(57)【要約】乾癬またはアトピー性皮膚炎の治療および／または予防のための方法および組成物であって、治療に有効な量のインターフェロンアルファサブタイプを、それを必要とする対象に投与することを含み、前記インターフェロンアルファサブタイプが、ＩＦＮ−α１４、ＨＹＢＲＩＤ１、またはＩＦＮ−α１４とＨＹＢＲＩＤ１の組合せ、である、方法および組成物が提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
乾癬またはアトピー性皮膚炎の治療および／または予防のための方法であって、
治療に有効な量のインターフェロンアルファサブタイプを、それを必要とする対象に投与することを含み、
前記インターフェロンアルファサブタイプはＩＦＮ−α１４、ＨＹＢＲＩＤ１、または、ＩＦＮ−α１４とＨＹＢＲＩＤ１の組合せ、である、方法。
【請求項２】
前記インターフェロンアルファサブタイプのＩＦＮ−α１４が、アミノ酸配列の配列番号１またはその機能的に活性のあるフラグメントもしくはその変異体を含む、または、それからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記インターフェロンアルファサブタイプのＨＹＢＲＩＤ１が、アミノ酸配列の配列番号２またはその機能的に活性のあるフラグメントもしくは変異体を含む、または、それからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記投与方法が、局所投与および舌下投与から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記インターフェロンアルファサブタイプの治療に有効な量が低用量である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記乾癬が、軽度、軽度〜中等度、中等度、中等度〜重度または重度の乾癬である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＩＦＮ−α１４、ＨＹＢＲＩＤ１、または、ＩＦＮ−α１４とＨＹＢＲＩＤ１の組合せ、である、乾癬またはアトピー性皮膚炎の治療および／または予防に使用するための、インターフェロンアルファサブタイプ。
【請求項８】
前記ＩＦＮ−α１４が、アミノ酸配列の配列番号１またはその機能的に活性のあるフラグメントもしくは変異体を含む、または、それからなる、請求項７に記載のインターフェロンアルファサブタイプ。
【請求項９】
前記ＨＹＢＲＩＤ１が、アミノ酸配列の配列番号２またはその機能的に活性のあるフラグメントもしくは変異体を含む、または、それからなる、請求項７に記載のインターフェロンアルファサブタイプ。
【請求項１０】
局所的に投与される、または、舌下投与によって投与される、請求項７〜９のいずれか一項に記載のインターフェロンアルファサブタイプ。
【請求項１１】
低用量で投与される、請求項１０に記載のインターフェロンアルファサブタイプ。
【請求項１２】
前記乾癬が軽度、軽度〜中等度、中等度、中等度〜重度または重度の乾癬である、請求項７〜１１に記載のインターフェロンアルファサブタイプ。
【請求項１３】
インターフェロンアルファサブタイプを含む組成物であって、
前記インターフェロンアルファサブタイプが、ＩＦＮ−α１４、ＨＹＢＲＩＤ１、または、ＩＦＮ−α１４とＨＹＢＲＩＤ１の組合せ、である、乾癬またはアトピー性皮膚炎の治療および／または予防に使用するための、組成物。
【請求項１４】
インターフェロンアルファサブタイプを含む医薬組成物であって、
前記インターフェロンアルファサブタイプが、ＩＦＮ−α１４、ＨＹＢＲＩＤ１、または、ＩＦＮ−α１４とＨＹＢＲＩＤ１の組合せ、である、乾癬またはアトピー性皮膚炎の治療および／または予防に使用するための、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乾癬および／またはアトピー性皮膚炎、すなわち、過剰なＴｈ−１７応答が炎症反応および自己免疫疾患などの有害な役割を果たす症状を予防または治療するための組成物および方法、に関する。本発明はさらに、ヒトおよび獣医学療法のための乾癬およびアトピー性皮膚炎の治療および／または予防のための組成物および本発明の組成物の使用にも及ぶ。
【背景技術】
【０００２】
過剰反応性Ｔｈ１応答は、関節炎、多発性硬化症、またはＩ型糖尿病などの臓器特異的自己免疫疾患を発生させ、一方過剰反応性Ｔｈ２／Ｔｈ１７応答は、アレルギーおよび萎縮症の根底にある可能性がある。現在では、Ｔｈ１７細胞は病原体に対する宿主防御において主要な役割を果たしており、Ｔｈ１７応答の亢進は乾癬などの重度の炎症反応および自己免疫疾患につながる可能性があると考えられている。Ｔｈ１７細胞はインターロイキン−１７（ＩＬ１７）を産生する。ＩＬ１７にはＡからＦまで６種類の既知のアイソフォームがあり、ＩＬ１７ＡとＩＬ１７Ｆはいずれも炎症誘発性サイトカインである。
【０００３】
異なる病原体はｉｎ ｖｉｔｒｏで異なるＩＦＮ−αサブタイプを誘導し、ＩＦＮ−αサブタイプは異なる抗ウイルス活性、抗増殖活性および免疫調節活性を有することが知られている。様々な経路を介した感染は、異なるサブタイププロファイルを誘導することが示されている。ＩＦＮ−αサブタイプは同じ受容体に結合し、共通のシグナル伝達経路を活性化し、同様の免疫学的機能を有することが期待されてきた。すべてのＩＦＮ−αサブタイプは、定義上、抗ウイルス活性を有するが、この状況におけるそれらの絶対的有効性はかなり異なる可能性がある。加えて、多くの他の生物学的特性が記載されているが、免疫調節活性および抗増殖活性を含む様々な効力を有する。多面的な作用は、受容体鎖との異なる相互作用と、一連のエフェクター分子に対する異なる細胞内経路を介するシグナル伝達によるものと思われる。Ｉ型ＩＦＮ受容体はＩＦＮＲ１とＩＦＮＲ２の２つの鎖からなる。１２のＩＦＮ−αサブタイプのそれぞれには、さまざまな受容体鎖をもつさまざまな結合親和性の範囲がある。ＩＦＮα−１４は、２つのインターフェロンレセプターの両方に対して最も高い親和性の１つを有しており、これが他の１１のサブタイプと比較して非常に活性がある理由である。ＩＦＮα−６はまた、２つのインターフェロンレセプターに対しても高親和性である。
【０００４】
ＩＦＮ−αは、Ｔｈ１およびＴｈ１７応答の調節において重要な役割を果たしている可能性がある。ＩＦＮ−α処置は間接的に（主にＩＦＮ−γを介して）Ｔｈ１細胞分化を促進するが、ＩＬ４とＩＬ１３遺伝子発現の抑制を介してＴｈ２細胞発生も抑制することが示されている。したがって、ＩＦＮ−αは、Ｔｈ２細胞の不均衡を促進する疾患および感染において、Ｔｈ１／Ｔｈ２集団バランスを再確立することができる。近年、その抗ウイルス作用の他に、いくつかの免疫調節機能がＩＦＮ−αによって発揮されることが明らかとなった。ＩＦＮ−αは、樹状細胞分化に影響を及ぼし、ＩＬ８またはＩＬ１８などの各種炎症誘発性サイトカインの発現を制御することができ、ＩＬ１受容体アンタゴニスト（ＩＬ１Ｒａ）、可溶性ＴＮＦ受容体ｐ５５、ＩＬ１０およびＩＬ１８結合タンパク質などのいくつかの抗炎症性メディエーターを誘導する。しかしながら、ＩＦＮ−α、特に個々のＩＦＮ−αサブタイプの作用機序は、まだ部分的にしか理解されていない。
【０００５】
乾癬は、患者の皮膚上の異常な斑点を特徴とする自己免疫疾患である。これらの異常な斑点は、典型的には赤く、かゆみがあり、鱗屑状である。斑点は通常肘、膝、腰、頭皮に現れるが、体のどこにでも現れる。乾癬は世界中で約１億２５００万人が罹患する。乾癬は、乾癬性関節炎、リンパ腫、心血管疾患、クローン病およびうつ病のリスク増加と関連している。乾癬性関節炎は乾癬患者の最大３０％に発症する。
【０００６】
乾癬は、皮膚の表皮層が異常に過剰かつ急速に成長することを特徴とする。通常の２８〜３０日ではなく、乾癬では３〜５日毎に皮膚細胞を入れ替える。これらの変化は、樹状細胞、マクロファージおよびＴ細胞が関与する真皮における炎症カスケードにより誘導されるケラチノサイト（角化細胞）の早期成熟に由来すると考えられている。これらの免疫細胞（Ｔｈ１７リンパ球およびマクロファージ）は真皮から表皮に移動し、炎症性化学シグナル（サイトカイン）、特に腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１７ＦおよびＩＬ２２を分泌する。これらの分泌された炎症シグナルは、ケラチノサイトを刺激して増殖させ、ケモカイン−ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ５およびＣＸＣＬ８（ＩＬ８）−を産生させる。これらのサイトカインは、好中球、好塩基球および肥満細胞に対してケモ−アトラクティブ（chemo-attractive）であり、それらはケラチノサイト層に移動する。好中球、好塩基球、肥満細胞は顆粒の内容物を放出し、乾癬の特性の多くをもたらす。
