(57)【要約】人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）技術により、エクスビボでのパーキンソン病（ＰＤ）に関連する生きた脳組織の生成及び研究が可能になる。ＰＤ患者由来の細胞株を利用することで、インビトロで観察された細胞の表現型を実際の臨床データと結び付ける強力な発見システムが実現する。患者由来のｉＰＳＣをドーパミン作動性（ＤＡ）神経運命に向けて分化させることにより、これらの細胞が、ＰＤ患者の黒質で著しく変性することが観察されるＤＡニューロンの分子的及び機能的特性をインビトロで呈することが明らかになった。他の関連する細胞型の生成を駆動する臨床症状も、ＰＤを有する患者のための新しい治療手段につながる可能性のある、インビトロでの新規のＰＤ特異的表現型をもたらし得る。これらの患者からの分化した神経組織は、患者らの早期発症及び非家族性起源に起因して、ニューロンサブタイプ特異的な病態形成機序を発見するため、また重要なことに、ＰＤへの感受性における患者らの遺伝的背景の寄与を調査するための重要な機会を提供する。2021523888.tif 000007
2021523888.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療方法であって、
治療上有効な薬剤及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物をパーキンソン病に罹患している対象に投与し、それにより前記対象を治療することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記治療上有効な薬剤が小分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記小分子が、ＰＫＣ活性化因子、その類似体及び誘導体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＫＣ活性化因子が、ＤＡＧ、ＤＡＧラクトン、ホルボール、インゲノール、インドラクタム、ベンゾラクタム、ブリオスタチン、及びカルホスチンを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＰＫＣ活性化因子、その類似体及び誘導体が、インゲノール誘導体を含む、請求項３記載の方法。
【請求項６】
前記インゲノール誘導体がインゲノール−３−アンゲレートを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＰＫＣ活性化因子、その類似体及び誘導体が、ＰＫＣアゴニストを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記治療上有効な薬剤が、α−シヌクレイン、ＴＦＥＢ、ＺＫＳＣＡＮ３、ＬＡＭＰ、ＧＣａｓｅ、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、及びドーパミンのうちの１つ以上の活性を調節することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記治療上有効な薬剤が、α−シヌクレイン、ＴＦＥＢ、ＺＫＳＣＡＮ３、ＬＡＭＰ、ＧＣａｓｅ、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、及びドーパミンのうちの１つ以上の発現を調節することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
発現の調節が転写産物発現レベルを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
発現の調節がタンパク質発現レベルを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
タンパク質発現レベルがα−シヌクレインタンパク質の減少を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
タンパク質発現レベルがＴＨタンパク質の増加を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記治療上有効な薬剤が、リソソームタンパク質分解を促進することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記治療上有効な薬剤が、電気的活動の同期バーストを改善することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記治療上有効な薬剤が、ステッピング（stepping）、回転非対称性（rotational asymmetry）、及びキネジア（kinesia）のうちの１つ以上を改善することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
パーキンソン病の進行を逆転または遅延させる方法であって、
治療上有効な薬剤及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物をパーキンソン病に罹患している対象に投与し、それにより前記対象におけるパーキンソン病の進行を逆転または遅延させることを含む、前記方法。
【請求項１８】
前記治療上有効な薬剤が、ＰＫＣ活性化因子、その類似体及び誘導体を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＰＫＣ活性化因子、その類似体及び誘導体が、インゲノール−３−アンゲレートを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記治療上有効な薬剤が、α−シヌクレインタンパク質レベルを低下させることができる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記治療上有効な薬剤が、リソソームタンパク質分解の促進を減少させることができる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記治療上有効な薬剤が、黒質の変性を逆転または遅延させることができる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記治療上有効な薬剤が、ドーパミンレベルを維持または促進することができる、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府支援の研究に関する声明文
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈから授与されたＮＳ１０５７０３のもと、政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
パーキンソン病に関連するものを含む中脳ニューロンの生成に関連する方法及び組成物が本明細書に記載されている。
【背景技術】
【０００３】
背景
パーキンソン病（ＰＤ）は、二番目に多く診断される神経変性疾患であり、現在の老齢人口の間で相当な経済的負担となっている。ＰＤにおける古典的に関連付けられる病理は、黒質緻密部におけるドーパミン作動性ニューロン（ＤａＮ）の進行性の消失、ならびにレビー小体及びレビー神経突起として知られる細胞質内封入体の存在を特徴とする。これらの封入体は、主にタンパク質α−シヌクレインで構成される。α−シヌクレインをコードする遺伝子（ＳＮＣＡ）の変異または三重化は、これらの特定の家族性ＰＤ症例の原因である。その本来の状態では、α−シヌクレインは、ヒトの脳全体のニューロンのシナプス前終末に見られ、小胞輸送、神経伝達物質の放出及び再取り込みにおいて機能を果たす。
【０００４】
α−シヌクレインなどの多くの遺伝子及びタンパク質がＰＤに関連付けられているが、患者から生きたニューロンを抽出できないこと、及び効果的なＰＤモデルがないことから、疾患の開始及び進行に関する未解決の問題が残っている。患者由来の細胞をｉＰＳＣに再プログラミングすることで、疾患の進行及び病理学的表現型を分子レベルで観察することができる。興味深いことに、より大きな非家族性（孤発性）集団に関する以前のｉＰＳＣ研究において、対照個体に由来するものと比較した場合、明白な違いが示されていない。このため、パーキンソン病の病理を裏打ちする複雑な生物学的背景を表すｉＰＳＣ疾患モデルが、当該技術分野において強く必要とされている。
【０００５】
パーキンソン病をモデル化及び治療するための組成物及び方法が本明細書に記載されている。重要なことに、中脳ニューロンの生成、発達を忠実に反映した様式での底板誘導により、神経変性につながる細胞キューを特定することができ、これには、ｉＰＳＣモデルでまだ十分に活用されていない孤発性ＰＤ症例の背後にある複雑な病因が含まれる。そのようなモデルを確立したところ、本発明者らは、本明細書において、ＰＫＣによって一部媒介されるものとして、α−シヌクレイン及びリソソーム分解機能障害のこれまで未知であった役割を特定した。アゴニストによるＰＫＣのターゲティングによって測定可能な結果が改善され、これにより、パーキンソン病の新しい治療手段が提案された。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】ＰＤ患者データ。
【図２−１】分化スキーム（ａ）。ＴＨの発現及び形態を示す代表的な画像（ｂ）。分化効率を示すフローサイトメトリーデータであり、各点は、独立した分化の３つの別個のウェルの平均を表す（ｃ）。
【図２−２】総ドーパミン含有量のＨＰＬＣ検出（ｄ）。株ごとに分化効率で正規化したドーパミン含有量のＨＰＬＣ検出（ｅ）。３０日齢のＤａＮにおけるｂＡＣＴ（ハウスキーピング）及びシヌクレインの発現を示すウエスタンブロット（ｆ）。各点は別個の分化からのバンドであり、色はｉｐｓｃ株を示し、データは各分化について０２ｉ対照で正規化した、複数のウエスタンブロットからの相対強度（ｇ）。３０日齢のＤａＮにおけるｑＰＣＲによるＳＮＣＡ発現（ｈ）。
【図３−１】ＲＮＡ−Ｓｅｑ及びプロテオミクスの組み合わせからの重複した転写物及びタンパク質の複合検出（ａ）。一致するトランスクリプトームデータ及びプロテオミクスデータのＰＣＡプロット（ｂ）。ＰＤにおいて上方調節されたＰＣ１成分のＧＳＥＡ分析（ｃ）。
【図３−２】ＰＤにおいて下方調節されたＰＣ１成分のＧＳＥＡ分析（ｄ）。
【図４−１】シクロヘキシミドによる阻害下でのシヌクレイン分解を示す代表的なウエスタンブロット（ａ）。０２ｉ対照及び１９０ｉＰＤ細胞からの３つの別個の分化のウエスタンブロットの平均強度であり、時間＝０のシヌクレイン（ｂ）、シナプトフィジン（ｃ）、及びＴＨ（ｄ）に対する変化倍率として提示する。
【図４−２】２４時間のＭＧ１３２プロテアソーム阻害剤下でのシヌクレイン分解を示すウエスタンブロット（ｅ）。ＰＤ  ＤａＮにおけるＬＡＭＰ１タンパク質の減少を示すウエスタンブロット（ｆ）。ＧＣａｓｅ活性であり、各点は、単一の分化からの３つの別個のウェルの平均である。データは、各分化について０２ｉ対照で正規化し、変化倍率として表した（ｇ）。Ｄ３０  ＤａＮ溶解物からの酸化ドーパミンのＮＩＲＦ検出（ｈ）。
【図５−１】ＰＤ株におけるリソソームアゴニストによる処理及びｐ−ＰＫＣａの上昇。指定の化合物で７２時間処理したｄ３０  ＤａＮのウエスタンブロット及び相対バンド定量化（ａ）。ｄ３０  ＤａＮにおけるｐ−ＰＫＣａのベースラインレベル（ｂ）。
【図５−２】複数のＰＤ株及び対照株からの、ＰＥＰで処理した３０日目のＤａＮ（ｃ）。ＰＥＰ処理のタイムコースおよびシヌクレインレベル（ｄ）。
【図５−３】ＳＮＣＡ（ｅ）およびＴＨ（ｆ）の遺伝子発現のＰＥＰ処理のタイムコース。
【図５−４】追加の対照株及びＰＤ株におけるシヌクレイン及びｐ−ＰＫＣａの上昇の確認（ｇ）。
【図６ａ】４段階のタイムコース（ａ）および成熟（ｂ）を含む分化プロトコル。
【図６ｂ】図６ａの続きを示す。
【図７】研究ワークフロー。
【図８】パーキンソン病動物モデルのモデルは、古典的なパーキンソン病の表現型を再現することができない。主要なモデルには、Ａ５３Ｔ、ＳＮＣＡ三重化、ＬＲＲＫ２  Ｇ２０１９Ｓが含まれる。ｉＰＳＣモデルは患者特異的な遺伝的性質を獲得する。
【図９】早期発症型ＰＤ分布。
【図１０】患者株の概要。末梢血細胞からの非組み込み型エピソーム再プログラミングから株を生成した。患者は、ＰＤの早期発症を呈し、家族歴がなく、ＮｅｕｒｏＸアレイ及びＷＧＳは、原因となる単一遺伝子ＰＤ変異がないことを確認した。
【図１１】ｍＤＡニューロン培養物への分化。Ｄ３０中脳ドーパミン作動性ニューロン（ｍＤＡ）培養物は、約２０％のＴＨ＋細胞を含み、ドーパミンを産生し、Ｋ及びＮａチャネルで自発的活動を呈し、電流注入時に一連のＡＰを発する。
【図１２】ＥＯＳＰＤ  ｍＤＡ培養物におけるα−シヌクレインの蓄積。ウエスタンブロット及びＥＬＩＳＡによる、ＥＯＳＰＤ  ｍＤＡ培養物におけるα−シヌクレインレベルの増加。
【図１３】ＥＯＳＰＤ  ｍＤＡ培養物のＯＭＩＣＳ分析の組み合わせ。ＳＷＡＴＨプロテオーム解析とＲＮＡ−Ｓｅｑトランスクリプトミクスの組み合わせ。
【図１４】ＥＯＳＰＤ  ｍＤＡ培養物では、α−シヌクレインの分解が損なわれている。α−シヌクレイン（α−ｓｙｎ）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、及びシナプトフィジン（Ｓｙｎｐ）タンパク質レベルを、４８時間のシクロヘキシミド処理にわたってアッセイした。
【図１５】α−シヌクレインはプロテアソームでは分解されない。Ｄ３０  ｍＤＡ培養物をプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２で２４時間処理した。Ｐ５３は典型的にプロテアソーム手段によって分解された。
【図１６】ＥＯＳＰＤ  ｍＤＡ培養物では、リソソーム経路が損なわれている。リソソーム関連膜タンパク質１（ＬＡＭＰ１）。ＧＣａｓｅ−リソソーム加水分解酵素。
【図１７】ｐ−ＰＫＣａは、ＥＯＳＰＤ  ｍＤＡ培養物において高い。ＰＫＣａリン酸化Ｔｈｒ−６３８は、アゴニストによるタンパク質の脱リン酸化及び不活性化の速度を制御する。活性の増強は他の神経変性疾患（アルツハイマー病）と関連している。
【図１８】ＰＥＰ００５はＥＯＳＰＤ表現型を調節する。
【図１９】ＰＥＰ００５はインビボでα−シヌクレインレベルを低下させる。野生型Ｃ５７／ＢＬ６マウスはＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓから購入した。片側線条体注射（Ｌ）。処置の３日後にα−シヌクレインレベルをアッセイした。
【図２０】ＥＯＳＰＤバイオマーカーは複数のｉＰＳＣ株を正しく識別する。この系でスクリーニングされた１１個のｉＰＳＣ株のうち１０個は、５個のＥＯＳＰＤのうち４個について正しく識別される。成人発症型ＰＤ株はＥＯＳＰＤ表現型を示さない。
【図２１】ＰＥＰ００５はＴＨ発現を増加させる。
【図２２】ＤＡチップ：ドーパミン作動性ニューロン｜内皮細胞の共培養。チップシステムは、再現性のあるＴＨ発現をモデル化するパーキンソン病の中脳ＤＡニューロンを含むように適合させた。薬物試験用の血液脳関門成分。
【図２３】追加のホルボールエステル化合物。ＰＥＰ００５、プロストラチン、及びＰＭＡはすべて、異なる植物種に由来するホルボールエステルである。化学構造が非常に類似している。３つのホルボールエステル化合物はすべて、本発明者らのモデルシステムにおけるインビトロ試験で、シヌクレイン、ｐＰＫＣａ、及びＴＨレベルに同様の影響を及ぼす。
【図２４】ＥＯＳＰＤ由来のｉＰＳＣは、α−シヌクレインを蓄積する中脳ドーパミン作動性（ｍＤＡ）ニューロン培養物に分化することができる。（ａ）ｍＤＡ培養物の分化図。（ｂ）ｍＤＡ培養物の代表的な画像は、ＴＨの発現及び形態を示す。（ｃ）フローサイトメトリーによって分化効率を定量化し、各点は独立した分化の３つの別個のウェルの平均を表し、株ごとに少なくとも３回繰り返した。＊は、テューキーの多重比較検定を用いた一元配置分散分析（Ｆ４．０７、ＤＦ２３）による有意性（ｐ＜０．０５）を示す。（ｄ）株ごとの分化効率で正規化したドーパミン総含有量のＨＰＬＣ検出。（ｅ）３０日目（ｄ３０）のｍＤＡニューロンにおける自発的活動のギャップのない記録。（ｆ）ｄ３０  ｍＤＡニューロンの電圧クランプ記録。（ｇ）ｄ３０  ｍＤＡニューロンの注入電流の記録。（ｈ）ｄ３０  ｍＤＡ培養物におけるｑＰＣＲによるＳＮＣＡ発現。（ｉ）α−シヌクレイン産生及びハウスキーピング対照としてのβ−アクチンについてのｄ３０  ｍＤＡ培養物のウエスタンブロット。（ｊ）複数のウエスタンブロットからの相対強度であり、各点は別個の分化からのバンド強度を表し、強度は対照株の平均に対するものである。（ｋ）α−シヌクレインＥＬＩＳＡであり、各点は別個の分化からの３つのウェルの平均を表し、３つの独立した分化が表される。グラフの色は異なるｉＰＳＣ株を示す。＊は、ウェルチの補正を用いたｔ検定による対照からの有意性ｐ＜０．０００１を示す（ｊ、ｋ）。エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を表す。
