(57)【要約】本発明は、操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）酵素、ＰＮＰ活性を有するポリペプチド、およびこれらの酵素をコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含むベクターおよび宿主細胞を提供する。ＰＮＰ酵素を産生させるための方法も提供する。本発明は、ＰＮＰ酵素を含む組成物、および操作されたＰＮＰ酵素を使用する方法をさらに提供する。本発明は、医薬化合物の生成において特に使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、６、１２６、２４２および／もしくは６８４またはそれらの機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼであって、前記操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼの前記ポリペプチド配列が、少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号２、６、１２６、２４２および／または６８４を参照して番号付けされる、操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼ。
【請求項２】
前記ポリペプチド配列が、配列番号２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有し、前記操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼの前記ポリペプチド配列が、６５、２、１２、１２／４２、１２／７４／８０／１０１／１６２／２１４／２１５、１２／７４／１０１、１２／８０／１６２／２１０／２１５、１２／８０／２１０、１２／１６２、１２／１６５／１７３／２１０／２１４、１２／１８７、１２／２１０、２０／９０、２１、２５、４２、４５、６９、７２、９１、９５／１７８／１９９、１０５、１１１、１１５、１５５、１６２、１６４、１７１／１７６／１９９、１７６／１７８／１９９、１７６／１９９、１７７、１７８、１７８／１９９、１７９、１８１、１８４、１９９、２０２、２０４、２０７、および２１２から選択される前記ポリペプチド配列中の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号２を参照して番号付けされる、請求項１に記載の操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼ。
【請求項３】
前記ポリペプチド配列が、配列番号６と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有し、前記操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼの前記ポリペプチド配列が、２、２／６５、１２／４２／６５、１２／６５、１２／６５／７４／８０／１０１／１６２／２１４／２１５、１２／６５／７４／１０１、１２／６５／８０／２１０、１２／６５／１６２、１２／６５／１６５／１７３／２１０／２１４、２１／６５、３８、４２、４２／１５５、４２／１７７、４５／６５、５４、６５／７２、６５／９１、６５／１０５、６５／１１５、６５／２０２、６５／２１２、８０、８０／９５、８０／１５５、８０／１７５、８４、９１、９１／１１５、９５、９５／１０１、９５／１５５、９５／１５５／２１５、９５／２１２、９５／２１２／２１５、１０１、１０１／１０５、１０１／１８７、１０１／２１２、１０５／１５５／２１２／２１５、１０８、１５５、１５５／１７７／２０４、１５５／１８４／２１２／２１５、１５５／２１２、１６２／１９９、１７５、１７７、１８４／２１２／２１５、１９９、２１２、２１２／２１５、および２１５から選択される前記ポリペプチド配列中の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号６を参照して番号付けされる、請求項１に記載の操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼ。
【請求項４】
前記ポリペプチド配列が、配列番号１２６と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有し、前記操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼの前記ポリペプチド配列が、２、２／８０／９５、２／８０／９５／１５５、２／８０／９５／１５５／１９９／２１２、２／８０／９５／１９９、２／８０／９５／１９９／２１２、２／８０／１０１／１５５／２１２、２／８０／１０１／２１２、２／８０／１５５／１７７／２１５、２／８０／１５５／２１５、２／８０／１７５／１９９、２／８０／１７５／１９９／２１２／２１５、２／８０／１７７、２／８０／１９９／２１２／２１５、２／８０／２１５、２／９５、２／９５／１５５、２／９５／１５５／１９９、２／９５／１５５／１９９／２１２／２１５／２２３、２／９５／１５５／１９９／２１５、２／９５／１５５／２１５、２／９５／１７５、２／９５／１９９、２／９５／１９９／２１２／２１５、２／９５／２１２／２１５、２／９５／２１５、２／１０１／１５５、２／１５５、２／１５５／１７７／２１２、２／１５５／１９９、２／１９９、２／１９９／２１２／２１５、２／２１２／２１５、２／２１５、２８、３９、４２、４５、５３、５４／１７３、５７／１７５、７５、８０、８０／９５／１０１／１５５／１９９、８０／９５／１０１／１５５／１９９／２１５、８０／９５／１０１／１９９、８０／９５／１５５、８０／９５／１５５／１７５／１９９／２１２／２１５、８０／９５／１５５／１９９、８０／９５／１５５／１９９／２１２、８０／９５／１５５／１９９／２１５、８０／９５／１５５／２１２／２１５、８０／９５／１７７、８０／９５／１７７／１９９、８０／９５／１７７／２１２／２１５、８０／９５／２１５、８０／１０１、８０／１５５、８０／１５５／１７７／１９９、８０／１５５／１７７／２１２／２１５、８０／１５５／１９９、８０／１９９、８０／２１２、８４、８５、９５、９５／１５５、９５／１５５／１７７、９５／１５５／１７７／１９９、９５／１５５／１７７／１９９／２１２、９５／１５５／１９９、９５／１５５／２１２／２１５、９５／１７７／１９９、９５／１９９、９５／２１２、９５／２１２／２１５、９５／２１５、９８、１０１、１０１／１５５／１９９、１０１／１５５／１９９／２１２、１０１／１７７／２１２、１０１／２１５、１１９、１２３、１２４、１２９、１３０、１３１、１３２、１３６、１３７、１３９、１４０、１４３、１４４、１４８、１４８／１７５、１５０、１５１、１５２、１５３、１５５、１５５／１９９、１５５／２１２／２１５、１６０、１７０／２０３、１７３、１７５／２１２、１７７、１７７／１９９、１９１、１９１／２３７、１９６、１９９、１９９／２１２、２１０、２１２、２１２／２１５、２１６、および２２０から選択される前記ポリペプチド配列中の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号１２６を参照して番号付けされる、請求項１に記載の操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼ。
【請求項５】
前記ポリペプチド配列が、配列番号２４２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有し、前記操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼの前記ポリペプチド配列が、７、１２、２７、２８、３１、３２、３５、３７、３８、５２、５７、８５、９４、９７、９８、１００、１０２、１３３、１３６、１４３、１４４、１４５、１４８、１４９、１５０、１６２、１６９、１７０、１７２、１７３、１９５／１９９、１９６、１９９、２０７、２０８、２０８／２３８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１７、２１９、２２０、２２１、２２３、２２４、２２７、２３５、および２３８から選択される前記ポリペプチド配列中の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号２４２を参照して番号付けされる、請求項１に記載の操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼ。
【請求項６】
前記ポリペプチド配列が、配列番号６８４と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有し、前記操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼの前記ポリペプチド配列が、１０、１０／１３３／２２７、１０／１４５、１０／１４５／２２７、１８、２０、２６、２９、３９／９８、３９／１３３／２２７、６０、６２、６３、７４、８９、９４、９７、９７／９８、１０８、１２６、１３３、１３５、１４５、１６１、１６２、１６５、１６７、１６８、１７７、１９９、２０８、２１０、２１２、２２４および２２７から選択される前記ポリペプチド配列中の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号６８４を参照して番号付けされる、請求項１に記載の操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼ。
【請求項７】
表４．１、５．１、６．１、７．１および／または８．１に示される少なくとも１つの操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼバリアントの配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高く同一であるポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼ。
【請求項８】
配列番号２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高く同一であるポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼ。
【請求項９】
配列番号４〜１００２の偶数配列に示される少なくとも１つの操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼバリアントの配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高く同一であるポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼ。
【請求項１０】
配列番号２〜１００２の少なくとも１つの偶数配列に示されるポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼ。
【請求項１１】
野生型Ｅ．ｃｏｌｉのプリンヌクレオシドホスホリラーゼと比較して少なくとも１つの改善された性質を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼ。
【請求項１２】
前記改善された性質が、基質に対する改善された活性を含む、請求項１１に記載の操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼ。
【請求項１３】
前記基質が、化合物３を含む、請求項１２に記載の操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼ。
【請求項１４】
前記基質が、化合物４を含む、請求項１２に記載の操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼ。
【請求項１５】
前記基質が、化合物８を含む、請求項１２に記載の操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼ。
【請求項１６】
前記改善された性質が、化合物１の改善された生成を含む、請求項１１〜１５のいずれかに記載の操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼ。
【請求項１７】
前記改善された性質が、化合物１０の改善された生成を含む、請求項１〜１２および１５のいずれかに記載の操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼ。
【請求項１８】
精製されている、請求項１〜１７のいずれかに記載の操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼ。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれかに記載の操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼを含む組成物。
【請求項２０】
請求項１〜１８のいずれかに記載の少なくとも１つの操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項２１】
少なくとも１つの操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするポリヌクレオチド配列であって、前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号１、５、１２５、２４１および／または６８３と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を含み、前記操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼの前記ポリヌクレオチド配列が、１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換を含む、ポリヌクレオチド配列。
【請求項２２】
配列番号１、５、１２５、２４１および／もしくは６８３またはそれらの機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれよりも高い配列同一性を含む少なくとも１つの操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項２３】
制御配列に作動可能に連結されている、請求項２０〜２２のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項２４】
コドン最適化されている、請求項２０〜２３のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項２５】
配列番号３〜１００１の奇数配列に示されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項２０〜２４のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項２６】
請求項２０〜２５のいずれかに記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項２７】
請求項２６に記載の少なくとも１つの発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２８】