【０００７】
乾癬の治療法は現在のところないが、各種治療法が症状のコントロールに役立つ。これらの治療には、コルチコステロイドクリーム、ビタミンＤ３アナログクリーム、紫外線、およびメトトレキサートなどの免疫系抑制薬が含まれる。乾癬症例の約７０〜８０％は軽度から中等度の形成で現れ、通常はクリームおよび／または光線療法で管理できる。しかしながら、既存の局所薬は有効性が限られており、長時間の使用には適していない。２５年以上の間に乾癬を治療するための新しい局所薬は存在しなかった。近年、例えば抗ＩＬ１７Ａ、ＴＮＦ−αモノクローナル抗体構築物などの、中等度から重度の乾癬の治療のための全身薬に研究が注目されている。これらの新しい全身性生物学的製剤は有効であるが、感染と闘う能力の低下に伴う一連の有害な副作用を引き起こす可能性がある。大多数の乾癬患者の治療に使用可能な、効果的で、安全で、局所的な治療に対する、かなりのまだ満たされていないニーズが存在する。
【０００８】
アトピー性皮膚炎（アトピー性湿疹としても知られる）は、皮膚の炎症の一種で、皮膚が赤く腫れてひび割れる。Ｔｈ２関連疾患であり、ＩＬ−３、４、５、１３、１７、２２、３１の上昇を伴う。顆粒球の増殖や誘引に関与するＧ（Ｍ）ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、５、８などのケモカインにも有意な増加がみられる。
【発明の概要】
【０００９】
本発明者は、乾癬およびアトピー性皮膚炎の治療および／または予防のための改良された免疫療法アプローチを開発することが望ましいであろうと主張する。乾癬は、Ｔｈ１７細胞の過剰反応およびそれに対応するある種のサイトカインの過剰産生に起因するので、誤ったＴｈ１７反応および関連サイトカインの過剰産生を修飾し、バランスをとることができる薬物が、乾癬の治療に有益であろう。そのような投薬は、例えばアトピー性皮膚炎のように、誇張されたＴｈ１７応答が役割を果たす疾患および状態を治療するのにさらに適切であろう。
【００１０】
本発明者は、表皮における乾癬および／またはアトピー性表皮炎を引き起こす好中球および好塩基球／肥満細胞に対して走化性であるケラチノサイト層におけるサイトカイン／ケモカインをオフにすることができる局所治療を提供する必要性があることを主張する。
【００１１】
本発明は、乾癬、すなわち、過剰なＴｈ−１７応答が炎症反応および自己免疫などの有害な役割を果たす症状を予防または治療するための組成物および方法に関する。本発明はさらに、乾癬の治療および／または予防における本発明の組成物の使用に及ぶ。
【００１２】
広範な実験の後、本発明の発明者は、本明細書に記載されるようにＩＦＮ−α１４、例えば配列番号１またはその変異体もしくはフラグメント（断片）を投与すると、乾癬またはアトピー性皮膚炎における免疫反応に関連する種々のサイトカインの抑制または阻害が生じることを驚くべきことに発見した。本発明者は、予想外に、ＩＦＮ−α１４が、表皮において乾癬を引き起こす好中球および好塩基球／肥満細胞に対して走化性であるケラチノサイト層におけるサイトカインを、直接スイッチをオフにするために相互作用することができることを決定した。本発明者は、ＩＦＮ−α１４が、ＴＮＦ−αの影響下でも、これらのケモカインを阻害することを実証した。驚くべきことに、この効果はＩＦＮ−α１４を局所投与した場合に実証される。ＩＦＮ−α１４は１７，０００ダルトンの大きな分子であり、この分子が表皮を通過することは予想外であった。さらに驚くべきことに、本発明者は、ケラチノサイト中のケモカインに対するＩＦＮ−α１４の効果が、局所的に提供された場合に観察されることを予期せず見出した。本発明者は、ＩＦＮ−α１４が全血に提供される場合のより無差別な効果と比較して、ＩＦＮ−α１４の局所効果はより選択的であり、乾癬に対して、多面発現性の影響とより多くの組織がＩＦＮ−α１４と接触するという事実の両方において、有用であると考える。
【００１３】
本発明者はまた、本明細書においてＨＹＢＲＩＤ１として知られる組換えＩＦＮ−ハイブリッド分子を確立した
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（配列番号２）はまた、インターフェロンレセプターに対する高結合親和性を有し、乾癬またはアトピー性皮膚炎に関与するケモカインに対する効果を示し、特に、皮膚において乾癬またはアトピー性皮膚炎を引き起こす好中球および好塩基球／肥満細胞に対して走化性である、ケラチノサイト層におけるケモカインのスイッチをオフにするか、または阻害するであろう。
【００１４】
インターフェロンサブタイプＩＦＮ−α１０およびＩＦＮ−α１４およびそれらのハイブリッドは、ＷＯ２０１４／０３７７１７およびＷＯ２０１５／１３６２８７に論じられている。特に、ＩＦＮ−α１０−ＩＦＮ−α１４ハイブリッドは、全ての１２のアルファ−インターフェロンの共通骨格配列に基づくＩＦＮ−α１０およびＩＦＮ−α１４サブタイプ結合部位に特徴的な配列を含むことが開示される。理論に拘束されることを望まないが、発明者は、ＩＦＮ−α１０のアミノ酸配列を含むタンパク質は、インターフェロン受容体２（ＩＦＮＲ２）に対してより大きな親和性を有し、ＩＦＮ−α１４のアミノ酸配列を含むタンパク質は、インターフェロン受容体１（ＩＦＮＲ１）に対してより大きな親和性を有すると考える。このように、ＩＦＮ−α１０アミノ酸配列を含むタンパク質を、インターフェロンレセプター１との結合を可能にするＩＦＮ−α１４のアミノ酸で置換したり、ＩＦＮ−α１４アミノ酸配列を含むタンパク質を、インターフェロンレセプター２との結合を可能にするＩＦＮ−α１０のアミノ酸で置換したりすることは、ＩＦＮ−α１０またはＩＦＮ−α１４のみよりも、インターフェロンレセプター１および２の両方に対してより強い結合親和性を有するはずのＩＦＮ−α１０ ＩＦＮ−α１４ハイブリッドタンパク質を提供すると考えられる。ＩＦＮ−α１０およびＩＦＮ−α１４のプライマリインターフェロンレセプター結合部位を含めることにより、該ハイブリッドは、ＩＦＮ−α１０から選択されＩＦＮ−α１４アミノ酸配列に置換されてＩＦＮ−α１４サブタイプのインターフェロンレセプター２への結合能を向上させるアミノ酸を含むこと、および／または該ハイブリッドがＩＦＮ−α１４から選択されてＩＦＮ−α１０アミノ酸配列に置換されてＩＦＮ−α１０サブタイプのインターフェロンレセプター１への結合能を向上させるアミノ酸を含むことを意味する。
【００１５】
適切には、ＩＦＮ−α１０アミノ酸配列を含むタンパク質のいくつかのアミノ酸置換が、インターフェロン受容体１への結合に関与すると決定されたＩＦＮ−α１４のアミノ酸と一緒になって、タンパク質のインターフェロン受容体１への結合を増強し得る。適切には、ＩＦＮ−α１４アミノ酸配列を含むタンパク質の、インターフェロンレセプター２への結合に関与すると決定されたＩＦＮ−α１０のアミノ酸とのアミノ酸置換は、タンパク質のインターフェロンレセプター２への結合を増強し得る。
【００１６】
実施形態では、ＩＦＮ−α１０−ＩＦＮ−α１４ハイブリッドは、ＩＦＮ−α１０のアミノ酸配列を実質的に有することができるが、アミノ酸残基８０〜１５０の間、または、適切には、アミノ酸残基８４〜１４４の間、または、適切には、アミノ酸残基９２〜１１５、または、適切には、アミノ酸残基９０〜１１０の間（ＩＦＮ−α１０配列の番号を使用）で修飾されて、ＩＦＮ−α１４配列によって提供されるアミノ酸を提供することができる。ＩＦＮ−α１４のインターフェロンレセプター１への結合には、これらの領域またはこれらの領域の一部におけるアミノ酸残基が必要であると考えられている。特に、ハイブリッド配列は、ＩＦＮ−α１４配列の対応する残基またはその保存された変異を提供するために、ＩＦＮ−α１０配列の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５つ、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０または少なくとも１１の修飾を含むことができる。実施形態では、太字で示されるアミノ酸によって示されるように、１１の修飾が提供される
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（配列番号３）
