(57)【要約】  本発明は、溶液中の少なくとも１つの目的のオリゴヌクレオチドコンジュゲイトを検出するための方法に関し、目的のオリゴヌクレオチドコンジュゲートは核酸実体および非極性実体から構成され、核酸実体は非極性実体と化学的に結合され、本方法は、目的のオリゴヌクレオチドコンジュゲートを含む液体試料を提供するステップ、液体試料から目的のオリゴヌクレオチドコンジュゲートを、溶液中に少なくとも１つのシクロデキストリンの存在を含む条件下で分析手段によって分離するステップ、および定量的または定性的分析の手段によって目的のオリゴヌクレオチドコンジュゲートを検出するステップを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液中の少なくとも１つの目的のオリゴヌクレオチドコンジュゲートを検出するための方法であって、前記目的のオリゴヌクレオチドコンジュゲートが核酸実体および非極性実体から構成され、前記核酸実体が前記非極性実体に化学的に結合されており、前記方法が、
ａ）前記目的のオリゴヌクレオチドコンジュゲートを含む液体試料を提供するステップ、
ｂ）溶液中の少なくとも１つのシクロデキストリンの存在を含む条件下で、分析手段によって前記目的のオリゴヌクレオチドコンジュゲートを前記液体試料から分離するステップ、
ｃ）前記目的のオリゴヌクレオチドコンジュゲートを定性的または定量的分析の手段によって検出するステップ、を含む、方法。
【請求項２】
ステップｂ）の前記分析手段が、陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＡＥＸ−ＨＰＬＣ）、サイズ排除液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＬＣ）、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、イオン対逆相高速液体クロマトグラフィー（ＩＰ−ＲＰ−ＨＰＬＣ）、およびキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドコンジュゲートの前記核酸実体が、ＤＮＡもしくはＲＮＡヌクレオチド、またはそれらの任意の組み合わせから構成され、好ましくは、前記核酸実体が、化学的に合成されたオリゴヌクレオチド、より好ましくは修飾ＤＮＡヌクレオチドおよび／または修飾ＲＮＡヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる化学的に合成されたオリゴヌクレオチドである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸実体が、６〜１５０ヌクレオチド、好ましくは１０〜８０ヌクレオチド、より好ましくは１２〜５０ヌクレオチドの長さを有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ステップｃ）がさらに、前記目的のオリゴヌクレオチドコンジュゲートの不純物を検出することを含み、好ましくは、前記不純物が、少なくとも１つの非全長核酸実体から構成されるか、またはそれらからなり、より好ましくは、１つ以上の非全長合成生成物（複数可）の形態にあり、さらにより好ましくは、前記全長合成生成物とは異なる長さまたは構造を有し、あるいはそれらの任意の組み合わせである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記非極性実体が親油性または疎水性実体であり、好ましくは、前記非極性実体が、コレステロール、トコフェロール、およびフルオロキノロンからなる群から選択され、より好ましくは、前記非極性実体がコレステロールである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ｉ）前記陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＡＥＸ−ＨＰＬＣ）が、１０℃〜９０℃の温度で、好ましくは３０℃〜７５℃の温度で、好ましくは周囲温度で実施され、
ｉｉ）前記サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）が、１０℃〜５０℃の温度で、好ましくは２０℃〜４０℃の温度で実施され、
ｉｉｉ）前記逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）が、１０℃〜１００℃の温度で、好ましくは４０℃〜７０℃の温度で実施され、
ｉｖ）前記イオン対逆相高速液体クロマトグラフィー（ＩＰ−ＲＰ−ＨＰＬＣ）が、１０℃〜１００℃の温度で、好ましくは３０℃〜８５℃の温度で実施され、
ｖ）前記キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）が、１０℃〜６０℃の温度で、好ましくは３０℃〜５０℃の温度で実施される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つのシクロデキストリンが、シクロデキストリンのアルファ、ベータ、ガンマ、またはデルタ変種からなる群から選択され、好ましくは、前記少なくとも１つのシクロデキストリンがメチル−ベータシクロデキストリンの形態にある、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
溶液中の前記少なくとも１つのシクロデキストリンが、０．０１ｍＭ〜５０ｍＭの最終濃度で、好ましくは０．５ｍＭ〜２５ｍＭの最終濃度で、より好ましくは１０ｍＭ〜２５ｍＭの最終濃度で、最も好ましくは２０ｍＭの最終濃度で存在する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのシクロデキストリンが、ステップｂ）を実行する前に前記液体試料に加えられる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップｃ）における前記検出することが、ＵＶ読み出しの手段によって、蛍光読み出しの手段によって、もしくは質量分析（ＭＳ）の手段によって、または同様な任意の方法によって実行される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法が、分析または調製目的のために使用され、好ましくは
ｉ）前記方法が分析目的のために使用される場合、前記合成生成物の品質が、好ましくは不純物の程度を決定することによって、ステップｃ）で決定されるか、または
ｉｉ）前記方法が調製目的のために使用される場合、前記全長合成生成物の収量は、前記目的のオリゴヌクレオチドコンジュゲートを含む液体画分が収集されるステップｃ）で最適化される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法が分析目的のために使用される場合、前記合成生成物の品質が、前記非全長合成生成物の量および／または比に対する前記全長合成生成物の量および／または比によって定められ、好ましくは、前記非全長合成生成物は、中間および／もしくは変則合成生成物、またはそれらの任意の組み合わせであり、より好ましくは、前記中間合成生成物が、どちらかの末端または両末端で１つ以上のヌクレオチドを欠如しており、最も好ましくは、前記中間合成生成物が、ｎ−１、ｎ−２、ｎ−３、ｎ−４、ｎ−５、ｎ−６、ｎ−７、ｎ−８、ｎ−９、ｎ−１０などの形態を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
