(57)【要約】  DNA鎖切断の修復を媒介する酵素の活性を阻害することのできる抗がん剤（PARPなど）を用いてがんを治療する方法、または前記抗がん剤に対するがんの反応性を予測する方法として、SASH1の発現レベルを明らかにする工程を含む方法が、ここに提示されている。がんを治療する方法として、SASH1の発現および／または活性を増大させる薬剤を治療に有効な量で投与する方法も提示されている。さらに、がんの治療に使用することを目的として、SASH1の発現および／または活性を変化させる薬剤を同定する方法もここに提示されている。
2021523146.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において抗がん剤に対するがんの反応性を予測する方法であって、前記抗がん剤が、DNA鎖切断の修復を媒介する酵素の活性を阻害する抗がん剤であり、前記方法が、前記対象の1個または複数個のがん細胞、またはがん組織、またはがん臓器の中でのSASH1核酸またはSASH1タンパク質の発現レベルを明らかにする工程を含んでいて、前記SASH1核酸またはSASH1タンパク質の発現レベルが、前記抗がん剤に対する前記がんの反応性の相対的な増加または減少を示しているか、前記抗がん剤に対する前記がんの反応性の相対的な増加または減少と相関している方法。
【請求項２】
前記酵素がポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼ（PARP）である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記抗がん剤がPARP阻害剤であるか、PARP阻害剤を含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記PARP阻害剤の選択が、オラパリブ、ベリパリブ、ルカパリブ、イニパリブ、タラゾパリブ、ニラパリブ、3-アミノベンズアミド、ME0328、PJ34、AG-14361、INO-1001、UPF-1069、AZD-2461、CEP9722、A-966492と、これらの任意の組み合わせからなるグループからなされる、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
SASH1核酸またはSASH1タンパク質のレベル低下が、前記PARP阻害剤に対する前記がんの反応の相対的な増加を示すか、前記PARP阻害剤に対する前記がんの反応の相対的な増加と相関している、および／またはSASH1核酸またはSASH1タンパク質のレベル上昇が、前記PARP阻害剤に対する前記がんの反応の相対的な減少を示すか、前記PARP阻害剤に対する前記がんの反応の相対的な減少と相関している、請求項3または4に記載の方法。
【請求項６】
前記対象の前記がんを治療する工程をさらに含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
対象のがんを治療する方法であって、前記対象の1個または複数個のがん細胞、またはがん組織、またはがん臓器の中でのSASH1核酸またはSASH1タンパク質の発現レベルを明らかにし、その結果に基づき、がん治療を開始するか、継続するか、変更するか、中断する工程を含む方法。
【請求項８】
前記がん治療が、DNA鎖切断の修復を媒介する酵素の活性を阻害する抗がん剤を治療に有効な量で投与することを含む、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記がん治療が、SASH1の発現および／または活性を阻害または阻止する薬剤を治療に有効な量で前記対象に投与することを含む、請求項7または8に記載の方法。
【請求項１０】
対象のがんを治療する方法であって、前記対象に、SASH1の発現および／または活性を阻害または阻止する薬剤の治療に有効な量を、DNA鎖切断の修復を媒介する酵素の活性を阻害する抗がん剤と組み合わせて投与する工程を含む方法。
【請求項１１】
前記酵素がポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼ（PARP）である、請求項8〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗がん剤がPARP阻害剤であるか、PARP阻害剤を含む、請求項8〜11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
前記PARP阻害剤の選択が、オラパリブ、ベリパリブ、ルカパリブ、イニパリブ、タラゾパリブ、ニラパリブ、3-アミノベンズアミド、ME0328、PJ34、AG-14361、INO-1001、UPF-1069、AZD-2461、CEP9722、A-966492と、これらの任意の組み合わせからなるグループからなされる、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
対象のがんを治療する方法であって、SASH1の発現および／または活性を増大させる薬剤を治療に有効な量で前記対象に投与する工程を含む方法。
【請求項１５】
前記薬剤が有機小分子である、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
対象のがんの治療に使用するための薬剤を同定および／または製造する方法であって、
（a）SASH1タンパク質またはSASH1核酸を発現する細胞を候補薬剤と接触させる工程と；
（b）その候補薬剤がSASH1の発現および／または活性を変化させるかどうかを判断する工程を含む方法。
【請求項１７】
前記候補薬剤が、SASH1の発現および／または活性を少なくとも部分的に低下させるか、消失させるか、抑制するか、阻害する、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記候補薬剤が、SASH1の発現および／または活性を少なくとも部分的に増大させる、請求項16に記載の方法。
【請求項１９】
前記候補薬剤が、抗体または有機小分子である、請求項16〜18のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２０】
前記候補薬剤が、がんの治療での使用に適している、請求項16〜19のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２１】
前記がんが生殖系のがんである、請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２２】
生殖系の前記がんが、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮がん、前立腺がん、精巣がんを含む、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
生殖系の前記がんが乳がんである、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
前記がんが肺がんであるか、肺がんを含む、請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２５】
請求項15〜24のいずれか1項に記載の方法によって製造または同定される、がんを治療するための薬剤。
【請求項２６】
請求項6〜15または21〜24のいずれか1項に記載の方法に従って利用するための、請求項25に記載の薬剤。
【請求項２７】
対象において抗がん剤に対するがんの反応性を予測するためのキットであって、前記抗がん剤が、DNA鎖切断の修復を媒介する酵素の活性を阻害する抗がん剤であり、前記キットが、前記対象の1個または複数個のがん細胞、またはがん組織、またはがん臓器の中でのSASH1タンパク質またはSASH1タンパク質をコードする核酸の発現レベルを明らかにすることのできる少なくとも1つの試薬を含んでいて、前記SASH1タンパク質またはSASH1タンパク質をコードする核酸の発現レベルが、前記抗がん剤に対する前記がんの反応性の相対的な増加または減少を示しているか、前記抗がん剤に対する前記がんの反応性の相対的な増加または減少と相関しているキット。
【請求項２８】
請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法で利用するための、請求項27に記載のキット。
【請求項２９】
対象の乳がんに関する予後を判断する方法であって、前記対象の1個または複数個のがん細胞、またはがん組織、またはがん臓器の中でのSASH1核酸またはSASH1タンパク質の発現レベルを明らかにする工程を含んでいて、SASH1の変化した発現レベルが、前記乳がんのより不良な予後またはより良好な予後を示すか、前記乳がんのより不良な予後またはより良好な予後と相関している方法。
【請求項３０】
前記乳がんが、ER陽性（ER+）乳がんまたはER陰性（ER-）乳がんである、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
前記対象がヒトである、請求項1〜24、29、30のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がんに関する。より具体的には、本発明は、がん（特に肺がんと生殖系のがん（乳がんなど））を治療する方法、および／または治療に対するがんの反応性および／またはがんの予後を明らかにする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳がんは世界中で2番目に多いがんであり、女性のあらゆるがんの25％を占めている。改良された管理戦略のおかげで生存率は過去数十年の間に増加してきている。しかし前記疾患は相変わらず女性のがん関連死の第2の原因である［1］。乳がんに関する現在の治療戦略は、主に患者の腫瘍の病理学的特徴に基づいている。ホルモン（エストロゲン（ER）とプロゲステロン）受容体とヒト上皮増殖因子2（HER2）受容体の発現が、診断では日常的に評価されている。なぜならこれらのタンパク質は、現在のところ乳がんの最強の予後バイオマーカー、予測バイオマーカーだからである。治療の選択肢は、これら受容体が陰性の（「トリプルネガティブ」）腫瘍では非常に限られている［2、3］。したがって新たな治療法の開発のほか、乳がんだけでなくより広範ながんのための予後マーカーが、相変わらず必要とされている。
【０００３】
ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼ（PARP）阻害剤（オラパリブなど）は、元々はBRCAが変異した乳がん、またはトリプルネガティブの乳がん（BRCA1またはBRCA2の機能喪失は「BRACA抑制状態（BRCAness）」と呼ばれることがしばしばある）を治療するために設計されたが、BRCA1とBRCA2は、前記治療剤に対する感度に関して信頼性のよいバイオマーカーにはなれなかった。それでも「BRACA抑制状態」とヘテロ接合性の喪失（LOH）は、PARP阻害剤に対する患者の感受性に関する補足的な診断法に留まっているが、これらの読み取り情報は、薬に対する反応性の信頼性が大きい予測因子ではない。その結果、複数の大規模な第III相臨床試験が要求されて、生存が増悪を上回るという利点のあることが実証された。それにもかかわらず、PARP阻害剤の有効性に関する多数の臨床試験が多くのタイプの固形がん（卵巣がん、前立腺がん、乳がん、肺がんが含まれる）について実施されているところである。したがってPARP阻害剤を用いたがんの治療のための改良されたコンパニオン／コンプリメンタリー診断の開発が相変わらず必要とされている。
【０００４】
SAMドメインとSH3ドメイン含有1（SASH1）は、乳がん、肺がん、甲状腺がん、大腸がんにおいて隣の正常な組織と比べてmRNAのレベルが有意に低いことが検出されたことに基づき、最初は、推定腫瘍抑制遺伝子として同定された［4、5］。SASH1の低発現は、大腸がんでの浸潤性の腫瘍増殖、転移、予後不良とも相関していた［6］。74％もの乳がんがSASH1転写産物の発現低下を示す［4］。前記観察結果は、のちに免疫組織学的研究において、乳がんでは隣の正常な組織と比べてSASH1の発現が低下していることが見いだされることによって確認された［7］。SASH1プロモータ（特にCpG_26.27とCpG_54.55）のメチル化が、乳がんにおけるSASH1の抑制と相関している［7］。
【０００５】
正常な組織とがんにおけるSASH1の正確な機能はまだ明確ではないが、前記タンパク質は核に局在することが知られていて、そのSAMドメインとSH3ドメインは、シグナル伝達機能、および／またはアダプタ機能、および／または分子足場機能を担っている［8、9］。SASH1に関して示唆されている腫瘍抑制という役割は、機能抑制によってA549肺がん細胞で細胞の生存、増殖、移動が増加する［5、10〜12］一方で、過剰発現によってアポトーシスが有意に増加することを実証した研究と合致している［5］。それに加え、SASH1の異所性発現は、カスパーゼ-3を含むアポトーシスタンパク質の発現を促進することが示されている［10］。発現、変異状態、DNAメチル化を調べる研究を除くと、乳がんにおけるSASH1の役割に関する理解は乏しい。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、広く、PARP阻害剤を用いた治療に対するがんの反応の予測マーカーおよび／または予後マーカーとしてのSASH1の発現レベルを明らかにすることに関する。いくつかの側面では、本発明は、広く、SASH1の発現を誘導する、および／または増大させる薬剤を用いたがんの治療にも関する。1つの特別な態様では、がんは、乳がんなどの生殖系のがんである。
【０００７】
第1の側面では、本発明により、対象において抗がん剤に対するがんの反応性を予測する方法として、前記抗がん剤が、DNA鎖切断の修復を媒介する酵素の活性を少なくとも部分的に阻害する抗がん剤であり、前記方法が、対象の1個または複数個のがん細胞、またはがん組織、またはがん臓器の中でのSASH1タンパク質またはSASH1タンパク質をコードする核酸の発現レベルを明らかにする工程を含んでいて、前記SASH1タンパク質またはSASH1タンパク質をコードする核酸の発現レベルが、抗がん剤に対するがんの反応性の相対的な増加または減少を示しているか、抗がん剤に対するがんの反応性の相対的な増加または減少と相関している方法が提供される。
【０００８】
特別な実施態様では、SASH1タンパク質またはSASH1タンパク質をコードする核酸の相対的なレベル低下は、抗がん剤に対するがんの反応の相対的な増加を示すか、抗がん剤に対するがんの反応の相対的な増加と相関している、および／またはSASH1タンパク質またはSASH1タンパク質をコードする核酸の相対的なレベル上昇は、抗がん剤に対するがんの反応の相対的な減少を示すか、抗がん剤に対するがんの反応の相対的な減少と相関している。
【０００９】
