(57)【要約】  本明細書に記載されるのは、抗ＬＩＦ抗体での治療に反応する可能性が高い患者を選択及び治療する方法である。【選択図】図２０−８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療用抗白血病抑制因子（ＬＩＦ）抗体で、癌を有する個人を治療する方法であって、前記個人からの生体試料中の基準レベルを超えるＬＩＦのレベルを決定することと、前記ＬＩＦのレベルがＬＩＦの前記基準レベルを超える場合に、治療量の抗ＬＩＦ抗体を前記個人に投与することとを含む方法。
【請求項２】
前記治療用抗ＬＩＦ抗体が、
ａ）配列番号１〜３のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域１（ＶＨ−ＣＤＲ１）；
ｂ）配列番号４又は５のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域２（ＶＨ−ＣＤＲ２）；
ｃ）配列番号６〜８のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域３（ＶＨ−ＣＤＲ３）；
ｄ）配列番号９又は１０のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域１（ＶＬ−ＣＤＲ１）；
ｅ）配列番号１１又は１２のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域２（ＶＬ−ＣＤＲ２）；及び
ｆ）配列番号１３に示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域３（ＶＬ−ＣＤＲ３）
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記治療用抗ＬＩＦ抗体が、配列番号１４、１５、１７、又は３８に対する少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、及び配列番号１８〜２１に対する少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記治療用抗ＬＩＦ抗体が、配列番号３０〜３３又は３９に対する少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含む免疫グロブリン重鎖領域、及び配列番号３４〜３７に対する少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含む免疫グロブリン軽鎖領域を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記治療用抗ＬＩＦ抗体が、２本の免疫グロブリン重鎖と２本の免疫グロブリン軽鎖を含むＩｇＧ抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記治療用抗ＬＩＦ抗体が、ヒト化されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＬＩＦのレベルが、ＬＩＦタンパク質レベルであり、且つ前記レベルを決定することが、ＬＩＦタンパク質を検出する少なくとも１つのアッセイを実施すること、又はＬＩＦタンパク質を検出する少なくとも１つのアッセイの結果を得ることを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つのアッセイが、免疫組織化学を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記基準レベルが、抗ＬＩＦ抗体での約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、又は３５％の細胞染色陽性である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記基準レベルが、約１０から約１００のＩＨＣスコアであるか又はこれを超える、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つのアッセイが、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＥＬＩＳＡが、電気化学発光を検出する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記基準レベルが、前記個人からの無希釈の生体試料中の約４ｐｇ／ｍＬのＬＩＦである、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＬＩＦの基準レベルが、同じ型のＬＩＦ陽性ヒト癌におけるＬＩＦタンパク質発現の５パーセンタイル、１０パーセンタイル、２５パーセンタイル、又は５０パーセンタイルに相当する、請求項７〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＬＩＦの基準レベルが、ヒト癌におけるＬＩＦタンパク質発現の５パーセンタイル、１０パーセンタイル、２５パーセンタイル、又は５０パーセンタイルに相当する、請求項７〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ヒト癌が、肺癌、卵巣癌、腎癌、膀胱癌、膵癌、前立腺癌、泌尿生殖器癌、婦人科癌、胃腸癌、内分泌系癌、多形神経膠芽腫、乳癌、黒色腫、結腸直腸癌、胆管癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、頭頸部扁平上皮癌、及びその組み合わせからなるリストから選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ヒト癌が、非小細胞肺癌、多形神経膠芽腫、卵巣上皮癌、膵臓腺癌、及びその組み合わせからなるリストから選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記生体試料が、血液試料を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記血液試料が、血漿である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記血液試料が、血清である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記生体試料が、組織試料を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記生体試料が、腫瘍生検試料である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
免疫調節分子の基準レベルを超える、前記免疫調節分子のタンパク質レベルを決定することをさらに含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記免疫調節分子が、ＣＣＬ７、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、及びＣＣＬ２２から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
免疫調節分子の基準レベル未満である、前記免疫調節分子のタンパク質レベルを決定することをさらに含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記免疫調節分子が、ＭＨＣＩＩ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＲ３、及びＰＤ−Ｌ１から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＩＩ型マクロファージ（Ｍ２）マーカーのタンパク質の基準レベルを超える、前記ＩＩ型マクロファージ（Ｍ２）マーカーのレベルを決定することをさらに含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記Ｍ２マーカーが、ＣＤ２０６、ＣＤ１６３、ＰＦ４、ＣＴＳＫ、及びＡＲＧ１からなるリストから選択される、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、２０１８年６月１８日に出願された欧州特許出願第１８３８２４３１．７号及び２０１９年２月２２日に出願された欧州特許出願第１９３８２１３１．１号の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
白血病抑制因子（ＬＩＦ）は、サイトカインのインターロイキン６（ＩＬ−６）ファミリーのメンバーである。ＬＩＦの公知の生理活性、ＬＩＦ欠乏の臨床的特徴、及び健康な組織及び腫瘍におけるＬＩＦ発現の非臨床研究に基づいて、ＬＩＦの阻害が、良好な耐容性を示すこと、また、限定はされないが非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、膵癌、卵巣癌、及び多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）を含めた様々な固形腫瘍における抗腫瘍有効性をもたらすことが期待されている。
【０００３】
標的特異的な治療薬で癌を治療する場合に臨床医が直面するある問題は、すべての腫瘍が所与の標的特異的な治療薬に対して反応性であり得るわけではないということである。ＬＩＦ又はＬＩＦ受容体を発現することが分かっている腫瘍型だとしても、個々の腫瘍の間には、かなりの不均一性が存在する。さらに、ＬＩＦ又はＬＩＦ受容体を発現するすべての腫瘍が、同様に反応することができるわけではなく、したがって、抗ＬＩＦ治療用抗体での治療から最も恩恵を受けることができる個人を決定するための有効な方法の必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示は、個人における癌を治療する方法であって、前記抗体に反応する可能性が最も高い個人に治療用抗ＬＩＦ抗体を投与することを含む方法、及びどの個人が治療用抗ＬＩＦ抗体に反応する可能性が最も高いかを決定する方法に関する。本明細書に記載される通りの基準レベルを超えるｍＲＮＡ又はタンパク質レベルのＬＩＦ又はＬＩＦ受容体の発現を呈する腫瘍又は癌を有する患者は、ＬＩＦ治療用抗体で有効に治療することができる。さらに、治療用抗ＬＩＦ抗体での治療から恩恵を受けるであろう個人を決定することができる、いくつかの非ＬＩＦバイオマーカーを記載する。これらの非ＬＩＦバイオマーカーは、単独で、又はＬＩＦ又はＬＩＦ受容体レベルを測定するアッセイと共に使用することができる。非ＬＩＦバイオマーカーには、免疫抑制特性（これらには、免疫抑制性の細胞型、免疫抑制性サイトカイン、又は免疫抑制性ケモカインの存在が含まれる）を示す免疫調節分子が含まれる。免疫抑制特性と共にＬＩＦ又はＬＩＦ受容体レベルを決定することは、治療用抗ＬＩＦ抗体での治療を決定する方法の予知力を高めることとなることが想定される。
【０００５】
一態様では、本明細書に記載されるのは、治療用抗白血病抑制因子（ＬＩＦ）抗体で、癌を有する個人を治療する方法であって、個人からの生体試料中の基準レベルを超えるＬＩＦのレベルを決定することと、ＬＩＦのレベルがＬＩＦの基準レベルを超える場合に、治療量の抗ＬＩＦ抗体を個人に投与することとを含む方法である。ある種の実施形態では、治療用抗ＬＩＦ抗体は、配列番号１〜３のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域１（ＶＨ−ＣＤＲ１）；配列番号４又は５のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域２（ＶＨ−ＣＤＲ２）；配列番号６〜８のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域３（ＶＨ−ＣＤＲ３）；配列番号９又は１０のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域１（ＶＬ−ＣＤＲ１）；配列番号１１又は１２のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域２（ＶＬ−ＣＤＲ２）；及び配列番号１３に示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域３（ＶＬ−ＣＤＲ３）を含む。ある種の実施形態では、治療用抗ＬＩＦ抗体は、配列番号１４、１５、１７、又は３８に対する少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、及び配列番号１８〜２１に対する少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。ある種の実施形態では、治療用抗ＬＩＦ抗体は、配列番号３０〜３３又は３９に対する少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含む免疫グロブリン重鎖領域、及び配列番号３４〜３７に対する少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含む免疫グロブリン軽鎖領域を含む。ある種の実施形態では、治療用抗ＬＩＦ抗体は、２本の免疫グロブリン重鎖と２本の免疫グロブリン軽鎖を含むＩｇＧ抗体である。ある種の実施形態では、ＬＩＦのレベルは、ＬＩＦタンパク質レベルであり、そのレベルを決定することは、ＬＩＦタンパク質を検出する少なくとも１つのアッセイを実施すること、又はＬＩＦタンパク質を検出する少なくとも１つのアッセイの結果を得ることを含む。ある種の実施形態では、少なくとも１つのアッセイは、免疫組織化学を含む。ある種の実施形態では、基準レベルは、抗ＬＩＦ抗体での約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、又は５０％の細胞染色陽性である。
である。
【０００６】
ある種の実施形態では、基準レベルは、約１００のＩＨＣスコアである。いくつかの実施形態では、基準レベルは、約１から約３００のＩＨＣスコアである。いくつかの実施形態では、基準レベルは、約１から約３０、約１から約６０、約１から約９０、約１から約１２０、約１から約１５０、約１から約１８０、約１から約２１０、約１から約２４０、約１から約２７０、約１から約３００、約３０から約６０、約３０から約９０、約３０から約１２０、約３０から約１５０、約３０から約１８０、約３０から約２１０、約３０から約２４０、約３０から約２７０、約３０から約３００、約６０から約９０、約６０から約１２０、約６０から約１５０、約６０から約１８０、約６０から約２１０、約６０から約２４０、約６０から約２７０、約６０から約３００、約９０から約１２０、約９０から約１５０、約９０から約１８０、約９０から約２１０、約９０から約２４０、約９０から約２７０、約９０から約３００、約１２０から約１５０、約１２０から約１８０、約１２０から約２１０、約１２０から約２４０、約１２０から約２７０、約１２０から約３００、約１５０から約１８０、約１５０から約２１０、約１５０から約２４０、約１５０から約２７０、約１５０から約３００、約１８０から約２１０、約１８０から約２４０、約１８０から約２７０、約１８０から約３００、約２１０から約２４０、約２１０から約２７０、約２１０から約３００、約２４０から約２７０、約２４０から約３００、又は約２７０から約３００のＩＨＣスコアである。いくつかの実施形態では、基準レベルは、約１、約３０、約６０、約９０、約１２０、約１５０、約１８０、約２１０、約２４０、約２７０、又は約３００のＩＨＣスコアである。いくつかの実施形態では、基準レベルは、少なくとも約１、約３０、約６０、約９０、約１２０、約１５０、約１８０、約２１０、約２４０、又は約２７０のＩＨＣスコアである。いくつかの実施形態では、基準レベルは、最大で約３０、約６０、約９０、約１２０、約１５０、約１８０、約２１０、約２４０、約２７０、又は約３００のＩＨＣスコアである。いくつかの実施形態では、基準レベルは、約１０から約１００のＩＨＣスコアであるか又はこれを超える。
【０００７】
ある種の実施形態では、少なくとも１つのアッセイは、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を含む。ある種の実施形態では、ＥＬＩＳＡは、電気化学発光を検出する。ある種の実施形態では、基準レベルは、個人からの無希釈の生体試料中の約１ｐｇ／ｍＬから約１０ｐｇ／ｍＬのＬＩＦである。ある種の実施形態では、ＬＩＦの基準レベルは、同じ型のＬＩＦ陽性癌におけるＬＩＦタンパク質発現の５パーセンタイルに相当する。ある種の実施形態では、ＬＩＦの基準レベルは、同じ型のＬＩＦ陽性癌におけるＬＩＦタンパク質発現の１０パーセンタイルに相当する。ある種の実施形態では、ＬＩＦの基準レベルは、ヒト癌の代表的な試料におけるＬＩＦタンパク質発現の５パーセンタイルに相当する。ある種の実施形態では、ＬＩＦの基準レベルは、ヒト癌の代表的な試料におけるＬＩＦタンパク質発現の１０パーセンタイルに相当する。ある種の実施形態では、ＬＩＦのレベルは、ＬＩＦ  ｍＲＮＡレベルであり、そのレベルを決定することは、ＬＩＦ  ｍＲＮＡを検出する少なくとも１つのアッセイを実施すること、又はＬＩＦ  ｍＲＮＡを検出する少なくとも１つのアッセイの結果を得ることを含む。ある種の実施形態では、基準レベルは、同じ型の癌におけるＬＩＦ  ｍＲＮＡ発現の５パーセンタイルに相当するレベルである。ある種の実施形態では、基準レベルは、同じ型の癌におけるＬＩＦ  ｍＲＮＡ発現の１０パーセンタイルに相当するレベルである。ある種の実施形態では、基準レベルは、ヒト癌の代表的な試料におけるＬＩＦ  ｍＲＮＡ発現の５パーセンタイルに相当するレベルである。ある種の実施形態では、基準レベルは、ヒト癌の代表的な試料におけるＬＩＦ  ｍＲＮＡ発現の１０パーセンタイルに相当するレベルである。ある種の実施形態では、ＬＩＦの基準レベルは、同じ型のＬＩＦ陽性癌におけるＬＩＦタンパク質発現の２５パーセンタイルに相当する。ある種の実施形態では、ＬＩＦの基準レベルは、同じ型のＬＩＦ陽性癌におけるＬＩＦタンパク質発現の５０パーセンタイルに相当する。ある種の実施形態では、ＬＩＦの基準レベルは、ヒト癌の代表的な試料におけるＬＩＦタンパク質発現の２５パーセンタイルに相当する。ある種の実施形態では、ＬＩＦの基準レベルは、ヒト癌の代表的な試料におけるＬＩＦタンパク質発現の５０パーセンタイルに相当する。ある種の実施形態では、ＬＩＦのレベルは、ＬＩＦ  ｍＲＮＡレベルであり、そのレベルを決定することは、ＬＩＦ  ｍＲＮＡを検出する少なくとも１つのアッセイを実施すること、又はＬＩＦ  ｍＲＮＡを検出する少なくとも１つのアッセイの結果を得ることを含む。ある種の実施形態では、基準レベルは、同じ型の癌におけるＬＩＦ  ｍＲＮＡ発現の２５パーセンタイルに相当するレベルである。ある種の実施形態では、基準レベルは、同じ型の癌におけるＬＩＦ  ｍＲＮＡ発現の５０パーセンタイルに相当するレベルである。ある種の実施形態では、基準レベルは、ヒト癌の代表的な試料におけるＬＩＦ  ｍＲＮＡ発現の２５パーセンタイルに相当するレベルである。ある種の実施形態では、基準レベルは、ヒト癌の代表的な試料におけるＬＩＦ  ｍＲＮＡ発現の５０パーセンタイルに相当するレベルである。ある種の実施形態��は、ＬＩＦのレベルは、ＬＩＦ  ＤＮＡレベルであり、そのレベルを決定することは、ＬＩＦ  ＤＮＡを検出する少なくとも１つのアッセイを実施すること、又はＬＩＦ  ＤＮＡを検出する少なくとも１つのアッセイの結果を得ることを含む。ある種の実施形態では、少なくとも１つのアッセイは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む。ある種の実施形態では、ＰＣＲは、定量的ＰＣＲを含む。ある種の実施形態では、少なくとも１つのアッセイは、シークエンシング反応を含む。ある種の実施形態では、シークエンシング反応は、次世代シークエンシング反応を含む。ある種の実施形態では、生体試料は、血液試料を含む。ある種の実施形態では、血液試料は、血漿である。ある種の実施形態では、血液試料は、血清である。ある種の実施形態では、生体試料は、組織試料を含む。ある種の実施形態では、生体試料は、腫瘍生検試料である。ある種の実施形態では、この方法は、免疫調節分子の基準レベルを超える、免疫調節分子のＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はタンパク質レベルを決定することをさらに含む。ある種の実施形態では、この方法は、免疫調節分子の基準レベル未満である免疫調節分子のＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はタンパク質レベルを決定することをさらに含む。ある種の実施形態では、免疫調節分子は、ＭＨＣＩＩ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＲ３、ＰＤ−Ｌ１、ＣＣＬ７、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、及びＣＣＬ２２からなるリストから転写されたｍＲＮＡ、又は産生されたタンパク質から選択される。ある種の実施形態では、この方法は、ＩＩ型マクロファージ（Ｍ２）マーカーのＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はタンパク質の基準レベルを超える、ＩＩ型マクロファージ（Ｍ２）マーカーのレベルを決定することをさらに含む。ある種の実施形態では、Ｍ２マーカーは、ＣＤ２０６、ＣＤ１６３、ＰＦ４、ＣＴＳＫ、及びＡＲＧ１からなるリストから転写されたｍＲＮＡ、又は産生されたタンパク質である。ある種の実施形態では、この方法は、ＬＩＦＲの基準レベルを超える、ＬＩＦ受容体（ＬＩＦＲ）のＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はタンパク質レベルを決定することをさらに含む。ある種の実施形態では、ＬＩＦＲのレベルは、免疫調節細胞上で検出される。ある種の実施形態では、ヒト癌は、非小細胞肺癌、卵巣癌、腎癌、膀胱癌、膵癌、前立腺癌、泌尿生殖器癌、婦人科癌、胃腸癌、内分泌系癌、多形神経膠芽腫、乳癌、黒色腫、結腸直腸癌、胆管癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、頭頸部扁平上皮癌、及びその組み合わせからなるリストから選択される。ある種の実施形態では、ヒト癌は、非小細胞肺癌、卵巣癌、腎癌、膀胱癌、及びその組み合わせからなるリストから選択される。ある種の実施形態では、ヒト癌は、膵癌、前立腺癌、多形神経膠芽腫、及びその組み合わせからなるリストから選択される。
【０００８】
別の態様では、本明細書に記載されるのは、治療用抗白血病抑制因子（ＬＩＦ）抗体で、癌を有する個人を治療する方法であって、個人からの生体試料中の基準レベルを超えるＬＩＦのレベルを決定することと、治療量の抗ＬＩＦ抗体を投与することとを含む方法である。ある種の実施形態では、治療用抗ＬＩＦ抗体は、配列番号１〜３のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域１（ＶＨ−ＣＤＲ１）；配列番号４又は５のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域２（ＶＨ−ＣＤＲ２）；配列番号６〜８のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域３（ＶＨ−ＣＤＲ３）；配列番号９又は１０のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域１（ＶＬ−ＣＤＲ１）；配列番号１１又は１２のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域２（ＶＬ−ＣＤＲ２）；及び配列番号１３に示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域３（ＶＬ−ＣＤＲ３）を含む。ある種の実施形態では、治療用抗ＬＩＦ抗体は、配列番号１４、１５、１７、又は３８に対する少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、及び配列番号１８〜２１に対する少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。ある種の実施形態では、治療用抗ＬＩＦ抗体は、配列番号３０〜３３又は３９に対する少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含む免疫グロブリン重鎖領域、及び配列番号３４〜３７に対する少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含む免疫グロブリン軽鎖領域を含む。ある種の実施形態では、治療用抗ＬＩＦ抗体は、２本の免疫グロブリン重鎖と２本の免疫グロブリン軽鎖を含むＩｇＧ抗体である。ある種の実施形態では、ＬＩＦのレベルは、ＬＩＦタンパク質レベルであり、そのレベルを決定することは、ＬＩＦタンパク質を検出する少なくとも１つのアッセイを実施すること、又はＬＩＦタンパク質を検出する少なくとも１つのアッセイの結果を得ることを含む。ある種の実施形態では、少なくとも１つのアッセイは、免疫組織化学を含む。ある種の実施形態では、基準レベルは、抗ＬＩＦ抗体での約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、又は５０％の細胞染色陽性である。
【０００９】
ある種の実施形態では、基準レベルは、約１００のＩＨＣスコアである。いくつかの実施形態では、基準レベルは、約１から約３００のＩＨＣスコアである。いくつかの実施形態では、基準レベルは、約１から約３０、約１から約６０、約１から約９０、約１から約１２０、約１から約１５０、約１から約１８０、約１から約２１０、約１から約２４０、約１から約２７０、約１から約３００、約３０から約６０、約３０から約９０、約３０から約１２０、約３０から約１５０、約３０から約１８０、約３０から約２１０、約３０から約２４０、約３０から約２７０、約３０から約３００、約６０から約９０、約６０から約１２０、約６０から約１５０、約６０から約１８０、約６０から約２１０、約６０から約２４０、約６０から約２７０、約６０から約３００、約９０から約１２０、約９０から約１５０、約９０から約１８０、約９０から約２１０、約９０から約２４０、約９０から約２７０、約９０から約３００、約１２０から約１５０、約１２０から約１８０、約１２０から約２１０、約１２０から約２４０、約１２０から約２７０、約１２０から約３００、約１５０から約１８０、約１５０から約２１０、約１５０から約２４０、約１５０から約２７０、約１５０から約３００、約１８０から約２１０、約１８０から約２４０、約１８０から約２７０、約１８０から約３００、約２１０から約２４０、約２１０から約２７０、約２１０から約３００、約２４０から約２７０、約２４０から約３００、又は約２７０から約３００のＩＨＣスコアである。いくつかの実施形態では、基準レベルは、約１、約３０、約６０、約９０、約１２０、約１５０、約１８０、約２１０、約２４０、約２７０、又は約３００のＩＨＣスコアである。いくつかの実施形態では、基準レベルは、少なくとも約１、約３０、約６０、約９０、約１２０、約１５０、約１８０、約２１０、約２４０、又は約２７０のＩＨＣスコアである。いくつかの実施形態では、基準レベルは、最大で約３０、約６０、約９０、約１２０、約１５０、約１８０、約２１０、約２４０、約２７０、又は約３００のＩＨＣスコアである。
【００１０】
ある種の実施形態では、少なくとも１つのアッセイは、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を含む。ある種の実施形態では、ＥＬＩＳＡは、電気化学発光を検出する。ある種の実施形態では、基準レベルは、個人からの無希釈の生体試料中の少なくとも約４ｐｇ／ｍＬのＬＩＦである。ある種の実施形態では、ＬＩＦの基準レベルは、同じ型のＬＩＦ陽性癌におけるＬＩＦタンパク質発現の５パーセンタイルに相当する。ある種の実施形態では、ＬＩＦの基準レベルは、同じ型のＬＩＦ陽性癌におけるＬＩＦタンパク質発現の１０パーセンタイルに相当する。ある種の実施形態では、ＬＩＦの基準レベルは、ヒト癌の代表的な試料におけるＬＩＦタンパク質発現の５パーセンタイルに相当する。ある種の実施形態では、ＬＩＦの基準レベルは、ヒト癌の代表的な試料におけるＬＩＦタンパク質発現の１０パーセンタイルに相当する。ある種の実施形態では、ＬＩＦのレベルは、ＬＩＦ  ｍＲＮＡレベルであり、そのレベルを決定することは、ＬＩＦ  ｍＲＮＡを検出する少なくとも１つのアッセイを実施すること、又はＬＩＦ  ｍＲＮＡを検出する少なくとも１つのアッセイの結果を得ることを含む。ある種の実施形態では、基準レベルは、同じ型の癌におけるＬＩＦ  ｍＲＮＡ発現の５パーセンタイルに相当するレベルである。ある種の実施形態では、基準レベルは、同じ型の癌におけるＬＩＦ  ｍＲＮＡ発現の１０パーセンタイルに相当するレベルである。ある種の実施形態では、基準レベルは、ヒト癌の代表的な試料におけるＬＩＦ  ｍＲＮＡ発現の５パーセンタイルに相当するレベルである。ある種の実施形態では、基準レベルは、ヒト癌の代表的な試料におけるＬＩＦ  ｍＲＮＡ発現の１０パーセンタイルに相当するレベルである。ある種の実施形態では、ＬＩＦの基準レベルは、同じ型のＬＩＦ陽性癌におけるＬＩＦタンパク質発現の２５パーセンタイルに相当する。ある種の実施形態では、ＬＩＦの基準レベルは、同じ型のＬＩＦ陽性癌におけるＬＩＦタンパク質発現の５０パーセンタイルに相当する。ある種の実施形態では、ＬＩＦの基準レベルは、ヒト癌の代表的な試料におけるＬＩＦタンパク質発現の２５パーセンタイルに相当する。ある種の実施形態では、ＬＩＦの基準レベルは、ヒト癌の代表的な試料におけるＬＩＦタンパク質発現の５０パーセンタイルに相当する。ある種の実施形態では、ＬＩＦのレベルは、ＬＩＦ  ｍＲＮＡレベルであり、そのレベルを決定することは、ＬＩＦ  ｍＲＮＡを検出する少なくとも１つのアッセイを実施すること、又はＬＩＦ  ｍＲＮＡを検出する少なくとも１つのアッセイの結果を得ることを含む。ある種の実施形態では、基準レベルは、同じ型の癌におけるＬＩＦ  ｍＲＮＡ発現の２５パーセンタイルに相当するレベルである。ある種の実施形態では、基準レベルは、同じ型の癌におけるＬＩＦ  ｍＲＮＡ発現の５０パーセンタイルに相当するレベルである。ある種の実施形態では、基準レベルは、ヒト癌の代表的な試料におけるＬＩＦ  ｍＲＮＡ発現の２５パーセンタイルに相当するレベルである。ある種の実施形態では、基準レベルは、ヒト癌の代表的な試料におけるＬＩＦ  ｍＲＮＡ発現の５０パーセンタイルに相当するレベルである。ある種の実施形態では、ＬＩ��のレベルは、ＬＩＦ  ＤＮＡレベルであり、そのレベルを決定することは、ＬＩＦ  ＤＮＡを検出する少なくとも１つのアッセイを実施すること、又はＬＩＦ  ＤＮＡを検出する少なくとも１つのアッセイの結果を得ることを含む。ある種の実施形態では、少なくとも１つのアッセイは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む。ある種の実施形態では、ＰＣＲは、定量的ＰＣＲを含む。ある種の実施形態では、少なくとも１つのアッセイは、シークエンシング反応を含む。ある種の実施形態では、シークエンシング反応は、次世代シークエンシング反応を含む。ある種の実施形態では、生体試料は、血液試料を含む。ある種の実施形態では、血液試料は、血漿である。ある種の実施形態では、血液試料は、血清である。ある種の実施形態では、生体試料は、組織試料を含む。ある種の実施形態では、生体試料は、腫瘍生検試料である。ある種の実施形態では、この方法は、免疫調節分子の基準レベルを超える、免疫調節分子のＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はタンパク質レベルを決定することをさらに含む。ある種の実施形態では、この方法は、免疫調節分子の基準レベル未満である免疫調節分子のＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はタンパク質レベルを決定することをさらに含む。ある種の実施形態では、免疫調節分子は、ＭＨＣＩＩ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＲ３、ＰＤ−Ｌ１、ＣＣＬ７、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、及びＣＣＬ２２からなるリストから転写されたｍＲＮＡ、又は産生されたタンパク質から選択される。ある種の実施形態では、この方法は、ＩＩ型マクロファージ（Ｍ２）マーカーの基準レベルを超える、ＩＩ型マクロファージ（Ｍ２）マーカーのＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はタンパク質レベルを決定することをさらに含む。ある種の実施形態では、Ｍ２マーカーは、ＣＤ２０６、ＣＤ１６３、ＰＦ４、ＣＴＳＫ、及びＡＲＧ１からなるリストから転写されたｍＲＮＡ、又は産生されたタンパク質である。ある種の実施形態では、この方法は、ＬＩＦＲの基準レベルを超える、ＬＩＦ受容体（ＬＩＦＲ）のＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はタンパク質レベルを決定することをさらに含む。ある種の実施形態では、ＬＩＦＲのレベルは、免疫調節細胞上で検出される。ある種の実施形態では、ヒト癌は、非小細胞肺癌、卵巣癌、腎癌、膀胱癌、膵癌、前立腺癌、泌尿生殖器癌、婦人科癌、胃腸癌、内分泌系癌、多形神経膠芽腫、乳癌、黒色腫、結腸直腸癌、胆管癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、頭頸部扁平上皮癌、及びその組み合わせからなるリストから選択される。ある種の実施形態では、ヒト癌は、非小細胞肺癌、卵巣癌、腎癌、膀胱癌、及びその組み合わせからなるリストから選択される。ある種の実施形態では、ヒト癌は、膵癌、前立腺癌、多形神経膠芽腫、及びその組み合わせからなるリストから選択される。
