(57)【要約】  本発明は、培養担体の担体表面上に少なくとも１つの閉領域を作成する方法に関し、この方法は、ａ．少なくとも１つの細胞および／または少なくとも１つの粒子を含む第１の流体を担体表面に添加するステップと、ｂ．第２の流体であって、第１の流体とは非混和性であり、かつ第１の流体を少なくとも部分的に覆う第２の流体を添加するステップと、ｃ．少なくとも１つの細胞情報の項目および／または少なくとも１つの粒子情報の項目を取得するステップと、ｄ．少なくとも１つの取得された細胞情報の項目および／または少なくとも１つの取得された粒子情報の項目に基づいて閉領域を作成するステップと、を含む。【選択図】図１
2021525057.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．少なくとも１つの細胞（１）および／または少なくとも１つの粒子を含む第１の流体（４）を担体表面（７）に添加するステップと、
ｂ．第２の流体（５）であって、前記第１の流体（４）とは非混和性であり、かつ前記第１の流体（４）を少なくとも部分的に覆う第２の流体（５）を添加するステップと、
ｃ．少なくとも１つの細胞情報の項目および／または少なくとも１つの粒子情報の項目を取得するステップと、
ｄ．前記少なくとも１つの取得された細胞情報の項目および／または前記少なくとも１つの取得された粒子情報の項目に基づいて閉領域（２）を作成するステップと
を含む、培養担体（３）の担体表面（７）上に少なくとも１つの閉領域（２）を作成する方法。
【請求項２】
ａ．第２の流体の一部（１５）が前記担体表面（７）を覆うように前記第１の流体（４）を変位させることで前記領域（２）が作成されること、または
ｂ．前記第２の流体の一部（１５）が前記担体表面（７）を覆うように前記第１の流体（４）を変位させ、前記第２の流体の一部（１５）が閉鎖線を形成することで前記領域（２）が作成されること
を特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ａ．複数の領域（２）が作成され、前記領域（２）が同一または異なる横断面を有すること、および／または
ｂ．複数の領域（２）が、前記担体表面（７）の法線に沿った形成において互いに異なって作成されること
を特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ａ．前記細胞情報の項目および／または前記粒子情報の項目に基づいて、少なくとも１つの領域（２）を作成する場所が決定されること、および／または
ｂ．前記領域（２）が少なくとも１つの細胞（１）および／または少なくとも１つの粒子を含むこと
を特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記領域（２）が作成される前に
ａ．前記取得された細胞情報の項目および／または粒子情報の項目に基づいて、前記培養担体（３）を移動させること、または
ｂ．前記取得された細胞情報の項目および／または粒子情報の項目に基づいて、前記少なくとも１つの細胞（１）および／または前記少なくとも１つの粒子が新しい位置に移動するように前記培養担体（３）を移動させること、または
ｃ．前記取得された細胞情報の項目に基づいて、前記培養担体を振とうまたは振動させて、および／または前記第１の流体を混合して、前記少なくとも１つの細胞（１）および／または前記少なくとも１つの粒子を新しい位置に移動させること
を特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ａ．細胞（１）を含まない残余領域（８）の少なくとも１つが除去されること、および／または
ｂ．具体的には細胞または粒子を含む前記領域（２）に、試薬が導入されること、および／または
ｃ．具体的には細胞または粒子を含む前記領域（２）が、少なくとも部分的に吸い出されるか、または満たされること
を特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記領域（２）の前記第２の流体（５）の一部が前記担体表面（７）を覆うように前記領域（２）の前記第１の流体（４）を変位させることによって、前記領域（２）が少なくとも２つの下位領域（９）に分割されることを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の流体（４）と前記第２の流体（５）とが変位媒体（６）を介して変位されることを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の流体（４）および／または前記第２の流体（５）を変位させるために、前記変位媒体（６）および／または前記培養担体（３）を移動させることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ａ．前記変位媒体（６）が固体部を有し、前記固体部によって前記第１の流体（４）を変位させること、または
ｂ．前記変位媒体（６）から前記第１の流体（４）にガスを適用することによって前記第１の流体（４）を変位させること
を特徴とする、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
