(57)【要約】  本発明は、標的抗原に特異的に結合される外因性受容体と外因性ＣＣＬ２１とを発現し、また、細胞増殖を促進するIL-7R結合タンパク質または外因性のIL-7をより発現することができる遺伝子操作された細胞を開示する。本発明は、外因性ＣＣＬ２１発現カセットの発現構成物とそれを含むベクター、ウイルス、及び前記細胞を含む薬物組成物をさらに開示する。本発明は、腫瘍を抑制したり、病原体を阻害したりする薬物の調製における前記細胞、発現構成物、ベクター及びウイルスの応用をさらに開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子操作された細胞であって、
前記細胞は、標的抗原に特異的に結合される外因性受容体と外因性ＣＣＬ２１とを発現し、好ましくは、前記細胞増殖を促進するタンパク質をさらに発現し、より好ましくは、前記細胞増殖を促進するタンパク質は、ＩＬ−７Ｒ結合タンパク質または外因性ＩＬ−７であることを特徴とする、前記遺伝子操作された細胞。
【請求項２】
前記ＩＬ−７Ｒ結合タンパク質は、外因性ＩＬ−７Ｒ結合タンパク質であり、前記外因性ＩＬ−７Ｒ結合タンパク質は、ＩＬ−７Ｒに特異的に結合することができ、ＩＬ−７Ｒ活性を増強させ、
好ましくは、前記外因性ＩＬ−７Ｒのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９に示されるとおりであることを特徴とする
請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記外因性ＣＣＬ２１は、天然ＣＣＬ２１、または天然ＣＣＬ２１と同じ機能を有する天然ＣＣＬ２１の切断断片または天然ＣＣＬ２１の突然変異体であり、
好ましくは、前記天然ＣＣＬ２１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するか、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示されるアミノ酸配列の切断断片であり、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４または１５に示されるヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するか、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４または１５に示されるヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列の切断断片であることを特徴とする
請求項１または２に記載の細胞。
【請求項４】
前記外因性ＣＣＬ２１は、構成的発現（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）されることを特徴とする
請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５】
前記外因性ＣＣＬ２１は、誘導的発現（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）され、好ましくは、前記誘導的発現は、免疫細胞誘導性プロモーターを介して開始され、より好ましくは、前記免疫細胞誘導性プロモーターは、ＮＦＡＴプロモーターであることを特徴とする
請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６】
前記外因性ＩＬ−７は、天然ＩＬ−７、または天然ＩＬ−７と同じ機能を有する天然ＩＬ−７の切断断片または天然ＩＬ−７の突然変異体であり、
好ましくは、前記天然ＩＬ−７は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するか、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に示されるアミノ酸配列の切断断片でああるか、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に示されるヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するか、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に示されるヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列の切断断片であることを特徴とする
請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項７】
前記外因性ＩＬ−７Ｒ結合タンパク質または外因性ＩＬ−７は、構成的発現されることを特徴とする
請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項８】
前記外因性ＩＬ−７Ｒ結合タンパク質または外因性ＩＬ−７は、誘導的発現され、好ましくは、前記誘導的発現は、免疫細胞誘導性プロモーターを介して開始され、より好ましくは、前記免疫細胞誘導性プロモーターは、ＮＦＡＴプロモーターであることを特徴とする
請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項９】
前記細胞は、免疫エフェクター細胞であり、
好ましくは、前記免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞であり、
より好ましくは、前記免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞であることを特徴とする
請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１０】
前記標的抗原は、腫瘍抗原および／または病原体抗原を含み、好ましくは、腫瘍抗原であることを特徴とする
請求項１に記載の細胞。
【請求項１１】
前記標的抗原は、固形腫瘍抗原であり、
好ましくは、前記固形腫瘍抗原は、ＧＰＣ３、ＥＧＦＲまたはＣｌａｕｄｉｎ１８．２であり、より好ましくは、前記固形腫瘍抗原は、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２であることを特徴とする
請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
前記外因性受容体は、標的抗原特異的に結合される抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む、キメラ受容体であることを特徴とする
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１３】
前記外因性受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、変形されたＴ細胞（抗原）受容体（ＴＣＲ）、Ｔ細胞融合タンパク質（ＴＦＰ）、Ｔ細胞抗原カプラー（ＴＡＣ）またはそれらの組み合わせから選択され、
好ましくは、前記外因性受容体は、キメラ抗原受容体であることを特徴とする
請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
前記キメラ抗原受容体は、
（ｉ）標的抗原に特異的に結合される抗体またはその断片、ＣＤ２８またはＣＤ８の膜貫通ドメイン、ＣＤ２８の共刺激信号ドメイン、及びＣＤ３ζ、または
（ｉｉ）標的抗原に特異的に結合される抗体またはその断片、ＣＤ２８またはＣＤ８の膜貫通ドメイン、４−１ＢＢの共刺激信号ドメイン、及びＣＤ３ζ、または
（ｉｉｉ）標的抗原に特異的に結合される抗体またはその断片、ＣＤ２８またはＣＤ８の膜貫通ドメイン、ＣＤ２８の共刺激信号ドメイン、４−１ＢＢの共刺激信号ドメイン、及びＣＤ３ζを含むことを特徴とする
請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
前記外因性受容体の抗原結合ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有することを特徴とする
請求項１２に記載の細胞。
【請求項１６】
前記外因性受容体のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２７またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３５に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有することを特徴とする
請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
前記外因性受容体、および／または外因性ＩＬ−７Ｒ結合タンパク質または外因性ＩＬ−７、および／または外因性ＣＣＬ２１は、ウイルスベクターを利用して発現され、
好ましくは、前記ウイルスベクターは、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）ベクター、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）ベクターまたはアデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）ベクターを含むことを特徴とする
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１８】
発現構成物であって、
前記発現構成物は、連続して接続された標的抗原に特異的に結合される外因性受容体の発現カセット１と、外因性ＩＬ−７Ｒ結合タンパク質または外因性ＩＬ−７の発現カセット２と、及び外因性ＣＣＬ２１の発現カセット３とを含み、好ましくは、前記発現カセットの間は、Ｆ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、および／またはＥ２Ａから選択された直列的な断片によって接続されることを特徴とする、前記発現構成物。
【請求項１９】
前記発現カセット２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７に示される核酸配列を含むことを特徴とする
請求項１８に記載の発現構成物。
【請求項２０】
前記発現カセット３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０に示される核酸配列を含むことを特徴とする
請求項１８に記載の発現構成物。
【請求項２１】
請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の発現構成物を含む、発現ベクター。
【請求項２２】
請求項２１に記載の発現ベクターを含むことを特徴とする、ウイルス。
【請求項２３】
個体におけるキメラ受容体を発現する免疫エフェクター細胞の活性を向上させる方法であって、
前記免疫エフェクター細胞で外因性ＣＣＬ２１、外因性ＩＬ−７Ｒ結合タンパク質または外因性ＩＬ−７を共発現し、好ましくは、前記キメラ受容体は、キメラ抗原受容体であることを特徴とする、前記方法。
【請求項２４】
前記外因性ＩＬ−７Ｒ結合タンパク質は、ＩＬ−７Ｒに特異的に結合することができ、ＩＬ−７Ｒ活性を増強させ、
好ましくは、前記外因性ＩＬ−７Ｒのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９に示されるとおりであることを特徴とする
請求項２４に記載の方法。
【請求項２５】
前記外因性ＣＣＬ２１は、天然ＣＣＬ２１、または天然ＣＣＬ２１と同じ機能を有する天然ＣＣＬ２１の切断断片または天然ＣＣＬ２１の突然変異体であり、
好ましくは、前記天然ＣＣＬ２１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するか、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示されるアミノ酸配列の切断断片であるか、または者ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４または１５に示されるヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するか、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４または１５に示されるヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列の切断断片であることを特徴とする
請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記外因性ＣＣＬ２１は、構成的発現されることを特徴とする
請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記外因性ＣＣＬ２１は、誘導的発現され、好ましくは、前記誘導的発現は、免疫細胞誘導性プロモーターを介して開始され、より好ましくは、前記免疫細胞誘導性プロモーターは、ＮＦＡＴプロモーターであることを特徴とする
請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記外因性ＩＬ−７は、天然ＩＬ−７、または天然ＩＬ−７と同じ機能を有する天然ＩＬ−７の切断断片または天然ＩＬ−７の突然変異体であり、
好ましくは、前記天然ＩＬ−７は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するか、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に示されるアミノ酸配列の切断断片であるか、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に示されるヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するか、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に示されるヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列の切断断片であることを特徴とする
請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記外因性ＩＬ−７Ｒ結合タンパク質または外因性ＩＬ−７は、構成的発現されることを特徴とする
請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記外因性ＩＬ−７Ｒ結合タンパク質または外因性ＩＬ−７は、誘導的発現され、好ましくは、前記誘導的発現は、免疫細胞誘導性プロモーターを介して開始され、より好ましくは、前記免疫細胞誘導性プロモーターは、ＮＦＡＴプロモーターであることを特徴とする
請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞であることを特徴とする
請求項２３〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
腫瘍を抑制したり病原体を阻害したりする薬物の調製において、好ましくは、腫瘍を抑制する薬物の調製において、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の細胞、または請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の発現構成物、または請求項２１に記載の発現ベクター、または請求項２２に記載のウイルスの用途。
【請求項３３】
前記調製された腫瘍を抑制する薬物と、化学療法薬物とを併用することを特徴とする
請求項３２に記載の用途。
【請求項３４】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の細胞及び薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含むことを特徴とする、前記薬物組成物。
【請求項３５】
キットであって、
キットＡとキットＢとを含み、前記キットＡは、遺伝子操作された細胞を含み、前記細胞は、標的抗原に特異的に結合される外因性受容体を発現し、前記キットＢは、ＣＣＬ２１、および／または、前記細胞増殖を促進するタンパク質を含み、好ましくは、前記細胞増殖を促進するタンパク質は、ＩＬ−７Ｒ結合タンパク質またはＩＬ−７であり、より好ましくは、前記キットＡとキットＢとは、前後の順序に関係なく使用される、前記キット。
【請求項３６】
前記ＩＬ−７Ｒ結合タンパク質は、ＩＬ−７Ｒに特異的に結合することができ、ＩＬ−７Ｒ活性を増強させ、好ましくは、前記外因性ＩＬ−７Ｒのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９に示されるとおりであることを特徴とする
請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
前記ＣＣＬ２１は、天然ＣＣＬ２１、または天然ＣＣＬ２１と同じ機能を有する天然ＣＣＬ２１の切断断片または天然ＣＣＬ２１の突然変異体であり、
好ましくは、前記天然ＣＣＬ２１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するか、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示されるアミノ酸配列の切断断片であるか、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４または１５に示されるヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するか、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４または１５に示されるヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列の切断断片であることを特徴とする
請求項３５または３６に記載のキット。
【請求項３８】
前記ＩＬ−７は、天然ＩＬ−７、または天然ＩＬ−７と同じ機能を有する天然ＩＬ−７の切断断片または天然ＩＬ−７の突然変異体であり、
好ましくは、前記天然ＩＬ−７は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するか、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に示されるアミノ酸配列の切断断片であるか、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に示されるヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するか、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に示されるヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列の切断断片であることを特徴とする
請求項３５〜３７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３９】
前記キットＡは、キメラ受容体によって変形された免疫エフェクター細胞を含み、
好ましくは、前記キメラ受容体は、キメラ抗原受容体であることを特徴とする
請求項３５に記載のキット。
【請求項４０】
前記免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞であることを特徴とする
請求項３５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、出願日が２０１８年５月１５日である中国特許出願ＣＮ２０１８１０４６３５６４．７、出願日が２０１８年９月１８日である中国特許出願ＣＮ２０１８１１０８８０９０．９、出願日が２０１８年１２月１９日である中国特許出願ＣＮ２０１８１１５５２８０６．６、及び出願日が２０１９年２月２８日である中国特許出願ＣＮ２０１９１０１５１９３０．Ｘの優先権を主張する。本出願は、前記中国特許出願の全文を引用する。
【０００２】
