(57)【要約】  本発明は、中枢神経系疾患の治療のための遺伝子配列コンストラクトを提供する。前記遺伝子配列コンストラクトでは、自動処理（ａｕｔｏ−ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）によりベクターの構築が発現されるとともに、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩ（ＧＣＨ１）、及び芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）などが発現され、タンパク質同士が自動処理ユニット（ＡＰＵ：ａｕｔｏ−ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｕｎｉｔ）を介して結合され、ウイルスベクターによって標的細胞にターゲティングして導入されると、最終的には、効率的に発現された、独立した機能を備えたチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩ（ＧＣＨ１）、及び芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）などをパーキンソン病、アルツハイマー病及び他の神経変性疾患の予防又は治療のために生成する。
2021525532.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
中枢神経系疾患の治療のための遺伝子配列コンストラクトであって、
前記コンストラクトは、自動処理ユニット（ＡＰＵ）によって結合された中枢神経系疾患の治療に関連するヌクレオチド配列であることを特徴とする、中枢神経系疾患の治療のための遺伝子配列コンストラクト。
【請求項２】
前記自動処理ユニット（ＡＰＵ）は、Ｎ−端自動処理構造ドメイン及び／又はＣ−端自動処理構造ドメインを含むことを特徴とする、請求項１に記載の中枢神経系疾患の治療のための遺伝子配列コンストラクト。
【請求項３】
前記Ｎ−端自動処理構造ドメインは、インテイン（Ｉｎｔｅｉｎ）、Ｂ型細菌体インテイン（Ｉｎｔｅｉｎ）様ドメイン（ＢＩＬ）、フューリン（Ｆｕｒｉｎ）配列、及びそれらの誘導体を含み、
前記Ｃ−端自動処理構造ドメインは、２Ａペプチド又は２Ａ様ペプチドを含むことを特徴とする、請求項２に記載の中枢神経系疾患の治療のための遺伝子配列コンストラクト。
【請求項４】
前記２Ａペプチド又は２Ａ様ペプチドは、口蹄疫ウイルス由来の２Ａペプチド（Ｆ２Ａ）、ブタジーシェンウイルス由来の２Ａペプチド（Ｐ２Ａ）、昆虫ウイルス由来の２Ａペプチド（Ｔ２Ａ）、及びウマ鼻炎ウイルス由来の２Ａペプチド（Ｅ２Ａ）を含むことを特徴とする、請求項３に記載の中枢神経系疾患の治療のための遺伝子配列コンストラクト。
【請求項５】
中枢神経系疾患の治療に関連するヌクレオチド配列は、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩ（ＧＣＨ１）、芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、神経系成長因子ヌクレオチド配列から選択された２種又は２種以上を含み、
前記ヌクレオチド配列のうちの少なくとも２つのヌクレオチド配列は、自動処理ユニット（ＡＰＵ）によって結合されることを特徴する、請求項１に記載の中枢神経系疾患の治療のための遺伝子配列コンストラクト。
【請求項６】
前記神経系成長因子は、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子−３（ＮＴ−３）、神経成長因子−４／５（ＮＴ−４／５）、神経成長因子−６（ＮＴ−６）、繊毛神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）及びＧＤＮＦ分子ファミリーを含み、
前記ＧＤＮＦ分子ファミリーは、ＧＤＮＦの天然に存在する類似体、神経ランクタンパク質、ペルセフィン（ｐｅｒｓｅｐｈｉｎ）及びアルテミン（ａｒｔｅｍｉｎ）を含むことを特徴する、請求項５に記載の中枢神経系疾患の治療のための遺伝子配列コンストラクト。
【請求項７】
前記コンストラクトは、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩ（ＧＣＨ１）、芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）を含み、
前記ヌクレオチド配列のうちの少なくとも２つのヌクレオチド配列は、自動処理ユニット（ＡＰＵ）によって結合されることを特徴する、請求項５に記載の中枢神経系疾患の治療のための遺伝子配列コンストラクト。
【請求項８】
ウイルスベクターゲノムであって、
前記ウイルスベクターゲノムは、請求項１から７のいずれか一項に記載の中枢神経系疾患の治療のための遺伝子配列コンストラクトを含み、