ａ．前記領域（２）を作成するために、前記変位媒体（６）を前記担体表面（７）の方向に限定して移動させるか、または前記培養担体（３）を前記変位媒体（６）の方向に限定して移動させること、もしくは
ｂ．前記領域（２）を作成するために、前記変位媒体（６）および／または前記培養担体（３）を、前記担体表面（７）と平行な少なくとも１つの方向に移動させること
を特徴とする、請求項８から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法を実施するためのデバイス（１０）。
【請求項１３】
少なくとも１つの細胞情報の項目および／または少なくとも１つの粒子情報の項目を取得するための光学的取得デバイス（２５）と、変位媒体（６）とを有し、それを用いて、前記少なくとも１つの取得された細胞情報の項目および／または前記少なくとも１つの取得された粒子情報の項目に基づいて、閉領域（２）を作成することができるデバイス（１０）であって、第１の流体（４）、および第２の流体（５）であって、前記第１の流体（４）とは非混和性であり、かつ前記第１の流体（４）を少なくとも部分的に覆う第２の流体（５）を受容する培養担体（３）の担体表面（７）上に少なくとも１つの閉領域（２）を作成するデバイス（１０）。
【請求項１４】
前記変位媒体（６）が、前記領域（２）を作成するために前記第１の流体（４）を変位させ、その結果、前記第２の流体の一部（１５）が前記担体表面（７）を覆うように設計され、かつ意図されていることを特徴とする、請求項１２または１３に記載のデバイス。
【請求項１５】
ａ．前記取得デバイス（２５）が、前記担体表面（７）の画像を作成する撮像デバイス（１１）を有すること、または
ｂ．前記取得デバイス（２５）が、前記担体表面（７）の画像を作成する撮像デバイス（１１）と評価デバイス（１２）とを有し、前記画像に基づいて前記細胞情報の項目および／または粒子情報の項目を決定すること
を特徴とする、請求項１２から１４のいずれか一項に記載のデバイス（１０）。
【請求項１６】
前記培養担体（３）を受容するレセプタクル（１３）を有するデバイス（１０）であって、前記撮像デバイス（１１）と前記変位媒体（６）とが前記レセプタクル（１３）に関して互いに反対側にあることを特徴とする、請求項１５に記載のデバイス（１０）。
【請求項１７】
ａ．前記変位媒体（６）が疎水性の固体部を有すること、および／または
ｂ．前記変位媒体（６）が前記第１の流体（４）および／または前記第２の流体（１５）と接触可能なその端部にパターン要素（２７）を有すること、および／または
ｃ．前記変位媒体（６）がガス出口開口部を有すること
を特徴とする、請求項１２から１６のいずれか一項に記載のデバイス（１０）。
【請求項１８】
ａ．前記第１の流体（４）の細胞を含まない前記残余領域（８）を除去するための、および／または前記領域（２）を除去するための除去デバイス（１４）、または
ｂ．前記第１の流体（４）の細胞を含まない前記残余領域（８）を少なくとも部分的に吸引する、および／または前記領域（２）を少なくとも部分的に吸い出すための除去デバイス（１４）
を特徴とする、請求項１２から１７のいずれか一項に記載のデバイス（１０）。
【請求項１９】
前記第１の流体（４）、および前記第２の流体（５）であって、前記第１の流体（４）とは非混和性であり、かつ前記第１の流体（４）を少なくとも部分的に覆う前記第２の流体（５）を受容する、請求項１２から１８のいずれか一項に記載のデバイス（１０）と培養担体（３）とを有するシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養担体の担体表面上に少なくとも１つの閉領域を作成する方法に関する。本発明はまた、培養担体の担体表面上に少なくとも１つの閉領域を作成するデバイスに関する。本発明はまた、そのようなデバイスおよび培養担体を有するシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体および他のタンパク質などの活性物質は、いわゆるモノクローナル細胞株を用いて作製されることが先行技術により知られている。モノクローナル細胞株は、すべてが単一の親細胞に由来する細胞集団である。モノクローナル細胞株の作製が必要な理由は、これが、一定かつ再現性のある品質で活性成分を作製するために、細胞集団のすべての細胞が同一のゲノムをほぼ有することを確実にする唯一の方法だからである。
【０００３】
モノクローナル細胞株を作製するために、細胞はマイクロタイタープレートの容器に個別に移される。移される細胞は、宿主細胞株を遺伝子改変し、これらの改変された細胞を単離することによって作製される。個々の細胞は、例えば、フリージェット印刷法またはピペッティングを使用してマイクロタイタープレートに沈着させる。細胞がマイクロタイタープレートのそれぞれの容器に沈着した後、細胞は成長することができ、その後バイオリアクタに移すことができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
