(57)【要約】本発明は、融合タンパク質の安定な薬学的製剤であって、ここで上記製剤は、緩衝剤、糖アルコール／ポリオール、アミノ酸および界面活性剤を含み、上記製剤は、スクロースを欠く製剤を開示する。さらに、上記製剤はまた、塩を欠いていてもよい。開示される融合タンパク質製剤は、凍結乾燥にも適した液体製剤である。本発明は、緩衝剤、ポリオール、アミノ酸および界面活性剤を含む融合タンパク質分子の安定な薬学的製剤であって、ここで上記融合タンパク質は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子である製剤を開示する。特に、本発明は、緩衝剤、ポリオール、アミノ酸および界面活性剤を含むＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質の安定な薬学的製剤であって、ここで上記製剤は、スクロースを欠く製剤を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
緩衝剤、ポリオール、アミノ酸および界面活性剤を含むＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質の安定な薬学的製剤であって、スクロースを欠く、製剤。
【請求項２】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質  対  ポリオールの比は、１：０．７またはこれより低く、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質  対  アミノ酸の比は、１：０．１またはこれより低い、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質製剤の濃度は、約２０ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の製剤。
【請求項４】
前記製剤のｐＨは、６．０〜８．０、好ましくは６．５〜７．５である、請求項１に記載の製剤。
【請求項５】
前記製剤の粘性は、１５ｃｐ未満、好ましくは１０ｃｐ未満である、請求項１に記載の製剤。
【請求項６】
製剤中の前記融合タンパク質は、３０℃において少なくとも２週間安定であり、約１０％未満の凝集物形態の融合タンパク質分子、好ましくは７．５％未満の凝集物形態の融合タンパク質を含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項７】
リン酸緩衝剤、マンニトール、ヒスチジンおよび界面活性剤を含むＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質の安定な製剤であって、スクロースを欠く、製剤。
【請求項８】
マンニトールの濃度は、約８０ｍｇ／ｍｌであり、ヒスチジンの濃度は、１０ｍｇ／ｍｌ〜１５ｍｇ／ｍｌの間である、請求項７に記載の製剤。
【請求項９】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質の安定な製剤を得る方法であって、前記方法は、緩衝剤、ポリオール、ヒスチジンおよび界面活性剤を添加する工程を含み、ここでヒスチジンおよびポリオールはまた、限外濾過および透析濾過の製剤化プロセス工程に添加される、方法。
【請求項１０】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質の安定性を増大させる方法であって、前記方法は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質を発現および精製する工程；限外濾過および透析濾過（ＵＦ−ＤＦ）によって、前記タンパク質を濃縮および／または緩衝剤交換する工程であって、ここで前記ＵＦおよび／またはＤＦ工程において使用される緩衝剤は、ヒスチジンおよびポリオールを含む工程；続いて、ヒスチジン、ポリオールおよび界面活性剤を含む緩衝剤中で前記タンパク質を製剤化する工程を包含し；ここで前記タンパク質の安定性は、その緩衝剤の中にヒスチジンおよびポリオールを含まないＵＦ−ＤＦ工程によって処理された前記タンパク質の製剤と比較して増大される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、融合タンパク質分子の安定な製剤に関する。特に、本発明は、安定な細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４−免疫グロブリン（ＣＴＬＡ４−Ｉｇ）融合タンパク質製剤であって、緩衝剤系および安定化剤を含む製剤を開示する。
【背景技術】
【０００２】
背景
過去２０年間で、組換えＤＮＡ技術は、多くのタンパク質、特に、抗体治療薬および融合タンパク質分子の商業化をもたらしてきた。
【０００３】
