(57)【要約】  本発明は、可溶化アピラーゼポリペプチドの設計及び治療使用、組織損傷を予防及び処置するのに有用な、医薬組成物、治療使用及び方法に関する。
2021529550.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端欠失、Ｃ末端欠失及び中央部修飾からなるリストから選択される少なくとも２つの修飾を有する可溶化ヒトアピラーゼ。
【請求項２】
Ｎ末端欠失、Ｃ末端欠失及び中央部修飾を有する、請求項１に記載の可溶化ヒトアピラーゼ。
【請求項３】
ａ）前記Ｎ末端欠失が３０〜５０アミノ酸長であり、
ｂ）前記Ｃ末端欠失が２０〜４０アミノ酸長であり、
ｃ）前記中央部修飾が欠失及び／又は点突然変異を含む、
請求項１又は２に記載の可溶化ヒトアピラーゼ。
【請求項４】
前記中央部修飾が、１０〜１５個の連続アミノ酸の欠失を含む、請求項１〜３の何れか一項に記載の可溶化ヒトアピラーゼ。
【請求項５】
中央部の欠失が、配列番号１に記載の野生型ＣＤ３９配列に対する、アミノ酸番号１９３〜２０４の欠失である、請求項４に記載の可溶化ヒトアピラーゼ。
【請求項６】
前記中央部修飾が、Ｋ７１Ｅ、Ｎ７３Ｑ、Ｖ９５Ａ、Ｇ１０２Ｄ、Ｙ１０４Ｓ、Ｔ１０６Ｓ、Ｒ１１３Ｍ、Ｌ１４９Ｍ、Ｖ１５１Ａ、Ｅ１７３Ｄ、Ｔ２２９Ａ、Ｌ２５４Ｍ、Ｋ２５８Ｒ、Ｗ２６３Ｒ、Ｅ２７６Ｄ、Ｎ２９２Ｑ、Ｒ３０４Ｇ、Ｉ３１９Ｔ、Ｎ３２７Ｑ、Ａ３６２Ｎ、Ｆ３６５Ｓ、Ｎ３７１Ｑ、Ｋ４０５Ｎ、Ｙ４１２Ｆ、Ｌ４２４Ｑ、Ｈ４３６Ｄ、Ｉ４３７Ｎ、Ｆ４３９Ｓ、Ｇ４４１Ｄ、Ｎ４５７Ｑ、Ｐ４６３Ｓ及びＳ４６９Ｒからなる群から選択される、配列番号１に記載の野生型ＣＤ３９配列に対する１、２、３、４又は５個の点突然変異を含む点突然変異を含む、請求項１〜５の何れか一項に記載の可溶化ヒトアピラーゼ。
【請求項７】
配列番号４、配列番号６、配列番号３２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号７０、配列番号７６及び配列番号７８からなる群から選択される配列を含む、請求項１〜６の何れか一項に記載の可溶化ヒトアピラーゼ。
【請求項８】
配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９及び配列番号１４１からなる群から選択される配列を含む、請求項１〜７の何れか一項に記載の可溶化ヒトアピラーゼ。
【請求項９】
配列番号２１３、配列番号２２７、配列番号２１９、配列番号２２５、配列番号２１７、配列番号２０９、配列番号２２１、配列番号７２、配列番号２１５、配列番号２２３、配列番号２１１、配列番号５８及び配列番号２２９からなる群から選択される配列を含むか又はそれらからなる、請求項８に記載の可溶化ヒトアピラーゼ。
【請求項１０】
配列番号５８、配列番号７２及び配列番号２２９からなる群から選択される配列からなる、請求項９に記載の可溶化ヒトアピラーゼ。
【請求項１１】
請求項１〜１０の何れか一項に記載のアピラーゼの治療的有効用量と、１つ以上の薬学的に許容可能な担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項１２】
１つ以上のさらなる有効成分をさらに含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
薬剤としての使用のための請求項１〜１０の何れか一項に記載の単離アピラーゼ。
【請求項１４】
組織損傷の処置における使用のための請求項１〜１０の何れか一項に記載の単離アピラーゼ。
【請求項１５】
前記組織損傷が、急性脳傷害（卒中発作）；急性多臓器不全；腎臓又は他の固形臓器の移植後の臓器移植後臓器機能障害；火傷による損傷；放射線による損傷；外傷及び／又は急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）又は肺傷害などの低酸素による急性損傷；急性腎臓傷害、例えば胸部手術（例えば大動脈弁置換術、冠動脈バイパス術）又は敗血症又は横紋筋融解症又は抗生物質若しくは他の薬品の毒性効果に対する二次的な急性腎臓傷害など；急性心筋傷害である、請求項１４に記載の使用のための単離アピラーゼ。
【請求項１６】
心臓手術に伴う急性腎臓傷害の処置での使用のための請求項１〜１０の何れか一項に記載の単離アピラーゼ。
【請求項１７】
臓器移植後臓器機能障害（ＤＧＦ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、外傷性脳傷害（ＴＢＩ）／急性虚血性発作（ＡＩＳ）、虚血再灌流傷害（ＩＲＩ）又は多臓器不全（ＭＯＦ）と呼ばれることが多いそれらの組み合わせの処置における使用のための、請求項１〜１０の何れか一項に記載の単離アピラーゼ。
【請求項１８】
敗血症に付随する急性腎臓傷害の処置での使用のための、請求項１〜１０の何れか一項に記載の単離アピラーゼ。
【請求項１９】
対象に対して可溶化ヒトアピラーゼの治療的有効用量を投与することを含む、ヒト対象において組織損傷を処置する方法。
【請求項２０】
前記可溶化ヒトアピラーゼが請求項１〜１０の何れか一項に記載のアピラーゼである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記組織損傷が、急性脳傷害（卒中発作）；急性多臓器不全；腎臓又は他の固形臓器移植後の臓器移植後臓器機能障害；火傷による損傷；放射線による損傷；外傷及び／又は急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）又は肺傷害などの低酸素による急性損傷；急性腎臓傷害、例えば胸部手術（例えば大動脈弁置換術、冠動脈バイパス術）又は敗血症又は横紋筋融解症又は抗生物質若しくは他の薬品の毒性効果に対する二次的な急性腎臓傷害など；急性心筋傷害である、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
心臓手術に付随する急性腎臓傷害を処置する方法であって、このような処置を必要とする対象に可溶化ヒトアピラーゼの治療的有効用量を投与することを含む、方法。
【請求項２３】
臓器移植後臓器機能障害（ＤＧＦ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、外傷性脳傷害（ＴＢＩ）／急性虚血性発作（ＡＩＳ）虚血再灌流傷害（ＩＲＩ）又は多臓器不全（ＭＯＦ）と呼ばれることが多いそれらの組み合わせを処置する方法であって、このような処置を必要とする対象に可溶化ヒトアピラーゼの治療的有効用量を投与することを含む、方法。
【請求項２４】
敗血症に付随する急性腎臓傷害を処置する方法であって、このような処置を必要とする対象に可溶化ヒトアピラーゼの治療的有効用量を投与することを含む、方法。
【請求項２５】
請求項１〜１０の何れか一項に記載の何れかのアピラーゼをコードする単離核酸分子。
【請求項２６】
請求項１〜１０の何れか一項に記載の単離アピラーゼの組み換え産生に適切である、請求項２５に記載の１つ以上の核酸配列を含むクローニング又は発現ベクター。
【請求項２７】
請求項２６に記載の１つ以上のクローニング又は発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２８】
請求項２７に記載の宿主細胞を培養し、アピラーゼを精製して回収することを含む、請求項１〜１０の何れか一項に記載のアピラーゼの産生のための工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、可溶化アピラーゼポリペプチドの設計及び治療的使用、組織損傷を予防及び処置するのに有用な医薬組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アピラーゼ（ＡＴＰ−ジホスファターゼ、アデノシンジホスファターゼ、ＡＤＰａｓｅ又はＡＴＰジホスホヒドロラーゼ）は、ヌクレオチド二リン酸及び三リン酸（ＮＤＰ及びＮＴＰ）の両方に対する酵素活性の形質膜結合酵素群であり、ＮＤＰを中間体として２つの個別の連続的なリン酸放出段階においてＮＴＰを一リン酸ヌクレオチド（ＮＭＰ）に加水分解する。細胞表面上に存在し、細胞外ヌクレオチドを加水分解するエクトＡＴＰａｓｅの殆どは、この酵素ファミリーに属する。これらは、ＡＴＰ及びＡＤＰの両方を加水分解するという点で、ＡＴＰを特異的に加水分解するＡＴＰａｓｅとは異なる。
【０００３】
表面抗原分類３９（ＣＤ３９、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ４９９６１又は配列番号１）としても知られる、最初に分かったヒトアピラーゼ、エクトヌクレオシドトリホスフェートジホスホヒドロラーゼ−１（遺伝子：ＥＮＴＰＤ１、タンパク質：ＮＴＰＤａｓｅ１）は、細胞表面に局在する酵素であり、細胞外に向いている触媒部位を有する。
【０００４】
既知のヒトＣＤ３９ファミリーの中で、メンバーＣＤ３９Ｌ３は、ＣＤ３９とＣＤ３９Ｌ１（エクトＡＴＰａｓｅ）との間の生化学的活性を有する、エクトアピラーゼ（エクトＡＴＰＤａｓｅ）として知られる。具体的にヒトＣＤ３９Ｌ３は、治療目的のために、例えば米国特許第７２４７３００Ｂ１号明細書（参照により本明細書中に組み込まれる）で開示されるように、又は配列番号３として本明細書中に含まれているように、可溶化され、精製されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は、とりわけ、ヒトＣＤ３９などの可溶化ヒトアピラーゼのある種の修飾が、驚くべきことに、活性タンパク質をもたらし、その作製がそれでもなお安全且つ容易であるという予想外の知見に基づく。
【０００６】
本発明の第１の態様によれば、Ｎ末端欠失、Ｃ末端欠失及び中央部修飾からなるリストから選択される少なくとも２つの修飾を有する可溶化ヒトアピラーゼが提供される。
【０００７】
ある実施形態では、可溶化ヒトアピラーゼは、Ｎ末端欠失、Ｃ末端欠失及び修飾欠失を含む。
【０００８】
ある実施形態では、中央部修飾は、１個以上のアミノ酸の欠失を含む。別の実施形態では、中央部修飾は、置換突然変異などの１個以上のアミノ酸の点突然変異を含む。また別の実施形態では、中央部修飾は、１個以上のアミノ酸の欠失及び１個以上のアミノ酸の点突然変異、例えば置換突然変異など、の組み合わせである。
【０００９】
Ｎ末端欠失は、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０個のアミノ酸の欠失など、配列番号１に従う野生型ＣＤ３９配列のＮ末端からの３０〜５０個のアミノ酸の欠失であり得る。好ましい実施形態では、Ｎ末端欠失は、３４、３７、３８又は４５個のアミノ酸である。
【００１０】
Ｃ末端欠失は、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０個アミノ酸の欠失など、配列番号１に従う野生型ＣＤ３９配列のＣ末端からの２０〜４０個のアミノ酸の欠失であり得る。好ましい実施形態では、Ｃ末端欠失は３７個のアミノ酸のうち２２、２９である。
【００１１】
中央部欠失は、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のアミノ酸の欠失など、配列番号１に従う野生型ＣＤ３９配列からの１０〜１５個の連続アミノ酸の欠失であり得る。好ましい実施形態では、中央部欠失は、配列番号１に従う野生型ＣＤ３９配列に対してアミノ酸番号１９３〜２０４など、１２個のアミノ酸である。
【００１２】
一実施形態では、可溶化ヒトアピラーゼは、Ｋ７１Ｅ、Ｎ７３Ｑ、Ｖ９５Ａ、Ｇ１０２Ｄ、Ｙ１０４Ｓ、Ｔ１０６Ｓ、Ｒ１１３Ｍ、Ｌ１４９Ｍ、Ｖ１５１Ａ、Ｅ１７３Ｄ、Ｔ２２９Ａ、Ｌ２５４Ｍ、Ｋ２５８Ｒ、Ｗ２６３Ｒ、Ｅ２７６Ｄ、Ｎ２９２Ｑ、Ｒ３０４Ｇ、Ｉ３１９Ｔ、Ｎ３２７Ｑ、Ａ３６２Ｎ、Ｆ３６５Ｓ、Ｎ３７１Ｑ、Ｋ４０５Ｎ、Ｙ４１２Ｆ、Ｌ４２４Ｑ、Ｈ４３６Ｄ、Ｉ４３７Ｎ、Ｆ４３９Ｓ、Ｇ４４１Ｄ、Ｎ４５７Ｑ、Ｐ４６３Ｓ及びＳ４６９Ｒからなる群から選択される、配列番号１に従う野生型ＣＤ３９配列に対する１、２、３、４又は５個の点突然変異を含む。
【００１３】
一実施形態では、可溶化ヒトアピラーゼは、配列番号４、配列番号６、配列番号３２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号７０、配列番号７６及び配列番号７８からなる群から選択される配列を含む。
【００１４】
一実施形態では、可溶化ヒトアピラーゼは、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９及び配列番号１４１からなる群から選択される配列を含む。
【００１５】
具体的な一実施形態では、可溶化ヒトアピラーゼは、配列番号２１３、配列番号２２７、配列番号２１９、配列番号２２７、配列番号２１７、配列番号２０９、配列番号２２１、配列番号７２、配列番号２１５、配列番号２２３、配列番号２１１、配列番号５８及び配列番号２２９からなる群から選択される配列を含む。
【００１６】
具体的な一実施形態では、可溶化ヒトアピラーゼは、配列番号２１３、配列番号２２７、配列番号２１９、配列番号２２７、配列番号２１７、配列番号２０９、配列番号２２１、配列番号７２、配列番号２１５、配列番号２２３、配列番号２１１、配列番号５８及び配列番号２２９からなる群から選択される配列からなる。
【００１７】
好ましい実施形態では、可溶化ヒトアピラーゼは、配列番号５８、配列番号７２及び配列番号２２９からなる群から選択される配列を含む。
【００１８】
一実施形態では、可溶化ヒトアピラーゼは配列番号５８を含む。一実施形態では、可溶化ヒトアピラーゼは配列番号７２を含む。一実施形態では、可溶化ヒトアピラーゼは配列番号２２９を含む。
【００１９】
好ましい実施形態では、可溶化ヒトアピラーゼは、配列番号５８、配列番号７２及び配列番号２２９からなる群から選択される配列からなる。
【００２０】
一実施形態では、可溶化ヒトアピラーゼは配列番号５８からなる。一実施形態では，可溶化ヒトアピラーゼは配列番号７２からなる。一実施形態では、可溶化ヒトアピラーゼは配列番号２２９からなる。
【００２１】
本発明の第２の態様によれば、本発明は、本発明の第１の態様によるアピラーゼの治療的有効用量を含む医薬組成物に関し、１つ以上の薬学的に許容可能な担体が提供される。
【００２２】
一実施形態では、本医薬組成物は、１つ以上のさらなる有効成分をさらに含む。
【００２３】
本発明の第３の態様によれば、薬剤としての使用のための第１の態様による単離アピラーゼが提供される。
【００２４】
本発明の第４の態様によれば、組織損傷の処置での使用のための第１の態様による単離アピラーゼが提供される。
【００２５】
組織損傷は、急性脳傷害（卒中発作）；急性多臓器不全；腎臓又は他の固形臓器の移植後の臓器移植後臓器機能障害；火傷による損傷；放射線による損傷；外傷及び／又は低酸素による急性損傷、例えば急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）又は肺傷害など；急性腎臓傷害、例えば胸部外科手術（例えば大動脈弁置換術、冠動脈バイパス術）又は敗血症又は横紋筋融解症又は抗生物質若しくは他の薬剤の毒性効果に対する二次的な急性腎臓傷害など；急性心筋傷害であり得る。
【００２６】
別の実施形態では、本開示の第４の態様は、心臓手術に付随する急性腎臓傷害の処置での使用のための、本発明の第１の態様による単離アピラーゼに関する。
【００２７】
別の実施形態では、本開示の第４の態様は、臓器移植後臓器機能障害（ＤＧＦ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、外傷性脳傷害（ＴＢＩ）／急性虚血性発作（ＡＩＳ）、虚血再灌流傷害（ＩＲＩ）又は多臓器不全（ＭＯＦ）と呼ばれることが多いそれらの組み合わせの処置での使用のための本発明の第１の態様による単離アピラーゼに関する。