【図２５】ｍＤＡ培養物からのＲＮＡシーケンス分析及びプロテオミクス分析の組み合わせ。（ａ）３０日目の一致するｍＤＡからの全トランスクリプトームデータセット及びＣＶでフィルタリングしたプロテオミクスデータセットのＰＣＡプロット。色は細胞株を示す。薄青色＝０２ｉ対照、濃青色＝ＷＰ３ｉ対照、紫色＝００ｉ対照、オレンジ色＝１９４ｉＰＤ、ピンク色＝２００ｉＰＤ、及び赤色＝１９０ｉＰＤ。同じ色は、異なる培養ウェルからの生物学的複製を示す。（ｂ）ｍＲＮＡ−Ｓｅｑデータ及びプロテオミクスデータの両方からのＰＣ１に沿って上方調節及び下方調節された一致する遺伝子セット成分のＧＳＥＡ分析。偽発見率（ＦＤＲ）によって計算した有意性によって、経路をランク付けした。ＧＳＥＡゼロ値を１Ｅ−５に設定した。（ｃ）ＧＳＥＡタームのプロテオミクス分析からの濃縮プロットは、ＰＣ１において有意に上方調節及び下方調節された。赤色は正の重み付けスコアを示し、青色は負の重み付けスコアを示す。ＰＣ１遺伝子はｘ軸に沿って遺伝子の重み付けで順序付け、黒色の線はＧＳＥＡタームに含まれる遺伝子を示す。（ｄ）差次的に下方調節されたタンパク質ＫＥＧＧ経路の文字列分析。（ｅ）ＫＥＧＧリソソーム経路に含まれる有意に下方調節された遺伝子あたりの検出されたタンパク質強度値の平均値。エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を表す。
【図２６】リソソームによるα−シヌクレインの分解は、ＥＯＳＰＤ  ｍＤＡ培養物において特異的に損なわれている。（ａ）シクロヘキシミドによる阻害下でのチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、シナプトフィジン（Ｓｙｎｐ）、及びα−シヌクレイン（α−Ｓｙｎ）の分解を示す代表的なウエスタンブロット。（ｂ）０２ｉ対照及び１９０ｉＰＤ細胞からの３つの別個の分化のウエスタンブロットの平均強度であり、時間＝０に対する変化倍率として提示する。＊は、シダックの多重比較検定を用いた一元配置分散分析（Ｆ１５．６、ＤＦ２３）による同じ時点での対照細胞に対する有意性（ｐ＜０．００５）を示す。（ｃ）２４時間のＭＧ１３２プロテアソーム阻害剤下でのα−シヌクレイン分解を示すウエスタンブロット。未処理細胞と比べたＭＧ１３２処理後のＰ５３（ｄ）及びα−シヌクレイン（ｅ）バンド強度の定量化、＊は、ウェルチの修正を用いたｔ検定による未処理細胞に対する有意性ｐ＜０．０５を示す。（ｆ）ＥＯＳＰＤ及び対照ｍＤＡ培養物におけるＬＡＭＰ１タンパク質を示すウエスタンブロット。（ｇ）対照細胞に対するＬＡＭＰ１バンド強度の定量化。各点は、別個の分化及びウエスタンブロットを表し、＊は、ウェルチの修正を用いたｔ検定による対照細胞に対する有意性ｐ＜０．００５を示す。（ｈ）ＧＣａｓｅ活性であり、各点は、単一の分化からの３つの別個のウェルの平均である。データは、各分化について対照細胞で正規化し、変化倍率として表した。＊は、ウェルチの修正を用いたｔ検定による未処理細胞に対する有意性ｐ＜０．０５を示す。３０日目（ｉ）及び６０日目（ｊ）のｍＤＡ培養溶解物からの酸化ドーパミンのＮＩＲＦ検出。対照細胞と比べたドットブロット及びシグナル強度を提示する。＊は、ウェルチの修正を用いたｔ検定による対照細胞に対する有意性ｐ＜０．００５を示す。エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を表す。
【図２７】ＥＯＳＰＤ  ｍＤＡ培養物をＰＫＣアゴニストで処理すると、細胞内α−シヌクレインが減少する。（ａ）指定の化合物で７２時間処理していない（ＵＴ）または処理した３０日目（ｄ３０）のｍＤＡ培養物のウエスタンブロット、及び（ｂ）相対バンド定量化。ＰＥＰ００５で７２時間処理したｄ３０  ｍＤＡ培養物のフローサイトメトリー分析、（ｃ）同じ株の未処理ｍＤＡ培養物と比べた陽性細胞のＴＨ強度の中央値、＊は、ウェルチの修正を用いたｔ検定による未処理からの有意性（ｐ＜０．０５）を示す、及び（ｄ）ＴＨ＋ニューロンへの分化効率。（ｅ）ｄ３０  ｍＤＡ培養物におけるｐ−ＰＫＣαのベースラインレベル。（ｆ）対照細胞に対するｐ−ＰＫＣαバンド強度の定量化。各点は、別個の分化及びウエスタンブロットを表し、＊は、ウェルチの修正を用いたｔ検定による対照細胞に対する有意性ｐ＜０．００５を示す。（ｇ）複数のＥＯＳＰＤ及び対照株からのＰＥＰ００５で処理したｄ３０  ｍＤＡ培養物のウエスタンブロット。（ｈ）同じ株の未処理細胞と比べた、ＰＥＰ００５あり及びなしのα−シヌクレインバンド強度の定量化。同じ株の未処理細胞と比べた、ＰＥＰ００５あり及びなしの（ｉ）ｐ−ＰＫＣα及び（ｊ）ＬＡＭＰ１のバンド強度。＊は、対応のあるｔ検定による未処理細胞に対する有意性ｐ＜０．００５を示す（ｈ、ｉ、ｊ）。エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を表す。
【図２８】ＰＫＣ経路効果の確認。（ａ）３０日目における追加の対照及びＥＯＳＰＤ  ｍＤＡ培養物のウエスタンブロット及び定量化。（ｂ）０２ｉ対照で正規化したすべてのｍＤＡ培養物からの平均α−シヌクレイン及びｐ−ＰＫＣα発現。（ｃ）正規化されたα−シヌクレイン（赤色）、ＬＡＭＰ１（青色）、ｐ−ＰＫＣα（オレンジ色）のＲＯＣ曲線プロット。（ｄ）追加のＰＫＣアゴニストによるｍＤＡ培養物の処理及びバンド強度の定量化。（ｅ）１７２ｉＰＤ  ｍＤＡ培養物におけるＰＥＰ００５及びプロストラチンの用量応答曲線。（ｅ）２１５ｎｇのＰＥＰ００５で３日間処理したマウス線条体におけるα−シヌクレインの免疫組織化学染色。（ｆ）ＰＥＰ００５の用量に応答した注射側（Ｌ）／反対側（Ｒ）として提示されているマウス線条体におけるα−シヌクレインのウエスタンブロット定量化。ｎ＝９匹のＶＨＣ、４匹の２．１５ｎｇ、３匹の２１．５ｎｇ、及び９匹の２１５ｎｇ。＊は、テューキーの多重比較検定を用いた一元配置分散分析（Ｆ３．９６、ＤＦ２４）による有意性（ｐ＜０．０５）を示す。エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を表す。
【図２９】ホルボールエステル化合物のＥＯＳＰＤバイオマーカー及び疑われる活性の概略図である。
【図３０】ＥＯＳＰＤ患者及び対照の臨床概要。
【図３１】独立したＲＮＡ−Ｓｅｑデータについての上位２０個の顕著な上方調節及び下方調節されたＧＳＥＡ結果。
【図３２】ＥＯＳＰＤ  ｉＰＳＣの生成。（ａ）ＥＯＳＰＤ患者からの未分化ｉＰＳＣにおけるＳＳＥＡ４（緑色）及びＯＣＴ−４免疫染色。（ｂ）ＥＯＳＰＤ患者のｉＰＳＣからの正常な核型。
【図３３】ｍＤＡ培養物の追加の特性。（ａ）６個のｉＰＳＣ株からの３０日目（ｄ３０）のｍＤＡ培養物におけるドーパミン作動性ニューロン遺伝子の発現。データは、対照株における平均発現に対するものである。（ｂ）ｄ３０  ｍＤＡ培養溶解物中の総ドーパミンのＨＰＬＣ検出。＊は、テューキー多重比較検定を用いた一元配置分散分析（Ｆ６７．７、ＤＦ１７）による、他のすべての株からの有意性（ｐ＜０．０５）を示す。（ｃ）３７℃で１５分間インキュベートした後の、ａＣＳＦ中の放出されたドーパミンのＨＰＬＣ検出。＊は、テューキー多重比較検定を用いた一元配置分散分析（Ｆ３１．６、ＤＦ１７）による、他のすべての株からの有意性（ｐ＜０．０５）を示す。（。（ｄ）分化２１日目の０２ｉ対照ｍＤＡニューロンからの自発的活動のＭＥＡ記録。（ｅ）分化３０日目の対照及びＥＯＳＰＤのｍＤＡニューロンのＭＥＡ記録。（ｆ）３０日目のニューロンごとの平均ソートスパイク。点は４つのウェルの平均を表し、色はｉＰＳＣ株を示す。（ｇ）対照及びＥＯＳＰＤのｉＰＳＣにおけるα−シヌクレインのウエスタンブロット。エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を表す。
【図３４】トランスクリプトーム及びプロテオーム解析の組み合わせ。（ａ）トランスクリプトームデータ及び（ｂ）プロテオミクスデータのピアソン相関プロット。（ｃ）検出されたすべてのタンパク質のＰＣＡプロット。（ｄ）一致するＲＮＡ−Ｓｅｑ転写産物のＰＣＡプロット。（ｅ）一致するタンパク質のＰＣＡプロット。
【図３５】ＰＥＰ００５処理の追加の特性評価。（ａ）ＰＥＰ００５処理あり及びなしの２００ｉＰＤ  ｄ３０  ｍＤＡ培養物におけるＴＨ及びα−シヌクレインを示す免疫細胞化学。（ｂ）複数のＥＯＳＰＤ及び対照株からのＰＥＰ００５で処理した３０日目のｍＤＡニューロン。（ｃ）同じ株からの未処理の細胞と比べたＬＣ３Ｉ／ＩＩ及びα−シヌクレインのバンド強度の定量化。（ｄ）ＥＯＳＰＤ及び対照ｍＤＡニューロンにおけるＰＥＰ００５処理のタイムコース。（ｅ）ＥＯＳＰＤ及び対照のｍＤＡニューロンにおけるα−シヌクレイン、ｐ−ＰＫＣα、及びＣＣ３のバンド強度の定量化。（ｆ）ＳＮＣＡ及び（ｇ）ＴＨの発現を示す、ＰＥＰ００５のタイムコースにわたる対になった試料のｑＰＣＲ。（ｈ）ｄ３０  ｍＤＡニューロン培養物中の総ＰＫＣαのウエスタンブロット及び定量化。ウェルチの修正を用いたｔ検定により、有意ではない（ｐ＞０．０５）。（ｉ）ｐ−ＰＫＣαを示す未分化ｉＰＳＣのウエスタンブロット。エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を表す。
【図３６】ＰＥＰ００５及び関連分子の用量応答及びインシリコ分析。（ａ）ｍＤＡ培養物中で試験したＰＥＰ００５に類似したホルボールエステルの構造。（ｂ）様々なＰＥＰ００５用量に応答したα−シヌクレイン及びｐ−ＰＫＣαのウエスタンブロット。（ｃ）ＥＯＳＰＤ及び対照両方のｍＤＡ培養物における様々なプロストラチン（ＰＲＯ）用量に応答したα−シヌクレイン及びｐ−ＰＫＣαのウエスタンブロット。（ｄ）ＰＫＣα上のＰＥＰ００５結合部位及び追加のタンパク質上の類似の親和性部位の予測モデリング。（ｅ）類似性を示すために重ね合わせた、ＰＫＣα、ＰＫＣδ、及びＲａｓ上のＰＥＰ００５結合部位の３Ｄモデル。
【図３７】ブリオスタチン１はＰＫＣアゴニスト（ＰＥＰ００５と同じクラスの薬物）であるが、化学構造が明確に異なる。ブリオストラチンによるＤ３０  ｍＤＡニューロンの処理により、ＰＥＰとしてのリン酸化ＰＫＣａの減少が生じるが、シヌクレインへの影響は不明瞭である。Ｇｏ６９７６はＰＫＣアゴニストであり、ＰＥＰとは逆の影響があるはずである。ブリオストラチンでのＤ３０  ｍＤＡニューロンの処理により、ｐＰＫＣａまたはシヌクレインレベルが影響を受けるようには見えなかった。
【図３８】インビトロでのＰＥＰ００５の影響の持続時間。
【発明の概要】
【０００７】
治療上有効な薬剤及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物をパーキンソン病に罹患している対象に投与し、それにより対象を治療することを含む、治療方法が、本明細書に記載されている。他の実施形態では、治療上有効な薬剤は小分子を含む。他の実施形態では、小分子は、ＰＫＣ活性化因子、その類似体及び誘導体を含む。他の実施形態では、ＰＫＣ活性化因子は、ＤＡＧ、ＤＡＧラクトン、ホルボール、インゲノール、インドラクタム、ベンゾラクタム、ブリオスタチン、及びカルホスチンを含む。他の実施形態では、ＰＫＣ活性化因子、その類似体及び誘導体は、インゲノール誘導体を含む。他の実施形態では、インゲノール誘導体は、インゲノール−３−アンゲレートを含む。他の実施形態では、ＰＫＣ活性化因子、その類似体及び誘導体は、ＰＫＣアゴニストを含む。他の実施形態では、治療上有効な薬剤は、α−シヌクレイン、ＴＦＥＢ、ＺＫＳＣＡＮ３、ＬＡＭＰ、ＧＣａｓｅ、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、及びドーパミンのうちの１つ以上の活性を調節することができる。他の実施形態では、治療上有効な薬剤は、α−シヌクレイン、ＴＦＥＢ、ＺＫＳＣＡＮ３、ＬＡＭＰ、ＧＣａｓｅ、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、及びドーパミンのうちの１つ以上の発現を調節することができる。他の実施形態では、発現の調節は、転写産物発現レベルを含む。他の実施形態では、発現の調節は、タンパク質発現レベルを含む。他の実施形態では、タンパク質発現レベルは、α−シヌクレインタンパク質の減少を含む。他の実施形態では、タンパク質発現レベルは、ＴＨタンパク質の増加を含む。他の実施形態では、治療上有効な薬剤は、リソソームタンパク質分解を促進することができる。他の実施形態では、治療上有効な薬剤は、電気的活動の同期バーストを改善することができる。他の実施形態では、治療上有効な薬剤は、ステッピング（stepping）、回転非対称性（rotational asymmetry）、及びキネジア（kinesia）のうちの１つ以上を改善することができる。
【０００８】
治療上有効な薬剤及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物をパーキンソン病に罹患している対象に投与し、それにより対象におけるパーキンソン病の進行を逆転または遅延させることを含む、パーキンソン病の進行を逆転または遅延させる方法が、本明細書に記載されている。他の実施形態では、治療上有効な薬剤は、ＰＫＣ活性化因子、その類似体及び誘導体を含む。他の実施形態では、ＰＫＣ活性化因子、その類似体及び誘導体は、インゲノール−３−アンゲレートを含む。他の実施形態では、治療上有効な薬剤は、α−シヌクレインタンパク質レベルを低下させることができる。他の実施形態では、治療上有効な薬剤は、リソソームタンパク質分解の促進を減少させることができる。他の実施形態では、治療上有効な薬剤は、黒質の変性を逆転または遅延させることができる。他の実施形態では、治療上有効な薬剤は、ドーパミンレベルを維持または促進することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
発明の詳細な説明
本明細書で引用されるすべての参考文献は、完全に記載されているのと同じように、全体が参照により組み込まれる。別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３ｒｄ  ｅｄ．，Ｒｅｖｉｓｅｄ，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  ２００６）、及びＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ４ｔｈ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  ２０１２）は、本出願で使用されている用語の多くに対する一般的なガイドを当業者に提供する。
【００１０】
当業者であれば、本発明の実施に使用することができる、本明細書に記載されているものと同様または同等である多くの方法及び材料を認識するであろう。実際に、本発明は、記載されている方法及び材料に決して限定されるものではない。
【００１１】
パーキンソン病（ＰＤ）は、振戦及び運動を開始できないことを特徴とする最も一般的な神経変性疾患の１つである。核となる病理には、黒質ドーパミンニューロンの進行性の消失、ならびにレビー小体及びレビー神経突起として知られる細胞質封入体の存在が伴う。これらの封入体は、大部分が、異常に凝集したα−シヌクレインタンパク質から構成される。本来の状態のα−シヌクレインは、脳全体のニューロンのシナプス前終末に局在し、小胞輸送、ならびに神経伝達物質の放出及び再取り込みにおいて機能を果たす。α−シヌクレイン遺伝子（ＳＮＣＡ）の変異または三重化は、ＰＤを引き起こすことが知られており、このタンパク質が疾患の開始及び進行に重要であることを示唆している。
【００１２】
患者からの生きたドーパミンニューロンの利用不能性及び動物モデルの制限により、疾患の研究及び効果的な創薬が阻まれる。患者由来の細胞を人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に再プログラミングし、その後ドーパミンニューロンに分化させることで、ＰＤのヒト組織特異的モデルがもたらされる。再プログラミングプロセス中に、細胞へのエピジェネティックな変化の大部分が完全に消去される。ｉＰＳＣから生成された新しいニューロンは未熟であるが、それでも患者の遺伝的性質を反映する。この未熟性は、成人発症疾患をモデル化するためには弱点となる可能性があるものの、細胞に存在するあらゆる疾患特異的表現型が、必ず患者の遺伝的組成から生じるものであり、疾患過程の非常に初期の段階を表すという点で、強みでもある。
【００１３】
ｉＰＳＣベースのモデリングを使用して、ＰＤの発端及び進行におけるα−シヌクレインの役割を解明するための大々的な努力がなされてきた。いくつかの研究では、ＳＮＣＡの三重化ならびにＬＲＲＫ２及びＧＢＡ１遺伝子の変異を含む単一遺伝子変異を有するＰＤ患者に由来するｉＰＳＣが用いられている。このような単一遺伝子変異を有するｉＰＳＣ由来のドーパミン作動性ニューロン培養物は、表現型の異常を示し、α−シヌクレインの蓄積を実証するが、これらの遺伝性症例は全ＰＤ患者の１０％未満である。しかしながら、より高頻度に見られる孤発性ＰＤ集団を使用するｉＰＳＣモデルは、対照細胞と比較した場合、α−シヌクレインの蓄積を示さない。
【００１４】
ＰＤ患者の１０パーセントは、５０歳より前に症状が発症する早期発症型とされる２６。これらの早期発症患者のうちの８０％超は孤発性と呼ばれ、家族歴または既知のＰＤ変異を伴わない。本発明者らは、脊髄性筋萎縮症などの早期発症疾患でこれまでに見られているように、疾患症状の早期発症がｉＰＳＣモデルにおいてより深刻な表現型をもたらし得ると推論した。
【００１５】
説明したように、患者由来の細胞をｉＰＳＣに再プログラミングすると、疾患の進行及び病理学的表現型を分子レベルで観察することができる。ドナーと遺伝的に同一であるｉＰＳＣは、インビボで臨床像に関係することが分かっている遺伝的背景を保有する、インビトロでのパーキンソン病の組織特異的モデルを提供するＤａＮに分化させることができる。近年、同様のｉＰＳＣモデリング技法を使用してＰＤの始まり及び進行におけるα−シヌクレインの役割を解明するために、多大な努力が払われている。いくつかの研究では、ＳＮＣＡの三重化ならびにＬＲＲＫ２及びＧＢＡ１遺伝子の変異を含む単一遺伝子変異を有するＰＤ患者に由来するｉＰＳＣが用いられている。これらのｉＰＳＣ株に由来するＤＡニューロンは、いくらかの表現型異常を示し、α−シヌクレインの蓄積を実証するが、家族性単一遺伝子変異はＰＤ患者のごく少数にしか存在せず、これらの症例の病態生理は容易にはＰＤ集団全体と関連しない。興味深いことに、より大きな非家族性（孤発性）集団に関する以前のｉＰＳＣ研究において、対照個体に由来するものと比較した場合、明白な違いが示されていない。