前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター又はアデノ関連ウイルスベクターを含むことを特徴する、ウイルスベクターゲノム。
【請求項９】
レンチウイルスベクターシステムであって、
前記レンチウイルスベクターシステムは、請求項１から７のいずれか一項に記載の中枢神経系疾患の治療のための遺伝子配列コンストラクトを含むゲノムを含むことを特徴する、レンチウイルスベクターシステム。
【請求項１０】
パーキンソン病、アルツハイマー病及び他の神経変性疾患の治療及び／又は予防に用いられる、請求項１から７のいずれか一項に記載の遺伝子配列コンストラクトを含む生物学的製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子治療分野に関し、具体的には中枢神経系疾患の治療のための遺伝子配列コンストラクトに関し、当該遺伝子配列コンストラクトがパーキンソン病、アルツハイマー病及び他の神経変性疾患の予防又は治療に用いられてもよい。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病（ＰＤ）は、黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの喪失を特徴とし、中脳ドーパミンレベルを低下させて発症する神経変性性疾患である。パーキンソン病は、世界の５５歳以上の人群の約１％に影響を与え、社会の高齢化に伴い、患者数は増え続ける。パーキンソン病の一般的な治療法は、ドーパミンの前駆体であるレボドパの経口投与であり、症状をある程度緩和することができる。しかしながら、病状の発展に伴い、レボドパの治療は満足のいくものではない。
【０００３】
遺伝子療法は、パーキンソン病の治療に独特な利点があり、ドーパミン合成遺伝子を線条体にターゲティングして伝送することにより、ドーパミンを線条体内に合成させて放出し、それによってパーキンソン病の治療をより効果的にすることができる。チロシンは、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）によって触媒されてレボドパを合成し、次に芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）は、レボドパをドーパミンに変換する。ＴＨは補酵素としてテトラヒドロビオプテリンを必要とするが、テトラヒドロビオプテリンはＧＴＰ−シクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１）によって合成されるため、ＴＨ、ＡＡＤＣ及びＧＣＨ１の発現によりドーパミンを効率的に合成することができる（Ａｚｚｏｕｚ  Ｍ  ら、２００２．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２（２３）：１０３０２−１２．ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ  Ｂら、２００９．Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．１（２）：２）。
【０００４】
２０１４年、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に基づくレンチウイルスベクターに、２つの内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）で結合された３つの主要なドーパミンシンターゼ酵素を含ませることは、第Ｉ／ＩＩ相臨床試験で良好な結果を示している（Ｐａｌｆｉ  Ｓら、２０１４．Ｌａｎｃｅｔ．３８３（９９２３）：１１３８−４６．）。しかしながら、この方法は、ＩＲＥＳで３つの遺伝子を発現すると、常に不均衡な発現が発生するなどの多くの問題がある。したがって、Ｓｔｅｗａｒｔ  ＨＪ  ｅｔ  ａｌらは、ＩＲＥＳエレメントをリンカーペプチド（ｌｉｎｋｅｒ）に置き換えて、ドーパミン合成に必要な３つの酵素活性のうちの２つ以上を含む融合タンパク質を生成する（ｔｅｗａｒｔ  ＨＪら、２０１６．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  Ｃｌｉｎ  Ｄｅｖ．２７（３）：１００−１０．）。