請求項２０〜２５のいずれかに記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞。
【請求項２９】
宿主細胞において操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼを産生させる方法であって、少なくとも１つの操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼが産生するように、適切な条件下で、請求項２７および／または２８に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
【請求項３０】
培養物および／または宿主細胞から少なくとも１つの操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼを回収することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記少なくとも１つの操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼを精製するステップをさらに含む、請求項２９および／または３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１８年７月９日に出願された米国仮特許出願第６２／６９５，５０７号、および２０１９年３月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／８２２，２６３号に対する優先権を主張し、この両方とも、すべての目的のために、その全体が参照によって組み込まれる。
【０００２】
本発明は、操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）酵素、ＰＮＰ活性を有するポリペプチド、およびこれらの酵素をコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含むベクターおよび宿主細胞を提供する。ＰＮＰ酵素を産生させるための方法も提供する。本発明は、ＰＮＰ酵素を含む組成物、および操作されたＰＮＰ酵素を使用する方法をさらに提供する。本発明は、医薬化合物の生成において特に使用される。
【０００３】
配列表、表またはコンピュータープログラムに対する参照
配列表の公式の写しを、作成日２０１９年６月２５日およびサイズ１，５４７キロバイトのファイル名「ＣＸ２−１７２ＷＯ１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」のＡＳＣＩＩフォーマットのテキストファイルとして本明細書と共に、ここに、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出する。ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）と表されるレトロウイルスは、罹患した個体の免疫系の進行性の破壊、ならびに中枢および末梢神経系の変性を含む複雑な疾患である後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病原因子である。レトロウイルスの複製の一般的な特徴は、ウイルスの複製のために必要なＨＩＶ配列のＤＮＡコピーを生じる、ウイルスにコードされる逆転写酵素によるウイルスのＲＮＡゲノムの逆転写である。ＭＫ−８５９１などのいくつかの化合物は、公知の逆転写酵素阻害剤であり、ＡＩＤＳおよび類似の疾患の処置において使用されている。ＨＩＶ逆転写酵素を阻害することが公知のいくつかの化合物があるが、この酵素の阻害においてより有効で、それによってＡＩＤＳの作用を寛解させるさらなる化合物について当技術分野における必要性が残されている。
【０００５】
ＭＫ−８５９１（Ｍｅｒｃｋ）などのヌクレオシドアナログは、ＤＮＡ合成において使用される天然のヌクレオシドに対するそれらの類似性に起因して、ＨＩＶの逆転写酵素の有効な阻害剤である。逆転写酵素によるこれらのアナログの結合は、逆転写酵素の進行性の性質を阻害することによって、ＤＮＡの合成を失速させる。酵素の失速は、ＤＮＡ分子の中途終止をもたらし、それを無効にする。しかしながら、標準的な化学合成技法によるヌクレオシドアナログの生成は、それらの化学的な複雑さに起因して課題をもたらし得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）酵素、ＰＮＰ活性を有するポリペプチド、およびこれらの酵素をコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含むベクターおよび宿主細胞を提供する。ＰＮＰ酵素を産生させるための方法も提供する。本発明は、ＰＮＰ酵素を含む組成物、および操作されたＰＮＰ酵素を使用する方法をさらに提供する。本発明は、医薬化合物の生成において特に使用される。
【０００７】
本発明は、配列番号２またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼであって、前記操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼのポリペプチド配列が、少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号２を参照して番号付けされる、操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼを提供する。一部の実施形態では、操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼは、配列番号２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、前記操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼのポリペプチド配列は、２、１２、１２／４２、１２／７４／８０／１０１／１６２／２１４／２１５、１２／７４／１０１、１２／８０／１６２／２１０／２１５、１２／８０／２１０、１２／１６２、１２／１６５／１７３／２１０／２１４、１２／１８７、１２／２１０、２０／９０、２１、２５、４２、４５、６５、６９、７２、９１、９５／１７８／１９９、１０５、１１１、１１５、１５５、１６２、１６４、１７１／１７６／１９９、１７６／１７８／１９９、１７６／１９９、１７７、１７８、１７８／１９９、１７９、１８１、１８４、１９９、２０２、２０４、２０７、および２１２から選択される前記ポリペプチド配列中の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２を参照して番号付けされる。一部の追加の実施形態では、前記操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼのポリペプチド配列は、２Ｎ、２Ｐ、２Ｓ、２Ｔ、１２Ａ、１２Ａ／４２Ｄ、１２Ａ／７４Ａ／８０Ｅ／１０１Ｖ／１６２Ｔ／２１４Ｓ／２１５Ｓ、１２Ａ／７４Ａ／１０１Ｖ、１２Ａ／８０Ｅ／１６２Ｔ／２１０Ｇ／２１５Ｓ、１２Ａ／８０Ｅ／２１０Ｇ、１２Ａ／１６２Ｔ、１２Ａ／１６５Ｐ／１７３Ｎ／２１０Ｇ／２１４Ｓ、１２Ａ／２１０Ｇ、１２Ｆ、１２Ｋ／１８７Ｈ、１２Ｌ、１２Ｓ、２０Ｓ／９０Ｌ、２１Ｒ、２５Ｌ、４２Ｄ、４５Ｔ、４５Ｗ、６５Ａ、６５Ｐ、６５Ｓ、６５Ｔ、６９Ｋ、７２Ａ、７２Ｌ、７２Ｍ、７２Ｔ、７２Ｖ、９１Ｔ、９５Ｉ／１７８Ａ／１９９Ａ、１０５Ｌ、１１１Ｍ、１１５Ｇ、１１５Ｒ、１１５Ｖ、１５５Ｈ、１６２Ａ、１６２Ｒ、１６４Ｅ、１６４Ｖ、１７１Ｌ／１７６Ｖ／１９９Ａ、１７６Ｖ／１７８Ａ／１９９Ａ、１７６Ｖ／１９９Ａ、１７７Ｖ、１７８Ａ、１７８Ａ／１９９Ａ、１７９Ｔ、１８１Ｌ、１８４Ｓ、１９９Ａ、２０２Ｖ、２０４Ａ、２０７Ｃ、および２１２Ａから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２を参照して番号付けされる。さらに一部の追加の実施形態では、前記操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼのポリペプチド配列は、Ａ２Ｎ、Ａ２Ｐ、Ａ２Ｓ、Ａ２Ｔ、Ｄ１２Ａ、Ｄ１２Ａ／Ｎ４２Ｄ、Ｄ１２Ａ／Ｔ７４Ａ／Ｄ８０Ｅ／Ｌ１０１Ｖ／Ｓ１６２Ｔ／Ｔ２１４Ｓ／Ａ２１５Ｓ、Ｄ１２Ａ／Ｔ７４Ａ／Ｌ１０１Ｖ、Ｄ１２Ａ／Ｄ８０Ｅ／Ｓ１６２Ｔ／Ｈ２１０Ｇ／Ａ２１５Ｓ、Ｄ１２Ａ／Ｄ８０Ｅ／Ｈ２１０Ｇ、Ｄ１２Ａ／Ｓ１６２Ｔ、Ｄ１２Ａ／Ｇ１６５Ｐ／Ｋ１７３Ｎ／Ｈ２１０Ｇ／Ｔ２１４Ｓ、Ｄ１２Ａ／Ｈ２１０Ｇ、Ｄ１２Ｆ、Ｄ１２Ｋ／Ｙ１８７Ｈ、Ｄ１２Ｌ、Ｄ１２Ｓ、Ｐ２０Ｓ／Ｇ９０Ｌ、Ｇ２１Ｒ、Ｒ２５Ｌ、Ｎ４２Ｄ、Ｇ４５Ｔ、Ｇ４５Ｗ、Ｍ６５Ａ、Ｍ６５Ｐ、Ｍ６５Ｓ、Ｍ６５Ｔ、Ｓ６９Ｋ、Ｉ７２Ａ、Ｉ７２Ｌ、Ｉ７２Ｍ、Ｉ７２Ｔ、Ｉ７２Ｖ、Ｓ９１Ｔ、Ｖ９５Ｉ／Ｇ１７８Ａ／Ｔ１９９Ａ、Ｖ１０５Ｌ、Ｃ１１１Ｍ、Ｋ１１５Ｇ、Ｋ１１５Ｒ、Ｋ１１５Ｖ、Ｆ１５５Ｈ、Ｓ１６２Ａ、Ｓ１６２Ｒ、Ｄ１６４Ｅ、Ｄ１６４Ｖ、Ｍ１７１Ｌ／Ｉ１７６Ｖ／Ｔ１９９Ａ、Ｉ１７６Ｖ／Ｇ１７８Ａ／Ｔ１９９Ａ、Ｉ１７６Ｖ／Ｔ１９９Ａ、Ｌ１７７Ｖ、Ｇ１７８Ａ、Ｇ１７８Ａ／Ｔ１９９Ａ、Ｖ１７９Ｔ、Ｍ１８１Ｌ、Ａ１８４Ｓ、Ｔ１９９Ａ、Ｔ２０２Ｖ、Ｓ２０４Ａ、Ｉ２０７Ｃ、およびＱ２１２Ａから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２を参照して番号付けされる。
【０００８】
本発明は、配列番号６またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼであって、前記操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼのポリペプチド配列が、少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号６を参照して番号付けされる、操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼを提供する。一部の実施形態では、操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼは、配列番号６と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、前記操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼのポリペプチド配列は、２、２／６５、１２／４２／６５、１２／６５、１２／６５／７４／８０／１０１／１６２／２１４／２１５、１２／６５／７４／１０１、１２／６５／８０／２１０、１２／６５／１６２、１２／６５／１６５／１７３／２１０／２１４、２１／６５、３８、４２、４２／１５５、４２／１７７、４５／６５、５４、６５／７２、６５／９１、６５／１０５、６５／１１５、６５／２０２、６５／２１２、８０、８０／９５、８０／１５５、８０／１７５、８４、９１、９１／１１５、９５、９５／１０１、９５／１５５、９５／１５５／２１５、９５／２１２、９５／２１２／２１５、１０１、１０１／１０５、１０１／１８７、１０１／２１２、１０５／１５５／２１２／２１５、１０８、１５５、１５５／１７７／２０４、１５５／１８４／２１２／２１５、１５５／２１２、１６２／１９９、１７５、１７７、１８４／２１２／２１５、１９９、２１２、２１２／２１５、および２１５から選択される前記ポリペプチド配列中の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号６を参照して番号付けされる。一部の追加の実施形態では、前記操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼのポリペプチド配列は、２Ｐ、２Ｐ／６５Ｍ、２Ｓ、２Ｓ／６５Ｍ、２Ｔ、１２Ａ／４２Ｄ／６５Ｍ、１２Ａ／６５Ｍ、１２Ａ／６５Ｍ／７４Ａ／８０Ｅ／１０１Ｖ／１６２Ｔ／２１４Ｓ／２１５Ｓ、１２Ａ／６５Ｍ／７４Ａ／１０１Ｖ、１２Ａ／６５Ｍ／８０Ｅ／２１０Ｇ、１２Ａ／６５Ｍ／１６２Ｔ、１２Ａ／６５Ｍ／１６５Ｐ／１７３Ｎ／２１０Ｇ／２１４Ｓ、１２Ｆ／６５Ｍ、１２Ｌ／６５Ｍ、２１Ｒ／６５Ｍ、３８Ｅ、４２Ｄ、４２Ｄ／１５５Ｈ、４２Ｄ／１７７Ｖ、４５Ｗ／６５Ｍ、５４Ｄ、６５Ｍ／７２Ｍ、６５Ｍ／９１Ｔ、６５Ｍ／１０５Ｌ、６５Ｍ／１１５Ｒ、６５Ｍ／１１５Ｖ、６５Ｍ／２０２Ｖ、６５Ｍ／２１２Ａ、８０Ｅ、８０Ｅ／９５Ｉ、８０Ｅ／１５５Ｈ、８０Ｅ／１７５Ｖ、８４Ｅ、９１Ｔ、９１Ｔ／１１５Ｒ、９５Ｉ、９５Ｉ／１０１Ｖ、９５Ｉ／１５５Ｈ、９５Ｉ／１５５Ｈ／２１５Ｓ、９５Ｉ／２１２Ａ、９５Ｉ／２１２Ａ／２１５Ｓ、１０１Ｖ、１０１Ｖ／１０５Ｌ、１０１Ｖ／１８７Ｈ、１０１Ｖ／２１２Ａ、１０５Ｌ／１５５Ｈ／２１２Ａ／２１５Ｓ、１０８Ｉ、１５５Ｈ、１５５Ｈ／１７７Ｖ／２０４Ａ、１５５Ｈ／１８４Ｓ／２１２Ａ／２１５Ｓ、１５５Ｈ／２１２Ａ、１６２Ｔ／１９９Ａ、１７５Ｖ、１７７Ｖ、１８４Ｓ／２１２Ａ／２１５Ｓ、１９９Ａ、２１２Ａ、２１２Ａ／２１５Ｓ、および２１５Ｓから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号６を参照して番号付けされる。さらに一部の追加の実施形態では、前記操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼのポリペプチド配列は、Ａ２Ｐ、Ａ２Ｐ／Ａ６５Ｍ、Ａ２Ｓ、Ａ２Ｓ／Ａ６５Ｍ、Ａ２Ｔ、Ｄ１２Ａ／Ｎ４２Ｄ／Ａ６５Ｍ、Ｄ１２Ａ／Ａ６５Ｍ、Ｄ１２Ａ／Ａ６５Ｍ／Ｔ７４Ａ／Ｄ８０Ｅ／Ｌ１０１Ｖ／Ｓ１６２Ｔ／Ｔ２１４Ｓ／Ａ２１５Ｓ、Ｄ１２Ａ／Ａ６５Ｍ／Ｔ７４Ａ／Ｌ１０１Ｖ、Ｄ１２Ａ／Ａ６５Ｍ／Ｄ８０Ｅ／Ｈ２１０Ｇ、Ｄ１２Ａ／Ａ６５Ｍ／Ｓ１６２Ｔ、Ｄ１２Ａ／Ａ６５Ｍ／Ｇ１６５Ｐ／Ｋ１７３Ｎ／Ｈ２１０Ｇ／Ｔ２１４Ｓ、Ｄ１２Ｆ／Ａ６５Ｍ、Ｄ１２Ｌ／Ａ６５Ｍ、Ｇ２１Ｒ／Ａ６５Ｍ、Ｒ３８Ｅ、Ｎ４２Ｄ、Ｎ４２Ｄ／Ｆ１５５Ｈ、Ｎ４２Ｄ／Ｌ１７７Ｖ、Ｇ４５Ｗ／Ａ６５Ｍ、Ｋ５４Ｄ、Ａ６５Ｍ／Ｉ７２Ｍ、Ａ６５Ｍ／Ｓ９１Ｔ、Ａ６５Ｍ／Ｖ１０５Ｌ、Ａ６５Ｍ／Ｋ１１５Ｒ、Ａ６５Ｍ／Ｋ１１５Ｖ、Ａ６５Ｍ／Ｔ２０２Ｖ、Ａ６５Ｍ／Ｑ２１２Ａ、Ｄ８０Ｅ、Ｄ８０Ｅ／Ｖ９５Ｉ、Ｄ８０Ｅ／Ｆ１５５Ｈ、Ｄ８０Ｅ／Ｇ１７５Ｖ、Ｋ８４Ｅ、Ｓ９１Ｔ、Ｓ９１Ｔ／Ｋ１１５Ｒ、Ｖ９５Ｉ、Ｖ９５Ｉ／Ｌ１０１Ｖ、Ｖ９５Ｉ／Ｆ１５５Ｈ、Ｖ９５Ｉ／Ｆ１５５Ｈ／Ａ２１５Ｓ、Ｖ９５Ｉ／Ｑ２１２Ａ、Ｖ９５Ｉ／Ｑ２１２Ａ／Ａ２１５Ｓ、Ｌ１０１Ｖ、Ｌ１０１Ｖ／Ｖ１０５Ｌ、Ｌ１０１Ｖ／Ｙ１８７Ｈ、Ｌ１０１Ｖ／Ｑ２１２Ａ、Ｖ１０５Ｌ／Ｆ１５５Ｈ／Ｑ２１２Ａ／Ａ２１５Ｓ、Ｍ１０８Ｉ、Ｆ１５５Ｈ、Ｆ１５５Ｈ／Ｌ１７７Ｖ／Ｓ２０４Ａ、Ｆ１５５Ｈ／Ａ１８４Ｓ／Ｑ２１２Ａ／Ａ２１５Ｓ、Ｆ１５５Ｈ／Ｑ２１２Ａ、Ｓ１６２Ｔ／Ｔ１９９Ａ、Ｇ１７５Ｖ、Ｌ１７７Ｖ、Ａ１８４Ｓ／Ｑ２１２Ａ／Ａ２１５Ｓ、Ｔ１９９Ａ、Ｑ２１２Ａ、Ｑ２１２Ａ／Ａ２１５Ｓ、およびＡ２１５Ｓから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号６を参照して番号付けされる。
【０００９】