融合タンパク質、特に、Ｆｃ融合タンパク質分子（ここでヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）のＦｃ部分は、レセプターの特定の部分にコンジュゲートされている）は、種々の腫瘍学的および免疫学的障害の処置におけるそれらの広い使用から、重要性を獲得しつつある。種々の障害を処置するために、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）が承認したそれらのＦｃ融合タンパク質の中には、エタネルセプト（ＴＮＦＲ−ＩｇＦｃ）、アフリベルセプト（ＶＥＧＦＲ−ＩｇＦｃ）ならびにアバタセプトおよびベラタセプト（ＣＴＬＡ４−ＩｇＦｃ）がある。融合タンパク質分子の有効性は、安定性、投与経路ならびにそれらの投与形態および濃度に大きく依存する。これは、次に、これらのタンパク質分子が安定性および活性を保持するように適切に製剤化されることを必要とする。
【０００４】
概してタンパク質、および特にＦｃ融合タンパク質は、液剤中で代表的には不安定であり、ｐＨ、温度および酸化に感受性であり、よって、種々の共有結合および非共有結合反応、液剤中での改変または変性を受け得る。より一般的なタンパク質変性経路は、凝集、脱アミノ化および／または酸化を含み、これらの変性経路は、ｐＨ、温度および貯蔵条件（製剤化条件および賦形剤を含む）によって影響を及ぼされることが公知である。従って、これらの経路は、液剤中のタンパク質の物理的および化学的両方の不安定性をもたらす。
【０００５】
治療用タンパク質の凝集は、特に重要である。なぜならそれはしばしば、経時的に減少した生体活性／活性の喪失を生じ、患者に投与される際に免疫原性であり得るからである。融合タンパク質の場合、凝集は重要である。なぜならそれは、２またはこれより多くのタンパク質の融合を伴い、大きくかつ複雑な構造であり、単一のポリペプチドまたは抗体と比較して、急激な速度で凝集物を形成する傾向にあるからである。
【０００６】
凝集とは別に、２またはこれより多くのタンパク質が融合される領域において特に起こる、マルチマータンパク質の不安定性の別のタイプは、脱アミド化、酸化、異性化および／または加水分解の結果であり得るフラグメント化／切り取り（ｃｌｉｐｐｉｎｇ）である。脱アミド化は、アスパラギンまたはグルタミン残基において起こり得、上記タンパク質の電荷改変体を生じる。融合タンパク質の酸化は、主にメチオニン残基が関わり、外部要因（例えば、光および遷移金属イオンへの曝露または賦形剤の変性生成物（例えば、ポリソルベート変性からの過酸化水素）によって概して影響を及ぼされる。治療用タンパク質分子中のこれらの酸化生成物および電荷改変体の存在は、不安定性を増大させ、従って、上記タンパク質の生体活性を減少させることが公知である。
【０００７】
よって、多くの物理的および化学的不安定性を誘導する要因に対して治療用（融合）タンパク質分子を安定化する製剤構成要素の適切な混合物を開発することは必須である。さらに、その開発された製剤は、貯蔵条件の間にコロイド安定性を維持するべきである。なぜならそれは、上記タンパク質分子が、平衡状態で水溶液中で懸濁されたままであると決定し、確実にするからである。
【０００８】
タンパク質および融合タンパク質分子を安定化するにあたって使用される、糖および糖アルコール、アミノ酸ならびに界面活性剤のような多くのクラスの賦形剤が存在する。しかし、タンパク質を製剤化する間の賦形剤の選択は、上記タンパク質および製剤中の他の構成要素とのそれらの適合性、上記治療用タンパク質の（意図した）投与様式および投与量などのような、種々の他の要因によって左右される。従って、製剤開発の背後にある難題は、安定な製剤を達成するための適切な緩衝剤条件および賦形剤（それらの濃度を含む）のスクリーニングおよび選択を含む。さらに、開発した製剤は室温において安定であり、凍結乾燥形態または液体形態のいずれかでの投与に適切であることも予測される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
要旨
本発明は、緩衝剤、ポリオール、アミノ酸および界面活性剤を含む融合タンパク質分子の安定な薬学的製剤であって、ここで上記融合タンパク質は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子である製剤を開示する。
【００１０】
特に、本発明は、緩衝剤、ポリオール、アミノ酸および界面活性剤を含むＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質の安定な薬学的製剤であって、ここで上記製剤は、スクロースを欠く製剤を開示する。
【００１１】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質の上記で開示される安定な製剤は、必要に応じて、塩化ナトリウムを含まなくてもよい。
【００１２】
さらに、本発明は、ヒスチジンおよびポリオールを添加する工程を含む製剤におけるＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質の凝集および／またはフラグメント化を低減する方法を開示する。
【００１３】
本発明はまた、ヒスチジンおよびマンニトールを含むＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質製剤の安定性を増大させる方法を開示し、ここで上記ヒスチジンおよびマンニトール構成要素はまた、上記プロセス工程の間に、特に、タンジェンシャルフロー濾過プロセス工程（製剤化工程の前の工程）において添加される。上記プロセスの間のこのような添加は、上記製剤に顕著な安定性を付与する。
【００１４】
