(57)【要約】本発明は、生物医学の分野に関するものである。具体的には、本発明は、特定のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドおよびその使用、特に、癌などのＰＤ−Ｌ１関連疾患の検出および／または診断における使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プログラムデスリガンド１（ＰＤ−Ｌ１）に特異的に結合することが可能であり、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドであって、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインが
配列番号５に記載のアミノ酸配列または配列番号５と比較して１以上のアミノ酸残基置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、
配列番号６に記載のアミノ酸配列または配列番号６と比較して１以上のアミノ酸残基置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含み、例えば配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および
配列番号７に記載のアミノ酸配列または配列番号７と比較して１以上のアミノ酸残基置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ３
を含む、ＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチド。
【請求項２】
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインが、
配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、
配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および
配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３
を含む、請求項１に記載のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチド。
【請求項３】
免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは９５％、さらに好ましくは９９％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチド。
【請求項４】
免疫グロブリン単一可変ドメインが唯一のリジン残基を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチド。
【請求項５】
免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号１−２、８−１２および１８−２２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチド。
【請求項６】
免疫グロブリン単一可変ドメインがＶＨＨである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチド。
【請求項７】
前記ポリペプチドがＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１への結合を遮断しない、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項９】
発現調節エレメントに作動可能に連結された請求項８に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項１０】
請求項８に記載の核酸分子を含むか、または請求項９に記載の発現ベクターで形質転換され、かつＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドを発現することができる宿主細胞。
【請求項１１】
ａ）ＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドの発現を可能にする条件下で請求項１０に記載の宿主細胞を培養すること；
ｂ）工程ａ）から得られた培養物から宿主細胞によって発現されたＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドを回収すること；および
ｃ）工程ｂ）から得られたＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドを任意にさらに精製および／または改変すること
を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドを製造する方法。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか１つのＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドおよびＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドに結合した少なくとも１つの検出可能なマーカーを含む複合分子。
【請求項１３】
前記検出可能なマーカーが、放射性核種、蛍光剤、化学発光剤、生物発光剤、常磁性イオン、および酵素からなる群より選択される、請求項１２に記載の複合分子。
【請求項１４】
検出可能なマーカーが、110Ｉｎ、111Ｉｎ、177Ｌｕ、18Ｆ、52Ｆｅ、62Ｃｕ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、67Ｇａ、68Ｇａ、68Ｇｅ、86Ｙ、90Ｙ、89Ｚｒ、94mＴｃ、120Ｉ、123Ｉ、124Ｉ、125Ｉ、131Ｉ、154-158Ｇｄ、32Ｐ、11Ｃ、13Ｎ、15Ｏ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、51Ｍｎ、52mＭｎ、55Ｃｏ、72Ａｓ、75Ｂｒ、76Ｂｒ、82ｍＲｂ、83Ｓｒまたは他のγ−、β−、またはポジトロンエミッターからなる群より選択され，例えば、検出可能なマーカーが、68Ｇａまたは125Ｉである、請求項１３に記載の複合分子。
【請求項１５】
ＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドがキレート剤を介して検出可能マーカーに結合される、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の複合分子。
【請求項１６】
キレート剤が、ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡまたはＮＥＴＡからなる群より選択される、請求項１５に記載の複合分子。
【請求項１７】
検出可能なマーカーが68Ｇａであり、キレート剤がＮＯＴＡである、請求項１６に記載の複合分子。
【請求項１８】
ＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドが、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の複合分子。
【請求項１９】
生体試料中のＰＤ−Ｌ１の存在および／またはＰＤ−Ｌ１の発現レベルを検出するための方法であって、
ａ）生体試料および対照試料を、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドおよび／または請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の複合分子に、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドおよび／または請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の複合分子がＰＤ−Ｌ１と複合体を形成することを可能にする条件下で接触させること；
ｂ）複合体形成を検出すること
を含み、
生体試料と対照試料との間の複合体形成の相違は、試料中のＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ１の発現レベルの存在を示す、方法。
【請求項２０】
癌などのＰＤ−Ｌ１関連疾患を検出および／または診断するための診断薬であって、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドおよび／または請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の複合分子、および任意に生理学的に許容可能な担体を含む、診断薬。
【請求項２１】
診断薬が、ＳＰＥＣＴ造影剤またはＰＥＴ造影剤のようなＥＣＴ造影剤である、請求項２０に記載の診断薬。
【請求項２２】
癌などのＰＤ−Ｌ１関連疾患を検出および／または診断するための診断薬の製造における請求項１〜７のいずれか一項に記載のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドおよび／または請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の複合分子の使用。
【請求項２３】
診断薬が、ＳＰＥＣＴ造影剤またはＰＥＴ造影剤などのＥＣＴ造影剤である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドおよび／または請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の複合分子および／または請求項２０〜２１のいずれか一項に記載の診断薬を対象に投与することを含む、癌を検出および／または診断する方法。
【請求項２５】
前記対象にＳＰＥＣＴ撮像またはＰＥＴ撮像などのＥＣＴ撮像を行う工程をさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
癌がＰＤ−Ｌ１を高度に発現する、例えば、癌が、肺癌、卵巣癌、結腸癌、直腸癌、黒色腫、膀胱癌、乳癌、肝臓癌、リンパ腫、血液悪性腫瘍、頭頸部癌、神経膠腫、胃癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、子宮頸癌、体癌、骨肉腫からなる群から選択される、請求項２０〜２１のいずれか一項に記載の診断薬、請求項２２〜２３のいずれか一項に記載の使用、または請求項２４〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドおよび／または請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の複合分子および／または請求項２０〜２１のいずれか一項に記載の診断薬を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物医学の分野に関するものである。具体的には、本発明は、特定のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドおよびその使用、特に、癌などのＰＤ−Ｌ１関連疾患の検出および／または診断における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ‐１（ＰＤ‐１）はＣＤ２８，ＣＴＬＡ‐４，ＩＣＯＳ，ＰＤ‐１，ＢＴＬＡを含むＣＤ２８受容体ファミリーのメンバーである。このファミリーの最初のメンバーであるＣＤ２８およびＩＣＯＳは、モノクローナル抗体の添加によるＴ細胞増殖の増強を介して発見された（Ｈｕｔｌｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９），  Ｎａｔｕｒｅ  ３９７：  ２６３−２６６；  Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８０），  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｓ  １０：  ２４７−２６０）。２つの細胞表面糖タンパク質リガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２が同定されており、ＰＤ−１に結合するとＴ細胞活性化およびサイトカイン分泌を下方調節することが示されている（Ｆｒｅｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００），  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９２：１０２７−３４；  Ｌａｔｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ  （２００１），  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２：２６１−８；  Ｃａｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ  （２００２），  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３２：６３４−４３；  Ｏｈｉｇａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ  （２００５），  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１：２９４７−５３）。ＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１）およびＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ）はいずれも、ＰＤ−１に結合するが、他のＣＤ２８ファミリーメンバーには結合しないＢ７ホモログである（Ｂｌａｎｋら、２００４）。ＰＤ−Ｌ１の発現は、ヒト肺癌、卵巣癌、結腸癌、メラノーマ、および種々の骨髄腫を含むいくつかのマウスおよびヒトの癌において見出されている（Ｉｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２），  ＰＮＡＳ  ９９：  １２２９３−７；  Ｏｈｉｇａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ  （２００５），  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１：  ２９４７−５３）。現在入手可能な結果から、腫瘍細胞に高発現しているＰＤ−Ｌ１は、Ｔ細胞のアポトーシスを増加させることで腫瘍の免疫逃避に重要な役割を果たしていることが示されている。患者中のＰＤ−Ｌ１の発現を検出することは、腫瘍診断のために、または抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１腫瘍免疫療法のための臨床診断基礎を提供するために用いることができる。しかし、以前に報告されたＰＤ‐Ｌ１に対する抗体は、初期ステージの癌の効果的な検出および／または診断にうまく使用されていない。
【０００３】
Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｃｏｍｐｕｔｅｄ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ  （ＥＣＴ）は腫瘍診断に用いられてきた。ＥＣＴには、Ｓｉｎｇｌｅ−Ｐｈｏｔｏｎ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｃｏｍｐｕｔｅｄ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ  （ＳＰＥＣＴ）とＰｏｓｉｔｒｏｎ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ  （ＰＥＴ）があり、画像を介して高解像度の腫瘍撮像と定量解析を行う。
【０００４】