本発明は、配列番号１２６またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼであって、前記操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼのポリペプチド配列が、少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号１２６を参照して番号付けされる、操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼを提供する。一部の実施形態では、操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼは、配列番号１２６と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、前記操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼのポリペプチド配列は、２、２／８０／９５、２／８０／９５／１５５、２／８０／９５／１５５／１９９／２１２、２／８０／９５／１９９、２／８０／９５／１９９／２１２、２／８０／１０１／１５５／２１２、２／８０／１０１／２１２、２／８０／１５５／１７７／２１５、２／８０／１５５／２１５、２／８０／１７５／１９９、２／８０／１７５／１９９／２１２／２１５、２／８０／１７７、２／８０／１９９／２１２／２１５、２／８０／２１５、２／９５、２／９５／１５５、２／９５／１５５／１９９、２／９５／１５５／１９９／２１２／２１５／２２３、２／９５／１５５／１９９／２１５、２／９５／１５５／２１５、２／９５／１７５、２／９５／１９９、２／９５／１９９／２１２／２１５、２／９５／２１２／２１５、２／９５／２１５、２／１０１／１５５、２／１５５、２／１５５／１７７／２１２、２／１５５／１９９、２／１９９、２／１９９／２１２／２１５、２／２１２／２１５、２／２１５、２８、３９、４２、４５、５３、５４／１７３、５７／１７５、７５、８０、８０／９５／１０１／１５５／１９９、８０／９５／１０１／１５５／１９９／２１５、８０／９５／１０１／１９９、８０／９５／１５５、８０／９５／１５５／１７５／１９９／２１２／２１５、８０／９５／１５５／１９９、８０／９５／１５５／１９９／２１２、８０／９５／１５５／１９９／２１５、８０／９５／１５５／２１２／２１５、８０／９５／１７７、８０／９５／１７７／１９９、８０／９５／１７７／２１２／２１５、８０／９５／２１５、８０／１０１、８０／１５５、８０／１５５／１７７／１９９、８０／１５５／１７７／２１２／２１５、８０／１５５／１９９、８０／１９９、８０／２１２、８４、８５、９５、９５／１５５、９５／１５５／１７７、９５／１５５／１７７／１９９、９５／１５５／１７７／１９９／２１２、９５／１５５／１９９、９５／１５５／２１２／２１５、９５／１７７／１９９、９５／１９９、９５／２１２、９５／２１２／２１５、９５／２１５、９８、１０１、１０１／１５５／１９９、１０１／１５５／１９９／２１２、１０１／１７７／２１２、１０１／２１５、１１９、１２３、１２４、１２９、１３０、１３１、１３２、１３６、１３７、１３９、１４０、１４３、１４４、１４８、１４８／１７５、１５０、１５１、１５２、１５３、１５５、１５５／１９９、１５５／２１２／２１５、１６０、１７０／２０３、１７３、１７５／２１２、１７７、１７７／１９９、１９１、１９１／２３７、１９６、１９９、１９９／２１２、２１０、２１２、２１２／２１５、２１６、および２２０から選択される前記ポリペプチド配列中の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１２６を参照して番号付けされる。一部の追加の実施形態では、前記操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼのポリペプチド配列は、２Ｓ、２Ｓ／８０Ｅ／９５Ｉ、２Ｓ／８０Ｅ／９５Ｉ／１５５Ｈ／１９９Ａ／２１２Ａ、２Ｓ／８０Ｅ／９５Ｉ／１９９Ａ、２Ｓ／８０Ｅ／９５Ｉ／１９９Ａ／２１２Ａ、２Ｓ／８０Ｅ／１０１Ｖ／１５５Ｈ／２１２Ａ、２Ｓ／８０Ｅ／１０１Ｖ／２１２Ａ、２Ｓ／８０Ｅ／１５５Ｈ／１７７Ｖ／２１５Ｓ、２Ｓ／８０Ｅ／１７５Ｖ／１９９Ａ／２１２Ａ／２１５Ｓ、２Ｓ／８０Ｅ／２１５Ｓ、２Ｓ／９５Ｉ、２Ｓ／９５Ｉ／１５５Ｈ／１９９Ａ、２Ｓ／９５Ｉ／１５５Ｈ／１９９Ａ／２１２Ａ／２１５Ｓ／２２３Ｈ、２Ｓ／９５Ｉ／１５５Ｈ／１９９Ａ／２１５Ｓ、２Ｓ／９５Ｉ／１７５Ｖ、２Ｓ／９５Ｉ／２１２Ａ／２１５Ｓ、２Ｓ／９５Ｉ／２１５Ｓ、２Ｓ／１０１Ｖ／１５５Ｈ、２Ｓ／１５５Ｈ／１９９Ａ、２Ｓ／１９９Ａ／２１２Ａ／２１５Ｓ、２Ｓ／２１２Ａ／２１５Ｓ、２Ｓ／２１５Ｓ、２Ｔ、２Ｔ／８０Ｅ／９５Ｉ／１５５Ｈ、２Ｔ／８０Ｅ／１５５Ｈ／２１５Ｓ、２Ｔ／８０Ｅ／１７５Ｖ／１９９Ａ、２Ｔ／８０Ｅ／１７７Ｖ、２Ｔ／８０Ｅ／１９９Ａ／２１２Ａ／２１５Ｓ、２Ｔ／９５Ｉ、２Ｔ／９５Ｉ／１５５Ｈ、２Ｔ／９５Ｉ／１５５Ｈ／１９９Ａ、２Ｔ／９５Ｉ／１５５Ｈ／２１５Ｓ、２Ｔ／９５Ｉ／１９９Ａ、２Ｔ／９５Ｉ／１９９Ａ／２１２Ａ／２１５Ｓ、２Ｔ／９５Ｉ／２１２Ａ／２１５Ｓ、２Ｔ／９５Ｉ／２１５Ｓ、２Ｔ／１５５Ｈ、２Ｔ／１５５Ｈ／１７７Ｖ／２１２Ａ、２Ｔ／１５５Ｈ／１９９Ａ、２Ｔ／１９９Ａ、２Ｔ／２１５Ｓ、２８Ｈ、３９Ｌ、４２Ｈ、４２Ｓ、４５Ａ、４５Ｃ、５３Ｌ、５４Ｎ／１７３Ｇ、５７Ａ／１７５Ｄ、７５Ｓ、８０Ｅ、８０Ｅ／９５Ｉ／１０１Ｖ／１５５Ｈ／１９９Ａ、８０Ｅ／９５Ｉ／１０１Ｖ／１５５Ｈ／１９９Ａ／２１５Ｓ、８０Ｅ／９５Ｉ／１０１Ｖ／１９９Ａ、８０Ｅ／９５Ｉ／１５５Ｈ、８０Ｅ／９５Ｉ／１５５Ｈ／１７５Ｄ／１９９Ａ／２１２Ａ／２１５Ｓ、８０Ｅ／９５Ｉ／１５５Ｈ／１９９Ａ、８０Ｅ／９５Ｉ／１５５Ｈ／１９９Ａ／２１２Ａ、８０Ｅ／９５Ｉ／１５５Ｈ／１９９Ａ／２１５Ｓ、８０Ｅ／９５Ｉ／１５５Ｈ／２１２Ａ／２１５Ｓ、８０Ｅ／９５Ｉ／１７７Ｖ、８０Ｅ／９５Ｉ／１７７Ｖ／１９９Ａ、８０Ｅ／９５Ｉ／１７７Ｖ／２１２Ａ／２１５Ｓ、８０Ｅ／９５Ｉ／２１５Ｓ、８０Ｅ／１０１Ｖ、８０Ｅ／１５５Ｈ、８０Ｅ／１５５Ｈ／１７７Ｖ／１９９Ａ、８０Ｅ／１５５Ｈ／１７７Ｖ／２１２Ａ／２１５Ｓ、８０Ｅ／１５５Ｈ／１９９Ａ、８０Ｅ／１９９Ａ、８０Ｅ／２１２Ａ、８４Ｅ、８５Ａ、８５Ｔ、９５Ｉ、９５Ｉ／１５５Ｈ、９５Ｉ／１５５Ｈ／１７７Ｖ、９５Ｉ／１５５Ｈ／１７７Ｖ／１９９Ａ、９５Ｉ／１５５Ｈ／１７７Ｖ／１９９Ａ／２１２Ａ、９５Ｉ／１５５Ｈ／１９９Ａ、９５Ｉ／１５５Ｈ／２１２Ａ／２１５Ｓ、９５Ｉ／１７７Ｖ／１９９Ａ、９５Ｉ／１９９Ａ、９５Ｉ／２１２Ａ、９５Ｉ／２１２Ａ／２１５Ｓ、９５Ｉ／２１５Ｓ、９８Ｄ、９８Ｙ、１０１Ｉ、１０１Ｖ、１０１Ｖ／１５５Ｈ／１９９Ａ、１０１Ｖ／１５５Ｈ／１９９Ａ／２１２Ａ、１０１Ｖ／１７７Ｖ／２１２Ａ、１０１Ｖ／２１５Ｓ、１１９Ｍ、１１９Ｔ、１１９Ｖ、１２３Ｇ、１２３Ｍ、１２３Ｓ、１２３Ｔ、１２４Ｒ、１２９Ｇ、１２９Ｍ、１２９Ｓ、１３０Ｐ、１３０Ｔ、１３１Ｍ、１３１Ｒ、１３２Ａ、１３２Ｃ、１３２Ｌ、１３２Ｎ、１３２Ｓ、１３６Ａ、１３６Ｃ、１３６Ｄ、１３６Ｅ、１３６Ｇ、１３６Ｉ、１３６Ｌ、１３６Ｓ、１３６Ｖ、１３７Ｅ、１３７Ｑ、１３７Ｗ、１３９Ａ、１３９Ｄ、１３９Ｇ、１３９Ｓ、１３９Ｔ、１４０Ｇ、１４３Ｃ、１４３Ｅ、１４３Ｇ、１４３Ｒ、１４３Ｖ、１４３Ｙ、１４４Ｆ、１４４Ｈ、１４４Ｌ、１４４Ｒ、１４４Ｔ、１４４Ｙ、１４８Ｆ、１４８Ｇ、１４８Ｉ／１７５Ｄ、１４８Ｍ、１４８Ｒ／１７５Ｄ、１５０Ｅ、１５０Ｍ、１５０Ｙ、１５１Ｆ、１５１Ｈ、１５１Ｌ、１５１Ｎ、１５１Ｑ、１５２Ａ、１５２Ｎ、１５２Ｓ、１５３Ｃ、１５３Ｇ、１５３Ｉ、１５３Ｌ、１５３Ｐ、１５３Ｒ、１５３Ｓ、１５３Ｔ、１５３Ｙ、１５５Ｈ、１５５Ｈ／１９９Ａ、１５５Ｈ／２１２Ａ／２１５Ｓ、１６０Ｌ、１７０Ｒ／２０３Ｉ、１７３Ｃ、１７３Ｅ、１７３Ｆ、１７３Ｇ、１７３Ｈ、１７３Ｍ、１７３Ｑ、１７３Ｓ、１７３Ｖ、１７３Ｗ、１７５Ｖ／２１２Ａ、１７７Ａ、１７７Ｇ、１７７Ｔ、１７７Ｖ、１７７Ｖ／１９９Ａ、１９１Ｆ、１９１Ｇ、１９１Ｐ、１９１Ｔ／２３７Ｎ、１９１Ｖ、１９１Ｗ、１９１Ｙ、１９６Ｖ、１９９Ａ、１９９Ａ／２１２Ａ、２１０Ｇ、２１０Ｒ、２１２Ａ、２１２Ａ／２１５Ｓ、２１２Ｗ、２１６Ｃ、２１６Ｆ、２１６Ｌ、２１６Ｒ、２１６Ｗ、２１６Ｙ、および２２０Ｆから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１２６を参照して番号付けされる。さらに一部の追加の実施形態では、前記操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼのポリペプチド配列は、Ａ２Ｓ、Ａ２Ｓ／Ｄ８０Ｅ／Ｖ９５Ｉ、Ａ２Ｓ／Ｄ８０Ｅ／Ｖ９５Ｉ／Ｆ１５５Ｈ／Ｔ１９９Ａ／Ｑ２１２Ａ、Ａ２Ｓ／Ｄ８０Ｅ／Ｖ９５Ｉ／Ｔ１９９Ａ、Ａ２Ｓ／Ｄ８０Ｅ／Ｖ９５Ｉ／Ｔ１９９Ａ／Ｑ２１２Ａ、Ａ２Ｓ／Ｄ８０Ｅ／Ｌ１０１Ｖ／Ｆ１５５Ｈ／Ｑ２１２Ａ、Ａ２Ｓ／Ｄ８０Ｅ／Ｌ１０１Ｖ／Ｑ２１２Ａ、Ａ２Ｓ／Ｄ８０Ｅ／Ｆ１５５Ｈ／Ｌ１７７Ｖ／Ａ２１５Ｓ、Ａ２Ｓ／Ｄ８０Ｅ／Ｇ１７５Ｖ／Ｔ１９９Ａ／Ｑ２１２Ａ／Ａ２１５Ｓ、Ａ２Ｓ／Ｄ８０Ｅ／Ａ２１５Ｓ、Ａ２Ｓ／Ｖ９５Ｉ、Ａ２Ｓ／Ｖ９５Ｉ／Ｆ１５５Ｈ／Ｔ１９９Ａ、Ａ２Ｓ／Ｖ９５Ｉ／Ｆ１５５Ｈ／Ｔ１９９Ａ／Ｑ２１２Ａ／Ａ２１５Ｓ／Ｎ２２３Ｈ、Ａ２Ｓ／Ｖ９５Ｉ／Ｆ１５５Ｈ／Ｔ１９９Ａ／Ａ２１５Ｓ、Ａ２Ｓ／Ｖ９５Ｉ／Ｇ１７５Ｖ、Ａ２Ｓ／Ｖ９５Ｉ／Ｑ２１２Ａ／Ａ２１５Ｓ、Ａ２Ｓ／Ｖ９５Ｉ／Ａ２１５Ｓ、Ａ２Ｓ／Ｌ１０１Ｖ／Ｆ１５５Ｈ、Ａ２Ｓ／Ｆ１５５Ｈ／Ｔ１９９Ａ、Ａ２Ｓ／Ｔ１９９Ａ／Ｑ２１２Ａ／Ａ２１５Ｓ、Ａ２Ｓ／Ｑ２１２Ａ／Ａ２１５Ｓ、Ａ２Ｓ／Ａ２１５Ｓ、Ａ２Ｔ、Ａ２Ｔ／Ｄ８０Ｅ／Ｖ９５Ｉ／Ｆ１５５Ｈ、Ａ２Ｔ／Ｄ８０Ｅ／Ｆ１５５Ｈ／Ａ２１５Ｓ、Ａ２Ｔ／Ｄ８０Ｅ／Ｇ１７５Ｖ／Ｔ１９９Ａ、Ａ２Ｔ／Ｄ８０Ｅ／Ｌ１７７Ｖ、Ａ２Ｔ／Ｄ８０Ｅ／Ｔ１９９Ａ／Ｑ２１２Ａ／Ａ２１５Ｓ、Ａ２Ｔ／Ｖ９５Ｉ、Ａ２Ｔ／Ｖ９５Ｉ／Ｆ１５５Ｈ、Ａ２Ｔ／Ｖ９５Ｉ／Ｆ１５５Ｈ／Ｔ１９９Ａ、Ａ２Ｔ／Ｖ９５Ｉ／Ｆ１５５Ｈ／Ａ２１５Ｓ、Ａ２Ｔ／Ｖ９５Ｉ／Ｔ１９９Ａ、Ａ２Ｔ／Ｖ９５Ｉ／Ｔ１９９Ａ／Ｑ２１２Ａ／Ａ２１５Ｓ、Ａ２Ｔ／Ｖ９５Ｉ／Ｑ２１２Ａ／Ａ２１５Ｓ、Ａ２Ｔ／Ｖ９５Ｉ／Ａ２１５Ｓ、Ａ２Ｔ／Ｆ１５５Ｈ、Ａ２Ｔ／Ｆ１５５Ｈ／Ｌ１７７Ｖ／Ｑ２１２Ａ、Ａ２Ｔ／Ｆ１５５Ｈ／Ｔ１９９Ａ、Ａ２Ｔ／Ｔ１９９Ａ、Ａ２Ｔ／Ａ２１５Ｓ、Ｙ２８Ｈ、Ｅ３９Ｌ、Ｎ４２Ｈ、Ｎ４２Ｓ、Ｇ４５Ａ、Ｇ４５Ｃ、Ｙ５３Ｌ、Ｋ５４Ｎ／Ｋ１７３Ｇ、Ｋ５７Ａ／Ｇ１７５Ｄ、Ｋ７５Ｓ、Ｄ８０Ｅ、Ｄ８０Ｅ／Ｖ９５Ｉ／Ｌ１０１Ｖ／Ｆ１５５Ｈ／Ｔ１９９Ａ、Ｄ８０Ｅ／Ｖ９５Ｉ／Ｌ１０１Ｖ／Ｆ１５５Ｈ／Ｔ１９９Ａ／Ａ２１５Ｓ、Ｄ８０Ｅ／Ｖ９５Ｉ／Ｌ１０１Ｖ／Ｔ１９９Ａ、Ｄ８０Ｅ／Ｖ９５Ｉ／Ｆ１５５Ｈ、Ｄ８０Ｅ／Ｖ９５Ｉ／Ｆ１５５Ｈ／Ｇ１７５Ｄ／Ｔ１９９Ａ／Ｑ２１２Ａ／Ａ２１５Ｓ、Ｄ８０Ｅ／Ｖ９５Ｉ／Ｆ１５５Ｈ／Ｔ１９９Ａ、Ｄ８０Ｅ／Ｖ９５Ｉ／Ｆ１５５Ｈ／Ｔ１９９Ａ／Ｑ２１２Ａ、Ｄ８０Ｅ／Ｖ９５Ｉ／Ｆ１５５Ｈ／Ｔ１９９Ａ／Ａ２１５Ｓ、Ｄ８０Ｅ／Ｖ９５Ｉ／Ｆ１５５Ｈ／Ｑ２１２Ａ／Ａ２１５Ｓ、Ｄ８０Ｅ／Ｖ９５Ｉ／Ｌ１７７Ｖ、Ｄ８０Ｅ／Ｖ９５Ｉ／Ｌ１７７Ｖ／Ｔ１９９Ａ、Ｄ８０Ｅ／Ｖ９５Ｉ／Ｌ１７７Ｖ／Ｑ２１２Ａ／Ａ２１５Ｓ、Ｄ８０Ｅ／Ｖ９５Ｉ／Ａ２１５Ｓ、Ｄ８０Ｅ／Ｌ１０１Ｖ、Ｄ８０Ｅ／Ｆ１５５Ｈ、Ｄ８０Ｅ／Ｆ１５５Ｈ／Ｌ１７７Ｖ／Ｔ１９９Ａ、Ｄ８０Ｅ／Ｆ１５５Ｈ／Ｌ１７７Ｖ／Ｑ２１２Ａ／Ａ２１５Ｓ、Ｄ８０Ｅ／Ｆ１５５Ｈ／Ｔ１９９Ａ、Ｄ８０Ｅ／Ｔ１９９Ａ、Ｄ８０Ｅ／Ｑ２１２Ａ、Ｋ８４Ｅ、Ｋ８５Ａ、Ｋ８５Ｔ、Ｖ９５Ｉ、Ｖ９５Ｉ／Ｆ１５５Ｈ、Ｖ９５Ｉ／Ｆ１５５Ｈ／Ｌ１７７Ｖ、Ｖ９５Ｉ／Ｆ１５５Ｈ／Ｌ１７７Ｖ／Ｔ１９９Ａ、Ｖ９５Ｉ／Ｆ１５５Ｈ／Ｌ１７７Ｖ／Ｔ１９９Ａ／Ｑ２１２Ａ、Ｖ９５
Ｉ／Ｆ１５５Ｈ／Ｔ１９９Ａ、Ｖ９５Ｉ／Ｆ１５５Ｈ／Ｑ２１２Ａ／Ａ２１５Ｓ、Ｖ９５Ｉ／Ｌ１７７Ｖ／Ｔ１９９Ａ、Ｖ９５Ｉ／Ｔ１９９Ａ、Ｖ９５Ｉ／Ｑ２１２Ａ、Ｖ９５Ｉ／Ｑ２１２Ａ／Ａ２１５Ｓ、Ｖ９５Ｉ／Ａ２１５Ｓ、Ｈ９８Ｄ、Ｈ９８Ｙ、Ｌ１０１Ｉ、Ｌ１０１Ｖ、Ｌ１０１Ｖ／Ｆ１５５Ｈ／Ｔ１９９Ａ、Ｌ１０１Ｖ／Ｆ１５５Ｈ／Ｔ１９９Ａ／Ｑ２１２Ａ、Ｌ１０１Ｖ／Ｌ１７７Ｖ／Ｑ２１２Ａ、Ｌ１０１Ｖ／Ａ２１５Ｓ、Ｉ１１９Ｍ、Ｉ１１９Ｔ、Ｉ１１９Ｖ、Ｄ１２３Ｇ、Ｄ１２３Ｍ、Ｄ１２３Ｓ、Ｄ１２３Ｔ、Ｈ１２４Ｒ、Ｉ１２９Ｇ、Ｉ１２９Ｍ、Ｉ１２９Ｓ、Ａ１３０Ｐ、Ａ１３０Ｔ、Ｄ１３１Ｍ、Ｄ１３１Ｒ、Ｆ１３２Ａ、Ｆ１３２Ｃ、Ｆ１３２Ｌ、Ｆ１３２Ｎ、Ｆ１３２Ｓ、Ｒ１３６Ａ、Ｒ１３６Ｃ、Ｒ１３６Ｄ、Ｒ１３６Ｅ、Ｒ１３６Ｇ、Ｒ１３６Ｉ、Ｒ１３６Ｌ、Ｒ１３６Ｓ、Ｒ１３６Ｖ、Ｎ１３７Ｅ、Ｎ１３７Ｑ、Ｎ１３７Ｗ、Ｖ１３９Ａ、Ｖ１３９Ｄ、Ｖ１３９Ｇ、Ｖ１３９Ｓ、Ｖ１３９Ｔ、Ｄ１４０Ｇ、Ｋ１４３Ｃ、Ｋ１４３Ｅ、Ｋ１４３Ｇ、Ｋ１４３Ｒ、Ｋ１４３Ｖ、Ｋ１４３Ｙ、Ａ１４４Ｆ、Ａ１４４Ｈ、Ａ１４４Ｌ、Ａ１４４Ｒ、Ａ１４４Ｔ、Ａ１４４Ｙ、Ｄ１４８Ｆ、Ｄ１４８Ｇ、Ｄ１４８Ｉ／Ｇ１７５Ｄ、Ｄ１４８Ｍ、Ｄ１４８Ｒ／Ｇ１７５Ｄ、Ｒ１５０Ｅ、Ｒ１５０Ｍ、Ｒ１５０Ｙ、Ｖ１５１Ｆ、Ｖ１５１Ｈ、Ｖ１５１Ｌ、Ｖ１５１Ｎ、Ｖ１５１Ｑ、Ｇ１５２Ａ、Ｇ１５２Ｎ、Ｇ１５２Ｓ、Ｎ１５３Ｃ、Ｎ１５３Ｇ、Ｎ１５３Ｉ、Ｎ１５３Ｌ、Ｎ１５３Ｐ、Ｎ１５３Ｒ、Ｎ１５３Ｓ、Ｎ１５３Ｔ、Ｎ１５３Ｙ、Ｆ１５５Ｈ、Ｆ１５５Ｈ／Ｔ１９９Ａ、Ｆ１５５Ｈ／Ｑ２１２Ａ／Ａ２１５Ｓ、Ｆ１６０Ｌ、Ｖ１７０Ｒ／Ｖ２０３Ｉ、Ｋ１７３Ｃ、Ｋ１７３Ｅ、Ｋ１７３Ｆ、Ｋ１７３Ｇ、Ｋ１７３Ｈ、Ｋ１７３Ｍ、Ｋ１７３Ｑ、Ｋ１７３Ｓ、Ｋ１７３Ｖ、Ｋ１７３Ｗ、Ｇ１７５Ｖ／Ｑ２１２Ａ、Ｌ１７７Ａ、Ｌ１７７Ｇ、Ｌ１７７Ｔ、Ｌ１７７Ｖ、Ｌ１７７Ｖ／Ｔ１９９Ａ、Ａ１９１Ｆ、Ａ１９１Ｇ、Ａ１９１Ｐ、Ａ１９１Ｔ／Ｄ２３７Ｎ、Ａ１９１Ｖ、Ａ１９１Ｗ、Ａ１９１Ｙ、Ｋ１９６Ｖ、Ｔ１９９Ａ、Ｔ１９９Ａ／Ｑ２１２Ａ、Ｈ２１０Ｇ、Ｈ２１０Ｒ、Ｑ２１２Ａ、Ｑ２１２Ａ／Ａ２１５Ｓ、Ｑ２１２Ｗ、Ａ２１６Ｃ、Ａ２１６Ｆ、Ａ２１６Ｌ、Ａ２１６Ｒ、Ａ２１６Ｗ、Ａ２１６Ｙ、およびＴ２２０Ｆから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１２６を参照して番号付けされる。
【００１０】
