(57)【要約】本発明は、配列番号１と５３の間の染色体１１のＱＴＬを含む、ＴＢＲＦＶに抵抗性であるソラヌム・リコペルシクム植物に関する。染色体１１の前記ＱＴＬの存在は、配列番号４−５２を含む群から選択される少なくとも１のマーカーの使用により同定される。前記ＱＴＬは受託番号ＮＣＩＭＢ４２８８２、ＮＣＩＭＢ４２８８５、ＮＣＩＭＢ４２８８７、またはＮＣＩＭＢ４２８９０でＮＣＩＭＢで寄託されたソラヌム・リコペルシクム植物の代表的な種子のゲノム中に含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＢＲＦＶに抵抗性であるソラヌム・リコペルシクム植物であって、前記植物は染色体１１のＱＴＬを含み、ここで染色体１１のＱＴＬは配列番号１と配列番号５３の間に位置する、植物。
【請求項２】
染色体１１の前記ＱＴＬの存在が、配列番号４−５２を含む群から選択される少なくとも１のマーカーの使用により同定される、請求項１に記載のソラヌム・リコペルシクム植物。
【請求項３】
ＱＴＬが受託番号ＮＣＩＭＢ４２８８２、ＮＣＩＭＢ４２８８５、ＮＣＩＭＢ４２８８７、またはＮＣＩＭＢ４２８９０でＮＣＩＭＢで寄託されたソラヌム・リコペルシクム植物の代表的な種子のゲノム中の配列番号４および配列番号５２に隣接する、請求項１または２に記載のソラヌム・リコペルシクム植物。
【請求項４】
請求項１−３のいずれかに記載のＴＢＲＦＶ抵抗性ソラヌム・リコペルシクム植物の細胞であって、前記細胞が、そのゲノム中に染色体１１の請求項１−３のいずれかに規定されるＱＴＬを含む、細胞。
【請求項５】
ソラヌム・リコペルシクム種子であって、請求項１−３のいずれかに規定される染色体１１のそのゲノム中のＱＴＬの存在に起因して、前記種子から生長した植物がＴＢＲＦＶに抵抗性である、ソラヌム・リコペルシクム種子。
【請求項６】
請求項１−３のいずれか一項に記載のソラヌム・リコペルシクム植物の生産に適した繁殖材料であって、ここで繁殖材料が有性生殖に適しており、特に小胞子、花粉、子房、胚珠、胚嚢、および卵細胞を含む群から選択される；または栄養繁殖に適しており、特にカッティング（ｃｕｔｔｉｎｇ）、根、茎、細胞、およびプロトプラストを含む群から選択される；または再生可能な細胞の組織培養に適しており、特に葉、花粉、胚、子葉、胚軸、分裂組織細胞、根、根冠、葯、花、種子、および茎を含む群から選択される；ここで、前記繁殖材料から産生された植物が、請求項１−３のいずれかに規定される染色体１１のＴＢＲＦＶ抵抗性をもたらすＱＴＬを含む、繁殖材料。
【請求項７】
配列番号４−５２を含む群から選択される、ソラヌム・リコペルシクム植物におけるＴＢＲＦＶ抵抗性の同定のためのマーカー。
【請求項８】
配列番号４−５２を含む群から選択される、ソラヌム・リコペルシクム植物におけるＴＢＲＦＶ抵抗性をもたらす染色体１１のＱＴＬの同定のためのマーカー。
【請求項９】
ソラヌム・リコペルシクム植物におけるＴＢＲＦＶ抵抗性の同定のための請求項７または８に記載のマーカーの使用。
【請求項１０】
Ｓ．リコペルシクム植物における染色体１１の請求項１−３のいずれかに規定されるＱＴＬを導入する工程を含む、ＴＢＲＦＶ抵抗性ソラヌム・リコペルシクム植物の製造方法。
【請求項１１】
染色体１１の請求項１−３のいずれかに規定されるＱＴＬの存在を同定する工程、およびＴＢＲＦＶ抵抗性植物として前記ＱＴＬを含む植物を選択する工程を含む、ＴＢＲＦＶ抵抗性ソラヌム・リコペルシクム植物を選択する方法。
【請求項１２】
染色体１１の前記ＱＴＬの存在を同定する工程が、配列番号４−５２を含む群から選択されるマーカーを使用して行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＴＢＲＦＶに抵抗性であるソラヌム・リコペルシクム植物の製造方法であって、前記方法が：
ａ）染色体１１のＱＴＬを含む請求項１−３のいずれか一項に記載の植物を別の植物と交配する工程；
ｂ）所望により工程ａ）の交配から得られる植物の１回以上の自家交配および／または交配を実施して、さらなる世代集団を得る工程；
ｃ）工程ａ）の交配から得られる植物から、または工程ｂ）のさらなる世代集団から、ＴＢＲＦＶに対して抵抗性である請求項１−３のいずれかに規定される染色体１１のＱＴＬを含む植物を選択する工程、
を含む、製造方法。
【請求項１４】
染色体１１のＱＴＬを含む植物の選択が前記ＱＴＬに遺伝的に連鎖している分子マーカーを使用して行われ、ここでマーカーが配列番号４−５２を含む群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＴＢＲＦＶに抵抗性である植物が、特にＴＢＲＦＶ抵抗性についてのバイオアッセイを使用することにより表現型的に選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１−３のいずれかに記載の植物がＮＣＩＭＢ受託番号ＮＣＩＭＢ４２８８２、ＮＣＩＭＢ４２８８５、ＮＣＩＭＢ４２８８７、もしくはＮＣＩＭＢ４２８９０で寄託された種子から生長した植物、またはその子孫植物である、請求項１３−１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
第一親植物を第二親植物と交配する工程、および得られるハイブリッド種子を収穫する工程を含むハイブリッド種子の製造方法であって、ここで第一親植物および／または第二親植物が、染色体１１の請求項１−３のいずれかに記載のＱＴＬを含むＴＢＲＦＶに抵抗性である本発明の植物であり、ここで前記ＱＴＬの存在が前記種子から生長するハイブリッド植物におけるＴＢＲＦＶへの抵抗性をもたらす、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トマト褐色しわ果実ウイルス（Ｔｏｍａｔｏ  ｂｒｏｗｎ  ｒｕｇｏｓｅ  ｆｒｕｉｔ  ｖｉｒｕｓ）（ＴＢＲＦＶ）に抵抗性であるトマト（ソラヌム・リコペルシクム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ））植物に関する。本発明はさらに、かかるソラヌム・リコペルシクム植物を生産する方法およびかかる植物の同定および選択のための方法に関する。本発明はまた、トマト褐色しわ果実ウイルス抵抗性ソラヌム・リコペルシクム植物の子孫、種子および果実、ソラヌム・リコペルシクム植物の産生に適した繁殖材料（Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  ｍａｔｅｒｉａｌ）、およびかかるトマト果実またはその部分を含む食品に関する。本発明はさらに、トマト褐色しわ果実ウイルス抵抗性ソラヌム・リコペルシクム植物に由来するか、またはトマト褐色しわ果実ウイルス抵抗性ソラヌム・リコペルシクム植物に再生され得る細胞または組織培養に関する。本発明はまた、トマト褐色しわ果実ウイルス抵抗性ソラヌム・リコペルシクム植物の同定のためのマーカー、およびマーカーの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