実施形態において、ＩＦＮ−α１０−ＩＦＮ−α１４ハイブリッド配列は、９４、１０１、１０２、１０９または１４４位のアミノ酸から選択される少なくとも１つの突然変異、好ましくは９４、１０１、１０２、１０９または１４４位のアミノ酸から選択される少なくとも２つの突然変異、より好ましくは９４、１０１、１０２、１０９または１４４位のアミノ酸から選択される少なくとも３つの突然変異、より好ましくは９４、１０１、１０２、１０９または１４４位のアミノ酸から選択される少なくとも４つの突然変異、より好ましくは９４、１０１、１０２、１０９、または１４４位のアミノ酸から選択される少なくとも５つの突然変異を含むことができる。別の実施形態では、ＩＦＮ−α１４をハイブリッドの骨格構造として利用することができ、配列のＮおよびＣ末端領域におけるＩＦＮ−α１０配列とＩＦＮ−α１４配列との間で異なる残基を、ＩＦＮ−α１０配列中に存在するものとしてハイブリッド配列中に提供することができる。適切には、ＩＦＮ−α１４Ｎ−末端配列の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、または少なくとも１１の置換が、アミノ酸がＩＦＮ−α１０とＩＦＮ−α１４との間で共有／共通でないそれらのアミノ酸位置でＩＦＮ−α１０からの残基を提供するために、ハイブリッド配列を提供するように作製され得る。適切には、ＩＦＮ−α１０とＩＦＮ−α１４の間で共有／共通でないそれらのアミノ酸位置におけるＩＦＮ−α１０からハイブリッド配列への残基を提供するために、ＩＦＮ−α１４Ｃ末端配列において少なくとも１、少なくとも２、または３の置換が提供される。実施形態において、ＩＦＮ−α１０とＩＦＮ−α１４との間で共有／共通でないそれらのアミノ酸を有するアミノ酸位置でＩＦＮ−α１０からハイブリッドへの残基を提供するために、ＩＦＮ−α１４の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０または少なくとも１１のＮ−末端配列からの置換、および少なくとも１、少なくとも２、または３のＩＦＮ−α１４のＣ−末端配列からの置換を行う。
【００１７】
実施形態において、ハイブリッドは、アミノ酸配列  配列番号２またはその機能的に活性のあるフラグメントもしくは変異体を含むか、またはそれからなる。
【００１８】
機能的に活性であるとは、ＩＦＮ−α１０およびＩＦＮ−α１４のプライマリインターフェロン結合部位を含むＩＬ−α１０  ＩＬα１４ハイブリッドポリペプチドを意味し、ここで、対象へのペプチドの投与または対象におけるペプチドの発現は、Ｔｈ１媒介性免疫反応の増強およびＴｈ２／Ｔｈ１７媒介性免疫反応の抑制を促進する。さらに、機能的活性は、Ｔｈ１媒介免疫応答を増強し、Ｔｈ２／Ｔｈ１７媒介応答を抑制するハイブリッドペプチドの能力によって示され得る。
【００１９】
フラグメントは、配列番号１または２からの少なくとも５０個、好ましくは１００個およびより好ましくは１５０個以上の連続アミノ酸を含むことができ、機能的に活性である。適切には、フラグメントは、例えば、ｃＤＮＡのＣ−末端の連続的な欠失を用いて決定することができる。次いで、当該欠失構築物を適当なプラスミドにクローニングすることができる。次いで、これらの欠失突然変異体の活性を、本明細書に記載されるように生物学的活性について試験することができる。
【００２０】
変異体とは、配列番号１または２と少なくとも７０％相同であり、より好ましくは配列番号１または２と少なくとも８０％相同であり、より好ましくは配列番号１または２と少なくとも９０％相同であり、さらにより好ましくは配列番号１または２と少なくとも９５％相同であり、さらにより好ましくは配列番号１または２と少なくとも９６％相同であり、さらにより好ましくは配列番号１または２と少なくとも９７％相同であり、最も好ましくは配列番号１または２と少なくとも９８％相同であるアミノ酸配列を意味する。変異体は、アミノ酸の置換を含む配列番号１または２のポリペプチド配列を包含し、特に、タンパク質の生物学的活性または構成、または折り畳み（フォールド）のいかなる有意な改変ももたらさない高い確率を有することが知られている／または知られている置換を包含する。これらの置換は、典型的には保存置換として知られており、当技術分野において公知である。例えば、アルギニン、リジンおよびヒスチジンの基は、交換可能な塩基性アミノ酸であることが知られている。適切には、実施形態において、同じ電荷、サイズまたは疎水性のアミノ酸は、互いに置換され得る。適切には、任意の置換は、配列が整列されたときに類似または同一の位置で他のアルファサブタイプに存在するアミノ酸にアミノ酸置換を提供するために、インターフェロンアルファサブタイプのアミノ酸配列アラインメントの分析に基づいて選択することができる。ハイブリッド、およびその変異体およびフラグメントは、当技術分野で公知の適切な分子生物学的方法を用いて作製することができる。
【００２１】
また、本発明者は、皮膚のサブ−表皮層に関して、局所治療としてＩＦＮ−α１４またはＨＹＢＲＩＤ１（配列番号２）の使用に何らかの関連性があると考える。理論に束縛されることを望まないが、ＩＦＮ−α１４またはＨＹＢＲＩＤ１の一部は表皮を通って真皮下層まで通過することができ、そこでは多くの白血球、特にＩＬ１７Ａ、ＩＬ１７ＦおよびＩＬ２２を産生するＴｈ１７が存在すると考えられる。ＩＬ１７ＡおよびＩＬ１７Ｆは、マクロファージを刺激してＴＮＦ−αを産生させ、ＴＮＦ−αは、ケラチノサイトにＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ５およびＣＸＣＬ８などのケモカインを誘引する顆粒球を放出させる主要メディエーターである。
【００２２】
本発明者は、驚くべきことに、局所治療としてＩＦＮ−α１４またはＨＹＢＲＩＤ１、特に配列番号１もしくは２またはその変異体もしくはフラグメントを投与すると、ケラチノサイト中のＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ８（ＩＬ８）、ＣＸＣＬ−５およびＣＣＬ２０が、以前の局所治療薬と比較して、より大きな減少または阻害をもたらすことを発見した。さらに、発明者らは、非常に低用量のＩＦＮ−α１４またはＨＹＢＲＩＤ１、例えば５×１０３ＩＵ／ｍｌまたは５×１０４ＩＵ／ｍｌまでの局所クリームを使用できることを決定した。
【００２３】
また、本発明者は、ＩＦＮ−α１４、特に配列番号１またはその変異体もしくはフラグメントが真皮下層に拡散すると、ＴＮＦ−αをオフにするか、または阻害することができ、これもまた、ＩＬ１７、例えばＩＬ１７Ａ、ＩＬ１７Ｂ、ＩＬ１７Ｆおよび／またはＩＬ２２などのケモカインの阻害をもたらすことを示す。
【００２４】
これにより、本発明者は、過剰なＴｈ１７，２２応答がアトピー性皮膚炎のような役割を果たす乾癬および疾患および状態の治療および／または予防において有用性を有する改良された治療組成物を識別することになった。
【００２５】
したがって、本発明の第一の態様は、乾癬またはアトピー性皮膚炎の治療および／または予防のための方法を提供し、該方法は、以下の工程を含む：
（i）治療に有効な量のインターフェロンアルファサブタイプを必要とする対象に投与し、ここで、インターフェロンアルファサブタイプはＩＦＮ−α１４、ＨＹＢＲＩＤ１、またはＩＦＮ−α１４とＨＹＢＲＩＤ１の組合せである。
実施形態において、インターフェロンアルファサブタイプＩＦＮ−α１４は、アミノ酸配列  配列番号１またはその機能的に活性のあるフラグメントもしくは変異体を含むか、またはそれからなる。
実施形態において、インターフェロンアルファサブタイプＨＹＢＲＩＤ１は、アミノ酸配列  配列番号２またはその機能的に活性のあるフラグメントもしくは変異体を含むか、またはそれからなる。
【００２６】
実施形態では、投与方法は局所投与である。実施形態において、投与法は舌下である。両方の投与方法において理論に拘束されることを望まないが、インターフェロンの全身作用が誘導されないように、ＩＦＮ−α１４およびＨＹＢＲＩＤ１の濃度が提供されると考えられる。したがって、ケモカインおよびインターロイキンの効果は、抗ウイルスまたは抗増殖作用を引き起こすことなく（または最小限にしか引き起こさない）達成することができる。
【００２７】
この投与は、薬理学的用量を提供した当該技術分野におけるインターフェロンの全身デリバリーとは区別されると考えられる。そのような薬理学的用量は、そのようなインターフェロンの抗ウイルス／バクテリア特性（例えば、当技術分野においてＩＦＮアルファ２ｃの投与後に観察されたであろう）を活性化し、副作用を引き起こし、局所投与後に本発明者らによって観察される低濃度関連免疫調節効果を無効にするであろう。典型的には、局所投与量は、全身投与量よりも１００〜１０００×（倍）少なくすることができ、表皮コンパートメントにおいてのみ免疫応答の制御を可能にする。
【００２８】
実施形態において、インターフェロンアルファサブタイプの治療に有効な量は、低用量（５×１０４ＩＵ単位または５×１０３ＩＵ単位／ｍｌまで）である。
