(57)【要約】  表現型についての抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）の文脈における、微生物同定（ＩＤ）のための、システム及び方法。複数菌試料を、迅速に同定するための手法であって、少なくとも１つの選択培地を含む、２種以上の異なる培地中の、試料のインキュベーション後において、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、ＰＣＲ又はＤＮＡハイブリダイゼーションなど、１種以上の同定法を実施する手法が導入される。試料から、ＡＳＴの結果までの時間を短縮し得る、並行的同定及びＡＳＴワークフローが提供される。
2021531000.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者試料が、単一菌試料であるか複数菌試料であるかを評価するための方法であって、
選択／鑑別増殖パネル（ＳＤＧＰ）に、試料を接種するステップであり、ＳＤＧＰが、第１の増殖培地及び第２の増殖培地を含み、（ａ）第１の増殖培地及び第２の増殖培地が、鑑別増殖培地又は選択増殖培地であり、（ｂ）各選択増殖培地が、（ｉ）微生物のサブセットの増殖を促進するのに適した１種以上の化合物、及び／又は（ｉｉ）微生物のサブセットの増殖を阻害する１種以上の化合物を含み、（ｃ）各鑑別増殖培地が、微生物の群により発現する酵素の基質を含み、（ｄ）酵素により触媒された基質の反応が、反応生成物をもたらすステップ；
ＳＤＧＰを、微生物の増殖に適した条件下においてインキュベートするステップ；
第１の副次試料及び第２の副次試料を、ＳＤＧＰの第１の選択増殖培地及び第２の選択増殖培地のそれぞれから選択するステップ；
各副次試料について、少なくとも１種のアッセイを実施して、選択増殖培地、基質及び反応生成物において存在する、微生物の１種以上を検出するステップ；
各副次試料について、微生物、基質及び／又は反応生成物の検出に基づき、副次試料中に存在する微生物種を同定するステップ；
副次試料のそれぞれに存在する、微生物種の群を比較して、試料が、単一菌試料であるか複数菌試料であるかを決定するステップ、並びに
任意選択的に、使用者に、試料が単一菌試料又は複数菌試料であると報告するステップ
を含む方法。
【請求項２】
使用者に、少なくとも１つの副次試料中に存在する微生物種を報告するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
選択増殖培地又は鑑別増殖培地の少なくとも１種が、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）又はこの断片を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＩｇＧ又はこの断片が、１種以上の光学標識を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
コアグラーゼアッセイを実施するステップと、コアグラーゼアッセイの結果、並びに選択及び／又は鑑別培地に由来する結果に基づき、試料が、単一菌試料であるか複数菌試料であるかを決定するステップとをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＳＤＧＰが、最小で、４つ、６つ、８つ、１０、１２、１４、１６、１８、２０のリザーバーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＳＤＧＰ上の１つ以上のリザーバーが、非選択培地を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
試料について実施されたグラム染色が陽性である場合に、第１のＳＤＧＰが使用され、グラム染色が陰性である場合に、第２のＳＤＧＰが使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つのＳＤＧＰリザーバーが、少なくとも１種のプローブ化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
プローブ化合物が、表面結合剤、ロックト核酸、ペプチド核酸、他の蛍光インサイチューハイブリダイゼーションプローブを含むがこれらに限定されない、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
プローブが、１種以上の光学標識を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
微生物を同定するアッセイが、第１の副次試料及び第２の副次試料について質量スペクトルを生成するステップ、及び質量スペクトルを、微生物についての標準的な質量スペクトルの１つ以上のライブラリーと比較するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
質量スペクトルを生成するステップが、以下：飛行時間（ＴＯＦ）検出器、質量分析器としての静電セクター及び／又は磁気セクター、四重極質量分析器並びにイオントラップの１種以上を利用する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
質量スペクトルを生成するステップが、以下のイオン化源：化学的イオン化、プラズマ放電及びグロー放電、電子衝撃、エレクトロスプレーイオン化、脱離エレクトロスプレーイオン化、高速原子衝撃、電界イオン化、レーザーイオン化、液体抽出表面解析、マトリックス支援レーザー脱離イオン化の１種以上を利用する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
質量スペクトルを生成するステップが、副次試料を、ＳＤＧＰのリザーバーから、マトリックス支援レーザー脱離イオン化ＴＯＦ質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）のためのプレートにスポッティングし、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを実施し、これにより、質量スペクトルを生成することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
スポッティング及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦが、自動化装置又は半自動化装置により実施される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
質量スペクトルの解析が、微生物のタンパク質及び／又は糖脂質を反映する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
質量スペクトルの解析が、イメージングを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
１つ以上のＳＤＧＰリザーバー内に含まれる１種以上のプローブ化合物が、質量分析により同定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
微生物が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ標的上のスポッティングの前に濃縮される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
微生物が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ標的上のスポッティングの前に、遠心分離により濃縮される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
微生物が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ標的上のスポッティングの前に、ペレットへと濃縮される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ標的上のスポッティングの前に、１回以上の洗浄ステップが実施される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
吸光度、蛍光、発光、時間ゲート発光を含む、ＳＤＧＰリザーバーの、１種以上の光学的測定が実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
１種以上の光学的測定が、洗浄の前及び／又は後に実施される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦが実施される前に、１種以上の生化学アッセイが、第１の選択／鑑別増殖培地中又は第２の選択／鑑別増殖培地中において実施される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦが、１種以上の耐性マーカーの存在を決定するのに使用される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
耐性マーカーが、非選択培地及び／又は抗菌剤含有培地に由来する微生物から決定される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
質量スペクトルを生成するステップが、気体クロマトグラフ及び／又は液体クロマトグラフを、質量分析の前に、試料分離のために利用することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項３０】
微生物種が、細菌、真菌、原生動物及び／又は古細菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
微生物種が、以下：エスケリキア属種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．）、エンテロコッカス属種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、スタフィロコッカス属種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、クレブシエラ属種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、アシネトバクター属種（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）、エンテロバクター属種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、ストレプトコッカス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、プロテウス属種（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｓｐｐ．）、シトロバクター属種（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、モルガネラ属種（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、アエロコッカス属種（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、アエロモナス属種（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）、アクロモバクター属種（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、アクチノマイセス属種（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、バシルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、バルトネラ属種（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ボルデテラ属種（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ブルセラ属種（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ブルクホルデリア属種（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐｐ．）、カンピロバクター属種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、クラミジア属種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐｐ．）、クラミドフィラ属種（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｓｐｐ．）、クロストリジウム属種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．）、コリネバクテリウム属種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、エーリキア属種（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．）、フランシセラ属種（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ガルデネレラ属種（Ｇａｒｄｅｎｅｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ヘモフィリウス属種（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｕｓ  ｓｐｐ．）、ヘリコバクター属種（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、ラクトバシルス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、レジオネラ属種（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、レプトスピラ属種（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐｐ．）、リステリア属種（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｐｐ．）、マイコバクテリウム属種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、マイコプラズマ属種（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．）、ナイセリア属種（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐｐ．）、ノカルディア属種（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｓｐｐ．）、パスツレラ属種（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、プロビデンシア属種（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｓｐｐ．）、リケッツィア属種（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓｐｐ．）、ラウルテラ属種（Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、サルモネラ属種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、セラチア属種（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐｐ．）、シゲラ属種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ステノトロホモナス属種（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）、トレポネマ属種（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｐｐ．）、ウレアプラズマ属種（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．）、ビブリオ属種（Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐｐ．）、エルシニア属種（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｓｐｐ．）及びこれらの組合せの１つ以上をさらに含む、請求項３０に��載の方法。
【請求項３２】
微生物種が、エンテロバクテリアセエ科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ  ｆａｍｉｌｙ）のメンバーをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
真菌が、カンジダ属種（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．）、イッサチェンキア属種（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ  ｓｐｐ．）、ブラストマイセス属種（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、コッキジオイデス属種（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｓｐｐ．）、アスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、クリプトコッカス属種（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、ヒストプラズマ属種（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．）、ニューモシスチス属種（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐｐ．）、スタキボトリス属種（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｓｐｐ．）、スポロトリックス属（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ）、エクセロイラム属（Ｅｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍ）、クラドスポリウム属（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）、リングワーム、ムコルマイセテス及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
患者試料が、以下：血液試料、尿試料、脳脊髄液試料、滑液試料、吸引物試料、洗浄液試料、創傷スワブ試料又は呼吸器試料の１種以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
患者試料が、ＳＤＧＰへの接種の前に培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
ＳＤＧＰが、単一の消耗材上に、２つ以上の独立のリザーバーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
ＳＤＧＰリザーバーが、ロボット式液体取扱い機により接種される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ロボット式液体取扱い機が、ＳＤＧＰリザーバー及び抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）パネルの、１つ以上のリザーバーの両方に接種する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ＳＤＧＰリザーバーと、ＡＳＴリザーバーとが、同じ消耗材上に含まれる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
２つ以上の同じＳＤＧＰリザーバーが、消耗材上に存在するために、２つ以上の患者試料が、この消耗材に接種され得る、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
アッセイが、ＳＤＧＰのインキュベーション後において、微生物の核酸配列を同定するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
アッセイが、核酸をシーケンシングするステップ、プローブを核酸とハイブリダイズさせるステップ、又は酵素により触媒される反応を核酸に対して実施するステップを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ＳＤＧＰ培地中の、微生物のインキュベーションが、１〜１０時間、２〜８時間、３〜７時間、４〜６時間の間にわたり実施される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
各選択培地が、ストレプトコッカス属濃縮ブロス、フレーザーブロス、ジオリッティ−カントーニブロス、ストレプトコッカス・フェカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）培地、ラウリル硫酸ナトリウム、亜テルル酸塩及び表１に列挙された培地からなる群から選択される、１種以上の培地から構成された、請求項１に記載の方法。
【請求項４５】
ＳＤＧＰの各鑑別リザーバーが、インドール試験、メチルレッド試験、フォーゲス−プロスカウエル（ＶＰ）試験、クエン酸塩利用（ＣＲＴ）試験及び選択的糖発酵試験［例えば、グルコース（ＭＲＧ）、セロビオース（ＭＲＣ）、ラクトース（ＭＲＬ）、マンニトール（ＭＲＭＴＬ）、マンノース（ＭＲＭＮＳ）、ラフィノース（ＭＲＲ）、スクロース（ＭＲＳＵ）、トレハロース（ＭＲＴ）、キシロース（ＭＲＸ）、ズルシトール（ＭＲＤ）、アドニトール（ＭＲＡＤ）、イノシトール（ＭＲＩ）、ソルビトール（ＭＲＳＯＲ）、アラビノース（ＭＲＡＲＢ）、マルトース、アルファ−メチル−Ｄ−グルコシド（ＭＲＡＭＧ）、エリトリトール（ＭＲＥ）、メリビオース（ＭＲＭＥＬ）、アラビトール、グリセロール（ＭＲＧＬＹ）及び／又はムコ酸塩（ＭＲＭＵＣ）の発酵試験］、クエン酸塩低減試験（ＣＲＴ）；フェニルアラニンデアミナーゼ試験（ＰＨＤ）；硫化水素の検出を伴う、又は伴わないＴＳＩ（ｔｒｉｐｌｅ  ｓｕｇａｒ  ｉｒｏｎ）；ウレアーゼ試験；リジン（ＤＣＬ）、オルニチン（ＤＣＯ）、アルギニン（ＤＣＡ）を使用する、脱カルボキシル化試験；マロン酸塩、酢酸塩及び／又は酒石酸塩の利用；ゼラチン加水分解試験；エスクリン加水分解試験；リパーゼ試験；ＤＮアーゼ試験；シアン化カリウム（ＫＣＮ）中の増殖；ノボビオチンを伴う増殖試験；コアグラーゼ試験（ＣＯＡＧ）；アミノ酸の脱カルボキシル化；グルクロニダーゼ活性（ＧＵＳ）；ベータ−ガラクトシダーゼ活性；内因性蛍光；エスクリン加水分解；トリプトファン加水分解の１つ以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４６】