化学的に合成されたオリゴヌクレオチドの品質を評価するための方法であって、
ａ）少なくとも１つの目的のオリゴヌクレオチドコンジュゲートを含むか、または含むことが疑われる液体試料を提供するステップであって、前記少なくとも１つの目的のオリゴヌクレオチドコンジュゲートが核酸実体および非極性実体から構成され、前記核酸実体が前記非極性実体と化学的に結合され、前記核酸実体が化学オリゴヌクレオチド合成生成物である、提供するステップ、
ｂ）前記少なくとも１つの目的のオリゴヌクレオチドコンジュゲートを、溶液中の少なくとも１つのシクロデキストリンの存在を含む条件下で、分析手段によって前記液体試料から分離するステップ、
ｃ）前記少なくとも１つの目的のオリゴヌクレオチドコンジュゲートを定性的または定量的分析の手段によって検出するステップ、
ｄ）液体画分を収集するステップ、
ｅ）前記目的のオリゴヌクレオチドコンジュゲートを含むか、または含むことが疑われる前記収集した画分を分析するステップであって、前記目的のオリゴヌクレオチドコンジュゲートの前記核酸実体が前記少なくとも１つの全長合成生成物から構成されるか、またはそれらからなることによって特徴付けられる、分析するステップ、を含む、方法。
【請求項１５】
前記方法がさらに、請求項２〜１３のいずれか一項で定められる実施形態のいずれか１つによって特徴付けられる、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
生物学的または液体の試料に由来する標的分子の高精度分析は、医学的または薬理学的診断を含む様々な科学分野における重要なツールになるように開発されている。オリゴヌクレオチドの定性的または定量的な検出および分析のための高感度検出システムは、最先端の分析実験室および分析用途にとって重要なツールである。
【０００２】
ＵＶ吸収または蛍光検出のいずれかと組み合わせたイオン交換クロマトグラフィーは、合成オリゴヌクレオチドの純度を分析するために、またはオリゴヌクレオチド修飾を検出するために、当技術分野で日常的に使用されている。ここで、オリゴヌクレオチドは、それらの骨格の長さによって定められるホスホジエステル骨格の負電荷の数によって、正に荷電した固定相上で分離される。ＵＶ検出または蛍光読み出しのいずれかと組み合わせたイオン交換クロマトグラフィーについては、オリゴヌクレオチド代謝物の高分解能分析の観点からさらに説明されている（ＷＯ２０１０／０４３５１２Ａ１）。
【０００３】
小分子、オリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドコンジュゲートなどの標的分子を分析する分野において、特に化学的オリゴヌクレオチド合成の品質管理の観点から、た分析方法の改善が常に必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の背景において、驚くべきことに、オリゴヌクレオチドの検出、分離、および分析は、溶液中のシクロデキストリンなど、特定の水溶性物質の存在下での分析手段によって著しく改善できることが見出されている。
【０００５】
シクロデキストリンは、様々な数のα−１−４−結合グルコース単位からなる環状オリゴサッカライドである。これらのグルコース鎖は円錐様の孔を生じ、そこに化合物が入って水溶性複合体を形成し得、したがって薬剤などの特定の物質の物理化学的特性を変化させる。ベータ−シクロデキストリンのヒドロキシルアルキル誘導体である２−ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン（ＨＰ−ベータ−ＣＤ）は、難水溶性薬剤の溶解度を改善する賦形剤として使用されている（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ５５（２０１４），１５３７−１５４８）。シクロデキストリンを含む溶液はさらに、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）の観点でのステロイドホルモンエナンチオマーのキラル分離のために（Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ、８４３（２００６）２８９−２９４）、またはジャスモン酸メチルの４種の異なる立体異性体を分離および同定するために（Ｍａｔｅｎｃｉｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（２０１６）、ｗｉｌｅｙｏｎｌｉｎｅｌｉｂｒａｒｙ．ｃｏｍ）使用されている。したがって、シクロデキストリンは立体異性体などの小分子の精製を改善することに関与している。
【０００６】
しかし、オリゴヌクレオチドなどの大きな標的分子の分析および精製は、小分子の分析とは著しく異なり、高分解能でのオリゴヌクレオチドの検出および分析は特に困難である。本発明の背景において、驚くべきことに、特定の長さのオリゴヌクレオチドなどの大きな標的分子の検出および分析は、シクロデキストリンが溶液中で添加剤として使用されるとき、そして標的分子が、シクロデキストリンの結合部位として作用する親油性または疎水性構造などの非極性実体と化学的に結合されているときにシクロデキストリンの存在中で著しく改善されることを見出した。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
第１の態様では、本発明は、溶液中の少なくとも１つの目的のオリゴヌクレオチドコンジュゲートを検出するための方法に関し、目的のオリゴヌクレオチドコンジュゲートは核酸実体および非極性実体から構成され、核酸実体は非極性実体と化学的に結合されており、本方法は、
ａ）目的のオリゴヌクレオチドコンジュゲートを含む液体試料を提供するステップ、
ｂ）溶液中に少なくとも１種類のシクロデキストリンの存在を含む条件下で、分析手段によって目的のオリゴヌクレオチドコンジュゲートを液体試料から分離するステップ、
ｃ）定性的または定量的分析の手段によって目的のオリゴヌクレオチドコンジュゲートを検出するステップ、を含む。
【０００８】
本発明の背景で使用される「核酸実体」または「オリゴヌクレオチド」という用語は、概して、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）もしくはリボヌクレオチド（ＲＮＡ）のいずれか、または両方から構成される任意の種類のオリゴマーまたはポリマーを指す。すなわち、本発明による核酸実体またはオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡオリゴヌクレオチドから構成されるＤＮＡ分子、またはＲＮＡオリゴヌクレオチドから構成されるＲＮＡ分子、またはＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドの両方から構成されるオリゴヌクレオチドのいずれかを指す。核酸実体またはオリゴヌクレオチドは、一本鎖であり得、または相補的な核酸鎖から構成される二本鎖の形態であり得る。核酸実体またはオリゴヌクレオチドはまた、限定されないが、例えば、デコイオリゴヌクレオチドなどの合成的に設計および／または合成的に製造されたＤＮＡオリゴヌクレオチドのすべての種類を含み得る。