実施形態において、インターフェロンアルファサブタイプの治療に有効な量は、乾癬または他の症状に対する現在の全身治療よりも低い。
【００２９】
実施形態において、インターフェロンアルファサブタイプは、５ＩＵ／ｍｌ、１０ＩＵ／ｍｌ、５０ＩＵ／ｍｌ、１ｘ１０２ＩＵ／ｍｌ、１ｘ１０３ＩＵ／ｍｌ、１ｘ１０４ＩＵ／ｍｌ、１ｘ１０５ＩＵ／ｍｌまたは１ｘ１０６ＩＵ／ｍｌの用量で投与される。
【００３０】
本発明者らは、インターフェロンアルファサブタイプが、互いに異なる応答を引き起こし、非全身レベルでの用量（全身性−抗ウイルス作用および抗増殖作用につながる高用量）および低用量−ケモカインおよびインターロイキン作用に依存すること、応答が組織に依存して変化し得ることを解明した。
【００３１】
実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプは、０．１ｍｇ〜１ｍｇ、１ｍｇ〜３ｍｇ、３ｍｇ〜５ｍｇまたは５ｍｇ〜１０ｍｇの用量で投与される。例えば、ヒトの局所適用において、５×１０４ＩＵ／ｍｌ以下のクリームを使用することができる。例えば、イヌにおいて、舌下使用は、例えば、１ｍｌのＰＢＳ中で１０４ＩＵ／Ｋｇであり得る。
【００３２】
実施形態において、インターフェロンアルファサブタイプは、１日１回、１日２回、１日３回または１日４回局所投与される。通常、舌下投与の場合は、１日１回投与する。
【００３３】
実施形態において、インターフェロンアルファサブタイプＩＦＮ−α１４およびＨＹＢＲＩＤ１は、ケラチノサイト層中のサイトカイン／ケモカインをオフまたは阻害するために直接相互作用する。実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプＩＦＮ−α１４およびＨＹＢＲＩＤ１は、表皮において乾癬を引き起こす好中球および好塩基球／肥満細胞に対して走化性であるケラチノサイト層におけるサイトカインをスイッチオフするために直接相互作用する。実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプは、表皮を通って真皮下層まで通過し、そこでケモカイン産生に作用する。
【００３４】
実施形態において、アトピー性皮膚炎は、例えば、腕、脚、顔、首、まぶた、手首、指、ナックル、足首、足および／または手の屈曲部など、身体上の特定の位置に局在することができる。実施形態において、アトピー性皮膚炎は、全身または実質的に全身に影響を及ぼし得る。これは特に、例えば、アトピー性皮膚炎が全身に擦過傷を引き起こす可能性のあるイヌにおいて観察され得る。
【００３５】
ある実施形態において、乾癬は、軽度、軽度−中等度、中等度−重度または重度の乾癬であり得る。
【００３６】
典型的には、対象は哺乳動物、特にヒトである。実施形態において、対象は、動物、例えば、限定されないが、イヌのようなコンパニオン動物であり得る。
【００３７】
特定の実施形態では、対象は、Th１７媒介性免疫反応の抑制が所望される状態に罹患し得る。特定の実施形態では、対象は乾癬に罹患し得る。
実施形態において、対象はアトピー性皮膚炎に罹患し得る。
【００３８】
本発明の第２の態様によれば、インターフェロンアルファサブタイプが、乾癬またはアトピー性皮膚炎またはＴｈ１７媒介性免疫反応の抑制が望まれる状態の治療および／または予防に使用するためのＩＦＮ−α１４、またはＨＹＢＲＩＤ１、またはＩＦＮ−α１４とＨＹＢＲＩＤ１の組み合わせである、インターフェロンアルファサブタイプが提供される。
【００３９】
実施形態において、インターフェロンアルファサブタイプＩＦＮ−α１４は、アミノ酸配列  配列番号１またはその機能的に活性のあるフラグメントもしくは変異体を含むか、またはそれからなる。
【００４０】
実施形態において、インターフェロンアルファサブタイプＨＹＢＲＩＤ１は、アミノ酸配列  配列番号２またはその機能的に活性のあるフラグメントもしくは変異体を含むか、またはそれからなる。
【００４１】
特定の実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプは、局所的に投与される。特定の実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプは舌下投与され得る。これは、獣医学的治療に特に有利である可能性がある。
【００４２】
実施形態において、インターフェロンアルファサブタイプは、本明細書に記載されるように低用量で投与される。実施形態において、インターフェロンアルファサブタイプは、非常に低用量で投与される。実施形態において、インターフェロンアルファサブタイプの治療に有効な量は、乾癬に対する現在の全身治療よりも低い。
【００４３】
実施形態において、インターフェロンアルファサブタイプは、５ＩＵ／ｍｌ、１０ＩＵ／ｍｌ、５０ＩＵ／ｍｌ、１ｘ１０２ＩＵ／ｍｌ、１ｘ１０３ＩＵ／ｍｌ、１ｘ１０４ＩＵ／ｍｌ、１ｘ１０５ＩＵ／ｍｌまたは１ｘ１０６ＩＵ／ｍｌの用量で投与することができる。
【００４４】
実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプは、０．１ｍｇ〜１ｍｇ、１ｍｇ〜３ｍｇ、３ｍｇ〜５ｍｇまたは５ｍｇ〜１０ｍｇの用量で投与することができる。
【００４５】
実施形態において、インターフェロンアルファサブタイプは、１日１回、１日２回、１日３回または１日４回投与することができる。適切には、舌下投与では、毎日１回投与してもよい。
【００４６】
ある実施態様において、乾癬は、軽度、軽度−中等度、中等度−重度または重度の乾癬であり得る。乾癬の重症度はＰＡＳＩスコアで評価してもよい。
これにより、患者上の病変の範囲がわかる。乾癬のほとんどの臨床試験では、乾癬エリアおおび重症度インデックス（Psoriasis Area and Severity Index）（ＰＡＳＩ）スコア（ＰＡＳＩ７５）の７５％の低下が主要評価項目の現在のベンチマークである。
【００４７】
本発明の第３の態様によれば、乾癬またはＴｈ１７媒介性免疫反応の抑制が望まれる状態の治療および／または予防のための医薬の調製における、インターフェロンアルファサブタイプの使用が提供され、ここで、インターフェロンアルファサブタイプは、ＩＦＮ−α１４、ＨＹＢＲＩＤ１、またはＩＦＮ−１４およびＨＹＢＲＩＤ１の組合せである。適切には、前記状態は、アトピー性皮膚炎であり得る。
【００４８】
本発明のさらなる態様によれば、インターフェロンアルファサブタイプを含み、インターフェロンアルファサブタイプが、乾癬の治療および／または予防に使用するためのＩＦＮ−α１４、ＨＹＢＲＩＤ１、またはＩＦＮ−α１４とＨＹＢＲＩＤ  １の組み合わせ、またはＴｈ１７媒介性免疫反応の抑制が望ましい状態である組成物が提供される。
【００４９】
本発明のさらなる態様によれば、インターフェロンアルファサブタイプを含む医薬組成物が提供され、ここで、インターフェロンアルファサブタイプは、乾癬の治療および／または予防に使用するためのＩＦＮ−α１４、ＨＹＢＲＩＤ１、またはＩＦＮ−α１４およびＨＹＢＲＩＤ１の組み合わせ、またはＴｈ１７媒介性免疫反応の抑制が所望される状態である。
【００５０】
本発明のさらなる態様によれば、インターフェロンアルファサブタイプが提供され、ここで、インターフェロンサブタイプは、免疫応答の調節に使用するための、ＩＦＮ−α１４、ＨＹＢＲＩＤ１、またはＩＦＮ−α１４とＨＹＢＲＩＤ１の組合せである。
【００５１】
上記に概説した本発明の態様の実施形態において、インターフェロンアルファサブタイプＩＦＮ−α１４は、アミノ酸配列  配列番号１またはその機能的に活性のあるフラグメントもしくは変異体を含むか、またはそれからなる。
【００５２】
上記に概説した本発明の態様の実施形態において、インターフェロンアルファサブタイプＨＹＢＲＩＤ１は、アミノ酸配列  配列番号２またはその機能的に活性のあるフラグメントもしくは変異体を含むか、またはそれからなる。
【００５３】
上に概説した本発明の態様の実施形態において、組成物または医薬組成物は局所的に投与される。
【００５４】
上記に概説した本発明の態様の実施形態において、インターフェロンアルファサブタイプは、低用量で投与される。実施形態において、インターフェロンアルファサブタイプは、非常に低用量で投与される。実施形態において、インターフェロンアルファサブタイプの治療に有効な量は、乾癬に対する現在の全身治療よりも低い。
【００５５】
上記に概説した本発明の態様の実施形態において、インターフェロンアルファサブタイプは、５ＩＵ／ｍｌ、１０ＩＵ／ｍｌ、５０ＩＵ／ｍｌ、１ｘ１０２ＩＵ／ｍｌ、１ｘ１０３ＩＵ／ｍｌ、１ｘ１０４ＩＵ／ｍｌ、１ｘ１０５ＩＵ／ｍｌまたは１ｘ１０６ＩＵ／ｍｌの用量で投与される。
【００５６】
上記に概説した本発明の態様の実施形態において、インターフェロンアルファサブタイプは、０．１ｍｇ〜１ｍｇ、１ｍｇ〜３ｍｇ、３ｍｇ〜５ｍｇまたは５ｍｇ〜１０ｍｇの用量で投与される。
