(57)【要約】治療用物質を疾患細胞または障害細胞に送達するようにミニ細胞と同様に機能するエキソソームを使用する方法が本明細書において提供される。特に、該エキソソームは、増殖因子勾配を用いて特定の身体領域を標的にすることができる。該勾配はまた、トランスフェクトされた核酸からの該エキソソーム内でのタンパク質発現を所望の標的において誘発するのに役立つ。2021519296.tif 000023
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
その必要のある患者において疾患または障害を処置する方法であって、
(a)その表面に増殖因子受容体を有するエキソソームを得る工程;
(b)該エキソソームに治療用タンパク質をコードする核酸をトランスフェクトする工程;
(c)トランスフェクトされた該エキソソームを患者に投与する工程;
(d)該疾患または障害の部位に増殖因子勾配を提供して該部位に該エキソソームを誘引しかつ該部位において該治療用タンパク質の産生を刺激し、それによって該患者において該疾患を処置する工程
を含む、該方法。
【請求項２】
患者において疾患細胞に治療用タンパク質を投与する方法としてさらに定義される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
工程(a)において得られるエキソソームが、前記患者から得られた体液試料から得られる、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記体液試料が、血液、リンパ液、唾液、尿、脳脊髄液、骨髄吸引液、眼滲出液/涙、または血清である、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸がmRNAである、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸がプラスミドである、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸がcDNAである、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記疾患または障害が、がん、傷害、自己免疫障害、神経障害、胃腸障害、感染症、腎臓疾患、心血管障害、眼障害、皮膚病もしくは皮膚障害、泌尿生殖器障害、または骨疾患もしくは骨障害である、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
前記がんが、乳がん、肺がん、頭頸部がん、前立腺がん、食道がん、気管がん、脳がん、肝臓がん、膀胱がん、胃がん、膵臓がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、精巣がん、結腸がん、直腸がん、または皮膚がんである、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記疾患または障害の部位が腫瘍である、請求項8に記載の方法。
【請求項１１】
前記がんが転移性である、請求項8に記載の方法。
【請求項１２】
前記疾患または障害の部位が転移性結節である、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記治療用タンパク質がキナーゼ、ホスファターゼ、または転写因子である、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
前記治療用タンパク質が、前記疾患または障害の部位における細胞中の変異しているまたは不活性化されているタンパク質の野生型バージョンに対応する、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
前記治療用タンパク質が、前記疾患または障害の部位における細胞中の活性過剰であるタンパク質のドミナントネガティブバージョンに対応する、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
前記疾患または障害ががんであり、前記治療用タンパク質が腫瘍抑制因子である、請求項1に記載の方法。
【請求項１７】
前記エキソソームがその表面にCD47を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１８】
トランスフェクションが電気穿孔を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも第2の療法を前記患者に実施する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項２０】
前記第2の療法が、外科的療法、化学療法、放射線療法、寒冷療法、ホルモン療法、または免疫療法を含む、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
前記エキソソームが組織スキャフォールドマトリックス中に含まれている、請求項1に記載の方法。
【請求項２２】
その必要のある患者において疾患または障害を処置する方法であって、
(a)その表面に増殖因子受容体を有するエキソソームを得る工程;
(b)該エキソソームに治療用物質をトランスフェクトする工程;
(c)トランスフェクトされた該エキソソームを患者に投与する工程;
(d)該疾患または障害の部位に増殖因子勾配を提供して該部位に該エキソソームを誘引しかつ該部位に該治療用物質を送達し、それによって該患者において該疾患を処置する工程
を含む、該方法。
【請求項２３】
患者において疾患細胞に治療用物質を投与する方法としてさらに定義される、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
工程(a)において得られるエキソソームが、前記患者から得られた体液試料から得られる、請求項22に記載の方法。
【請求項２５】
前記体液試料が、血液、リンパ液、唾液、尿、脳脊髄液、骨髄吸引液、眼滲出液/涙、または血清である、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
前記治療用物質が、治療用タンパク質、抗体、阻害RNA、遺伝子編集システム、または低分子薬物である、請求項22に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体が細胞内抗原に結合する、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体が、完全長抗体、scFv、Fab断片、(Fab)2、ダイアボディ、トリアボディ、またはミニボディである、請求項26に記載の方法。
【請求項２９】
前記阻害RNAがsiRNA、shRNA、miRNA、またはプレmiRNAである、請求項26に記載の方法。
【請求項３０】
前記遺伝子編集システムがCRISPR/Casシステムである、請求項26に記載の方法。
【請求項３１】
前記治療用タンパク質がキナーゼ、ホスファターゼ、または転写因子である、請求項26に記載の方法。
【請求項３２】
前記治療用タンパク質が、前記疾患または障害の部位における細胞中の変異しているまたは不活性化されているタンパク質の野生型バージョンに対応する、請求項26に記載の方法。
【請求項３３】
前記治療用タンパク質が、前記疾患または障害の部位における細胞中の活性過剰であるタンパク質のドミナントネガティブバージョンに対応する、請求項26に記載の方法。
【請求項３４】
前記低分子薬物がイメージング剤である、請求項26に記載の方法。
【請求項３５】
前記疾患または障害が、がん、傷害、自己免疫障害、神経障害、胃腸障害、感染症、腎臓疾患、心血管障害、眼障害、皮膚病もしくは皮膚障害、泌尿生殖器障害、または骨疾患もしくは骨障害である、請求項22に記載の方法。
【請求項３６】
前記がんが、乳がん、肺がん、頭頸部がん、前立腺がん、食道がん、気管がん、脳がん、肝臓がん、膀胱がん、胃がん、膵臓がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、精巣がん、結腸がん、直腸がん、または皮膚がんである、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
前記疾患または障害の部位が腫瘍である、請求項35に記載の方法。
【請求項３８】
前記がんが転移性である、請求項35に記載の方法。
【請求項３９】
前記疾患または障害の部位が転移性結節である、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
前記疾患または障害ががんであり、前記治療用タンパク質が腫瘍抑制因子である、請求項22に記載の方法。
【請求項４１】
前記疾患または障害ががんであり、前記治療用物質が、がん遺伝子を標的にする阻害RNAである、請求項22に記載の方法。
【請求項４２】
前記エキソソームがその表面にCD47を含む、請求項22に記載の方法。
【請求項４３】
トランスフェクションが電気穿孔を含む、請求項22に記載の方法。
【請求項４４】
少なくとも第2の療法を前記患者に実施する工程をさらに含む、請求項22に記載の方法。
【請求項４５】
前記第2の療法が、外科的療法、化学療法、放射線療法、寒冷療法、ホルモン療法、または免疫療法を含む、請求項44に記載の方法。
【請求項４６】
前記エキソソームが組織スキャフォールドマトリックス中に含まれている、請求項22に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本願は、全内容が参照により本明細書に組み入れられる、2018年3月28日に出願された米国特許仮出願第62/649,057号の優先権恩典を主張する。
【０００２】
配列表の参照
本願は、EFS-Web経由でASCIIフォーマットで提出されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられる配列表を含む。このASCIIコピーは2019年3月21日に作成され、UTFC.P1363WO_ST25.txtと命名され、サイズは3キロバイトである。
【０００３】
1.分野
本発明は、全体として、生物学、医学、および腫瘍学の分野に関する。さらに詳細には、本発明は、疾患細胞または障害細胞に治療用物質を標的送達するためのエキソソームの使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
2.関連技術の説明
エキソソームは、タンパク質とメッセンジャーRNA(mRNA)、ノンコーディングRNA、および二本鎖ゲノムDNAとを含むポリヌクレオチドを含有する脂質二重層を有する小さな細胞外小胞(EV)である(Kalluri, 2016; Raposo and Stoorvogel, 2013)。網状赤血球分化の副産物として初めて発見された後(Harding et al., 1984; Raposo and Stoorvogel, 2013)、今では、エキソソームは実質的に全ての哺乳動物細胞によって分泌され、かつ全ての体液中に見出されると一般に受け入れられている(El-Andaloussi et al., 2013; Kalluri, 2016)。
【０００５】
エキソソームは、マイクロベシクルおよびアポトーシス小体も含む大きな細胞外小胞グループの一部である(Colombo et al., 2014)。細胞外小胞の中で、エキソソームは、通常、エンドサイトーシス経路を介したユニークなバイオジェネシスによって区別される。エンドサイトーシス小胞は、エンドソーム膜が陥入することで生じた多数の細胞内小胞(ILV)を含有する、多胞体とも知られる後期エンドソームに成熟する。これらの多胞体と原形質膜との適当な融合によって、エキソソームは細胞外空間に放出され、循環に入る(Bastos et al., 2017; Colombo et al., 2014)。エンドサイトーシスに起源をもつ結果として、エキソソーム膜は細胞膜と同様の極性を有し、内腔に面している細胞内ドメインと、細胞外空間に面している細胞外ドメインで固定された膜タンパク質を含有する。エキソソームのタンパク質含有量は細胞起源に応じて変化するが、一般的に、いくつかのタンパク質が豊富にあるように見える。これらには、テトラスパニンファミリーのメンバー、ならびにエンドサイトーシス経路およびILV成熟経路の成分、例えば、Rabタンパク質およびESCRT複合体のメンバーが含まれる。興味深いことに、多くの異なる細胞タイプに由来するエキソソームを用いて行われた様々なプロテオミクス研究から、真核生物開始因子、ADPリボシル化因子、リボソームタンパク質などのタンパク質翻訳機構に関連した多くの構成要素が同定されている(Pisitkun et al., 2004; Valadi et al., 2007)。さらに、プロテオーム分析によってエキソソーム中の同定された転写制御因子および翻訳制御因子の一部はレシピエント細胞に送達されて、遺伝子およびタンパク質の発現のパターンを変えることが示唆されている(Ung et al., 2014)。
【０００６】
エキソソームにおいて通常同定されるタンパク質の中には上皮増殖因子受容体(EGFR)などの増殖因子受容体がある。EGFRは、HER2、HER3、およびHER4も含む増殖因子受容体ErbBファミリーのメンバーである(Seshacharyulu et al., 2012)。上皮増殖因子(EGF)などのリガンドの1つに結合すると、この受容体は二量体化してホモ二量体を形成するか、またはErbBファミリーの他のメンバーとヘテロ二量体を形成する(Seshacharyulu et al., 2012)。この二量体化は受容体の内因性キナーゼ活性を活性化し、それによって、細胞質ドメイン上の様々な重要なチロシン残基を自己リン酸化する。この自己リン酸化反応は、関連タンパク質の合成を含む様々な下流シグナル伝達活性を媒介する、SH2およびPTB(ホスホチロシン結合)ドメイン、例えば、ShcおよびGRB2を含有する様々なアダプタータンパク質を動員する(Normanno et al., 2006; Tomas et al., 2014)。リン酸化されたEGFRは最終的にユビキチン結合し、エンドソーム経路に輸送され、エンドソーム経路から膜に再循環されるか、または多胞体への組み込みまたはリソソーム分解につながる後期エンドソーム経路にとどまる(Tomas et al., 2014)。多胞体がエキソソームを生じるので、EGFR(および他の増殖因子)のリン酸後再循環は、これらの細胞外小胞内での膜局在化に寄与する可能性が高い。
【０００７】
EGFRシグナル伝達はグリア芽細胞腫、肺がん、および乳がんなどの様々な悪性腫瘍の進行に重要なことが示されている(Lim et al., 2016; Liu et al., 2012; Masuda et al., 2012; Morgillo et al., 2016; Westphal et al., 2017; Zhang et al., 2013)。おそらく、この理由のために、エキソソーム中のEGFRのほとんどの研究はがん発達という面に関して行われている。EGFRシグナル伝達は、特に、様々な起源に由来するエキソソームの細胞取り込みと分泌のパターンに結び付けられている。マントル細胞がん細胞では、ゲフィチニブ(EGFR阻害剤)とのインキュベーションがエキソソーム取り込み速度を激減させることが示されている(Hazan-Halevy et al., 2015)。肺がん細胞をゲフィチニブで処理するとエキソソーム分泌が増大し、これがシスプラチン耐性の水平伝播を媒介する(Li et al., 2016)。がん細胞由来エキソソームを介したEGFR伝播はまた内皮細胞およびT細胞などの微小環境成分を変えることも示されている(Al-Nedawi et al., 2009; Huang et al., 2013)。つい最近、EGFRを含有する胃がん細胞に由来するエキソソームが肝臓のストローマ細胞に送達されて転移を媒介することが示された(Zhang et al., 2017)。最後に、乳がん細胞に由来するエキソソームが機能的リン酸化型EGFRを含有し、機能的リン酸化型EGFRを単球に移動させてERK経路活性化により単球生存を媒介することが示された(Song et al., 2016)。
【０００８】
エキソソームによるEGFRおよびタンパク質翻訳機構メンバーの送達は細胞間コミュニケーションの状況において明らかな生物学的重要性を有するように考えられ、その上、ある特定の組織への治療用物質送達を標的にするために、および所望の送達部位での治療用タンパク質産生を誘導するためにこれらの特性が利用され得る。
【発明の概要】
【０００９】
概要
本明細書では、増殖因子刺激によってエキソソーム中でタンパク質合成が誘導された。DNA、RNA、およびタンパク質を含有するエキソソームは生物学的刺激に応答し、遊走、増殖、シグナル伝達ネットワーク/カスケードの開始、転写、およびタンパク質翻訳などの特性を開始することができる。従って、一態様では、ミニ細胞と同様に機能する能力を有するエキソソームが本明細書において提供される。下記でさらに議論するように、これらのミニ細胞様エキソソームは、様々な疾患および/または障害を処置するための非常に多くの治療手段において使用することができる。
【００１０】
一態様では、その必要のある患者において疾患または障害を処置する方法であって、(a)その表面に増殖因子受容体を有するエキソソームを得る工程;(b)エキソソームに治療用タンパク質をコードする核酸をトランスフェクトする工程;(c)トランスフェクトされたエキソソームを患者に投与する工程;(d)疾患または障害の部位に増殖因子勾配を提供してその部位にエキソソームを誘引しかつその部位において治療用タンパク質の産生を刺激し、それによって患者において疾患を処置する工程を含む、方法が本明細書において提供される。
【００１１】
一部の局面では、前記方法は、治療用タンパク質を、患者において疾患細胞に投与する方法としてさらに定義される。一部の局面では、工程(a)において得られるエキソソームは、患者から得られた体液試料から得られる。一部の局面では、体液試料は、血液、リンパ液、唾液、尿、脳脊髄液、骨髄吸引液、眼滲出液/涙、または血清である。一部の局面では、核酸はmRNA、プラスミド、またはcDNAである。
【００１２】
一部の局面では、疾患または障害は、がん、傷害、自己免疫障害、神経障害、胃腸障害、感染症、腎臓疾患、心血管障害、眼障害、皮膚病もしくは皮膚障害、泌尿生殖器障害、または骨疾患もしくは骨障害である。ある特定の局面では、がんは、乳がん、肺がん、頭頸部がん、前立腺がん、食道がん、気管がん、脳がん、肝臓がん、膀胱がん、胃がん、膵臓がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、精巣がん、結腸がん、直腸がん、または皮膚がんである。一部の局面では、疾患または障害の部位は腫瘍である。一部の局面では、がんは転移性である。ある特定の局面では、疾患または障害の部位は転移性結節である。
【００１３】
一部の局面では、治療用タンパク質はキナーゼ、ホスファターゼ、または転写因子である。ある特定の局面では、治療用タンパク質は、疾患または障害の部位における細胞中の変異しているまたは不活性化されているタンパク質の野生型バージョンに対応する。ある特定の局面では、治療用タンパク質は、疾患または障害の部位における細胞中の活性過剰であるタンパク質のドミナントネガティブバージョンに対応する。ある特定の局面では、疾患または障害はがんであり、治療用タンパク質は腫瘍抑制因子である。一部の局面では、エキソソームはその表面にCD47を含む。一部の局面では、トランスフェクションは電気穿孔を含む。
【００１４】
一部の局面では、前記方法は、少なくとも第2の療法を患者に実施する工程をさらに含む。一部の局面では、第2の療法は外科的療法、化学療法、放射線療法、寒冷療法、ホルモン療法、または免疫療法を含む。
【００１５】
一態様では、その必要のある患者において疾患または障害を処置する方法であって、(a)表面に増殖因子受容体を有するエキソソームを得る工程;(b)エキソソームに治療用物質をトランスフェクトする工程;(c)トランスフェクトされたエキソソームを患者に投与する工程;(d)疾患または障害の部位に増殖因子勾配を提供してその部位にエキソソームを誘引しかつその部位に治療用物質を送達し、それによって患者において疾患を処置する工程を含む、方法が提供される。
【００１６】
一部の局面では、前記方法は、患者において疾患細胞に治療用物質を投与する方法としてさらに定義される。一部の局面では、工程(a)において得られるエキソソームは、患者から得られた体液試料から得られる。ある特定の局面では、体液試料は血液、リンパ液、唾液、尿、脳脊髄液、骨髄吸引液、眼滲出液/涙、または血清である。
【００１７】
一部の局面では、治療用物質は治療用タンパク質、抗体、阻害RNA、遺伝子編集システム、または低分子薬物である。ある特定の局面では、抗体は細胞内抗原に結合する。ある特定の局面では、抗体は、完全長抗体、scFv、Fab断片、(Fab)2、ダイアボディ、トリアボディ、またはミニボディである。ある特定の局面では、阻害RNAはsiRNA、shRNA、miRNA、またはプレmiRNAである。ある特定の局面では、遺伝子編集システムはCRISPR/Casシステムである。ある特定の局面では、治療用タンパク質はキナーゼ、ホスファターゼ、または転写因子である。ある特定の局面では、治療用タンパク質は、疾患または障害の部位における細胞中で変異しているまたは不活性化されているタンパク質の野生型バージョンに対応する。ある特定の局面では、治療用タンパク質は、疾患または障害の部位における細胞中の活性過剰であるタンパク質のドミナントネガティブバージョンに対応する。一部の局面では、低分子薬物はイメージング剤である。
【００１８】
一部の局面では、疾患または障害は、がん、傷害、自己免疫障害、神経障害、胃腸障害、感染症、腎臓疾患、心血管障害、眼障害、皮膚病もしくは皮膚障害、泌尿生殖器障害、または骨疾患もしくは骨障害である。ある特定の局面では、がんは、乳がん、肺がん、頭頸部がん、前立腺がん、食道がん、気管がん、脳がん、肝臓がん、膀胱がん、胃がん、膵臓がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、精巣がん、結腸がん、直腸がん、または皮膚がんである。一部の局面では、疾患または障害の部位は腫瘍である。一部の局面では、がんは転移性である。一部の局面では、疾患または障害の部位は転移性結節である。一部の局面では、疾患または障害はがんであり、治療用タンパク質は腫瘍抑制因子である。一部の局面では、疾患または障害はがんであり、治療用物質は、がん遺伝子を標的にする阻害RNAである。
【００１９】
一部の局面では、エキソソームはその表面にCD47を含む。一部の局面では、トランスフェクションは電気穿孔を含む。一部の局面では、前記方法は、少なくとも第2の療法を患者に実施する工程をさらに含む。一部の局面では、第2の療法は外科的療法、化学療法、放射線療法、寒冷療法、ホルモン療法、または免疫療法を含む。
【００２０】
さらなる局面では、前記態様に従う使用のためのエキソソームは組織スキャフォールドマトリックス中に含まれている。例えば、このようなマトリックスは、合成マトリックス、例えば、組織において分解可能であるか、または吸収することができるマトリックスでもよい。さらなる局面では、マトリックスは生組織マトリックスでもよい。一部の局面では、前記態様のエキソソームはマトリックス内で培養される。
【００２１】
本明細書で使用する「本質的に含まない」とは指定された成分の観点からいうと、指定された成分がどれも、意図を持って組成物中に製剤化されていないこと、および/または単に汚染物質として、もしくは微量に存在することを意味するために本明細書において用いられる。従って、組成物の意図されない汚染に起因する、指定された成分の総量は、0.01％よりかなり少ない。指定された成分の量を標準的な分析方法を用いて検出できない組成物が最も好ましい。
【００２２】
本明細書で使用する「1つの(a)」または「1つの(an)」とは1つまたは複数を意味することがある。本明細書中の特許請求の範囲において使用する場合、「含む(comprising)」という単語と共に用いられる場合には、「1つの(a)」または「1つの(an)」という単語は1つまたは複数を意味することがある。
【００２３】
特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、選択肢だけを指すか、または選択肢が互いに相容れないことを指すと明示されていない限り「および/または」を意味するために用いられるが、この開示は、選択肢だけと「および/または」を指す定義を裏付ける。本明細書で使用する「別の」とは少なくとも第2の、またはそれより多くを意味することがある。
【００２４】
本願全体を通して「約」という用語は、ある値が、この値を求めるために用いられている装置、方法の誤差の固有の変動、または試験対象間に存在するばらつきを含むことを示すために用いられる。
【００２５】
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかしながら、詳細な説明および具体的な実施例は本発明の、好ましい態様を示しているが、この詳細な説明から本発明の精神および範囲の中で様々な修正および変更が当業者に明らかになるので例示にすぎないことが理解されるはずである。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
以下の図面は本明細書の一部をなし、本発明のある特定の局面をさらに証明するために含まれる。本発明は、これらの図面の1つまたは複数を、本明細書において示された特定の態様の詳細な説明と組み合わせて参照することによってさらに深く理解され得る。
【図１】図1A〜E. エキソソーム中のEGFRリン酸化。図1A - 様々なヒト細胞株およびマウス細胞株から得られたエキソソーム上でのEGFR発現のイムノブロット。エキソソームマーカーCD81をローディング対照として使用し、タンパク質抽出物のエキソソーム起源を確認するために使用した。図1B - 500ng/ml rhEGFと37℃で15分間インキュベートした後に、MDA-MB-231細胞に由来するエキソソーム上ではEGFRリン酸化を示したが、MCF10A細胞に由来するエキソソーム上ではEGFRリン酸化を示さなかったイムノブロット。リン酸化レベルはEGFRのTyr1068残基に特異的な抗体を用いて検出された。リン酸化の違いを確認するためにEGFRレベルをローディング対照として示した。バンドデンシトメトリー定量をImageJソフトウェアを用いて行った。図1C - rhEGFで37℃で15分間刺激した、および刺激しなかったMDA-MB-231細胞に由来するエキソソームにおけるEGFRアダプタータンパク質ShcおよびGRB2の存在、ならびに高レベルのリン酸化ERKタンパク質の存在を示したイムノブロット。エキソソームマーカーCD81をローディング対照として使用し、タンパク質抽出物のエキソソーム起源を確認するために使用した。図1D - 500ng/ml rhEGFと37℃で15分間インキュベートした、およびインキュベートしなかったMDA-MB-231エキソソームのタンパク質抽出物から、GRB2特異的抗体を用いてGRB免疫複合体を得た。免疫複合体のイムノブロット分析から、rhEGF刺激時のみGRB2とEGFRが結合することが分かる。非特異的アイソタイプ対照IgGをGRB2プルダウンの負の対照として使用した。等量の刺激済み抽出物および未刺激抽出物をインプット対照としてβ-アクチンについて調べた。図1E - プルダウン実験にShc抗体を用いて2回繰り返した同様の実験でも、EGFRとの結合は500ng/ml rhEGFで37℃で15分間刺激した後でしか示されなかった。非特異的アイソタイプ対照IgGをShcプルダウンの負の対照として使用した。等量の刺激済み抽出物および未刺激抽出物をインプット対照としてbアクチンについて調べた。
【図２】図2A〜G. EGFRリン酸化によってエキソソームの内容物が変化する。図2A - 未刺激エキソソームまたは37℃で15分間rhEGFで刺激した後のエキソソームから得られたタンパク質抽出物に対して行ったルシフェラーゼに基づくATP定量アッセイ。ルシフェリンに由来するルミネセンスをプレートリーダーで測定し、任意単位で示した。マンホイットニー検定を用いて有意性を求めた(n=4)。図2B - 500ng/ml rhEGFと37℃で48時間インキュベートしたMDA-MB-231細胞に由来するエキソソームのイムノブロット分析。未刺激エキソソームと比較した場合にpEGFRレベルおよびGRB2レベルが増加したことを示す。図2C - 未刺激のMDA-MB-231エキソソームまたは500ng/ml EGFと37℃で48時間インキュベートした後のMDA-MB-231エキソソームについて得られた質量分析法データの細胞成分結合分析。刺激済みエキソソームおよび未刺激エキソソームについて同定された重要なタンパク質のリストを入手し、同定されたタンパク質の細胞レベル下起源を同定するためにオープンアクセスFunRich functional enrichment analysisツールのインプットとして使用した。図2D - 対照MDA-MB-231エキソソームおよび500ng/ml rhEGFと37℃で48時間インキュベートしたエキソソームにおいて同定されたタンパク質の重複を図示したベン図。図2E - 500ng/ml rhEGFと48時間インキュベートした、またはインキュベートしなかったMDA-MB-231エキソソームの質量分析から得られた個々のEGFRおよびGRB2タンパク質スコア。図2F - 対照MDA-MB-231エキソソームおよび500ng/ml rhEGFと37℃で48時間インキュベートしたエキソソームから得られたタンパク質抽出物のBCA分析。マンホイットニー検定を用いて有意性を求めた(n=3)。図2G - 対照MDA-MB-231エキソソームならびに500ng/mlおよび1000ng/ml rhEGFと37℃で48時間インキュベートしたエキソソームから得られたタンパク質抽出物におけるβ-アクチン発現のイムノブロット分析(*p<0.05、**p<0.01、***p<0.005、****p<0.0001)。
