(57)【要約】  本発明は、ヒトＰＤ−１に特異的に結合する分離されたモノクローナル抗体を提供する。抗体をコードする核酸分子、発現ベクター、宿主細胞、及び抗体を発現させるための方法もまた提供される。本発明はさらに、抗体を含む免疫結合体、二重特異性分子、及び医薬組成物、並びに本発明の抗ＰＤ−１抗体を使用する診断方法及び治療方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分であって、ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域が、
（１）それぞれ、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３、又は
（２）それぞれ、配列番号１、配列番号２、及び配列番号４
のアミノ酸配列を含み、
抗体又はその抗原結合断片がＰＤ−１に結合する、
前記分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
【請求項２】
ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域をさらに含み、ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域が、それぞれ配列番号５、６、及び７のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項３】
配列番号８〜１６のいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項４】
配列番号１７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項５】
配列番号１７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をさらに含む、請求項３に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項６】
重鎖及び軽鎖を含み、重鎖が、配列番号２１〜３８のいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、軽鎖が、配列番号３９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項７】
（ａ）ヒトＰＤ−１に結合する、（ｂ）サルＰＤ−１に結合する、（ｃ）マウスＰＤ−１に結合しない、（ｄ）ＣＤ２８と交差反応しない、（ｅ）ＩＣＯＳと交差反応しない、（ｆ）ＢＴＬＡと交差反応しない、（ｇ）ＣＴＬＡ−４と交差反応しない、（ｈ）ＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１相互作用を阻害する、（ｉ）ＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ２相互作用を阻害する、（ｊ）Ｔ細胞によるＩＬ−２の放出を誘発する、（ｋ）Ｔ細胞によるＩＦＮｇの放出を誘発する、（ｌ）ＰＤ−１発現細胞に対してＡＤＣＣを誘発しない、及び／又は（ｍ）ＰＤ−１発現細胞に対してＣＤＣを誘発しない、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項８】
ヒト抗体、マウス抗体、キメラ抗体、又はヒト化抗体である、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項９】
請求項１に記載の抗体又はその抗原結合部分、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１０】
抗腫瘍剤をさらに含む、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
腫瘍の成長を阻害するための薬剤の調製における、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合部分の使用。
【請求項１２】
腫瘍が、結腸直腸腺がん、肺がん、リンパ腫、中皮腫、黒色腫、及び腎細胞がんからなる群から選択される、請求項１１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全体として、分離されたモノクローナル抗体、特に、高親和性及び高機能性でヒトＰＤ−１に特異的に結合するモノクローナル抗体に関する。抗体をコードする核酸分子、発現ベクター、宿主細胞、及び抗体を発現させるための方法もまた提供される。本発明はさらに、抗体を含む免疫結合体、二重特異性分子、及び医薬組成物、並びに本発明の抗ＰＤ−１抗体を使用する診断及び治療方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
治療用抗体、特に、特定の疾患に関連する細胞タンパク質を標的化するモノクローナル抗体は、製薬産業の最も急成長している分野の１つである。
【０００３】
１つのこのような標的タンパク質は、ＰＤＣＤ１遺伝子によってコードされる、ＰＤ−１（ＣＤ２７９）としても知られているプログラム細胞死タンパク質１であり（Ｉｓｈｉｄａ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ  １１：３８８７−９５（１９９２）、Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ＬＭ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ．２３６：２１９−４２（２０１０））、これは、Ｔ細胞調節因子のＣＤ２８ファミリーのメンバーであるがモノマーとして存在しており、他のＣＤ２８ファミリーメンバーにおいて特徴的な対合していないシステイン残基を欠いている。
【０００４】
ＰＤ−１は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、活性化したＢ細胞、Ｔ細胞、及び骨髄細胞上で発現する、５５ｋＤａのＩ型膜貫通タンパク質である（Ｋｅｉｒ  ＭＥ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２６：６７７−７０４（２００８）、Ａｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８：７６５−７２、Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：３９１７７９−８２、Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７０：７１１−８）。ＰＤ−１は、２つのリガンド、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２に結合する（Ｄｏｎｇ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ５：１３６５−９（１９９９）、Ｌａｔｃｈｍａｎ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２：２６１−８（２００１））。そのリガンドに結合すると、ＰＤ−１は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のシグナル伝達を阻害し、免疫刺激性サイトカインの分泌及び生存タンパク質の発現を下方調節することが見出されている（Ｋｅｉｒ  ＭＥ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２６：６７７−７０４（２００８）、Ｄｏｎｇ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ５：１３６５−９（１９９９））。
【０００５】
前臨床研究は、単独で（Ｈｉｒａｎｏ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５：１０８９−９６（２００５））又は他の免疫チェックポイント阻害と組み合わせて（Ｗｏｏ  ＳＲ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７２（４）：９１７−２７（２０１２））ＰＤ−１経路のシグナル伝達を無くした後の、腫瘍の退行又は宿主の生存の延長を示した。
【０００６】
ＰＤ−１受容体を標的化する多くのがん免疫療法剤が開発されている。１つのこのような抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  ＳｑｕｉｂｂによってＯＰＤＩＶＯ（登録商標）という商品名で販売されている）であり、これは、全部で２９６人の患者を用いた臨床試験において、非小細胞肺がん、黒色腫、及び腎細胞がんにおいて完全奏効又は部分奏効をもたらした（Ｔｏｐａｌｉａｎ  ＳＬ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．３６６（２６）：２４４３−５４）。ニボルマブは、日本において２０１４年に、及び米国ＦＤＡによって２０１４年に、転移性黒色腫の治療について認可された。別の抗ＰＤ−１抗体である、ＰＤ−１受容体を標的化するペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡＴＭ、ＭＫ−３４７５、Ｍｅｒｃｋ）もまた、米国ＦＤＡによって２０１４年に、転移性黒色腫の治療について認可された。これは、米国での臨床試験において、肺がん、リンパ腫、及び中皮腫に使用されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
既に開発され、認可されている抗ＰＤ−１抗体があるものの、結合親和性及び他の望ましい薬学的特性が増強した、さらなるモノクローナル抗体が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ヒト又はサルのＰＤ−１に結合する分離されたモノクローナル抗体、例えばヒトモノクローナル抗体を提供する。
【０００９】
一態様において、本発明は、ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域を有する分離されたモノクローナル抗体（例えば、ヒト抗体）又はその抗原結合部分であって、ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域が、
（１）それぞれ、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３、又は
（２）それぞれ、配列番号１、配列番号２、及び配列番号４
に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
抗体又はその抗原結合断片がＰＤ−１に結合する、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分に関する。これらのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４０から４３の核酸配列によってコードされ得る。
【００１０】
一態様において、本発明の分離されたモノクローナル抗体（例えば、ヒト抗体）又はその抗原結合部分は、配列番号８から１６のいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、抗体又はその抗原結合断片は、ＰＤ−１に結合する。これらのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４４から５２の核酸配列によってコードされ得る。
【００１１】
本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合部分は、一実施形態において、ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域を含み、ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域は、それぞれ配列番号５、６、及び７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、抗体又はその抗原結合断片は、ＰＤ−１に結合する。これらのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５３から５５の核酸配列によってコードされ得る。
【００１２】
一態様において、本発明の分離されたモノクローナル抗体（例えば、ヒト抗体）又はその抗原結合部分は、配列番号１７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、抗体又はその抗原結合断片は、ＰＤ−１に結合する。これらのアミノ酸配列は、配列番号５６の核酸配列によってコードされ得る。
【００１３】
一態様において、本発明の分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分は、各々がＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、（１）それぞれ、配列番号１、２、３、５、６、及び７、又は（２）それぞれ、配列番号１、２、４、５、６、及び７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、抗体又はその抗原結合断片は、ＰＤ−１に結合する。
【００１４】
一実施形態において、抗体又はその抗原結合部分は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、（１）それぞれ、配列番号８及び１７、（２）それぞれ、配列番号９及び１７、（３）それぞれ、配列番号１０及び１７、（４）それぞれ、配列番号１１及び１７、（５）それぞれ、配列番号１２及び１７、（６）それぞれ、配列番号１３及び１７、（７）それぞれ、配列番号１４及び１７、（８）それぞれ、配列番号１５及び１７、又は（９）それぞれ、配列番号１６及び１７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、抗体又はその抗原結合断片は、ＰＤ−１に結合する。
【００１５】
一実施形態において、抗体又はその抗原結合部分は、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖は、上記のような重鎖可変領域及び配列番号１８又は１９で示される重鎖定常領域を含み、軽鎖は、上記のような軽鎖可変領域及び配列番号２０で示される軽鎖定常領域を含む。配列番号１８から２０のアミノ酸配列は、配列番号５７から５９の核酸配列によってコードされ得る。
【００１６】
一実施形態において、抗体又はその抗原結合部分は、ジスルフィド結合によって相互接続している重鎖及び軽鎖を含み、これらは、（１）それぞれ、配列番号２１及び３９、（２）それぞれ、配列番号２２及び３９、（３）それぞれ、配列番号２３及び３９、（４）それぞれ、配列番号２４及び３９、（５）それぞれ、配列番号２５及び３９、（６）それぞれ、配列番号２６及び３９、（７）それぞれ、配列番号２７及び３９、（８）それぞれ、配列番号２８及び３９、（９）それぞれ、配列番号２９及び３９、（１０）それぞれ、配列番号３０及び３９、（１１）それぞれ、配列番号３１及び３９、（１２）それぞれ、配列番号３２及び３９、（１３）それぞれ、配列番号３３及び３９、（１４）それぞれ、配列番号３４及び３９、（１５）それぞれ、配列番号３５及び３９、（１６）それぞれ、配列番号３６及び３９、（１７）それぞれ、配列番号３７及び３９、又は（１８）それぞれ、配列番号３８及び３９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、抗体又はその抗原結合断片は、ＰＤ−１に結合する。
【００１７】
本発明の抗体又はその抗原結合部分は、先行技術の抗ＰＤ−１抗体、例えばニボルマブと比較して、ヒトＰＤ−１又はサルＰＤ−１に対する同等の又はさらに良好な結合親和性／能力を有する。さらに、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、Ｔ細胞を誘発して、より多くのＩＬ−２及びＩＦＮｇを放出させ、先行技術の抗ＰＤ−１抗体、例えばニボルマブより良好なインビボでの抗腫瘍効果をもたらす。
【００１８】
具体的には、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、およそ１．４０６×１０−９Ｍ以下のＫＤでヒトＰＤ−１に結合し、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２の結合を阻害する。本発明の抗体又はその抗原結合部分は、マウスＰＤ−１に結合せず、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ、又はＣＴＬＡ−４と交差反応しない。さらに、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、より低いＥＣ５０値でカニクイザルＰＤ−１に結合し、Ｔ細胞が先行技術の抗ＰＤ−１抗体、例えばニボルマブよりも、高いレベルのＩＬ−２分泌及びＩＦＮｇを放出することを誘発する。本発明の抗体又はその抗原結合部分は、抗原特異的な記憶応答を刺激し、及び／又は抗体応答を刺激する。
【００１９】
本発明の抗体は、例えばＩｇＧ１又はＩｇＧ４アイソタイプの、例えば完全長抗体であり得る。或いは、抗体は、抗体断片、例えばＦａｂ断片若しくはＦ（ａｂ’）２断片、又は一本鎖抗体であり得る。重鎖定常領域は、空間的に、抗ＰＤ−１抗体がＰＤ−１発現細胞に対して抗体依存性細胞介在性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を誘発しないように設計される。例えば、ヒトＩｇＧ１重鎖は、ＡＤＣＣ機能又はＣＤＣ機能を排除するためのＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｄ２６５Ａ、及び／又はＰ３２９Ａ突然変異を有し得る。本発明の抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体、例えばモノクローナル抗体であり得る。
【００２０】
本発明はまた、治療薬、例えば放射性同位体に連結している、本発明の抗体又はその抗原結合部分を含む免疫結合体を提供する。本発明はまた、前記抗体と異なる結合特異性を有する第２の機能的部分（例えば二次抗体）又はその抗原結合部分に連結した、本発明の抗体又はその抗原結合部分を含む、二重特異性分子を提供する。
【００２１】
本発明の抗体若しくはその抗原結合部分、又は免疫結合体、又は二重特異性分子、及び薬学的に許容される担体を含む組成物もまた提供される。
【００２２】
本発明の抗体又はその抗原結合部分をコードする核酸分子、並びに、このような核酸を含む発現ベクター、及びこのような発現ベクターを含む宿主細胞もまた、本発明に包含される。発現ベクターを含む宿主細胞を使用して抗ＰＤ−１抗体を調製するための方法もまた提供され、この方法は、（ｉ）宿主細胞において抗体を発現させるステップ、及び（ｉｉ）宿主細胞から抗体を分離するステップを含む。
【００２３】
さらに別の態様において、本発明は、被験体における免疫応答が調節されるように、本発明の抗体又はその抗原結合部分を被験体に投与することを含む、被験体において免疫応答を調節する方法を提供する。好ましくは、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、被験体における免疫応答を増強する、刺激する、又は増大させる。さらなる態様において、本発明は、治療有効量の本発明の抗体又はその抗原結合部分を被験体に投与することを含む、被験体における腫瘍細胞の成長を阻害する方法を提供する。一実施形態において、腫瘍は、肺がん、リンパ腫、中皮腫、黒色腫、又は腎細胞がんからなる群から選択される充実性腫瘍である。別の態様において、本発明は、治療有効量の本発明の抗体又はその抗原結合部分を被験体に投与することを含む、被験体における感染性疾患を治療する方法を提供する。別の態様において、本方法は、本発明の免疫結合体、二重特異性分子、又は代替として、被験体において本発明の免疫結合体、二重特異性分子を発現し得る核酸分子を投与することを含む。
【００２４】
さらに、本発明は、被験体における抗原に対する免疫応答が増強するように、（ｉ）抗原、及び（ｉｉ）抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合部分を被験体に投与することを含む、被験体における抗原に対する免疫応答を増強させる方法を提供する。抗原は、例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、又は病原体由来の抗原であり得る。
【００２５】
本発明の抗体は、少なくとも１つのさらなる作用物質、例えば、免疫刺激抗体（例えば、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＴＩＭ−３抗体、及び／若しくは抗ＣＴＬＡ−４抗体）、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２及び／若しくはＩＬ−２１）、又は共刺激抗体（例えば、抗ＣＤ１３７及び／若しくは抗ＧＩＴＲ抗体）と組み合わせて使用することができる。
