(57)【要約】本発明は、血小板−ＶＷＦ複合体、或いは血小板−ＶＷＦ複合体が位置する部位に、フィブリン非依存性様式で、プラスミノーゲン活性化因子の標的化送達を行うための融合タンパク質を提供する。本発明の融合タンパク質は、例えば血栓性血小板減少性紫斑病などの疾患において微小血管血栓症を引き起こしうる、かかる血小板−ＶＷＦ複合体に関連する疾患又は病態の防止又は処置の方法において使用するためのものである。融合タンパク質に組み込むのに好ましい標的化因子は、例えば、ＶＷＦ又は血小板に対するナノボディである。融合タンパク質に使用するのに好ましいプラスミノーゲン活性化因子は、ｕＰＡ又はｔＰＡのプロテアーゼドメインを含む。本発明はさらに、本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子、例えば遺伝子療法ベクター、及び本発明の融合タンパク質又はかかる遺伝子療法ベクターを含む医薬組成物に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
微小血管血栓症の防止又は処置に使用するための、プラスミノーゲン活性化因子と、ＶＷＦ及び血小板のうちの少なくとも１つを含む血栓の部位に前記プラスミノーゲン活性化因子を標的化するための標的化因子とを含む、融合タンパク質であって、前記標的化因子が、血小板にあるＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体の活性化型のみに特異的に結合する標的化因子ではない、融合タンパク質。
【請求項２】
前記標的化因子が、ＶＷＦ、血小板、及び活性化又は損傷した血管内皮のうちの少なくとも１つに特異的に結合する、請求項１に記載の使用のための融合タンパク質。
【請求項３】
前記標的化因子が、
ａ）少なくとも折り畳まれていないＶＷＦに結合する標的化因子であって、好ましくは、球状ＶＷＦよりも折り畳まれていないＶＷＦに優先的に結合する、標的化因子、
ｂ）ＶＷＦのＤ３ドメインに結合する標的化因子、
ｃ）血小板のＧＰ１Ｂ受容体に結合する標的化因子、
ｄ）血小板のインテグリンαＩＩｂ／βＩＩＩに結合する標的化因子、
ｅ）活性化した内皮によって優先的に発現される受容体に結合する標的化因子であって、好ましくは前記受容体が、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、ｕＰＡＲ、ｃ１ｑ受容体、キニンＢ１受容体、プラスミノーゲン受容体ＫＴ（ＰＬＧＲ−ＫＴ）、内皮タンパク質Ｃ受容体、トロンボモジュリン、ｎ−カドヘリン、ＩＣＡＭ−１、及びＶＣＡＭ−１からなる群から選択される、標的化因子、並びに
ｆ）活性化又は損傷した内皮の膜マーカーに結合する標的化因子であって、前記膜マーカーが、アニオン性リン脂質、ホスファチジルセリン、及びホスファチジルエタノールアミンのうちの１つ又は複数である、標的化因子
のうちの１つ又は複数である、請求項１又は２に記載の使用のための融合タンパク質。
【請求項４】
前記融合タンパク質が、２種以上の標的化因子を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のための融合タンパク質。
【請求項５】
前記標的化因子が、
ａ）ＶＷＦ、血小板、及び活性化した血管内皮のうちの少なくとも１つに特異的に結合する抗体可変ドメイン、並びに
ｂ）ＶＷＦ、血小板、及び活性化又は損傷した血管内皮に天然に結合するタンパク質由来の結合性ドメインであって、ＶＷＦ、血小板、及び活性化又は損傷した血管内皮のうちの少なくとも１つに特異的に結合する、結合性ドメイン
のうちの少なくとも１つを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のための融合タンパク質。
【請求項６】
前記抗体可変ドメインが、ＶＨＨ、好ましくはヒト化ＶＨＨであるか、又は前記結合性ドメインが、
ｉ）ＶＷＦの血小板ＧＰ１Ｂ受容体結合性Ａ１ドメイン、
ｉｉ）ＡＤＡＭＴＳ１３、第ＸＩＩ因子、第Ｈ因子（補体調節因子）、プラスミノーゲン、及び第ＶＩＩＩ因子のうちの１つのＶＷＦ結合性ドメイン、並びに
ｉｉｉ）ビタミンＫ依存性カルボキシル化／ガンマカルボキシグルタミン酸（ＧＬＡ）ドメイン、第Ｖ因子のＣドメイン、及び第ＶＩＩＩ因子のＣドメインから選択される膜結合性ドメイン
からなる群から選択される結合性ドメインを含む、請求項５に記載の使用のための融合タンパク質。
【請求項７】
前記プラスミノーゲン活性化因子が、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、プラスミノーゲン、ストレプトキナーゼ、又はスタフィロキナーゼのプロテアーゼドメインを含み、
好ましくは、前記プラスミノーゲン活性化因子が、そのプロテアーゼドメインのすぐ上流に前記プラスミノーゲン活性化因子において天然に発生する連結ペプチドのシステイン含有部分を少なくともさらに含み、
前記融合タンパク質が、任意選択で、前記標的化因子と前記プラスミノーゲン活性化因子とを結合させるリンカーアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用のための融合タンパク質。
【請求項８】
前記融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端の順に、
ａ）請求項１〜６のいずれか一項に記載の１つ又は複数の標的化因子であって、任意選択でリンカーアミノ酸配列によって結合している、標的化因子と、
ｂ）任意選択で、リンカーアミノ酸配列と、
ｃ）請求項７に記載のプラスミノーゲン活性化因子又はプラスミノーゲン由来プロテアーゼドメインと
を含む、請求項７に記載の使用のための融合タンパク質。
【請求項９】
後天性又は遺伝性の血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、補体媒介性血栓性微小血管症、溶血性尿毒症症候群、抗リン脂質抗体症候群、非閉塞性血栓、閉塞性血栓の形成、動脈血栓形成、急性冠閉塞、末梢動脈閉塞性疾患、冠動脈バイパスグラフト、冠状動脈弁置換術、及び血管形成術、ステント術、又は粥腫切除術などの冠動脈インターベンションに起因する再狭窄及び障害、血管形成術、粥腫切除術、又は動脈ステント術の後の肥厚、脈管系の閉塞性症候群又は罹患動脈の開存性の欠如、一過性脳虚血発作、不安定狭心症又は安定狭心症、大脳梗塞、ＨＥＬＬＰ症候群、頸動脈内膜剥離術、頸動脈狭窄、重症虚血肢、心塞栓、末梢血管疾患、再狭窄、鎌状赤血球症、並びに心筋梗塞からなる群から選択される疾患又は病態において、前記微小血管血栓症が防止又は処置される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用のための融合タンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質を、それを必要とする対象に有効量で投与するステップを含む、微小血管血栓症の処置又はリスク低減の方法。
【請求項１１】
後天性又は遺伝性の血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、補体媒介性血栓性微小血管症、溶血性尿毒症症候群、抗リン脂質抗体症候群、非閉塞性血栓、閉塞性血栓の形成、動脈血栓形成、急性冠閉塞、末梢動脈閉塞性疾患、冠動脈バイパスグラフト、冠状動脈弁置換術、及び血管形成術、ステント術、又は粥腫切除術などの冠動脈インターベンションに起因する再狭窄及び障害、血管形成術、粥腫切除術、又は動脈ステント術の後の肥厚、脈管系の閉塞性症候群又は罹患動脈の開存性の欠如、一過性脳虚血発作、不安定狭心症又は安定狭心症、大脳梗塞、ＨＥＬＬＰ症候群、頸動脈内膜剥離術、頸動脈狭窄、重症虚血肢、心塞栓、末梢血管疾患、再狭窄、鎌状赤血球症、並びに心筋梗塞からなる群から選択される疾患又は病態において、前記微小血管血栓症が処置されるか、又はその発生リスクが低減する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
プラスミノーゲン活性化因子と、ＶＷＦ及び血小板のうちの少なくとも１つを含む血栓の部位に前記プラスミノーゲン活性化因子を標的化するための標的化因子とを含む、融合タンパク質であって、前記標的化因子が、
ａ）少なくとも折り畳まれていないＶＷＦに結合する標的化因子であって、好ましくは、球状ＶＷＦよりも折り畳まれていないＶＷＦに優先的に結合する、標的化因子、
ｂ）ＶＷＦのＤ３ドメインに結合する標的化因子、
ｃ）血小板のインテグリンαＩＩｂ／βＩＩＩに結合する標的化因子、
ｄ）活性化した内皮によって優先的に発現される受容体に結合する標的化因子であって、好ましくは前記受容体が、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、ｕＰＡＲ、ｃ１ｑ受容体、キニンＢ１受容体、プラスミノーゲン受容体ＫＴ（ＰＬＧＲ−ＫＴ）、内皮タンパク質Ｃ受容体、トロンボモジュリン、ｎ−カドヘリン、ＩＣＡＭ−１、及びＶＣＡＭ−１からなる群から選択される、標的化因子、並びに
ｅ）活性化又は損傷した内皮の膜マーカーに結合する標的化因子であって、前記膜マーカーが、アニオン性リン脂質、ホスファチジルセリン、及びホスファチジルエタノールアミンのうちの１つ又は複数である、標的化因子
のうちの１つ又は複数である、融合タンパク質。
【請求項１３】
前記融合タンパク質が、２種以上の標的化因子を含む、請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記標的化因子が、
ａ）ＶＷＦ、血小板、及び活性化した血管内皮のうちの少なくとも１つに特異的に結合する抗体可変ドメイン、並びに
ｂ）ＶＷＦ、血小板、及び活性化又は損傷した血管内皮に天然に結合するタンパク質由来の結合性ドメインであって、ＶＷＦ、血小板、及び活性化又は損傷した血管内皮のうちの少なくとも１つに特異的に結合する、結合性ドメイン
のうちの少なくとも１つを含む、請求項１２又は１３に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
前記抗体可変ドメインが、ＶＨＨ、好ましくはヒト化ＶＨＨであるか、又は前記結合性ドメインが、
ｉ）ＡＤＡＭＴＳ１３、第ＸＩＩ因子、第Ｈ因子（補体調節因子）、プラスミノーゲン、及び第ＶＩＩＩ因子のうちの１つのＶＷＦ結合性ドメイン、並びに
ｉｉ）ビタミンＫ依存性カルボキシル化／ガンマカルボキシグルタミン酸（ＧＬＡ）ドメイン、第Ｖ因子のＣドメイン、及び第ＶＩＩＩ因子のＣドメインから選択される膜結合性ドメイン
からなる群から選択される結合性ドメインを含む、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
前記プラスミノーゲン活性化因子が、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、プラスミノーゲン、ストレプトキナーゼ、又はスタフィロキナーゼのプロテアーゼドメインを含み、
好ましくは、前記プラスミノーゲン活性化因子が、そのプロテアーゼドメインのすぐ上流に前記プラスミノーゲン活性化因子において天然に発生する連結ペプチドのシステイン含有部分を少なくともさらに含み、
前記融合タンパク質が、任意選択で、前記標的化因子と前記プラスミノーゲン活性化因子とを結合させるリンカーアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
前記融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端の順に、
ａ）請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の１つ又は複数の標的化因子であって、任意選択でリンカーアミノ酸配列によって結合している、標的化因子と、
ｂ）任意選択で、リンカーアミノ酸配列と、
ｃ）請求項１６に記載のプラスミノーゲン活性化因子又はプラスミノーゲン由来プロテアーゼドメインと
を含む、請求項１６に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記融合タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、好ましくは、前記融合タンパク質に作動可能に連結したシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、核酸分子が、好ましくは、前記融合タンパク質の発現を助ける調節エレメントをさらに含み、前記調節エレメントが、前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結している、核酸分子。
【請求項１９】
請求項１８に記載の核酸分子を含む遺伝子療法ベクター。
【請求項２０】
請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質、又は請求項１９に記載の遺伝子療法ベクター、及び薬学的に許容できる賦形剤を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬及び薬学の分野、特に、例えば血栓性血小板減少性紫斑病などの微小血管血栓症に関連する疾患又は病態の防止又は処置において使用するための生物製剤の分野に関する。より詳細には、本発明は、標的化因子及びプラスミノーゲン活性化因子を含む融合タンパク質に関し、この標的化因子は、フィブリン非依存性様式で血管閉塞を酵素的に分解することを目的として、ＶＷＦ、血小板、及び活性化した血管内皮のうちの少なくとも１つにプラスミノーゲン活性化因子を標的化する。本発明はさらに、かかる融合タンパク質をコードする遺伝子療法ベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
微小血管血栓症（ＭＶＴ：Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ）は、微小血管の血小板凝集体の形成を特徴とする。血小板凝集体は、最低でも血小板及びＶＷＦから構成される。このことは、血小板及びＶＷＦは豊富だがフィブリンに乏しい微小血栓が微小血管系を閉塞させ、生命を脅かす結果をもたらす、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）において明らかになる。したがって、大血管血栓症において見られるフィブリンは、こうした微小血管閉塞に本質的に必要であるわけではない。ＭＶＴは、血栓性血小板減少性紫斑病、溶血性尿毒症症候群、抗リン脂質抗体症候群、及び補体媒介性血栓性微小血管症を含むいくつかの病状に共通する特徴である（Ｇｅｏｒｇｅら、２０１４年、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３７１巻（７号）：６５４〜６６頁）。ＭＶＴの重症例では、致命的な結果を伴う多臓器不全が起こる場合がある。重症度の低い症例においても臓器損傷が生じ、患者の生活の質と平均余命との両方を低下させる可能性がある。近年の研究では、循環器疾患を有し、放射線検査で大血管閉塞の明白な兆候を示さない、より一般的な集団の患者における循環器疾患／事象の根底には、微小血管疾患があると示唆されている。微小血管疾患は、特に女性において、最終的に心不全を引き起こすと考えられている。
【０００３】
ＴＴＰ患者は、血小板がフォンヴィルブランド因子（ＶＷＦ）の超大型多量体と複合体を形成すると、微小血管血栓症の発作を経験する。この発作は、酵素ＡＤＡＭＴＳ１３（ディスインテグリン及びトロンボスポンジンＩ型モチーフを有するメタロプロテイナーゼメンバー１３）の活性の著しい減少の結果である。ＡＤＡＭＴＳ１３は通常、ＶＷＦ多量体のサイズを酵素的に低減させることにより、ＶＷＦの血栓形成性を調節する。そのためには、ＶＷＦは、球状形態をほどいて展開された立体構造になることにより、Ａ２ドメインをタンパク質分解のために露出させる必要がある。大多数のＴＴＰ患者は、ＡＤＡＭＴＳ１３に対する中和自己抗体の影響を受ける。小さな下位集団では、欠損をもたらすＡＤＡＭＴＳ１３の変異について記述されている（Ｕｐｓｈａｗ−Ｓｈｕｌｍａｎ症候群）。
【０００４】
現在のＴＴＰ療法は、阻害性抗体を枯渇させると同時にＡＤＡＭＴＳ１３活性を回復させるための大量の血漿交換を必要とする。しかしながら、持続性のある自己抗体により、微小血栓の排除が妨げられる。そのため治療は時間がかかり、非常に高コストなものになる（Ｆｉｊｎｈｅｅｒら、Ｎｅｄ  Ｔｉｊｄｓｃｈ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２０１６年、１３巻（１号）：１８〜２４頁）。
【０００５】
ＡＤＡＭＴＳ１３のほかに、酵素のプラスミンによってもＶＷＦは切断されうる（Ｂｅｒｋｏｗｉｔｚら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９８７年２月、７９巻（２号）：５２４〜３１頁）。本発明者らは、ＴＴＰのマウスモデルにおける（ストレプトキナーゼによる）全身的なプラスミノーゲンの活性化に治療能があることを過去に特定したが、このことは、プラスミンがＡＤＡＭＴＳ１３の機能的代替物として作用しうることを示唆している（Ｔｅｒｓｔｅｅｇら、２０１４年、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１２９巻（１２号）：１３２０〜３１頁）。プラスミン（プラスミノーゲン）は展開されたＶＷＦに直接結合することができるが、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）及びウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）といった天然のプラスミノーゲン活性化因子にはＶＷＦに直接結合することができない。ｔＰＡ及びｕＰＡの天然の標的は、それぞれ、フィブリン及び内皮細胞受容体ｕＰＡＲである。さらに、ＴＴＰにおける微小血栓はフィブリンに乏しく、フィブリンが他のタイプのＭＶＴに必須であるかどうかは不明である。このため、大血管疾患の処置において血栓溶解剤として一般的に使用されている分子（すなわちｔＰＡ、ｕＰＡ）が、ＭＶＴの処置においては無効になる。さらに、安全上の理由（すなわち血小板数低下）のため、全身的なプラスミノーゲンの活性化は避けることが望ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的の１つは、ＭＶＴ及び関連する病態を処置するための手段及び方法を提供することである。したがって、本発明は、血小板−ＶＷＦ複合体、或いは血小板−ＶＷＦ複合体が位置する部位に、フィブリン非依存性様式で、プラスミノーゲン活性化因子の標的化送達を行うための融合タンパク質を提供する。本発明はさらに、微小血管閉塞の部位に対するプラスミノーゲン活性化の局所送達／刺激によって防止又は処置されうる病態の治療方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第１の態様において、本発明は、プラスミノーゲン活性化因子と、ＶＷＦ及び血小板のうちの少なくとも１つを含む血栓の部位にプラスミノーゲン活性化因子を標的化するための標的化因子とを含む、融合タンパク質に関する。本発明の融合タンパク質中の標的化因子は、ＶＷＦ、血小板、及び活性化又は損傷した血管内皮のうちの少なくとも１つに特異的に結合することが好ましい。さらに、本発明の融合タンパク質中の標的化因子は、血小板にあるＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体の活性化型のみに特異的に結合する標的化因子ではないことが好ましい。より好ましくは、本発明の融合タンパク質中の標的化因子は、ａ）少なくとも折り畳まれていないＶＷＦに結合する標的化因子であって、好ましくは、球状ＶＷＦよりも折り畳まれていないＶＷＦに優先的に結合する、標的化因子、ｂ）ＶＷＦのＤ３ドメインに結合する標的化因子、ｃ）血小板のＧＰ１Ｂ受容体に結合する標的化因子、ｄ）血小板のインテグリンαＩＩｂ／βＩＩＩに結合する標的化因子、ｅ）活性化した内皮によって優先的に発現される受容体に結合する標的化因子であって、好ましくは該受容体が、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、ｕＰＡＲ、ｃ１ｑ受容体、キニンＢ１受容体、プラスミノーゲン受容体ＫＴ（ＰＬＧＲ−ＫＴ）、内皮タンパク質Ｃ受容体、トロンボモジュリン、ｎ−カドヘリン、ＩＣＡＭ−１、及びＶＣＡＭ−１からなる群から選択される、標的化因子、並びにｆ）活性化又は損傷した内皮の膜マーカーに結合する標的化因子であって、該膜マーカーが、アニオン性リン脂質、ホスファチジルセリン、及びホスファチジルエタノールアミンのうちの１つ又は複数である、標的化因子のうちの１つ又は複数である。一実施形態において、好ましくは、本発明の融合タンパク質は、２種以上の標的化因子を含む。