【００２８】
一実施形態では、心臓手術に付随する急性腎臓傷害の処置のために使用される可溶化ヒトアピラーゼは、配列番号５８のアミノ酸配列を含む。
【００２９】
一実施形態では、心臓手術に付随する急性腎臓傷害の処置のために使用される可溶化ヒトアピラーゼは、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、心臓手術に付随する急性腎臓傷害の処置のために使用される可溶化ヒトアピラーゼは、配列番号２２９のアミノ酸配列を含む。
【００３０】
さらなる好ましい実施形態では、本開示は、敗血症に付随する急性腎臓傷害の処置のための本発明の第１の態様による単離アピラーゼの使用に関する。
【００３１】
第４の態様の一実施形態では、敗血症に付随する急性腎臓傷害の処置での使用のための可溶化ヒトアピラーゼは、配列番号５８のアミノ酸配列を含む。
【００３２】
第４の態様の一実施形態では、敗血症に付随する急性腎臓傷害の処置での使用のための可溶化ヒトアピラーゼは、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。
【００３３】
第４の態様の一実施形態では、敗血症に付随する急性腎臓傷害の処置での使用のための可溶化ヒトアピラーゼは、配列番号２２９のアミノ酸配列を含む。
【００３４】
本発明の第５の態様によれば、ヒト対象において組織損傷を処置する方法が提供され、これは、前記対象に第１の態様による可溶化ヒトアピラーゼの治療的有効用量を投与することを含む。本発明の第５の態様の一実施形態は、このような処置を必要とする対象に本発明の第１の態様による単離アピラーゼの治療的有効用量を投与することを含む、心臓手術に付随する急性腎臓傷害を処置する方法に関する。
【００３５】
本発明の第５の態様の別の実施形態は、このような処置を必要とする対象に本発明の第１の態様による単離アピラーゼの治療的有効用量を投与することを含む、臓器移植後臓器機能障害（ＤＧＦ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、外傷性脳傷害（ＴＢＩ）／急性虚血性発作（ＡＩＳ）虚血再灌流傷害（ＩＲＩ）又は多臓器不全（ＭＯＦ）と呼ばれることが多いそれらの組み合わせを処置する方法に関する。
【００３６】
第５の態様のある実施形態では、心臓手術に付随する急性腎臓傷害を処置する方法において使用される可溶化ヒトアピラーゼは、配列番号５８、配列番号７２又は配列番号２２９のアミノ酸配列を含む。
【００３７】
本発明の第５の態様の一実施形態は、このような処置を必要とする対象に本発明の第１の態様による単離アピラーゼの治療的有効用量を投与することを含む、敗血症に付随する急性腎臓傷害を処置する方法に関する。
【００３８】
第５の態様の一実施形態では、敗血症に付随する急性腎臓傷害を処置する方法において使用される可溶化ヒトアピラーゼは、配列番号５８、配列番号７２又は配列番号２２９のアミノ酸配列を含む。組織損傷は、急性脳傷害（卒中発作）；急性多臓器不全；腎臓又は他の固形臓器の移植後の臓器移植後臓器機能障害；火傷による損傷；放射線による損傷；外傷及び／又は低酸素による急性損傷、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）又は肺傷害など；急性腎臓傷害、例えば胸部手術（例えば大動脈弁置換術、冠動脈バイパス術）又は敗血症又は横紋筋融解症又は抗生物質若しくは他の薬剤の毒性効果に対する二次的な急性腎臓傷害など；急性心筋傷害であり得る。
【００３９】
本発明の第６の態様によれば、第１の態様による何れかのアピラーゼをコードする単離核酸分子が提供される。
【００４０】
本発明の第７の態様によれば、第６の態様による１つ以上の核酸配列を含むクローニング又は発現ベクターが提供され、ここでこのベクターは、第１の態様による単離アピラーゼの組み換え産生に適切である。
【００４１】
本発明の第８の態様によれば、第７の態様による１つ以上のクローニング又は発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。
【００４２】
本発明の第９の態様によれば、第１の態様によるアピラーゼの産生のための工程が提供され、これは、第８の態様による宿主細胞を培養し、前記アピラーゼを精製して回収することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は配列アライメントである。
【図２】図２Ａは、一実施形態による抗ＡＰＰウエスタンブロットによるヒトＣＤ３９を含有する上清の発現レベルの表示である。図２Ｂは、一実施形態による抗ＡＰＰウエスタンブロットによるシステイン架橋欠失ヒトＣＤ３９変異体を含有する上清の発現レベルを示すものである。
【図３】図３は、ＣＤ３９変異体の固相ＡＴＰａｓｅアッセイ結果を示すグラフである。
【図４】図４は、一実施形態によるヒトＣＤ３９変異体で形質転換されたＨＥＫ２９３細胞上での固相ＡＴＰ切断を示すグラフである。
【図５】図５は、一実施形態によるベクターの図式的概観である。
【図６】図６は、定常状態近似に基づく酵素モデルである。
【図７】図７は、一実施形態によるタンパク質にフィットさせた反応速度データ及びモデルの概要である。
【図８】図８は、一実施形態によるタンパク質にフィットさせた反応速度データ及びモデルの概要である。
【図９】図９は、一実施形態によるタンパク質にフィットさせた反応速度データ及びモデルの概要である。
【図１０Ａ】図１０：図１０は実験条件の略図である。
【図１０Ｂ】（上記の通り。）
【図１１】図１１は、実施形態によるタンパク質に対するＡＭＰレベルを示すグラフである。
【図１２Ａ】図１２：図１２は、実施形態によるタンパク質に対するインビボの結果を示すグラフである。
【図１２Ｂ】（上記の通り。）
【図１２Ｃ】（上記の通り。）
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本開示はとりわけ、可溶化ＣＤ３９のある一定の修飾が、驚くべきことに、活性タンパク質をもたらし、その作製が安全且つ容易であるという予想外の知見に基づく。
【００４５】
以下の具体例で示されるように、好ましい実施形態は、Ｎ末端欠失、Ｃ末端欠失及び中央部欠失からなるリストから選択される少なくとも２つの修飾を有する可溶化ヒトアピラーゼ、例えば配列番号４、配列番号６、配列番号３２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号７０、配列番号７６及び配列番号７８からなる群から選択される配列を含む可溶化ヒトアピラーゼなどである。
【００４６】
発明者らは、免疫原性上昇のリスク及び従って安全性リスクを上昇させるので過多な修飾を依然として導入せずに、活性保持、発現される能力の両方を有する可溶化ヒトアピラーゼを獲得するために、いくつかの異なる配列修飾ストラテジーを試みた。驚くべきことに、効率及びヒトアピラーゼ発現能の両方を上昇させることが分かった１つの配列修飾は、同時に過多な免疫原性リスクを付加しない、中央セクションの欠失、所謂デルタＭＩＬ（ΔＭＩＬ）修飾であった。
【００４７】
本発明の実施形態による可溶化ヒトアピラーゼの発現を上昇させるために、Ｎ末端発現タグを試験した。様々なＮ末端発現タグが当技術分野で知られているが、驚くべきことに全てのタグが機能するわけではなかった。発明者らは、予見され得ていなかった数個のタグが機能したことを見出した。
【００４８】
これらのＮ末端タグは、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９又は配列番号１４１であった。本明細書中で示されるように、特に好ましいタグは、配列番号１３３、配列番号１３５又は配列番号１３７である。
【００４９】
具体的な詳細を以下の実施例９〜１３で示す。しかし、これらの実施例の非予測可能な性質を例示するために、比較のまとめを表１で与える。
【００５０】
【表１】
2021529550.tif 000003
【００５１】
１．定義
当業者が本発明を実施し易くするために、この記載全体を通じて次の用語を使用する。
【００５２】
「ＣＤ３９」及び「ｈＣＤ３９」という用語は、本開示全体を通じて同義的に使用され、別段示されない限り、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ４９９６１又は配列番号１に従うヒト表面抗原分類３９（ＣＤ３９）を意味する。
【００５３】
「アピラーゼ」という用語は、別段示されない限り、ヒトアピラーゼを指す。「可溶化アピラーゼ」は、本明細書中で使用される場合、野生型タンパク質として細胞膜に結合して存在するアピラーゼが修飾されており、もはや細胞膜に結合しないようになっているが、可溶性の状態で存在すること、即ち細胞膜にもはや係留されないことを意味する。
【００５４】
「ＭＩＬ」という略語は、膜相互作用ループを指し、これには、細胞膜を通じて物理的に係留されるＮ末端及びＣ末端部分に加え、細胞膜と相互作用する野生型（ヒト）ＣＤ３９タンパク質の中央部がある。「デルタＭＩＬ」又は「ΔＭＩＬ」という用語は、野生型（ヒト）ＣＤ３９からのＭＩＬ配列の欠失を指す。
【００５５】
「約」という用語は、数値ｘに関して、例えば＋／−１０％を意味する。「約」という用語は、数字範囲又は数の一覧の前に使用する場合、一連の中でそれぞれの数に適用され、例えば、「約１〜５」という句は、「約１〜約５」として解釈すべき、又は例えば「約１、２、３、４」という句は、「約１、約２、約３、約４など」として解釈すべきである。
【００５６】
「実質的に」という語は、「完全に」を排除せず、例えば「実質的にＹ不含である」組成物は、完全にＹ不含であり得る。必要な場合、「実質的に」という語は、本開示の定義から省略され得る。
【００５７】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」並びに「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えばＸを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、独占的にＸからなり得るか、又は何かさらなるものを含み得、例えばＸ＋Ｙである。
【００５８】
ネイティブポリペプチド及びその機能的誘導体に関する「同一性」は、最大パーセント同一性を達成するために配列をアラインし、必要に応じてギャップを導入した後の、配列同一性の一部として保存的置換を考慮しない、対応するネイティブポリペプチドの残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして本明細書中で定義される。Ｎ又はＣ末端伸長及び挿入の何れも、同一性を低下させるように解釈されるものはない。アライメントのための方法及びコンピュータプログラムは周知である。標準的なアライメントアルゴリズム、例えばＡｌｔｓｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３  ４１０）により記載されるＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．のアルゴリズム（（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４４  ４５３）；又はＭｅｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．のアルゴリズム（（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１  １７）によってパーセント同一性が決定され得る。一連のパラメーターは、ギャップペナルティーが１２であり、ギャップ伸長ペナルティーが４であり、フレームシフトギャップペナルティーが５であるＢｌｏｓｕｍ６２スコア行列であり得る。２つのアミノ酸又はヌクレオチド配列間のパーセント同一性はまた、ギャップ長ペナルティーが１２であり、ギャップペナルティーが４であるＰＡＭ１２０ウェイト・レジデュー・テーブル（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）を使用して、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている、Ｅ．Ｍｅｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ（（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７）のアルゴリズムを使用して決定され得る。
【００５９】
「アミノ酸」は、例えば全ての天然のＬ−α−アミノ酸を指し、Ｄ−アミノ酸を含む。「アミノ酸配列変異体」という句は、本開示による配列と比較した場合、それらのアミノ酸配列中でいくつかの相違がある分子を指す。本開示によるタンパク質の、例えば指定される配列の、アミノ酸配列変異体は、依然としてアピラーゼ活性を有する。アミノ酸配列変異体は、置換変異体（少なくとも１個のアミノ酸残基が除去され、本開示によるポリペプチド中の同じ位置でその場所において異なるアミノ酸が挿入されているもの）、挿入変異体（１個以上のアミノ酸が本開示によるポリペプチド中の特定の位置のアミノ酸のすぐ隣に挿入されているもの）及び欠失変異体（１個以上のアミノ酸が本開示によるポリペプチド中で除去されているもの）を含む。
【００６０】
「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」又は「処置する（ｔｒｅａｔ）」という用語は、本明細書中で、対象への本発明によるアピラーゼの適用若しくは投与又は、対象若しくは対象由来の単離組織若しくは細胞株への前記アピラーゼを含む医薬組成物の適用若しくは投与として定義され、この対象には組織損傷、組織損傷に関連する症状があり、目的は、とりわけ細胞外ＡＴＰレベルを低下させることによって、組織損傷又は組織損傷の何らかの関連症状を、緩和する、寛解させる又は改善することである。
【００６１】
「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、対象へのアピラーゼを含む医薬組成物の適用若しくは投与又は対象由来の単離組織若しくは細胞株への本発明のアピラーゼを含む医薬組成物の適用若しくは投与も意図し、対象は組織損傷又は組織損傷に関連する症状を有し、目的は、組織損傷又は組織損傷の何れかの関連症状を、緩和する、寛解させる又は改善することである。
【００６２】
「防ぐ（ｐｒｅｖｅｎｔ）」又は「防ぐこと（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」という用語は、予防的又は予防の処置を指し；これは、疾患、障害及び／又はそれに付随する症状の発症を遅らせるか又はその発症を防ぐことに関する。
【００６３】
本明細書中で使用される場合、対象は、このような対象が生物学的に、医学的に又はクオリティーオブライフにおいてこのような処置から恩恵を受ける場合、処置を「必要とする」。
【００６４】
「薬学的に許容可能な」という用語は、有効成分の生物学的活性の有効性を妨害しない無毒性物質を意味する。
【００６５】