ＳＤＧＰが、液体培地を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４７】
ＳＤＧＰが、固体培地を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４８】
ＳＤＧＰが、固体培地及び液体培地を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４９】
同定が、種、属、科のレベルまで報告される、請求項１に記載の方法。
【請求項５０】
グラム染色型が報告される、請求項１に記載の方法。
【請求項５１】
１種以上の耐性マーカーが報告される、請求項１に記載の方法。
【請求項５２】
１種以上の抗菌剤に対する耐性が報告される、請求項１に記載の方法。
【請求項５３】
患者試料が、複数菌性であるかどうかを評価するためのシステムであって、
患者に由来する試料を接種するための第１及び第２の選択及び／又は鑑別増殖培地を含む、選択／鑑別増殖パネル（ＳＤＧＰ）であり、（ａ）各選択増殖培地が、微生物のサブセットの増殖を促進するのに適した１種以上の化合物を含み、（ｂ）各選択増殖培地が、微生物のサブセットの増殖を阻害する１種以上の化合物を含み、（ｃ）各鑑別増殖培地が、微生物の群により発現する酵素の基質を含み、（ｄ）酵素により触媒された基質の反応が、反応生成物をもたらす、選択／鑑別増殖パネル（ＳＤＧＰ）、並びに
（１）各選択／鑑別増殖培地に由来する、微生物、基質及び／又は反応生成物についての情報を、検出モジュールから受け取り、この情報に基づき、各培地中の、１種以上の微生物種の存在を決定し、（２）選択及び／又は鑑別増殖培地のそれぞれに割り当てられた微生物種を比較し、（３）単一の種だけが同定される場合、その同定を報告する、又は２種以上の種が同定される場合、試料を複数菌試料とフラグ付けし、任意選択的に、同定を報告するように構成されたプロセッサー
を含むシステム。
【請求項５４】
種の同定を決定し、報告する、請求項５３に記載のシステム。
【請求項５５】
選択及び／又は鑑別増殖培地の少なくとも１種が、標識付けされた又は結合したＩｇＧ又はこの断片を含み、検出モジュールが、標識付けされた又は結合したＩｇＧ又はこの断片に特徴的な、少なくとも１種のシグナルを検出するように構成された、請求項５４に記載のシステム。
【請求項５６】
１種以上のコアグラーゼアッセイが実施され、これらの１種以上のアッセイの結果が、選択及び／又は鑑別培地に由来する結果と併せて、試料が単一菌試料であるか複数菌試料であるかを決定するのに利用される、請求項５３に記載のシステム。
【請求項５７】
基質及び／又は反応生成物についての情報が、質量スペクトルを含み、プロセッサーが、質量スペクトルを、微生物についての標準的な質量スペクトルの１つ以上のライブラリーと比較するように構成された、請求項５３に記載のシステム。
【請求項５８】
質量スペクトルを生成するステップが、以下：飛行時間（ＴＯＦ）検出器、質量分析器としての静電セクター及び／又は磁気セクター、四重極質量分析器並びにイオントラップの１種以上を利用する、請求項５３に記載のシステム。
【請求項５９】
質量スペクトルを生成するステップが、以下のイオン化源：化学的イオン化、プラズマ放電及びグロー放電、電子衝撃、エレクトロスプレーイオン化、高速原子衝撃、電界イオン化、レーザーイオン化、マトリックス支援レーザー脱離イオン化の１種以上を利用する、請求項５８に記載のシステム。
【請求項６０】
質量スペクトルが、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの実施により生成される、請求項５３に記載のシステム。
【請求項６１】
（ａ）物質を、鑑別増殖培地のそれぞれから、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦのために使用されるプレートに沈着させ、（ｂ）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを実施する、自動化装置をさらに含む、請求項５３に記載のシステム。
【請求項６２】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦが実施される前に、１種以上の生化学アッセイが、第１の鑑別増殖培地中又は第２の鑑別増殖培地中において実施される、請求項６０に記載のシステム。
【請求項６３】
患者試料が、以下：血液試料、尿試料、脳脊髄液試料、滑液試料、吸引物試料、洗浄液試料、創傷スワブ試料又は呼吸器試料の１種以上である、請求項５３に記載のシステム。
【請求項６４】
患者試料が、選択／鑑別増殖パネル（ＳＤＧＰ）の調製の前に培養される、請求項５３に記載のシステム。
【請求項６５】
ＳＤＧＰが、単一の消耗材上に、２つ以上のリザーバーを含む、請求項５３に記載のシステム。
【請求項６６】
ＳＤＧＰリザーバーが、ロボット式液体取扱い機により接種される、請求項６５に記載のシステム。
【請求項６７】
ロボット式液体取扱い機が、ＳＤＧＰリザーバー及び抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）パネルの、１つ以上のリザーバーの両方に接種する、請求項６６に記載のシステム。
【請求項６８】
２つ以上のリザーバーが、ＳＤＧＰリザーバー及びＡＳＴリザーバーを含む、請求項６５に記載のシステム。
【請求項６９】
２つ以上の同じＳＤＧＰリザーバーが、２つ以上の患者試料が消耗材に接種され得るように、消耗材上に存在する、請求項６５に記載のシステム。
【請求項７０】
選択増殖培地又は鑑別増殖培地の少なくとも１種が、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）又はこの断片を含む、請求項５３に記載のシステム。
【請求項７１】
ＩｇＧ又はこの断片が、１種以上の光学標識を含む、請求項７０に記載のシステム。
【請求項７２】
コアグラーゼアッセイを実施するように構成され、コアグラーゼアッセイの結果、並びに選択及び／又は鑑別培地に由来する結果に基づき、試料が、単一菌試料であるか複数菌試料であるかを決定するように構成された、請求項５３に記載のシステム。
【請求項７３】
ＳＤＧＰが、最小で、４つ、６つ、８つ、１０、１２、１４、１６、１８、２０のリザーバーを含む、請求項５３に記載のシステム。
【請求項７４】
ＳＤＧＰ上の１つ以上のリザーバーが、非選択培地を含む、請求項５３に記載のシステム。
【請求項７５】
第１のＳＤＧＰが、グラム陽性菌のために構成され、第２のＳＤＧＰが、グラム陰性菌のために構成された、請求項５３に記載のシステム。
【請求項７６】
少なくとも１つのＳＤＧＰリザーバーが、少なくとも１種のプローブ化合物を含む、請求項５３に記載のシステム。
【請求項７７】
プローブ化合物が、表面結合剤、ロックト核酸、ペプチド核酸、他の蛍光インサイチューハイブリダイゼーションプローブを含むがこれらに限定されない、請求項７６に記載のシステム。
【請求項７８】
プローブが、１種以上の光学標識を含む、請求項７７に記載のシステム。
【請求項７９】
アッセイが、微生物を同定するように構成され、第１の副次試料及び第２の副次試料について質量スペクトルを生成するステップ、及び質量スペクトルを、微生物についての標準的な質量スペクトルの１つ以上のライブラリーと比較するステップを含む、請求項５３に記載のシステム。
【請求項８０】
飛行時間（ＴＯＦ）検出器、質量分析器としての静電セクター及び／又は磁気セクター、四重極質量分析器並びにイオントラップからなる群から選択される質量分析器を含む、請求項７９に記載のシステム。
【請求項８１】
化学的イオン化、プラズマ放電及びグロー放電、電子衝撃、エレクトロスプレーイオン化、脱離エレクトロスプレーイオン化、高速原子衝撃、電界イオン化、レーザーイオン化、液体抽出表面解析、マトリックス支援レーザー脱離イオン化からなる群から選択されるイオン化源を含む、請求項７９に記載のシステム。
【請求項８２】
副次試料を、ＳＤＧＰのリザーバーから、マトリックス支援レーザー脱離イオン化ＴＯＦ質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）のためのプレートにスポッティングし、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを実施し、これにより、自動化装置又は半自動化装置を用いて、質量スペクトルを生成するように構成された、請求項７９に記載のシステム。
【請求項８３】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ標的上のスポッティングの前に、微生物を濃縮するように構成された、請求項８２に記載のシステム。
【請求項８４】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ標的上のスポッティングの前に、遠心分離により微生物をペレットへと濃縮するように構成された、請求項８３に記載のシステム。
【請求項８５】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ標的上のスポッティングの前に、１回以上の洗浄ステップを実施するように構成された、請求項８３に記載のシステム。
【請求項８６】
吸光度、蛍光、発光、時間ゲート発光を含む、ＳＤＧＰリザーバーの、１種以上の光学的測定を実施するように構成された、請求項５３に記載のシステム。
【請求項８７】
気体クロマトグラフ及び／又は液体クロマトグラフを、質量分析の前に、試料分離のために利用することを含む、質量スペクトルを生成するように構成された、請求項７９に記載のシステム。
【請求項８８】
ＳＤＧＰが、単一の消耗材上に２つ以上の独立のリザーバーを含む、請求項５３に記載のシステム。
【請求項８９】
ＳＤＧＰリザーバーが、ロボット式液体取扱い機により接種される、請求項８８に記載のシステム。
【請求項９０】
ロボット式液体取扱い機が、ＳＤＧＰリザーバー及び抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）パネルの、１つ以上のリザーバーの両方に接種する、請求項８９に記載のシステム。
【請求項９１】
ＳＤＧＰリザーバーと、ＡＳＴリザーバーとが、同じ消耗材上に含まれる、請求項９０に記載のシステム。
【請求項９２】
２つ以上の同じＳＤＧＰリザーバーが、消耗材上に存在するために、２例以上の患者試料が、この消耗材に接種され得る、請求項５３に記載のシステム。
【請求項９３】
アッセイが、ＳＤＧＰのインキュベーション後に、微生物の核酸配列を同定するように構成された、請求項５３に記載のシステム。
【請求項９４】
アッセイが、核酸をシーケンシングするステップ、プローブを核酸とハイブリダイズさせるステップ、又は酵素により触媒される反応を核酸に対して実施するステップを含むように構成された、請求項９３に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年７月１８日に出願された、米国特許仮出願第６２／７００，０８４号、２０１８年７月２０日に出願された、米国特許仮出願第６２／７０１，１４６号、２０１８年８月１７日に出願された、米国特許仮出願第６２／７１９，２３０号、２０１９年５月７日に出願された、同第６２／８４４，２６０号に対する優先権の利益を主張する。前出の出願のそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
分野
本開示は、抗菌剤感受性試験及び微生物同定のための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
抗菌剤耐性微生物感染は、増大する罹患率、死亡率及び感染患者の中での健康管理費も含めた不十分な臨床成績を伴う。米国内でのこれらの生物の蔓延は、過去３０年にわたり着実に増大してきた。微生物の表現型抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）は、適切な療法レジメンを医師に知らせるのに極めて重要である。現行の方法を使用すると、ＡＳＴ決定は、典型的には最短で８時間を要することから、多くの臨床微生物学研究室でのシフト作業に起因して、この決定は一晩かかるプロセスとなる。現行のＡＳＴ法からの決定を待つ間、患者には広域スペクトル抗菌剤がしばしば投与され、それが患者の健康に著しく有害な影響を及ぼしかつ／又は増大する抗菌剤耐性伝染病に寄与する。さらに、正確な抗菌剤治療情報を得るこの時間遅延は、病院内での患者の滞在を長くし、それによってコスト及び患者の不快感が増大する。
【０００４】
この状況に対し、政府及び業界関係者は、病院での抗菌剤管理を促進させる規則を提案してきた。しかし抗菌剤管理努力は、現行のＡＳＴ法及び抗菌剤処方業務の制約によって複雑になり得る。本発明者らは、ＡＳＴ決定に要する時間を削減しかつ抗菌剤管理を容易にすることができる、迅速なＡＳＴのための方法を、既に開示してきた。例えば、微生物表面を結合する蛍光プローブを利用するＡＳＴシステム及び方法が、共同所有の米国特許第９，８３４，８０８号に記載されている。これらのシステム及び方法は、費用効果のある手法でこのニーズに対処しかつ既存のアッセイハードウェア構成要素に適合可能であるので、有利である。
【０００５】
ＡＳＴ結果は、試料が、１種よりも多くの微生物種を含む場合に、複雑になり得る。これは、感染の原因である場合もそうでない場合もあるが、試料中において最も急速に増殖する種に対する、抗菌剤の効果により、支配される可能性が高いからである。このことは、現行のＡＳＴ慣行において、典型的には個々の細菌コロニーを単離及び同定する固相培養物である「純度プレート（ｐｕｒｉｔｙ  ｐｌａｔｅ）」を使用して、取り組まれている。コロニーの培養及び解析は、典型的に、少なくとも、１８時間を要し、一部の臨床検査室は、純度プレート結果が入手されるまで、ＡＳＴ結果を報告しないため、純度プレートの使用は、ＡＳＴワークフローに遅れを生じさせる場合があり、この帰結として、ターゲティングされた治療の患者への送達を、遅延させてしまう場合がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第９，８３４，８０８号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本開示は、患者試料からの、ＡＳＴ結果の送出に要する時間を、潜在的に短縮する、改善された、高速ＡＳＴシステム及び高速ＡＳＴ法であって、微生物の種及び株の単離及び同定が加速化された、ＡＳＴシステム及びＡＳＴ法を提供する。一態様において、本開示は、試料中の、多数の異なる微生物種を評価するための方法、例えば、試料が、単一菌試料であるか複数菌試料であるかを評価するための方法に関する。方法は、微生物の増殖に適した条件下において、接種され、インキュベートされた、複数の選択及び／又は鑑別増殖培地を含む、選択／鑑別増殖パネル（ＳＤＧＰ）を利用する。本方法は、選択／鑑別増殖パネル（ＳＤＧＰ）に、試料を接種するステップであり、ＳＤＧＰが、第１の増殖培地及び第２の増殖培地を含み、（ａ）第１の増殖培地及び第２の増殖培地が、鑑別増殖培地又は選択増殖培地であり、（ｂ）各選択増殖培地が、（ｉ）微生物のサブセットの増殖を促進するのに適した１種以上の化合物、及び／又は（ｉｉ）微生物のサブセットの増殖を阻害する１種以上の化合物を含み、（ｃ）各鑑別増殖培地が、微生物の群により発現する酵素の基質を含み、（ｄ）酵素により触媒された基質の反応が、反応生成物をもたらすステップを含み得る。ＳＤＧＰは、微生物の増殖に適した条件下においてインキュベートされ得る。第１の副次試料及び第２の副次試料は、ＳＤＧＰの第１の選択増殖培地及び第２の選択増殖培地のそれぞれから選択され得る。各副次試料又は各コロニーについて、選択増殖培地、基質及び反応生成物において存在する、微生物の１種以上を検出するように、少なくとも１種のアッセイが実施され得る。各副次試料について、微生物、基質及び／又は反応生成物の検出に基づき、副次試料中に存在する微生物種が同定され得る。副次試料のそれぞれに存在する、微生物種の群は、試料が、単一菌試料であるか複数菌試料であるかを決定するように比較される場合があり、任意選択的に、試料が、単一菌性又は複数菌性であることが、使用者に報告され得る。
【０００８】
一部の実施形態において、方法は、使用者に、少なくとも１つの副次試料中に存在する微生物種を報告するステップをさらに含み得る。選択増殖培地又は鑑別増殖培地の少なくとも１種は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）又はこの断片を含み得る。ＩｇＧ又はこの断片は、１種以上の光学標識を含み得る。方法は、コアグラーゼアッセイを実施するステップ、並びにコアグラーゼアッセイの結果、並びに選択及び／又は鑑別培地に由来する結果に基づき、試料が、単一菌試料であるか複数菌試料であるかを決定するステップをさらに含み得る。ＳＤＧＰは、最小で、４つ、６つ、８つ、１０、１２、１４、１６、１８、２０のリザーバーを含み得る。ＳＤＧＰ上の１つ以上のリザーバーは、非選択培地を含み得る。第１のＳＤＧＰは、試料について実施されたグラム染色が陽性である場合に使用される場合があり、第２のＳＤＧＰは、グラム染色が陰性である場合に使用され得る。少なくとも１つのＳＤＧＰリザーバーは、少なくとも１種のプローブ化合物を含み得る。プローブ化合物は、表面結合剤、ロックト核酸、ペプチド核酸、他の蛍光インサイチューハイブリダイゼーションプローブを含み得るがこれらに限定されない。プローブは、１種以上の光学標識を含み得る。微生物を同定するアッセイは、第１の副次試料及び第２の副次試料について質量スペクトルを生成するステップ、及び質量スペクトルを、微生物についての標準的な質量スペクトルの１つ以上のライブラリーと比較するステップを含み得る。質量スペクトルを生成するステップは、以下：飛行時間（ＴＯＦ）検出器、質量分析器としての静電セクター及び／又は磁気セクター、四重極質量分析器並びにイオントラップの１種以上を利用し得る。質量スペクトルを生成するステップは、以下のイオン化源：化学的イオン化、プラズマ放電及びグロー放電、電子衝撃、エレクトロスプレーイオン化、脱離エレクトロスプレーイオン化、高速原子衝撃、電界イオン化、レーザーイオン化、液体抽出表面解析、マトリックス支援レーザー脱離イオン化の１種以上を利用し得る。質量スペクトルを生成するステップは、副次試料を、ＳＤＧＰのウェルリザーバーから、マトリックス支援レーザー脱離イオン化ＴＯＦ質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）のためのプレートにスポッティングし、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを実施し、これにより、質量スペクトルを生成することを含み得る。スポッティング及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦは、自動化装置又は半自動化装置により実施され得る。質量スペクトルの解析は、微生物のタンパク質及び／又は糖脂質を反映し得る。質量スペクトルの解析は、イメージングを含み得る。１つ以上のＳＤＧＰリザーバー内に含まれる１種以上のプローブ化合物は、質量分析により同定され得る。微生物は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ標的上のスポッティングの前に濃縮され得る。微生物は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ標的上のスポッティングの前に、遠心分離により濃縮され得る。微生物は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ標的上のスポッティングの前に、ペレットへと濃縮され得る。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ標的上のスポッティングの前に、１回以上の洗浄ステップが実施され得る。吸光度、蛍光、発光、時間ゲート発光を含む、ＳＤＧＰリザーバーの、１種以上の光学的測定が実施され得る。１種以上の光学的測定は、洗浄の前及び／又は後に実施され得る。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦが実施される前に、１種以上の生化学アッセイが、第１の選択／鑑別増殖培地中又は第２の選択／鑑別増殖培地中において実施され得る。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦは、１種以上の耐性マーカーの存在を決定する使用され得る。耐性マーカーは、非選択培地及び／又は抗菌剤含有培地に由来する微生物から決定され得る。質量スペクトルを生成するステップは、気体クロマトグラフ及び／又は液体クロマトグラフを、質量分析の前に、試料分離のために利用することを含み得る。微生物種は、細菌、真菌、原生動物及び／又は古細菌であり得る。微生物種は、以下：エスケリキア属種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．）、エンテロコッカス属種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、スタフィロコッカス属種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、クレブシエラ属種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、アシネトバクター属種（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）、エンテロバクター属種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、ストレプトコッカス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、プロテウス属種（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｓｐｐ．）