しかしながら、天然状態においてＴＨ、ＡＡＤＣ及びＧＣＨ１の３つのタンパク質は、独立したタンパク質の形で発現され、融合タンパク質は、ドーパミン合成の効率に影響を与える可能性があり、したがって、新しいタンパク質結合発現方式を見つけ、適切なベクターを選択して標的細胞に導入し、それらを効率的に発現させることは、依然としてパーキンソン病の治療において解決すべき問題である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、従来の治療技術の欠点に対して、自動処理（ａｕｔｏ−ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）によってベクターの構築が発現されるとともに、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩ（ＧＣＨ１）、及び芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、及び神経系成長因子などが発現され、タンパク質同士が自動処理ユニット（ＡＰＵ：ａｕｔｏ−ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｕｎｉｔ）によって結合され、ウイルスベクターによって標的細胞にターゲティングして導入されると、最終的には、高度に発現された、独立した機能を備えたチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩ（ＧＣＨ１）、及び芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）などをパーキンソン病の治療のために生成することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は以下の内容を含む：中枢神経系疾患の治療のための遺伝子配列コンストラクトにおいて、前記コンストラクトは、自動処理ユニット（ＡＰＵ）によって結合された、中枢神経系疾患の治療に関連するヌクレオチド配列であり、
好ましくは、中枢神経系疾患の治療のための遺伝子配列コンストラクトにおける中枢神経系疾患の治療に関連するヌクレオチド配列は、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩ（ＧＣＨ１）、芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、神経系成長因子ヌクレオチド配列から選択された２種又は２種以上であり、
前記ヌクレオチド配列のうちの少なくとも２つのヌクレオチド配列は、自動処理ユニット（ＡＰＵ）によって結合され、前記自動処理ユニット（ＡＰＵ）は、Ｎ−端自動処理構造ドメイン及び／又はＣ−端自動処理構造ドメインを含み、
好ましくは、前記神経系成長因子は、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子−３（ＮＴ−３）、神経成長因子−４／５（ＮＴ−４／５）、神経成長因子−６（ＮＴ−６）、繊毛神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）及びＧＤＮＦ分子ファミリー（ＧＤＮＦの天然に存在する類似体、神経ランクタンパク質、ペルセフィン（ｐｅｒｓｅｐｈｉｎ）及びアルテミン（ａｒｔｅｍｉｎ））を含み、
好ましくは、中枢神経系疾患の治療のための遺伝子配列コンストラクトは、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩ（ＧＣＨ１）、芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）を含み、
前記ヌクレオチド配列のうちの少なくとも２つのヌクレオチド配列は、自動処理ユニット（ＡＰＵ）によって結合され、
好ましくは、前記Ｎ−端自動処理構造ドメインは、インテイン（Ｉｎｔｅｉｎ）、Ｂ型細菌体インテイン（Ｉｎｔｅｉｎ）様構造ドメイン（ＢＩＬ）、フューリン（Ｆｕｒｉｎ）配列、及びそれらの誘導体を含み、
好ましくは、前記Ｃ−端自動処理構造ドメインは、２Ａペプチド又は２Ａ様ペプチドを含み、
好ましくは、中枢神経系疾患の治療のための遺伝子配列コンストラクトにおける２Ａペプチド又は２Ａ様ペプチドは、口蹄疫ウイルス由来の２Ａペプチド（Ｆ２Ａ）、ブタジーシェンウイルス由来の２Ａペプチド（Ｐ２Ａ）、昆虫ウイルス由来の２Ａペプチド（Ｔ２Ａ）、及びウマ鼻炎ウイルス由来の２Ａペプチド（Ｅ２Ａ）を含む。
【０００７】
自動処理された２Ａペプチドは、最も早く口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）に由来する。ＦＭＤＶは、小ＲＮＡウイルス科口蹄疫ウイルス属に属する。ＦＭＤＶゲノムによって符号化されたプロテアーゼ２Ａの翻訳プロセスに形成できる高レベルの構造は、リボソームペプチジルトランスフェラーゼの中心を立体的に妨害し、正常なペプチド鎖結合を形成できないが、同時にリボソームは下流のタンパク質を翻訳し続けることができ、それによって前後の２つのタンパク質をシスで「カット」するタンパク質分解酵素のような作用を形成し、ＦＭＤＶと同様に、ピコルナウイルス科のカーディオウイルス、ティラーのマウス脳脊髄ウイルス、ウマ鼻炎ウイルス、ブタジーシェンウイルスなどにも２Ａペプチドが含まれ、なお、昆虫ウイルス、Ｃ型ロタウイルスとトリパノソーマ型繰り返し配列ではすべて２Ａペプチドの機能を持つ類似の遺伝子配列が発見される。