(57)【要約】  本出願は、修飾されたヌクレオシド三リン酸を含むＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲ（逆転写−ＰＣＲ）による核酸増幅に対して用いられる安定的なヌクレオチド試薬を提供する。本出願はまた、増幅反応中の試料の標的核酸配列の有無の検出のために修飾されたヌクレオシド三リン酸を用いた方法を提供する。
2021505127.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料における標的核酸配列の有無を検出する方法であって、
ａ）前記標的核酸配列が前記試料中に存在した場合の増幅産物を産生するための増幅試薬と前記試料との接触を含む増幅工程の実施と
ｂ）前記増幅産物の検出
を含み、ここで前記増幅試薬は光開裂性の部分を有し、つぎの構造を有する修飾されたヌクレオシド三リン酸を含む方法：
【化１】
2021505127.tif 000009
（Ｂａｓｅはプリンもしくはピリミジン塩基又は類似体である）。
【請求項２】
ステップａ）の前に、前記修飾されたヌクレオシド三リン酸に前記光開裂性の部位を切断可能な波長を有する光を照射する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
増幅試薬を用いた標的核酸配列の増幅方法であって、ここで前記増幅試薬は光開裂性の部分を有し、つぎの構造を有する修飾されたヌクレオシド三リン酸を含む方法：
【化２】
2021505127.tif 000010
（Ｂａｓｅはプリンもしくはピリミジン塩基又は類似体である）。
【請求項４】
増幅の前に、前記修飾されたヌクレオシド三リン酸に前記光開裂性の部位を切断可能な波長を有する光を照射する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
標的核酸の増幅のために用いられる増幅試薬の提供を含む増幅反応時に核酸の非特異的な増幅を減少又は予防する方法であって、ここで前記増幅試薬は光開裂性の部分を有し、つぎの構造を有する修飾されたヌクレオシド三リン酸を含む方法：
【化３】
2021505127.tif 000011
（Ｂａｓｅはプリンもしくはピリミジン塩基又は類似体である）。
【請求項６】
増幅の前に、前記修飾されたヌクレオシド三リン酸に前記光開裂性の部位を切断可能な波長を有する光を照射する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
光開裂性の部位を有し、つぎの構造を有する修飾されたヌクレオシド三リン酸：
【化４】
2021505127.tif 000012
（Ｂａｓｅはプリンもしくはピリミジン塩基又は類似体である）。
【請求項８】
未修飾のヌクレオシド三リン酸と比較してより高い熱安定性を有することを特徴とする、請求項７の前記修飾されたヌクレオシド三リン酸。
【請求項９】
請求項７の前記修飾されたヌクレオシド三リン酸を含み、さらに増幅反応を実施するために必要な試薬を含むキット。
【請求項１０】
請求項８の前記修飾されたヌクレオシド三リン酸を含み、さらに増幅反応を実施するために必要な試薬を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安定的なヌクレオチド試薬、それらの調製のための方法、それらの使用のための方法及びそれらを含むキットを提供する。そのヌクレオチド試薬は、多くのリコンビナントＤＮＡ技術、特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による核酸増幅において有用である。
【背景技術】
【０００２】
核酸増幅試薬は典型的に温度感受性の成分を含み、それゆえ往々にして周囲温度より十分に低い温度で貯蔵及び輸送をしなければならない。これは特にデオキシヌクレオシド三リン酸又はそれらのリボヌクレオシド三リン酸類似体の場合である。これらの試薬はその末端から連なるリン酸基の欠失を介して分解する傾向があり、ヌクレオシド二リン酸及び一リン酸の形成をもたらし、それらの両方とも核酸ポリメラーゼの基質としてもはや活性ではない。ヌクレオシドポリリン酸の安定性はその末端のリン酸のエステル化によって大幅に改善されうる。例えば、γ-メチル-ｄＮＴＰ類似体は、通常のｄＮＴＰｓが完全に分解されるのに十分な熱ストレスの状況下で完全に安定的であった。しかしながら、その末端リン酸のエステル化は、あるポリメラーゼ酵素に対する効果的な基質として寄与するための、これらのヌクレオチドのその能力に否定的な影響を有しえる。熱的に安定であり、かつ基質としてはじめは不活化状態であるが、単純なステップによってすぐに活性化される両方の性質をヌクレオシド三リン酸が有する需要が存在している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、光開裂性の部分を有する修飾されたヌクレオシドポリリン酸を含むＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）による核酸増幅のために用いる熱的に安定なヌクレオチド試薬を提供する。本発明はまた、増幅反応における試料中の標的核酸配列の有無の検出のために修飾されたヌクレオシド三リン酸を用いるための方法を提供する。それゆえ、一つの側面では、本発明は、試料中の標的核酸配列の有無を検出する方法を含み、ここで当該方法は、前記試料と増幅試薬とを接触させて、前記標的核酸配列が前記試料中に存在した場合、増幅産物を産生するための増幅工程の実施と前記増幅産物の検出とを含み、ここで前記増幅試薬は光開裂性の部分を有し、つぎの構造を有する修飾されたヌクレオシド三リン酸を含む
【化１】
2021505127.tif 000003
（式中、Ｂａｓｅはプリンもしくはピリミジン塩基又は類似体である）。一の態様において、増幅ステップに先立ち、前記修飾されたヌクレオシドポリリン酸に前記光開裂性の部位を切断可能な波長を有する光を照射する。いくつかの態様において、前記増幅試薬は少なくとも一つの核酸ポリメラーゼ、緩衝剤、ヌクレオシド三リン酸、少なくとも一つのオリゴヌクレオチドプライマー、検出可能なラベルをしたオリゴヌクレオチドプローブ及び／又は染料を含む。
【０００４】
もう一つの側面は、本発明は、増幅試薬を用いた標的核酸配列の増幅方法を含み、ここで前記増幅試薬は光開裂性の部分を有し、つぎの構造を有する修飾されたヌクレオシド三リン酸を含む
【化２】
2021505127.tif 000004
（式中、Ｂａｓｅはプリンもしくはピリミジン塩基又は類似体である）。一の態様において、増幅に先立ち、前記修飾されたヌクレオシド三リン酸に前記光開裂性の部位を切断可能な波長を有する光を照射する。いくつかの態様において、前記増幅試薬は少なくとも一つの核酸ポリメラーゼ、緩衝剤、ヌクレオシド三リン酸、少なくとも一つのオリゴヌクレオチドプライマー、検出可能なラベルをしたオリゴヌクレオチドプローブ及び／又は染料を含む。
【０００５】
もう一つの側面は、本発明は、増幅反応時の核酸の非特異的な増幅を減少又は予防する方法を含み、ここで当該方法は、標的核酸の増幅に用いられる増幅試薬を提供することを含み、ここで前記増幅試薬は光開裂性の部分を有し、つぎの構造を有する修飾されたヌクレオシド三リン酸を含む
【化３】
2021505127.tif 000005
（式中、Ｂａｓｅはプリンもしくはピリミジン塩基又は類似体である）。一の態様において、増幅に先立ち、前記修飾されたヌクレオシド三リン酸に前記光開裂性の部位を切断可能な波長を有する光を照射する。いくつかの態様において、前記増幅試薬は少なくとも一つの核酸ポリメラーゼ、緩衝剤、ヌクレオシド三リン酸、少なくとも一つのオリゴヌクレオチドプライマー、検出可能なラベルをしたオリゴヌクレオチドプローブ及び／又は染料を含む。
【０００６】
もう一つの側面では、本発明は光開裂性の部位を有し、つぎの構造を有する修飾されたヌクレオシド三リン酸を含む組成物を含む
【化４】
2021505127.tif 000006
（式中、Ｂａｓｅはプリンもしくはピリミジン塩基又は類似体である）。一の態様において、前記修飾されたヌクレオシド三リン酸は未修飾のヌクレオシド三リン酸と比較してより高い熱安定性を有することを特徴とする。いくつかの態様において、当該組成物はさらに、核酸ポリメラーゼからなるグループより選択された少なくとも一つの増幅試薬、緩衝剤、ヌクレオシド三リン酸、少なくとも一つのオリゴヌクレオチドプライマー、検出可能なラベルをしたオリゴヌクレオチドプローブ及び／又は染料を含む。
【０００７】
さらにもう一つの側面では、本発明は前述の修飾されたヌクレオシド三リン酸と、さらに増幅反応を実施するために必要な試薬とを含むキットを提供する。いくつかの態様において、前記試薬は少なくとも一つの核酸ポリメラーゼ、緩衝剤、ヌクレオシド三リン酸、少なくとも一つのオリゴヌクレオチドプライマー、検出可能なラベルをしたオリゴヌクレオチドプローブ及び／又は染料を含む。
【０００８】
本発明の態様及び利点は、発明の詳細な説明及び図面に詳細に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】前記光開裂性ヌクレオシド三リン酸、チオフェニルｏ−ニトロフェニルプロピルｄＮＴＰの構造及び一般概念を示す。