上記製剤中の開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質は、低濃度および高濃度（１０ｍｇ／ｍｌから２００ｍｇ／ｍｌまで）および種々の温度（３０℃を含む）で少なくとも２週間安定である。上記製剤は、約１０％未満の凝集物形態の融合タンパク質分子、好ましくは７．５％未満の凝集物形態の融合タンパク質分子を含む。
【００１５】
さらに、ポリオールおよびアミノ酸の組み合わせは、上記製剤に存在する融合タンパク質分子にコロイド安定性を付与する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
定義
用語「融合タンパク質は、同じではない２種のポリペプチドの全てまたは一部を融合（すなわち、結合）することによって形成されるタンパク質を意味する。代表的には、融合タンパク質は、組換えＤＮＡ技術を使用して、上記２種のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの末端同士の結合によって、作製される。
【００１７】
用語「ＣＴＬＡ４−Ｉｇ」または「ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子」または「ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子」は交換可能に使用され、ＣＴＬＡ４細胞外ドメインまたはその一部、および免疫グロブリン定常領域またはその一部を有するポリペプチドを含むタンパク質分子を指す。上記細胞外ドメインおよび上記免疫グロブリン定常領域は、野生型であってもよいし、または変異体であってもよいし、もしくは改変されていてもよく、哺乳動物（ヒトまたはマウスを含む）のものであり得る。上記ポリペプチドは、さらなるタンパク質ドメインをさらに含み得る。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子はまた、上記ポリペプチドのマルチマー形態（例えば、ダイマー、テトラマー、およびヘキサマー）も指し得る。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子はまた、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６に結合し得る。
【００１８】
用語「安定な」製剤とは、その中にある上記抗体が、貯蔵に際してその物理的安定性および／または化学的安定性および／または生物学的活性を保持する製剤を指す。
【００１９】
安定性試験は、時間経過の間の種々の環境要因の影響下での抗体の品質という証拠を提供する。ＩＣＨの「Ｑ１Ａ：  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ」は、加速安定性試験のデータが、抗体の輸送の間に起こり得る表示貯蔵条件より高いかまたは低い短時間の影響の効果を評価するために使用され得ることを述べる。
【００２０】
種々の分析方法が、薬学的製剤中の融合タンパク質の物理的および化学的分解を測定するために利用可能である。融合タンパク質は、色および／もしくは透明性の目視検査の際に、またはＵＶ光散乱によってもしくはサイズ排除クロマトグラフィーによって測定される場合に、凝集、沈殿および／または変性の徴候を実質的に示さなければ、薬学的製剤において「その物理的安定性を保持する」。融合タンパク質は、融合タンパク質の化学的改変（例えば、脱アミノ化、酸化など）の結果としての改変体を含み得る生成物改変体の形成を全くまたは最小限にしか示さない場合に、薬学的製剤において「その化学的安定性を保持する」といわれる。イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性イオンククロマトグラフィーのような分析法は、化学的生成物改変体を調べるために使用され得る。
【００２１】
ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子のモノマー、ダイマーおよび高分子量（ＨＭＷ）種は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分離され得る。ＳＥＣは、分子サイズに基づいて分子を分離する。分離は、分子がカラムの長さに沿って移動するにつれて、分子の差次的な排除または包含によって達成される。従って、分離能は、カラムの長さの関数として増大する。融合タンパク質の適切な活性を維持するために、生成物の凝集物の形成またはフラグメント化（モノマー／低分子量種）を低減し、よって、ダイマー含有量を目標値に制御することは望ましい。ダイマーは、融合タンパク質に存在する主要な形態であり、サイズ排除クロマトグラフィーにおいて主要ピークとして溶離する。ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子サンプルは、ＴＳＫ  Ｇｅｌ（登録商標）  Ｇ３０００ＳＷＸＬ（３００ｍｍ×７．８ｍｍ）カラムおよびＴＳＫ  Ｇｅｌ（登録商標）  Ｇ３０００ＳＷＸＬ（４０ｍｍ×６．０ｍｍ）カラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、Ｐａ．）を備えた２６９５  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．）を使用して分離され得る。
