(57)【要約】  本発明は組換えの生物学的に封じ込められたフィロウイルス及びそれらのウイルスを作製する及び使用する方法を含むワクチンを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量の組換えフィロウイルス及び一以上のアジュバントを含み、ここで前記組換えフィロウイルスのゲノムが、エボラウイルスＶＰ３０に対応するウイルスタンパク質のポリヌクレオチド配列において一以上のヌクレオチドの欠失失を含み、かつここで組換えフィロウイルスによる細胞の感染時に、前記欠失がエボラウイルスＶＰ３０に対応する機能的なウイルスタンパク質の発現を妨げることに効果的であるワクチン。
【請求項２】
前記ウイルスのウイルスゲノムにおけるＶＰ３０配列に対応する配列の少なくとも９０％が欠失した請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記ゲノムがさらに予防的な又は治療的な異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む請求項１又は２に記載のワクチン。
【請求項４】
前記ヌクレオチド配列が欠失部位の１０００ヌクレオチド内又は欠失部位に挿入される請求項３に記載のワクチン。
【請求項５】
前記ヌクレオチド配列がポリヌクレオチド内の欠失部位以外の部位で前記フィロウイルスゲノム内に挿入される請求項３に記載のワクチン。
【請求項６】
前記ヌクレオチド配列がフィロウイルスゲノム内のＮＰコード配列とＶＰ３５コード配列との間に挿入される請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】
前記ヌクレオチド配列をＧＰ／ｓＧＰ配列又はその一部に置換する請求項３に記載のワクチン。
【請求項８】
前記ヌクレオチド配列がＧＰ／ｓＧＰコード配列内に挿入される請求項３に記載のワクチン。
【請求項９】
前記異種遺伝子産物が異種フィロウイルスの糖タンパク質を含む請求項３〜８のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１０】
前記フィロウイルスの糖タンパク質がマールブルグウイルス、エボラウイルス、スーダンウイルス、タイフォレストウイルス、レストンウイルス、又はブンディブギョウイルスの糖タンパク質を含む請求項９に記載のワクチン。
【請求項１１】
前記組換えフィロウイルスゲノムが組換えエボラウイルスゲノムである請求項１〜９のいずれか一項のワクチン。
【請求項１２】
医薬的に許容可能な担体をさらに含む請求項１〜１１のいずれか一項のワクチン。
【請求項１３】
前記アジュバントがリポ多糖を含む請求項１〜１２のいずれか一項のワクチン。
【請求項１４】
前記リポ多糖がモノホスホリルリピドＡを含む請求項１３のワクチン。
【請求項１５】
前記アジュバントがスクアレンを含む請求項１〜１４のいずれか一項のワクチン。
【請求項１６】
前記アジュバントがキラヤの抽出物を含む請求項１〜１５のいずれか一項のワクチン。
【請求項１７】
前記アジュバントがサポニンを含む請求項１〜１６のいずれか一項のワクチン。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項のワクチンの有効量を哺乳動物へ投与することを含む、哺乳動物に免疫を与える方法。
【請求項１９】
前記哺乳動物がヒトである請求項１８の方法。
【請求項２０】
２回投与することを含む請求項１８又は１９の方法。
【請求項２１】
１回投与することを含む請求項１８又は１９の方法。
【請求項２２】
組換えフィロウイルス、ここでその組換えフィロウイルスのゲノムが、エボラウイルスＶＰ３０に対応するウイルスタンパク質のポリヌクレオチド配列内の一以上のヌクレオチドの第一の欠失を含み、その第一の欠失は組換えフィロウイルスによる細胞の感染時に、エボラウイルスＶＰ３０に対応する機能的なウイルスタンパク質の発現を妨げることに効果的であり、かつここで前記ゲノムはＮＰコード配列とＶＰ３５コード配列に隣接される領域における変異、ＧＰ／ｓＧＰコード配列における変異、及び／又は第一の欠失部位の１０００ヌクレオチド内若しくは第一の欠失部位への挿入、又はそれらの組み合わせを含み、ここで前記ゲノムは一以上のフィロウイルスの糖タンパク質をコードし、ここでＮＰコード配列とＶＰ３５コード配列に隣接する領域内の前記変異は予防的な又は治療的な異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列の挿入及び任意にまた前記ＮＰコード配列とＶＰ３５コード配列に隣接する領域において一以上のヌクレオチドの欠失を含み、ここで前記ＧＰ／ｓＧＰコード配列におけるその変異は予防的な又は治療的な異種遺伝子産物をコードするヌクレオチドの挿入及び任意にまたＧＰ／ｓＧＰコード配列における一以上のヌクレオチドの欠失を含み、又はここで第一の欠失部位の１０００ヌクレオチド内若しくは第一の欠失部位でのその挿入が予防的な又は治療的な異種遺伝子産物をコードする、ウイルス。
【請求項２３】
前記領域内のその変異がＮＰコード配列とＶＰ３５コード配列に隣接する請求項２２に記載のウイルス。
【請求項２４】
前記ＧＰ／ｓＧＰコード配列内のその変異を有する請求項２２又は２３に記載のウイルス。
【請求項２５】
前記ＶＰ３０配列の欠失に近接する又は前記ＶＰ３０配列の欠失で予防的な又は治療的な異種遺伝子産物をコードする挿入を有する請求項２２、２３又は２４に記載のウイルス。
【請求項２６】
組換えフィロウイルスの有効量を含む多価ワクチンであって、ここで前記組換えフィロウイルスのゲノムがエボラウイルスＶＰ３０に対応するウイルスタンパク質のポリヌクレオチド配列において一以上のヌクレオチドを含む第一の欠失を含み、その欠失が前記組換えフィロウイルスによる細胞の感染時にエボラウイルスＶＰ３０に対応する機能的なウイルスタンパク質の発現を妨げることに効果的であり、かつここで前記ゲノムがＮＰコード配列とＶＰ３５コード配列に隣接される領域内に変異、及び／又は前記第一の欠失部位の１０００ヌクレオチド内若しくは前記第一の欠失部位での挿入、又はそれらの組み合わせを含み、ここでそのゲノムが一以上のフィロウイルスの糖タンパク質をコードし、ここでＮＰコード配列とＶＰ３５コード配列に隣接される領域における変異が、予防的な又は治療的な異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列の挿入及び任意にまた前記ＮＰコード配列とＶＰ３５コード配列に隣接する領域において一以上のヌクレオチドの欠失を含み、ここでＧＰ／ｓＧＰコード配列内のその変異は予防的な又は治療的な異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列の挿入及び任意にまたＧＰ／ｓＧＰコード配列内の一以上のヌクレオチドの欠失を含み、又は、ここで前記第一の欠失部位の１０００ヌクレオチド内若しくは前記第一の欠失部位でのその挿入が予防的な若しくは治療的な遺伝子産物をコードするワクチン。
【請求項２７】
前記ゲノムによってコードされるフィロウイルスの糖タンパク質の一つが同種のフィロウイルスの糖タンパク質を含む請求項２６のワクチン。
【請求項２８】
前記ゲノムによってコードされるフィロウイルスの糖タンパク質の一つが異種のフィロウイルスの糖タンパク質を含む請求項２６又は２７のワクチン。
【請求項２９】
前記予防的な又は治療的な異種遺伝子産物が糖タンパク質ではない請求項２６〜２８のいずれか一項のワクチン。
【請求項３０】
前記遺伝子産物がＥｂｏｌａ  ＮＰ、Ｅｂｏｌａ  ＶＰ４０、Ｅｂｏｌａ  ＶＰ３５、Ｍａｒｂｕｒｇ  ＮＰ、Ｍａｒｂｕｒｇ  ＮＰ  ＶＰ４０、Ｍａｒｂｕｒｇ  ＮＰ  ＶＰ３５、プラスモジウムスポロゾイト周囲タンパク質（ＣＳＰ）、プラスモジウム頂端膜タンパク質（ＡＭＡ）、プラスモジウムロプトリー頚部タンパク質２（ＲＯＮ２）、又はプラスモジウムＲＨ５を含む請求項２９のワクチン。
【請求項３１】
前記予防的な又は治療的な異種遺伝子産物が糖タンパク質を含む請求項２６〜２８のいずれか一項のワクチン。
【請求項３２】
前記遺伝子産物がＭａｒｂｕｒｇ  ＧＰ、フラビウイルス膜タンパク質、フラビウイルスエンベロープタンパク質、又はブニヤウイルス糖タンパク質前駆体（ＧＰＣ）タンパク質を含む、請求項３１のワクチン。
【請求項３３】
前記ワクチンがさらにアジュバントを含む請求項２６〜３２のいずれか一項のワクチン。
【請求項３４】
前記アジュバントがリポ多糖を含む請求項３３のワクチン。
【請求項３５】
前記リポ多糖がモノホスホリルリピドＡを含む請求項３４のワクチン。
【請求項３６】
前記アジュバントがスクアレンを含む請求項３３のワクチン。
【請求項３７】
前記アジュバントがキラヤの抽出物を含む請求項３３のワクチン。
【請求項３８】
前記アジュバントがサポニンを含む請求項３３のワクチン。
【請求項３９】
医薬的に許容可能な担体をさらに含む請求項２６〜３８のいずれか一項のワクチン。
【請求項４０】
請求項２６〜３９のいずれか一項のワクチンの有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物に免疫を与える方法。
【請求項４１】
組換えフィロウイルスを製造する方法であって、：
子孫のフィロウイルスをもたらすために無血清培地内で培養される組換えフィロウイルスゲノムを発現する哺乳動物細胞からの上清を提供することであって、ここで、前記組換えフィロウイルスのゲノムが、エボラウイルスＶＰ３０に対応するウイルスタンパク質のポリヌクレオチド配列において一以上のヌクレオチドの欠失を含み、かつここで前記欠失が組換えフィロウイルスによる細胞の感染時にエボラウイルスＶＰ３０に対応する機能的なウイルスタンパク質の発現を妨げることに効果的であり、かつここで前記哺乳動物細胞がエボラウイルスＶＰ３０に対応するウイルスタンパク質を発現すること；
上清とＤＮａｓｅ及びウイルス不活化剤とを接触させること、それによって不活化したウイルス調製液を提供すること；かつ
不活化したウイルス調製液を濃縮することを含む方法。
【請求項４２】
前記細胞がＶｅｒｏ細胞である請求項４１の方法。
【請求項４３】
前記収集した上清がＤＮａｓｅ又はウイルス不活化剤と接触する前に濾過される請求項４１又は４２の方法。
【請求項４４】
前記収集した上清が０．５〜５ミクロンのフィルター又は１〜５ミクロンのフィルターによる濾過の対象になる請求項４３の方法。
【請求項４５】
前記不活化したウイルス調製液が濾過の対象になる請求項４１〜４４のいずれか一項の方法。
【請求項４６】
前記不活化したウイルス調製液のその濾過が、０．０１〜１ミクロンのフィルター又は０．０５〜０．２５ミクロンのフィルターである請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記上清をＤＮａｓｅと接触し、続いてウイルス不活化剤と接触する請求項４０〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記不活化したウイルス調製液と一以上のアジュバントとを組み合わせることをさらに含む請求項４０〜４７のいずれか一項の方法。
【請求項４９】
請求項４０〜４８のいずれか一項の方法によって生産される組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１８年８月７日に出願した米国特許第６２／７１５，６７３号の出願日の利益を主張し、その開示は本明細書に参照によって取り込まれる。
【０００２】
［連邦政府の権利に関する声明］
本発明は米国国立衛生研究所により授与されたＡｌ１０９７６２下の政府の支援によって作製された。連邦政府は本発明の一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
エボラウイルスは、ヒト及びヒト以外の霊長類において出血熱をもたらし、ある大流行において９０％の致死率を有したケースを有する（Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。エボラウイルス及び密接に関連するマールブルグウイルスはフィロウイルス科に属する（Ｆｅｌｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。現在、フィロウイルスに対する使用のための承認されたワクチン又は抗ウイルス薬はなく、これらのウイルスを扱うための必須条件であるバイオセーフティレベル−４（ＢＳＬ−４）封じ込めを製作していない。十分なＢＳＬ−４スペースの欠如、訓練された人材、及びＢＳＬ−４実験室において仕事をすることにおける厳密さは、エボラウイルスを有する基礎研究及びワクチンの開発及び効果的な抗ウイルス化合物のためのラージスケールのスクリーニングを著しく妨げている。これらの限界は、感染性ウイルスの非存在下におけるエボラウイルスのライフサイクルの様々なステップの試験を促した：（ｉ）複製及び転写を、プラスミドからの必要なウイルス成分の発現に基づいたレポーター遺伝子アッセイの使用により研究した（Ｂｏｅｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｇｒｏｓｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｍｕｈｌｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｍｏｄｒｏｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００３：Ｍｏｄｒｏｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）；（ｉｉ）侵入及び融合プロセスを、組換えの水疱性口内炎ウイルス又はレトロウイルスの使用に依存するシュードタイピングアッセイによって評価した（Ｙｏｎｅｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｗｏｏｌ−Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｔａｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｍａｒｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）；並びに（ｉｉｉ）タンパク質発現プラスミドより提供されるウイルスタンパク質より発生されるウイルス様粒子を用いて出芽を試験した（Ｊａｓｅｎｏｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｌｉｃａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｎｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；ＭｃＣａｒｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。しかしながら、いくつかの最新の見解では、これらの人工的な機構によって得られたデータは必ずしも生きた、真正のエボラウイルスで再現性があるとは限らないことを示唆している（Ｎｅｕｍａｎｎ  ｅｔ．ａｌ．，２００５）。それゆえ、野生型のウイルスのようであるが、ＢＳＬ−４封じ込めの外で操作されうる生物学的に封じ込められたエボラウイルスが明白に求められている。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は組換えの一本鎖マイナス鎖ＲＮＡウイルスの有効量を含むワクチンを提供し、そのゲノムはウイルス複製のためのｉｎ  ｔｒａｎｓに必要不可欠な非構造的な又は非グリコシル化のウイルスタンパク質におけるそれらに対応するウイルス配列の欠失を含んでおり、そして一の態様において、一以上のアジュバント、又は一の態様において、一以上の異種の遺伝子産物をコードする一以上のヌクレオチド配列の挿入、又は一の態様において、一以上のアジュバント及び一以上の異種遺伝子産物をコードする一以上のヌクレオチド配列の挿入であって、ここでその挿入はコード又は非コード配列内でありうる。一の態様において、その異種遺伝子産物はザイール、スーダン、コートジボワール、ブンディブギョ、レストン、又はマールブルグフィロウイルス、一以上のそれらのフィロウイルスの糖タンパク質由来である。一の態様において、その挿入はコード配列、例えば糖タンパク質のコード配列、若しくはその部分を置き換えうり、又は非コード配列を置き換えうる。一の態様において、その欠失は組換えの一本鎖マイナス鎖ＲＮＡウイルスによる細胞の感染におけるウイルス複製を阻害すること又は予防することに効果的である。例えば、ウイルス複製のためのｉｎ  ｔｒａｎｓに必要不可欠な非構造的な又は非グリコシル化のウイルスタンパク質におけるそれらに対応するウイルス配列の欠失は、組換えの一本鎖マイナス鎖ＲＮＡウイルスによる細胞の感染の機能的な非構造的な又は非グリコシル化のタンパク質の発現を防止することに有効でありうる。一の態様において、ウイルス複製のためのｉｎ  ｔｒａｎｓに必要不可欠な非構造的な又は非グリコシル化のウイルスタンパク質におけるそれらに対応するウイルス配列の欠失は、エボラウイルスＶＰ３０タンパク質に対応するウイルスタンパク質におけるフィロウイルス配列内でありうる。一の態様において、その組換え体のゲノムである、生物学的に封じ込められたフィロウイルスは、異種配列例えば、ＶＰ３０に関連した配列の欠失内に位置されるものを含む。一本鎖マイナス鎖ＲＮＡウイルスのウイルス配列の任意の欠失は、一以上のヌクレオチド、例えば少なくとも０．１％、１％、５％、１０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はその間の任意の整数、及び最大１００％の非構造的な、グリコシル化の又は非グリコシル化のウイルスタンパク質に対応するウイルス配列の欠失を含みうる。ウイルス複製のためのｉｎ  ｔｒａｎｓに必要不可欠な非構造的な又は非グリコシル化のウイルスタンパク質におけるそれらに対応するウイルス配列の欠失は、多数回の継代にわたり安定的で、例えばＲＴ−ＰＣＲによって容易に検出可能なものである。一の態様において、組換えウイルスのゲノムは、二以上の非構造的な又は非グリコシル化のタンパク質におけるウイルス配列において欠失、例えばお互いに隣接しないウイルスタンパク質における配列、例えばエボラウイルスＶＰ３０タンパク質に対応するウイルスタンパク質及びエボラウイルスＧＰタンパク質に対応するウイルスタンパク質における配列内の欠失を有する。一の態様において、組換えウイルスのゲノムが非構造的な、グリコシル化の又は非グリコシル化のタンパク質におけるウイルス���列内に欠失を有する場合に、その欠失したウイルス配列の少なくとも一つの部分が、哺乳動物に投与される場合に、予防薬又は治療薬である、組換えのフィロウイルス内で発現される抗原をコードするヌクレオチド配列に置き換わりうる。一の態様において、組換えウイルスのゲノムが非構造的な、グリコシル化の又は非グリコシル化のタンパク質である二以上のタンパク質のウイルス配列内に欠失を有する場合に、その欠失したウイルス配列の少なくとも一つの部分が、哺乳動物に投与される場合に、予防薬又は治療薬である、組換えのフィロウイルス内で発現される抗原をコードするヌクレオチド配列と置き換わりうる。本発明のワクチンはサブタイプの交差防御を、フィロウイルスの交差防御を、及び任意にフィロウイルス以外の病原体における一価、二価、又は多価のワクチンとして提供しうる。
【０００５】
本明細書の以下の部分で示すように、アジュバントを前記ワクチンに組み込むことは、予期しない結果を提供した。さらに、全てのアジュバントは効果的ではなく、例えばアルミはコントロール（アジュバントなし）と比較して本発明の前記ワクチンウイルスの効果を増強しなかった。一の態様において、一価の組換えフィロウイルスワクチンは一以上のアジュバント及び組換えフィロウイルスを含み、そのゲノムの発現は同種の糖タンパク質を有するウイルスをもたらし、例えば、ザイール遺伝子はザイール糖タンパク質を発現する。一の態様において、一価の組換えフィロウイルスワクチンは一以上のアジュバント及び組換えフィロウイルスを含み、そのゲノムの発現は、異種糖タンパク質を有するウイルスをもたらし、例えば（親の糖タンパク質を置換するために）ＯＲＦ４内に挿入され、例えばザイールゲノムがマールブルグウイルス、スーダンエボラウイルス、又はブンディブギョエボラウイルスの糖タンパク質を発現する。一の態様において、一価の組換えフィロウイルスワクチンは一以上のアジュバント及び組換えフィロウイルスを含み、そのゲノムの発現は異種糖タンパク質を有するウイルスをもたらし、例えばザイールゲノムがマールブルグウイルス、スーダンエボラウイルス、又はブンディブギョエボラウイルスの糖タンパク質を発現し、例えばエボラウイルスＶＰ３０（ＯＲＦ５）に対応する配列内に挿入され又はＯＲＦ５若しくはその一部の欠失をもたらし、例えば二つの異なる糖タンパク質が発現される。
【０００６】
一の態様において、組換えフィロウイルス及び一以上のアジュバントの有効量を含むワクチンが提供される。その組換えフィロウイルスのゲノムはエボラウイルスＶＰ３０に対応するウイルスタンパク質のポリヌクレオチド配列内の一以上のヌクレオチドの欠失を含み、そしてその欠失は組換えフィロウイルスによる細胞の感染時にエボラウイルスＶＰ３０に対応する機能的なウイルスタンパク質の発現の予防に効果的である。一の態様において、そのウイルスのウイルスゲノム内のＶＰ３０配列に対応する配列の少なくとも９０％は欠失される。一の態様において、そのゲノムはさらに予防薬又は治療薬の異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む。一の態様において、そのヌクレオチド配列は欠失部位の５００ヌクレオチド内に又はその欠失の領域で挿入される。一の態様において、そのヌクレオチド配列はポリヌクレオチド内の欠失の部位外でフィロウイルスゲノム内に挿入される。一の態様において、そのヌクレオチド配列はフィロウイルスゲノム内のＮＰコード配列とＶＰ３５コード配列との間に挿入される。一の態様において、そのヌクレオチド配列はＧＰ／ｓＧＰ配列又はその部分を置換する。一の態様において、そのヌクレオチド配列はＧＰ／ｓＧＰコード配列内に挿入される。一の態様において、その異種遺伝子産物は異種フィロウイルス糖タンパク質を含む。一の態様において、そのフィロウイルスの糖タンパク質はマールブルグウイルス、エボラウイルス、スーダンウイルス、タイフォレストウイルス、レストンウイルス、ブンディブギョウイルスの糖タンパク質を含む。一の態様において、その組換えフィロウイルスゲノムは組換えエボラウイルスゲノムである。一の態様において、さらなるワクチンは医薬的に許容可能な担体を含む。
