(57)【要約】  本発明は、新規なマグネシウム−セリナート（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ−ｓｅｒｉｎａｔｅ）化合物、及びその用途に係り、さらに具体的には、Ｌ−セリン（ｓｅｒｉｎｅ）にマグネシウム原子がキレート結合された新規なマグネシウム−セリナート化合物、及び中枢神経系疾患（ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）等と関連した、その医薬用途等に関する。本発明に係る製造方法から得られる新規なマグネシウム−セリナート化合物は、機器分析の結果として、〜１０％のマグネシウムと〜９０％のセリンからなることが確認され、常温の水にｐＨ６．０〜ｐＨ１０．０の範囲で〜５００ｍｇ／ｍｌの濃度で可溶化され、水溶液状態で沈殿物の生成なしに維持され、またリン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）溶液でも、常温で沈殿物の生成なしに、〜５００ｍｇ／ｍｌの濃度で可溶化されることが明らかになり、人体に経口及び注射剤で投与するのに適切な性質を有することが確認され、前記化合物は、ミトコンドリア酸素消費量を向上させることにより、ミトコンドリア機能及び神経細胞の増殖を活性化させ、酸化的ストレスによるミトコンドリア膜電位損傷及び/または小胞体ストレスによる神経細胞死を抑制する神経細胞保護効果を示し、改善した血液脳関門の透過効率を示すことにより、認知障害、知的障害、小脳髄症、てんかん、神経発達障害、認知症、自閉症スペクトラム障害、ダウン症候群、レット症候群、脆弱Ｘ症候群、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、及び筋萎縮性側索硬化症等の中枢神経系疾患の予防、治療及び改善の効果に優れるので、医薬産業等に極めて有用な発明である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）の化合物、前記化合物の薬剤学的に許容可能な塩、溶媒和物、水和物、または異性体：
【化１】
2021533178.tif 000010
【請求項２】
Ｌ−セリン(Ｌ−ｓｅｒｉｎｅ)にＭｇＯを反応させて製造される下記一般式（Ｉ）の化合物の製造方法：
【化２】
2021533178.tif 000011
【請求項３】
前記反応は、７０〜８０℃で行われることを特徴とする請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
Ｌ−セリン(Ｌ−ｓｅｒｉｎｅ)にＭｇＨ２を反応させて製造される下記一般式（Ｉ）の化合物の製造方法：
【化３】
2021533178.tif 000012
【請求項５】
前記反応は、常温で行われることを特徴とする請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
前記反応は、７０〜８０℃で行われることを特徴とする請求項４に記載の製造方法。
【請求項７】
下記一般式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む中枢神経系疾患の予防または治療用の薬学的組成物：
【化４】
2021533178.tif 000013
【請求項８】
前記中枢神経系疾患は、認知障害、知的障害、小脳髄症、てんかん、神経発達障害、認知症、自閉症スペクトラム障害、ダウン症候群、レット症候群、脆弱Ｘ症候群、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、及び筋萎縮性側索硬化症よりなる群から選ばれることを特徴とする請求項７に記載の薬学的組成物。 
【請求項９】
下記一般式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む中枢神経系疾患の予防または改善用の健康機能食品：
【化５】
2021533178.tif 000014
【請求項１０】
前記中枢神経系疾患は、認知障害、知的障害、小脳髄症、てんかん、神経発達障害、認知症、自閉症スペクトラム障害、ダウン症候群、レット症候群、脆弱Ｘ症候群、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、及び筋萎縮性側索硬化症よりなる群から選ばれることを特徴とする請求項９に記載の健康機能食品。
【請求項１１】
下記一般式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を含む飼料添加用の組成物：
【化６】
2021533178.tif 000015
【請求項１２】
下記一般式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を含む神経細胞死抑制用の試薬組成物：
【化７】
2021533178.tif 000016
【請求項１３】
インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で、前記一般式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を神経細胞に処理することを含む神経細胞の細胞死抑制方法：
【化８】
2021533178.tif 000017
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なマグネシウム−セリナート（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ−ｓｅｒｉｎａｔｅ）化合物、及びその用途に係り、さらに具体的には、Ｌ−セリン（ｓｅｒｉｎｅ）にマグネシウム原子がキレート結合された新規なマグネシウム−セリナート化合物、及び中枢神経系疾患（ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）等と関連した、その医薬用途等に関する。
【背景技術】
【０００２】
マグネシウムは、人体で４番目に豊かな無機塩類である。約５０％は、骨に貯蔵されるのに対して、残りの５０％は、主に身体組織と臓器の細胞内部に存在する［Ｊａｈｎｅｎ−Ｄｅｃｈｅｎｔ  ａｎｄ  Ｋｅｔｔｅｌｅｒ，  ２０１２；  Ｆａｒｒｕｇｇｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４］。細胞内において、マグネシウムは、幾百種もの酵素の補助因子（ｃｏｆａｃｔｏｒ）として作用するので、マグネシウムは、主な細胞反応に関連している。特に、マグネシウムは、ＡＴＰ(アデノシン三リン酸、ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ)−生成反応に関与する多数の酵素の安定化に要求され、エネルギー代謝と連関している［Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ，  ２００３；  Ｓａｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００；  Ｒｏｍａｎｉ，  ２０１３］。特に、最近は、細胞内マグネシウムの主な貯蔵所であるミトコンドリアにおいて、マグネシウム恒常性が、ミトコンドリア内膜のＭｇ２＋輸送体であるＭＲＳ２の作用により調節され、このとき、ＭＲＳ２の欠陥によりマグネシウム恒常性維持が失敗する場合は、ミトコンドリアのエネルギー代謝及び形態の変化とともに、ＡＴＰ産生が阻害し、ストレスに対する細胞の抵抗性が減少することが報告されている［Ｙａｍａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６］。このような研究結果は、ミトコンドリア内におけるマグネシウム恒常性の調節が、細胞内エネルギー代謝、及びストレスに対する細胞抵抗性の決定に重要な役割を果たすことを示唆する。
【０００３】
また、神経系疾患を改善及び緩和するマグネシウムの潜在的な神経保護の役割については、過去約３０年間にわたって認識されてきたが、臨床分野において、マグネシウムの治療効果と関連した正確な解析は、依然として足りない状況である。最近、登場する研究結果は、マグネシウムが、頭痛、ストレス、アルコール・薬物中毒、急性脳損傷、発作、パーキンソン病、及びアルツハイマー病を含めた多くの神経疾患的状態と関連して重要な役割を果たすことを示唆している［Ｖｉｎｋ，  ２０１６］。
【０００４】
それだけでなく、最近の多くの研究では、経口によるマグネシウムの供給が、人体の脳の可塑性（ｂｒａｉｎ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ）を増加させ、学習（ｌｅａｒｎｉｎｇ）、記憶（ｍｅｍｏｒｙ）、及び認知機能（ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を向上させることが報告されている［Ｓｌｕｔｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０］。老化した脳の回復については、マグネシウムを摂取したヒトの場合は、脳の老化を９〜１４年ほど前まで反転させ、脳機能を回復させることが明らかになった［Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５］。
【０００５】
しかしながら、人体内において、マグネシウムの脳内吸収率及び細胞内透過率が低いという問題点は、依然として改善すべき研究対象として残っている。マサチューセッツ工科大学（ＭＩＴ）の研究者等は、マグネシウム−Ｌ−トレオネート（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ−Ｌ−ｔｈｒｅｏｎａｔｅ）という化合物をテストし、マグネシウム−Ｌ−トレオネートが、無機マグネシウム塩（ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ｓａｌｔｓ）に対して高いバイオアベイラビリティと脳マグネシウム増進機能を有しており、脳マグネシウム数値を約１５％増加させることを見い出した［Ｍｉｃｋｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、２０１３］。このような研究結果は、無機金属塩形態のマグネシウムに対して、糖酸（ｓｕｇａｒ  ａｃｉｄ）の一種であるトレオン酸（ｔｈｒｅｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）と有機結合したマグネシウムの細胞内透過率及び中枢神経系への吸収率がさらに高いということを示唆する。
【０００６】
一方、アミノ酸の一種であるＬ−セリンは、生体内でタンパク質構成要素であるだけでなく、グリシンとシステイン等のアミノ酸の生合成、ＤＮＡ前駆体であるプリン及びピリミジンの生合成、細胞膜リン脂質であるホスファチジルセリン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ）の生合成、また脳におけるスフィンゴミエリン（ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ）、セレブロシド（ｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄｅ）、及びＤ−セリン（Ｄ−ｓｅｒｉｎｅ）等の生合成にも有意に関与する。したがって、細胞内のＬ−セリン濃度は、細胞の分裂増殖による成長に直接に寄与し、また、Ｌ−セリンに由来するグリシン及びシステインは、細胞内の主な抗酸化物質と言われるグルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ、ＧＳＨ）の構成要素であるので［Ｐｏｍｐｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３］、Ｌ−セリンは、細胞内のＧＳＨ生成に要求される前駆物質の供給源としての作用によって、活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ、ＲＯＳ）による損傷から細胞を保護する防御機構にも有意に寄与する［Ａｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８；  Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７］。
【０００７】
このように、ヒト細胞が必要とするＬ−セリンは、細胞質内で起こるリン酸化経路（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ｐａｔｈｗａｙ）を介して生合成される。しかし、疾病やストレス条件下で、細胞内で生合成されるＬ−セリンは、その生成量が、細胞が必要とするＬ−セリンの量に比べて十分でないので、食べ物からの体外供給が要求される準必須アミノ酸（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）に分類されている。特に、先天性Ｌ−セリン生合成代謝の遺伝的欠陥は、血液脳関門（ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ、ＢＢＢ）の透過効率が比較的低いというＬ−セリンの特性と連動し、脳でのＬ−セリン欠乏症を誘発して、小脳髄症、重篤なてんかん性脳症、知的障害等の疾病をもたらすことが知られている［Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７；  Ｂｏａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９；  Ｄｅ  Ｋｏｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  ２００２］。
【０００８】