【００１６】
本明細書では、本発明者らは、早期発症型孤発性ＰＤ（ＥＯＳＰＤ）患者のコホートからのｉＰＳＣ株を生成する。本発明者らは、早期発症型孤発性の患者が、より侵攻性の疾患形態に影響し得る未知の遺伝的危険因子を有し得るため、これらの株が孤発性ＰＤをよりよく理解するための有望な機会を示すと仮定した。本発明者らは、ＥＯＳＰＤ患者株及び非罹患対照株のいずれかからの分化ＤａＮを比較することにより、α−シヌクレインタンパク質の異常な蓄積が実際にＰＤ患者コホートにおいて特異的に再現されることを示す。プロテオミクスアッセイ、全トランスクリプトームアッセイ、及び酵素活性アッセイを含むこれらの組織の分子的及び生理学的プロファイリングにより、分解経路の調節不全が見出され、ＥＯＳＰＤ培養物における以前に報告されていないリン酸化ＰＫＣ−αの上方調節が示唆される。最後に、この経路を標的とすることにより、本発明者らは、インビトロ及びインビボの両方での小分子ＰＥＰ００５による処理後のα−シヌクレイン蓄積の逆転を観察する。本明細書に記載のｉＰＳＣベースのモデルにより、ＰＤに寄与する孤発性ＰＤの遺伝的起源の証拠が得られ、可能性のある臨床診断及びＥＯＳＰＤ患者のための新しい治療標的の開発用のプラットフォームが得られる。
【００１７】
ある量の血球を、再プログラミング因子をコードする１つ以上のベクターと接触させること；ある量の再プログラミング因子を血球内に送達すること；及び血球を再プログラミング培地で培養することを含む方法が本明細書に記載され、当該量の血球は、神経変性疾患に罹患しているヒト対象から得られ、さらに、再プログラミング因子の送達及び再プログラミング培地中での培養によって血球由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が生成される。他の実施形態では、神経変性疾患はパーキンソン病（ＰＤ）である。他の実施形態では、神経変性疾患は早期発症型ＰＤである。他の実施形態では、神経変性疾患は家族性ＰＤである。他の実施形態では、ｉＰＳＣは、さらに、星状細胞、ミクログリア、及び血管細胞のうちの１つ以上と流体連通して培養される。他の実施形態では、１つ以上のベクターはｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１ベクターである。他の実施形態では、本方法は、ｉＰＳＣをニューロンに分化させることを含む。他の実施形態では、本方法は、ｉＰＳＣを血管細胞に分化させることを含む。様々な実施形態において、血管細胞は脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）である。他の実施形態では、本方法は、ｉＰＳＣを星状細胞に分化させることを含む。他の実施形態では、本方法は、ｉＰＳＣをミクログリアに分化させることを含む。他の実施形態では、本方法は、ｉＰＳＣを、前脳、中脳、及び／または後脳のニューロンを含むニューロンに分化させることを含む。様々な実施形態では、ニューロンは、脊髄運動ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、またはコリン作動性ニューロンである。ｉＰＳＣ再プログラミングの詳細は、Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｌｉａｂｌｅ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１４  Ｄｅｃ；３（１２）：１４２９−３４、及び米国仮出願第６２／６５３，６９７号、米国仮出願第６２／７５５，２８２号、米国仮出願第６２／８１６，７８５号、米国仮出願第６２／６６４，８８８号、米国仮出願第６２／６６４，８２７号、米国仮出願第６２／８１６，７９５号、米国仮出願第６２／６６４，９４２号、米国仮出願第６２／７５５，３６５号に見出され、これらは参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【００１８】
治療上有効な薬剤及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物をパーキンソン病に罹患している対象に投与し、それにより対象を治療することを含む、治療方法が、本明細書に記載されている。他の実施形態では、治療上有効な薬剤は小分子を含む。他の実施形態では、小分子は、ＰＫＣ活性化因子、その類似体及び誘導体を含む。他の実施形態では、ＰＫＣ活性化因子は、ＤＡＧ、ＤＡＧラクトン、ホルボール、インゲノール、インドラクタム、ベンゾラクタム、ブリオスタチン、及びカルホスチンを含む。他の実施形態では、ＰＫＣ活性化因子、その類似体及び誘導体は、インゲノール誘導体を含む。他の実施形態では、インゲノール誘導体は、インゲノール−３−アンゲレートを含む。他の実施形態では、ＰＫＣ活性化因子、その類似体及び誘導体は、ＰＫＣアゴニストを含む。他の実施形態では、ＰＫＣ活性化因子、その類似体及び誘導体を含む小分子は、ＤＡＧシグナル伝達を調節することができる。他の実施形態では、ＰＫＣ活性化因子、その類似体及び誘導体は、例えば、当業者に知られている数あるアイソフォームの中でも、従来の、新規の、非定型のＰＫＣアイソフォーム、例えば、ＰＫＣ−アルファ、ＰＫＣ−ベータ１／ベータ２、ＰＫＣ−ガンマを含むＰＫＣアイソフォームに特異的である。様々な実施形態において、治療上有効な薬剤は、０．１〜１、１〜５、５〜１０、１０〜２５、２５〜５０、または５０ｕｇ／ｋｇ以上の用量で静脈内投与される。様々な実施形態において、治療上有効な薬剤は、５ｕｇ／ｋｇの用量で静脈内投与される。様々な実施形態では、治療上有効な薬剤は、０．１〜１、１〜５、５〜１０、１０〜２５、２５〜５０、または５０ｕｇ／ｋｇ以上の用量で直接脳注入を介して投与される。
【００１９】
他の実施形態では、治療上有効な薬剤は、α−シヌクレイン、ＴＦＥＢ、ＺＫＳＣＡＮ３、ＬＡＭＰ、ＧＣａｓｅ、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、及びドーパミンのうちの１つ以上の活性を調節することができる。他の実施形態では、治療上有効な薬剤は、α−シヌクレイン、ＴＦＥＢ、ＺＫＳＣＡＮ３、ＬＡＭＰ、ＧＣａｓｅ、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、及びドーパミンのうちの１つ以上の発現を調節することができる。他の実施形態では、発現の調節は、転写産物発現レベルを含む。他の実施形態では、発現の調節は、タンパク質発現レベルを含む。他の実施形態では、タンパク質発現レベルは、α−シヌクレインタンパク質の減少を含む。他の実施形態では、タンパク質発現レベルは、ＴＨタンパク質の増加を含む。他の実施形態では、治療上有効な薬剤は、リソソームタンパク質分解を促進することができる。他の実施形態では、治療上有効な薬剤は、電気的活動の同期バーストを改善することができる。他の実施形態では、治療上有効な薬剤は、ステッピング、回転非対称性、及びキネジアのうちの１つ以上を改善することができる。様々な実施形態において、パーキンソン病は、家族性、孤発性であり、さらに早期発症型孤発性パーキンソン病を含む。
【００２０】
パーキンソン病を発症する可能性が高いと予後診断された対象に予防薬及び薬学的に許容される担体を投与し、それによりパーキンソン病を予防することを含む、パーキンソン病を予防する方法が本明細書に記載されている。治療上有効な薬剤及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物をパーキンソン病に罹患している対象に投与し、それにより対象におけるパーキンソン病の進行を逆転または遅延させることを含む、パーキンソン病の進行を逆転または遅延させる方法が、本明細書に記載されている。他の実施形態では、予防上または治療上有効な薬剤は、ＰＫＣ活性化因子、その類似体及び誘導体を含む。他の実施形態では、ＰＫＣ活性化因子、その類似体及び誘導体は、インゲノール−３−アンゲレートを含む。他の実施形態では、予防上または治療上有効な薬剤は、α−シヌクレインタンパク質レベルを低下させることができる。他の実施形態では、予防上または治療上有効な薬剤は、リソソームタンパク質分解の促進を減少させることができる。他の実施形態では、予防上または治療上有効な薬剤は、黒質の変性を逆転または遅延させることができる。他の実施形態では、治療上有効な薬剤は、ドーパミンレベルを維持または促進することができる。様々な実施形態において、パーキンソン病を発症する可能性が高いと予後診断されたまたはパーキンソン病に罹患している対象は、ＥＩＦＧ１、ＰＡＲＫ２、ＬＲＲＫ２、ＧＢＡ、ＳＮＣＡ、ＰＩＮＫ１、ＰＡＲＫ７、ＶＳＰ３５、ＡＴＰ１３Ａ２の１つ以上の突然変異、またはＳＮＣＡ遺伝子座の増殖を保有するヒト対象を含む。様々な実施形態において、パーキンソン病を発症する可能性が高いと予後診断されたまたはパーキンソン病に罹患している対象は、線条体におけるＤＡＴシグネチャが減少したヒト対象が含まれる。様々な実施形態において、パーキンソン病は、家族性、孤発性であり、さらに早期発症型孤発性パーキンソン病を含む。
【実施例】
【００２１】
実施例１
早期発症型孤発性パーキンソン病患者（ＥＯ−ｓＰＤ）からのｉＰＳＣの生成
ＰＤの家族歴が報告されていない３０〜３９歳の早期発症型孤発性パーキンソン病患者３人を、ｉＰＳＣ産生のために選択した（図１）。ＮｅｕｒｏＸプラットフォームによる分析に基づくと、患者株において、ＥＩＦＧ１、ＰＡＲＫ２、ＬＲＲＫ２、ＧＢＡ、ＳＮＣＡ、ＰＩＮＫ１、ＰＡＲＫ７、ＶＳＰ３５、ＡＴＰ１３Ａ２の単一遺伝子変異、またはＳＮＣＡ遺伝子座の増幅は検出されなかった。３人の患者全員が、ＰＤの診断と一致して、線条体のＤＡＴ（フェニルトロパン）シグネチャの減少を示した（図１）。比較のために、収集時に神経疾患のない正常な個体から３つの対照株を生成した。
【００２２】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を収集し、続いて非組み込み型エピソーム技法を使用してｉＰＳＣに再プログラムした（図１）。すべてのｉＰＳＣ株は、核型が正常であり、標準的な多能性マーカーを発現した。
【００２３】
実施例２
ＥＯＳＰＤ  ｉＰＳＣからＤＡＮへの効率的な分化
ＰＤの決定的な特徴は黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの特定の消失であるため、この細胞系譜に沿ってｉＰＳＣを分化させることは関心を引くものである。ＰＤ患者と対照患者の両方からのｉＰＳＣ株を、表１、図２Ａ及び図６に記載のプロトコルを使用してドーパミン作動性ニューロンに分化させた。
【００２４】
端的には、ｉＰＳＣ株を、改変した二重ＳＭＡＤ阻害ベースの底板誘導プロトコルに供した。ＬＤＮ／ＳＢ、続いてＳＨＨ／パルモルファミン／ＦＧＦ８及びＣＨＩＲ９９０２１に曝露させ、その後、ＳＢの除去及びレチノイン酸の追加を含めると、中脳ＦＰ及びＤＡニューロンの産生が支援される（図１ｄを参照）。ＡＡ、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＴＧＦβ３、及びｄｂｃＡＭＰを補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７培地中でさらなる成熟を行った。
【００２５】
（表１）分化プロトコル：培地
2021523888.tif 000003
2021523888.tif 000004
【００２６】
３０日目に、分化した細胞は、ＴＨ、Ｎｕｒｒ１、及びＧＲＩＫ２を含むドーパミンニューロンのマーカーを発現し、細胞の約１５％がＴＨを発現した（補足図２ａ）（図２ｂ、ｃ）。フローサイトメトリーを使用してＴＨ発現細胞の数を計数することにより、全体的な分化効率を６つの株すべてで比較した（図２ｃ）。ＰＤ株のうちの２つは、対照で見られるものと同様の数のＤＡニューロンを示した。しかしながら、１９０ｉＰＤ株の分化ではＴＨ陽性ニューロンの産生が少なく、これらの細胞では、底板前駆マーカーであるＦＯＸＡ２及びＬＭＸ１Ａの発現はより少なかったが、成熟神経マーカーであるＧＲＩＫ２及びＮＥＦＨの発現はより多かった。
【００２７】
発達中のニューロンにおけるドーパミンのレベルがＴＨ酵素によって変わるかどうかを判定するために、３０日齢のＤＡＮを溶解し、ドーパミン産生についてＨＰＬＣで分析した。総ドーパミンの違いは株ごとに存在し、またもや１９０ｉＰＤ株においてドーパミンの生成が少なく、ＷＰ３ｉ対照株ではより多く生成された。しかしながら、ＴＨ発現ニューロンの数で正規化すると、すべての株が同等のレベルでドーパミンを生成した（図２ｄ、ｅ）。発達中のニューロンの電気生理学的機能及び可能性のある疾患シグネチャを決定するために、多電極アレイの記録を培養中に経時的に行った。分化の２０日目に自発的活動が観察され、３０日目までにＰＤ細胞と対照細胞の両方が活動の同期バーストを生じた。すべての株にわたって活動を定量化すると、疾患ＤａＮ培養物と対照ＤａＮ培養物との間で同様のレベルの自発的スパイクが観察された。まとめると、これらのデータは、ＥＯＳＰＤ患者由来のｉＰＳＣが、罹患していない患者株と同様の神経活動を保有する機能的なドーパミン作動性ニューロンに効率的に分化したことを示す。
【００２８】
実施例３
α−シヌクレインはＥＯＳＰＤ  ＤＡＮにおいて特異的に蓄積する
あらゆる形態のパーキンソン病においてα−シヌクレインタンパク質がレビー小体内に異常蓄積し、ＳＮＣＡ遺伝子の二重化または三重化を通した蓄積によってＰＤが生じることが知られている。しかしながら、孤発性ＰＤにおけるその正確な役割は依然として不明であり、これまでの研究では、成人発症型孤発性ＰＤにおける一貫した違いは示されていない。早期発症型孤発性ＰＤ起源の培養物においてα−シヌクレインタンパク質が蓄積するかどうかを判定するために、６つの株を３０日間分化させて、ウエスタンブロットにより可溶性α−シヌクレインについて調査した。
【００２９】
驚くべきことに、３つすべてのＥＯＳＰＤ  ＤＡＮ溶解物は、対照と比較した場合、α−シヌクレインタンパク質のレベルの増加を呈した（図２ｆ、ｇ）。α−シヌクレインの蓄積を検証するために、培地上清と細胞溶解物の両方についてＥＬＩＳＡを行った。上清中のα−シヌクレイン濃度は検出限界を下回り、細胞溶解物は罹患株におけるα−シヌクレインタンパク質の有意な増加を裏付けた。ｉＰＳＣステージにある株からのタンパク質溶解物は、α−シヌクレインの増加を呈さず、蓄積は分化した培養物に特異的であったことが示された。
【００３０】
タンパク質の増加がＳＮＣＡ遺伝子の転写の増加に起因し得るかどうかを判定するために、３０日目のＤＡＮ培養物についてＱＰＣＲを行った（図２ｈ）。これらのデータは、ＥＯＳＰＤ株のうちの２つである１９０ｉＰＤ及び２００ｉＰＤは対照株と比較してＳＮＣＡ発現の増加を呈するが、３つ目の１９４ｉＰＤは呈さないことを示しており、転写の増加だけがα−シヌクレイン蓄積の唯一の原因ではなかったことを示唆している。
【００３１】
実施例４
ＥＯＳＰＤ  ＤＡＮにおいてリソソームタンパク質が異常調節される
ＳＮＣＡ遺伝子の転写の増加はＥＯＳＰＤに特異的なα−シヌクレインタンパク質の蓄積を完全には説明できないため、本発明者らは次に、同じ培養ウェルに由来する対になった試料セットのＲＮＡシーケンシング及びプロテオミクスの両方を通して、この効果に寄与し得る他の要因を決定することを試みた。全トランスクリプトームＲＮＡシーケンス（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）によって２７３８４個のユニークな転写産物が検出され、一方でプロテオミクス分析では、再現性閾値を満たす２４７８個のタンパク質が得られた。ピアソン相関係数は、試料複製間で高い一貫性を示した。
【００３２】
プロテオミクス及びＲＮＡ−Ｓｅｑの両方のデータセットに共通するタンパク質及び転写産物の組み合わせ分析により、２つの分析モード間で２４３７個の一致した遺伝子が得られた（図３ａ）。一致した遺伝子セットの教師なし主成分分析（ＰＣＡ）により、トランスクリプトームとプロテオミクスの両方のデータセットからのＰＣ１に沿ったＰＤ細胞と対照との間の明確な線引きが明らかになった（図３ｂ）。ＲＮＡ−Ｓｅｑデータセット全体を分析すると、同様のＰＣＡが得られた。この分離に寄与した重要な経路を決定するために、ｍＲＮＡまたはプロテオミクスの両方のＰＣＡ分析からのＰＣ１遺伝子重み付けによって、すべての一致した遺伝子をランク付けした。次に、ランク付けした各リストの個別のＧＳＥＡ分析をマージして、ＰＤ細胞と対照細胞との間で有意に異常調節されている共通経路を明らかにした（図３ｃ）。α−シヌクレイン、ならびにシナプシン（ＳＹＰ）、シナプス小胞２Ａ（ＳＶ２Ａ）、及びＳＮＡＰ２５などのドーパミン放出に関連する他のシナプス小胞遺伝子が、そのターム、ならびにＧＯ＿ＥＸＯＣＹＴＩＣ＿ＶＥＳＩＣＬＥなどの一般的なシナプス機構及び機能に関連するタームにおいて有意に濃縮された（図３ｃ）。ＫＥＧＧ＿ＯＸＩＤＡＴＩＶＥ＿ＰＨＯＳＰＨＯＲＹＬＡＴＩＯＮに含まれる代謝遺伝子も、ＥＳＯＰＤ株において有意に上方調節されていた。加えて、ＰＤ、アルツハイマー病、及びハンチントン病などの神経変性疾患に関連するタームがＰＤ  ＤＡＮにおいて有意に上方調節されており、神経変性の重要な側面が培養系で捕捉されたことが示唆された（図３ｃ）。有意に下方調節されたタームであるＧＯ＿ＬＹＳＯＳＯＭＡＬ＿ＬＵＭＥＮ及びＧＯ＿ＥＮＤＯＰＬＡＳＭＩＣ＿ＲＥＴＩＣＵＬＵＭ＿ＬＵＭＥＮは、非罹患対照と比較したタンパク質形成及びリソソームタンパク質分解の欠陥を示した（図３ｆ）。
【００３３】
実施例５
