(57)【要約】本発明は、網膜疾患を予防又は治療するための、有効成分としてＣＣＮ５を含む医薬組成物に関する。本発明によるＣＣＮ５は、網膜色素上皮細胞においてＴＧＦ−β、ＥＥＦ、又は抗ＶＥＧＦ薬によって引き起こされる線維性変化を予防する。さらに、ＣＣＮ５は、網膜色素上皮細胞の線維性変化によって引き起こされた形態的又は機能的損傷を正常な細胞のレベルへと回復させる。したがって、有効成分としてＣＣＮ５を含む当該組成物は、網膜疾患を予防又は治療するために、有利に利用することができる。【選択図】  図６ｃ
2021523205.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分として
ＣＣＮ５又はその断片
を含む、網膜疾患を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項２】
前記ＣＣＮ５が、配列番号３又は配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
網膜色素上皮細胞の線維性変形を予防又は治療する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記線維性変形が、ＴＧＦ−β、ＥＧＴＡ、ＥＧＦ、ＦＧＦ−２、及び抗ＶＥＧＦ薬からなる群より選択されるいずれか１種によって引き起こされる、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記網膜疾患が、増殖性硝子体網膜症、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、脈絡膜血管新生、及び網膜浮腫からなる群より選択されるいずれか１つの疾患である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
有効成分として、
ＣＣＮ５をコードするポリヌクレオチド
を含む、網膜疾患を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドが、ＣＣＮ５をコードするｍＲＮＡである、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
有効成分として、
ＣＣＮ５をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えウイルス
を含む、網膜疾患を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２又は配列番号５のヌクレオチド配列を含む、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記ウイルスが、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、及びワクシニアウイルスからなる群より選択されるいずれか１種のウイルスである、
請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物を個体に投与するステップ
を含む、網膜疾患を予防又は治療する方法。
【請求項１２】
前記投与が、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、胸骨内、経皮、鼻腔内、吸入、局所的、経直腸、経口、眼内、硝子体内、及び皮内経路からなる群より選択されるいずれか１つの経路よって実施される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
有効成分として、
ＣＣＮ５又はその断片と、
抗ＶＥＧＦ薬と
を含む、網膜疾患を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項１４】
前記抗ＶＥＧＦ薬が、ベバシズマブ、ラニビズマブ、又はアフリベルセプトである、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
有効成分として、
ＣＣＮ５をコードするポリヌクレオチド、又はＣＣＮ５をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えウイルスと、
抗ＶＥＧＦ薬と
を含む、網膜疾患を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項１６】
有効成分として、
ＣＣＮ５をコードするポリヌクレオチド、又はＣＣＮ５をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えウイルスと、
抗ＶＥＧＦ薬と
を含む、網膜疾患を予防又は治療するためのキット。
【請求項１７】
有効成分として、
ＣＣＮ５をコードするポリヌクレオチドが導入された細胞
を含む、網膜疾患を予防又は治療するための組成物。
【請求項１８】
前記ＣＣＮ５が、ヒト由来ＣＣＮ５である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記細胞が、幹細胞又は網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
前記幹細胞が、間葉幹細胞又はｉＰＳＣである、請求項１９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有効成分としてＣＣＮ５を含む、網膜疾患を予防又は治療するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
網膜は、眼の最も奥深くの内壁を覆う、眼の硝子体に接触している薄い透明な膜である。網膜は、対象物の光学情報を電気シグナルへと変換して視神経を通して脳の視覚野へ画像を送る、視覚情報処理のための一次器官として機能する。網膜は、１億を超える光受容細胞と、網膜のアウトプットニューロンである１００万を超える神経節細胞と、これらの細胞を接続するケーブルとして機能する多数のニューロンとで構成される洗練された組織である。色及び対象物を区別し、視力をもたらす、網膜の中心部である黄斑部（ｍａｃｕｌａｒ  ｌｕｔｅａ）は、錐体細胞からなる光受容細胞層と神経節細胞層とで構成される。黄斑部において、画像の電気シグナルは、化学シグナルへと変換され、それは、次に、神経節細胞の軸索突起で形成された視神経を通って脳へと送られる。網膜の黄斑部以外の部分は、周辺部の認識を担い、暗闇において主要な役割を果たす。
【０００３】
老化又は外的要因により、網膜に異常が生じると、この異常は、視力及び視野に問題を生じさせ、重症の場合、失明に至る。網膜の疾患としては、神経網膜が網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞層から剥離して、網膜が眼底から持ち上がり、それによって視力障害を引き起こす網膜剥離；網膜の周りの組織に異常を引き起こす周辺網膜変性症；及び黄斑部に異常を引き起こす黄斑変性症が挙げられる。網膜が、網膜色素上皮から剥離すると、画像に関する光学情報を受け取ることができない。さらに、脈絡膜からの栄養供給が達成されず、結果として、ニューロンは適切に機能しない。この状態が持続する場合、永久的な網膜萎縮が生じ、失明に至る（Ｙｏｏ、２０１５）。
【０００４】
網膜色素上皮は、神経網膜と脈絡膜との間に位置しており、網膜機能を維持する上で極めて重要な役割を果たす、立方体状の、極性がある単層である。正常な網膜色素上皮は、形態的及び機能的非対称構造を有する。網膜色素上皮細胞の変形は、線維性眼疾患、例えば、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、及び加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）などを引き起こす場合がある。病的状態において、網膜色素上皮細胞は変形し、それにより、これらの細胞は、それらの本来の形態を有さず、並びに開口分泌機能及び食作用機能も失う。
【０００５】
一方、網膜色素上皮細胞の線維性変形によって視力障害が始まった場合、以前の視力への回復を達成することはできない。したがって、初期段階においてそのような変形を検出し治療することが重要である。網膜色素上皮細胞の線維性変形に関して、早期検出及びその治療は、視力喪失を最小限に抑えることができるが；しかしながら、現在、信頼性の高い治療は存在しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
網膜色素上皮細胞の線維性変形によって引き起こされる疾患の治療薬を研究する一方、本発明者らは、ＣＣＮ５が、形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）によって引き起こされた網膜色素上皮細胞の形態的又は機能的損傷を、正常な細胞のレベルへと回復させ、結果として、網膜疾患の予防又は治療に対して素晴らしい効果を有することを見出した。この発見に基づいて、本発明者らは、本発明を完成させた。
【０００７】
本発明の目的は、有効成分としてＣＣＮ５を含む、網膜疾患を予防又は治療するための医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の目的を達成するために、本発明は、有効成分として、ＣＣＮ５又はその断片を含む、網膜疾患を予防又は治療するための医薬組成物を提供する。
【０００９】
さらに、本発明は、有効成分として、ＣＣＮ５をコードするポリヌクレオチドを含む、網膜疾患を予防又は治療するための医薬組成物を提供する。
【００１０】
さらに、本発明は、有効成分として、ＣＣＮ５をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えウイルスを含む、網膜疾患を予防又は治療するための医薬組成物を提供する。
【００１１】
さらに、本発明は、当該医薬組成物を個体に投与するステップを含む、網膜疾患を予防又は治療するための方法を提供する。
【００１２】
さらに、本発明は、有効成分として、ＣＣＮ５又はその断片と；抗ＶＥＧＦ薬とを含む、網膜疾患を予防又は治療するための医薬組成物を提供する。
【００１３】
さらに、本発明は、有効成分として、ＣＣＮ５をコードするポリヌクレオチド、又はＣＣＮ５をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えウイルスと；抗ＶＥＧＦ薬とを含む、網膜疾患を予防又は治療するための医薬組成物を提供する。
【００１４】
さらに、本発明は、有効成分として、ＣＣＮ５をコードするポリヌクレオチド、又はＣＣＮ５をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えウイルスと；抗ＶＥＧＦ薬とを含む、網膜疾患を予防又は治療するためのキットを提供する。
【００１５】