原則として、本発明による核酸実体またはオリゴヌクレオチドは、核酸塩基（すなわち、窒素塩基）、リボース、２’−デオキシリボース、またはその任意の誘導体のいずれかであり得る五炭糖、およびリン酸基から構成される構造のすべての種類を含み得る。核酸塩基および糖はヌクレオシドと呼ばれる単位を構成する。リン酸基は、糖の２、３、または５位の炭素、特に糖の３および５位の炭素と結合を形成し得る。リボヌクレオチドは糖部分としてリボースを含み、一方、デオキシリボヌクレオチドは糖部分としてデオキシリボースを含む。本発明の核酸実体は、プリンもしくはピリミジン塩基、またはそれらの任意の誘導体のいずれかを含むことができる。本発明による核酸実体またはオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、またはそれらの任意の組み合わせのいずれかで構成され、さらに１つ以上の修飾ヌクレオチド（複数可）を含み得る。任意に、核酸実体またはオリゴヌクレオチドは修飾ヌクレオチドのみを含み得る。修飾ヌクレオチドのリボ型およびデオキシ型には、限定されないが、５−プロピニル−ウリジン、５−プロピニル−シチジン、５−メチル−シチジン、２−アミノ−アデノシン、４−チオウリジン、５−ヨードウリジン、Ｎ−６−メチル−アデノシン、５−フルオロウリジン、イノシン、７−プロピニル−８−アザ−７−デアザプリン、および７−ハロ−８−アザ−７−デアザプリンヌクレオシドが含まれ得る。本発明の背景において言及される核酸実体またはオリゴヌクレオチドは、例えば、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）ＲＮＡまたは２’−フルオロ（２’−Ｆ）ＲＮＡなどの糖またはリボース修飾をさらに含み得る。任意に、本発明の核酸実体またはオリゴヌクレオチドは、リン酸骨格上に、例えば、ホスホロチオエートもしくはメチルホスホネート、または当技術分野で知られている任意の他の修飾などの１つ以上の修飾（複数可）も含み得るか、またはそれらを代わりに含み得る。
【０００９】
核酸実体はさらに、天然、非天然、または人工起源のすべての種類に由来することができ、限定されないが、ウイルス、細菌、および真核生物のＤＮＡまたはＲＮＡを含む。あるいは、核酸実体は、研究における使用のため、診断における使用のため、または治療薬としての使用のため、オリゴヌクレオチドの製造および／または化学合成を含む合成源に由来することができる。本明細書で使用される「合成する」という用語は、好ましくは、化学合成の手段によるＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドの製造を指し、限定されないが、自動化ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ合成装置および／またはホスホロアミダイト化学の使用を含む。自動化ＤＮＡまたはＲＮＡ合成装置は当業者によって日常的に使用されており、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ドイツ、ダルムシュタット）、Ｂｉｏｌｙｔｉｃ（米国、カリフォルニア州ニューアーク）、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、またはＢｉｏＯｏｍａｔａｔｉｏｎ（米国、テキサス州、プラノ）などの多様な供給業者から市販されている。
【００１０】
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドコンジュゲートの核酸実体は、ＤＮＡもしくはＲＮＡヌクレオチド、またはそれらの任意の組み合わせから構成される。より好ましくは、核酸実体は化学的に合成されたオリゴヌクレオチドであり、さらにより好ましくは、修飾ＤＮＡヌクレオチドおよび／または修飾ＲＮＡヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる化学的に合成されたオリゴヌクレオチドである。
【００１１】
本発明による「オリゴヌクレオチドコンジュゲート」は、本明細書で定義される核酸実体またはオリゴヌクレオチドを指し、核酸実体またはオリゴヌクレオチドは、別の物質または別の化学的実体、好ましくは任意の種類の非極性実体に化学的に結合されている。本発明の背景において、オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、好ましくは、核酸実体および非極性実体から構成され、核酸実体は非極性実体に化学的に結合されている。任意の種類の非極性実体などの他の化学的実体との核酸分子の化学的結合は、当技術分野における日常的な方法であり、当業者によく知られている。
【００１２】
本明細書で言及される「非極性実体」は、任意の種類の非極性物質であり得、限定されないが、核酸実体に化学的に結合されるのに適している任意の種類の親油性、疎水性、または脂質性の構造を含む。このことは、本発明の背景において、非極性実体は、核酸実体と化学的に結合できることが当業者に知られている非極性物質、非極性化学的実体、または非極性分子の群から選択されることを意味する。したがって、「非極性実体」という用語は、それらの性質または構造的特徴によって、本発明の目的に使用することに適していない非極性分子または脂質構造までには拡大されない。
【００１３】
好ましい実施形態では、非極性実体は親油性または疎水性実体である。非極性実体は、好ましくはコレステロール、トコフェロール、およびフルオロキノロンからなる群から選択される。より好ましくは、非極性実体はコレステロールである。
【００１４】
本発明の背景で使用される「液体試料」という特徴は、溶液中の目的の標的分子、または、代わりに、標的分子の集団を含む液体試料のすべての種類を指す。液体試料は、限定されないが、細胞または組織抽出物の調製に適した標準的な生化学的および／または細胞生物学的な手順を含む手順によって生成され得、細胞および／または組織は任意の種類の生物に由来し得る。本発明による液体試料は、任意の種類の緩衝液、分析手段の観点で使用される溶出液、または、代わりに、細胞由来もしくは細胞培養で増殖した細胞由来の細胞抽出物もしくは組織抽出物であり得るか、または、代わりに、切除および／もしくは手術によって生物から得ることができる。特に、本発明による生物学的試料は、１人以上の患者（複数可）の１つ以上の組織（複数可）から、または任意の種類の生きているヒトもしくは非ヒト対象から得ることができる。好ましくは、本発明の液体試料は分析手段のために調製された試料であり、そのためヒトまたは非ヒトのいずれかの生きている生物に直接的に由来する試料ではない。細胞から、細胞抽出物から、または、代わりに、組織からの液体試料の提供は、例えば、遠心分離および／もしくは分画化などの１つ以上の生化学的精製ステップ、例えば、複数回の凍結および／もしくは解凍サイクル、塩処理（複数可）、フェノール−クロロホルム抽出、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）処理、ならびにプロテイナーゼＫ消化を含む機械的もしくは化学的破壊ステップの手段による細胞溶解、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。本発明の液体試料が、本明細書で説明される沈殿および／または精製ステップのいずれも伴わないで提供されることも、同様に好ましい。
【００１５】