【０００７】
一の態様において、そのアジュバントはリポ多糖を含む。一の態様において、そのリポ多糖はモノホスホリルリピドＡを含む。一の態様において、そのアジュバントはスクアレンを含む。一の態様において、そのアジュバントはキラヤの抽出物を含む。一の態様において、そのアジュバントはサポニンを含む。一の態様において、ワクチン内の組換えフィロウイルスは不活化される。また組換えフィロウイルスを有する組成物を用いる哺乳動物への免疫方法を提供する。一の態様において、その哺乳動物はヒトである。一の態様において、その組成物の二投与量を投与する。一の態様において、単回投与量を投与する。一の態様において、その組成物の三投与量を投与する。一の態様において、組換えのフィロウイルスは例えば、熱、一以上の化学物質、例えばホルムアルデヒド、ホルマリン、ベータ−プロピオラクトン、ジエチルピロカルボネート、酸化剤例えば過酸化水素、２−２’−ジチオジピリジン、バイナリエチレンイミン、グルタルアルデヒド又はガンマ線若しくはＵＶのような放射線照射を用いて不活化される。
【０００８】
アフリカのたいていの領域では、深刻な特定の風土病又は繰り返し起こる病気であり、そしてその組み合わせは地域によって変化するので、本開示は特定の地域に衝撃を与える疾病の組み合わせに立ち向かう二価／多価ワクチンを提供する。一価ワクチンは他のワクチンに十分対応しない任意の大流行への反応において特に有用でありうる。多価ワクチンは、これらに限定されないが、フィロウイルスゲノム中の任意のいくつかの位置中の外的な配列の付加に基づきうる：１）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）１（例えば、ＮＰ）とＯＲＦ２（例えばＶＰ３５）との間の人工的な転写ユニット、２）ＯＲＦ４（例えば、ザイール糖タンパク質遺伝子）、及び３）ＯＲＦ５（例えば、ＶＰ３０遺伝子）。一の態様において、二価ワクチンウイルスは、例えば、ザイールエボラウイルス及びマールブルグウイルス、エボラ及びマールブルグウイルス、フィロウイルス及びラッサウイルス、又はフィロウイルス及びマラリア原虫（マラリア）からの、一以上の非グリコシル化タンパク質、一以上のグリコシル化タンパク質、又は少なくとも一つの非グリコシル化タンパク質及び少なくとも一つのグリコシル化タンパク質を発現しうる。
【０００９】
それゆえ、一の態様において、組換えフィロウイルスは、組換えフィロウイルスのそのゲノムが、エボラウイルスＶＰ３０に対応するウイルスタンパク質のポリヌクレオチド配列中に一以上のヌクレオチドの第一の欠失を含む組換えフィロウイルスであり、その第一の欠失は組換えフィロウイルスによる細胞の感染時にエボラウイルスＶＰ３０に対応する機能的なウイルスタンパク質の発現を防止することに効果的であり、そしてそのゲノムは一以上のフィロウイルスの糖タンパク質をコードする。そのゲノムはＮＰコード配列及びＶＰ３５コード配列と隣接している領域内の変異、ＧＰ／ｓＧＰコード配列内の変異、並びに／又はその第一の部位の５００ヌクレオチド内若しくはその第一の欠失部位での挿入、又はその組み合わせを含みうり、そしてそのゲノムは一以上のフィロウイルスの糖タンパク質をコードする。ＮＰコード配列及びＶＰ３５コード配列に隣接する領域の変異は、予防的な又は治療的な異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列の挿入及びまた任意にＮＰコード配列及びＶＰ３５コード配列に隣接する領域内に一以上のヌクレオチドの欠失を含む。ＧＰ／ｓＧＰコード配列内の変異は、予防的な又は治療的な異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列の挿入及びまた任意にＧＰ／ｓＧＰコード配列内に一以上のヌクレオチドの欠失を含む。第一の欠失部位の５００ヌクレオチド以内又は第一の欠失部位での挿入は、予防的な又は治療的な異種遺伝子産物をコードする。一の態様において、その組換えフィロウイルスは、例えば熱、一以上の化学物質、例えばホルムアルデヒド、ホルマリン、ベータ−プロピオラクトン、ジエチルピロカルボネート、酸化剤例えば過酸化水素、２−２’−ジチオジピリジン、バイナリエチレンイミン、グルタルアルデヒド又はガンマ線若しくはＵＶのような放射線照射を用いて、不活化される。
【００１０】
さらに提供されるものは組換えフィロウイルスの有効量を含む多価ワクチンであり、ここでその組換えフィロウイルスのゲノムはエボラウイルスＶＰ３０に対応するウイルスタンパク質のポリヌクレオチド配列において一以上のヌクレオチドの第一の欠失を含み、その欠失は組換えフィロウイルスによる細胞の感染時にエボラウイルスＶＰ３０に対応する機能的なウイルスタンパク質の発現を阻害することに効果的であり、そしてここでそのゲノムは一以上のフィロウイルスの糖タンパク質をコードする。そのゲノムはＮＰコード配列及びＶＰ３５コード配列に隣接する領域中の変異、ＧＰ／ｓＧＰコード配列内の変異、並びに／又は第一の欠失部位の５００ヌクレオチド内の若しくは第一の欠失部位での挿入、又はそれらの組み合わせを含みうる。ＮＰコード配列及びＶＰ３５コード配列に隣接する領域中の変異は、予防的な又は治療的な異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列の挿入並びにまた任意にＮＰコード配列及びＶＰ３５コード配列に隣接する領域内に一以上のヌクレオチドの欠失を含む。ＧＰ／ｓＧＰコード配列中の変異は、予防的な又は治療的な異種遺伝子産物のヌクレオチド配列の挿入並びにまた任意にＧＰ／ｓＧＰコード配列内に一以上のヌクレオチドの欠失を含む。第一の欠失部位の５００ヌクレオチド、例えば少なくとも１０００ヌクレオチド内にある又は第一の欠失部位でのその挿入は、予防的な又は治療的な異種遺伝子産物をコードする。一の態様において、ゲノムによりコードされる一つのフィロウイルスの糖タンパク質は、同種のフィロウイルスの糖タンパク質を含む。一の態様において、ゲノムによりコードされる一つのフィロウイルスの糖タンパク質は、異種のフィロウイルスの糖タンパク質を含む。一の態様において、その予防的な又は治療的な異種の遺伝子産物は糖タンパク質ではない。一の態様において、予防的な又は治療的な異種の遺伝子産物は糖タンパク質を含む。一の態様において、そのワクチンはさらにアジュバントを含む。一の態様において、そのアジュバントはリポ多糖を含む。一の態様において、そのアジュバントはスクアレンを含む。一の態様において、そのアジュバントはキラヤの抽出物を含む。一の態様において、そのアジュバントはサポニンを含む。一の態様において、そのワクチンはさらに医薬的に許容可能な担体を含む。一の態様において、ワクチン中の組換えフィロウイルスは不活化される。さらに提供されるものはそのワクチンの有効量を哺乳動物に投与することによる、哺乳動物、例えばヒトを免疫する方法である。例えば、フィロウイルス感染した個人と接触した又は、例えば実験室内で、不注意にフィロウイルスにさらされたヒトは、ヒトにおいてフィロウイルスの複製を阻害する又は持続的に排除する有効量において、組換えの感染性の、本発明の生物学的に封じ込められたウイルスを投与されうる。
【００１１】
そのようなウイルスを調製するために、マイナス鎖ＲＮＡウイルスにおける逆遺伝学的な機構を利用し、エボラΔＶＰ３０ウイルスと称される、そのＬ遺伝子の実質的な部分を欠いている、又は両方の遺伝子の実質的な部分を欠いている、（必須の転写因子をコードする）ＶＰ３０遺伝子の実質的な部分を欠失するエボラウイルスを産生した。エボラΔＶＰ３０ウイルスは遺伝的に安定に保持され、そしてＶＰ３０を発現する細胞株に生物学的に限定された。従って、そのエボラΔＶＰ３０ウイルスは、ワクチンウイルスのいくつかの基準を満たす：ヘルパー細胞において合理的により高いタイターに増殖され、（ＶＰ３０を発現するＶｅｒｏ細胞における連続した７継代後の配列分析により決定されるように）遺伝的に安定であり、そして安全である。さらに、その結果として得られるウイルスはそれらのライフサイクル、それらの形態、及びそれらの増殖特性において野生型のようであるようにみえるが、非ＢＳＬ−４実験室において取り扱われうり、エボラウイルスのライフサイクル及び有効な抗ウイルス化合物の同定の研究のための新たな機会を開いている。
【００１２】
他の一本鎖マイナス鎖ＲＮＡウイルスは同様に操作されうり、例えばニパウイルス、ヘンドラウイルス、へニパウイルス等はウイルス複製に要求される非構造的な又は非グリコシル化のウイルスタンパク質におけるそれらに対応する配列を変異又は欠失させるために操作されうる。それゆえ、以下の科におけるウイルスのゲノムは操作されうり、そのライフサイクル、形態、及び増殖特性において野生型のウイルスのようである、感染性の、生物学的に封じ込められたウイルスを提供し、ヘルパー細胞において合理的に高いタイターに増殖されうり、遺伝的に安定であり、そして安全である：ボルナウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科（マールブルグ属及びエボラウイルス属）、パラミクソウイルス科、アブラウイルス、ヘニパウイルス、モルビリウイルス、レスピロウイルス、又はルブラウイルス。
【００１３】
また、本開示は感染性の、生物学的に封じ込められた一本鎖マイナス鎖ＲＮＡウイルス、例えばフィロウイルスを調製する方法を提供する。一の態様において、本方法は（安定的に又は一過的に）発現した場合に感染性の、生物学的に封じ込められた一本鎖マイナスＲＮＡウイルスをもたらす、多数のウイルスベクターを有する宿主細胞、例えばＶｅｒｏ細胞を提供することを含む。一の態様において、複数のベクターはウイルスＤＮＡに作用可能式に連結されているプロモーターを含むｖＲＮＡ産生のためのベクターを含み、そのウイルスＤＮＡはエボラウイルスＶＰ３０に対応するウイルス遺伝子における配列の欠失を含み、その欠失は転写終結配列、及び上記に議論されるような異種配列の挿入に連結され、エボラウイルスＶＰ３０に対応する機能的なウイルスタンパク質の発現を阻害することに有効である。また、その宿主細胞は、ウイルスポリメラーゼをコードするＤＮＡ断片、ウイルスポリメラーゼ及び核タンパク質と共にウイルス複製に必要とされるウイルスタンパク質である一以上の他のウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ断片に作用可能式に連結されるプロモーターを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、並びに宿主細胞に異種であるＲＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡに作用可能式に連結されるプロモーターを含むベクターを含む。その異種ＲＮＡポリメラーゼは選択され、欠失を含むウイルスＤＮＡの転写を促進する。一の態様において、ｖＲＮＡのためのベクターはＴ７ポリメラーゼプロモーター及び転写を開裂でき、ｖＲＮＡ−様３’末端をもたらすリボザイム配列を含む。続いて感染性の、生物学的に封じ込められたウイルスを細胞より単離する。一の態様において、その宿主細胞は複数のベクターによって一過的にトランスフェクションされ、ウイルスはトランスフェクション後１、２、３及び最大７日以内に収集される。一の態様において、その宿主はワクチン産生のために承認されているものである。一の態様において、追加の異種配列は宿主細胞に実質的に導入される、及び／又はｍＲＮＡベクターを介して宿主細胞内に導入される、ｖＲＮＡベクターに又はｍＲＮＡベクターに含まれる。一の態様において、その追加の異種配列は病原体、ガン抗原、又は治療的なタンパク質の免疫原性のポリペプチド又はペプチドの用途である。
【００１４】
一の態様において、多価の感染性の、生物学的に封じ込められたフィロウイルスを調製する方法は提供される。その方法は宿主細胞内で発現した場合に、感染性の、生物学的に封じ込められたフィロウイルスをもたらすために効果的であり、ここで複数のベクターは、エボラウイルスＶＰ３０に対応する機能的なウイルスタンパク質の配列における欠失を含む、フィロウイルスのＤＮＡに作用可能式に連結されるプロモーターを含むｖＲＮＡ産生のためのベクターであって、その欠失が、転写終結配列、及び本明細書の上記に記載されるような他の配列であるベクター、フィロウイルスの核タンパク質をコードするＤＮＡ断片に作用可能式に連結されるプロモーターを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、エボラウイルスＶＰ３０に対応するフィロウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ断片に作用可能式に連結されるプロモーターを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、エボラウイルスＶＰ３５に対応するフィロウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ断片に作用可能式に連結されるプロモーターを含むｍＲＮＡ産生のためのベクター、並びに宿主細胞に異種であるＲＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡに作用可能式に連結されるプロモーターを含むｍＲＮＡ産生のためのベクターを含み、ここでその異種ＲＮＡポリメラーゼはその欠失を含むフィロウイルスＤＮＡからｖＲＮＡの転写を促進し；そして宿主細胞から感染性の、生物学的に封じ込められたフィロウイルスを単離することを含む。一の態様において、その細胞は哺乳動物の細胞である。一の態様において、その細胞は霊長類細胞である。一の態様において、その細胞はＶｅｒｏ細胞である。一の態様において、その異種ＲＮＡポリメラーゼはＴ３、Ｔ７、又はＳＰ６ポリメラーゼである。一の態様において、その遺伝子産物の配列は病原体、ガン抗原、又は治療的なタンパク質の免疫原性のポリペプチド又はペプチドをコードする。一の態様において、フィロウイルスタンパク質をコードするそれぞれのベクターは別々のプラスミド上にある。
【００１５】
さらに提供されるものは組換えフィロウイルス、例えばワクチン産物を製造する、例えばラージスケールで製造する方法である。その方法は、後代の組換えの生物学的に封じ込められたフィロウイルスをもたらすための細胞培養系の無血清培地において組換えフィロウイルスゲノムを発現する哺乳動物の細胞を培養することを含む。組換えフィロウイルスのゲノムは、エボラウイルスＶＰ３０に対応するウイルスタンパク質におけるポリヌクレオチド配列中に一以上のヌクレオチドの欠失を含み、そしてここでその欠失はその組換えフィロウイルスによる細胞の感染時にエボラウイルスＶＰ３０に対応する機能的なウイルスタンパク質の発現を阻害するために効果的である。一の態様において、その無血清培地は、非動物性のタンパク質又はペプチド、例えば植物性のタンパク質又はペプチド、イオンキレート剤、例えばＥＤＴＡ、硝酸第二鉄、硫酸第一鉄、又はトランスフェリン、又はそれらの組み合わせを含む。後代を有する哺乳動物の細胞から上清は収集され、ＤＮａｓｅ及びウイルス不活化剤、例えばベータ−プロピオラクトン、熱、ホルムアルデヒド、ガンマ線、又はヒドロキシルアミンと接触され、それによって不活化したウイルス調製物を提供する。その不活化したウイルス調製物を続いて精製し、濃縮し、脱塩し、及び／又は他の分子から、例えば濾過を介して、不活化したウイルス粒子の、例えば任意に裸眼で目に見える沈殿をもたらさない条件下で画分化する。
【００１６】
一の態様において、その哺乳動物の細胞はＶｅｒｏ細胞である。一の態様において、その収集した上清は、ＤＮａｓｅ又はそのウイルスの不活化剤との接触前に、濾過のような分離を受ける。一の態様において、その収集した上清は０．５から５ミクロンのフィルター又は１から５ミクロンのフィルターによって濾過を受ける。一の態様において、その収集した上清は０．０１から１ミクロンのフィルター又は０．０５から０．２５ミクロンのフィルターによって濾過を受ける。一の態様において、その不活化したウイルス調製物は０．０１から１ミクロンのフィルター又は０．０５から０．２５ミクロンのフィルターによって濾過を受ける。一の態様において、その不活化したウイルス調製物を一以上のアジュバントと組み合わせる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】エボラΔＶＰ３０コンストラクトの体系図。プラスセンス方向の（上列）リーダー配列（ｌ）及びトレーラー配列（ｔ）に隣接したエボラウイルスゲノムの体系図。ＳａｌＩ及びＳａｃＩ（それぞれ、ウイルスアンチゲノムの位置６１８０及び１０９４２）における二つの独特な制限酵素部位は、ＶＰ３０遺伝子に及ぶ断片のサブクローニングを認めた。そのサブゲノムの断片を続けて用いて、ＶＰ３０遺伝子とネオマイシン（ｎｅｏ）又は高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）をコードする遺伝子とをそれぞれ置換した。独特な制限酵素部位を用いて、その変化したサブゲノムの断片を増殖し全長のエボラウイルスのｃＤＮＡコンストラクトに戻した。
【００１８】
【図２】代表的なフィロウイルス配列（受け入れ番号  ＮＣ００６４３２、ＮＣ００４１６１、ＡＹ７６９３６２、ＡＹ１４２９６０、ＡＦ５２２８７４、ＡＦ４９９１０１、Ｌ１１３６５、ＮＣ００１６０８、ＤＱ４４７６５２、ＤＱ４４７６４９、ＡＢ０５０９３６、ＮＣ００２５４９、ＮＣ００１６０８、ＡＦ０８６８３３及びＡＦ２７２００１、それらの開示は本明細書で参照によって取り込まれる；ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏｓ．１〜１５及び１８〜４０）。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
定義
「ベクター」又は「コンストラクト」（遺伝子送達の又は遺伝子転移の「ビヒクル」として時々称される）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかにおいて、宿主細胞へ送達されるポリヌクレオチド又はウイルスを含む巨大分子又は分子の複合体を意味する。送達されるポリヌクレオチド又はウイルスは遺伝子療法に関心のあるコード配列を含みうる。ベクターは例えば、ウイルスベクター（例えば、フィロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、ヘルペスウイルス及びレトロウイルス）、リポソーム及び他の脂質を含む複合体、そして宿主へポリヌクレオチドの送達を仲介することのできる他の巨大分子複合体を含む。また、ベクターは遺伝子送達及び／若しくは遺伝子発現をさらに調節する、又は一方で有利な特性を標的細胞へと提供する他の成分又は機能性を含みうる。そのような他の成分は、例えば（細胞型又は組織特異的な結合を媒介する成分を含む）細胞に結合すること又は細胞を標的とすることに影響する成分；細胞によるベクター核酸の取り込みに影響する成分；（核の局在化を仲介する試薬のような）取り込み後に細胞内にポリヌクレオチドの局在化に影響する成分；並びにポリヌクレオチドの発現に影響する成分を含む。また、そのような成分は、マーカー、例えばベクターによって送達される核酸を取り込み、発現する細胞のための検出する又は選択するために使用されうる検出可能な及び／又は選択可能なマーカーを含むと考えられる。そのような成分は（結合及び取り込みを仲介する成分若しくは機能性を有するあるウイルスベクターの使用のような）そのベクターの天然の特徴として提供されうり、又はベクターは調製されうりそのような機能性を提供する。多種多様のそのようなベクターは当該分野で既知であり、一般的に利用可能である。ベクターが宿主細胞内に維持されている場合に、そのベクターは自律的な構造として有糸分裂中に細胞により安定的に複製されるか、宿主細胞のゲノム内に取り込まれるか、又は宿主細胞の核又は細胞質内に維持されるかのいずれかでありうる。
【００２０】
「組換えウイルスベクター」は欠失、挿入及び／又は異種遺伝子若しくは配列を含む、一以上の修飾を含むウイルスベクターを意味する。多くのウイルスベクターはパッケージングと関連したサイズ制限を示すので、その異種の遺伝子又は配列はウイルスゲノムの一以上の部分を置換することによって典型的に導入される。そのようなウイルスは（生物学的に封じ込められた）複製欠失になりうり、（例えば、複製及び／又はキャプシド形成のための必要な遺伝子を運搬するヘルパーウイルス又はパッケージング細胞株を用いることによって）ｉｎ  ｔｒａｎｓに提供される欠失した機能を求められる。また、送達されるポリヌクレオチドがウイルス粒子の外側に運搬される修飾したウイルスベクターは記載されている。
【００２１】
（時々、「遺伝子導入」と称される）本明細書で用いられる「遺伝子送達」、「遺伝子転移」等の用語は、その導入のための用いられる方法と無関係な、宿主細胞内への外的なポリヌクレオチドの導入を意味している。そのような方法は、様々な周知の技術、（例えばウイルス感染／トランスフェクション、又は様々な他のタンパク質に基づいた若しくは脂質に基づいた遺伝子送達複合体によって）例えばベクターを仲介した遺伝子転移及び「裸の」ポリヌクレオチドの送達を促進する技術（例えばエレクトロポレーション、「遺伝子銃」送達及びポリヌクレオチドの導入のための様々な他の技術）を含む。その導入したポリヌクレオチドは宿主細胞において安定又は一過性で維持されうる。安定的な維持は典型的に導入したポリヌクレオチドが宿主細胞と適合する複製開始点を含むことか、染色体外のレプリコン（例えばプラスミド）若しくは核若しくはミトコンドリア染色体のような宿主細胞のレプリコン内に組み込むことのいずれかを必要とする。多くのベクターが哺乳動物の細胞へ遺伝子の移転を仲介することができることは当該分野で既知である。
【００２２】
「遺伝子導入」に関しては、策略により細胞内に一過的に又は恒久的に挿入される任意の核酸分子（例えば、ＤＮＡ）を意味し、そしてゲノム又は染色体外に維持されるものへ組み込まれる場合に、組織の一部になる。そのような遺伝子導入は、組織内の内在性の遺伝子への部分的に又は全体的に異種の（すなわち外来の）遺伝子の少なくとも一部のオープンリーディングフレームを含みうり、その部分は全長のポリペプチドと対応するような実質的に同じ活性を有するポリペプチド又は対応する全長のポリペプチドの少なくとも一つの活性を任意にコードする。