さらに、本発明は、有効成分として、ＣＣＮ５をコードするポリヌクレオチドが導入された細胞を含む、網膜疾患を予防又は治療するための組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によるＣＣＮ５、それをコードするポリヌクレオチド、又は当該ポリヌクレオチドを含有するウイルスは、ＴＧＦ−β、ＥＥＦ（ＥＧＴＡ、ＥＧＦ、及びＦＧＦ２）、又は抗ＶＥＧＦ薬によって誘発される網膜色素上皮細胞の線維性変形を予防する。さらに、当該ＣＣＮ５、それをコードするポリヌクレオチド、又は当該ポリヌクレオチドを含有するウイルスは、線維性変形によって引き起こされた網膜色素上皮細胞の形態的又は機能的損傷を、正常な細胞のレベルへと回復させることができる。したがって、有効成分として、当該ＣＣＮ５、それをコードする当該ポリヌクレオチド、又は当該ポリヌクレオチドを含有するウイルスは、網膜疾患を予防又は治療するために効果的に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１ａ】ＴＧＦ−βによって誘発されるＡＲＰＥ−１９細胞の線維性変形を研究するための実験プロセスを図式的に示す。
【図１ｂ】ＡＲＰＥ−１９細胞が、示された濃度においてＴＧＦ−βで処理される場合のＡＲＰＥ−１９細胞の線維性変形を顕微鏡下において観察することによって得られた結果を示す。
【図１ｃ】ＡＲＰＥ−１９細胞が、示された濃度においてＴＧＦ−βで処理される場合に生じるタンパク質発現パターンにおける変化を特定することによって得られた結果を示す。
【図１ｄ】ＡＲＰＥ−１９細胞にＴＧＦ−βによる処理を施し、次いで、抗ＺＯ−１抗体、抗α−ＳＭＡ抗体、及びファロイジンを使用して細胞の密着結合を観察することによって得られた結果を示す。
【図２ａ】ＴＧＦ−βによって誘発されたＡＲＰＥ−１９細胞の線維性変形に対するＡｄＣＣＮ５の阻害効果を特定するための実験プロセスを図式的に示す。
【図２ｂ】ＡＲＰＥ−１９細胞にＡｄＬａｃＺ又はＡｄＣＣＮ５による処理を施し、次いで、ＴＧＦ−βで処理した場合に生じるＡＲＰＥ−１９細胞の形態変化を顕微鏡下において観察することによって得られた結果を示す。
【図２ｃ】ＡＲＰＥ−１９細胞にＡｄＬａｃＺ又はＡｄＣＣＮ５による処理を施し、次いで、ＴＧＦ−βで処理した場合に生じる、ＡＲＰＥ−１９細胞におけるＣＣＮ５、間葉マーカータンパク質、及び上皮マーカータンパク質の発現における変化を観察することによって得られた結果を示す。
【図２ｄ】ＡＲＰＥ−１９細胞にＡｄＬａｃＺ又はＡｄＣＣＮ５による処理を施し、次いで、ＴＧＦ−βで処理した場合に生じるＡＲＰＥ−１９細胞における間葉マーカータンパク質及び上皮マーカータンパク質の転写の発現における変化を、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応実験により特定することによって得られた結果を示す。
【図２ｅ】ＡＲＰＥ−１９細胞にＡｄＬａｃＺ又はＡｄＣＣＮ５による処理を施し、次いで、ＴＧＦ−βを用いて処理した場合に生じるＡＲＰＥ−１９細胞の免疫蛍光分析の画像を、抗ＺＯ−１抗体、抗α−ＳＭＡ抗体、及びファロイジンを使用して観察することによって得られた結果を示す。
【図２ｆ】ＡＲＰＥ−１９細胞にＡｄＬａｃＺ又はＡｄＣＣＮ５による処理を施し、次いで、ＴＧＦ−βを用いて処理した場合に生じるＡＲＰＥ−１９細胞の収縮性における変化を、コラーゲンゲル収縮アッセイにより観察することによって得られた結果を示す。
【図３】ＡＲＰＥ−１９細胞の線維性変形に対するＣＣＮ５の阻害効果を、ＴＧＦ−β受容体阻害剤であるＡ８３−０１の阻害効果と比較することによって得られた結果を示す。
【図４ａ】ＴＧＦ−βで処理したＡＲＰＥ−１９細胞の移動能力に対するＡｄＣＣＮ５の効果を特定することによって得られた結果を示す。
【図４ｂ】ＴＧＦ−βで処理したＡＲＰＥ−１９細胞におけるＲＰＥ６５及びＭｅｒＴＫの発現に対するＡｄＣＣＮ５の効果を特定することによって得られた結果を示す。
【図４ｃ】ＴＧＦ−βで処理したＡＲＰＥ−１９細胞の食作用に対するＡｄＣＣＮ５の効果を、ｐＨｒｏｄｏ  Ｒｅｄ  ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓを使用して特定することによって得られた結果を示す。
【図４ｄ】ＴＧＦ−βで処理したＡＲＰＥ−１９細胞の食作用に対するＡｄＣＣＮ５の効果を、ＴＡＭＲＡ標識アポトーシス性胸腺細胞を使用して測定することによって得られた結果を示す。
【図５】ＴＧＦ−β−ＳＭＡＤシグナル伝達経路に対するＡｄＣＣＮ５の効果を特定することによって得られた結果を示す。
【図６ａ】ＣＣＮ５が、ＴＧＦ−βによって誘発されたＡＲＰＥ−１９細胞の線維性変形を回復させることができるか否かを特定するための実験プロセスを図式的に示す。
【図６ｂ】ＡＲＰＥ−１９細胞の変形がＡｄＣＣＮ５によって回復することを顕微鏡下において観察することによって得られた結果を示す。
【図６ｃ】ＡＲＰＥ−１９細胞にＴＧＦ−βによる処理を施し、続いて、ＡｄＣＣＮ５による処理を施し、次いで、当該ＡＲＰＥ−１９細胞におけるＣＣＮ５、間葉マーカータンパク質、及び上皮マーカータンパク質の発現における変化を観察することによって得られた結果を示す。
【図６ｄ】ＡＲＰＥ−１９細胞にＴＧＦ−βによる処理を施し、続いて、ＡｄＣＣＮ５による処理を施し、次いで、抗ＺＯ−１抗体、抗α−ＳＭＡ抗体、及びファロイジンを使用して当該ＡＲＰＥ−１９細胞を観察することによって得られた結果を示す。
【図６ｅ】ＡＲＰＥ−１９細胞の収縮の正常化に対するＡｄＣＣＮ５の効果を、コラーゲンゲル収縮アッセイによって特定することによって得られた結果を示す。
【図７ａ】ＡＲＰＥ−１９細胞にＴＧＦ−βによる処理を施し、続いてＡｄＣＣＮ５による処理を施し、次いで、それらの移動能力が正常化されることを観察することによって得られた結果を示す。
【図７ｂ】ＡＲＰＥ−１９細胞にＴＧＦ−βによる処理を施し、続いてＡｄＣＣＮ５による処理を施し、次いで、当該ＡＲＰＥ−１９細胞におけるＲＰＥ６５及びＭｅｒＴＫの発現が回復されることを観察することによって得られた結果を示す。
【図７ｃ】ＡＲＰＥ−１９細胞にＴＧＦ−βによる処理を施し、次いで、ｐＨｒｏｄｏ  Ｒｅｄ  ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓを使用して当該ＡＲＰＥ−１９細胞の食作用に対するＡｄＣＣＮ５の効果を特定することによって得られた結果を示す。
【図７ｄ】ＡＲＰＥ−１９細胞にＴＧＦ−βによる処理を施し、次いで、ＴＡＭＲＡ標識アポトーシス性胸腺細胞を使用して、当該ＡＲＰＥ−１９細胞の食作用に対するＡｄＣＣＮ５の効果を測定することによって得られた結果を示す。
【図８ａ】ＴＧＦ−βで処理したＡＲＰＥ−１９細胞におけるＡ８３−０１の効果を特定するための実験プロセスを図式的に示す。
【図８ｂ】ＡＲＰＥ−１９細胞において、ＴＧＦ−βによって引き起こされたＣＣＮ５、ＣＣＮ２、間葉マーカータンパク質、及び上皮マーカータンパク質の発現における変化をＡ８３−０１が正常化しないことを観察することによって得られた結果を示す。
【図９ａ】Ｃｃｌ２−／−マウスにおけるＲＰＥ変形に対するＣＣＮ５の回復効果を測定するためのプロセスを図式的に示す。
【図９ｂ】ＣＣＮ５、ＲＰＥ６５、ＭｅｒＴＫ、間葉マーカータンパク質、及び上皮マーカータンパク質の発現における変化によって、Ｃｃｌ２−／−マウスのＲＰＥ細胞に対するＡＡＶ９−ＣＣＮ５の効果を特定することによって得られた結果を示す。
【図９ｃ】抗ＺＯ−１抗体、抗ＣＣＮ５抗体、抗ＲＰＥ６５抗体、又は抗α−ＳＭＡ抗体で染色することにより、Ｃｃｌ２−／−マウスのＲＰＥ細胞における密着結合の形成に対するＡＡＶ９−ＣＣＮ５の効果を特定することによって得られた結果を示す。
【図１０ａ】ＡＲＰＥ−１９細胞のＥＥＦ誘発線維性変形がＡｄＣＣＮ５によって予防することができるか否かを特定するためのプロセスを図式的に示す。
【図１０ｂ】ＥＥＦで処理したＡＲＰＥ−１９細胞における形態変化を、顕微鏡下において観察することによって得られた結果を示す。
【図１０ｃ】ＡｄＣＣＮ５処理したＡＲＰＥ−１９細胞にＥＥＦによる処理を施し、次いで、当該ＡＲＰＥ−１９細胞におけるＣＣＮ５、ＣＣＮ２、間葉マーカータンパク質、及び上皮マーカータンパク質の発現における変化を観察することによって得られた結果を示す。
【図１０ｄ】ＡｄＣＣＮ５で処理したＡＲＰＥ−１９細胞にＥＥＦによる処理を施し、次いで、抗ＺＯ−１抗体、抗α−ＳＭＡ抗体、及びファロイジンを使用して当該ＡＲＰＥ−１９細胞を観察することによって得られた結果を示す。
【図１１ａ】ＡＲＰＥ−１９細胞のベバシズマブ誘発線維性変形がＡｄＣＣＮ５によって予防されるか否かを特定するためのプロセスを図式的に示す。
【図１１ｂ】ベバシズマブで処理したＡＲＰＥ−１９細胞における形態変化を、顕微鏡下において観察することによって得られた結果を示す。
【図１１ｃ】ＡｄＣＣＮ５で処理したＡＲＰＥ−１９細胞にベバシズマブによる処理を施し、次いで、当該ＡＲＰＥ−１９細胞におけるＣＣＮ５、ＣＣＮ２、間葉マーカータンパク質、及び上皮マーカータンパク質の発現における変化を観察することによって得られた結果を示す。
【図１１ｄ】ＡｄＣＣＮ５で処理したＡＲＰＥ−１９細胞にベバシズマブによる処理を施し、次いで、抗ＺＯ−１抗体、抗α−ＳＭＡ抗体、及びファロイジンを使用して当該ＡＲＰＥ−１９細胞を観察することによって得られた結果を示す。
【図１２ａ】ＡＲＰＥ−１９細胞がＴＧＦ−βで処理され、次いでＣＣＮ５をコードする修飾されたｍＲＮＡで処理される場合に、ＡＲＰＥ−１９細胞のＴＧＦ−β誘発線維性変形がＣＣＮ５によって回復されるか否かを特定するためのプロセスを図式的に示す。
【図１２ｂ】ＴＧＦ−βで処理したＡＲＰＥ−１９細胞に、ＣＣＮ５をコードする修飾されたｍＲＮＡによる処理を施し、次いで、当該ＡＲＰＥ−１９細胞におけるＣＣＮ５、ＣＣＮ２、間葉マーカータンパク質、及び上皮マーカータンパク質の発現における変化を観察することによって得られた結果を示す。
【図１２ｃ】ＴＧＦ−βで処理したＡＲＰＥ−１９細胞に、ＣＣＮ５をコードする修飾されたｍＲＮＡによる処理を施し、次いで、抗ＺＯ−１抗体、抗α−ＳＭＡ抗体、及びファロイジンを使用して当該ＡＲＰＥ−１９細胞を観察することによって得られた結果を示す。
【図１３ａ】ＡＲＰＥ−１９細胞のＴＧＦ−β誘発線維性変形がＣＣＮ５タンパク質によって回復されるか否かを特定するためのプロセスを図式的に示す。
【図１３ｂ】ＴＧＦ−βで処理したＡＲＰＥ−１９細胞にＣＣＮ５タンパク質による処理を施し、次いで、当該ＡＲＰＥ−１９細胞におけるＣＣＮ５、ＣＣＮ２、間葉マーカータンパク質、及び上皮マーカータンパク質の発現を観察することによって得られた結果を示す。
【図１３ｃ】ＴＧＦ−βで処理したＡＲＰＥ−１９細胞にＣＣＮ５タンパク質による処理を施し、次いで、抗ＺＯ−１抗体、抗α−ＳＭＡ抗体、及びファロイジンを使用して当該ＡＲＰＥ−１９細胞を観察することによって得られた結果を示す。
【図１４ａ】ＡＲＰＥ−１９細胞が、抗ＶＥＧＦ薬（ベバシズマブ、ラニビズマブ、及びアフリベルセプト）とＣＣＮ５タンパク質とによる同時処理を施される場合に、当該ＡＲＰＥ−１９細胞の抗ＶＥＧＦ薬誘発線維性変形が当該ＣＣＮ５タンパク質によって阻害されるか否かを測定するためのプロセスを図式的に示す。