先天性セリン生合成代謝の遺伝的欠陥が、脳でのＬ−セリン欠乏による中枢神経系の重篤な疾病を引き起こす理由としては、Ｌ−セリンが、神経細胞の神経栄養因子（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）として作用するのみならず［Ｆｕｒｕｙａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００］、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸塩の受容器（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＮＭＤＡＲ）に対して、グルタミン酸とともにコアゴニスト(ｃｏ−ａｇｏｎｉｓｔ）の役割を果たすグリシン及びＤ−セリンの供給源として作用して、脳神経発達、シナプス精密化（ｓｙｎａｐｓｅ  ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ）、神経可塑性（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ）、及び興奮毒性（ｅｘｃｉｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）等に有意に寄与すること等が挙げられる［Ｄｅ  Ｍｉｒａｎｄａ  ｅｔ  ｌａ．，  ２０００］。
【０００９】
先天性Ｌ−セリン生合成代謝の欠陥として、Ｌ−セリン生合成酵素遺伝子である３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（３−ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＰＨＧＤＨ）、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＰＳＡＴ）、及びホスホセリンホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＰＳＰ）の突然変異が診断され、Ｌ−セリン生合成代謝欠陥のある嬰児に、Ｌ−セリンを１００〜６００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、またはＬ−セリン２００〜７００ｍｇ／ｋｇ及びグリシン２００〜３００ｍｇ／ｋｇを同時に長期的に経口投与すれば、副作用なしにてんかんと神経発達障害が好転し、脳白質体積と髄鞘化が回復したことが報告された［Ｐｉｎｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００；  Ｄｅ  Ｋｏｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２；  ＥｌＨａｔｔａｂ、２０１６］。また、３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼの変異によるＬ−セリン生合成代謝欠陥のある青少年に、Ｌ−セリン１００〜１５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙを投与すれば、てんかん、行動障害、基本障害が好転することが報告された［Ｔａｂａｔａｂａｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１］。したがって、先天性Ｌ−セリン生合成代謝欠陥により欠乏するＬ−セリンを、中枢神経系に必要な水準で、体外から供給することは、関連疾患の効果的な治療方案として明らかになった。
【００１０】
最近、成人神経疾患に対する治療剤として、Ｌ−セリンの活用性が大いに拡大するきっかけになる臨床研究結果として、β−Ｎ−メチルアミノ−Ｌ−アラニン(β−Ｎ−mｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ−Ｌ−ａｌａｎｉｎｅ、Ｌ−ＢＭＡＡ)によるグアム型筋萎縮性側索硬化症（Ｇｕａｍａｎｉａｎ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ＡＬＳ）／パーキンソン認知症症候群（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ  ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｃｏｍｐｌｅｘ、ＰＤＣ）の治療、及び筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）の治療において、Ｌ−セリンの肯定的な効果が報告された［Ｄｕｎｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１８］。
【００１１】
一方、Ｌ−セリン及びマグネシウムは、ミトコンドリア機能維持に必須な役割を果たす［Ｌｕｃａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１８；  Ｙａｍａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６］。ミトコンドリアの生成及び調節は、神経発生及び神経可塑性において主な役割を果たし、自閉症スペクトラム障害、ダウン症候群、レット症候群、脆弱Ｘ症候群等の認知及び適応障害と関連する様々な神経発達障害の核心病因であることが明らかになり、ミトコンドリア機能活性化が新たな治療法になることが提示された［Ｖａｌｅｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４］。ほとんどのダウン症候群患者は、その脳が、アルツハイマー病の患者に似た病理学的所見を示し、５０歳以上になれば、７５％が認知症を患うことになるが、これは、ミトコンドリア機能障害と深い関連があるので、早期にミトコンドリア機能活性と関連した治療を始めたら、認知症の発生率を下げることが提示された［Ｐｉｎａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２］。また、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ）［Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４］、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ）［Ｆｒａｎｃｏ−Ｉｂｏｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．、２０１８］、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）［Ｊｏｄｒｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７］、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ＡＬＳ）［Ｃｏｚｚｏｌｉｎｏ  ａｎｄ  Ｃａｒｒｉ，  ２０１２］のような神経変性病の発病原因が、ミトコンドリアの損傷による酸化的ストレスによる神経細胞死に起因すると報告されている。ミトコンドリアは、細胞の自然死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）または壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）の実行器官として、外部環境的ストレスからの細胞恒常性維持のために、ミトコンドリアの分裂及び融合のようなミトコンドリア数の量的調節を行い、細胞を保護し、或いは損傷した細胞を回復または除去する［Ｙｏｕｌｅ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｌｉｅｋ、２０１２；  Ｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４］。
【００１２】
特に、神経細胞は、他組織の細胞に比べて高いエネルギー代謝を要求し、過酸化（ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ）しやすい脂肪酸と金属イオンの割合が高いとともに、細胞抗酸化系の水準が比較的低い分裂後非増殖細胞（ｐｏｓｔ−ｍｉｔｏｔｉｃ  ｎｏｎ−ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）であって、活性酸素種や活性窒素種による酸化的ストレスに極めて脆弱である［Ｏｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｂｈａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５］。このような神経細胞の特徴に起因して、主な発病原因は互いに異なるが、自閉症スペクトラム障害、ダウン症候群、レット症候群、脆弱Ｘ症候群等のような神経発達障害、及びアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症のような神経変性病における共通した症状は、酸化的ストレスによるミトコンドリア機能障害（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）であると報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Aoyama K, Watabe M, Nakaki T. Regulation of neuronal glutathione synthesis. J Pharmacol sci. 2008;108(3):227-38.
【非特許文献２】Bhat AH, Dar KB, Anees S, Zargar MA, Masood A, Sofi MA, Ganie SA. Oxidative stress, mitochondrial dysfunction and neurodegenera1ive diseases; a mechanistic insight. Biomed Pharmacother. 2015;74:101-110.
【非特許文献３】Boado RJ, Li JY, Nagaya M, Zhang C, Pardridge WM. Selective expression of the large neutral amino acid transporter at the blood -brain barrier. Proc Natl Acad Sci USA 1999;96(21):12079-12084.
【非特許文献４】Cozzolino M,Carri MT. Mitochondrial dysfunction in ALS. Prog Neurobiol. 2012;97(2):54-66.
【非特許文献５】De Koning TJ, Duran M, Van Maldergem L, Pineda M, Dorland L, Gooskens R, Jaeken J, Poll-The BT. Congenital microcephaly and seizures due to 3-phosphoglycerate dehydrogenase deficiency:outcome of treatment with amino acids. J Inherit Metab Dis. 2002;25(2):119-125.
【非特許文献６】De Koning TJ, Snell K, Duran M, Berger R, Poll-The BT, Surtees R. L-serine in disease and development. Biochem J. 2003;37J(Pt3):653-661.
【非特許文献７】De Miranda J. Santoro A, Engelender S, Wolosker H. Human serine racemase: moleular cloning, genomic organization and functional analysis. Gene. 2000;256(1-2):183-8.
【非特許文献８】Doyle KM, Kennedy D, Gorman AM, Gupta S, Healy SJ, Samali A. Unfolded proteins and endoplasmic rcticulum stress in neurodegenerative disorders. J Cell Mo1 Med. 2011;15(10):2025-2039.
【非特許文献９】Dranka BP, Hill BG, Darley-Usmar VM. Mitochondrial reserve capacity in endothelial cells: The impact of nitric oxide and reactive oxygen species. Free Radic Biol Med. 2010;48(7):905-914.
【非特許文献１０】Dunlop RA, Powell JT, Metcalf JS, Guillemin GJ, Cox PA L-Serine-mediated neuroprotection includes the upregulation of the ER stress chaperone protein disulfide isomerase(PDI). Neurotox Res. 2018;33(1):113-122.
【非特許文献１１】El-Hattab AW. Serine biosynthesis and trnnsport defects. Mol Genet Metab. 2016;118(3):153-159.
【非特許文献１２】Farruggia G, Castiglioni S, Sargenti A, Marraccini C, Cazzaniga A, Merolle L, Iotti S, Cappadone C, Maier JA. Effects of supplementation with different Mg salts in cells: is there a clue? Magnes Res. 2014;27(1):25-34.