本明細書で使用される「液体試料」という用語は、概して、目的の標的分子の懸濁液、特に検出されるオリゴヌクレオチドコンジュゲートの懸濁液を可能にする任意の種類の水溶液、緩衝液、または液体溶液を指すものと理解されるべきである。
【００１６】
好ましい実施形態では、第１の態様の方法は、ステップｂ）の分析手段が、陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＡＥＸ−ＨＰＬＣ）、サイズ排除液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＬＣ）、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、イオン対逆相高速液体クロマトグラフィー（ＩＰ−ＲＰ−ＨＰＬＣ）、およびキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）からなる群から選択されることを特徴とする。
【００１７】
本発明の方法の背景において上記のように適用される分析手段は、生化学的分析の分野における当技術分野で一般的に使用され、当業者によく知られている日常的な方法である。本発明による多様な分析手段の適用は、本出願の実施例のセクションでさらに例示される。
【００１８】
概して、本発明の背景において、検出されるオリゴヌクレオチドコンジュゲート、特にその核酸実体は、６〜１５０ヌクレオチド、または１０〜１００ヌクレオチド、または１０〜５０ヌクレオチドの全長、または好ましくは１０〜２５ヌクレオチドの長さを有し得る。目的のオリゴヌクレオチドコンジュゲートが１０〜８０ヌクレオチドの範囲、より好ましくは１２〜５０ヌクレオチドの範囲、最も好ましくは１０〜４０ヌクレオチドの範囲の長さを有することも、同様に好ましい。しかし、上記の上限および下限が組み合わされて異なる範囲に達することも当業者には明らかである。さらに、目的のオリゴヌクレオチドコンジュゲートを含む本発明の液体試料は、そのような様々な長さを有するオリゴヌクレオチド分子の集団も含み得る。すなわち、本発明の背景で提供される試料は、同じ長さのオリゴヌクレオチドコンジュゲートを含み得るか、または異なる長さのオリゴヌクレオチドコンジュゲートを含み得るか、またはその両方であり得る。しかし、異なる長さのオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートの存在は、本発明の方法によるオリゴヌクレオチドコンジュゲートの定性的または定量的検出を損なわない。
【００１９】
別の好ましい実施形態では、核酸実体は、６〜１５０ヌクレオチドの長さ、好ましくは１０〜８０ヌクレオチドの長さ、より好ましくは１２〜５０ヌクレオチドの長さを有する。
【００２０】
好ましい実施形態では、第１の態様の方法は、ステップｃ）における検出が、目的のオリゴヌクレオチドコンジュゲート自体の検出、ならびにオリゴヌクレオチドコンジュゲートの不純物の検出を含むことを特徴とする。好ましくは、これらの不純物は、１つ以上の非全長核酸実体から、好ましくは、化学的なオリゴヌクレオチド合成のプロセスに由来し得る１つ以上の非全長合成生成物（複数可）の形態で構成される。さらにより好ましいのは、不純物が、全長合成生成物とは異なる長さおよび／もしくは構造を有する合成生成物（複数可）、またはそれらの任意の組み合わせの形態で、１つ以上の核酸実体から構成されることである。
【００２１】
本発明の背景において、「検出」または「検出する」という用語は、概して、目的の標的分子を視覚化、分析、および／または定量することを意味する。特に、「検出する」という用語は、オリゴヌクレオチドをＵＶ吸収の手段によって、または、代わりに、蛍光読み出しの手段によって検出および分析するのに適している、当技術分野および当業者に知られている任意の方法を指す。ＵＶ吸収は、２５４ｎｍ〜２６０ｎｍの波長で日常的に実行される。オリゴヌクレオチドの定性的または定量的検出のための方法は、当業者によく知られており、当技術分野で集中的に説明されている。少なくとも１つのシクロデキスチンの存在下および非存在下における本発明によるオリゴヌクレオチドコンジュゲートの検出は、本発明の実施例によってさらに例示される。
【００２２】
本明細書で使用される「不純物」という用語は、概して、任意の種類の非全長オリゴヌクレオチドコンジュゲートを意味し、ヌクレオチド数が同一、類似、少ない、または多いのいずれかの核酸実体を有するその任意の種類の誘導体を含み、等しいが必ずしも同一の長さではないオリゴヌクレオチドコンジュゲートをもたらす。しかし、「等しい長さ」という用語は、オリゴヌクレオチドコンジュゲートが同一の長さを有することも含み得る。オリゴヌクレオチドコンジュゲート、特にその核酸実体が類似の長さ、すなわち、全長生成物の長さとわずかに異なる長さを有することも、同様に好ましい。したがって、本発明による「等しい長さ」は、それぞれの核酸実体の長さが、いくつかのヌクレオチドだけ、好ましくは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上だけ互いに異なることを含む。あるいは、オリゴヌクレオチドコンジュゲートはまた、化学的なオリゴヌクレオチド合成のプロセスから生じ得る、または生じ得ない任意の種類の添加物、修飾、または付加物を含み得るか、またはそれらから構成され得る。
【００２３】
好ましくは、本発明による不純物は、限定されないが、長さで少数のヌクレオチドのみ、好ましくは長さで２５ヌクレオチド以下の差、より好ましくは長さで１５ヌクレオチド以下の差、さらにより好ましくは長さで１０または５ヌクレオチド以下の差だけ異なる、類似の長さの核酸実体を有するオリゴヌクレオチドコンジュゲートを含む。本明細書で使用される「不純物」という用語はまた、目的のオリゴヌクレオチドコンジュゲート（複数可）およびその誘導体が、１つ以上の同一または異なる化学修飾（複数可）を含む、からなる、または包含し得る。化学修飾は、数および／または同一性の両方に関して同一または異なり得る。
【００２４】
本発明の背景において、陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＡＥＸ−ＨＰＬＣ）などの分析手段を特定の温度で実行することは、改善された分離プロファイルをもたらすことがさらに認められている。特定の温度範囲はまた、本発明の方法に適していることが認められている様々な他の分析手段に適用され得る。さらに、本発明の方法は、メチル−β−シクロデキストリン（ＭｂＣＤ）を含む緩衝液の存在下で実行されるとき、周囲温度でさえ溶出によって高分解能の結果およびコレステロール共役体化オリゴヌクレオチドの明確なピークを可能にすることが認められている。
【００２５】
好ましい実施形態では、第１の態様の方法は、ステップｂ）の分析手段が、陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＡＥＸ−ＨＰＬＣ）、サイズ排除液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＬＣ）、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、イオン対逆相高速液体クロマトグラフィー（ＩＰ−ＲＰ−ＨＰＬＣ）、およびキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）からなる群から選択されることを特徴とし、