【図２】既知の光開裂性の（ｄ）ＮＴＰｓの分子構造を示す。
【図３】チオフェニルｏ−ニトロフェニルプロピルｄＡＴＰ（ｄＡＴＰ−ＳＰｈ−ＮＰＰ）の調製方法の概略を示す。
【図４】チオフェニルｏ−ニトロフェニルプロピルｄＡＴＰ（ｄＡＴＰ−ＳＰｈ−ＮＰＰ）と通常のｄＡＴＰとを比較した熱安定性を示す。前記試料は１２０時間まで６５℃条件下に曝露した。
【図５】チオフェニルｏ−ニトロフェニルプロピルｄＡＴＰ（ｄＡＴＰ−ＳＰｈ−ＮＰＰ）と商業的に入手できる光開裂性のヌクレオチドであるＤＭＮＰＥ−ＡＴＰとを比較した光切断を、室温、１００ｍＭ リン酸緩衝液  ｐＨ７．０、ＬＥＤ ＵＶの照射を用いて示す。
【図６】通常のｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＵＴＰとケージ化されたｄＡＴＰ−ＳＰｈ−ＮＰＰとを用いて８分間のＵＶ照射無し（グラフの左カラム）、ＵＶ照射有り（グラフの右カラム）でのＰＣＲ増幅反応の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は光開裂性の部位を有する熱安定的な修飾されたヌクレオシド三リン酸、それらの調製方法、それらの使用方法、及びそれらを含むキットを提供する。これらの熱安定的な修飾されたヌクレオシド三リン酸は、多くのリコンビナントＤＮＡ技術、特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による核酸増幅において有用である。
【００１１】
定義：
特に断りのない限り、本明細書で用いられる全ての技術と科学的な用語は本発明が属する業界における当業者により一般的に理解される意味を有する。本明細書に記載のものと類似の本質的に任意の方法及び材料が本発明の実施又は試験において用いることができるが、典型的な方法及び材料のみ記載してある。本発明の目的のために、つぎの用語が以下に定義される。
【００１２】
特に断りのない限り、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という前記の用語は複数形も含む。
【００１３】
「周囲温度」という用語は、周囲の温度を称しており、温度制御された屋内での前記温度を称する時の「室温」と同義である。典型的には周囲温度は１５℃から２５℃の間の温度を意味するが、ごくわずかに冷たい又は暖かい温度も前記周囲温度の範囲内に考えられてもよい。
【００１４】
本明細書で用いられる、「光開裂性の部位」という用語は、その文章中にいくつかの同義語を有し、「光脱離性基」、「光で遮蔽される基」、「光惹起物質」、「ケージ化された化合物」、「感光性の基」、そして他の類似の用語としても称されうる。光開裂性の部位の利用の一つの利点は、高い選択性でその機能の一時的な阻害又は遮蔽により反応を制御する能力である。その光開裂性の部位はある波長、例えば約２００ｎｍから約４５０ｎｍ、例えば約２００ｎｍから約３００ｎｍ、又は例えば約２８０ｎｍから約３１５ｎｍ、又は例えば約３００ｎｍから約４００ｎｍ、又は例えば約３１５ｎｍから４１５ｎｍの波長の光で、ヌクレオシド三リン酸から切断すなわち分離されるように選択することができる。定められた波長との関係で本明細書の「約」という用語は、その定められた波長を正確に含んでいても、１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ又は５ｎｍのプラス又はマイナスの誤差の波長を有していてもよい。それゆえ、適切な波長の光を例えば輝き又は閃光により、修飾されたヌクレオシド三リン酸に導入した時、その光開裂性の部分が切断され、それは核酸ポリメラーゼによる反応から立体的又は他の障害を取り除く。光の導入は手動又は自動で行いうる。一旦その光が導入され、光開裂性の部位が取り除かれると、残されたヌクレオシド三リン酸はＰＣＲ反応中のポリメラーゼのための基質になりうる。
【００１５】
本発明でいう「リコンビナント」は、リコンビナント法により意図的に修飾されたアミノ酸配列又はヌクレオシド配列を称する。本明細書の「リコンビナント核酸」という用語は、自然には通常見いだせられない形態で、制限エンドヌクレアーゼにより、一般に核酸の操作によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで本来形成された核酸を意味する。従って、通常では連結されていないＤＮＡ分子をライゲーションすることによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成された、線形型又は、発現ベクターにおける、単離された変異型ＤＮＡポリメラーゼ核酸は、ともに本開示の目的ではリコンビナントと考えられる。一旦リコンビナント核酸が作製され、宿主細胞に再導入されると、非リコンビナント的に、すなわちｉｎ  ｖｉｔｒｏ操作ではなく、むしろ宿主細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ細胞機構を用いて複製されるものと理解される。しかしながら、そのような核酸は、一旦リコンビナント的に作製されると、その後は非リコンビナント的に複製されるが、本開示の目的ではまだリコンビナントとして考えられる。「リコンビナントタンパク質」はリコンビナント技術を用いて、すなわち上記の通り、リコンビナント核酸の発現を通じて作製されたタンパク質である。
【００１６】
他の核酸配列と機能的な関係に配置された時、核酸は「作用可能式に連結」されている。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を与えるならば、コード配列に作用可能式に連結されている。又は、リボソーム結合部位は、翻訳を促進するために配置されているならば、リボソーム結合部位はコードされた配列に作用可能式に連結されている。
【００１７】
「宿主細胞」という上記の用語は、単細胞の原核生物及び真核生物の組織（例えば微生物、酵母及び放線菌）及び細胞培養物中で増殖する時の高次の植物又は動物由来の単細胞の両方を称する。
【００１８】
「ベクター」という用語は、ＤＮＡ断片を称し、典型的には二本鎖で、それには外来のＤＮＡ断片が導入されていてもよい。ベクターは例えばプラスミド起源でよい。ベクターは宿主細胞での自律的な複製を促す「レプリコン」ポリヌクレオチド配列を含んでいる。宿主細胞内で見られる天然ではない異種ＤＮＡとして定義される外来のＤＮＡとは、例えば、ベクター分子を複製する、選択可能なもしくは選別可能なマーカーをコードする、又は導入遺伝子をコードするものをいう。そのベクターは外来又は異種ＤＮＡを適当な宿主細胞に輸送するために用いられる。一旦宿主細胞に入ったら、そのベクターが独立して又はその宿主の染色体ＤＮＡと一緒に複製でき、そしてそのベクターとそれらの挿入されたＤＮＡのいくつかのコピーとが発生する。加えて、そのベクターは、挿入されたＤＮＡのｍＲＮＡ分子への転写を可能にするか又は、そうでなければその挿入されたＤＮＡのＲＮＡの多数のコピーへの複製を引き起こす必須要素も含みうる。いくつかの発現ベクターは加えて、その発現されたｍＲＮＡの半減期の増大及び／又はｍＲＮＡのタンパク質分子への翻訳を可能にする配列要素を、その挿入されたＤＮＡに隣接して含む。ｍＲＮＡ及び挿入されたＤＮＡによりコードされるポリペプチドの多くの分子はそれゆえ素早く合成することができる。
【００１９】
「増幅試薬」は化学的又は生化学的な成分で核酸の複製を可能にする。そのような試薬は、限定することなく、核酸ポリメラーゼ、緩衝剤、モノヌクレオチド、例えばヌクレオシド三リン酸、オリゴヌクレオチドプライマー、例えばオリゴヌクレオチド、塩及びそれらのそれぞれの溶液、検出プローブ、染料、及びその他のものを含む。
【００２０】
当業界で周知のように、「ヌクレオシド」は塩基−糖の結合体である。ヌクレオシドの前記塩基の部分は、通常は複素環塩基である。そのような複素環塩基の二つの最も一般的な種類はプリンとピリミジンである。
【００２１】
「ヌクレオチド」はヌクレオシドの糖の部分に共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むそれらのヌクレオシドに対して、リン酸基はその糖の２’−、３’−又は５’−ヒドロキシ基のいずれかに結合してよい。ヌクレオチドは、より一般的には「オリゴマー化合物」と称することのできる「オリゴヌクレオチド」の単量体ユニット、又はより一般的には「高分子化合物」と称される「ポリヌクレオチド」の単量体ユニットを意味する。上述に対する他の一般的な表現はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）である。
【００２２】
「オリゴマー化合物」はヌクレオチド単独又は天然でない化合物（以下参照）、より詳しくは修飾されたヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）又は非ヌクレオチド化合物の、それらの単独又は組み合わせである「単量体ユニット」からなる化合物である。
【００２３】