腫瘍細胞を発現するＰＤ−Ｌ１を検出するために用いることができる診断薬、特にＥＣＴ検出に適したＰＤ−Ｌ１抗体ベースの診断薬のニーズがある。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、従来のＰＥＴ技術を抗体および類似分子と組み合わせ、抗体を用いて標的細胞を同定し、それにより体内の全ての腫瘍のスナップショットを提供する。本発明は、興味深い細胞を同定するための画像化薬剤としてＰＤ−Ｌ１重鎖単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）または誘導体分子を使用するツールに関する。
【０００６】
１つの態様において、本発明は、プログラムデスリガンド１（ＰＤ−Ｌ１）に特異的に結合することが可能であり、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドであって、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインが
配列番号５に記載のアミノ酸配列または配列番号５と比較して１以上のアミノ酸残基置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、
配列番号６に記載のアミノ酸配列または配列番号６と比較して１以上のアミノ酸残基置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含み、例えば配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および
配列番号７に記載のアミノ酸配列または配列番号７と比較して１以上のアミノ酸残基置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ３
を含む。
【０００７】
いくつかの具体的な実施形態において、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインが、
配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、
配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および
配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３
を含む。
【０００８】
いくつかの実施形態において、免疫グロブリン単一可変ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、免疫グロブリン単一可変ドメインが唯一のリジン残基を含む。いくつかの実施形態において、免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号１−２、８−１２および１８−２２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態において、免疫グロブリン単一可変ドメインはＶＨＨである。
【００１１】
いくつかの実施形態において、ＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドはＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１への結合を遮断しない。
【００１２】
別の態様において、本発明は、本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。
【００１３】
別の態様では、本発明は、発現調節エレメントに作動可能に連結された本発明の核酸分子を含む発現ベクターを提供する。
【００１４】
別の態様において、本発明は、本発明の核酸分子を含むか、または本発明の発現ベクターで形質転換され、かつＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドを発現することができる宿主細胞を提供する。
【００１５】
別の態様において、本発明は、
ａ）ＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドの発現を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養すること；
ｂ）工程ａ）から得られた培養物から宿主細胞によって発現されたＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドを回収すること；および
ｃ）工程ｂ）から得られたＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドを任意にさらに精製および／または改変すること
を含む本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドを製造するための方法を提供する。
【００１６】
別の態様において、本発明は、本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチド、およびＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドに複合した少なくとも１つの検出可能なマーカーを含む結合分子を提供する。
いくつかの実施形態において、検出可能なマーカーは、放射性核種、蛍光剤、化学発光剤、生物発光剤、常磁性イオン、および酵素からなる群より選択される。
【００１７】
いくつかの実施形態では、検出可能なマーカーが、110Ｉｎ、111Ｉｎ、177Ｌｕ、18Ｆ、52Ｆｅ、62Ｃｕ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、67Ｇａ、68Ｇａ、68Ｇｅ、86Ｙ、90Ｙ、89Ｚｒ、94mＴｃ、120Ｉ、123Ｉ、124Ｉ、125Ｉ、131Ｉ、154-158Ｇｄ、32Ｐ、11Ｃ、13Ｎ、15Ｏ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、51Ｍｎ、52mＭｎ、55Ｃｏ、72Ａｓ、75Ｂｒ、76Ｂｒ、82ｍＲｂ、83Ｓｒまたは他のγ−、β−、またはポジトロンエミッターからなる群より選択される。例えば、検出可能なマーカーは、68Ｇａまたは125Ｉである。
【００１８】
いくつかの実施形態において、ＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドは、キレート剤を介して検出可能なマーカーに結合される。
【００１９】
いくつかの実施形態において、キレート剤は、ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡまたはＮＥＴＡからなる群より選択される。
【００２０】
いくつかの実施形態において、検出可能なマーカーは68Ｇａであり、キレート剤はＮＯＴＡである。
【００２１】
いくつかの実施形態において、ＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドは、配列番号１２または２２に記載のアミノ酸配列を含む。
【００２２】
別の態様では、本発明は、生体試料中のＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ１の発現レベルの存在を検出するための方法であって、
ａ）  本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドおよび／または本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドおよび／または本発明の結合分子がＰＤ−Ｌ１と複合体を形成し得るという条件下で、生体試料および対照試料を本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドおよび／または本発明の結合分子と接触させること；
ｂ）  複合体形成を検出すること
を含み、生体試料と対照試料との間の複合体形成の相違は、試料中のＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ１の発現レベルの存在を示す、方法を提供する。
【００２３】
別の態様では、本発明は、癌などのＰＤ−Ｌ１関連疾患を検出および／または診断するための診断薬を提供し、本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドおよび／または本発明の結合分子、および任意に生理学的に許容可能な担体を含む。いくつかの実施形態において、診断薬は、ＳＰＥＣＴ造影剤またはＰＥＴ造影剤などのＥＣＴ造影剤である。
【００２４】
別の態様では、本発明は、癌などのＰＤ−Ｌ１関連疾患を検出および／または診断するための診断薬の製造において、本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドおよび／または本発明の結合分子の使用を提供する。いくつかの実施形態において、診断薬は、ＳＰＥＣＴ造影剤またはＰＥＴ造影剤などのＥＣＴ造影剤である。
【００２５】
別の態様では、本発明は、本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドおよび／または本発明の結合分子および／または本発明の診断薬を対象に投与することを含む、対象における癌などのＰＤ−Ｌ１関連疾患を検出および／または診断するための方法を提供する。
【００２６】
いくつかの実施形態において、方法はさらに、対象に対するＥＣＴ撮像などの撮像を実施する工程を含む。いくつかの実施形態において、ＥＣＴ撮像はＳＰＥＣ撮像である。いくつかの実施形態において、ＥＣＴ撮像はＰＥＴ撮像である。
【００２７】
本発明の様々な態様のいくつかの実施形態において、癌はＰＤ−Ｌ１を高度に発現する。例えば、癌は、肺癌、卵巣癌、結腸癌、直腸癌、黒色腫、膀胱癌、乳癌、肝臓癌、リンパ腫、血液悪性腫瘍、頭頸部癌、神経膠腫、胃癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、子宮頸癌、体癌、骨肉腫からなる群より選択される。
【００２８】
別の態様において、本発明は、本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドおよび／または本発明の結合分子および／または本発明の診断薬を含むキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、重鎖単一ドメイン抗体１０９の生化学分析を示し、ここで、図１Ａおよび図１Ｂは、それぞれ、１０９−ｃｈｉｓおよび１０９のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析を示し、図１Ｃは、１０９−ｃｈｉｓおよび１０９の精製タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【００３０】
【図２】図２は１０９−ｃｈｉｓとＰＤ−Ｌ１の結合曲線を示す。
【００３１】
【図３】図３は、ＰＤ−Ｌ１の重鎖単一ドメイン抗体のｉｎｖｉｔｒｏ活性を示す。図３Ａは１０９−ｃｈｉｓの競合ＥＬＩＳＡ曲線を示し、図３Ｂはフローサイトメトリーによる細胞表面上のＰＤ−Ｌ１への１０９−ｃｈｉｓの結合効果を示し、図３Ｃは動物腫瘍切片における１０９−ｃｈｉｓの免疫組織化学的結果を示している。
【００３２】
【図４】図４は、単一ドメイン抗体のポジトロン核種による標識を示し、ここで、図４Ａは、単一ドメイン抗体をキレート剤および放射性核種68Ｇａと結合させるフローチャートを示し、図４Ｂは、タンパク質１０９および１０９−ＮＯＴＡの質量分析を示し、図４Ｃは67Ｇａ−ＮＯＴＡ−１０９の質量スペクトル分析を示し、図４Ｄは、67Ｇａ−ＮＯＴＡ−１０９−ｃｈｉｓのＰＤ−Ｌ１に対する結合曲線およびＥＣ５０値を示す。
【００３３】
【図５】図５は、変異体１０９−Ｋ６４Ｑ−ＲＤＮＳＥ−ｃＨｉｓの同定および分析を示し、図５Ａは、変異体１０９−Ｒ７３Ｎ＆Ｋ７５Ｅ−ｃＨｉｓおよび１０９−Ｋ８６Ｒ＆Ｐ８７Ａ−ｃＨｉｓのＥＬＩＳＡ活性分析を示し、図５Ｂは、変異抗体１０９−ＲＤＮＳＥ−ｃＨｉｓおよび１０９−Ｋ６４Ｑ−ｃＨｉｓのＥＬＩＳＡ活性分析を示し、図５Ｃは、変異体のＮＯＴＡコンジュゲートの質量分析を示す。
【００３４】
【図６】図６は、ポジトロン核種標識単一ドメイン抗体68Ｇａ−ＮＯＴＡ−１０９のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析を示し、ここで、図６Ａは、68Ｇａ−ＮＯＴＡ−１０９−ｃｈｉｓのＩＴＬＣ分析を示し、図６Ｂは、ＳＥＣ−ＨＰＬＣおよび68Ｇａ−ＮＯＴＡ−１０９−ｃｈｉｓのｉｎｖｉｔｒｏ安定性を示し、図６Ｃは、68Ｇａ−ＮＯＴＡ−１０９−ｃｈｉｓのエンドサイトーシス試験の結果である。
【００３５】
【図７】図７は、68Ｇａ−ＮＯＴＡ−１０９のｉｎ  ｖｉｖｏ分布を示し、ここで、図７Ａは、様々な組織における68Ｇａ−ＮＯＴＡ−１０９−ｃｈｉｓのｉｎ  ｖｉｖｏ分布を示し、図７Ｂは、68Ｇａ−ＮＯＴＡ−１０９−ｃｈｉｓｉｎｖｉｖｏ分布の腫瘍対臓器比を示し、図７Ｃは、68Ｇａ−ＮＯＴＡ−１０９−ｃｈｉｓのｉｎ  ｖｉｖｏ  ＰＥＴ撮像を示し、図７Ｄは、68Ｇａ−ＮＯＴＡ−１０９−ｃｈｉｓのｉｎ  ｖｉｖｏ生体内分布曲線を示す。
【００３６】
【図８】図８は、125Ｉ標識単一ドメイン抗体１０９のＳＰＥＣＴ結果を示す。
【００３７】
【図９】図９は、それぞれＰＢＳおよび血清中の68Ｇａ−ＮＯＴＡ−１０９のｉｎ  ｖｉｔｒｏ安定性を示したものである。
【００３８】
【図１０】図１０は、ＰＢＳ中の68Ｇａ−ＮＯＴＡ−１０９の種々の温度でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ安定性を示す。
【００３９】
【図１１】図１１は、68Ｇａ−ＮＯＴＡ−１０９のｉｎ  ｖｉｖｏ安定性を示す。
【００４０】
【図１２】図１２は、68Ｇａ−ＮＯＴＡ−１０９の免疫学的活性検出を示す。
【００４１】
【図１３】図１３は、同一マウスの様々な移植腫瘍における68Ｇａ−ＮＯＴＡ−１０９のＰＥＴ撮像を示したものである。Ａ：注射１時間後、68Ｇａ−ＮＯＴＡ−１０９；Ｂ：ＰＥＴ画像のＲＯＩ定量解析による腫瘍内68Ｇａ−ＮＯＴＡ−１０９の生体内分布。
【００４２】
【図１４】図１４は、Ｇａ−ＮＯＴＡ−１０９を用いたＰＥＴ撮像、同一マウスにおける異なる移植腫瘍のオートラジオグラフィーおよび免疫組織化学的分析を示す。Ａ：ＰＤ−Ｌ１腫瘍の免疫組織化学的染色。Ｂ：Ａ３７５（ｉ）、Ａ３７５／Ａ３７５−ＨＰＤ−Ｌ１（ｉｉ）、およびＡ３７５−ＨＰＤ−Ｌ１（ｉｉｉ）腫瘍における68ＧＡ−ＮＯＴＡ−１０９オートラジオグラフィー分析（上段）およびオートラジオグラフィー定量分析（下段）。
【発明の詳細な説明】
【００４３】
＜定義＞
指示されているか、明確に規定されていない限り、全ての用語は当該技術分野においてそれらの通常の意味を用いており、当業者には明らかであろう。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，  ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”  （２ｎｄ．Ｅｄ．），  Ｖｏｌｓ．  １−３，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）；  Ｌｅｗｉｎ，  ”Ｇｅｎｅｓ  ＩＶ”，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  （１９９０）；  および  Ｒｏｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”  （２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），  Ｇｏｗｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  Ｌｏｎｄｏｎ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８９），  および  本明細書に引用する一般的な先行技術文献などの標準的なハンドブックが参照される。また、特に断りのない限り、具体的に詳述されていない方法、工程、技術、手術はすべて、それ自体既知の方法で行うことができ、当業者には明らかである。例えば、標準マニュアル、上述の一般的な先行技術および本明細書に引用される他の参考文献にも記載されている。
【００４４】
