(57)【要約】膀胱がんの治療のための方法が本明細書に提供されている。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
膀胱がんを治療する方法であって、化合物１：
【化１】
2021525758.tif 000043
又はその薬学的に許容される塩の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記薬学的に許容される塩がジアンモニウム塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
膀胱がんを治療する方法であって、化合物１：
【化２】
2021525758.tif 000044
又はその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、方法。
【請求項４】
膀胱がんを治療するための医薬組成物の調製のための、化合物１：
【化３】
2021525758.tif 000045
又はその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項５】
膀胱がんに対する治療における、化合物１：
【化４】
2021525758.tif 000046
若しくはその薬学的に許容される塩、又は化合物１若しくはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物の使用。
【請求項６】
膀胱がんを治療する方法であって、
化合物１、化合物１の薬学的に許容される塩、又は化合物１若しくは化合物１の薬学的に許容される塩を含む医薬組成物により治療可能な膀胱がんを有する個体を特定するステップと、
膀胱がんを治療可能であると特定された前記化合物、薬学的に許容される塩又は医薬組成物の有効量を前記個体に投与するステップと
を含む、方法。
【請求項７】
前記個体が、前記患者内のＲＥＦ  ＳＴＩＮＧ変異体アレルの存在により、化合物１、化合物１の薬学的に許容される塩、又は化合物１若しくは化合物１の薬学的に許容される塩を含む医薬組成物で治療可能な膀胱がんを有すると特定される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＲＥＦ  ＳＴＩＮＧアレルを有する患者において膀胱がんを治療する方法であって、化合物１、化合物１の薬学的に許容される塩、又は化合物１若しくは化合物１の薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項９】
ＷＴ  ＳＴＩＮＧアレルを有する患者において膀胱がんを治療する方法であって、化合物１、化合物１の薬学的に許容される塩、又は化合物１若しくは化合物１の薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項１０】
ＡＱ  ＳＴＩＮＧアレルを有する患者において膀胱がんを治療する方法であって、化合物１、化合物１の薬学的に許容される塩、又は化合物１若しくは化合物１の薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項１１】
ＨＡＱ  ＳＴＩＮＧアレルを有する患者において膀胱がんを治療する方法であって、化合物１、化合物１の薬学的に許容される塩、又は化合物１若しくは化合物１の薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項１２】
膀胱がんを治療する方法であって、ＳＴＩＮＧアゴニストの治療有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、方法。
【請求項１３】
化合物１、化合物１の薬学的に許容される塩、又は化合物１若しくは化合物１の薬学的に許容される塩を含む医薬組成物の投与が膀胱内に行われる、請求項１〜３又は６〜１２のいずれか一項に記載の方法、又は請求項４又は５に記載の使用。
【請求項１４】
前記膀胱がんが筋層非浸潤性膀胱がんである、請求項１〜３又は６〜１２のいずれか一項に記載の方法、又は請求項４又は５に記載の使用。
【請求項１５】
化合物１、化合物１の薬学的に許容される塩、又は前述のいずれか１つを含む医薬組成物の投与が膀胱内投与によるものである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
該当なし。
【背景】
【０００２】
ＳＴＩＮＧ（インターフェロン遺伝子刺激物質）は、サイトゾルにおけるｄｓＤＮＡに対する先天性応答におけるシグナル伝達分子である。ＳＴＩＮＧ欠損が複数のヒトがんにおいて報告されている。加えて、ヒトがんにおけるＳＴＩＮＧシグナル伝達の調節解除は、黒色腫（Ｘｉａ  Ｔら、「Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  Ｌｏｓｓ  ｏｆ  ＳＴＩＮＧ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  Ｖｉｒａｌ  Ｏｎｃｏｌｙｓｉｓ」Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２０１６年）及び結腸がん（Ｘｉａ  Ｔら、「Ｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＴＩＮＧ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｓ  ＤＮＡ  Ｄａｍａｇｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｎｄ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  Ｗｉｔｈ  Ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ」Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．、２０１６年；１４巻：２８２〜９７頁）においても報告された。興味深いことに、これらの実験において、ゲノム分析結果は、ＳＴＩＮＧの損失発現が、遺伝子欠損又は突然変異によるものではなく、後成的変化を介したものであることを示した（Ｘｉａ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２０１６年；Ｘｉａ、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．、２０１６年）。ＳＴＩＮＧのがん保護活性はまたマウスモデル実験から得られる証拠により支持される。ＳＴＩＮＧノックアウトマウスは、腫瘍制御の不良を示す。（Ｗｏｏ  ＳＲら、「ＳＴＩＮＧ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ＤＮＡ  ｓｅｎｓｉｎｇ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｔｕｍｏｒｓ」、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２０１４年；４１巻：８３０〜４２頁）。
【０００３】
加えて、個体発生の保護におけるＳＴＩＮＧの役割が、グリア細胞腫（Ｏｈｋｕｒｉ  Ｔら、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＳＴＩＮＧ  ａｇａｉｎｓｔ  ｇｌｉｏｍａｇｅｎｅｓｉｓ：  Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｕｓｅ  ｏｆ  ＳＴＩＮＧ  ａｇｏｎｉｓｔ  ｉｎ  ａｎｔｉ−ｇｌｉｏｍａ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ」、Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．、２０１５年；４号：ｅ９９９５２３頁）、及び結腸がん（Ｚｈｕ  Ｑら、「Ｃｕｔｔｉｎｇ  ｅｄｇｅ：  ＳＴＩＮＧ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｇｏｖｅｒｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍａｇｎｉｔｕｄｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１４年；１９３巻：４７７９〜８２頁）を含めたいくつかのマウス自然発症モデルにおいて実証されてきた。この抗腫瘍作用は、ＮＦ−ｋＢ及びＳＴＡＴ３の過剰活性化に対抗するこの能力によるものであり得る。（Ｏｋｉｈｕｒｉ、２０１５年）。ＳＴＩＮＧ経路の活性化はまた、臨床前マウス腫瘍モデルにおける強力な活性を示した。（Ｗｏｏ、２０１４年；Ｃｈａｎｄｒａ  Ｄら、「ＳＴＩＮＧ  ｌｉｇａｎｄ  ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｃａｎｃｅｒ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ．、２０１４年；２巻：９０１〜１０頁；Ｃｏｒｒａｌｅｓ  Ｌら、「Ｄｉｒｅｃｔ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＴＩＮＧ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｕｍｏｒ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ｌｅａｄｓ  ｔｏ  Ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｔｕｍｏｒ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ」、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．、２０１５年；１１巻：１０１８〜３０頁；Ｃｕｒｒａｎ  Ｅら、「ＳＴＩＮＧ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  Ｐｏｔｅｎｔ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  Ａｃｕｔｅ  Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ」Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．、２０１６年；１５巻：２３５７〜６６頁；Ｔａｎｇ  ＣＨら、「Ａｇｏｎｉｓｔ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＴＩＮＧ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｂ  Ｃｅｌｌｓ」Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２０１６年；７６巻：２１３７〜５２頁）。この抗腫瘍活性は、恐らく、腫瘍血管系の破壊、及びこれに続く適応免疫応答の誘導による。（Ｃｏｒｒａｌｅｓ  Ｌら、「Ｔｈｅ  ｈｏｓｔ  ＳＴＩＮＧ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｔ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ」Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．、２０１６年；１２６巻：２４０４〜１１頁）。したがって、アゴニストによる腫瘍微小環境におけるＳＴＩＮＧの直接的又は腫瘍内刺激は、がんを治療するための新規の手法を表し得る。
【０００４】
更に、膀胱がんは男性及び女性においてそれぞれ第４番目及び第１１番目に多いがんであり、初期段階のがん患者に対して独特な薬物投与経路を有する（Ｋａｍａｔら、「Ｗｈａｔ  ｉｓ  ｎｅｗ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｍｕｓｃｌｅ−ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ２０１６？」Ｔｕｒｋ  Ｊ  Ｕｒｏｌ  ２０１７年；４３巻（１号）：９〜１３頁）。２０１８年には、およそ８１，１９０件の膀胱がんの新規症例が米国において予測され、膀胱がんによる約１７，２４０件の死亡が予想されている（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｗｅｂｓｉｔｅ）。ＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉ））の投与は、ハイリスクの筋層非浸潤性膀胱がん（ＮＭＩＢＣ）に対するフロントライン治療オプションである。残念なことに、患者の４０％までがＢＣＧ治療に無反応であり、これらの患者多くは根治的膀胱切除手術を受けて膀胱を全摘出しなければならず（Ｚｌｏｔｔａ、Ａ．Ｒ．ら、「Ｔｈｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＢＣＧ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｍｕｓｃｌｅ−ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ：ａｎ  ｕｐｄａｔｅ」Ｃａｎ  Ｕｒｏｌ  Ａｓｓｏｃ  Ｊ、２００９年；３巻（付録ｌ４）：Ｓ１９９〜２０５頁）、手術後の患者の生活の質を低めてしまう。したがって、根治的膀胱切除を回避又は遅らせる有効な代替の膀胱がん療法に対する、未だ対処されていない重要な医学的必要性が存在する。
【簡単な概要】
【０００５】
実施形態は、治療を必要とする患者において膀胱がんを治療する方法であって、患者に化合物１：
【化１】
2021525758.tif 000002
又はその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法を提供することができる。
【０００６】
一部の実施形態では、本明細書で報告されたような実施形態に従い投与される薬学的に許容される塩はジアンモニウム塩又はトリエチルアミン（ＴＥＡ）塩である。更なる実施形態は、膀胱がんに対する治療を必要とする患者に、化合物１又はその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物を投与することにより、膀胱がんの治療を提供することができる。
【０００７】
更なる実施形態は、治療を必要とする患者において膀胱がんを治療する方法であって、患者に化合物２：
【化２】
2021525758.tif 000003
又はその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法を提供することができる。
【０００８】
更なる実施形態は、膀胱がんを治療するための医薬組成物の調製のための、本明細書で報告されたような化合物１、化合物２、又はその薬学的に許容される塩の使用を提供することができる。
【０００９】
実施形態は、膀胱がんに対する治療における、化合物１、化合物２、その薬学的に許容される塩、又は化合物１、化合物２、若しくはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物の使用を提供することができる。
【００１０】
実施形態は、膀胱がんを治療する方法であって、化合物１、化合物２、その薬学的に許容される塩、又は化合物１、化合物２、若しくはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物により治療可能な膀胱がんを有する個体を特定すること、及び膀胱がんが治療可能であると特定された化合物１、化合物２、薬学的に許容される塩又は医薬組成物の治療有効量を前記個体に投与することを含む、方法を提供することができる。
【００１１】
一部の実施形態では個体は、患者内のＲＥＦ  ＳＴＩＮＧ変異体アレルの存在により化合物１、化合物２、その薬学的に許容される塩、又は化合物１、化合物２、若しくはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物で治療可能な膀胱がんを有すると特定される。
一部の実施形態は、ＲＥＦ  ＳＴＩＮＧアレルを有する患者において膀胱がんを治療する方法であって、化合物１、化合物２、その薬学的に許容される塩、又は化合物１、化合物２、若しくはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を前記患者に投与することを含む、方法を提供する。
【００１２】
一部の実施形態は、ＷＴ  ＳＴＩＮＧアレルを有する患者においてがんを治療する方法であって、化合物１、化合物２、その薬学的に許容される塩、又は化合物１若しくはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を前記患者に投与することを含む方法を提供する。
【００１３】
一部の実施形態は、ＡＱ  ＳＴＩＮＧアレルを有する患者においてがんを治療する方法であって、化合物１、化合物２、化合物１、化合物２の薬学的に許容される塩、又は化合物１、化合物２、若しくはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を前記患者に投与することを含む方法を提供する。
【００１４】
一部の実施形態は、ＨＡＱ  ＳＴＩＮＧアレルを有する患者においてがんを治療する方法であって、化合物１、化合物２、化合物１、化合物２の薬学的に許容される塩、又は化合物１、化合物２、若しくはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を前記患者に投与することを含む方法を提供する。
【００１５】
一部の実施形態では、化合物１は遊離酸として提供される。一部の実施形態では、化合物はＮＨ４塩又はトリエチルアミン（ＴＥＡ）塩として提供される。
【００１６】
実施形態は、それを必要とする患者において膀胱がんを治療する方法であって、上記に列挙されたような化合物１又はその薬学的に許容される塩の治療有効量を患者に投与することを含む、方法を提供することができる。
【００１７】
実施形態は、患者において膀胱がんを治療する方法であって、本明細書で報告されたような化合物１、化合物２、若しくはその薬学的に許容される塩、又は医薬組成物を前記患者に投与することを含む、方法を提供することができる。本明細書で報告されたように治療される膀胱がんは、尿路上皮癌であってよい。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】化合物１ａの合成を示す図である。この合成は、また２０１８年２月１７日に出願し、本明細書で参照により組み込まれている米国特許出願第１５／８９８，５３３号にも報告されている。
【図２Ａ】化合物１及び化合物１ａの代替合成を示す図である。その代替合成は図２Ｃ〜図２Ｅにも示されている。
【図２Ｂ】化合物１及び化合物１ａの代替合成を示す図である。その代替合成は図２Ｃ〜図２Ｅにも示されている。
【図２Ｃ】代替合成を示す図である。
【図２Ｄ】代替合成を示す図である。
【図２Ｅ】代替合成を示す図である。
【図３】化合物１に対する１Ｈ  ＮＭＲスペクトログラフを示す図である。
【図４Ａ】化合物１の非対称的結晶に対するＸ線結晶構造解析結果（ＯＲＴＥＰ図）を示す図である。
【図４Ｂ】非対称的結晶からの第１の分子に対するＸ線結晶構造解析結果（ＯＲＴＥＰ図）を示す図である。
【図４Ｃ】非対称的結晶からの第２の分子に対するＸ線結晶構造解析結果（ＯＲＴＥＰ図）を示す図である。
【図４Ｄ】化合物２の結晶に対するＸ線結晶構造解析結果（ＯＲＴＥＰ図）を示す図である。
【図５】化合物１との複合体におけるヒトＷＴ  ＳＴＩＮＧのＸ線結晶構造を示す画像である。
【図６】化合物１との複合体におけるヒトＲＥＦ  ＳＴＩＮＧＣ末端ドメインを示す画像である。
【図７】第２０〜２１日からの、ＭＲＩにより定量化した腫瘍容積を示すグラフである。
【図８】膀胱がん治療の実施例４におけるすべての群に対する生存曲線を示すグラフである。
【図９】ＷＴ  ＳＴＩＮＧ（ｐＬｅｎｔｉ−ＷＴヒトＳＴＩＮＧ−Ｐｕｒｏ）に対する発現ベクターマッピングを示すグラフである。
【図１０】実施例１０８に付随し、ＣＴ２６二重腫瘍モデルにおける化合物１ａの治癒的活性を示すグラフである。
【図１１】実施例１０８に付随し、ＣＴ２６二重腫瘍モデルにおける化合物１ａの治癒的活性を示すグラフである。
【図１２】実施例１０９に付随し、治療した腫瘍に対する腫瘍容積プロット及び生存曲線を示すグラフである。
【図１３】実施例１１０に付随し、治療した腫瘍に対する腫瘍容積プロット及び生存曲線を示すグラフである。
【実施形態の詳細な説明】
【００１９】
膀胱がんを治療するのに有用であり得る化合物（化合物１）及びその薬学的に許容される塩、並びに医薬組成物が本明細書に提供される。化合物２又はその薬学的に許容される塩、並びに化合物２又はその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物もまた、膀胱がんを治療するのに有用であり得る。化合物は、インターフェロン遺伝子刺激物質（ＳＴＩＮＧ）を活性化することができる。
【００２０】
これは、化合物１：
【化３】
2021525758.tif 000004
である。
【００２１】
これは、化合物２：
【化４】
2021525758.tif 000005
である。
【００２２】
一部の実施形態では、化合物１は遊離酸として提供される。一部の実施形態では、化合物は、例えば、ＮＨ４塩として提供される。「化合物１ａ」についての言及は化合物１ジアンモニウム塩を示すことになる。
【００２３】
実施形態は、それを必要とする患者において膀胱がんを治療する方法であって、化合物１、化合物２、又はその薬学的に許容される塩の治療有効量を患者に投与することを含む、方法を提供することができる。
【００２４】
本明細書で報告された化合物又はその薬学的に許容される塩、並びに薬学的に許容される賦形剤を含む、膀胱がんを治療するための医薬組成物もまた提供することができる。本明細書で報告されたような実施形態は、膀胱がんを治療するため又は膀胱がんの治療に有用な医薬を調製するために使用することができる。
【００２５】
当業者であれば、リン原子（Ｐ１，Ｐ２）に結合している置換基が単結合と二重結合の両方を有する場合、これらは互変を受けやすいことを認識されよう。例えば、化合物は平衡において互変異性体化し得る。１つの例を以下に示す。
【化５】
2021525758.tif 000006
【００２６】
このような互変異性体は、特許請求の範囲内であると考えられるべきである。所与の化合物に対するいずれかの互変異性体の構造的表示は同じ化合物を表すことになる。
【００２７】
治療の方法
実施形態は、それを必要とする患者において膀胱がんを治療する方法であって、化合物１又はその薬学的に許容される塩の治療有効量を患者に投与することを含む、方法を提供することができる。
【００２８】
一部の実施形態では、化合物１は、遊離酸又はその薬学的に許容される塩として提供される。一部の実施形態では、投与される化合物はＮＨ４塩、遊離酸、又はその薬学的に許容される塩として提供される。一部の実施形態では、化合物はＮＨ４塩として提供される。
【００２９】