一実施態様では、前記側面の方法は、対象のがんを治療する工程をさらに含んでいる。
【００１０】
第2の側面では、本発明により、対象のがんを治療する方法として、前記対象の1個または複数個のがん細胞、またはがん組織、またはがん臓器の中でのSASH1タンパク質またはSASH1タンパク質をコードする核酸の発現レベルを明らかにし、その結果に基づき、がん治療を開始するか、継続するか、変更するか、中断する工程を含む方法が提供される。
【００１１】
がん治療は、DNA鎖切断の修復を媒介する酵素の活性を阻害する抗がん剤を治療に有効な量で投与することを含んでいることが適切である。
【００１２】
いくつかの実施態様では、がん治療は、SASH1の発現および／または活性を阻害または阻止する薬剤を治療に有効な量で対象に投与することを含んでいる。
【００１３】
第3の側面では、本発明により、対象のがんを治療する方法として、前記対象に、SASH1の発現および／または活性を阻害または阻止する薬剤の治療に有効な量を、DNA鎖切断の修復を媒介する酵素の活性を阻害する抗がん剤と組み合わせて投与する工程を含む方法が提供される。
【００１４】
第1の側面、第2の側面、第3の側面に関し、酵素はポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼ（PARP）であることが適切である。
【００１５】
第4の側面では、本発明により、対象のがんを治療する方法として、前記対象に、SASH1の発現および／または活性を増大させる薬剤を治療に有効な量で投与する工程を含む方法方法が提供される。
【００１６】
薬剤は有機小分子であることが適切である。
【００１７】
第1の側面、第2の側面、第3の側面、第4の側面に関し、抗がん剤またはがん治療は、PARP阻害剤であること、またはPARP阻害剤を含むことが適切である。PARP阻害剤の選択は、オラパリブ、ベリパリブ、ルカパリブ、イニパリブ、タラゾパリブ、ニラパリブ、3-アミノベンズアミド、ME0328、PJ34、AG-14361、INO-1001、UPF-1069、AZD-2461、CEP9722、A-966492と、これらの任意の組み合わせからなるグループからなされることが好ましい。
【００１８】
第5の側面では、本発明により、対象のがんの治療に使用するための薬剤を同定および／または製造する方法として、
（a）SASH1核酸またはSASH1タンパク質を発現する細胞を候補薬剤と接触させる工程と；
（b）その候補薬剤がSASH1の発現および／または活性を変化させるかどうかを判断する工程を含む方法が提供される。
【００１９】
いくつかの実施態様では、候補薬剤は、SASH1の発現および／または活性を少なくとも部分的に低下させるか、消失させるか、抑制するか、阻害する。代わりの実施態様では、候補薬剤は、SASH1の発現および／または活性を少なくとも部分的に増大させる。
【００２０】
薬剤は、抗体または有機小分子であることが適切である。
【００２１】
第6の側面では、本発明により、第4の側面の方法によって同定または製造された薬剤が提供される。
【００２２】
第7の側面では、本発明により、対象において抗がん剤に対するがんの反応性を予測するためのキットとして、前記抗がん剤が、DNA鎖切断の修復を媒介する酵素の活性を阻害する抗がん剤であり、前記キットが、対象の1個または複数個のがん細胞、またはがん組織、またはがん臓器の中でのSASH1タンパク質またはSASH1タンパク質をコードする核酸の発現レベルを明らかにすることのできる少なくとも1つの試薬を含んでいて、前記SASH1タンパク質またはSASH1タンパク質をコードする核酸の発現レベルが、抗がん剤に対するがんの反応性の相対的な増加または減少を示しているか、抗がん剤に対するがんの反応性の相対的な増加または減少と相関しているキットが提供される。
【００２３】
特別な実施態様では、SASH1タンパク質またはSASH1タンパク質をコードする核酸の相対的なレベル低下は、抗がん剤に対するがんの反応の相対的な増加を示すか、抗がん剤に対するがんの反応の相対的な増加と相関している、および／またはSASH1タンパク質またはSASH1タンパク質をコードする核酸の相対的なレベル上昇は、抗がん剤に対するがんの反応の相対的な減少を示すか、抗がん剤に対するがんの反応の相対的な減少と相関している。
【００２４】
前記側面に関し、酵素はポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼ（PARP）であることが適切である。したがって抗がん剤は、PARP阻害剤であること、またはPARP阻害剤を含むことが適切である。PARP阻害剤の選択は、オラパリブ、ベリパリブ、ルカパリブ、イニパリブ、タラゾパリブ、ニラパリブ、3-アミノベンズアミド、ME0328、PJ34、AG-14361、INO-1001、UPF-1069、AZD-2461、CEP9722、A-966492と、これらの任意の組み合わせからなるグループからなされることが好ましい。
【００２５】
前記キットは、SASH1タンパク質またはSASH1タンパク質をコードする核酸の発現レベルと、抗がん剤に対するがんの反応性の間の相関データを含むデータのコレクションをさらに含んでいることが適切である。
【００２６】
データのコレクションは、コンピュータ可読媒体上に存在することが適切である。
【００２７】
特別な実施態様では、キットは、上記の側面の方法で利用するためのものである。
【００２８】
上記の側面のがんは、生殖系のがんであることが適切である。生殖系のがんには、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮がん、前立腺がん、精巣がんが含まれることが好ましい。生殖系のがんは乳がんであることがより好ましい。
【００２９】
別の実施態様では、上記の側面のがんは、肺がんであるか、肺がんを含んでいる。肺がんには、扁平細胞癌腫、腺癌、大細胞癌腫、小細胞癌腫、中皮腫が含まれることが好ましい。
【００３０】
第8の側面では、本発明により、対象の乳がんに関する予後を判断する方法として、前記対象の1個または複数個のがん細胞、またはがん組織、またはがん臓器の中でのSASH1核酸またはSASH1タンパク質の発現レベルを明らかにする工程を含んでいて、SASH1の発現レベルが、乳がんのより不良な予後またはより良好な予後を示すか、乳がんのより不良な予後またはより良好な予後と相関している方法が提供される。
【００３１】
特別な実施態様では、乳がんは、ER陽性（ER+）乳がんまたはER陰性（ER-）乳がんである。
【００３２】
上記の側面の対象は、哺乳動物、好ましくはヒトであることが適切である。
【００３３】
「含む」、「含んでいる」や、それと同様の用語は、文脈が別の意味を要求しているのでなければ、非限定的な包含を意味するものとし、要素または特徴の掲載リストには、言及または掲載されている要素だけが含まれるのではなく、掲載または言及されていない他の要素または特徴が含まれていてもよい。
【００３４】
不定冠詞「1つの」は、本明細書では、単数または複数の要素または特徴を意味するか包含しているため、「1つの」すなわち「単一の」要素または特徴を意味または規定していると理解してはならない。例えば「1つの」細胞には、1つの細胞と、1つ以上の細胞と、複数の細胞が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】アポトーシスのためにはカスパーゼ-3によるSASH1の切断が必要とされる。A）組み換えカスパーゼ-3がSASH1をアミノ酸230位と231位の間で切断する。B）SASH1の切断された断片の過剰発現は、SASH1のアポトーシス機能にSASH1の切断が必要とされることを示している。
【００３６】
【図２】SASH1、または切断されたSASH1のC末端側231〜1247の過剰発現は、NF-κB核タンパク質のレベルを上昇させる。A）免疫蛍光を通じたNF-κB核タンパク質のレベルの定量。
【００３７】
【図３】相同組み換えとゲノム安定性にはSASH1が必要とされる。A）SASH1タンパク質のレベルは、DNA損傷刺激の後に蓄積する。B）SASH1の機能低下は相同組み換えの効率を有意に低下させる。C) DNA損傷マーカーyH2AXの効果的な消失にはSASH1が必要とされる。D) SASH1の機能低下により、コメットアッセイを通じて測定されるゲノム不安定性になる。
【００３８】
【図４】SASH1タンパク質のレベルは、オラパリブ感受性、タラゾパリブ感受性、ベリパリブ感受性と相関している。A）乳がん細胞系、D）肺がん細胞系、E）卵巣がん細胞系におけるPARP阻害剤オラパリブのIC50とSASH1タンパク質のレベルの相関。B）乳がん細胞系におけるPARP阻害剤タラゾパリブのIC50とSASH1タンパク質のレベルの相関。C）乳がん細胞系におけるPARP阻害剤ベリパリブのIC50とSASH1タンパク質のレベルの相関。
【００３９】
【図５】SASH1の機能低下はオラパリブに対するがん細胞の感受性を増大させる。A）SASH1が機能低下した細胞系はオラパリブに対するIC50が低下している。B）SASH1機能が低下した細胞系はオラパリブに対するIC50が有意に低下することを示す複合データ。
【００４０】
【図６】SASH1の過剰発現はU2OS細胞においてオラパリブに対する抵抗性を与える。
【００４１】
【図７】SASH1と既知のPARP阻害剤感受性マーカーBRCA1またはBRCA2の間に相関は存在しない。SASH1のmRNA発現とA）BRCA1またはB）BRCA2の相関。オンラインデータベースCOXPRES。
【００４２】
【図８】SASH1の発現は、乳がんにおける再発および生存と関連している。（A）ER陽性乳がんとER陰性乳がんにおけるSASH1 mRNA（左）またはSASH1タンパク質（右）の発現と臨床転帰の間の関係のカプラン-マイヤー分析。BCSS：乳がん特異的生存。ログ-ランク検定のp値とハザード比（HR；括弧内は95％信頼区間）が示されている。（B）乳がん組織マイクロアレイコアの代表的なSASH1 IHC画像。核でのSASH1の発現が陰性と強い陽性である2つのグレード3（G3）の浸潤性乳管がん（IDC）が、低倍率と高倍率で示されている。（C、D）ER+乳がんにおけるBCSSのSASH1層化から、Ki67の発現（C）または核分裂スコア（D）によると増殖指数が大きいサブグループと小さいサブグループの両方で似た傾向になることがわかった。SASH1-高のケースとSASH1-低のケースの割合は、増殖指数が大きいER+サブグループと小さいER+サブグループで異なっていなかった（X2＝χ2検定）。
【００４３】
【図９】乳がん細胞系におけるSASH1タンパク質の発現。乳がん細胞系をイムノブロッティングによってSASH1の発現に関して分析した。代表的なイムノブロットが（A）に示されている。（B）は、SASH1の発現濃度をβ-アクチンと比べた定量化を示している。示されているデータは、3つの独立な実験からの平均値±標準偏差であり、任意単位でMCF7に規格化されている。
【００４４】
【図１０】SASH1の異所性発現は細胞死を増やす。（A）イムノブロッティングによるSASH1過剰発現の確認。乳がん細胞系に、PCMV6-SASH1-GFP融合タンパク質をコードする発現コンストラクト、またはPCMV6-GFPだけをコードする発現コンストラクトをトランスフェクトしてから48時間後に回収してライセートを調製し、SASH1／β-アクチンイムノブロッティングを実施した。OE：過剰発現。（B）SASH1の過剰発現は乳がん細胞系の死を増やす。細胞系に上記のようにトランスフェクトしてから48時間後、Hoechst 33342とヨウ化プロピジウム（PI）で染色し、ディジタル蛍光顕微鏡法を利用して定量化した。示されているデータは、3つの独立な実験からのGFP陽性PI陽性細胞（死んだ細胞と後期アポトーシス細胞）の相対的割合の平均値±標準偏差である。SASH1-GFP培養物とGFP対照培養物の間の差を、両側t検定を利用して評価した。* p＜0.05、** p＜0.005。
【００４５】
【図１１】クロロピラミンは乳がん細胞系でSASH1の発現を増大させる。（A〜H）細胞を25μMまたは50μMのクロロピラミンで24時間処理した後、ライセートを調製し、イムノブロッティングを利用してSASH1タンパク質の発現を分析した。3つの独立な実験でイムノブロットのバンド強度をβ-アクチンと比べて定量化した。処理したSASH1発現の変化の再現性と有意性を、両側t検定を利用して評価した。* p＜0.05、** p＜0.005。
【００４６】
【図１２】クロロピラミンは、アポトーシスが関与する乳がん細胞系増殖低下を用量に依存して誘導する。（A〜H）クロロピラミンで処理した後に接着した乳がん細胞系の集密度の変化。細胞をクロロピラミンで96時間処理した後、光学顕微鏡法を利用して画像を取得してディジタルに分析し、処理なしの対照と比べた集密度を評価した。（I〜K）クロロピラミンは、乳がん細胞系でアポトーシスを誘導する。クロロピラミンで処理してから48時間後に細胞をヨウ化プロピジウムとアネキシンV-FITC抗体複合体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。示されているすべてのデータは、3つの独立な実験からの平均値±標準偏差である。両側t検定を利用して統計的分析を実施した；* p＜0.05、** p＜0.005、*** p＜0.0005。
【００４７】
【図１３】SASH1の機能低下が、乳がん細胞系においてクロロピラミンによって誘導されるアポトーシスを部分的に救う。（A）細胞に陰性対照またはSASH1 esiRNAを用いて形質導入した。72時間後、細胞ライセートを調製し、イムノブロッティングによってSASH1の発現をβ-アクチンと比べて分析した。KD：ノックダウン。（B〜D）細胞に上記のようにして形質導入し、トランスフェクションの24時間後にクロロピラミンを添加した。処理してから96時間後、培養物の画像を光学顕微鏡法によって取得してディジタルに分析し、処理なしの対照と比べた集密度を評価した。示されているデータは、3つの独立な実験からの平均値±標準偏差である。t検定を利用し、個々の用量のクロロピラミンについて、SASH1の機能が低下した細胞とSASH1の機能が低下していない細胞の集密度を比較した；* p＜0.05。
【００４８】
【図１４】（a）BRCAの機能が低下した腫瘍とBRCAの機能を保持している腫瘍におけるSASH1タンパク質のレベル。（b）SASH1のレベルと、ルカパリブを用いた治療に対する反応性の相関。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
本発明の少なくとも一部は、SASH1が、PARP阻害剤を用いたがんの治療の予測バイオマーカーであるという驚くべき発見に基づいている。それに加え、本明細書に記載されている発明は、SASH1の発現を変化させること、より具体的には増大させることが効果的な抗がん治療である可能性があるという発見に基づいている。さらに、本発明の少なくとも一部は、SASH1が生殖系のがん（乳がんなど）のほか、他の固形腫瘍（肺がん、胃がんなど）における予後マーカーであるという発見に基づいている。
