(57)【要約】  本発明は、２本の相補的な鎖を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含む組成物であって、ポリＡの少なくとも１つのブロック及びポリＵの相補的なブロック、ここで、各鎖は、５０〜２００塩基、好ましくは５５〜２００塩基の間の長さを有し、ＴＬＲ３受容体を発現する癌を治療する方法で使用するための、医薬的に許容されたビヒクル、担体又は賦形剤を含む組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２本の相補鎖を有するｄｓＲＮＡから本質的になる二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含む組成物であって、ポリＡの少なくとも１つのブロック又はホモポリマーと、ポリＵの相補的ブロック又はホモポリマーを含み、各ブロックが、少なくとも１５、２０、２５又は３０のＡ、又はＵを含み、及び各鎖が、５０〜２００塩基の間、好ましくは５５〜２００塩基の間の定められた長さを有し、及び医薬的に許容されるビヒクル、担体又は賦形剤を含む、組成物。
【請求項２】
前記ｄｓＲＮＡが、下記の式（Ｉ）：
（Ｉ）［Ｐ］ａ［Ｑ］ｂ［Ｒ］ｃ
（式中、
−  Ｑは、Ａ又はＵのホモポリマーを表し、ｂは、少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０以上の整数を表し；
−  ａ及びｃは、独立して０又はａ＋ｂ＋ｃ＝５０〜２００、好ましくは６０〜１２０、より好ましくは７０〜１００の間であるような整数であってもよく；ａ、ｂ及びｃは、等しくても異なっていてもよく；
−  ａ＝１ならば、Ｑ＝Ａの場合、Ｐが、Ｕ、Ｇ、Ｉ及びＣのうちの１つの基から作られ；Ｑ＝Ｕの場合、Ｐが、Ａ、Ｇ、Ｉ及びＣのうちの１つの基から作られ；
−  ａ＞１ならば、以下の何れかの構成で、Ｐが、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｉ及びＣのうちの少なくとも１つ又は２つの塩基から作られる：これらの塩基の少なくとも２つの組み合わせ、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｉ及びＣのうちの塩基の１つのブロック、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｉ及びＣのうちの異なる塩基の少なくとも２つのブロック、又はＡ、Ｕ、Ｇ、Ｉ及びＣのうちの少なくとも１つのブロック並びにＡ、Ｕ、Ｇ、Ｉ及びＣのうちの少なくとも１つの他の塩基の混合物；
−  ｃ＝１ならば、Ｒ＝Ａの場合、Ｒは、Ｕ、Ｇ、Ｉ及びＣのうちの１つの塩基で作られ、
−  ｃ＞１ならば、Ｒは、以下の何れかの構成で、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｉ、及びＣのうちの少なくとも１つ又は２つの塩基で作られる：これらの塩基の少なくとも２つのランダムな組み合わせ、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｉ及びＣのうちの塩基の１つのブロック、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｉ及びＣのうちの異なる塩基の少なくとも２つのブロック、又はＡ、Ｕ、Ｇ、Ｉ及びＣのうちの塩基の少なくとも１つのブロック並びにＡ、Ｕ、Ｇ、Ｉ及びＣのうちの少なくとも１つの他の塩基の混合物；
−  Ｐ及びＲは、塩基及び／又は配列の長さに関して同一又は異なる場合がある）
によるＡの少なくとも１つのブロックを有し、ここで、前記ｄｓＲＮＡが、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも７０％のＡ及びＵを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ｄｓＲＮＡが、式（ＩＩ）：
［Ａ］ｂ
［Ｕ］ｂ
（式中、
ｂ＝５０〜２００、最良では約５５〜約１００、１５０又は２００、好ましくは、約６０〜約１２０、好ましくは約７０〜約１００の間、例えば、約６０、約７０、約８０、約９０である）
である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ｄｓＲＮＡが、式（ＩＩＩ）：
［Ｐ］ａ［Ａ］ｂ［Ｒ］ｃ
［Ｙ］ａ［Ｕ］ｂ［Ｚ］ｃ
（式中、
Ｐ及びＲが、Ｇ、Ｉ及び／又はＣの中から選択され、並びにＹ及びＺは、相補的な塩基である。
特に、
ｂ＝２０、２５又は３０〜１００の間、特に約３５〜約１００、特に約４０〜約１００、最良では約５０〜約１００、例えば、約５０〜約９０、好ましくは約５０〜約８０、例えば、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０の整数であり、
ａ及びｃが、独立して、約１０〜約５０、好ましくは約１５〜約４０である。）
である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項５】
前記ｄｓＲＮＡが、式（ＩＶ）：
［Ａ］ｂ［Ｒ］ｃ
［Ｕ］ｂ［Ｚ］ｃ
（式中、
Ｒが、Ｇ、Ｉ及び／又はＣの中から選択され、Ｚが、相補的な塩基である。
特に、
ｂ＝２０、２５又は３０〜１００の間、特に約３５〜約１００、特に約４０〜約１００、最良では約５０〜約１００、例えば、約５０〜約９０、好ましくは約５０〜約８０、例えば、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０の整数であり、
ｃ＝約１０〜約５０、好ましくは約１５〜約４０、好ましくは約３０〜約４０、例えば、約３５、約４０、約４５である）
である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項６】
前記ｄｓＲＮＡが、式（Ｖ）：
［Ｐ］ａ［Ａ］ｂ
［Ｙ］ａ［Ｕ］ｂ
（式中、
Ｐが、Ｇ、Ｉ及び／又はＣの中から選択され、Ｙが、相補的な塩基である。
特に、
ｂ＝２０、２５又は３０〜１００、特に約３５〜約１００、特に約４０〜約１００、最良では約５０〜約１００、例えば、約５０〜約９０、好ましくは約５０〜約８０、例えば、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０の整数であり、
ａ＝約１０〜約５０、好ましくは約１５〜約４０、好ましくは約３０〜約４０、例えば、約３５、約４０、約４５である。）
である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項７】
前記ｄｓＲＮＡが、式（ＶＩ）：
［Ｐ］ａ［Ａ］ｂ［Ｒ］ｃ
［Ｙ］ａ［Ｕ］ｂ［Ｚ］ｃ
（式中、
Ｐ及びＲが、Ｉ及びＣの中から独立して選択され、並びにＹ及びＺが、相補的な塩基であり、
ｂ＝約２０、２５又は３０〜約１００の間の整数であり、
ａ又はｃのうちの１つが、０であり得、並びにａ及びｃが、同時に０に等しくない場合、約１０〜約５０である。）
である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項８】
前記Ａのブロックが、２０、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％未満のＵ、Ｇ、Ｉ及びＣのうちの他の塩基を含む、請求項１〜７の何れか１項に記載の組成物。
【請求項９】
組成物１ｍｌ当たり０．０１〜１００ｍｇの前記ｄｓＲＮＡを含む、請求項１〜８の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
医薬としての、請求項１〜９の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
ＴＬＲ３受容体を発現する癌を治療する方法で使用するための請求項１〜９の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、骨髄細胞を活性化し、上皮癌細胞の死を誘発する、請求項１１に記載の使用のための組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、骨髄細胞によって発現されるＴＬＲ３を活性化し、炎症性サイトカイン及びケモカインの分泌を誘導し、ヒト又は哺乳動物の癌細胞における炎症及び死のＴＬＲ３依存性活性化を誘発する、請求項１１に記載の使用のための組成物。
【請求項１４】
前記組成物及び化学療法薬が、哺乳動物又はヒトへの同時、別個、又は連続投与用である、請求項１１〜１３の何れか１項に記載の使用のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリＡの少なくとも１つのブロックを含む一本鎖、及びポリＵの相補的なブロック、及び場合によってＡ、Ｕ、Ｇ、Ｉ又はＣのうちの他のヌクレオチドとのキメラ形態を含む２本の相補鎖を有する短く定義された二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含む医薬組成物に関する。本発明はまた、ＴＬＲ３陽性癌の治療に使用するためのそのような組成物、及び治療方法に関する。特に、ＴＬＲ３リガンドとして作用し、上皮細胞及び骨髄細胞の両方を活性化するｄｓＲＮＡに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＬＲ３は、主にエンドリソソームで発現するパターン認識受容体であり、ｄｓＲＮＡとの結合によりウイルス感染の検出に特化していると考えられている。実施に、ウイルスがゲノム材料（ｄｓＲＮＡウイルス）として、又はそのライフサイクルの中間体（ｓｓＲＮＡウイルス、ＤＮＡウイルス）として産生されるｄｓＲＮＡは、ＴＬＲ３を活性化することが示されている。さらに、組織破壊中に遊離したいくつかの脊椎動物の内因性ｄＳＲＮＡが、ＴＬＲ３を活性化することが分かっている。加えて、ＴＬＲ３も活性化する合成ｄｓＲＮＡが設計されている。それらには、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ポリ（Ａ：Ｕ）及びポリＩ：ポリＣ１２Ｕ（Ａｍｐｌｉｇｅｎ(登録商標)）等の変異体が含まれる。
【０００３】
ＴＬＲ３の野生型及び突然変異体を用いたＴＬＲ３結合アッセイ及びＴＬＲ３依存性シグナル伝達アッセイ、ｄｓＲＮＡ結合ＴＬＲ３での結晶学的研究及び野生型及びＴＬＲ３−／−マウスにおけるｄｓＲＮＡ応答のインビボ解析を含むｄｓＲＮＡを用いた広範な実験の全てが、ＴＬＲ３の活性化に必要な構造的特徴の解明に貢献した（Botos, I. et al., Biochim. Biophys. Acta 1789, 667-674, 2009）。ＴＬＲ３のアゴニストリガンドは、以下の機能を備えたｄｓＲＮＡである： （１）ｄｓＲＮＡは、イノシンを含み得る未修飾リボースで構成される必要がある； （２）正確な配列は重要ではない； （３）約５０ｂｐ（４８Å）の最小長は、シグナル伝達ユニットを表すホモダイマー中のＴＬＲ３の細胞外ドメイン上のＲＮＡ結合部位間の距離によって、制限されているように見える； （４）折り畳まれステムループ構造を形成する一本鎖ＲＮＡは、ＴＬＲ３を活性化することができる；（５）ｄｓＲＮＡは、シグナル伝達の最初の工程を表すＴＬＲ３二量体化を誘発する前に、最初に細胞内に、すなわち、スカベンジャー受容体の結合を介して、効率的に内在化される必要がある。ヒトＴＬＲ３に非常に特異的であると思われるポリ（Ａ：Ｕ）とは対照的に、ポリ（Ｉ：Ｃ）は、細胞質ゾルのｄｓＲＮＡ受容体ＲＩＧ−１、ＭＤＡ５、及びＰＫＲにも結合して活性化する。
【０００４】
癌及び他の疾患でＴＬＲ３を標的とすることの利益は、上皮細胞、骨髄細胞、間葉細胞及び内皮細胞等、様々な種類の細胞を組み合わせて活性化することで得られる可能性が最も高いと思われる。ヒト免疫細胞及び非免疫細胞は、ポリ（Ｉ：Ｃ）に反応して炎症性サイトカインを産生するか否かが示されていたが、これは、ヒトにおいてＴＬＲ３リガンド自体ではなく、細胞の種類に依存すると考えられていた。
【０００５】
ＴＬＲ３を対象としたｄｓＲＮＡを含む組成物が製品化されている。例えば、異なる長さのｄｓＲＮＡの混合物である市販のポリ（Ａ：Ｕ）組成物が存在し、その長さは一般的に２００〜８０００塩基対のオーダーである。
【０００６】
本発明の目的は、骨髄細胞及び上皮細胞の両方を活性化するために効率的であり、癌の細胞死をもたらす短いｄｓＲＮＡを産生することである。より具体的には、本目的は、骨髄細胞を活性化しかつ、上皮癌細胞の死を誘発することができるような短いｄｓＲＮＡを取得することである。
【０００７】
他の目的は、全てを網羅してはないが、全てのｄｓＲＮＡ分子が所定の構成を有しかつ、活性を有するものでない場合に、ｄｓＲＮＡ組成物を提案することであり、それにより、未決定の混合物を用いる場合に比べて、より容易に権限調節の必要条件を達成することができ、及びｄｓＲＮＡの用量が改善され得る。
【０００８】
さらに他の目的は、標的細胞に浸透するためのトランスフェクション剤を必ずしも必要としないｄｓＲＮＡを提案することである。
【０００９】
治療用の新規臨床用ＴＬＲ３リガンドを開発するために、発明者達は、骨髄細胞を活性化しかつ、上皮細胞の死を誘発する能力の両方について定義されたｄｓＲＮＡをスクリーニングし、これらの目的及び他の目的に対応することが可能なｄｓＲＮＡを記述することができた。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、ポリＡの少なくとも１つのブロック又はホモポリマー及び短く定義された長さのポリＵの相補的ブロックを含むｄｓＲＮＡ、特に、各鎖が、５０〜２００ヌクレオチド又は塩基を有するｄｓＲＮＡを含む組成物に関する。好ましくは、各鎖の長さは、約５５〜約１００、１５０又は２００塩基、特に約６０〜約７０、８０、９０又は１００塩基の間である。有利には、組成物中の全ての鎖又は実質的に全ての鎖は、所定の長さを有する。好ましくは、鎖及びｄｓＲＮＡは、合成である。
【００１１】
合成は、短く定義された長さのｄｓＲＮＡ鎖を産生する特権的な様式である。本発明のｄｓＲＮＡ鎖は、例えば合成によって得られる、合成ｄＳＲＮＡ鎖であり得る。慣例では、得られた鎖及びｄｓＲＮＡは、合成されたものとされている。異なる合成方法は、本願の他の箇所に記載されている。本発明による鎖の短く定義された長さは、本明細書で例示されるようなアクリルアミド上での電気泳動等の標準的な方法によって制御され得る。
【００１２】
合成方法は、有利には、本発明の短く定義されたｄｓＲＮＡを産生することを可能にし得る。これらの方法により、希望する正確な長さを有するｄｓＲＮＡを有利に産生することができる。これらの方法により、全ての鎖が同じ長さである、及び／又は全てのｄｓＲＮＡが同じ長さを有する鎖で構成される組成物を有利に産生することができる。しかしながら、いくつかの鎖の長さの特定の限定された変動は、鎖が合成によって産生されるか又は他の方法によって産生されるかにかかわらず、許容され得かつ、本発明による組成物に含まれ得る。特に、そのような変動は、組成物の機能又は有効性が実質的に変更されない限り、許容されかつ、包含される。一実施形態において、変形組成物は、依然として骨髄細胞を活性化しかつ、上皮細胞の死を誘発する。他の実施形態において、変形組成物は、依然として骨髄細胞を活性化しかつ、全ての鎖が同じ長さである、及び／又は全てのｄｓＲＮＡが同じ長さを有する鎖で構成される組成物と実質的に同じレベルで上皮癌細胞の死を誘発する。好ましくは、本発明の組成物は、有意かつ、効率的な割合、特に定義された長さを有する鎖の９５、９６、９７、９８、９９、又は９９．５以上の割合、又は約１００％の割合を含む。組成物は、それらのパーセンテージを含む定義された長さを有するそのような有意かつ、効率的な割合の鎖から本質的になるｄｓＲＮＡ有効成分を含むと言うことができる。
【００１３】
ｄｓＲＮＡにおいて、ポリＡ及びポリＵブロックは、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｉ、Ｃ、ポリＡ、ポリＵ、ポリＧ、ポリＩ又はポリＣ、並びに相補的ヌクレオチド又はブロックの間の１つ以上の塩基に組み合わせられ得る。例示的な構造は、１つの鎖に対するものである（次に、相補的な鎖がある）：ポリＡ−ポリＩ、ポリＡ−ポリＣ、ポリＩ−ポリＡ、ポリＣ−ポリＡ、ポリＩ−ポリＡ−ポリＩ、ポリＣ−ポリＡ−ポリＣ、ポリＡ−ポリＩ−ポリＡ、ポリＡ−ポリＣ−ポリＡ。
【００１４】
「ホモポリマー」とは、少なくとも２つの同一で隣接する塩基の配列を意味する。
【００１５】
従って、ポリＡ／Ｉ又はＡ／Ｃ、及びポリＵ／Ｃ又はＵ／Ｉのブロックで構成される相補鎖が包含される。それらは、ポリＡ／Ｉ：ポリＵ／Ｃ又はポリＡ／Ｃ：ポリＵ／Ｉとして指定され得る。特徴によると、ポリＡ／Ｉ又はポリＵ／Ｃ鎖は、５０〜約２００塩基を超える所定の長さを有する。好ましくは、前記鎖の長さは、約５５〜約２００塩基の間、特に約６０〜約１００塩基の間である。
【００１６】