本明細書中で使用される場合、対象化合物を「投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」又は「投与すること（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」という用語は、処置を必要とする対象に本発明の化合物及びそのプロドラッグを提供することを意味する。１つ以上のさらなる治療剤「と組み合わせた」投与には、何れかの順序及び何れかの投与経路での同時（同時的）及び連続投与が含まれる。
【００６６】
本明細書中で使用される場合、「治療的有効用量」は、障害又は再発障害の少なくとも１つの症状を、処置する、防ぐ、その発症を防ぐ、治癒させる、遅らせる、その重症度を低下させる、寛解させるか、又はこのような処置をせずに予想されるものを超えて患者の生存を延長させるための、患者（ヒトなど）への単回又は複数回投与時に有効である、アピラーゼの用量（量）を指す。単独で投与される個々の有効成分（例えばアピラーゼ）に適用される場合、この用語は、その成分のみを指す。組み合わせに適用される場合、この用語は、組み合わせて、投与が連続的であろうと同時であろうと、治療効果を生じさせる有効成分の合わせた用量又は量を指す。
【００６７】
「投与レジメン」という句は、疾病を処置するために使用されるレジメン、例えば組織損傷の処置中に使用される投与プロトコールを意味する。
【００６８】
「投与するための手段」という句は、プレフィルドシリンジ、バイアル及びシリンジ、注射ペン、自動注入装置、静脈（ｉ．ｖ．）点滴及びバッグ、ポンプ、パッチポンプなどを含むが限定されない、患者に薬物を全身投与するための何らかの利用可能な道具を示すために使用される。このような物品を用いて、患者が薬物を自己投与し得る（即ち自分自身のために薬物を投与する）か又は医師が薬物を投与し得る。
【実施例】
【００６９】
２．実施例１：膜遊離型ＣＤ３９
野生型ヒトアピラーゼＣＤ３９（ｈＣＤ３９、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ４９９６１又は配列番号１）は、Ｎ末端の膜貫通ドメイン（推定ａａ１７〜３７）、中央の推定膜相互作用ループ（ＭＩＬ推定ａａ１９３〜２０４）及びＣ末端膜貫通ドメイン（推定ａａ４７９〜４９９）により細胞膜において天然に係留される。哺乳動物宿主細胞を用いてＣＤ３９の可溶性変異体の発現を可能にするため、膜遊離型又は可溶化型タンパク質を得るためにＣＤ３９配列のいくつかのエレメントを修飾した。分泌リーダー及び精製タグ（配列番号１３３）によって、天然のリーダー配列及びＮ末端膜貫通領域を置換した。発現、精製及び活性パラメーターを最適化するために、ＣＤ３９の細胞外ドメインの境界を変動させた（それぞれ配列番号１のアミノ酸番号３８〜４７６、配列番号１のアミノ酸番号３９〜４６９、配列番号１のアミノ酸４６〜４６１及び配列番号１のアミノ酸４６〜４７６）。システインをアラニンにより置換することによって、又はジスルフィド架橋により作られるループを短縮することによって、凝集傾向及び酵素活性に対するシステイン及びジスルフィド架橋の影響を体系的に評価した（配列番号１０７、１０９、１１１、１１３及び１１５）。疎水性アミノ酸のストレッチはラットＣＤ３９の構造研究に記載され（Ｚｅｂｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１２），４１５，２８８−３０６，野生型ラットＣＤ３９，Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ９７６８７、配列番号２で示される）、このループは細胞膜（ＭＩＬ）と相互作用し得ると考えられる。発明者らは、配列アライメントによりヒトＣＤ３９配列に対する知見を置き換えて、ループ欠失（ＣＤ３９ΔＭＩＬ又はＥＰ２８、配列番号４で示されるとおり）を有するＣＤ３９変異体を作製した。機能的ＣＤ３９の発現レベル及び熱安定性に対するＭＩＬの欠失（又はデルタ／Δ）の影響を評価した。
【００７０】
配列番号１及び配列番号４の配列アライメントを示す図１で見られ得るように、ＣＤ３９ΔＭＩＬ（配列番号４）を形成させるために、Ｎ末端アミノ酸１〜２７、Ｃ末端アミノ酸４７７〜５１０及び中央膜相互作用ループ（ＭＩＬ）アミノ酸１９３〜２０４をｗｔＣＤ３９（配列番号１）から欠失させた。
【００７１】
熱安定性に対する異なる配列修飾の影響を研究した。さらに、ＣＨＯ細胞発現収率及び単量体の含量に対する異なる配列修飾の影響を研究した。
【００７２】
（１）方法
（ａ）発現プラスミドの作製
異なるｈＣＤ３９境界変異体及び膜相互作用ループ（ＭＩＬ）欠失をコードするＤＮＡ配列は、ホモサピエンスに対するコドン最適性を含めＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に注文した。ｈＣＤ３９変異体をコードする配列は、ＧｅｎｅＡｒｔ由来ベクター又は内部で作製されたその変異体から哺乳動物細胞中での分泌に適切な発現ベクターへと、標準的な分子生物学的技術によりサブクローニングした。修飾されたオリゴヌクレオチドによってシステイン架橋欠失変異体中に存在するシステインからアラニンへの突然変異を標的とし、続くアセンブリーＰＣＲ段階後に、作製された断片を前に言及した同じ発現ベクターにサブクローニングした。発現ベクターのエレメントとしては、プロモーター（サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー−プロモーター）、分泌を促進するためのシグナル配列、ポリアデニル化シグナル及び転写終結因子（ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子）、エピソーム複製及び原核生物における複製を可能にするエレメント（例えばＳＶ４０起点及びＣｏｌＥ１又は当技術分野で公知の他のもの）及び選択を可能にするためのエレメント（アンピシリン耐性遺伝子及びゼオシンマーカー）が挙げられる。短縮型可溶化ヒトＣＤ３９バージョンのリストを表２で例示し、配列番号１を基準にしてアミノ酸修飾を付番した。
【００７３】
【表２】
2021529550.tif 000004
【００７４】
【表３】
2021529550.tif 000005
【００７５】
（ｂ）ｈＣＤ３９変異体のマイクロスケール発現
血清非存在下でのタンパク質の一過性発現のための好ましい宿主細胞株の１つとしてマイクロスケール実験のために２９３−６Ｅ細胞（参照により本明細書中に組み込まれる国際公開第２００６０９６９８９Ａ２号パンフレットで開示されるとおり）を選択した。遺伝子移入試薬としてＦｕＧｅｎｅ  ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．０４７０９７０５００１）を使用して、遺伝子移入を行った。遺伝子移入及び細胞の増殖のために、Ｖ３血清不含培地（Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｖ３−Ｋ）を使用した懸濁培養において２９３−６Ｅ細胞を培養した。５％ＣＯ２で加湿インキュベーターにおいてオービタル振盪機（１００〜１２０ｒｐｍ）上、Ｃｏｒｎｉｎｇ振盪フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ，ＭＡ）中で細胞を増殖させた（シードフラスコ）。シード培養物中の細胞は、指数増殖期で維持し（５ｘ１０５〜３ｘ１０６／ｍＬの細胞密度）、遺伝子移入に対する＞９０％の生存能を示すべきである。細胞密度がこの範囲外であると、希釈後に遅滞期となるか又は遺伝子移入効率が低下するかの何れかが起こる。
【００７６】
マイクロスケール（０．５ｍＬ）遺伝子移入の場合、細胞のアリコートをシード培養から採取し、Ｖ３血清不含培地中で細胞０．５ｘ１０６個／ｍＬに調整した。１４μＬのＶ３血清不含培地中で０．５μｇのｈＣＤ３９発現プラスミドを希釈することによって、ＤＮＡ溶液（溶液１と呼ばれる）を調製し、次に２．３μＬのＦｕＧｅｎｅ  ＨＤ溶液も１４μＬのＶ３血清不含培地中で希釈した（溶液２）。室温（ＲＴ）で５〜１０分間、両溶液を温置した。その後、穏やかに混合しながら溶液２を溶液１に添加し、室温でさらに５〜１５分間温置した。次に、４８ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ，ＭＡ）中で播種される０．５ｘ１０６個細胞／ｍＬの０．５ｍＬの細胞に遺伝子移入混合液を添加し、５％ＣＯ２で加湿インキュベーター中のオービタル振盪機（３００ｒｐｍ）上にプレートを置いた。４℃にて１０分間にわたり４０００ｒｐｍの遠心分離を行うことによって、遺伝子移入から３日後に培養物を回収した（Ｈｅｒａｅｕｓ，Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ  ３  Ｓ−Ｒ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）。さらなる処理まで、回収した細胞上清を４℃で保管した。
【００７７】
（ｃ）マイクロスケール発現上清におけるウエスタンブロット分析
組み換えｈＣＤ３９変異体の発現及び正しい形成を調べるために、マイクロスケール発現上清においてウエスタンブロット分析を行った。Ｅ−ＰＡＧＥ（商標）ローディング緩衝液（４ｘ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃ＥＰＢＮＦ−０１）中で８μＬの上清を希釈し、非還元条件のＥ−Ｐａｇｅ４８、８％ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃ＥＰ０４８０８）上に載せた。Ｅ−ｂａｓｅマザー装置（ｍｏｔｈｅｒ  ｄｅｖｉｃｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で２３分間ゲルを泳動し、製造者の説明書に従い、ｉＢｌｏｔ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、タンパク質をニトロセルロース膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＩＢ３０１００１）に転写した（７ｍｉｎ稼働）。ＴＢＳ／０．０５Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）中で３回洗浄した後、穏やかに撹拌しながら５％ミルク／ＴＢＳＴとともに膜を１時間温置し、続いて２％ミルク／ＴＢＳＴ中で希釈した抗ＡＰＰマウス抗体の４μｇ／ｍＬ溶液（Ｎｏｖａｒｔｉｓ内部で、タンパク質タグ付加のために使用したアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のペプチドストレッチに対して抗体を作製）とともに１時間温置した。さらなる３回の洗浄段階後、２％ミルク／ＴＢＳＴ中で希釈した抗マウスＩｇＧ−アルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ５１５３−１ＭＬ）の１：１０００希釈液とともに膜を温置し、ＴＢＳＴ中で再び３回洗浄し、続いてＴＢＳ中ですすぎ段階を行った。製造者の説明書に従いＳＩＧＭＡＦＡＳＴ（商標）ＢＣＩＰ（登録商標）／ＮＢＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，＃Ｂ５６５５−２５ＴＡＢ）を使用して１〜５分間シグナルを発色させ、水で膜をすすぐことによってシグナルを停止させた。
【００７８】
（ｄ）固相ＡｘＰａｓｅアッセイ
マイクロスケール発現上清からのプレート捕捉ｈＣＤ３９変異体に対してＰｉ  ＣｏｌｏｒＬｏｃｋ  Ｇｏｌｄリン酸検出系（Ｉｎｎｏｖａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｃａｔ  ｎ．３０３−００３０）を使用して、ＡＴＰａｓｅ、ＡＤＰａｓｅ及びＡＭＰａｓｅ活性を判定した（固相Ａｘｐａｓｅアッセイ）。この方法は、製造者により推奨される溶液に基づくアッセイ（液相Ａｘｐａｓｅアッセイ）と比較して感度がより低いことが分かったが、マイクロスケール発現上清中に存在する可能性がある宿主細胞酵素が介在するＡｘＰａｓｅ活性を低下させるという長所がある。ＰＢＳ中で希釈した２０μＬの抗ＡＰＰマウス抗体１０μｇ／ｍＬ溶液抗体（Ｎｏｖａｒｔｉｓ内部で、タンパク質タグ付加のために使用されるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のペプチドストレッチに対して作製された抗体）をｍａｘｉｓｏｒｐ  ３８４ウェルクリアプレート（Ｎｕｎｃ）の各ウェルに添加し、４℃で一晩温置した。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、穏やかに撹拌しながら室温で１００μＬの５％ミルク／ＴＢＳＴを使用してウェルを１時間ブロッキング処理した。さらなる３回の洗浄段階後、２％ミルク／ＴＢＳＴ中の２０μＬの連続希釈マイクロスケール発現上清を３つ組でウェルに添加し、穏やかに撹拌しながら室温で２時間温置した。次に、ウェルを再び、１００μＬのＴＢＳＴで４回及び８０μＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ｐＨ７．５で２回洗浄した。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ｐＨ７．５（ＡＴＰ：ＳＩＧＭＡ  Ａ２３８３、ＡＤＰ：ＳＩＧＭＡ  Ａ２７５４）中で希釈した３０μＬの８０μＭアデノシンリン酸溶液をそれぞれ３つ組で添加し、３７℃で２４時間温置した。製造者の説明書に従い調製した７．５μＬのＧｏｌｄ試薬混合液を使用して１０分間にわたりシグナルを発色させ、３μＬの安定化剤を使用して反応を停止させた。ＴＥＣＡＮ  Ｇｅｎｉｏｓ  Ｐｒｏ機器を使用して６２０ｎｍでの吸収を読み取った。
【００７９】
（２）結果
（ａ）ｈＣＤ３９発現レベルに対する境界、膜相互作用ループ（ＭＩＬ）欠失及びシステイン架橋欠失の影響
異なるｈＣＤ３９変異体の発現レベルを評価するために、０．５ｍＬの２９３−６Ｅ細胞において対応する発現プラスミドを２つ組で遺伝子移入し、遺伝子移入の３日後に回収した上清においてウエスタンブロット（抗ＡＰＰ検出Ａｂ）を行った。結果を図２Ａ及び図２Ｂで例示する。
【００８０】
結果は、ａａ４６と比較して、ａａ３８で開始するｈＣＤ３９のより高い発現レベルを示す。Ｎ末端境界並びにＭＩＬ欠失は、発現レベルに対して大きな影響がないと思われる。ｈＣＤ３９（ａａ４６−４６１）の状況下で第１又は第４のシステイン架橋が欠失しているｈＣＤ３９のより高い発現レベルも観察された。ｈＣＤ３９（ａａ４６−４６１）ΔＭＩＬ骨格も使用して、第１のシステイン架橋欠失のより高い発現レベルを確認した。
【００８１】
ｈＣＤ３９活性に対する境界、膜相互作用ループ（ＭＩＬ）欠失及びシステイン架橋欠失の影響
上記上清試料において固相ＡｘＰａｓｅアッセイによってＣＤ３９酵素活性を測定した。結果を図３及び図４並びに表３で例示する。
【００８２】
【表４】
2021529550.tif 000006
【００８３】
【表５】
2021529550.tif 000007
【００８４】
【表６】
2021529550.tif 000008
【００８５】
ＭＩＬの欠失により、機能的に発現されるＣＤ３９組み換えタンパク質の割合が増加すると思われる。境界が異なることにより、活性のあるｈＣＤ３９活性に対して大きな影響は示されない。結果は、システイン架橋欠失変異体全てのＡＴＰａｓｅ活性の強い低下又は完全な消失を示す。固相ＡＤＰａｓｅアッセイを使用して同様の結果を得た。従って、驚くべきことにＣＤ３９発現効率及びＣＤ３９発現能力を両方とも上昇させる配列修飾はデルタＭＩＬ（ΔＭＩＬ）修飾である。
【００８６】
３．実施例２：発現タグ