【００２３】
「トランスジェニック細胞」に関しては、遺伝子導入を含む細胞を意味する。例えば、発現カセットを含むベクターによって安定的に又は一過的に形質転換した細胞は、表現型の特徴を変化している細胞の集団を産生するために用いられうるトランスジェニック細胞である。「組換え細胞」は遺伝的に修飾されたもの、例えば遺伝的な操作することによる非組換え細胞内の配列の挿入、欠失又は置換である。
【００２４】
「野生型」又は「天然」という用語は天然的に生じる原料より単離された場合に遺伝子又は遺伝子産物の特徴を有する遺伝子又は遺伝子産物を意味する。野生型の遺伝子は集団において最も頻繁に観察されるものであり、その遺伝子の「通常の」又は「野生型」の形態をそれゆえ任意に命名される。対照に、「修飾した」又は「変異型」は、野生型の遺伝子又は遺伝子産物と比較した場合に、配列及び／又は機能的な特性（すなわち変化した特徴）の修飾を示す遺伝子又は遺伝子産物を意味する。天然に生じる変異は単離されうることが知られており；これらはそれらが野生型の遺伝子又は遺伝子産物と比較した場合に特徴を変化する事実により同定される。
【００２５】
「形質導入」という用語は、ウイルスベクター及び好ましくは複製欠失のウイルスベクターを介する、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかの受容細胞へのポリヌクレオチドの送達を示す。
【００２６】
それが核酸配列、例えばタンパク質及び制御配列をコードする遺伝子配列と関連しているので、「異種」という用語は、例えば（例えばウイルス由来の配列が非感染細胞のゲノム内の配列に異種である）異なる起源からの、共に正常に連結されない及び／又は正常に特定の細胞と関連しない配列を示す。それゆえ核酸コンストラクト又はベクターの「異種」領域は、天然において他の分子との関連において見られない別の核酸分子内の又は核酸分子に接着する核酸の断片である。例えば、核酸コンストラクトの異種領域は天然におけるコード配列との関連において見られない配列、すなわち異種のプロモーターに隣接するコード配列を含むと考えられる。異種コード配列の別の例は、（例えば、コドンを有する合成配列がネイティブの遺伝子から異なる）コード配列それ自身が天然に見られないコンストラクトである。同様に、正常に存在しないコンストラクトによって形質転換した細胞は、本発明の目的において異種であると考えられる。
【００２７】
「ＤＮＡ」は線状ＤＮＡ分子（例えば制限酵素断片）、ウイルス、プラスミド、及び染色体における、とりわけ、発見された二重鎖又は一重鎖型におけるデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン、又はシトシン）由来の重合体の形状を意味する。特定のＤＮＡ分子の構造を議論することにおいて、配列は非転写ＤＮＡ鎖（すなわち、ｍＲＮＡに相補的な配列を有する鎖）に沿って５’から３’方向への配列においてのみ与える通常の慣習に従い本明細書に記載されうる。捕捉分子という用語は、４つの塩基であるアデニン、グアニン、チミン、又はシトシン、及び当該分野で既知の塩基類似体を含む分子を含む。
【００２８】
本明細書に用いられるように、「相補的な」又は「相補性」という用語は塩基対合則によって関連したポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）に参照において用いられる。例えば、「Ａ−Ｇ−Ｔ」配列は「Ｔ−Ｃ−Ａ」配列と相補性がある。相補性は、ある核酸の塩基のみが塩基対合則に従って適合される、「部分的」でありうる。又は、これらは核酸間で「完全」若しくは「全体的に」相補性がありうる。核酸鎖間の相補性の度合いは核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度の著しい効果を有する。これは増幅反応における特定の重要性、及び核酸間の結合に依存する検出方法である。
【００２９】
ＤＮＡ分子は、モノヌクレオチドが一つのモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸基がリン酸ジエステル結合を介して一方向においてその近くの３’酸素原子に接着される方法において、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドへ到達されるので、５’末端及び３’末端を有すると考えられている。それゆえ、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの末端は、その５’リン酸基がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素と連結しない場合にその５’末端として、その３’酸素が連続したモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸と連結しない場合にその３’末端として称される。本明細書で用いられるように、核酸配列は、たとえより大きなオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの内部だとしても、また５’及び３’末端を有すると考えられうる。線状又は環状のＤＮＡ分子のいずれにおいて、別々の因子が「下流」又は３’の因子の「上流」又は５’であるように称される。この用語法は転写がＤＮＡ鎖に沿って５’から３’への方法で進行する事実を反映する。連結される遺伝子の転写を指揮するプロモーター及びエンハンサー因子は一般的にコード領域の５’又は上流に局在化される。しかしながら、エンハンサー因子はこれらの効果をプロモーター因子及びコード領域の３’に局在化される場合で働かしうる。転写終結及びポリアデニル化シグナルはコード領域の３’又は下流に局在化される。
【００３０】
特定のタンパク質を「コード化」する、「遺伝子」「ポリヌクレオチド」「コード領域」「配列」「断片」又は「遺伝子導入」は転写され、また任意に遺伝子産物に翻訳される核酸分子、例えば、適当な制御配列の制御下で置かれる場合のｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏのポリペプチドである。そのコード領域はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はＲＮＡ型のいずれかにおいて存在しうる。ＤＮＡ型において存在する場合に、その核酸分子は一本鎖（すなわちセンス鎖）又は二本鎖でありうる。コード領域の境界は５’（アミノ）末端での開始コドン及び３’（カルボキシ）末端での翻訳停止コドンによって決定される。遺伝子は、これらに限定されないが原核生物の又は真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、原核生物の又は真核生物のＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、並びに合成ＤＮＡ配列を含む。転写終結配列は遺伝子配列のたいてい３’に位置するだろう。
【００３１】
「制御因子」という用語は、まとめると、プロモーター領域、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流制御ドメイン、複製開始点、配列内リボソーム進入部位（「ＩＲＥＳ」）、エンハンサー、スプライスジャンクション等を意味し、それらはまとめると複製、転写、転写後プロセシング及び受容細胞のコード配列の転写を提供する。選択されるコード配列が適当な宿主細胞において複製、転写、翻訳可能である限り、これらの制御因子の全てがいつも存在しているわけではない。
【００３２】
その通常の意味において、本明細書において用いられる「プロモーター」という用語は、ＤＮＡ制御配列を含むヌクレオチド領域を意味し、ここでその制御配列はＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始することができる遺伝子より由来する。
【００３３】
「エンハンサー」に関しては、プロモーターに近接して位置する場合に、核酸配列を意味し、エンハンサードメインの不在下でプロモーターに起因する転写活性に対して増加した転写活性を与える。
【００３４】
核酸分子への参照による「作用可能式に連結される」に関しては、二以上の核酸分子（例えば、転写される核酸分子、プロモーター、及びエンハンサー因子）は、核酸分子の転写を認めるような方法において、連結される。ペプチド及び／又はポリペプチド分子への参照による「作用可能式に連結される」は、二以上のペプチド及び／又はポリペプチド分子が単一のポリペプチド鎖、すなわち、その融合の各ペプチド及び／又はポリペプチド成分の少なくとも一つの特性を有する、融合ポリペプチドをもたらすような方法において、連結されることを意味する。その融合ポリペプチドは好ましくはキメラであり、すなわち異種分子により構成される。
【００３５】
「ホモロジー」は二つのポリヌクレオチド又は二つのポリペプチド間で同じ割合を意味する。一つの配列と別の配列との間の一致は、当該分野で既知の技術によって決定されうる。例えば、配列情報を調整すること及び容易に利用可能なコンピュータープログラムを用いることにより二つのポリペプチド分子間の配列情報の直接比較によってホモロジーは決定されうる。一方で、ホモロジーは、相同的な領域間で安定的な二本鎖を形成する条件下でポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって、続けて一本鎖特異的なヌクレアーゼによる消化、そして消化した断片のサイズ決定によって決定されうる。上記の方法を用いることで決定されるように、二つのＤＮＡ、又は二つのポリペプチド、配列はヌクレオチド、又はアミノ酸の少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、及び最も好ましくは少なくとも約９５％がそれぞれ定義された分子の長さにわたり適合する場合に、お互いに「実質的に相同的」である。
【００３６】
「哺乳動物」に関しては、これらに限定されないが、ヒト及びヒト以外の霊長類、例えば、チンパンジー及び他の類人猿及びサルの種；家畜、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ及びウマ；飼育動物、例えばイヌ及びネコ；げっ歯類を含む実験動物、例えばマウス、ラット、ウサギ及びモルモット等を含む哺乳類の任意の一員を意味する。
【００３７】
「由来した」に関しては、核酸分子が親核酸分子より作製される又は設計されることのいずれかを意味し、その誘導体は、例えば、それが作製される又は設計される親核酸分子によってコードされる遺伝子産物と実質的に同じ活性を有する遺伝子産物をコードする、親核酸分子の同じ機能的な特徴を実質的に保持している。
【００３８】
「発現コンストラクト」又は「発現カセット」に関しては、転写を指揮可能である核酸分子を意味する。発現コンストラクトは、少なくともプロモーターを含む。追加の因子、例えばエンハンサー、及び／又は転写終結シグナルは、含まれうる。
【００３９】
「外因性」という用語は、細胞又は組織内のタンパク質、遺伝子、核酸、又はポリヌクレオチドに関して用いられる場合に、人工的な又は天然の方法によって細胞又は組織に導入されているタンパク質、遺伝子、核酸、又はポリヌクレオチドを意味する。外因性の核酸は異なる組織若しくは細胞より由来しうり、又は組織又は細胞内に天然に生じる一以上の追加の核酸のコピーでありうる。非制限的な例として、染色体位置内の外因性の核酸は天然細胞のそれと異なり、又は別の方法では、天然に見られる異なる核酸配列に隣接される。
【００４０】
「単離した」という用語は、核酸、ペプチド、ポリペプチド又はウイルスに関して用いられる場合に、少なくとも一つの混入物の核酸、ポリペプチド、例えばｉｎ  ｖｉｖｏの物質に関連せず、又は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの物質より実質的に精製されるので、その天然の原料と一般的に関連されるものを含む他の生物学的な成分から同定される及び分離される核酸配列、ペプチド、ポリペプチド又はウイルスを意味する。単離した核酸、ペプチド、ポリペプチド又はウイルスは天然に見られるもののそれから異なるものの形態において存在し又は配置する。例えば、与えられるＤＮＡ配列（例えば、遺伝子）は隣接する遺伝子に近接する宿主の染色体に見られ、；ＲＮＡ配列、例えば、特定のタンパク質をコードする特定のｍＲＮＡ配列は多数のタンパク質をコードする多数の他のｍＲＮＡによる混合物として細胞内に見られる。その単離した核酸分子は一本鎖又は二本鎖の形態において存在しうる。単離した核酸分子がタンパク質を発現するために利用される場合に、その分子は少なくともセンス鎖又はコード鎖を含むだろう（すなわちその分子は一本鎖でありうる）が、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方を含みうる（すなわちその分子は二本鎖でありうる）。
【００４１】
本明細書で用いられるように、「組換え核酸」又は「組換えＤＮＡ配列、分子又は断片」という用語は、連続して化学的にｉｎ  ｖｉｔｒｏで変化されうる原料より由来した又は単離した核酸、例えばＤＮＡを意味し、これらに限定されないが、それらが天然のゲノムに位置されると考えられるように位置しない、天然に生じる、天然に生じない、又は天然に生じる配列と対応する配列含む。原料より「由来した」ＤＮＡの例は、有用な断片として定義されるＤＮＡ配列であると考えられ、そして続いて本質的にその物質だけが科学的に合成される。原料より「単離した」そのようなＤＮＡの例は、化学的な手法によって、例えば、制限エンドヌクレアーゼの使用によって、本発明の使用において、遺伝子操作の方法論により、例えば増幅のようなさらに操作されうるための、前記原料より削除又は除去される有用なＤＮＡ配列であると考えられる。
【００４２】
本明細書で用いられる「組換えタンパク質」又は「組換えポリペプチド」という用語は、組換えＤＮＡ分子より発現されるタンパク質分子を意味する。
【００４３】
「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、特に区別のない限り、本明細書において交換可能に用いられる。
【００４４】
「配列ホモロジー」という用語は、二つの核酸配列間の塩基適合の割合又は二つのアミノ酸配列間のアミノ酸の適合の割合を意味する。配列ホモロジーはパーセンテージ、例えば５０％として表現され、そのパーセンテージはいくつかの他の配列と比較される選択される配列の長さにわたる適合の割合を示す。（二つの配列のいずれかにおいて）ギャップは適合することを最大にすることを認められる；１５塩基以下のギャップ長をたいてい使用し、好ましくは６塩基以下、より好ましくは２塩基以下を用いる。プローブ又は治療としてオリゴヌクレオチドを用いる場合、標的核酸とそのオリゴヌクレオチド配列との配列ホモロジーは、一般的に２０のありうるオリゴヌクレオチド塩基対適合のうち１７以上の標的塩基適合である（８５％）；好ましくは１０のありうる塩基対適合のうち９以上の適合（９０％）、そしてより好ましくは２０のありうる塩基対適合のうち１９以上の適合（９５％）である。
【００４５】
「選択的にハイブリダイズする」という用語は、検出できるほどの、特異的に結合することを意味する。ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及び本発明の断片は、非特異的な核酸への検出可能な結合の適当量を最小化するハイブリダイゼーション及び洗浄工程下で核酸鎖に選択的にハイブリダイズする。高いストリンジェンシーの状態は、当該分野で既知であり、そして本明細書で議論されるように選択的なハイブリダイゼーション条件を成し遂げるために用いられうる。一般的に、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、及び本発明の断片と、関心のある核酸配列との間の核酸の配列ホモロジーは、少なくとも６５％であり、そしてより典型的に、好ましくは少なくとも約７０％、約９０％、約９５％、約９８％、及び１００％のホモロジーを増加することを有する。
【００４６】
二つのアミノ酸配列は、それらの配列間の部分的な又は完全な同一性がある場合に、相同的である。例えば、８５％のホモロジーは、二つの配列が最大の適合において配列される場合に、８５％のアミノ酸が同一であることを意味する。（適合される二つの配列のいずれかにおける）ギャップは適合を最大にすることを認められる；５以下のギャップ長が好ましく、２以下がより好ましい。代わりに、そして好ましくは、二つのタンパク質の配列（又は少なくとも３０アミノ酸の長さのそれらに由来したポリペプチド配列）は、本明細書で用いられるこの用語のように、それらが、変異データマトリックス及び６以上のギャップペナルティによるＡＬＩＧＮプログラムを用いて（標準偏差単位における）５以上の配列スコアを有する場合に、相同的である。その二つの配列又は部分は、任意にＡＬＩＧＮプログラムを用いて配列される場合に、より好ましくは、それらのアミノ酸が５０％以上同じである場合に、相同的である。
【００４７】
本明細書で用いられる「対応する」という用語は、ポリヌクレオチド配列が、ポリペプチド若しくはその相補体をコードする参照のポリヌクレオチド配列の全部若しくは一部に相同的である（例えば、同一であり、厳密に進化的に関連しない）こと、又はポリペプチド配列が参照ポリペプチド配列と配列又は機能において同一であることを意味する。例示のために、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は参照配列「ＴＡＴＡＣ」に対応し、そして参照配列「ＧＴＡＴＡ」に相補的である。
【００４８】
二つ以上のポリヌクレオチド間の配列の相関を記載するために以下の用語は用いられる：「参照配列」、「比較ウインドウ」、「配列相同性」、「配列相同性のパーセンテージ」、及び「実質的な相同性」。「参照配列」は、配列比較において基礎として用いられる定義した配列である；参照配列はより長い配列のサブセット、例えば、全長のｃＤＮＡの断片若しくは配列表内に与えられる遺伝子配列としてありうり、又は完全なｃＤＮＡ若しくは遺伝子配列を含みうる。一般的に、参照配列は少なくとも２０ヌクレオチド長であり、しばしば少なくとも２５ヌクレオチド長であり、そして往々にして少なくとも５０ヌクレオチド長である。二つのポリヌクレオチドは、それぞれ（１）二つのポリヌクレオチド間で同様である配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の部分）を含み、そして（２）さらに二つのポリヌクレオチド間で異なる配列を含みうり、二つ（以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は、部分的な領域の配列類似性を同定及び比較するための「比較ウインドウ」にわたり典型的に二つのポリヌクレオチドの配列を比較することによって実施される。
【００４９】
本明細書で用いられる「比較ウインドウ」は、少なくとも２０の近接しているヌクレオチドの概念的なセグメントを意味し、ここで比較ウインドウ内のポリヌクレオチド配列の部分は、二つの配列の最適なアラインメントのための、（追加又は欠失を含まない）参照配列と比較して２０パーセント以下の追加又は欠失（すなわちギャップ）を含みうる。最適な比較ウインドウを調節するための配列アラインメントは、部分的なホモロジーアルゴリズム用いることによって若しくは同様の方法のためのサーチによって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化したインプリメンテーション（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ）によって又は検査によって行い、そして様々な方法によって作成される最善のアラインメント（すなわち比較ウインドウにわたりホモロジーの最も高いパーセンテージをもたらすこと）を選択する。
【００５０】
「配列相同性」という用語は二つのポリヌクレオチド配列が比較のウインドウにわたり（すなわちヌクレオチドごとに基づいて）同一であることを意味する。「配列相同性のパーセンテージ」という用語は、二つのポリヌクレオチド配列が比較のウインドウにわたり（すなわちヌクレオチドごとに基づいて）同一であることを意味する。「配列相同性のパーセンテージ」という用語は、比較のウインドウにわたり二つの最適に整列した配列を比較することによって計算され、適合した位置の数をもたらす両方の配列において生じる同一の核酸塩基（例えばＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、又はＩ）の位置の数を決定し、比較のウインドウ内の位置の総数（すなわちウインドウサイズ）によって適合した位置の数を分け、そして１００まで結果を増加し配列相同性のパーセンテージをもたらす。本明細書で用いられる「実質的な相同性」という用語は、ポリヌクレオチド配列の特徴を示し、ここでそのポリヌクレオチドは、少なくとも２０のヌクレオチド位置の比較ウインドウにわたり、しばしば少なくとも２０〜５０のヌクレオチドのウインドウにわたり、参照配列と比較して、少なくとも８５パーセントの配列相同性、好ましくは少なくとも９０〜９５パーセントの配列相同性、さらにたいてい少なくとも９９パーセントの配列相同性を有する配列を含み、ここで配列相同性のパーセンテージは、比較のウインドウにわたり合わせて２０パーセント以下の参照配列の欠失又は追加を含みうるポリヌクレオチド配列と参照配列とを比較することによって計算される。
【００５１】
ポリペプチドに適用されるように、「実質的な相同性」という用語は、デフォルトのギャップの重みを用いて、例えばＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴプログラムによって、至適に整列される、二つのペプチド配列を意味し、少なくとも約８０％の配列相同性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列相同性、より好ましくは少なくとも約９５％の配列相同性、そして最も好ましくは少なくとも約９９％の配列相同性を共有する。
【００５２】
「防御免疫反応」及び「予防の免疫反応」は交換可能に用いられ、個人が曝露されていないイムノゲンを標的にし、又は疾病を有しない個人の疾病、例えば癌を有しない患者における癌関連タンパク質に関わるタンパク質を標的にする免疫反応を意味する。