【００２６】
本発明の他の特性及び利点は、以下の詳細な説明及び実施例から明らかとなるであろうが、これらは、限定するものと解釈されるべきではない。本願の全体で引用されている全ての参考文献、ＧｅｎＢａｎｋエントリー、特許、及び公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】抗ＰＤ−１抗体２１Ｆ１２のＨＰＬＣプロファイルを示す図である。
【図２Ａ−２Ｄ】ヒトＰＤ−１への抗ＰＤ−１抗体２１Ｆ１２、１９Ｅ１１（Ａ）、２１Ｆ１２−１Ｆ６、２１Ｆ１２−１Ｂ１２（Ｂ）、２１Ｆ１２−１Ｅ１１、２１Ｆ１２−１Ｅ１０、２１Ｆ１２−３Ｇ１（Ｃ）、及び２１Ｆ１２−１Ｅ１１、２１Ｆ１２−１Ｂ１２、２１Ｆ１２−２Ｅ１、２１Ｆ１２−２Ｈ７（Ｄ）の結合能力を示す図である。
【図３Ａ−３Ｃ】ヒトＰＤ−１（Ａ）、カニクイザルＰＤ−１（Ｂ）、及びマウスＰＤ−１（Ｃ）への抗ＰＤ−１抗体２１Ｆ１２−１Ｆ６の結合能力を示す図である。
【図４Ａ−４Ｄ】ヒトＣＤ２８（Ａ）、ヒトＩＣＯＳ（Ｂ）、ヒトＢＴＬＡ（Ｃ）、及びヒトＣＴＬＡ４（Ｄ）に対する抗ＰＤ−１抗体２１Ｆ１２−１Ｆ６の交差反応性を示す図である。
【図５Ａ−５Ｆ】ヒトＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用に対する抗ＰＤ−１抗体２１Ｆ１２−１Ｂ１２（Ａ）、２１Ｆ１２、２１Ｆ１２−３Ｇ１（Ｂ）、２１Ｆ１２、２１Ｆ１２−１Ｅ１１、２１Ｆ１２−１Ｂ１２、２１Ｆ１２−２Ｅ１、２１Ｆ１２−２Ｈ７（Ｃ）、２１Ｆ１２−１Ｃ４、２１Ｆ１２（Ｄ）、及び２１Ｆ１２−１Ｅ１０、２１Ｆ１２（Ｅ）の遮断能力、並びに、ヒトＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ２相互作用（Ｆ）に対する抗ＰＤ−１抗体２１Ｆ１２−１Ｂ１２の遮断能力を示す図である。
【図６Ａ−６Ｂ】ＣＨＯ−Ｋ１−ＰＤ−１細胞で発現しているＰＤ−１への抗ＰＤ−１抗体２１Ｆ１２−１Ｆ６（Ａ）、２１Ｆ１２、２１Ｆ１２−１Ｃ４、２１Ｆ１２−１Ｅ１０、２１Ｆ１２−１Ｂ１２、及び２１Ｆ１２−３Ｇ１（Ｂ）の結合能力を示す図である。
【図７Ａ−７Ｂ】ヒトＰＢＭＣ（Ａ）又はカニクイザルＰＢＭＣ（Ｂ）で発現しているＰＤ−１への抗ＰＤ−１抗体２１Ｆ１２−１Ｆ６の結合能力を示す図である。
【図８Ａ−８Ｂ】抗ＰＤ−１抗体２１Ｆ１２−１Ｆ６がヒトＴ細胞によるＩＬ２（Ａ）及びＩＦＮｇ（Ｂ）の放出を誘発することを示す図である。
【図９】Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴ−ＰＤ１レポーター遺伝子システムにおけるＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１相互作用に対する抗ＰＤ−１抗体２１Ｆ１２−１Ｆ６の遮断能力を示す図である。
【図１０】ＦｃγＲＩへの抗体２１Ｆ１２−１Ｆ６の結合能力を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本開示をより容易に理解するために、特定の用語を最初に定義する。追加の定義は、詳細な説明全体で記載されている。
【００２９】
用語「ＰＤ−１」とは、プログラム細胞死タンパク質１を指す。用語「ＰＤ−１」は、バリアント、アイソフォーム、ホモログ、オルソログ、及びパラログを含む。例えば、ヒトＰＤ−１タンパク質に特異的な抗体は、特定のケースにおいて、ヒト以外の種、例えばカニクイザルに由来するＰＤ−１タンパク質と交差反応し得る。他の実施形態において、ヒトＰＤ−１タンパク質に特異的な抗体は、ヒトＰＤ−１タンパク質に完全に特異的であり得、他の種に対して交差反応性を示さないか若しくは他のタイプの交差反応性を示し得、又は特定の他の種（全ての他の種ではなく）に由来するＰＤ−１と交差反応し得る。
【００３０】
用語「ヒトＰＤ−１」とは、ＰＤ−１のヒト配列、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００５００９．２を有するヒトＰＤ−１の完全なアミノ酸配列を指す。
【００３１】
用語「免疫応答」とは、例えば、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、及び前記細胞又は肝臓によって産生される可溶性高分子（抗体、サイトカイン及び補体を含む）の作用を指す。当該作用は、侵入した病原体、病原体に感染した細胞及び組織、がん細胞、又は正常なヒト細胞又は組織（自己免疫若しくは病的炎症の場合）に対する選択的な損傷、破壊、及び人体からの排除をもたらす。
【００３２】
「抗原特異的Ｔ細胞応答」とは、Ｔ細胞が特異的な抗原でＴ細胞を刺激することにより引き起こされるＴ細胞による応答を指す。抗原特異的刺激時のＴ細胞による応答の非限定的な例は、増殖及びサイトカイン産生（例えば、ＩＬ−２産生）を含む。
【００３３】
本明細書において、用語「抗体」は、全抗体及びそのいずれかの抗原結合断片（即ち、「抗原結合部分」）又は一本鎖を含む。全抗体は、ジスルフィド結合によって互いに結合された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（ここで、ＶＨと略される）及び重鎖定常領域（ここでＣＨと略される）から構成される。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３の３つのドメインから構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ここで、ＶＬと略される）及び軽鎖定常領域（ここで、ＣＬと略される）から構成される。軽鎖定常領域は、ＣＬの１つのドメインから構成される。ＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存的な領域が散在する領域にさらに細分化することができる。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端までＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配置される３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、宿主組織又は因子（免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む）への免疫グロブリンの結合を媒介できる。時として、重鎖定常領域は、このような機能を排除するように修飾される。
【００３４】
本明細書で使用されている抗体の「抗原結合部分」（又は単に「抗体部分」）との用語とは、抗原（例えば、ＰＤ−１タンパク質）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片によって達成できることが示されている。抗体の「抗原結合部分」との用語に含まれる結合断片の例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインから構成される一価断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド橋により結合された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインから構成されるＦｄ断片、（ｉｖ）単一アームのＶＬ及びＶＨドメインから構成されるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインから構成されるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）、（ｖｉ）分離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、並びに（ｖｉｉ）単一の可変ドメイン及び２つの定常ドメインを含む重鎖可変領域であるナノボディを含む。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、組換え法により、それらを単一タンパク質鎖にすることができる合成リンカーを用いて結合することができる。前記単一タンパク質鎖において、ＶＬ及びＶＨがペアになって一価分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている。例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照）を形成する。このような一本鎖抗体も抗体の「抗原結合部分」との用語に含まれることが意図されてる。これらの断片は、当業者に知られている従来の技術を使用して得られ、断片は、インタクト抗体と同じ方法で有用性についてスクリーニングされる。
【００３５】
本明細書で使用されている「分離(単離)された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことを意図している（例えば、ＰＤ−１タンパク質に特異的に結合する分離された抗体は、ＰＤ−１タンパク質以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、ヒトＰＤ−１タンパク質に特異的に結合する分離された抗体は、他の抗原（例えば、他の種に由来するＰＤ−１タンパク質）に対して交差反応性を有してもよい。さらに、分離された抗体は、他の細胞物質及び／及び化学物質を実質的に含まない。
【００３６】
本明細書で使用されている用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」とは、単一分子組成の抗体分子の調製を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性及び親和性を示す。
【００３７】
用語「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭ又はＩｇＧ１）を指す。
【００３８】
用語「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」は、本明細書では用語「抗原に特異的に結合する抗体」と互換的に使用される。
【００３９】
用語「抗体誘導体」とは、抗体の修飾型（例えば、抗体と別の薬剤及び抗体との複合体）のいずれかを指す。
【００４０】
本明細書において、「ヒトＰＤ−１に特異的に結合する」抗体は、非ＰＤ−１タンパク質に実質的に結合せず、ヒトPD-1タンパク質（例えば、１つの以上の非ヒト種に由来するＰＤ−１タンパク質）に結合する抗体を指すことを意図している。好ましくは、抗体は、「高親和性」で、すなわち、１×１０−８Ｍ以下、及びより好ましくは５×１０−９Ｍ以下のＫＤで、ヒトＰＤ−１タンパク質に結合する。
【００４１】
本明細書において、タンパク質又は細胞に「実質的に結合しない」という用語は、タンパク質又は細胞に結合しないか、又は高親和性で結合しないことを意味する。即ち、１ｘ１０−６Ｍ以上、好ましくは１ｘ１０−５Ｍ以上、より好ましくは１ｘ１０−４Ｍ以上、さらに好ましくは１ｘ１０−３Ｍ以上、さらにより好ましくは１ｘ１０−２Ｍ以上のＫＤでタンパク質又は細胞に結合する。
【００４２】
本明細書において、用語「Ｋａｓｓｏｃ」又は「Ｋａ」は、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を指すことを意図している。また、用語「Ｋｄｉｓ」又は「Ｋｄ」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指すことを意図している。用語「ＫＤ」は、解離定数であり、Ｋａに対するＫｄの比（即ち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られａｎモル濃度（Ｍ）で示される。抗体のＫＤ値は、当技術分野で十分に確立された方法を使用して決定することができる。好ましくは、抗体のＫＤの決定は、表面プラズモン共鳴、より好ましくは、バイオセンサーシステム（例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭシステム）を使用して行われる。
【００４３】
ＩｇＧ抗体についての「高親和性」という用語は、標的抗原に対して１ｘ１０−６Ｍ以下、より好ましくは５ｘ１０−８Ｍ以下、さらに好ましくは１ｘ１０−８Ｍ以下、さらにより好ましくは５ｘ１０−９Ｍ以下、特に好ましくは１ｘ１０−９Ｍ以下のＫＤを有する抗体を指す。しかし、「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプによって異なる。例えば、ＩｇＭアイソタイプの「高親和性」結合とは、１０−６Ｍ以下、より好ましくは１０−７Ｍ以下、さらに好ましくは１０−８Ｍ以下のＫＤを有する抗体を指す。
【００４４】
最大阻害濃度の半分としても知られている用語「ＩＣ５０」とは、特異的な生物学的又は生化学的機能を抗体の不存在下と比較して５０％阻害する抗体の濃度を指す。
【００４５】
用語「ＥＣ５０」は、最大有効濃度の半分として知られており、特定の曝露時間後にベースラインと最大値との中間の反応を誘発する抗体の濃度を指す。
【００４６】
本明細書において、用語「抗体依存性細胞傷害性」、「抗体依存性細胞介在性細胞傷害性」、又は「ＡＤＣＣ」とは、それによって、免疫系のエフェクター細胞が、標的細胞、例えば、その膜表面抗原に抗体が結合している腫瘍細胞を活動的に溶解する、細胞介在性の免疫防御のメカニズムを指す。本発明の抗体は、ＰＤ−１発現細胞に対してはＡＤＣＣを誘発せず、そのため、免疫細胞を保護する。
【００４７】
用語「補体依存性細胞傷害性」又は「ＣＤＣ」とは、一般に、表面抗原に結合すると古典的な補体経路を開始して膜侵襲複合体の形成及び標的細胞の溶解を誘発する、ＩｇＧ抗体及びＩｇＭ抗体のエフェクター機能を指す。本発明の抗体は、ＰＤ−１発現細胞に対してはＣＤＣを誘発せず、そのため、免疫細胞を保護する。
【００４８】
用語「被験体」には、ヒト及び非ヒト動物が含まれる。用語「非ヒト動物」には、すべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類、爬虫類のような哺乳類及び非哺乳類が含まれる。非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマのような哺乳類動物が好ましい。
【００４９】
以下、本発明の様々な態様をさらに詳しく説明する。
【００５０】
本発明は抗ＰＤ−１抗体を目的としており、その配列情報を以下の表１にまとめる。
【００５１】
表１におけるＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムによって決定されている。しかし、当分野で周知されているように、ＣＤＲ領域はまた、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＣＣＧ、及びＩＭＧＴシステム／方法のような、重鎖／軽鎖可変領域配列に基づく他のシステムによっても決定することができる。
【００５２】
【表１】
2021523949.tif 000002
【００５３】
本発明の抗体は、配列番号１８のアミノ酸配列を有する突然変異体ＩｇＧ１定常領域を含有し得る。本発明の抗体はまた、配列番号１９のアミノ酸配列を有するＩｇＧ４定常領域を含有し得る。
【００５４】
＜ＰＤ−１に対する増大した結合能力及び有利な機能的性質を有する抗ＰＤ−１抗体＞
【００５５】
本発明の抗体又はその抗原結合部分は、先行技術の抗ＰＤ−１抗体、例えばニボルマブと比較して、ヒトＰＤ−１又はサルＰＤ−１に対する同等の又はさらに良好な結合親和性／能力を有する。さらに、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、ＰＢＭＣを誘発して、より多くのＩＬ−２及びＩＦＮｇを放出させ、先行技術の抗ＰＤ−１抗体、例えばニボルマブよりも良好なインビボでの抗腫瘍効果をもたらす。
【００５６】
具体的には、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、およそ１．４０６×１０−９Ｍ以下のＫＤでヒトＰＤ−１に結合し、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２の結合を阻害する。本発明の抗体又はその抗原結合部分は、マウスＰＤ−１に結合せず、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ、又はＣＴＬＡ−４と交差反応しない。さらに、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、より低いＥＣ５０値でカニクイザルＰＤ−１に結合し、ＰＢＭＣが先行技術の抗ＰＤ−１抗体、例えばニボルマブよりも、高いレベルのＩＬ−２分泌及びＩＦＮｇを放出することを誘発する。本発明の抗体又はその抗原結合部分は、抗原特異的な記憶応答を刺激し、及び／又は抗体応答を刺激する。
【００５７】
本発明の好ましい抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。さらに、又は代替として、抗体は、例えばキメラ抗体又はヒト化モノクローナル抗体であり得る。
【００５８】
＜モノクローナル抗ＰＤ−１抗体＞
【００５９】
ヒトＰＤ−１に結合する他の抗ＰＤ−１抗体のＶＨ配列及びＶＬ配列（又はＣＤＲ配列）は、本発明の抗ＴＩＭ−３抗体のＶＨ配列及びＶＬ配列（又はＣＤＲ配列）と「ミックス及びマッチ」し得る。好ましくは、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖（又はこのような鎖内のＣＤＲ）がミックス及びマッチすると、特定のＶＨ／ＶＬ対のＶＨ配列は、構造的に類似のＶＨ配列で置き換えられる。同様に、好ましくは、特定のＶＨ／ＶＬ対のＶＬ配列は、構造的に類似のＶＬ配列で置き換えられる。
【００６０】
したがって、一実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、
（ａ）表１において上記で列挙されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
（ｂ）表１において上記で列挙されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又はヒトＰＤ−１に特異的に結合する別の抗ＰＤ−１抗体のＶＬ
を含む。
【００６１】
別の実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、
（ａ）表１において上記で列挙される重鎖可変領域のＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域、並びに
（ｂ）表１において上記で列挙される軽鎖可変領域のＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域、又はヒトＰＤ−１に特異的に結合する別の抗ＰＤ−１抗体のＣＤＲ
を含む。
【００６２】
さらに別の実施形態において、抗体又はその抗原結合部分は、ヒトＰＤ−１に結合する他の抗体のＣＤＲ、例えば、異なる抗ＰＤ−１抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１及び／若しくはＣＤＲ３、並びに／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／若しくはＣＤＲ３と組み合わされている、抗ＰＤ−１抗体の重鎖可変領域ＣＤＲ２を含む。
【００６３】
さらに、当分野で周知されているように、ＣＤＲ３ドメインは、ＣＤＲ１及び／及びＣＤＲ２ドメインとは独立して単独で、同族抗原に対する抗体の結合特異性を決定でき、共通のＣＤＲ３配列に基づく同じ結合特異性を有する複数の抗体が予測可能に生成される。例えば、Ｋｌｉｍｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ８３（２）：２５２−２６０（２０００）；Ｂｅｉｂｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：８３３−８４９（２０００）；Ｒａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：８９１０−８９１５（１９９８）；Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２１６１−２１６２（１９９４）；Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：２５２９−２５３３（１９９５）；Ｄｉｔｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：７３９−７４９（１９９６）；Ｂｅｒｅｚｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＩＡｊｏｕｒｎａｌ  ８：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｖｉｅｗ  ８（２００１）；Ｉｇａｒａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）１１７：４５２−７（１９９５）；Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７２：８０７−１０（１９９８）；Ｌｅｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：４３７４−８（１９９３）；Ｐｏｌｙｍｅｎｉｓ  ａｎｄ  Ｓｔｏｌｌｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５２１８−５３２９（１９９４）ａｎｄ  Ｘｕ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３：３７−４５（２０００）を参照されたい。また、米国特許第６，９５１，６４６；６，９１４，１２８；６，０９０，３８２；６，８１８，２１６；６，１５６，３１３；６，８２７，９２５；５，８３３，９４３；５，７６２，９０５及び５，７６０，１８５も参照されたい。これらの参考文献のそれぞれは、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【００６４】
