(57)【要約】  本発明は、酵母抽出物を含む糖尿改善または抗酸化用の組成物と、前記酵母抽出物の製造方法に関するものである。
2021529183.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母を培養した後で得られた培養物を遠心分離して菌体含有物質と培養液にそれぞれ分離し；
前記菌体含有物質を溶解させて菌体ライセートを生産し、前記菌体ライセートおよび／または前記培養液を有機溶媒で抽出して菌体ライセートの抽出物および／または培養液抽出物を生産するか、
前記菌体含有物質または前記培養液にそれぞれ有機溶媒を添加し、前記菌体含有物質を溶解させて菌体ライセートの抽出物および／または培養液抽出物を生産し；且つ、
前記抽出物を濃縮及び乾燥することを含む、糖尿改善用または抗酸化用酵母抽出物を製造する方法。
【請求項２】
前記有機溶媒は、ブタノール、クロロホルム、アセトン、エタノール、エチルアセテート、またはヘキサンのいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記培養は、２０℃ないし４０℃の温度で１２時間ないし７日間実施することを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
前記酵母は、サッカロマイセス・セルバジまたはサッカロマイセス・セレビシエであることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
前記サッカロマイセス・セルバジはＫＣＣＭ１２１５７Ｐで受託したサッカロマイセス・セルバジＣｅｂ−ｋｃ−０１１であることを特徴とする、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
請求項１に記載の製造方法で製造された酵母抽出物を含む、糖尿改善用または抗酸化用の組成物。
【請求項７】
組成物の固形重量を基準に、前記酵母抽出物が１重量％ないし７０重量％で含まれることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物は、医薬または食品組成物であることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
酵母の菌体ライセートまたは酵母の培養液の有機溶媒抽出物を含む、糖尿改善用または抗酸化用の組成物。
【請求項１０】
前記有機溶媒は、ブタノール、クロロホルム、アセトン、エタノール、エチルアセテートまたはヘキサンのいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記酵母は、サッカロマイセス・セルバジまたはサッカロマイセス・セレビシエであることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
受託番号ＫＣＣＭ１２１５７Ｐで受託されたサッカロマイセス・セルバジＣｅｂ−ｋｃ−０１１、またはその培養液、またはその菌体ライセート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母抽出物を含む糖尿改善または抗酸化用の組成物、前記酵母抽出物の製造方法、または、糖尿改善方法ないし抗酸化方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
最近、癌、糖尿病、高血圧、心臓病、心血管系疾患などの慢性疾患の有病割合が増加し、これに対する予防と治療の目的で有益な菌株とその生理活性物質を用いた研究が進められている。現代人の酸化的ストレスの原因である活性酸素種やフリーラジカルは体内において人間の代謝過程中で継続的に発生し、また、不安定で反応性が高く、他の生体内物質と反応しやすくなる。これらは体内の高分子を攻撃して細胞膜を分解し、タンパク質の合成を抑制して突然変異、細胞毒性および癌などを誘発する。
【０００３】