鎖は、特に、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、ＡとＵ各々を含むＡ又はＵの１つ以上のブロック（好ましくは１つ又は２つ）を含み得る：そのようなブロックは、任意に、Ａ（Ｑ＝Ａの場合）／Ｕ（Ｑ＝Ａの場合）、Ｇ、Ｉ及びＣの中で２０、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％未満の他の塩基を含み得る。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、以下の式（Ｉ）（１つの鎖のみが示される）に従い、特にＡ又はＵの少なくとも１つのブロックを含む少なくとも１つの鎖を有する５０ｂｐ〜約２００ｂｐ（最良は、約５５〜約１００、１５０又は２００、好ましくは約６０〜約１２０、好ましくは約７０〜約１００の間、例えば、約６０、約７０、約８０、約９０）、並びに相補鎖（従って、ＵとＡ各々の相補的なブロックを有する）を含む長さのｄｓＲＮＡを利用するものであり、ここで、ｄｓＲＮＡは、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも７０又は７５％（又はちょうど少なくとも８０、８５、９０又は９５％）のＡ及びＵを含む：
（Ｉ）  ［Ｐ］ａ［Ｑ］ｂ［Ｒ］ｃ
（式中、
−  Ｑは、Ａ又はＵのホモポリマーを表し、ｂは、少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、又はそれ以上の整数であり；そのようなブロックは、任意に、Ａ（Ｑ＝Ａの場合）／Ｕ（Ｑ＝Ａの場合）、Ｇ、Ｉ及びＣの中で２０、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％未満の他の塩基を含み得る；
−  ａ、ｂ及びｃは、塩基又はヌクレオチドの数を表すため、ａ＋ｂ＋ｃは、鎖又はｄｓＲＮＡの長さを表す；
−  ａ及びｃは、独立して、０又はａ＋ｂ＋ｃ＝５０〜２００、好ましくは６０〜１２０、より好ましくは７０〜１００の間のような整数であり得る；ａ、ｂ及びｃは、同一又は異なる場合がある；
−  ａ＝１ならば、Ｑ＝Ａの場合において、Ｐは、Ｕ、Ｇ、Ｉ及びＣのうち１つの塩基から構成され；相補性の結果、Ｑ＝Ｕの場合において、Ｐは、Ａ、Ｇ、Ｉ及びＣのうち１つの塩基から構成される；
−  ａ＞１ならば、Ｐは、次の何れかの構成で、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｉ及びＣのうち少なくとも１つ又は２つの塩基から構成される：これらの塩基の少なくとも２つのランダムな組み合わせ、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｉ及びＣの中の塩基の１つのブロック、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｉ及びＣの中の異なる塩基の少なくとも２つのブロック、又はＡ、Ｕ、Ｇ、Ｉ及びＣの中の塩基の少なくとも１つのブロック及びＡ、Ｕ、Ｇ、Ｉ及びＣ中の少なくとも１つの他の塩基の混合物；
−  ｃ＝１ならば、Ｒ＝Ａの場合において、Ｒは、Ｕ、Ｇ、Ｉ及びＣの中の１つの塩基で構成され；相補性の結果、Ｒ＝Ｕの場合において、Ｐは、Ａ、Ｇ、Ｉ及びＣの中の塩基の１つで構成される；
−  ｃ＞１ならば、Ｒは、次の何れかの構成で、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｉ及びＣ中の少なくとも１つ又は２つの塩基で構成される：これらの塩基の少なくとも２つのランダムな組み合わせ、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｉ及びＣの中の塩基の１つのブロック、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｉ及びＣの中の異なる塩基の少なくとも２つのブロック、又はＡ、Ｕ、Ｇ、Ｉ及びＣの中の塩基の少なくとも１つのブロック及びＡ、Ｕ、Ｇ、Ｉ及びＣ中の少なくとも１つの他の塩基の混合物；
−  Ｐ及びＲは、塩基及び／又は配列の長さに関して同一又は異なる場合がある。）
【００１８】
変形において、式（Ｉ）におけるｂは、少なくとも１０の整数である。
【００１９】
Ｑ＝Ａ又はＵである式（Ｉ）において、ｂは、特に約３５〜約２００、特に約５０〜約２００、最良には約５５〜約１００、１５０又は２００、好ましくは約６０〜約１２０、好ましくは、約７０〜約１００、例えば、約６０、約７０、約８０、約９０であり得る。ポリＡのブロックは、Ｕ、Ｇ、Ｉ及びＣ中で２０、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％未満の他の塩基が含まれ得る。ポリＵのブロックは、それを補完し、対応するＡ、Ｇ、Ｉ及び／又はＣを含む。
【００２０】
上記の式（Ｉ）の実施形態及び以下のその実施形態において、ポリＡのブロック又はポリＡのブロック類は、Ｕ、Ｇ、Ｉ及びＣ中で２０、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％未満の他の塩基が含まれ得る。従って、対応するポリＵのブロック又はポリＵのブロック類は、相補的でありかつ、Ａ、Ｇ、Ｉ及びＣの中の塩基対を有する。
【００２１】
他の実施形態において、式（Ｉ）は、ポリＡ：ポリＵを形成する。その場合、例えば、ａ＝ｃ＝０、Ｑ＝Ａ及びｂが少なくとも５０、又は少なくとも約５０、特に約５０〜約２００、最良では約５５〜約１００、１５０又は２００、好ましくは約６０〜約１２０、好ましくは約７０〜約１００の間、例えば、約６０、約７０、約８０、約９０であることが十分である。
【００２２】
本発明はまた、Ｏ−メチル化ヌクレオチド、ホスホロチオエートヌクレオチド等のＡ、Ｕ、Ｉ、Ｇ、Ｃの修飾ヌクレオチドの使用を包含する。
【００２３】
他の実施形態において、式（Ｉ）は、ポリＰ−ポリＡ−ポリＲを形成する。相補鎖は、ポリＰ’−ポリＵ’−ポリＲ’であり、Ｐ’及びＲ’はそれぞれＲの位置でＰの相補的な塩基又は塩基類である。
【００２４】
他の実施形態において、式（Ｉ）は、ポリＡ−ポリＸ−ポリＡを形成し、ここで、Ｘは、Ｕ、Ｇ、Ｉ、Ｃ、ポリＵ、ポリＧ、ポリＩ、ポリＣ又はそれらの何れかの組み合わせを表し、場合によってＡ又はポリＡ挿入を有する。相補鎖は、ポリＵ−ポリＹ−ポリＵであり、Ｙはその位置にあるＸの相補塩基又は相補塩基類である。
【００２５】
他の実施形態において、式（Ｉ）は、ポリＰ−ポリＡを形成する。相補鎖は、ポリＰ’−ポリＵであり、Ｐ’はその位置にあるＰの相補塩基又は相補塩基類である。
【００２６】
他の実施形態において、式（Ｉ）は、ポリＡ−ポリＲを形成する。相補鎖は、ポリＵ−ポリＲ’であり、Ｒ’はその位置にあるＲの相補塩基又は相補塩基類である。
【００２７】
以下の実施形態の式において、ａ、ｂ及びｃは、上記と同じ意味を有し得る。Ａ及びＵは、塩基Ａ及びＵを示す。
【００２８】
第１の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、式（ＩＩ）のものである：
［Ａ］ｂ
［Ｕ］ｂ
【００２９】
特に、ｂ＝５０〜２００、最良では約５５〜約１００、１５０又は２００、好ましくは約６０〜約１２０、好ましくは約７０〜約１００の間、例えば、約６０、約７０、約８０、約９０である。
【００３０】
第２の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、式（ＩＩＩ）のものである：
［Ｐ］ａ［Ａ］ｂ［Ｒ］ｃ
［Ｙ］ａ［Ｕ］ｂ［Ｚ］ｃ
【００３１】
Ｐ及びＲは、Ｇ、Ｉ及び／又はＣの中から独立して選択され、並びにＹ及びＺは、相補的な塩基である。
【００３２】
特に、
ｂ＝２０、２５又は３０〜１００、特に約３５〜約１００、特に約４０〜約１００、最良では約５０〜約１００、例えば、約５０〜約９０、好ましくは約５０〜約８０、例えば、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０の整数であり、
ａ及びｃは、独立して約１０〜約５０、好ましくは約１５〜約４０である。
【００３３】
特に、
ｂ＝１０、１５、２０、２５又は３０〜１００、特に約３５〜約１００、特に約４０〜約１００、最良では約５０〜約１００、例えば、約５０〜約９０、好ましくは約５０〜約８０、例えば、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０の整数であり、
ａ及びｃは、独立して約５〜約５０、好ましくは約１５〜約５０であり、好ましくは約１５〜約４０である。
【００３４】
特に、
ｂ＝は、１０〜１００の間の整数であり、
ａ及びｃは独立して約１０〜約５０、好ましくは約１５〜約４０である。
【００３５】
特に、
ｂ＝１０、１５、２０、２５又は３０〜１００の間の整数、特に約３５〜約１００、特に約４０〜約１００、最良では約５０〜約１００、例えば、約５０〜約９０、好ましくは約５０〜約８０、例えば、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０であり、
ａ及びｃは、独立して約１０〜約５０である。
【００３６】
第３の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、式（ＩＶ）のものである：
［Ａ］ｂ［Ｒ］ｃ
［Ｕ］ｂ［Ｚ］ｃ
【００３７】
Ｒは、Ｇ、Ｉ及び／又はＣの中から選択され、Ｚは相補塩基である。
【００３８】
特に、
ｂ＝２０、２５又は３０〜１００の間の整数、特に約３５〜約１００、特に約４０〜約１００、最良では約５０〜約１００、例えば、約５０〜約９０、好ましくは約５０〜約８０、例えば、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０であり、
ｃ＝約１０〜約５０、好ましくは約１５〜約４０、好ましくは約３０〜約４０、例えば約３５、約４０、約４５である。
【００３９】
特に、
ｂ＝１０、１５、２０、２５又は３０〜１００の間の整数、特に約３５〜約１００、特に約４０〜約１００、最良では約５０〜約１００、例えば、約５０〜約９０、好ましくは約５０〜約８０、例えば、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０であり、
ｃ＝約１０〜約５０、好ましくは約１５〜約４０、好ましくは約３０〜約４０、例えば約３５、約４０、約４５である。
【００４０】
特に、
ｂ＝１０〜１００の間の整数、又は約３５〜約１００であり、
ｃ＝約３０〜約５０、好ましくは約３０〜約４０、例えば約３５、約４０、約４５である。
【００４１】
特に、
ｂ＝１０、１５、２０、２５又は３０〜１００の間の整数、特に約３５〜約１００、特に約４０〜約１００、最良では約５０〜約１００、例えば、約５０〜約９０、好ましくは約５０〜約８０、例えば、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０であり、
ｃ＝約１０〜約５０である。
【００４２】
第４の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、式（Ｖ）のものである：
［Ｐ］ａ［Ａ］ｂ
［Ｙ］ａ［Ｕ］ｂ
【００４３】
Ｐは、Ｇ、Ｉ及び／又はＣの中から選択され、Ｙは、相補的塩基である。
【００４４】
特に、
ｂ＝２０、２５又は３０〜１００の間の整数、特に約３５〜約１００、特に約４０〜約１００、最良では約５０〜約１００、例えば、約５０〜約９０、好ましくは約５０〜約８０、例えば、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０であり、
ａ＝約１０〜約５０、好ましくは約１５〜約４０、好ましくは約３０〜約４０、例えば約３５、約４０、約４５である。
【００４５】
特に、
ｂ＝１０〜１００の間の整数、特に約３５〜約１００、特に約４０〜約１００、最良では約５０〜約１００、例えば、約５０〜約９０、好ましくは約５０〜約８０、例えば、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０であり、
ａ＝約１０〜約５０、好ましくは約１５〜約４０、好ましくは約３０〜約４０、例えば約３５、約４０、約４５である。
【００４６】
特に、
ｂ＝１０〜１００の間の整数、特に約３５〜約１００であり、
ａ＝約３０〜約５０、好ましくは約３０〜約４０、例えば約３５、約４０、約４５である。
【００４７】
特に、
ｂ＝１０〜１００の間の整数、特に約３５〜約１００、特に約４０〜約１００、最良では約５０〜約１００、例えば、約５０〜約９０、好ましくは約５０〜約８０、例えば、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０であり、
ａ＝約１０〜約５０である。
【００４８】
一実施形態において、ｄｓＲＮＡは、式（ＶＩ）のものである：
［Ｐ］ａ［Ａ］ｂ［Ｒ］ｃ
［Ｙ］ａ［Ｕ］ｂ［Ｚ］ｃ
【００４９】
Ｐ及びＲは、Ｉ及びＣの中から独立して選択され、並びにＹ及びＺは、相補的な塩基であり、
ｂ＝約２０、２５又は３０〜約１００の間の整数であり、ａ又はｃのいずれかが０であり、ａ及びｃが同時に０に等しくない場合、約１０〜約５０である。
【００５０】
これら式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）の実施形態において、ポリＡのブロック若しくはホモポリマー又はポリＡのブロック類若しくはホモポリマー類は、Ｕ、Ｇ、Ｉ及びＣの間の他の塩基の２０、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％未満を含み得る。当然ながら、Ｕの相補的ブロックは、相補的な塩基を統合する。
【００５１】
好ましい実施形態において、組成物は、ポリＡ／Ｉ鎖及びポリＵ／Ｃ鎖を含み、ここで、両方の鎖は、５０〜約２００塩基を超える同じ所定の長さを有する。好ましくは、両方の鎖の長さは、約５５〜約２００、特に約６０〜約１００塩基である。例えば、両方の鎖は、それぞれ、約６０、７０、８０、９０又は１００塩基を有する。
【００５２】
「二本鎖」という用語は、リボヌクレオチドが相補的なリボヌクレオチドに水素結合して（塩基対）二本鎖構造を形成する部分を意味する。両方の鎖が対になっている場合、重複すると言ってもよい。好ましくは、鎖全体が対になっている（相補鎖の１００％が対になっている）。しかしながら、本発明は、対になった鎖長の少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は９９．５％を有するｄｓＲＮＡを包含する（二本鎖構造）。同じ組成物において、ペアリングの異なる％のｄｓＲＮＡを有することが可能である。ｄｓＲＮＡ ＴＬＲ３アゴニストの何パーセントが二本鎖構造にあるかの決定は、塩基対になっているヌクレオチドの数を分子内のヌクレオチドの総数で割ることによって達成される。従って、３’及び５’末端の両方に２ヌクレオチドのオーバーハングを含む２１塩基対の分子は、塩基対の４２ヌクレオチドと塩基対ではない４ヌクレオチドを有し、４２／４６又は９１．３％の二本鎖又は対となる。
【００５３】
ｄｓＲＮＡのバッチの適合性は、既知の手段によって制御され得る。一例として、アクリルアミドゲルを用いた実施例１及び１０に記載の方法が挙げられる。
【００５４】
好ましくは、本発明の組成物は、９５、９６、９７、９８、９９又は９９．５％を超える対を有する、又は完全に（約１００％）対を有するｄｓＲＮＡのセット、例えばポリＡ／Ｉ鎖及びポリＵ／Ｃ鎖を含むｄｓＲＮＡを含み、ここで、両方の鎖は、５０〜約２００塩基を超える同じ所定の長さを生ウシ、好ましくは、両方の鎖の長さは、約５５〜約２００塩基、特に約６０〜約１００塩基の間である。例えば、両方の鎖は、それぞれ約６０、７０、８０、９０又は１００塩基を有する。
【００５５】
組成物は、医薬的に許容されるビヒクル、担体又は賦形剤をされに含み得る。一実施形態において、組成物は、無菌である。
【００５６】
本発明において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」又は「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」に置き換えられ得る。
【００５７】
本発明の目的は、医薬等の組成物である。
【００５８】
本発明の他の目的は、ＴＬＲ３受容体を発現するヒト又は動物の癌を治療する方法で使用するためのような組成物である。
【００５９】
本発明の他の目的は、医薬として使用するためのような組成物である。
【００６０】
他の目的は、ＴＬＲ３受容体を発現するヒト又は動物の癌を治療するための医薬の製造のためのこの組成物の使用である。
【００６１】
組成物に含まれるｄｓＲＮＡは、ＴＬＲ３受容体のアゴニストとして機能する。
【００６２】
一実施形態において、組成物は、ヒト又は動物の骨髄細胞に炎症を誘発する。
【００６３】
一実施形態において、組成物は、例えば、ヒト又は動物の骨髄細胞によるＴＮＦ−アルファ及び／又はＩ型インターフェロンの産生を誘導する。
【００６４】
一実施形態において、組成物は、上皮癌細胞の死を誘発する。
【００６５】
一実施形態において、組成物は、炎症及び癌細胞死の両方を誘発する。
【００６６】