したがって、別の実施形態において、本発明の抗体は、抗ＰＤ−１抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ２、並びに、抗ＰＤ−１抗体の重鎖及び／若しくは軽鎖可変領域の少なくともＣＤＲ３、又はヒトＰＤ−１に特異的に結合し得る別の抗ＰＤ−１抗体の重鎖及び／若しくは軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む。これらの抗体は、好ましくは、本発明の抗ＰＤ−１抗体と（ａ）ＰＤ−１との結合について競合する、（ｂ）機能的特性を保持している、（ｃ）同一のエピトープに結合する、及び／又は（ｄ）類似の結合親和性を有する。さらに別の実施形態において、抗体はさらに、抗ＰＤ−１抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、又はヒトＰＤ−１に特異的に結合し得る別の抗ＰＤ−１抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２を含み得る。別の実施形態において、本発明の抗体は、抗ＰＤ−１抗体の重鎖及び／若しくは軽鎖可変領域のＣＤＲ１、又はヒトＰＤ−１に特異的に結合し得る別の抗ＰＤ−１抗体の重鎖及び／若しくは軽鎖可変領域のＣＤＲ１を含み得る。
【００６５】
＜保存的修飾＞
【００６６】
別の実施形態において、本発明の抗体は、１つ以上の保存的修飾によって本発明の抗ＰＤ−１抗体のものと異なる、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列の重鎖及び／又は軽鎖可変領域配列を含む。当分野で理解されているように、抗原結合機能が維持されたままで特定の保存的配列修飾を行うことができる。例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３２：１１８０−８、ｄｅ  Ｗｉｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：８３５−４１、Ｋｏｍｉｓｓａｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２６８６４−２６８７０、Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：１６０５−１２、Ｋｅｌｌｅｙ  ａｎｄ  Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：６８６２−３５、Ａｄｉｂ−Ｃｏｎｑｕｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：３４１−６及びＢｅｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．６：２８３５−４３を参照されたい。
【００６７】
したがって、一実施形態において、抗体は、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、並びに／又はＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含み、ここで、
（ａ）重鎖可変領域のＣＤＲ１配列は、上記の表１に列挙される配列、及び／若しくはその保存的修飾を含み、並びに／又は
（ｂ）重鎖可変領域のＣＤＲ２配列は、上記の表１に列挙される配列、及び／若しくはその保存的修飾を含み、並びに／又は
（ｃ）重鎖可変領域のＣＤＲ３配列は、上記の表１に列挙される配列、及び／若しくはその保存的修飾を含み、並びに／又は
（ｄ）軽鎖可変領域のＣＤＲ１配列及び／若しくはＣＤＲ２配列及び／若しくはＣＤＲ３配列は、上記の表１に列挙される配列、及び／若しくはその保存的修飾を含み、並びに／又は
（ｅ）抗体は、ヒトＰＤ−１に特異的に結合する。
【００６８】
本明細書において、用語「保存的配列修飾」は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特性を顕著に影響及び変化を与えないアミノ酸修飾を指すことを意図している。このような保存的修飾は、アミノ酸の置換、挿入、欠失を含む。修飾は、部位特異的変異導入及びＰＣＲ媒介変異導入などの当分野で知られている標準的な技術により本発明の抗体に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。このようにして、本発明の抗体のＣＤＲ領域における１つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置換することができ、変更された抗体は、本明細書に記載の機能的アッセイを使用して、保持機能（即ち、上記の機能）について試験することができる。
【００６９】
＜改造抗体及び修飾体(修飾抗体)＞
【００７０】
本発明の抗体は、本発明の抗ＰＤ−１抗体のＶＨ／ＶＬ配列の１つ以上を有する抗体を、修飾抗体を改造するための出発材料として使用して、調製することができる。抗体は、一方及び両方の可変領域（即ち、ＶＨ及び／又はＶＬ）、例えば、１つ以上のＣＤＲ領域及び／又は１つ以上のフレームワーク領域内の１つ以上の残基を修飾することにより改造され得る。追加及び代替として、抗体は、例えば、抗体のエフェクター機能を変更するために、定常領域内の残基を修飾することにより改造され得る。
【００７１】
特定の実施形態において、ＣＤＲ移植を採用して抗体の可変領域を改造することができる。抗体は、主に６つの重鎖及び軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）にあるアミノ酸残基を介して標的抗原と相互作用する。このため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲ外の配列よりも個々の抗体間で多様である。ＣＤＲ配列はほとんどの抗体−抗原相互作用の原因であるため、異なる特性を有する異なる抗体に由来のフレームワーク配列上に移植された特定の天然型抗体に由来のＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、特定の天然型抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９−１００３３、米国特許第５，２２５，５３９、５，５３０，１０１、５，５８５，０８９、５，６９３，７６２及び６，１８０，３７０）。
【００７２】
したがって、本発明の別の実施形態は、上記のような本発明の配列を含むＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、並びに／又は上記のような本発明の配列を含むＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分に関する。これらの抗体は本発明のモノクローナル抗体のＶＨ  ＣＤＲ配列及びＶＬ  ＣＤＲ配列を含むが、これらの抗体は、異なるフレームワーク配列を含んでいてよい。
【００７３】
このようなフレームワーク配列は、公共ＤＮＡデータベース又は生殖細胞系列抗体遺伝子配列を含む公開された参考文献から得られる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子のための生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖細胞系列配列データベース（インターネット上で利用可能：ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅ）、及びＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１），ｃｉｔｅｄ  ｓｕｐｒａ、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８、Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７−８３６から見出される。それぞれの内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。他の例として、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子のための生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースから見出される。例えば、以下のＨＣｏ７  ＨｕＭＡｂマウスで見出される重鎖生殖細胞系列配列は、付随のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号１−６９（ＮＧ−００１０１０９、ＮＴ−−０２４６３７＆ＢＣ０７０３３３）、３−３３（ＮＧ−−００１０１０９＆ＮＴ−−０２４６３７）及び３−７（ＮＧ−−００１０１０９＆ＮＴ−−０２４６３７）で入手可能である。他の例として、以下のＨＣｏ１２  ＨｕＭＡｂマウスで見出される重鎖生殖細胞系列配列は、付随のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号１−６９（ＮＧ−００１０１０９、ＮＴ−−０２４６３７＆ＢＣ０７０３３３）、５−５１（ＮＧ−−００１０１０９＆ＮＴ−−０２４６３７）、４−３４（ＮＧ−−００１０１０９＆ＮＴ−−０２４６３７）、３−３０．３（ＣＡＪ５５６６４４）＆３−２３（ＡＪ４０６６７８）で入手可能である。
【００７４】
抗体タンパク質配列は、当業者に周知であるＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴと呼ばれる配列類似性検索方法の１つを使用して、コンパイルされたタンパク質配列データベースと比較される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７），ｓｕｐｒａ）。
【００７５】
本発明の抗体で使用するための好ましいフレームワーク配列は、本発明の抗体で使用されるフレームワーク配列と構造的に類似するもの。ＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列は、フレームワーク配列が由来する生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子に見出される配列と同一の配列を有するフレームワーク領域に移植され得る。或いは、ＣＤＲ配列は、生殖細胞系列配列と比較して１つ以上の変異を含むフレームワーク領域に移植され得る。例えば、特定の例では、フレームワーク領域内の残基を変異させて抗体の抗原結合能力を維持及び強化することが有益であることが発見された（例えば、米国特許第５，５３０，１０１、５，５８５，０８９、５，６９３，７６２及び６，１８０，３７０）．
【００７６】
他の可変領域修飾のタイプは、内ＶＨ及び／又はＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３領域のアミノ酸残基を変異させることで目的抗体の１つ以上の結合特性（例えば、親和性）を向上させることである。部位特異的変異導入又はＰＣＲ媒介変異導入を実施して変異を導入することができ、抗体結合又は他の目的機能特性に対する影響は、本明細書に記載され、実施例に提供されているインビトロ又はインビボアッセイで評価することができる。好ましくは、保存的修飾（当分野で知られている）が導入されるのが好ましい。変異は、アミノ酸の置換、挿入又は欠失であり得るが、好ましくは置換である。さらに、典型的には、ＣＤＲ領域内の１つ、２つ、３つ、４つ及び５つ以下の残基が変更される。
【００７７】
したがって、別の実施形態において、本発明は、（ａ）本発明の配列、又は１つ、２つ、３つ、４つ、若しくは５つのアミノ酸の置換、欠失、若しくは付加を有するアミノ酸配列を含む、ＶＨ  ＣＤＲ１領域、（ｂ）本発明の配列、又は１つ、２つ、３つ、４つ、若しくは５つのアミノ酸の置換、欠失、若しくは付加を有するアミノ酸配列を含む、ＶＨ  ＣＤＲ２領域、（ｃ）本発明の配列、又は１つ、２つ、３つ、４つ、若しくは５つのアミノ酸の置換、欠失、若しくは付加を有するアミノ酸配列を含む、ＶＨ  ＣＤＲ３領域、（ｄ）本発明の配列、又は１つ、２つ、３つ、４つ、若しくは５つのアミノ酸の置換、欠失、若しくは付加を有するアミノ酸配列を含む、ＶＬ  ＣＤＲ１領域、（ｅ）本発明の配列、又は１つ、２つ、３つ、４つ、若しくは５つのアミノ酸の置換、欠失、若しくは付加を有するアミノ酸配列を含む、ＶＬ  ＣＤＲ２領域、及び（ｆ）本発明の配列、又は１つ、２つ、３つ、４つ、若しくは５つのアミノ酸の置換、欠失、若しくは付加を有するアミノ酸配列を含む、ＶＬ  ＣＤＲ３領域を含む、重鎖可変領域を含む、分離された抗ＰＤ−１モノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。
【００７８】
本発明の改造抗体は、例えば、抗体の特性を改善するためのＶＨ及び／又はＶＬにおけるフレームワーク残基に対する修飾を含む。典型的には、このようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を低下させるために行われる。例えば、１つのアプローチは、１つ以上のフレームワーク残基を対応する生殖細胞系列配列に「逆変異」させることである。より具体的には、体細胞変異を受けた抗体は、抗体が由来する生殖細胞系列配列と異なるフレームワーク残基を含み得る．このような残基は、前記抗体フレームワーク配列を前記抗体が由来する生殖細胞系列配列と比較することにより同定することができる。
【００７９】
他のフレームワーク修飾のタイプは、フレームワーク領域、又は１つ以上のＣＤＲ領域における１つ以上の残基をＴ細胞エピトープが除去されるように変異させることにより、抗体の潜在的な免疫原性を低下させることを含む。このアプローチは「脱免疫化」とも呼ばれ、米国特許公開第２００３０１５３０４３号に詳しく記載されている。
【００８０】
フレームワーク又はＣＤＲ領域内になされる修飾に加えて又はその代わりに、本発明の抗体は、本発明の抗体は、典型的には、抗体の１つ以上の機能特性、例えば、血清半減期、補体固定、Ｆｃ受容体結合、及び／及び抗原依存性細胞毒性を変えるために、Ｆｃ領域内の修飾を含むように改造されてもよい。さらに、本発明の抗体は、化学的に修飾されてもよく（例えば、１つ以上の化学的部分が抗体に取り付けられてもよく）、そのグリコシル化を変更するように修飾されてもよく、又は１つ以上の抗体の機能特性を変更するように修飾されてもよい。
【００８１】
一実施形態において、ヒンジ領域におけるシステイン残基の数が変更（例えば、増加又は減少）されるようにCH1のヒンジ領域を修飾する。このアプローチは米国特許第５，６７７，４２５号に詳しく記載されている。CH1のヒンジ領域のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖及び重鎖のアセンブリを促進するために、及び抗体の安定性を増加若しくは減少させるために変更される。
【００８２】
他の実施形態において、抗体のＦｃヒンジ領域を変異させることにより、生物学的半減期を短縮させる。より具体的には、Ｆｃヒンジ断片のCH2-CH3ドメイン界面領域に１つ以上のアミノ酸変異を導入することにより、抗体は、天然のＦｃヒンジドメインＳｐＡ結合と比較して、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）結合が低下する。このアプローチは米国特許第６，１６５，７４５号に詳しく記載されている。
【００８３】
さらに別の実施形態において、抗体のグリコシル化が修飾される。例えば、非グリコシル化抗体が作製される（即ち、抗体はグリコシル化を欠いている）。グリコシル化を変更することにより、例えば、抗原に対する抗体の親和性を高めることができる。このような炭水化物の修飾は、例えば、抗体配列における１つ以上のグリコシル化部位を変更することにより達成され得る。例えば、１つ以上のアミノ酸置換を導入することにより、１つ以上の可変領域フレームワークのグリコシル化部位を除去することで、その部位のグリコシル化を除去することができる。このようなグリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を高めることができる。例えば、米国特許第５，７１４，３５０号及び第６，３５０，８６１号を参照されたい。
【００８４】
追加及び代替として、フコシル残基の量が減少した低フコシル化抗体及び二分ＧｌｃＮａｃ構造が増加した抗体などのグリコシル化のタイプが変更された抗体を作製することができる。このような変更されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を高めることが実証されている。このような炭水化物の修飾は、例えば、抗体をグリコシル化機構が変更された宿主細胞で発現させることにより達成され得る。グリコシル化機構が変更された細胞は、当分野で記載されており、本発明の組換え抗体を発現することによりグリコシル化が変更された抗体を産生する宿主細胞として使用することができる。例えば、細胞株Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５及びＭｓ７０９は、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ＦＵＴ８（α（１，６）−フコシルトランスフェラーゼ）を欠いているため、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５及びＭｓ７０９細胞株で発現する抗体の炭水化物がフコースを欠いている。Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５及びＭｓ７０９  ＦＵＴ８−／−細胞株は、２つの置換ベクターを使用して、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞におけるＦＵＴ８遺伝子の標的破壊によって作製された（米国特許公開第２００４０１１０７０４及びＹａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ８７：６１４−２２を参照）。他の例として、ＥＰ１，１７６，１９５には、機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子（フコシルトランスフェラーゼをコードする）を持つ細胞株が記載されている。このような細胞株で発現される抗体は、α−１，６結合関連酵素を減少及び除去することにより低フコシル化を示す。ＥＰ１，１７６，１９５には、抗体のＦｃ領域に結合するか又は酵素活性を持たないＮ−アセチルグルコサミンにフコースを加える酵素活性が低い細胞株、例えば、ラット骨髄腫細胞株ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６６２）がさらに記載されている。ＰＣＴ公開ＷＯ０３／０３５８３５には、フコースをＡｓｎ（２９７）結合炭水化物に結合する能力が低下し、その宿主細胞で発現される抗体の低フコシル化ももたらすバリアントＣＨＯ細胞株であるＬｅｃ１３細胞が記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０を参照）。ＰＣＴ公開ＷＯ  ０６／０８９２３１に記載されているように、修飾されたグリコシル化プロファイルを有する抗体は鶏の卵でも産生され得る。或いは、修飾されたグリコシル化プロファイルを有する抗体は、レムナなどの植物細胞で産生され得る。植物系で抗体を産生する方法は、２００６年８月１１日に出願されたＡｌｓｔｏｎ＆Ｂｉｒｄ  ＬＬＰ代理人整理番号０４０９８９／３１４９１１に対応する米国特許出願に開示されています。ＰＣＴ公開ＷＯ９９／５４３４２には、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように改造された細胞株が記載されている。この改造された細胞株で発現された抗体は、増加した二分ＧｌｃＮａｃ構造を示し、これにより、抗体のＡＤＣＣ活性が増加する（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１８０を参照）。或い���、フコシダーゼ酵素により抗体のフコース残基を切り離すことができる。例えば、α−Ｌ−フコシダーゼは、抗体からフコシル残基を除去する（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：５５１６−２３）。