本発明は、配列番号２４２またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼであって、前記操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼのポリペプチド配列が、少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号２４２を参照して番号付けされる、操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼを提供する。一部の実施形態では、操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼは、配列番号２４２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、前記操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼのポリペプチド配列は、７、１２、２７、２８、３１、３２、３５、３７、３８、５２、５７、８５、９４、９７、９８、１００、１０２、１３３、１３６、１４３、１４４、１４５、１４８、１４９、１５０、１６２、１６９、１７０、１７２、１７３、１９５／１９９、１９６、１９９、２０７、２０８、２０８／２３８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１７、２１９、２２０、２２１、２２３、２２４、２２７、２３５、および２３８から選択される前記ポリペプチド配列中の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２４２を参照して番号付けされる。一部の追加の実施形態では、前記操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼのポリペプチド配列は、７Ｙ、１２Ａ、２７Ｆ、２７Ｓ、２８Ａ、２８Ｇ、２８Ｌ、２８Ｔ、３１Ｌ、３１Ｔ、３１Ｗ、３２Ｇ、３２Ｑ、３２Ｖ、３５Ｒ、３７Ｌ、３８Ｌ、３８Ｙ、５２Ｖ、５２Ｙ、５７Ｌ、５７Ｙ、８５Ａ、９４Ｔ、９７Ａ、９７Ｓ、９８Ａ、９８Ｃ、９８Ｄ、９８Ｎ、１００Ａ、１００Ｙ、１０２Ｌ、１３３Ａ、１３３Ｗ、１３３Ｙ、１３６Ｋ、１４３Ｒ、１４４Ｈ、１４４Ｒ、１４４Ｔ、１４５Ａ、１４５Ｆ、１４５Ｈ、１４５Ｑ、１４５Ｓ、１４８Ｉ、１４８Ｓ、１４９Ｐ、１５０Ｈ、１５０Ｖ、１６２Ｍ、１６９Ｈ、１６９Ｒ、１６９Ｓ、１７０Ｃ、１７２Ｒ、１７３Ｒ、１９５Ｓ／１９９Ａ、１９６Ａ、１９９Ａ、２０７Ｌ、２０８Ｆ、２０８Ｈ、２０８Ｈ／２３８Ｐ、２０８Ｋ、２０８Ｓ、２０８Ｔ、２０９Ｆ、２０９Ｇ、２０９Ｈ、２０９Ｌ、２０９Ｓ、２０９Ｗ、２１０Ｆ、２１１Ｎ、２１１Ｑ、２１１Ｓ、２１１Ｔ、２１１Ｙ、２１２Ｇ、２１２Ｒ、２１２Ｖ、２１３Ｓ、２１４Ａ、２１４Ｈ、２１４Ｖ、２１５Ｇ、２１５Ｈ、２１５Ｐ、２１５Ｓ、２１７Ａ、２１７Ｄ、２１７Ｍ、２１７Ｑ、２１９Ａ、２２０Ａ、２２０Ｇ、２２０Ｒ、２２０Ｓ、２２１Ｓ、２２３Ａ、２２３Ｌ、２２３Ｖ、２２４Ａ、２２４Ｇ、２２４Ｋ、２２４Ｎ、２２７Ｔ、２３５Ｍ、および２３８Ｐから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２４２を参照して番号付けされる。さらに一部の追加の実施形態では、前記操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼのポリペプチド配列は、Ｎ７Ｙ、Ｄ１２Ａ、Ｋ２７Ｆ、Ｋ２７Ｓ、Ｙ２８Ａ、Ｙ２８Ｇ、Ｙ２８Ｌ、Ｙ２８Ｔ、Ｅ３１Ｌ、Ｅ３１Ｔ、Ｅ３１Ｗ、Ｔ３２Ｇ、Ｔ３２Ｑ、Ｔ３２Ｖ、Ｅ３５Ｒ、Ａ３７Ｌ、Ｒ３８Ｌ、Ｒ３８Ｙ、Ｔ５２Ｖ、Ｔ５２Ｙ、Ｋ５７Ｌ、Ｋ５７Ｙ、Ｋ８５Ａ、Ａ９４Ｔ、Ｐ９７Ａ、Ｐ９７Ｓ、Ｈ９８Ａ、Ｈ９８Ｃ、Ｈ９８Ｄ、Ｈ９８Ｎ、Ｋ１００Ａ、Ｋ１００Ｙ、Ｒ１０２Ｌ、Ｄ１３３Ａ、Ｄ１３３Ｗ、Ｄ１３３Ｙ、Ｒ１３６Ｋ、Ｋ１４３Ｒ、Ａ１４４Ｈ、Ａ１４４Ｒ、Ａ１４４Ｔ、Ｌ１４５Ａ、Ｌ１４５Ｆ、Ｌ１４５Ｈ、Ｌ１４５Ｑ、Ｌ１４５Ｓ、Ｄ１４８Ｉ、Ｄ１４８Ｓ、Ａ１４９Ｐ、Ｒ１５０Ｈ、Ｒ１５０Ｖ、Ｓ１６２Ｍ、Ｄ１６９Ｈ、Ｄ１６９Ｒ、Ｄ１６９Ｓ、Ｖ１７０Ｃ、Ｅ１７２Ｒ、Ｋ１７３Ｒ、Ａ１９５Ｓ／Ｔ１９９Ａ、Ｋ１９６Ａ、Ｔ１９９Ａ、Ｉ２０７Ｌ、Ｒ２０８Ｆ、Ｒ２０８Ｈ、Ｒ２０８Ｈ／Ｋ２３８Ｐ、Ｒ２０８Ｋ、Ｒ２０８Ｓ、Ｒ２０８Ｔ、Ｔ２０９Ｆ、Ｔ２０９Ｇ、Ｔ２０９Ｈ、Ｔ２０９Ｌ、Ｔ２０９Ｓ、Ｔ２０９Ｗ、Ｈ２１０Ｆ、Ｅ２１１Ｎ、Ｅ２１１Ｑ、Ｅ２１１Ｓ、Ｅ２１１Ｔ、Ｅ２１１Ｙ、Ａ２１２Ｇ、Ａ２１２Ｒ、Ａ２１２Ｖ、Ｔ２１３Ｓ、Ｔ２１４Ａ、Ｔ２１４Ｈ、Ｔ２１４Ｖ、Ａ２１５Ｇ、Ａ２１５Ｈ、Ａ２１５Ｐ、Ａ２１５Ｓ、Ｅ２１７Ａ、Ｅ２１７Ｄ、Ｅ２１７Ｍ、Ｅ２１７Ｑ、Ｑ２１９Ａ、Ｔ２２０Ａ、Ｔ２２０Ｇ、Ｔ２２０Ｒ、Ｔ２２０Ｓ、Ｔ２２１Ｓ、Ｎ２２３Ａ、Ｎ２２３Ｌ、Ｎ２２３Ｖ、Ｄ２２４Ａ、Ｄ２２４Ｇ、Ｄ２２４Ｋ、Ｄ２２４Ｎ、Ｋ２２７Ｔ、Ｌ２３５Ｍ、およびＫ２３８Ｐから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２４２を参照して番号付けされる。
【００１１】
本発明は、配列番号６８４またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼであって、前記操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼのポリペプチド配列が、少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号６８４を参照して番号付けされる、操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼを提供する。一部の実施形態では、操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼは、配列番号６８４と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、前記操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼのポリペプチド配列は、１０、１０／１３３／２２７、１０／１４５、１０／１４５／２２７、１８、２０、２６、２９、３９／９８、３９／１３３／２２７、６０、６２、６３、７４、８９、９４、９７、９７／９８、１０８、１２６、１３３、１３５、１４５、１６１、１６２、１６５、１６７、１６８、１７７、１９９、２０８、２１０、２１２、２２４および２２７から選択される前記ポリペプチド配列中の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号６８４を参照して番号付けされる。一部の追加の実施形態では、前記操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼのポリペプチド配列は、１０Ｐ、１０Ｐ／１３３Ｇ／２２７Ｅ、１０Ｐ／１４５Ｋ、１０Ｐ／１４５Ｋ／２２７Ｅ、１８Ｍ、２０Ａ、２０Ｇ、２６Ｓ、２９Ｌ、２９Ｔ、３９Ｑ／９８Ｄ、３９Ｑ／１３３Ｇ／２２７Ｅ、６０Ｔ、６２Ａ、６３Ｓ、７４Ｓ、７４Ｖ、８９Ｉ、８９Ｔ、９４Ｓ、９４Ｔ、９７Ｄ、９７Ｄ／９８Ｄ、１０８Ａ、１０８Ｑ、１０８Ｓ、１０８Ｖ、１２６Ｌ、１３３Ｇ、１３５Ｌ、１４５Ｑ、１６１Ｈ、１６２Ｆ、１６５Ａ、１６５Ｃ、１６５Ｈ、１６５Ｌ、１６５Ｐ、１６５Ｒ、１６５Ｓ、１６５Ｔ、１６７Ｌ、１６８Ｌ、１６８Ｔ、１７７Ｍ、１９９Ｓ、２０８Ｆ、２０８Ｋ、２０８Ｌ、２０８Ｖ、２１０Ｍ、２１２Ｍ、２１２Ｓ、２１２Ｖ、２２４Ｇ、および２２７Ｅから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号６８４を参照して番号付けされる。さらに一部の追加の実施形態では、前記操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼのポリペプチド配列は、Ｍ１０Ｐ、Ｍ１０Ｐ／Ｄ１３３Ｇ／Ｋ２２７Ｅ、Ｍ１０Ｐ／Ｌ１４５Ｋ、Ｍ１０Ｐ／Ｌ１４５Ｋ／Ｋ２２７Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｐ２０Ａ、Ｐ２０Ｇ、Ａ２６Ｓ、Ｉ２９Ｌ、Ｉ２９Ｔ、Ｅ３９Ｑ／Ｈ９８Ｄ、Ｅ３９Ｑ／Ｄ１３３Ｇ／Ｋ２２７Ｅ、Ｖ６０Ｔ、Ｇ６２Ａ、Ｈ６３Ｓ、Ｔ７４Ｓ、Ｔ７４Ｖ、Ｖ８９Ｉ、Ｖ８９Ｔ、Ａ９４Ｓ、Ａ９４Ｔ、Ｐ９７Ｄ、Ｐ９７Ｄ／Ｈ９８Ｄ、Ｍ１０８Ａ、Ｍ１０８Ｑ、Ｍ１０８Ｓ、Ｍ１０８Ｖ、Ｆ１２６Ｌ、Ｄ１３３Ｇ、Ｖ１３５Ｌ、Ｌ１４５Ｑ、Ｙ１６１Ｈ、Ｓ１６２Ｆ、Ｇ１６５Ａ、Ｇ１６５Ｃ、Ｇ１６５Ｈ、Ｇ１６５Ｌ、Ｇ１６５Ｐ、Ｇ１６５Ｒ、Ｇ１６５Ｓ、Ｇ１６５Ｔ、Ｍ１６７Ｌ、Ｆ１６８Ｌ、Ｆ１６８Ｔ、Ｖ１７７Ｍ、Ｔ１９９Ｓ、Ｒ２０８Ｆ、Ｒ２０８Ｋ、Ｒ２０８Ｌ、Ｒ２０８Ｖ、Ｈ２１０Ｍ、Ａ２１２Ｍ、Ａ２１２Ｓ、Ａ２１２Ｖ、Ｄ２２４Ｇ、およびＫ２２７Ｅから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号６８４を参照して番号付けされる。
【００１２】
一部のさらなる実施形態では、操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼは、表４．１、５．１、６．１、７．１および／または８．１に示される少なくとも１つの操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼバリアントの配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高く同一であるポリペプチド配列を含む。一部の追加の実施形態では、操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼは、配列番号２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高く同一であるポリペプチド配列を含む。さらに一部の追加の実施形態では、操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼは、配列番号４〜１００２の偶数配列に示される少なくとも１つの操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼバリアントの配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高く同一であるポリペプチド配列を含む。一部のさらなる実施形態では、操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼは、配列番号２〜１００２の少なくとも１つの偶数配列に示される（forth）ポリペプチド配列を含む。一部の追加の実施形態では、操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼは、野生型Ｅ．ｃｏｌｉのプリンヌクレオシドホスホリラーゼと比較して少なくとも１つの改善された性質を含む。一部のさらなる実施形態では、改善された性質は、基質に対する改善された活性を含む。一部の実施形態では、基質は、化合物４を含む。一部の実施形態では、基質は、化合物３を含む。一部の実施形態では、基質は、化合物８を含む。一部の追加の実施形態では、改善された性質は、化合物１の改善された生成を含む。一部の追加の実施形態では、改善された性質は、化合物１０の改善された生成を含む。なお一部の追加の実施形態では、操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼは、精製されている。本発明は、本明細書に提供される少なくとも１つの操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼを含む組成物も提供する。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に提供される１つの操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼを含む。
【００１３】
本発明は、本明細書に提供される少なくとも１つの操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするポリヌクレオチド配列も提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１、５、１２５、２４１および／または６８３と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を含む。一部の追加の実施形態では、前記操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼのポリヌクレオチド配列は、１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換を含む。一部のさらなる実施形態では、少なくとも１つの操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１、５、１２５、２４１および／もしくは６８３またはそれらの機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれよりも高い配列同一性を含む。なお一部の追加の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、制御配列に作動可能に連結されている。さらに一部の追加の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。一部のさらなる実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号３〜１００１の奇数配列に示されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００１４】
本発明は、本明細書に提供される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターも提供する。本発明は、本明細書に提供される少なくとも１つの発現ベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。一部の実施形態では、宿主細胞は、本明細書に提供される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む。本発明は、宿主細胞において操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼを産生させる方法であって、本明細書に提供される少なくとも１つの操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼが産生するように、適切な条件下で、宿主細胞を培養することを含む、方法も提供する。一部の実施形態では、方法は、培養物および／または宿主細胞から少なくとも１つの操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼを回収することをさらに含む。一部の追加の実施形態では、方法は、前記少なくとも１つの操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼを精製するステップをさらに含む。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）酵素、ＰＮＰ活性を有するポリペプチド、およびこれらの酵素をコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含むベクターおよび宿主細胞を提供する。ＰＮＰ酵素を産生させるための方法も提供する。本発明は、ＰＮＰ酵素を含む組成物、および操作されたＰＮＰ酵素を使用する方法をさらに提供する。本発明は、医薬化合物の生成において特に使用される。
【００１６】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、一般に、本発明が関係する分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使用される命名法、ならびに下記に記載する細胞培養、分子遺伝学、微生物学、有機化学、分析化学および核酸化学の実験手順は、当技術分野において周知かつ通常用いられるものである。このような技法は周知であり、多数のテキストおよび当業者に周知の参照文献に記載されている。標準的な技法、またはその改変は、化学合成および化学分析のために使用される。本明細書において言及されるすべての特許、特許出願、文献および刊行物は、上記および下記の両方とも、ここに、参照によって本明細書に明示的に組み込まれる。
【００１７】
本明細書に記載されるものに類似または同等の任意の適切な方法および材料は、本発明の実施において使用されるが、いくつかの方法および材料を、本明細書に記載する。それらが当業者によって使用される状況に応じて変わり得るので、本発明が、記載される特定の方法論、プロトコールおよび試薬に限定されないことが理解されるべきである。したがって、直下で定義される用語は、全体として本発明に対する参照によって、より完全に記載される。
【００１８】
前述の一般的な記載および以下の詳細な記載の両方が、例示的かつ説明的なものにすぎず、本発明を制限するものではないことが理解されるべきである。本明細書において使用される節の見出しは、構成の目的のためにすぎず、記載される主題を限定するものとして解釈されるべきではない。数値範囲は、その範囲を定義する数字を包含する。したがって、本明細書に開示されるすべての数値範囲は、より狭い数値範囲が本明細書においてすべて明示的に記載されているかのように、より広い数値範囲内に入るそのようなすべてのより狭い数値範囲を包含することが意図される。本明細書に開示されるすべての最大の（または最小の）数値限定は、より低い（またはより高い）数値限定が本明細書において明示的に記載されているかのように、そのようなすべてのより低い（またはより高い）数値限定を含むことも意図される。
