(57)【要約】本明細書において、消耗したCAR T細胞を若返らせるために、これらのCAR T細胞に送達するように特に設計された、標的リガンドと結合体化された薬物ペイロードが提供される。標的化されたCAR T細胞は融合受容体によって改変されており、該融合受容体は標的リガンドに結合することができ、かつ、結合体化された薬物ペイロードを内部移行させて、消耗したCAR T細胞に対するその調節機能を実行することができる。2021533166.tif 000051
2021533166.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも2成分を含む、消耗した古典的CAR T細胞を若返らせるためのシステムであって、第1の成分が、ペイロード薬物と共有結合により連結された標的リガンドを含む結合体であり、第2の成分が、膜アンカーモジュールと連結された標的リガンド結合モジュールであり、第2の成分の標的リガンド結合モジュールが、第1の成分中の標的リガンドを高親和性で認識して複合体を形成し、ペイロード薬物が、消耗した古典的CAR Tの阻害シグナル伝達をブロックするか、または抗原非依存性経路を介して該CAR Tを再活性化し、膜アンカーモジュールが、消耗したCAR T細胞の中への2成分複合体の内部移行を媒介する、前記システム。
【請求項２】
第1の成分の標的リガンドが、葉酸、FITC、またはFK506である、請求項1記載のシステム。
【請求項３】
第2の成分の標的リガンド結合モジュールが、抗FITC抗体断片、FKBP、または葉酸受容体である、請求項1記載のシステム。
【請求項４】
膜アンカーモジュールが葉酸受容体である、請求項1記載のシステム。
【請求項５】
第1の成分が、標的リガンドとペイロード薬物との間に遊離可能なリンカーを含む、請求項1記載のシステム。
【請求項６】
第1の成分が、標的リガンドとペイロード薬物との間に遊離不可能なリンカーを含む、請求項1記載のシステム。
【請求項７】
標的リガンドとリガンド結合モジュールとの間の結合親和性がnM以下の範囲である、請求項1記載のシステム。
【請求項８】
薬物ペイロードが、Toll様受容体7(TLR7)アゴニストまたはインターフェロン遺伝子刺激因子(Simulator of interferon genes)(STING)アゴニストである、請求項1記載のシステム。
【請求項９】
薬物ペイロードが、以下のタンパク質: SHP1/2、TC-PTPまたはDGKα、TGFβに対するインヒビターである、請求項1記載のシステム。
【請求項１０】
TLR7アゴニストが、
2021533166.tif 000035
の構造を有する、請求項8記載のシステム。
【請求項１１】
第1の成分が、
2021533166.tif 000036
の構造を有するフルオレセイン-TLR7アゴニストである、請求項1記載のシステム。
【請求項１２】
第1の成分が、
2021533166.tif 000037
の構造を有するFK506-TLR7アゴニストである、請求項1記載のシステム。
【請求項１３】
第1の成分が、以下:
2021533166.tif 000038
のうちの1つである、請求項1記載のシステム。
【請求項１４】
第1の成分が、以下のTC-PTPホスファターゼインヒビター:
2021533166.tif 000039
からなる群より選択されるペイロード薬物を含む、請求項1記載のシステム。
【請求項１５】
ホスファターゼインヒビターが、以下の構造:
2021533166.tif 000040
を形成するようにフルオレセインまたはFK506(タクロリムス)と連結されている、請求項14記載のシステム。
【請求項１６】
第1の成分中のペイロード薬物が、以下の構造:
2021533166.tif 000041
のうちの1つのSTINGアゴニストを含む、請求項1記載のシステム。
【請求項１７】
第1の成分が、標的リガンドとペイロード薬物との間に、以下の構造:
2021533166.tif 000042
からなる群より選択されるスペーサーを含む、請求項1記載のシステム。
【請求項１８】
消耗したCAR T細胞を若返らせるための方法であって、
(a) 消耗したCAR T細胞に、結合体を含む第1の成分を提供する工程であって、該結合体が、遊離可能なリンカーまたは遊離不可能なリンカーを介して薬物ペイロードと共有結合により連結された標的リガンドを含む、工程;
(b) 該消耗したCAR T細胞に、消耗したCAR構築物と連結された融合受容体を含む第2の成分を提供する工程であって、該融合受容体が、標的リガンド結合モジュールと膜結合型受容体モジュールを含む、工程;
(c) 第2の成分の標的リガンド結合モジュールを第1の成分中の標的リガンドと結合させて複合体を形成する工程;
(d) 膜結合型CARモジュールに、消耗したCAR T細胞の中への複合体の内部移行を媒介させる工程;
(e) ペイロード薬物に、消耗したCAR Tの阻害シグナル伝達をブロックさせるか、または抗原非依存性経路を介して該CAR Tを再活性化させる工程
を含む、前記方法。
【請求項１９】
ペイロード薬物が、その機能を、消耗したCAR Tのエンドソームの中で果たし、標的リガンドとペイロード薬物が、遊離不可能なリンカーによって連結されている、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
ペイロード薬物が、その機能を、消耗したCAR Tのサイトゾルの中で遊離薬物として果たし、標的リガンドとペイロード薬物が、遊離可能なリンカーによって連結されている、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
第1の成分の標的リガンドが、葉酸、FITC、またはFK506である、請求項18記載の方法。
【請求項２２】
第2の成分の標的リガンド結合モジュールが、抗FITC、葉酸受容体、またはFKBPである、請求項18記載の方法。
【請求項２３】
リガンド結合モジュールが葉酸受容体α(FRa)である、請求項18記載の方法。
【請求項２４】
薬物ペイロードが、Toll様受容体7(TLR7)アゴニストまたはインターフェロン遺伝子刺激因子(STING)アゴニストである、請求項18記載の方法。
【請求項２５】
薬物ペイロードが、以下のタンパク質: SHP1/2、TC-PTPまたはDGKα、TGFβに対するインヒビターである、請求項18記載の方法。
【請求項２６】
TLR7アゴニストが、
2021533166.tif 000043
の構造を有する、請求項18記載の方法。
【請求項２７】
第1の成分が、
2021533166.tif 000044
の構造を有するフルオレセイン-TLR7アゴニストである、請求項18記載の方法。