α−シヌクレインの分解はＰＤ  ＤＡＮにおいて損なわれる
ＥＯＳＰＤ  ＤＡＮにおけるリソソームタンパク質の減少により、α−シヌクレインの蓄積が分解機能の低下の結果であったかどうかを判定するに至った。全体的な分解速度を試験するために、ＤＡＮにおいてシクロヘキシミド処理を介して転写機能全体を４８時間阻害し、α−シヌクレインタンパク質を経時的に定量化した（図４ａ、ｂ）。対照株０２ｉ対照では、α−シヌクレインは４８時間の処理の過程で分解され、約１０時間の半減期が観察された（図４ｂ）。しかしながら、最も重篤なＥＯＳＰＤ株（１９０ｉＰＤ）では、α−シヌクレインはむしろこの処理の期間にわたって蓄積した。この著しい二分により、α−シヌクレインの特異的分解における根本的な欠陥が示唆された。これは、ＴＨ（図４ａ、ｃ）またはシナプトフィジン（図４ａ、ｄ）などの他のタンパク質の対照細胞とＰＤ細胞との間の同様の分解プロファイルによって裏付けられる。
【００３４】
タンパク質分解は、主にプロテアソーム分解経路とオートファジー／リソソーム分解経路とに分けられる。プロテアソーム分解がα−シヌクレインのタンパク質分解の原因であることを判定するために、ＤａＮ培養物をプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２で２４時間処理したところ、プロテアソーム手段を介して典型的に分解されるタンパク質であるＰ５３が蓄積したが、α−シヌクレインレベルには実質的な変化がなかった（図４ｅ）。この結果は、プロテアソーム分解が、ＤＡＮ培養物におけるα−シヌクレインの分解の重要な一因ではなかったことを示す。
【００３５】
α−シヌクレイン分解におけるリソソームの関与を判定するために、本発明者らは、グルコセレブロシダーゼまたはＧＣａｓｅの活性及び総ＬＡＭＰ１タンパク質について調査した。本発明者らは、プロテオミクス分析と一致して、３つのＥＯＳＰＤ株すべてでＬＡＭＰ１の量の減少を観察した（図４ｆ）。ＧＣａｓｅは、一部のＰＤ患者の末梢血において活性の低下が報告されているリソソーム加水分解酵素のクラスである。ＥＯＳＰＤ患者からの３０日齢のＤａＮでは、対照と比較してＧＣａｓｅ活性の有意な低下が観察された（図４ｆ）。他の研究者らは、ｉＰＳＣ由来のＤａＮにおけるＧＣａｓｅ活性の低下が、酸化ドーパミンの増加によって引き起こされることを見出した。しかしながら、酸化ドーパミンの同様の増加は、本発明者らの３０日齢のＰＤ  ＤａＮでは見られなかった（図４ｈ）。リソソーム経路タンパク質の有意な下方調節を考慮すると、これらの結果により、ＥＯＳＰＤ  ＤＡＮにおけるα−シヌクレイン蓄積の推定原因として、リソソーム分解の機能不全の証拠がもたらされた。
【００３６】
実施例６
ＰＫＣシグナル伝達の調節によりＥＯＳＰＤ表現型が救済される
本発明者らは、リソソーム特異的経路の活性化を通して本発明者らのＥＯＳＰＤ  ＤＡＮのシヌクレインレベルを低下させ得るかどうかを試験するために、３つのリソソームアゴニストを選択した。本発明者らが選択した化合物は、ＰＫＣアゴニストであり、ＨＥＰ１４薬物の構造類似体であるＰＥＰ００５、ＰＣ１２細胞モデルでハンチントン及びα−シヌクレイン凝集体を減少させることが示されている小分子ＴＦＥＢアゴニストであるＳＭＥＲ２８、ならびにα−シヌクレインのクリアランスを促進することが示されている別の生体化合物であるトレハロースであった。２７日目から、ＤａＮを上記のリソソームアゴニストで３日間処理した。トレハロースではなく、ＰＥＰ００５での処理及びＳＭＥＲ２８での処理の両方で、対照株からのＤａＮにおいてα−シヌクレインタンパク質の量が有意に減少した（図５ａ）。しかしながら、ＥＳＯＰＤ  ＤａＮでは、ＰＫＣアゴニストＰＥＰ００５のみが有意にシヌクレインレベルを低下させた。興味深いことに、対照及びＰＤ両方のＤａＮにおいて、ＰＥＰ００５処理により、存在するＴＨ酵素量の増加も生じた（図５ａ）。
【００３７】
ＰＥＰ００５に応答して対照及びＰＤ両方のＤＡＮでシヌクレインレベルを低下させながら同時にＴＨ発現を増加させるという興味深い複合効果により、薬物の作用機序を調査するに至った。ＰＥＰ００５は、確立されたＰＫＣδアゴニストであり、ＰＫＣリン酸化の短期バースト、それに続くより長期的なリン酸化されたＰＫＣの強力な減少を生じさせる。この研究の終点で、本発明者らは、未処理の１９０ｉＰＤ  ＤａＮにおける基礎レベルのＰＫＣαリン酸化の増加を観察し（図５ａ）、ＰＥＰ００５処理は、このシグナルを対照及びＰＤ両方のＤａＮにおいて完全に除去した（図５ａ、ｃ）。
【００３８】
１９０ｉＰＤ株におけるベースラインのリン酸化ＰＫＣａの増加を観察した後、本発明者らは、この観察が複数の株にわたって実証されるかどうかを確かめるために、すべての追加のＤＡＮを確認した。本発明者らは、３つのＥＯＳＰＤ株すべてからの３０日目のＤＡＮにおいてより高いレベルのｐ−ＰＫＣａを見出した（図５ｂ）。本発明者らはまた、３つの追加の新たに誘導したＥＯＳＰＤ株（１７２ｉＰＤ、１８３ｉＰＤ、１９２ｉＰＤ）、３つの追加の対照（０７７１ｉ対照、１０３４ｉ対照、１１８５ｉ対照）、及び通常発症型ＰＤ株（７８ｉＰＤ、発症時６７歳、ＰＤの家族歴）を、α−シヌクレインの蓄積及びｐ−ＰＫＣａの増加の両方について確認した（図５ｇ）。
【００３９】
ＰＫＣａのリン酸化の上昇は未分化のｉＰＳＣには存在せず、分化したＤａＮへの特異性を示す個々の患者からの末梢血において明確なパターンはなかった。ＰＫＣａのリン酸化の上昇は、すべてのｉＰＳＣ株からのＤａＮに１ｕＭのＰＥＰ００５を３日間添加することにより、明らかに除去される（図５ｃ）。この除去は処理したすべての株におけるシヌクレインの減少と相関するが、ＬＡＭＰ１もＬＣ３も、ＰＤ細胞におけるＰＥＰ処理に応答しないように見受けられ（図５ｃ）、ＰＤ細胞における作用機序がリソソームタンパク質の典型的な上方調節とは異なり得ることが示されている。対照及びＰＤのＤａＮにおけるＰＥＰ処理のタイムコースは、ｐ−ＰＫＣａとα−シヌクレインが両方とも約２４時間以内に薬物処理に反応して分解されることを示す（図５ｄ）。この同じタイムコースは、ＰＤ細胞に存在する切断されたカスパーゼ３（ＣＣ３）の著しい減少も示す。この同じタイムコースに沿った対になった試料からの遺伝子発現データは、ＳＮＣＡがＰＥＰ処理の４時間後に下方調節され（図５ｅ）、ＴＨが最初の曝露の約８時間後に上方調節されることを示す（図５ｆ）。
【００４０】
実施例７
ＷＴマウスにおけるα−シヌクレインのインビボでの減少
インビボで、ＰＥＰはシヌクレインの分解を刺激する。０．３、３、及び３０ｕＭのＰＥＰの投与量研究を、ＷＴマウスの脳室に注入した。注射後１及び５日目のマウス線条体におけるシヌクレインの減少及びＴＨの増加。
【００４１】
実施例８
考察
本発明者らは、早期発症型孤発性ＰＤ患者のｉＰＳＣから分化したドーパミン作動性ニューロンにおけるパーキンソニズムの兆候を探すためにこの研究を開始した。本発明者らは、無作為に選択された家族歴のない早期発症ＰＤ患者中３人の個体からのＰＢＭＣを再プログラムした。結果として得られたｉＰＳＣ株は、遺伝的に正常であり、既知の単一遺伝子ＰＤ変異の多くを欠いていた。これを評価するために使用したゲノムチップアッセイは、神経変性疾患に関連する約２６０，０００個の既知のＳＮＰを網羅する。可能性は非常に低いとしても、ＰＤ  ｉＰＳＣを生成するために使用した３人の特発性個体が、ＮｅｕｒｏＸスクリーンで見逃された未だ知られていない単一遺伝子変異をすべて有することは可能である。いずれにせよ、これらのＥＯＳＰＤ  ｉＰＳＣの背景にある複雑な遺伝的性質により、わずか３０日齢のＤａＮにおいてα−シヌクレインの蓄積が生じた。これは、孤発性パーキンソン病患者に由来するｉＰＳＣにおいて最初に特定された表現型である。
【００４２】
次に、本発明者らは、トランスクリプトーム及びプロテオミクス両方の技法を使用するこれらの分化した細胞の詳細な分析の完了に移った。トランスクリプトーム分析により、ＰＤ細胞における多くのシナプス及びエキソサイトーシス転写産物の発現の増加が明らかになった。これらの転写産物の増加は、翻訳されて、ＰＤ  ＤａＮにおけるタンパク質レベルの上昇に直接的につながり、これはシナプス機構の過剰を示している。しかしながら、より多くのシナプス機構の存在にもかかわらず、ＭＥＡ記録もライブカルシウムイメージングも、ＰＤ  ＤａＮと対照ＤａＮとの間の活性の違いを示さなかった。逆に、プロテオミクスデータは、ＰＤ  ＤａＮにおけるリソソーム内腔タンパク質の量の減少を示す。この減少は、このシグナル伝達経路の断絶を示す同じ細胞のＲＮＡには反映されなかった。タンパク質は少ないが、細胞はより多く作製するという応答はしない。このリソソームタンパク質の減少は、ＰＤ  ＤａＮにおけるＧＣａｓｅ活性の減少、ウエスタンブロットによるＬＡＭＰ１タンパク質の減少、及びシクロヘキシミドによる阻害下でのα−シヌクレインの蓄積によってさらに確認され、これらのすべてが、ＰＤ  ＤａＮにおけるタンパク質分解のなんらかの欠損を指摘する。また、プロテアソーム分解の阻害がα−シヌクレインレベルの変化をもたらさなかったので、この欠損はリソソーム分解経路に特異的であると思われる。
【００４３】
本発明者らは次に、この観察された欠損を補正するように、一連のリソソームアゴニストを選択した。試験した３つのアゴニストのうち、ＰＥＰ００５小分子のみが、対照及びＰＤ両方のＤａＮにおいてα−シヌクレインレベルを低下させた。興味深いことに、ＰＥＰ処理により、対照及びＰＤ両方のＤａＮの処理済み培養物に存在するＴＨの量の増加も生じた。ここで観察された細胞内α−シヌクレインレベルの低下及びＴＨの増加という二重の効果により、ＰＥＰ００５は、可能性のある治療薬として非常に魅力的な候補となる。
【００４４】
ＰＥＰ００５（インゲノール−３−アンゲレート）は、抗白血病活性も有し、かつ潜伏ＨＩＶの再活性化に役割を果たし得る、光線性角化症の局所治療用のＦＤＡ承認薬である。これは、インゲノール−３−アンゲレート及びインゲノールメブテートとしても知られ、チャボタイゲキ（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ  ｐｅｐｌｕｓ）植物の樹液から最初に抽出された最も研究されているインゲノール誘導体である。この小分子はナノモル以下の親和性でＰＫＣ  Ｃ１ドメインに結合し、インビトロで個々のＰＫＣアイソフォームに対する選択性を示さないものの、ＰＥＰ００５によって誘導されるＰＫＣアイソフォームの移行及び下方調節のパターンは、ときに細胞株依存的な様式で、異なり得る。本研究では、これを、ＭＴＯＲ経路とは無関係にＴＦＥＢアゴニストとして作用する、Ｌｉ及び同僚によって特定されたＨＥＰ１４（５β−Ｏ−アンゲレート−２０−デオキシインゲノール）化合物と同じチャボタイゲキ植物に由来する構造類似体として選択した。
【００４５】
ＰＥＰ００５で処理した対照細胞において、本発明者らは、リソソームのマスター調節因子ＴＦＥＢの活性化と一致するリソソームタンパク質ＬＡＭＰ１の増加を観察したが、この増加は、薬物で処理したＰＤ  ＤａＮにおいて再現されるようには見えない。ＰＥＰは、アポトーシス促進性ＰＫＣδの活性化因子とＰＫＣαの阻害因子の両方として説明される。ＰＥＰ００５は、様々ながん細胞株及び原発性急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞の増殖を阻害すると説明されている。白血病細胞株及び原発性ＡＭＬ細胞において、ＰＥＰ００５は、ＰＫＣδを活性化し、続いてＥＲＫ１／２の持続的な活性化を誘導することによって、アポトーシスを誘導する。
【００４６】
本発明者らのＤａＮ培養物において、本発明者らは、強力なＰＫＣδシグナルを観察せず、また本発明者らが細胞死を誘発していた場合に予想され得るような薬物治療におけるＬＤＨの増加も見ることはなかった。実際、本発明者らは薬物治療における活性なカスパーゼ３の量の減少を観察したものの、この効果は、初めから切断されたカスパーゼ３のレベルが高いＰＤ  ＤａＮにおいて最も容易に観察されたものであった。本発明者らの分化したニューロンは主に有糸分裂後のものであるのに対し、ＰＥＰの毒性は高度に増殖性の細胞により特異的である可能性が高い。
【００４７】
本発明者らのＤａＮにおけるＰＥＰ００５小分子の作用機序を調査すると、本発明者らは、ＰＤ  ＤａＮにおけるリン酸化ＰＫＣαのレベルの増加を観察した。シヌクレインは、ＴＦＥＢ活性化に関与する典型的な１４−３−３タンパク質に結合してそれと相同性を共有するだけでなく、ＰＫＣαにも結合することが示唆されており、本発明者らの観察したシヌクレイン蓄積、リソソーム生合成、及びＰＫＣアゴニストＰＥＰ００５の間の関連性が示唆される。ＰＫＣは、ＴＦＥＢ転写因子の活性化とＺＫＳＣＡＮ３転写抑制因子の不活性化とを、２つの並行したシグナル伝達カスケードを介して繋げる。活性化したＰＫＣは、ＧＳＫ３を不活性化させて、ＴＦＥＢのリン酸化、核移行、及び活性化を減少させるが、ＰＫＣは、ＺＫＳＣＡＮ３をリン酸化して、これを核外への移行により不活性化させる。したがって、ＰＫＣの活性化は、凝集タンパク質のクリアランスを含む多くの細胞外キューへのリソソーム適応を媒介し、それにより、本明細書で概説するパーキンソン病の機序などのリソソームネクサスによる疾患及び障害の実行可能な治療選択肢を提供する。
【００４８】
α−シヌクレイン分解には議論の余地があるが、ニューロン細胞系における少なくとも単量体ＷＴα−シヌクレインの分解の大部分は、シャペロン媒介オートファジー（ＣＭＡ）及びマクロオートファジーのリソソーム経路を介して発生するように見える。これらの分解経路の機能異常はＰＤ病因の要因となり得る。本明細書では、ＰＫＣのターゲティングは、内因性分解系による過剰なα−シヌクレインのクリアランスの亢進を促進するための戦略の実行可能性を実証し、α−シヌクレインがその機能に与える異常な影響も緩和できるという利点を有し得る。
【００４９】
この研究は、早期発症患者からのｉＰＳＣにおける孤発性パーキンソン病の分子シグネチャを特定した最初のものである。本発明者らは、これらの細胞がα−シヌクレインを蓄積し、リソソームの生合成及び機能の調節異常を有しており、またより重度にリン酸化されたＰＫＣαを示すことを見出した。これらの３つのバイオマーカーを総合すると、ＰＤの根本的な機序に影響を与え得る新しい治療薬をスクリーニングするためのプラットフォームが得られる。本発明者らは、このシグネチャを排除し、対照及びＰＤ両方の細胞において細胞内α−シヌクレインを減少させる、ＰＤにおける新規薬物の特定に乗り出した。これらの発見は、ＰＤの根本的な機序のうちのいくつかを最終的に治療する機会を提示する特異的かつ新規な創薬可能な経路を示唆する。
【００５０】
実施例９
さらなる研究
本発明者らは、ＰＤ変異が検出されなかった早期発症型孤発性ＰＤ（ＥＯＳＰＤ）患者のコホートからの最初のｉＰＳＣ株を生成した。本発明者らは、驚くべきことに、ＥＯＳＰＤ患者のｉＰＳＣに由来するドーパミンニューロン培養物の大部分が、α−シヌクレイン及びリン酸化タンパク質キナーゼＣ−α（ｐ−ＰＫＣα）の堅牢な増加、ならびに重要なリソソームタンパク質の減少を示したことを見出した。小分子でこれらの経路をターゲティングすることで、ホルボールエステルがこれらの疾患関連の表現型の多くを逆転させ得ることが明らかになった。本発明者らの発見により、ＥＯＳＰＤには、後にα−シヌクレインのリソソーム分解を損なう、未だ決定されていない遺伝的根拠があることが実証される。特定のホルボールエステルがこの損失を逆転させ得るという事実は、ＥＯＳＰＤの新しい治療法としてのこれらの薬物の可能性を浮き彫りにする。
【００５１】
さらなる研究を以下のように企画した。
【００５２】
ｉＰＳＣ株生成：ｉＰＳＣ株を、親細胞を非組み込み型ｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１プラスミドでヌクレオフェクトすることによって生成し、これに、Ｃｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉ  ｉＰＳＣ  Ｃｏｒｅとの共同研究で以前に説明されているように、再プログラミング因子をエピソーム発現させた。
【００５３】
