゾリン、3-イミダゾリン、ピラゾール、ピラゾリン、2-ピラゾリン、3-ピラゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドール、インドール、1時間インダゾール、イソインドールの2位、モルホリンの4位、およびカルバゾールの9位、またはベータカルボリンの1位に結合している。更に典型的には、窒素結合ヘテロシクリルは1-アジリジル、1-アゼチジル、1-ピロリル、1-イミダゾリル、1-ピラゾリル、及び1-ピペリジニルを包含する。
【００７２】
本明細書で使用され、上記のアルキル、アルケニル, アルキニル,アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアリール、ヘテロシクリルなどのいずれかに適用される「置換された」とは1個以上の水素原子がそれぞれ独立して置換基で置換されていることを手段し、上記の化学的な部分構造、例えば「アルキル」、「アルキレン」、「ヘテロアルキル」、「ヘテロアルキル」、「アルケニル」、「アルケニレン」、「ヘテロアルケニレン」、「ヘテロアルケニレン」、「アルキニル」、「アルキニレン」、「ヘテロアルキニル」、「ヘテロアルキニレン」、「シクロアルキル」、「ヘテロシクロアルキル」、「ヘテロシクロアルキレン」、「アリール」、「アリーレン」、「ヘテロアリール」、および「ヘテロアリーレン」基は任意に置換されていてもよい。典型的な置換は-XOBR)3、-CX3、-CN、-OCN、OObNO、-NO2、-N3,  -NC(=O)HOOZC(=O)H、-C(=O)R、-C(=O)NH2、-C(=O)N(R)2、-SO3 -、-SO3 H、-S(=O)2 R、-OS(=O)2 or、-S(=O)2 NH2、-S(=O)2 N(R)2、-S(=O)R、-OP(=O)(OH)2、-P(=O)(or)OOIXOOOJ C6 -C20O)SR、-C(=S)SR、-C(=O)NH2,  -C(=OODS)OER)2、-C(=NH)NH2, および2、-OP(=O)(orを含むが、これらに限定されるものではない。ここで、それぞれのXはF、Cl、Br、およびIからのそれぞれのオカレンスに対して独立して選択され、それぞれのRはC1 -C12のアルキ、2、-PO3、-PO3 H2、-C(=O)のアリール、-C(=S)R、-CO2のヘテロシクロアルクまたはヘテロアルヤルからのオカレンス、保護群およびプロダクトモティからのそれぞれのオカレンスに対して独立して選択される。基が「任意に置換されている」と記載されている場合はいつでも、その基は、各場合に独立して、上記の置換基の1つ以上で置換され得る。
【００７３】
ある種のラジカル命名規則は、文脈に応じて、モノラジカルまたはジラジカルのいずれかを含むことができることを理解されたい。例えば、置換基が分子の残りの部分への2つの結合点を必要とする場合、置換基はジラジカルであることが理解される。例えば、2つの結合点を必要とするアルキルとして同定される置換基は、-CH2 -、-CH2 CH2 -、-CH2 CH(CH3)CH2 -, などのジラジカルを含む。他のラジカル命名規則は、ラジカルが「アルキレン」、「アルケニレン」、「アリーレン」、「ヘテロシクロアルキレン」などのようなジラジカルであることを明確に示す。
【００７４】
置換基がジラジカルとして描かれている(すなわち、分子の残りの部分への2つの結合点を有する)場合はいつでも、別段の指示がない限り、置換基は任意の方向性配置で結合することができることを理解されたい。
【００７５】
同一の分子式を有するが、原子の結合の配列や原子の空間配置が異なる「異性体」手段化合物を「立体異性体」と呼び、互いに鏡像関係にない立体異性体を「ジアステレオ異性体」と呼び、互いに鏡像関係にない立体異性体を「鏡像異性体」と呼び、時には「光学異性体」と呼ぶ。
【００７６】
4つの非同一置換基に結合した炭素原子は「キラル中心」と呼ばれ、少なくとも1つのキラル中心を有する化合物を手段する。1つ以上のキラル中心を有する化合物は、個々のジアステレオマーとして、または「ジアステレオマー混合物」と呼ばれるジアステレオマーの混合物として存在することができる 1つのキラル中心が存在する場合、立体異性体は、そのキラル中心の絶対配置(RまたはS)によって特徴付けることができる。絶対配置とは、キラル中心に結合した置換基の空間的配置をいう。考慮中のキラル中心に結合した置換基は、Cahn、IngoldおよびPrelogの配列規則に従ってランク付けされる。(Cahnら、AngewChemInterEdit.1966,5,385; errata 511; Cahnら、AngewChem.1966,78,413; CahnおよびIngold、JChemSoc.1951(London),612; Cahnら、Experientia 1956,12,81; Cahn、JChemEduc)。1964, 41, 116). 等量の反対側のキラリティーの個々のエナンチオマー形態を含む混合物は、「ラセミ混合物」と呼ばれる。
【００７７】
本明細書および特許請求の範囲に開示される化合物は、1つ以上の不斉中心を含んでもよく、各化合物の異なるジアステレオマーおよび/またはエナンチオマーが存在してもよい。本説明書および保険金請求書に記載されている化合物の記述は特に断りのない限り、すべてのエネンテンショナー、ディアステレマーおよびそれらの混合物を含むことを意味する。さらに、本明細書および特許請求の範囲における任意の化合物の説明は別段の記載がない限り、個々の鏡像異性体、ならびに鏡像異性体の任意の混合物(ラセミ体または他のもの)の両方を含むことを意味する。化合物の構造が特定の鏡像異性体として描かれる場合、本出願の発明は、その特定の鏡像異性体に限定されないことを理解されたい。したがって、本開示の構造式の各々の鏡像異性体、光学異性体、およびジアステレオマーが、本明細書中で企図される。本明細書において、化合物の構造式は便宜上、いくつかの場合において特定の異性体を表すが、本開示は幾何異性体、不斉炭素に基づく光学異性体、立体異性体、互変異性体等のような全ての異性体を含み、全ての異性体が同じレベルの活性を有するわけではないことが理解される。これらの化合物は、異なる互変異性体形態で存在し得る。本開示による化合物は特に明記しない限り、全ての互変異性体形態を含むことを意味する。化合物の構造が特定の互変異性体として描写される場合、本出願の発明は、その特定の互変異性体に限定されないことが理解されるべきである。
【００７８】
本明細書中に記載される任意の式の化合物は適用可能であれば、化合物自体、ならびにそれらの塩、およびそれらの溶媒和物を含む。例えば、塩は本開示の化合物上のアニオンと正に荷電した基(例えば、アミノ)との間で形成され得る。好適なアニオンには、塩化物、ブロミド、ヨウ化物、硫酸塩、重硫酸塩、スルファメート、硝酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩、グルタミン酸塩、グルクロン酸塩、グルタル酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩、サリチル酸塩、乳酸塩。用語「薬学的に受容可能なアニオン」は、薬学的に許容可能な塩を形成するために適切なアニオンをいう。同様に、陽イオンと本発明の化合物上の負に荷電した基(例えば、カルボキシレート)との間に塩を形成することもできる。好適な陽イオンとしては、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、およびテトラメチルアンモニウムイオンなどのアンモニウム陽イオンが挙げられる。いくつかの好適な置換アンモニウムイオンの例は、エチルアミン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリエチルアミン、ブチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン、ベンジルアミン、フェニルベンジルアミン、コリン、メグルミン、およびトロメタミン、ならびにリジンおよびアルギニンなどのアミノ酸から誘導されるものである。本開示の化合物はまた、第四級窒素原子を含有する塩を含む。
【００７９】
適切な無機アニオンの例としては以下の無機酸:塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、亜硫酸、硝酸、亜硝酸、亜硝酸、リン酸およびリン酸から誘導されるものが挙げられるが、これらに限定されない。適切な有機アニオンの例としては、以下の有機酸:2-アセトキシ安息香酸、酢酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、安息香酸、安息香酸、カンファルスルホン酸、ケイ桂皮、クエン酸、エデチック、エタンジスルホン酸、エタンジスルホン酸、フマル酸、グルケプトン酸、グルタミン酸、グルタミン酸、グリコール酸、ヒドロキシマレイン酸、ヒドロキシナフタレンカルボン酸、イセチオン酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ムチン酸、オレイン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、パントテン酸、フェニルスルホン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、スルファニル酸、酒石酸。適切なポリマー有機アニオンの例としては以下のポリマー酸:タンニン酸、カルボキシメチルセルロースから誘導されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
さらに、本発明の化合物、例えば化合物の塩は、含水または非含水(無水)形態で、または他の溶媒分子との溶媒和物として存在することができる。水和物の非限定的な例には、一水和物、二水和物などが含まれる。溶媒和物の非限定的な例としてはエタノール溶媒和物、アセトン溶媒和物などが挙げられる。「溶媒和物」手段溶媒付加形態は化学量論量または非化学量論量のいずれかの溶媒を含有する。いくつかの化合物は結晶性固相中に固定されたモル比率の溶媒分子を捕捉し、したがって溶媒和物を形成する傾向を有する。溶媒が水である場合、形成される溶媒和物は水和物であり、溶媒がアルコールである場合、形成される溶媒和物はアルコラートである。水和物とは、水がH2 Oとして分子状態を保持する物質の1分子と1分子以上の水の組合せによって形成される。水和物とは例えば、一水和物、二水和物、三水和物などを指す。
【００８１】
さらに、本明細書中に開示される式によって表される化合物またはその塩について、結晶多型が存在し得る。任意の結晶形態、結晶形態混合物、またはそれらの無水物もしくは水和物が、本開示の範囲に含まれることに留意されたい。
【００８２】
以下の節は、同種細胞療法の拒絶を処置または予防するためにヒト患者に投与され得るADCの説明、ならびにそのような治療薬を患者に投与する方法を提供する。
【００８３】
II. 同種細胞治療方法
免疫能が正常な宿主では、移植された同種細胞はしばしば急速に拒絶される。このような拒絶は一般に、宿主対移植片(HvG)拒絶と呼ばれる。同種細胞療法の1つの課題は、同種細胞がヒトレシピエント(recipient)に受け入れられる手段を同定することである。このような同種細胞の受理は治療の有効性に影響を及ぼし、また、患者に有害な副作用をもたらす可能性がある。
【００８４】
内因性CD137+細胞(例えば、活性化T細胞)を標的とする抗-CD137抗体薬物コンジュゲート(ADC)を投与することによって、ヒト対象における同種細胞の拒絶を処置または予防するための方法が本明細書に記載される。
【００８５】
ある特定の実施形態に、抗-CD137 ADCの投与前に、ヒト対象においてプライミング応答が最初に誘発される。患者の「プライミング」は同種細胞の投与後に産生される活性化された抗同種抗原T細胞の発現を助ける。同種細胞の注入が同種細胞に対する患者の免疫システムを刺激して反応させることが望まれる。プライミングする量の同種細胞をヒト対象に投与し、「プライミング」免疫反応を誘導する。
【００８６】
プライミング段階では、例えば、静脈内に同種細胞を投与し、内因性活性化CD137+ T細胞を生じる免疫反応を誘発する。従って、同種細胞の初回投与量は、好ましくは内因性CD137+ T細胞の活性化を含む免疫反応を誘発するのに有効な量である。例示的な実施形態では、効果的なプライミング用量が少なくとも約1×105細胞/kg、0.5×106 細胞/kg、約1×106 細胞/kg、約1×107 細胞/kg、約1×108 同種細胞/kg、約1×109 同種細胞/kg、約1×10細胞同種細胞/kg、約0.5×106 ~約1×1010 細胞/kg、約0.5×106 ~約1×108 細胞/kg、約1×107 ~約1×1010 細胞/kg、約1×108 ~約1×1010 /kg、または約1×109 ~約1×1010 細胞/kgで静脈内注入のための同種10 細胞のアリコートである。他の例示的な実施形態では、初回投与量が約1×105~1×1012同種細胞/kg、例えば、1×105~1×106細胞/kg、1×105~1×107細胞/kg、1×105~1×108細胞/kg、1×105~1×109細胞/kg、1×105~1×1010細胞/kg、1×105~1×1011細胞/kg、または1×105~1×1012細胞/kgを含む。他の例示的な実施形態では、同種細胞の初回投与量が約1x106~1x1012細胞/kg、1x107~1x1012細胞/kg、1x108~1x1012細胞/kg、1x109~1x1012細胞/kg、1x1010~1x1012細胞/kg、または1x1011~1x1012細胞/kgを含む。前記の範囲の中間体の用量もまた、本方法における使用のために意図される。免疫反応を誘発することができるこれらの範囲外の同種細胞の用量もまた、本発明の範囲内である。
【００８７】
ある実施形態に、同種細胞は同種T細胞または同種NK細胞を含むが、これらに限定されない。例示的な実施形態において、同種細胞は本明細書に記載されるように、キメラ抗原レセプター(chimeric antigen receptor)を発現する。
【００８８】
プライミング量の同種異系細胞の投与後、抗-CD137抗体-薬物結合体(ADC)をヒト対象に投与する。CD137は活性化T細胞上に発現される。したがって、抗-CD137 ADCは同種細胞療法の投与前に、ヒト対象中の活性化T細胞の数量を枯渇させるために使用することができる。本明細書中に記載される方法における使用に好適な例示的な抗-CD137抗体、細胞毒素、およびリンカーは、以下に詳細に記載される。
【００８９】
CD137 ADCの投与後、治療有効量の同種異系細胞がヒト対象に投与される。同種細胞、例えばCARを発現する同種細胞の投与前に活性化T細胞集団を選択的に除去すると、同種細胞の治療または拒絶を防止することにより、同種細胞療法の全般的な有効性が改善される。同種細胞の治療有効量は、被験体において治療的利益を達成するのに有効な量であり得る。例えば、同種異系細胞が癌を有する被験体のための処置において使用される場合、治療有効量は癌を処置するために、癌の大きさまたは体積を減少させるために、癌に関連する1つ以上の症状(symptom)を減少させるために、癌の寛解を誘導するために、および/または癌を有する被験体の生存期間または無病生存を延長するために有効な量であり得る。ある実施形態に、同種異系細胞の治療有効量は、プライミング工程の間に対象に投与される細胞の数よりも多い。別の実施形態において、同種細胞の治療有効量は、プライミング工程の間に被験体に投与される細胞の数にほぼ等しい。別の実施形態において、同種細胞の治療有効量は、プライミング工程の間に被験体に投与される細胞の数未満である。
【００９０】
例示的な実施形態において、同種細胞の治療有効量は少なくとも1×105細胞/kg、例えば、少なくとも1×106細胞/kg、少なくとも1×107細胞/kg、少なくとも1×108細胞/kg、少なくとも1×109細胞/kg、少なくとも1×1010細胞/kg、少なくとも1×1011細胞/kg、少なくとも1×1012細胞/kg、少なくとも1×1013細胞/kg、少なくとも1×1014細胞/kg、少なくとも1×1015細胞/kg、少なくとも1×1016細胞/kg、少なくとも1×1017細胞/kg、またはそれ以上を含む。他の例示的な実施形態において、同種異系細胞の治療有効量は1×105細胞/kgまで、例えば、1×106細胞/kgまで、1×107細胞/kgまで、1×108細胞/kgまで、1×109細胞/kgまで、1×1010細胞/kgまで、1×1011細胞/kgまで、1×1012細胞/kgまで、1×1013細胞/kgまで、1×1014細胞/kgまで、1×1015細胞/kgまで、1×1016細胞/kgまで、または1×1017細胞/kgまでを含む。他の例示的な実施形態において、同種異系細胞の治療有効量は1x105~1x1017細胞/kg、例えば、1x106~1x1017細胞/kg、1x107/kg、1x1017細胞/kg、1x1017細胞~1x108/kg、1x1016/kg、1x1017細胞~1x109/kg、1x1017細胞~1x1010/kg、1x1017細胞~1x1011/kg、または1x1011~1x1012/kgを含む。他の例示的な実施形態において、同種異系細胞の治療有効量は1x105~1x1017細胞/kg、例えば、1x105~1x1016細胞/kg、1x105/kg、1x1011細胞/kg、1x1015細胞~1x105/kg、1x105/kg、1x1014細胞~1x105/kg、1x1013細胞~1x105/kg、1x1012細胞~1x105/kg、または1x1011~1x105/kgを含む。他の例示的な実施形態では、同種細胞の治療有効量が1×108~1×1010細胞/kgを含む。他の例示的な実施形態では、同種細胞の治療有効量が1×1010~1×1012細胞/kgを含む。他の例示的な実施形態では、同種細胞の治療有効量が1×1012~1×1014細胞/kgを含む。
【００９１】
治療の初期プライミング段階で使用される同種細胞は、同種細胞療法の一環としてヒト対象に投与される同種細胞と同じ種類(または類似)とすることができる。例えば、プライミング工程において使用される同種細胞は、同種細胞療法において使用される細胞と同じドナー(donor)に由来し得る。別の実施形態では、プライミング工程で使用される同種細胞が同種細胞療法で使用される細胞と同じまたは類似の補体のMHC分子を発現することができる。初回刺激および/または治療用細胞によって発現されるMHC分子の相補体は天然に存在し得るか、または、例えば、遺伝子工学を使用して改変され得る。ある実施形態に、同種CAR細胞療法では、CAR細胞療法で使用されている同種細胞と同じ型である同種細胞を発現する非CARをヒト対象に投与して、プライミング反応を誘発する。別の方法では、プライミング応答を、患者を治療するために使用されるのであろうCAR発現細胞の同じ型であるCAR発現同種細胞で誘発することができる。
【００９２】
CARを発現する同種細胞の拒絶反応の危険性は、CAR細胞の治療法の投与後に高くなる可能性がある。患者CD137 ADCは、同種異系CAR細胞療法を受けている活性化T細胞を選択的に標的とするために用いられる。ある特定の実施形態に、本明細書中に開示される方法は、ヒト患者においてCARを発現する同種細胞の拒絶を阻害または予防するために使用され得る。
【００９３】
抗-CD137 ADCは同種細胞治療の1つ以上のプライミング照射量の投与と同時に、またはそれに続いて、それを必要とするヒトに投与することができる。ある実施形態に、抗-CD137 ADCは同種異系細胞のプライミング用量の投与の前に、それを必要とするヒト患者に投与される。例えば、いくつかの実施形態において、抗-CD137 ADCはプライミングが同種細胞を投与する前の約10日まで、例えば、プライミングが同種細胞を投与する前の約10日間、約9日間、約8日間、約7日間、約6日間、約5日間、約4日間、約3日間、約2日間、約1日間、約24時間、約12時間、約6時間、約3時間、約2時間、または約1時間まで投与することができる。いくつかの実施形態に、抗-CD137 ADCは同種細胞のプライミング用量の投与前に、約1~約48時間;約1~約24時間;約1~約18時間;約1~約12時間;約1~約10時間;約1~約6時間;約1~約3時間;約1~約2時間;約1~約2日;約1~3日;約1~4日;約1~7日;約1~10日;約3~5日;約3~7日;約3~10日;約12時間~約48時間;約12時間~約36時間などを必要とするヒト患者に投与される。
【００９４】
別の実施形態において、抗-CD137 ADCは同種細胞の初回投与量の投与と同時に、それを必要とするヒト患者に投与される。
【００９５】
他の実施形態において、抗-CD137 ADCは同種細胞のプライミング用量の投与後に、それを必要とするヒト患者に投与される。例えば、いくつかの実施形態において、抗-CD137 ADCは同種細胞のプライミング用量の投与後、約1時間、4時間、6時間、10馬12時間、24時間(1日)、36時間、48時間(2日)、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、21日またはそれ以上後に、それを必要とするヒトに投与することができる。他の実施形態において、抗-CD137 ADCは同種細胞のプライミング照射量、例えば、約1~6時間、約1~12時間、約12時間~約7日、約12時間~約6日、約12時間~約6日、約12時間~約5日、約12時間~約4日、約12時間~約3日、約12時間~約2日、約12時間~約24時間、約1~約10日、約1~約9日、約1~約8日、約1~約7日、約1~約6日、約1~約5日、約1~約4日、約1~約3日、約1~約2日、約3日~約10日、約5日~約7日などの投与後に、それを必要とするヒト患者に投与することができる 同種細胞のプライミング照射量。
【００９６】
ある実施形態に、抗-CD137 ADCの単回用量は同種細胞の初回投与量の投与の前、後、または同時にヒト患者に投与され、このような単回用量は同種細胞の投与に応じて活性化されるT細胞の集団を選択的に枯渇させるのに充分である。
【００９７】
抗-CD137 ADCは治療有効量の同種細胞、例えば、同種細胞発現CARの投与の前、同時、または後に、それを必要とするヒト患者に投与することができる。ある実施形態に、抗-CD137 ADCは、CARを発現する同種異系細胞の投与がそれを必要とするヒト患者に投与される前に投与される。ある実施形態に、同種細胞療法は抗-CD137 ADCが患者の血中から除去または実質的に除去された後に、患者に投与される。ある実施形態に、抗-CD137 ADCは同種異系細胞療法、例えば、CAR細胞療法の投与の前に(例えば、約14日前、約13日前、約12日前、約11日前、約10日前、約9日前、約8日前、約7日前、約6日前、約5日前、約4日前、約2日前、または約1日前)それを必要とするヒト患者に投与される。ある実施形態に、抗-CD137 ADCは同種細胞療法の投与前に、必要なヒト患者に、約1~約14日、約2~約13日、約3~約12日、約3~約11日、約4~約10日、約5~約9日、約6~約8日、約1~約13日、約1~約12日、約1~約11日、約1~約10日、約1~約9日、約1~約8日、約1~約7日、約1~約6日、約1~約5日、約1~約4日、約1~約3日、または約1~約2日投与される。
【００９８】
ある実施形態に、抗-CD137 ADCは、CARを発現する同種異系細胞の投与の約12時間~約14日前にヒト対象に投与される、CARを発現する同種異系細胞の前にヒト患者に投与される。ある実施形態に、抗-CD137 ADCは、CARを発現する同種異系細胞の投与の約24時間~約12日前にヒト対象に投与される、CARを発現する同種異系細胞の前にヒト患者に投与される。ある実施形態に、抗-CD137 ADCは、CARを発現する同種異系細胞の投与の約1日~約10日前にヒト対象に投与される、CARを発現する同種異系細胞の前にヒト患者に投与される。ある実施形態に、抗-CD137 ADCは、CARを発現する同種異系細胞の投与の約2日~約8日前にヒト対象に投与される、CARを発現する同種異系細胞の前にヒト患者に投与される。
【００９９】
ある実施形態に、抗-CD137 ADCは、CARを発現する同種異系細胞の、それを必要とするヒト患者への投与と同時に投与される。
【０１００】
抗-CD137 ADCの投与後、ヒト患者を試験して、CD137+活性化T細胞が同種異系CAR療法の開始前に患者から実質的に枯渇していることを確認してもよい。CD137+活性化T細胞のレベルはCD137 ADCの投与後、ヒト患者由来の生物学的サンプル(例えば、血液)においてアッセイされ得、そして抗-CD137 ADCの投与前(しかし、同種細胞プライミング後)に、生物学的サンプル(例えば、同じ供給源、例えば、血液)由来のCD137+活性化T細胞のレベルと比較され得る。内因性CD137+活性化T細胞の数の低下は、抗-CD137 ADCが同種(同じまたは実質的に類似した同種細胞を使用)CAR療法の拒絶の危険性を低下させるのに効果的であったことを示す。ある実施形態に、ヒト患者由来の生物学的サンプル中の内因性CD137+活性化T細胞のレベルは抗-CD137 ADCの投与直前のヒト患者由来の生物学的サンプル(同じ型、例えば、血)中のCD137+活性化T細胞のレベルと比較して、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%減少する。ある実施形態に、内因性CD137+活性化T細胞の濃度は、抗-CD137 ADCの投与の1日前以下に測定される。
【０１０１】
代わりに、ヒト患者由来の生物学的サンプルにおけるT細胞の全量を、防CD137 ADCの投与後(同種細胞プライミング後)に試験することができ、ここで、投与前の量と比較して、防CD137 ADCの投与後のヒト患者におけるT細胞の番号の減少は、同種細胞療法の拒絶を防止するための防CD137 ADCの有効性を示す。ある実施形態に、ヒト患者由来の生物学的サンプル中の内因性T細胞のレベルは抗-CD137 ADCの投与直前のヒト患者由来の生物学的サンプル(例えば、血)中のT細胞のレベルと比較して、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%減少する。ある実施形態に、ヒト患者由来の生物学的サンプル中の内因性T細胞のレベルは抗-CD137 ADCの投与直前のヒト患者由来の生物学的サンプル(例えば、血)中のT細胞のレベルに対して、約5%~25%、約5%~20%、約5%~15%、または約5%~10%減少する。ある実施形態に、内因性T細胞の濃度は、抗-CD137 ADCの投与の1日前以下に測定される。
【０１０２】
CD137+活性化T細胞を含むT細胞のレベルはインビトロ抗原刺激アッセイを含むがこれに限定されない、当技術分野で公知の標準方法に従って決定することができ、同種細胞への露光後の活性化同種抗原T細胞の数を、抗-CD137 ADCの存在下での同種細胞への露光後の活性化同種抗原T細胞の数と比較する。
【０１０３】
本明細書中に開示される方法は、同種細胞発現CARを対象に送達するために使用され得る。重要なことに、本明細書中に記載される抗-CD137 ADC調整方法は、同種異系細胞の寛容が提供され得る手段を提供することによって、CAR治療において使用され得る免疫細胞の型を拡大するために有効である。ある実施形態に、同種細胞を発現するCARは同種T細胞または同種NK細胞を含むが、これらに限定されない。
【０１０４】
ある実施形態に、抗-CD137抗体-薬物結合体は同種異系細胞の初回投与量の投与の前、同時、または後に抗-CD137抗体-薬物結合体を投与することによって、CD137発現T細胞、例えば、CD137を発現する活性化T細胞を枯渇させるために使用される。特に、抗-CD137 ADCを用いて、ホスト反応性T細胞(プライミングに続く活性化T細胞)を枯渇させることができる。
【０１０５】
本明細書中に開示される方法は、これらの障害の1つを有するヒト対象における癌または自己免疫疾患の処置に特に有効である。
【０１０６】
ある実施形態に、本明細書中に開示される方法は、ガンを処置するために使用される。本明細書に開示された方法を用いて治療することができる癌の種類の例には成人進行癌、膵臓癌、切除不能な膵臓癌、結腸直腸癌、転移性結腸直腸癌、トリプルネガティブ乳癌、結腸癌、肝小細胞癌、非小細胞肺癌、B細胞リンパ腫、再発性または難治性B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、原発性縦隔B細胞リンパ腫、再発性縦隔大細胞型B細胞リンパ腫、大細胞型B細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、再発性または難治性非ホジキンリンパ腫、難治性アグレッシブ非ホジキンリンパ腫、B細胞非ホジキンリンパ腫が含まれるが、これらに限定されない 治療抵抗性非ホジキンリンパ腫、大腸癌、膵癌、トリプルネガティブ浸潤性乳癌、腎細胞癌、肺扁平上皮癌、 尿路上皮性白血病、B細胞性急性リンパ性白血病、B細胞性急性リンパ性白血病、成人急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ性白血病、前リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、再発性形質細胞性骨髄腫、多発性骨髄腫、骨の多発性骨髄腫、脳の悪性神経膠腫、骨髄異形成症候群、EGFR陽性結腸直腸癌、多形性膠芽腫、新生物、芽球様樹状細胞腫瘍、固形腫瘍、進行性固形腫瘍、メソテリン陽性腫瘍、血液悪性腫瘍 および他の進行した悪性腫瘍。
【０１０７】
ある実施形態に、本明細書に開示される方法は、自己免疫疾患を治療するために使用される。より具体的には、抗-CD137 ADCを、同種細胞療法、例えばCARを発現する同種細胞と組合せて、自己免疫疾患を有するヒト対象に投与する。本明細書中に開示される組合せ方法を使用して処置され得る自己免疫疾患の例としては多発性硬化症, クローン病,潰瘍性大腸炎,関節リウマチ、I型糖尿病、ループス、および乾癬が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０８】
ある特定の実施形態に、抗-CD137 ADCは、CAR-T細胞療法と併用してヒト患者に投与される。ある実施形態に、抗-CD137 ADCは、CAR-T治療の投与前にヒト患者に投与される。
【０１０９】
同種異系細胞において発現され得、そして本明細書中に開示される方法とともに使用され得るCAR-T構築物の例は以下を含むが、これらに限定されない。CAR-T(例:CART-19-01,02,03(富士医科大学)、ダオペイカート(Hebei Senlang Biotechnology Inc.)、IM19CART/001, YMCART 201702(武漢Sian Medical Technology Co.)、ユニバーサルCD19-CART/SHBYCL001,002(Shanghai Bioray Laboratory Inc.)、UnicarTherapy 201701(Shanghai Unicar-Therapy Biomedicine Technology Co.)、GeneChem/NCT02672501(Shanghai GeneChem Co.)、SenL_19(Hebei Senlang Biotechnology Inc.)、PCAR-019(PersonGen BioTherapeutics(Suzhou))、ICAR19(Immune)CART-02(Sinobioway Cell Therapy Co.)、HenanCH080,152(Henan Cancer Hospital / the Pregene(Shenzhen)Biotechnology Co.)、IM19-CD28およびIM19-41BB CAR-T細胞(Beijing Immunochina Medical Science & Technology Company)); CTL019/IT1601-CART19(北京三洋生物工業); CTL019/CCTL019C2201(Novartis Pharmaceuticals); CD19:4-1BB:CD3/ FirstShenzhen Second People's Hospital / the Beijing Pregene Science and Technology Company); MB-CART19.1(Shanghai Children's Medical Center / Miltenyi Biotec GmbH); PZ01CAR-T細胞(Pinze Lifetechnology Co.); YMCART201701(Beijing Immunochina Medical Science & Technology Co.);2016YJZ12 EGFRt/19-28z-1BBL CAR T細胞(Memorial Sloan Kettering Cancer Center / Juno Therapeutics、Inc.); Doing-002(Beijing Doing Biomedical Co.); PCAR-019(PersonGen BioTherapeutics(Suzhou)Co.); C-CAR011(Peking Union Medical College Hospital / Cellular Biomedicine Group Ltd.); iPD1 CD19 eCAR T細胞 / イントレキソンCAR 2-1(ヘナンがん病院/プレジーンバイオテクノロジー社)、JCAR015(ジュノセラピューティクス社)、JCAR017/017001,004,006(ジュノセラピューティクス社)、JCAR017(セルジーン社)、TBI-1501(タカラバイオ社)、JMU-CD19CAR(Jichi Medical University)、KTE-C19(キテ)TriCAR-T-CD19(Timmune Biotech Company); PF-05175157(Fred Hutchinson Cancer Research Center); CD22/NCT03121625(Hebei Senlang Biotechnology Inc.);CD22(例えば、Ruijin-CAR-01(Ruijin Hospital / Shanghai Unicar-Therapy medicine Technology Co.); AUTO-PA1, DB1(Autolus Limited)); CD20(例えば、Doing-006(Beijing Doing Biomedical Co.);またはCD20/CD22/CD30(例えば、SZ5601)Soochow University Shanghai / Unicar-Therapy Bio-medicine Technology Co.)の第1関連病院。
【０１１０】
キメラ抗原レセプター(Chimeric Antigen receptor)(CAR)
本発明は治療に必要な同種細胞の拒絶を処置または予防するために、抗-CD137免疫抑制ADCと併用した同種細胞療法(例えば、同種CAR細胞療法)の使用を包含する。本発明は、抗-CD137 ADCが内因性T細胞などの内因性CD137+免疫細胞を除去することによってCAR発現細胞の受理を促進することによって、CAR治療のための調整剤として働くことができるという知見に少なくとも部分的に基づいているので、本発明は一般に、特定のCAR構築物、例えば、特異的抗原結合部位または細胞内シグナリング・ドメインに限定されない。特定のCAR、例えば、CD19特異的CARは本明細書中で意図され、そして本明細書中に開示される方法に含まれるが、限定することを意味しない。
【０１１１】
CAR構築物は当該分野で公知であり、そして一般的に、(a)抗原結合ドメインを含む細胞外領域、(b)膜貫通ドメインおよび(c)細胞内シグナリング・ドメインを含む。例示的なCAR構成は当技術分野で知られており、本明細書で説明する方法では、任意の好適な形態を使用することができる。例えば、CARは例えば、ゲダンらに記載されているように、第1世代、第2世代、または第3世代CARであってもよい。分子治療方法と臨床開発。12: 145-156(2019)またはSadelain et al. がん発見3.4: 388-398(2013年)、その全内容を参考までに盛り込んだ。簡潔には、「第1世代」CARが(A)細胞外抗原結合ドメイン、(b)膜貫通ドメイン、(c)1つ以上の細胞内シグナリング・ドメイン、および任意選択で(d)抗原結合ドメインを膜貫通ドメインに接続するヒンジ領域を含むことができる。「第2世代」CARは元素(A)、(b)、(c)、および任意選択で(d)を含むことができ、さらに、共刺激ドメイン、例えば、CD28または4-1BBの共刺激ドメインを含むことができる。「第3世代」CARは元素(A)、(b)、(c)、および任意選択で(d)を含むことができ、さらに、多重共刺激ドメイン、例えば、CD28および4-1BBの共刺激ドメイン、またはCD28およびOX40の共刺激ドメインを含むことができる。以下、上記各要素について詳細に説明する。いくつかの実施形態に、以下の例示的な非限定的な配置によって記載されるCAR分子は、CARの左側から権利、N末端側からC末端側であることを理解されたい。本発明によって記載されるCARは、本明細書に記載される元素の任意の他の組合せを含んでもよく、またはさらに含んでもよい。他の例示的なキメラ抗原レセプター構築物は、米国特許第9,328,156号;米国特許第9,783,591号;米国特許第9,765,156号;米国特許第10,117,896号;米国特許第10,308,717号;米国特許第10,221,245号;米国特許公開第2018/0256712A1号;米国特許公開第2018/027107A1号;米国特許公開第2016/0046724A1号;米国特許公開第2018/0044424A1号;米国特許公開第2018/0258149A1号に開示されている。特許公報第2019/0151363A1号;および米国特許公報第2018/0273601A1号;前記の特許および特許公報のそれぞれの内容がその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１２】
本明細書中に開示される方法において使用されるCARは、細胞外抗原結合ドメインを含み得る。細胞外抗原結合ドメインはヒト抗体、ヒト化抗体、またはその任意の機能的フラグメントを含むがこれらに限定されない、抗原に結合する任意の分子であり得る。ある特定の実施形態に、抗原結合ドメインはscFvである。他の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは非免疫グロブリン・スキャフォールド・タンパク質(scaffold protein)である。他の実施形態では、本CARの細胞外結合ドメインが単鎖T細胞レセプター(scTCR)を含む。米国特許に記載されているように。番号。5,359,046, 5,686,281 5,686,281および6,103,521、細胞外ドメインはまた、リガンド結合および/またはシグナル伝達に関連する多種多様な細胞外ドメインまたは分泌タンパク質のいずれかから得られ得る。
【０１１３】
細胞外結合ドメインの分子標的(抗原)の選択肢は、ターゲット細胞の表面積を規定するリガンドの種類および個数に依存する。例えば、抗原結合ドメインは、特定の病態に関連するターゲット細胞に対する細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択され得る。従って、1つの局面において、CAR媒介性免疫細胞(例えば、T-細胞)反応は、所望の抗原をCARに特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインを操作することによって、目的の抗原に向けられ得る。例えば、抗原結合ドメインは、がんまたは自己免疫疾患などの特定の病態に関連するターゲット細胞に対する細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択することができる。従って、CARにおける抗原結合ドメインのためのリガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例としては、がん細胞および他の形態の疾患細胞(例えば、自己免疫疾患細胞および病原体感染細胞)に関連するものが挙げられる。いくつかの実施形態に、CARは、腫瘍細胞上の抗原に特異的に結合する所望の抗原結合ドメインを操作することによって、目的の腫瘍抗原を標的化するように操作される。本発明の文脈において、「腫瘍抗原」は、癌などの特定の過剰増殖性障害に共通する抗原を指す。ある実施形態において、抗原は腫瘍抗原であり、これらに限定されるものではないが、CD19、CD22、CD30、CD7、BCMA、CD137、CD22、CD20、AFP、GPC3、MUC1、メソテリン、CD38、PD1、EGFR(例えば、EGFRvIII)、MG7、BCMA、TACI、CEA、PSCA、CEA、HER2、MUC1、CD33、ROR2、NKR-2、PSCA、CD28、TAA、NKG2D、またはCD123。ある実施形態において、CARはCD19、CD22、CD30、CD7、BCMA、CD137、CD22、CD20、AFP、GPC3、MUC1、メソテリン、CD38、PD1、EGFR(例えば、EGFRvIII)、MG7、BCMA、TACI、PSCA、CEA、HER2、MUC1、CD33、ROR2、NKR-2、PSCA、CD28、TAA、NKG2D、またはCD123に結合するscFvを含む。
【０１１４】
別の局面において、CARの細胞外結合領域はAFP(例えば、ETCH17AFPCAR01(イオンセラピューティクス(上海)社)に結合する/ Eureka Therapeutics Co.)、302 GPC3-CART(Shanghai GeneChem Co.)、CAR-T for肝臓癌(Shanghai GeneChem Co.)、CAR-GPC3 T細胞(Carsgen Therapeutics)、MUC1(例えば、PG-021-001,002(Person BioTherapeutics(Suzhou)Co.))、メソテリン(例えば、H2017-01-P01(Ningbo cancer Hospital)、TAI-meso-CART(Shanghai GeneChem Co.)、K16-4/NCT02930993(China Meitan General Hospital / Marino Biotechnology Co.)、CD38(例えば、Anti-CD38 A2 CAR-T/SOR-MM-001(Sorrento Therapeutics)herinCAR-PD1など)/NBWYKY2016-06-001,002,003(Ningbo cancer Hospital)、SIMC-20160101,02,03(Shanghai International Medical Center)、BCMA(Tscm)CART-T細胞/ P-BCMA-101-001(Poseida Therapeutics、Inc.)、HenanCH284(HenZhen)Biotech Company)、LCAR-B38M CAR-T細胞(Nanjing Legend Biotech Co.)、9762/NCT03338972(Fred Hutchinson cancer Research Center / Juno Therapeutics、Inc.)、Descartes-08(Cartesian Therapeutics)、KITE-585(Kite)Aギリアド社)、bb21217(ブルーバードバイオジーン)、JCARH125(Juno Therapeutics、Inc.)、CD30(例えば、ICAR30 T細胞(Immune Cell、Inc.)、EGFR(例えば、EGFR:4-1BB:CD28:CD3改変T細胞/ First Shenzhen02(深セン・スコープランド・ピープルズ・ホスピタル/北京・サイエンス)EGFR-IL12-CART(深セン)バイオテクノロジー社)、SBNK-2016-015-01(北京サンボブレーン病院/マリノバイオテクノロジー社)、MG7(Xijing Hospital / Shanghai GeneChem Co.)、BCMA/TACI(例えば、AUTO2-MM1(Autolus Limited))、CEA(例えば、383-74/NCT02416466(Roger Williams Medical Center / Sirtex Medical)、中皮/PSCA/CEA/HER2/MUC1/EGFRvIII(例えば、NCT03267173(ハービン・メディカル・ユニカー・セラピー・バイオメディカル・テクノロジー社))CD20(例えば、EY201605-19(Beijing Biohealthcare Biotechnology Co.)、CD33(例えば、2016-341/NCT03126864(M.DAnderson cancer Center / Intrexon Corp/ Ziopharm))、EGFR/BCMA(例えば、 EGFRt/BCMA-41Bz CAR T細胞(Memorial Sloan Kettering cancer Center / Juno Therapeutics、Inc.)、ROR2(例えば、自己CCT301-38またはCCT301-59 T細胞(Shanghai Sinobioway Sunterra Biotech))、NKR-2(例えば、CYAD-N2T-002,003,004(Celyad))、PSCA(例えば、BP-012(Bellicum Pharmaceuticals))、CD28(例えば、自己CSR T細胞(Beijing Sanbo Brain Hospital / Marino Biotechnology Co.))、TAA(例えば、AMG 119(Amgen))、NKG2D(例えば、CM-CS1(Celyad))、またはCD123(例えば、UCART123(Celle。前記はさらに、前記抗原(例えば、AMG 119(Amgen))に結合するCARの例を提供する。これらのCAR構築物は、本明細書中に開示される方法において、抗-CD137 ADCと共に使用され得る。
【０１１５】
CAR構築物は細胞外抗原結合ドメインを細胞内シグナリング・ドメインに連結する(文字通り、または、例えば、スペーサーとほぼ近接して)膜貫通ドメインをさらに含み得る。いくつかの実施形態に、CARの細胞外抗原結合ドメイン(例えば、scFv、Fabまたは他の抗原結合部分)は、ヒンジまたは他のリンカーを使用して膜貫通ドメインに連結され得る。スペーサ、リンカー、またはヒンジを細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に導入して、抗原結合ドメインが様々な方向に配向することを可能にする柔軟性を提供し、それによって抗原の認識および結合を容易にすることができる。膜貫通ドメインの細胞質側はCD28またはCD3ζ(CD3-ζ)の細胞内シグナリング・ドメインのような細胞内シグナリング・ドメインに付着させることができ、さらに、以下で論じるように1つ以上の共刺激ドメインを含むことができる。
【０１１６】
したがって、ある特定の実施形態に、CARは、細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置するヒンジ領域をさらに含むことができる。例えば、ヒンジ領域は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE、IgM、CD28、またはCD8αのヒンジ領域に由来し得る。特定の一実施形態では、ヒンジ領域がIgG4のヒンジ領域に由来する。別の実施形態では、ヒンジ領域はCD8ヒンジドメインである(SwissProt/GenBank Acc.NoP01732参照)。
【０１１７】
ある実施形態に、CARは、細胞外抗原結合ドメインと、CD8ヒンジを介して連結された膜貫通ドメインとを含む: AKPTTTPAPR PPTPAPTIAS QPLSLRPEAC RPAAGGAVHT RGLDFA(配列番号(SEQ ID NO): 2)。
【０１１８】
ある実施形態に、CARは、細胞外抗原結合ドメインと、ハイブリッドCD8-CD28ヒンジ: AKPTTTPAPR TPAPTIAS QPLSLRPEAC RPAAGGAVHT RGLDFAPRKI EVMYPPPYLD NEKSNGTIIH VKGKHLCPSP LCPLFPKP(配列番号(SEQ ID NO): 3)を介して連結された膜貫通ドメインとを含む。
【０１１９】
膜貫通ドメインは、増殖シグナル伝達部分に寄与するタンパク質であるエフェクター機能シグナリング・ドメインに寄与するタンパク質である細胞外抗原結合ドメインに寄与するタンパク質の配列、または全く異なったタンパク質に由来してもよい。いくつかの実施形態に、膜貫通ドメインは、CARの他のドメインの1他自然に関連する。例えば、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインは、同じタンパク質の膜貫通領域および細胞質領域に由来することができる。ある実施形態に、本CARの膜貫通および細胞質ドメインは、CD28配列の連続部分を含む。ドメインが抗原結合ドメインを含むCARを細胞膜に固定することができるならば、任意の膜貫通ドメインを本明細書に記載のCAR構築物に使用することができる。
【０１２０】
膜貫通ドメインは、天然または合成源のいずれかに由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合または膜貫通タンパク質に由来し得る。本明細書中に提供される方法において使用され得る例示的な膜貫通ドメインはT-細胞レセプター、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、LCFA-1 T-細胞共レセプター、CD2 T-細胞共レセプター/接着分子、CD8α、およびそれらのフラグメントのアルファ鎖、ベータ鎖、またはゼータ鎖に由来し得る(例えば、それらの膜貫通ドメインを少なくとも含み得る)。タンパク質の膜貫通ドメインは当該分野で公知の任意の方法(例えば、疎水性解析、構造解析など)を使用して、または公開データベース(例えば、ユニプロットデータベース)を使用することによって同定され得る。
【０１２１】
いくつかの実施形態に、膜貫通ドメインは合成であってもよい。例示的な実施形態では、膜貫通ドメインが主にロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含むことができる。ある実施形態に、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットは、合成膜貫通ドメインのそれぞれの端部に位置し得る。場合により、好ましくは2~10アミノ酸長の短いオリゴまたはポリペプチドリンカーが、膜貫通ドメインとCARの細胞内シグナリング・ドメインとの間の連結を形成し得る。グリシン-セリンダブレットは、特に好適なリンカーを提供する。
【０１２２】
いくつかの実施形態に、本明細書で使用されるCARにおける膜貫通ドメインは、CD8膜貫通ドメインまたはその一部である。この目的のためのCD8の配列は、PCT公開番号WO2014/055771A1に教示されている。
【０１２３】
いくつかの実施形態に、CAR中の膜貫通ドメインは、CD8膜貫通ドメインまたはその機能的部位である。例えば、CARは、LDPKLCYLLD GILFIYGVIL TALFLRVK(配列番号(SEQ ID NO): 4)のアミノ酸配列を有するCD3膜貫通ドメイン、またはその機能的部分、例えばLCYLLDGILF IYGVILTALF(配列番号(SEQ ID NO): 5)を含むことができる。
【０１２４】
いくつかの実施形態に、本発明の膜貫通ドメインは、CD28膜貫通ドメインであるCAR物中のものである。CD28の例示的な配列、ならびに例示的な膜貫通ドメイン配列を以下に提供する。いくつかの実施形態に、CD28膜貫通ドメインは、以下の例示的な膜貫通ドメイン配列、またはその配列を含むCARを細胞膜に固定することができるフラグメントもしくはその変形例を含む。従って、いくつかの実施形態に、本CARの膜貫通ドメインは、以下のアミノ酸配列を含むCD28膜貫通ドメインである: FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(配列番号(SEQ ID NO): 6)。ある実施形態に、本CARの膜貫通ドメインは、以下のアミノ酸配列を含むCD28膜貫通ドメインである: IEVMYPPPYL DNEKSNGTII HVKGKHLCPS PLFPGPSKPF WVLVVVGGVL ACYSLLVTVA FIIFWV(配列番号(SEQ ID NO): 7)、またはその機能的フラグメント、例えば配列番号(SEQ ID NO): 6。
【０１２５】
CARは、細胞外抗原結合ドメインおよび膜貫通ドメインに加えて、細胞内(または細胞質)シグナリング・ドメインをさらに含む。
【０１２６】
内因性TCRのみを介して生成されるシグナルはT細胞の完全な活性化には不十分であり、二次的または補助刺激シグナルも必要とされる可能性があることが知られている。このように、T細胞の活性化は二つの異なる種類の細胞質シグナル伝達配列によって媒介される。すなわち、TCRを介して抗原依存性の一次活性化を開始させるもの(一次細胞質シグナル伝達配列)と、抗原独立に作用して二次シグナルまたは補助刺激シグナルを提供するもの(二次細胞質シグナル伝達配列)である。
【０１２７】
用語「細胞内シグナリング・ドメイン」または「細胞内シグナリング・ドメイン」は、本明細書中で使用される場合、CARの細胞内部位をいう。細胞内シグナリング・ドメインは免疫同種細胞を含むCARの免疫エフェクタ機能を促進するシグナル、例えば、CAR-T細胞またはCAR発現NK細胞を生成することができる。例えばCART細胞またはCAR発現NK細胞における免疫エフェクター機能の例には、細胞溶解活性およびサイトカインの分泌を含むヘルパー活性が含まれる。ある特定の実施形態に、細胞内シグナルドメインはエフェクタ機能シグナルを変換し、細胞に特化した機能を実行するように指示する。細胞内シグナリング・ドメイン全体を使用することができるが、多くの場合、連鎖全体を使用することは必須ではない。細胞内シグナリング・ドメインの切断された部分が使用される限り、そのような切断された部分はそれがエフェクタ機能シグナルを伝達する限り、無傷の連鎖の代わりに使用され得る。したがって、細胞内シグナリング・ドメインという言葉は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに充分な細胞内シグナリング・ドメインの任意の切断部分を含むことを意味する。
【０１２８】
ある実施形態に、本CARの細胞内シグナリング・ドメインは、実施配列番号(SEQ ID NO): 8に記載されるようなCD3ゼータシグナル伝達部位、またはそのシグナル伝達部位を含む。
FSAPRSKVQNLYNEQQGQNLYNELGREREDVLDKRRGREMDPGGKPRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(配列番号(SEQ ID NO): 8)。
【０１２９】
細胞内シグナリング・ドメインはさらに、CD3ゼータ、FcRガンマ、FcRベータ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CDS、CD22、CD79a、CD79b、CD278(「ICOS」)、FcεRI、CD66d、DAP10、およびDAP12に由来するものを含み得るが、これらに限定されない。
【０１３０】
CARはさらに、サイトカイン産生を増強するCD28および4-1BBなどの共刺激タンパク質またはタンパク質の細胞内シグナリング・ドメインに由来するポリペプチド鎖である「細胞内共刺激ドメイン」を含み得る。例示的な共刺激信号領域は、4-1BB、CD21、CD28、CD27、CD127、ICOS、IL-15Rα、およびOX40を含む。
【０１３１】
ある特定の実施形態に、CARの細胞質共刺激ドメインは、4-1BBシグナリング・ドメインを単独で、またはCARの文脈において有益な任意の他の所望の細胞質ドメインと組み合わせて含む。4-1BBは、GenBank Accとして提供されるアミノ酸配列を有するTNFRスーパーファミリーのメンバーである。AAA62478.2号、または非ヒト種(例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人公など)由来の同等の残基;および「4-1BB共刺激ドメイン」は、GenBank acc no.のアミノ酸残基214~255として定義される。AAA62478.2、または非ヒト種(例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人種など)由来の同等の残基。
【０１３２】
ある実施形態に、本CARの細胞内共刺激ドメインは、4-1BB(CD137)共刺激信号域またはその信号域である:
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (OB9)。
【０１３３】
ある実施形態として、CARの共刺激シグナリング・ドメインはCD28共刺激シグナル伝達領域配列である。例えば、共刺激シグナリング・ドメインは、以下のCD28共刺激シグナル伝達部位、またはそのシグナル伝達部位を含むことができる:
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (OB10)。
【０１３４】
例示的な実施形態では、本発明CARの細胞質ドメインがCD3-ゼータシグナリング・ドメインを、本発明CARの文脈において有効な任意の他の所望の細胞質ドメインと組合せて含有することができる。ある特定の実施形態に、本CARの細胞質ドメインはCD3ゼータドメインと、4-1BB、CD28、および/またはCD27の同時刺激シグナル伝達領域を含むが、これらに限定されない同時刺激シグナル伝達領域とを含むことができる。
【０１３５】
本発明CARの細胞質シグナル伝達部内の細胞質シグナル伝達配列は、無作為または特定の順序で互いに連結され得る。任意に、好ましくは5~20アミノ酸長の短期のオリゴまたはポリペプチドリンカーまたはスペーサを細胞質ドメインの間に挿入することができる。GGGS(配列番号(SEQ ID NO):27)または(GGGGS)×3(配列番号(SEQ ID NO):28)は、特に好適なリンカーを提供する。
【０１３６】
ある実施形態に、本明細書で使用されるCARは、抗-CD19モノクローナル抗体の一本鎖可変ドメイン、CD8αのヒンジおよび膜貫通ドメインを含有する膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζのシグナリング・ドメインおよび4-1BBのシグナリング・ドメインを含有する細胞質ドメインを含有する細胞外ドメインを含む。例示的なCARは、Nicholson I C、et al、Mol Immunol 34:1157-1165(1997)に記載されている抗-CD19モノクローナル抗体と、CD8αの21アミノ酸シグナルペプチド(GenBankアクセッション番号.NM_001768の26-88位の63ヌクレオチドから翻訳される)とを含む。CD8αヒンジおよび膜貫通ドメインは、GenBankアクセッション番号の815~1021位の207ヌクレオチドから翻訳された69アミノ酸からなる。NM_001768。好ましい実施形態のCD3ζシグナリング・ドメインは、GenBankアクセッション番号の1022~1360位の339ヌクレオチドから翻訳された112アミノ酸を含む。NM_000734。
【０１３７】
細胞外ドメイン(抗原結合ドメインを含む)とCAR(上記)の膜貫通ドメインとの間、または細胞質ドメインとCARの膜貫通ドメインとの間に、スペーサまたはヒンジドメインが組み込まれてもよい。本明細書で使用される「スペーサドメイン」という語は一般に、膜貫通ドメインをポリペプチド鎖中の細胞外ドメインおよび/または細胞質ドメインに連結するように機能する任意のオリゴまたはポリペプチドを手段する。本明細書中で使用される場合、ヒンジドメインは一般に、CAR、またはそのドメインに柔軟性を提供するように、および/またはCAR、またはそのドメインの立体障害を予防するように機能する任意のオリゴマーまたはポリペプチドを手段する。いくつかの実施形態に、スペーサまたはヒンジドメインは、300個までのアミノ酸、好ましくは10~100個のアミノ酸、最も好ましくは5~20個のアミノ酸を含み得る。しばしば、スペーサまたはヒンジが、細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に導入されて、抗原結合ドメインが種々の方向に配向して抗原の認識および結合を容易にすることを可能にする柔軟性を提供する。本発明の態様はこの点に限定されないので、1つ以上のスペーサドメインがCARの他の領域に含まれてもよいことも理解されるべきである。
【０１３８】
CARは本明細書中に提供される配列を有する領域(例えば、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞質ドメイン、シグナリング・ドメイン、安全ドメイン、および/またはリンカー、またはそれらの任意の組合せ)、またはそれらの変異体、またはそれらのいずれかのフラグメント(例えば、CAR活性に必要とされる機能を保持する変異体および/またはフラグメント)を含み得ることが、本明細書中に記載されるCARプロテインAに含まれ得ることが理解されるべきである。いくつかの実施形態に、変異体は、例示された配列に対して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸変化を有する。いくつかの実施形態に、変異体は、図示の配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、90%~95%、少なくとも95%または少なくとも99%同一である配列を有する。いくつかの実施形態に、フラグメントは、本明細書中に提供される配列よりも1~5、5~10、10~20、20~30、30~40、または40~50アミノ酸短い。いくつかの実施形態に、フラグメントは、提供される配列のN末端、C-末端、または両方の末端領域でより短い。いくつかの実施形態に、フラグメントは、本明細書中に提供される配列中のアミノ酸の数の80%~85%、85%~90%、90%~95%、または95%~99%を含む。
【０１３９】
他の実施形態において、本発明は、本明細書中に開示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
【０１４０】
いくつかの実施形態に、上記の例示的な非限定的な構成は、CARの左側から権利、N末端側からC末端側である。CARは、本明細書に記載されるような元素の任意の他の組合せを含んでもよく、またはさらに含んでもよい。
【０１４１】
CAR構築物がその様々な部品で同定されると、CARが発現する免疫細胞が産生され、それによって免疫細胞がCARを発現する。この方法は本明細書中に記載される核酸分子(例えば、RNA分子(例えば、mRNA))、またはCAR(例えば、本明細書中に記載されるCAR)を符号化する核酸分子を含むベクターを用いて、免疫細胞を導入すること(例えば、形質導入すること)を包含する。また、細胞集団(例えば、外因性RNAを一時的に発現するRNA操作細胞)を作製する方法を提供する。この方法は本明細書中に記載されるようなRNA(例えば、インビトロで転写されたRNAまたは合成RNA;本明細書中に記載されるようなCARポリペプチドをコードするmRNA配列)を細胞に導入することを包含する。実施形態において、RNAは、CARポリペプチドを一過性に発現する。ある実施形態に、細胞は本明細書に記載の細胞、例えば、免疫エフェクタ細胞(例えば、T細胞もしくはNK細胞、または細胞集団)である。
【０１４２】
抗-CD137抗体薬物コンジュゲート(ADC)
本明細書中に記載されるように、抗-CD137ADCはヒト患者におけるガンまたは自己免疫疾患を処置するために、同種細胞療法と組合せて使用され得る。より具体的には、抗-CD137 ADCを用いて、同種細胞療法も受けているヒト対象においてCD137+細胞(例えば、CD137+ T細胞)を枯渇させることができる。患者CD137 ADCは内因性T細胞を標的とし、これらの細胞を殺して、被験体に投与された同種細胞療法(例えば、CARを発現する同種細胞)を被験体の免疫システムが攻撃しないようにする。このように、抗-CD137 ADCはレシピエント(recipient)における細胞療法の拒絶の予防または危険性を減少させるために、CAR療法と併用される。コンディショニング・レジメンとして抗-CD137 ADCを用いる1つの利点は、CD137を発現する活性化T細胞を欠乏のために特異的に標的化することができることである。
【０１４３】
抗-CD137抗体
本発明は、CD137(CDw137、TNFRSF9、4-1BB、およびILAとも呼ばれる)に結合し得る抗体およびその抗原結合フラグメントが細胞治療を必要とする患者において細胞治療の拒絶の危険性を予防または低減するための治療薬剤として使用され得るという知見に部分的に基づいている。
【０１４４】
T細胞はCD137を発現することが示されており、この抗原は共刺激分子の膜貫通TNFレセプター・スーパーファミリーであり、様々な造血細胞上に発現され、T細胞活性化を促進し、T細胞の増殖および存続を調節する(例えば、Cannonsら、JImmunol.167:1313-1324、2001を参照されたい。この開示は、T細胞によるCD137の発現に関連するので、本明細書中に参考として援用される)。ヒトCD137のアミノ酸配列を以下に示す:
MGNSCYNIVA TLLLVLNFER TRSLQDPCSN CPAGTFCDNN RNQICSPCPP
NSFSSAGGQR TCDICRQCKG VFRTRKECSS TSNAECDCTP GFHCLGAGCS
MCEQDCKQGQ ELTKKGCKDC CFGTFNDQKR GICRPWTNCS LDGKSVLVNG
TKERDVVCGP SPADLSPGAS SVTPPAPARE PGHSPQIISF FLALTSTALL
FLLFFLTLRF SVVKRGRKKL LYIFKQPFMR PVQTTQEEDG CSCRFPEEEE
GGCEL(GenBank NoAAX42660.1;配列番号(SEQ ID NO): 1)
【０１４５】
ヒトCD137に特異的な抗体およびその抗原結合フラグメントは当技術分野で公知であり、本明細書中に記載される技術を使用して、例えば、免疫化、コンピューターモデル化技術、およびインビトロ選択方法(例えば、以下に記載されるファージディスプレイおよび細胞ベースのディスプレイプラットフォーム)によって同定され得る。
【０１４６】
In one embodiment, an anti-CD137 antibody that may be used in the methods and compositions ( including ADCs) described herein is the murine anti-CD137 antibody BBK2 ( Thermo Fisher; MS621PABX) or an anti-CD137 antibody comprising antigen binding regions corresponding to the BBK2 antibody .The BBK2 antibody ( which may also be referred to as a BBK-2 antibody or an anti-4-1BB antibody), is a mouse monoclonal antibody ( IgG1, kappa) that binds to the ectodomain of human 4-1BB recombinant protein ( 4-1BB is also known as CD137) .In certain embodiments, the methods and compositions of the disclosure include an anti-CD137 antibody comprising the binding regions ( e.g., the CDRs) of the BBK2 antibody .In another embodiment, the methods and compositions of the disclosure comprise an antibody that competitively inhibits the binding of the BBK2 antibody to its epitope on CD137 .In certain embodiments, the anti-CD137 antibody is humanized BBK2 or chimeric BBK2.