トマト作物（ソラヌム・リコペルシクム）を栽培する際に遭遇する問題の一つに、様々なウイルスの発生がある。多くの既知のウイルスに対する抵抗性が確認されており、それらの抵抗性は育種により適切なトマト品種に組み込まれる。これにより、生産中に特定のウイルスが存在する場合でも、生産者は良好な収量を得ることができる。しかしながら、ある場合にはその利用可能な抵抗性を破壊できる新しいウイルスや既知のウイルスの株が定期的に同定される。
【０００３】
２０１５年にトマトの新しいトバモウイルスの発生が発表された（Ｓａｌｅｍｅｔ  ａｌ：  Ａ  ｎｅｗ  ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ  ｔｏｍａｔｏ  ｃｒｏｐｓ  ｉｎ  Ｊｏｒｄａｎ．  Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ．  ２０１６  Ｆｅｂ；  １６１（２）：５０３−６．  Ｅｐｕｂ  ２０１５  Ｎｏｖ  １９）。このウイルスは、既知のトバモウイルスであるタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、トマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）、トマトマイルドモトルウイルス（ＴｏＭＭＶ）に関することが示され、ＴｏＭＭＶとＴｏＭＶの最も近い関連配列については、約８０％から９０％の配列同一性を有することが示された。病徴は、植物上ではやや軽度であったが、ほとんどすべての果実に非常に重度の褐色縮葉病徴が存在した。前記ウイルスは、ＴｏＭＶに対する一般的に使用される抵抗性遺伝子：Ｔｍ−１、Ｔｍ−２、Ｔｍ−２２（Ｔｍ−２ａとしても知られている）の抵抗性を破壊することが観察された。その後の刊行物では、前記ウイルスはイスラエルでも発見されており、前記ウイルスはトウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｕｍ）植物にも感染できることが確立された（Ｌｕｒｉａ  ｅｔ  ａｌ  （２０１７）：  Ａ  ｎｅｗ  Ｉｓｒａｅｌｉ  ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ  ｉｓｏｌａｔｅ  ｉｎｆｅｃｔｓ  ｔｏｍａｔｏ  ｐｌａｎｔｓ  ｈａｒｂｏｒｉｎｇ  Ｔｍ−２２  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｇｅｎｅｓ．  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  １２（１）：ｅ０１７０４２９．  Ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１７０４２９）。病徴は罹患した品種によって異なるようで、場合によっては重度または軽度のモザイク、壊死、葉の歪み、またはその他の病徴の形で主に生長部分に病徴が見られた。前記ウイルスは、既知のトバモウイルスとは明らかに異なっていたため、新しい名称トマト褐色しわ果実ウイルス（ＴＢＲＦＶ）で記載された。
【０００４】
果実への病徴が深刻であるため、果実は基本的に市場に出回ることができずＴＢＲＦＶの存在がトマト生産者に与える影響は非常に大きい。これまでに前記ウイルスに対する抵抗性は確認されていない。前記ウイルスは少なくとも機械的に伝播するため、伝播は容易かつ迅速であり、コントロールは困難である。ウイルスの伝染はまた、感染した種子を介して起こる可能性が高い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、トマト褐色しわ果実ウイルス（ＴＢＲＦＶ）に抵抗性であるソラヌム・リコペルシクム種のトマト植物を提供することである。
【０００６】
新型ＴＢＲＦＶの問題点は、非常に迅速に拡散し、特定の地域でトマトの生産に大きな影響を与えたため、抵抗性トマト植物を得る緊急性が非常に高かった。また、その非常に効果的な伝染により、このウイルスは他の地域にも急速に広がることが予想された。そのため、可能性のある供給源の存在についての見識を得るために、大規模な遺伝資源スクリーニングが組織された。
【０００７】
ソラヌム・リコペルシクムには、病気の抵抗性を有し、かつ育種のための貴重な資源である様々な近縁野生種がある。そのため、最新のトマト品種の多くは、すでに野生種からの１以上の遺伝子移入を保有する。しかしながら、近縁野生種からのトバモウイルス抵抗性遺伝子をすでに持っているものも含む現在栽培されているトマト品種は、この新しいウイルスに感染しやすいようであった。このことは、抵抗性を同定することが容易ではないことを意味していると考えられる。
【０００８】
驚くべきことに、広範なスクリーニングの後、ＴＢＲＦＶに対して非常に高い抵抗性を持つソラヌム・ピンピネリフォリウム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ）種の３つの系統種（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）を同定することができた（実施例１）。続いて、この抵抗性がソラヌム・リコペルシクムに移入され得るどうかを判断し、抵抗性の背後にある遺伝学を同定するための研究プログラムが設定された。
【０００９】
３つのＳ．ピンピネリフォリウム供給源ＧＮＬ．３９１９、ＧＮＬ．３９２０、およびＧＮＬ．３９５１と、一方では内部育種系統と交配を行い、その後、ＱＴＬマッピングのためにＦ２、Ｆ３、および戻し交配集団などの集団形成を行った。すべての世代でバイオアッセイを実施して、様々な集団における抵抗性の確認とモニタリングをし、そして遺伝の決定を行った。分子マーカーを介するＱＴＬの同定および特性解析により、遺伝的に連鎖したマーカーを使用して、前記ＱＴＬの存在、したがって抵抗性の存在を同定する機会が得られ、これは、バイオアッセイの使用よりも明らかにはるかに効率的である。
【００１０】
この目的のために、ＱＴＬマッピング研究を行った。Ｆ２集団に対する第一ＱＴＬマッピングは、３つすべてのＳ．ピンピネリフォリウム供給源に基づいて開発された集団に存在する染色体１１のＱＴＬ領域を同定した。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、トマト褐色しわ果実ウイルス（ＴＢＲＦＶ）に抵抗性であるトマト植物を提供し、前記植物は、染色体１１のＱＴＬを含む。染色体１１のＱＴＬは特にＳ．ピンピネリフォリウム種に由来するかまたは遺伝子移入されたＱＴＬである。
