(57)【要約】  トランスジェニックＴ細胞及びトランスジェニックＴ細胞を作製するためのベクターが記載されている。ベクターは、膜結合抗ＩＬ６（ｍｂ−ａＩＬ６）単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をコードする核酸を含むことができ、且つトランスジェニックＴ細胞はｍｂ−ａＩＬ６を発現することができる。トランスジェニックＴ細胞は、ＩＬ−６依存性細胞の増殖の抑制、ＩＬ−６濃度の低下、又はその両方に有用である。一実施形態では、ベクターは、ｍｂ−ａＩＬ６及び抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−００３ζキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするバイシストロニック構築物である。別の実施形態では、抗ＩＬ−６  ｓｃＦｖを４１ＢＢ及び００３ζドメインに連結して抗ＩＬ−６  ＣＡＲを形成することができる。前記構築物を発現するトランスジェニックＴ細胞は、ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置された癌患者のサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）のリスクを低減することができる、又はサイトカインが病因に関与している自己免疫疾患及び炎症性疾患の処置に使用することができる。
2021519593.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜結合抗ＩＬ６（ｍｂ−ａＩＬ６）単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をコードする核酸を含むベクターであって、前記ｍｂ−ａＩＬ６  ｓｃＦｖが：
ａ）抗ＩＬ−６可変軽鎖ドメイン、抗ＩＬ−６可変重鎖ドメイン、及び前記可変軽鎖ドメインと前記可変重鎖ドメインを連結するリンカードメインを含む抗ＩＬ６単鎖可変断片（抗ＩＬ６  ｓｃＦｖ）；並びに
ｂ）前記抗ＩＬ６  ｓｃＦｖに結合されたヒンジ及び膜貫通ドメインを含む、ベクター。
【請求項２】
前記抗ＩＬ−６可変軽鎖ドメイン及び前記抗ＩＬ−６可変重鎖ドメインの１つ又は複数が、ヒト抗ＩＬ６可変軽鎖及び可変重鎖ドメインである、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
前記可変軽鎖ドメインが、配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項２に記載のベクター。
【請求項４】
前記可変重鎖ドメインが、配列番号８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項２に記載のベクター。
【請求項５】
前記リンカードメインが（Ｇ４Ｓ）xであり、式中、ｘが１〜１００の整数である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項６】
前記リンカードメインが（Ｇ４Ｓ）3である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項７】
前記ヒンジ及び膜貫通ドメインがＣＤ８αヒンジ及び膜貫通ドメインである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項８】
前記核酸が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらにコードする、請求項１〜４のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項９】
前記キメラ抗原受容体が、抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ＣＤ３ζキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項８のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１０】
前記ｍｂ−ａＩＬ６が、Ｐ２Ａ配列によって前記抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ＣＤ３ζに結合されている、請求項９のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１１】
抗ＩＬ６キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含むベクターであって、前記抗ＩＬ６  ＣＡＲが：
ａ）抗ＩＬ−６可変軽鎖ドメイン、抗ＩＬ−６可変重鎖ドメイン、及び前記可変軽鎖ドメインと前記可変重鎖ドメインを連結する第１のリンカードメインを含む抗ＩＬ６単鎖可変断片（抗ＩＬ６  ｓｃＦｖ）；
ｂ）前記抗ＩＬ６  ｓｃＦｖのＮ末端にある第２のリンカードメイン；
ｃ）前記第２のリンカードメインのＮ末端にあるヒンジ及び膜貫通ドメイン；並びに
ｄ）前記ヒンジ及び膜貫通ドメインのＮ末端にある細胞内シグナル伝達ドメインを含む、ベクター。
【請求項１２】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが４１ＢＢドメインである、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
前記細胞内シグナル伝達ドメインのＮ末端にある共刺激ドメインをさらに含む、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１４】
前記共刺激ドメインがＣＤ３ζドメインである、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１５】
哺乳動物のＩＬ−６濃度を低下させる方法であって：
膜結合抗ＩＬ６（ｍｂ−ａＩＬ６）単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をＴ細胞で発現させること、及び前記Ｔ細胞をＩＬ−６を含む液体に接触させることを含み、前記ｍｂ−ａＩＬ６が：
ａ）抗ＩＬ−６可変軽鎖ドメイン、抗ＩＬ−６可変重鎖ドメイン、及び前記可変軽鎖ドメインと前記可変重鎖ドメインを連結するリンカードメインを含む抗ＩＬ６単鎖可変断片（抗ＩＬ６  ｓｃＦｖ）；並びに
ｂ）前記抗ＩＬ６  ｓｃＦｖに結合されたヒンジ及び膜貫通ドメインを含む、方法。
【請求項１６】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｔ細胞を培養して、前記ｍｂ−ａＩＬ６を発現する新たなＴ細胞を作製することをさらに含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）のリスクを低減することをさらに含み、前記哺乳動物のＴ細胞がキメラ抗原受容体を発現する、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記哺乳動物が、自己免疫疾患、炎症性疾患、又はリンパ増殖性障害に罹患しており、前記哺乳動物のＩＬ−６濃度を低下させることにより前記自己免疫疾患、前記炎症性疾患、又は前記リンパ増殖性障害それぞれを処置する、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記哺乳動物が、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、移植片対宿主病、又はキャッスルマン病に罹患しており、ＩＬ−６濃度を低下させることにより関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、移植片対宿主病、又はキャッスルマン病それぞれを処置する、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１８年４月２日に出願された米国仮特許出願第６２／６５１，３１１号の利益を主張する。上記の出願の全教示が、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
ＡＳＣＩＩテキストファイル内の資料の参照による組み込み
本出願は、同時に提出された以下のＡＳＣＩＩテキストファイルに含まれる配列表を参照により組み込む：
ａ）ファイル名：４４５９１１４９００１ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ；２０１９年３月２９日作成、サイズ３３ＫＢ。
【背景技術】
【０００３】
インターロイキン−６（ＩＬ−６）は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、及び移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を含む複数の自己免疫疾患及び炎症性疾患の病因に関与する炎症誘発性サイトカインである。
【０００４】
ＩＬ−６はまた、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）でリダイレクトされるＴ細胞の注入の最も一般的な副作用の１つであるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）の発症にも関与している。ＣＲＳは、重症であり、場合によっては致命的であり得る。ＩＬ−６は、ＣＲＳの発症に重要であり、抗ＩＬ−６受容体抗体（トシリズマブ）は、現在その効果を抑制するために使用されている。
【０００５】
自己免疫疾患及びＣＲＳの重症度及び発生率を低下させるための方法が望ましい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書には、核酸、ベクター、及びトランスジェニック宿主細胞、並びにそれらを作製及び使用する方法が記載されている。核酸は、宿主細胞において核酸を発現させるために使用できるベクターに組み込むことができる。トランスジェニック宿主細胞は、ＩＬ−６などのサイトカインの濃度を低下させる方法において、宿主哺乳動物（例えば、ヒト）に導入（例えば、注入、移植（ｉｍｐｌａｎｔ）、移植（ｅｎｇｒａｆｔ）、注射）することができる。核酸は、ＩＬ−６などのサイトカインの濃度を低下させる方法において宿主哺乳動物（例えば、ヒト）で発現させることができる。
【０００７】
いくつかの実施形態では、ベクターは、膜結合抗サイトカイン単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をコードする核酸を含む。膜結合抗サイトカインは、抗サイトカイン単鎖可変断片（抗サイトカインｓｃＦｖ）、及び抗サイトカインｓｃＦｖに結合されたヒンジ及び膜貫通ドメインを含み得る。抗サイトカインｓｃＦｖは、抗サイトカイン可変軽鎖ドメイン、抗サイトカイン可変重鎖ドメイン、及び可変軽鎖ドメインと可変重鎖ドメインを連結するリンカードメインを含み得る。抗サイトカイン構築物は、ＩＬ−６（例えば、抗ＩＬ−６）、（ＴＮＦ）−α（例えば、抗ＴＮＦ−α）、ＩＬ−１β（例えば、抗ＩＬ−１β）、ＩＬ−１２（例えば、抗ＩＬ−１２）、ＩＬ−１７（例えば、抗ＩＬ−１７）、及びＩＬ−１８（例えば、抗ＩＬ−１８）、及びＩＦＮγ（例えば、抗ＩＦＮγ）などの多種多様なサイトカインに特異的であり得る。
【０００８】
いくつかの実施形態では、核酸は、膜結合抗ＩＬ６（ｍｂ−ａＩＬ６）単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をコードする。ｍｂ−ａＩＬ６は、抗ＩＬ６単鎖可変断片（抗ＩＬ６  ｓｃＦｖ）を含み得る。抗ＩＬ６  ｓｃＦｖは、抗ＩＬ−６可変軽鎖ドメイン、抗ＩＬ−６可変重鎖ドメイン、及び可変軽鎖ドメインと可変重鎖ドメインを連結するリンカードメインを含み得る。ヒンジ及び膜貫通ドメインは、抗ＩＬ６  ｓｃＦｖに結合することができる。いくつかの実施形態では、ベクターの核酸は、抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ＣＤ３ζなどのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらにコードし得る。
【０００９】
本明細書に記載のベクターを使用して、トランスジェニックＴ細胞などのトランスジェニック細胞を作製することができる。特にトランスジェニックＴ細胞を使用して、ＩＬ−６依存性細胞の増殖を抑制する、ＩＬ−６濃度を低下させる、又はその両方を行うことができる。いくつかの実施形態では、トランスジェニックＴ細胞を使用して、（例えば、癌で）処置されている哺乳動物などの哺乳動物（例えば、ヒト）におけるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）のリスク又は重症度を軽減することができる。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞で処置されている（例えば、癌で処置されている）。一例は、抗ＣＤ１９  ＣＡＲを発現するＴ細胞で癌の処置を受けている患者である。