【図３】図3A〜F. エキソソームは転写および翻訳のための機能的成分を含有する。図3A - 超高速液体クロマトグラフィー-質量分析法(UPLCMS)を使用して、MCF10A由来、MDA-MB-231由来、HDF由来、E10由来、およびNIH-3T3由来エキソソームにおける遊離アミノ酸を検出した。データを、正規化されたシグナル強度を用いてヒートマップで示した(log10)。色の説明文に示したように、よりホットな色はより高い強度レベルに対応する。図3B - E10由来、NIH-3T3由来、MCF10A由来、HDF由来、およびMDA-MB-231由来エキソソームから得られたエキソソームのタンパク質抽出物中のeIF4A1、eIF3A、およびeIF1Aのイムノブロット。CD9をローディング対照として使用した。図3C - pEMT7-GFP cDNA発現プラスミドとインキュベートしたMCF10A由来エキソソームおよびMDA-MB-231由来エキソソームに由来するタンパク質溶解産物を用いたインビトロ翻訳アッセイ。細胞から得られたタンパク質溶解産物を対照として使用した。図3D - エキソソームタンパク質抽出物中のRNAポリメラーゼIIのイムノブロット分析。CD9をローディング対照として示した。図3E - 35S-メチオニンの存在下で培養したMDA-MB-231細胞およびE10細胞に由来するエキソソームのオートラジオグラフィー。エキソソームのみ、ならびに35S-メチオニンおよびシクロヘキシミドの存在下で培養したエキソソームを対照として使用した。図3F - 単離直後に、または無細胞条件で24時間および48時間のインキュベーション後にエキソソームから得られたタンパク質抽出物のBCA定量。一元配置ANOVAの後にチューキー多重比較検定を用いて有意性を求めた(*p<0.05、**p<0.01、***p<0.005、****p<0.0001、n=3)。
【図４】図4A〜J. エキソソームはDNA転写およびキャップ依存的mRNA翻訳を介して新たなタンパク質を合成する。図4A - MDA-MB-231細胞から単離され、かつ電気穿孔されていない、モック(mock)電気穿孔した、またはα-アマニチンの存在ありもしくはなしでpCMV-GFPプラスミドを用いて電気穿孔したMDA-MB-231細胞から単離したエキソソームにおけるGFP mRNAレベルのqPCR分析。発現レベルをGAPDHに対して正規化した。図4B - GFPプラスミドを用いて電気穿孔し、無細胞条件で48時間インキュベートしたエキソソームの、抗GFP抗体を用いた免疫金標識の透過型電子顕微鏡画像(下の横列)。二次抗体のみを負の対照として使用した(上の横列)。金粒子は黒色の点として示される。スケールバー、100nm。図4C - pCMV-GFPプラスミドを用いて電気穿孔し、37℃で12時間、2日間、または1週間インキュベートしたエキソソームにおけるGFPタンパク質発現のイムノブロット。エキソソームのみ、およびモック電気穿孔済みエキソソームを負の対照として使用した。エキソソームマーカーTSG101をエキソソームの存在のローディング対照として使用した。図4D - GFPプラスミドを用いて電気穿孔し、1ヶ月まで、いくつかの期間にわたってインキュベートしたエキソソームにおけるGFPタンパク質発現のイムノブロット。電気穿孔されていないエキソソームを負の対照として使用した。エキソソームマーカーCD63をエキソソームの存在のローディング対照として使用した。図4E - 単離直後(0時間)の、または無細胞条件でインキュベートし(24時間)、前記のように培養した後の、GFPプラスミドを用いて電気穿孔したエキソソームにおけるGFPタンパク質発現のイムノブロット。モック電気穿孔済みエキソソームを負の対照として使用した。エキソソームマーカーTSG101をエキソソームの存在のローディング対照として使用した。図4F - pCMV-GFPプラスミドを用いて電気穿孔し、翻訳阻害剤シクロヘキシミドと共に培養したエキソソームにおけるGFPタンパク質発現のイムノブロット。エキソソームのみ、およびモック電気穿孔済みエキソソームを負の対照として使用した。TSG101をエキソソームの存在のローディング対照として使用した。バンドデンシトメトリーをImageJソフトウェアを用いて行った。図4G - GFPプラスミドを用いて電気穿孔し、転写阻害剤α-アマニチンと共に培養したエキソソームにおけるGFPタンパク質発現のイムノブロット。エキソソームのみ、およびモック電気穿孔済みエキソソームを負の対照として使用した。TSG101をエキソソームの存在のローディング対照として使用した。バンドデンシトメトリーをImageJソフトウェアを用いて行った。図4H - キャップ依存的またはキャップ非依存的な翻訳のレポーターとして使用したバイシストロニックプラスミド(pCDNA3-rLuc-polIRESfLuc)の模式図。図4I - バイシストロニックプラスミドを用いて電気穿孔したエキソソームを48時間インキュベートした後の、バイオルミネセンスによって測定したウミシイタケ(renilla)(r-Luc)およびホタルルシフェラーゼ(f-Luc)の活性。電気穿孔されていないエキソソームを負の対照として使用した。図4J - CMVプロモーター下で発現するホタルルシフェラーゼを有するプラスミドを用いてまたは用いずに電気穿孔した後、48時間インキュベートしたエキソソームから測定したルミネセンスカウント。
【図５】図5A〜E. エキソソーム中のタンパク質翻訳は機能的タンパク質を生じ、増殖因子刺激によって増大する。図5A - MCF10A電気穿孔済み細胞、ならびにシクロヘキシミドで予め処理し、pCMV-GFPプラスミドを用いて電気穿孔し、48時間プレインキュベートしたMDA-MB-231由来エキソソームとインキュベートしたMCF10A細胞におけるGFPの存在を示した共焦点顕微鏡観察。電気穿孔されていないMDA-MB-231由来エキソソームで処理したMCF10A細胞を負の対照として使用した。図5B - p53-GFP発現プラスミドを用いて電気穿孔したMDA-MB-231由来エキソソームに由来するタンパク質溶解産物におけるGFP発現のイムノブロット分析。電気穿孔されていないエキソソームを負の対照として使用した。TSG101をエキソソームの存在のローディング対照として使用した。図5C - モック電気穿孔済みMDA-MB-231由来エキソソームで、またはシクロヘキシミドの存在ありおよび存在なしでp53-GFPプラスミドを用いて電気穿孔したエキソソームで処理したMDA-MB-231細胞におけるp21 mRNA発現。発現レベルをハウスキーピング遺伝子GAPDHに対して正規化した。図5D - 100μg/mlの翻訳阻害剤シクロヘキシミドとインキュベートした、MDA-MB-231細胞から単離したエキソソームのイムノブロット。エキソソーム溶解産物をβ-アクチンおよびGAPDHについて調べた。バンドデンシトメトリー定量をImageJソフトウェアを用いて行った。図5E - pCMV-GFPプラスミドを用いて電気穿孔し、次いで、異なる濃度のrhEGFの存在下で37℃で48時間インキュベートしたエキソソームにおけるGFPタンパク質発現のイムノブロット。モック電気穿孔済みエキソソームおよびrhEGFインキュベーションの無いエキソソームを負の対照として示した。エキソソームマーカーCD81をローディング対照として使用した。バンドデンシトメトリー定量をImageJソフトウェアを用いて行った。
【図６】図6A〜C. MDA-MB-231細胞に由来するエキソソームは増殖因子勾配に向かって走化性を示す。図6A - エキソソーム逆行遊走(exosome retrograde migration)アッセイのセットアップを示した模式図。手短に言うと、MDA-MB-231細胞から単離した10×109個のエキソソームをCorning Transwell(登録商標)システムのボトムウェルに入れた。400nm孔を有するHTS Transwell(登録商標)インサートを、PBS、20％FBS、または10,000ng/ml rhEGFのいずれかを含有するエキソソーム懸濁液の上に置き、37℃でインキュベートした。エキソソーム運動性を評価するために、様々な時点の後に、トップインサート上のエキソソームの数をNanosight NTAで測定した。図6Bおよび6C - Nanosight NTAによる、4時間(図6B)および24時間(図6C)、37℃でインキュベートした後の、逆行遊走アッセイのトップインサート上のMDA-MB-231エキソソームの定量。一元配置ANOVAの後にニューマン・コイルス(Newman-Keuls)多重比較検定を用いて有意性を求めた(*p<0.05、**p<0.01、***p<0.005、****p<0.0001、n=3)。
【図７】図7A〜D. 担がんマウスは、送達されたエキソソームにおいてタンパク質合成の増大を示す。図7A - インビボ翻訳実験の実験計画を図示した模式図。手短に言うと、雌Balb/Cマウスに4T1腫瘍を同所に注射し、腫瘍を500mm3まで成長させた。この後に、マウスに、pCMV-mCherryプラスミドを用いて電気穿孔した300億個のMDA-MB-231エキソソームを注射した。エキソソーム注射の12時間後にマウスを安楽死させ、エキソソーム抽出のために血清を収集した。図7B - 同等の成長速度を示した、4T1腫瘍と電気穿孔済みエキソソームを注射したマウスまたは4T1腫瘍のみを注射したマウスの腫瘍成長を示した図。図7C - 電気穿孔済みエキソソームを注射した健常マウス、ならびに電気穿孔済みエキソソームを注射した4T1担がんマウスおよびエキソソーム注射の無い4T1担がんマウスの血清から抽出したエキソソームのNanosight NTA分析。全エキソソームは100nmのあたりに同様のサイズピークを示す。図7D - 図7Cに示した血清エキソソームのNanosight NTA定量。異なる動物の血清から得られたエキソソーム量に有意差はなかったが、MDA-MB-231電気穿孔済みエキソソームを注射した4T1担がんマウスの方がエキソソームが多くなる傾向があった。
【図８】図8A〜G. エキソソームの特徴決定。図8A - Nanosight NTA 2.1分析ソフトウェアを用いて得られた、MDA-MB-231細胞から収集したエキソソームのナノ粒子追跡分析。左グラフは溶解状態での粒子のサイズ分布を表す。平均サイズが104nmであることを示し、大きなサイズにはピークが無いことも示す。右グラフは溶解状態での粒子のサイズおよび濃度による分布を表す。図8B - エキソソームの原子間力顕微鏡画像(左画像)。右グラフは、分析した領域における粒子の分布を表す。図8C - MDA-MB-231エキソソームの透過型電子顕微鏡写真。スケールバー-100nm。図8D - 抗CD9抗体を用いた免疫金標識MDA-MB-231エキソソームの透過型電子顕微鏡写真。金粒子は黒色の点として示される。スケールバー-100nm。図8E - 異なる細胞株から得られたエキソソームのタンパク質抽出物中のエキソソームマーカーCD9、CD63、およびTSG101のイムノブロット分析。図8F - マーカーCD9、CD81、CD82、およびCD63の抗体を用いた、0.4μmビーズと結合したMDA-MB-231細胞に由来するエキソソームのイメージングフローサイトメトリー分析。図8G - 大腸菌とインキュベートしたLB培養プレート、およびMDA-MB-231(上)またはMCF10A(下)エキソソームのいずれかとインキュベートしたLB培養プレートの代表的な画像。大腸菌接種側(左)ではコロニー形成を示し、エキソソーム接種側(右)ではコロニー形成を示さなかった。
【図９】図9A〜B. MDA-MB-231細胞に由来するエキソソームにおけるEGFRリン酸化および下流生物学的活性。図9A - MDA-MB-231細胞から得られ、p-EGFRおよびGRB2について調べられたタンパク質抽出物のイムノブロット。β-アクチンをローディング対照として使用した。図9B - 500ng/mlと37℃で15分間インキュベートした、またはインキュベートしなかったMDA-MB-231エキソソームに由来するタンパク質溶解産物の抗EGFR抗体プルダウンを用いて得られた免疫複合体のイムノブロット。免疫複合体をGRB2について調べた。非特異的アイソタイプ対照IgGをGRB2プルダウンの負の対照として使用した。等量の刺激済み抽出物および未刺激抽出物をインプット対照としてβ-アクチンについて調べた。
【図１０】様々な細胞に由来するエキソソームのプロテオミクス分析。マウス肝臓細胞(Valadi et al., 2007)、マウス線維芽細胞(Luga et al., 2012)、ヒト結腸直腸がん細胞(Choi et al., 2012)、ヒト血漿(Kalra et al., 2013)、ヒト胸腺組織(Skogberg et al., 2013)、およびヒト尿(Gonzales et al., 2009)から得られた質量分析データにおける、Reactome(Croft et al., 2014)データベースにあるタンパク質翻訳経路に含まれる全てのタンパク質1つ1つの二値識別(binary identification)を表したヒートマップ。黒色は、それぞれのデータセットに、それぞれのタンパク質が存在することを示し、白色は存在しないことを示す。サマリー(summary)の縦列は、それぞれのタンパク質が、分析した全てのデータセットにどれくらい偏在するかを表している。暖色は、異なるタイプのエキソソームの中で分布が広範囲にわたることを表している。
【図１１】図11A〜B. 様々な起源に由来するエキソソームのプロテオミクス分析。図11A - Reactome(Croft et al., 2014)データベースにあるタンパク質翻訳に関係する様々な経路と関連する、マウス肝臓細胞(Valadi et al., 2007)、マウス線維芽細胞(Luga et al., 2012)、ヒト結腸直腸がん細胞(Choi et al., 2012)、ヒト血漿(Kalra et al., 2013)、ヒト胸腺組織(Skogberg et al., 2013)、およびヒト尿(Gonzales et al., 2009)から得られた質量分析法データにおいて同定されたタンパク質の数を表したヒートマップ。より暖色の色は、1経路あたりの、同定されたタンパク質数がより多いことを表している。図11B - HDF、NIH3T3、MDA-MB231、MCF10A、およびE10細胞から単離したエキソソームから得られた質量分析法において同定されたタンパク質翻訳に関連するタンパク質のタンパク質スコアを表したヒートマップ。より暖色の色は、タンパク質スコアがより大きいことを表している。
【図１２】図12A〜C. エキソソームは、タンパク質翻訳機構に関連した核酸およびタンパク質を含有する。図12A - NIH-3T3、E10、67NR、4T1、HDF、MCF10A、MCF7、およびMDA-MB-231細胞株のエキソソームから抽出したRNAを使用して、18Sおよび28S rRNAをqPCRによって定量した。rRNAの発現レベルをU6 snRNA発現に対して正規化した。各群のバーは左から右に向かってNIH 3T3、E10、67NR、4T1、HDF、MCF10A、MCF7、およびMDA-MB-231を表す。図12B - 4T1エキソソームおよび細胞から抽出したRNAを使用して、tRNAMet、tRNAGly、tRNALeu、tRNASer、およびtRNAValの存在をデジタルqPCRによって同定した。各群のバーは左から右に向かってLeu、Met、Val、Ser、およびGlyを表す。図12C - eIF3A MCF10AおよびMDA-MB-231由来エキソソームの存在を示したeIF4A1の免疫沈降。MB231およびMCF10A細胞溶解産物を使用して正の対照として使用した。エキソソームマーカーCD82をローディング対照として使用した。
【図１３】図13A〜E. MCF10A細胞およびMDA-MB-231細胞に由来するエキソソームにおけるDNA転写およびmRNA翻訳。図13A - pCMV-GFPプラスミドを用いて電気穿孔し、37℃で様々な期間にわたってインキュベートしたMCF10A細胞から単離したエキソソームにおけるGFPタンパク質発現のイムノブロット。エキソソームのみ、およびモック電気穿孔済みエキソソームを負の対照として使用した。CD63をローディング対照として、エキソソームの存在を確認するために使用した。図13B - GFPプラスミドを用いて電気穿孔したMCF10A由来エキソソームにおいてNanoSightによって検出された緑色エキソソームの量を図示したプロット。MCF10A由来エキソソーム、MCF10A由来モック電気穿孔済みエキソソーム、ならびにα-アマニチンおよびシクロヘキシミドを用いて電気穿孔したエキソソームを負の対照として使用した。図13C - 高電圧を用いてGFPプラスミドを用いて電気穿孔した後の、エキソソームに付着しているビーズのフローサイトメトリー分析。緑色蛍光シグナルを有するビーズのパーセントを示す。図13D - pCMV-Ovaプラスミドを用いて電気穿孔し、37℃で48時間インキュベートしたMDA-MB-231エキソソームにおけるオボアルブミンタンパク質レベルのイムノブロット。β-アクチンをローディング対照として使用した。図13E - モック電気穿孔済みMDA-MB-231由来エキソソームで処理したMDA-MB-231細胞、またはp53-GFPプラスミドを用いて電気穿孔し、すぐに細胞に添加したエキソソーム(0時間)、もしくは処理前に細胞条件で37℃で48時間インキュベートしたエキソソーム(48時間)で処理したMDA-MB-231細胞におけるp21mRNA発現。RNA抽出前に、エキソソームを細胞に30分間または48時間添加した。発現レベルをハウスキーピング遺伝子GAPDHに対して正規化した。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
詳細な説明
エキソソームを含む細胞外小胞(EV)は、サイトゾル様材料を取り囲む脂質二重層を有するナノサイズの細胞内コミュニケーションビヒクルである。エキソソームはいくつかの生理学的プロセスに関与し、DNA、RNA、およびタンパク質を含有する。エキソソーム中の全ての内容物は細胞に由来し、他の細胞に侵入し、内容物を沈着するまでエキソソーム中にそのままとどまると一般に想定されている。エキソソームは全ての細胞から数多く放出され、ペイロードとして細胞構成要素を細胞外空間に運ぶゴミ袋であり、エキソソームそれ自体には生物学的な意義は全くないとみなされている。
【００２８】
ミニ細胞と同様に挙動し、刺激に対して生物学的に応答し、細胞と全く同じように増殖および遊走する能力を示すが、定義された核を有さないエキソソームが本明細書で提供される。これらのエキソソームは血清因子への走化性を示し、EGFなどの増殖因子で刺激されると表面上のEGFR受容体をリン酸化し、新たなタンパク質の転写および翻訳につながるシグナル伝達カスケードを開始する。これらのエキソソームが担がんマウスに注入されると、腫瘍に優先的に蓄積する。まとめると、これらのエキソソームによるタンパク質翻訳および増殖因子応答の能力があるために、エキソソームは組織ホメオスタシスおよび疾患の調節において機能的な役割を果たす。
【００２９】
I.本発明の局面
細胞外小胞、特にエキソソームは、DNA、RNA、およびタンパク質などのいくつかの構成要素が同定されたことで、ここ数年にわたってかなりの注目を集めてきた。さらに、エキソソームは、その内容物を様々な組織のレシピエント細胞に移すことで多くの多様な生物学的プロセスに影響を及ぼし、ユニークな形の細胞間コミュニケーションを容易にすることに結び付けられてきた(Bastos et al., 2017)。または、特に、がんまたは神経学的病態の状況における治療剤の送達ビヒクルとしてのエキソソームの能力も報告された(El-Andaloussi et al., 2012; Kamerkar et al., 2017)。しかしながら、エキソソームの全身分布および臓器向性の正確なパターンは今もなお十分に理解されていない。
【００３０】
しかしながら、エキソソームの核成分および細胞質成分はレシピエント細胞への受動的移入に用いられるだけでなく、EGFRなどの増殖因子受容体をリン酸化する外部刺激に応答し、活発な転写および翻訳を介して新たなタンパク質を生成することもできる。エキソソームの外部刺激は逆行遊走などの新規の生物学的活性を開始することができる。エキソソームは、外部刺激に応答した、細かく調整された働きに関して原始的ではあるがミニ細胞と同様に機能し得ると考えられている。実際に、最近になって、エキソソームは、原始細胞リボソームの、現存して代表するものと潜在的になり得ることが示唆されている。このためにはrRNAを含有する必要があり、このことは本研究において確認されている(Sinkovicsm, 2015)。エキソソームは増殖因子勾配に対して能動的に生物学的に応答し、遊走する。アクチンリモデリングが関与している可能性がある。従って、アクチン重合パターンが、エキソソーム生体内分布の調整における興味深い標的となり得る。
【００３１】
様々な種から得られたプロスタソーム(prostasome)などの小胞が、無細胞条件でATPを生成することを可能にする解糖経路の様々な成分を含有することが示されている(Ronquist et al., 2013a; Ronquist et al., 2013b)。エキソソーム中の直接転写は以前に報告されていないが、ある研究から、ウシ白血病ウイルスに感染した乳牛からのエキソソームが逆転写酵素活性を示すことが分かっている(Yamada et al., 2013)。また最近になって、がん細胞から単離されたエキソソーム中の成熟miRNAの非依存的産生が可能であることが証明された(Melo et al., 2014)。ここでは、エキソソームは、mRNA翻訳と結びついたDNA転写を介して機能的タンパク質を新規合成する内因的能力を有することが証明された。血小板は、巨核球分化後に血小板内に残っているmRNA分子からタンパク質を翻訳することができる(Weyrich et al., 2004)。それにもかかわらず、血小板内でDNAが転写されて新たなmRNA分子が生じることは報告されていない。さらに、ポリリボソームおよびmRNA結合タンパク質と関連するmRNA翻訳活性の中心が、樹状突起棘において、大きい方の細胞体から切断された場合でも観察された(Aakalu et al., 2001; Smith et al., 2001; Steward and Levy, 1982)。従って、一部の細胞構造が核の非存在下でも、おそらく、特定の生物学的機能を迅速に支援するためにタンパク質生合成の能力を保存してきたことは明らかである。タンパク質翻訳の他に、エキソソームはRNAポリメラーゼIIを介してDNA転写することができる。ヌクレオソームを含まない領域における裸のDNAの基本転写が最小限の転写機構成分、すなわち、RNA Pol IIと6種類の一般的な転写因子(GTF)のカクテルだけで可能であることは十分に確立している(Lorch et al., 2014; Nagai et al., 2017)。エキソソームは、タンパク質発現パターンを変えるために細胞に送達できる極めて多くの転写因子を含有することも示されている(Ung et al., 2014)。従って、エキソソームは、クロマチンに結合しておらず、これらの最小限の転写成分の存在下で転写を受けることができる裸のDNA残基を含有すると考えられている。
【００３２】
本研究から、転写/翻訳に必要な成分が24時間以内に使い尽くされる可能性が高く、その結果、限られた転写速度および翻訳速度をもたらすことも示唆される。エキソソームの異なる亜集団が別個の分子的特徴を有し得ることが示唆されているので(Willms et al., 2016)、エキソソームの小さなサブセットしか新規タンパク質合成の能力がない可能性がある。エキソソーム中の新たに合成されたタンパク質は機能的に活性があり、適切なタンパク質コンホメーションがあることを示唆している。エキソソームはリボソーム成分だけでなく、Hsp60およびHsp70などの、いくつかの分子シャペロンも含有することが示されている。リボソームそのものが、翻訳と同時に起こるタンパク質フォールディングにおいて重要な役割を有する。例えば、リボソームは、新たに形成されたタンパク質における二次構造形成を促進することができる。リボソームはまた、新生タンパク質の適切なフォールディングを支援できるシャペロンが結合するためのプラットフォームとしても働く(Kramer et al., 2009)。これらのエキソソーム成分は、新たに形成されたタンパク質の安定化に寄与する可能性があると考えられている。エキソソーム内腔での場合のように物理的制限もタンパク質フォールディングに対する安定化作用を有することができる(Rao and Cruz, 2013)。しかしながら、多くのタンパク質が不適切なコンホメーションまたはミスフォールディングを示すという可能性を除外することができない。未知の構造または内因的に障害のある領域を有するタンパク質が重要な生理学的機能を有する可能性があることを示唆する、「ダークプロテオーム」の思いもよらなかった特徴が最近解明されたことにより証明されたように(Perdigao et al., 2015)、これらには依然として重要な生物学的意味がある可能性がある。
【００３３】
このプロセスの生物学的意義を完全に理解するには、エキソソーム中で天然に合成されたタンパク質を細心かつ量的に同定することが必要である。しかしながら、このことは、真核生物生物学の理解の再評価において重大な影響を及ぼし得ることは明らかである。最近の研究から、細胞はエキソソームの中にmRNAを選択的に取り込むことができると示唆されている(Raposo and Stoorvogel, 2013)。このことは、概念実証として本研究において示されたように、エキソソームの中に選択的に入れられたmRNAが、起源の細胞中で発現が抑制されているタンパク質に翻訳できるという可能性を高める。新たに合成されたタンパク質は翻訳の1ヶ月後までのエキソソーム中で同定されたことから、おそらくタンパク質分解酵素レベルが低いために、エキソソームにより媒介されたタンパク質産生がタンパク質半減期の大幅な延長につながった可能性があると示唆される。
【００３４】
まとめると、これらの結果から、エキソソームは、身体のホメオスタシスおよび組織の病理発生に潜在的に重大な影響を及ぼす、以前では認識されていなかった生物学的活性を有することが証明された。増殖因子勾配が体内でのエキソソームの全身向性において役割を果たす可能性があると推測することができる。増殖因子産生の天然パターンを破壊すると、エキソソームの再分布および送達パターンがすぐに影響を受ける可能性がある。これらの応答パターンには、特に、遠く離れた身体部位間での細胞間コミュニケーションの決定において潜在的な意味がある可能性がある。これらの細胞外のきっかけに応答してエキソソームがタンパク質発現パターンを変えるという事実から、組織傷害における一次反応として働く可能性があることが示唆されるだろう。結論として、これらの発見はエキソソームの基本生物学への新規の洞察を提供し、生物ホメオスタシスにおける生物学的機能および疾患状態における潜在的な影響についての情報を提供する。
【００３５】
I.脂質ベースナノ粒子
一部の態様では、脂質ベースナノ粒子は、リポソーム、エキソソーム、脂質調製物、または別の脂質ベースナノ粒子、例えば、脂質ベース小胞(例えば、DOTAP:コレステロール小胞)である。脂質ベースナノ粒子は正に荷電してもよく、負に荷電していてもよく、中性でもよい。脂質ベースナノ粒子は、転写および翻訳、シグナル伝達、走化性、または他の細胞機能を可能にするために必要な成分を含んでもよい。
【００３６】
A.リポソーム
「リポソーム」は、閉じた脂質二重層または凝集物を生じることで形成された様々な単一膜および多重膜の脂質ビヒクルを含む総称的な用語である。リポソームは、一般的にリン脂質を含む二重層膜がある小胞構造と、一般的に水性組成物を含む内部媒体とを有すると特徴決定されることがある。本明細書において提供されるリポソームには、単層リポソーム、多重膜リポソーム、および多胞体リポソーム(multivesicular liposome)が含まれる。本明細書において提供されるリポソームは正に荷電してもよく、負に荷電していてもよく、中性に荷電していてもよい。ある特定の態様では、リポソームは電荷が中性である。
【００３７】
多重膜リポソームには、水性媒体によって分けられた複数の脂質層がある。リン脂質を含む脂質が過剰量の水溶液に懸濁されると、このようなリポソームは自発的に形成する。脂質成分は自己再編成した後に、閉じた構造が形成され、脂質二重層の間に水と、溶解した溶質が閉じ込められる。親油性分子または親油性領域を有する分子も脂質二重層に溶解するか、または脂質二重層と結合し得る。
【００３８】
特定の局面では、ポリペプチド、核酸、または低分子薬物は、例えば、リポソームの水性内部に入れられてもよく、リポソームの脂質二重層内に分散されてもよく、リポソームとポリペプチド/核酸の両方と結合する連結分子を介してリポソームに付着されてもよく、リポソームの中に閉じ込められてもよく、リポソームと複合体化されてもよい。
【００３９】
本態様に従って用いられるリポソームは、当業者に公知なように様々な方法によって作製することができる。例えば、リン脂質、例えば、中性リン脂質ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)をtert-ブタノールに溶解する。次いで、脂質をポリペプチド、核酸、および/または他の成分と混合する。Tween20が組成物の重量の約5％になるようにTween20を脂質混合物に添加する。tert-ブタノールの体積が少なくとも95％になるように、この混合物に過剰なtert-ブタノールを添加する。混合物をボルテックスし、ドライアイス/アセトン浴に入れて凍結し、一晩凍結乾燥する。凍結乾燥した調製物を-20℃で保管し、3ヶ月まで使用することができる。必要な場合に、凍結乾燥したリポソームを0.9％食塩水に溶解して再構成する。