「オリゴヌクレオチド」及び「修飾されたオリゴヌクレオチド」（又は「オリゴヌクレオチド類似体」）はオリゴマー化合物のサブグループである。「オリゴヌクレオチド」という用語は、それらの単量体ユニットとしての複数のヌクレオチドから構成される成分を意味する。リン酸基はオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成するものを一般に意味する。ＲＮＡ及びＤＮＡの通常の結合又は骨格は３’から５’ホスホジエステル結合である。オリゴヌクレオチド及び修飾されたオリゴヌクレオチド（以下参照）は主に当業界で記載されるように合成でき、当業界分野の専門家に周知である。特異的な配列のオリゴマー化合物の作製方法は当業界において既知で、例えば適切な配列のクローニングや制限処理や直接的な化学合成などを含む。化学合成方法は、例えばＮａｒａｎｇ  Ｓ．Ａ．ｅｔ．ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ６８（１９７９）９０−９８に記載のホスホトリエステル法、Ｂｒｏｗｎ  Ｅ．Ｌ．ｅｔ．ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ６８（１９７９）１０９−１５１に開示されたホスホジエステル法、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２２（１９８１）１８５９に開示されたホスホラミジット法、Ｇａｒｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｓｃｒ．２５（１９８５）２８０−２８２に開示されたＨ−ホスホネート法及び米国特許第４，４５８，０６６号に開示の固相支持体法を含んでよい。
【００２４】
上記のプロセスにおいて、前記オリゴヌクレオチドは化学的に修飾されたものであってよく、すなわち修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチド化合物を含むプライマー及び／又はプローブであってよい。そのような場合、そのプローブ又はそのプライマーは修飾したオリゴヌクレオチドである。
【００２５】
「修飾されたヌクレオチド」（又は「ヌクレオチド類似体」）は任意の修飾により天然のヌクレオチドとは異なるが、それにしても、塩基、ペントフラノソール糖、リン酸部分、塩基様、ペントフラノソール糖様及びリン酸様部分、又はそれらの組み合わせからなる。例えば、ラベルをヌクレオチドの塩基部分に結合させてよく、それにより修飾されたヌクレオチドが得られる。ヌクレオチド内の天然の塩基は例えば７−デアザプリンにより置き換ることもあってよく、それにより修飾されたヌクレオチドが同様に得られる。
【００２６】
「修飾されたオリゴヌクレオチド」（又は「オリゴヌクレオチド類似体」）はオリゴマー化合物の別の特異的なサブグループに属し、一つ以上のヌクレオチドと一つ以上の修飾されたヌクレオチドを単量体ユニットとして有する。従って、「修飾されたオリゴヌクレオチド」（又は「オリゴヌクレオチド類似体」）という用語はオリゴヌクレオチドに実質的に似たように機能する構造体を意味し、そして本開示で同義語として用いることができる。合成の観点から、修飾されたオリゴヌクレオチド（又はオリゴヌクレオチド類似体）は例えばリン酸の骨格、リボースユニット又はそのヌクレオチド塩基の適切な修飾によるオリゴヌクレオチドの化学的な修飾によって作製できうる（Ｕｈｌｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐｅｙｍｅｎ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０（１９９０）５４３；Ｖｅｒｍａ  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  Ｆ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７（１９９８）９９−１３４）。代表的な修飾は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合に代わるホスホロチオエート、ジチオリン酸、メチルホスホナート、リン酸トリエステル又はホスホロアミダードヌクレオチド間結合；天然のプリン及びピリミジン塩基の代わりに、デアザ―又はアザプリン及び−ピリミジン；５位又は６位に置換基を有するピリミジン塩基；２位、６位もしくは８位の位置に変化した置換基を有するプリン塩基又は７位の位置の変化した置換基を有する７−デアザプリンとしてのプリン塩基；アルキル、アルケニル、アルキニル又はアリール部分、例えば低級アルキル基、メチル、エチル、プロピル、ブチル、tert-ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、又はアリール基、例えばフェニル、ベンジル、ナフチルを有する塩基；例えば２’位に置換基を有する糖；又はカルボキシル化又はアセチル化された糖類似体を含む。他の修飾は当業者に周知である。そのような修飾されたオリゴヌクレオチド（又はオリゴヌクレオチド類似体）は、天然のオリゴヌクレオチドとは構造的に異なるが、機能的に同義語として最もよく記載される。より詳細には、代表的な修飾は、Ｖｅｒｍａ  Ｓ．，ａｎｄ  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  Ｆ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７（１９９８）９９−１３４又はＷＯ  ０２／１２２６３に開示されている。加えて、ヌクレオシドユニットが、ヌクレオシド間のリン酸又は糖リン酸結合にとって代わる基を介して結合した修飾を施すことができる。そのような結合はＶｅｒｍａ  Ｓ．，ａｎｄ  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  Ｆ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７（１９９８）９９−１３４の開示にそれらを含む。リン酸結合以外をヌクレオシドユニットの結合に利用される時、そのような構造物も「オリゴヌクレオシド」として記載されている。
【００２７】
「核酸」及び「標的核酸」は当業者に周知のとおり、ヌクレオチドの重合化合物である。本明細書で用いられる「標的核酸」は分析すべき試料中の核酸を意味し、すなわち、試料中のその有無及び／又はその量が決定されるべきものを意味する。
【００２８】
「プライマー」という用語は本明細書で当業者に周知のとおりに用いられ、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成を開始させるオリゴマー化合物、主としてオリゴヌクレオチド、さらには修飾されたオリゴヌクレオチドを意味する。すなわち、例えばそのプライマーの３’末端は遊離した３’−ＯＨ基を提供し、それに対しさらなるヌクレオチドが鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼによって結合して３’−から５’−ホスホジエステル結合を形成し、それによってデオキシヌクレオチド三リン酸が用いられ、かつそれによってピロリン酸が放出される。
【００２９】
「プローブ」も天然又は修飾されたオリゴヌクレオチドを意味する。当業界で周知のように、プローブは分析物又は増幅物を検出する目的のために寄与する。上記のプロセスの場合において、プローブは標的核酸の増幅物を検出するために用いられる。この目的のためにプローブは典型的にラベルを有する。
【００３０】
「ラベル」は往々にして「レポーター基」と称され、一般的に、核酸特にオリゴヌクレオチド又は修飾されたオリゴヌクレオチド及びそこに結合する任意の核酸を試料の残りから区別できるようにする基である。（ラベルの結合した核酸は、ラベル化された化合物結合性核酸、ラベル化されたプローブ又は単にプローブと名付けることができる）。代表的なラベルは蛍光ラベルで、例えば蛍光色素、例えばフルオロセイン色素、ローダミン色素、シアニン色素、クマリン色素である。代表的な蛍光色素はＦＡＭ、ＨＥＸ、ＪＡ２７０、ＣＡＬ６３５、Ｃｏｕｍａｒｉｎ３４３、Ｑｕａｓａｒ７０５、Ｃｙａｎ５００、ＣＹ５．５、ＬＣ−Ｒｅｄ６４０、ＬＣ−Ｒｅｄ７０５である。
【００３１】
任意のプライマー及び／又はプローブは化学的に修飾されてよい。すなわち前記プライマー及び／又は前記プローブは修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチド化合物を含む。そのような場合、前記プローブ又は前記プライマーは修飾されたオリゴヌクレオチドである。
【００３２】