【００１０】
また、トランスジェニックＴ細胞を使用して、サイトカインが自己免疫疾患、炎症性疾患、又はリンパ増殖性障害などの病因に関与している疾患又は障害に罹患している哺乳動物を処置することができる。自己免疫疾患の例には、関節リウマチ及び全身性エリテマトーデスが含まれる。炎症性疾患の例には、移植片対宿主病及び血球貪食性リンパ組織球症が含まれる。リンパ増殖性障害の一例はキャッスルマン病である。
【００１１】
前述は、同様の参照文字が様々な図面を通して同じ部分を指す添付の図面に例示されているように、例示的な実施形態の以下のより具体的な説明から明らかになるであろう。図面は、必ずしも縮尺通りではなく、代わりに実施形態の例示に重点が置かれている。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ−１Ｄ】図１Ａ〜図１Ｄは、ｍｂ−ａＩＬ６の設計及び発現に関する。図１Ａは、ｍｂ−ａＩＬ６構築物の概略図である。図１Ｂは、ＭＳＣＶ−ｍｂ−ａＩＬ６−ＩＲＥＳ−ＧＦＰプラスミドの概略図である。図１Ｃは、ＧＦＰのみ（「Ｍｏｃｋ」）又はＧＦＰとｍｂ−ａＩＬ６のいずれかで形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞のフローサイトメトリー分析である。ドットプロットは、ＧＦＰ蛍光と、ビオチン標識ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２抗体及びストレプトアビジン−ＡＰＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で染色した後のｍｂ−ａＩＬ６発現を例示している。図１Ｄは、ｍｏｃｋ又はｍｂ−ａＩＬ６−形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞に結合しているＩＬ−６のフローサイトメトリー分析である。ドットプロットは、ＧＦＰ蛍光と、ＩＬ−６ビオチン（Ａｂｃａｍ）及びストレプトアビジン−ＡＰＣで染色した後のＩＬ−６の結合を例示している。大豆トリプシン阻害剤（ＳＴＩ）−ビオチンを対照として使用した。
【図２Ａ−２Ｅ】図２Ａ〜図２Ｅは、ｍｂ−ａＩＬ６構築物の機能に関する。図２Ａは、ＩＬ−６のレベルを示すチャートである。ＧＦＰのみ（「Ｍｏｃｋ」）又はＧＦＰとｍｂ−ａＩＬ６のいずれかで形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞（２×１０6／ｍＬ）を、１ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ−６を含む組織培養培地で２時間培養した。培養の最後に、ＩＬ−６のレベルをＥＬＩＳＡで測定した。図２Ｂは、ＩＬ−６中和が細胞用量依存性であることを示すグラフである。異なる細胞濃度（０．２５〜２×１０6／ｍＬ）で試験し、培養の２時間後の上清中のＩＬ−６のレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。図２Ｃは、ＩＬ−６中和が時間依存性であることを示すグラフである。図２Ａに関して説明したように培養物を準備し、示された培養時間の後に上清中のＩＬ−６のレベルを測定した。細胞を１０分間、３０分間、６０分間、及び１２０分間インキュベートした。破線の曲線は、近似指数関数的減衰曲線を表す。図２Ｄは、ｍｂ−ａＩＬ６  Ｊｕｒｋａｔ細胞が低ＩＬ−６濃度でも有効性を維持したことを示すチャートである。図２Ａに関して説明したように培養物を準備したが、組織培養培地中のＩＬ−６の初期濃度は０．０２５〜０．２ｎｇ／ｍＬであり、Ｊｕｒｋａｔ細胞は０．５×１０6／ｍＬである。図２Ｅは、Ｊｕｒｋａｔ−ｍｂ−ａＩＬ６細胞の増殖を可能にすることによってＩＬ−６中和が促進されることを示すグラフである。図２Ａに関連して説明したように培養物を準備したが、初期細胞濃度は、０．２×１０6細胞／ｍＬであり；上清中のＩＬ−６を、２〜７２時間後にＥＬＩＳＡによって測定した。
【図３Ａ−３Ｂ】図３Ａ及び図３Ｂは、ｍｂ−ａＩＬ６を発現する細胞がＩＬ−６依存性シグナル伝達及び細胞増殖を抑止することを示す。図３Ａは、ＩＬ−６によって引き起こされるＵ９３７細胞におけるＳｔａｔ３リン酸化が、ｍｂ−ａＩＬ６  Ｊｕｒｋａｔ細胞への曝露によって妨げられることを示すチャートである。形質導入されていない（「ＷＴ」）又はＧＦＰとｍｂ−ａＩＬ６で形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞（２×１０6／ｍＬ）を、１ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ−６を含む組織培養培地で２時間培養した。次いで、上清を、３７℃で１５分間、Ｕ９３７細胞に加えた。ＩＬ−６を含む又は含まない組織培養培地（「Ｔ細胞なし」）を対照として使用した。バーは、抗ＰｈｏｓｐｈｏＳｔａｔ３抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｎｔｉ−Ｓｔａｔ３  ｐＹ７０５）で染色した後、フローサイトメトリーで測定したＳｔａｔ３リン酸化の平均（±ＳＤ）を示す。***Ｐ＜０．００１。図３Ｂは、ＤＳ−１細胞のＩＬ−６依存性増殖が、ｍｂ−ａＩＬ６  Ｊｕｒｋａｔ細胞への曝露によって抑制されることを示すグラフである。ｍＣｈｅｒｒｙで形質導入されたＤＳ−１及びｍｏｃｋ−形質導入又はｍｂ−ＩＬ６形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞をＩＬ−６（０．５ｎｇ／ｍＬ）と１：１の比率で共培養した。ＤＳ−１の増殖は、ＩｎｃｕＣｙｔｅ  ｌｉｖｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｓｓｅｎ）を用いて定量した；結果を、３回の測定における赤色較正単位（ＲＣＵ：ｒｅｄ  ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ  ｕｎｉｔ）×μｍ2／ウェルの平均（±ＳＤ）として表す。１２０時間の測定では**Ｐ＜０．０１。
【図４Ａ−４Ｄ】図４Ａ〜図４Ｄは、末梢血Ｔ細胞でのｍｂ−ａＩＬ６構築物の発現及び機能を示す。図４Ａは、ＧＦＰのみ（「Ｍｏｃｋ」）又はＧＦＰとｍｂ−ａＩＬ６のいずれかで形質導入された末梢血Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析である。ドットプロットは、ＧＦＰ蛍光と、ビオチン標識ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２抗体及びストレプトアビジンＡＰＣで染色した後のｍｂ−ａＩＬ６発現を例示している。図４Ｂは、ｍｏｃｋ又はｍｂ−ａＩＬ６形質導入末梢血Ｔ細胞に結合しているＩＬ−６のフローサイトメトリー分析である。ドットプロットは、ＧＦＰ蛍光、及びＩＬ−６ビオチンとストレプトアビジン−ＡＰＣで染色した後のＩＬ−６の結合を示している。図４Ｃは、抗ＣＤ３  ＡＰＣ、抗ＣＤ５６  ＰＥ、抗ＣＤ４  Ｖ４５０、及び抗ＣＤ８  ＰｅｒＣＰ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で標識された、ｍｏｃｋ又はｍｂ−ａＩＬ６形質導入末梢血Ｔ細胞の細胞マーカープロファイルである。図４Ｄは、ＤＳ−１細胞のＩＬ−６依存性増殖が、ｍｂ−ａＩＬ６  Ｔリンパ球への曝露によって抑制されることを示すグラフである。ｍＣｈｅｒｒｙで形質導入されたＤＳ−１及びｍｏｃｋ形質導入又はｍｂ−ａＩＬ６形質導入Ｔ細胞を、ＩＬ−６（０．５ｎｇ／ｍＬ）と１：１の比率で共培養した。ＤＳ−１の増殖を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ  ｌｉｖｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｓｓｅｎ）を用いて定量した；結果を、３連測定における赤色較正単位（ＲＣＵ）×μｍ2／ウェルの平均（±ＳＤ）として表す。１２０時間の測定では**Ｐ＜０．０１。
【図５Ａ−５Ｃ】図５Ａ〜図５Ｃは、ｍｂ−ａＩＬ６及び抗ＣＤ１９  ＣＡＲをコードするバイシストロニック構築物の設計、発現、及びＩＬ−６中和能力を示す。図５Ａは、両方の受容体（「ＤＵＡＬ」）を含むＭＳＣＶプラスミドの概略図である。図５Ｂは、ＧＦＰのみ（Ｍｏｃｋ）、ＧＦＰと抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ  ＣＡＲ、ｍｂ−ａＩＬ６のいずれか、又は両方で形質導入された末梢血Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析である。ドットプロットは、ビオチン標識ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２抗体及びストレプトアビジン−ＡＰＣで染色した後のｍｂ−ａＩＬ６発現、及びＣＤ１９−ｍｙｃ、続いてＲ−フィコエリトリン（ＰＥ）−標識抗ｍｙｃ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で染色した後の抗ＣＤ１９  ＣＡＲ発現を例示する。図５Ｃは、ｍｂ−ａＩＬ６  Ｔリンパ球によるＩＬ−６の中和がＣＡＲ共発現による影響を受けないことを示すグラフである。図５Ｂに関連して説明したように形質導入されたＴリンパ球を、１ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６を含む組織培養培地で培養した。２時間後、ＥＬＩＳＡによって上清中のＩＬ−６を測定した。
【図６Ａ−６Ｄ】図６Ａ〜図６Ｄは、ｍｂ−ａＩＬ６の発現が抗ＣＤ１９  ＣＡＲ機能に影響を及ぼさないことを示す。図６Ａは、１：１のＥ：Ｔ比で６時間、ＣＤ１９＋全細胞株ＯＰ−１と共培養したＴ細胞におけるＩＦＮ−γの産生を示すプロットである。ＩＦＮγの発現を、ＰＥ標識抗ヒトＩＦＮγ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した後にフローサイトメトリーによって測定した。記号は、３人のドナーからのＴ細胞で得られた３回の実験の結果を表す。図６Ｂは、１：１のＥ：Ｔ比で４時間、ＯＰ−１と共培養したＴ細胞におけるＣＤ１０７ａの発現を示すプロットである。ＣＤ１０７ａの発現を、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ１０７ａ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した後にフローサイトメトリーによって測定した。図６Ｃは、１：１のＥ：Ｔ比での４時間後のＯＰ−１に対するＴ細胞の細胞毒性を示すプロットである。図６Ｄは、１２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を用いて、１：１のＥ：Ｔ比で２１日間、照射ＯＰ−１を用いて又は用いずに共培養したＴ細胞の増殖を示す２つのチャートである。照射ＯＰ−１細胞を、０日目、７日目、及び１４日目に加えた。記号は３回の測定の平均（±ＳＤ）を表す。
【図７Ａ−７Ｂ】図７Ａ及び図７Ｂは、ＣＲＳのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおけるｍｂ−ａＩＬ６及び抗ＣＤ１９  ＣＡＲを発現するＴ細胞の機能を示す。図７Ａは、ＴＨＰ−１細胞を含めて又は含まずにｍＣｈｅｒｒｙ形質導入ＯＰ−１細胞と共培養したＴ細胞の細胞毒性を示す２つのグラフである（Ｔ細胞：ＯＰ−１：ＴＨＰ−１の比率が１：５：１）。ＯＰ−１細胞数を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｌｉｖｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｓｓｅｎ）を用いて定量した；結果を、３回の測定における赤色較正単位（ＲＣＵ）×μｍ2／ウェルの平均（±ＳＤ）として表す。図７Ｂは、ＥＬＩＳＡによって測定された、培養の４０時間後の図７Ａに示されている培養物の上清におけるＩＬ−６のレベルを示すチャートである。
【図８Ａ−８Ｃ】図８Ａ〜図８Ｃは、他のＩＬ−６中和受容体の概略図である。図８Ａは、分泌ａＩＬ６用の核酸構築物及び分泌ａＩＬ６を発現する細胞の概略図である。図８Ｂは、抗ＩＬ６  ＣＡＲを形成する、４１ＢＢドメイン及びＣＤ３ζドメインに連結された抗ＩＬ−６  ｓｃＦｖ用の核酸構築物の概略図である。図８Ｃは、抗ＩＬ６  ｓｃＦｖが、シグナル伝達能力が失われたＩＬ−６受容体によって置換されている核酸構築物の概略図である。