【００８５】
本発明の抗体の他の修飾はペグ化である。抗体をペグ化することにより、例えば抗体の生物学的（例えば血清）半減期を延長することができる。抗体をペグ化するために、１つ以上のＰＥＧ基が抗体及び抗体断片に結合する条件下で、抗体及びその断片を、典型的に、ＰＥＧの反応性エステル及びアルデヒド誘導体などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と反応させる。好ましくは、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（及び類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応及びアルキル化反応を介して行われる。本明細書で使用される「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−若しくはアリールオキシ−ポリエチレングリコール及びポリエチレングリコール−マレイミドなど、他のタンパク質を誘導体化するために使用されるＰＥＧの任意の形態を包含することを意図している。特定の実施形態において、ペグ化される抗体は非グリコシル化抗体である。タンパク質のペグ化方法は当分野で知られており、本発明の抗体に適用することができる。例えば、ＥＰＯ１５４３１６及びＥＰ０４０１３８４を参照されたい。
【００８６】
＜抗体の物理的性質＞
【００８７】
本発明の抗体は、それらの異なるクラスを検出及び／及び区別するために、それらの様々な物理的特性によって特徴付けられ得る。
【００８８】
例えば、抗体は、軽鎖又は重鎖可変領域のいずれかに１つ以上のグリコシル化部位を含み得る。このようなグリコシル化部位は、抗原結合の変化により、抗体の免疫原性の増加、及び抗体のｐＫの変化をもたらす可能性がある（Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ（１９７２）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ４１：６７３−７０２、Ｇａｌａ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（２００４）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７２：５４８９−９４、Ｗａｌｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６８：１０９９−１０９、Ｓｐｉｒｏ（２００２）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １２：４３Ｒ−５６Ｒ、Ｐａｒｅｋｈ  ｅｔ  ａｌ（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１６：４５２−７、Ｍｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３７：６９７−７０６）。グリコシル化は、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を含むモチーフで起こることが知られている。いくつかの例では、可変領域グリコシル化を含まない抗ＰＤ−１抗体を有することが好ましい。これは、可変領域にグリコシル化モチーフを含まない抗体を選択するか、又はグリコシル化領域内の残基を変異させることにより達成できる。
【００８９】
好ましい実施形態において、抗体にはアスパラギン異性部位が含まれない。アスパラギンの脱アミド化はＮ−Ｇ及びＤ−Ｇ配列で起こり、ポリペプチド鎖にキンクを導入し、その安定性を低下させるイソアスパラギン酸残基の生成をもたらす可能性がある（イソアスパラギン酸効果）。
【００９０】
各抗体には固有の等電点（ｐＩ）があり、一般的に６〜９．５のｐＨ範囲にある。ＩｇＧ１抗体のｐＩは典型的には７〜９．５のｐＨ範囲内にあり、ＩｇＧ４抗体のｐＩは典型的には６〜８のｐＨ範囲内にある。正常範囲外のｐＩを持つ抗体は、インビボ条件下でいくらかの展開及び不安定性を有する可能性があると推測されている。したがって、正常範囲にあるｐＩ値を含む抗PD-1抗体を有することが好ましい。これは、ｐＩが正常範囲の抗体を選択するか、又は帯電した表面残基を変異させることにより達成できる。
【００９１】
＜本発明の抗体をコードする核酸分子＞
【００９２】
他の態様において、本発明は、本発明の抗体の重鎖及び／又は軽鎖可変領域又はＣＤＲをコードする核酸分子を提供する。核酸は、細胞全体、細胞溶解物に存在し、又は部分的に精製された形若しくは実質的に純粋な形で存在し得る。核酸は、標準技術により他の細胞成分及び他の汚染物質、例えば他の細胞核酸及びタンパク質から精製されると、「分離」されるか、又は「実質的に純粋に」なる。本発明の核酸は、例えばＤＮＡ及びＲＮＡであり得、イントロン配列を含んでも含まなくてもよい。好ましい実施形態において、核酸はｃＤＮＡ分子である。
【００９３】
本発明の核酸は、標準的な分子生物学技術を使用して得ることができる。ハイブリドーマ（例えば、以下にさらに説明するように、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスから調製されたハイブリドーマ）によって発現される抗体の場合、ハイブリドーマによって作られた抗体の軽鎖及び重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準的なＰＣＲ増幅及びｃＤＮＡクローニング技術によって得られる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから得られた抗体の場合（例えば、ファージディスプレイ技術を使用する）、このような抗体をコードする核酸は、遺伝子ライブラリーから回収することができる。
【００９４】
本発明の好ましい核酸分子は、ＰＤ−１モノクローナル抗体のＶＨ配列及びＶＬ配列又はＣＤＲをコードする核酸分子を含む。ＶＨ及びＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られると、これらのＤＮＡ断片は、標準的な組換えＤＮＡ技術によってさらに操作することにより、例えば、可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子又はｓｃＦｖ遺伝子に変換することができる。これらの操作では、ＶＬ又はＶＨをコードするＤＮＡ断片は、抗体定常領域や柔軟なリンカーなどの、別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片に機能的に連結される。本明細書において、用語「機能的に連結される」は、２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームに保持されるように２つのＤＮＡ断片が連結されることを意味する。
【００９５】
ＶＨ領域をコードする分離されたＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に機能的に連結することにより、全長重鎖遺伝子に変換され得る。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当分野で知られており、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅により得られる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域であってもよくいが、最も好ましくは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４定常領域である。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子の場合、ＶＨコードＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする他のＤＮＡ分子に機能的に連結することができる。
【００９６】
ＶＬ領域をコードする分離されたＤＮＡは、ＶＬコードＤＮＡを軽鎖定常領域ＣＬをコードする他のＤＮＡ分子に機能的に連結することにより、全長軽鎖遺伝子（及びＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当業者で知られており、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅により得られる。好ましい実施形態において、軽鎖定常領域は、κ及びλ定常領域であり得る。
【００９７】
ｓｃＦｖ遺伝子を作製するために、ＶＨ及びＶＬコードＤＮＡ断片を柔軟なリンカー、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードする他の断片に機能的に連結することにより、ＶＨ及びＶＬ配列は、柔軟なリンカーを介してＶＬ及びＶＨ領域が結合された連続した一本鎖タンパク質として発現され得る（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４）。
【００９８】
＜本発明のモノクローナル抗体の調製＞
【００９９】
本発明のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、よく知られている体細胞ハイブリダイゼーション技術（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５）を使用して調製することができる。モノクローナル抗体を調製するための他の実施形態には、Ｂリンパ球のウイルス及び発がん性形質転換及びファージディスプレイ技術が含まれる。キメラ抗体及びヒト化抗体も当分野で周知である。例えば、米国特許第４，８１６，５６７、５，２２５，５３９、５，５３０，１０１、５，５８５，０８９、５，６９３，７６２及び６，１８０，３７０号を参照されたい。それらの内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０１００】
＜本発明のモノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの調製＞
【０１０１】
本発明の抗体は、例えば、組換えＤＮＡ技術と当分野で周知である遺伝子トランスフェクション方法との組み合わせにより宿主細胞トランスフェクトーマ内で産生することができる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２）。一実施形態において、標準的な分子生物学技術によって得られた部分及び全長軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡは、遺伝子が転写及び翻訳調節配列に機能的に連結されるように１つ以上の発現ベクターに挿入される。本明細書において、用語「機能的に連結される」とは、ベクター内の転写及び翻訳調制御列が抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節する意図された機能を果たすように抗体遺伝子がベクターに連結されることを意味する。
【０１０２】
用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー及び抗体鎖遺伝子の転写及び翻訳を制御する他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図している。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０））に記載されている。哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい調節配列には、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルス要素（例えば、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及び／及びエンハンサー（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）及びポリオーマ）が含まれる。或いは、ユビキチンプロモーターやβ−グロビンプロモーターなどの非ウイルス性調節配列を使用してもよい。さらに、調節要素は、異なる由来源からの配列から構成され、例えば、ＳＲαプロモーターシステムは、ＳＶ４０初期プロモーターとヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長い末端反復配列に由来する配列を含む（Ｔａｋｅｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６６−４７２）。発現ベクター及び発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選択される。
【０１０３】
抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子は、同じ又は別々の発現ベクターに挿入することができる。好ましい実施形態において、可変領域を使用して、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメントに機能的に連結され、ＶＬセグメントがベクター内のＣＬセグメントに機能的に連結されるように、可変領域を目的のアイソタイプの重鎖定常領域及び軽鎖定常領域を既にコードしている発現ベクターに挿入することにより、任意の抗体アイソタイプの全長抗体遺伝子を作製する。追加及び代替として、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるように、ベクターにクローニングされ得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド及び異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド）であり得る。
【０１０４】
本発明の組換え発現ベクターは、前記抗体鎖遺伝子及び調節配列に加えて、宿主細胞内のベクターの複製を調節する配列（例えば複製起点）及び選択マーカー遺伝子などの追加の配列を持ってもよい。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を促進する（例えば、米国特許第４，３９９，２１６、４，６３４，６６５及び５，１７９，０１７号）。例えば、典型的には、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキサートなどの薬剤に対する耐性を付与する。好ましい選択マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅を伴うｄｈｆｒ宿主細胞で使用）及びＮｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）を含む。
【０１０５】
軽鎖及び重鎖の発現のために、標準的な技術により発現ベクターをコードする重鎖及び軽鎖を宿主細胞にトランスフェクトする。用語「トランスフェクション」のさまざまな形態は、外因性ＤＮＡを原核生物及び真核生物の宿主細胞に導入するために一般的に使用される多種多様な技術（例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなど）を包含することを意図している。原核及び真核宿主細胞のいずれかで本発明の抗体を発現させることは理論的には可能であるが、真核細胞、最も好ましくは哺乳動物宿主細胞での抗体の発現が最も好ましい。これは、このような真核細胞、特に哺乳類細胞は、原核細胞よりも免疫学的活性を有する適切に折りたたまれた抗体を組み立てて分泌する可能性が高いためである。
【０１０６】
本発明の組換え抗体を発現するための好ましい哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ細胞）（ＤＨＦＲ選択マーカー（例えば、Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１）と共に使用されるｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０）を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２を含む。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞と共に使用するための別の好ましい発現系は、ＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６及びＥＰ３３８，８４１に開示されているＧＳ遺伝子発現系である。組換え発現ベクターをコードする抗体遺伝子が哺乳動物宿主細胞に導入された場合、抗体は、宿主細胞での抗体の発現、又は好ましくは宿主細胞が成長する培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間、宿主細胞を培養することにより産生される。標準的なタンパク質精製法により培地から抗体を回収することができる。
【０１０７】
＜免疫結合体(免疫コンジュゲート)＞
【０１０８】
本発明の抗体を治療薬に結合させて、抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）などの免疫結合体を形成することができる。適切な治療薬には、代謝拮抗剤、アルキル化剤、ＤＮＡマイナーグルーブバインダー、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ架橋剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、核外輸送阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼＩ及びＩＩ阻害剤、熱ショックタンパク質阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗生物質、及び抗有糸分裂剤が含まれる。ＡＤＣにおいて、抗体及び治療薬は、好ましくは、ペプチジル、ジスルフィド、及びヒドラゾンリンカーなどの切断可能なリンカーを介して結合される。より好ましくは、前記リンカーは、ペプチジルリンカー、例えば、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ、Ｃｉｔ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ、Ｓｅｒ又はＧｌｕである。ＡＤＣは、米国特許第７，０８７，６００、６，９８９，４５２及び７，１２９，２６１号、ＰＣＴ公開ＷＯ０２／０９６９１０、ＷＯ０７／０３８，６５８、ＷＯ０７／０５１，０８１、ＷＯ０７／０５９，４０４、ＷＯ０８／０８３，３１２及びＷＯ０８／１０３，６９３、米国特許公開第２００６００２４３１７、２００６０００４０８１及び２００６０２４７２９５号に記載のように調製され得る。これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０９】
＜二重特異性分子＞
【０１１０】
他の態様において、本開示は、少なくとも１つの他の機能分子に連結された本発明の１つ及び複数の抗体を含む二重特異性分子を特徴とする。前記他の機能分子は、例えば、少なくとも２つの異なる結合部位又は標的分子に結合する二重特異性分子を産生する他のペプチド又はタンパク質（例えば、受容体のための別の抗体及びリガンド）である。したがって、本明細書で使用される「二重特異性分子」には、３つ以上の特異性を有する分子が含まれる。
【０１１１】
一実施形態において、二重特異性分子は、抗Ｆｃ結合特異性及び抗ＰＤ−１結合特異性に加えて、第３特異性を有する。第３特異性は、抗エンハンスメント因子（ＥＦ）に対するものであり得る。前記抗エンハンスメント因子（Ｅ）は、例えば、細胞毒性活性に関与する表面タンパク質に結合し、これにより標的細胞に対する免疫応答を増強させる分子。例えば、前記抗エンハンスメント因子は、（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ４０又はＩＣＡＭ−１を介して）細胞毒性Ｔ細胞又は他の免疫細胞に結合することにより、標的細胞に対する免疫応答を増強させることができる。
【０１１２】