一部の実施形態は、膀胱がんを治療する方法であって、ＳＴＩＮＧアゴニストの治療有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、方法を提供する。このような実施形態では、投与は膀胱内投与であってもよいが、必ずしも膀胱内投与である必要はない。膀胱がんの治療に使用することができ、膀胱内投与されてもよいが、必ずしも膀胱内投与される必要はない有望なＳＴＩＮＧアゴニストの例として、これらに限定されないが、米国特許出願第１５／８９８，５３３号、２０１８年２月１７日出願；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１８５５６、２０１８年２月１７日出願；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１８５６１、２０１８年２月１７日出願；米国特許出願公開２０１４／０２０５６５３号；米国特許出願公開第２０１４／０３２９８８９号；米国特許出願公開第２０１４／０３４１９７６号；米国特許出願公開第２００７／０１４９４６２号；国際公開第２０１８／０９８２０３号；国際公開第２０１８／１９８０７６号；国際公開第２０１８／１９８０８４号；国際公開第２０１８／１４０８３１号；米国特許出願公開第２０１４／０３４１９７６号；国際公開第２０１５／１８５５６５号；米国特許第７，７０９，４５８号；米国特許第７，５９２，３２６号；米国特許第７，５６９，５５５号；米国特許出願公開第２０１４／０２０５６５３号；米国特許出願公開第２０１４／０３４１９７６号；米国特許出願公開第２０１５／００５６２２４号；米国特許出願公開第２０１６／０３６２４４１号；米国特許出願公開第２０１７／０１５８７２４号；米国特許出願公開第２０１７／０４４２０６号；米国特許第５，５４７，９４１号；米国特許第７，５６９，５５５号；米国特許第７，５９２，３２６号；米国特許第７，７０９，４５８号；米国特許第９，５４９，９４４号；国際公開第２００９／１３３５６０号；国際公開第２０１５／０７４１４５号；国際公開第２０１５／０７７３５４号；国際公開第２０１５／１８５５６５号；国際公開第２０１６／１００２６１号；国際公開第２０１６／１２０３０５号；国際公開第２０１６／１４５１０２号；国際公開第２０１７／０２７６４５号；国際公開第２０１７／０２７６４６号；国際公開第２０１７／０７５４７７号；国際公開第２０１９／０４３６３４号；国際公開第２０１９／０４６４９６号；国際公開第２０１９／０４６４９８号；国際公開第２０１９／０４６５００号；国際公開第２０１９／０４６５１１号；国際公開第２０１７／０９３９３３号；国際公開第２０１７／１２３６５７号；国際公開第２０１７／１７５１５６号；欧州特許第１７４０，１９２号；ＣＮ１０２１９９１８３Ａ；Ｆｕ、Ｊ．ら、「ＳＴＩＮＧ  Ａｇｏｎｉｓｔ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｃａｎ  Ｃｕｒｅ  Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  Ｔｕｍｏｒｓ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｔｏ  ＰＤ−１Ｂｌｏｃｋａｄｅ」、Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄ．、７巻（２８３号）：２８３ｒａ５２、（２０１５年４月１５日）；Ｃｏｒｒａｌｅｓ、Ｌ．ら、「Ｄｉｒｅｃｔ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＴＩＮＧ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｕｍｏｒ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ｌｅａｄｓ  ｔｏ  Ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｔｕｍｏｒ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ」、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ、１１巻：１０１８〜１０３０頁（２０１５年）；及びＬｉｏｕｘ、Ｔ．ら、「Ｄｅｓｉｇｎ、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｃｙｃｌｉｃ  Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ−Ｉｎｏｓｉｎｅ  Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｃＡＩＭＰ）Ａｎａｌｏｇｓ  Ｔｈａｔ  Ａｃｔｉｖａｔｅ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｇｅｎｅｓ（ＳＴＩＮＧ）」、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、５９巻：１０２５３〜１０２６７頁（２０１６年）において特定されたものが挙げられる。それらの中の化合物を含む、それらの文献のすべては本明細書で参照により組み込まれている。もしある場合には、これらの文献のいずれかの構成成分のいずれかが矛盾する、又はさもなければ、本明細書における何かと矛盾する場合、本明細書が優先する。
【００３０】
用量
膀胱がんの治療のための最適な用量は公知の方法を使用して各個体に対して経験的に決定することができ、薬剤の活性；個体の年齢、体重、全般的な健康状態、性別及び食事；時間及び投与経路；並びに個体が服用している他の薬物を含む様々な因子に依存する。最適な用量は、当技術分野で周知の所定の試験及び手順を使用して確立することができる。上記化合物の投与はいかなる適切な経路によるものであってよい。
【００３１】
「薬学的に許容される塩」とは、本明細書で使用される場合、本発明の開示の化合物の酸付加塩又は塩基付加塩を指す。薬学的に許容される塩は親化合物の活性を保持し、それが投与される対象及び式中それが投与される状況において任意の過度に有害な又は望ましくない作用を付与しない任意の塩である。薬学的に許容される塩として、これらに限定されないが、金属錯体及び無機酸とカルボン酸の両方の塩が挙げられる。薬学的に許容される塩としてまた、金属塩、例えば、アルミニウム、カルシウム、鉄、マグネシウム、マンガン及び複合体塩などが挙げられる。加えて、薬学的に許容される塩として、これらに限定されないが、酸性塩、例えば、酢酸、アスパラギン酸、アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸、アキセチル、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、重炭酸、重硫酸、重酒石酸、酪酸、エデト酸カルシウム、カムシル酸、カルボン酸、クロロ安息香酸、クエン酸、エデト酸、エジシル酸、エストリン酸、エシル酸、エシリル酸、ギ酸、フマル酸、グルセプト酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、グリコールイルアルサニン酸、ヘキサミン酸、ヘキシルレソルシノン酸、ヒドラバミン酸、臭水素酸、塩酸、塩酸塩、ヨウ化水素酸、ヒドロキシナフトエ酸、イセチオン酸、乳酸、ラクトビオン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、メチル硝酸、メチル硫酸、ムコ酸、ムコン酸、ナプシル酸、硝酸、シュウ酸、ｐ−ニトロメタンスルホン酸、パモ酸、パントテン酸、リン酸、１水素リン酸塩、２水素リン酸塩、フタル酸、ポリガラクツロ酸、プロピオン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、スルファミン酸、スルファニル酸、スルホン酸、硫酸、タンニン酸、酒石酸、テオクリン酸、トルエンスルホン酸などが挙げられる。ナトリウム塩及びカリウム塩もまた調製することができる。
【００３２】
実施形態はジアンモニウム塩であってよい。薬学的に許容される塩は、これらに限定されないが、システインを含むアミノ酸から誘導することができる。化合物を塩として生成するための方法は当業者に公知である（例えば、Ｓｔａｈｌら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｕｓｅ、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ；Ｖｅｒｌａｇ  Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ、Ｚｕｒｉｃｈ、２００２年；Ｂｅｒｇｅら、Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．、６６巻：１頁、１９７７年を参照されたい）。
【００３３】
「有効量」又は「治療有効量」の治療剤とは、対象又は患者において未治療のままの膀胱がんと比較して、観察可能な治療上の利益を得るのに十分な量である。
【００３４】
本明細書で報告されたような活性剤は、その医薬製剤を提供するために薬学的に許容される担体と組み合わせることができる。担体及び製剤の特定の選択は、組成物が意図する特定の投与経路に依存する。
【００３５】
「薬学的に許容される担体」とは、本明細書で使用される場合、担体が製剤化に用いられる化合物の薬理学的活性を破壊しない非毒性の担体、アジュバント、又はビヒクルを指す。本発明の組成物において使用することができる薬学的に許容される担体、アジュバント又はビヒクルとして、これらに限定されないが、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和した植物脂肪酸、水、塩又は電解質の部分的なグリセリド混合物、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状のシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレングリコール及び羊毛脂が挙げられる。
【００３６】
本発明の組成物は、非経口、経口、吸入スプレー、局所、直腸、経鼻、口腔内頬側、膀胱内、経膣又はインプラントリザーバー投与などにとって適切となり得る。一部の実施形態では、製剤は天然又は非天然の供給源由来の成分を含む。一部の実施形態では、製剤又は担体は、滅菌形態で提供され得る。滅菌担体の非限定的例として内毒素を含まない水又はパイロジェンを含まない水が挙げられる。組成物は膀胱内投与を介して投与することができる。
【００３７】
「非経口」という用語は、本明細書で使用される場合、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、関節滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、肝内、病巣内及び脳内注射又は点滴の技術を含む。特定の実施形態では、化合物は静脈内に経口、皮下又は筋肉内投与を介して投与される。滅菌注射用形態の本発明の組成物は水性又は油性懸濁剤であってよい。これらの懸濁剤は、適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を使用して、当技術分野で公知の技術に従い製剤化することができる。滅菌注射用調製物はまた、非毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の注射可能な滅菌溶液又は懸濁剤であってよい。許容されるビヒクル及び溶媒の中でも利用することができるのは水、リンガー液及び等張性塩化ナトリウム溶液である。加えて、滅菌の、不揮発性油は、溶媒又は懸濁媒として慣例的に利用されている。一部の実施形態では、組成物は膀胱内投与される。
【００３８】
この目的のために、合成モノグリセリド又はジグリセリドを含む任意の無菌性不揮発性油を利用することができる。脂肪酸及びこれらのグリセリド誘導体は、これらの天然の薬学的に許容される油、例えば、オリーブ油又はヒマシ油、特にこれらのポリオキシエチル化バージョンなどのように、注射剤の調製に有用である。これらの油溶液又は懸濁液はまた、長鎖アルコール希釈液又は分散液、例えば、カルボキシメチルセルロースなど、又は乳剤及び懸濁液を含めた、薬学的に許容される剤形の製剤に一般的に使用されている同様の分散剤なども含有することができる。一般的に使用される他の界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ、Ｓｐａｎなど、及び他の乳化剤は、薬学的に許容される固体、液体、又は製剤の目的のためにも使用し得る他の剤形の製造に共通して使用することもできる。
【００３９】
経口投与に対して、化合物又は塩は、これらに限定されないが、カプセル剤、錠剤、水性懸濁剤又は溶液を含む許容される経口投与剤形で提供することができる。経口使用のための錠剤の場合、共通して使用される担体はラクトース及びトウモロコシデンプンを含む。滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムなどもまた加えることができる。カプセル剤形態での経口投与のため、有用な希釈剤はラクトース及び乾燥コーンスターチを含む。水性懸濁剤が経口使用のために必要とされる場合、活性成分を乳化剤及び懸濁剤を合わせることができる。所望する場合、ある特定の甘味剤、香味剤又は着色剤もまた加えることができる。加えて、保存剤もまた加えることができる。薬学的に許容される保存剤の適切な例として、これらに限定されないが、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、溶媒など、例えばエタノール、プロピレングリコール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、第四級アンモニウム塩、及びパラベン（例えば、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベンなど）を挙げることができる。
【００４０】
「即時放出性」は、薬物放出が投与後直ちに開始する従来の放出を含むことが意図されている。本明細書で使用される場合、「即時放出性」という用語は、薬物の溶解又は吸収を遅延させる又は長引かせるという意図なしで、消化管内容物中への薬物の溶解を可能にする剤形を含む。この目的は、薬物を投与後に急速に放出する、例えば、溶解試験において溶解開始後およそ３０分以内に薬物の少なくとも８０％が放出可能とすることである。
【００４１】
「持続放出」又は「徐放性」は、その時間経過及び／又は位置の薬物放出特徴が、溶液又は即時放出性剤形などの従来の剤形により提供されない治療又は利便性の目的を遂行するために選択される剤形を含む。
【００４２】
「定常状態」という用語は、所与の活性剤に対する血漿レベルが達成され、治療の最低有効レベル、又はそれより上のレベルで、及び所与の活性剤に対する有毒性の最低血漿レベル未満のレベルで、活性剤をその後投薬することよりこの血漿レベルが維持されることを意味する。
【００４３】
「用量範囲」という用語は、本明細書で使用される場合、特定された薬剤の量の許容されるばらつきの上限及び下限を指す。通常、特定された範囲内の任意の量の薬剤の用量を、治療を受ける患者に投与することができる。
【００４４】
「治療する」という用語は、対象における疾患の少なくとも１つの症状を和らげる、減少させる又は緩和することを意味するように本明細書で使用されている。例えば、膀胱がんとの関連で、「治療する」という用語は、抑止する、開始（すなわち、疾患の臨床所見又は疾患の症状以前の期間）を遅延させる及び／又は膀胱がんの症状を発症若しくは悪化するリスクを減少させることを意味し得る。「保護する」という用語は、本明細書で使用することによって、遅延を阻止する、又は、必要に応じて、対象における膀胱がんの症状の発症若しくは継続若しくは重大化を治療すること、又はこの全部を意味する。
【００４５】
「対象」又は「患者」という用語は、膀胱がんを患うこと、又は罹患することが可能である動物を含むことを意図する。対象又は患者の例として、哺乳動物、例えば、ヒト、イヌ、雌ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラット、及び遺伝子組換えしたヒト以外の動物が挙げられる。ある特定の実施形態では、対象は、ヒト、例えば、膀胱がんを患っている、患っているリスクがある、又は患うことが潜在的に可能であるヒトである。
【００４６】
「約」又は「およそ」という用語は普通、所与の値又は範囲の２０％以内であり、１０％以内がより好ましく、５％以内が更に最も好ましいことを意味する。代わりに、特に生体系では、「約」という用語は、およその対数（すなわち、１桁）以内、所与の値の２の倍数の範囲内が好ましいことを意味する。
【００４７】
本発明を記載する状況での（特に、以下の特許請求の範囲の状況で）、「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という用語及び同様の指示対象の使用は、本明細書で他に指摘されていない限り又は状況により明確に矛盾しない限り、単数と複数の両方を網羅すると解釈されるものとする。「含む」、「有する」、「を含む」及び「含有する」という用語は、別途明示されていない限り、制限のない用語（すなわち、「これらに限定されないが、〜を含む」という意味）と解釈されるものとする。本明細書の値の範囲の列挙は、本明細書で他に指摘されていない限り、範囲内に入るそれぞれ別個の値を個々に指す簡単な方法として機能することを単に意図し、それぞれ別個の値はそれがあたかも本明細書で個々に列挙されているかのように明細書に組み込まれている。
【００４８】
本明細書で開示されている１つ又は複数の化合物を使用して治療され得る例示的な細胞増殖性障害として、これらに限定されないが、体内の組織及び器官におけるがん、前がん状態又は前がん性の状態、及び転移性の病変が挙げられる。細胞増殖性障害は、過形成、化生、及び異形成を含み得る。
【００４９】
本明細書で開示されている化合物、又はその薬学的に許容される塩は、一般の集団と比べてがんを発症するより大きいリスクを有する対象において、細胞増殖性障害を治療若しくは予防するために、又はがんを治療若しくは予防するために使用することができ、或いはこのような目的のために、適切な候補を特定するために使用することができる。
【００５０】
医薬製剤及び投与経路
膀胱がんの治療のための、化合物１又はその薬学的に許容される塩を含む医薬製剤が提供される。医薬製剤は、担体若しくは賦形剤、安定剤、香味剤、及び／又は着色剤を更に含み得る。
【００５１】
化合物１又はその薬学的に許容される塩は、当業者に公知の様々な投与経路を使用して投与することができる。投与経路は、経口投与及び膀胱内投与を含む。ある特定の実施形態では、化合物若しくはその薬学的に許容される塩を含む医薬製剤は、液体、シロップ剤、錠剤、カプセル剤、粉末、スプリンクル、チュータブ又は溶解可能なディスクの形態で経口的に摂取することができる。代わりに、本発明の医薬製剤は、静脈内又は経皮的に投与することもできる。追加の投与経路は当業者に公知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｎｎａｒｏ  Ａ．Ｒ．編、第２０版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａを参照されたい。）。
【００５２】
一部の実施形態では、化合物又は薬学的に許容される塩はペースト剤、ゼリー、又は懸濁剤として製剤化される。例えば、薬物は、薬物粒子、マイクロカプセル化粒子、又は薬物−ポリマー粒子の形態でゼラチン状溶液又は半固体に溶解している、封じ込められている又は懸濁されている。経口ゼリー製剤の利点は、錠剤、カプセル剤又は丸剤を嚥下するのが困難な患者に対して、より容易に薬物を投与することである。ある特定の実施形態では、化合物は適当な媒体中で、ペースト剤又はゲル剤を形成するために十分混合及び懸濁されている。経口投与の間風味を得るために追加の薬剤を任意選択で混合することができる。ピーナッツバター又はキイチゴの風味を持つアルギン酸塩及び甘味剤が多くの適切な矯味剤の例である。様々な実施形態では、ペースト剤又はゼリーはまた、局所投与のため、当技術分野で公知の適切な結合剤又は賦形剤を用いて製剤化することもできる。
【００５３】
錠剤、カプセル剤又は丸剤の形態の持続放出製剤を調製する方法は当技術分野で公知である。一部の実施形態では、持続放出製剤は、ポリマーを有する薬物の活性成分をコーティングすることにより調製され、水不溶性ポリマーが好ましい。例えば、水不溶性ポリマーは、薬学的分野において持続放出コーティング剤、腸溶コーティング薬剤、又は胃のコーティング剤として使用される。水不溶性ポリマーとして、例えば、エチルセルロース、精製セラック、白色セラック、アミノメタクリル酸アルキルコポリマーＲＳ、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート、カルボキシメチルエチル−セルロース、酢酸フタル酸セルロース、メタクリル酸コポリマーＬ、メタクリル酸コポリマーＬＤ、メタクリル酸コポリマーＳ、アミノメタクリル酸アルキルコポリマーＥ、又はポリビニルアセタールジエチルアミノアセテートを挙げることができる。
【００５４】
水不溶性ポリマーの種類、置換度及び分子量は、水又はアルコール中の活性成分の溶解度、所望の持続放出レベルなどに依存し得る。水不溶性ポリマーは単独で又は組み合わせて使用することができる。水素化油、ステアリン酸、又はセタノールをコーティング助剤薬剤として、及び可塑剤として中鎖トリグリセリド、トリアセチン、クエン酸トリエチル、又はセタノールを更に組み込むことができる。
【００５５】
一部の実施形態では、持続放出製剤はマトリックス型錠剤又は粒剤である。活性成分は３種までの異なる種類のポリマーでコーティングすることができる。これら３種の異なる種類のポリマーは、１）水不溶性ポリマー、例えば、エチルセルロースなど；２）ｐＨ非依存性ゲル化ポリマー、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど；及び３）ｐＨ依存性ゲル化ポリマー、例えば、アルギン酸ナトリウムなどを含むことができる。これら３種の異なる種類のポリマーは、薬物の放出速度を減弱させるために一緒に使用することができる。
【００５６】
剤形：放出特性
持続放出製剤は、ある程度の持続作用を達成することができる。しかし、活性成分の曝露及び／又はバイオアベイラビリティーは、様々な因子、例えば、吸収ウィンドウ、製剤に使用されている担体又は賦形剤、製剤の送達モード、及び／又は患者の消化管を介する活性成分の輸送時間などに基づき異なり得る。
【００５７】
治療は、持続放出機能を実施するための少なくとも１つの持続放出部分と、即時放出性機能を実施するための１つの即時放出性部分とを含有することができる。ある特定の実施形態では、治療が単一剤形である場合、この単一剤形は、持続放出部分を構成する持続放出性粒剤と即時放出性部分を構成する即時放出性粒剤の混合物から形成される錠剤、カプセル剤に持続放出性粒剤及び即時放出性粒剤を充填することにより得られるカプセル調製物、又は即時放出性部分を構成する外層が持続放出部分を構成する内側コア上に形成されている圧縮コーティング錠剤の形態であることができる。しかし、上記実施形態に制限はない。
【００５８】
更に、組成物中又は即時放出性部分若しくは持続放出部分中の薬物の格納容器の状態に対して特定の制限はなく、化合物は、組成物、即時放出性部分若しくは持続放出部分中に均一に分散していてもよいし、或いは、組成物、即時放出性部分若しくは持続放出部分の一部分のみに含有されていてもよいし、又は濃度勾配が存在するように含有されていてもよい。
【００５９】
本発明による組成物中の持続放出部分は、薬物放出を制御するための、少なくとも１つの非ｐＨ依存性ポリマー性物質又はｐＨ依存性ポリマー性物質を含有することができる。
【００６０】
本明細書で使用される非ｐＨ依存性ポリマー性物質は、消化管に一般的に見出されるｐＨ条件下、具体的にはｐＨ１〜ｐＨ８で、その電荷状態がほとんど変化しないポリマー性物質を含むことができる。これは、例えば、その電荷状態がｐＨに応じて変化する官能基、例えば、アミノ基などの塩基性官能基若しくはカルボン酸基などの酸性官能基などを有さないポリマー性物質を意味する。非ｐＨ依存性ポリマー性物質は、本発明による組成物に持続放出機能を付与するために含めることができるが、別の目的のために含まれていてもよいことに注意されたい。更に、本発明に使用される非ｐＨ依存性ポリマー性物質は水不溶性であってもよいし、又は水中で膨張若しくは溶解して、ゲル剤を形成してもよい。
【００６１】