【図９Ａ−９Ｂ】図９Ａ及び図９Ｂは、Ｔ細胞におけるｍｂ−ａＩＬ６の発現がｉｎ  ｖｉｖｏでＩＬ−６を中和することを示す。ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃscid  ＩＬ２ｒｇtm1Wjl／ＳｚＪ（ＮＯＤ／ｓｃｉｄ  ＩＬ２ＲＧｎｕｌｌ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、０日目に１×１０6のＤＳ−１細胞を、２日目にＧＦＰのみ（Ｍｏｃｋ）又はＧＦＰプラスｍｂ−ａＩＬ６のいずれかで形質導入された１×１０7の末梢血Ｔ細胞を腹腔内注射した。腫瘍の生着及び増殖を、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ−２００システム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて測定した。すべてのマウスに、０日目から開始して２日ごとに１０００ＩＵのヒトＩＬ−６及び２００００ＩＵのヒトＩＬ−２を腹腔内投与した。図９Ａは、マウスの腹側及び背側の画像である。図９Ｂは、ルシフェラーゼを発現するＤＳ−１が移植されたマウスにおける発光の変化を示すチャートである。各記号は、１つの生物発光測定に対応し；線は、１匹のマウスにおけるすべての測定値をつないでいる。
【図１０Ａ−１０Ｆ】図１０Ａ〜図１０Ｆは、ｍｂ−ａＩＬ６の発現がｉｎ  ｖｉｖｏで抗ＣＤ１９  ＣＡＲ機能に影響を及ぼさないことを示す。ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃscid  ＩＬ２ｒｇtm1Wjl／ＳｚＪ（ＮＯＤ／ｓｃｉｄ  ＩＬ２ＲＧｎｕｌｌ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、０日目に０．５×１０6のＮａｌｍ−６細胞を、３日目に、抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ（ＣＡＲ）又はＣＡＲとｍｂ−ａＩＬ６（ＣＡＲ＋ｍｂ−ａＩＬ６）のいずれかで形質導入された２×１０7の末梢血Ｔ細胞を静脈注射した。腫瘍の生着及び増殖を、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ−２００システム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて測定した。すべてのマウスに、０日目から開始して２日ごとに２００００ＩＵのヒトＩＬ−２を腹腔内投与した。シグナル閾値が１０10光子／秒に達したときにマウスを安楽死させた。図１０Ａは、マウスの腹側及び背側の画像である。３日目の画像は、エンジニアリングされたＴ細胞の注入前の腫瘍の存在を示すために高い感度で処理した。図１０Ｂは、ルシフェラーゼを発現するＮａｌｍ−６が移植されたマウスにおける発光の変化を示すチャートである。図１０Ｃは、マウスの腹側と背側の画像である。３日目の画像は、エンジニアリングされたＴ細胞の注入前の腫瘍の存在を示すために高い感度で処理した。図１０Ｄは、５３日目のＣＡＲ  Ｔ細胞数を示すチャートである。マウスの血液を頬部を刺して得、ＣＡＲ  Ｔ細胞をフローサイトメトリーを用いて定量した。図１０Ｅは、マウスの生存曲線を示すチャートである。Ｔ細胞を注入しなかったマウスの曲線及びＣＡＲ−Ｔ細胞又はＣＡＲ−Ｔ＋ｍｂ−ａＩＬ６を注入したマウスの曲線をログランク検定で計算した（どちらの比較でもＰ＜０．０１）。図１０Ｆは、ルシフェラーゼを発現するＮａｌｍ−６が移植されたマウスにおける発光の変化を示すチャートである。各記号は、１つの生物発光測定に対応し；線は、１匹のマウスにおけるすべての測定値をつないでいる。
【図１１Ａ−１１Ｂ】図１１Ａ及び図１１Ｂは、ｍｂ−ａＴＮＦαの設計に関する。図１１Ａは、ｍｂ−ａＴＮＦα構築物の概略図である。図１１Ｂは、ＭＳＣＶ−ｍｂ−ａＴＮＦα−ＩＲＥＳ−ＧＦＰプラスミドの概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
実施形態の例の説明は次の通りである。
【００１４】
インターロイキン−６及びサイトカイン放出症候群
インターロイキン−６（ＩＬ−６）は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、関節リウマチ、及び全身性エリテマトーデスを含む複数の自己免疫疾患、炎症性疾患、及びリンパ増殖性障害の病因に関与する炎症誘発性サイトカインである。ＩＬ−６はまた、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）でリダイレクトされるＴ細胞の注入の最も一般的な副作用の１つであるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）の発症にも関与している。ＣＲＳは、重症であり、場合によっては致命的であり得る7-10。ＩＬ−６は、ＣＲＳの発症に重要であり、抗ＩＬ−６受容体抗体（トシリズマブ）は、現在その効果を抑制するために使用されている7-10。
【００１５】
本明細書に記載のベクターは、改変Ｔ細胞を作製するために使用することができ、この改変Ｔ細胞は、自己免疫疾患及びＣＲＳの処置に使用することができる。本明細書に記載のプロセスは、ＩＬ−６を中和し、それによりＣＲＳのリスク及び／又は重症度を低下させることができるトランスジェニックＴ細胞を作製するために使用することができる。本明細書に記載の特定の例は、ＩＬ−６をパラダイムとして使用するが、このアプローチは、自己免疫疾患及びＣＲＳの病因に関与する他のサイトカインの中和にも適用可能である。
【００１６】
核酸
本明細書で使用される「核酸」という用語は、複数のヌクレオチドモノマー（例えば、リボヌクレオチドモノマー又はデオキシリボヌクレオチドモノマー）を含むポリマーを指す。「核酸」には、例えば、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡ）、ＲＮＡ、及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド分子が含まれる。核酸分子は、天然、組換え、又は合成であり得る。加えて、核酸分子は、一本鎖、二本鎖、又は三本鎖であり得る。特定の実施形態では、核酸分子を修飾することができる。二本鎖ポリマーの場合、「核酸」は、分子の一方又は両方の鎖を指し得る。
【００１７】
「ヌクレオチド」及び「ヌクレオチドモノマー」という用語は、天然に存在するリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドモノマー、並びに天然に存在しないその誘導体及び類似体を指す。従って、ヌクレオチドは、例えば、天然に存在する塩基を含むヌクレオチド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、イノシン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、又はデオキシシチジン）及び当技術分野で公知の修飾塩基を含むヌクレオチドを含み得る。
【００１８】
本明細書で使用される「配列同一性」という用語は、最大レベルの同一性を達成するために配列がアラインメントされたときに、２つのヌクレオチド配列又は２つのアミノ酸配列が同じ位置に同じ残基を有する程度を指し、パーセンテージで表される。配列のアラインメント及び比較では、典型的には、１つの配列が参照配列として指定され、それに対して試験配列が比較される。参照配列と試験配列との間の配列同一性は、参照配列と試験配列が最大レベルの同一性を達成するためにアラインメントされたときに、参照配列と試験配列が同じヌクレオチド又はアミノ酸を共有する、参照配列の全長における位置のパーセンテージとして表される。一例として、最大レベルの同一性を達成するためにアラインメントされたときに、試験配列が参照配列の全長にわたって７０％の同じ位置で同じヌクレオチド又はアミノ酸残基を有する場合、２つの配列は７０％の配列同一性を有すると見なされる。
【００１９】
最大レベルの同一性を達成するための比較のための配列のアラインメントは、適切なアラインメント方法又はアルゴリズムを使用して当業者が容易に行うことができる。場合によっては、アラインメントは、最大レベルの同一性を提供するために導入されたギャップを含み得る。例として、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相動性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の同様の方法での検索、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実施（ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，ａｎｄ  ＴＦＡＳＴＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、及び目視検査（一般に、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙを参照）が挙げられる。
【００２０】
配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列がコンピューターに入力され、必要に応じて後続の座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列（複数可）のパーセント配列同一性を計算する。パーセント配列同一性を決定するために一般的に使用されるツールは、米国の国立衛生研究所の全米バイオテクノロジー情報センター、国立医学図書館から入手できるＰｒｏｔｅｉｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴＰ）である（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−１０（１９９０））。
【００２１】
様々な実施形態では、２つのヌクレオチド配列又は２つのアミノ酸配列は、少なくとも、例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有し得る。本明細書に記載の１つ又は複数の配列に対するパーセント配列同一性を確認する場合、本明細書に記載の配列は参照配列である。
【００２２】
いくつかの実施形態では、可変軽鎖ドメインは、配列番号４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、可変重鎖ドメインは、配列番号８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有する。
【００２３】
ベクター
「ベクター」、「ベクター構築物」、及び「発現ベクター」という用語は、宿主を形質転換して導入された配列の発現（例えば、転写及び翻訳）を促進するように、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列（例えば外来遺伝子）を宿主細胞に導入することができるビヒクルを意味する。ベクターは、典型的には、遺伝性物質のＤＮＡを含み、その中にタンパク質をコードする外来ＤＮＡが制限酵素技術によって挿入される。一般的なタイプのベクターは、「プラスミド」であり、これは一般に、追加の（外来）ＤＮＡを容易に受け入れることができる二本鎖ＤＮＡの自己完結型分子（ｓｅｌｆ−ｃｏｎｔａｉｎｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）であり、且つ適切な宿主細胞に容易に導入することができる。プラスミド及び真菌ベクターを含む多数のベクターが、様々な真核生物宿主及び原核生物宿主における複製及び／又は発現について記載されている。
【００２４】
「発現する」及び「発現」という用語は、遺伝子又はＤＮＡ配列中の情報の出現を可能にすること又は引き起こすこと、例えば、対応する遺伝子又はＤＮＡ配列の転写及び翻訳に関与する細胞機能を活性化することによってタンパク質を産生させることを意味する。ＤＮＡ配列は、細胞内で又は細胞によって発現されて、タンパク質などの「発現産物」を形成する。発現産物自体、例えば、得られるタンパク質は、細胞によって「発現される」とも言える。ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、例えば、外来若しくは天然プロモーターの制御下で外来宿主細胞において、又は外来プロモーターの制御下で天然宿主細胞において発現又は産生される場合、組換え的に発現される。
【００２５】
遺伝子送達ベクターは一般に、プロモーターに作動可能に連結された導入遺伝子（例えば、酵素をコードする核酸）、及びベクターが導入される宿主細胞における導入遺伝子の発現に必要な他の核酸要素を含む。遺伝子発現及び送達構築物に適したプロモーターは、当技術分野で公知である。組換えプラスミドはまた、細胞における酵素の発現のための誘導性又は調節可能なプロモーターを含み得る。
【００２６】
様々な遺伝子送達ビヒクルが当技術分野で公知であり、これには、ウイルス及び非ウイルス（例えば、裸のＤＮＡ、プラスミド）ベクターの両方が含まれる。遺伝子送達に適したウイルスベクターは当業者に公知である。そのようなウイルスベクターには、例えば、ヘルペスウイルスに由来するベクター、バキュロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、及びマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）が含まれる。ウイルスベクターは、複製又は非複製であり得る。このようなベクターは、本明細書に開示若しくは引用された、又は当業者に公知の方法を使用して、多くの適切な宿主細胞に導入することができる。