ｉＰＳＣ維持、ｍＤＡニューロン分化、及び薬物処理：ｉＰＳＣをマトリゲル上のＥ８培地で維持し、必要に応じてＶｅｒｓｅｎｅを使用して、１：６から１：１２の分割比で５日ごとに継代した。この研究では、１７代から３５代までのｉＰＳＣのみを使用した。分化のために、ｉＰＳＣを約８０％のコンフルエンスに成長させた。細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ／Ｓｉｇｍａ＃ＳＣＲ００５）で単一化し（３７℃で５分）、５μＭのＹ２７６３２（ＳｔｅｍＧｅｎｔ）を含むＥ８培地中で、１ｃｍ２あたり２００，０００個の細胞で（完全にコンフルエントな単層の場合）、マトリゲルをコーティングした６ウェルプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にプレーティングした。プレーティングの２４時間後に、培地をステージ１（５０％のＤＭＥＭ／Ｆ１２、５０％のＮｅｕｒｏｂａｓａｌ、Ｎ２、Ｂ２７−ビタミンＡ、ＬＤＮ−１９３１８９（ＬＤＮ）、ＳＢ４３１５４２（ＳＢ））に交換した。ステージ１の培地を３日間毎日（ウェルあたり３ｍＬ）交換した。次に培地をステージ２（５０％のＤＭＥＭ／Ｆ１２、５０％のＮｅｕｒｏｂａｓａｌ、Ｎ２、Ｂ２７−ビタミンＡ、ＬＤＮ、ＳＢ、パルモルファミン（ＰＭＮ）、ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ）、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、線維芽細胞成長因子８（ＦＧＦ８））に切り替えた。ステージ２の培地を４日間毎日（ウェルあたり３ｍＬ）交換した。その後、培地をステージ３（５０％のＤＭＥＭ／Ｆ１２、５０％のＮｅｕｒｏｂａｓａｌ、Ｎ２、Ｂ２７−ビタミンＡ、ＬＤＮ、ＣＨＩＲ、オールトランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ））に切り替えた。ステージ３の培地を４日間毎日（ウェルあたり３ｍＬ）交換した。最後に、培地をステージ４（５０％のＤＭＥＭ／Ｆ１２、５０％のＮｅｕｒｏｂａｓａｌ、Ｎ２、Ｂ２７＋ビタミンＡ、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ジブチリル環状ＡＭＰナトリウム塩（ｄｂＣＡＭＰ）、Ｌ−アスコルビン酸（ＡＡ）、γ−セクレターゼ阻害剤（ＤＡＰＴ）、ＣＨＩＲ、形質転換成長因子ベータ−３（ＴＧＦ  β３））に切り替えた。ステージ４の培地を３日間毎日（ウェルあたり３ｍＬ）交換した。１５日目に、Ａｃｃｕｔａｓｅを使用して（３７℃で２０分）細胞を単一細胞に分離し、穏やかに浮遊させた。解離させた細胞を成熟培地（５０％のＤＭＥＭ／Ｆ１２、５０％のＮｅｕｒｏｂａｓａｌ、Ｎ２、Ｂ２７＋ビタミンＡ、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ｄｂＣＡＭＰ、ＡＡ、ＤＡＰＴ、ＴＧＦ３）及び５μＭのＹ２７６３２に再懸濁させ、１ｍＬの全量で２００，０００／ｃｍ２で、マトリゲルをコーティングした６ウェルプレートに、または２００，０００／５０μＬの液滴で２４ウェルプレート中のマトリゲルをコーティングしたＬガラスカバースリップに再播種した。細胞を３７℃で４５分間付着させた後、成熟培地を加えて、６ウェルプレートの場合はウェルあたり３ｍＬ、カバーガラス付きの２４ウェルプレートの場合はウェルあたり１．５ｍＬの最終量にした。完全培地交換を播種から４８時間後に行い、培地を３０日目まで３日ごとに交換した。薬物処理のため、示す薬物を含む成熟培地を２７日目の細胞に与え、細胞を３０日目に分析���た。薬物は、ＰＥＰ００５（１μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ、＃４０５４）、ＳＭＥＲ−２８（５μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ、＃４２９７）、トレハロース（２５Ｍ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｔ０１６７）、ＰＭＡ（１０μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ、＃１２０１）、及びプロストラチン（ＰＲＯ）（５μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ、＃５７３９）であった。
【００５４】
表１．培地の配合
2021523888.tif 000005
【００５５】
表２．培地の配合
2021523888.tif 000006
【００５６】
分析フローサイトメトリー：６ウェルプレートの３０日目の培養物をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄し、その後、１ｍＬのＡｃｃｕｔａｓｅを各ウェルに加え、３７℃で２５分間、または細胞が完全に浮遊するまで、インキュベートした。細胞を追加の２ｍＬの成熟培地で洗浄し、大きな塊が見えなくなるまで穏やかに粉砕し、その時点で遠心分離（１５００ＲＰＭで３分間）により細胞をペレット化した。細胞をＰＢＳ中４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中に穏やかに再懸濁させ、室温で１０〜１５分間固定させた。固定した単一細胞を、１％のＴｒｉｔｉｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して透過処理し、ＴＨ（１：５００、Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｒ、２２９４１）、α−シヌクレイン（１：１０００、Ａｂｃａｍ、ａｂ１３８５０１）、及びＭＡＰ２ａｂ（１：１０００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍ１４０６）、または同じ希釈のアイソタイプ対照（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＩｇＧ  Ｉｓｏｔｙｐｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌウサギ＃３９００Ｓ及びマウス＃５４１５Ｓ）に対する一次抗体を使用して染色した。二次抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ならびに５９４ロバ抗マウス及びロバ抗ウサギ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は１：５００で使用した。染色した試料を、ＢＤ  ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを使用してＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａサイトメーターで定量化した。
【００５７】
ドーパミン検出：ｍＤＡニューロンの培養物をＬガラスカバーガラスにプレーティングし、上記のように成長させた。総ドーパミンについて、培養物を人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）で洗浄し、すぐに２００μＬの０．２Ｍ過塩素酸／０．１ｍＭのＥＤＴＡに溶解させた。溶解物をＬＮ２中で瞬間凍結させた。３０日目に放出されたドーパミンを検出するために、培地を吸引し、細胞をａＣＳＦで２回洗浄した。洗浄後、２００μＬのａＣＳＦを各カバースリップの上に慎重にプレーティングし、３７℃で１５分間インキュベートして、収集した。次に、２００μＬの高Ｋ＋ａＣＳＦを各カバースリップの上に加え、１５分間インキュベートし、収集した。収集直後、２０μＬの１０倍の安定化緩衝液（２Ｍ過塩素酸／１ｍＭのＥＤＴＡ）を各試料に加えた。安定化させた試料をＬＮ２中で瞬間凍結させ、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）分析まで−８０℃で保管した。分離は、２．１×１００ｍｍの３μｍ逆相Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ＯＤＳカラムで行い、７５ｍＭの酢酸ナトリウム、０．７５ｍＭのドデカンスルホン酸ナトリウム、２．５％のアセトニトリル、１２．５％のメタノール、及び１０ｕＭのＥＤＴＡ（ｐＨ＝５．５）からなる移動相を０．２ｍｌ／分の速度でポンプ注入した。ドーパミンの電気化学的検出を、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極に対して、０．２９Ｖの電位で保持したガラス状炭素電極で行い、１０ｕｌの注入について０．１ｎＭの検出限界を得た。既知の標準濃度のドーパミンに対して試料を三連で分析した。
【００５８】
免疫細胞化学及びイメージング：ｍＤＡニューロンの培養物をＬガラスカバースリップにプレーティングし、上記のように成長させた。３０日目のニューロンを、１０〜１５分間室温で４％のＰＦＡに固定した。固定したカバーガラスをＰＢＳ中で洗浄し、ＰＢＳ中１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中、室温で１０分間透過処理した後、以下の抗体により、４℃で一晩、一次抗体溶液（５％の正常ロバ血清、０．１２５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ、ＰＢＳ）中で染色した：ＴＨ（１：５０００、Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｒ、＃２２９４１）及びα−シヌクレイン（１：５００、Ａｂｃａｍ、＃ａｂ１３８５０１）。試料をＰＢＳ中で３回洗浄し、室温で２時間、種特異的なＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８または５９４共役二次抗体（１：５００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した後、ＤＡＰＩ対比染色を行った。４０倍及び２０倍の対物レンズを備えたＡ１顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）を使用して共焦点Ｚスタック画像を取得し、ＩＭＡＲＩＳソフトウェア（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）により最大強度投影を使用してレンダリングした。
【００５９】
ウエスタンブロット：細胞をプレートからそっと掻き取り、ＰＢＳで洗浄し、１５０００ＲＰＭで１分間遠心分離し、乾燥ペレットを−８０℃で凍結させた。次に、試料を、ホスファターゼ／プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＭＳ−ＳＡＦＥ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充した１倍ＮＥＴＮ緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．５％のＮＰ−４０）を使用して解凍し、溶解させた。溶解物を、自動冷浴超音波洗浄器で、２０分間、１０秒間のパルスと１０秒間の休止とを交互に使用して超音波処理した。試料を、１５０００ＲＰＭ、４℃で、２０分間遠心分離した。総可溶性タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を使用して測定した。４倍Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（ＢＩＯ−ＲＡＤ、１６１−０７７４）を、１００μｇまたは５０μｇいずれかの総タンパク質抽出物に加え、試料を５分間煮沸した。試料を、４〜２０％のＭｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ  ＴＧＸ  Ｐｒｅｃａｓｔゲル（ＢＩＯ−ＲＡＤ、４５６−１０９４）中に泳動させ、Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｔｕｒｂｏ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を使用してＰＶＤＦ膜に転写した。膜をＯｄｙｓｓｅｙ遮断緩衝液（ＬＩ−ＣＯＲ）で遮断した後、一次抗体と４℃で一晩または室温で３時間インキュベートした。色素標識した二次抗体と室温で２時間インキュベートした後、Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｆｃイメージングシステム（ＬＩ−ＣＯＲ）を使用してシグナルを可視化した。使用した一次抗体は、ヒトα−シヌクレイン（１：１０００、Ａｂｃａｍ、＃ａｂ１３８５０１）、マウスα−シヌクレイン（１：１０００、Ａｂｃａｍ、＃ａｂ２１２１８４）、ＴＨ（１：２０００、ＩｍｍｕｎｏＳｔａｒ、＃２２９４１）、総ＰＫＣα（１：１０００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃２０５６Ｓ）、ｐ−ＰＫＣα  １：１０００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃９３７５ｓ）、ＬＡＭＰ１（１：１０００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃９０９１Ｓ）、ＬＣＩ／ＩＩ（１：１０００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃１２７４１Ｓ）、切断型カスパーゼ３−ＣＣ３（１：１０００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃９６６１Ｓ）、シナプトフィジン（１：１０００、Ａｂｃａｍ、ａｂ３２１２７）、Ｐ５３（１：２０００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、＃ｓｃ−１２６）、ＧＡＰＤＨ（１：５０００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇ８７９５）、及びβ−アクチン（１：５０００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ａ５４４１）であった。二次抗体は、１：５，０００希釈でのＩＲＤｙｅ  ６８０  ＲＤヤギ抗マウス及びＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷヤギ抗ウサギ（それぞれＬＩ−ＣＯＲ  ９２６−６８０７０及び９２６−３２２１１）であった。α−シヌクレインとｐ−ＰＫＣαとの組み合わせた発現プロットを、最初にバンドをβ−アクチンで正規化し、次に各ブロットに存在する０２ｉ対照シグナルで正規化することで計算した。次に、すべての値を、各株の少なくとも３つの独立した分化にわたって比較した。ＲパッケージＲＯＣＲを使用してＲＯＣプロット及び曲線下面積を決定して、予測確率の割合を決定した。
【００６０】
ｑＰＣＲ：全細胞ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬、続いてＤＮａｓｅ処理を施したＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキットを使用して単離した。ＰＣＲ用のｃＤＮＡ合成のためのＱｕａｎｔｉｔａｔｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用したｃＤＮＡ合成に、全ＲＮＡ（１μｇ）を使用した。リアルタイムＰＣＲは、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を使用して行った。それぞれの遺伝子の発現レベルを、対応するＧＡＰＤＨ値で正規化し、対照試料の値に対する変化の倍率として示した（ΔΔＣｔ法）。
【００６１】
酸化ドーパミンのＮＩＲＦ検出：アッセイを記載のとおりに行った。端的には、ニューロンを冷ＰＢＳ中でスクラップし、１分間１５０００ＲＰＭで遠心分離した。細胞ペレットを凍結してから解凍し、ホスファターゼ／プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む１倍ＮＥＴＮ溶解緩衝液で均質化した。溶解物を超音波洗浄器中で１０分間超音波処理し、１５分間１５０００ＲＰＭで回転させた。上清を除去し、不溶性ペレットを１８ＭΩの脱イオン水に再懸濁させた。全タンパク質をブラッドフォードアッセイを使用して測定し、１００μｇのタンパク質を２０□Ｌで採取し、Ｂｉｏｄｙｎｅ  Ｎｙｌｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｐａｌｌ、＃Ｐａｌｌ−６０２０９）に落とした。７００チャネルのＯｄｙｓｓｅｙ赤外線イメージングシステム（ＬＩ−ＣＯＲ）を使用して、膜をスキャンした。Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線イメージングソフトウェア、バージョン３．１を使用して、統合されたスポット強度を取得することにより、試料を定量化した。
【００６２】
ＧＣａｓｅ活性：アッセイを記載のとおりに行った。端的には、試料を上記のように溶解させ、４℃で１５分間、１５０００ｒｐｍで遠心分離した。５０μｇの全タンパク質を、全量２００μｌの１ｍＭの４−メチルウンベリフェリルβ−グルコピラノシド（４−ＭＵ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｍ３６３３）を含む１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中の活性アッセイ緩衝液（０．２５％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍＭのＥＤＴＡ、クエン酸／リン酸緩衝液中、ｐＨ５．４）中でインキュベートした。３７℃で４０分のインキュベーション後、等量の１Ｍグリシン、ｐＨ１２．５を加えることにより反応を停止させた。１００μｌの複製を白色の９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ａｓｓａｙプレート）にロードし、蛍光（励起＝３５５ｎｍ、蛍光＝４６０）を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉ３  Ｍｕｌｔｉ−Ｍｏｄｅマイクロプレートリーダー及びＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏソフトウェアにおいて決定した。
【００６３】