【０００８】
本発明に係る融合タンパク質は、好ましくは、標的化因子が、ａ）ＶＷＦ、血小板、及び活性化した血管内皮のうちの少なくとも１つに特異的に結合する抗体可変ドメイン、並びにｂ）ＶＷＦ、血小板、及び活性化又は損傷した血管内皮に天然に結合するタンパク質由来の結合性ドメインであって、ＶＷＦ、血小板、及び活性化又は損傷した血管内皮のうちの少なくとも１つに特異的に結合する、結合性ドメインのうちの少なくとも１つを含む、融合タンパク質である。したがって、本発明に係る融合タンパク質において、抗体可変ドメインは、好ましくはＶＨＨ、より好ましくはヒト化ＶＨＨである。或いは、本発明に係る融合タンパク質において、ＶＷＦ、血小板、及び活性化又は損傷した血管内皮に天然に結合するタンパク質由来の結合性ドメインは、好ましくは、ｉ）ＶＷＦの血小板ＧＰ１Ｂ受容体結合性Ａ１ドメイン、ｉｉ）ＡＤＡＭＴＳ１３、第ＸＩＩ因子、第Ｈ因子（補体調節因子）、プラスミノーゲン、及び第ＶＩＩＩ因子のうちの１つのＶＷＦ結合性ドメイン、並びにｉｉｉ）ビタミンＫ依存性カルボキシル化／ガンマカルボキシグルタミン酸（ＧＬＡ）ドメイン、第Ｖ因子のＣドメイン、及び第ＶＩＩＩ因子のＣドメインから選択される膜結合性ドメインからなる群から選択される結合性ドメインを含む。
【０００９】
上記に定義した本発明の融合タンパク質において、プラスミノーゲン活性化因子は、好ましくは、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、プラスミノーゲン、ストレプトキナーゼ、又はスタフィロキナーゼのプロテアーゼドメインを含む。本発明の融合タンパク質では、プラスミノーゲン活性化因子が、そのプロテアーゼドメインのすぐ上流にプラスミノーゲン活性化因子において天然に発生する連結ペプチドのシステイン含有部分を少なくともさらに含むことが好ましい。任意選択で、本発明の融合タンパク質は、標的化因子とプラスミノーゲン活性化因子とを結合させるリンカーアミノ酸配列を含む。
【００１０】
したがって、本発明に係る融合タンパク質は、好ましくは、Ｎ末端からＣ末端の順に、ａ）上記に定義した１つ又は複数の標的化因子であって、任意選択でリンカーアミノ酸配列によって結合している、標的化因子と、ｂ）任意選択で、リンカーアミノ酸配列と、ｃ）上記に定義したプラスミノーゲン活性化因子又はプラスミノーゲン由来プロテアーゼドメインとを含む。
【００１１】
第２の態様において、本発明は、上記に定義した本発明に係る融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。好ましくは、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、融合タンパク質に作動可能に連結したシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。核酸分子は、好ましくは、融合タンパク質の発現を助ける調節エレメントをさらに含み、この調節エレメントは、ヌクレオチド配列に作動可能に連結している。
【００１２】
第３の態様において、本発明は、本発明に係る核酸分子を含む遺伝子療法ベクターに関する。
【００１３】
第４の態様において、本発明は、本発明に係る融合タンパク質、又は本発明に係る遺伝子療法ベクター、及び薬学的に許容できる賦形剤を含む、医薬組成物に関する。
【００１４】
第５の態様において、本発明は、ＶＷＦ及び血小板のうちの少なくとも１つを含む血栓に関連する疾患又は病態、好ましくは微小血管血栓症に関連する疾患又は病態の防止又は処置に使用するための、本発明に係る融合タンパク質、本発明に係る遺伝子療法ベクター、又は本発明に係る医薬組成物に関する。より好ましくは、ＶＷＦ及び血小板のうちの少なくとも１つを含む（微小）血栓に関連する疾患又は病態は、後天性又は遺伝性の血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、補体媒介性血栓性微小血管症、溶血性尿毒症症候群、抗リン脂質抗体症候群、非閉塞性血栓、閉塞性血栓の形成、動脈血栓形成、急性冠閉塞、末梢動脈閉塞性疾患、冠動脈バイパスグラフト、冠状動脈弁置換術、及び血管形成術、ステント術、又は粥腫切除術などの冠動脈インターベンションに起因する再狭窄及び障害、血管形成術、粥腫切除術、又は動脈ステント術の後の肥厚、脈管系の閉塞性症候群又は罹患動脈の開存性の欠如、一過性脳虚血発作、不安定狭心症又は安定狭心症、大脳梗塞、ＨＥＬＬＰ症候群、頸動脈内膜剥離術、頸動脈狭窄、重症虚血肢、心塞栓、末梢血管疾患、再狭窄、鎌状赤血球症、並びに心筋梗塞からなる群から選択される。
【００１５】
第６の態様において、本発明は、本発明に係る融合タンパク質、本発明に係る遺伝子療法ベクター、又は本発明に係る医薬組成物を、それを必要とする対象に有効量で投与するステップを含む、ＶＷＦ及び血小板のうちの少なくとも１つを含む血栓に関連する疾患又は病態、好ましくは、微小血管血栓症に関連する疾患又は病態の処置又はリスク低減の方法に関する。より好ましくは、ＶＷＦ及び血小板のうちの少なくとも１つを含む（微小）血栓に関連する疾患又は病態は、後天性又は遺伝性の血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、補体媒介性血栓性微小血管症、溶血性尿毒症症候群、抗リン脂質抗体症候群、非閉塞性血栓、閉塞性血栓の形成、動脈血栓形成、急性冠閉塞、末梢動脈閉塞性疾患、冠動脈バイパスグラフト、冠状動脈弁置換術、及び血管形成術、ステント術、又は粥腫切除術などの冠動脈インターベンションに起因する再狭窄及び障害、血管形成術、粥腫切除術、又は動脈ステント術の後の肥厚、脈管系の閉塞性症候群又は罹患動脈の開存性の欠如、一過性脳虚血発作、不安定狭心症又は安定狭心症、大脳梗塞、ＨＥＬＬＰ症候群、頸動脈内膜剥離術、頸動脈狭窄、重症虚血肢、心塞栓、末梢血管疾患、再狭窄、並びに心筋梗塞からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】ＶＨＨ−ｍｉｎｉＵＰＡ（ｍＵＰＡ）構築物。Ａ）ｍＵＰＡ構築物の概略図。Ｂ）ＶＨＨコード配列を含むｍＵＰＡ構築物（ＶＨＨ−ｍＵＰＡ）の概略図。
【図１Ｂ】ＶＨＨ−ｍｉｎｉＵＰＡ（ｍＵＰＡ）構築物。Ａ）ｍＵＰＡ構築物の概略図。Ｂ）ＶＨＨコード配列を含むｍＵＰＡ構築物（ＶＨＨ−ｍＵＰＡ）の概略図。
【図２】精製されたＶＨＨ−ｍＵＰＡ構築物のウェスタンブロット。
【図３】プラスミンによる活性化後のＶＨＨ−ｍＵＰＡ構築物の活性。
【図４】ＶＨＨ−ｍＵＰＡ構築物によるプラスミノーゲン活性化。
【図５Ａ】球状ＶＷＦ又は開いたＶＷＦの存在下におけるＶＨＨ−ｍＵＰＡ構築物によるプラスミノーゲン活性化。Ａ）ＶＨＨ−ｓＶＷＦによるプラスミノーゲン活性化、Ｂ）ＶＨＨ−Ｄ３によるプラスミノーゲン活性化、Ｃ）ＶＨＨ−ＧＰ１Ｂ１７によるプラスミノーゲン活性化、Ｄ）ＶＨＨ−Ｒ２によるプラスミノーゲン活性化、Ｅ）ＶＨＨ−Ａ１２によるプラスミノーゲン活性化。
【図５Ｂ】球状ＶＷＦ又は開いたＶＷＦの存在下におけるＶＨＨ−ｍＵＰＡ構築物によるプラスミノーゲン活性化。Ａ）ＶＨＨ−ｓＶＷＦによるプラスミノーゲン活性化、Ｂ）ＶＨＨ−Ｄ３によるプラスミノーゲン活性化、Ｃ）ＶＨＨ−ＧＰ１Ｂ１７によるプラスミノーゲン活性化、Ｄ）ＶＨＨ−Ｒ２によるプラスミノーゲン活性化、Ｅ）ＶＨＨ−Ａ１２によるプラスミノーゲン活性化。
【図５Ｃ】球状ＶＷＦ又は開いたＶＷＦの存在下におけるＶＨＨ−ｍＵＰＡ構築物によるプラスミノーゲン活性化。Ａ）ＶＨＨ−ｓＶＷＦによるプラスミノーゲン活性化、Ｂ）ＶＨＨ−Ｄ３によるプラスミノーゲン活性化、Ｃ）ＶＨＨ−ＧＰ１Ｂ１７によるプラスミノーゲン活性化、Ｄ）ＶＨＨ−Ｒ２によるプラスミノーゲン活性化、Ｅ）ＶＨＨ−Ａ１２によるプラスミノーゲン活性化。
【図５Ｄ】球状ＶＷＦ又は開いたＶＷＦの存在下におけるＶＨＨ−ｍＵＰＡ構築物によるプラスミノーゲン活性化。Ａ）ＶＨＨ−ｓＶＷＦによるプラスミノーゲン活性化、Ｂ）ＶＨＨ−Ｄ３によるプラスミノーゲン活性化、Ｃ）ＶＨＨ−ＧＰ１Ｂ１７によるプラスミノーゲン活性化、Ｄ）ＶＨＨ−Ｒ２によるプラスミノーゲン活性化、Ｅ）ＶＨＨ−Ａ１２によるプラスミノーゲン活性化。
【図５Ｅ】球状ＶＷＦ又は開いたＶＷＦの存在下におけるＶＨＨ−ｍＵＰＡ構築物によるプラスミノーゲン活性化。Ａ）ＶＨＨ−ｓＶＷＦによるプラスミノーゲン活性化、Ｂ）ＶＨＨ−Ｄ３によるプラスミノーゲン活性化、Ｃ）ＶＨＨ−ＧＰ１Ｂ１７によるプラスミノーゲン活性化、Ｄ）ＶＨＨ−Ｒ２によるプラスミノーゲン活性化、Ｅ）ＶＨＨ−Ａ１２によるプラスミノーゲン活性化。
【図６】構築物ＶＨＨ−ｓＶＷＦ、ＶＨＨ−Ｄ３、ＶＨＨ−ＧＰ１Ｂ１７、ＶＨＨ−Ｒ２、及びＶＨＨ−Ａ１２の３７℃で５分間のインキュベーション後のプラスミン基質の変換。
【図７Ａ】ＶＷＦ−血小板凝集物の微小血栓溶解（すなわち酵素的分解）。凝集物の溶解を経時的にモニタリングした。Ａ）ＶＨＨ−ｓＶＷＦにより誘導された微小血栓溶解、Ｂ）ＶＨＨ−Ｄ３により誘導された微小血栓溶解、Ｃ）ＶＨＨ−Ｒ２により誘導された微小血栓溶解、Ｄ）ＶＨＨ−ＧＰ１Ｂ１７により誘導された微小血栓溶解。
【図７Ｂ】ＶＷＦ−血小板凝集物の微小血栓溶解（すなわち酵素的分解）。凝集物の溶解を経時的にモニタリングした。Ａ）ＶＨＨ−ｓＶＷＦにより誘導された微小血栓溶解、Ｂ）ＶＨＨ−Ｄ３により誘導された微小血栓溶解、Ｃ）ＶＨＨ−Ｒ２により誘導された微小血栓溶解、Ｄ）ＶＨＨ−ＧＰ１Ｂ１７により誘導された微小血栓溶解。
【図７Ｃ】ＶＷＦ−血小板凝集物の微小血栓溶解（すなわち酵素的分解）。凝集物の溶解を経時的にモニタリングした。Ａ）ＶＨＨ−ｓＶＷＦにより誘導された微小血栓溶解、Ｂ）ＶＨＨ−Ｄ３により誘導された微小血栓溶解、Ｃ）ＶＨＨ−Ｒ２により誘導された微小血栓溶解、Ｄ）ＶＨＨ−ＧＰ１Ｂ１７により誘導された微小血栓溶解。
【図７Ｄ】ＶＷＦ−血小板凝集物の微小血栓溶解（すなわち酵素的分解）。凝集物の溶解を経時的にモニタリングした。Ａ）ＶＨＨ−ｓＶＷＦにより誘導された微小血栓溶解、Ｂ）ＶＨＨ−Ｄ３により誘導された微小血栓溶解、Ｃ）ＶＨＨ−Ｒ２により誘導された微小血栓溶解、Ｄ）ＶＨＨ−ＧＰ１Ｂ１７により誘導された微小血栓溶解。
【図８Ａ】Ａ）５０％の微小血栓の分解が起こった時点を判定するための分析方法の図式的な例。Ｂ）構築物ＶＨＨ−ｓＶＷＦ、ＶＨＨ−Ｄ３、ＶＨＨ−ＧＰ１Ｂ１７、ＶＨＨ−Ｒ２、及びＶＨＨ−Ａ１２による５０％の微小血栓の分解。
【図８Ｂ】Ａ）５０％の微小血栓の分解が起こった時点を判定するための分析方法の図式的な例。Ｂ）構築物ＶＨＨ−ｓＶＷＦ、ＶＨＨ−Ｄ３、ＶＨＨ−ＧＰ１Ｂ１７、ＶＨＨ−Ｒ２、及びＶＨＨ−Ａ１２による５０％の微小血栓の分解。
【図９】流動灌流実験において分析した、ヒト血管内皮細胞に粘着したＶＷＦ−血小板複合体の微小血栓溶解。ＶＷＦ−血小板複合体は血小板のストリングとして視認でき、視認できるストリングの数は、示されている融合タンパク質の添加に応じた時間の関数として計数されている。
【図１０Ａ】ＶＷＦ−血小板凝集物の微小血栓溶解（すなわち酵素的分解）。凝集物の溶解を光透過凝集計で経時的にモニタリングした。Ａ）プラスミノーゲン（１００μｇ／ｍＬ）の存在下で、カプラシズマブ（１５４．３ｎＭ）又はＵＰＡを含むＶＨＨ−Ｄ３融合タンパク質（１５４．３ｎＭ）によって誘導した微小血栓溶解。Ｂ）プラスミノーゲン（１００μｇ／ｍＬ）の存在下で、カプラシズマブ（１５４．３ｎＭ）又はＵＰＡを含むＶＨＨ−ＧＰ１Ｂ１７融合タンパク質（１５４．３ｎＭ）によって誘導した微小血栓溶解。
【図１０Ｂ】ＶＷＦ−血小板凝集物の微小血栓溶解（すなわち酵素的分解）。凝集物の溶解を光透過凝集計で経時的にモニタリングした。Ａ）プラスミノーゲン（１００μｇ／ｍＬ）の存在下で、カプラシズマブ（１５４．３ｎＭ）又はＵＰＡを含むＶＨＨ−Ｄ３融合タンパク質（１５４．３ｎＭ）によって誘導した微小血栓溶解。Ｂ）プラスミノーゲン（１００μｇ／ｍＬ）の存在下で、カプラシズマブ（１５４．３ｎＭ）又はＵＰＡを含むＶＨＨ−ＧＰ１Ｂ１７融合タンパク質（１５４．３ｎＭ）によって誘導した微小血栓溶解。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
定義
「相同性」、「配列同一性」などの用語は、本明細書では交換可能に使用される。本明細書において、配列同一性は、２つ以上のアミノ酸（ポリペプチド若しくはタンパク質）の配列又は２つ以上の核酸（ポリヌクレオチド）の配列を比較することによって決定される、これらの配列間の関係として定義される。当技術分野において、「同一性」は、アミノ酸配列又は核酸配列（場合による）のストリング間のマッチによって決定される、このような配列同士の間の配列関連性の程度も意味する。２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存的アミノ酸置換物を第２のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。「同一性」及び「類似性」は、公知の方法によって容易に計算することができる。
【００１８】
「配列同一性」及び「配列類似性」は、２つの配列の長さに応じて大域的又は局所的なアライメントアルゴリズムを使用した、２つのペプチド又は２つのヌクレオチドの配列のアライメントによって決定することができる。同様な長さの配列は、全長にわたって配列を最適にアラインする大域的アライメントアルゴリズム（例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｗｕｎｓｃｈ）を使用してアラインするのが好ましいが、長さが実質的に異なる配列は、局所的アライメントアルゴリズム（例えばＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎ）を使用してアラインするのが好ましい。配列が（デフォルトパラメータを使用して例えばＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴなどのプログラムによって最適にアラインした場合に）少なくとも一定の最小配列同一性パーセンテージ（以下に定義するとおり）を共有するとき、これらの配列は「実質的に同一」又は「本質的に同様」であるということができる。ＧＡＰでは、２つの配列を全長（完全長）にわたってアラインしてマッチの数を最大にし、ギャップの数を最小限に抑える、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈの大域的アライメントアルゴリズムを使用する。大域的アライメントは、２つの配列の長さが同様である場合に配列同一性を決定するために好適に使用される。一般的に、ギャップ生成ペナルティ＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）、及びギャップ伸長ペナルティ＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）のＧＡＰデフォルトパラメータが使用される。ヌクレオチドの場合は、使用されるデフォルトのスコアリング行列はｎｗｓｇａｐｄｎａであり、タンパク質の場合は、デフォルトのスコアリング行列はＢｌｏｓｕｍ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２年、ＰＮＡＳ  ８９巻、９１５〜９１９頁）。配列アライメント及び配列同一性パーセンテージのスコアは、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．、９６８５  Ｓｃｒａｎｔｏｎ  Ｒｏａｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ  ９２１２１−３７５２  ＵＳＡから入手可能なＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅバージョン１０．３などのコンピュータプログラムを使用すること、又は、上記のＧＡＰと同じパラメータ若しくはデフォルト設定を使用して、ＥｍｂｏｓｓＷＩＮバージョン２．１０．０のプログラム「ｎｅｅｄｌｅ」（大域的なＮｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用するもの）若しくは「ｗａｔｅｒ」（局所的なＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用するもの）などのオープンソースソフトウェアを使用することにより、決定することができる（「ｎｅｅｄｌｅ」及び「ｗａｔｅｒ」の両方、並びにタンパク質及びＤＮＡのアライメントの両方で、デフォルトのギャップオープニングペナルティは１０．０であり、デフォルトのギャップ伸長ペナルティは０．５であり、デフォルトのスコアリング行列は、タンパク質の場合はＢｌｏｓｓｕｍ６２であり、ＤＮＡの場合はＤＮＡＦｕｌｌである）。配列の全体的な長さが実質的に異なる場合、Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用するものなどの局所的アライメントが好ましい。
【００１９】
