(57)【要約】非微生物細胞を含有する試料中の非微生物細胞から微生物を分離する方法は、粒子とともに試料をインキュベートして、粒子−微生物複合体を形成し、次に非微生物細胞から粒子−微生物複合体を分離することを含む。これらの方法は、非微生物細胞も含む試料中の微生物の不存在又は存在を検出するために使用される。特定の試薬及び試薬の組み合わせは、混合試料中の微生物の選択的捕捉を増大させる。対応する組成物及びキットも提供される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非微生物細胞を含有する試料中の非微生物細胞から微生物を分離する方法であって、
ａ）前記試料を粒子とともにインキュベートして、粒子−微生物複合体を形成させるステップであり、試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、ポリアネトールスルホン酸ナトリウム及び／又は試料中の非微生物細胞を選択的に溶解する試薬の存在下で行われるステップと；
ｂ）非微生物細胞から粒子−微生物複合体を分離するステップと
を含む方法。
【請求項２】
非微生物細胞を含有する試料中の非微生物細胞から微生物を分離する方法であって、
ａ）前記試料を粒子とともにインキュベートして、粒子−微生物複合体を形成するステップと；
ｂ）非微生物細胞から粒子−微生物複合体を分離するステップと
を含み、前記粒子が、（ｉ）抗体、（ｉｉ）炭水化物、（ｉｉｉ）アポリポタンパク質Ｈタンパク質由来のペプチド、（ｉｖ）マンノース結合レクチンタンパク質のいずれでも被覆されていない外面を有する、方法。
【請求項３】
非微生物細胞も含有する試料中の微生物の不存在又は存在を検出する方法であって、
ａ）前記試料を粒子とともにインキュベートして、粒子−微生物複合体を形成させるステップであり、試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、ポリアネトールスルホン酸ナトリウム及び／又は試料中の非微生物細胞を選択的に溶解する試薬の存在下で行われるステップと；
ｂ）非微生物細胞から粒子−微生物複合体を分離するステップと；
ｃ）粒子−微生物複合体中の微生物の不存在又は存在を検出するステップと
を含む方法。
【請求項４】
非微生物細胞も含有する試料中の微生物の不存在又は存在を検出する方法であって、
ａ）前記試料を粒子とともにインキュベートして、粒子−微生物複合体を形成するステップと；
ｂ）非微生物細胞から粒子−微生物複合体を分離するステップと；
ｃ）粒子−微生物複合体中の微生物の不存在又は存在を検出するステップと
を含み、前記粒子は、（ｉ）抗体、（ｉｉ）炭水化物、（ｉｉｉ）アポリポタンパク質Ｈタンパク質由来のペプチド、（ｉｖ）マンノース結合レクチンタンパク質のいずれでも被覆されていない外面を有する、方法。
【請求項５】
インキュベートするステップが、試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、ポリアネトールスルホン酸ナトリウム及び／又は試料中の非微生物細胞を選択的に溶解する試薬の存在下で行われる、請求項２又は請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｃ）が、（ｉ）微生物に関連する核酸分子の酵素活性を検出するステップ、（ｉｉ）サイトメトリー又は顕微鏡により微生物を直接検出するステップ、（ｉｉｉ）細胞培養後に微生物を検出するステップ、（ｉｖ）核酸増幅により微生物を検出するステップ、又は（ｖ）核酸配列決定により微生物を検出するステップを含む、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｃ）が、
ｉ）粒子−微生物複合体中の微生物を溶解するステップと；
ｉｉ）溶解物を、微生物の核酸修飾活性の基質として作用する核酸分子とともにインキュベートするステップと；
ｉｉｉ）微生物の不存在又は存在を示すために、基質核酸分子への核酸修飾酵素の作用に起因する修飾核酸分子の不存在又は存在を特異的に決定するステップと
を含む、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｉ）が、基質核酸分子を含有する溶解試薬を添加するステップを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸修飾酵素が、ＤＮＡポリメラーゼ又はＲＮＡポリメラーゼを含み、任意選択で、前記ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼＩである、請求項７又は請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
対象からの試料に対して請求項３〜９のいずれか一項に記載の方法を行うステップを含む、対象における微生物感染の不存在又は存在を検出する方法。
【請求項１１】
分離された粒子−微生物複合体を洗浄して、非微生物細胞又は溶解物を除去するステップをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップｂ）が、前記粒子−微生物複合体から前記非微生物細胞を除去するステップをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ステップｂ）が、磁場又は遠心分離を用いて行われる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ａ）微生物と複合体を形成することができる粒子であって、外面を有する粒子；
ｂ）ポリアネトールスルホン酸ナトリウム；及び
ｃ）試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解する少なくとも１つの試薬
を含む組成物。
【請求項１５】
微生物細胞を潜在的に含有し、非微生物細胞を含有する試料をさらに含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法を行うためのキットであって、
ａ）微生物と複合体を形成することができる粒子であり、外面を有する粒子；
ｂ）ポリアネトールスルホン酸ナトリウム；及び
ｃ）試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解する少なくとも１つの試薬
を含むキット。
【請求項１７】
請求項３〜１３のいずれか一項に記載の方法を行うためのキットであって、
ｃ）微生物と複合体を形成することができる粒子；
ｄ）ポリアネトールスルホン酸ナトリウム；
ｅ）試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解する少なくとも１つの試薬；及び
ｆ）粒子−微生物複合体中の微生物の不存在又は存在を検出する検出手段であって、前記検出手段が、微生物の核酸修飾活性の基質として作用する核酸分子（ＤＮＡ）を含み、前記核酸分子（ＤＮＡ）が、少なくとも部分的に二本鎖であり、相補鎖にウラシル残基を含む、検出手段
を含むキット。
【請求項１８】
請求項４〜１３のいずれか一項に記載の方法を行うためのキットであって、
ａ）微生物と複合体を形成することができる粒子であり、（ｉ）抗体、（ｉｉ）炭水化物、（ｉｉｉ）アポリポタンパク質Ｈタンパク質由来のペプチド、（ｉｖ）マンノース結合レクチンタンパク質のいずれでも被覆されていない外面を有する粒子；及び
ｂ）粒子−微生物複合体中の微生物の不存在又は存在を検出する検出手段であって、前記検出手段が、微生物の核酸修飾活性の基質として作用する核酸分子（ＤＮＡ）を含み、前記核酸分子（ＤＮＡ）が、少なくとも部分的に二本鎖であり、相補鎖にウラシル残基を含む、検出手段
を含むキット。
【請求項１９】
前記試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、前記試料中の非微生物細胞を選択的に溶解する試薬をさらに含む、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
緩衝液及び／又は塩化ナトリウムをさらに含む、請求項１４若しくは請求項１５に記載の組成物、又は請求項１６〜１９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２１】
試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解する試薬が界面活性剤であり；任意選択で界面活性剤は非イオン性である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法、請求項１４、１５若しくは２０のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項１６〜２０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２２】
界面活性剤が微生物と複合体を形成することができる粒子にコンジュゲートしていない、請求項２１に記載の方法、請求項２１に記載の組成物、又は請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
粒子が０．１〜２．０μｍの直径を有する、請求項１〜１３、２１若しくは２２のいずれか一項に記載の方法、請求項１４、１５、若しくは２０〜２２のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項１６〜２２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２４】
粒子が磁性であり、任意選択で、粒子が超常磁性である、請求項１〜１３若しくは２１〜２３のいずれか一項に記載の方法、請求項１４、１５、若しくは２０〜２３のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項１６〜２３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２５】
微生物と複合体を形成することができる粒子の外面がポリマーを含み、任意選択で、ポリマーが炭素ベースである、請求項１〜１３若しくは２１〜２４のいずれか一項に記載の方法、請求項１４、１５、若しくは２０〜２４のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項１６〜２４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２６】
微生物と複合体を形成することができる粒子の外面が、
ｉ）カルボン酸基；
ｉｉ）アミノ基；
ｉｉｉ）疎水性基；及び
ｉｖ）ストレプトアビジン
のうちのいずれか１つ又は複数を含むか又はそれで被覆されている、請求項１〜１３若しくは２１〜２５のいずれか一項に記載の方法、請求項１４、１５、若しくは２０〜２５のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項１６〜２５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２７】
微生物が病原性微生物であり、任意選択で、病原性微生物が病原性細菌又は真菌である、請求項１〜１３若しくは２１〜２６のいずれか一項に記載の方法、請求項１４、１５、若しくは２０〜２６のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項１６〜２６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２８】
非微生物細胞が赤血球及び／又は白血球を含む、請求項１〜１３若しくは２１〜２７のいずれか一項に記載の方法、請求項１４、１５、若しくは２０〜２７のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項１６〜２７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２９】
試料が、血液、尿、唾液又はミルクを含み、任意選択で試料が全血を含む、請求項１〜１３若しくは２１〜２８のいずれか一項に記載の方法、請求項１４、１５、若しくは２０〜２８のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項１６〜２８のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、一般的に、試料中の非微生物細胞から微生物を分離する分野、及び試料中の微生物の不存在又は存在を検出する方法に関する。これらの方法は、典型的には、試料中に存在する微生物酵素活性（もしあれば）を測定することに依存し、この場合、試料はまた、酵素活性の非微生物源を含有する。本発明は、酵素活性の微生物源の効果的な単離に依存する。したがって、本発明の方法は、精製されていない血液、血液培養物及び他の体液などの試料中の微生物病原体の不存在及び存在の決定を可能にする。本発明はまた、本方法を行うのに有用な試薬を含むキットに関する。
【０００２】
［発明の背景］
細胞生存率に関連する特定の分子の存在及びレベルを測定することは、多くの状況において重要である。例えば、ＡＴＰのレベルを測定することは、増殖分析及び毒性学の目的で哺乳動物細胞において有用である。少数の細菌を検出するには培養アプローチを用いることができるが、このような技術を完成させるには、特に、少数の細菌を検出しようとする場合、また、増殖の遅い微生物を検出する場合には、数日を要する。
【０００３】
生存率の指標としてのアデニル酸キナーゼの検出も提案されている（Ｓｑｕｉｒｒｅｌｌ  ＤＪ、Ｍｕｒｐｈｙ  ＭＪ、Ｌｅｓｌｉｅ  ＲＬ、Ｇｒｅｅｎ  ＪＣＤ：Ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ＡＴＰ  ａｎｄ  ａｄｅｎｙｌａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ  ａｓ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｍａｒｋｅｒｓ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｇａｒ  ｐｌａｔｅ  ｃｏｕｎｔｓ）。国際公開第９６／００２６６５号は、試料中に存在する微生物及び／又はそれらの細胞内物質の存在及び／又は量を決定する方法を記載し、試料中のアデニル酸キナーゼの量が、それをアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）と混合し、このＡＤＰからの試料によって生成されるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の量を決定し、そのように生成されたＡＴＰの量を、アデニル酸キナーゼの存在及び／又は量、並びに微生物及び／又はそれらの細胞内物質に関連付けることによって推定されることによって特徴付けられ、ＡＤＰのＡＴＰへの変換は、ＡＤＰのＡＴＰへの最大変換を可能にするのに十分なモル濃度のマグネシウムイオンの存在下で行われる。
【０００４】
国際公開第２００９／００７７１９号において、ＮＡＤ依存性リガーゼは、試料中の微生物の存在の有用な指標として記載されている。リガーゼは、核酸分子の連結を触媒する酵素である。連結反応は、関連するリガーゼに依存して、補助因子としてＡＴＰ又はＮＡＤ＋のいずれかを必要とする。
【０００５】
国際公開第２０１１／１３０５８４号は、試料を微生物ポリメラーゼの基質として作用する核酸基質に接触させ、無傷の微生物からのポリメラーゼ活性に適した条件下でインキュベートし、いずれもの得られた核酸生成物を、定量的ポリメラーゼ連鎖反応などの核酸増幅技術を用いて決定する、ＤＮＡポリメラーゼ又はＲＮＡポリメラーゼの検出に基づく生存微生物の検出方法を記載する。このようなアッセイは、「ＥＴＧＡアッセイ」と呼ばれており、ＥＴＧＡは、酵素的鋳型生成及び増幅（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を表す。粗試料中の生存微生物に対するＥＴＧＡアッセイの問題点は、宿主（例えば、ヒト）細胞及び死んだ微生物から生じる、微生物は別として、汚染されたポリメラーゼ活性の存在である。ＥＴＧＡアッセイは、微生物ポリメラーゼ活性を宿主又は死んだ微生物の活性と区別することができない。
【０００６】
国際公開第２０１０／１１９２７０号は、無傷の微生物は別として、ＤＮＡリガーゼ活性を除去する方法を記載する。
【０００７】
国際公開第２０１１／０７０５０７号は、非イオン性界面活性剤及び緩衝液を用いた動物細胞の選択的溶解を記載する。
【０００８】
国際公開第２０１７／１８２７７５号は、非微生物細胞を選択的に溶解し、溶解物を濾過し、及びフィルター内又はフィルター上に保持された微生物の不存在又は存在を検出することを含む、非微生物細胞も含有し得る試料中の微生物の不存在又は存在を検出する方法を記載する。
【０００９】
抗体などの特異的結合部分で被覆された磁性ビーズの使用も公知である。これらの生成物の特異性は、特定の微生物の単離を可能にするために高度に特異的である特定の目的で一般的に選択される抗体又は他の結合リガンドの特異性によって定義される。
【００１０】
国際公開第０３／１０２１８４号は、ポリアミン又はカチオン性界面活性剤などの凝集剤を用いて、細胞（例えば、細菌）を濃縮又は分離し、それらを凝結させる細胞との複合体を形成するための方法、組成物及びキットを記載する。凝結した細胞の分離は、磁性ビーズなどの、細胞と結合することができる固相を用いて達成させることができる。
【００１１】
国際公開第０１／５３５２５号は、試料から細胞（例えば、微生物）を単離する方法を記載し、該方法は、固体支持体上に固定化された炭水化物リガンドによって、細胞を固体支持体に結合することを含む。このような方法を行うためのキットは、ＤｉａＳｏｒｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ（「Ｂｕｇｓ’ｎ  Ｂｅａｄｓ（商標）」キット）によって販売されている。
【００１２】
微生物を単離するための他のキットには、ＡｐｏＨ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｐｅｐｓ６磁性ビーズが含まれる。ビーズは、β−２糖タンパク質としても公知であるアポリポタンパク質Ｈタンパク質（ＡｐｏＨ）に由来する合成分子であるＰｅｐｓ６で被覆される。
【００１３】
［発明の説明］
本発明者らは、微生物感染を有する疑いのある対象から採取された試料において、試料の大部分が実際には感染した対象からではないにもかかわらず、以前に想像したよりもはるかに高いレベルの有核血球（白血球）が存在することを認識している。このことは、感染についてスクリーニングされた患者から採取された血液試料において、血液細胞、特に白血球から潜在的な微生物を分離する改良された方法の必要性をもたらした。本発明は、粒子−微生物複合体を形成する、粒子（例えば、磁性粒子）で微生物を選択的に捕捉し、粒子−微生物複合体を非微生物細胞から（例えば、磁場を用いて）分離することによって、試料中の非微生物細胞から微生物を分離することに関する。これは、試料中の微生物の不存在又は存在の検出を可能にする上記される問題に対処する方法を提供する。本発明者らは、驚くべきことに、この分離がリガンドで被覆されていない粒子（例えば、磁性粒子）で達成され得ることを見出した。本発明者らは、特定の試薬が、非微生物細胞から、特に血液、ミルク及び尿などの複雑な試料において、微生物を確実に良好に分離する方法において特に有用であることを発見した。
【００１４】
本発明は、非微生物細胞を含有する試料中の非微生物細胞から微生物を分離する方法であって、ａ）試料を外面を有する粒子とともにインキュベートして、粒子−微生物複合体を形成するステップと；ｂ）非微生物細胞から粒子−微生物複合体を分離するステップとを含む方法を提供する。
【００１５】
本発明は、非微生物細胞を含有する試料中の非微生物細胞から微生物を分離する方法であって、ａ）試料を粒子とともにインキュベートして、粒子−微生物複合体を形成するステップであり、粒子が外側ポリマー表面を有するステップと；ｂ）非微生物細胞から粒子−微生物複合体を分離するステップとを含む方法を提供する。
【００１６】
本発明は、非微生物細胞を含有する試料中の非微生物細胞から微生物を分離する方法であって、ａ）試料を粒子とともにインキュベートして、粒子−微生物複合体を形成するステップであり、試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解するポリアネトールスルホン酸ナトリウム及び／又は試薬の存在下で行われるステップと；ｂ）非微生物細胞から粒子−微生物複合体を分離するステップとを含む方法を提供する。
【００１７】
本発明は、非微生物細胞を含有する試料中の非微生物細胞から微生物を分離する方法であって、ａ）試料を粒子とともにインキュベートして、粒子−微生物複合体を形成するステップであり、インキュベートするステップが、ポリアネトールスルホン酸ナトリウム及び／又は界面活性剤の存在下で行われるステップと；ｂ）非微生物細胞から粒子−微生物複合体を分離するステップとを含む方法を提供する。
【００１８】
本発明は、非微生物細胞を含有する試料中の非微生物細胞から微生物を分離する方法であって、ａ）試料を粒子とともにインキュベートして、粒子−微生物複合体を形成するステップと；ｂ）非微生物細胞から粒子−微生物複合体を分離するステップとを含み、粒子が、（ｉ）抗体、（ｉｉ）炭水化物、（ｉｉｉ）アポリポタンパク質Ｈタンパク質由来のペプチド、（ｉｖ）マンノース結合レクチンタンパク質のいずれでも被覆されていない外面を有する、方法を提供する。
【００１９】
本方法において、インキュベートするステップは、試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、ポリアネトールスルホン酸ナトリウム、及び試料中の非微生物細胞を選択的に溶解する試薬の存在下で行われ得る。
【００２０】
本方法において、インキュベートするステップは、ポリアネトールスルホン酸ナトリウム及び／又は界面活性剤の存在下で行われ得る。界面活性剤は、試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解する試薬の例である。
【００２１】
本方法において、本方法は、分離された粒子−微生物複合体を洗浄して、非微生物細胞又は溶解物を除去するステップをさらに含み；任意選択で、分離された粒子−微生物複合体が、界面活性剤及び／又は塩化ナトリウムを含む溶液で洗浄される。
【００２２】
試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解する試薬は、界面活性剤と１つ又は複数の酵素の組み合わせを含み得る。１つ又は複数の酵素は、プロテイナーゼ及び／又はＤＮＡａｓｅを含み得る。適切な界面活性剤及び酵素は、本明細書において検討される。
【００２３】