先行技術により知られているｉｏｔａ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｌｔｄ．社のデバイスでは、細胞はマイクロタイタープレートの容器ではなく、ペトリ皿に沈着させる。細胞をペトリ皿に沈着させる前に、ペトリ皿はデバイスのレセプタクルに配置される。ペトリ皿は、互いに非混和性の２つの液体を含み、第２の液体は、第１の液体の後にペトリ皿に添加され、第１の液体を完全に覆う。第２の液体はＦＣ−４０などのオイルとすることができる。
【０００５】
疎水性のピンを用いて２つの液体の一部に力を加え、第２の液体の一部が皿の底面を覆うようにする。具体的には、皿の底部を覆う第２の液体の一部がグリッド状パターンを形成するようにピンを動かす。その結果、第２の液体の一部は、それぞれが第１の液体を有する複数の領域を互いに分離する。
【０００６】
グリッド状パターンが作成された後、細胞懸濁液が第１の液体の各領域に適用され、それぞれの領域に適用される細胞懸濁液は、細胞を含む可能性がある。その後、ユーザは、適用された細胞懸濁液が各領域で細胞を有するかどうかを、例えば顕微鏡を用いて、各領域について手動でチェックする。この場合、細胞を含む領域はユーザが手動でマークする。
【０００７】
前述のデバイスには、細胞を含む領域を決定するために多大な時間を消費する作業工程が必要とされるという欠点がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本発明の目的は、実験室でより効率的なワークフローを可能にする方法を提供することである。
【０００９】
この目的は、培養担体の担体表面上に少なくとも１つの閉領域を作成する方法によって達成され、この方法は、
ａ．少なくとも１つの細胞および／または少なくとも１つの粒子を含む第１の流体を担体表面に添加するステップと、
ｂ．第２の流体であって、第１の流体とは非混和性であり、かつ第１の流体を少なくとも部分的に覆う第２の流体を添加するステップと、
ｃ．少なくとも１つの細胞情報の項目および／または少なくとも１つの粒子情報の項目を取得するステップと、
ｄ．少なくとも１つの取得された細胞情報の項目および／または少なくとも１つの取得された粒子情報の項目に基づいて閉領域を作成するステップと、を含む。
【００１０】
さらに、本発明の目的は、実験室での作業プロセスをより効率的に実行することができるデバイスを開示することである。
【００１１】
この目的は、少なくとも１つの細胞情報の項目および／または少なくとも１つの粒子情報の項目を取得するための取得デバイスと変位媒体とを有し、それを用いて、少なくとも１つの取得された細胞情報の項目および／または少なくとも１つの取得された粒子情報の項目に基づいて、閉領域を作成することができるデバイスであって、第１の流体、および第２の流体であって、第１の流体とは非混和性であり、かつ第１の流体を少なくとも部分的に覆う第２の流体を受容する培養担体の担体表面上に少なくとも１つの閉領域を作成するデバイスによって達成される。
【００１２】
本発明による解決策は、少なくとも１つの細胞情報の項目および／または粒子情報の項目が取得されるという利点を有する。細胞情報の項目および／または粒子情報の項目は、第１の流体中の細胞および／または粒子の位置、ならびに／もしくは細胞および／または粒子のサイズおよび／または真円度などの形態に関する情報、ならびに／もしくは細胞および／または粒子の光学特性に関する情報を含むことができる。光学特性は、細胞および／または粒子のコントラスト、蛍光性および／または粒度に関連する。細胞情報の項目および／または粒子情報の項目を評価することにより、ユーザにとって適切な細胞または粒子を簡単な方法で識別し、領域内に封入することができる。
【００１３】
本発明の別の利点は、３つの流体が添加されなくなり、代わりに第１の流体および第２の流体のみが添加されることである。その結果、本発明による方法は、先行技術により知られている方法と比較して単純化される。
【００１４】
細胞および／または粒子を含む第１の流体が、１つまたは複数の領域が作成される前に、デバイスに属していない培養担体の担体表面に適用される場合も有利である。これは、時間のかかるグリッド形状パターンの作成が不要になるために有利となる。したがって、多数の領域を作成する必要はなく、むしろ、以下で詳細に説明するように、特定の領域、例えば、ユーザにとって関心のある領域を作成することができる。個々の領域に含まれる細胞および／または粒子は、さらなる処理ステップを経ることができる。
【００１５】
上記の処理ステップａ〜ｄは、記載された順序で実行することができる。
【００１６】
第１の流体は、具体的には水性の液体とすることができ、および／または半固体の粘度を有していてもよい。具体的には、第１の流体は、第１の流体中にある細胞の増殖を促進する細胞懸濁液とすることができる。第１の流体は、より高い粘度を得るために、寒天、半固体培地、またはゲルを含むことができる。第２の流体は、液体とすることができる。好ましくは、第２の流体は、フッ素不活性（フルオロカーボン系）液体などのオイルとすることができ、第１の流体とは非混和性である。具体的には、第２の流体はＦＣ−４０とすることができる。第２の流体の第１の流体との非混和性のために、第１の流体および第２の流体は互いに別々に配置され、および／または第２の流体は第１の流体上に配置される。第２の流体は、第１の流体、具体的には第２の流体に面する第１の流体の表面を部分的に、または完全に覆うことができる。培養担体は、ペトリ皿などの容器とすることができる。担体表面は、容器底部とすることができる。あるいは、培養担体は側壁のないプレートであってもよい。