【請求項２８】
第1の成分が、
2021533166.tif 000045
の構造を有するFK506-TLR7アゴニストである、請求項18記載の方法。
【請求項２９】
第1の成分が、以下:
2021533166.tif 000046
のうちの1つである、請求項18記載の方法。
【請求項３０】
第1の成分が、以下のTC-PTPホスファターゼインヒビター:
2021533166.tif 000047
からなる群より選択されるペイロード薬物を含む、請求項18記載の方法。
【請求項３１】
ホスファターゼインヒビターが、以下の構造:
2021533166.tif 000048
を形成するようにフルオレセインまたはFK506(タクロリムス)と連結されている、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
第1の成分中のペイロード薬物が、以下の構造:
2021533166.tif 000049
のうちの1つのSTINGアゴニストを含む、請求項18記載の方法。
【請求項３３】
第1の成分が、標的リガンドとペイロード薬物との間に、以下の構造:
2021533166.tif 000050
からなる群より選択されるスペーサーを含む、請求項18記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本開示は、癌抗原によって消耗したキメラ抗原受容体T(CAR T)細胞を若返らせるためのシステムを提供する。特に、前記システムは古典的CAR構築物の中に融合受容体を含み、融合受容体は、高親和性リガンド-ペイロード薬物結合体を認識して、消耗したCAR Tの阻害シグナル伝達をブロックするかまたは抗原非依存性経路を介してCAR Tを再活性化するように設計された薬物ペイロードを送達するリガンド結合モジュールを提供する。
【背景技術】
【０００２】
背景
キメラ抗原受容体(CAR)T細胞療法の分野は過去20年間にわたってかなりの進歩を遂げてきた。CAR構築物は、4つの部分:(1)腫瘍特異的抗原に対する細胞外結合部分、(2)ヒンジドメイン、(3)膜貫通ドメイン、ならびに(4)様々な活性化ドメイン、例えば、CD28、4-1BB、およびCD3ζ鎖の組み合わせからなる。CD19陽性B細胞白血病に対するCAR T療法において最も印象的な成功が見られ、いくつかの臨床試験において80％を超える完全寛解率が成し遂げられた。
【０００３】
対照的に、CAR Tによる固形腫瘍処置は困難なことが今までに判明している。同系マウスモデルを用いた前臨床試験または免疫不全マウスにおける異種移植片腫瘍モデルでは大成功が収められている。しかしながら、固形腫瘍、例えば、乳癌、卵巣癌、または肺癌が関与する臨床試験はどれも対照と比較して改善を示さなかった。一般的に、CAR Tは、(1)十分でない腫瘍浸透;(2)低酸素圧;(3)腫瘍関連マクロファージ、線維芽細胞、および抑制性サイトカインを含む免疫抑制腫瘍微小環境を含む、他の養子細胞療法が直面するものと同じ制約を欠点として持つ1。CAR T細胞は腫瘍浸潤リンパ球(TIL)と同じように、この抑制性微小環境によって再教育され、共抑制分子(co-inhibitory molecule)(すなわち、PD-1、Tim-3、LAG-3など)の過剰発現、INFγ分泌および死滅能力の低下を特徴とする「機能低下(hypofunctional)」状態に転じることがある。患者の卵巣癌試料からのデータは、PD-1+CD8+T細胞の大部分には、T細胞におけるエフェクター-メモリー移行に重要なことが知られているCD127発現が無かったことを示している。LAG-3過剰発現もTCR特異的CD8+TILのエフェクター機能と負の相関関係があった。さらに、PD-1+LAG-3+二重陽性T細胞は少ないINFγ産生を示した2。同様に、NY-ESO-1 TCR特異的ヒトT細胞はマウス固形腫瘍モデルにおいて機能低下状態になり、共抑制分子の高発現と効率的でない抗腫瘍効果を示した。これは、微小環境と、抗原への連続曝露による絶え間ないT細胞活性化が原因である3。従って、もっと良好な固形腫瘍の処置には、抑制性微小環境を逆転させること、さらに重要なことには、消耗したCAR T細胞を若返らせることが極めて望ましい。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は、消耗した古典的CAR T細胞を若返らせるためのシステムを提供する。前記システムは少なくとも2成分を含み、第1の成分は、ペイロード薬物と共有結合により連結された標的リガンドを含む結合体であり、第2の成分は、膜アンカーモジュールと連結された標的リガンド結合モジュールである。第2の成分の標的リガンド結合モジュールは、第1の成分中の標的リガンドを高親和性で認識して複合体を形成し、ペイロード薬物は、消耗した古典的CAR Tの阻害シグナル伝達をブロックするか、または抗原非依存性経路を介して前記CAR Tを再活性化する。膜アンカーモジュールは、消耗したCAR T細胞の中への2成分複合体の内部移行を媒介する。
【０００５】
一部の好ましい態様では、第1の成分の上記の標的リガンドは、葉酸、FITC、またはFK506である。
【０００６】
一部の好ましい態様では、第2の成分の上記の標的リガンド結合モジュールは、葉酸受容体、抗FITC抗体断片、またはFKBPを含む。
【０００７】
一部の好ましい態様では、上記の膜アンカーモジュールは葉酸受容体である。
【０００８】
一部の好ましい態様では、上記の第1の成分は、標的リガンドとペイロード薬物との間に遊離可能なリンカーを含む。
【０００９】
一部の好ましい態様では、上記の第1の成分は、標的リガンドとペイロード薬物との間に遊離不可能なリンカーを含む。
【００１０】
一部の好ましい態様では、上記の標的リガンドと標的リガンド結合モジュールとの間の結合親和性はnM以下の範囲である。
【００１１】
一部の好ましい態様では、上記の薬物ペイロードは、Toll様受容体7(TLR7)アゴニストまたはインターフェロン遺伝子刺激因子(Simulator of interferon genes)(STING)アゴニストである。
【００１２】
一部の好ましい態様では、上記の薬物ペイロードは、以下のタンパク質:SHP1/2、TC-PTPまたはDGKα、TGFβに対するインヒビターである。
【００１３】
一部の好ましい態様では、上記のTLR7アゴニストは、
2021533166.tif 000003
の構造を有する。
【００１４】
一部の好ましい態様では、上記の第1の成分は、
2021533166.tif 000004
の構造を有するフルオレセイン-TLR7アゴニストである。
【００１５】
一部の好ましい態様では、上記の第1の成分は、
2021533166.tif 000005