生理活性物質（ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）は体内に入ると、酸化を抑制する作用によって、糖尿病や癌などを予防する機能があると知られている。したがって、現代人にとって、酸化的ストレスを軽減し、副作用がなく、抗酸化活性が優れた天然抗酸化剤の開発が必要である。
【０００４】
また、慢性疾患である糖尿病は、１９７０年代の有病割合が人口の１％未満であったが、２００１年以降は３０歳以上の有病割合が１０人に１人の１０％水準まで増加しており、韓国の死亡原因の５位に該当する。特に網膜症、白内障などの合併症を誘発するため、糖尿病の治療は炭水化物の消化と吸収を遅くして、食後の血糖値を低下させながら合併症を防ぐことができなければならない。現在アカルボースとボグリボース（ｖｏｇｌｉｂｏｓｅ）などα−グルコシダーゼ阻害剤のような血糖降下剤は、耐性と体重増加、浮腫、悪心、消化器障害などの副作用が懸念され、天然物質を対象とした血糖値改善剤の開発が求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の一つの目的は、酵母を利用して、副作用なしに血糖値を低下または調節することと、抗酸化機能を有する酵母抽出物又はこれを含む組成物を提供することである。
【０００６】
本発明の他の一つの目的は、抗酸化または抗糖尿活性を有する酵母抽出物の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一実施形態は、
酵母を培養した後に得られた培養物を遠心分離して菌体含有物質と培養液にそれぞれ分離し；
前記菌体含有物質を溶解させて菌体ライセートを生産し、前記菌体ライセートおよび／または前記培養液を有機溶媒で抽出して菌体ライセートの抽出物および／または培養液の抽出物を生産するか、
前記菌体含有物質または前記培養液にそれぞれ有機溶媒を添加して前記菌体含有物質を溶解させて菌体ライセートの抽出物、および／または、培養液の抽出物を生産し；且つ、
前記抽出物を濃縮と乾燥することを含む、糖尿改善用または抗酸化用の酵母抽出物を製造する方法に関するものである。
【０００８】
酵母は、ビール、ワイン、マッコリなどを製造するために用いられる微生物であって、カビやキノコの種類であるが、菌糸がなく光合成能や運動性のない単細胞生物の総称である。本明細書では、酵母としてサッカロマイセス属の微生物を用いることができ、具体的にサッカロマイセス・セルバジ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｅｒｖａｚｚｉｉ）やサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を利用することができるが、これらに限定されることではない。一実施例において、サッカロマイセス・セルバジのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｅｒｖａｚｚｉｉ  ＫＣＣＭ１２１５７Ｐの菌株を利用することができる。前記菌株は、韓国の伝統食品であるキムチから分離されたものであり、血糖低下や抗酸化に効果がある。
【０００９】
酵母培養の培地として、天然培地または合成培地を利用することができる。培地の炭素源としては、例えば、グルコース、スクロース、デキストリン、デキストロース、グリセロール、でんぷんなどを利用し、窒素源としては、ペプトン、肉抽出物、全脂粉乳、酵母抽出物、乾燥した酵母、大豆、アンモニウム塩、ナイトレートおよびその他の有機または無機窒素含有化合物を利用することができるが、これらの成分に限定されることではない。培地に含まれる無機塩としては、マグネシウム、マンガン、カルシウム、鉄、カリウムなどを利用するが、これらに限定されることではない。前記炭素源、窒素源、無機塩の成分に加えて、アミノ酸、ビタミン、核酸、およびそれに関連した化合物を培地に添加することができる。酵母菌株の培養温度条件は、２０℃ないし４０℃の温度範囲、具体的には、２１℃ないし３０℃で１２時間ないし７日間、例えば１２時間ないし３日間培養する。一実施例において、培養培地にガシオガピ、グアバ、コガネバナ（黄金花）、キハダ（黄柏）、クチナシ（梔）、ゴミシ（五味子）、オウレン（黄連）、アマドコロ（玉竹）などの生薬製剤、その抽出物、またはそれらの混合物を添加して培養し、前記培養物を使用して本菌株による血糖低下、血糖調節または抗酸化の効果をもっと向上させることができる。特に、培養培地にガシオガピまたはコガネバナを添加することが好ましく、その添加量は、それぞれの培地重量を基準に０．０１重量％ないし１０重量％、具体的には、０．０１重量％ないし５重量％程度が良い。