、シトロバクター属種（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、モルガネラ属種（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、アエロコッカス属種（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、アエロモナス属種（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）、アクロモバクター属種（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、アクチノマイセス属種（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、バシルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、バルトネラ属種（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ボルデテラ属種（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ブルセラ属種（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ブルクホルデリア属種（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐｐ．）、カンピロバクター属種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、クラミジア属種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐｐ．）、クラミドフィラ属種（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｓｐｐ．）、クロストリジウム属種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．）、コリネバクテリウム属種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、エーリキア属種（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．）、フランシセラ属種（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ガルデネレラ属種（Ｇａｒｄｅｎｅｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ヘモフィリウス属種（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｕｓ  ｓｐｐ．）、ヘリコバクター属種（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、ラクトバシルス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、レジオネラ属種（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、レプトスピラ属種（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐｐ．）、リステリア属種（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｐｐ．）、マイコバクテリウム属種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、マイコプラズマ属種（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．）、ナイセリア属種（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐｐ．）、ノカルディア属種（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｓｐｐ．）、パスツレラ属種（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、プロビデンシア属種（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｓｐｐ．）、リケッツィア属種（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓｐｐ．）、ラウルテラ属種（Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、サルモネラ属種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、セラチア属種（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐｐ．）、シゲラ属種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ステノトロホモナス属種（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）、トレポネマ属種（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｐｐ．）、ウレアプラズマ属種（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．）、ビブリオ属種（Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐｐ．）、エルシニア属種（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｓｐｐ．）及びこれらの組合せの１つ以上をさらに含み得る。微生物種は、エンテロバクテリアセエ科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ  ｆａｍｉｌｙ）のメンバーを含み得る。真菌は、カンジダ属種（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．）、イッサチェンキア属種（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ  ｓｐｐ．）、ブラストマイセス属種（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、コッキジオイデス属種（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｓｐｐ．）、アスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、クリプトコッカス属種（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、ヒストプラズマ属種（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．）、ニューモシスチス属種（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐｐ．）、スタキボトリス属種（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｓｐｐ．）、スポロトリックス属（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ）、エクセロイラム属（Ｅｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍ）、クラドスポリウム属（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）、リングワーム、ムコルマイセテス及びこれらの組合せからなる群から選択され得る。
【０００９】
一部の実施形態において、患者試料は、以下：血液試料、尿試料、脳脊髄液試料、滑液試料、吸引物試料、洗浄液試料、創傷スワブ試料又は呼吸器試料の１種以上であり得る。患者試料は、ＳＤＧＰへの接種の前にさらに培養され得る。例示的な培養法は、血液培養プレート、他の液体培養プレート、固体培養プレートであり、特に、コロニーが、完全な増殖の前に収集され、「スマッジプレート」と称される、固体培養プレートを含むがこれらに限定されない。
【００１０】
一部の実施形態において、ＳＤＧＰは、単一の消耗材上に、２つ以上の独立のリザーバーを含む。さらに、ＳＤＧＰリザーバーは、ロボット式液体取扱い機により接種され得る。ロボット式液体取扱い機また、ＳＤＧＰリザーバー及び抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）パネルの、１つ以上のリザーバーのいずれにも接種し得る。さらに、ＳＤＧＰリザーバーと、ＡＳＴリザーバーとは、同じ消耗材上に存在し得る。さらに別の実施形態において、２つ以上のＳＤＧＰリザーバーが、消耗材上に存在するために、２つ以上の患者試料が、この消耗材に接種され得る。
【００１１】
一部の実施形態において、アッセイは、ＳＤＧＰのインキュベーション後において、微生物の核酸配列を同定するステップを含み得る。アッセイは、核酸をシーケンシングするステップ、プローブを核酸とハイブリダイズさせるステップ、又は酵素により触媒される反応を核酸に対して実施するステップを含み得る。ＳＤＧＰ培地中の、微生物のインキュベーションは、１〜１０時間、２〜８時間、３〜７時間、４〜６時間の間にわたり実施され得る。各選択培地は、ストレプトコッカス属濃縮ブロス、フレーザーブロス、ジオリッティ−カントーニブロス、ストレプトコッカス・フェカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）培地、ラウリル硫酸ナトリウム、亜テルル酸塩及び表１に列挙された培地からなる群から選択される、１種以上の培地から構成される。ＳＤＧＰの各鑑別リザーバーは、インドール試験、メチルレッド試験、フォーゲス−プロスカウエル（ＶＰ）試験、クエン酸塩利用（ＣＲＴ）試験及び選択的糖発酵試験［例えば、グルコース（ＭＲＧ）、セロビオース（ＭＲＣ）、ラクトース（ＭＲＬ）、マンニトール（ＭＲＭＴＬ）、マンノース（ＭＲＭＮＳ）、ラフィノース（ＭＲＲ）、スクロース（ＭＲＳＵ）、トレハロース（ＭＲＴ）、キシロース（ＭＲＸ）、ズルシトール（ＭＲＤ）、アドニトール（ＭＲＡＤ）、イノシトール（ＭＲＩ）、ソルビトール（ＭＲＳＯＲ）、アラビノース（ＭＲＡＲＢ）、マルトース、アルファ−メチル−Ｄ−グルコシド（ＭＲＡＭＧ）、エリトリトール（ＭＲＥ）、メリビオース（ＭＲＭＥＬ）、アラビトール、グリセロール（ＭＲＧＬＹ）及び／又はムコ酸塩（ＭＲＭＵＣ）の発酵試験］、クエン酸塩低減試験（ＣＲＴ）；フェニルアラニンデアミナーゼ試験（ＰＨＤ）；硫化水素の検出を伴う、又は伴わないＴＳＩ（ｔｒｉｐｌｅ  ｓｕｇａｒ  ｉｒｏｎ）；ウレアーゼ試験；リジン（ＤＣＬ）、オルニチン（ＤＣＯ）、アルギニン（ＤＣＡ）を使用する、脱カルボキシル化試験；マロン酸塩、酢酸塩及び／又は酒石酸塩の利用；ゼラチン加水分解試験；エスクリン加水分解試験；リパーゼ試験；ＤＮアーゼ試験；シアン化カリウム（ＫＣＮ）中の増殖；ノボビオチンを伴う増殖試験；コアグラーゼ試験（ＣＯＡＧ）；アミノ酸の脱カルボキシル化；グルクロニダーゼ活性（ＧＵＳ）；ベータ−ガラクトシダーゼ活性；内因性蛍光；エスクリン加水分解；トリプトファン加水分解などから構成された培地の１種以上を含み得る。ＳＤＧＰは、液体培地を含み得る。ＳＤＧＰは、固体培地を含み得る。ＳＤＧＰは、液体培地及び固体培地を含み得る。同定は、種、属、科のレベルまで報告され得る。グラム染色型が報告され得る。１種以上の耐性マーカーが報告され得る。１種以上の抗菌剤に対する耐性が報告され得る。
【００１２】
一部の実施形態において、選択及び／又は鑑別増殖培地の少なくとも１種は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）又はこの断片を含み、少なくとも１種のアッセイを実施して、コロニー内又は副次試料中の反応生成物を同定するステップは、ＩｇＧ又はこの断片に特徴的な、少なくとも１種のシグナルの存在又は非存在を検出することを含む。
【００１３】
１種以上のコアグラーゼアッセイが実施される、一部の実施形態において、これらの１種以上のアッセイの結果は、選択及び／又は鑑別培地に由来する結果と併せて、試料が単一菌試料であるか複数菌試料であるかを決定するのに利用される。
【００１４】
多様な実施形態において使用されたアッセイは、質量分析、例えば、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）及び／又は核酸配列を増幅するステップ、プローブを核酸とハイブリダイズさせるステップ若しくはコロニー又は試料に由来する核酸をシーケンシングするステップを含む。質量分析アッセイが使用される場合、方法は、任意選択的に、（ａ）微生物ペレット又は微生物流体を、ＳＤＧＰのウェルから、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦプレートにスポッティングし、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを実施するステップ、（ｂ）自動化／半自動化装置を使用して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを実施し、かつ／又はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを実施する前に、選択培地中において、１種以上の生化学アッセイを実施するステップの１つ以上を含む。方法は、任意選択的に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ標的上のスポッティングの前に、微生物を濃縮するステップを含む。方法は、任意選択的に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ標的上のスポッティングの前に、微生物を、ペレットへと濃縮するステップをさらに含む。
【００１５】
多様な実施形態において使用されたアッセイは、第１の副次試料及び第２の副次試料について質量スペクトルを生成するステップ、及び質量スペクトルを、微生物についての標準的な質量スペクトルの１つ以上のライブラリーと比較するステップをさらに含み得る。他の実施形態は、気体クロマトグラフ及び／又は液体クロマトグラフを、質量分析の前に、試料分離のために利用して、質量スペクトルを生成することをさらに含み得る。
【００１６】
他の実施形態において、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦが実施される前に、１種以上の生化学アッセイが、第１のＳＤＧＰ内又は第２のＳＤＧＰ内において実施され得る。
【００１７】
本開示のこの態様について続けると、一部の実施形態において、ＳＤＧＰは、マルチウェルプレート（例えば、４８ウェルプレート、９６ウェルプレート又は３８４ウェルプレート）であり、プレートの複数のウェルは、本明細書の表１に列挙された選択培地など、異なる選択培地を含む。方法はまた、任意選択的に、抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）を、試料に対して実施し、試料が、複数菌試料としてフラグ付けされない（即ち、単一菌試料であることが決定する）場合に、同定及びＡＳＴの結果を公表するステップも含む。一部の実施形態において、ＳＤＧＰは、固体形態にある、複数の選択培地を含むプレートであり、この場合、副次試料又はコロニーを選択するステップは、ＳＤＧＰの画像を撮影し、画像内の微生物コロニーを同定し、微生物コロニーを、用具と接触させ、これにより、コロニーの少なくとも一部を、固体培地から引き離すこと（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦプレートにスポッティングするために）を含み得る。一部の実施形態において、器具は、スワブであり得る。本開示のこの態様に従う、多様な実施形態において、試料を接種された、非選択培地を含む、増殖対照ウェルが、任意選択的に利用される。増殖は、インキュベーションの後、増殖対照ウェル内において評価され、所定の閾値と比較される：増殖のレベルが、閾値を満たす、又はこれを超える場合、コロニー又は副次試料は選択され、方法は先に進み；増殖のレベルが、閾値を下回る場合、ＳＤＧＰは、さらにインキュベートされ、増殖のレベルは、任意選択的に、閾値が満たされるまで、増殖対照ウェル内において再度点検される。
【００１８】
別の態様において、本開示は、それぞれが、複数種の異なる選択増殖培地の１種を含む、複数の流体リザーバーを含む、選択／鑑別増殖パネル（ＳＤＧＰ）に関する。ＳＤＧＰは、任意選択的に、非選択培養培地を含む、少なくとも１つの流体リザーバー及び／又は複数種の抗菌剤についての希釈系列を規定する、第２の、複数の流体リザーバーを含む、ＡＳＴパネルを含む。
【００１９】
別の態様において、本開示は、微生物同定（ＩＤ）試験順序を実施するための方法であって、本開示の他の態様について記載されている通り、ＳＤＧＰに、試料を接種するステップ、次いで、ＳＤＧＰを、同定試験順序を実施するための自動化システムに装填するステップ、及びＳＤＧＰをインキュベート及び攪拌し、ＳＤＧＰの複数のウェルのそれぞれに由来する、流体培養物又は微生物ペレットの一部を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦプレートにスポッティングし、マトリックス溶液及び溶媒を添加し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを実施して、複数のウェルのそれぞれについて、質量スペクトルを生成するように、システムを作動させるステップを含む方法に関する。場合によって、ＳＤＧＰは、複数のウェルのそれぞれにおいて、微生物ペレットを形成するように、ＭＡＬＤＩ標的へのスポッティングの前に遠心分離される。本開示の他の態様において、上記に記載した通り、ＳＤＧＰは、複数種の抗菌剤のための、複数の希釈系列を規定するＡＳＴパネル及び抗菌剤を欠き、非選択増殖培地を含む、少なくとも１つの増殖対照ウェルを含み得る。これらの場合に、方法はまた、任意選択的に、以下のステップ：ＳＤＧＰを、所定の時間にわたり、インキュベート及び攪拌した後において、少なくとも１つの増殖対照ウェル内の微生物増殖レベルを評価するステップ、並びに微生物の増殖が、所定の閾値を超える場合、複数の希釈系列のそれぞれについて、少なくとも１種のエンドポイントアッセイを実施し、複数種の抗菌剤の少なくとも１種について、最小阻害濃度を同定するステップも含む。
【００２０】
さらに別の態様において、本開示は、患者が複数菌性であるかどうかを評価するためのシステムであって、種の同定を決定し、報告するシステムに関する。
【００２１】
本開示のこの態様に従う実施形態において、選択及び／又は鑑別増殖培地の少なくとも１種は、ＩｇＧ又はこの断片を含み、検出モジュールは、ＩｇＧ又はこの断片に特徴的な、少なくとも１種のシグナルを検出するように構成される。
【００２２】
別の実施形態において、１種以上のコアグラーゼアッセイが実施され、これらの１種以上のアッセイの結果は、選択及び／又は鑑別培地に由来する結果と併せて、試料が単一菌試料であるか複数菌試料であるかを決定するのに利用される。
【００２３】
別の実施形態において、基質及び／又は反応生成物についての情報は、質量スペクトルを含み、プロセッサーは、質量スペクトルを、微生物についての標準的な質量スペクトルの１つ以上のライブラリーと比較するように構成される。
【００２４】
さらに別の実施形態において、質量スペクトルを生成するステップは、飛行時間（ＴＯＦ）検出器、質量分析器としての静電セクター及び／若しくは磁気セクター、四重極質量分析器又はイオントラップを利用し得る。このシステムは、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの実施により生成された質量スペクトルをさらに含む。このシステムは、（ａ）物質を、鑑別増殖培地のそれぞれから、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦのために使用されるプレートに沈着させ、（ｂ）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを実施する、自動化装置をさらに含む。システムについての、さらなる実施形態は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦが実施される前に、１種以上の生化学アッセイが、第１の鑑別増殖培地中又は第２の鑑別増殖培地中において実施されるシステムを含む。
【００２５】
別の実施形態において、質量スペクトルを生成するステップは、以下のイオン化源：化学的イオン化、プラズマ放電及びグロー放電、電子衝撃、エレクトロスプレーイオン化、高速原子衝撃、電界イオン化、レーザーイオン化又はマトリックス支援レーザー脱離イオン化の１つ以上を利用し得る。
【００２６】
別の態様において、本開示は、患者試料が、複数菌性であるかどうかを評価するためのシステムについて記載する。このシステムは、患者に由来する試料を接種するための第１及び第２の選択及び／又は鑑別増殖培地を含む選択／鑑別増殖パネル（ＳＤＧＰ）であって、（ａ）各選択増殖培地が、微生物のサブセットの増殖を促進するのに適した１種以上の化合物を含み、（ｂ）各選択増殖培地が、微生物のサブセットの増殖を阻害する１種以上の化合物を含み、（ｃ）各鑑別増殖培地が、微生物の群により発現する酵素の基質を含み、（ｄ）酵素により触媒された基質の反応が、反応生成物をもたらす、選択／鑑別増殖パネル（ＳＤＧＰ）、並びに（１）各選択／鑑別増殖培地に由来する、微生物、基質及び／又は反応生成物についての情報を、検出モジュールから受け取り、この情報に基づき、各培地中の、１種以上の微生物種の存在を決定し、（２）選択及び／又は鑑別増殖培地のそれぞれに割り当てられた微生物種を比較し、（３）単一の種だけが同定される場合、その同定を報告する、又は２種以上の種が同定される場合、試料を複数菌試料とフラグ付けし、任意選択的に、同定を報告するように構成されたプロセッサーを含み得る。
【００２７】