【非特許文献１３】Franco-Iborra S, Vila M, Perier C. Mitochondrial quality control in neurodegenerative diseases:Focus on Parkinson's disease and Huntington's disease. Front Neurosci. 2018;12:342.
【非特許文献１４】Furuya S, Tabata T, Mitoma J, Yamada K, Yamasaki M, Makino A, Yamamoto T, Watanabe M, Kano M, Hirabayashi Y. L-serine and glycine serve as major astroglia-derived trophic factors for cerebellar Purkinje neurons. Proc Narl Acad Sci USA. 2000;97(21):11528-11533.
【非特許文献１５】Jahnen-Dechent W, Ketteler M. Magnesium basics. Clin Kidney J 2012;5:i3-l4.
【非特許文献１６】Lench AM, Massey PV, Pollegioni L, Woodhall GL, Jones RS. Astroglial d-serine is the endogenous co-agonist at the presynaptic NMDA receptor in rat entorhinal cortex. Neuropharmacology. 2014;83:118-127.
【非特許文献１７】Liu G, Weinger JG, Lu ZL, et al. Efficacy and safety of MMFS-Ol, a synapse density enhancer, for treating cognitive impairment in older adults: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial. J Alzheimers Dis. 2015;49(4):971-90.
【非特許文献１８】Metcalf JS, Dunlop RA, Powell JT, Banack SA, Cox PA. L-Serine:a Naturally-occurring aminoacid with therapeutic potential. Neurotox Res. 2018;33(1):213-221.
【非特許文献１９】Mickley GA, Hoxha N, Luchsinger JL, et al. Chronic dietary magnesium-L-threonate speeds extinction and reduces spontaneous recovery of a conditioned taste aversion. Pharmacol Biochem Behav.   2013;106:16-26.
【非特許文献２０】Ni HM, Williams JA, Ding WX. Mitochondrial dynamics and mitochondrial quality control. Redox Biol. 2015;4:6-13.
【非特許文献２１】Ogawa S, Kitao Y, Hori O. Ischemia-induced neuronal cell death and stress response. Antioxid Redox Signal. 2007;9(5):573-587.
【非特許文献２２】Pineda M, Vilaseca MA, Artuch R. Santos S, Garcia Gonzalez MM, Aracil A, Van Schaftingen E, Jaeken J. 3-phosphoglycerate dehydrogenase deficiency in a patient with West syndrome. Dev Med Child Neurol. 2000;42(9):629-633.
【非特許文献２３】Pompella A, Visvikis A, Paolicchi A, De Tata V, Casini AF. The changing faces of glutathione, a cellular protagonist. Biochem Pharmacol. 2003;66(8):1499-1503.
【非特許文献２４】Romani AMP. Magnesium homeostasis in mammalian cells. Met Ions Life Sci 2013;12:69-118.
【非特許文献２５】Saris NEL, Mervaala E, Karppanen H, Khavaja JA, Lewenstam A. An update on physiological, clinical and analytical aspects. Clin Chim Acta 2000;294:1-26.
【非特許文献２６】Shahbah D, Hassan T, Morsy S, Saadany HE, Fathy M, Al-Ghobashy A., Elsamad N, Emam A, Elhewala A, Ibrahim B, Gebaly SE, Sayed HE, Ahmed H. Oral magnesium supplementation improves glycemic control and lipid profile in  children with type l diabetes and hypomagnesaemia. Medicine(Baltimore). 2017;96(ll):e6352.
【非特許文献２７】Slutsky I, Abumaria N, Wu LJ, et al. Enhancement of learning and memory by elevating brain magnesium. Neuron. 2010;65(2):165-77.
【非特許文献２８】Smith QR. Transport of glutamate  and other  amino  acids  at the blood-brain  barrier. J Nutr. 2000;130(4S Suppl):1016S-l022S.
【非特許文献２９】Swaminathan R. Magnesium metabolism and its disorders. Clin Biochem Rev 2003;24:47-66.
【非特許文献３０】Tabatabaie L, Klomp LW, Rubio-Gozalbo ME, Spaapen LJ, Haagen AA, Dorland L, De Koning TJ. Expanding the clinical spectrum of 3-phosphoglycerate dehydrogenase deficiency. J inherit Metab Dis. 2011;34(1):181-184.
【非特許文献３１】Valenti D, de Bari L, De Filippis B, Henrion-Caude A, Vacca RA. Mitochondrial dysfunction as a central actor in intellectual disability-related diseases:an overview of Down syndrome, autism, Fragile X and Rett syndrome. Neurosci Biobehav Rev. 2014;46 Pt 2:202-217.
【非特許文献３２】Vink R. Magnesium in the CNS:recent advances and developments. Magnes Res. 2016;29(3):95-101.
【非特許文献３３】Wang X, Wang W, LiL, Perry G, Lee HG, Zhu X. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease. Biochim Biophys Acta. 2014;1842(8):1240-1247.
【非特許文献３４】Wolosker H, Panizzutti R, De Miranda J. Neurobiology through the looking-glass:D-serine as a new glial-derived transmitter. Neurochem Int. 2002;41(5):327-332.
【非特許文献３５】Yamanaka R, Tabata S, Shindo Y, Hotta K., Suzuki K, Soga T, Oka K. Mitochondrial Mg(2+) homeostasis decides cellular energy  metabolism and vulnerability to stress. Sci Rep. 2016;6:30027.
【非特許文献３６】Youle RJ, van der Bliek AM. Mitochondrial fission, fusion, and stress. Science. 2012;337(6098):1062-1065.
【非特許文献３７】Zhou X, He L, Wu C, Zhang Y, Wu X, Yin Y. Serine alleviates oxidative stress via supporting glutathione synthesis and methionine cycle in mice. Mol Nutr Food Res. 2017;6l(11).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明が解決しようとする課題は、必要に応じて、人体内にマグネシウムとＬ−セリンを同時に伝達して、マグネシウムとＬ−セリンの細胞内透過率のみならず、脳でのマグネシウム及びＬ−セリンの濃度を増加させる効果を示し、ミトコンドリア機能の活性に役立つ新規なマグネシウム−セリナート化合物、及びその製造方法を提供することである。