核酸増幅の方法はとりわけその他の文献の中でも、米国特許第４，６８３，２０２号、４，６８３，１９５号、４，８００，１５９号及び４，９６５，１８８号に開示されたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。ＰＣＲは典型的に、選択された核酸鋳型（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）に結合するオリゴヌクレオチドプライマーを二以上使用する。核酸分析に役立つプライマーはその標的核酸の核酸配列内の核酸合成の開始点として働くことができるオリゴヌクレオチドを含む。そのプライマーは慣用な方法による制限消化により精製されてもよく、さもなくばそれは合成的に作製されてもよい。そのプライマーは増幅において最大の効率のために一本鎖とすることができるが、そのプライマーは二本鎖でもよい。二本鎖プライマーははじめに変性され、すなわち、鎖を分離させるために処理する。二本鎖核酸を変性させる一つの方法は加熱である。「熱安定性ポリメラーゼ」は熱で安定的なポリメラーゼ酵素で、すなわちそれは、鋳型に相補的なプライマーの伸長産物の形成を触媒し及び二本鎖鋳型核酸の変性をもたらすために必要な時間の間温度上昇に従う時に不可逆的に変性しない酵素である。一般的に、その合成は各プライマーの３’末端から開始され、その鋳型の鎖に沿って５’から３’の方向に進む。熱安定性のポリメラーゼは例えばＴｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ、Ｔ．ｒｕｂｅｒ、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔ．ｌａｃｔｅｕｓ、Ｔ．ｒｕｂｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ及びＭｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ、ｆｅｒｖｉｄｕｓから単離された。にもかかわらず、熱安定的でないポリメラーゼもその酵素を補充することを条件にＰＣＲアッセイにおいて利用できる。
【００３３】
前記鋳型の核酸が二本鎖であれば、ＰＣＲにおいて鋳型として使用する前に、二本の鎖に分ける必要がある。鎖の分離は、物理的、化学的又は酵素学的な手法を含む、任意の適切な変性方法によって成し遂げられうる。核酸の鎖の分離方法の一つに、主に変性するまで前記核酸を加熱することを含む（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％変性以上）。鋳型の核酸を変性させるために必要なその加熱条件は、例えば緩衝剤中の塩濃度並びに変性される核酸の長さ及びヌクレオチド組成物に依存するであろうが、温度及びその核酸の長さのようなその反応の特徴に依存した時間にわたって、典型的には約９０℃から約１０５℃までの範囲である。変性は典型的に約５秒から９分行われる。それぞれのポリメラーゼ、例えばＺ０５  ＤＮＡポリメラーゼをそのような長時間の高温及びそれゆれ機能的な酵素の欠失する危機に曝露しないために、短い変性ステップを用いることが好まれうる。
【００３４】
前記二本鎖鋳型の核酸を熱により変性させる場合、反応混合物は、標的核酸上のその標的配列へのそれぞれのプライマーのアニーリングを促進する温度へと冷却させる。
【００３５】
アニーリングのための温度は、約３５℃から約７０℃、又は約４５℃から約６５℃、又は約５０℃から約６０℃、又は約５５℃から約５８℃であってよい。アニーリング時間は、約１０秒から約１分（例えば約２０秒から約５０秒；約３０秒から約４０秒）であってよい。本明細書において、それぞれのアッセイの包括性を増やすために異なるアニーリング温度を用いることが利点になりえる。要するに、これは比較的低いアニーリング温度で、プライマーが一塩基ミスマッチを有している標的に結合して、ある一定の配列の変異が増幅されうることも意味している。これは例えば所定の有機体がさらに検出すべき既知又は未知の遺伝変異を有する場合に所望されうる。一方で、比較的高いアニーリング温度はより高い特異性を提供する利点を有し、より高い温度に向かえば、プライマーの標的配列への正しくない結合の可能性は減少し続ける。両方の現象からの利点のために、任意の例において、上記工程は異なった温度でのアニーリング、例えば開始時はより低温でその後より高温であることを含む。例えば開始時のインキュベーションが５５℃で約５サイクルにより行われれば、正確ではない標的配列への結合が（事前に）増幅されうる。これは、例えば５８℃で約４５サイクルにより、実験の主要な部分を通してより高い特異性を提供し、続けて行うことができる。この方法は、潜在的に重要な遺伝的変異が見逃されない一方でその特異性が比較的高いまま維持される。
【００３６】
前記反応混合物は、前記ポリメラーゼ活性が促進又は最適化される温度、すなわち分析された核酸に相補的な産物を生じるためにアニール化されたプライマーにより起こる伸長のために十分な温度によってその時調整される。その温度は核酸鋳型へアニーリングされる各プライマーからの伸長産物の合成に十分であるべきだが、その相補的な鋳型から伸長産物を変性させるほど高くすべきではない。（例えば伸長のためのその温度は一般的に、約４０℃から８０℃の範囲である（例えば、約５０℃から７０℃；約６５℃）。伸長時間は約１０秒から約５分又は約１５秒から２分又は約２０秒から約１分、約２５秒から約３５秒でもよい。その新たに合成された鎖は、反応の継続するステップにおいて用いることができる二本鎖分子を形成する。鎖の分離、アニーリング及び伸長ステップは、前記標的核酸に対応する増幅産物の望まれた量を産生するために必要に応じて繰り返すことができる。前記反応のその限界因子は、その反応に存在するプライマー、熱安定性酵素及びヌクレオシド三リン酸の量である。そのサイクリングステップ（すなわち変性、アニーリング及び伸長）は少なくとも一回繰り返してもよい。検出に用いるために、サイクリングステップ数は例えばその試料の性質に依存する。前記試料が核酸の複雑な混合物であれば、より多くのサイクリングステップが標的配列を検出のために十分に増幅することが求められるだろう。一般的に、そのサイクリングステップは最低でも約２０回繰り返されるが、４０回、６０回又は１００回でさえも繰り返されてよい。
【００３７】
ＰＣＲは、アニーリング及び伸長のステップが同時のステップ（１ステップＰＣＲ）又は上記のように分かれたステップ（２ステップＰＣＲ）で行われることで実行されてもよい。アニーリング及び伸長を同時に、同じ物理的及び化学的条件下で、例えばＺ０５ＤＮＡポリメラーゼなどの適切な酵素を用いて行うことは、各サイクルにおいて加えられたステップの時間を省き、そしてまたアニーリングと伸長との間の加えられた温度調整の必要性も廃止する利点を有する。それゆえ、前記１ステップＰＣＲは対応のアッセイのその全体の複雑性を減らす。
【００３８】
一般的には、結果までの時間を短くし、可能性のある早期診断を導くため、全体の増幅についてより短い時間が好まれうる。
【００３９】
使用された他の核酸増幅法は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ；Ｗｕ  Ｄ．Ｙ．ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ  Ｒ．Ｂ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４（１９８９）５６０−６９；ａｎｄ  Ｂａｒａｎｙ  Ｆ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８（１９９１）１８９−１９３）、ポリメラーゼリガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ  Ｆ．，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃ．１（１９９１）５−１６）、ギャップＬＣＲ（ＷＯ  ９０／０１０６９）、復旧連鎖反応（ＥＰ  ０４３９１８２  Ａ２）、３ＳＲ（Ｋｎｏｈ  Ｄ．Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６（１９８９）１１７３−１１７７；Ｇｕａｔｅｌｌｉ  Ｊ．Ｃ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７（１９９０）１８７４−１８７８；ＷＯ  ９２／０８８０８）；及びＮＡＳＢＡ（ＵＳ  ５，１３０，２３８）を含む。さらに、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）及びＱｂ増幅（例えば、Ｗｈｅｌｅｎ  Ａ．Ｃ．ａｎｄ  ｐｅｒｓｉｎｇ  Ｄ．Ｈ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５０（１９９６）３４９−３７３；Ａｂｒａｍｓｏｎ  Ｒ．Ｄ．ａｎｄ  Ｍｙｅｒｓ  Ｔ．Ｗ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４（１９９３）４１−４７）参照）がある。
【００４０】