【００５７】
上記に概説した本発明の態様の実施形態において、インターフェロンアルファサブタイプは、１日１回、１日２回、１日３回または１日４回投与される。
【００５８】
上記に概説した本発明の態様の特定の実施形態において、乾癬は、軽度、軽度〜中等度、中等度〜重度または重度の乾癬であり得る。
【００５９】
上に概説した本発明の態様の特定の実施形態において、ＩＦＮ−αサブタイプは、融合タンパク質、または組換えタンパク質などのＩＦＮ−α１４を含み、それからなり、特に、アミノ酸配列  配列番号１またはその変異体もしくはフラグメントを含むか、またはそれからなる。実施形態において、ＩＦＮ−α１４はグリコシル化され得る。
【００６０】
上に概説した本発明の態様の特定の実施形態において、ＩＦＮ−αサブタイプは、融合タンパク質、または組換えタンパク質などのＨＹＢＲＩＤ１を含み、それからなり、特に、アミノ酸配列  配列番号２またはその変異体もしくはフラグメントを含むか、またはそれからなる。
【００６１】
本発明のさらなる態様において、配列番号：１またはそのフラグメントもしくは変異体を含むかまたはそれからなる組換えポリペプチドが提供される。本発明は、アミノ酸配列  配列番号１に由来する核酸配列に及ぶ。
【００６２】
本発明のさらなる態様において、配列番号：２またはそのフラグメントもしくは変異体を含むかまたはそれからなる組換えポリペプチドが提供される。本発明は、アミノ酸配列  配列番号２に由来する核酸配列に及ぶ。
【００６３】
次に、本発明を、説明のために提供され、本発明を限定するものとして解釈されるものではない、以下の非限定的な図および実施例を参照して説明する。
本発明の他の実施形態は、この説明を考慮すると、当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１は、ＴＮＦ−αによる誘導の有りおよび無しの場合における、ヒトケラチノサイトからのＣＸＣＬ８（ＩＬ８）産生に対するＩＦＮα−１４の影響を示すグラフである。
【図２】図２は、ＴＮＦ−αによる誘導の有りおよび無しの場合における、ヒトケラチノサイトからのＣＸＣＬ１産生に対するＩＦＮα−１４の影響を示すグラフである。
【図３】図３は、ＴＮＦ−αによる誘導の有りおよび無しの場合における、ヒトケラチノサイトからのＣＸＣＬ５産生に対するＩＦＮα−１４の影響を示すグラフである。
【図４】図４は、ＴＮＦ−αで誘導することなく、ＩＦＮα−１４がヒトケラチノサイトからのＩＬ６製造に及ぼす影響を示すグラフである。
【図５】図５は、ＴＮＦ−αによる誘導を伴わないヒトケラチノサイトからのＣＣＬ２産生に対するＩＦＮα−１４の影響を示すグラフである。
【図６】図６は、ＴＮＦ−αで誘導することなく、ＩＦＮα−１４がヒトケラチノサイトからのＣＣＬ５製造に及ぼす影響を示すグラフである。
【図７】図７は、ＴＮＦ−αで誘導することなく、ＩＦＮα−１４がヒトケラチノサイトからのＣＣＬ２０製造に及ぼす影響を示すグラフである。
【図８】図８は、乾癬状態に刺激された正常皮膚生検におけるＩＬ１７Ａ産生に対するＩＦＮα−１４の影響を示すグラフである。
【図９】図９は、全ヒト血液アッセイにおけるＩＬ１７Ａ産生に対するＩＦＮα１４の影響を示すグラフである。
【図１０】図１０は、全ヒト血液アッセイにおけるＩＬ１７Ｆ産生に対するＩＦＮα−１４の影響を示すグラフである。
【図１１】図１１は、全ヒト血液アッセイにおけるＩＬ２２産生に対するＩＦＮα−１４の影響を示すグラフである。
【図１２】図１２は、全ヒト血液アッセイにおけるＴＮＦ−α産生に対するＩＦＮα−１４の影響を示すグラフである。
【図１３】図１３は、全ヒト血液アッセイにおけるＩＬ６産生に対するＩＦＮα−１４の影響を示すグラフである。
【図１４】図１４は、全ヒト血液アッセイにおけるＣＸＣＬ８（ＩＬ８）産生に対するＩＦＮα−１４の影響を示すグラフである。
【図１５】図１５は、全ヒト血液アッセイにおけるＣＸＣＬ１産生に対するＩＦＮα−１４の影響を示すグラフである。
【図１６】図１６はＩＦＮ−α１４アミノ酸配列を示す。
【図１７】図１７は、ＨＹＢＲＩＤ１アミノ酸配列を示す。
【図１８】図１８は、ヒト単核細胞をヒトＩＦＮα１０／１４で処置した後のインターロイキン、ケモカインおよびＣＤマーカーの濃度の変化を示す。
【図１９】図１９は、ヒトＩＦＮ−α１４によるイヌ白血球からのイヌＩＬ−１７Ａ分泌物の抑制を示す。
【図２０】図２０は、ＩＬ−１７Ａの産生に対するＨＹＢＲＩＤ１およびＩＦＮ−α１４の影響の比較を示す。
【図２１】図２１は、ＩＬ−８の産生に対するＨＹＢＲＩＤ１およびＩＦＮ−α１４の影響の比較を示す。
【図２２】図２２は、ＨＹＢＲＩＤ１およびＩＦＮ−α１４がＣＸＣＬ−１の産生に及ぼす影響の比較を示す。
【図２３】図２３は、インターフェロンγの産生に対するＨＹＢＲＩＤ１とＩＦＮ−α１４の影響の比較を示す。
【図２４】図２４は、腫瘍壊死因子αの産生に対するＨＹＢＲＩＤ１およびＩＦＮ−α１４の影響の比較を示す。
【図２５】図２５は、ＣＸＣＬ−１０の分泌に対するＩＦＮ−α１４とＨＹＢＲＩＤ１との影響の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
本発明の発明者は、驚くべきことに、本明細書に記載のようにＩＦＮ−α１４、例えば配列番号１またはその変異体もしくはフラグメントを投与すると、乾癬における免疫反応に関連する種々のサイトカインの抑制または阻害が生じることを発見した。驚くべきことに、ＩＦＮ−α１４を局所投与すると、この効果は増強される。
【００６６】
配列番号１はＩＦＮα−１４であり、以下のように定義することができる：
2021525234.tif 000005
配列番号２はＨＹＢＲＩＤ−１であり、以下のように定義することができる：
2021525234.tif 000006
【００６７】
特に、本発明者は、ＩＦＮ−α１４、特に配列番号１またはＨＹＢＲＩＤ１（配列番号２）またはその変異体またはフラグメントが、乾癬に関連するケラチノサイト層の特定のサイトカインを標的とすることを発見した（例えば、ＣＸＣＬ−１，５，８ではあるが、ＣＣＬ−１，５、ＩＬ−６ではない）。乾癬における免疫反応は、ＩＬ２３／Ｔｈ１７／ＩＬ−１７Ａ軸を含む。ＩＬ２３は、樹枝状細胞または単細胞から生成される。Ｔｈ１７のリンパ球は、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１７ＢおよびＩＬ１７Ｆを放出するために活性化される。ＩＬ１７は、さらに大量のＴＮＦ−αを放出するマクロファージを刺激する。これは、ケラチノサイトからのＣＸＣＬ８（ＩＬ８）、ＣＸＣＬ５、ＣＣＬ−２０およびＣＸＣＬ１の放出を引き起こす。これが好中球と好塩基球／肥満細胞を引き寄せ、それが乾癬性プラークを引き起こす剥離剤となる。さらに、ＴＮＦ−αはプラーク発達の主要な寄与因子である。ＩＬ２２は炎症の活性化剤であり、ケラチノサイト末端の分化を阻害する。近年、ＩＬ２３、ＩＬ１７ＡまたはＴＮＦ−αを個別に標的とする新たな全身薬が開発されている。本発明者らは、天然分子ＩＦＮα−１４、特に配列番号１もしくは配列番号２またはその変異体もしくはフラグメントが、非常に低い用量でケラチノサイト中のＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ８（ＩＬ８）、ＣＸＣＬ５およびＣＣＬ２０を除去またはオフにすることを実証した。ＨＹＢＲＩＤ１は、ＩＬ−１７経路および関連ケモカインに対して同じようにＩＦＮ−α１４と同じ機能的効果を提供する。さらに、本発明者らは、ＩＦＮ−α１４とは異なり、それがＮＫ細胞の乏しい活性化剤であることを決定したが（図２５を参照のこと）。これは、ＨＹＢＲＩＤ１が「より良い副作用」プロファイルを有することを意味するため、有利である可能性がある。また、本発明者は、ＩＦＮα−１４、特に配列番号１またはその変異体もしくはフラグメントが真皮層内に移動すると、ＩＬ２３、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１７ＦおよびＴＮＦ−αＩＬ１７Ｆを同時に標的とすることを決定した。これらの知見は、乾癬の治療および／または予防のための改良された方法および改良された組成物を提供するために適用することができる。
【００６８】
発明者は、ＩＦＮ−α１４及びＨＹＢＲＩＤ１が以下に作用すると考察する：
（ｉ）ＣＸＣＬ１：炎症を誘発し、好中球を誘引し、それらの破壊酵素の放出を引き起こす；
（ｉｉ）ＣＸＣＬ８（ＩＬ８）：多くの組織損傷物質の放出を引き起こす、好中球、好塩基球および肥満細胞の誘引物質であるケラチノサイト由来のケモカイン；
