(57)【要約】  膜貫通−細胞内ストレッチに、任意選択でフレキシブルヒンジを介して連結されたホモ二量体ＩＬ−１０をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子が、その核酸分子を含み、発現する哺乳類の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）及びその使用と共に提供される。
2021519107.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜貫通−細胞内ストレッチに連結されたホモ二量体ＩＬ−１０を含む、膜結合型ホモ二量体ＩＬ−１０（ｍｅｍ−ＩＬ１０）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項２】
前記ホモ二量体ＩＬ−１０は、前記膜貫通−細胞内ストレッチにフレキシブルヒンジを介して連結されている、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記ホモ二量体ＩＬ−１０は、第１のＩＬ−１０モノマーのＣ末端が第１のフレキシブルリンカーを介して第２のＩＬ−１０モノマーのＮ末端に連結されるように単鎖構成で連結された第１及び第２のＩＬ−１０モノマーを含む、請求項１又は２に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記第１のフレキシブルリンカーは、アミノ酸配列ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号１）を有する、請求項３に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記フレキシブルヒンジは、ＣＤ８αのヒンジ領域、ＩｇＧの重鎖のヒンジ領域、ＩｇＤの重鎖のヒンジ領域、ＩＬ−１０Ｒβ鎖の細胞外ストレッチ、及び少なくとも１つのＧｌｙ４Ｓｅｒ（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２配列を含む最大２８アミノ酸のアミノ酸配列を含む第２のフレキシブルリンカーから選択されるポリペプチドを含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項６】
前記第２のフレキシブルヒンジは、アミノ酸配列Ｇｌｙ４Ｓｅｒ（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２（配列番号１３；本願では「短いリンカー」と呼ぶ）を含む２１アミノ酸配列を含む、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】
前記第２のフレキシブルリンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ４Ｓｅｒ（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２Ｓｅｒ２（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）３（配列番号１５；本願では「長いリンカー」と呼ぶ）を含む２８アミノ酸配列を含む、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項８】
前記ポリペプチドは、配列ＳＳＱＰＴＩＰＩ（配列番号１７；）のアミノ酸ブリッジをさらに含む、請求項５〜７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項９】
前記膜貫通−細胞内ストレッチは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ又はＨＬＡ−Ｃ分子、好ましくはＨＬＡ−Ａ２；ヒトＣＤ２８；又はヒトＩＬ−１０Ｒβ鎖から選択されるヒトＭＨＣクラスＩ分子の重鎖に由来する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１０】
完全なｍｅｍ−ＩＬ１０のアミノ酸配列は、配列番号２５に示されるように、短い第２のフレキシブルリンカー及び連結ペプチドを介してＨＬＡ−Ａ２の膜貫通−細胞内ストレッチに連結されたホモ二量体ＩＬ−１０を含むか、又は本質的にそれからなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１１】
完全なｍｅｍ−ＩＬ１０のアミノ酸配列は、配列番号２７に示されるように、長い第２のフレキシブルリンカー及び連結ペプチドを介してＨＬＡ−Ａ２の膜貫通−細胞内ストレッチに連結されたホモ二量体ＩＬ−１０を含むか、又は本質的にそれからなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１２】
ホモ二量体ＩＬ−１０は、配列番号２９に示されるように、短いリンカーを介して本質的に完全なヒトＩＬ−１０Ｒβ鎖のＮ末端に連結される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の核酸分子を含む組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の核酸分子を含むウイルスベクター。
【請求項１５】
レトロウイルス、レンチウイルス、ガンマウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、及びヘルペスウイルスから選択されるウイルスに由来する改変ウイルスである、請求項１４に記載のウイルスベクター。
【請求項１６】
請求項１４又は１５に記載のウイルスベクターを含む組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の核酸分子、あるいは請求項１４又は１５に記載のウイルスベクターを含む哺乳類調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）。
【請求項１８】
膜貫通−細胞内ストレッチに連結されているホモ二量体ＩＬ−１０を表面に発現する、請求項１７に記載の哺乳類Ｔｒｅｇ。
【請求項１９】
ヒトＴｒｅｇである、請求項１７又は１８に記載の哺乳類Ｔｒｅｇ。
【請求項２０】
細胞表面マーカーＣＤ４９ｂ及びＬＡＧ−３を提示する安定なＴｒ１表現型を有する、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の哺乳類Ｔｒｅｇ。
【請求項２１】
ＰＤ−１、４−１ＢＢ、ＣＤ２５及びＩＬ−１０Ｒαをさらに提示する、請求項２０に記載の哺乳類Ｔｒｅｇ。
【請求項２２】
安定なＴｒ１表現型を有する同種異系又は自己Ｔｒｅｇを調製する方法であって、ＣＤ４Ｔ細胞を、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の核酸分子、又はそれを含むウイルスベクターと接触させることにより前記ＣＤ４Ｔ細胞に安定なＴｒ１表現型を付与することで、安定なＴｒ１表現型を有するＴｒｅｇを調製することを含む方法。
【請求項２３】
必要とする対象において免疫抑制を高めるために使用するための、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の哺乳類Ｔｒｅｇ。
【請求項２４】
免疫系の過剰な又は他の望ましくない活性として現れる疾患、障害又は状態の治療又は予防に使用するための、２３に記載の哺乳類Ｔｒｅｇ。
【請求項２５】
前記疾患、障害又は状態は、自己免疫疾患、アレルギー、喘息、ならびに臓器及び骨髄移植から選択される、請求項２４に記載の哺乳類Ｔｒｅｇ。
【請求項２６】
自己免疫疾患は、１型糖尿病；関節リウマチ；乾癬；乾癬性関節炎；多発性硬化症；全身性エリテマトーデス；クローン病や潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；アジソン病；グレーブス病；シェーグレン症候群；橋本甲状腺炎；重症筋無力症；血管炎；悪性貧血；セリアック病；及びアテローム性動脈硬化から選択される、請求項２５に記載の哺乳類Ｔｒｅｇ。
【請求項２７】
前記哺乳類ＴｒｅｇはヒトＴｒｅｇであり、ヒト対象における前記疾患、障害又は状態の治療又は予防に使用される、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の哺乳類Ｔｒｅｇ。
【請求項２８】