一部の実施形態において、システムは、種の同定を決定し、報告する。選択及び／又は鑑別増殖培地の少なくとも１種は、標識付けされた又は結合したＩｇＧ又はこの断片を含むことが可能であり、検出モジュールは、標識付けされた又は結合したＩｇＧ又はこの断片に特徴的な、少なくとも１種のシグナルを検出するように構成される。１種以上のコアグラーゼアッセイが実施される可能性があり、これらの１種以上のアッセイの結果は、選択及び／又は鑑別培地に由来する結果と併せて、試料が単一菌試料であるか複数菌試料であるかを決定するのに利用され得る。基質及び／又は反応生成物についての情報は、質量スペクトルを含む可能性があり、プロセッサーは、質量スペクトルを、微生物についての標準的な質量スペクトルの１つ以上のライブラリーと比較するように構成され得る。質量スペクトルを生成するステップは、以下：飛行時間（ＴＯＦ）検出器、質量分析器としての静電セクター及び／又は磁気セクター、四重極質量分析器並びにイオントラップの１種以上を利用し得る。質量スペクトルを生成するステップは、以下のイオン化源：化学的イオン化、プラズマ放電及びグロー放電、電子衝撃、エレクトロスプレーイオン化、高速原子衝撃、電界イオン化、レーザーイオン化、マトリックス支援レーザー脱離イオン化の１種以上を利用し得る。質量スペクトルは、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの実施により生成され得る。システムは、（ａ）物質を、鑑別増殖培地のそれぞれから、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦのために使用されるプレートに沈着させ、（ｂ）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを実施する、自動化装置をさらに含み得る。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦが実施される前に、１種以上の生化学アッセイが、第１の鑑別増殖培地中又は第２の鑑別増殖培地中において実施され得る。患者試料は、以下：血液試料、尿試料、脳脊髄液試料、滑液試料、吸引物試料、洗浄液試料、創傷スワブ試料又は呼吸器試料の１種以上であり得る。患者試料は、選択／鑑別増殖パネル（ＳＤＧＰ）の調製の前に培養され得る。ＳＤＧＰは、単一の消耗材上に、２つ以上のリザーバーを含み得る。ＳＤＧＰリザーバーは、ロボット式液体取扱い機により接種され得る。ロボット式液体取扱い機は、ＳＤＧＰリザーバー及び抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）パネルの、１つ以上のリザーバーの両方に接種し得る。２つ以上のリザーバーは、ＳＤＧＰリザーバー及びＡＳＴリザーバーを含み得る。２つ以上の同じＳＤＧＰリザーバーは、２つ以上の患者試料が消耗材に接種され得るように、消耗材上に存在し得る。選択増殖培地又は鑑別増殖培地の少なくとも１種は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）又はこの断片を含み得る。ＩｇＧ又はこの断片は、１種以上の光学標識を含み得る。システムは、コアグラーゼアッセイを実施するように構成される場合があり、コアグラーゼアッセイの結果、並びに選択及び／又は鑑別培地に由来する結果に基づき、システムは、試料が、単一菌試料であるか複数菌試料であるかを決定するように構成され得る。ＳＤＧＰは、最小で、４つ、６つ、８つ、１０、１２、１４、１６、１８、２０のリザーバーを含み得る。ＳＤＧＰ上の１つ以上のリザーバーは、非選択培地を含み得る。第１のＳＤＧＰは、グラム陽性菌のために構成される場合があり、第２のＳＤＧＰは、グラム陰性菌のために構成され得る。少なくとも１つのＳＤＧＰリザーバーは、少なくとも１種のプローブ化合物を含み得る。プローブ化合物は、表面結合剤、ロックト核酸、ペプチド核酸、他の蛍光インサイチューハイブリダイゼーションプローブを含み得るが、これらに限定されない。プローブは、１種以上の光学標識を含み得る。アッセイは、微生物を同定するように構成され、第１の副次試料及び第２の副次試料について質量スペクトルを生成するステップ、及び質量スペクトルを、微生物についての標準的な質量スペクトルの１つ以上のライブラリーと比較するステップを含む。システムは、飛行時間（ＴＯＦ）検出器、質量分析器としての静電セクター及び／又は磁気セクター、四重極質量分析器並びにイオントラップからなる群から選択される質量分析器を含み得る。システムは、化学的イオン化、プラズマ放電及びグロー放電、電子衝撃、エレクトロスプレーイオン化、脱離エレクトロスプレーイオン化、高速原子衝撃、電界イオン化、レーザーイオン化、液体抽出表面解析、マトリックス支援レーザー脱離イオン化からなる群から選択されるイオン化源を含み得る。システムは、副次試料を、ＳＤＧＰのリザーバーから、マトリックス支援レーザー脱離イオン化ＴＯＦ質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）のためのプレートにスポッティングし、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを実施し、これにより、自動化装置又は半自動化装置を用いて、質量スペクトルを生成するように構成され得る。システムは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ標的上のスポッティングの前に、微生物を濃縮するように構成され得る。システムは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ標的上のスポッティングの前に、遠心分離により微生物をペレットへと濃縮するように構成され得る。システムは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ標的上のスポッティングの前に、１回以上の洗浄ステップを実施するように構成され得る。システムは、吸光度、蛍光、発光、時間ゲート発光を含む、ＳＤＧＰリザーバーの、１種以上の光学的測定を実施するように構成され得る。システムは、気体クロマトグラフ及び／又は液体クロマトグラフを、質量分析の前に、試料分離のために利用することを含む、質量スペクトルを生成するように構成され得る。ＳＤＧＰは、単一の消耗材上に、２つ以上の独立のリザーバーを含み得る。ＳＤＧＰリザーバーは、ロボット式液体取扱い機により接種され得る。ロボット式液体取扱い機は、ＳＤＧＰリザーバー及び抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）パネルの、１つ以上のリザーバーの両方に接種し得る。ＳＤＧＰリザーバーと、ＡＳＴリザーバーとは、同じ消耗材上に含まれ得る。２つ以上の同じＳＤＧＰリザーバーは、２つ以上の患者試料が、この消耗材に接種され得るように、消耗材上に存在し得る。アッセイは、ＳＤＧＰのインキュベーション後に、微生物の核酸配列を同定するように構成され得る。アッセイは、核酸をシーケンシングするステップ、プローブを核酸とハイブリダイズさせるステップ、又は酵素により触媒される反応を核酸に対して実施するステップを含むように構成され得る。
【００２８】
前出の列挙は、限定的ではなく、例示的であることが意図され、当業者なら、本開示のさらなる態様、並びに上記において記載された態様及び実施形態への改変を理解しよう。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本開示の、ある特定の実施形態に従うＡＳＴワークフローを示す図である。
【図２】本開示の、ある特定の実施形態に従う、例示的な液相純度プレートのデザインを示す図である。
【図３】本開示の、ある特定の実施形態に従う、例示的な固相純度プレートのデザインを示す図である。
【図４】本開示の、ある特定の実施形態に従うＡＳＴを伴う、例示的なワークフローの組込みを示す図である。
【図５Ａ】５つの異なる複数菌濃縮物及び対照について、インドール試験の吸光度の読取りを、Ｋ．ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）対Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の比と対比して示す図である。
【図５Ｂ】５つの異なる混合比のＫ．ニューモニエ及びＥ．コリについての、ＭＡＬＤＩの結果を示す図である。
【図６】Ｓ．ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の、Ｓ．ルグドゥネンシス（Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）に対する、５つの異なるスパイク比についてのＭＡＬＤＩ結果並びに非選択培地（ミュラー−ヒントンブロス、ＭＨＢ）中及びマンニトール塩ブロス中における、４時間にわたる増殖の後における、Ｂｒｕｋｅｒ  ＢｉｏＴｙｐｅｒ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの結果を示す図である。いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、ＭＨＢ中の、Ｓ．ルグドゥネンシスの、比較的遅い増殖速度は、Ｓ．ニューモニエが、非選択培地に由来する試料中の、ＭＡＬＤＩシグナルを支配することを可能とすると考えられる。これに対し、選択的マンニトール塩ブロス中において増殖した試料についてのＭＡＬＤＩ解析は、試料中の、Ｓ．ルグドゥネンシスの存在を明らかにする。
【図７】Ｅ．コリの、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対する、５つの異なるスパイク比についてのＭＡＬＤＩ結果並びに非選択培地（ミュラー−ヒントンブロス）中又は選択培地中：マンニトール塩ブロス中及びマッコンキーブロス中における、４時間にわたる増殖の後における、Ｂｒｕｋｅｒ  ＢｉｏＴｙｐｅｒ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの結果を提示する図である。両方の選択培地中の試料増殖の、ＭＡＬＤＩによる同定は、試料中の２つの細菌種の存在を明らかにする。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
概説
本開示のシステム及び方法は、一般に、微生物の同定（「ＩＤ」）と関連するアッセイ時間を短縮することにより、抗生剤感受性試験（「ＡＳＴ」）の実施及びＡＳＴ結果の送出に要する時間を短縮することに取り組む。多くの臨床検査室は、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）プラットフォームを使用して、同定解析を実施する。質量スペクトルは、複雑であるため、同定は、典型的に、臨床試料に由来するスペクトルを、微生物標準品のデータベースと比較することにより達成される。当業者に、これらのスペクトルの複雑性は、試料中の、１種を超える微生物の存在により増大し、夾雑種又は共培養種も、同定判定を複雑化し得る、又はこれを妨げ得ることが明らかである。現行の、業界標準的なワークフローにおいて、純度プレートは、ＡＳＴに使用された、同じ細菌接種物からの、ＡＳＴのための加工と並行して、非選択寒天上において、一晩にわたり試行される。このワークフローは、ＡＳＴ結果が、単一の細菌種及び／又は微生物株に由来することを確実にする。一部の臨床微生物学検査室は、純度プレートが入手可能となる前に、ＡＳＴ結果を、診療所に公表するが、多くの臨床微生物学検査室は、ＡＳＴ結果が、診療所に公表される前に、純度プレートによる単一菌性試料の確認を必要とする。ＡＳＴ結果の公表が、ＡＳＴ結果を確認する一助となる前に、純度プレート結果を待つことは、実施可能であるが、ＡＳＴデータの報告に遅延を導入し、この帰結として、ターゲティングされた治療の、患者への送達に、遅延を導入する。
【００３１】
本開示の多様な実施形態において、ＡＳＴ結果が、所与の患者試料に送り返されるために要する時間を短縮し、得られたこれらの結果に基づき、決定を下すのに、多数の戦略が用いられる。本開示のある特定の実施形態において、第１に、特定の微生物又は微生物類型の増殖に選択的な条件を使用して、微生物の同定及び／又は単一菌性確認（「純度」）のための試料を培養するのに続き、これらの培養された試料を、適切な方法による同定にかける。
【００３２】
下記の表１は、本開示のシステム及び方法において使用され得る、代表的な選択培地を列挙する。選択培地は、それが支援するようにデザインされた、特定の微生物型（即ち、種、科、属など）以外の微生物の増殖を抑制、阻害、低減などするが、当業者なら、抑制、阻害、低減などの程度が、微生物に依存し得ることを理解しよう。これらの培地は、固体形態において使用される場合もあり、液体形態において使用される場合もある。他の選択培地は、ストレプトコッカス属濃縮ブロス、フレーザーブロス、ジオリッティ−カントーニブロス、ストレプトコッカス・フェカリス培地、ラウリル硫酸ナトリウム及び亜テルル酸塩を含み得る。
【００３３】
【表１】
2021531000.tif 000003
【００３４】
【表２】
2021531000.tif 000004
2021531000.tif 000005
【００３５】
本開示に従う、選択培地又は鑑別培地を利用する、例示的なワークフローは、図１に描示される。１つ以上の鑑別培地又は選択培地を含む、「鑑別増殖プレート」及び／又は「鑑別増殖パネル」に、試料を接種し、微生物の増殖を支援する条件下においてインキュベートする。選択培地のために、これらの条件は、異なる温度（例えば、高温）及び制御されたＣＯ２レベルを含み得る。１種以上の非選択培地はまた、プレート及び／又はパネル上に含まれる場合もある。インキュベーション後、限定するものではないが、例えば、シーケンシング（サンガーシーケンシング又は次世代シーケンシング）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、プローブとのハイブリダイゼーション、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１などによる、配列特異的な結合を介する、特異的なヌクレオチド配列の検出、抗体、アプタマーなどを使用する、特異的な抗原又はエピトープの検出を含む、任意の適切な方法を使用して、かつ／又は、例えば、下記において記載される、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを使用する、質量分析を介する、微生物の同定のために、試料を採取し、調製する。
【００３６】
同定試料を、選択的増殖培地中において増殖させる、１つの利点は、各条件下において検出される、対象となる種の幅が限定されることである。例えば、培地が、ブドウ球菌の増殖だけを支援する場合、遺伝子の同定のために、ブドウ球菌のためのプライマーだけが必要であり、ブドウ球菌のデータセットだけが、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの同定について精査される必要がある。
【００３７】
微生物試料は、鑑別増殖プレート又は鑑別増殖パネルに、直接添加される場合もあり、添加の前に、加工される（例えば、濃縮される。）場合もある。一部の実施形態において、鑑別増殖プレートは、微生物の種又は株が、増殖条件下において、存在するのか、存在しないのかを指し示す基質（例えば、酵素の基質）を含む。代替的に、又は加えて、鑑別増殖プレートは、微生物の種又は株が、増殖条件下において、存在することを指し示す、抗原又はヌクレオチド配列を認識する、抗体又はこの断片、アプタマー、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどの薬剤を含み得る。
【００３８】
本開示に従う鑑別増殖パネルは、一般に、例えば、４８ウェル、９６ウェル、３８４ウェルなど、複数の流体リザーバーを含む、カセット又はプレートを利用する。２種以上の選択培地が、カセットの、異なるウェルに施され、カセットの、少なくとも１つのウェルは、ミュラー−ヒントンブロス、ウマ全血液を溶解させたトリプシンソイ寒天など、非選択培地を、例えば、増殖対照ウェルとして含み得る。場合によって、カセットは、２つ以上の試料（例えば、２人以上の患者に由来する）が、単一のカセット上において試行されるように、異なる選択培地又は非選択培地を含むウェルの、実質的に２つ以上のアレイを含み得る。
【００３９】
例示的な３８４ウェル鑑別増殖パネルのレイアウトが、図２に示される。パネルは、多数の、同一な、４８ウェルアレイを含み；使用する場合、各アレイに、異なる試料を接種し、複数例の（最大において、８例の）試料の、並行的な加工を可能とする。各アレイ内に、選択培地に加えて、エンテロバクテリアセエ科と、ブドウ球菌とを鑑別するための情報など、さらなる種情報をもたらし得る、１つ以上の、生化学的試験又は結合試験のウェル（例えば、１種以上の微生物種の存在又は非存在を指し示す、酵素基質又は結合剤を含むウェル）が含まれ得る。グラム陽性菌又はグラム陰性菌のためだけのブロス及び試験を含むプレートも、利用され得るが、全てのブロス及び試験が、単一のプレート上において試行されることが好ましい場合もある。プレートを分離することにより、例えば、異なる微生物型のために、異なる増殖条件が使用され得る。異なる増殖条件を要する、特定の培地及び／又は試験もまた、異なるプレート上において、並行して試行され得る。液相プレートが、複数菌性の同定のための、主要な手段として利用される場合、本方法は、複数菌試料の場合に、同定及び／又はＡＳＴのために利用され得る、単離株を提供し得るので、固相培養物を、並行して試行することが有利であり得る。
【００４０】
選択／鑑別増殖パネルは、微生物のサブセットを、選択的に増殖させる、又は選択的に阻害する、多様な培地を含む。各選択増殖培地は、微生物種又は微生物種の群の増殖を、多様に促進する、若しくは容易とする、又はこれらの増殖を、多様に阻害若しくは防止する、１種以上の化合物を含有する。各鑑別増殖培地は、微生物種又は微生物種の群に特徴的な、酵素触媒型反応のための、１種以上の基質を含有する。鑑別増殖培地中の基質が、酵素触媒型反応物中の微生物と反応する場合、反応生成物がもたらされる、かつ／又は反応基質が消失させる。基質及び／又は反応生成物の存在若しくは非存在又は相対数量に基づき、使用者は、接種物中の、特定の微生物種又は微生物種の群の存在又は非存在を推定し得る。
【００４１】
鑑別増殖培地は、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）と、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣｏＮＳ）とを鑑別するのに使用され得る。鑑別増殖培地の例は、増殖培地中の、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の使用において見られる。スタフィロコッカス・アウレウスのプロテインＡ受容体は、ＩｇＧに結合しているが、スタフィロコッカス属の他の株のプロテインＡ受容体は、ＩｇＧに結合しない。したがって、スタフィロコッカス・アウレウスが、試料中に存在し、ＩｇＧに結合している場合、ＩｇＧ又はこの断片に特徴的な、いかなるシグナルも存在しない。ＩｇＧの存在は、例えば、蛍光標識により、光学的に検出され得る。結合しなかったＩｇＧは、遠心分離を介して除去され得る。別の例は、コアグラーゼアッセイの使用である。これらのアッセイにおいて、コアグラーゼの、反応生成物としての存在は、スタフィロコッカス・アウレウスの、試料中の存在を指し示す。コアグラーゼアッセイにおいて、Ｓ．アウレウスを枯渇させた後に、残るブドウ球菌株を同定するように、他の個別の増殖試験が実施され得る。
【００４２】
選択増殖培地は、微生物種及び／又は微生物株の選択的な増殖を促進するが、場合によって、所与の選択増殖培地中において同様に増殖する、種又は株の間において鑑別する（例えば、エンテロバクテリアセエ科の間において鑑別する。）ことが所望であり得る。当技術分野において、限定するものではないが、インドール試験、メチルレッド試験、フォーゲス−プロスカウエル（ＶＰ）試験、クエン酸塩利用（ＣＲＴ）試験及び選択的糖発酵試験［例えば、グルコース（ＭＲＧ）、セロビオース（ＭＲＣ）、ラクトース（ＭＲＬ）、マンニトール（ＭＲＭＴＬ）、マンノース（ＭＲＭＮＳ）、ラフィノース（ＭＲＲ）、スクロース（ＭＲＳＵ）、トレハロース（ＭＲＴ）、キシロース（ＭＲＸ）、ズルシトール（ＭＲＤ）、アドニトール（ＭＲＡＤ）、イノシトール（ＭＲＩ）、ソルビトール（ＭＲＳＯＲ）、アラビノース（ＭＲＡＲＢ）、マルトース、アルファ−メチル−Ｄ−グルコシド（ＭＲＡＭＧ）、エリトリトール（ＭＲＥ）、メリビオース（ＭＲＭＥＬ）、アラビトール、グリセロール（ＭＲＧＬＹ）及び／又はムコ酸塩（ＭＲＭＵＣ）の発酵試験］、クエン酸塩低減試験（ＣＲＴ）；フェニルアラニンデアミナーゼ試験（ＰＨＤ）；硫化水素の検出を伴う、又は伴わないＴＳＩ（ｔｒｉｐｌｅ  ｓｕｇａｒ  ｉｒｏｎ）；ウレアーゼ試験；リジン（ＤＣＬ）、オルニチン（ＤＣＯ）、アルギニン（ＤＣＡ）を使用する、脱カルボキシル化試験；マロン酸塩、酢酸塩及び／又は酒石酸塩の利用；ゼラチン加水分解試験；エスクリン加水分解試験；リパーゼ試験；ＤＮアーゼ試験；シアン化カリウム（ＫＣＮ）中の増殖；ノボビオチンを伴う増殖試験；コアグラーゼ試験（ＣＯＡＧ）；アミノ酸の脱カルボキシル化；グルクロニダーゼ活性（ＧＵＳ）；ベータ−ガラクトシダーゼ活性；内因性蛍光；エスクリン加水分解などを含む、このような種又は株の間において鑑別するための、多数の、適切な試薬が公知である。本開示の一部の実施形態において、前出の試薬の１種以上を、選択増殖培地に添加して、これを、鑑別増殖培地とする。前出に限定されるものではないが、場合によって、選択培地中の増殖の評価と並行して、さらなる試験を実施することが有利であり得る。例えば、スタフィロコッカス・アウレウスを、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣｏＮＳ）から鑑別するために、コアグラーゼ試験及び／又はマンニトール塩など、ブドウ球菌選択培地中の、個別の増殖試験を、Ｓ．アウレウスを同定する、１種以上の試験、例えば、Ｓ．アウレウスにより発現するが、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌により発現しない表面タンパク質である、プロテインＡに結合している免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の使用を介する試験と共に、実施することが有用であり得る。次いで、非枯渇ウェル内及び枯渇ウェル内の、相対的増殖が、比較及び解析される。
【００４３】
多数のリードアウトは、限定するものではないが、光の吸収又は伝搬を含む、鑑別増殖培地中において増殖した、種又は種の群の間の鑑別において使用され得る。例えば、エオシンメチレンブルー（ＥＭＢ）培地が使用される場合、吸光度による光学的精査が、コロニーの色を解釈するのに使用される。米国付与前公開第２０１８／００８８１４１号において記載されている通り、例えば、試験パネル上の、液体培養物中において増殖させた細菌は、遠心分離によりペレット化されるのに続き、培地の吸引（及び潜在的な、後続の洗浄）にかけられ、これに続き、特定の染色試薬又は他の試薬と接触させる。これらの方法は、かつて、固相中において増殖させたコロニーに限定されていた、微生物のコロニーの査定を、液相において増殖させたコロニーの場合にも可能とする。
【００４４】
本開示の、ある特定の実施形態において、質量分析は、１つ以上の鑑別増殖培地のリードアウトとして使用される。質量分析及び、とりわけ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦは、特定の微生物種を表す、酵素反応の生成物を検出するのに使用され得る。質量スペクトルのライブラリーが確立されたら、質量分析は、試料中に存在する微生物を同定する、効率的、かつ、費用効果的手段である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦプレートのデザインにより、多数の試料が、短い時間枠内において試行され得る（大半の標的プレートは、３８４の試料スポットを含有する。）。さらに、方法は、細菌を、多数の病原体を含有する試料から検出するのに、十分に高感度である。最後に、試料に必要な調製は、使用される他の方法と比較して、最小限であり、試験に要する時間を、著明に節減し、２〜３日単位において短縮する。試料の調製における変動（培養条件、培養時間）は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを使用する、微生物の同定に影響を及ぼさず、したがって、結果の信頼性を確実にする。