（ｉｉｉ）ＣＸＣＬ５：主に急性炎症反応の際に、好中球に対する走化性および活性化機能を有することがよく知られている。また、好中球の恒常性を維持する；
（ｉｖ）ＩＬ６：一般的にストレスおよび発熱と関連している、ケラチノサイト由来の増殖因子。ＩＬ６は急性期反応物質であり、炎症誘発性でも抗炎症性でもありうる。ＩＬ６は、Ｔｈ１７細胞の生成を阻害することにより、ＩＬ１７産生前に作用し、その後、ケラチノサイトの増殖を増加させるＩＬ６の産生を抑制することにより、産生後に作用する；
（ｖ）ＴＮＦ−α：プラーク発達の主要な寄与因子であり、ケラチノサイトからの望ましくないケモカイン産生を活性化する；
（ｖｉ）ＩＬ１７およびＩＬ２３：乾癬の病態形成において中心的役割を果たすことが臨床的に検証されている；
（ｖｉｉ）ＩＬ−２２：炎症およびケラチノサイト末端の分化を阻害し、ＩＬ−１７のケモカイン刺激活性の多くを複製する。
【００６９】
ＣＸＣＬ８（ＩＬ８）は、損傷または感染部位への好中球の動員に関与する主要なサイトカインであり、このプロセスは走化性と呼ばれる。好中球の走化性を成功させるためには、好中球を患部近傍の内皮に固定する（したがって、循環系に洗い流されない）ための高親和性密着性分子の発現増加、および好中球が基底膜および細胞外マトリックス組織（ＥＣＭ）を介してその経路を消化して患部に到達できることなど、多くの変数が不可欠である。ＣＸＣＬ８は、これらの変化をもたらすのに必要な細胞シグナリングを誘導する重要な役割を果たす。まず、感染部位でヒスタミンが放出されると、損傷部位近くの毛細血管が拡張し、その部位の血流が遅くなり、好中球などの白血球が内皮に近づき、血流速度が最も速い管腔の中心部から離れるのを促す。これがひとたび起こると、好中球細胞と内皮細胞に発現しているセレクチンの間に弱い相互作用が生じる（その発現は、ＣＸＣＬ８や他のサイトカインの作用を介しても増加する）。
【００７０】
本発明者は、ＩＦＮ−α１４、特に配列番号１またはその変異体もしくはフラグメントの投与が、以前の局所的投薬と比較して、１０％、好ましくは２０％、好ましくは３０％、好ましくは４０％、好ましくは５０％、好ましくは６０％、好ましくは７０％、好ましくは８０％およびより好ましくは８７％ＩＬ−１７（ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７ＢまたはＩＬ−１７Ｆ）の低下をもたらすことを発見した。ＨＹＢＲＩＤ１も同様の効果があると考えられる。
【００７１】
本発明者は、驚くべきことに、ＩＦＮ−α１４、特に、配列番号１またはその変異体もしくはフラグメントの投与により、ＩＬ−２２がα／βおよびγ／δＴリンパ球合成を５０％、好ましくは６０％、好ましくは７０％、好ましくは７６％、好ましくは７６％超、好ましくは８０％、好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％阻害することを可能にすることを発見した。ここでも、ＨＹＢＲＩＤ１は同じ効果をもたらすと考えられる。
【００７２】
本発明者は、驚くべきことに、ＩＦＮ−α１４、特に、配列番号１またはその変異体もしくはフラグメントの投与により、ケラチノサイト中のＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ８（ＩＬ−８）、ＣＸＣＬ−５またはＣＣＬ−２０が５０％、好ましくは６０％、好ましくは７０％、好ましくは８０％、好ましくは９０％、好ましくは９１％、好ましくは９２％、好ましくは９３％、好ましくは９４％、好ましくは９５％、好ましくは９６％、好ましくは９７％、およびより好ましくは９８％の抑制がもたらされることを発見した。
【００７３】
本発明者は、驚くべきことに、ＩＦＮ−α１４、特に、配列番号１またはその変異体もしくはフラグメントの投与が、本明細書に記載されるような低用量でケラチノサイト中のＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ８（ＩＬ８）、ＣＸＣＬ５またはＣＣＬ２０の抑制をもたらすことを発見した。ここでも、ＨＹＢＲＩＤ１は同様の機能的効果を示す。
【００７４】
本発明の治療は、５ＩＵ／ｍｌ、１０ＩＵ／ｍｌ、５０ＩＵ／ｍｌ、１×１０２ＩＵ／ｍｌ、１×１０３ＩＵ／ｍｌ、１×１０４ＩＵ／ｍｌ、１×１０５ＩＵ／ｍｌまたは１×１０６ＩＵ／ｍｌの用量で投与することができる。
【００７５】
本発明の治療は、０．１ｍｇ〜１ｍｇ、１ｍｇ〜３ｍｇ、３ｍｇ〜５ｍｇまたは５ｍｇ〜１０ｍｇの用量で投与することができる。
【００７６】
本発明の治療は、１日１回、１日２回、１日３回または１日４回局所投与することができる。
【００７７】
加えて、本発明者は、ＩＦＮ−α１４、特に、配列番号１もしくはＨＹＢＲＩＤ１（配列番号２）またはその変異体もしくはフラグメントの投与または使用が、ケラチノサイトにおける、ＣＸＣＬ１の完全もしくは部分的抑制および／またはＣＸＣＬ８（ＩＬ８）の完全もしくは部分的抑制および／またはＣＸＣＬ５の完全もしくは部分的抑制および／またはＣＣＬ２０の完全もしくは部分的抑制をもたらすことを発見した。
【００７８】
さらに、発明者は、ＩＦＮ−α１４、特に、配列番号１またはＨＹＢＲＩＤ１（配列番号２）またはその変形またはフラグメントの投与または使用が、皮層にける、ＩＬ１７の完全もしくは部分的抑制および／またはＩＬ２２の完全もしくは部分的抑制および／またはＩＬ２３の完全もしくは部分的抑制および／またはＩＬ６の完全もしくは部分的抑制および／またはＴＮＦ−αの完全もしくは部分的抑制をもたらすことを発見した。
【００７９】
さらに、本発明者は、驚くべきことに、ＩＦＮ−α１４またはＨＹＢＲＩＤ１、特に配列番号１もしくは配列番号２またはそのフラグメントもしくは変異体の局所投与が、本明細書に記載のケラチノサイト層中の関連するサイトカインの標的化をもたらし得ることを発見した。本発明は、軽度、中等度および重度の乾癬において安全かつ有効である優れた局所治療を提供する。この治療は、副作用プロファイルが低いことを示している。低用量の薬剤が必要であり、天然物であるＩＦＮ−α１４またはＨＹＢＲＩＤ１は、最高濃度（１×１０８ＩＵ／ｍｌ）でもｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞毒性を示さない。
【００８０】
本発明者は、ＴＮＦ−αで活性化されてケモカイン（Ｉｌ８）分泌物を誘導する正常ヒト皮膚培養由来のケラチノサイトにおいて、ＩＦＮα−１４、特に配列番号１またはその変異体もしくはフラグメントが、ＩＬ８分泌を直接的に＞８０％抑制することを実証した。加えて、本発明者は、乾癬状態に誘発された正常ヒト皮膚からの生検で試験した場合、ＩＦＮα−１４、特に配列番号１またはその変異体もしくはフラグメントの添加は、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１７ＦおよびＩＬ２２の分泌の強い阻害をもたらすことを実証した。これらの結果は、ＩＦＮα−１４、特に配列番号１またはその変異体もしくはフラグメントが、既存の全身性生物製剤に比べて優れている可能性を示す明確な表示である。
【００８１】
理論に拘束されることを望まないが、本発明者は、ＩＦＮ−α１４、特に配列番号１またはその変異体もしくはフラグメントの局所投与が、乾癬およびアトピー性皮膚炎を治療するために使用できることを同定した。本発明者らは、その比較的高分子量にもかかわらず、ＩＦＮα−１４およびＨＹＢＲＩＤ１、特に配列番号１もしくは配列番号２またはその変異体もしくはフラグメント、皮膚を通過する良好な透過性を示し、したがって、皮膚を通過した治療用量のこのペプチドの送達を可能にする臨床的に実行可能な配合組成の発達が、乾癬を治療または予防するための予期しない手法を提供することを実証した。
定義
【００８２】
フラグメント
フラグメントは、配列番号１または配列番号２からの少なくとも５０個、好ましくは１００個およびより好ましくは１５０個以上の連続アミノ酸を含むことができ、これらは機能的に活性である。適切には、フラグメントは、例えば、ｃＤＮＡのＣ−末端連続欠失を用いて決定することができる。次いで、前記欠失構築物を適切なプラスミドにクローニングすることができる。次いで、これらの欠失突然変異体の活性を、本明細書に記載されるように生物学的活性について試験することができる。フラグメントは、当技術分野で公知の適切な分子生物学的方法を用いて生成され得る。
【００８３】
変異体