候補の発現特性を向上させるために、様々な発現タグを試験した。
【００８７】
表４で示されるように、ＩＬ−２のＮ末端部分に基づく異なる発現タグ（配列番号１３１）を試験した。配列番号１３１による発現タグ１−１６ａａはＧｅｎｅａｒｔにより合成された。
【００８８】
【表７】
2021529550.tif 000009
【００８９】
配列番号４で示されるようにＣＤ３９ΔＭＩＬに関して全ての発現タグを試験した。コンストラクト全てがＡＰＰタグ及びＨｉｓタグを含んだ。
【００９０】
図５で示されるように、ベクターｐＲＳ５ａを発現のために使用した。プライマー対を表４で示した。
【００９１】
アニーリング温度は全例で６４℃であった。
【００９２】
１μＬ鋳型ＤＮＡ保存液、２５μＬ  Ｋａｐａ  Ｈｉｆｉ  Ｈｏｔｓｔａｒｔポリメラーゼ（ｋａｐｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＫＫ２６０２より）、１．５μＬフォワードプライマー、１．５μＬリバースプライマーを混合し、Ｈ２Ｏで５０μＬまで最終体積を調整することによってＰＣＲ溶液を調製した。
【００９３】
表５のスケジュールに従いＰＣＲ反応を行った。
【００９４】
【表８】
2021529550.tif 000010
【００９５】
ＰＣＲ反応の完了後、製造者の説明書に従い、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ  Ｇｅｌ及びＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｋｉｔ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｎｏ．９２８２、１カラム、３０μＬ中での溶出を使用してＤＮＡ抽出を行った。
【００９６】
ＣｕｔＳｍａｒｔ（Ｒ）緩衝液中でＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）、ＮｒｕＩ−ＨＦ（ＮＥＢ＃Ｒ３１９２）及びＮｏｔＩ−ＨＦ（ＮＥＢ＃Ｒ３１８９）により供給された酵素で挿入物及びベクターを切断した。反応時間は３７℃で３時間であった。
【００９７】
生産者の有効なプロトコールに従い、迅速ＤＮＡ脱リン酸化及びライゲーションキット、Ｆａ．Ｒｏｃｈｅ，Ｎｏ．０４８９８１１７００１とともに脱リン酸化ベクターを用いてライゲーションを一晩行った。
【００９８】
翌日、フォワードプライマーＰ２７０（配列番号１６５）及びリバースプライマーＰ２７１（配列番号１６６）を用いたＤＮＡ−Ｍｉｎｉｐｒｅｐ及び配列分析のために単コロニーを拾った。
【００９９】
さらに、表６に従って、発現を上昇させることが当技術分野で知られる数個のタンパク質配列を試験した。
【０１００】
【表９】
2021529550.tif 000011
【０１０１】
試験した、得られた組み合わせを表７で示す。
【０１０２】
【表１０】
2021529550.tif 000012
【０１０３】
タンパク質（データは示さない）の発現をもたらした表６からの先行技術タグはなかった。先行技術はこれらの配列が発現を上昇させるはずであることを教示するので、これは予想外であった。
【０１０４】
４．実施例３：さらなる突然変異
可溶性ＣＤ３９の特徴を改善し、薬物開発に適切にするために、配列番号４で示される、ＣＤ３９ΔＭＩＬ、ＥＰ２８においてさらなる修飾を導入した。異なる突然変異及び突然変異した変異体は、表８で見られ、配列番号１で示されるような野生型ＣＤ３９のアミノ酸位置に従い付番する。
【０１０５】
【表１１】
2021529550.tif 000013
【０１０６】
【表１２】
2021529550.tif 000014
【０１０７】
活性部位中の２つの突然変異は、より高い活性につながる（３６５及び４１２）。
【０１０８】
５．実施例４：グリコシル化部位除去
上のＥＰ１４変異体に基づき、表９による点突然変異を導入することによってグリコシル化部位の効果を調べ、配列番号１で示されるような野生型ＣＤ３９のアミノ酸位置に従い付番する。
【０１０９】
【表１３】
2021529550.tif 000015
【０１１０】
（ａ）材料及び方法
クローニングのために発現ベクターｐＲＳ５ａ（図５）を使用した。表１０で示されるようにプライマーを使用した。
【０１１１】
【表１４】
2021529550.tif 000016
【０１１２】
製造者の説明書に従い、ＰＣＲのためにＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｎｏ．２１０５１９−５）を使用した。
【０１１３】
翌日、ＤＮＡ−Ｍｉｎｉｐｒｅｐのために単コロニーを拾い、フォワードプライマーＰ２７０（配列番号１６５）及びリバースプライマーＰ２７１（配列番号１６６）を用いて配列分析を行った。
【０１１４】
（突然変異誘発による）ベクター骨格の精度も確実にするために、次の方法を使用して、ｐＲＳ５ａの新しいベクター骨格（図５）に、配列決定した挿入断片をクローニングした。
【０１１５】
ＡＰＰ＿ＨＩＳ−Ｔａｇ、保存濃縮液３．３μｇ／μＬを含有する、発現タグ配列番号１３５とともに配列番号３６のベクター骨格を使用して、ベクターを調製した。
【０１１６】
５０μＬの最終体積まで１０μｇベクター−ＤＮＡ、０．４μＬ  ＨｉｎｄＩＩＩ（１００Ｕ／μＬ、ＮＥＢ）、２μＬ  ＥｃｏＲＩ（２０Ｕ／μＬ、ＮＥＢ）、５μＬ  Ｃｕｔｓｍａｒｔ緩衝液１０ｘｃｏｎｃ．（ＮＥＢ）、Ｈ２Ｏを混合することによって、ベクターを消化した。３７℃で３時間消化を行った。
【０１１７】
アルカリホスファターゼ、子牛腸（ＣＩＰ，ＮＥＢ，Ｎｏ．Ｍ０２９０Ｌ）、１０Ｕ／μＬを用いて脱リン酸化を行った。消化の直後、消化したベクターに３μＬのＣＩＰを添加し、３７℃で３０分間温置した。消化し、脱リン酸化したベクターを分取０．８％ＴＡＥアガロースゲル上に載せ、約６１００ｂｐのベクターの妥当なバンドサイズを切り出した。Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ  Ｇｅｌ及びＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｋｉｔ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｎｏ．９２８２、１カラムを用いて、１００μＬの溶出で、クリーンアップを行った。ＯＤ２６０ｎｍは６４ｎｇ／μＬの濃度を示した。
【０１１８】
４２．５μＬのＤＮＡ（各ＤＮＡに対して約３〜５μｇ）、５μＬ  Ｃｕｔｓｍａｒｔ緩衝液、１０ｘｃｏｎｃ．、ＮＥＢ  ｎｏ  Ｂ７２０４Ｓ、０．４μＬ  ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦ、１００Ｕ／μＬ、ＮＥＢ  ｎｏ．Ｒ３１０４Ｓ、２μＬ  ＥｃｏＲＩ−ＨＦ、２０Ｕ／μＬ、ＮＥＢ  ｎｏ．Ｒ３１０３Ｌを混合し、体積をＨ２Ｏで５０μＬに調整することによって、突然変異挿入断片の消化を行った。ＰＣＲ機器中で３７℃にて３時間、消化を行った。分取０．８％ＴＡＥアガロースゲルに、消化した挿入物を載せ、約１４００ｂｐのベクターの妥当なバンドサイズを切り出した。Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ  Ｇｅｌ及びＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｋｉｔ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｎｏ．９２８２、１カラムを用いて、３０μＬの溶出で、クリーンアップを行った。ＯＤ２６０ｎｍは１〜２５ｎｇ／μＬの濃度を示した。
【０１１９】
Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｎｏ．Ｋ１４２３，Ｆａ．Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃとともに（ベクター：挿入比約１：１０）を使用してライゲーションを行った。４μＬ  ５ｘライゲーション緩衝液を１μＬリガーゼ、２μＬベクター断片、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ消化、保存濃縮液６４ｎｇ／μＬ、１３μＬ挿入断片、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ消化、保存濃縮液１〜２５ｎｇ／μＬと混合した。ＲＴで１０分間、ライゲーションを行った。
【０１２０】
氷上での３０分間にわたる８０μＬ化学コンピーテントＸＬ１Ｂｌｕｅ細胞（Ｎｏｖａｒｔｉｓ，ＦＳ／ＲＬ）との１０μＬライゲーション物の温置によって形質転換を行った。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆインキュベーター中で４２℃にて４５秒間の熱ショックを行い、続いて氷上で２分間温置した。その後、１ｍＬ  ２ＹＴ培地を添加し、続いてＥｐｐｅｎｄｏｒｆ振盪機（８００ｒｐｍ）上で３７℃にて１．５時間温置した。７０００ｒｐｍで３分間、細胞を遠心分離し、ＬＢ／Ｃａｒｂ／Ｇｌｕｃ上にコロニーを蒔いた。続いてプレートを３７℃で一晩温置した。
【０１２１】
翌日、ＤＮＡ−Ｍｉｎｉｐｒｅｐのために単コロニーを拾い、フォワードプライマーＰ２７０（配列番号１６５）及びリバースプライマーＰ２７１（配列番号１６６）を使用して配列分析を行った。
【０１２２】
７日間の発現により、２００ｍＬスケールで、妥当な配列をＨＥＫ２９３細胞に遺伝子移入した。
【０１２３】
次の材料を使用した：
ＳＶ４０ラージＴ抗原（ＨＥＫ２９３−Ｔ）を構成的に発現するヒト胚腎臓細胞、例えばＡＴＣＣ１１２６８
ポリエチレンイミン”ＭＡＸ”ＭＷ４０．０００（ＰＥＩ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｔ．２４７６５）、ＲＴにてＨ２０中で溶解し、ＮａＯＨでｐＨ７．０５に調整。
Ｍ１１Ｖ３血清不含培地（Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ，ＣＨ，Ｃａｔ：Ｖ３−Ｋ）
ＤＮＡ：供給者により推奨されるプロトコールに従い、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＡ  Ｋｉｔ、Ｍｉｄｉｐｒｅｐ−Ｋｉｔ（Ｎｏ．１２９４３）を用いて調製。
【０１２４】
一過性遺伝子移入のための細胞培養作業は全て、血清不含Ｍ１１Ｖ３培地中で増殖させた懸濁適合ＨＥＫ２９３−Ｔ細胞を使用して行う。
【０１２５】
５％ＣＯ２の加湿ＣＯ２−インキュベーターにおいてオービタル振盪機（１１５ｒｐｍ）上でＣｏｒｎｉｎｇ振盪フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＵＳＡ）中で細胞を増殖させる（シードフラスコ）。
【０１２６】
使用される細胞は指数増殖期になっており（５ｘ１０５〜３ｘ１０６／ｍＬの細胞密度）、＞９０％の生存能であった。
【０１２７】
数を数えた細胞を使用して、小スケール（ここでは２０／５０又は１００ｍＬ）で遺伝子移入を行い、細胞の対応する量をＭ１１Ｖ３培地で細胞１．４ｘ１０６個／ｍＬに調整した。最終遺伝子移入体積の３６％細胞懸濁液を使用する。
【０１２８】
７％最終体積Ｍ１１Ｖ３中で１ｍｇ／Ｌ最終体積ＤＮＡを希釈し、穏やかに混合することによって、ＤＮＡ溶液（溶液１）を調製する。非滅菌ろ過ＤＮＡなので培養物の汚染を防ぐために、フィーディング後、Ｐｅｎｃ．／Ｓｔｒｅｐを遺伝子移入物に添加した。次に、７％最終体積Ｍ１１Ｖ３中で３ｍｇ／Ｌ最終体積ＰＥＩ溶液を希釈し、穏やかに混合する（溶液２）。５〜１０分にわたり室温（ＲＴ）で両溶液を温置する。その後、穏やかに混合しながら溶液２を溶液１に添加し、ＲＴでさらに５〜１５分間温置する。温置後、遺伝子移入混合物を細胞に添加し、培養物を４時間培養する（１１５ｒｐｍ、３７℃、５％ＣＯ２）。
【０１２９】
発現の７日後に上清を回収した。
【０１３０】
遠心分離４５００ｒｐｍ．、１５ｍｉｎ．、４℃（Ｈｅｒａｅｕｓ，Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ  ３  Ｓ−Ｒ）
【０１３１】
滅菌ろ過、０．２２μｍ（Ｓｔｅｒｉｃｕｐ  ｆｉｌｔｅｒ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ．５６７−００２０））を通じて清澄化。
【０１３２】
さらなる段階のために上清を精製に送る。Ｏｐｅｎ  Ａｃｃｅｓｓ  ＡＰＰ−カラム上でＩＰＣに対して上清の１ｍＬ試料を使用する。
【０１３３】
試料バイアルは、ガラス圧着バイアル、２ｍＬ  Ａｇｉｌｅｎｔ、カタログ番号５１８２−０５４３及びキャップ：圧着１１ｍｍ、カタログ番号５０４０−４６６７であった。
【０１３４】
５ｍＬ  Ｈｉｓｔｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｏｒｄｅｒ  Ｎｏ．１７−５２４８−０２）を使用して、次のプロトコールに従い、Ａｅｋｔａ  Ｐｕｒｅ又はＡｅｋｔａ  Ａｖａｎｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を使用して、タンパク質を精製した。仕様を表１１で示す。
【０１３５】
【表１５】
2021529550.tif 000017
【０１３６】
表１２及び表１３に従い、使用する緩衝液を構成した。
【０１３７】
【表１６】
2021529550.tif 000018
【０１３８】
【表１７】
2021529550.tif 000019
【０１３９】
表１４による、得られるタンパク質を保管した。
【０１４０】
【表１８】
2021529550.tif 000020
【０１４１】
（ｂ）結果及び解釈
分析的ＳＥＣの収率及び単量体のピークに関する突然変異体の改善はなかった。配列番号１３７による発現タグ付きの親タンパク質（ＥＰ１４）は、分析における最良の収率及び最大単量体のピークをもたらした。最低収率及びまた最低単量体のピークは突然変異体Ｎ３７１Ｑで得た。
【０１４２】
６．実施例５：組み合わせ
試行し、さらに特性を改善するために、上の実施例３で導入された突然変異のうちいくつかを下の表１５に従い組み合わせた。突然変異は、配列番号１で示されるような野生型ＣＤ３９のアミノ酸位置に従い付番する。
【０１４３】
【表１９】
2021529550.tif 000021
【０１４４】
（ａ）材料及び方法
表１６によるプライマーを使用した。
【０１４５】
【表２０】
2021529550.tif 000022
【０１４６】
次のピペッティングスキームを使用してＰＣＲ反応を設定した：
５μＬの１０ｘ反応緩衝液、
１μＬ  ｄｓ−ＤＮＡ−鋳型（保存濃縮液１００ｎｇ／μＬ）、
１．５μＬプライマー１、
１．５μＬプライマー２、
１μＬ  ｄＮＴＰ混合物、
１．５μＬ  ＱｕｉｃｋＳｏｌｕｔｉｏｎ試薬、
３５．５μＬ  Ｈ２Ｏ（５０μＬの最終体積に対する）及び
１μＬ  ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ。
【０１４７】
表１７によるＰＣＲサイクリングパラメーターを使用した。
【０１４８】
【表２１】
2021529550.tif 000023
【０１４９】
反応直後、２μＬ  ＤｐｎＩ−酵素を各反応に添加し、混合し、３７℃で５分間温置した。
【０１５０】