【００１２】
染色体１１のＱＴＬは、配列番号１と配列番号５３の間に位置する。本発明のＱＴＬは優先度の増加順に配列番号４および配列番号５２、配列番号５および配列番号５２、配列番号５および配列番号５１、配列番号４および配列番号３３、配列番号５および配列番号１１、または配列番号６および配列番号１１、または配列番号７および配列番号１１に隣接する。染色体１１の本発明のＱＴＬはもっとも好ましくは配列番号８および配列番号１０に隣接する。本明細書中で使用される「隣接する」は、配列がＱＴＬ領域の境界を示し、したがって、前記ＱＴＬの一部であることを意味する。
【００１３】
染色体１１の本発明の前記ＱＴＬの存在の同定のためのマーカーは、優先度の増加順に配列番号４−５２を含む群から、または配列番号５−５２を含む群から、または配列番号５−５１を含む群から、または配列番号４−３３を含む群から、または配列番号５−１１を含む群から、または配列番号６−１１を含む群から、または配列番号７−１１を含む群から選択される。本発明のＱＴＬの同定のためのマーカーはもっとも好ましくは配列番号８−１０を含む群から選択される。本明細書中で使用されるように、ＱＴＬの同定のためのマーカーは、ＱＴＬに存在する図１の配列により表されるマーカーである。
【００１４】
本発明の前記ＱＴＬの存在の同定のためのさらなるマーカーは本発明の抵抗性植物および感受性のコントロール植物間の任意のほかの多型に基づくことができ、ここで多型は優先度の増加順に配列番号４および配列番号５２の間、または配列番号５および配列番号５２の間、または配列番号５および配列番号５１の間、または配列番号４および配列番号３３の間、または配列番号５および配列番号１１の間、または配列番号６および配列番号１１の間に位置する。本発明の前記ＱＴＬの存在の同定のためのさらなるマーカーはもっとも好ましくは本発明の抵抗性植物および感受性植物間の任意のほかの多型に基づき、ここで多型は配列番号７および配列番号１１の間に位置する（実施例２）。
【００１５】
図１は、トマト植物にＴＢＲＦＶ抵抗性をもたらす染色体１１の本発明の前記ＱＴＬの存在を同定するためにマーカーとして使用され得るか、またはマーカーを開発するために使用され得る配列番号の配列を示す。表３は、マーカースコア、すなわちＱＴＬの存在、したがって抵抗性植物を同定する配列のヌクレオチド並びに図１の配列のＳＮＰの位置を示す。マーカーの配列が例えば、Ｓ．リコペルシクムの公表されているゲノム参照配列のバージョンＳＬ３＿００上に位置する場合、前記マーカー配列中のＳＮＰ多型が対応する前記物理的位置が由来し得る。この位置はまた、表３に示される。公開されているＳ．リコペルシクムゲノム参照配列のバージョンＳＬ３＿００は例えば、ソルゲノミクスウェブサイト（ｓｏｌｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｎｅｔ）でアクセスでき、本明細書中で使用される「公開トマトゲノム」の参照である。前記ＱＴＬの前記位置および本発明のマーカーは公開されたマップに由来でき、かつこれらの位置は物理的位置に相対的である。
【００１６】
マーカーの存在の同定は特に、ＳＮＰの位置の野生型ヌクレオチドと比較して前記配列番号を決定する配列のいずれかに存在するような前記抵抗性を示すＳＮＰの位置のヌクレオチドの存在を同定することにより行われ；遺伝的に連鎖され、そのため抵抗性を示すＳＮＰｓの位置およびヌクレオチドは表３に示される。野生型ヌクレオチドは公開ゲノムにおけるその位置に存在するヌクレオチドである。
【００１７】
本明細書中で使用されるトマト植物はソラヌム・リコペルシクム種の植物である。
【００１８】
本明細書中で使用されるように、トマト褐色しわ果実ウイルスへの抵抗性は、Ｓａｌｅｍ  ｅｔ  ａｌ（２０１６、ｓｕｐｒａ）に記載されるウイルスへの抵抗性であり、ここで前記ウイルスはＮＣＢＩ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ１７６１４７７が割り当てられている。
【００１９】
本明細書中で使用されるように、本発明のＱＴＬを含む植物と前記ＱＴＬを欠く植物を交配して得られる分離集団において前記マーカーと前記ＴＢＲＦＶ抵抗性が共分離である場合、マーカーは遺伝的に連鎖しており、したがって、本発明のＱＴＬの同定のために使用され得る。
【００２０】
本発明のＴＢＲＦＶ抵抗性は、中間的に遺伝する。本明細書中で使用されるように、中間的とは、本発明のＱＴＬがホモ接合的に存在する場合、本発明のＱＴＬがヘテロ接合的に存在する場合よりも高いレベルのＴＢＲＦＶ抵抗性を与えることを意味する。しかしながら本発明のＱＴＬのヘテロ接合的な存在であっても、抵抗性として定義され得るＴＢＲＦＶ抵抗性の一定のレベルを付与する。ホモ接合およびヘテロ接合の植物の両方のＴＢＲＦＶ抵抗性はＴＢＲＦＶが存在する条件下での前記植物の栽培をより適したものにする。したがって抵抗性の両方のレベルは改良された農学的特性であると考えられる。最も高いレベルの抵抗性は前記ＱＴＬがホモ接合的に存在する場合に得られる。
【００２１】
ＴＢＲＦＶ抵抗性の存在はバイオアッセイ、例えば、当業者に知られ、かつ例えばＬｕｒｉａ  ｅｔ  ａｌ（２０１７、ｓｕｐｒａ）に記載されるトバモウイルスについての標準的な樹液−機械的播種技術（ｓａｐ−ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を使用するバイオアッセイを介して決定され得る。若いトマト植物での病徴の観察は播種後約１２−１８日（ｄａｉ）で行うことができる。
【００２２】
ＴＢＲＦＶ抵抗性は、ＴＢＲＦＶ感受性として知られるコントロール品種との比較により決定される。コントロールとして使用され得るＴＢＲＦＶ感受性トマト品種の例は、Ｃａｎｄｅｌａ  Ｆ１およびＲａｚｙｍｏ  Ｆ１である。本発明が行われる前にはＴＢＲＦＶに抵抗性であると知られたトマト品種はなかったため、本発明前に抵抗性コントロールを含めることはできなかった。抵抗性は好適には０−４のスケールでスコア化され；スコアのスケールは表１で示される。
表１：スケール  ＴＢＲＦＶ抵抗性スコア
【表１】
2021505165.tif 000002
【００２３】
本明細書中で使用されるように、ＱＴＬがホモ接合的に存在するＴＢＲＦＶ抵抗性トマト植物は表１に従うスコアリングが使用される場合、０または１のスコア、または最大でも２より小さいスコアを有する。抵抗性植物は３より小さいスコアを有する。
【００２４】
ＴＢＲＦＶ抵抗性をもたらす本発明のＱＴＬを有するＳ．リコペルシクム植物はＮＣＩＭＢ４２８８２、ＮＣＩＭＢ４２８８５、ＮＣＩＭＢ４２８８７、またはＮＣＩＭＢ４２８９０として寄託された種子から生長し得る。ＮＣＩＭＢ４２８８２は、ＧＮＬ．３９５１から開発した。ＮＣＩＭＢ４２８８５は、ＧＢＮ．３９２０から開発した。ＮＣＩＭＢ４２８８７およびＮＣＩＭＢ４２８９０は、ＧＮＬ．３９１９から開発した。