【０１４７】
In one embodiment, the methods and compositions described herein include a chimeric anti-CD137 ( ch-BBK2) antibody comprising the variable heavy and light chain regions of BBK2 .In certain embodiments, the chimeric BBK2 antibody is an IgG1 antibody comprising human constant regions .The heavy chain amino acid sequence of ch-BBK2 is described in SEQ ID NO: 11, and the light chain amino acid sequence of ch-BBK2 is described in SEQ ID NO:12 .重鎖および軽鎖配列の各CDR領域(CDR1、CDR2、およびCDR3)を、以下に太字で記載する。可変領域はイタリック体で示されている。
GPSYGNTYYGVSSKNTYGVSSKYGNTKGPSYVSSSLYGFPVTKVSSSLVGPSVTVTCVTCVVTCHEVKNWVVVEGVTKNAKTKPREEQYNSTVLTVLHQDWLNKVSKYCKVSNKALPAEPISKAKAKAKAKAKAKAKA PRQVSLTKYPSDIAVENGQPENYNKTTPVLDSDGSFFLYSKLTKSRWQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSPGK(配列番号(SEQ ID NO): 11)
LSSASTQLLYTGTQYLLYTGTQYKTGSTVAFCYTQFCYTLPYTKGGTKGTKVARTAPVPSFPSFPSFPSDEQLKSGTASVLLNFYPREADVQWKNALQNSQNSGNSQESVTESQDSKDSTYSSTLSSTLSKADYEKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号(SEQ ID NO): 12)
【０１４８】
The foregoing CDR regions ( and BBK2 antibody) are described in Lee et al. ( 2002) European J of Immunogenetics 29( 5):449-452 .Thus, in one embodiment, the VH CDR amino acid sequences of anti-CD137 antibody BBK2 ( including ch-BBK2) are as follows: SGYTFTSYW ( VH CDR1; SEQ ID NO: 13); NIYPSDSYT ( VH CDR2; SEQ ID NO: 14) and TRNGVEGYPHYYAME ( VH CDR3; SEQ ID NO: 15) .The VL CDR amino acid sequences of anti-CD137 antibody BBK2 ( including ch-BBK2) are as follows: SQDLSNH ( VL CDR1; SEQ ID NO: 16); YYTS ( VL CDR2; SEQ ID NO: 17) and CQQGYTLPY ( VL CDR3; SEQ ID NO: 18).
【０１４９】
Alternatively, the CDR regions of BBK2 can be defined according to Kabat numbering .Kabat番号付けによって定義されるようなCDRは、重鎖および軽鎖配列の各々について以下に記載される(以下に太字で記載される)。The variable regions of BBK2 are italicized .
GPSYGNTYYGVSSKNTYGVSSKYGNTKGPSYVSSSLYGFPVTKVSSSLVGPSVTVTCVTCVVTCHEVKNWVVVEGVTKNAKTKPREEQYNSTVLTVLHQDWLNKVSKYCKVSNKALPAEPISKAKAKAKAKAKAKAKA PRQVSLTKYPSDIAVENGQPENYNKTPVLDSDGSFFLYSKLTKVDSRWQGNVFSCSVHEALHNHYTQKSLSPGK(ch-BK2重鎖;配列番号(SEQ ID NO): 11)
LSSASTQLTIGQTYLLYTGQYTQPDTVATLLETVAFCYTQFCYTQGFCYTLYTKGGGGTKVARTAPVPSFPSFPSFPIQSVFPSDEQLKSGTASVLLNFYPREAKVQWKNALQNSQNSGNSQESQESVTESQDSKDSTYTSSTLSTLSKADYEKVYACEVTHQGLSSPVTSFNRGEC(ch-BK2軽鎖;配列番号(SEQ ID NO): 12)
【０１５０】
Thus, in one embodiment, the VH CDR amino acid sequences of anti-CD137 antibody BBK2 ( including ch-BBK2) are as follows: SYWIN ( VH CDR1; SEQ ID NO: 19); NIYPSDSYTNYNQKFKD ( VH CDR2; SEQ ID NO: 20) and NGVEGYPHYYAMEY ( VH CDR3; SEQ ID NO: 21), and the VL CDR amino acid sequences of anti-CD137 antibody BBK2 ( including ch-BBK2) are as follows: RASQDLSNHLY ( VL CDR1; SEQ ID NO: 23); YTSRLHS ( VL CDR2; SEQ ID NO: 24) and QQGYTLPYT ( VL CDR3; SEQ ID NO: 25) .
【０１５１】
The heavy chain variable region of BBK2 is set forth in SEQ ID NO: 22 as QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWINWVKQRPGQGLEWIGNIYPSDSYTNYNQKFKDKATLTVDKSSNTVYMQLNSPTSEDSAVYYCTRNGVEGYPHYYAMEYWGQGTSVTVSS .The light chain variable region of BBK2 is set forth in SEQ ID NO: 26 as DIQMTQTTSALSASLGDRVTIGCRASQDLSNHLYWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTIRNLEQEDVATYFCQQGYTLPYTFGGGTKLEIK .抗-CD137抗体(抗-CD137 ADCを含む)は、配列番号(SEQ ID Nos): 22および26にそれぞれ記載されるような重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸配列を含み得る。
【０１５２】
In one embodiment, the anti-CD137 antibody, e.g., a chimeric ( ch-BBK2) antibody or a humanized BBK2 antibody, comprises a heavy chain variable region comprising a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21; and comprises a light chain variable region comprising a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25 .
【０１５３】
In one embodiment, the anti-CD137 antibody, e.g., a chimeric ( ch-BBK2) antibody or a humanized BBK2 antibody, comprises a heavy chain variable region comprising a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15; and comprises a light chain variable region comprising a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 .
【０１５４】
Thus, BBK2, humanized BBK2, or chimeric BBK2 antibodies can be used in the anti-CD137 ADCs and methods described herein .これらの抗体の各々は、当技術分野で公知の方法および本明細書中に記載されるものを使用して、以下に記載される細胞毒素のいずれかに結合され得る。
【０１５５】
種々の他の抗-CD137抗体が当該分野で公知であり、そして本明細書中に記載される方法において有益である。例えば、ある特定の実施形態において、抗-CD137抗体はADG106(例えば、WO2019105468、US20190055314、WO2019037711、WO2019036855に記載されるように); AGEN2373(例えば、WO2018191502、US20180344870に記載されるように); ATOR-1017(例えば、WO2018091740、US20180118841)PE0166(例えば、Songらに記載されるように)から選択される。AACR 2019、Abstract 2397/21; 例えば、WO2004010947、WO2005035584、US20090068192、US4786290、US20100183621、US20100183621、US20141494、US9382328、US20140193422、WO20160029073、US2016036898、WO2017181034、US20190062445、Chin et alNature communications.9.1(2018): 4679; Segal et al.に記載されているように。臨床がん研究。23.8(2017): 1929-1936.); およびutomilumab(PF-05082566、MOR-7480としても知られている;例えば、WO2012032433、US20120237498、US20140178368、WO2012145183、WO2015119923、WO2015179236、US20160152722、US20190031765、WO2017130076、Chinら、Nature communications.9.1(2018):4679; Segalらに記載されている)。臨床がん研究。24.8(2018):1816-1823; サーモフィッシャーサイエンティフィックら。がん免疫学、免疫療法。61.10(2012):1721-1733)、これらの各々は、参照により組み込まれる。
【０１５６】
他の抗-CD137抗体は例えば、WO2019020774、WO2017077085、US20180327504、US2019009488、US20190090015508、WO20190071510、WO2018127787、US1018025584、WO2018017761、WO20130149301、WO201908156740、US20160244528、WO2016134358、US20170226215、US20160083474、WO2017049452、US20180282422、WO2015188047、WO2010132389、US20176722、US20110177104、WO20110310663、US20080305113、US20080008716に記載されている。US782988、US20090041763、WO2006126835、US20030096976、US20030223989、US20060182744、WO1996029348、Soderstromet al. Circulation J.81.12(2017):1945-1952; Makkoukら。Annals of Oncology 28.2(2016):415-420; Martinez-Foreroら。Jof Immunology. 190.12(2013):6694-6706; Dubrotら。がん免疫学、免疫療法。59.8(2010):1223-1233;これらの各々は、参考として援用される。
【０１５７】
ある実施形態に、抗-CD137抗体は、本明細書に記載される抗-CD137抗体の重鎖、および本明細書に記載される抗-CD137抗体の軽鎖可変領域を含む。ある実施形態に、抗-CD137抗体は、本明細書に記載の抗-CD137抗体のCDR1、CDR2およびCDR3を含む重鎖、ならびに本明細書に記載の抗-CD137抗体のCDR1、CDR2およびCDR3を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１５８】
別の実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントが本明細書中の抗-CD137抗体に対して少なくとも95%のアイデンティティ、例えば、本明細書中の抗-CD137抗体に対して少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、または100%のアイデンティティを有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。特定の実施形態において、抗体は本明細書中の抗-CD137抗体のHC可変ドメインを含む改変重鎖(HC)可変領域、またはその変異体を含み、この変異体は(i)1、2、3、4または5アミノ酸の置換、付加または欠失において抗-CD137抗体と異なる;(ii)多くとも5、4、3、2または1アミノ酸の置換、付加または欠失において抗-CD137抗体と異なる;(iii)1-5、1-3、1-2、2-5または3-5アミノ酸の置換、付加または欠失において抗-CD137抗体と異なる;および/または(iv)抗-CD137抗体と少なくとも約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるアミノ酸配列を含み、(iv)-(iv)のいずれかにおいて、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換または非-であってもよい。保存的アミノ酸置換;および改変重鎖可変領域は抗体のCD137結合特異性を保持しながら、抗-CD137抗体の重鎖可変領域と比較して増強された生物学的活性を有し得る。
【０１５９】
本明細書中に記載される細胞毒素と組み合わせて使用され得る他の抗-CD137抗体は当該分野で公知の技術(例えば、ハイブリドーマ産生)を使用して同定され得る。ハイブリドーマは、マウスシステムを用いて調製することができる。免疫化およびその後の融合のための脾細胞の単離のためのプロトコルは、当該分野で公知である。ハイブリドーマ生成のための融合パートナーおよび手続もまた公知である。ヒト抗-CD137抗体は、HuMAb-マウス(R)またはXenoMouseTMで生成することもできる。抗-CD137抗体を作製する際に、CD137抗原を単離および/または精製する。CD137抗原は、CD137の細胞外ドメインからのCD137のフラグメントであり得る。動物の免疫化は、当技術分野で公知の任意の方法によって行うことができる。例えば、HarlowおよびLane, 抗体: A Laboratory Manual、New York: Cold Spring Harbor Press、1990を参照されたい。マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシおよび馬などの動物を免疫するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、Harlowおよび車線、上記および米国特許を参照のこと。有しない. 5,994,619。CD137抗原をアジュバントとともに投与して免疫反応を刺激することができる。当技術分野で公知のアジュバントには、完全または不完全フロイントアジュバント、RIBI(ムラミルジペプチド)またはISCOM(免疫刺激複合体)が含まれる。CD137抗原で動物を免疫した後、免疫した動物から単離した細胞から抗体産生不死化細胞株を調製する。免疫化後、動物を屠殺し、そしてリンパ節および/または脾臓B細胞を、当該分野で公知の方法(例えば、癌遺伝子導入、癌原性ウイルス形質導入、発癌性または変異化合物への露光、不死化細胞(例えば、骨髄腫細胞)との融合、および腫瘍サプレッサー遺伝子の不活性化)によって不死化する。例えば、Harlowおよび車線、前出を参照のこと。ハイブリドーマは、強固な増殖、高抗体産生、および所望の抗体特性を含む、所望の特性について選択、クローニング、およびさらにスクリーニングされ得る。
【０１６０】
抗-CD137抗体は、本発明によって提供されるCD137結合分子のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子から生成され得る。ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列は、抗体の任意の一部、例えばCDR、1つ、2つ、または3つのCDRを含む配列、重鎖の可変領域、軽鎖の可変領域であってもよく、または全長重鎖または全長軽鎖であってもよい。本開示の核酸は例えば、DNAまたはRNAであり得、イントロン配列を含んでも含まなくてもよい。典型的には、核酸はcDNA分子である。
【０１６１】
いくつかの実施形態に、抗-CD137抗体(またはそのフラグメント)は、定義された血清半減期を有する。例えば、抗-CD137抗体(またはそのフラグメント)は、ヒト患者において約1~24時間の血清半減期を有し得る。このような抗-CD137抗体を含むADCはまた、例えば、ヒト患者において約1~24時間の血清半減期を有し得る。血清レベルの計測による薬物動態解析は、当技術分野で公知のアッセイによって行うことができる。
【０１６２】
本明細書中に記載されるADCと関連して使用するための抗体は、本明細書中に記載される抗体、抗体フラグメントのCDRまたはその等価な領域の1つ以上または全てを含む、Fcドメインを含むかまたは欠損する抗体フラグメントのような、上記に記載されるそれらの抗体の変形例を含む。
【０１６３】
抗体識別方法
CD137に結合し得る抗体、抗体フラグメントのライブラリのハイスループットスクリーニングのための方法は例えば、同種細胞治療の拒絶を処置剤予防するために有益である成熟因子を同定および親和性するために使用され得る。このような方法には、とりわけ、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、イーストディスプレイ、哺乳動物細胞ディスプレイ、リボソームディスプレイ、mRNAディスプレイ、およびcDNAディスプレイなどの、当技術分野で公知のインビトロディスプレイ技術が含まれる。生物学的に関連する分子に結合する抗体または抗原結合フラグメントを単離するためのファージディスプレイの使用は例えば、Feliciら、Biotechnolにおいて概説されている。Annual Rev。1:149-183、1995; Katz、Annual Rev. Biophys. Biomol. 構造。26:27-45, 1997; 1997;およびHoogenboomら、Immunotechnology 4:1-20、1998、これらの各々の開示は、インビトロディスプレイ技術に関連するので、参照により本明細書に組み込まれる。ランダム化コンビナトリアル・ペプチド・ライブラリはKay、Perspectに記載されるように、細胞表面抗原に結合するポリペプチドを選択するために構築された。創薬デス。2:251-268, 1995年およびKayら、Mol. ダイバー。1:139-140, 1996, 1996、これらの各々の開示は、抗原結合分子の発見に関連するので、参照により本明細書に組み込まれる。タンパク質(例えば、多量体タンパク質)は機能的分子として首尾よくファージディスプレイされている(例えば、EP 0349578; EP 4527839;およびEP 0589877、ならびにChiswellおよびMcCafferty、Trends Biotechnolを参照のこと)。10:80-84 1992, 1992、これらの各々の開示は、抗原結合分子の発見のためのインビトロディスプレイ技術の使用に関するので、参照により本明細書に組み込まれる。さらに、機能的抗体フラグメント(例えば、高速原子衝撃およびscFvフラグメント)はインビトロディスプレイフォーマットにおいて発現されている(例えば、McCaffertyら、Nature 348:552554、1990; Barbasら、Procを参照のこと)。Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982、1991;およびClacksonら、Nature 352:624-628、1991(これらの各々の開示は、抗原結合分子の発見のためのインビトロディスプレイプラットフォームに関連するので、本明細書中に参考として援用される)。ヒト抗-CD137抗体は例えば、HuMAb-マウス(R)またはXenoMouseTMにおいて生成することもできる。これらの技術はとりわけ、CD137に結合し、次いで、患者における造血細胞を枯渇させるために使用され得る、抗体または抗体フラグメントの親和性を同定他改善するために使用され得る。
【０１６４】
In vitroディスプレイ技術に加えて、計算モデル化技術を使用して、抗-CD137抗体、または例えば、US 2013/0288373に記載された手順を使用して、インシリコスクリーニング中の抗体フラグメントを設計および同定することができ、その開示は抗-CD137抗体を同定するための分子モデル化方法に関するものとして、本明細書に組み込まれる。例えば、コンピューターモデル化技術を使用して、当業者のある者はCD137上の特異的エピトープ(例えば、CD137の細胞外エピトープ)を結合し得る分子について、インシリコで、抗体または抗体フラグメントのライブラリを画面し得る。
【０１６５】
さらなる技術を使用して、細胞(例えば、T細胞)の表面上のCD137に結合し、そして細胞によって、例えば、レセプター媒介エンドサイトーシスによってインターナライズされる抗体または抗体フラグメントを同定し得る。例えば、上記のインビトロディスプレイ技術は造血幹細胞の表面上のCD137に結合し、続いて内在化される抗体または抗体フラグメントについてスクリーニングするように適合され得る。ファージディスプレイは、このスクリーニングパラダイムと組み合わせて使用され得る1つのこのような技術を表す。CD137に結合し、続いて造血幹細胞によって内在化される抗-CD137抗体または抗体フラグメントを同定するために、当業者のある者はウィリアムズ(Williams)ら、白血病19:1432-1438,2005に記載されるファージディスプレイ技術を使用し得る。例えば、当技術分野で公知の突然変異誘発方法を使用して、とりわけscFvフラグメント、Fabフラグメント, ダイアボディ,トリアボディ、および10 Fn3ドメインなどの抗体、抗体フラグメント、またはランダム化アミノ酸カセットを含有するリガンド(例えば、CDRもしくはその等価領域の1つ以上、またはすべて、または抗体もしくは抗体フラグメント)を符号化する組換えファージ・ライブラリを産生することができる。抗体または抗体フラグメントの骨格領域、ヒンジ、Fcドメイン、および他の領域は例えば、ヒト生殖系列抗体配列またはヒト生殖系列抗体と比較してわずかな変異しか示さない配列を有することによって、ヒトにおいて非免疫原性であるように設計され得る。
【０１６６】
本明細書中に記載されるか、または当該分野で公知のファージディスプレイ技術を使用して、ファージ粒子に共有結合したランダム化抗体または抗体フラグメントを含むファージ・ライブラリは例えば、最初にファージ・ライブラリをブロッキング薬剤(例えば、抗体を符号化するファージ、または抗体フラグメントを除去するために、乳タンパク質、ウシ血清アルブミン、および/またはIgG)とインキュベートし、Fcドメインに結合する抗体またはそのフラグメントを符号化するファージと非特異的タンパク質結合を示すファージ、および次いでファージ・ライブラリを造血幹細胞の集団(CD137+)とインキュベートすることによって、CD137抗原とインキュベートされ得る。CD137特異的抗体または抗体フラグメントが細胞表面CD137に結合し、続いて造血幹細胞によって内部移行されるのに十分な時間(例えば、4℃で1時間など、4℃で30分~6時間)、ファージ・ライブラリを、例えば、冷(4℃)0.1Mグリシン幹細胞、pH 2.8で洗うことによって、造血幹細胞への結合およびそれによる内部移行を可能にするのに十分なCD137親和性を示さない抗体または抗体フラグメントを含むファージを、造血バッファーとインキュベートすることができる。造血幹細胞によって内在化された抗体または抗体フラグメントに結合したファージは例えば、細胞を溶解し、細胞培養培地から内在化ファージを回収することによって同定することができる。次いで、ファージは例えば、当該分野で公知の方法を使用して、2×YT媒体中で回収されたファージと共に細菌細胞をインキュベートすることによって、細菌細胞中で増幅され得る。次いで、この媒体から回収されたファージは例えば、ファージゲノム内に挿入された抗体または抗体フラグメントを符号化する遺伝子の核酸配列を決定することによって特徴付けられ得る。コードされた抗体または抗体フラグメントは続いて、化学合成(例えば、抗体フラグメント、例えば、scFvフラグメント)または組換え発現(例えば、全長抗体)によって新たに調製され得る。
【０１６７】
調製された抗体または抗体フラグメントの内部移行能力は例えば、当該分野で公知の放射性核種内部移行アッセイを使用して評価され得る。例えば、18 F、75 Br、 77 Br、122 I、 123 I、124 I、 125 I、抗体I、抗体フラグメントI、211、At、67 Ga、111、In、99 Tc、169 Yb、186 Re、64 Cu、129 Cu、131 Lu、77 As、72 As、86 Y、 90 Y、89 Zr、212 Bi、213 Bi、または67 Acなどの放射性同位体を組み込むことによって、本明細書に記載されるか、または当技術分野で公知のインビトロディスプレイ技術を使用して同定される抗-CD137 225または177を官能化することができる。例えば、18 F、75 Br、 77 I、 123 I、 125 I、129 I、131 Atなどの放射性ハロゲンは電解ハロゲン試薬を含むポリスチレンビーズなどの122を使用して、211、I、 77、I、75、At、抗体、または抗体フラグメントに取り込むことができる(例えば、ヨードネーション124、サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社、ケンブリッジ、MA)。放射標識抗体、そのフラグメント、またはADCは内在化を可能にするのに充分な時間(例えば、4℃で1時間など、4℃で30分~6時間)、造血幹細胞とともにインキュベートされ得る。次いで、細胞を洗浄して、(例えば、冷(4℃)0.1Mグリシンバッファー(pH 2.8)を使用して)非内在化抗体またはそのフラグメントを除去することができる。内部抗体または抗体フラグメントは回収された洗浄バッファーの放出された照射(例えば、γ線)と比べて、得られた造血幹細胞の放出された照射(例えば、γ線)を検出することによって同定され得る。前記の内在化アッセイはまた、ADCを特徴付けるために使用され得る。
【０１６８】
抗体は例えば、米国特許に記載されるように、組換え方法および組成物を使用して産生され得る。有しない. 4,816,567。ある実施形態に、本明細書に記載の抗-CD137抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸分子はVLを含むアミノ酸配列および/または本抗体のVHを含むアミノ酸配列(例えば、本抗体の軽鎖および/または重鎖)をコードし得る。更なる実施形態において、このような核酸を含む1つ以上のベクター(例えば、発現ベクター)が提供される。更なる実施形態において、このような核酸を含む宿主細胞が提供される。1つのこのような実施形態において、宿主細胞は(1)本抗体のVLを含むアミノ酸配列および本抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または(2)本抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸配列および本抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクターを含む(例えば、形質転換されている)。ある実施形態に、宿主細胞は真核生物、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞またはリンパ系細胞(例えばY0、NS0、Sp20細胞)である。ある実施形態に、抗CLL-1抗体を作製する方法が提供され、ここで、この方法は抗体の発現に適した条件下で、上記に提供されるような抗体を符号化する核酸を含む宿主細胞を培養すること、および任意に、宿主細胞(または宿主細胞培養培地)から抗体を回収することを含む。
【０１６９】
抗-CD137抗体の組換え産生のために、抗体を符号化する核酸(例えば、上記のよう)は、単離され、そして宿主細胞におけるさらなるクローニングおよび/または式のために1つ以上のベクターに挿入される。このような核酸は従来の手順を使用して(例えば、本抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって)容易に単離され得、そして配列決定され得る。
【０１７０】
抗体を符号化するベクターのクローン化または発現に適した宿主細胞には、本明細書に記載の原核生物または真核生物細胞が含まれる。例えば、抗体は特にグリコシル化およびFcエフェクタ機能が必要とされない場合に、inバクテリアで産生され得る。バクテリアにおける抗体フラグメントおよびポリペプチドの発現については、例えば、米国特許を参照のこと。番号。5,648,237, 5,789,199, 5,789,199、5,840,523。発現後、抗体を、可溶性画分中の細菌細胞糊から単離し、さらに精製することができる(Charlton, 方法in Molecular Biology、Vol。248(B.K.CLo、ed、Humana Press、Totowa、NJ、2003)、pp。245-254を参照されたい。
【０１７１】
脊椎動物細胞も宿主として使用することができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合された哺乳動物細胞株が有益であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例はSV40(COS-7)によって形質転換されたサル腎臓CV1株;ヒト胚腎臓株(293または293細胞、例えば、Grahamら、JGen Virol.36:59(1977)に記載される);乳児ハムスター腎臓細胞(BHK);マウスセルトリ細胞(TM4細胞、例えば、Mather、BiolReprod.23:243-251(1980)に記載される);サル腎臓細胞(CV1);アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO-76);ヒト子宮頸部がん(carcinoma)細胞(HELA);イヌ腎臓細胞(MDCK;バッファローラット肝臓細胞(BRL 3A);ヒト肺細胞(W138);ヒト肝臓細胞(Hep G2);マウス乳房腫瘍(MMT 060562);TRI細胞、例えば、Matherら、Annals N.Y.に記載される)である。Acad. Sci. 383:44-68(1982);(1982); MRC 5細胞;およびFS4細胞。他の有用な哺乳動物宿主細胞株はチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞(DHFRCHO細胞を含む(ウルラウブら、ProcNatlAcadSciUSA 77:4216(1980));および骨髄腫細胞株(例えば、Y0、NS0およびSp2/0)を含む)。抗体産生に適した一定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、YazakiおよびWu, 方法in Molecular Biology、Vol.248(BKCLo、ed、Humana Press、Totowa、NJ), pp.255-268(2003)を参照のこと。ある実施形態に、宿主細胞は真核生物、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞またはリンパ系細胞(例えばY0、NS0、Sp20細胞)である。
【０１７２】
細胞毒素
種々の細胞毒素を、本明細書中に記載される併用療法における使用のために、リンカーを介して抗-CD137抗体に結合体化し得る。特に、抗-CD137ADCは細胞傷害性部分(または細胞毒素)に結合された(すなわち、リンカーによって共有結合された)抗体(またはその抗原結合フラグメント)を含む。本明細書中で使用される場合、用語「細胞傷害性」、「細胞傷害性性部分」および「医薬品」は、互換的に使用される。様々な実施形態において、細胞毒性部分は共役中で結合される場合、減少した細胞毒性を示すか、または細胞毒性を示さないが、リンカーからの切断後に細胞毒性を再開する。様々な実施形態において、細胞毒性部分は、リンカーからの切断なしに細胞毒性を維持する。いくつかの実施形態に、細胞傷害性分子は抗体またはそのフラグメントの細胞内取り込み後に、細胞毒素がその細胞内標的に接近し、例えば、T細胞死を媒介することができるように、本明細書に開示されるような細胞内在化抗体またはその抗原結合フラグメントに結合される。
【０１７３】
したがって、本発明のADCは、抗体またはその抗原結合フラグメント(Ab)が化学的な部分構造(Z)を介してリンカー(L)に細胞傷害性部分(「薬剤」、D)に結合(共有結合)されている、一般式Iのものであってもよい
Ab-(Z-L-D)n(I)。
【０１７４】
したがって、その抗体または抗原結合フラグメントは、例えば約1~約20の範囲であり得る、抗体当たりの細胞毒素の平均数を表す整数nによって示されるような多数の薬物部分に結合され得る。任意の数の細胞毒素、例えば、約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、または約8を抗体に結合させることができる。いくつかの実施形態に、nは1~4である。いくつかの実施形態に、nは1~3である。いくつかの実施形態に、nは約2である。いくつかの実施形態に、nは約1である。共役反応からのADCの調製物中の抗体当たりの薬物部分の平均個数は、マススペクトロスコピー、ELISAアッセイ、およびHPLCのような従来の手段によって特徴づけることができる。nに関するADCの定量的分布も決定することができる。場合によってはnが他の薬物負荷量を有するADCからの特定の数値である均質ADCの分離、浄化、および特性評価は逆相HPLCまたは電気泳動のような手段によって達成され得る。
【０１７５】
いくつかの抗-CD137ADCについて、nは、抗体上の付着部位の数によって制限され得る。例えば、結合がシステインチオールである場合、抗体は、1つまたはいくつかのシステインチオール基のみを有してもよく、またはリンカーが結合され得る1つまたはいくつかの十分に反応性のチオール基のみを有する可能性がある。一般に、抗体は薬物部分に連結され得る多くの遊離および反応性システイン基を含まず;主に、抗体中のシステイン残基は、ジスルフィド架橋として存在する。ある特定の実施形態に、抗体は、部分的または全還元条件下で、ジチオトレイトール(DTT)またはトリカルボニルエチルホスフィン(TCEP)などの還元剤で還元して、反応性システインチオール基を生成することができる。ある特定の実施形態に、より高い薬物負荷(例えば、n>5)は、特定の抗体-薬物結合体の凝集、不溶性、毒性、または細胞透過性の損を引き起こし得る。
【０１７６】
ある特定の実施形態に、コンジュゲーション反応中に抗体にコンジュゲートされる薬物部分の数は理論上の最大数より少ない。抗体は例えば、以下に議論されるように、薬物-リンカー中間体またはリンカー試薬と反応しないリシン残基を含み得る。最も反応性の高いリジン基のみがアミン反応性リンカー試薬と反応することができる。ある特定の実施形態に、抗体は、リジンまたはシステインのような反応性求核基を明らかにするために変性条件下に置かれる。
【０１７７】
ADCの負荷(薬剤/抗体比)は種々の方法で、例えば、(i)抗体に対する薬剤-リンカー中間体またはリンカー試薬のモル過剰を制限すること、(ii)共役反応時間または温度を制限すること、(iii)システインチオール修飾のための部分的または制限的還元条件下で、(iv)システイン残基の数および位置がリンカー-薬剤結合の数および/または位置の制御のために修飾されるように、抗体のアミノ酸配列を組換え技術によって操作することによって、制御され得る。
【０１７８】
本明細書に装置の組成物および方法と共に使用するのに適した細胞毒素には、とりわけ、当技術分野で公知のDNA挿入剤(例えば、アントラサイクリン)、紡錘体を破壊することができる薬剤(例えば、ビンカ・アルカロイド, メイタンシン,メイタンシノイド、およびその誘導体)、RNAポリメラーゼ阻害剤(例えば、α-アマニチンなどのアマトキシン、およびその誘導体)、ならびにタンパク質生合成を破壊することができる薬剤(例えば、サポリンおよびリシンA鎖などのrRNA N-グリコシダーゼ活性を示す薬剤)が含まれる。
【０１７９】
いくつかの実施形態に、細胞毒素は微小管結合剤(例えば、メイタンシンまたはメイタンシノイド)、アマトキシン, シュードモナス外毒素A、deブーガニン、ジフテリア毒素、サポリン、アウリスタチン、アントラサイクリン、カリケアマイシン、イリノテカン、SN-38、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、二量体、インドリノベンゾジアゼピン、その変異体、または本明細書に記載もしくは当技術分野で公知の別の細胞毒性化合物である。
【０１８０】
いくつかの実施形態に、抗体-薬物結合体の細胞毒素はRNAポリメラーゼ阻害剤である。いくつかの実施形態に、RNAポリメラーゼ阻害剤はアマトキシンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態に、本明細書に開示される抗体-薬物結合体の細胞毒素は、α-アマニチン、βアマニチン、γアマニチン、εアマニチン、アマニン、アマニンアミド, アマヌリン,アマヌリン酸,プロアマヌリンまたはその誘導体などのアマトキシンまたはその誘導体である。
【０１８１】
本方法において有効な抗-CD137 ADCにおいて使用され得る細胞毒素に関するさらなる細部は、以下に記載される。
【０１８２】
アマトキシン
いくつかの実施形態に、RNAポリメラーゼ阻害剤はアマトキシンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態に、本明細書に開示される抗体-薬物結合体の細胞毒素は、α-アマニチン、βアマニチン、γアマニチン、εアマニチン、アマニン、アマニンアミド, アマヌリン,アマヌリン酸,プロアマヌリンまたはその誘導体などのアマトキシンまたはその誘導体である。種々の天然に存在するアマトキシンの構造は式IIおよび付随する表1によって表され、そして例えば、Zanottiら、Int.に開示される。J. ペプチドタンパク質Res.30、1987、450-459.
【化９】
2021530546.tif 000010
【０１８３】
【表１】
2021530546.tif 000011
【０１８４】
ある実施形態に、細胞毒素はアマニチンまたはその誘導体である。ある実施形態に、細胞毒素はα-アマニチンまたはその誘導体である。
【０１８５】
アマトキシンまたはその誘導体上の多くの位置は、連結部分L、したがってその抗体または抗原結合フラグメントを共有結合させる位置として働くことができる。いくつかの実施形態に、式IのADC中の細胞毒素は式(II)によるアマトキシンまたはその誘導体であり、ある実施形態に、ADCは式Ab-Z-L-Amによって表され、ここで、AbはCD137に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであり、Lはリンカーであり、Zは化学的な部分構造であり、Amはアマトキシンである。ある特定の実施形態に、リンカーアマトキシン共役Am-L-Zは、式(III)で表される
【化１０】
2021530546.tif 000012
である:
R1はH、OH、ORA、またはORC;
R2はH、OH、ORB、またはORC;
RA およびRBは、存在する場合、それらが結合している酸素原子と一緒になって、5員ヘテロシクロアルキル基を形成する;
R3はH、RC、またはRD;
R4、R5,  R6、およびR7 はそれぞれ独立してH、OH、ORC、ORD、RC、またはRD;
R8はOH、NH2、ORC、ORD、NHRC、またはNRC RD;
R9はH、OH、ORC、またはORD;
Qは-S-、-S(O)-、または-SO2 -;
RCは-L-Z'または-L-Z-Abであり、ここでLは任意に置換されたC 1 -C 6アーキテクト、任意に置換されたC 1 -C 6ヘテロアルケニール、任意に置換されたC 2 -C 6アルケニル、任意に置換されたC 2 -C 6アルキニル、任意に置換されたC 2 -C 6ヘテロアルキニール、任意に置換されたシクロアルキネル、任意に置換されたアリールであるか、または-(CH 2)m O)C 2 -C 6-を含む。ここで、mおよびnはそれぞれ1、2、3、4、5、6、7、8、9および10から個別に選択される。またはそれらの組合せである。Z'が反応性部分であり、Z'はAb上の機能的基とZ'の結合反応から生じる化学的な部分構造である
RDは、C 1 -C 6アルキル、C 1 -C 6ヘテロアルキル、C 2 -C 6アルケニル、C 2 -C 6ヘテロアルケニル、C 2 -C 6アルキニル、C 2 -C 6ヘテロアルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、C 1 -C 6ヘテロアルキル、C 2 -C 6アルケニル、C 2 -C 6ヘテロアルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、C 1 -C 6、またはヘテロアリールがアルキル、C 1 -C 6、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルキルアリール、ヘテロアリール、アミノ、アンモニウム、アシル、アシルオキシ、アシルアミノカルボニル、アミノカルボニル、C 2 -C 6アルキニル、C 2 -C 6、カルバメート、アリール、ヘテロアリール、C 1 -C 6、C 1 -C 6、ヒドロキシル、アルコキシ、C 2 -C 6アルケニル、C 2 -C 6、ハロゲン、カルボキシ、トリハロメチル、シアノ、ヒドロキシ、メルカプト、およびニトロからなる群からそれぞれ独立して選択される1~5個の置換基で置換されていてもよい、ヘテロアルキル、C 2 -C 6アルケニル、C 2 -C 6、ヘテロアルキニル、C 2 -C 6アルキニル、C 2 -C 6、ヘテロアルキニル、C 1 -C 6、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシル。
【０１８６】
式(III)はアマトキシンおよびリンカー、ならびにいくつかの実施形態に、リンカー、化学的な部分構造、および抗体を含む。
【０１８７】
いくつかの実施形態に、細胞毒素はアマトキシンであり、リンカーアマトキシンコンジュゲートまたは抗体リンカーアマトキシンコンジュゲートは式(IIIA)で表される:
【化１１】
2021530546.tif 000013
ここで:
R1はH、OH、ORA、またはORC;
R2はH、OH、ORB、またはORC;
RA およびRBは、存在する場合、それらが結合している酸素原子と一緒になって、5員ヘテロシクロアルキル基を形成する;
R3はH、RC、またはRD;
R4、R5,  R6、およびR7 はそれぞれ独立してH、OH、ORC、ORD、RC、またはRD;
R8はOH、NH2、ORC、ORD、NHRC、またはNRC RD;
R9はH、OH、ORC、またはORD;
Qは-S-、-S(O)-、または-SO2 -
RCは-L-Z'または-L-Z-Abであり、ここで、Lはリンカー、任意選択で置換されたC 1 -C 6の、置換されたC 1 -C 6のヘテロアルキ、任意選択で置換されたC 2 -C 6アルケニルのヘテロアルケニール、任意選択で置換されたC 2 -C 6アルキニル、置換されたC 2 -C 6のヘテロアルキニール、任意選択で置換されたシクロアルキ、任意選択で置換されたアリール、またはジペプチドを含む)m O)C 2 -C 6-であり、ここで、mおよびnはそれぞれ1、2、3、4、5、6、7、8、9および10から個別に選択される。またはそれらの組合せである。Z'が反応性部分であり、Z'はAb上の機能的基とZ'の結合反応から生じる化学的な部分構造である
RDは、C 1 -C 6アルキル、C 1 -C 6ヘテロアルキル、C 2 -C 6アルケニル、C 2 -C 6ヘテロアルケニル、C 2 -C 6アルキニル、C 2 -C 6ヘテロアルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、C 1 -C 6ヘテロアルキル、C 2 -C 6アルケニル、C 2 -C 6ヘテロアルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、C 1 -C 6、またはヘテロアリールがアルキル、C 1 -C 6、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルキルアリール、ヘテロアリール、アミノ、アンモニウム、アシル、アシルオキシ、アシルアミノカルボニル、アミノカルボニル、C 2 -C 6アルキニル、C 2 -C 6、カルバメート、アリール、ヘテロアリール、C 1 -C 6、C 1 -C 6、ヒドロキシル、アルコキシ、C 2 -C 6アルケニル、C 2 -C 6、ハロゲン、カルボキシ、トリハロメチル、シアノ、ヒドロキシ、メルカプト、およびニトロからなる群からそれぞれ独立して選択される1~5個の置換基で置換されていてもよい、ヘテロアルキル、C 2 -C 6アルケニル、C 2 -C 6、ヘテロアルキニル、C 2 -C 6アルキニル、C 2 -C 6、ヘテロアルキニル、C 1 -C 6、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシル。
【０１８８】
いくつかの実施形態に、共役体は1個のR C置換基を含む。
【０１８９】
いくつかの実施形態に、R A およびR Bは、それらが結合している酸素原子と一緒になって、次式の5員ヘテロシクロアルキル基を形成する:
【化１２】
2021530546.tif 000014
ここで、Yは-(C=O)-、-(C=S)-、-(C=NRE) -, または-(CRE RE’)-;
REおよびRE’は、それぞれ独立にH、C1 -C6アルキレン-RC、C2 -C6アルキニーレン、ヘテロアルキニーレン-RC、C2 -C6アルキニーレン、ヘテロアルキニーレン-RCアルキニーレン、ヘテロアルキニレン、アルキニレン-RC、シクロアルキレン-RC、C1 -C6、アルキニール、アルキニール、シクロ式-RC、C1 -C6がアルキニール、アルキニール、シクロ式、アルキニール、ヘテロアルキリール、アルキニール、アルキニール、アノニュ、アサイロ、アシーラミノ、アルキノ、アルカムネート、アリール、スルフィニール、アルキノル、ハロージュンからなる群から独立して選択される1から5の代替物で置換される。Cyxy、trihalomethyl、cyano、hydro、mercapto、and nitro.
【０１９０】
式(IIIA)はアマトキシンおよびリンカー、ならびにいくつかの実施形態に、リンカー、化学的な部分構造、および抗体を含む。
【０１９１】
いくつかの実施形態に、細胞毒素はアマトキシンまたはその誘導体であり、アマトキシンリンカー結合体は、式IIIAによって表される:
R1はH、OH、ORA、またはORC;
R2はH、OH、ORB、またはORC;
RA とRBが存在する場合、それらがバインドされているアトムと一緒に結合して形成される:
【化１３】
2021530546.tif 000015
ここで、R3 はHまたはRC である。
【０１９２】
いくつかの実施形態に、細胞毒素はアマトキシンまたはその誘導体であり、複合体は、式IIIAによって表される
R1はH、OH、ORA、またはORC;
R2はH、OH、ORB、またはORC;
RAとRBが存在する場合、それらがバインドされているアトムと一緒に結合して形成される:
【化１４】
2021530546.tif 000016
ここで
R3がHまたはRC;
R4とR5はそれぞれ個別にH、OH、ORC、RC、またはORD;
R6とR7はそれぞれH;
R8はOH、NH2、ORC、またはNHRC;
R9はHまたはOHである
ここで、RCおよびRDは上記で定義された通りである。
【０１９３】
いくつかの実施形態に、細胞毒素はアマトキシンまたはその誘導体であり、アマトキシンリンカー結合体は、式IIIAによって表される:
R1はH、OH、またはORA;
R2はH、OH、またはORB;
RA とRBが存在する場合、それらがバインドされているアトムと一緒に結合して形成される:
【化１５】
2021530546.tif 000017
ここで
R3、R4、R6、およびR7はそれぞれH;
R5がORC;
R8がOHまたはNH2;
R9がHまたはOH;
Qは-S-、-S(O)-、または-SO2 -; および
ここで、RC およびRDは上記で定義された通りである。このようなアマトキシン共役は例えば、米国特許出願公開第2016/0002298号に記載されており、その開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０１９４】
いくつかの実施形態に、細胞毒素はアマトキシンまたはその誘導体であり、アマトキシンリンカー結合体は、式IIIAによって表される:
R1とR2 はそれぞれ独立してHまたはOHである;
R3がRC;
R4、R6、およびR7はそれぞれH;
R5は、H、OH、またはOC1 -C6のバイトである;
R8がOHまたはNH2;
R9がHまたはOH;
Qは-S-、-S(O)-、または-SO2 -; および
ここで、RC およびRDは上記で定義された通りである。このようなアマトキシンリンカー共役は例えば、米国特許出願公開第2014/0294865号に記載されており、その開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０１９５】
いくつかの実施形態に、細胞毒素はアマトキシンまたはその誘導体であり、アマトキシンリンカー結合体は、式IIIAによって表される:
R1とR2はそれぞれ独立してHまたはOHである;
R3、R6、およびR7はそれぞれH;
R4とR5はそれぞれ個別にH、OH、ORC、またはRC;
R8がOHまたはNH2;
R9がHまたはOH;
Qは-S-、-S(O)-、または-SO2 -; および
ここで、RCおよびRDは上記で定義された通りである。このようなアマトキシンリンカー共役は例えば、米国特許出願公開第2015/0218220号に記載されており、その開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０１９６】
いくつかの実施形態に、細胞毒素はアマトキシンまたはその誘導体であり、アマトキシンリンカー結合体は、式IIIAによって表される:
R1とR2はそれぞれ独立してHまたはOHである;
R3、R6、およびR7はそれぞれH;
R4とR5はそれぞれ独立してHまたはOHである;
R8はOH、NH2、ORC、またはNHRC;
R9がHまたはOH;
Qは-S-、-S(O)-、または-SO2 -; および
ここで、RCおよびRDは上記で定義された通りである。このようなアマトキシン共役は例えば、米国特許番号に記載されている。9,233,173 および9,399,681は、各開示を参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１９７】
いくつかの実施形態に、細胞毒素はアマトキシンまたはその誘導体であり、アマトキシンリンカー結合体は、式IIIBによって表される:
【化１６】
2021530546.tif 000018
ここで:
R1はH、OH、ORA、またはORC;
R2はH、OH、ORB、またはORC;
RA およびRBは、存在する場合、それらが結合している酸素原子と一緒になって、5員ヘテロシクロアルキル基を形成する;
R3はH、RC、またはRD;
R4、R5、R6、およびR7 はそれぞれ独立してH、OH、ORC、ORD、RC、またはRD;
R8はOH、NH2、ORC、ORD、NHRC、またはNRC RD;
R9はH、OH、ORC、またはORD;
Qは-S-、-S(O)-、または-SO2 -;
RCは-L-Z'または-L-Z-Abであり、式中、Lはリンカー、置換されていてもよいC 1 -C 6アルキル、置換されていてもよいC 1 -C 6ヘテロアルキル、置換されていてもよいC 2 -C 6アルケニル、置換されていてもよいC 2 -C 6ヘテロアルケニル、置換されていてもよいC 2 -C 6アルキニル、置換されていてもよいC 2 -C 6ヘテロアルキニル、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいヘテロシクロアルキル、ペプチド、ジペプチド、-(C=O)-、-((CH 2)mO) n(CH 2)m-であり、ここで、mおよびnはそれぞれ独立して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、および10から選択され;またはそれらの組合せであり;Z'は反応性部分であり、Z'はAb上の官能基とのカップリン
RDは、C 1 -C 6アルキル、C 1 -C 6ヘテロアルキル、C 2 -C 6アルケニル、C 2 -C 6ヘテロアルケニル、C 2 -C 6アルキニル、C 2 -C 6ヘテロアルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、C 1 -C 6ヘテロアルキル、C 2 -C 6アルケニル、C 2 -C 6ヘテロアルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、C 1 -C 6、またはヘテロアリールがアルキル、C 1 -C 6、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルキルアリール、ヘテロアリール、アミノ、アンモニウム、アシル、アシルオキシ、アシルアミノカルボニル、アミノカルボニル、C 2 -C 6アルキニル、C 2 -C 6、カルバメート、アリール、ヘテロアリール、C 1 -C 6、C 1 -C 6、ヒドロキシル、アルコキシ、C 2 -C 6アルケニル、C 2 -C 6、ハロゲン、カルボキシ、トリハロメチル、シアノ、ヒドロキシ、メルカプト、およびニトロからなる群からそれぞれ独立して選択される1~5個の置換基で置換されていてもよい、ヘテロアルキル、C 2 -C 6アルケニル、C 2 -C 6、ヘテロアルキニル、C 2 -C 6アルキニル、C 2 -C 6、ヘテロアルキニル、C 1 -C 6、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシル。
【０１９８】
式(IIIB)はアマトキシンおよびリンカー、ならびにいくつかの実施形態に、リンカー、化学的な部分構造、および抗体を含む。
【０１９９】
いくつかの実施形態に、R A およびR Bは、それらが結合している酸素原子と一緒になって、次式の5員ヘテロシクロアルキルを形成する:
【化１７】
2021530546.tif 000019
ここで、Yは-(C=O)-、-(C=S)-、-(C=NRE) -, または-(CRE RE’)-;
REおよびRE’は、それぞれ独立にH、C1 -C6アルキレン-RC、C2 -C6アルキニーレン、ヘテロアルキニーレン-RC、C2 -C6アルキニーレン、ヘテロアルキニーレン-RCアルキニーレン、シクロ-RC、C1 -C6アルキニーレン、ヘテロアルキニーレン、-RCシクロアルキレン、アルキニールC1 -C6、またはヘテロアリーレンの-RC、C1 -C6がアルキニール、アルキニール、シクロ式、アルキニール、アルキニール、ヘテロアルキリール、アルキニール、ヘテロアルキリール、アルキニール、アルキニール、アノニュ、アシル、アシル、アシーラミノ、アルキノ、アルカムネート、アルフィニール、アルキノニルからなる群から独立して選択される1~5個の代替物で置換される。Cyxy、trihalomethyl、cyano、hydro、mercapto、and nitro.
【０２００】
いくつかの実施形態に、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントは、式IIIBで表されるアマトキシンリンカー結合体またはその誘導体に結合される
R1はH、OH、ORA、またはORC;
R2はH、OH、ORB、またはORC;
RA およびRBは、存在する場合にはそれらが結合している酸素原子と一緒になって、次式の5員ヘテロシクロアルキルを形成する:
【化１８】
2021530546.tif 000020
ここで、R3 はHまたはRC である。
【０２０１】
いくつかの実施形態に、細胞毒素はアマトキシンまたはその誘導体であり、アマトキシンリンカー結合体は、式IIIBによって表される
R1はH、OH、ORA、またはORC;
R2はH、OH、ORB、またはORC;
RA およびRBは、存在する場合にはそれらが結合している酸素原子と一緒になって、次式の5員ヘテロシクロアルキル基を形成する:
【化１９】
2021530546.tif 000021
である
R3がHまたはRC;
R4とR5はそれぞれ個別にH、OH、ORC、RC、またはORD;
R6とR7はそれぞれH;
R8はOH、NH2、ORC、またはNHRC;
R9はHまたはOHである
ここで、RCおよびRDは上記で定義された通りである。
【０２０２】
いくつかの実施形態に、細胞毒素はアマトキシンまたはその誘導体であり、アマトキシンリンカー結合体は、式IIIBによって表される:
R1はH、OH、またはORA;
R2はH、OH、またはORB;
RA およびRBは、存在する場合にはそれらが結合している酸素原子と一緒になって、次式の5員ヘテロシクロアルキル基を形成する:
【化２０】
2021530546.tif 000022
である
R3、R4、R6、およびR7はそれぞれH;
R5がORC;
R8がOHまたはNH2;
R9がHまたはOH;
Qは-S-、-S(O)-、または-SO2 -; および
ここで、RCおよびRDは上記で定義された通りである。このようなアマトキシンリンカー共役は例えば、米国特許出願公開第2016/0002298号に記載されており、その開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０２０３】
いくつかの実施形態に、細胞毒素はアマトキシンまたはその誘導体であり、アマトキシンリンカー結合体は、式IIIBによって表される:
R1とR2 はそれぞれ独立してHまたはOHである;
R3がRC;
R4、R6、およびR7はそれぞれH;
R5は、H、OH、またはOC1 -C6のバイトである;
R8がOHまたはNH2;
R9がHまたはOH;
Qは-S-、-S(O)-、または-SO2 -; および
ここで、RCおよびRDは上記で定義された通りである。このようなアマトキシン共役は例えば、米国特許出願公開第2014/0294865号に記載されており、その開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０２０４】
いくつかの実施形態に、細胞毒素はアマトキシンまたはその誘導体であり、アマトキシンリンカー結合体は、式IIIBによって表される:
R1とR2はそれぞれ独立してHまたはOHである;
R3、R6、およびR7はそれぞれH;
R4とR5はそれぞれ個別にH、OH、ORC、またはRC;
R8がOHまたはNH2;
R9がHまたはOH;
Qは-S-、-S(O)-、または-SO2 -; および
ここで、RC およびRDは上記で定義された通りである。このようなアマトキシンリンカー共役は例えば、米国特許出願公開第2015/0218220号に記載されており、その開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０２０５】
いくつかの実施形態に、細胞毒素はアマトキシンまたはその誘導体であり、アマトキシンリンカー結合体は、式IIIBによって表される:
R1とR2はそれぞれ独立してHまたはOHである;
R3、R6、およびR7はそれぞれH;
R4とR5はそれぞれ独立してHまたはOHである;
R8はOH、NH2、ORC、またはNHRC;
R9がHまたはOH;
Qは-S-、-S(O)-、または-SO2 -; および
ここで、RCおよびRDは上記で定義された通りである。このようなアマトキシンリンカー共役は例えば、米国特許番号に記載されている。9,233,173 および9,399,681は、各開示を参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２０６】
アウリスタチン
本明細書中に記載される抗-CD137抗体およびその抗原結合フラグメントは、アウリスタチンである細胞毒素に結合体化され得る(米国特許第5,635,483号;第5,780,588号)。アウリスタチンは、微小管動態、GTP加水分解、および核と細胞の分裂を妨害する抗有糸分裂剤である(Woykeら(2001)抗菌薬)。薬剤と化学療法。45(12):3580-3584)そして、抗癌(米国特許第5,663,149号)および抗真菌活性(Pettitら(1998)Antimicrob)を有する。薬剤Chemother. 42:2961-2965). (米国特許第5,635,483号;第5,780,588号)。アウリスタチン医薬品部分は、ペプチド医薬品部分のN(アミノ)末端またはC(カルボキシル)末端を介して抗体に結合され得る(国際公開第02/088172号パンフレット)。
【０２０７】
例示的なアウリスタチンの実施形態は2004年3月28日に提示された米国癌研究協会の会報第45巻、要約数623に開示されたN末端結合モノメチル・アウリスタチン薬物部分DEおよびDF(それぞれ、MMAEおよびMMAF)を含み、その開示は、その全体が参考として明示的に援用される。
【０２０８】
例示的なアウリスタチンの実施形態は、MMAEである:
【化２１】
2021530546.tif 000023
ここで、波線は抗体-薬物または薬物-リンカー結合体(本明細書中に記載されるように、-L-Z-Abまたは-L-Z')のリンカーへの共有結合の点を示す。
【０２０９】
別の例示的なアウリスタチンの実施形態はMMAFである
【化２２】
2021530546.tif 000024
ここで、波線は米国特許出願公開第2005/0238649号に開示されているように、抗体リンカー結合体(本明細書に記載されているように、-L-Z-Abまたは-L-Z')のリンカーへの共有結合点を示す:
【０２１０】
アウリスタチンは、米国特許の方法に従って調製することができる。米国特許第5,635,483号。No.5,780,588; Pettitら(1989)JAm. 化学協会。111:5463-5465; Pettitら(1998)Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit、GR.ら。合成、1996、719-725; Pettit et al(1996)JChemSoc. Perkin Trans. 15:859-863; and Doronina (2003) Nat. Biotechnol. 21(7):778-784.
【０２１１】
メイタンシノイド
本明細書中に記載される抗体およびその抗原結合フラグメントは、微小管結合剤である細胞毒素に結合され得る。いくつかの実施形態に、微小管結合剤は、メイタンシン、メイタンシノイドまたはメイタンシノイドアナログである。メイタンシノイドは有糸分裂抑制因子であり、微小管と結合し、チューブリンの重合を阻害することによって作用する。メイタンシンは最初に、東アフリカ低木Maytenus serrataから単離された(米国特許第3,896,111号)。続いて、一定の微生物(例えば、メイタンシノールおよびC-3メイタンシノールエステル)もまた、メイタンシノイドを産生することが発見された(米国特許第4,151,042号)。合成メイタンシノールならびにその誘導体および類似体は例えば、米国特許に開示されている。番号。4,137,230; 4,248,870; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,748; 4,256,744,608; 4,265,814,267; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424。メイタンシノイド薬物部分は(i)発酵または化学修飾、発酵産物の誘導体化によって調製するために比較的アクセス可能であり、(ii)非ジスルフィドリンカーによる抗体への結合に適した官能基による誘導体化に従い、(iii)血漿中で安定であり、そして(iv)種々の腫瘍細胞株に対して効果的であるため、抗体薬物コンジュゲートにおいて魅力的な薬物部分である。
【０２１２】
適当なメイタンシノイドとしては、例えば、メイタンシノールのエステル、合成メイタンシノール、及びメイタンシノールアナログ及び誘導体が挙げられる。メイタンシノイド、メイタンシノール、およびメイタンシノールアナログ、ならびに誘導体のように、微小管形成を阻害し、哺乳動物細胞に対して非常に毒性である任意の細胞毒素が本明細書に含まれる。
【０２１３】
好適なメイタンシノールエステルの例としては、修飾芳香環を有するもの、および他の位置に修飾を有するものが挙げられる。このような好適なメイタンシノイドは、米国特許に開示されている。番号。4,137,230; 4,151,042; 4,151,042; 4,248,608; 4,256,744,267; 4,307,306; 4,308,268; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219 ; 4,450,254; 4,322,348; 4,362,663; 4,371,533; 5,208,020; 5,415,092; 5,585,499; 5,846,545; 6,333,410; 7,276,497;これらの各々は、メイタンシノイドおよびその誘導体に関連するので、本明細書中に参考として援用される。
【０２１４】
いくつかの実施形態に、本発明の抗体-薬物結合体(ADC)は、細胞毒性剤として、形式的にN 2'-デアセチル-N 2'-(3-メルカプト-1-オキソプロピル)-メイタンシンと呼ばれるチオール含有メイタンシノイド(DM1)を利用する。DM1は、以下の構造式IVで表される:
【化２３】
2021530546.tif 000025
【０２１５】
別の実施形態において、本発明の複合体はチオール含有メイタンシノイドN 2'-デアセチル-N 2'(4-メチル-4-メルカプト-1-オキソペンチル)-メイタンシン(例えば、DM4)を細胞毒性剤として利用する。DM4は、以下の構造式Vで表される:
【化２４】
2021530546.tif 000026
【０２１６】
立体障害チオール結合を含む側鎖を含む別のメイタンシノイドは、以下の構造式VIで表されるN 2'-デアセチル-N-2'(4-メルカプト-1-オキソペンチル)-メイタンシン(DM3と呼ばれる)である:
【化２５】
2021530546.tif 000027
【０２１７】
メイタンシノイドの各々は、米国特許に教示されている。番号。5,208,020 7,276,497もまた、本開示の結合体において使用され得る。この点に関して、5,208,020および7,276,697の開示全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２１８】
メイタンシノイド上の多くの位置は連結部分、従ってその抗体または抗原結合フラグメント(本明細書中に記載されるように、-L-Z-Abまたは-L-Z')を共有結合する位置として役立ち得る。例えば、ヒドロキシル基を有するC-3位、ヒドロキシメチルで修飾されたC-14位、ヒドロキシで修飾されたC-15位、およびヒドロキシ基を有するC-20位は全て有用であると予想される。いくつかの実施形態に、C-3位はリンカー部分を共有結合するための位置として働き、いくつかの特定の実施形態では、メイタンシノールのC-3位が連結部分を共有結合するための位置として働く。例えば、米国特許に開示されているものを含む、抗体メイタンシノイド共役を作製するための当技術分野で知られている多くの連結基が存在する。番号。5,208,020, 6,441,163, 6、441、163、およびEP特許番号0425235 B1; Chariら、Cancer Research 52:127-131(1992);および米国2005/0169933 A1であり、その開示内容は本明細書に引用により明示的に組み込まれる。さらなる結合基は、本明細書に記載され、例示される。
【０２１９】
また、メイタンシノイドとコンジュゲートの種々の異性体および混合物も包含する。本発明の特定の化合物およびコンジュゲートは、種々の立体異性体、エナンチオマー、およびジアステレオマー形成で存在し得る。このような抗体メイタンシノイド共役を生成するためのいくつかの説明は、米国特許に提供される。番号。5,208,020; 5,416,064; 5,416,064; 6,333,410; 6,441,163; 6,716,821;および7,368,565(これらの各々は、その全体が本明細書中に援用される)。
【０２２０】
アントラサイクリン
他の実施形態では、本明細書に記載の抗体およびその抗原結合フラグメントがアントラサイクリン分子である細胞毒素に結合させることができる。アントラサイクリンは、細胞傷害活性を示す抗生物質化合物である。研究はアントラサイクリンが1)細胞のDNAへの薬物分子のインターカレーション、それによってDNA依存性核酸合成を阻害すること;2)次いで細胞性高分子と反応して細胞に損傷を引き起こすフリーラジカルの薬物による製造、または3)薬物分子と細胞膜との相互作用[例えば、CPetersonら、「Transport And Storage OfアントラサイクリンIn ExperimentalシステムAnd Human白血病」(アントラサイクリンAntibiotics In Cancer Therapy; N.RBachur、「free Radical damage」、同97~102頁を参照のこと]を含む、多くの様々な機構によって細胞を死滅させるように作用し得ることを示した。その細胞傷害性電位アントラサイクリンがアントラサイクリンにおける白血病、乳癌、肺癌、卵巣がん(carcinoma)、卵巣腺がん(carcinoma)および肉腫[例えば、P.HWiernik、アントラサイクリン:現状と新たな展開p 11を参照]などの多数がん(carcinoma)の治療に使用されている。よく用いられるアントラサイクリンには、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシンおよびダウノマイシンがある。
【０２２１】
アントラサイクリンの代表的なものとしてはダウノルビシン(セルビジン;ベッドフォード研究所)、ドキソルビシン(アドリアマイシン;ベッドフォード研究所;塩酸ドキソルビシン、水酸基ダウノルビシン、およびルベックスとも呼ばれる)、エピルビシン(エラレンス;ファイザー)、およびイダルビシン(イダマイシン;ファイザー社)が挙げられるが、これらに限定されない。アントラサイクリン類似体であるドキソルビシン(ADRIAMYCINO)は転写のためにDNAを巻き戻す酵素トポイソメラーゼIIのインターカレーションおよび進行の抑制によってDNAと相互作用すると考えられている。ドキソルビシンは複製のためのDNA鎖を切断した後、トポイソメラーゼII錯体を安定化し、DNA二重らせんが再結合するのを妨げ、それによって複製方法を停止させる。ドキソルビシンおよびダウノルビシン(DAUNOMYCIN)は化学療法剤をアントラサイクリンする原型細胞傷害性天然産物である(Sessaら、(2007)Cardiovasc)。トキシコール。7:75-79).