代替的な類似性又は同一性のパーセンテージは、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどのアルゴリズムを使用し、公開データベースに対して検索することによって決定することができる。したがって、本発明の核酸及びタンパク質の配列を「クエリ配列」としてさらに使用して、公開データベースに対する検索を行い、例えば、他のファミリーメンバー又は関連する配列を特定することができる。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５巻：４０３〜１０頁のＢＬＡＳＴｎ及びＢＬＡＳＴｘプログラム（バージョン２．０）を使用して行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、単語長＝１２で行うと、本発明のオキシドレダクターゼ核酸分子と相同のヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＢＬＡＳＴｘプログラム、スコア＝５０、単語長＝３で行うと、本発明のタンパク質分子と相同のアミノ酸配列を得ることができる。比較の目的のためにギャップ付きアライメントを得るためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５巻（１７号）：３３８９〜３４０２頁に記載されているようにＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する際は、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴｘ及びＢＬＡＳＴｎ）のデフォルトパラメータを使用することができる。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を参照されたい。
【００２０】
当業者には明らかであろうが、アミノ酸類似性の程度を決定する際、当業者は、任意選択で、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮に入れてもよい。保存的アミノ酸置換とは、同様の側鎖を有する残基の互換性を指す。保存的置換のためのアミノ酸残基のクラスの例を、以下の表に示す。
【表１】
2021519093.tif 000002
【表２】
2021519093.tif 000003
【表３】
2021519093.tif 000004
【００２１】
本発明の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列はまた、中等度、又は好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に例示するコード融合タンパク質のヌクレオチド配列とハイブリダイズする能力によって定義されうる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、本明細書では、少なくとも約２５、好ましくは約５０ヌクレオチド、７５又は１００、最も好ましくは約２００以上のヌクレオチドからなる核酸配列が、約１Ｍの塩を含む溶液、好ましくは６×ＳＳＣ又は同等のイオン強度を有する任意の他の溶液中、約６５℃の温度でハイブリダイズすることができる条件、及び約０．１Ｍ以下の塩を含む溶液、好ましくは０．２×ＳＳＣ又は同等のイオン強度を有する任意の他の溶液中で６５℃における洗浄と定義される。ハイブリダイゼーションは、好ましくは一晩、すなわち少なくとも１０時間にわたって行われ、洗浄は、好ましくは少なくとも１時間にわたり、洗浄液を少なくとも２回交換して行われる。これらの条件は通常、約９０％以上の配列同一性を有する配列の特異的なハイブリダイゼーションを可能にする。
【００２２】
中等度の条件は、本明細書では、少なくとも５０ヌクレオチド、好ましくは約２００以上のヌクレオチドからなる核酸配列が、約１Ｍの塩を含む溶液、好ましくは６×ＳＳＣ又は同等のイオン強度を有する任意の他の溶液中、約４５℃の温度でハイブリダイズすることができる条件、及び約１Ｍの塩を含む溶液、好ましくは６×ＳＳＣ又は同等のイオン強度を有する任意の他の溶液中で室温における洗浄と定義される。ハイブリダイゼーションは、好ましくは一晩、すなわち少なくとも１０時間にわたって行われ、洗浄は、好ましくは少なくとも１時間にわたり、洗浄液を少なくとも２回交換して行われる。これらの条件は通常、最大５０％の配列同一性を有する配列の特異的なハイブリダイゼーションを可能にする。当業者であれば、同一性が５０％〜９０％と異なる配列を特異的に特定するために、これらのハイブリダイゼーション条件を改変することができよう。
【００２３】
「核酸構築物」又は「核酸ベクター」は、本明細書では、組換えＤＮＡ技術の使用からもたらされる人工の核酸分子を意味するものと理解される。したがって、核酸構築物は天然に発生する核酸分子（の一部）を含んでもよいが、「核酸構築物」という用語には、天然に発生する核酸分子は含まれない。「発現ベクター」又は「発現構築物」という用語は、かかる発現ベクター又は構築物と適合する宿主細胞又は宿主生物においてヌクレオチド配列又は遺伝子の発現をもたらすことができる核酸分子を指す。これらの発現ベクターには、典型的に、発現させようとするヌクレオチド配列に作動可能に連結し、ヌクレオチド配列の発現をもたらす、調節配列エレメントが含まれる。かかる調節エレメントは通常、少なくとも好適な転写調節配列と、任意選択で、３’転写終結シグナルとを含む。発現エンハンサーエレメントなど、発現をもたらすのに必要又は有用な追加のエレメントが存在する場合もある。発現ベクターは好適な宿主細胞に導入され、宿主細胞のインビトロ細胞培養物においてコード配列の発現をもたらすことができるようになる。発現ベクターは、本発明の宿主細胞又は宿主生物における複製に好適であるが、発現構築物は通常、宿主細胞のゲノムが維持されるように宿主細胞のゲノムに組み込まれる。核酸を細胞に導入するための技術は、当技術分野で十分に確立されており、特定の状況に応じて任意の好適な技術を用いることができる。真核細胞の場合、好適な技術としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、電気穿孔、リポソーム媒介性トランスフェクション、及びレトロウイルス又は他のウイルス、例えばアデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルス、又はワクシニアを使用した形質導入を挙げることができる。微生物細胞、例えば細菌細胞の場合、好適な技術としては、塩化カルシウム形質転換、電気穿孔、及びバクテリオファージを使用したトランスフェクションを挙げることができる。導入される核酸は、細胞内の染色体外ベクターに搭載される場合もあれば、又は核酸は、宿主細胞のゲノム内に組み込まれる場合もある。組み込みは、標準的な技術に従い、ゲノムとの組換えを促進する核酸又はベクターに配列を含めることによって促進されうる。導入の後に核酸の発現を行い、コードされた融合タンパク質を産生してもよい。いくつかの実施形態では、コードされた融合タンパク質ポリペプチドが産生されるように、核酸を発現させる条件下にてインビトロで宿主細胞を培養してもよく（宿主細胞は形質転換細胞の子孫であることが多いが、実際に形質転換した細胞を含むこともある）、誘導性プロモーターが使用される場合、発現には誘導性プロモーターの活性化が必要でありうる。
【００２４】
本明細書において使用される場合、「プロモーター」又は「転写調節配列」という用語は、１つ又は複数のコード配列の転写を制御するように機能し、転写の方向を基準としてコード配列の転写開始部位の上流に位置し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、転写開始部位、及び任意の他のＤＮＡ配列、例えば、限定されるものではないが、転写因子結合部位、リプレッサー及び活性化因子タンパク質結合部位、並びにプロモーターからの転写の量を調節するように直接的又は間接的に作用することが当業者に公知である任意の他のヌクレオチド配列の存在によって構造的に特定される、核酸断片を指す。「構成的」プロモーターとは、ほとんどの生理条件及び発生条件下で、ほとんどの組織において活性のあるプロモーターである。「誘導性」プロモーターとは、例えば化学誘導物質の適用により、生理的又は発生的に調節されるプロモーターである。
【００２５】
「選択マーカー」という用語は、当業者であれば精通している用語であり、本明細書では、発現すると、選択マーカーを含む単数又は複数の細胞を選択するために使用することができる、あらゆる遺伝的実体を表すように使用される。「レポーター」という用語は、主に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの視認できるマーカーを指すように使用されるが、マーカーと交換可能に使用される場合もある。選択マーカーは、優性、又は劣性、又は双方向性でありうる。
【００２６】
本明細書において使用される場合、「作動可能に連結した」という用語は、機能的な関係におけるポリヌクレオチド要素のつながりを指す。核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれた場合、「作動可能に連結」している。例えば、転写調節配列は、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、そのコード配列に作動可能に連結している。作動可能に連結したとは、連結しているＤＮＡ配列が典型的には連続的であること、また、２つのタンパク質コード領域を結合させるのに必要な場合は、連続的であり、リーディングフレーム内にあることを意味する。
【００２７】
「タンパク質」又は「ポリペプチド」という用語は、交換可能に使用され、特定の作用様式、サイズ、３次元構造、又は起源に関係なく、アミノ酸の鎖からなる分子を指す。
【００２８】
「シグナルペプチド」という用語（シグナル配列ということもある）は、分泌経路に運命付けられた新たに合成されたタンパク質の大部分のＮ末端に存在する短いペプチド（通常１６〜３０アミノ酸長）である。シグナルペプチドの末端には、通常、移行（サイトゾルから分泌経路、すなわちＥＲへの移行）の間又は移行完了後のいずれかで、シグナルペプチダーゼによって認識及び切断されて、遊離シグナルペプチド及び成熟タンパク質を生成する、アミノ酸の区間が存在する。シグナルペプチドは不均一性が極めて高く、多くの原核生物及び真核生物のシグナルペプチドは、異なる種間であっても機能的に互換性があるが、タンパク質分泌の効率はシグナルペプチドに依存しうる。好適なシグナルペプチドについては、当技術分野において、例えばＫａｌｌら（２００４年Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８巻：１０２７〜１０３６頁）及びｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ（１９８５年、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１８４巻（１号）：９９〜１０５頁）から広く知られている。
【００２９】
「遺伝子」という用語は、好適な調節性領域（例えばプロモーター）に作動可能に連結した、細胞内でＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）に転写される領域（転写領域）を含むＤＮＡ断片を意味する。遺伝子は通常、プロモーター、５’リーダー配列、コード領域、及びポリアデニル化部位を含む３’非翻訳配列（３’末端）など、いくつかの作動可能に連結した断片を含む。「遺伝子の発現」とは、適切な調節性領域、特にプロモーターに作動可能に連結したＤＮＡ領域が、生物学的活性のある、すなわち生物学的活性のあるタンパク質又はペプチドに翻訳されることができるＲＮＡに転写されるプロセスを指す。
【００３０】
「相同」という用語は、所与の（組換え）核酸又はポリペプチド分子と、所与の宿主生物又は宿主細胞との間の関係を示すために使用される場合、本質的に、核酸又はポリペプチド分子が、同じ種、好ましくは同じ変種又は系統の宿主細胞又は生物によって生成されることを意味するものと理解される。宿主細胞と相同である場合、ポリペプチドをコードする核酸配列は、典型的には（必ずしもそうであるとは限らないが）、自然環境におけるものとは別の（異種）プロモーター配列に、また該当する場合は、別の（異種）分泌シグナル配列及び／又はターミネーター配列に、作動可能に連結している。調節配列、シグナル配列、ターミネーター配列などが宿主細胞と相同である場合もあると理解される。２つの核酸配列の関連性を示すために使用される場合、「相同」という用語は、１つの一本鎖核酸配列が、相補的な一本鎖核酸配列にハイブリダイズしうることを意味する。ハイブリダイゼーションの程度は、後述するように、配列間の同一性の量、並びに温度及び塩濃度などのハイブリダイゼーション条件を含む、いくつかの要因に左右されうる。
【００３１】
核酸（ＤＮＡ若しくはＲＮＡ）又はタンパク質に関して使用される場合の「異種」という用語は、核酸又はタンパク質が存在する生物、細胞、ゲノム、又はＤＮＡ配列若しくはＲＮＡ配列の一部として天然に発生しない核酸又はタンパク質、或いは、核酸又はタンパク質が天然に見出されるものとは異なる細胞、又はゲノム、又はＤＮＡ配列若しくはＲＮＡ配列内の単数又は複数の位置に見出される核酸又はタンパク質を指す。異種核酸又は異種タンパク質は、導入される細胞に内在しないが、別の細胞から得られたもの、又は合成若しくは組換えで生成されたものである。必ずしもそうであるとは限らないが、一般的に、このような核酸は、ＤＮＡが転写又は発現される細胞によって通常は産生されないタンパク質をコードする。同様に、外来性ＲＮＡは、外来性ＲＮＡが存在する細胞で通常は発現されないタンパク質をコードする。異種核酸及び異種タンパク質は、外来核酸又は外来タンパク質と呼ばれる場合もある。核酸又はタンパク質が発現される細胞に対して異種又は外来であると当業者が認識するであろう核酸又はタンパク質はいずれも、本明細書では、異種核酸又は異種タンパク質という用語に包含される。異種という用語は、核酸配列又はアミノ酸配列の非天然の組み合わせ、すなわち、組み合わせられた配列のうちの少なくとも２つが互いに対して外来である組み合わせにも適用される。
【００３２】
特記なき限り、「免疫グロブリン」及び「抗体」という用語は、本明細書において重鎖抗体を指すために使用されるか従来の４本鎖抗体を指すために使用されるかにかかわらず、完全サイズの抗体、抗体の個々の鎖、並びに抗体のすべての部分、ドメイン、又は断片（抗原結合性ドメイン又は断片、例えばそれぞれＶＨＨドメイン又はＶＨ／ＶＬドメインなどを含むがこれらに限定されない）の両方を含む一般的用語として使用される。さらに、本明細書で（例えば「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「可変ドメイン配列」、「ＶＨＨ配列」、又は「タンパク質配列」のような用語において）使用される「配列」という用語は、文脈上さらに具体的な解釈が必要な場合を除き、概して、関連するアミノ酸配列と、このアミノ酸配列をコードする核酸配列又はヌクレオチド配列との両方を含むものと理解されるべきである。
【００３３】
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖の可変ドメインは、「ＶＨ」、又は重鎖のみからなるラクダ科抗体などの重鎖抗体の場合は「ＶＨＨ」と呼ばれる場合がある。軽鎖の可変ドメインは、「ＶＬ」と呼ばれる場合がある。これらのドメインは、一般的に、抗体において最も可変性の高い部分であり、抗原結合部位を含む。「可変」という用語は、可変ドメインのうちの特定のセグメントの配列が抗体間で大きく異なるという事実を指す。Ｖドメインは抗原結合を媒介し、特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を定義する。しかしながら、可変性は、可変ドメインの平均１１０アミノ酸のスパンにわたって均一に分布してはいない。むしろ、Ｖ領域は、それぞれ約９〜１２アミノ酸長の「超可変領域」（ＨＶＲ）又は相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる可変性が極めて高い短い領域で区切られた、約１５〜３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的インバリアントな区間からなる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、大部分がβシート構成をとる４つのＦＲを含み、βシートは３つの超可変領域によって連結され、超可変領域はループを形成し、このループはβシート構造を連結し、場合によってはβシート構造の一部を形成する。各鎖における超可変領域は、ＦＲによって緊密にまとめられ、他方の鎖の超可変領域とともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ．（１９９１年）を参照されたい）。
【００３４】
「ＶＨＨ」、「ＶＨＨドメイン」、及び「ナノボディ」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、本明細書では、重鎖抗体、すなわち、例えばラクダ科抗体から公知のように重鎖のみからなり軽鎖を含まない抗体の可変ドメインを指すように使用される。ＶＨＨのアミノ酸配列及び構造は、当技術分野及び本明細書以下でそれぞれ「フレームワーク領域１」又は「ＦＲ１」、「フレームワーク領域２」又は「ＦＲ２」、「フレームワーク領域３」又は「ＦＲ３」、及び「フレームワーク領域４」又は「ＦＲ４」と呼ばれる４つのフレームワーク領域すなわち「ＦＲ」の間に、当技術分野でそれぞれ「相補性決定領域１」又は「ＣＤＲ１」、「相補性決定領域２」又は「ＣＤＲ２」、及び「相補性決定領域３」又は「ＣＤＲ３」と呼ばれる３つの相補性決定領域すなわち「ＣＤＲ」が介在する構成をとると考えることができるが、この構成に限定されるものではない。ＶＨＨにおけるアミノ酸残基の総数は１１０〜１２０の領域内でありえ、好ましくは１１２〜１１５であり、最も好ましくは１１３である。しかしながら、ＶＨＨの部分、断片、又は類似体（本明細書以下でさらに説明する）は、かかる部分、断片、又は類似体が、本明細書以下に概説するさらなる機能的要件を満たし、好ましくは本明細書に記載する目的に好適である限り、その長さ及び／又はサイズに関して特に限定されないことに留意されたい。
【００３５】
ＶＨＨ（又は従来の可変ドメイン）のアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔら（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、ＵＳ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．、論文番号９１）によって示されたＶＨドメインの一般的な付番法に従い、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ及びＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ（１９９９年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２３１巻：２５〜３８頁；例えば該参考文献の図２を参照されたい）によりラクダ科抗体のＶＨＨドメインに適用されるように付番される。この付番法によれば、ＶＨＨのＦＲ１は１〜３０位のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＣＤＲ１は３１〜３６位のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＦＲ２は３６〜４９位のアミノ酸を含み、ＶＨＨのＣＤＲ２は５０〜６５位のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＦＲ３は６６〜９４位のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＣＤＲ３は９５〜１０２位のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＦＲ４は１０３〜１１３位のアミノ酸残基を含む。この点において、当技術分野において周知のように、ＶＨドメイン及びＶＨＨドメインに関しては、ＣＤＲのそれぞれにおけるアミノ酸残基の総数が異なる場合があり、Ｋａｂａｔ付番法により示されるアミノ酸残基の総数に対応しない場合がある（つまり、Ｋａｂａｔ付番法に従う１つ又は複数の位置が、実際の配列では使用されていない場合があるか、又は実際の配列が、Ｋａｂａｔ付番法において可能な数よりも多くのアミノ酸残基を含む場合がある）ことに留意されたい。これが意味するのは、一般的に、Ｋａｂａｔによる付番法が、実際の配列におけるアミノ酸残基の実際の付番に対応する場合もあれば、対応しない場合もあるということである。しかしながら、一般的に、Ｋａｂａｔの付番法によれば、ＣＤＲにおけるアミノ酸残基の数とは無関係に、Ｋａｂａｔ付番法による１位はＦＲ１の始点に対応し、逆もまた同様であり、Ｋａｂａｔ付番法による３６位はＦＲ２の始点に対応し、逆もまた同様であり、Ｋａｂａｔ付番法による６６位はＦＲ３の始点に対応し、逆もまた同様であり、Ｋａｂａｔ付番法による１０３位はＦＲ４の始点に対応すると言うことができる。