ｉ）陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＡＥＸ−ＨＰＬＣ）は、１０℃〜９０℃の温度で、好ましくは３０℃〜７５℃の温度で、より好ましくは周囲温度で実施され、
ｉｉ）サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）は、１０℃〜５０℃の温度で、好ましくは２０℃〜４０℃の温度で実施され、
ｉｉｉ）逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）は、１０℃〜１００℃の温度で、好ましくは４０℃〜７０℃の温度で実施され、
ｉｖ）イオン対逆相高速液体クロマトグラフィー（ＩＰ−ＲＰ−ＨＰＬＣ）は、１０℃〜１００℃の温度で、好ましくは３０℃〜８５℃の温度で実施され、
ｖ）キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）は、１０℃〜６０℃の温度で、好ましくは３０℃〜５０℃の温度で実施される。
【００２６】
別の好ましい実施形態では、本発明の方法の背景で使用される少なくとも１つのシクロデキストリンは、シクロデキストリンのアルファ、ベータ、ガンマ、またはデルタ変種からなる群から選択される。好ましくは、少なくとも１つのシクロデキストリンは、ベータシクロデキストリンの群から選択される。さらにより好ましいのは、少なくとも１つのシクロデキストリンがメチル−ベータ−シクロデキストリンであることである。
【００２７】
本発明の背景において、溶液中の少なくとも１つのシクロデキストリンの存在は、本明細書で定められる様々な分析手段の背景において、目的のオリゴヌクレオチドコンジュゲートを検出および分析するために有利であることが認められている。本発明によるオリゴヌクレオチドコンジュゲートを検出するための方法を実行するとき、溶液中の少なくとも１つのシクロデキストリンの存在から生じる有利な効果は、本発明の実施例によってさらに例示される。
【００２８】
特に、溶液中のシクロデキストリンの特定の最終濃度範囲は、好ましくは、高いピーク分解能、それによって最適な分析結果を得るのに適していることが認められている。
【００２９】
好ましくは、本発明の方法は、溶液中の少なくとも１つのシクロデキストリンが、０．０１ｍＭ〜５０ｍＭの最終濃度で、好ましくは０．５ｍＭ〜２５ｍＭの最終濃度で、より好ましくは１ｍＭ〜１５ｍＭの最終濃度で存在することによって特徴付けられる。
【００３０】
同様に好ましいのは、溶液中の少なくとも１つのシクロデキストリンが５ｍＭ、１０ｍＭ、または２０ｍＭの最終濃度で存在することである。
【００３１】
好ましくは、少なくとも１つのシクロデキストリンはステップｂ）を実行する前に液体試料に加えられる。
【００３２】
好ましくは、ステップｃ）における検出は、ＵＶ読み出しの手段によって、蛍光読み出しの手段によって、もしくは質量分析（ＭＳ）の手段、または同様な任意の方法によって実行される。
【００３３】
さらに別の好ましい実施形態では、本方法は分析または調製目的のいずれかに使用される。
【００３４】
一実施形態では、本方法が分析目的で使用される場合、合成生成物の品質はステップｃ）で、好ましくは不純物の程度を決定することによって決定される。
【００３５】
同様に好ましい代替の実施形態では、本方法が調製目的で使用される場合、全長合成生成物の収量は、目的のオリゴヌクレオチドコンジュゲートを含む液体画分が収集されるステップｃ）で最適化される。好ましくは、収集される少なくとも１つ以上の液体画分（複数可）は、高含有量の目的のオリゴヌクレオチドコンジュゲートを含み、より好ましくは、収集された画分中の目的のオリゴヌクレオチドコンジュゲートが全長サイズの核酸実体を含むことを特徴とする。
【００３６】
本発明の背景で使用される「調製目的」という用語は、概して、大量の投入物質が精製および／または処理されるあらゆる種類の実験設定を意味する。一般に、大量の投入物質は、任意の種類の濃度範囲、好ましくは、投入物質の１ｍｇ〜１０ｋｇの任意の種類の濃度範囲であり得る。同様に好ましいのは、濃度範囲がさらに小さいか大きい、より好ましくは投入物質の２０、３０、５０、または１００ｋｇまでであることであり、実験設定、特に精製システムの容量がそのような大量の投入物質を処理するのに適している必要がある。
【００３７】
本発明による投入物質は、概して、本発明の背景において検出および／または分析されるべき任意の種類の目的の合成生成物、好ましくは目的のオリゴヌクレオチドコンジュゲートを意味する。本明細書で使用される「高含有量」または「大量」という用語は、オリゴヌクレオチド濃度の適応性のある範囲、好ましくは、本発明の背景で適用される分析手段のための出発物質として使用される、目的のオリゴヌクレオチドコンジュゲート投入物質のかなりの量を反映する濃度範囲を示すと理解されるべきである。
【００３８】
本明細書で使用される「液体画分」という用語は、概して、本発明の背景で適用される分析手段の結果として、好ましくは溶出プロファイルから収集された液体試料、より好ましくは、クロマトグラフィー溶出プロファイルから得られた液体試料の形態で得ることができる任意の種類の液体試料を意味する。本発明の液体画分は、実施者に都合のよい任意のサイズとすることができ、かつ／または利用可能であり当業者に知られている任意の実験的または実用的手段によって収集することができる。
【００３９】
好ましくは、本発明の背景において、合成生成物の品質は、非全長合成生成物の量および／または比に対する全長合成生成物の量および／または比によって定められる。
【００４０】
好ましくは、非全長合成生成物は、中間および／もしくは変則合成生成物、または両方の組み合わせであり、より好ましくは、中間合成生成物は、５’または３’末端のいずれか、または両端で１つ以上のヌクレオチドが欠如している。さらにより好ましいのは、中間合成生成物が予想される全長に対して、ｎ−１、ｎ−２、ｎ−３、ｎ−４、ｎ−５、ｎ−６、ｎ−７、ｎ−８、ｎ−９、ｎ−１０などの形態で核酸実体から構成されることである。
【００４１】
さらなる態様では、本発明は、化学オリゴヌクレオチド合成生成物の品質を評価する方法に関し、本方法は、
ａ）少なくとも１つの目的のオリゴヌクレオチドコンジュゲートを含むか、または含むことが疑われる液体試料を提供するステップであって、少なくとも１つの目的のオリゴヌクレオチドコンジュゲートが核酸実体および非極性実体から構成され、核酸実体が非極性実体と化学的に結合され、核酸実体が化学オリゴヌクレオチド合成生成物である、提供するステップ、
ｂ）少なくとも１つの目的のオリゴヌクレオチドコンジュゲートを、溶液中の少なくとも１つのシクロデキストリンの存在を含む条件下で、分析手段によって液体試料から分離するステップ、
ｃ）少なくとも１つの目的のオリゴヌクレオチドコンジュゲートを定性的または定量的分析の手段によって検出するステップ、
ｄ）液体画分を収集するステップ、
ｅ）目的のオリゴヌクレオチドコンジュゲートを含むか、または含むことが疑われる収集した画分を分析手段によって分析するステップであって、目的のオリゴヌクレオチドコンジュゲートの核酸実体が少なくとも１つの全長合成生成物から構成されることによって特徴付けられる、分析するステップ、を含む。
【００４２】