【０２２２】
本明細書で使用するのに適したアントラサイクリンの非限定的な一例は、PNU-159682(「PNU」)である。PNUは親ネモルビシンに対して3000倍を超える細胞毒性を示す(Quintieriら、Clinical Cancer Research 2005、11、1608-1617)。PNUは、構造式によって表される:
【化２６】
2021530546.tif 000028
.
【０２２３】
PNUのようなアントラサイクリン上の多数の位置は、連結部分、従って、本明細書中に記載されるような抗-CD137抗体またはその抗原結合フラグメントを共有結合するための位置として役立ち得る。例えば、リンカーは、ヒドロキシメチルケトン側鎖への修飾を介して導入され得る。
【０２２４】
いくつかの実施形態に、細胞毒素は、下記構造式で表されるPNU誘導体である:
【化２７】
2021530546.tif 000029
,
ここで、波線は、本明細書に記載されるようなADCのリンカーへの共有結合点を示す。
【０２２５】
いくつかの実施形態に、細胞毒素は、下記構造式で表されるPNU誘導体である:
【化２８】
2021530546.tif 000030
,
ここで、波線は、本明細書に記載されるようなADCのリンカーへの共有結合点を示す。
【０２２６】
ピロロベンゾジアゼピン(PBD)
他の実施形態において、本明細書に記載される抗-CD137抗体またはその抗原結合フラグメントは、ピロロベンゾジアゼピン(PBD)である細胞毒素またはPBDを含む細胞毒素に結合され得る。PBDは、特定の放線菌によって産生され得、配列選択的DNAアルキル化化合物であることが示されている。PBD細胞毒素にはアントラマイシン、二量体PBD、および例えば、Hartley、JA(2011)The development ofピロロベンゾジアゼピンas antitumour agents.に開示されているものが含まれるが、これらに限定されない。Expert Opin Inv Drug、20(6)、733-744 and Antonow D、Thurston DE(2011)Synthesis of DNA-interactive pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepines(PBD). Chem Rev 111: 2815-2864.
【０２２７】
いくつかの実施形態に、細胞毒素は、構造式で表されるピロロベンゾジアゼピン二量体であってもよい:
【化２９】
2021530546.tif 000031
, 
ここで、波線は、本明細書に記載されるようなADCのリンカーへの共有結合点を示す。このPBDに基づくADCは例えば、Sutherlandら、Blood 2013 122:1455-1463(これは、その全体が参照により本明細書中に援用される)に開示される。
【０２２８】
いくつかの実施形態に、細胞毒素は、構造式で表されるPBD二量体であってもよい:
【化３０】
2021530546.tif 000032
,
式中、nは3または5であり、波線は、本明細書に記載のADCのリンカーへの共有結合点を示す。
【０２２９】
いくつかの実施形態に、細胞毒素は、構造式で表されるPBD二量体であってもよい:
【化３１】
2021530546.tif 000033
,
ここで、波線は、本明細書に記載されるようなADCのリンカーへの共有結合点を示す。
【０２３０】
特定の実施では細胞毒素がPBD量体であってもよく、これはリンカーおよび反応性部分Z'と一緒になった場合、それぞれ本明細書に記載されるように、以下の構造によって表されてもよい:
【化３２】
2021530546.tif 000034
.
【０２３１】
この特定の細胞毒素-リンカー結合体はテシリン(SG3249)として知られており、例えば、ハワードら、ACS Medに記載されている。ChemLett. 2016, 7(11), 7(11)、983-987、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２３２】
特定の実施では細胞毒素がPBD量体であってもよく、これはリンカーおよび反応性部分Z'と一緒になった場合、それぞれ本明細書に記載されるように、以下の構造によって表されてもよい:
【化３３】
2021530546.tif 000035
【０２３３】
この特定の細胞毒素-リンカー結合体はタリリンとして知られており、例えば、マンタジら、Angewandte Chemie International Edition English 2017,56,462-488に記載されており、その開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０２３４】
カリケアマイシン
他の実施形態において、本明細書に記載される抗体およびその抗原結合フラグメントはエネジイン抗腫瘍抗生物質(例えば、カリケアマイシン、オゾガミシン)である細胞毒素に結合され得る。カリケアマイシンファミリーの抗生物質は、ピコモル未満の濃度で二本鎖DNA破壊を生じることができる。使用に適したカリケアマイシンの例は例えば、米国特許に開示されている。米国特許第4,671,958号。米国特許第4,970,198号。米国特許第5,053,394号。No.5,037,651;および米国特許。No.5,079,233は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０２３５】
例示的なカリケアマイシンは、ここでは単にガンマとして参照され、構造公式を有する、ガンマ1と表される:
【化３４】
2021530546.tif 000036
.
【０２３６】
いくつかの実施形態に、カリケアマイシンは、ガンマ-カリケアマイシン誘導体またはN-アセチルガンマ-カリケアマイシン誘導体である。使用され得るカリケアマイシンの構造類似体は例えば、Hinmanら、Cancer Research 53:3336-3342(1993)、Lodeら、Cancer Research 58:2925-2928(1998)、および上記の米国特許に開示されるものを含むが、これらに限定されない。カリケアマイシンは適切なチオールと反応させてジスルフィドを形成することができるメチルトリスルフィド部分を含み、同時に、リンカーを介して、本明細書に記載の抗-CD137抗体またはその抗原結合フラグメントにカリケアマイシン誘導体を結合させるのに役立つ官能基を導入する。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許を参照のこと。番号。5,712,374; 5,714,586; 5,714,586; 5,739,116; 5,767,285; 5,770,701; 5,770,710; 5,773,001; および5,877,296(すべてアメリカン・シアナミド・カンパニー)。使用され得るカリケアマイシンの構造類似体としては例えば、Hinmanら、Cancer Research 53:3336-3342(1993)、Lodeら、Cancer Research 58:2925-2928(1998)、およびAmerican Cyanamidに対する上記の米国特許に開示されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３７】
ある実施形態に、本明細書に開示されるADCの細胞毒素は、次式で表されるカリケアマイシンジスルフィド誘導体である:
【化３５】
2021530546.tif 000037
,
ここで、波線は、リンカーの付着点を示す。
【０２３８】
追加の細胞毒素
他の実施形態では、本明細書に記載される抗体およびその抗原結合フラグメントが本明細書において上記で開示される細胞毒素以外の細胞毒素に、またはそれに加えて、結合体化され得る。本明細書に記載される組成物および方法での使用に適した追加のサイトトキシンは限定されるものではないが、5-エチニルウラシル、アビラテロン、アドゼレシン、アルデスレタミン、アムスチン、アミドックス、アミノレブリン酸、アムサクリン、アナストロゾール、アンドログラホリド、血管新生阻害剤、アンタレリクス、抗背側形成タンパク質-1、抗アンドロゲン、前立腺癌、アンチネオプラストン、アンチネオプラストン、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アフィジコリングリシネート、アポトーシス調節剤、アプリン酸、アスウラクリン、アタメスタン、アキシナスタチン1、アキシナスタチン2、アザセトロン、アザチロシン、バカチンIII誘導体を含む バラノール、BCR/ABL拮抗薬、ベンゾクロリン、βラクタム誘導体、ベタクラミンB、ベツリン酸、ビカルタミド、ビサントレミン、ビスナフィド、ビゼレシンA、ブレオマイシンA2、ブレオマイシンB2、ブロピリミン、ブチオニンスルホキシミン、カルシポトリオール、カルホスチンC、カンプトテシン誘導体(例えば、10-ヒドロキシカンプトテシン)、カペシタビン、カルボキサミドアミノトリアゾール、 カルボキシアミドトリアゾール、カルゼレシン、カセリン、クロロリクス、クロロキノキサリンスルホンアミド、シカプロスト、シスポルフィリン、クロトリマゾール、クロトリマゾールA、コルブレタスタチンA4、コンブレタスタチンアナログ、コナゲニン、クリプトフィシン816、クリプトフィシンA誘導体、クラシンA、シクロペンタントラキノン、シペマイシン、シタラビンオクホスファート、細胞溶解因子、サイトスタチン、ダクリキシマブ、デシタビン、デヒドロジデムニンB、2'デオキシコホルマイシン(DCF)、デスロレリン、デクスファミド、デクスラゾキサン、デクスラパミル ジアジクオン、ジデムニンB、ジヒドロノルスペルミン、ジヒドロキサシチジン、ジヒドロキサシチジン、ドロキソサノール、ドロキシフェン、ドロナビノール、デュオカルマイシンSA、エブセレン、エコムスチン、エドレクロマブ、エフロルニチン、エミテフル、エポチロン、エプリステリド、エトポシド、エトポシド4'-リン酸(エトポフオスともいう)、エキセメスタン、ファザラビン、フェンレチニド、フィラステリド、フラボピリドール、フラゼラスチン、フルダラビン、フルオロダウニシン、 フェニメク、ギャドリニウムテキサフィリン、ギロシタビン、ガロシタビン、ゲムシタビン、グルタチオン阻害薬、ヘプスルファン、ホモハリンギシン、イドキシフェン、イロマスタット、イミダゾクリドン、イミキモド、免疫刺激ペプチド、ヨードキソルビシン、イリノテカン、イリノグラジン、イソベンガゾール、ジャスファリドF、ラメラリン-Nトリアセテート、レナマイシン、レノグラスチム、レプトルスタチン、レトロゾール、脂溶性白金化合物、リスソクリナミド7、ロバプラチン メトレキソール、ロニダミン、ロキサントロン、ロキソリビン、ロキソトリビン、マソプロテイナーゼ阻害薬、マソプロテイナーゼ、メノガリン、メテロシナーゼ、メチオニナーゼ、MIF阻害薬、イフェプリストン、ミルテホシン、ミリモスチム、ミトガゾン、ミトキサントロン、ミトキサントロン、モファロテン、ミリアポロンB、N-アセチルジナリン、ナフェルスティプ、ナフテルピン、ナルグラスチム、ネモルビシン、ニルタミド、ニトルリン、オクトレオチド、イセノン 、オナプリストン、オキサリプラチン、オキサロマイシン、パルミトキシン、パミドロン酸、パルミトリオール、パゼリン、ペグアスパラガーゼ、パゼリプチン、ポリ硫酸ナトリウム、ペントスタチン、ペントロゾール、ペルフルブロン、ペルフルブロン、フェナジノマイシン、ピシバニール、ピラルビシン、ポドフィロトキシン、ポルフィロマイシン、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤、ラルチトレキセド、リゾキシン、ロヒツカイン、ルビギノンB1、ルフィン、サルコフィトールA、サルガモスチム、ソブゾキサン、スパルフォシンD、スピロムスチン ピスチアミド、スルフィノシン、テモゾロミド、テニポシド、タリブラスチン、チオコラザミン、トポテカン、トプセンチン、トリシリビン、トリメトレキサート、ビノレルビン、ビンキサルチン、ボロゾール、ゼニプラチン、およびジラスコルブ。
【０２３９】
リンカー
本明細書で使用される「リンカー」という語は抗-CD137抗体またはそのフラグメント(Ab)を薬物部分(D)に共有結合する共有結合または原子鎖を含む二価化学的な部分構造を手段して、式Iの抗体-薬物結合体(ADC)を形成する。好適なリンカーは2つの反応性末端を有し、一方は抗体への結合のためであり、他方は細胞毒素への結合のためである。リンカーの抗体共役反応性末端(反応性部分、Z')は典型的には抗体上のシステインチオールまたはリジンアミン基を介して抗体に共役することができる部位であり、従って、典型的には二重結合(マレイミドにおけるよう)のようなチオール反応性基、またはクロロ、ブロモ、ヨード、もしくはR-スルファニル基のような脱離基、またはカルボキシル基のようなアミン反応性基であり;一方、リンカーの細胞毒素共役反応性末端は典型的には細胞毒素に共役することができる部位である。リンカー-細胞毒共役の非限定的な例としては、例えば、細胞毒素上の基本アミンまたはカルボキシル基とのアミド共役の形成、それぞれリンカー上のカルボキシルまたは基本アミン基による形成、または例えばリンカー上の脱離基による細胞毒素上のOH基のアルキル化によるエーテルなどの形成が挙げられる。いくつかの実施形態に、細胞毒素-リンカー結合は細胞毒素上の基本アミンまたはカルボキシル基とのアミド結合の形成によるものであり、したがって、リンカー上の反応性置換基は、それぞれカルボキシルまたは基本アミン基である。「リンカー」という語が共役成形で本リンカーを記載する際に使用される場合、反応性末端の一方または両方はリンカーおよび/または細胞毒素間、ならびにリンカーおよび/またはその抗体もしくは抗原結合フラグメント間の結合の生成のために、存在しない(例えば、化学的な部分構造Zに変換された反応性部分Z')か、または不完全である(例えば、カルボン酸のカルボニル基のみ)。このような共役反応は、本明細書中以下にさらに記載される。
【０２４０】
種々のリンカーを用いて、記載された抗体または抗体フラグメントを細胞傷害性分子に結合させることができる。いくつかの実施形態に、リンカーは細胞内条件下で切断可能であり、その結果、リンカーの切断は、細胞内環境において抗体から薬物ユニットを放出する。さらに他の実施形態では、リンカーユニットは切断可能ではなく、薬剤は例えば、抗体分解によって放出される。本発明のADCに有効なリンカーは好ましくは細胞外で安定であり、ADC分子の凝集を防止し、ADCを水溶性媒体中および単量体状で自由に溶解し続ける。細胞への移送またはデリバリーの前に、ADCは好ましくは安定であり、無傷のままであり、すなわち、抗体は、薬物部分に連結されたままである。リンカーはターゲット細胞の外部で安定であり、細胞内部である有効な速度で切断され得る。効果的なリンカーは(i)抗体の特異的結合特性を維持し;(ii)共役または薬物部分の細胞内デリバリーを可能にし;(iii)共役がその標的部位に送達または輸送されるまで、安定かつ完全なままであり、すなわち切断されない;および(iv)細胞傷害性、細胞殺傷効果または細胞傷害性部分の細胞増殖抑制効果を維持する。ADCの安定性は、マススペクトロスコピー、HPLC、および分離/解析技術LC/MSなどの通常の分析技術によって測定することができる。抗体および薬物部分の共有結合は、リンカーが2つの反応性官能基、すなわち反応性の意味での二価を有することを必要とする。ペプチド、核酸、薬剤、毒素、抗体、ハプテン、およびレポーター基などの2つ以上の機能的または生物学的に活性な部分を付着させるのに役立つ二価リンカー試薬が知られており、方法は、それらの得られた共役について記載されている(Hermanson、GT(1996)Bioconjugate Techniques; Academic Press: New York、p。234-242)。
【０２４１】
好適な切断可能なリンカーとしては例えば、酵素的加水分解、光分解、酸性条件下での加水分解、基本条件加水分解、酸化、ジスルフィド還元、求核切断、または有機金属切断により切断され得るものが挙げられる(例えば、Lericheら、Bioorg.Med.Chem、20:571-582、2012を参照されたい。これらの開示は共有共役共役に好適なリンカーに関連するので、本明細書中に参考として援用される)。好適な切断可能なリンカーは例えば、ヒドラジン、ジスルフィド、チオエーテルまたはジペプチドなどの化学的な部分構造を含み得る。
【０２４２】
酸性条件下で加水分解可能なリンカーとしては、例えば、ヒドラゾン化合物、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、シスアコニトアミド、オルトエステル、ポリビニルアセタール、ケタール等が挙げられる。(例えば、米国特許を参照されたい。番号。5,122,368; 5,824,805; 5,824,805; 5,622,929; Dubowchik and Walker、1999、Pharm. Therapeutics 83:67-123; Nevilleら、1989、Biol. Chem.264:14653-14661(これらの各々の記載は、共有結合に適したリンカーに関連するので、その全体が本明細書中に参考として援用される)。このようなリンカーは血中のものような中性pH条件下では比較的安定であるが、リソソームのおよそのpHであるpH 5.5または5.0未満では不安定である。
【０２４３】
還元条件下で切断可能なリンカーとしては、例えば、ジスルフィドが挙げられる。例えば、アドバンストテクノロジアタッチメント(N-スクシンイミジル-S-アセチルチオアセテート)、SPDP(N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオナート)、SPDB(N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)酪酸)およびSMPT(N-スクシンイミジル-オキシカルボニル-α-メチル-α-(2-ピリジルジチオ)トルエン)、SPDBおよびSMPTを使用して形成することができるものを含む、様々なジスルフィドリンカーが当技術分野で知られている(例えば、Thorpeら、1987、Cancer Resを参照されたい)。47:5924-5931; Wawrzynczakら、Inイミュノコンジュゲート:抗体Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer(CWVogel編、Oxford Uプレス、1987)。米国特許も参照されたい。その各々の記載は、共有結合に適したリンカーに関連するので、その全体が本明細書中に参考として援用される、第4,880,935号。
【０２４４】
酵素的加水分解に感受性のリンカーは例えば、細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素(リソソームプロテアーゼまたはエンドソームプロテアーゼを含むが、これらに限定されない)によって切断されるペプチド含有リンカーであり得る。治療薬剤の細胞内タンパク質分解放出を使用することの1つの利点は、結合体高された場合に薬剤が典型的に弱毒高され、結合体の血清安定性が典型的に高まることである。いくつかの実施形態に、ペプチジルリンカーは、少なくとも2アミノ酸長または少なくとも3アミノ酸長である。例示的なアミノ酸リンカーには、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドまたはペンタペプチドが含まれる。好適なペプチドの例としては、バリン、アラニン、シトルリン(Cit)、フェニルアラニン、リジン、ロイシン、およびグリシンなどのアミノ酸を含むものが挙げられる。アミノ酸リンカー成分を含むアミノ酸残基には、天然に存在するもの、ならびに少量のアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸アナログ(例えば、シトルリン)が含まれる。例示的なジペプチドには、バリン-シトルリン(vcまたはval-cit)およびアラニン-フェニルアラニン(afまたはala-phe)が含まれる。例示的なトリペプチドには、グリシンバリンシトルリン(gly-val-cit)およびグリシングリシングリシン(gly-gly-gly)が含まれる。いくつかの実施形態的に、リンカーには、Val-Cit、Ala-Val、またはPhe-Lys、Val-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Phe-ArgまたはTrp-Citのようなジペプチドが含まれる。Val-CitまたはPhe-Lysのようなジペプチドを含むリンカーは例えば、米国特許に開示されている。第6,214,345号明細書は、共有共役共役に適したリンカーに関連するので、その全体が本明細書に参考として援用される。いくつかの実施形態に、リンカーは、Val-AlaおよびVal-Citから選択されるジペプチドを含む。
【０２４５】
本明細書に記載の抗体または抗体フラグメントを細胞傷害性分子に結合させるのに適したリンカーには、1,6-排除方法によって細胞毒素を放出することができるものが含まれる。この脱離過程が可能な化学的な部分構造には、p-アミノベンジル基、6-マレイミドヘキサン酸、pH感受性炭酸塩、およびJainら、Pharmに記載されているような他の試薬が含まれる。Res. 32:3526-3540, 2015, 2015、その内容は、共有結合に適したリンカーに関連するので、その全体が引用により本明細書に組み込まれる。
【０２４６】
いくつかの実施形態に、リンカーは例えば、Carlら、JMed.に開示されている、前述のPABまたはPABC(パラアミノベンジルオキシカルボニル)などの「自己免疫性」基を含む。Chem(1981)24:479-480; Chakravartyら(1983)JMed. 化学物質26:638-644; US200306214345; US20030096743; US200400759509; US20040052793; US6218519; US6835807; US6268488; US2004001894;W098/13059; US20040052793; US5621002; US20040121940;WO2004/032828。この方法が可能な他のこのような化学的な部分構造(「自壊リンカー」)としては、メチレンカルバメートおよびヘテロアリール基(例えば、アミノチアゾール、アミノイミダゾール、アミノピリミジンなど)が挙げられる。このような複素環自己固定基を含むリンカーは例えば、米国特許公報に開示されている。20160303254および20150079114、ならびに米国特許第7,754,681号; Hayら(1999)Bioorg。中央値。ChemLett. 9:2237; 米国 2005/0256030; de Groot et al(2001)JOrg. Chem.66:8815-8830;およびUS 7223837。いくつかの実施形態に、ジペプチドは自壊リンカーと組合せて使用される。
【０２４７】
本明細書での使用に適したリンカーはさらに、C 1 -C 6アルキレン、C 1 -C 6ヘテロアルキレン、C 2 -C 6アルケニレン、C 2 -C 6ヘテロアルケニレン、C 2 -C 6 アルキニレン、C 2 -C 6 ヘテロアルキニレン、C 3 -C 6 シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、およびそれらの組合せから選択される1つ以上の群を含み、それらの各々は任意に置換されてもよい。このようなグループの非限定的な例は(CH2)p、(CH2 CH2O)p, および-(C=O)(CH2)p-ユニットを含み、ここでpは、各場面に対して独立に選択される1から6の整数である。
【０２４８】
いくつかの実施形態に、それぞれのC 1 -C 6 アルキル、C 1 -C 6ヘテロアルキル、C 2 -C 6アルケニル、C 2 -C 6 ヘテロアルケニル、C 2 -C 6 アルキニル、C 2 -C 6 ヘテロアルキニル、C 3 -C 6 シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、スルホニルシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリール基は、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルキアリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、アミノ、アンモニウム、アシル、アシルオキシ、アシルアミノカルボニル、アルコキシカルボニル、ウレイド、カルバメート、アリール、ヘテロアリール、スルフィニル、ヒドロキシル、スルホニル、アルコキシル、スルファニル、ハロゲン、カルボキシ、トリハロメチル、シアノ、ヒドロキシ、メルカプト、およびニトロからなる群からそれぞれ独立に選択される1~5個の置換基で置換されていてもよい。
【０２４９】
いくつかの実施形態に、それぞれのC 1 -C 6 のバイトルク、C 1 -C 6のヘテロアルキル、C 2 -C 6アルケニル、C 2 -C 6 のヘテロアルケニール、C 2 -C 6 アルキニル、C 2 -C 6 のヘテロアルキニール、C 3 -C 6 のシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールグループは、O、SおよびNから選択される1つ以上のヘテロアトムによって任意に中断されてもよい。
【０２５０】
いくつかの実施形態に、それぞれのC 1 -C 6 アルキル、C 1 -C 6ヘテロアルキル、C 2 -C 6アルケニル、C 2 -C 6 ヘテロアルケニル、C 2 -C 6 アルキニル、C 2 -C 6 ヘテロアルキニル、C 3 -C 6 シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリール基は、O、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルカリール、ヘテロアリール、アルキル、アミノ、アンモニウム、アシル、アシルオキシ、アシルアミノカルボニル、アルコキシカルボニル、ウレイド、カルバメート、アリール、ヘテロアリール、スルフィニル、ヒドロキシル、スルホニル、アルコキシ、スルファニル、ハロゲン、カルボキシ、トリハロメチル、シアノ、ヒドロキシ、メルカプト、およびニトロからなる群からそれぞれ独立に選択される1個または5個の置換基によって任意に中断されてもよい。
【０２５１】
好適なリンカーは、溶解性を高める特性を有する基を含有する可能性がある。例えば、(CH 2 CH 2O)p単位(ポリエチレングリコール、PEG)を含むリンカーは溶解性を高めることができ、アミノ、スルホン酸、ホスホン酸またはリン酸残基で置換されたアルキル鎖も同様である。このような部分を含むリンカーは例えば、米国特許番号に開示されている。8,236,319 および9,504,756は、共有共役的共役に適したリンカーに関連するので、その全体が本明細書に参考として援用される。さらなる溶解性増強基としては、例えば、以下の構造を有するアシルおよびカルバモイルスルファミド基が挙げられる:
【化３６】
2021530546.tif 000038
式中、aは0または1である
R10は水素、C 1 -C 24アルキル基、C 3 -C 24シクロアルキル基、C 1 -C 24(ヘテロ)アリール基、C 1 -C 24アルキル(ヘテロ)アリール基およびC 1 -C 24(ヘテロ)アリールアルキル基、C 1 -C 24アルキル基、C 2 -C 24(ヘテロ)アリール基、C 3 -C 24アルキル(ヘテロ)アリール基およびC 3 -C 24(ヘテロ)アリールアルキル基からなる群から選択され、これらの各々はO、SおよびNR 11 R 12から選択される1つまたは複数のヘテロ原子によって置換および/または任意に中断されてもよく、ここで、R 11およびR 12は水素およびC 3 -C 24アルキル基からなる群から独立して選択され;またはサイトトキシンであり、ここで、サイトトキシンはスペーサ部分を介してNに任意に連結される。このような基を含むリンカーは例えば、米国特許第9,636,421号および米国特許出願公開第2017/0298145号に記載されており、これらの開示は、細胞毒素および抗体またはそれらの抗原結合フラグメントへの共有結合に適したリンカーに関連するため、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０２５２】
いくつかの実施形態に、リンカーはヒドラジン、ジスルフィド、チオエーテル、ジペプチド、p-アミノベンジル(PAB)基、複素環自己免疫基、任意選択的に置換されたC 1 -C 6 アルキル、任意選択的に置換されたC 1 -C 6ヘテロアルキル、任意選択的に置換されたC 2 -C 6アルケニル、任意選択的に置換されたC 2 -C 6 ヘテロアルケニル、任意選択的に置換されたC 2 -C 6 アルキニル、任意選択的に置換されたC 2 -C 6 ヘテロアルキニル、任意選択的に置換されたC 3 -C 6 シクロアルキル、任意選択的に置換されたヘテロシクロアルキル、任意選択的に置換されたアリール、任意選択的に置換されたヘテロアリール、溶解増強基、アシル、-(C=O)-、または-(CH 2 CH 2O)p-基のうちの1つまたは複数を含むことができ、pは1~6の整数である。当業者のある者は、列挙された基の1つ以上が二価(ジラジカル)種(例えば、C 1 -C 6アルキレンなど)の形態で存在し得ることを認識する。
【０２５３】
いくつかの実施形態に、リンカーは、p-アミノベンジル基(PAB)を含む。ある実施形態に、p-アミノベンジル基は、細胞傷害性薬物とリンカー中のプロテアーゼ切断部位との間に配置される。ある実施形態に、p-アミノベンジル基は、p-アミノベンジルオキシカルボニルユニットの一部である。ある実施形態に、p-アミノベンジル基は、p-アミノベンジルアミド単位の一部である。
【０２５４】
いくつかの実施形態に、リンカーは、Phe-Lys、Val-Lys、Phe-Ala、Phe-Cit、Val-Ala、Val-Cit、およびVal-Argからなる群より選択されるジペプチドを含む。いくつかの実施形態に、リンカーは、PAB、Val-Cit-PAB、Val-Ala-PAB、Val-Lys(Ac)-PAB、Phe-Lys-PAB、Phe-Lys(Ac)-PAB、D-Val-Leu-Lys、Gly-Gly-Arg、Ala-Ala-Asn-PAB、またはAla-PABのうちの1つ以上を含む。
【０２５５】
いくつかの実施形態に、リンカーは、PAB、Val-Cit-PAB、Val-Ala-を含むPAB、Val-Lys(Ac)-PAB、Phe-Lys-PAB、Phe-Lys(Ac)-PAB、D-Val-Leu-Lys、Gly-Gly-Arg、Ala-Ala-Asn-PAB、またはAla-PAB。
【０２５６】
いくつかの実施形態に、リンカーは以下の組合せを含むポリゴサッカライド、-(CH2)p -、-(CH2 CH2 O)p -, PAB、Val-Cit-PAB、Val-Ala-PAB、Val-Lys(Ac)-PAB、Phe-Lys-PAB、Phe-Lys(Ac)-PAB、D-Val-Leu-Lys、Gly-Gly-Arg、Ala-Ala-Asn-PAB、またはAla-PABの1つ以上。
【０２５７】
いくつかの実施形態に、リンカーは-(C=O)(CH 2)p -単位を含み、pは、1-6からの整数である。
【０２５８】
いくつかの実施形態に、リンカーは-(CH2) n-ユニットを含み、ここでnは2~6の整数である。いくつかの実施形態では、リンカーに-(CH 2)nが含まれる。nは6 である。いくつかの実施形態に、L-Zはである
【化３７】
2021530546.tif 000039
ここで、Sは(例えば、システイン残基の-SH基からの)CD137に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメント内に存在する反応性置換基を表す硫黄原子である。
【０２５９】
いくつかの実施形態に、リンカーは(CH 2)m(n)m-グループを含み、ここで、nおよびmはそれぞれ独立に、1、2、3、4、5、6、7、8、9および10から選択され、ヘテロアリール基、ここで、ヘテロアリールグループは、トリアゾールである。いくつかの実施形態では、(CH 2)m(m O) n - groupとトリアゾール は一緒に構成される
【化３８】
2021530546.tif 000040
, 
ここで、nは1~10であり、波線は、追加のリンカー成分、化学的な部分構造Z、またはアマトキシンへの付着点を示す。本明細書中に記載される方法および組成物において使用され得る他のリンカーは米国特許出願公開第2019/0144504号に記載され、これは本明細書中に参考として援用される。
【０２６０】
1つの具体的な実施形態において、リンカーは、構造によって表されるPAB-Ala-Val-プロピオニルを含む
【化３９】
2021530546.tif 000041
ここで、波線は、細胞毒素および反応性部分Z'への付着点を示す。別の具体的な実施形態では、リンカーが構造によって表されるPAB-Cit-Val-プロピオニルを含む
【化４０】
2021530546.tif 000042
ここで、波線は、細胞毒素および反応性部分Z'への付着点を示す。このようなPAB-ジペプチド-プロピオニルリンカーは例えば、国際公開第2017/149077号パンフレットに開示されており、これは、その全体が本明細書中に参考として援用される。さらに、WO2017/149077に開示された細胞毒素は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２６１】
本明細書中に開示される化学基、部分および特徴のいずれか1つ以上は本明細書中に開示されるような抗体および細胞毒素の結合に有用なリンカーを形成するために、多様な方法で組み合わされ得ることが、当業者のある者によって認識される。本明細書中に記載される組成物および方法と関連して有効なさらなるリンカーは例えば、米国特許出願公開第2015/0218220号に記載されており、その開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０２６２】
ある特定の実施形態に、リンカーの前駆物質である中間体は、適切な条件下で薬物部分と反応する。ある特定の実施形態に、反応性基は、医薬品および/または中間体もしくはリンカー上で使用される。薬剤と中間体または誘導体化薬剤との間の反応の生成物は、その後、適切な条件下で抗体または抗原結合フラグメントと反応される。あるいは、リンカーまたは中間体を最初に抗体または誘導体化抗体と反応させ、次いで薬物または誘導体化薬物と反応させてもよい。このような共役反応は、ここで、より完全に記載される。
【０２６３】
抗体またはその抗原結合フラグメントへのリンカーまたは薬物-リンカー結合体の共有結合には、多くの様々な反応が利用可能である。抗体分子上の適当な付着点には、リジンのアミン基、グルタミン酸およびアスパラギン酸の遊離カルボン酸基、システインのスルフヒドリル基、および芳香族アミノ酸の種々の部分が含まれる。例えば、非特異的共有結合は、化合物上のカルボキシ(またはアミノ)基を抗体部分上のアミノ(またはカルボキシ)基に連結するためのカルボジイミド反応を用いて行うことができる。さらに、化合物上のアミノ基を抗体部分上のアミノ基に結合させるために、ジアルデヒドまたはイミドエステルなどの二官能性剤を使用することもできる。医薬品の結合剤への付着には、シッフ塩基反応も利用可能である。この方法はグリコールまたは水酸基を含有する薬剤の過よう素酸塩酸化を伴い、したがってアルデヒドを形成し、次いでこれを結合剤と反応させる。結合は、結合剤のアミノ基を有するシッフ塩基の形成を介して起こる。イソチオシアネートはまた、薬剤を結合剤に共有結合させるためのカップリング剤として使用され得る。他の技術は当業者に知られており、本開示の範囲内である。
【０２６４】
本明細書中に記載されるような抗体または抗原結合フラグメントへの共役に有用なリンカーは以下の表2に示されるようなカップリング反応によって形成される化学的な部分構造Zを含むが、これらに限定されない。曲線は、それぞれ、抗体または抗原結合フラグメント、および細胞傷害性分子への付着点を示す。
【０２６５】
表2:。抗体薬物結合体の生成におけるカップリング反応によって形成される例示的な化学的な部分構造Z
[表２]
【０２６６】
当業者のある者は、リンカーに結合した反応性置換基Z'および抗体またはその抗原結合フラグメント上の反応性置換基が化学的な部分構造Zを生成するための共有カップリング反応に関与し、反応性部分Z'を認識することを認識する。したがって、本明細書中に記載される方法と併せて有用な抗体薬物結合体は、化学的な部分構造Zを形成するための、抗体、またはその抗原結合フラグメントと、本明細書中に記載されるような、反応性置換基Z'(抗体、またはその抗原結合フラグメント上の反応性置換基との反応に適した)を含むリンカーまたは細胞毒素リンカー結合体と、リンカーまたは細胞毒素リンカー結合体との反応によって形成され得る。
【０２６７】
表2に示されるように、リンカーおよび抗体またはそれらの抗原結合フラグメント上の適切な反応性置換基の例には、求核剤/求電子剤対(例えば、特に、チオール/ハロアルキル対、アミン/カルボニル対、またはチオール/α, β-不飽和カルボニル対など)、ジエン/ジエノフィル対(例えば、アジド/アルキン対、またはジエン/α,β-不飽和カルボニル対など)などが含まれる。化学的な部分構造Zを形成するための反応性置換基間のカップリング反応としてはチオールアルキル化、ヒドロキシルアルキル化、アミンアルキル化、アミンまたはヒドロキシルアミン縮合、ヒドラジン形成、アミド化、エステル化、ジスルフィド形成、環化付加(例えば、とりわけ、[4+2]Diels-Alder環化付加、[3+2]Huisgen環化付加)、芳香族求核置換、アミン、またはヒドロキシルアミン縮合、芳香族求電子置換、および当技術分野で公知であるか、または本明細書に記載される他の反応様式が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、リンカーが抗体上の求核性官能基またはその抗原結合フラグメントとの反応のための求電子性官能基を含有する。
【０２６８】
本明細書中に開示されるように、抗体またはその抗原結合フラグメント内に存在し得る反応性置換基は限定されないが、(i)N末端アミン基、(ii)側鎖アミン基(例えば、リジン)、(iii)側鎖チオール基(例えば、システイン)、および(iv)糖水酸基またはアミノ基(ここで、抗体はグリコシル化される)のような求核基を含む。本明細書中に開示されるように、抗体またはその抗原結合フラグメント内に存在し得る反応性置換基としては、非限定的に、セリン、トレオニン、およびチロシン残基のヒドロキシル部分;リジン残基のアミノ部分;アスパラギン酸およびグルタミン酸残基のカルボキシル部分;ならびにシステイン残基のチオール部分、ならびにプロパルギル、アジド、ハロアリール(例えば、フルオロアリール)、ハロヘテロアリール(例えば、フルオロヘテロアリール)、ハロアルキル、および非天然アミノ酸のハロヘテロアルキル部分が挙げられる。いくつかの実施形態に、本明細書に開示されるような抗体またはその抗原結合フラグメント内に存在する反応性置換基は、アミンまたはチオール部分を含む。特定の抗体は、還元可能な鎖間ジスルフィド、すなわちシステイン架橋を有する。抗体は、DTT(ジチオトレイトール)などの還元剤で処理することによって、リンカー試薬との結合のために反応性にされ得る。従って、各システイン架橋は、理論的には2つの反応性チオール求核試薬を形成する。追加の求核基はリジンと2-イミノチオラン(トラウト試薬)との反応によって抗体中に導入することができ、その結果、アミンがチオールに転化する。反応性チオール基は1つ、2つ、3つ、4つ、またはそれ以上のシステイン残基を導入することによって(例えば、1つまたはそれ以上の非天然システインアミノ酸残基を含む変異体抗体を調製することによって)、抗体(またはそのフラグメント)に導入され得る。米国特許。第7,521,541号は、反応性システインアミノ酸の導入による工学的抗体を教示している。
【０２６９】
いくつかの実施形態に、リンカーに結合した反応性部分Z'は、抗体上に存在する求電子基と反応性である求核基である。抗体上の有用な求電子基としてはアルデヒドおよびケトンカルボニル基が挙げられるが、これらに限定されない。求核基のヘテロ原子は抗体上の求電子基と反応し、抗体と共有結合を形成することができる。有用な求核基としてはヒドラジド、オキシム、アミノ、水酸基、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびアリールヒドラジドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２７０】
いくつかの実施形態に、Zは抗体内に存在する反応性求核置換基、またはその抗原結合フラグメント(例えば、アミン部分およびチオール部分)と、反応性求電子置換基Z'との間の反応の生成物である。例えば、Z'はとりわけ、マイケルアクセプター(例えば、マレイミド)、活性化エステル、電子欠損カルボニル化合物、およびアルデヒドであり得る。反応性置換基Z'および得られる化学的な部分構造Zのいくつかの典型的かつ非限定的な例を表3に示す。
【０２７１】
表3。相補的な反応性置換基と化学的な部分構造
【表３】
2021530546.tif 000043
【０２７２】
例えば、ADCの合成に適したリンカーとしてはマレイミドまたはハロアルキル基などの反応性置換基Z'が挙げられるが、これらに限定されない。これらはとりわけ、例えば、Liuら、18:690-697、1979に記載されている、スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-L-カルボキシレート(SMCC)、Nsuccinimidylヨードアセテート(SIA)、スルホ-SMCC、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル(MBS)、スルホ-MBS、およびスクシンイミジルヨードアセテートなどの試薬によってリンカーに付着させることができ、その開示内容は化学結合のためのリンカーに関するものとして本明細書に参考として援用される。
【０２７３】
いくつかの実施形態に、リンカーLに結合した反応性置換基Z'は、マレイミド、アジド、またはアルキンである。マレイミド含有リンカーの例は非切断性マレイミドカプロイルベースのリンカーであり、これは、アウリスタチンなどの微小管破壊剤の結合に特に有効である。このようなリンカーはDoronina et al、Bioconjugate Chem。17:14-24、2006によって記述されているが、本文書では化学結合のリンカーに関するものとして、その開示を参照して取り入れる。
【０２７４】
いくつかの実施形態に、反応性置換基Z'は-(C=O)-または-NH(C=O)-であり、その結果、リンカーは、-(C=O)-または-NH(C=O)基と抗体またはその抗原結合フラグメントのアミノ基との反応から生じる、アミドまたはウレア部分によって、それぞれ、抗体またはその抗原結合フラグメントに結合され得る。
【０２７５】
いくつかの実施形態に、反応性置換基はN-マレイミジル基、ハロゲン化N-アルキルアミド基、スルホニルオキシN-アルキルアミド基、カーボネート基、ハロゲン化スルホニル基、チオール基またはその誘導体、内部炭素-三重結合を含むアルキニル基、(het-ero)シクロアルキニル基、ビシクロ[6.1.0]非-4-yn-9-イル基、内部炭素-二重結合を含むアルケニル基、シクロアルケニル基、テトラジニル基、アジド基、ホスフィン基、ニトリルオキシド基、ニトロン基、ニトリルイミン基、ジアゾ基、ケトン基、(O-アルキル)ヒドロキシルアミノ基、ヒドラジン基、ハロゲン化N-マレイミジル基、1,1-ビス(スルホニルメチル)メチルカルボニル基またはその脱離誘導体、ハロゲン化カルボニル基、またはアレンアミド基であり、これらはそれぞれ任意に置換されていてもよい。いくつかの実施形態に、反応性置換基は、シクロアルケン基、シクロアルキン基、または任意に置換された(ヘテロ)シクロアルキニル基を含む。
【０２７６】
抗体またはその抗原結合断片上の反応性残基との反応に適した反応性置換基Z'を含有するアマトキシン-リンカー結合体の非限定的な例には、以下が含まれる。7'C-(4-(6-(マレイミド)ヘキサンアミド)ピペリジン-1-イル;7'C-(4-(6-(マレイミド)ヘキサンアミド)ピペラジン-1-イル)-アマトキシン;7'C-(4-(4-(マレイミド)メチル)シクロヘキサンアミド)ヘキサノイル)ピペラジン-1-イル;7'C-(4-(6-(マレイミド)ヘキサンアミド)エチル)ピペリジン-1-イル; C-(4-(6-(6-(マレイミド)ヘキサミド)エチル)ピペリジン-1-イル;7'C-(4-(6-(4-(4-(4-(4-(マレイミド)メチル)シクロヘキサンアミド)エチル)ピペリジン-1-イル)-アマトキシン;7'C-(4-(2-(2-ブロモアセトアミド)エチル)ピペリジン-1-イル)-アマトキシン;7'C-(4-(3-(ピリジン-2-イルジスルファニル)プロパンアミド)エチル)ピペリジン-1-イル;7'C-(4-(マレイミド)ブタン-(2-(マレイミド)アセチル)-ピペラジン-1-イル;7'C-(4-(マレイミド)ピペラジン-1-イル)-アマトキシン;7'C-(4-(4-(マレイミド)メチル)シクロヘキサンカルボキサミド)エチル)ピペリジン-1-イル;7'C-(3-(6-(マレイミド)ヘキサンアミド)メチル)ピロリジン-1-イル 7'C-(3-(6-(マレイミド)ヘキサンアミド)メチル)ピロリジン-1-イル;7'C-(4-((マレイミド)メチル)シクロヘキサンカルボキサミド)メチル)ピロリジン-1(-(3-(4-(マレイミド)メチル)シクロヘキサンアミド)メチル)ピロリジン-1-イル;7-(2-(4-(2-(アミノオキシ)アセトアミド)エチル)ピペラジン-1-イル;7'C-(4-(2-(アミノオキシ)アセトアミド)エチル)ピペラジン-1-イル;7'C-(4-(2-(アミノオキシ)アセトアミド)ヘキサノイル)ピペラジン-1-イル)-アマトキシン;7'C-(4-(6-(マレイミド)ヘキサンアミド)ピペリジン-1-イル)-アマトキシン;7'C-(4-(2)(6-(6-(マレイミド)ヘキサノイル)メチル)ピペリジン-1-イル(7-(6-(マレイミド)メチル)ピペラジン-1-イル)-アマトキシン;(7-(6-(マレイミド)ヘキサノイル)メチル)-アマトキシン;7-(4-(2-(6-(6-(マレイミド)ヘキサンアミド)エチル)ピペリジン-1-イル)メチル)-アマトキシン;7'C-(4-(4-(マレイミド)メチル)シクロヘキサンカルボキサミド)エチル)ピペリジン-1-イル)-メチル;7'C-(4-(6-(マレイミド))(2-(4-(6-(6-(マレイミド)エチル)ピペラジン-1-イル)メチル)ピペラジン-1-イル)メチル)-アマトキシン;7'C-((4-(4-(4-(マレイミド)メチル)シクロヘキサンカルボキサミド)エチル)ピペラジン-1-イル)-メチル;7'C-((4-(6-(4-(マレイミド)メチル)シクロヘキサンカルボキサミド)エチル)ピペラジン-1-イル)-アマトキシン;7'C-(3-(6-(マレイミド)ヘキサンアミド)-S-メチル)ピロリジン-1-イル)-アマトキシン;7'C-(3-)((6-(6-(マレイミド)ヘキサンアミド)-R-メチル)ピロリジン-1-アミドキシン;7-((3-(4-(マレイミド)メチル)シクロヘキサンカルボキサミド)-R-メチル)-ピロリジン-1-イル)-メチル;7'C-(((6-(4-(マレイミド)メチル)シクロヘキサンカルボキサミド)メチル)ピロリジン-1-イル)-アマトキシン;7'C-((2-(3-カルボキシプロパンアミド)エチル)ピペラジン-1-イル)-メチル;7'C-(6-(マレイミド)ヘキサノイル)ピペラジン-1-イル)-アマトキシン;7'C-(4-(6-)4-(((マレイミド)メチル)シクロヘキサノイル)ピペラジン-1-イル(マレイミド)メチル;7-(3-(マレイミド)ピペラジン-1-イル)ピペラジン-1-イル)メチル;7'C-((4-(4-(マレイミド)ブタノイル)ピペラジン-1-イル)メチル;7'C-(4-(4-(マレイミド)ブタナミド)エチル)ピペリジン-1-イル)-アマトキシン;'C-(4-(6-(マレイミド)メチル)シクロヘキサンカルボキサミド)ヘキサンアミド)エチル)ピペリジ���-1-イル)-アマトキシン; 7'C-((3-(6-(マレイミド)メチル)アゼチジン-1-イル;7'C-((3-(4-(マレイミド)エチル)アゼチジン-1-イル)メチル)アゼチジンアマトキシン;7'C-((3-(4-(マレイミド)メチル)シクロヘキサンカルボキサミド)エチル)アゼチジン-1-イル)-アマトキシン;7'C-(3-(2-(6-(4-(マレイミド)メチル)シクロヘキサンカルボキサミド)エチル)アゼチジン-1-イル)メチル;7'C-((2-(マレイミド)-N-メチルヘキサンアミド)エチル)(メチル)-アマトキシン;7'C-(4-(6-(マレイミド)))(2-(6-(2-(メチル)アマトキシン;7-(2-(6-(マレイミド)エチル)アジリジン)メチル)アジリジン-1-イル;7'C-(4-(6-(2-(アミノオキシ)アセトアミド)ヘキサノイル)ピペラジン-1-イル)メチル;7'C-((4-(1-(アミノオキシ)-2-オキソ-6,9,12,15-テトラオキサ-3-アザヘプタデカン-17-オイル)ピペラジン-1-イル)-イル)-アマトキシン;7'C-(4-(2-(アミノオキシ)アセトアミド)アセチル)ピペラジン-1-イル)-アマトキシン;7'C-(4)(2-(3-(4-(2-(アミノオキシ)アセトアミド)ピペラジン-1-イル)メチル)ピペラジン-1-イル;7-(2-(4-(2-(アミノオキシ)アセトアミド)エチル)ピペリジン-1-イル)メチル)-アマトキシン;7'C-((4-(2-(4-(2-(アミノオキシ)アセトアミド)エチル)ピペリジン-1-イル)メチル)-アマトキシン;'7-(4-(20-(アミノオキシ)-4,19-ジオキソ-6,9,12,15-テトラオキサ-3,18-ジアザイコシル)ピペリジン-1-イル)-メチル)-アマトキシン ; 7'C-(((2-(2-(アミノオキシ)アセトアミド)-N-メチル)エチル;7'C-(4-(2-(アミノオキシ)アセトアミド)-N-メチル)ブチル;7'C-((3-(4-(4-(マレイミド)メチル)シクロヘキサンカルボキサミド)ヘキサミド)メチル)ピロリジン-1-イル)-アマトキシン;7'C-(((3-(6-(4-(マレイミド)メチル)シクロヘキサンカルボキサミド)-R-メチル)ピロリジン-1-イル)-メチル)-アマトキシン;7'C-(4-(2-(ブロモアセトアミド)エチル)ピペラジン-1-イル)-アマトキシン;7'C-(4-(2-(ブロモアセトアミド)エチル)ピペリジン-1-イル)メチル(2-(3-(ピリジン-2-イルジスルファニル)エチル)ピペリジン-1-イル)メチル)ピペリジンアマトキシン;6'O-(5-(マレイミド)メチル)シクロヘキサンアミド)-ペンチル;6'O-(2-(6-(マレイミド)ヘキシル)-2-オキソエチル)-アマトキシン;6'O-(((6-(マレイミド)ヘキシル)カルバモイル)-アマトキシン;6'O-((6-(4-(マレイミド)メチル)シクロヘキサンカルボキサミド)ヘキシル)-カルバモイル;6'O-(2-ブロモアセトアミド)-ヘキシル;7'C-(4-(アジド)ヘキサミド)ピペリジン-1-イル)-アマトキシン;7'C-(4-(hex-5-ynoylamino))(2-(4-(6-(6-(マレイミド)ヘキサミド)エチル)ピペラジン-1-イル;7-(6-(4-イル)-アマトキシン)-1-エチル)ピペラジン-1-イル;6-(11,12-ジデヒドロ-5,6-ジヒドロジベンズ[b,f]アゾシン-5-イル)-6-オキソヘキサミド)-ヘキシル;6'O-(6-(ヘキス-5-イノイルアミノ)ヘキシル)-アマトキシン;6'O-((6-アミノオキシ)ヘキシル)-アマトキシン;O-(6-(2-ヨードアセトアミド)ヘキシル)-アマトキシン。
【０２７７】
いくつかの実施形態に、化学的な部分構造Zは、表2または表3から選択される。いくつかの実施形態において、化学的な部分構造Zは:
【化４１】
2021530546.tif 000044
式中、Sは、抗-CD-137抗体のような、抗体またはその抗原結合フラグメント内に存在する反応性置換基を表す硫黄原子である。
【０２７８】
いくつかの実施形態に、本明細書に開示されるアマトキシンは、以下の式を有するリンカー反応性部分-L-Z'に結合される:
【化４２】
2021530546.tif 000045
,
ここで、波線は細胞毒素上の置換基(例えば、アマトキシン)への結合点を示す。このリンカー反応性置換基L-Z'は代わりに、N-β-マレイミドプロピオニル-Val-Ala-パラ-アミノベンジル(BMP-Val-Ala-PAB)と呼ばれてもよい。
【０２７９】
いくつかの実施形態に、本明細書に開示されるアマトキシンは、以下の式を有するリンカー反応性部分-L-Z'に結合される:
【化４３】
2021530546.tif 000046
,
ここで、波線は細胞毒素上の置換基(例えば、アマトキシン)への結合点を示す。このリンカー反応性置換基L-Z'は、N-ベータマレイミドプロピル-Val-Cit-para-アミノベンジル(BMP-Val-Cit-PAB)とも呼ばれる。
【０２８０】
いくつかの実施形態に、リンカーL及び化学的な部分構造Zは、L-Zとして一緒になって、
【化４４】
2021530546.tif 000047
式中、Sは、抗-CD-5抗体のような、抗体またはその抗原結合フラグメント内に存在する反応性置換基を表す硫黄原子である。リンカー末端の波線は、アマトキシンへの結合点を示す。
【０２８１】
いくつかの実施形態に、リンカーLおよび化学的な部分構造Zは、抗体に共役した後、L-Z-Abとして一緒になって、次の構造を有する:
【化４５】
2021530546.tif 000048
式中、Sは、抗-CD-137抗体のような、抗体またはその抗原結合フラグメント内に存在する反応性置換基を表す硫黄原子である。リンカー末端の波線は、アマトキシンへの結合点を示す。
【０２８２】
前記のリンカー部分およびアマトキシンリンカー共役はとりわけ、本明細書中に記載される組成物および方法と関連して有益であり、例えば、米国特許出願公開第2015/0218220号および特許出願公開第WO2017/149077号に記載されており、これらの各々の開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０２８３】
前記のリンカー部分およびアマトキシンリンカー共役はとりわけ、本明細書中に記載される組成物および方法と関連して有益であり、例えば、米国特許出願公開第2015/0218220号および特許出願公開第WO2017/149077号に記載されており、これらの各々の開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０２８４】
ある実施形態に、本明細書に記載されるCD137抗体または抗原結合フラグメントはそれぞれ本明細書に記載されるように、式Ab-Z-L-Am(式中、AbはCD137抗体またはその抗原結合フラグメントであり、Lはリンカーであり、Zは化学的な部分構造であり、Amはアマトキシン)によって表されるコンジュゲートを形成するように、アマトキシンに結合されてもよい。
【０２８５】
いくつかの実施形態に、Am-L-Z-Abはである:
【化４６】
2021530546.tif 000049
. 
【０２８６】
いくつかの実施形態に、Am-L-Z-Abはである:
【化４７】
2021530546.tif 000050
.