【００２５】
ＮＣＩＭＢ４２８８２は本発明のＴＢＲＦＶ抵抗性を有し、かつ優先度の増加順に配列番号１と５３の間、または配列番号４および配列番号５２の間、または配列番号５および配列番号５２の間、または配列番号５および配列番号５１の間、または配列番号４および配列番号３３の間、または配列番号５および配列番号１１の間、または配列番号６および配列番号１１の間に位置する染色体１１の本発明のＱＴＬを含む。ＮＣＩＭＢ４２８８２における本発明のＱＴＬはもっとも好ましくは配列番号７および配列番号１１の間に位置する。前記ＱＴＬはホモ接合形態で寄託物ＮＣＩＭＢ４２８８２に存在する。
【００２６】
ＮＣＩＭＢ４２８８５は本発明のＴＢＲＦＶ抵抗性を有し、かつ優先度の増加順に配列番号１と５３の間、または配列番号４および配列番号５２の間、または配列番号５および配列番号５２の間、または配列番号５および配列番号５１の間、または配列番号４および配列番号３３の間、または配列番号５および配列番号１１の間、または配列番号６および配列番号１１の間に位置する染色体１１の本発明のＱＴＬを含む。ＮＣＩＭＢ４２８８５における本発明のＱＴＬはもっとも好ましくは配列番号７および配列番号１１の間に位置する。前記ＱＴＬはホモ接合形態で寄託物ＮＣＩＭＢ４２８８５に存在する。
【００２７】
ＮＣＩＭＢ４２８８７は本発明のＴＢＲＦＶ抵抗性を有し、かつ優先度の増加順に配列番号１と５３の間、または配列番号４および配列番号５２の間、または配列番号５および配列番号５２の間、または配列番号５および配列番号５１の間、または配列番号４および配列番号３３の間、または配列番号５および配列番号１１の間、または配列番号６および配列番号１１の間に位置する染色体１１の本発明のＱＴＬを含む。ＮＣＩＭＢ４２８８７における本発明のＱＴＬはもっとも好ましくは配列番号７および配列番号１１の間に位置する。前記ＱＴＬはホモ接合形態で寄託物ＮＣＩＭＢ４２８８７に存在する。
【００２８】
ＮＣＩＭＢ４２８９０は本発明のＴＢＲＦＶ抵抗性を有し、かつ優先度の増加順に配列番号１と５３の間、または配列番号４および配列番号５２の間、または配列番号５および配列番号５２の間、または配列番号５および配列番号５１の間、または配列番号４および配列番号３３の間、または配列番号５および配列番号１１の間、または配列番号６および配列番号１１の間に位置する染色体１１の本発明のＱＴＬを含む。ＮＣＩＭＢ４２８９０における本発明のＱＴＬはもっとも好ましくは配列番号７および配列番号１１の間に位置する。前記ＱＴＬはホモ接合形態で寄託物ＮＣＩＭＢ４２８９０に存在する。
【００２９】
染色体１１の本発明のＱＴＬを含む植物はＴＢＲＦＶバイオアッセイにおける抵抗性コントロール品種として使用され得る。評価されるべき植物、系統、または集団が、バイオアッセイにおいてＮＣＩＭＢ４２８８２、ＮＣＩＭＢ４２８８５、ＮＣＩＭＢ４２８８７、またはＮＣＩＭＢ４２８９０と同じレベルの抵抗性を示し、かつこの植物、系統または集団が染色体１１の本明細書中に記載されるＱＴＬを含む場合、この植物、系統、または集団は本発明のＴＢＲＦＶ抵抗性を有すると考えられ、したがって本発明の植物である。
【００３０】
本発明の植物は所望により、植物を商業的栽培に適したものとする改良された農学的特性を有する栽培されたＳ．リコペルシクム植物である。本発明はまた、本発明の植物から収穫されたトマト果実に関し、ここでトマト果実は、前記植物におけるＴＢＲＦＶ抵抗性をもたらす本発明のＱＴＬをそのゲノム中に含む。このトマト果実はまた、本明細書中で「本発明の果実」または「本発明のトマト果実」とも呼ばれる。本明細書中で使用される「トマト果実」は、ソラヌム・リコペルシクム種の植物により産生される果実を含む。
【００３１】
本発明は、染色体１１のＱＴＬを提供し、ここで、ＱＴＬは優先度の増加順に配列番号４−５２を含む群から、または配列番号５−５２を含む群から、または配列番号５−５１を含む群から、または配列番号４−３３を含む群から、または配列番号５−１１を含む群から、または配列番号６−１１を含む群から、または配列番号７−１１を含む群から選択される少なくとも１のマーカーに遺伝的に連鎖しており、ここでＳ．リコペルシクム植物における前記ＱＴＬの存在がＴＢＲＦＶ抵抗性をもたらす。本発明のＱＴＬはもっとも好ましくは配列番号８−１０を含む群から選択される少なくとも１のマーカーに遺伝的に連鎖している。
【００３２】
本発明は、染色体１１のＱＴＬを導入する工程を含むＴＢＲＦＶ抵抗性Ｓ．リコペルシクム植物を生産する方法に関し、ここで前記ＱＴＬ領域は優先度の増加順にＳ．リコペルシクム植物において、配列番号４および配列番号５２に隣接する、または配列番号５および配列番号５２に隣接する、または配列番号５および配列番号５１に隣接する、または配列番号４および配列番号３３に隣接する、または配列番号５および配列番号１１に隣接する、または配列番号６および配列番号１１に隣接する、または配列番号７および配列番号１１に隣接する。もっとも好ましくは、導入される前記ＱＴＬは配列番号８および配列番号１０に隣接する。
【００３３】
本発明のＱＴＬは、植物が性的に適合する場合に交配および選択などの一般的に使用される育種技術により前記ＱＴＬを含む別の植物から導入され得る。かかる導入は通常容易に交配がされ得る同種の植物から、または近縁種の植物からである。交配の困難性は、胚救出などの当該技術で知られている技術により克服でき、またはシスジェネシスが適用できる。好適には、本明細書中に記載されるマーカーは別の植物への前記ＱＴＬの組み込みを追跡するために使用される。
【００３４】
上記方法は特に、かかる遺伝情報の組み込みに適した植物種に本発明のＱＴＬを導入するために使用され得る。特定の実施形態では、前記ＱＴＬは例えば、標準的な育種方法を使用して前記ＱＴＬを含むソラヌム・ピンピネリフォリウム植物から前記ＱＴＬを欠くソラヌム・リコペルシクム植物に導入され得る。別の実施形態では、前記ＱＴＬは、標準的な育種方法を使用して前記ＱＴＬを含むソラヌム・リコペルシクム植物から前記ＱＴＬを欠くソラヌム・リコペルシクム植物に導入され得る。
【００３５】
染色体１１のＱＴＬは、受託番号ＮＣＩＭＢ４２８８２、ＮＣＩＭＢ４２８８５、ＮＣＩＭＢ４２８８７、またはＮＣＩＭＢ４２８９０でＮＣＩＭＢで寄託されたソラヌム・リコペルシクム植物の代表的な種子から、またはＮＣＩＭＢ４２８８２、ＮＣＩＭＢ４２８８５、ＮＣＩＭＢ４２８８７、またはＮＣＩＭＢ４２８９０の寄託された種子から、またはそれらの性的または栄養的子孫から導入され得る。ソラヌム・リコペルシクムにおける染色体１１のＱＴＬの導入はＴＢＲＦＶ抵抗性をもたらす。
【００３６】