【００１１】
別の態様では、本明細書に記載されるのは、治療用抗白血病抑制因子（ＬＩＦ）抗体で、癌を有する個人を治療する方法であって、個人からの生体試料中の基準レベルを超える白血病抑制因子受容体（ＬＩＦＲ）のレベルを決定することと、ＬＩＦＲのレベルがＬＩＦＲの基準レベルを超える場合に治療量の抗ＬＩＦ抗体を個人に投与することとを含む方法である。ある種の実施形態では、ＬＩＦＲのレベルは、免疫調節細胞上で検出される。ある種の実施形態では、治療用抗ＬＩＦ抗体は、配列番号１〜３のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域１（ＶＨ−ＣＤＲ１）；配列番号４又は５のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域２（ＶＨ−ＣＤＲ２）；配列番号６〜８のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域３（ＶＨ−ＣＤＲ３）；配列番号９又は１０のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域１（ＶＬ−ＣＤＲ１）；配列番号１１又は１２のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域２（ＶＬ−ＣＤＲ２）；及び配列番号１３に示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域３（ＶＬ−ＣＤＲ３）を含む。ある種の実施形態では、治療用抗ＬＩＦ抗体は、配列番号１４、１５、１７、又は３８に対する少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、及び配列番号１８〜２１に対する少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。ある種の実施形態では、治療用抗ＬＩＦ抗体は、配列番号３０〜３３又は３９に対する少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含む免疫グロブリン重鎖領域、及び配列番号３４〜３７に対する少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含む免疫グロブリン軽鎖領域を含む。ある種の実施形態では、治療用抗ＬＩＦ抗体は、２本の免疫グロブリン重鎖と２本の免疫グロブリン軽鎖を含むＩｇＧ抗体である。ある種の実施形態では、ＬＩＦＲのレベルは、ＬＩＦＲタンパク質のレベルであり、そのレベルを決定することは、ＬＩＦＲタンパク質を検出する少なくとも１つのアッセイを実施すること、又はＬＩＦＲタンパク質を検出する少なくとも１つのアッセイの結果を得ることを含む。ある種の実施形態では、少なくとも１つのアッセイは、免疫組織化学を含む。ある種の実施形態では、少なくとも１つのアッセイは、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を含む。ある種の実施形態では、ＥＬＩＳＡは、電気化学発光を検出する。ある種の実施形態では、少なくとも１つのアッセイは、フローサイトメトリーを含む。ある種の実施形態では、ＬＩＦＲのレベルは、ＬＩＦＲ  ｍＲＮＡのレベルであり、そのレベルを決定することは、ＬＩＦＲ  ｍＲＮＡを検出する少なくとも１つのアッセイを実施すること、又はＬＩＦＲ  ｍＲＮＡを検出する少なくとも１つのアッセイの結果を得ることを含む。ある種の実施形態では、ＬＩＦＲのレベルは、ＬＩＦＲ  ＤＮＡのレベルであり、そのレベルを決定することは、ＬＩＦＲ  ＤＮＡを検出する少なくとも１つのアッセイを実施すること、又はＬＩＦＲ  ＤＮＡを検出する少なくとも１つのアッセイの結果を得ることを含む。ある種の実施形態では、少なくとも１つのアッセイは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む。ある種の実施形態では、ＰＣＲは、定量的ＰＣＲを含む。ある種の実施形態では、少なくとも１つのアッセイは、シークエンシング反応を含む。ある種の実施形態では、シークエンシング反応は、次世代シークエンシング反応を含む。ある種の実施形態では、生体試料は、血液試料を含む。ある種の実施形態では、血液試料は、血漿である。ある種の実施形態では、血液試料は、血清である。ある種の実施形態では、生体試料は、組織試料を含む。ある種の実施形態では、生体試料は、腫瘍生検試料である。ある種の実施形態では、この方法は、免疫調節分子の基準レベルを超える、免疫調節分子のＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はタンパク質レベルを決定することをさらに含む。ある種の実施形態では、この方法は、免疫調節分子の基準レベル未満である免疫調節分子のＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はタンパク質レベルを決定することをさらに含む。ある種の実施形態では、免疫調節分子は、ＭＨＣＩＩ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＲ３、ＰＤ−Ｌ１、ＣＣＬ７、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、及びＣＣＬ２２からなるリストから転写されたｍＲＮＡ、又は産生されたタンパク質から選択される。ある種の実施形態では、この方法は、ＩＩ型マクロファージ（Ｍ２）マーカーの基準レベルを超える、ＩＩ型マクロファージ（Ｍ２）マーカーのＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はタンパク質レベルを決定することをさらに含む。ある種の実施形態では、Ｍ２マーカーは、ＣＤ２０６、ＣＤ１６３、ＰＦ４、ＣＴＳＫ、及びＡＲＧ１からなるリストから転写されたｍＲＮＡ、又は産生されたタンパク質である。ある種の実施形態では、この方法は、ＬＩＦの基準レベルを超える、ＬＩＦのＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はタンパク質レベルを決定することをさらに含む。ある種の実施形態では、ヒト癌は、非小細胞肺癌、卵巣癌、腎癌、膀胱癌、膵癌、前立腺癌、泌尿生殖器癌、婦人科癌、胃腸癌、内分泌系癌、多形神経膠芽腫、乳癌、黒色腫、結腸直腸癌、胆管癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、頭頸部扁平上皮癌、及びその組み合わせからなるリストから選択される。ある種の実施形態では、ヒト癌は、非小細胞肺癌、卵巣癌、腎癌、膀胱癌、及びその組み合わせからなるリストから選択される。ある種の実施形態では、ヒト癌は、膵癌、前立腺癌、多形神経膠芽腫、及びその組み合わせからなるリストから選択される。
【００１２】
別の態様では、本明細書に記載されるのは、治療用抗白血病抑制因子（ＬＩＦ）抗体で、癌を有する個人を治療する方法であって、個人からの生体試料中の基準レベルを超える白血病抑制因子受容体（ＬＩＦＲ）のレベルを決定することと、治療量の抗ＬＩＦ抗体を個人に投与することとを含む方法である。ある種の実施形態では、ＬＩＦＲのレベルは、免疫調節細胞上で検出される。ある種の実施形態では、治療用抗ＬＩＦ抗体は、配列番号１〜３のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域１（ＶＨ−ＣＤＲ１）；配列番号４又は５のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域２（ＶＨ−ＣＤＲ２）；配列番号６〜８のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖相補性決定領域３（ＶＨ−ＣＤＲ３）；配列番号９又は１０のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域１（ＶＬ−ＣＤＲ１）；配列番号１１又は１２のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域２（ＶＬ−ＣＤＲ２）；及び配列番号１３に示したアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域３（ＶＬ−ＣＤＲ３）を含む。ある種の実施形態では、治療用抗ＬＩＦ抗体は、配列番号１４、１５、１７、又は３８に対する少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、及び配列番号１８〜２１に対する少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。ある種の実施形態では、治療用抗ＬＩＦ抗体は、配列番号３０〜３３又は３９に対する少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含む免疫グロブリン重鎖領域、及び配列番号３４〜３７に対する少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含む免疫グロブリン軽鎖領域を含む。ある種の実施形態では、治療用抗ＬＩＦ抗体は、２本の免疫グロブリン重鎖と２本の免疫グロブリン軽鎖を含むＩｇＧ抗体である。ある種の実施形態では、ＬＩＦＲのレベルは、ＬＩＦＲタンパク質のレベルであり、そのレベルを決定することは、ＬＩＦＲタンパク質を検出する少なくとも１つのアッセイを実施すること、又はＬＩＦＲタンパク質を検出する少なくとも１つのアッセイの結果を得ることを含む。ある種の実施形態では、少なくとも１つのアッセイは、免疫組織化学を含む。ある種の実施形態では、少なくとも１つのアッセイは、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を含む。ある種の実施形態では、ＥＬＩＳＡは、電気化学発光を検出する。ある種の実施形態では、少なくとも１つのアッセイは、フローサイトメトリーを含む。ある種の実施形態では、ＬＩＦＲのレベルは、ＬＩＦＲ  ｍＲＮＡのレベルであり、そのレベルを決定することは、ＬＩＦＲ  ｍＲＮＡを検出する少なくとも１つのアッセイを実施すること、又はＬＩＦＲ  ｍＲＮＡを検出する少なくとも１つのアッセイの結果を得ることを含む。ある種の実施形態では、ＬＩＦＲのレベルは、ＬＩＦＲ  ＤＮＡのレベルであり、そのレベルを決���することは、ＬＩＦＲ  ＤＮＡを検出する少なくとも１つのアッセイを実施すること、又はＬＩＦＲ  ＤＮＡを検出する少なくとも１つのアッセイの結果を得ることを含む。ある種の実施形態では、少なくとも１つのアッセイは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む。ある種の実施形態では、ＰＣＲは、定量的ＰＣＲを含む。ある種の実施形態では、少なくとも１つのアッセイは、シークエンシング反応を含む。ある種の実施形態では、シークエンシング反応は、次世代シークエンシング反応を含む。ある種の実施形態では、生体試料は、血液試料を含む。ある種の実施形態では、血液試料は、血漿である。ある種の実施形態では、血液試料は、血清である。ある種の実施形態では、生体試料は、組織試料を含む。ある種の実施形態では、生体試料は、腫瘍生検試料である。ある種の実施形態では、この方法は、免疫調節分子の基準レベルを超える、免疫調節分子のＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はタンパク質レベルを決定することをさらに含む。ある種の実施形態では、この方法は、免疫調節分子の基準レベル未満である免疫調節分子のＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はタンパク質レベルを決定することをさらに含む。ある種の実施形態では、免疫調節分子は、ＭＨＣＩＩ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＲ３、ＰＤ−Ｌ１、ＣＣＬ７、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、及びＣＣＬ２２からなるリストから転写されたｍＲＮＡ、又は産生されたタンパク質から選択される。ある種の実施形態では、この方法は、ＩＩ型マクロファージ（Ｍ２）マーカーの基準レベルを超える、ＩＩ型マクロファージ（Ｍ２）マーカーのＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はタンパク質レベルを決定することをさらに含む。ある種の実施形態では、Ｍ２マーカーは、ＣＤ２０６、ＣＤ１６３、ＰＦ４、ＣＴＳＫ、及びＡＲＧ１からなるリストから転写されたｍＲＮＡ、又は産生されたタンパク質である。ある種の実施形態では、この方法は、ＬＩＦの基準レベルを超える、ＬＩＦのＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はタンパク質レベルを決定することをさらに含む。ある種の実施形態では、ヒト癌は、非小細胞肺癌、卵巣癌、腎癌、膀胱癌、膵癌、前立腺癌、泌尿生殖器癌、婦人科癌、胃腸癌、内分泌系癌、多形神経膠芽腫、乳癌、黒色腫、結腸直腸癌、胆管癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、頭頸部扁平上皮癌、及びその組み合わせからなるリストから選択される。ある種の実施形態では、ヒト癌は、非小細胞肺癌、卵巣癌、腎癌、膀胱癌、及びその組み合わせからなるリストから選択される。ある種の実施形態では、ヒト癌は、膵癌、前立腺癌、多形神経膠芽腫、及びその組み合わせからなるリストから選択される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】異なる抗ＬＩＦヒト化抗体のＬＩＦ誘発ＳＴＡＴ３リン酸化の阻害を示すウエスタンブロットを表す。
【図２Ａ−２Ｂ】ヒト化された親５Ｄ８抗体のＬＩＦ誘発ＳＴＡＴ３リン酸化の阻害を示すウエスタンブロットを表す。
【図３Ａ】ｈ５Ｄ８抗体を使用するＵ−２５１細胞におけるＬＩＦ阻害についてのＩＣ５０を示す。
【図３Ｂ】内在性ＬＩＦ刺激条件下でのｐＳＴＡＴ３のｒ５Ｄ８及びｈ５Ｄ８阻害の代表的なＩＣ５０用量反応曲線を示す。示したのは、代表的な曲線である（ｎ＝１  ｈ５Ｄ８、ｎ＝２  ｒ５Ｄ８）。
【図４】この開示に記載した異なるモノクローナル抗体のＬＩＦ誘発ＳＴＡＴ３リン酸化の阻害を示すウエスタンブロットを表す。
【図５】ヒト患者からの多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）、卵巣癌、結腸直腸癌腫瘍、及び膵腫瘍における、ＬＩＦ発現の免疫組織化学染色及び定量化を表す。バーは、平均値＋／−ＳＥＭを表す。
【図６】ヒト化５Ｄ８抗体を使用して、非小細胞肺癌のマウスモデルにおいて行われた実験を示すグラフである。
【図７Ａ】ＧＢＭの同所移植（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）マウスモデルにおけるＵ２５１細胞の阻害に対するｒ５Ｄ８の効果を示す。第２６日での定量化が示される。
【図７Ｂ】ルシフェラーゼ発現ヒトＵ２５１  ＧＢＭ細胞を接種し、且つその後１００、２００、又は３００μｇのｈ５Ｄ８又は賦形剤で週２回治療されたマウスからのデータを示す。腫瘍サイズは、第７日に、生物発光（Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）によって決定した。このグラフは、平均値±ＳＥＭを示す水平なバーと共に、個々の腫瘍測定値を示す。統計的有意性は、対応のないノンパラメトリックなマン・ホイットニーのＵ検定を使用して算出した。
【図８Ａ】同系移植（ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ）マウスモデルにおける卵巣癌細胞の増殖の阻害に対するｒ５Ｄ８の効果を示す。
【図８Ｂ】第２５日での腫瘍の個々の測定値を示す。
【図８Ｃ】ｈ５Ｄ８が、週２回２００μｇ／マウスで投与された場合に腫瘍増殖の有意な低下を示す（ｐ＜０．０５）ことを図示する。記号は、平均値±ＳＥＭであり、統計的有意性は、（対応のないノンパラメトリックなマン・ホイットニーのＵ検定を用いて）賦形剤と比較した。
【図９Ａ】同系移植マウスモデルにおける結腸直腸癌細胞の増殖の阻害に対するｒ５Ｄ８の効果を示す。
【図９Ｂ】第１７日での腫瘍の個々の測定値を示す。
【図１０Ａ】ＣＣＬ２２＋細胞の代表的な画像及び定量化を用いて、ＧＢＭの同所移植マウスモデルにおける腫瘍部位へのマクロファージ浸潤の減少を示す。
【図１０Ｂ】ヒト器官型組織片培養モデルにおけるマクロファージ極性化の減少を示す。代表的な画像（左）及び定量化（右）が示されている。
【図１０Ｃ】ＣＣＬ２２＋細胞の代表的な画像及び定量化を用いて、卵巣癌の同系移植マウスモデルにおける腫瘍部位へのマクロファージ極性化の減少を示す。
【図１０Ｄ】ＣＣＬ２２＋細胞の代表的な画像及び定量化を用いて、結腸直腸癌の同系移植マウスモデルにおける腫瘍部位へのマクロファージ浸潤の減少を示す。
【図１１Ａ】ｒ５Ｄ８での治療後の卵巣癌の同系移植マウスモデルにおける非骨髄性エフェクター細胞の増加を示す。
【図１１Ｂ】ｒ５Ｄ８での治療後の結腸直腸癌の同系移植マウスモデルにおける非骨髄性エフェクター細胞の増加を示す。
【図１１Ｃ】ｒ５Ｄ８での治療後のＮＳＣＬＣ癌のマウスモデルにおけるＣＤ４＋ＴＲＥＧ細胞のパーセンテージの低下を示す。
【図１２】抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８枯渇抗体の存在又は非存在下で腹腔内に投与されるＰＢＳ（対照）又はｒ５Ｄ８で週２回治療された、ＣＴ２６腫瘍を有するマウスからのデータを示す。このグラフは、平均腫瘍体積＋ＳＥＭとして表される第１３日での個々の腫瘍測定値を示す。群間の統計的有意差は、対応のないノンパラメトリックなマン・ホイットニーのＵ検定によって決定した。Ｒ５Ｄ８は、ＣＴ２６腫瘍の増殖を阻害した（＊ｐ＜０．０５）。ｒ５Ｄ８による腫瘍増殖阻害は、抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８枯渇抗体の存在下で有意に低下した（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図１３Ａ】ＬＩＦとの複合体におけるｈ５Ｄ８  Ｆａｂの共結晶構造の全体像を図示する。ｇｐ１３０相互作用部位の位置を、ＬＩＦの表面上に示す（濃く色付けされている）。
【図１３Ｂ】塩橋を形成する残基と１００Å２を超える埋没した表面積を有するｈ５Ｄ８残基を示す、ＬＩＦとｈ５Ｄ８との間の詳細な相互作用を図示する。
【図１４Ａ】５つのｈ５Ｄ８  Ｆａｂ結晶構造の重ね合わせを図示し、また、異なる化学的条件で結晶化されているにもかかわらず高度の類似性を示す。
【図１４Ｂ】不対のＣｙｓ１００によって媒介されるファンデルワールス相互作用の広範なネットワークを図示する。この残基は、秩序立っており、ＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ３の立体構造を形作るのに加わり、所望されないジスルフィドスクランブリングには関与しない。残基間の距離は、破線として示され、標識が付けられている。
【図１５Ａ】ＥＬＩＳＡによる、ｈ５Ｄ８  Ｃ１００変異体のヒトＬＩＦへの結合を図示する。
【図１５Ｂ】ＥＬＩＳＡによる、ｈ５Ｄ８  Ｃ１００変異体のマウスＬＩＦへの結合を図示する。
【図１６Ａ】Ｏｃｔｅｔによって、ｈ５Ｄ８が、ＬＩＦとＬＩＦＲとの間の結合を阻止しないことを示す。ｈ５Ｄ８のＬＩＦへの結合の後、ＬＩＦＲへの連続した結合が続く。
【図１６Ｂ−１６Ｃ】固定化されたＬＩＦＲ又はｇｐ１３０に対するＬＩＦ／ｍＡｂ複合体結合のＥＬＩＳＡ分析を図示する。固定化されたＬＩＦＲ（図１６Ｂ）又はｇｐ１３０（図１６Ｃ）コーティングプレートと結合するｍＡｂ／ＬＩＦ複合体の抗体部分を検出する、種特異的なペルオキシダーゼ結合抗ＩｇＧ抗体（（−）及びｈ５Ｄ８については抗ヒト、ｒ５ｄ８及びＢ０９については抗ラット）のシグナル。
【図１７Ａ−１７Ｂ】７２個の異なるヒト組織におけるＬＩＦ（図１６Ａ）又はＬＩＦＲ（図１６Ｂ）のｍＲＮＡ発現を図示する。
【図１８】高、中−高、中−低、及び低レベルに層別化される、異なる癌型におけるｍＲＮＡ発現レベルを示す。発現データは、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓから収集された２２種の適応症から収集された７，７６９本の試料にわたって測定されるＬＩＦ転写物レベルを表し、データセットを通して４分割することによって閾値設定される。
【図１９Ａ】ＬＩＦ  ｍＲＮＡレベルとＣＣＬ７  ｍＲＮＡレベルとの相関（ｒ２）を示す。各適応症についての試料を、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓから入手し、ＬＩＦとＣＣＬ７との間の関連を、ピアソン相関によって評価した。
【図１９Ｂ】ＬＩＦ  ｍＲＮＡレベルとＣＣＬ２  ｍＲＮＡレベルとの相関（ｒ２）を示す。各適応症についての試料を、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓから入手し、ＬＩＦとＣＣＬ２との間の関連を、ピアソン相関によって評価した。
【図１９Ｃ】ＬＩＦ  ｍＲＮＡレベルとＣＣＬ３  ｍＲＮＡレベルとの相関（ｒ２）を示す。各適応症についての試料を、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓから入手し、ＬＩＦとＣＣＬ３との間の関連を、ピアソン相関によって評価した。
【図１９Ｄ】ＬＩＦ  ｍＲＮＡレベルとＣＣＬ２２  ｍＲＮＡレベルとの相関（ｒ２）を示す。各適応症についての試料を、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓから入手し、ＬＩＦとＣＣＬ２２との間の関連を、ピアソン相関によって評価した。
【図２０Ａ】ＬＩＦ  ｍＲＮＡレベルと、ＩＩ型マクロファージ（Ｍ２）に典型的な発現特性との相関（ｒ２）を示す。
【図２０Ｂ】ＧＢＭ及び卵巣癌における、ＬＩＦと、ＣＤ１６３、ＣＤ２０６、及びＣＣＬ２発現との間の相関を示す。回帰プロットは、ＧＢＭ及び卵巣癌（ＯＶ）ＴＣＧＡ腫瘍コホートにおける（ｌｏｇ２  ＲＳＥＭにおける）、ＬＩＦと、ＣＤ１６３、ＣＤ２０６、ＣＣＬ２発現との間のものである。
【図２０Ｃ】２０個のＧＢＭ腫瘍からの示されたマーカーのＩＨＣの相関を示す。Ｒ二乗係数（Ｒ２）を用いて、ＬＩＦと、ＣＣＬ２、ＣＤ２０６、ＣＤ１６３、及びＣＸＣＬ９との間の相関が示される。
【図２０Ｄ】抗ＬＩＦで治療された又は治療されていないＧＬ２６１Ｎ腫瘍からのＴＡＭ（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ−Ｌｙ６Ｃ−）におけるＣＣＬ２＋及びＣＸＣＬ９＋のパーセンテージ及び平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。
【図２０Ｅ】ＴＡＭマーカー陽性細胞に対するダブルポジティブ細胞のパーセンテージを示す。ＣＸＣＬ９定量化は、総細胞数に対するものである。
【図２０Ｆ】ＴＡＭ（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ−Ｌｙ６Ｃ−）におけるＣＣＲ２、ＣＸＣＲ３、及びＬＩＦＲ受容体のパーセンテージを示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋）集団は、フローサイトメトリーによって決定した。データは、平均値±ＳＥＭとして示される。マン・ホイットニーＴ検定による統計解析。＊Ｐ＜０．０５。
【図２０Ｇ】ＣＸＣＬ９−／−及びＣＣＬ２−／−マウス又は示された抗体で治療されたマウスにおけるＧＬ２６１Ｎの腫瘍増殖が、全光束（ｐ／ｓ）として示されることを示す。
【図２０Ｈ】示された治療における腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞の増大（倍）（ＦＩ）を示す。データは、平均値±ＳＥＭである。マン・ホイットニーＴ検定による統計解析。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図２０Ｉ】Ｉｂａ１＋細胞に対するダブルポジティブ細胞のパーセンテージ、及び１０ｊ．ｔｇ／ｍｌ抗ＬＩＦと共に３日間インキュベートされたＧＢＭ器官型切片（患者１、２、３）におけるＣＸＣＬ９＋細胞の総細胞数に対するパーセンテージを示す。データは、すべての患者の平均±ＳＥＭである。マン・ホイットニーＴ検定による統計解析。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図２０Ｊ】全腫瘍ライセート（ｎ＝８）のｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、終点でのＣＴ２６腫瘍におけるＭ１及びＭ２遺伝子の転写物レベルを示す。データは、ＩｇＧ１対照で治療された腫瘍（Ｈｐｒｔ、Ｔｂｐ、Ｔｆｒｃ）の平均に対する変化（倍）として表される。
【図２０Ｋ】ｐａｎ骨髄細胞集団（ＣＤ４５＋細胞におけるＣＤ１１ｂ＋）、ＴＡＭ（ＣＤ４５＋細胞におけるＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６ＣｌｏｗＦ４／８０＋）、ＭＨＣ  ＩＩ＋ＴＡＭ（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６ＣｌｏｗＦ４／８０＋細胞におけるＭＨＣ  ＩＩ＋）、及びＴＡＭにおけるＭＨＣ  ＩＩ発現の定量化を示す。データは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．として示される（ｎは各実験について示される）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図２１Ａ−Ｂ】フローサイトメトリーによる（図２１Ａ）、及び蛍光キャリブレーションビーズに対する補間によって定量化される（図２１Ｂ）、３人の異なるドナーからの初代単球から分化した初代マクロファージ上のＬＩＦ受容体のレベルを示す。
【図２２】７２時間のＬＩＦ治療（２０ｎＭ）に反応する、初代Ｍ０マクロファージにおけるＣＤ２０６及びＣＤ１６３の増大を示す。
【図２３】Ｍ０マクロファージにおける、及びＭ１及びＭ２マクロファージ（右下隅）における、ＬＩＦ治療（２０ｎＭ）に反応するＣＣＬ２２分泌の増大を示す。
【図２４】フローサイトメトリーによって決定される、漿液性卵巣癌、ステージＩＩＩ−Ｃ（２人の異なるドナー、左の２つのパネル）、及び肺腺癌、ステージＩＩＩ−Ａ（２人の異なるドナー、右の２つのパネル）からの腫瘍関連マクロファージ上のＬＩＦ受容体発現を示す。対照プロットは、蛍光色素を１つ除いた（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｍｉｎｕｓ  ｏｎｅ）（ＦＭＯ）対照である。
【図２５】フローサイトメトリーによって決定される、漿液性卵巣癌、ステージＩＩＩ−Ｃ（２人の異なるドナー、左の２つのパネル）、及び肺腺癌、ステージＩＩＩ−Ａ（２人の異なるドナー、右の２つのパネル）からの腫瘍単球系の骨髄由来抑制細胞（ｍｙｅｌｏｉｄ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｃｅｌｌ）（Ｍ−ＭＤＳＣ）腫瘍多形核細胞系の（ｔｕｍｏｒ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ）骨髄由来抑制細胞（ＰＭＮ−ＭＤＳＣ）上のＬＩＦ受容体発現を示す。対照プロットは、蛍光色素を１つ除いた（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｍｉｎｕｓ  ｏｎｅ）（ＦＭＯ）染色である。試料は、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３３＋ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗに対してゲーティングを行う。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
一態様では、本明細書に記載されるのは、治療用抗白血病抑制因子（ＬＩＦ）抗体で、癌を有する個人を治療する方法であって、個人からの生体試料中の基準レベルを超えるＬＩＦのレベルを決定することと、ＬＩＦのレベルがＬＩＦの基準レベルを超える場合に治療量の抗ＬＩＦ抗体を個人に投与することとを含む方法である。
【００１５】