本方法において、ステップｂ）は、任意の適切な分離手段によって行われ得る。例えば、分離は、磁場を用いて粒子−微生物複合体を引きつけるか又は遠心分離を用いて達成され得る。
【００２４】
本方法において、ステップｂ）は、粒子−微生物複合体から非微生物細胞を除去するステップをさらに含み得る。
【００２５】
本方法において、ステップａ）は、試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解することによって先行させ得る。
【００２６】
本方法において、試料中に存在する無傷のいずれもの微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解することは、試料を凍結及び解凍することを含み得る。
【００２７】
本方法において、試料中に存在する無傷のいずれもの微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解することは、界面活性剤を添加することを含み得る。
【００２８】
本方法において、ステップａ）は、緩衝液の存在下で行うことができる。緩衝液は、７．４〜８．５のｐＨを有し得る。
【００２９】
本方法において、ステップａ）は、塩化ナトリウムの存在下で行うことができる。塩化ナトリウムは、５０〜５００ｍＭの濃度で存在することができる。好ましくは、塩化ナトリウムは、約１５０ｍＭの濃度で存在することができる。
【００３０】
本方法において、試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解する試薬は、界面活性剤であり得る。本方法において、界面活性剤は、非イオン性であり得る。本方法において、界面活性剤は、微生物と複合体を形成することができる粒子にコンジュゲートされない場合がある。したがって、典型的には、界面活性剤は、粒子が添加される溶液の一部を形成し、粒子自体の一部を形成しない。
【００３１】
本方法において、粒子は、０．１〜３μｍの直径、又は０．１〜２μｍの直径を有し得る。好ましくは、粒子は、０．１〜１．０μｍの直径を有する。
【００３２】
本方法において、粒子は、磁性であり得る（及び典型的には磁性である）。粒子は、超常磁性であり得る。粒子は、酸化鉄を含み得る。酸化鉄は、磁鉄鉱及び／又は磁赤鉄鉱を含み得る。酸化鉄は、Ｆｅ２＋及びＦｅ３＋の１：１、２：１、３：１又は４：１の比率を含まない場合がある。
【００３３】
微生物との複合体を形成することができる粒子の外面は、ポリマーを含み得；任意選択で、ポリマーは、炭素ベースであり得る。ポリマーは、無機ポリマーを含まない場合がある。ポリマーは、ポリスチレン及び／又はポリ（スチレン／ジビニルベンゼン）を含み得る。
【００３４】
本方法において、微生物との複合体を形成することができる粒子の外面は、ｉ）カルボン酸基；ｉｉ）アミノ基；ｉｉｉ）疎水性基；及びｉｖ）ストレプトアビジンのうちのいずれか１つ又は複数を含むか又はそれで被覆され得：任意選択で、カルボン酸基；ｉｉ）アミノ基；ｉｉｉ）疎水性基は、ポリペプチドの一部でない場合がある。
【００３５】
本方法において、微生物は、病原性微生物であり得る。例えば、病原性微生物は、病原性細菌又は真菌であり得る。
【００３６】
本方法において、非微生物細胞は、赤血球及び／又は白血球を含み得る。
【００３７】
本方法において、試料は、１ミリリットルあたり細胞２０，０００〜５００万個の濃度で非微生物細胞を含み得る。試料は、１ミリリットルあたり細胞少なくとも約１００，０００個の濃度で非微生物細胞を含み得る。好ましくは、試料は、１ミリリットルあたり細胞少なくとも約２０，０００個の濃度で非微生物細胞を含み得る。
【００３８】
試料は、微生物を含有するか又は含有する疑いがあるものである。試料は、試料中に存在する微生物を検出すること、また、潜在的に該微生物を同定し及び／又は定量することを目的とした場合、望ましくないバックグラウンドを提供することができる非微生物細胞を含有する。したがって、一部の実施形態では、試料は、血液、尿、唾液又はミルクを含み得る。血液試料は、血液細胞を含有する任意の試料であり得る。血液試料は、全血であり得るか、又は全血を含み得る（例えば、血液ブロス）。
【００３９】
本発明は、非微生物細胞を含有する試料中の非微生物細胞から微生物を分離する方法であって、（ａ）試料を粒子（例えば、磁性粒子）とともにインキュベートして、粒子−微生物複合体を形成するステップと；（ｂ）非微生物細胞から粒子−微生物複合体を（例えば、磁場を用いて）分離するステップとを含む方法を提供する。
【００４０】
本方法において、粒子（例えば、磁性粒子）は、（ｉ）抗体、（ｉｉ）炭水化物、（ｉｉｉ）アポリポタンパク質Ｈタンパク質由来のペプチド、（ｉｖ）マンノース結合レクチン、（ｖ）ポリアミン、又は（ｖｉ）カチオン性界面活性剤のいずれでも被覆されていない外側ポリマー表面を有し得る。
【００４１】
本方法において、粒子（例えば、磁性粒子）は、（ｉ）抗体、（ｉｉ）炭水化物、又は（ｉｉｉ）先天性免疫系タンパク質のいずれでも被覆されていない外面（例えば、外側ポリマー表面）を有し得る。
【００４２】
本方法において、粒子（例えば、磁性粒子）は、（ｉ）抗体、（ｉｉ）炭水化物、（ｉｉｉ）アポリポタンパク質Ｈタンパク質由来のペプチド、（ｉｖ）マンノース結合レクチン、又は（ｖ）凝集剤（例えば、国際公開第０３／１０２１８４号に定義される凝集剤）のいずれでも被覆されていない外面（例えば、外側ポリマー表面）を有し得る。
【００４３】
本方法において、粒子（例えば、磁性粒子）は、（ｉ）抗体、（ｉｉ）炭水化物、（ｉｉｉ）先天性免疫系タンパク質、又は（ｉｖ）凝集剤（例えば、国際公開第０３／１０２１８４号に定義される凝集剤）のいずれでも被覆されていない外面（例えば、外側ポリマー表面）を有し得る。
【００４４】
本方法において、粒子（例えば、磁性粒子）は、リガンドで被覆されていない外面（例えば、外側ポリマー表面）を有し得る。
【００４５】
本方法において、粒子（例えば、磁性粒子）は、ストレプトアビジンで被覆され、リガンドで被覆されていない外面（例えば、外側ポリマー表面）を有し得る。
【００４６】
本方法において、粒子（例えば、磁性粒子）は、ストレプトアビジンのみで被覆された外面（例えば、外側ポリマー表面）を有し得る。
【００４７】
本方法において、粒子（例えば、磁性粒子）は、カルボキシル基のみで被覆された外面（例えば、外側ポリマー）を有し得る。
【００４８】
本方法において、粒子（例えば、磁性粒子）は、微生物に結合することができるいずれもの分子又は部分で被覆されていない外面（例えば、外側ポリマー表面）を有し得る。
【００４９】
本方法において、粒子（例えば、磁性粒子）は、いずれもの分子又は部分で被覆されていない外面（例えば、外側ポリマー表面）を有し得る。
【００５０】
「被覆された」とは、外面（例えば、外側ポリマー表面）に結合されることを意味する。当業者は、粒子（例えば、磁性粒子）の外面（例えば、外側ポリマー表面）への分子及び化学基の結合手段を知っている。
【００５１】
本発明の分離方法は、非微生物細胞も含有する試料中に微生物が見出されるか否かの検出を可能にするのに有用である。ひとたび、微生物が、バックグラウンドシグナルの潜在的な供給源から分離されると、それらは、次に、一連の技術を用いて特異的であり、高感度に検出され得る。したがって、本発明はまた、非微生物細胞も含有し得る試料中の微生物の不存在又は存在を検出する方法であって、ａ）試料を粒子とともにインキュベートして、粒子−微生物複合体を形成するステップと；ｂ）非微生物細胞から粒子−微生物複合体を分離するステップと；ｃ）粒子−微生物複合体中の微生物の不存在又は存在を検出するステップとを含む方法を提供する。
【００５２】
また、本発明はまた、非微生物細胞も含有し得る試料中の微生物の不存在又は存在を検出する方法であって、ａ）試料を粒子とともにインキュベートして、粒子−微生物複合体を形成するステップであり、粒子が外側ポリマー表面を有するステップと；ｂ）非微生物細胞から粒子−微生物複合体を分離するステップと；ｃ）粒子−微生物複合体中の微生物の不存在又は存在を検出するステップとを含む方法を提供する。
【００５３】
関連して、本発明は、非微生物細胞も含有し得る試料中の微生物の不存在又は存在を検出する方法であって、ａ）試料を粒子とともにインキュベートして、粒子−微生物複合体を形成するステップであり、試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、ポリアネトールスルホン酸ナトリウム、及び／又は試料中の非微生物細胞を選択的に溶解する試薬の存在下で行われるステップと；ｂ）非微生物細胞から粒子−微生物複合体を分離するステップと；ｃ）粒子−微生物複合体中の微生物の不存在又は存在を検出するステップとを含む方法を提供する。
【００５４】
同様に、本発明は、非微生物細胞も含有し得る試料中の微生物の不存在又は存在を検出する方法であって、ａ）試料を粒子とともにインキュベートして、粒子−微生物複合体を形成するステップであり、インキュベートするステップが、ポリアネトールスルホン酸ナトリウム及び／又は界面活性剤の存在下で行われるステップと；ｂ）非微生物細胞から粒子−微生物複合体を分離するステップと；ｃ）粒子−微生物複合体中の微生物の不存在又は存在を検出するステップとを含む方法を提供する。
【００５５】
本発明は、さらに、非微生物細胞も含有し得る試料中の微生物の不存在又は存在を検出する方法であって、ａ）試料を粒子とともにインキュベートして、粒子−微生物複合体を形成するステップと；ｂ）非微生物細胞から粒子−微生物複合体を分離するステップと；ｃ）粒子−微生物複合体中の微生物の不存在又は存在を検出するステップとを含み、粒子が、（ｉ）抗体、（ｉｉ）炭水化物、（ｉｉｉ）アポリポタンパク質Ｈタンパク質由来のペプチド、（ｉｖ）マンノース結合レクチンタンパク質のいずれでも被覆されていない外面を有する、方法を提供する。
【００５６】
本方法において、インキュベートするステップは、試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、ポリアネトールスルホン酸ナトリウム、及び／又は試料中の非微生物細胞を選択的に溶解する試薬の存在下で行われ得る。
【００５７】
本方法において、ステップｃ）は、（ｉ）微生物に関連する核酸分子の酵素活性を検出するステップ、（ｉｉ）サイトメトリー又は顕微鏡により微生物を直接検出するステップ、（ｉｉｉ）細胞培養後の微生物を検出するステップ、（ｉｖ）ＰＣＲにより微生物を検出するステップ、又は（ｖ）核酸配列決定により微生物を検出するステップを含み得る。
【００５８】
本方法において、ステップｃ）は、ｉ）粒子−微生物複合体中の微生物を溶解するステップ；ｉｉ）溶解物を、微生物の核酸修飾活性の基質として作用する核酸分子とともにインキュベートするステップ；及びｉｉｉ）微生物の不存在又は存在を示すために、基質核酸分子上の核酸修飾酵素の作用に起因する修飾核酸分子の不存在又は存在を特異的に決定するステップを含み得る。本方法において、ステップ（ｉ）は、基質核酸分子を含有する溶解試薬を添加するステップを含み得る。本方法において、核酸修飾酵素は、ＤＮＡポリメラーゼ又はＲＮＡポリメラーゼを含み得、任意選択で、ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼＩである。
【００５９】
微生物は、対象における一般的な感染源であるため、本発明の方法は、微生物によって引き起こされる感染を同定するのに有用である。したがって、本発明はまた、対象からの試料上で本明細書に記載される方法（試料中の微生物を検出する）のいずれかを行うことを含む、対象における微生物感染の不存在又は存在を検出する方法を提供する。
【００６０】
本方法は、分離された粒子−微生物複合体を洗浄して、非微生物細胞又は溶解物を除去することをさらに含み得る。
【００６１】
本方法において、ステップ（ｂ）は、粒子−微生物複合体から非微生物細胞を除去するステップをさらに含み得る。
【００６２】
本方法において、ステップｂ）は、任意の適切な分離手段によって行われ得る。例えば、分離は、磁場を用いて粒子−微生物複合体を引きつけるか、又は遠心分離を用いて達成することができる。
【００６３】
本方法において、ステップｂ）は、粒子−微生物複合体から非微生物細胞を除去するステップをさらに含み得る。
【００６４】
本方法において、ステップａ）は、試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解することによって先行させることができる。
【００６５】
本方法において、試料中に存在する無傷のいずれもの微生物を保持しながら、非微生物細胞を選択的に溶解することは、試料を凍結及び解凍することを含み得る。
【００６６】
本方法において、試料中に存在する無傷のいずれもの微生物を保持しながら、非微生物細胞を選択的に溶解することは、界面活性剤を添加することを含み得る。
【００６７】
本方法において、ステップａ）は、緩衝液の存在下で行うことができる。緩衝液は、７．４〜８．５のｐＨを有し得る。
【００６８】
本方法において、ステップａ）は、塩化ナトリウムの存在下で行うことができる。塩化ナトリウムは、５０〜５００ｍＭの濃度で存在することができる。好ましくは、塩化ナトリウムは、約１５０ｍＭの濃度で存在することができる。
【００６９】
本方法において、試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解する試薬は、界面活性剤であり得る。本方法において、界面活性剤は、非イオン性であり得る。本方法において、界面活性剤は、微生物と複合体を形成することができる粒子にコンジュゲートされない場合がある。したがって、典型的には、界面活性剤は、粒子が添加される溶液の一部を形成し、粒子自体の一部を形成しない。
【００７０】
本方法において、粒子は、０．１〜３μｍの直径、又は０．１〜２μｍの直径を有し得る。好ましくは、粒子は、０．１〜１．０μｍの直径を有する。
【００７１】
本方法において、粒子は、磁性であり得る（及び典型的には磁性である）。粒子は、超常磁性であり得る。粒子は、酸化鉄を含み得る。酸化鉄は、磁鉄鉱及び／又は磁赤鉄鉱を含み得る。酸化鉄は、Ｆｅ２＋及びＦｅ３＋の１：１、２：１、３：１又は４：１の比率を含まない場合がある。
【００７２】
微生物と複合体を形成することができる粒子の外面は、ポリマーを含み得；任意選択で、ポリマーは、炭素ベースであり得る。ポリマーは、無機ポリマーを含まない場合がある。ポリマーは、ポリスチレン及び／又はポリ（スチレン／ジビニルベンゼン）を含み得る。
【００７３】
本方法において、微生物との複合体を形成することができる粒子の外面は、ｉ）カルボン酸基；ｉｉ）アミノ基；ｉｉｉ）疎水性基；及びｉｖ）ストレプトアビジンのうちのいずれか１つ又は複数を含むか又はそれで被覆され得る；任意選択で、カルボン酸基；ｉｉ）アミノ基；ｉｉｉ）疎水性基は、ポリペプチドの一部でない場合がある。
【００７４】
本方法において、微生物は病原性微生物であり得る。例えば、病原性微生物は、病原性細菌又は真菌であり得る。
【００７５】
本方法において、非微生物細胞は、赤血球及び／又は白血球を含み得る。
【００７６】
本方法において、試料は、１ミリリットルあたり細胞２０，０００〜５００万個の濃度で非微生物細胞を含み得る。試料は、１ミリリットルあたり細胞少なくとも約１００，０００個の濃度で非微生物細胞を含み得る。好ましくは、試料は、１ミリリットルあたり細胞少なくとも約２０，０００個の濃度で非微生物細胞を含み得る。
【００７７】
試料は、微生物を含有するか又は含有する疑いがあるものである。試料は、試料中に存在する微生物を検出すること、また、潜在的に該微生物を同定し及び／又は定量することをも目的とした場合、望ましくないバックグラウンドを提供することができる非微生物細胞を含有する。したがって、一部の実施形態では、試料は、血液、尿、唾液又はミルクを含み得る。血液試料は、血液細胞を含有する任意の試料であり得る。血液試料は、全血であり得るか、又は全血を含み得る（例えば、血液ブロス）。
【００７８】
本発明は、（ａ）試料を粒子（例えば、磁性粒子）とともにインキュベートして、粒子−微生物複合体を形成するステップと；（ｂ）非微生物細胞から粒子−微生物複合体を（例えば、磁場を用いて）分離するステップと；（ｃ）粒子−微生物複合体中の微生物の不存在又は存在を検出するステップとを含む、非微生物細胞も含有し得る試料中の微生物の不存在又は存在を検出する方法を提供する。
【００７９】
本方法において、粒子（例えば、磁性粒子）は、（ｉ）抗体、（ｉｉ）炭水化物、（ｉｉｉ）アポリポタンパク質Ｈタンパク質由来のペプチド、（ｉｖ）マンノース結合レクチンタンパク質、（ｖ）ポリアミン、又は（ｖｉ）カチオン性界面活性剤のいずれでも被覆されていない外面（例えば、外側ポリマー表面）を有し得る。
【００８０】
本方法において、粒子（例えば、磁性粒子）は、（ｉ）抗体、（ｉｉ）炭水化物、又は（ｉｉｉ）先天性免疫系タンパク質のいずれでも被覆されていない外側ポリマー表面を有し得る。
【００８１】
本方法において、粒子（例えば、磁性粒子）は、（ｉ）抗体、（ｉｉ）炭水化物、（ｉｉｉ）アポリポタンパク質Ｈタンパク質由来のペプチド、（ｉｖ）マンノース結合レクチン、又は（ｖ）凝集剤（例えば、国際公開第０３／１０２１８４号に定義される凝集剤）のいずれでも被覆されていない外側ポリマー表面を有し得る。
【００８２】
本方法において、粒子（例えば、磁性粒子）は、リガンドで被覆されていない外面（例えば、外側ポリマー表面）を有し得る。
【００８３】
本方法において、粒子（例えば、磁性粒子）は、（ｉ）抗体、（ｉｉ）炭水化物、（ｉｉｉ）先天性免疫系タンパク質、又は（ｉｖ）凝集剤（例えば、国際公開第０３／１０２１８４号に定義される凝集剤）のいずれでも被覆されていない外面（例えば、外側ポリマー表面）を有し得る。
【００８４】
本方法において、粒子（例えば、磁性粒子）は、ストレプトアビジンで被覆され、リガンドで被覆されていない外面（例えば、外側ポリマー表面）を有し得る。
【００８５】
本方法において、粒子（例えば、磁性粒子）は、ストレプトアビジンのみで被覆された外面（例えば、外側ポリマー表面）を有し得る。
【００８６】
本方法において、粒子（例えば、磁性粒子）は、カルボキシル基のみで被覆された外面（例えば、外側ポリマー表面）を有し得る。
【００８７】
本方法において、粒子（例えば、磁性粒子）は、微生物に結合することができる任意の分子又は部分で被覆されていない外面（例えば、外側ポリマー表面）を有し得る。
【００８８】
本方法において、粒子（例えば、磁性粒子）は、任意の分子又は部分で被覆されていない外面（例えば、外側ポリマー表面）を有し得る。
【００８９】
本方法において、ステップ（ｃ）は、（ｉ）微生物に関連する核酸分子の酵素活性を検出するステップ、（ｉｉ）サイトメトリー又は顕微鏡により微生物を直接検出するステップ、又は（ｉｉｉ）細胞培養後の微生物を検出するステップを含み得る。
【００９０】
本発明の全ての関連する態様による粒子−微生物複合体中の微生物の不存在又は存在の検出は、任意の所望の方法に従って行うことができる。本方法は、１つ又は複数の微生物の単純な不存在又は存在を検出することを伴うことができる。存在する場合、微生物の定量化を伴う場合がある。また、一部の実施形態では、微生物の性質の特徴付けを伴うこともできる。したがって、細菌及び／又は真菌の検出を行うことができる。グラム陽性菌対グラム陰性菌の識別も行うことができる。微生物の同定及び抗菌剤感受性も行うことができる。
【００９１】
粒子−微生物複合体から微生物を除去（又は回収）した後に検出することができる。回収された微生物は、検出前に溶解され得る。回収は、無傷の微生物、又は微生物の溶解後の溶解物であり得る（本明細書においてさらに詳細に検討される）。
【００９２】
好ましくは、検出は、粒子−微生物複合体からの微生物の事前除去（又は回収）なしに行われる。この実施形態は、本発明を磁性ビーズ処理装置に適用する際に特に有用である。
【００９３】
微生物の不存在又は存在の検出は、微生物に関連する酵素活性又は核酸分子を検出するステップ；サイトメトリー又は顕微鏡により微生物を直接検出するステップ；又は細胞培養後に微生物を検出するステップを含むことができる。
【００９４】
微生物に関連する核酸分子の検出は、当該技術分野において公知であり、ＤＮＡ又はＲＮＡレベルで行うことができる。それは、増幅（例えば、ＰＣＲ）又は配列決定（特に、次世代シークエンシング）などの任意の適切な方法によって行うことができる。このような方法は、微生物と、ヒト、ＤＮＡ及びＲＮＡなどの非微生物との間の配列の相違を利用することができる。このような方法は、核酸成分を放出するために、微生物（例えば、粒子−微生物複合体の形態で存在する）を溶解することを伴うことができる。
【００９５】
微生物の直接検出はまた公知である。これは、例えば、フローサイトメトリーによるサイトメトリー分析を伴うことができる。例えば、粒子−微生物複合体から回収された微生物を可視化するため、又は微生物を粒子−微生物複合体中で可視化するために、顕微鏡の使用を伴うことができる。
【００９６】
微生物の数を拡大するために、細胞培養後に微生物検出を行うこともできる。したがって、粒子−微生物複合体内に最初に捕捉された微生物は、検出前に、一定期間培養することができる。培養法によって、元の試料中の微生物を直接検出することができる。
【００９７】
しかしながら、好ましい実施形態では、微生物の不存在又は存在の検出は、微生物に関連する酵素活性を検出することを含み得る。適切な酵素活性は、典型的には、核酸修飾活性であり、本明細書においてより詳細に検討される。
【００９８】
したがって、本方法において、ステップ（ｃ）は、（ｉ）粒子−微生物複合体中の微生物を溶解するステップと；（ｉｉ）溶解物を、微生物の核酸修飾活性の基質として作用する核酸分子とともにインキュベートするステップと；（ｉｉｉ）微生物の不存在又は存在を示すために、基質核酸分子上の核酸修飾酵素の作用に起因する修飾核酸分子の不存在又は存在を特異的に決定するステップとを含むことができる。
【００９９】
本方法において、ステップ（ｉ）は、基質核酸分子を含有する溶解試薬を添加するステップを含み得る。
【０１００】
試料をインキュベートすることは、粒子−微生物複合体の形成を誘導する条件下で、試料を粒子と接触させることを指す。一部の実施形態では、試料を粒子（例えば、磁性粒子）とともにインキュベートするステップは、粒子（例えば、磁性粒子）を一定期間（例えば、３０分間）、所定の温度（例えば、３７℃）で試料と接触させるステップを含む。インキュベーションは、振とう（例えば、５００〜１０００ｒｐｍに設定されたプラットフォームシェーカー、軌道振とう機又は振とうインキュベーターによる）を伴う又は伴わないで行うことができる。
【０１０１】