【００１０】
その後、前記培養培地で培養された菌体を遠心分離して、菌体含有物質と培養液にそれぞれ分離することができる。培養液は、遠心分離後に菌体含有物質を除いた培養上澄み液である。菌体含有物質は菌体を含み、培養上澄み液を除去するか、その後に残留物を濃縮した菌体含有成分である。前記培養液または菌体含有物質の組成は、通常の酵母の培養に必要な成分だけではなく、酵母の生長で相乗的に作用する成分をさらに含むことができ、これによる組成物は、当業界における通常の技術を有する者によって容易に選択することができる。
【００１１】
前記菌体含有物質に有機溶媒を添加し、菌体含有物質を溶解させて菌体ライセートを製造する。前記溶解は菌体内に含まれた成分を抽出するためのものであり、例えば機械的な方法を利用することができる。例えば、高圧で回転刃を用いて均質化する方法、攪拌ミルで破砕する方法、狭い穴を通して試料を高圧圧着する方法、または超音波ホモジナイザーを適用する方法などがあり、具体的には、超音波ホモジナイザーを適用する。
【００１２】
または、前記菌体含有物質をまず、例えば、機械的な方法で溶解させて菌体ライセートを生産し、その後これを有機溶媒で抽出して抽出物を製造する。
【００１３】
前記抽出に使用できる有機溶媒は、エタノール、ブタノール、クロロホルム、アセトン、ヘキサンまたはエチルアセテートなどを利用することができるが、血糖低下の観点からエタノール、ヘキサンまたはエチルアセテート、特にヘキサンまたはエチルアセテートを抽出溶媒として使用することが良く、抗酸化の観点からはヘキサン、エチルアセテート、またはエタノールを抽出溶媒として使用するのが良い。有機溶媒の濃度は、３０重量％ないし８０重量％の濃度の溶媒を使用するが、具体的に４０重量％ないし７０重量％の濃度で使用する。前記菌体ライセートまたは培養液をそれぞれ有機溶媒で抽出するか、これを混合して一緒に有機溶媒で抽出しても良い。
【００１４】
抽出時間と抽出温度は設計条件によって異なり、具体的には、２０℃ないし５０℃の範囲の温度で１時間ないし１２時間、より具体的には２５℃ないし４０℃の範囲、または２５℃ないし３０℃の範囲の温度で１時間ないし６時間である。菌体ライセートまたは培養液中における有効物質の熱変性などを防止することができる側面から、前記抽出温度で抽出することが好ましい。
【００１５】
前記抽出物を任意にろ過することができ、ろ過方法としては、沈降法、膜分離法、遠心分離法、分別蒸留法、分配法などがあり、例えば、ろ紙を用いてろ過する。
【００１６】
次に、前記菌体ライセートまたは培養液の抽出物を濃縮及び乾燥して酵母抽出物を得る。濃縮方法は、蒸発濃縮法、冷凍濃縮法、膜濃縮法、または乾燥濃縮法などがあり、具体的には、回転式蒸発器を用いて減圧濃縮することができる。乾燥は通風乾燥、自然乾燥、噴霧乾燥、および凍結乾燥が可能であるが、これらに限定されることではなく、具体的には、凍結乾燥することができる。
【００１７】
本発明の別の実施形態は、本出願に記述の方法で製造された酵母抽出物を含む糖尿改善、血糖低下、または抗酸化用の組成物に関するものである。
【００１８】
酵母抽出物は、本明細書に記述された菌体ライセートの有機溶媒抽出物、および／または培養液の有機溶媒による抽出物を意味する。利用できる酵母の種類、有機溶媒と抽出方法は、前述した実施態様で記述したことと同様である。前記組成物は、血糖低下、糖尿予防、血糖値の調節、または抗酸化のための食品組成物または医薬組成物であり得る。本出願の組成物は、抗酸化活性のために、癌、炎症、貧血、心筋梗塞、動脈硬化症、糖尿病、脳性麻痺、関節炎（例えば、リウマチ性関節炎）、パーキンソン病、または自己免疫疾患の治療に有用であることができる。食品組成物の一実施形態では、食品、健康食品、健康補助食品、または健康機能性の食品組成物であり得る。医薬組成物の一実施形態では、医薬部外品または医薬製剤であり得る。