本発明の他の目的は、特にＴＮＦ−アルファ産生及びＩＳＲＥ−レポーター遺伝子活性を伴う、ヒト又は動物の骨髄細胞を活性化し、上皮癌細胞の死を誘発する医薬等の組成物のようなものである。
【００６７】
本発明の他の目的は、骨髄細胞（マクロファージ及び樹状細胞）によって発現されるＴＬＲ３を特異的に活性化し、炎症性サイトカインの分泌を誘導し、及びヒト又は哺乳動物の癌細胞における炎症及び死のＴＬＲ３依存性活性化を誘発する医薬等の組成物のようなものである。
【００６８】
他の目的は、本発明によるｄｓＲＮＡ及びＴＬＲ３を発現する癌を治療する方法において使用するための、本発明によるｄｓＲＮＡ及び化学療法剤を哺乳類又はヒトに対し、同時に、別々に、又は連続して投与するための化学療法剤を含む医薬組成物である。
【００６９】
本発明の他の目的は、治療を必要とする患者の癌を治療するための方法である。当該方法は、本明細書に記載の十分な量の組成物の投与を含む。
【００７０】
一実施形態において、当該方法は、骨髄細胞を活性化する。
【００７１】
一実施形態において、当該方法は、骨髄細胞によるＴＮＦ−アルファの産生を誘導する。
【００７２】
一実施形態において、当該方法は、ＴＬＲ３の下流のＮＦ−Ｋｂ及びＩＳＲＥ−依存性シグナル伝達経路を誘発する。
【００７３】
一実施形態において、当該方法は、上皮癌細胞の死を誘発する。
【００７４】
一実施形態において、当該方法は、特にＴＮＦ−アルファ産生を伴う骨髄細胞を活性化し、上皮癌細胞の死を誘発する。
【００７５】
一実施形態において、当該方法は、骨髄細胞（マクロファージ及び樹状細胞）によって発現されるＴＬＲ３を特異的に活性化し、炎症性サイトカインの分泌を誘導し、ヒト又は哺乳動物の癌細胞においてＴＬＲ３−依存性の炎症及び死を誘発する。
【００７６】
［発明の詳細な説明］
本発明者達は、様々な塩基組成、二本鎖上のヌクレオチドの分布、及びＲＡＷマウスマクロファージ細胞系統によるＴＮＦ−アルファ産生を誘発する能力を有する配列を有する一連の合成ｄｓＲＮＡをスクリーニングした。試験した最初の４７個のｄｓＲＮＡを表１に示す。市販のポリ（Ａ：Ｕ）及びネイティブアクリルアミドゲルで９個の３４５、３９７、３９８、４１５、４１８、４０５、４１１、４１２、４１３配列の分析は、異なる長さのｄｓＲＮＡの混合物である市販のポリ（Ａ：Ｕ）とは対照的に、単一の主要なバンドが、各合成５０ｂｐ ｄｓＲＮＡの予想サイズで検出可能であることを示す（図１）。４７個の合成ｄｓＲＮＡをマウスマクロファージＲａｗ細胞によるＴＮＦ−アルファの産生を活性化する能力についてテストした際、効果的なものは確認できなかったが、市販の高分子量ポリ（Ａ：Ｕ）と同じくらい効果的な５０ｂｐのポリ（Ａ：Ｕ）配列（以下、配列４１２と称する）が確認された。従って、配列４１２は、マクロファージによって効率的に内在化され、ＴＬＲ３の下流のＮＦ−Ｋｂシグナル伝達経路を誘発することが可能である。注目すべきは、５０ｂｐのポリ（Ａ：Ｕ）のＡｓ及びＵｓが二本鎖上で分布されている場合（配列４１３）、ＴＮＦ−アルファの分泌は、観察されなかった。意外なことに、５０ｂｐのポリ（Ｉ：Ｃ）（配列４１１）は、ＴＮＦ−アルファの産生を誘発することができなかった。
【００７７】
次に、本発明者達は、ＴＬＲ３ ＷＴ及びＴＬＲ３ ＫＯヒト非小細胞癌上皮細胞ＮＣＩ−Ｈ２９２の死を誘発する配列４１２の能力を評価した。トランスフェクション剤がない場合、配列４１２は、炎症反応（図３）もＨＣｌ−Ｈ２９２細胞の死（図４）も活性化できなかった。従って、マクロファージとは対照的に、配列４１２は、内在化されていないか、又はＮＦ−ｋＢ ＴＬＲ３シグナル伝達経路の活性化も上皮癌細胞の死も誘発できなかった。
【００７８】
次に、７０ｂｐ（配列４３２）及び９０ｂｐ（配列４５２）のポリ（Ａ：Ｕ）を使用した。繰り返して説明すると、これら合成配列は、両方とも、ネイティブアクリルアミドゲルでの分析の際に単一の主要なバンドを示す（図５）。配列４３２及び４５２は、ＴＮＦ−アルファの産生及びＩＳＲＥ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性化（図７）によって示されるように、Ｒａｗ細胞の炎症反応を誘発することに配列４１２と同じくらい効率的であった。さらに、配列４３２及び４５２は、トランスフェクション剤を使用しないヒト癌細胞ＮＣＩ−Ｈ２９２のＴＬＲ３−依存性炎症（図８）及びアポトーシス応答（図９）を予期せず誘発した。
【００７９】
本発明者たちはさらに、６０ｂｐ（配列４２２）及び８０ｂｐ（配列４４２）のポリ（Ａ：Ｕ）、３つのキメラ７０ｂｐポリＡ／Ｉ：Ｕ／Ｃ：１０ポリ（Ｉ：Ｃ）に続く５０ポリ（Ａ：Ｕ）に続く１０ポリ（Ｉ：Ｃ）の配列（配列Ｉ１０Ａ５０Ｉ１０）（５３２）、３５ポリ（Ａ：Ｕ）に続く３５ポリ（Ｉ：Ｃ）（配列Ａ３５Ｉ３５）（５３３）、１０ポリ（Ａ：Ｕ）に続く５０ポリ（Ｉ：Ｃ）に続く１０ポリ（Ａ：Ｃ）（配列Ａ１０Ｉ５０Ａ１０）（５３４）、及び７０ｂｐのポリ（Ｉ：Ｃ）（５３５）をテストした（表２）。この場合も、ネイティブアクリルアミドゲルでの分析で、各合成ｄｓＲＮＡの予想されたサイズで単一の主要なバンドを示す（図１０）。
【００８０】
（１）７０ｂｐのキメラ５３２及び５３３は、Ｒａｗ細胞によるｍＴＮＦａの分泌を誘導することに最も強力であり（図１１）、及び（２）ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞によるＩＬ−６の分泌を誘発することに両方とも非常に有効であり（図１２）；（３）さらに、それらは、７０ｂｐのポリ（Ａ：Ｕ）と同様にＮＣＩ−Ｈ２９２細胞を死滅させることに有効であった（図１３）、ことが観察された。注目すべきことに、７０ｂｐのポリ（Ｉ：Ｃ）（５３５）もＩ：Ｃリッチキメラ７０ｂｐのｄｓＲＮＡ（５３４）も、Ｒａｗ細胞によるＴＮＦ−アルファの分泌を有意に活性化しなかった（図１１）。
【００８１】
従って、本発明により明確に定義された合成ポリ（Ａ：Ｕ）、例えば、５３２及び５３３配列等の７０ｂｐ及び８０ｂｐ、及び７０ｂｐのＡ：Ｕリッチキメラ配列は、骨髄細胞を活性化して炎症性サイトカインの分泌を誘導し、ＴＬＲ３−依存し得の炎症活性化及び癌細胞の死を誘発する両方の独自の能力を有する。
【００８２】
ｄｓＲＮＡ４２２、４３２、４４２、４５２、５３２及び５３３は、本発明によるｄｓＲＮＡの好ましい例である。他の例は、以下の通りである（ＵとＡのぞれぞれで相補鎖Ｃ又はＩを有する）：
５’（Ｉ）１０−（Ｕ）５０−（Ｉ）１０ ３’
５’（Ａ）６０−（Ｉ）１０ ３’
５’（Ａ）５０−（Ｉ）２０ ３’
５’（Ａ）２０−（Ｉ）５０ ３’
５’（Ｉ）５−（Ａ）６０−（Ｉ）５ ３’
５’（Ｉ）１５−（Ａ）４０−（Ｉ）１５ ３’
５’（Ｉ）２０−（Ａ）３０−（Ｉ）２０ ３’
５’（Ｉ）２５−（Ａ）２０−（Ｉ）２５ ３’
５’（Ｉ）５−（Ａ）５０−（Ｉ）１５ ３’
５’（Ｉ）１３−（Ａ）６４−（Ｉ）１３ ３’
５’（Ｉ）１０−（Ａ）７０−（Ｉ）１０ ３’
【００８３】
他のさらなる例は、以下の通りである（ＵとＡのぞれぞれで相補鎖Ｃ又はＩを有する）：
５’（Ａ）１０−（Ｉ）６０ ３’
５’（Ｉ）３０−（Ａ）１０−（Ｉ）３０ ３’
【００８４】
従って、本発明は、これらの語句亭のｄｓＲＮＡの１つを、前記組成物に含まれるｄｓＲＮＡの固有の集団として、又は有意かつ、効率的な割合、特に組成物に含まれる総ｄｓＲＮＡの９５、９６、９７、９８、９９、又は９９．５以上の割合を含む組成物に関する。
【００８５】
定義
互換的に使用される「ＴＬＲ３」、「ＴＬＲ３タンパク質」、及び「ＴＬＲ３受容体」は、本明細書において、トール（Ｔｏｌｌ）様受容体（ＴＬＲ）ファミリーのメンバーであるトール様受容体３を指すために使用される。そのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ７０９８に示される。トール様受容体３は、病原体の認識及び自然免疫の活性化の基本的な役割を担うトール様受容体（ＴＬＲ）ファミリーのメンバーである。この受容体は、胎盤及び膵臓で最も豊富に発現しており、白血球の樹状細胞亜集団に限定される。ウイルス感染に関するｄｓＲＮＡを認識し、ＮＦ−ｋＢの活性化及びＩ型インターフェロンの産生を誘導する。
【００８６】
「癌」とは、体内の異常細胞の成長、分裂、又は増殖を意味する。特に、対象となる癌は、ＴＬＲ３を発現する癌である。癌細胞におえるＴＬＲ３発現の決定は、当該技術分野の当業者の行える範囲であり、免疫組織化学、ウェスタンブロット、又は定量的ＰＣＲ（例えば、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ(登録商標)Ｓｙｓｔｅｍ等を用いる）等の当業者が利用できる何れかの方法によって測定され得る。さらに特に、本発明の対象となる癌は、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肝細胞癌、神経芽細胞腫、頭頚部癌、卵巣癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、頸部癌、膵臓癌、食道癌、胃癌、小腸癌、結腸癌、又は黒色腫及び中皮種若しくは肉腫等の間葉系の癌、及びより具体的には非小細胞肺癌から選択される。
【００８７】
本明細書で使用される場合、「対象」又は「患者」という用語は、本明細書に記載の１つ以上の疾患及び病状に罹患している、又は罹患する可能性がある、哺乳動物、動物又はヒト、特にヒト等の温血動物を指す。
【００８８】
本明細書で使用される「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療される（ｔｒｅａｔｅｄ）」又は「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、症状を排除又は軽減することを目的とする治療処置を指す。有益な又は望ましい臨床結果には、限定されないが、症状の除去、症状の緩和、病状の程度の減少、病状の安定した（すなわち、悪化しない）状態、病状の進行の遅延又は緩徐化、疾患又は障害、又はそれらの１つ以上の症状の発症、再発又は拡大の予防が含まれる。特定の実施形態において、これらの用語は、症状の発症前に本明細書で提供される化合物による治療又は投与を指す。これらの用語は、特定の疾患の症状の抑制又は軽減を包含する。特に疾患の家族歴を有する対象は、特定の実施形態における治療計画の候補である。また、特定の疾患の遺伝的素因が示されている対象は、特定の実施形態における治療計画の対象である。加えて、再発症状の既往歴を有する対象も処置の候補となる。この点に関して、「治療」という用語は、「予防的治療（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語と互換的に使用され得る。
【００８９】
本明細書に記載の疾患及び病状の治療を必要としている対象の特定は、当業者の能力及び知識の範囲内である。当該技術分野の臨床医は、臨床試験、身体検査、及び病歴／家族歴を用いることにより、その治療を必要としている対象を容易に特定することができる。
【００９０】
本明細書で用いられる場合、「医薬的に許容される賦形剤」は、必要に応じて哺乳動物、特にヒトに投与されたときに、有害、アレルギー又は他の有害な反応を生じない分子実体及び組成物を指す。医薬的に許容される賦形剤は、非毒性の固体、半固体又は液体の充填剤、希釈剤、カプセル化剤、又は何れかのタイプの製剤補助剤を指す。
【００９１】
本開示の目的のために、同じ時間に（例えば同時に）投与することは、同じ製剤又は別々の製剤で一緒に薬物を投与することを指し、ここで、投与は、数分〜数時間離れている場合があるが、１日以内である。本明細書で用いられる場合、異なる時間に（例えば、連続して）投与することは、併用療法の薬物を数時間から数日、数週間、さらには数か月間隔で投与することを指す。従って、特定の実施形態において、併用療法を受けている対象は、治療を受けている対象に両薬剤の組み合わせの治療効果が生じる限り、両薬剤を同じ時間に（例えば、同時に）又は異なる時間に（例えば、順次、何れかの順序で、同じ日に、又は異なる日に）受けることができる。いくつかの実施形態において、薬剤の組み合わせは、１回の投与で同時に投与されるが、他の投与は、連続投与、何れかの順序で、同じ日に、又は異なる日を含む。２つの薬物が、同時に投与される場合、それらは、それぞれが組み合わせの何れかの薬物を含む別個の医薬組成物として投与され得、又はこれらの薬物の両方を含む単一の医薬組成物として投与され得る。
【００９２】
ＴＬＲ３アゴニスト製剤及び送達システム
ＴＬＲ３アゴニストとは、本明細書において、別段の定めが無い限り、本発明によるｄｓＲＮＡを意味する。
【００９３】
好ましくは、ＴＬＲ３アゴニストは、医薬的に許容される組成物に製剤化される。本明細書に記載の医薬的に許容される組成物は、医薬的に許容される担体、アジュバント及び／又はビヒクルをさらに含む。使用され得る医薬的に許容される担体、アジュバント及びビヒクルは、限定されないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミン等の血清タンパク質、リン酸塩等の緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩又は電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール及び羊毛脂を含む。
【００９４】
医薬組成物は、経口、直腸、経鼻、局所（頬側及び舌下を含む）、膣又は非経口（皮下、筋肉内、静脈内及び皮内を含む）投与に適したものを含む。特定の実施形態において、本明細書の製剤の化合物は、経皮的に投与される（例えば、経皮パッチ又はイオントフォレーシス（ｉｏｎｔｏｐｈｏｒｅｔｉｃ）技術を使用して）。他の製剤は、単位剤形、例えば、錠剤及び徐放性カプセル、及びリポソームで都合よく提供され得、薬学分野で周知の何れかの方法によって調製され得る。例えば、以下の文献を参照（Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA (17th ed. 1985)）。そのような調製方法は、１つ以上の副成分を構成する担体等の成分を投与される分子と会合させる工程を含む。一般的に、組成物は、有効成分を液体担体、リポソーム、又はナノ粒子を含む細かく分割された固体担体、あるいはその両方と均一かつ、密接に結合させ、次に必要に応じて産物を成形することによって調製される。
【００９５】
特定の実施形態において、組成物は、腫瘍に投与される。組成物は、表面に適用することができ、例えば、腫瘍部位での長時間の接触のためにゲル又はパッチ等の適切な製剤を使用するか、又は例えば、インプラントを使用し腫瘍塊内において、又は例えば、本明細書に記載の注射可能な組成物を使用し、腫瘍に注入され得る。
【００９６】
特定の好ましい実施形態において、化合物は、経口投与される。経口投与に適した組成物は、それぞれが所定量の有効成分を含むカプセル、サシェ又は錠剤等の個別の単位として；粉末又は顆粒として；水性液体又は非水性液体中の溶液又は懸濁液として；又は水中油型液体エマルジョン又は油中水型液体エマルジョンとして、又はリポソームに包含され、及びボーラス等として、提供され得る。ソフトゼラチンカプセルは、そのような懸濁液を含むのに有用であり得、これは、化合物の吸収速度を有利に増加させる。
【００９７】
錠剤は、圧縮又は成形により製造されてもよく、任意に１つ以上の副成分を含んでもよい。圧縮錠剤は、適切な機械で、粉末又は顆粒等の自由流動形態の有効成分を、任意に、結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、防腐剤、界面活性剤又は分散剤と混合して圧縮することによって調製され得る。成形錠剤は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化合物の混合物を適切な機械で成形することによって製造され得る。錠剤は、任意に、コーティング又はスコアリングすることができ、その中の有効成分の徐放又は制御放出を提供するように製剤化され得る。本明細書に記載された化合物及び当該技術分野で知られている他の化合物等の医薬活性成分のそのような徐放性又は制御放出組成物を製剤化する方法は、当該技術分野で周知であり、いくつかは刊行済の米国特許に記載されており、そのいくつかは、限定されないが、ＵＳ４，３６９，１７２及びＵＳ４，８４２，８６６を含む。コーティングは、化合物を腸に送達するために使用され得る（例えば、米国特許６，６３８，５３４、５，２１７，７２０、及び６，５６９，４５７、６，４６１，６３１、６，５２８，０８０、６，８００，６６３を参照）。
【００９８】
経口用錠剤の場合、一般的に使用される担体は、乳糖及びコーンスターチを含む。ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤も通常加えられる。カプセル形態での経口投与の場合、有用な希釈剤は、ラクトース及び乾燥コーンスターチを含む。水性懸濁液を経口投与する場合、有効性分は、乳化剤及び／又は懸濁剤と組み合わせられる。必要に応じて、特定の甘味料及び／又は香味料及び／又は着色剤が加えられ得る。ラウリル硫酸ナトリウム等の界面活性剤は、溶解及び吸収を高めるために役立ち得る。