【００１５】
本発明が解決しようとする他の課題は、前記マグネシウム−セリナート化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む認知障害、知的障害、小脳髄症、てんかん、神経発達障害、認知症、自閉症スペクトラム障害、ダウン症候群、レット症候群、脆弱Ｘ症候群、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、及び筋萎縮性側索硬化症等のミトコンドリア機能障害による中枢神経系疾患の予防または治療のための薬学的組成物等を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記した課題を解決するために、本発明は、下記一般式（Ｉ）の化合物、前記化合物の薬剤学的に許容可能な塩、溶媒和物、水和物、または異性体を提供する：
【００１７】
【化１】
2021533178.tif 000002
【００１８】
また、本発明は、Ｌ−セリンにＭｇＯを反応させて製造される前記一般式（Ｉ）の化合物の製造方法を提供する。
【００１９】
前記反応は、７０〜８０℃で行われることが好ましい。
【００２０】
また、本発明は、Ｌ−セリンにＭｇＨ２を反応させて製造される前記一般式（Ｉ）の化合物の製造方法を提供する。
【００２１】
前記反応は、常温で行われることが好ましい。
【００２２】
前記反応は、７０〜８０℃で行われることが好ましい。
【００２３】
また、本発明は、前記一般式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む中枢神経系疾患の予防または治療用の薬学的組成物を提供する。
【００２４】
前記中枢神経系疾患は、認知障害、知的障害、小脳髄症、てんかん、神経発達障害、認知症、自閉症スペクトラム障害、ダウン症候群、レット症候群、脆弱Ｘ症候群、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、及び筋萎縮性側索硬化症よりなる群から選ばれることが好ましい。
【００２５】
また、本発明は、前記一般式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む中枢神経系疾患の予防または改善用の健康機能食品を提供する。
【００２６】
前記中枢神経系疾患は、認知障害、知的障害、小脳髄症、てんかん、神経発達障害、認知症、自閉症スペクトラム障害、ダウン症候群、レット症候群、脆弱Ｘ症候群、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、及び筋萎縮性側索硬化症よりなる群から選ばれることが好ましい。
【００２７】
また、本発明は、前記一般式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を含む飼料添加用の組成物を提供する。
【００２８】
また、本発明は、前記一般式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を含む神経細胞死抑制用の試薬組成物を提供する。
【００２９】
また、本発明は、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で、前記一般式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を神経細胞に処理することを含む神経細胞の細胞死抑制方法を提供する。
【発明の効果】
【００３０】
本発明に係る製造方法から得られる新規なマグネシウム−セリナート化合物は、機器分析の結果として、〜１０％のマグネシウムと〜９０％のセリンからなることが確認され、常温の水にｐＨ６．０〜ｐＨ１０．０の範囲で〜５００ｍｇ／ｍｌの濃度で可溶化され、水溶液状態で沈殿物の生成なしに維持され、またリン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）溶液でも、常温で沈殿物の生成なしに、〜５００ｍｇ／ｍｌの濃度で可溶化されることが明らかになり、人体に経口及び注射剤で投与するのに適切な性質を有することが確認され、前記化合物は、ミトコンドリア酸素消費量を向上させることにより、ミトコンドリア機能及び神経細胞の増殖を活性化させ、酸化的ストレスによるミトコンドリア膜電位損傷及び/または小胞体ストレスによる神経細胞死を抑制する神経細胞保護効果を示し、改善した血液脳関門の透過効率を示すことにより、認知障害、知的障害、小脳髄症、てんかん、神経発達障害、認知症、自閉症スペクトラム障害、ダウン症候群、レット症候群、脆弱Ｘ症候群、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、及び筋萎縮性側索硬化症等の中枢神経系疾患の予防、治療及び改善の効果に優れるので、医薬産業等に極めて有用な発明である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】Ｌ−セリンの１Ｈ−ＮＭＲ分析結果を示すものである。
【図２】本発明に係るマグネシウム−セリナート（下記実施例１の合成法により得られる化合物として、以下、「ＡＳＴ−０１１」と命名する）の１Ｈ−ＮＭＲ分析結果を示すものである。
【図３】本発明に係るマグネシウム−セリナート（下記実施例２の合成法により得られる化合物として、「ＡＳＴ−０１４」と命名する）の１Ｈ−ＮＭＲ分析結果を示すものである。
【図４】Ｌ−セリンの１３Ｃ−ＮＭＲ分析結果を示すものである。
【図５】本発明に係るマグネシウム−セリナート（ＡＳＴ−０１１）の１３Ｃ−ＮＭＲ分析結果を示すものである。
【図６】本発明に係るマグネシウム−セリナート（ＡＳＴ−０１４）の１３Ｃ−ＮＭＲ分析結果を示すものである。
【図７】Ｌ−セリンのＦＴ−ＩＲ分析結果を示すものである。
【図８】本発明に係るマグネシウム−セリナート（ＡＳＴ−０１１）のＦＴ−ＩＲ分析結果を示すものである。
【図９】本発明に係るマグネシウム−セリナート（ＡＳＴ−０１４）のＦＴ−ＩＲ分析結果を示すものである。
【図１０】本発明に係るマグネシウム−セリナート(下記実施例３の合成法により得られる化合物として、「ＡＳＴ−０１６」と命名する)のＦＴ−ＩＲ分析結果を示すものである。
【図１１】本発明に係るマグネシウム−セリナート（ＡＳＴ−０１１）の処理濃度によるマウス海馬神経細胞（ｍｏｕｓｅ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｎｅｕｒｏｎａｌ）のＨＴ−２２細胞における細胞活性化を示す。（Ａ）は、セリン／グリシン欠乏培地における細胞生存性（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を示し、（Ｂ）は、完全培地における細胞生存性を示す。
【図１２】本発明に係るマグネシウム−セリナート（ＡＳＴ−０１１）のマウス海馬神経細胞のＨＴ−２２細胞におけるミトコンドリアエネルギー生成系と呼吸系の代謝能（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｃａｐａｃｉｔｙ）への影響をシーホース細胞外フラックス（ＸＦ）アナライザー（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｆｌｕｘ（ＸＦ）  ａｎａｌｙｚｅｒ）で分析した結果を示すものである。
【図１３】本発明に係るマグネシウム−セリナート（ＡＳＴ−０１１）の処理濃度によるＤＭＮＱ（２，３−ジメトキシ−１，４−ナフトキノン）が処理されたマウス海馬神経細胞のＨＴ−２２細胞の細胞保護効果を示すものである。
【図１４】本発明に係るマグネシウム−セリナート（ＡＳＴ−０１１）をＩＣＲ系マウスに投与した後、血液と脳に分布する濃度を定量し、脳／血液中の割合を求めて、薬物の血液脳関門の透過力を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、本発明について詳述する。
【００３３】
本発明の発明者等は、必要に応じて、人体内にマグネシウムとＬ−セリンを同時に伝達して、マグネシウムとＬ−セリンの細胞内透過率のみならず、脳でのマグネシウム及びＬ−セリンの濃度増加効果を示すことができる新たな化合物を開発することを目的として、アミノ酸であるＬ−セリンにマグネシウム塩（ＭｇＯまたはＭｇＨ２）を処理し、アミノ酸Ｌ−セリンにマグネシウムが結合した金属アミノ酸キレートの形態としてマグネシウムセリナートを製造した。製造されたマグネシウムセリナートは、常温の水にｐＨ６．０〜ｐＨ１０．０の範囲で〜５００ｍｇ／ｍｌの濃度で可溶化され、水溶液状態で沈殿物の生成なしに維持されることが明らかになった。また、製造されたマグネシウムセリナートは、塩化ナトリウム(ＮａＣｌ)とリン酸塩（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が含有されている常温の生理食塩水でも沈殿物の生成なしに〜５００ｍｇ／ｍｌの濃度で可溶化された。
【００３４】
したがって、本発明は、下記一般式（Ｉ）の化合物、前記化合物の薬剤学的に許容可能な塩、溶媒和物、水和物、または異性体を提供する：
【００３５】
【化２】
2021533178.tif 000003
【００３６】
前記一般式（Ｉ）の化合物は、下記構造式に示すように、２分子のセリンが１分子のマグネシウムとイオン結合及び配位結合を行った構造である。
【化３】
2021533178.tif 000004
【００３７】
前記一般式（Ｉ）の化合物は、塩基付加塩または酸付加塩の形態で存在する。前記付加塩は、本発明の一部に含まれる。前記塩は、好ましくは、薬学的に許容可能な酸により製造されるが、例えば、一般式（Ｉ）の化合物を精製し、または分離するのに有用な他の酸の塩もまた本発明の一部に含まれる。前記酸は、例えば、ピクリン酸、シュウ酸、または光学活性酸、例えば、酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、マンデル酸、またはカンファースルホン酸、及び生理学的に許容可能な塩、例えば、ハイドロクロライド、ハイドロブロマイド、サルフェート、ヒドロゲンサルフェート、ジヒドロゲンホスフェート、マレイン酸エステル、フマル酸エステル、２−ナフタレンスルホナート、またはパラ−トルエンスルホナートを形成する酸であってもよい。生理学的に許容可能な塩については、文献［Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｂｙ  Ｓｔａｈｌ  ａｎｄ  Ｗｅｒｍｕｔｈ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，  ２００２）]を参照してもよい。