【００３６】
ＶＨドメインのアミノ酸残基を付番する代替的方法で、ラクダ科抗体のＶＨＨドメインにも類似の様式で適用することができる方法は、Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２巻、８７７〜８８３頁）によって説明されている方法、いわゆる「ＡｂＭ定義」及びいわゆる「接触定義」である。しかしながら、本明細書、特許請求の範囲、及び図面では、特記なき限り、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ及びＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓによるＶＨＨドメインに適用されるＫａｂａｔによる付番法に従う。
【００３７】
重鎖抗体及び重鎖抗体の可変ＶＨＨドメインの概説に関しては、とりわけ、一般的な背景技術として挙げられる次の参考文献：国際公開第９４／０４６７８号、国際公開第９５／０４０７９号、国際公開第９６／３４１０３号、国際公開第９４／２５５９１号、国際公開第９９／３７６８１号、国際公開第００／４０９６８号、国際公開第００／４３５０７号、国際公開第００／６５０５７号、国際公開第０１／４０３１０号、国際公開第０１／４４３０１号、欧州特許第１１３４２３１号、国際公開第０２／４８１９３号、国際公開第９７／４９８０５号、国際公開第０１／２１８１７号、国際公開第０３／０３５６９４号、国際公開第０３／０５４０１６号、国際公開第０３／０５５５２７号、国際公開第０３／０５０５３１号、国際公開第０１／９０１９０号、国際公開第０３／０２５０２０号、国際公開第０４／０４１８６７号、国際公開第０４／０４１８６２号、国際公開第０４／０４１８６５号、国際公開第０４／０４１８６３号、及び国際公開第０４／０６２５５１号、並びにＨａｓｓａｎｚａｄｅｈ−Ｇｈａｓｓａｂｅｈら（２０１３年、Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ、８巻（６号）：１０１３〜１０２６頁）が参照される。フォンヴィルブランド因子又は血小板受容体ＧＰＩｂに対する単一ドメインＶＨＨ抗体のより具体的な説明については、国際公開第２００４／０６２５５１号及び国際公開第２００６／１２２８２５号が参照される。
【００３８】
一般的に、本明細書において最も広い意味で使用される「ＶＨＨ」（又はナノボディ）という用語は、特定の生物学的起源又は特定の調製方法に限定されないことに留意されたい。例えば、本発明で使用されるＶＨＨは、（１）天然に発生する重鎖抗体のＶＨＨドメインの単離、（２）天然に発生するＶＨＨドメインをコードするヌクレオチド配列の発現、（３）天然に発生するＶＨＨドメインの「ヒト化」（後述するとおり）若しくはかかるヒト化ＶＨＨドメインをコードする核酸の発現、（４）任意の動物種由来、特に哺乳動物の種、例えばヒト由来の天然に発生するＶＨドメインの「ラクダ化」、若しくはかかるラクダ化ＶＨドメインをコードする核酸の発現、（５）タンパク質、ポリペプチド、若しくは他のアミノ酸配列を調製するための合成技術若しくは半合成技術の使用、（６）核酸合成の技術を使用してＶＨＨをコードする核酸を調製した後に得られた核酸の発現、及び／又は（７）前述の内容の任意の組み合わせにより、得ることができる。前述の内容を行うために好適な方法及び技術は、現時点の技術水準であり、したがって当業者には公知である。
【００３９】
本発明で使用されるＶＨＨの特に好ましいクラスの１つには、天然に発生するＶＨＨドメインのアミノ酸配列に対応するが、「ヒト化されている」、すなわち、天然に発生する該ＶＨＨ配列のアミノ酸配列における１つ又は複数のアミノ酸残基が、ヒト由来の従来の４本鎖抗体のＶＨドメインの対応する位置（複数可）で生じるアミノ酸残基のうちの１つ又は複数で置換されている、アミノ酸配列を有するＶＨＨが含まれる。ヒト化は、当業者には明らかであろう本質的に公知の様式、例えば、ヒト化に関する、例えばＪｏｎｅｓら（Ｎａｔｕｒｅ  ３２１巻：５２２〜５２５頁、１９８６年）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（Ｎａｔｕｒｅ  ３３２巻：３２３〜３２９頁、１９８８年）、Ｐｒｅｓｔａ（Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２巻：５９３〜５９６頁、１９９２年）、Ｖａｓｗａｎｉ及びＨａｍｉｌｔｏｎ（Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１巻：１０５〜１１５頁１９９８年）、Ｈａｒｒｉｓ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ、２３巻：１０３５〜１０３８頁、１９９５年）、Ｈｕｒｌｅ及びＧｒｏｓｓ（Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、５巻：４２８〜４３３頁、１９９４年）などの先行技術、並びに、例えばＶｉｎｃｋｅら（２００９年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８４巻：３２７３〜３２８４頁）などのＶＨＨのヒト化に関する特定の先行技術に基づいて行うことができる。繰り返しになるが、かかる本発明のヒト化ＶＨＨは、本質的に公知である任意の好適な様式において得ることができ、したがって、出発材料として天然に発生するＶＨＨドメインを含むポリペプチドを使用して得られたポリペプチドに厳密に限定されるものではないことに留意されたい。
【００４０】
「ブロッキング」抗体又は「アンタゴニスト」抗体は、結合する抗原の生物学的活性を阻害又は低減するものである。好ましいブロッキング抗体又はアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を実質的又は完全に阻害する。本明細書において使用される「アゴニスト抗体」は、目的のポリペプチドの機能的活性のうちの少なくとも１つを模倣する抗体である。
【００４１】
「結合親和性」は、一般的に、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位と分子の結合パートナー（例えば、抗原又は標的）との間の非共有結合的相互作用の全体の強度を指す。特記なき限り、本明細書において使用される場合、「結合親和性」は、結合ペアのメンバー（例えば、抗体及び抗原／標的）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのパートナーＹに対する親和性は、一般的に、解離定数（Ｋｄ）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載されるものを含めた当技術分野において公知の一般的方法によって測定することができる。低親和性抗体は一般的に、抗原／標的にゆっくりと結合し、容易に解離する傾向にあるが、高親和性抗体は一般的に、より急速に抗原に結合し、より長く結合した状態を保つ傾向にある。結合親和性を測定する様々な方法が当技術分野において公知であり、そのいずれを本発明の目的に使用してもよい。特定の例示的な実施形態を以下に記載する。
【００４２】
「Ｋｄ」又は「Ｋｄ値」は、本明細書の実施例に記載するようにＥＬＩＳＡを使用すること、又は約１０〜５０反応単位（ＲＵ）で固定化抗原ＣＭ５チップとともに２５℃でビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）（商標）−２０００若しくはビアコア（商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用した表面プラズモン共鳴アッセイを使用することにより、測定することができる。簡潔に述べると、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．）を、供給元の説明に従い、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドハイドロクロライド（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化させる。抗原をｐＨ４．８の１０ｍＭ酢酸ナトリウムで５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）に希釈してから、５μｌ／分の流速で注入すると、およそ１０反応単位（ＲＵ）のタンパク質の結合が達成される。抗原の注入後、１Ｍのエタノールアミンを注入して未反応基をブロッキングする。動態を測定するには、抗体又はＦａｂ（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）の二倍段階希釈物を、２５℃で０．０５％のトゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）に、およそ２５μｌ／分の流速で注入する。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は、単純な一対一のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ評価ソフトウェアバージョン３．２）を使用し、会合及び解離のセンサグラムを同時に当てはめることによって計算される。平衡解離定数（Ｋｄ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として計算される。例えば、Ｃｈｅｎ，Ｙら（１９９９年）Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９３巻：８６５〜８８１頁を参照されたい。オン速度が上記の表面プラズモン共鳴アッセイによって１０６Ｍ−１Ｓ−１を超える場合、オン速度は、ストップフローを備えた分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）又は撹拌赤色キュベットを備えた８０００シリーズのＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計で測定されるような、漸増濃度の抗原の存在下におけるｐＨ７．２のＰＢＳ中の２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の２５℃における蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、帯域１６ｎｍ）の増加又は減少を測定する蛍光消光技術を使用することにより、決定することができる。
【００４３】
本発明に係る「オン速度」、又は「会合の速度」、又は「会合速度」、又は「ｋｏｎ」は、上述のようにビアコア（商標）−２０００又はビアコア（商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して、上述のものと同じ表面プラズモン共鳴を用いて決定することもできる。
【００４４】
「薬学的又は薬理学的に許容できる」という表現は、例えばヒトなどの動物に適切に投与したときに有害反応、アレルギー反応、若しくは他の不都合な反応をもたらさないか、又は許容できる反応をもたらす、分子的実体及び組成物を指す。特定の有害作用が許容できるかどうかは、疾患の重症度に基づいて決定される。少なくとも１つのキメラポリペプチド又はさらなる有効成分を含む医薬組成物の調製は、参照により本明細書に組み込まれる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」（Ａｌｌｅｎ，Ｌ．Ｖ編、第２２版、２０１２年、ｗｗｗ．ｐｈａｒｍｐｒｅｓｓ．ｃｏｍ）に例示されているように、本開示を踏まえれば、当業者に公知となるであろう。さらに、動物（例えばヒト）への投与の場合、調製物が、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓにより要求される無菌性、発熱性、一般的安全性、及び純度の基準を満たす必要があることは理解されよう。
【００４５】
本明細書において使用される場合、「薬学的に許容できる担体」は、当業者には公知であるように（例えば、参照により本明細書に組み込まれる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」（Ａｌｌｅｎ，Ｌ．Ｖ編、第２２版、２０１２年、ｗｗｗ．ｐｈａｒｍｐｒｅｓｓ．ｃｏｍ）を参照されたい）、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、色素などの材料及びこれらの組み合わせを含む。従来の担体が有効成分と不適合である場合を除いて、治療用組成物又は医薬組成物における従来の担体の使用が想定される。
【００４６】
公開配列データベースにおいてアクセス可能なヌクレオチド又はアミノ酸の配列が本明細書において言及される場合はいずれも、本文書の出願日に利用可能なバージョンの配列エントリーを参照する。
【００４７】
実施形態の説明
本発明者らは、驚くべきことに、ＭＶＴの部位へのプラスミノーゲン活性化の標的化が、ＴＴＰを処置するための実現可能なアプローチであることを見出した。ＴＴＰ患者は、血小板が超大型ＶＷＦと複合体を形成すると、ＭＶＴの発作を経験する。本発明者らは、ＴＴＰのマウスモデルにおける（ストレプトキナーゼによる）全身的なプラスミノーゲンの活性化に治療能があることを過去に報告したが、このことは、プラスミンがＡＤＡＭＴＳ１３の機能的代替物として作用しうることを示唆している（Ｔｅｒｓｔｅｅｇら、２０１４年、上記参照）。プラスミン（プラスミノーゲン）はＶＷＦに直接結合することができるが、天然のプラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ、ｕＰＡ）にはＶＷＦに直接結合することができない。さらに、微小血栓はフィブリンに乏しく、安全上の理由のため、全身的なプラスミノーゲンの活性化は避けることが望ましい。したがって、本発明は、治療有効性及び安全性を増大させるために、血栓形成性多量体タンパク質ＶＷＦのプラスミンによる切断を刺激することを目的とする。より詳細には、本発明は、フィブリン非依存性様式で、ＭＶＴのクリアランスのためにプラスミン活性を局所的に誘導するように、ＶＷＦ、血小板、又は活性化／損傷した（微小）血管内皮細胞のいずれかに結合する能力を獲得した、改変されたプラスミノーゲン活性化因子に関する。本発明はさらに、ＭＶＴの部位に対するプラスミノーゲン活性化の局所送達／刺激によって防止又は処置されうる病態の治療方法を提供する。
【００４８】
したがって、第１の態様において、本発明は、プラスミノーゲン活性化因子と、ＶＷＦ及び血小板のうちの少なくとも１つを含む血栓の部位にプラスミノーゲン活性化因子を標的化するための標的化因子とを含む、融合タンパク質に関する。標的化因子が本発明の融合タンパク質を標的化する血栓部位は、原理上、大血管血栓及び微小血管血栓（ＭＶＴ）の部位、並びに（未だ）非閉塞性の大血管血栓又は微小血管血栓の部位を含む、血栓が存在又は発生している任意の部位でありうる。しかしながら、本発明の融合タンパク質は、フィブリンに乏しいが、ＶＷＦ、血小板、及び血管内皮の活性化又は損傷の可能性がある場所を含む、ＭＶＴの部位の排除を（また）目的とする。したがって、本発明の融合タンパク質中の標的化因子は、ＶＷＦ、血小板、及び活性化又は損傷した血管内皮のうちの少なくとも１つに特異的に結合する標的化因子であることが好ましい。
【００４９】
標的化因子は、ＶＷＦ、血小板、及び活性化又は損傷した血管内皮のうちの少なくとも１つに特異的に結合する任意のリガンド又は結合性分子でありうる。しかしながら、標的化因子は、タンパク質性標的化因子であることが好ましい。より好ましくは、タンパク質性標的化因子は、融合タンパク質の単一のアミノ酸鎖の一部であり、この鎖は、プラスミノーゲン活性化因子も含む。
【００５０】
目的の標的、例えばＶＷＦ、血小板、又は活性化／損傷した内皮に「結合する」標的化因子は、標的を発現又は露出させるＭＶＴ、細胞、又は組織のような構造体を標的化する際に標的化因子が治療剤として有用となるような十分な親和性で標的に結合し、他のタンパク質又は分子と著しく交差反応しない薬剤である。このような実施形態において、「非標的」分子（例えばタンパク質）に対する標的化因子の結合の程度は、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）分析又は放射性免疫沈降法（ＲＩＡ）によって判定した場合、特定の標的分子に対する標的化因子の結合の約１０％未満になる。標的分子に対する標的化因子の結合に関し、「特異的結合」、又は特定の標的分子若しくはポリペプチド、例えば特定のポリペプチド標的におけるエピトープに「特異的に結合する」若しくは「結合する」若しくは「特異的である」という用語は、非特異的相互作用とは測定可能に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、一般的に結合活性を有しない同様の構造の分子である対照分子の結合と比較した分子の結合を判定することによって測定することができる。例えば、特異的結合は、標的と類似する対照分子、例えば過剰量の標識されていない標的との競合によって判定することができる。この場合、標識された標的のプローブに対する結合が、過剰量の標識されていない標的によって競合的に阻害されれば、特異的結合が示される。本明細書で使用される、「特異的結合」、又は特定のポリペプチド若しくは特定のポリペプチド標的におけるエピトープに「特異的に結合する」若しくは「特異的である」という用語は、例えば、標的に対するＫｄ（上述のように判定されうる）が少なくとも約１０−４Ｍ、或いは少なくとも約１０−５Ｍ、或いは少なくとも約１０−６Ｍ、或いは少なくとも約１０−７Ｍ、或いは少なくとも約１０−８Ｍ、或いは少なくとも約１０−９Ｍ、或いは少なくとも約１０−１０Ｍ、或いは少なくとも約１０−１１Ｍ、或いは少なくとも約１０−１２Ｍ、又はそれ以上である分子によって示されうる。一実施形態において、「特異的結合」という用語は、標的化因子が特定の標的分子、ポリペプチド、又は特定のポリペプチドにおけるエピトープに結合し、いかなる他の分子、ポリペプチド、又はエピトープにも実質的に結合しないような結合を指す。