変異体とは、配列番号１または配列番号２と少なくとも７０％相同であり、より好ましくは配列番号１または配列番号２と少なくとも８０％相同であり、より好ましくは配列番号１または配列番号２と少なくとも９０％相同であり、さらに好ましくは配列番号１または配列番号２と少なくとも９５％相同であり、さらにより好ましくは配列番号１または配列番号２と少なくとも９６％相同であり、さらにより好ましくは配列番号１または配列番号２と少なくとも９７％相同であり、最も好ましくは配列番号１または配列番号２と少なくとも９８％相同であるアミノ酸配列を意味する。変異体は、アミノ酸の置換を含む配列番号１または配列番号２のポリペプチド配列を包含し、特に、タンパク質の生物学的活性または構成、または折り畳みのいかなる有意な改変ももたらさない高い確率を有することが知られている置換（単数または複数）を包含する。これらの置換は、典型的には保存置換として知られており、当技術分野において公知である。例えば、アルギニン、リジンおよびヒスチジンの基は、交換可能な塩基性アミノ酸であることが知られている。適切には、実施形態において、同じ電荷、サイズまたは疎水性のアミノ酸は、互いに置換され得る。適切には、任意の置換は、配列が整列されたときに類似または同一の位置で他のアルファサブタイプに存在するアミノ酸にアミノ酸置換を提供するために、インターフェロンアルファサブタイプのアミノ酸配列整列の分析に基づいて選択することができる。変異体は、当技術分野で公知の適切な分子生物学的方法を用いて作製され得る。
【００８４】
対象
本明細書に定義されるように、「対象」は、ヒト、霊長類および家畜動物（例えば、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ）のような、哺乳動物；マウス、ウサギ、ラットおよびモルモットのような実験室試験動物；ならびにイヌおよびネコのようなコンパニオン動物を含み、包含する。
【００８５】
治療／処置
「治療」という語は、本明細書では、ヒトまたはヒト以外の動物に利益をもたらし得る任意のレジメンを指すために使用される。治療は、乾癬に関してであり得、そしてその治療は、予防的（preventing treatment）であり得る。治療は、治癒的または緩和的効果を含み得る。「治療的」および「予防的」処置は、その最も広い文脈において考慮されるべきである。「治療的」という語は、必ずしも、対象が完全に回復するまで治療されることを意味しない。同様に、「予防的」という語は、その対象が最終的に疾患状態に至らないことを意味しない。したがって、治療的および／または予防的治療は、特定のアレルギー状態の症状の改善、または特定のアレルギー状態を発症する危険性の予防または他の方法での低減を含む。「予防的」という語は、その重症度または特定の状態の発症を低減すると考えられ得る。「治療的」は、また、現存する状態の重症度を低減し得る。
【００８６】
投与
本発明において使用される活性成分、特にインターフェロンサブタイプＩＦＮ−α１４、例えば、配列番号１またはＨＹＢＲＩＤ１（配列番号２）は、本明細書に記載されるように、同一の対象に別々に、場合によっては連続的に投与することができ、または医薬組成物もしくは免疫原性組成物として同時に同時投与することができる。医薬組成物は、一般に、目的とする投与経路に応じて選択される適切な医薬賦形剤、希釈剤または担体を含む。
【００８７】
活性成分は、任意の適切な経路を介して、治療を必要とする患者に投与することができる。正確な用量は、以下でより詳細に論じるように、多数の要因に依存する。
【００８８】
１つの適切な投与経路は、局所的に、例えば、皮膚に直接適用される。
【００８９】
医薬組成物
上述のように、本発明は、乾癬またはアトピー性皮膚炎を治療するための医薬組成物に及ぶ。
【００９０】
本発明による薬学的組成物は、本発明に従って使用するために、活性成分に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝安定剤または当業者に公知の他の材料を含み得る。そのような物質は非毒性であり、活性成分の有効性を妨げてはならない。担体または他の物質の正確な性質は、例えば経口、静脈内、鼻腔内、または経口もしくは経鼻吸入による投与経路に依存する。配合組成は、液体、例えば、ｐＨ６．８〜７．６の非リン酸緩衝液を含む生理学的塩類の溶液、または凍結乾燥またはフリーズドライ紛体であってよい。
【００９１】
用量
組成物は、好ましくは、「治療に有効な量」または「所望量」で個々に投与され、これは個々に利益を示すのに十分である。本明細書で定義されるように、「有効量」という用語は、少なくとも部分的に所望の応答を得る、または発症を遅らせるか、進行を阻害するか、または治療されている特定の状態の発症または進行を完全に停止するのに必要な量を意味する。治療される対象の健康状態および身体状態、治療される対象の分類群、所望される保護の程度、組成物の配合組成、医学的状態の評価およびその他関連要因に応じて、その量は変化する。この量は比較的広い範囲で減少すると予想されており、これは日常的な試験によって決定される可能性がある。治療の処方、例えば、投薬量などの決定は、最終的には、非専門医、医師または他のメディカルドクターの責任および裁量の範囲内であり、典型的には、治療される障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法、および医師に知られている他の因子を考慮に入れる。最適な用量は、例えば、年齢、性別、体重、治療される状態の重症度、投与される活性成分、および投与経路を含む多くのパラメータに基づいて、医師によって決定され得る。広範囲の用量が適用可能である。ヒト患者への経口投与を考慮すると、例えば、約１０μｇ〜約１０００μｇの薬剤をヒト用量当たり、場合により３〜４用量で投与することができる。最適な治療反応を示し、副作用を軽減するために、投与量を調節してもよい。例えば、数回の分割投与は、毎日、毎週、毎月または他の適当な時間間隔で投与することができ、または状況の緊急性応じて提示されるように、投与量を比例的に減らすことができる。
【００９２】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の分野において当業者によって一般的に理解される意味を有する。
【００９３】
自己免疫疾患
本明細書で使用される用語「自己免疫疾患」は、身体の組織がそれ自体の免疫系によって攻撃されることによって引き起こされる任意の疾患または状態を意味すると理解される。
【００９４】
明細書を通じて、文脈が他に要求しない限り、「備える」もしくは「含む」、または、「備えている」もしくは「含んでいる」といったバリエーションは、明示された整数または整数のグループの包含を意味するものであるが、他の整数または整数のグループの排除を意味するものではないことを意味するものとして理解されるであろう。
【００９５】
実験データ
実験１：正常ヒト皮膚由来ケタチノサイトにおけるＩＬ−６、ＣＸＣＬ８（ＩＬ８）、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２産生に及ぼすＩＦＮα−１４の影響
本発明者は、ケモカイン分泌を誘導するためにＴＮＦ−αで活性化された正常なヒト皮膚由来のケラチノサイトに対するＩＦＮα−１４の効果を試験した。
【００９６】
図１は、ＩＦＮα−１４がＣＸＣｌ８（ＩＬ８）分泌物を、直接８０％を超えて抑制することを示している。ＣＸＣＬ８（ＩＬ−８）は乾癬に関与する主要なケモカインであり、図１はＩＦＮα−１４存在下でＣＸＣＬ８（ＩＬ８）を強く阻害することを示している。
【００９７】
図２は、ＣＸＣＬ１産生の強い阻害を示す。ＣＸＣＬ１はＣＸＣファミリーのメンバーであり、組織損傷および微生物感染に応答した好中球の動員および活性化において不可欠な役割を果たす。
【００９８】
図３は、ＣＸＣＬ５産生の強い阻害を示す。ＣＸＣＬ５は、主に急性炎症反応の間、好中球に対して走化性および活性化機能を有することがよく知られている。また、好中球の恒常性を維持する。
【００９９】
したがって、３種類の好中球走化性誘引物質はいずれも低濃度のＩＦＮα−１４によって強く阻害される。
【０１００】
図４は、ＩＦＮα−１４の存在下ではＩＬ６産生の抑制がないことを示す。ＩＬ‐６は成長促進剤である。ＩＦＮα−１４はＩＬ６に影響を及ぼさない。これは、ＩＦＮα−１４が表皮の増殖を継続させることを示唆している。
【０１０１】
図５は、ＩＦＮα−１４がＣＣＬ２を誘導することを示している。ＣＣＬ２はＭ２マクロファージ走化性因子である。Ｍ２マクロファージは一般的に損傷組織の修理に関与する。これは、ケラチノサイトの損傷を修復するために「修復」細胞であるＭ２マクロファージを引き寄せるという点で珍しい。
【０１０２】
図６は、ＩＦＮα−１４がＣＣＬ５を誘導することを示す。ＣＣＬ５はＴリンパ球の走化性誘引物質である。これは、ＩＦＮα−１４がＴｈ１バイアスに向かって応答をスキューしていることを示している。
【０１０３】