用語「Ｃｐ値」又は「Ｃｒｏｓｓｉｎｇ  Ｐｏｉｎｔ」値は導入された標的核酸の定量化を可能にする値を意味する。前記Ｃｐ値は、二次微分最大値法に従って決定できる（Ｖａｎ  Ｌｕｕ−Ｔｈｅ  ｅｔ．ａｌ．，「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｅｃｏｎｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｏｕｂｌｅ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ．」ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｖｏｌ．３８，Ｎｏ．２，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００５，ｐｐ．２８７−２９３）。二次微分法において、Ｃｐは二次導関数曲線の第一のピークと相当する。このピークは対数直線増幅領域のその初期と相当する。二次微分法はそのリアルタイム蛍光強度曲線の二次導関数値を計算し、そして一つの値のみが得られる。元々のＣｐ法は、例えば多項式関数により、その強度の値を部分的に定義された微分近似に基づく。次に、三次導関数が計算される。前記Ｃｐ値は三次導関数の最小根である。前記Ｃｐはまた、フィットポイント法を用いて決定でき、その中でそのＣｐは前記対数直線領域内の閾値線の平行線の交差により決定する。（Ｖａｎ  Ｌｕｕ−Ｔｈｅ  ｅｔ．ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｖｏｌ．３８，  Ｎｏ．２，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００５，ｐｐ．２８７−２９３）。Ｒｏｃｈｅにより提供されるＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ装置により提供される前記Ｃｐ値は、二次微分最大値法に従って計算される。
【００４１】
「ＰＣＲ効率」という用語は、サイクルからサイクルへの増幅効率の指標を意味する。ＰＣＲ効率は式を用いて各条件で計算される：％ＰＣＲ効率＝（１０（-slope）−１）×１００、その中で、そのｓｌｏｐｅはＹ軸上にプロットされたコピー数の対数とＸ軸上にプロットされたＣｐの線形回帰により計算された。ＰＣＲ効率は完全適合又は不適合のプライマー鋳型を用いて測定できる。
【００４２】
「ＦＲＥＴ」又は「蛍光共鳴エネルギー移動」又は「Ｆｏｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動」という用語は、少なくとも二つの発色団の間のエネルギー移動を意味し、当該二つの発色団は供与体の発色団及び受容体の発色団（消光剤として称される）である。その供与体は、当該供与体が適当な波長の光の照射により励起される時、典型的にそのエネルギーを受容体へ転移する。前記受容体は、典型的に異なった波長の光の照射の形式において転移されたエネルギーを再放出する。前記受容体が「ｄａｒｋ」消光剤の時、光以外の形式において転移されたエネルギーを消散する。特定の蛍光色素が供与体又は受容体として働くかどうかは、前記ＦＲＥＴのペアの他のメンバーの特性に依存する。一般に用いられる供与体−受容体のペアはＦＡＭ−ＴＡＭＲＡのペアを含む。一般に用いられる消光剤はＤＡＢＣＹＬ及びＴＡＭＲＡである。一般に用いられるｄａｒｋ消光剤はＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  ＱｕｅｎｃｈｅｒｓTM（ＢＨＱ）、（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｏｖａｔｏ，Ｃａｌ．）、Ｉｏｗａ  ＢｌａｃｋTM（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈ．，Ｉｎｃ．，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ）及びＢｌａｃｋＢｅｒｒｙTM  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  ６５０（ＢＢＱ−６５０）（Ｂｅｒｒｙ＆Ａｓｓｏｃ．，Ｄｅｘｔｅｒ，Ｍｉｃｈ）を含む。
【００４３】
上記に述べたその方法は、供与体の蛍光部位と受容体の蛍光部位との間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づいてもよい。代表的な供与体の蛍光部位はフルオレセインであり、そして代表的な対応する受容体の蛍光部位はＬＣ−Ｒｅｄ  ６４０、ＬＣ−Ｒｅｄ  ７０５、Ｃｙ５及びＣｙ５．５を含む。典型的に、検出は供与体の蛍光部位により吸収された波長での試料を励起し、その対応する受容体の蛍光部位により発光された波長の可視化及び／又は測定を含む。本開示に従うプロセスにおいて、検出にＦＲＥＴの定量化が続きうる。例えば検出は各サイクリングステップ後に行われる。例えば検出はリアルタイムに行われる。商業的に入手できるリアルタイムＰＣＲ装置（例えばＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒTM又はＴａｑＭａｎ）の使用により、ＰＣＲ増幅及び増幅産物の検出は、著しくサイクル時間を減らし、単一の閉鎖系のキュベット内で組み合わせることができる。検出が増幅と同時に行われるので、前記リアルタイムＰＣＲ法は前記増幅産物の操作の必要性を取り除き、そして増幅産物間の相互汚染のリスクを減少する。リアルタイムＰＣＲは周回時間を大きく減らし、臨床検査室内の慣用なＰＣＲ技術の魅力的な代替物である。
【００４４】
下記の特許出願はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ技術において使用されるものとしてのリアルタイムＰＣＲを記載している：ＷＯ  ９７／４６７０７、ＷＯ  ９７／４６７１４及びＷＯ  ９７／４６７１２。前記ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ装置は高品質な光学機器を利用した微量蛍光光度計と組み合わされる迅速なサーマルサイクラーである。この迅速な熱サイクリング技術は反応容器として薄いガラスキュベットを用いている。反応容器の加温及び冷却は加熱及び周囲の空気の変化により制御される。キュベットの容量に対して低質量の空気及び高い割合の表面積により、非常に迅速な温度交換効率が温度容器内で成し遂げられえる。
【００４５】
ＴａｑＭａｎ技術は二つの発色団部位をラベル化された一本鎖ハイブリダイゼーションプローブを利用する。第一の蛍光部分は適当な波長の光により励起された時、その吸収されたエネルギーはＦＲＥＴの原理に従い第二の蛍光に移送される。典型的な蛍光色素はこの方式では例えば、とりわけＦＡＭ、ＨＥＸ、ＣＹ５、ＪＡ２７０、Ｃｙａｎ及びＣＹ５．５が用いられる。前記第二の蛍光部分は一般的に消光分子である。ＰＣＲ反応のアニーリング工程の間、そのラベル化されたハイブリダイゼーションプローブはその標的核酸（すなわちその増幅産物）に結合し、続く伸長工程の間、Ｔａｑ又は当業者により周知の他の適当なポリメラーゼ、例えばＺ０５ポリメラーゼ変異体の５’から３’のエキソヌクレアーゼ活性により分解される。結果として、その励起された蛍光部位と消光部位は空間的に互いに離れる。結果として、消光剤の非存在において、第一の蛍光部位の励起時に第一の蛍光部位から蛍光発光が検出されえる。
【００４６】
上記の両方の検出方式において、放出されたシグナルの強度は元々の標的核酸分子の数に相関しうる。
【００４７】
ＦＲＥＴの代替物として、増幅産物は、二本鎖ＤＮＡ結合色素、例えば蛍光ＤＮＡ結合色素（例えばＳＹＢＲＧＲＥＥＮ  Ｉ又はＳＹＢＲＧＯＬＤ（分子プローブ））を用いて検出してもよい。二本鎖核酸との相互作用上で、そのような蛍光ＤＮＡ結合色素は適当な波長での光の励起後に蛍光シグナルを発する。二本鎖ＤＮＡ結合色素、例えば核酸挿入色素も用いられうる。二本鎖ＤＮＡ結合色素が用いられる時、融解曲線分析は通常、前記増幅産物の存在の確認のために行われる。
【００４８】
ＦＲＥＴと組み合わせて分子標識はまた本開示のリアルタイムＰＣＲ法を用いた増幅産物の存在の検出に用いてもよい。分子標識技術は第一の蛍光部位及び第二の蛍光部位にラベルされたハイブリダイゼーションプローブを用いる。その第二の蛍光部位は一般的には消光剤で、そしてその蛍光ラベルは典型的にそのプローブの各末端に位置する。分子標識技術は二次構造の形成を可能にする配列（例えばヘアピン）を有するプローブオリゴヌクレオチドを用いる。プローブ内の二次構造の形成の結果として、両方の蛍光部位はそのプローブが溶液中にある時、空間的に近位である。増幅産物にハイブリダイゼーションした後、そのプローブの二次構造は壊され、その蛍光部位は離れ離れになり、かくして、適当な波長の光で励起された後、第一の蛍光部位の発光が検出されうる。
【００４９】
それゆえ、本開示に従った方法は、ＦＲＥＴを用いた上記の方法であって、その中でそのプローブは二次構造の形成を可能にする核酸配列を含み、それにおいてその二次構造の形成がその第一と第二の蛍光部位との間で空間的に近位をもたらす。
【００５０】
効率的なＦＲＥＴは、その蛍光部位が部分的に近位にある時及び供与体の蛍光部分の発光スペクトルが受容体の蛍光部分の吸収スペクトルに重なる時のみ起こりうる。
【００５１】
それゆえ、例えば、その供与体及び受容体の蛍光部分は、そのプローブ上でお互いに５ヌクレオチド以内にある。さらなる例において、その受容体蛍光部分は消光剤である。
【００５２】
上記のように、ＴａｑＭａｎの方式において、ＰＣＲ反応のアニーリング工程の間、そのラベル化されたハイブリダイゼーションプローブはその標的核酸（すなわちその増幅産物）に結合し、続く伸長工程の間、Ｔａｑ又は当業者により周知の他の適当なポリメラーゼ、例えばＺ０５ポリメラーゼ変異体の５’から３’のエキソヌクレアーゼ活性により分解される。それゆえ、一例において、上記のプロセスにおいて、増幅は５’から３’のエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を用いる。