前記ヒトＴｒｅｇは同種異系Ｔｒｅｇである、請求項２７に記載の哺乳類Ｔｒｅｇ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、膜結合型ＩＬ１０を発現する遺伝子的にリプログラミングされた調節性Ｔ細胞、ならびに全身免疫抑制の増強における、及び免疫系の過剰な活性として現れる疾患の治療におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
局所炎症を抑制し、免疫バランスを回復するためにＣＤ４調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を利用することは、自己免疫疾患、炎症性腸疾患、アレルギー、アテローム性動脈硬化、移植拒絶、移植片対宿主病など、様々な病状の治療において非常に期待されるところである。しかしＴｒｅｇは、天然のもの（ｎＴｒｅｇ）であれ誘導型（ｉＴｒｅｇ）であれ、ヒトＣＤ４Ｔ細胞集団全体でわずかな割合しか形成しない。したがって、自己の又は同種異系のＴｒｅｇを十分な数でリクルートし、誘導し、又は操作するためのＴｒｅｇベースの治療法の開発、及び治療の臨床的有効性と安全性にとって重要な安定した表現型が差し迫って必要である。
【発明の概要】
【０００３】
一態様では、本発明は、膜貫通−細胞内ストレッチに任意選択でフレキシブルヒンジを介して連結された、本願でｍｅｍ−ＩＬ１０と呼ぶホモ二量体ＩＬ−１０をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。
【０００４】
異なる態様では、本発明は、本明細書で定義される膜貫通−細胞内ストレッチに連結されたホモ二量体ＩＬ−１０をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む組成物を提供する。
【０００５】
さらなる態様では、本発明は、上記で定義する膜貫通−細胞内ストレッチに連結されたホモ二量体ＩＬ−１０をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子のいずれか１つを含むウイルスベクターを提供する。
【０００６】
別の態様では、本発明は、上記で定義するウイルスベクターを含む組成物を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、上記で定義する核酸分子のいずれか１つ、又は上記で定義するウイルスベクターを含む哺乳類調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を提供する。
【０００７】
さらに追加の態様では、本発明は、安定なＴｒ１表現型を有する同種異系又は自己Ｔｒｅｇを調製する方法を提供し、この方法は、ＣＤ４Ｔ細胞を、上記で定義するホモ二量体ＩＬ−１０をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、又はそれを含むウイルスベクターと接触させることにより前記ＣＤ４Ｔ細胞に安定なＴｒ１表現型を付与することで、安定なＴｒ１を有するＴｒｅｇを調製することを含む。
【０００８】
さらに追加の態様では、本発明は、上記で定義するホモ二量体膜結合型ＩＬ−１０をその表面で発現する哺乳類Ｔｒｅｇを対象に投与することを含む、必要とする対象において免疫抑制を高める方法を提供する。
【０００９】
特定の実施形態では、本発明は、上記で定義するホモ二量体ＩＬ−１０をその表面に発現する哺乳類Ｔｒｅｇを対象に投与することを含む、対象における疾患、障害又は状態を治療又は予防する方法を提供し、前記疾患、障害又は状態は、自己免疫疾患、アレルギー、喘息、ならびに臓器及び骨髄移植などの免疫系の過剰な又は他の望ましくない活性として現れる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】膜アンカー型ホモ二量体ＩＬ−１０の模式図を示す。
【図２Ａ】Ｔ細胞におけるｍｅｍＩＬ−１０発現の分析、及びＣＤ４９ｂに対するその効果を示す。ヒトジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞に、ヒトｍｅｍＩＬ−１０をコードする１０μｇのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ｍＲＮＡをエレクトロポレーションした。トランスフェクションの２４時間後にフローサイトメトリーで細胞を分析した。ヒトｍｅｍＩＬ−１０及びヒトＣＤ４９ｂを、それぞれのヒトタンパク質に特異的なモノクローナル抗体によってそれぞれ分析した。
【図２Ｂ】Ｔ細胞におけるｍｅｍＩＬ−１０発現の分析、及びＩＬ−１０受容体（ＩＬ−１０Ｒ）に対するその効果を示す。ヒト初代末梢血リンパ球由来ＣＤ４Ｔ細胞に、ヒトｍｅｍＩＬ−１０をコードする１０μｇのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ｍＲＮＡをエレクトロポレーションした。トランスフェクションの２４時間後にフローサイトメトリーで細胞を分析した。ヒトｍｅｍＩＬ−１０及びＩＬ−１０Ｒを、それぞれのヒトタンパク質に特異的なモノクローナル抗体によってそれぞれ分析した。
【図２Ｃ】Ｔ細胞におけるｍｅｍＩＬ−１０発現の分析を示す。マウスＢ３Ｚ細胞に、マウスｍｅｍＩＬ−１０をコードする１０μｇのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ｍＲＮＡをエレクトロポレーションした。トランスフェクションの２４時間後にフローサイトメトリーで細胞を分析した。マウスｍｅｍＩＬ−１０を、それぞれのマウスタンパク質に特異的なモノクローナル抗体によってそれぞれ分析した。
【図２Ｄ】Ｔ細胞におけるｍｅｍＩＬ−１０発現の分析、及びＩＬ−１０受容体（ＩＬ−１０Ｒ）に対するその効果を示す。マウスＮＯＤ脾臓ＣＤ４Ｔ細胞に、マウスｍｅｍＩＬ−１０をコードする１０μｇのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ｍＲＮＡをエレクトロポレーションした。トランスフェクションの４８時間後（左及び右）にフローサイトメトリーで細胞を分析した。マウスｍｅｍＩＬ−１０及びＩＬ−１０Ｒを、それぞれのマウスタンパク質に特異的なモノクローナル抗体によってそれぞれ分析した。
【図３Ａ】その細胞表面受容体に結合した天然ＩＬ−１０ホモ二量体の模式図を示す。
【図３Ｂ】膜アンカー型ＩＬ−１０（ｍｅｍ−ＩＬ１０）の誘導体であって、短いリンカーを有するｍｅｍ−ＩＬ１０の模式図を示す。
【図３Ｃ】膜アンカー型ＩＬ−１０（ｍｅｍ−ＩＬ１０）の誘導体であって、長いリンカーを有するｍｅｍ−ＩＬ１０の模式図を示す。
【図３Ｄ】膜アンカー型ＩＬ−１０（ｍｅｍ−ＩＬ１０）の誘導体であって、ＩＬ−１０Ｒβに連結されたｍｅｍ−ＩＬ１０（ＩＬ−１０Ｒβ融合）の模式図を示す。
【図４】ｍＲＮＡエレクトロポレーションの２４時間後のジャーカット細胞における３つのｍｅｍＩＬ−１０誘導体の細胞表面発現を示す。ヒトジャーカットＣＤ４Ｔ細胞に、１０μｇの指示されたｍＲＮＡをそれぞれエレクトロポレーションした（ｓＬ及びｌＬは、それぞれ短いリンカー及び長いリンカーを表す）。２４時間の細胞を、ＩＬ−１０の表面発現についてフローサイトメトリーにより分析した。
【図５Ａ】ＣＤ４Ｔ細胞におけるｍｅｍＩＬ−１０発現がＳＴＡＴ３の自発的リン酸化を誘導することを示す。マウスＣＤ４Ｔ細胞に、無関係なｍＲＮＡ（Ｉｒｒ．ｍＲＮＡ）、短いリンカーｍｅｍＩＬ−１０（ｓＬｍｅｍＩＬ−１０）、長いリンカーｍｅｍＩＬ−１０（ｌＬｍｅｍＩＬ−１０）、又はＩＬ−１０Ｒβ鎖に連結されたＩＬ−１０（ｍｅｍＩＬ−１０Ｒβ）をコードするｍＲＮＡをエレクトロポレーションするか、又は２０ｎｇ／ｍｌの可溶性組換えＩＬ−１０（ｓＩＬ−１０）で処理した。２４時間後、細胞を表面ＩＬ−１０についてフローサイトメトリー分析した。
【図５Ｂ】ＣＤ４Ｔ細胞におけるｍｅｍＩＬ−１０発現がＳＴＡＴ３の自発的リン酸化を誘導することを示す。マウスＣＤ４Ｔ細胞に、無関係なｍＲＮＡ（Ｉｒｒ．ｍＲＮＡ）、短いリンカーｍｅｍＩＬ−１０（ｓＬｍｅｍＩＬ−１０）、長いリンカーｍｅｍＩＬ−１０（ｌＬｍｅｍＩＬ−１０）、又はＩＬ−１０Ｒβ鎖に連結されたＩＬ−１０（ｍｅｍＩＬ−１０Ｒβ）をコードするｍＲＮＡをエレクトロポレーションするか、又は２０ｎｇ／ｍｌの可溶性組換えＩＬ−１０（ｓＩＬ−１０）で処理した。２４時間後、細胞を表面ＩＬ−１０Ｒα鎖についてフローサイトメトリー分析した。
【図５Ｃ】ＣＤ４Ｔ細胞におけるｍｅｍＩＬ−１０発現がＳＴＡＴ３の自発的リン酸化を誘導することを示す。マウスＣＤ４Ｔ細胞に、無関係なｍＲＮＡ（Ｉｒｒ．ｍＲＮＡ）、短いリンカーｍｅｍＩＬ−１０（ｓＬｍｅｍＩＬ−１０）、長いリンカーｍｅｍＩＬ−１０（ｌＬｍｅｍＩＬ−１０）、又はＩＬ−１０Ｒβ鎖に連結されたＩＬ−１０（ｍｅｍＩＬ−１０Ｒβ）をコードするｍＲＮＡをエレクトロポレーションするか、又は２０ｎｇ／ｍｌの可溶性組換えＩＬ−１０（ｓＩＬ−１０）で処理した。２４時間後、細胞を細胞内リン酸化ＳＴＡＴ３（ｐＳＴＡＴ３）についてフローサイトメトリー分析した。