【００３８】
前記溶媒和物または水和物は、合成過程以後、直接得られてもよく、化合物（Ｉ）は、水和物、例えば、一水和物または半水和物の形態で分離され、または、反応若しくは精製溶媒の溶媒和物の形態で分離されてもよい。
【００３９】
また、前記一般式（Ｉ）の化合物は、異性体、例えば、回転異性体の形態で存在してもよい。前記一般式（Ｉ）の化合物の回転異性体は、本発明の一部に含まれる。
【００４０】
本発明の前記一般式（Ｉ）の化合物は、下記のような製造方法により、高い収率と純度で合成され得る。
【００４１】
したがって、本発明は、Ｌ−セリンにＭｇＯを反応させて製造される前記一般式（Ｉ）の化合物の製造方法を提供する。
【００４２】
前記一般式（Ｉ）の化合物は、下記の化学反応式により合成され、合成反応は、７０〜８０℃で行われることが好ましい。
【００４３】
【化４】
2021533178.tif 000005
【００４４】
具体的に、蒸溜水が入った反応容器にＬ−セリンを投入して溶かし、粉砕したＭｇＯを一度に添加して撹拌しながら、約２時間の間反応させて、前記一般式（Ｉ）の化合物を得る。反応容器内の前記一般式（Ｉ）の化合物を回収及び精製する方法は、一般的な有機合成反応後の分離及び精製方法によってもよい。
【００４５】
また、本発明は、Ｌ−セリンにＭｇＨ２を反応させて製造される前記一般式（Ｉ）の化合物の製造方法を提供する。
【００４６】
前記一般式（Ｉ）の化合物は、下記の化学反応式により合成され、合成反応は、常温または７０〜８０℃で行われることが好ましい。
【００４７】
【化５】
2021533178.tif 000006
【００４８】
具体的に、蒸溜水が入った反応容器にＬ−セリンを投入し、常温(常温反応)で、または７０〜８０℃で昇温(加温反応)させ、ＭｇＨ２を少量ずつ添加して撹拌しながら、常温反応の場合は、約１４時間の間、加温反応の場合は、約６時間の間、Ｈ２ガスが発生しないときまで反応させて、前記一般式（Ｉ）の化合物を得る。反応容器内の前記一般式（Ｉ）の化合物を回収及び精製する方法は、一般的な有機合成反応後の分離及び精製方法によってもよい。
【００４９】
本発明の前記マグネシウム−セリナート化合物は、必要に応じて、人体内にマグネシウムとＬ−セリンを同時に伝達して、マグネシウム及びＬ−セリンの低い血液脳関門の透過力を改善し、先天性神経疾患及び神経変性病等の中枢神経系と関連した疾患に効果を示す医薬用途として適用され得る。
【００５０】
したがって、本発明は、前記一般式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む中枢神経系疾患の予防または治療用の薬学的組成物を提供する。
【００５１】
本発明の有効成分は、医薬用途として中枢神経系関連疾患に適用され、前記中枢神経系疾患は、認知障害、知的障害、小脳髄症、てんかん、神経発達障害、認知症、自閉症スペクトラム障害、ダウン症候群、レット症候群、脆弱Ｘ症候群、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、及び筋萎縮性側索硬化症よりなる群から選ばれることが好ましい。
【００５２】
前記有効成分は、神経細胞増殖の活性化を誘導することが好ましい。前記用語の「神経細胞増殖の活性化」とは、神経細胞の細胞分裂を促進させる作用、神経細胞の死滅や壊死を抑制する作用を全て含むものと理解されるべきである。
【００５３】
前記神経細胞増殖の活性化は、ミトコンドリア酸素消費量の増加による効果であることが好ましい。
【００５４】
前記有効成分は、神経細胞保護活性を有することが好ましい。前記用語の「神経細胞保護」とは、神経細胞が外的要因や細胞の内的要因により、細胞死滅や壊死が発生することを抑制する作用を意味するものである。
【００５５】
前記神経細胞保護は、酸化的ストレスからの保護であることが好ましい。前記用語の「酸化的ストレス」とは、細胞が活性酸素種により、正常ではない状態に置かれたことを意味する。
【００５６】
前記酸化的ストレスからの保護は、ミトコンドリア膜電位損傷による細胞死滅の抑制によることが好ましい。
【００５７】
前記酸化的ストレスからの保護は、小胞体ストレスによる細胞死滅の抑制によることが好ましい。
【００５８】
前記有効成分は、血液脳関門に対する透過力を有することが好ましい。本発明の有効成分は、Ｌ−セリンが有する低い血液脳関門透過度を顕著に改善させたものであって、Ｌ−セリン生合成欠陥を有する患者への投与時、脳に効果的で伝達される効果がある。
【００５９】
本発明の薬学的組成物は、それぞれの使用目的に合わせて、常法により、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液剤、エマルジョン、シロップ、エアロゾル等の経口剤形、滅菌注射溶液の注射剤等の様々な形態に剤形化して用いられ、経口投与し、または静脈内、腹腔内、皮下、直腸、局所投与等を含めた様々な経路を介して投与されてもよい。
【００６０】
このような薬学的組成物には、さらに、担体、賦形剤、または希釈制等が含まれてもよく、含まれる適合した担体、賦形剤、または希釈制の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、非晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び鉱物油等が挙げられる。
【００６１】
また、本発明に係る薬学的組成物は、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤等をさらに含んでもよい。
【００６２】
本発明に係る薬学的組成物は、薬剤学的に有効な量で投与する。本発明において、「薬剤学的に有効な量」とは、医学的治療に適用可能な合理的な利益／危険の割合であって、疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量の水準は、患者の疾患の種類、重症度、薬物活性、薬物への敏感度、投与時間、投与経路、及び排出割合、治療期間、同時に使用される薬物を含めた要素、及びその他医薬分野によく知られた要素により決定され得る。
【００６３】
本発明に係る薬学的組成物は、個別治療剤として投与し、または他の治療剤と併用して投与されてもよく、従来の治療剤と順次または同時に投与されてもよく、単一または多重投与されてもよい。上記した要素を全て考慮して、副作用なしに、最小限の量で最大効果が得られる量を投与することが重要であり、これは、当業者によって容易に決定され得る。
【００６４】
好適な具体例として、本発明の薬学的組成物の有効成分の有効量は、患者の年齢、性別、体重によって異なるが、一般的には、体重当たり１乃至５，０００ｍｇ、好ましくは１００乃至３，０００ｍｇを、毎日または隔日投与し、または１日１回乃至３回に分けて投与してもよい。しかし、投与経路、疾病の重症度、性別、体重、年齢等によって増減され得るので、前記投与量が、如何なる方法によっても、本発明の範囲を限定するものではない。
【００６５】
本発明に係る薬学的組成物は、様々な経路を介して対象に投与され得る。投与の全ての方式は、予想され得るが、例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内膜、または脳室内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）注射によって投与され得る。
【００６６】
本発明における「投与」とは、任意の適切な方法で、患者に所定の物質を提供することを意味し、本発明に係る薬学的組成物の投与経路は、目標組織に到達する限り、一般的な全ての経路を介して、経口または非経口投与され得る。また、本発明の組成物は、有効成分を標的細胞に伝達可能な任意の装置を用いて投与されてもよい。
【００６７】
本発明における「対象」とは、特に限定されるものではないが、例えば、ヒト、サル、牛、馬、羊、豚、ニワトリ、ターキー、うずら、猫、犬、マウス、ネズミ、ウサギ、または、ギニーピッグを含み、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトを意味する。
【００６８】
上述した医薬用途以外にも、本発明に係るマグネシウム−セリナート化合物は、健康機能食品の用途として使用され得る。
【００６９】
したがって、本発明は、前記一般式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む中枢神経系疾患の予防または改善用の健康機能食品を提供する。
【００７０】
前記中枢神経系疾患は、認知障害、知的障害、小脳髄症、てんかん、神経発達障害、認知症、自閉症スペクトラム障害、ダウン症候群、レット症候群、脆弱Ｘ症候群、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、及び筋萎縮性側索硬化症よりなる群から選ばれることが好ましい。
【００７１】
本発明に係る健康機能食品は、中枢神経系関連疾患の予防及び改善に有効な食品及び飲み物等に多様に利用され得る。
【００７２】
本発明の有効成分を含む食品としては、例えば、各種の食品類、飲み物、ガム、お茶、複合ビタミン剤、健康補助食品類等が挙げられ、粉末、顆粒、錠剤、カプセル、または飲み物の形態として用いることができる。
【００７３】
本発明の有効成分は、一般に、全体食品重量に対して０．０１乃至１５重量％で加えられ、健康飲料組成物は、１００ｍｌを基準として０．０２乃至１０ｇ、好ましくは０．３乃至１ｇの割合で加えられる。
【００７４】
本発明に係る健康機能食品は、指示された割合で、必須成分として前記化合物を含有するほか、食品学的に許容可能な食品補助添加剤、例えば、天然の炭水化物及び様々な香味剤等を追加成分として含有してもよい。
【００７５】
前記天然の炭水化物の例としては、ブドウ糖、果糖等の単糖類、マルトース、スクロース等の二糖類、及びデキストリン、シクロデキストリン等の多糖類のような通常の糖、及びキシリトール、ソルビトール、エリスリトール等の糖アルコールが挙げられる。