粒子−微生物複合体中の微生物の溶解は、核酸修飾酵素などの微生物内の核酸分子又は酵素の検出を可能にする。溶解は、溶解混合物の添加によって達成され得る。溶解混合物は、一般的に、本発明の方法において有用である。溶解混合物は、細胞内の核酸分子及び／又は核酸修飾活性などの酵素活性に悪影響を及ぼすことなく、微生物の効率的な溶解を確実にするために、成分の特定の混合物を含み得る。成分は、担体／血清タンパク質、例えば、ＢＳＡ、サーファクタント／界面活性剤、金属ハロゲン化物塩、緩衝液、キレート剤などから選択することができる。本発明の溶解混合物は、その基本形態において、以下の成分を含むことができる：
１．サーファクタント／界面活性剤
２．アルブミン（例えば、ＢＳＡ）などの血清タンパク質
３．緩衝液
４．ｄＮＴＰなどのヌクレオチド
５．核酸分子（本発明のアッセイにおいて基質として作用する）。
【０１０２】
適切な溶解混合物を以下に記載する：
【０１０３】
Ｌ１：３６０ｍＬのＬＭ中２５２ｍＬ
１．４６％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ
０．１５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００
０．１５％のＴｗｅｅｎ  ２０
【０１０４】
Ｌ２：３６０ｍＬのＬＭ中３６ｍＬ
１００ｍＭ硫酸アンモニウム
２０ｍＭ硫酸マグネシウム七水和物
１００ｍＭ塩化カリウム
２００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］
【０１０５】
Ｌ３：３６０ｍＬのＬＭ中３６ｍＬ
０．１μＭのＰＴＯ−ＡＳオリゴ
０．１μＭのＰＴＯ−Ｓ１オリゴ
２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．５］
１０ｍＭ塩化カリウム
１０μＭのＥＤＴＡ
【０１０６】
１０ｍＭのｄＮＴＰ：３６０ｍＬのＬＭ中３．６ｍＬ
【０１０７】
ＰＴＯ−ＩＰＣストック：３６０ｍＬのＬＭ中約１８０μＬ
【０１０８】
Ｈ２Ｏ：３６０ｍＬのＬＭ中約３２．４ｍＬ
【０１０９】
「ＰＴＯ−ＡＳオリゴ」とは、ホスホロチオエートヌクレオチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを意味する。「ＰＴＯ−Ｓ１オリゴ」とは、ホスホロチオエートヌクレオチドを含むセンスオリゴヌクレオチドを意味する。２つのオリゴヌクレオチドは、互いにハイブリダイズし、基質核酸分子を形成する。
【０１１０】
「ＰＴＯ−ＩＰＣ」とは、ホスホロチオエートヌクレオチドを含むＩＰＣ分子を意味する。
【０１１１】
適切な基質及びＩＰＣ分子は、本明細書においてさらに詳細に検討される。
【０１１２】
各成分の例示的な量及び濃度は列挙されているが、当業者であれば容易に理解できるように修飾することができる。
【０１１３】
また、溶解には細胞の破壊が必要となる場合がある。例えば、細胞は、物理的及び／又は酵素的手段と組み合わせて溶解混合物を用いて破壊され得る。しかしながら、典型的には、細胞を溶解する方法は、物理的破壊の使用を避ける。一部の実施形態では、物理的破壊は、ディスラプターを使用する。ディスラプターは、細胞を溶解するためにガラスビーズなどのビーズを取り込むことができる。適切な装置は市販されており、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．によって製造されたディスラプターＧｅｎｉｅを含む。超音波処理は、例えば、超音波ホーンを適用することで利用することができる。酵素的破壊は、一部の実施形態では、リゾスタフィン、リゾチーム及び／又はリチカーゼから選択される１つ又は複数の薬剤の使用を必要とすることができる。
【０１１４】
ひとたび、試料中に存在する微生物が溶解されると、放出された核酸及び／又は酵素は、試料中に微生物が存在するかどうかを示すために検出され得る。一部の実施形態では、溶解物は、（微生物の）核酸修飾活性の基質として作用する核酸分子とともにインキュベートされる。次に、基質核酸分子上の核酸修飾酵素の作用に起因する修飾核酸分子の不存在又は存在は、微生物の不存在又は存在を示すために決定される。核酸基質分子は、検出されるべき核酸修飾活性に従って設計される。当業者は、適切な基質核酸分子を設計することができる。最初の試料は、核酸修飾活性の非微生物源を含有するが、本発明の方法は、基質核酸分子に作用するこの汚染活性を防ぐ。
【０１１５】
核酸修飾酵素は、ＤＮＡポリメラーゼ又はＲＮＡポリメラーゼを含み得、任意選択で、ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼＩである。
【０１１６】
核酸修飾酵素は、リガーゼを含み得、任意選択で、核酸修飾酵素がＮＡＤ依存性リガーゼである。
【０１１７】
さらに、本発明は、対象における微生物感染の不存在又は存在を検出する方法であって、対象からの試料に対して本明細書に記載される方法のいずれかの方法を行うことを含み、任意選択で、試料が対象からの血液を含む、方法を提供する。
【０１１８】
この方法は、分離された粒子−微生物複合体を洗浄して、非微生物細胞又は溶解物を除去することをさらに含み得る。洗浄ステップは、その後の分析のインヒビター、例えば、ＰＣＲ阻害剤を除去することができる。洗浄ステップは、粒子−微生物複合体を解離しない条件下で行うことができる。
【０１１９】
本発明の方法によれば、検出され得る典型的な核酸修飾活性は、ポリメラーゼ及び／又はリガーゼ活性を含む。特定の実施形態では、核酸修飾酵素は、ＤＮＡポリメラーゼ又はＲＮＡポリメラーゼを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＩを含むか又はそれである。一部の実施形態では、核酸修飾酵素は、リガーゼを含む。特定の実施形態では、核酸修飾酵素は、ＮＡＤ依存性又はＡＴＰ依存性リガーゼを含むか、又はそれである。ＮＡＤ依存性リガーゼは（ｅｕ）細菌にのみ見出され、このような活性を検出することにより、さらなるレベルの特異性が得られる可能性がある。これは、国際公開第２００９／００７７１９号及び国際公開第２０１０／１１９２７０号（関連開示は本明細書に組み込まれる）でさらに検討されている。生存率に関連する他の核酸修飾活性、例えば、ホスファターゼ、キナーゼ及び／又はヌクレアーゼ活性は、代替的に測定され得る。
【０１２０】
一部の実施形態では、基質核酸分子に対する核酸修飾活性の作用は、伸長された核酸分子を生成する。これは、鎖伸長（ポリメラーゼ活性）により、及び／又は２つの核酸分子の連結（リガーゼ活性）によるものであり得る。一部の実施形態では、ポリメラーゼ又はリガーゼのいずれかによって作用され得る基質が利用され、これは、いずれかの活性が試料中の微生物の存在を示すためである。一部の実施形態では、関連活性は、生成される新規の核酸分子に関して区別することができる。
【０１２１】
基質は、微生物の核酸修飾活性のための鋳型であり得る。例えば、基質は、ＤＮＡポリメラーゼ又はＲＮＡポリメラーゼの鋳型であり得、任意選択で、ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼＩである。
【０１２２】
微生物の核酸修飾活性の基質として作用する適切な核酸分子は、国際公開第２０１１／１３０５８４号、国際公開第２０１０／１１９２７０号及び国際公開第２００９／００７７１９号（関連開示は本明細書に組み込まれる）に記載されている。ホスファターゼ活性の場合、適切な核酸分子は、国際公開第２００６／１２３１５４号に開示され、この開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２３】
具体的な実施形態では、本発明の方法で使用される（基質）核酸分子は、少なくとも部分的に二本鎖であり、相補鎖にウラシル残基を含み、修飾核酸分子の不存在又は存在を特異的に決定するステップは、相補鎖中のウラシル残基を分解するために、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）を試料に添加することを含む。
【０１２４】
特定の実施形態では、（基質）核酸分子は、ＤＮＡを含む。特定の実施形態では、（基質）核酸分子は、ＤＮＡを含み、部分的に二本鎖である。
【０１２５】
一部の実施形態では、（基質）核酸分子は、センスオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）鎖及びアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）鎖からなる核酸を含み、これらの２本の鎖が、重なり合って、二本鎖領域を形成し、アンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の一本鎖部分は、ポリメラーゼ活性の存在下で伸長産物を作製するためのプライマーとして作用する、二本鎖領域のセンスオリゴヌクレオチド鎖を有する鋳型として作用する。
【０１２６】
特定の実施形態では、部分的に二本鎖（基質）核酸分子の第１鎖は、合成ヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド）を含み（又はそれからなり）、第２（相補性）鎖は、ウラシル残基、及び任意選択で、合成ヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド）を含む（又はそれからなる）。好ましくは、二本鎖領域は、第１及び第２（相補性）鎖の３’末端領域を包含する。好ましくは、第２（相補性）鎖は、第２鎖のＤＮＡポリメラーゼ媒介伸長を遮断するその３’末端に塩基（例えば、ジデオキシシチジン）を含む。このような部分的二本鎖（基質）核酸分子は、例えば、Ｚｗｅｉｔｚｉｇら、２０１２年（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｓｓａｙ  ｅｎａｂｌｉｎｇ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉａｂｌｅ  ｍｉｃｒｏｂｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４０巻、１４号、ｅ１０９、１〜１２頁）に記載されている。好ましくは、二本鎖領域は、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、又は少なくとも２５ヌクレオチドであり；任意選択で、二本鎖領域は５０ヌクレオチド以下である。第１鎖は、本明細書に記載されるように、試料中の微生物のポリメラーゼ活性による保護されていない（又は標準の）ｄＮＴＰを用いて、インキュベーションステップ中に伸長されて、保護されていない（又は標準の）ヌクレオチドを含む伸長された第１鎖を形成することができる。このステップは、第２鎖を鋳型（第１と第２鎖の間の相補性領域の上流）として使用することに依存する。インキュベーションステップの後、第２（相補性）鎖は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）を試料に添加することによって分解され得、伸長された第１鎖は、合成ヌクレオチド及び保護されていないヌクレオチドを含む一本鎖分子として残される。第２鎖の分解に続いて、（基質）核酸分子の伸長された第１鎖を増幅ステップで検出することができる。本発明者らは、上記される部分的二本鎖（基質）核酸分子の使用が、試料中の微生物の検出を改善することを見出した。
【０１２７】
一部の実施形態では、基質核酸分子は、ヌクレアーゼ活性からそれを保護するように予め修飾され、すなわち、核酸分子は、アッセイに加えられる前に、それをヌクレアーゼ活性から保護するように修飾される。本発明者らは、ヌクレアーゼ活性から基質核酸分子を保護することが、本発明のアッセイとの関連で有利であることを決定した。より具体的には、本発明の方法への保護された核酸分子の取り込みは、検出の感度を改善する。核酸分子をヌクレアーゼ活性から保護するために、任意の適切な手段を採用することができる。非限定的な例としては、核酸分子へのメチル化の取り込み、３’末端及び／又は５’末端の保護などの末端修飾、並びに合成ヌクレオチドの取り込みが挙げられる。具体的な実施形態では、合成ヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド及び／又はロックされた核酸ヌクレオチドを含む。好ましくは、合成ヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチドである。特定の実施形態では、合成ヌクレオチドは、核酸分子中のヌクレオチドの少なくとも１つから全部までを置換する。
【０１２８】
（基質）核酸分子は、（新規の検出可能な）核酸分子を生成するために、核酸修飾活性によって作用することができる任意の天然核酸及び天然若しくは合成類似体を含み得る。基質は、具体的な実施形態では、伸長及び／又は連結することができる。一部の実施形態では、ポリメラーゼ及びリガーゼ活性の検出を可能にするために、核酸基質分子の組み合わせを採用することができる。
【０１２９】
核酸基質は、試料中の核酸修飾活性（微生物によって提供される）に対して、過剰に、特に、大きなモル過剰で存在し得る。新規な伸長又は連結された核酸分子が検出されるため、試料中のこの分子の存在のみが、検出方法が効果的に働くために必須である。したがって、他の核酸分子が、検出対象の微生物由来、又は哺乳動物若しくは、例えば、試験対象の試料中に見出され得る他の供給源由来などの試料中に存在する場合、本発明の方法に有害ではない。
【０１３０】
本発明者らは、以前に、内部陽性対照（ＩＰＣ）分子の使用を、それらの方法との関連で調査した。したがって、全ての態様によれば、本発明は、ＩＰＣ分子の包含に依存し得る。一部の実施態様では、ＩＰＣは、ＩＰＣが同一の条件に曝露されるように、基質核酸分子とともに含まれる。一部の実施態様では、ＩＰＣ分子は、ヌクレアーゼ活性からそれを保護するように予め修飾され、すなわち、核酸分子は、アッセイに加えられる前に、ヌクレアーゼ活性からそれを保護するように修飾される。本発明者らは、ＩＰＣ分子をヌクレアーゼ活性から保護することが、本発明のアッセイとの関連で有利であると決定した。核酸分子をヌクレアーゼ活性から保護するために、任意の適切な手段を採用することができる。非限定的な例としては、核酸分子へのメチル化の取り込み、３’末端及び／又は５’末端の保護などの末端修飾、並びに合成ヌクレオチドの取り込みが挙げられる。具体的な実施形態では、合成ヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド及び／又はロックされた核酸ヌクレオチドを含む。好ましくは、合成ヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチドである。特定の実施形態では、合成ヌクレオチドは、ＩＰＣ分子中のヌクレオチドの少なくとも１つから全部までを置換する。好ましくは、基質及びＩＰＣ分子は、それらが本発明のアッセイにおいて同様に挙動するために有利であるのと同じ方法で修飾される。
【０１３１】
一部の実施形態では、内部陽性対照（ＩＰＣ）核酸分子は、核酸分子とＩＰＣの両方を含む核酸増幅反応においてプライマー結合に対する競合が存在するように、基質核酸分子に対する同一のプライマー結合部位を含む。
【０１３２】
本発明の全ての方法において、修飾された核酸分子の不存在又は存在を特異的に決定することは、核酸増幅ステップを含み、それから本質的になり、又はそれからなり得る。これは、本発明の方法を最大限に高感度にするのに役立つ。このような増幅技術は、当該技術分野において周知であり、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ（Ｃｏｍｐｔｏｎ、１９９１年）、３ＳＲ（Ｆａｈｙら、１９９１年）、ローリングサークル複製、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４５巻：７７７〜７８４頁、１９９９年）、米国特許第６，２６１，８４６号に記載されるＤＮＡオリゴマー自己集合プロセス（参照により本明細書に組み込まれる）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｂａｒｒｉｎｇｅｒら、１９９０年）、標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅（米国特許第６，４１０，２７６号）、任意プライミングＰＣＲ（国際公開第９０／０６９９５号）、コンセンサス配列プライミングＰＣＲ（米国特許第４，４３７，９７５号）、インバーダー技術、鎖置換技術、及びニック置換増幅（国際公開第２００４／０６７７２６号）などの方法が含まれる。上記のリストは、網羅的であることを意図したものではない。適切な核酸生成物が特異的に増幅されれば、任意の核酸増幅技術を使用することができる。
【０１３３】
同様に、配列決定に基づく方法論は、一部の実施形態では、クローン的に増幅された配列の合成によるシークエンシング（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ピロシークエンシング、４５４シークエンシング（Ｒｏｃｈｅ）、ナノ細孔シークエンシング（例えば  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ）、イオントレント（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、及び単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）シークエンシング（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などの、次世代シークエンシングプラットフォームの範囲のいずれかを含むために採用され得る。新規な核酸分子が生成されるという事実は、配列決定アプローチが、修飾された核酸分子の存在又はその他を確認することができ、また、その分子の定量化を提供することができることを意味する。
【０１３４】
増幅は、検出されるべき修飾核酸分子の配列に特異的な増幅プライマーの使用によって達成される。核酸分子に対する特異性を提供するために、配列の適切な領域に対応するプライマー結合部位を選択することができる。当業者は、核酸分子はまた、試料中の修飾活性によって生成される新規核酸分子の検出に必要なプライマー結合部位以外の配列を含み得、例えば、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位又はプロモーター配列は、ＮＡＳＢＡ、３ＳＲ及びＴＭＡなどの等温増幅技術に必要とされ得ることを理解する。
【０１３５】
１つ又は複数のプライマー結合部位は、増幅産物が、例えば、連結／伸長が生じた場合にのみ生成されるように、基質核酸分子の連結／伸長境界を架橋することができる。或いは、プライマーは、連結／伸長された核酸分子が形成される場合にのみ（指数関数的に）増幅産物が生成されるように、連結／伸長境界のいずれかの側に結合し、境界を越えて直接増幅することができる。プライマー及び基質核酸分子（複数可）は、非特異的増幅（例えば、試料中のゲノムＤＮＡの増幅）を回避するように設計することができる。
【０１３６】
プライマーは、合成ヌクレオチド類似体を適切に組み込むことができ、又はＲＮＡ若しくはＰＮＡに基づく、例えば、又はそれらの混合物であり得る。プライマーは、採用される検出モードに応じて、蛍光標識及び／又はＦＲＥＴ対などで標識化され得る。
【０１３７】
プローブが、利用され得、再度、所望により、標識化され得る。検出方法は、プライマーに加えて、又はプライマーの代替物としてのヌクレオチドプローブの使用を必要とすることができる。例えば、プライマーの使用を必要としない分枝状ＤＮＡアッセイを一部の実施形態で採用することができる。
【０１３８】
特定の態様では、本発明の方法は、試料中の微生物の存在を示す基質核酸分子に対する核酸修飾活性の作用の直接の結果として生成された修飾核酸分子を検出するために、核酸増幅技術を用いて行われる。特定の実施形態では、使用される技術は、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、３ＳＲ、ＴＭＡ、ＳＤＡ及びＤＮＡオリゴマー自己集合から選択される。
【０１３９】
増幅産物の検出は、例えば、ゲル電気泳動などの日常的な方法により行うことができるが、一部の実施形態では、リアルタイム検出方法又はエンドポイント検出方法を用いて行われる。
【０１４０】
増幅反応の生成物のリアルタイム又はエンドポイント検出のためのいくつかの技術が、当該技術分野において公知である。これらには、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版）などの挿入蛍光色素の使用が含まれ、増幅されたＤＮＡの収率を生成された蛍光量に基づいて推定することができる。リアルタイム検出方法の多くは、連続的にモニターすることができる蛍光読み出しを生成する；具体的な例には、分子ビーコン及び蛍光共鳴エネルギー移動プローブが含まれる。リアルタイム及びエンドポイント技術は、反応を「単一チューブ」に維持するため、有利である。これは、結果を得るために、下流の分析は必要なく、より迅速に結果を得ることができることを意味する。さらに、反応を「単一チューブ」環境に維持することは、交差汚染のリスクを低減し、本発明の方法からの定量的な生産を可能にする。これは、健康及び安全上の懸念が（例えば、患者試料における潜在的な微生物感染の検出において）最も重要であり得る本発明の関連において、特に重要であり得る。
【０１４１】
ＰＣＲ反応のリアルタイム及びエンドポイント定量は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて達成することができる。Ｈｏｌｌａｎｄら；Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｂｙ  ｕｔｉｌｉｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ５’−３’ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８巻、７２７６〜７２８０頁（１９９１年）、Ｇｅｌｍｉｎｉら、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ａｓｓａｙ  ｗｉｔｈ  ｆｌｕｒｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｂｅｓ  ｔｏ  ｍｅａｓｕｒｅ  Ｃ−Ｅｒｂ−２  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３巻、７５２〜７５８頁（１９９７年）、及びＬｉｖａｋら、Ｔｏｗａｒｄｓ  ｆｕｌｌｙ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｗｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．９巻、３４１〜３４２頁（１９９５年）（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。このタイプのプローブは、一般的に、加水分解プローブと呼ばれることがある。リアルタイム又はエンドポイント検出に使用するための適切な加水分解／Ｔａｑｍａｎプローブも提供される。プローブは、例えば、以下に詳述される標識を使用して、適切に標識化され得る。