【図６Ａ】ｍｅｍＩＬ−１０を発現するレトロウイルス形質導入マウスＣＤ４Ｔ細胞の分析を示す。形質導入後４８時間の、短いリンカーｍｅｍＩＬ−１０形質導入マウスＣＤ４Ｔ細胞（ｖ−ｍｅｍｌＬ−１０）の表現型分析。分析は、同じ細胞培養で増殖しているｍｅｍＩＬ−１０（＋）及びｍｅｍｌＬ−１０（−）細胞で並行して行い、ＬＡＧ−３、ＣＤ４９ｂ、及びＰＤ−１を染色した。陽性対照として、形質導入していない細胞を可溶性ＩＬ−１０（ｓＩＬ−１０）で処理した。Ｍｏｃｋは、レトロウイルス形質導入細胞と同じプロトコルで処理しているが、ウイルス粒子に曝露していない細胞である。
【図６Ｂ】ｍｅｍＩＬ−１０を発現するレトロウイルス形質導入マウスＣＤ４Ｔ細胞の分析を示す。形質導入後６日の、短いリンカーｍｅｍＩＬ−１０形質導入マウスＣＤ４Ｔ細胞（ｖ−ｍｅｍｌＬ−１０）の表現型分析。分析は、同じ細胞培養で増殖しているｍｅｍＩＬ−１０（＋）及びｍｅｍｌＬ−１０（−）細胞で並行して行い、ＬＡＧ−３、ＣＤ４９ｂ、及びＰＤ−１を染色した。陽性対照として、形質導入していない細胞を可溶性ＩＬ−１０（ｓＩＬ−１０）で処理した。Ｍｏｃｋは、レトロウイルス形質導入細胞と同じプロトコルで処理しているが、ウイルス粒子に曝露していない細胞である。
【図７】活性化されたｍｅｍＩＬ−１０形質導入マウスＣＤ４Ｔ細胞によるＩＬ−１０の分泌を示す。図６と同じ実験からの細胞を抗ＴＣＲ−ＣＤ３ｍＡｈ（２Ｃ１１）で刺激し、その増殖培地をＩＬ−１０ＥＬＩＳＡにかけた。Ｍｏｃｋ及びＧＦＰ形質導入Ｔ細胞を陰性対照とする。
【図８Ａ】ｍｅｍＩＬ−１０形質導入ヒトＣＤ４Ｔ細胞の表現型の特徴解析を示す。ＣＤ４Ｔ細胞を、健康なドナーの血液サンプルから用意した末梢血単核細胞から磁気ビーズによって分離した。細胞を抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体及びＩＬ−２の存在下で目的の数まで増殖させ、ｍｅｍＩＬ−１０又は無関係の遺伝子（Ｉｒｒ．）をコードする組換えレトロウイルスで形質導入するか、又は可溶性ＩＬ−１０（ｓＩＬ−１０）で処理した。細胞をＩＬ−２の存在下で増殖させ、１日目に、示された細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析のためにサンプルを採取した。ｍｅｍＩＬ−１０（陽性、実線枠）を発現する細胞を、ＩＬ−１０を発現しない同じ培養からの細胞（陰性、点線枠）と並べて分析した。
【図８Ｂ】ｍｅｍＩＬ−１０形質導入ヒトＣＤ４Ｔ細胞の表現型の特徴解析を示す。ＣＤ４Ｔ細胞を、健康なドナーの血液サンプルから用意した末梢血単核細胞から磁気ビーズによって分離した。細胞を抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体及びＩＬ−２の存在下で目的の数まで増殖させ、ｍｅｍＩＬ−１０又は無関係の遺伝子（Ｉｒｒ．）をコードする組換えレトロウイルスで形質導入するか、又は可溶性ＩＬ−１０（ｓＩＬ−１０）で処理した。細胞をＩＬ−２の存在下で増殖させ、５日目に、示された細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析のためにサンプルを採取した。ｍｅｍＩＬ−１０（陽性、実線枠）を発現する細胞を、ＩＬ−１０を発現しない同じ培養からの細胞（陰性、点線枠）と並べて分析した。
【図８Ｃ】ｍｅｍＩＬ−１０形質導入ヒトＣＤ４Ｔ細胞の表現型の特徴解析を示す。ＣＤ４Ｔ細胞を、健康なドナーの血液サンプルから用意した末梢血単核細胞から磁気ビーズによって分離した。細胞を抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体及びＩＬ−２の存在下で目的の数まで増殖させ、ｍｅｍＩＬ−１０又は無関係の遺伝子（Ｉｒｒ．）をコードする組換えレトロウイルスで形質導入するか、又は可溶性ＩＬ−１０（ｓＩＬ−１０）で処理した。細胞をＩＬ−２の存在下で増殖させ、１８日目に、示された細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析のためにサンプルを採取した。１８日目に、非形質導入Ｔｒｅｇを分析に加えて、細胞表面マーカーを比較した。ｍｅｍＩＬ−１０（陽性、実線枠）を発現する細胞を、ＩＬ−１０を発現しない同じ培養からの細胞（陰性、点線枠）と並べて分析した。
【図９】ｍｅｍＩＬ−１０形質導入ヒトＣＤ４Ｔ細胞の表現型を調べた第２の実験を示す。細胞を準備し、ｍｅｍＩＬ−１０で形質導入し、４日後、示されたマーカーについて図８の説明文に記載されているように分析した。非形質導入（ナイーブ）及び偽形質導入（Ｍｏｃｋ）ＣＤ４細胞を陰性対照とした。ＭｅｍＩＬ−１０陽性細胞を、同じ培養からのｍｅｍＩＬ−１０陰性細胞と、ならびに５０、１００又は３００ｎｇ／ｍｌのｓＩＬ−１０の存在下で増殖させたナイーブＣＤ４Ｔ細胞と比較した。各サンプルにおける陽性染色細胞の％が示されている。Ｄｏｕｂｌｅ  ｐｏｓは、ＬＡＧ−３及びＣＤ４９ｂで陽性に染色された細胞の％である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明に従って、膜結合型ＩＬ−１０を恒常的に発現するようにＴ細胞を遺伝子的にリプログラミングすることで、Ｔ細胞に安定なＴｒ１表現型が付与されることが見出された。
【００１２】
選択するＴｒｅｇ細胞の種類は、臨床導入を成功させるために非常に重要である。Ｔｒ１細胞はＣＤ４（＋）ＦｏｘＰ３（＋／−）Ｔｒｅｇのサブセットであり、ＩＬ−１０の存在下で樹状細胞上の抗原に慢性的に曝露させると、ＴＣＲ及び抗原特異的な態様で末梢に誘導される（１、２）。これらの細胞は、非増殖性（アネルギー）状態、ＩＬ−１０及びＴＧＦ−βの生産は高いが、ＩＬ−２の生産はごくわずかで、ＩＬ−４又はＩＬ−１７の生産はないこと、及び細胞間接触に依存しない態様でエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）を抑制する能力によって特徴づけられる。Ａｎｄｏｌｆｉらは、レンチウイルス形質導入により達成された、ヒトＣＤ４Ｔ細胞におけるＩＬ−１０の強制発現は、これらの細胞にオートクリン様式で安定なＴｒ１表現型を与えるのに十分であることを示した（３）。この研究はまた、これらの細胞をＩＬ−２に曝露すると、これらのＩＬ−１０誘導性Ｔｒ１細胞のアネルギー状態を一時的に逆転させることができることも示した。重要なことに、２つの細胞表面マーカーＣＤ４９ｂ及びＬＡＧ−３が同定されており、これらは、ヒト（及びマウス）Ｔｒ１細胞上に安定かつ選択的に共発現し、それらの単離と細胞集団の純度についてのフローサイトメトリー分析を可能にする（４）。
【００１３】
本発明は、ＩＬ−１０の膜アンカー型誘導体（ｍｅｍ−ＩＬ１０）をコードする遺伝子を提供する。天然のＩＬ−１０はホモ二量体であり（５、６）、本願において、その膜アンカー型形態に機能的なホモ二量体構成を付与すると、ＩＬ−１０に駆動される安全なロックが提供され、抗原刺激がないときのＩＬ−１０の分泌を回避しつつ、Ｔｒ１表現型の永続的な保存を確実にできることが見出された。安全性に関しては、ＩＬ−１０はＴ細胞の増殖をシグナル伝達しないため、ＩＬ−１０シグナル伝達経路の自律的な活性化は、無制御な細胞増殖のリスクを伴わない。
【００１４】
本発明では、膜ＩＬ−１０を発現するようにＴｒｅｇを改変することにより、免疫抑制を与えるための抗炎症効果を初めて達成した。さらに、ＩＬ−１０はＴ細胞の増殖を誘発しないため、自律的な細胞増殖や細胞の形質転換を誘発するリスクがなく、安定なウイルス形質導入を通じて恒常的に発現させることができる。
【００１５】
一態様では、本発明は、本願でｍｅｍ−ＩＬ１０と呼ぶ、任意選択でフレキシブルヒンジを介して膜貫通−細胞内ストレッチに連結されたホモ二量体ＩＬ−１０をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。
【００１６】
特定の実施形態において、単離された核酸分子は、ｍｅｍ−ＩＬ−１０を除いて、さらなる異なるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含まないが、プロモーター及びターミネーターなどのさらなる制御エレメントを含み得る。
【００１７】