【００２７】
遺伝子送達のための非ウイルスベクターには、とりわけ、裸のＤＮＡ、プラスミド、トランスポゾン、及びｍＲＮＡが含まれる。非限定的な例としては、ｐＫＫプラスミド（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）、ｐＵＣプラスミド、ｐＥＴプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ｐＲＳＥＴ又はｐＲＥＰプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ｐＭＡＬプラスミド（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）が挙げられる。このようなベクターは、本明細書に開示若しくは引用された、又は当業者に公知の方法を使用して、多くの適切な宿主細胞に導入することができる。
【００２８】
特定の実施形態では、ベクターは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐ）などの選択マーカーを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩとの間のｐＭＳＣＶ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰへのサブクローニングに適している。いくつかの実施形態では、ベクターは、所望の遺伝子の挿入のための多重クローニング部位（ＭＣＳ）を含む。
【００２９】
遺伝子コードは、ほとんどのアミノ酸が複数のコドン（「同義語（ｓｙｎｏｎｙｍ又はｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ）」コドンと呼ばれる）によって表されるという点で縮重しているが、特定の生物によるコドンの使用はランダムではなく、特定のコドントリプレットに偏っていることが当技術分野で理解されている。従って、いくつかの実施形態では、ベクターは、特定のタイプの宿主細胞における発現のために（例えば、コドン最適化を通じて）最適化されたヌクレオチド配列を含む。コドン最適化とは、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、同じアミノ酸（複数可）をコードするが、核酸が発現される宿主細胞でより一般的に使用／認識されるコドンでそのポリヌクレオチドの特定のコドンを置換するために修飾されるプロセスを指す。いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、Ｔ細胞での発現に最適化されたコドンである。
【００３０】
膜結合抗サイトカイン構築物
一例が図１Ａのｍｂ−ａＩＬ６構築物である膜結合抗サイトカイン構築物を本明細書に記載されるように作製することができる。抗サイトカイン構築物は、ＩＬ−６、（ＴＮＦ）−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、及びＩＦＮγなどの様々なサイトカインに特異的であり得る。
【００３１】
図１Ａは、ヒンジ及び膜貫通ドメインに結合された抗ＩＬ６単鎖可変断片（抗ＩＬ６  ｓｃＦｖ）である特定の構築物を例示する。抗ＩＬ６  ｓｃＦｖは、抗ＩＬ−６可変軽鎖ドメイン、抗ＩＬ−６可変重鎖ドメイン、及び可変軽鎖ドメインと可変重鎖ドメインを連結するリンカードメインを含む。可変軽鎖ドメインと可変重鎖ドメインの相対位置は逆にすることができるが、これらは両方とも、ＣＤ８αヒンジ及び膜貫通ドメインとして図１Ａに例示されている膜貫通ドメインのＮ’末端である。構築物はまた、ＣＤ８αシグナルペプチドなどのＮ末端シグナルペプチド（図１Ａには示されていない）を含み得る。図１Ｂは、ＭＳＣＶ  ｍｂ−ａＩＬ６−ＩＲＥＳ−ＧＦＰプラスミドの概略図である。
【００３２】
様々なリンカードメインが適している。いくつかの実施形態では、リンカードメインは（Ｇ４Ｓ）xであり得、式中、ｘは１〜１００の整数である。いくつかの実施形態では、リンカードメインは（Ｇ４Ｓ）3であり得る。他の実施形態では、リンカードメインは１つ又は複数のグリシン残基であり得る。他の実施形態では、リンカードメインは（ＥＡＡＡＫ）3であり得る。
【００３３】
様々なヒンジ及び膜貫通ドメインが適切である。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αヒンジドメインであり得る。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ヒンジ及び膜貫通ドメインは、ＣＤ８αヒンジ及び膜貫通ドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ヒンジは、複数のグリシン残基及びセリン残基であり得る。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ４、ＣＤ８β、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ３４、ＣＤ６４、ＣＤ１３７、ＦｃεＲＩγ、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、又はＦＧＦＲ２Ｂからの膜貫通ドメインであり得る。
【００３４】
図１Ａの実施形態は抗ＩＬ６構築物であるが、同様のアプローチを適用して、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＦＮγなどの他のサイトカインの構築物を作製し、且つ／又はそれらの受容体をブロックすることができる。例えば、図１Ａの概略図に基づいて、抗ＩＬ６  ｓｃＦｖ部分を、（ＴＮＦ）−α（図１１）、ＩＬ−１β、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、又はＩＦＮγなどの異なるサイトカインに特異的に結合する異なるｓｃＦｖで置換することができる。本明細書の教示のすべては、サイトカインを中和する膜結合タンパク質の発現のための構築物に等しく適用可能である。
【００３５】
複数の中和受容体を同じ細胞で又は異なる細胞サブセット内で発現させて、広範囲で持続的な抗炎症効果を与えることができる。
【００３６】
トランスジェニック宿主細胞を作製する方法
本明細書には、トランスジェニックＴ細胞などのトランスジェニック宿主細胞を作製する方法が記載されている。トランスジェニック宿主細胞は、例えば、本明細書に記載のベクターの実施形態の１つ又は複数を宿主細胞に導入することによって作製することができる。
【００３７】
一実施形態では、この方法は、膜結合抗ＩＬ６（ｍｂ−ａＩＬ６）単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をコードする核酸を含むベクターを宿主細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、ベクターの核酸は、抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ＣＤ３ζなどのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらにコードし得る。いくつかの実施形態では、バイシストロニックベクターなどの核酸は、ｍｂ−ａＩＬ６及びＣＡＲを発現する。いくつかの実施形態では、２つの別個のベクターを使用して、ｍｂ−ａＩＬ６及びＣＡＲを発現するトランスジェニックＴ細胞などのトランスジェニック細胞を作製することができる。
【００３８】
いくつかの実施形態では、１つ又は複数の核酸が宿主細胞のゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、宿主ゲノムに組み込まれるべき核酸は、例えば、相同組換え、ＣＲＩＳＰＲベースのシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９；ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１）及びＴＡＬＥＮシステムを含む当技術分野で公知の様々な適切な方法のいずれかを使用して宿主細胞に導入することができる。
【００３９】
値及び範囲
特に断りのない限り、又は文脈及び同業者の理解から明白でない限り、範囲として表される値は、文脈が明確に特段に示さない限り、様々な実施形態で述べられる範囲内の任意の特定の値又は部分範囲をとり得る。数値についての「約」は、一般に、特に明記しない限り、又は文脈から明白でない限り、値の±８％、いくつかの実施形態では±６％、いくつかの実施形態では±４％、いくつかの実施形態では±２％、いくつかの実施形態では±１％、いくつかの実施形態では±０．５％の範囲に含まれる値の範囲を指す。
【００４０】
実施形態の例：ベクター
一実施形態は、膜結合抗ＩＬ６（ｍｂ−ａＩＬ６）単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をコードする核酸を含むベクターである。ｍｂ−ａＩＬ６  ｓｃＦｖは、ａ）抗ＩＬ−６可変軽鎖ドメイン、抗ＩＬ−６可変重鎖ドメイン、及び可変軽鎖ドメインと可変重鎖ドメインを連結するリンカードメインを含む抗ＩＬ６単鎖可変断片（抗ＩＬ６  ｓｃＦｖ）；並びにｂ）抗ＩＬ６  ｓｃＦｖに結合されたヒンジ及び膜貫通ドメインを含む。
【００４１】
いくつかの実施形態では、抗ＩＬ−６可変軽鎖ドメイン及び抗ＩＬ−６可変重鎖ドメインの１つ又は複数は、ヒト抗ＩＬ６可変軽鎖及び可変重鎖ドメインである。いくつかの実施形態では、可変軽鎖ドメインは、配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、可変重鎖ドメインは、配列番号８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。
【００４２】
いくつかの実施形態では、リンカードメインは（Ｇ４Ｓ）xであり、式中、ｘは１〜１００の整数である。いくつかの実施形態では、リンカードメインは（Ｇ４Ｓ）3である。いくつかの実施形態では、リンカードメインは１つ又は複数のグリシン残基である。いくつかの実施形態では、リンカードメインは（ＥＡＡＡＫ）3である。
【００４３】
いくつかの実施形態では、ヒンジ及び膜貫通ドメインは、ＣＤ８αヒンジ及び膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態では、ヒンジは、複数のグリシン残基及びセリン残基を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ４、ＣＤ８β、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ３４、ＣＤ６４、ＣＤ１３７、ＦｃεＲＩγ、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、又はＦＧＦＲ２Ｂからの膜貫通ドメインである。
【００４４】
いくつかの実施形態では、核酸は、抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ＣＤ３ζキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらにコードする。いくつかの実施形態では、ｍｂ−ａＩＬ６は、Ｐ２Ａ配列によって抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ＣＤ３ζに結合される。
【００４５】
実施形態の例：ベクター
別の実施形態は、抗ＩＬ６（ａＩＬ６）単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をコードする核酸を含むベクターである。ａＩＬ６  ｓｃＦｖは：（ａ）抗ＩＬ−６可変軽鎖ドメイン、抗ＩＬ−６可変重鎖ドメイン、及び可変軽鎖ドメインと可変重鎖ドメインを連結するリンカードメインを含む抗ＩＬ６単鎖可変断片（抗ＩＬ６  ｓｃＦｖ）を含む。
【００４６】
実施形態の例：ベクター
別の実施形態は、抗ＩＬ６キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含むベクターである。抗ＩＬ６  ＣＡＲは：ａ）抗ＩＬ−６可変軽鎖ドメイン、抗ＩＬ−６可変重鎖ドメイン、及び可変軽鎖ドメインと可変重鎖ドメインを連結する第１のリンカードメインを含む抗ＩＬ６単鎖可変断片（抗ＩＬ６  ｓｃＦｖ）；ｂ）抗ＩＬ６  ｓｃＦｖのＮ末端にある第２のリンカードメイン；ｃ）第２のリンカードメインのＮ末端にあるヒンジ及び膜貫通ドメイン；並びにｄ）ヒンジ及び膜貫通ドメインのＮ末端にある細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【００４７】
いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは４１ＢＢドメインである。
【００４８】
いくつかの実施形態では、ベクターは、細胞内シグナル伝達ドメインのＮ末端にある共刺激ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインはＣＤ３ζドメインである。
【００４９】
実施形態の例：ベクター
別の実施形態は、膜結合ＩＬ−６受容体をコードする核酸を含むベクターである。膜結合ＩＬ−６受容体は：ａ）細胞外ドメイン；ｂ）細胞外ドメインのＮ末端にあるリンカードメイン；ｃ）ＩＬ−６受容体αドメイン；及びｄ）膜貫通ドメインを含む。
【００５０】
いくつかの実施形態では、細胞外ドメインはｇｐ１３０細胞外ドメインである。
【００５１】
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインはＣＤ８α膜貫通ドメインである。
【００５２】
実施形態の例：哺乳動物Ｔ細胞
別の実施形態は、本明細書に記載の任意の実施形態による、膜結合抗ＩＬ６（ｍｂ−ａＩＬ６）単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をコードする導入遺伝子を含む哺乳動物Ｔ細胞である。
【００５３】
いくつかの実施形態では、ｍｂ−ａＩＬ６  ｓｃＦｖは：ａ）抗ＩＬ−６可変軽鎖ドメイン、抗ＩＬ−６可変重鎖ドメイン、及び可変軽鎖ドメインと可変重鎖ドメインを連結するリンカードメインを含む抗ＩＬ６単鎖可変断片（抗ＩＬ６  ｓｃＦｖ）；並びにｂ）抗ＩＬ６  ｓｃＦｖに結合されたヒンジ及び膜貫通ドメインを含み得る。
【００５４】
いくつかの実施形態では、哺乳動物Ｔ細胞はヒトＴ細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物Ｔ細胞は、ヒト末梢血Ｔリンパ球である。
【００５５】
実施形態の例：哺乳動物におけるＩＬ−６依存性細胞の増殖を抑制する方法
別の実施形態は、哺乳動物におけるＩＬ−６依存性細胞の増殖を抑制する方法である。この方法は、膜結合抗ＩＬ６（ｍｂ−ａＩＬ６）単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をＴ細胞で発現させることを含む。ｍｂ−ａＩＬ６  ｓｃＦｖは、本明細書に記載の任意の実施形態に従うことができる。
【００５６】
いくつかの実施形態では、ｍｂ−ａＩＬ６  ｓｃＦｖは：ａ）抗ＩＬ−６可変軽鎖ドメイン、抗ＩＬ−６可変重鎖ドメイン、及び可変軽鎖ドメインと可変重鎖ドメインを連結するリンカードメインを含む抗ＩＬ６単鎖可変断片（抗ＩＬ６  ｓｃＦｖ）；並びにｂ）抗ＩＬ６  ｓｃＦｖに結合されたヒンジ及び膜貫通ドメインを含む。
【００５７】
いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【００５８】
実施形態の例：哺乳動物のＩＬ−６濃度を低下させる方法
別の実施形態は、哺乳動物におけるＩＬ−６濃度を低下させる方法である。この方法は：膜結合抗ＩＬ６（ｍｂ−ａＩＬ６）単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をＴ細胞で発現させること、及びＩＬ−６を含む液体にＴ細胞を接触させることを含む。ｍｂ−ａＩＬ６  ｓｃＦｖは、本明細書に記載の任意の実施形態に従うことができる。
【００５９】
いくつかの実施形態では、ｍｂ−ａＩＬ６は：ａ）抗ＩＬ−６可変軽鎖ドメイン、抗ＩＬ−６可変重鎖ドメイン、及び可変軽鎖ドメインと可変重鎖ドメインを連結するリンカードメインを含む抗ＩＬ６単鎖可変断片（抗ＩＬ６  ｓｃＦｖ）；並びにｂ）抗ＩＬ６  ｓｃＦｖに結合されたヒンジ及び膜貫通ドメインを含む。
【００６０】
いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【００６１】
いくつかの実施形態では、この方法は、Ｔ細胞を培養して、ｍｂ−ａＩＬ６を発現する新たなＴ細胞を作製することをさらに含む。
【００６２】
いくつかの実施形態では、この方法は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）のリスクを低減することをさらに含み、哺乳動物のＴ細胞はキメラ抗原受容体を発現する。
【００６３】
いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ  ＣＡＲである。
【００６４】
いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、抗ＣＤ２２ドメイン、抗ＣＤ２０ドメイン、抗ＣＤ１２３ドメイン、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）ドメイン、抗メソセリンドメイン、抗ＣＤ７ドメイン、抗ＣＤ２ドメイン、抗ＣＤ５ドメイン、抗ＣＤ３ドメイン、抗ルイスＹドメイン、抗ＥｐＣａｍドメイン、抗Ｈｅｒ２ドメイン、又は抗前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を含む。
【００６５】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、４−１ＢＢドメイン、ＣＤ３ζドメイン、ＣＤ２８ドメイン、誘導性Ｔ細胞共刺激（ＩＣＯＳ）ドメイン、ＤＮＡＸ活性化タンパク質１０（ＤＡＰ１０）ドメイン、又はＤＮＡＸ活性化タンパク質１２（ＤＡＰ１２）ドメインをさらに含む。
【００６６】
いくつかの実施形態では、哺乳動物は自己免疫疾患に罹患しており、哺乳動物のＩＬ−６濃度を低下させることにより自己免疫疾患を処置する。
【００６７】
いくつかの実施形態では、哺乳動物は関節リウマチに罹患しており、ＩＬ−６濃度を低下させることにより関節リウマチを処置する。
【００６８】
いくつかの実施形態では、哺乳動物は全身性エリテマトーデスに罹患しており、ＩＬ−６濃度を低下させることにより全身性エリテマトーデスを処置する。
【００６９】
いくつかの実施形態では、哺乳動物は炎症性疾患に罹患しており、哺乳動物のＩＬ−６濃度を低下させることにより炎症性疾患を処置する。
【００７０】
いくつかの実施形態では、哺乳動物は、移植片対宿主病に罹患しており、ＩＬ−６濃度を低下させることにより移植片対宿主病を処置する。
【００７１】
いくつかの実施形態では、哺乳動物はリンパ増殖性障害に罹患しており、ＩＬ−６濃度を低下させることによりリンパ増殖性障害を処置する。
【００７２】
いくつかの実施形態では、哺乳動物はキャッスルマン病に罹患しており、ＩＬ−６濃度を低下させることによりキャッスルマン病を処置する。
【００７３】
実施形態の例：ベクター
別の実施形態では、ベクターは、膜結合抗サイトカイン単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をコードする核酸を含む。膜結合抗サイトカインｓｃＦｖは、本明細書に記載の任意の実施形態に従うことができる。
【００７４】
いくつかの実施形態では、膜結合抗サイトカインは：ａ）抗サイトカイン可変軽鎖ドメイン、抗サイトカイン可変重鎖ドメイン、及び可変軽鎖ドメインと可変重鎖ドメインを連結するリンカードメインを含む抗サイトカイン単鎖可変断片（抗サイトカインｓｃＦｖ）；並びにｂ）抗サイトカインｓｃＦｖに結合されたヒンジ及び膜貫通ドメインを含む。
【００７５】
いくつかの実施形態では、抗サイトカインは、抗（ＴＮＦ）−α、抗ＩＬ−１β、抗ＩＬ−１２、抗ＩＬ−１７、抗ＩＬ−１８、又は抗ＩＦＮγである。
【実施例】
【００７６】
材料及び方法
細胞
ヒト細胞株Ｎａｌｍ−６（Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、ＡＬＬ）、Ｊｕｒｋａｔ（Ｔ細胞ＡＬＬ）、ＴＨＰ−１及びＵ９３７（急性単球性白血病）、ＤＳ−１（Ｂ細胞リンパ腫）、及びＨＥＫ２９３Ｔ（胚性腎線維芽細胞）をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入した。Ｂ−ＡＬＬ細胞株ＯＰ−１を本発明者らの研究室で開発した11。Ｎａｌｍ−６、ＯＰ−１、ＴＨＰ−１、Ｕ９３７、及びＪｕｒｋａｔ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＨｙＣｌｏｎｅ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）及び１％ペニシリン／ストレプトアビジン（Ｐ／Ｓ）（ＰＡＮ−Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｉｄｅｎｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で維持した。ＤＳ−１細胞は、１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ、及び１ｎｇ／ｍＬのインターロイキン−６（ＩＬ−６）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０で維持した。ＨＥＫ−２９３Ｔは、１０％ＦＢＳ及び１％Ｐ／Ｓを添加したＤＭＥＭ（ＨｙＣｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で維持した。
【００７７】
ＤＳ−１及びＮａｌｍ−６を、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）−内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）−緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レトロウイルスベクター（Ｓｔ．Ｊｕｄｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｈａｒｅｄ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ，Ｍｅｍｐｈｉｓ，ＴＮから入手）で形質導入し、ＭｏＦｌｏセルソーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）を用いてＧＦＰ発現で選択した。ＤＳ−１及びＯＰ−１を、ｍＣｈｅｒｒｙを含むＭＳＣＶ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰレトロウイルスベクターで形質導入し、ＭｏＦｌｏセルソーターを用いてｍＣｈｅｒｒｙ発現で選択した。
【００７８】
ＴＨＰ−１の分化を誘導するために、２×１０6のＴＨＰ−１細胞を、１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ、及び２０ｎｇ／ｍｌのホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）を添加した１０ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０で７２時間培養した。続いて、分化したＴＨＰ−１細胞を１％ＥＤＴＡ（Ｍｅｒｃｋ，Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ，ＮＪ）を使用して回収した。
【００７９】
末梢血単核細胞を、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｄｏｎａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｒｅによって提供された、廃棄され、非特定化された血小板献血の副産物からの密度勾配によって単離した。単核細胞を、１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ、１２０ＩＵ／ｍｌのインターロイキン−２（ＩＬ−２）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０においてＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）と共に３日間培養した。４日目に、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを除去し、細胞を新鮮な抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで再刺激した。続いて、増殖したＴ細胞を、１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ、及び１２０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を添加したＲＰＭＩ−１６４０で培養した。
【００８０】
プラスミド及びレトロウイルス形質導入