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎシステムでは、Ｔｙａｇｉ  ＆  Ｋｒａｍｅｒ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓ−ｐｒｏｂｅｓ  ｔｈａｔ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ  ｕｐｏｎ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４巻、３０３〜３０８頁（１９９６年）、及びＴｙａｇｉら、Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓ  ｆｏｒ  ａｌｌｅｌｅ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６巻、４９〜５３頁（１９９８年）（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。ビーコンは、標的に結合したときに蛍光が回復される内部的にクエンチされたフルオロフォアを有するヘアピン形状のプローブである。これらのプローブは、ヘアピンプローブと呼ばれることがある。
【０１４２】
本発明の方法に組み込むことができるさらなるリアルタイム蛍光ベースのシステムは、Ｓｃｏｒｐｉｏｎシステムであり、Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７巻、８０４〜８０７頁（１９９９年８月１日）による自己プロービングアンプリコン及び蛍光を使用するＰＣＲ産物の検出を参照されたい。当業者に周知であり、市販されている追加のリアルタイム又はエンドポイント検出技術には、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）技術、Ａｍｐｌｉｆｕｏｕｒ（登録商標）プライマー技術、ＤｚｙＮＡプライマー（Ｔｏｄｄら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４６巻：５号、６２５〜６３０頁（２０００年））、又はＰｌｅｘｏｒ（商標）ｑＰＣＲ及びｑＲＴ−ＰＣＲシステムが含まれる。
【０１４３】
したがって、本発明のさらなる態様では、核酸増幅の生成物は、リアルタイム又はエンドポイント技術を用いて検出される。本発明の具体的な実施形態では、リアルタイム技術は、加水分解プローブ（Ｔａｑｍａｎ（登録商標）システム）、ＦＲＥＴプローブ（Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）システム）、ヘアピンプライマー（Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｕｒ（登録商標）システム）、ヘアピンプローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓシステム）、プライマーに組み込まれたヘアピンプローブ（Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プローブシステム）、ＤＮＡｚｙｍｅの相補配列及び切断可能な蛍光ＤＮＡｚｙｍｅ基質（ＤｚＹＮＡ）を組み込んだプライマー、Ｐｌｅｘｏｒ  ｑＰＣＲ及びオリゴヌクレオチド遮断システムのいずれか１つを使用することからなる。
【０１４４】
増幅産物を定量して、試料中の微生物の核酸修飾活性、したがって、試料中の微生物のレベルの近似を与えることができる。したがって、「不存在又は存在」は、試料中の微生物のレベルの定量化を包含することが意図される。
【０１４５】
本発明者らは、さらに、微生物の核酸修飾活性を測定するための最適温度が、微生物の溶解のための最適温度と同じでない可能性があることを発見した。したがって、一部の実施形態では、微生物の溶解は、溶解物を、微生物の核酸修飾活性の基質として作用する核酸分子とともにインキュベートするステップよりも低い温度で行われる。既に検討したように、本発明の一部の実施形態では、基質核酸分子は、微生物を溶解するために使用される溶解試薬に含まれる。このような実施形態は、異なる温度選好と一致する。したがって、基質核酸分子が溶解試薬に含まれ得るとしても、初期のより低い温度は、基質が、微生物から放出された核酸修飾活性によって修飾されるより高い温度でのその後のインキュベーションに悪影響を及ぼさない。したがって、一部の実施形態では、本方法は、溶解試薬が、微生物の核酸修飾活性の基質として作用する核酸分子を含有する微生物の溶解ステップを伴う。このステップは、微生物から放出された酵素の活性を可能にするために、溶解物を基質核酸分子とともにインキュベートするその後のステップよりも低い温度で行われる。したがって、基質は、初期のより低い温度に曝露され、続いて、酵素活性が増大されるより高い温度に曝露される。
【０１４６】
一部の実施形態では、溶解物を、微生物の核酸修飾活性の基質として作用する核酸分子とともにインキュベートするステップは、少なくとも約３０℃の温度で行われる。温度は、任意選択で、約３０℃〜４０℃又は約３２℃〜３７℃、例えば、約３７℃で行うことができる。
【０１４７】
追加の又は代替の実施形態では、微生物を溶解するステップは、約３０℃以下、任意選択で、約１５℃〜３０℃又は約１８℃〜２５℃、例えば、約１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５℃の温度で行われる。一部の実施形態では、溶解物を、微生物の核酸修飾活性の基質として作用する核酸分子とともにインキュベートする前の全てのステップは、約３０℃以下の温度で行われる。温度は、任意選択で、約１５℃〜３０℃又は約１８℃〜２５℃、例えば、約１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５℃であり得る。
【０１４８】
このような方法は、本発明の種々の態様に関して記載された実施形態のうちのいずれか１つ又は複数から全てまでを組み込むことができる。
【０１４９】
一部の実施形態では、本方法は、溶解物を基質核酸分子とともにインキュベートするステップが、少なくとも約３０℃、任意選択で、約３０℃〜４０℃、又は約３２℃〜３７℃、例えば、約３７℃の温度で行われるという点でさらに特徴付けられる。
【０１５０】
追加の又は代替の実施形態では、溶解物を基質核酸分子とともにインキュベートする前の各ステップは、約３０℃以下、任意選択で、約１５℃〜３０℃、又は約１８℃〜２５℃、例えば、約１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４若しくは２５℃の温度で行われる。
【０１５１】
試料を磁性粒子とともにインキュベートして、粒子−微生物複合体を形成するステップの前（すなわち、ステップ（ａ）の前）に、本方法は、試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解するステップを含み得る。
【０１５２】
試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解するステップは、界面活性剤及び１つ又は複数の酵素の組み合わせを試料に添加するステップを含み得る。１つ又は複数の酵素は、プロテイナーゼ及び／又はＤＮＡａｓｅを含み得、任意選択で、プロテイナーゼがプロテイナーゼＫである。
【０１５３】
試料中に存在する無傷のいずれもの微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解するステップは、白血球などの非微生物細胞からの酵素活性を防ぎ、試料中の微生物の存在を偽って示し得る。このような選択的な溶解は、本明細書においてさらに検討される任意の適切な手段によって達成することができる。試料中に存在するが、試料中の微生物を溶解しない非微生物、特に哺乳動物細胞を溶解する任意の適切な試薬を使用することができる。試薬は、一部の実施形態においてサーファクタント又は界面活性剤、例えば、非イオン性界面活性剤を含み得る。適切な例としては、例えば、５％ｗ／ｖのポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ  ２０）が含まれる。試薬は、例えば、５％ｗ／ｖのサポニンを含み得る。試薬は、例えば、８．５ｇ／Ｌの、塩化ナトリウムなどの金属ハロゲン化物塩を含み得る。試薬は、３つ全ての成分の混合物を含み得る。試料は、試料中に存在する場合、非微生物細胞、特に哺乳動物細胞の溶解を確実にするために、適切な条件下で試薬と混合され得るが、試料中に存在する場合、微生物の溶解はない（又はわずかである）。試料は、５、１０、１５、２０、２５又は３０分などの約５〜３０分間、試薬に曝露され得る。このステップは、任意の適切な温度、例えば、１５〜３０℃又は室温で行うことができる。
【０１５４】
一部の実施形態では、本発明の全ての態様によれば、試料中に存在する無傷のいずれもの微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞の選択的溶解は、界面活性剤及び１つ又は複数の酵素の組み合わせを試料に添加することを含む。特定の理論に拘束されることを望まないが、界面活性剤は、非微生物の細胞膜を選択的に透過するが、微生物は、それらの細胞壁によって保護される。酵素は、放出された細胞内物質及び他の細胞残屑を分解するのに有用であり、放出された酵素活性の持ち越しを防ぐのに寄与し得る。一部の実施形態では、１つ又は複数の酵素は、プロテイナーゼ及び／又はヌクレアーゼを含む。適切なプロテイナーゼには、プロテイナーゼＫが含まれる。適切なヌクレアーゼにはＤＮＡｓｅが含まれる。一実施形態では、非微生物細胞を選択的に溶解するために使用される試薬は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及びプロテイナーゼＫの組み合わせを含む。より具体的には、溶解試薬は、０．２５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び４．８μｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫを含み得る。
【０１５５】
非微生物細胞を溶解する場合には、放出されたいずれもの関連する酵素活性を不活化することが重要である。本発明者らは、酵素活性の効果的な不活化を確実にするために、高ｐＨ条件を利用する方法を考案した。微生物細胞は、典型的には、少なくとも処理の一部の間、無傷の状態であり、細胞内酵素活性は、高ｐＨ処理によって有意に悪影響を受けない。加えて、本発明者らは、微生物酵素が、いずれの場合においても高ｐＨ処理に対してより耐性であることを以前に示した。
【０１５６】
したがって、試料中に存在する無傷のいずれもの微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解するステップの後、本方法は、溶解物を高ｐＨ条件に曝露するステップを含み得る。高ｐＨ条件への曝露期間は、典型的には２０分未満であり、１０、９、８、７、６又は５分以下であり得、約５、６、７、８、９又は１０分であり得る。一部の実施形態では、処理は、約２〜１５分間、例えば、約５分間行われる。「約」とは、プラス又はマイナス３０秒を意味する。
【０１５７】
任意の適切な試薬は、高いｐＨ条件を提供するためであり得る。特定の実施形態では、高ｐＨ条件は、試料をアルカリ又は緩衝液と接触させることを含む。特定の実施形態では、ＮａＯＨ又はＮａ２ＣＯ３が使用される。具体的な実施形態では、ＮａＯＨ又はＮａ２ＣＯ３の濃度は、約５ｍＭ又はそれ以上である。緩衝液は、９を超えるｐＫａ値を有することができる。適切な緩衝液の例としては、ホウ酸、炭酸及びピロリン酸緩衝液が挙げられる。
【０１５８】
高ｐＨ条件は、典型的には、哺乳動物細胞などの非微生物源由来のＡＴＰ依存性リガーゼ及びポリメラーゼを含む核酸修飾酵素の活性を阻害するが、微生物のリガーゼ又はポリメラーゼの活性を阻害しない。これは、主に、非微生物酵素のみが高ｐＨ条件に曝露されることを確実にする方法において採用される示差的な溶解条件によるものである。しかしながら、これらの条件に対する微生物酵素の耐性が高いことも原因である可能性がある。「高ｐＨ」は、一般的に、約１０、１１、１２、１３又は１４などの少なくとも約１０のｐＨである。「低ｐＨ」は、一般的に、約４、３、２、若しくは１などの約４未満又はそれに等しいｐＨである。「約」とは、規定された値のいずれかの側のｐＨ単位の０．５を意味する。当業者に容易に理解されるように、試料のｐＨを変化させることは、任意の適切な手段を用いて達成することができる。ポリメラーゼ及びリガーゼなどの微生物の酵素は、極端なｐＨに耐性であり得るが、対応する哺乳動物の酵素は同じｐＨ条件下で不活化され得る。これは、哺乳動物細胞と微生物細胞の両方を含有する試料における微生物酵素活性の選択的検出を助ける。具体的な実施形態では、哺乳動物細胞からの、ＡＴＰ依存性リガーゼなどの非微生物核酸修飾活性の活性を阻害するが、微生物リガーゼなどの核酸修飾活性の微生物源の活性を阻害しない条件は、試料を水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）又は炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）で処理することを含む。このような薬剤は、本明細書に示されるように、微生物（真菌及び細菌）酵素を活性の状態にしながら、試料のｐＨを高ｐＨに増加させ、したがって、非微生物酵素活性を不活性化するために容易に使用することができる。適切な濃度及び体積の適切な薬剤は、当業者によって適用され得る。しかしながら、特定の実施形態において、ＮａＯＨは、少なくとも約５ｍＭのＮａＯＨである。一部の実施態様では、アルカリ濃度は、５、６、７、８、９又は１０ｍＭなどの１０ｍＭ以下である。
【０１５９】
さらなる実施形態では、ｐＨは、哺乳動物の核酸修飾活性（例えば、ポリメラーゼ及び／又はＡＴＰ依存性リガーゼ活性）を不活性化する約１２であるが、微生物の核酸修飾活性（例えば、ポリメラーゼ及び／又はリガーゼ活性）を不活性化しない。具体的な実施形態では、ｐＨ条件は、少なくとも約１１、又は少なくとも１１．２まで増加され得る。この処理は、特定の期間後に、試料中の微生物の溶解をもたらし、したがって、核酸修飾活性（例えば、ポリメラーゼ及び／又はリガーゼ）を試料中に放出させることができる。したがって、一部の実施形態では、微生物の溶解は、高ｐＨ処理によって達成される。これは、別個の細胞溶解ステップを必要とせずに、微生物に由来する、試料中の核酸修飾活性（例えば、ポリメラーゼ及び／又はリガーゼ）の検出を可能にする。このような条件下では、哺乳動物のリガーゼ（血中ＡＴＰ依存性リガーゼなど）は不活性化される。しかしながら、典型的には、本明細書でより詳細に検討されるように、本方法は、試料中の微生物を溶解するための別のステップを含む。
【０１６０】
一部の実施形態では、高ｐＨ条件下での処理は、ｐＨを低下させるために試薬を添加することによって停止される。これは、微生物が溶解する前に行われる。適切な試薬は、緩衝液及び／又は酸を含む。したがって、中和緩衝液を添加することによってｐＨを低下させることができる。具体的な実施形態では、緩衝液は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（例えば、ｐＨ７．２又は８）を含む。ｐＨを低下させるための他の適切な薬剤には、塩酸（ＨＣｌ）及び硫酸（Ｈ２ＳＯ４）などの酸が含まれる。これら（及び他の）酸は、当業者に容易に理解されるように、緩衝液中に取り込まれ得る。ｐＨが上昇した後に試料を処理するのに有用な１つの具体的な試薬は、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム七水和物、塩化カリウム及びＴｒｉｓ−ＨＣｌの組み合わせを含む。より具体的には、試薬は、１０ｍＭ硫酸アンモニウム、２ｍＭ硫酸マグネシウム七水和物、１０ｍＭ塩化カリウム及び２０ｍＭトリス−ＨＣｌ［ｐＨ  ８．０］を含むことができる。
【０１６１】
ステップ（ｂ）は、さらに、例えば吸引によって、粒子−微生物複合体から非微生物細胞を除去するステップを含み得る。
【０１６２】
本発明との関連で「試料」は、非微生物細胞を含み、核酸修飾活性を発現する真菌（例えば、酵母）及び／又は細菌などの微生物の存在について試験することが望ましいものである。したがって、試料は、血液試料（全血、血漿、血清、及び血液培養物又は血液ブロスなどの血液含有試料）などの臨床試料を含むか、それから本質的になるか又はそれからなる場合がある。本発明の方法は、特に、陰性（及び陽性）血液培養物の迅速な決定に適用可能である。したがって、試料は、血流感染を患っていることが疑われるか、又はスクリーニングされている患者からの血液培養試料（又は血液ブロス試料）を含み得る。試料は、１〜１０ｍｌ、好ましくは１ｍｌの血液培養試料などの任意の適切な体積であり得る。
【０１６３】
使用される試料は、利用可能性、利便性、及び試験される条件などの様々な要因に依存する。使用することができるが、本発明を限定することを意図しない典型的な試料には、患者、最も好ましくはヒト患者から採取される、全血、血清、血漿、血小板、関節液及び尿試料などが含まれる。患者は、血流感染を患っていることが疑われるか、又はスクリーニングされている場合がある。患者は、入院している場合がある。試料は、血液１ｍｌあたり５００、１０００又は１５００万を超える白血球（ＷＢＣ）を含む対象から採取することができる。本発明の方法は、インビトロ試験を表す。それらは、対象から除去された試料上で行われる。しかしながら、より好ましくない実施形態では、本方法は、対象から試料を得るステップを追加で含むことができる。対象から適切な試料を得る方法は、当該技術分野において周知である。しかしながら、典型的には、本方法は、別の手順で患者から既に単離された試料から開始して行うことができる。本方法は、最も好ましくは、ヒト由来の試料上で行われるが、本発明の方法は、多数の動物にとって有用性を有し得る。
本発明の方法は、潜在的に初期診断を確認する方法として、任意の既に利用可能な診断技術を補完するために使用することができる。或いは、これらの方法は、迅速であり、便利な診断手段を提供するため、それら自体、予備的な診断方法として使用することができる。さらに、本発明の方法は、固有の感度のために、最小限の試料しか必要とせず、したがって、不必要な侵襲的手術を防ぐ。また、本発明の方法に従って、大型であるが濃縮されていない試料を効果的に試験することもできる。
【０１６４】
本発明の全ての態様による具体的な実施形態では、試料中に検出され得る微生物は、病原性細菌又は真菌／酵母などの病原性微生物である。細菌は、対象、好ましくはヒト対象において感染又は疾患を引き起こすことができる任意の細菌であり得る。一実施形態では、細菌は、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、例えば、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）及び黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（及び好ましくはメチシリン耐性株）、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、特に結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）種、特にコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）及び／又は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）などのうちのいずれか１つ又は複数を含むか、それらから本質的になるか、又はそれからなる。細菌は、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種、特に、特定の実施形態ではクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなることができる。クロストリジウム・ディフィシルは、抗生物質関連の下痢及び大腸炎の主要な原因であり、主に他の基礎疾患を有する高齢患者に影響を及ぼす医療に関連した腸管感染症である。カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）種、例えば、カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・パラプシローシス（Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）及びカンジダ・グラブラタ（Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ）が検出され得る。クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、例えば、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）が検出され得る。真菌血症、例えば、カンジダ性敗血症は、本発明を用いて検出（存在又は不存在）され得る。微生物は、好ましくは、その酵素活性によって示される（これは必須ではないが）。したがって、本方法は、試料中の生存可能な微生物の指標、又は最近そうであったことを提供する。ある期間後に、微生物が生存できなければ、酵素活性は試料から失われる。これは、試料中の微生物の指標として酵素活性を用いることが、核酸分子、特に長く存続する可能性のあるＤＮＡの使用よりも有利であることを表す。
【０１６５】
本発明の方法は、ひとたび微生物の陽性存在が試料中に検出されると、感染の性質を同定することを伴うことができる。このさらなる同定ステップには、任意の適切な方法を採用することができる。
【０１６６】
磁性粒子は、超常磁性粒子であり得る。
【０１６７】
粒子（例えば、磁性粒子）は、非微生物細胞よりも微生物に対してより高い親和性を有し得る。磁性粒子は、非特異的結合によって微生物に結合し得る。
【０１６８】
粒子（例えば、磁性粒子）は、ポリスチレン及び／又はポリ（スチレン／ジビニルベンゼン）を含む外側ポリマー表面を有し得る。
【０１６９】
磁性粒子は、酸化鉄を含み得る。好ましくは、酸化鉄は、外側ポリマー表面によってカプセル化される。粒子は、酸化鉄及びポリマーのアマルガムであり得る。粒子は、外側ポリマー表面によって部分的にカプセル化され得る。ポリマーは、ポリスチレンを含み得る。
【０１７０】