本発明は、細胞治療の分野に属し、遺伝子操作された細胞及び応用に関する。より具体的には、本発明は、標的抗原に特異的に結合される外因性受容体と外因性ＣＣＬ２１の細胞とに関する。
【背景技術】
【０００３】
ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＭＨＣ非制限的な方法で腫瘍を特異的に殺害することができ、腫瘍免疫治療で比較的望ましい応用の見通しを示したが、例えば、固形腫瘍の治療効果が良くなく、インビトロで優れた効果を示す候補薬が、インビボで対応する効果を示すことができないなど、まだ比較的多くの制限がある。
【０００４】
Ａｄａｃｈｉらは、ＩＬ７とＣＣＬ１９とを発現するＣＡＲ−Ｔ細胞（ＩＬ−７  ａｎｄ  ＣＣＬ１９  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ＣＡＲ−Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＣＡＲ−Ｔ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１８,３６（４）,３４６−３５１）を利用して、ＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍能力を向上させようと、試みている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、遺伝子操作された細胞を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第１の態様において、標的抗原を特異的に結合される外因性受容体と外因性ＣＣＬ２１とを含む遺伝子操作された細胞を提供する。
具体的な実施形態において、前記細胞は、標的抗原に特異的に結合される外因性受容体、外因性ＣＣＬ２１、及び前記細胞増殖を促進するタンパク質を発現する。好ましくは、前記前記細胞増殖を促進するタンパク質は、ＩＬ−７Ｒ結合タンパク質または外因性ＩＬ−７である。
【０００７】
具体的な実施形態において、前記ＩＬ−７Ｒ結合タンパク質は、外因性ＩＬ−７Ｒ結合タンパク質であり、即ち、前記細胞は、標的抗原に特異的に結合される外因性受容体、外因性ＣＣＬ２１、及び外因性ＩＬ−７Ｒ結合タンパク質を含む。
具体的な実施形態において、前記外因性ＩＬ−７Ｒ結合タンパク質は、ＩＬ−７Ｒに特異的に結合することができ、ＩＬ−７Ｒ活性を増強させる。
【０００８】
具体的な実施形態において、前記外因性ＩＬ−７Ｒ結合タンパク質は、ＩＬ−７Ｒの抗体から選択される。好ましくは、前記外因性ＩＬ−７Ｒのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９に示されるとおりである。
具体的な実施形態において、前記外因性ＣＣＬ２１は、天然ＣＣＬ２１、または天然ＣＣＬ２１と同じ機能を有する天然ＣＣＬ２１の切断断片または天然ＣＣＬ２１の突然変異体である。
【０００９】
具体的な実施形態において、前記天然ＣＣＬ２１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するか、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示されるアミノ酸配列の切断断片であるか、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４または１５に示されるヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するか、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４または１５に示されるヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列の切断断片である。好ましい例において、前記天然ＣＣＬ２１は、ヒトＣＣＬ２１であり、そのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示され、またはそのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４または１５に示されるヌクレオチドによってコードされる。
【００１０】
具体的な実施形態において、前記外因性ＣＣＬ２１は、構成的発現（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）される。
具体的な実施形態において、前記外因性ＣＣＬ２１は、誘導的発現（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）される。好ましい例において、前記誘導的発現は、免疫細胞誘導性プロモーターを介して開始される。より好ましい例において、前記免疫細胞誘導性プロモーターは、ＮＦＡＴプロモーターである。
【００１１】
具体的な実施形態において、前記外因性ＩＬ−７は、天然ＩＬ−７、または天然ＩＬ−７と同じ機能を有する天然ＩＬ−７の切断断片、または天然ＩＬ−７の突然変異体である。
具体的な実施形態において、前記天然ＩＬ−７のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に示される配列と少なくとも９０％の同一性を有するか、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に示されるアミノ酸配列の切断断片であるか、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に示されるヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するか、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に示されるヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列の切断断片である。
【００１２】
具体的な実施形態において、前記外因性ＩＬ−７Ｒ結合タンパク質または外因性ＩＬ−７は、構成的発現される。
好ましい実施形態において、前記外因性ＩＬ−７Ｒ結合タンパク質または外因性ＩＬ−７は、誘導的発現である。
好ましい実施例において、前記誘導的発現は、免疫細胞誘導性プロモーターを介して開始される。より好ましい例において、前記免疫細胞誘導性プロモーターは、ＮＦＡＴプロモーターである。
【００１３】
具体的な実施形態において、前記細胞は、免疫エフェクター細胞である。具体的な実施例において、前記免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラル殺害（ＮＫ）細胞、ナチュラル殺害Ｔ（ＮＫＴ）細胞、肥満細胞または骨髄由来マクロファージまたはそれらの組み合わせから選択され、好ましくは、前記免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞から選択され、より好ましくは、前記免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞である。
【００１４】
具体的な実施形態において、前記細胞は、自己細胞から由来され、好ましくは、自己Ｔ細胞、自己ＮＫ細胞であり、より好ましくは、自己Ｔ細胞である。
具体的な実施形態において、前記細胞は、同種異系細胞から由来され、好ましくは、同種異系Ｔ細胞または同種異系ＮＫ細胞（ＮＫ９２細胞のようなＮＫ細胞の細胞株を含む）である。
具体的な実施形態において、前記標的抗原は、腫瘍抗原または病原体抗原である。
【００１５】
具体的な実施形態において、前記標的抗原は、腫瘍抗原である。好ましい実施形態において、前記腫瘍抗原は、甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、Ｃ型レクチン類似分子−１、ガングリオシドＧＤ３、Ｔｎ抗原、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ  ２２、ＣＤ  ３０、ＣＤ  ７０、ＣＤ  １２３、ＣＤ  １３８、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７Ｈ６、ＫＩＴ（ＣＤ１１７）、インターロイキン１３受容体サブユニットα（ＩＬ−１３Ｒα）、インターロイキン１１受容体α（ＩＬ−１１Ｒα）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、癌胚抗原（ＣＥＡ）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、チロシン酵素、メソセリン、ＥｐＣＡＭ、プロテアーゼセリン２１（ＰＲＳＳ２１）、血管内皮成長因子受容体、ルイス（Ｙ）抗原、ＣＤ２４、血小板由来成長因子受容体β（ＰＤＧＦＲ−β）、発生段階特異的胎児性抗原−４（ＳＳＥＡ−４）、細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）、ＭＵＣ６、上皮成長因子受容体ファミリー及びその突然変異体（ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、炭酸アンヒドラーゼＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＬＭＰ２、エフリンＡ受容体２（ＥｐｈＡ２）、フコシルＧＭ１、シアリルルイス接着分子（ｓＬｅ）、ガングリオシドＧＭ３、ＴＧＳ５、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）、Ｏ−アセチルＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）、葉酸受容体、腫瘍血管内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）、腫瘍血管内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）、Ｃｌａｕｄｉｎ  ６、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２（ＣＬＤ１８Ａ２）、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．１、ＡＳＧＰＲ１、ＣＤＨ１６、５Ｔ４、８Ｈ９、αｖβ６インテグリン、Ｂ細胞成熟化抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＡ９、κ軽鎖（ｋａｐｐａ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）、ＣＳＰＧ４、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＦＡＰ、ＦＡＲ、ＦＢＰ、胚型ＡｃｈＲ、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＭＡＧＥＡ１、ＭＡＧＥ３、ＫＤＲ、ＭＣＳＰ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＰＳＣ１、ＲＯＲ１、Ｓｐ１７、ＳＵＲＶＩＶＩＮ、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ１、ピブロネクチン、テネイシン、腫瘍壊死部位のがん胚変異体、Ｇタンパク質共役受容体のクラスＣのグループ５のメンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）、Ｘ染色体オープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、逆形成リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）、ポリシアル酸、胎盤特異遺伝子１（ＰＬＡＣ１）、ｇｌｏｂｏＨ  ｇｌｙｃｏｃｅｒａｍｉｄｅのヘキソース部分（ＧｌｏｂｏＨ）、乳房分化抗原（ＮＹ−ＢＲ−１）、ｕｒｏｐｌａｋｉｎ  ２（ＵＰＫ２）、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）、アドレナリン受容体β３（ＡＤＲＢ３）、ｐａｎｎｅｘｉｎ  ３（ＰＡＮＸ３）、Ｇタンパク質共役受容体２０（ＧＰＲ２０）、リンパ球抗原６複合遺伝子座Ｋ９（ＬＹ６Ｋ）、嗅覚受容体５１Ｅ２５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）、Ｔ細胞受容体ガンマ代替読み出しフレームタンパク質（ＴＡＲＰ）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）、ＥＴＳ電位変化の遺伝子６（ＥＴＶ６−ＡＭＬ）、精子タン���ク質１７（ＳＰＡ１７）、ＸＸ抗原ファミリーメンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）、アンジオポエチン結合細胞表面受容体２（Ｔｉｅ２）、メラノーマ癌精巣抗原−１（ＭＡＤ−ＣＴ−１）、メラノーマ癌精巣抗原−２（ＭＡＤ−ＣＴ−２）、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３突然変異体、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、育種電位ブレークポイント、細胞死滅の黒色腫阻害剤（ＭＬ−ＩＡＰ）、ＥＲＧ（膜貫通プロテアーゼセリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子）、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）、ペアリングボックスタンパク質Ｐａｘ−３（ＰＡＸ３）、アンドロゲン受容体、テトラサイクリンＢ１、Ｖ−ｍｙｃ鳥骨髄症ウイルスの腫瘍遺伝子神経芽細胞腫由来同族体（ＭＹＣＮ）、Ｒａｓ同族体ファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）、シトクロムＰ４５０  １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）、ＣＣＣＴＣ結合因子（亜鉛フィンガータンパク質）類似（ＢＯＲＩＳ）、Ｔ細胞によって識別される扁平上皮癌抗原３（ＳＡＲＴ３）、ペアリングボックスタンパク質Ｐａｘ−５（ＰＡＸ５）、ｐｒｏａｃｒｏｓｉｎ結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹＴＥＳ１）、リンパ球特異タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）、ＡＡキナーゼ固定タンパク質４（ＡＫＡＰ−４）、滑膜肉腫Ｘブレークポイント２（ＳＳＸ２）、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、白血球関連免疫グロブリン類似受容体１（ＬＡＩＲ１）、ＩｇＡ受容体のＦｃ断片（ＦＣＡＲ）、白血球免疫グロブリン類似の受容体サブファミリーのメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）、ＣＤ３００分子類似ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）、骨髄基質細胞抗原２（ＢＳＴ２）、ＥＧＦ類似モジュール含有ムチン類似ホルモン受容体２（ＥＭＲ２）、リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）、ホスファチジル筋肉グリカン−３（ＧＰＣ３）、Ｆｃ受容体類似５（ＦＣＲＬ５）、免疫グロブリンラムダ類似ペプチド１（ＩＧＬＬ１）から選択される。
【００１６】
好ましい例において、前記腫瘍抗原は、ＧＰＣ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩまたはＣｌａｕｄｉｎ１８．２である。
具体的な実施形態において、前記標的抗原は、病原体抗原である。好ましい実施形態において、前記病原体抗原は、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、または寄生虫の抗原から選択される。具体的な実施例において、前記ウイルス抗原は、サイトメガロウイルス抗原、ＥＢウイルス抗原、ヒト免疫不全ウイルス抗原またはインフルエンザウイルス抗原から選択される。
【００１７】
具体的な実施形態において、前記外因性受容体は、キメラ受容体であり、前記キメラ受容体は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む。
具体的な実施形態において、前記外因性受容体は、キメラ受容体であり、前記キメラ受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、変形されたＴ細胞（抗原）受容体（ＴＣＲ）、Ｔ細胞融合タンパク質（ＴＦＰ）、Ｔ細胞抗原カプラー（ＴＡＣ）またはそれらの組み合わせから選択される。
【００１８】
好ましい実施形態において、前記外因性受容体は、キメラ抗原受容体であり、前記キメラ抗原受容体の抗原結合ドメインは、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ＳＤＡＢ）、ＶＨまたはＶＬドメイン、またはラクダ科ＶＨＨドメイン、または対応する抗原の天然リガンド、またはそれらの組み合わせを含む。
【００１９】
好ましい実施形態において、前記外因性受容体は、キメラ抗原受容体であり、前記キメラ抗原受容体の膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のα鎖、β鎖、またはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、及びＮＫＧ２Ｃからなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む。
【００２０】
好ましい実施形態において、前記外因性受容体は、キメラ抗原受容体であり、前記キメラ抗原受容体の細胞内ドメインは、１級信号伝達ドメインおよび／または共刺激信号伝達ドメインを含み、ここで、（１）前記１級信号伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、よく見られるＦｃＲγ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃＲβ（ＦｃεＲ１ｂ）、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃγＲＩＩａ、ＤＡＰ１０、及びＤＡＰ１２から選択されるタンパク質の機能信号伝達ドメイン、またはそれらの組み合わせを含み、および／または（２）前記共刺激信号伝達ドメインは、：ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３に特異的に結合されるリガンド、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、及びＮＫＧ２Ｄから選択されるタンパク質の機能信号伝達ドメイン、またはそれらの組み合わせを含む。
【００２１】
具体的な実施形態において、前記キメラ抗原受容体は、（ｉ）標的抗原に特異的に結合される抗体またはその断片、ＣＤ２８またはＣＤ８の膜貫通ドメイン、ＣＤ２８の共刺激信号ドメイン及びＣＤ３ζ、または（ｉｉ）標的抗原に特異的に結合される抗体またはその断片、ＣＤ２８またはＣＤ８の膜貫通ドメイン、４−１ＢＢの共刺激信号ドメイン及びＣＤ３ζ、または（ｉｉｉ）標的抗原に特異的に結合される抗体またはその断片、ＣＤ２８またはＣＤ８の膜貫通ドメイン、ＣＤ２８の共刺激信号ドメイン、４−１ＢＢの共刺激信号ドメイン及びＣＤ３ζを含む。
具体的な実施形態において、前記外因性受容体の抗原結合ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示される配列と少なくとも９０％の同一性を有する。
【００２２】
具体的な実施形態において、前記外因性受容体のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２７またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３５に示される配列と少なくとも９０％の同一性を有する。