【０２８７】
いくつかの実施形態に、Am-L-Z-Abはである:
【化４８】
2021530546.tif 000051
【０２８８】
いくつかの実施形態に、Am-L-Z-Abはである:
【化４９】
2021530546.tif 000052
【０２８９】
いくつかの実施形態に、Am-L-Z-Abはである:
【化５０】
2021530546.tif 000053
【０２９０】
抗体薬物結合体の調製
本明細書中に開示される式IのADCにおいて、抗-CD137抗体またはその抗原結合フラグメントは本明細書中に開示されるリンカーLおよび化学的な部分構造Zを介して、1つ以上の細胞傷害性薬剤部分(D)(例えば、1抗体あたり約1~約20個の薬剤部分)に結合体化される。本発明のADCは、(1)抗体またはその抗原結合フラグメントの反応性置換基と二価リンカー試薬との反応、それに続く薬剤部分Dとの反応;または(2)薬剤部分の反応性置換基と二価リンカー試薬との反応、それに続くD-L-Z'の形成、それに続く本明細書中に記載されるような抗体またはその抗原結合フラグメントの反応性置換基との反応を含む、当業者に公知の有機化学反応、条件および試薬を使用するいくつかの経路によって調製され得る。ADCを調製するためのさらなる方法は、本明細書中に記載される。
【０２９１】
別の局面において、抗-CD137抗体またはその抗原結合フラグメントは、1つ以上のスルフヒドリル基を導入するために化学的に改変され得る1つ以上のリジン残基を有する。次いで、ADCは本明細書中上記のように、スルフヒドリル基の硫黄原子を通る共役によって形成される。リジンを修飾するために使用することができる試薬にはN-スクシンイミジルS-アセチルチオアセテート(SATA)および2-イミノチオラン塩酸塩(トラウト試薬)が含まれるが、これらに限定されない。
【０２９２】
別の局面において、抗-CD137抗体またはその抗原結合フラグメントは、1つ以上のスルフヒドリル基を有するように化学修飾され得る1つ以上の炭水化物基を有し得る。次いで、ADCは本明細書中上記のように、スルフヒドリル基の硫黄原子を通る共役によって形成される。
【０２９３】
さらに別の局面において、抗-CD137抗体は酸化されてアルデヒド(-CHO)基を提供し得る1つ以上の炭水化物基を有し得る(例えば、Laguzzaら、JMedChem.1989,32(3),548-55を参照のこと)。次いで、ADCは本明細書中上記のように、対応するアルデヒドを通る共役によって形成される。細胞毒素の付着または会合のためのタンパク質の修飾のための他のプロトコルはColiganら、電流プロトコルinタンパク質Science、volに記載されている。2, John Wiley & Sons (2002)(参照により本明細書に組み込まれる)。
【０２９４】
抗体、免疫グロブリンまたはそれらのフラグメントのような細胞標的タンパク質へのリンカー-薬物部分の結合のための方法は例えば、米国特許に見出される。米国特許第5,208,020号。No。6,441,163; WO2005037992; WO2005081711; およびWO2006/034488いずれも参照により明示的に組み込まれている。
【０２９５】
投与経路および投与法
あるいは、抗体および細胞傷害剤を含む融合タンパク質が例えば、組換え技術またはペプチドシンセシスによって作製され得る。DNAの長さは、結合体の2つの部分をコードするそれぞれの領域を、互いに隣接するか、または結合体の所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域によって分離されてもよい。
【０２９６】
本明細書中に記載されるADCは種々の投薬形態で患者(例えば、免疫疾患または癌に罹患しているヒト患者)に投与され得る。例えば、本明細書中に記載されるADCは、1つ以上の薬学的に受容可能な賦形剤を含む水溶液のような水溶液の形態で、免疫病またはガンに罹患している患者に投与され得る。本明細書中に記載される組成物および方法物と共に使用するための好適な薬学的に許容される賦形剤物は、粘度変性剤を含む。水溶液は、当技術分野で公知の技術を使用して滅菌することができる。
【０２９７】
本明細書に記載されるような抗-CD137 ADCを含む医薬製剤は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、このようなADCを1つ以上の任意の薬学的に許容可能な担体(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition、Osol、AEd(1980))と混合することによって調製される。薬学的に受容可能なキャリアは一般に、使用される用量および濃度で受領者に対して非毒性であり、これにはリン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝液;アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止;塩化オクタデシルベンジルアンモニウム;塩化ベンザルコニウム;フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール;メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン;レゾルシノール;3-ペンタノール;およびm-クレゾール;低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどの親水性ポリマー;単糖類、二糖類が挙げられるが、これらに限定されない。グルコース、マンノース、デキストリンなどの他の炭水化物;スクロース、マンニトール、トレハロース、ソルビトールなどの糖;ナトリウムなどの塩形成対イオン;金属錯体(Zn-タンパク質複合体など);および/または非イオン性界面活性剤 例えば、ポリエチレングリコール(PEG)。
【０２９８】
投与されるADCの量は自己細胞療法(例えば、CAR細胞療法)を拒絶する細胞(例えば、活性化T細胞)を枯渇させるのに充分であるべきである。治療的に有効な用量の決定は当業者の能力の範囲内であるが、例えば、免疫疾病またはがんの治療のためにADCの全身投与を利用する本明細書に記載の方法の実施形態において、有効なヒト用量は0.1~150mg/kg(例えば、5mg/kg、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg、75mg/kg、100mg/kg、150mg/kgなど)であろう。投与経路が推奨用量に影響を及ぼす可能性がある。有効なレベルを維持するために、例えば、採用される投与様式に依存して、CAR-T細胞拒絶の危険性を減少させるために、反復全身性用量が意図される。
【０２９９】
本明細書に記載の抗-CD137 ADCは、経口、経皮、皮下、鼻腔内、静脈内、筋肉内、眼内、または非経口などの様々な経路によって投与することができる。任意の所与の症例における投与のための最も好適な経路は特定のADC、患者、医薬製剤方法、投与方法(例えば、投与時刻および投与経路)、患者の年齢、身体重量、性別、治療される疾患の重症度、患者の食事、および患者の排泄速度に依存する。
【０３００】
本明細書中に記載される抗-CD137 ADCの有効量は例えば、単回(例えば、ボーラス)照射量、反復照射量、または持続照射量当たり、または抗-CD137 ADCの最適血清濃度(例えば、0.0001~5000μg/mLの血清濃度)を達成するために、約0.001~約100mg/kg体重量であり得る。抗-CD137 ADCの投与量は抗-CD137 ADCのデリバリー後の時点でCAR治療を受けたことがあるか、同時に受けているか、または受けることになるヒト対象に、1日、1週間、または1ヶ月あたり1回以上(例えば、2~10回)投与されてもよい。抗-CD137 ADCは、1回または複数回用量としてヒトに投与することができる。ある実施形態に、抗-CD137 ADCはホスト反応性T細胞の量を、例えば、CAR治療前に10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、またはそれ以上減少させるのに充分な量で投与することができる。
【実施例】
【０３０１】
以下の実施例は、本明細書中に記載される組成物および方法がどのように使用され、作製され、そして評価され得るかの記載を当業者に提供するために提示され、そして純粋に本発明の例示であることが意図され、そして本発明者らがそれらの発明とみなす範囲を限定することが意図されない。実施例1~3のデータは国際特許出願第WO2018/134787号(2018年7月26日公開)に以前に提示されており、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０３０２】
（実施例１）
インビトロT細胞死滅アッセイを用いる抗-CD137‐アマニチン抗体薬物コンジュゲート(ADC)のインビトロ解析
【０３０３】
凍結保存されたネガティブに選択された一次ヒトT細胞を解凍し、0.5:1のビーズ:細胞比率で抗‐CD3/抗‐CD28ビーズ(インビトロジェン)で刺激した。アッセイの最初に、384ウェルプレートのウェル当たり2e4 T細胞を播種し、ADCを0.003nm~30nmの間の様々な濃度でウェルに添加した後、37℃および5% CO 2を含むインキュベーターに入れた。4日間の培養後、細胞をフロー・サイトメトリーによって分析した。細胞を生存率マーカLive/Dead Yellow(Invitrogen)で染色し、容量フローサイトメーターで泳動した。生存、活性化細胞(図1A)および生存、非活性化細胞(図1B)の番号を、FSC対SSCによって決定した。アマニチンに結合した非特異的ヒトIgG(hIgG-アマニチン)は、ネガティブ・コントロールとして役立った。Thus control was compared to two different ADCs: 1) chimeric anti-CD137 antibody BBK2 conjugated to amanitin ( CD137-Amanitin); and 2) an ADC including an antibody specific a T-cell antigen conjugated to Amanitin ( anti-Tcell-Amanitin) .抗T細胞アマニチンADCは、活性化および非活性化T細胞の両方に結合して殺傷することが期待されたため、ポジティブ・コントロールとして役立った。
【０３０４】
図に示すように。抗-CD137-アマニチンADC(すなわち、"CD137-アマニチン")は活性化T細胞を特異的に殺し、非活性化(休止、定常状態)T細胞を有意に殺さなかった。さらに、活性化および非活性化T細胞の両方を特異的に標的とするADCであるポジティブ・コントロール(すなわち、「抗Tcell-アマニチン」ADC)は、活性化および非活性化T細胞の両方を死滅させた。
【０３０５】
（実施例２）
Xeno-GvHDマウスを用いたGvHD防止の解析
【０３０６】
抗-CD137‐アマニチンADCのGvHDの形成または発生を防止する能力をxeno‐GvHDマウスモデルを用いてインビボで評価した。6~8週齢の雌性NSGマウスを照射し(200cGy)、翌日、6×106ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を移植し、GvHDマウス模型を作製した。1日後、動物に、抗-CD137-アマニチンADC(すなわち、「CD137-アマニチン」)または様々な制御試薬(すなわち、緩衝液単独(「PBS」)、抗-CD137抗体(「CD137裸」)、またはCD137に特異的でないアマニチンベースのADC(「アイソタイプ-アマニチン」))を(3mg/kgで)投与した。The anti-CD137 antibody used in this example in the ADCs and as a naked antibody was chimeric BBK2.
【０３０７】
GvHDの徴候および/または身体状態の低下(限定するわけではないが、円背姿勢、波打った被毛、重量の喪失、および/または限定された活動を含む)について、投与後、毎日動物を密接に追跡した。身体状態に重大な問題がある動物、または重量喪失>20%を示した動物を屠殺し、その組織をヒトの細胞について分析した。マウスの末梢血および脾臓を、hCD45、mCD45、hCD3、およびhCD137抗体を含む抗体の混合物で染色し、赤血球細胞を溶解し、フロー・サイトメトリーによって分析した。血中のヒトT細胞数をhCD45+CD3+と定義し、入力血液量に対して正規化した。治療後の日数の関数としての生存パーセントを図2に示す。移植後日数の関数としての末梢血中のヒトT細胞の個数を図3に示す。
【０３０８】
図2に示されるように、抗-CD137-アマニチンADC(「CD137-アマニチン」)の単回用量で処置された動物は移植後80日でさえ、GvHDの本質的に完全な予防を示したが、管理(すなわち、PBS、抗-CD137抗体(裸)、およびアイソタイプアマニチン)で処置された動物はすべて、移植後11~13日以内に死亡した。これらの結果はまた、防CD137-アマニチンADCは全ての動物において良好な忍容性を示し、防CD137-アマニチンADCの単回用量がGvHDを完全に予防するのに充分であったことを示している(複数回用量を必要とするのに対して)。図3に示すように、ヒトT細胞は移植後少なくとも70日間にわたって末梢血のマウス中に検出されなかったが、対照で処理された動物は移植後数日間のマウスの末梢血中に検出可能なヒトT細胞を有すると特徴付けられ、対照で処理された動物におけるGvHDの発症を示した。
【０３０９】
（実施例３）
hNSG‐SGM3マウス模型における生着率と定常状態T細胞減少の決定
【０３１０】
雌、ヒト化NSG-SGM3マウスを、hCD45、mCD45、hCD3、およびhCD137抗体を用いたフロー・サイトメトリーにより、末梢血におけるベースラインヒト造血(全体およびT-細胞)生着率について評価した。Mice were randomized and then treated with CD137-Amanitin ADC ( chimeric BBK2-Amanitin ADC), Isotype-Amanitin ADC, or an anti-T cell Amanitin ADC, each at a dose of 3 mg/kg .マウスの末梢における生着およびT細胞枯渇を、処置後5日目、9日目、14日目、22日目および27日目に測定した(図4Aおよび4B)。末梢血を染色して、キメラ性およびT細胞数の変化を評価した。等量の血液を容量フローサイトメーターで流し、事象数に基づいて絶対カウントを決定した。生着率およびT細胞数の低下は、投与前値に正規化した。
【０３１１】
図の結果。4Aおよび4Bは、抗-CD137-アマニチンADCがこのマウスモデルにおいて良好な忍容性を示したことを示す。さらに、生着およびT細胞頻度(ベースラインまで正常化した後)はベースラインレベル付近のままであり、抗-CD137-アマニチンADC処理マウスについては、生着およびT細胞頻度の中等度から一過性の減少が認められた。これらのことから、定常状態のヒト化NSGマウスでは一般にT細胞欠乏がないことが示され、このことはT細胞の大部分が枯渇していないため、抗-CD137-アマニチンADC処理マウスでは免疫機能を保持できることを示している。逆に、別のT細胞マーカ(「抗T細胞アマニチン」)を特異的に標的とするADCで処理したマウスは、生着およびT細胞数の完全なアブレーションを示した。
【０３１２】
The heavy and light chain amino acid sequences of chimeric BBK2 described in the above examples are set forth in SEQ ID NOs: 11 and 12, respectively.
【０３１３】
（実施例４）
マウスモデルにおける同種CAR-T細胞の投与
【０３１４】
以下の研究は、様々な条件下で同種レシピエント(recipient)に存在するCAR-T細胞の濃度を評価するために実施される。
【０３１５】
本試験では、マウス同種CAR-Tを用いる。1つの適切なモデルはGhoshら、Nature Medicine(2017),23(2):242-249に記載される。
【０３１６】
第1の処置群のマウスを、0日目に1×107~1×109細胞/kgを静脈内注入することによって、同種T細胞の初回投与量で処置する。3日目に、マウスに抗-CD137-αアマニチンADCを3mg/kgの照射量で投与する。10日目に、ADCがマウスの血中から実質的に除去された後、マウスに同種異系CAR-T細胞を投与する。CAR-T細胞は、0日目に投与された同種T細胞と同じドナー(donor)からのものである。
【０３１７】
第2の治療群のマウスは第1の治療群と同じプロトコルを用いて治療するが、抗-CD137 ADCの代わりに、第3日に非抱合抗-CD137抗体を投与する。
【０３１８】
マウスの第3の処置群を、第1の処置群と同じプロトコルを用いて処置するが、抗-CD137 ADCの代わりに、3日目にα-アマニチンに結合したアイソタイプ対照抗体を投与する。
【０３１９】
マウスの4番目の治療群は最初の治療群と同じプロトコルを用いて治療するが、同種T細胞の代わりに0日目に初回投与量の自己T細胞を投与する。
【０３２０】
マウスの5番目の治療群には、前治療なしに、10日目に同種異系CAR-T細胞を投与する。
【０３２１】
マウスの6番目の治療群には、前治療を行わずに、10日目に自家CAR-T細胞を投与する。
【０３２２】
14日目、17日目、および30日目に、それぞれの投与群から得られたマウスの脾および末梢血中に存在するCAR-T細胞の個数を測定する。投与9日目に、それぞれの投与群の脾臓およびマウスの末梢血中のCD137+活性化T細胞の個数を測定する。試験期間を通じて、GVHDの症状(symptom)およびCAR-T細胞の有無についてマウスをモニタリングする。
【０３２３】
（実施例５）
同種細胞療法の拒否反応を防止するための抗-CD137のヒトへの投与
【０３２４】
同種CAR細胞療法などの同種細胞療法を受ける人を選択する。同種異系細胞の拒絶を阻害または予防するために、抗-CD137抗体薬物コンジュゲート(ADC)が、本明細書中に開示される方法に従って投与される。医師は以下の治療ステップを行う。
【０３２５】
第一に、同種細胞に対するプライミング免疫反応を誘発するのに充分な量の同種細胞を、最初の量で患者に静脈内投与する。プライミング段階では、同種細胞を投与して免疫反応を誘発し、内因性活性化CD137+ T細胞を生じる。
【０３２６】
続いて、リンカーを介して細胞毒素に結合した抗-CD137抗体を含む抗-CD137 ADCを投与する。抗-CD137 ADCは、内因性CD137+活性化T細胞を枯渇させるのに効果的な量で投与される。CD137+活性化T細胞のレベルを、抗-CD137 ADCの投与後に評価して、欠乏を確認する。
【０３２７】
次に、CARを発現する同種細胞を治療有効量投与する。同種細胞は、プライミング工程の間に被験者に投与された細胞と同じドナー(donor)に由来する。プライミングおよび抗-CD137 ADCの投与を伴わない同種細胞療法を受けた患者と比較して、レシピエント(recipient)患者における同種細胞の受理が促進され、宿主対移植片(HvG)反応の危険性が低下する。
【０３２８】
[表４]
【０３２９】
他の実施形態
本明細書において言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、あたかも各独立した刊行物または特許出願が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されたかのように、同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
【０３３０】
本発明はその特定の実施形態に関連して説明されてきたが、本発明はさらなる修正が可能であり、本出願は一般に、本発明の原理に従い、本発明が関係する技術内の既知のまたは慣例的な実施の範囲内に入り、本明細書で前述され、特許請求の範囲に従う本質的な特徴に適用され得る本発明からのそのような逸脱を含む、本発明の任意の変形、使用、または適応を包含することが意図されることが理解されるのであろう。
【０３３１】
他の実施形態は、請求項の範囲内である。
【図１Ａ】
2021530546.tif 000058
【図１Ｂ】
2021530546.tif 000059
【図２】
2021530546.tif 000060
【図３】
2021530546.tif 000061
【図４Ａ】
2021530546.tif 000062
【図４Ｂ】
2021530546.tif 000063
【誤訳訂正書】
【提出日】令和3年9月3日(2021.9.3)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、2018年7月23日に出願された米国仮特許出願第62/702292号に対し、35 U.S.C. §119(e)に基づく優先権の利益を主張する。上記出願の内容は、参照により本明細書に取り込まれる。
【０００２】
［技術分野］
本発明は、ヒト対象において、同種異系細胞療法（キメラ抗原レセプター(chimeric antigen receptor)(CAR)細胞療法）が拒絶されることを、前記細胞療法の拒絶を媒介することを担う、宿主の免疫システムの細胞が発現する抗原に結合する抗体-薬物コンジュゲート(antibody-drug conjugate (ADC))を投与することによって、治療する又は予防するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
同種異系細胞療法とは、患者に対して細胞を移植することが含まれ、その移植する細胞は、前記患者以外のドナー(donor)に由来する。同種異系細胞療法に用いられる同種ドナー(donor)の一般的な種類としては、HLAが適合している同胞、適合しているが非血縁のドナー(donor)、部分的に適合している家系員のドナー(donor)、血縁の臍帯血ドナー(donor)、及び非血縁の臍帯血ドナー(donor)が挙げられる。細胞療法における最終目標は、「既製」製品の基礎を形成することができる同種異系細胞療法を同定することであり（Brandenberger, et al. (2011). BioProcess International. 9 (suppl. I): 30-37）、これによって、同種異系細胞療法の使用は拡大するであろう。
【０００４】
同種異系細胞療法にとって、大きな可能性を抱える治療領域の一つにキメラ抗原レセプター(chimeric antigen receptor)(CAR)療法がある。CAR療法は、身体自身の免疫システムを利用して、がんなどある特定の疾患に関連する特異的抗原を発現する細胞を破壊する免疫学的治療法である。例えば、がんにおいて、CAR療法は、がんを攻撃する患者の免疫システムの力を得る、及び強化する。CAR療法は、T細胞などの免疫細胞に基づいており、この免疫細胞は、細胞外抗原結合ドメイン（scFvなど）と、前記細胞に表面レセプターからシグナル伝達をする細胞質活性シグナリング及び「共刺激」ドメインとが結合した、一般的に膜貫通融合タンパク質であるCARを発現する。従って、T-細胞のような免疫細胞がCARを発現すると、前記免疫細胞はCARの抗原結合ドメインがターゲットとする抗原(例えば、腫瘍関連抗原)を発現する細胞を認識し、それを傷害することができる(Geyer and Brentjens (2016) Cytotherapy 18(11): 1393-1409)。
【０００５】
現在まで、承認されているCAR療法は、前記患者から自家細胞を入手し、前記患者自身の細胞をCAR発現細胞に形質転換することに依存しており、その後、これらを治療に用いる。しかしながら、CAR療法には、自家細胞がしばしば個別のプロトコルを必要とするため、自家細胞を得ることに伴う時間とコストという課題がある。同種異系細胞を使用することができれば、CAR療法に関連する時間及びコストを減少させるであろう。
【０００６】
その有望性にもかかわらず、現在のところ同種異系細胞を治療的に使用することには、この治療を困難にする合併症がある。免疫応答能がある宿主では、移植された同種異系細胞は速やかに拒絶され、宿主対移植片拒絶(host versus graft rejection (HvG))と呼ばれる過程を経る。HvGにより、移入された細胞の有効性が実質的に低下することがあり、レシピエント(recipient)において有害事象が引き起こされ、同種異系細胞の使用が制限されることがある。同種異系細胞療法の可能性を更に高めるために、HvG拒絶を克服できる方法が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ヒト対象において、移植した同種異系細胞の拒絶を、予防する又は治療するための方法を提供する。特に、本明細書中に開示される方法を使用して、同種異系細胞療法を受けている患者において、宿主対移植片(HvG)を治療する又は予防することがある。本発明は、同種異系細胞療法の投与を容易にするために、前記患者中の、CD137を発現する活性化T細胞などの免疫細胞の集団を減少させるように、抗-CD137抗体-薬物コンジュゲート(ADC)を投与する方法を特徴とする。前記患者の免疫システムのCD137+細胞（例えば、活性化T細胞）を選択的に減少させることは、前記細胞療法の拒絶のリスクを予防するか、又は有意に減少させる。
【０００８】
第1の態様では、本発明は、ヒト対象に移植された同種異系細胞の拒絶を治療する又は予防するための方法、を特徴とする、前記方法は、前記ヒト対象において、同種異系細胞の拒絶を治療する又は予防するように、以下による、(a) 前記ヒト対象に、第1の量の同種異系細胞を投与すること、ここで、前記第1の量は、前記ヒト対象中で同種異系細胞に対するプライミング応答を誘発するのに十分である；(b) 内因性のCD137+活性化T細胞が減少するように、前記ヒト対象に、抗-CD137抗体薬物コンジュゲート(ADC)を投与すること、ここで、前記抗-CD137 ADCは、リンカーを介して細胞毒素にコンジュゲートした抗-CD137抗体又はその抗原結合フラグメントを含む；並びに、(c) 前記ヒト対象に、治療有効量のCARを発現する同種異系細胞を投与すること、ここで、前記同種異系細胞は、上記で投与される同種異系細胞と同じタイプである、及びここで、前記CARは、腫瘍抗原に結合する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナリング・ドメインを含む。ある実施形態では、前記方法は、ステップ(b)の約48時間〜約7日前に、前記ヒト対象に、前記第1の量の同種異系細胞を投与することを含む。別の実施形態では、ここで、前記方法は、ステップ(b)の約24時間〜約14日後に、前記ヒト対象に、治療有効量の前記CARを発現する同種異系細胞を投与することを含む。
【０００９】
別の態様では、本発明は、ヒト対象に移植された同種異系細胞の拒絶を治療する又は予防するための方法、を特徴とする、前記方法は、前記ヒト対象において、同種異系細胞の拒絶を治療する又は予防するように、以下による、(a) 前記ヒト対象に、抗-CD137抗体薬物コンジュゲート(ADC)を投与すること、ここで、前記抗-CD137 ADCは、リンカーを介して細胞毒素にコンジュゲートした抗-CD137抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、及びここで、前記ヒト対象は、前記ヒト対象に以前に投与された同種異形細胞に対する活性化T細胞を有することを特徴とする；並びに、(b) 前記ヒト対象に、治療有効量のCARを発現する同種異系細胞を投与すること、ここで、前記同種異系細胞は、(a)で記載される同種異系細胞と同じタイプである、及びここで、前記CARは、腫瘍抗原に結合する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナリング・ドメインを含む。ある実施形態では、前記方法は、ステップ(a)の約24時間〜約14日後に、前記ヒト対象に、治療有効量の前記CARを発現する同種異系細胞を投与することを含む。
【００１０】
ある特定の実施形態では、前記同種異系細胞は、同種異系T細胞又は同種異系NK細胞である。他の実施形態では、前記治療有効量の前記CARを発現する同種異系細胞は、約2×106〜約3.0×108 細胞/kgである。更に別の実施形態では、前記同種異系細胞の拒絶は、サイトカイン放出症候群(CRS)を特徴とする。他の実施形態では、前記ヒト対象は、がん又は自己免疫疾患を有する。別の実施形態では、前記抗-CD137抗体又はその抗原結合フラグメントは、それぞれ、配列番号(SEQ ID NO) 19、20、及び21に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2、及びCDR3を含む重鎖可変領域を含む、並びに、それぞれ、配列番号(SEQ ID NO)23、24、及び25に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2、及びCDR3を含む軽鎖可変領域を含む。他の実施形態では、前記抗-CD137抗体又はその抗原結合フラグメントは、キメラ化又はヒト化されている。
【００１１】
更に他の実施形態では、前記抗-CD137抗体又はその抗原結合フラグメントは、IgG1アイソタイプ又はIgG4アイソタイプである。他の実施形態では、前記細胞毒素は、抗有糸分裂薬剤又はRNAポリメラーゼ阻害剤である。
【００１２】
他の実施形態では、前記細胞毒素は、メイタンシン、カリケアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、インドリノベンゾジアゼピン、又はアウリスタチンである。ある実施形態では、前記アウリスタチンは、モノメチル・アウリスタチンF(MMAF)又はモノメチル・アウリスタチンE(MMAE)である。ある実施形態では、前記細胞毒素は、メイタンシンである。ある実施形態では、前記細胞毒素は、ピロロベンゾジアゼピン(PBD)である。例えば、いくつかの実施形態では、前記PBDを、テシリン又はタリリンから選択することがある。いくつかの実施形態では、前記細胞毒素は、カリケアマイシンであってもよい。例えば、いくつかの実施形態では、前記カリケアマイシンはオゾガマイシンであってもよい。
【００１３】
別の実施形態では、前記RNAポリメラーゼ阻害剤は、アマトキシンである。更に別の実施形態では、前記RNAポリメラーゼ阻害剤は、アマニチンである。更なる実施形態では、前記アマニチンは、α-アマニチン、β-アマニチン、γ-アマニチン、ε-アマニチン、アマニン、アマニンアミド、アマヌリン、アマヌリン酸、及びプロアマヌリンからなる群から選択される。更に別の実施形態では、前記抗-CD137 ADCは、式Ab-Z-L-Amによって表される、ここで、AbはCD137に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントである、Lはリンカーである、Zは化学的な部分構造である、及びAmはアマトキシンである。ある特定の実施形態では、リンカー-アマトキシン・コンジュゲートAm-L-Zは、式(III)で表される、
【化１】
2021530546.tif 000064
ここで、R1は、H、OH、ORA、又はORCである；
R2は、H、OH、ORB、又はORCである；
RA 及びRBは、存在する場合、それらが結合する酸素原子と一緒になって、任意選択的に置換された5員ヘテロシクロアルキル基を形成する；
R3は、H、RC、又はRDである；
R4、R5、R6、及びR7は、それぞれ独立してH、OH、ORC、ORD、RC、又はRDである；
R8は、OH、NH2、ORC、ORD、NHRC、又はNRCRDである；
R9は、H、OH、ORC、又はORDである；
Qは、-S-、-S(O)-、又は-SO2-である；
RCは-L-Zである；
RDは、任意選択的に置換されたC1-C6アルキル、任意選択的に置換されたC1-C6ヘテロアルキル、任意選択的に置換されたC2-C6アルケニル、任意選択的に置換されたC2-C6ヘテロアルケニル、任意選択的に置換されたC2-C6アルキニル、任意選択的に置換されたC2-C6ヘテロアルキニル、任意選択的に置換されたシクロアルキル、任意選択的に置換されたヘテロシクロアルキル、任意選択的に置換されたアリール、又は任意選択的に置換されたヘテロアリールである；
Lは、任意選択的に置換されたC1-C6アルキル、任意選択的に置換されたC1-C6ヘテロアルキル、任意選択的に置換されたC2-C6アルケニル、任意選択的に置換されたC2-C6ヘテロアルケニル、任意選択的に置換されたC2-C6アルキニル、任意選択的に置換されたC2-C6ヘテロアルキニル、任意選択的に置換されたシクロアルキル、任意選択的に置換されたヘテロシクロアルキル、任意選択的に置換されたアリール、任意選択的に置換されたヘテロアリール、である；若しくはジペプチドを含む；若しくは-((CH2)mO)n(CH2)m-を含む、ここで、m及びnは、それぞれ独立して、1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 及び 10から選択される；又は、それらの組み合わせである；並びに、
Zは、L上に存在する反応性置換基と、抗-CD137抗体、又はその抗原結合フラグメント内に存在する反応性置換基との間のカップリング反応から形成される化学的な部分構造である。
【００１４】
ある特定の実施形態では、前記リンカー-アマトキシン・コンジュゲートAm-L-Zは、式(III)で表される
【化２】
2021530546.tif 000065
ここで、R1は、H、OH、ORA、又はORCである；
R2は、H、OH、ORB、又はORCである；
RA 及びRBは、存在する場合、それらが結合する酸素原子と一緒になって、任意選択的に置換された5員ヘテロシクロアルキル基を形成する；
R3は、H、RC、又はRDである；
R4、R5、R6、及びR7は、それぞれ独立してH、OH、ORC、ORD、RC、又はRDである；
R8は、OH、NH2、ORC、ORD、NHRC、又はNRCRDである；
R9は、H、OH、ORC、又はORDである；
Qは、-S-、-S(O)-、又は-SO2-である；
RCは-L-Zである；
RDは、任意選択的に置換されたC1-C6アルキル、任意選択的に置換されたC1-C6ヘテロアルキル、任意選択的に置換されたC2-C6アルケニル、任意選択的に置換されたC2-C6ヘテロアルケニル、任意選択的に置換されたC2-C6アルキニル、任意選択的に置換されたC2-C6ヘテロアルキニル、任意選択的に置換されたシクロアルキル、任意選択的に置換されたヘテロシクロアルキル、任意選択的に置換されたアリール、又は任意選択的に置換されたヘテロアリールである；
Lはリンカーである；並びに、
Zは、L上に存在する反応性置換基と、抗-CD137抗体、又はその抗原結合フラグメント内に存在する反応性置換基との間のカップリング反応から形成される化学的な部分構造である。
【００１５】
式(III)のある実施形態では、Lは、ペプチドを含むリンカーである。
【００１６】
いくつかの実施形態では、前記リンカーは、一種以上のジペプチド、p-アミノベンジル(PAB)基、任意選択的に置換されたC1-C6アルキル、任意選択的に置換されたC1-C6ヘテロアルキル、任意選択的に置換されたC2-C6アルケニル、任意選択的に置換されたC2-C6ヘテロアルケニル、任意選択的に置換されたC2-C6アルキニル、任意選択的に置換されたC2-C6ヘテロアルキニル、任意選択的に置換されたC3-C6シクロアルキル、任意選択的に置換されたヘテロシクロアルキル、任意選択的に置換されたアリール、任意選択的に置換されたヘテロアリール、溶解度を高める基、-(C=O)-、-(CH2CH2O)p-基（ここで、pは1-6からの整数である）、((CH2)mO)n(CH2)m-（ここで、n及び各mは、それぞれ独立して、1、2、3、4、5、6、7、8、9及び10から選択される）；又はそれらの組み合わせ、を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、前記リンカーは、((CH2)mO)n(CH2)m-基及びヘテロアリール基を含む、ここで、前記ヘテロアリール基は、トリアゾールである。いくつかの実施形態では、((CH2)mO)n(CH2)m-基及びトリアゾールは、一緒になって以下を含む
【化３】
2021530546.tif 000066
ここで、nは1〜10である、及び波線は、更なるリンカー成分、化学的な部分構造Z、又はアマトキシンへの結合の位置を示す。
【００１８】
いくつかの実施形態では、Amは、丁度1個のRC置換基を含む。
【００１９】
他の実施形態では、前記抗有糸分裂薬剤は、メイタンシン、カリケアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、インドリノベンゾジアゼピン、又はアウリスタチンである。別の実施形態では、前記アウリスタチンは、モノメチル・アウリスタチンF(MMAF)又はモノメチル・アウリスタチンE(MMAE)である。
【００２０】
ある特定の実施形態では、前記ADCのリンカーは、N-ベータマレイミドプロピオニル-Val-Ala-パラ-アミノベンジル(BMP-Val-Ala-PAB)である。ある実施形態では、前記ADCのリンカーは、N-ベータ-マレイミドプロピオニル-Val-Ala-パラ-アミノベンジル(BMP-Val-Ala-PAB)である。いくつかの実施形態では、前記リンカーL及び前記化学的な部分構造Zは、L-Zとして一緒になって、以下である、
【化４】
2021530546.tif 000067
ここで、Sは、CD5に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント内に存在する反応性置換基を表す硫黄原子である(例えば、システイン残基の-SH基に由来する)。
【００２１】
いくつかの実施形態では、L-Zは、
【化５】
2021530546.tif 000068
である。
【００２２】
ある実施形態では、前記ADCは、以下の構造の何れか一つによって表される：
【化６】
2021530546.tif 000069
。
【００２３】
ある実施形態では、前記ADCは、以下の構造の何れか一つによって表される：
【化７】
2021530546.tif 000070
又は
【化８】
2021530546.tif 000071
。
【００２４】
他の実施形態では、前記ADCは、3日以下の血清半減期を有する。他の実施形態では、前記細胞外ドメインは、scFv抗体である、又は単鎖T細胞レセプター(scTCR)である。更なる別の実施形態では、前記細胞外ドメインは、非-免疫グロブリン・スキャフォールド・タンパク質(scaffold protein)を含む。他の実施形態では、前記CARの細胞外ドメインは、CD19、CD22、CD30、CD7、BCMA、CD137、CD22、CD20、AFP、GPC3、MUC1、メソテリン、CD38、PD1、EGFR(例えば、EGFRvIII)、MG7、BCMA、TACI、CEA、PSCA、CEA、HER2、MUC1、CD33、ROR2、NKR-2、PSCA、CD28、TAA、NKG2D、又はCD123からなる群から選択される腫瘍抗原に結合する。他の実施形態では、前記CARの細胞内シグナリング・ドメインは、CD28細胞内シグナリング・ドメイン、CD3ゼータ細胞内シグナリング・ドメイン、OX40細胞内シグナリング・ドメイン、及び／又はCD137細胞内シグナリング・ドメインを含む。更なる別の実施形態では、前記CARの細胞内シグナリング・ドメインは、CD3ゼータ細胞内シグナリング・ドメインを含む。ある特定の実施形態では、前記がんは、白血病、成人進行がん、膵臓がん、切除不能な膵臓がん、結腸直腸がん、転移性結腸直腸がん、卵巣がん、トリプル-ネガティブ乳がん、造血系／リンパ系がん、大腸がん肝臓転移、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、B細胞リンパ腫、再発性又は難治性B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞リンパ腫、再発性又は難治性びまん性大細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、原発性縦隔B細胞リンパ腫、再発性縦隔、難治性縦隔大細胞型B細胞リンパ腫、大細胞型B細胞リンパ腫、ホジキン・リンパ腫、非-ホジキン・リンパ腫、再発又は難治性非-ホジキンリンパ腫、難治性進行性非-ホジキンリンパ腫、B細胞性非-ホジキン・リンパ腫、難治性非-ホジキンリンパ腫、結腸直腸がん腫(colorectal carcinoma)、胃がん(gastric carcinoma)、膵がん(pancreatic carcinoma)、トリプルネガティブ浸潤性乳がん(triple-negative invasive breast carcinoma)、腎細胞がん(renal cell carcinoma)、肺扁平上皮がん(lung squamous cell carcinoma)、肝細胞がん(hepatocellular carcinoma)、尿路上皮がん(urothelial carcinoma)、白血病、B細胞性白血病、B細胞性急性リンパ球性白血病（B-cell acute lymphocytic leukemia）、B細胞性急性リンパ芽球性白血病（B-cell acute lymphoblastic leukemia）、成人急性リンパ芽球性白血病、B細胞性前リンパ球性白血病（B-cell prolymphocytic leukemia）、小児急性リンパ芽球性白血病(childhood acute lymphoblastic leukemia)、難治性小児急性リンパ芽球性白血病(refractory childhood acute lymphoblastic leukemia)、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ球性白血病、前リンパ球性白血病(prolymphocytic leukemia)、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、再発性プラズマ細胞性骨髄腫(recurrent plasma cell myeloma)、難治性プラズマ細胞性骨髄腫(refractory plasma cell myeloma)、多発性骨髄腫、再発性又は難治性多発性骨髄腫、骨の多発性骨髄腫、脳の悪性神経膠腫(malignant glioma of brain)、骨髄異形成症候群、EGFR陽性結腸直腸がん、多形性膠芽腫(glioblastoma multiforme)、新生物、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍(blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm)、肝臓転移、固形腫瘍、進行性固形腫瘍(advanced solid tumor)、メソテリン陽性腫瘍(mesothelin positive tumor)、血液悪性腫瘍、又はその他の進行した悪性腫瘍、である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１Ａ及び図１Ｂは、ネガティブ・コントロール(即ち、「hIgG-アマニチン」)と比較した場合の、抗-CD137-アマニチンADC(即ち、「CD137-アマニチン」)及び抗-T細胞特異的-アマニチンADC(即ち、「抗-T細胞-アマニチン」)を含む、in vitro T細胞傷害アッセイの結果をグラフで示す。本結果は、ADC濃度(x軸)を横軸とした、各ADCの生存している活性化細胞（図１Ａ）又は生存している非-活性化細胞（図１Ｂ）の数(Y軸)、を示している。
【図２】図２は、NSGマウスのxeno-GvHDモデルにおいて、コントロールPBS、抗-CD137抗体(そのまま(naked))、及びアイソタイプ-アマニチンと比較した、抗-CD137-アマニチンADCについて、移植後の日数を横軸にした(x軸)、マウスの生存率(y軸)を比較する in vivo アッセイの結果をグラフで示す。
【図３】図３は、NSGマウスのxeno-GvHDモデルにおいて、コントロールPBS、抗-CD137抗体(そのまま(naked))、及びアイソタイプ-アマニチンと比較した、抗-CD137-アマニチンADCについて、移植後の日数を横軸にした(x軸)、末梢血中で検出されたヒトT細胞の数(y軸)を比較する in vivo アッセイの結果をグラフで示す。
【図４】図４Ａ及び図４Ｂは、ヒト化NSG-SGM3マウス・モデルにおいて、定植率（図４Ａ）及びT細胞頻度（図４Ｂ）を測定した in vivo アッセイの結果をグラフで示すものである、ここで、定植及びT細胞頻度を、コントロールPBS、抗-CD137-BBK抗体(そのまま(naked))、及びアイソタイプ-アマニチン及び抗-T-細胞-アマニチンADCと比較して、抗-CD137-アマニチンADCについて、移植後5日目、9日目、14日目、22日目、27日目、に測定した。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
［詳細な説明］
ヒト対象における移植された同種異系細胞の拒絶を治療する、又は予防する（即ち、宿主対移植片(host versus graft (HvG))疾患を治療する、又は予防する）方法を、本明細書に開示する。本明細書中に開示される方法は、抗-CD137抗体薬物コンジュゲート(ADC)(これは、内因性のCD137+免疫細胞(例えば、活性化T細胞)に結合する)、及び同種異系細胞療法の両方を投与することを含む。同種異系細胞移植を受けているヒトに抗-CD137 ADCを投与することにより、内因性のCD137+ T細胞を減少させ、同種異系細胞療法に対する内因性細胞による反応のリスクを減少させる。抗-CD137 ADC及びCARを発現する同種異系細胞の併用によって、レシピエント(recipient)患者における同種異系細胞の受容が提供されるので、及びCAR発現細胞の効果を無くすことがある宿主対移植片(HvG)反応のリスクが減少するので、本明細書に開示する方法を、同種異系キメラ抗原レセプター(chimeric antigen receptor)(CAR)療法と併用して使用することがある。
【００２７】
Ｉ．定義
本明細書中で使用される場合、用語「約」は、記載される値より5%高い値又は低い値をいう。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、用語「同種異系」は、移植の文脈において使用する場合、ドナー(donor)からレシピエント(recipient)に移植する細胞(又は組織若しくは臓器)を定義するために使用する、ここで、前記ドナー(donor)及び前記レシピエント(recipient)は、同じ種の異なる個体である。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、用語「自己」は、ドナー(donor)及びレシピエント(recipient)が同じ対象である細胞又は移植片を指す。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、用語「異種」は、ドナー(donor)及びレシピエント(recipient)の種が異なっている細胞を指す。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、用語「免疫細胞」は、限定されるものではないが、造血起源であり、及び免疫応答において役割を果たす細胞を含むことが意図される。免疫細胞としては、限定されるものではないが、T細胞及びナチュラル・キラー(NK)細胞が挙げられる。ナチュラル・キラー細胞は、当技術分野で周知である。ある実施形態では、ナチュラル・キラー細胞として、NK-92細胞などの細胞株が挙げられる。NK細胞株の更なる例としては、NKG、YT、NK-YS、HANK-1、YTS細胞、及びNKL細胞が挙げられる。免疫細胞は、同種異系又は自己であることがある。
【００３２】
「操作した細胞」は、遺伝子、DNA若しくはRNA配列、又はタンパク質若しくはポリペプチドの付加又は改変によって、改変した、形質転換した、又は処理した任意の生命体の任意の細胞を意味する。本開示の単離した細胞、宿主細胞、及び遺伝子操作した細胞としては、CARをコードするDNA又はRNA配列を含み、細胞表層に前記CARを発現するNK細胞及びT細胞などの、単離した免疫細胞が挙げられる。単離した宿主細胞及び操作した細胞を、例えば、NK細胞活性又はTリンパ球活性を増強する、がんを治療する、及び自己免疫疾患を治療するために使用することがある。ある実施形態では、前記操作した細胞としては、免疫細胞、例えば、T-細胞又はナチュラル・キラー(NK細胞)、が挙げられる。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、特定の抗原に特異的に結合する、又は特定の抗原と免疫学的に反応性である免疫グロブリン分子をいう。抗体としては、限定されるものではないが、それらが所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、マルチスペシフィック抗体(multispecific antibody)(例えば、バイスペシフィック抗体(bispecific antibody))、及び抗体フラグメントが挙げられる。
【００３４】
一般的に、抗体は、抗原結合領域を含む重鎖及び軽鎖を含む。各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書では、HCVR又はVHと略す)及び重鎖定常領域から構成される。前記重鎖定常領域は、3つのドメイン（CH1、CH2及びCH3）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書では、LCVR又はVLと略す)及び軽鎖定常領域から構成される。前記軽鎖定常領域は、1つのドメイン（CL）から構成される。前記VH及びVL領域は、超可変性の領域（相補性決定領域(CDR)と呼ばれる）に更に細分化することができ、より保存された領域（骨格領域(FR)と呼ばれる）が点在する。各VH及びVLは、3つのCDR及び4つのFRから構成され、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、以下の順序で配列する：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。前記重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。前記抗体の定常領域は、前記免疫グロブリンが宿主の組織又は因子（例えば、免疫システムの種々の細胞(例、エフェクター細胞)及び古典的補体システムの第一成分(C1q)等）に結合することを、仲立ちすることがある。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、用語「抗原結合フラグメント」は、ターゲット抗原に特異的に結合する作用能を保持する抗体の1つ以上の部分をいう。抗体の抗原結合機能を、全長抗体のフラグメントによって果たすことができる。前記抗体フラグメントは、例えば、Fab、F(ab')2、scFv、ダイアボディ、トリアボディ、アフィボディ、ナノボディ、アプタマー、又はドメイン抗体であることがある。抗体の「抗原結合フラグメント」という用語に包含される結合フラグメントの例としては、限定されるものではないが、以下が挙げられる：(i)Fabフラグメント、VL、VH、CL及びCH1ドメインからなる一価フラグメント；(ii)F(ab')2フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結した、2つのFabフラグメントを含む二価フラグメント；(iii) VH及びCH1ドメインからなるFdフラグメント；(iv)抗体の単一アームのVL及びVHドメインからなるFvフラグメント；(v) VH及びVLドメインを含むdAb；(vi) VHドメインからなるdAbフラグメント(例えば、Ward et al., Nature 341:544-546、1989を参照のこと)；(vii) VH又はVLドメインからなるdAb；(viii)単離した相補性決定領域(CDR)；並びに(ix)合成リンカーによって任意選択的に連結することがある2つ以上(例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、又は6つ)の単離したCDRの組み合わせ。更に、Fvフラグメントの2つのドメイン（VL及びVH）は、別々の遺伝子によってコードされているが、それらを、組換え方法を使用することで、リンカーによって連結して、その結果、単一タンパク質鎖（VL及びVH領域が対になって一価分子を形成する）とすることができる(単鎖Fv(scFv)として公知である；例えば、Bird et al., Science 242:423-426, 1988 及び Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988を参照のこと)。これらの抗体フラグメントを、当業者に公知の従来の技術を使用して入手することができ、及び前記フラグメントを、インタクトな抗体と同じ様式で、有用性についてスクリーニングすることができる。抗原結合フラグメントを、組換えDNA技術、インタクトな免疫グロブリンの酵素的な又は化学的な切断によって、又は、ある場合には、当該技術分野で公知の化学的ペプチド合成手順によって、産生することができる。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、「インタクト」又は「全長」抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続された2つの重(H)鎖ポリペプチド及び2つの軽(L)鎖ポリペプチドを有する抗体を指す。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、「抗-CD137抗体」又は「CD137に結合する抗体」又は「抗-CD137 ADC」又は「CD137に結合するADC」という用語は、CD137がT細胞などの細胞の細胞表面上に見出される場合、ヒトCD137に特異的に結合する抗体又はADCを指す。ヒトCD137の細胞外ドメインのアミノ酸配列を、配列番号(SEQ ID NO): 1として、以下に記載する。
【化９】
2021530546.tif 000072
【００３８】
用語「特異的に結合する」は、本明細書で使用される場合、抗体(又はADC)が、タンパク質一般というよりも、特異的なタンパク質構造(エピトープ)を認識し、結合する能力を指す。抗体がエピトープ「A」に特異的である場合、標識した「A」及び前記抗体を含む反応において、エピトープA(又は遊離の、非標識のA)を含む分子が存在すると、前記抗体に結合する標識したAの量が減少する。例えば、抗体は（標識されている場合）、対応する非標識抗体によってそのターゲットから競合して離れることができる場合、ターゲットに「特異的に結合する」。ある実施形態では、抗体は、ターゲット（例えば、CD137）に、前記抗体が、少なくとも約10-4M、10-5 M、10-6 M、10-7 M、10-8 M、10-9 M、10-10 M、10-11M、10-12 M、又はそれ未満(未満とは、10-12未満の数値を意味する、例えば10-13)の、前記ターゲットに対するKDを有する場合、特異的に結合する。ある実施形態では、「CD137に対する特異的な結合」又は「CD137に特異的に結合する」という用語は、本明細書中で使用される場合、又はCD137に結合し、そして表面プラズモン共鳴によって測定すると、1.0×10-7M以下の解離定数(KD)を有する、抗体を指す。ある実施形態では、KDを、標準的なバイオレイヤー干渉法(Bio-Layer Interferometry)(BLI)に従って測定する。しかし、前記抗体は、配列が関連する2つ以上の抗原に特異的に結合することができることを理解されたい。例えば、ある実施形態では、抗体は、CD137のヒト及び非-ヒト(例えば、マウス又は非-ヒト霊長類)オルソログの両方に特異的に結合することがある。
【００３９】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術によって産生される抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、任意の真核生物、原核生物、又はファージ・クローンを含む単一のクローンから、当技術分野で利用可能な、又は公知の任意の手段によって、得られる。本開示と供に有用なモノクローナル抗体を、ハイブリドーマ、組換え、及びファージ・ディスプレイ技術、又はそれらの組合せを使用することを含む、当技術分野で公知の多種多様な技術を使用して調製することができる。
【００４０】
本明細書で使用される用語「キメラ」抗体は、ラット又はマウス抗体などの非-ヒト免疫グロブリンに由来する可変配列、及び典型的にはヒト免疫グロブリン・テンプレートから選択されるヒト免疫グロブリン定常領域、を有する抗体を指す。キメラ抗体を産生するための方法は、当該分野で公知である。例えば、Morrison, 1985, Science 229(4719):1202-7; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214-221; Gillies et al., 1985, J. Immunol. Methods 125:191-202; U.S. Pat. Nos. 5,807,715; 4,816,567; 及び 4,816,397を参照のこと。
【００４１】
本明細書で使用される場合、用語「半減期」は、体内での抗体薬物の血漿中濃度が半分又は50%低下するのにかかる時間を指す。この血清濃度の50%の低下は、循環する薬物の量を反映する。
【００４２】
本明細書で使用される場合、用語「宿主対移植片病（host-versus-graft disease）」又は「HvG」は、同種異系細胞、組織、又は臓器がレシピエント(recipient)の免疫システムによって拒絶される移植拒絶を指す。
【００４３】
非-ヒト(例えば、マウス)抗体の「ヒト化」形態は、非-ヒト免疫グロブリンに由来する配列を最小限に含むキメラ免疫グロブリンである。概して、ヒト化抗体は少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、CDR領域の全て又は実質的に全ては非-ヒト免疫グロブリンのものに対応し、FR領域の全て又は実質的に全てはヒト免疫グロブリン配列のものである。前記ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリン・コンセンサス配列の少なくとも一部を含むことがある。抗体をヒト化する方法は、当該分野で公知である。例えば、Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-7; U.S. Pat. Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; 及び 6,180,370 to Queen et al.; EP239400; PCT公開 WO 91/09967; U.S. Pat. No. 5,225,539; EP592106; EP519596; Padlan, 1991, Mol. Immunol., 28:489-498; Studnicka et al., 1994, Prot. Eng. 7:805-814; Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:969-973; 及び U.S. Pat. No. 5,565,332を参照。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、用語「キメラ抗原レセプター(chimeric antigen receptor)」又は「CAR」は、抗原に特異的に結合し得る少なくとも1つの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び少なくとも1つの細胞内シグナリング・ドメインを含む組換えポリぺプチドをいう。一般に、CARは、免疫エフェクター細胞の細胞傷害性を、所定の抗原を提示する細胞に向けるように遺伝子操作をしたレセプターである。CARは、所望の抗原(例えば、腫瘍抗原)に対する抗体ベースの特異性を、T細胞受容体-活性化細胞内ドメインと組み合わせて、特異的な細胞性免疫活性を示すキメラ・タンパク質を生成する分子である。特定の実施形態では、CARは、細胞外ドメイン(結合ドメイン又は抗原特異的結合ドメインとも呼ばれる)、膜貫通ドメイン、及び細胞内(intracellular)（細胞内(細胞質側(cytoplasmic))）シグナリング・ドメインを含む。前記CARの抗原結合ドメインが、ターゲット細胞の表面上のターゲット抗原と結合すると、前記CARはクラスター化し、活性化刺激をCAR含有細胞に送る。CARの主要な特徴は、免疫エフェクター細胞の特異性を転換する作用能であり、それにより、モノクローナル抗体、可溶性リガンド又は細胞特異的コ-レセプターの細胞特異的ターゲティングの作用能を利用しながら、増殖、サイトカイン産生、ファゴサイトーシス又は主要組織適合性(MHC)非依存的に、ターゲット抗原を発現する細胞の細胞死を媒介することができる分子の産生をトリガーする。いくつかの実施形態では、CARは、腫瘍抗原に特異的に結合する細胞外結合ドメイン；膜貫通ドメイン；及び1つ以上の細胞内シグナリング・ドメインを含む。様々な実施形態では、CARは、ヒトCD137に特異的に結合する細胞外結合ドメイン；膜貫通ドメイン；及び1つ以上の細胞内シグナリング・ドメインを含む。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、用語「CAR療法」は、CARを発現するように操作した免疫細胞を、所与の疾患(例えば、がん又は自己免疫疾患)を治療するために、ヒト対象へ投与することを言う。CAR療法は、操作した免疫細胞を使って、前記患者を特異的に治療することをいい、そしてCAR細胞療法と併せて一般的に使用される療法(例えば、リンパ球除去化学療法)を含むことは意図されない。特に、用語「細胞」が全体を通して使用される場合、細胞の集団もまた、特に明記されない限り、この用語に含まれる。例えば、CAR療法は、操作した細胞の集団を投与することを必要とする。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、用語「併用」又は「併用療法」は、単一のヒト患者において、2種(又はそれ以上)の治療を使用することをいう。これらの用語は、合剤組成物を指すことを意図していない。例えば、本明細書に記載することは、抗-CD137 ADCを投与すること及び同種異系のCAR療法、を含む併用療法である。
【００４７】
用語「プライミング応答（priming response）」とは、本明細書中で使用される場合、ヒト対象において誘発される免疫応答を指し、前記対象の免疫システムが最初に抗原を提示される場合の免疫応答を指す。T又はB細胞が特異的な抗原を最初に接触することをプライミングと呼び、活性化した同種-抗原T細胞を引き起こす。プライミング用量は、応答を誘発するために必要な単回用量又は複数回用量であることがある。「プライミング量（priming amount）」は、プライミング応答を誘発するために使用される抗原(例えば、同種異系細胞)の量である。プライミング量は、一般的には、治療有効量ではなく、寧ろ、対象のT細胞を活性化するために使用する量である。いくつかの実施形態では、同種異系細胞のプライミング量は、同種異系細胞の治療有効量未満である。ある実施形態では、プライミング応答は、ヒト対象への同種異系細胞の投与時に誘発され、その結果、CD137+ T細胞が活性化する。
【００４８】
用語「減少させる（deplete）」は、CD137発現細胞に対する抗-CD137抗体又はADCの効果に関する文脈において、CD137発現細胞を、数で減少させる又は排除することを指す。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、用語「有効量」又は「治療有効量」は、所望の結果を達成するために、又は自己免疫疾患若しくはがんに対する効果を有するために、十分な量をいう。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、用語「対象」及び「患者」は、本明細書中に記載するような特定の疾患又は症状のための治療を受ける、ヒトのような生命体をいう。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、「治療する」又は「治療」は、疾患の任意の結果に対して任意の向上(例えば、生存期間の延長、より少ない罹患率、及び／又は代替の治療モダリティの副産物である副作用の減少)をもたらすことを言う；当該分野で容易に認識されるように、疾患の完全な根絶は好ましいが、治療行為の必要条件ではない。有益な又は所望の臨床成績としては、限定されるものではないが、同種異系のCARを発現する免疫細胞の受容を促進することが挙げられる。本発明の方法が障害を予防することに向けられる限り、用語「予防する」は、前記病態が完全に阻止されることを必要としないことが理解される。寧ろ、本明細書中で使用される場合、用語の予防することとは、障害に対して感受性がある集団を同定する当業者の能力をいい、その結果、疾患が発症する前に、本発明の化合物を投与することがある。前記用語は、病態を完全に回避することを意味するものではない。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」は、プラスミド、DNAベクター、プラスミド、RNAベクター、ウイルス、又は他の好適なレプリコン等の、核酸ベクターを含む。本明細書中に記載する発現ベクターは、ポリヌクレオチド配列、並びに、例えば、タンパク質を発現させる及び／又は哺乳動物細胞のゲノムの中にこれらのポリヌクレオチド配列を組み込ませるために使用する更なる配列エレメントを含むことがある。CARを発現させるのに用いることができる特定のベクターとしては、遺伝子転写を指示する調節配列（例えば、プロモーター領域及びエンハンサー領域等）を含むプラスミドが挙げられる。抗体又はCARを発現させるための他の有用なベクターは、これらの遺伝子の翻訳効率を高めるか、又は遺伝子転写から生じるmRNAの安定性又は核外への移行を改善するポリヌクレオチド配列を含む。これらの配列要素は、例えば、発現ベクター上にある遺伝子を効率的に転写するようにするために、5'及び3'非翻訳領域及びポリアデニル化シグナル部位を含むことがある。本明細書中に記載する発現ベクターはまた、このようなベクターを含む細胞を選択するためのマーカーをコードするポリヌクレオチドを含むこともある。好適なマーカーの例としては、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、及びノウルセオスリシン(nourseothricin)等の抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子が挙げられる。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体薬物コンジュゲート」又は「ADC」は、細胞毒素に連結した抗体を指す。ADCは、ある分子(例えば、抗体又はその抗原結合フラグメント)の反応性官能基と、別の分子(例えば、本明細書中に記載する細胞毒素)の適切な反応性官能基との化学結合によって形成される。コンジュゲートは互いに結合した2つの分子間(例えば、抗体と細胞毒素との間)にリンカーを含むことがある。特に、用語「コンジュゲート」(化合物をいう場合)はまた、本明細書中で、「薬物コンジュゲート」、「抗体薬物コンジュゲート」又は「ADC」とも、互換的に称される。コンジュゲートの形成に用いることができるリンカーの例としては、ペプチド含有リンカー（例えば、天然に存在する又は天然に存在しないアミノ酸、例えば、D-アミノ酸を含有するリンカー）が挙げられる。リンカーを、本明細書中に記載する、及び当該技術分野で公知である、種々のストラテジーを使用して調製することがある。その中の反応性成分に依存して、リンカーは、例えば、酵素的加水分解、光分解、酸性条件下での加水分解、塩基性条件下での加水分解、酸化、ジスルフィド還元、求核切断、又は有機金属切断によって、切断されることがある(例えば、Leriche et al., Bioorg. Med. Chem., 20:571-582, 2012を参照のこと)。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、用語「カップリング反応」は、互いに反応するのに適した2つ以上の置換基が反応して、それぞれの置換基に結合した分子フラグメントを(例えば、共有結合的に)結合させる化学的な部分構造を形成する化学反応を指す。カップリング反応には、細胞毒素（例えば、当該技術分野で公知の又は本明細書中に記載する細胞毒素）であるフラグメントに結合した反応性置換基が、抗体、又はその抗原結合フラグメント（例えば、当該技術分野で公知の若しくは本明細書中に記載される、CD137に結合する、抗体、その抗原結合フラグメント、又は特異的な抗-CD137抗体）であるフラグメントに結合した好適な反応性置換基と反応する反応が含まれる。好適な反応性置換基の例としては、求核／求電子対(例えば、特に、チオール／ハロアルキル対、アミン／カルボニル対、又はチオール／α, β-不飽和カルボニル対等)、ジエン／ジエノフィル対(例えば、とりわけ、アジド／アルキン対)等が挙げられる。カップリング反応としては、限定されるものではないが、チオール・アルキル化、ヒドロキシル・アルキル化、アミン・アルキル化、アミン縮合、アミド化、エステル化、ジスルフィド形成、環化付加(例えば、特に、[4+2]Diels-Alder環化付加、[3+2]Huisgen環化付加)、芳香族求核置換、芳香族求電子置換、及び当該技術分野で知られているか又は本明細書に記載されている他の反応様式が挙げられる。本明細書中で使用される場合、「微小管結合剤」という語は、細胞における有糸分裂及び間期細胞機能に必須である微小管ネットワークを破壊することによって作用する化合物をいう。微小管結合剤の例としては、限定されるものではないが、メイタシン(maytasine)、メイタンシノイド、及びそれらの誘導体(本明細書に記載するか、又は当該技術分野で公知のものなど)、ビンブラスチン、ビンブラスチン硫酸、ビンクリスチン、ビンクリスチン硫酸、ビンデシン、及びビノレルビン等のビンカ・アルカロイド、ドセタキセル及びパクリタキセル等のタキサン、ディスコデルモリド、コルヒチン(cochicine)及びエポチロン等のマクロライド、並びにそれらの誘導体(エポチロンB又はそれらの誘導体など)が挙げられる。