別の態様では、本明細書に記載されるのは、治療用抗白血病抑制因子（ＬＩＦ）抗体で、癌を有する個人を治療する方法であって、個人からの生体試料中の基準レベルを超えるＬＩＦのレベルを決定することと、治療量の抗ＬＩＦ抗体を投与することとを含む方法である。
【００１６】
別の態様では、本明細書に記載されるのは、治療用抗白血病抑制因子（ＬＩＦ）抗体で、癌を有する個人を治療する方法であって、個人からの生体試料中の基準レベルを超える白血病抑制因子受容体（ＬＩＦＲ）のレベルを決定することと、ＬＩＦＲのレベルがＬＩＦＲの基準レベルを超える場合に治療量の抗ＬＩＦ抗体を個人に投与することとを含む方法である。
【００１７】
別の態様では、本明細書に記載されるのは、治療用抗白血病抑制因子（ＬＩＦ）抗体で、癌を有する個人を治療する方法であって、個人からの生体試料中の基準レベルを超える白血病抑制因子受容体（ＬＩＦＲ）のレベルを決定することと、治療量の抗ＬＩＦ抗体を個人に投与することとを含む方法である。
【００１８】
本明細書で使用する場合、用語「個人」、「患者」、又は「対象」は、癌、腫瘍、又は新生物と診断された、又は癌、腫瘍、又は新生物を患っている疑いがある、又は癌、腫瘍、又は新生物を発症するリスクがある個人を指す。ある種の実施形態では、個人は、哺乳類である。ある種の実施形態では、哺乳類は、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ラマ、アルパカ、又はヤクである。ある種の実施形態では、個人は、ヒトである。
【００１９】
本明細書で使用する場合、他に指示されない限り、用語「免疫調節分子」は、限定はされないが、免疫抑制性ケモカイン、免疫抑制性サイトカイン、又はチェックポイント阻害剤分子を含めた、自然及び／又は適応免疫系を調節する又は調節を引き起こす、腫瘍又は腫瘍微小環境に存在するあらゆる分子、ポリペプチド、又はタンパク質を指す。免疫調節分子は、免疫調節細胞、腫瘍／癌細胞、又は間質細胞によって産生され得る。免疫調節分子としては、非限定的な例として、ＣＣＬ７、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ２２、ＭＨＣＩＩ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＲ３、及びＰＤ−Ｌ１が挙げられる。
【００２０】
本明細書で使用する場合、他に指示されない限り、用語「免疫調節細胞」は、免疫調節因子を産生する能力を有する、免疫系のあらゆる細胞を指し、樹状細胞、マクロファージ、腫瘍関連マクロファージ、Ｉ型マクロファージ、ＩＩ型マクロファージ、骨髄由来抑制細胞、腫瘍多形核細胞系の骨髄由来抑制細胞（ＰＭＮ−ＭＤＳＣ）、ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、活性化Ｔ細胞、抗原曝露歴のあるＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞などが含まれる。
【００２１】
本明細書で使用する場合、他に指示されない限り、用語「抗体」には、抗体の抗原結合断片、すなわち、全長抗体によって結合される抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体断片、例えば、１つ以上のＣＤＲ領域を保持する断片が含まれる。抗体断片の例としては、限定はされないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；二重特異性抗体；線状抗体；重鎖抗体、単鎖抗体分子、例えば単鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）、ナノボディ、及び二重特異性抗体などの別の特異性を有する抗体断片から形成される多特異性抗体が挙げられる。ある種の実施形態では、抗体は、その抗体に対する個人の免疫応答を低下させるようにヒト化されている。例えば、抗体は、キメラ、例えばヒト定常領域を有する非ヒト可変領域、又はＣＤＲグラフトされたもの、例えばヒト定常領域及び可変領域のフレームワーク配列を有する非ヒトＣＤＲ領域であり得る。ある種の実施形態では、抗体は、ヒト化後に脱免疫原性化される。脱免疫原性化は、抗体の定常領域内の１つ以上のＴ細胞エピトープを除去する又は変異させることを含む。ある種の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、モノクローナルである。本明細書で使用する場合、「組換え抗体」は、２つの異なる種又は２つの異なる供給源由来のアミノ酸配列を含む抗体であり、合成の分子、例えば、非ヒトＣＤＲ及びヒトフレームワーク又は定常領域を含む抗体が含まれる。ある種の実施形態では、本発明の組換え抗体は、組換えＤＮＡ分子から産生される、又は合成される。用語「癌」及び「腫瘍」は、無秩序な細胞増殖を特徴とする、哺乳類における生理学的状態に関する。癌は、一群の細胞が、制御されない増殖又は望まれない増殖を呈する類の疾患である。癌細胞は、他の位置に拡散する可能性もあり、これが、転移の形成をもたらす可能性がある。体内の癌細胞の拡散は、例えば、リンパ又は血液を介して起こる可能性がある。制御されない増殖、侵入、及び転移形成は、癌の悪性特性とも呼ばれる。これらの悪性特性は、癌を、一般的には浸潤も転移もしない良性腫瘍と区別する。
【００２２】
本明細書で使用する場合、「治療用抗体」は、個人に投与され、且つ癌の治療に有用な１つ以上の有益な効果をもたらすことが意図されるものである。本開示の治療用抗体には、ｈ５Ｄ８と同一のＣＤＲ配列、重鎖及び／又は軽鎖免疫グロブリン可変領域、若しくは完全な免疫グロブリン重鎖及び軽鎖、又はｈ５Ｄ８とは異なるが類似の結合特性（エピトープ、親和性、又は生物学的効果）を有するＣＤＲを有し、且つ癌の治療に有用な１つ以上の有益な効果をもたらすことができる抗体が含まれる。
【００２３】
本明細書で使用する場合、「治療量」は、癌を治療するのに有用な１つ以上の有益な効果をもたらすことが意図される治療用抗体の投薬量である。いくつかの具体的な治療量を、本明細書で詳細に論じる。
【００２４】
本明細書で使用する場合、「を治療すること」又は「治療」は、１つ以上の有益な効果を生じることが意図される病的状態への介入を指す。癌／腫瘍のためには、治療には、病態安定、部分応答、完全寛解、無増悪生存期間の延長、全生存期間の延長、腫瘍縮小、腫瘍増殖の遅延、腫瘍増殖の停止、又は転移の予防若しくは低下をもたらす又は確かにもたらすことを目的とする方法が含まれる。ある種の場合では、本明細書に記載される治療方法は、成功裏の治療後の維持として、又は特定の腫瘍若しくは癌の再発若しくは転移を予防するために使用することができる。すべての個人が、治療用抗体の所与の投与に対して、同程度に反応する又は全く反応しないこととなるわけではないが、たとえ反応が検出されないとしても、これらの個人は治療されているとみなされることが理解されよう。
【００２５】
本明細書で使用する場合、「バイオマーカー」は、その存在がその個人の病的状態を示す、個人における測定可能な分子である。限定はされないが、バイオマーカーは、例えば、タンパク質及びその翻訳後修飾物、ポリペプチド、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アミノ酸、脂肪酸、脂質、ステロール、炭水化物、又はアミノ酸、脂肪酸、脂質、ステロール、及び炭水化物の代謝産物及び代謝中間体を含む。
【００２６】
本明細書で使用する場合、「ＩＨＣスコア」は、検査試料におけるＬＩＦ又はＬＩＦ受容体発現レベルを定量化するために使用されるパラメータに関する。試料におけるＩＨＣスコアは、試料を、免疫組織化学を使用して抗ＬＩＦ又はＬＩＦ受容体特異的抗体で染色することによって決定される。各腫瘍細胞には、染色なしに対する０から最も強い染色に対する３＋までの範囲の強度レベルが与えられ、中程度に染色している細胞については２＋、及び弱く染色している細胞については１＋である。次いで、ＩＨＣスコアを、次の式：
［１×（１＋の細胞（％））＋２×（２＋の細胞（％））＋３×（３＋の細胞（％））］
によって算出することができる。
ＩＨＣスコアは、１から３００までの範囲であり得る。試料におけるＩＨＣスコアを、直接的に使用して、ＬＩＦ発現レベルに関する指標を提供することもできるし、基準のＩＨＣスコア値と比較して、個人が抗ＬＩＦ治療用抗体での治療に反応したかどうかについての指標を提供することもできる。
【００２７】
本明細書で使用する場合、「免疫組織化学」又は「ＩＨＣ」は、組織又は細胞の試料中のある種の抗原（バイオマーカー）について試験するために抗体、親和性分子、及び染料を使用する臨床検査を指す。抗体は、酵素又は蛍光色素と結合させることができる。ＩＨＣは、組織又は細胞構造、例えば核又は細胞膜染色をさらに生じる他の非抗体染色又は方法と組み合わせることができる。ＩＨＣは、ホルマリン固定パラフィン包埋された又は凍結された組織又は生検試料に対して実施することができる。ＩＨＣはまた、懸濁液中の細胞に対しても実施することができ、その後、細胞を遠心沈殿させる又は顕微鏡のスライドガラス若しくはカバーガラスに付着させる。ＩＨＣ試料は、可視光での顕微鏡観察若しくは画像化又は蛍光での顕微鏡観察若しくは画像化によって適切に分析することができる。定量化は、手作業で又はコンピュータプログラム（例えば、Ｉｍａｇｅ  Ｊ）によって実施することができる。
【００２８】
本明細書で使用する場合、「基準レベル」は、個人から得られた試料から得られた値又はデータを評価するために参照基準として使用される、あらかじめ定められた基準に関する。基準レベルは、絶対値；相対値；上限又は下限を有する値；値の範囲；平均値（ａｖｅｒａｇｅ  ｖａｌｕｅ）；中央値；平均値（ｍｅａｎ  ｖａｌｕｅ）；又は特定の対照若しくはベースライン値と比較された値であり得る。基準レベルは、例えば検査される対象からのより早い時点での試料から得られた値などの、個々の試料の値に基づくものであり得る。基準レベルは、同様の暦年齢、性別、病態、又は他に対応する群の対象の集団からのものなどの多数の試料に基づくもの、又は検査されることとなる試料が含められた又は除外された試料のプールに基づくものであり得る。基準レベルは、癌を患っている異なる個人から得られた典型的な数の癌／腫瘍試料から決定することもできる。基準レベルは、癌を患っている又は癌を患っていない個人からの生体試料から決定することもできる。癌を患っている又は癌を患っていない個人からのこれらの生体試料は、例えば、組織生検試料、血液、血漿、血清、糞便試料、尿、脳脊髄液、パップスメア、又は精液を含むことができる。代表的な試料は、少なくとも５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００又はそれ以上の個人、又は個人からの癌／腫瘍生体試料からの測定を含むことができる。
【００２９】
参照ポリペプチド又は抗体配列に関する配列同一性のパーセント（％）は、配列同一性の最大のパーセントを得るために、必要であれば配列を整列させてギャップを導入した後の、且つ配列同一性の一部としてのいかなる保存的置換も考慮しない、参照ポリペプチド又は抗体配列内のアミノ酸残基と同一である、候補配列内のアミノ酸残基のパーセンテージである。アミノ酸配列同一性のパーセントを決定する目的のアラインメントは、公知である様々な方式で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、実現することができる。比較される配列の全長にわたる最大アラインメントを実現するために必要とされるアルゴリズムを含めた、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することが可能である。しかし、本明細書の目的では、アミノ酸配列同一性の値（％）は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用してもたらされる。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって作成され、ソースコードは、Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  Ｏｆｆｉｃｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，２０５５９に、ユーザ文書と共に保管されており、ここでは、これは、Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．から公的に利用可能であるし、ソースコードからコンパイルすることもできる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ｄｉｇｉｔａｌ  ＵＮＩＸ  Ｖ４．０Ｄを含めたＵＮＩＸオペレーティングシステムでの使用のためにコンパイルされるべきである。すべての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変更しない。
【００３０】
ＡＬＩＧＮ−２が、アミノ酸配列比較のために用いられる場合、所与のアミノ酸配列Ｂに対する、アミノ酸配列Ｂとの、又はアミノ酸配列Ｂと対照する、所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性（％）（これは、代わりに、所与のアミノ酸配列Ｂに対して、アミノ酸配列Ｂと、又はアミノ酸配列Ｂと対照して、あるアミノ酸配列同一性（％）を有する又は含む所与のアミノ酸配列Ａと表現することもできる）は、次の通りに算出される：１００×分数Ｘ／Ｙ（ここでは、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２によって、ＡとＢのプログラムのアラインメントについて同一のマッチとして記録されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の総数である）。アミノ酸配列Ａの長さが、アミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列同一性（％）は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性（％）と等しくないこととなるということを理解されたい。他に具体的に規定されない限り、本明細書で使用されるすべてのアミノ酸配列同一性の値（％）は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して、直前の段落に記載した通りに得られる。
【００３１】
用語「エピトープ」には、抗体などの抗原結合タンパク質によって結合されることが可能であるあらゆる決定基が含まれる。エピトープは、その抗原を標的にする抗原結合タンパク質によって結合される抗原の領域であり、抗原がタンパク質である場合、抗原結合タンパク質と直接的に接触する特異的なアミノ酸が含まれる。エピトープは、タンパク質上に存在することが最も多いが、糖類又は脂質などの他の種類の分子上に存在する場合もあり得る。エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、又はスルホニル基などの分子の、化学的に活性な表面集団（ｇｒｏｕｐｉｎｇ）を含むことができ、特異的な三次元構造特性及び／又は特異的な電荷特性を有することができる。一般に、特定の標的抗原に特異的な抗体は、タンパク質及び／又は高分子の複合混合物における標的抗原上のエピトープを優先的に認識することとなる。ある種の実施形態では、本明細書に開示した抗体は、線状配列のアミノ酸を認識する。ある種の実施形態では、本明細書に開示した抗体は、立体構造（非線状）配列のアミノ酸を認識する。
【００３２】
本明細書に記載される抗体の構造的特質
相補性決定領域（「ＣＤＲ」）は、主として抗体の抗原結合特異性の原因である、免疫グロブリン（抗体）可変領域の一部である。ＣＤＲ領域は、抗体が同じ標的又はエピトープに特異的に結合する場合でも、抗体ごとに高度に変動する。重鎖可変領域は、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３と省略される３つのＣＤＲ領域を含み；軽鎖可変領域は、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３と省略される３つのＣＤＲ領域を含む。これらのＣＤＲ領域は、可変領域内に連続して並んでおり、ＣＤＲ１が最もＮ末端側であり、ＣＤＲ３が最もＣ末端側である。ＣＤＲは、構造に寄与し且つＣＤＲ領域よりもかなり低い変動性を呈するフレームワーク領域の間に挿入されている。重鎖可変領域は、ＶＨ−ＦＲ１、ＶＨ−ＦＲ２、ＶＨ−ＦＲ３、及びＶＨ−ＦＲ４と省略される４つのフレームワーク領域を含み；軽鎖可変領域は、ＶＬ−ＦＲ１、ＶＬ−ＦＲ２、ＶＬ−ＦＲ３、及びＶＬ−ＦＲ４と省略される４つのフレームワーク領域を含む。２本の重鎖と軽鎖を含む完全なフルサイズの二価抗体は、３つの特有の重鎖ＣＤＲと３つの特有の軽鎖ＣＤＲを含む１２個のＣＤＲ；４つの特有の重鎖ＦＲ領域と４つの特有の軽鎖ＦＲ領域を含む１６個のＦＲ領域を含むこととなる。ある種の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、３つの重鎖ＣＤＲを最小限含む。ある種の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、３つの軽鎖ＣＤＲを最小限含む。ある種の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲを最小限含む。所与のＣＤＲ又はＦＲの厳密なアミノ酸配列の境界は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１），“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，アメリカ国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ），Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（「Ｋａｂａｔ」ナンバリングスキーム）；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）ＪＭＢ  ２７３，９２７−９４８（「Ｃｈｏｔｈｉａ」ナンバリングスキーム）；ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（１９９６），“Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：Ｃｏｎｔａｃｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ，”（「Ｃｏｎｔａｃｔ」ナンバリングスキーム）；Ｌｅｆｒａｎｃ  ＭＰ  ｅｔ  ａｌ．，”ＩＭＧＴ  ｕｎｉｑｕｅ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ａｎｄ  Ｉｇ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  Ｖ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎｓ，”Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００３  Ｊａｎ；２７（１）：５５−７７（「ＩＭＧＴ」ナンバリングスキーム）；及びＨｏｎｅｇｇｅｒ  Ａ  ａｎｄ  Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ  Ａ，“Ｙｅｔ  ａｎｏｔｈｅｒ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｓｃｈｅｍｅ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ：ａｎ  ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｏｏｌ，”Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２００１  Ｊｕｎ  ８；３０９（３）：６５７−７０，（「Ａｈｏ」ナンバリングスキーム）によって記載されているものを含めた、いくつかの周知のスキームのいずれかを使用して容易に決定することができる。ＣＤＲは、異なるナンバリングシステムを使用して、本明細書ではＫａｂａｔ、ＩＭＧＴ、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングシステム、又は３つの任意の組み合わせを用いて提供される可変の配列から、本明細書で特定される。所与のＣＤＲ又はＦＲの境界は、特定のために使用されるスキームに応じて変わり得る。例えば、Ｋａｂａｔスキームは、構造アラインメントに基づいているのに対して、Ｃｈｏｔｈｉａスキームは、構造情報に基づいている。ＫａｂａｔスキームとＣｈｏｔｈｉａスキームのどちらについてのナンバリングも、いくつかの抗体に現れる、挿入（挿入文字、例えば「３０ａ」によって対応される）及び欠失と共に、最も一般的な抗体領域配列長に基づいている。２つのスキームは、ある種の挿入及び欠失（「インデル」）を、異なる位置に配置し、その結果、異なるナンバリングがもたらされる。Ｃｏｎｔａｃｔスキームは、複合体結晶構造の解析に基づいており、多くの点でＣｈｏｔｈｉａナンバリングスキームと似ている。ある種の実施形態では、本明細書に開示した可変領域から定義されるＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ、Ｃｏｎｔａｃｔ、若しくはＡｈｏ方法、又はその任意の組み合わせに従って定義されるものを含む。
【００３３】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体が抗原に結合することに関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、一般に、類似の構造を有し、各ドメインは、４つの保存されるフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つのＣＤＲを含む（例えば、Ｋｉｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，ｐａｇｅ  ９１（２００７）を参照されたい）。たった１つのＶＨ又はＶＬドメインが、抗原結合特異性を与えるのに十分であり得る。さらに、特定の抗原と結合する抗体を、抗原と結合する抗体由来のＶＨ又はＶＬドメインを使用して単離して、それぞれ相補的ＶＬ又はＶＨドメインのライブラリをスクリーニングすることができる（例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０−８８７（１９９３）；Ｃｌａｒｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３５２：６２４−６２８（１９９１）を参照されたい）。ある種の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ラット起源の可変領域を含む。ある種の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ラット起源のＣＤＲを含む。ある種の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、マウス起源の可変領域を含む。ある種の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、マウス起源のＣＤＲを含む。
【００３４】
例えば抗体親和性を向上させるために、ＣＤＲに変更（例えば置換）を施すことができる。こうした変更は、体細胞成熟中に高い変異率を有するＣＤＲコードコドンに施すことができ（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９−１９６（２００８）を参照されたい）、得られたバリアントを、結合親和性について試験することができる。親和性成熟（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、ＣＤＲのランダム化、又はオリゴヌクレオチド指定変異誘発を使用する）を使用して、抗体親和性を向上させることができる（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（２００１）を参照されたい）。抗原結合に関与するＣＤＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発又はモデリングを使用して、具体的に特定することができる（例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９）を参照されたい）。具体的には、ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３が、しばしば標的にされる。或いは、又はさらに、抗原−抗体複合体の結晶構造を解析して、抗体と抗原の間の接触点が特定される。こうした接触残基及び隣接残基は、置換のための候補として標的にする又は排除することができる。バリアントをスクリーニングして、そのバリアントが所望される特性を含有するかどうかを決定することができる。
【００３５】
ある種の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、可変領域に加えて定常領域を含む。重鎖定常領域（ＣＨ）は、完全な重鎖ポリペプチドのＣ末端、可変領域に対してＣ末端側に位置する、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４と省略される４つのドメインを含む。軽鎖定常領域（ＣＬ）は、ＣＨよりもかなり小さく、完全な軽鎖ポリペプチドのＣ末端、可変領域に対してＣ末端側に位置する。定常領域は、高度に保存され、わずかに異なる機能及び特性と関連する異なるアイソタイプを含む。ある種の実施形態で定常領域は、標的抗原への抗体結合にとって不必要である。ある種の実施形態では、抗体の定常領域、重鎖と軽鎖は両方とも、抗体結合にとって不必要である。ある種の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、１つ以上の軽鎖定常領域、重鎖定常領域、又はこれらの両方を欠いている。最も多いモノクローナル抗体は、ＩｇＧアイソタイプのものであり；これは、さらに、４つのサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４に分類される。ある種の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、あらゆるＩｇＧサブクラスを含む。ある種の実施形態では、ＩｇＧサブクラスは、ＩｇＧ１を含む。ある種の実施形態では、ＩｇＧサブクラスは、ＩｇＧ２を含む。ある種の実施形態では、ＩｇＧサブクラスは、ＩｇＧ３を含む。ある種の実施形態では、ＩｇＧサブクラスは、ＩｇＧ４を含む。
【００３６】
抗体は、補体及びＦｃ受容体への結合を担うフラグメント結晶化可能領域（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）（Ｆｃ領域）を含む。Ｆｃ領域は、抗体分子のＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４領域を含む。抗体のＦｃ領域は、補体及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の活性化を担う。Ｆｃ領域はまた、抗体の血清半減期に寄与する。ある種の実施形態では、本明細書に記載される治療用抗体のＦｃ領域は、補体介在性の細胞溶解を促進する１つ以上のアミノ酸置換を含む。ある種の実施形態では、本明細書に記載される治療用抗体のＦｃ領域は、ＡＤＣＣを促進する１つ以上のアミノ酸置換を含む。ある種の実施形態では、本明細書に記載される治療用抗体のＦｃ領域は、補体介在性の細胞溶解を減少させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。ある種の実施形態では、本明細書に記載される治療用抗体のＦｃ領域は、抗体のＦｃ受容体への結合を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。ある種の実施形態では、Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）、又はこれらのあらゆる組み合わせを含む。ある種の実施形態では、本明細書に記載される治療用抗体のＦｃ領域は、抗体の血清半減期を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。ある種の実施形態では、治療用抗体の血清半減期を増大させる１つ以上のアミノ酸置換は、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する抗体の親和性を増大させる。
【００３７】
診療現場において有用な抗体は、ヒト個人における免疫原性を低下させるために、しばしば「ヒト化」されている。ヒト化抗体は、モノクローナル抗体療法の安全性及び有効性を向上させる。ある一般的なヒト化の方法は、いずれかの好適な動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター）においてモノクローナル抗体を産生し、定常領域をヒト定常領域と置き換えることであり、このようにして遺伝子操作で作られた抗体は、「キメラ」と称される。別の一般的な方法は、非ヒトＶ−ＦＲをヒトＶ−ＦＲと置き換える「ＣＤＲグラフティング」である。ＣＤＲグラフティング方法では、ＣＤＲ領域を除くすべての残基が、ヒト起源のものである。ある種の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ヒト化されている。ある種の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、キメラである。ある種の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ＣＤＲグラフトされている。
【００３８】
治療用抗ＬＩＦ抗体での治療を決定する方法
本明細書に記載されるのは、個人からの試料中のバイオマーカーのレベルが基準レベルを超える場合に、治療用抗ＬＩＦ抗体で個人を治療することを含む方法である。試料は、血液試料、血漿試料、血清試料、尿試料、糞便試料、又は組織試料、例えば疑われている又は分かっている腫瘍からの組織生検試料などを含むことができる。バイオマーカーは、ＬＩＦ、ＬＩＦ受容体、ＩＩ型マクロファージ（Ｍ２）細胞のマーカー、制御性Ｔ細胞のマーカー、活性化Ｔ細胞、抗原曝露歴のあるＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、免疫抑制性サイトカイン、若しくは免疫抑制性ケモカイン、若しくはリン酸化ＳＴＡＴ３、又はあらゆる他の免疫調節分子を含むことができる。バイオマーカーのレベルは、あらゆる一般的に使用される分子又は細胞技術、例えば、限定はされないが：半定量的ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、若しくはＲＮＡ−ｓｅｑによるｍＲＮＡ定量化；又はウエスタンブロット、フローサイトメトリー、マスサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光、若しくは均一系による（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）タンパク質定量化アッセイ（例えば、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標））によるタンパク質定量化などによって決定することができる。ある種の実施形態では、バイオマーカーは、ある種のバイオマーカーに対して特異的な抗体を使用する免疫組織化学によって決定される。免疫組織化学は、個人からの生検試料又は血液試料に対して実施することができる。免疫組織化学を使用して、ある種のタンパク質についてのＩＨＣスコアを決定し、基準レベル又は対照試料と比較することができる。さらに、治療法決定の情報を与えるために、バイオマーカーの組み合わせのタンパク質、ｍＲＮＡ、又はＤＮＡレベルを決定することができる。