【００１９】
一実施例において、前記組成物は、ガシオガピ、グアバ、コガネバナ（黄金花）、キハダ（黄柏）、クチナシ（梔）、ゴミシ（五味子）、オウレン（黄連）、アマドコロ（玉竹）などの生薬製剤、その抽出物、またはそれらの混合物などの抗糖尿または抗酸化効果がある成分をさらに含むことができる。
【００２０】
本発明の組成物は、組成物の固形重量を基準に、１重量％〜７０重量％、具体的に５重量％〜６０重量％の酵母抽出物を含む。
【００２１】
酵母抽出物は、液状状態または乾燥状態であり、具体的には、乾燥された粉末状態であり得る。
【００２２】
一実施例において、組成物は薬学的にあるいは食品学的に許容可能な担体をさらに含むことができ、担体と共に製剤化されて食品または医薬品として提供することができる。
【００２３】
本発明において「薬学的にあるいは食品学的に許容可能な担体」という用語は、生物体を刺激せずに活性物質の生物学的活性及び特性を阻害しない担体または希釈剤を称する。
【００２４】
前記組成物は、経口または非経口の様々な剤形で製剤化するが、好ましくは液状の経口溶液で剤形化する。
【００２５】
液状溶液で製剤化される場合、許容される薬剤学的あるいは食品学的許容担体は、滅菌および生体に適したものであり、食塩水、滅菌水、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、およびこれらの成分中の１成分以上を混合して使用することができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、潤滑油を付加的に添加し、水溶液、懸濁液、乳濁液などの液状剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤で製剤化することができる。また、組成物の品質低下を防止するために結着剤、乳化剤、保存剤などをさらに添加することができ、または、アミノ酸剤、ビタミン剤、酵素剤、香味剤、非タンパク質態窒素化合物、ケイ酸塩剤、緩衝剤、抽出剤、オリゴ糖などをさらに含ませることができる。
【００２６】
本発明の組成物を含む製剤は、例えば、錠剤、トローチ剤（ｔｒｏｃｈｅｓ）、ローゼンジ（ｌｏｚｅｎｇｅ）、水溶性または油性懸濁液、粗製粉末または顆粒、エマルジョン、ハードまたはソフトカプセル、シロップまたはエリキシル剤などがある。錠剤およびカプセルなどの剤形で製剤化するために、ラクトース、サッカロース（Ｓａｃｃｈａｒｏｓｅ）、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アミロペクチン、セルロースまたはゼラチンなどの結合剤、ジカルシウムホスフェートなどの賦形剤、トウモロコシ澱粉またはサツマイモ澱粉などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリルフマル酸ナトリウムまたはポリエチレングリコールワックスなどの潤滑剤を含むことができ、カプセル剤形の場合は前記物質の他にも脂肪油などの液体担体をさらに含むことができる。
【００２７】
前記組成物または前記酵母抽出物の１日投与量は、対象の体重、年齢、性別、健康状態、治療、予防、または改善しようとする主な症状、投与時間、投与方法、重症度に応じて異なるが、約０．０００１ｍｇ／ｋｇないし約１０ｇ／ｋｇ、具体的には、約０．０１ｍｇ／ｋｇないし約５００ｍｇ／ｋｇであり、一日１回ないし６回、例えば、一日１回ないし４回を投与、あるいは適用する。
【００２８】
本発明におけるさらに他の一実施例は、本出願に記述の方法によって製造された酵母抽出物の治療的または予防的有効量を、糖尿予防または治療、または抗酸化のために対象体に投与することを含む、糖尿改善、予防または治療方法、あるいは抗酸化方法に関するものである。前記治療的または予防的有効量は、前述したように、対象体の体重、年齢、性別、健康状態、治療、予防、または改善しようとする主な症状、投与時間、投与方法、重症度に応じて異なるが、１日約０．０００１ｍｇ／ｋｇないし約１０ｇ／ｋｇ、具体的には、約０．０１ｍｇ／ｋｇないし約５００ｍｇ／ｋｇであり、一日１回ないし６回、例えば、一日１回ないし４回を投与、あるいは適用する。