【００５５】
本明細書中で使用される場合、用語「アマトキシン」は、Amanita phalloides mushroomsによって産生されるペプチドのアマトキシン・ファミリーのメンバー、又はその誘導体（例えば、RNAポリメラーゼII活性を阻害し得るそのバリアント若しくは誘導体）のことをいう。アマトキシンを、種々のキノコ種(例えば、Amanita phalloides、Galerina marginata、Lepiota brunneo-incarnata)から単離することがある、又は半合成的若しくは合成的に調製することがある。このファミリーのメンバー（α-アマニチン）は、Wieland, Int. J. Pept. Protein Res.1983, 22(3):257-276に記載されている。アマトキシンの誘導体を、天然に存在する化合物を化学的に改変すること(「半合成」)によって得ることがある、又は完全に合成の供給源から得ることがある。種々のアマトキシン誘導体の合成経路は、例えば、米国特許第 9,676,702 及び Perrin et al., J. Am. Chem. Soc. 2018, 140, p. 6513-6517に記載されている(これらの各々は、アマトキシンを調製する及び誘導体化するための合成方法に関して、その全体が本明細書に参照により取り込まれる)。
【００５６】
本明細書に記載する組成物及び方法と併用して有用なアマトキシンとしては、限定されるものではないが、式(II)の化合物（例えば、α-アマニチン、β-アマニチン、γ-アマニチン、ε-アマニチン、アマニン、アマニンアミド、アマヌリン、アマヌリン酸、又はプロアマヌリン）が挙げられる。本明細書中に記載するように、アマトキシンを、例えば、リンカー部分(L)を介して、抗体、又はその抗原結合フラグメントにコンジュゲートさせることがある（これにより、ADCを形成する)。アマトキシンをコンジュゲートする例示的な方法及びそのようなプロセスに有用なリンカーを以下に記載する。例示的なアマトキシン-リンカー・コンジュゲートの構造は、式(III)、(IIIA)、及び(IIIB)によって表される。前記組成物及び方法による、抗体、又は抗原結合フラグメントへのコンジュゲートに有用な、例示的なリンカー含有アマトキシンもまた、本明細書に記載する。
【００５７】
本明細書で使用される用語「アシル」は、-C(=O)Rを指す、ここで、本明細書で定義されるように、Rは水素(「アルデヒド」)、C1-C12アルキル、C2-C12アルケニル、C2-C12アルキニル、C3-C7カルボシクリル、C6-C20アリール、5-10員ヘテロアリール、又は5-10員ヘテロシクリルである。非限定的な例としては、ホルミル、アセチル、プロパノイル、ベンゾイル、及びアクリロイルが挙げられる。
【００５８】
本明細書で使用される用語「C1-C12アルキル」は、1〜12個の炭素原子を有する直鎖又は分岐の飽和炭化水素を指す。典型的なC1-C12アルキル基としては、限定されるものではないが、-メチル、-エチル、-n-プロピル、-n-ブチル、-n-ペンチル、及び-n-ヘキシルが挙げられる；一方、分岐C1-C12アルキルとしては、限定されるものではないが、-イソプロピル、-sec-ブチル、-イソブチル、-tert-ブチル、-イソペンチル、及び2-メチルブチルが挙げられる。C1-C12のアルキル基は、置換されていない、又は置換されていることがある。
【００５９】
本明細書で使用される用語「アルケニル」は、不飽和の少なくとも1つの部位、即ち、炭素-炭素、sp2二重結合、を有する、通常の、第2級の、又は第3級の炭素原子を含むC2-C12炭化水素を指す。例としては、限定されるものではないが、以下が挙げられる：エチレン又はビニル、-アリル、-1-ブテニル、-2-ブテニル、-イソブチレニル、-1-ペンテニル、-2-ペンテニル、-3-メチル-1-ブテニル、-2-メチル-2-ブテニル、-2,3-ジメチル-2-ブテニルなどが挙げられる。アルケニル基は、置換されていない、又は置換されていることがある。
【００６０】
本明細書で使用される「アルキニル」は、不飽和の少なくとも1つの部位、即ち、炭素-炭素、sp三重結合を有する、通常の、第2級の、又は第3級の炭素原子を含むC2-C12炭化水素を指す。例としては、限定されるものではないが、アセチレン及びプロパルギルが挙げられる。アルキニル基は、置換されていない、又は置換されていることがある。
【００６１】
本明細書で使用される「アリール」は、C6-C20炭素環芳香族基を指す。アリール基の例としては、限定されるものではないが、フェニル、ナフチル及びアントラセニルが挙げられる。アリール基は、置換されていない、又は置換されていることがある。
【００６２】
本明細書で使用される「アリールアルキル」は、炭素原子（典型的には末端又はsp3炭素原子）に結合した水素原子の1つがアリール・ラジカルで置換されている、非環状アルキル・ラジカルを指す。典型的なアリールアルキル基としては、限定されるものではないが、ベンジル、2-フェニルエタン-1-イル、2-フェニルエテン-1-イル、ナフチルメチル、2-ナフチルエタン-1-イル、2-ナフチルエテン-1-イル、ナフトベンジル、2-ナフトフェニルエタン-1-イルなどが挙げられる。前記アリールアルキル基は6〜20個の炭素原子を含み、例えば、アリールアルキル基のアルキル部分（例えば、アルカニル、アルケニル又はアルキニル基等が挙げられる）は1〜6個の炭素原子であり、アリール部分は5〜14個の炭素原子である。アルカリル基は、置換されていない、又は置換されていることがある。
【００６３】
本明細書で使用される「シクロアルキル」は、飽和炭素環ラジカルを指し、これは単環式又は二環式であることがある。シクロアルキル基としては、単環として3〜7個の炭素原子を有する環、又は二環として7〜12個の炭素原子を有する環が挙げられる。単環式シクロアルキル基の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、及びシクロオクチルが挙げられる。シクロアルキル基は、置換されていない、又は置換されていることがある。
【００６４】
本明細書で使用される「シクロアルケニル」は不飽和炭素環ラジカルを指し、これは単環式でも二環式でもよい。シクロアルケニル基としては、単環として3〜6個の炭素原子を有する環、又は二環として7〜12個の炭素原子を有する環が挙げられる。単環式シクロアルケニル基の例としては、1-シクロペント-1-エニル、1-シクロペント-2-エニル、1-シクロペント-3-エニル、1-シクロヘキサ-1-エニル、1-シクロヘキサ-2-エニル、及び1-シクロヘキサ-3-エニルが挙げられる。シクロアルケニル基は、置換されていない、又は置換されていることがある。
【００６５】
本明細書で使用される「ヘテロアラルキル」は、炭素原子（典型的には末端又はsp3炭素原子）に結合した水素原子の1つがヘテロアリール・ラジカルで置換されている、非環状アルキル・ラジカルを指す。典型的なヘテロアリールアルキル基としては、限定されるものではないが、2-ベンズイミダゾリルメチル、2-フリルエチル等が挙げられる。前記ヘテロアリールアルキル基は6〜20個の炭素原子を含み、例えば、ヘテロアリールアルキル基のアルキル部分(アルカニル、アルケニル又はアルキニル基等が挙げられる)は1〜6個の炭素原子である、並びにヘテロアリール部分は5〜14個の炭素原子である並びにN、O、P、及びSから選択される1〜3個のヘテロ原子である。前記ヘテロアリールアルキル基のヘテロアリール部分は、3〜7個の環員を有する単環(2〜6個の炭素原子)であることがある、又は7〜10個の環員を有する二環(4〜9個の炭素原子並びにN、O、P、及びSから選択される1〜3個のヘテロ原子)であることがある、例えば：二環[4,5]、[5,5]、[5,6]、又は[6,6]システム。
【００６６】
本明細書で使用される「ヘテロアリール」及び「ヘテロシクロアルキル」は、それぞれ芳香族又は非芳香族環システムを指し、ここで1つ以上の環原子は、ヘテロ原子、例えば窒素、酸素、及び硫黄である。ヘテロアリール又はヘテロシクロアルキル・ラジカルは、2〜20個の炭素原子及びN、O、P、及びSから選択される1〜3個のヘテロ原子を含む。ヘテロアリール又はヘテロシクロアルキルは、3〜7個の環員を有する単環(2〜6個の炭素原子並びにN、O、P、及びSから選択される1〜3個のヘテロ原子)であることがある、又は7〜10個の環員を有する二環(4〜9個の炭素原子並びにN、O、P、及びSから選択される1〜3個のヘテロ原子)であることがある、例えば：二環[4,5]、[5,5]、[5,6]、又は[6,6]システム。ヘテロアリール及びヘテロシクロアルキルは、置換されていない、又は置換されていることがある。
【００６７】
ヘテロアリール及びヘテロシクロアルキル基は、Paquette, Leo A.; "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W. A. Benjamin, New York, 1968), 特に1, 3, 4, 6, 7, 及び 9章; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, New York, 1950 to present), 特に Volumes 13, 14, 16, 19, 及び 28; 並びに J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566、に記載されている。
【００６８】
ヘテロアリール基の例としては、例えば、限定されるものではないが、ピリジル、チアゾリル、テトラヒドロチオフェニル、ピリミジニル、フラニル、チエニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、テトラゾリル、ベンゾフラニル、チアナフタレニル、インドリル、インドレニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンズイミダゾリル、イソキサゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、インドリジニル、イソインドリル、3H-インドリル、1H-インダゾリル、プリニル、4H-キノリジニル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、プテリジニル、4aH-カルバゾリル、カルバゾリル、フェナントリジニル、アクリジニル、ピリミジニル、フェナントロリニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フラザニル、フェノキサジニル、イソクロマニル、クロマニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、及びイサチノイルが挙げられる。
【００６９】
ヘテロシクロアルキルの例としては、例えば、限定されるものではないが、ジヒドロピリジル、テトラヒドロピリジル(ピペリジル)、テトラヒドロチオフェニル、ピペリジニル、4-ピペリドニル、ピロリジニル、2-ピロリドニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、ビス-テトラヒドロピラニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、デカヒドロキノリニル、オクタヒドロイソキノリニル、ピペラジニル、キヌクリジニル、及びモルホリニルが挙げられる。
【００７０】
限定ではなく例として、炭素結合ヘテロアリール類及びヘテロシクロアルキル類は、ピリジンの2、3、4、5、若しくは6位、ピリダジンの3、4、5、若しくは6位、ピリミジンの2、4、5、若しくは6位、ピラジンの2、3、5、若しくは6位、フラン、テトラヒドロフラン、チオフラン、チオフェン、ピロール若しくはテトラヒドロピロールの2、3、4、若しくは5位、オキサゾール、イミダゾール若しくはチアゾールの2、4、若しくは5位、イソオキサゾール、ピラゾール、若しくはイソチアゾールの3、4、若しくは5位、アジリジンの2、若しくは3位、アゼチジンの2、3若しくは4位、キノリンの2、3、4、5、6、7、若しくは8位、又はイソキノリンの1、3、4、5、6、7、若しくは8位、で結合する。更に典型的には、炭素結合ヘテロシクリルとしては、2-ピリジル、3-ピリジル、4-ピリジル、5-ピリジル、6-ピリジル、3-ピリダジニル、4-ピリダジニル、5-ピリダジニル、6-ピリダジニル、2-ピリミジニル、4-ピリミジニル、5-ピリミジニル、6-ピリミジニル、2-ピラジニル、3-ピラジニル、5-ピラジニル、6-ピラジニル、2-チアゾリル、4-チアゾリル、又は5-チアゾリルが挙げられる。
【００７１】
限定ではなく例として、窒素結合ヘテロアリール類及びヘテロシクロアルキル類は、アジリジン、アゼチジン、ピロール、ピロリジン、2-ピロリン、3-ピロリン、イミダゾール、イミダゾリジン、2-イミダゾリン、3-イミダゾリン、ピラゾール、ピラゾリン、2-ピラゾリン、3-ピラゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドール、インドリン、1H-インダゾールの1位で、イソインドール又はイソインドリンの2位、モルホリンの4位、及びカルバゾール又はベータ・カルボリンの9位、で結合する。更に典型的には、窒素結合ヘテロ環としては、1-アジリジル、1-アゼテジル(1-azetedyl)、1-ピロリル、1-イミダゾリル、1-ピラゾリル、及び1-ピペリジニルが挙げられる。
【００７２】
本明細書で使用される、並びに上記のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアリール、ヘテロシクリルなどの何れかに適用される、「置換された」とは1個以上の水素原子がそれぞれ独立して置換基で置換されていることを意味する。個々の置換基を定義することによる制約が特に無い場合、上記の化学的な部分構造、例えば「アルキル」、「アルキレン」、「ヘテロアルキル」、「ヘテロアルキレン」、「アルケニル」、「アルケニレン」、「ヘテロアルケニル」、「ヘテロアルケニレン」、「アルキニル」、「アルキニレン」、「ヘテロアルキニル」、「ヘテロアルキニレン」、「シクロアルキル」、「シクロアルキレン」、「ヘテロシクロアルキル」、「ヘテロシクロアルキレン」、「アリール」、「アリーレン」、「ヘテロアリール」、及び「ヘテロアリーレン」基は任意選択的に置換されていることがある。典型的な置換基には、限定されるものではないが、-X, -R, -OH, -OR, -SH, -SR, NH2, -NHR, -N(R)2, -N+(R)3, -CX3, -CN, -OCN, -SCN, -NCO, -NCS, -NO, -NO2, -N3, -NC(=O)H, -NC(=O)R,  -C(=O)H, -C(=O)R, -C(=O)NH2,  -C(=O)N(R)2, -SO3-, -SO3H, -S(=O)2R, -OS(=O)2OR, -S(=O)2NH2, -S(=O)2N(R)2, -S(=O)R, -OP(=O)(OH)2, -OP(=O)(OR)2, -P(=O)(OR)2, -PO3, -PO3H2, -C(=O)X, -C(=S)R, -CO2H, -CO2R, -CO2-, -C(=S)OR, -C(=O)SR, -C(=S)SR, -C(=O)NH2, -C(=O)N(R)2, -C(=S)NH2, -C(=S)N(R)2, -C(=NH)NH2, 及び-C(=NR)N(R)2、が含まれる；ここで、各Xは、F、Cl、Br、及びIから、それぞれの場合について独立に選択される；及び、各Rは、C1-C12アルキル、C6-C20アリール、C3-C14ヘテロシクロアルキル又はヘテロアリール、保護基及びプロドラック部分から、それぞれの場合について独立に選択される。基が「任意選択的に置換される」と記載されている場合はどんな場合でも、その基は、それぞれの場合について独立に、1個以上の上記の置換基で置換されることがある。
【００７３】
あるラジカルの命名規則には、状況に応じて、モノ-ラジカル又はジ-ラジカルの何れかが含まれうることを理解しておく必要がある。例えば、置換基が分子の残りの部分への2つの結合の位置を必要とする場合、前記置換基はジ-ラジカルであると理解される。例えば、2点の結合の位置を必要とするアルキルとして識別される置換基には、-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH(CH3)CH2-、等のジ-ラジカルが含まれる。他のラジカル命名規則は、前記ラジカルが「アルキレン」、「アルケニレン」、「アリーレン」、「ヘテロシクロアルキレン」等のようなジ-ラジカルであることを明確に示す。
【００７４】
置換基がジ-ラジカルとして示される(即ち、分子の残りの部分への2つの結合の位置を有する)場合はどこでも、前記置換基は、別段の指示がない限り、任意の方向性配置で結合することができることを理解されたい。
【００７５】
「異性 (Isomerism)」とは、同一の分子式を有するが、その原子の結合の配列、又はその原子の空間配置が異なる化合物を意味する。その原子の空間配置が異なる異性体を「立体異性体」と呼ぶ。互いに鏡像関係にない立体異性体を「ジアステレオマー」と呼ぶ、及び互いに重ね合わせることができない、鏡像関係にある立体異性体を「エナンチオマー」と呼び、時には「光学異性体」と呼ぶ。
【００７６】
4つの非-同一置換基に結合した炭素原子を「キラル中心」と呼ぶ。「キラル異性体」とは、少なくとも1つのキラル中心を有する化合物を意味する。1つ以上のキラル中心を有する化合物は、個々のジアステレオマーとして、又は「ジアステレオマー混合物(diastereomeric mixture)」と呼ばれるジアステレオマーの混合物として存在することがある。1つのキラル中心が存在する場合、立体異性体は、そのキラル中心の絶対配置(R又はS)によって特徴付けることができる。絶対配置とは、前記キラル中心に結合した置換基の空間配置をいう。検討するキラル中心に結合した置換基を、Cahn、Ingold及びPrelogの配列規則に従ってランク付けする。(Cahn et al., Angew. Chem. Inter. Edit. 1966, 5, 385; errata 511; Cahn et al., Angew. Chem. 1966, 78, 413; Cahn and Ingold, J. Chem. Soc. 1951 (London), 612; Cahn et al., Experientia 1956, 12, 81; Cahn, J. Chem. Educ. 1964, 41, 116)。キラリティーが反対である個々のエナンチオマー形態を等量で含む混合物を、「ラセミ混合物」と呼ぶ。
【００７７】
本明細書及び特許請求の範囲に開示される化合物は、1つ以上の不斉中心を含むことがある、及び、各化合物の異なるジアステレオマー及び／又はエナンチオマーが存在することがある。この明細書及び特許請求の範囲にある任意の化合物の記載は、別段の記載がない限り、全てのエナンチオマー、ジアステレオマー及びそれらの混合物を含むことを意味する。更に、この明細書及び特許請求の範囲にある任意の化合物の記載は、別段の記載がない限り、個々のエナンチオマー、並びに前記エナンチオマーの任意の混合物、ラセミ体又は他のものを含むことを意味する。化合物の構造を特定のエナンチオマーとして描いた場合、本出願の発明は、その特定のエナンチオマーに限定されないことを理解されたい。従って、本開示の各々の構造式のエナンチオマー、光学異性体、及びジアステレオマーが、本明細書中で企図される。本明細書において、前記化合物の構造式は、便宜上、いくつかの場合において、特定の異性体を表すが、本開示は、幾何異性体、不斉炭素に基づく光学異性体、立体異性体、互変異性体等のような全ての異性体を含み、全ての異性体が同じレベルの活性を有するわけではないことが理解される。これらの化合物類は、異なる互変異性体形態で存在し得る。本開示による化合物は、別段の記載がない限り、全ての互変異性体の形態を含むことを意味する。化合物の構造を特定の互変異性体として描いた場合、本出願の発明は、その特定の互変異性体に限定されないことが理解されるべきである。
【００７８】
本明細書中に記載する任意の式の化合物は、適用可能であれば、化合物自体、並びにそれらの塩、及びそれらの溶媒和物を含む。例えば、塩は、アニオンと本開示の化合物上の正に荷電した基(例えば、アミノ)との間で形成されることがある。好適なアニオンとしては、塩化物、臭化物（ブロミド）、ヨウ化物、硫酸塩、重硫酸塩、スルファミン酸塩（スルファメート）、硝酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩、グルタミン酸塩、グルクロン酸塩、グルタル酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩、サリチル酸塩、乳酸塩、ナフタレンスルホン酸塩及び酢酸塩（例、トリフルオロ酢酸塩）が挙げられる。用語「薬学的に許容可能なアニオン」は、薬学的に許容可能な塩を形成するための好適なアニオンをいう。同様に、塩は、カチオンと本開示の化合物上の負に荷電した基(例えば、カルボキシレート)との間で形成されることがある。好適なカチオンとしては、ナトリウム・イオン、カリウム・イオン、マグネシウム・イオン、カルシウム・イオン、及びテトラメチルアンモニウム・イオンなどのアンモニウム・カチオンが挙げられる。いくつかの好適な置換アンモニウム・イオンの例としては、以下から誘導したものが挙げられる：エチルアミン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリエチルアミン、ブチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン、ベンジルアミン、フェニルベンジルアミン、コリン、メグルミン、及びトロメタミン、リジン及びアルギニンなどのアミノ酸。本開示の化合物はまた、第四級窒素原子を含有する塩を含む。
【００７９】
好適な無機アニオンの例としては、限定されるものではないが、以下の無機酸から誘導されるものが挙げられる：塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、亜硫酸、硝酸、亜硝酸、リン(phosphoric)及びリン(phosphorous)。好適な有機アニオンの例としては、限定されるものではないが、以下の有機酸から誘導されるものが挙げられる：2-アセトキシ安息香酸、酢酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、安息香酸、カンファルスルホン酸、桂皮酸、クエン酸、エデト酸、エタンジスルホン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルケプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、ヒドロキシマレイン酸、ヒドロキシナフタレン・カルボン酸、イセチオン酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ムチン酸、オレイン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、パントテン酸、フェニル酢酸、フェニルスルホン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、スルファニル酸、酒石酸、トルエンスルフォン酸、及び吉草酸。好適なポリマー有機アニオンの例としては、限定されるものではないが、以下のポリマー酸から誘導されるものが挙げられる：タンニン酸、カルボキシメチル・セルロース。
【００８０】
更に、本開示の化合物（例えば、前記化合物の塩）は、含水若しくは非含水(無水)形態で、又は他の溶媒分子との溶媒和物として存在することがある。水和物の非限定的な例としては、一水和物、二水和物などが挙げられる。溶媒和物の非限定的な例としては、エタノール溶媒和物、アセトン溶媒和物などが挙げられる。「溶媒和物」は、化学量論的な量又は非化学量論的な量の何れかの溶媒を含有する、溶媒が付加された形態を意味する。いくつかの化合物は、結晶性の固相中に、固定したモル比率の溶媒分子を補足する傾向を有し、それによって溶媒和物を形成する。前記溶媒が水である場合、形成される溶媒和物は水和物である；及び前記溶媒がアルコールである場合、形成される溶媒和物はアルコラートである。水和物は、1分子の物質と1分子以上の水の組合せによって形成され、その中では、水がH2Oとしての分子状態を保持する。水和物とは、例えば、一水和物、二水和物、三水和物などを指す。
【００８１】
更に、本明細書中に開示する式が表す化合物又はその塩について、結晶多型が存在することがある。任意の結晶形態、結晶形態の混合物、又はそれらの無水物若しくは水和物が、本開示の範囲に含まれることに留意されたい。
【００８２】
以下の節は、同種異系細胞療法の拒絶を治療する又は予防するためにヒト患者に投与され得るADCの説明、並びにそのような療法を前記患者に処方する方法を提供する。
【００８３】
II. 同種異系細胞治療の方法
免疫能が正常な宿主では、移植した同種異系細胞はしばしば素早く拒絶される。このような拒絶は一般に、宿主対移植片(HvG)拒絶と呼ばれる。同種異系細胞療法の1つの課題は、ヒト・レシピエント(recipient)が同種異系細胞を受容する手段を同定することである。このような同種異系細胞の受容はその治療の有効性に影響を及ぼし、また、前記患者に有害な副作用をもたらす可能性がある。
【００８４】
内因性CD137+細胞(例えば、活性化T細胞)をターゲットとする抗-CD137抗体薬物コンジュゲート(ADC)を投与することによって、ヒト対象における同種異系細胞の拒絶を治療する又は予防するための方法が本明細書に記載される。
【００８５】
ある特定の実施形態では、抗-CD137 ADCの投与前に、ヒト対象においてプライミング応答を最初に誘発する。前記患者の「プライミング」は、同種異系細胞の投与後に産生される活性化した抗-同種異系抗原T細胞の発現を促進する。同種異系細胞を注入すると、前記同種異系細胞に対する前記患者の免疫システムの反応が刺激されることが望まれる。「プライミング」免疫応答を誘導するために、プライミングする量の同種異系細胞をヒト対象に投与する。
【００８６】
プライミングのステップでは、内因性の活性化CD137+ T細胞を生じる免疫応答を誘発させるために、（例えば、静脈内に）同種異系細胞を投与する。従って、同種異系細胞のプライミングする量は、好ましくは、内因性CD137+ T細胞の活性化を含む免疫応答を誘発するのに有効な量である。例示的な実施形態では、効果的なプライミング用量は、約 1x105 細胞/kg, 0.5x106 細胞/kg, 約 1x106 細胞/kg, 約 1x107 細胞/kg, 約 1x108  同種異系細胞/kg, 約 1x109 同種異系細胞/kg, 約 1x1010 同種異系細胞/kg, 約 0.5x106〜約 1x1010 細胞/kg, 約 0.5x106〜約 1x108 細胞/kg, 約 1x107〜約 1x1010 細胞/kg, 約 1x108〜約 1x1010 細胞/kg, 又は約 1x109〜約 1x1010 細胞/kgで静脈内に注入するための同種異系細胞のアリコートである。他の例示的な実施形態では、前記プライミング用量は、約 1x105〜1x1012 同種異系細胞/kg, e.g., 1x105〜1x106 細胞/kg, 1x105〜1x107 細胞/kg, 1x105〜1x108 細胞/kg, 1x105〜1x109 細胞/kg, 1x105〜1x1010 細胞/kg, 1x105〜1x1011 細胞/kg, 又は1x105〜1x1012 細胞/kgを含む。他の例示的な実施形態では、同種異系細胞のプライミング用量は、約 1x106〜1x1012 細胞/kg, 1x107〜1x1012 細胞/kg, 1x108〜1x1012 細胞/kg, 1x109〜1x1012 細胞/kg, 1x1010〜1x1012 細胞/kg, 又は1x1011〜1x1012 細胞/kgを含む。前記の範囲の中間の用量もまた、本発明の方法における使用のために意図される。免疫応答を誘発することができるこれらの範囲外の同種異系細胞の用量もまた、本発明の範囲内である。
【００８７】
ある実施形態では、前記同種異系細胞としては、限定されるものではないが、同種異系T細胞又は同種異系NK細胞が挙げられる。例示的な実施形態では、前記同種異系細胞は、本明細書に記載されるように、キメラ抗原レセプター(chimeric antigen receptor)を発現する。
【００８８】
プライミング量の同種異系細胞を投与した後、抗-CD137抗体-薬物コンジュゲート(ADC)を前記ヒト対象に投与する。CD137は活性化T細胞上に発現している。従って、抗-CD137 ADCを使用して、同種異系細胞療法を処方する前に、前記ヒト対象中の活性化T細胞の数を減少させる。本明細書中に記載する方法における使用に好適な例示的な抗-CD137抗体、細胞毒素、及びリンカーを、以下に詳細に記載する。
【００８９】
CD137 ADCを投与した後、治療有効量の同種異系細胞を前記ヒト対象に投与する。同種異系細胞（例えば、CARを発現する同種異系細胞）を投与する前に、活性化T細胞集団を選択的に減少させると、同種異系細胞の拒絶を治療する又は防止することにより、同種異系細胞療法の全般的な有効性が改善される。同種異系細胞の治療有効量は、患者において治療上の利益を達成するのに有効な量であることがある。例えば、同種異系細胞を、がんを有する対象のための治療において使用する場合、治療有効量は、がんを処置するために、がんの大きさ又は体積を減少させるために、がんに関連する1つ以上の症状(symptom)を減少させるために、がんの寛解を誘導するために、及び／又はがんを有する対象の生存期間又は無病生存を延長するために、有効な量であることがある。ある実施形態では、同種異系細胞の治療有効量は、プライミング・ステップの間に、前記対象に投与する細胞の数よりも多い。別の実施形態では、同種異系細胞の治療有効量は、プライミング・ステップの間に、前記対象に投与する細胞の数にほぼ等しい。別の実施形態では、同種異系細胞の治療有効量は、プライミング・ステップの間に、前記対象に投与する細胞の数よりも少ない。
【００９０】
例示的な実施形態では、同種異系細胞の治療有効量は、少なくとも1x105 細胞/kg, e.g., 少なくとも1x106 細胞/kg, 少なくとも1x107 細胞/kg, 少なくとも1x108 細胞/kg, 少なくとも1x109 細胞/kg, 少なくとも1x1010 細胞/kg, 少なくとも1x1011 細胞/kg, 少なくとも1x1012 細胞/kg, 少なくとも1x1013 細胞/kg, 少なくとも1x1014 細胞/kg, 少なくとも1x1015 細胞/kg, 少なくとも1x1016 細胞/kg, 少なくとも1x1017 細胞/kg, 又はそれより多く、を含む。他の例示的な実施形態では、同種異系細胞の治療有効量は、最大1x105 細胞/kg, e.g., 最大1x106 細胞/kg, 最大1x107 細胞/kg, 最大1x108 細胞/kg, 最大1x109 細胞/kg, 最大1x1010 細胞/kg, 最大1x1011 細胞/kg, 最大1x1012 細胞/kg, 最大1x1013 細胞/kg, 最大1x1014 細胞/kg, 最大1x1015 細胞/kg, 最大1x1016 細胞/kg, 又は最大1x1017 細胞/kgを含む。他の例示的な実施形態では、同種異系細胞の治療有効量は、1x105〜1x1017 細胞/kg, e.g., 1x106〜1x1017 細胞/kg, 1x107〜1x1017 細胞/kg, 1x108〜1x1017 細胞/kg, 1x109〜1x1017 細胞/kg, 1x1010〜1x1017 細胞/kg, 1x1011〜1x1017 細胞/kg, 1x1012〜1x1017 細胞/kg, 1x1013〜1x1017 細胞/kg, 1x1014〜1x1017 細胞/kg, 1x1015〜1x1017 細胞/kg, 又は 1x1016〜1x1017 細胞/kgを含む。他の例示的な実施形態では、同種異系細胞の治療有効量は、1x105〜1x1017 細胞/kg, e.g., 1x105〜1x1016 細胞/kg, 1x105〜1x1015 細胞/kg, 1x105〜1x1014 細胞/kg, 1x105〜1x1013 細胞/kg, 1x105〜1x1012 細胞/kg, 1x105〜1x1011 細胞/kg, 1x105〜1x1010 細胞/kg, 1x105〜1x109 細胞/kg, 1x105〜1x108 細胞/kg, 1x105〜1x107 細胞/kg, 又は1x105〜1x106 細胞/kgを含む。他の例示的な実施形態では、同種異系細胞の治療有効量は1×108〜1×1010細胞/kgを含む。他の例示的な実施形態では、同種異系細胞の治療有効量が1×1010〜1×1012細胞/kgを含む。他の例示的な実施形態では、同種異系細胞の治療有効量が1×1012〜1×1014細胞/kgを含む。
【００９１】
治療の初期プライミング・ステップで使用する同種異系細胞は、同種異系細胞療法の一環として、前記ヒト対象に投与する同種異系細胞と同じ種類(又は類似)であることがある。例えば、前記プライミング・ステップで使用する同種異系細胞は、同種異系細胞療法で使用する細胞と同じドナー(donor)に由来することがある。別の実施形態では、前記プライミング・ステップで使用する同種異系細胞は、同種異系細胞療法で使用する細胞と同じ又は類似の補体のMHC分子を発現することがある。プライミング及び／又は治療用細胞が発現する補体のMHC分子は、天然に存在することがある、又は、例えば、遺伝子工学を使用して改変されていることがある。ある実施形態では、同種異系CAR細胞療法では、CAR細胞療法で使用する同種異系細胞と同じ種類である、CARを発現しない同種異系細胞を前記ヒト対象に投与して、プライミング応答を誘発させる。或いは、前記プライミング応答を、前記患者を治療するために使用するであろうCAR発現細胞と同じ種類であるCAR発現同種異系細胞で、誘発させることがある。
【００９２】
CARを発現する同種異系細胞が拒絶されるリスクは、CAR細胞療法を処方した後に高くなることがある。抗-CD137 ADCを使用して、同種異系CAR細胞療法を受けようとしている患者において、活性化T細胞を選択的にターゲット化することがある。ある特定の実施形態では、本明細書中に開示する方法を使用して、ヒト患者において、CARを発現する同種異系細胞の拒絶を阻害する又は予防することがある。
【００９３】
抗-CD137 ADCを、それを必要とするヒト患者に、1つ以上のプライミング用量の同種異系細胞療法を処方する前に、同時に、又は後に投与することがある。ある実施形態では、抗-CD137 ADCを、それを必要とするヒト患者に、プライミング用量の同種異系細胞を処方する前に、投与する。例えば、いくつかの実施形態では、抗-CD137 ADCを、プライミング用量の同種異系細胞を処方する約10日前までに、例えば、プライミング用量の同種異系細胞を投与する、約10日、約9日、約8日、約7日、約6日、約5日、約4日、約3日、約2日、約1日、約24時間、約12時間、約6時間、約3時間、約2時間、又は約1時間前に、投与することがある。いくつかの実施形態では、抗-CD137 ADCを、それを必要とするヒト患者に、プライミング用量の同種異系細胞を処方する約1〜約48時間；約1〜約24時間; 約1〜約18時間; 約1〜約12時間; 約1〜約10時間; 約1〜約6時間; 約1〜約3時間; 約1〜約2時間; 約1〜2日; 約1〜3日; 約1〜4日; 約1〜7日; 約1〜10日; 約3〜5日; 約3〜7日; 約3〜10日; 約12時間〜約48時間; 約12時間〜約36時間、前に投与する。
【００９４】
別の実施形態では、抗-CD137 ADCを、それを必要とするヒト患者に、プライミング用量の同種異系細胞を投与するのと同時に、投与する。
【００９５】
他の実施形態では、抗-CD137 ADCを、それを必要とするヒト患者に、プライミング用量の同種異系細胞を処方した後に、投与する。例えば、いくつかの実施形態では、抗-CD137 ADCを、それを必要とするヒト患者に、プライミング用量の同種異系細胞を処方した、約1時間, 4時間, 6時間, 10時間, 12時間, 24時間 (1 日) , 36時間, 48時間 (2日), 3日, 4日, 5日, 6日, 7日, 8日, 9日, 10日, 11日, 12日, 13日, 14日, 21日 後に、又はそれよりも後に、投与することがある。他の実施形態では、抗-CD137 ADCを、それを必要とするヒト患者に、プライミング用量の同種異系細胞を処方した約1時間〜約10日, e.g., 約1-6時間; 約1-12時間; 約12時間〜約7日; 約12時間〜約6日; 約12時間〜約5日; 約12時間〜約4日; 約12時間〜約3日; 約12時間〜約2日; 約12時間〜約24時間; 約1〜約10日; 約1〜約9日; 約1〜約8日; 約1〜約7日; 約1〜約6日; 約1〜約5日; 約1〜約4日; 約1〜約3日; 約1〜約2日, 約3日〜約10日; 約5日〜約7日; 等.,後に又はそれより後に、投与することがある。
【００９６】
ある実施形態では、抗-CD137 ADCの単回用量を、前記ヒト患者に、プライミング用量の同種異系細胞を処方する前、した後に、又は同時に投与する、ここで、そのような単回用量は、同種異系細胞の投与に応じて活性化されるT細胞の集団を選択的に減少させるのに十分である。
【００９７】
抗-CD137 ADCを、それを必要とするヒト患者に、治療有効量の同種異系細胞（例えば、CARを発現する同種異系細胞）を処方する前に、同時に、又は後に、投与する。ある実施形態では、前記抗-CD137 ADCを、CARを発現する同種異系細胞を、それを必要とするヒト患者に投与する前に、投与する。ある実施形態では、前記同種異系細胞療法を、前記抗-CD137 ADCが前記患者の血中からクリアランス又は実質的にクリアランスされた後に、前記患者に投与する。ある実施形態では、抗-CD137 ADCを、それを必要とするヒト患者に、同種異系細胞療法（例えば、CAR細胞療法）を処方する前に（e.g., 約14日前, 約13日前, 約12日前, 約11日前, 約10日前, 約9日前, 約8日前, 約7日前, 約6日前, 約5日前, 約4日前, 約2日前, 又は約1日前に）、投与する。ある実施形態では、前記抗-CD137 ADCを、それを必要とするヒト患者に、同種異系細胞療法を処方する、約1〜約14日; 約2〜約13日; 約3〜約12日; 約3〜約11日; 約4〜約10日; 約5〜約9日; 約6〜約8日; 約1〜約13日; 約1〜約12日; 約1〜約11日; 約1〜約10日; 約1〜約9日; 約1〜約8日; 約1〜約7日; 約1〜約6日; 約1〜約5日; 約1〜約4日; 約1〜約3日; 又は 約1〜約2日前に、投与する。
【００９８】
ある実施形態では、前記抗-CD137 ADCを、前記ヒト患者に、CARを発現する同種異系細胞の前に、投与する、ここで、前記抗-CD137 ADCを、ヒト対象に、CARを発現する同種異系細胞を投与する約12時間〜約14日前に、投与する。ある実施形態では、前記抗-CD137 ADCを、前記ヒト患者に、CARを発現する同種異系細胞の前に、投与する、ここで、前記抗-CD137 ADCを、ヒト対象に、CARを発現する同種異系細胞を投与する約24時間〜約12日前に、投与する。ある実施形態では、前記抗-CD137 ADCを、前記ヒト患者に、CARを発現する同種異系細胞の前に、投与する、ここで、前記抗-CD137 ADCを、ヒト対象に、CARを発現する同種異系細胞を投与する約1日〜約10日前に、投与する。ある実施形態では、抗-CD137 ADCを、前記ヒト患者に、CARを発現する同種異系細胞の前に、投与する、ここで、前記抗-CD137 ADCを、ヒト対象に、CARを発現する同種異系細胞を投与する約2日〜約8日前に、投与する。
【００９９】
ある実施形態では、前記抗-CD137 ADCを、CARを発現する同種異系細胞を、それを必要とするヒト患者への投与と同時に、投与する。
【０１００】
前記抗-CD137 ADCを投与した後、前記ヒト患者を試験して、同種異系CAR療法を開始する前に、CD137+の活性化T細胞が前記患者から実質的に減少していることを確認してもよい。CD137+活性化T細胞のレベルを、前記CD137 ADCを投与した後に、前記ヒト患者由来の生物学的サンプル(例えば、血液)において、アッセイすることがある、そして前記抗-CD137 ADCを投与する前(しかし、同種異系細胞プライミングの後)に、生物学的サンプル(例えば、同じ供給源、例えば、血液)由来のCD137+活性化T細胞のレベルと比較することがある。内因性CD137+活性化T細胞の数が減少することは、前記抗-CD137 ADCが同種異系(同じ又は実質的に類似した同種異系細胞を使用すること)CAR療法が拒絶されるリスクを減少させることにおいて、効果的であったことを示す。ある実施形態では、前記ヒト患者由来の生物学的サンプル中の内因性CD137+活性化T細胞のレベルは、前記抗-CD137 ADCを投与する直前の、前記ヒト患者由来の生物学的サンプル(同じ種類、例えば、血液)中のCD137+活性化T細胞のレベルと比較して、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%減少する。ある実施形態では、内因性CD137+活性化T細胞のレベルを、前記抗-CD137 ADCを投与する1日前以下に測定する。
【０１０１】
或いは、ヒト患者由来の生物学的サンプル中のT細胞の全体的なレベルを、抗-CD137 ADCを投与した後（同種異系細胞プライミングの後）に評価することがある、ここで、抗-CD137 ADCの投与後の、投与前のレベルと比較したヒト患者におけるT細胞の全体的な数の低下は、前記同種異系細胞療法が拒絶されることを予防するための、前記抗-CD137 ADCの有効性を示す。ある実施形態では、前記ヒト患者由来の生物学的サンプル中の、内因性のT細胞のレベルは、前記抗-CD137 ADCを投与する直前の、前記ヒト患者由来の生物学的サンプル(例えば、同じタイプである、血液)中のT細胞のレベルと比較して、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%減少している。ある実施形態では、前記ヒト患者由来の生物学的サンプル中の、内因性のT細胞のレベルは、前記抗-CD137 ADCを投与する直前の、前記ヒト患者由来の生物学的サンプル(例えば、同じタイプである、血液)中のT細胞のレベルと比較して、約5%〜25%、約5%〜20%、約5%〜15%、又は約5%〜10%減少している。ある実施形態では、内因性のT細胞のレベルを、抗-CD137 ADCを投与する1日前以下に、測定する。
【０１０２】
CD137+活性化T細胞を含むT細胞のレベルを、当技術分野で公知の標準的な方法（限定されるものではないが、in vitro 抗原刺激アッセイを含む）に従って測定することがある、ここで、同種異系細胞に暴露した後の活性化同種異系抗原T細胞の数を、抗-CD137 ADCの存在下で同種異系細胞に暴露した後の活性化同種異系抗原T細胞の数と、比較する。
【０１０３】
本明細書中に開示する方法を使用して、CARを発現する同種異系細胞を対象に送達する。重要なことに、本明細書中に記載される抗-CD137 ADCコンディショニング方法は、同種異系細胞のトレランスが提供され得る手段を提供することによって、CAR療法において使用され得る免疫細胞の種類を拡大するのに有用である。ある実施形態では、CARを発現する同種異系細胞としては、限定されるものではないが、同種異系T細胞又は同種異系NK細胞が挙げられる。
【０１０４】
ある実施形態では、抗-CD137抗体-薬物コンジュゲートを使用して、プライミング用量の同種異系細胞を処方する前に、同時に、又は後に、前記抗-CD137抗体-薬物コンジュゲートを投与することによって、CD137発現T細胞（例えば、CD137を発現する活性化T細胞）を減少させる。
【０１０５】
本明細書中に開示する方法は、がん又は自己免疫疾患のうちの1つを有するヒト対象におけるがん又は自己免疫疾患を治療するのに特に有用である。
【０１０６】
ある実施形態では、本明細書中に開示する方法を使用してがんを治療する。本明細書に開示する方法を用いて治療することができるがんの種類の例としては、限定されるものではないが、成人進行がん、膵臓がん、切除不能な膵臓がん、結腸直腸がん、転移性結腸直腸がん、卵巣がん、トリプル-ネガティブ乳がん、造血系／リンパ系がん、大腸がん肝臓転移、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、B細胞リンパ腫、再発性又は難治性B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞リンパ腫、再発性又は難治性びまん性大細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、原発性縦隔B細胞リンパ腫、再発性縦隔、難治性縦隔大細胞型B細胞リンパ腫、大細胞型B細胞リンパ腫、ホジキン・リンパ腫、非-ホジキン・リンパ腫、再発又は難治性非-ホジキンリンパ腫、難治性進行性非-ホジキンリンパ腫、B細胞性非-ホジキン・リンパ腫、難治性非-ホジキンリンパ腫、結腸直腸がん腫(colorectal carcinoma)、胃がん(gastric carcinoma)、膵がん(pancreatic carcinoma)、トリプルネガティブ浸潤性乳がん(triple-negative invasive breast carcinoma)、腎細胞がん(renal cell carcinoma)、肺扁平上皮がん(lung squamous cell carcinoma)、肝細胞がん(hepatocellularcarcinoma)、尿路上皮がん(urothelial carcinoma)、白血病、B細胞性白血病、B細胞性急性リンパ球性白血病（B-cell acute lymphocytic leukemia）、B細胞性急性リンパ芽球性白血病（B-cell acute lymphoblastic leukemia）、成人急性リンパ芽球性白血病、B細胞性前リンパ球性白血病（B-cell prolymphocytic leukemia）、小児急性リンパ芽球性白血病(childhood acute lymphoblastic leukemia)、難治性小児急性リンパ芽球性白血病(refractory childhood acute lymphoblastic leukemia)、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ球性白血病、前リンパ球性白血病(prolymphocytic leukemia)、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、再発性プラズマ細胞性骨髄腫(recurrent plasma cell myeloma)、難治性プラズマ細胞性骨髄腫(refractory plasma cell myeloma)、多発性骨髄腫、再発性又は難治性多発性骨髄腫、骨の多発性骨髄腫、脳の悪性神経膠腫(malignant glioma of brain)、骨髄異形成症候群、EGFR陽性結腸直腸がん、多形性膠芽腫(glioblastoma multiforme)、新生物、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍(blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm)、肝臓転移、固形腫瘍、進行性固形腫瘍(advanced solid tumor)、メソテリン陽性腫瘍(mesothelin positive tumor)、血液悪性腫瘍、及びその他の進行した悪性腫瘍、が挙げられる。
【０１０７】
ある実施形態では、本明細書中に開示する方法を使用して、自己免疫疾患を治療する。より具体的には、抗-CD137 ADCを、同種異系細胞療法（例えば、CARを発現する同種異系細胞）と併用して、自己免疫疾患を有するヒト対象に投与する。本明細書中に開示する併用方法を使用して治療することがある自己免疫疾患の例としては、限定されるものではないが、多発性硬化症、クローン病、潰瘍性大腸炎、関節リウマチ、I型糖尿病、ループス、及び乾癬が挙げられる。
【０１０８】
ある特定の実施形態では、抗-CD137 ADCを、CAR-T細胞療法と併用してヒト患者に投与する。ある実施形態では、前記抗-CD137 ADCを、CAR-T療法を処方する前に、前記ヒト患者に投与する。
【０１０９】
同種異系細胞で発現させることがある、及び本明細書中に記載する方法と一緒に使用することがある、CAR-Tコンストラクトの例としては、限定されるものではないが、以下が挙げられる：CD19 CAR-T (e.g., CART-19-01,02,03 (Fujian Medical University); daopeicart (Hebei Senlang Biotechnology Inc.); IM19CART/001,YMCART201702 (Beijing Immunochina Medical Science & Technology Co.); CART-CD19-02,03 (Wuhan Sian Medical Technology Co.); Universal CD19-CART/SHBYCL001,002 (Shanghai Bioray Laboratory Inc.); UnicarTherapy201701 (Shanghai Unicar-Therapy Biomedicine Technology Co.); Genechem/NCT02672501 (Shanghai GeneChem Co.); SenL_19 (Hebei Senlang Biotechnology Inc.); PCAR-019 (PersonGen BioTherapeutics (Suzhou); ICAR19 (Immune Cell, Inc.); WM-CART-02 (Sinobioway Cell Therapy Co.); HenanCH080,109,152 (Henan Cancer Hospital / The Pregene (ShenZhen) Biotechnology Co.); IM19-CD28 and IM19-41BB CAR-T 細胞 (Beijing Immunochina Medical Science & Technology Company); CTL019/IT1601-CART19 (Beijing Sanwater Biological Technology Co.); CTL019/CCTL019C2201 (Novartis Pharmaceuticals); CD19:4-1BB:CD28:CD3 / FirstShenzhen01 (Shenzhen Second People’s Hospital / The Beijing Pregene Science and Technology Company); MB-CART19.1 (Shanghai Children’s Medical Center / Miltenyi Biotec GmbH); PZ01 CAR-T 細胞 (Pinze Lifetechnology Co.); YMCART201701 (Beijing Immunochina Medical Science & Technology Co.); 2016YJZ12 (Peking University / Marino Biotechnology Co.); EGFRt/19-28z/4-1BBL CAR T 細胞 (Memorial Sloan Kettering Cancer Center / Juno Therapeutics, Inc.); Doing-002 (Beijing Doing Biomedical Co.); PCAR-019 (PersonGen BioTherapeutics (Suzhou) Co.); C-CAR011 (Peking Union Medical College Hospital / Cellular Biomedicine Group Ltd.); iPD1 CD19 eCAR T 細胞 (Peking University / Marino Biotechnology Co.); 2013-1018/NCT02529813 (M.D. Anderson Cancer Center / Ziopharm / Intrexon Corp.); HenanCH CAR 2-1 (Henan Cancer Hospital / The Pregene (ShenZhen) Biotechnology Co.); JCAR015 (Juno Therapeutics, Inc.); JCAR017/017001,004,006 (Juno Therapeutics, Inc.); JCAR017 (Celgene); TBI-1501 (Takara Bio Inc.); JMU-CD19CAR (Jichi Medical University); KTE-C19 (Kite, A Gilead Company); TriCAR-T-CD19 (Timmune Biotech Inc.); PF-05175157 (Fred Hutchinson Cancer Research Center)); CD22/CD30/CD7/BCMA/CD123 (e.g., 2016040/NCT03121625 (Hebei Senlang Biotechnology Inc.)); CD22 (e.g., Ruijin-CAR-01 (Ruijin Hospital / Shanghai Unicar-Therapy Bio-medicine Technology Co.); AUTO-PA1,DB1 (Autolus Limited)), CD20 (e.g., Doing-006 (Beijing Doing Biomedical Co.)); 又は CD20/CD22/CD30 (e.g., SZ5601 (The First Affiliated Hospital of Soochow University Shanghai / Unicar-Therapy Bio-medicine Technology Co.))。
。
【０１１０】
キメラ抗原レセプター(Chimeric Antigen receptor)(CAR)
本発明は、抗-CD137免疫抑制ADCと併用して同種異系細胞療法（例えば、同種異系CAR細胞療法）を使用して、治療に必要な同種異系細胞が拒絶されることを治療する又は予防することを含む。本発明は、抗-CD137 ADCが、内因性CD137+免疫細胞（例えば、内因性のT細胞など）を除去することによるCAR発現細胞の受容を促進することによって、CAR療法のためのコンディショニング剤として役割を果たすことがある、という知見に少なくとも部分的に基づいているので、本発明は一般に、特定のCAR構築物（例えば、特定の抗原結合部位又は細胞内シグナリング・ドメイン）に限定されない。特定のCAR（例えば、CD19特異的なCAR）を本明細書中で想定し、及び本明細書中に開示する方法に含まれるが、限定することを意味しない。
【０１１１】
CAR構築物は当該分野で公知である、並びに一般的に、(a)抗原結合ドメインを含む細胞外領域、(b)膜貫通ドメイン及び(c)細胞内シグナリング・ドメインを含む。例示的なCARの構成は、当技術分野で知られている、及び本明細書で説明する方法では、任意の好適な構成を使用することがある。例えば、前記CARは、例えばGuedan et al.  Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 12: 145-156 (2019) 又は Sadelain et al. Cancer discovery 3.4: 388-398 (2013)らに記載されているように（その全内容は、本明細書に参照により取り込まれる）、第1世代の、第2世代の、又は第3世代のCARであることがある。簡単に述べると、「第1世代」のCARは、(a)細胞外抗原結合ドメイン、(b)膜貫通ドメイン、(c)1つ以上の細胞内シグナリング・ドメイン、及び任意選択的に(d)前記抗原結合ドメインを前記膜貫通ドメインに接続するヒンジ領域を含むことがある。「第2世代」のCARは、要素(a)、(b)、(c)、及び任意選択的に(d)を含むことがある、並びに更に、共刺激ドメイン（例えば、CD28又は4-1BBの共刺激ドメイン）を含むことがある。「第3世代」のCARは、要素(a)、(b)、(c)、及び任意選択的に(d)を含むことがある、並びに更に、複数の共刺激ドメイン（例えば、CD28及び4-1BBの共刺激ドメイン、又はCD28及びOX40の共刺激ドメイン）を含むことがある。上記の各要素について、以下で詳細に説明する。いくつかの実施形態では、以下の例示的な非限定的な配置によって記載するCAR分子は、左側から右側に向かって、前記CARのN-末端側からC-末端側であることを理解されたい。本開示が記載するCARは、本明細書に記載する要素の任意の他の組合せを含むことがある、又は更に含むことがある。他の例示的なキメラ抗原レセプター構築物は、米国特許 No. 9,328,156; 米国特許 No. 9,783,591; 米国特許 No. 9,714,278; 米国特許 No. 9,765,156; 米国特許 No. 10,117,896; 米国特許 No. 9,573,988; 米国特許 No. 10,308,717; 米国特許 No. 10,221,245; 米国特許 No. 10,040,865; 米国特許出願公開 No. 2018/0256712A1; 米国特許出願公開No. 2018/0271907A1; 米国特許出願公開No. 2016/0046724A1; 米国特許出願公開No. 2018/0044424A1; 米国特許出願公開No. 2018/0258149A1; 米国特許出願公開No. 2019/0151363A1; and 米国特許出願公開No. 2018/0273601A1；に開示されている（前記の特許及び特許出願公開のそれぞれの内容は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる）。
【０１１２】
本明細書中に開示する方法において使用するCARは、細胞外抗原結合ドメインを含むことがある。前記細胞外抗原結合ドメインは、抗原に結合する任意の分子であることがあり、限定されるものではないが、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はその任意の機能的フラグメント等を含む。ある特定の実施形態では、前記抗原結合ドメインはscFvである。他の実施形態では、前記細胞外抗原結合ドメインは非-免疫グロブリン・スキャフォールド・タンパク質(scaffold protein)である。他の実施形態では、前記CARの細胞外結合ドメインは、単鎖T細胞レセプター(scTCR)を含む。米国特許第5,359,046, 5,686,281及び6,103,521に記載されているように、前記細胞外ドメインを、リガンド結合及び／又はシグナル伝達に関連する多種多様な細胞外ドメイン又は分泌タンパク質の何れかから得ることもある。
【０１１３】
前記細胞外結合ドメインの分子ターゲット(抗原)を選択することは、ターゲット細胞の表面を規定するリガンドの種類及び個数に依存する。例えば、前記抗原結合ドメインを選択して、特定の病態に関連するターゲット細胞に対する細胞表面マーカーとして振る舞うリガンドを認識するようにすることがある。従って、ある態様において、所望の抗原に特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインを、操作してCARの中に入れることによって、CARを介した免疫細胞(例えば、T-細胞)の反応を、目的の抗原に向けさせることがある。例えば、前記抗原結合ドメインを選択して、がん又は自己免疫疾患などの特定の病態に関連するターゲット細胞上の細胞表面マーカーとして振る舞うリガンドを認識するようにすることがある。従って、CARにおける抗原結合ドメインに対するリガンドとして振る舞うことがある細胞表面マーカーの例としては、がん細胞及び他の形態の疾患細胞(例えば、自己免疫疾患細胞及び病原体感染細胞)に関連するものが挙げられる。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞上の抗原に特異的に結合する所望の抗原結合ドメインを操作することによって、CARを操作して、目的の腫瘍抗原をターゲット化するようにする。本発明の文脈において、「腫瘍抗原」は、がんなどの特定の過剰増殖性障害に共通する抗原を指す。ある実施形態では、前記抗原は腫瘍抗原である、これらの例としては、限定されるものではないが、CD19, CD22, CD30, CD7, BCMA, CD137, CD22, CD20, AFP, GPC3, MUC1, メソテリン(mesothelin), CD38, PD1, EGFR  (e.g., EGFRvIII), MG7, BCMA, TACI, CEA, PSCA, CEA, HER2, MUC1, CD33, ROR2, NKR-2, PSCA, CD28, TAA, NKG2D, 又は CD123、が挙げられる。ある実施形態では、CARは、CD19, CD22, CD30, CD7, BCMA, CD137, CD22, CD20, AFP, GPC3, MUC1, メソテリン(mesothelin), CD38, PD1, EGFR  (e.g., EGFRvIII), MG7, BCMA, TACI, CEA, PSCA, CEA, HER2, MUC1, CD33, ROR2, NKR-2, PSCA, CD28, TAA, NKG2D, 又は CD123、に結合するscFvを含む。
【０１１４】
別の態様では、前記CARの細胞外結合領域は、以下に結合する、AFP (e.g., ETCH17AFPCAR01 (Aeon Therapeutics (Shanghai) Co. / Eureka Therapeutics Inc.)), GPC3 (e.g., GeneChem GPC-3 CART (Shanghai GeneChem Co.); 302 GPC3-CART (Shanghai GeneChem Co.); 肝臓がんのCAR-T (Shanghai GeneChem Co.); CAR-GPC3 T 細胞 (Carsgen Therapeutics)), MUC1 (e.g., PG-021-001,002 (PersonGen BioTherapeutics (Suzhou) Co.)), メソテリン(mesothelin) (e.g., H2017-01-P01 (Ningbo Cancer Hospital); TAI-meso-CART (Shanghai GeneChem Co.); K16-4/NCT02930993 (China Meitan General Hospital / Marino Biotechnology Co.)), CD38 (e.g., 抗-CD38 A2 CAR-T / SOR-CART-MM-001 (Sorrento Therapeutics, Inc.)), herinCAR-PD1 (e.g., herinCAR-PD1/NBWYKY2016-06-001,002,003 (Ningbo Cancer Hospital); SIMC-20160101,02,03 (Shanghai International Medical Center)), BCMA (e.g., P-BCMA-101 自己 T 幹細胞メモリ(Tscm) CAR-T 細胞 / P-BCMA-101-001 (Poseida Therapeutics, Inc.); HenanCH284 (Henan Cancer Hospital / The Pregene (ShenZhen) Biotechnology Company); LCAR-B38M CAR-T 細胞 (Nanjing Legend Biotech Co.); 9762/NCT03338972 (Fred Hutchinson Cancer Research Center / Juno Therapeutics, Inc.); Descartes-08 (Cartesian Therapeutics); KITE-585 (Kite, A Gilead Company); bb21217 (bluebird bio); bb21217 (Celgene); JCARH125 (Juno Therapeutics, Inc.)), CD30 (e.g., ICAR30 T 細胞 (Immune Cell, Inc.)), EGFR (e.g., EGFR:4-1BB:CD28:CD3改変T細胞 / First Shenzhen02 (Shenzhen Sceond People’s Hospital / The Beijing Pregene Science and Technology Company); EGFR-IL12-CART (Shenzhen Second People’s Hospital / The Pregene (ShenZhen) Biotechnology Co.); SBNK-2016-015-01 (Beijing Sanbo Brain Hospital / Marino Biotechnology Co.)), MG7 (e.g., MG7-CART (Xijing Hospital / Shanghai GeneChem Co.)), BCMA/TACI (e.g., AUTO2-MM1 (Autolus Limited)), CEA (e.g., 383-74/NCT02416466 (Roger Williams Medical Center / Sirtex Medical)), メソテリン(mesothelin)/PSCA/CEA/HER2/MUC1/EGFRvIII (e.g., NCT03267173 (First Affiliated Hospital of Harbin Medical University / Shanghai Unicar-Therapy Bio-medicine Technology Co.)), CD20 (e.g., EY201605-19 (Beijing Biohealthcare Biotechnology Co.)), CD33 (e.g., 2016-0341/NCT03126864 (M.D. Anderson Cancer Center / Intrexon Corp. / Ziopharm)), EGFR/BCMA (e.g., EGFRt/BCMA-41BBz CAR T細胞 (Memorial Sloan Kettering Cancer Center / Juno Therapeutics, Inc.)), ROR2 (e.g., 自己 CCT301-38 又は CCT301-59 T 細胞 (Shanghai Sinobioway Sunterra Biotech)), NKR-2 (e.g., CYAD-N2T-002,003,004 (Celyad)), PSCA (e.g., BP-012 (Bellicum Pharmaceuticals)), CD28 (e.g., 自己 CSR T 細胞(Beijing Sanbo Brain Hospital / Marino Biotechnology Co.)), TAA (e.g., AMG 119 (Amgen)), NKG2D (e.g., CM-CS1 (Celyad)), 又は CD123 (e.g., UCART123 (Cellectis S.A.))。前述の文は、前記抗原(例えば、AMG 119(Amgen))に結合するCARの例を、更に提供する。これらのCAR構築物を、抗-CD137 ADCを用いた、本明細書中に開示する方法において使用することがある。
【０１１５】
CAR構築物は、前記細胞外抗原結合ドメインを細胞内シグナリング・ドメインに連結する(文字通り、又は、ほぼ近接して、例えば、スペーサを使って)、膜貫通ドメインを更に含むことがある。いくつかの実施形態では、CARの細胞外抗原結合ドメイン(例えば、scFv、Fab又は他の抗原結合部分)は、ヒンジ又は他のリンカーを使用して膜貫通ドメインに連結していることがある。スペーサ、リンカー、又はヒンジを、前記細胞外抗原結合ドメインと前記膜貫通ドメインとの間に導入して、前記抗原結合ドメインが様々な方向に配向することを可能にする柔軟性を提供し、それによって抗原の認識及び結合を容易にすることがある。前記膜貫通ドメインの細胞質側を、CD28又はCD3ゼータ(CD3-ζ)の細胞内シグナリング・ドメインのような細胞内シグナリング・ドメインに付けることがある、及び、更に、以下で論じるように1つ以上の共-刺激ドメインを含むことがある。
【０１１６】