【００５３】
「治療的な免疫反応」は個人が暴露されていないイムノゲン又はその疾病を有する個人における疾病と関連するタンパク質を標的にする免疫反応を意味する。
【００５４】
「予防有効量」という用語は、感染性因子の場合において、感染を発生することから個人を防止し、そして疾病の場合において、疾病を発生することから個人を防止する必要な量を意味することを意味する。
【００５５】
「治療有効量」という用語は、感染性因子の場合において、症状を減らし、又は感染を排除するための感染した個人の感染のレベルを減少させ、そして疾病の場合に、症状を減らし、又は個人を治療する必要な量を意味することを意味する。
【００５６】
「イムノゲンに対する免疫反応を減少する」は、ナイーブな個人における免疫反応の誘導及びイムノゲンに前もってさらされた個人における免疫反応の誘導であって、ここでイムノゲンに対するその免疫反応は促進されることを言及することを意味する。
【００５７】
本明細書で用いられるように、「実質的に純な」は対象の種類が存在する主な種類である（すなわち、モルに基づき、組成物中の任意の他の個々の種類よりもより豊富である）ことを意味し、好ましくは実質的に精製される画分が、その対象の種類が存在する全ての巨大分子の種の少なくとも（モルに基づき）約５０パーセントを含む組成物である。一般的に、実質的に純な組成物は、組成物中に、存在する全ての巨大分子種の約８０パーセント以上、より好ましくは約８５％、約９０％、約９５％、及び約９９％を含むだろう。最も好ましくは、その対象の種が、必要な均一性に精製され、（組成物中に混入物の種を慣習的な検出方法によって検出することができず、）ここでその組成物は本質的に単一の巨大分子種からなる。
【００５８】
本明細書で用いられる「トランスフェクションした」、「形質転換した」、又は「遺伝子導入した」は、任意の宿主細胞又は細胞株を含み、それは少なくとも一つの組換えＤＮＡ配列の存在により変化している、又は増大している。本発明の宿主細胞は、単離される線状ＤＮＡ配列のように、プラスミド発現ベクター内のＤＮＡ配列によるトランスフェクションによって、又は組換えウイルスベクターによる感染によって典型的に産生される。
【００５９】
本発明の例示的なウイルス及び方法
本発明は、単離したベクター、例えば、変異の一本鎖マイナス鎖ＲＮＡウイルスにおける配列に対応する、一本鎖マイナス鎖ＲＮＡウイルスのタンパク質をコードする及び／又は組換えの核酸からのｖＲＮＡを発現する、プラスミドを提供する。細胞内に導入される場合に、これらのベクターの組み合わせは組換えの、感染性の、生物学的に封じ込められたウイルスを生じることが可能である。それゆえ、本発明は本発明の組換えの、感染性の、生物学的に封じ込められたウイルスを産生する宿主細胞を含む。一の態様において、本発明は単離したベクター、例えば、フィロウイルスタンパク質をコードする及び／又は変異のフィロウイルスｖＲＮＡを発現するプラスミドを提供し、細胞内に導入される場合、それらは組換えの感染性の、生物学的に封じ込められたフィロウイルスをもたらすことが可能である。本発明は、本明細書に開示される方法によって調製されたヘルパー細胞、及び単離した組換えのフィロウイルスを含む、組換えの感染性の、生物学的に封じ込められたフィロウイルスを一過的に又は安定に産生する宿主細胞を含む。
【００６０】
本発明のベクターはｍＲＮＡ産生及びｖＲＮＡ産生のためのベクターを含む。一の態様において、そのベクターはフィロウイルスＤＮＡを含み、例えば、フィロウイルスタンパク質をコードする一以上のオープンリーディングフレームに対応する配列を有するｍＲＮＡ産生のためのベクター、又は、少なくとも一つのオープンリーディングフレームの部分に対応する内部のフィロウイルス配列の欠失を含む、全長ゲノム配列の欠失を含むｖＲＮＡ産生のためのベクターを含む。ｖＲＮＡベクターより産生したＲＮＡをフィロウイルスタンパク質の存在下でウイルス粒子内にパッケージすることができるが、結果として生じるウイルス粒子の部分として、複製することができず、他のものがフィロウイルスの複製をサポートする細胞内に導入された場合にウイルス産生をもたらさず、そしてその細胞は、例えば、フィロウイルスヘルパー細胞でない細胞において、ｉｎ  ｔｒａｎｓで少なくとも一つのフィロウイルスタンパク質を発現しない。
【００６１】
例えば、エボラウイルスは、七つの構造タンパク質及び少なくとも一つの非構造タンパク質をコードする約１９キロベースの長さのマイナス鎖の、非分割型のＲＮＡゲノムを有する（Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。ＮＰ、ウイルスタンパク質（ＶＰ）３５、ＶＰ３０、及びＬ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、ウイルス複製及び転写に含まれるヌクレオカプシドの成分である（Ｍｕｈｌｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。ＶＰ４０はマトリックスプロテインであり、ウイルス出芽に含まれる（Ｈａｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｐａｎｃｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ＶＰ２４はＮＰ、ＶＰ３５及びウイルスＲＮＡで構成されるヌクレオカプシドの形成に含まれる（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。ウイルス表面糖タンパク質の、ＧＰのみがウイルス接着及び侵入における役割を果たす（Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｍａｎｉｃａｓｓａｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｓｈｉｍｏｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｃｈａｎｄｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。欠失／変異／挿入及び異種配列による任意の置換のための候補の配列は、これらに限定されないが、エボラウイルスＶＰ３０配列又は他の一本鎖マイナス鎖ＲＮＡウイルス、例えば、非構造的な、非ポリメラーゼ及び／又は非グリコシル化のウイルスタンパク質の配列、又は非コード領域内の配列に対応する配列を含む。そのベクターは、フィロウイルスのような一本鎖マイナス鎖ＲＮＡウイルス（異種配列）のベクター以外のその遺伝子又は部分を含みうり、タンパク質として又はｖＲＮＡ内への組み込みのいずれかで、その遺伝子又は部分を宿主細胞内で発現することを目的とする。それゆえ、本発明のベクターは、ウイルス配列の追加、例えば、フィロウイルス配列、関心のある遺伝子又はオープンリーディングフレーム、例えば、ワクチン又は治療的なタンパク質のような有用な免疫原性ペプチド又はタンパク質のための異種遺伝子を含みうる。
【００６２】
一以上のベクターが用いられる場合に、そのベクターは物理学的に連結されうる又はそれぞれのベクターは個々のプラスミド若しくは他の、例えば線状の核酸送達ビヒクルに存在しうる。そのベクター又はプラスミドは任意の宿主細胞、例えば、ウイルス複製をサポートする真核細胞、例えば哺乳動物細胞に導入されうる。本発明のウイルスを調整するために有用な宿主細胞は、これらに限定されないが、昆虫、トリ、又は哺乳類の宿主細胞、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、又はサル若しくはヒト細胞を含む霊長類細胞を含む。一の態様において、宿主細胞はワクチン産生に承認されたものである。
【００６３】
本明細書に記載される方法によって産生されるウイルスは、（例えば、ＡＩＤＳ、インフルエンザ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ライノウイルス、フィロウイルス、マラリア、ヘルペス、及び口蹄疫のための）ウイルスの変異原性の研究、薬物スクリーニング及びワクチンの産生並びに（例えば、ガン、ＡＩＤＳ、アデノシンデアミナーゼ、筋ジストロフィー、オルニチントランスカルバミラーゼ欠失症及び中枢神経系腫瘍のための）遺伝子療法のベクターにおいて有用である。特に、強力な体液性及び細胞性免疫を誘導する本発明の感染性の、生物学的に封じ込められたフィロウイルスは、感染性の組換えウイルスを発生させる可能性が低いので、ワクチンベクターとして用いられうる。
【００６４】
それゆえ、薬物療法における使用のための（例えば、ワクチン又は遺伝子療法のための）ウイルスは提供される。例えば、本発明は病原体、例えば微生物、エボラウイルスのようなウイルス、又は寄生虫、又は悪性腫瘍に対して動物を免疫する方法を提供する。その方法は、少なくとも一つのコード及び発現する本発明の単離したウイルスの有効量を動物に投与すること、又は、動物に免疫するために効果的な、病原体若しくは腫瘍の免疫原性ペプチド又はタンパク質のための核酸を、任意にアジュバントと組み合わせて含む。
【００６５】
本発明の形質転換のための発現カセットの調製のために、その組換えＤＮＡ配列又は断片は環状又は線状の、二本鎖又は一本鎖でありうる。関心のある遺伝子産物をコードするｍＲＮＡ配列に実質的に相補的であるＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列は、反対の向き（すなわち、５＿から３＿よりむしろ３＿から５＿）においてカセット内にクローニングされる典型的に「プラス」ＤＮＡ配列である。また、一般的に、そのＤＮＡ配列又は断片は、細胞内のＤＮＡの発現を促進するコントロールの配列に隣接したコード領域を含みうる、プラスミドＤＮＡのような、キメラＤＮＡの形態である。本明細書に用いられる、「キメラの」はベクターが少なくとも二つの異なる種由来のＤＮＡを含み、又は同一の種由来のＤＮＡを含むことを意味し、それらは「天然」又は野生型の種において生じない方法において連結される又は関連される。
【００６６】
転写単位、又はその部分として寄与するＤＮＡ配列だけでなく、ＤＮＡの部分は非転写でありうり、制御的な又は構造的な機能に寄与する。例えば、そのＤＮＡはそれ自身が真核細胞、例えば、哺乳動物細胞内で、又はある細胞型において活性であるプロモーターを含みうり、又はリンパ球向性のウイルスの形質転換の標的であるゲノム内に既に存在するプロモーターを利用しうる。そのようなプロモーターはＣＭＶプロモーター、及びＳＶ４０後期プロモーター、及びレトロウイルス性のＬＴＲｓ（長い末端反復配列）、例えばＭＭＴＶ、ＲＳＶ、ＭＬＶ又はＨＩＶのＬＴＲを含むが、当該分野で既知の多くの他のプロモーター配列が本発明の実行において用いられうる。
【００６７】
また、宿主細胞内で機能的な他のエレメント、例えばイントロン、エンハンサー、ポリアデニル化配列等は、組換えＤＮＡの部分でありうる。そのようなエレメントはそのＤＮＡの機能のために必要でありうる又はありえないが、転写、ｍＲＮＡの安定性等に影響を与えることによってそのＤＮＡの改良された発現を提供しうる。そのようなエレメントは、その細胞において形質転換するＤＮＡの最適なパフォーマンスを得ることを所望されるように、そのＤＮＡ内に含まれうる。
【００６８】
その細胞内に導入される組換えＤＮＡは、形質転換するために探索した細胞の集団より形質転換した細胞の同定及び選択を促進する選択マーカー遺伝子又はレポーター遺伝子又は両方を含みうる。一方で、その選択マーカーは、別々のＤＮＡのかけらに運ばれうり、そして同時形質転換工程において用いられる。選択マーカー及びレポーター遺伝子の両方は適当な制御配列に隣接されうり、その宿主細胞内の発現を可能にする。有用な選択マーカーは当該分野に周知であり、例えば、薬剤耐性遺伝子及び除草剤抵抗性遺伝子、例えば、ｎｅｏ、ｈｐｔ、ｄｈｆｒ、ｂａｒ、ａｒｏＡ、ｐｕｒｏ、ｈｙｇ、ｄａｐＡ等を含む。また、その遺伝子はＬｕｎｄｑｕｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許番号  ５，８４８，９５６）の表１に挙げられる。
【００６９】
レポーター遺伝子を用いて潜在的形質転換細胞（ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｃｅｌｌｓ）を同定し、制御配列の機能性を評価した。容易に分析可能なタンパク質をコードするレポーター遺伝子は当該技術分野で周知である。一般的に、レポーター遺伝子は、レシピエントの器官又は組織内に存在しない又はレシピエントの器官又は組織によって発現される遺伝子であり、そしてそれはその発現がある容易に検出可能な特性、例えば酵素活性によって表されるタンパク質をコードする。例示的なレポーター遺伝子は、Ｅ．ＣｏｌｉのＴｎ９由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｃａｔ）、Ｅ．ＣｏｌｉのｕｉｄＡ遺伝子座位のβ−グルクロニダーゼ遺伝子、緑色、赤色又は青色蛍光タンパク質遺伝子、及びルシフェラーゼ遺伝子を含む。そのレポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡをレシピエント細胞に導入した後、適当な時間で定量化される。
【００７０】
標的細胞を形質転換しうる組換えＤＮＡを構成する一般的な方法は、当業者に周知であり、そして同様の組成物及び構成方法は本明細書で有用なＤＮＡの産生方法のために利用されうる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２００２）は適当な構成方法を提供する。
【００７１】
組換えＤＮＡは、特定の細胞内への導入に有用な任意の工程、例えば、物理学的な又は生物学的な方法による、組換えＤＮＡを含む発現ベクターによるトランスフェクションによって、哺乳動物、酵母、又は昆虫細胞のような、宿主細胞内に容易に導入されうり、組換えＤＮＡを有する形質転換した（遺伝子導入の）細胞をもたらし、宿主細胞によって関心のあるＤＮＡ配列が発現される。一の態様において、細胞内に導入される少なくとも一つの組換えＤＮＡは染色体外に保持される。一の態様において、少なくとも一つの組換えＤＮＡは宿主細胞のゲノム内に安定的に統合される。
【００７２】
宿主細胞内に組換えＤＮＡを導入する物理的な方法はカルシウムに仲介される方法、リポフェクション法、微粒子銃、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法等を含む。宿主細胞内に関心のあるＤＮＡを導入する生物学的な方法は、ＤＮＡ及びＲＮＡウイルスベクターの使用を含む。ウイルスベクター、例えばレトロウイルス又はレンチウイルスベクターは、真核生物、例えば哺乳動物、例えばヒト細胞内に遺伝子を挿入するための広く使用される方法になっている。細胞内に遺伝子を導入する有用な他のウイルスベクターはポックスウイルス、例えばワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス等に由来しうる。
【００７３】
宿主細胞内の組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、様々なアッセイを実施しうる。そのようなアッセイは、例えば当業者に周知の分子生物学的なアッセイ、例えばサザン及びノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ及びＰＣＲを含み；生物化学的なアッセイ、例えば免疫学的な方法（ＥＬＩＳＡｓ及びウエスタンブロット）によって又は他の分子アッセイによって特定の遺伝子産物の存在又は不在を検出する。
【００７４】
導入した組換えＤＮＡ断片から産生されるＲＮＡを検出及び定量化するために、ＲＴ−ＰＣＲを実施しうる。ＰＣＲの本適用において、第一に酵素、例えば逆転写酵素を用いたＲＮＡのＤＮＡへの逆転写が必要であり、続いて慣習のＰＣＲ技術の使用を通じてＤＮＡを増幅する。ほとんどの場合、ＰＣＲ技術は有用であるが、ＲＮＡ産物の完全性を実証しないだろう。ＲＮＡ産物の性質についてさらなる情報はノーザンブロッティングによって得られうる。本技術はＲＮＡ種の存在を実証し、そのＲＮＡの完全性の情報をもたらす。また、ＲＮＡ種の存在又は不在は、ドット又はスロットブロットのノーザンハイブリダイゼーションを用いて決定されうる。これらの技術はノーザンブロッティングの改良であり、ＲＮＡ種の存在又は不在を実証するのみである。
【００７５】
サザンブロッティング及びＰＣＲは、問題になっている組換えＤＮＡ断片を検出するために用いられうるのと同時に、それらは組換えＤＮＡ断片が発現されているかどうかに関する情報を提供しない。発現は導入したＤＮＡ配列のペプチド産物を特異的に同定すること、又は宿主細胞内に導入したＤＮＡ断片の発現により引き起こされる表現型の変化を評価することによって評価されうる。
【００７６】
本明細書に記載した組換えウイルスは、対応の野生型のウイルスゲノムに関連するゲノム配列内に修飾を有し、すなわち、その組換えウイルスのゲノムは、転写と関連し、非構造的な又は非グリコシル化のウイルスタンパク質の配列に対応する領域において、欠失、及び任意に挿入を含む修飾を有する。ウイルスゲノム内の変異は、ウイルス複製をサポートする非トランスジェニック細胞においてそれらの配列が存在する場合に、ゲノムから少なくとも一つの機能的なウイルスタンパク質の産生を阻害すること又は予防することに効果的である。一の態様において、その欠失は、ウイルスタンパク質についてコード領域に対応する１から最大数千ものヌクレオチド、例えば、ウイルスタンパク質におけるコード領域に対応する配列の１％、１０％、５０％、９０％又はそれ以上を含む。一の態様において、その欠失した配列は、例えば少なくとも８０％、又はそれ以上、例えば８５％、９０％、９５％及び最大で１００％又は間の任意の整数の、ＶＰ３０配列及び／又はＧＰ／ｓＧＰ配列への、核酸配列相同性である、実質的な相同性を有する配列に対応する。一の態様において、その欠失は１から最大で数百ものヌクレオチド、ＮＰコード配列とＶＰ３５コード配列との間の少なくとも非コード配列に対応する配列を例えば、１％、１０％、５０％、９０％又はそれ以上含む。一の態様において、その欠失した配列は、実質的な相同性を有する配列、ＮＰコード配列とＶＰ３５コード配列との間の非コード配列への、核酸配列相同性に、例えば少なくとも８０％以上、例えば８５％、９０％、又は９５％及び最大１００％又は間の任意の整数に対応する。
【００７７】
一の態様において、感染性のウイルスゲノム、本発明の複製の不完全な一本鎖マイナス鎖ＲＮＡウイルスは、転写と関連される又は非構造的である又は非グリコシル化のタンパク質における野生型ウイルスゲノムにおけるそれらに対応する配列中に欠失を含み、そして免疫化される組織内の細胞を含む宿主細胞に無毒の異種配列を含む。一の態様において、その異種配列は、マーカー配列、選択配列、又は検出可能な若しくは検出できる他の配列、例えばＧＦＰ又はルシフェラーゼであり、又は選択可能な遺伝子、例えば薬剤耐性遺伝子、例えばハイグロマイシンＢ耐性遺伝子又はネオマイシンホスホトランスフェラーゼであり、そのマーカー遺伝子又は選択可能な遺伝子は、ベクターの導入前に宿主細胞内に存在しない。
【００７８】
医薬組成物
例えば、経鼻、非経口、又は経口投与、例えば、静脈内、筋肉内、鼻腔内、外用、又は皮下経路による接種に適当な、本発明の医薬組成物は、一以上のウイルス単離物、例えば、一以上の組換えの感染性の、生物学的に封じ込められた一本鎖マイナス鎖ＲＮＡウイルス単離物であって、任意にさらに無菌の水性の又は非水性の溶液、懸濁液及び乳剤を含む。その組成物はさらに、当該分野で既知である、助剤又は賦形剤を含みうる。その組成物は一般的に個人の投与量（単位投与量）の形状において示される。非経口投与のための調製は無菌の水性又は非水性の溶液、懸濁液及び／又は乳剤を含み、それらは当該分野で既知の助剤又は賦形剤を含みうる。非水性溶媒の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブオイル、及びオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルである。担体又は密封包帯は用いられうり、皮膚透過性を増加し、そして抗原吸収を促進する。経口投与のための液剤投与形態は一般的に液体投与剤形を含むリポソーム溶液を含みうる。リポソームを懸濁するための適当な形態は、精製水のような当業者に共通して用いられる挿入希釈剤を含む、乳剤、懸濁剤、溶液、シロップ、及びエリキシル剤を含む。挿入希釈剤に加えて、また、そのような組成物はアジュバント、湿潤剤、乳化剤及び懸濁剤、又は甘味料、調味料、又は芳香剤を含みうる。
【００７９】
組成物を個人への投与のために用いる場合に、さらにその組成物の有効性を改善することが所望される塩、緩衝剤、アジュバント、又は他の物質を含みうる。ワクチンにおいて、特異的な免疫反応を増大しうるアジュバント、物質が用いられうる。免疫機構への提示の前に、正常に、そのアジュバント及びその組成物は混合され、又は、別々ではあるが、免疫される組織の同じ部位内に提示される。
【００８０】
一の態様において、その医薬組成物は徐放システムの一部、例えばポンプを有する、又は高分子化合物を形成したものである（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｉｏｎ，Ｆｌａ．（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ  ＆  Ｐｅｐｐａｓ，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３：６１（１９８３）参照；また、Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，２５：３５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．，７１：１０５（１９８９）参照）。他の徐放システムはＬａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：１５２７（１９９０））によるレビューにおいて議論される。
【００８１】