【００５１】
本発明の一実施形態において、融合タンパク質中の標的化因子は、フォンヴィルブランド因子（ＶＷＦ）、好ましくはヒトＶＷＦに特異的に結合する。基本的なヒトＶＷＦ単量体は、２０５０アミノ酸のタンパク質である。すべての単量体には、例えば、第ＶＩＩＩ因子に結合するＤ’／Ｄ３ドメイン、血小板ＧＰＩｂ受容体に特に結合するＡ１ドメイン、Ａ２ドメイン（大幅に小さい多量体を作ることによりＶＷＦを不活性化する特異的なＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼの隠れた切断部位を露出させるために部分的にほどける必要がある）、コラーゲンに結合するＡ３ドメイン、Ｃ１ドメイン（血小板インテグリンαＩＩｂβ３が活性化するとインテグリンαＩＩｂβ３にＲＧＤモチーフが結合する）、及び「システインノット」ドメイン（タンパク質のＣ末端における）を含め、特異的な機能を有するいくつかの特異的なドメインが含まれる。ＶＷＦの多量体は、極めて大きく２０，０００ｋＤａを超えることがあり、８０個を超えるそれぞれ２５０ｋＤａのサブユニットからなることがある。ＶＷＦの主な機能は、他のタンパク質、特に第ＶＩＩＩ因子に結合することであり、これは創傷部位への血小板の粘着において重要である。ＶＷＦは酵素ではないため、触媒活性を有しない。ＶＷＦは、例えばコラーゲン（例えば、血管に生じた損傷に起因して内皮細胞で露出した場合）、及び血小板ＧＰ１Ｂ受容体を含め、いくつかの細胞及び分子に結合する。後者の結合はあらゆる状況下で起こるが、高せん断応力（すなわち、狭い血管内の急速な血流）下で最も効率的である。ＶＷＦは、他の血小板受容体が例えばトロンビンによって活性化されると（すなわち、凝血が刺激されると）、こうした血小板受容体に結合する。
【００５２】
本発明の融合タンパク質中の標的化因子は、ＶＷＦのありとあらゆる形態、立体構造、ドメイン、及びエピトープに特異的に結合することができる。したがって、標的化因子は、折り畳まれていない（活性化型）立体構造のＶＷＦ、及び球状（循環中の非活性化型）立体構造のＶＷＦ（ｓＶＷＦ）のうちの少なくとも１つに特異的に結合することができる。一実施形態において、標的化因子は、少なくとも折り畳まれていないＶＷＦに結合し、好ましくは、標的化因子は、球状ＶＷＦよりも折り畳まれていないＶＷＦに優先的に結合し（すなわち、球状ＶＷＦよりも折り畳まれていないＶＷＦに対して高い親和性を有し）、より好ましくは、標的化因子は、折り畳まれていない（活性化型）立体構造のＶＷＦに結合し、循環中の非活性化型球状形態のＶＷＦには結合しない。より詳細には、本発明の融合タンパク質中の標的化因子は、ＶＷＦ  Ａ１ドメイン、活性化ＶＷＦのＡ１ドメイン、ＶＷＦ  Ａ２ドメイン、活性化ＶＷＦのＡ２ドメイン、ＶＷＦ  Ａ３ドメイン、及びＶＷＦ  Ｄ３ドメインのうちの少なくとも１つに特異的に結合する。ＶＷＦに結合する標的化因子の好適な例は、以下にさらに詳述するように、本明細書の実施例で使用したＶＨＨラクダ科抗体断片である。
【００５３】
本発明の別の実施形態では、融合タンパク質中の標的化因子は、血小板（ｐｌａｔｅｌｅｔ）（血小板（ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｅ）ともいう）、好ましくはヒト血小板に特異的に結合する。ＶＷＦとともに、血小板はＭＶＴの主成分であり、したがって、本発明の融合タンパク質中の標的化因子の好適な標的でもある。本発明の融合タンパク質中の標的化因子は、ありとあらゆる形態の血小板に特異的に結合することができる。したがって、標的化因子は、活性化血小板及び非活性化血小板のうちの少なくとも１つに特異的に結合することができる。好ましくは、標的化因子は（少なくとも）非活性化血小板に結合する。大血管血栓症又は通常の血栓症とは異なり、ＭＶＴは活性化血小板を必然的に含み、特に非活性化血小板は（ＶＷＦとともに）、例えばＴＴＰのＭＶＴにおける問題を引き起こしている。したがって、融合タンパク質中の標的化因子は、活性化血小板のみに特異的に結合する（非活性化血小板には特異的に結合しない）標的化因子でないことが好ましい。より詳細には、標的化因子は、例えばＳｃｈｗａｒｚら（２００４年、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１８巻：１７０４〜１７０６頁）によって説明されている一本鎖抗体ＳＣＥ５など、血小板にあるＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体の活性化型のみに特異的に結合する標的化因子ではないことが好ましい。したがって標的化因子は、好ましくは、非活性型のインテグリンαＩＩｂ／βＩＩＩに特異的に結合する。好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質中の標的化因子は、ａ）血小板ＧＰ１Ｂ受容体、及びｂ）血小板のインテグリンαＩＩｂ／βＩＩＩのうちの少なくとも１つに特異的に結合する。しかしながら、血小板ＧＰ１Ｂ受容体に特異的に結合する標的化因子が好ましい。血小板に結合する好適な標的化因子は、例えば、Ｆｏｎｔａｙｎｅら（２００６年、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．９６巻（５号）：６７１〜８４頁）によって説明されている抗ＧＰＩｂα抗体６Ｂ４、又は本明細書の実施例で使用した抗ＧＰ１ＢのＶＨＨ抗体断片によって例示されるように、当技術分野において公知である。
【００５４】
本発明のさらなる実施形態では、融合タンパク質中の標的化因子は、活性化、損傷、及び／又は疲弊した内皮（以降、本明細書では活性化した内皮と総称する）に特異的に結合する。活性化した内皮は、好ましくは活性化した血管内皮、より好ましくは活性化した微小血管内皮である。したがって、標的化因子は、活性化した内皮によって優先的に発現される受容体、及び活性化した内皮の膜マーカーのうちの少なくとも１つに特異的に結合することができる。好ましくは、活性化した内皮によって優先的に発現される受容体は、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、ｕＰＡＲ、ｃ１ｑ受容体、キニンＢ１受容体、プラスミノーゲン受容体ＫＴ（ＰＬＧＲ−ＫＴ）、内皮タンパク質Ｃ受容体、トロンボモジュリン、ｎ−カドヘリン、ＩＣＡＭ−１、及びＶＣＡＭ−１からなる群から選択される。好ましくは、活性化した内皮の膜マーカーは、アニオン性リン脂質、ホスファチジルセリン、及びホスファチジルエタノールアミンのうちの１つ又は複数である。
【００５５】
本発明の融合タンパク質の一実施形態において、上記に定義した標的のうちの１つに特異的に結合する標的化因子は、好ましくは、ａ）該標的のうちの１つに特異的に結合する抗体可変ドメイン、及びｂ）該標的のうちの１つに天然に結合するタンパク質由来の結合性ドメインのうちの少なくとも１つを含む。
【００５６】
本発明の融合タンパク質中に標的化因子として存在する好ましい抗体可変ドメインは、本明細書上記に定義したＶＨＨであり、より好ましくは、抗体可変ドメインはヒト化ＶＨＨである。
【００５７】
好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質中に標的化因子として存在するＶＨＨは、ＶＷＦに特異的に結合するＶＨＨである。ＶＷＦに結合し、標的化因子として本発明の融合タンパク質の一部であるＶＨＨの好適な例は、本明細書の実施例における融合タンパク質の一部であるか、又は参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３／０１３６７３６号Ａ１に記載されている、ＶＷＦ結合性ＶＨＨである。
【００５８】
可溶性球状ＶＷＦに結合し、本発明の融合タンパク質中に標的化因子として存在する好ましいＶＨＨは、配列番号７の５５〜１７８位のアミノ酸配列を有するＶＨＨ−ｓＶＷＦ、又は配列番号７の５５〜１７８位と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８若しくは９９％の配列同一性をもつアミノ酸配列を有し、ＶＷＦに対するＫｄが１、０．５、０．２、０．１、０．０５若しくは０．０３０６ｎＭ未満のＶＨＨである。
【００５９】
ＶＷＦのＤ３ドメインに結合し、本発明の融合タンパク質中に標的化因子として存在する好ましいＶＨＨは、配列番号８の５５〜１７８位のアミノ酸配列を有するＶＨＨ−Ｄ３、又は配列番号８の５５〜１７８位と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８若しくは９９％の配列同一性をもつアミノ酸配列を有し、ＶＷＦに対するＫｄが１、０．５、０．４、０．３５、若しくは０．３３ｎＭ未満のＶＨＨである。
【００６０】
ＶＷＦのＡ１ドメインに結合し、本発明の融合タンパク質中に標的化因子として存在する好ましいＶＨＨは、配列番号１１の５５〜１７９位のアミノ酸配列を有するＶＨＨ−Ａ１２、又は配列番号１１の５５〜１７９位と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８若しくは９９％の配列同一性をもつアミノ酸配列を有し、ＶＷＦに対するＫｄが２５、２０、１８、１５若しくは１３ｎＭ未満のＶＨＨである。ＶＷＦのＡ１ドメインに結合し、本発明の融合タンパク質中に標的化因子として存在する別の好ましいＶＨＨは、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＨＨ若しくは配列番号１４のアミノ酸配列を有するそのヒト化バージョン、又は配列番号１３若しくは１４と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８若しくは９９％の配列同一性をもつアミノ酸配列を有し、ＶＷＦに対するＫｄが１０、５若しくは２ｎＭ未満のＶＨＨである。
【００６１】
血小板ＧＰ１Ｂ受容体に結合し、本発明の融合タンパク質中に標的化因子として存在する好ましいＶＨＨは、配列番号１２の５５〜１７８位のアミノ酸配列を有するＶＨＨ−ＧＰ１Ｂ１７、又は配列番号１２の５５〜１７８位と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８若しくは９９％の配列同一性をもつアミノ酸配列を有し、血小板ＧＰ１Ｂ受容体に対するＫｄが２０、１５、１０、５、２、１、０．５、０．２若しくは０．１ｎＭ未満のＶＨＨである。血小板ＧＰ１Ｂ受容体に結合し、本発明の融合タンパク質中に標的化因子として存在する他の好ましいＶＨＨは、配列番号２０の５５〜１７５位、配列番号２１の５５〜１７８位、配列番号２２の５５〜１７２位、配列番号２３の５５〜１７１位、配列番号２４の５５〜１７４位、配列番号２５の５５〜１７６位、配列番号２６の５５〜１７８位、配列番号２７の５５〜１７８位、配列番号２８の５５〜１７８位、配列番号２９の５５〜１６６位、配列番号３０の５５〜１８０位、配列番号３１の５５〜１７６位、配列番号３２の５５〜１７６位、配列番号３３の５５〜１７９位、配列番号３４の５５〜１７９位、配列番号３５の５５〜１７７位、配列番号３６の５５〜１７８位、及び配列番号３７の５５〜１８１位のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するか、又は、この群のアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８若しくは９９％の配列同一性をもち、血小板ＧＰ１Ｂ受容体に対するＫｄが２０、１５、１０、５、２、１、０．５、０．２若しくは０．１ｎＭ未満のアミノ酸配列を有する。
【００６２】
ＶＷＦのＡ１ドメインに結合する別の好ましいＶＨＨは、配列番号４６と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％の配列同一性をもつアミノ酸配列を含む。好ましくは、ＶＷＦのＡ１ドメインに結合し、配列番号４６のアミノ酸配列を含むＶＨＨは、本発明の融合タンパク質中に標的化因子として存在し、配列番号４５のアミノ酸配列を有するＶＨＨ若しくは配列番号４４のアミノ酸配列を有するそのヒト化バージョン、又は配列番号４４若しくは４５と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８若しくは９９％の配列同一性をもつアミノ酸配列を有し、ＶＷＦに対するＫｄが１０、５若しくは２ｎＭ未満のＶＨＨである。
【００６３】
本発明の融合タンパク質の別の実施形態では、ＶＷＦ、血小板、及び活性化又は損傷した血管内皮のうちの少なくとも１つに特異的に結合する標的化因子は、ＶＷＦ、血小板、及び活性化又は損傷した血管内皮のうちの少なくとも１つに天然に結合するタンパク質由来の結合性ドメインを含む。好ましくは、結合性ドメインは、ｉ）ＶＷＦのＡ１ドメイン、又は血小板ＧＰ１Ｂ受容体に結合するＶＷＦ  Ａ１ドメインの少なくとも一部、ｉｉ）ＡＤＡＭＴＳ１３、第ＸＩＩ因子、第Ｈ因子（補体調節因子）、プラスミノーゲン、及び第ＶＩＩＩ因子のうちの１つのＶＷＦ結合性ドメイン、これらのドメインのうち少なくともＶＷＦに結合する部分、並びにｉｉｉ）活性化又は損傷した血管内皮の膜（複数可）に結合するドメインであって、ビタミンＫ依存性カルボキシル化／ガンマカルボキシグルタミン酸（ＧＬＡ）ドメイン、第Ｖ因子のＣドメイン、及び第ＶＩＩＩ因子のＣドメインから選択されるドメインからなる群から選択される、結合性ドメインを含む。
【００６４】
本発明の一実施形態において、融合タンパク質は、２種以上の標的化因子を含む。したがって、融合タンパク質は、例えば２種、３種、４種、５種、６種、又はそれ以上の標的化因子を含んでもよい。２種以上の標的化因子が融合タンパク質中に存在する場合、２コピー以上の同じ標的化因子が融合タンパク質中に存在してもよい。或いは、融合タンパク質は、少なくとも２つの異なる標的化因子を含んでもよい。例えば、融合タンパク質は、ＶＷＦの少なくとも２つの異なるドメイン又は血小板にある少なくとも２つの異なる受容体に（それぞれ）結合する少なくとも２つの異なる標的化因子を含んでもよい。又は、融合タンパク質は、少なくとも２つの異なる標的化因子を含み、そのうち少なくとも１つの標的化因子がＶＷＦに結合し、少なくとも１つの他の標的化因子が血小板に結合してもよい。２種以上の標的化因子を融合タンパク質に組み込むことの利点は、ＭＶＴの部位における多価結合のアビディティ、すなわち個々の標的化因子による個々の結合相互作用の複数の親和性の累積強度である。２種以上の標的化因子が融合タンパク質中に存在する場合、個々の標的化因子は、タンデム配置されることが好ましく、個々の標的化因子同士の間に好適な（可動性）スペーサーアミノ酸配列又はリンカーアミノ酸配列が存在することが好ましい。
【００６５】
好適な可動性リンカーアミノ酸配列は、当技術分野で（例えば、Ｃｈｅｎら、２０１３年、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．６５巻（１０号）：１３５７〜１３６９頁から）公知である。可動性リンカーは通常、結合されるドメインがある程度の動き又は相互作用を必要とする場合に適用される。可動性リンカーは概して、小さく非極性のアミノ酸（例えばＧｌｙ）又は極性のアミノ酸（例えばＳｅｒ又はＴｈｒ）から構成される。これらのアミノ酸はサイズが小さいため可動性がもたらされ、連結する機能的ドメインの易動性が可能になる。Ｓｅｒ又はＴｈｒの組み込みは、水分子と水素結合を形成することによって水溶液中のリンカーの安定性を維持することができ、したがって、リンカーとタンパク質部分との間の好ましくない相互作用を低減させる。好ましい可動性リンカーは、Ｇｌｙ及びＳｅｒ残基の区間（「ＧＳ」リンカー）から主になる配列を有する。好ましい（そして広く使用されている）可動性リンカーの一例は、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎの配列を有する。コピー数「ｎ」を調節することにより、このＧＳリンカーの長さを最適化して、機能性ドメインの適切な分離を達成したり、又は必要なドメイン間相互作用を維持したりすることができる。ＧＳリンカーに加えて、多くの他の可動性リンカーが組換え融合タンパク質のために設計されている。こうした可動性リンカーはまた、Ｇｌｙ及びＳｅｒなどの小型又は極性のアミノ酸に富むが、例えば、生理活性のあるｓｃＦｖの構築のために適用されている可動性リンカーＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号３８）及びＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ（配列番号３８）のように、可動性を維持するためのＴｈｒ及びＡｌａなどのさらなるアミノ酸、並びに可溶性を向上させるためのＬｙｓ及びＧｌｕなどの極性アミノ酸を含んでもよい。
【００６６】
ＭＶＴへ標的化するための上述の１つ又は複数の標的化因子に加えて、本発明の融合タンパク質は、プラスミノーゲン活性化因子を少なくともさらに含む。プラスミノーゲン活性化因子は、チモーゲン型プラスミノーゲンのタンパク質分解性切断を介してプラスミンの活性化を触媒するセリンプロテアーゼである。プラスミンは線維素溶解において重要な因子であるが、本発明の範囲では、ＭＶＴに対するフィブリン非依存性血栓溶解活性のためにプラスミノーゲン活性化に依存する。したがって、本発明に係る融合タンパク質は、プラスミノーゲン活性化因子を含み、このプラスミノーゲン活性化は、好ましくは、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、プラスミノーゲン、ストレプトキナーゼ、又はスタフィロキナーゼの（触媒的）プロテアーゼドメインを含む。ｔＰＡ、ｕＰＡ、プラスミノーゲン、ストレプトキナーゼ、及びスタフィロキナーゼの触媒的プロテアーゼドメインは、当技術分野において周知である。本発明の融合タンパク質への組み込みに好ましいプラスミノーゲン活性化触媒的プロテアーゼドメインは、配列番号１の１６〜２６８位のアミノ酸配列を含む、ｕＰＡの、好ましくはヒトｕＰＡの触媒的プロテアーゼドメイン、又は配列番号１９の１５〜２６６位のアミノ酸配列を含む、ｔＰＡの、好ましくはヒトｔＰＡの触媒的プロテアーゼドメインである。
【００６７】
本発明の融合タンパク質に組み込むための触媒的ドメインプロテアーゼドメインが、ｕＰＡの、好ましくはヒトｕＰＡの触媒的プロテアーゼドメインである一実施形態において、（ヒト）ｕＰＡドメインは、その配列に（ヒト）ｕＰＡを安定化する変異を含む。安定化変異は、全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，４７２，６９２号及びＳｕｎら（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９７年９月１９日；２７２巻（３８号）：２３８１８〜２３８２３頁）によって説明されている。好ましい一実施形態において、触媒的ドメインプロテアーゼは、配列番号１の１５７位に位置するリジン（Ｋ）がヒスチジン（Ｈ）に変異した配列番号１を含むもの、及び／又はそれからなるものである。好ましい一実施形態において、触媒的ドメインプロテアーゼは、配列番号２の１５８位に位置するリジン（Ｋ）がヒスチジン（Ｈ）に変異した配列番号２を含むもの、及び／又はそれからなるものである。
【００６８】