の構造を有するFK506-TLR7アゴニストである。
【００１６】
一部の好ましい態様では、上記の第1の成分は、以下:
2021533166.tif 000006
のうちの1つである。
【００１７】
一部の好ましい態様では、上記の第1の成分は、以下のTC-PTPホスファターゼインヒビター:
2021533166.tif 000007
からなる群より選択されるペイロード薬物を含む。
【００１８】
一部の好ましい態様では、上記のホスファターゼインヒビターは、以下の構造:
2021533166.tif 000008
を形成するようにフルオレセインまたはFK506(タクロリムス)と連結されている。
【００１９】
一部の好ましい態様では、上記の第1の成分中のペイロード薬物は、以下の構造:
2021533166.tif 000009
のうちの1つのSTINGアゴニストを含む。
【００２０】
一部の好ましい態様では、上記の第1の成分は、標的リガンドとペイロード薬物との間に、以下の構造:
2021533166.tif 000010
からなる群より選択されるスペーサーを含む。
【００２１】
本開示は、消耗したCAR T細胞を若返らせるための方法をさらに提供する。前記方法は、
(a) 消耗したCAR T細胞に、結合体を含む第1の成分を提供する工程であって、前記結合体が、遊離可能なリンカーまたは遊離不可能なリンカーを介して薬物ペイロードと共有結合により連結された標的リガンドを含む、工程;
(b) 前記消耗したCAR T細胞に、消耗したCAR構築物と連結された融合受容体を含む第2の成分を提供する工程であって、前記融合受容体が、標的リガンド結合モジュールと膜アンカーモジュールを含む、工程;
(c) 第2の成分の標的リガンド結合モジュールを第1の成分中の標的リガンドと結合させて複合体を形成する工程;
(d) 膜アンカーモジュールに、消耗したCAR T細胞の中への複合体の内部移行を媒介させる工程;
(e) ペイロード薬物に、消耗したCAR Tの阻害シグナル伝達をブロックさせるか、または抗原非依存性経路を介して前記CAR Tを再活性化させる工程
を含む。
【００２２】
一部の好ましい態様では、上記の方法は、ペイロード薬物が、その機能を、消耗したCAR Tのエンドソームの中で果たすペイロード薬物を運搬し、標的リガンドとペイロード薬物が、遊離不可能なリンカーによって連結されている。
【００２３】
一部の好ましい態様では、上記の方法は、その機能を、消耗したCAR Tのサイトゾルの中で遊離薬物として果たすペイロード薬物を運搬し、標的リガンドとペイロード薬物が、遊離可能なリンカーによって連結されている。
【００２４】
一部の好ましい態様では、上記の方法において、第1の成分の標的リガンドは葉酸、FITC、またはFK506である。
【００２５】
一部の好ましい態様では、上記の方法において、第2の成分の標的リガンド結合モジュールは抗FITC、葉酸受容体、またはFKBPである。
【００２６】
一部の好ましい態様では、上記の方法において、第2の成分の標的リガンド結合モジュールは葉酸受容体α(FRa)である。
【００２７】
一部の好ましい態様では、上記の方法において、第1の成分の薬物ペイロードは、Toll様受容体7(TLR7)アゴニストまたはインターフェロン遺伝子刺激因子(STING)アゴニストである。
【００２８】
一部の好ましい態様では、上記の方法において、第1の成分の薬物ペイロードは、以下のタンパク質:SHP1/2、TC-PTPまたはDGKα、TGFβに対するインヒビターである。
【００２９】
一部の好ましい態様では、上記の方法において、TLR7アゴニストは、
2021533166.tif 000011
の構造を有する。
【００３０】
一部の好ましい態様では、上記の方法において、第1の成分は、
2021533166.tif 000012
の構造を有するフルオレセイン-TLR7アゴニストである。
【００３１】
一部の好ましい態様では、上記の方法において、第1の成分は、
2021533166.tif 000013
の構造を有するFK506-TLR7アゴニストである。
【００３２】
一部の好ましい態様では、上記の方法において、第1の成分は、
2021533166.tif 000014
である。
【００３３】
一部の好ましい態様では、上記の方法において、第1の成分は、以下のTC-PTPホスファターゼインヒビター:
2021533166.tif 000015
からなる群より選択されるペイロード薬物を含む。
【００３４】
一部の好ましい態様では、上記の方法において、第1の成分は、以下の構造:
2021533166.tif 000016
を形成するようにフルオレセインまたはFK506(タクロリムス)と連結されているホスファターゼインヒビターを含む。
【００３５】
一部の好ましい態様では、上記の方法において、第1の成分は、以下の構造:
2021533166.tif 000017
のうちの1つのSTINGアゴニストのペイロード薬物を含む。
【００３６】
一部の好ましい態様では、上記の方法において、第1の成分は、標的リガンドとペイロード薬物との間に、以下の構造:
2021533166.tif 000018
からなる群より選択されるスペーサーを含む。
【００３７】
本発明のこれらの、および他の特徴、局面、および利点は、以下の図面、関連する説明、および特許請求の範囲を参照すればさらに深く理解される。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図1a：消耗モデルのグラフ図。図1b：インビトロで新鮮なRaji細胞で3回刺激した後に、死滅作用の低下によって示されるように、抗CD19 CAR T細胞は消耗状態になる。
【図２】秘密経路(secret passageway)のグラフ図。FKBPまたは抗FITCが融合受容体としてFRaと連結され、融合受容体は、FK506またはFITCと連結されているペイロードを細胞内に絶え間無く内部移行し、送達する。
【図３】FK506およびFITCの、対応する融合受容体に対する結合親和性。FK506-ローダミンはFKBP-FR融合受容体に対してKd=3.39nMを示す。これに対して、FITC-AF647は抗FITC-FRに対してKd=8.03nMを示す。
【図４】図4a：TLR7アゴニストの構造。図4b：死滅作用、INFrレベルの増加、共抑制分子レベルの減少として示された、消耗した抗CD19 CAR T細胞に対するTLR7アゴニストの若返り効果。
【図５】TLR7アゴニストの化学構造。