粒子（例えば、磁性粒子）は、０．０５〜１μｍ、０．１〜０．５μｍ、０．２〜０．３μｍの直径を有し得る。好ましくは、磁性粒子は、０．２〜０．３μｍの直径を有し得る。粒子（例えば、磁性粒子）は、０．１〜３μｍ、又は０．１〜２μｍの直径を有し得る。より好ましくは、粒子は、０．１〜１．０μｍの直径を有する。
【０１７１】
粒子（例えば、磁性粒子）は、外側ポリマー表面を有し得る。磁性粒子の外側ポリマー表面は、（ｉ）抗体、（ｉｉ）炭水化物、（ｉｉｉ）アポリポタンパク質Ｈタンパク質由来のペプチド、（ｉｖ）マンノース結合レクチンタンパク質、（ｖ）ポリアミン、又は（ｖｉ）カチオン性界面活性剤のいずれでも被覆されない場合がある。
【０１７２】
マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）タンパク質は、ＭＢＬに基づく遺伝子操作タンパク質であり得る。例えば、それは、免疫グロブリンのＦｃ領域に融合されたＭＢＬの病原体結合部分（すなわち、ＦｃＭＢＬ）を含む遺伝子操作されたタンパク質であり得る。
【０１７３】
粒子（例えば、磁性粒子）の外面（例えば、外側ポリマー表面）は、（ｉ）抗体、（ｉｉ）炭水化物、又は（ｉｉｉ）先天性免疫系タンパク質のいずれでも被覆されない場合がある。
【０１７４】
粒子（例えば、磁性粒子）の外面（例えば、外側ポリマー表面）は、（ｉ）抗体、（ｉｉ）炭水化物、（ｉｉｉ）アポリポタンパク質Ｈタンパク質由来のペプチド、（ｉｖ）マンノース結合レクチン、又は（ｖ）凝集剤（例えば、国際公開第０３／１０２１８４号に定義される凝集剤）のいずれでも被覆されない場合がある。
【０１７５】
粒子（例えば、磁性粒子）の外面（例えば、外側ポリマー表面）は、（ｉ）抗体、（ｉｉ）炭水化物、（ｉｉｉ）先天性免疫系タンパク質、又は（ｉｖ）凝集剤（例えば、国際公開第０３／１０２１８４号に定義される凝集剤）のいずれでも被覆されない場合がある。
【０１７６】
抗体は、抗原特異的結合機能を保持する抗体の断片又は誘導体であり得る。このような断片及び誘導体には、Ｆａｂ断片、ＳｃＦｖ、単一ドメイン抗体、ナノ抗体、重鎖抗体などが含まれる。
【０１７７】
炭水化物は、単糖、オリゴ糖（例えば、二糖又は三糖）、多糖及び／又はその誘導体であり得る。
【０１７８】
粒子（例えば、磁性粒子）の外面（例えば、外側ポリマー表面）は、リガンドで被覆されない場合がある。粒子（例えば、磁性粒子）の外面（例えば、外側ポリマー表面）は、非特異的リガンド（例えば、国際公開第０１／５３５２５号に記載される非特異的リガンド）で被覆されない場合がある。粒子（例えば、磁性粒子）の外面（例えば、外側ポリマー表面）は、非タンパク質性リガンド（例えば、国際公開第０１／５３５２５号に記載される非タンパク質性リガンド）で被覆されない場合がある。
【０１７９】
粒子（例えば、磁性粒子）の外面（例えば、外側ポリマー表面）は、カルボキシル化され得る。粒子（例えば、磁性粒子）の外面（例えば、外側ポリマー表面）は、カルボキシル基のみで被覆され得る。
【０１８０】
粒子（例えば、磁性粒子）の外面（例えば、外側ポリマー表面）は、ストレプトアビジンで被覆され得る。粒子（例えば、磁性粒子）の外面（例えば、外側ポリマー表面）は、ストレプトアビジンで被覆され得、リガンドで被覆されない場合がある。粒子（例えば、磁性粒子）の外面（例えば、外側ポリマー表面）は、ストレプトアビジンのみで被覆され得る。
【０１８１】
粒子（例えば、磁性粒子）の外面（例えば、外側ポリマー表面）は、被覆されない場合がある。
【０１８２】
微生物は、病原性微生物であり得、任意選択で、病原性微生物が、病原性細菌又は真菌である。
【０１８３】
非微生物細胞は、赤血球及び／又は白血球を含み得る。
【０１８４】
本発明はさらに組成物を提供する。本明細書に提供される組成物は、本明細書に記載される方法のいずれかを行うためのものであり得る。本発明の方法に関して記載された全ての態様及び実施形態は、関連する組成物に準用される。
【０１８５】
組成物は、ｉ）微生物と複合体を形成することができる粒子であって、外面を有する粒子；ｉｉ）ポリアネトールスルホン酸ナトリウム；及びｉｉｉ）試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解する少なくとも１つの試薬を含み得る。
【０１８６】
組成物は、ｉ）微生物と複合体を形成することができる粒子であって、外面を有する粒子；ｉｉ）ポリアネトールスルホン酸ナトリウム；及びｉｉｉ）界面活性剤を含み得る。界面活性剤は、試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解する試薬の例である。
【０１８７】
組成物はさらに、微生物細胞及び／又は非微生物細胞を含み得る。組成物は、微生物細胞を含有することが疑われ、非微生物細胞を含有することが公知である試料を含み得る。
【０１８８】
組成物は、緩衝液及び／又は塩化ナトリウムをさらに含むことができる。
【０１８９】
組成物において、試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解する試薬は、界面活性剤であり得、任意選択で、界面活性剤が非イオン性である。組成物において、界面活性剤は、微生物と複合体を形成することができる粒子にコンジュゲートされない場合がある。したがって、典型的には、界面活性剤は、粒子が添加される溶液の一部を形成し、粒子自体の一部を形成しない。
【０１９０】
組成物において、粒子は、０．１〜３μｍ、又は０．１〜２μｍの直径を有することができる。好ましくは、粒子は、０．１〜１．０μｍの直径を有する。
【０１９１】
組成物において、粒子は磁性であり得る（典型的には磁性である）。本方法において、粒子は超常磁性であり得る。粒子は酸化鉄を含み得る。酸化鉄は、磁鉄鉱及び／又は磁赤鉄鉱を含み得る。酸化鉄は、Ｆｅ２＋及びＦｅ３＋の１：１、２：１、３：１又は４：１の比率を含まない場合がある。
【０１９２】
組成物において、微生物と複合体を形成することができる粒子の外面は、ポリマーを含み得る；任意選択で、ポリマーは、炭素ベースであり得る。ポリマーは、無機ポリマーを含まない場合がある。ポリマーは、ポリスチレン及び／又はポリ（スチレン／ジビニルベンゼン）を含み得る。
【０１９３】
組成物において、微生物と複合体を形成することができる粒子の外面は、ｉ）カルボン酸基；ｉｉ）アミノ基；ｉｉｉ）疎水性基；及びｉｖ）ストレプトアビジンのうちのいずれか１つ又は複数を含むか又は被覆され得る；任意選択で、カルボン酸基；ｉｉ）アミノ基；ｉｉｉ）疎水性基は、ポリペプチドの一部であり得る。
【０１９４】
組成物において、微生物は、病原性微生物であり得る。例えば、病原性微生物は、病原性細菌又は真菌であり得る。
【０１９５】
組成物において、非微生物細胞は、赤血球及び／又は白血球を含み得る。
【０１９６】
組成物において、試料は、血液、尿、唾液又はミルクを含み得、任意選択で、試料が全血である。
【０１９７】
本発明は、さらに、本明細書に記載される方法のいずれかを行うためのキットを提供する。本発明の方法に関して記載された全ての態様及び実施形態は、関連するキットに準用される。
【０１９８】
キットは、ｉ）微生物と複合体を形成することができる粒子であって、外面を有する粒子；ｉｉ）ポリアネトールスルホン酸ナトリウム；及びｉｉｉ）試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解する少なくとも１つの試薬を含み得る。
【０１９９】
キットは、ｉ）微生物と複合体を形成することができる粒子であって、外面を有する粒子；ｉｉ）ポリアネトールスルホン酸ナトリウム；及びｉｉｉ）界面活性剤を有し得る。界面活性剤は、試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解する試薬の例である。
【０２００】
界面活性剤は非イオン性であり得る。界面活性剤は、微生物と複合体を形成することができる粒子にコンジュゲートされない場合がある。したがって、典型的には、界面活性剤は、粒子が添加される溶液の一部を形成し、粒子自体の一部を形成しない。
【０２０１】
キットにおいて、粒子は、０．１〜３μｍ、又は０．１〜２μｍの直径を有することができる。好ましくは、粒子は、０．１〜１．０μｍの直径を有する。
【０２０２】
キットにおいて、粒子は磁性であり得る（典型的には磁性である）。粒子は超常磁性であり得る。粒子は酸化鉄を含み得る。酸化鉄は、磁鉄鉱及び／又は磁赤鉄鉱を含み得る。酸化鉄は、Ｆｅ２＋及びＦｅ３＋の１：１、２：１、３：１又は４：１の比率を含まない場合がある。
【０２０３】
粒子の外面は、ポリマーを含み得る；任意選択で、ポリマーは、炭素ベースであり得る。ポリマーは、無機ポリマーを含まない場合がある。ポリマーは、ポリスチレン及び／又はポリ（スチレン／ジビニルベンゼン）を含み得る。
【０２０４】
本方法において、微生物と複合体を形成することができる粒子の外面は、ｉ）カルボン酸基；ｉｉ）アミノ基；ｉｉｉ）疎水性基；及びｉｖ）ストレプトアビジンのうちのいずれか１つ又は複数を含むか又は被覆され得る；任意選択で、カルボン酸基；ｉｉ）アミノ基；ｉｉｉ）疎水性基は、ポリペプチドの一部であり得る。
【０２０５】
キットは、ａ）微生物と複合体を形成することができる粒子；ｂ）ポリアネトールスルホン酸ナトリウム；ｃ）試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解する少なくとも１つの試薬；及びｄ）粒子−微生物複合体中の微生物の不存在又は存在を検出する検出手段であって、検出手段が、微生物の核酸修飾活性の基質として作用する核酸分子を含み、核酸分子が、少なくとも部分的に二本鎖であり、相補鎖中にウラシル残基を含む、検出手段を含み得る。
【０２０６】
キットは、ａ）微生物と複合体を形成することができる粒子；ｂ）ポリアネトールスルホン酸ナトリウム；ｃ）界面活性剤；及びｄ）粒子−微生物複合体中の微生物の不存在又は存在を検出する検出手段であって、検出手段が、微生物の核酸修飾活性の基質として作用する核酸分子を含み、核酸分子が、少なくとも部分的に二本鎖であり、相補鎖中にウラシル残基を含む、検出手段を含み得る。
【０２０７】
キットは、ａ）微生物と複合体を形成することができる粒子であって、（ｉ）抗体、（ｉｉ）炭水化物、（ｉｉｉ）アポリポタンパク質Ｈタンパク質由来のペプチド、（ｉｖ）マンノース結合レクチンタンパク質のいずれでも被覆されていない外面を有する粒子；及びｂ）粒子−微生物複合体中の微生物の不存在又は存在を検出する検出手段であって、検出手段が、微生物の核酸修飾活性の基質として作用する核酸分子を含み、核酸分子が、少なくとも部分的に二本鎖であり、相補鎖中にウラシル残基を含む、検出手段を含み得る。
【０２０８】
キットは、試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解する試薬をさらに含み得る。
【０２０９】
キットは、緩衝液及び／又は塩化ナトリウムをさらに含むことができる。
【０２１０】
キットにおいて、試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解する試薬は、界面活性剤であり得、任意選択で、界面活性剤は非イオン性であり得る。組成物において、界面活性剤は、微生物と複合体を形成することができる粒子にコンジュゲートされない場合がある。
【０２１１】
キットにおいて、粒子は、０．１〜３μｍ、０．１〜２μｍの直径を有することができる。好ましくは、粒子は、０．１〜１．０μｍの直径を有する。
【０２１２】
キットにおいて、粒子は磁性であり得る。本方法において、粒子は、超常磁性であり得る。
【０２１３】
キットにおいて、微生物との複合体を形成することができる粒子の外面は、ポリマーを含み得、任意選択で、ポリマーは炭素ベースであり得る。
【０２１４】
キットにおいて、微生物と複合体を形成することができる粒子の外面は、ｉ）カルボン酸基；ｉｉ）アミノ基；ｉｉｉ）疎水性基；及びｉｖ）ストレプトアビジンのうちのいずれか１つ又は複数を含むか又は被覆され得る；任意選択で、カルボン酸基；ｉｉ）アミノ基；ｉｉｉ）疎水性基は、ポリペプチドの一部であり得る。
【０２１５】
キットにおいて、微生物は、病原性微生物であり得、任意選択で、病原性微生物が、病原性細菌又は真菌であり得る。
【０２１６】
キットにおいて、非微生物細胞は、赤血球及び／又は白血球を含み得る。
【０２１７】
キットにおいて、試料は、血液、尿、唾液又はミルクを含み得、任意選択で、試料が全血である。
【０２１８】
キットは、（ａ）微生物と複合体を形成することができる粒子（例えば、磁性粒子）；及び（ｂ）粒子−微生物複合体中の微生物の不存在又は存在を検出する検出手段を含み得る。
【０２１９】
任意の適切な検出手段を採用することができ、それらは、粒子−微生物複合体中の微生物の不存在又は存在を検出するために必要な試薬の完全なセットを表すことができる。
【０２２０】
特定の実施形態では、検出手段は、微生物の核酸修飾活性の基質として作用する核酸分子を含むか又は該核酸分子である。
【０２２１】
一部の実施形態では、検出手段は、核酸増幅のための試薬を含むか又はさらに含む。核酸増幅のための試薬は、プライマー対及び／又は少なくとも１つのプローブを含み得る。一部の実施形態では、それらのプライマー及び／又はプローブは、微生物核酸分子とハイブリダイズする。したがって、それらは、増幅された微生物核酸分子を検出することによって、試料中の微生物を検出することができる。或いは、プライマー又はプローブは、微生物の核酸修飾活性の基質として作用する核酸分子にハイブリダイズする。このような核酸分子は、本明細書にさらに詳細に記載される。
【０２２２】
キットは、（ａ）微生物と複合体を（選択的に）形成することができる粒子（例えば、磁性粒子）（すなわち、粒子−微生物複合体）；及び（ｂ）粒子−微生物複合体中の微生物の不存在又は存在を検出する検出手段を含み得る。検出手段は、微生物の核酸修飾活性の基質として作用する核酸分子を含み得る。核酸分子は、少なくとも部分的に二本鎖であり得、任意選択で、相補鎖中にウラシル残基を含み得る。相補鎖は、その３’末端に、ＤＮＡポリメラーゼが媒介する第２鎖の伸長を遮断する塩基（例えば、ジデオキシシチジン）を含み得る。核酸分子は、本明細書に記載される核酸分子のいずれかであり得る。
【０２２３】
キットにおいて、粒子（例えば、磁性粒子）は、（ｉ）抗体、（ｉｉ）炭水化物、（ｉｉｉ）アポリポタンパク質Ｈタンパク質由来のペプチド、（ｉｖ）マンノース結合レクチンタンパク質、（ｖ）ポリアミン又は（ｖｉ）カチオン性界面活性剤のいずれによっても被覆されていない外面（例えば、外側ポリマー表面）を有し得る。
【０２２４】
キットにおいて、粒子（例えば、磁性粒子）は、（ｉ）抗体、（ｉｉ）炭水化物、又は（ｉｉｉ）先天性免疫系タンパク質のいずれによっても被覆されていない外面（例えば、外側ポリマー表面）を有し得る。
【０２２５】
キットにおいて、粒子（例えば、磁性粒子）は、（ｉ）抗体、（ｉｉ）炭水化物、（ｉｉｉ）アポリポタンパク質Ｈタンパク質由来のペプチド、（ｉｖ）マンノース結合レクチン、又は（ｖ）凝集剤（例えば、国際公開第０３／１０２１８４号に定義される凝集剤）のいずれでも被覆されていない外面（例えば、外側ポリマー表面）を有し得る。
【０２２６】
キットにおいて、粒子（例えば、磁性粒子）は、（ｉ）抗体、（ｉｉ）炭水化物、（ｉｉｉ）先天性免疫系タンパク質、又は（ｉｖ）凝集剤（例えば、国際公開第０３／１０２１８４号に定義される凝集剤）のいずれによっても被覆されていない外面（例えば、外側ポリマー表面）を有し得る。
【０２２７】
キットにおいて、粒子（例えば、磁性粒子）は、リガンドで被覆されていない外面（例えば、外側ポリマー表面）を有し得る。
【０２２８】
キットにおいて、粒子（例えば、磁性粒子）は、ストレプトアビジンで被覆され、リガンドで被覆されていない外面（例えば、外側ポリマー表面）を有し得る。
【０２２９】
キットにおいて、粒子（例えば、磁性粒子）は、ストレプトアビジンのみで被覆された外面（例えば、外側ポリマー表面）を有し得る。
【０２３０】
キットにおいて、粒子（例えば、磁性粒子）は、カルボキシル基のみで被覆された外面（例えば、外側ポリマー表面）を有し得る。
【０２３１】
キットにおいて、粒子（例えば、磁性粒子）は、微生物に結合することができる任意の分子又は部分で被覆されていない外面（例えば、外側ポリマー表面）を有し得る。
【０２３２】
本方法において、粒子（例えば、磁性粒子）は、任意の分子又は部分で被覆されていない外面（例えば、外側ポリマー表面）を有し得る。
【０２３３】
（基質）核酸分子は、核酸修飾酵素がＤＮＡポリメラーゼ又はＲＮＡポリメラーゼを含むことに基づいて設計することができる。一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＩである。追加の又は代替の実施形態では、核酸修飾酵素は、リガーゼ、例えば、ＡＴＰ又はＮＡＤ依存性リガーゼを含む。
【０２３４】
検出手段は、核酸増幅のための試薬をさらに含み得、任意選択で、核酸増幅のための試薬が、核酸分子とハイブリダイズするプライマー対及び／又は少なくとも１つのプローブを含む。
【０２３５】
キットは、粒子−微生物複合体中の微生物を溶解することができる試薬をさらに含み得、任意選択で、粒子−微生物複合体中の微生物を溶解することができる試薬が、微生物の核酸修飾活性の基質として作用する核酸分子を含む。
【０２３６】
キットは、試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解する試薬をさらに含み得る。
【０２３７】
試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解する試薬は、界面活性剤及び１つ又は複数の酵素の組み合わせを含み得、１つ又は複数の酵素が、任意選択で、プロテイナーゼ及び／又はＤＮＡａｓｅを含む。適切な界面活性剤及び酵素は、本明細書において検討される。
【０２３８】
キットは、高ｐＨ試薬、例えば、塩基又は緩衝液をさらに含み得る。これは、例えば、ＮａＯＨ、例えば、５ｍＭ  ＮａＯＨであり得る。他の適切な試薬は、本明細書に記載される。
【０２３９】
キットは、中和緩衝液をさらに含むことができる。中和緩衝液は、高ｐＨ処理後に試料のｐＨを戻すことができる。適切な試薬は本明細書に記載される。
【０２４０】
核酸修飾酵素は、（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ若しくはＲＮＡポリメラーゼ、任意選択で、ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼＩである；及び／又は（ｂ）リガーゼ、任意選択で、リガーゼがＡＴＰ及び／若しくはＮＡＤ依存性リガーゼである。
【０２４１】
本発明の全ての関連する態様及び実施形態によれば、用語「ポリアネトールスルホン酸ナトリウム」は、その全ての機能的に等価な誘導体及び塩の形態（例えば、ポリアネトールスルホン酸カリウム、ポリアネトールスルホン酸マグネシウムなど）を包含することが意図される。
【０２４２】
開示全体を通じて、用語「粒子」及び「ビーズ」は、互換的に使用することができる。
本発明はまた、以下の条項によって定義することができる。
【０２４３】
１．非微生物細胞を含有する試料中の非微生物細胞から微生物を分離する方法であって、
ａ）試料を磁性粒子とともにインキュベートして、粒子−微生物複合体を形成するステップと；
ｂ）磁場を用いて非微生物細胞から粒子−微生物複合体を分離するステップと
を含み、磁性粒子が、（ｉ）抗体、（ｉｉ）炭水化物、（ｉｉｉ）アポリポタンパク質Ｈタンパク質由来のペプチド、（ｉｖ）マンノース結合レクチンタンパク質、（ｖ）ポリアミン、又は（ｖｉ）カチオン性界面活性剤のいずれでも被覆されていない外側ポリマー表面を有する、方法。
【０２４４】
２．非微生物細胞をも含有し得る試料中の微生物の不存在又は存在を検出する方法であって、
ａ）試料を磁性粒子とともにインキュベートして、粒子−微生物複合体を形成するステップと；
ｂ）磁場を用いて非微生物細胞から粒子−微生物複合体を分離するステップと；
ｃ）粒子−微生物複合体中の微生物の不存在又は存在を検出するステップと
を含み、磁性粒子が、（ｉ）抗体、（ｉｉ）炭水化物、（ｉｉｉ）アポリポタンパク質Ｈタンパク質由来のペプチド、（ｉｖ）マンノース結合レクチンタンパク質、（ｖ）ポリアミン、又は（ｖｉ）カチオン性界面活性剤のいずれでも被覆されていない外側ポリマー表面を有する、方法。
【０２４５】
３．ステップ（ｃ）が、（ｉ）微生物に関連する核酸分子の酵素活性を検出するステップ、（ｉｉ）サイトメトリー又は顕微鏡により微生物を直接検出するステップ、又は（ｉｉｉ）細胞培養後の微生物を検出するステップを含む、条項２に記載の方法。
【０２４６】
４．ステップ（ｃ）が、
ｉ．粒子−微生物複合体中の微生物を溶解するステップと；
ｉｉ．溶解物を、微生物の核酸修飾活性の基質として作用する核酸分子とともにインキュベートするステップと；
ｉｉｉ．微生物の不存在又は存在を示すために、基質核酸分子への核酸修飾酵素の作用に起因する修飾核酸分子の不存在又は存在を特異的に決定するステップと
を含む、条項２又は条項３に記載の方法。
【０２４７】
５．ステップ（ｉ）が、基質核酸分子を含有する溶解試薬を添加するステップを含む、条項４に記載の方法。
【０２４８】
６．核酸修飾酵素が、ＤＮＡポリメラーゼ又はＲＮＡポリメラーゼを含み、任意選択で、ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼＩである、条項４又は条項５に記載の方法。
【０２４９】
７．核酸修飾酵素がリガーゼを含み、任意選択で、核酸修飾酵素がＮＡＤ依存性リガーゼである、条項４〜６のいずれか１つに記載の方法。
【０２５０】
８．対象からの試料に対して条項２〜条項７のいずれか１つに記載の方法を行うステップを含む、対象における微生物感染の不存在又は存在を検出する方法。
【０２５１】
９．分離された粒子−微生物複合体を洗浄して、非微生物細胞又は溶解物を除去することをさらに含む、先行する条項のいずれかに記載の方法。
【０２５２】
１０．ステップ（ａ）の前に、方法が、試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解することを含む、先行する条項のいずれかに記載の方法。
【０２５３】
１１．試料中に存在する無傷のいずれもの微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解するステップが、試料に界面活性剤及び１つ又は複数の酵素の組み合わせを添加するステップを含み、１つ又は複数の酵素が、プロテイナーゼ及び／又はＤＮＡａｓｅを含み、任意選択で、プロテイナーゼがプロテイナーゼＫである、条項１０に記載の方法。
【０２５４】
１２．ステップ（ｂ）が、粒子−微生物複合体から非微生物細胞を除去するステップをさらに含む、先行する条項のいずれかに記載の方法。
【０２５５】
１３．試料が血液を含む、先行する条項のいずれかに記載の方法。
【０２５６】
１４．条項４〜条項１３のいずれか１つに記載の方法を行うためのキットであって、