【００１７】
担体表面を覆う第２の流体の一部は、第１の流体の残余部分から閉領域を流体的に分離する役割を果たす。第２の流体の一部による担体表面の被覆は、担体表面を覆う第２の流体の一部が被覆された後で、これが第１の流体によって当初の位置に押し戻されないように行われる。当初の位置とは、第２の流体が担体表面を覆っていない第２の流体の位置であると理解される。
【００１８】
閉領域は、第１の流体の残余部分から流体的に分離された、担体表面上の領域であると理解される。具体的には、その領域内に位置する第１の流体は、残余部分内に位置する第１の流体から流体的に分離される。上述のように、分離は、第２の流体の一部を介して少なくとも部分的に行うことができる。したがって、第２の流体に加えて、培養担体の少なくとも１つの側壁および／または担体表面によって閉領域が画定されてもよい。
【００１９】
閉領域は、少なくとも１つの細胞および／または少なくとも１つの粒子を含むことができる。しかし、代替的に、領域が事前に定義された数の細胞および／または粒子を含むか、もしくは細胞および／または粒子を含まないことも可能である。この領域は、以下では残余領域と呼ばれる。
【００２０】
特定の実施形態では、領域は、第２の流体の一部が担体表面を覆うように第１の流体を変位させることで作成することができる。これにより、領域の作成が容易になる。第１の流体は、変位媒体によって変位させることができる。代替的または追加的に、第２の流体は、変位媒体によって変位させることができる。第１の流体および／または第２の流体を変位させるために、変位媒体および／または培養担体、ひいては担体表面を移動させることができる。
【００２１】
担体表面を覆う第２の流体の一部は、閉鎖線を形成することができる。これにより、第２の流体の一部によって第１の流体の残余部分から簡単な方法で分離された閉領域が作成される。さらに、この場合、閉領域は、第２の流体および担体表面によってのみ画定される。
【００２２】
閉領域は非常に小さい体積、例えば０．５ｎｌ（ナノリットル）〜１０μｌ（マイクロリットル）の体積を有することができる。このような小体積の領域により、特定の細胞で細胞増殖が行われるようになる。これは、一部の細胞では、第１の流体中の細胞濃度が低すぎない場合にのみ成長することができるために起こる。細胞自体は、領域よりもさらに小さい体積を有する。同様に、粒子も領域よりさらに小さい体積を有し、粒子は、第１の流体に導入されるガラスまたはポリマーのビーズとすることができる。
【００２３】
本発明による方法および／または本発明によるデバイスを使用して、複数の領域を作成することができる。これは、複数の細胞が第１の流体に配置される場合に有用である。この場合、複数の領域は、複数の領域のそれぞれが、少なくとも１つの、具体的には正確に１つの、単一の細胞および／または少なくとも１つの粒子、具体的には正確に１つの単一の粒子を含むように作成される。複数の領域は、互いに隣接して配置することができ、すなわち、担体表面を覆う第２の流体の一部によってのみ互いに分離することができる。あるいは、複数の領域は、第１の流体を有し、かつ細胞または粒子を含まない残余領域によって互いに分離することもできる。この場合、残余領域と複数の領域との間の分離もまた、担体表面を覆う第２の流体の一部を用いて行われる。
【００２４】
複数の領域は、異なる横断面を有することができる。具体的には、複数の領域は、横断面の形状および／またはサイズが互いに異なっていてもよい。これは、細胞に適合する領域を作成することができるという利点を提供する。これが必要である理由は、前述のように、例えば、成長を可能にするために、細胞によって異なる体積を必要とするためである。あるいは、複数の領域が同一の横断面を有していてもよい。横断面は、領域を有し、かつ担体表面と平行に走る平面に対応する。さらに、複数の領域は、担体表面の法線に沿った領域形成において互いに異なっていてもよい。
【００２５】
特定の実施形態では、細胞情報の項目および／または粒子情報の項目に基づいて、少なくとも１つの領域が作成される場所を決定することができる。領域が作成される前に細胞情報の項目または粒子情報の項目として第１の流体中の少なくとも１つの細胞または粒子の位置が決定される場合は、特に有利である。これは、培養担体上のどの地点で領域が作成されるかが簡単にわかるという利点を提供する。具体的には、第１の流体が担体表面に添加される前にグリッド形状パターンを作成する必要がなくなる。
【００２６】
代替的または追加的に、特に適切な細胞および／または粒子を、細胞情報の項目および／または粒子情報の項目に基づいて選択することができ、選択された細胞または粒子のみを第２の流体の一部を用いて封入し、ならびに／もしくは選択された細胞および／または粒子を含む領域のみを作成する。