トランスクリプトミクス：各株の３つのウェルを上記のとおりに分化させ、ｍＲＮＡシーケンシングまたはプロテオミクス分析のいずれかのために細胞ペレットに分割した。以前に説明されている方法を使用して、ｍＲＮＡを単離した。端的には、ライブラリーの構築は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｍＲＮＡライブラリー調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、ライブラリーの構築を行った。端的には、全ＲＮＡ試料を、Ｑｕｂｉｔ蛍光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して濃度について、２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して品質について評価した。試料あたり最大１μｇの全ＲＮＡをポリ−Ａ  ｍＲＮＡの選択に使用した。ｃＤＮＡを、逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びランダムプライマーを使用して、濃縮及び断片化されたＲＮＡから合成した。ｃＤＮＡをさらに二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に変換し、結果として得られたｄｓＤＮＡをライブラリー調製用のＰＣＲで濃縮した。ＰＣＲで増幅したライブラリーを、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して精製した。増幅したライブラリーの濃度をＱｕｂｉｔ蛍光光度計で測定し、ライブラリーのアリコートをＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒで解像した。試料ライブラリーを多重化し、７５ｂｐのシングルエンドシーケンスを使用してＮｅｘｔＳｅｑ  ５００プラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）でシーケンスした。平均して、各試料から約２，０００万のリードが生成された。
【００６４】
ヒトＧＥＮＣＯＤＥバージョン２３（またはＭｏｕｓｅ  ＧＥＮＣＯＤＥ  Ｍ８）注釈に基づく全タンパク質コード化及び長い非コード化ＲＮＡ遺伝子を含む、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｃｏｄｅｇｅｎｅｓ．ｏｒｇからダウンロードしたカスタムヒトＧＲＣｈ３８（またはマウスＣＲＣｍ３８）トランスクリプトーム参照を使用し、ＳＴＡＲ（バージョン２．５．０）６２／ＲＳＥＭ（バージョン１．２．２５）６３をデフォルトのパラメータで使用して、ＲＮＡ−Ｓｅｑから得た生のリードをトランスクリプトームに整列させた。すべての試料における各遺伝子の発現数（ＴＰＭ：１００万あたりの転写産物）を、シーケンス深度で正規化した。検出された転写産物を決定するために、少なくとも９個の試料における０．１ＴＰＭ超のフィルターをユニークな転写産物の検出のための閾値として使用した（Ｃｌｕｓｔｅｒ  ３．０）。ＰＣＡを、Ｃｌｕｓｔｅｒ  ３．０ソフトウェアを使用して、対数変換したデータに対して実施した。この研究からのすべてのトランスクリプトームデータは、ＧＥＯリポジトリにおいてＧＳＥ１２０７４６のもと利用可能である。
【００６５】
プロテオミクス：冷凍ペレットを、２％のＳＤＳ＋１０ｍＭのＴＣＥＰ（トリス２−カルボキシエチルホスフィン）緩衝液を使用して溶解させ、超音波処理した。ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡアッセイ、Ｐｉｅｒｃｅ、＃２３２２５）を使用して、タンパク質濃度を決定し、１２５μｇのタンパク質を、ＦＡＳＰ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎキット（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）を使用して消化させた。３．１２５μｇのトリプシン／ｌｙｓＣを使用して、１０００ｒｐｍで振盪しながら、３７℃で一晩、各試料を消化させた。試料を、Ｏａｓｉｓ  ＭＣＸ  μｅｌｕｔｉｏｎプレートを使用して脱塩し、３００μｌのメタノール／水酸化アンモニウムで溶出した。試料を、乾燥状態までＳｐｅｅｄＶａｃで乾燥させ、Ｂｉｏｇｎｏｓｙｓ  ｉＲＴ溶液に再懸濁させた。試料／ｉＲＴ溶液（４μｇ）を、マイクロフローモードで動作する６６００  ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ（Ｓｃｉｅｘ）に接続したＥｋｓｉｇｅｎｔ  ４１５  ＬＣにロードした。ペプチドを、３分間流速１０μＬ／分でトラップカラム（ＣｈｒｏｍＸＰ  Ｃ１８ＣＬ  １０×０．３ｍｍ  ５μｍ  １２０Å）に事前ロードし、温度３０℃及び流速５μＬ／分の分析カラム（ＣｈｒｏｍＸＰ  Ｃ１８ＣＬ  １５０×０．３ｍｍ  ３μｍ  １２０Å）上で分離させた。ＤＩＡ試料については、３〜３０％のＡで３８分間、３０〜４０％のＢで５分間、４０〜８５％のＢで２分間、８５％で３分間のアイソクラティックホールド、及び３％のＡで８分間の再平衡化で構成される線形Ａ−Ｂグラジエントを使用して、ペプチドを分離させた。データを、ＭＳ１スキャン１５０ミリ秒及び１００可変ウィンドウＭＳ２スキャン２５ミリ秒で、４００〜１２５０ｍ／ｚを使用して取得した。ソースパラメータを次の値に設定した：ガス１＝１５、ガス２＝２０、カーテンガス＝２５、ソース温度＝１００、及び電圧＝５５００Ｖ。ＤＤＡ試料を、３〜３５％のＡで６０分間、３５〜８５％のＢで２分間、その後３％のＡで７分間の再平衡化を伴う８５％で５分間のアイソクラティックホールドで構成される線形Ａ−Ｂグラジエントを使用して泳動させた。ＤＤＡ取得については、４００〜１２５０ｍ／ｚの質量範囲で２５０ミリ秒の滞留時間を使用してＭＳ１スキャンを取得し、１秒あたり１００カウントの閾値に達する上位５０個のイオンを断片化に選択した。転動衝突エネルギー（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  ｅｎｅｒｇｙ）及び５の衝突エネルギー拡散（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  ｅｎｅｒｇｙ  ｓｐｒｅａｄ）を使用して、＋２〜＋５の範囲のイオンについて、２５ミリ秒の滞留時間で、動的取得オプションをオンにした高感度モードで、ＭＳ２スキャンを取得した。イオンは、１５秒の期間で１回発生した後、断片化から除外した。以前に概説したとおり、ＤＩＡファイルをＯｐｅｎＳＷＡＴＨを使用してＤＤＡライブラリーと比較した。ＭＳ２正規化遷移レベルデータをＭＡＰ  ＤＩＡソフトウェアに通して、正規化ペプチド及びタンパク質レベルのデータを得た。加えて、タンパク質の差異分析をＭＡＰ  ＤＩＡによって行った。三連の中で変動が大きいあらゆるペプチドを取り除くために、ＣＶフィルターを適用し、各技術的反復内でＣＶが２０％を超えるペプチドを除外した。次に、ペプチドレベルのデータを合計して、タンパク質レベルのデータを得た。その後、このデータを、主成分分析、ＧＳＥＡ、及びＳＴＲＩＮＧを含む、下流分析に使用した。質量分析プロテオミクスデータは、データセット識別子ＰＸＤ０１１３２６で、ＰＲＩＤＥパートナーリポジトリを介してＰｒｏｔｅｏｍｅＸｃｈａｎｇｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍに寄託されている。
【００６６】
ＧＳＥＡ及びＳＴＲＩＮＧ分析：遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）を、以前に記載したとおりに実施した６８。ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ及びプロテオミクスデータの一致分析では、両方のデータセットで見つかった一致する遺伝子をＧＳＥＡで個別に分析した。各独立したＰＣＡ分析からの事前ランク付けされたＰＣ１遺伝子の重み付けを、ＧＳＥＡアルゴリズムを使用してＧｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）及びＫＥＧＧデータベース上で実行した。ＲＮＡ−Ｓｅｑ及びプロテオミクス分析から得られたランク付けされた経路リストを、Ｒソフトウェアを使用して一致させ、ＦＤＲによって計算した有意性によってランク付けした。ＭＡＰ  ＤＩＡからの所定の異なって発現されるタンパク質のリストをＳＴＲＩＮＧタンパク質間相互作用オンラインツールとともに使用して、全ゲノムに対する高信頼度タンパク質間相互作用及び濃縮を得た。
【００６７】
ＭＥＡ記録：細胞を、分化１５日目に４８ウェル微小電極アレイ（ＭＥＡ）プレート（Ａｘｉｏｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にプレーティングした。自発的活動を、Ｍａｅｓｔｒｏ  ＭＥＡプラットフォーム（Ａｘｉｏｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で５分間毎日測定した。波形事象を、電極ノイズの標準偏差を６に設定した適応スパイク閾値クロッシングを使用して特定し、事象をＯｆｆｌｉｎｅ  Ｓｏｒｔｅｒ  ｖ．４（Ｐｌｅｘｏｎ）を使用してさらにソートした。分析に含めるため、１分あたり最低５つのスパイクを使用した。
【００６８】
パッチクランプ：全細胞パッチクランプを、Ｌガラスカバースリップ上にプレーティングした約３０日目の培養物に行った。細胞を、室温のフェノールレッドを含まないｂｒａｉｎ  ｐｈｙｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、５７９０）中に置き、取得中最大２時間維持した。先端抵抗が４〜５ＭΩのＳｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｐ−１０００を使用して、ガラス製ピペットを引いた。内部溶液（ｍＭ単位）は、１１２．５のＫ−グルコン酸塩、４のＮａＣｌ、１７．５のＫＣｌ、０．５のＣａＣｌ２、１のＭｇＣｌ２、５のＡＴＰ、１のＮａＧＴＰ、５のＥＧＴＡ、１０のＨＥＰＥＳで構成された。電圧及び電流クランプの記録を、Ｍｕｌｔｉｃｌａｍｐ  ７００Ｂ増幅器、Ｄｉｇｉｄａｔａ  １３００、及びＰＣｌａｍｐ  １０取得ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して実行した。アクセス抵抗が３０ＭΩを超えるニューロン、または記録中に抵抗が４ＭΩを上回って変化したニューロンを除外した。０ｐＡを記録する連続電圧を平均化することにより、電流クランプ中に静止膜電位（ＲＭＰ）を測定した。電位依存性ナトリウム及びカリウム電流は、−７０  ｍＶの保持電圧から測定し、続いて１００ミリ秒にわたって１０ｍＶの増分で−１２０ｍＶから４０ｍＶに段階的に測定した。誘導された活動電位を電流クランプで測定し、ここで、セル全体で一定の−６０ｍＶベースライン電圧を維持するように保持電流を調整し、次いで１０ｐＡの増分ステップを５００ミリ秒かけて適用した。
【００６９】
ＰＫＣ−ＰＥＰ００５タンパク質複合体のインシリコモデリング：ＰＥＰ００５のＰＫＣへの推定結合を、ホモロジーモデリング、それに続いてドッキング研究を使用して決定した。端的には、１２−アセチルホルボールと複合体形成したＰＫＣのＣ１ドメインをテンプレートとして使用した（ＰＤＢ：１ＰＴＲ）６９。ＰＫＣ□のモデル構造を、Ｒｏｓｅｔｔａ  ７０を使用したホモロジーモデリングによって開発した。次に、ＰＫＣの上位の３次元モデル（５つの予測構造のうち）を使用し、Ｇｌｉｄｅ  ７１を使用したＰＥＰ００５の結合を評価した。ＰＥＰ００５の最適な結合配向を、Ｇｌｉｄｅ  ＸＰスコアに基づいて選択した。ＰＥＰ００５の他の推定タンパク質標的は、ＰＫＣのＣ１ドメインの３次元構造に基づいてＤＡＬＩ  ７２を使用して調査した。
【００７０】
ＰＥＰ００５活性のインビボ評価：野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｓ）を使用し、すべての動物実験をＣｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＣｅｎｔｅｒでＩＡＣＵＣ  ６４６２に従って行った。ＰＥＰ００５を、０．９％の滅菌生理食塩水中で、１０、１、または０．１ｍＭに希釈した。ビヒクル（ＤＭＳＯ）を、０．９％の滅菌生理食塩水で１０ｍＭに希釈した。マウスの左線条体に、次の座標で２μｌを単回注射した：前項から０．７ｍｍ  ＡＰ及び２．５ｍｍ  ＭＬ、ならびに硬膜から３．５ｍｍ  ＤＶ。注射の３日後に動物を屠殺した。免疫組織化学（ＩＨＣ）分析のため、マウスを４％のＰＦＡ／ＰＢＳで灌流し、全脳を摘出し、４℃で一晩、４％のＰＦＡ中で事後固定した。次に、脳をＰＢＳですすぎ、３０％のスクロース中４℃で保管した。ミクロトームを使用して脳を３０μｍで切片化し、浮遊部分として収集した。線条体切片を、ＰＢＳで５分間３回洗浄し、０．３％のＨ２Ｏ２で３０分間クエンチした。切片を、ＰＢＳ中０．００５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ＰＢＳ−Ｔ）で５分にわたって３回洗浄し、ＰＢＳ−Ｔ中３％の正常ウマ血清（ＮＨＳ）及び２％のＢＳＡの溶液中、室温で１時間遮断した後、遮断溶液中のα−シヌクレイン抗体（１：３００、Ａｂｃａｍ、＃ａｂ２１２１８４）中、室温で一晩インキュベートした。スライドをＰＢＳ−Ｔで５分にわたって３回洗浄し、遮断溶液中でビオチン化抗ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ、ＢＡ−１０００）とインキュベートした。次に、切片をＰＢＳ−Ｔで１０分にわたって３回洗浄し、Ａｖｉｄｉｎ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘ（Ｖｅｃｔｏｒ、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  ＡＢＣ  Ｋｉｔｓ（ＨＲＰ）、＃ＡＫ５０００）と４５分間インキュベートし、ＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン）（１：５００、Ｖｅｃｔｏｒ  ＳＫ４１００）を使用してシグナルを可視化した。ウエスタンブロット分析のために、マウスをＰＢＳで灌流し、左右の線条体を切除した。個々の線条体半球をすぐに均質化し、ホスファターゼ／プロテアーゼ阻害剤カクテルを補充した１倍ＮＥＴＮ緩衝液に溶解させた。溶解物を、連続プローブ、続いて超音波洗浄により超音波処理し、１５０００ＲＰＭで２０分間、４℃で遠心分離した。各溶解物からの全タンパク質（５０μｇ）を、４〜２０％のＭｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ  ＴＧＸ  Ｐｒｅｃａｓｔゲルに泳動させ、ＰＶＤＦ膜に転写した。マウス特異的α−シヌクレイン（Ａｂｃａｍ、＃ａｂ２１２１８４）及びβ−アクチン抗体を使用した。タンパク質バンドをＬＩ−ＣＯＲソフトウェアにより定量化して、注入した側（Ｌ）の反対側（Ｒ）に対する相対的シヌクレインレベル（α−シヌクレイン／β−アクチン）を示した。
【００７１】
実施例１０
早期発症型孤発性パーキンソン病患者からのｉＰＳＣの生成
本発明者らは、最初に、既知のＰＤの家族歴のない３人のＥＯＳＰＤ患者（３０〜３９歳）（１９０ｉＰＤ、１９４ｉＰＤ、２００ｉＰＤ）から末梢血単核細胞を収集した。これらの細胞を、確立された非組み込み型エピソーム技法を使用してｉＰＳＣに再プログラムした。ｉＰＳＣ株は多能性マーカーを発現し、核型的に正常であった。ＮｅｕｒｏＸプラットフォームを用いた分析では、確立されているＰＤ遺伝子ＥＩＦＧ１、ＰＡＲＫ２、ＬＲＲＫ２、ＧＢＡ、ＳＮＣＡ、ＰＩＮＫ１、ＰＡＲＫ７、ＶＳＰ３５、ＡＴＰ１３Ａ２の原因単一遺伝子変異、または患者株のＳＮＣＡ遺伝子座の増殖は検出されなかった（データ割愛）。患者の病状には、振戦優位、無動硬直、または混合表現型が含まれ、すべてが、ＰＤ診断を確定する線条体ＤＡＴ取り込みにおける対応する非対称性の欠損を伴う非対称性の発症を有した。また、収集時に神経疾患のない個体の血液または線維芽細胞から３つの対照ｉＰＳＣ株を生成した（０２ｉ対照、ＷＰ３ｉ対照、００ｉ対照）。
【００７２】
実施例１１
ｉＰＳＣからｍＤＡ培養物への効率的な分化
ＥＯＳＰＤ及び対照両方の患者からのｉＰＳＣ株を、Ｋｒｉｋｓ  ｅｔ  ａｌ  ３１に基づく修正した３０日間プロトコルを使用して、中脳ドーパミン作動性（ｍＤＡ）ニューロン培養物に分化させた。３０日目の分化した培養物は、成熟したニューロンマーカー（ＰＡＸ６、ＮＥＦＨ）、ニューロンマーカー（ＴＵＢ３及びＭＡＰ２）、ならびに重要なことに、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、Ｎｕｒｒ１、ＤＡＴ、及びＧＩＲＫ２３１−３３を含むドーパミン作動性ニューロンマーカーを発現した。免疫染色により、６株すべてでＴＨ産生が確認された。フローサイトメトリーの定量化により、対照株とＥＯＳＰＤ株との間でＴＨ発現細胞の数が類似していることが示されたが、個々の株を比較すると、ＥＯＳＰＤ株の１つである１９０ｉＰＤが、０２ｉ対照株と比較して有意に少ないＴＨ陽性ニューロンを生じたことが明らかになった。他の株間の違いは有意ではなかった。ＥＯＳＰＤがドーパミンの含有量及び／または放出を変化させたかどうかを判定するために、ｍＤＡ培養物の抽出物及び流出物をＨＰＬＣにより分析した。ＴＨ発現ニューロンの数で正規化すると、すべての株が同様のレベルでドーパミンを産生及び放出した。ＥＯＳＰＤ発達中のニューロンの電気生理学的機能を決定するために、パッチクランプ及び多電極アレイ（ＭＥＡ）の記録を培養中に経時的に行った。ＭＥＡ記録からの自発的活動が分化の２１日目に観察され、３０日までに、ＥＯＳＰＤ細胞と対照細胞が両方とも活動の同期バーストを生じさせた。活動をすべての株にわたって定量化すると、疾患ｍＤＡ培養物と対照ｍＤＡ培養物との間で同様の数の自発的スパイクが観察された。３０日目にパッチされたニューロンは、大きな電位依存性ナトリウム及びカリウム電流を伴う自発的活動を呈し、電流注入の際に一連の活動電位を引き出し、これにより成熟したニューロンが示された。まとめると、これらのデータは、ＥＯＳＰＤ患者由来のｉＰＳＣが機能的なドーパミン作動性ニューロンに効率的に分化し、株を制御する同様のニューロンプロファイルを保有したことを実証し、これらの表現型測定が疾患特異的シグネチャを提供しなかったことが示唆された。