ａ）微生物と複合体を形成することができる磁性粒子であって、磁性粒子が、（ｉ）抗体、（ｉｉ）炭水化物、（ｉｉｉ）アポリポタンパク質Ｈタンパク質由来のペプチド、（ｉｖ）マンノース結合レクチンタンパク質、（ｖ）ポリアミン、又は（ｖｉ）カチオン性界面活性剤のいずれでも被覆されていない外側ポリマー面を有し；及び
ｂ）粒子−微生物複合体中の微生物の不存在又は存在を検出する検出手段であって、検出手段が、微生物の核酸修飾活性の基質として作用する核酸分子を含み、核酸分子が、少なくとも部分的に二本鎖であり、相補鎖にウラシル残基を含む、検出手段
を含むキット。
【０２５７】
１５．検出手段が、核酸増幅のための試薬をさらに含み、任意選択で、核酸増幅のための試薬が、核酸分子とハイブリダイズするプライマー対及び／又は少なくとも１つのプローブを含む、条項１４に記載のキット。
【０２５８】
１６．粒子−微生物複合体中の微生物を溶解することができる試薬をさらに含み、任意選択で、粒子−微生物複合体中の微生物を溶解することができる試薬が、微生物の核酸修飾活性の基質として作用する核酸分子を含む、条項１４又は条項１５に記載のキット。
【０２５９】
１７．試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解する試薬をさらに含む、条項１４〜１６のいずれか１つに記載のキット。
【０２６０】
１８．試料中に存在する無傷の微生物を保持しながら、試料中の非微生物細胞を選択的に溶解する試薬が、界面活性剤及び１つ又は複数の酵素の組み合わせを含み、１つ又は複数の酵素が、任意選択で、プロテイナーゼ及び／又はＤＮＡａｓｅを含む、条項１７に記載のキット。
【０２６１】
１９．ａ）高ｐＨ試薬；及び／又は
ｂ）中和緩衝液
をさらに含む、条項１４〜条項１８のいずれか１つに記載のキット。
【０２６２】
２０．試料が血液を含む、条項１４〜１９のいずれか１つに記載のキット。
【０２６３】
２１．核酸修飾酵素が、
ａ）ＤＮＡポリメラーゼ又はＲＮＡポリメラーゼ、任意選択で、ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼＩである；及び／又は
ｂ）リガーゼ、任意選択で、リガーゼはＡＴＰ及び／又はＮＡＤ依存性リガーゼである
を含む、条項１４〜２０のいずれか１つに記載のキット。
【０２６４】
２２．磁性粒子が超常磁性粒子である、条項１〜１３のいずれか１つに記載の方法、又は条項１４〜２１のいずれか１つに記載のキット。
【０２６５】
２３．外側ポリマー表面がポリスチレンを含む、条項１〜１３若しくは２２のいずれか１つに記載の方法、又は条項１４〜２２のいずれか１つに記載のキット。
【０２６６】
２４．磁性粒子が酸化鉄を含む、条項１〜１３又は条項２２若しくは２３のいずれか１つに記載の方法、或いは条項１４〜２３のいずれか１つに記載のキット。
【０２６７】
２５．磁性粒子が０．１〜０．５μｍの直径を有する、条項１〜１３若しくは条項２２〜２４のいずれか１つに記載の方法、又は条項１４〜２４のいずれか１つに記載のキット。
【０２６８】
２６．磁性粒子の外側ポリマー表面がストレプトアビジンで被覆されている、条項１〜１３若しくは条項２２〜２５のいずれか１つに記載の方法、又は条項１４〜２５のいずれか１つに記載のキット。
【０２６９】
２７．磁性粒子の外側ポリマー表面がカルボキシル化されている、条項１〜１３若しくは条項２２〜２６のいずれか１つに記載の方法、又は条項１４〜２６のいずれか１つに記載のキット。
【０２７０】
２８．磁性粒子の外側ポリマー表面がストレプトアビジンで被覆され、リガンドで被覆されていない、条項２６に記載の方法又はキット。
【０２７１】
２９．磁性粒子の外側ポリマー表面がリガンドで被覆されていない、条項１〜１３若しくは条項２２〜２７のいずれか１つに記載の方法、又は条項１４〜２７のいずれか１つに記載のキット。
【０２７２】
３０．微生物が病原性微生物であり、任意選択で、病原性微生物が病原性細菌又は真菌である、条項１〜１３若しくは条項２２〜２９のいずれか１つに記載の方法、又は条項１４〜２９のいずれか１つに記載のキット。
【０２７３】
３１．非微生物細胞が赤血球及び／又は白血球を含む、条項１〜１３若しくは条項２２〜３０のいずれか１つに記載の方法、又は条項１４〜３０のいずれか１つに記載のキット。
【図面の簡単な説明】
【０２７４】
【図１】血液試料の画像であり、各試料セット：Ｅ−ＢＵＦ、ＵＲＥＡ、Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌ、凍結（左から右）についての血液溶解の程度を示す図である（実施例８を参照されたい）。
【図２】ＰＣＲ設定前の最終試料生産の画像である。この画像は、血液中の磁性ビーズを用いた試料処理のためのＳＰＳの利点を視覚的に実証するものである。ＳＰＳは、ＳＰＳの存在下で赤色溶出物が少ないことにより示されるように、血液成分のより徹底した除去を可能にするようである。血液ブロス試料セットに使用されるＢａｃＴｅｃ  ＰＬＵＳ好気性ブロスはまたＳＰＳを含有することに留意されたい（実施例９を参照されたい）。
【実施例】
【０２７５】
本発明は、以下の非限定的な実施例に関して理解される。
［実験の部］
略語及び定義：
５ｔｈ％        ５％ＦＰＲを決定するための５番目のパーセンタイル閾値計算
（式＝ＰＥＲＣＥＮＴＩＬＥ．ＩＮＣ（アレイ，０．０５））
ＢＯ            ブロスのみ
ＢＢ            血液ブロス
Ｃｆｕ          コロニー形成単位
Ｃｏｎｆｉｒｍ  グラム状態（グラム陰性、グラム陽性又はカンジダ）に応じて微生物ＤＮＡを標的とするＰＣＲ多重アッセイ
ＣＰＤ          クエン酸リン酸デキストロース
Ｃｔ            サイクル閾値
ＣＶ            臨界値（ｃｆｕ）：式：試料ｃｆｕ÷２ΔＣｔを用いるｃｆｕ値及びΔＣｔに基づく理論検出限界
Ｄ１．．        希釈点（１０倍系列）
Ｅ＊ｃｆｕ      希釈系列中で最高計数可能なＴＶＣを有する希釈点を用いて外挿したｃｆｕ値
ＥＣ            大腸菌
ＥＴＧＡ        酵素鋳型の生成及び増幅
ＩＰＣ          内部プロセス対照：ＥＴＧＡ陰性試料の正しい試料処理を実証し、ＰＣＲ増幅を検証するためにＬＭに存在するＰＣＲ鋳型
ＬＡＷＮ        コンフルエントな微生物増殖
ＬＭ            界面活性剤と微生物溶解酵素の混合物を含む微生物溶解混合物
ＭＭ            マスターミックス
ＮｏＣｔ        ５０サイクル後、閾値蛍光を超える増幅なし
ＮＳＣ          スパイク対照なし
Ｏ／ｎ          一晩
ＰＣ            ポリメラーゼスパイク対照
ＰＣＲ          ポリメラーゼ連鎖反応
Ｐｔ            ＮＳＣ／ＮＣ結果から計算された陽性閾値
ｑＰＣＲ        定量的ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＴ            室温（＋１９〜＋２０℃）
ｓ／ｎ          上清
ＳＰＳ          ポリアネトールスルホン酸ナトリウム
ＴＮＴＣ        多すぎて計数することができない
ＴＶＣ          生菌数合計
ＷＢ            洗浄緩衝液（特に断らない限り、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ＋塩化ナトリウム＋Ｉｇｅｐａｌ＋デオキシコール酸ナトリウム＋テルギトールを含有する）；又は記載のある場合は全血
ΔＣｔ          ２つのＣｔ値（典型的にはＮＳＣ  Ｃｔ−陽性試料Ｃｔ）間の差
【０２７６】
実施例１
手動フォーマットでは、２つのビーズタイプ（Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏ−Ｅｓｔａｐｏｒ（ストレプトアビジンコンジュゲートした）３００ｎｍビーズ（製品−ＢＥ−Ｍ０８／０３；「Ｂｉｏ−Ｅｓｔａｐｏｒ」）及びＡｄｅｍｔｅｃｈ  Ｂｉｏ−Ａｄｅｍｂｅａｄｓストレプトアビジン＋２００ｎｍビーズ（製品番号０３２２２；「Ｂｉｏ−Ａｄｅｍｔｅｃｈ」））を、ＡｐｏＨ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｐｅｐｓ６ビーズ（参照−ＭＰ２０００６；「ＡｐｏＨ  Ｐｅｐｓ６」）と比較した。
【０２７７】
実験１Ａでは、Ｂｉｏ−Ｅｓｔａｐｏｒビーズ（２５μＬ）のアリコート及びＡｐｏＨ  Ｐｅｐ６ビーズ（１０μＬ）のアリコートを結合について比較した。Ｂｉｏ−Ｅｓｔａｐｏｒの体積がより大きいことは、ＡｐｏＨ材料と比較して、提供された材料中の１ｍＬあたりのビーズ数がより少ないことを反映する。３種類の微生物：大腸菌（グラム陰性菌）、表皮ブドウ球菌（グラム陽性菌）、カンジダ・アルビカンス（酵母）を試験した。０．５ｍＬの生物懸濁液を、ＡｐｏＨ  Ｐｅｐｓ６キット（「Ｐｅｐｓ６  Ｃａｐｔｏｂａｃ」、参照ＭＰ１００３１−５０Ｔ）に提供された０．５ｍＬの「ＴＴＧＢ」微生物結合緩衝液中でビーズに曝露した。
【０２７８】
生物を３０分間結合させた後、ビーズを濃縮するために磁場を適用し、上清をピペットで除去することにより、液体上清からビーズの試料を分離した。ビーズを３アリコートの洗浄緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、１％ｖ／ｖ  Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２５％ｖ／ｖ  Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  １５−Ｓ−９）で穏やかに洗浄し、保持された上清及び洗浄されたビーズを、２つの方法：寒天ペトリ皿上のコロニー数、並びに酵素的鋳型生成及び増幅（ＥＴＧＡ）試験（Ｚｗｅｉｔｚｉｇら、２０１２年．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｓｓａｙ  ｅｎａｂｌｉｎｇ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉａｂｌｅ  ｍｉｃｒｏｂｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４０巻、１４号、ｅ１０９、１〜１２頁；並びに国際公開第２０１１／１３０５８４号、国際公開第２０１３／１０３７４４号及び国際公開第２０１６／００５７６８号に記載される）による微生物ＤＮＡの検出により、生存生物について分析した。
【０２７９】
表１Ａのプレートカウントは、Ｂｉｏ−Ｅｓｔａｐｏｒビーズ及び大腸菌では、増殖の大部分がビーズ（３３ＣＦＵ）対上清（２ＣＦＵ）から見出され、これはＡｐｏＨ  Ｐｅｐｓ６からの結果と類似していることを示す。表皮ブドウ球菌では増殖は見られず、この生物は、元のブロスでは増殖しないようであった。カンジダ・アルビカンスは、Ｂｉｏ−Ｅｓｔａｐｏｒ及びＡｐｏＨ  Ｐｅｐｓ６のいずれにおいても、上清中のＣＦＵの約１０％及び９０％結合を示した。これらの結果は、Ｂｉｏ−Ｅｓｔａｐｏｒビーズが、試験条件下で市販されている生物結合ビーズＰｅｐｓ６と同等の速度で生物と結合するようであることを示している。高感度のＥＴＧＡ試験は、この結果を支持するが、より低いＣｑ値によって示されるように、表皮ブドウ球菌は、Ｐｅｐｓ６よりもＢｉｏ−Ｅｓｔａｐｏｒに結合する可能性があることを示している。
【表１】
2021519591.tif 000002
2021519591.tif 000003
【０２８０】
実験１Ｂは、実験１Ａと同様の条件下での大腸菌の結合を実証するが、１Ｂでは洗浄ステップは省略された。実験１Ｂは、別のビーズ、Ｂｉｏ−Ａｄｅｍｔｅｃｈも、より低いレベルではあるが、生物と結合することを示す（表１Ｂを参照されたい）。ここで、プレート数は、生菌数の約３分の１がビーズに結合したことを示している。より高感度のＥＴＧＡ  ＤＮＡポリメラーゼアッセイは、ビーズに対するＣｑ及び上清がほぼ等しいため、生物の半分がビーズ上に残存することを示している。
【表２】
2021519591.tif 000004
【０２８１】
実施例２
実験２では、カルボキシル化表面を有するＡｐｏＨ  Ｐｅｐｓ６、Ｂｉｏ−Ｅｓｔａｐｏｒ及びＥｓｔａｐｏｒビーズ（製品ＭＩ−０３０／４０；「Ｅｓｔａｐｏｒ  ＣＯＯＨ」）を比較した。蛍光ＡＴＰアッセイ（ＢａｃＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ；Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｇ８２３０）を用いて、大腸菌をビーズに３０分間結合させた後、上清中に残存する生物数を測定した。これは、ビーズ上の生物の存在を直接検出しないという点で間接的な試験であるが、本発明のリガンドベースのビーズ（ＡｐｏＨ  Ｐｅｐｓ６）及び非リガンドビーズ（Ｂｉｏ−Ｅｓｔａｐｏｒ及びＥｓｔａｐｏｒ  ＣＯＯＨ）についての有用な比較試験である。１ｍＬの１０４ＣＦＵ／ｍＬの大腸菌をリン酸緩衝生理食塩水から３０ｍＬ結合させた後、ＢａｃＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイを用いて、生物含量の測定として、上清のアリコートをＡＴＰについてアッセイした。表２の結果は、Ｐｅｐｓ６ビーズ、Ｂｉｏ−Ｅｓｔａｐｏｒ及びＥｓｔａｐｏｒ  ＣＯＯＨの上清中の生物レベルの減少が、この技術を用いて測定した場合、それぞれ３３％、２７％及び２４％であったことを示す。
【表３】
2021519591.tif 000005
【０２８２】
実施例３
実施例３は、実施例１に記載した磁気分離方法を自動化して実施した希釈系列における大腸菌（ＥＣ）、黄色ブドウ球菌（ＳＡ）及びカンジダ・アルビカンス（ＣＡ）の試験結果を示す。アッセイには、０．２５％Ｔｅｒｇｉｔｏｌを含有するＴＴＧＢの結合緩衝液を有する捕捉媒体として、Ｂｉｏ−Ｅｓｔａｐｏｒ  ３００ｎｍ直径ビーズを使用した。３つの各生物の１０倍希釈を行ったため、Ｃｔの連続的変化を記録し、用量反応曲線を作成した。
【表４】
2021519591.tif 000006
【０２８３】
以下の実施例は、ＭｏｍｅｎｔｕｍのＭａｇｎｉｔｏｒ試験における磁性ビーズによる微生物の普遍的な微生物捕捉を実証する。Ｍａｇｎｉｔｏｒ試験は、２つの微生物検出の読み出しからなる。
ＥＴＧＡ：無傷の微生物細胞からの微生物ポリメラーゼの検出
Ｃｏｎｆｉｒｍ：グラム状態（グラム陰性、グラム陽性、又はカンジダ）による微生物ＤＮＡの検出
【０２８４】
主な所見：
磁性ビーズは、単純な緩衝液及び種々の複雑な生物学的な標本タイプから細菌及び真菌を捕捉する
微生物捕捉は、種々の異なるビーズサイズ（直径０．２〜１．５μｍのビーズ）及び表面被覆（例えば、カルボキシル化、疎水性、アミノ化など）を用いて行う
【０２８５】
特定の結合緩衝液成分は、Ｍａｇｎｉｔｏｒアッセイにおける微生物検出、例えば、血液の界面活性剤ベースの溶解を改善することができる。
【０２８６】
実施例４：微生物の検出は磁性ビーズによる捕捉に依存する。
目的：
大腸菌、黄色ブドウ球菌及びカンジダ・アルビカンスについて、単純なＴｒｉｓ＋ＮａＣｌ緩衝液（水中でのみ起こり得る微生物浸透圧ショックを防ぐために、ｐＨを生理的塩濃度で緩衝化した）中で微生物結合性能を評価した。検出が微生物捕捉のための磁性ビーズの存在に依存することを実証するために、「ビーズなし対照」試料セットもこの実験に含まれた。
磁性ビーズの調製：
【０２８７】
Ｅｓｔａｐｏｒビーズ（Ｍｅｒｃｋ、カタログ番号Ｍ１−３０／４０）を、１×Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌ緩衝液の３×１ｍＬで洗浄した：４０μＬビーズを、最終体積の４００μＬの１×Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌ緩衝液（１％固形分）中に再懸濁した。
【０２８８】
プロトコール：
ＢａｃＴｅｃ  ＰＬＵＳ好気性ブロス（寒天プレートから３ｍＬブロスを接種）では、微生物の一晩液体培養物（ｏ／ｎ）を標準として設定した。翌日（約１６時間後）に、１．８８μＬの大腸菌及び黄色ブドウ球菌の液体培養物を３ｍＬのブロスに添加し、１８．７５μＬのカンジダ・アルビカンスの液体培養物を３ｍＬのブロスに添加し、２時間の成長を３７℃、５００ｒｐｍで行った。
２時間の成長後、微生物の前培養物を１×Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中で希釈（ＤＦ１０）し、微生物あたり４つの希釈点を作製した。
各微生物希釈に対して１００μＬのＴＶＣを行った
【０２８９】
ＤｙｎａＭａｇ−２磁石及び手動液体移送を使用して行ったＭａｇｎｉｔｏｒの手動シミュレーション：
１５μＬの予備洗浄済みビーズを含有する２ｍＬチューブに１ｍＬの試料を添加した−注記、全ての微生物試料を同じ１×緩衝液で希釈したため、ビーズを入れたチューブに１１２μＬの１×Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌ緩衝液に添加しなかった（標準プロトコールに従う）。
３７℃で３０分間、振とうした（１０００ｒｐｍ）
ＤｙｎａＭａｇ−２上で５分間、磁化した
全てのｓ／ｎを除去した
１ｍＬ洗浄緩衝液（ＷＢ）を添加し、ＲＴで２分間、チューブを混合した（１０００ｒｐｍ）
Ｄｙｎｍａｇ−２上で３分間、磁化した
全てのｓ／ｎを除去した
５０μＬ溶解ミックス（ＬＭ）をチューブに添加し、磁石を取り出した（５μＬのポリメラーゼ対照（ＰＣ）を各ＰＣ試料チューブに添加した）
ＥＴＧＡ反応：２６℃にて１０００ｒｐｍで５分間、次に８００ｒｐｍで５５分間行った
ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍのために手動ｑＰＣＲを設定した（１０μＬ反応）
【０２９０】
結果：
【表５】
2021519591.tif 000007
【表６】
2021519591.tif 000008
【表７】
2021519591.tif 000009
【表８】
2021519591.tif 000010
【表９】
2021519591.tif 000011
【表１０】
2021519591.tif 000012
【０２９１】
分析：
「（＋）ＢＥＡＤＳ」試料のＭａｇｎｉｔｏｒ結果は、３つの全ての微生物種について、非常に強い細胞密度特異的なＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍシグナルを示し、広範囲の微生物群（ＧｒＮｅｇ、ＧｒＰｏｓ、カンジダ）のビーズ特異的結合を実証する。
カンジダ結果は、より良好な細胞密度傾向に従うことができたが、液体培養は、連続希釈の質に影響を与えた可能性がある完全に粒子であったことに留意されたい
微生物細胞のいくつかの証拠は「（−）ＢＥＡＤＳ」対照において引き継がれるが、単一の洗浄ステップでのみ期待される。
【０２９２】
実施例５：磁性ビーズによる血液からの微生物捕捉は、単純及び複雑な血液溶解緩衝液中で起こり、遠心分離による捕捉に匹敵する微生物検出を可能にする
目的：
単純で迅速な「Ｒａｐｉｄ  Ｍａｇｎｉｔｏｒ」試験（プロトコールには洗浄ステップが含まれていない）を開発するために、２つの異なる希釈フォーマットの２つの異なる血液溶解緩衝液を比較することである。
【０２９３】
試験条件：
２×ＥＢＢ        １ｍＬの２×ＥＢＢ＋１ｍＬ標本
１０×ＥＢＢ      １１２μＬの１０×ＥＢＢ＋１ｍＬ標本
２×Ｂ−ＢＵＦ    １ｍＬの２×Ｂ−ＢＵＦ＋１ｍＬ標本
１０×Ｂ−ＢＵＦ  １１２μＬの１０×Ｂ−ＢＵＦ＋１ｍＬ標本
１０×ＥＢＢ：５００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］＋２．５％Ｔｅｒｇｉｔｏｌ
１０×Ｂ−ＢＵＦ：５００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ  ８．０］＋１．５Ｍ塩化ナトリウム＋１０％Ｉｇｅｐａｌ＋５％デオキシコール酸ナトリウム＋２．５％Ｔｅｒｇｉｔｏｌ
【０２９４】
試料設定：
大腸菌ｏ／ｎ液体培養１Ｅ−３希釈液を血液ブロス（１ｍＬあたり６．２５μＬのｏ／ｎ：２４４μＬのｏ／ｎ＋３９ｍＬ血液ブロス）にスパイクし、３７℃で５００ｒｐｍの振とうインキュベーターで６０分間の成長を行った
２時間の成長後、１ｍＬの標本を、緩衝液（及びＭａｇビーズ試料セット用に１５μＬのＢｉｏＥｓｔａｐｏｒビーズ（Ｍｅｒｃｋ、カタログ番号ＢＥ−Ｍ  ０８／０．３））を含有する２ｍＬのチューブに添加することによって試料を生成した：試験条件ごとに３重の大腸菌（ＥＣ）及びスパイク対照（ＮＳＣ）試料
１００μＬのＴＶＣをＮＳＣ及び大腸菌について行った（計数可能なプレートを確実にするために標本の希釈を含む）
【０２９５】
プロトコール：
上記のように設定された試料は、すぐにスピン又はＭａｇビーズプロトコールに進行した。
【０２９６】
スピンプロトコール
試料を３分間、９０００×ｇで遠心分離した（チューブヒンジはペレットトレーサビリティのために外側に面する）
上清を除去した
５０μＬのＬＭを試料（ペレットを再懸濁するための約１０×ピペットミックス）に添加した
試料を９００ｒｐｍで５分間、次に、８００ｒｐｍで５５分間（２６℃）の振とうインキュベーターに配置した
試料を１７０００×ｇで１分間遠心分離後、ｑＰＣＲを設定した
【０２９７】
Ｍａｇビーズプロトコール
試料を９００ｒｐｍで３０分間（３７℃）、振とうインキュベーターに配置した
試料をＤｙｎａＭａｇ−２磁気ラック上に５分間配置し、次に上清を除去した
５０μＬのＬＭを試料（ペレットを再懸濁するための約１０×ピペットミックス）に添加した
試料を５分間、９００ｒｐｍの振とうインキュベーターに配置し、次に５５分間（２６℃）、８００ｒｐｍに配置した
試料を３分間、磁化した後、ｑＰＣＲを設定した
ＥＴＧＡマスターミックスのみの手動ｑＰＣＲを設定した（１０μＬ反応）
【０２９８】
結果：
【表１１】
2021519591.tif 000013
【表１２】
2021519591.tif 000014
【０２９９】
分析：
磁性ビーズによる微生物結合は、次のように起こる：
単純及び複雑な血液溶解緩衝液（ＥＢＢ＝Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ＋Ｔｅｒｇｉｔｏｌ；Ｂ−ＢＵＦ＝Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ＋塩化ナトリウム＋Ｉｇｅｐａｌ＋デオキシコール酸ナトリウム＋Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）であるが、血液由来の試験シグナルは、血液溶解緩衝液の成分によって異なる
希釈（２×緩衝液：１部の標本に１部の血液溶解緩衝液）され、及び濃縮（１０×緩衝液：９部の標本に１部の血液溶解緩衝液）された試料フォーマット
さらに、磁性ビーズによる微生物捕捉のための微生物検出シグナルは、遠心分離による捕捉に匹敵する。