従って、ある特定の実施形態では、前記CARは、前記細胞外抗原結合ドメインと前記膜貫通ドメインとの間に位置するヒンジ領域を更に含むことがある。例えば、前記ヒンジ領域は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE、IgM、CD28、又はCD8アルファのヒンジ領域に由来することがある。ある特定の実施形態では、前記ヒンジ領域は、IgG4のヒンジ領域に由来する。別の実施形態では、前記ヒンジ領域は、CD8のヒンジ・ドメインである(SwissProt/GenBank Acc.NoP01732参照)。
【０１１７】
ある実施形態では、CARは、細胞外抗原結合ドメイン、及びCD8ヒンジを介して連結した膜貫通ドメインを含む：  AKPTTTPAPR PPTPAPTIAS QPLSLRPEAC RPAAGGAVHT RGLDFA (配列番号(SEQ ID NO): 2)。
【０１１８】
ある実施形態では、CARは、細胞外抗原結合ドメイン、及びハイブリッドCD8-CD28ヒンジを介して連結した膜貫通ドメインを含む：  AKPTTTPAPR PPTPAPTIAS QPLSLRPEAC RPAAGGAVHT RGLDFAPRKI EVMYPPPYLD NEKSNGTIIH VKGKHLCPSP LFPGPSKP (配列番号(SEQ ID NO): 3)。
【０１１９】
前記膜貫通ドメインは、細胞外抗原結合ドメインに寄与するタンパク質、エフェクター機能シグナリング・ドメインに寄与するタンパク質、増殖シグナリング部分に寄与するタンパク質、又は全く異なったタンパク質、の配列に由来していることがある。いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインは、前記CARの他のドメインのうちの1つと自然に関連している。例えば、前記膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインは、同じタンパク質の膜貫通領域及び細胞質領域に由来することがある。ある実施形態では、前記CARの膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインは、CD28配列の連続している部分を含む。任意の膜貫通ドメインを、そのドメインが抗原結合ドメインを含むCARを細胞膜に固定することができるならば、本明細書に記載のCAR構築物に使用することができる。
【０１２０】
前記膜貫通ドメインは、天然の又は合成した供給源の何れかに由来することがある。前記供給源が天然である場合、前記ドメインは、任意の膜結合又は膜貫通タンパク質に由来することがある。本明細書中で提供する方法において使用することがある例示的な膜貫通ドメインは、T-細胞レセプターのアルファ鎖、ベータ鎖、若しくはゼータ鎖、CD28、CD3イプシロン、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、LFA-1 T-細胞共-レセプター、CD2 T-細胞共-レセプター／接着分子、CD8アルファ、及びそれらのフラグメント、に由来することがある（例えば、少なくとも上記の膜貫通ドメインを含む）。タンパク質の膜貫通ドメインは、当該分野で公知の任意の方法(例えば、疎水性解析、構造解析など)を使用して、又は公的なデータベース(例えば、UniProtデータベース)を使用することによって、同定することができる。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインは合成したものであることがある。例示的な実施形態では、前記膜貫通ドメインは、ロイシン及びバリンなどの疎水性残基を主に含むことがある。ある実施形態では、フェニルアラニン、トリプトファン及びバリンのトリプレットを、合成膜貫通ドメインのそれぞれの端部に配置させることがある。任意選択的に、短いオリゴの又はポリペプチドのリンカー（好ましくは2〜10アミノ酸長）によって、CARの前記膜貫通ドメインと前記細胞内シグナリング・ドメインとの間の連結を形成することがある。グリシン-セリン・ダブレットは、特に好適なリンカーを提供する。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、本明細書中で使用するCAR中の膜貫通ドメインは、CD8の膜貫通ドメイン又はその一部である。この目的のためのCD8の配列は、PCT公開番号WO2014/055771A1に教示されている。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、前記CAR中の膜貫通ドメインは、CD8の膜貫通ドメイン又はその機能的部分である。例えば、CARは、LDPKLCYLLD GILFIYGVIL TALFLRVK (配列番号(SEQ ID NO): 4)のアミノ酸配列を有するCD3の膜貫通ドメイン、又はその機能的部分（例えば、LCYLLDGILF IYGVILTALF L (配列番号(SEQ ID NO): 5)）、を含むことがある。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、本発明のCAR中の膜貫通ドメインは、CD28の膜貫通ドメインである。CD28の例示的な配列、並びに例示的な膜貫通ドメイン配列を以下に提供する。いくつかの実施形態では、前記CD28の膜貫通ドメインは、以下の例示的な膜貫通ドメイン配列、又はそのフラグメント若しくはそのバリアント（これは、その配列を含むCARを細胞膜に固定することができるものである）を含む。従って、いくつかの実施形態では、前記CARの膜貫通ドメインは、以下のアミノ酸配列を含むCD28の膜貫通ドメインである：FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(配列番号(SEQ ID NO): 6)。ある実施形態では、前記CARの膜貫通ドメインは、以下のアミノ酸配列を含むCD28の膜貫通ドメインである：IEVMYPPPYL DNEKSNGTII HVKGKHLCPS PLFPGPSKPF WVLVVVGGVL ACYSLLVTVA FIIFWV (配列番号(SEQ ID NO): 7)、又はその機能的フラグメント、例えば配列番号(SEQ ID NO): 6。
【０１２５】
細胞外抗原結合ドメイン及び膜貫通ドメインに加えて、CARは、細胞内(intracellular)（又は細胞内(細胞質側(cytoplasmic))）シグナリング・ドメインを更に含む。
【０１２６】
内因性のTCRを介して生成されるシグナルだけでは、T細胞を完全に活性化するには不十分であり、二次的又は共-刺激シグナルも必要とされることがある、ということが知られている。このように、T細胞の活性化は二つの異なる種類の細胞内シグナリング配列によって媒介されることがある：即ち、前記TCRを介して抗原依存性の一次活性化を開始させるもの(一次細胞内シグナリング配列)と、抗原-独立的に作用して二次シグナル又は共-刺激シグナルを提供するもの(二次細胞内シグナリング配列)である。
【０１２７】
用語「細胞内シグナリング・ドメイン(intracellular signaling domain)」又は「細胞内シグナリング・ドメイン(cytoplasmic signaling domain)」は、本明細書中で使用される場合、前記CARの細胞内部位をいう。前記細胞内シグナリング・ドメインは、CARを含む免疫同種異系細胞（例えば、CAR-T細胞又はCAR発現NK細胞）の免疫エフェクター機能を促進するシグナル、を生成することができる。例えばCART細胞又はCAR発現NK細胞における免疫エフェクター機能の例としては、細胞溶解活性及びサイトカインの分泌を含むヘルパー活性が挙げられる。ある特定の実施形態では、前記細胞内シグナル・ドメインがエフェクター機能シグナルを伝達し、その細胞に対して、特化した機能を実行するように指示する。細胞内シグナリング・ドメイン全体を使用することができるが、多くの場合、その鎖全体を使用することは必須ではない。切断を受けた細胞内シグナリング・ドメインの部分を使用する範囲について、そのような切断を受けた部分は、それが前記エフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクトな鎖の代わりに使用することができる。従って、細胞内シグナリング・ドメインという用語は、前記エフェクター機能シグナルを伝達するのに充分な細胞内シグナリング・ドメインの任意の切断を受けた部分を含むことを意味する。
【０１２８】
ある実施形態では、前記CARの細胞内シグナリング・ドメインは、配列番号(SEQ ID NO): 8に記載するようなCD3ゼータのシグナリング領域、又はそのシグナリング部分を含む：
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (配列番号(SEQ ID NO): 8)。
【０１２９】
細胞内シグナリング・ドメインは、限定されるものではないが、CD3ゼータ、FcRガンマ、FcRベータ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CDS、CD22、CD79a、CD79b、CD278(「ICOS」)、Fc イプシロン RI、CD66d、DAP10、及びDAP12から誘導されるものを、更に含むことがある。
【０１３０】
CARは、サイトカイン産生を増強する共刺激タンパク質又はタンパク質類（例えば、CD28及び4-1BB等）の細胞内シグナリング・ドメインに由来するポリペプチド鎖である「細胞内共刺激ドメイン」を、更に含むことがある。例示的な共-刺激シグナリング領域としては、4-1BB、CD21、CD28、CD27、CD127、ICOS、IL-15Rα、及びOX40、が挙げられる。
【０１３１】
ある特定の実施形態では、CARの細胞内共刺激ドメインは、4-1BBシグナリング・ドメインを単独で、又はCARの文脈において有益な任意の他の所望の細胞内ドメインと組み合わせて含む。4-1BBは、GenBank Acc 番号AAA62478.2 として提供されるアミノ酸配列、又は非-ヒト種(例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿など)由来の同等の残基、を有するTNFRスーパーファミリーのメンバーである；及び「4-1BB共刺激ドメイン」は、GenBank Acc 番号AAA62478.2 のアミノ酸残基214〜255、又は非-ヒト種(例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人種など)由来の同等の残基、として定義される。
【０１３２】
ある実施形態では、前記CARの細胞内共刺激ドメインは、4-1BB(CD137)の共-刺激シグナリング領域、又はそのシグナリング部分である：
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (配列番号(SEQ ID NO): 9)。
【０１３３】
ある実施形態では、前記CARの共刺激シグナリング・ドメインは、CD28の共-刺激シグナリング領域配列である。例えば、前記共刺激シグナリング・ドメインは、以下のCD28共-刺激シグナリング部位、又はそのシグナリング部位を含むことがある：
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (配列番号(SEQ ID NO): 10)。
【０１３４】
例示的な実施形態では、前記CARの細胞内ドメインは、CD3-ゼータのシグナリング・ドメインを、本発明のCARの文脈において有用である任意の他の所望の細胞内ドメインと組合せて、含有することがある。ある特定の実施形態では、前記CARの細胞内ドメインは、CD3ゼータのドメイン及び共刺激シグナリング領域（例えば、限定されるものではないが、4-1BB、CD28、及び／又はCD27の共刺激シグナリング領域）を含むことがある。
【０１３５】
本発明のCARの細胞内シグナリング部分内の細胞内シグナリング配列は、ランダム又は特定の順序で互いに連結していても良い。任意選択的に、短いオリゴの又はポリペプチドのリンカー又はスペーサ（好ましくは5〜20アミノ酸長）を細胞内ドメインの間に挿入することがある。GGGGS(配列番号(SEQ ID NO): 27)又は(GGGGS)×3(配列番号(SEQ ID NO): 28)は、特に好適なリンカーを提供する。
【０１３６】
ある実施形態では、本明細書で使用するCARは、抗-CD19モノクローナル抗体の単鎖可変ドメインを含有する細胞外ドメイン、CD8αのヒンジ及び膜貫通ドメインを含有する膜貫通ドメイン、並びにCD3ζのシグナリング・ドメイン及び4-1BBのシグナリング・ドメインを含有する細胞内ドメイン、を含む。例示的なCARは、Nicholson I C, et al., Mol Immunol 34:1157-1165 (1997)に記載されている抗-CD19モノクローナル抗体を含む抗-CD19細胞外ドメインに加えて、CD8αの21アミノ酸シグナル・ペプチド(GenBankアクセッション番号.NM_001768の26-88位の63ヌクレオチドから翻訳される)、を含む。CD8αヒンジ及び膜貫通ドメインは、GenBankアクセッション番号NM_001768の815〜1021位の207ヌクレオチドから翻訳される69アミノ酸からなる。好ましい実施形態のCD3ζシグナリング・ドメインは、GenBankアクセッション番号NM_000734の1022〜1360位の339ヌクレオチドから翻訳される112アミノ酸を含む。
【０１３７】
前記CAR(上記)の細胞外ドメイン(抗原結合ドメインを含む)と膜貫通ドメインとの間、又は前記CARの細胞内ドメインと膜貫通ドメインとの間に、スペーサ又はヒンジ・ドメインが組み込まれていることがある。本明細書で使用する場合、用語「スペーサ・ドメイン」は一般に、前記膜貫通ドメインをポリペプチド鎖中の細胞外ドメイン及び／又は細胞内ドメインに連結するように機能する任意のオリゴ又はポリペプチドを意味する。本明細書中で使用する場合、ヒンジ・ドメインは一般に、前記CAR、若しくはそのドメインに柔軟性を提供するように、及び／又は前記CAR、又はそのドメインの立体障害を防止するように機能する任意のオリゴ又はポリペプチドを意味する。いくつかの実施形態では、スペーサ又はヒンジ・ドメインは、300個までのアミノ酸、好ましくは10〜100個のアミノ酸、最も好ましくは5〜20個のアミノ酸を含むことがある。しばしば、スペーサ又はヒンジが、細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に導入されて、前記抗原結合ドメインが種々の方向に配向して抗原の認識及び結合を容易にすることを可能にする柔軟性を提供する。本開示の態様はこの点に限定されないので、1つ以上のスペーサ・ドメインがCARの他の領域に含まれてもよいことも理解されるべきである。
【０１３８】
CARは、本明細書中に提供される配列を有する領域(例えば、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメイン、シグナリング・ドメイン、安全性ドメイン、及び／若しくはリンカー、又はそれらの任意の組合せ)を含むことがあること、又はそれらのバリアント、若しくはそれらの何れかのフラグメント(例えば、CAR活性に必要とされる機能を保持するバリアント及び／又はフラグメント)が本明細書中に記載するCARタンパク質に含まれ得ること、は理解されるべきである。いくつかの実施形態では、バリアントは、示した配列に対して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個のアミノ酸が変化している。いくつかの実施形態では、バリアントは、示した配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、90%〜95%、少なくとも95%又は少なくとも99%同一である配列を有する。いくつかの実施形態では、フラグメントは、本明細書中に提供される配列よりも、1〜5、5〜10、10〜20、20〜30、30〜40、又は40〜50アミノ酸分、短い。いくつかの実施形態では、フラグメントは、提供する配列のN-末端、C-末端、又は両方の末端領域でより短い。いくつかの実施形態では、フラグメントは、本明細書中で提供する配列中のアミノ酸の数の80%〜85%、85%〜90%、90%〜95%、又は95%〜99%を含む。
【０１３９】
他の実施形態では、本発明は、本明細書中に開示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、上記の例示的な非限定的な配置は、前記CARの左側から右側、N-末端側からC-末端側である。前記CARは、本明細書中に記載するように、要素の任意の他の組合せを含んでもよく、又は更に含んでもよい。
【０１４１】
CAR構築物がその様々な部分で同定されると、CARを発現する免疫細胞が産生され、それによって、前記免疫細胞が前記CARを発現する。本方法は、本明細書中に記載する核酸分子(例えば、RNA分子(例えば、mRNA))、又はCAR(例えば、本明細書中に記載するCAR)をコードする核酸分子を含むベクターを、前記免疫細胞に導入すること(例えば、形質導入すること)を包含する。また、本発明は、細胞集団(例えば、外因性RNAを一時的に発現する、RNAで操作した細胞)を作製する方法を提供する。本方法は、本明細書中に記載するようなRNA(例えば、in vitroで転写したRNA又は合成RNA；本明細書中に記載するようなCARポリペプチドをコードするmRNA配列)を細胞に導入することを包含する。実施形態では、前記RNAは、CARポリペプチドを一過性に発現する。ある実施形態では、前記細胞は本明細書に記載の細胞（例えば、免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞若しくはNK細胞、又は細胞集団)）である。
【０１４２】
抗-CD137抗体薬物コンジュゲート(ADC)
本明細書中に記載するように、抗-CD137 ADCを、同種異系細胞療法と併用して、ヒト患者におけるがん又は自己免疫疾患を治療する。より具体的には、抗-CD137 ADCを使用して、同種異系細胞療法も受けているヒト対象において、CD137+細胞(例えば、CD137+ T細胞)を減少させることができる。抗-CD137 ADCは、内因性T細胞をターゲットとし、これらの細胞を傷害することにより、前記患者の免疫系が、前記対象に投与した同種異系細胞（例えば、CARを発現する同種異系細胞)を攻撃しないようにする。このように、抗-CD137 ADCを、CAR療法と併用して、レシピエント(recipient)患者において、前記細胞療法が拒絶されるリスクを予防する、又は減少させる。コンディショニング・レジメンとして抗-CD137 ADCを使用することの1つの利点は、CD137を発現する活性化T細胞を特異的にターゲット化して減少させることである。
【０１４３】
抗-CD137抗体
本発明は、CD137(CDw137、TNFRSF9、4-1BB、及びILAとも呼ばれる)に結合し得る抗体及びその抗原結合フラグメントが、細胞治療を必要とする患者において細胞治療が拒絶されるリスクを予防する又は減少させるための治療薬剤として使用され得るという発見に部分的に基づいている。
【０１４４】
T細胞はCD137を発現することが示されており、この抗原は、共刺激分子の膜貫通TNFレセプター・スーパーファミリーであり、様々な造血細胞上で発現している、及びT細胞活性化を促進する、並びにT細胞の増殖及び生存を調節する(例えば、Cannons et al., J. Immunol. 167:1313-1324, 2001を参照されたい。この開示は、T細胞によるCD137の発現に関連するので、本明細書に参照により取り込まれる)。ヒトCD137のアミノ酸配列を以下に示す：
MGNSCYNIVA TLLLVLNFER TRSLQDPCSN CPAGTFCDNN RNQICSPCPP 
NSFSSAGGQR TCDICRQCKG VFRTRKECSS TSNAECDCTP GFHCLGAGCS 
MCEQDCKQGQ ELTKKGCKDC CFGTFNDQKR GICRPWTNCS LDGKSVLVNG 
TKERDVVCGP SPADLSPGAS SVTPPAPARE PGHSPQIISF FLALTSTALL 
FLLFFLTLRF SVVKRGRKKL LYIFKQPFMR PVQTTQEEDG CSCRFPEEEE 
GGCEL   (GenBank No. AAX42660.1; 配列番号(SEQ ID NO): 1)。
【０１４５】
ヒトCD137に特異的な抗体及びその抗原結合フラグメントを、当技術分野で公知である、及び本明細書中に記載される技術（例えば、免疫化、コンピューター・モデリング技術、及びin vitro選択方法(例えば、以下に記載するファージ・ディスプレイ及び細胞ベースのディスプレイ・プラットフォーム)）を使用することによって同定され得る。
【０１４６】
ある実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物（ADCを含む）に使用され得る抗-CD137抗体は、マウス抗-CD137抗体BBK2（Thermo Fisher; MS621PABX）、またはBBK2抗体に対応する抗原結合領域を含む抗-CD137抗体である。前記BBK2抗体（BBK-2抗体又は抗4-1BB抗体とも呼ばれることがある）は、ヒト4-1BB組換えタンパク質（4-1BBは、CD137としても知られている）のエクトドメインに結合するマウス・モノクローナル抗体（IgG1、κ）である。ある特定の実施形態では、本開示の方法及び組成物は、BBK2抗体の結合領域（例えば、CDR）を含む抗-CD137抗体を含む。別の実施形態では、本開示の方法及び組成物は、CD137上のそのエピトープに対するBBK2抗体の結合を競合的に阻害する抗体を含む。ある特定の実施形態では、前記抗-CD137抗体は、ヒト化BBK2又はキメラBBK2である。
【０１４７】
ある実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物は、BBK2の可変重鎖領域及び軽鎖領域を含むキメラ抗-CD137（ch-BBK2）抗体を含む。ある特定の実施形態では、そのキメラBBK2抗体は、ヒト定常領域を含むIgG1抗体である。ch-BBK2の重鎖アミノ酸配列は、配列番号(SEQ ID NO):11に記載されている、及びch-BBK2の軽鎖アミノ酸配列は、配列番号(SEQ ID NO):12に記載されている。重鎖及び軽鎖の各配列のCDR領域（CDR1、CDR2、及びCDR3）を、以下に太字で記載する。可変領域をイタリックにする。
【０１４８】
【化１０】
2021530546.tif 000073
(配列番号(SEQ ID NO): 11)
【０１４９】
【化１１】
2021530546.tif 000074
(配列番号(SEQ ID NO): 12)
【０１５０】
前述のCDR領域（及びBBK2抗体）は、Lee et al. (2002) European J of Immunogenetics 29(5):449-452に記載されている。従って、ある実施形態では、抗-CD137抗体BBK2（ch-BBK2を含む）のVH CDRアミノ酸配列は以下の通りである：SGYTFTSYW（VH CDR1；配列番号(SEQ ID NO)：13）；NIYPSDSYT（VH CDR2；配列番号(SEQ ID NO)：14）及びTRNGVEGYPHYYAME（VH CDR3；配列番号(SEQ ID NO)：15）。抗-CD137抗体BBK2（ch-BBK2を含む）のVL CDRのアミノ酸配列は以下の通りである：SQDLSNH（VL CDR1；配列番号(SEQ ID NO)：16）；YYTS（VL CDR2；配列番号(SEQ ID NO)：17）及びCQQGYTLPY（VL CDR3；配列番号(SEQ ID NO)：18）である。
【０１５１】
或いは、BBK2のCDR領域をKabat番号付けによって定義することがある。Kabat番号付けによって定義したCDRを、重鎖及び軽鎖配列の各々について、以下に記載する(以下に太字で記載する)。BBK2の可変領域をイタリックにする。
【０１５２】
【化１２】
2021530546.tif 000075
【０１５３】
【化１３】
2021530546.tif 000076
【０１５４】
従って、ある実施形態では、抗-CD137抗体BBK2（ch-BBK2を含む）のVH CDRアミノ酸配列は、以下の通りである：SYWIN（VH CDR1；配列番号(SEQ ID NO)：19）；NIYPSDSYTNYNQKFKD（VH CDR2；配列番号(SEQ ID NO)：20）及びNGVEGYPHYYAMEY（VH CDR3；配列番号(SEQ ID NO)：21）、並びに抗-CD137抗体BBK2（ch-BBK2を含む）のVL CDRアミノ酸配列は以下の通りである：RASQDLSNHLY（VL CDR1；配列番号(SEQ ID NO)：23）；YTSRLHS（VL CDR2；配列番号(SEQ ID NO)：24）及びQQGYTLPYT（VL CDR3；配列番号(SEQ ID NO)：25）。
【０１５５】
BBK2の重鎖可変領域を、配列番号(SEQ ID NO)：22に、以下として記載する
QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWINWVKQRPGQGLEWIGNIYPSDSYTNYNQKFKDKATLTVDKSSNTVYMQLNSPTSEDSAVYYCTRNGVEGYPHYYAMEYWGQGTSVTVSS
。
BBK2の軽鎖可変領域を、配列番号(SEQ ID NO)：26に、以下として記載する
DIQMTQTTSALSASLGDRVTIGCRASQDLSNHLYWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTIRNLEQEDVATYFCQQGYTLPYTFGGGTKLEIK
。
抗-CD137抗体(抗-CD137 ADCを含む)は、配列番号(SEQ ID Nos): 22及び26に記載するような重鎖及び軽鎖可変領域アミノ酸配列を、それぞれ含むことがある。
【０１５６】
ある実施形態では、抗-CD137抗体、例えば、キメラ（ch-BBK2）抗体又はヒト化BBK2抗体は、配列番号(SEQ ID NO)：19のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号(SEQ ID NO)：20のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号(SEQ ID NO)：21のアミノ酸配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域；並びに配列番号(SEQ ID NO)：23のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号(SEQ ID NO): 24のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号(SEQ ID NO): 25のアミノ酸配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域、を含む。
【０１５７】
ある実施形態では、抗-CD137抗体、例えば、キメラ（ch-BBK2）抗体又はヒト化BBK2抗体は、配列番号(SEQ ID NO)：13のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号(SEQ ID NO)：14のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号(SEQ ID NO)：15のアミノ酸配列を含むCDR3を含む重鎖可変領域；並びに配列番号(SEQ ID NO)：16のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号(SEQ ID NO): 17のアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号(SEQ ID NO): 18のアミノ酸配列を含むCDR3を含む軽鎖可変領域、を含む。
【０１５８】
従って、BBK2、ヒト化BBK2、又はキメラBBK2抗体を、本明細書に記載する抗-CD137 ADC及び方法において使用することがある。これらの抗体の各々は、当技術分野で公知の方法及び本明細書中に記載する方法を使用して、以下に記載する細胞毒素の何れかにコンジュゲートさせることがある。
【０１５９】
種々の他の抗-CD137抗体が当該分野で公知であり、そして本明細書中に記載する方法において有用である。例えば、ある特定の実施形態では、前記抗-CD137抗体を、ADG106 (以下に記載されている, e.g., WO2019105468, US20190055314, WO2019037711, WO2019036855); AGEN2373 (以下に記載されている, e.g., WO2018191502, US20180344870); ATOR-1017 (以下に記載されている, e.g., WO2018091740, US20180118841) PE0166 (以下に記載されている, e.g., Song et al. AACR 2019, Abstract 2397/21), ウレルマブ(urelumab) (BMS-663513としても知られる; 以下に記載されている, e.g., WO2004010947, WO2005035584, US20090068192, US7659384, US8475790, US8137667, US20100183621, US8716452, US20120141494, US9382328, US20140193422, WO2016029073, US20160368998, WO2017181034, US20190062445, Chin et al. Nature communications. 9.1 (2018): 4679.; Segal et al. Clinical Cancer Research. 23.8 (2017): 1929-1936.); 及びウトミルマブ(utomilumab) (PF-05082566としても知られる, MOR-7480.; 以下に記載されている, e.g., WO2012032433, US20120237498, US20140178368, WO2012145183, WO2015119923, WO2015179236, US20160152722, US20190031765, WO2017130076, Chin et al. Nature communications. 9.1 (2018): 4679.; Segal et al. Clinical Cancer Research. 24.8 (2018): 1816-1823; Fisher et al. Cancer Immunology, Immunotherapy. 61.10 (2012): 1721-1733)、から選択する（これらの各々は、参照により取り込まれる）。
【０１６０】
他の抗-CD137抗体は、例えば、以下に記載されている、WO2019020774, WO2017077085, US20180327504, US20190099488, US2019006045, US20190015508, WO2019014328, US20190071510, WO2018127787, US20180258177, US10174122, WO2016110584, WO2018017761, WO2018098370, US20130149301, WO2019027754, WO2018156740, US20160244528, WO2016134358, US10233251, US20170226215, US20160083474, WO2017049452, US20180282422, WO2015188047, WO2010132389, US20120076722, US20110177104, WO2011031063, US20080305113, US20080008716, US7829088, US20090041763, WO2006126835, US20030096976, US20030223989, US20060182744, WO1996029348, Soderstromet al. Circulation J. 81.12 (2017): 1945-1952; Makkouk, et al. Annals of Oncology 28.2 (2016): 415-420; Martinez-Forero et al. J. of Immunology. 190.12 (2013): 6694-6706; Dubrot et al. Cancer immunology, immunotherapy. 59.8 (2010): 1223-1233；これらの各々は、参照により取り込まれる。
【０１６１】
ある実施形態では、前記抗-CD137抗体は、本明細書に記載する抗-CD137抗体の重鎖、及び本明細書に記載する抗-CD137抗体の軽鎖可変領域を含む。ある実施形態では、前記抗-CD137抗体は、本明細書に記載する抗-CD137抗体のCDR1、CDR2及びCDR3を含む重鎖、並びに本明細書に記載する抗-CD137抗体のCDR1、CDR2及びCDR3を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１６２】
別の実施形態では、前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、本明細書中の抗-CD137抗体に対して少なくとも95%の同一性、例えば、本明細書中の抗-CD137抗体に対して少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、本明細書中の抗-CD137抗体のHC可変ドメインを含む改変重鎖(HC)可変領域、又はそのバリアントを含む、ここで、そのバリアントは、(i)1、2、3、4又は5個のアミノ酸が置換、付加又は欠失していることにおいて、前記抗-CD137抗体と異なる；(ii)せいぜい、5、4、3、2又は1個のアミノ酸が置換、付加又は欠失していることにおいて、前記抗-CD137抗体と異なる；(iii)1-5、1-3、1-2、2-5又は3-5個のアミノ酸が置換、付加又は欠失していることにおいて、前記抗-CD137抗体と異なる；及び／又は(iv)前記抗-CD137抗体と少なくとも約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるアミノ酸配列を含む、ここで、(i)-(iv)の何れにおいても、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換又は非-保存的アミノ酸置換であってもよい；並びにここで、前記改変した重鎖可変領域は、前記抗-CD137抗体のCD137結合特異性を保持しながら、前記抗-CD137抗体の重鎖可変領域と比較して増強した生物学的活性を有していることがある。
【０１６３】
本明細書中に記載する細胞毒素と併せて使用することがある他の抗-CD137抗体を、当該分野で公知の技術(例えば、ハイブリドーマ産生)を使用して、同定することがある。ハイブリドーマを、マウスのシステムを用いて調製することがある。免疫化及びその後に融合するために脾細胞を単離するためのプロトコルは、当該分野で公知である。ハイブリドーマを産生するための融合パートナー及び手順もまた公知である。HuMAb-Mouse登録商標又はXenoMouseTMで、ヒト抗-CD137抗体を生成することもある。抗-CD137抗体を作製する際に、そのCD137抗原を単離及び／又は精製する。前記CD137抗原は、CD137の細胞外ドメイン由来のCD137のフラグメントであることがある。動物の免疫化を、当技術分野で公知の任意の方法によって行うことができる。例えば、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990、を参照のこと。マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ及びウマなどの動物を免疫するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、Harlow and Lane、同上及び、米国特許第5,994,619号、を参照。前記CD137抗原を、免疫反応を刺激するために、アジュバントと共に投与することがある。当技術分野で公知のアジュバントとしては、完全又は不完全フロイント・アジュバント、RIBI(ムラミル・ジペプチド)又はISCOM(免疫刺激複合体)が挙げられる。CD137抗原で動物を免疫した後、免疫した動物から単離した細胞から抗体産生不死化細胞株を調製する。免疫化後、前記動物を屠殺し、そしてリンパ節及び／又は脾臓B細胞を、当該分野で公知の方法(例えば、がん遺伝子導入、がん原性ウイルス形質導入、発がん性又は変異原性化合物への暴露、不死化細胞(例えば、骨髄腫細胞)との融合、及び腫瘍サプレッサー遺伝子の不活性化)によって不死化する。例えば、Harlow and Lane、同上を参照。ハイブリドーマを、所望の特性（例えば、強固な増殖、高い抗体産生、及び所望の抗体特性が挙げられる）について、選択する、クローニングする及び更にスクリーニングすることがある。
【０１６４】
抗-CD137抗体を、本発明が提供するCD137結合分子のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離した核酸分子から生成することがある。前記ヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列は、抗体の任意の一部（例えばCDR、1つ、2つ、又は3つのCDRを含む配列、重鎖の可変領域、軽鎖の可変領域）であってもよく、又は全長重鎖又は全長軽鎖であってもよい。本開示の核酸は、例えば、DNA又はRNAであってよく、イントロン配列を含んでも含まなくてもよい。典型的には、前記核酸はcDNA分子である。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、前記抗-CD137抗体(又はそのフラグメント)は、規定する血清半減期を有する。例えば、抗-CD137抗体(又はそのフラグメント)は、ヒト患者において、約1〜24時間の血清半減期を有することがある。このような抗-CD137抗体を含むADCもまた、例えば、ヒト患者において、約1〜24時間の血清半減期を有することがある。血清レベルを測定することによる薬物動態解析は、当技術分野で公知のアッセイによって行うことができる。
【０１６６】
本明細書中に記載するADCと併せて使用するための抗体としては、上記に記載されるそれらの抗体のバリアント（例えば、本明細書中に記載する抗体、抗体フラグメントの、CDR又はその等価な領域の1つ以上又は全てを含む、Fcドメインを含むか又は欠損する抗体フラグメント等）を含む。
【０１６７】
抗体を同定する方法
CD137に結合可能な抗体又は抗体フラグメントのライブラリをハイスループット・スクリーニングするための方法を使用して、例えば、同種異系細胞療法が拒絶されることを治療する又は予防するのに有用な薬剤を、同定する、及び親和性成熟させる、ことがある。このような方法としては、当技術分野で公知のin vitroディスプレイ技術、例えば、とりわけ、ファージ・ディスプレイ、バクテリア・ディスプレイ、酵母ディスプレイ、哺乳動物細胞ディスプレイ、リボソーム・ディスプレイ、mRNAディスプレイ、及びcDNAディスプレイなど、が挙げられる。生物学的に関連する分子に結合する抗体、又は抗原結合フラグメントを単離するためにファージ・ディスプレイを使用することは、例えば、Felici et al., Biotechnol. Annual Rev. 1:149-183, 1995; Katz, Annual Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26:27-45, 1997; 及び Hoogenboom et al., Immunotechnology 4:1-20, 1998、でレビューされてきている、これらの各々の開示は、in vitroディスプレイ技術に関連するものとして、本明細書に参照により取り込まれる。Kay, Perspect. Drug Discovery Des. 2:251-268, 1995 及び Kay et al., Mol. Divers. 1:139-140, 1996に記載されるように、ランダム化したコンビナトリアル・ペプチド・ライブラリを構築して、細胞表面抗原に結合するポリペプチドを選択することも行われてきている、これらの各々の開示は、抗原結合分子の発見に関連するものとして、本明細書に参照により取り込まれる。タンパク質類(例えば、多量体タンパク質類)を、機能的分子として、ファージ・ディスプレイすることが、うまくできてきている(例えば、EP 0349578; EP 4527839;及びEP 0589877、並びにChiswell and McCafferty, Trends Biotechnol. 10:80-84 1992を参照、これらの各々の開示は、抗原結合分子の発見のためのin vitroディスプレイ技術の使用に関するものとして、本明細書に参照により取り込まれる）。更に、機能的抗体フラグメント(例えば、Fab及びscFvフラグメント)を、in vitroディスプレイ・フォーマットで、発現させることも行われてきている(例えば、McCafferty et al., Nature 348:552- 554, 1990; Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982, 1991; 及び Clackson et al., Nature 352:624-628, 1991を参照、これらの各々の開示は、抗原結合分子を発見するためのin vitroディスプレイ・プラットフォームに関連するものとして、本明細書に参照により取り込まれる）。ヒト抗-CD137抗体を、例えば、HuMAb-マウス登録商標又はXenoMouseTMにおいて生成することもできる。これらの技術はとりわけ、CD137に結合する、次いで、患者における造血細胞を減少させるために使用することがある、抗体又は抗体フラグメントの親和性を同定する及び改善するために使用することがある。
【０１６８】
in vitroディスプレイ技術に加えて、例えば、US2013/0288373に記載された手順を使用しながら、計算モデリング技術を使用して、抗-CD137抗体又は抗体フラグメントをin silicoで設計する、及び同定することがある（その開示は、抗-CD137抗体を同定するための分子モデリング方法に関するものとして、本明細書に組み込まれる）。例えば、計算モデリング技術を用いて、当業者のある者は、CD137の細胞外エピトープなどのCD137上の特異的エピトープに結合することができる分子を求めて、抗体又は抗体フラグメントのライブラリをin silicoでスクリーニングすることがある。
【０１６９】
更なる技術を使用して、細胞(例えば、T細胞)の表面上のCD137に結合し、例えば、レセプター媒介エンドサイトーシスによって、前記細胞が中に取り込むことができる抗体又は抗体フラグメントを同定することがある。例えば、上記のin vitroディスプレイ技術を、造血幹細胞の表面上のCD137に結合し、続いて中に取り込まれる抗体又はその抗体フラグメントを求めてスクリーニングするように、適合させることがある。ファージ・ディスプレイは、このスクリーニング・パラダイムと組み合わせて使用することがあるような技術の1つの代表である。CD137に結合し、続いて造血幹細胞が中に取り込む抗-CD137抗体又は抗体フラグメントを同定するために、当業者のある者は、Williams et al., Leukemia 19:1432-1438, 2005に記載されるファージ・ディスプレイ技術を使用することがある（その開示は、その全体が本明細書に参照により取り込まれる）。例えば、当技術分野で公知の突然変異誘発方法を使用して、抗体、抗体フラグメント（例えば、とりわけscFvフラグメント、Fabフラグメント、ダイアボディ、トリアボディ、及び10Fn3ドメイン）、又はリガンド（これらは、ランダム化アミノ酸カセットを(例えば、CDR若しくはその等価領域、又は抗体若しくは抗体フラグメントの1つ以上、若しくは全ての中に)含有する）をコードする組換えファージ・ライブラリを産生することができる。前記抗体又は抗体フラグメントの骨格領域、ヒンジ、Fcドメイン、及び他の領域を、例えば、ヒト生殖系列抗体配列又はヒト生殖系列抗体と比較して僅かに違う配列を有するようにすることによって、ヒトにおいて非-免疫原性であるように設計することがある。
【０１７０】
本明細書中に記載する、又は当該分野で公知のファージ・ディスプレイ技術を使用して、ファージ粒子に共有結合したランダム化抗体又は抗体フラグメントを含むファージ・ライブラリを、例えば、まず最初に前記ファージ・ライブラリをブロッキング薬剤(例えば、非-特異的タンパク質結合を示す抗体又は抗体フラグメントをコードするファージを除去するために、及びFcドメインに結合する抗体又はそのフラグメントをコードするファージを除去するために、乳タンパク質、ウシ血清アルブミン、及び／又はIgG等)とインキュベートしてから、CD137とインキュベートする（前記ファージ・ライブラリをCD137+である造血幹細胞の集団とインキュベートする）。CD137特異的抗体又は抗体フラグメントが細胞表面CD137に結合し、続いて前記造血幹細胞が中に取り込むのに十分な時間(例えば、30分〜6時間、4℃で1時間等)、前記ファージ・ライブラリを前記造血幹細胞とインキュベートする。続いて、例えば、冷した(4℃)pH 2.8の0.1 Mグリシン・バッファーで洗うことによって、造血幹細胞への結合及びそれによる内部への取り込みを可能にするのに十分なCD137親和性を示さない抗体又は抗体フラグメントを含むファージを除去することがある。造血幹細胞が中に取り込んだ抗体又は抗体フラグメントに結合したファージを、例えば、前記細胞を溶解し、細胞培養培地から中に取り込まれたファージを回収することによって同定することがある。次いで、例えば、当該分野で公知の方法を使用してバクテリア細胞を回収したファージと共に2×YT培地中でインキュベートすることによって、前記ファージをバクテリア細胞中で増幅することがある。次いで、この培地から回収したファージを、例えば、ファージ・ゲノム内に挿入された抗体又は抗体フラグメントをコードする遺伝子の核酸配列を決定することによって、同定することがある。そのコードされた抗体又は抗体フラグメントを、続いて、化学合成(例えば、抗体フラグメント、例えば、scFvフラグメント)又は組換え発現(例えば、全長抗体)によって、新たに調製することがある。
【０１７１】
その調製した抗体又は抗体フラグメントを中に取り込む許容量を、例えば、当該分野で公知の放射性核種内部取込アッセイを使用して、評価することがある。例えば、本明細書中に記載する、又は当技術分野で公知のin vitroディスプレイ技術を用いて同定した抗-CD137抗体又は抗体フラグメントを、放射性同位元素（例えば、18F, 75Br,77Br, 122I, 123I, 124I, 125I, 129I, 131I, 211At, 67Ga, 111In, 99Tc, 169Yb, 186Re, 64Cu, 67Cu, 177Lu, 77As, 72As, 86Y, 90Y, 89Zr, 212Bi, 213Bi, 又は 225Ac）を取り込ませることにより、機能的にすることがある。例えば、放射性ハロゲン（例えば、18F, 75Br,77Br, 122I, 123I, 124I, 125I, 129I, 131I, 211At等）を、求電子性ハロゲン試薬(例えば、ヨード化ビーズ、Thermo Fisher Scientific, Inc., Cambridge, MA)を含むビーズ（例えば、ポリスチレン・ビーズ）を使用して、抗体、又は抗体フラグメントの中に組み込ませることがある。放射性標識した抗体、そのフラグメント又はADCを、造血幹細胞と共に、中に取り込まれるのに充分な時間(例えば、4℃で30分〜6時間、4℃で1時間等)、インキュベートすることがある。次いで、（例えば、冷した(4℃)pH 2.8の0.1 Mグリシン・バッファーを使用して）前記細胞を洗浄して、中に取り込まれなかった抗体又はそのフラグメントを除去する。中に取り込まれた抗体、又は抗体フラグメントを、得られた造血幹細胞から放出される放射線(例えば、γ線)を検出し、回収した洗浄バッファーから放出される放射線(例えば、γ線)と比べることによって、同定することがある。前記の内部取込アッセイを使用して、ADCを特徴付けることもある。
【０１７２】
抗体を、例えば、米国特許4,816,567に記載されるように、組換え方法及び組成物を使用して産生することがある。ある実施形態では、本明細書に記載の抗-CD137抗体をコードする単離された核酸を提供する。このような核酸分子は、前記抗体のVLを含むアミノ酸配列及び／又はVHを含むアミノ酸配列(例えば、前記抗体の軽鎖及び／又は重鎖)をコードすることがある。更なる実施形態では、このような核酸を含む1種以上のベクター(例えば、発現ベクター)を提供する。更なる実施形態では、このような核酸を含む宿主細胞を提供する。あるそのような実施形態では、宿主細胞は以下を含む（例えば、以下によって形質転換を受けている）：(1)前記抗体のVLを含むアミノ酸配列及び前記抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は(2)前記抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクター、及び前記抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクター。ある実施形態では、前記宿主細胞は真核生物、例えばチャイニーズ・ハムスター卵巣(CHO)細胞又はリンパ系細胞(例えば、Y0、NS0、Sp20細胞)である。ある実施形態では、抗CLL-1抗体を作製する方法を提供する、ここで、前記方法は、抗体の発現に適した条件下で、上記に提供されるような抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養すること、及び任意選択的に、前記宿主細胞(又は宿主細胞の培養培地)から抗体を回収すること、を含む。
【０１７３】
抗-CD137抗体を組換えにより産生するためには、抗体をコードする核酸(例えば、上記のよう)を、単離し、及び宿主細胞において更にクローニングする及び／又は発現させるために、1種以上のベクターに挿入する。このような核酸分子を、従来の手順を使用して(例えば、前記抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチド・プローブを使用することによって)容易に単離することができ、及びシークエンシングをすることができる。
【０１７４】
抗体をコードするベクターをクローニングする又は発現させるのに好適な宿主細胞としては、本明細書に記載の原核生物の、又は真核生物の細胞が挙げられる。例えば、抗体類を、特にグリコシル化及びFcエフェクター機能を必要としない場合に、バクテリアの中で産生することがある。バクテリアの中で抗体フラグメント及びポリペプチドを発現させることについては、例えば、米国特許第5,648,237号, 5,789,199号,及び5,840,523を参照のこと（大腸菌の中で抗体フラグメントを発現させることを記載する、Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 245-254、も参照のこと）。発現させた後、前記抗体をバクテリア細胞のペースト(paste)から可溶性画分として単離し、更に精製することがある。
【０１７５】
脊椎動物細胞を宿主としても使用することができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合化した哺乳動物細胞株は有益であることがある。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株(COS-7)；ヒト胚腎臓株(293又は293細胞、例えば、Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載されている)；乳児ハムスター腎臓細胞(BHK)；マウス・セルトリ細胞(TM4細胞、例えば、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されている)；サル腎臓細胞(CV1)；アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO-76)；ヒト子宮頸部がん(carcinoma)細胞(HELA)；イヌ腎臓細胞(MDCK)；バッファロー・ラット肝臓細胞(BRL 3A)；ヒト肺細胞(W138)；ヒト肝臓細胞(Hep G2)；マウス乳房腫瘍(MMT 060562)；TRI細胞、例えば、Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載されている；MRC 5細胞；及びFS4細胞、である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、チャイニーズ・ハムスター卵巣(CHO)細胞(例えば、DHFR-CHO細胞等を含む(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))；及び骨髄腫細胞株(例えば、Y0、NS0及びSp2/0)、が挙げられる。抗体産生に適した、ある特定の哺乳動物宿主細胞株のレビューについては、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J.), pp. 255-268 (2003)を参照のこと。ある実施形態では、前記宿主細胞は真核生物、例えば、チャイニーズ・ハムスター卵巣(CHO)細胞又はリンパ系細胞(例えば、Y0、NS0、Sp20細胞)である。
【０１７６】
細胞毒素
種々の細胞毒素を、本明細書中に記載する併用療法における使用のために、リンカーを介して抗-CD137抗体にコンジュゲートすることがある。特に、抗-CD137 ADCは、細胞毒性部分(又は細胞毒素)にコンジュゲートした(即ち、リンカーによって共有結合した)抗体(又はその抗原結合フラグメント)を含む。本明細書中で使用する場合、用語「細胞毒素」、「細胞毒性部分」及び「薬物」を、互換的に使用する。様々な実施形態では、前記細胞毒性部分は、コンジュゲートとして結合している場合、細胞毒性は減少している、又は細胞毒性を示さない。しかし、前記リンカーからの切断後、細胞毒性を再び示すようになる。様々な実施形態では、前記細胞毒性部分は、前記リンカーから切断されること無しに、細胞毒性を保持する。いくつかの実施形態では、前記細胞毒性分子は、本明細書中に記載するような、細胞の中に取り込まれる抗体又はその抗原結合フラグメントにコンジュゲートする、その結果、前記抗体又はそのフラグメントが細胞の中に取り込まれた後に、前記細胞毒素がその細胞内ターゲットにアクセスし、例えば、T細胞死を媒介することがある。
【０１７７】
従って、本発明のADCは、一般式Iであることがある、ここで、抗体又はその抗原結合フラグメント(Ab)は、リンカー(L)にコンジュゲート(共有結合)し、化学的な部分構造(Z)を通じて、細胞毒性部分(「薬物」、D)にコンジュゲートする。
Ab-(Z-L-D)n      (I)
【０１７８】
従って、前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、整数nによって示されるような多数の薬物部分にコンジュゲートすることがある、ここで、整数nは抗体当たりの細胞毒素の平均個数を表す、ここで、整数nは例えば約1〜約20の範囲であることがある。任意の数（例えば、約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、又は約8）の細胞毒素が前記抗体にコンジュゲートすることがある。いくつかの実施形態では、nは1〜4である。いくつかの実施形態では、nは1〜3である。いくつかの実施形態では、nは約2である。いくつかの実施形態では、nは約1である。コンジュゲーション反応によるADCの調製物中の抗体当たりの薬物部分の平均個数を、マス・スペクトロスコピー、ELISAアッセイ、及びHPLCのような従来の手段によって明らかにすることができる。nに関するADCの定量的な分布も決定することができる。場合によっては、逆相HPLC又は電気泳動のような手段によって、nが特定の数値である均質なADCを、他の薬物搭載量を有するADCから、分離する、精製する、及び特性評価することができる。
【０１７９】
いくつかの抗-CD137 ADCについて、nは、抗体上の結合部位の数によって制限されることがある。例えば、結合がシステインのチオールである場合、抗体は1個又は数個のシステインのチオール基しかもたない、又はリンカーが結合するのに十分な反応性をもつチオール基を1個又は数個しかもたない。一般に、抗体は、薬物部分に結合することができる遊離及び反応性システイン基を多くは含まない；主に、抗体中のシステインのチオール残基は、ジスルフィド架橋として存在する。ある特定の実施形態では、抗体を、ジチオトレイトール(DTT)又はトリカルボニルエチルホスフィン(TCEP)などの還元剤で還元して、部分的又は全還元条件下で、反応性システインのチオール基を生成させることができる。ある特定の実施形態では、より高く薬物を搭載させると(例えば、n>5)、ある特定の抗体-薬物コンジュゲートでは凝集性、不溶性、毒性が引き起こされる、又は細胞透過性が失われることが引き起されることがある。
【０１８０】
ある特定の実施形態では、コンジュゲーション反応の間に、理論上の最大数よりも少ない薬物部分が、抗体にコンジュゲートする。抗体は、例えば、以下に論じるように、薬物-リンカー中間体又はリンカー試薬と反応しないリジン残基を含むことがある。最も反応性の高いリジン基のみがアミン反応性リンカー試薬と反応することができる。ある特定の実施形態では、抗体を、変性条件下に供し、リジン又はシステインのような反応性求核基を表に出す。
【０１８１】
ADCの搭載(薬物／抗体比)を、種々の方法で（例えば、(i)抗体に対する、薬物-リンカー中間体又はリンカー試薬のモル過剰を制限すること、(ii)コンジュゲーション反応の時間又は温度を制限すること、(iii)システインのチオール修飾のために、部分的又は制限的な還元条件下にすること、(iv)リンカー-薬物結合の数及び／又は位置をコントロールするために、システイン残基の数及び位置を改変するように、抗体のアミノ酸配列を組換え技術によって操作すること）、コントロールすることがある。
【０１８２】
本明細書に記載の組成物及び方法と共に使用するのに適した細胞毒素としては、当該技術分野において公知の、とりわけ、DNA-インターカレーティング剤(例えば、アントラサイクリン)、紡錘体装置を破壊することができる薬剤(例えば、ビンカ・アルカロイド、メイタンシン、メイタンシノイド、及びその誘導体)、RNAポリメラーゼ阻害剤(例えば、α-アマニチン等のアマトキシン、及びその誘導体)、並びにタンパク質生合成を破壊することができる薬剤(例えば、サポリン及びリシンA鎖等のrRNA N-グリコシダーゼ活性を示す薬剤)が挙げられる。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、前記細胞毒素は、微小管結合剤(例えば、メイタンシン又はメイタンシノイド)、アマトキシン、シュードモナス外毒素A、deブーガニン、ジフテリア毒素、サポリン、アウリスタチン、アントラサイクリン、カリケアマイシン、イリノテカン、SN-38、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、ピロロベンゾジアゼピン二量体、インドリノベンゾジアゼピン、インドリノベンゾジアゼピン二量体、又はそのバリアント、又は本明細書に記載する若しくは当該技術分野で公知の他の細胞毒性化合物である。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、前記抗体-薬物コンジュゲートの細胞毒素は、RNAポリメラーゼ阻害剤である。いくつかの実施形態では、前記RNAポリメラーゼ阻害剤は、アマトキシン又はその誘導体である。いくつかの実施形態では、本明細書中で開示する抗体-薬物コンジュゲートの細胞毒素は、アマトキシン又はその誘導体（例えば、α-アマニチン、β-アマニチン、γ-アマニチン、ε-アマニチン、アマニン、アマニンアミド、アマヌリン、アマヌリン酸、プロアマヌリン又はその誘導体など）である。
【０１８５】
本発明の方法において有用な抗-CD137 ADCにおいて使用することがある細胞毒素に関する更なる詳細を、以下に記載する。
【０１８６】
アマトキシン
いくつかの実施形態では、前記RNAポリメラーゼ阻害剤は、アマトキシン又はその誘導体である。いくつかの実施形態では、本明細書中で開示する抗体-薬物コンジュゲートの細胞毒素は、アマトキシン又はその誘導体（例えば、α-アマニチン、β-アマニチン、γ-アマニチン、ε-アマニチン、アマニン、アマニンアミド、アマヌリン、アマヌリン酸、プロアマヌリン又はその誘導体など）である。種々の天然に存在するアマトキシンの構造は、式II及び一緒に提示する表１によって表される、及び、例えば、Zanotti et al., Int. J. Peptide Protein Res. 30, 1987, 450-459に開示される。
【化１４】
2021530546.tif 000077
【０１８７】
【表１】
2021530546.tif 000078
【０１８８】
ある実施形態では、前記細胞毒素はアマニチン又はその誘導体である。ある実施形態では、前記細胞毒素はα-アマニチン又はその誘導体である。
【０１８９】
アマトキシン又はその誘導体上の多くの位置は、連結部分Lと共有結合する位置としての役割を果たすことができる、及びそれ故に、前記抗体、又はその抗原結合フラグメントと共有結合する位置としての役割を果たすことができる。いくつかの実施形態では、式IのADC中の細胞毒素は、式(II)で表されるアマトキシン又はその誘導体である。ある実施形態では、前記ADCは式Ab-Z-L-Amで表される、ここで、AbはCD137に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントである、Lはリンカーである、Zは化学的な部分構造である、Amはアマトキシンである。ある特定の実施形態では、前記リンカー-アマトキシン・コンジュゲートAm-L-Zは、式(III)で表される
【化１５】
2021530546.tif 000079
ここで：
R1は、H、OH、ORA、又はORCである；
R2は、H、OH、ORB、又はORCである；
RA 及びRBは、存在する場合、それらが結合している酸素原子と一緒になって、5員ヘテロシクロアルキル基を形成する；
R3は、H、RC、又はRDである；
R4、R5,  R6、及びR7は、それぞれ独立してH、OH、ORC、ORD、RC、又はRDである；
R8は、OH、NH2、ORC、ORD、NHRC、又はNRCRDである；
R9は、H、OH、ORC、又はORDである；
Qは、-S-、-S(O)-、又は-SO2-である；
RCは、-L-Z'又は-L-Z-Abである、ここで、Lは任意選択的に置換されたC1-C6アルキル、任意選択的に置換されたC1-C6ヘテロアルキル、任意選択的に置換されたC2-C6アルケニル、任意選択的に置換されたC2-C6ヘテロアルケニル、任意選択的に置換されたC2-C6アルキニル、任意選択的に置換されたC2-C6ヘテロアルキニル、任意選択的に置換されたシクロアルキル、任意選択的に置換されたヘテロシクロアルキル、任意選択的に置換されたアリール、である；若しくはジペプチドを含む；若しくは-((CH2)mO)n(CH2)m-を含む（ここで、m及びnは、それぞれ独立して、1、2、3、4、5、6、7、8、9及び10から選択される）；又はそれらの組み合わせである；Z'は反応性部分である、及びZはZ'とAb上の官能基とのカップリング反応から生じる化学的な部分構造である；並びに、
RDは、C1-C6アルキル、C1-C6ヘテロアルキル、C2-C6アルケニル、C2-C6ヘテロアルケニル、C2-C6アルキニル、C2-C6ヘテロアルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、又はそれらの組み合わせである、ここで、各C1-C6アルキル、C1-C6ヘテロアルキル、C2-C6アルケニル、C2-C6ヘテロアルケニル、C2-C6アルキニル、C2-C6ヘテロアルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールは、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルカリル、アルキル・ヘテロアリール、アミノ、アンモニウム、アシル、アシルオキシ、アシルアミノ、アミノカルボニル、アルコキシカルボニル、ウレイド、カルバメート、アリール、ヘテロアリール、スルフィニル、スルホニル、ヒドロキシル、アルコキシ、スルファニル、ハロゲン、カルボキシ、トリハロメチル、シアノ、ヒドロキシ、メルカプト、及びニトロからなる群よりそれぞれ独立して選択される1〜5個の置換基で、任意選択的に置換されている。
【０１９０】
式(III)は、アマトキシン及びリンカーを含む、並びに、いくつかの実施形態では、リンカー、化学的な部分構造、及び抗体を含む。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、前記細胞毒素はアマトキシンである、及びリンカー-アマトキシン・コンジュゲート又は抗体-リンカー-アマトキシン・コンジュゲートは式(IIIA)で表される：
【化１６】
2021530546.tif 000080
ここで：
R1は、H、OH、ORA、又はORCである；
R2は、H、OH、ORB、又はORCである；
RA 及びRBは、存在する場合、それらが結合している酸素原子と一緒になって、5員ヘテロシクロアルキル基を形成する；
R3は、H、RC、又はRDである；
R4、R5,  R6、及びR7は、それぞれ独立してH、OH、ORC、ORD、RC、又はRDである；
R8は、OH、NH2、ORC、ORD、NHRC、又はNRCRDである；
R9は、H、OH、ORC、又はORDである；
Qは、-S-、-S(O)-、又は-SO2-である；
RCは、-L-Z'又は-L-Z-Abである、ここで、Lはリンカーであり、任意選択的に置換されたC1-C6アルキル、任意選択的に置換されたC1-C6ヘテロアルキル、任意選択的に置換されたC2-C6アルケニル、任意選択的に置換されたC2-C6ヘテロアルケニル、任意選択的に置換されたC2-C6アルキニル、任意選択的に置換されたC2-C6ヘテロアルキニル、任意選択的に置換されたシクロアルキル、任意選択的に置換されたヘテロシクロアルキル、任意選択的に置換されたアリール、である；若しくはジペプチドを含む；若しくは-(C=O)-、-((CH2)mO)n(CH2)m-を含む（ここで、m及びnは、それぞれ独立して、1、2、3、4、5、6、7、8、9及び10から選択される）；又はそれらの組み合わせである；Z'は反応性部分である、及びZはZ'とAb上の官能基とのカップリング反応から生じる化学的な部分構造である；並びに、
RDは、C1-C6アルキル、C1-C6ヘテロアルキル、C2-C6アルケニル、C2-C6ヘテロアルケニル、C2-C6アルキニル、C2-C6ヘテロアルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、又はそれらの組み合わせである、ここで、各C1-C6アルキル、C1-C6ヘテロアルキル、C2-C6アルケニル、C2-C6ヘテロアルケニル、C2-C6アルキニル、C2-C6ヘテロアルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールは、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルカリル、アルキル・ヘテロアリール、アミノ、アンモニウム、アシル、アシルオキシ、アシルアミノ、アミノカルボニル、アルコキシカルボニル、ウレイド、カルバメート、アリール、ヘテロアリール、スルフィニル、スルホニル、ヒドロキシル、アルコキシ、スルファニル、ハロゲン、カルボキシ、トリハロメチル、シアノ、ヒドロキシ、メルカプト、及びニトロからなる群よりそれぞれ独立して選択される1〜5個の置換基で、任意選択的に置換されている。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、前記コンジュゲートは、1個のRC置換基を含む。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、RA 及びRBは、それらが結合している酸素原子と一緒になって、次式の5員ヘテロシクロアルキル基を形成する：
【化１７】
2021530546.tif 000081
ここで、Yは、-(C=O)-、-(C=S)-、-(C=NRE)-, 又は-(CRERE’)-である；並びに
ここで、RE及びRE’は、それぞれ独立して、H、C1-C6アルキレン-RC、C1-C6ヘテロアルキレン-RC、C2-C6アルケニレン-RC、C2-C6ヘテロアルケニレン-RC、C2-C6アルキニレン-RC、C2-C6ヘテロアルキニレン-RC、シクロアルキレン-RC、ヘテロシクロアルキレン-RC、アリーレン-RC、若しくはヘテロアリーレン-RC、又はそれらの組み合わせである；ここで、各C1-C6アルキレン-RC、C1-C6ヘテロアルキレン-RC、C2-C6アルケニレン-RC、C2-C6ヘテロアルケニレン-RC、C2-C6アルキニレン-RC、C2-C6ヘテロアルキニレン-RC、シクロアルキレン-RC、ヘテロシクロアルキレン-RC、アリーレン-RC、又はヘテロアリーレン-RCは、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルカリル、アルキル・ヘテロアリール、アミノ、アンモニウム、アシル、アシルオキシ、アシルアミノ、アミノカルボニル、アルコキシカルボニル、ウレイド、カルバメート、アリール、ヘテロアリール、スルフィニル、スルホニル、ヒドロキシル、アルコキシ、スルファニル、ハロゲン、カルボキシ、トリハロメチル、シアノ、ヒドロキシ、メルカプト、及びニトロからなる群よりそれぞれ独立して選択される1〜5個の置換基で、任意選択的に置換されている。