【図１４ｂ】ＡＲＰＥ−１９細胞に、抗ＶＥＧＦ薬（ベバシズマブ、ラニビズマブ、及びアフリベルセプト）とＣＣＮ５タンパク質とによる同時処理を施し、次いで、当該ＡＲＰＥ−１９細胞におけるＣＣＮ５、ＣＣＮ２、間葉マーカータンパク質、及び上皮マーカータンパク質の発現を観察することによって得られた結果を示す。
【図１４ｃ】ＡＲＰＥ−１９細胞に、抗ＶＥＧＦ薬（ベバシズマブ、ラニビズマブ、及びアフリベルセプト）とＣＣＮ５タンパク質とによる同時処理を施し、次いで、抗ＺＯ−１抗体、抗α−ＳＭＡ抗体、及びファロイジンを使用して当該ＡＲＰＥ−１９細胞を観察することによって得られた結果を示す。
【図１５ａ】ｉＰＳＣ由来ＲＰＥ細胞がＡＡＶ２−ＣＣＮ５で処理され、次いでＴＧＦ−βで処理される場合に、当該ＲＰＥ細胞のＴＧＦ−β誘発線維性変形がＣＣＮ５によって阻害されるか否かを特定するための実験プロセスを図式的に示す。
【図１５ｂ】ｉＰＳＣ由来ＲＰＥ細胞にＡＡＶ２−ＣＣＮ５による処理を施し、続いて、ＴＧＦ−βによる処理を施し、次いで、抗ＺＯ−１抗体、抗α−ＳＭＡ抗体、及びファロイジンを使用して当該ＲＰＥ細胞の画像を観察することによって得られた結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の態様において、有効成分としてＣＣＮ５又はその断片を含む、網膜疾患を予防又は治療するための医薬組成物が提供される。
【００１９】
本明細書において使用される場合、用語「ＣＣＮ５」は、血管病、血管新生、腫瘍形成、線維性疾患の誘発、及び細胞機能、例えば、細胞分化及び生存など、の調整において様々な役割を果たすＣＣＮファミリー（ＣＣＮ１〜６）に属する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）関連タンパク質を意味する。ＣＣＮ５タンパク質は、他のＣＣＮファミリーのタンパク質とは異なり、Ｃ末端ドメインを有さず、ＷＩＳＰ−２、ＨＩＣＰ、Ｃｏｐ１、ＣＴＧＦ−Ｌなどと呼ばれる。さらに、当該ＣＣＮ５タンパク質は、２５０のアミノ酸残基の単一のポリペプチド鎖からなる。
【００２０】
本発明の網膜疾患を予防又は治療するための医薬組成物は、網膜色素上皮細胞の線維性変形を予防又は治療することができる。当該線維性変形は、ＴＧＦ−β、ＥＧＴＡ、ＥＧＦ、ＦＧＦ−２、及び抗ＶＥＧＦ薬からなる群より選択されるいずれか１種によって誘発され得る。本発明の実施形態において、ＣＣＮ５が、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の変形のトリガーとして知られているＴＧＦ−βによって誘発されたＲＰＥ細胞の線維性変形を予防することが確認された。さらに、別の実施形態において、線維性変形を既に生じているＲＰＥ細胞を、ＣＣＮ５が正常な細胞へと回復させることが確認された。
【００２１】
本明細書において使用されるＣＣＮ５は、ヒト又は動物由来のＣＣＮ５であり得る。本発明の実施形態において、マウス又はヒト由来ＣＣＮ５が、ＲＰＥ細胞の線維性変形に対する阻害効果を有することが確認された。
【００２２】
当該マウス由来ＣＣＮ５は、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり得る。さらに、当該マウス由来ＣＣＮ５をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２のヌクレオチド配列を含み得る。さらに、本発明において、当該マウス由来ＣＣＮ５は、成熟型であり得る。詳細には、当該マウス由来ＣＣＮ５は、配列番号１のアミノ酸配列からシグナルペプチドに対応する位置１〜２３のアミノ酸を除外することによって得られる、位置２４〜２５１のアミノ酸配列（配列番号３）であり得る。
【００２３】
当該ヒト由来ＣＣＮ５は、配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり得る。さらに、当該ヒト由来ＣＣＮ５をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５のヌクレオチド配列を含み得る。さらに、本発明において、当該ヒト由来ＣＣＮ５は、成熟型であり得る。詳細には、当該ヒト由来ＣＣＮ５は、配列番号４のアミノ酸配列から、シグナルペプチドに対応する位置１〜２３のアミノ酸を除外することによって得られる、位置２４〜２５０のアミノ酸配列（配列番号６）であり得る。
【００２４】
本明細書において使用される場合、用語「網膜疾患」は、網膜色素上皮細胞の変形又はその機能を失うことによって引き起こされた疾患を意味する。詳細には、当該網膜疾患は、増殖性硝子体網膜症、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、脈絡膜血管新生、及び網膜浮腫からなる群より選択されるいずれか１つの疾患であり得る。ここで、当該網膜色素上皮（ＲＰＥ）は、神経網膜と脈絡膜との間に位置され、並びに網膜機能を維持する上で重要な役割を果たす、立方体状の、極性がある単層である。
【００２５】
増殖性硝子体網膜症は、糖尿病性網膜症の増悪の場合、又は網膜剥離手術において裂け目が完全に閉じられていない場合に、線維性細胞が、網膜表面上又は硝子体において増殖して、膜及び膜収縮を形成し、それにより網膜剥離が引き起こされる、疾患である。網膜剥離が生じると、網膜色素上皮細胞が放出され、線維性細胞へと形質転換され；当該線維性細胞が、膠細胞と組み合わされ、それが、網膜表面において増殖して、薄膜又は牽引帯（ｔｒａｃｔｉｏｎ  ｂａｎｄ）を形成する。この膜又は牽引帯が収縮すると、網膜全体が縮まるので、固定された皺が形成される。ここで、重症の場合、視神経乳頭を除いて網膜全体がファンネル形状になって剥離し得る。
【００２６】
糖尿病性網膜症は、糖尿病によって引き起こされた末梢循環障害により、眼の網膜に生じる併発症である。当該疾患は、最初は症状がなく、黄斑部へのその浸潤が生じるに従って視力低下の症状を示し得る。糖尿病性網膜症は、進行期に応じて、単純網膜症、増殖前網膜症（ｐｒｅ−ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、及び増殖網膜症に分けられ得る。
【００２７】
黄斑変性症は、年を取るに従って黄斑機能が低下し、そのため、視力が低下するか又は失われる疾患である。この疾患により、視力が低下し始めた場合、以前の視力への回復を達成することはできない。当該疾患は、加齢黄斑変性症と呼ばれ、高齢における視力喪失の主な原因である。黄斑変性症は、２つのタイプ：乾性黄斑変性症及び湿性黄斑変性症、に分けられる。黄斑変性症を患う患者の約９０％は、乾性黄斑変性症を有し、この乾性黄斑変性症は、加齢による沈着物が網膜の下に蓄積するか、又は病斑、例えば、網膜色素上皮萎縮などを発症した場合に生じる。黄斑における視細胞が、ゆっくりと破壊されるため、黄斑機能は低下し、中心視覚は時間が経つにつれて低下する。湿性黄斑変性症の場合、症状は、黄斑部のより下の層を構築する脈絡膜における多くの新生血管の異常形成により生じる。湿性黄斑変性症は、乾性黄斑変性症より速く進行し、急激な視力低下につながり得、２か月から３年以内に失明に至り得る。
【００２８】
脈絡膜血管新生は、異常な血管の形成によって脈絡膜が損傷し、それにより、視力障害が生じる疾患である。脈絡膜血管新生は、世界的な不可逆の視力喪失の主な原因の１つである。脈絡膜血管新生の場合、様々な治療の試みにもかかわらず、ほとんどの患者において視力の予後は好ましくない。
【００２９】
網膜浮腫は、網膜が膨潤することを意味する。様々な理由から、網膜又は黄斑における毛細血管などの細い血管において、変性又は異常が生じたとき、出血が生じ得、結果として、網膜浮腫を生じ得る。浮腫が網膜に生じた場合、視力低下などの様々な症状が生じ得る。
【００３０】
有効成分としてＣＣＮ５を含む、網膜疾患を予防又は治療するための当該医薬組成物において、有効成分としてのＣＣＮ５タンパク質は、当該医薬組成物の総重量に対して１０〜９５重量％において含有され得る。本発明の医薬組成物は、有効成分に加えて、さらに、同じ又は同様の機能を示す１種又は複数種の有効成分も含んでもよい。本発明による医薬組成物は、上記において説明した有効成分に加えて、さらに、投与のために、１種又は複数種の薬学的に許容できる担体も含んでもよい。
【００３１】
本発明の別の態様において、有効成分として、ＣＣＮ５をコードするポリヌクレオチドを含む、網膜疾患を予防又は治療するための医薬組成物が提供される。
【００３２】
当該ポリヌクレオチドは、ＣＣＮ５をコードするｍＲＮＡであり得る。ＣＣＮ５をコードする当該ｍＲＮＡは、ＣＣＮ５をコードするポリヌクレオチドである配列番号２又は配列番号５に対して相補的な配列であり得る。本発明の実施形態において、ＣＣＮ５をコードする修飾されたｍＲＮＡは、ＲＰＥ細胞を変形させるトリガーとして知られるＴＧＦ−β又はＥＥＦ（ＥＧＴＡ、ＥＧＦ、及びＦＧＦ−２）によって誘発されたＲＰＥ細胞の線維性変形を、正常な細胞のレベルへと回復させることが確認された。修飾されたｍＲＮＡは、様々な形態において修飾されたｍＲＮＡを意味する。そのような修飾としては、ｍＲＮＡの５’末端のキャッピング、ｍＲＮＡの３’末端へのポリＡテールの結合（ポリアデニル化）、並びに修飾されたヌクレオチド、例えば、５−メチルシチジン及び２−チオウリジンなど、の追加が挙げられる。
【００３３】
本発明のさらなる別の態様において、有効成分として、ＣＣＮ５をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えウイルスを含む、網膜疾患を予防又は治療するための医薬組成物が提供される。
【００３４】
当該ポリヌクレオチドは、ＣＣＮ５を表す配列番号１又は配列番号４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であり得、及び当該ヌクレオチド配列は、配列番号２又は配列番号５であり得る。さらに、当該ポリヌクレオチドは、ＣＣＮ５が発現されるように当該ポリヌクレオチドに作動的に連結されたプロモータを含み得る。
【００３５】
本明細書において使用される場合、用語「作動的に連結される」は、ヌクレオチド発現調節配列（例えば、プロモータ、シグナル配列、又は多くの転写因子結合部位）と、別のヌクレオチド配列との間の機能的結合を意味する。当該調節配列は、他の核酸配列の転写及び／又は翻訳を調整し得る。
【００３６】
詳細には、ＣＣＮ５をコードするポリヌクレオチドに結合したプロモータは、ＣＣＮ５タンパク質遺伝子の転写を調整するように、好ましくは動物細胞において、より好ましくは哺乳動物細胞において、機能し得る。当該プロモータは、哺乳動物ウイルス由来のプロモータ及び哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモータを含む。
【００３７】
