(57)【要約】  本開示は抗原性ＥＢＶポリペプチドおよびＥＢＶに対する抗体の誘発におけるその使用に関する。ＥＢＶポリペプチドおよびフェリチンタンパク質を含む抗原性ポリペプチドも開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）  ｇＬポリペプチドおよびＥＢＶ  ｇＨポリペプチドを含む抗原性ＥＢＶポリペプチドであって、少なくとも１５アミノ酸の長さを有するリンカーが該ＥＢＶ  ｇＬポリペプチドと該ＥＢＶ  ｇＨポリペプチドとを隔てている、前記抗原性ＥＢＶポリペプチド。
【請求項２】
エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）  ｇＬポリペプチド、ＥＢＶ  ｇＨポリペプチド、およびＥＢＶ  ｇｐ４２ポリペプチドを含む抗原性ＥＢＶポリペプチドであって、少なくとも１５アミノ酸の長さを有するリンカーが該ＥＢＶ  ｇＬポリペプチドと該ＥＢＶ  ｇＨポリペプチドとを隔てている、前記抗原性ＥＢＶポリペプチド。
【請求項３】
フェリチンをさらに含む、請求項１または２に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチド。
【請求項４】
ＥＢＶポリペプチドおよびフェリチンタンパク質を含む抗原性ＥＢＶポリペプチドであって、フェリチンタンパク質が表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える変異を含む、前記抗原性ＥＢＶポリペプチド。
【請求項５】
ＥＢＶポリペプチドがＥＢＶ  ｇＬポリペプチド、ＥＢＶ  ｇＨポリペプチド、またはＥＢＶ  ｇｐ２２０ポリペプチドを含む、請求項４に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチド。
【請求項６】
ＥＢＶポリペプチドがｇＬポリペプチドを含み、該ポリペプチドがＥＢＶ  ｇＨポリペプチドをさらに含む、請求項５に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチド。
【請求項７】
ポリペプチドがＥＢＶ  ｇｐ４２ポリペプチドをさらに含む、請求項１または３〜６のいずれか１項に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチド。
【請求項８】
第１の抗原性ＥＢＶポリペプチドおよび第２の抗原性ＥＢＶポリペプチドを含む組成物であって、該第１の抗原性ＥＢＶポリペプチドがフェリチン重鎖および第１のＥＢＶポリペプチドを含み、該第２の抗原性ＥＢＶポリペプチドがフェリチン軽鎖および第２のＥＢＶポリペプチドを含み、該第１および第２のＥＢＶポリペプチドが異なる、前記組成物。
【請求項９】
第１のＥＢＶポリペプチドまたは第２のＥＢＶポリペプチドがｇｐ２２０ポリペプチドを含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
（ｉ）第１の抗原性ＥＢＶポリペプチドがｇＬポリペプチドおよびｇＨポリペプチドの一方または両方を含み、第２の抗原性ＥＢＶポリペプチドがｇｐ２２０ポリペプチドを含むか、または（ｉｉ）第１の抗原性ＥＢＶポリペプチドがｇｐ２２０ポリペプチドを含み、第２の抗原性ＥＢＶポリペプチドがｇＬポリペプチドおよびｇＨポリペプチドの一方または両方を含む、請求項８または９に記載の組成物。
【請求項１１】
第１の抗原性ＥＢＶポリペプチドがｇＬポリペプチドおよびｇＨポリペプチドを含むか、または第２の抗原性ＥＢＶポリペプチドがｇＬポリペプチドおよびＥＢＶ  ｇＨポリペプチドを含む、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
ｇＬポリペプチドおよび／またはｇＨポリペプチドを含む抗原性ＥＢＶポリペプチドがｇｐ４２ポリペプチドをさらに含む、請求項１０または１１に記載の組成物。
【請求項１３】
ｇＨおよびｇＬポリペプチドを含み、該ｇＨポリペプチドが、場合によりｇｐ４２ポリペプチドを含む該ｇＬポリペプチドに対してＣ末端側であり、ｇｐ４２ポリペプチドが該ｇＨポリペプチドに対してＣ末端側である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドまたは組成物。
【請求項１４】
ｇｐ４２ポリペプチドを含み、該ｇｐ４２ポリペプチドが配列番号２３９または２４０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドまたは組成物。
【請求項１５】
ＥＢＶ  ｇＨポリペプチドおよびＥＢＶ  ｇｐ４２ポリペプチドを含み、少なくとも１５アミノ酸の長さを有するリンカーが該ＥＢＶ  ｇＨポリペプチドと該ＥＢＶ  ｇ４２ポリペプチドとを隔てており、場合により該リンカーが１５〜６０アミノ酸、２０〜６０アミノ酸、３０〜６０アミノ酸、４０〜６０アミノ酸、３０〜５０アミノ酸、または４０〜５０アミノ酸の長さを有し、さらに場合により該リンカーが配列番号２３４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドまたは組成物。
【請求項１６】
リンカーを含み、該リンカーが少なくとも１５アミノ酸の長さを有し、場合により該リンカーが第１のＥＢＶポリペプチドと第２のＥＢＶポリペプチドとを隔てている、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドまたは組成物。
【請求項１７】
リンカーが１５〜６０アミノ酸、２０〜６０アミノ酸、３０〜６０アミノ酸、４０〜６０アミノ酸、３０〜５０アミノ酸、または４０〜５０アミノ酸の長さを有する、請求項１６に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドまたは組成物。
【請求項１８】
ＥＢＶポリペプチドが配列番号３６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドまたは組成物。
【請求項１９】
ＥＢＶポリペプチドが配列番号３７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドまたは組成物。
【請求項２０】
ポリペプチドが配列番号３０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むリンカーを含み、場合により該リンカーが第１のＥＢＶポリペプチドと第２のＥＢＶポリペプチドとを隔てている、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドまたは組成物。
【請求項２１】
ＥＢＶポリペプチドが配列番号３８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドまたは組成物。
【請求項２２】
ＥＢＶポリペプチドとフェリチンとを隔てるさらなるリンカーをさらに含む、請求項３〜２１のいずれか１項に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドまたは組成物。
【請求項２３】
フェリチンに対してＮ末端側、ｇＨポリペプチドに対してＣ末端側に位置するＥＢＶ  ｇｐ４２ポリペプチドを含み、リンカーがＥＢＶ  ｇｐ４２ポリペプチドとフェリチンとを隔てており、場合により該リンカーが少なくとも１５アミノ酸の長さを有するか、または１５〜６０アミノ酸、２０〜６０アミノ酸、３０〜６０アミノ酸、４０〜６０アミノ酸、３０〜５０アミノ酸、もしくは４０〜５０アミノ酸の長さを有し、さらに場合により該リンカーが配列番号２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、または２３８のうちいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３〜２２のいずれか１項に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドまたは組成物。
【請求項２４】
リンカーがシステインを含む、請求項２２または２３に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドまたは組成物。
【請求項２５】
リンカーが配列番号３３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドまたは組成物。
【請求項２６】
システインが免疫刺激性部分にコンジュゲートされており、場合により該免疫刺激性部分がＴＬＲ２、ＴＬＲ７／８、ＴＬＲ９、またはＳＴＩＮＧのアゴニストである、請求項２４または２５に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドまたは組成物。
【請求項２７】
フェリチンがＨ．ピロリフェリチンのＥ１２Ｃ、Ｓ２６Ｃ、Ｓ７２Ｃ、Ａ７５Ｃ、Ｋ７９Ｃ、Ｓ１００Ｃ、およびＳ１１１Ｃ変異の１つもしくはそれ以上、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって決定される、非Ｈ．ピロリフェリチンにおける１つもしくはそれ以上の対応する変異を含む、請求項３〜２６のいずれか１項に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドまたは組成物。
【請求項２８】
フェリチンが表面に露出したアスパラギンを非アスパラギンアミノ酸に置き換える変異を含み、場合により該アスパラギンがＨ．ピロリフェリチンの１９位、またはペアワイズまたは構造アライメントによって決定される、非Ｈ．ピロリフェリチンの類似の位置にある、請求項３〜２７のいずれか１項に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドまたは組成物。
【請求項２９】
フェリチンが内部システインを非システインアミノ酸に置き換える変異を含み、場合により、該内部システインがＨ．ピロリフェリチンの３１位、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって決定される、Ｈ．ピロリフェリチンの３１位に対応する位置にある、請求項３〜２８のいずれか１項に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドまたは組成物。
【請求項３０】
フェリチンが配列番号２０１〜２０７または２１１〜２１５のうちいずれか１つと８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３〜２９のいずれか１項に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドまたは組成物。
【請求項３１】
抗原性ＥＢＶポリペプチドが配列番号２２６のアミノ酸２３〜１０７８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドまたは組成物
【請求項３２】
抗原性ＥＢＶポリペプチドが配列番号２２６〜２３１または２４１〜２４２のうちいずれかと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含み、場合によりリーダー配列を欠除する、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドまたは組成物。
【請求項３３】
請求項３〜３２のいずれか１項に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドまたは第１および第２のポリペプチドを含むフェリチン粒子。
【請求項３４】
請求項１〜３３のいずれか１項に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドまたはフェリチン粒子および薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項３５】
フェリチン粒子がＥＢＶ  ｇＬポリペプチドおよびＥＢＶ  ｇＨポリペプチドを含み、組成物がｇｐ２２０ポリペプチドを含む第２のフェリチン粒子を含む、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
インフルエンザに対する免疫応答を誘発する方法における、またはＥＢＶによる感染からの対象の保護における使用のための、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチド、フェリチン粒子、または組成物。
【請求項３７】
請求項１〜３６のいずれか１項に記載の任意の１つまたはそれ以上の抗原性ＥＢＶポリペプチド、フェリチン粒子、または組成物を対象に投与する工程を含む、ＥＢＶに対する免疫応答を誘発し、またはＥＢＶによる感染から対象を保護する方法。
【請求項３８】
対象がヒトである、請求項３６または３７に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチド、フェリチン粒子、組成物、または方法。
【請求項３９】
請求項１〜３２のいずれか１項に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドをコードする核酸であって、場合によりｍＲＮＡである核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、２０１８年４月３日に提出された米国仮特許出願第６２／６５２，２０１号の優先権の利益を主張する。
【０００２】
本出願は、配列表を含有し、それらはＡＳＣＩＩフォーマットで電子提出されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１９年３月２７日に作成され、名称は２０１９−０３−２７＿０１１２１−００３２−００ＰＣＴ＿ＳＬ＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、サイズは３７７，８０３バイトである。
【背景技術】
【０００３】
ワクチン学の分野での多くの成功にも関わらず、生命を脅かす多くの感染疾患からヒトを保護するために、新規打開策が必要である。現在認可されている多くのワクチンは、何十年も前の技術に依存して生弱毒化または不活化死菌ワクチンを産生しているが、これらは固有の安全性の懸念を有し、多くの場合、ごく短命な弱い免疫応答を刺激するに過ぎず、複数回用量の投与を必要とする。遺伝子工学および生化学工学の進歩により、難題である疾患標的に対する治療薬を開発することが可能となっているが、ワクチン学の分野へのこれらの応用は、まだ十分に実現されていない。組換えタンパク質技術により、現在では最適な抗原の設計が可能となっている。加えて、ナノ粒子は、最適な抗原提示および標的化薬物送達に関する潜在性をますます証明している。多数の抗原が結合したナノ粒子は、その分子積み荷を多価で呈示することによって得られる結合アビディティの増加およびその微視的なサイズによってより効率的に生物学的障壁を通過する能力を有していることが示されている。インフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡ）タンパク質に融合したヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ））フェリチンナノ粒子は、マウスインフルエンザモデルにおいて抗原の安定性の改善および免疫原性の増大を可能にした（非特許文献１を参照されたい）。この融合タンパク質は、８面体の対称性ナノ粒子へと自己集合して８個の３量体ＨＡスパイク構造を提示し、アジュバントと共に使用する場合、様々な前臨床モデルにおいて強力な免疫応答を与える。
【０００４】
エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）は世界の成年人口の約９５％に感染し、２つのＢ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫およびホジキンリンパ腫に関連していることが知られている。このウイルスは上皮細胞にも感染することがあり、鼻咽頭がんに関連している。さらに、ＥＢＶは先進国において伝染性単核球症の大部分の症例を惹起し、主として小児および若年成人を侵している。伝染性単核球症は１か月にも及ぶ長い回復期間をもたらすことがある。現在のところ市場には承認済みのワクチンはなく、したがって予防用ワクチンへの強いニーズがある。
【０００５】
本明細書では、ＥＢＶポリペプチドが関与する１組の新たなポリペプチド、ナノ粒子、組成物、方法、および使用を提示する。新規なＥＢＶ一本鎖ｇＬおよびｇＨ（ｇＬ／ｇＨまたはｇＨ／ｇＬと表記することもある）ポリペプチドを、これらの新規なＥＢＶポリペプチドおよびフェリチンを含む抗原性ポリペプチドと同様に産生した。一本鎖ｇＬおよびｇＨポリペプチドを含む抗原性ポリペプチドおよびナノ粒子は、ｇＬおよびｇＨの配列の間に比較的長いリンカーを含むことができ、これは免疫原性の増大を提供することが観察された。ＥＢＶ  ｇｐ２２０ポリペプチドを含む抗原性フェリチンポリペプチドおよびナノ粒子も産生した。さらに、アジュバントのような免疫刺激性部分が抗原性ポリペプチドに直接化学的に結合した、記載したＥＢＶポリペプチドおよびフェリチンを含む自己アジュバント性抗原性ポリペプチドを開発した。免疫刺激性部分を、抗原ポリペプチドと直接コンジュゲートすると、免疫刺激性部分とＥＢＶポリペプチドとを単一の高分子実体として標的化同時送達することが可能となり、これによって抗原およびアジュバントのような免疫刺激性部分を個別の分子として含む従来のワクチンに関して懸念される全身毒性の可能性を大きく減少させることができる。免疫刺激性部分をＥＢＶポリペプチドと共に高分子実体として同時送達すること、およびそれが多価で提示されることもまた、保護を誘発するのに必要な全体的な用量を低減させ、製造負荷およびコストを低減させることができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋａｎｅｋｉｙｏら、Ｎａｔｕｒｅ  ４９９：１０２〜１０６頁（２０１３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本開示の目的は、上記の利点の１つまたはそれ以上を提供することができる、または有用な選択を公共に少なくとも提供する組成物、キット、方法、および使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
実施形態１は、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）  ｇＬポリペプチドおよびＥＢＶ  ｇＨポリペプチドを含む抗原性ＥＢＶポリペプチドであって、少なくとも１５アミノ酸の長さを有するリンカーがＥＢＶ  ｇＬポリペプチドとＥＢＶ  ｇＨポリペプチドとを隔てている、抗原性ＥＢＶポリペプチドである。
【０００９】
実施形態２は、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）  ｇＬポリペプチド、ＥＢＶ  ｇＨポリペプチド、およびＥＢＶ  ｇｐ４２ポリペプチドを含む抗原性ＥＢＶポリペプチドであって、少なくとも１５アミノ酸の長さを有するリンカーがＥＢＶ  ｇＬポリペプチドとＥＢＶ  ｇＨポリペプチドとを隔てている、抗原性ＥＢＶポリペプチドである。
【００１０】
実施形態３は、フェリチンをさらに含む、実施形態１または２に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドである。
【００１１】
実施形態４は、ＥＢＶポリペプチドおよびフェリチンタンパク質を含む抗原性ＥＢＶポリペプチドであって、フェリチンタンパク質が表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える変異を含む、抗原性ＥＢＶポリペプチドである。
【００１２】
実施形態５は、ＥＢＶポリペプチドがＥＢＶ  ｇＬポリペプチド、ＥＢＶ  ｇＨポリペプチド、またはＥＢＶ  ｇｐ２２０ポリペプチドを含む、実施形態４に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドである。
【００１３】
実施形態６は、ＥＢＶポリペプチドがｇＬポリペプチドを含み、ポリペプチドがＥＢＶ  ｇＨポリペプチドをさらに含む、実施形態５に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドである。
【００１４】
実施形態７は、ポリペプチドがＥＢＶ  ｇｐ４２ポリペプチドをさらに含む、実施形態１または３〜６のいずれか１項に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドである。
【００１５】
実施形態８は、第１の抗原性ＥＢＶポリペプチドおよび第２の抗原性ＥＢＶポリペプチドを含む組成物であって、第１の抗原性ＥＢＶポリペプチドがフェリチン重鎖および第１のＥＢＶポリペプチドを含み、第２の抗原性ＥＢＶポリペプチドがフェリチン軽鎖および第２のＥＢＶポリペプチドを含み、第１および第２のＥＢＶポリペプチドが異なる、組成物である。
【００１６】
実施形態９は、第１のＥＢＶポリペプチドまたは第２のＥＢＶポリペプチドがｇｐ２２０ポリペプチドを含む、実施形態８に記載の組成物である。
【００１７】
実施形態１０は、（ｉ）第１の抗原性ＥＢＶポリペプチドがｇＬポリペプチドおよびｇＨポリペプチドの一方または両方を含み、第２の抗原性ＥＢＶポリペプチドがｇｐ２２０ポリペプチドを含むか、または（ｉｉ）第１の抗原性ＥＢＶポリペプチドがｇｐ２２０ポリペプチドを含み、第２の抗原性ＥＢＶポリペプチドがｇＬポリペプチドおよびｇＨポリペプチドの一方または両方を含む、実施形態８または９に記載の組成物である。
【００１８】
実施形態１１は、第１の抗原性ＥＢＶポリペプチドがｇＬポリペプチドおよびｇＨポリペプチドを含むか、または第２の抗原性ＥＢＶポリペプチドがｇＬポリペプチドおよびＥＢＶ  ｇＨポリペプチドを含む、実施形態８〜１０のいずれか１項に記載の組成物である。
【００１９】
実施形態１２は、ｇＬポリペプチドおよび／またはｇＨポリペプチドを含む抗原性ＥＢＶポリペプチドがｇｐ４２ポリペプチドをさらに含む、実施形態１０または１１に記載の組成物である。
【００２０】
実施形態１３は、ｇＨおよびｇＬポリペプチドを含み、ｇＨポリペプチドが場合によりｇｐ４２ポリペプチドを含むｇＬポリペプチドに対してＣ末端側であり、ｇｐ４２ポリペプチドがｇＨポリペプチドに対してＣ末端側である、実施形態１〜１２のいずれか１項に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドまたは組成物である。
【００２１】
実施形態１４は、ｇｐ４２ポリペプチドを含み、ｇｐ４２ポリペプチドが配列番号２３９または２４０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１〜１３のいずれか１項に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドまたは組成物である。
【００２２】
実施形態１５は、ＥＢＶ  ｇＨポリペプチドおよびＥＢＶ  ｇｐ４２ポリペプチドを含み、少なくとも１５アミノ酸の長さを有するリンカーがＥＢＶ  ｇＨポリペプチドとＥＢＶ  ｇｐ４２ポリペプチドとを隔てており、場合によりリンカーが１５〜６０アミノ酸、２０〜６０アミノ酸、３０〜６０アミノ酸、４０〜６０アミノ酸、３０〜５０アミノ酸、または４０〜５０アミノ酸の長さを有し、さらに場合によりリンカーが配列番号２３４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１〜１４のいずれか１項に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドまたは組成物である。
【００２３】
実施形態１６は、リンカーを含み、リンカーが少なくとも１５アミノ酸の長さを有し、場合によりリンカーが第１のＥＢＶポリペプチドと第２のＥＢＶポリペプチドとを隔てている、実施形態１〜１５のいずれか１項に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドまたは組成物である。
【００２４】
実施形態１７は、リンカーが１５〜６０アミノ酸、２０〜６０アミノ酸、３０〜６０アミノ酸、４０〜６０アミノ酸、３０〜５０アミノ酸、または４０〜５０アミノ酸の長さを有する、実施形態１６に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドまたは組成物である。
【００２５】
実施形態１８は、ＥＢＶポリペプチドが配列番号３６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１〜１７のいずれか１項に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドまたは組成物である。