【００２２】
タンパク質のコロイド安定性は、水性の環境において、自己内部のおよび周辺分子間のタンパク質分子の相互作用に関する情報を与える。液剤中のタンパク質分子のコロイド安定性の共通する指標または予測因子は、拡散係数（ｋＤ）値であり、動的光散乱（ＤＬＳ）技術によって測定される。拡散係数値が高いほど、斥力はより高く、タンパク質分子における溶解度はより高く、凝集物形成はより少なく、従って、上記タンパク質は、コロイド安定性を示す。そしてコロイド安定性は、タンパク質溶解度、粘性、タンパク質凝集物のタイプなどの指標である。
【００２３】
薬学的に受容可能な賦形剤とは、添加剤またはキャリアを指し、これらは、製剤中の抗体の安定性に寄与し得る。上記賦形剤は、安定化剤および張度改変剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）を包含し得る。安定化剤および張度改変剤の例としては、糖、塩、界面活性剤、および誘導体ならびにこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
前製剤化工程は、上記タンパク質を治療用製品へと製剤化する前に行われる任意のまたは複数の工程を指す。このような工程の例としては、クロマトグラフィー、濾過（限外濾過、滅菌濾過、ナノ濾過、透析濾過（diafiltration）、深層濾過（ｄｅｐｔｈ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ））、または上記タンパク質を濃縮するかもしくは緩衝剤を異なる／適切な緩衝剤へと交換するために行われる任意の他の工程が挙げられる。本明細書で言及される濾過工程は、タンジェンシャルフロー濾過モードにおいて行われ得る。
【００２５】
用語「ポリオール」または「糖アルコール」は、本明細書で使用される場合、多数のヒドロキシル基を含む有機化合物を含む。ポリオールの例としては、マンニトール、ソルビトール、キシリトールなどが挙げられる。
【００２６】
界面活性剤とは、撹拌、剪断、高温への曝露などのような種々のストレス条件からタンパク質製剤を保護するために使用される薬学的に受容可能な賦形剤を指す。適切な界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０またはＴｗｅｅｎ（登録商標）８０）、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー（例えば、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などまたはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
塩の例としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、塩化カルシウム、塩化亜鉛および／または酢酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
本発明のある種の具体的局面および実施形態は、以下の例を参照することによってより十分に記載される。しかし、これらの例は、いかなる様式においても本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【００２９】
実施形態の詳細な説明
承認された融合タンパク質製剤のうちの多くは、安定化剤としてスクロースを含む。しかし、本発明は、スクロースの存在なしに安定性を提供する融合タンパク質（ＣＴＬＡ４−Ｉｇ）製剤を開示する。
【００３０】
本発明は、緩衝剤、ポリオール、アミノ酸および界面活性剤を含む融合タンパク質の安定な薬学的製剤を開示する。
【００３１】
一実施形態において、本発明は、緩衝剤、ポリオール、アミノ酸および界面活性剤を含むＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質の安定な薬学的製剤であって、スクロースを欠く製剤を開示する。
【００３２】
一実施形態において、本発明は、緩衝剤、マンニトール、ヒスチジンおよび界面活性剤を含むＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質の安定な薬学的製剤であって、スクロースを欠く製剤を開示する。
【００３３】
上述の実施形態のうちのいずれかにおいて、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質  対  ポリオールの比は、１：０．７またはこれより低く、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質  対  アミノ酸の比は、１：０．１またはこれより低い。
【００３４】
本発明の上記で述べられた実施形態において、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質の上記製剤はまた、治療用タンパク質製剤を安定化するために塩を必要としない。
【００３５】
上述の実施形態において、上記ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質製剤はさらに、塩を含まず、ここで上記塩は、塩化ナトリウムである。