本発明による化学オリゴヌクレオチド合成生成物の品質を評価することは概して、限定されないが、合成生成物の純度の分析を含み、純度は、限定されないが、本明細書で説明される分析手段によって決定され得る。化学オリゴヌクレオチド合成生成物の品質を評価することはまた、例えば、任意の種類の非全長合成生成物などの液体試料、および／または、例えば、任意の種類の生成添加物もしくは人工産物などの他の合成生成物の不純物の程度および／または量を決定することを意味する。一般的に、純度が高いほど、検出される不純物は少ない。好ましくは、合成生成物の純度は、少なくとも１つ以上の収集された画分（複数可）が、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％の全長合成生成物を含む場合、最良である。最適には、少なくとも１つ以上の収集された画分（複数可）は、少なくとも９５％または１００％の全長合成生成物を含む。
【００４３】
本発明の方法の利点は、ピーク幅が著しく減少すること、ピーク幅の減少がメインピークの直前および直後に溶出するピークの分解能の有意な増加をもたらすこと、およびピークが、溶液中の添加剤としての少なくとも１つのシクロデキストリンの存在において対称的であり、一方、シクロデキストリンが存在しないと対称的ではないことである。本発明の背景で使用される方法の改善された技術的効果は、本出願の実施例および図にさらに例示されている。
【００４４】
本発明の第２の態様の方法は、好ましくは、本明細書で定められる実施形態のいずれか１つによって、好ましくは、本発明の第１の態様の背景で定められる実施形態のいずれか１つによって特徴付けられる。本方法の実施形態は、本出願の実施例および図によってさらに概説される。
【００４５】
「定量的読み出し」という用語は、一般に、試料から目的のオリゴヌクレオチドを視覚化、検出、分析、および／または定量するのに適した、当技術分野で知られているすべての種類の画像化方法を意味する。
【００４６】
同様に好ましいのは、オリゴヌクレオチドコンジュゲートの検出が定性分析の手段によって実行されることである。本発明による定性分析は、例えば、本発明の実施例によって例示される。
【００４７】
さらに、オリゴヌクレオチドコンジュゲートの検出は、定量的読み出しによって実行され得る。本発明による定量的読み出しは、内部または外部標準のいずれかの使用を伴う。内部標準の使用による定量的読み出しは、本発明の背景で説明されている。あるいは、同様に好ましいのは、定量的読み出しが、外部検量線との比較の形態で外部標準の使用を伴うことである。
【００４８】
好ましくは、外部検量線は、目的の試料と同一条件下で処理される既知の濃度（複数可）または既知のモル重量（複数可）の標的分子の希釈系列から導き出される。
【００４９】
以下の図および実施例は、本発明の様々な実施形態を例示することが意図されている。したがって、そこで論じられる特定の修正は、本発明の範囲の制限として理解されるべきではない。当業者には、本発明の範囲から逸脱することなく様々な同等物を作製し、変更を行い、また修正を行うことができることは明らかであり、したがって、そのような同等の実施形態が本明細書に含まれることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】ＳＥＣ−ＨＰＬＣカラム：ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５  Ｉｎｃｅａｓｅ１０／３００ＧＬ。温度：室温２５℃（非変性：二本鎖はクロマトグラフィー中でそのままである）。溶出液：１ｍＭメチル−β−シクロデキストリンを含む１５％ＡＣＮ中の１×ＰＢＳ、またはメチル−β−シクロデキストリンを含まない１５％ＡＣＮ中の１×ＰＢＳ。流量：０．９ｍＬ／分。黒色トレース：メチル−β−シクロデキストリンの存在下で分析された二本鎖。青色トレース：メチル−β−シクロデキストリンの非存在下で分析された二本鎖（二本鎖ピークはカラムから溶出せず、ピークはない）。
【００５１】
【図２】ＡＥＸ−ＨＰＬＣによるＸ３２７５５Ｋ１の一本鎖分析、カラム：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＤＮＡ  Ｐａｃ  ＰＡ２００：４×２５０ｍｍ、温度：８５℃。溶出液Ａ：２５％アセトニトリル中の２５ｍＭ  ＴＲＩＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ＝８、溶出液Ｂ：溶出液Ａ中の５００ｍＭ過塩素酸ナトリウム。溶出液は、５ｍＭメチル−β−シクロデキストリンの存在下または非存在下で調製される。流量：１．０ｍＬ／分。化合物は、１分後の２４．５％から３３分で３７％まで増加させる溶出液Ｂの勾配によって溶出される。黒色トレース：溶出液Ａおよび溶出液Ｂに５ｍＭメチル−β−シクロデキストリンの存在下で分析されたＸ３２７５５Ｋ１。青のトレース：溶出液Ａおよび溶出液Ｂにメチル−β−シクロデキストリンの非存在下で分析されたＸ３２７５５Ｋ１。
【００５２】
メチル−β−シクロデキストリンの存在下では、メインピークはより対称的であり、ベースラインでのピーク幅がはるかに小さく（０．９２対０．６２分）、ピークがより高くなる。ピーク高が高いほど、メインピークの検出感度が高くなる。メインピークからの不純物ピークの分解能が改善され、例えば、ＵＳＰ（米国薬局方）に従い、メインピークより後に溶出する不純物ピークの分解能は、溶出液中のメチル−β−シクロデキストリンの非存在下での１．４８から５ｍＭメチル−β−シクロデキストリンの存在下での３．６３に増加する。
【００５３】
【図３】ＣＧＥによるＸ３２７５５Ｋ１の一本鎖分析、キャピラリー：ｅＣＡＰ  ＤＮＡキャピラリー（全長６５ｃｍ、内径１００μｍ）、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｎｏ．４７７４７７、温度：３５℃。泳動緩衝液：１０ｍＭメチル−β−シクロデキストリンを含む１×ＴＲＩＳホウ酸緩衝液、または１０ｍＭメチル−β−シクロデキストリンを含まない１×ＴＲＩＳホウ酸緩衝液。分離電圧：３０ｋＶ。青色トレース：１０ｍＭメチル−β−シクロデキストリンの存在下で分析されたＸ３２７５５Ｋ１。黒色トレース：メチル−β−シクロデキストリンの非存在下で分析されたＸ３２７５５Ｋ１（一本鎖ピークはキャピラリから溶出せず、ピークはない）。
【００５４】
【図４】ＣＧＥによるＸ３２７５５Ｋ１の一本鎖分析、キャピラリー：ｅＣＡＰ  ＤＮＡキャピラリー（全長６５ｃｍ、内径１００μｍ）、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｎｏ．４７７４７７、温度：３５℃。泳動緩衝液：１０ｍＭメチル−β−シクロデキストリンを含む１×ＴＲＩＳホウ酸緩衝液、または２０ｍＭメチル−β−シクロデキストリンを含む１×ＴＲＩＳホウ酸緩衝液、または１０ｍＭメチル−β−シクロデキストリンを含まない１×ＴＲＩＳホウ酸緩衝液。分離電圧：３０ｋＶ。ピンク色トレース：１０ｍＭメチル−β−シクロデキストリンの存在下で分析されたＸ３２７５５Ｋ１、青色トレース：１０ｍＭメチル−β−シクロデキストリンの存在下で分析されたＸ３２７５５Ｋ１。黒色トレース：メチル−β−シクロデキストリンの非存在下で分析されたＸ３２７５５Ｋ１（一本鎖ピークはキャピラリから溶出せず、ピークはない）。
【００５５】
【図５】固定化コレステロールの構造。
【００５６】