ｍｂ−ａＩＬ６における抗ＩＬ６  ｓｃＦｖの重鎖及び軽鎖ドメインは、ヒト抗ＩＬ６モノクローナル抗体ＡＭＥ−１９ａの公表された配列に由来し、１５個のアミノ酸［（Ｇ４Ｓ）3］リンカーに結合して単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を形成し；構築物をＧｅｎｓｃｒｉｐｔ  （Ｎａｎｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）によって合成した。ｓｃＦｖを、ＣＤ８αヒンジ及び膜貫通ドメイン（「ｍｂ−ａＩＬ６」）に連結した。抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ構築物は本発明者らの研究室で以前に開発した12。ｍｂ−ａＩＬ６と抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ＣＤ３ζを連結するために使用したＰ２Ａ配列は以前に報告された13。すべての構築物を、ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩの間のｐＭＳＣＶ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰにサブクローニングした。
【００８１】
レトロウイルス上清の調製及び形質導入を既に記載されたように行った14。簡単に説明すると、Ｔ細胞を、３７℃で、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ  （Ｔａｋａｒａ，Ｋｕｓａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）の存在下でレトロウイルス上清と共にインキュベートした。レトロウイルス上清は、次の３日間、その後１２時間ごとに新しく採取した上清と交換した。続いて、形質導入されたＴ細胞を採取し、１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ、及び２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を添加したＲＰＭＩ−１６４０で培養した。
【００８２】
形質導入細胞の表面染色
ｍｂ−ａＩＬ６及び抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ＣＤ３ζの表面発現をフローサイトメトリーによって検出した。ｍｂ−ａＩＬ６の場合、ビオチン標識ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ）’２（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を使用し、続いてアロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識ストレプトアビジン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で二次染色した。細胞はまた、ビオチンに結合したヒトＩＬ−６（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）で標識し、続いてストレプトアビジン−ＡＰＣで標識した；ビオチンに結合した大豆トリプシン阻害剤（Ｒ＆Ｄ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を陰性対照として使用した。ｍｙｃ−ｔａｇに連結されたヒトＣＤ１９の細胞外ドメインを含む、本発明者らの研究室で生成された可溶性融合タンパク質であるＣＤ１９−ｍｙｃを使用して、抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ＣＤ３ζを特異的に検出した。Ｔ細胞をＣＤ１９−ｍｙｃと共に３０分間インキュベートし、続いてＲ−フィコエリトリン（ＰＥ）標識抗ｍｙｃ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）と共にインキュベートした。細胞の免疫表現型検査では、Ｔ細胞を、抗ＣＤ３  ＡＰＣ、抗ＣＤ５６  ＰＥ、抗ＣＤ４  Ｖ４５０、及び抗ＣＤ８  ＰｅｒＣＰ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で標識した。細胞染色を、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６又はＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
【００８３】
ＩＬ−６枯渇アッセイ
ＩＬ−６枯渇を測定するために、２×１０6個のＴ細胞を、１ｎｇのＩＬ−６を含む１ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０で２時間培養した。別の実験では、０．５〜２×１０6個のＴ細胞を、１０ＩＵのＩＬ−６を含む１ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０で２時間培養した。さらに別の実験では、２×１０6個のＴ細胞を、１ｎｇのＩＬ−６を含む１ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０で、２０分〜２時間の異なる時間間隔で培養した。さらなる実験では、０．５×１０6個の細胞を、２５〜２００ｐｇ／ｍＬの組換えヒトＩＬ−６を含む１ｍＬのＲＰＭＩで、３７℃で２時間培養した。別のさらなる実験では、０．２×１０6個のＴ細胞を、１ｎｇのＩＬ−６を含む１ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０で２〜７２時間培養した。培養の最後に、上清を回収し、０．２２μｍフィルターで濾過し、１：１０に希釈した。ＩＬ−６のレベルを、ヒトＩＬ−６  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＥＬＩＳＡキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いるＥＬＩＳＡによって測定した。計算された標準曲線からの補間を使用して、各試料のＩＬ−６の濃度を決定した。
【００８４】
Ｓｔａｔ３リン酸化の測定のために、２×１０6個の細胞を、１０ＩＵのＩＬ−６を含む１ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０に２時間播種した。上清を回収し、０．２×１０6個のＵ９３７細胞と共に３７℃で、１５分間インキュベートした。Ｌｙｓｅｆｉｘ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を添加し、試料を３７℃で１０分間さらに維持した。次いで、細胞を洗浄し、Ｐｅｒｍ  ＩＩＩ緩衝液に入れて氷上に３０分間置いた。３回の洗浄後、ＰＥ標識抗Ｓｔａｔ３（ｐＹ７０５）抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加した。１時間後、細胞を洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。
【００８５】
ＩＬ−６依存性細胞株ＤＳ−１の増殖に対するｍｂ−ａＩＬ６によるＩＬ−６枯渇の影響を決定するために、１．５×１０4個のＴ細胞を、１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ、及び０．５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６を添加したＲＰＭＩ−１６４０において、１：１の比率でｍＣｈｅｒｒｙを形質導入したＤＳ−１細胞と共にインキュベートした。増殖したＴ細胞では、１２０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を添加した。ＤＳ−１細胞は、実験開始の７２時間前に飢餓状態にした。ＩＬ−２及びＩＬ−６を、培養中２日ごとに添加した。ＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｌｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を使用して、４時間ごとに各ウェルの４倍画像をキャプチャした。細胞数を蛍光を用いて測定し、ウェル内のＤＳ−１  ｍＣｈｅｒｒｙの量の指標として、赤色物体の全積分強度（ｔｏｔａｌ  ｒｅｄ  ｏｂｊｅｃｔ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を使用した。他の実験では、Ｔ細胞、ＯＰ−１、及び分化したＴＨＰ−１を１：５：１の比率で用いて同様の培養を行った。アッセイの開始の１時間前に分化したＴＨＰ−１を播種した。各ウェルの４倍画像を、ＩｎｃｕＣｙｔｅシステムを使用して上記のようにキャプチャした。４０時間後、各ウェルから上清を回収し、１：５に希釈し、上記のようにＥＬＩＳＡによってＩＬ−６を測定した。
【００８６】
インターフェロン−γ（ＩＦＮγ）の産生、ＣＤ１０７αの発現、細胞毒性、及び増殖アッセイ
ＩＦＮγの産生について試験するために、１×１０5個のＴ細胞を、１：１の比率でＯＰ−１細胞と共に培養した。１時間後、ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を細胞に添加し、これをさらに５時間培養した。本発明者らの研究室で開発された透過化試薬である８Ｅによる細胞膜透過化後、細胞をＰＥ標識抗ヒトＩＦＮγ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で標識し、フローサイトメトリーによって分析した。
【００８７】
細胞毒性顆粒のエキソサイトーシスを測定するために、上記のように細胞を培養した。培養の初めに、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ１０７ａ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加した。１時間後、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加し、培養をさらに３時間続けた後、フローサイトメトリーによって分析した。
【００８８】
細胞毒性を試験するために、ＯＰ−１細胞をカルセイン−ＡＭ  Ｒｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で標識し、９６ウェル丸底プレートにプレーティングした。Ｔ細胞（１×１０5個）を１：１のＥ：Ｔ比で添加し、４時間共培養した。前述のように、生存可能な標的細胞（カルセイン−ＡＭ陽性）をフローサイトメトリーによってカウントした14。
【００８９】
細胞増殖を測定するために、１×１０5個のＴ細胞を、１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ、及び１２０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を添加したＲＰＭＩ−１６４０において、１：１のＥ：Ｔ比で照射ＯＰ−１と共培養した。ＩＬ−２を、各ウェルに２日ごとに添加した。７日目、１４日目、及び２１日目に、Ｔ細胞をフローサイトメトリーによってカウントした。細胞をカウントした後、新鮮な照射ＯＰ−１細胞を添加して、１：１のＥ：Ｔ比で再構成した。
【００９０】
異種移植実験
ルシフェラーゼを発現するＤＳ−１細胞を、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃscid  ＩＬ２ｒｇtm1Wjl／ＳｚＪ  （ＮＯＤ／ｓｃｉｄ  ＩＬ２ＲＧｎｕｌｌ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に腹腔内注射した（ｉ．ｐ．；１×１０6個の細胞／マウス）。ＤＳ−１接種の２日後、マウスに、ＧＦＰのみで形質導入した１×１０7個のＴ細胞、ＭＳＣＶ−ｍｂ−ａＩＬ６で形質導入した１×１０7個のＴ細胞、又はＴ細胞の代わりに１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ  １６４０のいずれかを腹腔内注射した。すべてのマウスに、２００００ＩＵのＩＬ−２及び１０００ＩＵのＩＬ−６を２日ごとに腹腔内投与した。腫瘍細胞量を、水性ｄ−ルシフェリンカリウム塩（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を（マウス当たり２ｍｇ）腹腔内注射した後、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ−２００システム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて週２回測定した。発光を、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ３．０ソフトウェアを用いて測定した。
【００９１】