【００４０】
または、リポソームは、容器、例えば、ガラス梨型フラスコの中で溶媒に溶解して脂質を混合することによって調製することができる。容器の体積は、予想されるリポソーム懸濁液の体積の10倍でなければならない。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を陰圧下で約40℃で除去する。通常、溶媒は、リポソームの所望体積に応じて約5分〜2時間以内に除去される。この組成物をデシケーターに入れて減圧下でさらに乾燥することができる。乾燥した脂質は時間の経過につれて劣化する傾向があるので一般的には約1週間後に廃棄する。
【００４１】
乾燥した脂質は、脂質膜が全て再懸濁されるまで震盪することで、発熱物質を含まない滅菌水に約25〜50mMリン脂質で溶解して水和することができる。次いで、リポソーム水溶液をアリコートに分け、それぞれをバイアルに入れ、凍結乾燥し、減圧下で密封することができる。
【００４２】
上記のように調製した、乾燥した脂質または凍結乾燥したリポソームを脱水し、タンパク質またはペプチドの溶液に溶解して再構成し、適切な溶媒、例えば、DPBSを用いて適切な濃度まで希釈し得る。次いで、混合物をボルテックスミキサーに入れて勢いよく震盪させる。ホルモン、薬物、核酸構築物などを含むが、これに限定されない作用物質などの包まれていない、さらなる材料を遠心分離によって29,000×gで除去し、リポソームペレットを洗浄する。洗浄したリポソームを適切な総リン脂質濃度、例えば、約50〜200mMで再懸濁する。包まれた、さらなる材料または活性物質の量は標準的な方法に従って求めることができる。リポソーム調製物に包まれた、さらなる材料または活性物質の量を求めた後に、リポソームを適切な濃度で希釈し、使用するまで4℃で保管し得る。リポソームを含む薬学的組成物は、通常、薬学的に許容される滅菌した担体または希釈剤、例えば、水または食塩水を含む。
【００４３】
本態様と共に有用であり得るさらなるリポソームには、カチオン性リポソーム、例えば、WO02/100435A1、米国特許第5,962,016号、米国特許出願第2004/0208921号、WO03/015757A1、WO04029213A2、米国特許第5,030,453号、および米国特許第6,680,068号に記載のカチオン性リポソームが含まれる。これらは全て、免責事項(disclaimer)なく、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００４４】
このようなリポソームを調製する際に、本明細書に記載の、または当業者に公知の任意のプロトコールを使用することができる。リポソームを調製するさらなる非限定的な例は、米国特許第4,728,578号、同第4,728,575号、同第4,737,323号、同第4,533,254号、同第4,162,282号、同第4,310,505号、および同第4,921,706号;国際出願PCT/US85/01161および同PCT/US89/05040に記載され、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる。
【００４５】
ある特定の態様では、脂質ベースナノ粒子は中性リポソーム(例えば、DOPCリポソーム)である。本明細書で使用する「中性リポソーム」または「非荷電リポソーム」は、本質的に中性の実効電荷(実質的に非荷電)を生じる1つまたは複数の脂質成分を有するリポソームとして定義される。「本質的に中性」または「本質的に非荷電」とは、ある特定の集団(例えば、リポソームの集団)の中に、もしあれば、いくつかの脂質成分が、別の成分の反対の電荷によって相殺されない電荷を含む(すなわち、成分の10％未満、より好ましくは5％未満、最も好ましくは1％未満が、相殺されていない電荷を含む)ことを意味する。ある特定の態様では、中性リポソームは、大部分は、生理学的条件下(すなわち、約pH7)では、それ自体で中性の脂質および/またはリン脂質を含んでもよい。
【００４６】
本態様のリポソームおよび/または脂質ベースナノ粒子はリン脂質を含んでもよい。ある特定の態様では、リポソームの作製において1種類のリン脂質が用いられてもよい(例えば、中性リポソームを作製するために中性リン脂質、例えば、DOPCが用いられてもよい)。他の態様では、リポソームを作製するために複数種類のリン脂質が用いられてもよい。リン脂質は中性供給源または合成供給源に由来してもよい。リン脂質には、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、およびホスファチジルエタノールアミンが含まれる。ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルコリンは生理学的条件下(すなわち、約pH7)では非荷電であるので、これらの化合物は中性リポソームを作製するのに特に有用な場合がある。ある特定の態様では、非荷電リポソームを生成するためにリン脂質DOPCが用いられる。ある特定の態様では、リン脂質でない脂質(例えば、コレステロール)が用いられてもよい。
【００４７】
リン脂質にはグリセロリン脂質およびある特定のスフィンゴ脂質が含まれる。リン脂質には、ジオレオイルホスファチジルコリン(「DOPC」)、卵ホスファチジルコリン(「EPC」)、ジラウリロイルホスファチジルコリン(「DLPC」)、ジミリストイルホスファチジルコリン(「DMPC」)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(「DPPC」)、ジステアロイルホスファチジルコリン(「DSPC」)、1-ミリストイル-2-パルミトイルホスファチジルコリン(「MPPC」)、1-パルミトイル-2-ミリストイルホスファチジルコリン(「PMPC」)、1-パルミトイル-2-ステアロイルホスファチジルコリン(「PSPC」)、1-ステアロイル-2-パルミトイルホスファチジルコリン(「SPPC」)、ジラウリロイルホスファチジルグリセロール(「DLPG」)、ジミリストイルホスファチジルグリセロール(「DMPG」)、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(「DPPG」)、ジステアロイルホスファチジルグリセロール(「DSPG」)、ジステアロイルスフィンゴミエリン(「DSSP」)、ジステアロイルホファチジルエタノールアミン(distearoylphophatidylethanolamine)(「DSPE」)、ジオレオイルホスファチジルグリセロール(「DOPG」)、ジミリストイルホスファチジン酸(「DMPA」)、ジパルミトイルホスファチジン酸(「DPPA」)、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン(「DMPE」)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(「DPPE」)、ジミリストイルホスファチジルセリン(「DMPS」)、ジパルミトイルホスファチジルセリン(「DPPS」)、脳ホスファチジルセリン(「BPS」)、脳スフィンゴミエリン(「BSP」)、ジパルミトイルスフィンゴミエリン(「DPSP」)、ジミリストイルホスファチジルコリン(「DMPC」)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(「DAPC」)、1,2-ジアラキドイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(「DBPC」)、1,2-ジエイコセノイル(dieicosenoyl)-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(「DEPC」)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(「DOPE」)、パルミトイルオエオイル(palmitoyloeoyl)ホスファチジルコリン(「POPC」)、パルミトイルオエオイルホスファチジルエタノールアミン(「POPE」)、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、およびジリノレオイルホスファチジルコリンが含まれるが、これに限定されない。
【００４８】
B.エキソソーム
本明細書で使用する「マイクロベシクル」および「エキソソーム」という用語は、直径(または粒子がスフェロイドでない場合は最大の寸法)が約10nm〜約5000nm、より典型的には30nm〜1000nm、最も典型的には約50nm〜750nmであり、エキソソームの膜の少なくとも一部が細胞から直接得られている膜状粒子を指す。最も一般的には、エキソソームのサイズ(平均直径)はドナー細胞のサイズの5％までである。従って、特に意図されるエキソソームには、細胞から脱落したエキソソームが含まれる。
【００４９】
エキソソームは、例えば、体液などの任意の適切な試料タイプの中に検出されてもよく、任意の適切な試料タイプから単離されてもよい。本明細書で使用する「単離された」という用語は、天然環境から分離することを指し、少なくとも部分的な精製を含むことが意図され、大幅な精製を含む場合がある。本明細書で使用する「試料」という用語は、本発明によって提供される方法に適した任意の試料を指す。前記試料は、検出または単離に適したエキソソームを含む任意の試料でよい。試料の供給源には、血液、骨髄、胸膜液、腹水、脳脊髄液、尿、唾液、羊水、悪性腹水、気管支肺胞洗浄液、関節液、母乳、汗、涙、滑液、および気管支洗浄液が含まれる。一局面では、前記試料は、例えば、全血またはその任意の画分もしくは成分を含む、血液試料である。本発明と使用するのに適した血液試料は、血球またはその成分を含む公知の任意の供給源、例えば、静脈、動脈、末梢、組織、帯(cord)などから抽出することができる。例えば、試料は、周知の、かつ日常的な臨床方法(例えば、全血を採取および処理するための手法)を用いて入手および処理することができる。一局面では、例示的な試料は、がんがある対象から採取された末梢血でもよい。
【００５０】
エキソソームはまた、組織試料、例えば、手術試料、生検試料、組織、糞便、および培養細胞からも単離されてよい。組織供給源からエキソソームを単離する場合に、単一細胞懸濁液を入手し、その後に細胞を溶解してエキソソームを放出するために組織をホモジナイズすることが必要な場合がある。組織試料からエキソソームを単離する場合に、エキソソームを破壊しないホモジナイゼーションおよび溶解の手法を選択することが重要である。本明細書において意図されるエキソソームは、好ましくは、生理学的に許容される溶液、例えば、緩衝食塩水、増殖培地、様々な水性媒体などに溶解した体液から単離される。
【００５１】
エキソソームは、新鮮に収集された試料から単離されてもよく、凍結または冷蔵されて保管されていた試料から単離されてもよい。一部の態様では、エキソソームは細胞培養培地から単離されてもよい。必要ではないが、試料から破片を除去するために、流体試料が、体積排除(volume-excluding)ポリマーを用いた沈殿前に清澄化されれば、さらに高純度のエキソソームが得られる場合がある。清澄化方法には、遠心分離、超遠心、濾過、または限外濾過が含まれる。最も典型的には、エキソソームは、当技術分野において周知の非常に多くの方法によって単離することができる。好ましい方法の1つは、体液または細胞培養上清からの分画遠心である。エキソソーム単離の例示的な方法は、(Losche et al., 2004; Mesri and Altieri, 1998; Morel et al., 2004)に記載されている。または、エキソソームはまた、(Combes et al., 1997)に記載のようにフローサイトメトリーでも単離されることがある。
【００５２】
エキソソームを単離するための一般に受け入れられているプロトコールの1つには、比較的低い密度のエキソソームを浮かべるためにスクロース密度勾配またはスクロースクッションと組み合わされることが多い超遠心が含まれる。連続分画遠心によるエキソソームの単離は、他のマイクロベシクルまたは巨大分子複合体とサイズ分布が重複する可能性があるために複雑になる。さらに、遠心分離は、サイズに基づいて小胞を分離する不十分な手段を提供することがある。しかしながら、連続遠心分離がスクロース勾配超遠心と組み合わされるとエキソソームを高度に濃縮することができる。
【００５３】
超遠心経路に代わるものを用いるサイズに基づいたエキソソームの単離が別の選択肢である。超遠心よりも時間がかからず、特別な装置を必要としない、限外濾過法を用いた首尾良いエキソソーム精製が報告されている。同様に、流体を動かす陽圧を用いて、あるマイクロフィルターで細胞、血小板、および細胞破片を除去し、第2のマイクロフィルターに30nmよりも大きな小胞を捕獲する市販のキット(EXOMIR(商標), Bioo Scientific)を利用することができる。しかしながら、このプロセスの場合、エキソソームは回収されず、そのRNA内容物は、第2のマイクロフィルターに捕らえた材料から直接抽出され、次いで、PCR分析に使用することができる。HPLCベースのプロトコールを用いた場合、これらのプロセスは専用の装置を必要とし、スケールアップすることが難しいが、潜在的には高純度のエキソソームを得ることができるだろう。重大な問題は、血液と細胞培養培地が両方とも、エキソソームと同じサイズ範囲の多数のナノ粒子(一部は非小胞)を含有することである。例えば、エキソソームではなく細胞外タンパク質複合体の中に、いくらかのmiRNAが含まれることがある。しかしながら、プロテアーゼ(例えば、プロテイナーゼK)を用いた処理を行って、「エキソソーム外(extraexosomal)」タンパク質による、あらゆる汚染を排除することができる。
【００５４】
別の態様では、がん細胞由来エキソソームが、試料のエキソソームを濃縮するためによく用いられる技法、例えば、免疫特異的相互作用が関与する技法(例えば、免疫磁気的捕獲)によって捕獲される場合がある。免疫磁気的捕獲は免疫磁気的細胞分離とも知られ、典型的には、ある特定の細胞タイプの表面に見出されるタンパク質に対して作られた抗体を小さな常磁性ビーズに付着することを伴う。抗体でコーティングしたビーズを血液などの試料と混合すると、ビーズは特定の細胞に付着し、取り囲む。次いで、試料を強力な磁場に配置すると、ビーズが片側でペレット化する。血液を除去した後に、捕獲した細胞はビーズと一緒に保持される。この一般的方法の多くのバリエーションが当技術分野において周知であり、エキソソームを単離するための使用に適している。一例では、エキソソームは磁気ビーズ(例えば、アルデヒド/硫酸塩ビーズ)に付着さられることがあり、次いで、ビーズに付着されたエキソソームの表面上のエピトープを認識させるために、混合物に抗体が添加される。がん細胞由来エキソソーム上に見出されることが分かっている例示的なタンパク質には、ATP-binding cassette sub-family A member 6(ABCA6)、テトラスパニン-4(TSPAN4)、SLIT and NTRK-like protein 4(SLITRK4)、putative protocadherin β-18(PCDHB18)、骨髄性細胞表面抗原CD33(CD33)、およびグリピカン-1(GPC1)が含まれる。がん細胞由来エキソソームは、例えば、これらのタンパク質のうちの1つまたは複数に対する抗体またはアプタマーを用いて単離され得る。
【００５５】
本明細書で使用する分析は、エキソソームの直接的または間接的な視覚化を可能にする任意の方法を含み、インビボでもエクスビボでもよい。例えば、分析には、固体支持体に結合したエキソソームの顕微鏡または細胞数測定によるエクスビボ検出および視覚化、フローサイトメトリー、蛍光画像化などが含まれ得るが、これに限定されない。例示的な局面では、がん細胞由来エキソソームは、ATP-binding cassette sub-family A member 6(ABCA6)、テトラスパニン-4(TSPAN4)、SLIT and NTRK-like protein 4(SLITRK4)、putative protocadherin β-18(PCDHB18)、骨髄性細胞表面抗原CD33(CD33)、グリピカン-1(GPC1)、ヒストンH2A 2型-A(HIST1H2AA)、ヒストンH2A 1-A型(HIST1H1AA)、ヒストンH3.3(H3F3A)、ヒストンH3.1(HIST1H3A)、ジンクフィンガータンパク質37ホモログ(ZFP37)、ラミニンサブユニットβ-1(LAMB1)、Tubulointerstitial nephritis antigen-like(TINAGL1)、ペルオキシレデオキシン(Peroxiredeoxin)-4(PRDX4)、コラーゲン α-2(IV)鎖(COL4A2)、推定タンパク質C3P1(C3P1)、ヘミセンチン(Hemicentin)-1 (HMCN1)、Putative rhophilin-2-like protein(RHPN2P1)、Ankyrin repeat domain-containing protein 62(ANKRD62)、Tripartite motif-containing protein 42(TRIM42)、Junction plakoglobin(JUP)、チューブリンβ-2B鎖(TUBB2B)、エンドリボヌクレアーゼダイサー(DICER1)、E3ユビキチン-タンパク質リガーゼTRIM71(TRIM71)、Katanin p60 ATPase-containing subunit A-like 2(KATNAL2)、タンパク質S100-A6(S100A6)、5’-nucleotidase domain-containing protein 3(NT5DC3)、バリン-tRNAリガーゼ(VARS)、カズリン(Kazrin)(KAZN)、ELAV-like protein 4(ELAVL4)、リングフィンガータンパク質166(RNF166)、FERM and PDZ domain-containing protein 1(FRMPD1)、78 kDa glucose-regulated protein(HSPA5)、Trafficking protein particle complex subunit 6A(TRAPPC6A)、スクアレンモノオキシゲナーゼ(SQLE)、Tumor susceptibility gene 101 protein(TSG101)、Vacuolar protein sorting 28 homolog(VPS28)、Prostaglandin F2 receptor negative regulator(PTGFRN)、Isobutyryl-CoA dehydrogenase, mitochondrial(ACAD8)、26S protease regulatory subunit 6B(PSMC4)、伸長因子1-γ(EEF1G)、タイチン(TTN)、チロシン-タンパク質ホスファターゼ13型(PTPN13)、トリオースリン酸イソメラーゼ(TPI1)、もしくはカルボキシペプチダーゼE(CPE)のうちの1つもしくは複数に対して作られた抗体を用いて検出され、その後に、固体支持体に結合され、かつ/または顕微鏡もしくは細胞数測定による検出を用いて視覚化される。
【００５６】
細胞において発現している全てのタンパク質が、その細胞が分泌したエキソソームに見出されるとは限らないことに留意しなければならない（図11）。例えば、カルネキシン、GM130、およびLAMP-2は全て、MCF-7細胞において発現しているタンパク質であるが、MCF-7細胞が分泌したエキソソームには見出されない(Baietti et al., 2012)。別の例として、ある研究から、190/190人の膵管腺がん患者に、健常対照より高いレベルのGPC1+エキソソームがあることが見出された(Melo et al., 2015。その全体が参照により本明細書に組み入れられる)。注目すべきことに、平均して健常対照の2.3％にしかGPC1+エキソソームがなかった。
【００５７】
1.細胞培養物からエキソソームを収集するための例示的なプロトコール
翌日に細胞が約70％コンフルエントになるように、1日目に、10％FBSを含有する培地が入っているT225フラスコに、十分な数の細胞(例えば、約500万個の細胞)を播種する。2日目に、細胞上の培地を吸引し、細胞をPBSで2回洗浄し、次いで、25〜30mLの基本培地(すなわち、PenStrepもFBSも無い)を細胞に添加する。細胞を24〜48時間インキュベートする。48時間のインキュベーションが好ましいが、細胞株の中には無血清培地に対して感受性が高いものもあり、そのため、インキュベーション時間を24時間に短縮しなければならない。FBSは、NanoSight結果を強くゆがめるエキソソームを含有することに留意のこと。
【００５８】
3/4日目に、培地を収集し、死細胞と大きな破片をペレット化するために800×gで室温において5分間遠心分離する。上清を新しいコニカルチューブに移し、他の大きな破片と大きな小胞を除去するために2000×gで10分間、培地を再遠心分離する。培地を0.2μmフィルターに通し、次いで、35mL/チューブを用いて超遠心チューブ(例えば、25×89mm Beckman Ultra-Clear)にアリコートする。1チューブあたりの培地の体積は35mL未満であれば、35mLになるようにチューブの残りをPBSで満たす。SW 32 Tiローター(k-factor 266.7, RCF max 133,907)を用いて、培地を28,000rpmで4℃において2〜4時間超遠心する。およそ1インチの液体が残るまで、上清を注意深く吸引する。チューブを傾け、残りの培地を、ゆっくりと吸引ピペットに入れる。所望であれば、エキソソームペレットをPBSで再懸濁し、エキソソーム集団をさらに精製するために28,000rpmの超遠心を1〜2時間繰り返すことができる。
【００５９】
最後に、エキソソームペレットを210μLのPBSに再懸濁する。各試料について複数の超遠心チューブがあれば、同じ210μL PBSを用いて、それぞれのエキソソームペレットを連続して再懸濁する。各試料について、10μLを採取し、ナノ粒子追跡分析に使用するために990μLのH2Oに添加する。残りの200μLエキソソーム含有懸濁液を下流プロセスに使用するか、または-80℃ですぐに保管する。
【００６０】
2.血清試料からエキソソームを抽出するための例示的なプロトコール
最初に、血清試料を氷上で解凍する。次いで、250μLの無細胞血清試料を11mLのPBSで希釈する。0.2μm孔フィルターで濾過する。希釈した試料を150,000×gで4℃において一晩超遠心する。翌日、上清を注意深く捨て、11mL PBSでエキソソームペレットを洗浄する。150,000×gで4℃において2時間、2回目の超遠心を行う。最後に、上清を注意深く捨て、分析のために100μL PBSにエキソソームペレットを再懸濁する。
【００６１】
C.エキソソームおよびリポソームを電気穿孔するための例示的なプロトコール
1×108個のエキソソーム(NanoSight分析によって測定した)または100nmリポソーム(例えば、Encapsula Nano Sciencesから購入した)と、1μgのsiRNA(Qiagen)またはshRNAを400μLの電気穿孔緩衝液(1.15mMリン酸カリウム, pH7.2、25mM塩化カリウム、21％Optiprep)に入れて混合する。4mmキュベットを用いてエキソソームまたはリポソームを電気穿孔する(例えば、Alvarez-Erviti et al., 2011; El-Andaloussi et al., 2012を参照されたい)。電気穿孔後に、エキソソームまたはリポソームをプロテアーゼフリーRNアーゼで処理し、その後に10×濃縮RNアーゼ阻害剤を添加する。最後に、前記のように超遠心法下でエキソソームまたはリポソームをPBSで洗浄する。
【００６２】
II.疾患の診断、予後予測、および処置
本発明のある特定の局面は、治療用物質または診断用物質を発現するまたは含むエキソソームを用いて患者を処置することを提供する。本明細書で使用する「治療用物質」は、がんまたは他の状態の処置において有用な原子、分子、または化合物である。治療用物質の例には、薬物、化学療法剤、治療抗体および抗体断片、毒素、放射性同位体、酵素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、キレート剤、ホウ素化合物、光活性剤、および色素が含まれるが、これに限定されない。本明細書で使用する「診断用物質」は、疾患を診断、検出、または視覚化するのに有用な原子、分子、または化合物である。本明細書に記載の態様によれば、診断用物質には、放射性物質(例えば、放射性同位体、放射性核種、放射標識、または放射性トレーサ)、色素、造影剤、蛍光化合物または蛍光分子、生物発光化合物または生物発光分子、酵素、および増強剤(enhancing agent)(例えば、常磁性イオン)が含まれ得るが、これに限定されない。
【００６３】
一部の局面では、治療用組換えタンパク質は、患者の細胞において失われている活性を有するタンパク質、所望の酵素活性を有するタンパク質、所望の阻害活性を有するタンパク質などでもよい。例えば、前記タンパク質は、転写因子、酵素、タンパク質毒素、抗体、モノクローナル抗体などでもよい。モノクローナル抗体は細胞内抗原に特異的または選択的に結合し得る。モノクローナル抗体は細胞内抗原の機能を阻害し得、かつ/またはタンパク質間相互作用を破壊し得る。本発明の他の局面は、患者試料中のがん細胞由来エキソソームの存在に基づいて疾患を診断することを提供する。
【００６４】
エキソソームは、mRNA転写およびタンパク質翻訳を完了するのに必要な機構を含むことが知られているので(その全体が参照により本明細書に組み入れられるPCT/US2014/068630を参照されたい)、治療用タンパク質をコードするmRNAまたはDNA核酸がトランスフェクションによってエキソソームに導入される場合がある。または、治療用タンパク質そのものがエキソソームに電気穿孔されてもよく、リポソームに直接取り込まれてもよい。例示的な治療用タンパク質には、腫瘍抑制因子タンパク質、ペプチド、変異タンパク質の野生型タンパク質対応物、DNA修復タンパク質、タンパク質分解酵素、タンパク質毒素、細胞内タンパク質の活性を阻害することができるタンパク質、細胞内タンパク質の活性を活性化することができるタンパク質、または機能喪失を再構成する必要がある任意のタンパク質が含まれるが、これに限定されない。例示的な治療用タンパク質の具体例には、123F2、Abcb4、Abcc1、Abcg2、Actb、Ada、Ahr、Akt、Akt1、Akt2、Akt3、Amhr2、Anxa7、Apc、Ar、Atm、Axin2、B2m、Bard1、Bcl2l1、Becn1、Bhlhal5、Bin1、Blm、Braf、Brca1、Brca2、Brca3、Braf、Brcata、Brinp3、Brip1、Bub1b、Bwscr1a、Cadm3、Casc1、Casp3、Casp7、Casp8、Cav1、Ccam、Ccnd1、Ccr4、Ccs1、Cd28、Cdc25a、Cd95、Cdh1、Cdkn1a、Cdkn1b、Cdkn2a、Cdkn2b、Cdkn2c、Cftr、Chek1、Chek2、Crcs1、Crcs10、Crcs11、Crcs2、Crcs3、Crcs4、Crcs5、Crcs6、Crcs7、Crcs8、Crcs9、Ctnnb1、Cts1、Cyp1a1、Cyp2a6、Cyp2b2、Cyld、Dcc、Dkc1、Dicer1、Dmtf1、Dnmt1、Dpc4、E2f1、Eaf2、Eef1a1、Egfr、Egfr4、Erbb2、Erbb4、Ercc2、Ercc6、Ercc8、Errfi1、Esr1、Etv4、Faslg、Fbxo10、Fcc、Fgfr3、Fntb、Foxm1、Foxn1、Fus1、Fzd6、Fzd7、Fzr1、Gadd45a、Gast、Gnai2、Gpc1、Gpr124、Gpr87、Gprc5a、Gprc5d、Grb2、Gstm1、Gstm5、Gstp1、Gstt1、H19、H2afx、Hck、Lims1、Hdac、Hexa、Hic1、Hin1、Hmmr、Hnpcc8、Hprt、Hras、Htatip2、Il1b、Il10、Il2、Il6、Il8rb Inha、Itgav、Jun、Jak3、Kit、Klf4、Kras、Kras2、Kras2b、Lig1、Lig4、Lkb1、Lmo7、Lncr1、Lncr2、Lncr3、Lncr4、Ltbp4、Luca1、Luca2、Lyz2、Lzts1、Mad1l1、Mad2l1、Madr2/Jv18、Mapk14、Mcc、Mcm4、Men1、Men2、Met、Mgat5、Mif、Mlh1、Mlh3、Mmac1、Mmp8、Mnt、Mpo、Msh2、Msh3、Msh6、Msmb、Mthfr、Mts1、Mutyh、Myh11、Nat2、Nbn、Ncoa3、Neil1、Nf1、Nf2、Nfe2l1、Nhej1、Nkx2-1、Nkx2-9、Nkx3-1、Nprl2、Nqo1、Nras、Nudt1、Ogg1、Oxgr1、p16、p19、p21、p27、p27mt、p57、p14ARF、Palb2、Park2、Pggt1b、Pgr、Pi3k、Pik3ca、Piwil2、Pl6、Pla2g2a、Plg、Plk3、Pms1、Pms2、Pold1、Pole、Ppard、Pparg、Ppfia2、Ppm1d、Prdm2、Prdx1、Prkar1a、Ptch、Pten、Prom1、Psca、Ptch1、Ptf1a、Ptger2、Ptpn13、Ptprj、Rara、Rad51、Rassf1、Rb、Rb1、Rb1cc1、Rb12、Recgl4、Ret、Rgs5、Rhoc、Rint1、Robo1、Rpl38、S100a4、SCGB1A1、Skp2、Smad2、Smad3、Smad4、Smarcb1、Smo、Snx25、Spata13、Srpx、Ssic1、Sstr2、Sstr5、Stat3、St5、St7、St14、Stk11、Suds3、Tap1、Tbx21、Terc、Tnf、Tp53、Tp73、Trpm5、Tsc2、Tsc1、Vhl、Wrn、Wt1、Wt2、Xrcc1、Xrcc5、Xrcc6、およびZac1が含まれる。