【００４５】
鑑別増殖プレートと、鑑別増殖パネルとは、同じ原理に従い作動するが、鑑別増殖プレートは、それらによる、選択培地又は鑑別培地の、固相における使用において異なる。各プレートに、試料を線条接種し、微生物の増殖に適した条件下においてインキュベートし、コロニーの形成を評価する。鑑別増殖プレートを利用する、本開示の方法は、コロニーの増殖が、一晩にわたるインキュベーションの後において、目視により評価されるのではなく、それが、裸眼に目視可能となる前に（例えば、６時間、７時間、８時間、１０時間、１２時間未満後に）、コロニーの増殖を明らかにするイメージング技術を使用する点において、現行において用いられている、純度プレートワークフローと異なる。これらの技術は、限定するものではないが、光学顕微鏡法、近視野イメージング及び／又は自己蛍光法を含む。鑑別増殖プレートの画像を撮像し、光学密度などの画像変数に基づき、かつ／又は単一菌標準品及び／又は複数菌標準品のライブラリーとの比較により、単一菌対複数菌判定を下すことができる。
【００４６】
鑑別増殖プレートは、手動により線条接種される場合もあり、自動化線条接種器を使用して線条接種される場合もある。場合によって、異なる試料濃度を使用して、多数の鑑別増殖プレートに線条接種することが有用な場合もある。
【００４７】
図３は、本開示の実施形態に従う、例示的な鑑別増殖プレート３００を描示する。５％の血液溶解させたトリプシンソイ寒天などの非選択培地３０１は、プレート３００の、中心部分に位置させされられる場合もあり、周縁部分に位置させる場合もあり、選択培地３０２、３０３などは、プレートに沿って、放射状に配置され得る。
【００４８】
上において記載された、方法及びシステムを使用して生成された、微生物同定データは、複数菌試料にフラグ付けするのに使用され得る。一部の実施形態において、同定データは、ＡＳＴ結果の解釈の一助となるのに使用され得る。
【００４９】
一部の実施形態において、単一のカセットは、上記において記載した、鑑別増殖パネル及び複数のウェルが、各ウェル中で様々な濃度の多数の抗菌剤を含む、ＡＳＴパネルの両方を含む。これらを利用する、カセット、ＡＳＴパネル及び自動化ＡＳＴシステムについて、全ての目的のために、参照により組み込む、同一出願人による、米国付与前公開第２０１８／００８８１４１号において記載されている。
【００５０】
本明細書において記載された方法の、高速ＡＳＴと並行した使用を示す例は、図４に示される。図に示されたインキュベーション時間は、高速ＡＳＴプラットフォームの速度を例示するものであり、限定的であることを意図するものではない。例示された場合において、複数菌性の同定結果は、決定的な同定をもたらし、次いで、これが、ＡＳＴアルゴリズムに報告されて、定量的なＡＳＴ結果並びに定性的解釈基準が、診療所に、決定及び報告されることを可能とする。この場合は、高速ＡＳＴ、ＭＡＬＤＩ、流体及び試料の操作など、多数のモジュールによるシステムの組込みにより可能とされる、自動化処理の使用をさらに例示する。
【００５１】
本開示のある特定の実施形態に従う、高速ＡＳＴ法は、以下のステップ：まず、微生物含有試料を、（ａ）抗菌剤を含まない、少なくとも１つのリザーバー（即ち、増殖対照リザーバー）及び（ｂ）そのアニオン性表面電荷に応じて、微生物の増殖に、鑑別として影響する試薬（例えば、低度のアニオン性表面電荷を伴う微生物と比べて、高度のアニオン性電荷を伴う微生物の増殖を低減する試薬）を含む、少なくとも１つの被験リザーバーを含む、複数のリザーバーを含む、ＡＳＴ試験パネルに接種するステップを伴う。
【００５２】
試験パネルはまた、典型的に、複数種の抗菌剤のための希釈系列を規定する、複数のリザーバーも含み、本開示のＡＳＴ法は、一般に、各抗菌剤中の、微生物の増殖を、希釈系列にわたり評価して、各抗菌剤について、最小阻害濃度を決定し、任意選択的に、切断点濃度を決定するステップを伴う。微生物の増殖を、抗菌剤の希釈系列について評価する前に、試験パネルを、微生物の増殖に適切な条件下において、例えば、２５°、３０°、３５°、３７°などの温度（摂氏温度）において、任意選択的に、インキュベーション時間の、少なくとも一部において、攪拌しながら、ある時間にわたりインキュベートする。インキュベーション後、微生物の増殖を、少なくとも１つの増殖対照リザーバー内において評価する。増殖が、所定の最小レベルを満たす、又はこれを超える場合、各抗菌剤中の、微生物増殖のレベルを、各被験濃度において評価する、１種以上のエンドポイントアッセイを実施する。次いで、これらの結果を、手動により、又はアルゴリズムにより査定して、試料が感受性である抗菌剤を、この最小阻害濃度と共に同定する。
【００５３】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦのための試料は、市販のＭＡＬＤＩ標的プレート及びマトリックス溶液を使用して調製され得る。一般的な試料の調製において、適切なＭＡＬＤＩマトリックスを含む液体は、適切な溶媒及び微生物試料と組み合わされて、液体のＭＡＬＤＩ試料を形成する。ＭＡＬＤＩ試料は、専用のＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量分析器に入れられる前に、任意選択的に、乾燥させた（例えば、溶媒の蒸発により）、ＭＡＬＤＩ標的プレートに適用される（例えば、ＭＡＬＤＩ標的プレートにスポッティングされる。）。代替的に、液体の微生物試料は、ＭＡＬＤＩ標的プレートにスポッティングされ、適切なＭＡＬＤＩマトリックスを含む液体を添加する前に、乾燥させる。代替的に、微生物試料は、標的プレートに塗布され得る。任意選択の抽出ステップは、スポッティングされた、当業者に公知の微生物に対して実施され得る。質量スペクトルが生成され、参照スペクトルのデータベースに対して比較され、同定判定が下される。
【００５４】
微生物試料は、無傷微生物、溶解させた微生物又は沈殿させた、又は単離された、微生物のタンパク質、脂質、糖脂質、糖タンパク質など、微生物の成分を含み得る。一部の場合に、微生物試料は、例えば、生化学的基質、抗体、アプタマー、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は、試料中の、微生物の種若しくは株の存在若しくは非存在を指し示す、他の報告試薬若しくは検出試薬の添加により加工される。
【００５５】
無傷微生物は、固相において、例えば、プレートから採取された、単一の微生物コロニーとして用意される場合もあり、液相において、例えば、微生物コロニーの液体培養物又は患者試料から得られた液体培養物として用意される場合もある。微生物の溶解は、標的上のスポッティングの後において、ギ酸などにより実施される場合もあり、標的上のスポッティングの前に実施される場合もある。微生物の成分は、タンパク質の溶解及びエタノール沈殿など、当技術分野において公知の方法に従い、用意され得る。
【００５６】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析は、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ（ＭＡＬＤＩ  Ｂｉｏｔｙｐｅｒ（商標））、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ（ＶＩＴＥＫ（商標）ＭＳ）、株式会社島津製作所、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎなどにより販売されている装置など、特注又は市販の装置を使用して実施され得る。微生物を同定するための、標準的な質量スペクトルのデータベースもまた、Ａｎｄｒｏｍａｓ、ｂｉｏＭｅｒｉｕｘ（ＳＡＲＡＭＩＳ）などから市販されており、例えば、ｍＭＡＳＳ、Ｍａｓｓ−Ｕｐ、ｐｋＤＡＣＬＡＳＳ、ＭＡＬＤＩｑｕａｎｔ、ＳｐｅｃｔｒａＢａｎｋなど、オープンソース又は公開のデータベースもまた、利用可能である。代替的に、又は加えて、特注の質量スペクトルデータベースも、試料スペクトルからの同定のために使用され得る。
【００５７】
微生物の同定に適したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマトリックスは、限定するものではないが、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＨＣＣＡ）、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）、２，５−ジヒドロキシアセトフェノン（ＤＨＡＰ）、シナピン酸、３−ヒドロキシピコリン酸及びこれらの混合物を含み得る。水、エタノール、アセトニトリル、トリフルオロ酢酸及びこれらの混合物を含む、多数の溶媒が、これらのマトリックスに適し得る。
【００５８】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ用の試料調製及び分光法は、手動により実施される場合もあり、Ｃｏｐａｎ及び他の販売元により販売されている自動化システムなどの自動化システムを使用して実施される場合もある。
【００５９】
微生物
感染は、微生物由来の任意の感染因子、例えば細菌、真菌細胞、古細菌及び原生動物を含むことができる。一部の実施例では、感染因子は細菌、例えばグラム陽性菌、グラム陰性菌及び非定型細菌である。抗菌耐性微生物は、抗菌剤、即ち抗細菌薬、抗真菌薬、抗古細菌医薬及び抗原生動物薬に対して耐性のある微生物とすることができる。
【００６０】
微生物（例えば、微生物の液体懸濁液）は、微生物の１つの株を含んでいてもよい。微生物は、微生物の１種を含んでいてもよい。微生物は、微生物の１株よりも多くの株を含んでいてもよい。微生物は、微生物の１目を含んでいてもよい。微生物は、微生物の１綱を含んでいてもよい。微生物は、微生物の１科を含んでいてもよい。微生物は、微生物の１界を含んでいてもよい。
【００６１】
微生物（例えば、微生物の液体懸濁液）は、１株よりも多くの微生物の株を含んでいてもよい。微生物は、１種よりも多くの微生物の種を含んでいてもよい。微生物は、１属よりも多くの微生物の属を含んでいてもよい。微生物は、１目よりも多くの微生物の目を含んでいてもよい。微生物は、１綱よりも多くの微生物の綱を含んでいてもよい。微生物は、１科よりも多くの微生物の科を含んでいてもよい。微生物は、１界よりも多くの微生物の界を含んでいてもよい。
【００６２】
微生物は、細菌であってもよい。細菌の例には、限定するものではないが、アセトバクター・アウランティウス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｕｒａｎｔｉｕｓ）、アシネトバクター・ビチュメン（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂｉｔｕｍｅｎ）、アシネトバクター属種（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、アクチノマイセス・イスラエリイ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｉｉ）、アクチノマイセス属種（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、アエロコッカス属種（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、アナプラズマ（Ａｎａｐｌａｓｍａ）、アナプラズマ・ファゴシトフィリウム（Ａｎａｐｌａｓｍａ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ）、アゾリゾビウム・カウリノダンス（Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｃａｕｌｉｎｏｄａｎｓ）、アゾトバクター・ヴィネランディイ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、バシルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、バシルス・ブレヴィス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バシルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バシルス・フシフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ）、バシルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バシルス・ミコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｙｃｏｉｄｅｓ）、バシルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、バシルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バシルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、バクテロイデス・フラギリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、バクテロイデス・ギンギバリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、バクテロイデス・メラニノゲニカス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ）（プレボテラ・メラニノゲニカ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ）としても公知である。）、バルトネラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）、バルトネラ・ヘンセラエ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｈｅｎｓｅｌａｅ）、バルトネラ・クウィンタナ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｑｕｉｎｔａｎａ）、バルトネラ属種（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、ボルデテラ・ペルタスシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボルデテラ属種（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、ブルセラ・アボルタス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）ブルセラ・メリテンシス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉ��ｅｎｓｉｓ）、ブルセラ属種（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ブルセラ・スイス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ）、ブルクホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、ブルクホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）、ブルクホルデリア・マレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ）、ブルクホルデリア・シュードマレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、カリマトバクテリウム・グラニュロマチス（Ｃａｌｙｍｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｌｉ）、カンピロバクター・フィータス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｔｕｓ）、カンピロバクタージェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・ピロリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、カンピロバクター属種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、クラミジア属種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐｐ．）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クラミドフィラ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）、クラミドフィラ・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（以前はクラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と呼ばれた。）、クラミドフィラ・プシッタチ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）（以前はクラミジア・プシッタチ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）と呼ばれた。）、クラミドフィラ属種（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｓｐｐ．）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、クロストリジウム・ボツリナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）（以前はクロストリジウム・ウェルチイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｗｅｌｃｈｉｉ）と呼ばれた。）、クロストリジウム属種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム・ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コリネバクテリウム・フシフォルメ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｅ）、コリネバクテリウム属種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、コキシエラ・ブルネチイ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉ）、エーリキア・シャフェンシス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ）、エーリキア属種（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．）、エンテロバクター・クロアセ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、エンテロバクター属種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス・アビウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｖｉｕｍ）、エテロコッカス・デュランス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｕｒａｎｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・ガルリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・マロラタス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｌｏｒａｔｕｓ）、エンテロコッカス属種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、エスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、フランシセラ属種（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、ガルデネレラ属種（Ｇａｒｄｅｎｅｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ガルデネレラ・ヴァギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、ヘモフィリウス属種（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｕｓ  ｓｐｐ．）、ヘモフィリウス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ヘモフィリウス・ダクレイイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ）、ヘモフィリウス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィリウスパラインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィリウス・ペルタッシス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ヘモフィリウム・ヴァギナリス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、ヘリコバクター属種（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ属種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバシルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバシルス・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバシルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバシルス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、ラクトバシルス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、レジオネラ属種（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、レプトスピラ属種（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐｐ．）