水不溶性の非ｐＨ依存性ポリマー性物質の例として、これらに限定されないが、セルロースエーテル、セルロースエステル、及びメタクリル酸−アクリル酸コポリマー（商標名オイドラギット（Ｅｕｄｒａｇｉｔ）、Ｒｏｈｍ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．ＫＧ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙにより製造）が挙げられる。例として、これらに限定されないが、セルロースアルキルエーテル、例えば、エチルセルロース（商標名エトセル（Ｅｔｈｏｃｅｌ）、Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ＵＳＡにより製造）、エチルメチルセルロース、エチルプロピルセルロース又はイソプロピルセルロース、及びブチルセルロース、セルロースアラルキルエーテル、例えば、ベンジルセルロース、セルロースシアノアルキルエーテルなど、例えば、シアノエチルセルロース、セルロース有機酸エステルなど、例えば、酢酸酪酸セルロース、酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース若しくは酪酸セルロース、及び酢酸セルロースプロピオネート、アクリル酸エチル−メタクリル酸メチルコポリマーなど（商標名オイドラギット（Ｅｕｄｒａｇｉｔ）ＮＥ、Ｒｏｈｍ  ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙにより製造）、及びアミノメタクリル酸アルキルコポリマーＲＳ（商標名オイドラギット（Ｅｕｄｒａｇｉｔ）ＲＬ、オイドラギット（Ｅｕｄｒａｇｉｔ）ＲＳ）が挙げられる。本発明に使用された水不溶性ポリマー平均粒子直径に対して特定の制限はないが、普通この平均粒子直径が低いほど、性能が良く、平均粒子直径は０．１〜１００μｍが好ましく、１〜５０μｍがより好ましく、３〜１５μｍが特に好ましく、５〜１５μｍが最も好ましい。更に、水溶性又は水膨潤性非ｐＨ依存性ポリマー性物質の例として、これらに限定されないが、ポリエチレンオキシド（商標名ポリオックス（Ｐｏｌｙｏｘ）、Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙにより製造、分子量１００，０００〜７，０００，０００）、低置換ヒドロキシプロピルセルロース（商標名Ｌ−ＨＰＣ、Ｓｈｉｎ−Ｅｔｓｕ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｊａｐａｎにより製造）、ヒドロキシプロピルセルロース（商標名ＨＰＣ、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｓｏｄａ、Ｃｏ．、Ｌｔｄ、Ｊａｐａｎにより製造）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（商標名メトロース（Ｍｅｔｏｌｏｓｅ）６０ＳＨ、６５ＳＨ、９０ＳＨ、Ｓｈｉｎ−Ｅｔｓｕ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｊａｐａｎにより製造）、及びメチルセルロース（商標名メトロース（Ｍｅｔｏｌｏｓｅ）ＳＭ、Ｓｈｉｎ−Ｅｔｓｕ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｊａｐａｎにより製造）が挙げられる。
【００６２】
一部の実施形態では、単一の非ｐＨ依存性ポリマー性物質が組成物中に含有されていてもよく、又は複数の非ｐＨ依存性ポリマー性物質が含有されていてもよい。非ｐＨ依存性ポリマー性物質は、本明細書で報告された実施形態に使用された場合、水不溶性ポリマー性物質であってよく、エチルセルロース、アクリル酸エチル−メタクリル酸メチルコポリマー（商標名オイドラギット（Ｅｕｄｒａｇｉｔ）ＮＥ）、又はアミノメタクリル酸アルキルコポリマーＲＳ（商標名オイドラギット（Ｅｕｄｒａｇｉｔ）ＲＬ、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  ＲＳ）がより好ましい。エチルセルロース及びアミノメタクリル酸アルキルコポリマーＲＳのうちの少なくとも１つが特に好ましい。エチルセルロースが最も好ましい。組成物中に含有される非ｐＨ依存性ポリマー性物質の量に対して特定の制限は存在しない。この量は、持続性薬物放出を制御することなどの目的に従い必要に応じて調整することができる。
【００６３】
本明細書で報告された実施形態において使用することができるｐＨ依存性ポリマー性物質は、消化管に一般的に見出されるｐＨ条件下、具体的にはｐＨ１〜ｐＨ８下で電荷状態が変化するポリマー性物質であってよい。これは、例えば、その電荷状態がｐＨに応じて変化する官能基、例えば、アミノ基などの塩基性官能基など、又はカルボン酸基などの酸性官能基などを有するポリマー性物質を意味する。ｐＨ依存性ポリマー性物質のｐＨ依存性官能基は酸性官能基が好ましく、カルボン酸基を有するｐＨ依存性ポリマー性物質が最も好ましい。
【００６４】
本発明に使用されるｐＨ依存性ポリマー性物質は水不溶性であってもよいし、又は水中で膨張する若しくは水に溶解して、ゲル剤を形成してもよい。本発明に使用されるｐＨ依存性ポリマー性物質の例として、これらに限定されないが、腸内ポリマー性物質が挙げられる。腸内ポリマー性物質の例として、これらに限定されないが、メタクリル酸−メタクリル酸メチルコポリマー（Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ１００、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｓ１００、Ｒｏｈｍ  ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙにより製造）、メタクリル酸−アクリル酸エチルコポリマー（Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ１００−５５、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ３０Ｄ−５５、Ｒｏｈｍ  ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙにより製造）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰ−５５、ＨＰ−５０、Ｓｈｉｎ−Ｅｔｓｕ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｊａｐａｎにより製造）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートコハク酸塩（ＡＱＯＡＴ、Ｓｈｉｎ−Ｅｔｓｕ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｊａｐａｎにより製造）、カルボキシメチルエチルセルロース（ＣＭＥＣ、Ｆｒｅｕｎｄ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｊａｐａｎにより製造）、及び酢酸フタル酸セルロースが挙げられる。
【００６５】
水中で膨張し、又は水に溶解して、ゲル剤を形成するｐＨ依存性ポリマー性物質の例として、これらに限定されないが、アルギン酸、ペクチン、カルボキシビニルポリマー、及びカルボキシメチルセルロースが挙げられる。本発明では、単一のｐＨ依存性ポリマー性物質が組成物中に含有されていてもよいし、又は複数のｐＨ依存性ポリマー性物質が含有されていてもよい。本発明に使用されるｐＨ依存性ポリマー性物質は、腸内ポリマー性物質が好ましく、メタクリル酸−アクリル酸エチルコポリマー、メタクリル酸−メタクリル酸メチルコポリマー、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、又はヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートコハク酸塩がより好ましく、メタクリル酸−アクリル酸エチルコポリマーが特に好ましい。
【００６６】
本発明による組成物の製造プロセスにおいてｐＨ依存性ポリマー性物質を使用する場合、粉末タイプ若しくは顆粒タイプ、又はｐＨ依存性ポリマー性物質が事前に溶媒中に分散されている懸濁タイプの市販の製品は、そのまま使用することができるし、又はこのような市販の製品は水又は有機溶媒中に分散させて使用することもできる。ｐＨ依存性ポリマー性物質の粒子直径が低いほど、性能が良くなり、ｐＨ依存性ポリマー性物質は粉末タイプが好ましい。メタクリル酸−アクリル酸エチルコポリマーの場合では、例はＥｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ１００−５５である。本発明に使用されるｐＨ依存性ポリマー性物質の平均粒子直径に対して特定の制限は存在しないが、平均粒子直径は０．０５〜１００μｍが好ましく、０．０５〜７０μｍがより好ましく、０．０５〜５０μｍが最も好ましい。更に、ｐＨ依存性ポリマー性物質の量に対する特定の制限は存在せず、例えば、腸内ポリマー性物質の場合、量は一般的に、１００重量部の組成物に基づき、０．１〜９０重量部であり、１〜７０重量部が好ましく、５〜６０重量部がより好ましく、１０〜５０重量部が特に好ましい。
【００６７】
本明細書で報告された実施形態による治療は、様々な添加物のいずれか、例えば、様々な薬理学的に許容される担体のうちのいずれか、例えば、希釈剤、滑沢剤、結合剤及び崩壊剤など、並びに保存剤、着色剤、甘味剤、可塑剤、フィルムコーティング薬剤などを、必要に応じて更に含有してもよい。希釈剤の例として、これらに限定されないが、ラクトース、マンニトール、第二リン酸カルシウム、デンプン、アルファ化デンプン、結晶性セルロース、軽質無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、マグネシウムアルミン酸メタケイ酸など挙げられる。滑沢剤の例として、これらに限定されないが、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、ステアリルフマル酸ナトリウムなどが挙げられる。結合剤の例として、これらに限定されないが、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。崩壊剤の例として、これらに限定されないが、カルボキシメチルセルロース、カルシウムカルボキシメチルセルロース、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルナトリウムデンプン、低置換ヒドロキシプロピルセルロースなどが挙げられる。
【００６８】
保存剤の例として、これらに限定されないが、パラオキシ安息香酸エステル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。着色剤の好ましい例として、これらに限定されないが、水不溶性のレーキ顔料、天然顔料（例えば、ベータ−カロテン、クロロフィル、赤色酸化鉄）、黄色酸化鉄、赤色酸化鉄、黒色酸化鉄などが挙げられる。甘味剤の好ましい例として、これらに限定されないが、サッカリンナトリウム、二カリウム甘草、アスパルテーム、ステビアなどが挙げられる。可塑剤の例として、これらに限定されないが、グリセロール脂肪酸エステル、クエン酸トリエチル、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。フィルムコーティング薬剤の例として、これらに限定されないが、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどが挙げられる。
【００６９】
製造方法
本明細書で報告されたように実施形態を製造するために、単一の従来の方法、又は従来の方法の組合せを使用することができる。例えば、薬物を含有する粒剤を持続放出部分又は即時放出性部分として製造する場合、造粒は主要作業であるが、造粒を他の作業、例えば、混合、乾燥、篩分け、及び分類などと組み合わせることもできる。造粒方法、例えば、結合剤及び溶媒を粉末に加え、造粒を行う湿式造粒法、粉末を圧縮し、顆粒を行う乾式造粒法、加熱により溶融する結合剤を加え、加熱及び造粒を行う溶融造方法などを使用することができる。
【００７０】
更に、造粒法に従い、遊星型ミキサー、ねじミキサーなどを使用する混合造粒法、Ｈｅｎｓｃｈｅｌミキサー、Ｓｕｐｅｒミキサーなどを使用する高速混合造粒法、円柱状造粒機、回転式造粒機、ねじ押出加工造粒機、ペレットミル型造粒機などを使用する押出加工造粒法、湿式高せん断造粒法、流動床造粒法、圧縮造粒法、粉砕造粒法、又はスプレー造粒法などの作動法を使用することができる。造粒後、使用のための粒剤又は微細粒剤を得るために、乾燥器、流動床などを使用する乾燥、クラッキング、及び篩分けを行うことができる。更に、本発明による組成物を調製する場合、造粒溶媒を使用することができる。このような造粒溶媒に対して特定の制限は存在せず、溶媒は、水又は様々な有機溶媒、例えば、水、低級アルコール、例えば、メタノール若しくはエタノールなど、ケトン、例えば、アセトン又はメチルエチルケトン、塩化メチレン、又はその混合物などのうちのいずれかであってよい。
【００７１】
実施形態に含有される持続放出性粒剤に対して、少なくとも１種の薬物及び非ｐＨ依存性ポリマー性物質及びｐＨ依存性ポリマー性物質から選択される少なくとも１つを一緒に混合し、希釈剤及び結合剤を必要に応じて加え、造粒を行って、顆粒状物質を得る。得られた顆粒状物質を、トレイ乾燥器、流動床乾燥器などを使用して乾燥させ、ミル又は振動を使用して篩分けを行い、これにより、持続放出性粒剤を得ることができる。代わりに、本発明の持続放出性粒剤の製造方法として、乾燥圧縮機、例えば、ローラー圧縮機又はスラグ打錠機などを使用して、少なくとも１種の薬物、非ｐＨ依存性ポリマー性物質及びｐＨ依存性ポリマー性物質から選択される少なくとも１つ、並びに必要に応じて、希釈剤及び結合剤を加え、混合しながら圧縮成型を行い、次いで適切なサイズまで破壊することによって造粒を行うことが可能である。このような造粒機を使用して調製した顆粒状物質は、本発明による粒剤又は微細な粒剤としてそのまま使用することができるし、又はパワーミル、ロール造粒機、ロータースピードミルなどを使用して更に破壊し、篩い分けすることによって、持続放出性粒剤を得ることができる。即時放出性粒剤はまた、持続放出性粒剤用としても製造することができることに注意されたい。
【００７２】
圧縮成型製品は、単一の従来の方法、又は従来の方法の組合せを使用して、薬物含有持続放出部分若しくは即時放出性部分として、又は本明細書で報告された組成物として製造することができる。例えば、少なくとも１種の薬物、非ｐＨ依存性ポリマー性物質及びｐＨ依存性ポリマー性物質から選択される少なくとも１つ、希釈剤、例えば、マンニトール又はラクトースなど、結合剤、例えば、ポリビニルピロリドン又は結晶性セルロースなど、崩壊剤、例えば、カルメロースナトリウム又はクロスポビドンなど、及び滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム又はタルクなどが使用され、普通の方法を使用して錠剤化が行われ、これによって、圧縮成型製品を得ることができる。この場合、打錠は圧縮成型製品の製造方法の主要作業であるが、これを、混合、乾燥、糖コーティング形成、及びコーティングなどの他の作業と組み合わせることもできる。
【００７３】
打錠のための方法の例として、これらに限定されないが、少なくとも１つの薬物及び薬理学的に許容される添加物を一緒に混合し、次いで、打錠機を使用して、混合物を錠剤へと直接圧縮成型する直圧縮成型、必要に応じて滑沢剤又は崩壊剤を添加した後、本発明による持続放出性粒剤又は即時放出性粒剤を圧縮成型の対象下におく、乾式粒剤圧縮又は湿式粒剤圧縮が挙げられる。圧縮成形に使用される打錠機について特定の制限は存在しない。例えば、単一パンチ打錠機、回転式打錠機、又は圧縮コーティング打錠機を使用することができる。
【００７４】
本明細書の実施形態による薬物含有持続放出性粒剤若しくは即時放出性粒剤、又は圧縮成型製品は、組成物としてそのまま粒剤又は錠剤の形態で使用することができるが、組成物を製造するための更なる加工の対象下におくこともできる。例えば、圧縮成型製品又は粒剤には、フィルム基材材料、例えば、エチルセルロース、カゼイン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メタクリル酸コポリマーＬ、酢酸フタル酸セルロース、セラックなどを使用してフィルムコーティングを付与することもできるし、又はサッカロース、糖アルコール、アラビアガム粉末、タルクなどを含有する糖コーティング液を使用して糖コーティングを付与することもでき、こうして、フィルムコーティング錠剤又は糖コーティング錠剤を生成する。このコーティング技術における１種の溶媒は精製水であってよいが、有機溶媒、例えば、アルコール、ケトン、エーテル若しくは塩素化炭化水素、又はこれらの混合物もまた使用することができる。例えば、エタノール、アセトン、塩化メチレンなどを有機溶媒として使用することができる。更に、コーティング装置として、薬の製造のために、コーティング技術で普通使用される装置を使用することができ、例として、コーティング液などをスプレーすることによってコーティングを行うスプレーコーティング装置、及び層状化のためのローター流動床造粒機が挙げられる。
【００７５】
カプセル調製物を製造する場合、カプセル調製物は、自動カプセル充填機を使用して、上記のような持続放出性粒剤若しくは即時放出性粒剤又は小型錠剤を、硬質ゼラチンカプセル又はＨＰＭＣカプセル剤に充填することによって製造することができる。代わりに、チューブごとの投与のための調製物又は摂取の際に水などと混合して使用する乾式シロップ剤の場合、上記のような持続放出性粒剤又は即時放出性粒剤は、これらの粒剤に分散させるための増粘剤又は分散剤と混合することができ、次いで、混合物を粒剤又は錠剤にする。更に、液体又はゼリーは、水、及び分散剤、乳化剤、増粘剤、保存剤、ｐＨ調節剤、甘味剤、香味剤、香料などから選択される物質を使用して作製することができる。しかし、他の製造方法に関して、上記に対する制限はない。
【００７６】
本明細書に記載の実施形態がより完全に理解され得るように、以下の実施例が記載されている。これらの実施例は例示的目的のためのみのものであり、限定的と解釈されないことを理解すべきである。
【実施例】
【００７７】
以下の略語が実施例を通して使用するされる場合がある。
Ａｌｌ：アリル
ＤＭＴ：４，４’−ジメトキシトリチル
（ＤＭＴＯ−：
【化６】
2021525758.tif 000007
）
Ｂｚ：ベンゾイル
ヒューニッヒ塩基：ｉ−Ｐｒ２ＮＥｔ（ジイソプロピルエチルアミン）
アリルＯＨ：アリルアルコール
ＯＡｌｌ：−ＯＣＨ２ＣＨＣＨ２
ＡＣＮ：アセトニトリル
Ａｌｌ：−ＣＨ２ＣＨＣＨ２
２−ニトロＢｎＢｒ：２−ニトロベンジルブロミド
Ｂｚ：ベンゾイル
ｉ−Ｐｒ：イソプロピル
ＣＥ：シアノエチル
【化７】
2021525758.tif 000008
ＤＥＡＤ：ジエチルアゾジカルボキシレート
ＤＩＡＤ：ジイソプロピルアゾジカルボキシレート
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＤＴＴ：Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ’−（３−チオキソ−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−５−イル）ホルムイミドアミド
【化８】
2021525758.tif 000009
ＤＭＯＣＰ：２−クロロ−５，５−ジメチル−１，３，２−ジオキサホスフィナン２−オキシド
【化９】
2021525758.tif 000010
ＴＢＳ：ｔ−ブチルジメチルシリル
３Ｈ−ベンゾ［ｃ］［１，２］ジチオール−３−オン：
【化１０】
2021525758.tif 000011
【００７８】
実施例１−−化合物１ａの合成
この合成の全スキームは図１に示されている。
【００７９】
ステップＡ
【化１１】
2021525758.tif 000012
【００８０】
（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−ベンズアミド−９Ｈ−プリン−９−イル）−２−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）−４−フルオロテトラヒドロフラン−３−イル（２−シアノエチル）ジイソプロピルホスホルアミダイト（化合物１００）（亜リン酸ジアステレオマーの混合物；８０．０ｇ、９１．３３２ｍｍｏｌ、１当量、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ社カタログ番号ＡＮＰ−９１５１）、アリルアルコール（９．６３ｍｌ、１４２ｍｍｏｌ、１．５５当量）及びトリフェニルホスフィン（３８．３ｇ、１４６ｍｍｏｌ、１．６０当量）のＴＨＦ（１．１Ｌ）中混合物に、周囲温度でＤＥＡＤ（トルエン中４０重量％溶液；５４．２ｍｌ、１３７ｍｍｏｌ、１．５当量）を加えた。周囲温度で撹拌を続け、反応をＬＣ／ＭＳにより監視した。完了した時点（１９時間）で、混合物を真空で濃縮（３５℃）し、得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（８００ｇ×２カラム、０．５％トリエチルアミンで緩衝したｎ−ヘプタン中４０〜６０％ＥｔＯＡｃ）により精製して、化合物１０１を白色泡状物として得た（８４．２ｇ、定量的収率、亜リン酸ジアステレオマーの混合物）。
１Ｈ  ＮＭＲ（３：２  亜リン酸ジアステレオマーの混合物，４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１．１４〜１．２１（ｍ，１２Ｈ）２．４０（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１．２Ｈ）２．５９（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，０．８Ｈ）３．２７（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ）３．５２〜３．６６（ｍ，５Ｈ）３．７８（ｓ  ２．４Ｈ）３．７９（ｓ  ３．６Ｈ）４．２８〜４．３４（ｍ，１Ｈ）４．８４〜４．９６（ｍ，０．４Ｈ）４．９９（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ）４．９５〜５．１０（ｍ，０．６Ｈ）５．０５（ｄ，Ｊ＝１０．９Ｈｚ，１Ｈ）５．２２（ｂｒ  ｄ，Ｊ＝１７．６Ｈｚ，１Ｈ）５．６４（ｂｒ  ｄ，Ｊ＝５３．２Ｈｚ，０．６Ｈ）５．７０（ｂｒ  ｄ，Ｊ＝５１．６Ｈｚ，０．４Ｈ）５．９６〜６．７５（ｍ，１Ｈ）６．２０（ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，０．６Ｈ）６．２４（ｄ，Ｊ＝１７．２Ｈｚ，０．４Ｈ）６．７４〜６．７９（ｍ，４Ｈ）７．０２〜７．０６（ｍ，２Ｈ）７．１７〜７．２４（ｍ，８Ｈ）７．３２〜７．３４（ｍ，２Ｈ）７．４１〜７．４４（ｍ，２Ｈ）８．１１（ｓ，１Ｈ）８．５２（ｓ，０．４Ｈ）８．５４（ｓ，０．６Ｈ）。
【００８１】
ステップＢ
【化１２】
2021525758.tif 000013
【００８２】
化合物１０１（３．００ｇ、３．２８ｍｍｏｌ、１当量）のアセトニトリル（３０ｍｌ）中溶液に、水（０．１１８ｍｌ、６．５５ｍｍｏｌ、２．０当量）及びピリジントリフルオロ酢酸塩（０．７５９ｇ、３．９３ｍｍｏｌ、１．２当量）を加えた。周囲温度で１分間撹拌した後、ｔｅｒｔ−ブチルアミン（１４．５ｇ、２１．０ｍｌ、０．２０ｍｏｌ、６０当量）を加えた。シアノエチル基の開裂が完結した時点（ＬＣ／ＭＳにより監視した）で、反応混合物を真空で濃縮し、アセトニトリルで２回共沸させた。粗製の混合物をＤＣＭ（４５．０ｍｌ）に溶解し、周囲温度で水（０．１１８ｍｌ、６．５５ｍｍｏｌ、２．０当量）及びＮａＨＳＯ４−ＳｉＯ２（１．１８ｇ、６．５５ｍｍｏｌ、２当量）で処理した。ＤＭＴ基の開裂が完結した時点（ＬＣ／ＭＳにより監視した、およそ１時間）で、反応混合物を濾過し、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（９／１、２０ｍｌ）で２回濯いだ。合わせた濾液を真空で濃縮し、ｎ−ヘプタン／トルエンの１：１混合物（約３０ｍｌ）で処理した。上層をデカント除去した。同じ操作をｎ−ヘプタン／トルエン（１／１、３０ｍｌ）でもう１回繰り返し、下層をアセトニトリルで２回共沸させて、化合物１０２（１００％理論的収率と仮定）を得た。生成物を更には精製せずに次のステップに使用した。
【００８３】
ステップＣ
【化１３】