【００５０】
特別な1つの側面では、本発明は、対象における抗がん剤に対するがんの反応性を予測する方法にあり、前記方法では、その抗がん剤が、DNA鎖切断の修復を媒介する酵素の活性を阻害する抗がん剤であり、前記方法は、対象の1個または複数個のがん細胞、またはがん組織、またはがん臓器の中でのSASH1核酸またはSASH1核酸がコードするタンパク質の発現レベルを明らかにする工程を含んでいて、SASH1核酸またはSASH1核酸がコードするタンパク質の発現レベルが、抗がん剤に対するがんの反応性の相対的な増加または減少を示しているか、反応性の相対的な増加または減少と相関している。
【００５１】
当業者であれば、SASH1遺伝子が、タンパク質SAMドメインとSH3ドメイン含有タンパク質1をコードするヌクレオチド配列を含むことを理解していると考えられる。SASH1の別の名称には、プロリン-グルタミン酸反復含有タンパク質3、2500002E12Rik、DJ323M4.1、KIAA0790、DJ323M4、SH3D6A、PEPE1を含めることができる。SASH1遺伝子のヌクレオチド配列、または前記ヌクレオチド配列がコードするタンパク質を示すアクセッション番号の非限定的な例は本分野ではよく理解されており、ヒトではNM_015278とNP_056093.3が含まれる。本明細書で一般に用いられているように、「SASH1」は、特に断わらない限り、SASH1核酸またはSASH1核酸がコードするタンパク質を指すことができる。
【００５２】
本発明の目的では、「単離された」は、天然の状態から取り出された材料、またはヒトが操作した材料を意味する。単離された材料は、その天然の状態で通常は付随している諸要素を実質的または本質的に含んでいない可能性、または操作されて、その天然の状態で通常は付随している諸要素とともに人工的な状態である可能性がある。単離された材料は、元の形態、または化学合成形態、または組み換え形態のものが可能である。
【００５３】
本明細書では、「遺伝子」は、ゲノムの構造的遺伝単位である核酸であり、その中には、アミノ酸をコードする1つ以上のヌクレオチド配列と、1つ以上の非コード配列（プロモータと他の5'非翻訳配列、イントロン、ポリアデニル化配列と他の3'非翻訳配列が含まれるが、これらに限定されない）が含まれている可能性がある。たいていの細胞組織では、遺伝子は、二本鎖DNAを含む核酸である。
【００５４】
「核酸」という用語は、本明細書では、一本鎖または二本鎖のDNAとRNAを指す。DNAにはゲノムDNAとcDNAが含まれる。RNAに含まれるのは、mRNA、RNA、RNAi、siRNA、cRNA、自己触媒RNAである。核酸としてDNA-RNAハイブリッドも可能である。核酸は、典型的には複数のヌクレオチド（A塩基、G塩基、C塩基、T塩基、U塩基が含まれる）を含有するヌクレオチド配列を含んでいる。しかしヌクレオチド配列は、他の塩基（イノシン、メチルシトシン、メチルイノシン、メチルアデノシン、チオウリジンなどだが、これらに限定されない）も含むことができる。
【００５５】
核酸には、SASH1の天然の（例えばアレル）バリアントと、（例えば異なる種からの）オルソログのヌクレオチド配列を含む「変異」核酸も含まれる。核酸バリアントは、本明細書に開示されているヌクレオチド配列と少なくとも70％または75％、好ましくは少なくとも80％または85％、より好ましくは少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％いずれかの割合が一致した配列を共有することが好ましい。
【００５６】
核酸には、核酸の断片も含まれる。「断片」は、核酸の区画、ドメイン、一部、領域のいずれかであり、そのそれぞれが、ヌクレオチド配列の100％未満を構成している。非限定的な一例は、増幅産物、プライマー、プローブのいずれかである。特別な実施態様では、核酸の断片は、例えばその核酸の少なくとも10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、125個、150個、175個、200個、225個、250個、275個、300個、325個、350個、375個、400個、425個、450個、475個、500個、600個、700個、800個、900個、1000個、1500個、2000個、2500個、3000個、3500個、4000個、4500個、5000個、5500個、6000個、6500個、7000個、7500個の連続したヌクレオチドを含むことができる。
【００５７】
本明細書では、「ポリヌクレオチド」は80個以上の連続したヌクレオチドを有する核酸であるのに対し、「オリゴヌクレオチド」は80個未満の連続したヌクレオチドを有する。「プローブ」として、一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが可能であり、例えばノーザンブロッティングまたはサザンブロッティングにおいて相補的配列を検出する目的で標識することが適切である。「プライマー」は、通常は一本鎖のオリゴヌクレオチドであり、15〜50個の連続したヌクレオチドを有することが好ましい。プライマーは、相補的な核酸「鋳型」にアニールし、DNAポリメラーゼ（Taqポリメラーゼ、RNA依存性DNAポリメラーゼ、Sequenase（商標）など）の作用によって鋳型に依存したやり方で伸長することができる。「鋳型」核酸は、核酸増幅を実施するための核酸である。
【００５８】
「タンパク質」は、アミノ酸ポリマーを意味する。アミノ酸として、天然のアミノ酸、または非天然のアミノ酸が可能であり、D-アミノ酸またはL-アミノ酸も本分野でよく理解されている。当業者であればわかるように、「タンパク質」という用語は、その範囲に、タンパク質のリン酸化された形態（すなわちリンタンパク質）および／またはタンパク質のグリコシル化された形態（すなわち糖タンパク質）も包含する。「ペプチド」は、50個未満のアミノ酸を持つタンパク質である。「ポリペプチド」は、50個超のアミノ酸を持つタンパク質である。
【００５９】
タンパク質「バリアント」（例えばSASH1の天然の（例えばアレル）バリアントと（例えば異なる種からの）オルソログ）も提供される。タンパク質バリアントは、本明細書に開示されているSASH1のアミノ酸配列または本分野で知られているアミノ酸配列と少なくとも70％または75％、好ましくは少なくとも80％または85％、より好ましくは少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％いずれかの割合が一致した配列を共有することが好ましい。
【００６０】
タンパク質の断片も提供される。その中には、アミノ酸配列全体の100％未満を含むペプチド断片が包含される。特別な実施態様では、タンパク質の断片は、例えばそのタンパク質の少なくとも10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、125個、150個、175個、200個、225個、250個、275個、300個、325個、350個、375個、400個、425個、450個、475個、500個、550個、600個、650個、700個、750個、800個、850個、900個、950個、1000個、1050個、1100個、1150個、1200個の連続したアミノ酸を含むことができる。
【００６１】
本明細書で一般に用いられている「がん」、「腫瘍」、「悪性の」、「悪性腫瘍」という用語は、疾患または状態を意味するか、その疾患または状態と関連する細胞または組織を意味し、細胞の異常な、または正常でない増殖、および／または分化、および／または移動を特徴としていて、それには、異常な、または正常でない分子表現型（腫瘍生成、および／または腫瘍マーカーの発現、および／または腫瘍抑制因子の発現または活性の喪失、および／または細胞表面マーカーの異常な発現に関係する1つ以上の遺伝子変異または他の遺伝的変化が含まれる）が伴っていることがしばしばある。
【００６２】
がんには、NCI Cancer Indexのhttp://www.cancer.gov/cancertopics/alphalistに掲載されているような浸潤性の、または潜在的に浸潤性のあらゆるがん、腫瘍、他の悪性腫瘍を含めることができ、その中には主要なあらゆる形態のがん、例えば肉腫、癌腫、リンパ腫、白血病、芽細胞腫が含まれるが、これらに限定されない。がんに含めることができるのは、乳がん、肺がん（肺腺癌が含まれる）、生殖系のがん（卵巣がん、子宮頸がん、子宮がん、前立腺がんが含まれる）、脳と中枢系のがん、頭頸部がん、胃腸がん（大腸がん、結直腸がん、胃がんが含まれる）、肝臓がん、腎臓がん、皮膚がん（黒色腫、皮膚癌腫など）、血液細胞のがん（リンパ系がん、骨髄単球性がんが含まれる）、内分泌系のがん（膵臓がん、下垂体がん）、筋骨格がん（骨がん、軟組織がんが含まれる）だが、これらに限定されない。
【００６３】
前記側面と下記の側面に関しては、がんは、生殖系のがん（乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮がん、前立腺がん、精巣がんなど）であることが適切である。生殖系のがんは乳がんであることが好ましい。その目的で、当業者であれば、乳がんに含めることができるのは、あらゆる浸潤性乳がんと本分野で知られているがんサブタイプ（トリプルネガティブ乳がん、グレード2の乳がん、グレード3の乳がん、リンパ節陽性（LN+）乳がん、HER2陽性（HER2+）乳がん、ER陰性（ER-）乳がん、ER陽性（ER+）乳がんなど）であることがわかるであろう。
【００６４】
別の実施態様では、本明細書に開示されている諸側面のがんは、肺がんであるか、肺がんを含む。その目的で、肺がんに含めることができるのは、あらゆる浸潤性肺がんと本分野で知られているがんサブタイプ（非小細胞癌腫（すなわち扁平細胞癌腫、腺癌、大細胞癌腫）、小細胞癌腫、中皮腫であることが明らかであろう。
【００６５】
「DNA鎖切断」という用語には、DNA二本鎖の一本の鎖が切断または切断（一本鎖切断）されている場合と、DNA二本鎖の両方の鎖が切断または切断（二本鎖切断）されている場合が含まれる。このようなDNA鎖切断は、外部因子（イオン化照射線、紫外線、薬剤、食品または環境の中に存在している他の変異源など）または内部因子（代謝プロセスで生成する活性酸素、DNA複製時のエラーなど）によって起こる可能性がある。
【００６６】
特別な実施態様では、がんにおいて、DNA鎖切断を修復する能力または力が低下するか損なわれている、および／またはDNA鎖切断の感受性または発生が増大していることが実証されている。この点に関し、がん細胞は、DNA鎖切断の修復に欠陥があり、またはDNA鎖切断の発生が増加し、それが少なくとも部分的にがんの異常な増殖特性、および／または分化特性、および／または移動特性に寄与していると実証される可能性がある。したがってこのようながん細胞は、その中のDNA鎖切断の誘導に対して特に感受性になる可能性がある。いくつかのがん細胞は、DNA鎖切断を修復する1つ以上の特定の経路または機構に欠陥を獲得し、その後、補償機構に依存して生存するようになる。したがって前記補償機構を標的とした阻害をDNAの損傷誘導と組み合わせるとがん細胞を選択的に殺傷することができるが、その正常な相方は殺傷しない（すなわち合成致死性）。
【００６７】
前記側面に関し、DNA鎖切断の修復を媒介する酵素として、本分野で知られている任意のものが可能である。前記酵素はポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼ（PARP）であることが好ましい。
【００６８】
ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼ（PARP）は、一般に多数の細胞プロセス（より具体的にはDNA修復と、プログラムされた細胞死）に関与するタンパク質のファミリーである。PARPファミリーには、ほぼ18種類のタンパク質（例えばPARP1、PARP2、VPARP（PARP4）、タンキラーゼ-1とタンキラーゼ-2（PARP-5aまたはTNKSと、PARP-5bまたはTNKS2）、PARP3、PARP6、TIPARP（または「PARP7」）、PARP8、PARP9、PARP10、PARP11、PARP12、PARP14、PARP15、PARP16）が含まれ、これらは触媒ドメイン内である程度の相同性を示すが、その細胞機能は一般に異なっている。PARP-1とPARP-2は、これらの触媒活性がDNA鎖切断の発生によって刺激されるという点で、前記ファミリーの特異なメンバーであると見なされている。この点に関し、PARPは、DNAの一本鎖または二本鎖の切断を認識して迅速に結合する能力を通じ、DNA損傷のシグナル伝達に関与している。
【００６９】
上記のことに関連して、抗がん剤は、PARP阻害剤であるか、PARP阻害剤を含むことが適切である。「PARP阻害剤」という用語は、一般に、本明細書では、ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼ活性の阻害剤またはアゴニストを意味する。特別な実施態様では、PARP阻害剤は、特定の1つのPARPタンパク質、または複数のPARPタンパク質（PARP1および／またはPARP2）を特異的に阻害する。当業者には、PARP阻害剤が対象に投与されたとき、対象の体内のPARP活性が変化する、より好ましくは低下することは明らかであろう。1つ以上のPARPの発現レベルを低下させることのできる薬もPARP阻害剤と見なされる。一実施態様では、PARP阻害剤のプロドラッグが対象に投与されて生体内で化合物に変換され、PARPを阻害する。
【００７０】
PARP阻害剤として、任意のタイプの化合物が可能である。前記化合物として、例えば有機小分子または生体化合物（抗体や酵素など）が可能である。この目的のため、当業者は、ある化合物がPARPの活性および／または発現を阻害できるかどうかを、本分野で知られている任意の手段によって明らかにすることができる。PARPの活性および／またはその阻害を評価するための代表的なアッセイに含まれるのは、例えば、ドットブロットとBERアッセイである。BERアッセイでは、PARPがポリADP-リボース鎖を形成する直接的な活性を、例えばトリチウム化基質NADを用いた放射活性アッセイを利用して、またはPARP活性によって形成されるポリマー鎖に対する特異的な抗体を利用して測定する
【００７１】
PARP阻害剤として、本分野で知られている任意のもの、例えばオラパリブ、ベリパリブ、ルカパリブ、イニパリブ、タラゾパリブ、ニラパリブ、3-アミノベンズアミド、ME0328、PJ34、AG-14361、INO-1001、UPF-1069、AZD-2461、CEP9722、A-966492と、これらの任意の組み合わせが可能であることがわかるであろう。