特に明記しない限り、「抗体」または「免疫グロブリン」という用語は、重鎖抗体を指すか従来の4鎖抗体を指すかにかかわらず、本明細書で交換可能に使用され、完全サイズの抗体、その個々の鎖の両方、ならびにその全部分、そのドメインまたは断片（それぞれ、ＶＨＨドメインまたはＶＨ／ＶＬドメインなどの抗原結合ドメインまたはその断片を含むが、これらに限定されない）を含む一般的な用語として使用される。さらに、本明細書中で使用される「配列」という用語（例えば、「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「（単一）可変ドメイン配列」、「ＶＨＨ配列」または「タンパク質配列」などの用語）は、一般的に、関連するアミノ酸配列のほか、より限定された解釈を必要とする文脈を除いて、同じものをコードする核酸配列またはヌクレオチド配列の両方を含むことが理解されるべきである。
【００４５】
本明細書中で使用される（ポリペプチドまたはタンパク質の）「ドメイン」という用語は、残りのタンパク質とは無関係にその三次構造を保持する能力を有する折りたたまれたタンパク質構造を意味する。一般に、ドメインは、タンパク質の個別の特性に関与し、多くの場合に残りのドメインおよび／またはタンパク質の機能を喪失することなく、別の機能性のタンパク質に付加、除去または移入され得る。
【００４６】
本明細書で使用する用語「免疫グロブリンドメイン」とは、抗体鎖の球状領域（例えば、従来の４鎖抗体の鎖または重鎖抗体の鎖）、または本質的にそのような球状領域からなるポリペプチドを意味する。免疫グロブリンドメインは、抗体分子に特徴的な免疫グロブリンフォールドを保持している点で特徴づけられる。抗体分子は、約７個の逆平行β鎖からなる２層サンドイッチが２枚のβシートに配置され、任意に保存されたジスルフィド結合によって安定化されている。
【００４７】
本明細書で使用される「免疫グロブリン可変ドメイン」という用語は、本質的に４つの「フレームワーク領域」からなる免疫グロブリンドメインを意味し、当技術分野でおよび以下では、それぞれ「フレームワーク領域１」または「ＦＲ１」、「フレームワーク領域２」または「ＦＲ２」、「フレームワーク領域３」または「ＦＲ３」、および「フレームワーク領域４」または「ＦＲ４」と呼ばれ、このフレームワーク領域は、３つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」によって中断され、これらは当技術分野でおよび以下では「相補性決定領域１」または「ＣＤＲ１」、「相補性決定領域２」または「ＣＤＲ２」、「相補性決定領域３」または「ＣＤＲ３」とそれぞれ呼ばれる。したがって、免疫グロブリン可変ドメインの全般的な構造または配列は、以下のように示すことができる：  ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４。抗原結合部位をもつことによって抗原に対する抗体に特異性を与えるのは、免疫グロブリン可変ドメインである。
【００４８】
本明細書中で使用される用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」は、さらなる可変免疫グロブリンドメインと組み合わさることなしに、抗原のエピトープに特異的に結合することができる免疫グロブリン可変ドメインを意味する。本発明の意味における免疫グロブリン単一可変ドメインの１つの例は、免疫グロブリン単一可変ドメインＶＨおよびＶＬ（ＶＨドメインおよびＶＬドメイン）のような「ドメイン抗体」である。免疫グロブリン単一可変ドメインの別の例は、後に定義するようにラクダ科動物由来の「ＶＨＨドメイン」（または、単に「ＶＨＨ」）である。「ＶＨＨドメイン」は、ＶＨＨ、ＶHＨドメイン、ＶＨＨ抗体断片、およびＶＨＨ抗体としても知られ、元々、「重鎖抗体」の抗原結合性免疫グロブリン（可変）ドメイン（すなわち、「軽鎖を欠く抗体」）として記載されている  （Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  Ｃ，  Ａｔａｒｈｏｕｃｈ  Ｔ，  Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  Ｓ，  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  Ｇ，  Ｈａｍｅｒｓ  Ｃ，  Ｓｏｎｇａ  Ｅ  Ｂ，  Ｂｅｎｄａｈｍａｎ  Ｎ，  Ｈａｍｅｒｓ  Ｒ．：  ”Ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｄｅｖｏｉｄ  ｏｆ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎｓ”；  Ｎａｔｕｒｅ  ３６３，  ４４６−４４８  （１９９３））。用語「ＶＨＨドメイン」は、これらの可変ドメインを、従来の４鎖抗体に存在する重鎖可変ドメイン（本明細書では「ＶＨドメイン」と呼ぶ）および従来の４鎖抗体に存在する軽鎖可変ドメイン（本明細書では「ＶＬドメイン」と呼ぶ）から区別するために選択されている。ＶＨＨドメインは、さらなる抗原結合ドメインなしにエピトープに特異的に結合することができる（ＶＨドメインとともにＶＬによってエピトープが認識される従来の４鎖抗体のＶＨやＶＬドメインとは対照的である）。ＶＨＨドメインは、単一免疫グロブリンドメインによって形成される、小さくて頑丈で効率的な抗原認識単位である。
【００４９】
本発明の文脈において、用語「重鎖単一ドメイン抗体」、「ＶＨＨドメイン」、「ＶＨＨ」、「ＶHＨドメイン」、「ＶＨＨ抗体断片」、および「ＶＨＨ抗体」、ならびに「Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）」および「Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）ドメイン」（「Ｎａｎｏｂｏｄｙ」は、ｔｈｅ  ｃｏｍｐａｎｙ  Ａｂｌｙｎｘ  Ｎ．Ｖ．；  Ｇｈｅｎｔ；  Ｂｅｌｇｉｕｍの商標である）は、互換的に使用される。
【００５０】
免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばＶＨＨのアミノ酸残基はＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．  （”Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，  ＵＳ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．，  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ９１）によるＶＨドメインのための一般的番号付けに従って番号付けされ、、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１，  ２５−３８  （１９９９）の図２に示されるように、ラクダ科動物のＶＨＨドメインに適用される。この番号付けによれば、ＦＲ１は位置１〜３０のアミノ酸残基を含み、ＣＤＲ１は位置３１〜３５のアミノ酸残基を含み、ＦＲ２は位置３６〜４９のアミノ酸を含み、ＣＤＲ２は位置５０〜６５のアミノ酸残基を含み、ＦＲ３は位置６６〜９４のアミノ酸残基を含み、ＣＤＲ３は位置９５〜１０２のアミノ酸残基を含み、ＦＲ４は位置１０３〜１１３のアミノ酸残基を含む。
【００５１】
しかしながら、ＶＨドメインおよびＶＨＨドメインについては当技術分野で周知であるように、ＣＤＲの各々におけるアミノ酸残基の総数は様々であり、カバット番号付けによって示されるアミノ酸残基の総数に対応していない可能性がある（すなわち、カバット番号付けによる１つ以上の位置が実際の配列において占有されていないか、または実際の配列がカバット番号付けが可能な数よりも多くのアミノ酸残基を含む可能性がある）。これは、一般に、カバットによる番号付けは、実際の配列中のアミノ酸残基の実際の番号付けと対応している場合もあれば、対応していない場合もあることを意味する。
【００５２】
ＶＨドメインのアミノ酸残基の番号付けのための別の方法（この方法はまた、ＶＨＨドメインに類似の様式で適用され得る）は、当該分野で公知である。ただし、本記載においては、特に断りのない限り、請求項及び図表において、カバットに準拠し、上記のＶＨＨドメインに適用する番号付けに従う。ＶＨＨドメイン中のアミノ酸残基の総数は、通常、１１０〜１２０個であり、しばしば１１２〜１１５個である。しかし、より小さい配列およびより長い配列も、本明細書に記載される目的に適している可能性があることに注意すべきである。
【００５３】
特異的な抗原またはエピトープに結合するＶＨＨを得る方法は、Ｒ．  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｉｎｄｅｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４０（２０００）１８５−１９５；  Ｌｉら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２８７（２０１２）１３７１３−１３７２１；  Ｄｅｆｆａｒら、Ａｆｆａｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．８（１２），  ｐｐ．２６４５−２６５２，１７，２００９  Ｊｕｎｅ；およびＷＯ９４／０４６７８に以前に記載されている。
【００５４】
ラクダ科動物に由来するＶＨＨドメインは、「ヒト化」（本明細書では「配列最適化」とも呼ばれる）することができ、「配列最適化」は、ヒト化に加えて、従来のヒト４鎖抗体からのＶＨドメイン中の対応する位置に生じるアミノ酸残基の１つ以上により、元のＶＨＨ配列のアミノ酸残基の１つ以上を置換することにより、改善された特性を有するＶＨＨを提供する１つ以上の変異による配列のさらなる改変を包含することができる。ヒト化ＶＨＨドメインは、１つ以上の完全ヒトフレームワーク領域配列を含むことができる。
【００５５】
さらに、ヒトスカフォールドまたは非免疫グロブリングロブリンスカフォールドを含むが、これらに限定されない、他の「スカフォールド」上に上記のＣＤＲの１つ以上を「移植」することが可能であることも、当業者には明らかであろう。このようなＣＤＲ移植のための適切なスカフォールドおよび技術が当技術分野で公知である。
【００５６】
本明細書中で使用される、用語「エピトープ」または互換的に使用される用語「抗原決定基」は、抗体のパラトープが結合する抗原上の任意の抗原決定基を指す。抗原決定基は通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基を含み、通常、特異的な三次元構造特性および特異的電荷特性を有する。例えば、エピトープは、独特の空間的コンホメーションにおいて、通常、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の連続アミノ酸または非連続アミノ酸を含み、それらは「線形エピトープ」または「立体配置」エピトープであり得る。例えば、ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ６６，  Ｇ．Ｅ．  Ｍｏｒｒｉｓ，  Ｅｄ．  （１９９６）の方法のＥｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  を参照されたい。線形エピトープでは、タンパク質と相互作用する分子（抗体など）との間のすべての相互作用点は、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って直線的に存在する。立体配置エピトープでは、互いに離れたタンパク質アミノ酸残基にわたって相互作用点が存在する。
【００５７】
当該技術分野で周知の多くのエピトープマッピング技術を用いて、所与の抗原のエピトープを同定することができる。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ６６，  Ｇ．Ｅ．  Ｍｏｒｒｉｓ，  Ｅｄ．  （１９９６）における方法におけるＥｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓを参照されたい。例えば、線形エピトープは、例えば、以下の方法によって決定され得る：多数のペプチドを固体支持上で同時に合成し、ここで、これらのペプチドは、タンパク質分子の一部に対応し、これらのペプチドを、支持体に依然として付着したまま抗体と反応させる。これらの技術は当該技術分野で公知であり、例えば、米国特許第４，７０８，８７１号；  Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：  ３９９８−４００２；  Ｇｅｙｓｅｎら（１９８６）  Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：７０９−７１５に記載されている。同様に、立体配置エピトープは、例えば、Ｘ線結晶解析や２次元核磁気共鳴によって、アミノ酸の空間配置を決定することによって同定することができる。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（前掲）を参照のこと。
【００５８】
当業者に公知の従来技術を用いて、同じエピトープへの競合的結合について抗体をスクリーニングすることができる。例えば、競合および交差競合研究を行い、互いに競合する抗体を得るか、または抗原への結合について交差競合する抗体を得ることができる。その交差競合に基づいて同じエピトープに結合する抗体を得るためのハイスループット法は、国際特許出願ＷＯ０３／４８７３１に記載されている。したがって、当業者に公知の従来技術を用いて、ＰＤ−Ｌ１上の同じエピトープに結合するために本発明の抗体分子と競合する抗体およびその抗原結合断片を得ることができる。
【００５９】
一般的に、「特異性」という用語は、特定の抗原結合分子または抗原結合タンパク質（本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインなど）分子が結合し得る様々な種類の抗原またはエピトープの数を意味する。抗原結合分子の特異性は、その親和性および／またはアビディティに基づいて決定することができる。抗原結合タンパク質をもつ抗原の解離に対する平衡定数（ＫＤ）で表される親和性は、抗原結合タンパク質上のエピトープと抗原結合部位との結合強度の尺度である。すなわち、ＫＤの値が小さいほど、エピトープと抗原結合分子との結合強度が強くなる（代替的に、親和性は１／ＫＤである親和定数（ＫＡ）として表されることもある）。当業者にとって明らかであるように、親和性は、対象とする特異的抗原に応じて、それ自体が知られている方法で決定することができる。アビディティは、抗原結合分子（例えば、免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメインまたはそれを含むポリペプチド）と該当する抗原との結合の強さの尺度である。アビディティは、抗原結合分子上のエピトープとその抗原結合部位との親和性と、抗原結合分子上に存在する適切な結合部位の数との両方に関係している。
【００６０】
本明細書中で使用される「ＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチド」という用語は、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する本発明の単一ドメイン抗体のような、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合することができる任意のポリペプチドを意味する。
【００６１】
「ＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチド」とは、ＰＤ−Ｌ１に結合する一価ポリペプチド（すなわち、ＰＤ−Ｌ１の１つのエピトープに結合するポリペプチド）、および二価または多価の結合ポリペプチド（すなわち、１より多いエピトープに結合する結合ポリペプチド）を意味してもよい。本発明の「ＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチド」は、ＰＤ−Ｌ１に結合するＶＨＨなどの少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含み得る。