一実施形態において、本発明の融合タンパク質に組み込まれるプラスミノーゲン活性化因子は、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子１（ＰＡＩ−１）などのプラスミノーゲン活性化因子の天然の阻害因子に対する感受性が低減している触媒的プロテアーゼドメインのバリアントを含む。このようなバリアントには、例えば、ＰＡＩ−１との相互作用に関与するエキソサイトループ、例えば、ｕＰＡのプロテアーゼドメインにおける３７ループ及び１４７ループ、又はｔＰＡのプロテアーゼドメインにおける類似のループ、例えば３７ループ、６０ループ、９７ループ、１４７ループ、及び２１７ループなどに、１つ又は複数の修飾を有するｕＰＡ又はｔＰＡのプロテアーゼドメインのバリアントが含まれる（Ｌｉｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１１年３月４日；２８６巻（９号）：７０２７〜７０３２頁を参照されたい）。このような修飾の例は、ＰＡＩ−１との相互作用に特異的なエキソサイトの欠失（ｔＰＡ  ｄｅｌ  ２９６−３０２）、又はＰＡＩ−１との相互作用を特異的に媒介する特定のアミノ酸の置換（ｔＰＡ  Ａｒｇ→Ｇｌｕ  ３０４又はＡｒｇ→Ｓｅｒ  ３０４）である（Ｍａｄｉｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ．１９８９年６月２９日；３３９巻（６２２７号）：７２１〜４頁）。
【００６９】
好ましい実施形態において、本発明の融合タンパク質に組み込まれるプラスミノーゲン活性化因子は、そのプロテアーゼドメインのすぐ上流（Ｎ末端側）にプラスミノーゲン活性化因子において天然に発生する連結ペプチドのシステイン含有部分を少なくともさらに含む。システインを含む連結ペプチドの存在は、プロテアーゼドメインにおける対応するシステインが不要なジスルフィド架橋を形成することを回避する。
【００７０】
本発明の融合タンパク質に組み込まれるプラスミノーゲン活性化因子に含めるのに好ましい連結ペプチドは、ａ）配列番号１６のアミノ酸１７〜２７を少なくとも含むｕＰＡの連結ペプチド、より好ましくは配列番号１６のアミノ酸１３〜２７を少なくとも含む連結ペプチド、ｂ）配列番号１７のアミノ酸３〜１４を少なくとも含むｔＰＡの連結ペプチド、より好ましくは配列番号１７のアミノ酸１〜１４を少なくとも含む連結ペプチド、又はｃ）配列番号１８のアミノ酸５〜１８を少なくとも含むプラスミノーゲンの連結ペプチド、より好ましくは配列番号１８のアミノ酸１〜１８を少なくとも含む連結ペプチドである。
【００７１】
別の好ましい実施形態において、本発明の融合タンパク質は、好ましくは、一方の１つ又は複数の標的化因子と、他方のプラスミノーゲン活性化因子との間に位置するリンカーアミノ酸配列を含む。したがって、プラスミノーゲン活性化因子が、例えば上述のような連結ペプチドを含む場合、リンカーアミノ酸配列は、プラスミノーゲン活性化因子の連結ペプチドの上流に位置することが理解される。標的化因子とプラスミノーゲン活性化因子とを結合させるリンカーアミノ酸配列は、好ましくは、上述のような可動性リンカーアミノ酸配列である。標的化因子とプラスミノーゲン活性化因子とを結合させる好ましいリンカーアミノ酸配列は、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎの配列を有し、式中、ｎは１〜４、より好ましくは２又は３、最も好ましくは２である。特に好ましいリンカーアミノ酸配列は、配列番号６のアミノ酸配列を有する。
【００７２】
したがって、本発明に係る好ましい融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端の順に、ａ）上記に定義した１つ又は複数の標的化因子であって、任意選択で上記に定義したリンカーアミノ酸配列によって結合している、標的化因子と、ｂ）任意選択で、上記に定義したリンカーアミノ酸配列と、ｃ）上記に定義したプラスミノーゲン活性化因子とを含む、融合タンパク質である。融合タンパク質は、望ましくないアミノ酸配列（例えば単離タグ）を融合タンパク質から切断することができるように、例えば単離タグ、例えばＨｉｓタグ若しくはＳＴＲＥＰ単離タグなど、又は特異的なプロテアーゼによってのみ認識される切断部位、例えばタバコエッチウイルス切断部位などを含む、さらなる機能的エレメントをさらに含んでもよい。本発明に係る好ましい融合タンパク質の構成の一例が図１Ａ及び図１Ｂに示されており、ここで、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、融合タンパク質の上流にある、タンパク質が産生される細胞からのタンパク質の分泌を指示する（Ｉｇκ）シグナル配列もコードする。
【００７３】
第２の態様において、本発明は、上記に定義した本発明の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、好ましくは、融合タンパク質に作動可能に連結したシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。本発明の融合タンパク質の分泌を指示するのに好ましいシグナルペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を有するＩｇκシグナルペプチドである。本発明の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子は、好ましくは、適切な宿主細胞における融合タンパク質の発現を助ける調節エレメントをさらに含み、この調節エレメントは、ヌクレオチド配列に作動可能に連結している。
【００７４】
第３の態様において、本発明は、本発明に係る核酸分子を含むベクターに関する。任意選択で、本発明に係るベクターは、遺伝子療法ベクターである。
【００７５】
好ましくは、遺伝子療法ベクターは、ウイルス遺伝子療法ベクター、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、腫瘍溶解性ウイルスベクター、及びレトロウイルスに基づく遺伝子療法ベクターから選択されるウイルス遺伝子療法ベクターである。好ましいウイルス遺伝子療法ベクターは、ＡＡＶベクター又はレンチウイルスベクターである。
【００７６】
第４の態様において、本発明は、本発明に係るベクターを含む宿主細胞に関し、この宿主細胞は、本発明に係る融合タンパク質を発現する。
【００７７】
細胞は、好ましくは、単離細胞又は培養細胞である。用いることができる宿主細胞には、原核細胞、酵母細胞、又は高等真核細胞がある。原核生物としては、グラム陰性生物又はグラム陽性生物、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）又は桿菌（ｂａｃｉｌｌｉ）が挙げられる。高等真核細胞としては、昆虫細胞及び哺乳動物起源の樹立細胞株が挙げられる。好適な哺乳動物宿主細胞株の例としては、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（Ｇｌｕｚｍａｎら、１９８１年、Ｃｅｌｌ  ２３巻：１７５頁）、Ｌ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞株、及びＭｃＭａｈａｎら、１９９１年、ＥＭＢＯ  Ｊ．１０巻：２８２１頁に記載されているアフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶＩに由来するＣＶＩ／ＥＢＮＡ細胞株が挙げられる。細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、及び哺乳動物細胞の宿主で使用するのに適切なクローニングベクター及び発現ベクターは、Ｐｏｕｗｅｌｓら（Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８５年）によって説明されている。
【００７８】
宿主細胞が本発明に係る融合タンパク質を発現することを促進する条件下で形質転換細胞を培養することができる。したがって、一態様において、本発明は、本発明に係る融合タンパク質の発現を助ける条件下で、本明細書で定義する少なくとも１つの発現ベクターを含む細胞を培養するステップと、任意選択で、本発明に係る融合タンパク質を回収するステップとを含む、本発明に係る融合タンパク質を生成する方法に関する。
【００７９】
本発明に係る融合タンパク質は、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又は例えばストレプトアビジン／ビオチンを使用した親和性クロマトグラフィーを含む従来のタンパク質精製手段によって回収することができる（例えば、Ｌｏｗら、２００７年、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ、８４８巻：４８〜６３頁、Ｓｈｕｋｌａら、２００７年、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ、８４８巻：２８〜３９頁を参照されたい）。
【００８０】
第５の態様において、本発明は、本発明に係る融合タンパク質、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター若しくは遺伝子療法ベクター、又は本発明に係る宿主細胞、及び薬学的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物、及び／又はそれらからなる医薬組成物に関する。
【００８１】
医薬組成物は、好ましくは、少なくとも１つの薬学的に許容できる担体をさらに含む。アジュバント又はビヒクルなどの薬学的に許容できる担体は、抗体又は抗体断片を対象に投与するためのものである。該医薬組成物は、有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することによる、本明細書以下に記載される処置方法において使用することができる。「対象」という用語は、本明細書において使用される場合、哺乳動物に分類されるすべての動物を指し、霊長類及びヒトを含むが、これらに制限されない。対象は、好ましくは、任意の年齢又は人種の男性又は女性のヒトである。
【００８２】
「薬学的に許容できる担体」という用語は、本明細書において使用される場合、薬学的投与に適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含むことが意図される（例えば、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」、Ｒｏｗｅら編、第７版、２０１２年、ｗｗｗ．ｐｈａｒｍｐｒｅｓｓ．ｃｏｍを参照されたい）。このような媒体及び薬剤の薬学的に活性な物質のための使用は、当技術分野において周知である。従来の媒体又は薬剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、組成物における従来の媒体又は薬剤の使用が想定される。許容できる担体、賦形剤、又は安定剤は、用いられる投与量及び濃度においてレシピエントに無毒であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などのバッファー、アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤、保存剤（例えば塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルアルコール若しくはベンジルアルコール、メチルパラベン若しくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾール）、低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリジンなどのアミノ酸、グルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む単糖、二糖、及び他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース、若しくはソルビトールなどの糖、ナトリウムなどの塩形成対イオン、金属複合体（例えばＺｎ２＋−タンパク質複合体）、及び／又はトゥイーン（商標）、プルロニックス（ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ）（商標）、若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
【００８３】
補足的な活性化合物を本発明の医薬組成物に組み込むこともできる。したがって、特定の実施形態において、本発明の医薬組成物は、処置されている特定の適応症に必要であれば、２種以上の活性化合物、好ましくは互いに有害な影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを含んでもよい。例えば、化学療法剤、サイトカイン、鎮痛剤、血栓溶解剤、又は免疫調節剤、例えば、免疫抑制剤又は免疫刺激剤をさらに供給することが望ましい場合がある。このような他の活性剤の有効量は、数ある中でもとりわけ、医薬組成物中に存在する本発明の抗体の量、疾患若しくは障害又は処置のタイプなどに左右される。
【００８４】
ある実施形態では、本発明に係る融合タンパク質は、インプラント及びマイクロカプセル化された送達系、例えばリポソームを含む、徐放製剤のように、該化合物が身体から急速に排除されることを防ぐ担体とともに調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの生物分解性、生体適合性のポリマーを使用してもよい。このような製剤の調製方法は、当業者には明らかであろう。標的化リポソームを含むリポソーム懸濁液も、薬学的に許容できる担体として使用することができる。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号又は国際公開第２０１０／０９５９４０号に記載されているような、当業者に公知の方法に従って調製することができる。
【００８５】
本発明に係る融合タンパク質の投与経路は、非経口でありうる。本明細書で使用される「非経口」という用語には、静脈内投与、動脈内投与、リンパ内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、直腸投与、又は腟内投与が含まれる。静脈内形態の非経口投与が好ましい。「全身投与」とは、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、及び筋肉内投与を意味する。治療効果又は予防効果のために必要とされる融合タンパク質の量は、当然ながら、選択される融合タンパク質、処置されている病態の性質及び重症度、並びに患者によって異なる。さらに、融合タンパク質は、例えば、漸減用量の融合タンパク質を用いるパルス注入によって好適に投与されうる。好ましくは、投薬は、投与が短時間であるか、又は慢性であるかに部分的に応じて、注射、最も好ましくは静脈内注射又は皮下注射によって行われる。
【００８６】
したがって、特定の実施形態において、本発明の医薬組成物は、例えば適切な単位剤形における無菌溶液、懸濁液、又は凍結乾燥生成物など、非経口投与に好適な形態であってもよい。注射用途に好適な医薬組成物は、無菌の水溶液（水溶性の場合）又は分散液、及び無菌の注射液又は分散液の即時調製のための無菌粉末を含む。静脈内投与の場合、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）、又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。いずれの場合においても、組成物は無菌でなければならず、容易なシリンジ操作性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動的であるべきである。組成物は、製造及び保管の条件下で安定である必要があり、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から保護される必要がある。担体は、例えば水、エタノール、薬学的に許容できるポリオール、例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの好適な混合物を含む溶媒又は分散媒とすることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合は必要な粒径の維持、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、又は塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい。
【００８７】
注射用組成物の長期にわたる吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に含めることによってもたらされうる。
【００８８】
無菌注射液は、必要量の活性化合物（例えば融合タンパク質）を、必要に応じて上記に列挙した成分のうちの１つ又は成分の組み合わせとともに、適切な溶媒に組み込んだ後、滅菌濾過を行うことによって調製することができる。一般に分散液は、塩基性分散媒と上記に列挙したもののうち必要な他の成分とを含む無菌ビヒクルに活性化合物を組み込むことによって調製される。無菌注射液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、有効成分と任意のさらなる所望の成分の予め滅菌濾過された溶液から、それらの粉末をもたらす真空乾燥及び凍結乾燥である。
【００８９】
特定の実施形態において、該医薬組成物は、静脈内（ＩＶ）又は皮下（ＳＣ）に投与される。増量剤、緩衝剤、又は界面活性剤などの適当な賦形剤を使用することができる。ここに挙げた製剤は、当技術分野において周知であり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」（Ａｌｌｅｎ，Ｌ．Ｖ編、第２２版、２０１２年、ｗｗｗ．ｐｈａｒｍｐｒｅｓｓ．ｃｏｍ）を含む様々な情報源にさらに詳細に記載されているように、非経口投与可能な組成物を調製するための標準的な方法を使用して調製される。
【００９０】
医薬組成物、すなわち非経口組成物を、容易な投与、及び均一な投与量のための単位剤形で製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される単位剤形は、処置される対象に対する投与量単位として適した物理的に別個の単位を指し、それぞれが、必要な薬学的担体と関連して所望の治療効果をもたらすように計算された所定の量の活性化合物（本発明の抗体）を含む。本発明の単位剤形の仕様は、活性化合物の固有の特徴、及び達成しようとする特定の治療効果、並びに個体を処置するためのこのような活性化合物を配合する分野に特有の制限によって決まり、これらに直接依存する。
【００９１】