二重特異性分子は、多くの異なる形式及びサイズになり得る。サイズスペクトルにおいて、二重特異性分子は、同一の特異性を持つ２つの結合アームを有する代わりに、それぞれ異なる特異性を持つ２つの結合アームを有する以外、従来の抗体形式を保持する。もう１つの極端な例では、二重特異性分子は、ペプチド鎖、いわゆるＢｓ（ｓｃＦｖ）２構築物によって連結された２つの一本鎖抗体断片（scFv's）からなる。中間サイズの二重特異性分子には、ペプチジルリンカーによって連結された２つの異なるＦ（ａｂ）断片が含まれる。これら及び他の形式の二重特異性分子は、遺伝子工学、体細胞交雑、及び化学的方法によって調製することができる。例えば、Ｋｕｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ，ｃｉｔｅｄ  ｓｕｐｒａ，Ｃａｏ  ａｎｄ  Ｓｕｒｅｓｈ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９（６），６３５−６４４（１９９８），ａｎｄ  ｖａｎ  Ｓｐｒｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，２１（８），３９１−３９７（２０００）を参照されたい。これらの参考文献は本明細書に組み込まれる。
【０１１３】
＜医薬組成物＞
【０１１４】
他の態様において、本開示は、薬学的に許容される担体と共に製剤化された本発明の１つ以上の抗体を含む医薬組成物を提供する。この組成物は、他の抗体及び薬物などの１つ以上の追加の薬学的有効成分を任意に含有してもよい。本発明の医薬組成物はまた、例えば、別の免疫刺激剤、抗がん剤、抗ウイルス剤又はワクチンとの併用療法で投与することができる。抗ＰＤ−１抗体がワクチンに対する免疫応答を増強させる。
【０１１５】
医薬組成物は、任意の数の賦形剤を含み得る。使用できる賦形剤には、担体、界面活性剤、増粘剤及び乳化剤、固体バインダー、分散及び懸濁助剤、可溶化剤、着色剤、香味剤、コーティング剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味料、保存料、等張剤、及びそれらの組み合わせが含まれる。適切な賦形剤の選択と使用は、Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  Ｅｄ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ  ２００３）に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１６】
好ましくは、前記医薬組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄及び表皮投与（例えば、注射及び注入による）に適している。投与経路に応じて、活性化合物は、酸の作用及びそれを不活性化する可能性のある他の自然条件から保護するために材料でコーティングすることができる。本明細書で使用される「非経口投与」という用語は、通常は注射による、経腸及び局所投与以外の投与様式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、胸骨内注射及び注入を含むがこれらに限定されない。或いは、本発明の抗体は、局所、表皮及び粘膜投与経路などの非腸管外経路を介して、例えば鼻腔内、経口、膣内、直腸内、舌下及び局所的に投与することができる。
【０１１７】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される塩を含み得る。「薬学的に許容される塩」は、親化合物の所望の生物学的活性を保持しており、いかなる望ましくない毒物学的影響も与えない、塩を指す。このような塩の例には、酸付加塩及び塩基付加塩が含まれる。酸付加塩には、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などの無毒の無機酸に由来するもの、並びに、脂肪族モノカルボン酸及びジカルボン酸、フェニル置換されたアルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族スルホン酸及び芳香族スルホン酸などの無毒の有機酸に由来するものが含まれる。塩基付加塩には、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属に由来するもの、並びに、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどの無毒の有機アミンに由来するものが含まれる。
【０１１８】
医薬組成物は、滅菌水溶液及び分散液の形態であり得る。それらはまた、マイクロエマルジョン、リポソーム、及び高薬物濃度に適した他の秩序構造に製剤化することができます。
【０１１９】
担体材料と組み合わせて単一剤形を生成することができる有効成分の量は、治療される被験体及び特定の投与経路に応じて異なり、一般的に、治療効果を奏する組成物の量である。一般的には、有効成分と薬学的に許容される担体の合計１００％に対して、有効成分の量は、約０．０１％から約９９％、好ましくは約０．１％から約７０％、最も好ましくは約１％から約３０％である。
【０１２０】
投与計画は、最適な望ましい反応（例えば、治療反応）を提供するために調整される。例えば、単回ボーラスで投与してもよく、治療状況の緊急性によって経時的に分割された用量で投与してもよいか、又は用量を比例的に減少及び増加させてもよい。投与の容易さ及び投与量の均一性の観点から、投与単位形態で非経口組成物を製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される用量単位形態は、治療される被験体の単位用量として適した物理的に別個の単位を指す。各単位は、必要な医薬品担体に関連して所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性化合物を含む。あるいは、抗体を徐放性製剤として投与してもよく、この場合、投与頻度を減少させる必要がある。
【０１２１】
抗体の投与については、投与量は宿主体重の約０．０００１−１００ｍｇ／ｋｇ、より一般的には０．０１−５ｍｇ／ｋｇの範囲である。例えば、投与量は、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重、１０ｍｇ／ｋｇ体重又は１−１０ｍｇ／ｋｇであり得る。例示的な治療計画は、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１か月に１回、３か月に１回及び３〜６か月に１回の投与を伴う。本発明の抗ＬＡＧ−３抗体の好ましい投与計画には、１ｍｇ／ｋｇ体重及び３ｍｇ／ｋｇ体重での静脈内投与が含まれ、各薬剤は、投薬計画（ｉ）４週間に１回で６回後、３か月に１回、（ｉｉ）３週間に１回及び（ｉｉｉ）３ｍｇ／ｋｇ体重で１回後、１ｍｇ／ｋｇ体重で３週間に１回のうちの１種により同時に与えられる。いくつの方法では、投与量は、血漿抗体濃度が約１〜１０００μｇ／ｍｌ、いくつの方法では約２５〜３００μｇ／ｍｌとなるように調整される。
【０１２２】
本発明の抗ＰＤ−１抗体の「治療有効用量」は、好ましくは、疾患症状の重症度の低下、疾患の症状のない期間の頻度と時間の増加、又は疾患の苦痛による障害若しくは障害の予防をもたらす。例えば、腫瘍を有する被験体の治療のために、「治療有効用量」は、治療されていない被験体と比較して腫瘍の成長を、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、よりさらに好ましくは少なくとも約８０％阻害する。治療的化合物の治療的有効量は、被験体の腫瘍サイズを減少させるか、又は症状を改善することができる。被験体は、典型的にはヒト、他の哺乳動物であり得る。
【０１２３】
医薬組成物は、インプラント、経皮パッチ、及びマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤であり得る。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、ｃｏｌＬＡＧｅｎ、ポリオルトエステル、ポリ乳酸などの生分解性の生体適合性ポリマーを使用できる。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８を参照されたい。
【０１２４】
治療用組成物は、（１）無針皮下注射装置（例えば、米国特許第５，３９９，１６３、５，３８３，８５１、５，３１２，３３５、５，０６４，４１３、４，９４１，８８０、４，７９０，８２４及び４，５９６，５５６号）、（２）微量注入ポンプ（米国特許第４，４８７，６０３号）、（３）経皮デバイス（米国特許第４，４８６，１９４号）、（４）点滴装置（米国特許第４，４４７，２３３及び４，４４７，２２４号）、及び（５）浸透デバイス（米国特許第４，４３９，１９６及び４，４７５，１９６号）などの医療機器により投与することができる。これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２５】
特定の実施形態において、本発明のヒトモノクローナル抗体は、生体内での適切な分布が確保されるように製剤化することができる。例えば、本発明の治療用抗体が血液脳関門を通過することを確保するために、リポソームに製剤化することができ、特定の細胞及び器官への選択的輸送を促進する標的化部分をさらに含んでもよい。例えば、米国特許第４，５２２，８１１、５，３７４，５４８、５，４１６，０１６及び５，３９９，３３１号、Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５、Ｕｍｅｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８、Ｂｌｏｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５７：１４０、Ｍ．Ｏｗａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０、Ｂｒｉｓｃｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４、Ｓｃｈｒｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０、Ｋｅｉｎａｎｅｎ  ａｎｄ  Ｌａｕｋｋａｎｅｎ（１９９４）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３４６：１２３、並びにＫｉｌｌｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２７３を参照されたい。
【０１２６】
＜発明の使用及び方法＞
【０１２７】
本発明の抗体（組成物、二重特異性抗体、及び免疫結合体）は、例えばＰＤ−１の遮断による免疫応答の増強を伴う、インビトロ及びインビボでの多くの有用性を有する。このような抗体は、インビトロ及びエクスビボで培養中の細胞に投与でき、或いは様々な状況で免疫を強化するために、例えばインビボでヒト被験者に投与することができる。したがって、一態様において、本発明は、被験体における免疫応答が改変されるように本発明の抗体及びその抗原結合部分を被験体に投与するステップを含む、被験体における免疫応答を改変する方法を提供する。好ましくは、応答は、強化、刺激及びアップレギュレートされる。
【０１２８】
好ましい被験体は、免疫応答の増強を必要とするヒト被験体を含む。該方法は、免疫応答（例えば、Ｔ細胞媒介免疫応答）を増強することにより治療できる障害を有するヒト患者の治療に特に適している。特定の実施形態では、この方法はインビボでのがんの治療に特に適している。免疫の抗原特異的増強を達成するために、抗ＰＤ−１抗体を目的抗原と一緒に投与することができ、或いは抗原が治療被験体（例えば、担がん又はウイルス感染被験体）にすでに存在している可能性がある。ＰＤ−１に対する抗体を他の薬剤と一緒に投与する場合、両者は順序で及び同時に投与することができる。
【０１２９】
本発明の抗ＰＤ−１抗体の、ＰＤ−Ｌ１分子及び／又はＰＤ−Ｌ２分子へのＰＤ−１の結合を阻害する能力、並びに抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する能力を考慮すると、本発明はまた、抗体を使用して抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する、増強する、又は上方調節するための、インビトロ及びインビボでの方法を提供する。例えば、本発明は、前記Ｔ細胞を本発明の抗体と接触することにより抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激するステップを含む抗原特異的Ｔ細胞応答の刺激方法を提供する。抗原特異的Ｔ細胞応答の適切な指標のいずれかは、抗原特異的Ｔ細胞応答を測定するために使用できます。
【０１３０】
このような適切な指標の非限定的な例には、抗体の存在下でのＴ細胞増殖の増加及び／及び抗体の存在下でのサイトカイン産生の増加が含まれる。好ましい実施形態において、抗原特異的Ｔ細胞によるインターロイキン２の産生が刺激される。
【０１３１】
本発明は、本発明の抗体を被験体に投与することにより前記被験体において免疫応答（例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答）を刺激することを含む被験体における免疫応答（例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答）の刺激方法をさらに提供する。好ましい実施形態において、前記被験体は担がん被験体であり、腫瘍に対する免疫応答が刺激される。他の好ましい実施形態において、前記被験体はウイルス感染被験体であり、ウイルスに対する免疫応答が刺激される。
【０１３２】
他の実施形態において、本発明は、被験体に本発明の抗体を投与することにより被験体において腫瘍の成長を抑制することを含む被験体における腫瘍細胞の成長を抑制する方法を提供する。さらに別の実施形態において、本発明は、被験体に本発明の抗体を投与することにより被験体においてウイルス感染を治療することを含む被験体におけるウイルス感染の治療方法を提供する。
【０１３３】
本発明の上記方法及び他の方法の詳細は、後述する。
【０１３４】
＜がん＞
【０１３５】
抗体によるＰＤ−１の遮断は、患者のがん性細胞に対する免疫応答を増強させることができる。一態様において、本発明は、抗ＰＤ−１抗体を使用することによりがん性腫瘍の成長を抑制する被験体のインビボ治療に関する。抗ＰＤ−１抗体を単独で使用してがん性腫瘍の成長を阻害することができる。或いは、抗ＰＤ−１抗体は、後述のように、他の免疫原性薬剤、標準的ながん治療剤又は他の抗体と組み合わせて使用することができる。
【０１３６】
したがって、一実施形態において、本発明は、被験体に治療有効量の抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合部位を投与するステップを含む被験体における腫瘍細胞の成長を抑制する方法を提供する。好ましくは、前記抗体は、ヒト抗ＰＤ−１抗体（例えば、本明細書に記載の任意のヒト抗ヒトＰＤ−１抗体）である。追加的及び代替的に、抗体はキメラ及びヒト化抗ＰＤ−１抗体であり得る。
【０１３７】
本発明の抗体を使用することで成長が抑制され得る好ましいがんは、免疫療法に典型的に応答するがんを含む。治療のための好ましいがんの非限定的な例には、肺がん、リンパ腫、中皮腫、黒色腫、及び腎細胞がんが含まれる。さらに、本発明は、本発明の抗体を使用することにより成長が抑制され得る難治性及び再発性の悪性腫瘍を含む。
【０１３８】
本発明の方法によって治療可能ながんの他の例には、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚及び眼内の悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部がん、胃がん、精巣がん、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膣がん、外陰がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、急性骨髄性白血病を含む慢性及び急性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、小児固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎臓及び尿管がん、腎盂がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、表皮がん、扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストによって誘発されるものを含む環境的に誘発されるがん、及びこれらのがんの組み合わせが含まれる。本発明は、転移性がん、特にＰＤ−Ｌ１を発現する転移性がんの治療にも有用である（Ｉｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１３３−１４４）。
【０１３９】
必要に応じて、ＰＤ−１に対する抗体は、がん性細胞、精製腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチド、炭水化物分子を含む）、細胞、免疫刺激性サイトカインをコードする遺伝子がトランスフェクトされた細胞などの免疫原性薬剤と組み合わせることができる（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：４９１９−２８）。使用できる腫瘍ワクチンの非限定的な例には、メラノーマ抗原のペプチド、例えば、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ−２、ＭＡＲＴ１及び／又はチロシナーゼ、又はサイトカインＧＭ−ＣＳＦを発現するようにトランスフェクトされた腫瘍細胞のペプチドが含まれる。
【０１４０】
ＰＤ−１遮断は、ワクチン接種プロトコールと組み合わせた場合、より効果的である。腫瘍に対するワクチン接種のための多くの実験的な戦略が考案されている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．，２０００，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，ＡＳＣＯ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ  Ｓｐｒｉｎｇ：６０−６２、Ｌｏｇｏｔｈｅｔｉｓ，Ｃ．，２０００，ＡＳＣＯ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ  Ｓｐｒｉｎｇ：３００−３０２、Ｋｈａｙａｔ，Ｄ．２０００，ＡＳＣＯ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ  Ｓｐｒｉｎｇ：４１４−４２８、Ｆｏｏｎ，Ｋ．２０００，ＡＳＣＯ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ  Ｓｐｒｉｎｇ：７３０−７３８，Ｒｅｓｔｉｆｏ，Ｎ．ａｎｄ  Ｓｚｎｏｌ，Ｍ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｃｈ．６１，ｐｐ．３０２３−３０４３  ｉｎ  ＤｅＶｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），１９９７，Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）。これらの戦略の１つでは、自己及び同種の腫瘍細胞を使用してワクチンを調製する。これらの細胞ワクチンは、腫瘍細胞がＧＭ−ＣＳＦを発現するように形質導入されたときに最も効果的であることが示されている。ＧＭ−ＣＳＦは、腫瘍ワクチン接種のための抗原提示の強力な活性化剤であることが示されている（Ｄｒａｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：３５３９−４３）．
【０１４１】
様々な腫瘍における遺伝子発現及び大規模な遺伝子発現パターンの研究により、いわゆる腫瘍特異的抗原の定義がもたらされた（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，ＳＡ（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １０：２８１−７）．多くの場合、これらの腫瘍特異的抗原は、腫瘍及び腫瘍が発生した細胞で発現する分化抗原（例えば、メラノサイト抗原ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、及びＴｒｐ−２）である。さらに重要なことに、これらの抗原の多くは、宿主に見られる腫瘍特異的Ｔ細胞の標的であることが示されている。ＰＤ−１遮断は、これらのタンパク質に対する免疫応答を生成するために、腫瘍で発現した組換えタンパク質及び／及びペプチドのコレクションと組み合わせて使用できます。これらのタンパク質は通常、免疫系によって自己抗原とみなされるため、それらに対して耐性がある。腫瘍抗原には、染色体のテロメアの合成に必要なタンパク質テロメラーゼが含まれる場合があり、タンパク質テロメラーゼは８５％以上のヒト癌及び限られた数の体組織でのみ発現される（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：２０１１−２０１３）。これらの体組織は、様々な手段によって免疫攻撃から保護され得る。腫瘍抗原は、タンパク質配列の変化、又は２つの無関係な配列（即ち、フィラデルフィア染色体におけるｂｃｒ−ａｂｌ）間での融合タンパク質の形成を引き起こす体細胞変異のため、がん細胞で発現する「新抗原」又はＢ細胞腫瘍のイディオタイプでもある。