特定の実施形態では、ホモ二量体ＩＬ−１０は、第１のＩＬ−１０モノマーのＣ末端が第１のフレキシブルリンカーを介して第２のＩＬ−１０モノマーのＮ末端に連結されるように単鎖構成で連結された第１及び第２のＩＬ−１０モノマーを含む。
【００１８】
フレキシブルペプチドリンカーは、当技術分野で周知である。研究者によって設計された経験的リンカーは一般に、その構造に応じて、例えば（７〜９）に定義されているように、フレキシブルリンカー、リジッドリンカー、及びｉｎ  ｖｉｖｏ切断可能リンカーの３つのカテゴリーに分類される。これらの文献はそれぞれ、参照によりそのすべてが本明細書に組み込まれる。
【００１９】
上記のように、第１のリンカーはフレキシブルリンカーであり、その構造は（７〜９）に開示されているリンカーのいずれかから選択される。原則として、フレキシビリティを提供するために、リンカーは概して小さく、非極性の（例えばＧｌｙ）又は極性の（例えばＳｅｒ又はＴｈｒ）アミノ酸、例えば、Ｇｌｙ及びＳｅｒ残基が交互に並ぶような基本的な配列で構成される。リンカー及び関連するホモ二量体ＩＬ−１０の溶解性は、帯電した残基、例えば２つの正に帯電した残基（Ｌｙｓ）と１つの負に帯電した残基（Ｇｌｕ）を含めることによって強化できる。リンカーは２から３１アミノ酸まで変化させることができ、各条件に最適化されているため、リンカーは連結されるパートナーの長さにおけるコンフォメーション又は相互作用に制約（例えば１２〜１８残基など）を課さない。
【００２０】
特定の実施形態では、第１のフレキシブルリンカーは、アミノ酸配列ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号１）を有する。特定の実施形態では、第１のフレキシブルリンカーは、ヌクレオチド配列によって、例えば、配列番号２に記載されるようにコードされる。
【００２１】
特定の実施形態では、フレキシブルヒンジは、以下のポリペプチド又はそのバリアントから選択されるポリペプチドを含む：
・ＣＤ８αのヒンジ領域（例えば、配列番号３に示されている；例えば配列番号４に示されているヌクレオチド配列によってコードされている）
・ＩｇＧの重鎖のヒンジ領域（例えば、配列番号５に示されている；例えば配列番号６に示されているヌクレオチド配列によってコードされている）
・ＩｇＤの重鎖のヒンジ領域（例えば、配列番号７に示されている；例えば配列番号８に示されているヌクレオチド配列によってコードされている）
・ＩＬ−１０Ｒβ鎖の細胞外ストレッチ（配列番号９に示されている；例えば配列番号１０に示されているヌクレオチド配列によってコードされている）；及び
・少なくとも１つのＧｌｙ４Ｓｅｒ（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２配列を含む、例えば、１つのＧｌｙ４Ｓｅｒ（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）配列（配列番号１１；例えば、配列番号１２に示されているヌクレオチド配列によってコードされている）、又は１つ又は２つのＳｅｒ残基が間に挿入された２つのＧｌｙ４Ｓｅｒ（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）配列を含む、最大２８アミノ酸のアミノ酸配列を含む第２のフレキシブルリンカー。
【００２２】
特定の実施形態では、第２のフレキシブルリンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ４Ｓｅｒ（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２（本願では「短いリンカー」と呼ばれ；配列番号１３；例えば、配列番号１４に示されるヌクレオチド配列によりコードされている）を含む２１アミノ酸配列を含む。
【００２３】
特定の実施形態では、第２のフレキシブルリンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ４Ｓｅｒ（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２Ｓｅｒ２（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）３（本願では「長いリンカー」と呼ばれ；配列番号１５；例えば、配列番号２２に示されるヌクレオチド配列によってコードされている）及び配列番号１６の連結ペプチドを含む２８アミノ酸スペーサーからなる。
【００２４】
特定の実施形態では、上記の実施形態のいずれか１つの第２のフレキシブルリンカーは、ＨＬＡ−Ａ２の連結ペプチドの膜近位部分に由来する配列ＳＳＱＰＴＩＰＩ（本願では「連結ペプチド」と呼ばれ；配列番号１７；例えば、配列番号１８のヌクレオチド配列によってコードされている）の８アミノ酸ブリッジをさらに含む。
【００２５】
特定の実施形態では、ｍｅｍ−ＩＬ１０の膜貫通−細胞内ストレッチは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ又はＨＬＡ−Ｃ分子、好ましくはＨＬＡ−Ａ２（例えば、配列番号１９に示される；例えば、配列番号２０に示されるヌクレオチド配列によりコードされる）；ヒトＣＤ２８（配列番号２１に示される；例えば、配列番号２２に示されるヌクレオチド配列によりコードされる）；又はヒトＩＬ−１０Ｒβ鎖（配列番号２３に示される；例えば配列番号２４に示されるヌクレオチド配列によりコードされる）から選択されるヒトＭＨＣクラスＩ分子の重鎖に由来する。
【００２６】
特定の実施形態では、完全なｍｅｍ−ＩＬ１０のアミノ酸配列は、配列番号２５に示される；例えば配列番号２６に示されるヌクレオチド配列によってコードされる、短い第２のフレキシブルリンカー及び連結ペプチドを介してＨＬＡ−Ａ２の膜貫通−細胞内ストレッチに連結されたホモ二量体ＩＬ−１０を含むか、又は本質的にそれからなる。
【００２７】
特定の実施形態では、完全なｍｅｍ−ＩＬ１０のアミノ酸配列は、配列番号２７に示される；例えば配列番号２８に示されるヌクレオチド配列によってコードされる、長い第２のフレキシブルリンカー及び連結ペプチドを介してＨＬＡ−Ａ２の膜貫通−細胞内ストレッチに連結されたホモ二量体ＩＬ−１０を含むか、又は本質的にそれからなる。
【００２８】
特定の実施形態では、ｍｅｍ−ＩＬ−１０は、第２のフレキシブルリンカーを介して（例えば、配列番号９に示されるように）ＩＬ−１０Ｒβ細胞外ドメインに融合され、任意選択でさらに（例えば、配列番号２３に示されるように）ＩＬ−１０Ｒβ膜貫通及び細胞質ドメインに融合される。
【００２９】
特定の実施形態では、ｍｅｍ−ＩＬ−１０は、（配列番号２９に示されるように；例えば、配列番号２３に示されるヌクレオチド配列によりコードされるように）短いリンカーを介して本質的に完全なＩＬ−１０Ｒβ鎖のＮ末端に融合される。
【００３０】
本発明の核酸分子によってコードされる本発明のｍｅｍ−ＩＬ１０を構成するポリペプチドは、特定のアミノ酸配列によって本明細書で定義されるものに限定されず、これらのオリゴペプチドのバリアントであってもよいし、上記に開示されたものと実質的に同一のアミノ酸配列を有してもよい。本願で使用する「実質的に同一」のアミノ酸配列は、１つ又は複数の保存的又は非保存的アミノ酸置換、欠失、又は挿入によって参照配列と異なり、特にそのような置換が分子の活性部位ではない部位で起こり、ポリペプチドがその機能的特性を本質的に保持している場合の配列を指す。保存的アミノ酸置換は、例えば、あるアミノ酸を同じクラスの別のアミノ酸で置換する。例えば、ある疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸で置換し、極性アミノ酸を別の極性アミノ酸で置換し、塩基性アミノ酸を別の塩基性アミノ酸で置換し、酸性アミノ酸と別の酸性アミノ酸で置換する。１つ又は複数のアミノ酸をペプチドから削除することができ、したがって、その生物学的活性を著しく変化させることなく、そのフラグメントを得ることができる。
【００３１】
特定の実施形態において、完全な膜結合型ＩＬ−１０のアミノ酸配列、又は上記に開示されるような膜結合型ＩＬ−１０の様々なサブ領域の各々、すなわち、第１及び第２のＩＬ−１０モノマーが第１のフレキシブルリンカーを介して単鎖構成で連結されているホモ二量体ＩＬ−１０；第１のフレキシブルリンカー自体、フレキシブルヒンジ；及び膜貫通−細胞内ストレッチは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、又は２９と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、又は少なくとも９８％同一である。