当該プロモータは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、アデノウイルス後期プロモータ、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモータ、ＳＶ４０プロモータ、ＨＳＶ  ｔｋプロモータ、ＲＳＶプロモータ、ＥＦ１αプロモータ、メタロチオネインプロモータ、β−アクチンプロモータ、ヒトＩＬ−２遺伝子プロモータ、ヒトＩＦＮ遺伝子プロモータ、ヒトＩＬ−４遺伝子プロモータ、ヒトリンホトキシン遺伝子プロモータ、及びヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子プロモータからなる群より選択されるいずれか１種のプロモータであり得る。しかしながら、当該プロモータは、それらに限定されるわけではない。詳細には、当該プロモータは、ＣＭＶプロモータであり得る。
【００３８】
当該ウイルスは、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスシンプレックスウイルス、及びワクシニアウイルスからなる群より選択されるいずれか１種のウイルスであり得る。当該アデノ関連ウイルスは、特定のセロタイプに限定されるわけではなく、好ましくは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９のうちのいずれか１種であり得る。
【００３９】
アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）は、非分裂細胞に感染することができるため、及び様々なタイプの細胞に感染する能力を有するために、本発明の遺伝子デリバリーシステムとして好適である。ＡＡＶベクターの構築及び使用についての詳細は、米国特許第５，１３９，９４１号及び同第４，７９７，３６８号において詳細に開示されている。
【００４０】
典型的には、ＡＡＶウイルスは、２つのＡＡＶ末端反復が両側に位置された関心対象の遺伝子配列を含むプラスミドと、末端反復を持たない野生型ＡＡＶコード配列を含む発現プラスミドとの同時形質移入によって作製され得る。
【００４１】
当該網膜疾患は、上記において説明される通りであり、並びに、増殖性硝子体網膜症、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、脈絡膜血管新生、及び網膜浮腫からなる群より選択されるいずれか１つの疾患であり得る。
【００４２】
さらに、有効成分として、ＣＣＮ５をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えウイルスを含む、網膜疾患を予防又は治療するための当該医薬組成物の用量は、疾患のタイプ、疾患の重篤度、当該医薬組成物中に含有される有効成分及び他の成分のタイプ及び量、製剤のタイプ、並びに患者の年齢、体重、全般的な健康状態、性別、及び食事、投与の時間、投与経路、治療の継続期間、並びに同時に使用される薬を含む、様々な要因に応じて変わり得る。
【００４３】
本発明のさらなる別の態様において、本発明による、網膜疾患を予防又は治療するための医薬組成物を個体に投与するステップを含む、網膜疾患を予防又は治療する方法であって、当該医薬組成物が、有効成分として、ＣＣＮ５又はその断片、ＣＣＮ５をコードするポリヌクレオチド、又はＣＣＮ５をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えウイルスを含む、方法が提供される。
【００４４】
有効成分として、ＣＣＮ５又はその断片、ＣＣＮ５をコードするポリヌクレオチド、又はＣＣＮ５をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えウイルスを含む、本発明による医薬組成物の用量は、疾患のタイプ、疾患の重篤度、当該医薬組成物中に含有される有効成分及び他の成分のタイプ及び量、製剤のタイプ、並びに患者の年齢、体重、全般的な健康状態、性別、投与の時間、投与経路、治療の継続期間、並びに同時に使用される薬を含む、様々な要因に応じて変わり得る。
【００４５】
しかしながら、有効成分としてＣＣＮ５を含む、網膜疾患を予防又は治療するための、本発明による医薬組成物において、ＣＣＮ５タンパク質は、当該医薬組成物が所望の効果を示すように、０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇの有効量において含有され得る。ここで、当該投与は、１日に１回又は複数回実施され得る。
【００４６】
さらに、本発明による医薬組成物中に含まれる組換えウイルスは、成人ベースにおいて１日あたり１．０×１０５〜１．０×１０１５ウイルスゲノムの量において投与され得る。詳細には、本発明の医薬組成物の用量において、当該ウイルスは、成人ベースにおいて１日あたり１．０×１０５〜１．０×１０１５、１．０×１０７〜１．０×１０１３、１．０×１０８〜１．０×１０１２、又は１．０×１０９〜１．０×１０１０の量において投与され得る。
【００４７】
さらに、本発明の医薬組成物は、それを必要とする個体に対して、当技術分野において既知の様々な方法によって投与され得る。当該個体は、哺乳動物、詳細にはヒトであり得る。投与経路は、投与方法、体液量、粘度などを考慮して、当業者によって適切に選択され得る。詳細には、当該投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、胸骨内、経皮、鼻腔内、吸入、局所的、経直腸、経口、眼内、硝子体内、及び皮内経路からなる群より選択されるいずれか１つの経路によって実施され得る。本発明の実施形態において、ＣＣＮ５をコードするウイルスを、硝子体内において投与した。
【００４８】
本発明のさらなる別の態様において、有効成分としてＣＣＮ５又はその断片と；抗ＶＥＧＦ薬とを含む、網膜疾患を予防又は治療するための医薬組成物が提供される。
【００４９】
本明細書において使用される場合、用語「抗ＶＥＧＦ薬」は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を阻害するために使用される薬を意味し、並びに、特定の癌又は加齢黄斑変性症を治療するために使用され得る。詳細には、当該抗ＶＥＦＧ薬は、ベバシズマブ、ラニビズマブ、又はアフリベルセプトであり得る。
【００５０】
アバスチンのブランド名において販売されているベバシズマブは、いくつかのタイプの癌及び特定の眼疾患を治療するために使用される薬である。癌に対しては、ベバシズマブは、静脈内へのゆっくりとした注入によって投与され、結直腸癌、肺癌、膠芽腫、腎細胞癌などに対して使用される。さらに、黄斑変性症に対しては、ベバシズマブは、眼への直接注射によって投与される。ベバシズマブが癌に対して使用される場合、一般的なその副作用としては、鼻出血、頭痛、高血圧、皮疹などが挙げられる。他のその重症副作用としては、消化管穿孔、出血、アレルギー反応、血餅、及び伝染病の増加したリスクが挙げられる。ベバシズマブが眼疾患に対して使用される場合、その副作用としては、視力喪失及び網膜剥離が挙げられる。ベバシズマブは、血管形成阻害因子であり、モノクローナル抗体系薬物に属する。ベバシズマブは、新生血管の成長を遅くすることによって機能する。
【００５１】
ルセンティスのブランド名において販売されているラニビズマブは、ベバシズマブと同じ親マウス抗体から作製されたモノクローナル抗体断片（Ｆａｂ）である。湿性加齢黄斑変性症を治療するために承認されている抗血管形成薬であるラニビズマブは、有効性、及び副作用の比率においてベバシズマブと同様である。
【００５２】
アイリーアのブランド名において販売されているアフリベルセプトは、湿性黄斑変性症を治療するために米国及びヨーロッパにおいて承認された薬である。
【００５３】
本発明のさらなる別の態様において、有効成分として、ＣＣＮ５をコードするポリヌクレオチド、又はＣＣＮ５をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えウイルスと；抗ＶＥＧＦ薬とを含む、網膜疾患を予防又は治療するための医薬組成物が提供される。
【００５４】
さらに、本発明により、有効成分として、ＣＣＮ５をコードするポリヌクレオチド、又はＣＣＮ５をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えウイルスと；抗ＶＥＧＦ薬とを含む、網膜疾患を予防又は治療するためのキットが提供される。
【００５５】
ここで、ＣＣＮ５をコードするポリヌクレオチド、ＣＣＮ５をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えウイルス、及び抗ＶＥＧＦ薬は、上記において説明される通りである。
【００５６】
本発明のさらなる別の態様において、有効成分として、ＣＣＮ５をコードするポリヌクレオチドを導入された細胞を含む、網膜疾患を予防又は治療するための組成物が提供される。
【００５７】
当該細胞は、ＣＣＮ５をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入された細胞であり得る。詳細には、当該ＣＣＮ５は、ヒト由来ＣＣＮ５であり得る。
【００５８】
さらに、当該細胞は、幹細胞又は網膜色素上皮細胞であり得る。当該幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）又は成体幹細胞であり得る。詳細には、当該成体幹細胞は、間葉幹細胞（ＭＳＣ）、多能性幹細胞、又は羊膜上皮細胞であり得る。さらに、当該間葉幹細胞は、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜、及び胎盤からなる群より選択されるいずれか１つに由来し得る。
【００５９】
本発明の実施形態において、ＴＧＦ−βによって誘発された線維性変形を有する、ヒト人工多能性幹細胞由来ＲＰＥ細胞におけるＣＣＮ５の効果を確認する実験を実施した。上記の実験の結果、ＴＧＦ−βによって誘発されたｉＰＳＣ由来ＲＰＥ細胞の線維性変形がＣＣＮ５によって予防されたことが確認された。
【００６０】
したがって、本発明により、有効成分として、ＲＰＥ細胞の線維性変形を予防又は治療するために、ＣＣＮ５をコードするポリヌクレオチドを導入された細胞を含む、網膜疾患を予防又は治療するための組成物が提供され得る。さらに、本発明により、ＣＣＮ５をコードするポリヌクレオチドが導入された細胞を含有する細胞治療薬が提供され得る。
【００６１】
本発明において、「細胞治療薬」は、細胞及び組織の機能を回復させるために、一連の作用、例えば、エキソビボ増殖の実施並びに自家性、同種、又は異種の生細胞のスクリーニング、若しくはその他として細胞の生物学的特性の変更などを通じて得られる、治療、診断、及び予防の目的で使用される医薬製品を意味する。
【００６２】
当該細胞治療薬は、使用された細胞の分化のタイプ及び程度に応じて、体細胞治療薬及び幹細胞治療薬に分類され得る。幹細胞治療薬は、胚性幹細胞治療薬及び成体幹細胞治療薬に分類され得る。