【００３６】
一実施形態において、本発明は、緩衝剤、マンニトール、ヒスチジンおよび界面活性剤から本質的になるＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質の安定な薬学的製剤を開示する。
【００３７】
上記で述べられた実施形態において、上記製剤に存在するポリオールの濃度は、約１２５ｍｇ／ｍｌ未満、好ましくは約８０ｍｇ／ｍｌ未満であり、上記製剤に存在するアミノ酸の濃度は、約２０ｍｇ／ｍｌ未満、好ましくは１５ｍｇ／ｍｌ未満であり、より好ましくは１０ｍｇ／ｍｌである。
【００３８】
上記で述べられた実施形態のうちのいずれかにおいて、上記製剤中の融合タンパク質の濃度は、約１０ｍｇ／ｍｌ〜２００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは２０ｍｇ／ｍｌ〜１５０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは２５ｍｇ／ｍｌ〜１２５ｍｇ／ｍｌである。
【００３９】
上記で述べられた実施形態のうちのいずれかにおいて、上記ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質製剤の粘性は、２０ｃｐ未満、好ましくは１０ｃｐ未満、より好ましくは５ｃｐ未満である。
【００４０】
本発明の上述の実施形態のうちのいずれかにおいて、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質製剤のｐＨは、６．０〜８．０、好ましくは６．５〜７．５である。
【００４１】
上記で述べられた実施形態において、上記製剤において言及される緩衝剤は、有機緩衝剤、無機緩衝剤および／またはこれらの組み合わせである。
【００４２】
本発明の上述の実施形態のうちのいずれかにおいて、上記有機緩衝剤は、クエン酸塩緩衝剤、コハク酸塩緩衝剤または酢酸塩緩衝剤である。
【００４３】
本発明のさらに別の実施形態において、上記製剤において言及される無機緩衝剤は、リン酸塩緩衝剤である。
【００４４】
上述の実施形態のうちのいずれかにおいて、上記アミノ酸は、塩基性アミノ酸、疎水性アミノ酸およびこれらの組み合わせを含む。
【００４５】
ある実施形態において、本発明は、リン酸塩緩衝剤、マンニトール、ヒスチジンおよび界面活性剤を含むＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質の安定な薬学的製剤を開示する。
【００４６】
ある実施形態において、本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質分子、クエン酸塩−リン酸塩緩衝剤、マンニトール、ヒスチジンおよびポロキサマーを含む安定な薬学的製剤であって、ここで上記製剤は安定であり、サイズ排除クロマトグラフィーによって分析した場合、主要ピークとして融合タンパク質分子のうちの少なくとも９４％を維持する製剤を開示する。
【００４７】
さらに別の実施形態において、本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質製剤中の凝集物を低減する方法であって、上記方法は、ヒスチジンおよびマンニトールを上記製剤に添加する工程を包含し、ここで上記製剤中の凝集物含有量は、３０℃で２週間の貯蔵の際に、上記タンパク質のうちの７．５％未満である方法を開示する。
【００４８】
ある実施形態において、本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質製剤中のフラグメント化を阻害する方法であって、上記方法は、ヒスチジンおよびマンニトールを上記製剤に添加する工程を包含し、ここで上記製剤中のフラグメント化分子の含有量は、３０℃で２週間の貯蔵の際に、上記タンパク質のうちの３％未満、好ましくは１％未満、より好ましくは０．５％未満である方法を開示する。
【００４９】
ある実施形態において、本発明は、１２５ｍｇ／ｍｌのＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質、リン酸塩緩衝剤、７５ｍｇ／ｍｌのマンニトール、１５ｍｇ／ｍｌのヒスチジンおよび８ｍｇ／ｍｌのポロキサマーを含むＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質分子の安定な薬学的製剤を開示する。
【００５０】
ある実施形態において、本発明は、１２５ｍｇ／ｍｌのＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質、リン酸塩緩衝剤、８５ｍｇ／ｍｌのマンニトール、１０ｍｇ／ｍｌのヒスチジンおよび８ｍｇ／ｍｌのポロキサマーを含むＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質分子の安定な薬学的製剤を開示する。
【００５１】
別の実施形態において、本発明は、製剤中のＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質のコロイド安定性を維持する方法であって、上記方法は、ヒスチジンおよびポリオールを上記製剤に添加する工程を包含する方法を開示する。