【００３９】
ある種の実施形態では、バイオマーカーは、ＬＩＦである。ある種の実施形態では、この開示の抗体で治療される個人は、ＬＩＦ陽性の腫瘍／癌を有する場合に治療について選択されている。ある種の実施形態では、腫瘍は、ＬＩＦ陽性である、又は上昇したレベルのＬＩＦを生じる。ある種の実施形態では、ＬＩＦ陽性は、基準値、又は一連の病理学的基準と比較して決定される。ある種の実施形態では、ＬＩＦ陽性腫瘍は、その腫瘍が由来する非形質転換細胞よりも２倍、３倍、５倍、１０倍、１００倍大きい、又はそれよりも大きいＬＩＦを発現する。ある種の実施形態では、腫瘍は、ＬＩＦの異所性発現を獲得している。
【００４０】
ＬＩＦタンパク質レベルは、免疫組織化学を使用して、定量的に又は半定量的に決定することができる。ある種の実施形態では、ＬＩＦ  ＩＨＣスコアは、個人からの試料において算出することができ、ＩＨＣスコアが、約１、５、１０、２５、５０、７５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、又は２５０である又はこれらを超えるならば、治療用抗ＬＩＦ抗体が、個人に投与される。ある種の実施形態では、治療用抗体は、ｈ５Ｄ８又はその抗原結合断片である。ある種の実施形態では、試料は、組織試料又は組織生検試料である。ある種の実施形態では、ＬＩＦ陽性細胞のパーセンテージは、個人からの試料において決定することができ、ＬＩＦ陽性細胞のパーセンテージが、１％、２％、３％．  ４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％を超えるならば、治療用抗ＬＩＦ抗体が、個人に投与される。ある種の実施形態では、治療用抗体は、ｈ５Ｄ８又はその抗原結合断片である。ある種の実施形態では、試料は、組織試料又は組織生検試料である。ＬＩＦ−ＩＨＣスコア基準レベルは、少なくともＮ本の試料の集団において観察されたレベルから得られる。ある種の実施形態では、Ｎは、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、又はそれ以上である。ある種の実施形態では、試料は、同様の型の癌（例えば、特定の癌についての基準レベルを定義すること）又はすべての癌（例えば、すべての癌についての基準レベルを定義すること）を含む。異なる型の癌は、ｈ５Ｄ８での成功裏の治療の可能性の増大を示す、異なる基準レベルを有する可能性があるので、ＬＩＦ  ＩＨＣスコアは、ある種の癌に特有であり得る。ある種の実施形態では、ＬＩＦ  ＩＨＣスコアは、非小細胞肺癌、卵巣癌、腎癌、膀胱癌、膵癌、前立腺癌、泌尿生殖器癌、婦人科癌、胃腸癌、内分泌系癌、多形神経膠芽腫、乳癌、黒色腫、結腸直腸癌、胆管癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、及び頭頸部扁平上皮癌のいずれか１つ以上に特有である。
【００４１】
ＬＩＦタンパク質レベルは、ＥＬＩＳＡに基づくアッセイを使用して、定量的に又は半定量的に決定することができる。ある種の実施形態では、ＬＩＦタンパク質量は、個人からの試料において決定することができ、タンパク質量が、１ピコグラム／ミリリットル（ｐｇ／ｍＬ）、２ｐｇ／ｍＬ、３ｐｇ／ｍＬ、４ｐｇ／ｍＬ、５ｐｇ／ｍＬ、６ｐｇ／ｍＬ、７ｐｇ／ｍＬ、８ｐｇ／ｍＬ、９ｐｇ／ｍＬ、１０ｐｇ／ｍＬ、２０ｐｇ／ｍＬ、３０ｐｇ／ｍＬ、４０ｐｇ／ｍＬ、５０ｐｇ／ｍＬ、６０ｐｇ／ｍＬ、７０ｐｇ／ｍＬ、８０ｐｇ／ｍＬ、９０ｐｇ／ｍＬを超えるならば、治療用抗ＬＩＦ抗体が、個人に投与される。ある種の実施形態では、治療用抗体は、ｈ５Ｄ８又はその抗原結合断片である。ある種の実施形態では、ＬＩＦタンパク質量は、個人からの試料において決定することができ、タンパク質量が、１００ｐｇ／ｍＬ）、２００ｐｇ／ｍＬ、３００ｐｇ／ｍＬ、４００ｐｇ／ｍＬ、５００ｐｇ／ｍＬ、６００ｐｇ／ｍＬ、７００ｐｇ／ｍＬ、８００ｐｇ／ｍＬ、９００ｐｇ／ｍＬ、１ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍＬ）、２ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬを超えるならば、治療用抗ＬＩＦ抗体が、個人に投与される。ある種の実施形態では、治療用抗体は、ｈ５Ｄ８又はその抗原結合断片である。ある種の実施形態では、ＬＩＦタンパク質量は、個人からの試料において決定することができ、タンパク質量が、１００ピコグラム／ミリリットル（ｐｇ／ｍＬ）、２００ｐｇ／ｍＬ、３００ｐｇ／ｍＬ、４００ｐｇ／ｍＬ、５００ｐｇ／ｍＬ、６００ｐｇ／ｍＬ、７００ｐｇ／ｍＬ、８００ｐｇ／ｍＬ、９００ｐｇ／ｍＬ、１ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍＬ）、２ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬを超えるならば、治療用抗ＬＩＦ抗体が、個人に投与される。ある種の実施形態では、治療用抗体は、ｈ５Ｄ８又はその抗原結合断片である。ある種の実施形態では、試料は、血液試料、血漿試料、又は血清試料である。ＥＬＩＳＡ基準レベルは、少なくともＮ本の試料の集団において観察されたレベルから得られる。ある種の実施形態では、Ｎは、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、又はそれ以上である。ある種の実施形態では、試料は、同様の型の癌（例えば、特定の癌についての基準レベルを定義すること）又はすべての癌（例えば、すべての癌についての基準レベルを定義すること）を含む。異なる型の癌は、ｈ５Ｄ８での成功裏の治療の可能性の増大を示す、異なる基準レベルを有する可能性があるので、ＬＩＦ  ＥＬＩＳＡ基準は、ある種の癌に特有であり得る。ある種の実施形態では、ＬＩＦ  ＥＬＩＳＡ基準は、非小細胞肺癌、卵巣癌、腎癌、膀胱癌、膵癌、前立腺癌、泌尿生殖器癌、婦人科癌、胃腸癌、内分泌系癌、多形神経膠芽腫、乳癌、黒色腫、結腸直腸癌、胆管癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、及び頭頸部扁平上皮癌のいずれか１つ以上に特有である。
【００４２】
ＬＩＦ  ｍＲＮＡレベルは、リアルタイムＰＣＲ又はＲＮＡ−ｓｅｑを使用して、定量的に又は半定量的に決定することができる。ある種の実施形態では、ＬＩＦ  ｍＲＮＡレベルを決定することができ、ＬＩＦ  ｍＲＮＡレベルが、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、又は７５パーセンタイルに相当するレベルを超えるならば、治療用抗ＬＩＦ抗体が、個人に投与される。ある種の実施形態では、治療用抗体は、ｈ５Ｄ８又はその抗原結合断片である。パーセンタイル基準は、少なくともＮ本の試料の集団において観察されたｍＲＮＡレベルに関する。ある種の実施形態では、Ｎは、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、又はそれ以上である。ある種の実施形態では、試料は、同様の型の癌（例えば、特定の癌についての基準レベルを定義すること）又はすべての癌（例えば、すべての癌についての基準レベルを定義すること）を含む。異なる型の癌は、ｈ５Ｄ８での成功裏の治療の可能性の増大を示す、異なる基準レベルを有する可能性があるので、ＬＩＦ  ｍＲＮＡ基準レベルは、ある種の癌に特有であり得る。ある種の実施形態では、ＬＩＦ  ｍＲＮＡ基準レベルは、非小細胞肺癌、卵巣癌、腎癌、膀胱癌、膵癌、前立腺癌、泌尿生殖器癌、婦人科癌、胃腸癌、内分泌系癌、多形神経膠芽腫、乳癌、黒色腫、結腸直腸癌、胆管癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、及び頭頸部扁平上皮癌のいずれか１つ以上に特有である。
【００４３】
ＬＩＦは、ＬＩＦ受容体及びｇｐ１３０への結合を介してシグナルを送る。ある種の実施形態では、本明細書に開示した抗体は、癌細胞上に直接的に、又は腫瘍関連骨髄細胞（例えば、マクロファージ若しくは骨髄由来抑制細胞）、間質細胞（癌関連線維芽細胞）、若しくは内皮細胞上に、ＬＩＦ受容体（ＣＤ１１８）を発現する腫瘍又は癌を治療するのに有用である。腫瘍関連マクロファージは、ＩＩ型マクロファージ（Ｍ２）などの特異的な免疫抑制性マクロファージであり得る。
【００４４】
ある種の実施形態では、バイオマーカーは、ＬＩＦ受容体である。ある種の実施形態では、この開示の抗体で治療される個人は、ＬＩＦ受容体陽性の腫瘍／癌を有する場合に治療について選択されている。ある種の実施形態では、この開示の抗体で治療される個人は、例えば、ＩＨＣ、フローサイトメトリー、又はｍＲＮＡ定量化によって評価された場合に腫瘍部位へのＬＩＦ受容体陽性の浸潤物を有する場合に治療について選択されている。これらの浸潤物は、腫瘍関連マクロファージ、ＩＩ型マクロファージ、骨髄由来抑制細胞、腫瘍単球系の骨髄由来抑制細胞（Ｍ−ＭＤＳＣ）、又は腫瘍多形核細胞系の骨髄由来抑制細胞（ＰＭＮ−ＭＤＳＣ）などの免疫調節細胞を含むことができる。
【００４５】
ある種の実施形態では、本明細書に開示した抗体は、ＬＩＦ受容体を発現する腫瘍又は癌を治療するのに有用である。ＬＩＦ受容体陽性の腫瘍は、病理組織学又はフローサイトメトリーによって決定することができ、ある種の実施形態では、アイソタイプ対照よりも２×、３×、４×、５×、１０×又はそれよりも多いＬＩＦ受容体抗体と結合する細胞を含む。ある種の実施形態では、腫瘍は、ＬＩＦ受容体の異所性発現を受けている。ある種の実施形態では、癌は、癌幹細胞である。ある種の実施形態では、ＬＩＦ受容体陽性の腫瘍又は癌は、抗ＬＩＦ受容体を使用する免疫組織化学によって決定することができる。ある種の実施形態では、免疫抑制性反応と関連する１つ以上の細胞集団と関連するＬＩＦ受容体タンパク質又はｍＲＮＡのレベルが決定される。ある種の実施形態では、細胞集団は、骨髄細胞、マクロファージ細胞、Ｍ２細胞、好中球、骨髄由来抑制細胞、腫瘍Ｍ−ＭＤＳＣ、又は腫瘍ＰＭＮ−ＭＤＳＣである。
【００４６】
ＬＩＦ受容体タンパク質レベルは、免疫組織化学を使用して、定量的に又は半定量的に決定することができる。ＬＩＦ受容体についてのＩＨＣアッセイは、試料中のすべての細胞上に、試料中のすべての免疫細胞上に、試料中のすべての骨髄由来の細胞上に、又は試料中のすべてのマクロファージ上に発現されるＬＩＦ受容体に基づくものであり得る。ある種の実施形態では、ＬＩＦ受容体ＩＨＣスコアは、個人からの試料において算出することができ、ＩＨＣスコアが、約１、５、１０、２５、５０、７５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、又は２５０である又はこれらを超えるならば、治療用抗ＬＩＦ抗体が、個人に投与される。ある種の実施形態では、治療用抗体は、ｈ５Ｄ８又はその抗原結合断片である。ある種の実施形態では、試料は、組織試料又は組織生検試料である。ある種の実施形態では、ＬＩＦ受容体陽性の細胞のパーセンテージは、個人からの試料において決定することができ、ＬＩＦ受容体陽性細胞のパーセンテージが、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％を超えるならば、治療用抗ＬＩＦ抗体が、個人に投与される。ある種の実施形態では、治療用抗体は、ｈ５Ｄ８又はその抗原結合断片である。ある種の実施形態では、試料は、組織試料又は組織生検試料である。ＬＩＦ受容体ＩＨＣスコア基準レベルは、少なくともＮ本の試料の集団において観察されたレベルから得られる。ある種の実施形態では、Ｎは、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、又はそれ以上である。ある種の実施形態では、試料は、同様の型の癌（例えば、特定の癌についての基準レベルを定義すること）又はすべての癌（例えば、すべての癌についての基準レベルを定義すること）を含む。異なる型の癌は、ｈ５Ｄ８での成功裏の治療の可能性の増大を示す、異なる基準レベルを有する可能性があるので、ＬＩＦ受容体ＩＨＣスコアは、ある種の癌に特有であり得る。ある種の実施形態では、ＬＩＦ受容体ＩＨＣスコアは、非小細胞肺癌、卵巣癌、腎癌、膀胱癌、膵癌、前立腺癌、泌尿生殖器癌、婦人科癌、胃腸癌、内分泌系癌、多形神経膠芽腫、乳癌、黒色腫、結腸直腸癌、胆管癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、及び頭頸部扁平上皮癌のいずれか１つ以上に特有である。
【００４７】
ＬＩＦ受容体タンパク質レベルは、フローサイトメトリーに基づくアッセイを使用して、定量的に又は半定量的に決定することができる。ある種の実施形態では、ＬＩＦ受容体タンパク質レベルは、個人からの試料において決定することができ、タンパク質量が、対照抗体（例えば、アイソタイプ対照）と比較して１．５×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×を超えるならば、治療用抗ＬＩＦ抗体が、個人に投与される。ある種の実施形態では、治療用抗体は、ｈ５Ｄ８又はその抗原結合断片である。ある種の実施形態では、試料は、血液試料、血漿試料、又は血清試料である。フローサイトメトリー基準レベルは、少なくともＮ本の試料の集団において観察されたレベルから得られる。ある種の実施形態では、Ｎは、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、又はそれ以上である。ある種の実施形態では、試料は、同様の型の癌（例えば、特定の癌についての基準レベルを定義すること）又はすべての癌（例えば、すべての癌についての基準レベルを定義すること）を含む。異なる型の癌は、ｈ５Ｄ８での成功裏の治療の可能性の増大を示す、異なる基準レベルを有する可能性があるので、ＬＩＦフローサイトメトリー基準スコアは、ある種の癌に特有であり得る。ある種の実施形態では、ＬＩＦフローサイトメトリー基準は、非小細胞肺癌、卵巣癌、腎癌、膀胱癌、膵癌、前立腺癌、泌尿生殖器癌、婦人科癌、胃腸癌、内分泌系癌、多形神経膠芽腫、乳癌、黒色腫、結腸直腸癌、胆管癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、及び頭頸部扁平上皮癌のいずれか１つ以上に特有である。
【００４８】
ＬＩＦ受容体ｍＲＮＡレベルは、リアルタイムＰＣＲ又はＲＮＡ−ｓｅｑを使用して、定量的に又は半定量的に決定することができる。ある種の実施形態では、ＬＩＦ受容体ｍＲＮＡレベルを決定することができ、ＬＩＦ受容体ｍＲＮＡレベルが、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、又は７５パーセンタイルに相当するレベルを超えるならば、治療用抗ＬＩＦ抗体が、個人に投与される。ある種の実施形態では、治療用抗体は、ｈ５Ｄ８又はその抗原結合断片である。パーセンタイル基準は、少なくともＮ本の試料の集団において観察されたｍＲＮＡレベルに関する。ある種の実施形態では、Ｎは、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、又はそれ以上である。ある種の実施形態では、試料は、同様の型の癌（例えば、特定の癌についての基準レベルを定義すること）又はすべての癌（例えば、すべての癌についての基準レベルを定義すること）を含む。異なる型の癌は、ｈ５Ｄ８での成功裏の治療の可能性の増大を示す、異なる基準レベルを有する可能性があるので、ＬＩＦ  ｍＲＮＡ基準レベルは、ある種の癌に特有であり得る。ある種の実施形態では、ＬＩＦ  ｍＲＮＡ基準レベルは、非小細胞肺癌、卵巣癌、腎癌、膀胱癌、膵癌、前立腺癌、泌尿生殖器癌、婦人科癌、胃腸癌、内分泌系癌、多形神経膠芽腫、乳癌、黒色腫、結腸直腸癌、胆管癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、及び頭頸部扁平上皮癌のいずれか１つ以上に特有である。
【００４９】
本明細書に記載される、治療用抗ＬＩＦ抗体で個人を治療する方法に有用な追加のバイオマーカーには、免疫抑制性バイオマーカーが含まれる。本明細書では、ＬＩＦ及びＬＩＦ受容体が、種々の免疫調節細胞型におけるシグナル伝達にとって重要であり、したがって、免疫抑制性バイオマーカーが、治療成功の可能性の指標としての役割を果たすことができることが示される。これらのバイオマーカーは、それ自体で利用することも、ＬＩＦ及びＬＩＦ受容体レベルの決定と組み合わせることもできる。ある種の実施形態では、免疫抑制性バイオマーカーのタンパク質、ｍＲＮＡ、又はＤＮＡレベルが基準レベルを超えるならば、治療用抗ＬＩＦ抗体が、個人に投与される。ある種の実施形態では、治療用抗体は、ｈ５Ｄ８又はその抗原結合断片である。ある種の実施形態では、免疫抑制性バイオマーカーのタンパク質、ｍＲＮＡ、又はＤＮＡレベルが基準レベルを超える、且つＬＩＦが基準レベルを超えるならば、治療用抗ＬＩＦ抗体が、個人に投与される。ある種の実施形態では、治療用抗体は、ｈ５Ｄ８又はその抗原結合断片である。ある種の実施形態では、免疫抑制性バイオマーカーのタンパク質、ｍＲＮＡ、又はＤＮＡレベルが基準レベルを超える、且つＬＩＦ受容体が基準レベルを超えるならば、治療用抗ＬＩＦ抗体が、個人に投与される。ある種の実施形態では、治療用抗体は、ｈ５Ｄ８又はその抗原結合断片である。
【００５０】
ある種の実施形態では、個人を治療について選択するために、ＬＩＦ、ＬＩＦ受容体、及び免疫抑制性バイオマーカーの３つすべての組み合わせを利用することができる。本開示の重要な免疫調節性及び免疫抑制性バイオマーカーには、制御性Ｔ細胞、活性化Ｔ細胞、抗原曝露歴のあるＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、及びそのそれぞれの機能（腫瘍関連マクロファージによって放出される又は腫瘍微小環境中に存在するケモカイン及びサイトカインが含まれる）；骨髄由来抑制細胞のマーカー、又はマクロファージ（Ｍ２マクロファージが含まれる）のマーカーと関連するものが含まれる。ある種の実施形態では、バイオマーカーは、制御性Ｔ細胞に作用する共刺激分子、抗原提示分子、サイトカイン、又はケモカインなどの免疫調節分子である。ある種の実施形態では、制御性Ｔ細胞に作用する共刺激分子、抗原提示分子、サイトカイン、又はケモカインは、ＭＨＣＩＩ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＲ３、ＰＤ−Ｌ１、ＣＣＬ７、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、及びＣＣＬ２２からなるリストから選択される。ある種の実施形態では、制御性Ｔ細胞に作用する抗原提示分子は、ＭＨＣＩＩである。ある種の実施形態では、制御性Ｔ細胞に作用するサイトカイン又はケモカインは、ＣＸＣＬ９である。ある種の実施形態では、制御性Ｔ細胞に作用するサイトカイン又はケモカインは、ＣＸＣＬ１０である。ある種の実施形態では、制御性Ｔ細胞に作用するサイトカイン又はケモカインは、ＣＸＣＲ３である。ある種の実施形態では、制御性Ｔ細胞に作用する共刺激分子は、ＰＤ−Ｌ１である。ある種の実施形態では、制御性Ｔ細胞に作用するサイトカイン又はケモカインは、ＣＣＬ７である。ある種の実施形態では、制御性Ｔ細胞に作用するサイトカイン又はケモカインは、ＣＣＬ２である。ある種の実施形態では、制御性Ｔ細胞に作用するサイトカイン又はケモカインは、ＣＣＬ３である。ある種の実施形態では、制御性Ｔ細胞に作用するサイトカイン又はケモカインは、ＣＣＬ２２である。ある種の実施形態では、患者は、ＭＨＣＩＩのレベルが基準レベル未満であるならば、治療について選択される。ある種の実施形態では、ＭＨＣＩＩが、対照抗体（例えば、アイソタイプ対照）と比較して１．５×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×未満であるならば、治療用抗ＬＩＦ抗体が、個人に投与される。ある種の実施形態では、患者は、ＣＸＣＬ９のレベルが基準レベル未満であるならば、治療について選択される。ある種の実施形態では、ＣＸＣＬ９が、対照抗体（例えば、アイソタイプ対照）と比較して１．５×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×未満であるならば、治療用抗ＬＩＦ抗体が、個人に投与される。ある種の実施形態では、患者は、ＣＸＣＬ１０のレベルが基準レベル未満であるならば、治療について選択される。ある種の実施形態では、ＣＸＣＬ１０が、対照抗体（例えば、アイソタイプ対照）と比較して１．５×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×未満であるならば、治療用抗ＬＩＦ抗体が、個人に投与される。ある種の実施形態では、患者は、ＣＸＣＲ３のレベルが基準レベル未満であるならば、治療について選択される。ある種の実施形態では、ＣＸＣＲ３が、対照抗体（例えば、アイソタイプ対照）と比較して１．５×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×未満であるならば、治療用抗ＬＩＦ抗体が、個人に投与される。ある種の実施形態では、患者は、ＰＤ−Ｌ１のレベルが基準レベル未満であるならば、治療について選択される。ある種の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１が、対照抗体（例えば、アイソタイプ対照）と比較して１．５×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×未満であるならば、治療用抗ＬＩＦ抗体が、個人に投与される。ある種の実施形態では、患者は、ＣＣＬ７のレベルが基準レベルを超えるならば、治療について選択される。ある種の実施形態では、ＣＣＬ７が、対照抗体（例えば、アイソタイプ対照）と比較して１．５×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×を超えるならば、治療用抗ＬＩＦ抗体が、個人に投与される。ある種の実施形態では、患者は、ＣＣＬ２のレベルが基準レベルを超えるならば、治療について選択される。ある種の実施形態では、ＣＣＬ２が、対照抗体（例えば、アイソタイプ対照）と比較して１．５×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×を超えるならば、治療用抗ＬＩＦ抗体が、個人に投与される。ある種の実施形態では、患者は、ＣＣＬ３のレベルが基準レベルを超えるならば、治療について選択される。ある種の実施形態では、ＣＣＬ３が、対照抗体（例えば、アイソタイプ対照）と比較して１．５×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×を超えるならば、治療用抗ＬＩＦ抗体が、個人に投与される。ある種の実施形態では、患者は、ＣＣＬ２２のレベルが基準レベルを超えるならば、治療について選択される。ある種の実施形態では、ＣＣＬ２２が、対照抗体（例えば、アイソタイプ対照）と比較して１．５×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×を超えるならば、治療用抗ＬＩＦ抗体が、個人に投与される。ある種の実施形態では、免疫抑制性バイオマーカーは、Ｍ２マクロファージ細胞のマーカーである。ある種の実施形態では、Ｍ２マクロファージ細胞のマーカーは、ＣＤ２０６、ＣＤ１６３、ＰＦ４、ＣＴＳＫ、及びＡＲＧ１からなるリストから選択される。ある種の実施形態では、Ｍ２マクロファージ細胞のマーカーは、ＣＤ２０６である。ある種の実施形態では、Ｍ２マクロファージ細胞のマーカーは、ＣＤ１６３である。ある種の実施形態では、Ｍ２マクロファージ細胞のマーカーは、ＰＦ４である。ある種の実施形態では、Ｍ２マクロファージ細胞のマーカーは、ＣＴＳＫである。ある種の実施形態では、Ｍ２マクロファージ細胞のマーカーは、ＡＲＧ１である。ある種の実施形態では、患者は、ＣＤ２０６のレベルが基準レベルを超えるならば、治療について選択される。ある種の実施形態では、ＣＤ２０６が、対照抗体（例えば、アイソタイプ対照）と比較して１．５×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×を超えるならば、治療用抗ＬＩＦ抗体が、個人に投与される。ある種の実施形態では、患者は、ＣＤ１６３のレベルが基準レベルを超えるならば、治療について選択される。ある種の実施形態では、ＣＤ１６３が、対照抗体（例えば、アイソタイプ対照）と比較して１．５��、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×を超えるならば、治療用抗ＬＩＦ抗体が、個人に投与される。ある種の実施形態では、患者は、ＰＦ４のレベルが基準レベルを超えるならば、治療について選択される。ある種の実施形態では、ＰＦ４が、対照抗体（例えば、アイソタイプ対照）と比較して１．５×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×を超えるならば、治療用抗ＬＩＦ抗体が、個人に投与される。ある種の実施形態では、患者は、ＣＴＳＫのレベルが基準レベルを超えるならば、治療について選択される。ある種の実施形態では、ＣＴＳＫが、対照抗体（例えば、アイソタイプ対照）と比較して１．５×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×を超えるならば、治療用抗ＬＩＦ抗体が、個人に投与される。ある種の実施形態では、患者は、ＡＲＧ１のレベルが基準レベルを超えるならば、治療について選択される。ある種の実施形態では、ＡＲＧ１が、対照抗体（例えば、アイソタイプ対照）と比較して１．５×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×を超えるならば、治療用抗ＬＩＦ抗体が、個人に投与される。免疫抑制性バイオマーカーのタンパク質レベルは、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、又はＩＨＣによって決定することができ；免疫抑制性バイオマーカーのｍＲＮＡレベルは、定量的ＰＣＲ又はＲＮＡ−ｓｅｑによって決定することができる。ある種の実施形態では、治療用抗体は、ｈ５Ｄ８又はその抗原結合断片である。ある種の実施形態では、本明細書に記載される免疫抑制性バイオマーカーのレベルが、基準レベルを超えるならば、患者は、治療用抗ＬＩＦ抗体での治療について選択される。ある種の実施形態では、免疫抑制性バイオマーカーのレベルが基準レベルを超える、且つＬＩＦが基準レベルを超えるならば、治療用抗ＬＩＦ抗体が、個人に投与される。ある種の実施形態では、免疫抑制性バイオマーカーのレベルが基準レベルを超える、且つＬＩＦ受容体が基準レベルを超えるならば、治療用抗ＬＩＦ抗体が、個人に投与される。ある種の実施形態では、個人を治療について選択するために、ＬＩＦ、ＬＩＦ受容体、及び免疫抑制性バイオマーカーの３つすべての組み合わせを利用することができる。
【００５１】
本明細書に記載される、治療用抗ＬＩＦ抗体での個人の治療を決定する方法に有用な追加のバイオマーカーには、ＬＩＦシグナル伝達のマーカーが含まれる。ある種の実施形態では、ＬＩＦシグナル伝達のマーカーは、リン酸化ＳＴＡＴ３である。ある種の実施形態では、患者は、リン酸化ＳＴＡＴ３のレベルが基準レベルを超えるならば、治療について選択される。ある種の実施形態では、ｐＳＴＡＴ３が、対照抗体（例えば、アイソタイプ対照）と比較して１．５×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×を超えるならば、治療用抗ＬＩＦ抗体が、個人に投与される。ある種の実施形態では、治療用抗体は、ｈ５Ｄ８又はその抗原結合断片である。
【００５２】
治療用抗ＬＩＦ抗体
本明細書に記載される５Ｄ８抗体は、ヒトＬＩＦをコードするＤＮＡで免疫化されたラットから産生された。この抗体の親ラット型は、ｒ５Ｄ８と称され、ヒト化型は、ｈ５Ｄ８と称される。
【００５３】
５Ｄ８
本明細書に記載される抗体は、ヒトＬＩＦをコードするＤＮＡで免疫化されたラットから産生された。あるこうした抗体（５Ｄ８）をクローン化及び配列決定した。これは、次のアミノ酸配列：配列番号１（ＧＦＴＦＳＨＡＷＭＨ）に相当するＶＨ−ＣＤＲ１、配列番号４（ＱＩＫＡＫＳＤＤＹＡＴＹＹＡＥＳＶＫＧ）に相当するＶＨ−ＣＤＲ２、配列番号６（ＴＣＷＥＷＤＬＤＦ）に相当するＶＨ−ＣＤＲ３、配列番号９（ＲＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＨＴＹＬＮ）に相当するＶＬ−ＣＤＲ１、配列番号１１（ＳＶＳＮＬＥＳ）に相当するＶＬ−ＣＤＲ２、及び配列番号１３（ＭＱＡＴＨＡＰＰＹＴ）に相当するＶＬ−ＣＤＲ３を含むＣＤＲ（ＫａｂａｔとＩＭＧＴ  ＣＤＲナンバリング方法の組み合わせを使用する）を含む。この抗体は、ＣＤＲグラフティングによってヒト化されており、ヒト化型はｈ５Ｄ８と称される。ＶＨ及びＶＬ領域を、配列番号１５及び配列番号１９に示している。
【００５４】
ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号１（ＧＦＴＦＳＨＡＷＭＨ）に示したものと少なくとも８０％又は９０％同一のＶＨ−ＣＤＲ１、配列番号４（ＱＩＫＡＫＳＤＤＹＡＴＹＹＡＥＳＶＫＧ）に示したものと少なくとも８０％、９０％、又は９５％同一のＶＨ−ＣＤＲ２、及び配列番号６（ＴＣＷＥＷＤＬＤＦ）に示したものと少なくとも８０％又は９０％同一のＶＨ−ＣＤＲ３を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号９（ＲＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＨＴＹＬＮ）に示したものと少なくとも８０％又は９０％同一のＶＬ−ＣＤＲ１、配列番号１１（ＳＶＳＮＬＥＳ）に示したものと少なくとも８０％同一のＶＬ−ＣＤＲ２、及び配列番号１３（ＭＱＡＴＨＡＰＰＹＴ）に示したものと少なくとも８０％又は９０％同一のＶＬ−ＣＤＲ３を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号１（ＧＦＴＦＳＨＡＷＭＨ）に示したＶＨ−ＣＤＲ１、配列番号４（ＱＩＫＡＫＳＤＤＹＡＴＹＹＡＥＳＶＫＧ）に示したＶＨ−ＣＤＲ２、配列番号６（ＴＣＷＥＷＤＬＤＦ）に示したＶＨ−ＣＤＲ３、配列番号９（ＲＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＨＴＹＬＮ）に示したＶＬ−ＣＤＲ１、配列番号１１（ＳＶＳＮＬＥＳ）に示したＶＬ−ＣＤＲ２、及び配列番号１３（ＭＱＡＴＨＡＰＰＹＴ）に示したＶＬ−ＣＤＲ３を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。この開示のＣＤＲのアミノ酸配列中の、ある程度の保存的アミノ酸置換が想定される。ある種の実施形態では、抗体は、配列番号１、４、６、９、１１、及び１３のいずれか１つに示したアミノ酸配列と、１、２、３、又は４個のアミノ酸が異なるＣＤＲを含む。ある種の実施形態では、抗体は、配列番号１、４、６、９、１１、及び１３のいずれか１つに示したアミノ酸配列と、１、２、３、又は４個のアミノ酸が異なり、且つ結合親和性に１０％、２０％、又は３０％を超える影響を与えないＣＤＲを含む。ある種の実施形態では、ＬＩＦと特異的に結合する抗体は、１つ以上のヒト重鎖フレームワーク領域を含む。