【００２６】
実施形態１９は、ＥＢＶポリペプチドが配列番号３７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１〜１８のいずれか１項に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドまたは組成物である。
【００２７】
実施形態２０は、ポリペプチドが配列番号３０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むリンカーを含み、場合によりリンカーが第１のＥＢＶポリペプチドと第２のＥＢＶポリペプチドとを隔てている、実施形態１〜１９のいずれか１項に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドまたは組成物である。
【００２８】
実施形態２１は、ＥＢＶポリペプチドが配列番号３８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１〜２０のいずれか１項に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドまたは組成物である。
【００２９】
実施形態２２は、ＥＢＶポリペプチドとフェリチンとを隔てるさらなるリンカーをさらに含む、実施形態３〜２１のいずれか１項に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドまたは組成物である。
【００３０】
実施形態２３は、フェリチンに対してＮ末端側、ｇＨポリペプチドに対してＣ末端側に位置するＥＢＶ  ｇｐ４２ポリペプチドを含み、リンカーがＥＢＶ  ｇｐ４２ポリペプチドとフェリチンとを隔てており、場合によりリンカーが少なくとも１５アミノ酸の長さを有するか、または１５〜６０アミノ酸、２０〜６０アミノ酸、３０〜６０アミノ酸、４０〜６０アミノ酸、３０〜５０アミノ酸、もしくは４０〜５０アミノ酸の長さを有し、さらに場合によりリンカーが配列番号２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、または２３８のうちいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態３〜２２のいずれか１項に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドまたは組成物である。
【００３１】
実施形態２４は、実施形態２２または２３に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドまたは組成物であって、リンカーがシステインを含む、抗原性ＥＢＶポリペプチドまたは組成物である。
【００３２】
実施形態２５は、リンカーが配列番号３３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態２２〜２４のいずれか１項に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドまたは組成物である。
【００３３】
実施形態２６は、実施形態２４または２５に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドまたは組成物であって、システインが免疫刺激性部分にコンジュゲートされており、場合により免疫刺激性部分がＴＬＲ２、ＴＬＲ７／８、ＴＬＲ９、またはＳＴＩＮＧのアゴニストである、抗原性ＥＢＶポリペプチドまたは組成物である。
【００３４】
実施形態２７は、フェリチンがＨ．ピロリフェリチンのＥ１２Ｃ、Ｓ２６Ｃ、Ｓ７２Ｃ、Ａ７５Ｃ、Ｋ７９Ｃ、Ｓ１００Ｃ、およびＳ１１１Ｃ変異の１つもしくはそれ以上、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって決定される、非Ｈ．ピロリフェリチンにおける１つもしくはそれ以上の対応する変異を含む、実施形態３〜２６のいずれか１項に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドまたは組成である。
【００３５】
実施形態２８は、フェリチンが表面に露出したアスパラギンを非アスパラギンアミノ酸に置き換える変異を含み、場合によりアスパラギンがＨ．ピロリフェリチンの１９位、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって決定される、非Ｈ．ピロリフェリチンの類似の位置にある、実施形態３〜２７のいずれか１項に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドまたは組成物である。
【００３６】
実施形態２９は、フェリチンが内部システインを非システインアミノ酸に置き換える変異を含み、場合により、内部システインがＨ．ピロリフェリチンの３１位、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって決定される、Ｈ．ピロリフェリチンの３１位に対応する位置にある、実施形態３〜２８のいずれか１項に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドまたは組成物である。
【００３７】
実施形態３０は、フェリチンが配列番号２０１〜２０７または２１１〜２１５のうちいずれか１つと８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態３〜２９のいずれか１項に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドまたは組成物である。
【００３８】
実施形態３１は、抗原性ＥＢＶポリペプチドが配列番号２２６のアミノ酸２３〜１０７８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む、実施形態１〜３０のいずれか１項に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドまたは組成物である。
【００３９】
実施形態３２は、抗原性ＥＢＶポリペプチドが配列番号２２６〜２３１または２４１〜２４２のうちいずれかと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含み、場合によりリーダー配列を欠如する、実施形態１〜３１のいずれか１項に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドまたは組成物である。
【００４０】
実施形態３３は、実施形態３〜３２のいずれか１項に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドまたは第１および第２のポリペプチドを含むフェリチン粒子である。
【００４１】
実施形態３４は、実施形態１〜３３のいずれか１項に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドまたはフェリチン粒子および薬学的に許容される担体を含む組成物である。
【００４２】
実施形態３５は、実施形態３４に記載の組成物であって、フェリチン粒子がＥＢＶ  ｇＬポリペプチドおよびＥＢＶ  ｇＨポリペプチドを含み、組成物がｇｐ２２０ポリペプチドを含む第２のフェリチン粒子をさらに含む、組成物である。
【００４３】
実施形態３６は、インフルエンザに対する免疫応答を誘発する方法における、またはＥＢＶによる感染からの対象の保護における使用のための実施形態１〜３５のいずれか１項に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチド、フェリチン粒子、または組成物である。
【００４４】
実施形態３７は、ＥＢＶに対する免疫応答を誘発する、またはＥＢＶ感染に対して対象を保護する方法であって、実施形態１〜３６いずれか１つに記載の１つまたはそれ以上の抗原性ＥＢＶポリペプチド、フェリチン粒子、または組成物を対象に投与する工程を含む方法である。
【００４５】
実施形態３８は、対象がヒトである、実施形態３６または３７に記載の抗原性ＥＢＶポリペプチド、フェリチン粒子、組成物、または方法である。
【００４６】
実施形態３９は、場合により核酸がｍＲＮＡである、実施形態１〜３２のいずれか１つに記載の抗原性ＥＢＶポリペプチドをコードする核酸である。
【００４７】
追加の目的および利点は、以下の説明に記載され、および／または説明から明白であり、または実践により学ぶことができるであろう。目的および利点は、添付の特許請求の範囲に特に指摘された要素および組合せによって実現および達成される。
【００４８】
前述の一般的説明および以下の詳細な説明は、単なる例示および説明であり、特許請求の範囲を制限するものではない。
【００４９】
本明細書に組み入れられ、本明細書の一部を構成する以下の図面は、特定の実施形態を例証し、説明と共に本明細書に記載する原理を説明するために役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１−１】図１Ａ−１Ｂは、クーマシーおよびウエスタンブロット分析によるＨｉｓ−タグの除去の有無に関わらず、一本鎖ｇＬおよびｇＨ単量体（図１Ａ）（配列番号６）および三量体（図１Ｂ）（配列番号１１）を示す図である。図１Ｂはまた、サイズ排除カラム（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）６）精製からの画分のＵＶ吸光度トレースを示す。
【図１−２】図１−１の続き。
【図２−１】図２Ａ−２Ｅは、一本鎖ｇＬ／ｇＨ−フェリチンナノ粒子（配列番号１４）の精製および特徴付けを示す図である。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）６精製画分のＵＶ吸光度トレース（図２Ａ）、ならびに精製から選択された画分のクーマシー（図２Ｂ）およびウエスタンブロット（図２Ｃ）分析（Ｌは、分子量ラダーを示し、１５０および２５０ｋＤａのバンドの位置は、図２Ｂの右に示される）。また、一本鎖ナノ粒子の動的光散乱（図２Ｄ）および電子顕微鏡（図２Ｅ）分析を提示する。
【図２−２】図２−１の続き。
【図２−３】図２−２の続き。
【図２−４】図２−３の続き。
【図３】異なる代表的な一本鎖ｇＬ／ｇＨ−フェリチン構築物を示す図である。
【図４】スクアレンエマルジョンベースのアジュバントである、ＡＦ０３アジュバントと混合した一本鎖ｇＬ／ｇＨ三量体またはナノ粒子（ＮＰ）でマウスを免疫した後の抗体力価を示す図である。＊ＮＰ構築物をその対応する三量体構築物と比較した場合のｐ値＝＜０．０５。左から右に、構築物は、配列番号１６、１０、１１、１３、１２、および１４であった。
【図５】図５Ａ−５Ｂは、一本鎖ｇＬ／ｇＨナノ粒子および陰性対照の裸のフェリチン（すなわち、いずれの非フェリチンポリペプチドまたは免疫刺激性部分にも結合していないフェリチン）と比較した、ｇｐ２２０ナノ粒子（配列番号１）と一本鎖ｇＬ／ｇＨナノ粒子（「ｇＬ＿ｇＨ＿Ｃ５  ＮＰ」、配列番号１９）の両方を含む二価組成物に対するマウスの抗ｇＬ／ｇＨ抗体応答を示す図である。結果は、二価組成物を使用しても、陰性対照の裸のフェリチンによる一本鎖ｇＬ／ｇＨの結果と比較して、抗ｇＬ／ｇＨ抗体応答との干渉をもたらさないことを示す。両組成物は、ＡＦ０３アジュバントを含んだ。個々の希釈液（図５Ａ）および結合力価（図５Ｂ）におけるＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図６】図６Ａ−６Ｂは、図５Ａ〜図５Ｂについて記載されるように、ｇｐ２２０ナノ粒子と一本鎖ｇＬ／ｇＨナノ粒子の両方を含む二価組成物に対する抗ｇｐ２２０抗体応答を示す図である。結果は、二価組成物を使用しても、陰性対照の裸のフェリチンを用いたｇｐ２２０ナノ粒子の結果と比較して、抗ｇｐ２２０抗体応答との干渉をもたらさないことを示す。両組成物は、ＡＦ０３アジュバントを含んだ。個々の希釈液（図６Ａ）および結合力価（図６Ｂ）におけるＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図７】図７Ａは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストなどの免疫刺激性部分へコンジュゲーションのために、表面露出アミノ酸をシステインで置き換える変異を含む、ＥＢＶポリペプチドおよびフェリチンを含むナノ粒子の設計を示す図である。この設計に対応する例示的な配列については、配列番号１４を参照されたい。ここで、一本鎖ｇＬ／ｇＨ抗原は、可撓性４６アミノ酸リンカーによってフェリチンに結合される。図７Ｂは、図７Ａによる構築物へのコンジュゲーションに適した代表的なトール様受容体アゴニスト（ＰＥＧ４−マレイミドリンカーを有するＳＭ７／８ａ）を示す。図７Ｃは、フェリチン表面上のシステインおよびＰＥＧ４−マレイミドリンカーを介してコンジュゲートされたＳＭ７／８ａを有するｇＬ／ｇＨナノ粒子の電子顕微鏡写真（ＥＭ）画像を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、表面露出アミノ酸をシステインで置き換える変異を含むフェリチンの一部の構造を示す図であり、システインの位置が示される。
【図８Ｂ】図８Ｂは、フェリチン、リンカー、およびＣｐＧアジュバントを隣接させることによる、フェリチンへのＣｐＧアジュバント（配列番号２４７）のコンジュゲーションを示し、これらは、互いに近接して結合するようになる各部分の一部を示すように配向される。
【図９Ａ】ｇＬ／ｇＨ−フェリチンをコンジュゲートしていない形態（図９Ａ）およびＳＭ７／８ａをコンジュゲートした形態（図９Ｂ）の質量分析（ＭＳ）スペクトルを示す図である。主ピークの質量の差は７１１Ｄａであり、これはＳＭ７／８ａとリンカーとのコンジュゲートから予測された差にほぼ対応する。
【図９Ｂ】ｇＬ／ｇＨ−フェリチンをコンジュゲートしていない形態（図９Ａ）およびＳＭ７／８ａをコンジュゲートした形態（図９Ｂ）の質量分析（ＭＳ）スペクトルを示す図である。主ピークの質量の差は７１１Ｄａであり、これはＳＭ７／８ａとリンカーとのコンジュゲートから予測された差にほぼ対応する。
【図１０Ａ】ｇｐ２２０−フェリチンのコンジュゲートしていない形態（図１０Ａ）およびＳＭ７／８ａをコンジュゲートした形態（図１０Ｂ）の質量分析（ＭＳ）スペクトルを示す図である。主ピークの質量の差は７１４．７Ｄａであり、これはＳＭ７／８ａとリンカーとのコンジュゲーションから予測された差にほぼ対応する。
【図１０Ｂ】ｇｐ２２０−フェリチンのコンジュゲートしていない形態（図１０Ａ）およびＳＭ７／８ａをコンジュゲートした形態（図１０Ｂ）の質量分析（ＭＳ）スペクトルを示す図である。主ピークの質量の差は７１４．７Ｄａであり、これはＳＭ７／８ａとリンカーとのコンジュゲーションから予測された差にほぼ対応する。
【図１１】図１１Ａ−１１Ｄは、コンジュゲートしていない（図１１Ａ、Ｃ）およびコンジュゲートした（図１１Ｂ、Ｄ）一本鎖ｇＬ／ｇＨ（図１１Ａ、Ｂ）およびｇｐ２２０（図１１Ｃ、Ｄ）フェリチンナノ粒子の電子顕微鏡（ＥＭ）画像を示し、これらのナノ粒子へのＳＭ７／８ａのコンジュゲーションは、ナノ粒子構造を破壊しなかったことを示す。
【図１２】図１２Ａ−１２Ｂは、コンジュゲートしたＳＭ７／８ａまたは他のアジュバントを含まない一本鎖ｇＬ／ｇＨ、別個の分子としてのＡＦ０３アジュバント、またはコンジュゲートＳＭ７／８ａを含むフェリチンナノ粒子で処置した後のマウスにおける抗体応答を示す図である。ＥＬＩＳＡの結果は、個々の希釈（図１２Ａ）および結合力価（図１２Ｂ）として示される。
【図１３】図１３Ａ−１３Ｂは、単独、別個の分子としてのＡＦ０３アジュバント、またはコンジュゲートしたＳＭ７／８ａのいずれかを含むナノ粒子での処置後のマウスにおける抗体応答を示す図である。ＥＬＩＳＡの結果は、個々の希釈（図１３Ａ）および結合力価（図１３Ｂ）として示される。
【図１４】図１４Ａ−１４Ｂは、ＥＬＩＳＡにより測定した、ＳＭ７／８ａにコンジュゲートした一本鎖ｇＬ／ｇＨフェリチンナノ粒子および裸のフェリチンでの処置と比較した、ＳＭ７／８ａにコンジュゲートしたｇｐ２２０ナノ粒子およびＳＭ７／８ａにコンジュゲートした一本鎖ｇＬ／ｇＨフェリチンナノ粒子での処置後のマウスにおける抗ｇＬ／ｇＨ抗体応答を示す図である。結果は、混合したＡＦ０３を用いない（図１４Ａ）または混合したＡＦ０３を用いた（図１４Ｂ）実験について示される。
【図１５】図１５Ａ−１５Ｂは、ＥＬＩＳＡにより測定した、ＳＭ７／８ａにコンジュゲートしたｇｐ２２０ナノ粒子および裸のフェリチンでの処置と比較した、ＳＭ７／８ａにコンジュゲートしたｇｐ２２０ナノ粒子およびＳＭ７／８ａにコンジュゲートした一本鎖ｇＬ／ｇＨナノ粒子での処置後のマウスにおける抗ｇｐ２２０抗体応答を示す図である。結果は、混合したＡＦ０３を用いない（図１５Ａ）または混合したＡＦ０３を用いた（図１５Ｂ）実験について示される。
【図１６】ＥＬＩＳＡエンドポイント力価によって測定した、ＥＬＩＳＡにより測定した、一本鎖ｇＬ／ｇＨナノ粒子にコンジュゲートした混合したＡＦ０３アジュバントおよび／またはＳＭ７／８ａのいずれかまたは両方を伴うまたは伴わない、一本鎖ｇＬ／ｇＨナノ粒子（ｇＬ／ｇＨ＿Ｃ５、配列番号１９）および裸のフェリチンでの処置後のマウスにおける抗ｇＬ／ｇＨ抗体応答を示す図である。
【図１７】ｇｐ２２０ナノ粒子にコンジュゲートした混合ＡＦ０３アジュバントおよび／またはＳＭ７／８ａのいずれかまたは両方を伴うまたは伴わない、ｇｐ２２０ナノ粒子および裸のフェリチンでの処置後のマウスにおける抗ｇｐ２２０抗体応答を示す図である。
【図１８】ｇｐ２２０ナノ粒子および一本鎖ｇＬ／ｇＨナノ粒子を含む二価組成物での処置後のマウスにおける抗ｇＬ／ｇＨ抗体応答を示す図である。凡例に示されるように、いくつかのナノ粒子はＳＭ７／８ａにコンジュゲートされ、いくつかのナノ粒子はＡＦ０３と混合された。鍵となる上から下へのシンボルの順序は、グラフの左から右へのシンボルの順序と一致する。
【図１９】一本鎖ｇＬ／ｇＨナノ粒子およびｇｐ２２０ナノ粒子および／または裸のフェリチンを含む二価組成物での処置後のマウスにおける抗ｇｐ２２０抗体応答を示す。凡例に示されように、いくつかのナノ粒子はＳＭ７／８ａにコンジュゲートされ、いくつかのナノ粒子はＡＦ０３と混合された。キーの上から下へのシンボルの順序は、グラフの左から右へのシンボルの順序と一致する。
【図２０−１】図２０Ａ−２０Ｄは、混合ＡＦ０３および／またはＳＭ７／８ａ（図２０Ａ、２０Ｃ、または２０Ｄ）もしくはＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（図２０Ｂ）へのコンジュゲーションを伴うまたは伴わない、ｇＬ＿ｇＨ＿Ｃ７ナノ粒子（配列番号２０）での処置後のマウスにおける抗体応答を示す図である。示されているのは、ＥＬＩＳＡ（図２０Ａ）によって測定されたプライム採血からのエンドポイント力価、ブースター採血（図２０Ｂ）からの個々の希釈でのＥＬＩＳＡ結果、ならびにブースター採血（図２０Ｃ）および最終採血（図２０Ｄ）からのＥＬＩＳＡによって測定されたエンドポイント力価である。
【図２０−２】図２０−１の続き。
【図２１】プライム、ブースト、および最終採血からのＥＬＩＳＡにより測定されたエンドポイント力価として、混合ＡＦ０３アジュバントおよび／またはＳＭ７／８ａへのコンジュゲーションを伴うまたは伴わない、ｇＬ＿ｇＨ＿Ｃ５ナノ粒子（配列番号１９）での処置後のマウスにおける抗体応答を示す図である。
【図２２】プライム、ブースト、および最終採血からのＥＬＩＳＡにより測定されたエンドポイント力価として、混合ＡＦ０３アジュバントおよび／またはＳＭ７／８ａへのコンジュゲーションを伴うまたは伴わない、ｇｐ２２０ナノ粒子での処置後のマウスにおける抗体応答を示す図である。
【図２３Ａ】図２３Ａは、クーマシー染色により可視化された、ｇｐ２２０またはｇＬ／ｇＨのいずれかとの融合有りまたは無しでの、Ｔ．ｎｉフェリチンの軽鎖および重鎖を示す図である（図２３Ａ）。図２３Ａの最も右側のレーンにおける２０、２５、７５、１００、および１５０ｋＤａのマーカーは標識される。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、ｇｐ２２０またはｇＬ／ｇＨのいずれかとの融合有りまたは無しでの、Ｔ．ｎｉフェリチンの軽鎖および重鎖を含む構築物の例を提供する。
【図２４−１】図２４Ａ−２４Ｄは、ｇｐ２２０−Ｔ．ｎｉフェリチンのイオン交換（Ｑカラム）クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）精製を実証する図である。ｐＨ７でのＱカラム（図２４Ａ）およびＳＥＣ  Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）６，１６／６００（図２４Ｂ）からの吸光度トレース、ｐＨ７でのＱカラムからの画分のクーマシー染色（図２４Ｃ）（左からのレーンは入力（「Ｉｎ」）、フロースルー（「ＦＴ」）、分子量ラダー（左にｋＤで表示されたサイズ）、および選択された画分）、およびＳＥＣ  Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）  ６，１６／６００からの画分のクーマシー染色（図２４Ｄ）（左からのレーンは分子量ラダーであり（左にｋＤで表示されたサイズ）および選択された画分）が示される。図２４Ｅは、構築物の例を示す。
【図２４−２】図２４−１の続き。
【図２４−３】図２４−２の続き。
【図２５−１】図２５Ａ−２５Ｄは、ｇＬ／ｇＨ（軽）／ｇｐ２２０（重）−Ｔ．ｎｉフェリチンのイオン交換（Ｑカラム）クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）精製を実証する図である。ｐＨ７でのＱカラム（図２５Ａ）およびＳＥＣ  Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）６，１６／６００（図２５Ｂ）からの吸光度トレース、ｐＨ７でのＱカラムからの画分のクーマシー染色（図２５Ｃ）（左からのレーンは入力（「Ｉｎ」）、フロースルー（「ＦＴ」）、分子量ラダー（左にｋＤで表示されたサイズ）、および選択された画分）、およびＳＥＣ  Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）  ６，１６／６００からの画分のクーマシー染色（図２５Ｄ）（左からのレーンは分子量ラダーであり（左にｋＤで表示されたサイズ）および選択された画分）が示される。図２５Ｅは、構築物の例を示す。
【図２５−２】図２５−１の続き。
【図２５−３】図２５−２の続き。
【図２６−１】図２６Ａ−２６Ｈは、クーマシー染色によって視覚化され（図２６Ａおよび２６Ｅ）、図式的に例示され（図２６Ｂおよび図２６Ｆ）、動的光散乱（ＤＬＳ）によって特徴付けられ（図２６Ｄおよび２６Ｈ）、および電子顕微鏡写真で可視化された（図２６Ｃおよび２６Ｇ）、ｇｐ２２０−Ｔ．ｎｉフェリチンまたはｇＬ／ｇＨ（軽鎖）／ｇｐ２２０（重鎖）−Ｔ．ｎｉフェリチン構築物を示す図である。図２６Ａ〜２６Ｄは、軽鎖と重鎖の両方に融合されたｇｐ２２０を用いたデータを示す（図２６Ｂの図）。図２６Ｅ〜２６Ｈは、重鎖に融合されたｇｐ２２０および軽鎖に融合されたｇＬ／ｇＨを用いたデータを示す（図２６Ｆの図）。
【図２６−２】図２６−１の続き。
【図２６−３】図２６−２の続き。
【図２６−４】図２６−３の続き。
【図２７−１】図２７Ａ−２７Ｃは、クーマシー染色によって可視化され（図２７Ａ）、電子顕微鏡写真で可視化され（図２７Ｂ）、およびＤＬＳによって特徴付けられた（図２７Ｃ）、裸のＴ．ｎｉフェリチン粒子（すなわち、非フェリチンポリペプチドに融合されていない）を示す図である。
【図２７−２】図２７−１の続き。
【図２８Ａ】図２８Ａは、２９３のｅｘｐｉ細胞で発現された精製ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２  ＮＰ構築物（配列番号２２７）を用いたＳＤＳ変性クーマシー染色ゲル（左）、および（右）ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２  ＮＰのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）ピークを示す図である。ＳＥＣクロマトグラムの水平軸の単位はｍＬである。
【図２８Ｂ】図２８Ｂは、約２６．２ｎｍの動的光散乱半径を有するようにＣＨＯプールから精製されたｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２  ＮＰを示す。