【００６５】
疾患細胞の細胞内空間に導入することが望ましい場合があるタンパク質の具体的なタイプの1つは抗体(例えば、モノクローナル抗体)である。このような抗体は細胞内タンパク質の機能を破壊し得、かつ/または細胞内タンパク質間相互作用を破壊し得る。このようなモノクローナル抗体の例示的な標的には、RNAi経路に関与するタンパク質、テロメラーゼ、疾患プロセスを制御する転写因子、キナーゼ、ホスファターゼ、DNA合成に必要なタンパク質、タンパク質翻訳に必要なタンパク質が含まれるが、これに限定されない。例示的な治療抗体標的の具体例には、以下の遺伝子:Dicer、Ago1、Ago2、Trbp、Ras、raf、wnt、btk、Bcl-2、Akt、Sis、src、Notch、Stathmin、mdm2、abl、hTERT、c-fos、c-jun、c-myc、erbB、HER2/Neu、HER3、VEGFR、PDGFR、c-kit、c-met、c-ret、flt3、API、AMLl、axl、alk、fins、fps、gip、lck、Stat、Hox、MLM、PRAD-I、およびtrkによってコードされるタンパク質が含まれる。モノクローナル抗体に加えて、任意のその抗原結合断片、例えば、scFv、Fab断片、Fab’、F(ab’)2、Fv、ペプチボディ(peptibody)、ダイアボディ、トリアボディ、またはミニボディも意図される。このような任意の抗体または抗体断片はグリコシル化されていてもよく、非グリコシル化(aglycosylated)されていてもよい。
【００６６】
エキソソームはDICERおよび活性RNAプロセシングRISC複合体を含むことが知られているので(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、PCT 公報WO 2014/152622を参照されたい)、トランスフェクションによってエキソソームに導入されたshRNAは、エキソソームそれ自体と一緒にRISC複合体結合siRNAに成熟することができる。または、成熟siRNAそのものがトランスフェクションによってエキソソームまたはリポソームに導入される。従って、例として、以下:発生遺伝子の野生型または変異バージョン(例えば、接着分子、サイクリンキナーゼ阻害剤、Wntファミリーメンバー、Paxファミリーメンバー、Wingedヘリックスファミリーメンバー、Hoxファミリーメンバー、サイトカイン/リンホカインおよびその受容体、増殖因子または分化因子ならびにその受容体、神経伝達物質およびその受容体)、腫瘍抑制遺伝子(例えば、APC、CYLD、HIN-1、KRAS2b、p16、p19、p21、p27、p27mt、p53、p57、p73、PTEN、Rb、ウテログロビン、Skp2、BRCA-1、BRCA-2、CHK2、CDKN2A、DCC、DPC4、MADR2/JV18、MEN1、MEN2、MTS1、NF1、NF2、VHL、WRN、WT1、CFTR、C-CAM、CTS-1、zac1、ras、MMAC1、FCC、MCC、FUS1、Gene26(CACNA2D2)、PL6、Beta*(BLU)、Luca-1(HYAL1)、Luca-2(HYAL2)、123F2(RASSF1)、101F6、Gene21(NPRL2)、またはSEM A3ポリペプチドをコードする遺伝子)、アポトーシス促進性遺伝子(例えば、CD95、カスパーゼ-3、Bax、Bag-1、CRADD、TSSC3、bax、hid、Bak、MKP-7、PARP、bad、bcl-2、MST1、bbc3、Sax、BIK、およびBID)、サイトカイン(例えば、GM-CSF、G-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32 IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α、TNF-β、PDGF、およびmda7)、がん遺伝子(例えば、ABLI、BLC1、BCL6、CBFA1、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETS1、ETS1、ETV6、FGR、FOX、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NRAS、PIM1、PML、RET、SRC、TAL1、TCL3、およびYES)、ならびに酵素(例えば、ACP不飽和化酵素およびヒクロキシラーゼ(hycroxylase)、ADP-グルコースピロホリラーゼ(pyrophorylase)、ATPアーゼ、アルコールデヒクロゲナーゼ(alcohol dehycrogenase)、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、シクロオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、デキストリナーゼ、エステラーゼ、DNAポリメラーゼおよびRNAポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、GTPアーゼ、ヘリカーゼ、ヘミセルラーゼ、インテグラーゼ、インベルターゼ、イソメルサーゼ(isomersase)、キナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リゾチーム、ヌクレアーゼ、ペクチンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、エンドポリガラクツロナーゼ、プロテイナーゼおよびペプチデアーゼ(peptidease)、プルラナーゼ(pullanase)、リコンビナーゼ、逆転写酵素、トポイソメラーゼ、キシラナーゼ)は、標的遺伝子発現を調整するかまたは弱めるために本発明の方法において使用され得る、考えられる標的遺伝子のクラスである。場合によっては、sh/siRNAは、対応する野生型バージョンの発現に影響を及ぼさずに、がん細胞で発現する遺伝子の変異バージョンを特異的に標的にするように設計される場合がある。実際に、このような阻害核酸が任意の供給���者によって関心対象のタンパク質の検証済みのダウンレギュレーターであることが見出されていれば、本発明の組成物および方法において、どんな阻害核酸でも適用することができる。
【００６７】
RNAiを設計する際に、siRNAの性質、サイレンシング効果の永続性、および送達系の選択などの考慮する必要がある、いくつかの要因がある。RNAi効果を生じさせるために、生物に導入されるsiRNAは典型的にはエキソン配列を含有する。さらに、RNAiプロセスは相同性に依存する。そのため、相同であるが、遺伝子特異的でない配列間の相互干渉(cross-interference)の可能性を最小にしながら遺伝子特異性を最大にするように、配列を注意深く選択しなければならない。好ましくは、siRNAは、siRNA配列と、阻害しようとする遺伝子との間で80％超、85％超、90％超、95％超、98％超の同一性、または100％の同一性さえ示す。標的遺伝子との同一性が約80％未満の配列は効果がかなり小さい。従って、siRNAと、阻害しようとする遺伝子との間の相同性が大きいほど、無関係の遺伝子の発現が影響を受ける可能性が小さくなる。
【００６８】
エキソソームはまた、CRISPR/Casシステムなどの遺伝子編集システムも含むように操作される場合がある。一般的に、「CRISPRシステム」は、ひとまとめにして、Cas遺伝子をコードする配列、tracr(トランス活性化CRISPR)配列(例えば、tracrRNAもしくは活性のある部分的tracrRNA)、tracr-mate配列(内因性CRISPRシステムの文脈では「ダイレクトリピート」およびtracrRNAによってプロセシングされたダイレクトリピートを含む)、ガイド配列(内因性CRISPRシステムの文脈では「スペーサー」とも呼ばれる)、ならびに/またはCRISPR遺伝子座に由来する他の配列および転写物を含む、CRISPR関連(「Cas」)遺伝子の発現または活性指示に関与する転写物および他のエレメントを指している。一部の局面では、CasヌクレアーゼおよびgRNA(標的配列に特異的なcrRNAと、ある決まったtracrRNAとの融合を含む)が細胞に導入される。一般的に、gRNAの5'末端における標的部位が、相補的塩基対合を用いてCasヌクレアーゼを標的部位に、例えば、遺伝子に標的指向させる。標的部位は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列のすぐ5'側の位置、例えば、典型的にはNGG、またはNAGに基づいて選択されてもよい。この点に関して、標的DNA配列に対応するようにガイドRNAの最初の20、19、18、17、16、15、14、14、12、11、または10ヌクレオチドを改変することによって、gRNAは所望の配列を標的にする。一般的に、CRISPRシステムは標的配列部位でのCRISPR複合体形成を促進するエレメントを特徴とする。典型的に、「標的配列」は、一般的に、ガイド配列が相補性を有するように設計されている配列を指し、標的配列とガイド配列とのハイブリダイゼーションによってCRISPR形成が促進される。ハイブリダイゼーションを引き起こし、CRISPR複合体形成を促進するのに十分な相補性があれば、完全相補性が必ず必要とされるわけではない。このようなシステムを含むように操作されたエキソソーム中のCRISPRシステムが標的細胞内でゲノムDNAを編集するように機能し得る、またはこのシステムがエキソソームそれ自体の中でDNAを編集し得る。
【００６９】
タンパク質ベースおよび核酸ベースの治療剤に加えて、エキソソームは低分子薬物を単独で、または任意のタンパク質ベースおよび核酸ベースの治療剤と組み合わせて送達するために使用される場合がある。本態様において使用することが意図される例示的な低分子薬物には、毒素、化学療法剤、細胞内タンパク質の活性を阻害する剤、細胞内タンパク質の活性を活性化する剤、再狭窄を予防するための剤、腎臓病を処置するための剤、間欠性跛行に用いられる剤、低血圧およびショックの処置において用いられる剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、抗狭心症剤、抗不整脈剤、降圧剤、アンチオテンシン(antiotensin)ii受容体アンタゴニスト、抗血小板薬、bブロッカーb1選択性、β遮断剤、心血管適応症の植物性薬品、カルシウムチャンネルブロッカー、心血管/診断剤、中心α-2アゴニスト、冠血管拡張剤、利尿薬および腎尿細管阻害剤、中性エンドペプチダーゼ/アンジオテンシン変換酵素阻害剤、末梢血管拡張剤、カリウムチャンネルオープナー、カリウム塩、抗痙攣剤、制吐剤、鎮吐薬、抗パーキンソン病剤、鎮痙剤、覚醒薬、外傷の処置において適用できる剤、アルツハイマー病または認知症の処置において適用できる剤、片頭痛の処置において適用できる剤、神経変性疾患の処置において適用できる剤、カポジ肉腫の処置において適用できる剤、AIDSの処置において適用できる剤、がん化学療法剤、免疫障害の処置において適用できる剤、精神障害の処置において適用できる剤、鎮痛薬、硬膜外麻酔剤およびくも膜下腔内麻酔剤、全身、局所、領域の神経筋遮断剤鎮静剤、麻酔前副腎/acth、タンパク質同化ステロイド、糖尿病の処置において適用できる剤、ドーパミンアゴニスト、成長ホルモンおよび類似体、血糖上昇剤(hyperglycemic agent)、血糖降下剤、経口インシュリン、大量非経口投与医薬品(lvp)、脂質を変える剤、代謝研究および代謝の先天異常、栄養分/アミノ酸、栄養lvp、肥満薬(食欲低下薬)、ソマトスタチン、甲状腺剤、バソプレッシン、ビタミン、コルチコステロイド、粘液溶解剤、肺抗炎症剤、肺サーファクタント、制酸剤、抗コリン作用薬、止痢薬、制吐剤、胆石溶解剤(cholelitholytic agent)、炎症性腸疾患剤、過敏性腸症候群剤、肝臓剤、金属キレート剤、種々の胃液分泌剤、膵炎剤、膵臓酵素、プロスタグランジン、プロスタグランジン、プロトンポンプ阻害剤、硬化剤、スクラルファート、抗プロゲスチン、避妊薬、経口避妊薬、非経口ドーパミンアゴニスト、エストロゲン、ゴナドトロピン、GNRHアゴニスト、GHRHアンタゴニスト、分娩誘発剤、プロゲスチン、子宮に作用する剤、抗貧血薬、抗凝固剤、抗線溶薬、抗血小板剤、抗トロンビン薬、血液凝固薬、線維素溶解薬、血液学、ヘパリン阻害剤、金属キレート剤、プロスタグランジン、ビタミンK、抗アンドロゲン、アミノグリコシド、抗菌剤、スルホンアミド、セファロスポリン、クリンダマイシン、皮膚科の薬、界面活性剤、エリスロマイシン、駆虫剤、抗真菌剤、抗マラリア剤、抗ミコバクテリア剤、抗寄生虫剤、抗原虫剤、抗トリコモナス剤、抗結核剤、免疫調節剤、免疫賦活剤、マクロライド系抗生物質、抗寄生虫剤、コルチコステロイド、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、酵素遮断薬、リウマチ性疾患用の免疫調節剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、非ステロイド性抗炎症剤、鎮痛薬、解熱剤、αアドレナリンアゴニスト/ブロッカー、抗生物質、抗ウイルス剤、βアドレナリンブロッカー、炭酸脱水酵素阻害剤、コルチコステロイド、免疫系制御因子、マスト細胞阻害剤、非ステロイド性抗炎症剤、ならびにプロスタグランジンが含まれるが、これに限定されない。
【００７０】
エキソソームはまた診断用物質を送達するために用いられてもよい。例示的な診断用物質には、磁気共鳴画像強調剤、ポジトロン放出断層撮影製品、放射性診断用物質、放射性治療用物質、放射線不透過性造影剤、放射性医薬品、超音波イメージング剤、および血管造影診断用物質が含まれるが、これに限定されない。
【００７１】
本明細書で使用する「対象」とは、本方法が行われる任意の個体または患者を指す。一般的に対象はヒトであるが、当業者に理解されるように、対象は動物でもよい。従って、哺乳動物、例えば、げっ歯類(マウス、ラット、ハムスター、およびモルモットを含む)、ネコ、イヌ、ウサギ、家畜(ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタなどを含む)、および霊長類(サル、チンパンジー、オランウータン、およびゴリラを含む)を含む他の動物が対象の定義の範囲内に含まれる。
【００７２】
「処置」および「処置する」とは、対象への治療用物質の投与もしくは適用、または疾患もしくは健康に関連する状態の治療的利益を得ることを目的とした対象への手技もしくはモダリティの遂行を指す。例えば、処置は、化学療法、免疫療法、もしくは放射線療法の実施、外科手術の遂行、またはその任意の組み合わせを含んでもよい。
【００７３】
本出願を通して使用する「治療的利益」または「治療に有効な」という用語は、この状態の医学的処置に関して対象の健康を増進する、または向上させる、どんなものも指す。この用語には、疾患の徴候または症状の頻度または重篤度の低下が含まれるが、これに限定されない。例えば、がんの処置は、例えば、腫瘍の侵襲性の低下、がんの増殖速度の低下、または転移の阻止を含んでもよい。がんの処置はまた、がんを有する対象の生存期間の延長も指すことがある。
【００７４】
本明細書で使用する「がん」という用語は、固形腫瘍、転移がん、または非転移がんを説明するために用いられることがある。ある特定の態様では、がんは、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、十二指腸、小腸、大腸、結腸、直腸、肛門、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、または子宮において生じることがある。
【００７５】
がんは、具体的には、以下の組織学的タイプのがん:新生物、悪性;がん腫;がん腫、未分化;巨細胞および紡錘体細胞のがん腫;小細胞がん;乳頭状がん;扁平上皮がん;リンパ上皮がん;基底細胞がん;石灰化上皮腫(pilomatrix carcinoma);移行上皮がん;乳頭状移行上皮がん;腺がん;ガストリノーマ、悪性;胆管がん;肝細胞がん;混合型肝細胞がんおよび胆管がん;小柱腺がん(trabecular adenocarcinoma);腺様嚢胞がん;腺腫性ポリープ内腺がん;腺がん、家族性大腸ポリポーシス;固形がん;カルチノイド腫瘍、悪性;細気管支肺胞(branchiolo-alveolar)腺がん;乳頭状腺がん;色素嫌性がん;好酸性がん(acidophil carcinoma);好酸性腺がん(oxyphilic adenocarcinoma);塩基好性がん;明細胞腺がん;顆粒細胞がん;濾胞腺がん;乳頭状腺がんおよび濾胞腺がん;非被包性硬化性がん(nonencapsulating sclerosing carcinoma);副腎皮質がん;類内膜がん(endometroid carcinoma);皮膚付属器がん;アポクリン腺がん;皮脂腺がん;耳道腺がん(ceruminous adenocarcinoma);粘表皮がん;嚢胞腺がん;乳頭状嚢胞腺がん;乳頭状漿液嚢胞腺がん;粘液性嚢胞腺がん;粘液性腺がん;印環細胞がん;浸潤性導管がん;髄様がん;小葉がん;炎症性がん;パジェット病、乳房;腺房細胞がん;腺扁平上皮がん;扁平上皮化生を伴う腺がん;胸腺腫、悪性;卵巣間質腫、悪性;莢膜細胞腫、悪性;顆粒膜細胞腫、悪性;アンドロブラストーマ、悪性;セルトリ細胞腫;ライディッヒ細胞腫、悪性;脂質細胞腫瘍(lipid cell tumor)、悪性;パラガングリオーマ、悪性;乳房外パラガングリオーマ(extra-mammary paraganglioma)、悪性;クロム親和細胞腫;血管球血管肉腫;悪性黒色腫;無色素性黒色腫;表在拡大型黒色腫;巨大色素性母斑中の悪性黒色腫(malignant melanoma in giant pigmented nevus);類上皮細胞黒色腫;青色母斑、悪性;肉腫;線維肉腫;線維性組織球腫、悪性;粘液肉腫;脂肪肉腫;平滑筋肉腫;横紋筋肉腫;胎児性横紋筋肉腫;胞巣型横紋筋肉腫;間質性肉腫;混合腫瘍、悪性;ミューラー混合腫瘍;腎芽腫;肝芽腫;がん肉腫;間葉腫、悪性;ブレンナー腫瘍、悪性;葉状腫瘍、悪性;滑膜肉腫;中皮腫、悪性;未分化胚細胞腫;胚性がん腫;テラトーマ、悪性;卵巣甲状腺腫、悪性;絨毛がん;中腎腫、悪性;血管肉腫;血管内皮腫、悪性;カポジ肉腫;血管周囲細胞腫、悪性;リンパ管肉腫;骨肉腫;傍骨骨肉腫;軟骨肉腫;軟骨芽細胞腫、悪性;間葉性軟骨肉腫;骨巨細胞腫;ユーイング肉腫;歯原性腫瘍、悪性;エナメル芽細胞歯牙肉腫;エナメル上皮腫、悪性;エナメル上皮線維肉腫;松果体腫、悪性;脊索腫;神経膠腫、悪性;上衣腫;星状細胞腫;原形質性星状細胞腫;線維性星状細胞腫;星状芽細胞腫;グリア芽細胞腫;乏突起神経膠腫;乏突起神経膠芽細胞腫;未分化神経外胚葉性;小脳肉腫;神経節芽細胞腫;神経芽細胞腫;網膜芽細胞腫;嗅神経腫瘍;髄膜腫、悪性;神経線維肉腫;神経鞘腫、悪性;顆粒細胞腫瘍、悪性;悪性リンパ腫;ホジキン病(hodgkin's disease);ホジキン病(hodgkin's);側肉芽腫;悪性リンパ腫、小リンパ球性;悪性リンパ腫、びまん性大細胞性;悪性リンパ腫、濾胞性;菌状息肉腫;明記された他の非ホジキンリンパ腫;悪性組織球症;多発性骨髄腫;マスト細胞肉腫;免疫増殖性小腸疾患;白血病;リンパ性白血病;プラズマ細胞白血病;赤白血病;リンパ肉腫細胞性白血病;骨髄性白血病;好塩基球性白血病;好酸球性白血病;単球性白血病;マスト細胞白血病;巨核芽球性白血病;骨髄肉腫;および毛様細胞性白血病でもよいが、これらに限定されない。
【００７６】
「接触した」および「曝露された」という用語は細胞に適用された場合には、治療用物質が標的細胞に送達されるか、または標的細胞とじかに並べて配置されるプロセスを説明するために本明細書において用いられる。細胞を死滅させるために、例えば、1種類または複数種類の作用物質が、細胞を死滅させるか、または細胞の分裂を阻止するのに有効な量で細胞に送達される。
【００７７】
患者の有効な応答または処置に対する患者の「応答性」とは、疾患もしくは障害のリスクがある、または疾患もしくは障害に罹患している患者に与えられる臨床的利益または治療的利益を指す。このような利益は、細胞応答または生物学的応答、完全応答、部分応答、安定病態(進行も再発も無い)、または後で再発する応答を含んでもよい。例えば、有効な応答は、がんと診断された患者における腫瘍サイズの縮小または無増悪生存期間でもよい。
【００７８】
治療アウトカムは予測およびモニタリングすることができ、かつ/またはこのような処置から利益を得る患者は、本明細書に記載の方法によって特定もしくは選択することができる。
【００７９】
新生物状態の処置に関して、新生物状態のステージに応じて、新生物状態の処置は、以下の療法:新生物組織を除去するための外科手術、放射線療法、および化学療法の1つまたは組み合わせを伴う。他の治療レジメンが、抗がん剤、例えば、治療用組成物および化学療法剤の投与と組み合わされてもよい。例えば、このような抗がん剤で処置しようとする患者はまた放射線療法も受けてよく、かつ/または外科手術も受けてもよい。
【００８０】
疾患を処置する場合、治療用組成物の適切な投与量は、前記で定義されたような処置しようとする疾患のタイプ、疾患の重篤度および経過、患者の病歴および剤に対する応答、ならびに主治医の判断に左右される。前記剤は、1回で、または一連の処置にわたって患者に適切に投与される。
【００８１】
治療的および予防的な方法および組成物は、所望の効果を実現するのに有効な組み合わせた量で提供することができる。組織、腫瘍、または細胞が、作用物質の1つまたは複数を含む1種類または複数種類の組成物または薬理学的製剤と接触してもよく、組織、腫瘍、および/または細胞を2つ以上の別個の組成物または製剤と接触させることで接触してもよい。また、このような併用療法が化学療法、放射線療法、外科的療法、または免疫療法と共に使用できることも意図される。
【００８２】
併用投与は、2種類またはそれ以上の剤を同じ剤形の中に入れて同時投与すること、別々の剤形に入れて同時投与すること、および別々に投与することを含んでもよい。すなわち、本治療用組成物と別の治療用物質を同じ剤形の中に入れて一緒に製剤化し、同時投与することができる。または、本治療用組成物と別の治療用物質を同時投与することができ、この場合、両物質とも別々の製剤に存在する。別の選択肢では、治療用物質を投与し、その直後に他の治療用物質を投与することができ、逆もまた同じである。別の投与プロトコールでは、本治療用組成物と別の治療用物質は数分間あけて、または数時間あけて、または数日間あけて投与されることがある。
【００８３】
第1の抗がん処置(例えば、組換えタンパク質を発現するエキソソーム、またはエキソソームから単離された組換えタンパク質)は、第2の抗がん処置の前、第2の抗がん処置の間、第2の抗がん処置の後に、または第2の抗がん処置と比べて様々な組み合わせで実施されてもよい。実施は同時から数分間〜数日間〜数週間に及ぶ間隔でもよい。第1の処置が第2の処置とは別に患者に提供される態様では、2種類の化合物が、患者に対して有利に組み合わされた効果を依然として発揮できるように、一般的には、有効な期間がそれぞれの送達の間に終わらないようにするだろう。このような場合、どちらかの療法を実施して約12〜24時間以内または72時間以内に、より詳細には、どちらかの療法を実施して約6〜12時間以内に、第1の療法および第2の療法が患者に提供され得ることが意図される。状況によっては、処置のための期間を大幅に延ばすことが望ましい場合もある。この場合、それぞれの実施の間の期間は数日間(2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、または7日間)〜数週間(1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、または8週間)である。
【００８４】
ある特定の態様では、処置の経過は1日〜90日間またはそれより長く(このような範囲は、その間の日を含む)続く。ある剤が、1日目〜90日目の任意の日に(このような範囲は、その間の日を含む)またはその任意の組み合わせで与えられてもよく、別の剤が、1日目〜90日目の任意の日に(このような範囲は、その間の日を含む)またはその任意の組み合わせで与えられることが意図される。1日(24時間の期間)の中で、患者には1回または複数回の剤投与が行われてもよい。さらに、処置の経過の後、抗がん処置が実施されない期間があることが意図される。この期間は、患者の状態、例えば、患者の予後、体力、健康状態などに応じて1日〜7日間、および/もしくは1〜5週間、および/もしくは1〜12ヶ月間またはそれ以上(このような範囲は、その間の日数を含む)続くことがある。処置サイクルは必要に応じて繰り返されることが予想される。
【００８５】
様々な組み合わせが用いられ得る。下記の例について、第1の抗がん療法が「A」であり、第2の抗がん療法が「B」である。
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【００８６】
患者への本発明の任意の化合物の投与または本発明の任意の療法の実施は、剤の毒性があればそれを考慮して、このような化合物を投与するための一般的なプロトコールに従う。従って、一部の態様では、併用療法に起因する毒性をモニタリングする工程がある。
【００８７】
1.化学療法
多種多様な化学療法剤を本発明に従って使用することができる。「化学療法」という用語は、がんを処置するための薬物の使用を指す。「化学療法剤」は、がんの処置において投与される化合物または組成物を意味するために用いられる。これらの剤または薬物は、細胞内での活性の様式、例えば、細胞周期に影響を及ぼすかどうか、またはどの段階で細胞周期に影響を及ぼすのかによって分類される。または、剤は、DNAを直接架橋する能力、DNAにインターカレートする能力、または核酸合成に影響を及ぼすことで染色体異常および有糸分裂異常を誘導する能力に基づいて特徴付けられることがある。
【００８８】
化学療法剤の例には、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロスホスファミド(cyclosphosphamide);アルキルスルホナート、例えば、ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファン;アジリジン、例えば、ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、およびウレドーパ(uredopa);アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、およびトリメチローロメラミン(trimethylolomelamime)を含む、エチレンイミンおよびメチルアメラミン(methylamelamine);アセトゲニン(特に、ブラタシンおよびブラタシノン(bullatacinone));カンプトテシン(合成類似体トポテカンを含む);ブリオスタチン;カリスタチン(callystatin);CC-1065(そのアドゼレシン、カルゼレシン(carzelesin)、およびビセレシン合成類似体を含む);クリプトフィシン(特に、クリプトフィシン1およびクリプトフィシン8);ドラスタチン;デュオカルマイシン(合成類似体KW-2189およびCB1-TM1を含む);エリュテロビン;パンクラチスタチン(pancratistatin);サルコジクチン(sarcodictyin);スポンギスタチン(spongistatin);ナイトロジェンマスタード、例えば、クロランブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベムビシン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン、トロホスファミド、およびウラシルマスタード;ニトロスレア(nitrosurea)、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン;抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質(例えば、カリチアマイシン、特に、カリチアマイシンγlIおよびカリチアマイシンωI1);ディネミシン(dynemicin)Aを含むディネミシン;ビスホスホネート、例えば、クロドロネート;エスペラミシン;ならびにネオカルジノスタチンクロモフォアおよび関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質(antiobiotic)クロモフォア、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウスララニシン(authrarnycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン(carabicin)、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシニス(chromomycinis)、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ドキソルビシン(モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、2-ピロリノ-ドキソルビシン、およびデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えば、マイトマイシンC、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ユベニメックス、ジノスタチン、またはゾルビシン;代謝拮抗物質、例えば、メトトレキセートおよび5-フルオロウラシル(5-FU);葉酸類似体、例えば、デノプテリン、プテロプテリン、トリメトレキセート;プリン類似体、例えば、フルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン(thiamiprine)、チオグアニン;ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオ��シウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン;アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、およびテストラクトン;抗副腎剤、例えば、ミトタンおよびトリロスタン;葉酸補充剤、例えば、フォリン酸;アセグラトン;アルドホスファミドグリコシド;アミノレブリン酸;エニルウラシル;アムサクリン;ベストラブシル;ビサントレン;エダトラキサート(edatraxate);デフォファミン(defofamine);デメコルチン;ジアジクオン;エルフォルミチン(elformithine);酢酸エリプチニウム;エポシロン;エトグルシド;硝酸ガリウム;ヒドロキシウレア;レンチナン;ロニダイニン;マイタンシノイド、例えば、マイタンシンおよびアンサミトシン(ansamitocin);ミトグアゾン;ミトキサントロン;モピダンモール(mopidanmol);ニトラエリン(nitraerine);ペントスタチン;フェナメット;ピラルビシン;ロソキサントロン(losoxantrone);ポドフィリニック酸;2-エチルヒドラジド;プロカルバジン;PSK多糖複合体;ラゾキサン;リゾキシン(rhizoxin);シゾフィラン(sizofiran);スピロゲルマニウム;テヌアゾン酸;トリアジクオン;2,2',2''-トリクロロトリエチルアミン;トリコテセン(特に、T-2毒素、ベラクリン(verracurin)A、ロリジン(roridin)A、およびアングイジン(anguidine));ウレタン;ビンデシン;ダカルバジン;マンノムスチン;ミトブロニトール;ミトラクトール;ピポブロマン;ガシトシン(gacytosine);アラビノシド(「Ara-C」);シクロホスファミド;タキソイド、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル、ゲムシタビン;6-チオグアニン;メルカプトプリン;白金配位錯体、例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、およびカルボプラチン;ビンブラスチン;白金;エトポシド(VP-16);イホスファミド;ミトキサントロン;ビンクリスチン;ビノレルビン;ノバントロン;テニポシド;エダトレキサート;ダウノマイシン;アミノプテリン;ゼローダ;イバンドロネート;イリノテカン(例えば、CPT-11);トポイソメラーゼ阻害剤RFS2000;ジフルオロメチルオルニチン(DMFO);レチノイド、例えば、レチノイン酸;カペシタビン;シスプラチン、カルボプラチン、プロカルバジン、プリコマイシン(plicomycin)、ゲムシタビエン(gemcitabien)、ナベルビン、ファルネシル-タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランス白金(transplatinum)、ならびに前記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が含まれる。