【００２７】
細胞情報の項目および／または粒子情報の項目は、例えば、以下に説明する光学的取得デバイスを用いて自動的に決定することができる。これにより、例えば細胞または粒子自体の位置を手動で決定する必要がなくなるため、デバイスのユーザの作業負荷が軽減される。
【００２８】
細胞情報の項目および／または粒子情報の項目を取得するために、デバイスは、光学的取得デバイスを有することができる。取得デバイスは、光学撮像デバイスを有することができる。撮像デバイスは、培養担体、具体的には担体表面の画像を作成することができる。撮像デバイスは、例えば、例えば顕微鏡と同様の光学系を備えたカメラとすることができる。
【００２９】
さらに、デバイスは、画像に基づいて少なくとも１つの細胞情報の項目および／または少なくとも１つの粒子情報の項目を決定する評価デバイスを有することができる。具体的には、第１の流体中の細胞および／または粒子の位置は、評価デバイスを用いて決定することができる。細胞および／または粒子の位置は、評価デバイスを用いて、具体的には画像から、ならびに／もしくは細胞および／または粒子から、少なくとも１つの光学特性を定義することによって決定することができる。評価デバイスは、制御デバイスに電気的に接続することができる。制御デバイスは、移動デバイスが領域を作成するために変位媒体および／または培養担体を移動させるように、移動デバイスを制御することができる。
【００３０】
デバイスは、培養担体を受容するレセプタクルを有することができ、撮像デバイスおよび変位媒体は、レセプタクルに関して互いに反対側にある。具体的には、変位媒体は、担体表面の上方に配置することができ、撮像デバイスは、担体表面の下方に配置することができる。その結果、コンパクトでシンプルな構成のデバイスが実現する。
【００３１】
領域が作成される前に、取得された細胞情報の項目および／または粒子情報の項目に基づいて、培養担体を移動させることができる。具体的には、少なくとも１つの細胞および／または少なくとも１つの粒子が新しい位置に移動するように、担体表面を移動させることができる。培養担体を振とうまたは振動させて、および／または第１の液体を混合して、第１の流体中の細胞または粒子を再配置することができる。一部の細胞および／または粒子が互いに付着し合っている、ならびに／もしくは互いに近づき過ぎて配置されていることが評価デバイスによって決定された場合には、培養担体を移動させることが好ましい。その結果、第１の流体中の細胞および／または粒子の均一な分布が、培養担体を移動させることによって達成されなければならない。
【００３２】
領域が作成された後、第１の流体の細胞を含まない残余領域を除去することができる。その結果、細胞および／または粒子を含む領域のみが担体表面に残り、それによって、ユーザは、培養担体のどの領域に細胞および／または粒子が位置するかを即座に確認することができる。残余領域を少なくとも部分的に除去するために、デバイスは除去デバイスを有することができる。残余領域は、残余領域を吸引すること、および／または残余領域を洗い流すことによって除去することができる。具体的には、残余領域の第１の流体および第２の流体を除去することができる。
【００３３】
特別な実施形態では、領域は、少なくとも２つの下位領域に分割することができる。これは、例えば、細胞が成長した後に有用である。領域を分割することにより、細胞のうちの一部を、細胞のうちの他の一部とは別に調べることができる。領域の分割は、領域の第２の流体の一部が担体表面を覆うように領域の第１の流体を変位させることで行うことができる。第１の流体は、変位媒体によって変位させることができる。
【００３４】
また、細胞を含む領域に試薬を入れる場合にも有利である。これにより、領域内の細胞増殖を簡単な方法で促進または停止させることができる。特に、細胞または領域の他の成分を分析するための試薬を入れることもできる。試薬は、分注デバイスを使用して添加することができる。除去デバイスおよび分注デバイスを１つの構造単位として設計すれば、コンパクトなデバイスを実現することができる。
【００３５】
さらに、細胞を含む領域は、具体的には所定の期間後に、吸い出すことができる。その後、吸い出された細胞は、例えばバイオリアクタまたはマイクロタイタープレートで、さらに処理することができる。少なくとも部分的な吸引は、除去デバイスによって実行することができる。あるいは、別個の吸引デバイスを利用することもできる。
【００３６】
特定の実施形態では、変位媒体は、固体部、具体的には疎水性の固体部を有することができる。第１の流体は、固体部によって変位させることができる。第１の流体を変位させるとき、固体部は第１の流体に直接接触する。固体部は、ピンまたはロッドの形状に設計することができる。変位媒体の疎水性の設計は、第１の流体が変位媒体に付着しないという利点を提供し、その結果、第２の流体は容易に担体表面を覆うことができる。変位媒体は、担体表面に面する先端に、丸みを帯びた端部を有することができる。
【００３７】