【００６２】
一般に、本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドは、結合されるべき抗原（すなわち、ＰＤ−Ｌ１）に、BiacoreまたはKinExAアッセイで測定で測定したとき、好ましくは１０-7〜１０-11ｍｏｌ／Ｌ（Ｍ）、より好ましくは１０-8〜１０-11ｍｏｌ／Ｌ、またはさらにより好ましくは１０-9〜１０-11、さらにより好ましくは１０-10〜１０-11Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）および／または少なくとも１０7Ｍ-1、好ましくは少なくとも１０8Ｍ-1、より好ましくは少なくとも１０9Ｍ-1、より好ましくは少なくとも１０10Ｍ-1、例えば少なくとも１０11Ｍ-1の会合定数（ＫＡ）で結合する。１０-4Ｍより大きいＫＤ値は、一般に、非特異的結合を示すと見なされる。抗原またはエピトープに対する抗原結合タンパク質の特異的結合は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ、スキャッチャードアッセイ、および／または本明細書に記載される競合結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）およびサンドイッチ競合アッセイ）を含む、公知の任意の好適な方法で決定され得る。
【００６３】
アミノ酸残基は、当該技術分野で一般に知られ、かつ合意されているように、標準的な３文字または１文字のアミノ酸コードに従って示されるであろう。２つのアミノ酸配列を比較する場合、「アミノ酸の違い」という用語は、第２の配列と比較して、参照配列の位置における指示された数のアミノ酸残基の挿入、欠失または置換を意味する。置換の場合、そのような置換は、アミノ酸置換であることが望ましく、これは、アミノ酸残基が類似の化学構造の別のアミノ酸残基と置換され、かつポリペプチドの機能、活性または他の生物学的特性にほとんど影響を及ぼさないか、本質的に影響を及ぼさないことを意味する。このような保存的アミノ酸置換は、当技術分野でよく知られており、保存的アミノ酸置換は好ましくは、（ｉ）〜（ｖ）の群内の１つのアミノ酸が同じ群内の別のアミノ酸残基により置換される置換である：（ｉ）小さな脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＰｒｏおよびＧｌｙ；（ｉｉ）極性、負電荷を帯びた残基およびその（非荷電）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕおよびＧｌｎ；（ｉｉｉ）極性、正電荷を帯びた残基：Ｈｉｓ、ＡｒｇおよびＬｙｓ；（ｉｖ）大きな脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌおよびＣｙｓ；ならびに（ｖ）芳香族残基：Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐ。特に好ましい保存的アミノ酸置換は以下のとおりである：ＡｌａをＧｌｙまたはＳｅｒへ；ＡｒｇをＬｙｓへ；ＡｓｎをＧｌｎまたはＨｉｓへ；ＡｓｐをＧｌｕへ；ＡｓｐをＧｌｕへ；ＣｙｓをＳｅｒへ；ＧｌｎをＡｓｎへ；ＧｌｕをＡｓｐへ；ＧｌｙをＡｌａまたはＰｒｏへ；ＨｉｓをＡｓｎまたはＧｌｎへ；ＩｌｅをＬｅｕまたはＶａｌへ；ＬｅｕをＩｌｅまたはＶａｌへ；ＬｙｓをＡｒｇへ、ＧｌｎへまたはＧｌｕへ；ＭｅをＬｅｕへ、ＴｙｒへまたはＩｌｅへ；ＰｈｅをＭｅｔへ、ＬｅｕへまたはＴｙｒへ；ＳｅｒをＴｈｒへ；ＴｈｒをＳｅｒへ；ＴｒｐをＴｙｒへ；ＴｙｒをＴｒｐへまたはＰｈｅへ；ＶａｌをＩｌｅへまたはＬｅｕへ。
【００６４】
２つのポリペプチド配列間の「配列同一性」とは、配列間の同一アミノ酸の割合を意味し、「配列類似性」とは、同一であるか又は保存的アミノ酸の置換を表す割合のアミノ酸を意味する。アミノ酸またはヌクレオチド間の配列同一性の程度を評価する方法は、当業者に公知である。例えば、アミノ酸配列の同一性は、通常、配列解析ソフトウェアを用いて測定される。例えば、ＮＣＢＩデータベースのＢＬＡＳＴプログラムを用いて、同一性を決定することができる。配列同一性の決定のために、例えば、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｌｅｓｋ，  ＡＭ，  ｅｄ．，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８８；  Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，  Ｓｍｉｔｈ，  ＤＷ，  ｅｄ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ，  １９９３；  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，  Ｐａｒｔ  Ｉ，  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  ＡＭ，  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  ＨＧ，  ｅｄｓ．，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，  １９９４；  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，  Ｇ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８７  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，  Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．，  ｅｄｓ．，  Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９１を参照されたい。
【００６５】
ポリペプチドまたは核酸分子は、供給源および／または培地（培養培地）と比較して、ポリペプチドまたは核酸分子が得られる（他のタンパク質／ポリペプチド、別の核酸、別の生物学的成分または高分子、または少なくとも１つの汚染物質、不純物または微量成分など）天然の生物学的供給源または培地（培養培地）において、通常それと関連している少なくとも１つの他の成分から単離された場合、「実質的に単離された」とみなされる。特に、ポリペプチドまたは核酸分子は、少なくとも２回、特に少なくとも１０回、より特に少なくとも１００回および最大１０００回またはそれ以上精製された場合、「実質的に単離された」とみなされる。任意の適切な技術（例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの適切なクロマトグラフィー技術）によって決定されるように、「実質的に単離された」ポリペプチドまたは核酸分子は、好ましくは実質的に均一である。
【００６６】
本明細書中で使用される「対象」という用語は、哺乳動物、とりわけ霊長類、とりわけヒトを意味する。
【００６７】
本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチド
一態様において、本発明は、プログラムデスリガンド１（ＰＤ−Ｌ１）と特異的に結合することが可能であり、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むことを特徴とする、ＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドを提供し、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインは、
配列番号５に記載のアミノ酸配列または配列番号５と比較して１以上のアミノ酸残基置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、
配列番号６に記載のアミノ酸配列または配列番号６と比較して１以上のアミノ酸残基置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含み、例えば配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および
配列番号７に記載のアミノ酸配列または配列番号７と比較して１以上のアミノ酸残基置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。
【００６８】
いくつかの具体的な実施形態において、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインは、
配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、
配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および
配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３
を含む。
【００６９】
いくつかの実施形態において、免疫グロブリン単一可変ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００７０】
いくつかの実施形態において、免疫グロブリン単一可変ドメインは、配列番号１に由来する。配列番号１のポリペプチドは、遊離アミノ基を有する全部で３個のリジン残基（それぞれ配列番号１の位置６４、７５および８６）を含み、これらの基は、ＮＯＴＡのようなキレート剤のコンジュゲーションに用いることができる。結合ポリペプチドおよびＮＯＴＡのようなキレート剤のコンジュゲートの純度を最適化し、ポリペプチドの１モルのみをキレート剤の１モルと結合させることができるようにするために、これらのリジン残基を置換することができる。例えば、いくつかの好ましい実施形態において、免疫グロブリン単一可変ドメインは、唯一のリジン残基を含むことができる。
【００７１】
さらに、リジン残基を置換する場合、適当な結合能を保持するために、リジン残基の隣接残基を変異させることができる。例えば、いくつかの実施形態において、免疫グロブリン単一可変ドメインは、配列番号１と比較してＫ６４Ｑ置換を含む。いくつかの実施形態において、免疫グロブリン単一可変ドメインは、配列番号１と比較してＫ８６ＲおよびＰ８７Ａ置換を含む。いくつかの実施形態において、免疫グロブリン単一可変ドメインは、配列番号１と比較して、Ｈ７１Ｒ、Ｒ７３Ｎ、Ａ７４Ｓ、およびＫ７５Ｅ置換を含む。いくつかの実施形態において、免疫グロブリン単一可変ドメインは、配列番号１と比較してＲ７３ＮおよびＫ７５Ｅ置換を含む。いくつかの実施形態において、免疫グロブリン単一可変ドメインは、配列番号１と比較して、Ｋ６４Ｑ、Ｈ７１Ｒ、Ｒ７３Ｎ、Ａ７４Ｓ、およびＫ７５Ｅ置換を含む。本願の実施例は、このような変異が、ＣＤＲ（例えば、Ｋ６４Ｑ）に位置していても、ＰＤ−Ｌ１に対する結合親和性を破壊しないことを示す。ここでのアミノ酸位置の番号付けは配列番号１を参照する。
【００７２】
用語「含む」が本明細書中でタンパク質または核酸の配列を記述するために使用される場合、タンパク質または核酸は、配列から成ることもあれば、タンパク質または核酸のいずれかまたは両端に付加アミノ酸またはヌクレオチドを有していてもよいが、それでもなお本発明に記載された活性を有する。例えば、本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドは、Ｈｉｓタグを含むが、これらに限定されない、発現および／または精製に適したタグも含み得る。
【００７３】
いくつかの実施形態において、免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号１−２、８−１２および１８−２２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００７４】
いくつかの実施形態において、免疫グロブリン単一可変ドメインはＶＨＨである。
【００７５】
いくつかの実施形態において、ＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドはＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１への結合を遮断しない。ＰＤ−Ｌ１の正常機能に影響を及ぼさないようにＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の結合を遮断しないことで、起こりうる副作用を軽減することができる。さらに、本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドが結合するＰＤ−１のエピトープは、ＰＤ−１が結合する先行技術のＰＤ−Ｌ１の結合部位とは異なっているため、本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドは、治療用抗体などのＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断するように設計された他の抗体の有効性に影響を及ぼさない可能性がある。したがって、いくつかの実施形態において、本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドは、ＰＤ−Ｌ１に対する治療用抗体とＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断せず、それにより、ＰＤ−Ｌ１に対する治療用抗体を投与することによって癌を治療し、本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドまたはそれに由来する複合分子を用いて癌を同時に監視することを可能にする。
【００７６】
核酸、ベクター、宿主細胞
別の態様において、本発明は、本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドをコードする核酸分子を含む。本発明の核酸分子は、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。当業者は、必要性または慣用手段に従って、ＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドをコードする核酸分子を選択し得る。
【００７７】
本発明の核酸分子はベクターの形態でもよく、ベクター中に存在してもよく、および／またはプラスミド、コスミドまたはＹＡＣなどのベクターの一部であってもよい。ベクターは、とりわけ発現ベクター、すなわち、ＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏ（すなわち、適当な宿主細胞、宿主生物、および／または発現系において）の発現を提供するベクターであってもよい。発現ベクターは、典型的には、１つ以上の適当な発現調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネータなど）に作動可能に連結された本発明の少なくとも１つの核酸を含む。特定の宿主における発現のためのエレメントおよびそれらの配列の選択は、当業者に共通の知見である。本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドの発現に有用または不可欠な調節エレメントおよび他のエレメントの具体例としては、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、組み込み因子、選択マーカー、リーダー配列、レポーター遺伝子などが挙げられる。
【００７８】
本発明の核酸分子は、本明細書に開示されている本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に関する情報に基づいて、既知の方法（例えば、自動ＤＮＡ合成および／または組換えＤＮＡ技術により）で調製または入手することができ、かつ／または適当な天然資源から単離することができる。
【００７９】
別の態様において、本発明は、本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドの１つ以上を発現するか、または発現することができる宿主細胞を含み、かつ／または本発明の核酸またはベクターを含む。本発明の好ましい宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞または哺乳動物細胞である。