【００５３】
上記のプロセスの結果として生じるアンプリコンの長さの注意深い選択はさらに利点がある。一般的に、比較的短い増幅産物はその増幅反応の効率を上げる。それゆえ、本開示の一つの側面は上記のプロセスであって、その中にその増幅断片は最大４５０塩基、最大３００塩基、最大２００塩基又は最大１５０塩基を含む。
【００５４】
「配列」は核酸の一次構造であり、すなわち対応の核酸からなる、単一の核酸塩基の特定の配置である。その「配列」という用語は例えばＲＮＡ又はＤＮＡのような核酸の特定の型を意味せず、両方及び他の型の核酸、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）又は他のものを適用すると理解される。核酸塩基がお互いに対応し合う場合、特にウラシル（ＲＮＡに存在）及びチミン（ＤＮＡに存在）のような場合において、当業者に周知のようにこれらの塩基はＲＮＡとＤＮＡ配列との間で等価と考えられうる。
【００５５】
臨床的に関連性のある核酸はいわゆるＤＮＡウイルスまたは細菌から由来しうるＤＮＡであり、当該ＤＮＡウイルスは例えばＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）及び他のものなどがあり、当該細菌は例えばクラミジア・トラコマチス（ＣＴ）、淋菌（ＮＧ）及び他のものなどがある。そのような場合において、標的核酸の性質を反映するために、ＤＮＡからなる内部のコントロール核酸を用いることは利点になりうる。
【００５６】
「細胞」、「株化細胞」及び「細胞培養物」という用語は互換的に用いることができ、全てのそのような表示は子孫を含む。それゆえ、「形質転換体」又は「形質転換細胞」という言葉は、導入の数に関わらず、その初代形質転換細胞及びその細胞から由来する培養物を含む。全ての子孫は、計画的又は偶発的な変異のために、ＤＮＡ構成において正確に同一でないかもしれない。起源となる形質転換細胞において、スクリーニングされたものと同等の機能性を有する変異した子孫は、形質転換体の定義に含まれる。その細胞は原核生物又は真核生物であってもよい。
【００５７】
「コントロール配列」という用語は、特定の宿主組織において作用可能式に連結するコード配列の発現のために必要なＤＮＡ配列を意味する。そのコントロール配列は、原核生物に適用可能で、例えば、プロモーター、任意にオペレーター配列、リボソーム結合部位、ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｒｅｔｒｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ（米国特許第４，６６６，８４８号）及び可能性のある他の配列を含む。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが既知である。
【００５８】
「制限エンドヌクレアーゼ」及び「制限酵素」という用語は、典型的に細菌由来で、特定のヌクレオチド配列上で又は近くで二本鎖ＤＮＡを切断する酵素を意味する。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは本明細書で規定される。これらのファミリーは塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えばアスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン、グリシン）、β−分岐鎖を有するアミノ酸（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。
【００５９】
「試薬溶液」という用語は、ＰＣＲの目的のために必要とされる又は用いられる少なくとも一つの試薬を含む任意の溶液である。最も典型的な成分は、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、プライマー、二価の金属イオン（例えばマグネシウム）、塩、ｐＨ緩衝試薬、ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰｓ）又はデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、一つ以上のプローブ、蛍光色素（プローブに結合しうる）、核酸結合試薬及び一つ以上の核酸鋳型である。前記試薬は、ポリメラーゼ反応又はそのモニタリングに影響を有する他のポリメラーゼ反応の添加剤でもよい。
【００６０】
「マスターミックス」という用語はＰＣＲを引き起こすために必要な成分又は因子の全て又は大半の混合物を意味し、そしてある場合において、試料及びアンプリコンに特異的な鋳型及びプライマーを除く全てを意味する。商業的に入手できるマスターミックスは通常濃厚な溶液である。マスターミックスは多数の試料に共通する全てのその試薬を含んでいてもよいが、一つの試料のみで構成されてもよい。マスターミックスの使用はピペット操作の誤差及びピペット量による試料間の差異を減らすことを手助けする。
【００６１】
「熱安定性ポリメラーゼ」という用語は、熱に対して安定であり、熱耐性であり、かつ二本鎖ＤＮＡを変性させるのに必要な時間上昇した温度にさらされた後に、後続のプライマーの伸長反応をもたらすために十分な活性を保持する酵素を意味する。核酸変性のための必要な加熱条件は当該分野で十分に周知であり、米国特許第４，９６５，１８８号及び第４，８８９，８１８号で例証される。本明細書で用いられるように、熱安定性ポリメラーゼは温度サイクリング反応、例えばＰＣＲでの使用に適用される。熱安定性核酸ポリメラーゼの例は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐ．Ｚ０５ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ  ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ  ポリメラーゼ、ＴＭＡ−２５及びＴＭＡ−３０ポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ及びそのようなものが含まれる。
【００６２】
「逆転写酵素活性を有するポリメラーゼ」は、ＲＮＡ鋳型を基にＤＮＡ合成を可能にする核酸ポリメラーゼである。それはまた、ＲＮＡが一旦一本鎖ｃＤＮＡに逆転写されると、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡの複製を可能にする。例えば、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼは熱安定的である。
【００６３】
ＤＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ分子の増幅において、一度目の伸長反応はＲＮＡ鋳型を用いた逆転写であり、そしてＤＮＡ鎖が産生される。二度目の伸長反応は、そのＤＮＡ鋳型を用いて、二本鎖ＤＮＡ分子を産生する。それゆえ、ＤＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ鋳型から相補的なＤＮＡ鎖の合成は、増幅のための出発材料を提供する。
【００６４】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、一式の酵素の逆転写／増幅反応において用いられてもよい。本明細書の「均質」という用語は、逆転写及びＲＮＡ標的の増幅に対する二つのステップの単一の添加剤の反応を意味する。均質とは、逆転写（ＲＴ）ステップの後、増幅反応前に反応容器の開封又は他の反応成分の調節の必要がないことを意味する。非均質なＲＴ／ＰＣＲ反応において、逆転写に続き及び増幅前に、一つ以上の反応成分例えば増幅試薬が、例えば調節され、加えられ、希釈され、そのために反応容器は開けられるか又は少なくともその成分は操作されなければならない。均質及び不均質の両方の反応が本開示の例である。
【００６５】
逆転写はＲＴ／ＰＣＴにおいて重要なステップである。それは例えば、ＲＮＡ鋳型がプライマー結合及び／又は対応の逆転写因子によるｃＤＮＡ鎖の伸長を妨害しうる二次構造形成への傾向を示すことは当該分野で周知のとおりである。それゆえ、ＲＴ反応のための比較的高い温度は転写効率に関しては利点がある。一方で、インキュベーション温度の上昇はまた、より高い特異性を意味し、すなわちそのＲＴプライマーは予想された配列にミスマッチを示す配列にはアニールしないだろう。特に、多数の異なる標的ＲＮＡの場合にはまた、例えば液体試料において未知又は希少な亜株又は亜種の有機体の存在する可能性がある場合に、単一のミスマッチ配列の転写及び続く増幅及び検出が所望されうる。
【００６６】
上記の両方の利点、すなわち二次構造及びミスマッチを有する鋳型の逆転写の減少から恩恵を被るため、そのＲＴインキュベーションは一つ以上の異なった温度で実行されてもよい。
【００６７】