【００９９】
特定の実施形態において、組成物は、抗体、他のタンパク質又はペプチド、脂質又は糖、又は他の受容体リガンド等の他の分子と共有結合しているか、又は共有結合していないかの何れかである。
【０１００】
経口投与に適した組成物は、通常スクロース及びアカシア又はトラガカンス等のフレーバーベースの成分を含むロゼンジ；並びにゼラチン及びグリセリン、又はショ糖及びアカシア等の不活性ベースで有効成分を含むパスティルを含む。
【０１０１】
特定の実施形態において、組成物は、ナノ粒子と共有結合しているか、又は結合していないかの何れかである。
【０１０２】
非経口投与に適した組成物は、抗酸化剤、緩衝剤、細菌発育阻止因子（ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔ）及び製剤を対象の受領者の血液と等張にする溶質；及び懸濁剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性無菌懸濁液を含み得る。製剤は、単位用量又は複数用量容器、例えば、密封されたアンプル及びバイアルで提供され得、使用直前に無菌液体担体、例えば、注射用の水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存され得る。即席注射液及び懸濁液は、無菌の粉末、顆粒及び錠剤から調製され得る。そのような注射液は、例えば、無菌注射可能な水性懸濁液又は油性懸濁液の形態であり得る。この懸濁液は、適切な分散剤又は湿潤剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０）及び懸濁剤を使用して当該技術分野で知られている技術によって製剤化され得る。また、無菌注射可能な調製物は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の無菌注射可能な溶液又は懸濁液であってもよく、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液としてもよい。許容され得るビヒクル及び溶媒としては、マンニトール、水、リンゲル溶液、及び等張性塩化ナトリウム溶液が挙げられ得る。加えて、無菌性の固定油は、従来、溶剤又は懸濁液として使用される。この目的のために、合成モノグリセリド又はジグリセリドを含む何れかの刺激の少ない固定油を使用することができる。オレイン酸及びそのグリセリド誘導体等の脂肪酸は、オリーブ油又はヒマシ油等の天然の医薬的に許容される油、特にそれらのポリオキシエチル化バージョンと同様に、注射剤の調製に有用である。これらの油溶液又は懸濁液はまた、長鎖アルコール希釈剤又は分散剤を含み得る。
【０１０３】
医薬組成物は、直腸又は膣内投与用の坐剤の形態で投与され得る。これらの組成物は、化合物を室温では固体であるが、直腸温度では液体であり、従って直腸で溶解し活性成分を放出する適切な非刺激性賦形剤と混合することによって調製され得る。そのような材料は、限定されないが、カカオバター、ミツロウ、及びポリエチレングリコールを含む。
【０１０４】
医薬組成物の局所投与は、所望の治療が、局所適用によって容易にアクセス可能な領域（粘膜及び中皮表面を含む）又は器官を含む場合に特に有用である。皮膚に局所的に塗布するために、医薬組成物は、担体に懸濁又は溶解された活性成分を含む適切な軟膏で製剤化される。本発明の化合物の局所投与用の担体は、限定されないが、ミネラルオイル、液体石油、ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックス及び水を含む。あるいは、医薬組成物は、担体に懸濁又は溶解された活性化化合物を含む適切なローション又はクリームを配合することができる。適切な担体は、限定されないが、ミネラルオイル、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール及び水を含む。あるいは、医薬組成物は、適切なゲルで製剤化され得る。本発明の医薬組成物はまた、直腸坐剤製剤又は適切な浣腸製剤によって下部腸管に局所的に適用され得る。局所経皮パッチ及びイオントフォレーシス投与についても記載する。
【０１０５】
医薬組成物は、経鼻エアロゾル又は吸入によって投与され得る。そのような組成物は、医薬製剤の分野で周知の技術によって調製され、ベンジルアルコール又は他の適切な防腐剤、バイオアベイラビリティを高めるための吸収促進剤、フルオロカーボン、及び／又は当該分野で既知の他の可溶化剤又は分散剤を使用して、生理食塩水中の溶液として調製され得る。本発明の方法で利用することができるエアロゾル製剤はまた、米国特許第６，８１１，７６７号に記載されているものも含む。
【０１０６】
ｐＨ感受性又は負に荷電したリポソームは、ｄｓＲＮＡと複合体を形成するのではなく、ｄｓＲＮＡを補足する。ｄｓＲＮＡ及び脂質の両方が同様に荷電しているため、複合体形成ではなく反発が生じる。従って、ｄｓＲＮＡは、これらのリポソームの水性内部に閉じ込められる。リポソーム組成物の１つの主要なタイプには、天然由来のフォスファチジルコリン以外のリン脂質が含まれる。中性リポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルフォスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）又はジパルミトイルフォスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成され得る。アニオン性リポソーム組成物は、一般にジミリストイルフォスファチジルグリセロールから形成され、アニオン性融合性リポソームは、主にジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。他のタイプのリポソーム組成物は、例えば、ダイズＰＣ、及びエッグＰＣ等のフォスファチジルコリン（ＰＣ）から形成される。他のタイプは、リン脂質及び／又はフォスファチジルコリン及び／又はコレステロールの混合物から形成される。核酸を含むリポソームは、例えば、ＷＯ９６／４００６２、ＵＳ５，２６４，２２１、ＵＳ５，６６５，７１０に記載される。
【０１０７】
また、本明細書に記載されているのは、ＴＬＲ３アゴニスト又はＴＬＲ３アゴニストを含む組成物を含侵又は含有し、前記ＴＬＲ３アゴニストが前記デバイスから放出され、治療的に活性である移植可能な薬物放出デバイスである。
【０１０８】
ＴＬＲ３アゴニストの組み合わせ化合物
本明細書に記載のＴＬＲ３アゴニストによる治療は、任意に、癌の治療に有用な１つ以上の他の治療薬と有利に組み合わせられ得る。従って、本明細書に記載のＴＬＲ３アゴニストは、癌の治療に有用な他の治療薬と一緒に、又は組み合わせて使用され得る。従って、ＴＬＲ３アゴニスト組成物は、癌の治療に有用な他の治療薬を含み得る。他の治療薬は、同じ又は好ましくは別の容器に入っていてもよい。そのような薬剤には、異なるヌクレオチド配列の他のｄｓＲＮＡ−ＴＬＲ３アゴニスト；限定されないが、細胞毒性及び殺腫瘍性ＴＬＲ３リガンド複合体で使用するために上記に記載されたものを含む細胞毒素；細胞毒性及び殺腫瘍性ＴＬＲ３リガンド複合体；腫瘍抗原又は腫瘍増殖性タンパク質を標的とする薬剤；限定されないが、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、オキサリプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロフォスファミド、カンプトテシン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロスレア、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タノキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合剤、タキソール、ゲムシタビン、ナベルビン、ファメシルタンパク質タンスフェラーゼ阻害剤、トランスプラチナ、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン及びメトトレキサート、又は前述の何れかの類似体又は誘導変異体を含む化学療法剤；例えば乳癌の場合：ドキソルビシン、エピルビシン、ドキソルビシンとシクロフォスファミド（ＡＣ）の組み合わせ、シクロフォスファミド、ドキソルビシン及び５−フルオロウラシル（ｅｓｐａｃｅａｊｏｕｔｅ）（ＣＡＦ）の組み合わせ、シクロフォスファミド、エピルビシン及び５−フルオロウラシル（ＣＥＦ）、ハーセプチン（商標）の組み合わせ、タモキシフェン、タモキシフェンと細胞毒素の組み合わせ、ドセタキセルとパクリタキセルを含むタキサン、タキサンとドキソルビシン及びシクロフォスファミドの組み合わせ；結腸癌の場合：５−ＦＵとロイコボリンの組み合わせ、５−ＦＵとレバミゾールの組み合わせ、又はイリノテカン、５−ＦＵとロイコボリン（ＩＦＬ）又はオキサリプラチンの組み合わせ；前立腺癌の場合：放射性同位元素（すなわち、パラジウム、ストロンジウム−８９及びイリジウム）、ロイプロリド又は他のＬＨＲアゴニスト、非ステロイド系抗アンドロゲン（フルタミド、ニルタミド、及びビカルタミド）、ステロイド系抗アンドロゲン（酢酸シプロテロン）、ロイプロリドとフルタニドの組み合わせ、ＤＥＳ等のエストロゲン、クロロトリアニセン、エチニルエストラジオール、抱合型エストロゲンＵ．Ｓ．Ｐ．、ＤＥＳ−二リン酸、アミノグルテチミド、ヒドロコルチゾン、フルタミド休薬、プロゲステロン、及びケトコナゾール等の第２選択ホルモン療法、又はドセタキセル、パクリタキセル、エストラムスチン／ドセタキセル、エストラムスチン／エトポシド、エストラムスチン／ビンブラスチン、及びエストラムスチン／パクリタキセルを含む症状の自覚的改善及びＰＳＡ値の低下をもたらすと報告されている他の化学療法剤又はその併用剤；メラノーマの場合：ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）等のニトロソウレア、ビンカアルカロイド、プラチナ化合物、及びタキサンなどの適度な単剤活性を有する薬剤、ダートマスレジメン（シスプラチン、ＢＣＮＵ、及びＤＴＩＣ）、インターフェロンアルファ（ＩＦＮ−Ａ）、及びインターロイキン−２（ＩＬ−２）；卵巣癌の場合：パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、オキサリプラチン、ヘキサメチルメラミン、タモキシフェン、イホスファミド、パクリタキセル（タキソール）又はドセタキセル（タキソテール）とシスプラチン又はカルボプラチンの組み合わせ、シクロフォスファミドとシスプラチンの組み合わせ、シクロフォスファミドとカルボプラチンの組み合わせ、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）とロイコボリン、エトポシド、リポソームドキソルビシン、ゲルシタビン又はトポテカンの組み合わせ；肺癌の場合：シスプラチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、マイトマイシン、ドキソルビシン、及びエトポシドの単独又は組み合わせ、シクロフォスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン／エトポシド、及びシスプラチン（ＣＡＶ／ＥＰ）の組み合わせ、シスプラチンとビノレルビン、パクリタキセル、ドセタキセル又はゲムシタビンの組み合わせ、及びカルボプラチンとパクリタキセルの組み合わせ等の特定の癌の治療のための治療薬及び治療薬の組み合わせを含む。
【０１０９】
一態様において、他の治療薬は、免疫チェックポイント阻害剤である。それは、生物学的治療薬又は小分子である可能性がある。好ましくは、チェックポイント阻害剤は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、完全ヒト化抗体、融合タンパク質、又はそれらの組み合わせである。抗体は、経路に関与する何れかのタンパク質に対して、より具体的には、受容体又はリガンドの何れかを対象とし得る。周知のように、免疫チェックポイント阻害剤は、癌細胞に対する免疫応答を回避することができる。特に、阻害剤は、相互作用するタンパク質間の相互作用を中断又は妨げる、又は阻害し、免疫応答、特に腫瘍細胞を殺傷するＴ細胞を作用可能にする。さらなる態様において、チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＣＧＥＮ−１５０４９、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ａ２ａＲ、Ｂ−７又はそれらの組み合わせ等のチェックポイントタンパク質を阻害する。さらなる態様において、チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＣＧＥＮ−１５０４９、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ａ２ａＲ、Ｂ−７又はそれらの組み合わせ等のチェックポイントタンパク質のリガンドと相互作用する。
【０１１０】
本発明は、ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ１／ＰＤ−Ｌ２経路を遮断、阻害、又は低減する抗体の併用を含む。現在、市販されている又は臨床評価において、経路を遮断する少なくとも５つの薬剤があり、これらの何れも、本発明と組み合わせにおいて有用であり得る。これら薬剤は、ＢＭＳ−９３６５５８（抗ＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂ、ニボルマブ／ＯＮＯ−４５３８、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ、従来はＭＤＸ−１１０６（ＷＯ２００６／１２１１６８における５Ｃ４抗体）、ＭＫ−３４７５（抗ＰＤ１ ｍＡｂ、ランブロリズマブ又はペンブロリズマブ、キイトルーダ(登録商標)、Ｍｅｒｃｋ）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ／ＲＧ７４４６（抗ＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂ、Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＡＭＰ−２２４（抗ＰＤ−Ｌ２、Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ及びＧＳＫを含むイムノアドヘシン）、ピドリズマブ（抗ＰＤ１ ｍＡｂ、ＣＴ−０１１、ＣｕｒｅＴｅｃｈ／ＴＥＶＡ−ＷＯ２００９／１０１６１１）である。
【０１１１】
ＭＫ−３４７５の場合、ヒト化抗体ｈ４０９ＡＩＩの重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡコンストラクトは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）に寄託されている。ｈ４０９Ａ−１の重鎖をコードするＤＮＡを含むプラスミドは、２００８年６月９日に寄託され、０８１４６９＿ＳＰＤ−Ｈとして識別され、ｈ４０９Ａ−１の軽鎖をコードするＤＮＡを含むプラスミドは、２００８年６月９日に寄託され、０８０１４７０＿ＳＰＤ−Ｌ−Ｉ１として識別された。
【０１１２】
さらに既知のＰＤ−１抗体及び他のＰＤ−１阻害剤は、ＡＭＰ−２２４（ＧＳＫにライセンス供与されたＢ７−ＤＣ／ＩｇＧ１融合タンパク質、ＷＯ２０１２／１４５４９３に記載されているＡＭＰ−５１４、ＷＯ２０１１／０６６３８９及びＵＳ２０１３／０３４５５９に記載されている抗体ＭＥＤＩ−４７３６（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ／Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅによって開発された抗ＰＤ−Ｌ−１）、ＷＯ２０１０／０７７６３４に記載されている抗体ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０（抗ＰＤ−Ｌ１）、ＷＯ２００７／００５８７４に記載されるＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂによって開発された抗ＰＤ−Ｌ１抗体である、ＢＭＳ−９３６５５９とも称されるＭＤＸ−１１０５、及びＷＯ２００６／１２１１６８、ＷＯ２００９／０１４７０８、ＷＯ２００９／１１４３３５及びＷＯ２０１３／０１９９０６に記載される抗体及び阻害剤を含む。本明細書で参照される何れかの文書の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。抗ＰＤ１抗体のさらなる例は、ＷＯ２０１５／０８５８４７、例えば、それぞれ配列番号６、７及び８の軽鎖可変ドメインＣＤＲ１、２及び３を有し、それぞれ配列番号３、４、及び５の抗体重鎖可変ドメインＣＤＲ１、２、３を有する抗体が開示され、ここで、配列番号の参照は、ＷＯ２０１５／０８５８４７の番号付けである。