【００７６】
前記香味剤としては、タウマチン、レバウジオシドＡ、グリシルリジン、サッカリン、アスパルテーム等が用いられる。前記香味剤の割合は、本発明の健康機能食品１００ｍｌ当たり一般に約１乃至２０ｇ、好ましくは約５乃至１２ｇを用いる。
【００７７】
前記以外に、本発明に係る健康機能食品は、様々な栄養剤、ビタミン、鉱物、合成の風味剤及び天然の風味剤等の風味剤、着色剤及び充填剤、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭酸化剤等を含有してもよい。
【００７８】
その他、本発明に係る健康機能食品は、天然のフルーツジュース及びフルーツジュース飲料、及び野菜飲料等の製造のための果肉を含有してもよい。このような成分は、単独または組み合わせて用いられる。このような添加剤の割合は、一般に、本発明の前記活性分画物１００重量部当たり０．０１乃至約２０重量部の範囲で選ばれる。
【００７９】
本発明に係るマグネシウム−セリナート化合物は、生体内に効果的にマグネシウムとセリンを供給することができるので、これを飼料に適用することができる。
【００８０】
したがって、本発明は、前記一般式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を含む飼料添加用の組成物を提供する。
【００８１】
前記飼料添加用の組成物は、動物用であってもよい。前記「動物」とは、植物に対応する生物群であって、主に有機物を栄養分として摂取し、消化や胚性及び呼吸器官が分化しているものをいい、具体的には、棘皮動物、甲殻類、軟体動物、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類であってもよく、好ましくはウニ類またはナマコ類のような棘皮動物、カニ、エビ、伊勢エビ等の甲殻類を含む節足動物、頭足類、腹足類、または二枚貝類等の軟体動物、マダイ、タイ、タラ、カレイ、ヒラメ等の魚類、キジまたはニワトリ等の家禽類を含む鳥類、または豚、牛、羊、馬、ヤギ、犬、猫等の哺乳類であってもよい。
【００８２】
前記飼料添加用の組成物は、本発明の有効成分に穀物、植物性タンパク質飼料、動物性タンパク質飼料、糖分、または乳製品をさらに含んでもよい。前記穀物は、具体的には、粉砕または破砕した小麦、燕麦、麦、トウモロコシ、及び米であってもよく、前記植物性タンパク質飼料は、具体的には、アブラナ、豆、及びヒマワリを主成分とするものであってもよく、前記動物性タンパク質飼料は、具体的には、血粉、肉粉、骨粉、及び魚粉であってもよく、前記糖分または乳製品は、具体的には、各種の粉ミルク及び乳漿粉からなる乾燥成分であってもよい。
【００８３】
前記飼料添加用の組成物は、さらに、栄養補充剤、消化及び吸収向上剤、成長促進剤、または疾病予防剤のような成分を一緒に用いてもよい。
【００８４】
本発明に係る飼料添加用の組成物は、飼料の使用目的及び使用条件によって異なるが、一例として、最終生産された飼料１ｋｇを基準として、前記飼料添加用の組成物が０．１乃至１００ｇで含まれてもよい。
【００８５】
また、前記飼料添加用の組成物は、成分の粉砕の程度によって、軽粘性の粗粒または顆粒物質に製造されてもよく、前記組成物は、メッシュで供給され、または追加の加工及び包装のために所望の分離した形状に形成させてもよく、貯蔵のためにペレット化、膨張化または押出工程を経てもよく、貯蔵の容易性のために、好ましくは過剰の水が乾燥除去されてもよい。
【００８６】
一方、本発明に係るマグネシウム−セリナートは、神経細胞死を効果的に抑制するので、細胞、好ましくは神経細胞に細胞死滅を誘導させる試薬として適用され得る。
【００８７】
したがって、本発明は、前記一般式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を含む研究用試薬組成物、好ましくは神経細胞死抑制用の試薬組成物を提供する。
【００８８】
前記神経細胞は、初代神経細胞、形質転換神経細胞、または神経細胞株であってもよい。
【００８９】
前記試薬は、神経細胞増殖の活性化、ミトコンドリア酸素消費量の増加による神経細胞増殖の活性化、神経細胞保護、酸化的ストレスに起因した神経細胞損傷の抑制、酸化的ストレスによるミトコンドリア膜電位損傷による神経細胞死の抑制、酸化的ストレスによる小胞体ストレスによる神経細胞死の抑制の用途として適用され得る。
【００９０】
また、本発明は、前記一般式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を含む本発明の試薬を神経細胞に処理することを含む神経細胞の細胞死抑制方法を提供する。
【００９１】
前記方法によって、神経細胞の増殖、ミトコンドリア酸素消費量の増加による神経細胞増殖の活性化、神経細胞保護、酸化的ストレスに起因した神経細胞損傷の抑制、酸化的ストレスによるミトコンドリア膜電位損傷による神経細胞死の抑制、酸化的ストレスによる小胞体ストレスによる神経細胞死の抑制の効果が得られる。
【００９２】
前記方法において、細胞培養法、試薬処理法等は、本発明の技術分野における通常の知識を有する者にとって自明な事項であり、特に、試薬の処理濃度等は、本明細書に記載された事項の範囲内またはその効果が変化しない範囲内での適切な変形が可能である。
【００９３】
前記方法は、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で行われることが好ましい。
【００９４】
以下、具体的な実施例に基づき発明についてさらに詳述する。下記の実施例は、本発明の好適な一具体例を記載したものであり、下記の実施例に記載された内容によって、本発明の権利範囲が限定されて解釈されるものではないことは明らかである。
【００９５】
［実施例］
１．マグネシウム−セリナート（Ｍｇ−Ｓｅｒｉｎａｔｅ）の製造
１．１．マグネシウム−セリナート（Ｍｇ−Ｓｅｒｉｎａｔｅ、ＡＳＴ−０１１）の製造
５００ｍｌ三角フラスコに蒸溜水１００ｍｌを入れ、温度を７０〜８０℃に上げてから、この蒸溜水に、Ｌ−セリン（ＭＷ１０５．１）５０ｇ（〜０．４８ｍｏｌｅｓ）を秤量して、マグネットかくはん機（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｔｉｒｒｅｒ）で撹拌しながら溶解させた。ＭｇＯ（ＭＷ４０．３）をすり鉢で小さな粒子に粉砕した後、９．７ｇ（〜０．２４ｍｏｌｅｓ）秤量して、Ｌ−セリン水溶液に、７０〜８０℃の温度で撹拌しながら少量ずつ添加して入れ、三角フラスコに還流冷却器を取り付けて２時間の間、同じ条件下で反応させた。
【００９６】
冷やさずに直ちに１０分間６，０００ｒｐｍで遠心分離して、上澄液１３０ｍｌを回収した。上澄液に、エタノールを、最終濃度が７５ｖ／ｖ％になるように添加した後、マグネットかくはん機を用いて、常温で１４時間の間撹拌して沈殿させた。上澄液を注ぎ捨て、沈殿物のみを回収し、凍結乾燥させてマグネシウム−セリナートの固形物を得た。
【００９７】
凍結乾燥で回収されたマグネシウム−セリナート固形物を、すり鉢を用いて小さな粒子に粉砕し、最終的にマグネシウム−セリナート粉末（ＡＳＴ−０１１）を得た。このとき、回収したマグネシウム−セリナート粉末は、５３．１ｇであり、回収率は〜８９％程度であった。
【００９８】
１．２．常温反応によるマグネシウム−セリナート（Ｍｇ−Ｓｅｒｉｎａｔｅ、ＡＳＴ−０１４）の製造
三角フラスコ（２，０００ｍｌ）に蒸溜水５００ｍｌを入れ、この蒸溜水に、Ｌ−セリン（ＭＷ１０５．１）７５ｇ（〜０．７１ｍｏｌｅｓ）を秤量し、常温で撹拌しながら溶解させた。ＭｇＨ２（ＭＷ２６．３）９．５ｇ（〜０．３６ｍｏｌｅｓ）を秤量して、Ｌ−セリン水溶液に、常温で撹拌しながら少量ずつ添加して入れ、常温で１４時間の間、マグネットかくはん機で撹拌しながら、Ｈ２ガスが発生しないときまで反応させた。
【００９９】
反応液をろ過紙（Ｗｈａｔｍａｎｎ  ３ＭＭ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｐａｐｅｒ、ＧＥ  Ｈｅａｔｈｃａｒｅ、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ)を用いて濾過した後、ろ過液を減圧濃縮機（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ  ＬＲ  ４０００、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて〜２００ｍｌで濃縮した。濃縮液（〜２００ｍｌ）にエタノール６００ｍｌを添加して、最終濃度が７５ｖ／ｖ％になるようにし、マグネットかくはん機を用いて、１４時間の間撹拌して沈殿させた。続いて、上澄液を注ぎ捨て、沈殿物をマグネシウム−セリナートで回収して凍結乾燥した。
【０１００】
凍結乾燥で回収されたマグネシウム−セリナート固体を、すり鉢を用いて小さな粒子に粉砕し、最終的にマグネシウム−セリナート粉末（ＡＳＴ−０１４）を得た。このとき、回収したマグネシウム−セリナート粉末は４８．３ｇであり、回収率は〜５７．３％であった。
【０１０１】
１．３．加温反応によるマグネシウム−セリナート（Ｍｇ−ｓｅｒｉｎａｔｅ、ＡＳＴ−０１６）の製造
三角フラスコ（１，０００ｍｌ）に蒸溜水２００ｍｌを入れて、７０〜８０℃で予め加温した。この加温した蒸溜水に、Ｌ−セリン（ＭＷ１０５．１）６０ｇ（〜０．５７ｍｏｌｅｓ）を秤量して撹拌しながら溶解させた。ＭｇＨ２（ＭＷ２６．３）７．５ｇ（〜０．２８５  ｍｏｌｅｓ）を秤量して、Ｌ−セリン水溶液に、マグネットかくはん機で撹拌しながら少量ずつ添加して入れた後、三角フラスコに還流冷却器を取り付けて、同じ７０〜８０℃でマグネットかくはん機で撹拌しながら、Ｈ２ガスが発生しないときまで６時間の間反応させた。
【０１０２】
反応液をろ過紙（Ｗｈａｔｍａｎ  ３ＭＭ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｐａｐｅｒ、ＧＥ  Ｈｅａｔｈｃａｒｅ、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）を用いて濾過した後、濾過液〜２２０ｍｌを減圧濃縮機（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ  ＬＲ  ４０００、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて〜１００ｍｌで濃縮した。濃縮液（〜１００ｍｌ）にエタノールを添加して、最終濃度が７５ｖ／ｖ％になるようにし、マグネットかくはん機を用いて、１４時間の間撹拌して沈殿させた。続いて、上澄液を注ぎ捨て、沈殿物を７５ｖ／ｖ％エタノール３００ｍｌに８時間浸して洗浄した後、沈殿物を凍結乾燥してマグネシウム−セリナートを回収した。