具体的な実施形態において、前記外因性受容体、および／または外因性ＩＬ−７Ｒ結合タンパク質、および／または外因性ＣＣＬ２１は、ウイルスベクターを利用して発現される。好ましくは、前記ウイルスベクターは、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）ベクター、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）ベクターまたはアデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）ベクターを含む。
【００２３】
本発明の第２の態様において、発現構成物を提供し、前記発現構成物は、連続して接続された標的抗原に特異的に結合される外因性受容体の発現カセット１、外因性ＩＬ−７Ｒ結合タンパク質または外因性ＩＬ−７の発現カセット２、外因性ＣＣＬ２１の発現カセット３を含み、好ましくは、前記発現カセットの間は、Ｆ２Ａ、ＰＡ２、Ｔ２Ａ、および／またはＥ２Ａから選択された直列的な断片によって接続される。ここで、前記Ｆ２ＡとＰ２Ａとの核酸配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６とに示される。
【００２４】
本発明の第３の態様において、本発明の第２の態様による発現構成物を含む発現ベクターを提供する。
本発明の第４の態様において、本発明の第３の態様による発現ベクターを含むウイルスを提供する。
【００２５】
本発明の第５の態様において、免疫エフェクター細胞で、本発明の第１の態様による標的抗原に特異的に結合されるキメラ抗原受容体、外因性ＩＬ−７Ｒ結合タンパク質または外因性ＩＬ−７、外因性ＣＣＬ２１を共発現する段階を含む、免疫エフェクター細胞の活性を向上させる方法を提供する。
【００２６】
本発明の第６の態様において、腫瘍を抑制し、病原体を阻害したり、被験者の免疫寛容（ｉｍｍｕｎｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）能力を強化させたりする薬物の調整で、本発明の第１の態様による細胞、または本発明の第２の態様による発現構成物、または本発明の第３の態様による発現担体、または本発明の第４の態様によるウイルスの用途を提供する。具体的な実施形態において、腫瘍を抑制する薬物の調製での用途を提供する。好ましい実施形態において、前記調製された腫瘍を抑制する薬物と化学療法薬物を併用する。
【００２７】
具体的な実施形態において、前記腫瘍は、血液腫瘍である。
具体的な実施形態において、前記腫瘍は、固形腫瘍である。
【００２８】
具体的な実施形態において、前記腫瘍は、結腸癌、直腸癌、腎臓細胞癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、小腸癌、食道癌、メラノーマ、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎腺癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、児童固形腫瘍、膀胱癌、腎臓または尿管癌、腎骨盤癌、中枢神経系（ＣＮＳ）癌、原発性中枢神経系リンパ腫、腫瘍血管新生、脊椎腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫癌、カポジ肉腫、表皮の形癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫、環境的に誘発された癌、前記癌の組み合わせ、及び前記癌の転移性病巣から選択される。
【００２９】
好ましい例において、前記固形腫瘍は、結腸癌、直腸癌、腎臓細胞癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、小腸癌、食道癌、メラノーマ、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎腺癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、膀胱癌、腎臓または尿管癌、腎骨盤癌、中枢神経系（ＣＮＳ）癌、原発性中枢神経系リンパ腫、腫瘍血管新生、脊椎腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫癌、カポジ肉腫、表皮の形癌、扁平上皮癌から選択される。
【００３０】
より好ましくは、前記固形腫瘍は、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、小腸癌、食道癌、膵臓癌、頭頸部癌、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門癌、胃癌から選択される。より好ましくは、前記固形腫瘍は、胃癌、膵臓癌、または食道癌である。
【００３１】
本発明の第７の態様において、本発明の第１の態様による細胞、及び薬学的に許容可能な担体、または賦形剤を含む、薬物組成物を提供する。
本発明の第８の態様において、キットＡとキットＢとを含むキットを提供し、前記キットＡは、遺伝子操作された細胞を含み、前記細胞は、本発明の第１の態様による標的抗原に特異的に結合される外因性受容体を発現し、前記キットＢは、ＣＣＬ２１、および／または、前記細胞増殖を促進するタンパク質を含む。好ましくは、前記細胞増殖を促進するタンパク質は、本発明の第１の一態様によるＩＬ−７Ｒ結合タンパク質またはＩＬ−７を含む。より好ましくは、前記キットＡとキットＢとは、前後の順序に関係なく使用される。
【００３２】
好ましい例において、前記キットＡは、キメラ受容体によって変形された免疫エフェクター細胞を含む。好ましくは、前記キメラ受容体は、キメラ抗原受容体である。
好ましい例において、前記免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫＴ細胞である。
【００３３】
本発明の第９の態様において、本発明の第１の態様による細胞、または本発明の第７の態様による薬物組成物、または本発明の第８の態様によるキットを使用する段階を含む、腫瘍を抑制したり、病原体を抑制したり、または被験者の免疫寛容能力を強化させる方法を提供する。好ましくは、化学療法薬物を使用する段階をさらに含む。
【発明の効果】
【００３４】
本発明の有利な効果は、次のとおりである。
１、本発明によって提供される細胞は、標的抗原に特異的に結合される外因性受容体、外因性ＩＬ−７Ｒ結合タンパク質または外因性ＩＬ−７、及び外因性ＣＣＬ２１を共発現するため、細胞の生存能力、蓄積能力を向上させることができる。
２、本発明の技術的解決手段で調製された免疫エフェクター細胞は、優れた腫瘍細胞殺害能力を有する。
３、本発明の技術的解決手段で調製された細胞は、癌の治療で、抗癌微細環境での免疫を抑制することができることで、固形腫瘍の作用を著しく増強させる。難治性と進行癌に対しても比較的優れた効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１Ａ】ＭＳＣＶ−ｈｕ８Ｅ５（２Ｉ）−ｍ２８Ｚのプラスミドプロファイルである。
【図１Ｂ】ＭＳＣＶ−ｈｕ８Ｅ５（２Ｉ）−ｍ２８Ｚ−Ｆ２Ａ−ｍＩＬ−７−Ｐ２Ａ−ｍＣＣＬ２１ａのプラスミドプロファイルである。
【図１Ｃ】ＭＳＣＶ−ｈｕ８Ｅ５（２Ｉ）−ｍ２８Ｚ−Ｆ２Ａ−ｍＩＬ７−Ｐ２Ａ−ｍＣＣＬ２１ｂのプラスミドプロファイルである。
【図１Ｄ】ＭＳＣＶ−ｈｕ８Ｅ５（２Ｉ）−ｍＢＢＺのプラスミドプロファイルである。
【図１Ｅ】ＭＳＣＶ−ｈｕ８Ｅ５（２Ｉ）−ｍＢＢＺ−Ｆ２Ａ−ｍＩＬ−７−Ｐ２Ａ−ｍＣＣＬ２１ａのプラスミドプロファイルである。
【図１Ｆ】ＭＳＣＶ−ｈｕ８Ｅ５（２Ｉ）−ｍ２８Ｚ−Ｆ２Ａ−ｍＩＬ７−Ｐ２Ａ−ｍＣＣＬ２１ｂのプラスミドプロファイルである。
【００３６】
【図２】インビトロサイトカインＩＬ７、ＣＣＬ２１の検出結果を示す。
【図３Ａ−３Ｂ】異なるグループの細胞がＰＤ−１を分泌する状況を示す。
【図３Ｃ−３Ｄ】異なるグループの細胞がＬＡＧ−３を分泌する状況を示す。
【図３Ｅ−３Ｆ】異なるグループの細胞がＴＩＭ−３を分泌する状況を示す。
【００３７】
【図４Ａ】２８Ｚのインビトロ殺害結果を示す。
【図４Ｂ】ＢＢＺのインビトロ殺害結果を示す。
【図５】インビトロ増殖検出結果を示す。
【図６】マウスのインビボ腫瘍の治療実験の結果を示す。
【図７】ｍＢＢＺ−７＊１９のプラスミドプロファイルである。
【００３８】
【図８Ａ】ＩＬ７とＣＣＬ２１とを発現するＣＡＲ−Ｔ細胞とＩＬ７とＣＣＬ１９とを発現するＣＡＲ−Ｔ細胞のインビボ殺害比較結果を示す。
【図８Ｂ】マウスの体重の変化を示す。
【図８Ｃ】腫瘍重量の比較結果を示す。
【図８Ｄ】マウスの膵臓癌ＰＡＮＣ０２−Ａ２の治療後のＣＡＲ−Ｔ細胞クローンの数を示す。
【図８Ｅ】マウス膵臓癌ＣＤ８＋細胞の免疫組織の化学検出結果を示す。
【００３９】
【図９Ａ】マウス乳癌Ｅ０７７１−Ａ２定位移植腫瘍がＣＡＲ−Ｔ細胞治療を経た後の腫瘍体積の変化状況を示す。
【図９Ｂ】マウス乳癌Ｅ０７７１−Ａ２定位移植腫瘍の治療後の腫瘍重量を示す。
【図９Ｃ】マウスの乳癌治療後のＣＡＲ−Ｔ細胞クローンの数を示す。
【図９Ｄ】マウス乳癌ＣＤ８＋細胞の免疫組織の化学検出結果を示す。
【００４０】
【図１０Ａ】マウス肝臓癌Ｈｅｐａｌ−６−Ａ２移植腫瘍の治療後の腫瘍体積の変化状況を示す。
【図１０Ｂ】マウス肝臓癌Ｈｅｐａ１−６−Ａ２移植腫瘍の治療後の腫瘍重量を示す。
【図１０Ｃ】マウスの肝臓癌の治療後のＣＡＲ−Ｔ細胞クローンの数を示す。
【図１０Ｄ】マウス肝臓癌ＣＤ８＋細胞の免疫組織の化学検出結果を示す。
【００４１】
【図１１】インビトロでのＩＦＮ−γの検出結果を示す。
【図１２Ａ】マウス膵臓癌皮下腫瘍ＱｉｎｇＬｉｎ（ＱｉｎｇＬｉｎ）モデルがＣＡＲ−Ｔ細胞治療を経た後の腫瘍体積の変化状況を示す。
【図１２Ｂ】マウス膵臓癌皮下腫瘍ＱｉｎｇＬｉｎモデル治療後の腫瘍重量を示す。
【図１２Ｃ】マウス膵臓癌皮下腫瘍ＱｉｎｇＬｉｎモデル治療後のＣＡＲ−Ｔ細胞クローンの数を示す。
【図１２Ｄ】マウス膵臓癌皮下腫瘍ＱｉｎｇＬｉｎモデルＣＤ８＋細胞の免疫組織の化学検出結果を示す。
【００４２】
【図１３Ａ】マウス膵臓癌ＰＡＮＣ０２−Ａ２皮下腫瘍モデルがＣＡＲ−Ｔ治療を経たｄ１０日目に脾臓中Ｔｃｍの検出状況を示す。
【図１３Ｂ】ｄ２０日目に脾臓中Ｔｃｍの検出状況を示す。
【図１４Ａ】マウス膵臓癌ＰＡＮＣ０２−Ａ２皮下腫瘍モデルがＣＡＲ−Ｔ治療を経たｄ１０日目に骨髓中Ｔｃｍの含有量の状況を示す。
【図１４Ｂ】ｄ２０日目に脾臓中Ｔｃｍの検出状況を示す。
【図１５】マウス膵臓癌ＰＡＮＣ０２−Ａ２皮下腫瘍モデルがＣＡＲ−Ｔ治療を経たｄ１０日目にマウス腫瘍組織でのより多くのＤＣ細胞浸潤状況を示す。
【図１６】マウス膵臓癌ＰＡＮＣ０２−Ａ２皮下腫瘍モデルがＣＡＲ−Ｔ治療を経たｄ１０日目にマウスの腫瘍組織中ＭＤＳＣの含有量の状況を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本発明では、腫瘍抗原を標的化する外因性受容体とＣＣＬ２１の免疫エフェクター細胞とが、腫瘍に対してより優れた殺害効果を有するだけでなく、腫瘍組織での免疫エフェクター細胞の生存を向上させることができ、即ち、難治性固形腫瘍であっても、より優れた抗腫瘍能力を示すことができることが見出された。
【００４４】
本開示の内容に基づいて、当業者は、開示された具体的な実施形態において様々な変更または変形を行うことができ、それでも本明細書に記載の精神及び範囲から逸脱することなく、同じまたは類似な結果を得ることができることを理解すべきである。本発明の範囲は、本明細書に記載の具体的な実施形態（本明細書に記載の様々な態様を例示することのみを意図する）に限定されず、機能的に同等の方法及び構成要素が依然として本明細書に記載された範囲内に含まれることを考慮すべきである。
【００４５】
特に明確に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、遺伝子治療、生物化学、遺伝学及び分子生物学の分野内の技術者が一般に理解する意味を有する。本明細書で説明されたすべての方法及び材料と類似または同等なものは、本明細書に記載される実践または試験に使用することができる。方法及び材料等のこれらの技術は、文献に十分に記載されたように、参照することができ、例えば、特に明記しない限り、本発明の実践は、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ及び免疫学の従来の技術を適用するが、これらはすべて本技術分野の範囲Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＦｒｅｄｅｒｉｃｋＭ．ＡＵＳＵＢＥＬ、２０００、Ｗｉｌｅｙａｎｄ  ｓｏｎＩｎｃ、Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ、ＵＳＡ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ、２００１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮｅｗＹｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔｅｄ．，１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４、６８３、１９５；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｒｒｉｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓｅｄｓ．１９８４）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓｅｄｓ．１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ｊ．ＡｂｅｌｓｏｎとＭ．Ｓｉｍｏｎ、ｅｄｓ．−ｉｎ−ｃｈｉｅｆ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、特にＶｏｌｓ．１５４と１５５（Ｗｕｅｔａｌ．ｅｄｓ．）及びＶｏｌ．１８５、“Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”（Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ、ｅｄ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒとＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓｅｄｓ．、１９８７、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒとＷａｌｋｅｒ、ｅｄｓ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８７）、Ｈａｎｄ  ｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、巻Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ及びＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、ｅｄｓ．，１９８６）、及びＭａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．，１９８６）に属する。
【００４６】
本明細書で言及されたすべての出版物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、すべて本明細書に参考として結合される。矛盾する場合、本明細書を基準とする。さらに、特に明記しない限り、本明細書に記載される材料、方法及び実施例は、例示にすぎず、限定することを意図するものではない。
【００４７】
本明細書で使用される「操作された」及び他の文法的形態という用語は、例えば、例えば、生物のゲノム内の核酸のような核酸における一つまたは複数の変形を指すことができる。「操作された」という用語は、遺伝子の改変、追加、および／または欠失を指すことができる。操作された細胞は、遺伝子が追加、欠失および／または改変された細胞をさらに指すことができる。
【００４８】
本明細書で使用される「遺伝子操作された細胞」という用語は、遺伝子操作の手段を介して改変された細胞を指す。一部の実施形態において、前記細胞は、免疫エフェクター細胞である。一部の実施形態において、前記細胞は、Ｔ細胞である。一部の実施形態において、本明細書に記載の遺伝子操作された細胞は、標的抗原に特異的に結合される外因性受容体を発現する細胞を指す。一部の実施形態において、本明細書に記載の遺伝子操作された細胞は、標的抗原に特異的に結合される外因性受容体を発現して、外因性ＣＬＬ２１を発現する細胞を指す。一部の実施形態において、本明細書に記載の遺伝子操作された細胞は、腫瘍抗原に特異的に結合されるキメラ抗原受容体、ＣＬＬ２１、及びＴ細胞増殖を促進するタンパク質を共発現する的Ｔ細胞であることもできる。一部の実施形態において、本明細書に記載の遺伝子操作された細胞は、腫瘍抗原に特異的に結合されるキメラ抗原受容体、ＣＬＬ２１、及びＩＬ−７Ｒ結合タンパク質または外因性ＩＬ−７を共発現するＴ細胞であることできる。
【００４９】
「免疫エフェクター細胞」という用語は、免疫反応に関与して、免疫エフェクターを引き起こす細胞を指し、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラル殺害（ＮＫ）細胞、ナチュラル天然殺害Ｔ（ＮＫＴ）細胞、肥満細胞、及び骨髄由来マクロファージを指す。一部の実施形態において、前記免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞である。一部の実施形態において、前記Ｔ細胞は、自己Ｔ細胞、異種Ｔ細胞、同種異系Ｔ細胞であることができる。一部の実施形態において、前記ＮＫ細胞は、同種異系ＮＫ細胞であることができる。
【００５０】
「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、交換して使用することができ、ペプチド結合によって共有結合されるアミノ酸残基からなる化合物を指す。タンパク質またはペプチドには、少なくとも二つのアミノ酸が含まれる必要があり、タンパク質またはペプチドの配列を含むことができるアミノ酸の最大の数に制限はない。ポリペプチドは、ペプチド結合を介して互いに結合される二つまたは複数のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を含む。本明細書に使用されたように、前記用語は、短鎖（例えば、当技術分野では一般にペプチド、オリゴペプチド、及びオリゴマーとも呼ばれる）及び長鎖（当技術分野では一般にタンパク質とも呼ばれ、様々なタイプが存在する）を指す。「ポリペプチド」は、例えば、生物学活性断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ポリペプチドの変異体、変形されたポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質等を含む。ポリペプチドは、天然ペプチド、組換えペプチド、またはそれらの組み合わせを含む。
【００５１】