【００３２】
特定の実施形態において、完全な膜結合型ＩＬ−１０のアミノ酸配列、又は上記に開示されるような膜結合型ＩＬ−１０の様々なサブ領域の各々、すなわち、第１及び第２のＩＬ−１０モノマーが第１のフレキシブルリンカーを介して単鎖構成で連結されているホモ二量体ＩＬ−１０；第１のフレキシブルリンカー自体、フレキシブルヒンジ；及び膜貫通−細胞内ストレッチ、ならびに全体の構築体は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、又は２９と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８、又は９９％同一である。
【００３３】
特定の実施形態では、単離された核酸分子は、完全な膜結合型ＩＬ−１０、又は上記に開示された膜結合型ＩＬ−１０の様々なサブ領域の各々をコードするポリヌクレオチド配列、すなわち、第１及び第２のＩＬ−１０モノマーが第１のフレキシブルリンカーを介して単鎖構成で連結されているホモ二量体ＩＬ−１０；第１のフレキシブルリンカー自体、フレキシブルヒンジ；及び、膜貫通−細胞内ストレッチ、ならびに、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、又は３０のいずれかと、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、又は少なくとも９８％同一である全体の構築体を含む。
【００３４】
特定の実施形態では、単離された核酸分子は、完全な膜結合型ＩＬ−１０、又は上記に開示された膜結合型ＩＬ−１０の様々なサブ領域の各々をコードするポリヌクレオチド配列、すなわち、第１及び第２のＩＬ−１０モノマーが第１のフレキシブルリンカーを介して単鎖構成で連結されているホモ二量体ＩＬ−１０；最初のフレキシブルリンカー自体、フレキシブルヒンジ；及び膜貫通−細胞内ストレッチ、ならびに、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８又は３０の１つと７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８、又は９９％同一である全体の構築体を含む。
【００３５】
特定の実施形態では、単離された核酸分子は、完全な膜結合型ＩＬ−１０、又は上記に開示された膜結合型ＩＬ−１０の様々なサブ領域の各々をコードするポリヌクレオチド配列、すなわち、第１及び第２のＩＬ−１０モノマーが第１のフレキシブルリンカーを介して単鎖構成で連結されているホモ二量体ＩＬ−１０；フレキシブルリンカー自体、フレキシブルヒンジ；及び膜貫通−細胞内ストレッチ、ならびに配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８又は３０の１つに記載されている全体の構築体を含む。
【００３６】
異なる態様では、本発明は、上記の実施形態のいずれかで定義される膜貫通−細胞内ストレッチに連結されたホモ二量体ＩＬ−１０をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む組成物を提供する。
【００３７】
特定の実施形態では、核酸分子は、組成物中の唯一の核酸分子である。すなわち、組成物は、追加の異なるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む追加の核酸分子を含まない。
【００３８】
本発明の核酸分子は、当技術分野で周知の方法を使用して安定なＴｒ１表現型を実現する目的でＴ細胞に送達される。例えば、ＭａｔｕｓｋｏｖａとＤｕｒｉｎｉｋｏｖａ（１０）は、細胞への導入遺伝子の送達にはウイルス性及び非ウイルス性の２つのシステムがあることを教示している。非ウイルス性のアプローチは、ＤＮＡをコーティングした微粒子の、ポリマーナノ粒子、脂質、リン酸カルシウム、エレクトロポレーション／ヌクレオフェクション、又はバイオリスティック送達に代表される。
【００３９】
ＤＮＡが宿主細胞のクロマチンに組み込まれるか否かに応じて、本発明に従って使用することができる２つの主要なタイプのベクターがある。ガンマレトロウイルスやレンチウイルスに由来するものなどのレトロウイルスベクターは、統合されたプロウイルスとして核内に存続し、細胞分裂とともに増殖する。他のタイプのベクター（例えば、ヘルペスウイルスやアデノウイルスに由来するもの）は、細胞内にエピソームの形で残る。
【００４０】
したがって、さらなる態様では、本発明は、上記で定義する膜貫通−細胞内ストレッチに連結されたホモ二量体ＩＬ−１０をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子のいずれかを含むウイルスベクターを提供する。
【００４１】
特定の実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、ガンマウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、及びヘルペスウイルスからなる群から選択されるウイルスに由来する改変ウイルスから選択される。
【００４２】
特定の実施形態では、ベクターはレトロウイルス、例えば、改変ガンマウイルス、レンチウイルス、マウス幹細胞ウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、及びスプマウイルスである。実際、（１１）にリストされている固形腫瘍のＣＡＲ−Ｔ細胞を評価する５２の臨床試験のうち、２４の試験はレトロウイルスベクターを使用し、９の試験はレンチウイルスベクターを使用している。また、Ｂ細胞性悪性腫瘍の治療用にＦＤＡが承認した２つのＣＡＲ製品は、Ｋｙｍｒｉａｈ（商標）（レンチウイルスベクター）及びＹｅｓｃａｒｔａ（商標）（ガンマレトロウイルスベクター）である。したがって、本発明のウイルスベクターの優れた候補は、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター及びガンマレトロウイルスベクターであり得る。例えば、レトロウイルスは、モロニーマウス白血病ウイルス又はマウス幹細胞ウイルス配列（ガンマレトロウイルスベクター）に由来し得る。
【００４３】
特定の実施形態において、核酸分子は、ヌクレオチド配列によってコードされる唯一のポリペプチドである。すなわち、ウイルスベクターの核酸分子は、さらなる異なるタンパク質をコードしないが、プロモーター及びターミネーターなどのさらなる制御エレメントを含み得る。
【００４４】
別の態様では、本発明は、上記で定義するウイルスベクターを含む組成物を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、上記で定義する核酸分子、又は上記で定義するウイルスベクターのいずれか１つを含む哺乳類の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を提供する。
【００４５】
特定の実施形態では、哺乳類Ｔｒｅｇは、その表面上で膜貫通−細胞内ストレッチに、任意選択でフレキシブルヒンジを介して連結されているホモ二量体ＩＬ−１０を発現する。
【００４６】
特定の実施形態では、哺乳類ＴｒｅｇはヒトＴｒｅｇである。
特定の実施形態では、哺乳類Ｔｒｅｇは、安定なＴｒ１表現型を有する（すなわち、細胞表面マーカーＣＤ４９ｂ及びＬＡＧ−３を提示するそれらの調節活性を失わない（１２）。
【００４７】
さらに追加の態様では、本発明は、安定なＴｒ１表現型を有する同種異系又は自己Ｔｒｅｇを調製する方法を提供し、この方法は、ＣＤ４Ｔ細胞を、上記で定義するホモ二量体ＩＬ−１０をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、又はそれを含むウイルスベクターと接触させることにより、前記ＣＤ４Ｔ細胞に安定なＴｒ１表現型を付与し、それにより安定なＴｒ１を有するＴｒｅｇを調製することを含む。
【００４８】
ＣＤ４Ｔ細胞を調製するための方法は、当技術分野で周知であり、例えば、以下の実施例の欄で開示される方法によって実施することができる。
組換えレトロウイルスベクター及びレンチウイルスベクターを作成し、それらをＴ細胞の形質導入に使用する方法も当技術分野で周知であり、通常、パッケージング細胞、プラスミド、及びトランスフェクション試薬を含む市販のキットを使用して行われ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｉｇｍａ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ＳＢＩ、Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ、その他多数の多くの企業が提供している。したがって、方法は、市販のキットに付属するガイドラインに従って実行される。