【０３００】
実施例６：磁性ビーズによる血液からの微生物捕捉は、血液溶解に依存しないが、下流の微生物検出は、微生物結合が溶解血液中で起こる場合に改善される。
目的：
複数のビーズタイプ／サイズが、微生物の連続希釈及びＮＳＣについて同様のＭａｇｎｉｔｏｒ結果をもたらすという最近の発見を考慮すると、Ｍｏｍｅｎｔｕｍの結合緩衝液内の成分が、観察されたこの普遍的な微生物結合特性を媒介／促進している可能性があると考えられた。この可能性を調査するために、標準結合緩衝液（Ｂ−ＢＵＦ）とＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］＋ＮａＣｌのみからなる界面活性剤を含まないＢ−ＢＵＦを比較して、大腸菌の希釈系列を行い、界面活性剤一般が微生物結合に重要であるかどうかを試験した。試料セットは、血液ブロス、ブロスのみ、及び１×結合緩衝液のみについて調製し、異なる標本タイプについての結果を比較した。
【０３０１】
調製：
新たに調製した１００ｍＬの１０×結合緩衝液：
Ｂ−ＢＵＦ：５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ  ８．０］＋１．５Ｍ塩化ナトリウム＋１０％Ｉｇｅｐａｌ＋５％デオキシコール酸ナトリウム＋２．５％Ｔｅｒｇｉｔｏｌ
Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌ：５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ  ８．０］＋１．５Ｍ塩化ナトリウム
Ｅｓｔａｐｏｒビーズ（Ｍｅｒｃｋ、カタログ番号Ｍ１−３０／４０）を、それぞれの１×緩衝液（希釈された１０×Ｂ−ＢＵＦ又は１０×Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌ）中で３×１ｍＬ洗浄した：４０μＬビーズを４００μＬの１×緩衝液（１％固形分）の最終濃度に再懸濁した。
【０３０２】
プロトコール：
大腸菌ｏ／ｎ液体培養液をＢａｃＴｅｃ  ＰＬＵＳ好気性ブロスにおける標準として設定し、次に、翌日（約１６時間後）、１．８８μＬ  ｏ／ｎを３ｍＬのブロス（６．２５μＬ／ｍＬでブロスに添加されるＥＣ  １Ｅ−１希釈に匹敵する）に添加し、３７℃、５００ｒｐｍで２時間の成長を行った。
２時間の成長後、大腸菌の前培養物は、予め加温された血液−ブロス（ＢＢ）、ブロスのみ（ＢＯ）又は１×緩衝液（Ｂ−ＢＵＦ若しくはＴｒｉｓ＋ＮａＣｌ）のいずれかでＥＣ  １Ｅ−６まで連続希釈（ＤＦ１０）された。
１００μＬのＴＶＣを全ての大腸菌希釈液及びＮＳＣに対して行った
【０３０３】
ＤｙｎａＭａｇ−２磁石及び手動液体移送を使用して行ったＭａｇｎｉｔｏｒの手動シミュレーション：
１１２μＬの結合緩衝液（Ｂ−ＢＵＦ又はＴｒｉｓ＋ＮａＣｌのいずれか：ＢＢ及びＢＯ試料セットについては１０×；及び緩衝液試料セットについては１×）＋１５μＬビーズ（それぞれの緩衝液中で予備洗浄する）を含有する２ｍＬチューブに１ｍＬの試料を添加した
３７℃で３０分間、振とうした（１０００ｒｐｍ）
ＤｙｎａＭａｇ−２上で５分間、磁化した
全てのｓ／ｎを除去した
１ｍＬのＷＢを添加し、チューブをＲＴで２分間、混合した（１０００ｒｐｍ）
Ｄｙｎｍａｇ−２上で５分間、磁化した
全てのｓ／ｎを除去した
チューブに５０μＬのＬＭを添加し、磁石を取り出した（５μＬのポリメラーゼコントロール（ＰＣ）を各ＰＣ試料チューブに添加する）
ＥＴＧＡ反応を行った：２６℃にて１０００ｒｐｍで５分間、次に８００ｒｐｍで５５分間
ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍのために手動ｑＰＣＲを設定した（１０μＬ反応）
【０３０４】
観察：
予想通り、Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌでは血液溶解は観察されなかった
界面活性剤が存在しない場合、ビーズはより粒状／凝結している
【０３０５】
結果：
【表１３】
2021519591.tif 000015
【表１４】
2021519591.tif 000016
【表１５】
2021519591.tif 000017
【表１６】
2021519591.tif 000018
【表１７】
2021519591.tif 000019
【表１８】
2021519591.tif 000020
【０３０６】
分析：
界面活性剤は、血液の存在下で良好なＥＴＧＡ結果を得るために重要であるが（「ＢＢを含む１０×Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌ」についての不良なＥＴＧＡ結果によって示される）、微生物捕捉／検出は、血液溶解が存在しない場合においてなおも明白である（（「ＢＢを含む１０×Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌ」試料セットの結果によって示される）。
血液が存在しない場合の良好なＥＴＧＡ結果は、結合緩衝液の成分としての界面活性剤が、大腸菌のビーズへの結合に必要でないことを示す
「１×Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌを含む１０×Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌ」試料セットにおける良好なＥＴＧＡ結果は、血液及び／又はブロス中の生物学的成分が微生物結合に必要でないことを実証する。
興味深いことに、Ｂ−ＢＵＦは、ＢＯ及び１×のＢ−ＢＵＦ試料セットを用いた１０×Ｂ−ＢＵＦにおいて、ＥＴＧＡシグナルに対してわずかに阻害作用を示すようであるが、最近の他の研究では、デオキシコール酸ナトリウムはこのアッセイに対していくぶん阻害作用を示す可能性があることが示されているため、この観察は予想外ではない
Ｃｏｎｆｉｒｍは「１×Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌを有する１０×Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌ」試料セットにおいて最良に行われる。他の全ての類似した試料セットは、同様のＣｏｎｆｉｒｍ  ＧｒＮｅｇ結果を生じた。
予想され得るように、ＩＰＣシグナルは血液の存在によっていくぶん阻害された。
これらの結果は、界面活性剤及び生物学的試料のいずれも、大腸菌についての微生物結合のメディエーターではないことを実証する
【０３０７】
実施例７：血液が存在しない場合、塩によるｐＨ緩衝化又は浸透圧安定化にかかわらず、磁性ビーズによる微生物捕捉が起こる
目的：
微生物結合の媒介におけるＭｏｍｅｎｔｕｍの結合緩衝液の重要性をさらに調べるために、結合におけるｐＨ緩衝化及び塩の効果を、クリーンな系（すなわち、血液又はブロスのいずれも存在しない場合）で調べた。
【０３０８】
１０×緩衝液調製：
２５ｍＬの各緩衝液を新たに作製した：
ＢＵＦ−１  ５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．４］＋１．５Ｍ  ＮａＣｌ
ＢＵＦ−２  ５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］＋１．５Ｍ  ＮａＣｌ
ＢＵＦ−３  ５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．５］＋１．５Ｍ  ＮａＣｌ
ＢＵＦ−４  ５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］のみ
ＢＵＦ−５  １．５Ｍ  ＮａＣｌのみ
ＢＵＦ−６  水のみ
【０３０９】
Ｅｓｔａｐｏｒビーズ（Ｍｅｒｃｋ、カタログＭ１−３０／４０）を、それぞれ１×緩衝液（１０×緩衝液の希釈）中で３×１ｍＬ洗浄した：３０μＬビーズを、３００μＬの１×緩衝液（１％固形分）の最終体積中に再懸濁した。
【０３１０】
プロトコール：
大腸菌ｏ／ｎ液体培養物をＢａｃＴｅｃ  ＰＬＵＳ好気性ブロス（ＳＰＳを含む）及びニュートリエントブロス（ＳＰＳを含まないＮＢ）における標準として設定し、次に、翌日（約１６時間後）、１．８８μＬ  ｏ／ｎを、各ブロスタイプ（午前にＮＢ及び午後にＰＬＵＳブロス）について３ｍＬブロス（６．２５μＬ／ｍＬでブロスに添加されるＥＣ  １Ｅ−１希釈に匹敵する）に添加し、３７℃、５００ｒｐｍで２時間の成長インキュベーションを行った。
各実験（ＮＢ及びＰＬＵＳ）について、１Ｅ−１大腸菌の前培養物は、各１×緩衝液（ＢＵＦ−１〜ＢＵＦ−６）中で大腸菌の１Ｅ−６まで希釈（ＤＦ１０）した
関連するブロス（ＮＢ又はＰＬＵＳブロス）で行われた別々のＥＣ希釈セットを用いて１００μＬのＴＶＣを行い、異なる１×緩衝液から生じるプレートの生存率の不一致を防ぐ
【０３１１】
ＤｙｎａＭａｇ−２磁石及び手動液体移送を使用して行ったＭａｇｎｉｔｏｒの手動シミュレーション：
１１２μＬのそれぞれ１×緩衝液＋１５μＬビーズ（それぞれの緩衝液中で予備洗浄する）を含有する２ｍＬチューブに１ｍＬの試料を添加した
３７℃で３０分間、振とうした（１０００ｒｐｍ）
ＤｙｎａＭａｇ−２上で５分間、磁化した
全てのｓ／ｎを除去した
１ｍＬのＷＢを添加し、チューブをＲＴで２分間、混合した（１０００ｒｐｍ）
Ｄｙｎｍａｇ−２上で５分間、磁化した
全てのｓ／ｎを除去した
チューブに５０μＬのＬＭを添加し、磁石を取り出した
ＥＴＧＡ反応を行った：２６℃にて１０００ｒｐｍで５分間、次に８００ｒｐｍで５５分間
ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍのために手動ｑＰＣＲを設定した（１０μＬ反応）
【０３１２】
結果：
【表１９】
2021519591.tif 000021
【表２０】
2021519591.tif 000022
【表２１】
2021519591.tif 000023
【表２２】
2021519591.tif 000024
【表２３】
2021519591.tif 000025
【表２４】
2021519591.tif 000026
【表２５】
2021519591.tif 000027
【表２６】
2021519591.tif 000028
【表２７】
2021519591.tif 000029
【表２８】
2021519591.tif 000030
【０３１３】
分析：
水のみを含む全ての緩衝液は、同様に大腸菌の捕捉を実証した（同様のＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍ結果により示される）−しかしながら、水中の低細胞密度のみでは浸透圧微生物溶解が示される場合もあった（ＢＵＦ−６）
ＰＬＵＳブロスとＮＢ増殖大腸菌はいずれも、試験した全ての緩衝液について非常に類似したＭａｇｎｉｔｏｒ結果を生じたが、これは、ＳＰＳが大腸菌の微生物結合の媒介において明確な役割を果たさないことを示している
これらの結果は、Ｅｓｔａｐｏｒ（カルボキシル化）ビーズへの大腸菌の結合には緩衝液成分が必須でないことを示している
【０３１４】
実施例８：磁性ビーズによる血液からの微生物捕捉は、種々の異なる血液溶解法を用いて行うことができる
目的：
代替の血液溶解法を用いる場合に、微生物の捕捉及び検出が起こり得るかどうかを判定すること。
【０３１５】
調製：
結合緩衝液を以下のように調製した：
Ｅ−ＢＵＦ＝５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］＋１．５Ｍ塩化ナトリウム＋１０％Ｉｇｅｐａｌ＋２．５％Ｔｅｒｇｉｔｏｌ
ＵＲＥＡ＝８３ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］＋１０Ｍ尿素
Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌ＝５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］＋１．５Ｍ塩化ナトリウム
【０３１６】
ＢｉｏＥｓｔａｐｏｒビーズ（Ｍｅｒｃｋ、カタログ番号ＢＥ−Ｍ  ０８／０．３）を使用前に再懸濁した。
【０３１７】
プロトコール：
黄色ブドウ球菌ｏ／ｎ液体培養物をＢａｃＴｅｃ  ＰＬＵＳ好気性ブロスにおける標準として設定し、次に、翌日（約１６時間後）、３．０μＬ  ｏ／ｎを３ｍＬの血液ブロス（１Ｅ−３希釈）に添加し、３７℃、５００ｒｐｍで４時間の成長を行った。
４時間の成長後、黄色ブドウ球菌の前培養物は、予め加温された血液ブロス中で１Ｅ−６まで連続希釈（ＤＦ１０）された。
全ての黄色ブドウ球菌希釈液及びＮＳＣに対して１００μＬのＴＶＣを行った
【０３１８】
ＤｙｎａＭａｇ−２磁石を使用した手動試料処理及びピペットによる手動液体移送：
初期設定
尿素を用いた試料について、０．７５ｍＬの尿素＋１５μＬビーズを含有する２ｍＬチューブに０．２５ｍＬの標本を添加した
凍結する試料について、１ｍＬの標本を２ｍＬチューブに添加し、次に、ドライアイス上で５分間、迅速に凍結させた。標本を３７℃で５分間解凍し、次に、１１２μＬのＴｒｉｓ＋ＮａＣｌ＋１５μＬビーズを添加した
Ｅ−ＢＵＦ又はＴｒｉｓ＋ＮａＣｌを使用する試料について、１ｍＬの標本を、１１２μＬの結合緩衝液（Ｅ−ＢＵＦ又はＴｒｉｓ＋ＮａＣｌのいずれか）＋１５μＬのビーズを含有する２ｍＬチューブに添加した
【０３１９】
全試料の処理
３７℃で３０分間、軌道混合した（１０００ｒｐｍ）
ＤｙｎａＭａｇ−２上で５分間、磁化する
全てのｓ／ｎを除去する
１ｍＬのＷＢを添加し、チューブを３７℃で３分間混合する（１０００ｒｐｍ）
Ｄｙｎｍａｇ−２上で５分間、磁化する
全てのｓ／ｎを除去する
５０μＬのＬＭをチューブに添加し、磁石を取り出す
ＥＴＧＡ反応を行う：２６℃にて１０００ｒｐｍで５分間、次に８００ｒｐｍで５５分間
ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍのために手動ｑＰＣＲ設定する（１０μＬ反応）
【０３２０】
観察：
血液溶解は、解凍後の凍結試料で観察された（図１を参照されたい）
尿素ではほぼ瞬時に血液溶解が観察された
いくつかのビーズは、尿素を用いた試料の処理中に喪失するように見えた
Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌ試料セットでは明らかな血液溶解は観察されなかった（予想通り）
【０３２１】
結果：
【表２９】
2021519591.tif 000031
【表３０】
2021519591.tif 000032
【表３１】
2021519591.tif 000033
【表３２】
2021519591.tif 000034
【表３３】
2021519591.tif 000035
【表３４】
2021519591.tif 000036
【０３２２】
図１は、Ｅ−ＢＵＦ、尿素、Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌ、凍結（左から右）の各試料セットの血液溶解の程度を示す。
【０３２３】
分析：
磁性ビーズによる黄色ブドウ球菌の微生物捕捉及び検出は、Ｃｏｎｆｉｒｍによって決定されるように、代替の溶解法に匹敵し、血液溶解はない。
しかしながら、ＥＴＧＡによる微生物検出は、血液由来ＥＴＧＡシグナルの減少に影響するため、代替の血液溶解法によって異なる程度に改善される。
【０３２４】
実施例９：ＳＰＳは、全血における最適なビーズ性能、試料処理及び微生物検出に必要である
目的：
１ｍＬの全血試料を用いて、Ｍａｇｎｉｔｏｒ迅速テストに最適なＳＰＳ濃度を決定すること。副次的目的は、ＴＶＣにより決定した全血中の微生物生存率におけるＳＰＳの効果を評価することであった。
【０３２５】
試験条件：
２×５ｍＬの全血又はＢａｃＴｅｃ  ＰＬＵＳ好気性血液ブロス（１：３比）を各試料セット（大腸菌及びＮＳＣ試料）に分注した。次に、ＳＰＳを次のように添加した：  
【０３２６】
試料セット        １０％ＳＰＳ（μＬ）
ＢＢ              なし
ＷＢ０％          なし
ＷＢ０．０１％    ５
ＷＢ０．０２％    １０
ＷＢ０．０４％    ２０
ＷＢ０．０６％    ３０
ＷＢ０．０８％    ４０
ＷＢ０．１０％    ５０
【０３２７】
次に、５μＬの大腸菌１Ｅ−２前培養液を５ｍＬの各標本チューブに添加し、標準１Ｅ−５希釈試料を再作製した
【０３２８】
プロトコール：
ニュートリエントブロス（ＮＢ）中の１．８８μＬの正味（ｎｅａｔ）ｏ／ｎを３ｍＬのＮＢに添加し；２時間、３７℃、５００ｒｐｍでインキュベートした
２時間後、大腸菌の前培養物を温めたＮＢで１０倍に希釈し；次に、５μＬを各５ｍＬの標本チューブ（試験条件において示されるように調製される）に添加した
直ちにＭａｇｎｉｔｏｒ試験を開始し、以下に詳述されるようにＴＶＣを行った。
【０３２９】
ＤｙｎａＭａｇ−２磁石及び手動液体移送を使用して行ったＭａｇｎｉｔｏｒの手動シミュレーション：
１１２μＬのＥ−ＢＵＦ（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］＋１．５Ｍ塩化ナトリウム＋１０％Ｉｇｅｐａｌ＋２．５％Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）＋１５μＬビーズ（ＢｉｏＥｓｔａｐｏｒ、Ｍｅｒｃｋ、カタログ番号ＢＥ−Ｍ  ０８／０．３）を各試料チューブに予め装填し、次に１ｍＬの標本を試料チューブに添加した
３７℃で３０分間、軌道混合した（１０００ｒｐｍ）
ＤｙｎａＭａｇ−２上で５分間、磁化した
全てのｓ／ｎを除去した
１ｍＬのＷＢを添加し、チューブをＲＴで３分間混合した（１０００ｒｐｍ）
Ｄｙｎｍａｇ−２上で５分間、磁化した
全てのｓ／ｎを除去した
５０μＬのＬＭをチューブに添加し、磁石を取り出した
ＥＴＧＡ反応を行う：２６℃にて１０００ｒｐｍで５分間、次に８００ｒｐｍで５５分間
ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍのために手動ｑＰＣＲを設定した（１０μＬ反応）
【０３３０】
結果：
ＴＶＣ分析
ゼロ時間でＣＯＬプレートに１００μＬ
試料ビジョウス（約２ｍＬの試料を含有する）を室温（２０．４℃）でベンチ上に放置した（静止）
ＴＶＣを表に示される時間点で行った：試料を播種前に完全に混合した
【表３５】
2021519591.tif 000037
【表３６】
2021519591.tif 000038
【表３７】
2021519591.tif 000039
【表３８】
2021519591.tif 000040
【０３３１】
分析：
ＳＰＳは、ＴＶＣアッセイに基づいて全血に微生物保護／生存率を提供する利点を示しているが、全血中の大腸菌の生存率に一般的に大きな問題はない
ＳＰＳの取り込みは、ＥＴＧＡとＣｏｎｆｉｒｍの読み出しの両方の試料処理効率及び微生物検出性能を改善した
０．０６％のＳＰＳは、ＴＶＣベースの生存率；ＥＴＧＡ検出（大腸菌及びＮＳＣ試料Ｃｔを考慮した最良の結果）；及びＩＰＣ  Ｃｔ値で示されるＰＣＲ阻害に関して最良の結果をもたらした。Ｃｏｎｆｉｒｍ  ＧｒＮｅｇ結果はまた、全血にＳＰＳを加えることによって改善されたが、ＳＰＳの正確な濃度はそれほど重要ではなかった。
【０３３２】
実施例１０：磁性ビーズによる血液からの微生物捕捉は、同サイズ（約３００ｎｍ直径）の種々の市販のカルボキシル化ビーズ製品を使用して起こる
目的：
ＭｏｍｅｎｔｕｍのＭａｇｎｉｔｏｒアッセイを用いて、同サイズの代替のカルボキシル化磁性ビーズを比較すること。
【０３３３】
試験条件：
【表３９】
2021519591.tif 000041
【０３３４】
プロトコール：
大腸菌及び化膿連鎖球菌ｏ／ｎ液体培養物をそれぞれ３ｍＬブロス及び血液ブロス（ＢａｃＴｅｃ  ＰＬＵＳ好気性）における標準として設定し、１６〜２０時間（３７℃）インキュベートした
【０３３５】
翌日：
大腸菌の液体培養物を血液ブロスで１Ｅ−３に希釈し、次に、血液ブロス（血液ブロス１ｍＬあたり６．２５μＬ）にスパイクし、１時間３０分（３７℃）プレインキュベートした
化膿連鎖球菌の液体培養物を血液ブロスで１Ｅ−１に希釈し、次に、血液ブロス（血液ブロス１ｍＬあたり６．２５μＬ）にスパイクし、２時間３０分（３７℃）プレインキュベートした
【０３３６】
午前に行われた大腸菌実験
大腸菌の１Ｅ−３前培養物を血液ブロスで連続希釈し、５希釈点（１Ｅ−３〜１Ｅ−７）を生成した
試料は、１５μｌの１％固体ビーズ＋１１２μＬの結合緩衝液を予め装填した２ｍＬチューブに１ｍＬ標本を添加することにより設定され；及びＭａｇｎｉｔｏｒ  Ｖ４．０試験を行った：３つのビーズタイプを有するビーズタイプあたり５希釈点＋３つのＮＳＣ（８つの試料セット）を各ｅｐＭｏｔｉｏｎ  ５０７３ｍで試験した
【０３３７】
午後に行われた化膿連鎖球菌実験
化膿連鎖球菌の１Ｅ−３前培養物を血液ブロスで連続希釈し、５希釈点（１Ｅ−１〜１Ｅ−５）を生成した
試料は、１５μｌの１％固体ビーズ＋１１２μＬの結合緩衝液を予め装填した２ｍＬチューブに１ｍＬ標本を添加することにより設定され；及びＭａｇｎｉｔｏｒ  Ｖ４．０試験を行った：３つのビーズタイプを有するビーズタイプあたり５希釈点＋３つのＮＳＣ（８つの試料セット）を各ｅｐＭｏｔｉｏｎ  ５０７３ｍで試験した
【０３３８】
Ｍａｇｎｉｔｏｒ  Ｖ４．０プロトコール（ｅｐＭｏｔｉｏｎ  ５０７３ｍ上の自動化試料処理）
３７℃で３０分間、軌道混合した（１０００ｒｐｍ）
１５分間、磁化した
１ｍＬのｓ／ｎを除去した
ビーズが磁化されている間に０．８２ｍＬのＷＢをチューブに添加した
１ｍＬのｓ／ｎを除去した
ビーズが磁化されている間に５０μＬのＬＭをチューブに添加した
磁化をオフにし、ＥＴＧＡ反応を行った：２６℃にて１０００ｒｐｍで５分間、次に８００ｒｐｍで５５分間
ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍのためにｑＰＣＲを設定した（１０μＬ反応）
【０３３９】
結果：
内部陽性閾値（Ｐｔ）を各ビーズタイプについてＮＳＣ（ｎ＝６）を用いて計算した：式＝ＰＥＲＣＥＮＴＩＬＥ．ＩＮＣ（アレイ，０．０５）
【表４０】
2021519591.tif 000042
【表４１】
2021519591.tif 000043
【表４２】
2021519591.tif 000044
【０３４０】
観察：
ビーズＢは、１％固形分に希釈する前に再懸濁することが困難であり、１％固形分に希釈した後、目視でより希釈されているように見えた
処理の終了時に、試料をＤｙｎａＭａｇ−２磁気ラック上に配置し、全てのビーズタイプＣ−Ｇは、重いペレットを有すると思われるビーズＡ、及び非常に小さなビーズペレットを有するビーズＢとは別に、同様に磁化した
【０３４１】
分析：
ここで試験した全てのカルボキシル化磁性ビーズは、ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍ読み出しによって決定した場合、微生物結合を実証する。しかしながら、微生物検出の感度は、血液由来ＥＴＧＡシグナル及び／又はアッセイ阻害のレベルに依存して、いくぶん変化する。