あるいは、本発明のＱＴＬは、例えばトランスジェニックアプローチを使用することにより、別の、性的に適合しない植物から移入または導入できる。好適に使用され得る技術は、アグロバクテリウム媒介トランスフォーメーション方法の使用などの当業者に知られた一般的な植物トランスフォーメーション技術を含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用などのゲノム編集法はまた、本発明の植物を得るために利用されてもよい。
【００３７】
本発明はホモ接合またはヘテロ接合のいずれかでＴＢＲＦＶ抵抗性をもたらす本発明のＱＴＬを含む本発明の植物にさらに関し、ここで前記植物は近交系統、ハイブリッド、二倍体ハプロイドの植物、または分離集団の植物である。好ましくは、本発明の植物は非トランスジェニック植物である。
【００３８】
本発明はまた、染色体１１の本発明のＱＴＬを含むソラヌム・リコペルシクム種子に関し、ここで前記種子から生長した植物はＴＢＲＦＶに抵抗性である本発明の植物である。本発明はまた、本発明の植物により産生された種子に関し、ここで前記種子は本発明のＱＴＬを有し、したがって、前記種子から生長した植物は本発明の植物である。
【００３９】
さらに、本発明はまた、本発明のトマト果実またはその部分を含む食品または加工食品に関する。前記食品は１以上の加工工程を受けていてもよい。かかる加工工程は以下の処置のいずれかまたはそれらの組合せを含むがこれらに限定されなくてもよい：皮むき（ｐｅｅｌｉｎｇ）、切断（ｃｕｔｔｉｎｇ）、洗浄、搾汁（ｊｕｉｃｉｎｇ）、調理（ｃｏｏｋｉｎｇ）、冷却または本発明の果実を含むサラダ混合物。得られた加工された形態も本発明の一部である。
【００４０】
本発明はまた、本発明のソラヌム・リコペルシクム植物を産生するのに適した繁殖材料に関し、ここで、繁殖材料は有性生殖に適しており、かつ特に小胞子、花粉、子房、胚珠、胚嚢、および卵細胞から選択される；または栄養繁殖に適しており、かつ特にカッティング（ｃｕｔｔｉｎｇ）、根、茎、細胞、プロトプラストから選択される；または再生可能な細胞の組織培養に適しており、かつ特に葉、花粉、胚、子葉、胚軸、分裂組織細胞、根、根冠、葯、花、種子、および茎から選択される；ここで、前記繁殖材料から産生された植物は、ＴＢＲＦＶ抵抗性を付与する本明細書中で規定される染色体１１の本発明のＱＴＬを含む。本発明の植物は前記繁殖材料の供給源として使用されてもよい。
【００４１】
本発明はさらに、本明細書中で規定される本発明のＱＴＬを含む細胞に関する。本発明の細胞は本発明の植物から得ることができ、または本発明の植物中に存在することができる。かかる細胞は単離形態、または完全な植物の一部もしくはそれらの部分のいずれかであってもよく、かかる細胞は、栽培されたＳ．リコペルシクム植物のＴＢＲＦＶ抵抗性をもたらす本明細書中に記載されるＱＴＬを決定する遺伝情報を含むので、それでなお本発明の細胞を構成する。本発明の植物の各細胞は、ＴＢＲＦＶ抵抗性をもたらす遺伝情報を保有する。本発明の細胞は本発明の新たな植物に再生できる再生可能な細胞であってもよい。この文脈における遺伝情報の存在は、染色体１１の本発明の前記ＱＴＬの存在であり、ここで前記ＱＴＬは本明細書中で規定される。
【００４２】
本発明はさらに、本明細書中で規定される染色体１１の本発明のＱＴＬを含む本発明の植物の植物組織に関する。前記組織は、未分化組織または既に分化した組織であり得る。未分化組織は例えば、茎の先端、葯、花弁、花粉であり、そしてマイクロプロパゲーションにおいて使用され、本発明の新たな植物に生長する新たな小植物を得ることができる。前記組織はまた、本発明の細胞から生長できる。
【００４３】
本発明は、本発明の植物、細胞、組織、または種子の子孫にさらに関し、ここで子孫は本明細書中で規定される染色体１１の本発明のＱＴＬを含み、ＱＴＬの存在、好ましくはホモ接合形態の存在がＴＢＲＦＶ抵抗性をもたらす。かかる子孫はそれ自体で、植物、カッティング（ｃｕｔｔｉｎｇ）、種子、細胞、または組織であり得る。
【００４４】
本明細書中で使用されるように「子孫」（ｐｒｏｇｅｎｙ）は本発明の植物との交配からの第一およびすべてのさらなる子孫（ｄｅｓｃｅｎｄａｎｔ）を意味することが企図され、ここで交配はそれ自体との交配または別の植物との交配を含み、ここで子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）であると決定される子孫（ｄｅｓｃｅｎｄａｎｔ）は、ＴＢＲＦＶへの抵抗性をもたらす本明細書中で規定される染色体１１の本発明のＱＴＬを含む。この交配において使用される本発明の植物は所望により寄託物ＮＣＩＭＢ４２８８２、ＮＣＩＭＢ４２８８５、ＮＣＩＭＢ４２８８７、ＮＣＩＭＢ４２８９０、またはそれらの子孫種子の植物であって、１以上の後続の世代について寄託された種子から生長した植物を、それ自身とまたは別の植物と交配することを介する直系またはさらなる子孫（ｄｅｓｃｅｎｄａｎｔ）である。
【００４５】
「子孫」はまた、染色体１１の本発明のＱＴＬを保有し、かつＴＢＲＦＶに抵抗性であるＳ．リコペルシクム植物を包含し、栄養繁殖または別の形態の繁殖により別の植物、または本発明の植物の子孫から得られる。
【００４６】
本発明はさらに、有性生殖に適している本発明のＳ．リコペルシクム植物の一部に関し、植物部分は、染色体１１の本発明のＱＴＬを含み、ここでＱＴＬは本明細書中で規定される。かかる部分は例えば、小胞子、花粉、子房、胚珠、胚嚢、および卵細胞を含む群から選択される。
【００４７】
さらに、本発明は、栄養繁殖に適している本発明のＳ．リコペルシクム植物の一部に関し、特に染色体１１の本発明のＱＴＬを含むカッティング（ｃｕｔｔｉｎｇ）、根、茎、細胞、またはプロトプラストであり、ここでＱＴＬは本明細書中で規定される。上述のような植物の一部は繁殖材料と考えられる。繁殖材料から産生される前記植物は、本明細書中で規定される染色体１１の本発明のＱＴＬを含み、ＱＴＬの存在はＴＢＲＦＶ抵抗性をもたらす。
【００４８】
本発明はさらに、繁殖材料でもあり、かつそのゲノム中に染色体１１の本発明のＱＴＬを含む、本発明の植物の組織培養に関し、ここでＱＴＬは本明細書中で規定される。前記組織培養は、再生可能な細胞を含む。かかる組織培養は前記植物の任意の部分、特に葉、花粉、胚、子葉、胚軸、分裂組織細胞、根、根冠、葯、花、種子、または茎から選択されまたは由来することができる。前記組織培養は本明細書中で規定される染色体１１の本発明のＱＴＬを含むＳ．リコペルシクム植物に再生でき、ここで前記再生されたＳ．リコペルシクム植物はＴＢＲＦＶ抵抗性をあらわし、そして発明の部分でもある。
【００４９】