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリア属種（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｐｐ．）、メタノバクテリウム・エクストロケンス（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｒｏｑｕｅｎｓ）、ミクロバクテリウム・マルチフォルメ（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ）、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）、モラキセラ・カタラリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、マイ���バクテリウム・ジフテリエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、マイコバクテリウム・イントラセルラレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバクテリウム・レプレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）、マイコバクテリウム・レプレエムリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅｍｕｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム・フレイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｌｅｉ）、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、マイコバクテリウム属種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、マイコバクテリウム・ツベルキュロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、マイコプラズマ・ゲニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・ペネトランス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｅｎｅｔｒａｎｓ）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、マイコプラズマ属種（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ナイセリア・ゴノリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ナイセリア属種（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐｐ．）、ノカルディア属種（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｓｐｐ．）、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、パスツレラ属種（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、パスツレラ・ツラレンシス（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、ペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ポルフィロモナス・ギンギバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、プレボテラ・メラニノゲニカ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ）（以前はバクテロイデス・メラニノゲニカス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ）と呼ばれた。）、
プロテウス属種（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｓｐｐ．）、シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）、リゾビウム・ラジオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、リケッツィア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、リケッツィア・プロワゼスキイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、リケッツィア・プシッタチ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）、リケッツィア・クウィンタナ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｑｕｉｎｔａｎａ）、リケッツィア・リケッツィ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、リケッツィア属種（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓｐｐ．）、リケッツィア・トラコーメ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｅ）、ロシャリメア（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ）、ロシャリメア・ヘンセラ（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ  ｈｅｎｓｅｌａｅ）、ロシャリメア・クウィンタナ（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ  ｑｕｉｎｔａｎａ）、ロシア・デントカリオサ（Ｒｏｔｈｉａ  ｄｅｎｔｏｃａｒｉｏｓａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、サルモネラ属種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、サルモネラ・ティフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、シゲラ・ディセンテリエ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、シゲラ属種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、スピリルム・ボルタンス（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｖｏｌｕｔａｎｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス属種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、ステノトロホモナス属種（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・アビウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｖｉｕｍ）、ストレプトコッカス・ボヴィス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｕｓ）、ストレプトコッカス・ファセイウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｃｅｉｕｍ）、ストレプトコッカス・フェカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・フェルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｅｒｕｓ）、ストレプトコッカス・ガリナルム（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、ストレプトコッカス・ラクティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ストレプトコッカス・ミチオル（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｏｒ）、ストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・オラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ラッタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｔｔｕｓ）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・サングィス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｓ）、ストレプトコッカス・ソブリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｂｒｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、トレポネマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、トレポネマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、トレポネマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、トレポネマ属種（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｐｐ．）、ウレアプラズマ属種（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ビブリオ・コンマ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｏｍｍａ）、ビブリオ・パラヘモリティカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ビブリオ属種（Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐｐ．）、ビブリオ・バルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）、ビリダンス・ストレプトコッキ（ｖｉｒｉｄａｎｓ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、ウォルバキア（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、エルシニア・エンテロコリティカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、エルシニア・ペスティス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、エルシニア・シュードツベルキュロシス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．）及びエルシニア属種（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｓｐｐ．）が含まれる。
【００６３】
微生物は、真菌であってもよい。真菌の例には、限定するものではないが、アスペルキルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、ブラストマイセス属種（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、カンジダ属種（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．）、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コッキジオイデス属種（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｓｐｐ．）、クリプトコッカス属種（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、エクセロイラム（Ｅｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍ）、フサリウム（ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ヒストプラズマ属種（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．）、イッサチェンキア属種（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ  ｓｐｐ．）、ムコルマイセテス（ｍｕｃｏｒｍｙｃｅｔｅｓ）、ニューモシスティス属種（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐｐ．）、リングワーム（ｒｉｎｇｗｏｒｍ）、セドスポリウム（ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）、スポロトリックス（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ）及びスタキボトリス属種（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｓｐｐ．）が含まれる。微生物は、原生動物であってもよい。原生動物の例には、限定するものではないが、エントアメーバヒストリチカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、プラスモジウム属種（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｐｐ．）、ジアルジア・ラムブリア（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ）及びトリパノソマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）が含まれる。
【００６４】
抗菌剤
微生物が細菌である場合、例示的な抗菌剤には、アミカシン、アミノグリコシド、アミノグリコシドアモキシリン、アミノグリコシド、アモキシリン、アモキシリン／クラブラン酸、アムピシリン、アムピシリン／スルバクタム、アンチトキシン、アルスフェナミン、アジスロマイシン、アズロシリン、アズトレオナム、β−ラクタム、バシトラシン、カプレオマイシン、カルバペネム、カルベニシリン、セファクロル、セファドロキシル、セファレキシン、セファロシン、セファロチン、セファマンドール、セファゾリン、セフジニル、セフジトレン、セフェピム、セフィキシム、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフォキシチン、セフポドキシム、セフプロジル、セフタロリン、セフタロリンフォサミル、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトビプロール、セフトリアキソン、セフロキシム、セファロスポリン、クロラムフェニコール、クロラムフェニコール（Ｂｓ）、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、クリンダマイシン、クロファジミン、クロキサシリン、コリスチン、コ−トリモキサゾール、シクロセリン、ダルババンシン、ダプソン、ダプトマイシン、デメクロシクリン、ジクロキサシリン、ジリスロマイシン、ドリペネム、ドキシシクリン、エノキサシン、エルタペネム、エリスロマイシン、エタムブトール、エタムブトール（Ｂｓ）、エチオナミド、フルクロキサシリン、フルオロキノロン、フルオロキノロンズ、ホスフォマイシン、フラゾリドン、フシジン酸、ガチフロキサシン、ゲルダナマイシン、ゲミフロキサシン、ゲンタマイシン、グレパフロキサシン、ハービマイシン、イミペネム／シラスタチン、イソニアジド、カナマイシン、レボフロキサシン、リンコマイシン、リネゾリド、ロメフロキサシン、ロラカルベフ、リゾスタフィン、マクロライド、マフェニド、メロペネム、メチシリン、メトロニダゾール、メズロシリン、ミノサイクリン、モキシフロキサシン、ムピロシン、ナフシリン、ナフシリン、ナリジクス酸、ネオマイシン、ネチルマイシン、ニトロフラントイン（Ｂｓ）、ノルフロキサシン、オフロキサシン、オプトヒン、オリタバンシン、オキサシリン、オキシテトラサイクリン、パルモマイシン、ペニシリン、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、ピペラシリン、ピペラシリン／タゾバクタム、プラテンシマイシン、ポリミキシンＢ、ポシゾリド、ピラジナミド、キヌプリスチン／ダルフォプリスチン、ラデゾリド、ラキシバクマブ、リファブチン、リファムピシン、リファムピン、リファペンチン、リファキシミン、ロキシスロマイシン、銀スルファジアジン、スパルフロキサシン、スペクチノマイシン、スペクチノマイシン（Ｂｓ）、スピラマイシン、ストレプトグラミン、ストレプトマイシン、スルバクタム、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファジメトキシン、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、スルファニリミド、スルファサラジン、スルフィソキサゾール、スルホンアミドクリソイジン、テジゾリド、テイコプラニン、テイキソバクチン、テラバンシン、テリスロマイシン、テマフロキサシン、テモシリン、テトラサイクリン、チアムフェニコール、チカルシリン、チカルシリン／クラブラン酸、チカルシリン／クラブラン酸、���ゲサイクリン、チゲサイクリン（Ｂｓ）、チニダゾール、ＴＭＰ／ＳＭＸ、トブラマイシン、トレゾリド、トリメトプリム（Ｂｓ）、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、トロレアンドマイシン、トロバフロキサシン、バンコマイシン及びこれらの属又はこれらの変種が含まれる。
【００６５】
微生物とのその相互作用が、微生物表面上の負電荷に影響を及ぼしかつ微生物表面上の負電荷によって影響を受ける、抗菌剤には：細胞表面に結合するとＭｇ２＋イオンを変位させ、脂質膜成分を架橋し、それによって外膜を破壊しかつ薬物の取込みを強化する、ポリカチオン性アミノクリコシド；微生物細胞とのその結合が膜の負電荷にも依存しかつ変異及びプラスミド媒介型耐性が共に膜の負電荷を低減させることによって生ずる、カチオン性ポリミキシン（コリスチン及びポリミキシンＢ）；及び宿主自然免疫応答カチオン性抗菌剤ペプチドに似ておりかつその膜破壊を生じる動作メカニズムにＣａ２＋及びホスファチジルグリセロールを必要とし、その耐性は細胞表面電荷の変化も伴うことがあるリポペプチドである、ダプトマイシンを含めることができる。
【００６６】
微生物が真菌である場合、例示的な抗菌剤には、５−フルオロシトシン、アバフンジン、アルバコナゾール、アリルアミン、アムホテリシンＢ、アンコボン、アニデュラフンジン、アゾール、ペルーバルサム、安息香酸、ビフォナゾール、ブトコナゾール、カンジシジン、カスポフンジン、シクロピロックス、クロトリマゾール、クレセムバ、クリスタルバイオレット、ジフルカン、エキノキャンジン、エコナゾール、エフィナコナゾール、エポキシコナゾール、フェンチコナゾール、フィリピン、フルコナゾール、フルシトシン、グリフルビンＶ、グリセオフルビン、グリス−ペグ、ハロプロジン、ハマイシン、イミダゾール、イサブコナゾール、イサブコナゾニウム、イソコナゾール、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ラミシル、ルリコナゾール、ミカフンジン、ミコナゾール、ナタマイシン、ノキサフィル、ナイスタチン、オモコナゾール、オンメル、オラビグ、オキシコナゾール、ポサコナゾール、プロピコナゾール、ラブコナゾール、リモシジン、セルタコナゾール、スポラノックス、スルコナゾール、テルビナフィン、テルコナゾール、チアゾール、チオカルバメート抗真菌剤、チオコナゾール、トルナフェート、トリアゾール、ウンデシレン酸、ブイフェンド、ボリコナゾール、及びこれらの属又はこれらの変種が含まれる。
【００６７】
微生物が原生生物の場合、例示的な抗菌剤には、８−アミノキノリン、アセタルゾル、アメーボゾアに対する薬剤、アイラントン、アモジアキン、アムホテリシンＢ、アムプロリウム、抗トリコモナス剤、アプラスモマイシン、アルスチノール、アルテリン酸、アルテメザー、アルテメザー／ルメファントリン、アルテミシニン、アルテモチル、アルテロラン、アルテスネート、アルテスネート／アモジアキン、アトバクオン、アトバクオン／プログアニル、アザニダゾール、アジスロマイシン、ベンズニダゾール、ブロキシキノリン、ブパルバクオン、カルバルゾン、カルニダゾール、キニオフォン、クロロキン、クロルプログアニル、クロルプログアニル／ダプソン、クロルプログアニル／ダプソン／アルテスネート、クロルキナルドール、クロマルベオレート抗寄生虫薬、シンコナ、シパルガミン、クラズリル、クレファミド、クリオキノール、コッキジオスタット、コジネオプシン、コトリファジド、クリプトレピン、シクログアニル、デヒドロメチン、ジフェタルゾン、ジヒドロアルテミシニン、ジロキサニド、ジミナゼン、ジスルフィラム、ドキシサイクリン、エフロルニチン、ＥＬＱ−３００、エメチン、エトファミド、エクスカバタ抗寄生虫薬、フマギリン、フラゾリドン、グリコビアルゾール、ＧＮＦ６７０２、ハロファントリン、ヒドロキシクロロキン、イミドカルブ、イプロニダゾール、キナノキ属の樹皮（Ｊｅｓｕｉｔ’ｓ  ｂａｒｋ）、ＫＡＦ１５６、ルメファントリン、マデュラマイシン、メフロキン、メガゾール、アンチモン酸メグルミン、メラルソプロール、メパクリン、メトロニダゾール、ミルテフォシン、ニューロレニンＢ、ニカルバジン、ニフルチモックス、ニモラゾール、ニタルゾン、ニチジン、ニトロフラール、オリバシン、オルニダゾール、オロイジン、パマキン、パルモマイシン、ペンタミジン、５価アンチモニアル、ファンキノン、フェナミジン、ピペラキン、プリマキン、プログアニル、プロジェクト５２３、プロペニダゾール、ピリメタミン、ピロナリジン、クィンファミド、キニン、ロニダゾール、スケジュラ・ロマナ（Ｓｃｈｅｄｕｌａ  Ｒｏｍａｎａ）、ＳＣＹＸ−７１５８、セクニダゾール、セマピモド、スチボグルコン酸ナトリウム、スピロインドロン、スルファドキシン、スルファドキシン−ピリメタミン、スルファレン、スラミン、タフェノキン、テクロザン、テノニトロゾール、チルブロキノール、チニダゾール、トリメトレキセート、殺トリマノソーマ剤、Ｗａｒｂｕｒｇのチンキ及びこれらの属又はこれらの変種が含まれる。