【図６】約１ｍｇの粗物質を、Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｑ樹脂を使用したＨＰＬＣによって周囲温度で精製した。緩衝液は３０％アセトニトリル（ＡＣＮ）を含んだ。
【００５７】
【図７】約１ｍｇの粗物質を、Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｑ樹脂を使用したＨＰＬＣによって周囲温度で精製した。緩衝液は、２５％ＡＣＮおよび２０ｍＭメチル−β−シクロデキストリン（ＭｂＣＤ）を含んだ。
【００５８】
【図８】約１００μｇの粗物質を、Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｑ樹脂を使用したＨＰＬＣによって６０℃で精製した。緩衝液は、３０％ＡＣＮのみ含み、ＭｂＣＤは加えなかった。
【００５９】
【図９】約８ｍｇの粗物質をＴＳＫゲル樹脂を使用して周囲温度でＨＰＬＣ精製した。ＮａＢｒ勾配、２０ｍＭのＭｂＣＤを含む１５％ＡＣＮ中の２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．８。流量は１ｍＬ／分であり、勾配は０％緩衝液Ｂから開始し、６０分で４０％緩衝液Ｂに到達するようにプログラムした。
【００６０】
【図１０】約８ｍｇの粗物質を、Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｑ樹脂を使用して周囲温度でＨＰＬＣ精製した。ＮａＢｒ勾配、２０ｍＭのＭｂＣＤを含む１５％ＡＣＮ中の２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．８。流量は１ｍＬ／分であり、勾配は０％緩衝液Ｂから開始し、６０分で４０％緩衝液Ｂに到達するようにプログラムした。
【００６１】
【図１１】約８ｍｇの粗物質をＴＳＫゲル樹脂を使用して６０℃でＨＰＬＣ精製した。物質は、ＮａＢｒ勾配、２０ｍＭのＭｂＣＤを含む１５％ＡＣＮ中の２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．８を使用して溶出した。流量は１ｍＬ／分であり、勾配は０％緩衝液Ｂから開始して５分で１０％緩衝液Ｂに到達するようにプログラムし、続いて、勾配の傾きを６０分で４０％Ｂに到達するように変更した。
【００６２】
【図１２】約８ｍｇの粗物質を、Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｑ樹脂を使用して６０℃でＨＰＬＣ精製した。ＮａＢｒ勾配、２０ｍＭのＭｂＣＤを含む１５％ＡＣＮ中の２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．８。流量は１ｍＬ／分で、勾配は０％緩衝液Ｂから開始して５分で１０％緩衝液Ｂに到達するようにプログラムし、続いて、勾配の傾きを６０分で４０％Ｂに到達するように変更した。
【００６３】
【図１３】分析結果を示す。プールされた画分は、図９から図１２において両方向矢印（←→）でマークされたＦＬＰピークの面積に対応する。
【実施例】
【００６４】
実施例１：ＳＥＣ−ＬＣにおける添加剤としてのメチル−β−シクロデキストリン
目標：コレステロール共役体化オリゴヌクレオチド二本鎖の分析のためのＳＥＣ−ＬＣ法の開発。
【００６５】
背景：通常、コレステロール修飾オリゴヌクレオチドはＳＥＣカラムから溶出しない。メチル−β−シクロデキストリンのＳＥＣ緩衝液への添加は、オリゴヌクレオチドのコレステロールをマスクし、そのため、化合物がＳＥＣカラムからピークとして溶出することを可能にする。
2021525086.tif 000002
【００６６】
ＳＥＣ−ＨＰＬＣカラム：ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５  Ｉｎｃｅａｓｅ１０／３００ＧＬ。ＳＥＣ−ＬＣは、非変性条件を達成するために室温で実施され、そのためｓｉＲＮＡ−二本鎖はクロマトグラフィー中でそのままである。溶出液は、１ｍＭメチル−β−シクロデキストリンを含む１５％ＡＣＮ中の１×ＰＢＳ、またはメチル−β−シクロデキストリンを含まない１５％ＡＣＮ中の１×ＰＢＳで構成され、０．９ｍＬ／分の流量を適用した。図１の結果は、二本鎖ピークが１ｍＭメチル−β−シクロデキストリンの存在下（黒色トレース）でのみ認められるが、非存在下（青色トレース）では認められないことを示し、これはピークが溶出せず、本物質がＳＥＣカラム表面に強く結合しているためである。
【００６７】
実施例２：ＡＥＸ−ＨＰＬＣにおける添加剤としてのメチル−β−シクロデキストリン
目標：コレステロール共役体化オリゴヌクレオチドの分析のためのＡＥＸ−ＨＰＬＣ法の開発。
【００６８】
背景：メチル−β−シクロデキストリンを異なるＨＰＬＣ緩衝液に加えて、オリゴヌクレオチドのコレステロールをマスクし、これによってカラム材料との相互作用の特性を変化させる。
2021525086.tif 000003
2021525086.tif 000004
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【００６９】
ＡＥＸ−ＨＰＬＣ緩衝液中に５ｍＭベータシクロデキストリンを含む場合、以下が認められた（図２）。ベースラインでのピーク幅が、０．９２分から０．５２分に大幅に減少した。ピーク幅の減少は、メインピークの直前および直後に溶出するピークの分解能に有意な増加をもたらす。ピークは、５ｍＭベータ−シルコデキストリンの存在下では対称であり、この添加剤の非存在下では対称的ではない。図２の結果は、以下を示す。
Ａ）ピークＮｏ．３は、５ｍＭベータ−シルコデキストリンの存在下で分析したときにのみ検出され、ベータ−シルコデキストリンの非存在下でメインピークと共溶出する。
Ｂ）ピークＮｏ．２は、分解能がない場合と比較して、ＵＳＰによって２．４６の分解能で分離され、ピークはメインピーク上に小さなショルダーを生じるだけだが、分離はない。
Ｃ）ピークＮｏ．５は、５ｍＭベータ−シルコデキストリンの存在下では３．６８の分解能で分離され、ベータ−シルコデキストリンの非存在下ではわずか１．４８で分離される。
【００７０】
実施例３：ＣＧＥにおける添加剤としてのメチル−β−シクロデキストリン
目標：コレステロール共役体化オリゴヌクレオチドの分析のためのキャピラリーゲル電気泳動法（ＣＧＥ）の開発。すべての作業は、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＣｏｕｌｔｅｒのＰＡ８００ｐｌｕｓＣＥ機器で実施された。背景：ＣＧＥはコレステロール修飾オリゴヌクレオチドでは機能せず、これは化合物がＣＧＥゲルによって強く保持され、キャピラリーからピークが溶出されないためである。ＣＧＥシステムの分離ゲルおよび分離緩衝液への１０ｍＭ以上のメチル−β−シクロデキストリンの添加は、コレステロール修飾鎖を移動させて、鋭いピークが認められ得る。
2021525086.tif 000007
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【００７１】
図３および図４は、Ｘ３２７５５Ｋ１が１０または２０ｍＭのメチル−β−シクロデキストリンの存在下でのみ分析できることを示し（図３の青色トレースおよび図４の青色およびピンク色のトレース）、一方、メチル−β−シクロデキストリンの非存在下では、ピークは検出できない。