「ＩＬ−７（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ７、インターロイキン７またはＩＬ７）」という用語は、ＩＬ−７Ｒ（好ましくは、例えば、マウスまたはヒトのような哺乳動物由来のＩＬ−７Ｒ）と相互に作用（例えば、結合）することができ、また、（ｉ）天然に存在する哺乳動物ＩＬ−７のアミノ酸配列またはその断片、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８（ヒト）に示されるアミノ酸配列またはその断片、（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８（ヒト）に示されるアミノ酸配列またはその断片と、ほぼ例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有するアミノ酸配列、（ｉｉｉ）天然に存在する哺乳動物ＩＬ−７ヌクレオチド配列またはその断片（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７（ヒト）またはその断片によってコードされるアミノ酸配列、（ｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７（ヒト）に示されるヌクレオチド配列またはその断片と、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有するヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列、（ｖ）天然に存在するＩＬ−７ヌクレオチド配列またはその断片と縮重されるヌクレオチド配列（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７（ヒト）またはその断片）によってコードされるアミノ酸配列、または（ｖｉ）厳しい条件で、前記ヌクレオチド配列のいずれか一つと交雑するヌクレオチド配列のいずれか一つを有するタンパク質（好ましくは、例えば、マウスまたはヒトのような哺乳動物由来）を指す。
【００５２】
「外因性ＩＬ−７Ｒ結合タンパク質」は、ＩＬ−７Ｒに特異的に結合することができ、ＩＬ−７Ｒ活性を増強させるすべてのタンパク質を指す。「ＩＬ−７Ｒ活性の増強」は、ＮＫ細胞の増殖、細胞毒性または成熟の抑制、Ｂ細胞とＴ細胞との増殖または分化の刺激、Ｂ細胞中の抗体の生成と親和性成熟との刺激、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞毒性の刺激、Ｔ細胞とＮＫ細胞のインターフェロンγの生成の刺激、樹状細胞（ＤＣ）活性化と成熟との抑制、肥満細胞からの炎症媒体の排出の抑制、マクロファージの貪食作用の増強、ＴＲｅｇ細胞の生成または生存の抑制、及び骨髄前駆細胞の増殖の刺激を含むがこれらに限定されない、ＩＬ−７Ｒ結合タンパク質が天然に存在するＩＬ−７Ｒの任意の一つまたは様々な活性を増強させることができることを指すものと理解すべきである。
【００５３】
「ＣＣＬ２１（Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ−Ｃ  ｍｏｔｉｆ）  ｌｉｇａｎｄ  ２１）」は、主な免疫ケモカインの一つとして、脾臓及びリンパ節の２級リンパ組織のＴ細胞領域で発現され、抗原の活性か（成熟）を担当する樹状細胞（ＤＣ）、非成熟したＤＣ及び未熟Ｔ細胞の収集である。本発明におけるＣＣＬ２１は、（ｉ）天然に存在する哺乳動物ＣＣＬ２１のアミノ酸配列またはその断片、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１（ヒト）に示されるアミノ酸配列またはその断片、（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１（ヒト）に示されるアミノ酸配列またはその断片と、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有するアミノ酸配列、（ｉｉｉ）天然に存在する哺乳動物ＣＣＬ２１ヌクレオチド配列またはその断片（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０（ヒト）またはその断片によってコードされるアミノ酸配列、（ｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０（ヒト）に示されるヌクレオチド配列またはその断片と、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有するヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列、（ｖ）天然に存在するＣＣＬ２１ヌクレオチド配列またはその断片と縮重されるヌクレオチド配列（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０（ヒト）またはその断片）によってコードされるアミノ酸配列、または（ｖｉ）厳しい条件で、前記ヌクレオチド配列のいずれか一つと交雑するヌクレオチド配列のいずれか一つを有する。
【００５４】
「アミノ酸変形」という用語は、アミノ酸の置換、追加、および／または欠失を含み、「アミノ酸置換」は、他のいずれか一つのアミノ酸で母体ポリペプチド配列のうち、特定の位置でアミノ酸を置換することを意味する。本明細書で使用される「アミノ酸挿入」は、母体ポリペプチド配列の特定の位置でアミノ酸を追加することを意味する。本明細書で使用される「アミノ酸欠失」または「欠失」は、母体ポリペプチド配列のうち、特定の位置でのアミノ酸を除去することを意味する。本明細書で使用される「保存的変形」という用語は、前記アミノ酸配列を含有する抗体の結合特徴に著しく影響したり改変させたりしないアミノ酸変形を意味する。これらの保存的変形は、アミノ酸置換、挿入、及び欠失を含む。
【００５５】
本技術分野で公知の標準的な技術を使用して変形を本発明の抗体に導入することができ、例えば、部位特異的変異誘発及びＰＣＲ媒介変異誘発を行うことができる。保存的アミノ酸置換は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基にアミノ酸残基を置換する置換である。本技術分野で類似な側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは、既に定義された。これらのファミリーは、塩基性側鎖を含有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、帯電されない極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。
【００５６】
本明細書で使用される「野生型」、「母体」、「天然」は、タンパク質とＤＮＡとに関連する場合、同じ意味を指す。「突然変異」、「変異体」または「突然変異体」は、天然タンパク質または天然ＤＮＡと同じか、より優れた生物活性を有し、それは、天然タンパク質のアミノ酸配列で一つまたは複数のアミノ酸の置換、追加、または欠失が発生したり、または天然ＤＮＡの核酸配列で一つまたは複数のヌクレオチドの置換、追加または欠失が発生したりする。
【００５７】
具体的な実施形態において、本明細書の突然変異体の配列は、天然タンパク質のアミノ酸配列または天然ＤＮＡの核酸配列と少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９７％、より好ましくは少なくとも約９８％、最も好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有する。例えば、「ＩＬ−７の変異体」は、一般に、野生型のＩＬ−７に対してアミノ酸変形を行った後に得られた、ＩＬ−７と類似な生物活性またはより優れた生物活性を有するポリペプチドを指す。「切断断片」という用語は、天然タンパク質または天然ＤＮＡの非全長形態を指し、それは天然アミノ酸配列または核酸配列で連続または非連続的複数のアミノ酸残基またはヌクレオチドの欠失が発生され、前記欠失は、配列の任意の位置、例えば、ヘッド部、中部、テール部またはそれらの組み合わせで発生する。本発明において、タンパク質の切断断片は、由来する天然タンパク質と同じ機能を依然として維持する。
【００５８】
「構成的発現（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」は、持続的発現とも呼ばれ、ほとんどすべての生理的条件で、遺伝子がすべての細胞で持続的に発現することができることを指す。「誘導性発現（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」は、一定の条件での発現を指し、前記条件は、例えば、Ｔ細胞と抗原が結合される場合である。
【００５９】
「有効量」という用語は、特定の生物学の結果を効果的に実現する化合物、製剤、物質または組成物の量を指し、例えば、Ｔ細胞反応を十分に促進する量または使用量を指すが、これに限定されない。「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍抑制有効量」または「治療有効量」を指す場合、本発明の免疫エフェクター細胞、または治療剤の正確な投与量は、医師が、個体の年齢、体重、腫瘍サイズ、または転移の程度、及び患者（被験者）の状况を考量して決定することができる。免疫エフェクター細胞の有効量は、免疫エフェクター細胞が抗腫瘍活性増加、増強または延長させるようにすること、抗腫瘍免疫エフェクター細胞または活性化免疫エフェクター細胞の数を増加させること、ＩＦＮ−γの分泌を促進すること、腫瘍退化、腫瘍縮小、腫瘍壊死の免疫エフェクター細胞の数を指すが、これに限定されない。
【００６０】
本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始するのに必要な細胞の合成メカニズムまたは導入された合成メカニズムによって識別されるＤＮＡ配列である。
典型的な真核生物プロモーターは、最小プロモーター及び他のシス要素で構成される。最小プロモーターは、実質的に、一つのＴＡＴＡ骨格領域、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌＩＩ）、ＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）、及びＴＢＰ関連因子（ＴＡＦ）がこれと結合されて転写を開始することができる。これらの配列要素（例えば、エンハンサ―）は、近接する遺伝子の全体の発現レベルを向上し、一般に位置および／または方向に非依存的な方法で向上させることが見出されている。
【００６１】
「ＮＦＡＴ（Ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）」は、活性化Ｔ細胞核因子である。一部の具体的実施形態において、ＮＦＡＴは、Ｔ細胞活性化の過程でサイトカインの転写発現に対して重要な作用を起こす、一部の実施形態において、ＲＵＮＸ３は、誘導性プロモーターを使用して誘導的発現される。一部の実施形態において、前記誘導性プロモーターは、ＮＦＡＴプロモーターである。一部の実施形態において、ＲＵＮＸ３のコード配列は、ＮＦＡＴ結合モチーフを含む最小プロモーターの調節下にある。一部の具体的実施形態において、六つのＮＦＡＴ結合モチーフを含むＩＬ２最小プロモーターは、六つのＮＦＡＴの結合位置を利用して、ＩＬ２の最小プロモーター（ｍｉｎｉｍａｌ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）と直列されて構成されたプロモーターである。
【００６２】
一部の実施形態において、本明細書に記載の抗原に結合される受容体は、キメラ受容体を指す。本明細書で使用される「キメラ受容体」は、遺伝子組換え技術を使用して、異なる由来のＤＮＡ断片またはタンパク質に対応するｃＤＮＡを連結して形成される融合分子を指す。キメラ受容体は、一般に、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む。本発明で使用することができるキメラ受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、変形されたＴ細胞（抗原）受容体（ＴＣＲ）、Ｔ細胞融合タンパク質（ＴＦＰ）、Ｔ細胞抗原カプラー（ＴＡＣ）を含むが、これに限定されない。
「オープンリーディングフレーム（Ｏｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ、ＯＲＦ）」という用語は、構造遺伝子の正常なヌクレオチド配列であって、開始コドンから終了コドンまでの解読枠は、完全なポリペプチド鎖をコードすることができ、その間に翻訳を中段させる終了コドンが存在しない。
【００６３】
本明細書で使用される「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」は、一つのグループのポリペプチドであり、これが免疫エフェクター細胞に存在する場合、前記細胞に標的細胞（一般に、癌細胞である）に対する特異性を提供し、細胞内信号生成機能を有する。ＣＡＲは、一般に、少なくとも一つの細胞外抗原結合ドメイン（細胞外領域とも呼ばれる）、膜貫通ドメイン（膜貫通領域とも呼ばれる）、及び細胞質信号伝達ドメイン（本明細書で、「細胞内信号伝達ドメイン」または「細胞内領域」とも呼ばれる）を含み、これは以下のように定義された刺激性分子および／または共刺激性分子から由来する機能性信号伝達ドメインを含む。
【００６４】
一部の態様において、ポリペプチドのグループは、互いに隣接する。ポリペプチドのグループは、二量体化分子が存在する場合のポリペプチドを互いにカップリングさせることができる二量体化スイッチを含み、例えば、抗原結合ドメインを細胞内信号伝達ドメインにカップリングさせることができる二量体化スイッチを含む。一つの態様において、刺激性分子は、Ｔ細胞受容体複合体に結合されるζ鎖である。一つの態様において、細胞質信号伝達ドメインは、少なくとも一つの下記のように定義される共刺激分子から由来する一つまたは複数の機能性信号伝達ドメインをさらに含む。一つの態様において、共刺激性分子は、例えば４−１ＢＢ（即ち、ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、および／またはＣＤ２８等の本明細書に記載の共刺激性分子に由来する。
【００６５】
一つの態様において、ＣＡＲは、キメラ融合タンパク質を含み、前記融合タンパク質は、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び刺激性分子から由来する機能性信号伝達ドメインを含む細胞内信号伝達ドメインを含む。一つの態様において、ＣＡＲは、キメラ融合タンパク質を含み、前記融合タンパク質は、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び共刺激性分子から由来する機能性信号伝達ドメインと刺激性分子から由来する機能性信号伝達ドメインを含む細胞内信号伝達ドメインを含む。一つの態様において、ＣＡＲは、キメラ融合タンパク質を含み、前記融合タンパク質は、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び一つまたは複数の共刺激性分子から由来する二つの機能性信号伝達ドメインを含む。
【００６６】
一つの態様において、本発明は、当初の抗体または断片（例えば、ｓｃＦｖ）と機能が同等である分子を生じるアミノ酸配列の変形が発生することを企図する。例えば、本明細書に記載の前記癌関連抗原の抗原結合ドメインのＶＨまたはＶＬは、例えば、ＣＡＲに含まれるｓｃＦｖは変形され、本明細書に記載の前記癌関連抗原の抗原結合ドメインの当初のＶＨまたはＶＬ骨格領域（例えば、ｓｃＦｖ）との少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を保存することができる。本発明では、機能が同等である分子を生成する、すべてのＣＡＲ構成物の変形、例えば、ＣＡＲ構成物の複数ドメインの一つまたは複数のアミノ酸配列の変形が、想定される。ＣＡＲ構成物は変形して、当初のＣＡＲ構成物との少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を保存することができる。
【００６７】
本明細書で使用される「膜貫通ドメイン（膜貫通領域とも呼ばれる）」は、膜貫通領域と隣接する一つまたは複数の他のアミノ酸を含むことができ、例えば、前記膜貫通タンパク質が由来するタンパク質の細胞外領域と関連する一つまたは複数のアミノ酸（例えば、細胞外領域の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個〜１５個のアミノ酸）および／または前記膜貫通タンパク質が由来するタンパク質の細胞外領域と関連する一つまたは複数の他のアミノ酸（例えば、細胞内領域の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個〜１５個のアミノ酸）を含むことができる。一つの態様において、膜貫通ドメインは、他のドメインのいずれか一つに関連するドメインであり、例えば、一実施形態において、前記膜貫通ドメインは、信号伝達ドメイン、共刺激ドメイン、またはヒンジドメインが由来する同じタンパク質から由来することができる。
【００６８】
一部の状況において、膜貫通ドメインは、選択されるか、またはアミノ酸を介して置換されて、このようなドメインと、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインの結合を防止することができ、例えば、受容体複合体の他のメンバーと相互作用を最小限に抑えることができる。一つの態様において、膜貫通ドメインは、キメラ受容体を発現する細胞の細胞表面での別のキメラ受容体と同型二量体化することができる。一つの異なる態様において、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、同じキメラ受容体を発現する細胞に存在する天然の結合パートナーの結合ドメインとの相互作用を最小限にするために、変形または置換されていてもよい。
【００６９】
膜貫通ドメインは、天然的または組換えから由来することができる。天然的である場合、前記ドメインは、任意の膜結合されたタンパク質または膜貫通タンパク質から由来することができる。一つの態様において、前記キメラ受容体と、前記標的抗原が結合されると、膜貫通ドメインは、細胞内ドメインに信号を転送することができる。本発明で特別に使用される膜貫通ドメインは、少なくとも、例えば、Ｔ−細胞受容体のα鎖、β鎖、またはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４等の膜貫通ドメインを含むことができる。
【００７０】
一部の実施形態において、膜貫通ドメインは、少なくとも、例えば、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ等の膜貫通領域を含むことができる。
【００７１】
一部の状況において、膜貫通ドメインは、ヒンジ（例えば、ヒトタンパク質から由来するヒンジ）を介して、例えば、ＣＡＲの抗原結合ドメインのようなＣＡＲの細胞外領域に接続することができる。例えば、一実施形態において、ヒンジは、ヒトＩｇ（免疫グロブリン）のヒンジ（例えば、ＩｇＧ４ヒンジ、ＩｇＤヒンジ）、ＧＳリンカー（例えば、本明細書に記載のＧＳリンカー）、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジまたはＣＤ８ａヒンジであることができる。一つの態様において、膜貫通ドメインは、組換えすることができ、このような場合、これは主に、例えば、ロイシンとバリンとのような疎水性残基を含む。一つの態様において、組換え膜貫通ドメインのそれぞれの末端でフェニルアラニン、トリプトファン、及びバリンのトリプレット（ｔｒｉｐｌｅｔ）を見出すことができる。任意に、長さが２〜１０個のアミノ酸の間の短いオリゴペプチドまたはポリペプチドリンカーは、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質領域との間で結合を形成することができる。グリシン−セリンダブレット（ｄｏｕｂｌｅｔ）は、特に適切なリンカーを提供する。
【００７２】
本明細書で使用される「細胞内ドメイン（細胞内領域とも呼ばれる）」は、細胞内信号伝達ドメインを含む。細胞内信号伝達ドメインは、一般に、その中で既にキメラ受容体を導入した免疫細胞の正常なエフェクター機能のうち少なくとも一つの活性化を担当する。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特化機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性または補助活性であることができ、サイトカインの分泌を含む。従って、「細胞内信号伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能の信号を伝達し、細胞が特定の機能を実行するタンパク質の部分を指す。一般的にすべての細胞内信号伝達ドメインを応用することができるが、ほとんどの場合、全体の鎖を使用する必要がない。細胞内信号伝達ドメインの切断部分を使用する場合、これらの切断部分で完全な鎖を交替することができ、これがエフェクター機能の信号を伝達するだけでよい。従って、「細胞内信号伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能の信号を十分に伝達する細胞内信号伝達ドメインを含む切断部分を指す。