概して、本明細書で挙げられる疾患及び障害の防止及び／又は処置に関しては、処置しようとする特定の疾患又は病態及びその重症度、使用される特定の本発明の融合タンパク質の効力、特定の投与経路、並びに使用される特定の医薬製剤又は組成物によっては、本発明の融合タンパク質は概して、０．００１〜１，０００ｍｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは約０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、最も好ましくは約０．０５〜１０ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲、例えば約１、１０、１００又は１０００マイクログラム／ｋｇ体重／日で、連続的に（例えば注入により）、単一の一日用量として、又は一日の間で分割された複数の用量として投与される。臨床医は一般的に、本明細書で挙げられる要因に応じて、好適な一日用量を決定することができよう。また特定の場合においては、臨床医が、例えば上述の要因及び臨床医自身の専門家判断に基づいて、これらの量から外れてもよいことは明らかであろう。
【００９２】
本発明に係る融合タンパク質の患者への投与に加えて、本願は、遺伝子療法による融合タンパク質の投与を想定する。
【００９３】
医薬組成物は、投与のための説明書とともに、容器、パック、又はディスペンサーに含まれうる。
【００９４】
本発明の融合タンパク質及び医薬組成物は、併用療法を行うために他の薬物とともに使用してもよい。他の薬物は同じ組成物の一部を形成してもよいし、又は同時若しくは異なる時点で投与される別個の組成物として用意されてもよい。
【００９５】
第６の態様において、本発明は、血栓症に関連する疾患又は病態の処置又は防止に使用するための、融合タンパク質、遺伝子療法ベクター、及び医薬組成物（それぞれ上記に定義したとおり）のうちの少なくとも１つに関する。防止又は処置しようとする疾患又は病態は、ＶＷＦ及び血小板のうちの少なくとも１つを含む血栓に関連又は関与する任意の疾患又は病態でありうる。このような、ＶＷＦ及び血小板のうちの少なくとも１つを含む血栓に関連する疾患又は病態は、大血管血栓及び／又は微小血管血栓（ＭＶＴ）に関与する任意の疾患若しくは病態、及び／又は（未だ）非閉塞性の大血管血栓若しくは微小血管血栓の部位に関与する任意の疾患若しくは病態でありうる。しかしながら、防止又は処置しようとする疾患又は病態は、少なくとも微小血管血栓症（ＭＶＴ）に関連する疾患又は病態であることが好ましい。本明細書において、「疾患又は病態を防止する」という用語は、その疾患若しくは病態が発生若しくは発達するリスクを低減させることを含むもの、及び／又はこれと等しいものであると理解されたい。
【００９６】
好ましい実施形態において、ＶＷＦ及び血小板のうちの少なくとも１つを含む血栓に関連する疾患又は病態は、後天性又は遺伝性の血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、補体媒介性血栓性微小血管症（Ｇｅｏｒｇｅら、２０１４年、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３７１巻（７号）：６５４〜６６頁の総説のとおり）、溶血性尿毒症症候群、抗リン脂質抗体症候群、閉塞性血栓の形成、動脈血栓形成、急性冠閉塞、末梢動脈閉塞性疾患、冠動脈バイパスグラフト、冠状動脈弁置換術、及び血管形成術、ステント術、又は粥腫切除術などの冠動脈インターベンションに起因する再狭窄及び障害、血管形成術、粥腫切除術、又は動脈ステント術の後の肥厚、脈管系の閉塞性症候群又は罹患動脈の開存性の欠如、一過性脳虚血発作、不安定狭心症又は安定狭心症、大脳梗塞、ＨＥＬＬＰ症候群（ＨＥＬＬＰは、溶血、肝酵素上昇、及び血小板数減少である）、頸動脈内膜剥離術、頸動脈狭窄、重症虚血肢、心塞栓、末梢血管疾患、再狭窄、鎌状赤血球症、並びに心筋梗塞からなる群から選択される疾患又は病態である。
【００９７】
本発明の方法によって処置又は防止される、ＶＷＦ及び血小板のうちの少なくとも１つを含む血栓に関連するさらなる疾患又は病態は、不安定狭心症、安定狭心症、狭心症、塞栓形成、深部静脈血栓症、溶血性貧血、急性腎不全、血栓溶解合併症、播種性血管内凝固障害（ＤＩＣ）、血栓症、冠動脈心疾患、血栓塞栓性合併症、心筋梗塞症、再狭窄、及び心房細動における心房血栓症形成、慢性不安定狭心症、一過性脳虚血発作及び卒中、末梢血管疾患、動脈血栓症、子癇前症、塞栓症、血管形成術、移植血管の吻合術、及び心血管装置への慢性曝露後の再狭窄及び／又は血栓症からなる群から選択される疾患又は病態である。このような病態は、血栓溶解療法の間及びその後、血管形成術後、並びに冠状動脈バイパス後の血栓塞栓症及び再閉塞に起因する場合もある。
【００９８】
さらなる実施形態において、融合タンパク質、遺伝子療法ベクター、及び医薬組成物（それぞれ上記に定義したとおり）は、個体のプラーク又は血栓の処置又は防止に使用するためのものである。該プラーク又は血栓の形成は、高せん断の条件下で起こりうる。血栓症及び再閉塞のいずれにおいても、高せん断速度における血小板の可逆的な粘着又はテザリングの後に、血小板のコラーゲン受容体を介した強力な粘着が起こり、血小板活性化がもたらされる。損傷した血管壁で露出したコラーゲンに対する、ＶＷＦによる血小板のテザリングは、高せん断条件下で特に重要である。本発明の融合タンパク質は、高せん断条件下で良好に機能する。
【００９９】
第７の態様において、本発明は、上記に定義した融合タンパク質、上記に定義した遺伝子療法ベクター、又は上記に定義した医薬組成物を、それを必要とする対象に有効量で投与するステップを含む、ＶＷＦ及び血小板のうちの少なくとも１つを含む血栓に関連する疾患又は病態、好ましくは、微小血管血栓症に関連する疾患又は病態の処置又はリスク低減の方法に関する。好ましくは、本方法において、ＶＷＦ及び血小板のうちの少なくとも１つを含む血栓に関連する疾患又は病態は、後天性又は遺伝性の血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、補体媒介性血栓性微小血管症、溶血性尿毒症症候群、抗リン脂質抗体症候群、非閉塞性血栓、閉塞性血栓の形成、動脈血栓形成、急性冠閉塞、末梢動脈閉塞性疾患、冠動脈バイパスグラフト、冠状動脈弁置換術、及び血管形成術、ステント術、又は粥腫切除術などの冠動脈インターベンションに起因する再狭窄及び障害、血管形成術、粥腫切除術、又は動脈ステント術の後の肥厚、脈管系の閉塞性症候群又は罹患動脈の開存性の欠如、一過性脳虚血発作、不安定狭心症又は安定狭心症、大脳梗塞、ＨＥＬＬＰ症候群、頸動脈内膜剥離術、頸動脈狭窄、重症虚血肢、心塞栓、末梢血管疾患、再狭窄、鎌状赤血球症、並びに心筋梗塞、又は上記に定義したさらなる疾患若しくは病態からなる群から選択される。
【０１００】
第８の態様において、本発明は、微小血管血栓、フィブリン非依存性血栓、並びにＶＷＦ及び血小板のうちの少なくとも１つを含む血栓のうちの少なくとも１つの処置又はリスク低減の方法に関する。好ましくは、本方法において、後天性又は遺伝性の血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、補体媒介性血栓性微小血管症、溶血性尿毒症症候群、抗リン脂質抗体症候群、非閉塞性血栓、閉塞性血栓の形成、動脈血栓形成、急性冠閉塞、末梢動脈閉塞性疾患、冠動脈バイパスグラフト、冠状動脈弁置換術、及び血管形成術、ステント術、又は粥腫切除術などの冠動脈インターベンションに起因する再狭窄及び障害、血管形成術、粥腫切除術、又は動脈ステント術の後の肥厚、脈管系の閉塞性症候群又は罹患動脈の開存性の欠如、一過性脳虚血発作、不安定狭心症又は安定狭心症、大脳梗塞、ＨＥＬＬＰ症候群、頸動脈内膜剥離術、頸動脈狭窄、重症虚血肢、心塞栓、末梢血管疾患、再狭窄、鎌状赤血球症、並びに心筋梗塞、又は上記に定義したさらなる疾患若しくは病態からなる群から選択される疾患又は病態において、これらの血栓のうちの少なくとも１つが処置されるか、又はその発生リスクが低減する。
【０１０１】
本文書及び特許請求の範囲において、「含む」という動詞及びその活用形は、この言葉に続く項目が含まれるが、明確に挙げられていない項目が除外されるものではないことを意味するよう、非限定的な意味で使用される。さらに、「ａ」又は「ａｎ」という不定冠詞による要素への言及は、その要素がただ１つしか存在しないことが文脈上明らかに必要である場合を除いて、その要素が２つ以上存在する可能性を除外するものではない。したがって、「ａ」又は「ａｎ」という不定冠詞は通常、「少なくとも１つ」を意味する。
【０１０２】
「約」又は「およそ」という言葉は、数値と関連して使用される場合（例えば約１０）、好ましくは、その値が所与の値（１０）から０．１％多いか又は少ない値であってもよいことを意味する。
【０１０３】
本明細書で引用するすべての特許文献及び参考文献は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【０１０４】
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１０５】
実施例１
方法及び材料
ナノボディ−ｍＵＰＡの構築
ヒト及びマウスの両方のウロキナーゼ（ＰＬＡＵ）のｃＤＮＡ配列を、ＮＣＢＩデータベースから得た（それぞれＮＭ＿００２６５８．４及びＮＭ＿００８８７３．３）。シグナルペプチドドメイン、ＥＧＦ様ドメイン、及びＫｒｉｎｇｌｅドメインの配列は、連結ペプチドの最初の部分とともに除去した。残りの連結ペプチド及びＳ１ペプチダーゼドメイン（触媒的ドメイン）に、ＧＧＧＧＳリンカーが続くタバコエッチウイルス切断部位をコードするＮ末端配列を付加した。ＧＧＧＧＳリンカーに、アミノ酸配列を乱すことなくＰｓｔＩ・ＢａｍＨＩ消化部位を組み込んだ。５’側にはＥｃｏＲＩ消化部位を付加し、３’側にはＰＬＡＵの終止コドン後にＮｏｔＩ消化を付加した。この構築物は、ＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｌｅｕｖｅｎ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）からカスタム遺伝子構築物として得た。
【０１０６】
ＩＤＴを介して、ナノボディ（別名ＶＨＨ）のコード配列をヒト宿主細胞で発現させるためにコドン最適化した。ＶＨＨコード配列のＮ末端側には、タバコエッチウイルス切断部位をコードする配列を配置し、Ｃ末端側には、ＧＧＧＧＳリンカー（ＰｓｔＩ・ＢａｍＨＩ消化部位をコードする）を配置した。これらのＤＮＡセグメントは、ＩＤＴから二本鎖ＤＮＡ断片（ｇＢＬｏｃｋｓ）として得た。
【０１０７】
カスタム遺伝子構築物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０で増殖させ、アンピシリン耐性によって選択した。得られたプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩによって消化した。結果として得られたインサート（８８６）をアガロースゲルで分離及び単離し、改変されたｐｃＤＮＡ６発現ベクター（ｐＳＭ２）（Ｄｅ  Ｍａａｔら、２０１６年、Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１１月３０日；１３８巻（５号）：１４１４〜２３頁））にライゲートした。ｐＳＭ２は、Ｎ末端側のマウスＩｇＫ分泌シグナル及び二重ＳＴＲＥＰ単離タグをコードし、二重ＳＴＲＥＰ単離タグの後に、改変されたＵＰＡ構築物がライゲーションされる。
【０１０８】
メーカーの説明に従って、ｇＢｌｏｃｋｓをｐＪＥＴ１．２クローニングベクターにライゲートした（ＣｌｏｎｅＪＥＴ  ＰＣＲクローニングキット、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。これらの構築物を大腸菌ＴＯＰ１０で増殖させ、アンピシリン耐性によって選択した。得られたプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩによって消化した。結果として得られたインサートをアガロースゲルで分離及び単離し、ｍｉｎｉＵＰＡ構築物を含むｐＳＭ２ベクターにライゲートした。これらの遺伝子構築物を図１Ａ及び図１Ｂに概略的に示す。
【０１０９】
表１は、調製されたナノボディ−ｍＵＰＡ融合タンパク質構築物の一覧であり、それらのナノボディの標的及びそれらの名称を含む。
【表４】
2021519093.tif 000005
【０１１０】
ナノボディ−ｍＵＰＡの生成
２３９フェクチンをメーカー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）による説明のとおりに使用して、ナノボディ／ｍＵＰＡ−ｐＳＭ２構築物をＨＥＫ２９３フリースタイル（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ）（商標）細胞にトランスフェクトした。１日後、細胞を２０ｍＬに増やした。それから２日後、細胞をブラストサイジン（５μｇ／ｍＬ）による選択下に置いた。構築物がＨＥＫゲノムに安定に組み込まれるまで、メーカーの説明に従って、トランスフェクト細胞をさらに培養した。細胞を増やし（１．１×１０６細胞／ｍＬまで）、７日間のタンパク質産生の後に、細胞を２０００×ｇで５分間スピンダウンした。それから、上清を収集し、ベンザミン（０．１７４ｍｇ／ｍＬ）を添加し、その後、上清をさらなる使用まで−２０℃で保管した。
【０１１１】
ナノボディ−ｍＵＰＡの精製
収集した上清（４００ｍＬ）を、１０ｋＤＡカットオフ膜（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、Ｑｕｉｘｓｔａｎｄで１５０ｍＬまで濃縮させた。それから、ベンズアミジンを含有する２Ｌの１×ＳＴＲＥＰバッファー（１００ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１７４ｍｇ／ｍＬのベンズアミジン、ｐＨ８．０）に対して濃縮物を透析した。８ｍＬのＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎスーパーフロービーズ（ＩＢＡ）を含むカラムに濃縮物を流した。２０ｍＬの１×ＳＴＲＥＰバッファーでカラムを洗浄した後、ｄ−デスチオビオチン（２．５ｍＭ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む１×ＳＴＲＥＰバッファーによってタンパク質を溶出させた。精製されたタンパク質を２Ｌの酢酸ナトリウム（４ｍＭの酢酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．４）に対して透析し、−８０℃で保管した。
【０１１２】
結果
精製されたナノボディ−ｍＵＰＡ構築物のウェスタンブロット
ナノボディ−ｍＵＰＡ構築物を試料バッファー（２５ｍＭのＤＴＴ）で１００μｇ／ｍＬの濃度まで希釈した。４〜１２％の勾配でビス−トリスゲルを含むＭＥＳバッファーに、１０μＬの試料をロードした。試料の分離は１６５ボルトで５０分間にわたって行った。ブロッティングバッファーに漬けたイモビロン−ＦＬ膜上に、１２５ボルトで１時間にわたってゲルを移す。０．５×Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキングバッファーで膜をブロッキングし、その後、ウサギポリクローナル抗ヒトＵＰＡ抗体をＩＲ８００標識ヤギ抗ウサギ抗体と組み合わせて用い、構築物を検出する。近赤外オデッセイスキャナー（Ｌｉｃｏｒ）により、メーカーの説明に従って結果を分析した。図２は、Ａ１１−ｍＵＰＡを除くすべての融合タンパク質が、ほぼ等しいレベルで発現されたことを示す。
【０１１３】
ナノボディ−ｍＵＰＡ構築物のウロキナーゼ活性
ナノボディ−ｍＵＰＡ構築物は、非自発的（すなわち非誘導性）の活性を示すはずだが、プラスミンによる分子切断によって活性化可能であるはずである。
【０１１４】
ナノボディ−ｍＵＰＡ構築物のうちのいずれも自発的活性を示さないことを立証するため、構築物（１μｇ／ｍＬ）を、０．２％のＢＳＡ−ＨＢＳ中、０．５ｍＭのウロキナーゼ基質（Ｉ１１４０；Ｂａｃｈｅｍ）の存在下でインキュベートした。基質の変換を、メーカーの説明に従って３７℃で測定した。融合タンパク質のうち、ウロキナーゼ基質に対する検出可能な自発的活性を示したものはなかった（データは示さない）。
【０１１５】
ナノボディ−ｍＵＰＡ構築物がプラスミンによって活性化可能であるかどうかを試験するため、プラスミノーゲンを３７℃で１５分間にわたり、ストレプトキナーゼによって予備活性化した（以降、プラスミンと呼ぶ）。ナノボディ−ｍＵＰＡ融合構築物（最終濃度１μｇ／ｍＬ）を０．２％のＢＳＡ−ＨＢＳで希釈し、プラスミン（最終濃度１μｇ／ｍＬ）とともに１２分間インキュベートした。その後、ウロキナーゼ基質（０．５ｍＭのＩ１１４０、Ｂａｃｈｅｍ）を添加し、その変換をメーカーの説明に従って３７℃で測定した。図３は、融合タンパク質が正常に活性化可能であることを示す。
【０１１６】
プラスミノーゲン活性化
ウロキナーゼによるプラスミノーゲン活性化の原理は、ウロキナーゼとプラスミノーゲンとの間の相反的な切断に依存する。ナノボディ−ｍＵＰＡ構築物によるプラスミノーゲン活性化を試験するため、構築物（１μｇ／ｍＬ）を、０．２％のＢＳＡ−ＨＢＳ中、１００μｇ／ｍＬのプラスミノーゲン及び０．２ｍＭのプラスミン基質（Ｉ１３９０；Ｂａｃｈｅｍ）の存在下でインキュベートした。基質の変換を、メーカーの説明に従って３７℃で測定した。図４は、すべての構築物が同等の酵素活性の発生を示したことを示す。
【０１１７】
ＥＬＩＳＡによって判定したＶＷＦに対する抗ＶＷＦ構築物の結合
ヌンクマキシソーププレート（Ｔｈｅｒｍｏ）をＰＢＳ中１μｇ／ｍＬのＶＷＦで一晩コーティングした。翌日、プレートを１％のＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキングした。抗ＶＷＦナノボディ−ｍＵＰＡ融合構築物を１％のＢＳＡ−ＰＢＳで様々な濃度に希釈し、その後、５０ｕＬを各ウェルに加え、１時間インキュベートした。それから、プレートをＰＢＳ−トゥイーン２０（ＰＢＳＴ、０．０５％  ｖ／ｖ）で洗浄する。結合した構築物を、ヤギ抗ウサギＨＲＰ二次抗体（Ａｂｃａｍ）と組み合わせたウサギ抗ＵＰＡポリクローナル抗体によって検出した。ウェルをＰＢＳＴですすぎ、その後、１００μｌのＴＭＢを室温で添加した。基質を５分間にわたって展開させ、その後、５０μｌのＨ２ＳＯ４（０．３Ｍ）を添加した。結果は４５０ｎｍの吸収によって分析した。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７．０２によって結果を分析し、非線形回帰曲線の当てはめによってＫｄ（ｎＭ単位）を判定した。結合親和性を表２に記載する。
【表５】
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【０１１８】
球状ＶＷＦ又は開いたＶＷＦの存在下におけるプラスミノーゲン活性化