【００８０】
適当な細菌細胞は、グラム陰性細菌株（例えば、大腸菌株、プロテウス株、およびシュードモナス株）およびグラム陽性細菌株（例えば、バチルス株、ストレプトマイセス株、ブドウ球菌株、およびラクトコッカス株）の細胞を含む。
【００８１】
適当な真菌細胞は、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の種の細胞を含むか；またはサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）  （例えば、サッカロマイセス・セレビシエ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）  （例えば、シゾサッカロマイセス・ポンぺ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）  （例えば、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）  およびピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ））およびハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）の種の細胞を含む。適当な哺乳動物細胞は、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞などを含む。
【００８２】
しかしながら、異種タンパク質を発現するための両生類細胞、昆虫細胞、植物細胞、および当該技術分野における任意の他の細胞もまた、本発明において使用することができる。
【００８３】
本発明はまた、一般に以下の工程を含む、本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドを製造する方法を提供する：
−  本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドの発現を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養すること；および
−  宿主細胞によって発現されたＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドを培養物から回収すること；および
−  任意に、本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドをさらに精製および／または改変すること。
【００８４】
本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドは、上述のように細胞内で（例えば、細胞質内、ペリプラズム内、または封入体内で）生産し、その後、宿主細胞から単離し、任意にさらなる精製を行うことができる；または、細胞外で（例えば、宿主細胞が培養される培地中で）生産し、続いて、培地から単離し、任意にさらなる精製を行うことができる。
【００８５】
特定の適切な発現ベクター、形質転換またはトランスフェクション方法、選択マーカー、タンパク質発現を誘導する方法、培養条件などのようなポリペプチドの組換え産生のための方法および試薬は、当該技術分野で公知である。同様に、本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドを作る方法に適したタンパク質単離および精製技術は当業者に周知である。
【００８６】
しかしながら、本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドは、固相または液相合成を含む化学合成など、当該技術分野で知られている他のタンパク質産生方法によっても得ることができる。
【００８７】
複合分子
別の態様において、本発明は、本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチド、および本発明のｐＤ−Ｌ１結合ポリペプチドに結合した少なくとも１つの検出可能なマーカーを含む複合分子を提供する。検出可能なマーカーは、放射性核種、蛍光剤、化学発光剤、生物発光剤、常磁性イオン、および酵素を含むが、これらに限定されない。
【００８８】
コンジュゲーションに用いることができる蛍光剤には、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、およびフルオレスアミンが含まれるが、これらに限定されない。コンジュゲーションに用いることができる化学発光剤としては、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジン塩およびオキサレートが挙げられるが、これらに限定されない。コンジュゲーションに用いることができる生物発光剤には、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびクラゲの発光タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。コンジュゲーションに用いることができる常磁性イオンには、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジウム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イットリビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホロミウム（ＩＩＩ）およびエルビウム（ＩＩＩ）、またはダム、ジアトリゾエート、エチオジッド油、クエン酸ガリウム、イオカルミン酸、ロセタミック酸（ｌｏｃｅｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、ヨーダミド、オジパミデ（ｏｄｉｐａｍｉｄｅ）、ロドキサム酸、イオプロミド、イオヘキソール、イオパミドール、イオパノ酸、イオプロセミン酸、イオセファミン酸、イオセリック酸、ロカルミン酸、ロタズール（Ｉｏｔａｓｕｌ）、イオテトリック酸、イオタラム酸、イオトロクス酸、イオキサグル酸、イオキソトリゾ酸、イポダート、メグルミン、メトリザミド、メトリゾ塩、ジオノシルおよび水酸化タリウムなどの放射性不透過性材料が含まれるが、これらに限定されないコンジュゲーションに用いることができる酵素としては、限定されないが、西洋ワサビペルオキシダーゼなどが挙げられる。
【００８９】
好ましくは、検出可能なマーカーは放射性核種である。例えば、では、コンジュゲーションに使用できる放射性核種、例えばエネルギーが２０〜４０００ＫｅＶの放射性核種であり、110Ｉｎ、111Ｉｎ、177Ｌｕ、18Ｆ、52Ｆｅ、62Ｃｕ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、67Ｇａ、68Ｇａ、68Ｇｅ、86Ｙ、90Ｙ、89Ｚｒ、94mＴｃ、120Ｉ、123Ｉ、124Ｉ、125Ｉ，131Ｉ、154-158Ｇｄ、32Ｐ、11Ｃ、13Ｎ、15Ｏ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、51Ｍｎ、52mＭｎ、55Ｃｏ、72Ａｓ、75Ｂｒ、76Ｂｒ、82ｍＲｂ、83Ｓｒまたは他のγ−、β−、またはポジトロン排出因子を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、検出可能なマーカーは68Ｇａまたは125Ｉである。
【００９０】
検出可能なマーカーをポリペプチドに結合する方法は、当業者に周知である。例えば、いくつかの実施形態において、ＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドは、キレート剤を介して検出可能なマーカーに結合され得る。
【００９１】
本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドを68Ｇａなどの放射性核種で標識するために、本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドは、イオンに結合するために複数の組み込み基を有する長い尾部を有する試薬と反応させることができる。このような尾部は、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸）、ＮＯＴＡ、ＴＥＴＡ、ＮＥＴＡ、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、ビスチオセミカルバゾン、ポリオキシムなどのキレート基に結合しうる側鎖の誘導体化または誘導体化された重合体、およびそのために有用であることが知られている類似基を有する、ポリリジン、多糖類、または他のポリマーであってもよい。キレート剤は、標準的な化学的方法を用いて抗体に結合させることができる。いくつかの実施形態において、検出可能なマーカーは、キレート剤を介して本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドに結合される。使用されるキレート剤は、ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡまたはＮＥＴＡを含むが、これらに限定されない。
【００９２】
いくつかの具体的な実施形態において、検出可能なマーカーは68Ｇａであり、キレート剤はＮＯＴＡである。いくつかの実施形態において、ＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドは、配列番号１２または２２に記載のアミノ酸配列を含む。
【００９３】
別の態様において、本発明は、１）本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドをキレート剤と結合させてＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドおよびキレート剤のコンジュゲートを生成すること；および２）68Ｇａなどの放射性核種と工程１）の産物を接触させること、を含む、68Ｇａなどの本発明の放射性核種で標識した複合分子を製造するための方法を提供し、これにより、本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドをキレート剤のキレート作用を通して68Ｇａなどの放射性核種と標識する。いくつかの実施形態において、キレート剤はＮＯＴＡであり、工程１）において、ＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドをｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＮＯＴＡまたはｐ−ＮＨ２−Ｂｎ−ＮＯＴＡと反応させて、ＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドおよびＮＯＴＡのコンジュゲートを生成する。
【００９４】
別の態様において、本発明は、１）本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドをクロラミンＴの存在下で125Ｉと反応させる工程；および２）任意に、メタ重亜硫酸ナトリウムとの反応を停止させる工程を含む、本発明の125Ｉ標識複合分子の製造方法を提供する。
【００９５】
検出／診断的使用
別の態様では、本発明は、
ａ）本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドおよび／または本発明の複合分子がＰＤ−Ｌ１と複合体を形成し得るという条件下で、生体試料および対照試料を本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドおよび／または本発明の複合分子と接触させること；および
ｂ）生体試料と対照試料との間の複合体形成の相違が、試料中のＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ１の発現レベルの存在を示す複合体形成を検出すること
を含む、生体試料中のＰＤ−Ｌ１の存在および／またはＰＤ−Ｌ１の発現レベルを検出するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、生体試料はｅｘ  ｖｉｖｏ試料である。
【００９６】
別の態様において、本発明は、本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドおよび／または本発明の複合分子、および任意に生理学的に許容可能な担体を含む組成物を提供する。該組成物は、診断薬、例えばＰＤ−Ｌ１関連疾患を検出および／または診断するための診断薬として用いることができる。
【００９７】
別の態様では、本発明は、癌などのＰＤ−Ｌ１関連疾患を検出および／または診断するための診断薬を提供し、本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドおよび／または本発明の複合分子、および任意に生理学的に許容可能な担体を含む。いくつかの実施形態において、診断薬は造影剤である。
【００９８】
本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドおよび／または本発明の複合分子は、特にｉｎ  ｖｉｖｏ撮像、例えば、発光コンピュータ断層撮影に適している。例えば、本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドおよび／または本発明の複合分子は、種々のマーカーに応じて単光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）およびポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）に適用することができる。腫瘍診断においては、高分解能腫瘍撮像を提供し、その画像で定量解析を行うことができる。ＳＰＥＣＴ撮像にはＳＰＥＣＴ／ＣＴ撮像も含まれる可能性があり、ＰＥＴ／ＣＴ撮像にはＰＥＴ／ＣＴ撮像も含まれる可能性があり、改良された撮像効果を提供することができる。
したがって、いくつかの実施形態において、造影剤は、ＳＰＥＣＴ造影剤またはＰＥＴ造影剤のようなＥＣＴ造影剤である。
【００９９】
別の態様では、本発明は、癌などのＰＤ−Ｌ１関連疾患を検出および／または診断するための診断薬の製造において、本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドおよび／または本発明の複合分子の使用を提供する。いくつかの実施形態において、診断薬は造影剤である。いくつかの実施形態において、造影剤は、ＳＰＥＣＴ造影剤またはＰＥＴ造影剤などのＥＣＴ造影剤である。
【０１００】
別の態様では、本発明は、本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドおよび／または本発明の複合分子および／または本発明の診断薬を対象に投与することを含む、癌などのＰＤ−Ｌ１関連疾患を対象で検出および／または診断する方法を提供する。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、方法は、さらに、ＥＣＴ撮像のような撮像を対象に実施する工程を含む。いくつかの実施形態において、ＥＣＴ撮像はＳＰＥＣ撮像である。いくつかの実施形態において、ＥＣＴ撮像はＰＥＴ撮像である。ＳＰＥＣＴまたはＰＥＴによるスキャンに使用される撮像技術およびデバイスは、当技術分野で周知であり、このような周知のＥＣＴ撮像技術およびデバイスをいずれも使用することができる。
【０１０２】
本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドおよび／または本発明の複合分子および／または本発明の診断薬によって検出および／または診断することができる疾患には、感染性疾患、癌などの細胞、組織又は器官においてＰＤ−Ｌ１発現が異常に上昇した疾患が含まれる。
【０１０３】