【００７３】
単独のＴＣＲを介して生成された信号は、Ｔ細胞を完全に活性化させることができず、２級および／または共刺激信号も必要であることがよく知られている。従って、Ｔ細胞活性化は、二つの異なる種類の細胞質信号伝達配列によって媒介され、ＴＣＲ開始抗原依存的１級活性化を介したもの（１級細胞内信号伝達ドメイン）、及び抗原独立方式で作用を起こし、２級または共刺激信号を提供するもの（２級細胞質ドメイン、例えば、共刺激ドメイン）と呼ばれることができる。
【００７４】
「刺激」という用語は、刺激性分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体またはＣＡＲ）とその同種リガンド（またはＣＡＲの場合、腫瘍抗原である）の結合によって、信号伝達事件（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介した信号伝達または適切なＮＫ受容体またはＣＡＲの信号伝達ドメインを介した信号伝達であるが、これに限定されない）を媒介して誘導された最初の反応を指す。刺激は、いくつかの分子の改変を媒介することができる発現を刺激する。
【００７５】
「刺激性分子」という用語は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞）によって発現された、細胞質信号伝達配列を提供する分子を指し、前記信号伝達配列は、刺激的方法で免疫細胞の信号伝達経路に使用される少なくともいくつかの態様の免疫細胞の活性化を調節する。一つの態様において、信号は、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介してペプチドがロードされたＭＨＣ分子と結合されて開始される初級信号であり、これは、増殖、活性化、分化等を含むが、これに限定されないＴ細胞の反応を媒介する。刺激方法で作用を起こす１級細胞質信号伝達配列（「１級信号伝達ドメイン」と呼ばれる）は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ、ＩＴＡＭ）と呼ばれる信号伝達モチーフを含有することができる。特に、本発明のＩＴＡＭを含有した細胞質信号伝達配列に使用される実装例では、ＣＤ３ζ、よく見られるＦｃＲγ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃＲβ（ＦｃＥｐｓｉｌｏｎ  Ｒ１ｂ）、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０、及びＤＡＰ１２から由来されるものを含むが、これに限定されない。本発明の特異的ＣＡＲにおいて、本発明のいずれか一つまたは複数のＣＡＲの細胞内信号伝達ドメインは、例えば、ＣＤ３−ζの初級信号伝達配列のような細胞内信号伝達配列を含む。本発明の特異的ＣＡＲにおいて、ＣＤ３−ζの初級信号伝達配列は、ヒトまたは例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿等から由来された非ヒトの同等の残基である。
【００７６】
「共刺激性分子」という用語は、Ｔ細胞での同種結合パートナーを指すが、これは、共刺激リガンドに特異的に結合されることにより、例えば、増殖であるが、これに含まれないＴ細胞の共刺激反応を媒介する。共刺激性分子は、抗原受容体またはそのリガンドを除く細胞表面分子であり、これは、効果的な免疫反応を促進する。共刺激性分子は、ＭＨＣＩ類分子、ＢＴＬＡ及びＴｏｌｌリガンド受容体、ならびにＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）を含むが、これに限定されない。
【００７７】
このような共刺激性分子の付加的な実装例は、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ及びＣＤ８３に特異的に結合されるリガンドを含む。
【００７８】
共刺激性細胞内信号伝達ドメインは、共刺激性分子の細胞内部分であることができる。共刺激性分子は、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン類似タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、信号伝達リンパ球性活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、及びＮＫ細胞受容体等のタンパク質ファミリーが代表的であることができる。このような分子の実装例は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＡＭ−１、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤＳ、ＣＤ７、ＣＤ２８７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、Ｂ７−Ｈ３、及びＣＤ８３に特異的に結合されるリガンド等を含む。
【００７９】
細胞内信号伝達ドメインは、分子のすべての細胞内部分またはすべての天然細胞内信号伝達ドメイン、またはその機能断片または誘導体を含むことができる。
「４−１ＢＢ」という用語は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＡ６２４７８．２で提供されたアミノ酸配列を有するＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバー、または例えば、マウス、齧歯類動物、サル、類人猿等から由来された非ヒトの同等の残基を指し、「４−１ＢＢ共刺激ドメイン」は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＡ６２４７８．２のアミノ酸残基２１４〜２５５、または例えば、マウス、齧歯類動物、サル、類人猿等から由来された非ヒトの同等の残基として定義される。一つの態様において、「４−１ＢＢ共刺激ドメイン」は、ヒトまたは例えば、マウス、齧歯類動物、サル、類人猿等から由来された非ヒトの同等の残基である。
【００８０】
「Ｔ細胞（抗原）受容体（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＣＲ）」という用語は、すべてのＴ細胞の表面の特徴的標識として、非共有結合的にＣＤ３と結合して、ＴＣＲ−ＣＤ３複合体を形成する。ＴＣＲは、主要組織適合複合体分子と結合される抗原を識別する。ＴＣＲは、２本の異なるペプチド鎖で構成されたヘテロダイマーであり、α、βの２本のペプチド鎖で構成され、それぞれのペプチド鎖は、可変領域（Ｖ領域）、不変領域（Ｃ領域）、膜貫通領域、及び細胞質領域等のいくつかの部分に分割することができ、その特徴は、細胞質領域が非常に短いものである。ＴＣＲ分子は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、その抗原は、Ｖ区領域に特異的に存在し、各Ｖ領域（Ｖα、Ｖβ）は、それぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の三つの超可変領域を含み、ここで、ＣＤＲ３による変化が最も大きいため、ＴＣＲの抗原結合特異性を直接決定する。ＴＣＲがＭＨＣ−抗原ペプチド複合体を識別する場合、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２は、ＭＨＣ分子の抗原結合溝の側壁を識別し、これに結合され、ＣＤＲ３は、抗原ペプチドと直接結合する。ＴＣＲは、ＴＣＲ１とＴＣＲ２との二つに分けられ、ＴＣＲ１は、γとδとの２本の鎖で構成され、ＴＣＲ２は、αとβとの２本の鎖で構成される。
【００８１】
「Ｔ細胞融合タンパク質（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＴＦＰ）」という用語は、ＴＣＲを構成する様々なポリペプチドから由来された組換えポリペプチドを含み、これは、標的細胞の表面抗原に結合することができ、完整なＴＣＲ複合体の他のポリペプチドとの相互作用することができ、一般にＴ細胞の表面に位置する。ＴＦＰは、一つのＴＣＲサブグループとヒトまたはヒト化抗体で構成された一つの抗原結合ドメインによって構成され、ここで、ＴＣＲサブグループは、少なくとも一部のＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、ＴＣＲ細胞内ドメインの細胞内信号ドメインの刺激ドメインを含み、前記ＴＣＲサブグループ及び前記抗体ドメインは、効果的に接続され、ここで、ＴＣＲサブグループの細胞外、膜貫通、細胞内信号ドメインは、ＣＤ３εまたはＣＤ３γから由来され、また、前記ＴＦＰは、Ｔ細胞で発現されるＴＣＲに統合される。
【００８２】
「Ｔ細胞抗原カプラー（Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｃｏｕｐｌｅｒ、ＴＡＣ）」という用語は、三つの機能ドメインを含み、即ち、１、単鎖抗体、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ａｎｋｙｒｉｎ  ｒｅｐｅａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＤＡＲＰｉｎ）または他の標的化グループを含む腫瘍標的化ドメイン、２、ＣＤ３と結合する単鎖抗体を介して、ＴＡＣ受容体とＴＣＲ受容体とを接近させる細胞外領域ドメイン、３、膜貫通領域、及びＣＤ４共受容体の細胞内領域を含み、ここで、細胞内領域は、タンパク質キナーゼＬＣＫに接続され、ＴＣＲ複合体の免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭｓ）リン酸化について触媒作用する段階をＴ細胞活性化の初期段階にする。
【００８３】
「抗体」という用語は、抗原に特異的に結合される免疫グロブリン分子から由来するタンパク質またはポリペプチド配列を指す。抗体は、多クローンまたは単クローン、多鎖または単鎖、または完全な免疫グロブリンであることができ、天然由来または組換え由来であることができる。抗体は、免疫グロブリン分子の四量体であることができる。
【００８４】
「抗体断片」という用語は、抗原のエピトープとの特異的相互作用（例えば、結合、空間立体障害、安定化／脱安定化、空間分布）の能力を維持する抗体の少なくとも一部を指す。抗体断片の実装例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、ジスルフィド結合−接続されたＦｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＨとＣＨ１ドメインで構成されたＦｄ断片、線形抗体、単一ドメイン抗体（例えば、ｓｄＡｂ）、抗体断片（例えば、ヒンジ領域でジスルフィド結合を介して接続された二つのＦａｂ断片を含む２価断片）で形成された多特異的抗体と抗体との分離されたＣＤＲまたは他のエピトープ結合断片を含むが、これに限定されない。
【００８５】
「ｓｃＦｖ」は、軽鎖を含む少なくとも一つの可変領域の抗体断片と重鎖を含む少なくとも一つの可変領域の抗体断片とを含む融合タンパク質を指し、ここで、前記軽鎖及び重鎖可変領域は、隣接して（例えば、短い柔軟ポリペプチドリンカーのような合成リンカーを介して隣接する）、単鎖ポリペプチド形態で発現されることができ、ここで、前記ｓｃＦｖは、これが由来する完全な抗体の特異性を維持する。特に指定されない限り、本明細書で使用されるように、ｓｃＦｖは、任意の順序で（例えば、ポリペプチドのＮ−末端及びＣ末端に対して）前記ＶＬとＶＨ可変領域を有することができ、ｓｃＦｖは、ＶＬ−リンカー−ＶＨまたはＶＨ−リンカー−ＶＬを含むことができる。
【００８６】
「抗体重鎖」という用語は、天然的に存在する配列で抗体分子に存在して、一般に抗体が属する種類を決定する二つのポリペプチド鎖のうち、比較的大きな鎖を指す。
「抗体軽鎖」という用語は、天然的に存在する配列で抗体分子に存在する二つのポリペプチド鎖のうち、比較的小さな鎖を指す。κ（ｋ）とλ（ｌ）との軽鎖は、二つの主な抗体軽鎖のアイソタイプを指す。
【００８７】
「組換え抗体」という用語は、組換えＤＮＡ技術で生成された抗体を指し、例えば、バクテリオファージまたは酵母菌発現システムによって発現される抗体を指す。前記用語は、既に合成コード抗体のＤＮＡ分子（また、ここで、ＤＮＡ分子発現抗体タンパク質）または指定された抗体のアミノ酸配列を使用して生成される抗体も指すものと解釈されるべきで、ここで、前記ＤＮＡまたはアミノ酸配列は、既に組換えＤＮＡまたは本技術分野で獲得可能で熟知されたアミノ酸配列技術を介して取得されたものである。
【００８８】
「抗原」という用語は、免疫反応を引き起こす分子を指す。前記免疫反応は、抗体生成または特異的免疫能力を有する細胞の活性化または両方に関連することができる。当業者は、実際的にすべてのタンパク質またはペプチドを含む任意の大分子がすべての抗原として使用されることができることを理解されたい。さらに、抗原は、組換えまたはゲノムＤＮＡから由来することができる。本明細書で前記用語を使用する場合、当業者は、免疫反応を引き起こしたタンパク質をコードするヌクレオチド配列または一部のヌクレオチド配列の任意のＤＮＡ、コードされたタンパク質またはペプチドを含むことを理解されたい。さらに、当業者は、抗原は、遺伝子の全長ヌクレオチド配列にのみコードされる必要がないことを理解されたい。本発明は、一つの遺伝子を超えるいくつかのヌクレオチド配列を含むが、これに限定されず、このようなヌクレオチド配列は、異なる組み合わせで配列されて希望する免疫反応を引き起こすポリペプチドをコードすることは明らかである。また、当業者は、抗原は、全く「遺伝子」によってコードされる必要がないことを理解されたい。抗原は、合成されて生成されることができるか、または生物サンプルから由来することができるか、またはポリペプチドを除く大分子であることができることは明らかである。このような生物サンプルは、組織サンプル、腫瘍サンプル、他の生物成分を有する細胞または液体を含むが、これに限定されない。
【００８９】
「腫瘍抗原」は、過剰増殖性疾患の発生、進行過程で新たに現れるか、または過剰発現された抗原を指す。一部の態様において、本発明の過剰増殖性病状は、癌を指す。
本発明による腫瘍抗原は、固形腫瘍抗原であることができ、血液腫瘍抗原であることもできる。
【００９０】
本発明の腫瘍抗原は、甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、Ｃ型レクチン類似分子−１、ガングリオシドＧＤ３、Ｔｎ抗原、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ  ２２、ＣＤ  ３０、ＣＤ  ７０、ＣＤ  １２３、ＣＤ  １３８、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７Ｈ６、ＫＩＴ（ＣＤ１１７）、インターロイキン１３受容体サブユニットα（ＩＬ−１３Ｒα）、インターロイキン１１受容体α（ＩＬ−１１Ｒα）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、癌胚抗原（ＣＥＡ）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、チロシン酵素、メソセリン、ＥｐＣＡＭ、プロテアーゼセリン２１（ＰＲＳＳ２１）、血管内皮成長因子受容体、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、ルイス（Ｙ）抗原、ＣＤ２４、血小板由来成長因子受容体β（ＰＤＧＦＲ−β）、発生段階特異的胎児性抗原−４（ＳＳＥＡ−４）、細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）、ＭＵＣ６、上皮成長因子受容体ファミリー及びその突然変異体（ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、炭酸アンヒドラーゼＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＬＭＰ２、エフリンＡ受容体２（ＥｐｈＡ２）、フコシルＧＭ１、シアリルルイス接着分子（ｓＬｅ）、ガングリオシドＧＭ３、ＴＧＳ５、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）、Ｏ−アセチルＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）、葉酸受容体、腫瘍血管内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）、腫瘍血管内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）、Ｃｌａｕｄｉｎ  ６、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．１、ＡＳＧＰＲ１、ＣＤＨ１６、５Ｔ４、８Ｈ９、αｖβ６インテグリン、Ｂ細胞成熟化抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＡ９、κ軽鎖（ｋａｐｐａ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）、ＣＳＰＧ４、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＦＡＰ、ＦＡＲ、ＦＢＰ、胚型ＡｃｈＲ、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＭＡＧＥＡ１、ＭＡＧＥ３、ＫＤＲ、ＭＣＳＰ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＰＳＣ１、ＲＯＲ１、Ｓｐ１７、ＳＵＲＶＩＶＩＮ、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ１、ピブロネクチン、テネイシン、腫瘍壊死部位のがん胚変異体、Ｇタンパク質共役受容体のクラスＣのグループ５のメンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）、Ｘ染色体オープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、逆形成リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）、ポリシアル酸、胎盤特異遺伝子１（ＰＬＡＣ１）、ｇｌｏｂｏＨ  ｇｌｙｃｏｃｅｒａｍｉｄｅのヘキソース部分（ＧｌｏｂｏＨ）、乳房分化抗原（ＮＹ−ＢＲ−１）、ｕｒｏｐｌａｋｉｎ  ２（ＵＰＫ２）、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）、アドレナリン受容体β３（ＡＤＲＢ３）、ｐａｎｎｅｘｉｎ  ３（ＰＡＮＸ３）、Ｇタンパク質共役受容体２０（ＧＰＲ２０）、リンパ球抗原６複合遺伝子座Ｋ９（ＬＹ６Ｋ）、嗅覚受容体５１Ｅ２５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）、Ｔ細胞受容体ガンマ代替読み出しフレームタンパク質（ＴＡＲＰ）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）、ＥＴＳ  電位変化の遺伝子６（ＥＴＶ６−ＡＭＬ）、精子タンパク質１７（ＳＰＡ１７）、Ｘ抗原ファミリーメンバー１Ａ��ＸＡＧＥ１）、アンジオポチン結合細胞表面受容体２（Ｔｉｅ２）、メラノーマ癌精巣抗原−１（ＭＡＤ−ＣＴ−１）、メラノーマ癌精巣抗原−２（ＭＡＤ−ＣＴ−２）、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３突然変異体、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、育種電位ブレークポイント、細胞死滅の黒色腫阻害剤（ＭＬ−ＩＡＰ）、ＥＲＧ（膜貫通プロテアーゼセリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子）、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）、ペアリングボックスタンパク質Ｐａｘ−３（ＰＡＸ３）、アンドロゲン受容体、テトラサイクリンＢ１、Ｖ−ｍｙｃ鳥骨髄症ウイルスの腫瘍遺伝子神経芽細胞腫由来同族体（ＭＹＣＮ）、Ｒａｓ同族体ファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）、シトクロムＰ４５０  １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）、ＣＣＣＴＣ結合因子（亜鉛フィンガータンパク質）類似（ＢＯＲＩＳ）、Ｔ細胞によって識別される扁平上皮癌抗原３（ＳＡＲＴ３）、ペアリングボックスタンパク質Ｐａｘ−５（ＰＡＸ５）、ｐｒｏａｃｒｏｓｉｎ結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹＴＥＳ１）、リンパ球特異タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）、ＡＡキナーゼ固定タンパク質４（ＡＫＡＰ−４）、滑膜肉腫Ｘブレークポイント２（ＳＳＸ２）、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、白血球関連免疫グロブリン類似受容体１（ＬＡＩＲ１）、ＩｇＡ受容体のＦｃ断片（ＦＣＡＲ）、白血球免疫グロブリン類似の受容体サブファミリーのメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）、ＣＤ３００分子類似ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）、骨髄基質細胞抗原２（ＢＳＴ２）、ＥＧＦ類似モジュール含有ムチン類似ホルモン受容体２（ＥＭＲ２）、リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）、ホスファチジル筋肉グリカン−３（ＧＰＣ３）、Ｆｃ受容体類似５（ＦＣＲＬ５）、免疫グロブリンラムダ類似ペプチド１（ＩＧＬＬ１）を含むが、これに限定されない。