【００７２】
当業者であればわかるように、SASH1核酸、またはSASH1核酸がコードするタンパク質の発現レベルは、対照サンプルまたは参照サンプルでの発現レベルと比べたとき、または閾値発現レベルと比べたとき、相対的に（i）より高い、または増加している、またはより大きいか、（ii）より低い、または減少している、または低下している。一実施態様では、発現レベルは、参照集団の発現レベルの平均値および／または中央値を超えた場合に、より高い、または増加している、またはより大きいと分類することができる。一実施態様では、発現レベルは、参照集団の発現レベルの平均値および／または中央値に達しない場合に、より低い、または減少している、または低下していると分類することができる。この点に関し、参照集団として、がんのタイプ、および／またはサブグループ、および／またはステージ、および／またはグレードが、発現レベルを明らかにする哺乳動物と同じである対象のグループが可能である。
【００７３】
「より高い」、「増加している」、「より大きい」などの表現は、本明細書では、例えば生物サンプル中のSASH1核酸またはSASH1タンパク質の量またはレベルが、対照または基準のレベルまたは量と比べたとき、上昇していることを意味する。SASH1核酸またはSASH1タンパク質の発現レベルとして、相対値または絶対値が可能である。いくつかの実施態様では、SASH1核酸またはSASH1タンパク質の発現がより高い、または増加している、またはより大きいのは、その発現レベルが、対照または基準の中のSASH1核酸またはSASH1タンパク質の発現レベルよりも約0.5％大きい、1％大きい、2％大きい、3％大きい、4％大きい、5％大きい、10％大きい、15％大きい、20％大きい、25％大きい、30％大きい、35％大きい、40％大きい、45％大きい、50％大きい、55％大きい、60％大きい、65％大きい、70％大きい、75％大きい、80％大きい、85％大きい、90％大きい、95％大きい、100％大きい、150％大きい、200％大きい、300％大きい、400％大きいのいずれかである場合、または少なくとも約500％大きい場合である。
【００７４】
「より低い」、「減少している」、「低下している」などの表現は、本明細書では、例えば生物サンプル中のSASH1核酸またはSASH1タンパク質の量またはレベルが、対照または基準のレベルまたは量と比べたとき、より低いことを意味する。SASH1核酸またはSASH1タンパク質の発現レベルとして、相対値または絶対値が可能である。いくつかの実施態様では、SASH1核酸またはSASH1タンパク質の発現がより低い、または減少している、または低下しているのは、その発現レベルが、対照または基準の中のSASH1核酸またはSASH1タンパク質の発現レベルの約95％未満、90％未満、80％未満、70％未満、60％未満、50％未満、40％未満、30％未満、20％未満、10％未満のいずれか、それどころか約5％未満、4％未満、3％未満、2％未満、1％未満、0.5％未満、0.1％未満、0.01％未満、0.001％未満、0.0001％未満のいずれかである場合である。
【００７５】
「対照サンプル」という用語は、典型的には、がんがない（健康な）無疾患の個体からの生物サンプルを意味する。一実施態様では、対照サンプルとして、がんがないことがわかっている対象からものが可能である。その代わりに、対照サンプルとして、がんから回復した対象からのものが可能である。対照サンプルとして、プールされたサンプル、平均サンプル、個体サンプルのいずれかが可能である。内部対照は、調べているのと同じ生物サンプルからのマーカーである。
【００７６】
本明細書では、発現レベルとして、発現した核酸またはタンパク質の絶対量または相対量が可能である。したがっていくつかの実施態様では、SASH1遺伝子および／またはその産物の発現レベルを、対照の発現レベル（例えば哺乳動物の1つ以上のがん細胞、またはがん組織、またはがん臓器の中の1個または複数の「ハウスキーピング」遺伝子および／またはタンパク質の発現レベル）と比べる。
【００７７】
さらに別の実施態様では、SASH1核酸、またはSASH1核酸がコードするタンパク質の発現レベルを、発現の閾値レベル（例えば非がん組織の中での遺伝子および／またはタンパク質のレベル）と比較する。発現の閾値レベルは、一般に、SASH1の定量化された発現レベルである。典型的には、サンプル中のSASH1の発現レベルが発現の閾値レベルを超えること、または発現の閾値レベルに達しないことが、特定の疾患状態または転帰を予測する。発現の閾値レベルの性質または数値（存在する場合）は、典型的には、例えば哺乳動物での抗がん療法（例えばPARP阻害剤療法）に対する予後および／または反応を明らかにするのに使用した1つ以上の遺伝子またはその産物の発現を求めるために選択した方法によって異なるであろう。
【００７８】
当業者であれば、遺伝子またはタンパク質の発現を測定するための本分野で知られている任意の方法（本明細書に記載されている方法など）を利用して、例えば抗がん療法に対する予後および／または反応を明らかにするのに使用できるサンプル中のSASH1核酸またはタンパク質の発現の閾値レベルを求めることができるであろう。一実施態様では、閾値レベルは、例えばがんのタイプ、および／またはサブグループ、および／またはステージ、および／またはグレードが発現レベルを求める哺乳動物と同じである参照集団の中のSASH1の発現レベルの平均値および／または中央値（中央値または絶対値）である。それに加え、発現の閾値レベルという考え方は、単一の値または結果に限定されてはならない。この点に関し、発現の閾値レベルは、例えばPARP阻害剤療法に対する反応の確率が例えば大きい、または中程度、または低いことを示す可能性のある多数の発現閾値レベルを包含することができる。
【００７９】
一実施態様では、SASH1核酸、またはSASH1核酸がコードするタンパク質の発現レベルがより低いというのは、抗がん治療に対するがんの反応性が相対的に増大していることを示す、またはそのことと相関している。代わりの実施態様では、SASH1核酸、またはSASH1核酸がコードするタンパク質の発現レベルがより低いというのは、抗がん治療に対するがんの反応性が相対的に低下していることを示す、またはそのことと相関している。
【００８０】
抗がん治療がPARP阻害剤であるかPARP阻害剤を含む特に好ましい一実施態様では、SASH1核酸、またはSASH1核酸がコードするタンパク質の発現レベルが相対的により低いというのは、PARP阻害剤に対するがんの反応性が相対的に増大していることを示す、またはそのことと相関している。同様に、SASH1核酸、またはSASH1核酸がコードするタンパク質の発現レベルがより高いというのは、PARP阻害剤に対するがんの反応性が相対的に低下していることを示す、またはそのことと相関している。
【００８１】
SASH1の低下したレベルまたは減少したレベルは、抗がん剤に対するがんの反応性が相対的に増大していることを示す、またはそのことと相関していることが適切である。逆に、SASH1のレベル上昇は、抗がん剤に対するがんの反応性が相対的に減少していることを示す、またはそのことと相関している。特別な実施態様では、SASH1のレベル低下は、PARP阻害剤に対するがんの反応性の相対的な増大を示す、またはそのことと相関している、および／またはSASH1のレベル上昇は、PARP阻害剤に対するがんの反応性の相対的な減少を示す、またはそのことと相関している。この点に関し、SASH1の発現レベルは、PARP阻害剤療法に対する対象のがんの感受性および／または抵抗性を予測するのに有用である。
【００８２】
「明らかにする」、「測定する」、「推定する」、「評価する」、「調べる」という表現は、本明細書では交換可能に用いられ、本分野で知られている任意の測定形態（例えば本明細書にこれから記載する方法）を包含することができる。
【００８３】
SASH1の核酸（RNA、mRNA、cDNAなど）を明らかにすること、評価すること、推定すること、調べること、測定することは、本分野で知られている任意の技術によって実施できる。こうした技術として、核酸配列の増幅、核酸のハイブリダイゼーション、ヌクレオチドのシークエンシング、質量分析と、これらの任意の組み合わせを含む技術が可能である。
【００８４】
核酸増幅技術に含まれるのは、典型的には、適切な条件下でポリメラーゼを用いて1つ以上のプライマーを「鋳型」ヌクレオチド配列にアニールさせて標的と相補的なヌクレオチド配列を合成することにより標的ヌクレオチド配列を「増幅する」反復サイクルである。核酸増幅技術は当業者には周知であり、その非限定的な例に含まれるのは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）；鎖置換増幅（SDA）；ローリングサークル複製（RCR）；核酸配列に基づく増幅（NASBA）、Q-βレプリカーゼ増幅；ヘリカーゼ依存性増幅（HAD）；ループ媒介等温増幅（LAMP）；切断酵素増幅反応（NEAR）；リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（RPA）である。一般に本明細書では、「増幅産物」は、核酸増幅技術によって生成した核酸産物を意味する。
【００８５】
PCRに含まれるのは、定量PCRと半定量PCR、リアルタイムPCR、アレル特異的PCR、メチル化特異的PCR、非対称PCR、ネステッドPCR、マルチプレックスPCR、タッチダウンPCR、ディジタルPCRと、「基本的な」PCR増幅に対する他のバリエーションと改変である。
【００８６】
核酸増幅技術は、細胞源または組織源から抽出されるか、単離されるか、別のやり方で得られたDNAまたはRNAを用いて実施することができる。別の実施態様では、核酸増幅は、適切に処理された細胞サンプルまたは組織サンプルに対して直接実施することができる。
【００８７】
核酸のハイブリダイゼーションは、典型的には、適切な条件下で、プローブの形態であることが典型的なヌクレオチド配列を標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズさせた後、ハイブリダイズしたプローブ-標的ヌクレオチド配列を検出することを含んでいる。検出法の非限定的な例に含まれるのは、ノーザンブロット、スロット-ブロッティング、インサイチュハイブリダイゼーション、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）検出だが、これらに限定されない。核酸のハイブリダイゼーションは、細胞源または組織源から抽出されるか、単離されるか、別のやり方で得られたDNAまたはRNAを用いて実施すること、または適切に処理された細胞サンプルまたは組織サンプルに対して直接実施することができる。
【００８８】
核酸増幅と核酸ハイブリダイゼーションの組み合わせを利用できることもわかるであろう。
【００８９】
SASH1タンパク質のレベルを明らかにすること、評価すること、推定すること、調べること、測定することは、細胞または組織が発現しているタンパク質を、細胞の表面に発現しているか細胞内に発現しているかに関係なく検出すること、または細胞源または組織源から抽出されるか、単離されるか、別のやり方で得られたタンパク質を検出することが可能な本分野で知られている任意の技術によって実施できる。これらの技術に含まれるのは、抗体に基づく検出（タンパク質に結合する1つ以上の抗体を用いる）、電気泳動、等電点電気泳動、タンパク質シークエンシング、クロマトグラフィ技術、質量分析と、これらの組み合わせだが、これらに限定されない。抗体に基づく検出に含めることができるのは、SASH1に結合する蛍光標識した抗体を用いるフローサイトメトリー、ELISA、イムノブロッティング、免疫沈降、インサイチュハイブリダイゼーション、免疫組織化学、免疫細胞化学だが、これらに限定されない。適切な技術をハイスループット分析および／または高速分析のために適合させることが、例えばタンパク質アレイ（TissueMicroArray（商標）（TMA）、MSD MultiArrays（商標）、マルチウエルELISAなどだが、これらに限定されない）を用いて可能になる。
【００９０】
SASH1の発現を明らかにすることには、例えば核酸増幅および／または核酸ハイブリダイゼーションによってその核酸のレベルを明らかにすることと、そのタンパク質のレベルを明らかにすることの両方を含めることができる。
【００９１】
いくつかの実施態様では、SASH1の遺伝子発現レベルは、遺伝子発現を調節する非コードRNA（miRNAなど）を測定することによって間接的に評価することができる。マイクロRNA（miRNAまたはmiR）は、標的mRNA転写産物の3'非翻訳領域（3' UTR）内の相補的配列に結合する転写後調節因子であり、結合した結果として通常は遺伝子サイレンシングに至る。miRNAは短いRNA分子であり、平均でわずか22個のヌクレオチドという長さである。ヒトゲノムは1000種類を超えるmiRNAをコードすることができ、これは哺乳動物の遺伝子の約60％を標的とすることができ、ヒト細胞の多くのタイプの中に豊富に存在する。それぞれのmiRNAは、数百の個別のmRNAの発現を変化させることができる。特に、miRNAは負の調節（例えば転写産物の分解と隔離、翻訳抑制）および／または正の調節（例えば転写と翻訳の活性化）において多くの役割を持つことができる。それに加え、異常なmiRNA発現は、さまざまなタイプのがんに関与している。
【００９２】
本発明のさらなる側面は、対象のがんの治療に関する。
【００９３】
特別な1つの側面では、がん治療は、対象の1個または複数個のがん細胞、またはがん組織、またはがん臓器の中のSASH1タンパク質、またはSASH1タンパク質をコードする核酸の発現レベルを明らかにすることと組み合わせて実施され、明らかにされた結果に基づき、がんの治療が開始、または継続、または変更、または中断される。この点に関し、抗がん剤（PARP阻害剤など）に対するがんの反応を予測するための本明細書に記載の方法には、哺乳動物に治療に有効な量の抗がん剤を投与する工程をさらに含めることができることが理解されよう。好ましい一実施態様では、抗がん剤は、SASH1の発現レベルが、抗がん剤に対するがんの反応が相対的に増大したこと、またはそれと相関していることを示すときに投与される。
【００９４】
いくつかの実施態様では、がん治療は、対象に、DNA鎖切断の修復を媒介する酵素の活性を阻害する抗がん剤を治療に有効な量で投与することを含んでいる。
【００９５】
特別な実施態様では、がん治療は、対象に、SASH1の発現および／または活性を阻害または阻止する薬剤を治療に有効な量で投与することを含んでいる。
【００９６】
別の1つの特別な側面では、本発明により、対象のがんを治療する方法として、SASH1の発現および／または活性を増大させる薬剤を治療に有効な量で投与する工程を含む方法が提供される。