【００５５】
ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号１（ＧＦＴＦＳＨＡＷＭＨ）に示したものと少なくとも８０％又は９０％同一のＶＨ−ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号４（ＱＩＫＡＫＳＤＤＹＡＴＹＹＡＥＳＶＫＧ）に示したものと少なくとも８０％、９０％、又は９５％同一のＶＨ−ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号８（ＴＳＷＥＷＤＬＤＦ）に示したものと少なくとも８０％又は９０％同一のＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号９（ＲＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＨＴＹＬＮ）に示したものと少なくとも８０％又は９０％同一のＶＬ−ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１１（ＳＶＳＮＬＥＳ）に示したものと少なくとも８０％同一のＶＬ−ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号１３（ＭＱＡＴＨＡＰＰＹＴ）に示したものと少なくとも８０％又は９０％同一のＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号１（ＧＦＴＦＳＨＡＷＭＨ）に示したＶＨ−ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号４（ＱＩＫＡＫＳＤＤＹＡＴＹＹＡＥＳＶＫＧ）に示したＶＨ−ＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号８（ＴＳＷＥＷＤＬＤＦ）に示したＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列、配列番号９（ＲＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＨＴＹＬＮ）に示したＶＬ−ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１１（ＳＶＳＮＬＥＳ）に示したＶＬ−ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号１３（ＭＱＡＴＨＡＰＰＹＴ）に示したＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。この開示のＣＤＲのアミノ酸配列中の、ある程度の保存的アミノ酸置換が想定される。ある種の実施形態では、抗体は、配列番号１、４、８、９、１１、及び１３のいずれか１つに示したアミノ酸配列と、１、２、３、又は４個のアミノ酸が異なるＣＤＲを含む。ある種の実施形態では、抗体は、配列番号１、４、８、９、１１、及び１３のいずれか１つに示したアミノ酸配列と、１、２、３、又は４個のアミノ酸が異なり、且つ結合親和性に１０％、２０％、又は３０％を超える影響を与えないＣＤＲを含む。
【００５６】
ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号１４、１５、又は１７のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含むヒト化重鎖可変領域を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号１４、１５、及び１７のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含むヒト化重鎖可変領域を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号１８〜２１のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含むヒト化軽鎖可変領域を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号１８〜２１のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含むヒト化軽鎖可変領域を含む、ＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。ある種の実施形態では、抗体は、ヒトＬＩＦと特異的に結合する。
【００５７】
ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号１５に示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含むヒト化重鎖可変領域；及び配列番号１９に示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含むヒト化軽鎖可変領域を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号１５に示したアミノ酸配列を含むヒト化重鎖可変領域；及び配列番号１９に示したアミノ酸配列を含むヒト化軽鎖可変領域を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。
【００５８】
ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号３８に示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含むヒト化重鎖可変領域；配列番号１９に示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含むヒト化軽鎖可変領域を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号３８に示したアミノ酸配列を含むヒト化重鎖可変領域と；配列番号１９に示したアミノ酸配列を含むヒト化軽鎖可変領域を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。
【００５９】
ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号３０〜３３のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含むヒト化重鎖；配列番号３４〜３７のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含むヒト化軽鎖を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号３０〜３３のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含むヒト化重鎖；配列番号３４〜３７のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含むヒト化軽鎖を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。
【００６０】
ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号３１に示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含むヒト化重鎖；配列番号３５に示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含むヒト化軽鎖を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号３１に示したアミノ酸配列を含むヒト化重鎖；配列番号３５に示したアミノ酸配列を含むヒト化軽鎖を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号３９に示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含むヒト化重鎖；配列番号３５に示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含むヒト化軽鎖を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号３９に示したアミノ酸配列を含むヒト化重鎖；配列番号３５に示したアミノ酸配列を含むヒト化軽鎖を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。
【００６１】
ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号３に示したアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＶＨ−ＣＤＲ１）；配列番号４に示したアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＶＨ−ＣＤＲ２）；配列番号７に示したアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＶＨ−ＣＤＲ３）；配列番号９に示したアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＶＬ−ＣＤＲ１）；及び配列番号１１に示したアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＶＬ−ＣＤＲ２）；及び配列番号１３に示したアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＶＬ−ＣＤＲ３）を含む、白血病抑制因子（ＬＩＦ）と特異的に結合する組換え抗体である。
【００６２】
ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号２に示したアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＶＨ−ＣＤＲ１）；配列番号５に示したアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＶＨ−ＣＤＲ２）；配列番号６に示したアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＶＨ−ＣＤＲ３）；配列番号１０に示したアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＶＬ−ＣＤＲ１）；及び配列番号１２に示したアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＶＬ−ＣＤＲ２）；及び配列番号１３に示したアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＶＬ−ＣＤＲ３）を含む、白血病抑制因子（ＬＩＦ）と特異的に結合する組換え抗体である。この開示のＣＤＲのアミノ酸配列中の、ある程度の保存的アミノ酸置換が想定される。ある種の実施形態では、抗体は、配列番号２、５、６、１０、１２、及び１３のいずれか１つに示したアミノ酸配列と、１、２、３、又は４個のアミノ酸が異なるＣＤＲを含む。ある種の実施形態では、抗体は、配列番号２、５、６、１０、１２、及び１３のいずれか１つに示したアミノ酸配列と、１、２、３、又は４個のアミノ酸が異なり、且つ結合親和性に１０％、２０％、又は３０％を超える影響を与えないＣＤＲを含む。
【００６３】
ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号３に示したアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＶＨ−ＣＤＲ１）；配列番号４に示したアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＶＨ−ＣＤＲ２）；配列番号７に示したアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＶＨ−ＣＤＲ３）；配列番号９に示したアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＶＬ−ＣＤＲ１）；及び配列番号１１に示したアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＶＬ−ＣＤＲ２）；及び配列番号１３に示したアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＶＬ−ＣＤＲ３）を含む、白血病抑制因子（ＬＩＦ）と特異的に結合する組換え抗体である。この開示のＣＤＲのアミノ酸配列中の、ある程度の保存的アミノ酸置換が想定される。ある種の実施形態では、抗体は、配列番号３、４、７、９、１１、及び１３のいずれか１つに示したアミノ酸配列と、１、２、３、又は４個のアミノ酸が異なるＣＤＲを含む。ある種の実施形態では、抗体は、配列番号３、４、７、９、１１、及び１３のいずれか１つに示したアミノ酸配列と、１、２、３、又は４個のアミノ酸が異なり、且つ結合親和性に１０％、２０％、又は３０％を超える影響を与えないＣＤＲを含む。
【００６４】
ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号２２〜２５のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含むヒト化重鎖；配列番号２６〜２９のいずれか１つに示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含むヒト化軽鎖を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号２２〜２５のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含むヒト化重鎖；配列番号２６〜２９のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含むヒト化軽鎖を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。
【００６５】
ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号２３に示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含むヒト化重鎖；配列番号２７に示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含むヒト化軽鎖を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号２３に示したアミノ酸配列を含むヒト化重鎖；配列番号２７のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含むヒト化軽鎖を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。
【００６６】
ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号３９に示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含むヒト化重鎖；及び配列番号２７に示したアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含むヒト化軽鎖を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、配列番号３９に示したアミノ酸配列を含むヒト化重鎖；及び配列番号２７のいずれか１つに示したアミノ酸配列を含むヒト化軽鎖を含むＬＩＦと特異的に結合する治療用抗体である。
【００６７】
治療的に有用なＬＩＦ抗体によって結合されるエピトープ
本明細書に記載されるのは、結合された場合にＬＩＦの生物学的活性（例えば、ＳＴＡＴ３リン酸化）を阻害する、且つインビボで腫瘍増殖を阻害し、治療効果をもたらす、ヒトＬＩＦの固有のエピトープである。本開示の治療用抗体は、ｈ５Ｄ８のＣＤＲを含まないが、ｈ５Ｄ８と同じ又は類似のエピトープ（アミノ酸残基）に結合する、治療用抗体であり得る。類似のエピトープは、特定されるエピトープの範囲内で結合するものである。本明細書に記載されるエピトープは、ヒトＬＩＦタンパク質の２つの別のトポロジカルドメイン（αヘリックスＡ及びＣ）中に存在する、（ヒトＬＩＦの残基１３から残基３２まで、及び残基１２０から１３８までの）アミノ酸の２つの不連続な伸長からなる。この結合は、弱い（ファンデルワールス引力）、中程度の（水素結合）、及び強い（塩橋）相互作用の組み合わせである。ある種の実施形態では、接触残基は、抗ＬＩＦ抗体上の残基と共に水素結合を形成するＬＩＦ上の残基である。ある種の実施形態では、接触残基は、抗ＬＩＦ抗体上の残基と共に塩橋を形成するＬＩＦ上の残基である。ある種の実施形態では、接触残基は、抗ＬＩＦ抗体上の残基と共にファンデルワールス引力をもたらし、且つ抗ＬＩＦ抗体上の残基の少なくとも５、４、又は３オングストローム以内である、ＬＩＦ上の残基である。治療用抗体は、このエピトープと結合する、又はこのエピトープのより小さい部分に結合する、又はこのエピトープと重複し、本明細書に記載されるアッセイに利用することができる。
【００６８】
ある種の実施形態では、本明細書に記載される治療用抗体は、次の配列番号４０の残基：Ａ１３、Ｉ１４、Ｒ１５、Ｈ１６、Ｐ１７、Ｃ１８、Ｈ１９、Ｎ２０、Ｑ２５、Ｑ２９、Ｑ３２、Ｄ１２０、Ｒ１２３、Ｓ１２７、Ｎ１２８、Ｌ１３０、Ｃ１３１、Ｃ１３４、Ｓ１３５、又はＨ１３８のうちのいずれか１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、又は２０個と結合する、単離された治療用抗体である。ある種の実施形態では、本明細書に記載されるのは、次の配列番号４０の残基：Ａ１３、Ｉ１４、Ｒ１５、Ｈ１６、Ｐ１７、Ｃ１８、Ｈ１９、Ｎ２０、Ｑ２５、Ｑ２９、Ｑ３２、Ｄ１２０、Ｒ１２３、Ｓ１２７、Ｎ１２８、Ｌ１３０、Ｃ１３１、Ｃ１３４、Ｓ１３５、又はＨ１３８のうちのすべてと結合する、単離された抗体である。ある種の実施形態では、抗体は、強い又は中程度の相互作用で抗体と関与する残基とのみ結合する。ある種の実施形態では、抗体は、強い相互作用で抗体と関与する残基とのみ結合する。ある種の実施形態では、抗体は、ＬＩＦのヘリックスＡ及びＣと相互作用する。ある種の実施形態では、抗体は、ｇｐ１３０と共にＬＩＦ相互作用を阻止する。
【００６９】
治療適応症
ある種の実施形態では、本明細書に開示した治療用抗体は、細胞におけるＬＩＦシグナル伝達を阻害する。ある種の実施形態では、Ｕ−２５１細胞における血清飢餓条件下での抗体の生物学的阻害についてのＩＣ５０は、約１００、７５、５０、４０、３０、２０、１０、５、又は１ナノモル濃度以下である。ある種の実施形態では、Ｕ−２５１細胞における血清飢餓条件下での抗体の生物学的阻害についてのＩＣ５０は、約９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、又は１００ナノモル濃度以下である。
【００７０】
ある種の実施形態では、本明細書に開示されるのは、癌又は腫瘍の治療に有用な抗体である。ある種の実施形態では、癌は、乳房、心臓、肺、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭部、頸部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣、及び肝臓腫瘍を含む。ある種の実施形態では、本発明の抗体で治療することができる腫瘍は、腺腫、腺癌、血管肉腫、星細胞腫、上皮癌、胚細胞腫、膠芽腫、神経膠腫、血管内皮腫、血管肉腫、血腫、肝芽腫、白血病、リンパ腫、髄芽腫、黒色腫、神経芽腫、骨肉腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫及び／又は奇形腫を含む。ある種の実施形態では、腫瘍／癌は、末端黒子型黒色腫、日光角化症、腺癌、腺様嚢胞癌、腺腫、腺肉腫、腺扁平上皮癌、星細胞系腫瘍、バルトリン腺癌、基底細胞癌、気管支腺癌、毛細血管カルチノイド（ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｃａｒｃｉｎｏｉｄ）、癌腫、癌肉腫、胆管癌、軟骨肉腫、嚢胞腺腫、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮内膜間質肉腫、類内膜腺癌、上衣肉腫（ｅｐｅｎｄｙｍａｌ  ｓａｒｃｏｍａ）、スウィング肉腫（Ｓｗｉｎｇ’ｓ  ｓａｒｃｏｍａ）、限局性結節性過形成、ガストロノーマ（ｇａｓｔｒｏｎｏｍａ）、生殖系列腫瘍、膠芽腫、グルカゴノーマ、血管芽細胞腫、血管内皮腫、血管腫、肝腺腫、肝腺腫症、肝細胞癌、インスリナイト（ｉｎｓｕｌｉｎｉｔｅ）、上皮内腫瘍、上皮内扁平上皮癌（ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ）、浸潤性扁平上皮癌、大細胞癌、脂肪肉腫、肺癌、リンパ芽球性白血病、リンパ性白血病、平滑筋肉腫、黒色腫、悪性黒色腫、悪性中皮腫、神経鞘腫、髄芽腫、髄上皮腫、中皮腫、粘表皮癌、骨髄性白血病、神経芽腫、神経上皮腺癌、結節性型黒色腫、骨肉腫、卵巣癌、漿液性乳頭状腺癌、下垂体腫瘍、形質細胞腫、偽肉腫、前立腺癌、肺芽腫、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、漿液性癌、有棘細胞癌、小細胞癌、軟部組織癌（ｓｏｆｔ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ソマトスタチン産生腫瘍（ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ）、扁平上皮癌、有棘細胞癌、未分化癌、ブドウ膜黒色腫、疣状癌、膣／外陰癌、ＶＩＰ産生腫瘍、及びウィルムス腫瘍の群から選択される。ある種の実施形態では、本発明の１つ以上の抗体で治療されるべき腫瘍／癌は、脳癌、頭頸部癌、結腸直腸癌、急性骨髄性白血病、プレＢ細胞急性リンパ性白血病、膀胱癌、星細胞腫、好ましくはグレードＩＩ、ＩＩＩ、又はＩＶ星細胞腫、膠芽腫、多形神経膠芽腫、小細胞癌、及び非小細胞癌、好ましくは非小細胞肺癌、肺腺癌、転移性黒色腫、アンドロゲン非依存性転移性前立腺癌、アンドロゲン依存性転移性前立腺癌、前立腺腺癌、及び乳癌（ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）、好ましくは乳管癌、及び／又は乳癌（ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）を含む。ある種の実施形態では、この開示の抗体で治療される癌は、膠芽腫を含む。ある種の実施形態では、この開示の１つ以上の抗体で治療される癌は、膵癌を含む。ある種の実施形態では、この開示の１つ以上の抗体で治療される癌は、卵巣癌を含む。ある種の実施形態では、この開示の１つ以上の抗体で治療される癌は、肺癌を含む。ある種の実施形態では、この開示の１つ以上の抗体で治療される癌は、前立腺癌を含む。ある種の実施形態では、この開示の１つ以上の抗体で治療される癌は、結腸癌を含む。ある種の実施形態では、治療される癌は、膠芽腫、膵癌、卵巣癌、結腸癌、前立腺癌、又は肺癌を含む。ある種の実施形態では、癌は、他の治療に対して抵抗性である。ある種の実施形態では、治療される癌は、再発性である。ある種の実施形態では、癌は、再発した／抵抗性の膠芽腫、膵癌、卵巣癌、結腸癌、前立腺癌、泌尿生殖器癌、婦人科癌、胃腸癌、内分泌系癌、又は肺癌である。ある種の実施形態では、癌は、進行した固形腫瘍、膠芽腫、胃癌、皮膚癌、前立腺癌、膵癌、乳癌、精巣癌、甲状腺癌、結腸直腸癌、胆管癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、肝臓癌、腎臓癌、食道癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌、リンパ腫、又は軟部組織癌を含む。ある種の実施形態では、癌は、非小細胞肺癌、卵巣上皮癌、又は膵臓腺癌を含む。ある種の実施形態では、癌は、進行した固形腫瘍を含む。
【００７１】
治療方法
ある種の実施形態では、治療用抗体は、例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、腫瘍内、又は脳内などの、抗体含有医薬組成物の投与に適したあらゆる経路によって投与することができる。ある種の実施形態では、抗体は、静脈内に投与される。ある種の実施形態では、抗体は、好適な投薬スケジュールで（例えば、毎週、週２回、毎月、月２回など）投与される。ある種の実施形態では、抗体は、３週に１回投与される。抗体は、あらゆる治療有効量で投与することができる。ある種の実施形態では、治療的に許容される量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇである。ある種の実施形態では、治療的に許容される量は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇである。ある種の実施形態では、治療的に許容される量は、約５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇである。治療用抗体は、ｈ５Ｄ８抗体が投与される個人の重量又は質量とは無関係に、一定の用量で投与することができる。ｈ５Ｄ８抗体は、個人が少なくとも約３７．５キログラムの質量を有するという条件で、治療用抗体が投与される個人の重量又は質量とは無関係に、一定の用量で投与することができる。約７５ミリグラムから約２０００ミリグラムまでの、一定の用量の治療用抗体を投与することができる。約２２５ミリグラムから約２０００ミリグラムまでの、約７５０ミリグラムから約２０００ミリグラムまでの、約１１２５ミリグラムから約２０００ミリグラムまでの、又は約１５００ミリグラムから約２０００ミリグラムまでの、一定の用量の治療用抗体を投与することができる。約７５ミリグラムの、一定の用量の治療用抗体を投与することができる。約２２５ミリグラムの、一定の用量の治療用抗体を投与することができる。約７５０ミリグラムの、一定の用量の治療用抗体を投与することができる。約１１２５ミリグラムの、一定の用量の治療用抗体を投与することができる。約１５００ミリグラムの、一定の用量の治療用抗体を投与することができる。約２０００ミリグラムの、一定の用量の治療用抗体を投与することができる。
【００７２】
治療用抗体の他の投薬量も企図される。約５０、１００、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、１０２５、１０５０、１０７５、１１００、１１５０、１１７５、１２００、１２２５、１２５０、１２７５、１３００、１３２５、１３５０、１３７５、１４００、１４２５、１４５０、１４７５、１５２５、１５５０、１５７５、１６００、１６２５、１６５０、１６７５、１７００、１７２５、１７５０、１７７５、１８００、１８２５、１８５０、１８７５、１９００、１９２５、１９５０、１９７５、２０２５、２０５０、２０７５、又は２１００ミリグラムの、一定の用量の治療用抗体を投与することができる。これらの用量のいずれかを、週１回、２週に１回、３週に１回、又は４週に１回投与することができる。
【００７３】
治療用抗体は、治療用抗体が投与される個人の重量又は質量に基づく用量で投与することができる。約１ｍｇ／ｋｇから約２５ｍｇ／ｋｇまでの、体重により調節された用量の治療用抗体を投与することができる。約３ｍｇ／ｋｇから約２５ｍｇ／ｋｇまでの、約１０ｍｇ／ｋｇから約２５ｍｇ／ｋｇまでの、約１５ｍｇ／ｋｇから約２５ｍｇ／ｋｇまでの、又は約２０ｍｇ／ｋｇから約２５ｍｇ／ｋｇまでの、体重により調節された用量の治療用抗体を投与することができる。約１ｍｇ／ｋｇの、体重により調節された用量のｈ５Ｄ８を投与することができる。約３ｍｇ／ｋｇの、体重により調節された用量の治療用抗体を投与することができる。約１０ｍｇ／ｋｇの、体重により調節された用量の治療用抗体を投与することができる。約１５ｍｇ／ｋｇの、体重により調節された用量の治療用抗体を投与することができる。約２０ｍｇ／ｋｇの、体重により調節された用量の治療用抗体を投与することができる。約２５ｍｇ／ｋｇの、体重により調節された用量の治療用抗体を投与することができる。
【００７４】
本明細書で詳述した用量のいずれかを、少なくとも約６０分という時間をかけてｉ．ｖ．投与することができる；しかし、この時間は、それぞれ個々の投与に関する条件に基づいて、いくらか変動する可能性がある。
【００７５】
薬学的に許容し得る補形薬、担体、及び希釈剤
ある種の実施形態では、本開示の抗体は、無菌の溶液に懸濁して投与される。ある種の実施形態では、この溶液は、生理学的に適切な塩濃度（例えば、ＮａＣｌ）を含む。ある種の実施形態では、この溶液は、約０．６％〜１．２％のＮａＣｌを含む。ある種の実施形態では、この溶液は、約０．７％〜１．１％のＮａＣｌを含む。ある種の実施形態では、この溶液は、約０．８％〜１．０％のＮａＣｌを含む。ある種の実施形態では、抗体の高度に濃縮されたストック溶液を、約０．９％のＮａＣｌに希釈することができる。ある種の実施形態では、溶液は、約０．９％のＮａＣｌを含む。ある種の実施形態では、溶液は、緩衝液、例えば、酢酸、クエン酸、ヒスチジン、コハク酸、リン酸、炭酸水素、及びヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）；界面活性剤、例えば、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０）、ポリソルベート及びポロクサマー１８８；ポリオール／二糖／多糖、例えば、グルコース、デキストロース、マンノース、マンニトール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、及びデキストラン４０；アミノ酸、例えば、ヒスチジン、グリシン、又はアルギニン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、メチオニン；並びにキレート剤、例えば、ＥＧＴＡ又はＥＧＴＡのうちの１種以上をさらに含む。ある種の実施形態では、本開示の抗体は、凍結乾燥して輸送／保管され、投与前に再構成される。ある種の実施形態では、凍結乾燥される抗体製剤は、マンニトール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、及びデキストラン４０などの充填剤を含む。ある種の実施形態では、この開示の抗ＬＩＦ抗体は、使用される治療場所で希釈されることとなる濃縮されたストック溶液として輸送及び保管することができる。ある種の実施形態では、このストック溶液は、約２５ｍＭのヒスチジン、約６％のスクロース、約０．０１％のポリソルベート、及び約２０ｍｇ／ｍＬの抗ＬＩＦ抗体を含む。ある種の実施形態では、この溶液のｐＨは、約６．０である。ある種の実施形態では、個人に投与される形態は、約２５ｍＭのヒスチジン、約６％のスクロース、約０．０１％のポリソルベート８０、及び約２０ｍｇ／ｍＬのｈ５Ｄ８抗体を含む水溶液である。ある種の実施形態では、この溶液のｐＨは、約６．０である。