ルシフェラーゼを発現するＮａｌｍ−６細胞を、ＮＯＤ／ｓｃｉｄ  ＩＬ２ＲＧｎｕｌｌマウスに静脈内注射した（ｉ．ｖ．；図１０Ａ〜図１０Ｂでは０．５×１０6個の細胞／マウス、図１０Ｃ〜図１０Ｆでは、１×１０6個の細胞／マウス）。３日後に、マウスに、抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ  ＣＡＲで形質導入した２×１０7個のＴ細胞、ＣＡＲ及びｍｂ−ａＩＬ６を含む構築物（「ＤＵＡＬ」）で形質導入した２×１０7個のＴ細胞、又はＴ細胞の代わりに１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ  １６４０のいずれかを静脈注射した。すべてのマウスに、２００００ＩＵのＩＬ−２を２日ごとに腹腔内投与した。腫瘍細胞量を、水性ｄ−ルシフェリンカリウム塩（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を（マウス当たり２ｍｇ）腹腔内注射した後、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ−２００システム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて週２回測定した。発光を、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ３．０ソフトウェアを用いて測定した。
【００９２】
結果
ｍｂ−ａＩＬ６の設計、発現、及び特異性
膜結合抗ＩＬ−６構築物を作製するために、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を、ヒト抗ＩＬ−６抗体ＡＭＥ−１９ａの可変軽鎖及び重鎖の配列から合成し、これをＣＤ８αのヒンジ及び膜貫通ドメインに連結した（図１Ａ）。この構築物を、ＩＲＥＳ及びＧＦＰを含むＭＳＣＶレトロウイルスベクターに導入した（図１Ｂ）。このレトロウイルスベクターを使用して、ＪｕｒｋａｔＴ細胞を形質導入した。ＭＳＣＶ−ｍｂ−ａＩＬ６で形質導入された細胞ではＧＦＰ発現が高かった：細胞の９８％がＧＦＰ陽性であった。形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞の表面におけるｍｂ−ａＩＬ６を検出するために、細胞を、ビオチン標識ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ）’抗体で標識し、続いてストレプトアビジン−ＡＰＣで標識した。図１Ｃに示されているように、ｍｂ−ａＩＬ６は、本質的にすべてのＧＦＰ発現Ｊｕｒｋａｔ細胞で検出されたが、ＧＦＰのみを含むベクターで形質導入された細胞（「Ｍｏｃｋ」）はｍｂ−ａＩＬ６陰性であった。
【００９３】
細胞表面で発現されたｍｂ−ａＩＬ６がヒトＩＬ−６に結合できるか否かを決定するために、形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞を、ビオチン標識ヒトＩＬ−６に１０分間曝露し；次いで、細胞をストレプトアビジン−ＡＰＣで標識した。図１Ｄに示されているように、ｍｂ−ａＩＬ６−Ｊｕｒｋａｔ細胞は、ＧＦＰのレベル、従って受容体の発現に比例するレベルでＩＬ−６に結合した：９９％の細胞がＩＬ−６に結合したが、ビオチン化対照タンパク質（大豆トリプシン阻害剤）で標識された細胞は未染色のままであった。
【００９４】
ｍｂ−ａＩＬ６細胞によるＩＬ−６の中和
ｍｂ−ａＩＬ６のＩＬ−６への結合は、Ｊｕｒｋａｔ細胞が組換えヒトＩＬ−６（１ｎｇ／ｍＬ）を含む培地で２時間培養される実験により裏付けられ；培養物をＥＬＩＳＡによって上清で測定された後に残留ＩＬ−６を回収した。２時間の培養後、ｍｂ−ａＩＬ６  Ｊｕｒｋａｔ細胞の上清中のＩＬ−６の濃度が０．１６３ｎｇ／ｍＬであったのに対し、ｍｏｃｋ−形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞の上清では０．９４１ｎｇ／ｍＬであった（図２Ａ）。
【００９５】
ＩＬ−６を中和するために必要なｍｂ−ａＩＬ６  Ｊｕｒｋａｔ細胞の数を決定するために、０．２５×１０6個の細胞／ｍＬから２×１０6個の細胞／ｍＬまで増加する濃度の細胞を使用した。上清からのＩＬ−６の除去は、細胞用量依存性であった（図２Ｂ）。並行実験で、ｍｂ−ａＩＬ６細胞によるＩＬ−６除去の動態を測定した。図２Ｃに示されているように、ＩＬ−６中和は、時間依存性であり、ほぼ９０％が３０分後に中和され、１２０分後には検出できなくなった。特に、この曲線は、一次指数関数的減衰曲線（Ｒ2＝０．９９５７）の曲線に適合し、ＩＬ−６の半減期が７．４４３分であり、Ｋが０．０９３１３であることを示している。
【００９６】
ｍｂ−ａＩＬ６発現Ｊｕｒｋａｔ細胞が低濃度のＩＬ−６も中和できるか否かを試験するために、０．０２５〜０．２ｎｇ／ｍＬの範囲のＩＬ−６の濃度を使用してＩＬ−６枯渇アッセイを設定した。図２Ｄに示されているように、ｍｂ−ａＩＬ６発現Ｊｕｒｋａｔ細胞は、ほとんどのＩＬ−６も同様に中和することができる。以前の実験と一致して、ｍｏｃｋ−形質導入細胞と比較して、ｍｂ−ａＩＬ６発現Ｊｕｒｋａｔ細胞により、様々な濃度にわたってＩＬ−６のレベルが３．８分の１〜５．４分の１に減少した。
【００９７】
本発明者らは、細胞増殖が、長期の細胞培養においてＩＬ−６を中和し続けることになる新たなｍｂ−ａＩＬ６細胞を生成するであろうと仮定した。この概念を試験するために、以前に決定された培養条件（図２Ｂ）を使用したが、これは２時間でＩＬ−６を中和するには不十分であり、７２時間培養を続けた。２４時間で、ＩＬ−６のほとんどが上清から除去されていた（図２Ｅ）。
【００９８】
ｍｂ−ａＩＬ６  Ｔ細胞によるＩＬ−６中和の機能的結果
Ｕ９３７は、ＩＬ−６によって刺激することができる単球細胞株である15、16。ＩＬ−６受容体に結合すると、ＩＬ−６がＳＴＡＴ３リン酸化を引き起こす17。ｍｂ−ａＩＬ６−又はｍｏｃｋ−形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞に２時間曝露した後のＩＬ−６を含む上清の、Ｕ９３７においてＳｔａｔ３リン酸化を引き起こす能力を試験した。１ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６を含む上清への暴露の１５分後に、Ｓｔａｔ３リン酸化が容易に検出された（Ｐ＜０．００１；ｎ＝３；図３Ａ）。ＩＬ−６上清をｍｏｃｋ−形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞を含む培養物から収集した場合、同様のレベルのリン酸化が観察された（Ｐ＝非有意）。対照的に、培養物がｍｂ−ａＩＬ６  Ｊｕｒｋａｔ細胞を含んでいた場合、Ｓｔａｔ３リン酸化のレベルは、ＩＬ−６又はｍｏｃｋ−形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞のＩＬ−６を含む上清に曝露されたＵ９３７細胞で測定されたレベルよりも著しく低く（いずれの比較でも、Ｐ＜０．００１）、刺激されていない細胞のレベルと同様であった（Ｐ＝非有意）。
【００９９】
ＤＳ−１は、その増殖がＩＬ−６を必要とするＢリンパ腫細胞株である18。本発明者らは、ｍｂ−ａＩＬ６を発現するＪｕｒｋａｔ細胞との共培養がＤＳ−１の増殖に影響を与えることになるか否かを決定した。この目的のために、５日間にわたるｍＣｈｅｒｒｙ形質導入ＤＳ−１細胞の連続した生細胞イメージングの記録を使用した。図３Ｂに示されているように、ＩＬ−６を含む培地で培養されたＤＳ−１は、ｍｏｃｋ−形質導入Ｊｕｒｋａｔの存在下で急速に増殖したが、ｍｂ−ａＩＬ６形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞が培養物中に存在した場合、増殖は著しく減少した。これらの条件下で、ＤＳ−１の増殖速度は、ｍｏｃｋ−又はｍｂ−ａＩＬ６形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞が存在したか否かにかかわらず、ＩＬ−６が存在しない培養物で観察された増殖速度と同様であった。まとめると、これらの結果は、ｍｂ−ａＩＬ６を発現する細胞がＩＬ−６の影響を中和する能力を裏付けている。
【０１００】
ヒト末梢血Ｔリンパ球におけるｍｂ−ａＩＬ６の発現
次の一連の実験で、ｍｂ−ａＩＬ−６が末梢血Ｔリンパ球の表面で発現され得るか否かを決定した。この目的のために、末梢血単核細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激し、次いでＭＳＣＶ−ｍｂ−ａＩＬ６レトロウイルスベクターで形質導入した。ＧＦＰのみを含むベクターで形質導入された細胞（「Ｍｏｃｋ」）を対照として使用した。図４Ａ及び図４Ｂに示されているように、ｍｂ−ａＩＬ６は、形質導入されたＧＦＰ＋Ｔリンパ球の表面で高度に発現し、ＩＬ−６に効果的に結合した。ｍｂ−ＩＬ６を発現するＴ細胞の免疫表現型は、ｍｏｃｋ−形質導入Ｔ細胞の免疫表現型と本質的に同一のままであった（図４Ｃ）。
【０１０１】
ｍｂ−ＩＬ６を発現するＴ細胞がＩＬ−６依存性細胞株ＤＳ−１の増殖を抑制できるか否かを試験した。図４Ｄは、ＤＳ−１の増殖が著しく抑制されたことを示し、Ｔリンパ球で発現されたｍｂ−ａＩＬ６が、受容体を発現しているＪｕｒｋａｔ細胞と同様にＩＬ−６を中和できることを示している。
【０１０２】
膜結合抗ＩＬ−６と抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ＣＤ３ｚ  ＣＡＲをＴリンパ球で同時発現させることができる
ＣＡＲ  Ｔ細胞がＣＡＲに加えてｍｂ−ａＩＬ６を発現するなら、これは、活性化Ｔリンパ球及び微小環境におけるマクロファージによって分泌されるＩＬ−６を中和することにより、ＣＲＳの発生を防止することになる。
【０１０３】
この概念を試験するための第１のステップとして、ｍｂ−ａＩＬ６とＣＡＲを同時に効果的に発現できるか否かを決定した。このために、ｍｂ−ａＩＬ６及び抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ  ＣＡＲをコードする遺伝子を含むバイシストロニックＭＳＣＶベクター（図５Ａ）を開発した12。抗ＣＤ１９  ＣＡＲを特異的に検出するために、ヒトＣＤ１９分子の細胞外ドメインをｍｙｃタグに連結し、細胞を抗ｍｙｃ抗体で染色した。図５Ｂは、ｍｂ−ａＩＬ６及び抗ＣＤ１９  ＣＡＲの両方が、末梢血Ｔ細胞において高レベルで発現され得ることを示す。単独で発現されたｍｂ−ａＩＬ６と同様に、ＣＡＲと共に発現されたｍｂ−ａＩＬ６はＩＬ−６を効果的に中和した（図５Ｃ）。
【０１０４】
ｍｂ−ａＩＬ６の発現はＣＡＲ  Ｔ細胞機能に影響を与えない
ｍｂ−ａＩＬ６の発現及びＩＬ−６の中和がＣＡＲによって活性化されたＴ細胞機能に影響を与えるか否かを決定した。ｍｂ−ａＩＬ６又は抗ＣＤ１９  ＣＡＲのいずれかを発現する３つのドナーからのＴリンパ球と両方の受容体を発現するＴ細胞を使用して、ＣＤ１９＋標的細胞ＯＰ−１との共培養後のＩＦＮγの産生を試験した。ＣＡＲを発現する細胞におけるＩＦＮγの産生は、ｍｂ−ａＩＬ６が発現したか否かにかかわらず高かったが、ｍｂ−ａＩＬ６のみを発現するＴ細胞は、ｍｏｃｋ−形質導入細胞と同様のレベルのＩＦＮγを分泌した（図６Ａ）。
【０１０５】
ＣＤ１９＋標的細胞の存在下で、ＣＡＲ発現細胞は、抗ＣＤ１０７ａ抗体での染色によって証明されているように、細胞毒性顆粒を放出した。ＣＤ１０７ａ＋細胞のパーセンテージは、ｍｂ−ａＩＬ６発現にかかわらず類似していたが、ｍｂ−ａＩＬ６のみを発現する細胞は、ＣＤ１０７ａ陰性のままであった（図６Ｂ）。この結果に一致して、ＣＡＲによって駆動されるＣＤ１９＋標的に対するパーセント細胞毒性は、ｍｂ−ａＩＬ６の存在によっても不変のままである（図６Ｃ）。
【０１０６】
第２世代及びそれ以降の世代のＣＡＲの重要な機能的特性は、共刺激を提供し、長期のＴ細胞増殖を維持する能力である19。図６Ｄに示されているように、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ１９＋標的細胞の存在下で４週間増殖し、その増殖速度は、ｍｂ−ａＩＬ６の有無にかかわらず細胞で類似していた。対照的に、ｍｂ−ａＩＬ６のみで形質導入された細胞及びｍｏｃｋ−形質導入された細胞は増殖せず、ＣＡＲの発現にかかわらず、標的細胞の非存在下では増殖は起きなかった。まとめると、これらの結果は、ｍｂ−ａＩＬ６の発現がＩＦＮγのＣＡＲ駆動Ｔ細胞分泌、特定の細胞毒性、又は細胞増殖に影響を与えないことを示している。
【０１０７】
ｍｂ−ａＩＬ６及びＣＡＲを発現するＴ細胞は、ＩＬ−６を中和すると同時に標的細胞を殺すことができる
ＣＡＲ活性化によって引き起こされるＣＲＳの際、マクロファージによって分泌されるＩＬ−６はその重症度に寄与する7-10。
【０１０８】
ＣＡＲ−Ｔ細胞とマクロファージとの間の相互作用を模倣するために、ＣＡＲ−Ｔ細胞を、ＴＮＦ−α及びＩＦＮγの存在下でＩＬ−６を分泌する単球細胞株ＴＨＰ−１と共培養した20；後者のサイトカインは、ＩＬ−６と一緒に、活性化時にＴリンパ球によって分泌される9、21。従って、ｍｂ−ａＩＬ６及び／又は抗ＣＤ１９  ＣＡＲ、ＴＨＰ−１、及びＣＤ１９＋白血病細胞ＯＰ−１で形質導入されたＴリンパ球を４０時間共培養した（図７Ａ）。ＯＰ−１細胞の死滅及び上清中のＩＬ−６のレベルをモニタリングした。図７Ｂに示されているように、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ｍｂ−ａＩＬ６発現又はＴＨＰ−１の存在にかかわらず、ＯＰ−１を効果的に殺す。驚くべきことに、ＩＬ−６のレベルは、ＣＡＲ−Ｔ細胞及びＴＨＰ−１細胞の両方を含む培養物中でかなり上昇したが、ＣＡＲ−Ｔ細胞がｍｂ−ａＩＬ６も発現している場合は、これらは本質的に検出できなかった。