【００９１】
病原体抗原は、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、または寄生虫の抗原から選択され、ウイルス抗原は、サイトメガロウイルス抗原、エプスタインバーウイルス抗原、ヒト免疫不全ウイルス抗原、またはインフルエンザウイルス抗原から選択される。
「腫瘍」という用語は、インビトロ（例えば、形質転換された細胞）またはインビボでの過剰増殖性細胞の生長の幅広い病状タイプを指す。本発明の方法を介して、予防または治療することができる病状は、例えば、良性または悪性腫瘍を含む、様々な新生物、様々な増殖等を含む。癌の具体的な例は、乳癌、前立腺癌、白血病、リンパ腫、鼻咽頭癌、神経膠腫、結腸癌、直腸癌、腎臓細胞癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、小腸癌、食道癌、メラノーマ、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、子宮癌、卵巣癌、胃癌、精巣癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎腺癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、膀胱癌、尿管癌、腎骨盤癌、中枢神経系（ＣＮＳ）癌、血管腫脊椎腫瘍、神経膠腫、星状細胞腫、下垂体腺腫癌、前記癌の組み合わせ、及び前記癌の転移病巣を含むが、これに限定されない。
【００９２】
「形質感染」または「形質転換された」または「形質導入された」は、外因性核酸が、これを介して、宿主細胞に転移または導入されるプロセスを指す。「形質感染」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、既に外因性核酸を利用して形質感染、形質転換または形質導入された細胞である。前記細胞は、原発性被験者の細胞とその次世代とを含む。
「特異的結合」という用語は、抗体またはリガンドがサンプル中に存在する結合パートナー（例えば、腫瘍抗原）に結合するが、サンプル中の他の分子はほとんど識別できないかまたはこれに結合されないことを指す。
【００９３】
ここで使用される「難治」は、例えば、治療に反応しない腫瘍のような一つの疾患を指す。実施形態において、難治性腫瘍は、治療開始前または開始時の治療について抵抗性を有することができる。他の実施形態において、難治性腫瘍は、治療の間に抵抗性を有することができる。本発明において、難治性腫瘍は、放射線治療に対する鈍感、放射線治療後の再発、化学治療に対する鈍感、化学治療後の再発、ＣＡＲ−Ｔ治療に対する鈍感または治療後の再発腫瘍を含むが、これに限定されない。難治性または再発性悪性腫瘍は、本明細書で説明された治療方法を適用することができる。
【００９４】
本明細書で使用される「再発」は、一定の改善期間に、例えば、まず、効果的な腫瘍治療後の患者に、前記効果的な治療前の病状及び症状が再び現れることを指す。
「個体」と「被験者」という用語は、本明細書で均等な意味を有し、ヒト及び他の従属の動物であることができる。
【００９５】
「増強」という用語は、被験者または腫瘍細胞の改善が本明細書で公開された治療を可能にする能力を指す。例えば、増強された反応は、反応性のうち５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％またはその以上の増加を含むことができる。本明細書で使用されるように、「増強」は、例えば、免疫エフェクター細胞療法のような治療に反応する被験者数を増加させることを指すこともできる。例えば、増強された反応は、治療に反応する被験者の合計パーセンテージを指すことができるが、ここで、パーセンテージは、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％以上である。
【００９６】
一つの態様において、治療は、臨床結果、Ｔ細胞を介した抗腫瘍活性の増加、増強または延長、抗腫瘍Ｔ細胞または活性化Ｔ細胞の数が治療前の数に比べての増加、ＩＦＮ−γの分泌に対する促進、またはそれらの組み合わせによって決定される。別の態様において、臨床結果は、腫瘍退化、腫瘍縮小、腫瘍壊死、免疫システムを介した抗腫瘍反応、腫瘍拡大、再発または拡散またはそれらの組み合わせである。別の態様において、治療エフェクターは、Ｔ細胞の存在、Ｔ細胞の炎症を示す遺伝子マーカーの存在、ＩＦＮ−γの分泌に対する促進、またはそれらの組み合わせを介して予測する。
【００９７】
本明細書で公開された免疫エフェクター細胞は、様々な経路を介して個体に使用することができ、例えば、経口投与または静脈内、筋肉内、皮下、眼窩内、嚢内、腹膜内、直腸内、脳内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌ）、腫瘍内、鼻腔内（ｉｎｔｒａｖａｓａｌｌｙ）、皮内または例えば、皮膚パッチまたは皮膚透過イオンの電気浸透治療をそれぞれ使用した皮膚を介した受動的または促進的吸収のような非経口投与の方法を含む。
【００９８】
本発明を実践する方法における使用する試薬の全体量は、単一の使用量として注射または比較的短い時間帯の注入を介して被験者に使用されたり、または段階を分ける治療方法で使用されたりすることができ、ここで、延長時間帯に多数の使用量を使用する。本技術分野の通常の技術者は、被験者の治療の過程での病理状態を治療する総生物の量は、被験者の年齢及び一般的な健康、使用経路、及び使用する治療の回数を含む様々な要因によって決定されることが分かる。技術者は、これらの要素を考慮して、需要に応じて、具体的な使用量を調節する。一般的には、最初にＩ期及びＩＩ期臨床実験を介して総生物の調節、及び頻度を測定する。
【００９９】
範囲において、全体の公開内容から、本発明の各態様は、すべての範囲の形で存在することができる。範囲の形式の説明は、単に便利性と簡潔のためのものであり、本発明の範囲に対する不変的な制限であると考えてはならないことを理解されたい。従って、範囲の説明は、すべての可能なサブ範囲及び前記範囲内の単独の数値を具体的に明らかにしたものと理解されるべきである。例えば、範囲の説明が、例えば、１〜６であれば、具体的に、サブ範囲である、例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６等、及び前記範囲内の単独の数値、例えば１、２、２．７、３、４、５、５．３及び６を公開したことを理解されたい。別の実装例において、範囲９５〜９９％の同一性は、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する範囲を含み、例えば、サブ範囲である９６〜９９％、９６〜９８％、９６〜９７％、９７〜９９％、９７〜９８％、及び９８〜９９％の同一性を含む。範囲の幅を考慮しない場合、これらはすべて適用可能である。
【０１００】
本開示の内容に基づいて、当業者は、開示された特定の実施形態において多くの変更または変形を行うことができ、それでも、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく同じまたは類似な結果を得ることができることを理解されたい。本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態（本発明の態様を提示することのみを意図する）に範囲が限定されず、機能的に同等の方法及び構成要素が本発明の範囲内にある。実際、本発明の様々な改変に加えて、本明細書に示されて記載されたものは、前記記載に基づいて当業者に明らかになるであろう。
【０１０１】
適用されたＩＬ７とＣＣＬ２１とを共発現するＣＡＲ−Ｔ細胞が被験者に使用される場合、対応する従属を選択することができ、例えば、マウスに使用される場合、マウス由来のＩＬ７とＣＣＬ２１とを使用して、例えば、膜貫通ドメイン、細胞内ドメイン等ＣＡＲを構築する要素もマウス由来であることを選択することができる。被験者がヒトである場合、好ましくは、ヒト由来のＩＬ７とＣＣＬ２１とヒト由来のＣＡＲとの要素を選択する。一部の実施形態において、使用されたＣＡＲの配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４に示されることができる。
一部の実施形態において、本発明の細胞は、腫瘍の治療に使用される場合、化学治療薬と併用して、応用されることができる。
【０１０２】
「ＣＬＤ１８（ｃｌａｕｄｉｎ  １８）」という用語は、クロ―ディン−１８を指し、細胞によって天然に発現されるか、またはＣＬＤ１８遺伝子を形質感染させた細胞によって発現された任意のＣＬＤ１８の変異体（ＣＬＤ１８Ａ１（ｃｌａｕｄｉｎ  １８．１）とＣＬＤ１８Ａ２（ｃｌａｕｄｉｎ  １８．２）とを含む）、配列、イソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）、及び種間同種物（ｓｐｅｃｉｅｓｈｏｍｏｌｏｇｓ）を含む。好ましくは、「ＣＬＤ１８」は、ヒトＣＬＤ１８、特にＣＬＤ１８Ａ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）および／またはＣＬＤ１８Ａ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）を指し、より好ましくはＣＬＤ１８Ａ２を指す。
【０１０３】
「ＣＬＤ１８Ａ１」は、細胞によって天然に発現されるか、またはＣＬＤ１８Ａ１遺伝子を形質感染させた細胞によって発現された任意のヒトＣＬＤ１８Ａ１の翻訳後の変形された変異体、イソフォーム、及び種間同種物を含む。
「ＣＬＤ１８Ａ２」という用語は、細胞によって天然に発現されるか、またはＣＬＤ１８Ａ２遺伝子を形質感染させた細胞によって発現された任意のヒトＣＬＤ１８Ａ２の翻訳後の変形された変異体、イソフォーム、及び種間同種物を含む。
【０１０４】
「ＣＬＤ１８変異体」という用語は、（ｉ）ＣＬＤ１８接合変異体、（ｉｉ）ＣＬＤ１８翻訳後の変形された変異体、特にＮグリコシル化状態が異なる変異体、（ｉｉｉ）ＣＬＤ１８配列変異体、特にＣＬＤ１８−配列−１、ＣＬＤ１８−配列−２及びＣＬＤ１８−配列−３、（ｉｖ）細胞間の緊密接続側に位置する遊離ＣＬＤ１８及び同型／異型関連変異体、（ｖ）ＣＬＤ１８癌関連変異体及びＣＬＤ１８非癌関連変異体を含むべきである。
【０１０５】
本発明のキメラ抗原受容体ポリペプチドは、
細胞外抗原結合領域−ＣＤ８膜貫通領域−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ、
細胞外抗原結合領域−ＣＤ８膜貫通領域−ＣＤ２８ｂ−ＣＤ３ζ、
細胞外抗原結合領域−ＣＤ２８ａ−ＣＤ２８ｂ−ＣＤ３ζ、
細胞外抗原結合領域−ＣＤ２８ａ−ＣＤ２８ｂ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ、
及びそれらの組み合わせである順序で接続されたことから選択されることができ、ここで、関連キメラ抗原受容体タンパク質のＣＤ２８ａは、ＣＤ２８分子の膜貫通領域を指し、ＣＤ２８ｂは、ＣＤ２８分子の細胞内信号領域を指す。本発明は、前記キメラ抗原受容体をコードする核酸も含む。本発明は、前記ポリヌクレオチドの変異体に関し、これは、本発明と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはポリペプチドの断片、類似体、及び誘導体をコードする。
【０１０６】
本発明は、前記キメラ抗原受容体の核酸を含むベクターをさらに提供する。本発明は、前記ベクターを含むウイルスをさらに含む。本発明のウイルスは、パッケージされた後の感染力を有するウイルスを含み、感染力を有するウイルスをパッケージするための必要な成分としてパッケージされるウイルスも含む。本技術分野で公知された外因性遺伝子を、免疫エフェクター細胞に形質導入するために使用されることができる他のウイルス及びこれに対応するプラスミドベクターも、本発明に使用されることができる。
【０１０７】
本発明は、キメラ抗原によって変形された免疫エフェクター細胞をさらに提供し、これは、前記キメラ抗原受容体をコードする核酸が形質導入されるか、または前記核酸を含有する、前記組換えプラスミドを含むか、または前記プラスミドを含むウイルスが形質導入される。本技術分野で通常の核酸形質導入の方法は、非ウイルス、及びウイルスの形質導入方法を含み、これらはすべて本発明に使用することができる。非ウイルスベースの形質導入方法は、電気穿孔法、及び転移因子法を含む。
【０１０８】
最近、Ａｍａｘａ会社で開発したＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ核形質感染機器は、外因性遺伝子を細胞核に直接導入させて目的の遺伝子を得ることができる効果的形質導入を実現する。この他に、スリーピングビューティーシステム（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ  ｓｙｓｔｅｍ）またはＰｉｇｇｙＢａｃ転移因子等の転移因子システムベースの形質導入効率は、一般的な電気穿孔に比べてさらに向上され、ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ形質感染機器と眠れるスリーピングビューティ転移因子システムの併用は、既に［Ｄａｖｉｅｓ  ＪＫ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ＣＤ１９  ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｌｌｏａｎｅｒｇｉｚａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２０１０，７０（１０）：ＯＦ１−１０．］で報告され、前記方法は、効果的な形質導入効率を有するだけでなく、ターゲット遺伝子のサイト指向統合を実現することもできる。
【０１０９】
本発明の一つの実施形態において、キメラ抗原受容体遺伝子によって変形された免疫エフェクター細胞の形質導入の方法は、例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルス等のウイルスの形質導入方法に基づいたものである。前記方法は、形質導入効率が高く、外因性遺伝子が安定的に発現することができ、インビトロで免疫エフェクター培養時の臨床レベルの数に到達する時間を短縮させる等の利点を有する。前記遺伝子組み換え免疫エフェクター細胞の表面で形質導入された核酸は、転写、翻訳を介してその表面に発現される。異なる方法で培養した様々な腫瘍細胞に対してインビトロ細胞毒実験を行って、本発明のキメラ抗原によって変形された免疫エフェクター細胞が高度の特異的腫瘍細胞殺害効果（細胞毒性とも呼ばれる）を有し、腫瘍組織で効果的に生存することができることを証明した。従って、本発明のキメラ抗原受容体をコードする核酸は、前記核酸を含むプラスミドを含み、前記プラスミドを含むウイルス及び前記核酸が形質導入されるプラスミド、または組換え免疫エフェクター細胞は、腫瘍の免疫治療に効果的に使用することができる。
【０１１０】
本発明によるキメラ抗原によって変形された免疫エフェクター細胞は、前記キメラ受容体を除いた他のキメラ受容体をさらに発現することができ、前記受容体は、ＣＤ３ζを含有しないが、ＣＤ２８の細胞内信号ドメイン、ＣＤ１３７の細胞内信号ドメインまたはこれらの両者の組み合わせを含有する。
【０１１１】
本発明のキメラ抗原受容体によって変形された免疫エフェクター細胞は、薬物組成物または診断試薬の調製に応用することができる。前記組成物は、有効量の前記免疫細胞を含むだけでなく、薬学的に許容可能な担体も含むことができる。「薬学的に許容可能な」という用語は、分子自体及び組成物を動物またはヒトに適切に投与する場合、これらが不利、敏感または他の副作用を発生しないことを指す。
【０１１２】
薬学的に許容可能な担体またはその組成成分であることができるいくつかの物質の具体的な例は、乳糖、ブドウ糖やショ糖などの糖類、トウモロコシの澱粉とジャガイモ澱粉などの澱粉、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、およびメチルセルロースなどのセルロースおよびその誘導体、トラがカント粉末、麦芽、ゼラチン、タルク、ステアリン酸とステアリン酸マグネシウムなどの固体潤滑剤、硫酸カルシウム、ピーナッツ油、綿実油、ごま油、オリーブ油、コーン油、およびカカオ油などの植物油、プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコールなどのポリオール、アルギン酸、Ｔｗｅｅｎなど乳化剤、ラウリル硫酸ナトリウムなど湿潤剤、着色剤、香料、錠剤、安定化剤、抗酸化剤、防腐剤、熱源なしの水、等張塩溶液とリン酸緩衝液などである。
【０１１３】
本発明の組成物は、需要に応じて、様々な剤型で調製されることができ、医師によって患者のタイプ、年齢、体重、及び概略的実感状況、投与方法等の要素に基づいて、患者に対して有利な使用量で使用するように決定することができる。投与方法は、注射または他の治療の方法を定容することができる。
【０１１４】
本発明の利点、
１．本明細書で提供された免疫エフェクター細胞は、腫瘍内での前記免疫エフェクター細胞の増殖、生存、及び機能を効果的に増加させることができ、抑制性免疫チェックポイントの発現を減少させることにより、Ｔ細胞の消耗を軽減させる。
２．本明細書で提供された免疫エフェクター細胞は、固形腫瘍の細胞に対してより優れた殺害効果及びインビトロ増幅機能を有する。
【０１１５】
以下に、具体的な実施例と結び付けて本発明をさらに説明する。これらの実施例は、本発明を説明するためのもので、本発明の範囲を限定しないことを理解されたい。下記の実施例において、具体的な条件を明記しない実験方法は、一般的にＳａｍｂｒｏｏｋ．Ｊ．等の編著、分子クローン実験指針、第３版、科学出版社、２００２年に記載された通常の条件、またはメーカーが推奨する条件に従うことができる。
【０１１６】