閉領域を作成するために、変位媒体を少なくとも１つの方向、具体的には正確に２つの方向に移動させることができ、その方向は担体表面と平行である。変位媒体は、担体表面に直接接触した後に、担体表面と平行な方向に移動させることができる。あるいは、変位媒体は、第２の流体が担体表面を覆い、変位媒体と担体表面との間に配置されるように第２の流体を変位させた後に、担体表面と平行な方向に移動させることができる。この場合、変位媒体は担体表面に直接接触しない。
【００３８】
あるいは、変位媒体は、第１の流体および第２の流体に面する先端に、具体的には円筒形、三角形または長方形のパターン要素を有することができる。具体的には、パターン要素は中空になるように設計することができる。パターン要素は、変位媒体の残余部分に取り外し可能に連結することができる。これは、パターン要素を使用後に取り外す、または別のパターン要素と交換することができるという利点を提供する。
【００３９】
パターン要素の設計に応じて、例えば、環状、三角形、または長方形の横断面を有する領域を実現することが可能である。さらに、異なる設計のパターン要素を用いて、担体表面の法線に沿って異なるように設計される、および／または異なる高さを有する領域を簡単な方法で作成することもできる。したがって、パターン要素の提供は、領域を非常に迅速に作成することができるという利点を提供する。具体的には、領域を作成するために、変位媒体は担体表面の方向に限定して移動させることができる。変位媒体は、垂直方向にのみ移動させることができる。代替的または追加的に、領域を作成するために、培養担体を変位媒体の方向に移動させてもよい。具体的には、培養担体を垂直方向にのみ移動させてもよい。
【００４０】
さらに、細胞または粒子は、変位媒体が下降した後、このように設計された変位媒体によって、第２の流体の一部により完全に封入することができる。これにより、変位媒体を用いて、細胞および／または粒子を担体表面上の異なる位置に移動させることができるという利点が提供される。この目的のために、変位媒体および／または担体表面は、担体表面と平行な少なくとも１つの方向に移動させることができる。
【００４１】
代替実施形態では、変位媒体は、ガス出口開口部を有することができる。ガス出口開口部は、第１の流体および第２の流体に面する変位媒体の端部に配置することができる。この場合、ガス出口開口部からガスを排出することができ、第１の流体に作用して第１の流体を変位させる。ガスを使用することにより、変位媒体の固体部が第１の流体および／または第２の流体と直接接触することが簡単な方法で回避される。
【００４２】
本発明による方法を実施するのに適したデバイスは特に有利である。さらに、本発明によるデバイスと、第１の流体、および第２の流体であって、第１の流体とは非混和性であり、かつ第１の流体を少なくとも部分的に覆う第２の流体を受容する培養担体とを有するシステムは有利である。培養担体は、デバイスによって受容することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
本発明の主題を図面に概略的に示し、同一の要素または同一の効果を有する要素には、ほとんどの場合同一の参照符号を付与する。
【図１】第１の流体と第２の流体とを有する培養担体を示す図である。
【図２】領域が作成される前の本発明によるデバイスの一部の側面図である。
【図３】変位媒体の第１の動作モードによって細胞を含む領域が作成される、本発明によるデバイスの一部の側面図である。
【図４】変位媒体の第２の動作モードによって細胞を含む領域が作成される、本発明によるデバイスの一部の側面図である。
【図５】それぞれが細胞を含む複数の領域が作成された後の本発明によるデバイスの一部の側面図である。
【図６】複数の領域が作成された後の培養担体の平面図である。
【図７】細胞を含む領域を有する本発明によるデバイスの一部の側面図である。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
図１は、容器として設計された培養担体３を示す。培養担体３は、第１の流体４と、第１の流体４とは非混和性の第２の流体５とを含む。第１の流体４は、複数の細胞１を含む。第１の流体４が代替的または追加的に粒子を含む設計も考えられる。第１の流体４および第２の流体５は、培養担体３に添加される。第１の流体４は、好ましくは、第２の流体５よりも先に添加することができる。第２の流体５は、第１の流体４上に配置され、培養担体３内でこれを完全に覆う。
【００４５】
図２は、領域が作成される前の本発明によるデバイス１０の一部の側面図を示す。図２からわかるように、培養担体３は、デバイス１０のレセプタクル１３上に配置される。デバイス１０は、方向ｘ、方向ｚ、方向ｙに沿って移動させることができる変位媒体６を有する。さらに、デバイス１０は、光学的取得デバイス２５を有する。取得デバイスは、撮像デバイス１１を有し、それを用いて培養担体３、具体的には担体表面７の光学画像を作成することができる。
【００４６】
さらに、取得デバイス２５は、評価デバイス１２を有する。撮像デバイス１１は、評価デバイス１２に電気的に接続される。評価デバイス１２は、担体表面７上の第１の流体４中にある細胞１の位置などの細胞情報の項目を決定する役割を果たす。評価デバイス１２は、詳細には示されていないが、制御デバイスに電気的に接続することができる。撮像デバイス１１と変位媒体６とは、デバイス１０のレセプタクル１３に関して互いに対向して配置することができ、または互いに中心からずらして配置することもできる。