【実施例】
【００６３】
本発明は、以下において、実施例により詳細に説明される。しかしながら、以下の実施例は、本発明を単に説明するものであり、本発明は、それらに限定されない。
【００６４】
Ｉ．実験用調製物及び実験方法
実施例１．動物モデル
Ｃ５７ＢＬ／６野生型（ＷＴ）マウス（Ｄａｍｕｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、韓国）を用いてＣｃｌ２−／−マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）を１０回戻し交配することによって、モデルマウスを作製した。１８月齢のＣｃｌ２−／−マウスにＡＡＶ９−ＶＬＰ又はＡＡＶ９−ＣＣＮ５を注射した。全ての動物実験の方法及びプロトコルは、光州科学技術院（Ｇｗａｎｇｊｕ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、生命科学研究科の動物実験委員会（ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）によって承認され、承認されたガイドライン（ＩＡＣＵＣ  ＧＩＳＴ−２０１５−２４）に従って、そこの施設において実施した。ここで、ＶＬＰは、ウイルス様粒子を意味する。
【００６５】
受け入れたＡＡＶ９−ＶＬＰを有する月齢が一致するＷＴマウスをコントロールとして使用した。当該マウスを、３：１の比のＺｏｌｅｔｉｌ  ５０（Ｖｉｒｂａｃ、フランス）及びＲｏｍｐｕｎ（Ｂａｙｅｒ  Ｋｏｒｅａ、韓国）の腹腔内注射によって麻酔した。外科処置後、有害事象が生じないか確認するために、当該マウスを１日おきにモニタリングした。モニタリングの結果、有害な臨床症状は、他の器官において認められなかった。１２週間後、当該マウスをＣＯ２で安楽死させ、眼を摘出した。
【００６６】
実施例２．試薬
組換えＴＧＦ−β２をＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  Ｋｏｒｅａ（韓国）から購入した。ＡＲＰＥ−１９細胞を１０ｎｇ／ｍｌの当該組換えＴＧＦ−β２で処理した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（米国）から組換えＥＧＦ及びＦＧＦ−２を購入した。ＡＲＰＥ−１９細胞を１ｍＭのＥＧＴＡ、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、及び２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２で処理した。さらに、ＡＲＰＥ−１９細胞を、３種の抗ＶＥＧＦ薬であるベバシズマブ（０．２５ｍｇ／ｍｌ、Ｇｅｎｅｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ、米国）、ラニビズマブ（０．１２５ｍｇ／ｍｌ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａ  Ｓｔｅｉｎ  ＡＧ、スイス）、及びアフリベルセプト（０．５ｍｇ／ｍｌ、Ｂａｙｅｒ  Ｐｈａｒｍａ  ＡＧ、ドイツ）で処理した。
【００６７】
実施例３．アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター及びアデノウイルスの作製
作製及び精製のために、ＣＭＶプロモータを使用してヒトＣＣＮ５遺伝子を発現するＡＡＶ（セロタイプ２及び９）を、米国企業Ｖｉｒｏｖｅｋ  Ｉｎｃ．に要求することによって獲得した。そのようにして、ＡＡＶ２−ＣＣＮ５及びＡＡＶ９−ＣＣＮ５を得た。さらに、アミノ末端ヘマグルチニン（ＨＡ）をタグ付けしたマウスＣＣＮ５を発現する組換アデノウイルスを作製及び精製する方法は、以前の研究（Ｙｏｏｎ  ＰＯら  「Ｔｈｅ  ｏｐｐｏｓｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＣＣＮ２  ａｎｄ  ＣＣＮ５  ｏｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ  ａｎｄ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ」，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．  ２０１０；  ４９（２）：  ２９４〜３０３）に記載されている。この方法において、それぞれＬａｃＺ及びＣＣＮ５をコードする遺伝子を含有するアデノウイルスであるＡｄＬａｃＺ及びＡｄＣＣＮ５を作製した。
【００６８】
実施例４．ＣＣＮ５をコードする修飾されたｍＲＮＡの作製
作製及び精製のために、米国企業ＴｒｉＬｉｎｋ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに要求することによって、ＣＣＮ５をコードする修飾されたｍＲＮＡを獲得した。この修飾されたｍＲＮＡを５’末端においてＣｌｅａｎＣａｐでキャッピングし、ポリＡテールを３’末端に結合させた。さらに、この修飾されたｍＲＮＡは、５−メチルシチジン及び２−チオウリジンを含有する。
【００６９】
実施例５．細胞培養
網膜色素上皮細胞株（ＡＲＰＥ−１９；  ＡＴＣＣ、米国）を、１％の抗生物質（Ｇｉｂｃｏ、米国）と１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ；  ＨｙＣｌｏｎｅ、米国）とを含有した、ダルベッコ改変イーグル培地及びハムＦ１２  栄養混合物培地（Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ／Ｆ１２；  Ｗｅｌｇｅｎｅ、韓国）を使用して、５％のＣＯ２インキュベータにおいて３７℃で培養した。当該培地を、１日おきに新鮮な培地と交換した。当該細胞が、培養プレートにおいてある程度まで培養されたとき、これらの細胞を、０．２５％のトリプシン／０．０２％のＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、米国）を使用して、継代培養した。
【００７０】
ヒトｉＰＳＣ由来網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を、Ａｘｏｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（米国）から入手した。当該細胞を、７：３の比で２％のＢ−２７補足物質（Ｇｉｂｃｏ，米国）と１％の抗生物質の抗かび薬（Ｇｉｂｃｏ、米国）とを含有した、ダルベッコ改変イーグル培地及びハムＦ１２栄養混合物培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２；Ｇｉｂｃｏ、米国）を使用して、５％のＣＯ２インキュベータにおいて３７℃で培養した。当該細胞を、マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、米国）で予めコーティングした８ウェルチャンバースライド（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、米国）に、１ウェルあたり１００，０００細胞において播種し、当該培地を毎日新鮮な培地と交換した。
【００７１】
培養した細胞を、以下の２つのグループに分け、薬物処理を施した：一方は、間葉細胞への網膜色素上皮細胞の分化誘導が抑圧されたグループ；及び、もう一方は、間葉細胞への分化を誘導された網膜色素上皮細胞を、正常な網膜色素上皮細胞へと戻したグループ。当該ＡＲＰＥ−１９細胞を無血清培地において２４時間増殖させた。次いで、当該細胞を、５０感染多重度（ＭＯＩ）においてＡｄＣＣＮ５で処理し、続いて、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  Ｋｏｒｅａ、韓国）によって処理するか、又はＴＧＦ−β２で処理し、その後にＡｄＣＣＮ５で処理した。
【００７２】
実施例６．ウェスタンブロット法
インビトロ実験のために、当該培養したＡＲＰＥ−１９細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、冷ＲＩＰＡ緩衝液（１％のＮＰ−４０、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ［ｐＨ７．４］、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び１０ｍＭのＮａＦ）とプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ、ドイツ）とによる混合溶液に懸濁させた。当該細胞懸濁液に、超音波発生器による処理を、２秒オン／１秒オフのサイクルで５％の振幅において５分間施した。
【００７３】
インビボ実験のために、眼をＣｃｌ２−／−マウスから摘出した。網膜／脈絡膜／強膜複合体のみを各眼から取り出し、冷ＲＩＰＡ緩衝液に入れた。当該複合体に、超音波発生器による処理を、１／８インチマイクロチップを使用して、２秒オン／２秒オフのオン−オフサイクルで、５％の振幅で１０秒間施した。当該細胞溶解物を、１３，０００ｒｐｍで２０分間、遠心分離処理した。タンパク質が溶解している上澄みを採取し、その中のタンパク質濃度を、ビシンコニン酸タンパク質アッセイキット（ＢＣＡ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を使用して測定した。同量のタンパク質試料を、５×ＳＤＳ緩衝液と混合し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけた。次いで、当該タンパク質を、二フッ化ポリビニリデン膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）に移した。当該膜を、５％のスキムミルクを含有するトリス緩衝液において１時間ブロックし、次いで、一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。次いで、当該膜を、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）でコンジュゲートした二次抗体と共にインキュベートし、化学ルミネセンス基質（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で処理し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＬＡＳ  ４，０００Ｍｉｎｉ画像表示装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって現像した。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を使用して、タンパク質定量分析を実施した。