【００７２】
実施例４：ＩＥＸ  ＨＰＣＬ精製のためのメチル−β−シクロデキストリン
配列：交互にＲＮＡヌクレオチドおよび２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなる２０ｍｅｒを、３’末端でＤＮＡヌクレオチドおよびコレステロールリガンドによって伸長した。配列は、コレステロールをロードした制御された多孔性ガラス（ＣＰＧ）固体支持体上で組み立てた。孔サイズは５００Ａであり、コレステロールロードは８５μｍｏｌ／ｇであった。固体支持体は、Ｐｒｉｍｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（米国、ペンシルベニア州１９０１４、アストン）から入手した。固定化コレステロールの構造を図５に示す。
【００７３】
オリゴヌクレオチド配列は、十分に確立されたホスホロアミダイトベースのオリゴマー化化学を使用して調製した。ＲＮＡホスホロアミダイト、２’−Ｏ−メチルホスホロアミダイト、ならびに補助試薬は、ＳＡＦＣ  Ｐｒｏｌｉｇｏ（ハンブルグ、ドイツ）から購入した。具体的には、以下のアミダイトを使用した。（５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ６−（ベンゾイル）−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−アデノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−（アセチル）−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−シチジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスホロアミダイト、（５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ２−（イソブチリル）−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−グアノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスホロアミダイト、および５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−ウリジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスホロアミダイト。２’−Ｏ−メチルホスホロアミダイトは、通常のＲＮＡアミダイトと同じ保護基を有した。すべてのアミダイトを無水アセトニトリル（１００ｍＭ）に溶解し、モレキュラーシーブ（３Å）を加えた。５−エチルチオテトラゾール（ＥＴＴ、アセトニトリル中に５００ｍＭ）を活性剤溶液として使用した。カップリング時間は、ＲＮＡ残基で８分、２’−Ｏ−メチル残基で６分だった。
【００７４】
支持体に結合したコレステロール共役体化オリゴヌクレオチドを固相から切断し、公開された手順（Ｗｉｎｃｏｔｔ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４，１９９５）に従って脱保護した。典型的な粗物質には、所望の全長生成物（ＦＬＰ）が７０〜８０％の範囲で含まれた。
【００７５】
粗コレステロール共役体化オリゴヌクレオチドのＨＰＬＣ精製について異なる条件を調査するために、直径５ｍｍおよびベッド高５０ｍｍを有する小規模カラムを使用した。これらの１ｍＬカラムは、オリゴヌクレオチドを精製するために一般的に使用される陰イオン交換樹脂で充填した。具体的には、２つの異なるＡＥＸビーズを試験した。ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手可能であるＳｏｕｒｃｅ１５Ｑ（１５μｍビーズ）およびＴｏｓｏｈから入手可能であるＴＳＫｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷ（２０μｍビーズ）を選択した。精製はＡＫＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ１００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実行した。
【００７６】
溶出には、以下の緩衝液を使用した。緩衝液Ａは２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８から作製した。緩衝液Ｂは緩衝液Ａと同一組成を有したが、追加で５００ｍＭ過塩素酸ナトリウム（ＮａＣＩＯ４）または１．４Ｍ臭化ナトリウム（ＮａＢｒ）を含んだ。さらに、コレステロールリガンドの疎水性の性質のため（各不完全配列は、３’末端から始まる化学合成のために３’−コレステロールで構成されている）、緩衝液は２０〜３０％アセトニトリル（ＡＣＮ）も含んだ。
【００７７】
高温での精製について、カラムオーブン（ＣＯ３０、Ｔｏｒｒｅｙ  Ｐｉｎｅｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国、カリフォルニア州、カールスバド）および移動相予熱器（ＴＬ−６００、Ｔｉｍｂｅｒｌｅｉｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国、コロラド州、ボールダーから入手可能）を使用した。両デバイスを同一温度（例えば、６０℃）に設定した。
【００７８】
溶出緩衝液へのＭｂＣＤの添加は、予測可能な様態で溶出プロファイルを変更することが実証されており、（切断された）コレステロール共役体化オリゴヌクレオチドが明確なピークで溶出するときに周囲温度で精製を可能にする（図６および図７を参照）。ＭｂＣＤを添加しない場合、コレステロール共役体化オリゴヌクレオチドの明確なピークを得るには、６０℃の温度が必要である（図８を参照）。
【００７９】
まとめると、溶出緩衝液へのＭｂＣＤの添加により、コレステロール共役体化オリゴヌクレオチドのＩＥＸ  ＨＰＬＣ精製が周囲温度で可能である（図９〜図１２を参照）。さらに、移動相におけるＡＣＮ調節剤の量を大幅に減らすことができる。
【００８０】
これらの特徴は移動相予熱器およびカラムオーブンまたはジャケット付きカラムへの設備投資を不要にする。さらに、有機溶剤／廃棄物は少なくとも半分に削減することができる。
【図１】
2021525086.tif 000009
【図２】
2021525086.tif 000010
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2021525086.tif 000014
【図７】
2021525086.tif 000015
【図８】
2021525086.tif 000016
【図９】
2021525086.tif 000017
【図１０】
2021525086.tif 000018
【図１１】
2021525086.tif 000019
【図１２】
2021525086.tif 000020
【図１３】
2021525086.tif 000021
【配列表】
2021525086000001.app
【国際調査報告】
2021525086.tif 000022
2021525086.tif 000023
2021525086.tif 000024