2021525758.tif 000014
【００８４】
化合物１０２（１．５６ｇ、３．２７ｍｍｏｌ、１当量）及び化合物１０１（３．００ｇ、３．２８ｍｍｏｌ、１当量）のアセトニトリル（３０ｍｌ）中混合物に、ピリジントリフルオロ酢酸塩（ピリジンを用いて共沸乾燥した；０．７６０ｇ、３．９４ｍｍｏｌ、１．２５当量）を加えた。５分後、ＤＤＴＴ（０．８４０ｇ、４．０９ｍｍｏｌ、１．３０当量、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ社カタログ番号ＲＮ−１５８８）を加え、硫化が完結した時点（ＬＣ／ＭＳにより監視した）で、反応混合物を真空で濃縮した。残留物をＤＣＭ（３０ｍｌ）に溶解し、水（０．５７ｍｌ、３２ｍｍｏｌ、１０当量）及びＤＣＭ（３０ｍｌ）中６％ジクロロ酢酸（１．５６ｍｌ、１８．９ｍｍｏｌ、６．０当量）で処理した。２０分後、反応物をピリジン（２０ｍｌ）でクエンチし、真空で濃縮した。残留物をピリジンで共沸させて、化合物１０３（３．２２ｇ、１００％理論的収率と仮定）を得た。生成物を更には精製せずに次のステップに使用した。
【００８５】
ステップＤ
【化１４】
2021525758.tif 000015
【００８６】
化合物１０３（３．２２ｇ、３．１５ｍｍｏｌ、１当量）のピリジン（１００ｍｌ）中溶液に、周囲温度でＤＭＯＣＰ（１．４５ｇ、７．８８ｍｍｏｌ、２．５０当量）を加えた。マクロ環化が完結した時点（ＬＣ／ＭＳにより監視した）で、水（１．７ｍｌ、９４．５ｍｍｏｌ、ＤＭＯＣＰに対して×１０倍）を、続いて３Ｈ−ベンゾ［ｃ］［１，２］ジチオール−３−オン（０．７９５ｇ、４．７３ｍｍｏｌ、１．５当量）を加えた。硫化が完結した時点（およそ４０分）で、反応混合物を真空で部分的に濃縮しておよそ１５ｍｌにし、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５０ｍｌ）と水（３０ｍｌ）との混合物中に注ぎ入れた。周囲温度で１０分撹拌した後、混合物をＥｔＯＡｃ／ＭＴＢＥの１：１混合物（６０ｍｌ×３回）で抽出した。有機層を合わせ、ブライン（２５ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水し、真空で濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０〜２０％ＭｅＯＨ）により精製して、化合物１０４（３．３１ｇ、３．２０ｍｍｏｌ、１００％理論的収率と仮定）を茶褐色油状物として得た。生成物を更には精製せずに次のステップに使用した。
【００８７】
ステップＥ
【化１５】
2021525758.tif 000016
【００８８】
化合物１０４（３．３１ｇ、３．２０ｍｍｏｌ、１当量）のアセトニトリル（６６．２ｍｌ）中溶液に、２−ニトロベンジルブロミド（２．４２ｇ、１１．２ｍｍｏｌ、３．５０当量）及びトリエチルアミン（１．７８ｍｌ、１２．８ｍｍｏｌ、４．００当量）を加えた。反応が完結した時点（ＬＣ／ＭＳにより監視した、周囲温度でおよそ２０時間）で、反応混合物を真空で濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（６０％酢酸エチル／ｎ−ヘプタンから１００％酢酸エチル）により精製して、生成物０．５６８ｇを亜リン酸ジアステレオマーの混合物として得た。ジアステレオマーを分取ＨＰＬＣ分離して、化合物１０５（ＳＲ異性体；０．２２５ｇ、０．１８０ｍｍｏｌ、化合物１０１からの合計収率５．６％）及び化合物１０６（ＲＲ異性体；０．１８７ｇ、０．１４９ｍｍｏｌ、化合物１からの合計収率４．７％）を得た。
化合物１０５（ＳｐＲｐ）１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝８．６３（ｓ，１Ｈ）、δ＝８．６１（ｓ，１Ｈ）、８．０４〜８．００（ｍ，２Ｈ）、７．９９（ｓ，１Ｈ）、７．９０（ｓ，１Ｈ）、７．６５〜７．４４（ｍ，８Ｈ）、７．４０〜７．３１（ｍ，４Ｈ）、７．２５〜７．２１（ｍ，４Ｈ）、６．１５〜５．８９（ｍ，５Ｈ）、５．６１（ｄｄ，Ｊ＝５２．０，５．１Ｈｚ，１Ｈ）、５．５５（ｄｄｄ，Ｊ＝５１．２，４．７，２．７Ｈｚ，１Ｈ）５．５１〜５．４２（ｍ，１Ｈ）、５．３１〜５．２２（ｍ，２Ｈ）、５．１１（ｄｄ，Ｊ＝３．９，９．８Ｈｚ，２Ｈ）、５．０４〜４．９５（ｍ，４Ｈ）、４．５５〜４．３７（ｍ，７Ｈ）、４．２９〜４．１２（ｍ，３Ｈ）
化合物１０６（ＲｐＲｐ）１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝８．６５（ｓ，２Ｈ）、８．０６（ｄｄ，Ｊ＝１．４，８．０Ｈｚ，２Ｈ）、７．９８（ｓ，２Ｈ）、７．５７〜７．５２（ｍ，６Ｈ）、７．４７〜７．３２（ｍ，６Ｈ）、７．２５〜７．２１（ｍ，４Ｈ）、６．１５（ｄ，Ｊ＝１８．７Ｈｚ，２Ｈ）、６．０９〜５．９９（ｍ，２Ｈ）、５．８２〜５．７６（ｍ，２Ｈ）、５．６０（ｄｄ，Ｊ＝５１．８，４．９Ｈｚ，２Ｈ）、５．２７（ｄｄ，Ｊ＝１．２，１７．２Ｈｚ，２Ｈ）、５．１２（ｄｄ，Ｊ＝１．０，１０．４Ｈｚ，２Ｈ）、５．０６〜４．９６（ｍ，４Ｈ）、４．５５〜４．４０（ｍ，４Ｈ）、４．３６〜４．２４（ｍ，４Ｈ）、４．２１〜４．０２（ｍ，２Ｈ）
【００８９】
分取ＨＰＬＣ条件：
【００９０】
【表１】
2021525758.tif 000017
【００９１】
ステップＦ
【化１６】
2021525758.tif 000018
【００９２】
化合物１０５（５１９ｍｇ、０．４１４ｍｍｏｌ、１当量）のトルエン（５１９ｍｌ）中加熱（９０℃）溶液に、ホベイダ−グラブス触媒（Ｈｏｖｅｙｄａ−Ｇｒｕｂｂｓ  Ｃａｔａｌｙｓｔ）（商標）第２世代（（１，３−ビス−（２，４，６−トリメチルフェニル）−２−イミダゾリジニリデン）ジクロロ（ｏ−イソプロポキシフェニルメチレン）ルテニウム；（シグマ−アルドリッチ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＴＣＨ）（登録商標）カタログ番号５６９７５５にて入手可能；ＣＡＳ３０１２２４−４０−８；９１ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、０．３５当量）及びキノン（０．１０２ｍｌ、１．２４３ｍｍｏｌ、３．０当量）を加えた。混合物を加熱還流し、反応の進行をＬＣ／ＭＳにより監視した。３時間後、更に触媒（９１ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、０．３５当量）を加え、反応を更に３時間続けた。冷却した後、混合物を周囲温度でＤＭＳＯ（０．５９ｍｌ、８．３ｍｍｏｌ、２０当量）にて１５時間処理し、真空で濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２  ２５ｇ、ｎ−ヘプタン中６６％酢酸エチルから１００％酢酸エチル）により精製して、化合物１０７（２００ｍｇ、０．１６３ｍｍｏｌ、収率３９％）を茶褐色乾燥泡状物として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝８．１９（ｓ，１Ｈ）、８．１２（ｄｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１．９Ｈｚ，１Ｈ）、８．１０（ｓ，１Ｈ）、８．０２（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ）、７．８９（ｓ，１Ｈ）、７．６３（ｂｒ  ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．５３〜７．４１（ｍ，１０Ｈ）、７．３５〜７．３０（ｍ，２Ｈ）、７．２５〜７．２０（ｍ，４Ｈ）、６．２３（ｄ，Ｊ＝１７．６Ｈｚ，１Ｈ）、６．１４（ｄ，Ｊ＝１８．８Ｈｚ，１Ｈ）、５．８６〜５．７５（ｍ，１Ｈ）、５．７５（ｄｔ，Ｊ＝１５．３，５．０Ｈｚ，１Ｈ）、５．６７（ｄｔ，Ｊ＝１５．３，４．７Ｈｚ，１Ｈ）、５．６０（ｄｄ，Ｊ＝５２．０，３．９Ｈｚ．１Ｈ）、５．４８（ｄｄ，Ｊ＝５０．４，３．９Ｈｚ．１Ｈ）５．５０〜５．３９（ｍ，１Ｈ）、４．９１〜４．６４（ｍ，４Ｈ）、４．５７〜４．２５（ｍ，９Ｈ）、４．１５（ｄ，Ｊ＝７．０３Ｈｚ，１Ｈ）、４．１１（ｄ，Ｊ＝７．０３Ｈｚ，１Ｈ）。
【００９３】
ステップＧ
【化１７】
2021525758.tif 000019
【００９４】
化合物１０７（８８ｍｇ、０．０７２ｍｍｏｌ、１当量）の１，４−ジオキサン（１．７６ｍｌ）中溶液に、チオフェノール（０．８８ｍＬ、８．５５ｍｍｏｌ、１１９当量）及びトリエチルアミン（０．８８ｍＬ、６．３１ｍｍｏｌ、８８当量）を加えた。得られた混合物を周囲温度で撹拌した。反応が完結した時点（ＬＣ／ＭＳにより監視した、１３時間）で、メタノール（５．２８ｍｌ）及び２８％水酸化アンモニウム（３．５２ｍｌ）を加え、得られた混合物を５０℃に加熱した。反応が完結した時点（ＬＣ／ＭＳにより監視した、５時間）で、混合物を周囲温度に冷却し、得られた茶褐色がかったスラリー液を濾過し、水（１５ｍｌ）で濯いだ。濾液を再度濾過して、更に固体を除去した。最後の濾液をトルエンとヘプタンとの１：１混合物（３０ｍｌ）で２回抽出した。水層を真空で濃縮し、次いで水（６ｍｌ）に再度懸濁させた。得られた固体を濾別し、濾液を分取ＨＰＬＣに供して、化合物１のジアンモニウム塩（化合物１ａとも称される）（３９ｍｇ、０．０５０ｍｍｏｌ、収率７０％）を白色固体として得た。
化合物１ａ（ＳｐＲｐ、ｔｒａｎｓ）１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ＝９．０５（ｓ，１Ｈ）、８．３３（ｓ，１Ｈ）、８．２５（ｓ，１Ｈ）、８．１２（ｓ，１Ｈ）、６．３４（ｂｒ  ｓ，２Ｈ）、５．８８（ｂｒ  ｓ，２Ｈ）、５．６６（ｂｒ  ｄ，Ｊ＝５１．６Ｈｚ，１Ｈ）、５．５９（ｂｒ  ｄ，Ｊ＝５２．２Ｈｚ，１Ｈ）５．０１（ｂｒ  ｓ，２Ｈ）、４．６８〜４．３４（ｍ，６Ｈ）、４．０７〜３．８２（ｍ，２Ｈ）、３．７９〜３．５５（ｍ，２Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ＝５５．４８（ｓ，１Ｐ）、５５．１６（ｓ，１Ｐ）。
化合物１ａ分取ＨＰＬＣ条件：
【００９５】
【表２】
2021525758.tif 000020
【００９６】
実施例１．１−−化合物１ａの代替合成
化合物１ａの代替合成経路を図２Ｃと同様に図２Ａ及び図２Ｂに示し、以下に報告する。
【００９７】
ステージ１
【化１８】
2021525758.tif 000021
【００９８】
化合物１２９（５７０ｇ、１．５３ｍｏｌ、１重量部、１容量、１当量）をピリジン（２．８５Ｌ、３５．２ｍｏｌ、４．８９重量部、５．０容量、２３当量）に溶解した。混合物を２．６℃に冷却し、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴＣｌ；５４３ｇ、１．６０ｍｏｌ、０．９５３重量部、１．０５当量）で処理した。混合物を０〜５℃で２時間撹拌し、次いで周囲温度に加温した。反応をＬＣ／ＭＳにより監視し、終夜撹拌した後、完全に転化していることを確認した。反応混合物を５℃未満に冷却し、ＭｅＯＨ（１２４ｍｌ、３．０５ｍｏｌ、０．１７２重量部、０．２１７容量、２．０当量）で１５分間処理することによりクエンチした。混合物を真空下トルエン（２．００Ｌ、３．０４重量部、３．５１容量）で共蒸発させ、次いでＥｔＯＡｃ（２．８５０Ｌ、４．５重量部、５．０容量）とｎ−ヘプタン（２．８５Ｌ、３．４２重量部、５．０容量）との混合物で希釈した。有機層を飽和ＮａＨＣＯ３（水中９重量％溶液；２．０Ｌ、３．５容量）で洗浄した。更にＥｔＯＡｃ（２．８５Ｌ、４．５重量部、５．０容量）を加えて粗生成物を完全に溶解させた。５分間撹拌した後、２層を分離した。有機層を水（２．０Ｌ、３．５重量部、３．５容量）で洗浄した。固体が有機層からゆっくり沈澱してきた。水層を分離した。次いで有機層をおよそ１容量に濃縮した。粗生成物をｎ−ヘプタン（２．００Ｌ、２．４０重量部、３．５１容量）とトルエン（０．５０Ｌ、０．７６重量部、０．８８容量）との混合物でスラリー化した。１５分間撹拌した後、淡黄色固体を真空濾過により集めた。濾過ケーキを（１）ｎ−ヘプタン（０．６０Ｌ、０．７２重量部、１．０５容量）とトルエン（０．３０Ｌ、０．４６重量部、０．５３容量）との混合物、次いで（２）ｎ−ヘプタン（３．００Ｌ，３．６重量部、５．２６容量）で順次濯いだ。固体を３０分間加熱せずに乾燥し、次いでトレイに移して真空乾燥機中５０℃で終夜乾燥して、化合物１３０を淡黄色固体として得た（９９６．７ｇ、１．４７ｍｏｌ、１．７５重量部、収率９７％）。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝８．９９（ｓ，１Ｈ）、８．７６（ｓ，１Ｈ）、８．２１（ｓ，１Ｈ）、８．０４〜８．００（ｍ，２Ｈ）、７．６４〜７．５９（ｍ，１Ｈ）、７．５７〜７．５０（ｍ，２Ｈ）、７．４１〜７．３６（ｍ，２Ｈ）、７．３２〜７．１５（ｍ，７Ｈ）、６．８３〜６．７６（ｍ，４Ｈ）、６．３１（ｄｄ，Ｊ＝２．５，１７．０Ｈｚ，１Ｈ）、５．６８（ｄｄｄ，Ｊ＝２．３，４．７，５２．７Ｈｚ，１Ｈ）、４．８８〜４．７７（ｍ，１Ｈ）、４．２６〜４．２１（ｍ，１Ｈ）、３．７７（ｓ，６Ｈ）、３．５７（ｄｄ，Ｊ＝３．１，１０．９Ｈｚ，１Ｈ）、３．４３（ｄｄ，Ｊ＝４．１，１０．７Ｈｚ，１Ｈ）、２．６０（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）
【００９９】
ステージ１’
【化１９】
2021525758.tif 000022
【０１００】
化合物１２９（４３０ｇ、１．１５ｍｏｌ、１重量部、１容量、１当量）及びイミダゾール（１１８ｇ、１．７３ｍｏｌ、０．２７４重量部、１．５０当量）をＤＭＦ（１．７２Ｌ、３．７８重量部、４．０容量）に溶解し、得られた混合物を５℃に冷却した。ＴＢＳ−Ｃｌ（１９１ｇ、１．２７ｍｏｌ、０．４４４重量部、１．１０当量）を加えた。混合物を０〜１１℃で２時間撹拌し、周囲温度にゆっくり加温した（進行をＬＣＭＳにより監視した）。ＴＢＳ−Ｃｌ添加後、反応は６時間で完結し、周囲温度で更に２０時間更に撹拌した。混合物を２℃に冷却し、メタノール（９３ｍｌ、７４ｇ、２．３ｍｏｌ、０．１７重量部、０．２２重量部、２．０当量）で１０分間処理した。反応混合物をＭＴＢＥ（１．７２Ｌ、１．２３ｋｇ、２．９６重量部、４．０容量）とＥｔＯＡｃ（１．７２Ｌ、１．５５ｋｇ、３．６０重量部、４．０容量）との混合物、続いて飽和ＮＨ４Ｃｌ（水中２８重量％溶液；２．１５Ｌ、５．０容量）で希釈した。固体が溶液からゆっくり沈澱してきた。混合物を２４℃に加温し、水（１．０８Ｌ、１．０８ｋｇ、２．５重量部、２．５容量）を（内温＝２２℃）に加えた。更に固体が混合物から沈澱し始めた。更に水（１．０８Ｌ、１．０８ｋｇ、２．５重量部、２．５容量）及びＭＴＢＥ（１．４０Ｌ、１．０４ｋｇ、２．４重量部、３．３容量）を混合物に加えた。灰白色固体を真空濾過により集めた。反応器を水（３２０ｍｌ、０．７４容量）で、次いでＭＴＢＥ（１．８０Ｌ、１．３３ｋｇ、３．１０重量部、４．１９容量）で濯いで、多少残った固体をフィルターに移した。濾過ケーキを（１）水（１．８０Ｌ、１．８０ｋｇ、４．２重量部、４．２容量）、（２）水（１．８０Ｌ、１．８０ｋｇ、４．２重量部、４．２容量）、（３）ＭＴＢＥ（０．９０Ｌ、０．６７ｋｇ、１．５重量部、２．１容量）とｎ−ヘプタン（０．９０Ｌ、０．６２ｋｇ、１．４重量部、２．１容量）との混合物、（４）ＭＴＢＥ（０．９０Ｌ、０．６７ｋｇ、１．５重量部、２．１容量）とｎ−ヘプタン（０．９０Ｌ、０．６２ｋｇ、１．４重量部、２．１容量）との混合物で順次濯いだ。回収固体を４０℃で２日かけて真空乾固して、化合物１３３を白色固体として得た（４８３ｇ、０．９９１ｍｏｌ、１．１２重量部、収率８６％）。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝８．９７（ｓ，１Ｈ）、８．８２（ｓ，１Ｈ）、８．３６（ｓ，１Ｈ）、８．０４〜８．００（ｍ，２Ｈ）、７．６４〜７．５８（ｍ，１Ｈ）、７．５６〜７．５１（ｍ，２Ｈ）、６．４０（ｄｄ，Ｊ＝２．３，１６．０Ｈｚ，１Ｈ）、５．４５（ｄｄｄ，Ｊ＝２．７，４．３，５３．１Ｈｚ，１Ｈ）、４．７５〜４．６６（ｍ，１Ｈ）、４．２２〜４．１７（ｍ，１Ｈ）、４．０７（ｄｄ，Ｊ＝２．３，１１．７Ｈｚ，１Ｈ）、３．９１（ｄｄ，Ｊ＝２．７，１１．７Ｈｚ，１Ｈ）、２．３８（ｄｄ，Ｊ＝２．７，７．０Ｈｚ，１Ｈ）、０．９２（ｓ，９Ｈ）、０．１１（ｓ，３Ｈ）、０．１１（ｓ，３Ｈ）。
【０１０１】
ステージ２
【化２０】
2021525758.tif 000023
【０１０２】
化合物１３０（９９３ｇ、１．４７ｍｏｌ、１重量部、１容量、１当量）及びイミダゾール（１５０ｇ、２．２０ｍｏｌ、０．１５１重量部、１．５当量）をＤＭＦ（３．４８Ｌ、３．２８ｋｇ、３．３重量部、３．５容量）に溶解し、混合物を５℃に冷却した。ＴＢＳ−Ｃｌ（２４４ｇ、１．６２ｍｏｌ、０．２４５重量部、１．１０当量）を加えた。反応物を０〜５℃で２時間撹拌し、周囲温度にゆっくり加温し、ＬＣＭＳにより監視した。１７時間後、更にイミダゾール（１００ｇ、１．４７ｍｏｌ、０．１０重量部、１．０当量）及びＴＢＳ−Ｃｌ（１１１ｇ、７３５ｍｍｏｌ、０．１１２重量部、０．５０当量）を加え、周囲温度で２時間及び３５℃で２時間撹拌を続けた。得られた混合物を１３．６℃に冷却し、ＭｅＯＨ（１１９ｍｌ、２．９４ｍｏｌ、２当量）で１０分間処理した。分離反応器に、氷（５ｋｇ、５重量部）及び飽和ＮＨ４Ｃｌ（水中２８重量％溶液；５．０Ｌ、５容量）を加えた。反応混合物を氷／ＮＨ４Ｃｌ混合物に加えた。灰白色固体が溶液から直ちに沈澱し始めた。更に氷２ｋｇ（２ｋｇ、２重量部）及び水（３．０Ｌ、３容量）を混合物に加えた。反応フラスコを水（０．５０Ｌ、０．５容量）で濯ぎ、濯ぎ液を混合物に加えた。ｎ−ヘプタン（２．００Ｌ、２容量）を混合物に加え、１０分間撹拌を続けた。灰白色固体を真空濾過により集めた。濾過ケーキを：（１）水（４．０Ｌ、４．０容量）、（２）水（４．０Ｌ、４．０容量）、（３）ｎ−ヘプタン（４．０Ｌ、４．０容量）、（４）ｎ−ヘプタン（４．０Ｌ、４．０容量）で濯いだ。回収固体を４５℃で４日間真空乾固して、化合物１３１を灰白色固体として得た（１．０９５ｋｇ、１．３９ｍｏｌ、１．１０重量部、収率９４％）。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝９．０９（ｓ，１Ｈ）、８．７８（ｓ，１Ｈ）、８．２８（ｓ，１Ｈ）、８．０２（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ）、７．６３〜７．５９（ｍ，１Ｈ）、７．５５〜７．５０（ｍ，２Ｈ）、７．３７（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ）、７．２９〜７．１７（ｍ，７Ｈ）、６．７９（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，４Ｈ）、６．２９（ｄｄ，Ｊ＝２．９，１６．２Ｈｚ，１Ｈ）、５．６０（ｄｄｄ，Ｊ＝２．７，３．９，５３．１Ｈｚ，１Ｈ）、４．７８（ｄｄｄ，Ｊ＝４．７，６．４，１５．８Ｈｚ，１Ｈ）、４．２６〜４．２２（ｍ，１Ｈ）、３．７７（ｓ，６Ｈ）、３．５８（ｄｄ，Ｊ＝３．１，１０．９Ｈｚ，１Ｈ）、３．２６（ｄｄ，Ｊ＝３．７，１０．７Ｈｚ，１Ｈ）、０．８５（ｓ，９Ｈ）、０．１０（ｓ，３Ｈ）、０．０２（ｓ，３Ｈ）
【０１０３】
ステージ３
【化２１】
2021525758.tif 000024
【０１０４】
化合物１３１（１０００ｇ、１．２７ｍｏｌ、１重量部、１容量、１当量）及びｔｒａｎｓ−２−ブテン−１，４−ジオール（オレフィンジオメトリーは１Ｈ−ＮＭＲにより確認；３３５ｇ、３．８０ｍｏｌ．０．３３５重量部、３．０当量）を、ＴＨＦ（３．０Ｌ、３．０容量）で２回共沸させた。残留物をＴＨＦ（１０Ｌ、１０容量）とトルエン（１５Ｌ、１５容量）との混合物に溶解した。トリフェニルホスフィン（４３２ｇ、１．６５ｍｏｌ、０．４３２重量部、１．３当量）を加え、次いで反応混合物を−５℃に冷却した。内温を５℃未満に維持しながら、ＤＩＡＤ（０．３２０Ｌ、１．６５ｍｏｌ、３３３ｇ、０．３３３重量部、０．３２０容量、１．３当量）を２０分かけてゆっくり加えた。反応物を０〜５℃で１時間撹拌し、ＬＣＭＳにより監視した。氷浴を除去し、混合物を室温に加温した。終夜撹拌した（１７時間）後、トリフェニルホスフィン（８３ｇ、０．３２ｍｏｌ、０．０８３重量部、０．２５当量）及びＤＩＡＤ（６２ｍｌ、０．３２ｍｏｌ、６４ｇ、０．０６４重量部、０．０６２容量、０．２５当量）を加えた。室温で更に１時間後、反応混合物をＭＴＢＥ（１０Ｌ、１０容量）で希釈し、半飽和ＮａＣｌ（水中１８重量％溶液；２×４Ｌ）で２回洗浄し、真空で濃縮して、濃厚油状物を得た。混合物をＭＴＢＥ（４．００Ｌ、４容量）とｎ−ヘプタン（０．５０Ｌ、０．５容量）との混合物に再度溶解し、次いで０℃に冷却した。トリフェニルホスフィンオキシドの種結晶を溶液に加えた。固体が溶液からゆっくり沈澱し始め、終夜撹拌した。白色固体を真空濾過により集め、ＭＴＢＥ（２Ｌ、２容量）で濯いで、トリフェニルホスフィンオキシド５４０ｇを単離した。濾液を濃縮し、Ｂｉｏｔａｇｅ  １５０Ｌ  ＫＰ−Ｓｉｌ（ＳｉＯ２  ５ｋｇ；Ｈｅｐ／ＥｔＯＡｃ中１％ＴＥＡで前処理；溶出液：ヘプタン／ＥｔＯＡｃ（１％ＴＥＡを含む３３％ＥｔＯＡｃ（４８Ｌ）、１％ＴＥＡを含む５０％ＥｔＯＡｃ（２４Ｌ）、ＴＥＡを含む６６％ＥｔＯＡｃ（２４Ｌ））→１％ＴＥＡを含む１００％ＥｔＯＡｃ）により精製した。カラムをＴＬＣ（２：１ＥｔＯＡｃ／ｎ−ヘプタン）により監視した。透明の生成物フラクションを合わせ、真空で濃縮して、化合物１３２を淡白色泡状固体として得た（６３４ｇ、１４重量％のＤＩＡＤから誘導された副生成物を含有、正味５４５ｇ、０．６３ｍｏｌ、調整収率５０％）。混合物フラクションを合わせ、真空で濃縮して、淡黄色泡状固体（７５０ｇ）を得、これをＢｉｏｔａｇｅ  １５０Ｍ  ＨＰ−Ｓｐｈｅｒｅ（ＳｉＯ２  ２．５ｋｇ；Ｈｅｐ／ＥｔＯＡｃ中１％ＴＥＡで前処理；トルエン溶出液で試料を装填：Ｈｅｐ／ＥｔＯＡｃ／１％ＴＥＡ（１％ＴＥＡを含む５０％ＥｔＯＡｃ（１２Ｌ）、１％ＴＥＡを含む６６％ＥｔＯＡｃ（１６Ｌ））→１％ＴＥＡを含むＥｔＯＡｃ）による再精製に供した。カラムをＴＬＣ（２／１／０．０３ＥｔＯＡｃ／ｎ−ｈｅｐ／ＴＥＡ）により監視した。透明の生成物フラクションを合わせ、真空で濃縮して、更に化合物１３２を淡白色泡状固体として得た（２０６ｇ、０．２４ｍｏｌ、収率１８％）。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝８．５８（ｓ，１Ｈ）、８．１０（ｓ，１Ｈ）、７．４３〜７．３７（ｍ，２Ｈ）、７．３２〜７．２８（ｍ，２Ｈ）、７．２４〜７．１５（ｍ，８Ｈ）、７．０３〜６．９８（ｍ，２Ｈ）、６．７８〜６．７３（ｍ，４Ｈ）、６．１８（ｄｄ，Ｊ＝２．７，１７．２Ｈｚ，１Ｈ）、５．８８（ｔｄ，Ｊ＝５．５，１５．６Ｈｚ，１Ｈ）、５．７７（ｔｄ，Ｊ＝５．１，１５．６Ｈｚ，１Ｈ）、５．６０（ｄｄｄ，Ｊ＝２．７，４．３，５３．１Ｈｚ，１Ｈ）、５．０３〜４．９６（ｍ，２Ｈ）、４．９１（ｄｄｄ，Ｊ＝４．５，６．６，１６．６Ｈｚ，１Ｈ）、４．１８〜４．１４（ｍ，１Ｈ）、３．８８〜３．８２（ｍ，２Ｈ）、３．７８（ｓ，６Ｈ）、３．５２（ｄｄ，Ｊ＝２．７，１０．９Ｈｚ，１Ｈ）、３．１４（ｄｄ，Ｊ＝３．５，１０．９Ｈｚ，１Ｈ）、０．８５（ｓ，９Ｈ）、０．１０（ｓ，３Ｈ）、０．０１（ｓ，３Ｈ）。
【０１０５】
ステージ４
【化２２】
2021525758.tif 000025
【０１０６】