【０１１３】
本発明はまた、ＣＤ１５２としても知られるＣＴＬＡ−４（細胞障害性Ｔリンパ球関連タンパク質４）に対する抗体の併用を含み、ＣＤ１５２は、ＣＤ２８ファミリーの受容体の他の阻害剤メンバーであり、Ｔ細胞上で発現する。ＣＴＬＡ−４に結合し阻害する抗体は、当該技術分野で周知である。一実施例において、抗体は、ヒト化ＩｇＧ抗体であるイピリムマブ（商品名Ｙｅｒｖｏｙ(登録商標)、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）である。
【０１１４】
他の組み合わせにおいて、ＴＬＲ３リガンドは、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、４−１ＢＢ又はＣＤ４０等の刺激性チェックポイント経路のアゴニストである。
【０１１５】
他の組み合わせにおいて、ＴＬＲ３リガンドに関連する薬剤は、トランスフォーミング増殖因子−ベータシグナル伝達経路の阻害剤（すなわち、ガルニセルチブ）等の腫瘍微小環境を標的とする分子である。
【０１１６】
本明細書に記載のＴＬＲ３アゴニスト組成物を使用する方法はまた、抗血管新生剤との併用療法を含み得る。従って、上記ＴＬＲ３アゴニスト組成物はまた、抗血管新生剤を含み得る。新しい血管の形成（血管新生）は、腫瘍の成長と播種性転位の過程における基本的なイベントである。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）経路は、このプロセスの主要な調節因子の１つとして確立されている。ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦ受容体軸は、重複する別個のリガンド受容体結合特異性、細胞型発現、及び機能を有する複数のリガンド及び受容体から構成される。ＶＥＧＦ受容体経路の活性化は、内皮細胞の成長、転移、及び既存の血管系からの生存を促進するシグナル伝達プロセスのネットワークを誘発する。加えて、ＶＥＧＦは、欠陥透過性と関係し、悪性胸水と関連している。ＶＥＧＦ関連遺伝子ファミリーは、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、及び胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）−１及び−２と称される６個の分泌された糖タンパク質を含む。ＶＥＧＲ経路に作用する小分子阻害剤、中和抗体アンチセンスストラトジー、ＲＮＡアプタマー及びＶＥＧＦ関連遺伝子ファミリーに対するリボザイム（例えば、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅタンパク質）を含む、いくつかの例示的な抗血管新生剤が知られており、それらの何れも、本発明に従って使用することができる。ＷＯ９８／１６５５１に記載されるように、拮抗特性を有するＶＥＧＦ変異体も使用され得る。併用療法に関連して有用であるさらなる例示的な抗血管新生剤は、米国特許第６，５２４，５８３号の表Ｄに記載されている。特に好ましい抗血管新生剤は、限定されないが、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ−２，３ ＰＤＧＦＲ−ベータ、Ｆｌｔ−３、ｃ−Ｋｉｔ、ｐ３８アルファ及びＦＧＦＲ−１を含む受容体チロシンキナーゼによるシグナル伝達を阻害する。さらなる抗血管新生剤は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２、ＣＯＸ−２、又はＨＩＦ−１等のＶＥＧＦの発現及び産生の様々な調節因子のうちの１つ以上を阻害する薬剤を含み得る。他の好ましいクラスの薬剤には、サリドマイド又はＣＣ−５０１３類似体が含まれる。
【０１１７】
一態様において、他の治療薬は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ阻害剤及びベバシズマブ（アバスチン）（ｍＡｂ、ＶＥＧＦ−Ａの阻害、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を含むチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）クラス；ＩＭＣ−１１２１Ｂ（ｍＡｂ、ＶＥＧＦＲ−２の阻害、ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）；ＣＤＰ−７９１（ペグ化ＤｉＦａｂ、ＶＥＧＦＲ−２、Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）；２Ｃ３（ｍＡｂ、ＶＥＧＦ−Ａ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ＰＴＫ−７８７（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１、−２、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＡＥＥ７８８（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−２及びＥＧＦＲ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＺＤ６４７４（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１、−２、−３、ＥＧＦＲ ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；ＡＺＤ２１７１（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１、−２、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；ＳＵ１１２４８（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１，−２、ＰＤＧＦＲ Ｐｆｉｚｅｒ）；ＡＧ１３９２５（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１，−２、Ｐｆｉｚｅｒ）；ＡＧ０１３７３６（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１，−２、Ｐｆｉｚｅｒ）；ＣＥＰ−７０５５（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１，−２，−３、Ｃｅｐｈａｌｏｎ）；ＣＰ−５４７，６３２（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１，−２、Ｐｆｉｚｅｒ）；ＶＥＧＦ−ｔｒａｐ（可溶性ハイブリッド受容体ＶＥＧＦ−Ａ、Ｐ１ＧＦ（胎盤成長因子）Ａｖｅｎｔｉｓ／Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）；ＧＷ７８６０２４（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１，−２，−３、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）；Ｂａｙ９３−４００６（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１，−２、ＰＤＧＦＲ Ｂａｙｅｒ／Ｏｎｙｘ）；及びＡＭＧ７０６（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１，−２，−３、Ａｍｇｅｎ）を含む免疫調節剤である。最も好ましいのは、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ−２，３ ＰＤＧＦＲ−ベータ、Ｆｌｔ−３、ｃ−Ｋｉｔ、ｐ３８アルファ及びＦＧＦＲ−１からなる群から選択される１つ以上の受容体チロシンキナーゼを阻害するチロシンキナーゼ阻害剤である。好ましい例には、ＳＵ１１２４８（Ｐｆｉｚｅｒ）及びＢａｙ９３−４００６（ソレファニブ、Ｂａｙｅｒ）が含まれる。
【０１１８】
本発明に記載されるＴＬＲ３アゴニスト組成物を使用する方法はまた、アポトーシス促進剤との併用治療を含み得る。従って、上記のＴＬＲ３アゴニスト組成物はまた、アポトーシス促進剤を含み得る。Green and Kroemer, J（Green and Kroemer, J. (2005) Clin. Investig. 115(10):2610-2617）で概説されているものを含め、医薬品による調節の標的として有用な多くのタンパク質が当該技術分野で知られている。アポトーシス促進医薬品の例は、ｏｂｌｉｍｉｒｓｅｎ（Ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチド、Ｇｅｎｔａ）、ＥＧＣＧ（Ｂｃｌ−２を標的とする小分子、Ｂｕｒｎｈａｍ Ｉｎｓｔ．／Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ）、ゴシポール（Ｂｃｌ−２を標的とする小分子、Ｕｎｉｖ． Ｍｉｃｈｉｇａｎ）、ＬＹ２１８１３０８（ｓｕｒｖｉｖｉｎｅ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ／Ｉｓｉｓ）を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド）、及び三酸化ヒ素等のミトコンドリア外膜透過性を誘導する薬剤；Ａｄｖｅｘｉｎ ＩＮＧＮ２０１（アデノウイルス調節ｐ５３、Ｉｎｔｒｏｇｅｎ）、ＳＣＨ５８５００（アデノウイルス調節ｐ５３、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）、ＯＮＹＸ−０１５（Ｅ１Ｂ突然変異アデノウイルス調節ｐ５３、Ｏｎｙｘ Ｐｈａｒｍａ．）等のｐ５３活性を調節する薬剤；カスパーゼ及び／又は内因性阻害剤又はＡＥＧ３５１５６（ＸＩＡＰを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド、Ａｅｇａｒａ／Ｈｙｂｒｉｄｏｎ）等のカスパーゼを調節する薬剤；ビリナパント等のｃｌＡＰ１−２を調節する薬剤；ＴＮＦ−アルファポリペプチド、ＨＧＳ−ＥＴＲ１（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１を標的とするアゴニストｍＡｂ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＨＧＳ−ＥＴＲ２及びＨＧＳ−ＴＲ２Ｊ（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２を標的とする２つのアゴニストｍＡｂ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）等の細胞死受容体及び／又はそのリガンドを調節する薬剤；ＰＲＯ１７６４（可溶性ＴＲＡＩＮリガンド、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ａｍｇｅｎ）；及びＡＧ０１４６９９（小分子、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． Ｔｅｃｈ．）等のポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）を標的とする薬剤；ボルテゾミブ（ベルケイド）（２６Ｓプロテアソーム阻害剤、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍａ．）等のプロテアソームを標的とする薬剤；及びハーセプチン（ＨＥＲ２を標的とするｍＡｂ、Ｒｏｃｈｅ）、センツキシマブ（ＨＥＲ１を標的とするｍＡｂ、Ｉｍｃｌｏｎｅ／ＢＭＳ）、ゲフィチニブ（イレッサ）及びエルロチニブ（タルセバ）（ＨＥＲ１の小分子阻害剤、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ及びＧｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＯＳＩのそれぞれ）、ＣＣＩ−７７９（ｍＴＯＲに作用する小分子、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、Ｂａｙ４３−９００６（Ｒａｆ及びＶＥＧＦＲを含むキナーゼの小分子阻害剤）、及びメシル酸イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ、ＳＴＩ−５７１） （ｃＫｉｔの小分子阻害剤、ＰＤＧＦＲ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）等のキナーゼ阻害剤を含む。
【０１１９】
上記のＴＬＲ３アゴニスト組成物はまた、腫瘍壊死因子、インターフェロンアルファ、ベータ、及びガンマ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＣｐＧ含有一本鎖ＤＮＡ、ＢＣＧ等の他のＴＬＲアゴニスト、他のサイトカイン及び免疫刺激剤等の免疫調節剤；Ｆ４２Ｋ及び他のサイトカイン類似体；又はＭＩＰ−１、ＭＩＰ−Ｉベータ、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、及び他のケモカイン；細胞表面受容体とＧＡＰ結合の上方制御に影響を与える薬剤；細胞増殖抑制剤及び分化剤；又は細胞接着阻害剤等の他の治療剤を含み得る。
【０１２０】
また、ＴＬＲ３アゴニストと、癌の治療に有用である他の治療薬を、別々の剤形であるが互いに関連させて含む物質の組成物も記載される。本明細書で使用される「互いに関連する（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｏｎｅ ａｎｏｔｈｅｒ）」という用語は、別個の剤形が一緒に包装されるか、そうでなければ互いに接着し、別個の剤形が、同じレジメンの一部として販売及び投与されることを意図していることが容易に明らかであることを意味する。薬剤及びＴＬＲ３アゴニストは、好ましくは、ブリスターパック又は他のマルチチャンバーパッケージに一緒に包装されるか、又は使用者が分離可能である（例えば、２つの容器の間のスコアライン上で引き裂くことによって）、接続され、別個に密封された容器（ホイルポーチ等）として包装される。
【０１２１】
上記のＴＬＲ３アゴニスト組成物はまた、電離放射線の使用、ＣＡＲ−Ｔ細胞の注射及び／又は腫瘍溶解性ウイルスの使用を含む他の治療法を含み得る。
【０１２２】
癌及び治療法
本明細書は、癌又はその１つ以上の症状の予防、管理、治療又は回復に使用するためのＴＬＲ３アゴニストを包含する。本発明はまた、癌又はその１つ以上の症状の予防、管理、治療又は回復のための薬剤の製造のためのＴＬＲ３アゴニストの使用を包含する。また、癌又はその１つ以上の症状の予防、管理、治療、又は回復するための方法も包含する。
【０１２３】
本発明の方法によって予防、管理、治療又は改善することができる癌の例は、限定されないが、固形腫瘍、特に頭、首、目、口、喉、食道、胸部、骨、肺、結腸、直腸、胃、前立腺、乳房、卵巣、腎臓、肝臓、膵臓、及び脳の癌等が含まれる。
【０１２４】
臓器又は組織（例えば、骨）又はそれら１つ以上に転移する可能性がある、又は転位した癌を予防、管理、治療、又は改善するための方法が記載される。臓器又は組織（例えば、骨）に転移する可能性、又は転位した癌、又はそれら１つ以上の症状を予防、管理、治療、又は改善するために使用するためのＴＬＲ３アゴニストも記載される。
【０１２５】
前記方法及び使用は、治療を必要とする対象に、本発明による予防的又は治療的量のＴＬＲ３アゴニストの１以上の用量を投与することを含む。好ましくは、ＴＬＲ３アゴニストは、複数回投与される。任意に、ＴＬＲ３アゴニストは、１か月未満、３週間未満、２週間未満、又は１週間未満の間隔で投与される。任意に、そのような治療は、例えば、１、２、３、４、５、６、又は７日ごと、又は１、２、３、４、及び５日ごと、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１２か月ごと繰り返され得る。
【０１２６】
本明細書は、癌又はその１つ以上の症状を予防、管理、治療又は改善するための方法を提供し、当該方法は、治療を必要とする対象に、予防的又は治療的に有効な量のＴＬＲ３アゴニストの投与を、癌治療に有用な予防的又は治療的に有効な量の１つ以上の薬剤の投与を癌治療に有用な予防的又は治療的に有効な量の１つ以上の他の薬剤の投与と組み合わせて投与することを含む。本明細書はまた、癌の予防、管理、治療又は改善に使用するためのＴＬＲ３アゴニストに関するものであり、ここで、前記ＴＬＲ３アゴニストは、癌治療に有用な１つ以上の薬剤と組み合わせて使用される。好ましくは、ＴＬＲ３アゴニストは、複数回投与される。任意に、ＴＬＲ３アゴニストは、１か月未満、３週間未満、２週間未満、又は１週間未満の間隔で投与される。任意に、そのような治療は、例えば、１、２、３、４、５、６、又は７日ごと、又は１、２、３、４、及び５日ごと、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１２か月ごと繰り返され得る。