医薬組成物はウイルスの治療有効量、及び医薬的に許容可能な担体を含む。特定の態様において、「医薬的に許容可能な」という用語は連邦政府又は州政府又は米国において挙げられたものの規制機関によって承認されることを意味する。薬局方又は他の一般的な認識された薬局方は、動物、及びより具体的にはヒトにおける使用のためのものである。「担体」という用語は、その医薬組成物が投与される、希釈液、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを意味する。また、生理食塩溶液及び水性のブドウ糖、及びグリセロール溶液は液体の担体として、具体的には注射可能な溶液の用途で用いられうる。適当な医薬的な賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、イネ、小麦、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール等を含む。これらの組成物は溶液、懸濁液、乳液、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末剤、徐放製剤等の形態をとりうる。これらの組成物は、坐薬として製剤化されうる。経口製剤は標準的な担体、例えば医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン・ナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、等を含みうる。適当な医薬的な担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される。そのような組成物は、患者への適当な投与のための形態を提供するために、ウイルスの治療有効量を、好ましくは、適当な量の担体と共に精製された形態において含むだろう。その製剤は投与方法に適するべきである。
【００８２】
その組成物は、医薬的に許容可能なビヒクル、例えば挿入希釈剤との組み合わせで、全身、例えば、経口、又は筋肉内投与でありうる。経口投与について、そのウイルスは、摂取可能なカプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ、ウエハー等の形態において、一以上の賦形剤と併用され、使用される。そのような組成物は、少なくとも０．１％の有効成分を含むと考えられる。その組成物及び調製物のパーセンテージは、もちろん、変化しうり、そして都合よく、与えられる単位投与剤形の約２から約６０質量％の間でありうる。そのような有用な組成物における有効成分の量は非常に優れていたので、効果的な投与水準は得られるだろう。
【００８３】
また、その組成物は以下を含む：トラガント、アカシア、コーンスターチ、ゼラチンのような結合剤；リン酸二カルシウムのような賦形剤；コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸等のような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤；及びスクロース、フルクトース、ラクトース若しくはアスパルテームのような甘味料、又はペパーミント、ウインターグリーンのオイル、又はチェリーフレーバーのような香味料を添加しうる。様々な他の材料は存在しうる。例えば、シロップ又はエリキシル剤は、甘味料としてそのウイルス、スクロース又はフルクトースを、保存剤としてメチル及びプロピルパラベンを、染料並びにチェリー又はオレンジフレーバーのような調味料を含みうる。もちろん、徐放調製剤、又は装置を含む、任意の単位剤形を調製することにおいて使用される任意の材料はその用いられる量において、医薬的に許容可能であり、実質的に無毒であると考えられる。
【００８４】
また、その組成物は、静脈内に又は腹腔内に点滴又は注射によって投与されうる。そのウイルスの溶液は水又は適当な緩衝剤で調製されうり、無毒の界面活性剤と任意に混合される。また、分散剤はグリコール、液体のポリエチレングリコール、トリアセチン、及びそれらの混合物において、並びにオイル内において調製されうる。通常の貯蔵及び使用条件下で、これらの調製物は所望されない微生物の増殖を防止する保存剤を含む。
【００８５】
注射及び点滴に適当な医薬的な投与剤形は、無菌の注射可能な又は点滴可能な溶液又は分散剤の即時調製に適当であり、任意にリポソーム内にカプセル化される、有効成分を含む無菌の水性溶液又は分散剤又は無菌の粉体を含む。全ての場合において、その最終的な投与剤形は、製造及び貯蔵条件下で無菌、流体、及び安定であると考えられる。その液体担体又はビヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体のポリエチレングリコール、等）、植物油、無毒のグリセリルエステル、及び適当なそれらの混合物でありうる。例えば、リポソームの形成によって、分散剤の場合において必要とされる粒子径の維持によって、又は界面活性剤の使用によって、その適当な流動性は保持される。所望されない微生物の作用の防止は様々な抗細菌薬及び抗真菌薬、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によりもたらされうる。多くの場合において、等張剤、例えば、糖類、緩衝剤、又は塩化ナトリウムを含むことが好ましいだろう。
【００８６】
無菌注射可能な溶液は、そのウイルスを上記に列挙した様々な他の成分を有する適当な溶媒に必要量取り込むことによって調製され、必要に応じて、続いてフィルター滅菌される。
【００８７】
有用な液体の担体は水、アルコール又はグリコール又は水−アルコール／グリコール結合剤を含み、ここで、本ウイルスは、任意に無毒の界面活性剤の補助によって、有効な濃度で溶解され、又は分散される。芳香剤のようなアジュバント及び追加の抗細菌薬は添加されうり、与えられる使用のための特性を最適化する。その結果としての液体組成物は、吸収パッドから応用されうり、含浸包帯及び他の包帯を用いられうり、又はポンプ型若しくはエアロゾルスプレーを用いて患部に噴霧されうる。
【００８８】
本発明のウイルスの有用な投与量は、それらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性と動物モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ活性とを比較することによって定義されうる。
【００８９】
医薬的な目的
組成物の投与は「予防的な」又は「治療的な」目的のいずれかのためでありうる。予防的に提供される場合に、病原体の感染の任意の症状又は臨床的な徴候が現れる前に、ワクチンである本発明の組成物は提供される。その組成物の予防的な投与は任意の後の感染を予防する、又は減弱することに寄与する。予防的に提供される場合に、本発明の遺伝子療法の組成物は、疾病の任意の症状又は臨床的な徴候が現れる前に提供される。その組成物の予防的な投与は疾病に関連する一以上の症状又は臨床的な徴候を防止すること又は減弱することに寄与する。
【００９０】
治療的に提供される場合に、実際の感染の症状又は臨床的な徴候の検出にウイルスワクチンは提供される。化合物の治療的な投与は、任意の実際の感染を減弱することに寄与する。治療的に提供される場合に、遺伝子療法の組成物はその疾病の症状又は臨床の徴候の検出に提供される。その化合物の治療的な投与はその疾病の症状又は臨床的な徴候を減弱することに寄与する。
【００９１】
それゆえ、本発明のワクチン組成物は、（予期される感染を防止する又は減弱するために）感染の開始前に、又は実際の感染の開始後のいずれかに提供されうる。同様に、遺伝子療法について、その組成物は、障害又は疾病の任意の症状又は臨床的な徴候が現れる前、又は一以上の症状を認めた後に提供されうる。
【００９２】
組成物は、その投与がレシピエント哺乳動物に使用できうる場合に、「薬理学的に許容可能」であると考えられている。そのような薬剤は、投与される量が生理学的に意味のある場合に、「治療有効量」において投与されると考えられる。本発明の組成物は、その存在がレシピエント患者の生理機能における検出可能な変化をもたらす場合に、例えば、少なくとも一つのウイルス株に対して少なくとも一つの原発性又は続発性の体液性又は細胞性免疫反応を増幅する場合に、生理学的に意味がある。
【００９３】
提供される「保護」は絶対である必要はない、すなわち、コントロール群又は一式の哺乳動物と比較して統計的に有意の改善がある場合に、そのインフルエンザの感染は総合的に保護される又は除去される必要はない。保護は、そのウイルス感染の症状又は臨床的な徴候の発病の重症度又は迅速性を軽減することに限定されうる。
【００９４】
医薬的な投与
本発明の組成物は、受動免疫又は能動免疫のいずれかによって、一以上の病原体、例えば一以上のウイルス、微生物又は寄生虫系統に耐性を与えうる。能動免疫において、生ワクチン組成物は宿主（例えば哺乳動物）へ予防的に投与されうり、そして投与への宿主の免疫反応は感染及び／又は疾病に対して保護する。受動免疫について、その誘発される抗血清は回収されうり、そして少なくとも一つのウイルス株に起因する感染を有すると疑われるレシピエントに投与されうる。
【００９５】
それゆえ、本発明は障害又は疾病、例えば少なくとも一つの病原体の株による感染を予防する又は減弱するための方法を含む。本明細書で用いられるように、ワクチンは、その投与がその疾病の臨床的な徴候若しくは状態の全ての若しくは部分的な減弱（すなわち抑制）をもたらすか、又は疾病の個人へ全て若しくは部分的な免疫のいずれかをもたらす場合に、疾病を予防する又は減弱すると考えられる。
【００９６】
本発明の少なくとも一つのウイルス単離物は、意図した目的を成し遂げる任意の方法によって投与されうる。例えば、そのような組成物の投与は皮下、皮内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内のような様々な非経口的な経路、経口又は経皮の経路でありうる。非経口投与は点滴によって又は経時的な段階的灌流によって成し遂げられうる。
【００９７】
ウイルスに関連した病態を予防する、抑制する、又は治療するための典型的なレジメンは、本明細書に記載され、単回治療として投与され、又は増強する若しくは追加の投与量として反復され、例えば、一週間から約２４カ月までの期間にわたって、又は、その中の任意の範囲若しくは値にわたるワクチン組成物の有効量の投与を含む。
【００９８】
本発明に従い、組成物の「有効量」は所望される効果をもたらすことに十分であるものである。有効量は、レシピエントの人種、年齢、性別、健康、及び体重、併用治療の種類、もしあれば、治療の回数、及び望ましい効果の働きに依存しうると理解される。以下に提供される有効量の範囲によって本発明を限定し、かつ投与量の範囲を示すことを意図しない。
【００９９】
例示的な投与量はこれらに限定されないが、約１０4から１０8ＦＦＵ若しくはＰＦＵ、１０6から１０8ＦＦＵ若しくはＰＦＵ、１０6から１０10ＦＦＵ若しくはＰＦＵ、又は１０8から１０12ＦＦＵ若しくはＰＦＵ、若しくはそれ以上、又は約１０6から１０8粒子数、１０8から１０10粒子数、若しくは１０10から１０12粒子数を含む。一の態様において、投与量は約１０4から１０8ＦＦＵ若しくはＰＦＵ、１０6から１０8ＦＦＵ若しくはＰＦＵ、１０6から１０10ＦＦＵ若しくはＰＦＵ、又は１０8から１０10ＦＦＵ若しくはＰＦＵである。
【０１００】
例示的なアジュバント
アジュバントはこれらに限定されないが、アルミニウム、油中水型（Ｗ／Ｏ）乳剤、水中油型（Ｏ／Ｗ）乳剤、ＩＳＣＯＭ、リポソーム、ナノ−又はマイクロ−粒子、ムラミルジ−及び／又はトリペプチド、サポニン、非イオン性のブロック共重合体、リピドＡ、サイトカイン、細菌性毒性、炭化水素、及び誘導体化した多糖及びアジュバント系（ＡＳ）内の二以上のこれらのアジュバントの組み合わせを含む。
【０１０１】
アジュバントの例示的な種類は、これらに限定されないが、ＴＬＲ３のアンタゴニスト、例えばポリ（Ｉ：Ｃ）、ＴＬＲ４のアゴニスト、例えば一以上の成分の微生物のリポ多糖、例えば、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）、ＭＰＬ（登録商標）、及び合成誘導体、例えばＥ６０２０、ＴＬＲ５のアゴニスト、例えば微生物のフラジェリン）、ＴＬＲ７、８のアゴニスト、例えば、一本鎖ＲＮＡ又はイミダゾキノリン（例えば、イミキモド、ガーディキモド、及びＲ８４８）、ＴＬＲ９のアゴニスト、例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、及びＩＳＳ免疫活性化配列、及びイミダゾキノリン、ＮＬＲＰ３インフラマソームのアゴニスト、例えば、キトサン、及び二重のＴＬＲ１／２アゴニスト、例えばＰａｍ３ＣＳＫ４、リポペプチドを含む。
【０１０２】
一の態様において、そのアジュバントはサポニン、コレステロール又はコレステロール様分子、例えばスクアレンと組み合わされうる樹皮由来の天然産物を含む。
【０１０３】
一の態様において、そのアジュバントは、例えば、ＭＦ５９又はＡＳ０３及び任意に２％スクアレンを含む、水中油型（Ｏ／Ｗ）乳剤を含む。一の態様において、そのアジュバントは二つの異なるアジュバント、例えば、ＭＰＬ及びＱＳ２１のようなサポニンを、例えばリポソーム内で含む。
【０１０４】
一の態様において、そのアジュバントは、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）、ＭＦ５９（登録商標）、ＧＬＡ−ＳＥ、ＩＣ３１（登録商標）、ＣＡＦ０１、ＡＳ０３、ＡＳ０４、又はＩＳＡ５１を含み、そして、水中油型乳剤にα−トコフェロール、スクアレン、及び／又はポリソルベート８０を含みうる。
【０１０５】
一の態様において、そのアジュバントは、これらに限定されないが、アシュワガンダ、アムラ（Ｅｍｂｌｉｃａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、サンシチニンジン、ティノスポラ・コーディフェリア、シャタバリ（ａｓｐａｒａｇｕｓ  ｒａｃｅｍｏｓｕｓ）を含むアーユルヴェーダ医学の植物から調製される抽出物及び製剤を含む。
【０１０６】
一の態様において、そのアジュバントはアルミニウム塩、サポニン、ムラミルジ−及び／又はトリペプチド、百日咳菌、及び／又はサイトカインを含む。
【０１０７】
一の態様において、そのアジュバントはミョウバン又はアルミニウム塩ではない。
【０１０８】
一の態様において、そのアジュバントは投与直前に組換えフィロウイルスと混合される。
【０１０９】
例示的な抗原
例示的なウイルス糖タンパク質は、これらに限定されないが、エボラウイルス、例えばザイール、スーダン、ブンディブギョ、（以前にコートジボアールとして知られた）タイフォレスト、又はレストン、マールブルグウイルス、ラッサウイルスのようなアレナウイルス；クリミアコンゴ出血熱ウイルス又はハンタウイルスのようなブニヤウイルス；又はデング熱、ジカ熱、若しくは黄熱ウイルスのようなフラビウイルスからのそれらを含む。
【０１１０】
例示的な寄生虫抗原は、これらに限定されないが、マラリア原虫、リーシュマニア、ジアルジア、クリプトスポリジウム、又はシクロスポアからのそれらを含む。
【０１１１】
例示的な微生物抗原は、これらに限定されないが、ビブリオ、例えばコレラ菌、又はマイコバクテリウムからのそれらを含む。
【０１１２】
組換えフィロウイルスの調製方法例
材料及び方法
【０１１３】
細胞及び細胞株。Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎臓由来細胞）を１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、Ｌ−グルタミン、ビタミン類、非必須アミノ酸溶液及び抗生物質を添加したイーグル最小必須培地（ＭＥＭ）において増殖した。ＶｅｒｏＶＰ３０細胞株を、トランスフェクション試薬ＴｒａｎｓＩＴ  ＬＴ−１（Ｍｉｒｕｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、（ＶＰ３０の発現のための）ｐＣＡＧ−ＶＰ３０及びピューロマイシン耐性遺伝子におけるタンパク質発現プラスミドである、ｐＰｕｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を同時導入したＶｅｒｏ細胞によって確立した。トランスフェクション後二日目に、ピューロマイシン耐性細胞を５μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）によって選択した。個々の細胞クローンをＶＰ３０へのポリクローナルペプチド抗体によってフローサイトメトリーによってＶＰ３０発現についてスクリーニングした。
【０１１４】
ヒト胎児由来腎臓２９３Ｔ細胞を１０％ＦＣＳ、Ｌ−グルタミン、及び抗生物質を含む、高グルコースのダルベッコ改変イーグル培地内で増殖した。全ての細胞は３７℃及び５％ＣＯ2で維持した。
【０１１５】
フローサイトメトリー。細胞を０．０２％ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）において剥離し、続けて冷却した２％ＦＣＳ及び０．１％アジ化ナトリウムを添加したＰＢＳ（洗浄緩衝液）によって一度洗浄した。細胞を２０分間氷上でＶＰ３０抗体でインキュベートした。緩衝液で洗浄した後に、さらにその細胞を２０分間氷上でＶＰ３０抗体によってインキュベートした。緩衝液で洗浄した後に、さらにその細胞をフルオレセインイソチアシアナート（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって二次標識抗体でインキュベートした。続けて、それらを緩衝液で洗浄し、そしてＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ及びＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）によって分析した。
【０１１６】
エボラΔＶＰ３０ウイルスの発生。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとリボザイム配列に隣接する全長のエボラウイルスｃＤＮＡを含む、ｐＴＭ−Ｔ７Ｇ−Ｅｂｏ−ＲｉｂプラスミドはＮｅｗｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）において記載されている。第一に、（プラス鎖抗ゲノムを意味する数字の）６１８０から１０９４２までのヌクレオチドを包含する断片は、カナマイシン耐性クローニングベクター内にサブクローニングされる。次に、前記ＶＰ３０のＯＲＦは、Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いる一連の重複するＰＣＲ増幅工程によってｎｅｏ又はｅＧＦＰをそれぞれコードするそれらに置換されている。その変化したサブゲノムの断片を二つの独特な制限酵素部位、ＳａｌＩ及びＳａｃＩ（図１）を用いて、全長のエボラウイルスｃＤＮＡプラスミド内に戻した。ｐＴＭ−ＥｂｏｌａΔＶＰ３０−ｎｅｏ又は−ｅＧＦＰと呼ばれる、結果として生じたプラスミドを、配列決定し、ＶＰ３０のＯＲＦの置換、及び任意の所望されない変異がないことを確認した。
【０１１７】
人工的に生じたエボラウイルスに、ＢＳＬ−４封じ込めにおいて、ＴｒａｎｓＩＴ  ＬＴ１（Ｍｉｒｕｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、５×１０5の２９３Ｔ細胞を１．０μｇのｐＴＭ−エボラΔＶＰ３０によってトランスフェクションした（Ｎｅｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。トランスフェクション後５日目に、上清を回収し、細胞残屑を低速遠心によって除去し、そしてＬ−グルタミン、ビタミン類、非必須アミノ酸溶液及びピューロマイシンを有しない抗生物質を添加したＭＥＭ内に２％ＦＣＳを含む増殖培地によって３７℃及び５％ＣＯ2でＶｅｒｏＶＰ３０細胞においてウイルスを増幅した。
【０１１８】
プラークアッセイ及び免疫染色アッセイ。野生型エボラウイルス又はエボラΔＶＰ３０ウイルスのタイターを決定するために、そのウイルスの１０倍希釈をコンフルエントのＶｅｒｏＶＰ３０又は野生型のＶｅｒｏ細胞に３７℃で１時間、吸着し、その後、任意の未結合のウイルスを増殖培地によって細胞を洗浄することによって除去した。その細胞を続いて、１．５％メチルセルロース（Ｓｉｇｍａ）を含む増殖培地によって覆った。感染後７日目に、細胞を１０％緩衝ホルムアルデヒド溶液によって固定し、ＢＳＬ−４より持ち出し、０．２５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を有するＰＢＳにより１０分間透過処理し、そして４％ヤギ血清及び１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を有するＰＢＳにおいて６０分間ブロッキングした。細胞を続けて、１：１０００希釈したマウス抗ＶＰ４０モノクローナル抗体によって６０分間インキュベートして、ＰＢＳによって洗浄し、そして１：１０００希釈した抗マウスＩｇＧ−ペルオキシダーゼ−結合二次抗体によって６０分間インキュベートした（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）。ＰＢＳによって洗浄した後に、細胞を３，３’−ジアミノベンシジン四塩酸塩（ＤＡＢ，Ｓｉｇｍａ）を有するＰＢＳによってインキュベートした。その反応を水によって細胞をすすぐことによって停止した。
【０１１９】
ウエスタンブロッティング。部分的に精製したウイルスを、プロテアーゼ阻害剤（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌｓ  ［Ｒｏｃｈｅ］）を含む溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，及び０．１％  ＳＤＳ）において再懸濁し、１００℃で５分間インキュベートし、ＢＳＬ−４より持ち出し、そして４〜２０％ポリアクリルアミドゲルで分離した。分離したタンパク質をウエスタンポリビニリデンジフルオリド膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｓａｎｆｏｒｄ  ＭＥ）に転移し、５％スキムミルクを有するＰＢＳＴ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０［Ｓｉｇｍａ］を有するＰＢＳ）によって４℃で一晩ブロッキングした。ブロットを一次抗体（マウス抗ＮＰ抗体、ウサギ抗ＶＰ３５抗体、ウサギ抗ＶＰ４０抗体、マウス抗ＧＰ抗体、ウサギ抗ＶＰ３０抗体、又はマウス抗ＶＰ２４抗体）によって６０分間室温でインキュベートし、ＰＢＳＴによって３回洗浄し、適当な二次抗体によってインキュベートし、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（Ｚｙｍｅｄ）と６０分間結合し、そして最終的にＰＢＳＴによって３回洗浄した。ブロットを続いてＬｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔウエスタン基質（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）にインキュベートし、そしてＸ線フィルム（Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に感光させた。