【図６】CAR T細胞消耗を誘導するためのインビトロモデル。(A)CD19+ Raji細胞と抗CD19 CAR T細胞を1:1比で共培養し、新鮮なRaji細胞を12時間毎に添加した。(B)刺激の回数(Raji細胞添加の回数)が増えるにつれて、CAR T細胞の溶解効果は徐々に減少した。CD19-K562細胞を対照として使用した。(C)CD4およびCD8陽性のCAR T細胞におけるstim1およびstim3を対象にした共抑制分子PD-1、LAG3、およびTim3の発現レベル変化。
【図７】消耗したCAR T細胞の若返りに対するTLR7アゴニストおよびPTP1bインヒビターの効果の評価。(A)TLR7アゴニストおよびPTP1bインヒビターの化学構造。(B〜C)消耗したCAR T細胞を異なる濃度のTLR7アゴニストおよびPTP1bインヒビターとインキュベートし、溶解効果およびINFγ(B)ならびにインキュベーション後のPD-1、LAG-3、およびTim3の発現レベル(C)によってモニタリングした。*はp値<0.05を示し、**は<0.01を示す。ns=有意でない。
【図８】遊離不可能なリガンドによって標的化される送達のためのTLR7アゴニストの潜在的な誘導体化部位の評価。(A)TLR7アゴニスト類似体の化学構造。(B)消耗したCAR T細胞を異なる濃度のTLR7類似体とインキュベートし、溶解効果を測定し、未処理群と比較した。
【図９】標的リガンドとしてFITCを用いたTLR7アゴニストの遊離可能および遊離不可能な標的化送達の設計および評価。(A)FITC-TLR7アゴニストの化学構造の図。(B)消耗したCAR T細胞を異なる濃度の遊離可能なFITC-TLR7および遊離不可能なFITC-JTLR7アゴニストとインキュベートし、溶解効果を測定し、未処理群と比較した。*はp値<0.05を示し、**は<0.01を示す。ns=有意でない。(C)左、FITC(緑色)とFITC scFv(灰色)の結合の結晶構造(PDB:1X9Q、左)。FITCとFTIC scFvの縁との間の距離は約18Åと測定された。右、同様に、R-848(赤色)とTLR7(灰色)の結合の結晶構造(PDB:5GMF)を示した。R-848とTLR7の縁との間の距離は約24Åと測定された。(D)遊離不可能なFITC-TLR7アゴニストについて、2つの可能性がある作用機構「到達(Reaching)」または「ジャンピング(Jumping)」モードを示した図。
【図１０】標的リガンド-ペイロード結合体の設計において使用することができる様々な硬直性(rigidity)および疎水性の化学リンカー。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
詳細な説明
本開示の概念が本明細書中での図面および説明において詳細に例示および説明されるが、図面およびその説明の中での結果は例示であり、特徴を制限するものではないと考えなくてはならない。例示的な態様だけが示され、かつ説明され、本開示の精神の範囲内にある全ての変更および修正が保護されることが望ましいと理解される。
【００４０】
特に定義のない限り、科学用語および技術用語は、本開示に属する当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【００４１】
最近、キメラ抗原受容体(CAR)T細胞療法は数種類の造血癌の治療において大きな成功を収めた。その一方で、CAR T細胞療法を用いても、リンパ腫の一部とほとんどの固形腫瘍症例の奏効率が非常に低いか、または再発率が高いことも認識しなければならない。これは、主に、以下の3つの理由:1.抗CD19 CAR T細胞で処置されたCD19陰性ALL再発の場合で認められるように、CAR T細胞の選択圧下で抗原陰性癌細胞コロニーが出現すること、2.異常な腫瘍脈管構造、密集した間質障壁(stromal barrier)、および抑制性の微小環境により固形腫瘍におけるCAR T細胞の初期ホーミングおよび増殖が妨害されること、3.連続して腫瘍抗原に曝露された後にCAR T細胞が徐々に消耗し、溶解効果が低下することの1つまたは組み合わせに起因する。ある特定の固形腫瘍患者には抗原消失が存在しないことを考えると(生検サンプリングにより確認された)、CAR T細胞療法の起こり得る失敗の原因は最後の2つの理由に起因する可能性がとても高い。従って、固形腫瘍でのCAR T細胞効力を高めるために、CAR T細胞をインビボで評価し、若返らせるための実用的な方法が大変望ましい。
【００４２】
本明細書において、本発明者らは、両方の目的を果たすためのユニバーサルなプラットフォームとして、CAR T細胞における私的経路(private passageway)融合受容体の新規の設計について説明する。このFITC-FR融合受容体は、2つの部分、N末端にあるリガンド結合ドメインであるFITCに対するscFvと、C末端にあるGPIアンカー・内部移行ドメインであるFRαで構成されている。抑制性腫瘍微小環境におけるCAR T細胞の消耗状態を克服するために、FITC-FR融合受容体をCAR T細胞上で独立して発現させた時に、FITC-イムノアゴニストによって特異的に標的化することができる。これらのイムノアゴニストは、通常、強力な自己免疫副作用を引き起こすが、今では、FITCによって標的化された形で全身投与され、FITC-FR陽性CAR T細胞に安全に送達することができる。この何十年で、細胞タイプ、送達方法、および適切な疾患モデルについて、この分野で大きな進歩が起こった。細胞タイプの点では、現行の細胞療法はキメラ抗原受容体(CAR)、腫瘍モデル用の細胞、および幹細胞ベースの再生医療として大まかに分類することができる。
【００４３】
キメラT細胞受容体、キメラ免疫受容体、または人工T細胞受容体としても知られるCAR Tを用いると、免疫エフェクター細胞(通常、T細胞またはNK細胞)は、対応する抗原をもつ標的細胞を認識し、細胞傷害活性を発揮することが可能になる。CAR-T技術の出現と開発は、ある特定の種類の癌に対して将来性を与え、これにより、CAR-Tは生物医学研究と臨床研究の両分野におけるスーパースターとなった。いくつかの従来の、および改善されたCAR T細胞設計が米国出願番号15/296,666において開示されている。米国出願番号15/296,666の内容は全体が本明細書において組み入れられる。‘666出願では、CARシステムは、処置されている対象の細胞が産生も発現もしない部分を標的とするCARを発現する細胞傷害性リンパ球を提供することによって生成される。従って、このCARシステムを用いると、細胞傷害性リンパ球を癌細胞などの標的細胞に集中して標的化することが可能になる。標的化部分は、腫瘍細胞受容体リガンドも含む低分子結合分子(small conjugate molecule)(SCM)の一部である。SCMとCAR発現細胞傷害性リンパ球を投与すると、細胞傷害性リンパ球応答は、SCMが結合する腫瘍受容体を発現する細胞にだけ標的化される。