【００１９】
略語および定義
遺伝子によってコードされるアミノ酸について使用される略語は、従来のものであり、以下の通りである：アラニン（ＡｌａまたはＡ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、リシン（ＬｙｓまたはＫ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、およびバリン（ＶａｌまたはＶ）。
【００２０】
三文字略語が使用される場合、「Ｌ」もしくは「Ｄ」が具体的に先行しない限り、または略語が使用される文脈から明らかでない限り、アミノ酸は、α炭素（Ｃα）についてＬ配置またはＤ配置のいずれかであり得る。例えば、「Ａｌａ」は、α炭素についての立体配置を特定することなくアラニンを指すが、「Ｄ−Ａｌａ」および「Ｌ−Ａｌａ」は、それぞれ、Ｄ−アラニンおよびＬ−アラニンを指す。一文字略語が使用される場合、大文字は、α炭素についてＬ配置にあるアミノ酸を指し、小文字は、α炭素についてＤ配置にあるアミノ酸を指す。例えば、「Ａ」は、Ｌ−アラニンを指し、「ａ」は、Ｄ−アラニンを指す。ポリペプチド配列が、一連の一文字または三文字の略語（またはこれらの混合）として表される場合、配列は、一般的な慣例に従って、アミノ（Ｎ）からカルボキシ（Ｃ）の方向で表される。
【００２１】
遺伝的にコードするヌクレオシドのために使用される略語は、従来のものであり、以下の通りである：アデノシン（Ａ）；グアノシン（Ｇ）；シチジン（Ｃ）；チミジン（Ｔ）；およびウリジン（Ｕ）。具体的に詳述されない限り、略されたヌクレオシドは、リボヌクレオシドまたは２’−デオキシリボヌクレオシドのいずれかであり得る。ヌクレオシドは、個別基準または集合基準で、リボヌクレオシドまたは２’−デオキシリボヌクレオシドのいずれかであると特定され得る。核酸配列が、一連の一文字略語として表される場合、配列は、一般的な慣例に従って、５’から３’の方向で表され、そのリン酸は示さない。
【００２２】
本発明に関して、本明細書における記載において使用される技術用語および科学用語は、特に他に定義されない限り、当業者によって通常理解される意味を有する。したがって、以下の用語は、以下の意味を有することが意図される。
【００２３】
本明細書で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「ポリペプチド（ａ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」への言及は、２つ以上のポリペプチドを含む。
【００２４】
同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、互換可能であり、限定することを意図しない。したがって、本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語およびその同語源語は、それらの包括的な意味で使用される（すなわち、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語およびその対応する同語源語と同等である）。
【００２５】
さまざまな実施形態の記載が「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語を使用する場合、当業者が、一部の特定の例では、実施形態が、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という語を使用して代わりに記載することができることを理解するはずであることがさらに理解されるべきである。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特定の値についての許容可能な誤差を意味する。一部の例では、「約」は、所与の値の範囲の０．０５％、０．５％、１．０％または２．０％以内を意味する。一部の例では、「約」は、所与の値の１、２、３または４標準偏差以内を意味する。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「ＥＣ」番号は、国際生化学・分子生物学連合の命名委員会（ＮＣ−ＩＵＢＭＢ）の酵素命名法を指す。ＩＵＢＭＢ生化学分類は、酵素が触媒する化学反応に基づく、酵素についての数字分類システムである。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「ＡＴＣＣ」は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関を指し、その保存機関は遺伝子および株を含む。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「ＮＣＢＩ」は、アメリカ国立生物学情報センター（National  Center  for  Biological  Information）およびそこで提供される配列データベースを指す。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「ホスホペントムターゼ」（「ＰＰＭ」）酵素は、リボース１−リン酸のリボース５−リン酸、ならびにデオキシリボースリン酸、ならびにリボースリン酸およびデオキシリボースリン酸のアナログなどの関連化合物への可逆的異性化を触媒する酵素である。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「プリンヌクレオシドホスホリラーゼ」（「ＰＮＰ」）酵素は、プリンリボヌクレオシドおよび関連化合物（例えば、デオキシリボヌクレオシド、ならびにリボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシドのアナログ）の遊離プリン塩基およびリボース−１−リン酸（およびそのアナログ）への可逆的加リン酸分解を触媒する酵素である。「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）に関わらず、アミド結合によって共有結合的に連結された少なくとも２つのアミノ酸のポリマーを示すために、本明細書で互換可能に使用される。この定義内には、Ｄ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸、ならびにＤ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸の混合物だけでなく、Ｄ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸、ならびにＤ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸の混合物を含むポリマーも含む。
【００３２】
「アミノ酸」は、本明細書において、それらの通常公知の三文字記号によって、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会によって推奨される一文字記号によってのいずれかで言及される。同様に、ヌクレオチドは、それらの通常許容される一文字表記によって言及され得る。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「親水性アミノ酸または残基」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら（Eisenberg  et  al.,  J.  Mol.  Biol.,  179:125-142  [1984]）の正規化コンセンサス疎水性尺度に従って、ゼロ未満の疎水性を示す側鎖を有するアミノ酸または残基を指す。遺伝子によってコードされる親水性アミノとしては、Ｌ−Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ−Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｌ−Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｌ−Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ−Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｌ−Ａｓｐ（Ｄ）、Ｌ−Ｌｙｓ（Ｋ）およびＬ−Ａｒｇ（Ｒ）が挙げられる。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「酸性アミノ酸または残基」は、アミノ酸がペプチドまたはポリペプチドに含まれる場合、約６未満のｐＫａ値を示す側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を指す。酸性アミノ酸は、典型的には、水素イオンの喪失に起因して、生理学的なｐＨで負に荷電した側鎖を有する。遺伝子によってコードされる酸性アミノ酸としては、Ｌ−Ｇｌｕ（Ｅ）およびＬ−Ａｓｐ（Ｄ）が挙げられる。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「塩基性アミノ酸または残基」は、アミノ酸がペプチドまたはポリペプチドに含まれる場合、約６よりも大きいｐＫａ値を示す側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を指す。塩基性アミノ酸は、典型的には、ヒドロニウムイオンとの会合に起因して、生理学的なｐＨで正に荷電した側鎖を有する。遺伝子によってコードされる塩基性アミノ酸としては、Ｌ−Ａｒｇ（Ｒ）およびＬ−Ｌｙｓ（Ｋ）が挙げられる。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「極性アミノ酸または残基」は、生理学的ｐＨで非荷電であるが、２つの原子によって共有される電子対が、原子の１つによってより密接に保持される少なくとも１つの結合を有する側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を指す。遺伝子によってコードされる極性アミノ酸としては、Ｌ−Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ−Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）およびＬ−Ｔｈｒ（Ｔ）が挙げられる。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「疎水性アミノ酸または残基」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら（Eisenberg  et  al.,  J.  Mol.  Biol.,  179:125-142  [1984]）の正規化コンセンサス疎水性尺度に従って、ゼロを超える疎水性を示す側鎖を有するアミノ酸または残基を指す。遺伝子によってコードされる疎水性アミノ酸としては、Ｌ−Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｌ−Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌ−Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌ−Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｌ−Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｌ−Ａｌａ（Ａ）およびＬ−Ｔｙｒ（Ｙ）が挙げられる。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「芳香族アミノ酸または残基」は、少なくとも１つの芳香族環もしくは芳香族複素環を含む側鎖を有する親水性または疎水性のアミノ酸または残基を指す。遺伝子によってコードされる芳香族アミノ酸としては、Ｌ−Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｌ−Ｔｙｒ（Ｙ）およびＬ−Ｔｒｐ（Ｗ）が挙げられる。Ｌ−Ｈｉｓ（Ｈ）は、その芳香族複素環の窒素原子のｐＫａに基づいて塩基性残基として分類される場合があり、または、その側鎖として芳香族複素環を含むので芳香族残基として分類される場合があるが、本明細書において、ヒスチジンは、親水性残基として、または「拘束残基」（以下を参照のこと）として分類される。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「拘束アミノ酸または残基」は、拘束配置を有するアミノ酸または残基を指す。本明細書において、拘束残基としては、Ｌ−Ｐｒｏ（Ｐ）およびＬ−Ｈｉｓ（Ｈ）が挙げられる。ヒスチジンは、比較的小さなイミダゾール環を有するので、拘束配置を有する。プロリンは、これも５員環を有するので、拘束配置を有する。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「非極性アミノ酸または残基」は、生理学的ｐＨで非荷電であり、２つの原子によって共有される電子対が、一般に、２つの原子のそれぞれによって同等に保持される結合を有する側鎖を有する（すなわち、側鎖は極性でない）疎水性アミノ酸または残基を指す。遺伝子によってコードされる非極性アミノ酸としては、Ｌ−Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｌ−Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌ−Ｍｅｔ（Ｍ）およびＬ−Ａｌａ（Ａ）が挙げられる。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「脂肪族アミノ酸または残基」は、脂肪族炭化水素側鎖を有する疎水性アミノ酸または残基を指す。遺伝子によってコードされる脂肪族アミノ酸としては、Ｌ−Ａｌａ（Ａ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｌｅｕ（Ｌ）およびＬ−Ｉｌｅ（Ｉ）が挙げられる。システイン（または「Ｌ−Ｃｙｓ」もしくは「［Ｃ］」）は、他のＬ−Ｃｙｓ（Ｃ）アミノ酸、または他のスルファニルもしくはスルフヒドリル含有アミノ酸とジスルフィド架橋を形成することができるという点で、普通ではないことに留意する。「システイン様残基」としては、システイン、およびジスルフィド架橋の形成のために利用可能なスルフヒドリル部分を含有する他のアミノ酸が挙げられる。還元型遊離−ＳＨまたは酸化型ジスルフィド架橋形態のいずれかでペプチド中に存在するＬ−Ｃｙｓ（Ｃ）（および−ＳＨを含有する側鎖を有する他のアミノ酸）の能力は、Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）がペプチドへの正味の疎水性または親水性の特性に寄与するかどうかに影響を及ぼす。Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ（Eisenberg  et  al.,  1984、上記）の正規化コンセンサス尺度に従って、０．２９の疎水性を示すが、本開示の目的のためには、Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）は、その独自の類のない群に分類されることが理解されるべきである。