【００７４】
実施例７．免疫蛍光染色
各ウェルがカバーガラスを備える１２ウェル培養プレートに播種して増殖させた細胞を、４％のホルムアルデヒドで固定し、０．２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で１０分間処理した。当該細胞を、ＰＢＳ中における５％ウシ血清アルブミンの希釈溶液でブロックし、抗ＺＯ−１及び抗α−ＳＭＡ抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。二次抗体に対して、当該細胞を、ＦＩＴＣコンジュゲート二次抗体又はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４コンジュゲート二次抗体を用いて、ｆ−アクチン染色に対してはテキサスレッドコンジュゲートファロイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を用いて、及び核染色に対してはＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を用いて、室温で１時間インキュベートした。当該結果を、落射蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）を使用して観察した。網膜フラットマウント実験のために、当該眼をマウスから摘出し、各眼を４％のホルムアルデヒドで２４時間固定した。ＲＰＥ／脈絡膜／強膜複合体を、半透過性溶液及びブロッキング溶液を含有する溶液で、それぞれ２時間及び１時間、室温において処理し、次いで、一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。当該複合体をＰＢＳで洗浄し、二次抗体と共に室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳによる洗浄を実施し、ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）によって核染色を実施した。当該ＲＰＥ／脈絡膜／強膜複合体を、再びＰＢＳで洗浄し、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）によってマウントした。観察は、蛍光顕微鏡下で実施した。
【００７５】
一方、本発明において使用した一次抗体についての情報を下記の表１に示す。
【表１】
2021523205.tif 000003
【００７６】
実施例８．ＲＮＡ抽出及び定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応
トリゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）試薬を使用してＲＮＡを抽出し、逆転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を使用してｃＤＮＡを合成し、ＳＹＢＲグリーン（ＴＡＫＡＲＡ、日本）を使用してリアルタイプポリメラーゼ連鎖反応を実施した。ＲＮＡのレベルを、増幅反応曲線を分析することによって分析し、この分析は、トリプリケート又はクワドルプリケートにおいて実施した。遺伝子の相対発現レベルを、１８代ｒＲＮＡへの正常化によって定量化した。
【００７７】
実施例９．コラーゲンゲル収縮アッセイ
以前に説明されるように、コラーゲンゲル収縮アッセイを実施した（Ｌｉｕ  Ｙら  「Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｌａｔａｎｏｐｒｏｓｔ  ｏｆ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｇｅｌ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｔｅｎｏｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ：  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」，  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  ｖｉｓｕａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２００８；  ４９（４）：  １４２９〜３６）。詳細には、培養したＡＲＰＥ−１９細胞を、１．２ｍｇ／ｍｌのコラーゲン溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）と混合し、１ＮのＮａＯＨを加えて当該コラーゲン溶液のｐＨを中性化した。コラーゲンゲル懸濁液（１×１０５細胞／ウェル、５００μＬ）を２４ウェル培養プレートに加え、３７℃で１時間、重合させた。コラーゲンゲルが形成されると、当該ゲルが培地に懸濁されるように、その端部をピペットチップで除去した。次いで、様々な試薬の処理を実施し、コラーゲンゲル収縮の程度を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して測定及び分析した。
【００７８】
実施例１０．細胞移動能力のインビトロ分析
細胞移動能力を測定するために、ＡＲＰＥ−１９細胞を１２ウェル培養プレート上に位置させ、各ウェルはカバーガラスを備え、培養された細胞がカバーガラスの全領域を覆うまで当該細胞を培養した。試薬による処理を実験設計に従って実施し、次いで、当該細胞を２００μＬチップを使用して引っ掻いた。２４時間後、当該細胞をＤＡＰＩで染色し、蛍光顕微鏡下において観察した。その後、細胞移動距離をＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して測定した。
【００７９】
実施例１１．食作用アッセイ
ＡＲＰＥ−１９細胞を、１ウェルあたり５×１０４細胞の密度において２４ウェル培養プレートに播種し、ＡｄＬａｃＺ又はＡｄＣＣＮ５及びＴＧＦ−βによって処理した。食細胞活性に対するＴＡＭＲＡ標識アポトーシス胸腺細胞又は１ｍｇ／ｍｌのｐＨｒｏｄｏ  Ｒｅｄ  ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）による処理の効果を観察するために、それらの処理を、５％ＣＯ２インキュベータにおいて、３７℃でそれぞれ６時間及び４時間実施した。
【００８０】
ＴＡＭＲＡ標識アポトーシス胸腺細胞を作製するために、５〜６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスから胸腺を採取し、単一の胸腺細胞を分離するために、５ｍｌの注射器ピストン及び細胞ストレーナを使用して解離させた。当該胸腺細胞を、５０μＭのＴＡＭＲＡ−ＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を用いて、細胞インキュベータにおいて３７℃で３０分間染色した。その後、当該胸腺細胞を、１０％のウシ胎仔血清及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミンを含有するＲＰＭＩにおいて、３７℃の条件下で２０分間インキュベートすることによって脱染色し、完全ＲＰＭＩ（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＲＰＭＩ）によって１回洗浄した。ＣＯ２細胞インキュベータにおいて５０μＭのデキサメタゾン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ドイツ）を用いて３７℃で４時間処理することによって、当該胸腺細胞のアポトーシスを誘発させた。その後、当該細胞を完全ＲＰＭＩで３回洗浄し、２×１０５のアポトーシス胸腺細胞を３００μｌの食細胞培養培地に再懸濁させた。
【００８１】
当該アポトーシス胸腺細胞懸濁液を、ＡＲＰＥ−１９細胞と共に細胞インキュベータにおいてインキュベートした。その後、当該食細胞を冷ＰＢＳで５回洗浄し、トリプシン処理し、完全培養培地に懸濁させた。次いで、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）  ＩＩフローサイトメータ（ＢＤ、米国）を使用して分析を実施した。
【００８２】
そのようなＡＲＰＥ−１９細胞を、前方散乱／側方散乱プロットに従ってゲートすることにより、食作用を実施したＡＲＰＥ−１９細胞と、そうでないＡＲＰＥ−１９細胞とを区別した。ゲーティングのためにマーカーＭ１を使用し、次いで、１試料あたり２０，０００個の生細胞からの蛍光ポジティブ事象の割合を計算した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して、データを分析した。
【００８３】
実施例１２．ＡＡＶ９−ＣＣＮ５及びＡＡＶ９−ＶＬＰの硝子体内注射
ＡＡＶ９−ＣＣＮ５を、手術用顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌｔｄ．、ドイツ）の下、３３Ｇ針を使用して硝子体内に注射した。もう一方の眼は、ＡＡＶ９−ＶＬＰコントロールとして機能した。
【００８４】
実施例１３．統計分析
定量的遺伝子発現分析を３回以上繰り返した。実験結果は、平均±標準偏差の形で表現され、スチューデントｔ検定を使用して、統計分析を実施した。統計的有意性は、アスタリスクで示される（＊、ｐ＜０．０５、又は＊＊、ｐ＜０．０１）。
【００８５】
ＩＩ．ＡＲＰＥ−１９細胞におけるＣＣＮ５の効果の特定
実験的実施例１．ＡＲＰＥ細胞の線維性変形に対するＣＣＮ５の阻害効果の特定
ＡＲＰＥ−１９は、ヒトＲＰＥから分化するように自然に誘導された細胞株である。成熟ＡＲＰＥ−１９細胞は、丸石様単層を形成し、上皮細胞に対して特異的なマーカータンパク質を発現する。培養されたＡＲＰＥ−１９細胞を、５ｎｇ／ｍｌ又は１０ｎｇ／ｍｌにおいて２日間、ＴＧＦ−βによって処理した（図１ａ）。結果を図１ｂから１ｄに示す。
【００８６】
図１ｂに示されるように、ＴＧＦ−βによる処理の後、当該ＡＲＰＥ−１９細胞は、線維芽細胞様形態を獲得した。特に、図１ｃに示されるように、ＴＧＦ−βによる処理は、ヒト由来ＣＣＮ５タンパク質の発現レベルを著しく低下させることが特定された。並行して、間葉マーカータンパク質、α−ＳＭＡ、ビメンチン、フィブロネクチン、及びＩ型コラーゲンの発現は増加され、その一方で、上皮マーカータンパク質、ＺＯ−１、及びオクルジンの発現は、著しく低下した。さらに、免疫蛍光染色により、ＴＧＦ−βによって処理した場合、α−ＳＭＡ及びｆ−アクチンの発現が増加され、密着結合の形成は阻害されることが特定された（図１ｄ）。これらの結果から、ＴＧＦ−βによる処理は、ＡＲＰＥ−１９細胞の線維性変形を誘発することが見出された。したがって、後続の実験において、当該ＡＲＰＥ−１９細胞を１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−βで４８時間処理して、線維性変形を誘発させた。