【００４４】
CAR T細胞療法が研究と臨床用途の両分野において急速に進歩しているのにもかかわらず、CAR T療法に付随する懸念がある。致命的な副作用の1つは、腫瘍細胞が急速に溶解することから生じるサイトカインストームであり、これは、CARをもつ正常細胞を死滅させる。このような副作用に対処するために、PCT/US2018/018557では、CAR T細胞と特定の薬物ペイロードを標的腫瘍細胞に標的送達して、このような副作用を制御することが開発されている。PCT/US2018/018557の内容は全体が本明細書において組み入れられる。簡単に述べると、操作されたタンパク質が高親和性標的リガンドと結合される。この場合、移植細胞療法の効果を調節するために、標的リガンドは、操作されたタンパク質を介してCAR T細胞によって内部移行される少なくとも1つの薬物ペイロードを運搬する。
【００４５】
CAR T療法の別の制約は、癌抗原で繰り返し刺激された後に消耗状態になる傾向があることである。抗原から一晩離された後に(「休養」後に)再刺激されると、固形腫瘍組織から単離されたT細胞が多量のINFγ分泌と死滅作用を示すので、T細胞の消耗表現型の可逆性が判明している4。しかしながら、もっと臨床に関係するやり方で、阻害シグナル伝達をブロックするか、または他の経路を介してT細胞を活性化する薬物を用いて若返らせることができれば魅力が高まる。チェックポイントインヒビター(すなわち、PD-1、CTLA-4など)を標的とする抗体が診療所において、固形腫瘍において、ある程度の成功を示した。しかしながら、2種類以上の標的の組み合わせが必要だと分かることが多い5 6。さらに、抗体療法は固形腫瘍に十分に浸透しないという欠点も持つ。従って、固形腫瘍におけるCAR Tとチェックポイントインヒビターに対する抗体の併用療法の報告は少なかった。TCR非活性化を媒介する、SHP1/27およびTC-PTP8などのホスファターゼの阻害は阻害経路をブロックする別の手法である。これらのホスファターゼのノックアウト実験と低分子インヒビターは両方ともTCR閾値の低下とT細胞活性の増加に対して強力な効果を示したが、いずれもCAR T療法で用いられたことがない。DGKαはTCRシグナル伝達の別の生理学的インヒビターであり、消耗したTILにおいて過剰発現している。DGKαはDAGをPAに異化し、それによってDAGレベルが低下し、その結果、RasおよびMARK ERKシグナル伝達は弱まる。DGKαインヒビターは脱顆粒を回復させ、TILおよびCAR Tの死滅作用を増大させる3 9。T細胞を若返らせる別のアプローチは、抗原非依存性経路を介してT細胞を活性化するアプローチである。Toll様受容体(TLR)を含む、ある特定の病原体パターン認識(PPR)受容体は、T細胞を含む非骨髄系細胞集団上に発現し、同じように活性化できることが知られてきた。研究から、TLR210、411、および7/812 13アゴニストはCD8 T細胞を活性化し、INFγ分泌を増大できることも分かっている。しかしながら、TLRアゴニスト全身投与の強力な副作用のために14、これらのアゴニストはいずれもCAR T療法において、T細胞を再活性化するために、または免疫抑制微小環境を変えるために用いられたことがない。これは、腫瘍細胞そのものに対するTLRアゴニストの議論の余地がある作用でも妨害される15。インターフェロン遺伝子刺激因子(STING)は、T細胞、骨髄系細胞、および単球を含む、末梢リンパ系組織中の造血細胞において広く発現しているサイトゾルDNAセンサー(cytosolic DNA sensor)(CDS)である。STINGアゴニストは多くの免疫療法の免疫刺激剤として用いられたことがあり、CAR T療法においても非常に大きな影響を及ぼす可能性がある。しかしながら、述べられたインヒビターとアゴニストはCAR T細胞に対して非常に大きな若返り効果を有する可能性があるが、極めて強力な炎症促進機能があるために全身投与された場合に重大な副作用も誘発する可能性が極めて高い。従って、潜在的なペイロードをCAR T細胞に標的送達することが極めて望ましい。
【００４６】
特異的送達問題を解決するために、本発明者らは、ある特定のペイロードを全身投与し、他の細胞を変えずにCAR T細胞内にだけ特異的に蓄積できるように、CAR構築物と一緒にT細胞において発現させることができる秘密経路プラットフォームを設計した。このシステムは、T2A自己切断可能な配列を介して連結された、融合受容体と古典的CAR構築物からなる。融合受容体は、2つの部分:(1)高親和性リガンド-ペイロード結合体を認識することができるリガンド結合モジュールと、(2)細胞への受容体/結合体複合体の内部移行を媒介することができる膜結合型受容体モジュールを含有する。以下の理由:(1)天然細胞膜上にはFKBPまたは4M5.3が無いので、融合受容体陽性CAR T細胞へのペイロードの特異的送達が保証され、従って、他の細胞に対する副作用が低下することと、(2)タンパク質/リガンドペア間のナノモル濃度以下の結合親和性によって標的細胞内での十分なペイロード蓄積が促進されることから、パート1には2つのタンパク質/リガンドペア、FKBP/FK506およびFITCに対するscFv(4M5.3)/FITCが選択された。パート2での膜結合型受容体については、葉酸受容体α(FRa)が葉酸結合に関係なく、その構成的な内部移行性のために選択された16。本発明者らはまた標的-ペイロード連結システムも設計した。このシステムでは、標的に応じて遊離不可能なリンカーまたは遊離可能なジスルフィドリンカーを用いて、ペイロードを標的リガンドと連結することができる。具体的には、TLR7はエンドソームにあるので、秘密経路によって送達されたTLR7アゴニストは、受容体を介した内部移行によってエンドソームに入ったらすぐに、その機能を発揮することができる。従って、この場合、遊離可能なリンカーは必要でない。エンドソームではなくサイトゾルにある他の標的、例えば、SHP1/2、TC-PTP、DGK、TGFβ、およびSTINGの場合、エンドソームから逃れるために、標的-ペイロード結合体から遊離薬物が放出されることが必要である。合わせると、この秘密経路システムは、非常に多くのペイロードを、消耗したCAR T細胞に特異的にインビボ送達するための汎用性のあるプラットフォームを提供する。
【００４７】
本発明のこれらの、および他の特徴、局面、および利点は以下の実験例によってさらに深く理解される。
【００４８】
方法:
抗CD19 CAR T細胞の消耗および薬物処理:
6ウェルプレートの中で抗CD19 CAR T細胞をRajiと1:1比で共培養したが、新鮮なRaji細胞を12時間ごとに同じウェルに添加した。死滅作用および共抑制マーカーをフローサイトメトリーカウンティングによって定量した。薬物処理のために、Raji細胞で4回刺激した後、消耗した抗CD19 CAR Tを異なる濃度の薬物と12時間さらにインキュベートし、次いで、同様に定量した。
【００４９】
標的リガンド結合アッセイ
融合受容体陽性細胞を、様々な濃度のある特定のリガンド-色素分子と4℃で30分間インキュベートした。インキュベーション後に、細胞をPBSで2回洗浄し、次いで、フローサイトメトリーに提出した。結合曲線およびKd計算にはMFIまたはシフト(shift)パーセントを使用した。
【００５０】
材料
細胞株およびヒトT細胞
MDAMB-231細胞とMDA-MB-231 CD19+細胞を培養するために、10％熱失活胎仔ウシ血清および1％ペニシリン-ストレプトマイシンを含有するDMEM(Gibco)を使用した。健常ボランティアから入手したヒト全血から末梢血単核球(PBMC)をフィコール密度勾配遠心分離法(GE Healthcare Lifesciences, #17-5442-02)によって単離した。PBMCから純粋なCD3+T細胞を、EasySep(商標)Human T Cell Isolation Kit(STEM CELL technologies, #17951)を用いて濃縮した。
【００５１】
消耗したCAR T細胞をインビトロで若返らせるための潜在的なペイロードの評価
12ウェルプレートの中で抗CD19 CAR T細胞をCD19+ Raji細胞と1:1比で、1ウェルにつき2x106個のCAR Tおよび2x106個のRajiの密度でコインキュベートした。新たなRaji細胞を12時間ごとに3回添加し、次いで、CAR T細胞の消耗を確認するためにRaji細胞集団、溶解効果、および共抑制性受容体を試験した。フローサイトメトリーとルシフェラーゼベースのアッセイを用いて溶解効果を定量した。次いで、潜在的なペイロードの若返り効力を試験するために、この細胞混合物を96ウェルプレートに1ウェルにつき約2x105個の細胞で移し、異なる濃度の薬物を添加した。12時間後に、Raji細胞集団、溶解効果、および共抑制性受容体を再試験し、PBS処理群と比較した。
【実施例】
【００５２】
実施例1.インビトロでの抗CD19 CAR T細胞の消耗
本実施例では、本発明者らは、消耗したCAR T細胞のモデルを示した。簡単に述べると、図1aは、方法のセクションで記載したように、Bリンパ腫細胞の一種であるRaji細胞を、抗CD19 CAR T細胞の一種であるFMC63 CAR T細胞と共培養し、連続3日間にわたって12時間ごとに新鮮なRaji細胞を共培養物に添加したことを示す。図1bは、インビトロで新鮮なRaji細胞で3回刺激した後に、これらのCAR T細胞が死滅作用の減少によって示されるように消耗状態になったことを示す。共培養されたK562細胞は負の対照として役立った。
【００５３】
実施例2.秘密経路の設計
本実施例では、本発明者らは、標的となる細胞タイプへの送達ペイロード薬物の秘密経路の図を示す。FKBPまたは抗FITCは融合受容体としてFRaと連結される。融合受容体は、特定の薬物ペイロードと連結された標的リガンドFK506またはFITCと結合することができる。FRaの性質により、融合受容体は、FK506またはFITCと連結されたペイロードをCAR T細胞の中に絶え間無く内部移行させ、かつ送達する。従って、CAR TがCARを介して標的細胞と結合した時、本実施例では、CAR T表面にある抗CD19分子は癌細胞のCD19に結合し、CAR Tの中にある送達ペイロード薬物はその機能を発揮し得る、すなわち、ペイロード機能に基づいてCAR T活性を調節し得る。例えば、必要に応じてCAR Tを若返らせるために、一部のペイロード薬物が、PD-1、CTLA4、またはLAG3 T細胞機能調節分子に作用するように向けられ得る。
【００５４】
実施例3.TLR7アゴニストによる消耗した抗CD19 CAR T細胞の逆転
本実施例では、本発明者らは、標的リガンドFK506またはFITCは、それぞれの融合受容体(G4Sによって葉酸受容体と連結したFKBPまたはFITC-AF647)と首尾よく結合することを示す。本実施例では、ペイロード薬物は、融合受容体でトランスフェクトされたジャーカット細胞におけるペイロード分布を示すためのイメージング剤ローダミンである。FK506およびFITCの結合親和性を競合的結合によって計算した。FK506-ローダミンはFKBP-FR融合受容体に対してKd=3.39nMを示すのに対して、FITC-AF647は抗FITC-FRに対してKd=8.03nMを示す。
【００５５】
実施例4.潜在的な遊離可能および遊離不可能なFK506-TLR7アゴニストおよびFITC-TLR7アゴニストの設計
本実施例では、本発明者らは、消耗したCAR T細胞を処理するために、以下の構造を有するToll様受容体7アゴニストと結合体化した標的リガンドFK506を提供した。消耗したCAR T細胞にTLR7アゴニストペイロード薬物が標的化された時に、死滅作用が増大する用量依存的パターンが観察される。従って、CAR T活性の指標であるIFNγ発現レベルはペイロード薬物濃度と比べて用量依存的に増大した。T細胞効果の阻害分子であるTim3の発現レベルは逆の用量依存性を示した。すなわち、ペイロード薬物の濃度が増加するとTim3発現は減少した。
【００５６】
FK506-TLR7アゴニスト結合体は、以下に示した構造：
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のうちの1つを有するはずである。
【００５７】
同様に、フルオレセイン-TLR7アゴニスト結合体は以下に示した構造のうちの1つを有するはずであり、機能的なCAR Tに抗FITC融合受容体があれば、消耗したCAR Tを若返らせる。
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【００５８】
実施例5.消耗したCAR T細胞を若返らせるための他の潜在的なペイロードの設計
本実施例では、本発明者らは、低ナノモル濃度範囲の抗力で、CAR T消耗を元に戻す可能性がある他の潜在的なペイロードの構造のリストを提供する。
【００５９】
1)TC-PTPホスファターゼインヒビターは以下の構造を有するはずである。
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【００６０】
上記で述べたホスファターゼインヒビターは、以下のようにフルオレセインまたはFK506(タクロリムス)と連結され得る。
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【００６１】