【００８９】
2.放射線療法
DNA損傷を引き起こし、かつ広範に用いられてきた他の要因には、γ線、X線、および/または腫瘍細胞への放射性同位体の特異的送達として一般に知られているものが含まれる。マイクロ波、陽子線照射(米国特許第5,760,395号および同第4,870,287号)、ならびにUV照射などの他の形態のDNA損傷因子も意図される。これらの要因が全て、DNA、DNA前駆体、DNAの複製および修復、ならびに染色体の集合および維持に対する広範な損傷に影響を及ぼす可能性が高い。X線の線量範囲は、長期の場合(3〜4週間)は50〜200レントゲンの1日線量から、2000〜6000レントゲンの単回線量まで及ぶ。放射性同位体の線量範囲は多種多様であり、同位体の半減期、放出される放射線の強度およびタイプ、ならびに新生細胞による取り込みによって決まる。
【００９０】
3.免疫療法
当業者は、本発明の方法と組み合わせて、または本発明の方法と一緒に、さらなる免疫療法が用いられ得ることを理解する。がん治療の状況では、免疫療法は、一般的に、がん細胞を標的にするおよび破壊するために免疫エフェクター細胞および免疫エフェクター分子の使用に頼る。リツキシマブ(Rituxan(登録商標))は、このような例の1つである。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞表面上の何らかのマーカーに特異的な抗体でもよい。この抗体だけが療法のエフェクターとして働いてもよく、他の細胞を動員して細胞死滅に実際に影響を及ぼしてもよい。この抗体はまた、薬物または毒素(化学療法剤、放射性核種、リシンA鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など)に結合体化されてもよく、単に標的指向性物質として働いてもよい。または、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接的または間接的に相互作用する表面分子を有するリンパ球でもよい。様々なエフェクター細胞には細胞傷害性T細胞およびNK細胞が含まれる。
【００９１】
免疫療法の一局面では、腫瘍細胞は、標的指向化の対象となる、すなわち、他の細胞の大多数に存在しない、何らかのマーカーを有さなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらはどれも、本発明の状況における標的指向化に適している可能性がある。一般的な腫瘍マーカーには、CD20、がん胎児抗原、チロシナーゼ(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、シアリルルイス抗原、MucA、MucB、PLAP、ラミニン受容体、erbB、およびp155が含まれる。免疫療法の別の局面は、抗がん作用を免疫刺激作用と組み合わせることである。サイトカイン、例えば、IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN、ケモカイン、例えば、MIP-1、MCP-1、IL-8、および増殖因子、例えば、FLT3リガンドを含む免疫刺激分子も存在する。
【００９２】
現在研究中のまたは使用されている免疫療法の例は、免疫アジュバント、例えば、マイコバクテリウム・ボビス(Mycobacterium bovis)、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、ジニトロクロロベンゼン、および芳香族化合物(米国特許第5,801,005号および同第5,739,169号; Hui and Hashimoto, 1998; Christodoulides et al., 1998); サイトカイン療法、例えば、インターフェロンα、β、およびγ、IL-1、GM-CSF、ならびにTNF(Bukowski et al., 1998; Davidson et al., 1998; Hellstrand et al., 1998);遺伝子療法、例えば、TNF、IL-1、IL-2、およびp53(Qin et al., 1998; Austin-Ward and Villaseca, 1998; 米国特許第5,830,880号および同第5,846,945号);ならびにモノクローナル抗体、例えば、抗CD20、抗ガングリオシドGM2、および抗p185(Hollander, 2012; Hanibuchi et al., 1998; 米国特許第5,824,311号)である。1種類または複数種類の抗がん療法が本明細書に記載の抗体療法と共に用いられ得ることが意図される。
【００９３】
一部の態様では、免疫療法は免疫チェックポイント阻害剤の場合がある。免疫チェックポイントはシグナルを強くするか(例えば、補助刺激分子)、またはシグナルを弱くする。免疫チェックポイント阻害によって標的にされ得る阻害性免疫チェックポイントには、アデノシンA2A受容体(A2AR)、B7-H3(CD276とも知られる)、B and T lymphocyte attenuator(BTLA)、細胞傷害性Tリンパ球抗原4(CTLA-4。CD152とも知られる)、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)、キラー細胞免疫グロブリン(KIR)、lymphocyte activation gene-3(LAG3)、programmed death 1 (PD-1)、T-cell immunoglobulin domain and mucin domain 3(TIM-3)、およびV-domain Ig suppressor of T cell activation(VISTA)が含まれる。特に、免疫チェックポイント阻害剤はPD-1 axisおよび/またはCTLA-4を標的にする。
【００９４】
免疫チェックポイント阻害剤は、薬物、例えば、低分子、組換え型のリガンドもしくは受容体の場合があるか、または特に、抗体、例えば、ヒト抗体(例えば、国際特許公報WO2015016718; Pardoll, Nat Rev Cancer, 12(4): 252-64, 2012;両方とも参照により本明細書に組み入れられる)である。既知の免疫チェックポイントタンパク質阻害剤またはその類似体が用いられることがあり、特に、キメラ化型、ヒト化型、またはヒト型の抗体が用いられることがある。当業者が知っているように、本開示において言及された、ある特定の抗体について別の名前および/または同等の名前が用いられることがある。このような別の名前および/または同等の名前は本開示の文脈において交換可能である。例えば、ランブロリズマブはMK-3475およびペンブロリズマブという別の名前および/または同等の名前でも知られていることが分かっている。
【００９５】
一部の態様では、PD-1結合アンタゴニストは、PD-1とそのリガンド結合パートナーの結合を阻害する分子である。特定の局面では、PD-1リガンド結合パートナーはPDL1および/またはPDL2である。別の態様では、PDL1結合アンタゴニストは、PDL1とそのリガンド結合パートナーの結合を阻害する分子である。特定の局面では、PDL1結合パートナーはPD-1および/またはB7-1である。別の態様では、PDL2結合アンタゴニストは、PDL2とそのリガンド結合パートナーの結合を阻害する分子である。特定の局面では、PDL2結合パートナーはPD-1である。前記アンタゴニストは抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドでもよい。例示的な抗体は米国特許第8,735,553号、同第8,354,509号、および同第8,008,449号に記載されており、全てが参照により本明細書に組み入れられる。本明細書において提供される方法において使用するための他のPD-1 axisアンタゴニストは、米国特許出願公開第20140294898号、同第2014022021号、および同第20110008369号に記載のように当技術分野において公知であり、これらは全て参照により本明細書に組み入れられる。
【００９６】
一部の態様では、PD-1結合アンタゴニストは抗PD-1抗体(例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体)である。一部の態様では、抗PD-1抗体は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、およびCT-011からなる群より選択される。一部の態様では、PD-1結合アンタゴニストは、イムノアドヘシン(例えば、定常領域(例えば、免疫グロブリン配列のFc領域)と融合したPDL1またはPDL2の細胞外部分またはPD-1結合部分を含むイムノアドヘシン)である。一部の態様では、PD-1結合アンタゴニストはAMP-224である。ニボルマブはMDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558、およびOPDIVO(登録商標)とも知られ、WO2006/121168に記載の抗PD-1抗体である。ペンブロリズマブはMK-3475、Merck3475、ランブロリズマブ、KEYTRUDA(登録商標)、およびSCH-900475とも知られ、WO2009/114335に記載の抗PD-1抗体である。CT-011はhBATまたはhBAT-1とも知られ、WO2009/101611に記載の抗PD-1抗体である。AMP-224はB7-DCIgとも知られ、WO2010/027827およびWO2011/066342に記載のPDL2-Fc融合可溶性受容体である。
【００９７】
本明細書において提供される方法において標的にされることができる別の免疫チェックポイントは、CD152とも知られる細胞傷害性Tリンパ球タンパク質4(CTLA-4)である。ヒトCTLA-4の完全cDNA配列はGenbankアクセッション番号L15006を有する。CTLA-4はT細胞表面に見出され、抗原提示細胞の表面上のCD80またはCD86に結合すると「オフ」スイッチとして働く。CTLA4は、ヘルパーT細胞表面に発現し、阻害シグナルをT細胞に伝達する免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。CTLA4はT細胞補助刺激タンパク質であるCD28に類似し、両分子とも、抗原提示細胞上の、B7-1とも呼ばれるCD80と、B7-2とも呼ばれるCD86に結合する。CTLA4は阻害シグナルをT細胞に伝達するのに対して、CD28は刺激シグナルを伝達する。細胞内CTLA4は調節性T細胞の中にも見出され、その機能にとって重要である可能性がある。T細胞受容体およびCD28を介してT細胞が活性化されると、B7分子に対する抑制性受容体であるCTLA-4の発現が増大する。
【００９８】
一部の態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗CTLA-4抗体(例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体)、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドである。
【００９９】
本方法における使用に適した抗ヒト-CTLA-4抗体(またはそれに由来するVHドメインおよび/もしくはVLドメイン)は、当技術分野において周知の方法を用いて作製することができる。または、当技術分野において認められている抗CTLA-4抗体を使用することができる。例えば、米国特許第8,119,129号、WO01/14424、WO98/42752;WO00/37504(CP675,206、トレメリムマブ;以前はチシリムマブ(ticilimumab)とも知られる)、米国特許第6,207,156号; Hurwitz et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95(17): 10067-10071; Camacho et al. (2004) J Clin Oncology 22(145): Abstract No. 2505 (antibody CP-675206);およびMokyr et al. (1998) Cancer Res 58:5301-5304に開示される抗CTLA-4抗体は、本明細書において開示される方法において使用することができる。前述した刊行物のそれぞれの開示は参照により本明細書に組み入れられる。CTLA-4との結合では、これらの当技術分野において認められている任意の抗体と競合する抗体も使用することができる。例えば、ヒト化CTLA-4抗体は、国際特許出願番号WO2001014424、同WO2000037504、および米国特許第8,017,114号に記載され、全てが参照により本明細書に組み入れられる。
【０１００】
例示的な抗CTLA-4抗体は、イピリムマブ(10D1、MDX-010、MDX-101、およびYervoy(登録商標)とも知られる)またはその抗原結合断片および変種である(例えば、WO01/14424を参照されたい)。他の態様では、前記抗体はイピリムマブの重鎖および軽鎖CDRまたはVRを含む。従って、一態様では、前記抗体は、イピリムマブのVH領域のCDR1、CDR2、およびCDR3ドメインと、イピリムマブのVL領域のCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む。別の態様では、前記抗体は、前述した抗体と同じ、CTLA-4上のエピトープとの結合において競合し、かつ/または前述した抗体と同じ、CTLA-4上のエピトープに結合する。別の態様では、前記抗体は、上述した抗体と少なくとも約90％の可変領域アミノ酸配列同一性(例えば、イピリムマブと少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約99％の可変領域同一性)を有する。
【０１０１】
CTLA-4を調節するための他の分子には、CTLA-4リガンドおよび受容体、例えば、全てが参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5844905号、同第5885796号、ならびに国際特許出願番号WO1995001994および同WO1998042752に記載のCTLA-4リガンドおよび受容体、ならびにイムノアドヘシン、例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第8329867号に記載のイムノアドヘシンが含まれる。
【０１０２】
一部の態様では、免疫療法は、エクスビボで作製した自己抗原特異的T細胞の移入を伴う養子免疫治療になる場合がある。養子免疫治療に用いられるT細胞は、抗原特異的T細胞を拡大するか、または遺伝子工学によってT細胞をリダイレクション(redirection)することによって作製することができる(Park, Rosenberg et al. 2011)。腫瘍特異的T細胞の単離および移入はメラノーマ治療に成功したことが示されている。T細胞における新規の特異性は、トランスジェニックT細胞受容体またはキメラ抗原受容体(CAR)を遺伝子移入することによって首尾良く生じた(Jena, Dotti et al. 2010)。CARは、1つの融合分子の形で1つまたは複数のシグナル伝達ドメインと結合した標的指向性部分からなる合成受容体である。一般的に、CARの結合部分は、モノクローナル抗体の軽鎖断片および可変断片が可動性リンカーによってつながった単鎖抗体(scFv)の抗原結合ドメインからなる。受容体またはリガンドドメインに基づく結合部分も首尾良く用いられてきた。第1世代CARのシグナル伝達ドメインはCD3ζの細胞質領域またはFc受容体γ鎖に由来する。CARを用いることで、リンパ腫および固形腫瘍を含む様々な新生物に由来する腫瘍細胞の表面に発現している抗原にT細胞は首尾良くリダイレクションされている(Jena, Dotti et al. 2010)。
【０１０３】
一態様では、本願は、養子T細胞療法およびチェックポイント阻害剤を含む、がんを処置するための併用療法を提供する。一局面では、養子T細胞療法は自己由来および/または同種異系のT細胞を含む。別の局面では、自己由来および/または同種異系のT細胞は腫瘍抗原に対して標的にしている。
【０１０４】
4.外科手術
がんを有する人の約60％は、予防手術、診断、または進行度診断のための手術、根治的手術、および姑息的手術を含む何らかの種類の外科手術を受ける。根治的手術は、がん組織の全てまたは一部が物理的に除去、切除、および/または破壊される切除を含み、本発明の処置、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法、および/または代替療法などの他の療法と共に用いられてもよい。腫瘍切除とは、腫瘍の少なくとも一部の物理的除去を指す。腫瘍切除に加えて、外科手術による処置は、レーザー手術、凍結手術、電気手術、および顕微鏡的に管理される手術(microscopically-controlled surgery)(モース術)を含む。
【０１０５】
がんの細胞、組織、または腫瘍の一部または全てを切除すると体内に空洞が形成されることがある。処置は、その領域にさらなる抗がん療法を灌流、直接注射、または局所塗布することによって行われてもよい。このような処置は、例えば、1日、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、もしくは7日間ごとに、または1週間、2週間、3週間、4週間、および5週間ごとに、または1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月間、7ヶ月間、8ヶ月間、9ヶ月間、10ヶ月間、11ヶ月間、または12ヶ月間ごとに繰り返されてもよい。これらの処置もまた様々な投与量の処置であり得る。
【０１０６】
5.他の作用物質
処置の治療有効性を改善するために、本発明のある特定の局面と組み合わせて他の作用物質が用いられ得ることが意図される。これらのさらなる作用物質には、細胞表面受容体およびギャップ結合のアップレギュレーションに影響を及ぼす作用物質、細胞分裂停止物質および分化物質、細胞接着阻害剤、アポトーシス誘導物質に対する過剰増殖性細胞の感受性を高める作用物質、または他の生物学的作用物質が含まれる。ギャップ結合数を増やすことで細胞間シグナル伝達を増大させると、付近の過剰増殖性細胞集団に対する抗過剰増殖作用が増大する。他の態様では、処置の抗過剰増殖有効性を改善するために、細胞分裂停止物質または分化物質は本発明のある特定の局面と組み合わせて使用することができる。細胞接着阻害剤は本発明の有効性を改善することが意図される。細胞接着阻害剤の例は局所接着キナーゼ(FAK)阻害剤およびロバスタチンである。処置有効性を改善するために、アポトーシスに対する過剰増殖性細胞の感受性を高める他の作用物質、例えば、抗体c225を本発明のある特定の局面と併用できることがさらに意図される。
【０１０７】
III.薬学的組成物
治療用タンパク質、阻害RNA、および/または低分子薬物を発現するまたは含むエキソソームは、腫瘍細胞増殖を阻害するために、最も好ましくは局所進行がんまたは転移がんを有するがん患者のがん細胞を死滅させるために全身投与または局所投与できることが意図される。CRISPRシステムを発現する、または含むエキソソームは静脈内投与、くも膜下腔内投与、および/または腹腔内投与することができる。CRISPRシステムを発現する、または含むエキソソームは単独で投与されてもよく、抗増殖性薬物と組み合わせて投与されてもよい。一態様では、CRISPRシステムを発現する、または含むエキソソームは外科手術または他の処置の前に患者のがん負荷(cancer load)を減らすために投与される。または、CRISPRシステムを発現する、または含むエキソソームは、残存しているがん(例えば、外科手術で除去されなかったがん)が生き残らないことを確かなものにするために外科手術後に投与することができる。
【０１０８】
本発明が治療用調製物の特定の性質によって制限されることは意図されない。例えば、このような組成物は、生理学的に許容できる液体、ゲル、固体担体、希釈剤、または賦形剤と一緒に製剤の形で提供することができる。これらの治療用調製物は他の治療用物質と同様に獣医学的使用、例えば、家畜を用いた獣医学的使用、およびヒトにおける臨床的使用のために哺乳動物に投与することができる。一般的に、治療有効性に必要とされる投与量は使用のタイプおよび投与方法ならびに個々の対象の特定の要件に従って変化する。
【０１０９】
臨床適用が意図される場合、意図された用途に適した形で組換えタンパク質および/またはエキソソームを含む薬学的組成物を調製することが必要な場合がある。一般的に、薬学的組成物は、薬学的に許容される担体に溶解または分散された、有効量の1種類もしくは複数種類の組換えタンパク質および/もしくはエキソソームまたはさらなる作用物質を含んでもよい。「薬学的または薬理学的に許容される」という句は、適宜、例えば、ヒトなどの動物に投与された場合に有害な、アレルギー性の、または他の都合悪い反応を生じない分子実体および組成物を指す。本明細書において開示される組換えタンパク質および/もしくはエキソソーム、またはさらなる活性成分を含む、薬学的組成物の調製は、参照により本明細書に組み入れられる、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990により例示されるように、本開示を考慮すれば当業者に公知であろう。さらに、動物(例えば、ヒト)への投与の場合、調製物は、FDAの生物製剤部の基準(the FDA Office of Biological Standard)に求められるように無菌性、発熱性、一般安全性、および純度の基準を満たさなければならないことが理解される。
【０１１０】
さらに、本発明のある特定の局面によれば、投与に適した組成物は、不活性希釈剤と共に、または不活性希釈剤を伴わずに薬学的に許容される担体に溶解して提供されてもよい。本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」は、当業者に公知の任意のおよび全ての水性溶媒(例えば、水、アルコール/水溶液、エタノール、食塩水、非経口ビヒクル、例えば、塩化ナトリウム、リンガーデキストロースなど)、非水性溶媒(例えば、脂肪、油、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)、植物油、および注射用有機エステル、例えば、オレイン酸エチル)、脂質、リポソーム、分散媒、コーティング(例えば、レシチン)、界面活性剤、抗酸化物質、防腐剤(例えば、抗菌剤または抗真菌剤、アンチオキシダント、キレート剤、希ガス、パラベン(例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン)、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールまたはその組み合わせ)、等張剤(例えば、糖および塩化ナトリウム)、吸収遅延剤(例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン)、塩、薬物、薬物安定剤、ゲル、樹脂、増量剤、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、着香剤、色素、液体および栄養補充薬(nutrient replenisher)、このような同様の材料およびその組み合わせを含む。担体は同化できなければならず、液体、半固体、すなわち、ペースト、または固体担体を含む。さらに、所望であれば、前記組成物は微量の補助物質、例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、安定化剤、またはpH緩衝剤を含有することがある。薬学的組成物中の様々な成分のpHおよび正確な濃度は周知のパラメータに従って調節される。適切な流動性は、例えば、コーティング、例えば、レシチンを用いることによって、分散液の場合は必要な粒径を維持することによって、界面活性剤を用いることによって維持することができる。
【０１１１】
薬学的に許容される担体は特にヒトへの投与のために製剤化されるが、ある特定の態様では、非ヒト動物への投与のために製剤化されたが、ヒトへの投与には(例えば、政府規制のために)許容されない薬学的に許容される担体を使用することが望ましい場合がある。従来の担体が活性成分と適合しない場合を除いて(例えば、レシピエントに有害な、または担体に含まれる組成物の治療効果に有害な場合を除いて)、治療組成物または薬学的組成物における、その使用が意図される。本発明のある特定の局面によれば、前記組成物は、任意の便利な、かつ実用的なやり方で、すなわち、溶解、懸濁、乳化、混合、カプセル化、吸収などによって担体と組み合わされる。このような手法は当業者にとって日常的なものである。
【０１１２】
本発明のある特定の態様は、固体、液体、またはエアロゾルの形で投与されるかどうかに応じて、注射などの投与経路のために滅菌する必要があるかどうかに応じて異なるタイプの担体を含んでもよい。前記組成物は、静脈内投与、皮内投与、経皮投与、くも膜下腔内、動脈内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、腟内投与、直腸内投与、筋肉内投与、皮下投与、粘膜投与、経口投与、局部投与、局所投与されてもよく、吸入(例えば、エアロゾル吸入)によって、注射によって、注入によって、連続注入によって、標的細胞を直接浸す局所灌流により、カテーテルを介して、洗浄を介して、脂質組成物(例えば、リポソーム)の中に入れて、または当業者に公知であるような他の方法もしくは前述の任意の組み合わせ(例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990を参照されたい)によって投与されてもよい。
【０１１３】
活性化合物は非経口投与用に製剤化することができる、例えば、静脈内経路、筋肉内経路、皮下経路を介した注射用に、または腹腔内経路を介した注射用でも製剤化することができる。典型的に、このような組成物は液体溶液または懸濁液のいずれかで調製することができる。注射前に液体を添加して溶液または懸濁液を調製するために使用するのに適した固体剤形も調製することができる。調製物は乳化することもできる。
【０１１４】
注射使用に適した薬学的形態には、滅菌した水溶液または分散液;ゴマ油、ピーナッツ油、またはプロピレングリコール水溶液を含む製剤;および滅菌した注射液または分散液を即時調製するための滅菌した散剤が含まれる。すべての場合で、剤形は無菌でなければならず、容易に注射できる程度に液状でならなければならない。剤形はまた製造および保管の条件下で安定でなければならず、細菌および菌類などの微生物の汚染作用から守らなくてはならない。