【図２９】図２９Ａ−Ｂは、裸のフェリチンナノ粒子と組み合わせた一価のｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２ナノ粒子組成物、または二価組成物（ｇｐ２２０と組み合わせたｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２ナノ粒子）によって誘発された免疫応答の評価を示す図である。図２９Ａは、Ｂ細胞中和を示す。図２９Ｂは、上皮細胞中和を示す。
【図３０−１】図３０Ａ−Ｅは、示された抗原に対するエンドポイント結合力価を示す図である。図３０Ｆ−Ｇは、示されるようにワクチン接種されたフェレット由来の血清のＥＢＶウイルス中和アッセイを示す図である。プライム＝Ｉｎｊ．１、ブースト＝Ｉｎｊ．２。
【図３０−２】図３０−１の続き。
【図３０−３】図３０−２の続き。
【図３０−４】図３０−３の続き。
【図３１Ａ】図３１Ａは、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６サイズ排除クロマトグラフィーを用いたｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２＿ＮＰ＿Ｃ１２（配列番号２２８）の精製を示す図である。矢印は、変性クーマシーゲル分析および抗フェリチン抗体を用いたウエスタンブロット分析によりピークから回収した画分を示す。
【図３１Ｂ】図３１Ｂは、２０．６ｎｍの粒子径半径を示す、図３１Ａにおける試料の動的光散乱分析である。
【図３２Ａ】図３２Ａは、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６サイズ排除クロマトグラフィーを用いたｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２＿ＮＰ＿Ｃ１３（配列番号２２９）の精製を示す図である。矢印は、変性クーマシーゲル分析および抗フェリチン抗体を用いたウエスタンブロット分析によりピークから回収した画分を示す。
【図３２Ｂ】図３２Ｂは、１７．１ｎｍの粒径半径を示す、図３２Ａにおける試料の動的光散乱分析である。
【図３３Ａ】図３３Ａは、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６サイズ排除クロマトグラフィーを用いたｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２＿ＮＰ＿Ｃ１４（配列番号２３０）の精製を示す図である。矢印は、変性クーマシーゲル分析および抗フェリチン抗体を用いたウエスタンブロット分析によりピークから回収した画分を示す。
【図３３Ｂ】図３３Ｂは、１６．９ｎｍの粒径半径を示す、図３３Ａにおける試料の動的光散乱分析である。
【図３４】左側のＳＤＳ還元クーマシーゲルは、精製された一本鎖ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２−Ｈｉｓ産物（配列番号２２６）を示す図である。タンパク質をニッケルアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。右側は、一本鎖ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２−Ｈｉｓ産物（配列番号２２６）の２．９オングストローム結晶構造である。Ｇｐ４２（濃い灰色であって、矢印で示す）はｇＨ／ｇＬヘテロ二量体と相互作用する。
【図３５】図３５Ａ−Ｅは、（配列番号２２７〜２３１の各々におけるように）フェリチンに融合されたｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２の一本鎖構築物の描画を図３５Ａに示す図である。各タンパク質間の融合は、可撓性アミノ酸リンカーまたは上記に明記された堅いアミノ酸リンカーを介する。一本鎖ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２分子は、ナノ粒子上のヘテロ三量体形成の１：１：１の比を確証する。このヘテロ三量体の結晶構造は、一本鎖ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２が、天然に見られる野生型ｇＨ、ｇＬ、およびｇｐ４２タンパク質と同様のヘテロ三量体形成を採用し得ることを示すために解明されている（図３５Ｂ、図３４も参照されたい）。図３５Ｃは、この一本鎖ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２ヘテロ三量体がフェリチンとの融合を介してナノ粒子上にどのように提示されるかのモデルである。単一のナノ粒子上に提示される一本鎖ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２のコピーが２４個ある。図３５Ｄは、２９３Ｅｘｐｉ細胞における配列番号２２７の発現後の精製を示す。変性ＳＤＳクーマシーゲルは、フェリチンに融合したｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２がグリコシル化により１５０ｋＤを超えることを示す。図３５Ｅは、精製産物のネガティブ染色電子顕微鏡分析を示し、フェリチンに融合した一本鎖ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２が、表面上にｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２抗原を提示するナノ粒子を首尾よく形成できることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
単独で、別の分子としてのアジュバントとともに、および／または自己アジュバント性であり得るナノ粒子（例えばフェリチン粒子またはルマジンシンターゼ粒子）の一部として投与すると抗原性であり得るＥＢＶポリペプチドが提供される。そのようなポリペプチドおよびそのようなポリペプチドを含む組成物は、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）に対する抗体応答を誘発するために使用することができる。ＥＢＶポリペプチドはｇＬ、ｇＨ、ｇＬ／ｇＨ、ｇｐ２２０、もしくはｇｐ４２ポリペプチド、またはそれらの組合せ、およびフェリチン等の多量体化ドメインを含み得る。フェリチンは表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える変異を含んでよく、これはシステインを介してフェリチンに免疫刺激性部分をコンジュゲートすることを促進することができる。そのようなコンジュゲーションは別に投与するアジュバントの必要性を除去または低減し、ＥＢＶポリペプチドに対する免疫応答を誘発するために必要なアジュバント／免疫刺激性部分の量を潜在的に低減させることもできる。一部の実施形態では、（ｉ）ＥＢＶポリペプチド、および（ｉｉ−ａ）表面に露出したシステインを含むフェリチンまたは（ｉｉ−ｂ）フェリチンおよびシステインを含むＮ末端もしくはＣ末端リンカーを含む抗原性ＥＢＶポリペプチドが提供される。本明細書に記載したＥＢＶポリペプチドのいずれも、以下に記載するフェリチンのいずれとも組み合わせることができる。本明細書に記載したポリペプチドをコードする核酸も提供される。
【００５２】
Ａ．定義
本明細書で使用される場合、「ＥＢＶポリペプチド」は、ＥＢＶによってコードされるアミノ酸配列の全てまたは一部を含むポリペプチドを指す。同様に、ｇＬ、ｇＨ、ｇｐ４２、およびｇｐ２２０ポリペプチドはそれぞれ、ＥＢＶによってコードされるｇＬ、ｇＨ、ｇｐ４２、またはｇｐ２２０アミノ酸配列の全てまたは一部を含むポリペプチドを指す。例えば、ＥＢＶコードポリペプチドと少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドは、必然的にＥＢＶコードポリペプチドの一部を含む。用語「ｇＬポリペプチド」、「ｇＨポリペプチド」、「ｇｐ４２ポリペプチド」、および「ｇｐ２２０ポリペプチド」はそれぞれ、「ＥＢＶ  ｇＬポリペプチド」、「ＥＢＶ  ｇＨポリペプチド」、「ＥＢＶ  ｇｐ４２ポリペプチド」、および「ＥＢＶ  ｇｐ２２０ポリペプチド」と互換的に使用される。抗原性ポリペプチドの一部または全てとしてのＥＢＶポリペプチドによる免疫は、ＥＢＶによる感染症に対する保護を付与し得る。本文がそれ以外であると述べていない限り、ＥＢＶポリペプチドを含む本明細書に開示される任意のポリペプチドは、ＥＢＶ（例えば、ＥＢＶのｇＬおよびｇＨの全てもしくは一部、またはＥＢＶのｇＬ、ｇＨ、およびｇｐ４２の全てもしくは一部）によってコードされる複数の配列の全てまたは一部を含み得る。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「単量体」または「単量体構築物」は、一本鎖タンパク質として発現される構築物を指す。単量体は、一本鎖で発現されるＥＢＶのｇＬおよびｇＨ、または一本鎖で発現されるＥＢＶのｇＬ、ｇＨ、およびｇｐ４２を含み得る。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「三量体」または「三量体構築物」は、Ｔ４ファージフィブリチンに由来するフォルドン三量体形成ドメインのような三量体形成ドメインと共にＥＢＶのｇＬおよび／またはｇＨを含む構築物を指す。ヒトコラーゲンＸＶＩＩＩ三量体形成ドメイン（例えば、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｃｉｅｎｆｕｅｇｏｓら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２０１６；６：２８６４３頁を参照されたい）およびＬ１ＯＲＦ１ｐ三量体形成ドメイン（例えば、Ｋｈａｚｉｎａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００９  Ｊａｎ  １２；１０６（３）：７３１〜３６頁を参照されたい）のような他の三量体形成ドメインもまた当技術分野で公知であり、三量体構築物において使用することができる。
【００５５】
「フェリチン」または「フェリチンタンパク質」は、本明細書で使用される場合、Ｈ．ピロリフェリチン（配列番号２０８または２０９）、またはＰ．フリオスス（Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ）フェリチン、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）フェリチン、もしくはヒトフェリチンのような本明細書で考察される別のフェリチンと検出可能な配列同一性を有し、鉄を例えば細胞内もしくは組織内で貯蔵する、または鉄を血流に運ぶ役目を果たすタンパク質を指す。重鎖および軽鎖（例えば、イラクサギンウワバおよびヒトフェリチン）として知られる２つのポリペプチド鎖として存在するフェリチンを含むそのような例示的なフェリチンを、以下で詳細に考察する。一部の実施形態では、フェリチンは、本明細書に、例えば表２（配列表）に開示されるフェリチン配列と少なくとも１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の同一性を有する配列を含む。フェリチンは、完全長の天然に存在する配列の断片であり得る。
【００５６】
「野生型フェリチン」は、本明細書で使用される場合、その配列が天然に存在する配列からなるフェリチンを指す。フェリチンはまた、完全長のフェリチン、または野生型フェリチンとはそのアミノ酸配列において１つまたはそれ以上の差を有するフェリチンの断片も含む。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「フェリチン単量体」は、他のフェリチン分子と集合していない単一のフェリチン分子（例えば、該当する場合、単一のフェリチン重鎖または軽鎖）を指す。「フェリチン多量体」は、複数の会合したフェリチン単量体を含む。「フェリチンタンパク質」は、単量体フェリチンおよび多量体フェリチンを含む。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「フェリチン粒子」は、球状形態に自己集合したフェリチンを指す。フェリチン粒子は時に、「フェリチンナノ粒子」または単に「ナノ粒子」と呼ばれる。一部の実施形態では、フェリチン粒子は、２４個のフェリチン単量体（または該当する場合、全体で２４個の重鎖および軽鎖）を含む。
【００５９】
「ハイブリッドフェリチン」は、本明細書で使用される場合、ウシガエルフェリチンのアミノ末端伸長部を有するＨ．ピロリフェリチンを含むフェリチンを指す。ウシガエルフェリチンのアミノ末端伸長部として使用される例示的な配列を、配列番号２１７として示す。ハイブリッドフェリチンでは、免疫刺激性部分の結合部位がフェリチン粒子表面上に均一に分布するように、ウシガエルフェリチンのアミノ末端伸長部をＨ．ピロリフェリチンに融合することができる。「ウシガエルリンカー」は、本明細書で使用される場合、配列番号２１７の配列を含むリンカーである。ハイブリッドフェリチンはまた、時に「ｂｆｐＦｅｒｒ」または「ｂｆｐフェリチン」と呼ばれる。ウシガエル配列を含むいずれの構築物も、ウシガエル配列がなくとも、例えばリンカーまたは代替リンカーがなくとも提供することができる。例示的なウシガエルリンカー配列を、表２に提供する。表２はウシガエルリンカーを示すが、リンカーまたは代替リンカーを有しない同じ構築物を作製してもよい。
【００６０】
「Ｎ−グリカン」は、本明細書で使用される場合、タンパク質のＮ（アスパラギン）残基のアミド窒素でタンパク質に結合した糖質鎖を指す。そのため、Ｎ−グリカンは、Ｎグリコシル化のプロセスによって形成される。このグリカンは多糖類であり得る。
【００６１】
「グリコシル化」は、本明細書で使用される場合、タンパク質への糖質単位の付加を指す。
【００６２】
「免疫応答」は、本明細書で使用される場合、抗原またはワクチンのような刺激に対する、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、マクロファージ、または多形核細胞のような免疫系の細胞の応答を指す。免疫応答は、例えばインターフェロンまたはサイトカインを分泌する上皮細胞を含む、宿主防御応答に関係する体の任意の細胞を含み得る。免疫応答は、生得のおよび／または適応免疫応答を含むがこれらに限定されない。本明細書で使用される場合、「保護的免疫応答」は、対象を感染から保護する（例えば、感染を防止する、または感染に関連する疾患の発生を防止する）免疫応答を指す。免疫応答を測定する方法は、当技術分野で周知であり、例えばリンパ球（例えば、ＢまたはＴ細胞）の増殖および／または活性、サイトカインまたはケモカインの分泌、炎症、抗体産生等を測定することを含む。「抗体応答」は、抗体が産生される免疫応答である。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「抗原」は、生物に曝露または投与した場合に、免疫応答を誘発する作用物質、および／またはＴ細胞受容体（例えば、ＭＨＣ分子によって提示される場合）が結合する、もしくは抗体（例えば、Ｂ細胞によって産生される場合）に結合する作用物質を指す。一部の実施形態では、抗原は、生物において液性応答（例えば、抗原特異的抗体の産生を含む）を誘発する。あるいはまたは加えて、一部の実施形態では、抗原は、生物において細胞性応答（例えば、その受容体が抗原と特異的に相互作用するＴ細胞を含む）を誘発する。特定の抗原は、標的生物（例えば、マウス、ウサギ、霊長類、ヒト）の１つまたはいくつかのメンバーにおいて免疫応答を誘発し得るが、標的生物種の全てのメンバーにおいて誘発するわけではない。一部の実施形態では、抗原は、標的生物種のメンバーの少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％において免疫応答を誘発する。一部の実施形態では、抗原は、抗体および／またはＴ細胞受容体に結合するが、生物において特定の生理的応答を誘導しても誘導しなくてもよい。一部の実施形態では、例えば、抗原は、ｉｎ  ｖｉｖｏでそのような相互作用が起こるか否かによらず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗体および／またはＴ細胞受容体に結合し得る。一部の実施形態では、抗原は、異種免疫原によって誘導される産物を含む、特異的液性免疫または細胞性免疫の産物と反応する。抗原は、本明細書に記載されるフェリチン（例えば、１つまたはそれ以上の変異を含む）および非フェリチンポリペプチドを含む抗原性フェリチンタンパク質を含む。
【００６４】
「免疫刺激性部分」は、本明細書で使用される場合、フェリチンまたは抗原性フェリチンポリペプチドに共有結合し、免疫系の構成要素を活性化することができる（単独で、またはフェリチンまたは抗原性フェリチンポリペプチドに結合した場合）部分を指す。例示的な免疫刺激性部分は、ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ受容体（ＴＬＲ）、例えば、ＴＬＲ４、７、８、または９のアゴニストを含む。一部の実施形態では、免疫刺激性部分はアジュバントである。
【００６５】
「アジュバント」は、本明細書で使用される場合、抗原に対する免疫応答を非特異的に増強する物質またはビヒクルを指す。アジュバントには、抗原を吸着させた無機質（例えば、ミョウバン、水酸化アルミニウム、またはリン酸塩）の懸濁液、抗原溶液を鉱油または水中で乳化させた油中水型または水中油型乳剤（例えば、フロイント不完全アジュバント）を挙げることができるがこれらに限定されない。時に、抗原性をさらに増強するために死菌マイコバクテリア（例えば、フロイント完全アジュバント）を含める。免疫刺激性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧモチーフ）もまた、アジュバントとして使用することができる（例えば、米国特許第６，１９４，３８８号；第６，２０７，６４６号；第６，２１４，８０６号；第６，２１８，３７１号；第６，２３９，１１６号；第６，３３９，０６８号；第６，４０６，７０５号；および第６，４２９，１９９号を参照されたい）。アジュバントはまた、Ｔｏｌｌ−Ｌｉｋｅ受容体（ＴＬＲ）アゴニストおよび共刺激分子のような生物学的分子も含み得る。アジュバントは、組成物中の個別の分子として、またはフェリチンもしくは抗原性フェリチンポリペプチドに共有結合（コンジュゲート）して投与してもよい。
【００６６】
「抗原性ＥＢＶポリペプチド」は、本明細書において使用される場合、分子がＥＢＶに関して抗原性であるのに十分な長さのＥＢＶアミノ酸配列の全てまたは一部を含むポリペプチドを指す。抗原性は、フェリチンまたはルマジンシンターゼタンパク質のような異種配列、および／または免疫刺激性部分をさらに含む構築物の一部としてのＥＢＶ配列の特色であり得る。すなわち、ＥＢＶ配列が異種配列をさらに含む構築物の一部である場合、構築物は、異種配列を有しないＥＢＶ配列がそうすることができるか否かによらず、抗ＥＢＶ抗体を生成する抗原としての役目を果たすことができれば十分である。
【００６７】
「抗原性フェリチンポリペプチド」および「抗原性フェリチンタンパク質」は、本明細書において互換的に使用され、分子が非フェリチンポリペプチドに関して抗原性である十分な長さのフェリチンおよび非フェリチンポリペプチド（例えばＥＢＶポリペプチド）を含むポリペプチドを指す。抗原性フェリチンポリペプチドはさらに、免疫刺激性部分を含み得る。抗原性は、より大きい構築物の一部としての非フェリチン配列の特色であり得る。すなわち、構築物は、フェリチンを有しない非フェリチンポリペプチド（および該当する場合、免疫刺激性部分）がそうすることができるか否かによらず、非フェリチンポリペプチドに対する抗原としての役目を果たすことができれば十分である。一部の実施形態では、非フェリチンポリペプチドはＥＢＶポリペプチドであり、この場合抗原性フェリチンポリペプチドはまた、「抗原性ＥＢＶポリペプチド」である。しかし、明白にするために、抗原性ＥＢＶポリペプチドはフェリチンを含む必要はない。「抗原性ポリペプチド」は、本明細書において使用される場合、抗原性フェリチンポリペプチドおよび抗原性ＥＢＶポリペプチドのいずれかまたは両方であるポリペプチドを指す。
【００６８】
「自己アジュバント性」は、本明細書で使用される場合、フェリチンおよび免疫刺激性部分が同じ分子実体中にあるように、フェリチンおよびフェリチンに直接コンジュゲートされた免疫刺激性部分を含む組成物またはポリペプチドを指す。非フェリチンポリペプチドを含む抗原性フェリチンポリペプチドを、免疫刺激性部分にコンジュゲートして、自己アジュバント性ポリペプチドを生成してもよい。
【００６９】
「表面に露出した」アミノ酸は、本明細書で使用される場合、該当する場合に、多量体形成後、タンパク質がその本来の三次元コンフォメーションにある場合に溶媒分子が接触することができる側鎖を有するタンパク質（例えば、フェリチン）中のアミノ酸残基を指す。このように、例えば２４量体を形成するフェリチンの場合、表面に露出したアミノ酸残基は、フェリチンが２４量体として、例えばフェリチン多量体またはフェリチン粒子として集合する場合に、その側鎖に溶媒が接触することができる残基である。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「対象」は、動物界の任意のメンバーを指す。一部の実施形態では、「対象」はヒトを指す。一部の実施形態では、「対象」は非ヒト動物を指す。一部の実施形態では、対象は、哺乳動物、鳥類、は虫類、両生類、魚類、昆虫、および／または虫を含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、非ヒト対象は、哺乳動物（例えば、齧歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、および／またはブタ）である。一部の実施形態では、対象は、トランスジェニック動物、遺伝子操作された動物、および／またはクローンであり得る。本発明のある特定の実施形態では、対象は成体、青年期、または幼体である。一部の実施形態では、用語「個体」または「患者」は、「対象」と互換的に使用され、互換的であると意図される。
【００７１】
本明細書で使用される場合、用語「ワクチン接種」または「ワクチン接種する」は、例えば病原体に対して免疫応答を生成することが意図される組成物の投与を指す。ワクチン接種は、病原体に対する曝露および／または１つもしくはそれ以上の症状の発生の前、間、および／または後に投与することができ、一部の実施形態では、病原体に対する曝露の前、間、および／または直後に投与することができる。一部の実施形態では、ワクチン接種は、ワクチン接種組成物の適切な間隔を空けた複数回の投与を含む。
【００７２】
本開示は、所定の核酸配列またはアミノ酸配列（参照配列）に対してそれぞれ、ある特定の程度の同一性を有する核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。
【００７３】
２つの核酸配列間の「配列同一性」は、配列間で同定されたヌクレオチドのパーセンテージを示す。２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」は、配列間で同一であるアミノ酸のパーセンテージを示す。
【００７４】
用語「同一％」、「同一性％」、または類似の用語は、特に比較される配列間の最適なアライメントにおいて同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸のパーセンテージを指すと意図される。前記パーセンテージは、純粋に統計学的であり、２つの配列間の差は、比較される配列の全長にわたって分布していてもよいが、必ずしもランダムに分布している必要はない。２つの配列の比較は通常、対応する配列の局所領域を同定するために、最適なアライメント後に前記配列を、セグメントまたは「比較ウィンドウ」に関して比較することによって実行される。比較のための最適なアライメントは、手動で、またはＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｓ  Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２，４８２頁によるローカルホモロジーアルゴリズムの助けを借りて、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３頁のローカルホモロジーアルゴリズムの助けを借りて、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８，２４４４頁の類似性検索アルゴリズムの助けを借りて、または前記アルゴリズムを使用するコンピュータプログラムの助けを借りて（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ  Ｐ、ＢＬＡＳＴ  Ｎ、およびＴＦＡＳＴＡ、  ｉｎ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）実行してもよい。