【０１９４】
式(IIIA)は、アマトキシン及びリンカーを含む、並びに、いくつかの実施形態では、リンカー、化学的な部分構造、及び抗体を含む。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、前記細胞毒素はアマトキシン又はその誘導体である、及び前記アマトキシン-リンカー・コンジュゲートは式IIIAで表される、ここで、
R1は、H、OH、ORA、又はORCである；
R2は、H、OH、ORB、又はORCである；
RA 及びRBは、存在する場合、それらが結合している酸素原子と一緒になって、以下を形成する：
【化１８】
2021530546.tif 000082
ここで、R3は、H又はRCである。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、前記細胞毒素はアマトキシン又はその誘導体である、及び前記コンジュゲートは式IIIAで表される、ここで、
R1は、H、OH、ORA、又はORCである；
R2は、H、OH、ORB、又はORCである；
RA 及びRBは、存在する場合、それらが結合している酸素原子と一緒になって、以下を形成する：
【化１９】
2021530546.tif 000083
ここで、
R3は、H又はRCである；
R4及びR5は、それぞれ独立してH、OH、ORC、RC、又はORDである；
R6及びR7は、それぞれHである；
R8は、OH、NH2、ORC、又はNHRCである；
R9は、H又はOHである；並びに、
ここで、RC及びRDは、上記で定義した通りである。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、前記細胞毒素はアマトキシン又はその誘導体である、及び前記アマトキシン-リンカー・コンジュゲートは式IIIAで表される、ここで、
R1は、H、OH、又はORAである；
R2は、H、OH、又はORBである；
RA 及びRBは、存在する場合、それらが結合している酸素原子と一緒になって、以下を形成する：
【化２０】
2021530546.tif 000084
ここで、
R3、R4、R6、及びR7は、それぞれHである；
R5は、ORCである；
R8は、OH又はNH2である；
R9は、H又はOHである；
Qは、-S-、-S(O)-、又は-SO2-である；並びに、
ここで、RC 及びRDは、上記で定義した通りである。このようなアマトキシン・コンジュゲートは、例えば、米国特許出願公開第2016/0002298号に記載されており、この開示は、その全体が本明細書に参照により取り込まれる。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、前記細胞毒素はアマトキシン又はその誘導体である、及び前記アマトキシン-リンカー・コンジュゲートは式IIIAで表される、ここで、
R1及びR2は、それぞれ独立してH又はOHである；
R3は、RCである；
R4、R6、及びR7は、それぞれHである；
R5は、H、OH、又はOC1-C6アルキルである；
R8は、OH又はNH2である；
R9は、H又はOHである；
Qは、-S-、-S(O)-、又は-SO2-である；並びに、
ここで、RC 及びRDは、上記で定義した通りである。このようなアマトキシン-リンカー・コンジュゲートは、例えば、米国特許出願公開第2014/0294865号に記載されており、この開示は、その全体が本明細書に参照により取り込まれる。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、前記細胞毒素はアマトキシン又はその誘導体である、及び前記アマトキシン-リンカー・コンジュゲートは式IIIAで表される、ここで、
R1及びR2は、それぞれ独立してH又はOHである；
R3、R6、及びR7は、それぞれHである；
R4及びR5は、それぞれ独立してH、OH、ORC、又はRCである；
R8は、OH又はNH2である；
R9は、H又はOHである；
Qは、-S-、-S(O)-、又は-SO2-である；並びに、
ここで、RC 及びRDは、上記で定義した通りである。このようなアマトキシン-リンカー・コンジュゲートは、例えば、米国特許出願公開第2015/0218220号に記載されており、この開示は、その全体が本明細書に参照により取り込まれる。
【０２００】
いくつかの実施形態では、前記細胞毒素はアマトキシン又はその誘導体である、及び前記アマトキシン-リンカー・コンジュゲートは式IIIAで表される、ここで、
R1及びR2は、それぞれ独立してH又はOHである；
R3、R6、及びR7は、それぞれHである；
R4及びR5は、それぞれ独立してH又はOHである；
R8は、OH、NH2、ORC、又はNHRCである；
R9は、H又はOHである；
Qは、-S-、-S(O)-、又は-SO2-である；並びに、
ここで、RC 及びRDは、上記で定義した通りである。このようなアマトキシン・コンジュゲートは、例えば、米国特許第9,233,173 及び9,399,681号に記載されており、この開示は、その全体が本明細書に参照により取り込まれる。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、前記細胞毒素はアマトキシン又はその誘導体である、及び前記アマトキシン-リンカー・コンジュゲートは、式IIIBによって表される:
【化２１】
2021530546.tif 000085
ここで：
R1は、H、OH、ORA、又はORCである；
R2は、H、OH、ORB、又はORCである；
RA 及びRBは、存在する場合、それらが結合している酸素原子と一緒になって、5員ヘテロシクロアルキル基を形成する；
R3は、H、RC、又はRDである；
R4、R5,  R6、及びR7は、それぞれ独立してH、OH、ORC、ORD、RC、又はRDである；
R8は、OH、NH2、ORC、ORD、NHRC、又はNRCRDである；
R9は、H、OH、ORC、又はORDである；
Qは、-S-、-S(O)-、又は-SO2-である；
RCは、-L-Z'又は-L-Z-Abである、ここで、Lはリンカーであり、任意選択的に置換されたC1-C6アルキル、任意選択的に置換されたC1-C6ヘテロアルキル、任意選択的に置換されたC2-C6アルケニル、任意選択的に置換されたC2-C6ヘテロアルケニル、任意選択的に置換されたC2-C6アルキニル、任意選択的に置換されたC2-C6ヘテロアルキニル、任意選択的に置換されたシクロアルキル、任意選択的に置換されたヘテロシクロアルキル、任意選択的に置換されたアリール、ぺプチド、ジペプチド、-(C=O)-、-((CH2)mO)n(CH2)m-（ここで、m及びnは、それぞれ独立して、1、2、3、4、5、6、7、8、9及び10から選択される）；又は、これらの組み合わせ、である；Z'は反応性部分である、及びZはZ'とAb上の官能基とのカップリング反応から生じる化学的な部分構造である；並びに、
RDは、C1-C6アルキル、C1-C6ヘテロアルキル、C2-C6アルケニル、C2-C6ヘテロアルケニル、C2-C6アルキニル、C2-C6ヘテロアルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、又はそれらの組み合わせである、ここで、各C1-C6アルキル、C1-C6ヘテロアルキル、C2-C6アルケニル、C2-C6ヘテロアルケニル、C2-C6アルキニル、C2-C6ヘテロアルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールは、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルカリル、アルキル・ヘテロアリール、アミノ、アンモニウム、アシル、アシルオキシ、アシルアミノ、アミノカルボニル、アルコキシカルボニル、ウレイド、カルバメート、アリール、ヘテロアリール、スルフィニル、スルホニル、ヒドロキシル、アルコキシ、スルファニル、ハロゲン、カルボキシ、トリハロメチル、シアノ、ヒドロキシ、メルカプト、及びニトロからなる群よりそれぞれ独立して選択される1〜5個の置換基で、任意選択的に置換されている。
【０２０２】
式(IIIB)は、アマトキシン及びリンカーを含む、並びに、いくつかの実施形態では、リンカー、化学的な部分構造、及び抗体を含む。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、RA 及びRBは、それらが結合している酸素原子と一緒になって、次式の5員ヘテロシクロアルキルを形成する：
【化２２】
2021530546.tif 000086
ここで、Yは、-(C=O)-、-(C=S)-、-(C=NRE)-, 又は-(CRERE’)-である；並びに
ここで、RE及びRE’は、それぞれ独立して、H、C1-C6アルキレン-RC、C1-C6ヘテロアルキレン-RC、C2-C6アルケニレン-RC、C2-C6ヘテロアルケニレン-RC、C2-C6アルキニレン-RC、C2-C6ヘテロアルキニレン-RC、シクロアルキレン-RC、ヘテロシクロアルキレン-RC、アリーレン-RC、若しくはヘテロアリーレン-RC、又はそれらの組み合わせである；ここで、各C1-C6アルキレン-RC、C1-C6ヘテロアルキレン-RC、C2-C6アルケニレン-RC、C2-C6ヘテロアルケニレン-RC、C2-C6アルキニレン-RC、C2-C6ヘテロアルキニレン-RC、シクロアルキレン-RC、ヘテロシクロアルキレン-RC、アリーレン-RC、若しくはヘテロアリーレン-RCは、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルカリル、アルキル・ヘテロアリール、アミノ、アンモニウム、アシル、アシルオキシ、アシルアミノ、アミノカルボニル、アルコキシカルボニル、ウレイド、カルバメート、アリール、ヘテロアリール、スルフィニル、スルホニル、ヒドロキシル、アルコキシ、スルファニル、ハロゲン、カルボキシ、トリハロメチル、シアノ、ヒドロキシ、メルカプト、及びニトロからなる群よりそれぞれ独立して選択される1〜5個の置換基で、任意選択的に置換されている。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントは、アマトキシン-リンカー・コンジュゲート又はその誘導体にコンジュゲートし、式IIIBで表される、ここで、
R1は、H、OH、ORA、又はORCである；
R2は、H、OH、ORB、又はORCである；
RA 及びRBは、存在する場合、それらが結合している酸素原子と一緒になって、次式の5員ヘテロシクロアルキルを形成する：
【化２３】
2021530546.tif 000087
ここで、R3は、H又はRCである。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、前記細胞毒素はアマトキシン又はその誘導体である、及び前記アマトキシン-リンカー・コンジュゲートは式IIIBで表される、ここで、
R1は、H、OH、ORA、又はORCである；
R2は、H、OH、ORB、又はORCである；
RA 及びRBは、存在する場合、それらが結合している酸素原子と一緒になって、次式の5員ヘテロシクロアルキル基を形成する：
【化２４】
2021530546.tif 000088
ここで、
R3は、H又はRCである；
R4及びR5は、それぞれ独立してH、OH、ORC、RC、又はORDである；
R6及びR7は、それぞれHである；
R8は、OH、NH2、ORC、又はNHRCである；
R9は、H又はOHである；並びに、
ここで、RC及びRDは、上記で定義した通りである。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、前記細胞毒素はアマトキシン又はその誘導体である、及び前記アマトキシン-リンカー・コンジュゲートは式IIIBで表される、ここで、
R1は、H、OH、又はORAである；
R2は、H、OH、又はORBである；
RA 及びRBは、存在する場合、それらが結合している酸素原子と一緒になって、次式の5員ヘテロシクロアルキル基を形成する：
【化２５】
2021530546.tif 000089
ここで、
R3、R4、R6、及びR7は、それぞれHである；
R5は、ORCである；
R8は、OH又はNH2である；
R9は、H又はOHである；
Qは、-S-、-S(O)-、又は-SO2-である；並びに、
ここで、RC 及びRDは、上記で定義した通りである。このようなアマトキシン-リンカー・コンジュゲートは、例えば、米国特許出願公開第2016/0002298号に記載されており、この開示は、その全体が本明細書に参照により取り込まれる。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、前記細胞毒素はアマトキシン又はその誘導体である、及び前記アマトキシン-リンカー・コンジュゲートは式IIIBで表される、ここで、
R1及びR2は、それぞれ独立してH又はOHである；
R3は、RCである；
R4、R6、及びR7は、それぞれHである；
R5は、H、OH、又はOC1-C6アルキルである；
R8は、OH又はNH2である；
R9は、H又はOHである；
Qは、-S-、-S(O)-、又は-SO2-である；並びに、
ここで、RC 及びRDは、上記で定義した通りである。このようなアマトキシン・コンジュゲートは、例えば、米国特許出願公開第2014/0294865号に記載されており、この開示は、その全体が本明細書に参照により取り込まれる。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、前記細胞毒素はアマトキシン又はその誘導体である、及び前記アマトキシン-リンカー・コンジュゲートは式IIIBで表される、ここで、
R1及びR2は、それぞれ独立してH又はOHである；
R3、R6、及びR7は、それぞれHである；
R4及びR5は、それぞれ独立してH、OH、ORC、又はRCである；
R8は、OH又はNH2である；
R9は、H又はOHである；
Qは、-S-、-S(O)-、又は-SO2-である；並びに、
ここで、RC 及びRDは、上記で定義した通りである。このようなアマトキシン-リンカー・コンジュゲートは、例えば、米国特許出願公開第2015/0218220号に記載されており、この開示は、その全体が本明細書に参照により取り込まれる。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、前記細胞毒素はアマトキシン又はその誘導体である、及び前記アマトキシン-リンカー・コンジュゲートは式IIIBで表される、ここで、
R1及びR2は、それぞれ独立してH又はOHである；
R3、R6、及びR7は、それぞれHである；
R4及びR5は、それぞれ独立してH又はOHである；
R8は、OH、NH2、ORC、又はNHRCである；
R9は、H又はOHである；
Qは、-S-、-S(O)-、又は-SO2-である；並びに、
ここで、RC 及びRDは、上記で定義した通りである。このようなアマトキシン-リンカー・コンジュゲートは、例えば、米国特許第9,233,173 及び9,399,681号に記載されており、この開示は、その全体が本明細書に参照により取り込まれる。
【０２１０】
アウリスタチン
本明細書に記載する抗-CD137抗体及びその抗原結合フラグメントは、アウリスタチンである細胞毒素にコンジュゲートしていることがある(米国特許第5,635,483号;第5,780,588号)。アウリスタチンは、微小管動態、GTP加水分解、核分裂及び細胞分裂を妨げる抗有糸分裂剤であり(Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584)、並びに抗がん活性(米国特許第5,663,149号)及び抗真菌活性(Pettit et al (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). (米国特許第5,635,483; 5,780,588号)を有する。アウリスタチン薬物部分は、ペプチド薬物部分のN(アミノ)末端又はC(カルボキシル)末端を介して、抗体に結合することがある(WO 02/088172)。
【０２１１】
例示的なアウリスタチンの実施形態は、N-末端結合モノメチル・アウリスタチン薬物部分DE及びDFを含み(それぞれ、MMAE及びMMAF)、これらは、Senter et al, Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 623, 2004年3月28日に開示されている（この開示は、その全体が本明細書に参照により取り込まれる）。
【０２１２】
例示的なアウリスタチンの実施形態はMMAEである：
【化２６】
2021530546.tif 000090
ここで、その波線は、抗体-薬物又は薬物-リンカー・コンジュゲート(本明細書で記載するように、-L-Z-Ab又は-L-Z')のリンカーへの共有結合の位置を示す。
【０２１３】
別の例示的なアウリスタチンの実施形態はMMAFである：
【化２７】
2021530546.tif 000091
ここで、その波線は、US 2005/0238649で開示されているように、抗体-リンカー・コンジュゲート(本明細書で記載するように、-L-Z-Ab又は-L-Z')のリンカーへの共有結合の位置を示す：
【０２１４】
アウリスタチンは以下の方法に従って調製することができる：米国特許第5,635,483号；米国特許第5,780,588；Pettit et al (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465; Pettit et al (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G. R., et al. Synthesis, 1996, 719-725; Pettit et al (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 15:859-863; 及び Doronina (2003) Nat. Biotechnol. 21(7):778-784。
【０２１５】
メイタンシノイド
本明細書に記載する抗体及びその抗原結合フラグメントは、微小管結合剤である細胞毒素にコンジュゲートしていることがある。いくつかの実施形態では、前記微小管結合剤は、メイタンシン、メイタンシノイド又はメイタンシノイド類似体である。メイタンシノイドは微小管と結合し、チューブリン重合を阻害することによって作用する有糸分裂阻害剤である。メイタンシンは最初に、東アフリカ低木Maytenus serrataから単離された(米国特許第3,896,111号)。続いて、特定の微生物もまた、メイタンシノイド(例えば、メイタンシノール及びC-3メイタンシノール・エステル)を産生することが発見された(米国特許第4,151,042号)。合成メイタンシノール、並びにその誘導体及びその類似体は例えば、米国特許4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; 及び 4,371,533 号において開示されている。メイタンシノイドの薬物部分は、抗体薬物コンジュゲートにおいて魅力的な薬物部分である。なぜならば、メイタンシノイドの薬物部分は：(i)発酵又は、発酵産物の化学修飾、誘導体化によって調製することに、比較的アクセス可能である、(ii)非-ジスルフィド・リンカーを介した抗体へのコンジュゲートに適した官能基による誘導体化がやり易い、(iii)血漿中で安定である、及び(iv)種々の腫瘍細胞株に対して効果的である、からである。
【０２１６】
好適なメイタンシノイドの例としては、メイタンシノール、合成メイタンシノール、並びにメイタンシノール類似体及び誘導体、のエステルが挙げられる。メイタンシノイド、メイタンシノール、並びにメイタンシノール類似体、及び誘導体のように、微小管形成を阻害し、哺乳動物細胞に対して非常に毒性である、任意の細胞毒素が本明細書に含まれる。
【０２１７】
好適なメイタンシノール・エステルの例としては、修飾された芳香環を有するもの、及び他の位置に修飾を有するものが含まれる。そのような好適なメイタンシノイドは、米国特許第4,137,230; 4,151,042; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814;  4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,362,663; 4,364,866; 4,424,219 ;4,450,254; 4,322,348; 4,362,663; 4,371,533; 5,208,020; 5,416,064; 5,475,092; 5,585,499; 5,846,545; 6,333,410; 7,276,497; 及び7,473,796号に開示されており、これらの各々は、メイタンシノイド及びその誘導体に関連するものとして、本明細書に参照により取り込まれる。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体-薬物コンジュゲート(ADC)は、細胞毒性薬物として、チオール含有メイタンシノイド(DM1)（正式にはN2'-デアセチル-N2'-(3-メルカプト-1-オキソプロピル)-メイタンシンと呼ばれる）を利用する。DM1は、以下の構造式IVで表される：
【化２８】
2021530546.tif 000092
【０２１９】
別の実施形態において、本発明のコンジュゲートは、チオール含有メイタンシノイドN2'-デアセチル-N2'(4-メチル-4-メルカプト-1-オキソペンチル)-メイタンシン(例えば、DM4)を細胞毒性薬物として利用する。DM4は、以下の構造式Vで表される：
【化２９】
2021530546.tif 000093
【０２２０】
立体障害チオール結合を含む側鎖を含む別のメイタンシノイドは、N2'-デアセチル-N-2'(4-メルカプト-1-オキソペンチル)-メイタンシン(DM3と呼ばれる)であり、以下の構造式VIで表される：
【化３０】
2021530546.tif 000094
【０２２１】
米国特許第5,208,020 及び 7,276,497が教示する各メイタンシノイドを、本発明のコンジュゲートにおいて使用することもある。この点に関して、5,208,020及び7,276,697の開示全体は、本明細書に参照により取り込まれる。
【０２２２】
メイタンシノイド上の多くの位置は、連結部分と共有結合する位置としての役割を果たすことができる、及び、それ故に前記抗体又はその抗原結合フラグメントと共有結合する位置としての役割を果たすことができる（本明細書に記載するように、-L-Z-Ab又は-L-Z'）。例えば、ヒドロキシル基を有するC-3位、ヒドロキシメチルで修飾されたC-14位、ヒドロキシで修飾されたC-15位、及びヒドロキシ基を有するC-20位は、全て有用であると予想される。いくつかの実施形態では、前記C-3位は、リンカー部分と共有結合する位置としての役割を果たし、いくつかの特定の実施形態では、メイタンシノールのC-3位が、連結部分と共有結合する位置としての役割を果たす。抗体-メイタンシノイド・コンジュゲートを作製するために、当該技術分野で知られている多くの連結基が存在し、例えば、それらは、米国特許第5,208,020、6,441,163、及び欧州特許第0425235 B1; Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992); 並びに U.S. 2005/0169933 A1に開示されているもの等を含む（これらの開示は、本明細書に明確に参照により取り込まれる）。更なる結合基は、本明細書に記載され、例示される。
【０２２３】
本発明はまた、メイタンシノイド及びコンジュゲートの種々の異性体及び混合物を含む。本発明の特定の化合物及びコンジュゲートは、種々の立体異性体、鏡像異性体、及びジアステレオマーの形態で存在することがある。このような抗体-メイタンシノイド・コンジュゲートを生成することは、米国特許5,208,020、5,416,064、6,333,410、6,441,163、6,716,821、及び7,368,565に記載されている(これらの各々は、その全体が本明細書に取り込まれる)。
【０２２４】
アントラサイクリン
他の実施形態において、本明細書に記載する抗体及びその抗原結合フラグメントは、アントラサイクリン分子である細胞毒素にコンジュゲートしていることがある。アントラサイクリンは、細胞傷害活性を示す抗生物質化合物である。研究によれば、アントラサイクリンは、以下を含む多数の異なるメカニズムによって、細胞を死滅させることがあることが示されてきている： 1)前記薬物分子が細胞のDNAにインターカレーションすることによって、DNA依存性の核酸合成を阻害すること；2) 薬物によるフリーラジカルの産生、フリーラジカルは、次いで細胞性高分子と反応して細胞に損傷を引き起こす、又は3)薬物分子と細胞膜との相互作用[例えば、C. Peterson et al.," Transport And Storage Of Anthracycline In Experimental Systems And Human Leukemia" in Anthracycline Antibiotics In Cancer Therapy; N.R. Bachur, "Free Radical Damage" id. at pp.97-102を参照のこと]。細胞毒性の可能性があるため、白血病、乳がん、肺がん、卵巣腺がん及び肉腫のような多数のがんの治療にアントラサイクリンが用いられている[例えば、P.H- Wiernik, in Anthracycline: Current Status And New Developments p 11を参照]。一般的に使用されるアントラサイクリンとしては、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン及びダウノマイシンが挙げられる。
【０２２５】
アントラサイクリンの代表的な例としては、限定されるものではないが、ダウノルビシン(Cerubidine; Bedford Laboratories)、ドキソルビシン(アドリアマイシン；Bedford Laboratories；塩酸ドキソルビシン、ヒドロキシ-ダウノルビシン、及びルベックス(Rubex)とも呼ばれる)、エピルビシン(エレンス(Ellence);ファイザー)、及びイダルビシン(イダマイシン;ファイザー社)が挙げられる。アントラサイクリン類似体であるドキソルビシン(ADRIAMYCINO)は、インターカレーションによってDNAと相互作用し、及び転写のためにDNAをほどく酵素トポイソメラーゼIIが進むことを阻害する、と考えられている。ドキソルビシンは、トポイソメラーゼII複合体を、複製のためにDNA鎖を切断した後に安定化させ、DNA二重らせんが再び閉じることを防ぎ、それによって複製のプロセスを止める。ドキソルビシン及びダウノルビシン(DAUNOMYCIN)は、プロトタイプの細胞毒性天然物アントラサイクリン化学療法剤である（Sessa et al., (2007) Cardiovasc. Toxicol. 7:75-79）。
【０２２６】
本明細書で使用するのに適したアントラサイクリンの非限定的な一例は、PNU-159682(「PNU」)である。PNUは、親であるネモルビシンに対して3000倍を超える細胞毒性を示す(Quintieri et al., Clinical Cancer Research 2005, 11, 1608-1617)。PNUは、以下の構造式によって表される：
【化３１】
2021530546.tif 000095
【０２２７】
PNUのようなアントラサイクリン上の多数の位置は、前記連結部分への共有結合する位置としての役割を果たす、そして、それ故に、本明細書中に記載するような抗-CD137抗体又はその抗原結合フラグメントと共有結合する位置としての役割を果たすことができる。例えば、リンカーを、ヒドロキシメチル・ケトン側鎖への改変を介して導入することがある。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、前記細胞毒素は、下記構造式で表されるPNU誘導体である：
【化３２】
2021530546.tif 000096
ここで、波線は、本明細書中に記載するようなADCのリンカーに共有結合をする位置を示す。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、前記細胞毒素は、下記構造式で表されるPNU誘導体である：
【化３３】
2021530546.tif 000097
ここで、波線は、本明細書中に記載するようなADCのリンカーに共有結合をする位置を示す。
【０２３０】
ピロロベンゾジアゼピン(PBDs)
他の実施形態では、本明細書に記載する抗-CD137抗体又はその抗原結合フラグメントは、ピロロベンゾジアゼピン(PBD)である細胞毒素、又はPBDを含む細胞毒素にコンジュゲートしていることがある。PBDはある特定の放線菌によって産生され、配列選択的なDNAアルキル化化合物であることが示されてきている。PBD細胞毒素としては、限定されるものではないが、アントラマイシン、二量体PBD、及び、例えば、Hartley, J.A. (2011). “The development of pyrrolobenzodiazepines as antitumour agents.”  Expert Opin. Inv. Drug, 20(6), 733-744; 及び Antonow, D.; Thurston, D.E. (2011) “Synthesis of DNA-interactive pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepines (PBDs).” Chem. Rev. 111: 2815-2864の中で開示されているものが挙げられる。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、前記細胞毒素は、以下の構造式で表されるピロロベンゾジアゼピン二量体であることがある：
【化３４】
2021530546.tif 000098
ここで、波線は、本明細書中に記載するようなADCのリンカーに共有結合をする位置を示す。このPBDに基づくADCは、例えば、Sutherland et al., Blood 2013 122:1455-1463（これは、その全体が本明細書に参照により取り込まれる）に開示されている。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、前記細胞毒素は、以下の構造式で表されるPBD二量体であることがある：
【化３５】
2021530546.tif 000099
ここで、nは3又は5である、ここで、波線は、本明細書中に記載するようなADCのリンカーに共有結合をする位置を示す。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、前記細胞毒素は、以下の構造式で表されるPBD二量体であることがある：
【化３６】
2021530546.tif 000100
ここで、波線は、本明細書中に記載するようなADCのリンカーに共有結合をする位置を示す。
【０２３４】
ある特定の実施形態では、前記細胞毒素はPBD二量体であることがある、これは、リンカー及び反応性部分構造Z'と一緒になった場合、それぞれ本明細書中に記載するように、以下の構造によって表されることがある：
【化３７】
2021530546.tif 000101
【０２３５】
この特定の細胞毒素-リンカー・コンジュゲートはテシリン(SG3249)として知られており、例えば、Howard et al., ACS Med. Chem. Lett. 2016, 7(11), 983-987、に記載されている、この開示は、その全体が本明細書に参照により取り込まれる。
【０２３６】
ある特定の実施形態では、前記細胞毒素はPBD二量体であることがある、これは、リンカー及び反応性部分構造Z'と一緒になった場合、それぞれ本明細書中に記載するように、以下の構造によって表されることがある：
【化３８】
2021530546.tif 000102
【０２３７】
この特定の細胞毒素-リンカー・コンジュゲートはタリリンとして知られており、例えば、Mantaj et al., Angewandte Chemie International Edition English 2017,56, 462-488、に記載されている、この開示は、その全体が本明細書に参照により取り込まれる。
【０２３８】
カリケアマイシン
他の実施形態において、本明細書に記載する抗体及びその抗原結合フラグメントは、エネジイン抗腫瘍抗生物質(例えば、カリケアマイシン、オゾガマイシン)である細胞毒素にコンジュゲートしていることがある。カリケアマイシン・ファミリーの抗生物質は、ピコモル未満の濃度で、二本鎖DNAを切断することができる。本発明における使用に適したカリケアマイシンの例としては、例えば、米国特許第4,671,958号。米国特許第4,970,198号。米国特許第5,053,394号、米国特許第5,037,651号；及び米国特許第5,079,233号、に開示されている、これらは、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０２３９】
例示的なカリケアマイシンは、γ1と命名されている、これらを、本明細書では単にガンマとして呼び、以下の構造式を有する：
【化３９】
2021530546.tif 000103
【０２４０】
いくつかの実施形態では、前記カリケアマイシンは、ガンマ-カリケアマイシン誘導体又はN-アセチル・ガンマ-カリケアマイシン誘導体である。使用することがあるカリケアマイシンの構造類似体としては、限定されるものではないが、例えば、Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998)、及び上記の米国特許に開示されるものが挙げられる。カリケアマイシンは、適当なチオールと反応してジスルフィドを形成することができるメチルトリスルフィド部分を含み、メチルトリスルフィド部分は、同時に、カリケアマイシン誘導体を本明細書に記載の抗-CD137抗体又はその抗原結合フラグメントに、リンカーを介して結合させるのに有用な官能基を導入する。カリケアマイシン・ファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第5,712,374; 5,714,586; 5,739,116; 5,767,285; 5,770,701; 5,770,710; 5,773,001; 及び 5,877,296号を参照のこと（全てAmerican Cyanamid Companyに関する）。使用され得るカリケアマイシンの構造類似体としては、限定されるものではないが、例えば、Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998), 及びAmerican Cyanamidに関する上記の米国特許、に開示されているものが挙げられる。
【０２４１】
ある実施形態では、本明細書中に開示するADCの細胞毒素は、以下の式で表されるカリケアマイシン・ジスルフィド誘導体である：
【化４０】
2021530546.tif 000104
ここで、波線は、前記リンカーの結合の位置を示す。
【０２４２】
追加の細胞毒素
他の実施形態では、本明細書に記載する抗体及びその抗原結合フラグメントを、本明細書において上記で開示される細胞毒素以外の、又はそれに加えた細胞毒素に、コンジュゲートすることがある。本明細書に記載する組成物及び方法と共に使用するのに適した追加の細胞毒素としては、限定されるものではないが、5-エチニルウラシル、アビラテロン(abiraterone)、アシルフルベン(acylfulvene)、アデシペノール(adecypenol)、アドゼレシン(adozelesin)、アルデスロイキン(aldesleukin)、アルトレタミン(altretamine)、アンバムスチン(ambamustine)、アミドックス(amidox)、アミフォスチン(amifostine)、アミノレブリン酸(aminolevulinic acid)、アムルビシン(amrubicin)、アムサクリン(amsacrine)、アナグレリド(anagrelide)、アナストロゾール(anastrozole)、アンドログラフォリド(andrographolide)、血管新生阻害剤、アンタレリクス(antarelix)、抗背側形成タンパク質-1（anti-dorsalizing  morphogenetic protein-1）、抗アンドロゲン、前立腺がん、抗エストロゲン、抗新生物薬(antineoplaston)、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、アフィジコリン・グリシネート(aphidicolin glycinate)、アポトーシス遺伝子モジュレーター、アポトーシス・レギュレーター、アプリン酸(apurinic acid)、アスラクリン(asulacrine)、アタメスタン(atamestane)、アトリムスチン(atrimustine)、アキシナスタチン1(axinastatin 1)、アキシナスタチン2、アキシナスタチン3、アザセトロン(azasetron)、アザトキシン(azatoxin)、アザチロシン(azatyrosine)、バッカチンＩＩＩ(baccatin III.)誘導体、バラノール(balanol)、バチマスタット(batimastat)、BCR/ABL拮抗薬、ベンゾクロリン、ベンゾイルスタウロスポリン(benzoylstaurosporine)、βラクタム誘導体、βアレチン(beta-alethine)、βクラマイシン(betaclamycin)B、ベツリン酸、bFGF阻害剤、ビカルタミド(bicalutamide)、ビサントレン(bisantrene)、ビスアジリジニルスペルミン(bisaziridinylspermine)、ビスナフィド(bisnafide)、ビストラテン(bistratene)A、ビゼレシン(bizelesin)、ブレフラート(breflate)、ブレオマイシンA2、ブレオマイシンB2、ブロピリミン(bropirimine)、ブドチタン(budotitane)、ブチオニン・スルホキシイミン(buthionine sulfoximine)、カルシポトリオール(calcipotriol)、カルホスチン(calphostin)C、カンプトテシン(camptothecin)誘導体（例えば、10-ヒドロキシ-カンプトテシン）、カペシタビン(capecitabine)、カルボキサミド-アミノ-トリアゾール、カルボキシアミドトリアゾール、カルゼレシン(carzelesin)、カゼイン・キナーゼ阻害剤、カスタノスペルミン(castanospermine)、セクロピン(cecropin)B、セトロレリクス(cetrorelix)、クロリン(chlorins)、クロロキノキサリン・スルホンアミド(chloroquinoxaline sulfonamide)、シカプロスト(cicaprost)、シス-ポルフィリン、クラドリビン(cladribine)、クロミフェン(clomifene)及びその類似体、クロトリマゾール(clotrimazole)、コリスマイシン(collismycin)A、コリスマイシンB、コンブレタスタチン(combretastatin)A4、コンブレタスタチン類似体、コナゲニン(conagenin)、クラムベシジン(crambescidin)816、クリスナトール(crisnatol)、クリプトフィシン(cryptophycin)8、クリプトフィシンA誘導体、キュラシン(curacin)A、シクロペンタアントラキノン(cyclopentanthraquinones)、シクロプラタム(cycloplatam)、シペマイシン(cypemycin)、シタラビン・オクホスファート(cytarabine ocfosfate)、細胞溶解因子、シトスタチン(cytostatin)、ダクリキシマブ(dacliximab)、デシタビン(decitabine)、デヒドロジデムニン(dehydrodidemnin)B、2'デオキシコホルマイシン(DCF)、デスロレリン(deslorelin)、デキシホスファミド(dexifosfamide)、デクスラゾキサン(dexrazoxane)、デクスベラパミル(dexverapamil)、ジアジクオン(diaziquone)、ジデムニン(didemnin)B、ジドクス(didox)、ジエチルノルスペルミン(diethylnorspermine)、ジヒドロ-5-アザシチジン、ジヒドロタキソール、ジオキサマイシン(dioxamycin)、ジフェニル・スピロムスチン(diphenyl spiromustine)、ディスコデルモライド(discodermolide)、ドコサノール(docosanol)、ドラセトロン(dolasetron)、ドキシフルリジン(doxifluridine)、ドロロキシフェン(droloxifene)、ドロナビノール(dronabinol)、デュオカルマイシン(duocarmycin)SA、エブセレン(ebselen)、エコムスチン(ecomustine)、エデルフォシン(edelfosine)、エドレコロマブ(edrecolomab)、エフロルニチン(eflornithine)、エレメン(elemene)、エミテフール(emitefur)、エポチロン（epothilones）、エピチロン（epithilones）、エプリステリド(epristeride)、エストラムスチン(estramustine)及びその類似体、エトポシド（etoposide）、エトポシド4’-リン酸（etoposide 4’-phosphate）（エトポフォスとも呼ばれる）、エキセメスタン(exemestane)、ファドロゾール(fadrozole)、ファザラビン(fazarabine)、フェンレチニド(fenretinide)、フィルグラスチム(filgrastim)、フィナステリド(finasteride)、フラボピリドール(flavopiridol)、フレゼラスチン(flezelastine)、フルアステロン(fluasterone)、フルダラビン(fludarabine)、塩酸フルロダウノルニシン(fluorodaunorunicin hydrochloride)、フォルフェニメクス(forfenimex)、フォルメスタン(formestane)、フォストリエシン(fostriecin)、フォテムスチン(fotemustine)、ガドリニウム・テキサフィリン(gadolinium texaphyrin)、硝酸ガリウム、ガロシタビン(galocitabine)、ガニレリクス(ganirelix)、ゲラチナーゼ阻害剤、ゲムシタビン(gemcitabine)、グルタチオン阻害剤、ヘプスルファム(hepsulfam)、ホモハリングトニン（homoharringtonine(HHT)）、ハイペリシン(hypericin)、イバンドロン酸（Ibandronic acid）、イドキシフェン(idoxifene)、イドラマントン(idramantone)、イルモフォシン(ilmofosine)、イロマスタット(ilomastat)、イミダゾアクリドン、イミキモド(imiquimod)、免疫刺激ペプチド、イオベングアン(iobenguane)、ヨードドキソルビシン(iododoxorubicin)、イポメアノール(ipomeanol)、イリノテカン、イロプラクト(iroplact)、イルソグラジン(irsogladine)、イソベンガゾール(isobengazole)、ジャスプラキノリド(jasplakinolide)、カハラリド(kahalalide)F、三酢酸ラメラリン-N(lamellarin-N triacetate)、ランレオチド(lanreotide)、レイナマイシン(leinamycin)、レノグラスチム(lenograstim)、硫酸レンチナン(lentinan sulfate)、レプトルスタチン(leptolstatin)、レトロゾール(letrozole)、親油性白金化合物、リソクリナミド(lissoclinamide)7、ロバプラチン(lobaplatin)、ロメトレキソール(lometrexol)、ロニダミン(lonidamine)、ロソキサントロン(losoxantrone)、ロキソリビン(loxoribine)、ルルトテカン(lurtotecan)、ルテチウム・テキサフィリン(lutetium texaphyrin)、リソフィリン(lysofylline)、マソプロコール(masoprocol)、マスピン(maspin)、マトリックス・メタロプロテイナーゼ阻害剤、メノガリル(menogaril)、メルバロン(merbarone)、メテレリン(meterelin)、メチオニナーゼ、メトクロプラミド(metoclopramide)、MIF阻害剤、ミフェプリストン(mifepristone)、ミルテホシン(miltefosine)、ミリモスチム(mirimostim)、ミトラシン(mithracin)、ミトグアゾン(mitoguazone)、ミトラクトール(mitolactol)、マイトマイシン及び��の類似体、ミトナフィド(mitonafide)、ミトキサントロン(mitoxantrone)、モファロテン(mofarotene)、モルグラモスチム(molgramostim)、マイカペルオキシドB、ミリアポロン(myriaporone)、N-アセチルジナリン(acetyldinaline)、N-置換ベンズアミド、ナファレリン(nafarelin)、ナグレスチップ(nagrestip)、ナパビン(napavin)、ナフテルピン(naphterpin)、ナルトグラスチム(nartograstim)、ネダプラチン(nedaplatin)、ネモルビシン(nemorubicin)、ネリドロン酸、ニルタミド(nilutamide)、ニサマイシン(nisamycin)、ニトルリン(nitrullyn)、オクトレオチド(octreotide)、オキセノン(okicenone)、オナプリストン(onapristone)、オンダンセトロン(ondansetron)、オラシン(oracin)、オルマプラチン(ormaplatin)、オキサリプラチン(oxaliplatin)、オキサウノマイシン(oxaunomycin)、パクリタキセル(paclitaxel)及びその類似体、パラウアミン(palauamine)、パルミトイルリゾキシン(palmitoylrhizoxin)、パミドロン酸、パナキシトリオール(panaxytriol)、パノミフェン(panomifene)、パラバクチン(parabactin)、パゼリプチン(pazelliptine)、ぺグアスパルガーゼ(pegaspargase)、ペルデシン(peldesine)、ポリ硫酸ペントサンナトリウム、ペントスタチン(pentostatin)、ペントロゾール(pentrozole)、パーフルブロン(perflubron)、パーホスファミド(perfosfamide)、フェナジノマイシン(phenazinomycin)、ピシバニル(picibanil)、ピラルビシン(pirarubicin)、ピリトレキシム(piritrexim)、ポドフィロトキシン（podophyllotoxin）、ポルフィロマイシン(porfiromycin)、プリン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼ阻害剤、ラルチトレキセド(raltitrexed)、リゾキシン(rhizoxin)、ログレチミド(rogletimide)、ロヒツキン(rohitukine)、ルビギノン(rubiginone)B1、ルボキシル(ruboxyl)、サフィンゴル(safingol)、サイントピン(saintopin)、サルコフィトール(sarcophytol)A、サルグラモスチム(sargramostim)、ソブゾキサン(sobuzoxane)、ソネルミン(sonermin)、スパルホジン酸(sparfosic acid)、スピカマイシン(spicamycin)D、スピロムスチン(spiromustine)、スチピアミド(stipiamide)、スルフィノシン(sulfinosine)、タリムスチン(tallimustine)、テガフール(tegafur)、テモゾロミド(temozolomide)、テニポシド(teniposide)、タリブラスチン(thaliblastine)、チオコラリン(thiocoraline)、チラパザミン(tirapazamine)、トポテカン、トプセンチン(topsentin)、トリシリビン(triciribine)、トリメトレキサート(trimetrexate)、ベラミン(veramine)、ビノレルビン(vinorelbine)、ビンキサルチン(vinxaltine)、ボロゾール(vorozole)、ゼニプラチン(zeniplatin)、並びにジラスコルブ(zilascorb)、が挙げられる。
【０２４３】
リンカー
本明細書で使用する用語「リンカー」は、抗-CD137抗体又はそのフラグメント(Ab)を薬物部分(D)に共有結合させて式Iの抗体-薬物コンジュゲート(ADC)を形成する、原子の共有結合又は鎖を含む、二価の化学的な部分構造を意味する。好適なリンカーは2つの反応性末端を有し、一方は抗体にコンジュゲートさせるためであり、他方は細胞毒素にコンジュゲートさせるためである。前記リンカーの抗体とコンジュゲートする反応性末端(反応性部分構造、Z')は、典型的には、前記抗体上のシステイン・チオール又はリジン・アミン基を介して、前記抗体にコンジュゲートさせることができる部位であり、従って、典型的には二重結合のようなチオールとの反応性がある基(例えば、マレイミドなど)、又はクロロ、ブロモ、ヨード等の脱離基、若しくはR-スルファニル基、又はカルボキシル基のようなアミンとの反応性がある基である；一方、前記リンカーの細胞毒素とコンジュゲートする反応性末端は、典型的には、細胞毒素にコンジュゲートすることができる部位である。リンカー-細胞毒素コンジュゲーションの非限定的な例としては、例えば、細胞毒素上の塩基性アミン基又はカルボキシル基とのアミド結合の形成（それぞれ、前記リンカーのカルボキシル又は塩基性アミン基を介する）、又はエーテル等の形成（前記細胞毒素のOH基をアルキル化することを介する、例えば、前記リンカーの脱離基を介する）、が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞毒素-リンカー・コンジュゲーションは、前記細胞毒素のアミン又はカルボキシル基とのアミド結合の形成を介する、そして、その場合、前記リンカーの反応性置換基はそれぞれカルボキシル又は塩基性アミン基である。前記用語「リンカー」を、コンジュゲートした形態のリンカーを説明する際に使用する場合、反応性末端の一方又は両方は、前記リンカー及び／又は前記細胞毒素間の、並びに前記リンカー及び／又は前記抗体若しくはその抗原結合フラグメント間の、結合が形成されているので、存在しない(例えば、反応性部分構造Z'、化学的な部分構造Zに変換されている)か、又は反応途中にある(例えば、カルボン酸のカルボニルだけになっている等)。このようなコンジュゲートさせる反応を、本明細書中以下に更に記載する。
【０２４４】
様々なリンカーを使用して、記載した抗体、又は抗体フラグメントを細胞毒性分子にコンジュゲートさせることができる。いくつかの実施形態では、前記リンカーは、細胞内の条件下で切断可能であり、その結果、前記リンカーの切断によって、細胞内環境において、抗体から薬物ユニットが放出される。更に他の実施形態では、そのリンカー・ユニットは切断可能ではなく、薬物は、例えば、抗体の分解によって放出される。本発明のADCに有用なリンカーは、好ましくは細胞外で安定であり、ADC分子が凝集することを防止し、ADCが水溶性の媒体中で及び単量体状で溶け易いように維持する。細胞内に輸送される又は送達される前には、前記ADCは、好ましくは安定であり、及びインタクトなままであり、即ち、前記抗体は、前記薬物部分に連結したままである。前記リンカーはターゲット細胞の外部では安定であり、細胞内部ではある有効な速度で切断されることがある。効果的なリンカーは：(i)前記抗体の特異的な結合特性を維持する；(ii)前記コンジュゲート又は薬物部分が細胞内に送達されることを可能にする；(iii)前記コンジュゲートがそのターゲット部位に送達又は輸送されるまで、安定かつインタクトなままであり、即ち切断されない；並びに(iv)前記細胞毒性部分の、細胞毒性、細胞傷害効果又は細胞増殖抑制効果を維持する。前記ADCの安定性を、質量分析、HPLC、及び分離／解析技術のLC/MS等の標準的な分析技術によって測定することができる。前記抗体及び前記薬物部分の共有結合は、前記リンカーが2つの反応性官能基を有することを要求する（即ち反応性の意味での二価である）。ペプチド、核酸、薬物、毒素、抗体、ハプテン、及びレポーター基等の2つ以上の機能的又は生物学的に活性な部分を結合させるのに有用な二価のリンカー試薬が知られており、それらのコンジュゲートを得る方法については記載されている(Hermanson, G.T. (1996)Bioconjugate Techniques; Academic Press: New York、p.234-242)。
【０２４５】
好適な切断可能なリンカーとしては、例えば、酵素的加水分解、光分解、酸性条件下での加水分解、塩基性条件下での加水分解、酸化、ジスルフィド還元、求核切断、又は有機金属切断によって切断され得るものが挙げられる(例えば、Lericheら、Bioorg.Med.Chem、20:571-582、2012を参照のこと、これらの開示は、共有結合的にコンジュゲートさせることに適したリンカーに関連するものとして、本明細書に参照により取り込まれる)。好適な切断可能なリンカーとしては、例えば、ヒドラジン、ジスルフィド、チオエーテル又はジペプチドなどの化学的な部分構造を挙げることができる。
【０２４６】
酸性条件下で加水分解可能なリンカーとしては、例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、シス-アコニット・アミド、オルトエステル、アセタール、ケタール等が挙げられる(例えば、米国特許第 5,122,368; 5,824,805; 5,622,929号； Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123; Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264:14653-14661、これらの各開示は、共有結合的にコンジュゲートさせることに適したリンカーに関するものとして、その全体が本明細書に参照により取り込まれる)。このようなリンカーは、血中のpH条件のような中性pHの条件下では比較的安定であるが、リソソームのおよそのpHであるpH 5.5又は5.0未満では不安定である。
【０２４７】
還元条件下で切断可能なリンカーとしては、例えば、ジスルフィドが挙げられる。例えば、SATA(N-スクシンイミジル-S-アセチルチオアセテート)、SPDP(N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート)、SPDB(N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)ブチレート)及びSMPT(N-スクシンイミジル-オキシカルボニル-α-メチル-α-(2-ピリジル-ジチオ)トルエン)、SPDB及びSMPT、を使用して形成することができるジスルフィド・リンカーを含む、様々なジスルフィド・リンカーが当該技術分野で知られている(例えば、Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931; Wawrzynczak et al., In Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987)を参照のこと)。米国特許第4,880,935も参照のこと。これらの各開示は、共有結合的にコンジュゲートさせることに適したリンカーに関するものとして、その全体が本明細書に参照により取り込まれる。
【０２４８】
酵素的な加水分解に感受性があるリンカーは、例えば、細胞内ペプチダーゼ又はプロテアーゼ酵素(リソソーム・プロテアーゼ又はエンドソーム・プロテアーゼが挙げられるが
、これらに限定されない)によって切断されるペプチド含有リンカーであることがある。治療薬剤が細胞内タンパク質分解によって放出されることを利用することの1つの利点は、前記治療薬剤は、コンジュゲートしている場合、一般に減弱していて、及び前記コンジュゲートの血清安定性は一般的に高い、ということである。いくつかの実施形態では、前記ペプチジル・リンカーは、少なくとも2アミノ酸長又は少なくとも3アミノ酸長である。例示的なアミノ酸リンカーとしては、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド又はペンタペプチドが挙げられる。好適なペプチドの例としては、バリン、アラニン、シトルリン(Cit)、フェニルアラニン、リジン、ロイシン、及びグリシン等のアミノ酸を含有するペプチドが挙げられる。アミノ酸リンカー成分を含むアミノ酸残基としては、天然に存在するもの、並びにマイナーなアミノ酸及び非天然に存在するアミノ酸類似体(例えば、シトルリン)が挙げられる。例示的なジペプチドとしては、バリン-シトルリン(vc又はval-cit)及びアラニン-フェニルアラニン(af又はala-phe)が挙げられる。例示的なトリペプチドとしては、グリシン-バリン-シトルリン(gly-val-cit)及びグリシン-グリシン-グリシン(gly-gly-gly)が挙げられる。いくつかの実施形態では、前記リンカーとしては、Val-Cit、Ala-Val、又はPhe-Lys、Val-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Phe-Arg、又はTrp-Citのようなジペプチドが挙げられる。Val-Cit又はPhe-Lys等のジペプチドを含むリンカーは、例えば、米国特許第6,214,345号に開示されている（この開示は、共有結合的にコンジュゲートさせることに適したリンカーに関するものとして、その全体が本明細書に参照により取り込まれる）。いくつかの実施形態では、前記リンカーとしては、Val-Ala及びVal-Citから選択されるジペプチドが挙げられる。
【０２４９】
本明細書に記載する抗体、又は抗体フラグメントに結合させるのに適したリンカーとしては、1,6-脱離過程によって、細胞毒素を放出することができるリンカーが挙げられる。この脱離過程を可能にする化学的な部分構造としては、p-アミノベンジル(PAB)基、6-マレイミドヘキサン酸、pH感受性炭酸塩、及びJain et al., Pharm. Res. 32:3526-3540, 2015（この開示は、共有結合的なコンジュゲーションに適したリンカーに関連するものとして、その全体が本明細書に参照により取り込まれる）に記載される他の試薬等が挙げられる。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、前記リンカーとしては、前述のPAB又はPABC(パラ-アミノベンジルオキシカルボニル)等の「自壊」基が挙げられ、これらは、例えば、Carl et al., J. Med. Chem. (1981) 24:479-480; Chakravarty et al (1983) J. Med. Chem. 26:638-644; US 6214345; US20030130189; US20030096743; US6759509; US20040052793; US6218519; US6835807; US6268488; US20040018194; WO98/13059; US20040052793; US6677435; US5621002; US20040121940; WO2004/032828に開示されている。このプロセスが可能な他のこのような化学的な部分構造(「自壊リンカー」)としては、メチレン・カルバメート及びヘテロアリール基、例えばアミノチアゾール、アミノイミダゾール、アミノピリミジンなどが挙げられる。このような複素環の自壊基を含むリンカーは、例えば、米国特許出願公開20160303254 及び 20150079114、並びに米国特許第7,754,681; Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237; US 2005/0256030; de Groot et al (2001) J. Org. Chem. 66:8815-8830; 及び US 7223837に開示されている。いくつかの実施形態では、ジペプチドを、自壊リンカーと組合せて使用する。
【０２５１】
本明細書での使用に適したリンカーは、C1-C6アルキレン、C1-C6ヘテロアルキレン、C2-C6アルケニレン、C2-C6ヘテロアルケニレン、C2-C6アルキニレン、C2-C6ヘテロアルキニレン、C3-C6シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、及びそれらの組合せから選択される1つ以上の基を更に含むことがあり、これらの各々は任意選択的に置換されていることがある。このような基の非限定的な実施例としては、(CH2)p、(CH2CH2O)p、及び-(C=O)(CH2)p-ユニットが挙げられ、ここで、pは1〜6の整数であり、各々の場合に対して独立に選択される。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、各C1-C6アルキル、C1-C6ヘテロアルキル、C2-C6アルケニル、C2-C6ヘテロアルケニル、C2-C6アルキニル、C2-C6ヘテロアルキニル、C3-C6シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、スルホニルシクロアルキル、アリール、又はヘテロアリール基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルカリル、アルキル・ヘテロアリール、アミノ、アンモニウム、アシル、アシルオキシ、アシルアミノ、アミノカルボニル、アルコキシカルボニル、ウレイド、カルバメート、アリール、ヘテロアリール、スルフィニル、スルホニル、ヒドロキシル、アルコキシ、スルファニル、ハロゲン、カルボキシ、トリハロメチル、シアノ、ヒドロキシ、メルカプト、及びニトロからなる群よりそれぞれ独立して選択される1〜5個の置換基で、任意選択的に置換されている。
【０２５３】
いくつかの実施形態では、各C1-C6アルキル、C1-C6ヘテロアルキル、C2-C6アルケニル、C2-C6ヘテロアルケニル、C2-C6アルキニル、C2-C6ヘテロアルキニル、C3-C6シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、スルホニルシクロアルキル、アリール、又はヘテロアリール基は、O、S及びNから選択される1つ以上のヘテロ原子によって、任意選択的に割り込まれていることがある。
【０２５４】
いくつかの実施形態では、各C1-C6アルキル、C1-C6ヘテロアルキル、C2-C6アルケニル、C2-C6ヘテロアルケニル、C2-C6アルキニル、C2-C6ヘテロアルキニル、C3-C6シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、スルホニルシクロアルキル、アリール、又はヘテロアリール基は、O、S及びNから選択される1つ以上のヘテロ原子によって、任意選択的に割り込まれていることがある、並びにアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルカリル、アルキル・ヘテロアリール、アミノ、アンモニウム、アシル、アシルオキシ、アシルアミノ、アミノカルボニル、アルコキシカルボニル、ウレイド、カルバメート、アリール、ヘテロアリール、スルフィニル、スルホニル、ヒドロキシル、アルコキシ、スルファニル、ハロゲン、カルボキシ、トリハロメチル、シアノ、ヒドロキシ、メルカプト、及びニトロからなる群よりそれぞれ独立して選択される1〜5個の置換基で、任意選択的に置換されている。
【０２５５】
好適なリンカーは、溶解性を高める特性を有する基を含むことがある。例えば、(CH2CH2O)pユニット(ポリエチレングリコール、PEG)を含むリンカーは、溶解性を高めることができる（例えば、アミノ、スルホン酸、ホスホン酸又はリン酸残基で置換して、アルキル鎖の溶解性を高めることができる）。このような部分構造を含むリンカーは、例えば、米国特許番号8,236,319 及び9,504,756に開示されている（これらの各々の開示は、共有結合的なコンジュゲーションに適したリンカーに関連するものとして、その全体が本明細書に参照により取り込まれる）。更なる溶解性を高める基としては、例えば、以下の構造を有するアシル及びカルバモイル・スルファミド基が挙げられる：
【化４１】
2021530546.tif 000105
ここで、aは0又は1である；並びに
R10は、水素、C1-C24アルキル基、C3-C24シクロアルキル基、C1-C24(ヘテロ)アリール基、C1-C24アルキル（ヘテロ）アリール基、及びC1-C24（ヘテロ）アリールアルキル基、C1-C24アルキル基、C3-C24シクロアルキル基、C2-C24（ヘテロ）アリール基、C3-C24アルキル（ヘテロ）アリール基、及びC3-C24（ヘテロ）アリールアルキル基、からなる基から選択され、これらの各々は、O、S、及びNR11R12から選択される1種以上のヘテロ原子によって、任意選択的に置換している、及び／又は任意選択的に割り込まれていることがある、ここで、R11及びR12は、水素及びC1-C4アルキル基からなる群から独立して選択される；又はR10は細胞毒素である、ここで、前記細胞毒素は、スペーサ部分を介して、Nに任意選択的に結合する。そのような基を含むリンカーは、例えば、米国特許9,636,421号及び米国特許出願公開第2017/0298145号(これら開示は、細胞毒素及び抗体又はそれらの抗原結合フラグメントへの共有結合的なコンジュゲーションに適したリンカーに関連するものとして、その全体が本明細書に参照により取り込まれる)に記載されている。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、前記リンカーは、ヒドラジン、ジスルフィド、チオエーテル、ジペプチド、p-アミノベンジル(PAB)基、複素環自壊基、任意選択的に置換されたC1-C6アルキル、任意選択的に置換されたC1-C6ヘテロアルキル、任意選択的に置換されたC2-C6アルケニル、任意選択的に置換されたC2-C6ヘテロアルケニル、任意選択的に置換されたC2-C6アルキニル、任意選択的に置換されたC2-C6ヘテロアルキニル、任意選択的に置換されたC3-C6シクロアルキル、任意選択的に置換されたヘテロシクロアルキル、任意選択的に置換されたアリール、任意選択的に置換されたヘテロアリール、溶解性増強基、アシル、-(C=O)-、又は-(CH2CH2O)p-基のうちの1つ以上を含むことがある、ここで、pは1〜6の整数である。当業者の中のある者は、列挙された基の1つ以上が、二価(ジラジカル)種(例えば、C1-C6アルキレン等)の形態で存在し得ることを認識する。
【０２５７】
いくつかの実施形態では、前記リンカーは、p-アミノベンジル基(PAB)を含む。ある実施形態では、前記p-アミノベンジル基は、細胞毒性薬物とリンカー中のプロテアーゼ切断部位との間に配置される。ある実施形態では、前記p-アミノベンジル基は、p-アミノベンジルオキシカルボニル・ユニットの一部である。ある実施形態では、p-アミノベンジル基は、p-アミノベンジルアミド・ユニットの一部である。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、前記リンカーは、Phe-Lys、Val-Lys、Phe-Ala、Phe-Cit、Val-Ala、Val-Cit、及びVal-Argからなる群より選択されるジペプチドを含む。いくつかの実施形態では、前記リンカーは、PAB、Val-Cit-PAB、Val-Ala-PAB、Val-Lys(Ac)-PAB、Phe-Lys-PAB、Phe-Lys(Ac)-PAB、D-Val-Leu-Lys、Gly-Gly-Arg、Ala-Ala-Asn-PAB、又はAla-PABのうちの1種以上を含む。
【０２５９】
いくつかの実施形態では、前記リンカーは、PAB, Val-Cit-PAB, Val-Ala-PAB, Val-Lys(Ac)-PAB, Phe-Lys-PAB, Phe-Lys(Ac)-PAB, D-Val-Leu-Lys, Gly-Gly-Arg, Ala-Ala-Asn-PAB, 又は Ala-PAB を含む。
【０２６０】
いくつかの実施形態では、前記リンカーは、ペプチド、オリゴ糖、-(CH2)p-, -(CH2CH2O)p-, PAB, Val-Cit-PAB, Val-Ala-PAB, Val-Lys(Ac)-PAB, Phe-Lys-PAB, Phe-Lys(Ac)-PAB, D-Val-Leu-Lys, Gly-Gly-Arg, Ala-Ala-Asn-PAB, 又は Ala-PAB、のうちの1つ以上の組合せを含む。
【０２６１】
いくつかの実施形態では、前記リンカーは、-(C=O)(CH2)p-ユニットを含み、ここで、pは1〜6の整数である。
【０２６２】
いくつかの実施形態において、前記リンカーは、-(CH2)n-ユニットを含む、ここで、nは2-6からの整数である。いくつかの実施形態において、前記リンカーは、nが6である-((CH2)nを含む。いくつかの実施形態において、L-Zは、