２Ａペプチド又は２Ａ様ペプチドの自動処理配列は内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）と同様に、２つ以上の非融合外来タンパク質を独立して発現させる目的を達成するために、マルチ遺伝子発現によく応用され、ＩＲＥＳと比較して、２Ａペプチド又は２Ａ様ペプチドは、マルチ遺伝子発現ベクターの構築において明らかな利点があり、例えば、２Ａペプチド又は２Ａ様ペプチドは小さく、且つ２Ａ要素によって結合された上流及び下流遺伝子の発現バランスが良く、本発明は、自動処理ペプチドＰ２Ａを使用してＴＨ、ＡＡＤＣ及びＧＣＨ１の３つのタンパク質を結合し、３つのタンパク質の独立した効率的な発現を得る。
【０００８】
ウイルスベクターゲノムであって、前記ウイルスベクターゲノムは、上記のいずれかの中枢神経系疾患の治療のための遺伝子配列コンストラクトを含み、
前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター又はアデノ関連ウイルスベクターを含む。
【０００９】
レンチウイルスベクターシステムであって、前記レンチウイルスベクターシステムは、上記の中枢神経系疾患の治療のための遺伝子配列コンストラクトを含むゲノム、及びｇａｇとｐｏｌタンパク質を符号化するための１つ又は複数のヌクレオチド配列及び他の必要なウイルスパッケージングコンポーネントのヌクレオチド配列を含む。
【００１０】
上記のいずれかの遺伝子配列コンストラクトを含む生物学的製剤であって、前記生物学的製剤は、パーキンソン病、アルツハイマー病及び他の神経変性疾患の治療及び／又は予防に用いられる。
上記のいずれかの遺伝子配列コンストラクトを含む生物学的製剤であって、前記生物学的製剤は、上記の遺伝子配列を含むコンストラクトウイルスベクターシステム、及び他の必要なウイルスパッケージングコンポーネントを含み、さらにウイルス粒子に医薬的に許容されるベクター又は希釈剤を加えて形成された生物学的製剤であり、体内でドーパミンを生成するための薬の調製、及びパーキンソン病、アルツハイマー病及び他の神経変性疾患の治療及び／又は予防の用途に用いられる。
【００１１】
具体的には、遺伝子配列コンストラクトであって、前記コンストラクトは、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩ（ＧＣＨ１）、芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）ヌクレオチド配列から選択された２種又は２種以上を含み、
前記ヌクレオチド配列のうちの少なくとも２つのヌクレオチド配列は、自動処理ユニット（ＡＰＵ）によって結合されている。
【００１２】
チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩ（ＧＣＨ１）、芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）ヌクレオチド配列を含む遺伝子配列コンストラクトが選択され、当該ヌクレオチド配列のうちの少なくとも２つの配列は自動処理ユニット（ＡＰＵ）によって結合され、当該遺伝子配列は次の構築方式を含む：
ＴＨ−ＡＰＵ−ＣＨ１−ＡＰＵ−ＡＡＤＣ、ＴＨ−ＡＰＵ−ＣＨ１−他の配列−ＡＡＤＣ、ＴＨ−他の配列−ＣＨ１−ＡＰＵ−ＡＡＤＣ、
ＴＨ−ＡＰＵ−ＡＡＤＣ−ＡＰＵ−ＣＨ１、ＴＨ−他の配列−ＡＡＤＣ−ＡＰＵ−ＣＨ１、ＴＨ−ＡＰＵ−ＡＡＤＣ−他の配列−ＣＨ１、
ＣＨ１−ＡＰＵ−ＴＨ−ＡＰＵ−ＡＡＤＣ、ＣＨ１−ＡＰＵ−ＴＨ−他の配列−ＡＡＤＣ；ＣＨ１−他の配列−ＴＨ−ＡＰＵ−ＡＡＤＣ、
ＣＨ１−ＡＰＵ−ＡＡＤＣ−ＡＰＵ−ＴＨ、ＣＨ１−ＡＰＵ−ＡＡＤＣ−他の配列−ＴＨ、ＣＨ１−他の配列−ＡＡＤＣ−ＡＰＵ−ＴＨ、
ＡＡＤＣ−ＡＰＵ−ＴＨ−ＡＰＵ−ＣＨ１、ＡＡＤＣ−ＡＰＵ−ＴＨ−他の配列−ＣＨ１、ＡＡＤＣ−他の配列−ＴＨ−ＡＰＵ−ＣＨ１、
ＡＡＤＣ−ＡＰＵ−ＣＨ１−ＡＰＵ−ＴＨ；ＡＡＤＣ−ＡＰＵ−ＣＨ１−他の配列−ＴＨ、ＡＡＤＣ−他の配列−ＣＨ１−ＡＰＵ−ＴＨ。
【００１３】
ＡＰＵは自動処理ユニットであり、他の配列はリンカーペプチドコード配列（ｌｉｎｋｅｒ）、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、プロモーター又はインテインを含む。
当該コンストラクトにおける自動処理ユニット（ＡＰＵ）は、２Ａペプチド又は２Ａ様ペプチドを含む。
遺伝子配列コンストラクトにおける２Ａペプチド又は２Ａ様ペプチドは、口蹄疫ウイルス由来の２Ａペプチド（Ｆ２Ａ）、ブタジーシェンウイルス由来の２Ａペプチド（Ｐ２Ａ）、昆虫ウイルス由来の２Ａペプチド（Ｔ２Ａ）、及びウマ鼻炎ウイルス由来の２Ａペプチド（Ｅ２Ａ）を含む。