本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドを用いて検出および／または診断され得る好ましい癌は、ＰＤ−Ｌ１を高度に発現する。非限定的な例としては、肺癌、卵巣癌、結腸癌、直腸癌、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、膀胱癌、乳癌、肝臓癌、リンパ腫、血液悪性腫瘍、頭頸部癌、神経膠腫、胃癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、子宮頸癌、体部癌、および骨肉腫が挙げられる。本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドを用いて検出および／または診断され得る他の癌の例は、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、前立腺癌、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮癌、肛門領域の癌、精巣癌、卵管癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺の癌、副腎癌、軟部肉腫、尿道癌、陰茎癌、急性骨髄性白血病を含む慢性または急性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、小児期の固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、尿管癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊椎軸腫瘍、脳幹部神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストによって誘発されたものを含む環境的に誘発された癌、および上記の癌の組み合わせを含む。本発明はまた、転移性癌、特にＰＤ−Ｌ１を発現する転移性癌の検出および／または診断に有用である（Ｉｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７：  １３３−１４４）。
【０１０４】
別の態様において、本発明は、本発明のＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドおよび／または本発明の複合分子および／または本発明の診断用剤を含むキットを提供する。本発明の方法を実施するためにキットを用いる。キットは、典型的には、キットの内容物の使用目的を示すラベルを含む。ラベルという用語には、キット上またはキットとともに提供される、あるいは他の方法でキットとともに提供される書面または記録された資料が含まれる。 
【実施例】
【０１０５】
以下、実施例によって本発明をさらに記載するが、本発明は記載した実施例の範囲に限定されない。
【０１０６】
実施例１：ＰＤ−Ｌ１に対する重鎖単一ドメイン抗体のスクリーニング
１．１  ライブラリー構築
免疫化のためのＰＤＬ１‐Ｆｃ融合タンパク質をＣＨＯ細胞で発現させ、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーにより精製した。新彊フタコブラクダが免疫のために選ばれた。４回の免疫化の後、１００ｍｌのラクダ末梢血リンパ球を抜き取り、ＱＩＡＧＥＮによって提供されたＲＮＡ抽出キットを用いて全ＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡを指示書に従ってＳｕｐｅｒ−Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＦＩＲＳＴ  ＳＴＲＡＮＤＳＵＰＥＲＭＩＸキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。重鎖抗体の可変領域をコードする核酸断片をネスト化ＰＣＲにより増幅した：
ＰＣＲの第１ラウンド：
上流プライマー：  ＧＴＣＣＴＧＧＣＴＧＣＴＣＴＴＣＴＡＣＡＡＧＧＣ（配列番号１４）；
下流プライマー：  ＧＧＴＡＣＧＴＧＣＴＧＴＴＧＡＡＣＴＧＴＴＣＣ    （配列番号１５）。
ＰＣＲの第２ラウンド：
鋳型としての第１ラウンドのＰＣＲ生成物、
上流プライマー：  ＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＲＧＧＡＧＧ  （配列番号１６）；
下流プライマー：  ＧＧＡＣＴＡＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＴＧＧＧＴ（配列番号１７）
【０１０７】
標的重鎖単一ドメイン抗体の核酸断片を回収し、ベクターｐＣＤｉｓｐｌａｙ−３（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｃａｔ：  ＶＰＴ４０２３）にクローニングし、制限酵素ＰｓｔＩおよびＮｏｔＩを用いてファージディスプレイを行った。その後、生成物をエレクトロポレーションコンピテント大腸菌ＴＧ１細胞にエレクトロトランスフォームし、ＰＤ−Ｌ１に対する重鎖単一ドメイン抗体のファージディスプレイライブラリーを構築し、検証した。勾配希釈後平板培養で計算したライブラリーの容量は１．３３×１０8である。ライブラリーの挿入率を検出するために、２４クローンをコロニーＰＣＲのために無作為に選択した。その結果、挿入率は１００％に達したことが示された。
【０１０８】
１．２  ＰＤ−Ｌ１に対する重鎖単一ドメイン抗体のスクリーニング
プレートを１０μｇ／ウェル中のＰＤＬ１−Ｆｃ融合タンパク質でコーティングし、４℃で一晩置いた。翌日、室温で１％脱脂乳を２時間ブロッキングに用い、１００μｌのファージ（８×１０  11  ｔｆｕ、１．１で構築したラクダ重鎖単一ドメイン抗体のファージディスプレイライブラリー由来のファージ）を加え、室温で１時間インキュベートした後、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ中０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）で５回洗浄し、非結合ファージをウォッシュオフした。最後に、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するファージをトリエチルアミン（１００ｍＭ）を用いて解離させ、対数増殖期に大腸菌ＴＧ１に感染させて、スクリーニングの次のラウンドためのファージを産生し、精製した。同じスクリーニングプロセスを３〜４ラウンド繰り返した。その結果、陽性クローンが濃縮されたことにより、ファージディスプレイ技術を用いた抗体ライブラリーにおけるＰＤ−Ｌ１特異的抗体のスクリーニングの目的が達成された。
【０１０９】
１．３  ファージの酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いた単一特異的陽性クローンのスクリーニング
３〜４ラウンドのスクリーニング後、得られたＰＤ−Ｌ１結合陽性ファージを用いて空の大腸菌細胞に感染させ、プレートした。その後、９６個の単一コロニーを選択し、別々に培養してファージを作り、精製した。このプレートを一晩４℃のＰＤＬ１−Ｆｃ融合タンパク質でコーティングし、得られた試料ファージ（対照群：ブランクファージ）を加え、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、一次抗体、抗体、ヒト抗ＨＡタグ抗体（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｋａｎｇｗｅｉ  Ｃｅｎｔｕｒｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．から購入）を追加し、常温で１時間インキュベートした。洗浄後、二次抗体であるヤギ抗マウスアルカリホスファターゼ標識抗体（Ａｍｉｃｔｅｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．より購入）を添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、アルカリフォルターゼの展開液を加え、４０５ｎｍの波長で吸光度値を読み取った。試料ウェルのＯＤ値が対照ウェルのＯＤ値より３倍大きい場合、試料ウェルは陽性クローンウェルとして決定される。プラスミドを抽出し、配列分析を行うために、陽性クローンウェルの細菌を培養用に１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ液体に移した。
【０１１０】
配列アラインメントソフトＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩに従って、各々のクローンのタンパク質の配列を分析した。同一のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３配列を有するクローンは同一の抗体とみなされ、ＣＤＲ配列が異なるクローンは異なる抗体とみなされる。最後に、ＰＤ−Ｌ１重鎖単一ドメイン抗体が得られ、１０９と命名された。
【０１１１】
実施例２：ＰＤ−Ｌ１  に対する重鎖単一ドメインの予備的検討・同定
２．１  ＰＤ−Ｌ１単一ドメイン抗体の遺伝子クローンの構築
単一ドメイン抗体のアミノ酸配列は、表１に示されており、ここで、１０９−ｃｈｉｓは、Ｃ末端にＨｉｓタグを有する組換えタンパク質である。ＣＤＲ配列は囲みで示してある。
【表１】
2021530248.tif 000002
【０１１２】
表１の単一ドメイン抗体をコードするヌクレオチド配列を配列番号３および配列番号４に示す。
１０９単一ドメイン抗体のヌクレオチド配列：
2021530248.tif 000003
１０９−ｃｈｉｓのヌクレオチド配列：
2021530248.tif 000004
【０１１３】
１０９抗体のＣＤＲ配列は、ＣＤＲ１：  ＧＦＳＬＤＤＳＤＭＧ（配列番号５）；  ＣＤＲ２：  ＩＡＳＤＲＳＴＹＹＴＰＳＶＫＧ（配列番号６）；およびＣＤＲ３：  ＡＰＲＬＡＹＴＴＡＭＴＣＥＧＤＦＡＹ（配列番号７）である。
【０１１４】
単一ドメイン抗体のヌクレオチド配列を基に設計したプライマーと遺伝子全体の合成ＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ産物をｐＣＤＮＡ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｔ  Ｖ８６２２０）ベクターにクローン化し、遺伝子配列解析を行い、標的クローンの遺伝子配列の正しさを調べた。
【０１１５】
２．２  哺乳動物細胞によるＰＤ−Ｌ１抗体タンパク質の調製
単一ドメイン抗体融合タンパク質の組換え体構築プラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、抗体発現を行った。組換え発現プラスミドをＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ａｒｔ．Ｎｏ．１２３３８０１８）で希釈し、形質転換に必要なＰＥＩ  （ポリエチレンイミン）溶液に添加した。プラスミド／ＰＥＩ混合物をＨＥＫ２９３細胞懸濁液に加え、３７℃および１０  ％  ＣＯ2で９０ｒｐｍで培養した。４時間後にＥＸ２９３培地（Ｓｉｇｍａ，  Ａｒｔ．Ｎｏ．  １４５７１Ｃ）と２ｍＭグルタミンを加え１３５ｒｐｍで培養した。２４時間後、培養液に３．８ｍＭのバルプロ酸ＶＰＡ  （Ｓｉｇｍａ，  Ａｒｔ．Ｎｏ．Ｐ４５４）を添加した。５〜６日間の培養後、一過性発現培養からの上清を採取し、１０９−ｃｈｉｓ単一ドメイン抗体をＮｉ＋レジンゲル親和性クロマトグラフィーにより精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で測定した純度が９５％以上の精製抗体を得た、１０９単一ドメイン抗体をまず親和性クロマトグラフィーによりワン工程で濃縮し、次にイオンクロマトグラフィーカラムにより精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で測定した純度が９５％以上の精製された１０９抗体を得ることができた（図１Ａ−Ｃに示す）。
【０１１６】
２．３  ＰＤ−Ｌ１重鎖単一ドメイン抗体のヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質への特異的結合の検出
ＰＤＬ１−Ｆｃ融合タンパク質はＨＥＫ２９３によって一過性発現され、ニッケルカラム親和性クロマトグラフィーによって精製された。得られたＰＤＬ１−Ｆｃ融合タンパク質を４℃で一晩０．５μｇ／ｗｅｌｌ  でコーティングした後、得られた連続希釈したＰＤ−Ｌ１単一ドメイン抗体に加え、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、抗ｈｉｓ−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗体（Ａｂｃａｍ，  Ａｒｔ．Ｎｏ．  ａｂ１１８７から購入）を添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄後に展開液を加え、４０５ｎｍの波長で吸光度値を読み取った。ソフトウェアＳｏｔｆＭａｘＰｒｏ  ｖ５．４を用いて４パラメータフィッティングによりデータ処理およびマッピング解析を実施した結果、図２に示すような抗体からＰＤ−Ｌ１への結合曲線およびＥＣ５０値（２．８９１ｎｇ／ｍＬ）が得られ、これは１０９抗体のＰＤ−Ｌ１への親和性を反映している。
【０１１７】
実施例３：ＰＤ−Ｌ１抗体タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性解析
３．１  ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の相互作用に対するＰＤ−Ｌ１重鎖単一ドメイン抗体の遮断作用を検討する競合ＥＬＩＳＡ
ＰＤＬ１−ｍｕＦｃ融合タンパク質（マウスＦｃを使用）及びＰＤ１−Ｆｃ融合タンパク質を、ｐＣＤＮＡ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｔ  Ｖ８６２２０）にクローニングし、ＨＥＫ２９３細胞に発現させることにより得た。プレートをＰＤＬ１−ｍｕＦｃ融合タンパク質０．５μｇ／ｗｅｌｌで４℃で一晩被覆した後、ＰＤ１−Ｆｃ  １０μｇを各ウェルに添加し（対照群：抗体又はタンパク質を添加せず、等容量の緩衝液のみを添加）、重鎖単一ドメイン抗体１０９−ｃｈｉｓの初回希釈濃度３μｇ／Ｌ（対照群：緩衝液）、２倍希釈、１２勾配で、室温で１時間インキュベートした。その後、ａｎｔｉ−ｈｉｓ−ＨＲＰ（Ａｂｃａｍ社から購入）を添加し、室温で１時間インキュベートした。次に展開液を加え、４０５ｎｍの波長で吸光度値を読み取った。ＰＤ−１過剰の存在下では、重鎖単一ドメイン抗体１０９−ｃｈｉｓ濃度が増加するにつれて結合に対するＳ曲線結合を示す傾向が認められた場合には、遮断作用はないと考える。
【０１１８】
プレートをＰＤＬ１−ｍｕＦｃ融合タンパク質０．５μｇ／ｗｅｌｌで４℃で一晩被覆した後、ＰＤ１−Ｆｃ  １０μｇを各ウェルに添加し（対照群：抗体又はタンパク質を添加せず、等容量の緩衝液のみを添加）、重鎖単一ドメイン抗体１０９−ｃｈｉｓの初期希釈濃度３μｇ／Ｌ（対照群：緩衝液）、２倍希釈、１２勾配で、室温で１時間インキュベートした。その後、抗Ｆｃ−ＨＲＰ（Ａｂｃａｍ社から購入）を添加し、室温で１時間インキュベートした。次に展開液を加え、４０５ｎｍの波長で吸光度値を読み取った。重鎖単一ドメイン抗体である１０９−ｃｈｉｓの濃度が上昇した場合、ＰＤ−１との結合傾向が安定していることから、ＰＤ−１とＰＤＬ１との結合は抗体の存在により影響を受けないと考えられる。結果を図３Ａに示す。ＰＤＬ１への１０９結合のエピトープはＰＤ−１のそれと同じではなく、それによって、ＰＤ−１タンパク質の存在によって１０９のＰＤ−Ｌ１タンパク質への結合に影響を与えない。
【０１１９】
３．２  フローサイトメトリーによるＰＤ−Ｌ１重鎖単一ドメインの細胞表面ＰＤ−Ｌ１への結合効果の検出
ヒトＰＤ−Ｌ１完全長タンパク質の遺伝子を安定にトランスフェクトしたヒトメラノーマＡ３７５細胞を構築することにより、膜上にヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質を安定に発現する３７５細胞（Ａ３７５−ＰＤＬ１細胞）が得られた。ＰＤ−Ｌ１を発現しない腫瘍形成性細胞株、ＭＣＦ−７を陰性対照として用いた。ＭＣＦ−７細胞株は、寄託番号ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２２を有するＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ）から入手し、推奨通り培養した。細胞は、使用前に９０％を超えるコンフルエンスまで培養した。抗ＰＤ−Ｌ１単一ドメイン抗体１０９を用いて、これらの細胞株のフローサイトメトリー解析を行い、間接免疫蛍光染色の定量解析を行い、各細胞表面受容体の個数を求めた。