【化４２】
2021530546.tif 000106
である、ここで、Sは、CD137に結合する、抗体、又はその抗原結合フラグメント内に存在する反応性置換基を表す硫黄原子である(例えば、システイン残基の-SH基に由来する)。
【０２６３】
いくつかの実施形態では、前記リンカーは、((CH2)mO)n(CH2)m-基を含み、ここで、n及びmはそれぞれ独立に、1、2、3、4、5、6、7、8、9及び10から選択される；並びにヘテロアリール基、ここで、前記ヘテロアリール基は、トリアゾールである。いくつかの実施形態では、((CH2)mO)n(CH2)m-基及びトリアゾールは、一緒になって以下を含む
【化４３】
2021530546.tif 000107
ここで、nは1〜10であり、及び波線は、追加のリンカー構成成分、化学的な部分構造Z、又はアマトキシンへの結合の位置を示す。本明細書中に記載する方法及び組成物において使用することがある他のリンカーは、米国特許出願公開第2019/0144504号に記載されており、これは、本明細書に参照により取り込まれる。
【０２６４】
ある具体的な実施形態では、前記リンカーは、PAB-Ala-Val-プロピオニルを含み、以下の構造によって表される
【化４４】
2021530546.tif 000108
ここで、波線は、前記細胞毒素及び反応性部分構造Z'への結合の位置を示す。
【０２６５】
別の具体的な実施形態では、前記リンカーは、PAB-Cit-Val-プロピオニルを含み、以下の構造によって表される
【化４５】
2021530546.tif 000109
ここで、波線は、前記細胞毒素及び反応性部分構造Z'への結合の位置を示す。このようなPAB-ジペプチド-プロピオニル・リンカーとしては、例えば、特許出願公開WO2017/149077に開示されている（これは、その全体が、本明細書に参照により取り込まれる）。更に、WO2017/149077に開示された細胞毒素は、本明細書に参照により取り込まれる。
【０２６６】
本明細書に開示する化学基、部分及び特徴の何れか1つ以上を、多様な方法で組み合わせて、本明細書に開示するような抗体と細胞毒素とをコンジュゲートさせることに対して有用なリンカーを形成し得ることは、当業者の中のある者によって認識されるだろう。本明細書中に記載する組成物及び方法と併せることにおいて有用な更なるリンカーは、例えば、米国特許出願公開第2015/0218220号に記載されており、その開示内容は、その全体が本明細書に参照により取り込まれる。
【０２６７】
ある特定の実施形態では、リンカーの前駆物質である中間体を、好適な条件下で薬物部分と反応させる。ある特定の実施形態では、反応性基を、前記薬物及び／又は前記中間体若しくはリンカー上で使用する。前記薬物と前記中間体との間の反応の生成物、又は誘導体化した薬物を、その後、好適な条件下で、抗体又は抗原結合フラグメントと反応させる。あるいは、前記リンカー又は中間体を、最初に前記抗体又は誘導体化した抗体と反応させ、次いで前記薬物又は誘導体化した薬物と反応させてもよい。このようなコンジュゲーション反応を、ここで、より完全に記載する。
【０２６８】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントに、リンカー又は薬物-リンカー・コンジュゲートを共有結合させるために、多くの様々な反応を利用することができる。前記抗体分子上の好適な結合の位置としては、リジンのアミン基、グルタミン酸及びアスパラギン酸の遊離カルボン酸基、システインのスルフヒドリル基、及び芳香族アミノ酸の種々の部分が挙げられる。例えば、化合物上のカルボキシ(又はアミノ)基を抗体部分上のアミノ(又はカルボキシ)基に連結するために、非特異的な共有結合を、カルボジイミド反応を用いて行うことがある。更に、化合物上のアミノ基を抗体部分上のアミノ基に結合させるために、ジアルデヒド又はイミドエステルなどの二官能基性の薬剤を使用することもある。薬物を結合剤に結合させることには、シッフ塩基反応を利用することも可能である。この方法は、グリコール又は水酸基を含有する薬物を過ヨウ素酸塩酸化させることを含み、このようにしてアルデヒドを形成させ、次いでこれを結合剤と反応させる。結合は、前記結合剤のアミノ基を有するシッフ塩基の形成を介して起こる。イソチオシアネートを、薬物を結合剤に共有結合させるためのカップリング剤として使用することもある。他の技術は当業者に知られており、本発明の範囲内である。
【０２６９】
本明細書に記載する場合、抗体又は抗原結合フラグメントへのコンジュゲーションに有用なリンカーとしては、限定されるものではないが、以下の表２に示すような、カップリング反応によって形成される化学的な部分構造Zを含むリンカーが挙げられる。曲線は、それぞれ、抗体又は抗原結合フラグメント、及び細胞毒性分子に結合する位置を示す。
【０２７０】
【表２−１】
2021530546.tif 000110
【表２−２】
2021530546.tif 000111
【表２−３】
2021530546.tif 000112
【表２−４】
2021530546.tif 000113
【０２７１】
当業者の中のある者は、前記リンカー及び前記抗体又はその抗原結合フラグメント上の反応性置換基に結合した反応性置換基Z'が、化学的な部分構造Zを生成する共有結合カップリング反応に関与するものであることを認識し、前記反応性の部分構造Z'を認識する。従って、本明細書に記載の方法と併せることにおいて有用な抗体-薬物コンジュゲートは、抗体又はその抗原結合フラグメントが、リンカー又は細胞毒素-リンカー・コンジュゲートと反応することによって形成されることがあり、本明細書に記載するように、前記リンカー又は細胞毒素-リンカー・コンジュゲートは反応性置換基Z'等を含み、抗体又はその抗原結合フラグメント上の反応性置換基との反応に適していて、化学的な部分構造Zを形成する。
【０２７２】
表２に示されるように、前記リンカー及び抗体、又はその抗原結合フラグメント上の好適な反応性置換基の例としては、求核／求電子対(例えば、チオール／ハロアルキル対、アミン／カルボニル対、又はチオール／α, β-不飽和カルボニル対等)、ジエン／ジエノフィル対(例えば、とりわけ、アジド／アルキン対、又はジエン／α,β-不飽和カルボニル対)等が挙げられる。化学的な部分構造Zを形成するための反応性置換基間のカップリング反応としては、限定されるものではないが、チオール・アルキル化、ヒドロキシル・アルキル化、アミン・アルキル化、アミン又はヒドロキシルアミン縮合、ヒドラジン形成、アミド化、エステル化、ジスルフィド形成、環化付加(例えば、とりわけ、[4+2]Diels-Alder環化付加、[3+2]Huisgen環化付加)、芳香族求核置換、芳香族求電子置換、及び当該技術分野で知られているか又は本明細書に記載されている他の反応様式が挙げられる。好ましくは、前記リンカーは、前記抗体又はその抗原結合フラグメント上の求核性官能基との反応のための求電子性官能基を含む。
【０２７３】
本明細書に開示するように、抗体、又はその抗原結合フラグメント内に存在し得る反応性置換基としては、限定されるものではないが、(i)N-末端アミン基、(ii)側鎖アミン基(例えば、リジン)、(iii)側鎖チオール基(例えば、システイン)、及び(iv)糖水酸基又はアミノ基(ここで、前記抗体はグリコシル化されている)、のような求核基が挙げられる。本明細書に開示するように、抗体、又はその抗原結合フラグメント内に存在し得る反応性置換基としては、限定されるものではないが、セリン、スレオニン、及びチロシン残基のヒドロキシル部分；リジン残基のアミノ部分；アスパラギン酸及びグルタミン酸残基のカルボキシル部分；並びにシステイン残基のチオール部分、並びに、非天然アミノ酸のプロパルギル、アジド、ハロアリール(例えば、フルオロアリール)、ハロヘテロアリール(例えば、フルオロヘテロアリール)、ハロアルキル、及びハロヘテロアルキル部分が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示するように、抗体、又はその抗原結合フラグメント内に存在する反応性置換基としては、アミン又はチオール部分が挙げられる。ある特定の抗体は、還元可能な鎖間ジスルフィド（即ち、システイン架橋）を有する。抗体は、DTT(ジチオトレイトール)等の還元剤で処理することによって、リンカー試薬とコンジュゲートさせるために、反応性にすることができる。従って、各システイン架橋は、理論的には、2つの反応性チオール求核基を形成する。リジンと2-イミノチオラン(トラウト試薬)との反応によって、更なる求核基を抗体中に導入して、アミンをチオールに転化させることができる。1個、2個、3個、4個、又はそれ以上のシステイン残基を導入することによって(例えば、1個以上の元々は無かったシステイン・アミノ酸残基を含む変異抗体を調製することによって)、反応性チオール基を、抗体(又はそのフラグメント)に導入することがある。米国特許第7,521,541号は、反応性システイン・アミノ酸を導入することによる工学的に操作した抗体を教示している。
【０２７４】
いくつかの実施形態では、前記リンカーに結合した反応性の部分構造Z'は、抗体上に存在する求電子基と反応性である求核基である。抗体上の有用な求電子基としてはアルデヒド及びケトンのカルボニル基が挙げられるが、これらに限定されない。求核基のヘテロ原子は、抗体上の求電子基と反応し、前記抗体と共有結合を形成することがある。有用な求核基としては、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドロキシル、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジン・カルボキシレート、及びアリールヒドラジドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２７５】
いくつかの実施形態では、Zは、抗体又はその抗原結合フラグメント内に存在する反応性求核置換基(例えば、アミン及びチオール部分)と反応性求電子置換基Z'との間の反応の生成物である。例えば、Z'は、特に、マイケル・アクセプター(例えば、マレイミド)、活性化エステル、電子欠損カルボニル化合物、及びアルデヒドであることがある。反応性置換基Z'及び得られる化学的な部分構造Zのいくつかの代表的な及び非限定的な例を、表３に示す。
【０２７６】
【表３】
2021530546.tif 000114
【０２７７】
例えば、ADCの合成に好適なリンカーとしては、限定されるものではないが、マレイミド又はハロアルキル基などの反応性置換基Z'が挙げられる。これらは、試薬（例えば、特に、スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-L-カルボキシレート(SMCC)、N-スクシンイミジル・ヨードアセテート(SIA)、スルホ-SMCC、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミジル・エステル(MBS)、スルホ-MBS、及びスクシンイミジル・ヨードアセテート、等であり、例えば、Liu et al., 18:690-697, 1979に記載されている（この開示は、化学的にコンジュゲートさせるためのリンカーに関するものとして、本明細書に参照により取り込まれる））によって、前記リンカーに結合することがある。
【０２７８】
いくつかの実施形態では、リンカーLに結合した反応性置換基Z'は、マレイミド、アジド、又はアルキンである。マレイミド含有リンカーの例は、非切断性マレイミドカプロイル-ベースのリンカーであり、これは、アウリスタチンなどの微小管破壊剤をコンジュゲートするのに特に有用である。このようなリンカーはDoronina et al., Bioconjugate Chem. 17:14-24, 2006に記載されている（この開示は、化学的にコンジュゲートさせるためのリンカーに関するものとして、本明細書に参照により取り込まれる）。
【０２７９】
いくつかの実施形態では、反応性置換基Z'は-(C=O)-又は-NH(C=O)-であり、その結果、前記リンカーは、それぞれ、-(C=O)-又は-NH(C=O)-基と抗体又はその抗原結合フラグメントのアミノ基との反応から生じるアミド又は尿素の部分構造によって、前記抗体又はその抗原結合フラグメントに結合することがある。
【０２８０】
いくつかの実施形態では、前記反応性置換基は、N-マレイミジル基、ハロゲン化N-アルキルアミド基、スルホニルオキシN-アルキルアミド基、カーボネート基、ハロゲン化スルホニル基、チオール基又はその誘導体、内部に炭素-炭素の三重結合を含むアルキニル基、（ヘテロ）シクロアルキニル基、ビシクロ[6.1.0]ノン-4-イン-9-イル基（bicyclo[6.1.0]non-4-yn-9-yl group）、内部に炭素-炭素の二重結合を含むアルケニル基、シクロアルケニル基、テトラジニル基、アジド基、ホスフィン基、ニトリル・オキシド基、ニトロン基、ニトリル・イミン基、ジアゾ基、ケトン基、(O-アルキル)ヒドロキシルアミノ基、ヒドラジン基、ハロゲン化N-マレイミジル基、1,1-ビス(スルホニルメチル)メチルカルボニル基又はその脱離誘導体、ハロゲン化カルボニル基、又はアレンアミド基であり、これらはそれぞれ任意に置換されていることがある。いくつかの実施形態では、前記反応性置換基は、シクロアルケン基、シクロアルキン基、又は任意選択的に置換された(ヘテロ)シクロアルキニル基を含む。
【０２８１】
前記抗体又はその抗原結合フラグメント上の反応性残基との反応に適した反応性置換基Z'を含むアマトキシン-リンカー・コンジュゲートの非限定的な例としては、限定されるものではないが、以下が挙げられる、7'C-(4-(6-(マレイミド)ヘキサノイル)ピペラジン-1-イル)-アマトキシン；7'C-(4-(6-(マレイミド)ヘキサンアミド)ピペリジン-1-イル)-アマトキシン；7'C-(4-(6-(6-(マレイミド)ヘキサンアミド)ヘキサノイル)ピペラジン-1-イル)-アマトキシン；7'C-(4-(4-((マレイミド)メチル)シクロヘキサンカルボニル)ピペラジン-1-イル)-アマトキシン；7'C-(4-(6-(4-((マレイミド)メチル)シクロヘキサンカルボキサミド)ヘキサノイル)ピペラジン-1-イル)-アマトキシン；7'C-(4-(2-(6-(マレイミド)ヘキサンアミド)エチル)ピペリジン-1-イル)-アマトキシン；7'C-(4-(2-(6-(6-(マレイミド)ヘキサンアミド)ヘキサンアミド)エチル)ピペリジン-1-イル)-アマトキシン；7'C-(4-(2-(4-((マレイミド)メチル)シクロヘキサンカルボキサミド)エチル)ピペリジン-1-イル)-アマトキシン；7'C-(4-(2-(6-(4-((マレイミド)メチル)シクロヘキサンカルボキサミド)ヘキサンアミド)エチル)ピペリジン-1-イル)-アマトキシン；7'C-(4-(2-(3-カルボキシプロパンアミド)エチル)ピペリジン-1-イル)-アマトキシン；7'C-(4-(2-(2-ブロモアセトアミド)エチル)ピペリジン-1-イル)-アマトキシン；7'C-(4-(2-(3-(ピリジン-2-イルジスルファニル)プロパンアミド)エチル)ピペリジン-1-イル)-アマトキシン；7'C-(4-(2-(4-(マレイミド)ブタンアミド)エチル)ピペリジン-1-イル)-アマトキシン；7'C-(4-(2-(マレイミド)アセチル)ピペラジン-1-イル)-アマトキシン；7'C-(4-(3-(マレイミド)プロパノイル)ピペラジン-1-イル)-アマトキシン；7'C-(4-(4-(マレイミド)ブタノイル)ピペラジン-1-イル)-アマトキシン；7'C-(4-(2-(6-(4-((マレイミド)メチル)シクロヘキサンカルボキサミド)ヘキサンアミド)エチル)ピペリジン-1-イル)-アマトキシン；7'C-(3-((6-(マレイミド)ヘキサンアミド)メチル)ピロリジン-1-イル)-アマトキシン；7'C-(3-((6-(6-(マレイミド)ヘキサンアミド)ヘキサンアミド)メチル)ピロリジン-1-イル)-アマトキシン；7'C-(3-((4-((マレイミド)メチル)シクロヘキサンカルボキサミド)メチル)ピロリジン-1-イル)-アマトキシン；7'C-(3-((6-((4-(マレイミド)メチル)シクロヘキサンカルボキサミド)ヘキサンアミド)メチル)ピロリジン-1-イル)-アマトキシン；7'C-(4-(2-(6-(2-(アミノオキシ)アセトアミド)ヘキサンアミド)エチル)ピペリジン-1-イル)-アマトキシン；7'C-(4-(2-(4-(2-(アミノオキシ)アセトアミド)ブタンアミド)エチル)ピペリジン-1-イル)-アマトキシン；7'C-(4-(4-(2-(アミノオキシ)アセトアミド)ブタノイル)ピペラジン-1-イル)-アマトキシン；7'C-(4-(6-(2-(アミノオキシ)アセトアミド)ヘキサノイル)ピペラジン-1-イル)-アマトキシン；7'C-((4-(6-(マレイミド)ヘキサンアミド)ピペリジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；7'C-((4-(2-(6-(マレイミド)ヘキサンアミド)エチル)ピペリジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；7'C-((4-(6-(マレイミド)ヘキサノイル)ピペラジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；(R)-7'C-((3-((6-(マレイミド)ヘキサンアミド)メチル)ピロリジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；(S)-7'C-((3-((6-(マレイミド)ヘキサンアミド)メチル)ピロリジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；7'C-((4-(2-(6-(6-(マレイミド)ヘキサンアミド)ヘキサンアミド)エチル)ピペリジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；7'C-((4-(2-(4-((マレイミド)メチル)シクロヘキサンカルボキサミド)エチル)ピペリジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；7'C-((4-(2-(6-(4-((マレイミド)メチル)シクロヘキサンカルボキサミド)ヘキサンアミド)エチル)ピペリジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；7'C-((4-(2-(6-(マレイミド)ヘキサンアミド)エチル)ピペラジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；7'C-((4-(2-(6-(6-(マレイミド)ヘキサンアミド)ヘキサンアミド)エチル)ピペラジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；7'C-((4-(2-(4-((マレイミド)メチル)シクロヘキサンカルボキサミド)エチル)ピペラジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；7'C-((4-(2-(6-(4-((マレイミド)メチル)シクロヘキサンカルボキサミド)ヘキサンアミド)エチル)ピペラジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；7'C-((3-((6-(6-(マレイミド)ヘキサンアミド)ヘキサンアミド)-S-メチル)ピロリジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；7'C-((3-((6-(6-(マレイミド)ヘキサンアミド)ヘキサンアミド)-R-メチル)ピロリジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；7'C-((3-((4-((マレイミド)メチル)シクロヘキサンカルボキサミド)-S-メチル)ピロリジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；7'C-((3-((4-((マレイミド)メチル)シクロヘキサンカルボキサミド)-R-メチル)ピロリジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；7'C-((3-((6-(4-((マレイミド)メチル)シクロヘキサンカルボキサミド)ヘキサンアミド)メチル)ピロリジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；7'C-((4-(2-(3-カルボキシプロパンアミド)エチル)ピペラジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；7'C-((4-(6-(6-(マレイミド)ヘキサンアミド)ヘキサノイル)ピペラジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；7'C-((4-(6-(4-((マレイミド)メチル)シクロヘキサンカルボキサミド)ヘキサノイル)ピペラジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；7'C-((4-(2-(マレイミド)アセチル)ピペラジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；7'C-((4-(3-(マレイミド)プロパノイル)ピペラジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；7'C-((4-(4-(マレイミド)ブタノイル)ピペラジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；7'C-((4-(2-(2-(マレイミド)アセトアミド)エチル)ピペリジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；7'C-((4-(2-(4-(マレイミド)ブタンアミド)エチル)ピペリジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；7'C-((4-(2-(6-(4-((マレイミド)メチル)シクロヘキサンカルボキサミド)ヘキサンアミド)エチル)ピペリジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；7'C-((3-((6-(マレイミド)ヘキサンアミド)メチル)アゼチジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；7'C-((3-(2-(6-(マレイミド)ヘキサンアミド)エチル)アゼチジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；7'C-((3-((4-((マレイミド)メチル)シクロヘキサンカルボキサミド)メチル)アゼチジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；7'C-((3-(2-(4-((マレイミド)メチル)シクロヘキサンカルボキサミド)エチル)アゼチジン-1イル)メチル)-アマトキシン；7'C-((3-(2-(6-(4-((マレイミド)メチル)シクロヘキサンカルボキサミド)ヘキサンアミド)エチル)アゼチジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；7'C-(((2-(6-(マレイミド)-N-メチルヘキサンアミド)エチル)(メチル)アミノ)メチル)-アマトキシン；7'C-(((4-(6-(マレイミド)-N-メチルヘキサンアミド)ブチル(メチル)アミノ)メチル)-アマトキシン；7'C-((2-(2-(6-(マレイミド)ヘキサンアミド)エチル)アジリジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；7'C-((2-(2-(6-(4-((マレイミド)メチル)シクロヘキサンカルボキサミド)ヘキサンアミド)エチル)アジリジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；7'C-((4-(6-(6-(2-(アミノオキシ)アセトア��ド)ヘキサンアミド)ヘキサノイル)ピペラジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；7'C-((4-(1-(アミノオキシ)-2-オクソ-6,9,12,15-テトラオキサ-3-アザヘプタデカン-17-オイル)ピペラジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；7'C-((4-(2-(2-(アミノオキシ)アセトアミド)アセチル)ピペラジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；7'C-((4-(3-(2-(アミノオキシ)アセトアミド)プロパノイル)ピペラジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；7'C-((4-(4-(2-(アミノオキシ)アセトアミド)ブタノイル)ピペラジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；7'C-((4-(2-(6-(2-(アミノオキシ)アセトアミド)ヘキサンアミド)エチル)ピペリジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；7'C-((4-(2-(2-(2-(アミノオキシ)アセトアミド)アセトアミド)エチル)ピペリジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；7'C-((4-(2-(4-(2-(アミノオキシ)アセトアミド)ブタンアミド)エチル)ピペリジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；7'C-((4-(20-(アミノオキシ)-4,19-ジオクソ-6,9,12,15-テトラオキサ-3,18-ジアザイコシル)ピペリジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；7'C-(((2-(6-(2-(アミノオキシ)アセトアミド)-N-メチルヘキサンアミド)エチル)(メチル)アミノ)メチル)-アマトキシン；7'C-(((4-(6-(2-(アミノオキシ)アセトアミド)-N-メチルヘキサンアミド)ブチル)(メチル)アミノ)メチル)-アマトキシン；7'C-((3-((6-(4-((マレイミド)メチル)シクロヘキサンカルボキサミド)ヘキサンアミド)メチル)ピロリジン-1-イル)-S-メチル)-アマトキシン；7'C-((3-((6-(4-((マレイミド)メチル)シクロヘキサンカルボキサミド)ヘキサンアミド)-R-メチル)ピロリジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；7'C-((4-(2-(2-ブロモアセトアミド)エチル)ピペラジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；7'C-((4-(2-(2-ブロモアセトアミド)エチル)ピペリジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；7'C-((4-(2-(3-(ピリジン-2-イルジスルファニル)プロパンアミド)エチル)ピペリジン-1-イル)メチル)-アマトキシン；6'O-(6-(6-(マレイミド)ヘキサンアミド)ヘキシル)-アマトキシン；6'O-(5-(4-((マレイミド)メチル)シクロヘキサンカルボキサミド)ペンチル)-アマトキシン；6'O-(2-((6-(マレイミド)ヘキシル)オキシ)-2-オキソエチル)-アマトキシン；6'O-((6-(マレイミド)ヘキシル)カルバモイル)-アマトキシン；6'O-((6-(4-((マレイミド)メチル)シクロヘキサンカルボキサミド)ヘキシル)カルバモイル)-アマトキシン；6'O-(6-(2-ブロモアセトアミド)ヘキシル)-アマトキシン；7'C-(4-(6-(アジド)ヘキサンアミド)ピペリジン-1-イル)-アマトキシン；7'C-(4-(へクス-5-イノイルアミノ)ピペリジン-1-イル)-アマトキシン；7'C-(4-(2-(6-(マレイミド)ヘキサンアミド)エチル)ピペラジン-1-イル)-アマトキシン；7'C-(4-(2-(6-(6-(マレイミド)ヘキサンアミド)ヘキサンアミド)エチル)ピペラジン-1-イル)-アマトキシン；6'O-(6-(6-(11,12-ジデヒドロ-5,6-ジヒドロ-ジベンズ[b,f]アゾシン-5-イル)-6-オクソヘキサンアミド)ヘキシル)-アマトキシン；6'O-(6-(へクス-5-イノイルアミノ)ヘキシル)-アマトキシン；6'O-(6-(2-(アミノオキシ)アセチルアミド)ヘキシル)-アマトキシン；6'O-((6-アミノオキシ)ヘキシル)-アマトキシン；及び 6'O-(6-(2-イオドアセトアミド)ヘキシル)-アマトキシン。
【０２８２】
いくつかの実施形態では、前記化学的な部分構造Zを、表２又は表３から選択する。いくつかの実施形態では、前記化学的な部分構造Zは：
【化４６】
2021530546.tif 000115
ここで、Sは、抗-CD-137抗体のような抗体又はその抗原結合フラグメント内に存在する反応性置換基を表す硫黄原子である。
【０２８３】
いくつかの実施形態では、本明細書中に開示するアマトキシンは、以下の式を有するリンカー-反応性部分構造である-L-Z'にコンジュゲートしている：
【化４７】
2021530546.tif 000116
ここで、波線は、前記細胞毒素(例えば、アマトキシン)上の置換基への結合の位置を示す。このリンカー-反応性置換基であるL-Z'を、代わりに、N-ベータ-マレイミドプロピオニル-Val-Ala-パラ-アミノベンジル(BMP-Val-Ala-PAB)と呼ぶことがある。
【０２８４】
いくつかの実施形態では、本明細書中に開示するアマトキシンは、以下の式を有するリンカー-反応性部分である-L-Z'にコンジュゲートしている：
【化４８】
2021530546.tif 000117
ここで、波線は、前記細胞毒素(例えば、アマトキシン)上の置換基への結合の位置を示す。このリンカー-反応性置換基であるL-Z'を、代わりに、N-ベータ-マレイミドプロピル-Val-Cit-パラ-アミノベンジル(BMP-Val-Cit-PAB) と呼ぶことがある。
【０２８５】
いくつかの実施形態では、前記リンカーL及び化学的な部分構造Zは、L-Zとして一緒になって、
【化４９】
2021530546.tif 000118
である、ここで、Sは、抗-CD-5抗体のような、抗体又はその抗原結合フラグメント内に存在する反応性置換基を表す硫黄原子である。前記リンカーの末端にある波線は、前記アマトキシンへの結合の位置を示す。
【０２８６】
いくつかの実施形態では、前記リンカーL及び化学的な部分構造Zは、前記抗体にコンジュゲートした後、L-Z-Abとして一緒になって、以下の構造を有する:
【化５０】
2021530546.tif 000119
ここで、Sは、抗-CD-137抗体のような、抗体又はその抗原結合フラグメント内に存在する反応性置換基を表す硫黄原子である。前記リンカーの末端にある波線は、前記アマトキシンへの結合の位置を示す。
【０２８７】
前記のリンカー部分構造及びアマトキシン-リンカー・コンジュゲートは、とりわけ、本明細書に記載する組成物及び方法と関連して有益であり、例えば、米国特許出願公開第2015/0218220号及び特許出願公開第WO2017/149077号に記載されており、これらの各々の開示は、その全体が本明細書に参照により取り込まれる。
【０２８８】
前記のリンカー部分構造及びアマトキシン-リンカー・コンジュゲートは、とりわけ、本明細書に記載する組成物及び方法と関連して有益であり、例えば、米国特許出願公開第2015/0218220号及び特許出願公開第WO2017/149077号に記載されており、これらの各々の開示は、その全体が本明細書に参照により取り込まれる。
【０２８９】
ある実施形態では、本明細書中に記載するCD137抗体又は抗原結合フラグメントは、それぞれ本明細書中に記載するように、式Ab-Z-L-Am(式中、Abは前記CD137抗体又はその抗原結合フラグメントである、Lはリンカーである、Zは化学的な部分構造である、及びAmはアマトキシンである)によって表されるコンジュゲートを形成するように、アマトキシンに結合していることがある。
【０２９０】
いくつかの実施形態では、Am-L-Z-Abは：
【化５１】
2021530546.tif 000120
である。
【０２９１】
いくつかの実施形態では、Am-L-Z-Abは：
【化５２】
2021530546.tif 000121
である。
【０２９２】
いくつかの実施形態では、Am-L-Z-Abは：
【化５３】
2021530546.tif 000122
である。
【０２９３】
いくつかの実施形態では、Am-L-Z-Abは：
【化５４】
2021530546.tif 000123
である。
【０２９４】
いくつかの実施形態では、Am-L-Z-Abは：
【化５５】
2021530546.tif 000124
である。
【０２９５】
抗体-薬物コンジュゲートの調製
本明細書に開示する式IのADCにおいて、抗-CD137抗体、又はその抗原結合フラグメントは、本明細書に開示するリンカーL及び化学的な部分構造Zを介して、1個以上の細胞毒性薬物部分(D)(例えば、1抗体あたり約1〜約20個の薬物部分)にコンジュゲートしている。本発明のADCは、以下を含む、当業者に公知の有機化学反応、条件、及び試薬を使用するいくつかの経路によって調製され得る：(1)抗体、又はその抗原結合フラグメントの反応性置換基を、2価リンカー試薬と反応させて、本明細書中上記のようなAb-Z-Lを形成させる、続いて、薬物部分Dと反応させる；又は、(2)薬物部分の反応性置換基を、2価リンカー試薬と反応させて、D-L-Z'を形成させる、続いて、本明細書中上記のような抗体、又はその抗原結合フラグメントの反応性置換基と反応させる。ADCを調製するための更なる方法は、本明細書中に記載される。
【０２９６】
別の態様において、前記抗-CD137抗体、又はその抗原結合フラグメントは、1つ以上のスルフヒドリル基を導入するために化学的に修飾され得る1つ以上のリジン残基を有する。次いで、前記ADCを、本明細書中上記に記載するように、スルフヒドリル基の硫黄原子を介してコンジュゲートすることによって形成する。リジンを修飾するために使用することができる試薬としては、限定されるものではないが、N-スクシンイミジルS-アセチルチオアセテート(SATA)及び2-イミノチオラン塩酸塩(Traut’s試薬)が挙げられる。
【０２９７】
別の態様において、前記抗-CD137抗体、又はその抗原結合フラグメントは、1つ以上のスルフヒドリル基を有するように化学的に修飾され得る1つ以上の糖鎖部分(carbohydrate groups)を有することがある。次いで、前記ADCを、本明細書中上記に記載されるように、スルフヒドリル基の硫黄原子を介してコンジュゲートすることによって形成する。
【０２９８】
更に別の態様において、前記抗-CD137抗体は、酸化されてアルデヒド(-CHO)基を提供し得る1つ以上の糖鎖部分(carbohydrate groups)を有することがある(例えば、Laguzza, et al., J. Med. Chem. 1989, 32(3), 548-55を参照のこと)。次いで、前記ADCを、本明細書中上記に記載されるように、対応するアルデヒドを介してコンジュゲートすることによって形成する。細胞毒素を結合させる又は会合させるためのタンパク質を改変する他のプロトコールは、Coligan et al., Current Protocols in Protein Science, vol. 2, John Wiley & Sons (2002)に記載されている（本明細書に参照により取り込まれる）。
【０２９９】
抗体、免疫グロブリン又はそのフラグメント等の細胞にターゲットするタンパク質に、リンカー-薬物部分をコンジュゲートさせるための方法は、例えば、米国特許第5,208,020号; 米国特許第6,441,163号; WO2005037992; WO2005081711; 及びWO2006/034488に記載されている（これらの全ては、その全体が本明細書に明確に参照により取り込まれる）。
【０３００】
投与経路及び用量
或いは、前記抗体及び細胞毒性薬物を含む融合タンパク質を、例えば、組換え技術又はペプチド合成によって、作製することがある。DNAの長さは、互いに隣接した、又は前記コンジュゲートの所望の特性を破壊しないリンカー・ペプチドをコードする領域によって分離された、前記コンジュゲートの2つの部分をコードするそれぞれの領域を含むことがある。
【０３０１】
本明細書中に記載するADCを、種々の投薬形態で患者(例えば、自己免疫疾患又はがんに罹患しているヒト患者)に投与することがある。例えば、本明細書中に記載するADCを、自己免疫疾患又はがんに罹患している患者に、水溶液（例えば、1種以上の薬学的に許容可能な賦形剤を含む水溶液等）の形態で投与することがある。本明細書に記載の組成物及び方法と共に使用するために好適な薬学的に許容される賦形剤には、粘度調整剤が含まれる。前記水溶液を、当該技術分野で公知の技術を使用して滅菌することがある。
【０３０２】
本明細書中に記載するような抗-CD137 ADCを含む医薬製剤は、このようなADCを、1種以上の任意選択的な薬学的に許容可能な担体と混合することによって(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition、Osol、AEd.(1980))、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で、調製される。薬学的に許容可能な担体は、一般に、使用する用量及び濃度で、レシピエントに対して無毒性であり、これには、限定されるものではないが、以下が挙げられる：リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存剤（塩化オクタデシルジメチルベンジル・アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル若しくはベンジル・アルコール；メチル若しくはプロピル・パラベン等のアルキル・パラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；3-ペンタノール；及びm-クレゾール等）；低分子量(約10残基未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、若しくはデキストリンなどの他の糖類；EDTAなどのキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロース、若しくはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成性対イオン；金属錯体（例えば、Zn-タンパク質錯体）；並びに／又はポリエチレン・グリコール（PEG）などの非イオン性界面活性剤。
【０３０３】
投与するADCの量は、同種異系細胞療法（例えば、CAR細胞療法）を拒絶する細胞(例えば、活性化T細胞)を減少させるのに充分であるべきである。治療的に有効な用量を決定することは当業者の能力の範囲内であるが、例えば、免疫疾患又はがんを治療するために、ADCを全身投与するのに利用する本明細書に記載の方法の実施形態では、有効なヒト用量は、0.1〜150 mg/kgの範囲(例えば、5 mg/kg、10 mg/kg、25 mg/kg、50 mg/kg、75 mg/kg、100 mg/kg、150 mg/kg等)にあるであろう。その投与経路は、推奨用量に影響を及ぼす可能性がある。採用する投与様式に依存しつつ、有効なレベルを維持するために、例えば、CAR-T細胞拒絶のリスクを減少させるために、全身投与を繰り返すことが意図される。
【０３０４】
本明細書に記載する抗-CD137 ADCを、経口、経皮、皮下、鼻腔内、静脈内、筋肉内、眼内、又は非経口などの様々な経路によって投与することがある。任意の所与の症例において投与するのに最も好適な経路は、具体的なADC、患者、医薬製剤方法、投与方法(例えば、投与時間及び投与経路)、患者の年齢、身体の重量、性別、治療する疾患の重症度、患者の食事、及び患者の排泄速度に依存する。
【０３０５】
本明細書中に記載する抗-CD137 ADCの有効用量は、例えば、単回(例えば、ボーラス)投与、複数回投与、又は持続投与あたりで、体重に関して約0.001〜約100 mg/kgの範囲にすることで、前記抗-CD137 ADCは最適な血中濃度(例えば、0.0001〜5000 μg/mLの血中濃度)になることがある。前記抗-CD137 ADCの1回用量を、前記抗-CD137 ADCを投与した後の時間にCAR療法を同時に受けている、又は受ける予定のヒト患者に、1日、1週間、又は1ヶ月あたり1回以上(例えば、2〜10回)、投与することがある。抗-CD137 ADCを、ヒト患者に1回又は複数回用量として投与することがある。ある実施形態では、前記抗-CD137 ADCを、宿主反応性T細胞の量を減少させる（例えば、CAR療法前の10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、又はそれ以上）のに充分な量で、投与することがある。
【実施例】
【０３０６】
以下の実施例は、本明細書中に記載される組成物及び方法がどのように使用され、作製され、そして評価され得るかの記載を当業者に提供するために提示され、そして純粋に本発明の例示であることが意図され、及び本発明者らがそれらの発明とみなす範囲を限定することは意図されていない。実施例１〜３のデータを、以前に、国際特許出願WO2018/134787号(2018年7月26日公開)の中で提示しており、その全内容は参照により本明細書に取り込まれる。
【０３０７】
実施例１．in vitro T細胞傷害アッセイを用いる、抗-CD137-アマニチン抗体薬物コンジュゲート(ADC)のin vitro解析
凍結保存されたネガティブに選択された初代ヒトT細胞を解凍し、抗-CD3／抗-CD28ビーズ(Invitrogen)と、0.5:1のビーズ：細胞の比で刺激した。アッセイの開始時に、384ウェル・プレートのウェル当たり2×104個のT細胞を播種し、ADCを、0.003nM〜30 nMの間の種々の濃度でウェルに添加した後、37℃及び5% CO2のインキュベーターの中に置いた。4日間の培養をした後、細胞をフロー・サイトメトリーによって解析した。細胞を生存率マーカーLive/Dead Yellow (Invitrogen)で染色し、体積フロー・サイトメーター（volumetric flow cytometer）で測定した。生存している、活性化細胞の数(図１Ａ)及び生存している、非-活性化細胞の数(図１Ｂ)を、FSC対SSCによって測定した。アマニチンにコンジュゲートした非-特異的なヒトIgG(hIgG-アマニチン)を、ネガティブ・コントロールとして使用した。こうして、コントロールを二種の異なるADCと比較した：1)アマニチンにコンジュゲートしたキメラ抗-CD137抗体BBK2（CD137-アマニチン）；及び2)アマニチンにコンジュゲートしたT-細胞抗原に特異的な抗体を含むADC（抗-T細胞-アマニチン）。前記抗-T細胞-アマニチンADCは、活性化及び非-活性化T細胞の両方に結合して傷害を加えるので、これをポジティブ・コントロールとして使用した。
【０３０８】
図１Ａ及び１Ｂに示すように、前記抗-CD137-アマニチンADC(即ち、「CD137-アマニチン」)は活性化T細胞を特異的に傷害し、非-活性化(休止、定常状態)T細胞を有意には傷害しなかった。更に、活性化及び非-活性化T細胞の両方を特異的にターゲットとするADCであるポジティブ・コントロール(即ち、「抗-T細胞-アマニチン」ADC)は、活性化及び非-活性化T細胞の両方を傷害した。
【０３０９】
実施例２．Xeno-GvHDマウス・モデルを用いたGvHD予防に関する解析
GvHDの形成又は発生を予防する抗-CD137-アマニチンADCの作用能を、xeno-GvHDマウス・モデルを用いてin vivoで評価した。メス、6〜8週齢のNSGマウスを放射線照射し(200cGy)、翌日、6×106ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を移植し、GvHDマウス・モデルを作製した。1日後、動物に、抗-CD137-アマニチンADC(即ち、「CD137-アマニチン」)、又は様々なコントロール試薬(即ち、バッファ単独(「PBS」)、抗-CD137抗体(「CD137そのまま(naked)」)、又はCD137に特異的ではないアマニチン・ベースのADC(「アイソタイプ-アマニチン」))を(3mg/kgで)投与した。ADCのこの実施例及びそのままの(naked)抗体として使用した抗-CD137抗体は、キメラBBK2である。
【０３１０】
投与後、毎日、GvHDの徴候及び／又は身体状態の低下(限定されるものではないが、円背姿勢、波打った被毛、体重減少、及び／又は活動が減少すること等を含む)について、動物を詳細に追跡した。身体状態に重大な問題がある動物、又は体重減少が>20%を示した動物を屠殺し、その組織をヒトの細胞について解析した。マウスの末梢血及び脾臓を、hCD45、mCD45、hCD3、及びhCD137抗体等を含む抗体のカクテルで染色し、赤血球細胞を可溶化し、フロー・サイトメトリーによって解析した。血中のヒトT細胞の数をhCD45+CD3+と定義し、インプットした血液量に対して正規化した。処置後の日数を横軸としての生存パーセントを図２に示す。移植後日数を横軸としての末梢血中のヒトT細胞の数を図３に示す。
【０３１１】
図２に示すように、前記抗-CD137-アマニチンADC(「CD137-アマニチン」)の単回用量で処置した動物では、移植後80日でさえ、GvHDが本質的に完全に予防された。しかし、一方、コントロール(即ち、PBS、抗-CD137抗体(そのまま(naked))、及びアイソタイプ-アマニチン)で処置した動物は全て、移植後11〜13日以内に死亡した。これらの結果はまた、前記抗-CD137-アマニチンADCは、全ての動物において良好な忍容性を示し、(複数回用量を必要とすることとは反対に) 単回用量の抗-CD137-アマニチンADCは、GvHDを完全に予防するのに充分であったことを示している。図３に示すように、抗-CD137-アマニチンで処置したマウスでは、移植後少なくとも70日間にわたって、マウスの末梢血中にヒトT細胞は検出されなかった。しかし、一方、コントロールで処置した動物は、移植後数日間のマウスの末梢血中に、ヒトT細胞が検出可能であること（これは、コントロールで処置した動物では、GvHDが発症していることを示している）が同定された。
【０３１２】
実施例３．hNSG-SGM3マウス・モデルにおける定植率と定常状態でのT細胞減少の測定
hCD45、mCD45、hCD3、及びhCD137抗体を用いたフロー・サイトメトリーにより、メス、ヒト化NSG-SGM3マウスを、その末梢血におけるベースライン・ヒト造血(全体及びT-細胞)定植率について評価した。マウスをランダムに振り分け、CD137-アマニチン ADC（キメラBBK2-アマニチン ADC）、アイソタイプ-アマニチン ADC、又は抗-T細胞-アマニチン ADCを、各々3 mg/kg の用量で処置した。前記マウスの末梢における定植及びT細胞の減少を、処置後5日目、9日目、14日目、22日目及び27日目に測定した(図４Ａ及び４Ｂ)。末梢血を染色して、キメラ性及びT細胞数の変化を評価した。等量の血液を体積フロー・サイトメーター（volumetric flow cytometer）に乗せて、イベント数に基づいて絶対カウントを測定した。定植及びT細胞数の低下は、ベースライン値で正規化した。
【０３１３】
図４Ａ及び４Ｂの結果は、前記抗-CD137-アマニチンADCが、このマウス・モデルにおいて良好な忍容性を示したことを示す。更に、定植及びT細胞の頻度(ベースラインで正規化した後)は、ベースライン・レベル付近のままであり、前記抗-CD137-アマニチンADCで処置したマウスについては、定植及びT細胞の頻度の減少は、中等度から一過的であった。これらのデータから、定常状態のヒト化NSGマウスでは、一般にT細胞は減少しないことが示され、このことは、抗-CD137-アマニチンADCで処置したマウスでは、T細胞の大部分は減少していないため、その免疫機能は保持され得ることを示している。逆に、別のT細胞マーカー(「抗-T細胞-アマニチン」)を特異的にターゲットとするADCで処置したマウスでは、定植及びT細胞の数が完全に無くなった。
【０３１４】
上記実施例に記載したキメラBBK2の重鎖及び軽鎖アミノ酸配列は、配列番号(SEQ ID NO)11及び12として、それぞれ、記載する。
【０３１５】
実施例４．マウス・モデルにおける同種異系CAR-T細胞の投与
以下の研究を行って、様々な条件下で同種異系レシピエント(recipient)中に存在するCAR-T細胞のレベルを評価する。
【０３１６】
この研究では、マウスの同種異系CAR-Tモデルを用いる。ある好適なモデルは、Ghosh et al., Nature Medicine(2017),23(2):242-249に記載されている。
【０３１７】
第1の処置群のマウスを、0日目に1×107〜1×109 細胞／kgを静脈内注入することによって、同種異系T細胞の初回用量で処置する。3日目に、前記マウスに抗-CD137-α-アマニチンADCを3 mg/kgの用量で投与する。10日目に、前記ADCが前記マウスの血中から実質的にクリアランスされた後、マウスに同種異系のCAR-T細胞を投与する。前記CAR-T細胞は、0日目に投与した同種異系T細胞と同じドナー(donor)に由来する。
【０３１８】
第2の処置群のマウスを、第1の処置群と同じプロトコルを用いて処置する、但し、抗-CD137 ADCの代わりに、3日目に非コンジュゲートの抗-CD137抗体を投与する。
【０３１９】
第3の処置群のマウスを、第1の処置群と同じプロトコルを用いて処置する、但し、抗-CD137 ADCの代わりに、3日目にα-アマニチンにコンジュゲートしたアイソタイプ・コントロールの抗体を投与する。
【０３２０】
第4の処置群のマウスを、第1の処置群と同じプロトコルを用いて処置する、但し、同種異系T細胞の代わりに、0日目に初回用量の自己T細胞を投与する。
【０３２１】
第5の処置群のマウスは、前処置なしに、10日目に同種異系CAR-T細胞を投与する。
【０３２２】
第6の処置群のマウスは、前処置なしに、10日目に自己CAR-T細胞を投与する。
【０３２３】
14日目、17日目、及び30日目に、各処置群から得られたマウスの脾臓及び末梢血中に存在するCAR-T細胞の個数を測定する。9日目に、各処置群から得られたマウスの脾臓及び末梢血中のCD137+活性化T細胞の個数を測定する。本試験期間を通じて、GVHDの症状(symptom)及びCAR-T細胞の存在についてマウスをモニターする。
【０３２４】
実施例５．同種異系細胞療法の拒絶反応を予防するための、抗-CD137抗体薬物コンジュゲートのヒト患者への投与
同種異系CAR細胞療法などの同種異系細胞療法を受けるヒト患者を選択する。同種異系細胞の拒絶を阻害又は予防するために、抗-CD137抗体薬物コンジュゲート(ADC)を、本明細書中に開示する方法に従って投与する。医師は、以下の治療ステップを行う。
【０３２５】
まず最初に、同種異系細胞に対するプライミング免疫反応を誘発するのに充分な量で、初回用量の同種異系細胞を、前記患者に静脈内投与する。プライミング段階では、同種異系細胞を前記患者に投与して、内因性の活性化CD137+ T細胞が生じる免疫反応を誘発させる。
【０３２６】
続いて、前記患者に、リンカーを介して細胞毒素にコンジュゲートした抗-CD137抗体を含む抗-CD137 ADCを投与する。前記抗-CD137 ADCは、内因性のCD137+活性化T細胞を減少させるのに有効な量で投与する。前記抗-CD137 ADCを投与した後に、CD137+活性化T細胞のレベルを評価し、減少を確認する。
【０３２７】
次に、治療有効量のCARを発現する同種異系細胞を投与する。前記同種異系細胞は、プライミング・ステップの間に、前記患者に投与した細胞と同じドナー(donor)に由来する。プライミング及び抗-CD137 ADCの投与を行わずに同種異系細胞療法を受けている患者と比較して、レシピエント(recipient)患者における同種異系細胞の受容が促進され、宿主対移植片(HvG)反応のリスクが低下する。
【０３２８】
【表４−１】
2021530546.tif 000125
【表４−２】
2021530546.tif 000126
【表４−３】
2021530546.tif 000127
【０３２９】
他の実施形態
本明細書において言及する全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかも各独立した刊行物又は特許出願を具体的かつ個別に示して参照により組み込まれるように、同じ程度まで、本明細書に参照により取り込まれる。
【０３３０】
本発明をその特定の実施形態に関連させて説明してきたが、本発明は更なる改変が可能であり、本出願は、広く、本発明の原理に従い、本発明が関係する技術内の既知の又は慣例的な実施の範囲内に入り、本明細書で前述され、特許請求の範囲に従う本質的な特徴に適用され得るような、本発明からの逸脱を含む、本発明の任意の変形、使用、又は適応を包含することが意図されることを理解されたい。
【０３３１】
他の実施形態は、請求項の範囲内である。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト対象に移植された同種異系細胞の拒絶を治療する又は予防するための方法、ここで、前記方法は、前記ヒト対象において、同種異系細胞の拒絶を治療する又は予防するように、以下を含む、
(a) 前記ヒト対象に、第1の量の同種異系細胞を投与すること、ここで、前記第1の量は、前記ヒト対象中で同種異系細胞に対するプライミング応答を誘発するのに十分である；
(b) 内因性のCD137+活性化T細胞が減少するように、前記ヒト対象に、抗-CD137抗体薬物コンジュゲート(ADC)を投与すること、ここで、前記抗-CD137 ADCは、リンカーを介して細胞毒素にコンジュゲートした抗-CD137抗体又はその抗原結合フラグメントを含む；並びに、
(c) 前記ヒト対象に、治療有効量のCARを発現する同種異系細胞を投与すること、ここで、前記同種異系細胞は、(a)で投与される同種異系細胞と同じタイプである、及び、前記CARは、腫瘍抗原に結合する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナリング・ドメインを含む。
【請求項２】
請求項１に記載の方法、ここで、前記方法は、ステップ(b)の約48時間〜約7日前に、前記ヒト対象に、第1の量の同種異系細胞を投与することを含む。
【請求項３】
請求項１に記載の方法、ここで、前記方法は、ステップ(b)の約48時間〜約7日前に、前記ヒト対象に、治療有効量の前記CARを発現する同種異系細胞を投与することを含む。
【請求項４】
ヒト対象に移植された同種異系細胞の拒絶を治療する又は予防するための方法、ここで、前記方法は、前記ヒト対象において、同種異系細胞の拒絶を治療する又は予防するように、以下を含む、
(a) 前記ヒト対象に、抗-CD137抗体薬物コンジュゲート(ADC)を投与すること、ここで、前記抗-CD137 ADCは、リンカーを介して細胞毒素にコンジュゲートした抗-CD137抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、及びここで、前記ヒト対象は、前記ヒト対象に以前に投与された同種異形細胞に対する活性化T細胞を有することを特徴とする；並びに、
(b) 前記ヒト対象に、治療有効量のCARを発現する同種異系細胞を投与すること、ここで、前記同種異系細胞は、(a)で記載される同種異系細胞と同じタイプである、及び、前記CARは、腫瘍抗原に結合する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナリング・ドメインを含む。
【請求項５】
請求項４に記載の方法、ここで、前記方法は、ステップ(a)の約24時間〜約14日後に、前記ヒト対象に、治療有効量の前記CARを発現する同種異系細胞を投与することを含む。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか一項に記載の方法、ここで、前記同種異系細胞は、同種異系T細胞又は同種異系NK細胞である。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか一項に記載の方法、ここで、前記治療有効量の前記CARを発現する同種異系細胞は、約2×106〜約3.0×108 細胞/kgである。
【請求項８】
請求項１〜７の何れか一項に記載の方法、ここで、同種異系細胞の拒絶は、サイトカイン放出症候群(CRS)を特徴とする。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか一項に記載の方法、ここで、前記ヒト対象は、がん又は自己免疫疾患を有する。
【請求項１０】
請求項１〜９の何れか一項に記載の方法、ここで、前記抗-CD137抗体又はその抗原結合フラグメントは、それぞれ、配列番号(SEQ ID NO) 19、20、及び21に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2、及びCDR3を含む重鎖可変領域を含む、並びに、それぞれ、配列番号(SEQ ID NO)23、24、及び25に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2、及びCDR3を含む軽鎖可変領域を含む。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法、ここで、前記抗-CD137抗体又はその抗原結合フラグメントは、キメラ化又はヒト化されている。
【請求項１２】
請求項１〜１１の何れか一項に記載の方法、ここで、前記抗-CD137抗体又はその抗原結合フラグメントは、IgG1アイソタイプ又はIgG4アイソタイプである。
【請求項１３】
請求項１〜１２に記載の方法、ここで、前記細胞毒素は、抗有糸分裂薬剤又はRNAポリメラーゼ阻害剤である。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法、ここで、前記RNAポリメラーゼ阻害剤は、アマトキシンである。
【請求項１５】
請求項１３に記載の方法、ここで、前記RNAポリメラーゼ阻害剤は、アマニチンである。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法、ここで、前記アマニチンは、α-アマニチン、β-アマニチン、γ-アマニチン、ε-アマニチン、アマニン、アマニンアミド、アマヌリン、アマヌリン酸、及びプロアマヌリンからなる群から選択される。
【請求項１７】
請求項１４に記載の方法、ここで、アマトキシンにコンジュゲートした抗-CD137抗体又はその抗原結合フラグメントは、式Ab-Z-L-Amによって表される、ここで、Abは抗体又はその抗原結合フラグメントである、Lはリンカーである、Zは化学的な部分構造である、及びAmは式(III)によって表されるアマトキシンである、
【化１】
2021530546.tif 000128
ここで、
R1は、H、OH、ORA、又はORCである；
R2は、H、OH、ORB、又はORCである；
RA 及びRBは、存在する場合、それらが結合している酸素原子と一緒になって、任意選択的に置換された5員ヘテロシクロアルキル基を形成する；
R3は、H、RC、又はRDである；
R4、R5、R6、及びR7は、それぞれ独立してH、OH、ORC、ORD、RC、又はRDである；
R8は、OH、NH2、ORC、ORD、NHRC、又はNRCRDである；
R9は、H、OH、ORC、又はORDである；
Qは、-S-、-S(O)-、又は-SO2-である；
RCは、-L-Zである；
RDは、任意選択的に置換されたC1-C6アルキル、任意選択的に置換されたC1-C6ヘテロアルキル、任意選択的に置換されたC2-C6アルケニル、任意選択的に置換されたC2-C6ヘテロアルケニル、任意選択的に置換されたC2-C6アルキニル、任意選択的に置換されたC2-C6ヘテロアルキニル、任意選択的に置換されたシクロアルキル、任意選択的に置換されたヘテロシクロアルキル、任意選択的に置換されたアリール、又は任意選択的に置換されたヘテロアリールである；
Lは、リンカーである；及び、
Zは、L上に存在する反応性置換基と、抗-CD137抗体又はその抗原結合フラグメント内に存在する反応性置換基との間のカップリング反応から形成される化学的な部分構造である、ここで、Amは正確に1つのRc置換基を含む。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法、ここで、前記リンカーは、任意選択的に置換されたC1-C6アルキル、任意選択的に置換されたC1-C6ヘテロアルキル、任意選択的に置換されたC2-C6アルケニル、任意選択的に置換されたC2-C6ヘテロアルケニル、任意選択的に置換されたC2-C6アルキニル、任意選択的に置換されたC2-C6ヘテロアルキニル、任意選択的に置換されたシクロアルキル、任意選択的に置換されたヘテロシクロアルキル、任意選択的に置換されたアリール、任意選択的に置換されたヘテロアリール、ジペプチド、-(C=O)-、-(CH2)mO)n(CH2)m-、ここでm及びnは、それぞれ独立して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10から選択されたものである；又はそれらの組み合わせ、である。
【請求項１９】
請求項１３に記載の方法、ここで、前記抗有糸分裂薬剤は、メイタンシン、カリケアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、インドリノベンゾジアゼピン又はアウリスタチンである。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法、ここで、前記アウリスタチンは、モノメチル・アウリスタチンF(MMAF)又はモノメチル・アウリスタチンE(MMAE)である。
【請求項２１】
請求項１〜２０の何れか一項に記載の方法、ここで、前記ADCのリンカーは、N-ベータ-マレイミドプロピオニル-Val-Ala-パラ-アミノベンジル(BMP-Val-Ala-PAB)である。
【請求項２２】
請求項１〜５の何れか一項に記載の方法、ここで、前記ADCは、以下の構造の何れか1つによって表される：
【化２】
2021530546.tif 000129
【請求項２３】
請求項１〜５の何れか一項に記載の方法、ここで、前記ADCは、以下によって表される：
【化３】
2021530546.tif 000130
又は、
【化４】
2021530546.tif 000131
【請求項２４】
請求項１〜２３の何れか一項に記載の方法、ここで、前記ADCは、3日以下の血清半減期を有する。
【請求項２５】
請求項１〜２４の何れか一項に記載の方法、ここで、前記細胞外ドメインは、scFv抗体又は単鎖T細胞レセプター(scTCR)を含む。
【請求項２６】
請求項１〜２４の何れか一項に記載の方法、ここで、前記細胞外ドメインは、非-免疫グロブリン・スキャフォールド・タンパク質(scaffold protein)を含む。
【請求項２７】
請求項１から２６の何れか一項に記載の方法、ここで、前記CARの細胞外ドメインは、CD19、CD22、CD30、CD7、BCMA、CD137、CD22、CD20、AFP、GPC3、MUC1、メソテリン、CD38、PD1、EGFR(例えば、EGFRvIII)、MG7、BCMA、TACI、CEA、PSCA、CEA、HER2、MUC1、CD33、ROR2、NKR-2、PSCA、CD28、TAA、NKG2D、又はCD123からなる群より選択される腫瘍抗原に結合する。
【請求項２８】
請求項１から２７の何れか一項に記載の方法、ここで、前記CARの細胞内シグナリング・ドメインは、CD28細胞内シグナリング・ドメイン、CD3ゼータ細胞内シグナリング・ドメイン、OX40細胞内シグナリング・ドメイン、及び／又はCD137細胞内シグナリング・ドメインを含む。
【請求項２９】
請求項１〜２８の何れか一項に記載の方法、ここで、前記CARの細胞内シグナリング・ドメインは、CD3ゼータ細胞内シグナリング・ドメインを含む。
【請求項３０】
請求項９に記載の方法、ここで、前記がんは、白血病、成人進行がん、膵臓がん、切除不能な膵臓がん、結腸直腸がん、転移性結腸直腸がん、卵巣がん、トリプル-ネガティブ乳がん、造血系／リンパ系がん、大腸がん肝臓転移、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、B細胞リンパ腫、再発性又は難治性B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞リンパ腫、再発性又は難治性びまん性大細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、原発性縦隔B細胞リンパ腫、再発性縦隔、難治性縦隔大細胞型B細胞リンパ腫、大細胞型B細胞リンパ腫、ホジキン・リンパ腫、非-ホジキン・リンパ腫、再発又は難治性非-ホジキンリンパ腫、難治性進行性非-ホジキンリンパ腫、B細胞性非-ホジキン・リンパ腫、難治性非-ホジキンリンパ腫、結腸直腸がん腫(colorectal carcinoma)、胃がん(gastric carcinoma)、膵がん(pancreatic carcinoma)、トリプルネガティブ浸潤性乳がん(triple-negative invasive breast carcinoma)、腎細胞がん(renal cell carcinoma)、肺扁平上皮がん(lung squamous cell carcinoma)、肝細胞がん(hepatocellularcarcinoma)、尿路上皮がん(urothelial carcinoma)、白血病、B細胞性白血病、B細胞性急性リンパ球性白血病（B-cell acute lymphocytic leukemia）、B細胞性急性リンパ芽球性白血病（B-cell acute lymphoblastic leukemia）、成人急性リンパ芽球性白血病、B細胞性前リンパ球性白血病（B-cell prolymphocytic leukemia）、小児急性リンパ芽球性白血病(childhood acute lymphoblastic leukemia)、難治性小児急性リンパ芽球性白血病(refractory childhood acute lymphoblastic leukemia)、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ球性白血病、前リンパ球性白血病(prolymphocytic leukemia)、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、再発性プラズマ細胞性骨髄腫(recurrent plasma cell myeloma)、難治性プラズマ細胞性骨髄腫(refractory plasma cell myeloma)、多発性骨髄腫、再発性又は難治性多発性骨髄腫、骨の多発性骨髄腫、脳の悪性神経膠腫(malignant glioma of brain)、骨髄異形成症候群、EGFR陽性結腸直腸がん、多形性膠芽腫(glioblastoma multiforme)、新生物、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍(blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm)、肝臓転移、固形腫瘍、進行性固形腫瘍(advanced solid tumor)、メソテリン陽性腫瘍(mesothelin positive tumor)、血液悪性腫瘍、及びその他の進行した悪性腫瘍、である。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図１Ａ
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１Ａ】
2021530546.tif 000132
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図１Ｂ
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１Ｂ】
2021530546.tif 000133
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図２】
2021530546.tif 000134
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図３】
2021530546.tif 000135
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図４Ａ
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図４Ａ】
2021530546.tif 000136
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図４Ｂ
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図４Ｂ】
2021530546.tif 000137
【国際調査報告】
2021530546.tif 000138
2021530546.tif 000139
2021530546.tif 000140