【０１２０】
ＲＮＡ単離及びＲＴ−ＰＣＲ。ウイルス感染したＶｅｒｏＶＰ３０細胞からの細胞培養上清をグアニジンチオシアン酸緩衝液によって不活化し、ＢＳＬー４より持ち出した。ウイルスＲＮＡをＲＮａｓｅｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって単離する。ＲＴ−ＰＣＲを、１μｇの単離したＲＮＡ及びエボラウイルス特異的なプライマーを用いて、ＲｏｂｕｓＴ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｋｉｔ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅ，Ｅｓｐｏｏ，Ｆｉｎｌａｎｄ）によって行う。その結果として生じるＰＣＲ産物を、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）にクローニングし、そして配列決定する。
【０１２１】
透過型電子顕微鏡。電子顕微鏡超薄切片法をＮｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）に記載のように実施した。簡潔に、感染後３６時間で、ＥｂｏｌａΔＶＰ３０−ｎｅｏウイルスによって感染したＶｅｒｏＶＰ３０細胞を固定し、２．５％のグルタルアルデヒドを有する０．１Ｍカコジル酸緩衝液によって不活化し、ＢＳＬ−４より持ち出し、２％の４酸化オスミウムを有する同じ緩衝液に後固定する。Ｅｐｏｎ８１２  Ｒｅｓｉｎ  ｍｉｘｔｕｒｅ（ＴＡＡＢ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｌｔｄ．，  Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ，  ＵＫ）に包埋する前に、細胞を続いて、一連のエタノール勾配、続けて酸化プロピレンによって脱水した。薄切片を２％酢酸ウラニル及びレイノルド法によって染色し、ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｈ−７５００電子顕微鏡で８０ｋＶで試験した。
【０１２２】
エスケープ変異体の選択。エボラΔＶＰ３０−ｅＧＦＰを１０倍階段希釈（１０-1から-6）し、３７℃で６０分間２５０〜５００μｇのｍＡｂ／ｍＬの濃度で指示されるｍＡｂｓによってインキュベートする。ウイルス／ｍＡｂ混合物を、ＶｅｒｏＶＰ３０細胞に６０分間接種する。ウイルスを抗体存在下で５日間増殖する。続いて、（ＧＦＰ発現によって定義されるように、）ｍＡｂｓの存在下で増殖する最高のウイルス陽性希釈でウイルスを回収し、抗体の存在下で合計３〜６回継代した。ウイルスＲＮＡを単離し、ＲＴ−ＰＣＲ増幅し、そしてそのＧＰ配列を配列分析によって決定した。
【０１２３】
ＥｂｏｌａΔＶＰ３０−ｎｅｏウイルスの産生及び継代。以前に、全長ｃＤＮＡクローンのＺａｉｒｅ  ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ−Ｍａｙｉｎｇａを産生した（Ｎｅｗｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。一連のオーバーラップＰＣＲ増幅工程を用いて、ウイルスゲノムの６１８０〜１０９４２のヌクレオチドを包含するサブゲノムの断片（数字はプラス鎖アンチゲノムを意味する）を用いて、ＶＰ３０におけるＯＲＦをネオマイシン（ｎｅｏ）のその部分と置換した。配列分析によってＰＣＲ断片の信頼性の確認後、その変化したサブゲノムの断片を独特なＳａｌＩ及びＳａｃＩ制限酵素部位（図１）を介して、全長エボラウイルスｃＤＮＡコンストラクト内に挿入し、ＶＰ３０ＯＲＦ内にエボラウイルス  ｃＤＮＡゲノムの欠失をもたらしている。プラスミドからのエボラウイルスの人工的な発生は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター及びＤ型肝炎ウイルスのリボザイム配列とウイルスＤＮＡが隣接することによって提供される（Ｎｅｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【０１２４】
ＶＰ３０欠失エボラウイルスを増幅するために、（ＶｅｒｏＶＰ３０と名付けられる）安定的なＶｅｒｏＥ６細胞株を、ＶＰ３０（ｐＣＡＧ−ＶＰ３０）及びピューロマイシン（ｐＰｕｒ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をコードする二つのタンパク質発現によるＶｅｒｏ細胞に同時導入することによって確立し、そして５．０μｇ／ｍＬのピューロマイシンに耐性の細胞クローンを選択する。個々のクローンにおけるＶＰ３０発現をＶＰ３０への抗体によってフローサイトメトリーによって決定した。ＶＰ３０を発現している細胞の（フローサイトメトリーによって測定される＞９０％の）最高のパーセンテージを有するクローンをさらに研究に用いて、エボラΔＶＰ３０ウイルスを増幅した。
【０１２５】
簡潔に、ヒト胎児由来腎臓（２９３Ｔ）細胞を、ＶＰ３０欠失エボラウイルス  ＲＮＡの転写のためのプラスミド、及びエボラウイルスのＮＰ、ＶＰ３０、ＶＰ３５、及びＬタンパク質の発現のためのプラスミド、及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼの発現のためのプラスミドによってトランスフェクションした。トランスフェクション後５日目に、ＶｅｒｏＶＰ３０細胞をトランスフェクションした細胞のプラスミド由来の無希釈の上清によってインキュベートした。７日後、その上清を回収し、１０倍希釈し、そして次の継代において、新鮮なＶｅｒｏＶＰ３０細胞に感染させるために用いた。各継代において複製するウイルスを未だに産生する接種材料の最大希釈を用いて、合計で７回の継代を行った。複製するウイルスの存在は細胞変性効果（ＣＰＥ）によって評価され、そしてＶＰ４０への抗体によって、感染したＶｅｒｏＶＰ３０細胞を免疫染色した。また、コントロールとして、野生型のＶｅｒｏ細胞によって各継代からの上清をインキュベートした。期待されるように、ＣＰＥ及びウイルス抗原は野生型Ｖｅｒｏ細胞において検出できず、ＥｂｏｌａΔＶＰ３０−ｎｅｏウイルスを複製することがＶｅｒｏＶＰ３０細胞に限られていることを実証している。
【０１２６】
感染したＶｅｒｏＶＰ３０細胞のＣＰＥの現れは、感染性の（しかし生物学的に封じ込められた）エボラウイルスの形態を示したので、さらなる証明では、感染したＶｅｒｏＶＰ３０細胞由来の細胞培養上清内のウイルス粒子の存在を探索した。簡潔に、ＶｅｒｏＶＰ３０細胞をＥｂｏｌａΔＶＰ３０−ｎｅｏウイルスによって感染した後、５日目に、上清を回収し、部分的に２０％スクロースによって精製した。その沈殿物をＰＢＳで懸濁し、そして４〜２０％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ウエスタンブロット分析を対応のエボラウイルスタンパク質に特異的な抗体によって実施した。（抗体が利用可能でなかった、Ｌを除外し、）全てのウイルスタンパク質を検出した。ウイルス粒子のＶＰ３０タンパク質がＶｅｒｏＶＰ３０細胞より生じることを認め、一方でその保持しているタンパク質をＥｂｏｌａΔＶＰ３０−ｎｅｏウイルスによってコードしている。対照に、エボラΔＶＰ３０−ｎｅｏウイルスによって感染した野生型Ｖｅｒｏ細胞由来のコントロール試料においてウイルスタンパク質は検出されなかった。
【０１２７】
エボラΔＶＰ３０−ｎｅｏウイルスの遺伝的な安定性。ＶＰ３０欠失エボラウイルスの使用による主な関心は、ＶｅｒｏＶＰ３０ヘルパー細胞株のゲノムへ組み込まれたＶＰ３０配列を有する潜在的な組換えである。それゆえ、エボラΔＶＰ３０−ｎｅｏウイルスのゲノム安定性を評価するために、（各７継代の）三つの独立した継代の試験を実施した。エボラΔＶＰ３０−ｎｅｏウイルスがＶｅｒｏＶＰ３０細胞において複製されている間に、ウイルス複製は野生型のＶｅｒｏ細胞において観察されなかった。全てのウイルスＲＮＡは、７継代後の感染したＶｅｒｏＶＰ３０細胞の細胞培養上清より単離された。ｎｅｏ遺伝子にまたがるウイルスゲノム断片をＲＴ−ＰＣＲによって増幅し、クローン化し、そして配列決定した。総数２０のクローンを配列決定し、そしてその配列は、ウイルス産生について使用されるエボラΔＶＰ３０ｃＤＮＡコンストラクトの配列と同一であった。従って、任意の三つの独立した継代試験における組換えの証拠はなく、エボラΔＶＰ３０−ｎｅｏウイルスゲノムの遺伝的な安定性を証明している。
【０１２８】
エボラΔＶＰ３０−ｎｅｏウイルスのバイオセーフティーをさらに実証するために、エボラΔＶＰ３０−ｎｅｏウイルスをＶｅｒｏＶＰ３０細胞において７回連続した継代後に収集し、このウイルスを野生型Ｖｅｒｏ細胞において３回連続した「ブラインド」継代用途で用いた。簡潔に、Ｖｅｒｏ細胞をエボラΔＶＰ３０−ｎｅｏウイルス（継代数７）によって５の感染多重度（ｍ．ｏ．Ｉ．）で感染させた。６日後、上清を次の「ブラインド」継代及びウエスタンブロットアッセイに用いた。任意の「ブラインド」継代後、ウイルスのＮＰタンパク質を検出しなかった（データは示されていない）。３回の連続した「ブラインド」継代後、野生型のＶｅｒｏ細胞にプラークアッセイ及び免疫染色を実施し、エボラウイルスを複製していないことを確認した。期待されるように、ウイルスを複製することを検出しなかった。まとめると、これらのデータはさらにエボラΔＶＰ３０システムのバイオセーフティーを証明する。
【０１２９】
エボラΔＶＰ３０−ｎｅｏウイルスの増殖速度。ｉｎ  ｔｒａｎｓでウイルスタンパク質を提供することによって高められる主要な関心の一つは、それらの量、発現速度、又は両方が野生型のウイルスによって感染した細胞におけるそれらと適合しえないことであり、減少したウイルスのタイター及び／又は異常なウイルス粒子の形態に繋がる。この潜在的な落とし穴に取り組むために、エボラΔＶＰ３０−ｎｅｏの増殖速度を、野生型のエボラウイルスの増殖速度と比較した。ＶｅｒｏＶＰ３０細胞又は野生型Ｖｅｒｏ細胞を高いｍ．ｏ．Ｉの１．０又は低いｍ．ｏ．Ｉの０．０１で感染させ、上清を２４時間ごとに収集した。エボラΔＶＰ３０−ｎｅｏのウイルスタイターをＶｅｒｏＶＰ３０細胞において決定し、一方で、野生型のエボラウイルスのウイルスタイターを野生型のＶｅｒｏ細胞において決定した。ウイルスタイターを決定するために、細胞を１．５％メチルセルロースで覆い、そして７日後、免疫染色アッセイを用いてＶＰ４０発現を試験した。エボラΔＶＰ３０−ｎｅｏウイルスは試験した両方の条件でＶｅｒｏＶＰ３０細胞において効率的に複製され、感染後６日目に１０7フォーカス形成単位（ＦＦＵ）／ｍＬに到達した。エボラΔＶＰ３０−ｎｅｏの複製は野生型のＶｅｒｏ細胞において検出されず、；感染後３日間まで検出された低いタイターはインプットのウイルスをおそらく反映した。まとめると、これらの見解は、エボラΔＶＰ３０システムの生物学的な閉じ込めを証明する。ＶｅｒｏＶＰ３０細胞におけるエボラΔＶＰ３０−ｎｅｏの複製速度は、ＶｅｒｏＶＰ３０（図３、上パネル、白丸）又は野生型Ｖｅｒｏ細胞（図３、下パネル、白丸）のいずれかにおける野生型のエボラウイルスの複製速度と同様であり、生物学的に封じ込められたエボラウイルスを産生するための高効率の方法として記載されるアプローチを確立している。
【０１３０】
エボラΔＶＰ３０−ｎｅｏウイルスの形態。次にエボラΔＶＰ３０−ｎｅｏウイルスの形態を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって評価した。ＶｅｒｏＶＰ３０細胞をエボラΔＶＰ３０−ｎｅｏウイルスによって感染させ、３６時間後に固定した。試料をＮｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）に記載のようにＴＥＭ用途で加工した。図４（右パネル）に示すように、エボラΔＶＰ３０−ｎｅｏウイルスに感染したＶｅｒｏＶＰ３０細胞から出芽している粒子は、野生型のエボラウイルスからのそれらの大きさ及び形において区別がつかなかった。それゆえ、ｉｎ  ｔｒａｎｓのＶＰ３０タンパク質を提供することは、ウイルス粒子の形態に認められる効果を有せず、記載されるシステムは、例えば、ウイルス粒子の形成及び出芽の研究に適当であると考えられる。
【０１３１】
まとめると、上記の結果は、エボラΔＶＰ３０−ｎｅｏウイルスが生物学的に封じ込められた、ヘルパー細胞株内で高いタイターに複製し、遺伝的に安定であり、そして形態学的に野生型のウイルス粒子から区別がつかないことを実証する。生物学的に封じ込められたエボラウイルスの産生のための概念実証を提供し、基礎研究及び薬剤スクリーニングの適用においてこの戦略の使用を評価した。
【０１３２】
基礎研究の適用のためのエボラΔＶＰ３０−ｅＧＦＰウイルス及びその有用性の産生。ＶＰ３０の代わりに高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）をコードするエボラΔＶＰ３０ウイルスを産生し（図１；エボラΔＶＰ３０−ｅＧＦＰと命名され）、エボラΔＶＰ３０−ｎｅｏウイルスにおける上記の同じ工程を用いる。エボラΔＶＰ３０−ｎｅｏウイルスに類似し、そのｅＧＦＰ変異体は８．０×１０7ＦＦＵ／ｍＬに到達するウイルスタイターによって効率的に複製された。ｅＧＦＰの発現を感染後早ければ１０時間で観察した（データは示されていない）。
【０１３３】
Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）ではエボラウイルスＧＰ及び二つの中和モノクローナル抗体（ｍＡｂ）１３３／３．１６及び２２６／８．１、によってシュードタイプ化した複製可能な水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を使用し、エボラウイルスＧＰエピトープを位置づけ、そしてエスケープ変異体を産生する。標準のエボラウイルスのウイルス粒子を確認するために、Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）の見解では、ＶＳＶ−シュードタイプシステムに基づき、エスケープ変異体をｍＡｂ１３３／３．１６又は２２６／８．１の存在においてエボラΔＶＰ３０−ｅＧＦＰウイルスを増幅することによって産生した。ｍＡｂ１３３／３．１６への８つのエスケープ変異体のそれぞれは、ＧＰにおける５４９の位置でヒスチジンからアルギニンへの置換（Ｈ５４９Ｒ）を有し、Ｔａｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）により報告されている。ｍＡｂ２６６／８．１を用いて、１３４の位置でアルギニンからトリプトファンへの置換（Ｒ１３４Ｗ）を全てが含む１２のエスケープ変異体を単離し、変異はＴａｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）によって同定されるものと同一である。しかしながら、Ｔａｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）により記載される二つのエスケープ変異体を保持することは検出されなかった。エスケープ変異体のこの矛盾が用いられる生物学的な機構の間に差異及びランダム変異を反映しているかどうかは現在不明である。それにもかかわらず、これら試験は、生物学的に封じ込められたボラウイルスが基礎研究の適用において用いられうる一つの方法を示した。
【０１３４】
ＶＰ３０遺伝子を欠失する生物学的に封じ込められたエボラウイルスは、標準のエボラウイルスを研究し、エボラウイルスワクチンを開発し、そしてエボラウイルスのライフサイクルに干渉する化合物について化学ライブラリをスクリーニングするために安全な、別の方法を提供する。実際に、（ＶＰ３０の代わりにネオマイシン又はｅＧＦＰをコードする）産生される三つの異なる生物学的に封じ込められたウイルスのそれぞれは、（ｉｎ  ｔｒａｎｓのＶＰ３０を安定的に発現するＶｅｒｏ細胞株の）ＶｅｒｏＶＰ３０内で複製するそれらの能力によって実証されるように、生物学的に抑制されたが、野生型ではなかった。さらに、ウイルスタイターは１０7ＦＦＵ／ｍＬに及び、従って、野生型エボラウイルスについて得られるそれらと比較可能であり（図３；Ｖｏｌｃｈｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｎｅｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｅｂｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、一方で形態学的な、生物学的な、そしてウイルス学的な分析ではエボラΔＶＰ３０ウイルスの試験した特性を野生型エボラウイルスのそれらから区別できないことを示した。
【０１３５】
例示的な有効性プロトコル
エボラウイルス（フィロウイルス科）は、最大で９０％の致死率を有するヒト及びヒト以外の霊長類における重症の出血熱を引き起こす（Ｊｏｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７）。現在、エボラウイルスに対する利用可能な認可されたワクチン又は抗ウイルス薬はない。エボラウイルスに対するワクチンは、アフリカの流行地域における地域住民においてだけでなく、大流行時の医療関係者及びそのウイルスへの偶発的曝露後の研究者の曝露後の治療においても所望される。少数のワクチン候補は、エボラウイルスの致死的攻撃に対してマウス、モルモット、又はヒト以外の霊長類を保護することを証明し；しかしながら、これらの候補のそれぞれは、デメリット、例えば、ヒト以外の霊長類における保護の欠如、ヒトにおけるベクターに対する既存の免疫、又は潜在的な中枢神経系の合併症を有する（Ｒｅｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。さらに、その現行のワクチン候補はウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）又はウイルスベクターワクチンに基づき、それらはウイルス抗原の全ての成分を発現していない。他方、弱毒生ワクチンの使用は、バイオセーフティーの展望から、エボラウイルスにおいてありえない。これらの潜在的な限界を克服するために、生物学的に封じ込められたウイルスはそれらが生物学的に安全であるが、全てのウイルス抗原を提供するので、魅力的な選択を提示する。
【０１３６】
材料及び方法
細胞。ＶｅｒｏＶＰ３０細胞を実施例１に記載したように確立し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、Ｌ−グルタミン、ビタミン類、非必須アミノ酸溶液、及び５μｇ／ｍＬピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加したイーグル最小必須培地（ＭＥＭ）において増殖した。
【０１３７】
ウイルス。前記エボラΔＶＰ３０ウイルスを実施例１に記載のように産生した。簡潔に、Ｚａｉｒｅ  Ｍａｙｉｎｇａ株のエボラウイルスの全長エボラｃＤＮＡゲノムを含むプラスミドを用いて、ＶＰ３０のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を薬剤耐性遺伝子のネオマイシンのＯＲＦと置換した。エボラウイルスの逆遺伝学（Ｎｅｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）を用いて、そのエボラΔＶＰ３０ウイルスを産生し、ＭＥＭ培地中のＶＰ３０を安定的に発現するＶｅｒｏ細胞株において継代した。エボラΔＶＰ３０を上記のように、２％ＦＣＳを添加した、ＭＥＭ培地中のＶｅｒｏＶＰ３０細胞において増殖した。そのウイルスを細胞の感染後６日目で１の感染多重度（ＭＯＩ）で回収し、そして−８０℃で直接貯蔵した。また、回収したウイルスを、２０％スクロースで、２時間、２７，０００ｒｐｍで超遠心分離によって部分的に精製した。そのウイルス沈殿物を滅菌ＰＢＳで再懸濁し、−８０℃で貯蔵した。また、回収したウイルスを、２０％スクロースによって２時間２７，０００ｒｐｍで超遠心分離によって部分的に精製した。そのウイルス沈殿物を滅菌したＰＢＳにおいて再懸濁し、−８０℃で貯蔵した。ウイルスタイターを、１．５％メチルセルロース（Ｓｉｇｍａ）を含む２％ＦＣＳ−ＭＥＭによって覆われるコンフルエントのＶｅｒｏＶＰ３０細胞におけるプラークアッセイによって決定した。
【０１３８】
野生型のエボラウイルスはマウスを殺さないので、マウスに適合したエボラウイルスによるチャレンジスタディを実施した（Ｂｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。このウイルスをＥｂｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６において記載されているように産生した。
【０１３９】