【０１０３】
凍結乾燥で回収されたマグネシウム−セリナート固体を、すり鉢を用いて小さな粒子に粉砕し、最終的にマグネシウム−セリナート粉末（ＡＳＴ−０１６）を得た。このとき、回収したマグネシウム−セリナート粉末は６２．６ｇであり、回収率は〜９２．８％であった。
【０１０４】
２．合成されたマグネシウム−セリナートの機器分析
２．１．マグネシウム−セリナート中のマグネシウムの含量分析
それぞれのキレート化金属のマグネシウム含量は、誘導結合プラズマ質量分析装置（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｐｌａｓｍａ−ｏｐｔｉｃａｌ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＩＣＰ−ＯＥＳ）（Ｏｐｔｉｍａ  ７３００ＤＶ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＵＳＡ）を用いて分析した。実験条件は、周波数４０ＭＨｚ、無機物分析に用いられた波長は、２８５．２１３ｎｍが用いられた。
【０１０５】
（１）試料約０．１〜０．２ｇを分取して正確に重さを測定した後、硝酸２５〜３０ｇを添加した。
【０１０６】
（２）ＵｌｔｒａＷＡＶＥ（Ｍｉｌｅｓｔｏｎｅ、Ｉｔａｌｙ）装置を用いて、２２０℃で２５分間処理した後、２％硝酸で希釈して分析した。
【０１０７】
これについての分析平均値を表１に示す。
【０１０８】
【表１】
2021533178.tif 000007
【０１０９】
２．２．マグネシウム−セリナート中の構成アミノ酸の含量分析
それぞれのマグネシウム−セリナート中の構成アミノ酸の含量は、アミノ酸自動分析装置（Ｌ−８９００、日立、日本国）を用いて確認した。
【０１１０】
（１）試料０．０５ｇに２ｍｌの６Ｎ  ＨＣｌを入れ、窒素充填して１１０℃で２４時間の間加水分解させた。
【０１１１】
（２）酸加水分解後、８０℃で、２４時間程度熱を加えて乾燥させた。
【０１１２】
（３）酸加水分解溶液を０．０２Ｎ  ＨＣｌで１，０００倍希釈した後、アミノ酸自動分析機で分析した。
【０１１３】
これについての分析値を表２示す。
【０１１４】
【表２】
2021533178.tif 000008
【０１１５】
２．３．核磁気共鳴（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＮＭＲ）によるマグネシウム−セリナートの分析
それぞれのマグネシウム−セリナート（ＡＳＴ−０１１、ＡＳＴ−０１４、及びＡＳＴ−０１６）及びオーセンティックＬ−セリン（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ  Ｌ−Ｓｅｒｉｎｅ）（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、ＯＨ、ＵＳＡ）を１Ｈ  ＮＭＲ及び１３Ｃ  ＮＭＲを用いて分析した。それぞれの試料１００ｍｇをＤ２Ｏ  ０．７ｍｌに溶かし、２４．８５℃（２９８Ｋ）で、核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）（Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ＩＩ  ５００ＭＨｚ  ｗｉｔｈ  ＣｙｒｏＢＢＯ  ｐｒｏｂｅ、Ｂｒｕｋｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定した。
【０１１６】
２．３．１．１Ｈ  ＮＭＲ分析
図１乃至図３に示すように、１Ｈ  ＮＭＲ分析法によって分析した結果として、オーセンティックＬ−セリンの場合は、カルボキシル基及びアミノ基を有するα炭素（α  ｃａｒｂｏｎ）と判断されるピークが３．７〜３．８ｐｐｍ台に、またヒドロキシル基を有するβ炭素（β  ｃａｒｂｏｎ）と判断されるピークは３．６〜３．７ｐｐｍ台に示した。このとき、ＡＳＴ−０１１の場合は、カルボキシル基とアミノ基を有するα炭素と判断されるピークが３．５〜３．６ｐｐｍ台に示し、ヒドロキシル基を有するβ炭素と判断されるピークは３．２ｐｐｍ台に示し、ＡＳＴ−０１４の場合も、カルボキシル基及びアミノ基を有するα炭素と判断されるピークが３．５〜３．６ｐｐｍ台で、また、ヒドロキシル基を有するβ炭素と判断されるピークは３．２ｐｐｍ台で確認された。
【０１１７】
結論として、ＡＳＴ−０１１及びＡＳＴ−０１４の両試料共において、共通してオーセンティックＬ−セリンと極めて類似した化学シフト（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｈｉｆｔ）を有する１Ｈ  ＮＭＲピークが確認された。このとき、オーセンティックＬ−セリンの１Ｈ  ＮＭＲピークとは異なり、ＡＳＴ−０１１及びＡＳＴ−０１４の場合は、３．４〜３．５  ｐｐｍ台においてエタノールのＣＨ２ピーク、及び１．００ｐｐｍ台においてエタノールのＣＨ３ピークが確認されたが、これは、ＡＳＴ−０１１及びＡＳＴ−０１４の製造工程中、エタノール沈殿段階において用いられたエタノールが凍結乾燥後も固体試料中に少量で残存するからであると判断される。
【０１１８】
２．３．２．１３Ｃ  ＮＭＲ分析
図４乃至図６に示すように、１３Ｃ  ＮＭＲ分析法を用いて分析した結果として、ＡＳＴ−０１１の場合は、オーセンティックＬ−セリン中のα炭素のカルボキシル基と判断されるＣ＝Ｏピークが１７７．８８５ｐｐｍ台に、β炭素のヒドロキシル基のＣ−Ｏピークは６２．６０７ｐｐｍ台に、α炭素とβ炭素のＣ−Ｃピークは５６．１５１ｐｐｍ台に示した。また、ＡＳＴ−０１４の場合は、α炭素のカルボキシル基と判断されるＣ＝Ｏピークが１７９．８３８ｐｐｍ台に、β炭素のヒドロキシル基のＣ−Ｏピークは６３．７８４ｐｐｍ台に、α炭素とβ炭素のＣ−Ｃピークは５６．８９２ｐｐｍ台に示すことが確認された。
【０１１９】
結論として、ＡＳＴ−０１１及びＡＳＴ−０１４の両試料共において、共通してオーセンティックＬ−セリンと極めて類似した１３Ｃ  ＮＭＲピークが確認された。一方、ＡＳＴ−０１１の場合は、５６．３９１ｐｐｍ台及び１５．７３２ｐｐｍ台において、また、ＡＳＴ−０１４の場合は、５７．３３４ｐｐｍ台及び１６．６９２ｐｐｍ台において示される小さな高さのピークは、１Ｈ  ＮＭＲ分析でも検出されたエタノールピークと確認された。
【０１２０】
２．３．３．ＮＭＲ分析結果
以上の１Ｈ  ＮＭＲ及び１３Ｃ  ＮＭＲを用いた二つの分析結果をまとめると、製造したマグネシウム−セリナートの試料であるＡＳＴ−０１１及びＡＳＴ−０１４中には、Ｌ−セリンが含有されていることが確認される。
【０１２１】
２．４．フーリエ変換赤外分光（Ｆｏｕｒｉｅｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍ  ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、ＦＴ−ＩＲ）によるマグネシウム−セリナートの分析
それぞれのマグネシウム−セリナート（ＡＳＴ−０１１、ＡＳＴ−０１４、及びＡＳＴ−０１６）及びオーセンティックＬ−セリン（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、ＯＨ、ＵＳＡ）を、ＦＴ−ＵＶ−ＶＩＳ−ＩＲ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｖｅｒｔｅｘ  ８０，  Ｂｒｕｋｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて分析した。この分析結果によって製造されたマグネシウム−セリナートのキレート化合物としての合成有無を調査した。
【０１２２】
このとき、各試料の３０〜４０ｍｇを減衰全反射（Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  Ｔｏｔａｌ  Ｒｅｆｌｅｃｔａｎｃｅ、ＡＴＲ）技法を用いて、Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ４ｃｍ−１でサンプル当たり３回ずつ測定して分析した。スペクトル範囲は、６００−４０００ｃｍ−１であり、ＤＬａＴＧＳ検出器を用いた。
【０１２３】
図７は、対照群であるＬ−セリンのみを単独として測定したＩＲ分析結果として、双性イオンの影響により、−ＣＯＯ−を示すフィンガープリントが８００〜１４００ｃｍ−１、１６００ｃｍ−１において示され、−ＮＨ３＋の特性バンドが〜２１００ｃｍ−１において形成されることが確認された。これを、図８乃至図１０と比較したとき、８００〜１４００ｃｍ−1で形成される−ＣＯＯ−フィンガープリントが変化し、数個のピークに単純化され、特に、−ＮＨ３＋の特性バンドを示す〜２１００ｃｍ−１に形成されたピークが完全に消えたことが確認された。
【０１２４】
このように、ＦＴ−ＩＲ分析を行った結果、Ｌ−セリンのアミン基とカルボキシル基のピークの変化によって、両官能基共にマグネシウムと有機的に結合に関与していることが間接的に確認された。
【０１２５】
３．マグネシウム−セリナートの神経細胞増殖活性の評価
３．１．細胞生存アッセイ（Ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｓｓａｙｓ）
ダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ））、ウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル)ピペラジン−１−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、及びストレプトマイシン−ペニシリン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ−ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）等の細胞培養用試薬は、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＵＳＡ）から購入した。