【０１２７】
本発明による各化合物の組み合わせ又は医薬組成物は、別個に、連続して又は同時に投与され得る。一実施形態において、本発明のＴＬＲ３アゴニストは、他の化学療法剤の前又は後に投与される。
【０１２８】
一実施形態において、ｄｓＲＮＡは、アゴニストの血漿濃度を所望のレベルに維持する用量レジメンを使用して対象に投与される。特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡの血漿濃度は、約１０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、３５μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、４５μｇ／ｍｌ又は５０μｇ／ｍｌに維持される。対象において望ましい血漿濃度は、限定されないが、癌の性質、癌の重症度、及びＴＬＲ３アゴニストの循環半減期（安定性）及び結合親和性を含む様々な要因に応じて変化し得る。
【０１２９】
本明細書で提供される投与量及び投与頻度は、「治療的に有効」及び「予防的に有効」の用語によって包含される。さらに、投与量及び頻度は、通常、投与される特定の治療薬又は予防薬、癌の重症度及び種類、投与経路、並びに年齢、体重に応じて、各患者の固有の要因によって変化する。
【０１３０】
特に、投与され得る本発明によるＴＬＲ３アゴニストの用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの間の体重、例えば、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ｍｇ／ｋｇの体重である。
【０１３１】
好ましくは、治療有効量のＴＬＲ３アゴニスト（任意に、他の治療薬又は治療プロトコルと組み合わせて）は、対象における腫瘍のサイズ又は腫瘍の広がりを、ＰＢＳ等のコントロールに対して、少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％低減させる。
【０１３２】
本発明の範囲において、「使用するためのＴＬＲ３アゴニスト（ａ ＴＬＲ３ ａｇｏｎｉｓｔ ｆｏｒ ｕｓｅ）」は、「ＴＬＲ３アゴニストの使用（ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ａ ＴＬＲ３ ａｇｏｎｉｓｔ）」に相当し、特に「治療に使用するためのＴＬＲ３アゴニスト（ａ ＴＬＲ３ ａｇｏｎｉｓｔ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ）」は、「治療のためのＴＬＲ３アゴニストの使用（ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ａ ＴＬＲ３ ａｇｏｎｉｓｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ）」に相当することが理解されなければならない。本発明はまた、「治療を意図した医薬の製造のためのＴＬＲ３アゴニストの使用」を本開示に従って包含する。
【０１３３】
癌の種類
様々な実施形態において、本明細書は、癌の対象の治療レジメンを決定するための方法を提供する。当該方法は、何れかの癌、又は腫瘍の治療レジメンを決定するために使用され得、例えば、悪性腫瘍及び関連疾患には、以下のものに限定されないが、ＴＬＲ３を発現するものを含む。
【０１３４】
従って、本発明の方法は、以下のもの（ただし、これらに限定されない）、膀胱、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、胃、子宮頸部、甲状腺及び皮膚を含む癌腫；扁平上皮癌；急性及び慢性骨髄性白血病及び前骨髄球性白血病を含む骨髄系の造血腫瘍；繊維肉腫及び横紋筋肉腫を含む間葉系由来の腫瘍；メラノーマ、セミノーマ、テラトカルシノーマ、神経芽腫及び神経膠腫を含む他の腫瘍；星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫及びシュワン細胞腫を含む中枢神経系及び末梢神経系の腫瘍；繊維肉腫、横紋筋肉腫、及び骨肉腫を含む、間葉系由来の腫瘍；及びメラノーマ、色素性乾皮症、ケラトアカントーマ、セミノーマ、甲状腺濾胞癌及び奇形癌腫等の他の腫瘍を含む様々な癌又は他の異常増殖性疾患の治療に有用である。特定の実施形態において、悪性腫瘍又は異常増殖性の変化（例えば、メタプラシア及び形成異常）、又は過剰増殖性の障害は、卵巣、膀胱、乳房、結腸、肺、皮膚、膵臓、又は子宮において治療される。他の特定の実施形態において、肉腫、メラノーマ、又は白血病が治療される。
【０１３５】
本発明の方法は、ＴＬＲ３陽性の固形腫瘍に使用される。腫瘍の例は、乳癌、結腸癌、卵巣癌、肺癌、脳癌及び前立腺癌、並びにメラノーマを含む。好ましくは、当該方法は、乳癌の治療を対象とする。
【０１３６】
ｄｓＲＮＡの合成
標準的な合成方法を使用して、本発明の明細書に従ってｄｓＲＮＡ組成物が産生され得る。一例として、標準的なホスホルアミダイト固相合成技術が使用され得る（参照、M. D. Matteucci et al., Tetrahedron Lett. 22, 1859-1862 (1981)）。２’−ＡＣＥ ＲＮＡ合成化学が用いられ得、これはＳ．Ａ． Ｓｃａｒｉｎｇｅによる博士学位論文、コロラド大学１９９６年に開示される保護基スキームに基づく。ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社のＲＮＡｉ、遺伝子発現＆遺伝子編集、２’−ＡＣＥ ＲＮＡ合成化学のためのＤｈａｒｍａｃｏｎ（商標）テクノロジーが使用され得る。実施例で使用されるアクリルアミドゲル等のゲルでの電気泳動等の方法を使用して、純度を確認することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】５０ｂｐのｄｓＲＮＡ及び市販のポリ（Ａ：Ｕ）の８％アクリルアミドゲル（ＴＢＥ １Ｘ）上でのｄｓＲＮＡプロファイル。５μｇのｄｓＲＮＡ（３４５、３９７、３９８、４１５、４１８、４０５、４１１、４１２、４１３）及び市販のポリ（Ａ：Ｕ）を８％アクリルアミドゲルにロードし、ＢＥＴで染色した。データは、テストされた１７個の５０ｂｐ ｄｓＲＮＡのうちの９個を表す。
【図２】５０ｂｐ ｄｓＲＮＡのみに応答したマウスマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞によるＴＮＦアルファの分泌。ＲＡＷ２６４．７細胞を、１０μｇ／ｍＬの各ｄｓＲＮＡで２４時間処理し、ｍＴＮＦアルファ分泌をＥＬＩＳＡで測定した。データは、５０ｂｐ ｄｓＲＮＡ ４１２の２つの異なるバッチを使用した２つの独立したアッセイを表す。
【図３】９個の５０ｂｐ ｄｓＲＮＡのみで処理した後のヒト非小細胞肺癌細胞ＮＣＩ−Ｈ２９２によるＩＬ６の分泌。ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞を、１０μｇ／ｍＬの各ｄｓＲＮＡで２４時間処理し、ｈＩＬ分泌をＥＬＩＳＡで測定した。データは、３つの独立したアッセイを示す。
【図４】５０ｂｐ ｄｓＲＮＡ ４１２は、ヒト非小細胞肺癌細胞ＮＣＩ−Ｈ２９２の死を誘発しない。ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞を、５０μｇ／ｍＬの各ｄｓＲＮＡで２４時間処理した。アネキシンＶ陽性細胞は、化学発光（キットアネキシンＶ−Ｇｌｏ、Ｐｒｏｍｅｇａ）によって測定された。データは、５０ｂｐ ｄｓＲＮＡ ４１２の２つの異なるバッチを使用した３つの独立したアッセイを表す。
【図５】ｄｓＲＮＡ ４１２、４３２、４５２及び市販のポリ（Ａ：Ｕ）のネイティブ６％アクリルアミドゲル（ＴＢＥ １Ｘ）でのｄｓＲＮＡプロファイル。１μｇのｄｓＲＮＡ ４１２（ポリ（Ａ：Ｕ）５０ｂｐ）、４３２（ポリ（Ａ：Ｕ）７０ｂｐ）、４５２（ポリ（Ａ：Ｕ）９０ｂｐ）及び市販のポリ（Ａ：Ｕ）を、６％アクリルアミドゲルにロードし、ＢＥＴで染色した。２つの独立した実験のデータを示す。
【図６】サイズの増加のみのポリ（Ａ：Ｕ）に応答したマウスマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞によるＴＮＦアルファの分泌。ＲＡＷ２６４．７細胞を、１０μｇ／ｍＬの各ｄｓＲＮＡで２４時間処理し、ＴＮＦアルファ分泌をＥＬＩＳＡで測定した。データは、３つの独立したアッセイを示す。
【図７】ポリ（Ａ：Ｕ）のサイズの増加のみで、マクロファージＲＡＷ２６４．７のＩＳＲＥ−レポーター遺伝子が活性化される。ＲＡＷ２６４．７細胞は、５０μｇ／ｍＬの示されたｄｓＲＮＡで２４時間処理された。ＩＳＲＥ駆動性の生物発光を測定した（ＱＵＡＮＴＩ−ｌｕｃ、ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）。データは、３つの独立したアッセイを示す。
【図８】ポリ（Ａ：Ｕ）のサイズの増加のみで、ヒト非小細胞肺癌細胞ＮＣＩ−Ｈ２９２によるＴＬＲ３依存性のＩＬ６分泌が誘発される。ＷＴ又はＴＬＲ３ ＫＯ ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞を、１０μｇ／ｍＬの各ｄｓＲＮＡで２４時間処理し、ｈＩＬ６分泌をＥＬＩＳＡで測定した。データは、３つの独立したアッセイを示す。
【図９】ポリ（Ａ：Ｕ）のサイズの増加のみで、ＴＬＲ３依存性のヒト非小細胞肺癌細胞ＮＣＩ−Ｈ２９２の死を誘発する。ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞は、５０μｇ／ｍＬの示されたｄｓＲＮＡで２４時間処理された。アネキシンＶ陽性細胞は、化学発光（キットアネキシンＶ−Ｇｌｏ、Ｐｒｏｍｅｇａ）によって測定された。データは、３つの独立したアッセイを示す。
【図１０】ｄｓＲＮＡ ４２２、４３２、４４２、５３２、５３３、５３４、５３５、及び市販のポリ（Ａ：Ｕ）のネイティブ６％アクリルアミドゲル（ＴＢＥ １Ｘ）でのｄｓＲＮＡプロファイル。これらｄｓＲＮＡと市販のポリ（Ａ：Ｕ）をそれぞれ１μｇずつ６％アクリルアミドゲルにロードし、ＢＥＴで染色した。データは、２つの独立した実験を表す。
【図１１】市販のポリ（Ａ：Ｕ）及びｄｓＲＮＡ ４２２、４３２、４４２、５３２、５３３、５３４、５３５に応答したマウスマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞によるＴＮＦアルファの分泌。ＲＡＷ２６４．７細胞を、１０μｇ／ｍＬの各ｄｓＲＮＡで２４時間処理し、ｍＴＮＦアルファ分泌をＥＬＩＳＡで測定した。データは、２つの独立したアッセイを示す。
【図１２】市販のポリ（Ａ：Ｕ）及びｄｓＲＮＡ ４２２、４３２、４４２、５３２、５３３、５３４、５３５に応答したヒト非小細胞肺癌細胞ＮＣＩ−Ｈ２９２によるＩＬ６ＴＬＲ３依存性の分泌。ＷＴ又はＴＬＲ３ ＫＯ ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞を、１０μｇ／ｍＬの各ｄｓＲＮＡで２４時間処理し、ｈＩＬ６分泌をＥＬＩＳＡで測定した。データは、少なくとも２つの独立したアッセイを示す。
【図１３】市販のポリ（Ａ：Ｕ）及びｄｓＲＮＡ ４２２、４３２、４４２、５３２、５３３、５３４、５３５に応答したヒト非小細胞肺癌細胞ＮＣＩ−Ｈ２９２によるＩＬ６ＴＬＲ３依存性の死。ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞は、５０μｇ／ｍＬの示されたｄｓＲＮＡで２４時間処理された。アネキシンＶ陽性細胞は、化学発光（キットアネキシンＶ−Ｇｌｏ、Ｐｒｏｍｅｇａ）によって測定された。データは、２つの独立したアッセイを示す。
【図１４】２つの異なる化学製造技術から作られたｄｓＲＮＡ５３２に応答したマウスマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞によるＴＮＦアルファの分泌。ＲＡＷ２６４．７細胞を、１〜１００μｇ／ｍＬの示されたｄｓＲＮＡ ５３２の１〜１００μｇ／ｍＬの用量反応で２４時間処理し、ｍＴＮＦアルファの分泌をＥＬＩＳＡで測定した。データは、少なくとも３つの独立したアッセイの平均であり、少なくとも６つの独立したアッセイを示す。
【図１５】２つの異なる製造会社から製造されたｄｓＲＮＡ ５３２に応答したマウスマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞によるＴＮＦアルファの分泌。ＲＡＷ２６４．７細胞を、１〜１００μｇ／ｍＬの示されたｄｓＲＮＡ ５３２の用量反応で２４時間処理し、ｍＴＮＦアルファの分泌をＥＬＩＳＡで測定した。データは、少なくとも５つの独立したアッセイの平均を示す。
【図１６】２つの異なる科学技術又は２つの異なる製造会社で造られたｄｓＲＮＡ ５３２は、ヒト非小細胞肺癌細胞ＮＣＩ−Ｈ２９２の同じレベルでの死を誘発する。ＲＡＷ２６４．７細胞を、１〜１００μｇ／ｍＬの示されたｄｓＲＮＡの用量反応で２４時間処理した。アネキシンＶ陽性細胞は、化学発光（キットアネキシンＶ−Ｇｌｏ、Ｐｒｏｍｅｇａ）によって測定された。データは、少なくとも４つの独立したアッセイを示す。
【図１７】２つの異なる化学合成技術から作られたｄｓＲＮＡ ５３２は、ヒト非小細胞肺癌細胞ＮＣＩ−Ｈ２９２の同じレベルの細胞生存率の低下を誘発する。ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞は、１〜１００μｇ／ｍＬの示されたｄｓＲＮＡの用量反応で２４時間処理された。細胞生存率アッセイは、ＭＴＳ（ｋｉｔ Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ）によって測定された。データは、少なくとも４つの独立したアッセイを示す。
【図１８】２つの異なる製造会社から製図されたｄｓＲＮＡ ５３２は、ヒト非小細胞肺癌細胞ＮＣＩ−Ｈ２９２の同じレベルの細胞生存率の低下を誘発する。ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞は、１〜１００μｇ／ｍＬの示されたｄｓＲＮＡの用量反応で２４時間処理された。細胞生存率アッセイは、ＭＴＳ（ｋｉｔ Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ）によって測定された。データは、少なくとも５つの独立したアッセイを示す。
【図１９】ＲＮＡｓｅ Ｉ又はＲＮＡｓｅ ＩＩＩの何れかで消化した後のポリ（Ａ：Ｕ）及びｄｓＲＮＡ ５３２のネイティブ６％アクリルアミドゲル（ＴＢＥ １Ｘ）でのｄｓＲＮＡプロファイル。１μｇ／ｍＬのｄｓＲＮＡと市販のポリ（Ａ：Ｕ）を、アクリルアミドゲルにロードし、ＢＥＴで染色した。データは、少なくとも２つの独立したアッセイを表す。
【図２０】ポリ（Ａ：Ｕ）及びｄｓＲＮＡ ５３２のｄｓＲＮＡのＴｍの計算プロファイル。１μｇのｄｓＲＮＡをＳｙＢｒグリーンＱ−ＰＣＲミックスと混合し、融解曲線分析を行った。データは、少なくとも３つの独立したアッセイを表す。ａｂｃｉｓｓにおいて、温度は摂氏である。縦座標は、−ｄ（ＲＦＵ）／ｄＴである。融解のピークを示す。
【実施例】
【０１３８】
略語：
ＴＬＲ３：トール様レセプター３（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３）（ＣＤ２８３）
ＷＴ：野生型（Ｗｉｌｄ Ｔｙｐｅ）
ＫＯ：ノックアウト（Ｋｎｏｃｋ Ｏｕｔ）
ＴＢＥ：トリスホウ酸塩ＥＤＴＡ（Ｔｒｉｓ Ｂｏｒａｔｅ ＥＤＴＡ）
ＡＰＳ：過硫酸アンモニウム（Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ）
ＴＥＭＥＤ：テトラメチルエチレンジアミン（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）
ＢＥＴ：ブロムレエチジウム（Ｂｒｏｍｕｒｅ Ｅｔｈｉｄｉｕｍ）
ＤＮＡ：デオキシリボ核酸（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）
ＲＮＡ：リボ核酸（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）
ｄｓＲＮＡ：二本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ）
ｓｓＲＮＡ：一本鎖ＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ）
Ｐｏｌｙ（Ａ：Ｕ）：ポリアデニル酸ポリウリジル酸（ＰｏｌｙＡｄｅｎｙｌｉｃ ＰｏｌｙＵｒｉｄｙｌｉｃ ａｃｉｄ）
ＰＡＵ：高分子量の市販のポリ（Ａ：Ｕ）（ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ Ｐｏｌｙ（Ａ：Ｕ））