抗体タイター。ワクチン接種したマウスにおけるエボラ糖タンパク質（ＧＰ）特異的な免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体の濃度を酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって調べた。簡潔に、Ｉｍｍｕｌｏｎ  ２ＨＢ  ｐｌａｔｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏｎ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭＡ）のウエルを、精製したＥｂｏｌａ  ＧＰ（Ｔａｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）によってコートし、１０ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンを含むＰＢＳによってブロックした。コントロール及びワクチン接種したマウスからのマウスの血清によって、Ｅｂｏｌａ  ＧＰ−コートしたウエルのインキュベーション後、結合した抗体を、４０５ｎｍの波長でＥＬＩＳＡプレートリーダーによって、ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）によって検出した。
【０１４０】
細胞間染色及びフローサイトメトリー。サイトカイン産生するＣＤ８+Ｔ細胞の数をＭｕｒａｌｉ−Ｋｒｉｓｈｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）に記載されているように、細胞間染色によって決定した。簡潔に、脾細胞をエボラペプチドＮＰ279-288（核タンパク質ＮＰに由来した、ＳＦＫＡＡＬＳＳＬＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）（Ｏｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｓｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、ＶＰ４０171-180（マトリックスタンパク質ＶＰ４０に由来した、ＹＦＴＦＤＬＴＡＬＫ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、又はＧＰ161-169（ＧＰに由来した、ＬＹＤＲＬＡＳＴＶ）（Ｏｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｗａｒｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）によって、ブレフェルジンＡ及びＩＬ−２の存在下で５時間刺激した。活性化に続き、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）からのＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ  ｋｉｔを用いることによって、細胞を細胞表面のＣＤ８+及び細胞内ＩＦＮγについて染色した。サイトカイン産生するＣＤ８+Ｔ細胞の数をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いることによって決定した。
【０１４１】
ワクチン及びチャレンジ。四週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）をイソフルランによって麻酔し、腹腔内（ＩＰ）に１０6フォーカス形成単位（ＦＦＵ）のスクロース精製したエボラΔＶＰ３０ウイルスによって３週間の間隔で２回接種し；コントロールのマウスをＰＢＳによって同時に接種した。第二群のマウスは細胞培養上清から回収した１０7ＦＦＵのウイルスによって（３週間の間隔で）３回のワクチン接種を受け、又は、コントロール群を２％ＦＣＳ−ＭＥＭの接種を受けた。ワクチン接種をウィスコンシン大学マディソン校で行った。続いて、マウスをＮａｔｉｏｎａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ａｇｅｎｃｙ  ｏｆ  ＣａｎａｄａのＢＳＬ−４実験室に移送し、ここで、１０００匹のマウスの５０％致死量のマウスに適合したエボラウイルス（ＭＬＤ50；すなわち、感染した動物の５０％を殺すために必要な投与量）によってそれらをチャレンジした。チャレンジ４日目に、ウイルスタイターを各群からの３つのコントロールの血清及び３つのワクチン接種したマウスにおいて決定した。残りのマウスについて２８日間生存を監視した。
【０１４２】
エボラΔＶＰ３０ウイルスによって免疫したマウスの抗体反応。潜在的なワクチンとしてエボラΔＶＰ３０ウイルスを評価するために、マウスにおけるその免疫原性を決定した。エボラΔＶＰ３０ウイルスによって接種されたマウスは、任意の疾病の徴候を示さず、エボラΔＶＰ３０ウイルスの病原性の欠失を実証している。エボラ糖タンパク質（ＧＰ）への抗体の濃度を決定するために各ワクチン接種後２週間で収集した、血清試料を精製したＧＰによるＥＬＩＳＡによってＩｇＧ抗体について試験した場合に、接種された動物は、コントロールマウスと比較して第一の接種後にＧＰに対する抗体のタイターの上昇した濃度を示し、さらにこれらの抗体のタイターは第二及び第三の接種後に増大した。この見解は、ＧＰへの抗体を誘発する生物学的に封じ込められたエボラΔＶＰ３０ウイルスの能力を実証する。
【０１４３】
ワクチン接種したマウスにおけるＣＤ８+Ｔ細胞反応。マウスにおけるワクチンへの細胞反応を試験した。マウスを上記のように接種した。第二のワクチン接種後８日目で、４匹の接種した及び２匹のコントロールのマウスを安楽死させ、それらの脾臓を除去した。脾細胞を単離し、そしてエボラペプチドＮＰ279-288（ＳＦＫＡＡＬＳＳＬＡ）、ＶＰ４０171-180（ＹＦＴＦＤＬＴＡＬＫ）又はＧＰ161-169（ＬＹＤＲＬＡＳＴＶ）によってブレフェルジンＡ及びＩＬ−２の存在下で５時間刺激した。ワクチン接種したマウスは、エボラペプチドＮＰ279-288によって刺激した細胞において０．０１７％から０．２２％の範囲においてＩＦＮ−γ陽性ＣＤ８+細胞を有した（図６）。コントロールマウスにおいて、ＩＦＮγ−陽性ＣＤ８+細胞の数は著しくより低く、０．００５１３％から０．００７９４％に及んだ。エボラペプチドＶＰ４０171-180又はＧＰ161-169によって刺激したＩＦＮγ−陽性ＣＤ８+細胞は検出されなかった。（データは示されていない）。
【０１４４】
マウスにおけるエボラΔＶＰ３０ウイルスの保護効率。エボラΔＶＰ３０ウイルスの保護効率を評価するために、４週齢の２群は腹腔内に接種され、続いてマウスに適合したエボラウイルスによって致死的チャレンジを受けた。「群１」のマウスは１０7ＦＦＵの非精製エボラΔＶＰ３０ウイルス（すなわち、細胞培養上清から回収したウイルス）によって３週間の間隔で３回接種した；８匹のコントロールマウスに２％ＦＣＳ−ＭＥＭによって同様の方法で接種した。この群からのマウスを、慣習的にマウスを殺す、１０００ＭＬＤ50のマウスに適合したエボラウイルスによって、最後の免疫後７週間チャレンジした（Ｂｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｅｂｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。「群２」のマウスを、１０6ＦＦＵの精製したエボラΔＶＰ３０ウイルスによって（３週間の間隔で）２回接種し、；１０匹のコントロールのマウスを同時にＰＢＳによって接種した。「群２」由来のマウスを、１０００ＭＬＤ50のマウスに適合したエボラウイルスによる最後の免疫後８週間チャレンジした。精製した又は未精製のエボラΔＶＰ３０ウイルスによって接種されたマウスにおいて、疾病又は病気の徴候は見られず、一方で両方の群からのコントロールマウスは、チャレンジ３日後の体重減少と共に病気（例えば乱れた毛並み）の徴候を示し始めた。チャレンジ後７日目までに、全てのコントロールのマウスは感染によって死んだ。対照に、乱れた毛並み及び体重減少によって特徴づけられるように、両方の群からのワクチン接種したマウスは疾病の徴候を示さず、そして最大２８日、十分に致死チャレンジに対して保護され、その時に全ての生存するマウスを安楽死させた。チャレンジ後４日目において、マウスを屠殺し、血清中のウイルスタイターを決定した。両群由来のワクチン接種したマウスは、それらの対応するコントロールマウスと比較してウイルスタイターにおいて３〜４ｌｏｇ10の減少を示した。まとめると、これらのデータはエボラΔ３０ウイルスがマウスに適合したエボラウイルスの致死量によるチャレンジに対してマウスを効率的に保護することを実証する。同様の結果はモルモットにおいて得られた。
【０１４５】
エボラΔＶＰ３０接種したマウスはマウスに適合したエボラウイルスによる致死チャレンジより完全に保護され、そしてこれらのマウスからの血清中のウイルスタイターが、コントロールマウスにおけるウイルスタイターよりも１０００倍以上低い。
【０１４６】
エボラウイルス感染への体液性の反応は、ウイルスの糖タンパクＧＰへの抗体の積極的な移行による致死チャレンジからの保護によって実証されるので、重要である（Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｗａｒｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。しかしながら、抗体反応を誘発するワクチンの能力は、それ自身においてエボラウイルス感染からの保護と相関しない。例えば、γ線照射したエボラ及びマールブルグウイルスのような古典的なワクチンアプローチは、バキュロウイルスにおいて発現されるＧＰと共に、穏やかな抗体反応を作り出し、；しかしながら、それらは致死チャレンジに対してマウスを保護することに失敗している（ｌｇｎａｔｙｅｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｌｕｐｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０；Ｍｅｌｌｑｕｉｓｔ−Ｒｉｅｍｅｎｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。対照に、エボラ及びマールブルグのＶＰＬｓはエボラ又はマールブルグウイルスの致死チャレンジからマウスを保護し（Ｗａｒｉｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｗａｒｉｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｗａｒｉｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）、そして体液性反応を誘導するだけでなく、ＣＤ８+Ｔ細胞反応を誘導する。同様に、ヒト以外の霊長類（ＮＨＰｓ）において、致死チャレンジからの全ての保護は体液性反応及びＣＤ８+細胞性反応の両方に依存するように思われる（Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。致死的なエボラウイルスチャレンジからのＮＨＰｓを保護するワクチン候補、例えば、組換え水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）及びアデノウイルス（Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）はＮＨＰｓにおいて、程度は変わるが、ＣＤ８+Ｔ細胞反応を誘導する（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。このＣＤ８+Ｔ細胞反応が致死エボラウイルス感染からＮＨＰｓに保護を提供するために十分であるかどうかは依然として検討されている。
【０１４７】
組換えＶＳＶ又はパラインフルエンザウイルスのようなワクチン候補は様々な動物モデルにおいて保護を提示するが（Ｂｕｋｒｅｙｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）、ヒトにおけるこれらのワクチンの使用への安全性への懸念がある（Ｂｕｋｒｅｙｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｒｅｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。また、組換えアデノウイルスに基づくワクチンへの既存の免疫は、多大なウイルス量（１０10粒子数）がＮＨＰｓにおける保護をもたらすために必要とされるので、懸念がある（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。エボラ及びマールブルグＶＬＰｓはこれらのウイルスの致死チャレンジからマウス及びモルモットを保護することを示した（Ｗａｒｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｗａｒｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。一方で、ＶＬＰｓは安全であり、そしてエボラウイルス感染の希少性のせいで、エボラ又はマールブルグウイルスへの既存の免疫はＶＬＰワクチンについて懸念はなく、それは細胞培養からのＶＬＰｓのより多い量を産生することを困難にする。
【０１４８】
生物学的に封じ込められたエボラΔＶＰ３０ウイルスは、それゆえ、ＶＬＰｓとベクター化したワクチンとの利点を組み合わせている（すなわち安全及び効果的である）ので、理想的なワクチン候補であるが、標準的なウイルスのように、ＶｅｒｏＶＰ３０細胞内の高いタイターに増殖されうる（実施例１）。さらなる研究はＮＨＰｓにおけるその保護効率のためのエボラΔＶＰ３０ウイルスを試験することを含むだろう。加えて、より短い、単一のワクチンプロトコルは、エボラΔＶＰ３０ウイルスワクチンが大流行又は生物テロ攻撃の事象における早く効果的な免疫を誘発すると考えられる場合を決定するために評価されるだろう。これは曝露後の治療のためのワクチンとしてエボラΔＶＰ３０ウイルスを評価することを含む。
【０１４９】
本発明はさらに以下の制限されない実施例において記載されるだろう。
【実施例】
【０１５０】
実施例１
ヒト以外の霊長類を１又は２のワクチンウイルス（ＩＭ又はエアロゾル）の投与量によってワクチン接種し、続いて最終投与後４週間チャレンジした（異種チャレンジ又は同種チャレンジ）。ある接種は三つの異なるアジュバントの一つを含んだ。研究＃２からのデータより示されるように、これは、異種チャレンジを生存したウイルス及びアジュバントによってワクチン接種したそれらの動物のみの、研究＃１よりも１０倍より高いワクチンウイルスを有した。研究＃３において、本発明のワクチンに用いられるプロトコルに加えて（３Ａ及び３Ｄ）、現在試験することを経験している二つの他の抗エボラウイルスワクチン（ワクチンＡ、複製能力のあるウイルスを有するワクチンの鼻腔内投与；ワクチンＢ、複製能力のあるウイルスを有するワクチンの筋肉内投与）を試験した。一つのプロトコルにおいて、接種のみはワクチンＡ（３Ｇ）を誘導した。他の接種プロトコルにおいて、本発明のワクチンとワクチンＡ（３Ｂ及び３Ｃ）との組み合わせ並びにワクチンＡとワクチンＢとの組み合わせ（３Ｅ及び３Ｆ）を試験した。いくつかのプロトコルはアジュバントを含んでいた（３Ａ−３Ｄ）。
【表１】
2021533157.tif 000002
【表２】
2021533157.tif 000003
【０１５１】
実施例２
例示的な製造工程
マスターウイルスシード（ＭＶＳ）の作製
【０１５２】
逆遺伝学的な技術によってワクチンウイルスの産生のためのプラスミドへ導入する化学的なトランスフェクション試薬はＶｅｒｏＶＰ３０細胞について不十分である。それゆえ、Ｎｅｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍを用いて、エレクトロポレーション法を実施した。使用前に、そのＮｅｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍをエチレンオキサイドによって滅菌した。それぞれに１×１０ｅ６  ＶｅｒｏＶＰ３０細胞を含む６つの微量遠心管を１０μｇの総量のプラスミド（ｐＣＡＧＧＳ  ＥＢＯＶ  Ｌ、ｐＣＡＧＧＳ  ＥＢＯＶ  ＮＰ−ＶＰ３５、Ｔ７、及びｐＴＭ  ＥｂｏｌａΔＶＰ３０  ｐｌａｓｍｉｄをそれぞれ２：１：１：２量比）によって混合し、Ｎｅｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍにおいて１２００Ｖで３回の２０ミリ秒パルスによって電気穿孔した。トランスフェクションした細胞を６穴プレートの各ウエルに播種し、ＴＣ７５フラスコにおける展開前４日間について３７±２℃、５±２％ＣＯ2でインキュベートした。
【０１５３】
細胞培養及びワクチンウイルス回収
細胞培養を１％Ｇｌｕｔａｍａｘによって添加した（ウイルス産生−無血清培地［ＶＰ−ＳＦＭ、Ｔｈｅｒｍｏ  ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］）完全培地によって開始し、１８×１０段セルファクトリー（Ｎｕｎｃ）内に展開した。前記ＶＰ−ＳＦＭはＯｐｔｉＶＥＲＯ培地（ＩｎＶｉｔｒｉａ）よりも良い機能を果たし、１０段セルファクトリーはウイルス産生という点において、ｈｙｐｅｒｓｔａｃｋｓ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）よりもより良い機能を果たし、ウイルスタイターにおける増加をもたらしている（フォーカス形成単位において示されたタイターにおける１〜１．５ｌｏｇ増加）。
【０１５４】
細胞が８０〜９０％の細胞密集度に到達した場合に、各１０段セルファクトリーをＤＰＢＳによって三回洗浄し、続いて１％Ｇｌｕｔａｍａｘを有するＶＰ−ＳＦＭにおいて０．１のＭＯＩでＭＶＳによって感染させた。各感染した１０段セルファクトリーを３７±２℃、５±２％ＣＯ2で７日間インキュベートした。７日間の感染期間に続いて、各１０段セルファクトリーをコンタミネーションについて試験し、その内容物を滅菌した２０Ｌのバイオプロセスバッグ内に回収した。プールした試料及びそのバルク回収物をデプスフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ２  ＸＬＧ  ＭｉｄｉＣａｐによる１．２μＭ濾過）を通じて新しい滅菌バイオプロセスバッグに汲み出した。
【０１５５】
宿主のゲノムＤＮＡをベンゾナーゼ処理によって除去した。ＭｇＣｌ2を濾過したウイルス収集物に最大で２ｍＭ  ＭｇＣｌ2の終濃度で添加し、そして４〜６時間、３７±２℃でインキュベートした。ベンゾナーゼ処理後、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）を終濃度０．１％ｖ／ｖで添加し、２〜８℃で１６〜１８時間インキュベートした。
【０１５６】
切断された宿主ＤＮＡ、ベンゾナーゼ、ＢＰＬ及び他の宿主不純物をタンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）によって連続して取り除いた。ベンゾナーゼ／ＢＰＬ処理したウイルス収集物を（例えば、沈殿をもたらさないために濃縮される）約１０倍に濃縮し、例えば、Ｃａ2+／Ｍｇ2+を有するダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）内に、０．１μｍポアサイズを用いて透析し、続けてさらに滅菌した／閉鎖したＴＦＦシステム（そのＴＦＦフィルターはＧＥ  Ｈｅａｌｔｈからの０．１μｍポアサイズ、３０ｃｍパッチ長、例えばＧＥ  ＲＴＰＣＦＰ−１Ｅ−８Ｓホローファイバーカートリッジ）を用いて〜２倍の所望される産物の濃度（例えば、６×１０7ＦＦＵ／ｍＬ）に濃縮した。透析後、そのＴＦＦ残余分及び洗浄プールの試料を透析し、ＥＬＩＳＡ及び宿主タンパク質によってタイターを決定した。宿主タンパク質の規格に適合する（例えば、≦５００ｎｇ／ｍＬ）残余分及び洗浄試料は、プールされ、遠心され、任意の残存の特定の物質を取り除き、滅菌した２ＬのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコに移され、そして製品を製造するまで（例えばＤＰＢＳ内で）２〜８℃で貯蔵された。
【０１５７】
培地及び条件の試験
ＴＣ１７５フラスコを用いて細胞を培養し、感染させた場合に、ＯＰＴＩＶｅｒｏ培地はＶＰ−ＳＦＭよりも約１ｌｏｇユニットの高いウイルスタイターをもたらした（例えば、６．８４  ｌｏｇ10ＦＦＵ／ｍＬ［ＯＰＴＩＶｅｒｏ］対５．７５  ｌｏｇ10ＦＦＵ／ｍＬ［ＶＰ−ＳＥＭ］）。ＶＰ−ＳＦＭ培地を用いて１０段システムにおいて細胞を培養し、感染させた場合に、ＶＰ−ＳＦＭ培地を用いてｈｙｐｅｒｓｔａｃｋにおいて細胞を培養し、感染させた場合よりも、約１ｌｏｇユニットの高いタイターを産生する（例えば、６．６９  ｌｏｇ10ＦＦＵ／ｍＬ［１０段システム］対５．５８  ｌｏｇ10ＦＦＵ／ｍＬ［ｈｙｐｅｒｓｔａｃｋ］）。ＶＰ−ＳＦＭ培地は（例えば、ｄｉ−及びｔｒｉ−植物ペプチドを含む）植物加水分解物及びイオンキレート剤を含み、一方でＯＰＴＩＶｅｒｏ培地は組換えヒトアルブミン、組換えヒトトランスフェリンを含む（すなわち、植物加水分解物又はイオンキレート剤を含まない）。
【０１５８】
参考文献
Ｂｏｅｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３２：４０６（２００５）．
Ｂｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１７８：６５１（１９９８）．
Ｂｕｋｒｅｙｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８０：２２６７（２００６）．
Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１０６：１１７（２００１）．
Ｃｈａｎｄｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０８：１６４３（２００５）．
Ｅｂｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌｏｓ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，２：０７０５（２００６）．
Ｅｂｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏｓ  Ｐａｔｈｏｇ．，２：ｅ７３（２００６）．
Ｆｅｌｄｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｖｉｒｕｓ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ：Ｅｉｇｈｔｈ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓｅｓ，ｅｄｓ．Ｆａｕｑｕｅｔ，Ｃ．，Ｍａｙｏ，Ｍ．Ａ．，Ｄｅｓｓｅｌｂｅｒｇｅｒ，Ｕ．，＆Ｂａｌｌ，Ｌ．Ａ．（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｌｏｎｄｏｎ），ｐｐ．６４５（２００４）．
Ｇｒｏｓｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７９：４４２５（２００５）．
Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５：４６４９（２００１）．
Ｈａｌｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  ｓｕｂｍｉｓｓｉｏｎ（２００７）．
Ｈａｒｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８０：６４３０（２００６）．
Ｈａｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，１０：３０７（２００２）．
Ｉｇｎａｔｙｅｖｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４４：１１１（１９９６）．
Ｊａｓｅｎｏｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５：５２０５（２００１）．
Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，ｉ：５６９（１９７７）．
Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．Ｊ．，３：３１（２００６）．
Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１１：７８６（２００５）．
Ｌｉｃａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：７３４４（２００４）．
Ｌｕｐｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，２：１２９４（１９８０）．
Ｍａｎｉｃａｓｓａｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７９：４７９３（２００５）．
Ｍａｒｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３５２：３４５（２００６）．
ＭｃＣａｒｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１３７：１１５（２００６）．
Ｍｅｌｌｑｕｉｓｔ−Ｒｉｅｍｅｎｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．，９２：１８７（２００３）．
Ｍｏｄｒｏｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：３３０９９（２００２）．
Ｍｏｄｒｏｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７７：３３３４（２００３）．
Ｍｕｈｌｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．，７３；２３３３（１９９９）．
Ｍｕｒａｌｉ−Ｋｒｉｓｈｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，８；１７７（１９９８）．
Ｎｅｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７６：４０６（２００２）．
Ｎｅｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７９：１０３００（２００５）．
Ｎｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７６：４８５５（２００２）．
Ｏｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７９：１４１８９（２００５）．
Ｐａｎｃｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：１５９３６（２００３）．
Ｒｅｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ．２５：１９２３（２００７）．
Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ｋｎｉｐｅ，Ｄ．Ｍ．，Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｄ．Ｅ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ｍ．Ａ．，Ｌａｍｂ，Ｒ．Ａ．，Ｒｏｉｚｍａｎ，Ｂ．，＆Ｓｔｒａｕｓ，Ｓ．Ｅ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ），ｐｐ．１４０９（２００７）．
Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．，２９：２１５（１９９３）．
Ｓｈｉｍｏｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８０：１０１０９（２００６）．
Ｓｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３１８：２２４（２００４）．
Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４０８：６８１（２０００），
Ｔａｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５：２３２４（２００１）．
Ｔａｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９４：１４７６４（１９９７）．
Ｔａｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，２５：９９３（２００７）．
Ｔａｋａｄａ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７７：１０６９（２００３）．
Ｔｈｅｒｉａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．Ｓｕｐｐｌ．，１９：１５７（２００５）．
Ｖｏｌｃｈｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９１：１９６５（２００１）．
Ｗａｒｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７５：１１８４（２００５）．
Ｗａｒｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：１５８８９（２００３）．
Ｗａｒｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，２２：３４９５（２００４）．
Ｗｏｏｌ−Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２：１５５（１９９８）．
Ｙｏｎｅｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７９：９１８（２００５）．
【０１５９】
全ての刊行物、特許及び特許出願は参照によって本明細書に組み込まれる。前述の明細書において、本発明はある程度その好ましい態様に関連して記載され、そして多くの詳細は例示の目的において説明されているので、本発明が追加の態様に影響を受けやすく、本発明の基本的な原理から離れることなく、本明細書の詳細のある程度がかなり変化しうることが当業者に明らかだろう。
【図１】
2021533157.tif 000004
【図２】
2021533157.tif 000005
【図２−１】
2021533157.tif 000006
【図２−２】
2021533157.tif 000007
【図２−３】
2021533157.tif 000008
【図２−４】
2021533157.tif 000009
【図２−５】
2021533157.tif 000010
【図２−６】
2021533157.tif 000011
【図２−７】
2021533157.tif 000012
【図２−８】
2021533157.tif 000013
【図２−９】
2021533157.tif 000014
【図２−１０】
2021533157.tif 000015
【図２−１１】
2021533157.tif 000016
【図２−１２】
2021533157.tif 000017
【図２−１３】
2021533157.tif 000018
【図２−１４】
2021533157.tif 000019
【図２−１５】
2021533157.tif 000020
【図２−１６】
2021533157.tif 000021
【図２−１７】
2021533157.tif 000022
【図２−１８】
2021533157.tif 000023
【図２−１９】
2021533157.tif 000024
【図２−２０】
2021533157.tif 000025
【図２−２１】
2021533157.tif 000026
【図２−２２】
2021533157.tif 000027
【図２−２３】
2021533157.tif 000028
【図２−２４】
2021533157.tif 000029
【図２−２５】
2021533157.tif 000030
【図２−２６】
2021533157.tif 000031
【図２−２７】
2021533157.tif 000032
【図２−２８】
2021533157.tif 000033
【図２−２９】
2021533157.tif 000034
【図２−３０】
2021533157.tif 000035
【図２−３１】
2021533157.tif 000036
【図２−３２】
2021533157.tif 000037
【図２−３３】
2021533157.tif 000038
【図２−３４】
2021533157.tif 000039
【図２−３５】
2021533157.tif 000040
【図２−３６】
2021533157.tif 000041
【図２−３７】
2021533157.tif 000042
【図２−３８】
2021533157.tif 000043
【図２−３９】
2021533157.tif 000044
【図２−４０】
2021533157.tif 000045
【図２−４１】
2021533157.tif 000046
【図２−４２】
2021533157.tif 000047
【図２−４３】
2021533157.tif 000048
【図２−４４】
2021533157.tif 000049
【図２−４５】
2021533157.tif 000050
【図２−４６】
2021533157.tif 000051
【図２−４７】
2021533157.tif 000052
【図２−４８】
2021533157.tif 000053
【図２−４９】
2021533157.tif 000054
【図２−５０】
2021533157.tif 000055
【図２−５１】
2021533157.tif 000056
【図２−５２】
2021533157.tif 000057
【図２−５３】
2021533157.tif 000058
【図２−５４】
2021533157.tif 000059
【図２−５５】
2021533157.tif 000060
【図２−５６】
2021533157.tif 000061
【図２−５７】
2021533157.tif 000062
【図２−５８】
2021533157.tif 000063
【図２−５９】
2021533157.tif 000064
【図２−６０】
2021533157.tif 000065
【図２−６１】
2021533157.tif 000066
【図２−６２】
2021533157.tif 000067
【図２−６３】
2021533157.tif 000068
【図２−６４】
2021533157.tif 000069
【図２−６５】
2021533157.tif 000070
【図２−６６】
2021533157.tif 000071
【図２−６７】
2021533157.tif 000072
【図２−６８】
2021533157.tif 000073
【図２−６９】
2021533157.tif 000074
【図２−７０】
2021533157.tif 000075
【図２−７１】
2021533157.tif 000076
【図２−７２】
2021533157.tif 000077
【図２−７３】
2021533157.tif 000078
【図２−７４】
2021533157.tif 000079
【図２−７５】
2021533157.tif 000080
【図２−７６】
2021533157.tif 000081
【図２−７７】
2021533157.tif 000082
【図２−７８】
2021533157.tif 000083
【図２−７９】
2021533157.tif 000084
【図２−８０】
2021533157.tif 000085
【図２−８１】
2021533157.tif 000086
【図２−８２】
2021533157.tif 000087
【図２−８３】
2021533157.tif 000088
【図２−８４】
2021533157.tif 000089
【図２−８５】
2021533157.tif 000090
【図２−８６】
2021533157.tif 000091
【図２−８７】
2021533157.tif 000092
【図２−８８】
2021533157.tif 000093
【図２−８９】
2021533157.tif 000094
【図２−９０】
2021533157.tif 000095
【図２−９１】
2021533157.tif 000096
【図２−９２】
2021533157.tif 000097
【図２−９３】
2021533157.tif 000098
【図２−９４】
2021533157.tif 000099
【図２−９５】
2021533157.tif 000100
【図２−９６】
2021533157.tif 000101
【図２−９７】
2021533157.tif 000102
【図２−９８】
2021533157.tif 000103
【図２−９９】
2021533157.tif 000104
【図２−１００】
2021533157.tif 000105
【図２−１０１】
2021533157.tif 000106
【図２−１０２】
2021533157.tif 000107
【図２−１０３】
2021533157.tif 000108
【図２−１０４】
2021533157.tif 000109
【図２−１０５】
2021533157.tif 000110
【図２−１０６】
2021533157.tif 000111
【図２−１０７】
2021533157.tif 000112
【図２−１０８】
2021533157.tif 000113
【図２−１０９】
2021533157.tif 000114
【図２−１１０】
2021533157.tif 000115
【手続補正書】
【提出日】令和3年4月9日(2021.4.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量の組換えフィロウイルス及び一以上のアジュバント、及び任意に医薬的に許容可能な担体を含み、ここで前記組換えフィロウイルスのゲノムが、エボラウイルスＶＰ３０に対応するウイルスタンパク質のポリヌクレオチド配列において一以上のヌクレオチドの欠失を含み、かつここで組換えフィロウイルスによる細胞の感染時に、前記欠失がエボラウイルスＶＰ３０に対応する機能的なウイルスタンパク質の発現を妨げることに効果的であるワクチン。
【請求項２】
前記ウイルスのウイルスゲノムにおけるＶＰ３０配列に対応する配列の少なくとも９０％が欠失した請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記ゲノムがさらに予防的な又は治療的な異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含み、かつ任意にここで前記ヌクレオチド配列が前記欠失部位の１０００ヌクレオチド内若しくは前記欠失部位に挿入され、又はここで前記ヌクレオチド配列がポリヌクレオチド内の前記欠失部位以外の部位で前記フィロウイルスゲノム内に挿入され、又はここで前記ヌクレオチド配列がＧＰ／ｓＧＰ配列又はその一部を置換し、又はここで、前記ヌクレオチド配列がＧＰ／ｓＧＰコード配列内に挿入される請求項１又は２に記載のワクチン。
【請求項４】
前記ヌクレオチド配列がフィロウイルスゲノム内のＮＰコード配列とＶＰ３５コード配列との間に挿入される請求項３に記載のワクチン。
【請求項５】
前記異種遺伝子産物が糖タンパク質又は非糖タンパク質を含み、それらは任意にマールブルグウイルス、エボラウイルス、スーダンウイルス、タイフォレストウイルス、レストンウイルス、又はブンディブギョウイルスの糖タンパク質、Ｅｂｏｌａ  ＮＰ、Ｅｂｏｌａ  ＶＰ４０、Ｅｂｏｌａ  ＶＰ３５、Ｍａｒｂｕｒｇ  ＮＰ、Ｍａｒｂｕｒｇ  ＮＰ  ＶＰ４０、Ｍａｒｂｕｒｇ  ＮＰ  ＶＰ３５、プラスモジウムスポロゾイト周囲タンパク質（ＣＳＰ）、プラスモジウム頂端膜タンパク質（ＡＭＡ）、プラスモジウムロプトリー頚部タンパク質２（ＲＯＮ２）、又はプラスモジウムＲＨ５、フラビウイルス膜タンパク質、フラビウイルスエンベロープタンパク質、又はブニヤウイルス糖タンパク質前駆体（ＧＰＣ）タンパク質である請求項３又は４に記載のワクチン。
【請求項６】
前記組換えフィロウイルスゲノムが組換えエボラウイルスゲノムである請求項１〜５のいずれか一項のワクチン。
【請求項７】
前記アジュバントがリポ多糖、スクアレン、又はサポニンを含む請求項１〜６のいずれか一項のワクチン。
【請求項８】
前記リポ多糖がモノホスホリルリピドＡを含む又は前記サポニンがキラヤの抽出物を含む請求項７のワクチン。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項のワクチンの有効量を含む、哺乳動物に免疫を与える薬物の製造における使用のための組成物。
【請求項１０】
組換えフィロウイルス、ここでその組換えフィロウイルスのゲノムが、エボラウイルスＶＰ３０に対応するウイルスタンパク質のポリヌクレオチド配列内の一以上のヌクレオチドの第一の欠失を含み、その第一の欠失は組換えフィロウイルスによる細胞の感染時に、エボラウイルスＶＰ３０に対応する機能的なウイルスタンパク質の発現を妨げることに効果的であり、かつここで前記ゲノムはＮＰコード配列とＶＰ３５コード配列に隣接される領域における変異、ＧＰ／ｓＧＰコード配列における変異、及び／又は第一の欠失部位の１０００ヌクレオチド内若しくは第一の欠失部位への挿入、又はそれらの組み合わせを含み、ここで前記ゲノムは一以上のフィロウイルスの糖タンパク質をコードし、ここでＮＰコード配列とＶＰ３５コード配列に隣接する領域内の前記変異は予防的な又は治療的な異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列の挿入及び任意にまた前記ＮＰコード配列とＶＰ３５コード配列に隣接する領域において一以上のヌクレオチドの欠失を含み、ここで前記ＧＰ／ｓＧＰコード配列におけるその変異は予防的な又は治療的な異種遺伝子産物をコードするヌクレオチドの挿入及び任意にまたＧＰ／ｓＧＰコード配列における一以上のヌクレオチドの欠失を含み、又はここで第一の欠失部位の１０００ヌクレオチド内若しくは第一の欠失部位でのその挿入が予防的な又は治療的な異種遺伝子産物をコードする、ウイルス。
【請求項１１】
ＮＰコード配列とＶＰ３５コード配列に隣接する前記領域内の変異、ＧＰ／ｓＧＰコード配列内の変異、又はＶＰ３０配列の欠失に近接する若しくは前記ＶＰ３０配列の欠失で予防的な又は治療的な異種遺伝子産物をコードする挿入を有する、請求項１０に記載のウイルス。
【請求項１２】
多価ワクチンである請求項１に記載のワクチン。
【請求項１３】
組換えフィロウイルスを製造する方法であって、：
子孫のフィロウイルスをもたらすために無血清培地内で培養される組換えフィロウイルスゲノムを発現する哺乳動物細胞からの上清を提供することであって、ここで、前記組換えフィロウイルスのゲノムが、エボラウイルスＶＰ３０に対応するウイルスタンパク質のポリヌクレオチド配列において一以上のヌクレオチドの欠失を含み、かつここで前記欠失が組換えフィロウイルスによる細胞の感染時にエボラウイルスＶＰ３０に対応する機能的なウイルスタンパク質の発現を妨げることに効果的であり、かつここで前記哺乳動物細胞がエボラウイルスＶＰ３０に対応するウイルスタンパク質を発現すること；
前記上清とＤＮａｓｅ及びウイルス不活化剤とを接触させること、それによって不活化したウイルス調製液を提供すること；かつ
不活化したウイルス調製液を濃縮することを含む方法。
【請求項１４】
前記細胞がＶｅｒｏ細胞である請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記収集した上清がＤＮａｓｅ又はウイルス不活化剤と接触する前に濾過され、かつ任意に前記収集した上清が０．５〜５ミクロンのフィルター又は１〜５ミクロンのフィルターによる濾過にかける請求項１３又は１４の方法。
【請求項１６】
前記不活化したウイルス調製液が濾過にかけられ、かつ任意に前記不活化したウイルス調製液の濾過が、０．０１〜１ミクロンのフィルター又は０．０５〜０．２５ミクロンのフィルターを介する請求項１３〜１５のいずれか一項の方法。
【国際調査報告】
2021533157.tif 000116
2021533157.tif 000117
2021533157.tif 000118
2021533157.tif 000119
2021533157.tif 000120
2021533157.tif 000121