【０１２０】
トリプシンの代わりに細胞解離緩衝液（ＰＢＳ＋１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を使用して、細胞表面受容体のタンパク質分解を回避するために細胞培養皿から接着細胞を溶出した。細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、氷冷緩衝液（ＰＢＳ  ＋  ０．５％  ＢＳＡ  ｗ／ｖ）中で５−１０×１０6細胞／ｍｌに再懸濁した。１００μＬ細胞のアリコートを一次抗体５μｇと混合し、氷上で４５分間インキュベートした。次に、細胞を１ｍｌの氷冷フローサイトメトリー緩衝液（２％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ）で洗浄し、３００×ｇで５分間遠心分離し、緩衝液０．５μＬ中で再懸濁した。１００μＬの二次抗体−ＰＥコンジュゲート及びＰＢＳの１：５０希釈液を加え、暗所で４５分間氷上インキュベートした。次に細胞を氷冷緩衝液１ｍＬで２回洗浄し、３００×ｇで５分間遠心分離し、緩衝液５００μＬ中で再懸濁した。
【０１２１】
フローサイトメトリー解析は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ５００  ＭＰＬで実施した。各試験管について、最低５×１０４のイベントを採取した。すべての分析は単一色であり、ＦＬ１でＰＥが検出される。前方散乱（ＦＳ）と側方散乱（ＳＳ）データは、全ての細胞集団が密接にクラスタ化されていることを示す。
【０１２２】
フローサイトメトリーを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞のＰＤＬ１発現を評価した（図３Ｂに示す）。Ａ３７５−ＰＤＬ１細胞についてＰＤＬ１の最高発現レベルが示され、ＭＣＦ−７細胞についてＰＤＬ１発現がほとんど示されなかった。
【０１２３】
３．３  ＰＤ−Ｌ１単一ドメイン抗体タンパク質のＰＤ−Ｌ１への結合能の同定（Ｂｉａｃｏｒｅ）
Ｂｉａｃｏｒｅの実験温度は２５℃、注入流量は５０μｌ／分であった。アナライトをＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液で一定の濃度に希釈し、ブランク参照チャネルおよび活性化チャネルを順に通過させた。ブランク参照チャネル上に発生したシグナル値はチップ上のアナライトの非特異的吸着を反映し、活性化チャネル上に発生したシグナル値はアナライトとリガンドとの特異的結合を反映する。アナライトを３００秒間導入した後、ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液を１８０秒間導入してアナライトをリガンドから解離させた。１０９抗体を７つの勾配で２００ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、１２．５ｎｇ／ｍｌ、６．２５ｎｇ／ｍｌ、３．１２５ｎｇ／ｍｌに希釈した。異なる濃度のアナライトを繰り返し導入し、解離させる。
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００により記録されたデータは、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウェアにより分析される。
【０１２４】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体の測定された結合親和性の結果は表２のとおりであった。そのＫｄ値は１．７ｎＭである。１０９タンパク質はＰＤ‐Ｌ１標的タンパク質に対して有意な親和性を有することが示された。
【表２】
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【０１２５】
３．４  免疫組織化学
６〜８週齢の雌ヌードマウスを用いてｉｎ  ｖｉｖｏ試験を実施した。ヌードマウスを特定の病原体を含まない（ＳＰＦ）環境で飼育し、食品や水を自由に摂取させ、標準的な１２時間の昼夜照明サイクルを行う。異種移植のために、１００μｌの細胞（Ａ３７５‐ＰＤＬ１またはＭＣＦ‐７）／ＰＢＳをマウスの右前肢の皮下に移植した。細胞接種濃度は約５〜６×１０6細胞／マウスである。移植はイソフルラン麻酔下で行った。これらの条件下で、注射動物の８０％以上において、３〜４週後に使用可能な腫瘍（Ａ３７５−ＰＤＬ１またはＭＣＦ−７）（１００−３００μｇ）が得られた。解剖によりマウスから腫瘍を採取し、腫瘍全体をホルマリンで固定し、免疫組織化学的検査まで４℃で保存した。免疫組織化学的切片は、当業者に周知の従来法に準じて作製し、抗ｈｉｓ−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗体で染色した。
【０１２６】
図３Ｃの免疫組織化学の結果から、Ａ３７５−ＰＤＬ１腫瘍は１０９−ｃｈｉｓを一次抗体とした使用したＰＤ−Ｌ１発現で陽性であり、ＰＤ−Ｌ１は主に細胞表面に発現しており、ＭＣＦ−７腫瘍は細胞表面のＰＤ−Ｌ１発現が陰性であることが分かり、フローサイトメトリーの結果と一致する。
【０１２７】
実施例４：核種で単一ドメイン抗体を標識
本発明の単一ドメイン抗体を、図４Ａに示されるフローチャートに従って、キレート剤、ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＮＯＴＡおよび放射性核種68Ｇａで標識した。
４．１  単一ドメイン抗体とｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＮＯＴＡとの反応
単一ドメイン抗体、１０９−ｃｈｉｓ（３ｍｇ）をｐＨ８．７の炭酸ナトリウム緩衝液０．０５Ｍに溶解し、１０倍モル比の過剰ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＮＯＴＡ（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ，  Ａｒｔ．Ｎｏ．  Ｂ−６０５）を加えた。混合物を常温で少なくとも１８時間暗所で撹拌し、過剰ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＮＯＴＡを除去するためＰＤ−１０カラム（ＧＥ）を用いて結合された産物を精製し、限外濾過チューブにより単一ドメイン抗体を約１ｍｇ／ｍＬに濃縮した。ｐＨ７．０のリン酸緩衝液０．１Ｍを移動相としてＳＥＣ−ＨＰＬ分析を行った。
【０１２８】
キレート化ＮＯＴＡの量は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬ液体クロマトグラフィー質量分析計により測定した。単一ドメイン抗体の濃度は、ＢＣＡタンパク質の濃度測定用キットにより測定した。クロマトグラフィー条件は以下のとおりである：Ｗａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ機器、  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ  Ｃ１８  １．７μｍ（２．１×１００ｍｍ）クロマトカラムを用い、オートサンプラー温度を４℃、カラム温度５０℃で流速０．２５ｍＬ／分、試料４μｌ、カラム温度での勾配溶出、０．１％ギ酸水溶液（Ａ）−０．１％ギ酸−アセトニトリル（Ｂ）の移動相と設定した。分子量の特性はＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ  ４．０を用いて算出した。単一ドメイン抗体１０９−ｃｈｉｓ−ＮＯＴＡの得られた質量分析結果を図４Ｂに示す。
【０１２９】
質量分析の結果からわかるように、図４Ｂの左パネルに示すように、１０９−ｃｈｉｓタンパク質の分子量は１３６０３Ｄａであり、ＮＯＴＡと結合させた後、ＮＯＴＡの１分子と結合させた０９−ｃｈｉｓについては、対応する分子量が４５０Ｄａ増加し、１４０５３Ｄａであった。また、ＮＯＴＡの２分子と結合させた０９−ｃｈｉｓについては、図４Ｂの右パネルに示すように、対応する分子量が９００Ｄａ増加し、１４５０３Ｄａであった。１０９−ｃｈｉｓ−ＮＯＴＡの質量分析の結果から、１０９−ｃｈｉｓ−ＮＯＴＡの結合反応後、生成物はＮＯＴＡ１分子と２分子と結合させた１０９−ｃｈｉｓの混合物であることが示された。
【０１３０】
４．２  69,71Ｇａ‐ＮＯＴＡ‐１０９‐ｃｈｉｓの合成
ＧａＣｌ3をＨＣＬ０．０５Ｍに溶解し、酢酸ナトリウム溶液０．２Ｍの１／２体積を加え、ｐＨ  ５．３で１０９‐ｃｈｉｓ‐ＮＯＴＡを含む酢酸ナトリウム緩衝液０．１Ｍの１／４体積を加えた。反応系のｐＨは４．５〜４．７で、室温で１０分間反応を行った。未反応のガリウムイオンはＰＤ−１０カラムにより除去される。キレート化67Ｇａの量は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬ液体クロマトグラフィー質量分析計を用いて測定した。単一ドメイン抗体の濃度は、ＢＣＡタンパク質の濃度測定用キットにより測定した。クロマトグラフィー条件は以下のとおりである：Ｗａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ機器、  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ  Ｃ１８  １．７μｍ（２．１×１００ｍｍ）クロマトカラムを用い、オートサンプラー温度を４℃、カラム温度５０℃で流速０．２５ｍＬ／分、試料４μｌ、勾配溶出、０．１％ギ酸水溶液（Ａ）−０．１％ギ酸−アセトニトリル（Ｂ）の移動相と設定した。得られた69,71Ｇａ−ＮＯＴＡ−１０９−ｃｈｉｓの質量分析結果を図４Ｃに示した。
69,71Ｇａ−ＮＯＴＡ−１０９−ｃｈｉｓの質量分析結果から、生成物は１分子と２分子69,71Ｇａでキレートされたタンパク質の混合物であることがわかった。
【０１３１】
分子量１４１２０はＮＯＴＡ１分子と69,71Ｇａ１分子で標識した１単一ドメイン抗体用、分子量１４６３７はＮＯＴＡ２分子と69,71Ｇａ２分子で標識した１単一ドメイン抗体用である。その結果、この条件下では、対応する生成物がＮＯＴＡ結合反応とＧａコールド標識によってうまく得られることを実証した。
【０１３２】
４．３  69,71Ｇａ−ＮＯＴＡ−１０９−ｃｈｉｓのＰＤ−Ｌ１に対する結合能の同定
ＰＤＬ１‐Ｆｃ融合タンパク質はＨＥＫ２９３によって一過性発現され、ニッケルカラム親和性クロマトグラフィーによって精製された。得られたＰＤＬ１−Ｆｃ融合タンパク質を０．５μｇ／ｗｅｌｌで４℃で一晩被覆した後、４．２で得られたＰＤ−Ｌ１単一ドメイン抗体タンパク質の連続希釈１０９−ｃｈｉｓ  ＰＤ−Ｌ１単一ドメイン抗体又はキレート化生成物を添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、抗ｈｉｓ−ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗体を加え、室温で１時間インキュベートした。洗浄後に展開液を付加し、４０５ｎｍの波長で吸光度値を読み取った。アプリケーションソフトウェアＳｏｔｆＭａｘＰｒｏ  ｖ５．４は、データ処理とマッピング解析に使用される。４パラメータフィッティングを通して、ＰＤ−Ｌ１に対する抗体の結合曲線およびＥＣ５０値を図４Ｄに示すように得て、１０９−ｃｈｉｓ抗体またはその標識形成のＰＤ−Ｌ１に対する親和性能力を反映させた。
【０１３３】
図４Ｄに示す。縦軸はＯＤ４０５、横軸はＰＤ−Ｌ１単一ドメインタンパク質の濃度（濃ｎｇ／ｍＬ）であり、四角は１０９−ｃｈｉｓ、ダイアモンドは69,71Ｇａ−ＮＯＴＡ−１０９−ｃｈｉｓである。２つの分子はＰＤ−Ｌ１に対して同等の親和性を有する。
【０１３４】
４．４  68Ｇａ‐ＮＯＴＡ‐１０９‐ｃｈｉｓの合成
０．０５Ｍの滅菌ＨＣＬをＥｃｋｅｒｔ  ＆  Ｚｉｅｇｌｅｒ  ＧａｌｌｉａＰｈａｒｍゲルマニウム６８／ガリウム６８（Ｇｅ６８／Ｇａ６８）ジェネレーターでリンスして68Ｇａ溶離液を調製し、０．２Ｍの酢酸ナトリウム溶液の１／２体積を加え、ｐＨ５．３の１０９−ｃｈｉｓ−ＮＯＴＡを含む酢酸ナトリウム緩衝液０．１Ｍの１／４体積を加えた。反応系のｐＨは４．５〜４．７で、反応は室温で１０分間行った。ＰＤ−１０カラムを用いて未反応ガリウムイオンを除去し、生成物緩衝液を同時に生理食塩水で置換した。68Ｇａ‐ＮＯＴＡ‐１０９‐ｃｈｉｓ注入の総放射能濃度を線量補正器（ｄｏｓｅ  ｃｏｒｒｅｃｔｏｒ）により分析した。
【０１３５】
実施例５：１０９抗体の構造変異
１０９抗体タンパク質は、構造上に遊離アミノ基を有する全部で３つのリジン基を含み、これは、その後の標識のために使用することができる。抗体標識キレートの純度を最適化し、抗体の各ｍｏｌがキレート１ｍｏｌとしか結合できないようにするために、抗体表面のリジンを変異させ、親和性を維持するために、リジンに近接するアミノ酸も変異させて、表３に示すように、１０９−Ｒ７３Ｎ＆Ｋ７５Ｅ−ｃＨｉｓ、１０９−Ｋ８６Ｒ＆Ｐ８７Ａ−ｃＨｉｓ、１０９−ＲＤＮＳＥ−ｃＨｉｓ、１０９−Ｋ６４Ｑ−ｃＨｉｓの計４種の変異体を得た。また、変異抗体のＰＤ−Ｌ１に対する結合能に影響を及ぼすか否かについても検討された。
【０１３６】
【表３】
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Ｋ６４Ｑ変異はＣＤＲ２に位置し、ＩＡＳＤＲＳＴＹＹＴＰＳＶＱＧ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含む変異ＣＤＲ２を生じる。
【０１３７】
５．１  変異抗体のＰＤ−Ｌ１に対する結合能の同定（ＥＬＩＳＡ法）
ＰＤＬ１−Ｆｃ融合タンパク質はＨＥＫ２９３によって一過性発現され、ニッケルカラム親和性クロマトグラフィーによって精製された。得られたＰＤＬ１−Ｆｃ融合タンパク質を０．５μｇ／ｗｅｌｌ  一晩４°Ｃでコートした。得られたＰＤ−Ｌ１単一ドメイン抗体タンパク質を連続希釈した後加えて室温で１  時間インキュベートした。洗浄後、抗ｈｉｓ−ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄後に展開液を付加し、４０５ｎｍの波長で吸光度値を読み取った。ソフトウェアＳｏｔｆＭａｘＰｒｏ  ｖ５．４は、データ処理とマッピング分析に使用される。４パラメータフィッティングを行ったが、ＰＤ‐Ｌ１に対する抗体の結合曲線とＥＣ５０値は、ＰＤ‐Ｌ１に対する抗体の親和性を反映するものであった。
【０１３８】
結果を図５Ａ〜Ｂに示す。縦軸をＯＤ４０５とし、横軸をＰＤ−Ｌ１単一ドメイン抗体タンパク質の濃度（ｎｇ／ｍＬ）とした。単一のリジン変異を有する変異体のＥＣ５０は、野生型１０９‐ｃｈｉｓのそれと比較してわずかに減少し、変異体の親和性が破壊されないことを示した。
【０１３９】
５．２  変異抗体のＮＯＴＡ標識の分析
前述したように、抗体表面のアミノ酸変異は、抗原の抗体への結合能に影響を与えなかった。キレート剤の標識率をさらに解析し、変異抗体をＮＯＴＡと結合させ、４．１に記載した方法を用いた質量分析法により同定した。
【０１４０】
質量分析の結果、図５Ｃから、Ｋ７５ＥおよびＫ６４Ｑ変異抗体については、アミノ酸変異によりＮＯＴＡ結合効率は変化せず、Ｋ８６Ｒ変異後、基本的にＮＯＴＡを抗体にうまく結合することができなかったことが分かる。この結果は、Ｋ８６がＮＯＴＡと容易に結合するアミノ酸であることを示した。そこで、ＲＤＮＳＥ変異体タンパク質に基づいてＫ６４Ｑ変異により１０９‐Ｋ６４Ｑ‐ＲＤＮＳＥ‐ｃＨｉｓを調製した。
【０１４１】
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【０１４２】
４．１に記載の方法を用いて、変異抗体、１０９−Ｋ６４Ｑ−ＲＤＮＳＥ−ｃＨｉｓをＮＯＴＡと結合させ、質量分析によって同定した。質量分析の結果、変異単一ドメイン抗体、１０９−Ｋ６４Ｑ−ＲＤＮＳＥ−ｃＨｉｓとキレート剤との反応からの産物であるｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＮＯＴＡは、ＮＯＴＡの１分子と結合した純粋な最終産物であることが実証された。