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）：ポリイノシン酸ポリシチジル酸（ＰｏｌｙＩｎｏｓｉｎｉｃ ＰｏｌｙＣｙｔｉｄｙｌｉｃ ａｃｉｄ）
ＰＩＣ：ポリ（Ｉ：Ｃ）（Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））
ｂｐ：塩基対（ｂａｓｅ ｐａｉｒ）
ｍＴＮＦａ：マウス腫瘍壊死因子アルファ（ｍｏｕｓｅ Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ）
ｈＩＬ６：ヒトインターロイキン−６（ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６）
Å：オングストローム（Ａｎｇｓｔｒｏｍ）
５’ｐｐｐ：５’三リン酸（５’ｔｒｉ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）
ＩＳＲＥ：インターフェロン刺激応答要素（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ）
【０１３９】
【表１−１】
2021522308.tif 000002
【表１−２】
2021522308.tif 000003
【表１−３】
2021522308.tif 000004
【表１−４】
2021522308.tif 000005
【表１−５】
2021522308.tif 000006
【０１４０】
【表２】
2021522308.tif 000007
【０１４１】
以下の他の鎖及びそれらの相補鎖は、同じ方法で合成され、ハイブリダイズされ得る：
５’（Ｉ）１０−（Ｕ）５０−（Ｉ）１０ ３’
５’（Ａ）６０−（Ｉ）１０ ３’
５’（Ａ）５０−（Ｉ）２０ ３’
５’（Ａ）２０−（Ｉ）５０ ３’
５’（Ａ）１０−（Ｉ）６０ ３’
５’（Ｉ）５−（Ａ）６０−（Ｉ）５ ３’
５’（Ｉ）１５−（Ａ）４０−（Ｉ）１５ ３’
５’（Ｉ）２０−（Ａ）３０−（Ｉ）２０ ３’
５’（Ｉ）２５−（Ａ）２０−（Ｉ）２５ ３’
５’（Ｉ）３０−（Ａ）１０−（Ｉ）３０ ３’
５’（Ｉ）５−（Ａ）５０−（Ｉ）１５ ３’
５’（Ｉ）１３−（Ａ）６４−（Ｉ）１３ ３’
５’（Ｉ）１０−（Ａ）７０−（Ｉ）１０ ３’
【０１４２】
実施例１及び図１：ネイティブ８％アクリルアミドゲル（ＴＢＥ １Ｘ）での５０ｂｐ ｄｓＲＮＡ及び市販のポリ（Ａ：Ｕ）の分析。
【０１４３】
ＤＨＡＲＭＡＣＯＮ（商標）（コロラド、ＵＳＡ）から入手した凍結乾燥ｄｓＲＮＡを、製造元のプロトコルに従って、ＲＮＡｓｅフリー滅菌生理水（ＩＮＶＩＶＯＧＥＮ、Ｆｒａｎｃｅ）に再懸濁した。核酸ローディングバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ＃ＡＭ８５５６）を加えた後、５μｇのｄｓＲＮＡを、以下のように調整した８％アクリルアミドゲルにロードした：９．３ｍＬの滅菌ＲＮＡｓｅフリー水（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ＃Ｗ４５０２）、１．５ｍＬＴＢＥ １０ｘ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、４ｍＬアクリルアミド−ビス３０％（Ｍｅｒｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ、Ｃａｔ＃１．００６３９．１０００）、０．２ｍＬ ＡＰＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、２０μＬ ＴＥＭＥＤ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。ＲＮＡラダーは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｔ＃ＳＭ１８３３）から入手した。サンプルの移行は、１μｇ／ｍＬでＢＥＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）染色を行う前に、１００Ｖで１時間設定した。次に、ＧｅｌＤｏｃ ＸＲ＋アナライザー（ＢＩＯＲＡＤ，カリフォルニア、ＵＳＡ）を使用してゲルを可視化した。データは、１７個の５０ｂｐ ｄｓＲＮＡのうちの９個を表す。
【０１４４】
実施例２及び図２：５０ｂｐ ｄｓＲＮＡのみに応答したマウスマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞によるＴＮＦ−アルファの分泌。
【０１４５】
凍結乾燥されたｄｓＲＮＡを、ＩＤＴ又はＤＨＡＲＭＡＣＯＮから入手した。５×１０４のＲＡＷ２６４．７細胞を、９６ウェルプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ、ＵＳＡ、Ｃａｔ＃３５３０７２）に最終容量２００μＬで播種した。２４時間後、細胞を、トランスフェクション試薬を含まないｄｓＲＮＡで最終濃度１０μｇ／ｍＬで２４時間処理し、上清を回収しＥＬＩＳＡでマウスＴＮＦ−アルファの分泌を測定した。ＰＡＵ＝高分子量の市販のポリ（Ａ：Ｕ）。データは、５０ｂｐ ｄｓＲＮＡ ４１２の２つの異なるバッチを使用した２つの独立したアッセイを示す。
【０１４６】
実施例３及び図３：ＰＡＵ又は５０ｂｐ ｄｓＲＮＡのみでの処理後のヒト非小細胞肺癌細胞ＮＣＩ−Ｈ２９２によるＩＬ６の分泌。
【０１４７】
３×１０３のＮＣＩ−Ｈ２９２ＷＴ又はＴＬＲ３ＫＯ細胞を、最終容量３００μＬ／ウェルの４８ウェルプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ、ＵＳＡ、Ｃａｔ＃３５３０７８）に播種した。２４時間後、培地を新しいものと交換し、細胞を、トランスフェクション試薬を含まない最終濃度１０μｇ／ｍＬのｄｓＲＮＡで処理した。２４時間後、ＥＬＩＳＡ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＵＳＡ Ｃａｔ＃４３０５０１）によりＩＬ−６分泌を測定するために上清を回収した。ＰＡＵ＝高分子量の市販のポリ（Ａ：Ｕ）。データは、３つの独立したアッセイを表す。
【０１４８】
実施例４及び図４：５０ｂｐ ｄｓＲＮＡ ４１２は、ヒト非小細胞肺癌細胞ＮＣＩ−Ｈ２９２の死を誘発しない。
【０１４９】
１×１０４のＮＣＩ−Ｈ２９２ＷＴ又はＴＬＲ３ＫＯ細胞を、最終容量１００μＬ／ウェルの９６ウェルプレート（ＧＲＥＩＮＥＲ、ＵＳＡ、Ｃａｔ＃６５５０９８）に播種した。２４時間後、細胞を、トランスフェクション試薬を含まないｄｓＲＮＡで最終濃度５０μｇ／ｍＬで２４時間処理した後、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｆｒａｎｃｅ、Ｃａｔ＃ＪＡ１０００）のＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ Ｇｌｏ アネキシンＶキットを使用してアネキシンＶ＋発光読み出しでアポトーシスを測定した。ＰＡＵ＝高分子量の市販のポリ（Ａ：Ｕ）。データは、５０ｂｐ ｄｓＲＮＡ ４１２の２つの異なるバッチを使用した３つの独立したアッセイを表す。
【０１５０】
実施例５及び図５：ネイティブ６％アクリルアミドゲル（ＴＢＥ １Ｘ）でのｄｓＲＮＡ ４１２、４３２、４５２及びポリ（Ａ：Ｕ）の分析。
【０１５１】
ＤＨＡＲＭＡＣＯＮから得られた凍結乾燥ｄｓＲＮＡを、製造元のプロトコルに従って、ＲＮＡｓｅを含まない滅菌生理水（ＩＮＶＩＶＯＧＥＮ）に再懸濁した。ＲＮＡローディングバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた後、以下のように調整した６％アクリルアミドゲルに１μｇのｄｓＲＮＡをロードした：１０．３ｍＬの滅菌ＲＮＡｓｅフリー水（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１．５ｍＬのＴＢＥ １０ｘ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、３ｍＬアクリルアミド−ビス３０％（Ｍｅｒｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、０．２ｍＬのＡＰＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、２０μＬ ＴＥＭＥＤ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。ＲＮＡラダーは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。サンプル移行は、１μｇ／ｍＬでＢＥＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）染色を行う前に、１００Ｖで１時間設定した。次に、Ｇｅｌ Ｄｏｃアナライザー（ＢＩＯＲＡＤ）を使用してゲルを可視化した。
【０１５２】
実施例６及び図６：ポリ（Ａ：Ｕ）のサイズの増加のみに応答したマウスマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞によるＴＮＦアルファの分泌。
【０１５３】
５×１０４のＲＡＷ２６４．７細胞を、９６ウェルプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ、ＵＳＡ、Ｃａｔ＃３５３０７２）に最終容量２００μＬで播種した。２４時間後、細胞を、トランスフェクション試薬を含まないｄｓＲＮＡで最終濃度１０μｇ／ｍＬで２４時間処理し、上清を回収してＥＬＩＳＡ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）でマウスＴＮＦ−アルファの分泌を測定した。ＰＡＵ＝高分子量の市販のポリ（Ａ：Ｕ）。データは、３つの独立したアッセイを表す。
【０１５４】
実施例７及び図７：ポリ（Ａ：Ｕ）のサイズ増加のみで、マウスマクロファージＲＡＷ２６４．７のＩＳＲＥ−レポーター遺伝子が活性化される。
【０１５５】
５×１０４のＲＡＷ２６４．７細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｆｒａｎｃｅ、Ｃａｔ＃ｒａｗｏ−ｉｓｇ）を、９６ウェルプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ、ＵＳＡ、３５３０７２）のウェル当たり１００μＬの最終容量で播種した。２４時間後、細胞を、トランスフェクション試薬を含まないｄｓＲＮＡで最終濃度５０μｇ／ｍＬで２４時間処理した後、ＱＵＡＮＴＩ−ｌｕｃキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ＃ｒｅｐ−ｑｌｃ１）を使用して、製造元のプロトコルに従って、ＩＳＲＥ駆動性生物発光アッセイを行った。ＰＡＵ＝高分子量の市販のポリ（Ａ：Ｕ）。データは、３つの独立したアッセイを表す。
【０１５６】
実施例８及び図８：ポリ（Ａ：Ｕ）のサイズ増加のみでヒト非小細胞肺癌細胞ＮＣＩ−Ｈ２９２によるＩＬ６のＴＬＲ３依存性分泌を誘発する。
【０１５７】
３×１０４のＮＣＩ−Ｈ２９２ＷＴ又はＴＬＲ３ＫＯ細胞を、４８ウェルプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ、ＵＳＡ、Ｃａｔ＃３５３０７８）のウェル当たり３００μＬの最終容量で播種した。２４時間後、培地を新しいものと交換し、細胞を、トランスフェクション試薬を含まない最終濃度１０μｇ／ｍＬのｄｓＲＮＡで処理した。２４時間後、ＥＬＩＳＡ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）によってヒトＩＬ−６の分泌を測定するために上清を回収した。ＰＡＵ＝高分子量の市販のポリ（Ａ：Ｕ）。データは、３つの独立したアッセイを表す。
【０１５８】
実施例９及び図９：ポリ（Ａ：Ｕ）のサイズ増加のみでヒト非小細胞肺癌細胞ＮＣＩ−Ｈ２９２のＴＬＲ３依存性の死を誘発する。
【０１５９】
１×１０４のＮＣＩ−Ｈ２９２ＷＴ又はＴＬＲ３ＫＯ細胞を、最終容量１００μＬ／ウェルのｐ９６ウェルプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ、Ｃａｔ＃６５５０９８）に播種した。２４時間後、細胞を、トランスフェクション試薬を含まないｄｓＲＮＡで最終濃度５０μｇ／ｍＬで２４時間処理した後、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｆｒａｎｃｅ、Ｃａｔ＃ＪＡ１０００）のＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ Ｇｌｏ アネキシンＶキットを使用してアネキシンＶ＋発光読み出しでアポトーシスを測定した。ＰＡＵ＝高分子量の市販のポリ（Ａ：Ｕ）。データは、３つの独立したアッセイを表す。
【０１６０】
実施例１０及び図１０：ネイティブ６％アクリルアミドゲル（ＴＢＥ １Ｘ）でのｄｓＲＮＡ ４２２、４３２、４４２、５３２、５３３、５３４、５３５、及びポリ（Ａ：Ｕ）の分析。
【０１６１】
ＤＨＡＲＭＡＣＯＮから得られた凍結乾燥ｄｓＲＮＡを、製造元のプロトコルに従って、ＲＮＡｓｅを含まない滅菌生理水（ＩＮＶＩＶＯＧＥＮ）に再懸濁した。ＲＮＡローディングバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた後、以下のように調整した６％アクリルアミドゲルに１μｇのｄｓＲＮＡをロードした：１０．３ｍＬの滅菌ＲＮＡｓｅフリー水（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１．５ｍＬのＴＢＥ １０ｘ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、３ｍＬアクリルアミド−ビス３０％（Ｍｅｒｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、０．２ｍＬのＡＰＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、２０μＬ ＴＥＭＥＤ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。ＲＮＡラダーは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。サンプル移行は、１μｇ／ｍＬでＢＥＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）染色を行う前に、１００Ｖで１時間設定した。次に、Ｇｅｌ Ｄｏｃアナライザー（ＢＩＯＲＡＤ）を使用してゲルを可視化した。ゲルは、２つの独立したアッセイを表す。
【０１６２】
実施例１１及び図１１：ポリ（Ａ：Ｕ）及びｄｓＲＮＡ ４２２、４３２、４４２、５３２、５３３、５３４、５３５に応答したマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞によるＴＮＦアルファの分泌。
【０１６３】
５×１０４ＲＡＷ２６４．７細胞を、ｐ９６ウェルプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ、ＵＳＡ、Ｃａｔ＃３５３０７２）を使用して、ウェル当たり２００μＬの最終容量で播種した。２４時間後、細胞を、トランスフェクション試薬を含まないｄｓＲＮＡで最終濃度１０μｇ／ｍＬで２４時間処理し、上清を回収してＥＬＩＳＡ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）でマウスＴＮＦ−アルファの分泌を測定した。ＰＡＵ＝高分子量の市販のポリ（Ａ：Ｕ）。データは、２つの独立したアッセイを表す。
【０１６４】
実施例１２及び図１２：増加するサイズのポリ（Ａ：Ｕ）及びｄｓＲＮＡ ４２２、４３２、４４２、５３２、５３３、５３４、５３５のみで、ヒト非小細胞肺癌細胞ＮＣＩ−Ｈ２９２によるＴＬＲ３依存性のＩＬ６分泌を誘発する。
【０１６５】
３×１０４のＮＣＩ−Ｈ２９２ＷＴ又はＴＬＲ３ＫＯ細胞を、ｐ４８ウェルプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ、ＵＳＡ、Ｃａｔ＃３５３０７８）を使用して、ウェル当たり３００μＬの最終容量で播種した。２４時間後、細胞を、トランスフェクション試薬を含まないｄｓＲＮＡで最終濃度１０μｇ／ｍＬで２４時間処理し、上清を回収し、ＥＬＩＳＡ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）でヒトＩＬ−６分泌を測定した。ＰＡＵ＝高分子量の市販のポリ（Ａ：Ｕ）。データは、少なくとも２つの独立したアッセイを表す。
【０１６６】
実施例１３及び図１３：増加するサイズのポリ（Ａ：Ｕ）及びｄｓＲＮＡ ４２２、４３２、４４２、５３２、５３３、５３４、５３５のみで、ヒト非小細胞肺癌細胞ＮＣＩ−Ｈ２９２によるＴＬＲ３依存性のアポトーシスを誘発する。
【０１６７】