【００２９】
本発明におけるさらに他の一実施例は、ＫＣＣＭ１２１５７Ｐで受託されたサッカロマイセス・セルバジＣｅｂ−ｋｃ−０１１菌株またはその培養物、その菌体ライセート、その濃縮液またはその乾燥物、またはその抽出物を含む、糖尿予防または治療用、あるいは抗酸化用組成物に関するものである。前記抗酸化は、例えば、癌、老化、炎症、貧血、心筋梗塞、動脈硬化症、糖尿病、脳性麻痺、関節炎（例えば、リウマチ性関節炎）、パーキンソン病、または自己免疫疾患などの治療活性を示すことができる。
【発明の効果】
【００３０】
本発明の方法で製造した酵母抽出物は、α−グルコシダーゼの阻害能力に優れて、副作用が少なく安全であり、糖尿病の予防および／または治療に活用価値が高い。
【００３１】
また、抗酸化効能が優秀であるため、抗酸化剤および活性酸素が過剰に蓄積されて誘発される疾患の予防または治療で有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明の一実施例に係る方法で抽出された菌体ライセートまたは培養液の各抽出溶媒によるα−グルコシダーゼ阻害能の結果をアカルボース（Ａｃａｒｂｏｓｅ；α−グルコシダーゼ阻害剤）と比較した結果である。
【図２】本発明の一実施例に係る方法で抽出された菌体ライセートまたは培養液の各抽出溶媒による、ラットの血糖変化に対する影響を示すグラフ（図２ａ：一般ＳＤ−ｒａｔ、図２ｂ：糖尿誘発ＳＤ−ｒａｔ）である（ここで、ＣＦＰ：菌体ライセート（リン酸緩衝液）、ＣＦＥ：菌体ライセート（エタノール）、ＣＦＥＡ：菌体ライセート（エチルアセテート）、ＳＰＭ：培養液、ＳＰＥ：培養液（エタノール）、ＳＰＥＡ：培養液（エチルアセテート）を意味する）。
【図３】本発明の一実施例に係る方法で抽出された菌体ライセートまたは培養液の各抽出溶媒による抗酸化能を、抗酸化剤であるアスコルビン酸に比べて、フリーラジカル消去の検査結果を比較したグラフである。
【図４】本発明の一実施例に係る方法で抽出された菌体ライセートまたは培養液の各抽出溶媒による抗酸化能を、抗酸化剤であるアスコルビン酸に比べて、ラジカルカチオン消色の実験結果を比較したグラフある。
【図５】本発明の一実施例に係る方法で抽出された菌体ライセートまたは培養液の各抽出溶媒による抗酸化能を、抗酸化剤であるアスコルビン酸に比べて、還元力の結果を比較したグラフである。
【図６】本発明の一実施例に係る方法で抽出された菌体ライセートまたは培養液の各抽出溶媒によるα−グルコシダーゼ阻害能の結果をアカルボース（Ａｃａｒｂｏｓｅ；α−グルコシダーゼ阻害剤）と比較した結果である。
【図７】本発明の一実施例に係る方法で抽出された菌体ライセートまたは培養液の各抽出溶媒による抗酸化能を、抗酸化剤であるアスコルビン酸に比べて、フリーラジカル消去の検査結果を比較したグラフである。
【図８】本発明の一実施例に係る方法で抽出された菌体ライセートまたは培養液の各抽出溶媒による抗酸化能を、抗酸化剤であるアスコルビン酸に比べて、ラジカルカチオン退色の実験結果として比較したグラフある。
【図９】本発明の一実施例に係る方法で抽出された菌体ライセートまたは培養液の各抽出溶媒による抗酸化能を、抗酸化剤であるアスコルビン酸に比べて、還元力の結果を比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されない。
【００３４】
実施例１：酵母抽出物１の製造
（１）試料の確保と菌株の分離
韓国の伝統食品であるキムチを採取し、確保された試料を段階希釈して１％塩化ナトリウムが添加されたＹＰＤ（イーストエクストラクト  ペプトン  デキストロース）に塗抹した後、３７℃の条件で２４時間培養した。前記試料から優占した菌株を分離した。選別されたコロニーは、３回にわたって新しい培地に移し培養する方法で純粋分離し、純粋培養された菌を２０％グリセロールが添加された培地に入れて零下７０℃以下で保存した。