【００１４】
遺伝子配列コンストラクトにプロモーターが含まれる場合、プロモーターは構成的プロモーター又は組織特異的プロモーターであり、構成的プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター又はチミジンキナーゼプロモーターを含む。組織特異的プロモーターは、シナプシン（ｓｙｎａｐｓｉｎ）プロモーター、ＣＤ６８プロモーター、ＧＦＡＰプロモーター又は他の合成プロモーターを含む。
【００１５】
従来技術と比べて、本発明は以下の利点を有する：
１、本発明は、ドーパミン合成遺伝子を結合するための新しい方法を提供する。本発明の実験的研究は、この方法が標的タンパク質発現のバランスを向上させ、ドーパミン及びその代謝物の合成レベルを高めることができ、抗パーキンソン病の治療効果を向上させることができることを示す。
２、本発明は、Ｐ２Ａの自動処理ペプチドを利用して各タンパク質を結合する発現を初めて確定し、最終的に、発現が安定であり且つ独立した機能を持っているチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩ（ＧＣＨ１）、芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、及び神経系成長因子を生成することができ、パーキンソン病及び他の神経変性疾患の治療及び／又は予防のための新しいポリ―シを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
本発明の実施例又は従来技術における技術的解決策をより明確に説明するために、以下に実施例又は従来技術の説明に必要な図面を簡単に紹介し、明らかに、以下に説明される図面は本発明のいくつかの実施例だけであり、当業者であれば、創造的な労働を要することなく、これらの図面に基づいて他の図面を得ることができる。
【００１７】
【図１】本発明のパーキンソン病遺伝子療法のための遺伝子配列コンストラクトの概略図である。
【図２】本発明のコンストラクトの構造の概略図である。
【図３】２９３Ｔ細胞が形質導入された後、芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩ（ＧＣＨ１）、及びチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）タンパク質のウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ）検出結果を示す図である。
【図４】ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞が形質導入された後、芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩ（ＧＣＨ１）、及びチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）タンパク質のウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ）検出を示す図である。
【図５】ウイルスがＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に形質導入された後、ＨＰＬＣがドーパミンがＤＡ生成量を検出した結果を示す図である。
【００１８】
ここで、図１では、芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩ（ＧＣＨ１）、及びチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）を発現するコード配列が含まれ、当該タンパク質同士は自動処理ペプチドＰ２Ａで結合され、当該遺伝子は転写及び翻訳され、自動処理ペプチドで処理された後、独立した芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ−Ｐ２Ａ）、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩ（ＧＣＨ１−Ｐ２Ａ）、及びチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、を生成することができ、Ｐ２Ａはブタジーシェンウイルスの２Ａ自動処理ペプチドである。
【００１９】
図２では、ＡＡＤＣは芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼであり、ＧＣＨ１はＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩであり、ＴＨはチロシンヒドロキシラーゼであり、Ｐ２Ａはブタジーゼンウイルスの２Ａ処理ペプチドであり、シナプシン（Ｓｙｎａｐｓｉｎ）、ＣＭＶ、ＳＶ４０及びＰＧＫはすべてプロモーターである。