化合物１３２（８００ｇ、０．９３０ｍｏｌ、１重量部、１容量、１当量）及び化合物１３３（５２２ｇ、１．０７ｍｏｌ、０．６５２重量部、１．１５当量）をＴＨＦ（２×３Ｌ、２×３．８容量）を用いて共沸乾燥し、室温でＴＨＦ（９．６０Ｌ、８．４５ｋｇ、１２．０容量）に再度溶解した。トリフェニルホスフィン（３１７ｇ、１．２１ｍｏｌ、０．３９６重量部、１．３０当量）を加え、混合物を−５℃未満に冷却した。ＤＩＡＤ（２２６ｍｌ、１．１６ｍｏｌ、２３５ｇ、０．２９４重量部、０．２８３容量、１．２５当量）を７℃未満の内温で加えた。反応物を室温にゆっくり加温した。反応をＬＣＭＳにより監視した。２１時間後、反応混合物を真空で濃縮して濃厚油状物にし、ｎ−ヘプタン（２．００、１．３７ｋｇ、１．７１重量部、２．５０容量）で共沸させ、次いでＭＴＢＥ（２．４０Ｌ、１．７８ｋｇ、２．２重量部、３．０容量）とｎ−ヘプタン（８００ｍｌ、５４７ｇ、０．６８重量部、１．０容量）との混合物に再度溶解した。溶液をトリフェニルホスフィンオキシドで播種し、５℃に冷却し、ｎ−ヘプタン（４００ｍｌ、２７４ｇ、０．３４重量部、０．５０容量）で希釈し、５℃で３０分間撹拌した。白色固体沈澱物を真空濾過により集め、ＭＴＢＥとｎ−ヘプタンとの２：１（容量／容量）混合物（１．８Ｌ）で濯いで、トリフェニルホスフィンオキシド（４５５ｇ）を得た。濾液を真空下で濃縮し、Ｂｉｏｔａｇｅ  １５０Ｌ  ＫＰ−Ｓｉｌ（ＳｉＯ２  ５ｋｇ；１％ＴＥＡで前処理；トルエン溶出液に溶解することにより試料を装填：９：１ヘプタン／ＥｔＯＡｃ（１６Ｌ）及び１５ＴＥＡ、３．６：１（４６Ｌ）、２：１（２０Ｌ）及び１％ＴＥＡ、１：１（３０Ｌ）及び１％ＴＥＡ並びに１００％ＥｔＯＡｃ（１６Ｌ）及び１％ＴＥＡ）により精製した。合わせた透明生成物フラクションを真空で濃縮して、化合物１３４を灰白色固体泡状物として得た（６６２．２ｇ）。混合物フラクションを合わせ、真空下で濃縮した（４８０ｇ）。Ｂｉｏｔａｇｅ  １５０Ｌ上に装填する前にトルエン（３００ｍｌ）で希釈することにより、生成した白色の不溶性固体を真空濾過により除去した。トルエンに可溶の物質をＢｉｏｔａｇｅ  １５０Ｍ  ＨＰ−Ｓｐｈｅｒｅ（ＳｉＯ２  ２．５ｋｇ（１％ＴＥＡで前処理）；トルエンで試料を装填；溶出液：１％ＴＥＡを含む２：１ヘプタン／ＥｔＯＡｃ（２６Ｌ）、１％ＴＥＡを含む１：１（２５Ｌ）、１％ＴＥＡを含む１：４（３４Ｌ））により精製した。カラムをＴＬＣ（１：１ヘプタン／ＥｔＯＡｃ）により監視した。合わせた透明生成物フラクションを真空で濃縮して、更に化合物１３４を灰白色固体泡状物として得た（１６５．５ｇ．合計６６２．２＋１６５，５ｇ＝８２７．７ｇ、９３０ｍｍｏｌ、１．０３重量部、収率６７％）。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝８．４７（ｓ，１Ｈ）、８．３９（ｓ，１Ｈ）、８．２０（ｓ，１Ｈ）、８．０１（ｓ，１Ｈ）、７．３８〜７．３１（ｍ，５Ｈ）、７．２７〜７．１９（ｍ，６Ｈ）、７．１４〜７．０６（ｍ，３Ｈ）、６．９３〜６．８７（ｍ，２Ｈ）、６．７６（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，４Ｈ）、６．２６（ｄｄ，Ｊ＝２．０，１６．０Ｈｚ，１Ｈ）、６．１５（ｄｄ，Ｊ＝２．７，１７．２Ｈｚ，１Ｈ）、５．８６（ｄｄ，Ｊ＝４．７，１５．２Ｈｚ，１Ｈ）、５．８０（ｄｄ，Ｊ＝４．７，１５．２Ｈｚ，１Ｈ）、５．５１（ｄｄｄ，Ｊ＝２．７，４．３，５２．８Ｈｚ，１Ｈ）、５．３１（ｄｄｄ，Ｊ＝２．０，４．３，５２．８Ｈｚ，１Ｈ）、４．８７（ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，２Ｈ）、４．８５〜４．８１（ｍ，１Ｈ）、４．７９（ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，２Ｈ）、４．７１〜４．５９（ｍ，１Ｈ）、４．２０〜４．１３（ｍ，２Ｈ）、４．０６（ｄｄ，Ｊ＝２．７，１１．３Ｈｚ，１Ｈ）、３．９０（ｄｄ，Ｊ＝２．７，１１．７Ｈｚ，１Ｈ）、３．７７（ｓ，６Ｈ）、３．５２（ｄｄ，Ｊ＝３．１，１０．９Ｈｚ，１Ｈ）、３．１８（ｄｄ，Ｊ＝３．９，１０．９Ｈｚ，１Ｈ）、０．９２（ｓ，９Ｈ）、０．８４（ｓ，９Ｈ）、０．１０（ｓ，３Ｈ）、０．０９（ｓ，６Ｈ）、０．０７（ｓ，３Ｈ）
【０１０７】
ステージ５〜６
【化２３】
2021525758.tif 000026
【０１０８】
化合物１３４（４１０．７ｇ、３０９ｍｍｏｌ、１重量部、１容量、１当量）のピリジン（１．２３Ｌ、１．２１ｋｇ、１５．２ｍｏｌ、２．９重量部、３．０容量、４９当量）中溶液に、亜リン酸ジフェニル（９０ｍｌ、１０９ｇ、０．４６ｍｏｌ、０．２６重量部、０．２２容量、１．５当量）を加えた。反応物を室温で撹拌し、ＬＣＭＳにより監視した。２時間後（転化率８０％）、更に亜リン酸ジフェニル（２９．９ｍｌ、３６．２ｇ、１５５ｍｍｏｌ、０．０８８重量部、０．０７３容量、０．５０当量）を加えた。更に１時間後、更に亜リン酸ジフェニル（６．０ｍｌ、７．２ｇ、３１ｍｍｏｌ、０．０１８重量部、０．０１５容量、０．１０当量）を加え、反応を更に０．５時間続けた（転化率９８％）。内温を４．７〜１２℃に維持しながら、反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３（水中９重量％溶液；２．１Ｌ、５容量）と水（１．０Ｌ、２．５容量）との混合物に加えた。反応器を少量のＥｔＯＡｃで濯いだ。室温で３０分間撹拌を続け、反応をＬＣＭＳにより監視した（転化率１００％）。反応混合物をＥｔＯＡｃとＭＴＢＥとの１：１混合物（２×８．２Ｌ、２×２０容量）で２回抽出した。合わせた有機層を水（４．１Ｌ、１０容量）で洗浄し、真空で濃縮し、トルエン（３×４．１Ｌ、３×１０容量；連続供給）と共沸させてピリジンを除去して、化合物１３５（０．５５当量のピリジンが残っていた）を得た。
【０１０９】
ステージ６−粗製の化合物１３５を周囲温度でジクロロメタン（３．０８Ｌ、４．０７ｋｇ、９．９重量部、７．５容量）に溶解した。内温を２５℃未満に維持しながら、水（５５．７ｍｌ、０．１３６容量、１０当量）を、続いてジクロロ酢酸（７７ｍｌ、１２０ｇ、０．９３ｍｏｌ、０．２９重量部、０．１９容量、３．０当量）のＤＣＭ（３．０８Ｌ、７．５容量）中溶液を加えた。（オレンジ色溶液に変化した）。３０分後、トリエチルシラン（Ｅｔ３ＳｉＨ；４９４ｍｌ、３５９ｇ、３．０９ｍｏｌ、０．８７５重量部、１．２０容量、１０．０当量）（内温は１８．２℃から１７℃になった）を加え、２０分間撹拌を続けた。トリエチルアミン（４３１ｍｌ、３１３ｇ、３．０９ｍｏｌ、０．７６２重量部、１．０５容量、１０．０当量）を加えた（内温は１７．８℃から２２℃になった）。混合物を１．５５ｋｇ（３．８重量部）に濃縮し、ＥｔＯＡｃ（６．２Ｌ、５．５ｋｇ、１４重量部、１５容量）に再度溶解し、（１）水（１．０Ｌ、２．５容量）及び飽和ＮａＨＣＯ３（水中９重量％溶液、０．８２Ｌ、２．０容量）で順次洗浄した。粗生成物ＥｔＯＡｃ溶液を−２０℃で終夜保管し（０．８２Ｌ、２．０容量）、翌日溶液を真空で２５℃にて濃縮した。このように得られた粗製の混合物（６５４ｇ）を（１）ｎ−ヘプタン（３．０１Ｌ、７．５容量）、（２）ｎ−ヘプタン（２．４６Ｌ，６．０容量）とトルエン（０．８２Ｌ、２．０容量）との混合物で摩砕した。溶液部分（上澄み液）をデカント除去し、底に残った固体をアセトニトリル（４．１Ｌ、１０容量）に溶解した。混合物を真空で２５℃にて濃縮し、アセトニトリルで２回共沸させて、化合物１３６を得た。生成物を精製せずに引き続くステージに使用した（理論的収率１００％と仮定）。
【０１１０】
ステージ７
【化２４】
2021525758.tif 000027
【０１１１】
ステージ７ａ  化合物１３６（３３７ｇ、３０９ｍｍｏｌ、１重量部、１容量、１当量）を室温で無水ピリジン（１３．５Ｌ、１３．２ｋｇ、３９重量部、４０容量）に溶解した。トリエチルアミン（１２９ｍｌ、９２７ｍｍｏｌ、９４ｇ、０．２８重量部、０．３８容量、３．０当量）を、続いて２−クロロ−５，５−ジメチル−１，３，２−ジオキサホスフィナン２−オキシド（ＤＭＯＣＰ；１０３ｇ、５５６ｍｍｏｌ、０．３１重量部、１．８０当量）を加えた。得られた混合物を周囲温度で３０分間撹拌し、化合物１３７が生成することをＬＣＭＳ（転化率１００％）により監視した。
【０１１２】
ステージ７ｂ  ＴＥＡ（１２９ｍｌ、９２７ｍｍｏｌ、９４ｇ、０．２８重量部、０．３８容量、３．０当量）、水（１００ｍｌ、５．５６ｍｏｌ、０．３０重量部、０．３０重量部、１８当量）及び硫黄（３４．７ｇ、１．０８ｍｏｌ、０．１０重量部、３．５当量）を、化合物１３７の上記混合物に加えた。９０分後（転化率１００％）、内温を３０℃未満（１６．６℃〜２７℃）に維持しながら、ＮａＨＣＯ３（水中９重量％溶液；３．３７Ｌ、１０容量）を加えた。得られた混合物を濾過して塩を除去した。濾液を真空で濃縮し、ＭＴＢＥ（５．１Ｌ、１５容量）で希釈し、ＮａＣｌ（水中３０重量％溶液；２×１．３５Ｌ、２×４容量）で２回洗浄した。不溶の固体を濾別し、濾液を真空で濃縮し、トルエン（４．０Ｌ、１２容量）で共沸させた。得られた固体を濾別し、粗製の混合物をトルエンに溶解し、Ｂｉｏｔａｇｅ  １５０Ｌ  ＫＰ−Ｓｉｌ（ＳｉＯ２  ５ｋｇ；Ｈｅｐ／ＥｔＯＡｃ／ＴＥＡ（１．５／１．５／０．０３ＣＶ）で前処理；ＥｔＯＡｃ／ＴＥＡ（３／０．０３ＣＶ）、ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ／ＴＥＡ（４／０．２／０．０４ＣＶ）、ＥｔＯＡＣ／ＭｅＯＨ／ＴＥＡ（２／０．２／０．０２ＣＶ）で溶出）により精製した。カラムをＴＬＣ（ＥｔＯＡＣ／ＭｅＯＨ／ＴＥＡ＝９／１／０．１）により監視した。Ｓｐ異性体を含むフラクションを合わせ、真空で濃縮して、化合物１３８を薄ピンク色泡状固体として得た（Ｓｐ異性体；１５４ｇ、１２８ｍｍｏｌ、０．４６重量部、収率４１．３％）。Ｒｐ異性体を含むフラクションを合わせ、真空で濃縮して、化合物２４０を薄ピンク色泡状固体として得た（Ｒｐ異性体；６４ｇ、５３ｍｍｏｌ、０．１９重量部、収率１７％）。
化合物１３８（Ｓｐ異性体）：
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝８．５１（ｓ，１Ｈ）、８．５０（ｓ，１Ｈ）、８．２２（ｓ，１Ｈ）、８．１４（ｓ，１Ｈ）、７．４９〜７．４４（ｍ，２Ｈ）、７．３８〜７．２７（ｍ，４Ｈ）、７．２５〜７．２１（ｍ，２Ｈ）、７．１４（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ）、６．４４（ｄｄ，Ｊ＝２．５，１３．９Ｈｚ，１Ｈ）、６．１８（ｄ，Ｊ＝１５．２Ｈｚ，１Ｈ）、５．７８（ｔｄ，Ｊ＝６．３，１５．６Ｈｚ，１Ｈ）、５．６９（ｔｄ，Ｊ＝４．７，１５．６Ｈｚ，１Ｈ）、５．５６（ｄｄ，Ｊ＝３．９，５０．８Ｈｚ，１Ｈ）、５．２０〜５．０６（ｍ，１Ｈ）、４．９５〜４．７９（ｍ，４Ｈ）、４．６９（ｄｄ，Ｊ＝４．３，１６．０Ｈｚ，１Ｈ）、４．５４〜４．３８（ｍ，３Ｈ）、４．３５（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ）、４．３２〜４．２９（ｍ，１Ｈ）、４．０５（ｄｄ，Ｊ＝１．６，１１．７Ｈｚ，１Ｈ）、３．９１（ｄｄ，Ｊ＝３．１，１１．７Ｈｚ，１Ｈ）、３．１４〜３．０６（ｍ，６Ｈ）、１．３０（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，９Ｈ）、０．９１（ｓ，９Ｈ）、０．９０（ｓ，９Ｈ）、０．１２（ｓ，３Ｈ）、０．０８（ｓ，３Ｈ）、０．０６（ｓ，３Ｈ）、０．０５（ｓ，３Ｈ）
化合物２４０（Ｒｐ異性体）：
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝８．５４（ｓ，１Ｈ）、８．３８（ｓ，１Ｈ）、８．３３（ｓ，１Ｈ）、８．０１（ｓ，１Ｈ）、７．３９〜７．０９（ｍ，１０Ｈ）、６．３９（ｄｄ，Ｊ＝２．３，１４．１Ｈｚ，１Ｈ）、６．１３（ｄ，Ｊ＝１７．２Ｈｚ，１Ｈ）、５．７２（ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ，２Ｈ）、５．６８（ｄｄ，Ｊ＝４．３，５１．２Ｈｚ，１Ｈ）、５．４３〜５．２９（ｍ，１Ｈ）、５．１０〜４．９６（ｍ，３Ｈ）、４．９０〜４．８３（ｍ，２Ｈ）、４．７８〜４．７２（ｍ，１Ｈ）、４．５２（ｄｄｄ，Ｊ＝３．９，６．６，１７．２Ｈｚ，１Ｈ）、４．４４〜４．３５（ｍ，２Ｈ）、４．３１〜４．２６（ｍ，１Ｈ）、４．２０〜４．１２（ｍ，２Ｈ）、３．８７（ｄｄ，Ｊ＝３．５，１１．７Ｈｚ，１Ｈ）、３．７９〜３．７７（ｍ，１Ｈ）、３．１５〜３．０９（ｍ，６Ｈ）、１．３３（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，９Ｈ）、０．９４（ｓ，９Ｈ）、０．８９（ｓ，９Ｈ）、０．１３（ｓ，３Ｈ）、０．１２（ｓ，３Ｈ）、０．１０（ｓ，３Ｈ）、０．０９（ｓ，３Ｈ）
【０１１３】
ステージ８
【化２５】
2021525758.tif 000028
【０１１４】
化合物１３８（２２１ｇ、１８３ｍｍｏｌ、１重量部、１容量、１当量）を、ピリジン（５３０ｍｌ、６．５６ｍｏｌ、５１９ｇ、２．３重量部、２．４容量）とＴＥＡ（２．６５Ｌ、１９．０ｍｏｌ、１．９３ｋｇ、８．７重量部、１２容量、１０４当量）との混合物に溶解した。トリエチルアミン三フッ化水素酸塩（２６４ｍｌ、１．６２ｍｏｌ、２６２ｇ、１．２重量部、１．２容量、錯体として８．９当量、２７当量ＨＦ）を加え、転化率をＬＣＭＳにより監視しながら、混合物を室温で撹拌した。３時間後（転化率９７％）、メトキシトリメチルシラン（ＴＭＳＯＭｅ；１．４０Ｌ、１０．２ｍｏｌ、１．０６ｋｇ、４．８重量部、６．３容量、５５当量）を加え、３０分間撹拌を続けた。粘着性固体が反応器に被覆した。溶液部分（上澄み液）をデカント除去した。固体をトルエン（２×２．２Ｌ、２×１０容量；上澄み液はデカント除去した）で２回摩砕した。反応器中に残った粗製の固体をジクロロメタン（２．２Ｌ、１０容量）に溶解し、ＮＨ４Ｃｌ（水中２８重量％溶液；２．２Ｌ、１０容量）で洗浄した。水層をジクロロメタン（２．２Ｌ、１０容量）で逆抽出した。合わせた有機層をＮａＣｌ（水中３６重量％溶液；１．１Ｌ、５容量）と水（１．１Ｌ、５容量）との混合物で洗浄し、次いで真空で濃縮して、化合物１３９を黄褐色乾燥泡状物として得た（１５２ｇ、１５５ｍｍｏｌ、０．７０重量部、収率８５％）。粗生成物を精製せずに次のステップに使用した。
【０１１５】
ステージ９
【化２６】
2021525758.tif 000029
【０１１６】
化合物１３９（１５０ｇ、１５３ｍｍｏｌ、１重量部、１容量、１当量）をアセトニトリル（４Ｌ、２７容量）で共沸させ、次いで室温でアセトニトリル（１．０５Ｌ、０．８３ｋｇ、５．５重量部、７．０容量）に再度溶解した。２−ニトロベンジルブロミド（４４．４ｇ、２０５ｍｍｏｌ、０．３０重量部、１．３４当量）を室温で加え、反応をＬＣＭＳにより監視した。２３時間後（転化率１００％）、ＥｔＯＡｃ（１．５０Ｌ、１０容量）、ＮＨ４Ｃｌ（水中２８重量％溶液；３００ｍｌ、２容量）及び水（３００ｍｌ、２容量）を加え（ｐＨ＝６）、得られた混合物を真空下２５℃で部分的に濃縮して重量を１．１１ｋｇにした。ＥｔＯＡｃ（２．２５Ｌ、１５容量）を加え、混合物を５分間撹拌した。２層を分離した。水層を酢酸エチル（７５０ｍｌ、５容量）で抽出した。合わせた有機層を（１）ＮａＣｌ（水中３６重量％溶液；３００ｍｌ、２容量）と水（３００ｍｌ、２容量）との混合物及び（２）水（６００ｍｌ，４容量）で順次洗浄した。次いで有機層を真空下で濃縮し、ｎ−ヘプタン（１．５０Ｌ、１０容量）で共沸させた。ＭＴＢＥ（０．９５Ｌ、６．３容量）を粗製の固体に加え、混合物を４０℃で加熱した。混合物をＥｔＯＡｃ（３００ｍｌ、２容量）で希釈し、０℃にゆっくり冷却した。濃厚固体を安定化させ、上澄み液をガラス製フィルターチューブに通してポンプ除去した。固体をＭＴＢＥ（２×３００ｍｌ、２×２容量；各回上澄み液をガラス製フィルターチューブに通してポンプ除去した）で２回濯ぎ、４０℃で終夜真空乾固して、化合物１４０を淡黄色固体として得た（１５６ｇ）。濾液を真空下で濃縮して茶褐色油状物（１７．８ｇ）を得、これをＢｉｏｔａｇｅ  Ｓｎａｐ−Ｕｌｔｒａ３４０ｇ（溶出液：ＥｔＯＡｃ中０〜５％ＭｅＯＨ）による精製に供して、更に化合物１４０を淡黄色固体として得た（５．８ｇ）。合計１５６ｇ＋５．８ｇ＝１６１．８ｇ（正味１５２ｍｍｏｌ、純度９５％、収率９９％）
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝８．４６（ｓ，１Ｈ）、８．１５（ｓ，１Ｈ）、８．１０（ｓ，１Ｈ）、８．０９〜８．０６（ｍ，１Ｈ）、７．８９（ｓ，１Ｈ）、７．５４〜７．５１（ｍ，１Ｈ）、７．４９〜７．４５（ｍ，４Ｈ）、７．３７〜７．２８（ｍ，３Ｈ）、７．２４〜７．１９（ｍ，３Ｈ）、７．１６〜７．１１（ｍ，２Ｈ）、６．２２（ｄ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ，１Ｈ）、６．１４（ｄｄ，Ｊ＝２．７，１７．２Ｈｚ，１Ｈ）、５．８３〜５．６１（ｍ，３Ｈ）、５．６０〜５．４８（ｍ，１Ｈ）、５．０７（ｄｄ，Ｊ＝３．５，５１．６Ｈｚ，１Ｈ）、５．０６〜４．９６（ｍ，１Ｈ）、４．７９（ｄｄ，Ｊ＝４．９，１５．８Ｈｚ，１Ｈ）、４．６９（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ）、４．６７〜４．５６（ｍ，１Ｈ）、４．４８〜４．４０（ｍ，３Ｈ）、４．３７〜４．３０（ｍ，１Ｈ）、４．２７（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ）、４．１９〜４．１３（ｍ，１Ｈ）、３．９３〜３．８５（ｍ，１Ｈ）、３．８５〜３．７８（ｍ，１Ｈ）
【０１１７】
ステージ１０〜１１
【化２７】
2021525758.tif 000030
【０１１８】
ステージ１０  化合物１４０（純度９５％、正味７３．２ｇ、７２．３ｍｍｏｌ、１重量部、１容量、１当量）及び２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（２５．３ｍｌ、７９．５ｍｍｏｌ、０．３３重量部、０．３５容量、１．１０当量）を、無水アセトニトリル（３×２Ｌ）で３回共沸させ、ジクロロメタン（０．７３Ｌ、１０容量）に再度溶解し、０〜５℃に冷却した。ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（６．１９ｇ、３６．１ｍｍｏｌ、０．０８５重量部、０．５０当量）を加えた。得られた反応混合物を０℃で１０時間撹拌し、２時間かけて１０℃に加温し、１０℃で１０時間保持し、２時間かけて室温に加温した。反応をＬＣＭＳ及びＴＬＣ（０．５％ＴＥＡを含むＥｔＯＡｃ）により監視した。１８時間後、無水アセトニトリル（０．７３Ｌ、１０容量）を加え、混合物を−２０℃で３日間かけて保存した。
【０１１９】
ステージ１１ａ  ステージ１０からの混合物を周囲温度に加温し、滴下漏斗によりピリジントリフルオロ酢酸塩（予めピリジンで２回共沸させた；４１．９ｇ、２１７ｍｍｏｌ、０．５７重量部、３．０当量）とアセトニトリル（５．８５Ｌ、８０容量）との混合物中に少しずつ（３０分毎に１００ｍＬ、９時間かけて）加えた。反応をＬＣＭＳにより監視した。１３時間後、２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（５．８ｍＬ、１８ｍｍｏｌ、０．２５当量）のアセトニトリル（２４ｍＬ）中溶液を４時間かけて加えた。更なる量の試薬を残った化合物１４０を基にして決定した（ＬＣＭＳを基に約３０％）。ジオールの更なる転化が６時間後に観察された。
【０１２０】
ステージ１１ｂ  （（ジメチルアミノメチリデン）アミノ）−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾリン−３−チオン（ＤＤＴＴ；２０．８ｇ、１０１ｍｍｏｌ、０．２８重量部、１．４当量）を加え、１時間撹拌を続けた。反応混合物を約８００ｍＬに部分的に濃縮し、ＭＴＢＥ（１．４６Ｌ、２０容量）、ＮａＨＣＯ３（水中９重量％溶液；１．１Ｌ、１５容量）及び水（０．３７Ｌ、５容量）で希釈した。ｐＨ＝８。層を分離し、水層をＭＴＢＥ（１．４６Ｌ、２０容量）とＥｔＯＡｃ（１．１０Ｌ、１５容量）との混合物で抽出した。合わせた有機層を３０％ＮａＣｌ水溶液（２×０．７３Ｌ、２×１０容量）で２回洗浄し、真空下３５℃で濃縮し、トルエン（１．４６Ｌ、２０容量）で共沸させた。ＬＣＭＳ及びＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ）は、化合物１４３（ＳｐＲｐ、所望物）：化合物２４１（ＳｐＳｐ）＝５：１を示した。
粗生成物をＢｉｏｔａｇｅ  １５０Ｍ  ＫＰ−Ｓｉｌ、（ＳｉＯ２  ２．５ｋｇ；溶出液：ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｐ：２：１（４ＣＶ）、３：１（２．５ＣＶ）、４：１（２．５ＣＶ）、１００％ＥＡ（３ＣＶ）、ＥＡ中５〜１０％ＭｅＯＨ（４ＣＶ））により精製して、化合物１４３（３６ｇ、３１．５ｍｍｏｌ、収率４４％）を得た。
化合物１４３（ＳｐＲｐ）：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝８．５９（ｓ，１Ｈ）、８．１０（ｓ，１Ｈ）、８．０３〜７．９９（ｍ，１Ｈ）、７．９１（ｓ，１Ｈ）、７．５６〜７．５３（ｍ，２Ｈ）、７．４９〜７．４０（ｍ，５Ｈ）、７．３５〜７．２８（ｍ，２Ｈ）、７．２４〜７．１６（ｍ，４Ｈ）、６．９２（ｓ，１Ｈ）、６．２９（ｄ，Ｊ＝１４．９Ｈｚ，１Ｈ）、６．０８（ｄ，Ｊ＝２０．７Ｈｚ，１Ｈ）、５．９７〜５．８３（ｍ，１Ｈ）、５．７６（ｔｄ，Ｊ＝４．７，１５．６Ｈｚ，１Ｈ）、５．６１〜５．５１（ｍ，２Ｈ）、５．４０（ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，１Ｈ）、５．２９〜５．１７（ｍ，１Ｈ）、４．９１（ｄｄ，Ｊ＝７．４，１４．９Ｈｚ，１Ｈ）、４．８６〜４．７５（ｍ，３Ｈ）、４．６３（ｄｄ，Ｊ＝３．７，９．２Ｈｚ，１Ｈ）、４．５８〜４．４３（ｍ，５Ｈ）、４．３４〜４．１９（ｍ，４Ｈ）、２．７９（ｔｄ，Ｊ＝５．９，１６．８Ｈｚ，１Ｈ）、２．６６（ｔｄ，Ｊ＝６．３，１６．８Ｈｚ，１Ｈ）。
化合物２４１（ＳｐＳｐ）１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝８．１１（ｓ，１Ｈ）、８．０３（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ）、７．９４（ｓ，１Ｈ）、７．９０（ｓ，１Ｈ）、７．６１（ｓ，１Ｈ）、７．５６〜７．４０（ｍ，７Ｈ）、７．３３〜７．２８（ｍ，２Ｈ）、７．２３〜７．１７（ｍ，４Ｈ）、６．２２（ｄ，Ｊ＝１７．６Ｈｚ，１Ｈ）、６．１５（ｄ，Ｊ＝１８．８Ｈｚ，１Ｈ）、５．８５（ｄｄ，Ｊ＝３．５，５１．２Ｈｚ，１Ｈ）、５．７５〜５．４５（ｍ，５Ｈ）、４．９５〜４．２３（ｍ，１４Ｈ）、２．８２（ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ）。
【０１２１】
ステージ１２
【化２８】
2021525758.tif 000031
【０１２２】
化合物１４３（７１．６ｇ、６２．６ｍｍｏｌ、１重量部、１容量、１当量）を１，４−ジオキサン（０．４３Ｌ、６容量）に溶解した。チオフェノール（２１５ｍｌ、２．０９ｍｏｌ、２３０ｇ、３．２重量部、３容量、＞３０当量）を、続いてトリエチルアミン（２１５ｍｌ、１．５４ｍｏｌ、１５６ｇ、２．２重量部、３容量）を加えた。多少の発熱が観察され（内温で約７℃の上昇）、そのため水／氷浴を使用して冷却し、内温を２７℃未満に制御した。反応をＬＣＭＳにより監視した。２時間後、ＭｅＯＨ（０．５７Ｌ、８容量）及びＮＨ４ＯＨ（２８重量％；１５ｍｏｌ、０．５７Ｌ、８容量、＞２００当量）を加えた。得られた混合物を５０℃で５時間加熱し、室温に冷却し、終夜撹拌した。１４時間後、水（０．７２Ｌ、１０容量）を加え（固体は観察されなかった）、混合物をｎ−ヘプタンとトルエンとの１：１（容量／容量）混合物（３×０．８６Ｌ、３×１２容量）で３回、続いてトルエン（０．５７Ｌ、８容量）で抽出した。水層を真空下４０〜５０℃で濃縮し、水（１．０７Ｌ、１５容量）で希釈した。得られたスラリー液を室温で終夜維持した。得られた固体を濾別し、水（０．３６Ｌ、５容量）で濯いだ。濾液はまだ濁っており、セライト及びＫｕｎｏフィルターに通して濾過した。濁りはまだ残っていた。ＨＣｌ（水中１．０Ｍ溶液；１３２ｍｌ、１３２ｍｍｏｌ、２．１当量）を１時間かけて加え、ｐＨをチェックした（ｐＨ＜２）。室温で１時間撹拌を続け、混合物を濾過した。濾過ケーキを水（８×０．２０Ｌ）で濯ぎ、真空乾燥機中３５℃で２日間及び加熱せずに１日間乾燥して、化合物１を淡オレンジ色固体として得た（４４．８８ｇ、６０．１ｍｍｏｌ、０．６３重量部、収率９６％）。
【０１２３】
ステージ１３
【化２９】