【００８７】
当該ＡＲＰＥ−１９細胞に、マウス由来ＣＣＮ５又はコントロールとしてのＡｄＬａｃＺを発現する組換えアデノウイルス（ＡｄＣＣＮ５）を感染させた。感染の２日後、当該細胞をＴＧＦ−βで処理した（図２ａ）。結果を図２ｂ〜２ｄに示す。
【００８８】
図２ｂに示されるように、ＡｄＣＣＮ５は、ＴＧＦ−βによって誘発される形態変化を著しく阻害した。さらに、図２ｃに示されるように、ウェスタンブロット法は、ＡｄＣＣＮ５が、ＴＧＦ−βによって誘発された、間葉マーカータンパク質及び上皮マーカータンパク質の発現における変化を正常化することを示した。これらの変化は、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応実験によっても特定された（図２ｄ）。さらに、ＺＯ−１に対する免疫蛍光染色により、密着結合がＴＧＦ−βによって破壊される現象が、マウス由来ＡｄＣＣＮ５によって阻害されることが見出された；並びにＴＧＦ−βによって誘発された、α−ＳＭＡの発現の増加及びｆ−アクチンの形成が、ＡｄＣＣＮ５によって阻害されることが特定された。
【００８９】
一方、α−ＳＭＡの発現の増加による収縮能力の増加は、上皮細胞の線維性変形における顕著な特徴であった。コラーゲンゲル収縮アッセイは、ＴＧＦ−βによって引き起こされた細胞収縮性の増加が、マウス由来ＡｄＣＣＮ５によって著しく減少することを示した。これらの結果を図２ｆに示す。
【００９０】
Ａ８３−０１は、ＡＬＫ５阻害剤に対して構造的類似性を有する、ＴＧＦ−β受容体の阻害剤である。ヒト由来ＣＣＮ５が、ＴＧＦ−βによって誘発されたＡＲＰＥ−１９細胞の線維性変形をＡ８３−０１と同じレベルまで阻害することが、ウェスタンブロット法によって認められた（図３）。
【００９１】
上記の結果から、ＣＣＮ５が、ＴＧＦ−βによって誘発されたＡＲＰＥ−１９細胞の線維性変形を予防することが見出された。
【００９２】
実験的実施例２．ＡＲＰＥ−１９細胞の機能低下に対するＣＣＮ５の予防効果の特定
ＴＧＦ−βは、形態変化と同様にＡＲＰＥ−１９細胞の機能低下も引き起こす。当該ＡＲＰＥ−１９細胞に、２日間、マウス由来ＡｄＣＣＮ５又はＡｄＬａｃＺを感染させ、次いで、再び２日間、ＴＧＦ−βで処理した。当該細胞単層を引っ掻いた。２４時間後、当該細胞単層を顕微鏡下において確認した。結果を図４ａに示す。図４ａに示されるように、ＴＧＦ−βは、ＡＲＰＥ−１９細胞の移動能力を増加させ、ＡＲＰＥ−１９細胞の移動は、ＡｄＣＣＮ５によって著しく阻害された。
【００９３】
酵素ＲＰＥ６５は、正常な視力にとって必須であり、並びに、オールトランスレチナール（ａｌｌ−ｔｒａｎｓ  ｒｅｔｉｎａｌ）を１１シスレチナール（１１−ｃｉｓ  ｒｅｔｉｎａｌ）へと変換する働きをする。さらに、タンパク質ＭｅｒＴＫは、ＲＰＥ細胞の食細胞活性において重要な役割を果たす。ウェスタンブロット法は、酵素ＲＰＥ６５及びタンパク質ＭｅｒＴＫの発現レベルが、ＴＧＦ−βによる処理後に著しく低下したこと、及び並びにそのような低下が、マウス誘発ＡｄＣＣＮ５によって阻害されることを示した。これらの結果を図４ｂに示す。
【００９４】
ＲＰＥ細胞の食作用機能を、ｐＨ感受性フルオロフォア標識物質、ｐＨｒｏｄｏ  Ｒｅｄ標識ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓ、及びＴＡＭＲＡ標識アポトーシス胸腺細胞を使用して観察した。当該フルオロフォア標識物質は、酸性ファゴソームによって飲み込まれる場合に活性化される。ＲＰＥ細胞を、これらのフルオロフォア標識物質と共にインキュベートし、フローサイトメトリによって分析した。結果を図４ｃ及び４ｄに示す。
【００９５】
図４ｃ及び４ｄに示されるように、ＲＰＥ細胞の食細胞活性は、ＴＧＦ−βによって著しく低下され、この現象は、マウス由来ＡｄＣＣＮ５によって大いに阻害された。上記の結果から、ＡｄＣＣＮ５が、ＴＧＦ−βによって誘発されるＡＲＰＥ−１９細胞の機能低下を予防することが見出された。
【００９６】
実験的実施例３．ＴＧＦ−β−ＳＭＡＤシグナル伝達経路に対するＣＣＮ５の阻害効果の特定
ウェスタンブロット法を使用して、ヒト由来ＣＣＮ５が、ＴＧＦ−β−ＳＭＡＤシグナル伝達経路に対して効果を有するか否かを特定した。結果を図５に示す。
【００９７】
図５に示されるように、ＴＧＦ−βは、ＴＧＦ−β受容体であるＴＧＦ−βＲＩＩの発現レベルと、ＴＧＦ−βによって誘発される上皮間葉移行に関与する転写因子であるＳＮＡＩ１及びＳＮＡＩ２の発現レベルとを増加させた。しかしながら、これらの転写因子の発現は、ＡｄＣＣＮ５によって大いに低下した。さらに、ＡｄＣＣＮ５による処理は、ＴＧＦ−βによって引き起こされるＳＭＡＤ２のリン酸化の増加を阻害し、並びにＴＧＦ−βによって引き起こされるＳＭＡＤ４の発現の増加を阻害した。さらに、ＡｄＣＣＮ５による処理は、ＴＧＦ−βによって引き起こされるＳＭＡＤ７の発現の低下を阻害した。ＣＣＮ２は、ＲＰＥ細胞の線維性変形に関与する線維化促進分子であり、並びにＴＧＦ−βシグナル伝達の下流標的である。ＣＣＮ２の発現レベルは、ＴＧＦ−βによって増加され、そのような増加は、ＡｄＣＣＮ５によって阻害された。上記の結果から、ＣＣＮ５は、ＴＧＦ−β−ＳＭＡＤシグナル伝達経路を阻害することが見出された。
【００９８】
実験的実施例４．ＡＲＰＥ−１９細胞の線維性変形に対するＣＣＮ５の回復効果の特定
ヒト由来ＣＣＮ５が、ＴＧＦ−βによって既に形成されているＡＲＰＥ−１９細胞の線維性変形を回復させることができるか否かを確認するために実験を行った。このために、ＡＲＰＥ−１９細胞を、ＴＧＦ−βで２日間処理し、続いて、ＡｄＣＣＮ５又はＡｄＬａｃＺを感染させた（図６ａ）。結果を図６ｂ〜６ｅに示す。
【００９９】
図６ｂに示されるように、ＴＧＦ−βによって誘発されたＡＲＰＥ−１９細胞における形態変化は、ＡｄＣＣＮ５によって原形へと回復した。さらに、ウェスタンブロット法は、ＡｄＣＣＮ５が、共にＴＧＦ−βによって誘発される、間葉マーカータンパク質（α−ＳＭＡ、ビメンチン、及びフィブロネクチン）の発現増加及びＴＧＦ−βによって誘発される上皮マーカータンパク質（ＺＯ−１及びオクルジン）の発現低下の両方を、著しく正常化することを示した（図６ｃ）。さらに、免疫蛍光染色は、ＴＧＦ−βによって破壊された密着結合が、ＡｄＣＣＮ５によって著しく回復すること、並びにＡｄＣＣＮ５が、ＴＧＦ−βによって引き起こされたα−ＳＭＡの発現増加を正常化することを示した。さらに、ファロイジン染色は、ＡｄＣＣＮ５が、ＴＧＦ−βによって引き起こされたｆ−アクチンのレベル増加を正常化することを明らかにした（図６ｄ）。さらに、コラーゲンゲル収縮アッセイは、ＴＧＦ−βによって引き起こされた細胞収縮の増加が、ＡｄＣＣＮ５によって著しく減少することを示した（図６ｅ）。上記の結果から、ＣＣＮ５は、ＴＧＦ−βによって誘発されたＡＲＰＥ−１９細胞の線維性変形を回復させることができることが見出された。
【０１００】
実験的実施例５．ＡＲＰＥ−１９細胞の機能低下に対するＣＣＮ５の回復効果の特定
ＡＲＰＥ−１９細胞をＴＧＦ−βで２日間処理し、次いで、ヒト由来ＡｄＣＣＮ５又はＡｄＬａｃＺを感染させた。次いで、ＡＲＰＥ−１９細胞の機能について分析した。結果を図７ａ〜７ｄに示す。
【０１０１】
図７ａに示されるように、ＴＧＦ−βによって誘発されたＡＲＰＥ−１９細胞の移動能力の向上は、ＡｄＣＣＮ５によって著しく減少した。図７ｂに示されるように、ＡｄＣＣＮ５は、ＴＧＦ−βによって低下されたタンパク質ＲＰＥ６５及びＭｅｒＴＫの発現を正常化した。さらに、フローサイトメトリ分析は、ＴＧＦ−βによって低下した食細胞活性がＡｄＣＣＮ５によって著しく回復することを示した（図７ｃ及び７ｄ）。上記の結果から、ＣＣＮ５が、ＴＧＦ−βによって誘発されたＡＲＰＥ−１９細胞の機能欠損を正常へと回復させることができることが見出された。
【０１０２】
ＴＧＦ−βによるＡＲＰＥ−１９細胞の処理の２日後、ＴＧＦ−β阻害剤である式１のＡ８３−０１（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）による処理を実施した（図８ａ）。
【化１】
2021523205.tif 000004
結果を図８ｂに示す。図８ｂに示されるように、ＣＣＮ５とは異なり、Ａ８３−０１は、間葉マーカータンパク質（α−ＳＭＡ、ビメンチン、及びフィブロネクチン）並びに上皮マーカータンパク質（ＺＯ−１及びオクルジン）の発現における異常な変化を正常化しなかった（図８ｂ）。上記の結果から、ＴＧＦ−βシグナル変換の阻害は、ＴＧＦ−βによって誘発されたＡＲＰＥ−１９細胞における線維性変形を予防することができ、並びに既に形成されている線維性変形を回復させることができないことが見出された。
【０１０３】
実験的実施例６．ＲＰＥの線維性変形に対するＣＣＮ５のインビボでの回復効果の特定
高齢のＣｃｌ２−／−マウスは、ＲＰＥの線維性変形を含む乾性加齢黄斑変性症の特徴を有する。硝子体内注射を使用して、１８月齢のＣｃｌ２−／−マウスの右眼にヒト由来ＣＣＮ５を発現する組換えアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ９−ＣＣＮ５）を注射し、左眼にはコントロールウイルス（ＡＡＶ９−ＶＬＰ）を注射した。注射の１２週間後、当該眼を摘出してＲＰＥ層を入手し、分析を実施した（図９ａ）。結果を図９ｂ及び９ｃに示す。
【０１０４】
図９ｂに示されるように、ＣＣＮ５の発現は、正常（ＷＴ）なマウスの眼のＲＰＥ層と比較して、Ｃｃｌ２−／−マウスの眼のＲＰＥ層では著しく低下し、そのような低下は、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５によって回復された。間葉マーカータンパク質（α−ＳＭＡ、ビメンチン、及びフィブロネクチン）の発現は、Ｃｃｌ２−／−マウスのＲＰＥにおいて著しく増加し、その一方で、上皮マーカータンパク質（ＺＯ−１及びオクルジン）及びＲＰＥ機能関連マーカータンパク質（ＲＰＥ６５及びＭｅｒＴＫ）の発現は、大いに低下した。そのような変化は、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５によって、正常な状態へと回復した。
【０１０５】
さらに、ＲＰＥ細胞の密着結合の独特な特徴を特定するために、ＲＰＥ／脈絡膜／強膜複合体を調べた。結果を図９ｃに示す。
【０１０６】
図９ｃに示されるように、ＡＡＶ９−ＶＬＰを注射された１８月齢の正常なマウスのＲＰＥにおいて示されるような秩序だった六方晶系の形状の密着結合の構造が、コントロールウイルスを注射された同月齢のＣｃｌ２−／−マウスのＲＰＥにおける異常な形状へと変形していることが認められた。逆に、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５を硝子体内に注射された同月齢のＣｃｌ２−／−マウスのＲＰＥ細胞では、密着結合は正常な形状へと回復していることが特定された。さらに、同時に、タンパク質ＲＰＥ６５の発現の低下が正常化され、α−ＳＭＡの発現も低下した（図９ｃ）。上記の結果から、高齢のＣｃｌ２−／−マウスのＲＰＥにおいて示される線維性変形が、ＣＣＮ５によって回復されることが見出された。