【００３５】
（２）分類学的特性の調査
前記分離された菌株の同定において、分類学的特性を分析するために１８ｓ  ｒＲＮＡ  ｐａｒｔｉａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇにより分析を実施し、その結果、配列番号１の塩基配列を有し、当該分離菌株はサッカロマイセス・セルバジ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｅｒｖａｚｚｉｉ）と９９％の相同性を有することが確認された。
【００３６】
そこで、本発明者らは、新規分離したサッカロマイセス・セルバジＣｅｂ−ｋｃ−０１１を２０１７年１１月１０日、韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、ソウル特別市西大門区弘済−２街−ギル１２０−８６１）に受託番号ＫＣＣＭ１２１５７Ｐで寄託した。
【００３７】
前記菌株を凍結乾燥して菌株粉末を製造した。
【００３８】
（３）酵母抽出物１の製造
サッカロマイセス・セルバジＣｅｂ−ｋｃ−０１１の培養物を、以下のような方法で製造した：
精製水１００リットルにデキストロース  ２ｋｇ、全脂粉乳１．５ｋｇ、ペプトン０．１ｋｇ、市販の酵母抽出液０．１ｋｇをそれぞれ添加した後、１２１℃で１５〜３０分間高温・高圧滅菌し、３５℃前後で冷却した後、サッカロマイセス・セルバジＣｅｂ−ｋｃ−０１１を無菌状態で０．２〜０．４リットル接種した後に３５℃前後で空気を供給し、２〜３日間培養して、サッカロマイセス・セルバジＣｅｂ−ｋｃ−０１１の培養物を得た。
【００３９】
その後、前記培養物を遠心分離して菌体含有物質と培養液にそれぞれ分離し、前記菌体含有物質と培養液にそれぞれ同量のエタノール、ヘキサン、エチルアセテートの有機溶媒を加えた後、超音波破砕で２５〜３０℃の温度を維持しながら２時間抽出し、各抽出溶媒にから１０ｍｇ／ｇ〜２００ｍｇ／ｇ（乾燥重量）の有機溶媒抽出物を生産した。
【００４０】
前記菌体または培養液の有機溶媒抽出物は、４５℃で減圧濃縮した後、凍結乾燥して菌体抽出物（セルフリー）と培養液抽出物（上清）である酵母抽出物１を製造した。
【００４１】
実施例２：酵母抽出物２の製造
酵母菌株としてサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌株を使用したことを除いて、前記実施例１（３）と同様の方法で実施して菌体抽出物と培養液抽出物の酵母抽出物２を製造した。
【００４２】
実施例３：α−グルコシダーゼ抑制活性の評価
前記実施例１と実施例２で製造された酵母抽出物１および２について、それぞれ以下の方法でα−グルコシダーゼ抑制活性を評価した：
酵母抽出物１および２を所定濃度で希釈し、２０、４０、８０または１００ｍｇ／ｍｌの酵母抽出物２０μｌ、緩衝溶液（０．１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ７．０）４０μｌ、基質（５ｍＭ  ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシド、ｐＨ７．０）２０μｌと１．０ｕｎｉｔ／ｍｌのα−グルコシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）２０μｌをよく混合した後、３７℃の恒温培養器で２０分間反応させた。Ｎａ２ＣＯ３  ５０μｌを前記反応物に加え反応を停止させた後、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。阻害度は（Ａ−Ｂ／Ａ）Х１００（％）により算出し、ここで、Ａは阻害物質が存在しない場合の吸光度であり、Ｂは阻害物質がある場合の吸光度である。
【００４３】
抽出物それぞれの濃度におけるα−グルコシダーゼの阻害度は、統計プログラム（ＳＰＳＳ  １７．０）に代入して回帰曲線を作成した後、α−グルコシダーゼ５０％を阻害する濃度であるＩＣ５０で表記し、その結果を表１および表２に示した（図１および図６を参照）。