次のようにＸＬ１０−ｇｏｌｄ  ｕｌｔｒａ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ細胞への形質転換を行った。氷上で細胞を凍結融解した。４５μＬ／形質転換を使用し、２μＬ  Ｂ−ＭＥを各バイアルに添加した。次に、３μＬ  ＤｐｎＩ−消化ＰＣＲ産物を添加し、１５ｍＬのＢＤチューブ中、氷上で３０分間温置した。その後、試料を４０秒間熱ショック処理し、氷上で２分間温置した。次に、９５０μＬ  ＳＯＣ培地を添加し、続いて振盪インキュベーター中で３７℃にて１．５時間温置した。最後に、ＬＢ−ｃａｒｂ−プレート上に細胞を蒔き、３７℃で一晩温置した。翌日、ＤＮＡ−ｍｉｎｉｐｒｅｐ及び配列分析のために単コロニーを拾った。
【０１５１】
実施例４に記載のように、妥当な配列をＨＥＫ２９３細胞に遺伝子移入した。
【０１５２】
次のように固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を使用してタンパク質を精製した。９５ｍＬの上清を使用した（全ての約４ｍＬを分析（ＩＰＣ）用に維持する）。
【０１５３】
使用材料：
Ｎｉｃｋｅｌ−ＮＴＡ−Ａｇａｒｏｓｅ、Ｑｉａｇｅｎ，Ｃａｔ  Ｎｏ．／ＩＤ：３０２３０、Ｐｏｌｙ−Ｐｒｅｐ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｃｏｌｕｍｎ，ｅｍｐｔｙ，ＢｉｏＲａｄ，Ｎｏ．７３１−１５５０，ＩＭＡＣ  Ａ緩衝液ｐＨ７．４（２０ｍＭ  ＮａＰＯ４−緩衝液及び５０ｍＭイミダゾール含有）。ＩＭＡＣ  Ｂ緩衝液ｐＨ７．４（２０ｍＭ  ＮａＰＯ４−緩衝液及び３００ｍＭイミダゾール含有）。ＴＢＳ（ＭｉｌｌｉＱ−Ｗａｔｅｒにより１０ｘ濃縮を１ｘ濃縮に希釈）。Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０メンブレン、１０Ｋ、ＵＦＣ８０１０９６付きＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ。
【０１５４】
工程段階：
１．Ｑｉａｇｅｎの１ｍＬ  Ｎｉｃｋｅｌ−ＮＴＡ−Ａｇａｒｏｓｅ（＝０．５ｍＬ  ＣＶ）でカラムを調製；
２．１０ＣＶ  ＩＭＡＣ  Ａで平衡化；
３．カラム上での１５／４５ｍＬ  ＳＮのローディング（フロースルーを回収）；
４．１０ＣＶ  ＩＭＡＣ  Ａで洗浄（１５ｍＬ  Ｆａｌｃｏｎチューブ中で回収）；
５．ＩＭＡＣ  Ｂの６．５ＣＶ中で溶出；
６．溶出物の濃度の決定；
７．Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ  １０Ｋを用いた約４００μＬへの３．５ｍＬ試料の濃縮；
８．ＴＢＳ添加及び遠心分離５０００することによる緩衝液交換。
【０１５５】
４０μＬの各試料で分析ＳＥＣを使用し、１２μＬの各試料でタンパク質ゲルを使用して、試料を分析した。
【０１５６】
得られたタンパク質を保存した。
【０１５７】
（ｂ）結果及び解釈
結果を表１８で示す。
【０１５８】
【表２２】
2021529550.tif 000024
【０１５９】
プロテアーゼ部位：
マトリプターゼを挿入した場合、産生されなかった／収率が非常に低かった。フューリン部位で約４０％収率があった（しかしフューリンプラスミドとの同時遺伝子移入であったので、遺伝子移入に対してＤＮＡの５０％のみを同様に使用した）。
【０１６０】
ＩＬ２−短縮：
ａａ１−３が含まれる全ての短縮が同等の結果を与え、他と比較してａａ１−３のみが僅かにより低くなり得るが、これは、試料から試料への変動であり得る。短縮ａａ４−１２ではタンパク質発現がなくなる。全ての他のＥＰ−変異体のように、ＩＬ２−ｓｔａｒｔとｈＣＤ３９−タンパク質との間にＴＳＳリンカーを含有するＥＰ２８の間で差は見られ得なかった。
【０１６１】
組み合わせ：
ＥＰ１９（Ｌ４２４Ｑ）との組み合わせは、タンパク質発現の顕著な改善につながらなかった。
【０１６２】
ＥＰ１（Ｒ１１３Ｍ）との組み合わせは、分析ＳＥＣでより低い凝集を示した。ＮＥＧ７２６はよく発現されたが、全ての試験物のうち最低の凝集を示した（約３７％）。ＥＰ１４ｘＥＰ１７の組み合わせは、何らかのさらなる改善につながらなかった（Ｆ３６５Ｓ＋Ｙ４１２Ｆ）。
【０１６３】
７．実施例６：最終候補のクローニング
さらなる試験のために以下の表１９で示されるような臨床候補の選択物を発現させた。
【０１６４】
【表２３】
2021529550.tif 000025
【０１６５】
次のプライマーを使用した：
【０１６６】
【表２４】
2021529550.tif 000026
【０１６７】
次のピペッティングスキームを使用してＰＣＲ反応を設定した：
０．２５μＬ  ＤＭＳＯ、
２０ｎｇベクター
１．５μＬ挿入物（４５ｎｇ／μＬ）、
２μＬ  ５ｘＨＦ緩衝液、
０．１μＬ  Ｐｈｕｓｉｏｎ  ｐｏｌ、
０．０８μＬ  ｄＮＴＰ混合物
１０−ＸμＬ  ｄｄＨ２Ｏ
【０１６８】
表１７によるＰＣＲサイクリングパラメーターを使用した。
【０１６９】
【表２５】
2021529550.tif 000027
【０１７０】
反応直後、各反応に０．５μＬ  ＤｐｎＩ−酵素を添加し、混合し、３７℃で２時間温置した。
【０１７１】
ＸＬ１０−ｇｏｌｄ  ｕｌｔｒａ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ細胞への形質転換を次のように行った。細胞を氷上で凍結融解した。４５μＬ／形質転換を使用して、２μＬ  Ｂ−ＭＥを各バイアルに添加した。次に、３μＬ  ＤｐｎＩ−消化ＰＣＲ産物を添加し、１５ｍＬのＢＤチューブ中で氷上にて３０分間温置した。その後、試料を４０秒間熱ショック処理し、氷上で２分間温置した。次に、９５０μＬ  ＳＯＣ培地を添加し、続いて振盪インキュベーター中で３７℃にて１．５時間温置した。最後に、ＬＢ−ｃａｒｂ−プレート上に細胞を蒔き、３７℃で一晩温置した。翌日、ＤＮＡ−ｍｉｎｉｐｒｅｐ及び配列分析のために単コロニーを拾った。
【０１７２】
配列が正しかったことを確実にするために、新しいベクター背景に全てのコンストラクトをサブクローニングした。このために、ＰＣＲで全てのコンストラクトを増幅し、Ｇ４Ｓ−リンカーを挿入し、次にＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩで消化した。得られたタンパク質を保存した。
【０１７３】
８．実施例７：比較タンパク質の作製
（１）ヌル突然変異
インビボ実験用に陰性対照タンパク質を作製するために、１／２個の突然変異を親ヒトＣＤ３９ΔＭＩＬタンパク質（ＥＰ２８）に挿入した。この突然変異は、このタンパク質の酵素活性を排除するか又は低下させることが文献に記載されている。突然変異位置はＥ１７４Ａ及びＳ２１８Ａである。
【０１７４】
次のプライマーを使用した：
【０１７５】
【表２６】
2021529550.tif 000028
【０１７６】
次のピペッティングスキームを使用してＰＣＲ反応を設定した：
５μＬの１０ｘ反応緩衝液、
１μＬ  ｄｓ−ＤＮＡ−鋳型（保管濃縮液１００ｎｇ／μＬ）、
１．５μＬプライマー１、
１．５μＬプライマー２、
１μＬ  ｄＮＴＰ混合液
１．５μＬ  ＱｕｉｃｋＳｏｌｕｔｉｏｎ試薬、
３５．５μＬ  Ｈ２Ｏ（５０μＬの最終体積に対する）及び
１μＬ  ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ。
【０１７７】
表１７によるＰＣＲサイクリングパラメーターを使用した。
【０１７８】
【表２７】
2021529550.tif 000029
【０１７９】
反応直後、２μＬ  ＤｐｎＩ−酵素を各反応に添加し、混合し、３７℃で５分間温置した。
【０１８０】
ＸＬ１０−ｇｏｌｄ  ｕｌｔｒａ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ細胞への形質転換を次のように行った。細胞を氷上で凍結融解した。４５μＬ／形質転換を使用し、２μＬ  Ｂ−ＭＥを各バイアルに添加した。次に、３μＬ  ＤｐｎＩ消化ＰＣＲ産物を添加し、１５ｍＬ  ＢＤチューブ中で氷上にて３０分間温置した。その後、試料を４０秒間熱ショック処理し、氷上で２分間温置した。次に、９５０μＬ  ＳＯＣ培地を添加し、続いて振盪インキュベーター中で３７℃にて１．５時間温置した。最後に、ＬＢ−ｃａｒｂ−プレート上に細胞を蒔き、３７℃で一晩温置した。翌日、ＤＮＡ−ｍｉｎｉｐｒｅｐ及び配列分析のために単コロニーを拾った。
【０１８１】
次のプロトコールに従い、妥当な配列をＨＥＫ２９３細胞に遺伝子移入した。
【０１８２】
５０μＬの最終体積まで、１０μｇベクター−ＤＮＡ、０．４μＬ  ＨｉｎｄＩＩＩ（１００Ｕ／μＬ、ＮＥＢ）、２μＬ  ＥｃｏＲＩ（２０Ｕ／μＬ、ＮＥＢ）、５μＬ  Ｃｕｔｓｍａｒｔ緩衝液１０ｘｃｏｎｃ．（ＮＥＢ）及びＨ２Ｏを使用して消化緩衝液を調製した。３７℃で３時間、消化反応を行った。
【０１８３】
消化の直後、脱リン酸化反応を行った。消化したベクター混合物に子牛腸アルカリホスファターゼ（１０Ｕ／μＬ、ＣＩＰ、ＮＥＢ、Ｎｏ．Ｍ０２９０Ｌ）を添加し（３μＬ）、３７℃で３０分間温置した。
【０１８４】
配列を調べるために、消化し、脱リン酸化したベクターをサブクローニングした。
【０１８５】
次のプロトコールに従い、妥当な配列をＨＥＫ２９３細胞に遺伝子移入した。
【０１８６】
次の材料を使用して、７日間の発現を行った；１．ＳＶ４０  ｌａｒｇｅＴ抗原を構成的に発現するヒト胚腎臓細胞（ＨＥＫ２９３−Ｔ、ＡＴＣＣ１１２６８）；２．ポリエチレンイミン”ＭＡＸ”ＭＷ４０．０００（ＰＥＩ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｔ．２４７６５）。
【０１８７】
室温（ＲＴ）にて９００ｍＬ細胞培養グレード水中で１ｇ  ＰＥＩを慎重に溶解させることによってＰＥＩ溶液を調製する。次に、これを７．０５の最終ｐＨになるようにＮａＯＨで中和する。最後に、体積を１Ｌに調整し、０．２２μｍフィルターを通じて溶液をろ過し、アリコートで分配し、さらなる使用まで−８０℃で凍結する。凍結融解した後、−２０℃で最大３回までアリコートを再凍結し得るが、−２０℃で長期間保管すべきではない。
【０１８８】
Ｍ１１Ｖ３血清不含培地（Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ，ＣＨ，Ｃａｔ：Ｖ３−Ｋ）。
【０１８９】
血清不含Ｍ１１Ｖ３培地中で増殖させた懸濁適合ＨＥＫ２９３−Ｔ細胞を使用して、一過性遺伝子移入のための全ての細胞培養作業を行う。
【０１９０】
小スケール（＜５Ｌ）遺伝子移入の場合、５％ＣＯ２の加湿ＣＯ２インキュベーターにおいて、オービタル振盪機（１００ｒｐｍ）上でＣｏｒｎｉｎｇ振盪フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＵＳＡ）中で細胞を増殖させる（シードフラスコ）。
【０１９１】
一般に、シード培養中の細胞は指数増殖期（５ｘ１０５〜３ｘ１０６／ｍＬの細胞密度）であるべきであり、生存能は＞９０％である。細胞密度がこの範囲外であると、分割後に遅滞期となるか又は遺伝子移入効率が低下するかの何れかが起こる。
【０１９２】
小スケール（ここでは２Ｌ）遺伝子移入の場合、細胞のアリコートをシード培養物から採取し、Ｍ１１Ｖ３培地により最終体積の３６％で細胞１．４ｘ１０６個／ｍＬに調整する。
【０１９３】
７％最終体積Ｍ１１Ｖ３中で１ｍｇ／Ｌ最終体積ＤＮＡを希釈し、穏やかに混合することによって、ＤＮＡ溶液（溶液１）を調製する。培養物の汚染を防ぐために、０．２２μｍフィルター（例えばＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｔｅｒｉｃｕｐ）を使用してこの溶液をろ過し得る。ここでは、体積が小さいので滅菌ろ過は行っていない。次に、３ｍｇ／Ｌ最終体積ＰＥＩ溶液を７％最終体積Ｍ１１Ｖ３中で希釈し、穏やかに混合する（溶液２）。室温（ＲＴ）で５〜１０分間両溶液を温置する。その後、穏やかに混合しながら溶液２を溶液１に添加し、さらに５〜１５分間ＲＴで温置する（ＰＥＩは、ＤＮＡを覆い／凝縮させて正荷電粒子にし、これが陰イオン性の細胞表面残基に結合し、エンドサイトーシスを介して細胞に取り込まれるので、温置時間中に再び混合しない）。温置後、遺伝子移入混合物を細胞に添加し、培養物を４時間培養する（１０ｒｐｍ、３７℃、６％ＣＯ２）。
【０１９４】
最後に、次の実施例に従い、培養物に残りの５０％最終体積Ｍ１１Ｖ３培地を供給する：接種体積：細胞１．４ｘ１０６個／ｍＬで３６ｍＬ。
【０１９５】
溶液１：１００μｇプラスミドＤＮＡ入りの７ｍＬ  Ｍ１１Ｖ３培地。溶液２：３００μｇ  ＰＥＩ（３００μＬ）入りの７ｍＬ  Ｍ１１Ｖ３培地。
供給：５０ｍＬ  Ｍ１１Ｖ３、合計１００ｍＬ。
【０１９６】
次のように固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を使用してタンパク質を精製した。９５ｍＬの上清を使用した（全ての約４ｍＬを分析（ＩＰＣ）用に維持する）。
【０１９７】
使用材料：
Ｎｉｃｋｅｌ−ＮＴＡ  Ａｇａｒｏｓｅ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｃａｔ  Ｎｏ．／ＩＤ：３０２３０，Ｐｏｌｙ−Ｐｒｅｐ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｃｏｌｕｍｎ，ｅｍｐｔｙ，ＢｉｏＲａｄ，Ｎｏ．７３１−１５５０，ＩＭＡＣ  Ａ緩衝液ｐＨ７．４（２０ｍＭ  ＮａＰＯ４−緩衝液及び５０ｍＭイミダゾール含有）。ＩＭＡＣ  Ｂ緩衝液ｐＨ７．４（２０ｍＭ  ＮａＰＯ４−緩衝液及び３００ｍＭイミダゾール含有）。ＴＢＳ（ＭｉｌｌｉＱ−Ｗａｔｅｒで１０ｘ濃縮を１ｘ濃縮に希釈）。Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０メンブレン、１０Ｋ、ＵＦＣ８０１０９６付きのＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ。
【０１９８】
工程段階：
１．Ｑｉａｇｅｎの１ｍＬ  Ｎｉｃｋｅｌ−ＮＴＡ−Ａｇａｒｏｓｅ（＝０．５ｍＬ  ＣＶ）でカラムを調製；
２．１０ＣＶ  ＩＭＡＣ  Ａで平衡化；
３．カラム上で１５／４５ｍＬ  ＳＮをローディング（フロースルーを回収）；
４．１０ＣＶ  ＩＭＡＣ  Ａで洗浄（１５ｍＬ  Ｆａｌｃｏｎチューブ中で回収）；
５．６．５ＣＶのＩＭＡＣ  Ｂ中で溶出；
６．溶出物の濃度の決定；
７．Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ  １０Ｋを用いて約４００μＬまで３．５ｍＬ試料を濃縮；
８．ＴＢＳの添加及び遠心分離５０００により緩衝液交換。
【０１９９】
４０μＬの各試料を用いた分析用ＳＥＣを使用して、及び１２μＬの各試料とともにタンパク質ゲルを使用して、試料を分析した。
【０２００】
得られたタンパク質を保存した。
【０２０１】
（２）ｐｌｕｓＭＩＬ
オーバーラップ伸長ＰＣＲで膜相互作用ループ（ａａ１９３−２０４）を用いてＥＰ１４ａａ１−３のクローニングを行った。
【０２０２】
次のプライマーを使用した。
【０２０３】
【表２８】
2021529550.tif 000030
【０２０４】
次のピペッティングスキームを使用してＰＣＲ反応を設定した：
１．２μＬ  Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、
２４μＬ  ５ｘＨＦ−緩衝液、
０．９６μＬ  １００ｍＭ  ｄＮＴＰ（各ｄＮＴＰ  ２５ｍＭ）、
０．６μＬ  Ｆｗプライマー、
０．６μＬ  Ｒｅｖプライマー、
９２．６４μＬ  ＤＥＰＣ  Ｈ２Ｏ。