【００９７】
薬剤は有機小分子であることが適切である。有機小分子の非限定的な一例はクロロピラミンである。
【００９８】
特別な1つの側面では、本発明により、対象のがんを治療する方法として、SASH1の発現および／または活性を阻害または阻止する薬剤を治療に有効な量で、DNA鎖切断の修復を媒介する酵素の活性を阻害する抗がん剤と組み合わせて投与する工程を含む方法が提供される。
【００９９】
酵素はポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼ（PARP）であることが適切である。したがって抗がん剤は、PARP阻害剤（例えば本明細書にすでに記載されているもの）であること、またはPARP阻害剤を含むことができる。
【０１００】
すでに指摘したように、特定のがんは、おそらく1つ以上の特定のDNA鎖切断修復経路で獲得した欠陥を通じてDNA鎖切断を修復する能力または力の低下または損傷を示す可能性、および／またはDNA鎖切断に対する感受性が増大するかDNA鎖切断の発生が増大する可能性がある。その結果として、これらがん細胞は、継続するDNA損傷から生き延びるため、補償機構（SASH1など）に依存するようになる可能性がある。したがって本明細書に示されているように、SASH1を標的とした阻害に、例えばPARP阻害剤の投与によるがんの中でのDNA鎖切断の誘導を組み合わせることで、がん細胞の選択的な殺傷を実現できる。この目的で、PARPとSASH1の間の遺伝子相互作用を合成致死性として記述することができる。2つの遺伝子間の合成致死性は、一般に、どちらかの遺伝子だけが喪失する場合には生存するが、両方の遺伝子が同時に喪失する場合には細胞死に至るときに起こる。
【０１０１】
特別な実施態様では、SASH1の発現および／または活性を阻害または阻止する薬剤は、抗がん剤を（i）投与する前；または（ii）投与した後；または（iii）投与するのと同時に投与される。一実施態様では、SASH1の発現および／または活性を阻害または阻止する薬剤の投与と抗がん剤の投与（を逐次的に、または同時に行なうこと）により、その薬剤と抗がん剤の一方が投与されて他方が投与されない治療または予防と比較して、がんの治療または予防がよりよくなされる。
【０１０２】
薬剤は、医薬として許容可能な基剤、希釈剤、賦形剤を含む医薬組成物として、対象に投与される。この点に関し、任意の剤形と投与経路（例えば本明細書に提示されている剤形と投与経路）を利用して対象に本発明の組成物を提供することができる。
【０１０３】
がん治療には、薬物療法、化学療法、抗体療法、核酸と他の生体分子療法、放射線療法、外科手術、栄養療法、リラクセーションまたは瞑想療法、他の自然療法またはホーリスティック療法を含めることができるが、これらに限定されない。一般に、薬、または生体分子（例えば抗体、抑制性核酸（siRNAなど））、または化学療法剤を、本明細書では「抗がん療法剤」または「抗がん剤」と呼ぶ。
【０１０４】
がんを治療する方法は、予防的方法、または防止的方法、または治療的方法が可能であり、哺乳動物（特にヒト）のがんの治療に適している。本明細書では、「治療している」、または「治療する」、または「治療」は、がんおよび／またはその症状が少なくとも発達を開始した後にがんの症状を少なくとも改善する治療的な介入、または一連の行為、またはプロトコルを意味する。本明細書では、「予防している」、または「予防する」、または「予防」は、がんおよび／またはがんの症状が出現する前に、がんまたは症状の発達または進行を阻止するため、または阻害するため、または遅延させるために開始される治療的な介入、または一連の行為、またはプロトコルを意味する。
【０１０５】
「治療に有効な量」という表現は、特定の薬剤（PARP阻害剤など）で治療している対象で望む効果を実現するのに十分なその薬剤の量を記述する。例えばこれは、がん、またはがんに関連する疾患、障害、状態を低減、および／または緩和、および／または予防するのに必要な、DNA鎖切断の修復を媒介する酵素の活性を阻害する本明細書に記載の1つ以上の薬剤を含む組成物の量が可能である。いくつかの実施態様では、「治療に有効な量」は、がんの症状を減らすかなくすのに十分である。別の実施態様では、「治療に有効な量」は、望む生物学的効果を実現するのに十分な量、例えばがんの増殖および／または転移を減らすか予防するのに有効な量である。
【０１０６】
理想的には、薬剤の治療に有効な量は、対象で細胞毒性効果を実質的に引き起こすことなく望む結果を誘導するのに十分な量である。がんを減らす、および／または緩和する、および／または予防するのに有用な薬剤の有効量は、治療中の対象と、関連するあらゆる疾患および／または障害および／または状態のタイプおよび重症度（例えば関連するあらゆる転移の数と位置）と、治療用組成物の投与方式に依存するであろう。
【０１０７】
抗がん剤は、医薬として許容可能な基剤、希釈剤、賦形剤を含む医薬組成物として哺乳動物に投与されることが適切である。
【０１０８】
「医薬として許容可能な基剤、希釈剤、賦形剤」という表現は、全身投与で安全に使用できる固体または液体の充填剤、または希釈剤、またはカプセル化物質を意味する。個々の投与経路に応じて本分野で周知の多彩な基剤を用いることができる。これら基剤の選択は、糖、デンプン、セルロースとその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、リポソームとそれ以外の脂質系基剤、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸塩緩衝化溶液、乳化剤、等張生理食塩水、塩（無機酸塩（塩酸塩、臭化物、硫酸塩など）、有機酸塩（酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩など））、発熱性物質除去水を含むグループからなすことができる。
【０１０９】
医薬として許容可能な基剤、希釈剤、賦形剤を記載している1つの有用な参考文献は、『Remington’s Pharmaceutical Sciences』（Mack Publishing Co.社、ニュージャージー州、アメリカ合衆国、1991年）であり、参照によって本明細書に組み込まれている。
【０１１０】
安全な任意の投与経路を利用して患者に本発明の組成物を提供することができる。例えば経口、直腸、非経口、舌下、口腔、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹腔内、脳室内、経皮などの経路を利用することができる。例えば免疫治療用組成物、タンパク質性ワクチン、核酸ワクチンの投与には、筋肉内注射と皮下注射が適切である。
【０１１１】
剤形に含まれるのは、錠剤、分散液、懸濁液、注射液、溶液、シロップ、トローチ、カプセル、座薬、エアロゾル、経皮パッチなどである。これらの剤形は、この目的専用に設計された制御放出装置、またはこの様式で追加して作用するように改変された他の形態のインプラントの注入または埋め込みも含むことができる。治療剤の制御放出は、治療剤の被覆を、例えばアクリル樹脂、蝋、高次脂肪族アルコール、ポリ乳酸とポリグリコール酸、いくつかのセルロース誘導体（ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）を含む疎水性ポリマーを用いて行なうことによって実現できる。それに加え、制御放出は、他のポリマーマトリックス、および／またはリポソーム、および／またはマイクロスフェアを用いて実現することができる。
【０１１２】
経口投与または非経口投与に適した本発明の組成物は、離散した単位（カプセル、サシェ、錠剤など）として提示することができ、そのそれぞれの単位は、粉末または顆粒として、または水性液体、非水性液体、水中油型エマルション、油中水型液体エマルションいずれかの中の溶液または懸濁液として、あらかじめ決められた量の本発明の1つ以上の治療剤を含有している。このような組成物は、調剤学の任意の方法で調製することができるが、すべての方法が、上記の1つ以上の薬剤を、必要な1つ以上の成分を構成する基剤と組み合わせる工程を含んでいる。一般に、組成物は、本発明の薬剤を液体基剤または細かく分割した固体基剤と均一かつ密に混合した後、必要な場合には生成物を望む形に成形することによって調製できる。
【０１１３】
上記の組成物は、剤形に応じた様式で、医薬として効果的な量を投与することができる。患者に投与される用量は、本発明の文脈では、適切な期間にわたって患者に有益な反応をもたらすのに十分でなければならない。投与される薬剤の量は、治療する対象（患者の年齢、性別、体重、全体的な健康状態が含まれる）と、医師の判断に依存する諸因子によって異なる可能性がある。
【０１１４】
特別な実施態様では、抗がん療法は、SASH1の作用の抑制および／または発現の減少を目的とすることができる。別の実施態様では、抗がん療法は、SASH1の作用の促進、および／または活性および／または発現の増大を目的とすることができる。
【０１１５】
代わりの実施態様では、抗がん治療は、SASH以外の遺伝子または遺伝子産物を対象とすることができる。例えば抗がん治療は、SASH1と直接的または間接的に相互作用することが知られている遺伝子または遺伝子産物、および／またはSASH1の発現を変化させる遺伝子または遺伝子産物を標的とすることができる。
【０１１６】
したがっていくつかの実施態様では、がん治療は、DNA鎖切断の修復を媒介する本明細書にすでに記載されているような酵素（ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼ（PARP）など）の活性を阻害する抗がん剤の投与を含んでいる。抗がん剤は、本明細書にすでに記載されているようなPARP阻害剤であること、またはPARP阻害剤を含むことが好ましい。
【０１１７】
特別な一実施態様では、本発明により、がん治療に関する「コンパニオン診断」が提供され、前記コンパニオン診断により、SASH1の発現レベルが、前記がん治療を安全および／または有効に適用するために利用される情報を、臨床医などに提供する。
【０１１８】
がんは、これまでに記述したタイプであることが適切だが、それに限定されることはない。がんは、SASH1の発現レベルが変化していること、または変えられていることが実証されることが好ましい。
【０１１９】
さらに別の1つの側面では、本発明により、対象のがんの治療に使用するための薬剤を同定する方法として、
（a）SASH1核酸、またはSASH1核酸がコードするタンパク質を発現する細胞を候補薬剤と接触させる工程と；
（b）その候補薬剤がSASH1の発現および／または活性を変化させるかどうかを判断する工程を含む方法が提供される。
【０１２０】
特別な実施態様では、候補薬剤は、SASH1の発現および／または活性を少なくとも部分的に低下させる、または消失させる、または抑制する、または阻害する。本開示があるため、このような薬剤を、DNA鎖切断の修復を媒介する酵素の活性を阻害する抗がん剤（本明細書に提示されているPARP阻害剤など）と組み合わせて使用できることは明らかであると考えられる。
【０１２１】
代わりの実施態様では、候補薬剤は、SASH1の発現および／または活性を少なくとも部分的に増大させる。この目的で、この薬剤は、単剤で使用すること、またはその代わりに追加の抗がん剤（本明細書に記載されている抗がん剤など）と組み合わせて使用することができる。
【０１２２】
薬剤は、標的外効果および／または非特異的効果をほとんど、または顕著には持たないか示さないことが適切である。
【０１２３】
薬剤は、抗体または有機小分子であることが好ましい。
【０１２４】
抗体阻害剤に関係する実施態様では、抗体として、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、天然の抗体または組み換え抗体が可能である。抗体の作製、精製、使用に適用できる周知のプロトコルは、例えばColiganらの『CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY』（John Wiley & Sons社、ニューヨーク、1991年〜1994年）の第2章と、Harlow, E.とLane, D.『Antibodies: A Laboratory Manual』、コールド・スプリング・ハーバー、Cold Spring Harbor Laboratory、1988年に見いだすことができ、両方とも参照によって本明細書に組み込まれている。
【０１２５】
一般に、本発明の抗体は、SASH1のタンパク質産物の単離されたタンパク質、断片、バリアント、誘導体のいずれかと結合するか、複合体を形成する。例えば抗体として、ポリクローナル抗体が可能である。このような抗体は、例えばSASH1のタンパク質産物の単離されたタンパク質、断片、バリアント、誘導体のいずれかを産生種（マウス、ウサギが含まれる）の中に注入してポリクローナル抗血清を得ることによって調製することができる。ポリクローナル抗体を作製する方法は当業者によく知られている。利用できる代表的なプロトコルは、例えばColiganらの『CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY』（上記文献）と、HarlowとLane、1988年、上記文献に記載されている。
【０１２６】
モノクローナル抗体は、例えばKohlerとMilsteinによる論文（1975年、Nature 第256号、495ページ）に記載されている標準的な方法（参照によって本明細書に組み込まれている）を利用して作製すること、または例えばColiganらの『CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY』（上記文献）に記載されているように、それを改変したより最近の方法に従い、単離されたSASH1タンパク質産物および／または断片、そのバリアントおよび／または誘導体のうちの1つ以上を接種された産生種に由来する脾臓または他の抗体産生細胞を不死化することによって作製することができる。
【０１２７】
典型的には、候補となる阻害性抗体の抑制活性は、前記抗体の存在下でSASH1タンパク質の発現レベルおよび／または活性を検出または測定するインビトロアッセイおよび／または生体内アッセイによって評価することができる。
【０１２８】
有機小分子阻害剤に関係する実施態様では、抑制活性の評価は、大きな化合物ライブラリをスクリーニングすることを含んでいる可能性があり、可能性のある新たな薬またはリード化合物を見いだすため、数十万〜数億の数の候補阻害剤（合成した有機小分子、または天然の生成物、例えば抑制性のペプチドまたはタンパク質を含む化合物）をスクリーニングまたは試験して、数百の分子標的のうちの任意の1つに対する生物活性を持つものを探すことができる。スクリーニング法には、コンピュータに基づく（「インシリコ」）スクリーニングと、インビトロアッセイに基づくハイスループットスクリーニングを含めることができるが、これらに限定されない。