【００６８】
抗菌剤は、本明細書に列挙される薬物に類似のメカニズムによって動作する薬物であってもよい。当技術分野で公知のその他の抗菌薬が、本明細書に記述される方法で使用されてもよい。
【００６９】
液体懸濁液
液体は、カチオン調整されたＭｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎブロスなどの増殖培地を含んでいてもよい。この培地は、微生物増殖及び安定性を促進させることが当業者に公知の添加剤を含んでいてもよい。種々の抗菌剤に加え、種々の試験ウェルは、特定の抗菌剤に関してＡＳＴ精度を改善することがわかっている添加剤を含んでいてもよい。例えば、追加の塩化ナトリウムを、オキサシリンを含む試験薬に添加してもよく、追加のカルシウムを、ダプトマイシンを含む試験薬に添加してもよい。
【００７０】
生体試料
本明細書に記述される微生物は、生体試料から誘導されてもよい。一部の実施形態では、生体試料は、微生物、例えば細菌及び真菌細胞を含む任意の試料である。生体試料は、臨床試料から誘導されてもよい。
【００７１】
例示的な生体試料には、限定するものではないが、全血、血漿、血清、痰、尿、便、白血球、赤血球、バフィーコート、涙、粘液、唾液、精液、膣液、リンパ液、羊水、脊椎又は脳脊髄液、腹膜滲出液、胸膜滲出液、滲出液、穿刺液、上皮スメア、生検、骨髄試料、嚢胞又は膿瘍からの流体、滑液、硝子体又は房水、眼の洗浄液又は吸引液、気管支肺胞洗浄液、気管支洗浄液又は肺洗浄液、肺吸引液、並びに器官及び組織であって、限定するものではないが、肝臓、脾臓、腎臓、肺、腸、脳、心臓、筋肉及び膵臓などを含めたもの、スワブ（限定するものではないが、創傷スワブ、頬側スワブ、喉スワブ、鼻スワブ、膣スワブ、尿道スワブ、子宮頸スワブ、直腸スワブ、病変スワブ、膿瘍スワブ、鼻咽頭スワブ及び同様のものが含まれる。）及びこれらの任意の組合せを含めることができる。細菌培養物又は細菌単離物、真菌培養物又は真菌単離物も含まれる。当業者なら、単離物、抽出物、又は上記例示的な生体試料のいずれかから得られた材料も、本発明の範囲内にあることも理解し得る。
【００７２】
生体試料から得られた微生物は、培養されてもよく又は当技術分野で通常行われるように処理されてもよい。
【００７３】
ＡＳＴ法で使用される対照
対照は、微生物が影響を受け難い抗菌剤を含んでいてもよい。例として、アッセイがグラム陽性菌の感受性を決定するのに使用される場合、対照（及び試験のインキュベーション）は、グラム陰性菌を標的とする１種以上の抗菌剤を含んでいてもよく、アッセイが、真核微生物の感受性を決定するのに使用される場合、対照（及び試験のインキュベーション）は、１種以上の抗菌性の抗菌剤を含んでいてもよい。
【００７４】
一部の実施形態では、対照は、抗菌剤がないこと又は微生物が影響を受け難い１種以上の抗菌剤があること以外、その他の点では同一の条件下で微生物から測定された正の制御である。一部の実施形態では、対照は、栄養素がないこと以外、その他の点では同一の条件下で微生物から測定される。一部の実施形態では、対照は、微生物の増殖を阻害することが公知である１種以上の毒素がある、その他の点では同一の条件下で、微生物から測定される。
【００７５】
対照は、過去に得られた（ｈｉｓｔｏｒｉｃ）対照であってもよい。一部の実施形態では、試験のインキュベーションは、対照インキュベーションが行われた後に行われる。一部の実施形態では、対照は、試験インキュベーションを含むカートリッジとは区別されるカートリッジで行われる。
【００７６】
カートリッジ
カートリッジは、微生物の液体懸濁液を保持し増殖させることが可能な容器とすることができる。カートリッジの非限定的な例には、培養フラスコ、培養皿、ペトリ皿、バイオアッセイ皿、培養管、試験管、微量遠心管、瓶、マイクロチャンバープレート、多重チャンバープレート、マイクロタイタープレート、マイクロプレートを含めることができる。カートリッジは１つのチャンバーを含んでいてもよい。カートリッジは複数のチャンバーを含んでいてもよく、各チャンバーは、別の空間から物理的に単離された状態で液体懸濁液を保持することが可能な空間であってもよく；チャンバーの例は、マルチウェルプレート内のチャンバーである。カートリッジは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、２４、４８、９６、１９２、３８４、１５３６又はそれよりも多くのチャンバー、及びそれらの間の任意の数のチャンバーを含んでいてもよい。カートリッジチャンバーの底部は、平らであっても、丸くても、Ｖ字形であってもよい。
【００７７】
カートリッジ上の複数のチャンバー内に存在する抗菌剤は、媒体に懸濁することができる。一部の実施形態では、抗菌剤は、抗菌被膜の形で存在する。ある特定の実施形態では、抗菌剤は固体形態にある。一部の実施形態では、固体抗菌剤は凍結乾燥されかつ／又は乾燥される。ある特定の実施形態は、微生物の懸濁液の導入前に、抗菌被膜として、固体形態で、凍結乾燥され又は乾燥させて、１つ以上のカートリッジチャンバーに存在する１種以上の抗菌剤を提供する。
【００７８】
抗菌希釈系列は、試料によるプレート接種前に、凍結されても、凍結乾燥されても、又は新鮮に調製されてもよい。ある場合には、カートリッジの接種は、手で又は自動化システムを使用して行うことができる。新鮮な抗菌プレートの場合などの一部の実施例では、自動化液体取扱いシステムを使用して、抗菌剤希釈系列を持つカートリッジを調製してもよい。接種プロセスは、当技術分野で公知であり得る様々なプロセスのいずれかを含むことができる。
【００７９】
本明細書に記述されるように、カートリッジは、チェックポイントアッセイ及び複数の異なる増殖アッセイなど、多数の試験順序を実施するために、流体の様々な組合せを含有するのに使用することができる。一部の実施形態では、カートリッジは、１つ以上のチェックポイントアッセイを容易にするのに使用されるひと組のチャンバー、及び１つ以上の増殖アッセイを容易にするのに使用されるひと組のチャンバーを有する。例として、カートリッジは、行及び列に配置構成されたチャンバーのアレイを含むことができる。カートリッジは、ひと組の対照チャンバー及びひと組の抗菌剤試験チャンバーを含むことができる。対照チャンバーの組は２つのチャンバーを含むことができ、試験チャンバーの組は、プレートに沿ってチャンバーの残りを含むことができる。一部の実施形態では、対照チャンバーの組は少なくとも２つのチャンバーを含み、１つのチャンバーが増殖チャンバーであり別のチャンバーが非増殖チャンバーである。一部の実施形態では、増殖チャンバーは、患者試料中の微生物を、インキュベーション期間中にブロス内で増殖させることができるように、ブロスと患者試料との組合せを含み又は含むように接種される。ある特定の実施形態では、抗菌剤は、チェックポイントアッセイチャンバーに添加されない。それに対して、一部の実施形態では、非増殖チャンバーは、患者試料なしでブロスを含む又は含むように（即ち、患者試料からの微生物が不在のブロス）接種することができる。一部の実施形態では、抗菌剤も非増殖チャンバーに添加されない。したがってインキュベーション期間中、非増殖チャンバーは、微生物が増殖できる増殖チャンバーと比較して、ベースラインとして働くことができる。
【００８０】
一部の実施形態では、各カートリッジは、「試験パネル」、各抗菌剤に定められた希釈系列（例えば、２倍希釈系列、１０倍希釈系列など）で多数のウェル全体にわたり分布された複数の抗菌剤を含む。さらに、各カートリッジ又は試験パネルは、増殖対照チャンバー、非増殖（汚染）対照チャンバー及び／又は生理食塩液対照チャンバーなどの対照チャンバーを含有することができる。生理食塩液対照チャンバーは、接種物中の微生物の初期濃度にほぼ等しいＦＩＴ対照を表すことができる。カートリッジは、カバー（例えば、取外し可能な蓋）、及び抗生剤構成及び独自のコードを独自に定める識別子（例えば、バーコード）であってプレートを定めかつＨＩＰＡＡに準拠する独自の患者試料に関連付けることができる識別子を備えた、多数のチャンバー（例えば、９６チャンバーカートリッジ又は３８４チャンバーカートリッジ）を含むことができる。
【００８１】
試験チャンバーは、患者試料の様々な組合せのうちの任意の組合せ、並びに感受性を分析できる様々なタイプ及び濃度の抗菌剤を含むことができる。チャンバーの行は、特定の抗菌剤に特化させることができ、その抗菌剤の濃度は、同じ行の列同士の間で変えることができる。例えばカートリッジは、ペニシリンを含有するチャンバーの行を有することができ、各チャンバーは左から右に、増大する濃度のペニシリンを含有する。
【００８２】
当然ながら、その他の実施例が可能である。例えば、種々のチャンバー及びチャンバーの組を、カートリッジに沿った様々な場所のいずれかに位置決めすることができる。さらに、種々の組のチャンバー（例えば、対照チャンバー及び試験チャンバー）は、カートリッジに沿って、より多くの又はより少ない個々のチャンバーを含むことができる。さらに、場合によっては、全てではないチャンバーが試験中に使用され／占有される。
【００８３】
自動化ＡＳＴ法
本明細書に記述される方法は、市販の設備、特注された設備又はこれらの組合せを使用して、自動化された手法で行うことができる。方法の自動化は、より多くの数のアッセイの性能並びにアッセイ間で増大した一貫性を可能にする。自動化は、これらの方法の速度及び分解能も増大させることができる。自動化ＡＳＴ法は、例えば、参照により本明細書に組み込む米国公開第２０１９／０２１２３３９号において記載されている。
【００８４】
表面結合プローブアッセイ
表面結合アッセイ（表面結合プローブアッセイとも呼ぶ。）は、シグナル生成剤を利用することができる。シグナル生成剤は、典型的には、微生物に結合することが可能な部分（例えば、微生物表面に結合する抗体及び／又はレクチン、微生物表面に非特異的に結合する荷電部分及び／又は機能的部分）、及びシグナルを提供すること又はシグナルの生成に寄与することが可能な化学的部分（例えば、酵素化学発光団及びランタニドキレート）を含む。例示的な酵素には、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ベータ−ラクタマーゼ及びこれらの組合せが含まれる。
【００８５】
シグナル発生物質には、１種以上の微生物受容体にコンジュゲートされた１種以上の化学部分を含めてもよい。シグナル発生物質には、限定するものではないが、１種以上の触媒（酵素、金属酸化物ナノ粒子、有機金属触媒、シグナル増幅のために設計されたナノ粒子（本出願が優先権を主張しかつ参照によりそれらの全体を本明細書に組み込む、米国仮出願に記載されたものなど）、シグナル発生要素を含むバクテリオファージ、蛍光団（有機蛍光団、ユーロピウム、又はルテニウム（ＩＩ）、レニウム（Ｉ）、白金（ＩＩ）、白金（ＩＩ）含有有機金属を含む。）、及び／又は比色性色素（有機染色を含む。））が含まれる。ナノ粒子、デンドリマー及び／又はその他のナノスケール構造であって酵素、蛍光団及び／又は有機金属分子を含むものなど、上記の組合せが使用されてもよい。
【００８６】
化学的部分は、シグナル生成剤を微生物に接触させる前に、シグナル生成剤にコンジュゲートされてもよく、一方、シグナル生成剤は、最初に微生物に接触され又はシグナル生成剤が微生物に接触した後に接触される。
【００８７】
シグナル生成剤が、微生物を含有するＡＳＴ希釈物に添加されるとき、シグナル生成剤受容体（例えば、特異的に又は非特異的に微生物に結合することができる部分）は、微生物表面に会合する可能性がある。このように微生物が、例えば溶液中にあるときにより無傷であるほど、これらの細菌に会合することになるシグナル生成剤の数は多くなる。その結果、無傷の細菌の数と、無傷の細菌に結合していないものとして定義される、溶液中で遊離しているシグナル生成剤の数との間には、逆の関係がある。遊離シグナル生成剤は、例えば抗菌処理に応答して微生物が溶解する場合、可溶性微生物成分に結合され得ることに留意されたい。
【００８８】
微生物表面に会合するかつ／又は微生物表面にインターカレートするシグナル生成剤の数は、微生物表面積に比例する。微生物表面積は、真に耐性のある微生物に強力に関連付けられる。特に、抗菌剤のＭＩＣ−及びサブ−ＭＩＣ濃度に応答して膨潤し又は延びる微生物の場合（例えば、フィラメント形成細菌）、代謝及び／又は体積による同定は、６時間未満のものと定義される、高速ＡＳＴ時点での偽感受性プロファイルを与えることがわかっている。この制約を克服するために、本発明は、微生物表面積（体積ではない）を、光シグナルなどの測定可能なシグナルに変換する。本明細書に記述される方法は、６時間未満で微生物耐性プロファイルを正確に決定することができる。
【００８９】
遊離シグナル生成剤から、微生物に会合したかつ／又は微生物にインターカレートされたシグナル生成剤を分離するために、１つ以上の分離及び／又は競合結合ステップを行うことが必要なことがある。そのようなステップには、限定するものではないが、遠心分離（例えば、ｇ−力が＞５００×ｇ）、濾過（例えば、０．４５ミクロン以下の又は０．２ミクロン以下の細孔を有するフィルターを介する。）、電気泳動、及び／又は磁気捕捉が含まれ；そのようなステップは当業者に周知である。
【００９０】
シグナル生成剤の結合を促進させかつ／又はバックグラウンドを低減するために、シグナル生成剤を添加する前に、微生物を、インキュベーション中にそれらが懸濁された液体から分離することが、さらに有利なことがある。そのような分離には、限定するものではないが、遠心分離、濾過、電気泳動及び／又は磁気捕捉が含まれてもよい。
【００９１】
シグナル生成剤は、ＡＳＴインキュベーション期間の全体にわたってそれらが存在するように、微生物及び／又は抗菌剤と一緒に添加されてもよい。この全期間は、最長で２４時間、又は８時間以内、又は５時間以内であってもよい。あるいは、シグナル生成剤は、規定されたインキュベーション期間後に、微生物及び抗菌剤に添加されてもよい。この期間は、最長で２４時間、又は８時間以内、又は４時間以内であってもよい。
【００９２】
シグナル生成剤は、壁及び／又は膜を含む微生物表面に会合するようにかつ／又はインターカレートされるように設計される。会合のために設計されたシグナル生成剤は、１種以上の抗体、レクチン、その他のタンパク質、１つ以上の荷電化学基を持つ小分子、１つ以上の官能化学基を持つ小分子、ファージ、糖タンパク質、ペプチド、アプタマー、荷電小分子、固定電荷を持つ小分子、荷電ポリマー、固定電荷を持つ荷電ポリマー、疎水性小分子、荷電ペプチド、固定電荷を持つ荷電ペプチド、親水性領域と疎水性領域とが交互に配されたペプチド、及び／又は小分子リガンドであって、有機金属錯体であってもそうでなくてもよいものを含むが、これらに限定されない結合部分を含む。微生物との会合のために設計された分子は、当業者に周知である。シグナル生成剤は、微生物に結合したままであってもよく、かつ／又は内在化してもよく、したがって全ての会合が含まれる。インターカレーション用に設計されたシグナル生成剤には、小さい疎水性分子、疎水性ペプチド、及び／又は疎水性領域と親水性領域とが交互に配されたペプチドが含まれてもよいがこれらに限定するものではない。微生物のインターカレーション用に設計された分子は、当業者に周知である。シグナル生成剤はさらに、微生物の１つ以上のタイプに特異的であってもよい。シグナル生成剤は、多数の受容体を有していてもよい。これらは、結合を強化してもよく、かつ／又は２種以上の微生物との同時結合を可能にしてもよく、そのことがさらに、細菌を凝集させる働きをし得る。シグナル生成剤の添加の前に又は同時に、溶液ｐＨを調整することが有利なことがある。これは微生物とシグナル生成剤との間の電荷−電荷相互作用を強化するのに有益なことがある。微生物のアニオン電荷は、溶液ｐＨを中性よりも上（より塩基性）に滴定することによって増加され得る。したがって、１つ以上の固定されたカチオン電荷を持つ部分を利用することが有利なことがある。
【００９３】
シグナル生成剤が、微生物特異的に結合し得ること（例えば、微生物種又は微生物の株に特異的に結合する抗体）又は微生物に非特異的に結合し得ること（例えば、当技術分野で公知の、包括的な共有又は非共有結合の形成及び別の非特異的な化学的会合による）は、注目に値する。
【００９４】
あるいは、シグナル生成剤に会合することが可能な化学物質及び／又は生化学物質が、微生物が増殖中に懸濁される液体に添加されてもよく、したがって化学物質及び／又は生化学物質は、インキュベーション中に微生物に組み込まれるようになる。これは微生物に対するシグナル生成剤の会合を強化する役割をすることができる。代替の実施形態では、シグナル生成剤そのものは、インキュベーション中に微生物が懸濁された液体中に存在してもよく、増殖中の微生物に組み込まれてもよい。
【００９５】
シグナル生成剤は増幅シグナル発生物質（増幅基）を含むことができ、したがってそれぞれの無傷の微生物からのシグナルは、各微生物に会合したシグナル生成剤の数を超えて増幅できるようになる。例えば、酵素ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は、シグナルを＞１×１０４倍増幅できることが公知である。したがって、１００個のＨＲＰ分子が各微生物表面に結合した場合、１０６の増幅が実現され得る。このことは、通常なら鑑別することができない微生物濃度の区別を可能にすることによって、ＡＳＴ決定がなされ得る速度を増大させ得る。欧州処方の使用は同様にシグナル増幅をもたらす。
【００９６】
あるいは、シグナル生成剤は、細胞膜など疎水性領域へのインターカレーションにより蛍光放出を大幅に増大させるよう設計された膜色素として、当業者に公知である光学色素前駆体を含んでいてもよい。これらのシグナル生成剤と共に設計されたアッセイは、容易に光学的に測定されるよう十分なシグナルを生成するために、平面に近付いた、より小さい体積に濃縮される微生物を必要とし得る。干渉種は、近ＩＲ蛍光団の使用を必要とし得る。
【００９７】
例示的な増幅基には、例えば、そのそれぞれの全体を参照により組み込む国際公開Ｎｏ．ＷＯ  ２０１６／０１５０２７及び国際出願Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ１６／４２５８９に記載されたものが含まれる。増幅基は、触媒、蛍光団、比色性色素、酵素、触媒又はナノ粒子を含むことができる。例示的な蛍光団は、その全体を参照により組み込む国際出願Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ１６／４２５８９の図１、表１に記載されるものを含む。増幅基は、ランタニド含むことができる。ランタニドには、限定するものではないが、ユーロピウム、ストロンチウム、テルビウム、サマリウム又はジスプロシウムが含まれる。
【００９８】
増幅基は、有機蛍光団、例えば配位錯体を含むことができる。配位錯体は、ユーロピウム配位錯体、ルテニウム配位錯体、レニウム配位錯体、パラジウム配位錯体、白金配位錯体とすることができる。増幅物質は、化学発光団、量子ドット、酵素、鉄配位触媒、ユーロピウム配位錯体、ルテニウム配位錯体、レニウム配位錯体、パラジウム配位錯体、白金配位錯体、サマリウム配位錯体、テルビウム配位錯体又はジスプロシウム配位錯体を含むことができる。
【００９９】
一部の実施形態では、増幅基は：
【０１００】
【化１】
2021531000.tif 000006
である部分を含む。
【０１０１】
一部の実施形態では、増幅基は：
【０１０２】
【化２】
2021531000.tif 000007
2021531000.tif 000008
である部分を含む。
【０１０３】
増幅基は、蛍光団又は比色性色素を含むことができる。適切な蛍光団及び比色性色素は、当業者に周知であり、それらの全体を参照により本明細書に組み込むＴｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）  Ｈａｎｄｂｏｏｋ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１１版（２０１０）並びにＧｏｍｅｓ、Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ及びＬｉｍａ  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６５（２００５）  ４５〜８０頁に記載されている。例示的な蛍光団は、例えば、そのそれぞれの全体を参照により組み込む国際公開Ｎｏ．ＷＯ  ２０１６／０１５０２７及び国際出願Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ１６／４２５８９に記載されたものも含む。
【０１０４】
適切な蛍光団又は比色性色素の例には、限定するものではないが、臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム、ＳＹＴＯＸグリーン、フェナントリジン、アクリジン、インドール、イミダゾール、シアニン、ＴＯＴＯ、ＴＯ−ＰＲＯ、ＳＹＴＯ、５−カルボキシ−２，７−ジクロロフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、５−カルボキシナフトフルオレセイン、５−カルボキシテトラメチルローダミン（５−ＴＡＭＲＡ）、５−ＦＡＭ（５−カルボキシフルオレセイン）、５−ＨＡＴ（ヒドロキシトリプタミン）、５−ＲＯＸ（カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、６−カルボキシローダミン６Ｇ、７−アミノ−４−メチルクマリン、７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン、９−アミノ−６−クロロ−２−メトキシアクリジン、ＡＣＭＡ（９−アミノ−６−クロロ−２−メトキシアクリジン）、アクリジン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ、アリザリン、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＡＭＣＡ（アミノメチルクマリン）、Ｂｏｄｉｐｙ、カルボキシ−Ｘ−ローダミン、カテコールアミン、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、ヒドロキシクマリン、リサミンローダミン、モノブロモビマン、オレゴングリーン、フィコエリスリン、ＳＹＴＯ、チアジカルボシアニン（ＤｉＳＣ３）、チオフラビン、Ｘ−ローダミン、Ｃ、又はテトラメチルローダミンイソチオシアネートが含まれる。
【０１０５】