2021525758.tif 000032
【０１２４】
遊離酸の化合物１（２２．４２ｇ、３０．０３ｍｍｏｌ、１重量部、１容量、１当量）に、アンモニア（ＭｅＯＨ中２．０Ｍ溶液；２２０ｍｌ、４４０ｍｍｏｌ、１０容量、１５当量）を加えた。ＥｔＯＨ（５５ｍｌ、２．５容量）を加え、得られた溶液をＫｕｎｏフィルター（０．４５ミクロン；ＰＴＦＥ）に通して濾過し、ＭｅＯＨとＥｔＯＨとの１：１（容量／容量）混合物（９０ｍＬ、４容量）で濯いだ。濾液を真空下３０℃で濃縮して灰白色固体を得、これを室温で終夜乾燥し、スパチュラで細かく砕き（砕きやすい）、室温で更に真空乾固した。次いで単離した固体をトルエン（２５０ｍｌ）中で懸濁させ、室温で３０分間撹拌した。次いで固体を真空濾過により集め、トルエン（２×５０ｍｌ）で２回濯いだ。次いで固体を真空乾燥機中で真空乾固して、化合物１ａ（２２．４ｇ、化合物１のジアンモニウム塩）を得た。
【０１２５】
再結晶化：化合物１ａ（２２．１４ｇ、２８．３６ｍｍｏｌ、１重量部、１容量、１当量）を水（６６４ｍｌ、３０容量）と水酸化アンモニウム（２８重量％；２．５ｍｌ、１８ｍｍｏｌ、０．６３当量）（ｐＨ＝９〜１０）との混合物に溶解し、トルエン（３×３００ｍｌ、３×１４容量）で３回、ＥｔＯＡｃ（３×２００ｍｌ、３×９容量）で３回及びトルエン（３×３００ｍｌ、３×１４容量）で３回抽出した。得られた水層をＨＣｌ（水中１．０Ｍ溶液；９０ｍｌ、９０ｍｍｏｌ、３．２当量）で３．５時間かけて処理した（ｐＨ≦２）。混合物を３０分間撹拌し、次いで固体の沈澱物を真空濾過により集めた。濾過ケーキを水（３×２００ｍｌ、３×９容量）で３回洗浄し、終夜真空乾固した。アンモニア（ＭｅＯＨ中２．０Ｍ溶液；２５０ｍｌ、５００ｍｍｏｌ、１７．６当量）及びエタノール（１００ｍｌ）を固体に加え、得られた混合物を結晶が生成するまで真空で濃縮（約１００ｍｌ）し、この時点で濃縮を止め、混合物を２０分間撹拌した。エタノール（４５ｍＬ）を加え、混合物を部分的に濃縮した（４５ｍＬを除去）。同じ操作を更に２回繰り返し、次いで混合物を０℃に冷却し、３．５時間撹拌した。白色固体を真空濾過により集め、冷エタノール（２０ｍｌ）で、続いて酢酸エチル（２×５０ｍＬ）で洗浄した。白色固体を室温で３日間真空乾固して、化合物１ａを白色固体として得た（１６．６ｇ、２１．３ｍｍｏｌ、０．７５重量部、収率７５％）。濾液を真空下で濃縮し、室温で３日間真空乾固して、化合物１ａを灰白色固体として得た（４．１６ｇ、５．３ｍｍｏｌ、収率１８％）。
【０１２６】
実施例１．２−化合物１の１Ｈ  ＮＭＲ分析
化合物１ａの１Ｈ  ＮＭＲスペクトログラフを図３に示す。得られたスペクトルは：
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，δＨ  ２．４９ｐｐｍ，８０℃）
δ（ｐｐｍ）：３．０５〜３．１３（４Ｈ，ｍ）、３．７０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３，５Ｈｚ）、３．７８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２，４Ｈｚ）、４．２１〜４．２４（２Ｈ，ｍ）、４．２８（１Ｈ，ｍ）、４．３８（１Ｈ，ｍ）、４．５３〜４．６８（２Ｈ，ｍ）、５．２２（１Ｈ，ｍ）、５．７６（２Ｈ，ｓ）、５．７８（１Ｈ，ｍ）、６．２６（１Ｈ，ｍ）、６．２９（１Ｈ，ｍ）、８．１３（１Ｈ，ｓ）、８．１４（１Ｈ，ｓ）、８．３６（１Ｈ，ｂｒｓ）、８．５９（１Ｈ，ｂｒｓ）。
【０１２７】
実施例１．３−化合物１のＸ線解析
化合物１約２ｍｇを水６００ｕＬに溶解した。この溶液１２０ｕＬを他のガラスバイアルに入れ、次いでこのバイアルを、固定容器中ＭｅＣＮ（３ｍＬ）と共に室温で１週間保管した。これは試料調製のＨ２Ｏ／ＭｅＣＮ蒸気拡散方法である。
【０１２８】
結晶化溶液に見られた無色板状単結晶（０．１×０．１×０．１ｍｍ）を液体のＰａｒａｂａｒ  １０３１２に分散し、Ｄｕａｌ−Ｔｈｉｃｋｎｅｓｓマイクロマウント（ＭｉｃｒｏＭｏｕｎｔｓ）（商標）（ＭｉＴｅＧｅｎ）上に取り付けた。回折データを−１６０℃でＸｔａＬＡＢ  ＰＲＯ  Ｐ２００  ＭＭ００７ＨＦ（Ｒｉｇａｋｕ）上にて多層ミラー単色Ｃｕ−Ｋα照射を使用するω軸振動法を用いて集めた。
【０１２９】
図４Ａは、多くの乱れた水分子と共に、非対称単位中の化合物１の分子のＯＲＴＥＰ図を示す。図４Ｂは、図４Ａからの化合物１の分子の一つの結晶構造を示す。図４Ｃは、図４Ａに示した化合物１の他の分子の結晶構造を示す。
【０１３０】
化合物１の結晶構造を最終Ｒ−因子０．１３５４で解いた。Ｆｌａｃｋパラメーターはほぼゼロ（０．０８３（１７））であり、化合物１の絶対立体配置が（Ｒ、Ｓ）であることを示した。結晶構造解析は、多くの水分子が化合物１の大きなチャンネル中に存在していることも示し、これは水分子がチャンネルから容易に抜け出すことができることを示した。解析は、非対称単位の両方の結晶学的に独立している分子の立体配置はほぼ同じであることも示した。
【０１３１】
更にＸ線解析のパラメーターを以下に示す：
【０１３２】
【表３】
2021525758.tif 000033
【０１３３】
実施例２−ＷＴ  ＳＴＩＮＧとの複合体を確認するＸ線構造
発明者らの新規化合物の標的結合機序を更に理解するために、複合体内のＷＴ  ＳＴＩＮＧのＸ線結晶構造を化合物で決定した。
【０１３４】
Ａ．ＷＴ  ＳＴＩＮＧ  Ｃ−末端ドメイン（残基１５５〜３４１）の発現及び精製
アミノ酸１５５〜３４１由来のヒトＷＴ  ＳＴＩＮＧタンパク質をコードしているＤＮＡ配列を（配列番号４）、そのＮ末端でのＨｉｓ−ＴＥＶ−Ｓｕｍｏタグに従い（配列番号５）、ｐＥＴ２１ｂベクターにクローニングした。ｐＥＴ２１ｂの配列はａｄｄｇｅｎｅに預けており、ここから入手可能である：ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｖｅｃｔｏｒ−ｄａｔａｂａｓｅ／２５５０／。その配列は本明細書で参照により組み込まれている。
【０１３５】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）コドンプラス細胞をこのプラスミドを用いて変換し、組換え型タンパク質の発現を０．１ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘発させた。Ｎｉ−ＮＴＡ親和クロマトグラフィーで、細胞溶解物の可溶性画分からタンパク質を精製した。Ｈｉｓ−ＴＥＶ−Ｓｕｍｏタグをｓｕｍｏプロテアーゼにより除去し、第２のＮｉ−ＮＴＡ親和性カラムを使用して、タグを含まないＷＴ  ＳＴＩＮＧ  １５５〜３４１から分離した。アニオン交換及びサイズ排除クロマトグラフィーによりタンパク質を更に精製し、２０ｍＭトリス・ＨＣｌ  ｐＨ７．５、及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌを３５ｍｇ／ｍｌ濃度で含有する緩衝液中に貯蔵した。
【０１３６】
Ｂ．化合物１との複合体のＷＴ  ＳＴＩＮＧ  Ｃ末端ドメインの結晶化及び構造判定
化合物１と共にＷＴ  ＳＴＩＮＧ  １５５〜３４１を共結晶化するため、貯蔵緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ  ｐＨ７．５、及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）を使用して、ＷＴ  ＳＴＩＮＧタンパク質を１０ｍｇ／ｍｌに希釈し、モル比１：５で化合物１（ＤＭＳＯ中１００ｍＭストック）と混合した。混合物を４℃で４時間インキュベートし、１３，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離してから結晶化した。ハンギングドロップ蒸気拡散法を１８℃で使用して、結晶化スクリーニングトレイを配置した。１μＬのＷＴ  ＳＴＩＮＧ／化合物１溶液を、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、２００ｍＭ  ＣａＣｌ２、及び１５％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＰＥＧ８０００を含有する等量のウェル溶液と混合することによって、結晶を増殖した。結晶を液体窒素内でフラッシュ凍結した際に、２０％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＰＥＧ４００を抗凍結剤試薬として使用した。ＳＳＲＦ  ＢＬ１９Ｕ１  ビームラインで、Ｐｉｌａｔｕｓ検出器を用いて、回折データセットを収集し、ＨＫＬ３０００及びＣＣＰ４ソフトウエアスイート中のプログラムＳＣＡＬＥＰＡＣＫ２ＭＴＺを処理した。
【０１３７】
化合物１に結合したＷＴ  ＳＴＩＮＧ  １５５〜３４１の構造を、プログラムＰＨＡＳＥＲ（Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を使用して、最初のサーチモデルとしてＰＤＢ  ＩＤ  ４Ｆ９Ｅを用いて、分子の置き換えにより決定した。ＷＴ  ＳＴＩＮＧのダイマー境界面の間の化合物１の存在を、モデルフェーズで計算したＦｏ−Ｆｃ差の分布図において確認した。Ｃｏｏｔプログラムを用いて、モデルを手作業で構築、完成し、ＣＣＰ４ソフトウエアスイート中のＲｅｆｍａｃ５プログラムでリファインした。空間群Ｐ２１２１２１において、分解能２．３８Åでリファインされた最終構造が報告され、単位格子がａ＝３３．８２０、ｂ＝７８．１１０、ｃ＝１３２．２１２、α＝９０．００、β＝９０．００、γ＝９０．００において測定された。ダイマー境界面で、化合物１の１つの分子に結合している各非対称的単位において、２コピーのＷＴ  ＳＴＩＮＧ  １５５〜３４１を特定した。
【０１３８】
Ｃ．Ｘ線結晶構造で観察された、化合物１とＷＴ  ＳＴＩＮＧとの相互作用
図５は、化合物１との複合体におけるヒトＷＴ  ＳＴＩＮＧのＸ線結晶構造の画像を示す。発明者らは、化合物１との複合体内のヒトＷＴ  ＳＴＩＮＧのＸ線結晶構造を試験したが、これは化合物１ａの試料から共結晶化したものであった。化合物は、ＷＴ  ＳＴＩＮＧタンパク質のダイマーにより形成された境界面ポケットにおいて結合している。化合物のアデニン塩基の２つの面は、Ｔｙｒ２４０及びＡｒｇ２３８のグアニジン基とそれぞれπ−πスタッキング相互作用を形成する。ｔｒａｎｓオレフィンリンカーは、Ａｒｇ２３８の側鎖の脂肪族部分とファンデルワールス相互作用を形成する。化合物のリボース基のＣ２’位のフッ素置換基は、Ｔｈｒ２６３、Ｐｒｏ２６４及びＴｙｒ１６３により定義される疎水性正孔に入り込んでいる。化合物の負電荷チオホスフェート基は、Ａｒｇ２３８との塩架橋並びにＳｅｒ１６２及びＴｈｒ２６７とのＨ−結合相互作用をそれぞれ形成する。加えて、チオホスフェート基はまた、Ａｒｇ２３２のグアニジン基と静電相互作用を形成する。残基２２６〜２４３からなるＷＴ  ＳＴＩＮＧのＬＩＤループ領域は、２つの塩基の基及びｔｒａｎｓオレフィンリンカーの回りに巻き付いている。
【０１３９】
実施例３−化合物１との複合体におけるＲＥＦ  ＳＴＩＮＧのＸ線結晶構造の判定。
Ａ．ＲＥＦ  ＳＴＩＮＧ  Ｃ末端ドメイン（残基１５５〜３４１、配列番号６）の発現及び精製
アミノ酸１５５〜３４１由来のヒトＲＥＦ  ＳＴＩＮＧタンパク質をコードしているＤＮＡ配列を（配列番号６）、そのＮ末端でのＨｉｓ−ＴＥＶ−Ｓｕｍｏタグに従い（配列番号７）、ｐＥＴ２１ｂベクターにクローニングした。ｐＥＴ２１ｂの配列はａｄｄｇｅｎｅに預けており、ここから入手可能である：ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｖｅｃｔｏｒ−ｄａｔａｂａｓｅ／２５５０／；その配列は本明細書で参照により組み込まれている。
【０１４０】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）コドンプラス細胞をこのプラスミドを用いて変換し、組換え型タンパク質の発現を０．１ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘発させた。Ｎｉ−ＮＴＡ親和クロマトグラフィーで、細胞溶解物の可溶性画分からタンパク質を精製した。Ｈｉｓ−ＴＥＶ−Ｓｕｍｏタグをｓｕｍｏプロテアーゼで取り出し、第２のＮｉ−ＮＴＡ親和性カラムを使用して、タグを含まないＲＥＦ  ＳＴＩＮＧ＿１５５〜３４１から分離した。アニオン交換及びサイズ排除クロマトグラフィーにより、タンパク質を更に精製し、２０ｍＭトリス・ＨＣｌ  ｐＨ７．５、及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌを２４ｍｇ／ｍｌ濃度で含有する緩衝液中に貯蔵した。
【０１４１】
Ｂ．化合物１との複合体におけるＲＥＦ  ＳＴＩＮＧ  Ｃ末端ドメインの結晶化及び構造判定
化合物１と共にＲＥＦ  ＳＴＩＮＧ＿１５５〜３４１を共結晶化するため、貯蔵緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ  ｐＨ７．５、及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）を使用して、ＲＥＦ  ＳＴＩＮＧタンパク質を１０ｍｇ／ｍｌに希釈し、モル比１：５で化合物１（ＤＭＳＯ中１００ｍＭストック）と混合した。混合物を４℃で４時間インキュベートし、１３，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離してから結晶化した。ハンギングドロップ蒸気拡散法を１８℃で使用して、結晶化スクリーニングトレイを配置した。１μＬのＲＥＦ  ＳＴＩＮＧ／化合物１溶液を、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、２００ｍＭ  ＣａＣｌ２、及び１５％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＰＥＧ８０００を含有する等量のウェル溶液と混合することによって、結晶を増殖した。結晶を液体窒素内でフラッシュ凍結した際に、２０％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＰＥＧ  ４００を抗凍結剤試薬として使用した。ＳＳＲＦ  ＢＬ１８Ｕ１ビームラインでＰｉｌａｔｕｓ検出器を用いて、回折データセットを収集し、ＨＫＬ３０００及びＣＣＰ４ソフトウエアスイート中のプログラムＳＣＡＬＥＰＡＣＫ２ＭＴＺを処理した。この構造は図６に示されている。
【０１４２】
以前に決定したＷＴ  ＳＴＩＮＧ１５５〜３４１構造（上に記載した通り）を最初のサーチモデルとして使用して、分子の置き換えプログラムＰＨＡＳＥＲ（Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を使用して、化合物１に結合しているＲＥＦＳＴＩＮＧ＿１５５〜３４１の構造を決定した。モデルフェーズで計算したＦｏ−Ｆｃ差の分布図において、ＲＥＦ  ＳＴＩＮＧのダイマー境界面の間の化合物１の存在を確認した。Ｃｏｏｔプログラムを用いて、モデルを手作業で構築、完成し、ＣＣＰ４ソフトウエアスイート中のＲｅｆｍａｃ５プログラムでリファインした。空間群Ｐ２１２１２１において、分解能２．７６Åでリファインされた最終構造が報告され、単位格子がａ＝３３．７３３、ｂ＝７７．８３１、ｃ＝１３１．６８９、α＝９０．００、β＝９０．００、γ＝９０．００において測定された。ダイマー境界面で、化合物１の１つの分子に結合している各非対称的単位において、２コピーのＲＥＦ  ＳＴＩＮＧ  １５５〜３４１を特定した。
【０１４３】
Ｃ．Ｘ線結晶構造において観察された、化合物１とＲＥＦ  ＳＴＩＮＧとの相互作用
図６は、化合物１との複合体におけるヒトＲＥＦ  ＳＴＩＮＧのＸ線結晶構造を示し、これは、化合物１ａの試料から共結晶化されたものであった。化合物は、ＳＴＩＮＧタンパク質のダイマーにより形成された境界面ポケットにおいて結合している。化合物のアデニン塩基の２つの面は、Ｔｙｒ２４０及びＡｒｇ２３８のグアニジン基とそれぞれπ−πスタッキング相互作用を形成する。Ａｒｇ２３８の側鎖のグアニジン部分が外側からのＨｉｓ２３２の側鎖のイミダゾール基とπ−πスタッキング相互作用を形成する一方で、ｔｒａｎｓオレフィンリンカーはＡｒｇ２３８の側鎖の脂肪族部分とファンデルワールス相互作用を形成する。オレフィンリンカーは、Ａｒｇ２３８とＨｉｓ２３２の側鎖の相互作用する対と接触している。化合物のリボース基のＣ２’位のフッ素置換基は、Ｔｈｒ２６３、Ｐｒｏ２６４及びＴｙｒ１６３により定義される疎水性の正孔に入り込んでいる。化合物の負電荷チオホスフェート基は、Ａｒｇ２３８との塩架橋並びにＳｅｒ１６２及びＴｈｒ２６７とのＨ−結合相互作用をそれぞれ形成する。残基２２６〜２４３からなるＲＥＦ  ＳＴＩＮＧのＬＩＤループ領域は、２つの塩基の基及びｔｒａｎｓオレフィンリンカーの回りに巻き付いている。
【０１４４】
実施例４−膀胱内投与経路を使用したネズミ膀胱がんモデルにおける化合物１ａのｉｎ  ｖｉｖｏの評価
ＭＢＴ−２ネズミ膀胱がん同所性モデルを確立し、２０１２年のＬｅｅら、（「Ｔｕｍｏｒ  Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  Ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｂｌａｄｄｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｏｄｅｌｓ」Ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２０１２年；５３巻：３９６〜４００頁）により特徴付けると、ヒト膀胱がんと類似の組織像を示した。したがって、このモデルを選択して、化合物１の抗膀胱がん活性を評価した。Ｌｅｅらにより記載されたＨＣｌ治療前手順を用いたプロトコルを適用して、モデルを確立した。手短に言えば、３０μＬの０．１Ｎ  ＨＣｌ溶液を、カテーテルを介してマウス膀胱に注入し、ＨＣｌ溶液を１５秒間膀胱内に留めた。次いで、ＨＣｌ溶液を３０μＬの０．１Ｎ  ＮａＯＨ溶液と置き換え、これに続いて１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）による１回のフラッシュステップを行った。続く腫瘍細胞インプランテーション手順は元の文献から改変した。手短に言えば、フラッシュステップ後、ＭＢＴ−２腫瘍細胞（５０μＬのＲＰＭＩ１６４０培地中２×１０６個の細胞）を膀胱に注入し、４５分間留めておいた。この４５分間の期間の終わりに、膀胱から排水した。
【０１４５】
腫瘍細胞のインプランテーションから３日後、表１に要約されたスケジュールでマウスを異なる用量の化合物１ａ、ＢＣＧ（ＯｎｃｏＴＩＣＥ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ  ＣａｎａｄａＩｎｃ．）、抗マウスＰＤ−１抗体（クローン＃ＲＭＰ１−１４、Ｂｉｏｘｃｅｌｌ）、及び化合物１ａとＰＤ−１抗体の組合せで処置した。化合物１ａとＢＣＧの両方は膀胱内経路を介して投与し、ＰＤ１抗体は腹腔内注射を介して投与した。
【０１４６】
最終濃度１６．８７５ｍｇ／ｍＬに到達するまで、毎日の投薬において投薬用にＢＣＧをＮａＣｌ  ０．９％（Ｌａｖｏｉｓｉｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ）中で希釈した。残ったあらゆる投薬溶液は使用後廃棄した。抗ＰＤ−１抗体、１×ＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用してストック溶液を希釈して、投薬用の作業用溶液１ｍｇ／ｍＬを調製した。化合物１ａに対して、乾燥粉末を１×ＰＢＳに溶解することにより、１０ｍｇ／ｍＬのストック溶液を最初に調製した。次いで、５ｍｇ／ｍＬ（４００μｇ／マウス群）、２．５ｍｇ／ｍＬ（２００μｇ／マウス群）及び１．２５ｍｇ／ｍＬ（１００μｇ／マウス群）を含む異なる濃度の化合物１ａを、１×ＰＢＳでストック溶液を更に希釈することにより調製した。
【０１４７】
【表４】
2021525758.tif 000034
【０１４８】
第２０日〜２１日の膀胱内の腫瘍成長をＭＲＩ（核磁気共鳴画像法）により定量化し、図７に示されている通りすべてのマウスの腫瘍サイズをグラフ化した。図７は、すべての実験動物の第２０〜２１日目のＭＲＩによる腫瘍容積定量化を示している。図７に示されている通り、化合物１ａで処置したすべての群（群４〜７）は、ビヒクル群（群１）、ＢＣＧ群（群２）及びＰＤ１抗体群（群３）よりもずっと小さな腫瘍容積を示した。
【０１４９】
化合物１ａはまた、図８に示されている通りビヒクルで処置した動物と比べて、統計学的に有意な生存という利点を示した。
【０１５０】
ＢＣＧも抗ＰＤ１抗体も、この同所性マウス膀胱がんモデルにおいて有意な抗がん活性を示すことができず、使用されたモデルがＢＣＧ／ＰＤ１抗体耐性／不応性モデルであることを示唆した。
【０１５１】
実施例１０３−ＨＡＱ  ＳＴＩＮＧアゴニスト活性レポーターアッセイ
ＴＨＰ１−デュアル（Ｄｕａｌ）（商標）Ｃｅｌｌｓ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、カタログ番号ｔｈｐｄ−ｎｆｉｓ）をＥＣ５０判定に適用した。ＴＨＰ１デュアル（Ｄｕａｌ）（商標）Ｃｅｌｌｓは、ＨＡＱ  ＳＴＩＮＧ遺伝子型を保持することが販売元Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ（Ｉｎｓｉｇｈｔ  ２０１４０２−１）により特徴付けられている。細胞を増殖させ、製造業者により推奨される条件下で維持した。ＥＣ５０判定のため、製造業者のマニュアルに記載されているインターフェロン調節因子（ＩＲＦ）経路誘導に従った。手短に言えば、細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートしながら、異なる濃度の化合物で２０時間処理した。細胞を再懸濁させ、クアンティ（ＱＵＡＮＴＩ）−Ｌｕｃ（商標）溶液（Ｃａｔ．＃：ｒｅｐ−ｑｌｃ１）を加えた。生成された光の放出を照度計（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で測定した。得られたシグナルをプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ７ソフトウエアでＥＣ５０を計算した。
【０１５２】
化合物１ａに対するヒトＳＴＩＮＧＥＣ５０（μＭ）値が以下の表２において報告されている。
【０１５３】
実施例１０４−ＳＴＩＮＧバリアントに特異的なレポーターアッセイ
ヒトＳＴＩＮＧは、ＷＴ、ＨＡＱ、ＲＥＦ、及びＡＱバリアントを含めた、４つの主要なバリアントを有する。Ｒ２３２Ｈとも呼ばれるＲＥＦ−ＳＴＩＮＧは、例えば、ヒト集団の約１４％において生じる。野生型アレルと比較して、Ｒ２３２Ｈは、細菌性の及び後生動物の環式ジヌクレオチドに対してより低い応答を有する。これらの４つの主要なバリアント並びに他の稀なバリアントの詳細がＹｉ  Ｇら，「Ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＳＴＩＮＧ  ｃａｎ  ａｆｆｅｃｔ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｃｙｃｌｉｃ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１３年；８巻：ｅ７７８４６頁に報告されている。ＳＴＩＮＧバリアントに特異的なレポーター細胞株は、ＴＨＰ１−デュアル（Ｄｕａｌ）（商標）ＫＯ−ＳＴＩＮＧ細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、カタログ番号ｔｈｐｄ−ｋｏｓｔｇ）及び３つのＳＴＩＮＧバリアントタンパク質発現ベクターを使用することにより確立された。ＷＴ  ＳＴＩＮＧに対する発現ベクターマップが図９に示されている。他の２つの発現ベクターに対して、異なるＳＴＩＮＧバリアント配列がそのベクターにおいて使用されており、ＷＴ  ＳＴＩＮＧは適当なヌクレオチド配列により置き換えられている。
【０１５４】