【０１４２】
他の腫瘍ワクチンは、ヒトのがんに関係するウイルス（例えば、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、肝炎ウイルス（ＨＢＶ及びＨＣＶ）、カポジヘルペス肉腫ウイルス（ＫＨＳＶ））に由来するタンパク質を含み得る。ＰＤ−１遮断物と併用できる腫瘍特異的抗原のもう１つの形態は、腫瘍組織自体から分離された精製熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）である。これらの熱ショックタンパク質は、腫瘍細胞からのタンパク質の断片を含み、これらのＨＳＰは、腫瘍免疫を誘発するための抗原提示細胞への送達において非常に効率的である（Ｓｕｏｔ＆Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：１５８５−１５８８、Ｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８：１１７−１２０）。
【０１４３】
樹状細胞（ＤＣ）は、抗原特異的応答を刺激するために使用できる強力な抗原提示細胞である。ＤＣはｅｘ  ｖｉｖｏで生成され、腫瘍細胞抽出物と同様に様々なタンパク質及びペプチド抗原を搭載することができる（Ｎｅｓｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４：３２８−３３２）。ＤＣは、これらの腫瘍抗原を発現させるための遺伝的手段によっても形質導入することができる。ＤＣは、免疫の目的で腫瘍細胞に直接融合されている（Ｋｕｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６：３３２−３３６）。ワクチン接種の方法として、ＤＣ免疫をＰＤ−１遮断と効果的に組み合わせて、より強力な抗腫瘍応答を活性化することができる。
【０１４４】
ＰＤ−１遮断は、標準的ながん治療と組み合わせることができる。ＰＤ−１遮断は、化学療法レジメンと効果的に組み合わせることができる。これらの場合、投与される化学療法剤の用量を減らすことが可能である（Ｍｏｋｙｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：５３０１−５３０４）。このような組み合わせの例は、黒色腫の治療のためのデカルバジンと組み合わせた抗ＰＤ−１抗体である。このような組み合わせの別の例は、黒色腫の治療のためのインターロイキン−２（ＩＬ−２）と組み合わせた抗ＰＤ−１抗体である。ＰＤ−１遮断と化学療法の併用の科学的根拠は、ほとんどの化学療法化合物の細胞毒性作用の結果である細胞死が、抗原提示経路の腫瘍抗原レベルの増加をもたらすことである。細胞死によるＰＤ−１遮断との相乗効果をもたらすことができる他の併用療法は、放射線、外科手術、及びホルモン除去である。これらのプロトコルのそれぞれにより、宿主において腫瘍抗原のソースが形成される。血管新生阻害剤は、ＰＤ−１遮断物と組み合わせることができる。血管新生の阻害は、腫瘍抗原を宿主抗原提示経路に供給する腫瘍細胞死を引き起こす。
【０１４５】
腫瘍は多種多様なメカニズムにより宿主の免疫監視を回避することができる。これらのメカニズムの多くは、腫瘍によって発現される免疫抑制性のあるタンパク質の不活性化によって克服することができる。これらのタンパク質は、特にＴＧＦ−β（Ｋｅｈｒｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６３：１０３７−１０５０）、ＩＬ−１０（Ｈｏｗａｒｄ＆Ｏ’Ｇａｒｒａ（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １３：１９８−２００）、及びＦａｓリガンド（Ｈａｈｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：１３６３−１３６５）を含む。これらの各実体に対する抗体を抗ＰＤ−１と組み合わせて使用することにより、免疫抑制剤の効果を打ち消し、宿主による腫瘍免疫応答を促進することができる。
【０１４６】
宿主免疫応答性を活性化する他の抗体は、抗ＰＤ−１と組み合わせて使用することができる。これらの抗体は、ＤＣ機能と抗原提示を活性化する樹状細胞の表面上の分子を含む。抗ＣＤ４０抗体は、Ｔ細胞ヘルパー活性を効果的に置換することができ（Ｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：４７４−４７８）、ＰＤ−１抗体と組み合わせて使用できる（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１（５）５２７−４０）。ＣＴＬＡ−４（例えば、米国特許第５，８１１，０９７号）、ＯＸ−４０（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４：２１６０−２１６９）、４−１ＢＢ（Ｍｅｌｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３：６８２−６８５（１９９７）及びＩＣＯＳ（Ｈｕｔｌｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ３９７：２６２−２６６）などのＴ細胞共刺激分子に対する活性化抗体は、Ｔ細胞活性化のレベルを高めることができる。
【０１４７】
腫瘍に対する抗原特異的Ｔ細胞を刺激するために、抗原特異的Ｔ細胞のエクスビボ活性化及び拡大ならびにこれらの細胞のレシピエントへの養子移入を含むいくつかの実験的治療プロトコルもある（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ＆Ｒｉｄｄｅｌｌ（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：５４６−５１）。これらの方法は、ＣＭＶなどの感染性因子に対するＴ細胞応答を活性化するためにも使用できる。抗ＰＤ−１抗体の存在下でのエクスビボ活性化は、養子移入されたＴ細胞の頻度と活性を増加させることができる。
【０１４８】
＜感染症＞
【０１４９】
本発明の他の方法は、特定の毒素及び病原体に曝露された患者を治療するために使用される。したがって、本発明の他の態様は、被験体に抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合部分を投与することにより前記被験体の感染症を治療することを含む被験体における感染症の治療方法を提供する。好ましくは、抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体である。
【０１５０】
上記で論じたような腫瘍へのその適用と同様に、抗体媒介性のＰＤ−１遮断を、単独で、又はワクチンと組み合わせてアジュバントとして使用して、病原体、毒素、及び自己抗原に対する免疫応答を刺激することができる。この治療アプローチが特に有用であり得る病原体の例には、効果的なワクチンが現在存在していない病原体、又は従来のワクチンが完全に効果的ではない病原体が含まれる。これらには、限定はしないが、ＨＩＶ、肝炎（Ａ型、Ｂ型、及びＣ型）、インフルエンザ、ヘルペス、ジアルジア、マラリア、リーシュマニア、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）が含まれる。
【０１５１】
＜併用療法＞
【０１５２】
他の態様において、本発明は、併用療法を提供する。この併用療法では、本発明の抗ＰＤ−１抗体（又はその抗原結合部分）を免疫応答の刺激に有効な１つ以上の追加抗体と同時に投与することにより、被験体における免疫応答をさらに増強、刺激又はアップレギュレートする。一実施形態において、本発明は、被験体における免疫応答を刺激する方法を提供する。この方法は、被験体に抗ＰＤ−１抗体及び１つ以上の追加の免疫刺激抗体（例えば、抗ＬＡＧ−３抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体及び／又は抗ＣＴＬＡ−４抗体）を同時に投与することにより、被験体において免疫応答を刺激する（例えば、腫瘍成長を抑制するか、又は抗ウイルス応答を刺激する）ことを含む。
【０１５３】
別の実施形態において、本発明は、腫瘍の成長が阻害されるように、抗ＰＤ−１抗体、並びに、抗ＬＡＧ−３抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、及び／又は抗ＣＴＬＡ−４抗体などの１つ以上の追加の免疫刺激抗体を被験体に投与することを含む、過剰増殖性疾患（例えば、がん）を治療するための方法を提供する。
【０１５４】
抗体による、ＰＤ−１、並びにＣＴＬＡ−４及び／又はＬＡＧ−３及び／又はＰＤ−Ｌ１などの１つ以上の第２の標的抗原の遮断は、患者におけるがん性細胞に対する免疫応答を増強し得る。その成長が本開示の抗体を使用して阻害され得るがんには、免疫療法に対して典型的に応答性のがんが含まれる。本開示の併用療法で治療するためのがんの代表的な例には、抗ＰＤ−１抗体での単剤療法についての考察において上記で具体的に列挙されているがんが含まれる。
【０１５５】
特定の実施形態において、本明細書において論じられる治療用抗体の組み合わせは、薬学的に許容される担体中の単一の組成物として同時に、又は薬学的に許容される担体中の各抗体を有する別個の組成物として同時に、投与することができる。別の実施形態において、治療用抗体の組み合わせは、連続的に投与することができる。
【０１５６】
さらに、２以上の用量の併用療法を連続的に投与する場合、連続投与の順序は、投与の各時点で逆になっても同一の順序で維持されてもよく、連続投与は同時投与であり得るか、又はこれらのあらゆる組み合わせであり得る。
【０１５７】
組み合わされたＰＤ−１並びにＣＴＬＡ−４及び／又はＬＡＧ−３及び／又はＰＤ−Ｌ１の遮断はまた、標準的ながん治療とさらに組み合わせることができる。例えば、組み合わされたＰＤ−１並びにＣＴＬＡ−４及び／又はＬＡＧ−３及び／又はＰＤ−Ｌ１の遮断は、化学療法レジメと効果的に組み合わせることができる。これらの場合において、本開示の組み合わせと投与される他の化学療法試薬の用量を低減させることが可能である（Ｍｏｋｙｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：５３０１−５３０４）。
【０１５８】
他の例においた、抗ＰＤ−１と抗ＣＴＬＡ−４及び／又は抗ＬＡＧ−３抗体及び／又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体の組み合わせは、抗腫瘍性抗体と組み合わせて使用することができる。前記抗腫瘍性抗体は、例えば、ＲｉｔｕｘａｎＴＭ（リツキシマブ）、ＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭ（トラスツズマブ）、ＢｅｘｘａｒＴＭ（トシツモマブ）、ＺｅｖａｌｉｎＴＭ（イブリツモマブ）、ＣａｍｐａｔｈＴＭ（アレムツズマブ）、ＬｙｍｐｈｏｃｉｄｅＴＭ（パーツズマブ）、ＡｖａｓｔｉｎＴＭ（ベバシズマブ）及びＴａｒｃｅｖａＴＭ（エルロチニブ）などである。理論に拘束されない一例としてと、抗がん抗体及び毒素に結合した抗がん抗体による治療は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１及びＬＡＧ−３によって媒介される免疫応答を強化するがん細胞死（例、腫瘍細胞）を引き起こすことができる。例示的な実施形態では、過剰増殖性疾患（例えば、がん腫瘍）の治療は、抗ＰＤ−１、抗ＣＴＬＡ−４及び／及び抗ＬＡＧ−３及び／及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせた抗癌抗体を同時、順次、及びそれらの任意の組み合わせで含むことができ、これにより、宿主による抗腫瘍免疫応答を強化することができる。
【０１５９】
腫瘍は多種多様なメカニズムにより宿主の免疫監視を回避する。これらのメカニズムの多くは、腫瘍によって発現される免疫抑制性のあるタンパク質の不活性化によって克服することができる。これらのタンパク質は、特にＴＧＦ−β（Ｋｅｈｒｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６３：１０３７−１０５０）、ＩＬ−１０（Ｈｏｗａｒｄ＆Ｏ’Ｇａｒｒａ（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １３：１９８−２００）、及びＦａｓリガンド（Ｈａｈｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：１３６３−１３６５）を含む。他の例では、。これらの各実体に対する抗体を抗ＰＤ−１、抗ＣＴＬＡ−４及び／又は抗ＬＡＧ−３及び／又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせて使用することにより、免疫抑制剤の効果を打ち消し、宿主による抗腫瘍免疫応答を促進することができる。
【０１６０】
宿主免疫応答性を活性化する他の抗体は、抗ＰＤ−１、抗ＣＴＬＡ−４及び／又は抗ＬＡＧ−３及び／又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体の組み合わせと組み合わせて使用することができる。これらの抗体は、ＤＣ機能と抗原提示を活性化する樹状細胞の表面上の分子を含む。抗ＣＤ４０抗体（Ｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ）は、抗ＬＡＧ−３、抗ＣＴＬＡ−４及び／又は抗ＰＤ−１及び／又は抗ＰＤ−Ｌ１の組み合わせと組み合わせて使用できる（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ）。Ｔ細胞共刺激分子に対する他の活性化抗体（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ，Ｍｅｌｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．ｓｕｐｒａ，Ｈｕｔｌｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ）もＴ細胞活性化レベルを高めることができる。
【０１６１】
腫瘍に対する抗原特異的Ｔ細胞を刺激するために、抗原特異的Ｔ細胞のエクスビボ活性化及び拡大ならびにこれらの細胞のレシピエントへの養子移入を含むいくつかの実験的治療プロトコルもある（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ＆Ｒｉｄｄｅｌｌ，ｓｕｐｒａ）。これらの方法は、ＣＭＶなどの感染性因子に対するＴ細胞応答を活性化するためにも使用できる。抗ＬＡＧ−３、抗ＣＴＬＡ−４及び／又は抗ＰＤ−１及び／又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体の存在下でのエクスビボ活性化は、養子移入されたＴ細胞の頻度と活性を増加させることができる。
【０１６２】
本開示は、以下の実施例によりさらに説明されるが、これらの実施例はさらなる限定と解釈されるべきではない。本出願を通して引用されたすべての図及びすべての参考文献、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、特許及び公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【０１６３】
［実施例］
［実施例１］
ファージのパンニング、スクリーニング、及び親和性成熟
ファージライブラリー
抗体一本鎖ファージディスプレイライブラリーを、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）のレパートリーをクローニングすることによって作成した。重鎖レパートリー及び軽鎖レパートリーを、末梢血から主に回収したヒトリンパ球からのＰＣＲ増幅によって作成した。ＶＬレパートリー及びＶＨレパートリーを混合し、オーバーラッププライマーを用いるＰＣＲにかけた。抗体の最終フォーマットは、ＶＨ断片及びＶＬ断片を有する一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）に、可撓性のリンカーペプチド（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６０））が連結したものであった。
【０１６４】
ヒトＰＤ−１に対するファージライブラリーパンニング
【０１６５】
特異的ｓｃＦｖ断片を提示するファージ粒子の選択を、Ｉｍｍｕｎｏ  ９６  ＭｉｃｒｏＷｅｌｌＴＭプレート（Ｎｕｎｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ）で行った。まず、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の５０μｇ／ｍｌのＰＤ−１組換えタンパク質（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＰＤ１−Ｈ５２２１）を、プレートに一晩、４℃でコーティングした。ＰＢＳ（２％ＭＰＢＳ）中の２％（ｗ／ｖ）ミルクパウダーでブロッキングした後、約１０１１個のファージ粒子を含有するライブラリーを添加し、プレートを２時間、室温（ＲＴ、２５〜２８℃）でインキュベートした。プレートを、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で１０〜２０回洗浄し、その後、ＰＢＳで１０〜２０回洗浄することによって、結合していないファージを除去した。結合したファージを、５０μｌの１μｇ／μｌトリプシンと１０分間、その後、ｐＨ２．０の５０μｌの５０ｍＭグリシン−ＨＣｌとインキュベーションすることによって溶出した（１０分後に、ｐＨ７．５の５０μｌの２００ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４ですぐに中和した）。４ラウンドのパンニングを行った。
【０１６６】
ファージスクリーニング
【０１６７】
３ラウンド目及び４ラウンド目のパンニングから、ファージをピックアップし、ヒトＰＤ−１の結合について試験した。具体的には、ヒトＰＤ−１（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＰＤ１−Ｈ５２２１）を０．１μｇ／ｍＬで９６ウェルプレートにコーティングし、単一クローンファージをプレートに添加した。次いで、結合していないファージを洗い流し、結合したファージを、抗Ｍ１３二次抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ５０３７０）によって検出した。
【０１６８】
ＥＬＩＳＡ陽性クローンをシーケンシングし、そこから、クローン２１Ｆ１２、１６Ｂ２、１６Ｃ１、１９Ｅ１１、及び４５Ｅ２を含む５つの固有の配列を同定した。抗ＰＤ−１抗体２１Ｆ１２の重鎖／軽鎖可変領域のアミノ酸配列のＩＤ番号を上記の表１に示す。
【０１６９】
親和性成熟
【０１７０】
クローン２１Ｆ１２由来の抗体の結合親和性を向上させるために、ＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ３についての２つのファージライブラリーをパンニングのために構築した。３ラウンドのパンニングの後、バリアントを、ヒトＰＤ−１（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＰＤ１−Ｈ５２２１）への正の結合についてＥＬＩＳＡスクリーニングによって試験した。正のバリアントのオフ速度ランキングを、Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ  ９６（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）によって決定した。オフ速度が向上したクローンを取り出し、分析のために完全長ＩｇＧに変換した。バリアント抗ＰＤ−１抗体２１Ｆ１２−１Ｂ１２、２１Ｆ１２−１Ｅ１１、２１Ｆ１２−２Ｅ１、２１Ｆ１２−２Ｈ７、２１Ｆ１２−１Ｃ４、２１Ｆ１２−１Ｅ１０、２１Ｆ１２−１Ｆ６、及び２１Ｆ１２−３Ｇ１の重鎖／軽鎖のアミノ酸配列のＩＤ番号もまた、上記の表１にまとめた。
【０１７１】