【００７５】
パーセンテージ同一性は、比較される配列が対応する同一の位置の数を決定する工程、この数を比較される位置の数（例えば、参照配列における位置の数）で除算する工程、およびこの結果に１００を乗算する工程によって得られる。
【００７６】
一部の実施形態では、同一性の程度は、参照配列の全長の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％である領域に関して与えられる。例えば、参照核酸配列が２００ヌクレオチドからなる場合、同一性の程度は、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０、または約２００ヌクレオチド、一部の実施形態では、連続ヌクレオチドに関して与えられる。一部の実施形態では、同一性の程度は、参照配列の全長にわたって与えられる。
【００７７】
所定の核酸配列またはアミノ酸配列に対してそれぞれ、特定の同一性の程度を有する核酸配列またはアミノ酸配列は、前記所定の配列の少なくとも１つの機能的特性を有することができ、例えば、一部の例では前記所定の配列と機能的に等価である。１つの重要な特性は、特に、対象に投与した場合にサイトカインとして作用する能力を含む。一部の実施形態では、所定の核酸配列またはアミノ酸配列に対して特定の同一性の程度を有する核酸配列またはアミノ酸配列は、前記所定の配列と機能的に等価である。
【００７８】
本明細書で使用される場合、用語「キット」は、１つまたはそれ以上の化合物または組成物のような関連する構成要素、および溶媒、溶液、緩衝液、説明書、または乾燥剤のような１つまたはそれ以上の関連する材料の包装された組を指す。
【００７９】
Ｂ．ｇＬおよびｇＨポリペプチドを含む抗原性ＥＢＶポリペプチド
ＥＢＶは３つの糖タンパク質、糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）、ｇＨ、およびｇＬを含み、これらはコア膜融合装置を形成して細胞内へのウイルスの浸透を可能にする。ｇＬおよびｇＨは、既に例えばＭａｔｓｕｕｒａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１０  Ｄｅｃ  ２８；１０７（５２）：２２６４１〜６頁に記載されている。ワクチンとしての使用のためのｇＬおよびｇＨの単量体および三量体は、例えばＣｕｉら、Ｖａｃｃｉｎｅ．２０１６  Ｊｕｌ  ２５；３４（３４）：４０５０〜５頁に記載されている。ｇＨおよびｇＬタンパク質は会合して、ウイルスの進入に要する効率的な膜の融合および上皮細胞のレセプターへの結合のために必要と考えられるヘテロ二量体複合体を形成する。
【００８０】
ＥＢＶ  ｇＬおよびＥＢＶ  ｇＨを含む抗原性ポリペプチドが本明細書で開示される。一部の実施形態では、ポリペプチドは一本鎖として存在する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、例えばＴ４ファージフィブリチン三量体形成ドメインのような三量体形成ドメインの三量体形成によって三量体を形成する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、例えばフェリチンまたはルマジンシンターゼの多量体形成によってナノ粒子（例えばフェリチンまたはルマジンシンターゼの粒子）を形成する。一部の実施形態では、本開示による抗原性ＥＢＶポリペプチドはＥＢＶ  ｇＬポリペプチドおよびＥＢＶ  ｇＨポリペプチド、ならびにＥＢＶ  ｇＬポリペプチドとＥＢＶ  ｇＨポリペプチドを隔てる少なくとも１５アミノ酸の長さを有するリンカーを含む。比較的長いリンカーが発現および／または免疫原性の改善のような提供することが見出された。
【００８１】
一部の実施形態では、ＥＢＶ  ｇＨおよび／またはｇＬポリペプチドは完全長のｇＨおよび／またはｇＬである（例示的な完全長配列については、それぞれＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．ＣＥＱ３５７６５．１およびＹＰ＿００１１２９４７２．１を参照されたい）。一部の実施形態では、ＥＢＶ  ｇＨおよび／またはｇＬポリペプチドは、ｇＨおよび／またはｇＬの断片である。一部の実施形態では、ｇＬポリペプチドはｇＬ  Ｃ末端の終端に７アミノ酸の欠失を有するｇＬ（Ｄ７）構築物である。一部の実施形態では、ｇＨポリペプチドはＣ１３７にＣ１３７Ａ変異のような変異を含む。一部の実施形態では、Ｃ１３７変異によって天然の不対システインが除去され、非特異的コンジュゲーションが避けられる。一部の実施形態では、ｇＨポリペプチドはＣ１３７Ａ変異のような、配列番号３７のシステイン１３７に対応するシステインを除去する変異を含む。一部の実施形態では、Ｃ１３７変異によって天然の不対システインが除去され、非特異的コンジュゲーションが避けられる。
【００８２】
一部の実施形態では、ＥＢＶ  ｇＬポリペプチドは配列番号３６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＥＢＶ  ｇＨポリペプチドは配列番号３７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００８３】
一部の実施形態では、哺乳動物のリーダー配列（シグナル配列としても知られている）は、ｇＨまたはｇＬポリペプチドのようなＥＢＶポリペプチドにＮ末端で、例えばポリペプチドのＮ末端に付加されている。一部の実施形態では、哺乳動物のリーダー配列は哺乳動物細胞中で発現されるとタンパク質の分泌をもたらす。
【００８４】
天然のＥＢＶ  ｇＨおよび／またはｇＬの配列はＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＣ＿００９３３４．１（ヒトヘルペスウイルス４、完全ゲノム、日付２０１０年３月２６日）に示されている。本明細書で開示する構築物のいくつかについては、ＮＣ＿００９３３４．１のｇＬアミノ酸配列のアミノ酸２３〜１３７をｇＬポリペプチドとして使用し、天然のシグナルペプチド（ＮＣＢＩ配列のアミノ酸１〜２２）をＩｇＧκリーダー配列に置き換えた。構築物のいくつかについては、ＮＣ＿００９３３４．１のｇＨアミノ酸配列のアミノ酸１９〜６７８をｇＨポリペプチドとして使用した。一部の実施形態では、ｇＬとｇＨを本明細書の配列の表に示すようにリンカーを介して連結した。
【００８５】
一部の実施形態では、ｇＬおよびｇＨポリペプチドは一本鎖単量体として発現される。一部の実施形態では、単量体組成物は配列表に示され、「単量体」としての記載で注記された配列を含み、またはそれからなる。ｇＬおよびｇＨポリペプチドを含む一本鎖は「ｇＬ／ｇＨ」と称し、これは「ｇＨ＿ｇＬ」、「ｇＬ＿ｇＨ」、または「ｇＬ／ｇＨ」と互換的に使用できる。
【００８６】
一部の実施形態では、ｇＬおよびｇＨは三量体として提供される。一部の実施形態では、三量体形成ドメインはｇＨ配列の後（Ｃ末端）に置かれ、一部の実施形態ではこの後にＨｉｓ６（配列番号２４３）配列が続く。本明細書で参照したコラーゲンまたはＬ１ＯＲＦ１ｐ三量体形成ドメインのような当技術分野で公知の任意の三量体形成ドメインが使用できるので、フォルドン三量体形成ドメインは例示的である。末梢血ヒトナイーブＢ細胞を使用し、ｇＬおよびｇＨ三量体はｇＬおよびｇＨ単量体と比較してより高い血清中和力価を誘起することが示された（例えばＣｕｉら、Ｖａｃｃｉｎｅ．２０１６  Ｊｕｌ  ２５；３４（３４）：４０５０〜５頁を参照されたい）。
【００８７】
一部の実施形態では、ｇＬ／ｇＨ三量体は配列表に示され、「三量体」としての記載で注記された配列を含み、またはそれからなるアミノ酸配列を有する。
【００８８】
ｇＬ／ｇＨポリペプチドは、本明細書で論じるフェリチンまたはルマジンシンターゼのいずれと組み合わせることもできる。例えば、一部の実施形態では、抗原性ＥＢＶポリペプチドは、単量体または三量体のｇＬ／ｇＨポリペプチド（＋／−ｇｐ４２および／またはｇｐ２２０）およびｉ）重鎖または軽鎖フェリチン（例えばＴ．ニイ重鎖または軽鎖フェリチン）、またはｉｉ）場合により表面に露出したシステインを含むフェリチンを含む。
【００８９】
さらに、一部の実施形態では、ＥＢＶ  ｇＬ／ｇＨポリペプチドおよびフェリチンを含む任意の抗原性ＥＢＶポリペプチドが、本明細書に開示した別のポリペプチドを含む組成物の中に存在してもよい。
【００９０】
Ｃ．ｇｐ２２０ポリペプチドを含む抗原性ＥＢＶポリペプチド
一部の実施形態では、抗原性ＥＢＶポリペプチドはｇｐ２２０ポリペプチドを含む。ｇｐ２２０ハイブリッドウシガエル／Ｈ．ピロリフェリチンナノ粒子は、既にＫａｎｅｋｉｙｏ、Ｃｅｌｌ．２０１５  Ａｕｇ  ２７；１６２（５）：１０９０〜１００頁に記載されている。このナノ粒子は、本明細書に記載したある種のフェリチンとの他の相違の中でも、表面に露出したシステインを提供する変異またはシステインを含むリンカーを含んでいなかった。
【００９１】
一部の実施形態では、ｇｐ２２０ポリペプチドは配列番号３８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００９２】
一部の実施形態では、哺乳動物のリーダー配列（シグナル配列としても知られている）は、ｇｐ２２０ポリペプチドにＮ末端で付加されている。一部の実施形態では、哺乳動物のリーダー配列は哺乳動物細胞中で発現されるとタンパク質の分泌をもたらす。
【００９３】
ｇｐ２２０ポリペプチドは、本明細書で論じるフェリチンまたはルマジンシンターゼのいずれと組み合わせることもできる。例えば、一部の実施形態では、抗原性ＥＢＶポリペプチドは、ｇｐ２２０ポリペプチド（＋／−ｇＬ／ｇＨおよび／またはｇｐ４２）およびｉ）重鎖または軽鎖フェリチン（例えばＴ．ニイ重鎖または軽鎖フェリチン）、またはｉｉ）場合により本明細書に記載した表面に露出したシステインを含むフェリチンを含む。
【００９４】
さらに、一部の実施形態では、ｇｐ２２０ポリペプチドおよびフェリチンを含む任意の抗原性ＥＢＶポリペプチドが、本明細書に開示した別のポリペプチドを含む組成物の中に存在してもよい。
【００９５】
Ｄ．ｇｐ４２ポリペプチドを含む抗原性ＥＢＶポリペプチド
一部の実施形態では、抗原性ＥＢＶポリペプチドはｇｐ４２ポリペプチドを含む。例示的なｇｐ４２配列は、配列番号３４として提供される。例えばｇＬおよびｇＨポリペプチドとの融合に含めるために適したさらなる例示的なｇｐ４２配列は、配列番号２３９として提供される。例えばｇＬおよびｇＨポリペプチドとの融合に含めるために適した別の例示的なｇｐ４２配列は、配列番号２４０として提供される。
【００９６】
一部の実施形態では、ｇｐ４２ポリペプチドは配列番号３４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ｇｐ４２ポリペプチドは配列番号２３９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ｇｐ４２ポリペプチドは配列番号２４０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００９７】
一部の実施形態では、哺乳動物のリーダー配列（シグナル配列としても知られている）は、ｇｐ４２ポリペプチドにＮ末端で付加されている。一部の実施形態では、哺乳動物のリーダー配列は哺乳動物細胞中で発現されるとタンパク質の分泌をもたらす。例示的なリーダー配列は配列番号２２６のアミノ酸１〜２２である。
【００９８】
一部の実施形態では、ｇＨおよび／またはｇＬポリペプチドを含む抗原性ＥＢＶポリペプチドは、ｇｐ４２ポリペプチドをさらに含む。上述のｇＨおよび／またはｇＬポリペプチドを含むＥＢＶポリペプチドのいずれも、ｇｐ４２ポリペプチドをさらに含んでよい。一部の実施形態では、ｇｐ４２ポリペプチドは、配列番号２１および２２６〜２３１に例示するように、ｇＨおよび／またはｇＬポリペプチドに対してＣ末端側に位置する。一部の実施形態では、ｇｐ４２ポリペプチドは、これも配列番号２１および２２７〜２３１に例示するように、フェリチンに対してＮ末端側に位置する。したがって、例えば抗原性ＥＢＶポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端への配向で、ｇＬポリペプチド、ｇＨポリペプチド、ｇｐ４２ポリペプチド、および場合によりフェリチンを含んでよい。本明細書に記載したようなリンカーは、ＥＢＶポリペプチドならびに／またはそのＮ末端および／もしくはＣ末端に位置するフェリチンからｇｐ４２ポリペプチドを隔てることができる。一部の実施形態では、リンカーは抗原性フェリチンポリペプチドの中のそれぞれのＥＢＶポリペプチド（例えばｇＬポリペプチド、ｇＨポリペプチド、およびｇｐ４２ポリペプチド）を隔て、さらにリンカーは、存在する場合にはフェリチンとそれに近接するＥＢＶポリペプチド（例えばｇｐ４２ポリペプチド）との間に存在してもよい。
【００９９】
一部の実施形態では、少なくとも１５アミノ酸の長さを有するリンカーは、ＥＢＶ  ｇＨポリペプチドとＥＢＶ  ｇｐ４２ポリペプチドとを隔てる。そのようなリンカーは１５〜６０アミノ酸、２０〜６０アミノ酸、３０〜６０アミノ酸、４０〜６０アミノ酸、３０〜５０アミノ酸、もしくは４０〜５０アミノ酸の長さを有してよい。一部の実施形態では、リンカーは配列番号２３４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１００】
一部の実施形態では、ｇｐ４２およびフェリチンがポリペプチドの中に存在する場合には、リンカーはＥＢＶ  ｇｐ４２ポリペプチドとフェリチンとを隔てる。そのようなリンカーは少なくとも１５アミノ酸の長さを有してよく、または１５〜６０アミノ酸、２０〜６０アミノ酸、３０〜６０アミノ酸、４０〜６０アミノ酸、３０〜５０アミノ酸、もしくは４０〜５０アミノ酸の長さを有する。一部の実施形態では、そのようなリンカーは配列番号２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、または２３８のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０１】
ｇｐ４２ポリペプチドは、本明細書で論じるフェリチンまたはルマジンシンターゼのいずれと組み合わせることもできる。例えば、一部の実施形態では、ポリペプチドは、ｇｐ４２ポリペプチド（＋／−ｇＬ／ｇＨおよび／またはｇｐ２２０）およびｉ）重鎖または軽鎖フェリチン（例えばＴ．ニイ重鎖または軽鎖フェリチン）、またはｉｉ）場合により本明細書に記載した表面に露出したシステインを含むフェリチンを含む。
【０１０２】
一部の実施形態では、抗原性ＥＢＶポリペプチドは、配列番号２２６のアミノ酸２３〜１０７８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、抗原性ＥＢＶポリペプチドは、配列番号２２６のアミノ酸１〜１０７８と８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、抗原性ＥＢＶポリペプチドは、配列番号２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、または２３１のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含み、場合によりリーダー配列を欠如する（例えば、これらの配列のアミノ酸１〜２２のいずれかまたは全てを欠如する）。
【０１０３】
さらに、一部の実施形態では、ｇｐ４２ポリペプチドおよびフェリチンを含む任意の抗原性ＥＢＶポリペプチドが、本明細書に開示した別のポリペプチドを含む組成物の中に存在してもよい。
【０１０４】
Ｅ．リンカー
一部の実施形態では、抗原性ＥＢＶポリペプチドは、ｇＬおよびｇＨポリペプチドの間にリンカーを含む。一部の実施形態では、抗原性ＥＢＶポリペプチドは、ＥＢＶポリペプチドとフェリチンまたはルマジンシンターゼとの間にリンカーを含む。そのようなリンカーのいずれかに関して以下の特徴が記述されるが、本発明はｇＬおよびｇＨ配列の間の比較的長いリンカーが免疫原性を増大させ得ることを提供する。任意のリンカーを使用してよく、例えば一部の実施形態では、リンカーの長さは２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸である。一部の実施形態では、リンカーの長さは約２〜４、２〜６、２〜８、２〜１０、２〜１２、または２〜１４アミノ酸である。一部の実施形態では、リンカーはペプチドリンカーであり、これは融合タンパク質としての抗原性フェリチンポリペプチドの発現（例えば単一のオープンリーディングフレームからの）を促進することができる。一部の実施形態では、リンカーはグリシン−セリンリンカーである。一部の実施形態では、グリシン−セリンリンカーはＧＳ、ＧＧＧＳ（配列番号２４４）、２×ＧＧＧＳ（すなわち、ＧＧＧＳＧＧＧＳ）（配列番号２４５）、または５×ＧＧＧＳ（配列番号２４６）である。一部の実施形態では、ＥＢＶポリペプチドとフェリチンとの間のリンカーはＧＳ、ＧＧＧＳ（配列番号２４４）、２×ＧＧＧＳ（すなわち、ＧＧＧＳＧＧＧＳ）（配列番号２４５）、または５×ＧＧＧＳ（配列番号２４６）である。
【０１０５】
一部の実施形態では、リンカーの長さは少なくとも１５アミノ酸である。一部の実施形態では、リンカーの長さは少なくとも２５アミノ酸である。一部の実施形態では、リンカーの長さは少なくとも３０アミノ酸である。一部の実施形態では、リンカーの長さは少なくとも３５アミノ酸である。一部の実施形態では、リンカーの長さは少なくとも４０アミノ酸である。一部の実施形態では、リンカーの長さは６０アミノ酸以下である。一部の実施形態では、リンカーの長さは５０アミノ酸以下である。一部の実施形態では、リンカーの長さは約１６、２８、４０、４６、または４７アミノ酸である。一部の実施形態では、リンカーは可撓性である。一部の実施形態では、リンカーは例えば免疫刺激性部分（例えばアジュバント）のコンジュゲーションのための部位としての使用のためにシステインを含み、システインを含む例示的なリンカーは配列番号２２５として提供される。一部の実施形態では、リンカーは配列番号２２５と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有する配列を含み、配列番号２２５におけるシステインに対応するシステインをさらに含む。一部の実施形態では、リンカーは少なくとも２５アミノ酸（例えば２５〜６０アミノ酸）を含み、システインはＮ末端から８番目のアミノ酸からＣ末端から８番目のアミノ酸までの範囲または中央残基の１０アミノ酸の中またはリンカーの結合の場所に位置している。
【０１０６】
一部の実施形態では、リンカーはグリシン（Ｇ）および／またはセリン（Ｓ）アミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカーはグリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）、および／またはアラニン（Ａ）アミノ酸、ならびに場合により上で論じたシステインを含むか、これらからなる。一部の実施形態では、リンカーは配列番号２２２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号２８）、ＧＧＳＧＳＧＳＮＳＳＡＳＳＧＡＳＳＧＧＡＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号２９）、ＧＧＳＧＳＡＳＳＧＡＳＡＳＧＳＳＮＧＳＧＳＧＳＧＳＮＳＳＡＳＳＧＡＳＳＧＧＡＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号３０）、またはＧＳを含む。一部の実施形態では、リンカーはＦＲ１（配列番号３１）またはＦＲ２（配列番号３２）を含む。一部の実施形態では、リンカーは配列番号２３３〜２３８を含む。
【０１０７】
一部の実施形態では、アジュバントのような免疫刺激性部分のためのコンジュゲーション部位としてシステインを含むリンカーは、表面に露出した不対システインを欠如するフェリチン分子を含む構築物、または表面に露出した不対システインを含むフェリチン分子を含む構築物において使用される。
【０１０８】
一部の実施形態では、リンカーはシステイン−トロンビン−ヒスチジンリンカーである。一部の実施形態では、このリンカーはクリックケミストリーを介してＥＢＶポリペプチドをフェリチンに直接コンジュゲートするために使用される。システイン−トロンビン−ヒスチジンリンカーを含む例示的な配列は配列番号３９である。システイン−トロンビン−ヒスチジンリンカーが関与するコンジュゲーション反応に好適なクリックケミストリーを本明細書で論じる。
【０１０９】
一部の実施形態では、構築物はリンカーを含まない。一部の実施形態では、構築物は１つのリンカーを含む。一部の実施形態では、構築物は２つ以上のリンカーを含む。
【０１１０】
一部の実施形態では、構築物はｇＨとｇＬとの間にリンカーを含むが、ポリペプチドとフェリチンとの間にはリンカーを含まず、逆もそうである。一部の実施形態では、構築物はポリペプチドとフェリチンとの間にのみリンカーを含む。
【０１１１】
Ｆ．ＥＢＶポリペプチドおよびフェリチンまたはルマジンシンターゼを含む抗原性ＥＢＶポリペプチド
一部の実施形態では、ＥＢＶポリペプチドおよびフェリチンを含む抗原性ＥＢＶポリペプチドが提供される。ＥＢＶポリペプチドはｇＬ、ｇＨ、ｇＬ／ｇＨ、ｇｐ２２０、ｇｐ４２ポリペプチド、またはそれらの組合せのような、本明細書に記載したＥＢＶポリペプチドのいずれであってもよい。ポリペプチドのフェリチン成分は任意の種からのフェリチンであってよく、本明細書に記載した表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える変異のような変異を有しても有しなくてもよい。一部の実施形態では、ポリペプチドは配列番号１〜２７のいずれか１つのアミノ酸を含む。
【０１１２】
一部の実施形態では、ポリペプチド中のフェリチンは野生型フェリチンである。一部の実施形態では、フェリチンは細菌、昆虫、真菌、鳥類、または哺乳動物由来である。一部の実施形態では、フェリチンはヒト由来である。一部の実施形態では、フェリチンは細菌由来である。
【０１１３】
一部の実施形態では、フェリチンは軽鎖および／または重鎖フェリチンである。一部の実施形態では、フェリチンはトリコプルシア・ニイ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）重鎖フェリチン（配列番号２１１）またはトリコプルシア・ニイ軽鎖フェリチン（配列番号２１２）のような昆虫フェリチンである。一部の実施形態では、フェリチンはヒト重鎖フェリチン（配列番号２１４またはＦＴＨ１、ＧＥＮＥ  ＩＤ  Ｎｏ：２４９５）またはヒト軽鎖フェリチン（配列番号２１５またはＦＴＬ、ＧＥＮＥ  ＩＤ  Ｎｏ：２５１２）のようなヒトフェリチンである。一部の実施形態では、フェリチンナノ粒子は、ヒトまたはトリコプルシア・ニイのフェリチンナノ粒子のような、重鎖フェリチンおよび軽鎖フェリチンの２４個の全サブユニットを含む。Ｔ．ニイフェリチンナノ粒子は重鎖フェリチンの１２個のサブユニットおよび軽鎖フェリチンの１２個のサブユニットを含み得る。
【０１１４】
一部の実施形態では、抗原性ＥＢＶポリペプチドは軽鎖フェリチンおよびＥＢＶポリペプチドを含む。一部の実施形態では、抗原性ＥＢＶポリペプチドは重鎖フェリチンおよびＥＢＶポリペプチドを含む。一部の実施形態では、軽鎖フェリチンおよびＥＢＶポリペプチドを含む抗原性ＥＢＶポリペプチドは、ＥＢＶポリペプチドに連結されていない重鎖フェリチンと集合することができる。一部の実施形態では、重鎖フェリチンおよびＥＢＶポリペプチドを含む抗原性ＥＢＶポリペプチドは、ＥＢＶポリペプチドに連結されていない軽鎖フェリチンと集合することができる。ＥＢＶポリペプチド（またはより一般的に非フェリチンポリペプチド）に連結されていないフェリチンは「裸のフェリチン」と称してよい。
【０１１５】
一部の実施形態では、重鎖フェリチンおよびポリペプチドを含む抗原性ポリペプチドは、軽鎖フェリチンおよびＥＢＶポリペプチドを含む抗原性ポリペプチドと集合して、単一のフェリチンナノ粒子上に同一のまたは異なる非フェリチンポリペプチドの２つの提示を可能にする。一部の実施形態では、２つの異なる非フェリチンポリペプチドはＥＢＶポリペプチドである。一部の実施形態では、２つの異なる非フェリチンポリペプチドは、ＥＢＶおよび異なる感染性作用物質によってコードされる。一部の実施形態では、異なる感染性作用物質からの異なる非フェリチンポリペプチドは、ウイルスまたは細菌由来である。
【０１１６】
一部の実施形態では、重鎖フェリチンおよび非フェリチンポリペプチドを含む抗原性ポリペプチドは、軽鎖フェリチンおよび非フェリチンポリペプチドを含むポリペプチドと集合して、二価組成物を生成することができる。