本発明のＣＡＲを含む例示的抗原受容体、及び工学の改善と受容体を細胞に導入する方法は、例えば、中国特許出願公開番号ＣＮ１０７０５８３５４Ａ、ＣＮ１０７４６０２０１Ａ、ＣＮ１０５１９４６６１Ａ、ＣＮ１０５３１５３７５Ａ、ＣＮ１０５７１３８８１Ａ、ＣＮ１０６１４６６６６Ａ、ＣＮ１０６５１９０３７Ａ、ＣＮ１０６５５４４１４Ａ、ＣＮ１０５３３１５８５Ａ、ＣＮ１０６３９７５９３Ａ、ＣＮ１０６４６７５７３Ａ、ＣＮ１０４１４０９７４Ａ、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１７１８６１２１Ａ１、ＷＯ２０１８００６８８２Ａ１、ＷＯ２０１５１７２３３９Ａ８、ＷＯ２０１８／０１８９５８Ａ１に開示された内容を参照することができる。
【０１１７】
実施例１．キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞の構築
本実施例において、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２をＣＡＲ−Ｔ細胞のターゲットとして使用し、マウスインビボでの抗腫瘍効果をより正確に検証するために、マウス由来の信号ペプチド、膜貫通領域、細胞内領域等を選択する。調製方法は、本技術分野の通常のＣＡＲ−Ｔ細胞の調製方法に基づいて実行される。
【０１１８】
１．プラスミド構築
本技術分野の通常の分子生物学方法を使用し、本実施例で使用されたｓｃＦｖは、ヒトＣｌａｕｄｉｎ１８．２を標的化する抗体であり、核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示され、使用されたキメラ抗原受容体は、第２の世代のキメラ抗原受容体であり、ｍＣＤ８の膜貫通ドメイン、ｍＣＤ２８の細胞内ドメインおよび／またはｍ４−１ＢＢ細胞内ドメイン、及びｍＣＤ３ζを有する。
【０１１９】
１．ＭＳＣＶ．ｐＢＡＢＥ  ５（ａｄｄｇｅｎｅ会社から購入）をベクターとして使用して、第２の世代のキメラ抗原受容体を発現するレトロウイルスプラスミドＭＳＣＶ−ｈｕ８Ｅ５（２Ｉ）−２８Ｚを構築する。ｈｕ８Ｅ５（２Ｉ）−２８Ｚの核酸配列は、ＣＤ８α信号ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ｓｃＦｖ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ｍＣＤ８ヒンジ領域と膜貫通領域（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ｍＣＤ２８細胞内信号伝達ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、及びｍＣＤ３の細胞内セグメントｍＣＤ３ζ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）を含んで構成する。ｈｕ８Ｅ５（２Ｉ）−２８Ｚのプラスミド構築図は、図１Ａに示されたとおりである。
【０１２０】
ＭＳＣＶ−ｈｕ８Ｅ５（２Ｉ）−ｍ２８Ｚプラスミドに基づいてＦ２Ａ−ｍＩＬ７−Ｐ２Ａ−ｍＣＣＬ２１ａまたはＦ２Ａ−ｍＩＬ７−Ｐ２Ａ−ｍＣＣＬ２１ｂの遺伝子を挿入して、ＣＡＲ、ＩＬ７、及びＣＣＬ２１を発現するレトロウイルスプラスミドＭＳＣＶ−ｈｕ８Ｅ５（２Ｉ）−ｍ２８Ｚ−Ｆ２Ａ−ｍＩＬ７−Ｐ２Ａ−ｍＣＣＬ２１ａ（プラスミドプロファイルの図面は、図１Ｂに示されたとおりである）とＭＳＣＶ−ｈｕ８Ｅ５（２Ｉ）−ｍ２８Ｚ−Ｆ２Ａ−ｍＩＬ７−Ｐ２Ａ−ｍＣＣＬ２１ｂ（プラスミドプロファイルの図面は、図１Ｃに示されたとおりである）とを構築する。
【０１２１】
Ｆ２Ａ−ｍＩＬ７−Ｐ２Ａ−ｍＣＣＬ２１ａは、Ｆ２Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、ｍｏｕｓｅ  ＩＬ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）で構成され、Ｐ２Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、ｍｏｕｓｅ  ＣＣＬ２１ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）で構成され、Ｆ２Ａ−ｍＩＬ７−Ｐ２Ａ−ｍＣＣＬ２１ｂは、Ｆ２Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、ｍｏｕｓｅ  ＩＬ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）で構成され、Ｐ２Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、ｍｏｕｓｅ  ＣＣＬ２１ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）で構成される。
【０１２２】
ＭＳＣＶ．ｐＢＡＢＥ  ５をベクターとして使用して、第２の世代のキメラ抗原受容体を発現するレトロウイルスプラスミドＭＳＣＶ−ｈｕ８Ｅ５（２Ｉ）−ｍＢＢＺを構築する。ｈｕ８Ｅ５（２Ｉ）−  ｍＢＢＺ配列は、ＣＤ８α信号ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ｓｃＦｖ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ｍＣＤ８  ｈｉｎｇｅ、膜貫通領域（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ｍ４−１ＢＢ細胞内信号伝達ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）、及びｍＣＤ３の細胞内セグメントＣＤ３ζ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）で構成される。プラスミドプロファイルの図面は、図１Ｄに示されたとおりである。
【０１２３】
ＭＳＣＶ−  ｈｕ８Ｅ５（２Ｉ）−ｍＢＢＺプラスミドに基づいて、それぞれＦ２Ａ−ｍＩＬ−７−Ｐ２Ａ−ｍＣＣＬ２１ａ、Ｆ２Ａ−ｍＩＬ７−Ｐ２Ａ−ｍＣＣＬ２１ｂを挿入して、ＣＡＲ、ＩＬ７、及びＣＣＬ２１を発現するレトロウイルスプラスミドＭＳＣＶ−ｈｕ８Ｅ５（２Ｉ）−ｍＢＢＺ−Ｆ２Ａ−ｍＩＬ−７−Ｐ２Ａ−ｍＣＣＬ２１ａ（プラスミドプロファイルの図面は、図１Ｅに示されたとおりである）と、ＭＳＣＶ−ｈｕ８Ｅ５（２Ｉ）−ｍＢＢＺ−Ｆ２Ａ−ｍＩＬ７−Ｐ２Ａ−ｍＣＣＬ２１ｂ（プラスミドプロファイルの図面は、図１Ｆに示されたとおりである）とを構築する。
【０１２４】
２．ＭＳＣＶ−ｈｕ８Ｅ５（２Ｉ）−ｍ２８Ｚ、ＭＳＣＶ−ｈｕ８Ｅ５（２Ｉ）−ｍ２８Ｚ−Ｆ２Ａ−ｍＩＬ−７−Ｐ２Ａ−ｍＣＣＬ２１ａ、ＭＳＣＶ−ｈｕ８Ｅ５（２Ｉ）−ｍ２８Ｚ−Ｆ２Ａ−ｍＩＬ７−Ｐ２Ａ−ｍＣＣＬ２１ｂ、ＭＳＣＶ−ｈｕ８Ｅ５（２Ｉ）−ｍＢＢＺ、ＭＳＣＶ−ｈｕ８Ｅ５（２Ｉ）−ｍＢＢＺ−Ｆ２Ａ−ｍＩＬ−７−Ｐ２Ａ−ｍＣＣＬ２１ａ、ＭＳＣＶ−ｈｕ８Ｅ５（２Ｉ）−ｍＢＢＺ−Ｆ２Ａ−ｍＩＬ７−Ｐ２Ａ−ｍＣＣＬ２１ｂをそれぞれ２９３Ｔ細胞に形質感染させて、レトロウイルスｈｕ８Ｅ５（２Ｉ）−２８Ｚ、ＩＬ７−ＣＣＬ２１ａ−２８Ｚ、ＩＬ７−ＣＣＬ２１ｂ−２８Ｚ、ｈｕ８Ｅ５（２Ｉ）−ＢＢＺ、ＩＬ７−ＣＣＬ２１ａ−ＢＢＺ、ＩＬ７−ＣＣＬ２１ｂ−ＢＢＺを得る。
【０１２５】
３．マウスのＴ細胞の抽出、及び活性化：Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓を剥離して、マウスのＴ細胞を抽出し、培養、及び活性化を経た後、得られたレトロウイルスｈｕ８Ｅ５（２Ｉ）−２８Ｚ、ＩＬ７−ＣＣＬ２１ａ−２８Ｚ、ＩＬ７−ＣＣＬ２１ｂ−２８Ｚ、ｈｕ８Ｅ５（２Ｉ）−ＢＢＺ、ＩＬ７−ＣＣＬ２１ａ−ＢＢＺ、ＩＬ７−ＣＣＬ２１ｂ−ＢＢＺをそれぞれＴ細胞に感染させ、ｍ２８Ｚ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、ｍ２８Ｚ−７＊２１Ａ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、ｍ２８Ｚ−７＊２１Ｂ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、ｍＢＢＺ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、ｍＢＢＺ−７＊２１Ａ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、及びｍＢＢＺ−７＊２１Ｂ  ＣＡＲ−Ｔ細胞を得る。
【０１２６】
実施例２．インビトロでのサイトカイン検出
まず、マイトマイシンＣを使用して、マウスの膵臓癌細胞ＰＡＮＣ０２（ｃｌａｕｄｉｎ１８．２陰性発現、ＡＴＣＣから購入）とＰＡＮＣ０２−Ａ２（ｃｌａｕｄｉｎ１８．２陽性発現）とを前処理する（４０μｇ／ｍｌ、３７℃、２−３ｈ）。
【０１２７】
按２×１０５細胞／４００ｕｌに基づいて２４ウェルプレートに接種し、１：１の感染多重度（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、ＭＯＩ）に応じて、それぞれＵｎｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  Ｔ細胞（ＵＴＤ）、ｍＢＢＺ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、ｍＢＢＺ−７＊２１Ａ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、ｍＢＢＺ−７＊２１Ｂ  ＣＡＲ−Ｔ細胞を、それぞれ２４ウェルプレートに接種する。ここで、標的細胞を入れない対照群を設置し、３日後、細胞上清液を収集し、ＥＬＩＳＡキットを利用して、各サイトカインＩＬ７とＣＣＬ２１との分泌状況を検出し、結果は、図２に示されたとおりである。
【０１２８】
ここで、ＰＡＮＣ０２−Ａ２細胞である場合、ｐｗｐｔ−ｍｃｌａｕｄｉｎ１８．２レンチウイルスを利用して、ＰＡＮＣ０２細胞に感染させた構築する。ｐＷＰＴ−ｍｃｌａｕｄｉｎ１８．２プラスミドの構築過程は、インビトロでのマウスｃｌａｕｄｉｎ１８．２遺伝子（ＧｅｎｅＢａｎｋ参照配列番号：ＮＭ＿００１１９４９２１）を合成し、酵素切断、接続方法を使用して、これをレンチウイルス発現ベクターｐＷＰＴにロードして、ｐｗｐｔ−ｍｃｌａｕｄｉｎ１８．２プラスミドを構築するものである。
【０１２９】
実施例３．インビトロでのＣＡＲ−Ｔ細胞の表現型の検出
ＵＴＤ、ｍＢＢＺ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、ｍＢＢＺ−７＊２１Ａ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、ｍＢＢＺ−７＊２１Ｂ  ＣＡＲ−Ｔ細胞を取り、細胞表面免疫チェックポイントであるＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３を検出する。まず、異なるＣＡＲ−Ｔ細胞をＥＰチューブにそれぞれ収集し、各細胞をそれぞれ３本のチューブに分け、事前アイスバスの流動式洗浄液（１％のＮＣＳにＰＢＳを入れて調製する）で２回洗浄し、異なる検出チューブをそれぞれ１：５０の割合に応じて希釈し、ＢＶ４２１標識抗−ＰＤ−１抗体、ＡＰＣ標識抗−ＬＡＧ−３抗体、ＡＰＣ標識抗−ＴＩＭ−３抗体を入れ、氷で４５分間培養して、３回洗浄した後、流動式チューブに入れて検出する。結果は、図３Ａ〜３Ｆに示されたとおりである。
【０１３０】
図３Ａは、異なるグループの細胞がＰＤ−１を発現する状況を示し、結果から、ｍＢＢＺグループのＰＤ−１の分泌は、３０．２％に達し、ｍＢＢＺ−７＊２１ＡグループのＰＤ−１の分泌は、わずか１１．７％であることを知ることができ、ｍＢＢＺ−７＊２１ＢグループのＰＤ−１の分泌は、わずか９．４％であり、図３Ｂは、ＰＤ−１の発現強度を示し、図３Ｂに示されたように、ｍＢＢＺグループのＰＤ−１の発現は、ｍＢＢＺ−７＊２１ＡグループとｍＢＢＺ−７＊２１Ｂグループとより高い。
【０１３１】
図３Ｃは、異なるグループの細胞がＬＡＧ−３を発現する状況を示し、結果から、ｍＢＢＺグループのＬＡＧ−３の分泌は、８０．７％に達し、ｍＢＢＺ−７＊２１ＡグループのＬＡＧ−３の分泌は、５３．４％であり、ｍＢＢＺ−７＊２１Ｂの分泌は、１３．７％であることを知ることができる。図３Ｄは、ＬＡＧ−３の発現強度を示し、図３Ｄに示されたように、ｍＢＢＺグループのＬＡＧ−３の発現は、ｍＢＢＺ−７＊２１Ａグループと和ｍＢＢＺ−７＊２１Ｂグループとより高い。
【０１３２】
図３Ｅは、異なるグループの細胞がＴＩＭ−３を発現する状況を示し、結果から、ｍＢＢＺグループのＴＩＭ−３の分泌は、４１．３％に達し、ｍＢＢＺ−７＊２１ＡグループのＴＩＭ−３の分泌は、１６．２％であり、ｍＢＢＺ−７＊２１Ｂの分泌は、１３．２％であることを知ることができる。図３Ｆは、ＴＩＭ−３の発現強度を示し、図３Ｆに示されたように、ｍＢＢＺグループのＴＩＭ−３の発現は、ｍＢＢＺ−７＊２１ＡグループとｍＢＢＺ−７＊２１Ｂとより高い。
【０１３３】
要約すると、ｍＢＢＺ−７＊２１Ａ  ＣＡＲ−Ｔ細胞とｍＢＢＺ−７＊２１Ｂ  ＣＡＲ−Ｔ細胞とのＰＤ−１、ＬＡＧ−３、及びＴＩＭ−３の発現は、すべてｍＢＢＺ−ＣＡＲ−Ｔ細胞より低く、これはサイトカインＩＬ７とＣＣＬ２１とを過発現した後、これらの抑制性免疫チェックポイントの発現を減少させることにより、Ｔ細胞の消耗を軽減させることができることを説明する。
【０１３４】
実施例４．インビトロでの殺害毒性検出
ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６非放射性細胞毒性検出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ会社）を使用する。具体的な方法は、ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６非放射性細胞毒性検出キットのマニュアルを参照することができる。
エフェクター細胞：３：１、１：１または１：３の感染多重度に応じて、ＵＴＤ細胞、ｍ２８Ｚ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、２８Ｚ−７＊２１Ａ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、ｍ２８Ｚ−７＊２１Ｂ  ＣＡＲ−Ｔ、ｍＢＢＺ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、ｍＢＢＺ−７＊２１Ａ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、ｍＢＢＺ−７＊２１Ｂ  ＣＡＲ−Ｔ細胞を、それぞれ９６ウェルプレートに接種する。
標的細胞：５０μＬの２×１０５／ｍＬのマウス膵臓癌細胞株ＰＡＮＣ０２−Ａ２とＰＡＮＣ０２細胞とを、それぞれ対応する９６ウェルプレートに接種する。
【０１３５】
各グループに５つの重複ウェルを設定する。培養プレートを細胞培養器において１８ｈ培養する。
ここで、各実験群と各対照群とは、下記のように設定する。実験群：各標的細胞＋異なるＣＡＲ−Ｔ細胞、対照群１：標的細胞の最大放出ＬＤＨ、対照群２：標的細胞の自発放出ＬＤＨ、対照群３：エフェクター細胞の自発放出ＬＤＨ。計算式：％細胞毒性＝［（実験群−エフェクター細胞の自発群−標的細胞の自発群）／（標的細胞の最大−標的細胞の自発）］＊１００。実験結果は、図４Ａと４Ｂとに示されたとおりである。
【０１３６】
図４Ａから、ｍ２８Ｚ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、ｍ２８Ｚ−７＊２１Ａ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、またはｍ２８Ｚ−７＊２１Ｂ  ＣＡＲ−Ｔは、対照群ＵＴＤと比べて、３：１と１：１との感染多重度でＰＡＮＣ０２−Ａ２に対して両方とも著しい毒性殺害作用を引き起こし、ＰＡＮＣ０２細胞に対して殺害作用を引き起こさないことを知ることができる。
図４Ｂから、ｍＢＢＺ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、ｍＢＢＺ−７＊２１Ａ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、ｍＢＢＺ−７＊２１Ｂ  ＣＡＲ−Ｔは、対照群ＵＴＤと比べて、３：１と１：１との感染多重度でＰＡＮＣ０２−Ａ２対して両方とも著しい毒性殺害作用を引き起こし、ＰＡＮＣ０２細胞に対して殺害作用を引き起こさない。
【０１３７】
実施例５．インビトロでの増殖検出
マイトマイシンＣを使用して、標的細胞であるＰＡＮＣ０２−Ａ２細胞（４０μｇ／ｍｌ、３７℃、２−３ｈ）を処理し、エフェクター細胞であるＵＴＤ細胞、ｍＢＢＺ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、ｍＢＢＺ−７＊２１Ａ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、ｍＢＢＺ−７＊２１Ｂ  ＣＡＲ−Ｔ細胞に、それぞれＣＦＳＥ染色を行った後、１：１の感染多重度（１×１０６細胞／ｍｌ）に基づいて、２日間共同培養する。
流動式検出でＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖状況を検出し、図５に示されたように、結果によると、ｍＢＢＺ−７＊２１Ａ  ＣＡＲ−Ｔ細胞とｍＢＢＺ−７＊２１Ｂ  ＣＡＲ−Ｔ細胞とは、ｍＢＢＺ  ＣＡＲ−Ｔ細胞に比べてすべて迅速に増殖することができる。
【０１３８】
実施例６．ＰＡＮＣ０２−Ａ２膵臓癌皮下移植腫瘍モデルの腫瘍治療
１）実験グループ：６−８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｘｉｐｕｅｒ−Ｂｉｋａｉ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｏ．、Ｌｔｄ．から購入）を、各グループに５〜６匹ずつランダムにグループに分けられ、それぞれＵＴＤ細胞、ｍＢＢＺ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、ｍＢＢＺ−７＊２１Ａ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、ｍＢＢＺ−７＊２１Ｂ  ＣＡＲ−Ｔ細胞治療群である。
２）皮下移植腫瘍の接種：プレートクレアチン消化法で対数成長期にあり、成長状態が優れたＰＡＮＣ０２−Ａ２細胞を収集し、ＰＢＳで１回洗浄した後、細胞密度が６×１０６／ｍＬになるように調節し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右腹部皮下に２００μＬの細胞懸濁液を注射し、即ち、それぞれのマウスに１．２×１０６の腫瘍細胞を接種し、接種日を０日目で記録する。
３）ＣＡＲ−Ｔ細胞の再注入：皮下に腫瘍細胞を接種した後、Ｄ１１日目に、腫瘍の平均体積は、約６０ｍｍ３である。処理しないＴ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞を注射し、注射使用量は、２．５×１０６／匹である。
【０１３９】
図６に示されたように、結果によると、ＣＡＲ−Ｔを注射した後、２０日目に、腫瘍抑制率は、それぞれ、ｍＢＢＺ  ＣＡＲ−Ｔグループ：３５．５％、ｍＢＢＺ−７＊２１Ａ  ＣＡＲ−Ｔグループ：６３％、ｍＢＢＺ−７＊２１Ｂ  ＣＡＲ−Ｔグループ：６２．４％であり、これは、ｍＢＢＺ−７＊２１Ａ  ＣＡＲ−Ｔ細胞とｍＢＢＺ−７＊２１Ｂ  ＣＡＲ−Ｔ細胞との治療群の抗腫瘍効果は、ｍＢＢＺ  ＣＡＲ−Ｔ細胞（Ｐ＜０．０５）より優れることを説明する。
【０１４０】
実施例７．異なるケモカインを発現する腫瘍殺害の比較
本実施例において、ＩＬ７とＣＣＬ１９とを発現するＣＡＲ−Ｔ細胞（ｍＢＢＺ−７＊１９  ＣＡＲ−Ｔ細胞）を選択して、対照群として使用する。ｍＢＢＺ−７＊１９  ＣＡＲ−Ｔ細胞の調製は、実施例１を参照して行い、ＭＳＣＶ−  ｈｕ８Ｅ５（２Ｉ）−ｍＢＢＺプラスミドに基づいて、Ｆ２Ａ−ｍＩＬ７−Ｐ２Ａ−ｍＣＣＬ１９を挿入して、ＣＡＲ、ＩＬ７、及びＣＣＬ１９を発現するレトロウイルスプラスミドを構築し、プラスミドプロファイルの図面は、図７に示されたとおりであり、ｍＣＣＬ１９の核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４に示される。プラスミドをマウスのＴ細胞に感染させて、ｍＢＢＺ−７＊１９  ＣＡＲ−Ｔ細胞を得る。