【実施例】
【００７６】
次の実例は、本明細書に記載される組成物及び方法の実施形態を代表するものであり、決して制限的であることが意図されない。
【００７７】
実施例１−ＬＩＦに特異的なラット抗体の産生
ヒトＬＩＦのアミノ酸２３〜２０２をコードするｃＤＮＡを、発現プラスミド（Ａｌｄｅｖｒｏｎ  ＧｍｂＨ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にクローニングした。実験用ラット（Ｗｉｓｔａｒ）の群に、微粒子撃ち込み（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）（「遺伝子銃（ｇｅｎｅ  ｇｕｎ）」）のための手持ち型装置を使用するＤＮＡコーティングされた金粒子の皮内適用によって、免疫化した。一過性トランスフェクトしたＨＥＫ細胞上の細胞表面発現を、ＬＩＦタンパク質のＮ末端に付加されたタグを認識する抗タグ抗体を用いて確認した。一連の免疫化後に、血清試料を収集し、前述の発現プラスミドを用いて一過性トランスフェクトしたＨＥＫ細胞に対してフローサイトメトリーで試験した。抗体産生細胞を単離し、標準の手順に従って、マウス骨髄腫細胞（Ａｇ８）と融合させた。上に記載した通りにフローサイトメトリー分析においてスクリーニングを行うことによって、ＬＩＦに特異的な抗体を産生するハイブリドーマを特定した。ＲＮＡ保護剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃによるＲＮＡｌａｔｅｒ，ｃａｔ．＃ＡＭ７０２０）を使用して、陽性のハイブリドーマ細胞の細胞ペレットを調製し、抗体の可変ドメインの配列決定のためにさらに処理した。
【００７８】
実施例２−ＬＩＦに特異的なマウス抗体の産生
ヒトＬＩＦのアミノ酸２３〜２０２をコードするｃＤＮＡを、発現プラスミド（Ａｌｄｅｖｒｏｎ  ＧｍｂＨ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にクローニングした。実験用マウス（ＮＭＲＩ）の群に、微粒子撃ち込み（「遺伝子銃」）のための手持ち型装置を使用するＤＮＡコーティングされた金粒子の皮内適用によって、免疫化した。一過性トランスフェクトしたＨＥＫ細胞上の細胞表面発現を、ＬＩＦタンパク質のＮ末端に付加されたタグを認識する抗タグ抗体を用いて確認した。一連の免疫化後に、血清試料を収集し、前述の発現プラスミドを用いて一過性トランスフェクトしたＨＥＫ細胞に対してフローサイトメトリーで試験した。抗体産生細胞を単離し、標準の手順に従って、マウス骨髄腫細胞（Ａｇ８）と融合させた。上に記載した通りにフローサイトメトリー分析においてスクリーニングを行うことによって、ＬＩＦに特異的な抗体を産生するハイブリドーマを特定した。ＲＮＡ保護剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃによるＲＮＡｌａｔｅｒ，ｃａｔ．＃ＡＭ７０２０）を使用して、陽性のハイブリドーマ細胞の細胞ペレットを調製し、抗体の可変ドメインの配列決定のためにさらに処理した。
【００７９】
実施例３−ＬＩＦに特異的なラット抗体のヒト化
それに続くヒト化のために、ラット免疫化（５Ｄ８）からの１つのクローンを選択した。ヒト化は、標準のＣＤＲグラフティング方法を使用して行った。重鎖及び軽鎖領域を、標準の分子クローニング技術を使用して、５Ｄ８ハイブリドーマからクローニングし、サンガー法によって配列決定した。次いで、ヒト重鎖及び軽鎖可変配列に対して、ＢＬＡＳＴ検索を行い、それぞれからの４つの配列を、ヒト化のためのアクセプターフレームワークとして選択した。これらのアクセプターフレームワークを脱免疫原性化して、Ｔ細胞応答エピトープを除去した。５Ｄ８の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を、４つの異なる重鎖アクセプターフレームワーク（Ｈ１からＨ４）、及び４つの異なる軽鎖フレームワーク（Ｌ１からＬ４）にクローニングした。次いで、１６個の異なる抗体をすべて、ＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｓｅｌｅｘｉｓ）における発現；ＬＩＦ誘発ＳＴＡＴ３リン酸化の阻害；及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による結合親和性について試験した。これらの実験を、以下にまとめて示す。
【００８０】
【表１】
2021529162.tif 000003
【００８１】
トランスフェクトした細胞の発現性能を、エルレンマイヤーフラスコ（３×１０５細胞／ｍＬ播種、２００ｍＬ培養体積）中で、流加培養で、１０日の細胞培養後に、比較した。この時点で、細胞を回収し、分泌された抗体をプロテインＡカラムを使用して精製し、次いで定量化した。Ｈ３重鎖を使用するものを除いて、すべてのヒト化抗体が発現した。Ｈ２及びＬ２可変領域は、他の可変領域と比較して、良い成果を果たした（配列番号１５及び配列番号１９）。
【００８２】
チロシン７０５でのＬＩＦ誘発ＳＴＡＴ３リン酸化の阻害を、ウエスタンブロットによって決定した。Ｕ２５１神経膠腫細胞を、１００，０００細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートにプレーティングした。細胞を、あらゆる処理の前に、完全培地で２４時間培養し、その後、細胞を、８時間、血清飢餓状態にした。その後、細胞を、１０μｇ／ｍｌの濃度の指示された抗体で、一晩処理した。処理後、ホスファターゼ及びプロテアーゼ阻害剤を含有する放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）溶解緩衝液中でタンパク質を得、定量化し（ＢＣＡ−タンパク質定量法、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ウエスタンブロットに使用した。ウエスタンブロットについては、メンブレンを、５％脱脂粉乳−ＴＢＳＴ中で１時間ブロッキングし、一次抗体と共に一晩（ｐ−ＳＴＡＴ３、ｃａｔａｌｏｇ＃９１４５、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ若しくはＳＴＡＴ３、ｃａｔａｌｏｇ＃９１３２、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）又は３０分（β−アクチン−ペルオキシダーゼ、ｃａｔａｌｏｇ＃Ａ３８５４、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）インキュベートした。次いで、メンブレンをＴＢＳＴで洗浄し、二次抗体と共にインキュベートし、再び洗浄した。タンパク質を、化学発光（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、ｃａｔａｌｏｇ＃３４０７６、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって検出した。これらの結果を、図１に示す。ｐＳＴＡＴ３バンドの色が濃いほど、存在する阻害が小さい。阻害は、５Ｄ８（非ヒト化ラット）、Ａ（Ｈ０Ｌ０）、Ｃ（Ｈ１Ｌ２）、Ｄ（Ｈ１Ｌ３）、及びＧ（Ｈ２Ｌ２）と標識が付けられたレーンでは高かった；阻害は、Ｈ（Ｈ２Ｌ３）、Ｏ（Ｈ４Ｌ２）、及びＰ（Ｈ４Ｌ３）では中程度であった；阻害は、Ｂ（Ｈ１Ｌ１）、Ｅ（Ｈ１Ｌ４）、Ｆ（Ｈ２Ｌ１）、Ｉ（Ｈ２Ｌ４）、Ｎ（Ｈ４Ｌ１）、及びＱ（Ｈ４Ｌ４）では存在しなかった。
【００８３】
次いで、ＬＩＦ誘発ＳＴＡＴ３リン酸化の阻害を呈する抗体を、ＳＰＲによって分析して、結合親和性を決定した。簡単に言うと、アミンカップリングｈＬＩＦに対するＡ（Ｈ０Ｌ０）、Ｃ（Ｈ１Ｌ２）、Ｄ（Ｈ１Ｌ３）、及びＧ（Ｈ２Ｌ２）、Ｈ（Ｈ２Ｌ３）及びＯ（Ｈ４Ｌ２）ヒト化抗体の結合を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）２００２装置を使用して観察した。速度定数及び親和性を、６つのリガンド濃度でのすべてのセンサーチップ表面上でもたらされたすべてのセンサーグラムの数学的センサーグラムフィッティング（ラングミュア相互作用モデル［Ａ＋Ｂ＝ＡＢ］）によって決定した。各濃度の最も適合する曲線（最小カイ二乗）を、速度定数及び親和性の算出のために使用した。表１を参照されたい。
【００８４】
実験手順は、検体として二価抗体を使用したので、ヒト化抗体の標的結合機構へのより詳細な洞察を得るために、最も適合するセンサーグラムをまた、二価検体フィッティングモデル［Ａ＋Ｂ＝ＡＢ；ＡＢ＋Ｂ＝ＡＢ２］に基づいて分析した。二価フィッティングモデル［Ａ＋Ｂ＝ＡＢ；ＡＢ＋Ｂ＝ＡＢ２］を使用するセンサーグラム動態解析によって、ｍＡｂ試料の相対的親和性順位が確認された。
【００８５】
その高い結合親和性、及び回分培養からの高い収率により、より掘り下げた分析のために、Ｈ２及びＬ２を含むヒト化５Ｄ８を選択した。
【００８６】
実施例４−クローン５Ｄ８のヒト化はＬＩＦに対する結合を向上させる
さらなる分析のために、Ｈ２Ｌ２クローン（ｈ５Ｄ８）を選択し、ＳＰＲによって、結合を、親ラット５Ｄ８（ｒ５Ｄ８）及びマウスクローン１Ｂ２と比較した。１Ｂ２抗体は、以前にＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ａｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭ  ＡＣＣ３０５４）に寄託された、以前に開示されたマウス抗ＬＩＦ抗体であり、比較目的で含められた。それぞれ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びＨＥＫ−２９３細胞から精製された組換え型ヒトＬＩを、リガンドとして使用した。ヒト又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）起源からのＬＩＦを、アミンカップリング化学を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ光学センサーチップの表面に共有結合させ、速度定数から結合親和性を算出した。
【００８７】
材料及び方法
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のヒトＬＩＦは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（参照記号ＬＩＦ  １０１０）から入手し；ＨＥＫ−２９３細胞由来のヒトＬＩＦは、ＡＣＲＯ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（参照記号ＬＩＦ−Ｈ５２１ｂ）から入手した。ＬＩＦを、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ａｍｉｎｅ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＢＲ−１０００−５０；ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ）を使用して、センサーチップにカップリングさせた。試料は、ＣＭ５光学センサーチップ（ＢＲ−１０００−１２；ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ）を使用するＢｉａｃｏｒｅ（商標）２００２装置に流した。機械の稼働中、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を使用した（ＢＲ−１００１−８８；ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ）。結合センサーグラムの動態解析を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ４．１ソフトウェアを使用して実施した。速度定数及び親和性を、漸増する検体濃度でのすべてのセンサーチップ表面上でもたらされたすべてのセンサーグラムの数学的センサーグラムフィッティング（ラングミュア相互作用モデル［Ａ＋Ｂ＝ＡＢ］）によって決定した。決定されたラングミュア抗体−標的親和性に対する二価の寄与（例えば、結合活性の寄与）についての見積もりをもたらすために、センサーグラムをまた、主成分分析を含めて、二価検体センサーグラムフィッティングモデル［Ａ＋Ｂ＝ＡＢ；ＡＢ＋Ｂ＝ＡＢ２］に基づいて分析した。各濃度の最も適合する曲線（最小カイ二乗）を、速度定数及び親和性の算出のために使用した。これらの親和性実験の概要を、表２（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において作られたヒトＬＩＦ）及び表３（ＨＥＫ２９３細胞において作られたヒトＬＩＦ）に示す。
【００８８】
【表２】
2021529162.tif 000004
【００８９】
【表３】
2021529162.tif 000005
【００９０】
この一連の実験から、ラングミュア１：１センサーグラムフィッティングモデルは、ヒト化５Ｄ８（ｈ５Ｄ８）抗体が、マウス１Ｂ２及びｒ５Ｄ８よりも約１０〜２５倍高い親和性で、ヒトＬＩＦに結合したことを示す。
【００９１】
次に、ｈ５Ｄ８抗体を、ＳＰＲによって、複数の種のＬＩＦに対して試験した。ｈ５Ｄ８  ＳＰＲ結合速度解析を、異なる種及び発現系由来の組換え型ＬＩＦ検体：ヒトＬＩＦ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ＨＥＫ２９３細胞）；マウスＬＩＦ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ＣＨＯ細胞）；ラットＬＩＦ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））；カニクイザルＬＩＦ（酵母、ＨＥＫ２９３細胞）について実施した。
【００９２】
材料及び方法
ｈ５Ｄ８抗体を、非共有結合性の、Ｆｃ特異的な捕捉によって、センサーチップ表面に固定した。ＬＩＦ検体に対する抗ＬＩＦ抗体の立体的に均一且つフレキシブルな提示を可能にする、組換え型の、Ｉｇ（Ｆｃ）特異的な黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡ／Ｇを、捕捉剤として使用した。ＬＩＦ検体の供給源は、次の通りである：ヒトＬＩＦ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）より；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ参照記号ＬＩＦ  １０５０）；ヒトＬＩＦ（ＨＥＫ細胞よりＡＣＲＯ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＬＩＦ−Ｈ５２１）；マウスＬＩＦ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃａｔ．Ｎｏ  ＮＦ−ＬＩＦ２０１０）；マウスＬＩＦ（ＣＨＯ細胞より；Ｒｅｐｒｏｋｉｎｅ  Ｃａｔａｌｏｇ＃  ＲＣＰ０９０５６）；サルＬＩＦ（酵母  Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃａｔａｌｏｇ＃  ＲＰ１０７４Ｙ）；ＨＥＫ−２９３細胞において産生されるサルＬＩＦ。全ｈ５Ｄ８が、いくつかの種由来のＬＩＦに対する結合を呈した。この親和性実験の概要を、表４に示す。
【００９３】
【表４】
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【００９４】
実施例５−ヒト化クローン５Ｄ８は、ＳＴＡＴ３のＬＩＦ誘発リン酸化をインビトロで阻害する
ｈ５Ｄ８の生物学的活性を決定するために、ＬＩＦ活性化の細胞培養モデルにおいて、ヒト化及び親型を試験した。図２Ａは、神経膠腫細胞株をヒトＬＩＦと共にインキュベートした場合に、ヒト化クローンが、ＳＴＡＴ３リン酸化（Ｔｙｒ  ７０５）の阻害の増大を呈したことを示す。図２Ｂは、異なる希釈のｈ５Ｄ８抗体を用いて再び行った、図２Ａと同じ手順を用いた実験を示す。
【００９５】
方法
Ｕ２５１神経膠腫細胞を、１５０，０００細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートにプレーティングした。細胞を、あらゆる処理の前に、完全培地で２４時間培養した。その後、細胞を、１０μｇ／ｍｌの濃度のｒ５Ｄ８抗ＬＩＦ抗体又はｈ５Ｄ８抗ＬＩＦ抗体で、一晩処理した、又はしなかった（対照細胞）。
【００９６】
処理後、ホスファターゼ及びプロテアーゼ阻害剤を含有する放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）溶解緩衝液中でタンパク質を得、定量化し（ＢＣＡ−タンパク質定量法、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ウエスタンブロットに使用した。ウエスタンブロットについては、メンブレンを、５％脱脂粉乳−ＴＢＳＴ中で１時間ブロッキングし、一次抗体と共に一晩（ｐ−ＳＴＡＴ３、ｃａｔａｌｏｇ＃９１４５、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ若しくはＳＴＡＴ３、ｃａｔａｌｏｇ＃９１３２、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）又は３０分（β−アクチン−ペルオキシダーゼ、ｃａｔａｌｏｇ＃Ａ３８５４、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）インキュベートした。次いで、メンブレンをＴＢＳＴで洗浄し、必要であれば二次抗体と共にインキュベートし、再び洗浄した。タンパク質を、化学発光（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、ｃａｔａｌｏｇ＃３４０７６、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって検出した。
【００９７】
実施例６−Ｕ−２５１細胞における内在レベルのＬＩＦに対するｈ５Ｄ８抗体処理のＩＣ５０値
Ｕ−２５１細胞において、血清飢餓条件下で、ｈ５Ｄ８についての生物学的阻害に対する４９０ピコモル濃度（図３Ａ）と低いＩＣ５０が決定された。代表的な結果図３Ａ及び３Ｂ及び表５を参照されたい。
【００９８】
【表５】
2021529162.tif 000007
【００９９】
方法
Ｕ−２５１細胞を、（条件あたり）６ｃｍプレートあたり６００，０００細胞で蒔いた。細胞を、対応する濃度（段階希釈（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ））のｈ５Ｄ８で、血清飢餓（０．１％  ＦＢＳ）下で３７℃で一晩処理した。ｐＳＴＡＴ３についての陽性対照として、組換え型ＬＩＦ（Ｒ＆Ｄ  ＃７７３４−ＬＦ／ＣＦ）を使用して、１．７９ｎＭで、３７℃で１０分間、細胞を刺激した。ｐＳＴＡＴ３の陰性対照として、ＪＡＫ  Ｉ阻害剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ＃４２００９９）を、１μＭで、３７℃で３０分間使用した。次いで、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｍｕｌｔｉ−Ｓｐｏｔ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｔｏｔａｌ  ＳＴＡＴ３（Ｃａｔ＃  Ｋ１５０ＳＮＤ−２）及びＰｈｏｓｐｈｏ−ＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）（Ｃａｔ＃  Ｋ１５０ＳＶＤ−２）キットのプロトコルに従って、細胞を、ライセートのために氷上に回収して、ＭＳＤ  Ｍｅｓｏ  Ｓｅｃｔｏｒ  Ｓ６００によって、検出可能なタンパク質レベルを測定した。
【０１００】
実施例７−ヒトＬＩＦに特異的に結合する追加の抗体
ヒトＬＩＦと特異的に結合する他のラット抗体クローン（１０Ｇ７及び６Ｂ５）を特定し、その結合特性の概要を、下の表６に示す（クローン１Ｂ２は比較としての役割を果たす）。
【０１０１】
方法
検体として、組換え型ＬＩＦ標的タンパク質［ヒトＬＩＦ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＬＩＦ  １０１０及びヒトＬＩＦ（ＨＥＫ２９３細胞）；ＡＣＲＯ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＬＩＦ−Ｈ５２１ｂ］を適用して、ＣＭ５光学センサーチップの表面上に固定された抗ＬＩＦ  ｍＡｂｓ  １Ｂ２、１０Ｇ７、及び６Ｂ５について、リアルタイム結合動態解析を実施した。
【０１０２】
速度定数及び親和性は、グローバルフィッティング（センサーグラムセットの同時フィッティング）並びに単一曲線フィッティングアルゴリズムを適用して、ラングミュア１：１結合モデルを使用する数学的センサーグラムフィッティングによって得た。グローバルフィットの妥当性を、ｋｏｂｓ解析によって評価した。
【０１０３】
【表６】
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【０１０４】
実施例８−ＳＴＡＴ３のＬＩＦ誘発リン酸化をインビトロで阻害する追加の抗ＬＩＦ抗体
追加のクローンを、細胞培養において、ＳＴＡＴ３のＬＩＦ誘発リン酸化を阻害するその能力について試験した。図４に示す通り、クローン１０Ｇ７及び以前に詳述したｒ５Ｄ８は、１Ｂ２クローンと比較して、ＬＩＦ誘発ＳＴＡＴ３リン酸化の高い阻害を呈した。抗ＬＩＦポリクローナル抗血清（ｐｏｓ．）は、陽性対照として含まれていた。６Ｂ５は、阻害を呈さなかったが、これは、この実験で使用された非グリコシル化ＬＩＦに対する６Ｂ５結合が存在しない可能性によって説明することができる。
【０１０５】
方法
患者由来の神経膠腫細胞を、１５０，０００細胞／ウェルの密度で、６ウェルプレートにプレーティングした。細胞を、あらゆる処理の前に、Ｂ２７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ペニシリン／ストレプトマイシン、及び増殖因子（２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ及び２０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−２［ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ］）を添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から構成されるＧＢＭ培地中で、２４時間培養した。次の日、細胞を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において産生された組換え型ＬＩＦ、又は組換え型ＬＩＦプラス指示された抗体の混合物で、１５分間処理した、又はしなかった（抗体については１０μｇ／ｍｌの最終濃度、及び２０ｎｇ／ｍｌの組換え型ＬＩＦ）。処理後、ホスファターゼ及びプロテアーゼ阻害剤を含有する放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）溶解緩衝液中でタンパク質を得、定量化し（ＢＣＡ−タンパク質定量法、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ウエスタンブロットに使用した。ウエスタンブロットについては、メンブレンを、５％脱脂粉乳−ＴＢＳＴ中で１時間ブロッキングし、一次抗体と共に一晩（ｐ−ＳＴＡＴ３、ｃａｔａｌｏｇ＃９１４５、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）又は３０分（β−アクチン−ペルオキシダーゼ、ｃａｔａｌｏｇ＃Ａ３８５４、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）インキュベートした。次いで、メンブレンをＴＢＳＴで洗浄し、必要であれば二次抗体と共にインキュベートし、再び洗浄した。タンパク質を、化学発光（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、ｃａｔａｌｏｇ＃３４０７６、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって検出した。
【０１０６】
実施例９−ＬＩＦは複数の腫瘍型にわたって高度に過剰発現される
複数のヒト腫瘍型に対して免疫組織化学を行って、ＬＩＦ発現の程度を決定した。図５に示す通り、ＬＩＦは、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、卵巣癌、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、及び膵腫瘍において高度に発現される。
【０１０７】
実施例１０−ヒト化クローンｈ５Ｄ８は非小細胞肺癌のマウスモデルにおいて腫瘍増殖を阻害する
ヒト化５Ｄ８クローンがＬＩＦ陽性癌をインビボで阻害する能力を決定するために、この抗体を、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）のマウスモデルにおいて試験した。図６は、この抗体で治療されたマウスにおける、賦形剤の陰性対照と比較した腫瘍増殖の減少を示す。
【０１０８】
方法
高いＬＩＦレベルを有するマウス非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞株ＫＬＮ２０５を、インビボでの生物発光モニタリングのために、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を発現するレンチウイルスに安定に感染させた。マウスモデルを発病させるために、５×１０５個のＫＬＮ２０５非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞を、８週齢の免疫適格性の同系移植ＤＢＡ／２マウスの左肺に、肋間穿刺によって同所性移植した。マウスを、対照賦形剤で又は１５ｍｇ／ｋｇ若しくは３０ｍｇ／ｋｇのｈ５Ｄ８抗体で（週２回、腹腔内に）治療し、腫瘍増殖を生物発光によってモニタリングした。生物発光画像化のために、マウスは、１〜２％吸入イソフルラン麻酔下で０．２ｍＬの１５ｍｇ／ｍＬ  Ｄ−ルシフェリンの腹腔内注射を受けた。生物発光シグナルは、高感度冷却ＣＣＤカメラから構成されるＩＶＩＳシステム２０００シリーズ（Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してモニタリングした。Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）を使用して、画像化データをグリッド処理し、囲まれた各領域内の全生物発光シグナルを統合した。データは、対象領域（ＲＯＩ）内の全光子束放射（光子／秒）を使用して解析した。結果は、ｈ５Ｄ８抗体での治療が、腫瘍退縮を促進することを実証する。データは、平均値±ＳＥＭとして示される。
【０１０９】
実施例１１−ｈ５Ｄ８は多形神経膠芽腫のマウスモデルにおいて腫瘍増殖を阻害する
ルシフェラーゼ発現ヒト細胞株Ｕ２５１を使用する、同所移植ＧＢＭ腫瘍モデルでは、腹腔内（ＩＰ）注射によって３００μｇ  ｒ５Ｄ８及びｈ５Ｄ８を週２回投与したマウスにおいて、ｒ５Ｄ８は、腫瘍体積を有意に低下させた。この研究の結果を、図７Ａに示す（治療後第２６日に定量化）。この実験をまた、２００μｇ又は３００μｇで治療されるヒト化ｈ５Ｄ８マウスを使用して行い、治療の７日後の腫瘍の統計的に有意な低下が示された。
【０１１０】
方法
ルシフェラーゼを安定に発現するＵ２５１細胞を収集し、ＰＢＳ中で洗浄し、４００ｇで５分間遠心分離し、ＰＢＳに再懸濁し、自動セルカウンター（Ｃｏｕｎｔｅｓｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて計数した。最適な生存能を維持するために、細胞を氷上に維持した。マウスを、ケタミン（Ｋｅｔｏｌａｒ５０（登録商標））／キシラシン（Ｘｙｌａｃｉｎｅ）（Ｒｏｍｐｕｎ（登録商標））（それぞれ７５ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与で麻酔した。各マウスを、注意深く定位装置に入れ、固定した。脱毛クリームを用いて頭部から毛を除去し、メスで頭部皮膚を切断して、頭蓋骨を露出させた。ラムダに対して横方向１．８ｍｍ且つ前方向１ｍｍの座標に、穿孔器を用いて小さい切開部を注意深く作成した。右線条体に、２．５ｍｍの深さでＨａｍｉｌｔｏｎ  ３０Ｇシリンジを使用して、５μＬの細胞を接種した。Ｈｙｓｔｏａｃｒｙｌ組織接着剤（Ｂｒａｕｎ）を用いて頭部切開部を閉じ、マウスに皮下鎮痛薬メロキシカム（Ｍｅｔａｃａｍ（登録商標））（１ｍｇ／ｋｇ）を注射した。各マウスに移植された最終細胞数は、３×１０５個であった。
【０１１１】
マウスを、腹腔内に投与されるｈ５Ｄ８で週２回治療した。治療は、腫瘍細胞接種の直後、第０日に開始した。マウスは、ｈ５Ｄ８又は賦形剤対照の合計２回の投与を受けた。
【０１１２】
体重及び腫瘍体積：体重は、２回／週、測定し、腫瘍増殖は、第７日に生物発光（Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）によって定量化した。生物発光活性をインビボで定量化するために、マウスを、イソフルオラン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）を使用して麻酔し、ルシフェリン基質（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）（１６７μｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。
【０１１３】
生物発光（Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）によって求められた腫瘍サイズを、第７日に評価した。個々の腫瘍測定値、及び各治療群についての平均値±ＳＥＭを算出した。統計的有意性は、対応のないノンパラメトリックなマン・ホイットニーのＵ検定によって決定した。
【０１１４】
実施例１２−ｈ５Ｄ８は卵巣癌のマウスモデルにおいて腫瘍増殖を阻害する