【０１２９】
典型的には、前記最初のスクリーニング法からの活性化合物または「ヒット」が、次に一連の他のインビトロ試験および／または生体内試験を通じて順次試験されて、活性化合物の特徴がさらに明らかになる。各段階で徐々に少なくなっていく「成功した」化合物がその後の試験のために選択され、最終的に1つ以上の薬候補が選択されて、ヒト臨床試験での試験に進む。
【０１３０】
臨床レベルでは、候補薬剤のスクリーニングは、試験対象を試験化合物に曝露する前、または曝露した後に、その試験対象からサンプルを取得することを含むことができる。次に、サンプル中のSASH1タンパク質のレベルを測定して分析し、SASH1タンパク質のレベルおよび／または活性が候補薬剤への曝露後に変化したかどうかを明らかにする。例えばサンプル中のタンパク質産物のレベルは、質量分析、および／またはウエスタンブロット、および／またはELISA、および／または当業者に知られている適切な他の任意の手段によって求めることができる。それに加え、タンパク質産物の活性（その抗アポトーシス活性など）は、本分野で知られている任意の方法によって求めることができる。これは、例えばアポトーシスアッセイ（例えばカスパーゼ活性化および／または切断アッセイ、アネキシンV陽性アッセイ、クロマチン形態アッセイ、細胞外ホスファチジルセリンアッセイ、DNA断片化アッセイ）を含むことができる。
【０１３１】
候補薬剤を用いて治療されてきた対象は、治療からの結果である可能性のあるあらゆる生理学的効果を定型的に調べることができることが理解されよう。特に、候補薬剤は、対象でがんの可能性または発生を減少させる能力に関して評価されることになる。その代わりに、候補薬剤が以前にがんと診断された対象に投与される場合には、がんの進行を遅延させるか停止させる能力のほか、疾患からの回復を誘導する能力に関してスクリーニングされることになる。
【０１３２】
この点に関し、SASH1の発現レベルおよび／または活性を低下させる、または消失させる、または抑制する、または阻害すると同定された候補薬剤は、その後、がんを患っている患者、またはがんが発達するリスクがある患者に投与することができる。バイオマーカーの活性増大が、がんの進行および／または発症の少なくとも部分的な原因である場合には、例えばSASH1の活性および／または発現を阻害または減少させる候補薬剤の投与によってがんを治療すること、および／またはがんのリスクを減少させることができる。
【０１３３】
関連する1つの側面では、本発明により、上記の側面によって製造または同定された抗がん剤が提供される。
【０１３４】
さらに別の1つの側面では、本発明により、対象で抗がん剤に対するがんの反応を予測するためのキットとして、前記抗がん剤が、DNA鎖切断の修復を媒介する酵素の活性を阻害する抗がん剤であり、前記キットが、対象の1個または複数個のがん細胞、またはがん組織、またはがん臓器の中でのSASH1タンパク質またはSASH1タンパク質をコードする核酸の発現レベルを明らかにすることのできる少なくとも1つの試薬を含んでいて、SASH1タンパク質またはSASH1タンパク質をコードする核酸の発現レベルが、抗がん剤に対するがんの反応性の相対的な増加または減少を示すか、反応性の相対的な増加または減少と相関しているキットが提供される。
【０１３５】
特別な実施態様では、SASH1タンパク質、またはSASH1タンパク質をコードする核酸の相対的なレベル低下は、抗がん剤に対するがんの反応性の相対的増加を示すか、それと相関している；および／またはSASH1タンパク質、またはSASH1タンパク質をコードする核酸の相対的なレベル低下は、抗がん剤に対するがんの反応性の相対的減少を示すか、反応性の相対的減少と相関している。
【０１３６】
この側面に関し、酵素はポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼ（PARP）であることが適切である。したがって抗がん剤は、PARP阻害剤であるか、PARP阻害剤を含んでいることが適切である。PARP阻害剤の選択は、オラパリブ、ベリパリブ、ルカパリブ、イニパリブ、タラゾパリブ、ニラパリブ、3-アミノベンズアミド、ME0328、PJ34、AG-14361、INO-1001、UPF-1069、AZD-2461、CEP9722、A-966492と、これらの任意の組み合わせからなるグループからなされることが好ましい。
【０１３７】
本発明のキットは、SASH1タンパク質またはSASH1タンパク質をコードする核酸の発現レベルと、抗がん剤に対するがんの反応を相関させるための参照データをさらに含んでいることが適切である。
【０１３８】
特別な実施態様では、参照データは、コンピュータ可読媒体（例えば本明細書に記載されている方法または機能の任意の1つ以上を実現しているか、その方法または機能によって利用されているソフトウエア）上に存在する。コンピュータ可読媒体は、記憶装置（コンピュータのメモリ（例えばハードディスクドライブまたは固体ドライブ）など）に含めることができ、プロセッサによって選択的に実行されたときに本発明の1つ以上の側面を実現するコンピュータ可読コード成分を含んでいることが好ましい。
【０１３９】
特別な一実施態様では、キットは「コンパニオン診断」を提供することができ、前記コンパニオン診断により、SASH1の発現レベルに関する情報が、抗がん剤の安全かつ有効な投与のために臨床医などによって利用される。
【０１４０】
キットは、上記の側面の方法で使用するためのものであることが適切である。
【０１４１】
さらに広い1つの側面では、本発明により、対象の乳がんに関する予後を判断する方法として、対象の1個または複数個のがん細胞、またはがん組織、またはがん臓器の中でのSASH1核酸またはSASH1タンパク質の発現レベルを求める工程を含んでいて、SASH1の発現レベルが、その乳がんのより不良な予後またはより良好な予後を示すか、その乳がんのより不良な予後またはより良好な予後と相関している方法が提供される。
【０１４２】
前記側面の乳がんは、ER陽性（ER+）乳がん、またはER陰性（ER-）乳がんであることが適切である。
【０１４３】
本明細書では、「予後」と「予後徴候」という用語に予後を判断することが含まれ、その判断に基づき、（医学的治療あり、または医学的治療なしの）臨床での転帰の予測、および／または適切な治療コースの選択（または治療が有効であると考えられるかどうか）、および／または現在の治療をモニタし、その治療を変える可能性を提示することができる。これは、SASH1の発現レベルの判定に少なくとも部分的に基づくことができ、前記判定に、追加のタンパク質バイオマーカーおよび／または他の核酸バイオマーカーの発現レベルの判定を組み合わせるか、追加することができる。予後には、対象が患っているがんがうまく治療されるか別のやり方で解決した後にそのがんに関して継続する（すなわち永続的な）肉体的または心理学的なあらゆる効果の予測、予見、予期も含めることができる。さらに、予後には、転移能力または転移発生の判断、治療に対する反応性の判断、適切な治療計画の実現、治療後のがん再発の確率または可能性、確立された療法（例えば化学療法）に対する抵抗性の発達の予測のうちの1つ以上も含めることができる。肯定的な予後は、典型的には好ましい臨床的な転帰または見通し（例えば対象のがんの長期の無再発生存期間）を意味するのに対し、否定的な予後は、典型的には否定的な臨床的な転帰または見通し（例えばがんの再発または進行）を意味することがわかるであろう。
【０１４４】
前記側面の方法は、対象が、より不良な予後、またはより良好な予後を持つと診断する工程をさらに含むことが適切である。一実施態様では、SASH1の発現の相対的または絶対的な減少は、対象の予後がより不良である、または悪いという診断である。乳がんがER+乳がんであるさらに別の一実施態様では、SASH1の発現の相対的または絶対的な増加は、対象の予後がより良好であるという診断である。乳がんがER-乳がんである別の一実施態様では、SASH1の発現の相対的または絶対的な減少は、対象の予後がより不良である、または悪いという診断である。
【０１４５】
上記のことに関し、がんは、がんの治療に利用できる療法に対する少なくとも部分的な抵抗性；浸潤性；転移能力；治療後の再発；低い確率の患者生存を非限定的な例として含む特徴または因子の1つまたは組み合わせが原因で、相対的に悪い予後を持つ可能性がある。特別な実施態様では、SASH1の発現レベルは、侵襲性の疾患であるという予後、特に生化学的再発までの時間がより短い、および／または患者の生存時間がより短いという予後を示している。さらに別の実施態様では、SASH1の発現レベルは、転移性がんと相関している、または転移性がんを示している。
【０１４６】
SASH1の発現レベルを利用して患者のより悪い予後（例えばより大きな腫瘍および／またはグレードがより大きい腫瘍）を同定することができるため、前記患者は、前記特定の患者群のための典型的または標準的な抗がん治療計画に追加される1つ以上の抗がん剤からの利益を得る可能性があることも理解されよう。
【０１４７】
上記のことから、本発明により、患者のがんの予後を判断する方法、および／または抗がん剤に対するがんの反応性を予測する方法が提供されることがわかるであろう。特に、本発明の広い実施態様は、がんの予後を判断した後、および／または抗がん剤に対するがんの反応性を予測した後、患者を治療する工程を含んでいる。したがってこれらの実施態様は、がんの予後、および／または抗がん剤に対して予測されるがんの反応性に関して得られた情報を利用することにより、患者のための抗がん治療計画を構成して実現することに関する。好ましい一実施態様では、前記治療計画は特定の患者用に個別化されているため、その特定の患者に最適化されている。
【０１４８】
上記の側面に関し、「対象」という用語の非限定的な例に含まれるのは、ヒトを含む哺乳動物、作業用動物（ウマ、ラクダ、グレイハウンドなど）、家畜（ウシ、ヒツジ、ウマなど）、ペット動物（ネコ、イヌなど）である。対象はヒトであることが好ましい。
【０１４９】
本発明の好ましい実施態様を十分に理解して実施できるようにするため、以下の非限定的な実施例を参照する。
【実施例】
【０１５０】
実施例1
【０１５１】
想定腫瘍抑制因子SASH1は、アポトーシスと細胞増殖に関与しているとされてきた。発明者による仕事は、相同組み換えDNA修復経路を通じた遺伝子切断の修復にもSASH1が必要とされることも示した。PARP阻害剤は、相同組み換え経路に欠陥があるがん細胞を合成致死性として知られるプロセスを通じて殺すように設計された新世代の治療薬である。現在までに開発された最高の薬はオラパリブである。われわれのデータは、相同組み換え経路にSASH1が関与することを示しているため、SASH1の発現が少ない（相同組み換え活性が低下していると考えられる）細胞がPARP1阻害剤に感受性であるかどうかを明らかにすることを試みた。
【０１５２】
結果
【０１５３】
発明者による今回の仕事から、アポトーシスにおけるSASH1の顕著な役割が明らかになった。SASH1はアポトーシス調節因子であるカスパーゼ-3によって切断されるが、前記切断イベントは、正常なアポトーシス反応のために必要とされる（図1）。さらに、接続性マッピング（connectivity mapping）によってわれわれが同定した薬であるクロロピラミンはSASH1を上方調節し、SASH1におけるアポトーシスをUVに依存して増強する（実施例2を参照されたい）。
【０１５４】
NF-κBは、UV曝露後のアポトーシス誘導において中心的な役割を果たしており、UV曝露後にNF-κBのp65サブユニットが細胞質から核へと転移する。われわれのデータは、NF-κBのp65サブユニットが核へと輸送されるためにはカスパーゼ-3によるSASH1の切断が必要であることを実証しており、切断された形態のSASH1の異所性発現があれば、NF-κBを核へと輸送できるようにするのに十分である（図2）。
【０１５５】
SASH1は、hSSB1を用いて逆調節される遺伝子として同定された。hSSB1は、相同組み換えによる二本鎖DNA切断の修復において機能する。hSSB1およびBRVA1/2のようにSASH1も二本鎖切断の修復において必要であるかどうかを評価するため、多数のアッセイを実施した。
【０１５６】
イオン化放射線（IR）からのDNA損傷に対するSASH1の反応性を評価した（図3A）。観察された反応性は、他のDNA損傷反応タンパク質の反応性と同様であり、タンパク質のレベルは安定していた。われわれは次に、GFR HRレポータ細胞系MCF7DRGFPを用い、SASH1の機能が低下した細胞が相同組み換えによる二本鎖DNA切断を修復する能力を調べた。これは、相同組み換え活性がSASH1の喪失によって低下することを示した（図3B）。前記機能障害は、BRCA1とBRCA2の機能が低下した細胞で観察されたのと同様である。エピジェネティックなマーカーγH2AXは二本鎖DNA切断の間接的な指標であるため、DNA損傷の修復は、γH2AX遺伝子座のカウント数を通じて評価することができる。ここでは、SASH1の機能が低下した細胞において、IRによって誘導されるDNA損傷の後にγH2AX遺伝子座の除去が遅延することが見いだされた（図3C）。われわれは次に、コメットアッセイを利用してSASH1の機能が低下した細胞内のゲノム不安定性の程度を評価し、モックで処理した細胞と比較した。SASH1の機能低下により、有意に長いコメットテイルになった（p＝0.0003）。これは、ゲノム不安定性が、機能が低下したこれらの細胞で起こったことを示している（図3D）。これらのデータが組み合わさって、SASH1が、相同組み換え経路を通じたDNAの修復とゲノム完全性の維持において極めて重要であることを示唆している。
【０１５７】
PARPタンパク質は、一本鎖DNA切断の検出と修復において、切除修復経路を通じて機能する［9、10］。したがって相同組み換えが欠けている腫瘍内のPARP1を標的とすることが、アポトーシスと壊死を通じてがん細胞の死を誘導する1つの戦略であることが突き止められた。がん治療法としてのPARP阻害剤の使用が臨床試験で調べられており、少なくとも53件の研究が、一般に化学療法剤との組み合わせで現在実施されている（表1）。
【０１５８】
【表１−１】
2021523146.tif 000003
【表１−２】
2021523146.tif 000004
【表１−３】
2021523146.tif 000005
【表１−４】
2021523146.tif 000006
【０１５９】