増幅基は、有機金属化合物、遷移金属錯体又は配位錯体を含むことができる。そのような増幅基の例には、限定するものではないが、それらの全体を参照により組み込むＥＰ  ０  １８０  ４９２、ＥＰ  ０  ３２１  ３５３、ＥＰ  ０  ５３９  ４３５、ＥＰ  ０  ５３９  ４７７、ＥＰ  ０  ５６９  ４９６、ＥＰ１３９６７５、ＥＰ６４４８４、米国特許第４，２８３，３８２号、米国特許第４，５６５，７９０号、米国特許第４，７１９，１８２号、米国特許第４，７３５，９０７号、米国特許第４，８０８，５４１号、米国特許第４，９２７，９２３号、米国特許第５，１６２，５０８号、米国特許第５，２２０，０１２号、米国特許第５，３２４，８２５号、米国特許第５，３４６，９９６号、米国特許第５，３７３，０９３号、米国特許第５，４３２，１０１号、米国特許第５，４５７，１８５号、米国特許第５，５１２，４９３号、米国特許第５，５２７，６８４号、米国特許第５，５３４，６２２号、米国特許第５，６２７，０７４号、米国特許第５，６９６，２４０号、米国特許第６，１００，３９４号、米国特許第６，３４０，７４４号、米国特許第６，５２４，７２７号、米国特許第６，７１７，３５４号、米国特許第７，０６７，３２０号、米国特許第７，３６４，５９７号、米国特許第７，３９３，５９９号、米国特許第７，４５６，０２３号、米国特許第７，４６５，７４７号、米国特許第７，６２５，９３０号、米国特許第７，８５４，９１９号、米国特許第７，９１０，０８８号、米国特許第７，９５５，８５９号、米国特許第７，９６８，９０４号、米国特許第８，００７，９２６号、米国特許第８，０１２，６０９号、米国特許第８，０１７，２５４号、米国特許第８，０１８，１４５号、米国特許第８，０４８，６５９号、米国特許第８，０６７，１００号、米国特許第８，１２９，８９７号、米国特許第８，１７４，００１号、米国特許第８，１８３，５８６号、米国特許第８，１９３，１７４号、米国特許第８，２２１，７１９号、米国特許第８，２８８，７６３号、米国特許第８，３６２，６９１号、米国特許第８，３８３，２４９号、米国特許第８，４９２，７８３号、米国特許第８，６３２，７５３号、米国特許第８，６６３，６０３号、米国特許第８，７２２，８８１号、米国特許第８，７５４，２０６号、米国特許第８，８９０，４０２号、米国特許第８，９６９，８６２号、米国特許第９，０１２，０３４号、米国特許第９，０５６，１３８号、米国特許第９，１１８，０２８号、米国特許第９，１３３，２０５号、米国特許第９，１８７，６９０号、米国特許第９，１９３，７４６号、米国特許第９，３１２，４９６号、米国特許第９，３３７，４３２号、米国特許第９，３４３，６８５号、米国特許第９，３９１，２８８号及び米国特許第９，５３７，１０７号に記載されるものが含まれる。例示的な有機金属化合物、遷移金属錯体又は配位錯体には、例えばそのそれぞれの全体を参照により本明細書に組み込む国際公開Ｎｏ．ＷＯ  ２０１６／０１５０２７及び国際出願Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ１６／４２５８９に記載されるものも含まれる。
【０１０６】
一部の実施形態では、増幅基が、ランタニド（例えば、Ｅｕ又はＴｂ）と四座配位子との間の錯体又はランタニド（例えば、Ｅｕ又はＴｂ）とクリプテート配位子との間の錯体などの、ランタニド配位錯体である。一部の実施形態では、増幅基は、ランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ネオジム（Ｐｍ）、サマリウム（Ｓｍ）、ユーロピウム（Ｅｕ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、テルビウム（Ｔｂ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、ホルミウム（Ｈｏ）、エルビウム（Ｅｒ）、ツリウム（Ｔｍ）、イッテルビウム（Ｙｂ）、ルテチウム（Ｌｕ）、ルテニウム（Ｒｕ）、ロジウム（Ｒｈ）、パラジウム（Ｐｄ）、オスミウム（Ｏｓ）、イリジウム（Ｉｒ）又は白金（Ｐｔ）の配位錯体である。一部の実施形態では、増幅基は、原子番号５７を有するランタンから原子番号７１を有するルテニウム（ランタニド）の１５元素並びに原子番号２１を有するスカンジウム及び原子番号３９を有するイットリウムからなる２つのさらなる元素の群からなる１７元素をまとめて指す希土類金属の配位錯体である。希土類金属の特定の例には、ユーロピウム、テルビウム、ランタン、セリウム、プラセオジム、ネオジム、プロメチウム、サマリウム、ガドリニウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウム、ルテニウム、スカンジウム及びイットリウムが含まれる。一部の実施形態では、増幅基は、ランタニド（例えば、ユーロピウム又はテルビウム）とジエチレントリアミン四酢酸又はクリプテート配位子との配位錯体である。
【０１０７】
シグナル伝達剤の具体例は、
【０１０８】
【化３】
2021531000.tif 000009
2021531000.tif 000010
2021531000.tif 000011
を含む部分を含むが、これらに限定されない。
【０１０９】
シグナル生成剤は、高いルミネセンス量子効率及び長いルミネセンス減衰時間（＞１００ｎｓ）を特徴とする発光団（ドナー）を含むことができる。例示的な発光団は、パラジウム、ロジウム、白金、ルテニウム、オスミウム、希土類（特に、ユーロピウム及びランタン）の、カチオン性金属有機錯体である。これらの金属有機錯体の有機部分は、例えばポルフィリン、ビピリジル、フェナントロリン又はその他の複素環式化合物の群からの配位子からなってもよい。
【０１１０】
一部の実施形態では、微生物表面に結合することが可能なシグナル生成剤は、抗体（例えば、モノクローナル又はポリクローナル）、修飾抗体（例えば、ビオチニル化モノクローナル抗体、ビオチニル化ポリクローナル抗体、ユーロピウムキレート抗体、ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート抗体）、抗体変種（例えば、Ｆａｂ：断片、抗原結合（１つのアーム）；Ｆ（ａｂ’）２：断片、抗原結合、ヒンジ領域（両方のアーム）を含む；Ｆａｂ’：断片、抗原結合、ヒンジ領域（１つのアーム）を含む；ｓｃＦｖ：一本鎖可変断片；ジ−ｓｃＦｖ：ダイマー一本鎖可変断片；ｓｄＡｂ：一本鎖ドメイン抗体；二種特異性モノクローナル抗体；三官能性抗体；及びＢｉＴＥ：二種特異性Ｔ細胞エンゲージャー）、ＷＧＡ−ビオチン、ポリミキシンＢ−ビオチン、レクチン、天然ペプチド、合成ペプチド、合成及び／又は天然配位子、合成及び／又は天然ポリマー、合成及び／又は天然グリコポリマー、炭水化物結合タンパク質及び／又はポリマー、糖タンパク質結合タンパク質及び／又はポリマー、荷電小分子、その他のタンパク質、バクテリオファージ及び／又はアプタマーを含む。
【０１１１】
一部の実施形態では、微生物表面に結合することが可能なシグナル生成剤は、抗体、レクチン、天然ペプチド、合成ペプチド、合成及び／又は天然配位子、合成及び／又は天然ポリマー、合成及び／又は天然グリコポリマー、炭水化物結合タンパク質及び／又はポリマー、糖タンパク質結合タンパク質及び／又はポリマー、荷電小分子、その他のタンパク質、バクテリオファージ及び／又はアプタマーを含む構造を含み又はそのような構造から形成される。
【０１１２】
一部の実施形態では、微生物表面に結合することが可能なシグナル生成剤は、ランタニド配位錯体、及び／又は酵素及びストレプトアビジン及び／又は抗体及び／又はアプタマーを含む増幅基を含む。一部の実施形態では、微生物表面に結合することが可能なシグナル生成剤は、ポリクローナル及び／又はモノクローナル抗体を含む結合部分を含む。
【０１１３】
一部の実施形態では、微生物表面に結合することが可能なシグナル生成剤は、修飾抗体を含む結合部分を含む。例示的な修飾抗体には、ビオチニル化モノクローナル抗体、ビオチニル化ポリクローナル抗体、ユーロピウムキレート抗体及びホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート抗体が含まれる。一部の実施形態では、微生物表面に結合することが可能なシグナル生成剤は、抗体変種を含む結合部分を含む。例示的な抗体変種には、Ｆａｂ：断片、抗原結合（１つのアーム）；Ｆ（ａｂ’）２：断片、抗原結合、ヒンジ領域を含む（両方のアーム）；Ｆａｂ’：断片、抗原結合、ヒンジ領域を含む（１つのアーム）；ｓｃＦｖ：一本鎖可変断片；ｄｉ−ｓｃＦｖ：ダイマー一本鎖可変断片；ｓｄＡｂ：単一ドメイン抗体；二種特異性モノクローナル抗体；三官能性抗体；及びＢｉＴＥ：二種特異性Ｔ細胞エンゲージャー）が含まれる。
【０１１４】
一部の実施形態では、微生物表面に結合することが可能なシグナル生成剤は、ＷＧＡ−ビオチン又はポリミキシンＢ−ビオチンを含む。一部の実施形態では、微生物表面に結合することが可能なシグナル生成剤は、合成及び／又は天然配位子及び／又はペプチドを含む結合部分を含む。一部の実施形態では、配位子及び／又はペプチドは、ビス（亜鉛−ジピコリルアミン）、ＴＡＴペプチド、セリンプロテアーゼ、カテリシジン、カチオン性デキストリン、カチオン性シクロデキストリン、サリチル酸、リジン及びこれらの組合せから選択される。一部の実施形態では、微生物表面に結合することが可能なシグナル生成剤は、合成及び／又は天然ポリマー及び／又はグリコポリマーを含む結合部分を含む。実施形態では、天然及び／又は合成ポリマーは、直鎖状又は分枝状であり、アミロペクチン、ポリ（Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］メタクリルアミド）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ［２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート］及びこれらの組合せから選択される。一部の実施形態では、天然及び／又は合成ポリマー及び／又はグリコポリマーは、限定するものではないが、キトサン、ゼラチン、デキストラン、トレハロース、セルロース、マンノース、カチオン性デキストラン及びシクロデキストラン、第四級アミン、三臭化ピリジニウム、ヒスチジン、リジン、システイン、アルギニン、スルホニウム、ホスホニウム又はこれらの組合せを含む部分であって、限定するものではないが、コブロック、グラフト及び交互ポリマーを含む部分を含む。一部の実施形態では、微生物表面に結合することが可能なシグナル生成剤は、マンノース結合レクチン、その他のレクチン、アネキシン及びこれらの組合せから選択される糖タンパク質を含む結合部分を含む。
【０１１５】
一部の実施形態では、微生物表面に結合することが可能なシグナル生成剤は：抗体；及びユーロピウム配位錯体を含む。一部の実施形態では、微生物表面に結合することが可能なシグナル生成剤は、ＮＨ２−ＰＥＧ−ビオチン（２Ｋ）、ＮＨ２−ＰＥＧ−ビオチン（４Ｋ）、スルホ−ＮＨＳ−ビオチン、ＷＧＡ−ビオチン又はポリミキシンＢ−ビオチンを含むリンカー基Ｌを含む。一部の実施形態では、微生物表面に結合することが可能なシグナル生成剤は：
【０１１６】
【化４】
2021531000.tif 000012
を含むユーロピウム錯体を含む。
【０１１７】
一部の実施形態では、微生物表面に結合することが可能なシグナル生成剤は：
【０１１８】
【化５】
2021531000.tif 000013
を含むユーロピウム錯体を含む。
【０１１９】
あるいは、シグナル生成剤は、ＦＲＥＴ／ＴＲ−ＦＲＥＴドナー及びアクセプター又は一重項酸素対であって光増感剤及び検出物質からなるものなどの、１対の部分であってもよい。これらのシグナル生成剤で設計されたアッセイは、初期増殖培地からの微生物の分離、その後の所望の反応緩衝剤への再懸濁、及びその後のシグナル生成試薬の添加を必要としてもよい。逆に、これらのシグナル生成剤で設計されたアッセイは、シグナルを発生させるのに必要な、必要とされる相対距離に起因して、分離ステップを必要としなくてもよい。
【０１２０】
ＦＲＥＴ／ＴＲ−ＦＲＥＴドナーの例には、限定するものではないが、ランタニド（Ｅｕ、Ｓｍ、Ｄｙ、又はＴｂ）含有クリプテート有機金属（ＣｉｓＢｉｏ）、ランスＥｕ−Ｗ１０２４（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、ランスＥｕ−Ｗ８０４４（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、任意の有機蛍光対ドナーも含まれる。
【０１２１】
ＦＲＥＴ／ＴＲ−ＦＲＥＴアクセプターの例には、限定するものではないが、マッチした有機色素、例えばＵＬｉｇｈｔ色素（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、ＳｕｒｅＬｉｇｈｔ  ＡＰＣ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、アロフィコシアニン、Ｃｙ５、ｄ２色素（ＣｉｓＢｉｏ）、任意の有機蛍光対アクセプターも含まれる。
【０１２２】
一重項酸素光増感剤の例には、限定するものではないが、メトセラグリーンカルボキシ（Ｕｒｓａ  Ｂｉｏ）、センシタイザーブルー（Ｕｒｓａ  Ｂｉｏ）、ローズベンガル、エリスロシンＢ、メチレンブルー、クロロフィル、アルファビードドナー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）が含まれる。
【０１２３】
一重項酸素検出物質の例には、限定するものではないが、一重項酸素検出物質グリーン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、トランス−１−（２’−メトキシビニル）ピレン、Ｓｉ−ＤＭＡ（Ｄｏｊｉｎｄｏ）、アルファビードアクセプター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）が含まれる。
【０１２４】
組込み物質の例には、限定するものではないが、エチニル−Ｄ−アラニン（ＥＤＡ）、アジド−Ｄ−アラニン（ＡＤＡ）、蛍光Ｄ−アラニンであって、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．  ２０１２年１２月７日；５１（５０）：１２５１９〜１２５２３に記載されたものが含まれる。
【実施例】
【０１２５】
実施例１：複数菌培養物中の、Ｅ．コリとＫ．ニューモニエとの鑑別
Ｅ．コリ及びＫ．ニューモニエのＡＴＣＣ（登録商標）試料を、５％の、溶解させたヒツジ血液を伴うトリプシンソイ寒天上、３５℃において、一晩にわたり培養した。各種について、コロニー３〜５個を採取し、滅菌生理食塩液中に、０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄの接種物を調製した。以下の表に従い、接種物を組み合わせることにより、５例の試料を作製した。
【０１２６】
【表３】
2021531000.tif 000014
【０１２７】
５例の試料並びに、対照としての、Ｅ．コリ及びＫ．ニューモニエのＭｃＦａｒｌａｎｄ標準液のそれぞれについて、２５μＬのアリコートを、９６ウェルプレート内の、（１）１００μＬのミュラー−ヒントンブロス（ＭＨＢ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、（２）１００μＬのフォーゲス−プロスカウエルブロス（ＶＰＢ；Ｓｉｇｍａ）及び（３）トリプトファン［又はペプトン］ブロス（ＴＰＢ；Ｓｉｇｍａ）のそれぞれに添加した。プレートにカバーをかけ、３５℃、３時間にわたる、オービタルシェーキング条件下においてインキュベートした。
【０１２８】
３．５時間にわたる、初回の増殖の後、１−ナフトール（Ｓｉｇｍａ）及び水酸化カリウム（Ｓｉｇｍａ）を、各ＶＰＢウェルに添加し、コバックス試薬（Ｓｉｇｍａ）を、各ＴＰＢウェルに添加した。試料を、さらに３０分間の増殖時間にわたり、インキュベーターに戻した。
【０１２９】
さらに３０分間の増殖時間の後、プレートを、インキュベーターから取り出し、ＶＰＢウェル及びＴＰＢウェルの吸光度を読み取った（４５０〜６５０ｎｍ）。吸光度の結果を、図５に提示する。次いで、プレートを、３，５００×ｇにおいて、５分間にわたり遠心分離して、細菌をペレット化した。上澄みを吸引し、ペレットを、１００μＬの脱イオン水（ＤＩ）中に再懸濁させ、プレートを、３，５００×ｇにおいて、５分間にわたり、再度遠心分離して、細菌をペレット化した。上澄みを再度吸引するのに続き、ペレットを、４μＬＤＩ水中に再懸濁液させ、１マイクロリットルの懸濁液を、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  ４８−ｓａｍｐｌｅ  ＭＡＬＤＩ上にスポッティングした。各試料をスポッティングした後において、ギ酸（７０％、１μＬ）に続き、アセトニトリル（４７．５％）及びトリフルオロ酢酸（２．５％）による溶液中の、シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（１０ｍｇ／ｍＬ）からなる、１μＬのマトリックスを添加した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルは、製造元の指示書に従い生成した。
【０１３０】
実施例２：コアグラーゼ陰性ブドウ球菌の、Ｓ．ニューモニエからの鑑別
Ｓ．ルグドゥネンシス（ＴｒｉＣｏｒｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにより提供された臨床分離株）及びＳ．ニューモニエ（ＡＴＣＣ（登録商標）４９６１９）の試料を、５％の、溶解させたヒツジ血液を伴うトリプシンソイ寒天上、３５℃において、一晩にわたり培養した。各種について、コロニー３〜５個を採取し、滅菌生理食塩液中に、０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄの接種物を調製した。以下の表に従い、接種物を組み合わせることにより、５例の試料を作製した。
【０１３１】
【表４】
2021531000.tif 000015
【０１３２】
５例の試料並びに、対照としての、Ｓ．ルグドゥネンシス及びＳ．ニューモニエのＭｃＦａｒｌａｎｄ標準液のそれぞれについて、２５μＬのアリコートを、９６ウェルプレート内の、（１）１００μＬのミュラー−ヒントンブロス（ＭＨＢ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、（２）１００μＬのマンニトール塩ブロス（ＭＳＢ；ＨｉＭｅｄｉａ）及び（３）選択的Ｓｔｒｅｐブロス（ＳＳＢ；Ｈａｒｄｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）のそれぞれに添加した。プレートにカバーをかけ、３５℃、４時間にわたる、オービタルシェーキング条件下においてインキュベートした。
【０１３３】
増殖が完了した後において、実施例１における手順に従い、試料を調製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを生成した。
【０１３４】
実施例３：複数菌培養物中の、Ｅ．コリと、Ｓ．アウレウスとの鑑別
Ｅ．コリ（２５９２２）及びＳ．アウレウス（２９２１３）のＡＴＣＣ（登録商標）試料を、５％の、溶解させたヒツジ血液を伴うトリプシンソイ寒天上、３５℃において、一晩にわたり培養した。各種について、コロニー３〜５個を採取し、滅菌生理食塩液中に、０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄの接種物を調製した。以下の表に従い、ＭｃＦａｒｌａｎｄ標準液を組み合わせることにより、５例の試料を作製した。
【０１３５】
【表５】
2021531000.tif 000016
【０１３６】
５例の試料並びに、対照としての、Ｅ．コリ及びＳ．アウレウスのＭｃＦａｒｌａｎｄ標準液のそれぞれについて、２５μＬのアリコートを、９６ウェルプレート内の、（１）１００μＬのミュラー−ヒントンブロス（ＭＨＢ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、（２）１００μＬのマンニトール塩ブロス（ＭＳＢ；ＨｉＭｅｄｉａ）及び（３）マッコンキーブロス（ＭＣＫ；Ｓｉｇｍａ）のそれぞれに添加する。プレートにカバーをかけ、３５℃、４時間にわたる、オービタルシェーキング条件下においてインキュベートした。
【０１３７】
増殖が完了した後において、実施例１における手順に従って試料を作製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを生成した。
【０１３８】
実施例４：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを使用した、さらなる共培養物の鑑別
細菌懸濁液を、異なる比において組み合わせることにより、複数菌混合物を作製した。これらの懸濁液を使用して、９６ウェルプレート内の、１００μｌの培地に、三連において接種した。培地は、非選択培地（ミュラー−ヒントンブロス、ＭＨＢ）、選択培地（マッコンキーブロス、ＭＡＣ；マンニトール塩ブロス、ＭＳＢ；セトリミドブロス、ＣＢ；レンサ球菌濃縮ブロス、ＳＥＢ；鉛寒天プレート、ＬＰ；トッド−ヒューイットブロス、ＴＨＢ）及び鑑別培地（スクロース、Ｓｕｃ又はアラビノース、Ａｒａを含有する、ブロモクレゾールパープルブロス、ＢｐＢ）を含んだ。選択性をさらに増強するために、抗生剤である、リソスタフィン又はバシトラシンを、表示の選択培地に添加した。接種されたプレートを、周囲空気のインキュベーター内、３７℃において、３〜５時間にわたりインキュベートした。次いで、遠心分離により、細胞をペレット化し、脱イオン水により、２回にわたり洗浄してから、１μｌの濃縮細胞を、ＭＡＬＤＩ標的上にスポッティングした。次いで、グラム陽性の選択的試料に、１μｌの７０％ギ酸を塗り重ねた。次いで、全ての試料に、１μｌのＨＣＣＡマトリックスを塗り重ねた。標的を、ＪＭＩ検査室に送付し、Ｂｒｕｋｅｒ  ＢｉｏＴｙｐｅｒ（商標）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦシステムにかけた。信頼性スコアが＞１．７である、上位２つのマッチを報告した。全ての標的を、２４時間にわたる標的調製により加工した。結果を、表６に示す。
【０１３９】
【表６】
2021531000.tif 000017
【図１】
2021531000.tif 000018
【図２】
2021531000.tif 000019
【図３】
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【図４】
2021531000.tif 000021
【図５Ａ】
2021531000.tif 000022
【図５Ｂ】
2021531000.tif 000023
【図６】
2021531000.tif 000024
【図７】
2021531000.tif 000025
【国際調査報告】
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2021531000.tif 000028
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