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「小型アミノ酸または残基」は、全部で３つまたはそれよりも少ない炭素および／またはヘテロ原子（α−炭素および水素を除く）で構成される側鎖を有するアミノ酸または残基を指す。小型アミノ酸または残基は、上記の定義に従って、脂肪族、非極性、極性もしくは酸性の小型アミノ酸または残基として、さらに分類されてもよい。遺伝子によってコードされる小型アミノ酸としては、Ｌ−Ａｌａ（Ａ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｌ−Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ−Ｔｈｒ（Ｔ）およびＬ−Ａｓｐ（Ｄ）が挙げられる。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「ヒドロキシル含有アミノ酸または残基」は、ヒドロキシル（−ＯＨ）部分を含有するアミノ酸を指す。遺伝子によってコードされるヒドロキシルを含有するアミノ酸としては、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ−Ｔｈｒ（Ｔ）およびＬ−Ｔｙｒ（Ｙ）が挙げられる。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、共有結合的に一緒に連結された２つまたはそれよりも多くのヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドから全体的に構成されてもよく（すなわち、ＲＮＡ）、２’デオキシリボヌクレオチドから全体的に構成されてもよく（すなわち、ＤＮＡ）、またはリボヌクレオチドおよび２’デオキシリボヌクレオチドの混合物で構成されてもよい。ヌクレオシドは、典型的には、標準的なホスホジエステル連結を介して一緒に連結されるが、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の非標準的な連結を含んでいてもよい。ポリヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖であってもよく、または一本鎖領域および二本鎖領域の両方を含んでいてもよい。また、ポリヌクレオチドは、典型的には、天然に存在するコード核酸塩基（すなわち、アデニン、グアニン、ウラシル、チミンおよびシトシン）から構成されるが、例えば、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチンなどのような１つまたは複数の修飾核酸塩基および／または合成核酸塩基を含んでいてもよい。一部の実施形態では、このような修飾核酸塩基または合成核酸塩基は、アミノ酸配列をコードする核酸塩基である。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「ヌクレオシド」は、核酸塩基（すなわち、窒素塩基）および５炭糖（例えば、リボースまたはデオキシリボース）を含むグリコシルアミンを指す。ヌクレオシドの非制限的な例としては、シチジン、ウリジン、アデノシン、グアノシン、チミジンおよびイノシンが挙げられる。対照的に、「ヌクレオチド」という用語は、核酸塩基、５炭糖、および１つまたは複数のリン酸基を含むグリコシルアミンを指す。一部の実施形態では、ヌクレオシドは、キナーゼによってリン酸化されて、ヌクレオチドを生成することができる。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「ヌクレオシド二リン酸」は、核酸塩基（すなわち、窒素塩基）、５炭糖（例えば、リボースまたはデオキシリボース）および二リン酸（すなわち、ピロリン酸）部分を含むグリコシルアミンを指す。本明細書における一部の実施形態では、「ヌクレオシド二リン酸」は、「ＮＤＰ」と略される。ヌクレオシド二リン酸の非限定的な例としては、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）およびイノシン二リン酸（ＩＤＰ）が挙げられる。「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」という用語は、一部の文脈において互換可能に使用され得る。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「コード配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸（例えば、遺伝子）の部分を指す。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「生体触媒」、「生体触媒の」、「生体内変換」および「生合成」という用語は、有機化合物に対して化学反応を行う酵素の使用を指す。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「野生型」および「天然に存在する」は、天然に見出される形態を指す。例えば、野生型ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然の供給源から単離することができ、ヒトの操作（human  manipulation）によって意図的に改変されていない、生物中に存在する配列である。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「組換え」、「操作された（engineered）」、「バリアント」および「天然に存在しない」は、細胞、核酸またはポリペプチドに関連して使用される場合、そうでなければ天然に存在しないはずである様式で改変されている材料、または材料の天然もしくはネイティブ形態に対応する材料を指す。一部の実施形態では、細胞、核酸またはポリペプチドは、天然に存在する細胞、核酸またはポリペプチドと同一であるが、合成材料からおよび／もしくは組換え技法を使用する操作によって、生成または誘導される。非限定的な例としては、中でも、細胞のネイティブ（非組換え）形態内では見出されない遺伝子を発現するか、またはそうでなければ異なるレベルで発現されるネイティブ遺伝子を発現する、組換え細胞が挙げられる。
【００５１】
「配列同一性のパーセント（％）」という用語は、本明細書において、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の比較を指すために使用され、２つの最適に整列させた配列を比較ウインドウに対して比較することによって決定され、ここで、比較ウインドウにおけるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適なアライメントのために参照配列と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでいてもよい。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列に存在する位置の数を決定して、マッチした位置の数を得、マッチした位置の数を比較ウインドウにおける位置の総数で除算し、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算されてもよい。あるいは、パーセンテージは、同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基のいずれかが両方の配列に存在する位置の数を決定するか、または核酸塩基もしくはアミノ酸残基をギャップと共に整列させてマッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を比較ウインドウにおける位置の総数で除算し、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算されてもよい。当業者は、２つの配列を整列させるために利用可能な多くの確立されたアルゴリズムが存在することを十分に理解している。比較のための配列の最適なアライメントは、当技術分野において公知であるように、限定されるものではないが、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのローカル相同性アルゴリズム（Smith  and  Waterman,    Adv.  Appl.  Math.,  2:482  [1981]）、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの相同性アライメントアルゴリズム（Needleman  and  Wunsch,  J.  Mol.  Biol.,  48:443  [1970]）、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似性についての検索方法（Pearson  and  Lipman,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  85:2444  [1988]）、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行（例えば、ＧＣＧ  ＷｉｓｃｏｎｓｉｎソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、または目視検査を含む、任意の適切な方法によって実施することができる。配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するために適切なアルゴリズムの例としては、限定されるものではないが、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（それぞれ、Altschul  et  al.,  J.  Mol.  Biol.,  215:  403-410  [1990]；およびAltschul  et  al.,  Nucl.  Acids  Res.,  3389-3402  [1977]を参照のこと）によって記載される、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが挙げられる。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、アメリカ国立生物工学情報センターのウェブサイトを通して公開されている。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列における同じ長さのワードと整列させた場合に、いくつかの正の値の閾値スコアＴとマッチするか、または満たす、クエリ配列における短いワード長Ｗを特定することによって、高スコアリングの配列ペア（ＨＳＰ）を特定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と称される（Altschul  et  al.、上記を参照のこと）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見出す検索を開始するためのシードとしての役割を果たす。次いで、ワードヒットを、累積アライメントスコ��を増加させることができる範囲まで、それぞれの配列に沿って両方の方向に伸長させる。累積スコアは、ヌクレオチド配列のために、パラメータＭ（マッチする残基の対についてのリワードスコア：常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を使用して計算する。アミノ酸配列のためには、スコアリング行列を使用して累積スコアを計算する。それぞれの方向におけるワードヒットの伸長は、以下の場合に停止する：累積アライメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ低下する；累積スコアが、１つもしくは複数の負のスコアリング残基アライメントの蓄積に起因して、ゼロもしくはそれよりも低くなる；またはいずれかの配列の末端に達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータのＷ、Ｔ、およびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列のため）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列のためには、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列を使用する（Henikoff  and  Henikoff,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  89:10915  [1989]を参照のこと）。配列アライメントおよび配列同一性％の例示的な決定は、提供されたデフォルトパラメータを使用して、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎソフトウェアパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）におけるＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプログラムを用いることができる。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「参照配列」は、配列および／または活性の比較のための基礎として使用される定義された配列を指す。参照配列は、より大きな配列のサブセット、例えば、全長の遺伝子またはポリペプチド配列のセグメントであってもよい。一般に、参照配列は、少なくとも２０ヌクレオチド長またはアミノ酸残基長、少なくとも２５残基長、少なくとも５０残基長、少なくとも１００残基長、または全長の核酸もしくはポリペプチドである。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それぞれ、（１）２つの配列間で類似である配列（すなわち、完全な配列の一部）を含んでいてもよく、（２）２つの配列間で相違する配列をさらに含んでいてもよいので、２つの（またはそれより多くの）ポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列比較は、典型的には、「比較ウインドウ」に対して２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を比較して、ローカル領域の配列類似性を同定および比較することによって行われる。一部の実施形態では、「参照配列」は、参照配列が一次配列中に１つまたは複数の変化を有することができる配列である場合、一次アミノ酸配列に基づくことができる。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「比較ウインドウ」は、少なくとも約２０の連続するヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念的セグメントを指し、ここで、配列は、少なくとも２０の連続するヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較されてもよく、比較ウインドウにおける配列の部分は、２つの配列の最適なアライメントのために参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して２０パーセントまたはそれよりも低い付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでいてもよい。比較ウインドウは、２０の連続する残基よりも長い場合があり、必要に応じて、３０、４０、５０、１００、またはそれよりも長いウインドウを含む。