【０２０５】
表１７に従うＰＣＲサイクリングパラメーターを使用した。
【０２０６】
【表２９】
2021529550.tif 000031
【０２０７】
反応直後に２μＬ  ＤｐｎＩ−酵素を各反応物に添加し、混合し、３７℃で２時間温置した。
【０２０８】
２μＬ  ＰＣＲ産物を９６ウェルＰＣＲプレート移し、氷上で冷却することによって形質転換を行った。２０μＬ  ＳＴＥＬＬＡＲ化学コンポーネント（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）細菌を添加し、ピペッティングで一度出し入れすることにより慎重に混合した。試料を氷上で３０分間温置し、次にＰＣＲ機器中で４２℃で４５秒温置し、続いて氷上で６０秒間さらに温置した。最後に、９０μＬ  ＳＯＣ培地を添加し、３７℃で１時間温置した。遺伝子移入混合物全てをＬＢ−アンピシリン又はＬＢ−カルベンシリンプレート上に蒔き、３７℃で一晩増殖させた。
【０２０９】
配列番号１５５に従うアミノ酸配列を有する得られたタンパク質ＥＰ１４＿ｐｌｕｓＭＩＬを保存した。
【０２１０】
９．実施例８：酵素活性
酵素活性アッセイを使用して、前の実施例で作製した候補の特徴を調べた。
【０２１１】
次の試薬を使用した：Ｐｉ不含緩衝液、リン酸不含生理食塩水溶液（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４）；及びＰｉ不含緩衝液＋２％ＢＳＡ、２０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ；ＣＤ３９タンパク質（配列番号１に従う）入りのリン酸不含生理食塩水溶液；ＡＴＰ。
【０２１２】
２つ組ＣＤ３９溶液を２μｇ／ｍＬで調製した。１５μＬ  ＡＴＰ保存液＋１１８５μＬ緩衝液、全部で１．２ｍＬ、から、１０００μＭで２つ組ＡＴＰ溶液を調製した。
【０２１３】
１２０μＬ最終／ウェルを満たした４８ウェルＰＣＲプレートにおいて６０μＬ  ＡＴＰを６０μＬ  ＣＤ３９と、又は対照用のＰｉ不含緩衝液と６０μＬを混合することによって、酵素反応を試験した。最終濃度は５００μＭ  ＡＴＰ及び１μｇ／ｍＬ  ＣＤ３９であった。
【０２１４】
それぞれ０、５、１５、３０、６０、９０及び１５０分間にわたり３７℃で試料を温置した。次に、Ｐｉ放出アッセイ又はＨＰＬＣの何れかにより試料を評価した。
【０２１５】
（１）Ｐｉ放出アッセイ
（ａ）材料及び方法
製造者の説明書に従い、標準Ｐｉ検出キットから試薬を調製した。
【０２１６】
水中での希釈により、Ｐｉによる標準曲線を作成した。Ｐｉ保存液（１００μＭ）の１：２連続希釈液を調製した：４５０μＬ＋４５０μＬ水。標準曲線濃度は５０μＭ／２５μＭ／１２．５μＭ／６．２５μＭ／３．１μＭ／１．５μＭ／０μＭであった。
【０２１７】
Ｇｏｌｄ試薬混合液を調製した：４ｍＬ  ｇｏｌｄ試薬＋４０μＬ促進剤（３プレートに対して）。９６ウェルプレートにおいて、Ｈ２Ｏ中で試料を１：１０希釈した（水中で希釈：１０μＬ試料＋９０μＬ  Ｈ２Ｏ）。５０μＬ、１：１０希釈試料を９６の半分の領域のウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３６９０）の各ウェルに分配した。１２．５μＬ  Ｇｏｌｄ試薬混合液を各ウェルに添加し（２５％試料体積）、試料を室温で１０分間温置した。６３５ｎｍで吸収を読んだ。
【０２１８】
（ｂ）結果及び解釈
候補に対する比較結果を表２６で示す。
【０２１９】
【表３０】
2021529550.tif 000032
【０２２０】
酵素に５００μＭ  ＡＴＰを添加し、経時的にＨＰＬＣ（下に記載の方法）によりＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰの濃度を分析することによって、酵素活性を測定した。得られた反応速度曲線は、酵素定数を得るために図６のモデルとフィットさせた。酵素定数Ｋｃａｔに関して、酵素は次の順序（低活性〜高活性）：ＥＰ２８（ｗｔ）、ＥＰ１７、ＥＰ１４、ＥＰ１５を示す。
【０２２１】
図７は、ＥＰ２８に対する反応速度データ及びモデルフィットを示す。図８は、ＥＰ１４に対する反応速度データ及びモデルフィットを示す。図９は、ＥＰ１５に対する反応速度データ及びモデルフィットを示す。
【０２２２】
ＥＰ２８（ｗｔ）、ＥＰ１４、ＥＰ１５及びＥＰ１７に対する酵素定数の概要は、表２７で示す。野生型（ＷＴ）と比較して、３つの新規変異体は触媒活性の向上を示す。重要なこととして、新規変異体は、触媒速度定数（ｋｃａｔ）触媒効率（ｋｃａｔ／Ｋｍ）の明らかな上昇を示す。組織損傷及び血栓症中の、報告されるＡＴＰ及びＡＤＰ基質濃度が報告されるＫｍを上回るので、このｋｃａｔ及びｋｃａｔ／Ｋｍの上昇は、インビボでの活性がより高いと言い換えられると思われる。
【０２２３】
【表３１】
2021529550.tif 000033
【０２２４】
（２）ＨＰＬＣ検証アッセイ（反応速度及び用量反応）
（ａ）材料及び方法
ＨＰＬＣ検証アッセイで候補を試験した。ＨＰＬＣのために７０μＬの各試料をガラスバイアルに移した。
【０２２５】
表２８で示されるような保存溶液５ｍＭを用いて候補試料を調製した。
【０２２６】
【表３２】
2021529550.tif 000034
【０２２７】
１０００μＭ  ２０μＬの各保存溶液をＨＰＬＣバイアル中で混合した。
５００μＭ  ２０μＬ  １ｍＭ＋２０μＬ  Ｈ２Ｏ
１００μＭ  １０μＬ  １ｍＭ＋９０μＬ  Ｈ２Ｏ
１０μＭ  １０μＬ  １００μＭ＋９０μＬ  Ｈ２Ｏ
１μＭ  １０μＬ  １０μＭ＋９０μＬ  Ｈ２Ｏ
【０２２８】
ＣａｐＰｕｍｐ（Ｇ１３７６Ａ）、Ｄｅｇａｓｓｅｒ（Ｇ１３７９Ａ）、ＡＬＳ（Ｇ１３２９Ａ）、Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｔ（Ｇ１３３０Ｂ、ＣｏｌＣｏｍｐ（Ｇ１３１６Ａ）及びＤＡＤ（Ｇ１３１５Ａ）とともにＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  Ｓｙｓｔｅｍを使用して、ＨＰＬＣ分離を行った。溶媒Ａ：１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（０４２４３、Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ  Ｈａｅｎ）＋２ｍＭ  ＴＢＡ臭化物、ｐＨ７．０（８６８５７−１０Ｇ−Ｆ、Ｆｌｕｋａ）及び溶媒Ｂ：１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／ＡＣＮ  １／１＋２ｍＭ  ＴＢＡ臭化物、ｐＨ５．５。カラム：Ｎｕｃｌｅｏｄｕｒ  ３００−５  Ｃ１８ｅｃ、２ｘ１５０ｍｍ、５μＭ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ  ７６０１８５．２０Ｂａｔｃｈ  Ｅ１４１００２５８  ３６６５４０５５。カラム温度は４０℃、注入体積１０μＬ、流速は０．３ｍＬ／ｍｉｎであり、勾配は０−３’：０％Ｂ；３−２３’：０−９５％Ｂ、直線的；２３−２８’：９５％Ｂ、直線的；２８−２９’：９５−０％Ｂ、直線的；５’Ｐｏｓｔ  Ｔｉｍｅ”。ＤＡＤ：２４７ｎｍ及び２５９ｎｍ。
【０２２９】
Ｗａｔｅｒｓ  ＵＰＬＣ  Ｉ  ｃｌａｓｓを使用して、ＵＰＬＣ分離を行った。溶媒Ａ：１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／１０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４  １／１＋２ｍＭ  ＴＢＡ臭化物、ｐＨ７．０。溶媒Ｂ：１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／ＡＣＮ  １／１＋２ｍＭ  ＴＢＡ臭化物、ｐＨ５．５。カラム：Ｆｏｒｔｉｓ  Ｂｉｏ  Ｃ１８、２．１ｘ５０ｍｍ、５μｍ、ｄｉ２ｃｈｒｏｍ  ＢＩＯ３１８−０２０３０１  ＳＮ  Ｈ０３１６１２１０−２。カラム温度は４０℃であり、注入体積は１０μＬであり、流速は０．５ｍＬ／ｍｉｎであり、勾配は０−１’：０％Ｂ；１−８’：０−５５％Ｂ、直線的；８−１０’：５５％Ｂ；１０−１１’：５５−０％Ｂ、直線的；１４’停止時間。ＤＡＤは２４７ｎｍ及び２５９ｎｍであった。
【０２３０】
（ｂ）結果
結果は図７、８、９及び１１で見ることができ、これらは異なる実施形態による候補に対して、反応速度データ及びモデルフィットを示す。
【０２３１】
１０．実施例９：インビトロ活性、最初のスクリーニング
ＩＬ２−リーダーなし及びＩＬ２−ｓｔａｒｔなしで、哺乳動物発現ベクターｐＲＳ５ａ＿Ｌｅａｄｅｒ＿ＡＰＰ＿Ｈｉｓ（図５）において、前の実施例に記載のＣＤ３９バージョンＥＰ１〜ＥＰ２４をクローニングした。
【０２３２】
（ａ）材料及び方法
７日間にわたるＨＥＫ２９３（ＰＥＩ−遺伝子移入）におけるＥＰ−Ｈｉｔｓの小スケール発現（２０／５０ｍＬスケール）を行い、続いてＡＰＰ−ＨＰＬＣ上でＩＰＣを行った（上記のとおり）。
【０２３３】
Ｎｉ−ＮＴＡ−カラム（０．５ｍＬ  ＣＶ）での１５／４５ｍＬ細胞上清のタンパク質精製；６ＣＶ  ＩＭＡＣ  Ｂ緩衝液（２０ｍＭ  ＮａＰＯ４−緩衝液、３００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）での溶出；
ＴＢＳ、ｐＨ７．４中での精製タンパク質の濃縮及び再緩衝；
タンパク質ゲル、分析ＳＥＣでのタンパク質の分析；
全ての変異体及び３つの対照（親ｈＣＤ３９−ｄＭＩＬ又はＥＰ２８、ＩＬ２−ｓｔａｒｔあり及びなし、及び８Ｍ−バージョン、ＩＬ２−ｓｔａｒｔなし）の送達：ＴＢＳ、ｐＨ７．４中の９０〜２００ｕＬの精製タンパク質。
【０２３４】
（ｂ）結果及び解釈
結果を下の表２９でまとめる。
【０２３５】
試料は全てＴＢＳｐＨ７．４中であり、ＡＰＰ−（配列番号２４７）及びＨｉｓ−Ｔａｇ（配列番号２４９）を有する。
【０２３６】
親ヒトＣＤ３９ΔＭＩＬ（ＥＰ２８）のみが１５アミノ酸長のＩＬ２−ｓｔａｒｔ、ａａ１−１５（配列番号１３３）を有する。
【０２３７】
Ｐｉ放出アッセイＢＯＥＮＫＴＨ１−０２５２８２４、ｄｏｕｂｌｅ  ｄｅｔ。６０及び１８０分間の値。
【０２３８】
【表３３】
2021529550.tif 000035
【０２３９】
【表３４】
2021529550.tif 000036
【０２４０】
１１．実施例１０：インビトロ活性、精密なスクリーニング
２回目で１２個の突然変異体のサブセットを試験したが、ＩＬ−２  ｓｔａｒｔにより大きい発現スケールが可能となる。
【０２４１】
（ａ）材料及び方法
１５アミノ酸長のＩＬ２−ｓｔａｒｔ、ａａ１−１５付きの哺乳動物発現ベクターｐＲＳ５ａ＿Ｌｅａｄｅｒ＿ＡＰＰ＿Ｈｉｓ（配列番号１３３）（図５）。７日間にわたるＨＥＫ２９３（ＰＥＩ−遺伝子移入）におけるＥＰ−Ｈｉｔｓの小規模発現（５０／１００ｍＬスケール）に続いて、ＡＰＰ−ＨＰＬＣ上でＩＰＣを行った（上記のとおり）。
【０２４２】
Ｎｉ−ＮＴＡ−カラム（０．５ｍＬ  ＣＶ）による４５／９５ｍＬ細胞上清のタンパク質精製
６ＣＶ  ＩＭＡＣ  Ｂ緩衝液（２０ｍＭ  ＮａＰＯ４−緩衝液、３００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）で溶出
ＴＢＳ、ｐＨ７．４中での精製タンパク質の濃縮及び再緩衝
タンパク質ゲル、分析ＳＥＣでのタンパク質の分析
全ての変異体及び対照（親ｈＣＤ３９−ｄＭＩＬ又はＥＰ２８、ＩＬ２−ｓｔａｒｔ  ａａ１−１５あり（配列番号１３３））の送達：
ＴＢＳ、ｐＨ７．４中の５００μＬの精製タンパク質。
【０２４３】
（ｂ）結果及び解釈
結果を下の表３０、表３１及び表３２でまとめる。
【０２４４】
【表３５】
2021529550.tif 000037
【０２４５】
【表３６】
2021529550.tif 000038
【０２４６】
【表３７】
2021529550.tif 000039
【０２４７】
【表３８】
2021529550.tif 000040
【０２４８】
１２．実施例１１：インビボ活性、ｐＫ
（ａ）材料及び方法
インビボＰＫの場合、４匹の意識のある雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対してＰＢＳ緩衝液中の１０ｍｇ／ｍＬの最終濃度の１０ｍｇ／ｋｇ化合物を尾静脈に静脈内投与した（１ｍＬ／ｋｇ）。マウスはＷＩＧＡから入手し、体重は２２ｇ前後であった。生存中の実験は全てスイス動物福祉法の下で行った。ＰＯＣＴ  Ｍｉｎｉｖｅｔｔｅｓを使用して小体積血清チューブに、投与後０．２５、３、８、２４及び４８時間で全血を回収した（５０μＬ／時間点）。血清を分離し、濃度決定のために使用した。
【０２４９】
Ｇｙｒｏｌａｂ技術は、遠心力及びレーザー誘起蛍光検出を通じて働くアフィニティーフロースルー方式を使用した、ナノリットルスケールの自動化免疫アッセイである。Ｇｙｒｏｌａｂ  Ｂｉｏａｆｆｙ  ＣＤにおいてストレプトアビジン被覆ビーズをアフィニティーカラムに予め充填する。各ＣＤは１１２本のカラムを含有する。微細構造に対するアフィニティー捕捉カラムは１５ｎＬを含む。注入した試料は毛細管作用により入る。ビオチン化捕捉試薬は、ストレプトアビジン被覆ビーズに結合する。後で、検体溶液を注入し、それは捕捉分子に結合する。最後に、フルオロフォア標識検出試薬を適用する。ＣＤ３９の場合、ＡＰＰタグの利用可能性に依存して、２回の異なるアッセイ読み取りを使用した。
１）抗ＣＤ３９（４００３５）及び抗ＡＰＰ（２７４３１）は図１０Ａで見られる。
２）Ｆａｂ（４００３５）及び抗Ｆｃ／抗ＣＤ３９（４００４４）１：１プレミックス（全ＥＰ２８ａａ１−１６コンストラクト）は図１０Ｂで見られる。アミンカップリングによりビオチン化された場合、抗体４００４４は活性を失い、従って抗体４００３５のみをビオチン化した。
【０２５０】
１：２の希釈系列中の５％（ｖ／ｖ）マウス血清を含有するＲｅｘｘｉｐ  Ａ中でＣＤ３９コンストラクトに対する全ての標準曲線を希釈した。ＡＰＰタグ付加コンストラクトに対する適用される濃度範囲は５０００ｎｇ／ｍＬ〜９．７７ｎｇ／ｍＬであり、ＥＰ２８ａａ１−１６の場合、これは１００００ｎｇ／ｍＬ〜９．７７ｎｇ／ｍＬであった。５％（ｖ／ｖ）マウス血清を含有するＲｅｘｘｉｐ  Ａ中で全てのマウス血清試料を１：１００希釈した。５％（ｖ／ｖ）マウス血清を含有するＲｅｘｘｉｐ  Ａ中でＣＤ３９コンストラクトのＱＣ試料を希釈した（ＡＰＰタグ付きのコンストラクトに対して５０及び５００ｎｇ／ｍＬ及びＥＰ２８ａａ１−１６に対して５００及び１０００ｎｇ／ｍＬ）。全てのビオチン化捕捉試薬に対する最終濃度は０．１ｍｇ／ｍＬであり、蛍光標識検出抗体をＲｅｘｘｉｐ  Ｆ中で１０ｎＭに希釈した。
【０２５１】
（ｂ）結果及び解釈
結果を表３４でまとめる。見られ得るように、全ての候補が同じＰＫを示す。従って候補の選択はＰＫ特性に基づかなかった。
【０２５２】
【表３９】
2021529550.tif 000041
【０２５３】
１３．実施例１２：インビボ活性、ＡＫＩモデル
（ａ）材料及び方法
Ｉ／Ｒ設定の開始前に右腎臓の腎摘除術を行う。全体的な生体のダイナミクスを変化させる代償機序を避けるために第２の腎臓を摘出した。自発呼吸する麻酔動物を恒温性監視システムの恒温性ブランケット上に置き、滅菌ガーゼで被覆する。低体温を回避するために、直腸プローブを通じて体温を記録し、３６．５〜３７．５℃の範囲で調節する。動物に麻酔をかけ、剃毛し、消毒する（Ｂｅｔａｓｅｐｔｉｃ）。正中線切開／開腹手術後に、腹部の内容物を左に寄せ、右腎臓を摘出する。尿管及び血管を連絡切断し、結紮し（９−０Ｅｔｈｉｃｏｎ）、次いで腎臓を摘出する。