【０１１５】
治療剤は遊離塩基、中性、または塩の形で組成物に製剤化されてもよい。薬学的に許容される塩には、酸添加塩、例えば、タンパク質組成物の遊離アミノ基と形成された酸添加塩、あるいは無機酸、例えば、塩酸もしくはリン酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、もしくはマンデル酸などのような有機酸と形成された酸添加塩が含まれる。遊離カルボキシル基と形成された塩はまた、無機塩基、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、もしくは水酸化第二鉄;またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、もしくはプロカインのような有機塩基からも得ることができる。製剤化されたら、溶液は、投与製剤と適合するやり方で、かつ治療に有効な量で投与される。製剤は様々な剤形で容易に投与され、例えば、注射液、または肺に送達する場合にはエアロゾルなど非経口投与用に製剤化されるか、または薬物放出カプセルなどの食事投与用に製剤化される。
【０１１６】
本発明の特定の態様では、前記組成物は半固体担体もしくは固体担体と組み合わされるか、または半固体担体もしくは固体担体と共に徹底的に混合される。混合は粉砕などの任意の便利なやり方で行うことができる。組成物を治療活性の消失、すなわち、胃の中での変性から保護するために、混合プロセスにおいて安定化剤も添加することができる。組成物において使用するための安定剤の例には、緩衝剤、アミノ酸、例えば、グリシンおよびリジン、炭水化物、例えば、デキストロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マルトース、ソルビトール、マンニトールなどが含まれる。
【０１１７】
さらなる態様では、本発明は、1種類または複数種類の脂質と水性溶媒を含む、薬学的な脂質ビヒクル組成物の使用に関することがある。本明細書で使用する「脂質」という用語は、特色として水に溶解せず、有機溶媒を用いて抽出可能な広範な任意の物質を含むと定義される。この広範な化合物クラスは当業者に周知であり、「脂質」という用語が本明細書において用いられる際には、どの特定の構造にも限定されない。例には、長鎖脂肪族炭化水素およびその誘導体を含有する化合物が含まれる。脂質は天然でもよく、合成でもよい(すなわち、人間によって設計または生成されてもよい)。しかしながら、通常、脂質は生物学的物質である。生物学的脂質は当技術分野において周知であり、例えば、中性脂肪、リン脂質、ホスホグリセリド、ステロイド、テルペン、リゾ脂質(lysolipid)、スフィンゴ糖脂質、糖脂質、スルファチド(sulphatide)、エーテル結合およびエステル結合脂肪酸を有する脂質、重合可能な脂質、ならびにその組み合わせを含む。もちろん、当業者が脂質として理解する本明細書中で具体的に説明された化合物以外の化合物も前記の組成物および方法に含まれる。
【０１１８】
当業者は、組成物を脂質ビヒクルで分散させるために使用することができる技法の範囲をよく知っているだろう。例えば、治療用物質は、脂質を含有する溶液で分散されてもよく、脂質を用いて溶解されてもよく、脂質を用いて乳化されてもよく、脂質と混合されてもよく、脂質と組み合わされてもよく、脂質と共有結合されてもよく、脂質に溶解した懸濁液として含まれてもよく、ミセルもしくはリポソームを用いて含まれるか、もしくは複合体化されてもよく、または当業者に公知の任意の手段によって脂質もしくは脂質構造と別のやり方で結合されてもよい。分散によってリポソームが形成されてもよく、形成されなくてもよい。
【０１１９】
「単位用量」または「投与量」という用語は、対象における使用に適した物理的に別個の単位を指し、それぞれの単位は、投与、すなわち、適切な経路および処置レジメンに関連して前記で議論された所望の応答を生じるように計算された所定量の治療用組成物を含有する。投与しようとする量は、治療の回数および単位用量に応じて、所望の効果に左右される。患者または対象に投与される本発明の組成物の実際の投与量は、身体的要因および生理学的要因、例えば、対象の体重、年齢、健康状態、および性別、処置されている疾患のタイプ、疾患侵入の程度、以前の治療介入または同時治療介入、患者の特発性疾患、投与経路、ならびに特定の治療物質の効力、安定性、および毒性によって決定することができる。例えば、用量はまた、1回の投与につき約1μg/kg/体重〜約1000mg/kg/体重(このような範囲は、その間の用量を含む)またはそれより多い用量、およびその中から導き出せる任意の範囲も含んでよい。本明細書において列挙された数から導き出せる範囲の非限定的な例では、約5μg/kg/体重〜約100mg/kg/体重、約5μg/kg/体重〜約500mg/kg/体重などの範囲を投与することができる。投与を担当する医者は、どんな状況でも、組成物中の活性成分の濃度と、個々の対象に適した用量を決定する。
【０１２０】
動物患者に投与された組成物の実際の投与量は、身体的要因および生理学的要因、例えば、体重、状態の重篤度、処置されている疾患のタイプ、以前の治療介入または同時治療介入、患者の特発性疾患、および投与経路によって決定することができる。投与量および投与経路に応じて、好ましい投与量および/または有効量の投与の回数は対象の応答に従って変化することがある。投与を担当する医者は、どんな状況でも、組成物中の活性成分の濃度と、個々の対象に適した用量を決定する。
【０１２１】
ある特定の態様では、薬学的組成物は、例えば、少なくとも約0.1％の活性化合物を含んでもよい。他の態様では、活性化合物は、例えば、単位の重量の約2％〜約75％または約25％〜約60％、およびその中から導き出せる任意の範囲を含んでもよい。天然では、それぞれの治療上有用な組成物中には、化合物のある特定の単位用量で適切な投与量が得られるようなやり方で、前記の量の活性化合物が調製され得る。溶解度、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与経路、製品の貯蔵寿命、ならびに他の薬理学的な考慮すべき事項などの要因が、このような薬学的製剤を調製する当業者によって検討され、従って、様々な投与量および処置レジメンが望ましい場合がある。
【０１２２】
他の非限定的な例では、用量はまた、1回の投与につき、約1マイクログラム/kg/体重、約5マイクログラム/kg/体重、約10マイクログラム/kg/体重、約50マイクログラム/kg/体重、約100マイクログラム/kg/体重、約200マイクログラム/kg/体重、約350マイクログラム/kg/体重、約500マイクログラム/kg/体重、約1ミリグラム/kg/体重、約5ミリグラム/kg/体重、約10ミリグラム/kg/体重、約50ミリグラム/kg/体重、約100ミリグラム/kg/体重、約200ミリグラム/kg/体重、約350ミリグラム/kg/体重、約500ミリグラム/kg/体重〜約1000ミリグラム/kg/体重、またはそれより多く、およびその中から導き出せる任意の範囲も含んでもよい。本明細書において列挙された数から導き出せる範囲の非限定的な例では、上記の数に基づいて、約5ミリグラム/kg/体重〜約100ミリグラム/kg/体重、約5マイクログラム/kg/体重〜約500ミリグラム/kg/体重などの範囲を投与することができる。
【０１２３】
IV.核酸およびベクター
本発明のある特定の局面では、治療用タンパク質または治療用タンパク質を含有する融合タンパク質をコードする核酸配列が開示され得る。どの発現系が用いられるかに応じて、核酸配列は従来の方法に基づいて選択することができる。例えば、それぞれの遺伝子またはその変種は、ある特定の系において発現するようにコドン最適化されてもよい。関心対象のタンパク質を発現するために様々なベクターも使用することができる。例示的なベクターには、プラスミドベクター、ウイルスベクター、トランスポゾン、またはリポソームベースのベクターが含まれるが、これに限定されない。
【０１２４】
V.組換えタンパク質、阻害RNA、および遺伝子編集システム
A.組換えタンパク質
一部の態様は組換えタンパク質およびポリペプチドに関する。特定の態様は、少なくとも1種類の治療活性を示す組換えタンパク質またはポリペプチドに関する。一部の態様において、組換えタンパク質およびポリペプチドは治療抗体であってもよい。一部の態様において、治療抗体は、細胞内タンパク質に特異的または選択的に結合する抗体であってもよい。さらなる局面では、前記タンパク質またはポリペプチドは血清安定性を高めるように改変されてもよい。従って、本願が「改変されたタンパク質」または「改変されたポリペプチド」の機能または活性について言及している場合に、これは、例えば、改変されていないタンパク質またはポリペプチドと比べて、さらなる利点を有するタンパク質またはポリペプチドを含むと当業者に理解されるだろう。「改変されたタンパク質」に関する態様は「改変されたポリペプチド」に関して実施されることがあり、逆もまた同じであると特に意図される。
【０１２５】
組換えタンパク質はアミノ酸の欠失および/または置換を有することがある。従って、欠失を有するタンパク質、置換を有するタンパク質、および欠失と置換を有するタンパク質は、改変されたタンパク質である。一部の態様では、これらのタンパク質は、挿入または付加されたアミノ酸、例えば、融合タンパク質またはリンカーを有するタンパク質をさらに含むことがある。「改変された欠失タンパク質」は天然タンパク質の1つまたは複数の残基を欠いているが、天然タンパク質の特異性および/または活性を有することがある。「改変された欠失タンパク質」はまた免疫原性または抗原性が低下していることがある。改変された欠失タンパク質の一例は、特定の生物において、例えば、改変されたタンパク質が投与されてもよい生物のタイプにおいて抗原性であると明らかにされたタンパク質領域である少なくとも1つの抗原性領域から欠失されたアミノ酸残基を有するものである。
【０１２６】
置換変種または置き換え変種は、典型的には、タンパク質内の1つまたは複数の部位での、あるアミノ酸から別のアミノ酸への取り替えを含有し、ポリペプチドの1つまたは複数の特性、特に、そのエフェクター機能および/またはバイオアベイラビリティを調節するように設計されることがある。置換は保存的置換でもよく、すなわち、あるアミノ酸が、類似する形状または電荷のアミノ酸と置き換えられ、置換は保存的置換でなくてもよい。保存的置換は当技術分野において周知であり、例えば、アラニンからセリンへの;アルギニンからリジンへの;アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジンへの;アスパラギン酸からグルタミン酸への;システインからセリンへの;グルタミンからアスパラギンへの;グルタミン酸からアスパラギン酸への;グリシンからプロリンへの;ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミンへの;イソロイシンからロイシンまたはバリンへの;ロイシンからバリンまたはイソロイシンへの;リジンからアルギニンへの;メチオニンからロイシンまたはイソロイシンへの;フェニルアラニンからチロシン、ロイシン、またはメチオニンへの;セリンからスレオニンへの;スレオニンからセリンへの;トリプトファンからチロシンへの;チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニンへの;およびバリンからイソロイシンまたはロイシンへの変更を含む。
【０１２７】
欠失または置換に加えて、改変されたタンパク質は残基の挿入を有することがあり、残基の挿入は、典型的には、ポリペプチドへの少なくとも1つの残基の付加を伴う。これは、標的指向性ペプチドまたは標的指向性ポリペプチドの挿入を含んでもよく、単に、1個の残基の挿入を含んでもよい。融合タンパク質と呼ばれる末端付加を下記で議論する。
【０１２８】
「生物学的に機能する等価物」という用語は当技術分野においてよく理解されており、さらに本明細書において詳細に定義される。従って、タンパク質の生物学的活性が維持されるのであれば、対照ポリペプチドのアミノ酸と同一の、または機能的に等価な、約70％〜約80％のアミノ酸配列、または約81％〜約90％のアミノ酸配列、または約91％〜約99％のアミノ酸配列さえ含まれる。組換えタンパク質は、ある特定の局面では、その天然対応物に生物学的に機能的に等価なものでもよい。
【０１２９】
アミノ酸配列および核酸配列は、タンパク質発現と関係がある生物学的タンパク質活性の維持を含む上記で示した判断基準を満たす限り、さらなる残基、例えば、さらなるN末端アミノ酸もしくはC末端アミノ酸または5'配列もしくは3'配列を含んでもよいが、依然として、本明細書において開示される配列の1つに本質的に示されたようなものであることも理解される。末端配列の付加は、特に、例えば、コード領域の5'部分もしくは3'部分に隣接する様々な非コード配列を含み得るか、または様々な内部配列、すなわち、遺伝子内部に存在することが知られているイントロンを含み得る核酸配列に適用される。
【０１３０】
本明細書で使用するタンパク質またはペプチドは、一般的に、遺伝子から翻訳される、約200アミノ酸超から完全長配列までのタンパク質;約100アミノ酸超のポリペプチド;および/または約3〜約100アミノ酸のペプチドを指すが、これに限定されない。便宜的に、「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチドという用語は本明細書中、同義で用いられる。
【０１３１】
本明細書で使用する「アミノ酸残基」は、当技術分野において公知の任意の天然アミノ酸、任意のアミノ酸誘導体、または任意のアミノ酸模倣物を指す。ある特定の態様では、タンパク質またはペプチドの残基は連続しており、アミノ酸残基配列を非アミノ酸は中断しない。他の態様では、この配列は1つまたは複数の非アミノ酸部分を含むことがある。特定の態様では、タンパク質またはペプチドの残基の配列は1つまたは複数の非アミノ酸部分によって中断されることがある。
【０１３２】
従って、「タンパク質またはペプチド」という用語は、天然のタンパク質に見出される20種類の一般アミノ酸のうちの少なくとも1つ、または少なくとも1つの修飾アミノ酸もしくは珍しいアミノ酸を含むアミノ酸配列を含む。
【０１３３】
本発明のある特定の態様は融合タンパク質に関する。これらの分子は、治療用タンパク質のN末端またはC末端が異種ドメインに連結されていてもよい。例えば、融合はまた、異種宿主でのタンパク質の組換え発現を可能にするために他の種に由来するリーダー配列も用いることがある。別の有用な融合には、タンパク質アフィニティタグ、例えば、血清アルブミンアフィニティタグまたは6つのヒスチジン残基、または免疫学的に活性なドメイン、例えば、抗体エピトープ、好ましくは、融合タンパク質精製を容易にするために切断可能な抗体エピトープの付加が含まれる。非限定的なアフィニティタグには、ポリヒスチジン、キチン結合タンパク質(CBP)、マルトース結合タンパク質(MBP)、およびグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)が含まれる。
【０１３４】
特定の態様において、治療用タンパク質は、インビボ半減期を延ばすペプチド、例えば、XTENポリペプチド(Schellenberger et al., 2009)、IgG Fcドメイン、アルブミン、またはアルブミン結合ペプチドに連結される場合がある。
【０１３５】
融合タンパク質を作製する方法は当業者に周知である。このようなタンパク質は、例えば、完全融合タンパク質の新規合成によって、または異種ドメインをコードするDNA配列を付着させ、その後にインタクトな融合タンパク質を発現させることによって産生することができる。
【０１３６】
親タンパク質の機能活性を回復する融合タンパク質の産生は、直列に接続されているポリペプチド間でスプライスされるペプチドリンカーをコードする架橋DNAセグメントを用いて遺伝子をつなげることによって容易になる場合がある。リンカーは、結果として生じる融合タンパク質の正しいフォールディングを可能にするのに十分な長さのリンカーであろう。
【０１３７】
B.阻害RNA
siNA(例えば、siRNA)は当技術分野において周知である。例えば、siRNAおよび二本鎖RNAは、米国特許第6,506,559号および同第6,573,099号ならびに米国特許出願第2003/0051263号、同第2003/0055020号、同第2004/0265839号、同第2002/0168707号、同第2003/0159161号、および同第2004/0064842号に記載されている。これらは全て、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１３８】
siNA内では核酸成分は全体を通して同じタイプまたは均一である必要はない(例えば、siNAはヌクレオチドおよび核酸またはヌクレオチド類似体を含んでもよい)。典型的に、siNAは二本鎖構造を形成する。二本鎖構造は、部分的または完全に相補的な2つの別々の核酸に起因してもよい。本発明のある特定の態様では、siNAは1本の核酸(ポリヌクレオチド)または核酸類似体しか含んでおらず、自身で相補する(例えば、ヘアピンループを形成する)ことによって二本鎖構造を形成してもよい。siNAの二本鎖構造は、16、20、25、30、35、40、45、50、60、65、70、75、80、85、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500個、またはそれより多い連続した核酸塩基を、その中にある全ての範囲を含めて含んでもよい。siNAは、相補的核酸(同じ核酸の別の部分または別々の相補的核酸でもよい)とハイブリダイズして二本鎖構造を形成する、17〜35個の連続した核酸塩基、より好ましくは18〜30個の連続した核酸塩基、より好ましくは19〜25個の核酸塩基、より好ましくは20〜23個の連続した核酸塩基、または20〜22個の連続した核酸塩基、または21個の連続した核酸塩基を含んでもよい。
【０１３９】
本発明の方法を実施するのに有用な本発明の剤にはsiRNAが含まれるが、これに限定されない。典型的に、本明細書において低分子干渉RNA(siRNA)と代わりに呼ばれることがある二本鎖RNA(dsRNA)の導入は、RNA干渉またはRNAiと呼ばれる現象である強力かつ特異的な遺伝子サイレンシングを誘導する。RNA干渉は「共抑制」、「転写後遺伝子サイレンシング」、「センス抑制(sense suppression)」、および「クエリング(quelling)」と呼ばれてきた。RNAiは特定の遺伝子の活性をノックアウトするための手段を提供するので魅力的なバイオテクノロジーツールである。
【０１４０】
RNAiを設計する際に、siRNAの性質、サイレンシング効果の永続性、および送達系の選択などの考慮する必要がある、いくつかの要因がある。RNAi効果を生じさせるために、生物に導入されるsiRNAは典型的にはエキソン配列を含有する。さらに、RNAiプロセスは相同性に依存する。そのため、相同であるが、遺伝子特異的でない配列間の相互干渉の可能性を最小にしながら遺伝子特異性を最大にするように、配列を注意深く選択しなければならない。好ましくは、siRNAは、siRNA配列と、阻害しようとする遺伝子との間で80％超、85％超、90％超、95％超、98％超の同一性、または100％の同一性さえ示す。標的遺伝子との同一性が約80％未満の配列は効果がかなり小さい。従って、siRNAと、阻害しようとする遺伝子との間の相同性が大きいほど、無関係の遺伝子の発現が影響を受ける可能性が小さくなる。
【０１４１】
さらに、siRNAのサイズは重要な考慮すべき事項である。一部の態様では、本発明は、少なくとも約19〜25ヌクレオチドを含み、遺伝子発現を調整することができるsiRNA分子に関する。本発明の文脈において、siRNAは、好ましくは、長さが500、200、100、50、または25ヌクレオチド未満である。より好ましくは、siRNAは長さが約19ヌクレオチド〜約25ヌクレオチドである。
【０１４２】
標的遺伝子は、一般的に、ポリペプチドをコードする領域を含むポリヌクレオチド、あるいは複製、転写、もしくは翻訳、またはポリペプチドの発現に重要な他のプロセスを調節するポリヌクレオチド領域、あるいはポリペプチドをコードする領域と、発現を調節する、ポリペプチドをコードする領域に機能的に連結される領域を両方とも含むポリヌクレオチドを意味する。細胞において発現されている、あらゆる遺伝子を標的にすることができる。好ましくは、標的遺伝子は、疾患に重要な細胞活性の進行に関与もしくは関連する遺伝子、または研究対象として特に関心が高い遺伝子である。
【０１４３】
siRNAは商業的供給業者、天然供給源から入手することができる、または当業者に周知の多数の技法のどれを用いても合成することができる。例えば、予め設計されたsiRNAの商業的供給業者の1つはAmbion(登録商標), Austin, Texである。別の商業的供給業者はQiagen(登録商標)(Valencia, Calif.)である。本発明の組成物および方法において適用できる阻害核酸は、任意の供給業者によって関心対象のタンパク質の検証済みのダウンレギュレーターであることが見出されている、どんな核酸配列でもよい。過度の実験なく、かつ本発明の開示を用いれば、さらなるsiRNAを設計し、本発明の方法を実施するために使用できることが理解される。
【０１４４】
siRNAはまた1つまたは複数のヌクレオチドの変化を含んでもよい。このような変化には、例えば、19〜25ヌクレオチドRNAの末端への、または(RNAの1つもしくは複数のヌクレオチドにおける)内部への非ヌクレオチド材料の付加が含まれ得る。ある特定の局面では、RNA分子は3’-ヒドロキシル基を含有する。本発明のRNA分子中のヌクレオチドはまた、非天然のヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含む非標準的なヌクレオチドも含んでよい。二本鎖オリゴヌクレオチドは、修飾されたバックボーン、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、または当技術分野において公知の他の修飾されたバックボーンを含有してもよく、非天然のヌクレオシド間結合を含有してもよい。siRNAのさらなる修飾(例えば、2’-O-メチルリボヌクレオチド、2’-デオキシ-2’-フルオロリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基(universal base)」ヌクレオチド、5-C-メチルヌクレオチド、1つまたは複数のホスホロチオエートヌクレオシド間結合、および逆位デオキシ脱塩基残基組込み(inverted deoxyabasic residue incorporation))は米国特許出願公開第2004/0019001号および米国特許第6,673,611号において見出される(これらのそれぞれが、その全体が参照により本明細書に組み入れられる)。ひとまとめにして、前述された、このような変化した核酸またはRNAは全て修飾siRNAと呼ばれる。
【０１４５】
C. 遺伝子編集システム
一般的に、「CRISPRシステム」とは、Cas遺伝子をコードする配列を含むCRISPR関連(「Cas」)遺伝子の発現または活性誘導に関与する転写物および他のエレメント、tracr(トランス活性化CRISPR)配列(例えば、tracrRNAもしくは活性のある部分的tracrRNA)、tracr-mate配列(内因性CRISPRシステムの文脈では「ダイレクトリピート」およびtracrRNAによってプロセシングされた部分的ダイレクトリピートを含む)、ガイド配列(内因性CRISPRシステムの文脈では「スペーサー」とも呼ばれる)、ならびに/またはCRISPR遺伝子座に由来する他の配列および転写物を総称して指す。
【０１４６】
CRISPR/CasヌクレアーゼまたはCRISPR/Casヌクレアーゼシステムは、DNAに配列特異的に結合するノンコーディングRNA分子(ガイド)RNAと、ヌクレアーゼ機能(例えば、2つのヌクレアーゼドメイン)を有するCasタンパク質(例えば、Cas9)を含んでもよい。CRISPRシステムの1つまたは複数のエレメントはI型、II型、またはIII型CRISPRシステムに由来してもよく、例えば、化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)などの内因性CRISPRシステムを含む特定の生物に由来してもよい。
【０１４７】
一部の局面では、CasヌクレアーゼおよびgRNA(標的配列に特異的なcrRNAと、ある決まったtracrRNAの融合体とを含む)が細胞に導入される。一般的に、gRNAの5'末端における標的部位は、相補的塩基対合を用いて、標的部位、例えば、遺伝子をCasヌクレアーゼの標的にする。標的部位は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列のすぐ5'側、例えば、典型的にはNGGまたはNAGのすぐ5'側のその場所に基づいて選択され得る。この点に関して、gRNAは、標的DNA配列に対応するようにガイドRNAの最初の20、19、18、17、16、15、14、14、12、11、または10ヌクレオチドを改変することによって所望の配列を標的にする。一般的に、CRISPRシステムは、標的配列部位にCRISPR複合体形成を促進するエレメントによって特徴付けられる。典型的には、「標的配列」とは、一般的に、ガイド配列が相補性を有するように設計されている配列を指し、この場合、標的配列とガイド配列の間でハイブリダイズすることでCRISPR複合体の形成が促進される。ハイブリダイゼーションを引き起こし、CRISPR複合体の形成を促進するのに十分な相補性があれば、完全な相補性が必ずしも必要とされるわけではない。
【０１４８】
CRISPRシステムは標的部位に二本鎖切断(DSB)を誘導し、その後に、本明細書において開示されるように破壊を誘導することができる。他の態様では、「ニッカーゼ」と考えられるCas9変種は、1本鎖の標的部位に切れ目を入れるために用いられる。対になるニッカーゼを、例えば、特異性を改善するために使用することができ、ニックが同時に導入されて5'オーバーハングが導入されるように、それぞれのニッカーゼは、配列を標的にする一対の異なるgRNAによって向けられる。他の態様では、遺伝子発現に影響を及ぼすために、触媒的に不活性なCas9が、転写リプレッサーまたはアクチベーターなどの異種エフェクタードメインと融合される。
【０１４９】
標的配列は、任意のポリヌクレオチド、例えば、DNAまたはRNAポリヌクレオチドを含んでよい。標的配列は細胞の核または細胞質に、例えば、細胞の細胞小器官の中にあってもよい。一般的に、標的配列を含む標的遺伝子座への組換えに用いられ得る配列またはテンプレートは「編集テンプレート」または「編集ポリヌクレオチド」または「編集配列」と呼ばれる。一部の局面では、外因性テンプレートポリヌクレオチドが編集テンプレートと呼ばれることがある。一部の局面では、組換えは相同組換えである。
【０１５０】
典型的に、内因性CRISPRシステムの文脈では、CRISPR複合体(標的配列にハイブリダイズし、1つまたは複数のCasタンパク質と複合体化したガイド配列を含む)が形成すると、標的配列の中で、または標的配列の付近で(例えば、標的配列から1塩基対、2塩基対、3塩基対、4塩基対、5塩基対、6塩基対、7塩基対、8塩基対、9塩基対、10塩基対、20塩基対、50塩基対、またはそれより多い塩基対の範囲内で)一方の鎖または両方の鎖が切断される。tracr配列はまた野生型tracr配列の全てもしくは一部(例えば、野生型tracr配列の約20個、約26個、約32個、約45個、約48個、約54個、約63個、約67個、約85個のもしくはそれより多いヌクレオチド、または約20個超、約26個超、約32個超、約45個超、約48個超、約54個超、約63個超、約67個超、約85個超のもしくはそれより多いヌクレオチド)を含んでもよく、あるいはそれからなってもよく、例えば、tracr配列の少なくとも一部に沿って、ガイド配列に機能的に連結されたtracr mate配列の全てまたは一部にハイブリダイズすることでCRISPR複合体の一部になり得る。tracr配列は、ハイブリダイズし、CRISPR複合体の形成に関与するのに十分な、tracr mate配列に対する相補性、例えば、最適にアラインメントされた場合に、tracr mate配列の長さに沿って少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％の配列相補性を有する。
【０１５１】
CRISPRシステムの1つまたは複数のエレメントを発現させることで1つまたは複数の標的部位にCRISPR複合体が形成されるように、CRISPRシステムの前記エレメントを発現させる1つまたは複数のベクターを細胞に導入することができる。成分はタンパク質および/またはRNAとしても細胞に送達することができる。例えば、Cas酵素、tracr-mate配列と連結したガイド配列、およびtracr配列はそれぞれが、別々のベクター上で別々の調節エレメントに機能的に連結することができる。または、1つのベクターの中で、同じ、または異なる調節エレメントから発現されるエレメントの2つ以上が、第1のベクターに含まれないCRISPRシステムの任意の成分を供給する1つまたは複数のさらなるベクターと組み合わされてもよい。このベクターは1つまたは複数の挿入部位、例えば、制限エンドヌクレアーゼ認識配列(「クローニング部位」とも呼ばれる)を含んでもよい。一部の態様では、1つまたは複数の挿入部位は、1つまたは複数のベクターの1つまたは複数の配列エレメントの上流および/または下流に位置する。複数の異なるガイド配列が用いられる場合には、1種類の発現構築物が、細胞内の複数の異なる対応する標的配列をCRISPR活性の標的にするために用いられてもよい。