【００２０】
図３では、ブランクはウイルスのない形質導入群であり、ＧＦＰ：ＣＭＶ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＥＧＦＰウイルス形質導入群であり、ＰＤ−１はＳｙｎａｐｓｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＡＡＤＣ−Ｐ２Ａ−ＧＣＨ１−Ｐ２Ａ−ＴＨウイルス形質導入群であり、ＰＤ−２はＣＭＶ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＡＡＤＣ−Ｐ２Ａ−ＧＣＨ１−Ｐ２Ａ−ＴＨウイルス形質導入群であり、Ｐ：ＣＭＶ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＡＡＤＣ−ＳＶ４０  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＴＨ−ＰＧＫ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＧＣＨ１ウイルス形質導入群であり、Ｅｎｄｏ−ＴＨは細胞の内因性ＴＨであり、Ｅｘｏ−ＴＨは外因的に過剰発現された触媒ドメインのみのＴＨである。
【００２１】
図４では、ブランクはウイルスのない形質導入群であり、ＧＦＰ：ＣＭＶ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＥＧＦＰウイルス形質導入群であり、ＰＤ−１はＳｙｎａｐｓｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＡＡＤＣ−Ｐ２Ａ−ＧＣＨ１−Ｐ２Ａ−ＴＨウイルス形質導入群であり、ＰＤ−２はＣＭＶ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＡＡＤＣ−Ｐ２Ａ−ＧＣＨ１−Ｐ２Ａ−ＴＨウイルス形質導入群であり、Ｐ：ＣＭＶ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＡＡＤＣ−ＳＶ４０  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＴＨ−ＰＧＫ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＧＣＨ１ウイルス形質導入群であり、Ｅｎｄｏ−ＴＨは細胞内因性ＴＨであり、Ｅｘｏ−ＴＨは外因的に過剰発現された触媒ドメインのみのＴＨである。
【００２２】
図５では、ＧＦＰはＧＦＰウイルス形質導入グループであり、ＰＤ−２はＣＭＶ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＡＡＤＣ−Ｐ２Ａ−ＧＣＨ１−Ｐ２Ａ−ＴＨウイルス形質導入群である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下に実施例を参照して本発明をさらに詳細に説明する。以下の実施例は、本発明を解釈するためのものであるが、本発明は、以下の実施例に限定されない。
【００２４】
実施例：
一、図２に示すように、様々なコンストラクトの構築：
ＫＬ００３９ベクター、人工的に合成されＣＭＶ  ｅｎｈａｎｃｅｒ−ｓｙｎａｐｓｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＡＡＤＣ−Ｐ２Ａ−ＧＣＨ１−Ｐ２Ａ−ＴＨ  及びＡＡＤＣ−ＳＶ４０  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＴＨ−ＰＧＫ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＧＣＨ１配列（ここでＴＨは切断型ＴＨである）が用いられ、ＣＭＶ  ｅｎｈａｎｃｅｒ−ｓｙｎａｐｓｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＡＡＤＣ−Ｐ２Ａ−ＧＣＨ１−Ｐ２Ａ−ＴＨ  はｐＵＣ５７ベクター（ｐＵＣ５７−ｓｙｎａｐｓｉｎ−ＡＧＴ）に結合され、ここでのＫＬ００３９ベクターは、既存のレンチウイルスベクター又は必要に応じてそれが部分的に変更されたレンチウイルスベクターから選択されたレンチウイルストランスファーベクターである。
【００２５】
１、ＰＤ１ベクターの構築