ｒ５Ｄ８の有効性を、２つの他の同系移植腫瘍モデルにおいて評価した。卵巣同所移植腫瘍モデルＩＤ８では、３００μｇ  ｒ５Ｄ８（週２回）のＩＰ投与は、腹部体積によって測定された場合に、腫瘍増殖を有意に阻害した（図８Ａ及び８Ｂ）。図８Ｃにおける結果は、ｈ５Ｄ８はまた、２００μｇ以上の用量でも腫瘍体積を低下させたことを示す。
【０１１５】
方法
ＩＤ８細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、４０Ｕ／ｍＬペニシリン及び４０μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ＰｅｎＳｔｒｅｐ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び０．２５μｇ／ｍＬプラスモシン（Ｐｌａｓｍｏｃｉｎ）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を添加した、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。
【０１１６】
ＩＤ８細胞を収集し、ＰＢＳ中で洗浄し、４００ｇで５分間遠心分離し、ＰＢＳに再懸濁した。最適な生存能を維持するために、細胞を氷上に維持し、２００μＬの細胞懸濁液を、２７Ｇ針を用いて腹腔内に注射した。マウスに移植された最終細胞数は、５×１０６個であった。
【０１１７】
マウスは、指示された通りの異なる用量でｉｐ投与されるｈ５Ｄ８で週２回治療した。体重は、２回／週、測定し、腫瘍増悪は、ノギス（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して腹囲を測定することによってモニタリングした。
【０１１８】
実施例１３−ｒ５Ｄ８は結腸直腸癌のマウスモデルにおいて腫瘍増殖を阻害する
皮下結腸ＣＴ２６腫瘍を有するマウスでは、ｒ５Ｄ８（週２回３００μｇをＩＰ投与される）は、腫瘍増殖を有意に阻害した（図９Ａ及び９Ｂ）。
【０１１９】
方法
ＣＴ２６細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、４０Ｕ／ｍＬペニシリン及び４０μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ＰｅｎＳｔｒｅｐ）、及び０．２５μｇ／ｍＬプラスモシン（Ｐｌａｓｍｏｃｉｎ）を添加した、ロズウェルパーク記念研究所培地（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｍｅｄｉｕｍ）（ＲＰＭＩ［Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］）中で培養した。
【０１２０】
ＣＴ２６細胞（８×１０５）を、トリプシン処理し、ＰＢＳですすぎ、４００ｇで５分間遠心分離し、１００μＬ  ＰＢＳに再懸濁した。細胞は、細胞死を回避するために氷上に維持した。ＣＴ２６細胞を、２７Ｇ針を使用する皮下注射を介して、マウスに投与した。
【０１２１】
３００μｇ  ｒ５Ｄ８、又は賦形剤対照を、ＣＴ２６細胞移植後、第３日から、週２回、腹腔内注射（ＩＰ）を介してマウスに投与した。
【０１２２】
体重及び腫瘍体積は、１週間に３回測定した。腫瘍体積は、ノギス（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した。
【０１２３】
実施例１４−ｒ５Ｄ８は腫瘍モデルにおいて炎症性浸潤を減少させる  
Ｕ２５１  ＧＢＭ同所移植モデルでは、ＣＣＬ２２、すなわちＭ２極性化マクロファージのマーカーの発現は、図１０Ａに示した通り、ｒ５Ｄ８で治療された腫瘍において有意に低下した。この所見はまた、ｒ５Ｄ８を使用する、生理学的に関連する器官型組織片培養モデルにおいても確認され、ここでは、３つの患者試料は、図１０Ｂに示した通り、治療後に、ＣＣＬ２２及びＣＤ２０６（ＭＲＣ１）発現（同様にＭ２マクロファージのマーカー）の有意な低下を示した（ＭＲＣ１とＣＣＬ２２の両方について、上（対照）を下（治療）と比較されたい）。さらに、ｒ５Ｄ８はまた、免疫適格性マウスにおける同系移植ＩＤ８（図１０Ｃ）及びＣＴ２６（図１０Ｄ）腫瘍において、ＣＣＬ２２＋Ｍ２マクロファージを減少させた。
【０１２４】
実施例１５−ｒ５Ｄ８は非骨髄性エフェクター細胞を増加させる
さらなる免疫機構を調べるために、腫瘍微小環境内でのＴ細胞及び他の非骨髄性免疫エフェクター細胞に対するｒ５Ｄ８の効果を評価した。卵巣同所移植ＩＤ８同系移植モデルでは、ｒ５Ｄ８治療は、図１１Ａに示した通り、腫瘍内ＮＫ細胞の増加及び全部の及び活性化されたＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の増加をもたらした。同様に、結腸同系移植ＣＴ２６腫瘍モデルでは、ｒ５Ｄ８は、図１１Ｂに示した通り、腫瘍内ＮＫ細胞を増加させ、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を増加させ、また、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ−ｒｅｇ細胞を減少させる傾向があった。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ−ｒｅｇ細胞の減少の傾向はまた、図１１Ｃに示した通り、ｒ５Ｄ８治療後の同系移植同所移植ＫＬＮ２０５腫瘍モデルにおいても観察された。有効性を媒介するためのＴ細胞の必要性と一致して、ＣＴ２６モデルにおけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇は、図１２に示した通り、ｒ５Ｄ８の抗腫瘍有効性を阻害した。
【０１２５】
Ｔ細胞枯渇のための方法
ＣＴ２６細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ［Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］）、４０Ｕ／ｍＬペニシリン及び４０μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ＰｅｎＳｔｒｅｐ［Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］）、及び０．２５μｇ／ｍＬプラスモシン（Ｐｌａｓｍｏｃｉｎ）を添加した、ＲＰＭＩ培養培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。ＣＴ２６細胞（５×１０５）を、収集し、ＰＢＳですすぎ、４００ｇで５分間遠心分離し、１００μＬ  ＰＢＳに再懸濁した。細胞は、細胞死を回避するために氷上に維持した。ＣＴ２６細胞を、２７Ｇシリンジを使用する皮下注射を介して、マウスの両側腹部に投与した。マウスは、研究デザインにおいて指示された通り、腹腔内投与されるｒ５Ｄ８で週２回治療した。賦形剤対照（ＰＢＳ）、ラットｒ５Ｄ８、及び／又は抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８を、研究デザインにおいて記述した通り、週２回、腹腔内注射（ＩＰ）を介してマウスに投与した。すべての抗体治療は、同時に施された。
【０１２６】
実施例１６−ヒトＬＩＦとの複合体におけるｈ５Ｄ８の結晶構造
ｈ５Ｄ８の結晶構造を、ｈ５Ｄ８が結合するＬＩＦ上のエピトープを決定する、また、結合に関与するｈ５Ｄ８の残基を決定するために、３．１オングストロームの分解能に対して解析した。共結晶構造から、ＬＩＦのＮ末端ループが、ｈ５Ｄ８の軽鎖可変領域と重鎖可変領域との間の中心に位置することが明らかになった（図１３Ａ）。さらに、ｈ５Ｄ８は、ＬＩＦのヘリックスＡ及びＣ上の残基と相互作用し、それによって、不連続且つ立体構造的エピトープを形成する。結合は、いくつかの塩橋、Ｈ結合、及びファンデルワールス相互作用によって推進される（表７、図１３Ｂ）。ＬＩＦのｈ５Ｄ８エピトープは、ｇｐ１３０との相互作用の領域に及ぶ。Ｂｏｕｌａｎｇｅｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｂａｎｋｏｖｉｃｈ，Ａ．Ｊ．，Ｋｏｒｔｅｍｍｅ，Ｔ．，Ｂａｋｅｒ，Ｄ．＆Ｇａｒｃｉａ，Ｋ．Ｃ．  Ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｓｈａｒｅｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｐ１３０．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  １２，５７７−５８９（２００３）を参照されたい。これらの結果を、下の表７にまとめて示し、また、図１３に表す。
【０１２７】
【表７】
2021529162.tif 000009
【０１２８】
方法
ＬＩＦは、ＨＥＫ  ２９３Ｓ（Ｇｎｔ  Ｉ−／−）細胞において一過性発現させ、Ｎｉ−ＮＴＡ親和性クロマトグラフィー、それに続いてゲル濾過クロマトグラフィー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中）を使用して精製した。組換え型ｈ５Ｄ８  Ｆａｂは、ＨＥＫ  ２９３Ｆ細胞において一過性発現させ、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔアフィニティクロマトグラフィー、それに続いて陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して精製した。精製されたｈ５Ｄ８  ＦａｂとＬＩＦを、１：２．５のモル比で混合し、室温で３０分間インキュベートし、その後ＥｎｄｏＨを使用して脱グリコシル化を行った。続いて、ゲル濾過クロマトグラフィーを使用して、複合体を精製した。この複合体を、２０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、低密度マトリックススクリーン（ｔｅｓｐａｒｓｅ  ｍａｔｒｉｘ  ｓｃｒｅｅｎ）を使用する結晶化試行のために準備した。１９％（ｖ／ｖ）イソプロパノール、１９％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ  ４０００、５％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０９５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．６）を含有する条件で、４℃で結晶を形成させた。この結晶を、Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ（ＣＬＳ）の０８ＩＤ−１ビームラインで、３．１Åの分解能まで回折させた。データを収集し、Ｋａｂｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｘｄｓ．Ａｃｔａ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ６６，１２５−１３２（２０１０）の通りにＸＤＳを使用して処理及びスケーリングした。構造は、ＭｃＣｏｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｓｅｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ４０，６５８−６７４（２００７）の通りに、Ｐｈａｓｅｒを使用して、分子置換によって決定した。構造が許容されるＲｗｏｒｋ及びＲｆｒｅｅに収束するまで、Ｃｏｏｔ及びｐｈｅｎｉｘ．ｒｅｆｉｎｅを使用して、数回繰り返されるモデル構築及び精密化を実施した。Ｅｍｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｅａｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｏｏｔ．Ａｃｔａ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ６６，４８６−５０１（２０１０）；及びＡｄａｍｓ，ｅｔ  ａｌ．ＰＨＥＮＩＸ：ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｐｙｔｈｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ａｃｔａ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ６６，２１３−２２１（２０１０）をそれぞれ参照されたい。図は、ＰｙＭＯＬ（Ｔｈｅ  ＰｙＭＯＬ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０  Ｓｃｈｒｏｅｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ）で作成した。
【０１２９】
実施例１７−ｈ５Ｄ８はＬＩＦに対する高い特異性を有する
目的は、ｈ５Ｄ８の他のＬＩＦファミリーメンバーに対する結合を試験して、結合特異性を決定することであった。Ｏｃｔｅｔ９６解析を使用すると、ヒトＬＩＦに対するｈ５Ｄ８結合は、ＬＩＦと最も高い相同性のＩＬ−６ファミリーメンバーオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）に対する結合よりもおよそ１００倍強い（どちらのタンパク質も大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において産生される場合）。どちらのタンパク質も哺乳類系において産生される場合、ｈ５Ｄ８は、ＯＳＭに対する結合は呈しない。データを、表８にまとめて示す。
【０１３０】
【表８】
2021529162.tif 000010
【０１３１】
方法
Ｏｃｔｅｔ結合実験：試薬は、製造者によって提供されたマニュアルの通りに使用及び調製した。基本の速度解析実験（Ｂａｓｉｃ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）は、Ｏｃｔｅｔ  Ｄａｔａ  Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎソフトウェアｖｅｒ．９．０．０．２６を次の通りに使用して実施した：センサー／プログラムの設定：ｉ）平衡化（６０秒）；ｉｉ）負荷（１５秒）；ｉｉｉ）ベースライン（６０秒）；ｉｖ）結合（１８０秒）；及びｖ）解離（６００秒）。
【０１３２】
サイトカインに対するｈ５Ｄ８のＯｃｔｅｔ親和性：基本の速度解析実験（Ｂａｓｉｃ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）は、Ｏｃｔｅｔ  Ｄａｔａ  Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎソフトウェアｖｅｒ．９．０．０．２６を次の通りに使用して実施した：アミン反応性第２世代バイオセンサー（Ａｍｉｎｅ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ２ｎｄＧｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ）（ＡＲ２Ｇ）を水中で最低１５分間含水させた。バイオセンサーに対するｈ５Ｄ８のアミン結合を、アミンカップリング第２世代キット（Ａｍｉｎｅ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を使用して、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｎｏｔｅ  ２６（参考文献を参照されたい）に従って実施した。浸漬ステップは、３０℃、１０００ｒｐｍで、次の通りに実施した：ｉ）水中での６０秒の平衡化；ｉｉ）２０ｍＭ  ＥＣＤ、１０ｍＭスルホ−ＮＨＳ（水中）中での３００秒の活性化；ｉｉｉ）１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）中での１０μｇ／ｍｌ  ｈ５Ｄ８の６００秒の固定化；ｉｖ）１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．５）中での３００秒の反応停止（Ｑｕｅｎｃｈ）；ｖ）水中での１２０秒のベースライン。次いで、３０℃、１０００ｒｐｍでの次の浸漬及び読み取りステップを伴う速度解析実験を実施した：ｖｉ）１Ｘ速度解析緩衝液中での６０秒のベースライン；ｖｉｉ）サイトカインの１Ｘ速度解析緩衝液中での適切な段階希釈物の１８０秒の結合；ｖｉｉｉ）１Ｘ速度解析緩衝液中での３００秒の解離；ｉｘ）それぞれ１０ｍＭグリシン（ｐＨ２．０）と１Ｘ速度解析緩衝液とを交代させる３回の再生／中和サイクル（３回のサイクルについてそれぞれ５秒）。再生後、バイオセンサーを、その後の結合分析のために再利用した。
【０１３３】
哺乳類細胞から産生されるヒト組換え型ＬＩＦは、ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＬＩＦ−Ｈ５２１ｂ）によるものであった；哺乳類細胞において産生されるヒト組換え型ＯＳＭは、Ｒ＆Ｄ（８４７５−ＯＭ／ＣＦ）によるものであった；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞において産生されるヒト組換え型ＯＳＭは、Ｒ＆Ｄ（２９５−ＯＭ−０５０／ＣＦ）によるものであった。
【０１３４】
実施例１８−ｈ５Ｄ８  ｆａｂの結晶構造
広範囲の化学的条件下でのｈ５Ｄ８  Ｆａｂの５つの結晶構造を決定した。これらの構造の高い分解能は、ＣＤＲ残基の立体構造が、わずかな自由度しか伴っておらず、異なる化学環境でも高度に類似であることを示す。この抗体の固有の特徴は、可変重鎖領域の第１００位における非カノニカルなシステインの存在である。構造分析により、システインが不対であり、溶媒に大いに近づきにくいことが示される。
【０１３５】
Ｈ５Ｄ８  Ｆａｂは、そのＩｇＧのパパイン消化、それに続く、標準のアフィニティ、イオン交換、及びクロマトグラフィー技術を使用する精製によって得た。結晶は、蒸気拡散法を使用して得、分解能が１．６５Å〜２．０Åの範囲である５つの結晶構造を決定することが可能になった。５つの異なるｐＨレベル：５．６、６．０、６．５、７．５、及び８．５にわたる範囲である結晶化条件にもかかわらず、すべての構造が、同じ結晶学的空間群内で、且つ類似の単位格子寸法を伴って（Ｐ２１２１２１、ａ  約５３．８Å、ｂ  約６６．５Å、ｃ  約１４３．３Å）解析された。したがって、これらの結晶構造は、人工産物を詰め込んだ結晶によって邪魔されない、また、広範囲の化学的条件にわたる、ｈ５Ｄ８  Ｆａｂの三次元配置の比較が可能である。
【０１３６】
すべての相補性決定領域（ＣＤＲ）残基について、電子密度を観察し、続いて、これをモデル化した。注目すべきことに、ＬＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２は、細長い立体構造をとり、これは、浅いＬＣＤＲ３及びＨＣＤＲ３領域と共に、パラトープの中心の結合溝を形成していた（図１４Ａ）。５つの構造は、すべての残基にわたって高度に類似であり、すべての原子の平均二乗偏差は、０．１９７Å〜０．３２７Åの範囲である（図１４Ａ）。これらの結果は、ＣＤＲ残基の立体構造が、５．６〜８．５の範囲であるｐＨレベル及び１５０ｍＭ〜１Ｍの範囲であるイオン強度を含めた様々な化学環境において維持されることを示した。ｈ５Ｄ８パラトープの静電表面の分析から、正及び負に帯電した領域が、親水特性に等しく寄与し、広く行きわたる疎水性パッチは存在しないことが明らかになった。ｈ５Ｄ８は、ＨＣＤＲ３の基部に（Ｃｙｓ１００）、非カノニカルなシステインというあまり見られない特徴を有する。５つすべての構造において、この遊離のシステインが配列され、ジスルフィドスクランブルをまったく形成しない。さらに、これは、Ｃｙｓ（システイン付加（ｃｙｓｔｅｉｎｙｌａｔｉｏｎ））又はグルタチオン（グルタチオン付加（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｌａｔｉｏｎ））の付加によって改変されず、重鎖のＬｅｕ４、Ｐｈｅ２７、Ｔｒｐ３３、Ｍｅｔ３４、Ｇｌｕ１０２、及びＬｅｕ１０５の主鎖及び側鎖原子と共にファンデルワールス相互作用（３．５〜４．３Å距離）を生じる（図１４Ｂ）。最後に、Ｃｙｓ１００は、ＣＤＲ１及びＨＣＤＲ３の立体構造を媒介するのに関与するように見える圧倒的に埋没した構造の残基である。したがって、本発明者らの５つの結晶構造におけるこの領域の均一な配置によって観察される場合に、他のシステインとの反応性を有する可能性が低い。
【０１３７】
方法
Ｈ５Ｄ８−１  ＩｇＧは、Ｃａｔａｌｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓから入手し、２５ｍＭヒスチジン、６％スクロース、０．０１％ポリソルベート８０中でｐＨ６．０で調製した。調製されたＩｇＧを、１０Ｋ  ＭＷＣＯ濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、大規模にＰＢＳに緩衝液交換し、その後、３７℃で１時間、１：１００マイクログラムのパパイン（Ｓｉｇｍａ）（ＰＢＳ、１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭシステイン中）を用いて消化を行った。パパインで消化されたＩｇＧを、ＡＫＴＡ  Ｓｔａｒｔクロマトグラフィーシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、プロテインＡカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に流した。ｈ５Ｄ８  Ｆａｂを含有するプロテインＡ素通り画分を回収し、１０Ｋ  ＭＷＣＯ濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、２０ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ５．６）に緩衝液交換した。得られた試料を、ＡＫＴＡ  Ｐｕｒｅクロマトグラフィーシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、Ｍｏｎｏ  Ｓ陽イオン交換カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に負荷した。１Ｍ塩化カリウムのグラジエントを用いる溶離は、顕著なｈ５Ｄ８  Ｆａｂピークをもたらし、これを回収し、濃縮し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム中で、ｐＨ８．０で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅゲル濾過カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製して、大きさを均一にした。還元及び非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、高純度のｈ５Ｄ８  Ｆａｂが確認された。
【０１３８】
精製されたｈ５Ｄ８  Ｆａｂを、１０Ｋ  ＭＷＣＯ濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して２５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。Ｏｒｙｘ  ４ディスペンサー（Ｄｏｕｇｌａｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、２０℃で低密度マトリックス９６−コンディションズ（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）市販のスクリーンＪＣＳＧ  ＴＯＰ９６（Ｒｉｇａｋｕ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ）及びＭＣＳＧ−１（Ａｎａｔｒａｃｅ）を用いる蒸気拡散結晶化実験の準備をした。次の５つの結晶化条件：１）０．０８５Ｍクエン酸ナトリウム、２５．５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ  ４０００、０．１７Ｍ酢酸アンモニウム、１５％（ｖ／ｖ）グリセロール（ｐＨ５．６）；２）０．１Ｍ  ＭＥＳ、２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ  ６０００、１Ｍ塩化リチウム（ｐＨ６．０）；３）０．１Ｍ  ＭＥＳ、２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ  ４０００、０．６Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ６．５）；４）０．０８５Ｍ  ＨＥＰＥＳナトリウム、１７％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ  ４０００、８．５％（ｖ／ｖ）２−プロパノール、１５％（ｖ／ｖ）グリセロール（ｐＨ７．５）；及び５）０．０８Ｍ  Ｔｒｉｓ、２４％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ  ４０００、０．１６Ｍ塩化マグネシウム、２０％（ｖ／ｖ）グリセロール（ｐＨ８．５）において、４日後に結晶を得、収集した。液体窒素中で瞬間凍結させる前、結晶を含有する母液を、必要に応じて５〜１５％（ｖ／ｖ）グリセロール又は１０％（ｖ／ｖ）エチレングリコールと共に添加した。結晶に、先端放射光施設（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ）でのＸ線シンクロトロン放射、ビームライン２３−ＩＤ−Ｄ（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を施し、回折パターンを、Ｐｉｌａｔｕｓ３  ６Ｍ検出器で記録した。ＸＤＳを使用してデータを処理し、Ｐｈａｓｅｒを使用して分子置換によって構造を決定した。Ｃｏｏｔでのモデル構築と共に、ＰＨＥＮＩＸでの精密化を実施した。図は、ＰｙＭＯＬで作成した。すべてのソフトウェアは、ＳＢＧｒｉｄを通してアクセスした。
【０１３９】
実施例１９−ｈ５Ｄ８のシステイン１００での変異は結合を維持する
ｈ５Ｄ８の分析から、重鎖の可変領域における第１００位での遊離のシステイン残基（Ｃ１００）が明らかになった。ヒト及びマウスＬＩＦに対する結合及び親和性を特徴付けるために、Ｃ１００をそれぞれ天然に存在するアミノ酸と置換することによって、Ｈ５Ｄ８バリアントを作製した。ＥＬＩＳＡ及びＯｃｔｅｔアッセイを使用して、結合を特徴付けた。結果を表９にまとめて示す。ＥＬＩＳＡ  ＥＣ５０曲線は、図１５に示す（図１５Ａ  ヒトＬＩＦ及び図１５Ｂ  マウスＬＩＦ）。
【０１４０】
【表９】
2021529162.tif 000011
【０１４１】
方法
ＥＬＩＳＡ：ヒト及びマウスＬＩＦに対するｈ５Ｄ８  Ｃ１００バリアントの結合を、ＥＬＩＳＡによって決定した。組換え型ヒト又はマウスＬＩＦタンパク質を、１μｇ／ｍＬで、４℃で一晩、Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ３８４ウェルプレート上にコーティングした。プレートを、室温で２時間、１×ブロッキング緩衝液でブロッキングした。各ｈ５Ｄ８  Ｃ１００バリアントの段階希釈物（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）を添加し、室温で１時間結合させた。プレートを、ＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した。ＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧを添加し、室温で３０分間結合させた。プレートを、ＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄し、１×ＴＭＢ基質を使用して顕色させた。１Ｍ  ＨＣｌを用いて反応を停止させ、４５０ｎｍでの吸収を測定した。図の作成及び非線形回帰分析は、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して実施した。
【０１４２】
Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６：ヒト及びマウスＬＩＦに対するｈ５Ｄ８  Ｃ１００バリアントの親和性を、Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６システムを使用して、ＢＬＩによって決定した。ｈ５Ｄ８  Ｃ１００バリアントを、１×速度解析緩衝液中での３０秒のベースライン後に、７．５μｇ／ｍＬで、抗ヒトＦｃバイオセンサーに負荷した。ヒト又はマウスＬＩＦタンパク質の段階希釈物（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）を、９０秒間、負荷されたバイオセンサーに結合させ、３００秒間、１×速度解析緩衝液中で解離させた。ＫＤは、１：１グローバルフィットモデルを使用して、データ分析ソフトウェアによって算出した。
【０１４３】
実施例２０−ｈ５Ｄ８はＬＩＦのｇｐ１３０への結合をインビトロで阻止する
ｈ５Ｄ８が、ＬＩＦがＬＩＦＲと結合するのを妨げるかどうかを決定するために、Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ  ９６  プラットフォームを使用する分子結合アッセイを実施した。Ｈ５Ｄ８を、抗ヒトＦｃ捕捉によってＡＨＣバイオセンサーに負荷した。次いで、バイオセンサーをＬＩＦに浸漬させ、予想通り、結合が観察された（図１６Ａ、３分割の中央）。続いて、バイオセンサーを、異なる濃度のＬＩＦＲに浸漬させた。用量依存性の結合が観察された（図１６Ａ、３分割の右側）。対照実験は、この結合がＬＩＦ特異的であり（図示していない）、ＬＩＦＲとｈ５Ｄ８との、又はバイオセンサーとの非特異的な相互作用に起因しないことを実証した。
【０１４４】
ｈ５Ｄ８とＬＩＦとの結合をさらに特徴付けるために、一連のＥＬＩＳＡ結合実験を行った。Ｈ５Ｄ８とＬＩＦをプレインキュベートし、次いで、組換え型ヒトＬＩＦＲ（ｈＬＩＦＲ）又はｇｐ１３０でコーティングしたプレートに導入した。ｈ５Ｄ８／ＬＩＦ複合体とコーティング基質との間の結合の欠如は、ｈ５Ｄ８が、ＬＩＦの受容体への結合を何らかの方法で妨害したことを示すであろう。さらに、ＬＩＦと結合しない対照抗体（（−）で示されるアイソタイプ対照）、又は知られている結合部位でＬＩＦと結合する対照抗体（Ｂ０９は、ＬＩＦ結合について、ｇｐ１３０ともＬＩＦＲとも競合しない；ｒ５Ｄ８は、ｈ５Ｄ８のラット親型である）も使用した。ＥＬＩＳＡ結果は、ｈ５Ｄ８／ＬＩＦ複合体が、ｈＬＩＦＲと結合することが可能である（ｒ５Ｄ８／ＬＩＦ複合体もそうである）ことを実証し、これらの抗体がＬＩＦ／ＬＩＦＲ結合を妨げないことが示された（図１６Ａ）。対照的に、ｈ５Ｄ８／ＬＩＦ複合体（及びｒ５Ｄ８／ＬＩＦ複合体）は、組換え型ヒトｇｐ１３０と結合することが可能ではなかった（図１６Ｂ）。これは、ＬＩＦがｈ５Ｄ８に結合した場合に、ＬＩＦのｇｐ１３０結合部位が影響を受けたことを示す。
【０１４５】
実施例２１−ヒト組織におけるＬＩＦ及びＬＩＦＲ発現