【００５２】
別の実施形態において、本発明は、製剤中のＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質の酸化を低減する方法であって、上記方法は、ヒスチジンおよびポリオールを添加する工程を包含する方法を開示する。
【００５３】
本発明の上記の実施形態のうちのいずれかにおいて、上記製剤は、安定な液体／水性製剤であり、凍結乾燥粉末のために適切であり、凍結乾燥粉末として凍結乾燥され得る。さらに、上記ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質の凍結乾燥製剤は、投与に適した液体製剤を達成するために適切な希釈剤で再構成される。
【００５４】
上述の実施形態のうちのいずれかにおいて、上記ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質は、アバタセプトまたはベラタセプトである。
【００５５】
上記で述べられた実施形態のうちのいずれかにおいて、上記製剤に存在するアミノ酸は、安定化剤として機能し、緩衝化剤の一部を形成しない。
【００５６】
別の実施形態において、本発明は、緩衝剤、ポリオール、ヒスチジンおよび界面活性剤を含むＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質製剤の安定性を増大する方法であって、ここでヒスチジンおよびポリオールはまた、タンジェンシャルフロー濾過工程［生成物濃縮および緩衝剤交換のために限外濾過（ＵＦ）および透析濾過（ＤＦ）として行われる］である前製剤化プロセス工程において添加される方法を開示する。
【００５７】
別の実施形態において、本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質組成物の安定性を増大させる方法であって、ここで上記方法は、ヒスチジンおよびマンニトールを上記プロセス工程の間に、特に、タンジェンシャルフロー濾過工程において添加する工程を包含する方法を開示する。上記タンパク質分子の安定性は、ヒスチジンおよびマンニトール構成要素を、タンジェンシャルフロー濾過工程において、具体的には、限外濾過および／または透析濾過工程において添加する場合に、熱安定性およびコロイド安定性において顕著に増大されることが見出される。
【００５８】
さらに別の実施形態において、本発明は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質の安定性を増大させる方法であって、上記方法は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質を発現および精製する工程；続いて、ＵＦ−ＤＦ−ＵＦによって上記タンパク質を濃縮および／または緩衝剤交換する工程であって、ここで上記ＵＦ−ＤＦ−ＵＦ工程のうちのいずれかにおいて使用される緩衝剤は、ヒスチジンおよびマンニトールを含む工程；続いて、ヒスチジン、マンニトールおよび界面活性剤を含む緩衝剤中で上記タンパク質を製剤化する工程を包含し；ここで上記タンパク質の安定性は、その緩衝剤のうちのいずれにおいてもヒスチジンおよびマンニトールを含まないＵＦ−ＤＦ−ＵＦ工程によって処理したタンパク質の製剤と比較して増大される方法を開示する。
【００５９】
ある実施形態において、本発明は、安定な高濃度ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質製剤を調製する方法であって、上記方法は、
ａ）精製ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質分子をクロマトグラフィー工程から得る工程、
ｂ）工程ａ）から得たＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質を、限外濾過［ＵＦ］に供して、上記タンパク質を濃縮する工程、
ｃ）工程ｂ）から得た濃縮ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質を、マンニトールおよびヒスチジンを含む緩衝剤を使用する透析濾過に供する工程、ならびに
ｄ）工程ｃ）からのＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質分子を、第２の限外濾過に供して、さらに高度に濃縮されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質薬物物質を得る工程であって、ここで工程ｄ）において得られる製剤の濃度は、２００ｍｇ／ｍｌまでであり、標準的安定性試験によって測定される場合に安定であることが見出される工程、
を包含する方法を開示する。
【００６０】
上記タンパク質分子の安定性は、ヒスチジンおよびマンニトール構成要素がタンジェンシャルフロー濾過工程において添加される場合に、熱安定性およびコロイド安定性において顕著に増大されることが見出される。そして上記ＵＦまたはＤＦ工程におけるヒスチジンおよびマンニトールの添加は、安定な生成物を生じ、％  ＨＭＷは、加速安定性試験に供された後にすら、一貫して１０未満である。
【００６１】