【００７３】
実施例１２
α−シヌクレインはＥＯＳＰＤ  ｍＤＡ培養物において特異的に蓄積する
α−シヌクレインがＥＯＳＰＤ由来のｍＤＡ培養物において異なって発現されたかどうかを判定するために、定量的ＰＣＲを行った。対照培養物に比べて、ＳＮＣＡ遺伝子発現はＥＯＳＰＤ  ｍＤＡ培養物では有意に増加しなかった。本発明者らはまた、α−シヌクレインタンパク質の蓄積が類似しているかどうかの確認も試みた。興味深いことに、ウエスタンブロット分析により、ＥＯＳＰＤ  ｍＤＡ培養物が、対照と比較してα−シヌクレインタンパク質レベルを有意に増加させたことが示された。細胞溶解物に対するその後のＥＬＩＳＡにより、対照と比較して、罹患株におけるα−シヌクレインタンパク質のレベルが有意に増加したことが確認された。ｉＰＳＣステージにあるＥＯＳＰＤ株からのタンパク質溶解物は、α−シヌクレインの増加を呈さず、蓄積が分化した培養物に特異的であったことが示された。総合すると、これらのデータにより、ＥＯＳＰＤ患者由来のｍＤＡ培養物におけるα−シヌクレインタンパク質の転写非依存性蓄積の表現型が示される。
【００７４】
実施例１３
リソソームタンパク質はＥＯＳＰＤ  ｍＤＡ培養物において異常調節される
次に、本発明者らは、同じ培養ウェルに由来する対になった試料セットに対するＲＮＡシーケンスとプロテオミクスの両方を通して、このα−シヌクレインの増加にどのような因子が寄与している可能性があるかを決定しようと試みた。全トランスクリプトームＲＮＡシーケンス（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）により、ＥＯＳＰＤ培養物と対照ｍＤＡ培養物との間に１９００４個のユニークなトランスクリプトが検出され、データ非依存型取得質量分析（ＳＷＡＴＨ）プロテオミクス分析では、２４７８個のユニークなタンパク質が特定された。トランスクリプトーム及びプロテオミクス両方のデータの独立した教師なし主成分分析（ＰＣＡ）により、主成分１（ＰＣ１）に沿ったＥＯＳＰＤ細胞と対照との間の明確な線引きが明らかとなった。
【００７５】
トランスクリプトームシグネチャとタンパク質シグネチャとの間の類似性を考慮して、本発明者らは、ＰＣ１に沿った２つのデータセットを比較して、ＥＯＳＰＤ  ｍＤＡ培養物におけるα−シヌクレインの蓄積に寄与し得る一致及び不一致両方の細胞経路を特定した。経路の直接比較を可能にするために、２４４０個の遺伝子、及び両方のデータセットに存在する対応するタンパク質にＰＣＡを繰り返した。この一致したリストからのＰＣ１ランク付けされた遺伝子及びタンパク質を、個別の遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）において分析し、タームの有意性によって比較した。ＲＮＡ−Ｓｅｑデータセット全体に対してＧＳＥＡを実行すると、同様の有意なタームが得られた。α−シヌクレイン、ならびにシナプシン（ＳＹＰ）、シナプス小胞２Ａ（ＳＶ２Ａ）、及びＳＮＡＰ２５などのドーパミン放出に関連する他のシナプス小胞遺伝子は、ＲＮＡとタンパク質の両方で有意に上方調節されたＧｏ  Ｐｒｅｓｙｎａｐｓｅタームに含まれた。ＫＥＧＧ酸化的リン酸化に含まれる代謝遺伝子も、ｍＲＮＡとタンパク質の両方ともＥＯＳＰＤ株で有意に上方調節された。タンパク質データでは、パーキンソン病、アルツハイマー病、及びハンチントン病などの神経変性疾患に関連するタームがＥＯＳＰＤ株において有意に上方調節されており、神経変性の一般的な側面が捕捉されたことが示唆された。
【００７６】
Ｇｏ  Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  Ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  Ｌｕｍｅｎタームで見られた転写産物とタンパク質の両方とも有意に下方調節されており、タンパク質形成に関連する遺伝子の不足が示唆された。興味深いことに、Ｇｏ  Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  Ｌｕｍｅｎタームで見られたリソソームタンパク質は、タンパク質では有意に下方調節されていたが、ｍＲＮＡデータではそうではなかった。ＰＣ１で見られた異常調節された経路がＥＯＳＰＤ株に特異的であることを確認するために、対照株とＥＯＳＰＤ株との間の差次的発現の別個の分析を、プロテオミクスデータを用いて行い、ＳＴＲＩＮＧ経路分析に入力した。ここでも、リソソームタンパク質はＥＯＳＰＤ株で有意に減少していることが分かった。これらのデータは、ＥＯＳＰＤ  ｍＤＡ培養物には、リソソーム機序の正常な転写があったが、対照ｍＤＡ培養物と比較して、存在する得られたタンパク質が少なかったことを示す。
【００７７】
ＥＯＳＰＤ  ｍＤＡ培養物におけるリソソームタンパク質の減少により、α−シヌクレインの蓄積が分解障害の結果であり得ることが示唆された。全体的な分解速度を試験するために、培養においてシクロヘキシミド処理を介して転写機能全体を４８時間阻害し、タンパク質を経時的に評定及び定量化した。４８時間の処理の過程で、０２ｉ対照対照株においてα−シヌクレインが分解され、観察された半減期は約１０時間であり、以前にＰＣ１２細胞で報告された半減期よりもわずかに長かった。まったく対照的に、最も重篤なＥＯＳＰＤ株（１９０ｉＰＤ）においては、シクロヘキシミド処理の過程でα−シヌクレインが蓄積した。しかしながら、ＴＨ及びシナプトフィジンなどのドーパミンニューロンに関連する他のタンパク質については、罹患株及び対照株が同様のタンパク質分解速度を示し、分解の欠損がα−シヌクレインに特異的であり、タンパク質分解はプロテアソーム分解経路とオートファジー／リソソーム分解経路とに主に分けられ得ることが示唆された。プロテアソーム分解がα−シヌクレインタンパク質分解の原因であるかどうかを判定するために、ｍＤＡ培養物をプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２で２４時間処理した。ＭＧ１３２処理により、プロテアソーム手段を介して正準に分解されたタンパク質であるＰ５３の蓄積が生じた。しかしながら、対照培養物またはＥＯＳＰＤ培養物のいずれにおいてもα−シヌクレインの有意な増加はなく、この状況ではα−シヌクレインの分解がプロテアソームを通して媒介されなかったことが示された。α−シヌクレイン分解へのリソソームの関与の可能性を決定するために３６，３７、本発明者らは次に、リソソーム関連膜タンパク質１（ＬＡＭＰ１）について調査した。ＬＡＭＰ１の量の有意な減少が３つのＥＯＳＰＤ株すべてで検出され、これはプロテオミクス分析と一致した。ＧＣａｓｅは、一部のＰＤ患者の末梢血で活性が低下していると報告されているリソソーム加水分解酵素である。１ｍＭの４−メチルウンベリフェリルβ−グルコフィラノシドを使用して相対的ＧＣａｓｅ機能を定量化したところ、本発明者らは、対照と比較してＥＯＳＰＤ  ｍＤＡ培養物における活性の有意な低下を見出した。早期発症型ではない孤発性患者のｉＰＳＣ株を使用した以前の研究では、分化したニューロン培養物におけるＧＣａｓｅ活性の低下は、後の培養時点（６０日超）での酸化ドーパミンの増加により生じた４２。対照的に、培養３０日で、本発明者らは、いずれの酸化ドーパミンの増加も観察しなかった。しかしながら、より長い期間（６０日）成長させると、酸化ドーパミンがＥＯＳＰＤ培養物中で蓄積し始めた。これらの結果により、このモデルでは、α−シヌクレインの増加及びリソソーム欠損が酸化ドーパミンの蓄積に先行することが示唆される。これにより、ＥＯＳＰＤ  ｍＤＡ培養物におけるα−シヌクレイン蓄積の推定原因としての機能異常のリソソーム分解のさらなる証拠がもたらされる。
【００７８】
実施例１４
ＰＥＰ００５はＥＯＳＰＤ表現型を調節する
本発明者らは次に、３つのリソソームアゴニストを使用して、リソソーム特異的経路の活性化を通してα−シヌクレインレベルが低下する可能性を試験した４３。選択した化合物は、ＰＫＣアゴニストであり、ＨＥＰ１４薬物の構造類似体であるＰＥＰ００５、ＰＣ１２細胞モデルでハンチンチン及びα−シヌクレイン凝集体を減少させることが示されている小分子オートファジープロモーターであるＳＭＥＲ２８、ならびにＰＣ１２細胞においてα−シヌクレインのクリアランスを促進することが示されている別の化合物であるトレハロースであった４６。対照株０２ｉ対照及びＥＯＳＰＤ株１９０ｉＰＤからのｍＤＡ培養物を、分化の２７日目に開始して３日間、各アゴニストで処理した。興味深いことに、トレハロースではなくＰＥＰ００５及びＳＭＥＲ２８で処理すると、対照培養物中のα−シヌクレインタンパク質の量が減少した。ＰＤ  ｍＤＡ培養物では、ＰＥＰ００５及びトレハロースはα−シヌクレインレベルを低下させたが、ＳＭＥＲ２８はさせなかった。しかしながら、ＰＫＣアゴニストＰＥＰ００５のみが、ＰＤ及び対照両方のＥＯＳＰＤ  ｍＤＡ培養中でα−シヌクレインレベルを低下させた。驚くべきさらなる発見は、対照及びＥＯＳＰＤのｍＤＡ培養物において、ＰＥＰ００５処理により、存在するＴＨ酵素の量の増加が生じたことであった。免疫染色により、ＰＥＰ００５で処理した個々のｍＤＡ培養物がＴＨの増強及びα−シヌクレインの減少を示したことが確認された。高密度の免疫染色されたｍＤＡ培養物により定量化が妨げられたため、代わりにフローサイトメトリーを使用してＴＨを定量化した。ＰＥＰ００５で処理した培養物には、実際に、ＴＨ発現のレベルが有意に高いニューロンが含まれたが、ＰＥＰ００５では、ＴＨニューロンの数の増加は生じなかった。これらのデータにより、ＰＥＰ００５が、すでに酵素を産生しているニューロンのＴＨ発現のレベルを高め、同時に異常に高いレベルのα−シヌクレインの発現を減少させたことが示される。
【００７９】
ＰＥＰ００５は、ＰＫＣアルファ（ＰＫＣα）とデルタ（ＰＫＣδ）の両方に対して十分に確立された活性を有する。２つのアイソフォームは互いに拮抗するが、文献では、ＰＥＰ００５による処理は、ＰＫＣδリン酸化の短期バースト、それに続くより長期的なリン酸化ＰＫＣδの強力な減少を生じさせることが報告されている。本発明者らは、驚くべきことに、３０日目に、リン酸化ＰＫＣ−α（ｐ−ＰＫＣα）の基礎レベルが対照と比較して１９０ｉＰＤ  ｍＤＡ培養物中で高く、ＰＥＰ００５処理が対照及びＥＯＳＰＤ両方の培養物でこのシグナルを完全に除去できることを発見した。この研究で使用した他のすべての株を評価することで、対照株と比較した場合、３つのＥＯＳＰＤ株すべてからのｍＤＡ培養物においてｐ−ＰＫＣαのレベルがより高かったことが確認されたが、総ＰＫＣαにおける違いは有意ではなかった。未分化のｉＰＳＣではｐ−ＰＫＣαの上昇はなく、個々の患者からの末梢血中で明確なパターンは見られなかったので（データ割愛）、分化したｍＤＡ培養物に対する特異性が示された。加えて、この上昇したｐ−ＰＫＣαは、すべてのｉＰＳＣ株からのｍＤＡ培養物に３日間１μＭのＰＥＰ００５を加えることで除去された。この除去には、α−シヌクレインレベルの減少及びＬＡＭＰ１の増加が伴った。
【００８０】
ＰＥＰ００５への反応をさらに評価するために、対照及びＥＯＳＰＤのｍＤＡ培養物における処理のタイムコースを評定すると、ｐ−ＰＫＣαとα−シヌクレインが両方とも約２４時間以内に薬物処理に応答して分解されたことが示された。同じタイムコースにおいて、ＥＯＳＰＤ  ｍＤＡ培養物では切断されたカスパーゼ３（ＣＣ３）も著しく減少し、薬物に対する毒性応答がないことが示された。対になった試料からの遺伝子発現データにより、ＳＮＣＡ発現がＰＥＰ００５処理の４時間後に下方調節され、ＴＨが最初の曝露の約８時間後に上方調節されたことが示され、２つのタンパク質の間の拮抗的な関連性が示唆された４８〜５０。
【００８１】
実施例１５
追加の患者におけるＥＯＳＰＤ表現型の確認
本発明者らは次に、これらの発見をより広い範囲の対照及びＥＯＳＰＤ患者で確認することを望んだ。本発明者らは、追加の２つのＥＯＳＰＤ株（１７２ｉＰＤ、１９２ｉＰＤ）、及び８３歳に達した神経変性または認知低下の兆候のない個体の群であるロージアン出生コホートからの３つの対照株（０７７１ｉ対照、１０３４ｉ対照、１１８５ｉ対照）を導出した５１。本発明者らはまた、これらの表現型がＰＤ集団全体で特定され得るかどうかを確かめるために、通常発症型ＰＤ株（７８ｉＰＤ、６７歳での症状発症及びＰＤの家族歴）を評価した。すべての新しい株からのｉＰＳＣをｍＤＡ培養物に分化させ、３０日目にα−シヌクレインの蓄積とｐ−ＰＫＣαの増加の両方について調査した。本発明者らの以前の発見を裏付けるように、ロージアン対照からの細胞はα−シヌクレインを蓄積せず、ｐ−ＰＫＣαの増加も示さなかったが、２つの新しいＥＯＳＰＤ株のうちの１つ（１７２ｉＰＤ）からの細胞は両方の表現型を示した。興味深いことに、通常発症型ＰＤ株からのｍＤＡ培養物及び新しいＥＯＳＰＤ株のうちの１つからのｍＤＡ培養物は、α−シヌクレインの蓄積もｐ−ＰＫＣαの増加も示さなかった。すべての株のウエスタンデータを比較するために、各ブロットにおける発現値を０２ｉ対照で正規化した。対照個体からのｍＤＡ培養物は同様のα−シヌクレイン及びｐ−ＰＫＣαの発現を明らかにした一方、ほとんどのＥＯＳＰＤ患者は別個のクラスターに分かれた。ＥＯＳＰＤの予測ツールとしてのα−シヌクレイン及びｐ−ＰＫＣα発現検出の可能性を判定するために、本発明者らは、正規化された発現値を受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）にプロットした。曲線下面積に反映された、ＥＯＳＰＤを対照から区別する予測精度は、α−シヌクレイン（赤色）で０．８４、ＬＡＭＰ１（青色）で０．９３、ｐ−ＰＫＣα（オレンジ色）で０．９６であり、これらの表現型マーカーが本発明者のコホート中の患者を正確に分別することを示した。
【００８２】
実施例１６
追加のホルボールエステルは、ｍＤＡ培養物におけるα−シヌクレイン及びＴＨレベルを変化させる
ＰＥＰ００５とα−シヌクレインとの間の相互作用の機序をさらに調査するために、本発明者らは、ＰＥＰ００５と同様の化学構造を有する２つの追加のＰＫＣアゴニストである１３−酢酸１２−ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）及びプロストラチン（ＰＲＯ）を試験した。追加のホルボールエステル化合物であるＰＭＡとＰＲＯが両方とも、ＰＥＰ００５と同様の活性を呈し、ｍＤＡ培養物の処理によりｐ−ＰＫＣα及びα−シヌクレインが減少し、それに対応してＴＨが増加した。
【００８３】
実施例１７
ＰＥＰ００５はｐ−ＰＫＣαとは無関係にα−シヌクレインを調節する
最適な効力を決定するために、本発明者らは、ＰＥＰ００５及びＰＲＯの両方に応答したｐ−ＰＫＣα及びα−シヌクレインの発現を検査する一連の用量応答研究を実施した。ＰＥＰ００５で処理したｍＤＡ培養物を評価すると、薬物の直接的な標的ｐ−ＰＫＣαの明確な用量応答関係が明らかになった。しかしながら、ｐ−ＰＫＣαレベルを変化させなかった低用量ＰＥＰ００５で、α−シヌクレインの堅牢な減少が観察された。これは、α−シヌクレインの減少におけるＰＥＰ００５の作用様式がｐ−ＰＫＣαとは無関係であり得ることを示唆する。ＰＲＯは、ｐ−ＰＫＣαとα−シヌクレインの両方を用量依存様式で低減させたが、α−シヌクレインレベルの低減においてはＰＥＰ００５ほど効率的ではなく、α−シヌクレイン調節経路との相互作用の親和性がより低いことを示唆する。
【００８４】
低用量でのＰＥＰ００５に対するα−シヌクレインとｐ−ＰＫＣαとの応答の違い、及びさらなる掘り下げがＰＥＰ００５処理と同様の効果を有したという事実を考慮して、本発明者らは、可能性のあるＰＥＰ００５結合部位のインシリコモデリングを実行して、新しい薬物結合パートナーを特定した。予想どおり、本発明者らは、ＰＥＰ００５がＰＫＣαに結合するためのいくつかの同様の親和性標的部位を確認したが、興味深いことに、複数の追加のタンパク質上の結合部位も見出した。３次元モデルに基づくより興味深い発見のうちの１つは、ＰＫＣαと同様の親和性でのＧＴＰａｓｅ  ＲＡＳへの結合であった。ＲＡＳは、ｍＴＯＲＣ経路を介した細胞増殖（ＭＡＰＫ経路）及びリソソーム生合成に直接影響する。
【００８５】
実施例１８
ＰＥＰ００５はインビボでα−シヌクレインレベルを低下させる
最後に、本発明者らは、ＰＥＰ００５がインビボでα−シヌクレインレベルも低下させることができるかどうかを評価したいと考えた。これを行うため、成体の野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの片側線条体にＰＥＰ００５（２．１５ｎｇ、２１．５ｎｇ、または２１５ｎｇ）を注射した。処置後３日目のマウス線条体のウエスタンブロット及び免疫組織化学的評価の両方で、２１５ｎｇ用量のＰＥＰ００５により、反対側に比べてα−シヌクレインのレベルが有意に低下したことが示された。これらの結果は、ＰＥＰ００５活性がインビボでα−シヌクレインレベルを低下させることを実証する。
【００８６】
実施例１９
考察
ＰＤの原因は、遺伝的、環境的、またはこの２つのなんらかの組み合わせのいずれかであると提案されており、ほとんどすべての場合、α−シヌクレインの異常な蓄積が関与している。本発明者らは、早期発症型孤発性患者（米国のＰＤ人工の３〜１０％）に焦点を当て、ここに、この研究中５人の患者のうち４人からのｉＰＳＣ由来ｍＤＡ培養物において信頼できる分子シグネチャを特定した。ｉＰＳＣ変換はほとんどのエピジェニックメモリーを一掃するので、この分子シグネチャは、ある数の未だ知られていない病原遺伝子及び修飾遺伝子の関与が推定される、ＥＯＳＰＤへの強力な遺伝的寄与が存在するはずであることを意味する。α−シヌクレインの蓄積は、現在の研究の成人発症型患者でも、以前の成人発症型孤発性ＰＤ研究でも観察されなかった。成人発症型ＰＤ細胞がＥＯＳＰＤ表現型を再現できないことは、これらのインビトロ表現型を顕出するにはさらに培養時間が必要であるか、または代替的に、ＥＯＳＰＤの加速された性質により、インビトロで容易に再現できるα−シヌクレインの取扱いに欠陥のあるＰＤの異なる亜集団が提供されることを示す。