【０１１７】
一部の実施形態では、抗原性ポリペプチドは、軽鎖フェリチンならびにｇｐ２２０および／またはｇｐ４２ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、抗原性ポリペプチドは、重鎖フェリチンならびにｇｐ２２０および／またはｇｐ４２ポリペプチドを含む。
【０１１８】
一部の実施形態では、抗原性ポリペプチドは、軽鎖フェリチンならびに一本鎖ｇＬおよびｇＨポリペプチドを含む。一部の実施形態では、抗原性ポリペプチドは、重鎖フェリチンならびに一本鎖ｇＬおよびｇＨポリペプチドを含む。
【０１１９】
一部の実施形態では、軽鎖フェリチンならびにｇｐ２２０および／またはｇｐ４２ポリペプチドを含む抗原性ポリペプチドは、重鎖フェリチンならびに一本鎖ｇＬおよびｇＨポリペプチドを含む抗原性ポリペプチドと集合する。
【０１２０】
一部の実施形態では、重鎖フェリチンならびにｇｐ２２０および／またはｇｐ４２ポリペプチドを含む抗原性ポリペプチドは、軽鎖フェリチンならびに一本鎖ｇＬおよびｇＨポリペプチドを含む抗原性ポリペプチドと集合する。一部の実施形態では、集合したＴ．ニイフェリチンナノ粒子の場合のように、１２個のｇｐ２２０および／またはｇｐ４２ポリペプチドならびに１２個の一本鎖ｇＬおよびｇＨポリペプチドが、集合したフェリチンナノ粒子の中に含まれる。
【０１２１】
ｇｐ２２０および／またはｇｐ４２ならびに一本鎖ｇＬおよびｇＨポリペプチドの両方を含むいずれの型のフェリチンナノ粒子も、「二価」または「二価ＥＢＶ」の粒子もしくは構築物と称し得る。ｇｐ２２０および／またはｇｐ４２を含むフェリチンとともにｇＬおよびｇＨ三量体を含む組成物も、二価ＥＢＶ組成物であろう。
【０１２２】
一部の実施形態では、フェリチンは、場合により本明細書に記載したような１つまたはそれ以上の変異を有するＨ．ピロリフェリチンである（例示的なＨ．ピロリフェリチンの配列については配列番号２０８または２０９を参照されたい）。一部の実施形態では、Ｈ．ピロリフェリチン（または他の細菌フェリチン）とヒトフェリチンとの間の配列相同性がより低いことにより、ワクチンプラットフォームとして使用した場合に自己免疫の可能性を減少させ得る（Ｋａｎｅｋｉｙｏら、Ｃｅｌｌ  １６２，１０９０〜１１００頁（２０１５）を参照されたい）。
【０１２３】
一部の実施形態では、ＥＢＶポリペプチドおよびフェリチンを含む本明細書に開示した抗原性ＥＢＶポリペプチドを含むナノ粒子が提供される。
【０１２４】
１．フェリチン変異
一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の変異を含むフェリチンを本明細書に開示する。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の変異は、例えば野生型フェリチンのアミノ酸配列の変化、および／またはＮもしくはＣ末端での挿入を含む。一部の実施形態では、１、２、３、４、５、またはそれより多くの異なるアミノ酸が、野生型フェリチンと比較してフェリチンにおいて変異している（一部の実施形態では、任意のＮ末端挿入に加えて）。１つまたはそれ以上の変異は、例えば以下で詳細に考察するように、フェリチンの機能的特性を変化させることができる。一般的に、変異は単に、対応する野生型フェリチンと比較した配列の差（置換された、付加された、または欠失されたアミノ酸残基または複数の残基のような）を指す。
【０１２５】
２．コンジュゲーションのためのシステイン
一部の実施形態では、フェリチンを、免疫刺激性部分および／またはＥＢＶポリペプチドのコンジュゲーションのための化学ハンドルを提供するように変異させる。これは、表面に露出した非システインアミノ酸をシステインに置き換える変異によって達成することができる。誤解を避けるため、「表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える」のような表現は、野生型または変異前配列における表面に露出したアミノ酸がシステインではないことを必然的に暗示している。免疫刺激性部分またはＥＢＶポリペプチドのコンジュゲーションのための化学ハンドルを提供する別のアプローチは、リンカーのようなアミノ酸のセグメントをフェリチンのＮまたはＣ末端に含めることであり、アミノ酸のセグメントはシステインを含む。一部の実施形態では、このシステイン（表面に露出したアミノ酸を置き換えるか、またはＮもしくはＣ末端リンカーにある）は不対であり、このことは、これがジスルフィド結合を形成するために適切なパートナーシステインを有していないことを意味する。一部の実施形態では、このシステインは、フェリチンの二次構造を変化させない。一部の実施形態では、このシステインは、フェリチンの三次構造を変化させない。
【０１２６】
一部の実施形態では、このシステインを使用して、免疫刺激性部分のような作用物質をフェリチンにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、このシステインは、反応性である遊離のチオール基を提供する。一部の実施形態では、フェリチン上のこのシステインにコンジュゲートされた作用物質は、集合したフェリチン粒子の表面上で露出する。一部の実施形態では、このシステインは、投与後にフェリチン粒子が集合する間、対象の分子および細胞と相互作用することができる。
【０１２７】
一部の実施形態では、このシステインの存在により、１つまたはそれ以上の免疫刺激性部分、例えばアジュバントのコンジュゲーションが可能となる。一部の実施形態では、免疫刺激性部分のコンジュゲーションは、このシステインの非存在下では起こらない。
【０１２８】
一部の実施形態では、システインに置き換えられる非システインアミノ酸は、Ｈ．ピロリフェリチンのＥ１２、Ｓ７２、Ａ７５、Ｋ７９、Ｓ１００、およびＳ１１１から選択される。このように、一部の実施形態では、システインのために置き換えられる表面に露出したアミノ酸は、Ｈ．ピロリフェリチンのＥ１２、Ｓ２６、Ｓ７２、Ａ７５、Ｋ７９、Ｓ１００、またはＳ１１１に対応するアミノ酸残基である。類似のアミノ酸を、ペアワイズまたは構造アライメントによって、非Ｈ．ピロリフェリチンにおいて見出すことができる。一部の実施形態では、システインに置き換えられる非システインアミノ酸は、ヒト軽鎖フェリチンのＳ３、Ｓ１９、Ｓ３３、Ｉ８２、Ａ８６、Ａ１０２、およびＡ１２０に対応するアミノ酸から選択することができる。一部の実施形態では、システインに置き換えられる表面に露出したアミノ酸は、本来のアミノ酸がシステインに置き換えられた場合、これは集合したフェリチン多量体もしくは粒子において反応性である、および／またはこのシステインはフェリチン多量体もしくは粒子の安定性を妨害しない、および／またはこのシステインがフェリチンの発現レベルの低減をもたらさないという理解に基づいて選択される。
【０１２９】
一部の実施形態では、フェリチンはＥ１２Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、Ｅ１２Ｃ残基を使用して、作用物質（例えば、免疫刺激性部分および／またはＥＢＶポリペプチド）をフェリチンにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、Ｅ１２Ｃ残基は、反応性である遊離のチオール基を提供する。一部の実施形態では、フェリチン単量体上のＥ１２Ｃ残基にコンジュゲートされた作用物質は、集合したフェリチン多量体または粒子の表面上で発現される。一部の実施形態では、２４個のＥ１２Ｃ残基（各単量体から１つ）が、フェリチン多量体または粒子の表面上に存在する。
【０１３０】
一部の実施形態では、フェリチンは、Ｓ２６Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、Ｓ２６Ｃ残基を使用して、作用物質（例えば、免疫刺激性部分および／またはＥＢＶポリペプチド）をフェリチンにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、Ｓ２６Ｃ残基は、反応性である遊離のチオール基を提供する。一部の実施形態では、フェリチン単量体上のＳ２６Ｃ残基にコンジュゲートされた作用物質は、集合したフェリチン多量体または粒子の表面上で発現される。一部の実施形態では、２４個のＳ２６Ｃ残基（各単量体から１つ）が、フェリチン多量体または粒子の表面上に存在する。
【０１３１】
一部の実施形態では、フェリチンは、Ｓ７２Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、Ｓ７２Ｃ残基を使用して、作用物質（例えば、免疫刺激性部分および／またはＥＢＶポリペプチド）をフェリチンにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、Ｓ７２Ｃ残基は、反応性である遊離のチオール基を提供する。一部の実施形態では、フェリチン単量体上のＳ７２Ｃ残基にコンジュゲートされた作用物質は、集合したフェリチン多量体または粒子の表面上で発現される。一部の実施形態では、２４個のＳ７２Ｃ残基（各単量体から１つ）が、フェリチン多量体または粒子の表面上に存在する。
【０１３２】
一部の実施形態では、フェリチンは、Ａ７５Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、Ａ７５Ｃ残基を使用して、作用物質（例えば、免疫刺激性部分および／またはＥＢＶポリペプチド）をフェリチンにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、Ａ７５Ｃ残基は、反応性である遊離のチオール基を提供する。一部の実施形態では、フェリチン単量体上のＡ７５Ｃ残基にコンジュゲートされた作用物質は、集合したフェリチン多量体または粒子の表面上で発現される。一部の実施形態では、２４個のＡ７５Ｃ残基（各単量体から１つ）が、フェリチン多量体または粒子の表面上に存在する。
【０１３３】
一部の実施形態では、フェリチンは、Ｋ７９Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、Ｋ７９Ｃ残基を使用して、作用物質（例えば、免疫刺激性部分および／またはＥＢＶポリペプチド）をフェリチンにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、Ｋ７９Ｃ残基は、反応性である遊離のチオール基を提供する。一部の実施形態では、フェリチン単量体上のＫ７９Ｃ残基にコンジュゲートされた作用物質は、集合したフェリチン多量体または粒子の表面上で発現される。一部の実施形態では、２４個のＫ７９Ｃ残基（各単量体から１つ）が、フェリチン多量体または粒子の表面上に存在する。
【０１３４】
一部の実施形態では、フェリチンは、Ｓ１００Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、Ｓ１００Ｃ残基を使用して、作用物質（例えば、免疫刺激性部分および／またはＥＢＶポリペプチド）をフェリチンにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、Ｓ１００Ｃ残基は、反応性である遊離のチオール基を提供する。一部の実施形態では、フェリチン単量体上のＳ１００Ｃ残基にコンジュゲートされた作用物質は、集合したフェリチン多量体または粒子の表面上で発現される。一部の実施形態では、２４個のＳ１００Ｃ残基（各単量体から１つ）が、フェリチン多量体または粒子の表面上に存在する。
【０１３５】
一部の実施形態では、フェリチンは、Ｓ１１１Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、Ｓ１１１Ｃ残基を使用して、作用物質（例えば、免疫刺激性部分および／またはＥＢＶポリペプチド）をフェリチンにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、Ｓ１１１Ｃ残基は、反応性である遊離のチオール基を提供する。一部の実施形態では、フェリチン単量体上のＳ１１１Ｃ残基にコンジュゲートされた作用物質は、集合したフェリチン多量体または粒子の表面上で発現される。一部の実施形態では、２４個のＳ１１１Ｃ残基（各単量体から１つ）が、フェリチン多量体または粒子の表面上に存在する。
【０１３６】
３．内部システインの除去
一部の実施形態では、フェリチンは、内部システインを非システインアミノ酸に置き換える変異を含む。本来の内部システイン残基を除去することによって、フェリチン単量体あたり１つのみの不対システインが存在することを確実にし、ジスルフィド形成のような望ましくない反応を回避することができ、より安定かつ効率的な結果（例えば、アジュバントの提示）をもたらし得る。一部の実施形態では、Ｈ．ピロリフェリチンのＣ３１が非システインアミノ酸に置き換えられる。一部の実施形態では、Ｈ．ピロリフェリチンのＣ３１がセリンに置き換えられる（Ｃ３１Ｓ）が、任意の非システイン残基、例えばアラニン、グリシン、トレオニン、またはアスパラギンを使用してもよい。類似のアミノ酸を、ペアワイズまたは構造アライメントによって、非Ｈ．ピロリフェリチンにおいて見出すことができる。このように、一部の実施形態では、非システインのために置き換えられる内部システインは、Ｈ．ピロリフェリチンのＣ３１と整列するアミノ酸残基である。Ｃ３１Ｓ変異を示す例示的なフェリチン配列を、配列番号２０１〜２０７に示す。一部の実施形態では、１つより多くの内部システインがフェリチンに存在する場合、２つまたはそれより多く（例えば、各々の）内部システインは、セリン、またはセリン、アラニン、グリシン、トレオニン、もしくはアスパラギンから選択されるアミノ酸のような非システインアミノ酸に置き換えられる。
【０１３７】
４．グリコシル化
ヒト適合性のグリコシル化は、組換え薬物製品における安全性および効能に関与し得る。規制当局の承認は、極めて重要な品質属性として適切なグリコシル化を証明することを条件とし得る（Ｚｈａｎｇら、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ２１（５）：７４０〜７６５頁（２０１６）を参照されたい）。Ｎ−グリカンは、アスパラギン側鎖のグリコシル化に起因することができ、ヒトと、細菌および酵母のような他の生物との間で構造が異なり得る。このように、本開示に従うフェリチンにおいて、非ヒトグリコシル化および／またはＮグリカン形成を低減または除去することが望ましいであろう。一部の実施形態では、フェリチンのグリコシル化を制御することにより、特にヒトワクチン接種に使用する場合、組成物の効能および／または安全性が改善される。
【０１３８】
一部の実施形態では、フェリチンを、Ｎ−グリカンの形成を阻害するように変異させる。一部の実施形態では、変異したフェリチンは、その対応する野生型フェリチンと比較して低減されたグリコシル化を有する。
【０１３９】
一部の実施形態では、フェリチンは、表面に露出したアスパラギンを非アスパラギンアミノ酸に置き換える変異を含む。一部の実施形態では、表面に露出したアスパラギンは、Ｈ．ピロリフェリチンのＮ１９、またはペアワイズまたは構造アライメントによって決定される、Ｈ．ピロリフェリチンの３１位に対応する位置である。一部の実施形態では、そのようなアスパラギン、例えばＨ．ピロリフェリチンのＮ１９を変異させることは、フェリチンのグリコシル化を減少させる。一部の実施形態では、変異は、アスパラギンをグルタミンに置き換える。一部の実施形態では、フェリチンは、Ｎ１９Ｑ変異を含むＨ．ピロリフェリチンである。配列番号２０１〜２０７は、Ｎ１９Ｑ変異を含む例示的なフェリチン配列である。
【０１４０】
細菌または酵母において産生されたグリコシル化タンパク質に曝露された哺乳動物は、細菌または酵母における所定のタンパク質のグリコシル化パターンが、哺乳動物における同じタンパク質のグリコシル化パターンとは異なり得ることから、グリコシル化タンパク質に対する免疫応答を生じ得る。このように、いくつかのグリコシル化治療タンパク質は、細菌または酵母における産生にとって適切ではないことがあり得る。
【０１４１】
一部の実施形態では、アミノ酸変異によるフェリチンのグリコシル化の減少は、細菌または酵母におけるタンパク質の産生を促進する。一部の実施形態では、フェリチンのグリコシル化の減少は、細菌または酵母において発現された変異フェリチンの投与時の哺乳動物における副作用の可能性を低減させる。一部の実施形態では、細菌または酵母において産生された変異フェリチンのヒト対象における反応原性は、グリコシル化が減少していることから低い。一部の実施形態では、ヒト対象における過敏応答の発生率は、野生型フェリチンと比較して低減されたグリコシル化を有する変異フェリチンによる処置後では低い。
【０１４２】
一部の実施形態では、低減されたグリコシル化を有する変異フェリチンを含む組成物の対象における分解は、野生型フェリチンを含む組成物、または野生型グリコシル化を有する対応するフェリチンを含む組成物と比較して遅い。一部の実施形態では、低減されたグリコシル化を有する変異フェリチンを含む組成物は、野生型フェリチン、または野生型グリコシル化を有する対応するフェリチンを含む組成物と比較して、対象において低減されたクリアランスを有する。一部の実施形態では、低減されたグリコシル化を有する変異フェリチンを含む組成物は、野生型フェリチン、または野生型グリコシル化を有する対応するフェリチンを含む組成物と比較してより長い血清中半減期を有する。
【０１４３】
５．変異の組合せ
一部の実施形態では、フェリチンは、本明細書に記載される変異の１つより多くのタイプを含む。一部の実施形態では、フェリチンは、グリコシル化を減少させる変異、内部システインを除去する変異、および表面に露出したシステインを生成する変異から独立して選択される１つまたはそれ以上の変異を含む。一部の実施形態では、フェリチンは、グリコシル化を減少させる変異、内部システインを除去する変異、および表面に露出したシステインを生成する変異を含む。
【０１４４】
一部の実施形態では、フェリチンは、Ｎ１９Ｑ変異、Ｃ３１Ｓ変異、および表面に露出したシステインを生成する変異を含む。一部の実施形態では、フェリチンは、Ｎ１９Ｑ変異、Ｃ３１Ｓ変異、およびＥ１２Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、フェリチンは、Ｎ１９Ｑ変異、Ｃ３１Ｓ変異、およびＳ７２Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、フェリチンは、Ｎ１９Ｑ変異、Ｃ３１Ｓ変異、およびＡ７５Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、フェリチンは、Ｎ１９Ｑ変異、Ｃ３１Ｓ変異、およびＫ７９Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、フェリチンは、Ｎ１９Ｑ変異、Ｃ３１Ｓ変異、およびＳ１００Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、フェリチンは、Ｎ１９Ｑ変異、Ｃ３１Ｓ変異、およびＳ１１１Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、フェリチンは、前述の変異の組のいずれかに対応する変異を含み、対応する変異は、フェリチンアミノ酸配列とＨ．ピロリフェリチンアミノ酸配列（配列番号２０８または２０９）とのペアワイズアライメントによって決定した位置で、ＮをＱに、ＣをＳに、および非システインの表面に露出したアミノ酸をシステインに変化させる。
【０１４５】
１つより多くのタイプの変異を含む例示的なフェリチンを、配列番号２０１〜２０７に提供する。
【０１４６】
６．構造アライメント
本明細書で考察したように、所定のポリペプチド（例えば、Ｈ．ピロリフェリチン）に関して記載した変異に対応する変異の位置は、ペアワイズまたは構造アライメントによって同定することができる。構造アライメントは、タンパク質がかなりの配列変動にも関わらず類似の構造を共有し、ファミリーの多くのメンバーが構造的に特徴付けされている、フェリチンのような大きいタンパク質ファミリーにとって適切であり、これもまた、ＥＢＶポリペプチド（例えば、ｇＬ、ｇＨ、ｇｐ２２０、またはｇｐ４２）のような、本明細書に記載される他のポリペプチドの異なる形態における対応する位置を同定するために使用することができる。タンパク質データバンク（ＰＤＢ）は、その受託番号と共に以下に列挙するフェリチンを含む、多くのフェリチンに関する３Ｄ構造を含む。
【０１４７】
２ｊｄ６，２ｊｄ７−ＰｆＦＲ−ピュロコックス・フリオスス。２ｊｄ８−ＰｆＦＲ＋Ｚｎ。３ａ６８−遺伝子ＳｆｅｒＨ４由来のｓｏＦＲ−ダイズ。３ａ９ｑ−遺伝子ＳｆｅｒＨ４（変異体）由来のｓｏＦＲ。３ｅｇｍ，３ｂｖｆ，３ｂｖｉ，３ｂｖｋ，３ｂｖｌ−ＨｐＦＲ−ヘリコバクター・ピロリ。５ｃ６ｆ−ＨｐＦＲ（変異体）＋Ｆｅ。１ｚ４ａ，１ｖｌｇ−ＦＲ−テルモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍｅ）。１ｓ３ｑ，１ｓｑ３，３ｋｘ９−ＦＲ−アルカエオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｕｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ），１ｋｒｑ−ＦＲ−カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）。１ｅｕｍ−ＥｃＦＲ−大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）。４ｒｅｕ−ＥｃＦＲ＋Ｆｅ。４ｘｇｓ−ＥｃＦＲ（変異体）＋Ｆｅ２Ｏ２。４ｚｔｔ−ＥｃＦＲ（変異体）＋Ｆｅ２Ｏ＋Ｆｅ２＋Ｆｅ＋Ｏ２。１ｑｇｈ−ＬｉＦＲ−リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ）。３ｑｚ３−ＶｃＦＲ−ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）。３ｖｎｘ−ＦＲ−アナアオサ（Ｕｌｖａ  ｐｅｒｔｕｓａ）。４ｉｓｍ，４ｉｓｐ，４ｉｔｔ，４ｉｔｗ，４ｉｗｊ，４ｉｗｋ，４ｉｘｋ，３ｅ６ｓ−ＰｎｍＦＲ−プセウドニッチア（Ｐｓｅｕｄｏ−ｎｉｔｓｃｈｉａ  ｍｕｌｔｉｓｅｒｉｅｓ）。４ｚｋｈ，４ｚｋｗ，４ｚｋｘ，４ｚｌ５，４ｚｌ６，４ｚｌｗ，４ｚｍｃ−ＰｎｍＦＲ（変異体）＋Ｆｅ。１ｚ６ｏ−ＦＲ−イラクサギンウワバ。４ｃｍｙ−ＦＲ＋Ｆｅ−緑色硫黄細菌（Ｃｈｌｏｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ｔｅｐｉｄｕｍ）。フェリチン軽鎖（ＦＴＬ）。１ｌｂ３，１ｈ９６−ｍＦＴＬ−マウス。１ｒｃｃ，１ｒｃｄ，１ｒｃｉ−ｂＦＴＬ＋タルトレート＋Ｍｇ。１ｒｃｅ，１ｒｃｇ−ｂＦＴＬ＋タルトレート＋Ｍｎ。３ｎｏｚ，３ｎｐ０，３ｎｐ２，３ｏ７ｒ−ｈｏＦＴＬ（変異体）−ウマ。３ｏ７ｓ，３ｕ９０−ｈｏＦＴＬ。４ｖ１ｗ−ｈｏＦＴＬ−ｃｒｙｏ  ＥＭ。３ｒａｖ，３ｒｄ０−ｈｏＦＴＬ＋バルビツレート。フェリチン軽鎖＋重鎖：５ｇｎ８−ｈＦＴＨ＋Ｃａ。
【０１４８】
構造アライメントは、（ｉ）第２の配列の公知の構造を使用して第１の配列の構造をモデリングする工程、または（ｉｉ）両方が公知である第１および第２の配列の構造を比較する工程、ならびに第２の配列における目的の残基に最も類似に位置する第１の配列中の残基を同定する工程によって、２つ（またはそれより多く）のポリペプチド配列を超えて対応する残基を同定する工程を伴う。対応する残基は、重ねた構造におけるアルファ炭素の距離の最小化（例えば、どの組のアルファ炭素対がアライメントに関する最小平均二乗偏差を提供するか）に基づいて一部のアルゴリズムにおいて同定される。Ｈ．ピロリフェリチンに関して記載された位置に対応する非Ｈ．ピロリフェリチンにおける位置を同定する場合、Ｈ．ピロリフェリチンは、「第２の」配列であり得る。目的の非Ｈ．ピロリフェリチンが利用可能な公知の構造を有しないが、公知の構造を有する別の非Ｈ．ピロリフェリチンに、Ｈ．ピロリフェリチンより密接に関連する場合、密接に関連する非Ｈ．ピロリフェリチンの公知の構造を使用して目的の非Ｈ．ピロリフェリチンをモデリングし、次にそのモデルをＨ．ピロリフェリチン構造と比較して、目的のフェリチンにおける所望の対応する残基を同定することが最も有効であり得る。構造モデリングおよびアライメントに関して広範囲の文献が存在し、代表的な開示には、米国特許第６８５９７３６号；米国特許第８７３８３４３号；およびＡｓｌａｍら、Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０（２０１６）９〜１３頁において引用される開示が挙げられる。公知の関連する構造または複数の構造に基づく構造のモデリングの考察に関して、例えば、Ｂｏｒｄｏｌｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ４（２００９）１〜１３頁、およびその中で引用されている参考文献を参照されたい。