各抗ＰＤ−１抗体の重鎖及び軽鎖をコードするヌクレオチド配列を、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入し、ここで、抗体は、配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有する突然変異体ＩｇＧ１定常領域、及び配列番号２０で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域を含有していた。ベクターを、ＥｘｐｉＣＨＯＴＭ発現系（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を製造者の指示に従って使用して、ＣＨＯ−Ｓ細胞にコトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞をＥｘｐｉＣＨＯＴＭ発現培地において１２日間培養し、次いで、培養上清を採取し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での精製に送った。
【０１７２】
［実施例２］
抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の物理的及び化学的特性
クローン２１Ｆ１２由来の抗体をサイズ排除クロマトグラフィーで試験した。特に、２０μｇのサンプルを、１００ｍＭのリン酸ナトリウム＋１００ｍＭのＮａ２ＳＯ４（ｐＨ７．０）をランニングバッファーとして使用して、ＴＳＫ  Ｇ３０００ＳＷＸＬカラムに注入した。ラン時間は２９分間であった。全ての測定は、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２２０  ＨＰＬＣで行った。データを、ＯｐｅｎＬＡＢソフトウェアを使用して分析した。
【０１７３】
図１に示すように、抗体２１Ｆ１２のメインピークはＳＥＣにおいて９５％を超えており、このことは、精製された抗体の高い純度及び完全性を示唆している。
【０１７４】
［実施例３］
抗ＰＤ−１抗体はヒトＰＤ−１に結合した
ＥＬＩＳＡアッセイを行って、ヒトＰＤ−１への抗体の相対的結合能力を決定した。
【０１７５】
ヒトＰＤ−１タンパク質（ＳＩＮＯ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．、カタログ番号１０３７７−Ｈ０８Ｈ−１００）を、一晩、４℃、２５ｎｇ／ウェルでインキュベートすることによって、９６ウェルプレートに固定した。プレートを次いで、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡと１時間、３７℃でインキュベートすることによって、ブロッキングした。ブロッキングした後、プレートを、ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）で３回洗浄した。連続希釈した抗ＰＤ−１抗体（配列番号１８の突然変異体ＩｇＧ１定常領域を有する）又はヒトＩｇＧコントロール（配列番号６１及び６２で示される重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を使用して、米国特許出願第２０１９００１６８００Ａ１号に従って調製された）を、結合バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０及び０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳ）中で調製し、固定されたタンパク質と１時間、３７℃でインキュベートした。結合した後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、１時間、３７℃で、結合バッファー中に１／２００００希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−０３５−０９７）とインキュベートし、再度洗浄し、ＴＭＢ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号３４０２８）で１５分間可視化し、次いで、１ＭのＨ２ＳＯ４で停止させた。各プレートウェルは、各ステップで５０μＬの溶液を含有していた。
【０１７６】
４５０ｎｍ〜６２０ｎｍでの吸光度を決定した。ヒトＰＤ−１に結合している抗体についてのＥＣ５０値及び結合曲線を図２Ａから図２Ｄに示し、これは、本発明の抗ＰＤ−１抗体がヒトＰＤ−１に特異的に結合したことを示唆している。
【０１７７】
［実施例４］
抗ＰＤ−１抗体はヒト及びカニクイザルＰＤ−１に結合した
ＥＬＩＳＡアッセイを行って、組換えヒト、カニクイザル、及びマウスＰＤ−１への抗体の相対的結合活性を決定した。
【０１７８】
ヒトＰＤ−１タンパク質（ＳＩＮＯ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．、カタログ番号１０３７７−Ｈ０８Ｈ−１００）、カニクイザルＰＤ−１タンパク質（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＰＤ１−Ｃ５２２３）、又はマウスＰＤ−１タンパク質（ＳＩＮＯ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．、カタログ番号５０１２４−Ｍ０８Ｈ）を、一晩、４℃、２５ｎｇ／ウェルでインキュベートすることによって、９６ウェルプレートに固定した。プレートを次いで、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡと１時間、３７℃でインキュベートすることによって、ブロッキングした。ブロッキングした後、プレートを、ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）で３回洗浄した。連続希釈したニボルマブ類似体（ポジティブコントロールとして使用され、配列番号６３及び６４で示される重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を使用して調製された）、抗ＰＤ−１抗体２１Ｆ１２−１Ｆ６（配列番号１８の突然変異体ＩｇＧ１定常領域を有する）、ヒトＩｇＧコントロール（実施例３において調製された通り）を、結合バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０及び０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳ）中で調製し、固定されたタンパク質と１時間、３７℃でインキュベートした。結合した後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、１時間、３７℃で、結合バッファー中に１／２００００希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−０３５−０９７）とインキュベートし、再度洗浄し、ＴＭＢ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号３４０２８）で１５分間可視化し、次いで、１ＭのＨ２ＳＯ４で停止させた。各プレートウェルは、各ステップで５０μＬの溶液を含有していた。
【０１７９】
４５０ｎｍ〜６２０ｎｍでの吸光度を決定した。ヒトＰＤ−１、カニクイザルＰＤ−１、又はマウスＰＤ−１に結合している抗体についてのＥＣ５０値及び結合曲線を図３Ａから３Ｃに示した。データは、抗ＰＤ−１抗体２１Ｆ１２−１Ｆ６がヒト及びサルＰＤ−１に特異的に結合したが、マウスＰＤ−１には結合しなかったことを示唆した。特に、抗体２１Ｆ１２−１Ｆ６は、ニボルマブ類似体と比較して低いＥＣ５０値でサルＰＤ−１に結合した。
【０１８０】
［実施例５］
ヒト及びカニクイザルＰＤ−１タンパク質に対する抗ＰＤ−１抗体の結合親和性
ヒトＰＤ−１及びカニクイザルＰＤ−１に対する抗体２１Ｆ１２−１Ｆ６の動態結合活性を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｘ１００システム（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した。
【０１８１】
簡潔に述べると、固定バッファー（１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５）中の５０μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＦｃγ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏカタログ番号１０９−００５−０９８）をフローセルに注入し、８００８．５ＲＵの固定レベルを得た。抗ＰＤ−１抗体２１Ｆ１２−１Ｆ６（配列番号１８の突然変異体ＩｇＧ１定常領域を有する）とランニングバッファー（ＨＢＳ−ＥＰ＋バッファー）とを、５μＬ／分の流量でフローセルに注入した。１２．５ｎＭから２００ｎＭの範囲の様々な濃度のヒトＰＤ−１−ｈｉｓタンパク質（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＰＤ１−Ｈ５２２１）を、ランニングバッファー中での希釈を用いて調製した。各濃度のヒトＰＤ−１タンパク質を、３０μＬ／分の流量で１２０秒間の結合領域にわたり注入し、その後、５００秒間解離させた。各サイクルの後、ＣＭ５チップ表面を、１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ１．５）を３０μＬ／分の流量で３０秒間注射して再生させた。バックグラウンド除去結合センサーグラムを使用して結合速度Ｋａ及び解離速度Ｋｄを分析し、それに応じて平衡解離定数ＫＤを計算した。得られたデータセットを、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｘ１００評価ソフトウェアを使用して１：１ラングミュア結合モデルにフィットさせた。
【０１８２】
サルＰＤ−１の結合では、固定バッファー（１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５）中の５０μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＦｃγ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏカタログ番号１０９−００５−０９８）をフローセルに注入し、７８０７．１ＲＵの固定レベルを得た。抗ＰＤ−１抗体２１Ｆ１２−１Ｆ６とランニングバッファー（ＨＢＳ−ＥＰ＋バッファー）とを、５μＬ／分の流量でフローセルに注入した。１２．５ｎＭから２００ｎＭの範囲の様々な濃度のカニクイザルＰＤ−１−ｈｉｓタンパク質（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＰＤ１−Ｃ５２２３）を、ランニングバッファー中での希釈を用いて調製した。各濃度のカニクイザルＰＤ−１タンパク質を、３０μＬ／分の流量で１２０秒間の結合領域にわたり注入し、その後、５００秒間解離させた。各サイクルの後、ＣＭ５チップ表面を、１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ１．５）を３０μＬ／分の流量で３０秒間注射して再生させた。バックグラウンド除去結合センサーグラムを使用して結合速度Ｋａ及び解離速度Ｋｄを分析し、それに応じて平衡解離定数ＫＤを計算した。得られたデータセットを、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｘ１００評価ソフトウェアを使用して１：１ラングミュア結合モデルにフィットさせた。
【０１８３】
以下の表２は、ヒトＰＤ−１タンパク質及びカニクイザルＰＤ−１タンパク質に対する抗ＰＤ−１抗体２１Ｆ１２−１Ｆ６の結合親和性をまとめたものである。
【０１８４】
【表２】
2021523949.tif 000003
【０１８５】
［実施例６］
抗ＰＤ−１抗体は、ヒトＩＣＯＳ、ヒトＣＤ２８、ヒトＣＴＬＡ−４、又はヒトＢＴＬＡと交差反応しなかった
ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、組換えヒトＩＣＯＳ、ヒトＣＤ２８、ヒトＣＴＬＡ４、及びヒトＢＴＬＡに対する抗ＰＤ−１抗体の結合活性を決定した。
【０１８６】
ヒトＩＣＯＳ（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＩＣＳ−Ｈ５２５０）、ヒトＣＤ２８（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１１５２４−Ｈ０２Ｈ）、ヒトＣＴＬＡ−４（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＣＴ４−Ｈ５２２９）、又はヒトＢＴＬＡ（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＢＴＡ−Ｈ５２Ｅ０）を、一晩、４℃、２５ｎｇ／ウェルでインキュベートすることによって、９６ウェルプレートに固定した。プレートを次いで、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡと１時間、３７℃でインキュベートすることによって、ブロッキングした。ブロッキングした後、プレートを、ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）で３回洗浄した。連続希釈したニボルマブ類似体（実施例４において調製された通り）、２１Ｆ１２−１Ｆ６（配列番号１８の突然変異体ＩｇＧ１定常領域を有する）、及びヒトＩｇＧコントロール（実施例３において調製された通り）を、結合バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０及び０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳ）中で調製し、固定されたタンパク質と１時間、３７℃でインキュベートした。結合した後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、１時間、３７℃で、結合バッファー中に１／２００００希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−０３５−０９７）とインキュベートし、再度洗浄し、ＴＭＢ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号３４０２８）で１５分間可視化し、次いで、１ＭのＨ２ＳＯ４で停止させた。各プレートウェルは、各ステップで５０μＬの溶液を含有していた。
【０１８７】
４５０ｎｍ〜６２０ｎｍでの吸光度を決定した。ヒトＩＣＯＳ、ヒトＣＤ２８、ヒトＣＴＬＡ４、及びヒトＢＴＬＡに結合している抗体の代表的な結合曲線を図４Ａから図４Ｄにそれぞれ示した。データは、抗ＰＤ−１抗体２１Ｆ１２−１Ｆ６が、試験した通りのタンパク質に結合しなかったことを示した。
【０１８８】
［実施例７］
抗ＰＤ１抗体は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２との相互作用を遮断した
抗ＰＤ−１抗体の、ヒトＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２へのヒトＰＤ−１の結合を阻害する能力を評価するために、ＥＬＩＳＡ遮断アッセイを行った。
【０１８９】
ヒトＰＤ−１（Ｌｅａｄｓｂｉｏｌａｂｓにおいて調製され、配列番号６６で示されるＮＰ＿００５００９．２のアミノ酸配列）を、一晩、４℃、２５ｎｇ／ウェルでインキュベートすることによって、９６ウェルプレートに固定した。非特異的結合部位を、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡと１時間、３７℃でインキュベートすることによってブロッキングした。ブロッキングした後、プレートを、ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）で３回洗浄した。連続希釈したニボルマブ類似体（実施例４において調製された通り）、抗ＰＤ−１  ２１Ｆ１２抗体（全て、配列番号１８の突然変異体ＩｇＧ１定常領域を有する）、及びヒトＩｇＧコントロール（実施例３において調製された通り）を、結合バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０及び０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳ）中で調製し、同一容積で０．８μｇ／ｍＬで調製されたヒトＰＤ−Ｌ１−マウスＦｃタグ（Ｌｅａｄｓｂｉｏｌａｂｓにおいて調製された、配列番号６５で示されるアミノ酸配列）と混合し、次いで、得られた混合物を、固定されたタンパク質と１時間、３７℃でインキュベートした。その後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、１時間、３７℃で、結合バッファー中に１／１００００希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス−Ｆｃ  ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１５−０３５−１６４）とインキュベートし、再度洗浄し、ＴＭＢ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号３４０２８）で１５分間可視化し、次いで、１ＭのＨ２ＳＯ４で停止させた。各プレートウェルは、各ステップで５０μＬの溶液を含有していた。
【０１９０】
４５０ｎｍ〜６２０ｎｍでの吸光度を決定した。これらの抗体についての代表的な結合曲線及びＩＣ５０値を図５Ａから図５Ｅに示した。結果は、本発明の抗ＰＤ−１抗体がヒトＰＤ１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用を遮断したことを示した。
【０１９１】
同様に、１００ｎｇ／ウェルのヒトＰＤ−１（Ｌｅａｄｓｂｉｏｌａｂｓにおいて調製された、配列番号６６で示されるアミノ酸配列）を、一晩、４℃でインキュベートすることによって、９６ウェルプレートに固定した。非特異的結合部位を、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡと１時間、３７℃でインキュベートすることによってブロッキングした。ブロッキングした後、プレートを、ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）で３回洗浄した。連続希釈したニボルマブ類似体（実施例４において調製された通り）、２１Ｆ１２−１Ｆ６（配列番号１８の突然変異体ＩｇＧ１定常領域を有する）、及びヒトＩｇＧコントロール（実施例３において調製された通り）を、結合バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０及び０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳ）中で調製し、同一容積で０．８μｇ／ｍＬで調製されたヒトＰＤ−Ｌ２−ｈｉｓタグ（ＳＩＮＯ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ、カタログ番号１０２９２−Ｈ０８Ｈ）と混合し、次いで、得られた混合物を、固定されたタンパク質と１時間、３７℃でインキュベートした。その後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、１時間、３７℃で、結合バッファー中に１／５０００希釈したペルオキシダーゼ標識マウス抗ｈｉｓタグ抗体（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、カタログ番号Ａ００６１２）とインキュベートし、再度洗浄し、ＴＭＢ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号３４０２８）で１５分間可視化し、次いで、１ＭのＨ２ＳＯ４で停止させた。各プレートウェルは、各ステップで５０μＬの溶液を含有していた。
【０１９２】
４５０ｎｍ〜６２０ｎｍでの吸光度を決定した。これらの抗体についての代表的な結合曲線及びＩＣ５０値を図５Ｆに示した。結果は、抗体２１Ｆ１２−１Ｆ６がヒトＰＤ１とＰＤ−Ｌ２との間の相互作用を遮断したことを示した。
【０１９３】
［実施例８］
抗ＰＤ−１抗体は、ＣＨＯ−Ｋ１−ＰＤ−１細胞によって発現される細胞表面ＰＤ−１に結合した
抗ＰＤ−１抗体を、ＣＨＯ−Ｋ１細胞で安定的に発現されるヒトＰＤ−１に結合するそれらの能力について試験した。
【０１９４】
チャイニーズハムスター卵巣上皮ＣＨＯ−Ｋ１細胞株（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＣＬ−６１）を、５％ＣＯ２を有する加湿インキュベーター内の１０％ＦＢＳを含有するＦ−１２Ｋ培地において３７℃で維持した。配列番号６６のヒトＰＤ−１をコードする核酸配列を、ポリエチレンイミン（ＭＷ２５Ｋ、２３９６６−２、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、ＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクトし、ヒトＰＤ−１を安定的に発現するクローンを、限界希釈によって得た。
【０１９５】