【００４４】
【表１】
2021529183.tif 000003
【００４５】
【表２】
2021529183.tif 000004
【００４６】
前記表のＰＢは、有機溶媒の代わりにリン酸緩衝液で処理したものである。
【００４７】
前記表１および表２の結果は、菌体ライセートまたは培養液自体はα−グルコシダーゼの阻害活性を有しないが、エチルアセテートまたはヘキサンなどの有機溶媒で抽出した抽出物は効果的にα−グルコシダーゼを抑制することを示している。
【００４８】
実施例４：血糖低下能の評価：ラット糖負荷試験
実験動物は、生後６週齢（１８０〜２００ｇ）のオスＳＤ−ｒａｔを使用し、温度２５℃、湿度６０ＲＨ％と昼夜を１２時間ずつ保持し、動物飼育室で５日間２０ｇを水と共に摂取させて適応させた。実験動物をランダムで一般群と糖尿誘発群に分け、さらにそれぞれ対照群と実験群に分けた。糖尿誘発は空腹状態であるＳＤ−ｒａｔに０．１Ｍ  クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）で溶解した糖尿誘発物質ストレプトゾトシン（ＳＴＺ、６０ｍｇ／ｋｇ、Ｓｉｇｍａ）を１回腹腔注射し、３日後に血糖値測定器で測定した後、血糖値が３００ｍｇ／ｄｌ以上のＳＤ  ｒａｔのみ選抜して、糖尿病ＳＤ−ｒａｔとして実験で用いた。
【００４９】
ＳＤ−ｒａｔにおける血糖値の上昇抑制実験は、前記実施例１と実施例２で製造された酵母抽出物１および２を１００ｍｇ／ｋｇの濃度で、Ａｃａｒｂｏｓｅを２０ｍｇ／ｋｇの濃度で、澱粉３ｇ／ｋｇと共に経口投与し、時間ごとに血中のグルコースの含量の変化を測定した。
【００５０】
前記結果を図２ａ（一般群）と図２ｂ（糖尿誘発群）で示した。
【００５１】
図２ａの結果は、一般群（正常ラット）において、ＳＰＥＡ（培養液エチルアセテート抽出物）、ＣＦＥＡ（菌体ライセートのエチルアセテート抽出物）、ＣＦＥ（菌体ライセートのエタノール抽出物）、ＳＰＥ（培養液のエタノール抽出物）がそれぞれ澱粉分解および吸収による血糖値の上昇を抑制する効果がある一方、ＳＰＭ（培養液）とＣＦＰ（リン酸緩衝液中の菌体ライセート）自体は血糖値の上昇抑制効果が微々たるであることを示す。
【００５２】
さらに図２ｂの結果は、糖尿ＳＤ−ｒａｔにおいて血糖値の変化が一般群に比べて急激であり、ＳＰＥＡ（培養液のエチルアセテート抽出物）、ＣＦＥＡ（菌体ライセートのエチルアセテート抽出物）の血糖低下の程度が最も大きく、ＣＦＥ（菌体ライセートのエタノール抽出物）、ＳＰＥ（培養液のエタノール抽出物）は、初期で急激な血糖値の上昇を抑制したが、ＳＰＭ（培養液）とＣＦＰ（リン酸緩衝液中の菌体ライセート）自体は血糖値の上昇抑制効果が微々たるであることを示す。
【００５３】
実施例５：抗酸化能の評価
前記実施例１と実施例２で製造された酵母抽出物１および２について、それぞれ以下の方法で抗酸化活性を評価した：
（１）ＤＰＰＨ検査（フリーラジカル捕捉アッセイ；Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ  Ａｓｓａｙ）
有機溶媒に溶解したＤＰＰＨ（２，２−ジフェニル−１−ピクリルヒドラジル）ラジカルは５１５ｎｍにおいて最大吸光度を有し、抗酸化物質はＤＰＰＨラジカルを消去するため、固有の色を失って透明に変化する。
【００５４】
ＤＰＰＨ（２，２−ジフェニル−１−ピクリルヒドラジル）１００μＭと処理する物質の試料を準備し、準備された試料をＤＰＰＨ溶液と１：２０の割合で混合し、３０分間、３７℃で保存した。その後、反応が終了した試料を、吸光度計を用いて５１７ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度が低いほど抗酸化力が高いことを意味する。
【００５５】
酵母抽出物１と２のＤＰＰＨ測定結果をＩＣ５０（５０％の消去活性に相当する濃度）で、以下の表３および表４にそれぞれ示した（図３及び図７を参照）。
【００５６】
【表３】