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「対応する」、「参照して」および「比べて」は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の番号付けの文脈において使用される場合、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列を参照配列と比較した場合の特定された参照配列の残基の番号付けを指す。言い換えれば、所与のポリマーの残基番号または残基位置は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の数的な位置によってよりもむしろ参照配列に関連して指定される。例えば、操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼのアミノ酸配列などの所与のアミノ酸配列は、２つの配列間の残基のマッチを最適化するためにギャップを導入することによって、参照配列と整列させることができる。これらの場合では、ギャップは存在するが、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列中の残基の番号付けは、それを整列させた参照配列に関して行われる。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「実質的な同一性」は、少なくとも２０残基位置の比較ウインドウに対して、しばしば少なくとも３０〜５０残基のウインドウに対して、参照配列と比較して、少なくとも８０パーセントの配列同一性、少なくとも８５パーセントの同一性、少なくとも８９〜９５パーセントの配列同一性、もしくはより通常は少なくとも９９パーセントの配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を指し、ここで、配列同一性のパーセンテージは、比較ウインドウに対して、参照配列の合計で２０パーセントまたはそれよりも少ない欠失または付加を含む配列に対して参照配列を比較することによって計算される。ポリペプチドに適用される一部の特定の実施形態では、「実質的な同一性」という用語は、デフォルトギャップ重みを使用して、プログラムのＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによってなど最適に整列させた場合に、２つのポリペプチド配列が、少なくとも８０パーセントの配列同一性、好ましくは、少なくとも８９パーセントの配列同一性、少なくとも９５パーセントまたはそれより高い配列同一性（例えば、９９パーセントの配列同一性）を共有することを意味する。一部の実施形態では、比較される配列中の同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸の相違」および「残基の相違」は、参照配列における対応する位置でのアミノ酸残基と比べて、ポリペプチド配列の位置でのアミノ酸残基の相違を指す。一部の場合では、参照配列は、ヒスチジンタグを有するが、番号付けは、ヒスチジンタグなしの同等の参照配列と比べて維持される。アミノ酸の相違の位置は、一般に、本明細書において、「Ｘｎ」と称し、ここで、ｎは、残基の相違がそれに基づく参照配列中の対応する位置を指す。例えば、「配列番号４と比較したＸ９３位での残基の相違」は、配列番号４の９３位に対応するポリペプチド位置でのアミノ酸残基の相違を指す。したがって、配列番号４の参照ポリペプチドが９３位にセリンを有する場合、「配列番号４と比較したＸ９３位での残基の相違」は、配列番号４の９３位に対応するポリペプチドの位置でのセリン以外の任意の残基のアミノ酸置換である。本明細書におけるほとんどの例では、ある位置での特定のアミノ酸残基の相違は、「ＸｎＹ」として示され、ここで、「Ｘｎ」は、上記に記載の対応する位置を特定し、「Ｙ」は、操作されたポリペプチドにおいて見出されるアミノ酸の一文字識別子（すなわち、参照ポリペプチドとは異なる残基）である。一部の例では（例えば、実施例に示す表では）、本発明は、従来の表記「ＡｎＢ」によって表される特定のアミノ酸の相違も提供し、ここで、Ａは、参照配列における残基の一文字識別子であり、「ｎ」は、参照配列における残基位置の番号であり、Ｂは、操作されたポリペプチドの配列における残基置換の一文字識別子である。一部の例では、本発明のポリペプチドは、参照配列と比べて残基の相違が存在する特定された位置のリストによって表される、参照配列と比べて１つまたは複数のアミノ酸残基の相違を含むことができる。一部の実施形態では、２つ以上のアミノ酸をポリペプチドの特定の残基位置で使用することができる場合、使用することができるさまざまなアミノ酸残基は、「／」によって区切られる（例えば、Ｘ３０７Ｈ／Ｘ３０７ＰまたはＸ３０７Ｈ／Ｐ）。スラッシュはまた、所与のバリアント内の複数の置換を示すために使用されてもよい（すなわち、コンビナトリアルバリアントにおけるなどの所与の配列において、２つ以上の置換が存在する）。一部の実施形態では、本発明は、保存的または非保存的アミノ酸置換を含む１つまたは複数のアミノ酸の相違を含む操作されたポリペプチド配列を含む。一部の追加の実施形態では、本発明は、保存的および非保存的アミノ酸置換の両方を含む操作されたポリペプチド配列を提供する。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」は、類似の側鎖を有する異なる残基による残基の置換を指し、したがって、典型的には、同じまたは類似の定義されたアミノ酸のクラス内のアミノ酸によるポリペプチド中のアミノ酸の置換を含む。限定ではなく例として、一部の実施形態では、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は、別の脂肪族アミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン）で置換され；ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸は、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、セリンおよびトレオニン）で置換され；芳香族側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびヒスチジン）で置換され；塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、リシンおよびアルギニン）で置換され；酸性側鎖を有するアミノ酸は、酸性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）で置換され；および／または疎水性もしくは親水性アミノ酸は、それぞれ、別の疎水性もしくは親水性アミノ酸で置き換えられる。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「非保存的置換」は、有意に異なる側鎖の性質を有するアミノ酸によるポリペプチド中のアミノ酸の置換を指す。非保存的置換は、定義された群内よりもむしろ、群の間のアミノ酸を使用してもよく、（ａ）置換（例えば、グリシンについてプロリン）の領域におけるペプチド主鎖の構造、（ｂ）電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩に影響を及ぼす。限定ではなく例として、例示的な非保存的置換は、塩基性または脂肪族アミノ酸で置換された酸性アミノ酸、小型アミノ酸で置換された芳香族アミノ酸、および疎水性アミノ酸で置換された親水性アミノ酸であり得る。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「欠失」は、参照ポリペプチドからの１つまたは複数のアミノ酸の除去によるポリペプチドへの改変を指す。欠失は、操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼ酵素の酵素活性を保持し、および／または該酵素の改善された性質を保持しながら、１つもしくはそれより多くのアミノ酸、２つもしくはそれより多くのアミノ酸、５つもしくはそれより多くのアミノ酸、１０もしくはそれより多くのアミノ酸、１５もしくはそれより多くのアミノ酸、または２０もしくはそれより多くのアミノ酸、参照酵素を構成するアミノ酸の総数の最大で１０％、または該アミノ酸の総数の最大で２０％の除去を含み得る。欠失は、ポリペプチドの内部部分および／または末端部分を対象とすることができる。さまざまな実施形態では、欠失は、連続するセグメントを含み得るか、または不連続であり得る。欠失は、典型的に、アミノ酸配列において「−」によって示される。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「挿入」は、参照ポリペプチドからの１つまたは複数のアミノ酸の付加によるポリペプチドへの改変を指す。挿入は、ポリペプチドの内部部分に存在し得るか、またはカルボキシ末端もしくはアミノ末端に対するものでよい。本明細書で使用される挿入は、当技術分野において公知の融合タンパク質を含む。挿入は、アミノ酸の連続するセグメントであり得るか、または天然に存在するポリペプチドにおいて１つまたは複数のアミノ酸によって分離され得る。
【００６１】
「アミノ酸置換セット」または「置換セット」という用語は、参照配列と比較して、ポリペプチド配列中のアミノ酸置換の群を指す。置換セットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれよりも多くのアミノ酸置換を有することができる。一部の実施形態では、置換セットは、実施例において提供される表に列挙されたバリアントプリンヌクレオシドホスホリラーゼのいずれかに存在するアミノ酸置換のセットを指す。
【００６２】
「機能的断片」および「生物活性断片」は、本明細書において互換可能に使用され、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失（複数可）および／または内部欠失を有するが、残りのアミノ酸配列が、それが比較される配列（例えば、本発明の全長の操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼ）における対応する部分と同一であり、全長ポリペプチドの活性の実質的にすべてを保持する、ポリペプチドを指す。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「単離されたポリペプチド」は、天然でそれに付随する他の夾雑物（例えば、タンパク質、脂質およびポリヌクレオチド）から実質的に分離されているポリペプチドを指す。この用語は、それらの天然に存在する環境または発現系（例えば、宿主細胞内またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成を介して）から除去されているか、または精製されているポリペプチドを包含する。組換えプリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチドは、細胞内に存在していてもよく、細胞培地に存在していてもよく、または溶解物もしくは単離された調製物などのさまざまな形態で調製されてもよい。このように、一部の実施形態では、組換えプリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチドは、単離されたポリペプチドであり得る。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「実質的に純粋なポリペプチド」または「精製されたタンパク質」は、ポリペプチド種が存在する主たる種である組成物を指し（すなわち、モルまたは重量に基づいて、それが組成物において任意の他の個々の高分子種より豊富である）、一般に、目的の種がモル％または重量％によって、存在する高分子種の少なくとも約５０パーセントを占める場合、実質的に精製された組成物である。しかしながら、一部の実施形態では、プリンヌクレオシドホスホリラーゼを含む組成物は、５０％未満（例えば、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、または約５０％）純粋であるプリンヌクレオシドホスホリラーゼを含む。一般に、実質的に純粋なプリンヌクレオシドホスホリラーゼ組成物は、組成物中に存在するモル％または重量％ですべての高分子種のうちの約６０％またはそれより多く、約７０％またはそれより多く、約８０％またはそれより多く、約９０％またはそれより多く、約９５％またはそれより多く、および約９８％またはそれより多くを占める。一部の実施形態では、目的の種は、本質的に均一まで精製され（すなわち、夾雑種が従来の検出法によって組成物中で検出することができない）、ここで、組成物は、単一の高分子種から本質的になる。溶媒種、小型分子（＜５００ダルトン）および元素イオン種は、高分子種とは見なさない。一部の実施形態では、単離された組換えプリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「改善された酵素の性質」は、酵素の少なくとも１つの改善された性質を指す。一部の実施形態では、本発明は、参照プリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチド、および／または野生型プリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチド、および／または別の操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチドと比較して、任意の酵素の性質の改善を示す操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチドを提供する。したがって、「改善」のレベルは、野生型だけでなく操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼを含む、さまざまなプリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチドの間で決定および比較することができる。改善された性質としては、限定されるものではないが、増加したタンパク質発現、増加した熱活性、増加した熱安定性、増加したｐＨ活性、増加した安定性、増加した酵素活性、増加した基質特異性もしくは親和性、増加した比活性、基質または最終生成物の阻害に対する増加した耐性、増加した化学安定性、改善された化学選択性、改善された溶媒安定性、酸性ｐＨに対する増加した耐性、タンパク質分解活性に対する増加した耐性（すなわち、タンパク質分解に対する低減された感受性）、低減された凝集、増加した溶解度、および変更された温度プロファイルなどの性質が挙げられる。追加の実施形態では、この用語は、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ酵素の少なくとも１つの改善された性質に関連して使用される。一部の実施形態では、本発明は、参照プリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチド、および／または野生型プリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチド、および／または別の操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチドと比較して、任意の酵素の性質の改善を示す操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチドを提供する。