上述の実施形態において、上記プロセスから得られた薬物物質は安定であり、上記薬物物質から調製した薬物生成物は、加速安定性条件下で安定であり、ここで上記薬物生成物の濃度は、１４０ｍｇ／ｍｌまで、好ましくは１３０ｍｇ／ｍｌである。ＴＦＦプロセスのＤＦ工程の間のヒスチジンおよび糖の添加は、安定で可溶性のより高濃度のＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質分子（約２００ｍｇ／ｍｌまで）を達成する助けとなり、延いては、単純な希釈技術によって産業スケールでの所望の濃度の薬物生成物の調製の助けとなる。これはさらに、時間および資源を節約する。
【００６２】
上記で述べられた実施形態において、ヒスチジンおよびポリオールが、ＵＦまたはＤＦの前製剤化プロセス工程に添加される場合、製剤化したタンパク質は、３０℃で少なくとも２週間貯蔵した場合にすら、タンパク質の１０％未満を凝集物形態で含む。
【００６３】
アミノ酸のみを含む（および糖もポリオールもない）開示される融合タンパク質製剤は、上記タンパク質を安定化しない。それに対して、アミノ酸を含む製剤へのマンニトールの添加は、安定化効果を示す。さらに、マンニトールは、上記製剤混合物中のアミノ酸の組み合わせの使用を可能にする。しかし、驚くべきことに、逆に、スクロースベースの融合タンパク質（ＣＴＬＡ４−Ｉｇ）製剤は、マンニトールより優れた安定化を発揮せず、アミノ酸の組み合わせの使用に有利でなく、代わりに、上記タンパク質に対して不安定化効果を示す。
【００６４】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質の上記に開示される製剤は、非経口投与のために使用され得る、安定な液体な（水性）製剤である。非経口投与としては、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内投与、または概して非経口投与の範囲内に入ると考えられかつ当業者に周知であるとおりの任意の他の送達経路が挙げられる。
【００６５】
本発明の開示される製剤は、治療用融合タンパク質分子を安定化させるために最小限の賦形剤をより少ない量で使用する。
【００６６】
本発明の開示される製剤は、治療用融合タンパク質分子を製剤化するためにより少ない量の糖アルコールを使用する。そして緩衝剤、ポリオール、アミノ酸および界面活性剤を含むＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質製剤の開示される製剤は、安定であり、多数の凍結融解サイクルおよび撹拌誘導性ストレスにも耐え得る。
【００６７】
開示される発明、すなわち、融合タンパク質、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（アバタセプト）の製剤は、ヒスチジンおよびマンニトールの組み合わせによって主に安定化される。驚くべきことに、上記製剤へのスクロースまたは任意の他のアミノ酸の添加は、実際に、上記融合タンパク質の安定性を改善しない。融合タンパク質であり、本質的にダイマーであるアバタセプトは、複雑な分子であり、凝集しやすく、酸化しやすいが、予測外にも、アミノ酸ヒスチジン（およびポリオール）によってのみ安定化される。
【実施例】
【００６８】
本発明の薬学的組成物での貯蔵に適したＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質分子、アバタセプトは、当該分野で公知の標準的方法によって生成される。例えば、アバタセプトは、チャイニーズハムスター卵巣細胞のような哺乳動物宿主細胞でのヒトＩｇＧのＣＨ２およびＣＨ３タンパク質に融合されたＣＴＬＡ４の組換え発現によって調製される。さらに、上記発現されたアバタセプトは採取され、その粗製採取物は、精製、濾過および必要に応じて、希釈工程または濃縮工程を含む標準的な下流のプロセス工程に供される。例えば、上記アバタセプトの粗製採取物は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよびこれらの組み合わせのような標準的クロマトグラフィー技術を使用して精製され得る。その精製されたアバタセプト溶液はさらに、１またはこれより多くの濾過工程に供され得、その得られた溶液は、さらなる製剤化試験に供される。
【００６９】
実施例１：  アバタセプトを製剤化するために適した緩衝剤のスクリーニングおよび選択
アバタセプトを安定化するために適した緩衝剤を選択するために、種々の緩衝剤を調製した。下流のクロマトグラフィープロセスから得られるリン酸塩緩衝剤バックグラウンド中の４０ｍｇ／ｍｌのアバタセプトを、緩衝剤交換し、それぞれの異なる緩衝剤バックグラウンドにおいて２５ｍｇ／ｍｌに希釈した。製剤の詳細を表１に示す。
【００７０】
全アバタセプト製剤を、２５℃および４０℃で４週間にわたる加速安定性試験に供した。その後、上記サンプルを、高分子量（ＨＭＷ）種および低分子量（ＬＭＷ）種［結果を表２および３に示す］についてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して分析し、また、ｐＨの変化［表４］および目視検査［表５］に関してチェックした。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【００７１】