【００４７】
デバイス１０は、制御デバイスによって制御される移動デバイス２６を有することができる。移動デバイス２６は、取得デバイス２５および／または変位媒体６および／または培養担体３を方向ｘ、方向ｙ、方向ｚに沿って移動させることができる。具体的には、移動デバイス２６は、以下により詳細に説明する領域を作成するために、評価デバイス１２によって決定された細胞情報の項目に基づいて、変位媒体６および／または培養担体３を移動させることができる。
【００４８】
変位媒体６は、疎水性のピンとして設計される。変位媒体６は、第２の流体５に面する先端に、丸みを帯びた端部を有する。
【００４９】
図３は、変位媒体６の第１の動作モードによって細胞を含む閉領域２が作成される、本発明によるデバイス１０の一部の側面図を示す。領域２が作成される前に、細胞情報の項目が取得デバイス２５を用いて決定される。具体的には、細胞１が配置されている担体表面７の領域が決定される。
【００５０】
その後、細胞１を含む閉領域２を作成するように変位媒体６を移動させる。領域２を作成するために、変位媒体６をまず方向ｙに沿って担体表面７へ移動させる。第２の流体５の一部によって担体表面７を覆った後、閉領域２を作成するために、変位媒体６を方向ｚおよび方向ｘに沿って移動させる。変位媒体６が方向ｚおよび方向ｘに沿って移動するとき、第１の流体４も変位媒体６によって変位するため、第２の流体５は、担体表面７を覆うことができる。
【００５１】
この動作モードでは、変位媒体６は、第２の流体５の一部が担体表面７を覆うまで、第２の流体５の一部を担体表面７の方向に押圧する。この動作モードでは、変位媒体７は、担体表面７と直接接触しない。図４からわかるように、第２の流体５の一部は、変位媒体６と担体表面７との間に配置される。
【００５２】
領域２は、第２の流体の一部１５によって残余部分１８から流体的に分離され、残余部分１８は、複数の細胞１を含む第１の流体４を有する。流体分離は、領域２内に位置する第１の流体４が、残余部分１８内に位置する第１の流体４に流体的に連結されないように行われる。
【００５３】
図４は、変位媒体６の第２の動作モードによって細胞１を含む閉領域２が作成される、本発明によるデバイス１０の一部の側面図を示す。この動作モードでは、変位媒体６が方向ｙに沿って移動するときに第２の流体５を通過し、第１の流体４および第２の流体５を変位させるように、変位媒体６を移動させる。変位媒体６は、担体表面７に直接接触する。
【００５４】
変位媒体６が担体表面７に接触後、閉領域２を作成するために、変位媒体６を方向ｘおよび／または方向ｚに移動させる。変位媒体６をｘ方向および／またはｚ方向に沿って移動させると、第１の流体４も変位する。変位媒体６が移動した後、第２の流体５の一部は、変位媒体６によって変位された第１の流体４が占めていた部分に流入して、担体表面７を覆う。
【００５５】
図５は、それぞれが細胞１を含む複数の領域２が作成された後の本発明によるデバイスの一部の側面図を示す。具体的には、図５は、正確には３つの領域２、すなわち第１の領域２２と、第２の領域１６と、第３の領域１７とがデバイス１０を用いて作成されたことを示す。さらに、培養担体３は、細胞を含まない残余領域８を含む。
【００５６】
個々の領域２は、第２の流体の一部１５によって、互いに、および残余領域８から流体的に分離される。具体的には、第１の領域２２は、第２の流体の第１の一部２３によって残余領域８から流体的に分離される。残余領域８はまた、第２の流体の第２の一部１９によって、第２の領域１６から流体的に分離される。第２の領域１６はさらに、第２の流体の第３の一部２０によって、第３の領域１７から流体的に分離される。
【００５７】
図３ですでに説明したように、領域２を作成するために、第１の流体４、第２の流体５の２つの流体が培養担体３に導入された後、撮像デバイス１１を用いて、培養担体３、具体的には担体表面７の画像、または、画像スタッキングを用いて流体体積全体の画像が作成される。評価デバイス１２は、作成された画像に基づいて、細胞情報の項目、具体的には第１の流体４中にある細胞１の位置を決定する。
【００５８】
第１の領域２２を作成するために、決定された細胞１の位置に基づいて、培養担体３に対する相対位置に変位媒体６を移動させ、図３または図４に示すように、担体表面７の方向に方向ｙに沿って下降させる。
【００５９】
ここで、変位媒体６の丸みを帯びた端部は、第２の流体の第１の一部２３が担体表面７を覆うように、第１の流体４を変位させる。その後、変位媒体６を、担体表面７と平行に走る方向ｚ、方向ｘに沿って移動させて、第１の領域２２を作成する。
【００６０】
第１の領域２２は、第２の流体の第１の一部２３によって、培養担体３内に位置する第１の流体４の残余から流体的に分離される。したがって、第１の領域２２は、担体表面７と、培養担体３の側壁と、担体表面７を覆う第２の流体の第１の一部２３と、第１の領域２２を覆う第２の流体５とによって画定される。第１の領域２２が作成された後、変位媒体６を担体表面７から離すように方向ｙに移動させる。その後、培養担体３に対する別の相対位置に変位媒体６を移動させ、そこから図５に示す第２の領域１６を作成する。第２の領域１６の完成後、第３の領域１７を作成する。