ＶＷＦは、微小血栓形成のための足場である。ＶＷＦには、タンパク質の立体構造に依存するプラスミン（プラスミノーゲン）結合特性もある（Ｔｅｒｓｔｅｅｇら、２０１４年、上記参照）。ＶＷＦは、せん断応力下で（また、マイクロタイタープレートにおける固定化中にも（過去の実験を参照されたい））ほどける。これは、小分子のリストセチンとともにインキュベーションすることによって模倣することができる。本発明者らは、本発明の標的化される融合タンパク質によるプラスミノーゲン活性化が、ＶＷＦの立体構造による影響を受けるかどうかを調べた。ナノボディ融合構築物（０．２５μｇ／ｍＬ）及びＶＷＦ（５μｇ／ｍＬ）を０．２％のＢＳＡ−ＨＢＳで希釈する。それから、３７℃で５分間インキュベートしながら、それぞれＶＷＦを開くためか又はＶＷＦを球状に保つために、リストセチン（０．６ｍｇ／ｍＬ）又はバッファーを添加する。それから、プラスミノーゲン（１００μｇ／ｍＬ）、続いてプラスミン基質（Ｉ１３９０  Ｂａｃｈｅｍ；０．２ｍＭ）を添加する。基質の変換を、メーカーの説明に従って３７℃で測定した。比較のため、異なる構築物について、５分後の基質の変換を、以下の棒グラフに示した。データはＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７．０２で処理し、一元配置分散分析によって分析した。＊Ｐ＜０．０５。図５Ａ〜５Ｅ及び図６は、プラスミン活性の発生までの時間が、開いたＶＷＦ（リストセチンの存在下）では、閉じたＶＷＦと比較して有意に短縮されることを示す。
【０１１９】
ＶＷＦ−血小板凝集物の微小血栓溶解。
【０１２０】
これまでに説明されている方法（Ｔｅｒｓｔｅｅｇら、２０１４年、上記参照）に従い、クエン酸加全血から血小板を単離した。単離した血小板（２００．０００／ｍＬ）を、ＶＷＦ（５μｇ／ｍＬ）、プラスミノーゲン（１００μｇ／ｍＬ）、並びに凝集阻害因子のＲＧＤＷ（２００μＭ）及びイロプロスト（０．４μｇ／ｍＬ）とともに、３７℃で１５分間にわたり、光透過凝集計においてインキュベートした。リストセチン（０．６ｍｇ／ｍＬ）の添加により、凝集を誘導した。それから６分後、ナノボディ−ｍＵＰＡ構築物（１μｇ／ｍＬ）を添加し、凝集物の溶解を経時的にモニタリングした（図７Ａ〜７Ｄ）。すべての試料で、５０％の微小血栓の分解が起こった時点を判定した（分析方法の図式的な例を図８Ａに示す）。結果をＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７．０２で処理し、一元配置分散分析によって分析した（＊Ｐ＜０．０５）。その結果を図８Ｂに示す。明らかに、少なくとも融合タンパク質のｓＶＷＦ−ｍＵＰＡ、Ｄ３−ｍＵＰＡ、及びＧＰ１Ｂ１７−ｍＵＰＡによるプラスミノーゲン活性化の標的化は、微小血栓溶解を加速させる。
【０１２１】
実施例２：流動灌流における内皮細胞のＶＷＦ−血小板の微小血栓溶解
材料及び方法
カバーガラスでのヒト血管内皮細胞（Ｈｕｖｅｃｓ）の培養
液体窒素中で保管したＨｕｖｅｃｓ（継代０）を３７℃で解凍し、１：１０で培地（ｈｕｖｅｃ増殖因子ＥＧＭ２を補充したＥＢＭ−２、Ｌｏｎｚａ又はＰｒｏｍｏｃｅｌ）に添加し、１００ｇで５分間スピンダウンした。上清を処分し、細胞を５ｍＬの培地に取り、Ｔ２５フラスコにて摂氏３７度、５％ＣＯ２で培養した。翌日、細胞を３つのＴ７５フラスコに継代した。６日目、１，２５％のグルタルアルデヒドを含むｐＨ７．４のＨＴバッファー（ＨＥＰＥＳタイロードバッファー：１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１４５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＳＯ４）で前処理したカバーガラスに、細胞を１：６で継代する。
【０１２２】
カバーガラスをグルタルアルデヒドでコーティングするために、カバーガラスを脱塩水及びエタノールですすいだ。次いで、カバーガラスをＨＣＬ  ３７％：メタノール（１：１）中で３０分間インキュベートし、その後、脱塩水で５分間すすいだ。次に、カバーガラスをアミノプロピルトリエトキシシラン：エタノール（１：１００）中で３０秒間インキュベートし、その後、脱塩水及びエタノールですすいだ。次いで、カバーガラスを乾燥させ、グルタルアルデヒド２０％：ＨＴバッファーｐＨ７．４（１：２０）とともに１時間インキュベートし、その後、脱塩水ですすぎ、使用までガラスをエタノール中で保管した。
【０１２３】
Ｈｕｖｅｃｓをカバーガラス上で使用までおよそ１０〜１５日間培養した。
【０１２４】
熱失活した血漿の調製
２袋の血漿（ＯｃｔａｐｈａｒｍａのＯｍｉｎｐｌａｓｍａ、血液型はいずれもＡＢ、ロット番号：Ｃ４４２Ａ９５２１、バッグ：Ｘ０００２１４２２３７８２、Ｘ０００２１４２２３５７７）を混合することにより、熱失活した血漿を調製した。このミックス２００ｍＬを１０本のファルコンチューブ（５０ｍＬ、各２０ｍＬ）に分配し、５６℃ちょうどに設定した水浴で３０分間インキュベートし（２０ｍＬを完全に水面下に置いた）、中間時点（１５分）でファルコンチューブを混合した。３０分間のインキュベーション後、ファルコンチューブを氷で覆い、遠心分離するまで氷上に保った（注：チューブを遠心分離のために氷から取り出したとき、チューブは依然としてある程度温かかった）。チューブを１５．０００ｇで５分間（冷却せずに）遠心分離した。上清を合わせ、１ｍＬのアリコートに分けるまで氷上に保った。
【０１２５】
フローチャンバの設定
層流灌流チャンバに予め温めた培地を充填して、カバースリップを置く前にチューブ類からすべての空気を除去した。灌流中にインレットに入る流体がちょうど１分後に灌流チャンバに到達するように、インレットチューブを９０，６μＬの容積に対応する長さに切断した。使用するシリンジの直径は１６ｍｍであり（ブラウンの１２ｍｌシリンジの場合のみ）、シリンジポンプは９０，６μＬ／分に設定する。これにより（３ｍｍのチューブ類を用いた場合に）、３００ｓ−１のせん断速度が得られるからである。ｈｕｖｅｃカバースリップを培地に置き、１０バールに設定した真空発生装置を取り付け、灌流チャンバを３７℃に保つ加熱モジュールを備えた倒立顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｚ．１、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）下に灌流チャンバを置く。残存する気泡があれば、培地を灌流することによって除去する。
【０１２６】
熱失活した血漿中の洗浄血小板
同意した健康なボランティアの血液を、０．１容積で３．２％（１０．９ｍＭ）のクエン酸三ナトリウムに収集した。遠心分離（１５分間にわたり室温で１６０ｇ）により、多血小板血漿（ＰＲＰ）を得た。１０％（ｖ／ｖ）のクエン酸デキストロース、８５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、７１ｍＭのクエン酸、１１１ｍＭのＤ−グルコースを補充したＰＲＰを遠心分離し（１５分間にわたり室温で４００ｇ）、０．１４５ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１ｍＭのＭｇＳＯ４、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、及び５．５ｍＭのＤ−グルコースを含むｐＨ６．５のＨＥＰＥＳタイロードバッファーに血小板を再懸濁した。１０μｇ／ｍＬのＰＧＩ２を血小板懸濁液に添加した後、別の遠心分離ステップ（１５分間にわたり室温で４００ｇ）を行い、熱失活した血漿に血小板を再懸濁し、最終的な計数が２００Ｇ／Ｌになるように血小板数を調節した。
【０１２７】
灌流実験の設定
２００Ｇ／Ｌの血小板を含む（３７℃の水浴で予め温めてある）熱失活した血漿を、２ｍＬエッペンドルフカップ（４０分間の実験→必要量２×２ｍＬなど）に分配し、開始前にすべてのエッペンドルフカップに、イロプロスト（０．１ｍｇ／ｍＬのストックを８μＬ（２５０倍希釈）添加、最終濃度０．４μｇ／ｍＬ、Ｂａｙｅｒ  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｈａｒｍａ  ＡＧ）をまず添加し、その後ヒスタミン（培地中５００μＭのストック４μＬ（５００倍希釈）、最終濃度１００μＭ）を添加する。イロプロスト及びヒスタミンの添加直後、空気が導入されないことを確実にするようにチューブを圧迫することにより、培地を含む２ｍＬエッペンドルフカップから、熱失活した血漿を血小板とともに含むエッペンドルフカップにインレットチューブを移すことによって、灌流を開始する。およそ１分後、最初の血小板がフローチャンバに入ったとき（視認できる変化）、フレーム１から実験を開始する。７分後、必要量を直接エッペンドルフカップにピペット操作で入れ、プラスチックピペットで混合することにより、構築物を残り（この時点で７×９０．６＝６３４μＬが使用されているため、２０００−６３４．２＝１３６５．８μＬ）に添加し、最終濃度を１０μｇ／ｍＬとする。この時点で、血漿とのプレインキュベーション時間が等しいことを確実にするため、構築物をさらなるエッペンドルフカップにも加える。灌流中は、プラスチックピペットで血漿を一滴ずつ慎重に添加することにより、２ｍＬエッペンドルフカップを再充填する必要がある。この再充填は、再充填に起因する可能性のある乱れを対応するフレーム／時点に一致させることができるように、フレーム１５０、２５０などで行う。実験中は５秒毎にＤＩＣ画像を作成し、実験の終わりに、灌流チャンバ内の他の領域のスクリーンショットを５枚取り、「血小板ストリング」の形態で視認できる血小板−ＶＷＦ複合体の数を計数する。
【０１２８】
結果
結果を図９に示す。図９は、少なくとも融合タンパク質のＧＰ１Ｂ１７−ｍＵＰＡ、ｓＶＷＦ−ｍＵＰＡ、及びＤ３−ｍＵＰＡにより標的化されたプラスミノーゲン活性化が、Ｈｕｖｅｃｓに結合した血小板−ＶＷＦ複合体の血栓溶解を、対照融合タンパク質Ｒ２−ｍＵＰＡと比較して加速させることを示す。特に、融合タンパク質ＧＰ１Ｂ１７−ｍＵＰＡは、血小板−ＶＷＦ複合体を急速に排除し、特に血小板の標的化が、微小血栓中の血小板−ＶＷＦ複合体を排除するのに効率的であることを示している。
【０１２９】
実施例３：
方法及び材料
カプラシズマブの生成
クローニング
カプラシズマブ（カブリビＶＨＨの二価バリアント）を大腸菌で産生させ、ＨＩＳタグ親和性クロマトグラフィーによって精製した。カプラシズマブのタンパク質配列をＥＭＡ審査報告（ＥＭＡ／４９０１７２／２０１８、手続き番号ＥＭＥＡ／Ｈ／Ｃ／００４４２６／００００）から得て、ＩＤＴ（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のコドン最適化ツールにより、大腸菌での発現のためにコドン最適化した。Ｎ末端側のＢａｍＨＩ消化部位及びＣ末端側のＮｏｔＩ消化部位を構築物に付加し、二本鎖ＤＮＡ断片としてＩＤＴに発注した（配列番号４０）。
【０１３０】
このＤＮＡ断片を５ｍＭのトリスバッファー（ｐＨ＝８．５）に溶解させ、５０℃で２０分間加熱した。それから、メーカーの説明に従って、ＤＮＡ断片をｐＪＥＴ１．２ベクターにライゲートした（ＣｌｏｎｅＪＥＴ  ＰＣＲクローニングキット、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。ライゲートした産物を、メーカーの説明に従い、熱ショックによってケミカルコンピテントな大腸菌ＴＯＰ１０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）に形質転換させた。形質転換した細菌を１０ｍＬの２×ＹＴ培地（１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む）で培養し、３７℃で一晩増殖させた。プラスミド単離キット（Ｍ＆Ｎ）により、メーカーの説明に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。ＢａｍＨＩ−ＨＦ及びＮｏｔＩ−ＨＦ（ＮＥＢ）を含むＣｕｔｓｍａｒｔバッファーによってインサートを消化し、１３０Ｖで１時間にわたり、０．７％（ｗ／ｖ）のアガロースゲル（１×ＴＢＥバッファー、１：１０．００ゲルレッド）で分離させた。インサートをゲルから切り取り、ＰＣＲ＆ゲルクリーンアップキット（Ｍ＆Ｎ）により、メーカーの説明に従って精製した。
【０１３１】
精製したインサートをｐＴＨ４．０ベクターにライゲートした。ｐＴＨ４．０ベクターは、Ｎ末端側のＰｅｌＢシグナルペプチド、精製目的のためのＨｉｓ６タグ、及びＢａｍＨＩ消化部位が続くタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼの切断部位をコードする配列をコードする、改変されたｐＥＴ３２ａ（＋）ベクターである。Ｃ末端側のＮｏｔＩ消化の後には、検出目的のためのｍｙｃタグ、続いて終止コドンを配置した（表１）。ｐＴＨ４．０ベクターをＢａｍＨＩ−ＨＦ及びＮｏｔＩ−ＨＦによって消化し、その後、断片について説明したように精製した。メーカーの説明に従い、Ｔ４リガーゼを含む１×Ｔ４ライゲートバッファーにより、消化されたｐＴＨ４．０ベクターに３：１の比で断片をライゲートした。前述のようにＴＯＰ１０菌においてライゲーション混合物を形質転換させ、形質転換した細菌をＹＴ寒天プレート（１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、２％（ｗ／ｖ）のグルコース）において３７℃で一晩増殖させた。コロニーを採取し、１０ｍＬの２×ＹＴ培地（１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、２％（ｗ／ｖ）のグルコースを含む）で増殖させた。プラスミドＤＮＡを前述のように単離した。ＭａｃｒｏｇｅｎによるサンガーシーケンシングによってＤＮＡ配列を確認した（配列番号４１）。
【０１３２】
産生
ｐＴＨ４．０プラスミドＤＮＡにおけるカプラシズマブを、メーカーの説明に従い、ケミカルコンピテントなＢＬ２１  ｐＬｙｓＳ大腸菌（Ｔｈｅｒｍｏ）に形質転換させた。形質転換した細菌を、１０ｍＬの２×ＹＴ培地（１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、及び２％（ｗ／ｖ）のグルコースを含む）において、３７℃で一晩培養した。一晩培養物を２×ＹＴ培地（１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、及び２％（ｗ／ｖ）のグルコースを含む）で１：１０に希釈し、３時間にわたって３７℃で増殖させた。その後、培養物を２×ＹＴ培地（１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含む）で１：１００に希釈し、３７℃で約３時間にわたって増殖させた。細菌がＯＤ６００ｎｍ＝０．６に達したとき、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシドの添加（０．１ｍＭの最終濃度）によってタンパク質産生を誘導した。タンパク質産生は一晩２４℃で行った。細菌を５０００×ｇで１５分間にわたってペレット化し、上清を処分した。４００ｍｌの培養物からの細菌ペレットを、２５ｍＬのダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、８．２ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ＝７．４）に再懸濁し、−２０℃で凍結させた。
【０１３３】
精製
凍結した細菌を３７℃で解凍し、遠心分離により１０．０００×ｇで１５分間にわたってペレット化した。上清を新しいチューブに移した。５ｍＬのコバルトセファロースビーズ（ＴＡＬＯＮ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ、Ｇ＆Ｅ  Ｈｅａｔｌｈｃａｒｅ、５０％溶液）を、メーカーの説明に従ってＰＢＳによって洗浄し、上清に加え、２時間にわたり室温でローラーベンチにおいてインキュベートした。ＴＡＬＯＮを遠心分離により１０００×ｇで５分間にわたってペレット化した。上清を処分し、ペレットを２０ｍＬのＰＢＳに溶解させた。ＴＡＬＯＮの洗浄を合計３回繰り返した。最後のステップの後、ＴＡＬＯＮを８ｍＬのＰＢＳに溶解させ、ＰＤ−１０カラムにロードした。カラムを過剰量のＰＢＳですすいだ。カラムをイミダゾール（ＰＢＳ中１５０ｍＭ）で溶出させ、０．５ｍＬの画分を収集した。タンパク質含有画分をプールし、ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（ＨＢＳ：１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝７．４）に対し、３．５００  ＭＷＣＯ透析膜（３  ＲＣチューブ；Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ）によって一晩透析した。ＤｅＮｏｖｉｘ分光光度計（ＤＳ−１１）において、２８０ｎｍの吸収によりタンパク質濃度を判定し、その後、濃度を消衰係数（ＰｒｏｔＰａｒａｍによって計算した）に対して補正した。クーマシーページブルー染色を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって純度を評価した。
【０１３４】
ＶＷＦ−血小板凝集物の微小血栓溶解。
【０１３５】
これまでに説明されている方法（Ｔｅｒｓｔｅｅｇら、２０１４年、上記参照）に従い、クエン酸加全血から血小板を単離した。単離した血小板（２００．０００／μＬ）を、ＶＷＦ（５μｇ／ｍＬ）、血漿精製プラスミノーゲン（１００μｇ／ｍＬ）、並びに凝集阻害因子のＲＧＤＷ（２００μＭ）及びイロプロスト（０．４μｇ／ｍＬ）とともに、３７℃で１５分間にわたり、光透過凝集計においてインキュベートした。リストセチン（０．６ｍｇ／ｍＬ）の添加により、凝集を誘導した。それから６分後、ナノボディ−ｍＵＰＡ構築物又はカプラシズマブを添加し、凝集物の溶解を経時的にモニタリングした。すべての試料で、５０％の微小血栓の分解が起こった時点を判定した（分析方法の図式的な例を図８Ａに示す）。結果をＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７．０２で処理し、一元配置分散分析によって分析した（＊Ｐ＜０．０５）。その結果を図１０Ａ及び１０Ｂに示す。
【０１３６】
結果
結果を図１０Ａ及び１０Ｂに示す。少なくとも融合タンパク質のＤ３−ｍＵＰＡ及びＧＰ１Ｂ１７−ｍＵＰＡによるプラスミノーゲン活性化の標的化が、カプラシズマブによって誘導される微小血栓溶解と比較して微小血栓溶解を加速させることが明らかに分かる。
【表６】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
2021519093.tif 000021
【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
2021519093.tif 000024
【図５Ｅ】
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【図６】
2021519093.tif 000026
【図７Ａ】
2021519093.tif 000027
【図７Ｂ】
2021519093.tif 000028
【図７Ｃ】
2021519093.tif 000029
【図７Ｄ】
2021519093.tif 000030
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
2021519093.tif 000034
【図１０Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2021519093.tif 000036
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