実施例２：  糖およびアミノ酸の存在下での高濃度アバタセプト（約１２５ｍｇ／ｍｌ）製剤
下流のプロセスのタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）工程から得られるリン酸塩緩衝剤バックグラウンド中のおよそ１２０ｍｇ／ｍｌのアバタセプトを、それぞれの緩衝剤バックグラウンドにおいて緩衝剤交換した。その後、種々の賦形剤（例えば、糖およびアミノ酸）を、異なる組み合わせおよび濃度において高濃度アバタセプト製剤に添加した。製剤の詳細を表６に示す。ＦＤＡ承認のアバタセプトの皮下製剤は、リン酸塩緩衝剤、１７０ｍｇ／ｍｌのスクロースおよびポロキサマーを含む。よって、参照標準を、リン酸塩緩衝剤バックグラウンドにおいて約１２０ｍｇ／ｍｌのインハウスのアバタセプトに維持するために、１７０ｍｇ／ｍｌ  スクロースおよび８ｍｇ／ｍｌのポロキサマーを上記製剤に添加した。
【００７２】
全ての高濃度アバタセプト製剤を、３０℃で２週間の加速安定性試験に供した。その後、上記サンプルを、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して高分子量（ＨＭＷ）種に関して分析し［結果を表７に示す］、ｐＨ［表８］および目視検査［表９］における変化についてもチェックした。３３３ｎｍでのタンパク質サンプルの光散乱をまた、ナノ液滴を使用してチェックした。結果を表１０に示す。
【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【００７３】
実施例３：  高濃度ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質の安定性に関するタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）工程の間の賦形剤の添加
実施例２において、下流のクロマトグラフィー工程から得られる精製ＣＴＬＡ４−Ｉｇを、リン酸塩緩衝剤へとさらに緩衝剤交換し、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって濃縮した。その後、賦形剤を、上記製剤に添加した。しかし、この従来のストラテジーとは異なり、種々の糖（例えば、スクロースおよびマンニトール）およびアミノ酸（例えば、ヒスチジンおよびグリシン）を、ＴＦＦ自体の間（すなわち、上記製剤化工程の前または上記タンパク質を薬物生成物として製剤化する前）に組み込んだ。クロマトグラフィー工程から得られる酢酸塩緩衝剤中８〜１５ｍｇ／ｍｌ  濃度のアバタセプト融合タンパク質を、限外濾過に供して、６０ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。その後、上記サンプルを、透析濾過に供し、ここで透析濾過媒体は、賦形剤（例えば、糖およびアミノ酸）なしおよびありのリン酸塩緩衝剤（製剤緩衝剤）を含み、別の別個の実験では、リン酸塩緩衝剤中の糖およびアミノ酸なしの上記透析濾過媒体を実験した。透析濾過後、上記サンプルを、第２の限外濾過に供して、１８０ｍｇ／ｍｌ〜２００ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。これらの高濃度サンプルは、いかなる目に見える粒子／凝集物なしに安定であることが見出された。上記高濃縮サンプルを、１２５ｍｇ／ｍｌへとさらに希釈し、賦形剤（例えば、糖、界面活性剤および必要に応じてグリシンのようなアミノ酸）のうちのいくつかを添加して、最終製剤を調製した。８ｍｇ／ｍｌのポロキサマーを、全ての最終製剤に添加した。製剤の詳細を表１１に示す。その後、全サンプルを、３０℃で２週間の加速安定性試験に供した。上記サンプルを、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して高分子量（ＨＭＷ）種および活性ダイマー形態に関して分析し［結果を表１２に示す］、ｐＨ［表１３］および目視検査［表１４］における変化についてもチェックした。
【表１１−１】
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【表１１−２】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【００７４】
実施例３に従って調製した上記アバタセプト製剤のうちのいくつか（Ａｂａ−ＳＣ−１４およびＡｂａ−ＳＣ−１８）の粘性を、ｍ−ＶＲＯＣ（登録商標）粘度計を使用して測定したところ、上記製剤（Ａｂａ−ＳＣ−１４およびＡｂａ−ＳＣ−１８）の粘性は、９．０ｍＰａ／Ｓであることが見出された。
【００７５】
実施例４：  高濃度アバタセプトタンパク質製剤のコロイド安定性
アバタセプト、糖およびアミノ酸を含む製剤を、動的光散乱（ＤＬＳ）に供して、拡散係数、アバタセプトの溶解度を示す流体力学的直径を測定した。次に、ＤＬＳ測定値は、タンパク質分子のコロイド安定性についての情報を与える。その結果を表１５に表す。
【表１５】
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【国際調査報告】
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