2)STINGアゴニストは以下の構造を有するはずである。
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【００６２】
実施例6.標的リガンドと潜在的なペイロードとの間にあるスペーサーの設計
以下は、標的リガンドと任意の潜在的なペイロードを連結するのに使用することができるスペーサーのリストである。
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【００６３】
実施例7.ホスファターゼインヒビターおよびTLR7アゴニストが消耗したCAR T細胞を若返らせる能力の評価
固形腫瘍におけるCAR T細胞療法の大きな制約の1つは、癌抗原で繰り返し刺激された後に消耗状態になる傾向があることである。しかしながら、この現象はCAR T細胞に特有ではなく、慢性ウイルス感染4と腫瘍浸潤リンパ球5の両方で述べられている。抗原から一晩離された後に(「休養」後に)再刺激されると、固形腫瘍組織から単離されたT細胞が多量のINFγ分泌と死滅作用を示した研究において、T細胞の消耗表現型の可逆性が判明している57。しかしながら、もっと臨床に関係するやり方で、阻害シグナル伝達をブロックするか、または他の経路を介してT細胞を活性化する市販の治療剤を用いて若返らせることができれば魅力が高まるだろう。チェックポイントインヒビター(すなわち、PD-1、CTLA-4など)を標的とする抗体が診療所において、固形腫瘍において、ある程度の成功を示している151。しかしながら、2種類以上の標的の組み合わせが必要だと見出されることが多い。さらに、抗体療法は固形腫瘍に十分に浸透しないという欠点も持つ。このことが、固形腫瘍におけるCAR T細胞とチェックポイントブロッケード(checkpoint blockade)(ICB)の併用療法の報告の少なさにつながった可能性がある。
【００６４】
TCR非活性化を媒介する、SHP1/2およびTC-PTPなどのホスファターゼの阻害は持続性のCAR Tシグナル伝達をブロックする潜在的な手法である。SHP1/2ホスファターゼはPD-1および他の消耗マーカーからのシグナルの媒介を担っている。データから、SHP1/2ホスファターゼインヒビターまたはサイレンシングがT細胞およびCAR T細胞の活性を増大できることが分かっている6-9。TC-PTPはT細胞活性シグナル伝達において重要なプレーヤーであることが分かっている。T細胞特異的TC-PTP欠損があるマウスは、抗原によるT細胞活性化が増大しているため炎症および自己免疫に対する感受性が高い。TC-PTPは、TCRの下流にあるSrcファミリーキナーゼを不活性化し、それによってTCR活性化の閾値に寄与する11。これらのホスファターゼのノックアウト実験および低分子インヒビターはTCR閾値の低下とT細胞活性の増大に対して強力な作用を示したが、これらはいずれもCAR T療法に用いられたことがない。代表的なSHP1/2インヒビターは、
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の構造を有する。
【００６５】
T細胞を若返らせる別のアプローチは、抗原非依存性の自然免疫受容体に結合することによってT細胞の活性を増強するアプローチである。toll様受容体(TLR)を含む、ある特定の病原体パターン認識(PPR)受容体が、T細胞を含む非骨髄系細胞集団上で発現しており、同じように活性化できることが知られている。研究から、TLR7/8アゴニストとTCRシグナル伝達を共刺激することでCD8 T細胞が活性化し、INFγ分泌が増大することも分かっている13。しかしながら、TLRアゴニストの全身投与には強い副作用があるために、これらのアゴニストはいずれも、T細胞を再活性化するために、または免疫抑制微小環境を変えるためにCAR T療法において用いられたことがない。癌免疫療法のためのTLRアゴニストの使用はまた、腫瘍細胞に対するTLRアゴニストの議論の余地がある作用でも妨害される。従って、潜在的なペイロードをCAR T細胞に標的送達することが極めて望ましい。強力なTLR7アゴニストが文献において発見された(図7A)。これは、FDAにより承認されたイミキモドより約40倍強い。
【００６６】
インビトロスクリーニングモデルを組み立てるために、図6に示したように、抗CD19 CAR T細胞を4回のCD19陽性Raji細胞添加に曝露した。抗CD19 CAR T細胞は、インビトロ共培養モデルにおいて溶解活性が徐々に減少し、共抑制マーカーが増加したことで示されたように消耗状態になった。培養培地がCAR T消耗の導入に重要であり、全プロセスの間に新たに補充することも交換することもなく同一に保つ必要があることは注目に値する。このことから、このプロセスでは、癌細胞および/またはCAR T細胞によって培地に放出された可溶性成分(最も可能性が高いのは、免疫抑制サイトカインおよびモジュレーター(アデノシンなど))が中心的な役割を果たすことが分かる。このことから、このインビトロモデルによって作製されたCAR T細胞の消耗は、不可逆的ではなく、適応性のある状態にあることも示唆される。
【００６７】
好ましいTLR7アゴニストと、(TC-PTPと極めて相同な26)PTP1bインヒビター27を、既に消耗しているCAR T細胞で処理すると、未処理群と比較してCAR T細胞を再活性化できることが示された(図7)。しかしながら、Tim3を除く共抑制マーカーの発現レベルにおいて有意な変化は観察されなかった。図7Cに示したように、PTP1bインヒビターは、概して、TLR7アゴニストほど強い再活性化作用を示さない。理論に拘束されるものではないが、この結果は、消耗の「阻止(prevention)」ではなく「逆転(reversion)」が研究され、ホスファターゼが消耗した状態で既に「抑制(silenced)」されており、従って、その阻害が全く影響を及ぼさないか、ほとんど影響を及ぼさない現行のインビトロスクリーニングモデルが原因であるかもしれない。将来の研究のための改良されたスクリーニングモデルでは、前培養の開始時に薬物を添加し、設定の残りを同一に保つことによって消耗の「阻止」に焦点を合わせて、ホスファターゼインヒビターおよび他の薬物の作用を試験するだろう。このように、ホスファターゼを阻害することによって、機能的な死滅作用を保ちながらCAR Tの持続性シグナル伝達を弱めることができるかどうか見ることができる可能性がある。本発明者らは、主に、以下の研究のためにTLR7アゴニストに焦点を合わせる。
【００６８】