【０１５２】
ベクターは、CRISPR酵素、例えば、Casタンパク質をコードする酵素コード配列に機能的に連結された調節エレメントを含んでもよい。Casタンパク質の非限定的な例には、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(Csn1およびCsx12とも知られる)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4、そのホモログ、またはその改変バージョンが含まれる。これらの酵素は公知である。例えば、S.ピオゲネス(S.pyogenes)Cas9タンパク質のアミノ酸配列はSwissProtデータベースにおいてアクセッション番号Q99ZW2で見られ得る。
【０１５３】
CRISPR酵素はCas9(例えば、S.ピオゲネスまたはS.ニューモニア(S.pneumonia)に由来する)でもよい。CRISPR酵素は、標的配列の場所で、例えば、標的配列内で、および/または標的配列の相補鎖内で一方の鎖または両方の鎖の切断を誘導することができる。このベクターは、変異したCRISPR酵素から、標的配列を含有する標的ポリヌクレオチドの一方の鎖または両方の鎖を切断する能力が無くなるように、対応する野生型酵素に対して変異したCRISPR酵素をコードすることができる。例えば、S.ピオゲネスに由来するCas9のRuvC I触媒ドメインにおけるアスパラギン酸からアラニンへの置換(D10A)は、両方の鎖を切断するヌクレアーゼに由来するCas9をニッカーゼ(1本の鎖を切断する)に変換する。一部の態様では、Cas9ニッカーゼは、ガイド配列、例えば、それぞれ、DNA標的のセンス鎖とアンチセンス鎖を標的にする2つのガイド配列と組み合わせて用いられることがある。この組み合わせを用いると、両方の鎖に切れ目を入れ、NHEJまたはHDRを誘導するために使用することが可能になる。
【０１５４】
一部の態様では、CRISPR酵素をコードする酵素コード配列は、真核細胞などの特定の細胞において発現するようにコドン最適化される。真核細胞は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、または非ヒト霊長類を含むが、これに限定されない、ある特定の生物、例えば、哺乳動物の真核細胞でもよく、それに由来してもよい。一般的に、コドン最適化は、関心対象の宿主細胞における発現を強化するために、天然アミノ酸配列を維持しながら、天然配列の少なくとも1つのコドンを、その宿主細胞の遺伝子において頻繁に、または最も頻繁に用いられるコドンと置き換えることによって核酸配列を改変するプロセスを指す。様々な種が、ある特定のアミノ酸のある特定のコドンについて特有のバイアスを示す。コドンバイアス(生物間のコドン使用頻度の差)はメッセンジャーRNA(mRNA)の翻訳効率と相関関係があることが多く、その結果として、メッセンジャーRNA(mRNA)の翻訳効率は、特に、コドンが翻訳される性質と、特定のトランスファーRNA(tRNA)分子の利用可能性に依存すると考えられている。ある細胞では、選択されたtRNAの数が優勢なことは、そのコドンが、ペプチド合成において最も頻繁に用いられるコドンであることを反映している。従って、ある特定の生物において最適に遺伝子発現するように、コドン最適化に基づいて遺伝子を合わせることができる。
【０１５５】
一般的に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズし、CRISPR複合体と標的配列との配列特異的結合を誘導するのに十分な、標的ポリヌクレオチド配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。一部の態様では、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、適切なアラインメントアルゴリズムを用いて適切にアラインメントされた場合には、約50％、約60％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％、約97.5％、約99％、もしくはそれより大きいか、または約50％超、約60％超、約75％超、約80％超、約85％超、約90％超、約95％超、約97.5％超、約99％超、もしくはそれより大きい。
【０１５６】
最適アラインメントは、配列をアラインメントするための任意の適切なアルゴリズムを用いて決定することができる。この非限定的な例には、Smith-Watermanアルゴリズム、Needleman-Wunschアルゴリズム、Burrows-Wheeler Transformに基づくアルゴリズム(例えば、Burrows Wheeler Aligner)、Clustal W、Clustal X、BLAT、Novoalign(Novocraft Technologies、ELAND(Illumina, San Diego, Calif.)、SOAP(soap.genomics.org.cnから入手可能)、およびMaq (maq.sourceforge.netから入手可能)が含まれる。
【０１５７】
CRISPR酵素は、1種類または複数種類の異種タンパク質ドメインを含む、融合タンパク質の一部でもよい。CRISPR酵素融合タンパク質は、任意の2つのドメイン間に任意のさらなるタンパク質配列、任意で、リンカー配列を含んでもよい。CRISPR酵素に融合され得るタンパク質ドメインの例には、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、ならびに以下の活性:メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、RNA切断活性、および核酸結合活性の1つまたは複数を有するタンパク質ドメインが含まれるが、それに限定されるわけではない。エピトープタグの非限定的な例には、ヒスチジン(His)タグ、V5タグ、FLAGタグ、インフルエンザ血球凝集素(HA)タグ、Mycタグ、VSV-Gタグ、およびチオレドキシン(Trx)タグが含まれる。レポーター遺伝子の例には、グルタチオン-5-トランスフェラーゼ(GST)、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)βガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、HcRed、DsRed、シアン蛍光タンパク質(CFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、および青色蛍光タンパク質(BFP)を含む自己蛍光(autofluorescent)タンパク質が含まれるが、これに限定されない。CRISPR酵素は、DNA分子に結合するか、または、マルトース結合タンパク質(MBP)、S-タグ、LexA DNA結合ドメイン(DBD)融合体、GAL4A DNA結合ドメイン融合体、および単純ヘルペスウイルス(HSV)BP16タンパク質融合体を含むがこれに限定されない他の細胞分子に結合する、タンパク質またはタンパク質断片をコードする遺伝子配列と融合されてもよい。CRISPR酵素を含む融合タンパク質の一部となり得る、さらなるドメインは、参照により本明細書に組み入れられるUS20110059502に記載されている。
【０１５８】
VI.キットおよび診断剤
本発明の様々な局面では、エキソソームを体液または組織培養培地から精製するための必要な成分を含むキットが想定される。他の局面では、エキソソームを単離してエキソソームに治療用核酸、治療用タンパク質、または治療用タンパク質をコードする核酸をトランスフェクトするための必要な成分を備えるキットが想定される。キットは、このような任意の成分を含む1つまたは複数の密封したバイアルを含んでもよい。一部の態様では、キットはまた、キットの成分と反応しない容器である適切な容器手段、例えば、エッペンドルフチューブ、アッセイプレート、注射器、瓶、またはチューブも備えてよい。容器は、プラスチックまたはガラスなどの滅菌可能な材料から作製されてもよい。キットは、本明細書において説明される方法の手順工程を概説する指示書をさらに備えてもよく、本明細書に記載のものと実質的に同じ手順に従うか、または当業者に公知である。コンピュータを用いて実行された場合に、試料からエキソソームを精製して治療用核酸をエキソソームにトランスフェクトするか、組換えタンパク質をエキソソームにおいて発現させるか、または組換えタンパク質を電気穿孔によってエキソソームに導入する現実または仮想の手法を表示する、機械可読指示書を備える、コンピュータ可読媒体中に、指示書の情報は存在してもよい。
【実施例】
【０１５９】
VII.実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を証明するために含まれる。以下の実施例に開示される技法は、本発明者が発見した技法が本発明の実施において十分に機能することを示すこと、かつ、従って、本発明を実施するための好ましい態様を構成すると考えられ得ることが、当業者に理解されるはずである。しかしながら、本開示を考慮すれば、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示された特定の態様において多くの変更を加えることができ、それでもなお、類似または同様の結果を得ることができると当業者に理解されるはずである。
【０１６０】
材料および方法
細胞培養。 MCF7、MDA-MB231、E10、HDF、およびBJヒト細胞株ならびにNIH 3T3マウス細胞株を、10％FBSを含むDMEM中で培養した。4T1および67NRマウス細胞株を、10％FBSを含むRPMI中で培養した。MCF10Aヒト乳房上皮細胞株を、5％ウマ血清、20ng/ml EGF、0.5mg/ml ヒドロコルチゾン、100ng/mlコレラ毒素、および10μg/mlインシュリンを含むDMEM/F12培地中で培養した。全ての細胞の供給元はAmerican Type Culture Collection-ATCCであった。
【０１６１】
エキソソームの単離および精製。 以前に述べられたように(Luga et al., 2012; Thery et al., 2006)、エキソソームを分画遠心によって精製した。48時間培養した細胞からの上清を800gおよび2000gの連続遠心分離工程に供した。結果として生じた上清を0.2μmフィルターを用いて濾過した。SW40Tiスインギングバケットローター(swinging bucket rotor)に入れて100,000gで3時間超遠心した後(Beckman-Coulter)にペレットを回収した。上清を除去し、ペレットをPBSに再懸濁し、その後に100,000gで3時間の超遠心をもう1回行った。結果として生じたペレットをエキソソーム含有量について分析した。RNA抽出に使用したエキソソームを500μLのトリゾルに再懸濁した。タンパク質抽出に使用したエキソソームを尿素/SDS溶解緩衝液(8M尿素、2.5％SDS、5μg/mLロイペプチン、1μg/mLペプスタチン、および1mMフッ化フェニルメチルスルホニル)に再懸濁した。細胞を送達するために使用したエキソソームを無血清DMEM培養培地に再懸濁した。他の用途については、単離したエキソソームを、残りの実験手法に記載のように処理した。
【０１６２】
イメージングフローサイトメトリー分析(ImageStream)。 エキソソームを、NaCl0.9％食塩水(B. Braun Medical Inc, Bethlehem, PA, USA)に溶解した4μmアルデヒド/硫酸塩ラテックスビーズ(aldehyde/sulfate latex beads)(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)に付着させた。食塩水に溶解した100mMグリシンおよび2％BSAを用いて反応を止め、室温で30分間回転しながら10％BSAでブロックした。食塩水/2％BSAで洗浄した後、ビーズに結合したエキソソームを10,000rpmで2分間遠心分離し、4℃で回転しながら1:200の抗CD63(Santa Cruz)、抗CD9(Abcam)、抗CD81(Abcam)、抗CD82(Abcam)、および抗FLOT1(Santa Cruz)と30分間インキュベートした。ビーズを10,000rpmで2分間遠心分離し、食塩水/2％BSAで洗浄し、4℃で回転しながら1:400のAlexa-488二次抗体(Life Technologies, NY 14072)と30分間インキュベートした。3回洗浄した後に、ビーズを食塩水に再懸濁し、ImageStream(登録商標)(Merck Millipore)で分析した。画素飽和(pixel saturation)を避けるために、画像取得ゲイン(image acquisition gain)(％)を陽性サンプルを用いて設定した。IDEAS(登録商標)(Merck Millipore)ソフトウェアを用いて画像処理を行った。焦点外(out-of-focus)のビーズを除外し、1個のビーズを選択するようにゲートを規定した。Alexa-488陽性ビーズゲートを負の対照試料に対して規定した。陽性ビーズのパーセントは、試料ごとに分析した事象の数と比べたものである。
【０１６３】
免疫金標識および電子顕微鏡。 ペレット化したエキソソームを、0.1Mリン酸緩衝液に溶解した2.5％グルタルアルデヒドに再懸濁することによって固定した。最適濃度で固定した標本を300メッシュ炭素/formvarコーティンググリッドの上に置き、最低1分間、formvarに吸収させた。免疫金染色のために、グリッドをブロック/透過処理工程用ブロッキング緩衝液に1時間入れた。リンスすることなく、すぐにグリッドを適切な希釈度の一次抗体(ポリクローナル抗GFP 1:10, Abcam)に4℃で一晩入れた。対照として、いくつかのグリッドを一次抗体に曝露しなかった。翌日、全てのグリッドをPBSでリンスし、10nm金粒子が結合した適切な二次抗体(AURION, Hatfield, PA)の複数滴上に室温で2時間浮かべた。グリッドをPBSでリンスし、0.1Mリン酸緩衝液に溶解した2.5％グルタルアルデヒドに15分間入れた。PBSおよび蒸留水でリンスした後に、グリッドを乾燥させ、対比のために酢酸ウラニルを用いて染色した。試料をTecnai Bio Twin透過型電子顕微鏡(FEI, Hillsboro, OR)で観察し、画像をAMT CCD Camera(Advanced Microscopy Techniques, Danvers, MA)で撮影した。
【０１６４】
エキソソームのEGF刺激。 前記のようにエキソソームをMBA-MB-231細胞から収集した。1×109個〜3×109個のエキソソームを1mL PBSに再懸濁し、様々な濃度のrEGFを添加した。EGFを含む、または含まないエキソソーム懸濁液を37℃で15分間、5％CO2と共にインキュベートし、次いで、氷上に置いた。3つのレプリケートをプールし、PBSを総体積11mLまで添加し、刺激済みエキソソームを、前記のようにSW40Tiスインギングバケットローターに入れて100,000gで3時間の超遠心によって収集した。タンパク質抽出物を、ペレット化した刺激済みエキソソームから、イムノブロット分析用の尿素/SDS溶解緩衝液(100mM NaFおよび1mM NaOV4を含む)または免疫沈降アッセイ用のTriton X-100緩衝液(150mM NaCl、1％(v/v) Triton X-100、10mM Na2HPO4、2mM KH2PO4, pH7.4、50mM 6-アミノヘキサン酸、10mM EDTA、5mM N-エチルマレイミド、5mMベンズアミジン、5μg/mLロイペプチン、1μg/mLペプスタチン、1mMフッ化フェニルメチルスルホニル、100mM NaF、および1mM NaOV4)に収集した。
【０１６５】
タンパク質ウエスタンブロットおよび抗体。 エキソソームタンパク質抽出物を、ビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイキット(Pierce, Thermo Fisher Scientific)に従ってアクリルアミドゲルにロードし、ウエット電気泳動転写によってPVDF膜(ImmobilonP)に転写した。ブロットを、TBS/0.05％ Tween20に溶解した5％脱脂粉乳でRTで1時間ブロックし、以下の一次抗体: 1:300 抗CD9 ab92726(Abcam); 1:300 抗TSG101 ab83(Abcam); 1:1000 抗EGFR 4267S(CST); 1:300 抗CD63 sc-365604、(Santa Cruz); 1:200 抗CD81 cs-166029(Santa Cruz); 1:1000 抗pEGFR Tyr1068 3777S(CST); 1:2000 抗GRB2 610111(BD Biosciences); 1:1000 抗Shc 06-203(Millipore); 1:5000 抗GFP ab13970(Abcam); 1:1000 GAPDH ab9483 (Abcam); 1:10,000 HRP結合β-アクチンa3854(Sigma); 1:400 抗RNA Pol IIカタログ番号39097(Active Motif); 1:500 抗Hsp90 ab1429(Abcam); 1:500 抗eIF3A ab86146(Abcam); 1:500 抗eIF4A1 ab31217(Abcam)と4℃で一晩インキュベートした。HRP結合二次抗体(Sigma, 1:2000)を室温で1時間インキュベートした。抗体インキュベーション後に、オービタルシェーカーに載せて洗浄を1×TBS 0.05％Tween20を用いて4回、10分間間隔で行った。Pierceの化学発光試薬を用いてブロットを発色させた。
【０１６６】
免疫沈降。 エキソソームおよび細胞タンパク質抽出物を4℃で2時間、穏やかに揺らした。溶解産物を、予め冷却した遠心機に入れて14,000gで15分間遠心分離し、ペレットを捨てた。プロテインAまたはGアガロース/sepharoseビーズをPBSで2回洗浄し、PBSで50％スラリーに戻した。ビーズ/スラリーミックス(100μl)を100μgのエキソソームタンパク質抽出物または20μgの細胞タンパク質抽出物に添加し、4℃で10分間インキュベートした。ビーズを遠心分離によって14,000g、4℃で10分間除去し、ペレットを捨てた。10μgの抗eIF4A1抗体を100μLのエキソソーム溶解産物に添加し、オービタルシェーカーに載せて4℃で一晩インキュベートした。100μLのプロテインAまたはGアガロース/sepharoseビーズスラリーを添加し、4℃で一晩放置した。遠心分離後に、上清を捨て、ビーズを氷冷尿素/SDS緩衝液で3回洗浄した。アガロース/sepharoseビーズを5分間煮沸して、ビーズから免疫複合体を解離させた。ビーズを遠心分離によって収集し、イムノブロットを上清に対して行った。
【０１６７】
UPLC-MSを用いたアミノ酸の同定。 エキソソームを、内部標準トリプトファン-d5を加えたメタノール200μLと混合し、-20℃で1時間インキュベートした。16,000g、4℃で15分間遠心分離した後に、190μLの上清を収集し、溶媒を除去した。乾燥させた抽出物を15μLのメタノールに溶解して再構成し、このうち10μLをマイクロチューブに移し、誘導体化した。使用したクロマトグラフィー分離および質量分析検出の条件を表1にまとめた。質量範囲、50〜1000m/zをギ酸ナトリウムのクラスターイオンを用いて較正した。操作の経過全体を通してLC/MSシステムの保持時間の安定性および感度を調べるために、無作為化した2回の同じ試料注射の全セットの前および後に、標準化合物の適切な試験混合物を分析した。
【０１６８】
（表１）アミノ酸プラットフォームのためのクロマトグラフィー条件
2021519296.tif 000004
【０１６９】
データを、MassLynx 4.1ソフトウェア(Waters Corp., Milford, USA)のTargetLynx application managerを用いて処理した。この分析に含まれる代謝産物に対応する、一組の既定の保持時間、質量電荷比ペア、Rt-m/zをプログラムに送り込む。次いで、真の代謝産物関連特徴だけをソフトウェアで処理するように、結合抽出イオンクロマトグラム(associated extracted ion chromatogram)(マストレランスウィンドウ(mass tolerance window)=0.05Da)をピーク検出し、LCおよびMSドメインの両方でノイズ低減する。次いで、識別子(identifier)としてRt-m/zデータペア(保持時間トレランス=6s)を用いて、それぞれの試料注入についてクロマトグラフィーピーク面積のリストを作成する。各代謝産物について、各試料中での強度を、同じ試料中での記録された内部標準強度で割ることによって規格化係数(normalization factor)を計算した。
【０１７０】
デジタルqPCR。 デジタルRNA反応を、3ngのcDNA、TaqMan(登録商標)Universal Master mixおよびQuantStudio(商標)3D Digital PCR Master Mix v1 (Applied Biosystems)を用いて製造業者の推奨に従って行った。QuantStudio(商標)3D Digital PCR Chip Loader(Applied Biosystems)を使用して、合計14.5μLのミックスを、QuantStudio(商標)3D Digital PCR 20K Chip Kit v1(Applied Biosystems)にロードした。PCR反応を、GeneAmp(登録商標)9700(Applied Biosystems)において製造プロトコールに従って行った。チップを、QuantStudio(商標)3D Digital PCR Instrument(Applied Biosystems)を用いて画像化した。
【０１７１】
（表２）デジタルPCRプライマー
2021519296.tif 000005
【０１７２】
エキソソームの[35S]メチオニン標識。 エキソソームを前記のように単離し、0.1〜1.0mCi/mlトランス標識(trans label)[35S]-L-メチオニン(Amersham Biosciences)を含み、FBSを含まない無メチオニン培養培地に再懸濁し、一晩インキュベートした。または、エキソソームをシクロヘキシミド(Sigma, 100μg/mL)の存在下でインキュベートした。エキソソームをペレット化し、氷冷PBSで洗浄し、前記のように尿素/SDS溶解緩衝液に再懸濁した。タンパク質抽出物をBCAタンパク質アッセイキットを用いて定量し、アクリルアミドゲル上で移動させ、ウエット電気泳動転写によってPVDF膜(ImmobilonP)に転写した。この後に、膜を、EN3HANCE(登録商標)オートラジオグラフィーエンハンサーを用いて製造業者の説明書(Perkin-Elmer)に従ってオートラジオグラフィーで分析した。
【０１７３】
リアルタイムPCR分析。 DNアーゼで処理したRNAを、トリゾル(Invitrogen)を用いた全エキソソームRNA精製後にMultiScribe Reverse Transcriptase(Applied Biosystems)とオリゴ-d(T)プライマーを用いてレトロ転写した。リアルタイムPCRを、SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems)と、対照としてβ-アクチンを用いてABI PRISM 7300HT Sequence Detection System Instrumentにおいて行った。28S rRNAプライマーペア(QF00318857)および18S rRNAプライマーペア(QF00530467)を、すぐに使うことができる特異的プライマーペアとしてQiagenから購入した。他のプライマーを以下に列挙した。それぞれの測定を3回繰り返して行った。増幅される標的量が、ある決まった閾値に達するサイクル数の分数となる  閾値サイクル(threshold cycle)(Rothstein et al.)を求め、以前に報告されたように(Livak and Schmittgen, 2001)、2-ΔCt式を用いて発現を測定した。
【０１７４】
（表３）qPCRプローブ
2021519296.tif 000006
【０１７５】
インビトロ転写および翻訳のための溶解産物調製。 エキソソームおよび細胞ペレットを氷冷PBSで1回洗浄し、等量の氷冷20mM HEPES(pH7.5)、100mM酢酸カリウム、1mM酢酸マグネシウム、2mMジチオスレイトール、および100μg/mLリゾレシチンに再懸濁した。氷上で1分後に、これらを再ペレット化し、等量の氷冷低浸透圧抽出緩衝液に再懸濁した。氷上で5分後に、溶解産物を、1mL注射器に取り付けた26ゲージ針に10回通すことで破壊した。結果として生じたホモジネートを1000g、4℃で5分間遠心分離した。上清を収集し、アリコートを液体窒素で凍結し、インビトロ翻訳アッセイで使用するために-80℃で保管した。
【０１７６】
インビトロ共役転写・翻訳。 前記のように細胞およびエキソソームから得た溶解産物をインビトロ翻訳に12μLの反応体積で使用した。標準的な反応条件は以下の通りであった:細胞溶解産物(最終タンパク質濃度10μg)またはエキソソーム溶解産物(最終濃度100μg)、1μgのpEMT7-GFP cDNA発現プラスミド、20mM HEPES-KOH(pH7.6)、80mM酢酸カリウム、1mM酢酸マグネシウム、1mM ATP、0.12mM GTP、17mMクレアチンリン酸、0.1mg/mLクレアチンホスホキナーゼ、2mMジチオスレイトール、40μMの20種類の各アミノ酸、0.15mMスペルミジン、および400U/mL RNAsin(Promega)。インキュベーションを37℃で3時間行った。
【０１７７】
エキソソームの電気穿孔および培養。 エキソソームをペレット化し、20μgのプラスミド(pCMV-GFP、pEGFP-p53 Addgeneプラスミド12091、pcDNA3-RLUC-POLIRES-FLUC、およびpcDNA-FLUC)と一緒に400μLの電気穿孔緩衝液(1.15mMリン酸カリウムpH7.2、25mM塩化カリウム、21％Optiprep)に再懸濁した。以前に述べられたように(Alvarez-Erviti et al., 2011)、エキソソームを、4mmキュベットを使用し、Gene Pulser Xcell Electroporation System(BioRad)を用いて電気穿孔した。必要に応じて、エキソソームを翻訳阻害の場合にはシクロヘキシミド(Sigma, 100μg/mL)または転写阻害の場合にはα-アマニチン(Sigma, 30μg/mL)の存在下で電気穿孔した。電気穿孔済みエキソソームを無血清DMEM中37℃で、示された時点にわたって培養した。
【０１７８】
電気穿孔済みエキソソームのフローサイトメトリー分析。 エキソソーム調製物(5〜10μg)を5μLの4μm直径アルデヒド/硫酸塩ラテックスビーズ(aldehyde/sulfate latex beads)(Interfacial Dynamics, Portland, OR)とインキュベートし、600μLに再懸濁した。エキソソームでコーティングされたビーズをFACS Caliburフローサイトメーター(BD Biosciences)で分析し、緑色蛍光について分析した。
【０１７９】
エキソソーム送達および共焦点顕微鏡観察。 MCF10A細胞を適切なコンフルエンシーで12ウェルプレート中で、挿入したカバーガラス上にプレートし、一晩培養した。翌日、細胞を、無血清培養DMEMに再懸濁したMDA-MB-231エキソソームと2時間インキュベートし、冷PBS1×で洗浄し、4％PFA/PBSで室温において20分間固定した。スライドをPBS 0.5％Triton X-100を用いてRTで10分間透過処理し、DAPIで対比染色した。Zeiss LSM510 Upright Confocal Systemを使用し、同一の設定を維持するためのリサイクルツール(recycle tool)を用いて画像を入手した。データ分析のために、画像を、少なくとも2回の独立した実験から抜き取ったプールから選択した。図は代表的な視野を示す。
【０１８０】
リバーストランスウェル(reverse transwell)アッセイ。 エキソソームを前記のようにMDA-MB-231細胞から単離し、PBSに再懸濁し、Nanosight NTAを用いて定量した。150μLのPBSに溶解した10×109個のエキソソームを、96ウェルCorning(商標)HTSTranswell(登録商標)システムのそれぞれのボトムウェルに添加した。PBSのみを負の対照としてボトムウェルに添加した。40nm孔があるポリカーボネート膜を備えるインサートを各ウェルに添加し、100μLのPBSのみ、20％FBSを含むPBS、または10,000ng/mlのEGFを含むPBSをインサートに添加した。Trasnswellプレートを37℃で5％CO2とインキュベートし、Nanosight NTAを用いたエキソソーム定量のために、4時間および24時間インキュベートした後に試料を上部インサートから収集した。
【０１８１】
統計。 エラーバーはバイオロジカルレプリケート間の±s.d.を示す。各実験のテクニカルトリプリケートならびにバイオロジカルトリプリケートを行った。統計的有意性を、適宜、および図の説明に示したようにスチューデントt検定、ANOVA、またはマンホイットニー検定によって計算した。
【０１８２】
実施例1 - EGFRリン酸化はMDA-MB-231、トリプルネガティブヒト乳がん細胞に由来するエキソソームにおいて検出される