連続希釈した抗ＰＤ−１抗体を、上記で調製された５０μＬの１００００個のＣＨＯ−Ｋ１細胞に添加した。得られた混合物を４℃で３０分間インキュベートし、次いで、細胞をＰＢＳバッファーによって２回洗浄した。ＰＢＳバッファー中のＰＥ標識ロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号１０９−１１６−０９８）第２試薬（１：１００）を使用して、第２試薬と混合物とを４℃で３０分間インキュベートし、その後２回洗浄することによって、結合を検出した。その後、細胞をＰＢＳバッファー中に再懸濁した。ヒトＰＤ−１の結合の分析を、ＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ５フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で行った。これらの抗体についての代表的な結合曲線及びＥＣ５０値を、図６Ａ及び図６Ｂに示した。
【０１９６】
結果は、本発明の抗ＰＤ−１抗体（配列番号１８の突然変異体ＩｇＧ１定常領域を有する）及びニボルマブ類似体が、ＣＨＯ−Ｋ１細胞で安定的に発現されるヒトＰＤ−１に、類似のＥＣ５０値で、特異的に結合したことを示した。
【０１９７】
［実施例９］
抗ＰＤ−１抗体は、刺激されたＰＢＭＣによって発現された細胞表面ＰＤ−１に結合した
抗ＰＤ−１抗体を、刺激されたＰＢＭＣで発現されるヒト及びカニクイザルＰＤ−１に結合するそれらの能力について試験した。
【０１９８】
ヒト及びカニクイザルＰＢＭＣを、密度勾配遠心分離によって末梢血から分離した。３×１０６個のヒトＰＢＭＣを、ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３０２５６０１）中に５μｇ／ｍＬで希釈された濃度の、コーティングされた抗ＣＤ３（Ｂｉｏｇｅｍｓ、カタログ番号０５１２１−２５−５００）抗体によって、２４時間、事前刺激した。３×１０６個のカニクイザルＰＢＭＣを、２０ｎｇ／ｍＬの濃度のＳＥＢ（Ｔｏｘｉｎ  Ｔｅｃｈ、カタログ番号ＢＴ２０２）によって２日間、事前刺激した。連続希釈したニボルマブ類似体（実施例４において調製された通り）及び２１Ｆ１２−１Ｆ６（配列番号１８の突然変異体ＩｇＧ１定常領域を有する）を、１０万個のヒトＰＢＭＣ又は１０万個のカニクイザルＰＢＭＣにそれぞれ添加した。混合物を４℃で３０分間インキュベートし、次いで、細胞を、ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３０２５６０１）バッファーを使用して２回洗浄した。細胞を、ＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−１１６−０９８）第２試薬と製造者の指示に従って４℃で３０分間インキュベートし、次いで、２回洗浄した。その後、細胞をＰＢＳバッファー中に再懸濁した。ＰＤ−１の結合の分析を、ＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ５フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で行った。これらの抗体についての代表的な結合曲線及びＥＣ５０値を、図７Ａ及び図７Ｂに示した。
【０１９９】
結果は、抗ＰＤ−１抗体である２１Ｆ１２−１Ｆ６及びニボルマブ類似体の両方が、ヒト及びカニクイザルの刺激されたＰＢＭＣで発現されているＰＤ−１に特異的に結合し得、抗体２１Ｆ１２−１Ｆ６が、ニボルマブ類似体と比較して低いＥＣ５０値でサルＰＤ−１に結合したことを示した。
【０２００】
［実施例１０］
抗ＰＤ−１抗体は、ヒトＴ細胞によるＩＬ−２及びＩＦＮｇの放出を誘発した
抗ＰＤ−１抗体の機能的活性を、ＳＥＢ刺激後のヒトＰＢＭＣで評価した。
【０２０１】
ヒトＰＢＭＣを、密度勾配遠心分離によって、健康なドナーの末梢血から分離した。ヘパリン添加した血液を２倍の容積のＰＢＳによって希釈し、希釈した血液をＳｅｐＭａｔｅ−５０（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、カタログ番号８６４５０）チューブ中で層にした。１２００ｇで１０分間、室温で遠心分離した後、リンパ球含有画分を採取し、ＰＢＳで洗浄し、１０％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ２６５０）及び９０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１００９９１４１）で組成されている凍結培地中に再懸濁し、次いで、液体窒素中に保存した。７．５×１０６個のヒトＰＢＭＣを、２０ｎｇ／ｍＬの濃度のＳＥＢ（Ｔｏｘｉｎ  Ｔｅｃｈ、カタログ番号ＢＴ２０２）で２４時間刺激した。１０万個の得られた細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルにおいて、完全ＲＰＭＩ  １６４０（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２２４０００８９）中に播種した。連続希釈したニボルマブ類似体（実施例４において調製された通り）、２１Ｆ１２−１Ｆ６（配列番号１８の突然変異体ＩｇＧ１定常領域を有する）、及びヒトＩｇＧコントロール（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号ＱＡ１６Ａ１５）を培地にそれぞれ添加した。ＳＥＢを２０ｎｇ／ｍＬの最終濃度で添加し、得られた混合物を３７℃で２日間インキュベートし、培養上清を回収し、ＩＬ−２及びＩＦＮｇのレベルを、ヒトＩＬ２  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号ＤＹ２０２）及びヒトＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号ＤＹ２８５Ｂ）を製造者の指示に従って使用して、ＥＬＩＳＡによって検出した。
【０２０２】
ＩＬ−２のレベルを図８Ａに示し、ＩＦＮｇのレベルを図８Ｂに示した。
【０２０３】
結果は、刺激されたヒトＰＢＭＣが、２１Ｆ１２−１Ｆ６治療で、ニボルマブ類似体又はＩｇＧコントロールでの治療と比較して、より高いレベルのＩＬ２及びＩＦＮｇを放出したことを示した。
【０２０４】
［実施例１１］
抗ＰＤ−１抗体は、Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴ−ＰＤ１レポーター遺伝子の発光を誘発した
抗ＰＤ−１抗体の活性を、Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴ−ＰＤ−１レポーター遺伝子アッセイで評価した。
【０２０５】
Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴ−ＰＤ１エフェクター細胞をＣＨＯ−ＰＤＬ１／ＣＤ３標的細胞と共培養すると、ＴＣＲ−ＮＦＡＴ媒介発光が、ＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１相互作用について阻害された。細胞混合物に抗ＰＤ−１抗体を添加した後、ＰＤ−１−ＰＤＬ１相互作用は遮断され、発光が次いで回復した。
【０２０６】
チャイニーズハムスター卵巣上皮ＣＨＯ−Ｋ１細胞株（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＣＬ−６１）を、５％ＣＯ２を有する加湿インキュベーター内の１０％ＦＢＳを含有するＦ−１２Ｋ培地において３７℃で維持した。ヒトＰＤ−Ｌ１（配列番号６７で示されるＮＰ＿０５４８６２．１のアミノ酸）及びＯＫＴ３−ｓｃＦｖ（配列番号６８で示されるアミノ酸配列）をコードする核酸配列を、ポリエチレンイミン（ＭＷ２５Ｋ、２３９６６−２、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してＣＨＯ−Ｋ１細胞にコトランスフェクトし、ヒトＰＤ−Ｌ１及びＯＫＴ３−ｓｃＦｖを安定的に発現するクローンを、限界希釈によって得た。得られたＣＨＯ−ＰＤＬ１／ＣＤ３標的細胞を、１日目に９６ウェルプレートに播種した（３００００個細胞／ウェル）。２日目に、９６ウェルプレート上の培地（１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ−Ｆ１２）を廃棄し、次いで、連続希釈した抗ＰＤ−１抗体並びにＪｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴ−ＰＤ１細胞（エレクトロポレーションによって、Ｊｕｒｋａｔ細胞株（ＣＢＴＣＣＣＡＳ、クローンＥ６−１）と、配列番号６６のヒトＰＤ−１及びｐＧＬ４．３０［ｌｕｃ２Ｐ／ＮＦＡＴ−ＲＥ／Ｈｙｇｒｏ］（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ８４８Ａ）をコードする核酸配列とをコトランスフェクトすることによって調製され、ヒトＰＤ−１及びＮＦＡＴを安定的に発現するクローンを限界希釈によって得た）（３００００個細胞／ウェル）を、プレートに添加した。プレートを、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで６時間インキュベートした。次いで、６０μｌのＯｎｅ−ＧｌｏＴＭ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎカタログ番号Ｅ６１３０）を、アッセイプレートのウェルに添加し、発光を、発光プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ  Ｆ２００）を使用して測定した。ＥＣ５０値を計算し、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１との相互作用の遮断についての代表的な曲線を図９に示した。
【０２０７】
結果は、抗ＰＤ−１抗体２１Ｆ１２−１Ｆ６（配列番号１８の突然変異体ＩｇＧ１定常領域を有する）及びニボルマブ類似体が、類似のＥＣ５０値でヒトＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用を遮断したことを示した。
【０２０８】
［実施例１２］
ＦｃγＲＩの結合
Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｄ２６５Ａ、及びＰ３２９Ａ突然変異を有する突然変異体ＩｇＧ１定常領域、又はＩｇＧ４定常領域を、抗体２１Ｆ１２−１Ｆ６の重鎖定常領域として使用して、ＦｃγＲ−Ｆｃ相互作用を引き起こした。ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ヒトＦｃγＲＩに対する得られた抗体の相対的結合活性を決定した。
【０２０９】
ヒトＦｃγＲＩ（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＦＣＡ−Ｈ５２Ｈ２）を、一晩、４℃でインキュベートすることによって、９６ウェルプレートに固定した。プレートを次いで、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡと１時間、３７℃、２００μＬ／ウェルでインキュベートすることによって、ブロッキングした。ブロッキングした後、プレートを、ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）で３回洗浄した。連続希釈したリツキシマブ類似体（ポジティブコントロールとして使用され、配列番号６９及び７０で示される重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を用いて、米国特許第５，７３６，１３７号に従って調製された）、突然変異体ＩｇＧ１定常領域を有する２１Ｆ１２−１Ｆ６、並びにＩｇＧ４定常領域を有する２１Ｆ１２−１Ｆ６を、結合バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０及び０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳ）中で調製し、固定されたタンパク質と１時間、３７℃でインキュベートした。結合した後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、１時間、３７℃で、結合バッファー中に１／１００００希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−０３５−０９７）とインキュベートし、再度洗浄し、ＴＭＢ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号３４０２８）で１５分間可視化し、次いで、１ＭのＨ２ＳＯ４で停止させた。各プレートウェルは、別段の指示がない限り、各ステップで５０μＬの溶液を含有していた。
【０２１０】
４５０ｎｍ〜６２０ｎｍでの吸光度を決定した。ＦｃγＲＩ−抗体の結合についてのＥＣ５０及び代表的な結合曲線を、図１０に示した。
【０２１１】
結果は、ＩｇＧ４重鎖定常領域又は突然変異体ＩｇＧ１重鎖定常領域を有する２１Ｆ１２−１Ｆ６が、野生型ＩｇＧ１重鎖定常領域を有するリツキシマブ類似体と比較して非常に弱くヒトＦｃγＲＩに結合したことを示した。
【０２１２】
［実施例１３］
抗ＰＤ−１抗体は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を誘発しなかった
抗体依存性細胞介在性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）アッセイをＪｕｒｋａｔ−ＰＤ１細胞で行った。Ｊｕｒｋａｔ−ＰＤ−１細胞は、エレクトロポレーションによって、ヒトＰＤ−１（配列番号６６で示されるアミノ酸）をコードする核酸配列でＪｕｒｋａｔ細胞株（ＣＢＴＣＣＣＡＳ、クローンＥ６−１）をトランスフェクトすることによって調製した。ヒトＰＤ−１を安定的に発現するクローンを、限界希釈によって得た。
【０２１３】
Ｊｕｒｋａｔ−ＰＤ１細胞を、ウェル当たり１００００個細胞の密度で播種し、アッセイバッファー（フェノールレッドを含有しないＭＥＭ培地＋１％ＦＢＳ）中で３０分間、１００ｎＭ又は１０ｎＭの抗ＰＤ−１抗体（突然変異体ＩｇＧ１定常領域又はＩｇＧ４定常領域を有する）とプレインキュベートした。健康なドナーのＰＢＭＣエフェクター細胞を添加して、１０：１、２５：１、又は５０：１のＥ／Ｔ比で、ＡＤＣＣの影響を開始させた。Ｄａｕｄｉ（ＣＢＴＣＣＣＡＳ、カタログ番号ＴＣＨｕ１４０）に対するリツキシマブ類似体（実施例１３において調製された通り）のＡＤＣＣの影響を内部コントロールとして使用して、アッセイの質を確実なものとした。３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターにおいて２４時間インキュベートした後、細胞上清を次いで回収して、細胞傷害性ＬＤＨアッセイキット（Ｄｏｊｉｎｄｏ、カタログ番号ＣＫ１２）を使用して、放出されたＬＤＨを測定した。ＯＤ４９０ｎｍでの吸光度をＦ５０（Ｔｅｃａｎ）で読み取った。細胞溶解のパーセンテージを、以下の式に従って計算した。
細胞溶解％＝１００×（ＯＤサンプル−ＯＤ標的細胞プラスエフェクター細胞）／（ＯＤ最大放出−ＯＤ最小放出）。
データをＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍによって分析した。
【０２１４】
データは、突然変異体ＩｇＧ１定常領域を有する抗ＰＤ−１抗体２１Ｆ１２−１Ｆ６も、ＩｇＧ４定常領域を有する２１Ｆ１２−１Ｆ６も、Ｊｕｒｋａｔ−ＰＤ１細胞に対してＡＤＣＣ活性を有していなかったことを示した。
【０２１５】
［実施例１４］
抗ＰＤ−１抗体は、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を誘発しなかった
Ｊｕｒｋａｔ−ＰＤ１細胞での補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）アッセイ。Ｊｕｒｋａｔ−ＰＤ１細胞を、ウェル当たり５０００個細胞の密度で播種し、アッセイバッファー（フェノールレッドを含有しないＭＥＭ培地＋１％ＦＢＳ）中で３０分間、１００ｎＭ又は１０ｎＭの抗体とプレインキュベートした。プレートに次いで、健康なドナーの血漿を１０容積％、２０容積％、及び５０容積％の濃度で添加して、ＣＤＣの影響を開始させた。３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターにおいて４時間インキュベートした後、細胞にＣｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ７５７２）を添加し、ＲＬＵデータをＦ２００（Ｔｅｃａｎ）で読み取った。細胞溶解のパーセンテージを、以下の式に従って計算した。
細胞溶解％＝１００×（１−（ＲＬＵサンプル）／（ＲＬＵ細胞＋ＮＨＰ））（式中、ＮＨＰは正常なヒト血漿を表す。）
【０２１６】
データは、突然変異体ＩｇＧ１定常領域を有する抗ＰＤ−１抗体２１Ｆ１２−１Ｆ６も、ＩｇＧ４定常領域を有する２１Ｆ１２−１Ｆ６も、Ｊｕｒｋａｔ−ＰＤ１細胞に対してＣＤＣ活性を有していなかったことを示した。
【０２１７】
［実施例１５］
抗ＰＤ−１抗体は、インビボでの抗腫瘍効果を有していた
抗ＰＤ−１抗体のインビボでの有効性を、結腸がんを有するｈＰＤ−１  ＫＩマウスにおいて研究した。
【０２１８】
本実施例における実験では、ヒトＰＤ−１の細胞外部分を発現するヒト化マウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｐｄｃｄ１ｅｍ１（ＰＤＣＤ１）Ｓｍｏｃを、Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｍｏｄｅｌ  Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．から購入した。
【０２１９】
ＭＣ３８マウス結腸がん細胞株を、Ｏｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏｒｐ．，Ｌｔｄ．から購入した。ＭＣ３８細胞に、レトロウイルス形質導入を使用して、オボアルブミン（ＯＶＡ）（配列番号７１で示されるＡＡＢ５９９５６のアミノ酸）をコードする核酸配列を形質導入した。細胞をその後、限界希釈によってクローニングした。ＯＶＡタンパク質を高度に発現するクローンを、ＥＬＩＳＡキット（ｃｌｏｕｄ  ｃｌｏｎｅ  ｃｏｒｐ、ＣＥＢ４５９Ｇｅ）を使用して選択した。ＭＣ３８−ＯＶＡクローンを、１０％ウシ胎児血清と４μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Ｇｉｂｃｏ、Ａ１１１３８−０３）とを有する完全培地において維持した。
【０２２０】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｐｄｃｄ１ｅｍ１（ＰＤＣＤ１）Ｓｍｏｃマウスに、１×１０６個のＭＣ３８−ＯＶＡ細胞を皮下移植し、これらのマウスを、平均腫瘍容積がおよそ８０ｍｍ３（Ｌ×Ｗ２／２）に達したら、０日目に３つの群（各郡においてＮ＝７）にランダム化した。０日目、３日目、７日目、１０日目、及び１４日目に、マウスに、２１Ｆ１２−１Ｆ６（突然変異体ＩｇＧ１定常領域を有する、１０ｍｇ／ｋｇ）、ニボルマブ類似体（実施例４において調製された通り、１０ｍｇ／ｋｇ）、及びＰＢＳをそれぞれ腹腔内投与した。腫瘍容積を、キャリパー測定によって、実験の間、週に２回、モニタリングした。
【０２２１】
抗ＰＤ−１抗体２１Ｆ１２−１Ｆ６及びニボルマブ類似体での治療は、ＰＢＳ群と比較して有意な腫瘍成長阻害をもたらし、２１Ｆ１２−１Ｆ６群は、以下の表３に示すように、ニボルマブ類似体群と比較して高いＴＧＩ率を示した（８９．９５％対７６．７１％）。
【０２２２】
【表３】
2021523949.tif 000004
【０２２３】
本願における配列を以下にまとめる。
【０２２４】
2021523949.tif 000005
2021523949.tif 000006
2021523949.tif 000007
2021523949.tif 000008
2021523949.tif 000009
2021523949.tif 000010
2021523949.tif 000011
2021523949.tif 000012
【図１】
2021523949.tif 000013
【図２Ａ−２Ｄ】
2021523949.tif 000014
【図３Ａ−３Ｃ】
2021523949.tif 000015
【図４Ａ−４Ｄ】
2021523949.tif 000016
【図５Ａ−５Ｆ】
2021523949.tif 000017
【図６Ａ−６Ｂ】
2021523949.tif 000018
【図７Ａ−７Ｂ】
2021523949.tif 000019
【図８Ａ−８Ｂ】
2021523949.tif 000020
【図９】
2021523949.tif 000021
【図１０】
2021523949.tif 000022
【配列表】
2021523949000001.app
【国際調査報告】
2021523949.tif 000023
2021523949.tif 000024