【０１２６】
マウス海馬神経細胞株（Ｍｕｒｉｎｅ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）ＨＴ−２２は、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）にウシ胎仔血清（ＦＢＳ）１０％及び１００μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを加えた培地において、３７℃、５％ＣＯ２の大気環境下で培養した。本実施例では、細胞継代回数が１５回以下である細胞を用いた。
【０１２７】
細胞増殖活性は、細胞生存性を測定するＭＴＴアッセイで調査した。先ず、海馬神経細胞（ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｃｅｌｌ）ＨＴ−２２（１×１０４ｃｅｌｌｓ）を段階別に希釈した試料溶液と一緒に、９６ウェルプレートにおいて１６時間培養させてから、５０μｌのＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾリル）２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）溶液（１．１ｍｇ／ｍｌ）と混合した後、４時間さらに培養した。形成されたホルマザン結晶（ｆｏｒｍａｚａｎ  ｃｒｙｓｔａｌ）を１５０μｌのＤＭＳＯ溶液で溶解させ、これを、プレートリーダーを用いて５４０ｎｍにおいてＯＤ（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ）を測定した。
【０１２８】
３．２．神経細胞増殖活性の評価結果
選別された本発明に係るマグネシウム−セリナート（ＡＳＴ−０１１）の神経細胞増殖活性を評価するために、ＡＳＴ−０１１と一緒に、Ｌ−セリンを対照群として、細胞増殖に関するそれぞれの物質を（２５〜１０，０００μｇ）で添加して比較した。その結果、図１１に示すように、完全培地において、Ｌ−セリンは、大いに細胞増殖を活性化させていないのに対して、ＡＳＴ−０１１は、処理濃度１ｍｇ／ｍｌで、最大１１２％の細胞生存率を示した(図１１のＢ)。また、セリンとグライシンが欠乏した培地でも、Ｌ−セリンの５００μｇ／ｍｌ添加時、１２５％の生存率を示すのに対して、ＡＳＴ−０１１は、１２９％を示し(図１１のＡ)、ＡＳＴ−０１１薬物が、海馬ＨＴ−２２細胞の増殖を活性化させることが確認された。
【０１２９】
４．マグネシウム−セリナートのミトコンドリア酸素消費量の評価
４．１．シーホースＸＦ細胞ミトストレステスト（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦ  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｔｏ  Ｓｔｒｅｓｓ  ｔｅｓｔ）
セリン及びマグネシウム−セリナート（ＡＳＴ−０１１）の海馬神経細胞株（ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｎｅｕｒｏｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）であるＨＴ−２２において、ミトコンドリアの酸素消費量（ＯＣＲ）に対する影響をシーホースＸＦ細胞ミトストレステスト（Ｓｅａｈｏｒｓｅ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を用いて検定した。全過程は、ミトストレステストキットのプロトコルに準じて進行した。先ず、海馬神経細胞ＨＴ−２２を８×１０３／ｗｅｌｌの濃度でＸＰ−９６ウェルの培養皿に播種した後、ＤＭＥＭ培地で、３７℃、ＣＯ２の培養器において１２時間培養した後、セリン及びＡＳＴ−０１１薬物を濃度別に処理した。薬物を４時間処理した後、新たな培地に交替し、３７℃、ＣＯ２の培養器において１２時間の間さらに培養した。１２時間の培養を終えた細胞を、アッセイ培地（１０ｍＭグルコース、１ｍＭピルビン酸塩、２ｍＭグルタミン、ＰＨ７．４）で２回洗ってから、１８０μｌの培地を加えた後、３７℃、非ＣＯ２培養器において１時間培養し、シーホース細胞外フラックスアナライザー（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｆｌｕｘ（ＸＦ）Ａｎａｌｙｚｅｒ）で分析した。ＯＣＲ値は、１μＭオリゴマイシン、０．５μＭ  ｆｌｕｏｒｏ−ｃａｒｂｏｎｙｌ  ｃｙａｎｉｄｅ  ｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｏｎｅ（ＦＣＣＰ）及び０．５μＭロテノン／アンチマイシンＡ（ｒｏｔｅｎｏｎｅ／ａｎｔｉｍｙｃｉｎ  Ａ）に反応して分析し、各試料当たり三つの同じウェルで実験を行い、平均値で結果を導出した。
【０１３０】
４．２．ミトコンドリア酸素消費量の評価結果
Ｌ−セリン及びマグネシウム−セリナート（ＡＳＴ−０１１）の細胞増殖の活性化が、ミトコンドリア機能の向上と関連しているかを調査するために、酸素消費量（ｏｘｙｇｅｎ  ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ  ｒａｔｅ）を材料及び方法に記述した方法で調査した。その結果、図１２に示すように、Ｌ−セリン及びＡＳＴ−０１１の両薬物によってＯＣＲ値が増加し、ミトコンドリアの機能が向上することが確認されたが、Ｌ−セリンは、処理濃度１００μｇ／ｍｌまではＯＣＲ値が増加してから、５００μｇ／ｍｌにおいて少し減少するのに対して（図１２のＡ）、ＡＳＴ−０１１は、処理濃度５００μｇ／ｍｌまでＯＣＲ値が増加するので（図１２のＢ）、図１１の細胞増殖活性実験の結果と一致することを確認された。
【０１３１】
５．マグネシウム−セリナートの神経細胞保護活性
５．１．フローサイトメトリー分析
先ず、１×１０６細胞を２％のＦＢＳを含有したＰＢＳ溶液で３回水洗した後、水洗された細胞を７０％エタノールに懸濁し、４℃で１時間の間固定した。固定された細胞を再び同じ溶液で２回洗浄した後、５０μｇ／ｍｌ濃度のＲＮａｓｅ  Ａ溶液２５０μｌに懸濁し、３７℃で３０分間処理して細胞内のＲＮＡを除去し、５０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）１．１２％、クエン酸ナトリウム緩衝剤（ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ８．４５）溶液２５０μｌを加え、３７℃で２０分間、細胞内のＤＮＡを染色した。これを、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ）で分析し、各細胞内の染色されたＤＮＡの含量を基準として、細胞周期の分布を調査した。
【０１３２】
５．２．神経細胞保護活性の評価結果
マグネシウム−セリナート（ＡＳＴ−０１１）のＤＭＮＱにより誘導される酸化的ストレスに対する細胞保護活性を、ＤｉＯＣ６染色法で比較した結果、図１３に示すように、ＤＭＮＱ（１０μＭ）の単独処理時、細胞損傷率が７７．８％であるのに対して、ＡＳＴ−０１１を０．５、１、５ｍｇ／ｍｌの濃度で処理すると、６６．５％、６５．９％、及び６４．６％のように、ミトコンドリア膜電位損傷が保護されることが確認された。以上の結果から、ＡＳＴ−０１１薬物が、Ｌ−セリンよりも細胞増殖を活性化させるのみならず、酸化的ストレスから神経細胞を保護する活性も優れることが分かった。
【０１３３】
６．マグネシウム−セリナートの血液脳関門（ＢＢＢ）透過力の検定
６．１．血液脳関門（ＢＢＢ）透過力の検定
Ｌ−セリン及びＡＳＴ−０１１を、６００ｍｇ／ｋｇで、７週齢のＩＣＲ系マウス（ｎ＝３）に投与した後、脳組織と血液を採取し、ＬＣ／Ｍｓを用いて、血液と脳に分布するＬ−セリンの濃度を定量し、脳／血中の割合を求めて、薬物のＢＢＢ透過力を比較した。
【０１３４】
６．２．マグネシウム−セリナートのＢＢＢ透過力の評価結果
ＡＳＴ−０１１の脳への移行有無を、Ｌ−セリンと比較しており、その結果を図１４及び表３に示す。図１４と表３に示すように、ＡＳＴ−０１１薬物のＣｂｒａｉｎ／Ｃｐｌａｓｍａ数値は、Ｌ−セリンの１８．２９±２．４３よりも高い２１．８５±４．２８と示された。これは、脳組織において、Ｌ−セリンが１１，４１０±１２９９、ＡＳＴ−０１１が１２，２９６±６１０と示された結果、及びプラズマにおいて、Ｌ−セリンが６３６±５５．２、ＡＳＴ−０１１が５７８±１０３と示された結果と一致するものであって、本発明に係るマグネシウム−セリナートは、Ｌ−セリンよりもＢＢＢ透過力が極めて向上したことが確認された。
【０１３５】
【表３】
2021533178.tif 000009
【０１３６】
［この発明を支援した国家研究開発事業］
［課題固有番号］Ｓ２６１１２２２
［省庁名］中小ベンチャー企業部
［研究管理専門機関］中小企業技術情報振興院
［研究事業名］創業成長−技術開発事業
［研究課題名］自閉症スペクトラム障害改善の機能性食品の開発
［寄与率］１／１
［主管機関］株式会社アストロゲン
［研究期間］２０１８．０６．２９〜２０１９．０６．２８
【図１】
2021533178.tif 000018
【図２】
2021533178.tif 000019
【図３】
2021533178.tif 000020
【図４】
2021533178.tif 000021
【図５】
2021533178.tif 000022
【図６】
2021533178.tif 000023
【図７】
2021533178.tif 000024
【図８】
2021533178.tif 000025
【図９】
2021533178.tif 000026
【図１０】
2021533178.tif 000027
【図１１】
2021533178.tif 000028
【図１２】
2021533178.tif 000029
【図１３】
2021533178.tif 000030
【図１４】
2021533178.tif 000031
【国際調査報告】
2021533178.tif 000032
2021533178.tif 000033
2021533178.tif 000034
2021533178.tif 000035