図７は、ＩＦＮα−１４がＣＣＬ２０を阻害することを示す。ＣＣＬ２０のアップレギュレーションは、潜在的な抗原侵入に対抗するバリア機能の障害を伴うバリア破壊された表皮および炎症性表皮状態における免疫サーベイランスの増加に対する危険シグナルを表す。リンパ球や樹状細胞を引き寄せる。ＩＦＮα−１４は、ＣＣＬ２０に到達するケラチノサイトを完全に停止させる。このようなＩＦＮα−１４による抑制は、全く予想外である。
【０１０４】
実験２：乾癬状態に刺激した皮膚生検組織のＩＬ１７Ａ産生に及ぼすＩＦＮα−１４の影響
健常対象から正常皮膚を採取し、サイトカインを混合して乾癬状態に誘導した。二相性反応は薬理学的によく知られており、ＩＦＮα−１４の抗ウイルス特性によるものである。図８は、ＩＬ１７Ａが広範囲のＩＦＮα−１４濃度にわたって有意に抑制されたことを示している。図８は、ＩＦＮα−１４が表皮でのＩＬ１７の分泌を阻害できるという仮説を支持している。ドージングの望ましい治療ウィンドウは、１０２〜１０５の範囲内である。
【０１０５】
実験３：全ヒト血液アッセイにおけるＩＬ１７、ＩＬ１７Ｆ、ＩＬ２２、ＴＮＦ−α、ＩＬ６、ＣＸＣＬ８（ＩＬ８）およびＣＸＣＬ１産生に及ぼすＩＦＮα−１４の影響
この実験では、正常なヒト全血を用いる。レクチンＰＨＡ（フィトヘムアグルチニン）で刺激され、Ｔリンパ球を非特異的に活性化する。反応にはばらつきがある可能性があるため（ないものもある）、ＰＨＡの２つの用量が用いられている。これが末梢血であるため、Ｔリンパ球の９６％以上はαβ受容体型である。これは、全身治療のみに対する有効性を強く示している。
【０１０６】
図９は、１００ＩＵ／ｍｌのＩＦＮ−α１４（１ｎｇ／ｍｌ）を用いて、全ヒト血由来のαβリンパ球から導出されるＩＬ１７Ａ合成が最大８０％低下したことを示している。これは予期せぬ顕著な結果であった。
【０１０７】
図１０は、ＩＦＮα−１４（３対象の平均）の存在下で、全ヒト血由来のαβリンパ球からのＩＬ１７Ｆ合成が強く抑制されることを示している。図１０は、ＩＦＮα−１４がＩＬ１７Ｆを最大８７％まで有意に阻害することを示す。
【０１０８】
図１１は、ＩＦＮα−１４の存在下でのＩＬ２２産生の強力な阻害を示す。ＩＬ２２はＩＬ１７のケモカイン刺激活性を複製するので、ＩＬ２２の阻害は乾癬に対しても好影響をもたらすであろう。
【０１０９】
図１２は、ＩＦＮα−１４の存在下でのＴＮＦ−α産生の強い阻害を示す。ＴＮＦ‐α産生は１００μｇのＰＨＡにより誘起される。この５日間全血アッセイは、ＴＮＦ−α産生の＞７０％の低下を示す。ＴＮＦ−αは、内皮細胞、上皮細胞およびケラチノサイトに信号を伝達し、好中球を誘引するケモカインを産生させる。これらの脱顆粒により、乾癬の原因となる組織損傷化学物質や酵素が放出される。
【０１１０】
図１３は、１日全血アッセイにおけるＩＦＮα−１４の存在下でのＩＬ−６産生の強力な阻害を示す。ＩＬ‐６は外傷で上昇する急性期反応物質であり、補助的増殖因子／刺激剤として広く使用されている。ＩＬ６は応力に通常関連する増殖因子である。ＩＬ１７を分泌するＴｈ１７細胞に対するＴｒｅｇの比率を決定するのに関与しており、その除去によりＴ細胞バランスはＩＬ１７を分泌するＴｈ１７細胞から遠ざかるように押し出される。
【０１１１】
図１４は、１日間の全血アッセイにおいて、非常に低いレベルのＩＦＮα−１４の存在下でＣＸＣＬ８（ＩＬ８）合成が阻害されることを示す。ＣＸＣＬ８は乾癬の多くの側面の主要な寄与因子であり、乾癬のエフェクター分子の１つである。ＣＸＣＬ８は炎症の主要な寄与因子である。好中球や好塩基球／肥満細胞を炎症部位に引き寄せ、後者はヒスタミンや他の多くの有害物質、たとえばプロスタグランジン、ロイコトリエンを放出する。
【０１１２】
図１５は、ＩＦＮα−１４の存在下でＣＸＣＬ−１産生が阻害されることを示す。ＣＸＣＬ１は強い走化性特性を有する重要なケラチノサイトケモカインである。ＣＸＣＬ１は主に好中球を作用部位に引き寄せ、ＴＮＦ−αによって誘導される。図８は、ＬＰＳまたはＰＨＡの両方による刺激が抑制されたことを示す。バーは、可能な限り高いレベルで産生するための、異なるレベルのＬＰＳまたはＰＨＡによる刺激を示す。これによりＩＣ５０は１ＩＵ／ｍｌと低くなり、ＩＦＮα−１４の効力を示す。この１日ＣＸＣＬ１全血アッセイは、治療がどれくらい効果的であり得るかを示す。
【０１１３】
これらの結果は、ケモカインのＩＦＮα‐１４抑制が標的化現象であることを実証する。その結果、ＩＦＮα‐１４はＩＬ１７産生の前後に作用することが示された。これは、他の乾癬治療法と比較して、この治療法のもう一つの鍵となる鑑別因子である。
【０１１４】
実験４：未処置ヒト正常単核細胞および５０μｇ／ｍｌフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）で３日間刺激したヒト正常単核細胞における４００のインターロイキン、ケモカインおよびＣＤマーカーの濃度の変化。
ヒトインターフェロンアルファ１０および１４を最終濃度１０５ＩＵ／ｍｌで培養物に添加したところ、有意な濃度変化（倍数）のみが示された。これは、ヒトBIOMARKER TESTING ARRAY‐（RayBiotech Inc．）を用いて行った。
【０１１５】
図１６は、前述のように、α−１４がＩＬ−３およびＧ−ＣＳＦ（骨髄細胞および顆粒球）、ＩＬ５（好酸球）、ＩＬ−１３（Ｔｈ２応答およびＩｇＥ合成）、ならびにＩＬ−１７および２２（Ｔｈ１７／Ｔｈ２２細胞）の合成を阻害することを示している。また、免疫バランスをＴｈ２からよりＴｈ１型へと刺激し変化させるＩＬ−１２ｐ７０を増強する。また、好塩基球／肥満細胞の低親和性ＩｇＥ受容体であるＣＤ−２３を阻害し、ケモカインであるＣＸＣＬ−１，５及びＣＣＬ−１，７，１６，２０を抑制することにより、アレルギー状態及びそれに伴う顆粒球の誘引を抑制する。このことは、乾癬のコントロールだけでなく、アトピー性皮膚炎の制御にも役割を果たしていることを強く示唆している。
【０１１６】
実験５：ヒトＩＦＮ−α１４はイヌＩＬ−１７Ａを阻害する。
雄ビーグル犬からヘパリン添加血液を全量採取し、ＩＦＮ−α１４濃度を上昇させた状態で、ＰＨＡで３日間刺激した。ＥＬＩＳＡにより得られた結果を図１７に示し、イヌＩＬ−１７Ａの顕著な阻害を示す。この結果は、ヒト血液（図９）およびヒトＩＬ−１７Ａで得られた結果と非常に類似している。ＩＬ−１７Ａはヒト乾癬およびアトピー性皮膚炎の主要な標的として認識されていることから、イヌの結果はヒトＩＦＮ−α１４を用いた同じ疾患のイヌにおける反応を示している。
【０１１７】
実験６：重症アトピー性皮膚炎の犬（雑種）の処置。
重度の皮膚炎を有する５歳齢のオスのペットイヌが、この疾患のために入手可能なすべての薬剤で治療されていた。これらの治療法のいずれにも利益は認められず、苦痛のある動物は絶えず引っかき傷をつけ、食事量が少なくなったため、体重は減少し、全身の健康状態は不良であった。
０．５ｍｌの０．９％生理食塩水中のヒトＩＦＮ‐α１４（１０４ＩＵ／Ｋｇ）を２週間かけて２日毎に舌下投与した。動物は３週間後には病状は回復し、ひっかいておらず、通常量の食事をしていた。このように、この治療は、使用された他のすべての治療法が成功しなかったところで有効であった。血液、肝臓または腎臓の機能検査で有害データは記録されなかった。
【０１１８】
実験７．全ヒト白血球からのインターロイキン／ケモカインのＰＨＡ誘導製造に対するＨＹＢＲＩＤ１とインターフェロンアルファ１４の比較。
インターフェロンの濃度は０〜４０ＩＵ／ｍｌの範囲であり、１００マイクログラム／ｍｌのＰＨＡ‐Ｐで３日間刺激した細胞であった。インターロイキン／ケモカインは市販のＥＬＩＳＡ法を用いて推定し、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−８、ＣＸＣＬ−１、ＴＮＦ−αおよびインターフェロン−γを測定した。その結果を図２０〜２４に示すが、インターフェロンアルファ−１４で得られた値とＨＹＢＲＩＤ１で誘発された値との間には、Ｐ＜０．０５（Student T検定）で統計的差は認められなかった。本質的には、これら２つの分子は、用いた５つのアッセイで同等であると判断される。
【０１１９】
本発明の範囲から逸脱することなく、本発明の記載された実施形態に対する様々な修正および変形が当業者には明らかであろう。本発明を具体的な好ましい実施形態と関連させて説明したが、特許請求される本発明は、そのような具体的な実施形態に不当に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、当業者に自明な本発明を実施するための記載された態様の様々な変更は、本発明によってカバーされることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際調査報告】
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