【０１４９】
７．ルマジンシンターゼ
一部の実施形態では、抗原性ポリペプチドはルマジンシンターゼタンパク質を含む。ルマジンシンターゼは高次構造、例えば６０サブユニットのルマジンシンターゼ粒子を形成し得る。例示的なルマジンシンターゼはアクイフェックス・エオリクス（Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ）ルマジンシンターゼ（配列番号４０）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ルマジンシンターゼ（配列番号４１）である。一部の実施形態では、ルマジンシンターゼは配列番号４０または４１の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する。ルマジンシンターゼはＥＢＶポリペプチドに対してＣ末端側に位置することができ、本明細書で論じるようにリンカーによってＥＢＶポリペプチドから隔てることができる。
【０１５０】
Ｇ．起こり得る酸化、脱アミド化、またはイソアスパルテート形成部位を除去するためのｇＬ、ｇＨ、ｇｐ４２、リンカー、および／またはフェリチンの配列における変異
一部の実施形態では、抗原性ＥＢＶポリペプチドは、以下の表１で説明する例示的な変異のような起こり得る酸化、脱アミド化、またはイソアスパルテート形成部位を除去するための１つまたはそれ以上の変異を含む。
【０１５１】
例えば、一部の実施形態では、ｇＬ配列は、起こり得るスクシンイミド／イソアスパルテートまたは脱アミド化部位を除去するための１つまたはそれ以上の変異を含む。例えば、ｇＬ配列は、配列番号２２７の３６位に対応する位置にＧからＡへの変異、配列番号２２７の４７位に対応する位置にＮからＱへの変異、または配列番号２２７の１０５位に対応する位置にＮからＱへの変異を含み得る。デフォルトパラメータを用いるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムのような標準的な配列アライメントアルゴリズムに従ってその位置に整列すれば、アミノ酸配列における位置は配列番号２２７における所与の位置に「対応」する。
【０１５２】
一部の実施形態では、リンカーは起こり得る脱アミド化部位を除去するための１つまたはそれ以上の変異を含む。例えば、リンカー配列は配列番号２２７の１３２位または１４１位に対応する位置にＮからＧへの変異を含み得る。
【０１５３】
一部の実施形態では、ｇＨ配列は起こり得るスクシンイミド／イソアスパルテートまたは酸化部位を除去するための１つまたはそれ以上の変異を含む。例えば、ｇＨ配列は配列番号２２７の１８９位、４０１位、または７２９位に対応する位置にＭからＬへの変異、配列番号２２７の３６８位に対応する位置にＤからＥへの変異、配列番号２２７の４９９位または６３９位に対応する位置にＭからＩへの変異、または配列番号２２７の６５３位に対応する位置にＮかＱへの変異を含み得る。
【０１５４】
一部の実施形態では、ｇｐ４２配列は起こり得る脱アミド化部位を除去するための１つまたはそれ以上の変異を含む。例えば、ｇｐ４２配列は配列番号２２７の９５９位または９９０位に対応する位置にＮからＱへの変異、または配列番号２２７の９８８位に対応する位置にＮからＳへの変異を含み得る。
【０１５５】
一部の実施形態では、フェリチン配列は起こり得る脱アミド化、酸化、またはイソアスパルテート形成部位を除去するための１つまたはそれ以上の変異を含む。例えば、フェリチン配列は配列番号２２７の１１５０位に対応する位置にＱからＳへの変異、配列番号２２７の１１６８位に対応する位置にＭからＩへの変異、配列番号２２７の１１７７位に対応する位置にＭからＬへの変異、配列番号２２７の１１８８位に対応する位置にＧからＡへの変異、または配列番号２２７の１２５３位もしくは１２９６位に対応する位置にＮからＱへの変異を含み得る。
【０１５６】
例示的な変異を下の表１に示す。位置の番号付けは配列番号２２７に対応する。
【０１５７】
【表１】
2021519598.tif 000002
【０１５８】
Ｈ．免疫刺激性部分；アジュバント；コンジュゲートされたＥＢＶポリペプチド
一部の実施形態では、ＥＢＶポリペプチドおよび／またはアジュバントのような免疫刺激性部分は、表面に露出したアミノ酸に結合する。一部の実施形態では、表面に露出したアミノ酸は、例えば上記で考察した変異に起因するシステインである。一部の実施形態では、表面に露出したアミノ酸は、リシン、アスパルテート、またはグルタメートである。グルタルアルデヒド（リシンをアミノ担持リンカーまたは部分にコンジュゲートするため）またはカルボジイミド（例えば、アスパルテートもしくはグルタメートをアミノ担持リンカーもしくは部分にコンジュゲートするための、またはリシンをカルボキシル担持リンカーもしくは部分にコンジュゲートするための、１−シクロヘキシル−３−（２−モルフォリン−４−イル−エチル）カルボジイミド、または１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ；ＥＤＡＣ））を使用するコンジュゲーション手順は、例えばｗｗｗ．ｓｐｒｉｎｇｅｒ．ｃｏｍ．から入手可能な、Ｃｈａｐｔｅｒ  ４  ｏｆ  Ｈｏｌｔｚｈａｕｅｒ，Ｍ．，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌａｂ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  ２００６，ＩＳＢＮ  ９７８−３−５４０−３２７８５−１に記載されている。
【０１５９】
一部の実施形態では、アジュバントのような免疫刺激性部分は、フェリチンの表面に露出したアミノ酸に結合する。一部の実施形態では、アジュバントのような１つより多くの免疫刺激性部分が、フェリチンの表面に露出したアミノ酸に結合する。一部の実施形態では、２４個の免疫刺激性部分が、フェリチン多量体または粒子（例えば、Ｈ．ピロリフェリチン粒子における各々の単量体の１つの部分）に結合する。複数の免疫刺激性部分がフェリチンナノ粒子に結合した一部の実施形態では、免疫刺激性部分は全て同一である。複数の免疫刺激性部分がフェリチンナノ粒子に結合した一部の実施形態では、免疫刺激性部分は全て同一ではない。
【０１６０】
１．免疫刺激性部分のタイプ；アジュバント
表面に露出したアミノ酸（例えば、システイン）に結合することができる免疫刺激性部分を、本開示に従ってフェリチンにおいて使用することができる。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、Ｂ細胞アゴニストである。
【０１６１】
一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、疎水性ではない。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は親水性である。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、極性である。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、水素結合またはイオン結合することが可能であり、例えば水素結合ドナー、水素結合アクセプター、カチオン性部分またはアニオン性部分を含む。部分が、ｐＨ  ６、７、７．４、または８のような生理的に関連するｐＨで、水溶液中でイオン化される場合、部分はカチオン性またはアニオン性であると考えられる。
【０１６２】
一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、アジュバントである。一部の実施形態では、アジュバントは、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を含む。一部の実施形態では、アジュバントは、ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ受容体（ＴＬＲ）アゴニストまたはインターフェロン遺伝子（ＳＴＩＮＧ）アゴニストの刺激剤である。一部の実施形態では、アジュバントはＢおよび／またはＴ細胞におけるＴＬＲシグナル伝達を活性化する。一部の実施形態では、アジュバントは、適応免疫応答を調節する。
【０１６３】
ａ）ＴＬＲ２アゴニスト
一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ２アゴニストである。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ２シグナル伝達を刺激する。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ２の合成低分子リガンドである。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ２シグナル伝達の合成低分子アゴニストである。
【０１６４】
一部の実施形態では、ＴＬＲ２アゴニストは、ＰＡＭ２ＣＳＫ４、ＦＳＬ−１、またはＰＡＭ３ＣＳＫ４である。
【０１６５】
ｂ）ＴＬＲ７／８アゴニスト
一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニスト（すなわち、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８の少なくとも１つのアゴニスト）である。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８シグナル伝達を刺激する。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８の合成低分子リガンドである。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８シグナル伝達の合成低分子アゴニストである。
【０１６６】
一部の実施形態では、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニストは、一本鎖（ｓｓＲＮＡ）である。一部の実施形態では、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニストは、イミダゾキノリンである。一部の実施形態では、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニストは、ヌクレオシドアナログである。
【０１６７】
一部の実施形態では、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニストは、３Ｍ−０１２（３Ｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）のようなイミダゾキノリンアミンＴｏｌｌ−ｌｉｋｅ受容体（ＴＬＲ）アゴニストである。遊離の３Ｍ−０１２の構造は：
【化１】
2021519598.tif 000003
である。３Ｍ−０１２または本明細書で考察する任意の部分のような免疫刺激性部分は、この部分の適切な末端原子（例えば、水素）を、例えば表面に露出したシステインの硫黄での本明細書に記載されるフェリチンとの結合に置換することによって、またはそのような硫黄に結合するリンカーによってフェリチンにコンジュゲートすることができると理解される。このように、フェリチンにコンジュゲートする場合、免疫刺激性部分の構造は、遊離の分子の構造とはわずかに異なる。
【０１６８】
一部の実施形態では、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニストは、ＳＭ７／８ａである。遊離のＳＭ７／８ａの構造は：
【化２】
2021519598.tif 000004
である。
【０１６９】
例えば、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５  Ｎｏｖ；３３（１１）：１２０１〜１０頁．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３３７１を参照されたい。
【０１７０】
ｃ）ＴＬＲ９アゴニスト
一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ９アゴニストである。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ９シグナル伝達を刺激する。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ９の合成低分子リガンドである。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ９シグナル伝達の合成低分子アゴニストである。
【０１７１】
一部の実施形態では、ＴＬＲ９アゴニストは、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である。一部の実施形態では、ＴＬＲ９アゴニストは、非メチル化ＣｐＧ  ＯＤＮである。一部の実施形態では、ＣｐＧ  ＯＤＮは、通常のＤＮＡにおいて見出される天然のホスホジエステル（ＰＯ）骨格の代わりに、部分的または完全なホスホロチオエート（ＰＳ）骨格を含む。
【０１７２】
一部の実施形態では、ＣｐＧ  ＯＤＮは、クラスＢ  ＯＤＮであり、これは５’プリン（Ｐｕ）−ピリミジン（Ｐｙ）−Ｃ−Ｇ−Ｐｙ−Ｐｕ３’を含む１つまたはそれ以上の６量体ＣｐＧモチーフを含み；十分にホスホロチオエート化された（すなわち、ＰＳ改変された）骨格を有し；１８〜２８ヌクレオチド長を有する。一部の実施形態では、ＣｐＧ  ＯＤＮは、配列番号２１０の配列を含み、場合により、骨格にホスホロチオエート結合を含む。
【０１７３】
一部の実施形態では、ＴＬＲ９アゴニストは、免疫刺激性配列（ＩＳＳ）を含む。一部の実施形態では、ＴＬＲ９アゴニストは、ＩＳＳ−１０１８（Ｄｙｎａｖａｘ）（配列番号２１０）である。
【０１７４】
ｄ）ＳＴＩＮＧアゴニスト
一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＳＴＩＮＧ（インターフェロン遺伝子タンパク質刺激因子、小胞体ＩＦＮ刺激因子とも呼ばれる）アゴニストである。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＳＴＩＮＧシグナル伝達を刺激する。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＳＴＩＮＧの合成低分子リガンドである。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＳＴＩＮＧシグナル伝達の合成低分子アゴニストである。
【０１７５】
一部の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）である。例えば、Ｄａｎｉｌｃｈａｎｋａら、Ｃｅｌｌ  １５４：９６２〜９７０頁（２０１３）を参照されたい。例示的なＣＤＮは、ｃｄＡ、ｃｄＧ、ｃＡＭＰ−ｃＧＭＰ、および２’−５’，３’−５’ｃＧＡＭＰを含む（構造に関しては、Ｄａｎｉｌｃｈａｎｋａら、を参照されたい）。ＳＴＩＮＧアゴニストはまた、ＤＭＸＡＡのような合成アゴニストも含む。
【化３】
2021519598.tif 000005
【０１７６】
２．コンジュゲートされたＥＢＶポリペプチド
一部の実施形態では、ＥＢＶポリペプチドは、フェリチンの表面に露出したアミノ酸にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、ＥＢＶポリペプチドは、フェリチンタンパク質を抗原性にする。一部の実施形態では、ＥＢＶポリペプチドは、単独で抗原性であるが、一部の実施形態では、ＥＢＶポリペプチドは、フェリチンとのその会合のために抗原性である。一部の実施形態では、ＥＢＶポリペプチドは、本明細書に記載されるＥＢＶポリペプチドのいずれか１つである。
【０１７７】
３．コンジュゲーション
一部の実施形態では、表面に露出したシステイン（例えば、本明細書に記載される変異に起因する）、またはフェリチン（例えば、フェリチンのＮ末端）に結合したペプチドリンカー中のシステインを使用して、アジュバントのような免疫刺激性部分またはＥＢＶポリペプチドを、フェリチンにコンジュゲートする。一部の実施形態では、リンカーは、そのようなシステインにコンジュゲートされ、リンカーを次に、アジュバントのような免疫刺激性部分、またはＥＢＶポリペプチドにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、そのようなシステインは、アジュバント、リンカー、またはＥＢＶポリペプチドを結合させるコンジュゲーション反応のための化学ハンドルを作製する。一部の実施形態では、バイオコンジュゲートが産生され、アジュバントのような免疫刺激性部分またはＥＢＶポリペプチドは、そのようなシステインの還元後にフェリチンに連結される。一部の実施形態では、システインは、表面に露出した不対システイン、すなわちジスルフィド結合を形成するための適切な位置にパートナーシステインを欠如するシステインである。一部の実施形態では、システインは、遊離のチオール側鎖を含む不対システインである。
【０１７８】
ａ）コンジュゲーションケミストリーのタイプ
任意のタイプのケミストリーを使用して、例えばシステインまたはＬｙｓ、Ｇｌｕ、もしくはＡｓｐのような別のアミノ酸のような表面に露出したアミノ酸の反応を介して、アジュバントのような免疫刺激性部分またはＥＢＶポリペプチドをフェリチンにコンジュゲートすることができる。
【０１７９】
一部の実施形態では、コンジュゲーションは、クリックケミストリーを使用して実施される。本明細書で使用される場合、「クリックケミストリー」は、互いに急速かつ選択的に反応する（すなわち、「クリックする」）１対の官能基間での反応を指す。一部の実施形態では、クリックケミストリーは、緩和な水性条件下で実施することができる。一部の実施形態では、クリックケミストリー反応は、表面に露出したアミノ酸の変異に起因するシステインのようなフェリチンの表面上のシステインを利用し、システインと反応することができる官能基を使用してクリックケミストリーを実施する。
【０１８０】
クリックケミストリーの基準を満たす多様な反応が、当技術分野で公知であり、当業者は、複数の公表された方法論のいずれかを使用することができる（例えば、Ｈｅｉｎら、Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  ２５（１０）：２２１６〜２２３０頁（２００８）を参照されたい）。クリックケミストリーに関してＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、またはＬｕｍｉｐｒｏｂｅの試薬のような広範囲の市販の試薬を使用することができる。一部の実施形態では、コンジュゲーションは、以下の実施例に記載されるようにクリックケミストリーを使用して実施される。
【０１８１】
一部の実施形態では、クリックケミストリーは、フェリチンの還元後に起こる。
【０１８２】
一部の実施形態では、クリックケミストリーは、１ステップクリック反応であり得る。一部の実施形態では、クリックケミストリーは、２ステップクリック反応であり得る。
【０１８３】
一部の実施形態では、反応は、金属フリーのクリックケミストリーを含む。一部の実施形態では、反応は、チオール−マレイミドおよび／またはジスルフィド交換を含む。
【０１８４】
金属フリークリックケミストリー
金属フリークリックケミストリーは、タンパク質の起こり得る酸化を回避するためにコンジュゲーション反応に関して使用することができる。金属フリークリックケミストリーは、抗体コンジュゲートを形成するために使用されている（ｖａｎ  Ｇｅｅｌら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２０１５，２６，２２３３〜２２４２頁を参照されたい）。
【０１８５】
一部の実施形態では、金属フリークリックケミストリーは、アジュバントをフェリチンに結合させる反応において使用される。一部の実施形態では、アジュバントをフェリチンに結合させる反応において銅フリーコンジュゲーションを使用する。一部の実施形態では、金属フリークリックケミストリーは、ビシクロ［６．１．０］ノニン（ＢＣＮ）を使用する。一部の実施形態では、金属フリークリックケミストリーは、ジベンゾアザシクロオクチン（ＤＢＣＯ）を使用する。一部の実施形態では、ＢＣＮまたはＤＢＣＯは、アジド基と反応する。
【０１８６】
ＤＢＣＯは、触媒の非存在下での歪み促進型クリック反応を介してアジド基に対して高い特異性を有し、高収率の安定なトリアゾールをもたらす。一部の実施形態では、ＤＢＣＯは、銅触媒の非存在下でアジドと反応する。
【０１８７】
一部の実施形態では、金属フリークリックケミストリーは、１ステップクリック反応において使用される。一部の実施形態では、金属フリークリックケミストリーは、２ステップクリック反応において使用される。
【０１８８】
チオール−マレイミドおよびジスルフィド交換
本明細書で使用されるフェリチンは、スルフヒドリルとしても知られるチオールを含むシステインを含むことができ、これはスルフヒドリル反応性化学基との反応に関して利用可能である（または還元を通して利用可能となり得る）。このように、システインは、アジュバントのような免疫刺激性部分をフェリチンに付加するための化学選択的改変を可能にする。塩基性条件下では、システインは、脱プロトン化されて、チオレート求核試薬を生成し、これはマレイミドおよびヨードアセトアミドのような弱い求電子試薬と反応することができる。システインとマレイミドまたはヨードアセトアミドとの反応は、炭素−硫黄結合をもたらす。
【０１８９】
一部の実施形態では、スルフヒドリル反応性化学基は、表面に露出したシステインまたはフェリチンのリンカー中のシステインと反応する。一部の実施形態では、スルフヒドリル反応性化学基は、ハロアセチル、マレイミド、アジリジン、アクリロイル、アリール化剤、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、またはＴＮＢ−チオールである。
【０１９０】
一部の実施形態では、スルフヒドリル反応性化学基は、アルキル化によってシステインのスルフヒドリルにコンジュゲートする（すなわち、チオエーテル結合の形成）。一部の実施形態では、スルフヒドリル反応性化学基は、ジスルフィド交換によってシステインのスルフヒドリルにコンジュゲートする（すなわち、ジスルフィド結合の形成）。
【０１９１】
一部の実施形態では、アジュバントのような免疫刺激性部分をフェリチンにコンジュゲートする反応は、チオール−マレイミド反応である。
【０１９２】
一部の実施形態では、スルフヒドリル反応性化学基は、マレイミドである。一部の実施形態では、マレイミドとシステインとの反応は、例えば可逆的ではない安定なチオエステル結合の形成をもたらす。一部の実施形態では、マレイミドは、フェリチン中のチロシン、ヒスチジン、またはメチオニンとは反応しない。一部の実施形態では、非反応マレイミドは、遊離のチオールを例えば過剰に添加することによって、反応終了時にクエンチされる。
【０１９３】
一部の実施形態では、アジュバントのような免疫刺激性部分をフェリチンにコンジュゲートする反応は、ジスルフィド相互交換としても知られるチオール−ジスルフィド交換である。一部の実施形態では、反応は、当初のジスルフィドの一部を含む混合ジスルフィドの形成を伴う。一部の実施形態では、当初のジスルフィドは、表面に露出したアミノ酸の変異またはＮ末端リンカーの付加によってフェリチンに導入されたシステインである。
【０１９４】
一部の実施形態では、スルフヒドリル反応性化学基は、ピリジルジチオールである。一部の実施形態では、スルフヒドリル反応性化学基は、ＴＮＢ−チオール基である。
【０１９５】
ｂ）リンカー
一部の実施形態では、アジュバントのような免疫刺激性部分、またはＥＢＶポリペプチドは、システインのような表面に露出したアミノ酸に共有結合したリンカーを介してフェリチンに結合する。一部の実施形態では、リンカーは、ポリエチレングリコール、例えば、ＰＥＧリンカーを含む。一部の実施形態では、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ）リンカーは、アジュバントのような免疫刺激性部分に連結したフェリチンの水溶性およびライゲーション効率を増加させる。ＰＥＧリンカーは、２〜１８ＰＥＧ長の間、例えば、ＰＥＧ４、ＰＥＧ５、ＰＥＧ６、ＰＥＧ７、ＰＥＧ８、ＰＥＧ９、ＰＥＧ１０、ＰＥＧ１１、ＰＥＧ１２、ＰＥＧ１３、ＰＥＧ１４、ＰＥＧ１５、ＰＥＧ１６、ＰＥＧ１７、およびＰＥＧ１８である。
【０１９６】