2021529183.tif 000005
【００５７】
【表４】
2021529183.tif 000006
【００５８】
前記表３および表４の結果は、培養液のエチルアセテート抽出物の抗酸化効果がアスコルビン酸の抗酸化効果と同様の水準で最も高く、次いで培養液、エタノール抽出物、菌体ライセートのエチルアセテート抽出物の順であることを示している。さらに、菌体ライセート自体は抗酸化効果を示さなかった。
【００５９】
（２）ＡＢＴＳ検査（ラジかルカチオン退色アッセイ；Ｒａｄｉｃａｌ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｄｅ−ｃｏｌｏｒｉｚａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）
その測定方法は以下の通りである：
７ｍＭのＡＢＴＳと２．４５ｍＭの過硫酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ）を混合し、室温で１６時間培養した後、ＡＢＴｓカチオン（ＡＢＴｓ＋）を生成した。７３４ｎｍで吸光度の値が０．７以下となるように希釈して試験溶液を製造した。７３４ｎｍにおける吸光度の値が０．７以下となるように希釈して試験溶液を製造した。ＡＢＴｓ＋溶液１００μｌに試料１００μｌを加え、吸光度の値を３分後に測定した。結果をＩＣ５０（５０％の消去活性に相当する濃度）で下記の［表５］と［表６］に示した（図４及び図８の結果を参照）。
【００６０】
【表５】
2021529183.tif 000007
【００６１】
【表６】
2021529183.tif 000008
【００６２】
前記表５の結果で、培養液のエチルアセテート抽出物によるＡＢＴＳの抗酸化効果がアスコルビン酸の抗酸化効果と同様の水準で最も高く、次いで培養液のエタノール抽出物、菌体ライセートのエチルアセテート抽出物、菌体ライセートのエタノール抽出物の順であることを示している。表６の結果では、培養液のエタノール抽出物によるＡＢＴＳの抗酸化効果が最も高かった。さらに、菌体ライセート自体は抗酸化効果を示さなかった。
【００６３】
（３）還元力検査（Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ｐｏｗｅｒ  Ａｓｓａｙ）
本発明の酵母抽出物１と２の抗酸化活性を評価するために、下記の手順に沿って還元力を検定した。
【００６４】
まず、０．２Ｍのリン酸緩衝溶液（ｐＨ６．６）５０μＬにフェリシアン化カリウム５０μＬと試料２０μＬを入れた後、５０℃で２０分間反応させた。反応が終了した後に１０％ＴＣＡ溶液５０μＬを入れて、３０００ｘｇで２０分間遠心分離した。上澄み液１００μＬと３次蒸留水１００μＬ、０．１％塩化第二鉄（ｆｅｒｒｉｃ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）２０μＬを入れた後に７００ｎｍで吸光度を測定した。陽性対照区としてトロロックス（Ｔｒｏｌｏｘ）とＢＨＡを使用した。
【００６５】
結果は、表７および表８に示した（図５および図９を参照）。
【００６６】
【表７】
2021529183.tif 000009
【００６７】
【表８】
2021529183.tif 000010
【図１】
2021529183.tif 000011
【図２】
2021529183.tif 000012
【図３】
2021529183.tif 000013
【図４】
2021529183.tif 000014
【図５】
2021529183.tif 000015
【図６】
2021529183.tif 000016
【図７】
2021529183.tif 000017
【図８】
2021529183.tif 000018
【図９】
2021529183.tif 000019
【配列表】
2021529183000001.app
【国際調査報告】
2021529183.tif 000020
2021529183.tif 000021
2021529183.tif 000022
2021529183.tif 000023