ＬＩＦ及びＬＩＦＲの発現レベルを決定するために、多くの異なる種類のヒト組織に対して、定量的リアルタイムＰＣＲを実施した。図１７Ａ及び１７Ｂに示した平均発現レベルは、１００ｎｇの全ＲＮＡあたりのコピー数として示される。ほとんどの組織は、１００ｎｇの全ＲＮＡあたり少なくとも１００コピーを発現した。ＬＩＦ  ｍＲＮＡ発現は、ヒト脂肪組織（腸間膜−回腸［１］）、血液−血管組織（脈絡膜−神経叢［６］及び腸間膜［８］）、及び臍帯［６８］組織において最も高く、脳組織（皮質［２０］及び黒質［２８］）において最も低かった。ＬＩＦＲ  ｍＲＮＡ発現は、ヒト脂肪組織（腸間膜−回腸［１］）、血管組織（肺［９］）、脳組織［１１−２８］、及び甲状腺［６６］組織において最も高く、ＰＢＭＣ［３１］において最も低かった。カニクイザル組織におけるＬＩＦ及びＬＩＦＲ  ｍＲＮＡ発現レベルは、ヒト組織において観察されるものと同様であり、ここでは、ＬＩＦ発現は、脂肪組織において高く、また、ＬＩＦＲ発現は、脂肪組織において高く、ＰＢＭＣにおいて低かった（データは示していない）。
【０１４６】
図１７Ａ及び図１７Ｂについての組織番号付けは、以下である：１−脂肪（腸間膜−回腸）；２−副腎；３−膀胱；４−膀胱（三角部）；５−血液−血管（大脳：中大脳−動脈）；６−血管（脈絡膜−神経叢）；７−血管（冠動脈）；８−血管（腸間膜（結腸））；９−血管（肺）；１０−血管（腎臓）；１１−脳（扁桃体）；１２−脳（尾状核）；１３−脳（小脳）；１４  脳−（皮質：帯状皮質−前）；１５−脳（皮質：帯状皮質−後）；１６−脳（皮質：前頭皮質−外側部）；１７−脳（皮質：前頭皮質−内側部）；１８−脳（皮質：後頭）；１９−脳（皮質：頭頂葉）；２０−脳（皮質：側頭）；２１−脳（背側縫線核）；２２−脳（海馬）；２３−脳（視床下部：前部）；２４−脳（視床下部：後部）；２５−脳（青斑核）；２６−脳（延髄）；２７−脳（側坐核）；２８−脳（黒質）；２９−乳房；３０−盲腸；３１−末梢血単核球（ＰＢＭＣ）；３２−結腸；３３−後根神経節（ＤＲＧ）；３４−十二指腸；３５−ファロピウス管；３６−胆嚢；３７−心臓（左心房）；３８−心臓（左心室）；３９−回腸；４０−空腸；４１−腎臓（皮質）；４２−腎臓（髄質）；４３−腎臓（骨盤）；４４−肝臓（実質）；４５−肝臓（気管支：主）；４６−肝臓（気管支：３次）；４７−肺（実質）；４８−リンパ腺（扁桃）；４９−筋肉（骨格筋）；５０−食道；５１−卵巣；５２−膵臓；５３−松果体；５４−脳下垂体；５５−胎盤；５６−前立腺；５７−直腸；５８−皮膚（包皮）；６９−脊髄；６０−脾臓（実質）；６１−胃（前庭部）；６２−胃（体部）；６３−胃（底部）；６４−胃（幽門管）；６５−精巣；６６−甲状腺；６７−気管；６８−臍帯；６９−尿管；７０−子宮（頸部）；７１−子宮（筋層）；及び７２−精管。
【０１４７】
実施例２２−用量選択、用量増大、及び一定投薬
抗ＬＩＦ抗体の用量選択、用量増大、及び一定投薬を、以下に記載する。ｈ５Ｄ８の安全性評価については、マウス及びカニクイザルを使用した。
【０１４８】
１００ｍｇ／ｋｇまでのＩＶ投薬を毎週受けたマウス及びサルにおける４週のＧＬＰ毒性研究において、非治療関連有害作用が認められた。したがって、重篤な毒性が発現しない最大用量（ｈｉｇｈｅｓｔ  ｎｏｎ−ｓｅｖｅｒｅｌｙ  ｔｏｘｉｃ  ｄｏｓｅ）（ＨＮＳＴＤ）は、＞１００ｍｇ／ｋｇであり、無毒性量（ＮＯＡＥＬ）は、この研究の条件下で、どちらの種においても１００ｍｇ／ｋｇ（ＩＶ）として確立された。投薬量をスケール調節して、ヒト等価用量（ＨＥＤ）を確立した。ＨＥＤの推定については、体表面積（ＢＳＡ）に基づくスケール調節手法を採用した。これらのＧＬＰ毒性研究に基づくと、推奨される最大開始用量（ｍａｘｉｍｕｍ  ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ  ｓｔａｒｔｉｎｇ  ｄｏｓｅ）（ＭＲＳＤ）は、以下に示した通りに推定された：
・マウスＮＯＡＥＬからの１０倍の安全係数を用いた０．８１ｍｇ／ｋｇ（ＩＶ）ＨＥＤ
・マウスにおける重篤な毒性が発現する用量（ｓｅｖｅｒｅｌｙ  ｔｏｘｉｃ  ｄｏｓｅ）の１／１０に基づいた＞１０ｍｇ／ｋｇ（ＩＶ）
・カニクイザルＮＯＡＥＬからの１０倍の安全係数を用いた３．２ｍｇ／ｋｇ（ＩＶ）ＨＥＤ
・ＨＮＳＴＤの１／６に基づいた＞１６．７ｍｇ／ｋｇ（ＩＶ）
毒性研究に基づき、また、第１相研究における進行癌患者集団について保守的な手法を取り、１ｍｇ／ｋｇ（又は７５ｍｇ一定用量）（ＩＶ）のＭＲＳＤを、データによって裏付けた。
【０１４９】
ＭＲＳＤの設定においては、薬理学的作用量（ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｄｏｓｅ）（ＰＡＤ）も考慮されている。今日までに利用可能なマウス薬理学モデルにおける薬理学、ＰＫ、及びＬＩＦ安定化データに基づいて、次の手法を使用して、ＰＡＤを推定した。Ｕ２５１マウス異種移植モデルにおける用量反応に基づくと、最適な有効用量は、約３００μｇ（ＩＰ  週２回）であると考えられ；この用量レベルは、約２３０μｇ／ｍＬの最終投与の前のトラフ血清レベルと関連していた。血清ＬＩＦレベルの最大の安定化が、このモデルにおけるこの３００μｇ用量で得られるという証拠が存在しており、これはまた、１０、３０、及び１００ｍｇ／ｋｇの用量でのマウスＧＬＰ毒性研究における血清ＬＩＦ安定化データによって裏付けられた。サルＰＫデータに適合させ、ヒトのためにスケール調節した２−コンパートメントモデルに基づくＰＫモデルを使用すると、３週ごとの１５００ｍｇの臨床用量は、約５００μｇ／ｍＬのＣトラフを提供するであろう。同様に、このＵ２５１マウス異種移植モデルにおける２０μｇ（週２回）の最小有効量は、約２０μｇ／ｍＬの最終投与の前のトラフ血清レベルと関連していた；マウスＰＫ−忍容性研究における０．５ｍｇ／ｋｇ（ＩＶ）の用量での最小ＬＩＦ安定化の証拠によって裏付けられる、最大血清ＬＩＦ安定化のわずか約５０％が、この２０μｇ用量で得られるという証拠が存在していた。３週ごとの７５ｍｇの臨床用量は、約２５μｇ／ｍＬのＣトラフを提供するであろう。マウス同系移植モデルから入手できる追加のＰＫ−ＰＤ（ＬＩＦ安定化）データによって、Ｕ２５１マウス異種移植モデルから得られるＰＡＤが裏付けられた。
【０１５０】
したがって、７５ｍｇ（ｉ．ｖ．）の開始用量は、マウス及びサルにおける毒性データとマウス異種移植モデルにおける最小有効用量との両方に基づいて、適切であると考えられた。１５００から２０００ｍｇの最大臨床用量は、毒性データによって裏付けられた。試験物関連の有害所見がないことと併せて、動物モデルにおける線形ＰＫの知見に基づくと、一定投薬手法が適切であった。
【０１５１】
実施例２３−異なる癌におけるＬＩＦ発現
癌型とは関係なくＬＩＦレベルに基づいて治療を設定することは、異なる癌型におけるＬＩＦ発現の不均一性が存在する場合にふさわしい方法であろう。図１８は、ある種の癌が、このように、より高頻度の高ＬＩＦ  ｍＲＮＡレベルを有することを示す。比較的高頻度の低ＬＩＦ発現を有する癌であっても、抗ＬＩＦ治療から恩恵を受けるであろう個人の亜集団を有する。
【０１５２】
方法
２２種の適応症にわたる７，７６９本の試料に対するＲＮＡシークエンシングデータは、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓリポジトリから入手した。ＬＩＦ転写物発現を、すべての試料にわたって算出されたＬＩＦ発現の上、中の上、中の下、及び下の４分割に基づいて、高、中−高、中−低、及び低に閾値設定した。
【０１５３】
実施例２４−ＬＩＦ発現は異なる癌においてＴ制御性ケモカインと相関する
以前に記述した通り、ＬＩＦ阻害は、マウス及びヒトエクスビボモデル（図１０Ａ〜１０Ｄ）における免疫抑制性マクロファージ集団（例えば、Ｍ２マクロファージ）を減少させる、及びＮＳＣＬＣのマウスモデル（図１１Ｃ）における制御性ＣＤ４＋Ｔ細胞、及び浸潤を減少させる効果を有する。したがって、骨髄細胞又はＭ２マクロファージによって分泌されるＬＩＦとＴ制御性ケモカインの両方が高レベルである癌は、抗ＬＩＦ治療に反応する可能性が高い個人の亜集団を定義することができる。制御性Ｔ細胞は、免疫抑制性ＣＤ４＋細胞であり、Ｍ２マクロファージは、炎症促進性環境を支えるＭ１マクロファージとは対照的に、組織における抗炎症性の免疫抑制性環境を支えるマクロファージである。図１９Ａから１９Ｄは、ＬＩＦ  ｍＲＮＡと、様々なＴ制御性ケモカインＣＣＬ７（図１９Ａ）、ＣＣＬ２（図１９Ｂ）、ＣＣＬ３（図１９Ａ）、及びＣＣＬ２２（図１９Ａ）のｍＲＮＡとの発現の相関を示す。同様に、図２０Ａは、ＬＩＦ  ｍＲＮＡと、Ｍ２マクロファージ特性を定義するｍＲＮＡとの発現の相関を示す。これらは、ＬＩＦ発現を有する個人（低又は中−低のＬＩＦを有する個人であっても）の集団を、（例えば、Ｍ２マーカーの発現、Ｔ制御性ケモカイン、又は制御性Ｔ細胞に基づいて）免疫抑制特性が存在する場合に抗ＬＩＦ治療用抗体に対する潜在的な反応者として分けるための根拠を提供する。
【０１５４】
ヒトＧＢＭと卵巣癌（図２０Ｂ）との両方のＴＣＧＡデータセットの解析において、ＬＩＦと、ＣＣＬ２、ＣＤ１６３、及びＣＤ２０６との間に、有意に正の相関が見られた。ＬＩＦとＣＸＣＬ９との間に相関は認められなかった（データは示していない）が、腫瘍すべてにわたって比較的に低いレベルのＣＸＣＬ９  ｍＲＮＡが認められた。これらの結果は、２０人のＧＢＭ患者のコホートを分析し、腫瘍のＬＩＦ、ＣＸＣＬ９、ＣＣＬ２、ＣＤ１６３、及びＣＤ２０６  ＩＨＣを実施することによって、タンパク質レベルで実証された。ＬＩＦと、ＣＣＬ２、ＣＤ１６３、及びＣＤ２０６との間に、強い正の相関が認められた（図２０Ｃ）。ＣＸＣＬ９は、細胞の孤立クラスター（ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｃｌｕｓｔｅｒ）において発現され、これは、腫瘍に存在する低レベルのＣＸＣＬ９  ｍＲＮＡを説明している。特に、ＣＸＣＬ９は、ヒトＧＢＭにおいてＬＩＦとの逆相関を示した（図２０Ｃ）。
【０１５５】
ＣＸＣＬ９及びＣＣＬ２は、ＣＤ８＋Ｔ細胞腫瘍浸潤、及びそれぞれＴＡＭとＴｒｅｇの動員にとって重要なケモカインとして際立っていた。ＴＡＭ（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ−Ｌｙ６Ｃ−）におけるＬＩＦの中和によるＣＸＣＬ９及びＣＣＬ２調節が確認された（図２０Ｄ）。ＴＡＭの免疫染色及び単離により、ＣＸＣＬ９、ＣＣＬ２、ＣＤ２０６、及びＣＤ１６３が、主としてＴＡＭ中で発現され（図２０Ｅ）、抗ＬＩＦ（ｈ５Ｄ８）での治療が、その発現を調節することが示された（図２０Ｄ、２０Ｅ）。ＣＸＣＲ３（ＣＸＣＬ９受容体）、ＣＣＲ２（ＣＣＬ２受容体）、及びＬＩＦＲは、ＴＡＭ及びＣＤ８＋Ｔ細胞において発現された（図２０Ｆ）。
【０１５６】
ＣＸＣＬ９及びＣＣＬ２ノックアウト（ＣＸＣＬ９−／−、ＣＣＬ２−／−）マウスモデルを使用して、ＬＩＦ発癌作用におけるＣＸＣＬ９及びＣＣＬ２の調節の関連性について試験した。これらのマウスモデルにおける腫瘍を、ＣＸＣＬ９及びＣＣＬ２に対するブロッキング抗体で治療した。興味深いことに、ＬＩＦの阻害に対する抗腫瘍反応は、ＣＸＣＬ９−／−マウスでは弱められたが、ＣＣＬ２−／−マウスでは弱められなかった（図２０Ｇ）。同様に、ＣＸＣＬ９中和抗体は、抗ＬＩＦ（ｈ５Ｄ８）に対する抗癌反応を減じたが、ＣＣＬ２抗体は減じなかった（図２０Ｇ）。これらの結果は、抗ＬＩＦ（ｈ５Ｄ８）反応の主要メディエータが、ＣＸＣＬ９であることを示した。予想通り、ＣＸＣＬ９の遮断は、抗ＬＩＦ（ｈ５Ｄ８）に反応するＣＤ８＋Ｔ細胞腫瘍浸潤を低下させた（図２０Ｈ）。
【０１５７】
ＬＩＦが、実際の癌患者からの腫瘍において、ＣＸＣＬ９の抑制を通じて免疫細胞腫瘍浸潤を調節することを確認するために、患者から新たに得られたＧＢＭ検体から、器官型組織培養物を産生した。これらの器官型モデルは、患者の腫瘍の組織構造及び間質（免疫細胞が含まれる）を維持する、腫瘍の切片の短期培養を可能にする。その腫瘍細胞が高レベルのＬＩＦを発現した３人の患者からの器官型組織培養物（図２０Ｉ）。３つすべての培養物において、Ｉｂａ１マーカーによって検出される場合のＴＡＭの大きな浸潤が存在しており、ＴＡＭの大部分は、ＣＣＬ２、ＣＤ１６３、及びＣＤ２０６を発現した。興味深いことに、ＬＩＦに対する中和抗体での、器官型培養物の３日の治療は、ＣＣＬ２、ＣＤ１６３、及びＣＤ２０６の減少、及びＣＸＣＬ９発現の増大を促進した（図２０Ｉ）。
【０１５８】
抗ＬＩＦ（ｈ５Ｄ８）で治療されたヒトマクロファージにおける上記の観察と同様に、抗ＬＩＦ（ｈ５Ｄ８）治療を観察して、ＣＴ２６腫瘍におけるＭ２マーカーＣＤ２０６及びＣＤ１６３の下方調節を誘発した（図２０Ｊ）。対照的に、抗ＬＩＦ（ｈ５Ｄ８）治療は、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、及びＰＤ−Ｌ１を含めた免疫刺激Ｍ１マーカーの発現の増大を誘発した（図２０Ｊ）。これらの知見を、抗ＬＩＦ（ｈ５Ｄ８）治療されたＭＣ３８腫瘍におけるＴＡＭ表現型も検討することによって、さらに拡張した。治療された腫瘍が、総骨髄又はＴＡＭ集団の全頻度の違いを示さないことが観察されたが、抗ＬＩＦ（ｈ５Ｄ８）治療は、ＭＨＣＩＩを発現するＴＡＭの割合と、ＭＨＣＩＩの全発現レベルとの両方の増大を誘発した（図２０Ｋ）。ＭＣ３８  ＴＡＭが、ＣＤ２０６、すなわち、ＣＴ２６モデルにおけるＭ２マクロファージの表現型を決定するために使用される重要なマーカーを発現しなかったので、ＣＴ２６及びＭＣ３８モデルを通したＭ１／Ｍ２歪度（ｓｋｅｗｉｎｇ）の並行比較は可能ではなかった。まとめると、これらのデータは、２つの独立した前臨床腫瘍モデルにおいて、抗ＬＩＦ治療が腫瘍増殖を阻害することを実証する。この分析は、抗ＬＩＦ治療が、ＴＡＭ表現型に影響を与えるが、ＴＡＭの全体数又は総骨髄細胞には影響を与えないことを実証し、この観察される有効性は、おそらく、ある程度、抗腫瘍免疫性へ向かうＴＡＭのリプログラミングを通じて生じることが示唆される。
【０１５９】
方法
ＲＮＡシークエンシングデータは、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓリポジトリから入手した。ＬＩＦ発現と、種々の制御性Ｔ細胞ケモカイン（ＣＣＬ７、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、及びＣＣＬ２２）との間の関連は、膀胱、脳、乳房、結腸、頭頸部、腎臓、肺、黒色腫、卵巣、膵臓、前立腺、及び子宮癌試料について、ピアソン相関に基づいて算出した。ＬＩＦ発現と、Ｍ２マクロファージとなる転写特性との間の関連は、膀胱、脳、乳房、結腸、頭頸部、腎臓、肺、黒色腫、卵巣、膵臓、前立腺、及び子宮癌試料について、ピアソン相関に基づいて算出した。
【０１６０】
ｍＲＮＡ抽出（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ又はＭｉｃｒｏ  Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）、逆転写（ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）（ｉＳｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ、ＢｉｏＲａｄから、ｍＲＮＡ用）のために細胞を溶解し、製造者の推奨に従ってＡｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＴａｑｍａｎプローブを使用してｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。パラフィン包埋切片に対して、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＦＦＰＥＴ  ＲＮＡ単離キット（Ｒｏｃｈｅ）を使用し、且つ製造者の指示書に従ってＲＮＡを得た。反応は、ＣＦＸ３８４  ＴｏｕｃｈＴＭリアルタイムＰＣＲ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で実施し、結果は、対照試料に対してＣｔ法によって算出された変化（倍）として表した。マウス又はヒトのＡＣＴＢ又はＧＡＰＤＨを、内部規準化（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）対照として使用した。
【０１６１】
ＲＮＡを、Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｅ  ２．１  ＳＴを用いるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイプラットフォーム上で分析にかけた。次に、これを、Ｒｏｂｕｓｔ−Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ａｖｅｒａｇｅ（ＲＭＡ）に基づいて正規化した。ｌｉｍｍａ  Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージを使用して、対応のあるデータを考慮するベイズ線形回帰を介して、抗ＬＩＦ治療マウスにおいて特異的に発現される遺伝子を特定した。
【０１６２】
マウス実験では、核をＤＡＰＩで対比染色し、共焦点レーザー走査型ＮＩＫＯＮ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｔｉ顕微鏡を使用して画像を取り込んだ。ＩｍａｇｅＪを用いて免疫蛍光の定量化を実施し、各マウス（３〜５匹／群）の２つ〜３つの異なる範囲のＣＤ１１ｂ、Ｉｂａ１、又はＣＤ３について陽性のすべて又は最大１００個の細胞をカウントし、Ｉｂａ１（ＧＬ２６１Ｎモデルについて）又はＣＤ６８／ＣＤ１１ｂ（ＩＤ８モデルについて）陽性の集団の中のＣＣＬ２、ＣＤ２０６、及びＣＤ１６３について陽性の細胞のパーセンテージを算出した。ＣＸＣＬ９については、全細胞集団の中の、このサイトカインのシグナルによって囲まれた細胞のパーセンテージを算出した。器官型切片については、各患者（ｎ＝３）の３つ〜４つの範囲を定量化した。器官型組織免疫蛍光のために、条件あたり５つの異なるＺスタック画像をＦｉｊｉ−Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアで処理した。ＣＤ８＋Ｔ細胞については、全集団の中でＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを算出した。グラフ内のデータは、平均値±ＳＥＭとして表す。
【０１６３】
免疫蛍光抗体：ヒト／マウス  ＣＣＬ２（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、１：２００）、ヒト／マウス  ＣＤ１１ｂ（ＡｂＣａｍ；１：２０００）、ヒト／マウス  Ｉｂａ１（Ｗａｋｏ；１：１０００）、マウス  ＣＤ６８（ＡｂＣａｍ；１：２００）、ヒト／マウス  ＣＤ２０６（Ａｂｃａｍ；１：５００）、マウス  ＣＤ１６３（Ａｂｃａｍ；１：２００）、ＣＸＣＬ９（マウス  Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  １：２００；ヒト  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；１：２００）、及びヒト  ＣＤ８（ＤＡＫＯ；１：２００）。
【０１６４】
ヒトＧＢＭ検体は、Ｖａｌｌ  ｄ’Ｈｅｂｒｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｈｏｓｐｉｔａｌから入手した。臨床プロトコルは、Ｖａｌｌ  ｄ’Ｈｅｂｒｏｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＣＥＩＣ）によって承認され、すべての対象からインフォームドコンセントを得た。
【０１６５】
ＧＢＭ器官型切片培養物は、次の通りに産生した。切除後、摘出検体をメスで長さ５〜１０ｍｍ、幅１〜２ｍｍの四角形のブロックに切断し、６ウェルプレート内の０．４μｍ膜カルチャーインサート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にそれぞれ移した。インサートを６ウェルプレートに入れる前に、各ウェルに、Ｂ２７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び増殖因子（２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ及び２０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−２）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を添加した１．２ｍｌのＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を入れた。培養物は、一定湿度、９５％空気及び５％  ＣＯ２と共に、３７℃に維持した。１日後、切片を、ラット抗マウス／ヒトＬＩＦブロッキング抗体（ｈ５Ｄ８）（抗ＬＩＦと称される）（社内で開発されたもの）で、又はその対応する正常ＩｇＧ（１０μｇ／ｍｌ）で、３日間処理した。ブロッキングＣＸＣＬ９研究については、ヒトＣＸＣＬ９に対する中和するマウスモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、１．５μｇ／ｍｌで、培養物に添加した。ある種の場合には、０．１ｎｇ／ｍｌのヒトｒＩＦＮγ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、２４時間添加した。並行して、同じ患者の全血から、Ｌｙｍｐｈｏｓｅｐ（Ｂｉｏｗｅｓｔ）を使用して、密度勾配遠心分離（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）によって、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を得た。ＰＢＭＣは、１０％非働化済みＦＢＳ及び１０％  ＤＭＳＯを添加したＲＰＭＩ培地中で、使用まで凍結保存した。免疫細胞浸潤アッセイのために、対照又は抗ＬＩＦ切片を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に包埋し、続いて、１×１０６ＰＢＭＣを、２４ウェルプレートの完全ＲＰＭＩ培地に添加した。さらに、上清を収集し、器官型切片をＭａｔｒｉｇｅｌから回収し、ＩＦ及びフローサイトメトリーのためにさらに処理した。ある種の条件では、ＰＢＭＣを１０６細胞／ｍｌの濃度でＰＢＳで再懸濁し、５μＭ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ  ＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に２０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を、ＲＰＭＩで洗浄し、Ｍａｔｒｉｇｅｌに包埋された切片に加えた。２４時間後、Ｍａｔｒｉｇｅｌへの蛍光ＰＢＭＣ侵入を、各条件につき５つの異なる領域内の、移動している細胞を計数することによって、顕微鏡下で評価した。
【０１６６】
スライドを、脱パラフィン処理し、水和させた。抗原賦活化を、ｐＨ６又はｐＨ９  Ｃｉｔｒａｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＤＡＫＯ）、１０分の１０％ペルオキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）、及びブロッキング溶液（２％  ＢＳＡ）を室温で１時間使用して実施した。検出システムとして、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ＋（ＤＡＫＯ）を、製造者の指示書に従って使用し、それに続いてヘマトキシリンでの対比染色、脱水、及びマウンティング（ＤＰＸ）を行った。患者からのＧＢＭ腫瘍におけるＬＩＦ、ＣＣＬ２、ＣＤ１６３、ＣＤ２０６、及びＣＸＣＬ９染色の定量化は、０から３００の範囲を与えるＨスコア（３×強い染色のパーセンテージ＋２×中程度の染色のパーセンテージ＋弱い染色のパーセンテージ）として表した。ｐ−ＳＴＡＴ３、Ｋｉ６７、ＣＣ３、及びＣＤ８の定量化は、ＩｍａｇｅＪを用いて実施し、マウス（５匹／群）あたり３つの異なる範囲の総細胞数をカウントし、陽性細胞のパーセンテージを算出した。グラフ内のデータは、平均値±ＳＥＭとして表す。
【０１６７】
免疫組織化学的抗体：ヒト  ＬＩＦ（Ａｔｌａｓ；１：２００）、マウス  ＬＩＦ（ＡｂＣａｍ；１：２００）、マウス  ｐ−ＳＴＡＴ３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ；１：５０）、マウス  Ｋｉ６７（ＡｂＣａｍ；１：２００）、マウス  Ｃｌｅａｖｅｄ−Ｃａｓｐａｓｅ３（ＣＣ３）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ；１：５００）、マウス  ＣＤ８（Ｂｉｏｓｓ；１：２００）、ヒト／マウス  ＣＣＬ２（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、１：２００）、ヒト  ＣＸＣＬ９（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；１：１００）、及びヒト  ＣＤ１６３（Ｌｅｉｃａ  Ｎｏｖａｃａｓｔｒａ；１：２００）。
【０１６８】
実施例２５−ＬＩＦはＩＩ型（Ｍ２）マクロファージ極性化を誘発する
二重の（ｄｕａｌ）ＬＩＦ−免疫抑制特性層別化は、潜在的に、抗ＬＩＦ治療薬治療に特に反応しやすい個人を特定するための頑強な方式である。これについてのさらなる証拠を、図２１Ａ及び２１Ｂ、２２、並びに２３に示す。図２１Ａ及び２１Ｂは、ヒト初代マクロファージが、単球を５０ｎｇ／ｍｌ  Ｍ−ＣＳＦと共に７日間培養した後に、ＬＩＦ受容体を上方調節することを示す。３人の異なる個人からの細胞が示される。図２２及び２３は、初代ヒトマクロファージが、ＬＩＦを伴う７２時間の培養後に、マクロファージ表面マーカーＣＤ２０６及びＣＤ１６３（図２２）、並びにＣＣＬ２２の分泌（図２３）を上方調節することをさらに示す。興味深いことに、ＣＣＬ２２分泌は、Ｍ２極性化マクロファージにおけるものよりもはるかに頑強である（図２３、右下）。このデータは、ＬＩＦ発現と、免疫抑制特性の存在との間の機構的関連を提供し、患者治療を選択するための二重のＬＩＦ−免疫抑制特性が、すべての癌型に、またすべての組織に適用できることが示される。
【０１６９】
方法
マクロファージは、１０％熱失活ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、及び５０ｎｇ／ｍｌ  Ｍ−ＣＳＦと共に、ＲＰＭＩ−１６４０培地中で７日間培養することによって、ＣＤ１４＋末梢ヒト単球から分化させた。いくつかの実験では、これに続いて、２０ｎＭ  ＬＩＦ、又はＰＢＳ（対照について）、又は１００ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳ及び２５ｎｇ／ｍｌ  ＩＦＮγ（Ｍ１極性化について）、又は各２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４、ＩＬ−１０、及びＴＧＦβ（Ｍ２極性化について）が添加された同じ培地中で、示されたさらなる時間、培養を行った。
【０１７０】
実施例２６−異なる癌からの骨髄細胞上でのＬＩＦ受容体発現
腫瘍増殖及び癌の生存にとって重要なものとしての二重のＬＩＦ−免疫抑制特性の見通しのための追加の裏付けは、ヒト腫瘍関連マクロファージが、実際、ＬＩＦ受容体を確かに発現することである。図２４及び２５は、卵巣癌及び肺癌の、４個のうちの３個の解離された腫瘍細胞から単離されたマクロファージが、ＬＩＦ受容体を発現することを示す（図２４）。さらに、ＬＩＦ受容体は、腫瘍関連骨髄由来抑制細胞、単球系の骨髄由来抑制細胞（Ｍ−ＭＤＳＣ）と腫瘍多形核細胞系の骨髄由来抑制細胞（ＰＭＮ−ＭＤＳＣ）の両方の細胞表面上に発現される（図２５）。
【０１７１】
本発明の好ましい実施形態を、本明細書に提示及び記載してきたが、こうした実施形態が、ほんの一例として提供されるに過ぎないことが、当業者には明らかであろう。本発明から逸脱しない多数の変更、改変、及び置換が、当業者には直ちに思い浮かぶであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する種々の代替物を、本発明を実施する際に用いることができることが理解されよう。
【０１７２】
本明細書において言及したすべての刊行物、特許出願、発行された特許、及び又は文書は、それぞれ個々の刊行物、特許出願、発行された特許、及び他の文書が、あたかも具体的且つ個々にその全体を参照によって組み込まれることが示されるがごとく、参照により本明細書に組み込む。参照によって組み込まれる本文に含有される定義は、それらがこの開示における定義と矛盾する限りは除外される。
【０１７３】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語は、本発明が属する分野の技術者当分野の技術者によって共通に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈によってそうではないと明確に指示されない限り、複数の指示物が含まれる。本明細書での「又は」に対するあらゆる言及は、他に規定されない限り、「及び／又は」を包含することが意図される。
【０１７４】
本明細書で使用する場合、他に示されない限り、用語「約」は、少なくとも１０％の差の、規定した量に近い量を指す。
【０１７５】
【表１０】
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【０１７６】
【表１１】
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【０１７７】
【表１２】
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【０１７８】
【表１３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２０−４】
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【図２０−５】
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【図２０−６】
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【図２０−７】
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【図２０−８】
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【図２０−９】
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【図２０−１０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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