【０１４３】
実施例６：ポジトロン核種で標識した単一ドメイン抗体68Ｇａ−ＮＯＴＡ−１０９のｉｎ  ｖｉｔｒｏ解析
６．１  薄層クロマトグラフィー（ＩＴＬＣ）分析
ＩＴＬＣ  ＳＡはあらかじめ１ｃｍｘ１２ｃｍの細片に切断し、細片の末端を互いに１ｃｍ離して鉛筆でマークした。酢酸アンモニウム１Ｍ：メタノール（１：１  Ｖ／Ｖ）溶液を３〜４ｍｍの深さに現像槽に投入し、槽を覆い平衡化した。68Ｇａ‐１０９注射液の液滴をＩＴＬＣ細片の下端から１ｃｍの鉛筆線に滴下した。ＩＴＬＣ細片を現像タンク内に配置し、試料を負荷点（すなわち頂部鉛筆線マークまで）から１０ｃｍ離して現像した。ＩＴＬＣスキャンニングはラジオメトリックＩＴＬＣスキャナーで行い、放射化学純度（ＲＣＰ）はクロマトグラム上のピークを統合して計算した。解析結果を図６Ａに示し、単一ドメイン抗体１０９がポジトロン核種68Ｇａで首尾よく標識されたことを示した。
【０１４４】
６．２  ＳＥＣ−ＨＰＬＣとｉｎ  ｖｉｔｒｏ安定性解析
ＳＥＣ‐ＨＰＬＣクロマトグラフィー条件は、Ｔｏｋｏｕ  ｓｖ３０００ＳＬ  （４．６×２５０ｍｍ）カラムとＲａｙｔｅｓｔ  ＧＡＢＩ放射能ディテクターを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＨＰＬＣでＳＥＣ‐ＨＰＬＣを行った。ｐＨ  ７．０の０．１Ｍリン酸緩衝液を移動相としてＳＥＣ分析を行った。
【０１４５】
ＰＤ−１０カラム上で精製された放射性標識された単一ドメイン抗体の代表的なＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを図６Ａに示した。２８０ｎｍのＵＶクロマトグラムでは、放射性標識した単一ドメイン抗体の保持時間は、対応する非標識単一ドメイン抗体の保持時間と比較して、ほとんど変化しなかった（ＵＶとγディテクターの物理的な分離の時間差を除く；データは示されていない）。
【０１４６】
放射性標識した抗体を正常生理食塩水中に室温で３時間保存した。ＳＥＣの結果、明らかな分解や68Ｇａの解離は認められず（図６Ｂ）、この条件下で放射性標識抗体は基本的に安定であることが示された。
【０１４７】
標識された放射性標識体である６８Ｇａ−ＮＯＴＡ−１０９をＰＢＳおよび血清（ＦＢＳ）に入れ、室温で０、２、４時間保存し、ＨＰＬＣで分析して、ＰＢＳおよびＦＢＳ中での安定性を観察した。結果を図９Ａおよび９Ｂに示す。その結果、調製した放射性標識体をＰＢＳ及び血清中に室温で４時間置いた後、保存前の放射性標識体と比較してピーク形状に差は認められなかった。放射化学的純度は＞９８％であり、有意な解離は観察されなかった。
【０１４８】
その後、標識した放射性標識体である６８Ｇａ−ＮＯＴＡ−１０９をＰＢＳに入れ、５５〜７５℃で４時間保存し（図１０）、そのｉｎ  ｖｉｔｒｏ温度安定性を測定した。その結果、調製した放射性標識体を５５℃のＰＢＳ中に４時間置いた後、貯蔵前の放射性標識体と比較してピーク形状に差は認められなかった。放射化学的純度は＞９８％であり、有意な解離は観察されなかった。放射性標識体を６５℃及び７５℃のＰＢＳ中に４時間置くと、主ピークの後ろに分解ピークが存在し、温度上昇に伴い分解量が増加した。
【０１４９】
６．３  細胞結合とエンドサイトーシス分析
細胞をウェルあたり８×１０5細胞および培地／ウェル３ｍＬで６−ウェルプレート中にプレートし、３７℃および５％ＣＯ2で一晩培養した。細胞を取り出し、４℃で３０分間インキュベートした。すべての６−ウェルプレートを取り出し、プレート中の培地を１０μｃｉ（〜５０ｎＭ）の加熱標識（ｈｅａｔ−ｌａｂｅｌｅｄ）タンパク質を含む培地に置き換え、プレートを４℃で１時間インキュベートした；プレートの３ウェル中の培地を非特異的吸着の対照試料として２５μＭの非標識タンパク質を含む培地に置き換えた。上清中の非結合タンパク質を含む培地を吸い出した。細胞を１％ＢＳＡを含むあらかじめ冷却したＰＢＳ２ｍＬで２回洗浄し、増殖培地で補い、３７℃および５％ＣＯ2で１時間および２時間インキュベートした。細胞を異なる期間インキュベートした後、２つの試験の上清を取り出し、細胞にｐＨ  ３．０で酢酸ナトリウム２０ｍＭを含むＰＢＳ２ｍＬを添加し、４℃で１５分間インキュベートした後、再びｐＨ  ３．０で酢酸ナトリウム２０ｍＭを含むＰＢＳ２ｍＬを添加した。これら２つの上清は細胞表面に結合した部分のｃｐｍ値用であった。残りの細胞ペレットを０．５％ＳＤＳを含むＰＢＳ中に再懸濁し、これはエンドサイトーシスに関与する部分のｃｐｍ値用であった。細胞結合とエンドサイトーシスに関与する部分のｃｐｍ値をガンマカウンターで測定し、減衰補正を行った。図６Ｃに示したように、68Ｇａはエンドサイトーシス後には基本的に解離せず、放射性標識抗体は構造中で安定であることが示された。
【０１５０】
６．４  安定性解析ｉｎ  ｖｉｖｏ
健常マウスを選択し、各々に９８％の放射化学純度の68Ｇａ‐ＮＯＴＡ‐１０９０．１ｍＬを尾静脈から注入した。注射２時間後に採尿し、ＨＰＬＣで分析し、68Ｇａ‐ＮＯＴＡ‐１０９  ｉｎ  ｖｉｖｏの安定性を測定した。
【０１５１】
この結果は、マウスに注射した放射性医薬品の２時間後に、尿中の放射性核種の主ピーク形状は、放射性標識体のそれと変わらなかったが、主なピークの後ろに分解ピークがあった。
【０１５２】
実施例７：  68Ｇａ−ＮＯＴＡ−１０９免疫活性測定法
68Ｇａ−ＮＯＴＡ−１０９の免疫学的活性は以下のように決定された。
（１）  細胞を消化してプレートし、３７℃および５％  ＣＯ2で一晩インキュベートした後、４℃で３０分間インキュベートする。
（２）  消化された細胞はＰＢＳ５００μＬ（ｐＨ  ７．４）で３×１０6細胞／チューブの細胞密度に再懸濁され、１０００倍過剰の１０９単一ドメイン抗体、または遮断抗体ＫＮ０３５（ＰＤ１とＰＤＬ１の結合を阻止できる治療用抗体）をそれぞれ０．５ｈ早く加えた。
（３）  細胞に放射性反応液１μｌ  （５μｃｉ／０．２μｇ）を加え、室温で０．５、１、２及び４時間インキュベートした。
【０１５３】
（４）  フローチューブ中の細胞を６００ｇで２分間遠心分離し、上清を新しいフローソーティングチューブに移した。細胞をあらかじめ冷却した５００μＬのＰＢＳで２回洗浄し、洗浄から得た上清をすべてあらかじめ遠心分離したフローチューブに加え、細胞を５００μＬのＰＢＳ中に再懸濁した。
（５）  細胞懸濁液および洗浄上清のｃｐｍ値をγカウンターで測定し、減衰補正を行った。
【０１５４】
結果を図１２に示す。68Ｇａ‐ＮＯＴＡ‐１０９の細胞取り込みは反応４時間後に７．１７％に達し、事前に遮断薬ＫＮ０３５で前処理した細胞の細胞取り込みは６．９３％に達し、これは基本的に同じであった。過剰非標識単一ドメイン抗体１０９で前処理した実験群は、68Ｇａ−ＮＯＴＡ−１０９の細胞取り込みを有意に阻害できることを示し、０．５〜４時間内の細胞取り込みは基本的に１〜２％であった。
【０１５５】
実施例８：６８Ｇａ−ＮＯＴＡ−１０９のｉｎ  ｖｉｖｏ分布
８．１  68Ｇａ−ＮＯＴＡ−１０９  の研究に使用される動物モデル
ｉｎ  ｖｉｖｏ試験には６〜８週齢の雌ヌードマウスを用いた。ヌードマウスをＳＰＦ環境で飼育し、食品と水を自由に摂取させ、標準的な１２時間の昼夜照明サイクルで飼育した。異種移植のために、１００μｌの細胞（Ａ３７５‐ＰＤＬ１またはＭＣＦ‐７）／ＰＢＳをマウスの右前肢の皮下に移植した。細胞接種濃度は約５〜６×１０6細胞／マウスである。移植はイソフルラン麻酔下で行った。これらの条件下で、注射した動物の８０％以上で、使用可能な腫瘍（１００〜３００ｍｍ3）（Ａ３７５‐ＰＤＬ１またはＭＣＦ‐７）が３〜４週後に得られた。
【０１５６】
８．２  68Ｇａ−ＮＯＴＡ−１０９のｉｎ  ｖｉｖｏ分布
〜１０μｇの放射標識単一ドメイン抗体（〜１００μＣｉ／１０μｇ）を尾静脈経由で、マウスに注入した。マウスは、安楽死させるまでろ紙で裏打ちしたケージに入れた。各時点で、５匹のマウスを安楽死させ、目的の組織を解剖し、ガンマカウンターにより計数した。データは、血液、腎臓、肝臓、脾臓、肺、心臓、腸、胃、筋肉、皮膚、脳、骨および腫瘍から収集した。注射量は総注射量とした。各臓器について、総注射量に基づいて注射量の％を求め、臓器重量を測定して１ｇ当たりの注射量の％（％ＩＤ／ｇ）を求めた。
【０１５７】
表４は、Ａ３７５−ＰＤ−Ｌ１腫瘍を有する無処置の雄マウスにおける68Ｇａ−ＮＯＴＡ−１０９取り込みの生体内分布データを示し、これは皮下腫瘍を有する無処置の雄マウス（ｎ＝５）における68Ｇａ−ＮＯＴＡ−１０９取り込みのｉｎ  ｖｉｔｒｏ生体内分布データである。静脈内投与の１、２、４時間後にデータを収集した。データは平均％  ＩＤ／ｇ  ±標準偏差（Ｓ．Ｄ．）で表す。この比の誤差を標準偏差の幾何平均として計算した。エラーバーが群の標準偏差を表す図７Ａにデータを示し、その結果、６８Ｇａ−ＮＯＴＡ−１０９の腫瘍に対する良好な特異性が実証された。
【０１５８】
【表４】
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【０１５９】
これらの結果から腫瘍組織の血中への取り込み率と腫瘍組織の対側正常への取り込み率を図７Ｂに示した。１０９単一ドメイン抗体は標的を発現するＡ３７５‐ＰＤＬ１腫瘍において良好な腫瘍取り込みを示し、最高値は注射（ＰＩ）３０分後、組織１ｇ当たり注射量の約５％であった。筋肉に対する腫瘍のピーク比はＰＩ４時間後でも６以上であった。対側正常の筋肉の取り込みと比較して、マウスの腫瘍組織の取り込みは高取り込みを示した。４時間後の骨への取り込みは低く、標識は68Ｇａの分離なしに安定したｉｎ  ｖｉｖｏであり、良好な腫瘍造影剤になる可能性があることを示した。
【０１６０】
８．３  68Ｇａ−ＮＯＴＡ−１０９によるｉｎ  ｖｉｖｏ  ＰＥＴ撮像
イソフルランを用いてマウスを麻酔し、ＰＥＴベッドに置き、〜１０μｇの放射性標識単一ドメイン抗体（〜１００μＣｉ／１０μｇ）を尾静脈に注入した。連続ＰＥＴスキャンを１２０分で実施し、図７Ｃの上および中パネルに示すように、複数の時点で腫瘍、筋肉および腎臓の放射性取り込みを分析した。二次元サブセット化による期待値最大化アルゴリズムを画像再構築に使用する。腫瘍、筋肉、肝臓等の臓器における放射能（ＭＢｑ／ｍＬ）は関心領域（ＲＯＩ）法により算出された。得られた値を注入量で除し、各組織におけるＰＥＴトレーサーの取り込み値（％ＩＤ／ｇ）を求めた（組織密度を１ｇ／ｍｌと仮定）。計算結果を図７Ｄに示した。
【０１６１】
遮断実験では、治療薬ＫＮ０３５（ＰＤ１とＰＤＬ１の結合を遮断できる）を２４時間前に投与した。治療薬の分布が完了した後、マウスをイソフルランで麻酔し、ＰＥＴベッド上に置いた。〜１０μｇの放射標識単一ドメイン抗体（〜１００μＣｉ／１０μｇ）を、マウスの尾静脈に注入した。連続ＰＥＴスキャンを１２０分で実施し、図７Ｃの下図に示すように、腫瘍、筋肉、腎臓の放射性取り込みを複数の時点で分析した。生体内分布は、図７Ｄに示すように、ＭＩＭソフトウエアの活性時間カーブを用いて分析した。
【０１６２】
図に示すように。図７Ｃおよび７Ｄに示すように、Ａ３７５−ＰＤ−Ｌ１移植された腫瘍は、ＰＥＴトレーサ68Ｇａ−ＮＯＴＡ−１０９の注射後５分から１２０分まで明瞭に視認された。ＰＤ‐Ｌ１発現陰性のＭＣＦ‐７移植腫瘍ようを注入した１２０分後、取り込みは認められなかった。図７Ｃから、Ａ３７５−ＰＤ−Ｌ１腫瘍は対側と比較して良好なコントラストを有していたことが分かる。
【０１６３】
68Ｇａ‐ＮＯＴＡ‐１０９はモデルマウスの腎臓に有意に濃縮され、主に腎臓で代謝されることを示した。68Ｇａ‐ＮＯＴＡ‐１０９は、半減期が短く、モデルマウスにダメージを与えなかった。
【０１６４】
注射１０分後、腫瘍内の68Ｇａ‐ＮＯＴＡ‐１０９の取り込みは約５〜６％  ＩＤ／ｇの最高値に達した。時間の変化に伴い、取り込み値は明らかに減少しなかった。注射１２０分後、腫瘍内の68Ｇａ‐ＮＯＴＡ‐１０９の取り込みは約４％  ＩＤ／ｇに維持できた。68Ｇａ−ＮＯＴＡ−１０９の腎臓への取り込み値は有意であり、ＰＥＴトレーサは主に腎臓で代謝されることが確認された。また、図７Ｄに示すように、腫瘍への68Ｇａ−ＮＯＴＡ−１０９の取り込みは筋肉などの正常組織に比べて有意に多く、腫瘍対筋肉への取り込み比（Ｔ／ＮＴ）は５よりも大きく、腫瘍の診断や治療のための腫瘍用高精細ＰＥＴ画像を得るためのメリットとなった。
【０１６５】
８．４  ＰＤ−Ｌ１ターゲティング能力を解析するための同一マウスにおける68Ｇａ−ＮＯＴＡ−１０９のｉｎ  ｖｉｖｏ  ＰＥＴ撮像
68Ｇａ‐ＮＯＴＡ‐１０９のＰＤ‐Ｌ１ターゲティング能力をさらに証明し、個体差を排除するために、異なった癌細胞、Ａ３７５‐ＨＰＤ‐Ｌ１，Ａ３７５‐ＨＰＤ‐Ｌ１／Ａ３７５混合物（１／１，  ｖ／ｖ）およびＡ３７５をそれぞれ同じマウスの左後肢、右後肢および右前肢に同時に皮下接種した。当初、腫瘍の大きさは約２５０〜３５０ｍｍ3であった。
【０１６６】
〜１０μｇの放射標識単一ドメイン抗体（〜１００μＣｉ／１０μｇ）を尾静脈経由で、マウスに注入した。静的ＰＥＴスキャンニングは、図１３Ａに示すように、投与１時間後に実施した。
【０１６７】
二次元サブセット化による期待値最大化アルゴリズムを画像再構築に使用する。腫瘍については、関心領域（ＲＯＩ）方法を用いて放射能（ＭＢｑ／ｍＬ）が算出された。その値を注入量で除し、各組織のＰＥＴトレーサーの取り込み値（％  ＩＤ／ｇ）を求めた（組織密度を１ｇ／ｍｌと仮定）。計算結果を図１３Ｂに示した。
【０１６８】
上記のＰＥＴトレーサ、68Ｇａ−ＮＯＴＡ−１０９、Ａ３７５−ＰＤ−Ｌ１移植腫瘍の注射６０分後に明瞭に認められ、放射性取り込みは４．９４±０．４６％  ｉｄ／ｇに達した。Ａ３７５−ＨＰＤ−Ｌ１／Ａ３７５混合物（１／１，  ｖ／ｖ）で接種した移植腫瘍は比較的中程度の取り込みを示し、一方、負の発現のＰＤ−Ｌ１で移植した腫瘍は注入後６０分で取り込みを示さなかった。同一個体において、３個の移植腫瘍は発現レベルの違いにより％ＩＤ／ｇに明らかな差があったことがＲＯＩの計算から分かる。
【０１６９】
ＰＥＴ撮像終了後、腫瘍を摘出し、オートラジオグラフィーおよび免疫組織化学的染色分析を行った（図１４）。免疫組織化学により検出されたＰＤ‐Ｌ１の発現は、Ａ３７５‐ＨＰＤ‐Ｌ１およびＡ３７５‐ＨＰＤ‐Ｌ１／Ａ３７５腫瘍のＰＤ‐Ｌ１陽性領域がそれぞれ３０％±６．３６および１５％±４．２４であることを示したが、Ａ３７５腫瘍は基本的に陰性であった。腫瘍オートラジオグラフィーｉｎ  ｖｉｔｒｏの結果はさらに免疫組織化学の結果を確認した。
【０１７０】
実施例９：  125Ｉ標識単一ドメイン抗体１０９と撮像
クロラミンＴ溶液及びメタ重亜硫酸ナトリウム溶液１０ｍｇ／ｍＬにＰＢＳ  ０．０５ｍｏｌ／Ｌを加え、ＰＨ＝７．５で調製した。２μｌのタンパク質を５０μｌのＰＢ溶液に希釈した。この溶液を５０μｌとり、Ｎａ125Ｉ１．５ｍＣｉ  （１０μｌ）に加えて混和した。クロラミンＴ溶液を混合溶液に加え、速やかに混合し、室温で４０秒間反応させた。メタ重亜硫酸ナトリウム溶液５０μｌを加え、反応を終了した。クロマトグラフィーペーパーの尾部にキャピラリーを滴下して反応液を一滴吸引し、ＰＢＳを停止用の現像剤として使用してクロマトグラフィーペーパーの頂部に現像した。標識率はＴＬＣスキャナーによって識別される。未反応125ＩをＰＤ‐１０カラムで除去し、生成物緩衝系を同時に生理食塩水で置換した。
【０１７１】
Ａ３７５−ＰＤＬ１腫瘍モデルを８．１の方法で接種し、マウスをイソフルランで麻酔し、ＳＰＥＣＴベッドに置き、放射性標識単一ドメイン抗体（〜１００μＣｉ／１０μｇ）を尾静脈に注入した。ＳＰＥＣＴスキャンニングは、図８に示すように、１時間後、２時間後、４時間後に実施し、腫瘍、組織や器官の放射性取り込みを複数の時点で分析した。
【０１７２】
125Ｉ‐１０９，Ａ３７５‐ＰＤ‐Ｌ１移植腫瘍ようの注射１２０分後に明瞭に見えた。図から、Ａ３７５−ＰＤ−Ｌ１腫瘍は対側と比較して良好なコントラストを有することが分かる。モデルマウスにおける68Ｇａ−ＮＯＴＡ−１０９の性能と同様に、125Ｉ−１０９は腎臓に有意に濃縮され、主に腎臓で代謝されることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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