【００４９】
要するに、Ａｄｄｇｅｎｅのウェブサイトのγ−レトロウイルスガイドに教示される非限定的な例によれば、以下の要素が必要である：（ａ）目的の導入遺伝子をコードするγ−レトロウイルストランスファープラスミド：導入遺伝子配列は長鎖末端反復（ＬＴＲ）配列によってフランキングされ、これは、トランスファープラスミド配列の宿主ゲノムへの組み込みを容易にする。典型的には、ウイルス形質導入時に宿主ゲノムに組み込まれるのは、ＬＴＲの間の、かつＬＴＲを含む配列である；（ｂ）パッケージング遺伝子（ウイルスＧａｇ−Ｐｏｌ）：Ｇａｇは構造前駆体タンパク質であり、Ｐｏｌはポリメラーゼである；及び（ｃ）エンベロープ遺伝子（感染性を変えるために偽型化されてもよい）。
【００５０】
非限定的な例として、上記の３つの要素（エンベロープ、パッケージング、及びトランスファー）は、２９３Ｔパッケージング細胞株にコトランスフェクションされる３種類のプラスミドによって提供される。このシステムは、トロピズムを変更するために様々なエンベロープを使用して、偽型γ−レトロウイルスに最大のフレキシビリティを提供する。簡潔に述べると、様々なエンベローププラスミドは様々なトロピズムを持つウイルスの生成をもたらすことができる。組換えレトロウイルス株の調製方法及びヒトＣＤ４Ｔ細胞のレトロウイルス形質導入のための方法の詳細な非限定的な例は、以下の実施例の欄に述べる。
【００５１】
さらに追加の態様では、本発明は、上記で定義するホモ二量体膜結合型ＩＬ−１０をその表面に発現する哺乳類Ｔｒｅｇを対象に投与することを含む、必要とされる対象において免疫抑制を高める方法を提供する。
【００５２】
特定の実施形態では、対象は、免疫系の過剰な又は他の望ましくない活性として現れる疾患、障害又は状態によって引き起こされる症状のために、免疫抑制を高める必要がある。
【００５３】
したがって、特定の実施形態では、本発明は、上記で定義するホモ二量体ＩＬ−１０を表面に発現する哺乳類Ｔｒｅｇを対象に投与することを含む、対象の疾患、障害又は状態を治療又は予防する方法を提供する。ここで、上記疾患、障害又は状態は、自己免疫疾患、アレルギー、喘息、ならびに臓器及び骨髄移植などの免疫系の過剰な又は他の望ましくない活性として現れる。
【００５４】
さらに別の態様では、本発明は、それを必要とする対象における免疫抑制の増強に使用するための、上記で定義するホモ二量体ＩＬ−１０をその表面に発現する哺乳類Ｔｒｅｇに関する。
【００５５】
特定の実施形態では、上記で定義するホモ二量体ＩＬ−１０をその表面に発現する哺乳類Ｔｒｅｇは、免疫系の過剰な又は他の望ましくない活性として現れる疾患、障害又は状態の治療又は予防に使用するためのものである。
【００５６】
特定の実施形態では、哺乳類Ｔｒｅｇはヒト対象を治療するためのものであり、哺乳類ＴｒｅｇはヒトＴｒｅｇである。
自己免疫疾患として定義される特定の疾患は、当技術分野でよく知られている。例えば、自己免疫疾患の百科事典（Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ）、Ｄａｎａ  Ｋ．Ｃａｓｓｅｌｌ、Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｒｏｓｅ、Ｉｎｆｏｂａｓｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２０１４年５月１４日に開示されており、参照によりその全体が本明細書に完全に開示されるかのように組み込まれる。
【００５７】
特定の実施形態では、自己免疫疾患は、１型糖尿病；関節リウマチ；乾癬；乾癬性関節炎；多発性硬化症；全身性エリテマトーデス；クローン病や潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；アジソン病；グレーブス病；シェーグレン症候群；橋本甲状腺炎；重症筋無力症；血管炎；悪性貧血；セリアック病；及びアテローム性動脈硬化から選択される。
【００５８】
いくつかの実施形態では、対象はヒトであり、前記哺乳類Ｔｒｅｇはヒトである。
いくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇは同種異系Ｔｒｅｇである。
精製されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの養子移入が、自己免疫疾患の一連のモデルにおいて疾患を阻害又は予防することができることを実証した前臨床研究から明らかなように、本発明の安定なＴｒ１細胞は、免疫抑制を高め、免疫系の過剰な又は他の望ましくない活性として現れる疾患、障害又は状態を、さらなる遺伝子操作をすることなく治療するために使用することができる。これらには、限定するものではないが、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、自己免疫性脳脊髄炎、１型糖尿病、自己免疫性肝炎及びコラーゲン誘発関節炎が含まれる。さらに、これらの細胞の養子移入は、同種造血幹細胞移植によって誘発される同種移植拒絶反応及び移植片対宿主病から保護することができる（１３）。さらに、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、同種移植拒絶反応及び１型糖尿病を含む多くの状態及び疾患の免疫療法におけるｅｘ−ｖｉｖｏで拡張された非抗原特異的Ｔｒｅｇの養子移入の安全性と有効性を評価する臨床試験が増えており（検討のため（１３）を参照されたい）、このアプローチの可能性を示している。
【００５９】
これらの研究で観察された有益な臨床反応は、Ｔｒｅｇの抗原との関わりが内因性ＴＣＲを介して免疫抑制を高めると主張する累積的な証拠に照らして改善され得る（１４〜１６）。
【００６０】
本発明の発明者らは、Ｔｒ１細胞を操作して組織標的化タンパク質を発現させるアプローチを想定している。例えば、レチノイン酸（ＲＡ）は、Ｔ細胞で腸管ホーミングレセプター  インテグリンα４β７及びケモカイン受容体ＣＣＲ９の発現を誘導し、生体外でのプレインキュベーション後にこの機能を生体内で発揮することができる（１７、１８）。ＲＡは、ＴｒｅｇによるＴＧＦ−βを介した抑制の重要な調節因子でもあり、Ｔｒｅｇの分化を促進する（１９）。ＲＡはまた、ナイーブＣＤ４Ｔｅｆｆ細胞の誘導Ｔｒｅｇへの変換を増強し（２０、２１）、炎症性環境においてＩＬ−６の存在下でＴｒｅｇの安定性及び機能を維持すること（１８）も示されている。全トランス型ＲＡとのプレインキュベーションは、リプログラミングされたＴｒ１細胞に腸管ホーミング能力を与えるための実行可能で簡単な手順として浮上している。したがって、上記で定義する疾患の治療方法で使用されるＴｒｅｇは、リプログラミングされたＴｒ１細胞に腸管ホーミング能力を与え、炎症性環境においてＩＬ−６の存在下でＴｒｅｇの安定性及び機能を維持させるために、対象への投与前にレチノイン酸と接触させることができる。
【００６１】
魅力的な代替の解決手段は、キメラ抗原受容体、すなわちＣＡＲを使用して、選択した細胞表面抗原に対して多数のＴ細胞を遺伝子的にリダイレクトする確立された能力を利用するものである（２２）。
【００６２】
原則として、ＣＡＲはＴｒｅｇのリプログラミングにも使用できる。実際、いくつかの研究所は最近、様々な実験設定での機能的なマウス及びヒトＣＡＲ−Ｔｒｅｇの生成について報告している（（２３〜２９）及び検討のため（１３、１６、３０、３１）を参照されたい）。外因性ＴＣＲ遺伝子の導入によるＴｒｅｇのリダイレクトも報告されている（３２〜３４）。
【００６３】
この分野での最近の研究（２８）では、ＨＬＡ−Ａ２＋エフェクターＴ細胞に起因する免疫不全マウスの異種ＧｖＨＤを防ぐ手段として、ＨＬＡ−Ａ２特異的ヒトＣＡＲ−Ｔｒｅｇを生成するためにレンチウイルス形質導入を採用している。実際、生体内では、これらのＣＡＲ−ＴｒｅｇはＧｖＨＤの抑制における無関係な特異性の同じ数のＣＡＲ−Ｔｒｅｇよりも顕著に優れていた。レシピエントマウスの血液で検出できたＨＬＡ−Ａ２ＣＡＲ−Ｔｒｅｇの数は、投与後１週間でピークに達し、さらに１週間安定を維持した後、３週目の終わりにほぼゼロまで減少した。
【００６４】