ＫＬ００３９ベクターをテンプレートとし、Ａｇｅ−Ｆ＋Ｓａｌ−Ｒを使用してＷＰＲＥとｃＰＰＴの間の配列を増幅し、ＰＣＲ産物を電気泳動により回収して精製する。使用したプライマー配列は、Ａｇｅ−Ｆ即ちＣＴＧＡＧＴＧＣＣＡＴＴＧＧＡＴＧＡ  ｃａａｔｃａａｃｃｔｃｔｇｇａｔｔａｃａ、Ｓａｌ−Ｒ即ちｇａｔｔａｃｔａｔｔａａｔａａｃｔａｃｔｃａｃｇｃａｔｇｃｔｃｔｔｃｔｃｃａである。同時に、ｐＵＣ５７−ｓｙｎａｐｓｉｎ−ＡＧＴプラスミドをＡｇｅＩとＳａｌＩで酵素消化し、４．１ｋｂのバンドを回収し、回収及び精製されたＰＣＲ産物と酵素消化されたｓｙｎａｐｓｉｎ−ＡＧＴフラグメントとＴ４  ＤＮＡリガーゼを介して結合された後、ＤＨ５αコンピテントセルを形質転換する。ＰＣＲ識別のためにいくつかの単一クローンを選択し、シーケンスによって陽性クローンを確認する。
【００２６】
２、ＰＤ２ベクターの構築
ＫＬ００３９ベクターをテンプレートとし、プライマーＳｎａＢＩ−Ｆ即ちＴＣＡＧｔａｃｇｔａｔｔａｇｔｃａｔｃｇｃｔａｔ及びＳｐｅＩ−Ｒ即ちＣＧＡＴａｃｔａｇｔｇａｇｃｔｃｔｇｃｔｔａｔａｔａｇａを使用してＣＭＶ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ配列を増幅し、ＰＣＲ産物（２４５  ｂｐ）を電気泳動により回収して精製する。ＣＭＶプロモーターとｐＵＣ５７−シナプシン−ＡＧＴプラスミドをＳｎａＢＩとＳｐｅＩで同時に二重酵素消化し、ＣＭＶ  ＰｒｏｍｏｔｅｒとｐＵＣ５７−ＡＧＴフラグメントをそれぞれ回収及び精製し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによって結合した後にＤＨ５αコンピテントセルを形質転換する。ＰＣＲ識別のためにモノクローナル形質転換体を選択する。シーケンスによって陽性クローンを確認する。この陽性クローンは、ｐＵＣ５７−ＣＭＶ−ＡＧＴプラスミドと名付けられる。次に、ＫＬ００３９ベクターをテンプレートとし、Ａｇｅ−Ｆ＋Ｓａｌ−Ｒを使用してＷＰＲＥとｃＰＰＴの間の配列を増幅し、ＰＣＲ産物を電気泳動により回収して精製する。ＰＣＲ産物とｐＵＣ５７−ＣＭＶ−ＡＧＴプラスミドをＡｇｅＩとＳａｌＩで同時に二重酵素消化し、ＰＣＲ産物とＣＭＶ−ＡＧＴフラグメントを電気泳動により回収し、精製する。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによって結合された後、ＤＨ５αコンピテントセルを形質転換する。ＰＣＲ識別のためにモノクローナル形質転換体を選択する。シーケンスによって陽性クローンを確認する。
【００２７】
３、ベクターの構築：ＰＤ２ベクターのＡＧＴ配列を配列ＡＡＤＣ−ＳＶ４０プロモーター−ＴＨ−ＰＧＫプロモーター−ＧＣＨ１で置き換える。
【００２８】
４、ＧＦＰベクターはＥＧＦＰ配列をクローン化し、ＰＤ２ベクターのＡＧＴ配列を置き換える。
【００２９】
二、２９３Ｔ及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を形質導入した後の異なるコンストラクトの標的タンパク質の発現の違いを評価する
【００３０】
２９３Ｔ細胞株をレンチウイルス４プラスミドシステムで瞬時にトランスフェクトし、ＧＦＰ（ＣＭＶ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＥＧＦＰ）、ＰＤ１（ｓｙｎａｐｓｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＡＧＴ）、ＰＤ２（ＣＭＶ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＡＧＴ）のレンチウイルス及び陽性対照ウイルスＰ（ＣＭＶ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＡＡＤＣ−ＳＶ４０  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＴＨ−ＰＧＫ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＧＣＨ１）をそれぞれパッケージ化する。初期のウイルスを精製、濃縮、希釈して２９３Ｔ細胞に形質導入し、ＲＴ−ＰＣＲ（ＷＰＲＥ／ＡＬＢ）により滴定濃度を測定し、すべてのコンストラクトの滴定濃度は類似し、滴定濃度範囲は、３．４Ｅ＋０９ＴＵ／ｍｌから＋８．７４Ｅ＋０９ＴＵ／ｍｌである。
【００３１】