ＷＴ−ＳＴＩＮＧ、ＲＥＦ−ＳＴＩＮＧ、及びＡＱ−ＳＴＩＮＧに対するＳＴＩＮＧバリアント発現ベクターを調製し、ＴＨＰ１−デュアル（Ｄｕａｌ）（商標）ＫＯ−ＳＴＩＮＧ細胞に安定的に形質移入して、ＷＴ−ＳＴＩＮＧ、ＲＥＦ−ＳＴＩＮＧ及びＡＱ−ＳＴＩＮＧに対するＳＴＩＮＧバリアントに特異的なレポーターアッセイをそれぞれ調製した。実施例１０３で上述したように、ＨＡＱ  ＳＴＩＮＧアゴニスト活性レポーターアッセイに対してＥＣ５０値を決定した。結果を以下の表２において示す。これらのＳＴＩＮＧバリアントに対して使用されているＤＮＡ配列が配列番号１（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ＷＴ  Ｈｕｍａｎ  ＳＴＩＮＧ）、配列番号２（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ＲＥＦ  Ｈｕｍａｎ  ＳＴＩＮＧ）、及び配列番号３（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ＡＱ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｔｉｎｇ）において示されている。
【０１５５】
ＷＴヒトＳＴＩＮＧ：
atgccccactccagcctgcatccatccatcccgtgtcccaggggtcacggggcccagaaggcagccttggttctgctgagtgcctgcctggtgaccctttgggggctaggagagccaccagagcacactctccggtacctggtgctccacctagcctccctgcagctgggactgctgttaaacggggtctgcagcctggctgaggagctgcgccacatccactccaggtaccggggcagctactggaggactgtgcgggcctgcctgggctgccccctccgccgtggggccctgttgctgctgtccatctatttctactactccctcccaaatgcggtcggcccgcccttcacttggatgcttgccctcctgggcctctcgcaggcactgaacatcctcctgggcctcaagggcctggccccagctgagatctctgcagtgtgtgaaaaagggaatttcaacgtggcccatgggctggcatggtcatattacatcggatatctgcggctgatcctgccagagctccaggcccggattcgaacttacaatcagcattacaacaacctgctacggggtgcagtgagccagcggctgtatattctcctcccattggactgtggggtgcctgataacctgagtatggctgaccccaacattcgcttcctggataaactgccccagcagaccggtgaccgggctggcatcaaggatcgggtttacagcaacagcatctatgagcttctggagaacgggcagcgggcgggcacctgtgtcctggagtacgccacccccttgcagactttgtttgccatgtcacaatacagtcaagctggctttagccgggaggataggcttgagcaggccaaactcttctgccggacacttgaggacatcctggcagatgcccctgagtctcagaacaactgccgcctcattgcctaccaggaacctgcagatgacagcagcttctcgctgtcccaggaggttctccggcacctgcggcaggaggaaaaggaagaggttactgtgggcagcttgaagacctcagcggtgcccagtacctccacgatgtcccaagagcctgagctcctcatcagtggaatggaaaagcccctccctctccgcacggatttctcttga（配列番号１）
【０１５６】
ＲＥＦヒトＳＴＩＮＧ：
atgccccactccagcctgcatccatccatcccgtgtcccaggggtcacggggcccagaaggcagccttggttctgctgagtgcctgcctggtgaccctttgggggctaggagagccaccagagcacactctccggtacctggtgctccacctagcctccctgcagctgggactgctgttaaacggggtctgcagcctggctgaggagctgcgccacatccactccaggtaccggggcagctactggaggactgtgcgggcctgcctgggctgccccctccgccgtggggccctgttgctgctgtccatctatttctactactccctcccaaatgcggtcggcccgcccttcacttggatgcttgccctcctgggcctctcgcaggcactgaacatcctcctgggcctcaagggcctggccccagctgagatctctgcagtgtgtgaaaaagggaatttcaacgtggcccatgggctggcatggtcatattacatcggatatctgcggctgatcctgccagagctccaggcccggattcgaacttacaatcagcattacaacaacctgctacggggtgcagtgagccagcggctgtatattctcctcccattggactgtggggtgcctgataacctgagtatggctgaccccaacattcgcttcctggataaactgccccagcagaccggtgaccatgctggcatcaaggatcgggtttacagcaacagcatctatgagcttctggagaacgggcagcgggcgggcacctgtgtcctggagtacgccacccccttgcagactttgtttgccatgtcacaatacagtcaagctggctttagccgggaggataggcttgagcaggccaaactcttctgccggacacttgaggacatcctggcagatgcccctgagtctcagaacaactgccgcctcattgcctaccaggaacctgcagatgacagcagcttctcgctgtcccaggaggttctccggcacctgcggcaggaggaaaaggaagaggttactgtgggcagcttgaagacctcagcggtgcccagtacctccacgatgtcccaagagcctgagctcctcatcagtggaatggaaaagcccctccctctccgcacggatttctcttga（配列番号２）
【０１５７】
ＡＱヒトＳＴＩＮＧ：
atgccccactccagcctgcatccatccatcccgtgtcccaggggtcacggggcccagaaggcagccttggttctgctgagtgcctgcctggtgaccctttgggggctaggagagccaccagagcacactctccggtacctggtgctccacctagcctccctgcagctgggactgctgttaaacggggtctgcagcctggctgaggagctgcgccacatccactccaggtaccggggcagctactggaggactgtgcgggcctgcctgggctgccccctccgccgtggggccctgttgctgctgtccatctatttctactactccctcccaaatgcggtcggcccgcccttcacttggatgcttgccctcctgggcctctcgcaggcactgaacatcctcctgggcctcaagggcctggccccagctgagatctctgcagtgtgtgaaaaagggaatttcaacgtggcccatgggctggcatggtcatattacatcggatatctgcggctgatcctgccagagctccaggcccggattcgaacttacaatcagcattacaacaacctgctacggggtgcagtgagccagcggctgtatattctcctcccattggactgtggggtgcctgataacctgagtatggctgaccccaacattcgcttcctggataaactgccccagcagaccgctgaccgagctggcatcaaggatcgggtttacagcaacagcatctatgagcttctggagaacgggcagcgggcgggcacctgtgtcctggagtacgccacccccttgcagactttgtttgccatgtcacaatacagtcaagctggctttagccgggaggataggcttgagcaggccaaactcttctgccagacacttgaggacatcctggcagatgcccctgagtctcagaacaactgccgcctcattgcctaccaggaacctgcagatgacagcagcttctcgctgtcccaggaggttctccggcacctgcggcaggaggaaaaggaagaggttactgtgggcagcttgaagacctcagcggtgcccagtacctccacgatgtcccaagagcctgagctcctcatcagtggaatggaaaagcccctccctctccgcacggatttctcttga（配列番号３）
【０１５８】
実施例１０５−マウスＳＴＩＮＧアゴニスト活性レポーターアッセイ
ＲＡＷ−ルシア（Ｌｕｃｉａ）（商標）ＩＳＧ  Ｃｅｌｌｓ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、カタログ番号ｒａｗｌ−ｉｓｇ）をマウスＳＴＩＮＧアゴニストレポーターアッセイに対して使用した。実施例１０３で上述したように、ＨＡＱ  ＳＴＩＮＧアゴニスト活性レポーターアッセイにおいてＥＣ５０値を決定した。結果を以下の表２において示す。
【０１５９】
実施例１０６−示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）アッセイ
ＤＳＦアッセイを利用して、化合物と組換え型ＳＴＩＮＧタンパク質との間の物理的相互作用を測定した。短縮組換え型ＳＴＩＮＧタンパク質（アミノ酸１５５〜３４１）（配列番号４）をＥ．ｃｏｌｉに発現させ、後述するようにアッセイ用に単離した。アッセイマトリックスを、３８４−ウェルプレート内で、１００ｍＭ  ＫＣｌ、５Ｘ  ＳＹＰＲＯオレンジ色染料及び５０μＭ化合物（最終ＤＭＳＯ濃度０〜１％）を補充した、１μＭ組換え型ＳＴＩＮＧタンパク質（アミノ酸１５５〜３４１）（配列番号４）、１００ｍＭ  ＰＢＳ  ｐＨ７．４からなる、１ウェル当たり１０μＬの最終容量で調製した。２５℃〜９５℃の温度勾配、０．０５℃／分の速度で、並びに４７０及び５８６ｎｍでのそれぞれ励起及び発光フィルターを使用するＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  １２Ｋ  Ｆｌｅｘ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍでアッセイを実施した。アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｓｈｉｆｔソフトウエア（アルゴリズムバージョン１．３．）により割り当てられた蛍光誘導体曲線に従い、未結合及びリガンド結合した組換え型ＳＴＩＮＧタンパク質の熱的融解（Ｔｍ）、及び熱的融解における差異（ｄＴｍ  Ｄ）を計算した。
一般的に、０より大きなΔＴｍ値を有する化合物は、試験したタンパク質と物理的相互作用を有すると考えられ、ΔＴｍの値は化合物結合親和性と正に関連する。ここで、化合物１ａは、１７．６というΔＴｍを示し（表２）、ＳＴＩＮＧタンパク質との物理的相互作用を示す。
【０１６０】
【表５】
2021525758.tif 000035
【０１６１】
実施例１０７−Ｅｘ  ｖｉｖｏヒトＰＢＭＣ刺激アッセイ
１０．０ｍＬ  ＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒナトリウムヘパリンチューブ（カタログ番号３６７８７４）を使用して、５人の健康な供与体からヒト血液を採取した。ＳＩＧＭＡ  ＡＣＣＵＳＰＩＮ  ５０ｍｌ  Ｔｕｂｅｓ（カタログ番号Ａ２０５５）及びＳＩＧＭＡ  ＡＣＣＵＳＰＩＮＳｙｓｔｅｍ−ＨＩＳＴＯＰＡＱＵＥ−１０７７（カタログ番号Ａ７０５４）を使用し、製造業者によるプロトコルを使用して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）単離を行った。ＰＢＭＣ層を収集し、Ｓｉｇｍａにより示唆されている通り１×Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）で洗浄した。ＰＢＭＣをカウントし、最後に、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ  カタログ番号２０１４０．７９）を補充したＲＰＭＩ（ｃｏｒｎｉｎｇ  カタログ番号１０−０４１−ＣＶ）中に＠１×１０ｅ６／ｍｌを懸濁させた。１ｍｌの細胞（１×１０ｅ６）を、Ｆａｌｃｏｎ  ５ｍＬ  Ｒｏｕｎｄ  Ｂｏｔｔｏｍ  Ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  Ｔｅｓｔ  Ｔｕｂｅ（カタログ番号３５２０６３）に移し、５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で２４時間、異なる濃度（０、０．１、１、１０μＭ）で刺激した。
【０１６２】
２４時間のインキュベーション後、チューブを１４００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を採取した。上清をその後のＩＦＮβ測定用に−８０℃で保存した。Ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ−β  Ｂａｓｅ  Ｋｉｔ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  カタログ番号Ｋ１５１ＡＤＡ）を使用してＩＦＮβ測定を行い、製造業者により提供されたプロトコルを使用した。ＭＥＳＯ  ＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒ  ２４００でのリーディングアッセイプレートにより、及びＭＳＤ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ  ４．０プログラムを使用して、ＩＦＮ−ベータ評価を行った。２４時間後、ＩＦＮβタンパク質を分析した。結果は、化合物１ａが用量依存性方式で第１次ヒトＰＢＭＣ  ＩＦＮβタンパク質の生成を誘発することができることを示した。
【０１６３】
表３に示されている結果は、５つの異なる供与体を使用して行った測定の平均を反映している。
【０１６４】
【表６】
2021525758.tif 000036
【０１６５】
ＩＦＮβ  ｍＲＮＡ定量化のため、製造業者のプロトコルに従い、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して全ＲＮＡを単離した。ＩＦＮβ  ｍＲＮＡをｑＰＣＲアッセイで定量化した。手短に言えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）を使用して６０μｌ反応物容量で全ＲＮＡ（４００ｎｇ〜１０００ｎｇ）をｃＤＮＡに変換した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｔａｑ  Ｍａｎ発現アッセイを使用して、ＩＦＮＢ１（Ｈｓ０１０７７９５８＿ｓ１）、及びＧＡＰＤＨ（Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１）に対するＲＮＡ特異的プライマーを使用して、得られたｃＤＮＡ（１０ｎｇ）を続いて増幅させた。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｑｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ  １２Ｋ  Ｆｌｅｘ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ上で、Ｔａｑ  Ｍａｎ  Ｆａｓｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）を用いて、５０℃で２分間の最初のステップ、これに続いて９５℃で２秒間、９５℃で１秒間及び６０℃で２０秒間を４０サイクル行い、ｑＰＣＲ分析を実施した。基準遺伝子ＧＡＰＤＨに対する正規化後、２−ΔΔＣＴ方法を使用して、相対的な遺伝子発現を計算した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｑｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ  １２Ｋ  Ｆｌｅｘソフトウエアｖ１．２．２を使用して計算を行った。ＩＦＮβ  ｍＲＮＡの倍変化と、ビヒクル処理した試料との対比を表４に要約した。結果は、化合物１ａが、初代ＰＢＭＣ中のＩＦＮβ  ｍＲＮＡを用量依存性方式及び時間依存性方式で誘発できることを示した。表４は、５つの異なる供与体から計算した平均値を示す。
【０１６６】
【表７】
2021525758.tif 000037
【０１６７】
実施例１０８−ＣＴ２６二重腫瘍モデルに対する化合物１ａの抗がん作用
マウス結腸がんモデルであるＣＴ２６二重腫瘍モデルにおいて、化合物１ａをその抗がん活性について試験した。雌の週齢５〜６週のＢａｌｂ／ｃＪマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ）には、ＣＴ２６腫瘍細胞を各動物の両側に、各側１０５個の細胞を皮下にインプラントした。実験Ａに対して、治療は、腫瘍のインプランテーション後、５日目に平均腫瘍がおよそ１００ｍｍ３到達した時点で開始した（１．２５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ及び５ｍｇ／ｋｇ）。実験Ｂに対して、治療は、腫瘍インプランテーション後、８日目に平均腫瘍がおよそ１２０ｍｍ３に到達した時点で開始した（０．６ｍｇ／ｋｇ、及び１０ｍｇ／ｋｇ）。表５及び表６に、治療スキームを記載する。
【０１６８】
【表８】
2021525758.tif 000038
【０１６９】
【表９】
2021525758.tif 000039
【０１７０】
実験におけるすべてのマウスは２種の皮下ＣＴ２６腫瘍を有する。「治療した腫瘍」は化合物を直接投与した腫瘍を示すのに対して、「未治療の腫瘍」は化合物を直接投与していない腫瘍を示す。実験全体にわたり腫瘍容積を追跡調査した。治療の開始後、腫瘍容積を週２回測定する。腫瘍負荷は、長球面（Ｌ×Ｗ２）／２の容積（式中、Ｌ及びＷはそれぞれの直交方向の長さ及び幅の測定値（ｍｍ）である）に対する式により、キャリパ測定から計算する。
【０１７１】
化合物１ａは、ＣＴ２６二重腫瘍モデルにおける強力な及び治癒的活性を示した（図１０及び図１１）。試験した最も低い用量でも、治療した腫瘍に対して治癒速度２０％が実験で検出された（図８、０．６ｍｇ／ｋｇ用量）。同時に、最も高い用量（１０ｍｇ／ｋｇ）は、実験終了時にはその腫瘍を有する動物の１００％を治癒した。未治療の腫瘍に対して、用量依存性抗腫瘍作用もまた明らかであった。一番高い用量群（１０ｍｇ／ｋｇ）は、８０％治癒的作用を示し、すべての低用量もまた腫瘍成長阻害活性を示した。したがって、注射していない遠位の腫瘍部位での作用に基づく治療濃度域０．６ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇが化合物１ａに対して観察され、抗腫瘍活性は唯一の局在的にばかりでなく、全身的にも見られた。結論として、結果は、化合物１ａの局所投与は、局所的及び全身性（アブスコパルの）抗がん活性の両方を誘発できることを表している。
【０１７２】
実施例１０９−ＣＴ２６肝臓転移性のモデルに対する化合物１ａの抗がん作用
ＣＴ２６肝臓転移性のモデルにおいて、化合物１ａをその抗がん活性について試験した。麻酔下の雌の週齢５〜６週のＢＡＬＢ／ｃＪマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ）に、ルシフェラーゼを発現するＣＴ２６腫瘍細胞（マウス１匹当たり５×１０５個の細胞）を脾臓内にインプラントした。その後の１０分間の待機期間により、腫瘍細胞の動物の肝臓への循環を可能にした。次いで、脾臓を取り出し、動物を縫合し、回復させた。３日後、ＣＴ２６腫瘍細胞（マウス１匹当たり１０５個の細胞）を、今度は右前肢の領域下に、再度皮下に（ｓｃ）インプラントすることによって、化合物投与のために腫瘤の発症を可能にした。脾臓内注射の９日後、化合物（１０ｍｇ／ｋｇ）を腫瘍内に、単回で、ｓｃ腫瘍へ投与した。
【０１７３】
各マウス肝臓内の増殖する腫瘤の有害な影響に基づき、ビヒクル治療した対照マウスと比較して、治療したマウスの全生存期間により化合物のアブスコパル効果を評価しながら、化合物の局所的抗がん作用をｓｃ腫瘍に対するその作用を介して測定した。化合物１ａは、局所的なｓｃ腫瘍に対する強力な活性と、また、治療した動物１０匹のうち９匹において、治癒的全身性活性の両方を示した（図１２）。これらの結果は、化合物１ａの局所的投与が局所的抗がん活性と、肝臓内などの深い病変を含めた、全身性（アブスコパルの）抗がん活性の両方を誘発できることを表している。
【０１７４】
実施例１１０−ＧＬ２６１脳同所性モデルに対する化合物１ａの抗がん作用
ＧＬ２６１脳同所性モデルにおいてその抗がん活性について化合物１ａを試験した。ＧＬ２６１はネズミグリア細胞腫細胞株である。ルシフェラーゼを発現するＧＬ２６１マウスグリア細胞腫細胞（２×１０４個の細胞／マウス）を、雌の週齢５〜６週のＢ６アルビノマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ）に頭側内にインプラントした。３〜４日後、ＧＬ２６１細胞を右の前肢領域下に、皮下にインプラント（１０６細胞／マウス）することによって、化合物投与のための腫瘤の発症を可能にした。頭側内腫瘍細胞インプラントの１０日後、化合物（１０ｍｇ／ｋｇ）を腫瘍内に、単回で、ｓｃ腫瘍へ投与した。各マウス脳内の増殖する腫瘤の有害な影響に基づき、ビヒクル治療した対照マウスと比較して、治療したマウスの全生存期間により化合物のアブスコパル効果を評価しながら、化合物の局所的抗がん作用をｓｃ腫瘍に対するその作用を介して測定した。化合物１ａは、局所的なｓｃ腫瘍に対する強力な活性も示し、治療した動物８匹のうち５匹における治癒的全身性活性も示した（図１３）。これらの結果は、化合物１ａの局所的投与が、局所的抗がん活性と、脳内などの深い病変を含めた、全身性（アブスコパルの）抗がん活性の両方を誘発できることを表している。
【０１７５】
実施例１１１−比較
本発明の開示の化合物１ａ、天然ＳＴＩＮＧリガンド（２’３’ｃＧＡＭＰ）、及び本明細書に参照により組み込まれているＣｏｒｒａｌｅｓら、「Ｄｉｒｅｃｔ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＴＩＮＧ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｕｍｏｒ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ｌｅａｄｓ  ｔｏ  Ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｔｕｍｏｒ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ」、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１５年）１１巻：１０１８〜１０３０頁で報告されたようなＳＴＩＮＧアゴニストＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡとされるものを使用した直接比較において、ＷＴ  ＳＴＩＮＧ、ＨＡＱ  ＳＴＩＮＧ、ＡＱ  ＳＴＩＮＧ、及びＲＥＦ  ＳＴＩＮＧのヒトＳＴＩＮＧアッセイに対してＥＣ５０値を計算した。アッセイは、上に記載された実施例に記載した通り行った。表７に報告されたアッセイ値は、直接比較で行われるアッセイに限定されるもので、上又は他の箇所で報告されたようなより大きな数のトライアルを通して決定される平均値を反映し得ないことに注意されたい。「２’３’  ｃＧＡＭＰ」は、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓの出版物で報告されているような「ＭＬ  ｃＧＡＭＰ」と同じであることに更に注意されたい。