本発明はさらに植物育種における本発明の植物の使用に関する。したがって、本発明はまた、ＴＢＲＦＶに抵抗性である栽培されたＳ．リコペルシクム植物の開発についての育種方法に関し、ここで本明細書中で規定される染色体１１の本発明のＱＴＬを含む植物は別の植物への抵抗性を付与するために使用される。ＴＢＲＦＶ抵抗性を有する別の植物を開発するために植物育種において使用され得る植物について代表的な種子は、受託番号ＮＣＩＭＢ４２８８２、ＮＣＩＭＢ４２８８５、ＮＣＩＭＢ４２８８７、およびＮＣＩＭＢ４２８９０でＮＣＩＭＢで寄託された。
【００５０】
本発明はまた、ＴＢＲＦＶへの抵抗性を有するソラヌム・リコペルシクム植物の開発のための本明細書中で規定される染色体１１の本発明のＱＴＬの使用に関する。
【００５１】
本発明はまた、ソラヌム・リコペルシクム植物におけるＴＢＲＦＶ抵抗性の同定のためのマーカーに関し、マーカーは染色体１１のＱＴＬの同定について優先度の増加順に配列番号４−５２を含む群から、または配列番号５−５２を含む群から、または配列番号５−５１を含む群から、または配列番号４−３３を含む群から、または配列番号５−１１を含む群から、または配列番号６−１１を含む群から、または配列番号７−１１を含む群から選択される。本発明のＱＴＬの同定のためのマーカーはもっとも好ましくは配列番号８−１０を含む群から選択される。上記で規定される領域のいずれかにおける多型に基づいて開発される任意のほかのマーカーも本発明の一部である。
【００５２】
ソラヌム・リコペルシクム植物におけるＴＢＲＦＶ抵抗性の同定のための、配列番号４−５２を含む群から、または配列番号５−５２を含む群から、または配列番号５−５１を含む群から、または配列番号４−３３を含む群から、または配列番号５−１１を含む群から、または配列番号６−１１を含む群から、または配列番号７−１１を含む群から、またはもっとも好ましくは配列番号８−１０を含む群からのマーカーのいずれかの使用も本発明の一部である。これらのマーカーのいずれかはまた、配列番号間の領域における任意の他の多型を決定することによってＴＢＲＦＶ抵抗性をもたらす染色体１１のＱＴＬの同定のための他のマーカーを開発するために使用され得、使用も本発明の一部である。
【００５３】
本発明はまた、染色体１１の本発明の前記ＱＴＬの存在を同定する工程を含むＴＢＲＦＶ抵抗性ソラヌム・リコペルシクム植物を選択する方法およびＴＢＲＦＶ抵抗性植物として前記ＱＴＬを含む植物を選択する方法に関する。
【００５４】
染色体１１の前記ＱＴＬの存在の同定は、配列番号４−５２を含む群から、または配列番号５−５２を含む群から、または配列番号５−５１を含む群から、または配列番号４−３３を含む群から、または配列番号５−１１を含む群から、または配列番号６−１１を含む群から、または配列番号７−１１を含む群から、またはもっとも好ましくは配列番号８−１０を含む群から選択されるマーカーを使用して好適には行われる。
【００５５】
本発明はまた、ＴＢＲＦＶ抵抗性を付与する染色体１１の本発明のＱＴＬのそのゲノム中の存在についてソラヌム・リコペルシクム植物を試験する方法であって、ソラヌム・リコペルシクム植物のゲノム中の配列番号４−５２を含む群から、または配列番号５−５２を含む群から、または配列番号５−５１を含む群から、または配列番号４−３３を含む群から、または配列番号５−１１を含む群から、または配列番号６−１１を含む群から、または配列番号７−１１を含む群から、またはもっとも好ましくは配列番号８−１０を含む群からなる群から選択されるマーカー配列の存在を検出する工程を含む、方法に関する。
【００５６】
ＴＢＲＦＶ抵抗性を付与する染色体１１の本発明のＱＴＬのそのゲノム中の存在についてソラヌム・リコペルシクム植物を試験する方法は、所望によりＴＢＲＦＶ抵抗性植物として前記ＱＴＬを含むソラヌム・リコペルシクム植物を選択する工程をさらに含む。
【００５７】
本発明はまた、ＴＢＲＦＶに抵抗性であるソラヌム・リコペルシクム植物の生産方法に関し、前記方法は以下：
ａ）    染色体１１の本発明のＱＴＬを含む本発明の植物を別の植物と交配する工程；
ｂ）    所望により交配から得られる植物の１回以上の自家交配および／または交配を実施してさらなる世代集団を得る工程；
ｃ）    交配から得られる植物、またはさらなる世代集団から、本明細書中で規定される染色体１１のＱＴＬを含む植物であって、ＴＢＲＦＶに対して抵抗性である植物を選択する工程、
を含む。
【００５８】
染色体１１のＱＴＬを含む植物の選択は好適には前記ＱＴＬに遺伝的に連鎖している分子マーカーを使用することにより行われ、染色体１１のＱＴＬの同定についてマーカーが配列番号４−５２を含む群から、または配列番号５−５２を含む群から、または配列番号５−５１を含む群から、または配列番号４−３３を含む群から、または配列番号５−１１を含む群から、または配列番号６−１１を含む群から、または配列番号７−１１を含む群から、またはもっとも好ましくは配列番号８−１０を含む群から選択される。前記植物は代替的には、または追加的には、ＴＢＲＦＶへの抵抗性を有することについて、特にＴＢＲＦＶ抵抗性についてバイオアッセイを実施することにより、表現型的に選択され得る。
【００５９】
本発明の一実施形態では、ＴＢＲＦＶに対して抵抗性であるソラヌム・リコペルシクム植物の生産方法において使用される本発明の植物は、ＮＣＩＭＢ受託番号ＮＣＩＭＢ４２８８２、ＮＣＩＭＢ４２８８５、ＮＣＩＭＢ４２８８７、またはＮＣＩＭＢ４２８９０で寄託された種子から生長した植物、または１以上の後続の世代について前記寄託された種子から生長した植物をそれ自身とまたは別の植物と交配することによる直系またはさらなる子孫（ｄｅｓｃｅｎｄａｎｔ）であるその子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）植物である。
【００６０】
本発明はさらにＴＢＲＦＶ抵抗性を含むソラヌム・リコペルシクム植物に別の所望の形質を導入する方法であって、以下：
ａ）    染色体１１のＱＴＬを含む本発明のソラヌム・リコペルシクム植物を、前記他の所望の形質を含む第二ソラヌム・リコペルシクム植物と交配してＦ１子孫を産生する工程；
ｂ）    所望によりＴＢＲＦＶ抵抗性および前記他の所望の形質を含む植物についてＦ１を選択する工程；
ｃ）    所望により選択したＦ１子孫をいずれかの親と交配すると交配して、戻し交配子孫を産生する工程；
ｄ）    ＴＢＲＦＶ抵抗性および前記他の所望の形質を含む戻し交配子孫を選択する工程；および
ｅ）    所望により工程ｃ）およびｄ）を１回以上連続して繰り返すことにより、前記他の所望の形質を含み、かつＴＢＲＦＶへの抵抗性を有する選択された第四またはそれ以上の戻し交配子孫を産生する工程、
を含む方法を提供する。戻し交配は所望により、戻し交配子孫が安定し、親系統として使用され得るまで行われ、最大で１０の戻し交配の後に達成され得る。
【００６１】