【０２５４】
Ｉ／Ｒ傷害誘発：右腎臓の腎摘除術直後に、腹部内容物を右に寄せ、腎臓虚血誘導のために左腎臓動脈を切り離す。
【０２５５】
腎臓への血流を阻止し、腎臓虚血を誘発するために、微細動脈瘤クリップを使用して椎弓根をクランプする。腎臓虚血の持続時間は、クランプ処理の時間から開始する。腎臓の色が数秒で赤から暗紫色に変化することにより虚血の成功を確認する。虚血後、微細動脈瘤クリップを外し、腎臓の色が赤に変化することによって再灌流が示される。
【０２５６】
（ｂ）結果及び解釈
結果は図１２で見られる。候補は、それらの特異的なインビトロ活性と相関するインビボでの用量反応を示す。図１２Ａは親ＥＰ２８に対する結果を示し、図１２ＢはＥＰ１ｘＥＰ１７に対する結果を示し、図１２ＣはＥＰ１４に対する結果を示す。見られ得るように、ＥＰ２８及びＥＰ１ｘＥＰ１７は同様の用量反応を示し、一方でインビトロ活性がより高いＥＰ１４は、より低い用量で十分な効果を示す。
【０２５７】
１４．実施例１３：タイター、収率及び開発可能性
商業的規模で選択候補を製造するために、比較的高収率でそれらを発現可能であることが重要である。治療用タンパク質の場合、これは、高産生クローンの選択を可能にする濃縮技術の欠如に加えて方式が複雑であるために、治療用抗体と比較してあまり容易ではない可能性がある。
【０２５８】
両候補、ＥＰ１４ａａ１−３及びＥＰ２８ａａ１−３は、同等な技術的特徴を有し、これは非常に困難であった。特に、早期発現バッチの低発現タイター（データは示さない）は、生産コストに影響を与えるか、又は宿主細胞タンパク質の制御が堅固ではないので、規模拡大後にさらにより低くなり得る。
【０２５９】
両候補に対する早期クローン選択によってタンパク質発現を改善しようとするために、必要とされる個々に適した精製工程が必要であった。この目的に対して、候補ＥＰ２８ａａ１−３及びＥＰ１４ａａ１−３を発現する細胞のプールを作製した。
【０２６０】
ＥＰ２８ａａ１−１６／ＥＰ１４ａａ１−３発現細胞株の産生のための宿主細胞株として親ＣＨＯ細胞株を使用した。宿主細胞株は、例えば両方ともそれらの全体において参照により組み込まれる特許出願、国際公開第２０１５０９２７３７号パンフレット及び同第２０１５０９２７３５号パンフレットに記載されるような、当業者にとって周知のＣＨＯ−Ｋ１細胞株由来である。ＥＰ２８ａａ１−１６／ＥＰ１４ａａ１−３組み換え細胞株を調製するためにＣＨＯ株からの単一バイアルを使用した。
【０２６１】
化学的に定義される培地中で細胞を増殖させた。１μｇのＳｗａＩで線状化したプラスミドＤＮＡ、ＥＰ２８ａａ１−１６／ＥＰ１４ａａ１−３をコードする発現ベクターを遺伝子移入につき添加した。化学的に定義された培地中で遺伝子移入反応を行った。
【０２６２】
製造者の説明書に従い、ＡＭＡＸＡ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒを使用して、エレクトロポレーションにより遺伝子移入を行った。遺伝子移入のために使用する親ＣＨＯ細胞は、指数増殖期であり、細胞生存能は９５％を超えた。全部で、細胞５ｘ１０６個／遺伝子移入を使用して３回の遺伝子移入を行った。遺伝子移入の直後に、科学的に定義された培地を含有する振盪フラスコに細胞を移した。
【０２６３】
選択工程の開始前に３６．５℃及び１０％ＣＯ２で細胞プールを４８時間温置した。発現ベクター中でコードされる選択マーカーを使用して、選択手順を行った。遺伝子移入及び低葉酸条件下での増殖の４８時間後に、化学的に定義された培地に１０ｎＭ  ＭＴＸを添加することによって、さらなる選択圧をかけた。ＭＴＸ選択開始から２１日後に、主にＭＴＸ耐性細胞からなるプール集団が出現した。プール後、回収細胞を凍結した。ＥＰ２８ａａ１−１６／ＥＰ１４ａａ１−３の濃度の決定のために、化学的に定義された培地中での標準的な流加培養を設定した。生成物濃度を決定するために、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）を使用した。個別化されたクローン細胞株を得るためのＦＡＣＳ単細胞選別／細胞プリンター手順用に、ＥＰ２８ａａ１−１６／ＥＰ１４ａａ１−３を産生するＣＨＯ細胞プールを使用した。
【０２６４】
１５．実施例１４：治療用途
Ｐ２Ｘ７Ｒを活性化する細胞外ＡＴＰは、移植片対宿主疾患を促進するなど、いくつかの疾患と明らかに関連している（Ｗｉｌｈｅｌｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｓ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｂｙ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ＡＴＰ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｐ２Ｘ７Ｒ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １６：１２，ｐａｇｅｓ  １４３４−１４３９（２０１０））。
【０２６５】
さらに、インビトロ及びインビボ試験の両方から、ＡＤＰのレベルを調節することによりＣＤ３９が心血管系の健康において重要なアピラーゼに相当することが示される。アピラーゼは、細胞外ＡＤＰを代謝することによって血小板凝集を阻害することが知られている。
【０２６６】
ヒトアピラーゼは、血小板上でＡＤＰ受容体に不可逆的に結合するクロピドグレル（Ｐｌａｖｉｘ（商標））のような他の治療薬とは対照的に、血小板と共有結合しない。これにより、治療的阻害のより速やかな消失、従って血小板活性化が過剰である患者に対するより安全なアプローチが可能になる。これは、血小板活性化が過剰である患者に対してより安全なアプローチを提供する。
【０２６７】
従って、本発明による化合物など、細胞外ＡＴＰのレベルを低下させる化合物の治療用途のための明らかな根拠がある。
【０２６８】
本発明による化合物の治療用途の具体的な非限定例は、外傷及び／又は低酸素による急性臓器障害、例えば急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、肺傷害など、腎不全、急性腎臓傷害（ＡＫＩ）（冠動脈バイパス移植手術後の急性腎臓傷害を含む）、腎臓又は他の固形臓器の移植（異種移植を含む）後の臓器移植後臓器機能障害又は血管疾患、例えば閉塞性血管疾患など、移植及び異種移植、次のものに罹患している個体の処置：卒中発作、冠動脈疾患又は心筋梗塞から起こる傷害、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、塞栓症、子癇前症、血管形成術、血管傷害、移植、新生児低酸素性虚血性脳症、血小板関連虚血障害（肺虚血、冠動脈虚血及び脳虚血を含む）、虚血再灌流傷害（ＩＲＩ）血栓障害（冠動脈血栓症、大脳動脈血栓症、心臓内血栓症、末梢動脈血栓症及び静脈血栓症を含む）、腎臓又は他の固形臓器の移植（異種移植を含む）後の臓器移植後臓器機能障害、である。本発明による化合物の治療用途の他の非限定例は、火傷又は放射線による損傷、敗血症の処置、創傷治癒改善、出血若しくは出血リスクの軽減、臓器障害、移植片対宿主疾患の予防又は移植拒絶の予防である。
【０２６９】
本発明による化合物の特に好ましい治療用途は、急性腎臓傷害（ＡＫＩ）、例えば冠動脈バイパス移植術後の急性腎臓傷害又は敗血症又は横紋筋融解症である。この状態は、患者死亡率を上昇させ、標準治療（ＳｏＣ）がない。集中治療ユニットにおけるＡＫＩの主要な原因は、敗血症（４７．５％）、大手術（３４％）、心原性ショック（２７％）、血液量減少（２６％）及び腎毒性化合物（１９％）である。さらにＡＫＩは、慢性腎臓病（ＣＫＤ）の発症に対する独立した強いリスク因子である。大きな心臓手術患者の２０〜３０％は急性腎臓傷害になる。別の好ましい実施形態は、心臓手術に関連する急性腎臓傷害の処置のための本発明による単離アピラーゼの使用に関する。
【０２７０】
別の実施形態では、本開示は、臓器移植後臓器機能障害（ＤＧＦ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、外傷性脳傷害（ＴＢＩ）／急性虚血性発作（ＡＩＳ）又は多臓器不全（ＭＯＦ）と呼ばれることが多いそれらの組み合わせの処置での使用のための本発明による単離アピラーゼに関する。
【０２７１】
１６．急性腎臓傷害（ＡＫＩ）は敗血症の一般的な合併症である。敗血症患者の２８％がＡＫＩになる。さらなる好ましい実施形態では、本開示は、敗血症に付随する急性腎臓傷害の処置のための本発明による単離アピラーゼの使用に関する。
【０２７２】
実施例１５：治療組成物
治療用タンパク質は一般的に、即時投与の水性形態で又は投与前の適切な希釈剤での再構成用の凍結乾燥物としての何れかで処方される。タンパク質は、例えばプレフィルドシリンジ中で、凍結乾燥物として、又は水性組成物としての何れかで処方され得る。
【０２７３】
適切な処方物は、患者への送達のための、水性医薬組成物又は、治療用タンパク質有効成分が高濃度であり、タンパク質凝集が低レベルである溶液を与えるために再構成され得る凍結乾燥物を提供し得る。高濃度のタンパク質は、患者に送達しなければならない物質の量（用量）を低下させるので有用である。投与体積を小さくすることにより、患者に固定用量を送達するために要する時間が抑えられる。高濃度タンパク質を伴う本発明の水性組成物は皮下投与に特に適切である。
【０２７４】
従って、本発明は、例えば皮下投与のための、治療用タンパク質を含む、対象での投与に適切な水性医薬組成物を提供する。
【０２７５】
薬学的に許容可能な担体と組み合わせた場合、医薬組成物として治療用タンパク質を使用し得る。このような組成物は、治療用タンパク質に加えて、担体、様々な希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定化剤、可溶化剤及び当技術分野で周知の他の物質を含有し得る。担体の特徴は投与経路に依存する。開示される方法での使用のための医薬組成物は、特定の標的障害の処置のためのさらなる治療剤も含有し得る。
【０２７６】
１７．実施例１６：投与経路
一般的には、本発明によるタンパク質は、注射により、例えば静脈内、腹腔内又は皮下の何れかで投与される。この投与を遂行するための方法は当業者にとって公知である。局所若しくは経口投与され得るか又は粘膜を横断して通過可能であり得る組成物を得ることも可能であり得る。当業者により認識されるように、特定の選択された投与経路に適切なように、投与するための何らかの適切な投与のための手段を使用し得る。
【０２７７】
可能な投与経路の例としては、非経口（例えば静脈内（Ｉ．Ｖ．又はＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、皮内、皮下（Ｓ．Ｃ．又はＳＣ）又は点滴）、経口及び肺（例えば吸入）、鼻腔、経皮（局所）、経粘膜、動脈内、連続点滴及び直腸投与が挙げられる。非経口、皮内又は皮下適用のために使用される溶液又は懸濁液は、次の構成成分：滅菌希釈剤、例えば注射用の水、食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒など；抗菌剤、例えばベンジルアルコール又はメチルパラベンなど；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなど；キレート剤、例えばエチレンジアミンテトラ酢酸など；緩衝液、例えば酢酸、クエン酸又はリン酸など、及び等張性の調整のための薬剤、例えば塩化ナトリウム又はデキストロースなどを含み得る。酸又は塩基、例えば塩酸又は水酸化ナトリウムなどでｐＨを調整し得る。非経口製剤は、ガラス又はプラスチック製の、アンプル、使い捨てシリンジ又は複数回投与バイアル中に封入され得る。
【０２７８】
治療を必要とする対象への本発明によるタンパク質の「負荷用量」を投与することによって、アピラーゼ療法を開始し得る。「負荷用量」は、対象に投与される本発明によるタンパク質の初回用量を意図し、ここで、投与される本発明によるタンパク質の用量はより高い用量範囲内に入る。「負荷用量」は、単回投与、例えばタンパク質がＩＶ投与される場合は単回点滴として、又は、完全な「負荷用量」が約２４時間の期間内（又は、疾患の重症度に基づき、複数回静脈内投与が必要な場合は最初の月内）に投与される限り、複数回投与として、例えばタンパク質がＩＶ投与される場合は複数回点滴として、投与され得る。「負荷用量」の投与後、次に本発明によるタンパク質の１回以上のさらなる治療的有効用量を対象に投与する。例えば毎週投与するスケジュール又は２週間ごとに１回、３週間ごとに１回若しくは４週間ごとに１回の投与に従い、後続の治療的有効用量を投与し得る。このような実施形態では、後続の治療的有効用量は一般に、より低い用量範囲内に入る。
【０２７９】
或いは、いくつかの実施形態では、「負荷用量」後、本発明によるタンパク質の後の治療的有効用量は、「維持スケジュール」に従い投与され、本発明によるタンパク質の治療的有効用量は、１か月に１回、６週間ごとに１回、２か月ごとに１回、１０週間ごとに１回、３か月ごとに１回、１４週間ごとに１開、４か月ごとに１回、１８週間ごとに１回、５か月ごとに１回、２２週間ごとに１回、６か月ごとに１回、７か月ごとに１回、８か月ごとに１回、９か月ごとに１回、１０か月ごとに１回、１１か月ごとに１回又は１２か月ごとに１回投与される。このような実施形態では、本発明によるタンパク質の治療的有効用量は、特により頻繁な間隔で、例えば２週間ごとに１回〜１か月に１回、後続用量が投与される場合はより低い用量範囲内に入るか、又は、特に後続用量がより少ない頻度の間隔で投与される場合、例えば続く用量が１か月〜１２か月離して投与される場合はより高い用量範囲内に入る。
【０２８０】
投与のタイミングは一般に、活性化合物の最初の投与日から測定され、これは「ベースライン」としても知られる。しかし、医療提供者によって異なる命名の慣習を使用する。
【０２８１】
注目すべきこととして、第０週は、一部の医療提供者により第１週と呼ばれ得、一方で第０日は、一部の医療提供者によって第１日と呼ばれ得る。従って、医師によっては、例えば第３週中／第２１日に、第３週中／第２２日に、第４週中／第２１日に、第４週中／第２２日に与えられるような用量と呼ぶ可能性があり、一方で同じ投与スケジュールを指す。一貫性を保つために、投与の最初の週は本明細書中では第０週と呼び、一方で投与の最初の日を第１日と呼ぶ。しかし、この命名の慣例は単に一貫性のために使用され、限定するものと解釈すべきではなく、即ち毎週の投与は、医師が特定の週を「第１週」又は「第２週」と呼ぶか否かにかかわらないタンパク質の週用量の提供であることを当業者は理解するであろう。本明細書中で述べられるような投与レジメの例は図１及び２で見られる。正確な時間点で用量が提供される必要がなく、例えば適切な週にそれが提供される限り、およそ第２９日での用量が例えば第２４日〜第３４日に、例えば第３０日に提供され得ることが理解されるであろう。
【０２８２】
本明細書中で使用される場合、「［指定される用量］の送達を可能にするためのタンパク質の十分量を有する容器」という句は、ある種の容器（例えばバイアル、ペン、シリンジ）がそこに、所望の用量を提供するために使用され得るタンパク質（例えば医薬組成物の一部として）の体積を配置していることを意味するために使用される。例として、所望の用量が５００ｍｇである場合、臨床家は、２５０ｍｇ／ｍＬの濃度のタンパク質処方物を含有する容器から２ｍＬ、５００ｍｇ／ｍＬの濃度のタンパク質処方物を含有する容器から１ｍＬ、１０００ｍｇ／ｍＬの濃度のタンパク質処方物を含有する容器から０．５ｍＬなどを使用し得る。それぞれのこのような場合、これらの容器は、所望の５００ｍｇ用量の送達を可能にするためのタンパク質の十分量を有する。