それゆえ、本開示の一つの側面は上記のプロセスであって、その中で逆転写活性を有するポリメラーゼのそのインキュベーションは３０℃から７５℃又は４５℃から７０℃又は５５℃から６５℃の異なった温度で実行される。
【００６８】
逆転写のさらなる重要な側面として、長いＲＴステップは液体試料中に存在しうるＤＮＡ鋳型を傷つけうる。その液体試料がＲＮＡ及びＤＮＡ種の両方を含むなら、それゆえＲＴステップの時間を可能な限り短く保つこと、引き続く増幅及び任意の増幅物の検出のためにｃＤＮＡの十分な量の合成を保証することが好ましい。
【００６９】
それゆえ本開示の一つの側面は上記のプロセスであり、その中で逆転写活性を有するポリメラーゼのインキュベーションのための期間は、最大３０分、２０分、１５分、１２．５分、１０分、５分又は１分である。
【００７０】
本開示のさらなる側面は上記のプロセスであり、その中で逆転写活性を有し、そして配列の変動を含んでおり、以下からなるグループから選択される。
ａ）ＣＳ５  ＤＮＡポリメラーゼ
ｂ）ＣＳ６  ＤＮＡポリメラーゼ
ｃ）Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ
ｄ）Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ
ｅ）Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ
ｆ）Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ
ｇ）Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ
ｈ）Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐ．ｓｐｓ１７  ＤＮＡポリメラーゼ
ｉ）Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐ．Ｚ０５  ＤＮＡポリメラーゼ
ｊ）Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ  ＤＮＡポリメラーゼ
ｋ）Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ
ｌ）Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ
【００７１】
これらの条件に特に適するものは、より迅速な伸長率という点でそれらの逆転写効率を促進するポリメラーゼドメイン内の配列変異を有する酵素である。
【００７２】
それゆえ、上記のプロセスにおいて、逆転写活性を有するポリメラーゼは対応の野生型のポリメラーゼと比較して改良された核酸伸長率及び／又は改良された逆転写活性を有するポリメラーゼ変異体である。
【００７３】
例えば、上記のプロセスにおいて、逆転写活性を有するポリメラーゼは対応の野生型ポリメラーゼと比較して改良された逆転写活性を有するポリメラーゼ変異体である。
【００７４】
それらに特に有用性を与える単一の配列変異を有するポリメラーゼはＷＯ  ２００８／０４６６１２において開示される。特に、用いられるポリメラーゼは、少なくともそのポリメラーゼドメインに以下のモチーフを含む配列修飾されたＤＮＡポリメラーゼであってもよい：Ｔ−Ｇ−Ｒ−Ｌ−Ｓ−Ｓ−Ｘｂ７−Ｘｂ８−Ｐ−Ｎ−Ｌ−Ｑ−Ｎ；式中で、Ｘｂ７はＳ又はＴから選択されたアミノ酸であり；式中で、Ｘｂ８はＧ、Ｔ、Ｒ、Ｋ又はＬから選択されたアミノ酸であって、その中でそのポリメラーゼは３’から５’エキソヌクレアーゼ活性を含み、野生型ＤＮＡポリメラーゼと比較して改良された核酸伸長率及び／又は改良された逆転写効率を有し、式中でその野生型ＤＮＡポリメラーゼにおいてＸｂ８はＤ、Ｅ又はＮから選択されたアミノ酸である。
【００７５】
一つの例は、Ｔｈｕｒｍｕｓ属Ｚ０５由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの変異体であり（例えば米国特許第５，４５５，１７０号に記載）、対応の野生型酵素Ｚ０５と比較してポリメラーゼドメイン内に前記配列の変異がある。本開示に従う方法の例は、５８０番目のアミノ酸がＧ、Ｔ、Ｒ、Ｋ及びＬからなるグループから選択されるＺ０５  ＤＮＡポリメラーゼ変異体である。
【００７６】
熱安定性ポリメラーゼを用いた逆転写のために、Ｍｎ2+は二価カチオンであってもよく、そして典型的に塩、例えば、塩化マンガン（ＭｎＣｌ2）、酢酸マンガン［Ｍｎ（ＯＡｃ）2］又は硫酸マンガン（ＭｎＳＯ4）として含まれる。ＭｎＣｌ2が５０ｍＭ  トリシン緩衝液を含む反応に含まれるなら、例えばＭｎＣｌ2は一般的には０．５〜７．０ｍＭの濃度で存在する；各ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ及びｄＣＴＰが２００μＭで使用される時、２．５〜３．５ｍＭは一般的には存在する。
【００７７】
「修飾された」熱安定性ポリメラーゼは少なくとも一つの単量体が参照配列、例えば天然もしくは野生型のポリメラーゼ又は他の修飾された型のポリメラーゼから異なるポリメラーゼを意味する。見本となる修飾は単量体の挿入、欠失及び置換を含む。修飾されたポリメラーゼはまた、二以上の親から由来する同定可能な成分の配列（例えば、構造的な又は機能的なドメインなど）を有するキメラのポリメラーゼを含む。修飾されたポリメラーゼの定義には、参照配列の化学的な修飾を含むそれらも含まれる。
【００７８】
修飾された熱安定性ポリメラーゼの例は、Ｇ４６Ｅ  Ｅ６７８Ｇ  ＣＳ５  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇ４６Ｅ  Ｌ３２９Ａ  Ｅ６７８Ｇ  ＣＳ５  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇ４６Ｅ  Ｌ３２９Ａ  Ｄ６４０Ｇ  Ｓ６７１Ｆ  ＣＳ５  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇ４６Ｅ  Ｌ３２９Ａ  Ｄ６４０Ｇ  Ｓ６７１Ｆ  Ｅ６７８Ｇ  ＣＳ５  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇ４６Ｅ  Ｅ６７８Ｇ  ＣＳ６  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ０５  ＤＮＡポリメラーゼ、ΔＺ０５ポリメラーゼ、ΔＺ０５−Ｇｏｌｄポリメラーゼ、ΔＺ０５Ｒポリメラーゼ、Ｅ６１５Ｇ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ６７８Ｇ  ＴＭＡ−２５ポリメラーゼ、Ｅ６７８Ｇ  ＴＭＡ−３０ポリメラーゼ及びその他同様のものを含む。
【００７９】
「熱活性ポリメラーゼ」という用語は、特異的なプライミング及びプライマーの伸長を保証するために必要な上昇した温度（例えば５５〜８０℃）で活性化する酵素を意味する。
【００８０】
「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は互換的に用いられる。「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は互換的に用いられる。特に断りのない限り、アミノ酸配列はアミノ末端からカルボキシ末端へと記載される。特に断りのない限り、一本鎖核酸配列は５’から３’へと記載される。特に断りのない限り、二本鎖核酸配列のトップストランドは５’から３’へと記載され、そのボトムストランドは３’から５’へと記載される。
【００８１】
核酸増幅試薬は典型的に温度感受性の成分を含み、そしてそれゆえ往々にして周囲温度より十分に低い温度で貯蔵、輸送しなければならない。これは特にデオキシヌクレオシド三リン酸又はそれらのリボヌクレオシド三リン酸類似体の場合である。これらの試薬はその末端から連なるリン酸基の欠失を介して分解する傾向があり、ヌクレオシド二リン酸と一リン酸の形成をもたらし、それらは両方とも核酸ポリメラーゼの基質としてもはや活性ではない。
【００８２】
ヌクレオシドポリリン酸の安定性はその末端のリン酸のエステル化によって大幅に改善されうる。例えば、γ-メチル-ｄＮＴＰ類似体は、通常のｄＮＴＰｓが完全に分解されるのに十分な熱ストレスの状況下で完全に安定的であった。しかしながら、この末端リン酸のエステル化は、あるポリメラーゼ酵素に対する効果的な基質として寄与するためのこれらのヌクレオチドのその能力に否定的な影響を有しえる。
【００８３】
本開示は改良された光開裂性（「ケージ化された」）ヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）を開示する。三リン酸の末端のリン酸へのチオフェニルｏ−ニトロフェニルプロピル基（ＳＰｈ−ＮＰＰ）の組み込みは加水分解を介する遅い分解に対してｄＮＴＰｓを安定化する。さらに、前記ＳＰｈ−ＮＰＰ部位は酵素例えばポリメラーゼによるプロセシングを妨げる。これらの化合物のＵＶ光の照射は、不可逆的にフリーなｄＮＴＰｓを放出し、そして酵素学的な反応を開始する（「Ｐｈｏｔｏ−ｓｔａｒｔ  ＰＣＲ」、図１参照）。この戦略は、その酵素の残存する室温活性に起因する、非特異的なＰＣＲ産物の形成を抑制する。その酵素が熱により活性化されるホットスタートＰＣＲとは対照的に、本明細書でその反応は、光誘発性のｄＮＴＰｓ基質の放出を介して制御される。