一部の実施形態では、リンカーは、マレイミドを含む。一部の実施形態では、リンカーは、免疫刺激性部分（ＩＳＭ）−リンカー−マレイミドの構成要素を含む。一部の実施形態では、ＩＳＭ−リンカー−マレイミドは、マレイミドとフェリチンのシステインとの反応によって１ステップクリックケミストリーにおいてフェリチンにコンジュゲートされる。一部の実施形態では、アジュバント−リンカー−マレイミドのＩＳＭは、ＳＭ７／８ａである。一部の実施形態では、ＩＳＭ−リンカー−マレイミドのリンカーはＰＥＧ４である。一部の実施形態では、ＩＳＭ−リンカー−マレイミドは、ＳＭ７／８ａ−ＰＥＧ４−マレイミドである。
【０１９７】
一部の実施形態では、２ステップクリックケミストリープロトコルを、１つの末端でスルフヒドリル反応性化学基および他方の末端でアミン反応基を含むリンカーと共に使用する。そのような２ステップクリックケミストリープロトコルでは、スルフヒドリル反応性化学基は、フェリチンのシステインと反応するが、アミン反応基はＩＳＭに結合した試薬と反応する。このようにして、ＩＳＭは、１組の２クリックケミストリー試薬の組を介してフェリチンにコンジュゲートされる。
【０１９８】
２ステップクリックケミストリープロトコルの一部の実施形態では、スルフヒドリル反応性化学基はマレイミドである。２ステップクリックケミストリープロトコルの一部の実施形態では、マレイミドは、表面に露出したアミノ酸の変異またはＮ末端リンカーの付加によってフェリチンに導入されたシステインと反応する。
【０１９９】
２ステップクリックケミストリープロトコルの一部の実施形態では、アミン反応基はＤＢＣＯである。２ステップクリックケミストリープロトコルの一部の実施形態では、ＤＢＣＯは、ＩＳＭに結合したアジド基と反応する。
【０２００】
一部の実施形態では、マレイミド−リンカー−ＤＢＣＯを使用する。一部の実施形態では、マレイミド−リンカー−ＤＢＣＯは、フェリチンの還元後、フェリチンにコンジュゲートされる。一部の実施形態では、マレイミド−リンカー−試薬は、第１のステップでマレイミドとフェリチンのシステインとの反応によってフェリチンにコンジュゲートされる。一部の実施形態では、ＤＢＣＯを使用してアジドに結合したＩＳＭに連結する。一部の実施形態では、アジドに連結したＩＳＭは、ＩＳＳ−１０１８である。一部の実施形態では、アジドにカップリングしたアジュバントは、３Ｍ−０１２またはＣｐＧである。
【０２０１】
一部の実施形態では、反応基を有するリンカーをＩＳＭに付加する。一部の実施形態では、リンカーは、ＰＥＧ４−アジドリンカー、またはＰＥＧ４−マレイミドリンカーである。
【０２０２】
一部の実施形態では、ＰＥＧ４−アジドリンカーは、３Ｍ−０１２にコンジュゲートされる。ＰＥＧ４−アジドリンカーにコンジュゲートされた３Ｍ−０１２の例示的な構造は：
【化４】
2021519598.tif 000006
である。
【０２０３】
一部の実施形態では、ＰＥＧ４−アジドリンカーは、ＳＭ７／８ａにコンジュゲートされる。ＰＥＧ４−アジドリンカーにコンジュゲートされたＳＭ７／８ａの例示的な構造は：
【化５】
2021519598.tif 000007
である。
【０２０４】
一部の実施形態では、ＰＥＧ４−マレイミドリンカーは、ＳＭ７／８ａにコンジュゲートされる。ＰＥＧ４−マレイミドリンカーにコンジュゲートされたＳＭ７／８ａの例示的な構造は：
【化６】
2021519598.tif 000008
である。
【０２０５】
一部の実施形態では、アジド基は、ＩＳＳ−１０１８にコンジュゲートされる。ＮＨＳエステル−アジドリンカーにコンジュゲートされたＩＳＳ−１０１８の例示的な構造は：
【化７】
2021519598.tif 000009
である。
【０２０６】
Ｉ．例示的な組成物、キット、核酸、使用、および方法
一部の実施形態では、本発明は、ＥＢＶによる感染に対して対象を免疫する方法を提供する。本発明は、対象におけるＥＢＶに対する免疫応答を誘発する方法をさらに提供する。一部の実施形態では、本発明の方法は、本明細書に記載される医薬組成物の有効量を対象に投与する工程を含む。一部の実施形態では、本発明の方法は、本明細書に記載される抗原性ＥＢＶポリペプチドまたはナノ粒子の有効量を対象に投与する工程を含む。
【０２０７】
一部の実施形態では、本明細書に記載した抗原性ＥＢＶポリペプチドおよび薬学的に許容されるビヒクル、アジュバント、または賦形剤のいずれか１つまたはそれ以上を含む組成物が提供される。
【０２０８】
一部の実施形態では、ＥＢＶによって惹起される感染に対して免疫するために、ヒトまたは以下に論じる対象のいずれかのような対象に、本明細書に記載した抗原性ＥＢＶポリペプチド、ナノ粒子、または組成物が投与される。一部の実施形態では、ＥＢＶによる将来の感染に対する保護的免疫応答を生成するために、ヒトのような対象に、本明細書に記載した抗原性ＥＢＶポリペプチドまたはナノ粒子が投与される。一部の実施形態では、抗原性ＥＢＶポリペプチドが投与される。一部の実施形態では、ＥＢＶポリペプチドおよびフェリチンを含む抗原性ＥＢＶポリペプチドが投与され、フェリチンは本明細書に記載した１つまたはそれ以上の変異を有し得る。一部の実施形態では、配列番号１〜２７のうちいずれか１つを含む抗原性ＥＢＶポリペプチドまたはナノ粒子が投与される。
【０２０９】
一部の実施形態では、保護的免疫応答は、入院の発生率を減少させる。一部の実施形態では、保護的免疫応答は、ＥＢＶ感染症、単核球症、単核球症によって引き起こされる合併症（例えば、肝炎、脳炎、重度の溶血性貧血、または脾腫）、鼻咽頭がん、胃がん、またはＢリンパ腫（バーキットまたはホジキンリンパ腫を含む）の発生率を減少させる。
【０２１０】
一部の実施形態では、組成物は１つの抗原性ＥＢＶポリペプチドを含む（例えば一価組成物）。一部の実施形態では、組成物はｇＨポリペプチドを含む抗原性ＥＢＶポリペプチドを含む。一部の実施形態では、組成物はｇＬポリペプチドを含む抗原性ＥＢＶポリペプチドを含む。一部の実施形態では、組成物はｇｐ２２０ポリペプチドを含む抗原性ＥＢＶポリペプチドを含む。
【０２１１】
一部の実施形態では、組成物は２つ以上の抗原性ＥＢＶポリペプチドを含む。一部の実施形態では、組成物はＥＢＶによってコードされる２つ以上のポリペプチドを含む１つまたはそれ以上の抗原性ＥＢＶポリペプチドを含む（すなわち多価組成物）。一部の実施形態では、ＥＢＶワクチンはｇｐ２２０ポリペプチドを含むナノ粒子、および別にｇＨおよびｇＬポリペプチドを含むナノ粒子を含む。
【０２１２】
一部の実施形態では、ＥＢＶによって惹起される感染に対する免疫における使用のために、本明細書に記載した抗原性ＥＢＶポリペプチド、ナノ粒子、または組成物のいずれの１つまたはそれ以上が提供される。一部の実施形態では、ＥＢＶによる将来の感染に対する保護的免疫応答の生成における使用のために、本明細書に記載したポリペプチド、ナノ粒子、または組成物のいずれの１つまたはそれ以上が提供される。
【０２１３】
１．対象
一部の実施形態では、対象は哺乳動物である。一部の実施形態では、対象はヒトである。
【０２１４】
一部の実施形態では、対象は成人（年齢１８歳より上または１８歳に等しい）である。一部の実施形態では、対象は小児または青年（年齢１８歳未満）である。一部の実施形態では、対象は高齢者（年齢６０歳より上）である。一部の実施形態では、対象は、非高齢成人（年齢１８歳より上またはそれに等しく、年齢６０歳未満またはそれに等しい）である。
【０２１５】
一部の実施形態では、組成物は意図した投与経路のために好適に処方される。好適な投与経路の例には、筋肉内、経皮、皮下、鼻内、経口、または経真皮が含まれる。
【０２１６】
一部の実施形態では、組成物の１回より多くの投与を対象に投与する。一部の実施形態では、ブースター投与は免疫応答を改善する。
【０２１７】
一部の実施形態では、本明細書に記載される抗原性ポリペプチドまたは組成物の１つまたはそれ以上は、霊長類（例えば、サル（例えば、アカゲザルまたはカニクイザルのようなマカク）または類人猿のような非ヒト霊長類）、齧歯類（例えば、マウスまたはラット）、または家畜哺乳動物（例えば、イヌ、ウサギ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ラクダ、またはロバ）のような哺乳動物において使用するためである。
【０２１８】
２．アジュバント
アジュバントは本明細書に記載した抗原性ＥＢＶポリペプチドおよび／またはナノ粒子とともに対象に投与してよく、そのような組成物の投与によって、アジュバントなしにＥＢＶポリペプチドを投与した場合と比較して、ＥＢＶポリペプチドに対するより高い力価の抗体を対象に生成することができる。アジュバントはＥＢＶポリペプチドに対して、より早期の、より強力な、またはより持続する免疫応答を促進することができる。
【０２１９】
一部の実施形態では、組成物は、１つのアジュバントを含む。一部の実施形態では、組成物は１つより多くのアジュバントを含む。一部の実施形態では、組成物は、アジュバントを含まない。
【０２２０】
一部の実施形態では、アジュバントはアルミニウムを含む。一部の実施形態では、アジュバントは、リン酸アルミニウムである。一部の実施形態では、アジュバントはミョウバン（Ａｌｙｈｙｄｒｏｇｅｌ’８５  ２％；Ｂｒｅｎｎｔａｇ−カタログ番号２１６４５−５１−２）である。
【０２２１】
一部の実施形態では、アジュバントは有機アジュバントである。一部の実施形態では、アジュバントは油基剤のアジュバントである。一部の実施形態では、アジュバントは水中油型ナノ乳剤を含む。
【０２２２】
一部の実施形態では、アジュバントはスクアレンを含む。一部の実施形態では、スクアレンを含むアジュバントは、Ｒｉｂｉ（Ｓｉｇｍａ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｓｙｓｔｅｍカタログ番号Ｓ６３２２−１ｖｌ）、Ａｄｄａｖａｘ（商標）ＭＦ５９、ＡＳ０３、またはＡＦ０３（米国特許第９７０３０９５号を参照されたい）である。一部の実施形態では、スクアレンを含むアジュバントは、ナノ乳剤である。
【０２２３】
一部の実施形態では、アジュバントは、ポリアクリル酸ポリマー（ＰＡＡ）を含む。一部の実施形態では、ＰＡＡを含むアジュバントはＳＰＡ０９である（ＷＯ２０１７２１８８１９を参照されたい）。
【０２２４】
一部の実施形態では、アジュバントは非代謝性油を含む。一部の実施形態では、アジュバントは、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）を含む。
【０２２５】
一部の実施形態では、アジュバントは、非代謝性油および結核死菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含む。一部の実施形態では、アジュバントはフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）である。
【０２２６】
一部の実施形態では、アジュバントは、リポ多糖類である。一部の実施形態では、アジュバントは、モノホスホリルＡ（ＭＰＬまたはＭＰＬＡ）である。
【０２２７】
３．医薬組成物
様々な実施形態では、本明細書に記載される抗原性ＥＢＶポリペプチドおよび／または関連する実体を含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、医薬組成物は、病原体に対して保護的免疫応答のような免疫応答を誘発することが可能な免疫原性組成物（例えば、ワクチン）である。
【０２２８】
例えば、一部の実施形態では、薬学的組成物は以下の１つまたはそれ以上を含んでよい。（１）ＥＢＶポリペプチドおよび表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える変異を含むフェリチンを含む抗原性ＥＢＶポリペプチド、（２）ＥＢＶポリペプチドならびに表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える変異およびシステインに連結された抗原刺激性部分を含むフェリチンを含む抗原性ＥＢＶポリペプチド、（３）ＥＢＶポリペプチドおよび（ｉ）表面に露出したシステイン、（ｉｉ）フェリチンタンパク質に対してＮ末端側のペプチドリンカーを含むフェリチンを含み、ＥＢＶポリペプチドがペプチドリンカーに対してＮ末端側にある、抗原性ＥＢＶポリペプチド、（４）ＥＢＶポリペプチドおよび（ｉ）表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える変異およびシステインに連結された免疫刺激性部分、（ｉｉ）Ｈ．ピロリフェリチンの３１位における内部システインを非システインアミノ酸に置き換える変異、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって決定される、非Ｈ．ピロリフェリチンの３１位と類似の位置における内部システインの非システインアミノ酸への変異、ならびに（ｉｉｉ）表面に露出したアスパラギンを非アスパラギンアミノ酸に置き換える変異を含むフェリチンを含む抗原性ＥＢＶポリペプチド、または（５）上記のポリペプチドのいずれかを含むフェリチン粒子。一部の実施形態では、薬学的組成物は抗原性ＥＢＶ  ｇＬ／ｇＨポリペプチドを含んでよく、例えばポリペプチドはｇＬおよびｇＨのポリペプチド配列の間に少なくとも１５アミノ酸のリンカーを含む。
【０２２９】
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される抗原性ポリペプチドに関連する抗体または他の作用物質を含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載される抗原性ポリペプチドに結合するおよび／またはそれと競合する抗体を含む。あるいは、抗体は、本明細書に記載される抗原性ポリペプチドの非フェリチンポリペプチド構成要素を含むウイルス粒子または細菌を認識し得る。
【０２３０】
一部の実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は、単独で、または免疫応答を増強するための１つもしくはそれ以上の作用物質、例えば本明細書に記載されるアジュバントと組み合わせて投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、上記のアジュバントをさらに含む。
【０２３１】
一部の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む。本明細書で使用される場合、用語「担体」は、それと共に医薬組成物が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。例示的な実施形態では、担体は、滅菌液体、例えば水、および石油、動物、植物、または合成起源の油を含む油、例えば落花生油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油等を含み得る。一部の実施形態では、担体は、１つまたはそれ以上の固体構成要素であるか、またはそれらを含む。薬学的に許容される担体はまた、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、およびその組合せを含み得るがこれらに限定されない。本明細書で使用される場合、賦形剤は、例えば所望のコンシステンシーまたは安定化効果を提供するまたはそれに関与するように医薬組成物に含めることができる任意の非治療剤である。適した薬学的賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール等を含むがこれらに限定されない。様々な実施形態では、医薬組成物は無菌的である。
【０２３２】
一部の実施形態では、医薬組成物は、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有する。一部の実施形態では、医薬組成物は、安定化剤、緩衝剤、または保存剤のような任意の多様な添加剤を含み得る。加えて、補助剤、安定化剤、濃化剤、潤滑剤、および着色剤を含めることができる。
【０２３３】
様々な実施形態では、医薬組成物は、任意の所望の投与様式に適合するように製剤化することができる。例えば、医薬組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、滴剤、錠剤、丸剤、ペレット、カプセル剤、液体を含有するカプセル、ゼラチンカプセル、散剤、徐放性製剤、坐剤、乳剤、エアロゾル、噴霧剤、懸濁剤、凍結乾燥粉末、凍結懸濁液、乾燥粉末の形態、または使用するために適した他の任意の形態をとることができる。薬剤の製剤化および製造における一般的検討は、例えば参照によって本明細書に組み入れられる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５に見出すことができる。
【０２３４】
医薬組成物は、任意の投与経路を介して投与することができる。投与経路は、例えば経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、粘膜、硬膜外、舌下、鼻腔内、脳内、膣内、経皮、直腸内、気管内点滴、気管支点滴、吸入、または局所投与経路を含む。投与は局所または全身であり得る。一部の実施形態では、投与は経口で実施される。別の実施形態では、投与は非経口注射による。一部の例では、投与は、本明細書に記載される抗原性フェリチンポリペプチドの血流への放出をもたらす。投与様式は、医師の裁量に委ねることができる。
【０２３５】
一部の実施形態では、医薬組成物は、非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、および皮下）にとって適している。そのような組成物は、例えば、液剤、懸濁剤、分散剤、乳剤等として製剤化することができる。それらは、使用直前に滅菌注射可能媒体に溶解または懸濁することができる滅菌固体組成物（例えば、凍結乾燥組成物）の形態で製造してもよい。例えば、非経口投与は注射によって達成することができる。そのような実施形態では、注射剤は、通常の形態、すなわち液体溶液または懸濁液、注射前に液体中の溶液または懸濁液にとって適した固体形態、または乳剤として調製される。一部の実施形態では、注射溶液および懸濁液は、滅菌粉末、凍結乾燥粉末、または顆粒から調製される。
【０２３６】
さらなる実施形態では、医薬組成物は、吸入（例えば、肺および呼吸器への直接送達）による送達のために製剤化される。例えば、組成物は、点鼻用噴霧剤または他の任意の公知のエアロゾル製剤の形態をとり得る。一部の実施形態では、吸入用またはエアロゾル送達のための調製物は、複数の粒子を含む。一部の実施形態では、そのような調製物は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、または約１３ミクロンの平均粒子サイズを有し得る。一部の実施形態では、吸入またはエアロゾル送達のための調製物は、乾燥粉末として製剤化される。一部の実施形態では、吸入またはエアロゾル送達のための調製物は、例えば湿潤剤を含めることを通して湿潤粉末として製剤化される。一部の実施形態では、湿潤剤は、水、食塩水、または生理的ｐＨの他の液体からなる群から選択される。
【０２３７】
一部の実施形態では、本発明に従う医薬組成物は、鼻または口腔への滴剤として投与される。一部の実施形態では、用量は、複数の液滴（例えば、１〜１００、１〜５０、１〜２０、１〜１０、１〜５滴等）を含み得る。
【０２３８】
本発明の医薬組成物は、所望の転帰を達成するために適切な任意の用量で投与することができる。一部の実施形態では、所望の転帰は、組成物に存在する抗原性フェリチンポリペプチドに存在する非フェリチンポリペプチドの起源のような病原体に対する長期間持続する適応免疫応答の誘導である。一部の実施形態では、所望の転帰は、感染症の１つまたはそれ以上の症状の強度、重症度、頻度の低減、および／または発生の遅延である。一部の実施形態では、所望の転帰は、感染症の阻害または予防である。必要な用量は、対象の種、年齢、体重、および全身状態、予防または処置される感染の重症度、使用される特定の組成物、およびその投与様式に応じて対象毎に変化する。
【０２３９】
一部の実施形態では、本発明に従う医薬組成物は、単回または複数回用量で投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、異なる日に投与される複数回用量で投与される（例えば、プライム−ブーストワクチン接種戦略）一部の実施形態では、医薬組成物は、ブースターレジメンの一部として投与される。
【０２４０】
様々な実施形態では、医薬組成物は、１つまたはそれ以上の追加の治療剤と同時投与される。同時投与は、それらの投与時期が、追加の治療剤および医薬組成物中の活性成分の薬理活性が時間的に重複し、それによって組み合わせた治療効果を発揮する場合には、治療剤を同時に投与する必要はない。一般的に、各々の作用物質は、その作用物質に関して決定された用量および時間スケジュールで投与される。
【０２４１】
４．核酸／ｍＲＮＡ
同様に、本明細書に記載される抗原性ＥＢＶポリペプチドをコードする核酸も提供される。一部の実施形態では、核酸はｍＲＮＡである。ポリペプチドをもたらす翻訳を受けることが可能な任意の核酸は、本開示の目的に関してｍＲＮＡであると考えられる。
【０２４２】
５．キット
同様に本明細書において、本明細書に記載される１つまたはそれ以上の抗原性ＥＢＶポリペプチド、核酸、抗原性フェリチン粒子、抗原性ルマジンシンターゼ粒子、組成物、または医薬組成物を含むキットも提供される。一部の実施形態では、キットは、溶媒、溶液、緩衝剤、説明書、または乾燥剤の１つまたはそれ以上をさらに含む。
【０２４３】
＊＊＊
【０２４４】
本説明および例示的な実施形態は、制限すると解釈すべきではない。本明細書および添付の特許請求の目的に関して、特に示していない限り、量、パーセンテージ、または割合を表記する全ての数値、ならびに本明細書および特許請求の範囲で使用される他の数値は、全ての例において、既にそのように修飾されていない程度に、用語「約」によって修飾されると理解される。「約」は、記載される主題の特性に実質的に影響を及ぼさない変動の程度、例えば１０％、５％、２％、または１％以内の変動を示す。したがって、逆を示していない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲で記載される数値パラメータは、得ることが求められる所望の特性に応じて変化し得る近似値である。少なくとも、および特許請求の範囲と均等論の適用を制限する試みとしてではなく、各々の数値パラメータは、報告された有効数字を検討する、および通常の四捨五入技術を適用することによると少なくとも解釈すべきである。
【０２４５】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その」、ならびに他の用語の任意の単数形での使用は、１つの指示対象に明白かつ明確に限定されていない限り、複数の指示対象を含むことに注意されたい。本明細書に使用される場合、用語「含む」およびその文法的変形形態は、非制限的であると意図され、リストにおける項目の引用は、列挙される項目に置換または追加することができる他の類似の項目の除外ではない。用語「または」は、包括的な意味で使用され、すなわち本文がそれ以外であることを示していない限り、「および／または」と等価である。
【０２４６】
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【実施例】
【０２４７】
以下の実施例は開示した特定の実施形態を説明するために提供され、本開示の範囲を限定するものとは決して解釈すべきでない。
【０２４８】
１．ＥＢＶに対する抗体を誘発するための抗原性ＥＢＶポリペプチド
ＥＢＶに対する抗体を誘発する抗原性ポリペプチドを開発した。ＥＢＶのｇＬおよびｇＨのポリペプチドを一本鎖として呈示する自己集合性フェリチンナノ粒子を開発し、これらのナノ粒子のマウスにおける免疫原性を評価した。
【０２４９】
単量体および三量体のｇＬ／ｇＨ構築物を発現させ、精製した。図１Ａは、クーマシーおよびウエスタンブロット（抗Ｈｉｓ）解析による、Ｈｉｓタグ切断を伴いまたは伴わない一本鎖のｇＬおよびｇＨの単量体（配列番号６）を示す。図１ＢにＳｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）ＳＥＣカラム上の吸光度のトレースとして、およびクーマシーによるｇＬおよびｇＨの三量体（配列番号１１）の分画を、トロンビンプロテアーゼによるＨｉｓタグの切断を確認するためのウエスタンブロットとともに示す。配列番号６の構築物について、サンプルの最終濃度は１ｍｇ／ｍＬ、全体積は１５ｍＬ、エンドトキシンレベルは１．４８ＥＵ／ｍＬであった。
【０２５０】
一本鎖ｇＬ／ｇＨフェリチンナノ粒子（配列番号１４）を発現させ、精製した。図２Ａ〜図２Ｅは、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）６  ＳＥＣ分画（２Ａ）、ＳＥＣ分画のクーマシー（２Ｂ）、ＳＥＣ分画の抗フェリチン一次抗体によるウエスタンブロット（２Ｃ）、動的光散乱（ＤＬＳ、２Ｄ）、および電子顕微鏡（２Ｅ）による精製および特徴解析を示す。