本発明の一実施形態では、別の所望の形質をＴＢＲＦＶへの抵抗性を含むソラヌム・リコペルシクム植物に導入する方法において使用される本発明の植物は、ＮＣＩＭＢ受託番号ＮＣＩＭＢ４２８８２、ＮＣＩＭＢ４２８８５、ＮＣＩＭＢ  ＮＣＩＭＢ４２８８７、またはＮＣＩＭＢ４２８９０で寄託された種子から生長した植物、または１以上の後続の世代について前記寄託された種子から生長した植物を、それ自身とまたは別の植物と交配することによる直系またはさらなる子孫であるその子孫植物、である。
【００６２】
所望により、自家交配工程は、交配または戻し交配工程のいずれかの後に実施される。ＴＢＲＦＶ抵抗性をもたらす染色体１１の本発明のＱＴＬおよび前記他の所望の形質を含む植物の選択は代替的には、前記方法の交配または自家交配のいずれかの工程のあとに行われ得る。前記他の所望の形質は以下の群から選択され得るが、これらに限定されない：細菌、真菌またはウイルス性の病気への抵抗性、昆虫または害虫抵抗性、改良された発芽、植物の大きさ、植物の種類、改良された貯蔵寿命、水ストレスおよび熱ストレス耐性、および雄性不稔性。本発明は、この方法により産生されたソラヌム・リコペルシクム植物およびそれらから得られたソラヌム・リコペルシクム果実を含む。
【００６３】
本発明はさらに、染色体１１の本発明のＱＴＬを含むソラヌム・リコペルシクム植物の生産方法であって、そのゲノム中に本発明のＱＴＬを含む植物材料の組織培養を使用することによる方法に関し、ここで前記ＱＴＬの存在がＴＢＲＦＶへの抵抗性をもたらす。
【００６４】
本発明はさらに、染色体１１の本発明のＱＴＬを含むソラヌム・リコペルシクム植物の生産方法であって、そのゲノム中に本発明のＱＴＬを含む植物材料の栄養繁殖を使用することによる方法に関し、ここで前記ＱＴＬの存在がＴＢＲＦＶへの抵抗性をもたらす。
【００６５】
本発明は、二倍体ハプロイド世代技術を使用してホモ接合に本発明のＱＴＬを含み、かつＴＢＲＦＶに対して抵抗性である二倍体ハプロイド系統を産生することにより、染色体１１の本発明のＱＴＬを含み、かつ本明細書中で規定されるＴＢＲＦＶへの抵抗性を有するソラヌム・リコペルシクム植物の生産方法をさらに提供する。
【００６６】
本発明はさらに、本明細書中で規定される染色体１１の本発明のＱＴＬを含むソラヌム・リコペルシクム植物の生産方法であって、ここで前記ＱＴＬの存在がＴＢＲＦＶ抵抗性をもたらし、前記方法が前記ＱＴＬを含む種子をソラヌム・リコペルシクム植物に生長させる工程を含む、方法に関する。一実施形態では、前記方法において使用される種子は、受託番号ＮＣＩＭＢ４２８８２、ＮＣＩＭＢ４２８８５、ＮＣＩＭＢ４２８８７、またはＮＣＩＭＢ４２８９０でＮＣＩＭＢで寄託された種子、または１以上の後続の世代について前記寄託された種子から生長した植物を、それ自身と、または別の植物と交配することによる直系またはさらなる子孫であるその子孫種子、である。
【００６７】
本発明はさらに、本発明の種子からソラヌム・リコペルシクム植物を生長させ、前記植物に種子を有する果実を産生させ、前記果実を収穫し、かつそれらの種子を抽出する工程を含む種子生産のための方法に関する。前記種子の生産は好適には、それ自身とまたは所望により本発明の植物でもある別の植物と交配することにより行われる。このようにして産生された種子は、本発明のＱＴＬを含み、かつＴＢＲＦＶに抵抗性である植物に生長する能力を有する。
【００６８】
本発明はさらに、ハイブリッド種子および第一親植物を第二親植物と交配する工程および得られたハイブリッド種子を収穫する工程を含む前記ハイブリッド種子を生産する方法に関し、ここで第一親植物および／または第二親植物は本明細書中で規定される染色体１１の本発明のＱＴＬを含む本発明の植物である。前記ＱＴＬを含むハイブリッド種子から生長できる得られるハイブリッド植物はまた本発明の植物であり、ここで前記ハイブリッド植物はＴＢＲＦＶへの抵抗性を有する。
【００６９】
本発明のＴＢＲＦＶ抵抗性を提供する親は寄託された種子から直接生長した植物であり得る。前記親はまた、１回以上それ自身とまたは別の植物と交配することにより得られる直系またはさらなる子孫である寄託された種子からの子孫植物、または、他の手段により本発明のＱＴＬを得、それにより本発明のＴＢＲＦＶ抵抗性を得た、として同定される種子からの子孫植物であり得る。
【００７０】
本明細書中で使用される染色体１１の本発明のＱＴＬの遺伝子移入は前記ＱＴＬを含むドナー植物から前記ＱＴＬを保有していないレシピエント植物への標準的な育種技術による前記ＱＴＬの導入を意味し、ここで本発明のＱＴＬを含む植物についての選択はＴＢＲＦＶへの抵抗性の観察によって表現型的に実施され得、または選択は、本明細書中で規定されるマーカー、好ましくは配列番号４−５２を含む群から、または配列番号５−５２を含む群から、または配列番号５−５１を含む群から、または配列番号４−３３を含む群から、または配列番号５−１１を含む群から、または配列番号６−１１を含む群から、または配列番号７−１１を含む群から、またはもっとも好ましくは配列番号８−１０を含む群から選択されるマーカーの使用により、マーカーアシスト育種またはこれらの選択方法の組合せを介して実施され得る。選択はＦ１または前記レシピエント植物および前記ドナー植物間の最初の交配からの任意のさらなる世代で始まり、その後好適には本明細書で同定され規定されるマーカーを使用することにより、それ自身とまたは別の植物とのいずれかのさらなる交配が行われる。当業者は前記ＱＴＬを同定するために使用され得るか、または前記ＱＴＬしたがって本発明のＴＢＲＦＶ抵抗性に遺伝的に連鎖している新たな分子マーカーを作製し、使用することに精通している。本発明の植物の同定および選択のためのかかるマーカーの開発および使用も本発明の一部である。
【００７１】
本発明は、後の実施例でさらに例示され、それは例示の目的のためだけのものである。実施例は、本発明をいかなる意味でも限定することを意図していない。実施例および本願では、以下の図を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】配列番号１−５３のヌクレオチド配列。
【００７３】
寄託
ＴＢＲＦＶ抵抗性植物をもたらす染色体１１の本発明のＱＴＬをホモ接合に含むトマトソラヌム・リコペルシクムの種子は、受託番号ＮＣＩＭＢ４２８８２、ＮＣＩＭＢ４２８８５、ＮＣＩＭＢ４２８８７、およびＮＣＩＭＢ４２８９０で２０１７年１１月９日にＵＫ、ＡＢ２１  ９ＹＡ、アベルディーン、ブックスバーン、クライブストーン  エステート、フェルグソンビルディング、ＮＣＩＭＢ  Ｌｔｄで寄託された。
【実施例】
【００７４】
実施例１
Ｓ．リコペルシクムにおけるＴＢＲＦＶ抵抗性についてのバイオアッセイおよび寄託開発