【００８４】
光開裂性の部位の連結はＧｈｏｓｎ，ｅｔ．ａｌ．，Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｐｈｏｔｏｃｌｅａｖａｂｌｅ  Ａｄｄｕｃｔｓ，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．，２００５，８１：９５３−９５９に報告されており、その中で１−（４、５−ジメトキシ−２−ニトロフェニル）−エチルエステル（ＤＭＮＰＥ）を介したＤＮＡオリゴヌクレオチドのリン酸骨格と光開裂性の部位との間のエステル結合が報告された。さらに最近では、既知のｏ−ニトロフェニル発色団のチオフェニルの伸長がＫｒｅｔｓｃｈｙ  ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２０１５，５４Ｚ：８５５５−８５５９で最初に導入された。その中で、チオフェニル−２−（２−ニトロフェニル）−プロポキシカルボニル（ＳＰｈ−ＮＰＰＯＣ）が光リソグラフィーマイクロアレイ合成のためのホスホロアミダイドの５’−ヒロドキシ基の保護基として用いられた。ＳＰｈ−ＮＰＰＯＣの光分解は、ヌクレオチド、副産物のスチレン、そしてまたカーボネート結合のため１モルの二酸化炭素を放出する。前記ＳＰｈ−ＮＰＰＯＣ基は光脱保護効率において、従来法の２−（２−ニトロフェニル）−プロポキシカルボニルＮＰＰＯＣ（図２）と比較して１２倍の増加を示す。
【００８５】
本開示のＳＰｈ−ＮＰＰ−ｄＮＴＰｓの安定性は冷蔵の制限された又は冷蔵を利用できない場所での使用に適している。それゆえ、本開示の前記光開裂性ｄＮＴＰｓは「従来の」ｄＮＴＰｓよりもさらに長く及びさらに高い温度で保存できる。
【００８６】
以下の実施は、実施に現状好ましいものとして開示する。これらの実施例は例示として理解すべきであり、添付の特許請求の範囲に示されているもの以外、本発明を限定するものとして解釈されるべきである。
【実施例】
【００８７】
略称：ＡＣＮ：アセトニトリル；ＣＤＩ：１，１’−カルボニルジイミダゾール；ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド；ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド；ＭｅＯＨ：メタノール；ＴＢＡ：トリブチルアンモニウム；ＴＥＡ：トリメチルアミン；ＴＥＡＡ：酢酸トリエチルアンモニウム；ＴＨＦ:テトラヒドロフラン
【００８８】
実施例１：チオフェニルｏ−ニトロフェニルプロピルｄＡＴＰ（ｄＡＴＰ−ＳＰｈ−ＮＰＰ）の調製方法
ｄＡＴＰ−ＳＰｈ−ＮＰＰの合成を図３に概略的に示し、本明細書では簡潔に記載する。全ての工程は暗条件下で実施した。ＰｈＳＮＰＰ３ＯＨ
【化５】
2021505127.tif 000007
をＡｒ雰囲気下、そして０−４℃に冷やしてＴＨＦ（５ｍＬ、乾燥）に溶解した。２２０μＬのＴＥＡ（乾燥）及び１２７μＬのＰＯＣｌ3を加え、その反応物を１８時間撹拌し、水（８ｍＬ）でクエンチし１．５時間撹拌した。その水相を酢酸エチルで３回抽出した。その合わせた有機相をＮａ2ＳＯ4で乾燥した。その溶媒を減圧下で取り除いた。その残渣をＡＣＮ／Ｈ2Ｏに溶解し、そして凍結乾燥して２００ｍｇのＰｈＳＮＰＰ３ＭＰが粘着性の樹脂として得られ、
【化６】
2021505127.tif 000008
それを次工程に直接用いた。
【００８９】
２００ｍｇの未加工のＰｈＳＮＰＰ３ＭＰを６ｍＬのＤＭＦ（乾燥）に溶解し、ＣＤＩを加え、混合物を乾燥条件下で４時間撹拌した。過剰なＣＤＩをＭｅＯＨでクエンチし、３０分間撹拌した。５２ｍｇのＭｇＣｌ2、そして次に２．２等量のＴＢＡ−ＡＤＰ溶液を加え、その反応物を３日間撹拌した。０．１ＭのＴＥＡＡ緩衝液（ｐＨ４．１）を１：１の比で加えた。ダイヤイオンＨＰ２０吸着剤を加え、その反応物を３０分間撹拌し、濾過した。その濾液を水で洗浄し、その生成物をＭｅＯＨで溶出した。その溶媒を次に吸引で取り除き、得られた残渣を水で溶解し、ＲＰ１８−ＨＰＬＣにより精製した。生成物画分を合わせ、凍結乾燥してＰｈＳＮＰＰ３ＡＴＰを５１％の収率で得た。
【００９０】
実施例２：ｄＡＴＰ−ＳＰｈ−ＮＰＰを用いた安定性の研究
３００μＭのｄＡＴＰ−ＳＰｈ−ＮＰＰ、４０％のＤＭＳＯ及び１．０Ｍの酢酸カリウムを含む水性混合物を調製した。対照のために、ｄＡＴＰ−ＳＰｈ−ＮＰＰの代わりに３００μＭのｄＡＴＰを含む別の混合物を準備した。１５０μＬの各混合物をサーモシェーカーで６５℃でインキュベートした。０、２、１８、２５及び１２０時間後の各溶液（２０μＬ）の試料をＵＰＬＣ−ＭＳ（超高速液体クロマトグラフィー−質量分析）で分析した。２６０ｎｍのピーク領域を出発材料及び分解生成物の割合を計算するために用いられた。
【００９１】
結果：
使用した条件下では、質量分析で確認されたように、ｄＡＴＰはすぐに一リン酸及び二リン酸に分解した。ｄＡＴＰ−ＳＰｈ−ＮＰＰはｄＡＴＰよりも著しく熱安定性があり、６５℃で１２０時間、ｄＡＴＰ−ＳＰｈ−ＮＰＰの分解生成物は見られなかった（図４）。
【００９２】
実施例３：ｄＡＴＰ−ＳＰｈ−ＮＰＰの光開裂性
ｄＡＴＰ−ＳＰｈ−ＮＰＰ及びＡＴＰ−ＤＭＮＰＥ（各３００μＭ）の二つの水性混合物をリン酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．０）で調製した。両方の試料は振とう又は撹拌せずに開放系の容器でＵＶ−ＬＥＤ光源（ＩｎＧａＮ，Ｑｕａｎｔｕｍ  ｗｅｌｌ、λｍａｘ  ＝ ３９３ｎｍ、０．１８  Ｗ／ＬＥＤ）からの光で同時に照射された。０、１、２、４、８及び１６分後、試料の除去（２０μＬ）及び続くＵＰＬＣ−ＭＳ分析のためにその照射を一時的に停止した。２６０ｎｍのピーク領域を出発材料及び分解生成物の割合を計算するために用いた。出発材料と開裂した生成物の分子の同一性は質量分析により確認された。
【００９３】
結果：
ｄＡＴＰ−ＳＰｈ−ＮＰＰに５分間以上照射した際に９０％以上のｄＡＴＰが遊離し、完全な開裂を８分間で達成した（図５）。ｄＡＴＰ−ＳＰｈ−ＮＰＰの光開裂は商用利用されているＡＴＰ−ＤＭＮＰＥ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）よりも著しく早い。
【００９４】
実施例４：ｄＡＴＰ−ＳＰｈ−ＮＰＰを用いた増幅反応
ＰＣＲマスターミックス（２０μＬ）、緩衝液ミックス（２０μＬ）及びｄＮＴＰミックス（１０μＬ）と名付けられる３つの成分の組み合わせにより、５０μＬの総量のリアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ）混合物を調製した。全てのＰＣＲ成分をＤＥＰＣ処理水から調製した。前記ＰＣＲマスターミックスはトリシン緩衝液（ｐＨ８．２）、酢酸カリウム、グリセロール、ＤＭＳＯ、界面活性剤、標的ＤＮＡ（４００ｃｐ）、ポリメラーゼアプタマー、プローブ、プライマー、ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ染色剤及びポリメラーゼ酵素を含んでいた。前記緩衝液ミックスは酢酸マンガン（８．３ｍＭ）及びイミダゾール（０、３．０又は６．０ｍＭ）を含んでいた。前記ｄＮＴＰミックスはｄＡＴＰ（４００μＭ）、ｄＣＴＰ（４００μＭ）、ｄＧＴＰ（４００μＭ）及びｄＵＴＰ（８００μＭ）を含んでいた。別のｄＮＴＰ混合物はｄＡＴＰの代わりにｄＡＴＰ−ＳＰｈ−ＮＰＰ（４００μＭ）を含んでいた。ＤＮＡ標的の最終濃度は４００ｃｐ／反応であった。
【００９５】
同じ組成物のＴａｑＭａｎ  ＰＣＲを９６穴プレートの二つの別々の区画に配置した。各区画は通常のｄＮＴＰｓのＰＣＲ混合物及びｄＡＴＰ−ＳＰｈ−ＮＰＰを含むＰＣＲ混合物を含んでいた。各ＰＣＲをトリプリケートで調製した。プレートの一区画をアルミホイルで覆い、一方で他の区画をＵＶ−ＬＥＤ光源（ＩｎＧａＮ，Ｑｕａｎｔｕｍ  ｗｅｌｌ、λｍａｘ  ＝ ３９３ｎｍ、０．１８  Ｗ／ＬＥＤ）からの光で室温で８．０分間露光した。その後、カバーを取り外し、プレートをＰＣＲ増幅サイクルにかけ、その後ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０システムでＤＮＡを融解した。ＰＣＲ増幅曲線の分析は、Ｃｙ５．５チャンネルで収集した蛍光データで実施し、一方で融解曲線の分析はＦＡＭチャンネル（４６５−５１０ｎｍ）で収集した蛍光データに基づいていた。
【００９６】
結果：
ＳＰｈ−ＮＰＰでケージ化されたｄＡＴＰは、ＰＣＲ増幅を妨げる（図６、グラフの左カラム；ＵＶ照射無し）。８．０分間のＵＶ光の照射及び続くＰＣＲサイクルはＤＮＡ増幅を導く（図６、グラフの右カラム）。イミダゾールの添加はＰＣＲ増幅曲線の形状には著しい影響を与えなかった。
【図１】
2021505127.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
2021505127.tif 000019
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