【００８７】
孤発性患者の大規模コホートに対する全ゲノム関連研究（ＧＷＡＳ）により、タンパク質分解に関連する対立遺伝子変異体が特定され、リソソーム分解経路を疾患病因に関係させた。本発明者らの結果は、本研究、及びＰＤの主要な原因としてリソソーム機能異常を指摘するこれまでの多くの研究を支持する。ＥＯＳＰＤ患者はリソソームリスク変異体を担持しないか、または転写レベルでのリソソーム遺伝子発現の変化を示さないものの、リソソームタンパク質は有意に下方調節されていた。小胞体内腔に見られるような、タンパク質処理に関連する経路の下方調節と、リソソームタンパク質の下方調節との組み合わせは、リソソームタンパク質の生合成及び／または安定性がＥＯＳＰＤに特異的なα−シヌクレインの蓄積に寄与し得ることを示唆している。リソソーム経路を直接刺激することにより、本発明者らは、細胞内α−シヌクレインタンパク質の減少をもたらすことができた。しかしながら、ホルボールエステル化合物による処理では、α−シヌクレインレベルの減少が誘導されただけでなく、対照及びＰＤ両方の起源のｍＤＡ培養物に存在するＴＨの量の増加が生じた。他の研究では、α−シヌクレインとＴＨ発現との間の拮抗的関連が示唆されているが、ＴＨの増加はＰＥＰ処理に特異的であったため、相互作用は単純な直接関連よりも複雑であり得る。ＳＭＥＲ−２８低分子で処理した対照ｍＤＡ培養物及びトレハロースで処理したＰＤ  ｍＤＡ培養物は、α−シヌクレインタンパク質の量の減少を示したが、ホルボールエステルとは異なり、いずれの減少もＴＨ酵素の増加をもたらさなかった。これらの相違する結果は、２つの経路が共通の標的の周りに集中し得るが、それ以外は独立していることを示唆する。
【００８８】
ここで観察された細胞内α−シヌクレインレベルの低下及びＴＨの増加という二重の効果により、ＰＥＰ００５は、可能性のある治療薬として非常に魅力的な候補となる。ＰＥＰ００５は、抗白血病活性も有し、かつ潜伏ＨＩＶの再活性化に役割を果たし得る、光線性角化症の局所治療用のＦＤＡ承認薬である。本研究では、これを、ｍＴＯＲＣ経路とは無関係に、ＴＦＥＢアゴニストとして作用するＨＥＰ１４化合物と同じ植物に由来する構造類似体として選択した。ＰＥＰ００５で処理した対照細胞及びＰＤ細胞において、本発明者らは、リソソームマスター調節因子ＴＦＥＢの活性化と一致するリソソームタンパク質ＬＡＭＰ１の増加を観察した。プロテオミクスデータのネットワーク分析により、ＴＦＥＢがＥＯＳＰＤ  ｍＤＡ培養物におけるリソソーム経路の下方調節の中心となることも示唆された。しかしながら、インビトロ及びインビボ両方でのＰＥＰ００５処理後のα−シヌクレインの急速な減少は、新しいリソソームタンパク質の転写が最初はα−シヌクレインの即時の減少の原因ではないことを示唆し得る。
【００８９】
ＰＥＰ００５小分子の作用機序を調査すると、ＥＯＳＰＤ  ｍＤＡ培養物に特異的なｐ−ＰＫＣαのレベルの上昇が明らかになった。これは、ある特定のがんに関連しているものの、ＰＤの文献では新規のシグナルであり、本発明者らは、このシグナルを、ＥＯＳＰＤ  ｍＤＡ培養物で観察されるα−シヌクレイン蓄積のバイオマーカー及び可能性のある原因として追及した。本発明者らが試験した３つのＰＫＣアゴニスト（３つのホルボールエステル）はすべて、ｐ−ＰＫＣαの減少をもたらし、これには、α−シヌクレインの減少及びＴＨレベルの上昇が付随した。加えて、用量応答研究は、ＰＥＰ００５がｐ−ＰＫＣαに実質的に影響を与えることなくα−シヌクレインレベルを変化させることができることを示す。これらの結果により、ホルボールエステル化合物の構造に特異的ななんらかの相互作用が、α−シヌクレインの減少を駆動し、ｐ−ＰＫＣαの減少を駆動しないことが示唆され得る。
【００９０】
このモデルの内在的な患者特異性は、ＥＯＳＰＤ診断及び治療法開発の機会を提示する。ＥＯＳＰＤ診断を支援するためにこのアプローチの予測精度を完全に評価するには、より多くの患者株が必要になる。本モデルはほとんどのＥＯＳＰＤ患者を正確に区別したが、１人の患者は正しく識別されなかった。このインビトロでの表現型の欠如は、固有の臨床的特徴、すなわち、非振戦優位症状と一致した。この患者の多様な臨床的特徴及びインビトロの結果により、ＥＯＳＰＤバイオマーカーのタイミングまたは取得を変化させ得る代替の病因論または固有の修飾遺伝子のセットが示唆される。
【００９１】
この研究は、早期発症型患者からのｉＰＳＣにおける孤発性パーキンソン病の分子シグネチャを特定した最初のものである。これらの細胞は、α−シヌクレインを蓄積し、リソソーム生合成及び機能の異常調節を有し、ｐ−ＰＫＣαの増加も示すので、運動症状を提示している若年患者がＥＯＳＰＤを有するかどうかの予測を可能にし得るバイオマーカーを提供し、したがって、臨床医のための新しい診断ツールとなる。また、このシステムにより、ＥＯＳＰＤの根本的な機序に影響を与え得る新しい治療薬をスクリーニングするためのプラットフォームが提示される。例えば、本発明者らは、このシグネチャを標的とし、対照及びＰＤ両方の細胞において細胞内α−シヌクレインを減少させる新規薬物のセットをすでに特定した。これらのホルボールエステル薬、特にＰＥＰ００５は、ＥＯＳＰＤの根本的な原因を治療する可能性があり、他の神経変性疾患と共通の原理を明らかにし得る。
【００９２】
実施例２０
治療及び投与
本発明者らは、複数の動物モデル（ラット、ウサギ、ミニブタ、及びヒト）におけるインビトロの血漿結合研究が、ＰＥＰ００５及び追加のホルボール化合物の非常に効率的な血漿結合を示すことに注目する。これはＩＶ送達を複雑にし得る。
【００９３】
複数のＩＶボーラス投薬研究において、次のことが観察された。ラットの呼吸への影響−最大１０ｕｇ／ｋｇの用量では、生物学的に関連のある応答は観察されなかった。ミニブタの心臓血管への影響−最大５ｕｇ／ｋｇ（試験した最高量）の用量は、有害な臨床的または行動的影響を生じさせず、また顕著な心血管変化を生じさせなかった。
【００９４】
ラット及びミニブタにおける用量決定研究について。７日間の反復投与は、ラットでは１５ｕｇ／ｋｇ／日、ブタでは５ｕｇ／ｋｇで認容された。
【００９５】
ラットにおける反復投薬毒性研究−動物に、最大１０ｕｇ／ｋｇ／日をＩＶ尾静脈注射により７日間与えた。すべての用量は忍容性が良好であった。ミニブタでの反復投薬毒性研究−動物に、最大５ｕｇ／ｋｇ／日をＩＶで週に約１回与えた。５ｕｇ／ｋｇ用量での処理により、翌日の食物摂取量が低下したが、その後、摂取量は回復した。
【００９６】
マウスでのＰＥＰのＰＫプロファイルを決定する研究−１０及び５０ｕｇ／ｋｇをＩＶ尾静脈注射によって投与した。試験の１時間後に血清濃度が検出限界を下回り、非常に高いクリアランス（肝臓を通る血流を超える）が示された。これも、ＩＶ送達には問題となる可能性がある。
【００９７】
上記の結果を総合して、本発明者らは、脳シヌクレインレベルに測定可能な影響を生成できるかどうかを確認するために、１０ｕｇ／ｋｇの用量範囲での尾静脈ＩＶ投与を直接試験することにする。しかしながら、高い結合力と非常に速いクリアランス／代謝速度を考慮すると、ＩＶ投与が効率的な送達経路である可能性は低いと思われる。本発明者らが検討し得る他の送達経路は、脳への直接注入である。
【００９８】
本発明者らは、今後の動物研究のための投薬計画を決定するには、ＰＥＰの単回投与の効果がどのくらい持続するかを知ることが必要であった。この研究により、ＰＥＰ００５の２４時間単回投与の作用期間が示される。シヌクレインレベルは１６８時間低下したままであり、ｐＰＫＣａレベルは投与後２４０時間が経過した後でも依然として低下していた。したがって、本発明者らは、週に約１回の動物への投薬を検討している。
【００９９】
上記の種々の方法及び手法は、本発明を実施する多数の手段を提供する。当然、記載の目的または利点の必ずしもすべてが、本明細書に記載の任意の特定の実施形態に従って達成されるわけではないことを理解すべきである。したがって、例えば、方法が、本明細書で教示または示唆され得るように、他の目的または利点を必ずしも達成することなく、本明細書に教示の１つの利点または利点群を達成または最適化する仕方で実施することができることを、当業者らは認識するであろう。様々な有利及び不利な代替物が、本明細書で述べられる。好ましい実施形態の一部が、１つの、別の、またはいくつかの有利な特徴を具体的に含む一方、他のものは、１つの、別の、またはいくつかの不利な特徴を具体的に除外するが、さらに他のものは、１つの、別の、またはいくつかの有利な特徴を含むことにより、本不利な特徴を具体的に軽減することが理解されるべきである。
【０１００】
さらに、当業者は、異なる実施形態の種々の特徴の適用性を認識するであろう。同様に、上述した種々の要素、特徴、及びステップ、ならびにそのような要素、特徴、またはステップそれぞれのための他の既知の等価物は、本明細書に記載の原理に従って方法を実施するために、当該技術分野の当業者が組み合わせ、一致させることができる。多様な実施形態では、種々の要素、特徴、及びステップ中に、一部が具体的に含まれ、残りのものが具体的に除外されるであろう。
【０１０１】
本発明は、特定の実施形態及び実施例の文脈で開示されているが、本発明の実施形態が、具体的に開示された実施形態を超えて、他の代替実施形態及び／または使用ならびにその修正及び等価物にまで及ぶことは、当業者らに理解されるであろう。
【０１０２】
本発明の実施形態では、多くの変形及び代替要素が開示されている。さらに別の変形及び代替要素は、当業者には明らかであろう。これらの変形には、限定されないが、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に関連する組成物及び方法、中脳ニューロン、底板ニューロン、ドーパミン作動性ニューロンを含む分化したｉＰＳＣ、技法及び組成物ならびにそれに使用される溶液の使用、ならびに本発明の教示により作製される生成物の特定の使用がある。本発明の種々の実施形態は、これらの変形または要素のいずれかを具体的に含むか、または除外し得る。
【０１０３】
一部の実施形態では、本発明の特定の実施形態を説明及び特許請求するために使用される成分の量、濃度などの特性、反応条件などの特性を表す数字は、一部の場合、「約」という用語で修飾されるものとして理解されるべきである。したがって、一部の実施形態では、書面による説明及び添付の特許請求の範囲に記載の数値パラメータは、特定の実施形態により得られることが求められる所望の特性に応じて変動し得る近似値である。一部の実施形態では、数値パラメータは、報告された有効桁数の数を考慮してかつ通常の丸め手法を適用することにより解釈されるべきである。本発明の一部の実施形態の広い範囲について記載する数値範囲及びパラメータは、近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に記載されている数値は、実行可能な限り正確に報告される。本発明の一部の実施形態で提示されている数値は、それぞれの試験測定値に見出される標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を含み得る。
【０１０４】
一部の実施形態では、本発明の特定の実施形態を説明する文脈で（特に、以下の特許請求の範囲の特定の文脈で）使用される「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という用語ならびに類似の指示対象は、単数形及び複数形の両方を網羅すると解釈することができる。本明細書の値の範囲の列挙は単に、範囲内に入るそれぞれの別々の値を個々に指す簡単な方法として役立つことが意図される。本明細書で別途指示のない限り、各個別値は、本明細書で個別に列挙されているかのように、本明細書に組み込まれる。本明細書に記載のすべての方法は、本明細書で別途指示のない限り、または別途文脈により明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施することができる。本明細書で特定の実施形態に関して提供される任意の及びすべての例の使用、または例示的な言語（例えば、「など」）は、本発明をより適切に表すことが意図され、別途特許請求される本発明の範囲に制限を課さない。本明細書の言語は、本発明の実施に必須の、特許請求されていない任意の要素を示すと解釈されるべきではない。
【０１０５】
本明細書に開示されている本発明の代替要素または実施形態のグループ化は、制限として解釈されるべきではない。各グループメンバーは、個別に、またはグループの他のメンバーもしくは本明細書に見られる他の要素と任意の組み合わせで、参照して、特許請求することができる。グループの１つ以上のメンバーは、便宜上の及び／または特許性の理由により、グループに含まれるか、またはグループから削除され得る。そのような任意の包含または削除が生じた場合、本明細書は、本明細書にこのように修正されたグループを含有するとみなされ、添付の特許請求の範囲で使用されるすべてのＭａｒｋｕｓｈグループの書面による説明を満たす。
【０１０６】
本発明を実施するための本発明者に既知の最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載されている。それらの好ましい実施形態の変形は、上述の説明を読むと当業者らに明らかになるであろう。当業者らが、必要に応じて、そのような変形を用い得ることが企図され、本発明は、本明細書に具体的に記載されているもの以外で実施することができる。したがって、本発明の多くの実施形態は、適用法により許可されるように、本明細書に添付された特許請求の範囲に列挙された主題のすべての修正及び同等物を含む。さらに、そのすべての可能な変形における上記の要素の任意の組み合わせは、本明細書に別途指示のない限り、または文脈により明らかに矛盾しない限り、本発明に包含される。
【０１０７】
さらに、本明細書を通して、特許及び印刷された出版物に対して、多数の参照がなされている。上記で引用された参考文献及び印刷された刊行物のそれぞれは、全体が参照により本明細書に個々に組み込まれる。
【０１０８】
最後に、本明細書に開示の本発明の実施形態は、本発明の原理の例示であることを理解すべきである。用いることができる他の修正は、本発明の範囲内であり得る。したがって、限定ではなく例として、本発明の代替構成を、本明細書の教示に従って利用することができる。したがって、本発明の実施形態は、厳密に示され記載されているものに限定されない。
【図１】
2021523888.tif 000008
【図２−１】
2021523888.tif 000009
【図２−２】
2021523888.tif 000010
【図３−１】
2021523888.tif 000011
【図３−２】
2021523888.tif 000012
【図４−１】
2021523888.tif 000013
【図４−２】
2021523888.tif 000014
【図５−１】
2021523888.tif 000015
【図５−２】
2021523888.tif 000016
【図５−３】
2021523888.tif 000017
【図５−４】
2021523888.tif 000018
【図６ａ】
2021523888.tif 000019
【図６ｂ】
2021523888.tif 000020
【図７】
2021523888.tif 000021
【図８】
2021523888.tif 000022
【図９】
2021523888.tif 000023
【図１０】
2021523888.tif 000024
【図１１】
2021523888.tif 000025
【図１２】
2021523888.tif 000026
【図１３】
2021523888.tif 000027
【図１４】
2021523888.tif 000028
【図１５】
2021523888.tif 000029
【図１６】
2021523888.tif 000030
【図１７】
2021523888.tif 000031
【図１８】
2021523888.tif 000032
【図１９】
2021523888.tif 000033
【図２０】
2021523888.tif 000034
【図２１】
2021523888.tif 000035
【図２２】
2021523888.tif 000036
【図２３】
2021523888.tif 000037
【図２４】
2021523888.tif 000038
【図２５】
2021523888.tif 000039
【図２６】
2021523888.tif 000040
【図２７】
2021523888.tif 000041
【図２８】
2021523888.tif 000042
【図２９】
2021523888.tif 000043
【図３０】
2021523888.tif 000044
【図３１】
2021523888.tif 000045
【図３２】
2021523888.tif 000046
【図３３】
2021523888.tif 000047
【図３４】
2021523888.tif 000048
【図３５】
2021523888.tif 000049
【図３６】
2021523888.tif 000050
【図３７】
2021523888.tif 000051
【図３８】
2021523888.tif 000052
【国際調査報告】
2021523888.tif 000053