ＣＡＲ−Ｔｒｅｇの臨床用途の別の例が最近報告され、このうち、レトロウイルスで形質導入されたヒトＴｒｅｇが、血友病Ａの補充療法における抗体反応を抑制するために凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）にリダイレクトされた（２９）。異種免疫応答性マウスモデルを使用した場合、抗体応答の強い抑制が免疫後８週間ではっきりと現れたが、導入されたＣＡＲ−Ｔｒｅｇは導入後２週間で既に検出不可能であった。
【００６５】
したがって、本明細書で定義される膜結合型ホモ二量体ＩＬ−１０を表面に発現し、安定なＴｒ１表現型を有する哺乳類Ｔｒｅｇは、免疫抑制を高め、免疫系の過剰な又は他の望ましくない活性として現れる疾患、障害又は状態を治療するための効率的な作用剤であり、有効性を高めるために当技術分野で周知の技術を使用して容易に操作できる作用剤である。さらに、ｅｘ−ｖｉｖｏで拡張された非抗原特異的ならびにリダイレクトされた抗原特異的Ｔｒｅｇの養子移入を採用する方法は、免疫療法の分野でよく知られている。
【００６６】
定義
「Ｔｒ１細胞」という用語は、本願において「ｉＴｒｅｇ」又は「１型細胞」という用語と互換的に使用され、２つの細胞表面マーカー、ＣＤ４９ｂ及びＬＡＧ−３の発現、ＦｏｘＰ３の低発現又は無発現、非増殖性（アネルギー）状態、ＩＬ−１０及びＴＧＦ−βの生産は高いが、ＩＬ−２の生産はごくわずかで、ＩＬ−４又はＩＬ−１７の生産はないこと、及び細胞間接触に依存しない態様でエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）を抑制する能力を特徴とするＣＤ４Ｔ細胞を指す。
【００６７】
本願で使用する「治療する」という用語は、所望の生理学的効果を得る手段を指す。効果は、疾患及び／又は疾患に起因する症状を部分的に又は完全に治癒するという観点で治療的であり得る。この用語は、疾患を抑制すること、すなわちその発症を阻止すること、又は疾患を改善すること、すなわち疾患の退行を引き起こすことを指す。
【００６８】
本願で使用する場合、「対象」又は「個体」又は「動物」又は「患者」又は「哺乳類」という用語は、診断、予後診断、又は治療が望まれる任意の対象、特に哺乳類の対象を指し、例えばヒトである。
【００６９】
本発明に従って使用するための医薬組成物は、１つ又は複数の生理学的に許容される担体又は賦形剤を使用して従来の方法で製剤化することができる。担体は、組成物の他の成分と適合し、そのレシピエントに有害でないという意味で「許容される」ものでなければならない。
【００７０】
担体、投与方法、剤形などの以下の例示は既知の可能性として列挙されており、この中から本発明で使用するための担体、投与方法、剤形などを選択することができる。しかしながら当業者は、まずは選択された任意の所与の製剤及び投与方法を試験して、それが所望の結果を達成するか判断すべきであることを理解するであろう。
【００７１】
投与方法には、限定するものではないが、非経口、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経粘膜（例えば、経口、鼻腔内、口腔、膣、直腸、眼内）、くも膜下腔内、局所及び皮内経路が含まれる。投与は全身的又は局所的であり得る。特定の実施形態では、医薬組成物は経口投与に適合している。
【００７２】
「担体」という用語は、活性剤と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを指す。
本願で使用する「バリアント」という用語は、塩基対、コドン、イントロン、エクソン、又はアミノ酸残基がそれぞれ１つ以上改変されているが、それでも天然配列のポリペプチドの生物活性を保持するポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。
【００７３】
特に断りのない限り、同一性又は類似性あるいは他のパラメータを表すすべての数値は、すべての場合において「約」という用語によって修飾されるものとして理解されるものとする。したがって、反対の指示がない限り、本明細書及び添付の特許請求の範囲に示される数値パラメータは、本発明が得ようとする所望の特性に応じて最大±１０％変動し得る近似値である。
【００７４】
ここで、本発明を以下の非限定的な実施例によって説明する。
実施例
材料及び方法
ヒトＣＤ４Ｔ細胞の分離
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、標準的なフィコールパック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ）（Ｓｉｇｍａ）分離手順を使用して、全血試料又はフェレーシス産物から調製した。分離後（又は細胞解凍後）２４時間のＰＢＭＣを、可溶性抗ＣＤ２８及び組換えヒトＩＬ−２の存在下で、プレート結合抗ＣＤ３  Ａｂ（ＯＫＴ３）によって７２時間活性化させた。次に、磁気ビーズ（ＢＤ  ＩＭａｇ（商標））によるポジティブセレクションを使用してＣＤ４Ｔ細胞を分離し、実験に使用する前に完全培地中で２４時間静置した。
【００７５】
組換えレトロウイルス株の調製
ｍｅｍＩＬ−１０遺伝子を、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ制限部位を介して、一般的に使用されるＭＳＧＶ１レトロウイルスベクターにクローニングした。得られたプラスミドを、ｇａｇ／ｐｏｌを保持するプラスミド及びｅｎｖを保持するプラスミドと共に、１０ｃｍポリ−Ｄ−リジン被覆プレートに配置した抗生物質を含まないＯｐｔｉＭＥＭ（商標）培地（イーグル最小必須培地の改変型であって、ＨＥＰＥＳ及び重炭酸ナトリウムで緩衝し、ヒポキサンチン、チミジン、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン、微量元素、及び成長因子を添加したもの）中の３×１０６ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）又はＦｕｇｅｎｅ  ＨＤ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）などのトランスフェクション試薬を、製造元の指示に従ってを使用してコトランスフェクションした。翌日、細胞を抗生物質を含む完全培地に移し、その翌日、上清を回収し、アリコートに分けて凍結するか、レトロウイルス形質導入に直接使用した。
【００７６】
ヒトＣＤ４Ｔ細胞のレトロウイルス形質導入
形質導入は、コーティングされていない６ウェル組織培養プレートで行った。ウェルを遺伝子導入エンハンサー（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）；Ｔａｋａｒａ）で一晩コーティングした。ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）は、レンチウイルス及びレトロウイルスが媒介する遺伝子導入の効率を高める組換えヒトフィブロネクチンフラグメント（ｒＦＮ−ＣＨ−２９６とも呼ばれる）の６３ｋＤのフラグメントである。ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）を除去し、ウェルを洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の２．５％滅菌ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングし、再度洗浄した。ウイルス上清を、ポリブレン（Ｍｅｒｃｋ）などのトランスフェクション試薬を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で希釈し、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）をコーティングしたウェルに４ｍｌ／ウェルで移した。プレートを３２℃、２０００×ｇで２時間遠心分離し、上清を吸引し、５０／５０のＡＩＭ−Ｖ／ＲＰＭＩ培地＋３００ＩＵ／ｍｌ組換えＩＬ−２中５×１０５細胞／ｍｌのＣＤ４Ｔ細胞を各ウェルに４ｍｌ添加した。プレートを１０００×ｇで１５分間遠心分離し、３７℃で一晩インキュベートした。次に、ＣＤ４Ｔ細胞を新しいコーティングされた６ウェル組織培養プレートに移し、１ｍｌの新しい５０／５０培地＋３００ＩＵ／ｍｌ  ｒＩＬ−２を各ウェルに添加した。翌日、培地を交換し、細胞を必要に応じて分割した。
【００７７】
実施例１．フレキシブルリンカーによって直列に連結され、かつ短いヒンジ領域を介して膜貫通−細胞内ストレッチに連結された２つのＩＬ−１０モノマー。