【００６１】
第２の領域１６および第３の領域１７は、第２の流体の第２の一部１９、第２の流体の第３の一部２０が担体表面７を覆うように変位媒体６が第１の流体４を変位させることで、第１の領域２２と同様に作成される。さらに、変位媒体６は担体表面７と平行に移動する。変位媒体６が担体表面７と平行に移動する場合でも、第１の流体４は、第２の流体の第２の一部１９、第２の流体の第３の一部２０が担体表面７を覆うように変位する。
【００６２】
デバイス１０はまた、除去デバイス１４を有する。残余領域８は、除去デバイス１４を用いて吸い出すことができる。この場合、除去デバイス１４は、細胞を含まない残余領域８を除去する役割を果たす。代替または追加として、除去デバイス１４は、領域２を吸い出す役割を果たすことができる。吸引は、所定の期間または検査の後に行われるため、細胞増殖はそれぞれの領域２で行われる。
【００６３】
図６は、複数の領域２、すなわち第１の領域２２と、第２の領域１６と、第３の領域１７とが作成された後の培養担体３の平面図を示す。図６に示す培養担体３内の細胞１の配置は、図１から図５に示す培養担体３内の細胞１の配置とは異なる。
【００６４】
図６からわかるように、３つの領域２は横断面が異なる。さらに、３つの領域２は、設計および体積が互いに異なる。第１の領域２２は円形であり、第２の領域１６は長方形であり、第３の領域１７は三角形である。残余領域８は、除去デバイス１４を用いて除去済である。
【００６５】
第２の領域１６は、２つの下位領域９に分割することができる。これは、変位媒体６が第２の領域１６の第１の流体４を変位させることによって起こり得る。その結果、第２の流体の第４の一部２１が担体表面７を覆う。２つの下位領域９を分離する第２の流体の第４の一部２１を図６に破線で示す。
【００６６】
図６に示す領域２は、図２〜図５に示す方法を用いて作成することができる。これは、変位媒体６が第２の流体の一部１５のそれぞれを担体表面７にすでに押圧した後に、または変位媒体６自体が担体表面７に直接接触した後に、ｘ方向、ｙ方向に沿って移動することを意味する。あるいは、図６に示す領域は、図７に関連して以下に説明する方法によって作成することができる。
【００６７】
図７は、細胞１を含む領域２を有する本発明によるデバイス１０の一部の側面図を示す。デバイス１０は、図３または図４に示すデバイス１０とは変位媒体６の設計が異なる。したがって、図７に示す変位媒体６は、担体表面７に面する先端にパターン要素２７を有し、それを用いて、例えば、横断面が円形の領域２を作成することができる。パターン要素２７は、中空の円筒として設計される。
【００６８】
閉領域２を作成するために、移動デバイス２６は、変位媒体６を方向ｙに限定して移動させる。したがって、変位媒体６は、第２の流体の一部１５を担体表面７の方向に、第２の流体の一部１５が担体表面７を覆うまで押圧する。あるいは、変位媒体６は、図４に示す実施形態と同様に操作することができ、その結果、変位媒体６は第１の流体４を変位させて担体表面７と直接接触する。変位媒体６が担体表面７に接触後に、これを方向ｙで反対方向に移動させる。第２の流体５の一部が担体表面７を覆い、それによって、領域２と第１の流体の残余部分１８との間の流体分離が実現される。
【００６９】
図６に示す変位媒体６を使用することにより、閉領域２を作成するために変位媒体６を方向ｘ、方向ｚに移動させる必要はない。すなわち、単に変位媒体６を方向ｙに限定して移動させることによって、領域を作成することができる。
【符号の説明】
【００７０】
１  細胞
２  領域
３  培養担体
４  第１の流体
５  第２の流体
６  変位媒体
７  担体表面
８  細胞を含まない残余領域
９  下位領域
１０  デバイス
１１  撮像デバイス
１２  評価デバイス
１３  レセプタクル
１４  除去デバイス
１５  第２の流体の一部
１６  第２の領域
１７  第３の領域
１８  残余部分
１９  第２の流体の第２の一部
２０  第２の流体の第３の一部
２１  第２の流体の第４の一部
２２  第１の領域
２３  第２の流体の第１の一部
２５  取得デバイス
２６  移動デバイス
２７  パターン要素
ｘ、ｙ、ｚ  方向
【図１】
2021525057.tif 000003
【図２】
2021525057.tif 000004
【図３】
2021525057.tif 000005
【図４】
2021525057.tif 000006
【図５】
2021525057.tif 000007
【図６】
2021525057.tif 000008
【図７】
2021525057.tif 000009
【国際調査報告】
2021525057.tif 000010
2021525057.tif 000011
2021525057.tif 000012
2021525057.tif 000013
2021525057.tif 000014