【０１０７】
実験的実施例７．密着結合の破壊によって引き起こされるＡＲＰＥ−１９細胞の線維性変形に対するＣＣＮ５の予防効果
細胞密着結合は、ＲＰＥ機能にとって重要であり、密着結合の破壊は、様々な眼の疾患に密接に相互関連している。ＲＰＥ細胞がＥＧＴＡ、ＥＧＦ、及びＦＧＦ−２（以下においては、ＥＥＦ）の組み合わせによって処理される場合、当該ＲＰＥ細胞の密着結合は破壊され、結果として、ＲＰＥの正常な形態及び機能が失われる。
【０１０８】
ＡＲＰＥ−１９細胞にヒト由来ＡｄＣＣＮ５又はＡｄＬａｃＺを２日間感染させ、次いで、再びＥＥＦで２日間処理した（図１０ａ）。結果を図１０ｂ〜１０ｄに示す。図１０ｂに示されるように、ＡｄＣＣＮ５は、ＥＥＦ処理によって誘発された形態変化を著しく阻害した。ウェスタンブロット法は、ＡｄＣＣＮ５が、共にＥＥＦの組み合わせによって誘発される、ＣＣＮ２及び間葉マーカータンパク質（α−ＳＭＡ、ビメンチン、及びフィブロネクチン）の発現の増加及び上皮マーカータンパク質（ＺＯ−１及びオクルジン）の発現の低下の両方を阻害することを示している（図１０ｃ）。ＣＣＮ５の発現がＥＥＦによって低下することは、注目に値する結果である。さらに、免疫蛍光染色は、ＡｄＣＣＮ５が、ＥＥＦによって誘発された密着結合の破壊を阻害し、並びに、ＥＥＦによって誘発されたα−ＳＭＡの発現の増加を阻害することを示した。ファロイジン染色は、ＡｄＣＣＮ５が、ＥＥＦによって形成されたｆ−アクチンを阻害することを示した（図１０ｄ）。上記の結果から、ＣＣＮ５が、ＥＥＦによって誘発された密着結合の破壊によって引き起こされるＡＲＰＥ−１９細胞の線維性変形を予防することが見出された。
【０１０９】
実験的実施例８．ベバシズマブによって誘発されるＡＲＰＥ−１９細胞の線維性変形に対するＣＣＮ５の予防効果
新生血管形成を阻害する抗ＶＥＧＦ薬の使用は、湿性加齢黄斑変性症を治療するために広く使用される方法である。しかしながら、この方法は、ＲＰＥ細胞において形態的及び機能的変化を引き起こす副作用を有する。ベバシズマブは、様々な癌又は湿性加齢黄斑変性症を治療するために一般的に使用される第一世代の抗ＶＥＧＦ薬である。この実験的実施例において、ベバシズマブがＡＲＰＥ−１９細胞の線維性変形を誘発するか否か、及びそのような有害な結果が、ヒト由来ＣＣＮ５によって予防されるか否かを調べた。特異的実験プロセスが実施例２に示されており、この実験プロセスは、図１１ａに図式的に示されている。当該実験結果を図１１ｂ〜１１ｄに示す。
【０１１０】
図１１ｂに示されるように、ＡＲＰＥ−１９細胞がベバシズマブで処理される場合、当該細胞の形態は変化し、この現象は、ＡｄＣＣＮ５によって阻害された。ウェスタンブロット法は、ＡｄＣＣＮ５が、共にベバシズマブによって誘発される、間葉マーカータンパク質（α−ＳＭＡ、ビメンチン及びフィブロネクチン）の発現の増加及び上皮マーカータンパク質（ＺＯ−１及びオクルジン）の発現の低下の両方を阻害することを示した（図１１ｃ）。ＣＣＮ５の発現が、ベバシズマブによって低下することは、注目に値する結果である。さらに、免疫蛍光染色は、ＡｄＣＣＮ５が、ベバシズマブによって誘発される密着結合の破壊を阻害することを示した（図１１ｄ）。上記の結果から、ＣＣＮ５が、ベバシズマブによって誘発されるＡＲＰＥ−１９細胞の線維性変形を予防することが見出された。
【０１１１】
実験的実施例９．ＣＣＮ５をコードする修飾されたｍＲＮＡ及びＣＣＮ５タンパク質の効果
ヒト由来ＣＣＮ５をコードする修飾されたｍＲＮＡ（以後、ｍｏｄＲＮＡ−ＣＣＮ５と称する）又は精製されたヒト由来ＣＣＮ５タンパク質を使用して、図１２ａ及び１３ａに図式的に示された実験プロセスに従って実験を実施した。結果を図１２ｂ〜１２ｃ及び図１３ｂ〜１３ｃに示す。
【０１１２】
ウェスタンブロット法は、ＡＲＰＥ−１９細胞において、ｍｏｄＲＮＡ−ＣＣＮ５及び精製されたＣＣＮ５タンパク質が、ＴＧＦ−βによって誘発される、間葉マーカータンパク質（α−ＳＭＡ、ビメンチン、及びフィブロネクチン）の発現の増加を阻害し、並びに同じくＴＧＦ−βによって誘発される、上皮マーカータンパク質（ＺＯ−１及びオクルジン）の発現の減少を正常なレベルへと回復させることを示した（図１２ｂ及び１３ｂ）。さらに、免疫蛍光染色は、当該ｍｏｄＲＮＡ−ＣＣＮ５及び精製されたＣＣＮ５タンパク質が、ＴＧＦ−βによって破壊された密着結合を正常な状態へと回復させることを示した（図１２ｃ及び図１３ｃ）。当該結果は、ＣＣＮ５が、修飾されたｍＲＮＡ及び精製されたタンパク質の形態において移入される場合でさえ、それらは、ＴＧＦ−βによって誘発されたＡＲＰＥ−１９細胞の線維性変形を回復させる優れた効果を有することを示している。
【０１１３】
実験的実施例１０．抗ＶＥＧＦ薬（ベバシズマブ、ラニビズマブ、及びアフリベルセプト）によって誘発されるＡＲＰＥ−１９細胞の線維性変形に対するＣＣＮ５の予防効果
抗ＶＥＧＦ薬であるベバシズマブ、ラニビズマブ、及びアフリベルセプトが、ＡＲＰＥ−１９細胞の線維性変形を等しく誘発するか否か、及びこの変形が、ヒト由来ＣＣＮ５によって予防されるか否かについて調べた（図１４ａ）。実験プロセスを図１４ａに図式的に示し、実験結果は、図１４ｂ及び１４ｃに示す。
【０１１４】
図１４ｂに示されるように、抗ＶＥＧＦ薬であるベバシズマブ、ラニビズマブ、及びアフリベルセプトは、等しくＣＣＮ５の発現を低下させ、ＣＣＮ２の発現を増加させ、この現象は、ＣＣＮ５タンパク質によって阻害された。ウェスタンブロット法は、ＣＣＮ５が、共に抗ＶＥＧＦ薬によって誘発される、間葉マーカータンパク質（α−ＳＭＡ、ビメンチン、及びフィブロネクチン）の発現の増加及び上皮マーカータンパク質（ＺＯ−１及びオクルジン）の発現の低下の両方を阻害することを示した（図１４ｃ）。さらに、免疫蛍光染色は、ＣＣＮ５が、いずれも抗ＶＥＧＦ薬によって誘発される、密着結合の破壊、α−ＳＭＡの発現の増加、及びｆ−アクチンの形成を阻害することを示した（図１４ｃ）。これらの結果は、抗ＶＥＧＦ薬によって誘発されるＡＲＰＥ−１９細胞の線維性変形が、ＣＣＮ５によって予防されることを示している。
【０１１５】
実験的実施例１１．ＴＧＦ−βによって誘発されるｉＰＳＣ由来ＲＰＥ細胞の線維性変形に対するＣＣＮ５の予防効果
ＴＧＦ−βによって誘発されるＲＰＥ細胞の線維性変形に対するヒト由来ＣＣＮ５の予防効果を特定する実験を、ヒトｉＰＳＣ由来ＲＰＥ細胞において実施した。当該ｉＰＳＣ由来ＲＰＥ細胞を播種し、２週間後、当該細胞にＡＡＶ２−ＣＣＮ５を感染させた。次いで、２５日間培養を実施し、次いで、ＴＧＦ−βによる処理を３日間実施した（図１５ａ）。細胞を播種した２週間以内に、当該ｉＰＳＣ由来ＲＰＥ細胞は、密集した丸石形状を示した。１カ月後、当該細胞は、円蓋形を形成しつつ、ＲＰＥ細胞特異的な着色を示し始めた。当該結果を図１５ｂに示す。
【０１１６】
免疫蛍光染色は、ＡＡＶ２−ＣＣＮ５が、いずれもＴＧＦ−βによって誘発される、密着結合の破壊、α−ＳＭＡの発現の増加、及びｆ−アクチンの形成を阻害することを示した。上記の結果は、ＴＧＦ−βによって誘発される、ｉＰＳＣ由来ＲＰＥ細胞の線維性変形が、ＣＣＮ５によって予防されることを示している。
【図１ａ】
2021523205.tif 000005
【図１ｂ】
2021523205.tif 000006
【図１ｃ】
2021523205.tif 000007
【図１ｄ】
2021523205.tif 000008
【図２ａ】
2021523205.tif 000009
【図２ｂ】
2021523205.tif 000010
【図２ｃ】
2021523205.tif 000011
【図２ｄ】
2021523205.tif 000012
【図２ｅ】
2021523205.tif 000013
【図２ｆ】
2021523205.tif 000014
【図３】
2021523205.tif 000015
【図４ａ】
2021523205.tif 000016
【図４ｂ】
2021523205.tif 000017
【図４ｃ】
2021523205.tif 000018
【図４ｄ】
2021523205.tif 000019
【図５】
2021523205.tif 000020
【図６ａ】
2021523205.tif 000021
【図６ｂ】
2021523205.tif 000022
【図６ｃ】
2021523205.tif 000023
【図６ｄ】
2021523205.tif 000024
【図６ｅ】
2021523205.tif 000025
【図７ａ】
2021523205.tif 000026
【図７ｂ】
2021523205.tif 000027
【図７ｃ】
2021523205.tif 000028
【図７ｄ】
2021523205.tif 000029
【図８ａ】
2021523205.tif 000030
【図８ｂ】
2021523205.tif 000031
【図９ａ】
2021523205.tif 000032
【図９ｂ】
2021523205.tif 000033
【図９ｃ】
2021523205.tif 000034
【図１０ａ】
2021523205.tif 000035
【図１０ｂ】
2021523205.tif 000036
【図１０ｃ】
2021523205.tif 000037
【図１０ｄ】
2021523205.tif 000038
【図１１ａ】
2021523205.tif 000039
【図１１ｂ】
2021523205.tif 000040
【図１１ｃ】
2021523205.tif 000041
【図１１ｄ】
2021523205.tif 000042
【図１２ａ】
2021523205.tif 000043
【図１２ｂ】
2021523205.tif 000044
【図１２ｃ】
2021523205.tif 000045
【図１３ａ】
2021523205.tif 000046
【図１３ｂ】
2021523205.tif 000047
【図１３ｃ】
2021523205.tif 000048
【図１４ａ】
2021523205.tif 000049
【図１４ｂ】
2021523205.tif 000050
【図１４ｃ】
2021523205.tif 000051
【図１５ａ】
2021523205.tif 000052
【図１５ｂ】
2021523205.tif 000053
【配列表】
2021523205000001.app
【国際調査報告】
2021523205.tif 000054
2021523205.tif 000055
2021523205.tif 000056
2021523205.tif 000057
2021523205.tif 000058
2021523205.tif 000059
2021523205.tif 000060
2021523205.tif 000061