ここで使用されている特定の構築体では、配列ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧのフレキシブルリンカーによって２つのＩＬ−１０モノマーが直列に連結されてホモ二量体を作成し、これをＨＬＡ−Ａ２重鎖に由来する膜貫通−細胞内ストレッチに、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２及びＨＬＡ−Ａ２の連結ペプチドの膜近位部分に由来する配列ＳＳＱＰＴＩＰＩの追加の８アミノ酸のブリッジフレキシブルリンカーを含む２１アミノ酸のスペーサーを有するフレキシブルヒンジ領域によって連結させた（図１）。次に、ヒト及びマウスＣＤ４Ｔ細胞におけるｍｅｍＩＬ−１０及びＩＬ−１０Ｒの表面発現を確認した（図２）。
【００７８】
ＣＤ４９ｂインテグリンの上昇は（Ａ）に見ることができ、ＩＬ−１０受容体（ＩＬ−１０Ｒ）の上方制御は組換えＩＬ−１０（ｒＩＬ−１０、（Ｂ））によって誘導されたものと同様であった。マウスｍｅｍＩＬ−１０は、トランスフェクションの４８時間後に明確に発現され（Ｄ、左）、予想通り、ｍｅｍｌＬ−１０は、使用した抗マウスＩＬ−１０Ｒ  ｍＡｂの結合をブロックした。これは、シス結合を示唆している（３５）。
【００７９】
実施例２．フレキシブルリンカーによって直列に連結され、かつ長いヒンジ領域又はＩＬ−１０Ｒβ鎖を介して膜貫通−細胞内ストレッチに連結された２つのＩＬ−１０モノマー。
【００８０】
我々の元のｍｅｍＩＬ−１０構築体は、ヒト及びマウスの両方とも、（８アミノ酸長の剛性スペーサーに加えて）２１アミノ酸のフレキシブルリンカーを含むヒンジを組み込んでいた（ここではＳｍｅｍＩＬ−１０（Ｓは短いリンカー、下記参照）。
【００８１】
ｍｅｍＩＬ−１０を最適化するために、この膜サイトカインの２つの新しいバージョンを設計しクローニングした。最初にクローニングした１つ目では、ＩＬ−１０Ｒとの最適な結合を促進するため、ｍｅｍＩＬ−１０に長いリンカーペプチド（３０アミノ酸であり、長いことからＬｍｅｍＩＬ−１０と呼ぶ）を提供した。（図３、左下）。別の誘導体を作成するために、ＩＬ−１０Ｒα鎖にあるＩＬ−１０結合部位に直接アクセスできるように設計された新しい足場として、ＩＬ−１０Ｒβ鎖のＮ末端に二量体ＩＬ−１０を融合させ、これをｍｅｍＩＬ−ｌ０ＲＢ（図３、右下）と呼ぶ。実際、図４から、ヒトジャーカット細胞における３つの産物の表面発現が確認される。注目すべきことに、ｍｅｍＩＬ−１０ＲＢ融合タンパク質の表面発現のレベルはＩＬ−１０Ｒα鎖の利用可能性に依存すると予想される。３つの異なるｍｅｍＩＬ−１０構成の発現及び機能を評価するために、マウスＣＤ４Ｔ細胞に３つの構築体をコードするｍＲＮＡをトランスフェクションし、表面発現（図５Ａ）、表面ＩＬ−１０Ｒの下方制御（図５Ｂ）及びＳＴＡＴ３の自発的リン酸化（図５Ｃ）についてアッセイした。実際、ジャーカット細胞で得られた結果と一致して、短いリンカー及び長いリンカーを持つ構築体は、ｍｅｍＩＬＬ−１０Ｒβよりもはるかに高いレベルで発現され、優れた機能を発揮する。これは、表面ＩＬ−１０Ｒの大幅な減少及びｐＳＴＡＴ３のより強い誘導から明白である。短いリンカー構築体（ｓＬｍｅｍＩＬ−１０）は、長いリンカー構築体（ｌＬｍｅｍＩＬ−１０）よりも、ｐＳＴＡＴ３を誘導する能力が繰り返し実験（図示略）においても優れていたため、さらなる実験用に選択した。
【００８２】
実施例４．レトロウイルス形質導入マウスＣＤ４Ｔ細胞におけるｍｅｍＩＬ−１０の発現及び特徴解析。
レトロウイルス形質導入Ｔ細胞におけるｍｅｍＩＬ−１０の発現及び機能を試験するために、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウスから磁気ビーズで精製された脾臓ＣＤ４Ｔ細胞を最初に使用した。ｍｅｍＩＬ−１０形質導入細胞に対する陰性対照として、偽形質導入細胞（Ｍｏｃｋ）を使用した。これらの実験では、可溶性ＩＬ−１０（ｓＩＬ−１０）を陽性対照として使用した。図６は、３つのＴｒ１関連マーカーＬＡＧ−３、ＣＤ４９ｂ、及びＰＤ−１の発現について、同じ培養で増殖させた形質導入細胞及び非形質導入細胞と偽形質導入細胞を、トランスフェクション後４８時間及び６日にフローサイトメトリー分析した結果を示す。３つのマーカーの明確な上昇は、実際に２日目で既に観察され、６日目も持続し、予想された表現型を示している。形質導入されたＴ細胞がＴＣＲを介した活性化によりＩＬ−１０を分泌する能力により、Ｔｒ１のような機能的特性の獲得が確認された（図７）。
【００８３】
実施例５．Ｔエフェクター細胞に対する形質導入細胞の阻害効果の評価。
形質導入細胞がその阻害効果を隣接するＴｅｆｆ細胞に対して発揮する能力を調べるために、１つのＴ細胞集団のみを選択的に活性化し、他のＴ細胞集団を活性化できないようにする共培養設定を設計する（明らかに、抗ＴＣＲ／ＣＤ３抗体は共培養中のすべてのＴ細胞を活性化する）。この目的のため、キメラＨ−２Ｋｂ−ＣＤ３ζ（Ｋｂ−ＣＤ３ζ）及びＨ−２Ｋｄ−ＣＤ３ζ（Ｋｄ−ＣＤ３ζ）ＭＨＣ−Ｉ重鎖をコードする、我々が作成した２つの遺伝子を利用する。我々は既に、両遺伝子が、ＴＣＲクロスリンクに匹敵する規模のＡｂを介したクロスリンク後にＴ細胞を選択的に活性化することを示している。次の一連の機能実験では、これらのツールを使用して、ｍＲＮＡをトランスフェクションしたＴｒ１細胞とＴｅｆｆ細胞を様々な比率で３〜４日間混合し、ＣＦＳＥ希釈及び細胞内ＩＦＮ−γ染色を使用して、（非活性化又はＲＦＰ＋非Ｔｒ１細胞に対する）活性化Ｔｒ１細胞の、活性化Ｔｅｆｆの増殖及びエフェクター機能の両方を抑制する能力を評価する。
【００８４】
実施例６．ＩＬ−１０形質導入細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ持続性及びヒト疾患のマウスモデルにおける抑制機能の評価。
シンジェニック野生型マウスにおけるＩＬ−１０形質導入ＮＯＤ又はＢ６  ＣＤ４Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ持続性及びその表現型の維持を評価するために、Ｔ１Ｄ実験系において我々が最近確立したプロトコル（３６）を使用する。簡潔に述べると、１０×１０６個の細胞を尾静脈に注射する。注射の１、７、及び１４日後に脾臓及び末梢リンパ節を採取し、ＣＤ４＋ＩＬ−１０＋ＬＡＧ−３＋ＣＤ４９ｂ＋Ｔ細胞をフローサイトメトリーで識別する（注射していないマウスのバックグラウンド染色レベルと比較する）。
【００８５】
次に、Ｔ１ＤやＩＢＤなどのヒト疾患のマウスモデルを使用して、生体内の生理学的条件下でのｍｅｍＩＬ−１０形質導入Ｔ細胞の実際の抑制機能を試験する。
実施例７．レトロウイルス形質導入ヒトＣＤ４Ｔ細胞におけるｍｅｍＩＬ−１０の発現及び特徴解析。
【００８６】
ヒトＣＤ４Ｔ細胞のレトロウイルス形質導入の表現型及び機能の結果を評価するために、イスラエルのマーゲン・ダビド公社の血液サービスセンターを通じて健康なドナーから得た血液試料からＣＤ４Ｔ細胞を単離した。２つの独立したｅｘ−ｖｉｖｏ実験の１回目が図８に示されている。この実験では、細胞を形質導入後１８日間培養し、形質導入後１、５、及び１８日目に、マーカーＬＡＧ−３、ＣＤ４９ｂ、ＰＤ−１、４−１ＢＢ、ＣＤ２５及びＩＬ−１０Ｒαの表現型分析をフローサイトメトリーで行った。我々の結果から、予想されるＴｒ１表現型に関連するこれらすべての細胞表面マーカーが、実験の全期間にわたって同じ培養皿で増殖させたｍｅｍＩＬ−１０陰性細胞と比較して、ｍｅｍＩＬ−１０発現細胞で有意に増加したことが確認される。
【００８７】
２回目の実験は別の血液試料に対して行われ、ＬＡＧ−３、ＣＤ４９ｂ、及びＰＤ−１（図９）について行われたフローサイトメトリーは、１回目の実験で得られた結果と一致している。これらの２つの実験から、レトロウイルス形質導入を介したヒトＣＤ４Ｔ細胞におけるｍｅｍＩＬ−１０の長期発現は、これらの細胞にＴＲ−１のような表現型を与えると結論付けることができる。
【００８８】
参考文献
【００８９】
【表１】
2021519107.tif 000003
【００９０】
【表２】
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【００９１】
【表３】
2021519107.tif 000005
【００９２】
【表４】
2021519107.tif 000006
【図１】
2021519107.tif 000007
【図２Ａ】
2021519107.tif 000008
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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