前記アプローチが正しいことの多くは、がん細胞の中にBRCA1および／またはBRCA2の変異が存在すること、またはどちらかの遺伝子の発現が少ないことに基づいている。「BRCA抑制状態」は、固形腫瘍（乳がん、前立腺がん、卵巣がん、肺がんなど）で記載されている。BRCA1/2タンパク質は、相同組み換え（SASH1が機能するのと同じ経路）を通じたDNA二本鎖切断の修復に必要とされる。BRCA1とBRCA2におけるこれらの変異は、二本鎖切断の修復能力の低下につながることがしばしばある［11］。PARP1を阻害すると一本差損傷イベントが解決されず、最終的に二本鎖DNAの切断につながる。BRCA1/2の機能が低下した細胞はこれらの二本鎖切断を修復することができず、DNAの損傷が蓄積してその後細胞死に至る。BRCAの機能が低下した細胞におけるPARP1阻害剤によるこのような細胞死の誘導は、合成致死性と呼ばれることがしばしばある。
【０１６０】
われわれは、SASH1タンパク質のレベルがオラパリブに対するがん細胞の感受性に線形に相関することをさらに実証した（図4）。siRNAを用いてSASH1の機能を低下させると、調べた12個の細胞系のうちの9つでオラパリブを用いた治療に対する感受性が増大した。これは、SASH1タンパク質のレベルとオラパリブ感受性（図5）の間に線形な相関があることと合致している。
【０１６１】
それに加え、組み換えSASH1を異所性発現する安定なU2OS細胞系を作製した。すると、U2OS細胞系の中で組み換えSASH1を過剰発現させるとオラパリブに対する抵抗性を誘導するのに十分であることが実証された（図6）。
【０１６２】
SASH1とゲノム安定性の相関はBRCA1/2の機能が低下した細胞で見られるのと同様であるため、われわれのグループは、SASH1 mRNAのレベルがBRCA1/2転写産物のレベルと相関しているかどうかを調べた。SASH1 mRNAとBRCA1/2 mRNAの発現のオンラインバイオインフォマティック共発現分析を実施した（図7）。SASH1 mRNAとBRCA1/2 mRNAの発現レベルの間には相関がなかった。これは、SASH1がPARP阻害剤感受性の独立なマーカーであることを示している。しかしBRCA1/2の変異評価が前記分析では考慮されなかったことに注意すべきである。
【０１６３】
考察
【０１６４】
われわれのデータは、SASH1タンパク質の高発現が、乳がん細胞系と肺がん細胞系の両方でオラパリブ抵抗性と関係していることを明確に実証している。それとは対照的に、低レベルのSASH1タンパク質は、PARP1阻害に対する感受性と関係していた。実際、SASH1の発現はオラパリブ感受性と直接的な線形関係であり、R2値は、乳がん細胞系で約0.8、肺がん細胞系で0.9であった。
【０１６５】
このことがSASH1タンパク質のレベルと直接関係しているかどうかを明らかにするため、siRNAを用いて乳がん細胞系からのSASH1の機能を低下させると、すべての細胞系がオラパリブに対して感受性になった。これは、SASH1のレベルとオラパリブ感受性が相関していることと合致している。逆に、U2OS細胞におけるSASH1の過剰発現は、オラパリブに対する抵抗性を与えた。
【０１６６】
オラパリブは、そもそもはBRCA1またはBRCA2の機能が低下した腫瘍を治療するために設計されたが、BRCA1とBRCA2は、感受性に関する信頼性あるバイオマーカーになれなかった。そのことに合致するように、SASH1の発現はオラパリブ感受性と直接相関しているが、SASH1は、BRCA1またはBRCA2の発現とは相関していなかった。これは、SASH1がオラパリブ感受性のよりロバストなマーカーである可能性を示している。
【０１６７】
ここに提示するわれわれのデータは、アポトーシスにおけるSASH1の分子的役割を初めて突き止めたものである。前記データはさらに、SASH1の腫瘍抑制活性がアポトーシス経路を通じてだけではなく、極めて重要な相同組み換え経路を通じても生じている可能性も突き止めている。われわれは、細胞毒性のある二本鎖DNA切断の相同組み換え修復においてSASH1が腫瘍抑制因子であるBRCA1およびBRCA2とともに機能することを実証している。SASH1は相同組み換えに必要とされるように見えるため、SASH1の発現が少ない細胞でPARP1阻害剤であるオラパリブを用いて合成致死性を誘導できるかを調べた。これは、SASH1の発現とオラパリブ感受性の間に極めて強い線形関係が存在することを示しており、R2は、乳がん細胞系で約0.8、肺がん細胞系で0.9であった。
【０１６８】
結論
【０１６９】
これらのデータは、腫瘍内のSASH1のレベルが、DNA修復を標的とする新たに出現したPARP1阻害剤に関する予測バイオマーカーであることを示している。R2値は、細胞系の研究では、SASH1が、オラパリブなどのPARP1阻害剤を用いた療法のための患者を選択する上で大きな影響を持つ可能性があるロバストなマーカーであることを示している。さらに、本明細書に提示した細胞系のデータは、がん細胞の中でこのマーカーのレベルを変えるだけでオラパリブ感受性の除去または誘導が可能であることを示している。重要なことだが、PARP1阻害剤感受性に関して他の有効で信頼性ある単一の遺伝子／タンパク質バイオマーカーは、現在のところ存在していない。
【０１７０】
参考文献
1. Zeller C, Hinzmann B, Seitz S, Prokoph H, Burkhard-Goettges E, Fischer J, et al. SASH1: a candidate tumor suppressor gene on chromosome 6q24.3 is downregulated in breast cancer. Oncogene. 2003rd ed. 2003;22:2972-83. 
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【０１７１】
実施例2
【０１７２】
前記研究では、SASH1の発現（mRNAとタンパク質の両方）と乳がん臨床病理学的パラメータの間の関係を分析した。インシリコ接続性マッピングとインビトロモデリングを利用して、抗ヒスタミンであるクロロピラミンが、一群の乳がん細胞系においてSASH1に依存して細胞死を誘導する薬であることを突き止めた。これは、臨床応用の可能性を調べるさらなる研究が正当であることを示唆している。
【０１７３】
材料と方法
【０１７４】
予後予測因子としてのSASH1 mRNAの重要性のインシリコ分析：多変量モデルにおいて、SASH1 mRNAの発現と、無再発生存期間および全生存期間の間の関係ほか、SASH1 mRNAの発現の予後予測因子としての重要性を、KMプロッタ乳がんデータベース［13］を用いて分析した。3つの異なるSASH1アレイプローブを分析した。「JetSet」最適プローブからの代表的なデータを提示する［29］（図8）。
【０１７５】
免疫組織化学（IHC）分析と組織マイクロアレイ（TMA）分析：乳がんにおけるSASH1タンパク質の発現を、Queensland乳がんフォローアップ（QFU）リソースのIHC分析によって調べた。前記リソースには、（デュープリケートでサンプリングされた）449件の浸潤性乳がんと、関連する臨床データが含まれていて、その中には20年を超える生存転帰が含まれている［30］。本研究で前記患者データと臨床サンプルを使用することは、University of Queenslandとthe Royal Brisbane and Women’s Hospital（RBWH）のヒト研究倫理委員会によって承認された。
【０１７６】
4μmのTMA切片を、抗原賦活化のためのデクローカ装置内のEDTAバッファ（pH 8.8）の中で15分間処理した後、抗SASH1抗体（Sigma Prestige社、HPA029947；1：850）とMach1 Universal HRP-ポリマー検出キット（Biocare Medical社）を用いてIHCを実施した。次に、ヘマトキシリンで対比染色してマウントした切片をAperio AT Turboスライドスキャナ（Leica Biosystems社）上で40倍の倍率にて走査した。熟練した病理医（AMM）が、個々の組織コアのディジタル画像を、腫瘍細胞の核および細胞質の強度と、染色された腫瘍細胞の割合に従って点数化した。それぞれのケースについて、デュープリケートの組織コアの最大スコアを利用して、SASH1の発現と臨床病理学的変数の間の関係性を、χ2検定とログ-ランク検定を利用して調べた（GraphPad Prism v6）。
【０１７７】
細胞の培養とトランスフェクション：乳がん細胞系を、10％のFCS（MDA-MB-231、MDA-MB-361、T47-D、BT-549）を含むRPMIの中、または10％のFCS（MCF7、MDA-MB-468、Hs578T）を含むDMEMの中、または5％のFBSと10μg/mlの組み換えヒト上皮増殖因子（SUM1315）を含むハムのF12の中で、5％CO2にして37℃で培養した。MCF7細胞系、Hs578T細胞系、BT-549細胞系、T47-D細胞系、SUM1315細胞系については、0.01 mg/mlのインスリンを補足した。トリプシンを用いて細胞を常法に従って継代させ、低い継代に維持した。指定された濃度（0〜100μM）で播種してから24時間後、接着した培養細胞にクロロピラミン（Sigma-Aldrich社）を添加した。細胞の確認は、Kerry Richard がQIMR Berghofer で実施した。SPRプロファイルが、Children'soncology groupの細胞培養物と、細胞系のためのXenograft repository（http://www.cogcell.org）STR遺伝子型決定データ（2016年2月）に照らして一致した。
【０１７８】
siRNA実験に関しては、esiRNA（Sigma社）を標的とするSASH1または非特異的対照オリゴを、RNAiMax（Invitrogen社）を製造者の指示に従って用いてトランスフェクトした。二重トランスフェクションを24時間の間隔で実施し、サンプルを最初のトランスフェクションから72時間後に分析すると、最適なSASH1機能低下が観察された。過剰発現の研究に関しては、完全長SASH1 cDNAを哺乳動物発現ベクターPCMV6（Origene社）にクローニングした。T25フラスコの中で3μgのDNA（SASH1-GFPまたはGFP）と6μlのリポフェクタミン2000（Invitrogen社）を製造者の指示に従って用いて細胞にトランスフェクトした。図の説明に示されているように、最適な過剰発現と死を評価するため、トランスフェクトしてから24〜48時間後に細胞を回収した。
【０１７９】
イムノブロッティング：イムノブロッティングを以前に記載されている［31］ようにして実施した。簡単に述べると、細胞を溶解させた（20 mM Hepes pH 8.0、150 mM KCl、5％グリセロール、10 mM MgCl2、0.5 mM EDTA、0.02％NP-40、新たに補足したNaF、NaVO4、PMSF、プロテアーゼ阻害剤）後、超音波処理した。ライセートを遠心分離によって透明にし、Bradfordアッセイ（Bo-Rad社）を利用してタンパク質の濃度を推定した。典型的には50μgのタンパク質ライセートをBolt 4〜12％勾配ゲル（Invitrogen社）の上で溶解させた後、タンパク質をニトロセルロース膜（Bo-Rad社）に移した。膜を2％魚皮ゼラチンと1％トゥイーン-20を含むPBS（Sigma社）の中で1時間ブロックし、同じバッファの中で一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートした。二次抗体とともにインキュベートした後、Li-COR Odyssey赤外線スキャナを用いて膜を可視化した。Image Jソフトウエアを用い、蛍光強度をローディング対照（β-アクチンまたはヒストンH3）と比べて定量化した。
【０１８０】
細胞死アッセイ：指定された処理をした細胞をインキュベートした後、ヨウ化プロピジウム（10μg/ml）とHoechst（1μg/ml）をイメージングの30分前に添加した。細胞の画像をIN Cell Analyzer 2200 (GE Healthcare社；10倍対物レンズ）上で取得した。InCell分析ソフトウエアを用いて生きている細胞／死んだ細胞の分析を実施した。
【０１８１】
細胞集密アッセイ：細胞を96ウエルのプレート（Nunc社）のウエル1つにつき2,500個の細胞の割合で播種した。細胞を24時間にわたって接着させた後、クロロピラミンを添加し、次いでIncuCyte ZOOM（登録商標）生存細胞イメージャ（社）で2時間ごとに96時間にわたって画像を取得して集密度を計算した。
【０１８２】
アネキシンV／ヨウ化プロピジウム（PI）分析：アネキシンV/PI染色を、記載されているようにして実施した［32］。簡単に述べると、処理した細胞または処理なし細胞（接着している細胞と浮遊している細胞）をトリプシンと遠心分離を利用して回収し、PBSの中で洗浄した後、Promega Annexin V-FITCアポトーシス検出キットのプロトコルに従って染色した。Galliosフローサイトメトリーシステムを利用してアネキシンV陽性（アポトーシス）細胞を検出し、Flow Joソフトウエアを用いて定量化した。
【０１８３】
統計的分析：大半の統計的検定は、Graph Pad Prism V6を用いて実施した。χ2検定を利用して乳がんのSASH1発現と臨床病理学的変数の間の関連性を調べた。乳がんのSASH1発現と無再発生存期間または全生存期間の間の関係をカプラン-マイヤー曲線を用いて表わし、ログ-ランク検定を利用して分析した。アポトーシスと増殖におけるSASH1を媒介とした変化の分析と、クロロピラミン処理の後のSASH1発現を、スチューデントの両側t検定で調べた。KMプロッタデータベース［13］の中の利用可能なパラメータ（MKI67とERBB2の発現）と内蔵関数を用い、予後予測因子としてのSASH1 mRNAの重要性の多変量解析を実施した。
【０１８４】
ER+乳がんにおける予後予測因子としてのSASH1タンパク質の重要性の多変量解析に関しては、MedCalc（登録商標）ソフトウエア（v13.2）を用い、HER2の状態（診断基準に従ってCISHによって判定される）、Ki67の状態（少なくとも20％の腫瘍細胞で核染色される）、組織学的グレード（熟練した病理学者が評価する（SRL））、腫瘍のサイズ（臨床病理学報告から導出する）を含むステップワイズCox回帰分析を実施した。これらのデータは、223件のER+のケースで完備していた。p値が0.05未満を有意であると見なした。
【０１８５】
接続性マッピングを利用した薬のスクリーニング：遺伝子発現の接続性マッピングというアプローチを採用して、SASH1の発現を誘導する可能性のある候補化合物を同定した。SASH1をAffimetrix HG-U133Aプローブセットにマッピングして質問遺伝子シグネチャを形成した。これを、sscMapアルゴリズム［33、34］を用いてCMap02データベースの中の参照薬の発現プロファイルと比較した。質問遺伝子シグネチャへのポジティブな接続が統計的に有意である化合物を、記載されているようにして実験室でさらに確認するためのSASH1誘導薬候補として選択した。
【０１８６】
結果
【０１８７】