【０１０９】
異種移植実験
ｍｂ−ａＩＬ６発現Ｔリンパ球がｉｎ  ｖｉｖｏでＩＬ−６を中和する能力を決定するために、ルシフェラーゼ標識ＤＳ−１細胞を移植したＮＯＤ／ｓｃｉｄ  ＩＬ２ＲＧｎｕｌｌマウスを用いた実験を行った。腫瘍の成長をライブイメージングによって測定し、ＧＦＰのみで形質導入されたＴ細胞が投与されたマウスと、ｍｂ−ａＩＬ６で形質導入されたＴ細胞が投与されたマウスを比較した。ｍｂ−ａＩＬ６形質導入Ｔ細胞が投与された３匹のマウスのうち２匹では、腫瘍組織量が減少したが、ｍｏｃｋ−形質導入Ｔ細胞が投与されたマウスの腫瘍組織量は、安定したままであったか、又は増加した（図９Ａ及び図９Ｂ）。
【０１１０】
ｍｂ−ａＩＬ６の発現が抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞の抗腫瘍能力に影響を与えるか否かを試験した。実験は、ルシフェラーゼ標識Ｎａｌｍ−６細胞を移植したＮＯＤ／ｓｃｉｄ  ＩＬ２ＲＧｎｕｌｌマウスを用いて行った。腫瘍の成長をライブイメージングで測定し、ＣＡＲのみで形質導入されたＴ細胞が投与されたマウスと、ＣＡＲ及びｍｂ−ａＩＬ６を含むバイシストロニック構築物で形質導入されたＴ細胞が投与されたマウスを比較した。ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ｍｂ−ａＩＬ６が発現されたか否かにかかわらず、抗白血病活性を与えた（図１０Ａ〜図１０Ｆ）。まとめると、これらの結果は、ｍｂ−ａＩＬ６がｉｎ  ｖｉｖｏでＩＬ−６を中和することができ、ＣＡＲ機能に有意な影響を与えないことを示唆している。
【０１１１】
考察
この研究の結果は、Ｔリンパ球によって運ばれるｍｂ−ａＩＬ６がＩＬ−６の強力な中和剤であることを示している。重要なことに、ｍｂ−ａＩＬ６は、ＣＡＲの効力に影響を与えることなく、ＣＡＲと組み合わせてＴリンパ球で発現させることができる。このため、ｍｂ−ａＩＬ６を発現するＣＡＲ−Ｔ細胞は、抗腫瘍能力を維持しながら、重度のＣＲＳを引き起こすリスクが小さいはずである。
【０１１２】
本発明者らは、ｍｂ−ａＩＬ６に機能的に関連するが、独特の特徴を有する他の受容体を設計した（図８Ａ〜図８Ｃ）。図８Ａは、ｍｂ−ａＩＬ６（ｓｅｃ−ａＩＬ６）のＣＤ８α膜貫通ドメインが存在しない可溶性形態の受容体の核酸構築物の概略図であり、このｍｂ−ａＩＬ６は、形質導入された細胞によって継続的に分泌され、炎症性微小環境領域により効果的に拡散する可能性がある。図８Ｂは、ｍｂ−ａＩＬ６が、典型的にはＣＡＲ（ａＩＬ６−ＣＡＲ）に組み込まれた刺激ドメイン及び共刺激ドメインに連結されている核酸構築物の概略図である。このような受容体を有する細胞は、ａＩＬ６−ＣＡＲのライゲーション時に増殖し、ＩＬ−６中和を拡大するはずである。図８Ｃは、ｓｃＦｖ抗ＩＬ６が、シグナル伝達能力が失われたＩＬ−６受容体によって置換されている核酸構築物の概略図である。これは、ＩＬ−６受容体αに融合したｇｐ１３０の細胞外ドメイン及びＣＤ８αのヒンジと膜貫通ドメインによって構成されている。この形態の潜在的な利点は、ｓｃＦｖ含有受容体よりも免疫原性が低い可能性があることである。
【０１１３】
この研究はＩＬ−６に焦点を当てたが、同様のアプローチを適用して、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α（図１１Ａ及び図１１Ｂ）、ＩＬ−１β、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＦＮγなどの他の炎症誘発性サイトカインを中和し、且つ／又はそれらの受容体をブロックすることができる。例えば、図１１Ａの概略図に基づいて、抗ＩＬ６  ｓｃＦｖ部分は、（ＴＮＦ）−α（図１１）、ＩＬ−１β、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、又はＩＦＮγなどの異なるサイトカインに特異的に結合する異なるｓｃＦｖで置換することができる。複数の中和受容体を同じ細胞又は異なる細胞サブセットで発現させて、広範囲で持続的な抗炎症効果を与えることができる。
【０１１４】
配列
ｍｂ−ａＩＬ６の配列
ＣＤ８αシグナルペプチドのヌクレオチド配列（配列番号１）：
【化１】
2021519593.tif 000003
【０１１５】
ＣＤ８αシグナルペプチドのアミノ酸配列（配列番号２）：ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ
【０１１６】
抗ＩＬ６の可変軽鎖のヌクレオチド配列（配列番号３）：
【化２】
2021519593.tif 000004
【０１１７】
抗ＩＬ−６の可変軽鎖のアミノ酸配列（配列番号４）：
【化３】
2021519593.tif 000005
【０１１８】
ＧＳＧリンカーのヌクレオチド配列（配列番号５）：ＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣ
【０１１９】
ＧＳＧリンカーのアミノ酸配列（配列番号６）：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
【０１２０】
抗ＩＬ−６の可変重鎖のヌクレオチド配列（配列番号７）：
【化４】
2021519593.tif 000006
【０１２１】
抗ＩＬ−６の可変重鎖のアミノ酸配列（配列番号８）：
【化５】
2021519593.tif 000007
【０１２２】
ＣＤ８αヒンジ及び膜貫通ドメインのヌクレオチド配列（配列番号９）：
【化６】
2021519593.tif 000008
【０１２３】
ＣＤ８αヒンジ及び膜貫通ドメインのアミノ酸配列（配列番号１０）：
【化７】
2021519593.tif 000009
【０１２４】
ｓｅｃ−ａＩＬ６
ｓｅｃ−ａＩＬ６のヌクレオチド配列（配列番号１１）：
【化８】
2021519593.tif 000010
【０１２５】
ｓｅｃ−ａＩＬ６のアミノ酸配列（配列番号１２）：
【化９】
2021519593.tif 000011
【０１２６】
ａＩＬ６ＢＢｚの配列
ＣＤ８αシグナルペプチドのヌクレオチド配列（配列番号１３）：
【化１０】
2021519593.tif 000012
【０１２７】
ＣＤ８αシグナルペプチドのアミノ酸配列（配列番号１４）：ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ
【０１２８】
ａＩＬ６  ｓｃＦｖのヌクレオチド配列（配列番号１５）：
【化１１】
2021519593.tif 000013
【０１２９】
ａＩＬ６  ｓｃＦｖのアミノ酸配列（配列番号１６）：
【化１２】
2021519593.tif 000014
【０１３０】
ＣＤ８αヒンジ及び膜貫通ドメインのヌクレオチド配列（配列番号１７）：
【化１３】
2021519593.tif 000015
【０１３１】
ＣＤ８αヒンジ及び膜貫通ドメインのアミノ酸配列（配列番号１８）：
【化１４】
2021519593.tif 000016
【０１３２】
４１ＢＢドメインのヌクレオチド配列（配列番号１９）：
【化１５】
2021519593.tif 000017
【０１３３】
４１ＢＢドメインのアミノ酸配列（配列番号２０）：ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ
【０１３４】
ＣＤ３ζドメインのヌクレオチド配列（配列番号２１）：
【化１６】
2021519593.tif 000018
【０１３５】
ＣＤ３ζドメインのアミノ酸配列（配列番号２２）：
【化１７】
2021519593.tif 000019
【０１３６】
ｍｂ−ｇｐ１３０−ＩＬ６Ｒの配列
ｇｐ１３０ドメインのヌクレオチド配列（配列番号２３）：
【化１８】
2021519593.tif 000020
【０１３７】
ｇｐ１３０ドメインのアミノ酸配列（配列番号２４）：
【化１９】
2021519593.tif 000021
【０１３８】
ＧＳＧリンカーのヌクレオチド配列（配列番号２５）：ＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＣＴＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＴ
【０１３９】
ＧＳＧリンカーのアミノ酸配列（配列番号２６）：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
【０１４０】
ＩＬ−６Ｒドメインのヌクレオチド配列（配列番号２７）：
【化２０】
2021519593.tif 000022
【０１４１】
ＩＬ−６Ｒドメインのアミノ酸配列（配列番号２８）：
【化２１】
2021519593.tif 000023
【０１４２】
ＣＤ８αヒンジ及び膜貫通ドメインのヌクレオチド配列（配列番号２９）：
【化２２】
2021519593.tif 000024
【０１４３】
ＣＤ８αヒンジ及び膜貫通ドメインのアミノ酸配列（配列番号３０）：
【化２３】
2021519593.tif 000025
【０１４４】
ｍｂ−ａＴＮＦα配列
ＣＤ８αシグナルペプチドのヌクレオチド配列（配列番号３１）：
【化２４】
2021519593.tif 000026
【０１４５】
ＣＤ８αシグナルペプチドのアミノ酸配列（配列番号３２）：ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ
【０１４６】
抗ＴＮＦαの可変軽鎖のヌクレオチド配列（配列番号３３）：
【化２５】
2021519593.tif 000027
【０１４７】
抗ＴＮＦαの可変軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３４）：
【化２６】
2021519593.tif 000028
【０１４８】
ＧＳＧリンカーのヌクレオチド配列（配列番号３５）：ＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣ
【０１４９】
ＧＳＧリンカーのアミノ酸配列（配列番号３６）：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
【０１５０】
抗ＴＮＦαの可変重鎖のヌクレオチド配列（配列番号３７）：
【化２７】
2021519593.tif 000029
【０１５１】
抗ＴＮＦαの可変重鎖のアミノ酸配列（配列番号３８）：
【化２８】
2021519593.tif 000030
【０１５２】
ＣＤ８αヒンジ及び膜貫通ドメインのヌクレオチド配列（配列番号３９）：
【化２９】
2021519593.tif 000031
【０１５３】
ＣＤ８αヒンジ及び膜貫通ドメインのアミノ酸配列（配列番号４０）：
【化３０】
2021519593.tif 000032
【０１５４】
参考文献
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１１．Ｍａｎａｂｅ  Ａ，Ｃｏｕｓｔａｎ−Ｓｍｉｔｈ  Ｅ，Ｋｕｍａｇａｉ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）ｉｎ  ｃａｓｅｓ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｂｌｏｏｄ．１９９４；８３（７）：１７３１−１７３７．
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【０１５５】
参照による組み込み；等価物
本明細書で引用されるすべての特許、公開出願、及び参考文献の教示は、それらの全体が参照により組み込まれる。
【０１５６】
実施形態の例が具体的に示され説明されてきたが、当業者であれば、添付の特許請求の範囲に含まれる実施形態の範囲から逸脱することなく、この実施形態の例に形態及び詳細の様々な変更を加えることができることを理解されよう。
【図１−１】
2021519593.tif 000033
【図１−２】
2021519593.tif 000034
【図２−１】
2021519593.tif 000035
【図２−２】
2021519593.tif 000036
【図２−３】
2021519593.tif 000037
【図３】
2021519593.tif 000038
【図４−１】
2021519593.tif 000039
【図４−２】
2021519593.tif 000040
【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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