【０３４２】
実施例１１：磁性ビーズによる血液からの微生物捕捉は、種々の異なるビーズサイズ及び機能性被覆を用いて起こる
目的：
ＭｏｍｅｎｔｕｍのＭａｇｎｉｔｏｒ試験（ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍ技術）を用いて、異なるサイズ及び機能性被覆を有する市販の様々な磁性ビーズについて微生物捕捉性能を比較すること。自動化（プロトコール１）及び手動（プロトコール２）試料処理のための微生物捕捉を実証するために、２つの実験を行った。重要なことに、プロトコール２は、３つのビーズ再懸濁洗浄を含み、ＥＴＧＡ／Ｃｏｎｆｉｒｍシグナルが試料キャリーオーバーよりもビーズ結合した微生物細胞に特異的であることをより説得力をもって実証する（単一ビーズを磁化した洗浄ステップを含むプロトコール１とは対照的である）。
【０３４３】
試験条件：
【表４３】
2021519591.tif 000045
【０３４４】
試料設定（プロトコール１及び２について別々に行い、異なる日に行った）：
大腸菌ｏ／ｎ液体培養物を３ｍＬブロス（ＢａｃＴｅｃ  ＰＬＵＳ好気性）における標準として設定し、１６〜２０時間（３７℃）インキュベートした
翌日、大腸菌の液体培養物を血液ブロスで１Ｅ−３に希釈し、２時間の成長インキュベーション（５００ｒｐｍで３７℃）を行った
２時間の成長インキュベーション後、大腸菌の１Ｅ−３前培養物を血液ブロスで連続希釈し、３つの希釈点（ＥＣ  １Ｅ−６〜１Ｅ−８）を生成した
１ｍＬの標本（３つの大腸菌希釈物及び３つのＮＳＣ試料：６つの試料セット）を１１２μＬの１０×Ｅ−ＢＵＦ（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］＋１．５Ｍ塩化ナトリウム＋１０％Ｉｇｅｐａｌ＋２．５％Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）＋１５μＬビーズ（１％固体）を予め装填した２ｍＬ試料チューブに添加し、次に、プロトコール１又はプロトコール２（下記参照）のいずれかに従ってＭａｇｎｉｔｏｒ試験を開始した。
【０３４５】
プロトコール１（ｅｐＭｏｔｉｏｎ  ５０７３ｍでの自動化試料処理）：
３７℃で３０分間、軌道混合した（１０００ｒｐｍ）
１５分間、磁化した
１ｍＬのｓ／ｎを除去した
ビーズが磁化されている間に、０．８２ｍＬのＷＢをチューブに添加した
１ｍＬのｓ／ｎを除去した
ビーズが磁化されている間に、５０μＬのＬＭをチューブに添加した
磁化をオフにし、ＥＴＧＡ反応を行った：２６℃にて１０００ｒｐｍで５分間、次に８００ｒｐｍで５５分間
ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍのためにｑＰＣＲを設定した（１０μＬ反応）
【０３４６】
プロトコール２（ＤｙｎａＭａｇ−２磁石及びピペットによる手動液体移送を使用した手動試料処理）：
３７℃で３０分間、軌道混合した（１０００ｒｐｍ）
ＤｙｎａＭａｇ−２上で５分間、磁化した
全てのｓ／ｎを除去した
１ｍＬのＷＢを添加し、ＲＴで２分間、チューブを混合した（１０００ｒｐｍ）
Ｄｙｎｍａｇ−２上で５分間、磁化した
全てのｓ／ｎを除去した
１ｍＬのＷＢを添加し、ＲＴで２分間、チューブを混合した（１０００ｒｐｍ）
Ｄｙｎｍａｇ−２上で５分間、磁化した
全てのｓ／ｎを除去した
１ｍＬのＷＢを添加し、ＲＴで２分間、チューブを混合した（１０００ｒｐｍ）
Ｄｙｎｍａｇ−２上で５分間、磁化した
全てのｓ／ｎを除去した
５０μＬのＬＭをチューブに添加し、磁石を取り出した
ＥＴＧＡ反応を行った：２６℃にて１０００ｒｐｍで５分間、次に８００ｒｐｍで５５分間
ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍのために手動ｑＰＣＲを設定した（１０μＬ反応）
【０３４７】
結果：
【表４４】
2021519591.tif 000046
【表４５】
2021519591.tif 000047
【０３４８】
分析：
これらの結果は、種々の異なるビーズサイズ及び機能性被覆が、ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍ読み出しによって決定した場合に、同等のレベルの微生物結合を生成することを実証する。
【０３４９】
実施例１２：異なるサイズ及び機能性被覆の磁性ビーズを使用して、血液から広範囲の微生物種（グラム陰性、グラム陽性及びカンジダ）を捕捉することができる
目的：
ＭｏｍｅｎｔｕｍのＭａｇｎｉｔｏｒ試験（ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍ技術）を用いて、異なるサイズ及び機能性被覆を有する市販の様々な磁性ビーズについて微生物捕捉性能を比較すること。大腸菌は、以前に、（ビーズサイズ及び被覆Ｉ：供給源実験：２０１９０２２１＿ＷＰ７＿Ｂｅａｄ−Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ＿Ａｎａｌｙｓｉｓ及び２０１９０２２８＿ＷＰ７＿Ｂｅａｄ−Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ−３−ｗａｓｈ＿Ａｎａｌｙｓｉｓ）試験された：この以前の研究を拡大するために、３つの追加微生物種を試験した（黄色ブドウ球菌、肺炎連鎖球菌及びカンジダ・アルビカンス）。
【０３５０】
試験条件：
【表４６】
2021519591.tif 000048
【０３５１】
プロトコール：
試料設定：
ＢａｃＴｅｃ  ＰＬＵＳ好気性ブロス（寒天プレートから３ｍＬのブロスを接種）における微生物の一晩液体培養物（ｏ／ｎ）の設定。翌日（約１６時間後）、３ｍＬ血液ブロス（１Ｅ−１希釈）に３００μＬの肺炎連鎖球菌及びカンジダ・アルビカンス液体培養物を接種し、３ｍＬ血液ブロス（１Ｅ−３希釈）に３μＬの黄色ブドウ球菌液体培養物を接種し；２時間の成長を３７℃、５００ｒｐｍで行った。
２時間の成長後、微生物前培養物を血液ブロスで希釈（ＤＦ１０）し、微生物あたり３つの希釈点を作製した。
各微生物希釈に対して１００μＬのＴＶＣを行った
【０３５２】
ＤｙｎａＭａｇ−２磁石を用いて行ったＭａｇｎｉｔｏｒの手動シミュレーション及び手動液体移送：
１５μＬのビーズ（１％固体）及び１１２μＬのＥ−ＢＵＦ（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］＋１．５Ｍ塩化ナトリウム＋１０％Ｉｇｅｐａｌ＋２．５％Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）を予め装填した２ｍＬの試料チューブに１ｍＬの標本（微生物種あたり３希釈、及び３ＮＳＣ試料：１２試料セット）を添加した
３７℃で３０分間、軌道混合した（１０００ｒｐｍ）
ＤｙｎａＭａｇ−２上で５分間、磁化した
全てのｓ／ｎを除去した
１ｍＬのＷＢを添加し、ＲＴで３分間、チューブを混合する（１０００ｒｐｍ）
Ｄｙｎｍａｇ−２上で５分間、磁化した
全てのｓ／ｎを除去した
５０μＬのＬＭをチューブに添加し、磁石を取り出した
ＥＴＧＡ反応を行った：２６℃にて１０００ｒｐｍで５分間、次に８００ｒｐｍで５５分間
ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍのために手動ｑＰＣＲを設定した（１０μＬ反応）
【０３５３】
結果：
【表４７】
2021519591.tif 000049
【表４８】
2021519591.tif 000050
【表４９】
2021519591.tif 000051
【０３５４】
分析：
これらの結果は、種々の異なるビーズサイズ及び機能性被覆が、ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍ読み出しによって決定されるように、同等のレベルの微生物結合を生成することを実証する。
【０３５５】
実施例１３：異なるサイズ及び機能性被覆の磁性ビーズを使用して、単純なＴｒｉｓ＋ＮａＣｌ緩衝液から広範囲の微生物種（グラム陰性、グラム陽性及びカンジダ）を捕捉することができる
目的：
ＭｏｍｅｎｔｕｍのＭａｇｎｉｔｏｒ試験（ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍ技術）を用いて、異なるサイズ及び機能性被覆を有する市販の様々な磁性ビーズについて微生物捕捉性能を比較すること。この実験は、標本として単純な緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ  ８．０］＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）及び洗浄緩衝液を用いて行われ、すなわち微生物溶解混合物を添加するまで界面活性剤を使用しなかった。
【０３５６】
試験条件：
【表５０】
2021519591.tif 000052
【０３５７】
プロトコール：
試料設定：
ＢａｃＴｅｃ  ＰＬＵＳ好気性ブロス（寒天プレートから３ｍＬのブロスを接種）では、微生物の一晩液体培養物（ｏ／ｎ）を設定する。翌日（約１６時間後）に、３μＬの大腸菌及び黄色ブドウ球菌の液体培養物を３ｍＬのブロス（１Ｅ−３希釈）に接種し、３００μＬのカンジダ・アルビカンスの液体培養物を３ｍＬのブロス（１Ｅ−１希釈）に接種し、２時間の成長を３７℃、５００ｒｐｍで行った。
２時間の成長後、微生物の前培養物を１×Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌ緩衝液中で希釈（ＤＦ１０）し、微生物あたり３つの希釈点を作製した。
各微生物希釈に対して１００μＬのＴＶＣを行った
【０３５８】
ＤｙｎａＭａｇ−２磁石及び手動液体移送を使用して行ったＭａｇｎｉｔｏｒの手動シミュレーション：
１５μＬのビーズ（１％固体）を予め装填した２ｍＬの試料チューブに１ｍＬの標本（微生物種あたり３希釈、及び３ＮＳＣ試料：１２試料セット）を添加した
３７℃で３０分間、軌道混合した（１０００ｒｐｍ）
ＤｙｎａＭａｇ−２上で５分間、磁化した
全てのｓ／ｎを除去した
１ｍＬのＷＢ（１×Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌ）を添加し、ＲＴで３分間、チューブを混合した（１０００ｒｐｍ）
Ｄｙｎｍａｇ−２上で５分間、磁化した
全てのｓ／ｎを除去した
５０μＬのＬＭをチューブに添加し、磁石を取り出した
ＥＴＧＡ反応を行った：２６℃にて１０００ｒｐｍで５分間、次に８００ｒｐｍで５５分間
ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍのために手動ｑＰＣＲを設定した（１０μＬ反応）
【０３５９】
結果：
【表５１】
2021519591.tif 000053
【表５２】
2021519591.tif 000054
【表５３】
2021519591.tif 000055
【０３６０】
分析：
これらの結果は、クリーンな系（すなわち、生物学的標本の代わりに単純なＴｒｉｓ＋ＮａＣｌ緩衝液）において、種々の異なるビーズサイズ及び機能性表面（カルボキシル化及び疎水性）が、ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍ読み出しによって決定した場合に、同等レベルの微生物結合を生じさせることを実証する。
興味深いことに、アミノ化ビーズ（ＮＨ２−１．５）は、微生物結合がほとんど／全くないことを示す標本タイプの極めて不良なＭａｇｎｉｔｏｒ結果を生じた。この観察は、アミノ化されたビーズが試験された他のビーズと同等レベルの微生物捕捉を生成した血液ブロス標本の状況とは異なる。
【０３６１】
実施例１４：異なるサイズ及び機能性被覆の磁性ビーズを使用して、非溶解血液から広範囲の微生物種（グラム陰性、グラム陽性及びカンジダ）を捕捉することができる
目的：
ＭｏｍｅｎｔｕｍのＭａｇｎｉｔｏｒ試験（ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍ技術）を用いて、血液溶解の不存在下、すなわち結合緩衝液中に界面活性剤を含まない場合、異なるサイズ及び機能性被覆を有する市販の様々な磁性ビーズについて微生物捕捉性能を比較すること。
【０３６２】
試験条件：
【表５４】
2021519591.tif 000056
【０３６３】
プロトコール：
試料設定：
ＢａｃＴｅｃ  ＰＬＵＳ好気性ブロス（寒天プレートから３ｍＬのブロスを接種）では、微生物の一晩液体培養物（ｏ／ｎ）を設定する。翌日（約１６時間後）に、３μＬの大腸菌及び黄色ブドウ球菌の液体培養物を３ｍＬのブロス（１Ｅ−３希釈）に接種し、３００μＬのカンジダ・アルビカンスの液体培養物を３ｍＬの血液ブロス（１Ｅ−１希釈）に接種し、２時間の成長を３７℃、５００ｒｐｍで行った。
２時間の成長後、微生物の前培養物を血液ブロス中で希釈（ＤＦ１０）し、微生物あたり３つの希釈点を作製した。
各微生物希釈に対して１００μＬのＴＶＣを行った
【０３６４】
ＤｙｎａＭａｇ−２磁石及び手動液体移送を使用して行ったＭａｇｎｉｔｏｒの手動シミュレーション：
１５μＬのビーズ（１％固体）及び１１２μＬの結合緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ＋塩化ナトリウム）を予め装填した２ｍＬの試料チューブに１ｍＬの標本（微生物種あたり３希釈、及び３ＮＳＣ試料：１２試料セット）を添加した
３７℃で３０分間、軌道混合した（１０００ｒｐｍ）
ＤｙｎａＭａｇ−２上で５分間、磁化した
全てのｓ／ｎを除去した
１ｍＬのＷＢを添加し、ＲＴで３分間、チューブを混合した（１０００ｒｐｍ）
Ｄｙｎｍａｇ−２上で５分間、磁化した
全てのｓ／ｎを除去した
５０μＬのＬＭをチューブに添加し、磁石を取り出した
ＥＴＧＡ反応を行う：２６℃にて１０００ｒｐｍで５分間、次に８００ｒｐｍで５５分間
ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍのために手動ｑＰＣＲを設定した（１０μＬ反応）
【０３６５】
結果：
【表５５】
2021519591.tif 000057
【表５６】
2021519591.tif 000058
【表５７】
2021519591.tif 000059
【０３６６】
分析：
これらの結果は、種々の異なるビーズサイズ及び機能性被覆が、ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍ読み出しによって決定した場合に、血液溶解の不存在下で、血液から同等レベルの微生物結合を生じさせることを実証する
しかしながら、ＥＴＧＡによる微生物検出は、微生物結合中の血液溶解に関する以前の実験と比較した場合、血液溶解の不存在下でのＮＳＣ  ＥＴＧＡシグナルの増加によって実質的に減少する。
【０３６７】
実施例１５：磁性ビーズによる微生物捕捉は、種々の複雑な生物学的標本タイプにおいて起こる
目的：
磁性ビーズを用いた微生物捕捉が、血液に加えて、他の複雑な生物学的流体に対して可能かどうかを調べること。
【０３６８】
試験条件：
【表５８】
2021519591.tif 000060
【０３６９】
プロトコール：
大腸菌ｏ／ｎ液体培養物をＢａｃＴｅｃ  ＰＬＵＳ好気性ブロスにおける標準として設定し、次に、翌日（約１６時間後）、３μＬ  ｏ／ｎを３ｍＬのブロス（大腸菌１Ｅ−３）に添加し、３７℃、５００ｒｐｍで２時間の成長インキュベーションを行った。
２時間の成長後、大腸菌１Ｅ−３の前培養物を各標本タイプにおいて５連続希釈点（大腸菌１Ｅ−６〜１Ｅ−９）に希釈した。ＣＯＬ寒天プレート上で１００μＬのＴＶＣを行った。
【０３７０】
ＤｙｎａＭａｇ−２磁石及び手動液体移送を使用して行ったＭａｇｎｉｔｏｒの手動シミュレーション：
１ｍＬの標本は、１１２μＬの結合緩衝液（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］＋１．５Ｍ塩化ナトリウム＋１０％Ｉｇｅｐａｌ＋２．５％Ｔｅｒｇｉｔｏｌ＋０．５％デオキシコール酸ナトリウム）＋１５μＬビーズ（ＢｉｏＥｓｔａｐｏｒビーズ；Ｍｅｒｃｋ  ＃ＢＥ−Ｍ０８／０３（１％固体））を予め装填した２ｍＬの試料チューブに添加された−注記、Ｔｒｉｓ−ＮａＣｌ試料セットについての試料チューブは、１１２μＬの結合緩衝液を予め装填していない（再増殖アッセイのための微生物増殖を阻害する可能性がある界面活性剤の混入を避けるためである）
３７℃で３０分間、振とうした（１０００ｒｐｍ）
ＤｙｎａＭａｇ−２上で５分間、磁化した
全てのｓ／ｎを除去した
１ｍＬのＷＢを添加し、ＲＴで３分間混合する（１０００ｒｐｍ）−注記、再増殖アッセイのための微生物増殖を阻害する可能性がある界面活性剤の混入を避けるために、Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌ試料セット用の洗浄緩衝液の代わりに１ｍＬのＴｒｉｓ＋ＮａＣｌ緩衝液を添加した
Ｄｙｎｍａｇ−２上で５分間、磁化した
全てのｓ／ｎを除去した
５０μＬのＬＭをチューブに添加し、磁石を取り出す−注記、再増殖アッセイのために１００μＬのＴｒｉｓ＋ＮａＣｌ緩衝液にビーズを再懸濁した
ＥＴＧＡ反応を行った：２６℃にて１０００ｒｐｍで５分間、次に８００ｒｐｍで５５分間
ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍのために手動ｑＰＣＲを設定した（１０μＬ反応）
【０３７１】
結果：
【表５９】
2021519591.tif 000061
【０３７２】
対のＴｒｉｓ＋ＮａＣｌ試料セットの再増殖アッセイ
１．１００μｌのＴｒｉｓ＋ＮａＣｌ標本を播種／接種した−「標本」
２．１００μｌの上清を微生物結合ステップ後に播種／接種した−「結合後」
３．１００μｌの上清を洗浄ステップ後に播種／接種した−「洗浄後」
４．５０μＬのビーズを１００μＬのＴｒｉｓ＋ＮａＣｌ緩衝液に再懸濁し、播種／接種した（すなわち、５０％の材料をプレート上に、及び５０％の材料を液体培養物に接種した）−「ビーズ」
【０３７３】
プレート及び液体培養物を一晩、３７℃でインキュベートした
【表６０】
2021519591.tif 000062
【表６１】
2021519591.tif 000063
【表６２】
2021519591.tif 000064
【表６３】
2021519591.tif 000065
【０３７４】
分析：
これらの結果は、磁性ビーズが、ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍ読み出しによって決定した場合、種々の複雑な生物学的標本タイプから微生物を捕捉するために使用し得ることを実証する。
再増殖アッセイは、大腸菌が磁性ビーズに結合した後、「ビーズ」試料セットの観察可能な増殖によって決定した場合、寒天及び液体培養物上で再増殖し得ることを実証する。
【０３７５】
実施例１６：標本溶解の不存在において、非血液標本から微生物の捕捉及び検出が可能である
目的：
非溶解性結合緩衝液及び非溶解性洗浄緩衝液を用いて、ミルク及び尿の非血液標本における微生物捕捉及び検出を示すこと。
【０３７６】
調製：
１０×Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌ結合緩衝液＝５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］＋１．５Ｍ塩化ナトリウム
１×Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌ洗浄緩衝液＝１０×Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌ結合緩衝液の１０分の１希釈
新鮮な（ヒト）尿
半脱脂（低温殺菌）牛乳
【０３７７】
ＢｉｏＥｓｔａｐｏｒビーズ（Ｍｅｒｃｋ、カタログ番号ＢＥ−Ｍ  ０８／０．３）を使用前に再懸濁した。
【０３７８】
プロトコール：
ＢａｃＴｅｃ  ＰＬＵＳ好気性ブロスにおける標準として大腸菌、黄色ブドウ球菌、カンジダ・アルビカンス及び肺炎連鎖球菌ｏ／ｎ液体培養物を設定した
翌日（約１６時間後）、３μＬの大腸菌及び黄色ブドウ球菌ｏ／ｎを使用して、新鮮な３ｍＬのブロス培養物（１Ｅ−３希釈）に接種し、３００μＬのカンジダ・アルビカンス及び肺炎連鎖球菌を使用して、新鮮な３ｍＬのブロス培養物（１Ｅ−１希釈）に接種し、２時間の成長を３７℃、５００ｒｐｍで行った。
２時間の成長後、微生物の前培養物を予め温めた新鮮な尿及び新鮮なミルク中で連続希釈（ＤＦ１０）し、５つの希釈点：大腸菌１Ｅ−５〜１Ｅ−９、黄色ブドウ球菌１Ｅ−５〜１Ｅ−９、カンジダ・アルビカンス１Ｅ−２〜１Ｅ−６、及び肺炎連鎖球菌１Ｅ−２〜１Ｅ−６を生じさせた。
ミルク及び尿中で試験した各微生物希釈について１００μＬのＴＶＣを行い、ミルク及び尿のＮＳＣを３種類の寒天プレート（ＳＡＢ、ＣＯＬ及びＣＢＡ）上に播種した。
１１２μＬの結合緩衝液＋１５μＬビーズ（１％固体）を予め装填した２ｍＬ試料チューブに、１ｍＬの標本（各微生物種の５希釈及び４つのＮＳＣ試料：標本タイプあたり２４試料）を添加し、次に自動化Ｍａｇｎｉｔｏｒ試験を開始した。
【０３７９】
ｅｐＭｏｔｉｏｎ  ５０７３ｍ上での自動化試料処理：
３７℃で３０分間、軌道混合した（１０００ｒｐｍ）
１５分間、磁化した
１ｍＬのｓ／ｎを除去した
ビーズが磁化されている間に０．８２ｍＬのＷＢ（１×Ｔｒｉｓ＋ＮａＣｌ）をチューブに添加した
１ｍＬのｓ／ｎを除去した
ビーズが磁化されている間に５０μＬのＬＭをチューブに添加した
磁化をオフにし、ＥＴＧＡ反応を行った：２６℃にて１０００ｒｐｍで５分間、次に８００ｒｐｍで５５分間
ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍのためにｑＰＣＲを設定した（１０μＬ反応）
【０３８０】
結果：
【表６４】
2021519591.tif 000066
【表６５】
2021519591.tif 000067
【表６６】
2021519591.tif 000068
【０３８１】
分析：
これらの結果は、ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍ読み出しによって決定した場合に、標本溶解の不存在において、磁性ビーズによる微生物捕捉が血液に代わる標本（特に、尿及びミルク）で可能であることを実証する。
しかしながら、これらの標本タイプ（特に、ミルク）における共生微生物の存在は、ＥＴＧＡ及びＣｏｎｆｉｒｍ読み出しのバックグラウンドシグナルのレベルに影響を与える。
【図１】
2021519591.tif 000069
【図２】
2021519591.tif 000070
【国際調査報告】
2021519591.tif 000071
2021519591.tif 000072
2021519591.tif 000073
2021519591.tif 000074
2021519591.tif 000075
2021519591.tif 000076