SASH1発現の予後予測因子としての重要性を、公開されている乳がん遺伝子発現データにKMプロッタデータベース［13］からの関連する臨床フォローアップ情報を組み合わせてメタ分析することにより、mRNAのレベルで評価した。カプラン-マイヤー分析から、患者コホート全体でSASH1 mRNAの発現喪失が予後不良と関連していることがわかった。しかし大きなKMプロッタコホートをERの状態に従ってサブグループに分割すると、SASH1 mRNAの予後予測因子としての重要性は文脈に依存していることがわかった。診断後15年の時点では、より高いレベルのSASH1発現は、ER陽性乳がんの患者ではよりよい転帰（p＝0.001；HR 1.4（1.15〜1.73））と関連していたが、ER陰性疾患ではかなり悪い転帰（p＝0.001；HR 0.5（0.37〜0.78））と関連していた（図8Aと表2）。
【０１８８】
SASH1タンパク質の発現と臨床病理学的パラメータの間の関係を、独立な臨床的にアノテーションされた379件の浸潤性乳がんのコホートにおいて、組織マイクロアレイ（TMA）の免疫組織化学（IHC）分析によって評価した［14、15］。特徴がよくわかっている抗SASH1抗体を用いると、強度が変化する広範囲の核染色が乳がん細胞で見られ、その強度を、陰性、弱い／中程度に陽性、強い陽性として記録した（図8B）。腫瘍細胞の染色された核の割合は、個々の組織コアの内部で適度に均一であった。χ2分析から、核におけるSASH1の発現はER発現と関係しているが、利用できる他のどの臨床病理学的パラメータとも関係していなかった（表3；p＝0.0035）。
【０１８９】
KMプロッタのデータと整合するように、核における強い陽性のSASH1発現と、ER+乳がんにおける良好な乳がん特異的生存率（BCSS）の間に有意な関係が見いだされた（p＝0.0012；HR 1.4［1.16〜2.69］）。ER+乳がんにおける転帰のSASH1層化から、Ki67の発現または核分裂スコアによると増殖指数が大きいサブグループと小さいサブグループで同様の傾向であることがわかった。SASH1が高いケースとSASH1が低いケースの割合は、増殖活性が高いER+サブグループまたは増殖活性が低いER+サブグループにおけるのと同様であった（図8C／図8D）。ER+のケースにおけるHER2の状態、Ki67の状態、腫瘍のサイズ、組織学的グレードを含む多変量Cox回帰モデルから、SASH1の発現はBCSSと独立な関係であることが明らかになった（HR＝0.45；95％信頼区間0.27〜0.77；p＝0.0037；表4）。ER陰性コホートでの傾向は、SASH1 mRNAのデータのKM分析と同様であったが、これは統計的有意性には達しなかった（p＝0.16）。ほぼ5％のケース（n＝19/379）で腫瘍細胞の細胞質が染色されたが、生存率を含め、調べた利用可能な臨床病理学的パラメータとの関連は存在していなかった。
【０１９０】
乳がんにおけるSASH1の機能を探索するため、3つのER陽性乳がん細胞系と5つのER陰性乳がん細胞系におけるタンパク質の発現をイムノブロット分析によって定量化した。そこから、細胞系の間で発現がさまざまであることが明らかになり、発現が多いのは3つの細胞系T47-D、BT-549、MDA-MB-231、発現が中程度であるのは2つの細胞系Hs578TとSUM-315、発現が少ないのは3つの細胞系MCF7、MDA-MB-361、MDA-MB-468であった（図9A、図9B）。前記一群の細胞系では、SASH1の発現とERの状態の間に明白な関係は存在していなかった。
【０１９１】
SASH1は、以前は腫瘍抑制因子として記述されており、過剰発現していると、肺がん細胞系、黒色腫細胞系、骨肉腫細胞系、グリオーマ細胞系において細胞死が増加した［5、10〜12］。これを調べるため、SASH1-GFP融合タンパク質を乳がん細胞系で一過性に過剰発現させた。過剰発現の結果として調べた8つの細胞系のうちの7つで細胞死が起こり、5つの細胞系ではそれが有意であり、カスパーゼ-3の機能が低下したMCF7細胞だけが反応を示さなかった（図10）。
【０１９２】
われわれは、SASH1のレベル上昇ががん療法の新規なアプローチである可能性があると仮定して、cmapデータベース（Broad Institute［16］）を用いた接続性スクリーニングを利用してSASH1の誘導につながる薬を同定した。そうすることにより、クロロピラミン処理とSASH1 mRNA発現の間の直接的な相関が同定された（p＝0.000005、zスコア2.431）。クロロピラミンは、欧州のいくつかの国でアレルギー状態（例えば結膜炎と気管支喘息）の管理に関して承認された第一世代の可逆的H1受容体アンタゴニストである。
【０１９３】
乳がん細胞系でクロロピラミンを媒介としたSASH1の誘導をタンパク質レベルで確認した後（図11）、前記処理が、細胞の増殖と生存に対するSASH1の過剰発現の効果を模倣できるかどうかを調べた。クロロピラミンを用いた処理により、処理した8つの系のうちの7つで細胞の増殖が抑制された（図12A〜図12H）。これがアポトーシスの誘導によるかどうかを調べるため、感受性が最も大きい3つの細胞系T47-D、MDA-MB-231、BT-549で処理後のアネキシンVのレベルを分析した。これら3つの系すべてがアネキシンVの増加を示した（図12I〜図12K）。これは、アポトーシスの誘導を示している。
【０１９４】
クロロピラミンが誘導する細胞死がSASH1に依存するかどうかを明らかにするため、SASH1を標的とするsiRNAを用いてT47-D細胞、MDA-MB-231細胞、BT-549細胞に形質導入した後、処理した。前記実験から、これら3つの系のすべてでSASH1の機能低下が細胞死という反応を部分的に救うことが実証された（図13A〜図13D）。これは、クロロピラミンによって誘導される細胞死がSASH1の機能に少なくとも部分的に依存していることを示唆している。
【０１９５】
【表２】
2021523146.tif 000007
【０１９６】
【表３−１】
2021523146.tif 000008
【表３−２】
2021523146.tif 000009
【０１９７】
【表４】
2021523146.tif 000010
【０１９８】
考察
【０１９９】
いくつかのヒト悪性腫瘍［4〜6、10〜12、19、20］において良好な予後と、インビトロでのがん細胞系生存率に対する有害な効果［5、10〜12］の証拠の関連性に基づき、SASH1は腫瘍抑制因子であるという提案がなされてきた［4〜7、10〜12、21、22］。現在のところ機序の研究が一般に欠けているが、SASH1はPI3KとAktのシグナル伝達を抑制できることを示唆するいくらかの証拠が存在している［23］。乳がんでの予後予測因子としての重要性は、他の悪性腫瘍におけるよりも特徴づけがよくなされていなかったため、われわれはよくアノテーションされた2つの臨床サンプルコホートを用いてこれを調べた。全体的にSASH1は良好な予後と関係していることをわれわれは見いだしたが、ERの状態に基づいてこれらのケースを層化すると、これはより優勢なER陽性のケース（分析したコホートの75〜80％）によって支配されていることが明らかになった。実際、SASH1は、ER陰性乳がんでは不良の転帰と関係していた。SASH1は腫瘍抑制因子と呼ばれてきたが、ER陽性乳がんとER陰性乳がんからのそれに反するデータは、このことが、SASH1の役割を単純化しすぎている可能性があることと、文脈が極めて重要であることを示唆している。実際、われわれは、他のKMプロッタがんデータセットを調べ、肺がんではSASH1 mRNAの発現とより良好な全生存率の間に強い関係があるが、胃がんでは不良の転帰であることを見いだした（データは示さない）。
【０２００】
本研究では、8つの乳がん細胞系のパネルにおいてSASH1の発現とERの状態の間に明白な関連性が見られなかった。SASH1の異所性発現は、ERの状態とは独立に細胞生存率を低下させた。これらの観察結果が合わさって、いくつかの文脈ではSASH1抑制が、がん細胞の生存と浸潤的な臨床挙動に必要なプロセスを反映している可能性があることを示唆していたため、SASH1の発現を増大させると新たな治療戦略になる可能性があると仮定した。この能力を持つ薬候補を同定するため、cmapデータベース（Broad Institute［16］）を用いてインシリコ接続性マッピングを実施し、候補SASH1誘導剤として抗ヒスタミンであるクロロピラミンを同定した。他の研究者は、クロロピラミンが、黒色腫、神経芽細胞腫、乳がん、膵臓がんからの細胞系の生存率を低下させ、おそらくはFAKシグナル伝達とVEGFR3のシグナル伝達の抑制に関与することを示している［17、18、24〜26］。接続性スクリーニングと整合するように、クロロピラミンは、調べた8つの乳がん細胞系のうちの7つでSASH1の発現を誘導し、8つのうちの6つで生存率を低下させた。処理前に最も感受性のある3つの細胞系にSASH1 siRNAを用いて形質導入すると、細胞毒性反応が部分的に救済された。これは、クロロピラミンによって誘導されるがん細胞系の死が少なくとも部分的にSASH1によって媒介されることを示唆している。クロロピラミンが生体内で乳がん異種移植片の増殖を低下させることができることを示唆する少なくとも1つの報告が存在している［18］が、前記薬剤の抗腫瘍活性をより包括的に特徴づけるには追加の臨床前試験が必要とされる。
【０２０１】
乳がんの管理は過去数十年にわたって改善されてきたが、オーストラリア、アメリカ合衆国、連合王国では15〜20％の患者がまだ診断後10年間を生き延びていない［27、28］。これは、がん関連の罹患率と死亡率の大きな割合を占めるとともに、公衆衛生の分野にとってのコストになっている。現在の第1選択肢の治療法に反応しない腫瘍は、より複雑で複合的である可能性が大きい。将来の疾患制御は、疾患の分子生物学の理解が増すことに依存するであろう。すると、コンパニオン診断と結びついた新たな個別化医学の治療アプローチが同定されることにつながる。インシリコ接続性スクリーニングにより、遺伝子-薬の関係同定とリポジショニングの迅速な手段が提供される。SASH1の誘導と「既製の」薬の間の関係のインシリコマッピングにより、インビトロで抗腫瘍活性を持つ新規な候補としてクロロピラミンが同定された。クロロピラミンと他の第1世代のH1アンタゴニストは血液-脳関門を通過するため鎮静剤であり、したがってアレルギーの治療では末梢に作用する薬剤に取って代わられた。脳への取り込みは分子腫瘍学では望ましい可能性があり、クロロピラミンは別の点ではよく忍容されるため、乳がんとそれ以外のがんの低毒性治療を目的として、クロロピラミンまたは構造的に関連した薬剤の潜在的な用途を、機序の研究と臨床前研究でさらに調べる価値がある。さらに、バイオマーカーを組み込んだ第0相と用量を見いだす第I相のネオアジュバント臨床試験を乳がん患者で実施することにより、クロロピラミンによるSASH1の薬力学的誘導を確認できる可能性があり、それが将来は、前記薬剤のリポジショニングの研究をさらに実施するための理論的根拠となると考えられる。これは、治療の選択肢が現在は限られているトリプルネガティブ乳がんにおいてだけでなく、現在の治療アプローチに対して抵抗性になっているERとHER2の乳がんにおいても特に重要である。
【０２０２】
参考文献
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【０２０３】
実施例3
【０２０４】
前記研究では、SASH1タンパク質のレベルと、PARP阻害剤に対する卵巣がん腫瘍サンプルの感受性の間の関係を、卵巣がん患者からのPDX腫瘍サンプルを用いて調べた。
【０２０５】
材料と方法
【０２０６】
グレードが大きい卵巣がんを患っていて、ルカパリブに対する反応がわかっている12人の患者からのPDX組織をWalter and Eliza Hall Instituteから受け取った。これらのサンプルは、Kondrashovaらの論文［1］の中に、より詳しく記載されている。各サンプルからの15 mgの組織を、プロテアーゼとホスファターゼ阻害剤（Invitrogen社）を含む400μlのRIPAバッファの中に溶解させた。サンプルを均一にした後、超音波処理し、遠心分離をによって細胞デブリを除去した。ゲル上で40μgを走らせてBCAアッセイを実施してタンパク質濃度を計算し、ウエスタンブロットを以前に記載されているようにして実施した。ImageJを用いてSASH1タンパク質のレベルを定量化し、γ-チューブリンに規格化した。
【０２０７】
結果
【０２０８】
SASH1タンパク質のレベルは一般に、BRCAの機能が低下した腫瘍でより低く、BRCAの機能を保持している腫瘍でより高いが、これら2つのグループの間のSASH1のレベルには相変わらずかなりの重複が存在している（図14A）。それとは対照的に、SASH1のレベルは、ルカパリブを用いた治療に対する反応に関するはるかに強力でより有意な予測を提供し、そのことにより、感受性のある患者または混合反応する患者ではSASH1のレベルがより低いのに対し、難治性の患者ではSASH1のレベルがより高いことが見いだされた（図14B）。
【０２０９】
考察
【０２１０】
これらの結果は、SASH1のレベルが、患者の予測と、PARP阻害剤に対する腫瘍の感受性の予測をする能力を持つことを実証しているため、このような情報は、患者を複数の治療群に層化して臨床での転帰を改善するのに役立つであろう。これらの結果は、SASH1のレベルを患者で測定してPARP阻害剤に反応する可能性がより大きい患者を臨床医が同定できるようにすることで、新たなPARP阻害剤を開発するための臨床試験を実施する効率を大きく改善し、コストを低下させることが可能であることも示している。
【０２１１】
参考文献
1. Olga Kondrashova, Monique Topp, et al,. Methylation of all BRCA1 copies predicts response to the PARP inhibitor rucaparib in ovarian carcinoma.  Nature Communications volume 9, Article number: 3970 (2018).
【０２１２】
本明細書全体を通じての目的は、本発明の好ましい実施態様を、本発明を特定の1つの実施態様や特徴の特定の集合に限定することなく記述することであった。したがって当業者は、本開示に照らし、本発明の範囲を逸脱することなく、例示されている個々の実施態様に対してさまざまな変更や改変を施すことが可能であることを理解しているであろう。
【０２１３】
本明細書で言及されているすべてのコンピュータプログラム、アルゴリズム、特許、学術文献は、参照によって本明細書に組み込まれている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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