【０１７６】
【表１０】
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【０１７７】
表７はまた、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）で測定された通り、３つの試験した化合物のそれぞれへのヒトＷＴ  ＳＴＩＮＧの結合に対する解離結合定数（Ｋｄ）を報告している。ＩＴＣは、分子間相互作用に関連する熱力学的特性を測定する微量熱量滴定技術である。これらの試験に基づき、化合物１ａは、試験した化合物のＷＴ  ＳＴＩＮＧと最も強い結合を形成するように見える。
【０１７８】
材料
組換え型ヒト野生型ＳＴＩＮＧ（アミノ酸１３９〜３７９、Ｈ２３２Ｒ）タンパク質は、アミノ酸１３９〜３７９を含むヒトＷＴ  ＳＴＩＮＧのサイトゾルドメインをコードしているＥ．ｃｏｌｉにおいて構造体を発現することにより生成された。
【０１７９】
試薬
この実験で使用した試薬の供給元を以下に示す：
【０１８０】
【表１１】
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【０１８１】
タンパク質緩衝液の調製
ＳＴＩＮＧタンパク質は、９０μＬ及び１００μＬのアリコートを、それぞれ３．０ｍｇ／ｍＬ及び２０ｍｇ／ｍＬの濃度で、それぞれ５％グリセロールを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．５中で、−６０℃で貯蔵した。分析の当日、アリコートのタンパク質を解凍し、４００μＬに希釈し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ遠心フィルターユニット（１０ｋ  ＭＷカットオフ、０．５ｍＬ）を使用して、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ微量遠心機を用いた少なくとも４回の１０分間、１４０００ｘｇの遠心分離により緩衝液をＰＢＳに交換し、次いで１Ｘ  ＰＢＳで、２０μＭ〜３０μＭ（実験依存性）に最後的に希釈した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ２０００分光光度計及び２２１４０（Ｍ−１ｃｍ−１）のタンパク質吸光係数を使用して、タンパク質濃度を決定した。
【０１８２】
試料の調製
化合物１ａ、２’３’ｃＧＡＭＰ、及びＭＬ  ＲＲ−Ｓ２ＣＤＡの２００μＬの１ｍＭストック溶液を１．５ｍＬ微小遠心管により供給した。各実験の前に、試料を２００ｕＭ〜５００ｕＭ（実験依存性）の濃度に希釈した。
【０１８３】
方法
ＩＴＣクリーニングアクセサリー（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ｎｏ  ６０１８００．９０１）を備えたＡｆｆｉｎｉｔｙ  ＩＴＣ  ｕｎｉｔ（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ｎｏ  ６０９００３．９０１）でアッセイを実施した。ＳＴＩＮＧタンパク質溶液、２０μＭ〜３０μＭのＳＴＩＮＧタンパク質を含有するおよそ４００μＬをピペットで取り、一部の過充填を許容して１８５μＬ熱量計セルに入れた。基準細胞は、当量のＭｉｌｌｉ−Ｑ水を含有した。１００μＭ〜３００μＭ化合物を２０×２．５μＬ注入し、２５℃でインキュベーションを行った。対照ソフトウエアはＩＴＣ  Ｒｕｎ  Ｖｅｒ．３．３．０．０（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）であり、これを使用して、各注入時の加熱速度を表す未加工の熱（μｃａｌ／秒）の複数のピークからなるサーモグラムを得た。分析ソフトウエアＮａｎｏ  Ａｎａｌｙｚｅ  Ｖｅｒ．３．７０（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、ベースライン補正、ブランク又は試料の希釈熱（飽和における）を補正し、グラフに示された「Ｑ」値を生成する加熱速度ピークを積分した。生成した等温線を非依存性モデルにフィットして、熱力学パラメーターを導き出した。
【０１８４】
Ｋｄ及びｎ値（曲線屈曲点でのモル比）を導き出し、報告した。タンパク質及びリガンドの濃度に対する最適条件は初期実験から導き出した。
【０１８５】
結果
試験化合物の組換え型ヒト野生型ＳＴＩＮＧ（アミノ酸１３９〜３７９、Ｈ２３２Ｒ）への結合に対する、加熱速度サーモグラム及びこれらから生成した等温線を決定した。各化合物のＳＴＩＮＧへの結合は、負の加熱速度により示されたように吸熱性であり、希釈の発熱性（正の向き）加熱（化合物のタンパク質の飽和を達成後に観察）があった。２’、３’ｃＧＡＭＰは、様々なＳＴＩＮＧバリアントに対する同様の吸熱性応答を生成することが示されている。化合物１ａは、０．０４μＭという最も低いＫｄを提供し、これに続いて、２’３’ｃＧＡＭＰが０．０７μＭのＫｄ、次いでＭＬ  ＲＲ−Ｓ２  ＣＤＡが０．４０μＭのＫｄを提供した。すべての化合物は、０．５近くのｎ値を提供し、これは、ＳＴＩＮＧタンパク質がダイマーとして存在し、２モルのＳＴＩＮＧ当たり１モルの化合物が結合していることを示唆する。
【０１８６】
実施例１１２−潜在的代謝物の特定
化合物１ａを、ＣＤ−１マウス、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット、ビーグル犬、カニクイザル、及びヒトの肝細胞中でインキュベートして、主要な代謝物の形成を評価した。
【０１８７】
材料
凍結保存し、プールした肝細胞は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、Ｘｅｎｏｔｅｃｈ、ＬＬＣ（ＫａｎｓａｓＣｉｔｙ、ＫＳ）及びＩｎ  Ｖｉｔｒｏ  ＡＤＭＥＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤ）から購入し、適当な培地はＩｎ  Ｖｉｔｒｏ  ＡＤＭＥＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤ）及びＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から購入した。ＡＯＰＩ染色溶液及びリン酸緩衝液は、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ、ＭＡ）及びＮｅｘｃｅｌｏｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｌａｗｒｅｎｃｅ、ＭＡ）からそれぞれ入手した。分析に使用したすべての化学物質、試薬、及び溶媒は、分析用又はＨＰＬＣ等級である。
【０１８８】
実験計画法及び手順
肝細胞インキュベーション
化合物１ａを秤量し、ＨＰＬＣ−水を含有する０．１２％ギ酸ＰＢＳに溶解して１０２０ｍｍｏｌ／Ｌにした。次いで、溶液を個々に２．５倍に４ｍｍｏｌ／Ｌまで希釈し、次いで、０．１％ヒト血清アルブミン及び２ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｌ−グルタミンを含有するＷｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地で２１０００倍更に希釈して、濃度２０μｍｏｌ／Ｌの作業ストック溶液を生成した。
【０１８９】
インキュベーション前、凍結保存した肝細胞を水槽内で、３７℃で解凍した。１本のチューブの凍結保存した肝細胞を、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ＡＤＭＥＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤ）から入手した凍結保存した肝細胞回復培地（ＵＣＲＭ）の各５０ｍＬコニカルチューブに加えた。Ｂｅｃｋｍａｎ遠心分離（Ｂｒｅａ、ＣＡ）内で、室温４℃で１０分間、７４０ｒｐｍで、ＧＨ３．８ローターを用いて細胞を回転させた。上清を取り出し、細胞をカウンティング用のプレーティング培地内に再懸濁させた。細胞をプレーティング培地に再懸濁させた後、２０μＬの再懸濁液を移し、２０μＬのＡＯＰＩ染色溶液と混合した。溶液を穏やかに混合し、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ、Ｌａｗｒｅｎｃｅ、ＭＡ）を使用して細胞をカウントした。カウントした後、次いで、細胞を２ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｌ−グルタミン（ｐＨ７．４）を含有するＷｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地内で１又は２百万個の生存細胞／ｍＬで再懸濁させた。
【０１９０】
肝細胞懸濁液（５０μＬ／ウェル）を４８−ウェルプレートに加えた。化合物１ａ（２０μｍｏｌ／Ｌ）を含有する５０マイクロリットルの作業ストック溶液を加えて、反応を開始させた。プレートを組織培養物インキュベーター（５％  ＣＯ２／９５％空気を加湿した雰囲気及び３７℃）内に配置し、２０１０ｎｇ／ｍＬ  フロセミド及び０．２μｍｏｌ／Ｌ  （Ｒ）−プロプラノロールと共に、１００％メタノール／アセトニトリル（１／１、ｖ／ｖ）からなる２００μＬの停止液を用いて、５、３０、６０、１２０、１８０及び２４０分の時点で反応を停止させた。混合物を遠心分離させ、濾過し、上清を分析用に収集した。凍結保存した肝細胞の最終濃度は１×１０６細胞／ｍＬであった。化合物１ａの最終インキュベーション濃度は１０μｍｏｌ／Ｌであった。
【０１９１】
代謝物同定のためのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ条件
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣ及びＡＢ−ＳＣＩＥＸ  ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ  ５６００ハイブリッド四重極及びＴＯＦ質量分析器（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）で構成された。Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣ（Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）は、コミュニケーションバスモジュール（ＣＢＭ−２０Ａ）、付随しているラックチェンジャー（Ｒａｃｋ  ＣｈａｎｇｅｒＩＩ）２つのポンプ（ＬＣ−３０ＡＤ）を備えたオートサンプラー（ＳＩＬ−３０ＡＣ）、及びカラムオーブン（ＣＴＯ−３０Ａ）からなった。ＡＢ−ＳＣＩＥＸ  ＡＰＣＩのＮｅｇａｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）を使用して質量分析器を較正した。肝細胞を用いたインキュベーションから得られた試料を負と正のスキャンモード下で分析した。塩基性分析法及び装置の条件を以下に要約する。分光器設定の改変は分析物の必要性に依存した。
【０１９２】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ条件：
【０１９３】
【表１２】
2021525758.tif 000042
【０１９４】
活性データのデータ分析
ＡＢ−Ｓｃｉｅｘ  Ａｎａｌｙｓｔ  ＴＦ（バージョン１．５．１；Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）を使用して、質量分析法データを取得した。ＡＢ−Ｓｃｉｅｘ  ＰｅａｋＶｉｅｗ（バージョン２．２．０．１；Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）を使用して、クロマトグラム及びスペクトルを得た。抽出したイオンクロマトグラムに対する相対的ピーク領域の比較は、目的の各分析物に対する予想された正確な質量電荷比（ｍ／ｚ）の±０．０００２Ｄａに基づいた。
【０１９５】
結果
肝細胞とのインキュベーションからの代謝物は検出されなかった。提示された分析条件下で、化合物１ａは、およそ７．８分間の保持時間を示した。負のスキャンモード下で、化合物１ａは、脱プロトン化分子イオンｍ／ｚ  ７４５（Ｃ２４Ｈ２５Ｆ２Ｎ１０Ｏ８Ｐ２Ｓ２−）及び二重脱プロトン化分子イオンｍ／ｚ  ３７２（Ｃ２４Ｈ２４Ｆ２Ｎ１０Ｏ８Ｐ２Ｓ２２−）を示した。ｍ／ｚ  ５３３（Ｃ１９Ｈ１９ＦＮ１０Ｏ４ＰＳ−）及びｍ／ｚ  １８６（Ｃ９Ｈ８Ｎ５−）を有する主要なＭＳ／ＭＳ生成物イオンを観察した。正のスキャンモード下で、化合物１ａは、ｍ／ｚ  ７４７（Ｃ２４Ｈ２７Ｆ２Ｎ１０Ｏ８Ｐ２Ｓ２＋）のプロトン化分子イオン及びｍ／ｚ  ６５１（Ｃ２４Ｈ２６Ｆ２Ｎ１０Ｏ６ＰＳ＋）、ｍ／ｚ  ２５２（Ｃ１０Ｈ１１ＦＮ５Ｏ２＋）、及びｍ／ｚ  １８８（Ｃ９Ｈ１０Ｎ５＋）を有する主要ＭＳ／ＭＳ生成物イオンを示した。ＭＳ及びＭＳ／ＭＳデータは、化合物１ａの構造に対して確証的である。
【０１９６】
化合物１ａは、マウス、ラット、イヌ、サル、及びヒトの肝細胞とのインキュベーションにおいて安定していた。化合物１ａの明らかな代謝物をこの実験において同定しなかった。肝細胞とのインキュベーションから得られた試料において、直列質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）の断片により、化合物１ａそれ自体のみを検出及び確認することができた。
【０１９７】
本開示で参照したすべての文献は、本明細書で参照により組み込まれているが、ただし、任意の組み込まれた文献がこの文書による明細書と矛盾した場合、この文書による明細書が優先されるものとする。当業者であれば、様々な変化及び修正を本明細書に提供されている材料に行うことができ、その材料は本開示の範囲内及び趣旨内であることを認識する。
【０１９８】
配列表
配列番号１（ＷＴヒトＳＴＩＮＧ）：
atgccccactccagcctgcatccatccatcccgtgtcccaggggtcacggggcccagaaggcagccttggttctgctgagtgcctgcctggtgaccctttgggggctaggagagccaccagagcacactctccggtacctggtgctccacctagcctccctgcagctgggactgctgttaaacggggtctgcagcctggctgaggagctgcgccacatccactccaggtaccggggcagctactggaggactgtgcgggcctgcctgggctgccccctccgccgtggggccctgttgctgctgtccatctatttctactactccctcccaaatgcggtcggcccgcccttcacttggatgcttgccctcctgggcctctcgcaggcactgaacatcctcctgggcctcaagggcctggccccagctgagatctctgcagtgtgtgaaaaagggaatttcaacgtggcccatgggctggcatggtcatattacatcggatatctgcggctgatcctgccagagctccaggcccggattcgaacttacaatcagcattacaacaacctgctacggggtgcagtgagccagcggctgtatattctcctcccattggactgtggggtgcctgataacctgagtatggctgaccccaacattcgcttcctggataaactgccccagcagaccggtgaccgggctggcatcaaggatcgggtttacagcaacagcatctatgagcttctggagaacgggcagcgggcgggcacctgtgtcctggagtacgccacccccttgcagactttgtttgccatgtcacaatacagtcaagctggctttagccgggaggataggcttgagcaggccaaactcttctgccggacacttgaggacatcctggcagatgcccctgagtctcagaacaactgccgcctcattgcctaccaggaacctgcagatgacagcagcttctcgctgtcccaggaggttctccggcacctgcggcaggaggaaaaggaagaggttactgtgggcagcttgaagacctcagcggtgcccagtacctccacgatgtcccaagagcctgagctcctcatcagtggaatggaaaagcccctccctctccgcacggatttctcttga
配列番号２（ＲＥＦヒトＳＴＩＮＧ）：
atgccccactccagcctgcatccatccatcccgtgtcccaggggtcacggggcccagaaggcagccttggttctgctgagtgcctgcctggtgaccctttgggggctaggagagccaccagagcacactctccggtacctggtgctccacctagcctccctgcagctgggactgctgttaaacggggtctgcagcctggctgaggagctgcgccacatccactccaggtaccggggcagctactggaggactgtgcgggcctgcctgggctgccccctccgccgtggggccctgttgctgctgtccatctatttctactactccctcccaaatgcggtcggcccgcccttcacttggatgcttgccctcctgggcctctcgcaggcactgaacatcctcctgggcctcaagggcctggccccagctgagatctctgcagtgtgtgaaaaagggaatttcaacgtggcccatgggctggcatggtcatattacatcggatatctgcggctgatcctgccagagctccaggcccggattcgaacttacaatcagcattacaacaacctgctacggggtgcagtgagccagcggctgtatattctcctcccattggactgtggggtgcctgataacctgagtatggctgaccccaacattcgcttcctggataaactgccccagcagaccggtgaccatgctggcatcaaggatcgggtttacagcaacagcatctatgagcttctggagaacgggcagcgggcgggcacctgtgtcctggagtacgccacccccttgcagactttgtttgccatgtcacaatacagtcaagctggctttagccgggaggataggcttgagcaggccaaactcttctgccggacacttgaggacatcctggcagatgcccctgagtctcagaacaactgccgcctcattgcctaccaggaacctgcagatgacagcagcttctcgctgtcccaggaggttctccggcacctgcggcaggaggaaaaggaagaggttactgtgggcagcttgaagacctcagcggtgcccagtacctccacgatgtcccaagagcctgagctcctcatcagtggaatggaaaagcccctccctctccgcacggatttctcttga
配列番号３（ＡＱヒトＳＴＩＮＧ）：
atgccccactccagcctgcatccatccatcccgtgtcccaggggtcacggggcccagaaggcagccttggttctgctgagtgcctgcctggtgaccctttgggggctaggagagccaccagagcacactctccggtacctggtgctccacctagcctccctgcagctgggactgctgttaaacggggtctgcagcctggctgaggagctgcgccacatccactccaggtaccggggcagctactggaggactgtgcgggcctgcctgggctgccccctccgccgtggggccctgttgctgctgtccatctatttctactactccctcccaaatgcggtcggcccgcccttcacttggatgcttgccctcctgggcctctcgcaggcactgaacatcctcctgggcctcaagggcctggccccagctgagatctctgcagtgtgtgaaaaagggaatttcaacgtggcccatgggctggcatggtcatattacatcggatatctgcggctgatcctgccagagctccaggcccggattcgaacttacaatcagcattacaacaacctgctacggggtgcagtgagccagcggctgtatattctcctcccattggactgtggggtgcctgataacctgagtatggctgaccccaacattcgcttcctggataaactgccccagcagaccgctgaccgagctggcatcaaggatcgggtttacagcaacagcatctatgagcttctggagaacgggcagcgggcgggcacctgtgtcctggagtacgccacccccttgcagactttgtttgccatgtcacaatacagtcaagctggctttagccgggaggataggcttgagcaggccaaactcttctgccagacacttgaggacatcctggcagatgcccctgagtctcagaacaactgccgcctcattgcctaccaggaacctgcagatgacagcagcttctcgctgtcccaggaggttctccggcacctgcggcaggaggaaaaggaagaggttactgtgggcagcttgaagacctcagcggtgcccagtacctccacgatgtcccaagagcctgagctcctcatcagtggaatggaaaagcccctccctctccgcacggatttctcttga
配列番号４（ＷＴ  ＳＴＩＮＧ残基１５５〜３４１）：
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配列番号５（Ｈｉｓ−ＴＥＶ−Ｓｕｍｏ−ＷＴ  ＳＴＩＮＧ  １５５〜３４１）
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配列番号６（ＲＥＦ  ＳＴＩＮＧ残基１５５〜３４１）：
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配列番号７（Ｈｉｓ−ＴＥＶ−Ｓｕｍｏ−ＲＥＦ  ＳＴＩＮＧ  １５５〜３４１）
MHHHHHHSSGVDLGTENLYFQSNAMSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGGSVAHGLAWSYYIGYLRLILPELQARIRTYNQHYNNLLRGAVSQRLYILLPLDCGVPDNLSMADPNIRFLDKLPQQTGDHAGIKDRVYSNSIYELLENGQRAGTCVLEYATPLQTLFAMSQYSQAGFSREDRLEQAKLFCRTLEDILADAPESQNNCRLIAYQEPADDSSFSLSQEVLRHLRQEEKEEV
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2021525758.tif 000051
【図２Ｅ】
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【図３】
2021525758.tif 000053
【図４Ａ】
2021525758.tif 000054
【図４Ｂ】
2021525758.tif 000055
【図４Ｃ】
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【図５】
2021525758.tif 000057
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2021525758.tif 000061
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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