標的タンパク質の発現レベルを研究するために、２９３Ｔ細胞を各グループのウイルスＭＯＩ＝１０で形質導入し、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞をＭＯＩ＝２０で形質導入し、それぞれ７２時間形質導入した後、ＡＡＤＣ、ＧＣＨ１及びＴＨのＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔのために細胞溶解物を収集する。結果は、２９３Ｔ細胞において、内因性タンパク質に対して、低いＴＨが検出されたが、ＡＡＤＣとＧＣＨ１が検出されないことを示す。すべてのタンパク質は、予測と同じである。ウイルスのない形質導入群ブランク及びＧＦＰウイルス形質導入対照群と比較して、３つのタンパク質の全ての最高レベルの発現はＰＤ２ウイルスベクターに由来し、ＰウイルスベクターのＡＡＤＣレベルが最も高いが、他の２つのタンパク質ＧＣＨ１とＴＨは基本的に検出できない。ＰＤ１ウイルスベクターの場合、そのプロモーターは、ニューロン特異的プロモーターＳｙｎａｐｓｉｎであるため、予想と同じであり、３つの標的タンパク質はいずれも２９３Ｔ細胞で発現されない（図３）。さらに、神経細胞ＳＨ−ＳＹ５Ｙでの３つの異なるコンストラクトの標的タンパク質の発現を検出し、内因性タンパク質ＴＨとＡＡＤＣの両方は、発現されたが、ＧＣＨ１は検出されなく、すべてのタンパク質の分子量は予測と同じである。２９３Ｔ細胞の結果と一致し、ウイルスのない形質導入群ブランク及びＧＦＰウイルス形質導入対照群と比較して、３つのタンパク質の全ての最高レベルの発現は依然としてＰＤ２ウイルスベクターに由来し、ＰウイルスベクターのＡＡＤＣレベルが最も高いが、他の２つのタンパク質ＧＣＨ１とＴＨは依然として基本的に検出できない。ＰＤ１ウイルスベクターの場合、少量のＡＡＤＣとＴＨの発現のみが見られ、ＧＣＨ１は基本的に検出できない（図４）。
【００３２】
三、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を形質導入した後の異なるコンストラクトのカテコラミンの生成量の違いを評価する
【００３３】
ニューロン内のＤＡは、主にモノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）によってジヒドロキシフェニル酢酸（ＤＯＰＡＣ）に変換され、レンチウイルスベクターを使用して、ＳＨＳＹ５Ｙ細胞と２９３Ｔ細胞の２種類の細胞をそれぞれ形質導入し、質量分析法を使用し、形質導入された細胞の上清中のドーパミンの生成量を検出する。ウイルスがＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に形質導入された後、一晩後に培地を交換し、３日目まで培養を続けて細胞培養液を収集し、４５００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離し、培養上清を１．５ｍＬ遠心管に移し、検出のために−８０℃の冷蔵庫に保管し、ウイルスがＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に形質導入された後、一晩後に培地を交換し、２日間の培養後１：１０に継代し、２日間培養し続けた後、培地を１０ｍＭ  Ｌ−Ｔｙｒｏｓｉｎｅを含む新鮮な培地に交換し、翌朝まで培養を続けて収集し、４５００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離し、培養上清を１．５ｍＬ遠心管に移し、検出のために−８０℃の冷蔵庫に保管する。
【００３４】
サンプルに対して質量分析法を使用してドーパミン含有量を検出する方法は、５００μＬの細胞培養培地を取り、適切な量の内部標準を加え、サンプルローディング溶液として１ｍＬの５０ｍＭ酢酸アンモニウムで希釈及び混合し、メタノールで活性化した後、２０ｍＭの酢酸アンモニウム、アセトニトリル：イソプロパノール（１：１）で洗浄し、カートリッジを吸引乾燥し、次いで２％ギ酸アセトニトリル溶液で溶出し、窒素で乾燥させ、残留物を１００μＬの０．１％ＦＡで溶解し、１５０００ｒ／ｍｉｎで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を取り、マシン（Ａｎｇｉｌｅｎｔ  １２９０ＵＰＬＣ−６４７０ＭＳ／ＭＳ検出システム）で分析する。
【００３５】
結果が図５に示され、ＫＬ−ＰＤ２レンチウイルスベクターを形質導入した２９３Ｔ細胞とＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、３つのドーパミンシンテターゼが効果的であり且つ均一に発現されるため、細胞上清中のドーパミンの生成量を大幅に増加させる。
【００３６】
なお、説明すべきこととして、本明細書に記載されている具体的な実施例では、様々な物質又はベクターの名称などが異なってもよい。本発明の特許の概念に記載された構造及び原理に従って行われたすべての同等又は簡単な変更は、いずれも本発明の特許の保護範囲に含まれる。当業者は、説明される具体的な実施例に対して様々な変更又は補充を行うか、または類似の方式で代替することができるが、本発明の構造から逸脱するか、又は本特許請求の範囲によって定義される範囲を超えない限り、それらは、いずれも本発明の保護範囲内に含まれるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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