【０１４１】
１）実施例６の操作を参照して、マウスの膵臓癌皮下移植腫瘍モデルを作製し、腫瘍の平均体積が約６５ｍｍ３である場合、それぞれｍＢＢＺ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、ｍＢＢＺ−７＊１９  ＣＡＲ−Ｔ細胞、ｍＢＢＺ−７＊２１Ｂ  ＣＡＲ−Ｔ細胞治療群を注射し、注射使用量は、２．５×１０６細胞／匹であり、腫瘍殺害結果を、図８Ａに示されたとおりであり、腫瘍抑制率は、それぞれ、ｍＢＢＺ  ＣＡＲ−Ｔグループ：２２．８％、ｍＢＢＺ−７＊１９  ＣＡＲ−Ｔグループ：３２．７％、ｍＢＢＺ−７＊２１Ｂ  ＣＡＲ−Ｔグループ：７６．６％であり、ｍＢＢＺ−７＊２１Ｂ  ＣＡＲ−Ｔ細胞治療群の抗腫瘍効果は、ｍＢＢＺ  ＣＡＲ−Ｔ細胞とｍＢＢＺ−７＊１９  ＣＡＲ−Ｔ細胞とのグループより優れる。
同時に、各グループのマウスの体重変化（図８Ｂに示されたとおりである）を検出した結果、各グループのマウスとの間の体重は、有意差がないため（ｎｓ）、サイトカインの分泌は、マウスに対して毒性作用がないことを説明する。
【０１４２】
２）腫瘍接種後の３１日目に、マウスを安楽死させ、マウスの腫瘍を剥離して、腫瘍重量を量り、具体的な統計結果は、図８Ｃに示されたとおりである。結果によると、ｍＢＢＺ−７＊２１Ｂ  ＣＡＲ−Ｔ治療群の腫瘍重量は、ｍＢＢＺグループ（Ｐ＜０．０５）より大幅に小さいことを示し、これは、キメラ抗原受容体によって変形されたＴ細胞がＩＬ７、ＣＣＬ２１を共発現して、インビボでの腫瘍に対するＴ細胞の抑制を顕著に増加させることができることを説明する。
【０１４３】
３）ＣＡＲ−Ｔ細胞を再注入した後、ｄ３１日目に、実験を終了する時に腫瘍組織を剥離して、腫瘍組織ＣＡＲ−Ｔ複製数を検出する。
１ｍｇの腫瘍組織の塊を取って、機械的に研磨した後、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｋｉｔｓを利用して、腫瘍中のＤＮＡを抽出し、それぞれ各サンプルの濃度を測定する。リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を利用して、ＣＡＲ複製数を検出する。鋳型プラスミドに基づいて、標準曲線を製作し、最後に、各サンプル中のＣＡＲの複製数を計算する。
図８Ｄに示されたように、結果によると、ｍＢＢＺ−７＊２１Ｂ  ＣＡＲ−ＴのＣＡＲ−Ｔの複製数が、比較的高い。
【０１４４】
４）ＣＤ８＋細胞の腫瘍浸潤に対する免疫組織の化学検出
段階２）で安楽死させたマウスの腫瘍組織を取り、パラフィン組織切片を製造し、一般的にパラフィンを除去した後、標本を水和処理し、水和処理した後、切片を振とう機において、ＰＢＳで３回洗浄し、クエン酸緩衝液を沸かした後、組織切片をクエン酸緩衝液に入れて、抗原熱復元を行い、復元した後、１％のＢＳＡでブロッキングする。
ブロッキングされた切片を、対応するＣＤ８ａの抗体（ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＣＤ８αａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇから購入）またはブランク対照試薬に入れて、４℃で一晩培養し、０．５％のＰＢＳＴ緩衝液で洗浄した後、ＰＢＳ緩衝液で洗浄する。
【０１４５】
洗浄した切片二次抗体ヤギ―抗―ウサギ（Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ）−ＨＲＰに入れて、３７℃で１ｈ培養する。０．５％のＰＢＳＴ緩衝液で２回洗浄した後、ＰＢＳ緩衝液で１回洗浄し、ＤＡＢ（Ｄａｋｏ  ＲＥＡＬ（商標）  ＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ／ＤＡＢ＋、１：５０で希釈）で発色する。
ヘマトキシリンで細胞核に深紅色になるまで再染色し、再染色した後の組織切片を１％の塩酸エタノール分化液に入れ、３〜５秒間分化し、流れる水道水で２０分間洗浄した後、透明になるまで脱水し、９０％のエタノールに１分間浸出し、１００％のエタノールＩに１分間浸出し、１００％のエタノールＩＩに１分間浸出し、キシレンに３分間浸出し、中性ゴムで封入し、風で乾かす。
図８Ｅに示されたように、顕微鏡で観察した結果によると、例えｍＢＢＺ−７＊１９グループとｍＢＢＺ−７＊２１Ｂグループとの腫瘍組織の両方で著しいＣＤ８＋  Ｔ細胞の浸潤が発生したが、その中でｍＢＢＺ−７＊２１Ｂ  ＣＡＲ−ＴグループのＣＤ８＋  Ｔ細胞の浸潤が比較的多かった。
【０１４６】
実施例８．マウスの乳癌の定位移植腫瘍モデル
マウスの乳癌の皮下移植腫瘍モデルを作製し、プレートクレアチン消化法で対数成長期にあり、成長状態が優れたＥ０７７１−Ａ２細胞（製造方法：ｐｗｐｔ−ｍｃｌａｕｄｉｎ１８．２プラスミドを利用して、レンチウイルスをパッケージしてＥ０７７１細胞に感染させる）を収集し、ＰＢＳで１回洗浄した後、細胞密度を２×１０７／ｍＬに調節し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右腹部の第４組の乳房皮下に５０μＬの細胞懸濁液を注射し、即ち、各マウスに１×１０６のＥ０７７１−Ａ２細胞を接種し、接種日を０日目に記録する。
【０１４７】
ＣＡＲ−Ｔ細胞の再注入：皮下に腫瘍細胞を接種した後、Ｄ１２日目に、腫瘍の平均体積は、約１５０ｍｍ３である。処理しないＴ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞を注射し、注射使用量は、２．５×１０６／匹である。
３〜４日間隔でＥ０７７１−Ａ２移植腫瘍の体積のサイズを測定し、各グループのマウスの腫瘍体積の変化を記録し、図９Ａに示されたように、結果によると、ｍＢＢＺ−７＊１９  ＣＡＲ−Ｔグループに比べて、ｍＢＢＺ−７＊２１Ｂ  ＣＡＲ−Ｔ治療群の腫瘍殺害能力が著しく増強された。
【０１４８】
腫瘍接種後３１日目に、マウスを安楽死させ、マウスの腫瘍を剥離して腫瘍重量を量り、具体的な統計結果は、図９Ｂに示されたとおりである。結果によると、ｍＢＢＺ−７＊２１Ｂ  ＣＡＲ−Ｔ治療群の腫瘍重量は、ｍＢＢＺ−７＊１９  ＣＡＲ−Ｔグループ（Ｐ＜０．０５）とｍＢＢＺ  ＣＡＲ−Ｔグループ（Ｐ＜０．００１）とより大幅に小さいことを示し、これは、キメラ抗原受容体によって変形されたＴ細胞がＩＬ７、ＣＣＬ２１を共発現して、インビボ腫瘍に対するＴ細胞の抑制を顕著に増加させることができることを説明する。
【０１４９】
実施例７の段階３）の操作を参照して、乳癌の皮下移植腫瘍モデルのＣＡＲ−Ｔの細胞の複製を検出し、図９Ｃに示されたように、結果によると、ｍＢＢＺ−７＊１９  ＣＡＲ−ＴとｍＢＢＺ−７＊２１Ｂ  ＣＡＲ−ＴグループのＣＡＲ−Ｔ複製数は、ＵＴＤとＢＢＺグループより高い。
実施例７の段階４）の操作を参照して、ＣＤ８＋細胞の腫瘍浸潤状況を検出し、図９Ｄに示されたように、結果によると、ｍＢＢＺ−７＊１９  ＣＡＲ−ＴグループとｍＢＢＺ−７＊２１Ｂ  ＣＡＲ−Ｔグループの腫瘍組織で顕著なＣＤ８＋  Ｔ細胞の浸潤が発生し、そのうちのｍＢＢＺ−７＊２１Ｂ  ＣＡＲ−ＴグループのＣＤ８＋  Ｔ細胞の浸潤が比較的多かった。
【０１５０】
実施例９．マウスの肝臓癌皮下移植腫瘍モデル
マウスの肝臓癌移植腫瘍モデルを作製し、プレートクレアチン消化法で対数成長期にあり、成長状態が優れたＨｅｐａ１−６−Ａ２細胞（ｐｗｐｔ−ｍｃｌａｕｄｉｎ１８．２プラスミドを利用して、レンチウイルスをパッケージしてＨｅｐａ１−６細胞に感染させる）を収集し、ＰＢＳで１回洗浄した後、細胞密度を５×１０７／ｍＬに調節し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右腹部の皮下に２００μＬの細胞懸濁液を注射し、即ち、各マウスに１×１０７のＨｅｐａｌ１−６−Ａ２肝臓癌細胞を接種し、接種日を０日目に記録する。
【０１５１】
ＣＡＲ−Ｔ細胞の再注入：皮下に腫瘍細胞を接種した後、Ｄ７日目に、腫瘍の平均体積は、約３００ｍｍ３である。処理しないＴ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞を注射し、注射使用量は、１×１０６／匹である。
３−４日間隔でＨｅｐａｌ１−６−Ａ２移植腫瘍の体積のサイズを測定し、各グループのマウス腫瘍の体積変化を記録し、図１０Ａに示されたように、結果によると、ｍＢＢＺ−７＊１９  ＣＡＲ−Ｔグループに比較して、ｍＢＢＺ−７＊２１Ｂ  ＣＡＲ−Ｔ治療群の腫瘍殺害能力は、著しく増強された。
【０１５２】
腫瘍接種後の第３１日目に、マウスを安楽死させ、マウスの腫瘍を剥離して、腫瘍重量を量り、具体的な統計結果は、図１０Ｂに示されたとおりである。結果によると、ｍＢＢＺ−７＊２１Ｂ  ＣＡＲ−Ｔ治療群の腫瘍重量は、ｍＢＢＺ−７＊１９  ＣＡＲ−Ｔグループ（ｐ＜０．０１）と８Ｅ５−２Ｉ−ｍＢＢＺ  ＣＡＲ−Ｔグループ（ｐ＜０．０５）とより大幅に小さいことを示し、これは、キメラ抗原受容体によって変形されたＴ細胞がＩＬ７、ＣＣＬ２１を共発現して、インビボの腫瘍に対するＴ細胞の抑制を顕著に増加させることができるごとを説明する。
【０１５３】
実施例７の段階３）の操作を参照して、ＣＡＲ−Ｔ細胞の複製数を検出し、図１０Ｃに示されたように、結果によると、ｍＢＢＺ−７＊２１Ｂ  ＣＡＲ−ＴグループのＣＡＲ−Ｔ複製数は、比較的高い。
実施例７の段階４）の操作を参照して、ＣＤ８＋細胞の腫瘍浸潤状況を検出し、図１０Ｄに示されたように、結果によると、ｍＢＢＺ−７＊１９  ＣＡＲ−ＴグループとｍＢＢＺ−７＊２１Ｂ  ＣＡＲ−Ｔグループの腫瘍組織で顕著なＣＤ８＋  Ｔ細胞の浸潤が発生し、そのうちのｍＢＢＺ−７＊２１Ｂ  ＣＡＲ−ＴグループのＣＤ８＋  Ｔ細胞の浸潤が比較的多かった。
【０１５４】
実施例１０．インビトロでのＩＦＮ−γ検出
ＵＴＤ、８Ｅ５−２Ｉ−ｍＢＢＺ−ＣＡＲ、ｍＢＢＺ−７＊２１Ｂ  ＣＡＲ−Ｔ、及びｍＢＢＺ−７＊１９  ＣＡＲ−Ｔを、それぞれ、標的細胞ＰＡＮＣ０２−Ａ２と、１：１に応じて、２４ｈ培養した後、上清液を収集した後、ＥＬＩＳＡで上清中のＩＦＮ−γの分泌レベルを検出する。使用されたＥＬＩＳＡキットは、Lianke Biotechのｍｏｕｓｅ  ＩＦＮ−γ検出キットである。
図１１に示されたように、結果によると、ｍＢＢＺ−７＊２１Ｂ  ＣＡＲ−Ｔ細胞とｃｌａｕｄｉｎ１８．２陽性の腫瘍細胞とを共同培養した後、ＩＦＮ−γ分泌が比較的多かった。
【０１５５】
実施例１１．マウスＰＡＮＣ０２−Ａ２膵臓癌皮下腫瘍ＱｉｎｇＬｉｎモデルの治療
実施例６の操作を参照して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＰＡＮＣ０２−Ａ２皮下移植腫瘍モデルを作製し、接種日を０日目に記録し、腫瘍接種後１４日目に、腫瘍の平均体積は、約６０ｍｍ３であり、１００ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドを尾静脈注射し、腫瘍接種後１５日目に、処理しないＴ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞を注射し、注射使用量は、２．５×１０６／匹である。
３〜４日間隔でＰＡＮＣ０２−Ａ２移植腫瘍の体積のサイズを測定し、各グループのマウス腫瘍の体積変化を記録し、図１２Ａに示されたように、結果によると、腫瘍接種後の３８日目に、マウスを安楽死させ、マウス腫瘍を剥離して、腫瘍重量を量り、具体的統計結果は、図１２Ｂに示されたとおりである。
【０１５６】
実施例７の段階３）の操作を参照して、ＣＡＲ−Ｔ細胞の複製数を検出し、図１２Ｃに示されたように、結果によると、ｍＢＢＺ−７＊１９  ＣＡＲ−ＴとｍＢＢＺ−７＊２１Ｂ  ＣＡＲ−ＴグループのＣＡＲ−Ｔとの複製数は、ＵＴＤとＢＢＺグループとより高い。
実施例７の段階４）の操作を参照して、ＣＤ８＋細胞の腫瘍浸潤状況を検出し、結果は、図１２Ｄに示されたとおりである。ｍＢＢＺ−７＊１９  ＣＡＲ−ＴグループとｍＢＢＺ−７＊２１Ｂ  ＣＡＲ−Ｔグループとの腫瘍組織で顕著なＣＤ８＋  Ｔ細胞の浸潤が発生し、そのうちのｍＢＢＺ−７＊２１Ｂ  ＣＡＲ−ＴグループのＣＤ８＋  Ｔ細胞の浸潤が比較的多かった。
【０１５７】
実施例１２．マウスＰＡＮＣ０２−Ａ２膵臓癌皮下腫瘍モデルのＣＡＲ−Ｔ細胞の検出及び分析
実施例６の操作を参照して、マウス膵臓癌皮下移植腫瘍モデルを作製し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右腹部皮下に２×１０６のＰＡＮＣ０２−Ａ２膵臓癌細胞を注射し、皮下に腫瘍細胞を接種した後、Ｄ１４日目に、腫瘍の平均体積は、約６０ｍｍ３であり、処理しないＴ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞（ｍＢＢＺ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、ｍＢＢＺ−７＊２１Ａ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、及びｍＢＢＺ−７＊１９  ＣＡＲ−Ｔ細胞）を、それぞれ注射し、注射使用量は、４×１０６／匹である。
【０１５８】
１、ＣＡＲ−Ｔ細胞治療後の１０日目（ｄ１０）、２０日目（ｄ２０）のマウスの脾臓、骨髓をそれぞれ抽出して、Ｔｃｍ（中心記憶性Ｔ細胞）の含有量（各治療群は、２匹のマウスを選択する）を検出する。実験方法は、次のとおりである。
１）脾臓細胞の抽出：頸椎脱臼の方法で、マウスを致死させた後、脾臓を取り、きれいな２ｍＬのチューブに入れて、ＰＢＳで血汚れを洗浄する。４０ｕｍのろ過膜を利用して研磨して脾臓細胞を得る。４００ｇの脾臓細胞混合液を５分間遠心分離し、上清液を除去し、４００μＬのマウス赤血球分解液（１×）を入れて、５分間静置し、１．５ｍＬのＰＢＳに入れて反応させ、遠心分離し、ＰＢＳを入れて再懸濁させ、チューブを分けて抗体を培養し、抗体をＣＤ８（ＰｅｒＣＰ）、ＣＤ４４（ＢＶ５１０）、ＣＤ６２Ｌ（ＡＰＣ）と表記する。
【０１５９】
２）骨髓細胞の抽出：頸椎脱臼の方法でマウスを致死させた後、マウスの大腿骨と脛骨をとり、筋肉を除去してきれいな２ｍＬのチューブ内に入れて、ＰＢＳで血汚れを洗浄する。２ｍＬの注射器で、２ｍＬのＰＢＳを吸い、注射針を大腿骨または脛骨の一端に沿って穿刺し、ピンセットで固定させ、ピストンを圧着して、洗浄して骨髄細胞を得る。４００ｇの細胞混合液を５分間遠心分離し、上清液を除去し、４００μＬのマウス赤血球分解液（１×）を入れて、５分間静置させ、１．５ｍＬのＰＢＳに入れ反応させ、遠心分離して、ＰＢＳを入れて再懸濁させ、チューブを分けて抗体を培養し、抗体をＣＤ８（ＰｅｒＣＰ）、ＣＤ４４（ＢＶ５１０）、ＣＤ６２Ｌ（ＡＰＣ）と表記する。
【０１６０】
ｄ１０日目に、脾臓中Ｔｃｍの検出状況は、図１３Ａに図示された通りであり、ｄ２０日目に、脾臓中Ｔｃｍの検出状況は、図１３Ｂに示される通りであり、通常のＣＡＲ−Ｔに比べて、ＩＬ７とＣＣＬ２１とを発現するｍＢＢＺ−ＣＡＲ−Ｔ細胞群のＴｃｍの含有量は、顕著に増加した。
ｄ１０日目に、骨髓中Ｔｃｍの含有量状況は、図１４Ａに示されたとおりであり、ｄ２０日目に、脾臓中Ｔｃｍの検出状況は、図１４Ｂに示されたとおりであり、通常のＣＡＲ−Ｔに比べて、ｍＢＢＺ−７＊２１ＢＣＡＲ−Ｔ治療後、骨髓中Ｔｃｍの含有量は、顕著に増加した。
【０１６１】
２、ＤＣ浸潤検出
ＣＡＲ−Ｔ細胞治療後の１０（ｄ１０）日目に、マウスの腫瘍組織を凍結して製造された切片でＤＣの浸潤を検出し、図１５に示されたように、結果によると、ｍＢＢＺ細胞群に比べて、ｍＢＢＺ−７＊２１Ｂ細胞群のマウス腫瘍組織でより多くのＤＣ細胞浸潤が発生した。
【０１６２】
３、ＭＤＳＣ（骨髓由来の抑制性細胞）の含有量の検出
ＣＡＲ−Ｔ細胞治療後の１０日目（ｄ１０）のＵＴＤ群、ｍＢＢＺ群、ｍＢＢＺ−７＊２１Ｂ群、及びｍＢＢＺ−７＊１９  ＣＡＲ−Ｔ群のマウスの腫瘍組織をそれぞれ抽出し、腫瘍表面の脂肪、血管、細胞膜、及び内部壊死組織を除去し、ＰＢＳで洗浄し、５ｍＬの遠心分離管に移し、２ｍＬの培養液を入れ、腫瘍を１×１ｍｍ程度まで切り、培養液を４．７ｍＬまで補充し割合に応じて消化酵素（組織分離に使用される消化酵素：ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ｔｙｐｅ  Ｉ（０．０５ｍｇ／ｍｌ）、ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ｔｙｐｅ  ＩＶ（０．０５ｍｇ／ｍｌ、ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ（０．０２５ｍｇ／ｍｌ）、ＤＮａｓｅ  Ｉ（０．０１ｍｇ／ｍｌ）を入れて、３７℃で３０分程度（途中で取り出して消化状況を観察する）振とうし、消化後、懸濁して、７０ｕｍの細胞スクリーニングを介して５０ｍＬのチューブ（氷で操作する）に入れ、注射器プッシャーで完全に消化されない組織を軽く押して、大量（〜２０ｍＬ）の培養液にスクリーンメッシュを洗浄して収集し、当時に、消化を終了し、４００ｇを８分間遠心分離して、４℃で、上清液を除去し、ＰＢＳで洗浄した後、チューブを分けて抗体を培養し、ＣＤ４５＋、ＣＤ１１ｂ＋（ＦＩＴＣ）、及びＧｒ−１＋（ＰＥ）の細胞の含有量、即ち、ＭＤＳＣの含有量を検出する。図１６に示されたように、実験結果は、ｍＢＢＺ群に比べて、ｍＢＢＺ−７＊２１Ｂ  ＣＡＲ−Ｔ治療後、腫瘍組織中ＭＤＳＣの含有量が比較的少ない。
【０１６３】
例示的に、上記実施例において、ＣＬＤ１８Ａ２を標的化するＣＡＲ−Ｔ細胞を選択し、例えば、ＧＰＣ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ等の他のターゲットに使用されるＣＡＲ−Ｔ細胞を使用しても、同じ効果を有することを理解されたい。使用された抗体は、マウス―ハンであることができ、ヒトであることができ、使用された膜貫通ドメイン、細胞内ドメインも、目的に応じて、ヒトのような異なる種族のものを使用することができる。
【０１６４】
例示的に、上記実施例において、たとえ、ＣＡＲ−Ｔ細胞を使用し、前記Ｔ細胞は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の機能を増強させる他のサイトカインが発現される可能性があり、例えば、ＣＡＲとＩ型インターフェロンとが共発現されたＣＡＲ−Ｔ細胞、ＣＡＲとＰＤ−１とが共発現されたＣＡＲ−Ｔ細胞などである。例示的に、上記実施例において、たとえＣＡＲ−Ｔ細胞を使用したが、ＮＫ細胞、ＮＫ−Ｔ細胞のような他の免疫細胞を選択することができ、具体的に、γ／δＴ細胞のような免疫細胞の特定の亜型（亜型）を選択することもできる。
【０１６５】
本発明で使用される配列は、下記表のように総括される。
【表１−１】
2021523743.tif 000002
【表１−２】
2021523743.tif 000003
【表１−３】
2021523743.tif 000004
【表１−４】
2021523743.tif 000005
【表１−５】
2021523743.tif 000006
【表１−６】
2021523743.tif 000007
【０１６６】
本発明で言及されるすべての文書は、あたかも各文書が個別に参照として引用されるかのように、本出願における参照として引用される。さらに、本発明の上記の教示内容を読んだ後、当業者は、本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態もまた、本出願の添付の特許請求の範囲によって定義される範囲に含まれることを理解されたい。
【図１Ａ】
2021523743.tif 000008
【図１Ｂ】
2021523743.tif 000009
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
2021523743.tif 000013
【図２】
2021523743.tif 000014
【図３Ａ−３Ｂ】
2021523743.tif 000015
【図３Ｃ−３Ｄ】
2021523743.tif 000016
【図３Ｅ−３Ｆ】
2021523743.tif 000017
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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