新たなＴＢＲＦＶトバモウイルスの存在により問題が増大し、このウイルスが広い地域に容易に拡散する恐れがあるため、大規模な遺伝資源スクリーニングが組織された。潜在的な抵抗性材料のスクリーニングは、バイオアッセイにより行った。ウイルスは機械的に感染するため、バイオアッセイでは標準的な機械的播種技術を使用した。当時は抵抗性材料が知られていなかったため、抵抗性コントロールを含めることはできなかった。しかしながら、感受性のコントロールを含めることは容易であった：Ｃａｎｄｅｌａ  Ｆ１は感受性があると発表されていたので含み、Ｒａｚｙｍｏ  Ｆ１も第二の感受性コントロールとして含んだ。抵抗性が栽培材料にすでに存在していることもあるかもしれず、存在するかどうかを決定するために、市販されている多数のハイブリッドトマト品種も含んだ。
【００７５】
試験される系統種の種子を標準的な種苗トレイに播種し、系統種あたり１１種苗を播種後３週間接種した。病徴のスコアリングは播種後２週および再度播種後３週目に表１に従って行った。
【００７６】
接種源をセライトと混合した０．０１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）中でＴＢＲＦＶに感染したトマト植物の葉を接地させることにより調製した。植物は接種源を葉に軽くこすりつける前に、カルボランダム粉末を散布した。
【００７７】
前記大規模スクリーニングでは、３つのソラヌム・ピンピネリフォリウム系統種ＧＮＬ．３９１９、ＧＮＬ．３９２０、およびＧＮＬ．３９５１がＴＢＲＦＶに抵抗性であると同定された。すべての３つの系統種は１００％抵抗性であり、第一並びに第二の観察で病徴を示さず、そのためスコア０を有した。Ｃａｎｄｅｌａ  Ｆ１およびＲａｚｙｍｏ  Ｆ１について、すべての植物はスコア４を有していたため、それらは感受性が高い。含まれた他の市販のトマト品種は主にスコア３および４を有しており、いずれも抵抗性植物を示さなかった。
【００７８】
同定された抵抗性Ｓ．ピンピネリフォリウム供給源を内部Ｓ．リコペルシクム系統ＴＢ１、ＴＢ２、およびＴＯ１と交配した。続いてこれらの交配からのＦ１植物を生長させ、Ｆ２種子も得た。前記供給源、前記育種系統、前記Ｆ１および集団あたり１８４のＦ２植物を含む新たな大規模スクリーニングを設定した。接種後２週間のこのスクリーニングの親およびＦ１の平均スコアは表２で示される。個々のＦ２植物スコアは予想通りにスコア０−４の範囲で分離した。内部育種系統ＴＢ１、ＴＢ２、およびＴＯ１の場合のように植物が第一観察で３をスコアした場合、当該植物を除去し、第二観察を行わなかった。
【００７９】
分離Ｆ２集団から、抵抗性植物を選択し、自家交配させた。ＱＴＬ解析から並列に開発されたマーカーを使用して（実施例２を参照されたい）、同定されたＱＴＬを有する植物を選択した。すべての３つの供給源が代表したこれらの個々の植物からの種子をその後ＮＣＩＭＢ４２８８２、ＮＣＩＭＢ４２８８５、ＮＣＩＭＢ４２８８７、およびＮＣＩＭＢ４２８９０として寄託した。ＮＣＩＭＢ４２８８２は、ＧＮＬ．３９５１との交配から開発した。ＮＣＩＭＢ４２８８５は、ＧＮＬ．３９２０との交配から開発した。ＮＣＩＭＢ４２８８７およびＮＣＩＭＢ４２８９０は、ＧＮＬ．３９１９との交配から開発した。全ての寄託植物は染色体１１のＱＴＬをホモ接合に有した。
表２−ＴＢＲＦＶバイオアッセイ結果
【表２】
2021505165.tif 000003
【００８０】
当該ＱＴＬをホモ接合に有するよう選択したＦ２およびＦ３植物でさらなる観察を行い、前記ＱＴＬの存在が表１に記載されるスケールに従って病気のスコア平均０−１、場合によっては１．５をもたらすことが確認された。戻し交配を、反復親として育種系統と行い、戻し交配世代のその後の自家交配集団でも、当該ＱＴＬのホモ接合の存在はＴＢＲＦＶに抵抗性である植物をもたらすことがわかった。
【００８１】
実施例２
ＱＴＬマッピングおよびマーカー開発
同定された供給源からＴＢＲＦＶ抵抗性を付与するＱＴＬをマッピングするために、７つのＦ１のＦ２集団の１８４の植物をＴＢＲＦＶ抵抗性について表２から表現型化した；参照のため親も含まれた；遺伝子型化のために各植物のＤＮＡ試料を採取した。表１に従った表現型スコア０−４は全Ｆ２集団に存在した。
【００８２】
集団ごとに遺伝地図を作成し、非多型マーカーと強い分離歪みを持つマーカーを除去した。各集団について、約４００−４５０のマーカーがマップされ、平均２−３ｃＭの間隔でゲノム上に十分に分布していた。マーカーの順番を決定し、公開されているゲノムアセンブリを使用して、番号付けと連鎖群の向きを決定した。７の個々のマップからコンセンサスマップを作製した。
【００８３】
表現型スコア、遺伝子型データ、マーカー位置を含有するコンセンサスマップをＱＴＬマッピングの入力データとして使用した。ＱＴＬ解析を実施し、データのマッピングは最初に３つのＱＴＬの同定：染色体１１に１つ、染色体１２に１つ、および染色体６に１つ、をもたらした。
【００８４】
抵抗性のために分離した集団のさらなる観察、およびその後のＱＴＬのファインマッピングにより、ＴＢＲＦＶへの抵抗性への主要な寄与が染色体１１の前記ＱＴＬの存在に起因することがわかった。このファインマッピングにより、染色体１１のＱＴＬ領域をさらに絞り込むことができた。元のＱＴＬ内の組み換えの同定により最初に約５４Ｍｂｐのより小さな領域が得られた。さらなるファインマッピングにより、約７．７Ｍｂｐから１０．１Ｍｂｐ間の供給源からの遺伝子移入を含む小さな領域が得られた。抵抗性を示した最終的な組み換えは配列番号７および配列番号１０の間である約８．６から１０．１Ｍｂｐ間の供給源からの小さな遺伝子移入を有するのみであった。公開ＳＬ３＿００トマトマップに基づく正確な位置は、表３に示され得る。この解析で同定され、かつ当該ＱＴＬ領域に存在する多型ＳＮＰマーカーは表３に示される。これらのマーカーの配列は図１に示される。これらのマーカーは、前記寄託から生長した植物またはそれらの子孫における前記ＱＴＬの存在を同定するために使用され得る。これらのマーカーは、前記ＱＴＬを含む任意のほかの集団における染色体１１のＴＢＲＦＶ抵抗性についての本発明のＱＴＬの存在を同定するためにさらに使用できる。
表３．ＳＮＰマーカー−ヌクレオチドおよび物理的位置
【表３】
2021505165.tif 000004
2021505165.tif 000005
【図１】
2021505165.tif 000006
【図２】
2021505165.tif 000007
【図３】
2021505165.tif 000008
【図４】
2021505165.tif 000009
【図５】
2021505165.tif 000010
【図６】
2021505165.tif 000011
【図７】
2021505165.tif 000012
【国際調査報告】
2021505165.tif 000013
2021505165.tif 000014
2021505165.tif 000015
2021505165.tif 000016