確立した超遠心法(Melo et al., 2015; Melo et al., 2014)を用いて、エキソソームを様々なマウス細胞株およびヒト細胞株から単離した。単離されたエキソソームは不均一な混合物であり、調製物間では同じサイズ分布が一貫して観察される。NanoSightナノ粒子追跡分析(NTA)ならびに原子間力顕微鏡(AFM)によって、直径平均104±1.5nm、おおよそ30〜200nmの範囲に及ぶサイズ分布を有する粒子が明らかになった。これは透過型電子顕微鏡(TEM)によって確認され、脂質二重層によって囲まれた細胞外小胞が示された(図8A〜C)。単離されたエキソソームは免疫金/TEM画像化、イムノブロット分析、およびイメージングフローサイトメトリーによって既知のエキソソームマーカーを有することがさらに示された(Raposo and Stoorvogel, 2013)(図8D〜F)。純度をさらに確認するために、エキソソーム試料を固化LBプレート上に接種した。口腔スワブから得られた細菌対照と比較した場合にコロニー形成は無いことが示された。これにより、単離されたエキソソームには細菌汚染が存在しないことが証明された(図8G)。
【０１８３】
様々な細胞株から得られたエキソソームのEGFR含有量をイムノブロッティングによって調べた。全ての細胞株に由来するエキソソームが低レベルのEGFR発現を示すが、BJ線維芽細胞細胞株およびMDA-MB-231トリプルネガティブ乳がん細胞株に由来するエキソソームはこの受容体の強力な発現を示した。既知のエキソソームマーカーCD81をローディング対照として示した(図1A)。トリプルネガティブ乳がんの進行にはEGFRが重要であると考えると (Lim et al., 2016; Liu et al., 2012; Nakai et al., 2016)、MDA-MB-231由来エキソソームにおけるEGFRの機能上の役割をさらに探索した。エキソソームをMDA-MB-231細胞およびMCF10A細胞から入手し、10億個のエキソソームを無血清培養培地中で500ng/mlの組換えヒトEGF(rhEGF)と37℃で15分間インキュベートした。EGFRのTyr1068残基に特異的な抗体を用いた、これらのエキソソームから得られたタンパク質抽出物のイムノブロッティングから、MDA-MB-231に由来するエキソソームでは、この受容体のリン酸化レベルは増加するが、非腫瘍形成性MCF10A乳房上皮細胞では増加しないことが明らかになった(図1B)。EGFRのベースラインレベルはどの試料でも変化しなかった。このことから、観察されたリン酸化増加の特異性が確認された。組換えヒトEGF(rhEGF)で刺激することでリン酸化ERKレベルも増加した。このことから、観察されたEGFRリン酸化はエキソソーム内での下流シグナル伝達事象を誘発することが示唆される(図1C)。さらに、MDA-MB-231エキソソームのタンパク質含有量を調べることで、MDA-MB-231エキソソームがEGFRの下流エフェクター、すなわち、GRB2およびShcも含有することが分かった(図1C)。
【０１８４】
次いで、rhEGFで刺激するとエキソソームEGFRはその下流アダプターに結合できるかどうか調べた。エキソソームをrhEGFで37℃で15分間刺激した。エキソソームタンパク質抽出物を、GRB2およびShcの特異的抗体を用いたプルダウンアッセイに供した。EGFで刺激すると、EGFRとの免疫共沈降が増加することが検出された(図1D,E)。アイソタイプIgGがプルダウンの負の対照として用いられ、EGFR免疫共沈降を示さなかった。さらに、このアッセイを逆にし、EGFRをプルダウンすることによって、EGF刺激済みエキソソームでのみ、免疫共沈降されたGRB2を検出することも可能であった(図8B)。まとめると、これらの結果から、無細胞条件でリガンドとインキュベートすることでリン酸化することができ、それによってエキソソーム内で推定下流シグナル伝達事象が生じるEGFRを、MDA-MB-231細胞に由来するエキソソームは含有することが証明された。
【０１８５】
実施例2 - エキソソームのEGF刺激によってエキソソームのタンパク質含有量が変化する
受容体型チロシンキナーゼはキナーゼ活性の基質としてATPを必要とし、前立腺由来エキソソームはATPを生成する能力があることが示されている(Ronquist et al., 2013a)。細胞の非存在下でのリン酸化活性の存在をさらに確認するために、ATP定量アッセイを、rhEGF刺激があるエキソソームまたはrhEGF刺激の無いエキソソームに対して行った。ルミネセンスに基づくキットを用いて、ATPがMDA-MB-231細胞およびMCF10A細胞に由来するエキソソームにおいて、後者の方が少量ではあるが検出された。EGFで刺激すると、MDA-MB-231細胞に由来するエキソソームはATP量のわずかな減少を示したが、MCF10A細胞は減少を示さなかった(図2A)。エキソソームに及ぼすEGF刺激の影響をさらに調べるために、エキソソームを無細胞条件でEGFと48時間インキュベートした。未刺激対応物と比較して、EGFで48時間刺激したエキソソームではGRB2タンパク質レベルのレベルは一貫して高かった(図2B)。このことは、増殖因子刺激によりエキソソームのタンパク質含有量が変化したという興味をそそる可能性を高めた。この可能性をさらに調べるために、質量分析を、rhEGFで刺激しなかったエキソソームまたはrhEGFで刺激したエキソソームから得られたタンパク質抽出物に対して行った。タンパク質抽出物をトリプシン消化に供し、各試料のMS/MSペプチドスペクトルを得るためにESI-TRAP質量分析計を用いて評価した。次いで、それぞれのエキソソーム試料のタンパク質のリストを得ることを目的としてペプチドを同定するために、得られたスペクトルをSwissProtデータベースと突き合わせて評価した。オープンアクセスFunRich functional enrichment analysisツール(Pathan et al., 2015)を用いて、未刺激エキソソームおよび刺激済みエキソソームにおいて同定されたヒットの大部分が、エキソソームにおいて以前に同定されたタンパク質(Vesiclepediaデータベース)とマッチすることが観察された(図2C)。未刺激エキソソームと比較した場合に、rhEGFで刺激したエキソソームでは多数のタンパク質が同定された(491対371、図2D)。これらのタンパク質の大部分が、刺激済みエキソソームおよび未刺激エキソソームの両方に共通して見られたが、rhEGF刺激によってのみだ491種類のうち224種類のタンパク質が検出された。EGFRが両試料で同定されたが、GRB2はrhEGF刺激済みエキソソームでしか同定されなかった(図2E)。しかしながら、このことは、GRB2が未刺激エキソソームに存在しないことを意味せず、このタイプの分析には、検出可能な閾値より低いレベルで存在する可能性があると強調しなければならない。観察可能なペプチドマッチに基づいたタンパク質含有量の相対変化のラベルフリー定量を可能にするemPAI(Exponentially Modified Protein Abundance Index)を使用した(Ishihama et al., 2005)。未刺激対応物と比較した場合にrhEGF刺激済みエキソソームにおいて強力な増大を示した上位15位のタンパク質には、a-アクチニン、MARCKS、エズリン、モエシン、およびインテグリンα-2などの、アクチンリモデリングおよび膜動態に関係する、いくつかのタンパク質が含まれた(表4および5)。次いで、遺伝子オントロジー(GO)分析を、PANTHER過剰表示検定（overrepresentation test）を用いて行った。興味深いことに、rhEGF刺激済みエキソソームに豊富にある上位のGO生物学的プロセスのうち、いくつかはアクチンリモデリングと遊走に関係があった(上位20位の経路のうち5つ、表6)。
【０１８６】
（表４）emPAI法(Ishihama et al., 2005)を用いたタンパク質スコアに基づいて、500ng/mlのEGFとともに37℃で48時間インキュベートしたMDA-MB-231細胞に由来するエキソソーム中で対照エキソソームと比較してアップレギュレートされていると同定された上位15位のタンパク質
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【０１８７】
（表５）emPAI法(Ishihama et al., 2005)を用いたタンパク質スコアに基づいて、500ng/mlのEGFとともに37℃で48時間インキュベートしたMDA-MB-231細胞に由来するエキソソーム中で対照エキソソームと比較してダウンレギュレートされていると同定された上位15位のタンパク質
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【０１８８】
（表６）対照エキソソームと、500ng/mlのEGFとともに37℃で48時間インキュベートしたエキソソームとの間の差次的なタンパク質スコアに基づいて同定された上位20位の遺伝子オントロジー(GO)経路。差次的に発現したタンパク質のリストを、emPAI法を用いて入手し、PANTHER過剰表示検定を用いてGO分析のインプットとして使用した。
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【０１８９】
まとめると、これらの質量分析法データから、rhEGFで刺激するとMDA-MB-231エキソソームはタンパク質含有量を変えることができると示唆される。これらのデータから、rhEGFで刺激した同じエキソソームはアクトミオシンリモデリングと遊走を経験し、rhEGF刺激に応答した運動性表現型を示すことができるとも示唆される。タンパク質定量のビシンコニン酸(BCA)アッセイによって、未刺激の対照と比較した場合に、rhEGFで刺激したエキソソームにおいてタンパク質含有量は増加することが確認された(図2F)。β-アクチンのイムノブロッティングからも、対照未刺激エキソソームと比較した場合に、様々な量のrhEGFで刺激したエキソソーム中の重合アクチンのレベルも増加することが示される(図2G)。まとめると、これらの観察はエキソソームにおける思いもよらない程度の生物学的活性を示している。従って、エキソソームが、許容される条件下でタンパク質を新規合成できるという可能性をさらに調べ、増殖因子刺激による潜在的なエキソソーム運動性誘導を探索した。
【０１９０】
実施例3 - 様々な細胞タイプに由来するエキソソームは転写および翻訳に必要な機能的構成要素を含有する
様々な細胞の起源のエキソソームに由来するプロテオミクスデータの分析から、真核生物開始因子、ADPリボシル化因子、およびリボソームタンパク質などのタンパク質合成機構のいくつかの構成要素が存在することが明らかになった(Choi et al., 2012; Melo et al., 2015; Pisitkun et al., 2004; Valadi et al., 2007)(図10、11A,B)。この情報を、mRNAとその対応するタンパク質がエキソソームに見出されるという知識とひとまとめにして考えると、単離されたエキソソームはmRNAをタンパク質に翻訳する能力を有する可能性があることがさらに示唆される。
【０１９１】
定量PCR(qPCR)分析を用いて、分析した全てのエキソソームにおいて18S rRNAと28S rRNA両方とも、ならびにメチオニン、グリシン、ロイシン、セリン、およびバリンのtRNAが存在することが確認された(図12A,B)。さらに、エキソソームの超高速液体クロマトグラフィー-質量分析法(UPLC-MS)分析から、全ての遊離アミノ酸が存在することが明らかになった(図3A)。イムノブロッティング分析から、エキソソームに、eIF4A、eIF3A、およびeIF1Aを含む翻訳開始複合体の異なるメンバーが存在することが同定された(図3B)。これにより、質量分析によりなされた観察が裏付けられた。さらに、開始因子eIF4AおよびeIF3Aが、エキソソームから得られたタンパク質抽出物中で免疫共沈降する(Morino et al., 2000)(図12C)。
【０１９２】
エキソソームに存在するタンパク質産生のための構成要素の関連性に機能的に取り組むために、MCF10A細胞およびMDA-MB-231細胞から単離したエキソソームの総タンパク質抽出物を緑色蛍光タンパク質用cDNA発現プラスミド(GFPプラスミド)とインキュベートした。共役インビトロ転写・翻訳アッセイを行った。GFPをコードするプラスミドとインキュベートした後に抽出物をウエスタンブロット分析することでGFPタンパク質の産生が明らかになった(図3C)。MDA-MB-231細胞とMCF10A細胞の両方に由来するエキソソーム溶解産物がGFP発現プラスミドからのタンパク質合成を可能にするという事実から、様々な細胞に由来するエキソソームはDNA転写とmRNA翻訳の両方に必要な機能成分を全て含有する可能性が高いことが裏付けられた。DNA転写能力と一致して、様々な細胞供給源から単離したエキソソームに由来するタンパク質抽出物のさらなるイムノブロット分析から、リン酸化型と非リン酸化型両方のRNAポリメラーゼIIサブユニットが存在すると同定された(図3D)。
【０１９３】
実施例4 - エキソソームは細胞非依存的タンパク質合成の能力がある
エキソソームが自立的に新規mRNA翻訳を行うことができるという発見をさらに検証するために、エキソソームによって新たに合成されたタンパク質が標識されるように、MDAMB-231細胞ならびにマウス肺がんE10細胞株から得られた単離されたエキソソームを35S-メチオニンとインキュベートした。推定生合成プロセスと潜在的なオートクライン刺激を活性化するために、このアッセイを37℃で行った。35S-メチオニンの存在下で72時間インキュベートしたエキソソームに由来するタンパク質抽出物のオートラジオグラフィーによって、40〜300kDaの範囲のいくつかのタンパク質に放射性アミノ酸が取り込まれることが示された。これは、主として、エキソソームを35S-メチオニンと一緒にタンパク質翻訳阻害剤シクロヘキシミドとインキュベートした場合に示された(図3E)。様々ながん細胞に由来するエキソソームを35S-メチオニンとインキュベートした場合に、別の標識タンパク質パターンが観察された。さらに、無細胞培養培地中でインキュベートした新鮮に単離されたエキソソームから総タンパク質含有量を定量した。48時間インキュベートした後に、総エキソソームタンパク質含有量は有意に増加した(図3F)。
【０１９４】
次に、エキソソームの溶解産物ではなく完全な形のエキソソームにおいて転写と翻訳が行われるかどうかを、エキソソームインビトロ翻訳のプロトコールを設定することで確認した。pCMV-GFP発現プラスミドをMDA-MB-231細胞由来エキソソームに直接電気穿孔し(Borges et al., 2013; El-Andaloussi et al., 2012; Kamerkar et al., 2017)、電気穿孔済みエキソソームを無血清培養培地中で37℃で48時間インキュベートした。DNアーゼ消化後に単離されたエキソソームRNAのqPCR分析から、pCMV-GFP発現プラスミドを用いて電気穿孔したエキソソームにGFP mRNAが存在することが明らかになった(図4A)。透過型電子顕微鏡から、pCMV-GFPプラスミドを用いて電気穿孔したエキソソームの構造は完全な形であることが分かり、抗GFP抗体を用いた免疫金標識から、GFPプラスミド含有エキソソームでしかタンパク質を検出できないことが分かった(図4B)。GFP抗体を用いたエキソソームタンパク質抽出物のイムノブロット分析から、pCMV-GFPプラスミド電気穿孔済みエキソソームにGFPが存在することがさらに確認され、電気穿孔後12時間と早い時期に観察された(図4C)。GFPは、24時間に観察されたレベルを上回って増加しないが、1週間後および1ヶ月まででも発現プラスミドを用いて電気穿孔したエキソソームにおいて観察することができた(図4C,D)。同じパターンがMCF10A細胞由来エキソソームでも観察された。このことから、腫瘍形成細胞だけでなく様々な細胞に由来するエキソソームが必要な全ての構成要素を含有し、新規のタンパク質合成の能力を有することも裏付けられた(図13A)。
【０１９５】
GFPプラスミドを用いて電気穿孔したエキソソームのイムノブロット分析から、タンパク質翻訳阻害剤であるシクロヘキシミドの存在下でインキュベートした場合にGFPレベルが約80％低減することが分かった(図4E)。GFP産生はまた、RNAポリメラーゼIIの転写阻害剤であるα-アマニチンの存在下でも減少した(図4E,F)。488nmレーザーを用いた電気穿孔済みエキソソームのNanoSight NTAでも、pCMV-GFPプラスミドを用いて電気穿孔したエキソソームにおいて緑色蛍光が検出されたが、モック電気穿孔済みエキソソーム、または前記プラスミドとシクロヘキシミドまたはα-アマニチンとを用いて電気穿孔したエキソソームでは検出されなかった(図13B)。さらに、様々な電気穿孔条件を用いたプラスミド含有エキソソームのビーズに基づくフローサイトメトリー分析によってGFPの存在が検出された(図13C)。次に、生物学的プロセスを開始するためにエキソソームを37℃で24時間インキュベートし、その後にpCMV-GFPプラスミドを用いて電気穿孔した。イムノブロッティングによって検出されたようにGFP産生は減少した。このことから、37℃でプレインキュベートしたエキソソームでは、転写と翻訳のための必要な成分が使い尽くされたことが示唆される(図4G)。
【０１９６】
これらの結果がGFPにだけ特有のものではないことを確認するために、これも哺乳動物細胞で発現していないタンパク質であるオボアルブミン発現プラスミド(pCMV-Ova)を使用した。GFPと同様に、電気穿孔し、37℃で48時間インキュベートした後にエキソソームをイムノブロッティング分析することで、pCMV-Ovaプラスミドを用いて電気穿孔したエキソソームでしかオボアルブミンは産生されないことが示された(図13D)。
【０１９７】
真核生物において大多数のmRNAのタンパク質翻訳が開始するには、eIF4F複合体によって5’キャップ構造が認識されることが必要である(Merrick, 2004)。エキソソームにおけるタンパク質翻訳がキャップ依存的かどうか判定するために、配列内リボソーム進入部位で隔てられた2つの異なるルシフェラーゼシストロンからなるcDNAバイシストロニック構築物を使用した(図4H)(Poulin et al., 1998)。このシステムでは、ウミシイタケルシフェラーゼの翻訳はキャップ依存的であるのに対して、ホタルルシフェラーゼの翻訳はポリオウイルスIRESによって誘導され、従って、キャップ非依存的である(図4H)。電気穿孔によってプラスミドをエキソソームに直接導入することで、ウミシイタケルシフェラーゼ活性が増加し、ホタルルシフェラーゼ活性は明らかに変化しなかった(図4I)(Poulin et al., 1998)。このことから、エキソソームにおけるタンパク質翻訳はキャップ依存的に起こることが示唆される。ホタルルシフェラーゼ酵素とウミシイタケルシフェラーゼ酵素の活性に必要な条件は異なるので、ホタルルシフェラーゼがCMVプロモーターの制御下で発現するプラスミドを用いて、このアッセイを繰り返した。ルシフェラーゼ活性はpCMV-Fluc電気穿孔済みエキソソームでも観察された(図4J)。
【０１９８】
実施例5 - エキソソーム中のmRNA翻訳は機能的タンパク質を生成し、かつ増殖因子によって刺激することができる
シクロヘキシミドで前処理したMCF10A細胞を、pCMV-GFPプラスミドを用いて直接、電気穿孔したMDA-MB-231エキソソームとインキュベートした。共焦点顕微鏡観察による画像化から、(転写および翻訳の後に)MDAMB-231エキソソームによって送達されたGFPタンパク質によってもたらされた可能性が高い緑色蛍光がMCF10A細胞において検出された(図5A、上および下のパネル)。興味深いことに、pCMV-GFPプラスミドを用いて直接、電気穿孔した細胞は、pCMV-GFPプラスミド含有エキソソームとインキュベートした細胞において観察された蛍光パターンとは異なるGFP蛍光パターンを示す(図5A、中央および下のパネル)。
【０１９９】
MDA-MB-231細胞は、腫瘍抑制因子タンパク質p53の不活性変異型を過剰発現し、従って、p21プロモーターを活性化することができない(Gartel et al., 2003)。野生型(wt)p53は典型的にはp21を直接誘導し、細胞周期停止を促進することでDNA損傷に応答する(Zilfou and Lowe, 2009)。MDA-MB-231細胞から単離したエキソソームを、GFPと融合したwt p53をコードするプラスミドを用いて電気穿孔した。転写と翻訳が起こってwt p53タンパク質が生成されるように、電気穿孔済みエキソソームを培養培地中で48時間インキュベートした(図5B)。その後に、新たに形成されたwt p53を含有するエキソソームをシクロヘキシミドの影響下でレシピエントMDA-MB-231細胞とインキュベートした。レシピエントMDA-MB-231細胞は大幅なp21発現増加を示した(図5C)。このことから、エキソソームによって排他的に合成されたwt p53タンパク質の機能性が裏付けられた(図5B)。このp21発現増加が、実際には、プラスミド送達によるものではなくエキソソームによって新たに合成されたwt p53タンパク質によるものであったとさらに確認するために、MDA-MB-231由来エキソソームをp53-GFPプラスミドを用いて電気穿孔し、wt p53タンパク質を合成するために48時間インキュベートした後にレシピエントMDA-MB-231細胞とインキュベートしたか(48時間)、またはwt p53タンパク質を生成させることなく、すぐにレシピエントMDA-MB-231細胞に送達した(0時間、図13E)。wt p53タンパク質を48時間、活発に合成した後に送達されたエキソソームは、レシピエントMDA-MB-231細胞においてエキソソームインキュベーション後、30分と早い時期に、プラスミドだけしかないエキソソームと比較した場合より大きくp21発現を誘導した。プラスミドだけしかないエキソソームは、対照MDA-MB-231細胞において観察されたものと同じベースラインp21発現を示す(図13E)。
【０２００】
MDA-MB-231細胞由来エキソソームが内因性タンパク質合成のためのベースライン能力を示すことをさらに証明するために、エキソソームをシクロヘキシミドの存在下および非存在下で37℃でインキュベートした。これらのエキソソームからタンパク質抽出物をイムノブロッティングすることで、シクロヘキシミドとインキュベートすると小さな細胞質タンパク質であるβ-アクチンおよびGAPDHの発現レベルが一貫して少なくなることが分かった。このことからも、これらのエキソソームにタンパク質合成のベースラインレベルが存在することが証明された(図5D)。
【０２０１】
どのタンパク質が外部刺激の非存在下でMDA-MB-231エキソソームによって産生されるのか決定するために、SILAC(stable isotope labeling with amino acids in culture)の改良版を行った。MDA-MB-231細胞由来エキソソームを、重標識(heavy labeled)13C-リジンおよび15N-アルギニンを加えたSILAC培地中でインキュベートした。MDA-MB-231エキソソームを重標識SILAC培地中で5日間インキュベートし、タンパク質抽出物を入手し、トリプシン消化し、質量分析に供した。小数の重標識ペプチドしか、得られたMS/MSスペクトルと一致しなかったが、11種類のタンパク質を同定することができ、それぞれが、重標識アミノ酸を含有する1または2つのペプチドと一致する(表7)。これにより、低レベルであるが、ベースラインmRNA翻訳がエキソソームにおいて行われ、極めて少ない量の新たに合成されたタンパク質が形成されることが裏付けられた。
【０２０２】
（表７）13C-リジンおよび15N-アルギニンSILAC培地を用いて5日間インキュベートしたMDA-MB-231エキソソームのタンパク質抽出物の質量分析から得られた、重同位体を含むスペクトルと一致するペプチドを含有するタンパク質のリスト。列挙した各タンパク質は、13C-リジンまたは15N-アルギニン重標識スペクトルと一致する少なくとも1つのペプチドを含有する。
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【０２０３】
次に、タンパク質翻訳アッセイを、電気穿孔済みpCMV-GFPプラスミドがあるMDA-MB-231細胞由来エキソソームを用いて繰り返した。このエキソソームを、rhEGF刺激ありまたはrhEGF刺激無しで無血清培養培地中で37℃で48時間インキュベートした。未刺激エキソソームはGFP産生のベースラインレベルを示したが、様々な濃度のrhEGFとインキュベートするとGFPレベルは増加した(図5E)。このことから、全てのエキソソームはタンパク質を合成できるが、これに対して、増殖因子刺激はタンパク質合成レベルを増やすことで産生速度を変えることができると再度裏付けられた。
【０２０４】
実施例6 - エキソソームはrhEGFおよび血清因子による刺激に応答して活発に遊走する
増殖因子がエキソソームにおいて運動性表現型を誘導できるかどうか判定するために、rhEGFおよび血清因子を含むBoydenチャンバーシステムに基づく逆遊走(reverse migration)アッセイを設計した。MDA-MB-231細胞から単離した100億個のエキソソームを96ウェルプレートの培養ウェルに入れ、400nm孔を備えるポリカーボネート表面インサートで覆った。インサートは、PBS、10μM rhEGFを含むPBS、または20％エキソソーム枯渇FBSを含むPBSを含有した(図6A)。エキソソーム枯渇FBSは依然として微量のエキソソームを含有している可能性があるので(データ示さず)、対照として、20％FBSを、ボトムウェル中のエキソソームが無いトップインサートの表面に置いた。37℃でインキュベートした後、様々な時点で試料をトップインサートから入手し、エキソソームをNanosightNTAを用いて定量した。
【０２０５】
4時間のインキュベーション後に、トップインサート上のエキソソームのレベルは全実験群にわたって同等であった(図6B)。24時間のインキュベーション後に、20％FBSは下から上へのエキソソーム遊走を有意に増加させた。このことから、血清増殖因子の高勾配に向かうMDA-MB-231エキソソームに及ぼす持続的な走化性影響が示唆される(図6C)。ウェル上に20％FBSを含むが、エキソソームを含まないインサートはエキソソームが24時間後に有意に少なかった。このことから、遊走エキソソームの正体はMDA-MB-231細胞に由来することが確認された(図6C)。PBSは無視できるほどの量のエキソソーム遊走をもたらしたが、rhEGFのみも、完全血清関連増殖因子と比較した場合に低レベルであるがエキソソーム運動性を誘導した(図6C)。まとめると、これらの結果から、エキソソームは、増殖因子によって誘導できる機能的な走化性能力を示すことが示唆される。
【０２０６】
実施例7 - エキソソームは担がんマウスにおいてタンパク質産生の向上を特異的に示す
腫瘍によって誘導された増殖因子勾配にエキソソームが応答する能力が、機能的重要性をもつ新たなタンパク質の内因的産生を伴うかどうかについて取り組むために、参照マウスモデルを作製した。確立した4T1乳腺腫瘍があるマウスに、GFPまたはオボアルブミン発現プラスミドを用いて電気穿孔した50億個のMDA-MD 231/CD63-mCherryエキソソームを注射した。この研究の対照実験アームは、上記のプラスミドが無いCD63-mCherryエキソソームと、プラスミドおよびシクロヘキサミドを用いて電気穿孔したCD63-mCherryエキソソームを含んだ。担がんマウスまたは非担がんマウスにエキソソームをI.P.注射して24時間後に、腫瘍、血清、およびいくつかの他の臓器を収集した。CD63 mCherryタグを用いてエキソソームをFACS単離し、GFPまたはオボアルブミンタンパク質について評価した。GFPおよびオボアルブミンは、主に、腫瘍があるマウスの腫瘍、肺、骨、脳、および血清において検出されたが、非担がんマウスおよびシクロヘキサミド含有エキソソームを注射した担がんマウスの組織では極めて低レベルでしか見出されなかった。これらの結果から、エキソソームは非担がんマウスの肝臓、肺、および脳において検出することができるが、エキソソームは、腫瘍組織を含めて、(おそらく運動性の向上によって)活発に、これらの臓器に侵入し、新規のタンパク質を生成することで生物学的に応答することが証明された。さらに、担がんマウスに由来する血清由来エキソソームはタンパク質産生を示す。このことから、腫瘍は全身レベルでエキソソームに生物学的に影響を及ぼすことが示唆される。
【０２０７】
本明細書において開示および請求された方法は全て、本開示を考慮すれば過度の実験なく作製および実施することができる。本発明の組成物および方法が好ましい態様に関して説明されたが、本発明の概念、精神、および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法および本明細書に記載の方法の工程または工程の順序に変更を加えることができることは当業者に明らかである。さらに具体的には、本明細書に記載の作用物質の代わりに、化学的および生理学的に関連している、ある特定の作用物質を使用することができ、それと同時に、同一の結果または類似の結果が得られることは明らかである。当業者に明らかな、このような類似する代用および変更は全て、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の精神、範囲、および概念の範囲内であると考えられる。
【０２０８】
参照文献
以下の参照文献は、例示的な手順の詳細または本明細書に記載のものを補足する他の詳細を示す程度まで参照により本明細書に特に組み入れられる。
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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