【０２８３】
本明細書中で使用される場合、「［指定用量］の［投与経路］送達を可能にするための投与量で処方される」という句は、指定の投与経路（例えばｓ．ｃ．又はｉ．ｖ．）を介してタンパク質の所望の用量を提供するためにある種の医薬組成物が使用され得ることを意味するために使用される。例として、所望の皮下用量が５００ｍｇである場合、臨床家は、２５０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する２ｍＬのタンパク質処方物、５００ｍｇ／ｍＬの濃度を有する１ｍＬのタンパク質処方物、１０００ｍｇ／ｍＬの濃度を有する０．５ｍＬのタンパク質処方物などを使用し得る。それぞれのこのような場合において、これらのタンパク質処方物は、本タンパク質の皮下送達を可能にするのに十分に高い濃度である。皮下送達は一般に、約２ｍＬ未満の体積、好ましくは約１ｍＬ以下の体積の送達を必要とする。しかし、例えばパッチ／ポンプ機序を使用して経時的により大きな体積が送達され得る。
【０２８４】
患者における組織損傷処置用の薬剤の製造のためのタンパク質の使用が本明細書中で開示され、この薬剤は、容器を含むように処方され、各容器は、少なくとも約７５ｍｇ、１５０ｍｇ、３００ｍｇ又は６００ｍｇタンパク質／単位用量の送達を可能とするためのタンパク質の十分な量を有する。
【０２８５】
患者における組織損傷処置用の薬剤の製造のためのタンパク質の使用が本明細書中で開示され、この薬剤は、６００ｍｇのうち７５ｍｇ、１５０ｍｇ、３００ｍｇのタンパク質／単位用量で全身送達（例えばｉ．ｖ．又はｓ．ｃ．送達）することを可能にするための投与量で処方される。
【０２８６】
１８．実施例１７：キット
本開示は、（場合に応じて）タンパク質で組織損傷がある患者を処置するためのキットも包含する。このようなキットは、タンパク質（例えば液体又は凍結乾燥形態）又はこのタンパク質（上記）を含む医薬組成物を含む。さらに、このようなキットは、本タンパク質を投与するための手段（例えばシリンジ及びバイアル、プレフィルドシリンジ、プレフィルドペン、パッチ／ポンプ）及び使用説明書を含み得る。この説明書は、具体的な投与計画の一部として患者にタンパク質を提供することを開示し得る。これらのキットは、例えば開示されるタンパク質と組み合わせた送達のために、乾癬を処置するためのさらなる治療剤（上記）も含有し得る。
【０２８７】
「投与するための手段」という句は、プレフィルドシリンジ、バイアル及びシリンジ、注射ペン、自動注入装置、ｉ．ｖ．点滴及びバッグ、ポンプ、パッチ／ポンプなどを含むが限定されない、患者に薬物を全身投与するための何らかの利用可能な装備を示すために使用される。このような物品を使用して、患者は、薬物を自分で投与（即ち自分自身のために薬物を投与）し得るか、又はケア提供者若しくは医師が薬物を投与し得る。
【０２８８】
ａ）タンパク質の治療的有効量を含む医薬組成物；ｂ）患者に本タンパク質を投与するための手段；及びｃ）それを必要とする患者にタンパク質を皮下投与することを提供する説明書を含む、組織損傷を有する患者の処置のためのキットが本明細書中で開示される。
【０２８９】
配列表
本発明を実施するための有用なアミノ酸及びヌクレオチド配列を表３５で開示する。
【０２９０】
【表４０】
2021529550.tif 000042
【０２９１】
【表４１】
2021529550.tif 000043
【０２９２】
【表４２】
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【０２９３】
【表４３】
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【０２９４】
【表４４】
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【０２９５】
【表４５】
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【０２９６】
【表４６】
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【０２９７】
【表４７】
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【０２９８】
【表４８】
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【０２９９】
【表４９】
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【０３００】
【表５０】
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【０３０１】
【表５１】
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【０３０２】
【表５２】
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【０３０３】
【表５３】
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【０３０４】
【表５４】
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【０３０５】
【表５５】
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【０３０６】
【表５６】
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【０３０７】
【表５７】
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【０３０８】
【表５８】
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【０３０９】
【表５９】
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【０３１０】
【表６０】
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【０３１１】
【表６１】
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【０３１２】
【表６２】
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【０３１３】
【表６３】
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【０３１４】
【表６４】
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【０３１５】
【表６５】
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【０３１６】
【表６６】
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【０３１７】
【表６７】
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【０３１８】
【表６８】
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【０３１９】
【表６９】
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【０３２０】
【表７０】
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【０３２１】
【表７１】
2021529550.tif 000073
【０３２２】
【表７２】
2021529550.tif 000074
【０３２３】
【表７３】
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【０３２４】
【表７４】
2021529550.tif 000076
【０３２５】
【表７５】
2021529550.tif 000077
【０３２６】
【表７６】
2021529550.tif 000078
【０３２７】
【表７７】
2021529550.tif 000079
【０３２８】
【表７８】
2021529550.tif 000080
【０３２９】
【表７９】
2021529550.tif 000081
【０３３０】
【表８０】
2021529550.tif 000082
【０３３１】
【表８１】
2021529550.tif 000083
【０３３２】
【表８２】
2021529550.tif 000084
【０３３３】
【表８３】
2021529550.tif 000085
【０３３４】
【表８４】
2021529550.tif 000086
【０３３５】
【表８５】
2021529550.tif 000087
【０３３６】
【表８６】
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【０３３７】
【表８７】
2021529550.tif 000089
【０３３８】
【表８８】
2021529550.tif 000090
【０３３９】
【表８９】
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【０３４０】
【表９０】
2021529550.tif 000092
【０３４１】
【表９１】
2021529550.tif 000093
【０３４２】
【表９２】
2021529550.tif 000094
【０３４３】
【表９３】
2021529550.tif 000095
【０３４４】
【表９４】
2021529550.tif 000096
【０３４５】
【表９５】
2021529550.tif 000097
【０３４６】
【表９６】
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【０３４７】
【表９７】
2021529550.tif 000099
【０３４８】
【表９８】
2021529550.tif 000100
【０３４９】
【表９９】
2021529550.tif 000101
【０３５０】
【表１００】
2021529550.tif 000102
【０３５１】
【表１０１】
2021529550.tif 000103
【０３５２】
【表１０２】
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【０３５３】
【表１０３】
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【０３５４】
【表１０４】
2021529550.tif 000106
【０３５５】
【表１０５】
2021529550.tif 000107
【０３５６】
【表１０６】
2021529550.tif 000108
【０３５７】
【表１０７】
2021529550.tif 000109
【０３５８】
【表１０８】
2021529550.tif 000110
【０３５９】
【表１０９】
2021529550.tif 000111
【０３６０】
【表１１０】
2021529550.tif 000112
【０３６１】
【表１１１】
2021529550.tif 000113
【０３６２】
【表１１２】
2021529550.tif 000114
【０３６３】
【表１１３】
2021529550.tif 000115
【０３６４】
【表１１４】
2021529550.tif 000116
【０３６５】
【表１１５】
2021529550.tif 000117
【０３６６】
【表１１６】
2021529550.tif 000118
【０３６７】
【表１１７】
2021529550.tif 000119
【０３６８】
【表１１８】
2021529550.tif 000120
【０３６９】
【表１１９】
2021529550.tif 000121
【０３７０】
【表１２０】
2021529550.tif 000122
【０３７１】
【表１２１】
2021529550.tif 000123
【０３７２】
【表１２２】
2021529550.tif 000124
【０３７３】
【表１２３】
2021529550.tif 000125
【０３７４】
【表１２４】
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【０３７５】
【表１２５】
2021529550.tif 000127
【０３７６】
【表１２６】
2021529550.tif 000128
【０３７７】
【表１２７】
2021529550.tif 000129
【０３７８】
【表１２８】
2021529550.tif 000130
【０３７９】
【表１２９】
2021529550.tif 000131
【０３８０】
【表１３０】
2021529550.tif 000132
【０３８１】
【表１３１】
2021529550.tif 000133
【０３８２】
【表１３２】
2021529550.tif 000134
【０３８３】
【表１３３】
2021529550.tif 000135
【０３８４】
【表１３４】
2021529550.tif 000136
【０３８５】
【表１３５】
2021529550.tif 000137
【０３８６】
【表１３６】
2021529550.tif 000138
【０３８７】
【表１３７】
2021529550.tif 000139
【０３８８】
【表１３８】
2021529550.tif 000140
【０３８９】
【表１３９】
2021529550.tif 000141
【０３９０】
【表１４０】
2021529550.tif 000142
【図１】
2021529550.tif 000143
【図２】
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【図３】
2021529550.tif 000145
【図４】
2021529550.tif 000146
【図５】
2021529550.tif 000147
【図６】
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【図７】
2021529550.tif 000149
【図８】
2021529550.tif 000150
【図９】
2021529550.tif 000151
【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
2021529550.tif 000153
【図１１】
2021529550.tif 000154
【図１２Ａ】
2021529550.tif 000155
【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
2021529550.tif 000157
【配列表】
2021529550000001.app
【国際調査報告】
2021529550.tif 000158
2021529550.tif 000159
2021529550.tif 000160
2021529550.tif 000161
2021529550.tif 000162