１×１０４のＮＣＩ−Ｈ２９２ＷＴ又はＴＬＲ３ＫＯ細胞を、ｐ９６ウェルプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ、ＵＳＡ、Ｃａｔ＃６５５０９８）を使用して、ウェル当たり１００μＬの最終容量で播種した。２４時間後、細胞を、トランスフェクション試薬を含まないｄｓＲＮＡで最終濃度５０μｇ／ｍＬで２４時間処理した後、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｆｒａｎｃｅ、Ｃａｔ＃ＪＡ１０００）のＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ Ｇｌｏ アネキシンＶキットを使用してアネキシンＶ＋発光読み出しでアポトーシスを測定した。ＰＡＵ＝高分子量の市販のポリ（Ａ：Ｕ）。データは、少なくとも２つの独立したアッセイを表す。
【０１６８】
実施例１４及び図１４：２つの異なる化学製造技術で作成された５３２に応答したマウスマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞によるＴＮＦ−アルファの分泌。
【０１６９】
凍結乾燥されたｄｓＲＮＡを、２つの異なる化学製造技術：ＴＢＤＭＳ又は２’ＡＣＥ、を使用してＤＨＡＲＭＡＣＯＮから得た。５×１０４のＲＡＷ２６４．７細胞を、ｐ９６ウェルプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ、ＵＳＡ、Ｃａｔ＃３５３０７２）のウェル当たり２００μＬの最終容量で播種した。２４時間後、細胞を、トランスフェクション試薬を含まないｄｓＲＮＡで最終濃度１〜１００μｇ／ｍＬで２４時間処理し、上清を回収し、ＥＬＩＳＡ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＵＳＡ、Ｃａｔ＃４３０９０３）でｍＴＮＦ−アルファの分泌を測定した。データは、少なくとも３つの異なるアッセイの平均であり、少なくとも６つの独立したアッセイを表す。統計分析は、両側独立ｔ検定を使用して実行される：ＮＳ＝ｐ＞０．０５では有意でない。
【０１７０】
実施例１５及び図１５：２つの異なる製造会社から製造された５３２に応答したマウスマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞によるＴＮＦ−アルファの分泌。
【０１７１】
凍結乾燥されたｄｓＲＮＡを、ＤＨＡＲＭＡＣＯＮ又はＢＩＯＳＰＲＩＮＧから得た。５×１０４のＲＡＷ２６４．７細胞を、ｐ９６ウェルプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ、ＵＳＡ、Ｃａｔ＃３５３０７２）のウェル当たり２００μＬの最終容量で播種した。２４時間後、細胞を、トランスフェクション試薬を含まないｄｓＲＮＡで最終濃度１〜１００μｇ／ｍＬで２４時間処理し、上清を回収し、ＥＬＩＳＡ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＵＳＡ、Ｃａｔ＃４３０９０３）でｍＴＮＦ−アルファの分泌を測定した。データは、少なくとも５つの異なるアッセイの平均を表す。統計分析は、両側独立ｔ検定を使用して実行される：ＮＳ＝ｐ＞０．０５では有意でない。
【０１７２】
実施例１６及び図１６：異なる化学製造合成及び異なる製造会社からの５３２は、ヒト非小細胞肺癌細胞ＮＣＩ−Ｈ２９２の同じアポトーシスレベルを誘発する。
【０１７３】
凍結乾燥されたｄｓＲＮＡを、２つの異なる化学製造技術：ＴＢＤＭＳ又は２’ＡＣＥ、を使用してＤＨＡＲＭＡＣＯＮから得た。加えて、凍結乾燥したｄｓＲＮＡを、ＢＩＯＳＰＲＩＮＧから得た。１×１０４のＮＣＩ−Ｈ２９２ＷＴ細胞を、ｐ９６ウェルプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ、ＵＳＡ、Ｃａｔ＃６５５０９８）を使用して、ウェル当たり１００μＬの最終容量で播種した。２４時間後、細胞を、トランスフェクション試薬を含まないｄｓＲＮＡで最終濃度５０μｇ／ｍＬで２４時間処理した後、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｆｒａｎｃｅ、Ｃａｔ＃ＪＡ１０００）のＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ Ｇｌｏ アネキシンＶキットを使用してアネキシンＶ＋発光読み出しでアポトーシスを測定した。データは、少なくとも４つの独立したアッセイを表す。
【０１７４】
実施例１７及び図１７：異なる化学製造合成由来の５３２は、ヒト非小細胞肺癌細胞ＮＣＩ−Ｈ２９２の同様の細胞生存率低下レベルを誘発する。
【０１７５】
凍結乾燥されたｄｓＲＮＡを、２つの異なる化学製造技術：ＴＢＤＭＳ又は２’ＡＣＥ、を使用してＤＨＡＲＭＡＣＯＮから得た。１×１０４のＮＣＩ−Ｈ２９２ＷＴ細胞を、ｐ９６ウェルプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ、ＵＳＡ、Ｃａｔ＃６５５０９８）を使用して、ウェル当たり１００μＬの最終容量で播種した。２４時間後、細胞を、トランスフェクション試薬を含まないｄｓＲＮＡで最終濃度１〜１００μｇ／ｍＬで２４時間処理し、ＰｒｏｍｅｇａのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｆｒａｎｃｅ、Ｃａｔ＃Ｇ３５８０）で細胞生存率を測定した。データは、少なくとも４つの独立したアッセイを表す。統計分析は、両側独立ｔ検定を使用して実行される：ＮＳ＝ｐ＞０．０５では有意でない。
【０１７６】
実施例１８及び図１８：異なる製造業者からの５３２は、ヒト非小細胞肺癌細胞ＮＣＩ−Ｈ２９２の同様の細胞生存率低下レベルを誘発する。
【０１７７】
凍結乾燥されたｄｓＲＮＡを、ＤＨＡＲＭＡＣＯＮ又はＢＩＯＳＰＲＩＮＧから得た。１×１０４のＮＣＩ−Ｈ２９２ＷＴ細胞を、ｐ９６ウェルプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ、ＵＳＡ、Ｃａｔ＃６５５０９８）を使用して、ウェル当たり１００μＬの最終容量で播種した。２４時間後、細胞を、トランスフェクション試薬を含まないｄｓＲＮＡで最終濃度１〜１００μｇ／ｍＬで２４時間処理し、ＰｒｏｍｅｇａのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｆｒａｎｃｅ、Ｃａｔ＃Ｇ３５８０）で細胞生存率を測定した。データは、少なくとも５つの独立したアッセイを表す。
【０１７８】
実施例１９及び図１９：ＲＮＡｓｅＩ及びＲＮＡｓｅＩＩＩに対するポリ（Ａ：Ｕ）及びｄｓＲＮＡ５３２の感度の分析及びネイティブ６％アクリルアミドゲル（ＴＢＥ １Ｘ）での分析。
【０１７９】
ＲＮＡｓｅＩは、配列に関係なく二本鎖ＲＮＡよりも一本鎖ＲＮＡを優先するＲＮＡｓｅであり、ＲＮＡｓｅＩＩＩは、二本鎖ＲＮＡを、１２〜３０塩基の短いｄｓＲＮＡに切断するＲＮＡｓｅである。ＤＨＡＲＭＡＣＯＮから得られた凍結乾燥されたｄｓＲＮＡを、製造元のプロトコルに従って、ＲＮＡｓｅフリー滅菌生理水（ＩＮＶＩＶＯＧＥＮ）に再懸濁した。１μｇのｄｓＲＮＡを最初に、１ユニットのＲＮＡｓｅＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ ＡＭＢＩＯＮ、Ｃａｔ＃ＡＭ２２９４）又は１ユニットのＲＮＡｓｅＩＩＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ ＡＭＢＩＯＮ、Ｃａｔ＃ＡＭ２２９０）と３７℃で１０分又は３０分インキュベートした後、ＲＮＡローディングバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、以下のように調製した６％アクリルアミドゲルにロードした：１０．３ｍＬの滅菌ＲＮＡｓｅフリー水（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１．５ｍＬのＴＢＥ １０ｘ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、３ｍＬアクリルアミド−ビス３０％（Ｍｅｒｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、０．２ｍＬのＡＰＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、２０μＬ ＴＥＭＥＤ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。ＲＮＡラダーは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。サンプルの移行は、１μｇ／ｍＬでＢＥＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）染色を行う前に、１００Ｖで４５分間に設定した。次に、Ｇｅｌ Ｄｏｃアナライザー（ＢＩＯＲＡＤ）を使用して、ゲルを視覚化した。ＰＡＵ＝高分子量の市販のポリ（Ａ：Ｕ）。データは、少なくとも２つの独立したアッセイを表す。
【０１８０】
実施例２０及び図２０：Ｑ−ＰＣＲマシン分析を使用したＲＮＡ融解曲線プロファイルの分析。
【０１８１】
ＤＨＡＲＭＡＣＯＮから得られた凍結乾燥されたｄｓＲＮＡを、製造元のプロトコルに従って、ＲＮＡｓｅフリー滅菌生理水（ＩＮＶＩＶＯＧＥＮ）に再懸濁した。１μｇのｄｓＲＮＡをＳｙＢｒグリーンミックス（ＢＩＯＲＡＤ、Ｃａｔ＃１７２５２７０）と混合した後、ＢＩＯＲＡＤのＱ−ＰＲＣマシン（ＢＩＯＲＡＤ、ＣＦＸ Ｃｏｎｎｅｃｔ）を使用して融解曲線を分析した。太線は、それぞれのグラフの上の名前付きｄｓＲＮＡに対応する。ＰＡＵ＝高分子量の市販のポリ（Ａ：Ｕ）。データは、少なくとも３つの独立したアッセイを表す。
【０１８２】
【表３】
2021522308.tif 000008
【０１８３】
【表４−１】
2021522308.tif 000009
【表４−２】
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【０１８４】
【表５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年3月3日(2021.3.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２本の相補鎖を有するｄｓＲＮＡから本質的になる二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含む組成物であって、ポリＡの少なくとも１つのブロック又はホモポリマーと、ポリＵの相補的ブロック又はホモポリマーを含み、ここで、各ブロックが、少なくとも１５のＡ、又はＵを含み、及び各鎖が、５０〜２００塩基の間の定められた長さを有し、前記組成物中の全ての鎖又は実質的に全ての鎖は、定められた長さを有し、更には医薬的に許容されるビヒクル、担体又は賦形剤を含む、組成物。
【請求項２】
前記ｄｓＲＮＡが、下記の式（Ｉ）：
（Ｉ）［Ｐ］ａ［Ｑ］ｂ［Ｒ］ｃ
（式中、
−  Ｑは、Ａ又はＵのホモポリマーを表し、ｂは、少なくとも１５の整数であり；
−  ａ及びｃは、独立して０又はａ＋ｂ＋ｃ＝５０〜２００の間であるような整数であってもよく；ａ、ｂ及びｃは、等しくても異なっていてもよく；
−  ａ＝１ならば、Ｑ＝Ａの場合、Ｐが、Ｕ、Ｇ、Ｉ及びＣのうちの１つの基から作られ；Ｑ＝Ｕの場合、Ｐが、Ａ、Ｇ、Ｉ及びＣのうちの１つの基から作られ；
−  ａ＞１ならば、以下の何れかの構成で、Ｐが、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｉ及びＣのうちの少なくとも１つ又は２つの塩基から作られる：これらの塩基の少なくとも２つのランダムな組み合わせ、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｉ及びＣのうちの塩基の１つのブロック、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｉ及びＣのうちの異なる塩基の少なくとも２つのブロック、又はＡ、Ｕ、Ｇ、Ｉ及びＣのうちの少なくとも１つのブロック並びにＡ、Ｕ、Ｇ、Ｉ及びＣのうちの少なくとも１つの他の塩基の混合物；
−  ｃ＝１ならば、Ｒ＝Ａの場合、Ｒが、Ｕ、Ｇ、Ｉ及びＣのうちの１つの塩基で作られ、
−  ｃ＞１ならば、Ｒは、以下の何れかの構成で、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｉ、及びＣのうちの少なくとも１つ又は２つの塩基で作られる：これらの塩基の少なくとも２つのランダムな組み合わせ、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｉ及びＣのうちの塩基の１つのブロック、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｉ及びＣのうちの異なる塩基の少なくとも２つのブロック、又はＡ、Ｕ、Ｇ、Ｉ及びＣのうちの塩基の少なくとも１つのブロック並びにＡ、Ｕ、Ｇ、Ｉ及びＣのうちの少なくとも１つの他の塩基の混合物；
−  Ｐ及びＲは、塩基及び／又は配列の長さに関して同一又は異なる場合がある）
によるＡの少なくとも１つのブロックを有し、ここで、前記ｄｓＲＮＡが、少なくとも２０％のＡ及びＵを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ｄｓＲＮＡが、式（ＩＩ）：
［Ａ］ｂ
［Ｕ］ｂ
（式中、
ｂ＝５０〜２００である）
である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ｄｓＲＮＡが、式（ＩＩＩ）：
［Ｐ］ａ［Ａ］ｂ［Ｒ］ｃ
［Ｙ］ａ［Ｕ］ｂ［Ｚ］ｃ
（式中、
Ｐ及びＲが、Ｇ、Ｉ及び／又はＣの中から選択され、並びにＹ及びＺは、相補的な塩基である。
特に、
ｂ＝２０〜１００の間の整数であり、
ａ及びｃが、独立して、１０〜５０である。）
である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項５】
前記ｄｓＲＮＡが、式（ＩＶ）：
［Ａ］ｂ［Ｒ］ｃ
［Ｕ］ｂ［Ｚ］ｃ
（式中、
Ｒが、Ｇ、Ｉ及び／又はＣの中から選択され、Ｚが、相補的な塩基である。
特に、
ｂ＝２０〜１００の間の整数であり、
ｃ＝１０〜５０である）
である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項６】
前記ｄｓＲＮＡが、式（Ｖ）：
［Ｐ］ａ［Ａ］ｂ
［Ｙ］ａ［Ｕ］ｂ
（式中、
Ｐが、Ｇ、Ｉ及び／又はＣの中から選択され、Ｙが、相補的な塩基である。
特に、
ｂ＝２０〜１００の間の整数であり、
ａ＝１０〜５０である。）
である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項７】
前記ｄｓＲＮＡが、式（ＶＩ）：
［Ｐ］ａ［Ａ］ｂ［Ｒ］ｃ
［Ｙ］ａ［Ｕ］ｂ［Ｚ］ｃ
（式中、
Ｐ及びＲが、Ｉ及びＣの中から独立して選択され、並びにＹ及びＺが、相補的な塩基であり、
ｂ＝約２０〜約１００の間の整数であり、
ａ又はｃのうちの１つが、０であり得、並びにａ及びｃが、同時に０に等しくない場合、１０〜５０である。）
である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項８】
前記Ａのブロックが、２０％未満のＵ、Ｇ、Ｉ及びＣのうちの他の塩基を含む、請求項１〜７の何れか１項に記載の組成物。
【請求項９】
組成物１ｍｌ当たり０．０１〜１００ｍｇの前記ｄｓＲＮＡを含む、請求項１〜８の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記鎖の少なくとも９５％が定められた長さを有する、請求項１〜９の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
医薬組成物であって、ＴＬＲ３受容体を発現する癌を治療するための請求項１〜１０の何れか１項に記載の組成物を含む、医薬組成物。
【請求項１２】
前記医薬組成物が、骨髄細胞を活性化し、上皮癌細胞の死を誘発する、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記医薬組成物が、骨髄細胞によって発現されるＴＬＲ３を活性化し、炎症性サイトカイン及びケモカインの分泌を誘導し、及びヒト又は哺乳動物の癌細胞における炎症及び死のＴＬＲ３依存性活性化を誘発する、請求項１１又は１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記医薬組成物及び化学療法薬が、哺乳動物又はヒトへの同時、別個、又は連続投与される、請求項１１〜１３の何れか１項に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
2021522308.tif 000032
2021522308.tif 000033
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