TLR7はエンドソーム内にある4つのTLRファミリーメンバーの1つであるので、TLR7アゴニストと、本発明者らの秘密経路標的リガンドとの間にある遊離不可能なリンカーが、そのTLR7アゴニスト機能を保存すると推測される28。これを実現する目的で、連結に適した誘導体化部位を発見するために、いくつかのTLR7アゴニスト類似体を調製および試験した。図8に示したように、ピペリジン環にCH2OH延長があるTLR7アゴニストは親薬物と比較してかなり高い活性がある。従って、この誘導体部位は遊離不可能な結合体に用いられる。ジスルフィド結合によって連結された自己犠牲(self-immolative)型も合成された。このTLR7アゴニストがそれ自身の標的に到達するのに必要な距離を理解するために、遊離不可能なFITC-TLR7のために、FITCとTLR7アゴニストとの間に3つの異なる長さのリンカー(PEG3、6、16)を作製した。図9Cに示したように、これらの遊離不可能型は全てある程度の効果があったが、PEG6化合物が最も良い用量依存的応答を示した。これらの結果から、TLR7アゴニストは、FITC-FRと結合しながら到達するか、またはTLRとFITC-FRとの間でジャンプすることでTLR7とドッキングし得ることが分かる。これらの条件下で、中間のリンカーの長さは決定要因でない(図9D〜E)。遊離不可能なFITC-TLR7はエンドソーム内に閉じ込められ、各エンドソームの体積はサイトゾルよりかなり少ないので、エンドソーム内TLR7は、非常に素早く、かつ迅速に機能的濃度に達することができ、その結果、IC50が小さくなる。
【００６９】
実施例8.CAR T細胞の消耗を元に戻す/阻止するための他の潜在的なペイロード
TLR7アゴニスト以外に、以下で説明するように、CAR T細胞の消耗を元に戻す/阻止する可能性がある他のいくつかの潜在的なペイロードがある。標的のいくつかは、今のところ本発明者らの標的化薬物送達アプローチに適したIC50をもつアゴニストもインヒビターも無い場合があるが、依然として注目する価値があり、CRISPRまたは標的化マイクロRNA送達アプローチなどの他の阻害機構によって探求される可能性がある。
【００７０】
・STINGアゴニスト
Simulator of IFN Genes(STING)は、サイトゾルDNAセンシング(sensing)と以下のIFN-β産生に関与するマスターアダプターである。STINGはsdDNAと弱く結合するが、cGMP-AMP合成酵素(sGAS)によって合成された内因性サイクリックジヌクレオチドGMP-AMP(cGAMP)に強く結合する。これは主にマクロファージ、T細胞、様々なDC、内皮細胞、ならびに選ばれた線維芽細胞および上皮細胞において発現している。STINGの試験は主にマクロファージおよび樹状細胞における機能に焦点を合わせており、最近、いくつかのグループがT細胞におけるSTING活性化の直接的な効果を認めた40。STINGアゴニストはT細胞に対して同様の炎症促進効果を有する可能性がある。ADU-S100は、診療所において探求されてきた多くのSTINGアゴニストの1つである。
【００７１】
・DGK-αインヒビター
ジアシルグリセロールキナーゼ-α(DGK-α)は、IP3と一緒になって、TCRシグナル伝達のセカンドメッセンジャーであるジアシルグリセロール(DAG)をホスファチジン酸(PA)に変換する。DGKはCD8-NILよりもCD8TILにおいて高発現しており、DGKを阻害するとERKリン酸化と溶解性脱顆粒が促進される41。これはまた、インビボから単離されたCAR TILの溶解機能も回復させる5。一部のDGKインヒビター構造は以下の通りである。
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【００７２】
・TGFβRI(ALK5)インヒビター
TGFβは、T細胞、B細胞、およびマクロファージなどの多くの免疫細胞において免疫抑制機能があることで知られている。T細胞においてTGFβI型受容体(TGFβRI。ALK5とも知られる)を遮断すると腫瘍の免疫抑制環境が元に戻る42。低分子インヒビターが探求されており、ガルニセルチブ(LY2157299一水和物)およびEW-7197が診療所において試験されている43-44。
【００７３】
TGFβインヒビター構造は以下の通りである。
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【００７４】
・EZH2インヒビター
zesteホモログ2エンハンサー(Enhancer of Zeste Homolog 2)(EZH2)は、Treg機能と強い相関関係(correv)があるヒストンH3K27メチルトランスフェラーゼである。EZH2の遺伝子破壊または薬理学的破壊によって腫瘍浸潤性Tregの炎症誘発機能が得られた45。慢性ウイルス感染における消耗したCTLはまた、ユニークなエピジェネティック変化でも特徴付けられるので174、EZH2インヒビターはこの消耗状態を逆転できる可能性がある。CPI1205、EPZ6438、およびGSK126を含む、EZH2インヒビターのいくつかの低分子が開発されている。
【００７５】
従って、FITC-FR融合受容体と、対応するFITC標的化免疫アゴニストペイロードは、固形腫瘍におけるCAR T細胞のホーミングと存続をモニタリングおよび制御するためのユニバーサルなプラットフォームを提供する。FITC-FR融合受容体がCAR構築物とは独立して発現されるので、このアプローチは、任意の抗原に対するCAR T細胞に容易に取り入れることができる。標的リガンド-ペイロード結合体のモジュール設計により切り換えと改良も容易である。このアプローチは細胞療法と低分子ベースの標的化薬物送達の利益を組み合わせており、操作された細胞と、対応するリガンドの両方を余分に特徴付けすることを必要とする場合がある。
【００７６】
固形腫瘍においてCAR T細胞が成功するには、ほぼ間違いなく、微小環境内にある他のプレーヤーを標的とする複数のアプローチ、例えば、PI3Kキナーゼインヒビターによる細胞外マトリックスの分解、抗炎症性M2マクロファージから炎症誘発性M1表現型へのリプログラミング、および癌細胞上で減少したMHC分子レベルのアップレギュレーションを組み合わせることも必要である。従って、ますます多くの併用療法試験が前臨床および臨床で行われる。しかしながら、同時に、CAR T細胞そのものの注意深い検査と管理は疎かにできず、ヒトに到達する前に、最初に、前臨床研究において、FITC-FR融合受容体のような簡単だがロバストなシステムを用いることで最適化しなければならない。
【００７７】
参考文献:
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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