【０２５１】
フェリチンに融合した一本鎖ＥＢＶのｇＬおよびｇＨの例示的な構築物を図３に示す。トール様受容体７／８アゴニスト（ＴＬＲ７／８ａ）等の免疫刺激性部分のためのコンジュゲート部位は、フェリチン上またはリンカー上に存在することができる（例示的な配列として例えば配列番号１４、１９、２２、２０、２３、および３３を参照）。
【０２５２】
様々なリンカーを含むｇＬ／ｇＨ三量体またはナノ粒子をマウスに注射して、免疫血清を評価した（図４）。マウスには３週の投与間隔で、２μｇの注射を２回、スクアレンエマルジョン系のアジュバントであるアジュバントＡＦ０３とともに投与した。６週目にＥＬＩＳＡによって抗ｇＬ／ｇＨ抗体エンドポイント力価を測定した。ｇＨ＿１６＿ｇＬについては、ナノ粒子（配列番号１０）が三量体構築物（配列番号１６）より優れていた。ｇＬ＿２８＿ｇＨナノ粒子（配列番１３）は、三量体構築物（配列番号１１）と顕著に異なる性能はなかった。ｇＬ＿４６＿ｇＨナノ粒子（配列番号１４）は、ｇＬ＿４６＿ｇＨ三量体（配列番号１２）より優れていた。
【０２５３】
これらのデータは、一本鎖ｇＬ／ｇＨナノ粒子がＥＢＶに対して強力な免疫応答を誘発し得ることを示している。
【０２５４】
２．ｇＬ／ｇＨおよびｇｐ２２０に対する二価の免疫
一本鎖のｇＬ／ｇＨナノ粒子およびｇｐ２２０ナノ粒子を含む組成物を用いて、二価の免疫を実施した。ｇｐ２２０ナノ粒子（配列番号１）を含ませることは、上述のようにワクチン接種したマウスの血清を用いるＥＬＩＳＡ結合アッセイによって測定して、一本鎖ｇＬ／ｇＨナノ粒子（ｇＬ−ｇＨ＿Ｃ５  ＮＰ［配列番号１９］）によって誘発された免疫応答に対して顕著な干渉効果を有しなかった（図５Ａ〜図５Ｂ、それぞれ個別の希釈および結合力価における測定を示す）。同様に、一本鎖ｇＬ／ｇＨナノ粒子と組み合わせて投与した場合、ＥＬＩＳＡによって測定して、ｇｐ２２０ナノ粒子への免疫応答に対する応答において干渉は観察されなかった（図６Ａ〜図６Ｂ、それぞれ個別の希釈および結合力価における測定を示す）。
【０２５５】
したがって、一本鎖ｇＬ／ｇＨナノ粒子およびｇｐ２２０ナノ粒子の両方による免疫は、いずれのポリペプチドに対する免疫応答も低減しなかった。
【０２５６】
３．フェリチンナノ粒子へのアジュバントのコンジュゲーション
次に、フェリチンナノ粒子へのアジュバントのコンジュゲーションを評価した。図７Ａに、その中のフェリチンが表面に露出したアミノ酸をコンジュゲーションのために利用可能なシステインに置き換える変異を含む構築物を図示する。図７Ｂは、ＰＥＧ４リンカーおよびマレイミドに連結された例示的な免疫刺激性部分（ＳＭ７／８ａ、ＴＬＲ−７／８アゴニスト）を示す。このマレイミドはフェリチンの表面に露出したシステインにリンカー（それ自体ＳＭ７／８ａに結合している）を共有結合でコンジュゲートするために用いることができる。ＳＭ７／８ａにコンジュゲートされたフェリチンに融合した一本鎖ｇＬ／ｇＨポリペプチドを含むポリペプチドを、図７Ｃの電子顕微鏡写真に示す。
【０２５７】
表面に露出したアミノ酸の変異に起因するシステインを、図８Ａのフェリチン分子の構造に図示する。ＣｐＧアジュバント（配列番号２３０）のフェリチンへのコンジュゲーションを、フェリチン、リンカー、およびＣｐＧアジュバントを並置し、互いに近接して結合する各部分のパーツを示すように配向させて、図８Ｂに図示する。
【０２５８】
ｇＬ／ｇＨナノ粒子（配列番号１９）を２ｍＭのＴＣＥＰを用いて還元し、次いで１Ｘ  ＰＢＳの添加および１００ｋＤのミクロスピンカラムを用いてＴＣＥＰを除去することによって酸化した。次いでコンジュゲーションのためにＳＭ７／８ａをｇＬ／ｇＨナノ粒子とインキュベートした。過剰なＳＭ７／８ａを１００ｋＤのミクロスピンカラムによって反応から除去した。マススペクトロメトリー（ＭＳ）データより、コンジュゲートしていないポリペプチドのスペクトル（図９Ａ）に対する主要なＭＳピークのシフトに基づいて、一本鎖ｇＬ／ｇＨおよびフェリチン（配列番号１９）を含むポリペプチドの約１００％がＳＭ７／８ａにコンジュゲートされた（図９Ｂ）ことが示された。コンジュゲートされたポリペプチドとコンジュゲートされていないポリペプチドの質量の差はＳＭ７／８ａ−リンカー−マレイミドアダクトの分子量（７１１Ｄａ）に相当する。
【０２５９】
ｇｐ２２０ナノ粒子（配列番号１）を２ｍＭのＴＣＥＰを用いて還元し、次いで１Ｘ  ＰＢＳの添加および１００ｋＤのミクロスピンカラムを用いてＴＣＥＰを除去することによって酸化した。次いでコンジュゲーションのためにＳＭ７／８ａをｇＬ／ｇＨナノ粒子とインキュベートした。過剰なＳＭ７／８ａを１００ｋＤのミクロスピンカラムによって反応から除去した。ＭＳデータより、コンジュゲートしていないポリペプチドのスペクトル（図１０Ａ）に対する主要なＭＳピークのシフトに基づいて、ｇｐ２２０およびフェリチン（配列番号１）を含むコンジュゲートされたポリペプチドの約１００％がＳＭ７／８ａにコンジュゲートされている（図１０Ｂ）ことが示された。
【０２６０】
電子顕微鏡（ＥＭ）データからも、一本鎖ｇＬ／ｇＨおよびフェリチンを含むポリペプチド（図１１Ａにおけるコンジュゲートしていないサンプルと比較した図１１Ｂ）またはｇｐ２２０およびフェリチンを含むポリペプチド（図１１Ｃにおけるコンジュゲートしていないサンプルと比較した図１１Ｄ）へのＳＭ７／８ａのコンジュゲーションがナノ粒子の集合を破壊しなかったことが確認された。
【０２６１】
一本鎖ｇＬ／ｇＨを含むナノ粒子（ｇＬ＿ｇＨ＿Ｃ５  ＮＰ、図１２Ａおよび図１２Ｂ）またはｇｐ２２０を含むナノ粒子（図１３Ａおよび図１３Ｂ）１μｇで免疫した後のＥＬＩＳＡによって抗体応答をアッセイした。ナノ粒子は裸のフェリチン１μｇと組み合わせ、ＳＭ７／８ａにコンジュゲートしたものとしないものであった。コンジュゲートしていないナノ粒子は混合したＡＦ０３アジュバントとともに、またはそれなしに投与した。それぞれのマウスは上述のナノ粒子組成物１００μＬの投与を受けた。ＡＦ０３アジュバントの投与を受けるマウスについては、体積比１：１でＡＦ０３とナノ粒子を混合した。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）を３週の投与間隔で２回免疫した。５週目にＥＬＩＳＡ解析のために血液を採取した。最も強力なＥＬＩＳＡ応答はＡＦ０３アジュバント中で投与したナノ粒子で見られた。ＳＭ７／８ａへのコンジュゲーションは、アジュバントなしのコンジュゲートしていないナノ粒子と比較してより強力なＥＬＩＳＡ応答を生じた。
【０２６２】
ＳＭ７／８ａにコンジュゲートしたｇＬ＿ｇＨ＿Ｃ５ナノ粒子およびＳＭ７／８ａにコンジュゲートしたｇｐ２２０ナノ粒子それぞれ１μｇの共投与の効果も、裸のフェリチンナノ粒子を伴ういずれかのナノ粒子の単独の投与と比較して、図１４Ａ〜図１４Ｂおよび図１５Ａ〜図１５Ｂで評価した。一本鎖ｇＬ／ｇＨ（図１４Ａ〜図１４Ｂ、それぞれＡＦ０３なしおよびあり）またはｇｐ２２０（図１５Ａ〜図１５Ｂ、それぞれＡＦ０３なしおよびあり）のいずれに対する免疫応答に対しても干渉は観察されなかった。
【０２６３】
４．長期免疫原性の検討
一本鎖ｇＬ／ｇＨ（ｇＬ／ｇＨ＿Ｃ５、配列番号１９）を含むナノ粒子を投与した３か月後の免疫原性を評価する検討を実施した。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）を３週の投与間隔で２回免疫した。裸のフェリチン（すなわち、いずれのポリペプチドまたはアジュバントにもコンジュゲートしていないフェリチン）１μｇを一本鎖ｇＬ／ｇＨを含むナノ粒子１μｇと投与し、ナノ粒子は混合したＡＦ０３アジュバントの存在下または非存在下に処方した。１３週目にＥＬＩＳＡ解析のために血液を採取した。ＡＦ０３アジュバントの投与を受けるマウスについては、体積比１：１でＡＦ０３とナノ粒子組成物を混合した。それぞれのマウスは上述のナノ粒子組成物１００μＬの投与を受けた。数匹のマウスはその中のフェリチンがＳＭ７／８ａにコンジュゲートされた一本鎖のｇＬ／ｇＨを含むナノ粒子の投与を受けた（図１６〜図１７における「７／８ａ」）。
【０２６４】
図１６に示すように、ＳＭ７／８ａにコンジュゲートした一本鎖ｇＬ／ｇＨを含むナノ粒子は、ＡＦ０３中で処方すると最大の免疫応答を生じた。これらのナノ粒子についても、ＡＦ０３がない場合でも強力な免疫応答が見られた。
【０２６５】
一本鎖ｇＬ／ｇＨを含むナノ粒子の代わりにｇｐ２２０ナノ粒子（配列番号１）（ＳＭ７／８ａへのコンジュゲーションありまたはなし）を用いて並行実験を実施した。これらのナノ粒子についても同様の結果が見られ、混合したＡＦ０３を含む処方は最も強力な応答を生じ、これらのナノ粒子についても、ＡＦ０３がない場合でも強力な免疫応答が見られた（図１７）。
【０２６６】
一本鎖ｇＬ／ｇＨを含むナノ粒子（ｇＬ／ｇＨ＿Ｃ５、配列番号１９）およびｇｐ２２０を含むナノ粒子（配列番号１）を含む二価の組成物によって誘発される免疫応答を評価した。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）を３週の投与間隔で免疫した。各ナノ粒子１μｇを含むナノ粒子組成物１００μＬを投与した。ＡＦ０３アジュバントの投与を受けるマウスについては、体積比１：１でＡＦ０３とワクチンを混合した。最終の１３週目にＥＬＩＳＡ解析のために血液を採取した。一本鎖ｇＬ／ｇＨ（図１８）およびｇｐ２２０（図１９）に対する免疫応答については、いずれかのナノ粒子を裸のフェリチンと組み合わせて投与した場合と比較して、組み合わせたナノ粒子の投与による干渉は見られなかった。
【０２６７】
ｇＬ／ｇＨ＿Ｃ５ナノ粒子（配列番号１９）を用いたさらなる実験により、ナノ粒子をＳＭ７／８ａにコンジュゲートした場合（７／８ａ）、またはナノ粒子をＡＦ０３中で処方した場合（図２１）に長期の免疫応答が見られることが確認された。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）を３週の投与間隔で免疫した。ナノ粒子１μｇを含むナノ粒子組成物１００μＬを投与した。ＡＦ０３アジュバントの投与を受けるマウスについては、体積比１：１でＡＦ０３とワクチンを混合した。２週（プライム）、５週（ブースト）、および１３週（最終）でＥＬＩＳＡ解析のために血液を採取した。ｇｐ２２０ナノ粒子（配列番号１）を用いて並行実験を実施し、ｇｐ２２０ナノ粒子についても同様の長期応答が見られた（図２２）。
【０２６８】
一本鎖ｇＬ／ｇＨを含む様々なナノ粒子（ｇＬ＿ｇＨ−Ｃ７、配列番号２０）も評価した。ｇＬ＿ｇＨ＿Ｃ７構築物は、ｇＨポリペプチドと、免疫刺激性部分のためのコンジュゲーション部位としてのシステインを含むフェリチンとの間の可撓性のリンカーを含む。リンカーは表面に露出したシステインを含まないフェリチンとともに用いてもよい（配列番号２０に示すように）。ＳＭ７／８ａは２ｍＭのＴＣＥＰを用いてこのタンパク質を還元し、次いで１Ｘ  ＰＢＳの添加および１００ｋＤのミクロスピンカラムを用いてＴＣＥＰを除去することによって酸化して、ｇＬ＿ｇＨ＿Ｃ７にコンジュゲートした。次いでＳＭ７／８ａをｇＬ／ｇＨナノ粒子とともにインキュベートした。コンジュゲートの後、過剰なＳＭ７／８ａを１００ｋＤのミクロスピンカラムによって反応から除去した。
【０２６９】
７／８ａにコンジュゲートしまたはコンジュゲートしていないこれらのｇＬ／ｇＨナノ粒子１μｇおよび裸のフェリチン１μｇをマウスに投与した。ナノ粒子１μｇを含むナノ粒子組成物１００μＬを投与した。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）を３週の投与間隔で免疫した。ＡＦ０３アジュバントの投与を受けるマウスについては、体積比１：１でＡＦ０３とナノ粒子組成物を混合した。２週（プライム）、５週（ブースター）、および１３週（最終）でＥＬＩＳＡ解析のために血液を採取した。これらのナノ粒子は、プライム採血におけるＥＬＩＳＡエンドポイント力価によって測定して、ＡＦ０３中で処方した場合またはＳＭ７／８ａにコンジュゲートした場合に、免疫応答を誘発した（図２０Ａ）。ブースター採血（図２０Ｃ）または最終採血（図２０Ｄ）のサンプルで同様の結果が見られた。これらのナノ粒子をＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドにもコンジュゲートし、同様にして投与した。ＣｐＧコンジュゲートについての結果は５週においてコンジュゲートしていないナノ粒子と同様であった（図２０Ｂ）。
【０２７０】
５．トリコプルシア・ニイ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）フェリチンを含むナノ粒子の特徴解析
トリコプルシア・ニイフェリチンならびにｇｐ２２０および／またはｇＬ／ｇＨポリペプチドを含むナノ粒子も開発した。トリコプルシア・ニイフェリチンナノ粒子は１：１の比で自己集合した重鎖および軽鎖を含む。軽鎖を有する１つの非フェリチンポリペプチドと重鎖上の別の非フェリチンポリペプチドとを組み合わせることにより、個別のナノ粒子の表面上に２つの異なったポリペプチドを提示することができることが見出された。したがって、例えば自己集合したトリコプルシア・ニイフェリチンナノ粒子は、ｇｐ２２０とｇＬ／ｇＨの両方を提示することができた。
【０２７１】
トリコプルシア・ニイフェリチンナノ粒子は、ｇｐ２２０（配列番号２４）または一本鎖ｇＬ／ｇＨ（配列番号２５）に融合した重鎖およびｇｐ２２０（配列番号２６）または一本鎖ｇＬ／ｇＨ（配列番号２７）に融合した軽鎖を用いて生成し精製した（構築物を図２３Ｂに図示し、クーマシーゲル染色によって図２３Ａに可視化している。軽鎖および重鎖の単独と比較して予想される分子量の増大を示す）。それぞれｇＬ／ｇＨおよびｇｐ２２０に融合した軽鎖および重鎖またはその逆の組合せによって、２つの異なるＥＢＶポリペプチドを提示することができる個別の多価ナノ粒子が産生された。
【０２７２】
重鎖と軽鎖の両方にｇｐ２２０のみを含むもの（図２４Ｅに示す）または重鎖にｇｐ２２０、軽鎖にｇＨ＿ｇＬを含むもの（図２５Ｅに示す）の２つのＴ．ニイフェリチンナノ粒子も生成した。精製は２つの工程に従った。最初の精製工程はイオン交換クロマトグラフィー工程であった（Ｑカラム、図２４Ａおよびクーマシー結果の図２４Ｃ、ならびに図２４Ａおよびクーマシー結果の図２５Ｃを参照）。この工程に続いてサイズ排除クロマトグラフィーを行った（図２４Ｂおよびクーマシー結果の図２４Ｄ、ならびに図２５Ｂおよびクーマシー結果の図２５Ｄを参照）。
【０２７３】
ｇｐ２２０に融合したトリコプルシア・ニイ軽鎖および重鎖を含むナノ粒子（配列番号２４および２６、図２６Ｂに図示）は、クーマシー染色（図２６Ａ）、裸のＴ．ニイフェリチン（図２７Ｃ）と比較したＤＬＳ半径の増大（図２６Ｄ）、および裸のナノ粒子と比較してナノ粒子のコアの周囲にさらに末梢の密度が現れたＥＭ解析（図２６Ｃ）に基づいて、異種のｇｐ２２０ポリペプチドを含むナノ粒子の形成と符合するプロファイルを示した（図２７Ｂ）。配列番号２４および２７についても、ナノ粒子中の異種のｇＬ／ｇＨおよびｇｐ２２０ポリペプチドの存在を示す同様の結果が見られた（トリコプルシア・ニイのｇＬ／ｇＨポリペプチドを含む軽鎖およびｇｐ２２０ポリペプチドを含む重鎖、それぞれクーマシー染色による可視化、構築物の図示、電子顕微鏡写真、およびＤＬＳによる特徴解析について図２６Ｅ〜図２６Ｈを参照）。比較のため、図２７Ａ〜図２７Ｃに裸の（すなわち、いずれのポリペプチドにもコンジュゲートしていない）Ｔ．ニイフェリチンについてのクーマシー染色（図２７Ａ）、ＤＬＳ半径（図２７Ｂ）、およびＥＭ解析（図２７Ｃ）を示す。
【０２７４】
したがって、Ｔ．ニイフェリチンを用いることにより、個別のナノ粒子の上に２つのポリペプチドを提示することが可能になる。
【０２７５】
６．ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２構築物
フェリチンに融合したｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２の一本鎖構築物の概略図を（配列番号２２７〜２３１および２４１〜２４２のそれぞれにおいて）図３５Ａに示す。各タンパク質の間の融合は、可撓性のアミノ酸リンカーまたは硬いアミノ酸リンカーを介している。一本鎖ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２分子は、ナノ粒子上で１：１：１の比のヘテロ三量体を形成する。
【０２７６】
ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２  Ｈｉｓタグ付け融合（配列番号２２６）の結晶構造が解明され、一本鎖ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２は、天然に見出される野生型のｇＨ、ｇＬ、およびｇｐ４２タンパク質と同様のヘテロ三量体コンフォメーションをとり得ることが示された（図３４および図３５Ｂ）。図３４および図３５Ｂにおいて、Ｇｐ４２（図３４では暗灰色矢印を示す）はｇＨ／ｇＬヘテロ二量体と相互作用する。図３５Ｃは、フェリチンに融合したこの一本鎖ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２ヘテロ三量体がナノ粒子上にどのように呈示されるかのモデルである。単一のナノ粒子の上に呈示される一本鎖ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２の２４個のコピーが存在する。
【０２７７】
ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２  ＮＰ構築物（配列番号２２７）を２９３ｅｘｐｉ細胞に発現させて精製した（図２８Ａ）。ＣＨＯプールから精製したｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２  ＮＰは、約２６．２ｎｍの動的光散乱半径を有していた（図２８Ｂ）。
【０２７８】
一価（ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２  ＮＰ＋裸のフェリチンナノ粒子）または二価（ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２  ＮＰ＋ｇｐ２２０  ＮＰ）の組成物によって誘発された免疫応答を評価した。ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２  ＮＰは配列番号２２７の配列を有し、ｇｐ２２０  ＮＰは配列番号１の配列を有していた。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）を３週の投与間隔で免疫した。各ナノ粒子１μｇを含むナノ粒子組成物１００μＬをＡＦ０３アジュバント（１：１の体積比でＡＦ０３をワクチンと混合）とともに投与した。ブーストは２回目の免疫の５週後に血清を採取したことを示す。５週でマウスから採取した血清を用いて、Ｂ細胞中（図２９Ａ）および上皮細胞中（図２９Ｂ）におけるＥＢＶウイルス中和アッセイ解析を行った。一価形（裸のフェリチンとｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２）の投与と比較して、二価処方のナノ粒子の投与による干渉は見られなかった。
【０２７９】
アジュバントＡＦ０３の存在下の一本鎖ｇＬ／ｇＨ／ナノ粒子（ｇＬ＿ｇＨ＿Ｃ１３７Ａ＿ｂｆｐ  Ｆｅｒｒナノ粒子Ｎ１９Ｑ／Ｃ３１Ｓ／Ｓ１１１Ｃ［配列番号２２］）およびｇｐ２２０ナノ粒子（配列番号１）（図３０Ａ〜図３０Ｂ）またはアジュバントＡＦ０３の存在下のｇＬ／ｇＨ／ｇｐ４２  ＮＰ（配列番号２２７）およびｇｐ２２０ナノ粒子（配列番号１）（図３０Ｃ〜図３０Ｅ）を含む組成物を用いてフェレットの二価免疫を実施した。Ｉｎｊ．１＝注射１（Ｉｎｊ．１の２週後に６匹のフェレットから血清を採取）。Ｉｎｊ．２＝注射２（Ｉｎｊ．２の２週後に６匹のフェレットから血清を採取）。図３０Ａ〜図３０Ｅ、図３０Ｆ〜図３０Ｇに示す抗原に対するＥＬＩＳＡ結合アッセイで測定したエンドポイント結合力価は、アジュバントＡＦ０３の存在下のｇＬ／ｇＨ／ｇｐ４２  ＮＰ（配列番号２２７）およびｇｐ２２０ナノ粒子（配列番号１）の二価ワクチン接種を受けたフェレットの血清の（それぞれＢ細胞および上皮細胞における）ＥＢＶウイルス中和アッセイを示す。プライム＝Ｉｎｊ．１、ブースト＝Ｉｎｊ．２。
【０２８０】
ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２  ＮＰ＿Ｃ１２（配列番号２２８）を発現して、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６サイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した（図３１Ａ）。図３１Ａのサンプルの動的光散乱解析により、２０．６ｎｍの粒子半径が示された（図３１Ｂ）。
【０２８１】
ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２  ＮＰ＿Ｃ１３（配列番号２２９）を発現して、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６サイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した（図３２Ａ）。図３２Ａのサンプルの動的光散乱解析により、１７．１ｎｍの粒子半径が示された（図３２Ｂ）。
【０２８２】
ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２  ＮＰ＿Ｃ１４（配列番号２３０）を発現して、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６サイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した（図３３Ａ）。図３３Ａのサンプルの動的光散乱解析により、１６．９ｎｍの粒子半径が示された（図３３Ｂ）。
【０２８３】
図３５Ｄに、２９３Ｅｘｐｉ細胞中で発現した後の配列番号２２７の精製を示す。変性ＳＤＳクーマシーゲルにより、フェリチンに融合したｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２がグリコシル化により１５０ｋＤを超えることが示される。精製した生成物の陰性染色電子顕微鏡解析により、フェリチンに融合した一本鎖ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２がナノ粒子を形成することに成功し、表面上にｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２抗原を呈示することが示される（図３５Ｅ）。０日、３日、７日、または１４日における温度、酸化、および／または脱アミド化のストレス試験により、配列番号２２７の一本鎖ｇＨ／ｇＬ／ｇｐ４２ナノ粒子の配列解析またはマススペクトロメトリーから潜在的な不安定配列が同定された。ワクチンの安定性を改善するため、様々な組合せ、特に表１に列挙した部位において、このワクチン構築物の発現および／または免疫原性、保存的なアミノ酸置換変異を配列番号２２７に加えることになる。特定の遺伝子のそれぞれの場所における保存的なアミノ酸置換は、ｇｐ４２のＣ末端をフェリチン配列のＮ末端と融合するリンカー配列のみが配列番号２２７と異なる配列番号２２８〜２３０においても試験することになる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２４−３】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２５−３】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２６−３】
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【図２６−４】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【図３０−３】
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【図３０−４】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３４】
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【図３５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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