したがって、「改善」のレベルは、野生型だけでなく操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼを含む、さまざまなプリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチドの間で決定および比較することができる。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「増加した酵素活性」および「増強された触媒活性」は、操作されたポリペプチドの改善された性質を指し、これは、参照酵素と比較して、比活性（例えば、生成した生成物／時間／重量タンパク質）の増加、または基質の生成物への変換パーセント（例えば、特定の量の酵素を使用して特定の期間での開始量の基質の生成物への変換パーセント）の増加によって表すことができる。一部の実施形態では、この用語は、本明細書に提供される操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチドの改善された性質を指し、これは、参照プリンヌクレオシドホスホリラーゼ酵素と比較して、比活性（例えば、生成した生成物／時間／重量タンパク質）の増加、または基質の生成物への変換パーセント（例えば、特定の量のプリンヌクレオシドホスホリラーゼを使用して特定の期間での開始量の基質の生成物への変換パーセント）の増加によって表すことができる。一部の実施形態では、この用語は、本明細書に提供される改善されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼ酵素に関連して使用される。本発明の操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼの酵素活性を決定する例示的な方法を実施例に提供する。Ｋｍ、Ｖｍａｘまたはｋｃａｔの古典的な酵素の性質を含む、酵素活性に関する任意の性質は影響を受け得、その変化が増加した酵素活性をもたらし得る。例えば、酵素活性の改善は、対応する野生型酵素の酵素活性の約１．１倍から、天然に存在するプリンヌクレオシドホスホリラーゼまたはプリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチドが由来する別の操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼよりも２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、またはそれより高い酵素活性であり得る。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「変換」は、基質（複数可）の対応する生成物（複数可）への酵素的変換（または生体内変換）を指す。「変換パーセント」は、特定の条件下で一定の期間内に生成物に変換される基質のパーセントを指す。したがって、プリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチドの「酵素活性」または「活性」は、特定の期間での基質の生成物への「変換パーセント」として表すことができる。
【００６８】
「万能の性質」を有する酵素（または「万能酵素（generalist  enzyme）」）は、親配列と比較して、広範囲の基質について改善された活性を示す酵素を指す。万能酵素は、すべての可能性がある基質について改善された活性を必ずしも実証する必要はない。一部の実施形態では、本発明は、それらが広範囲の立体的および電子的に多様な基質について親遺伝子と比べて、類似または改善された活性を実証するという点で、万能の性質を有するプリンヌクレオシドホスホリラーゼバリアントを提供する。加えて、本明細書に提供される万能酵素は、代謝物／生成物の生成を増加させるために広範囲の多様な分子にわたって改善されるように操作された。
【００６９】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、本明細書において、その条件の下で核酸ハイブリッドが安定である条件を指す。当業者に公知であるように、ハイブリッドの安定性は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）に反映される。一般に、ハイブリッドの安定性は、イオン強度、温度、Ｇ／Ｃ含量、およびカオトロピック剤の存在の関数である。ポリヌクレオチドについてのＴｍ値は、融解温度を予測するための公知の方法を使用して計算することができる（例えば、Baldino  et  al.,  Meth.  Enzymol.,  168:761-777  [1989]；Bolton  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  48:1390  [1962]；Bresslauer  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  83:8893-8897  [1986]；Freier  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  83:9373-9377  [1986]；Kierzek  et  al.,  Biochem.,  25:7840-7846  [1986]；Rychlik  et  al.,    Nucl.  Acids  Res.,  18:6409-6412  [1990]  (erratum,  Nucl.  Acids  Res.,  19:698  [1991])；Sambrook  et  al.、上記）；Suggs  et  al.,  1981,  in  Developmental  Biology  Using  Purified  Genes,  Brown  et  al.  [eds.],  pp.  683-693,  Academic  Press,  Cambridge,  MA  [1981]；およびWetmur,  Crit.  Rev.  Biochem.  Mol.  Biol.  26:227-259  [1991]を参照のこと）。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるポリペプチドをコードし、中ストリンジェントまたは高ストリンジェントな条件などの定義された条件下で、本発明の操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼ酵素をコードする配列の相補体とハイブリダイズする。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー」は、核酸のハイブリダイゼーションにおける洗浄条件などのハイブリダイゼーション条件に関する。一般に、ハイブリダイゼーション反応は、より低いストリンジェンシーの条件下で行われ、続いて、多様であるが、より高いストリンジェンシーの洗浄を行う。「中ストリンジェントなハイブリダイゼーション」という用語は、標的ＤＮＡを、標的ポリヌクレオチドに対して約９０％よりも高い同一性で、標的ＤＮＡに対して約６０％の同一性、好ましくは、約７５％の同一性、約８５％の同一性を有する相補的核酸に結合することを可能にする条件を指す。例示的な中ストリンジェントな条件は、５０％のホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％のＳＤＳ中、４２℃でのハイブリダイゼーション、続いて、０．２×ＳＳＰＥ、０．２％のＳＤＳ中、４２℃での洗浄と同等の条件である。「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」は、一般に、定義されたポリヌクレオチド配列のための溶液条件下で決定された熱融解温度Ｔｍから約１０℃またはそれより低い条件を指す。一部の実施形態では、高ストリンジェンシー条件は、０．０１８ＭのＮａＣｌ中、６５℃で安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す（すなわち、ハイブリッドが、０．０１８ＭのＮａＣｌ中、６５℃で安定ではない場合、これは、本明細書において企図されるように、高ストリンジェンシー条件下で安定ではない）。高ストリンジェンシー条件は、例えば、５０％のホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％のＳＤＳ、４２℃と同等の条件でのハイブリダイゼーション、続いて、０．１×ＳＳＰＥ、および０．１％のＳＤＳ中、６５℃での洗浄によって提供され得る。別の高ストリンジェンシー条件は、０．１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳを含有する５×ＳＳＣ中、６５℃でのハイブリダイズと同等の条件でハイブリダイズすること、および０．１％のＳＤＳを含有する０．１×ＳＳＣ中、６５℃で洗浄することである。他の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件および中ストリンジェントな条件は、上記で引用した参考文献に記載されている。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「コドン最適化」は、コードされるタンパク質が目的の生物において効率的に発現されるように、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンの、特定の生物において優先的に使用されるコドンへの変化を指す。遺伝コードは、ほとんどのアミノ酸が、「同義」または「同義の」コドンと呼ばれるいくつかのコドンによって表されるという点において縮重しているが、特定の生物によるコドン使用頻度は、ランダムではなく、特定のコドントリプレットの方に偏っていることは周知である。このコドン使用頻度バイアスは、所与の遺伝子、共通の機能または先祖起源の遺伝子、低コピー数タンパク質に対する高度に発現されるタンパク質、および生物のゲノムの凝集タンパク質コード領域（aggregate  protein  coding  region）に関連してより高くてもよい。一部の実施形態では、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドは、発現のために選択される宿主生物における最適な産生のためにコドン最適化されてもよい。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「好ましい」、「最適な」および「高いコドン使用頻度バイアス」コドンは、単独または組み合わせて使用される場合、同じアミノ酸をコードする他のコドンより高い頻度でタンパク質コード領域において使用されるコドンを互換可能に指す。好ましいコドンは、単一の遺伝子、共通の機能もしくは起源の遺伝子のセット、高度に発現された遺伝子におけるコドン使用頻度、生物全体の凝集タンパク質コード領域におけるコドン頻度、関連する生物の凝集タンパク質コード領域におけるコドン頻度、またはそれらの組合せに関して決定され得る。その頻度が遺伝子発現のレベルと共に増加するコドンは、典型的には、発現のために最適なコドンである。例えば、クラスター分析または対応分析、および遺伝子において使用されるコドンの有効数を使用する多変量解析を含む種々の方法が、コドン頻度（例えば、コドン使用頻度、相対的に同義のコドン使用頻度）および特定の生物におけるコドン優先選択を決定するために、公知である（例えば、GCG  CodonPreference,  Genetics  Computer  Group  Wisconsin  Package；CodonW,  Peden,  University  of  Nottingham；McInerney,  Bioinform.,  14:372-73  [1998]；Stenico  et  al.,  Nucl.  Acids  Res.,  222437-46  [1994]；およびWright,  Gene  87:23-29  [1990]を参照のこと）。コドン使用頻度の表は、多くの異なる生物について利用可能である（例えば、Wada  et  al.,  Nucl.  Acids  Res.,  20:2111-2118  [1992]；Nakamura  et  al.,  Nucl.  Acids  Res.,  28:292  [2000]；Duret,  et  al.、上記；Henaut  and  Danchin,  in  Escherichia  coli  and  Salmonella,  Neidhardt,  et  al.  (eds.),  ASM  Press,  Washington  D.C.,  p.  2047-2066  [1996]を参照のこと）。コドン使用頻度を得るためのデータソースは、タンパク質についてコードする能力を有する任意の利用可能なヌクレオチド配列に依拠し得る。これらのデータセットは、発現されるタンパク質をコードすることが実際に公知である核酸配列（例えば、完全なタンパク質コード配列−ＣＤＳ）、発現される配列タグ（ＥＳＴＳ）、またはゲノム配列の予想されるコード領域を含む（例えば、Mount,  Bioinformatics:  Sequence  and  Genome  Analysis,  Chapter  8,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  Cold  Spring  Harbor,  N.Y.  [  2001]；Uberbacher,  Meth.  Enzymol.,  266:259-281  [1996]；およびTiwari  et  al.,  Comput.  Appl.  Biosci.,  13:263-270  [1997]を参照のこと）。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「制御配列」は、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現のために必要であるか、または有利であるすべての構成要素を含む。それぞれの制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に対して、ネイティブまたは外来性であり得る。そのような制御配列としては、限定されるものではないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター配列、シグナルペプチド配列、開始配列および転写ターミネーターが挙げられる。最低でも、制御配列は、プロモーター、ならびに転写および翻訳停止シグナルを含む。制御配列は、制御配列とポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域とのライゲーションを容易にする特異的制限部位を導入する目的で、リンカーを備えていてもよい。
【００７４】
「作動可能に連結された」は、本明細書において、制御配列が、目的のポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチドの発現を指示または調節するように、制御配列が、目的のポリヌクレオチドに対する位置で適切に（すなわち、機能的な関係で）配置される配置として定義される。
【００７５】
「プロモーター配列」は、コード配列などの目的のポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識される核酸配列を指す。プロモーター配列は、目的のポリヌクレオチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、変異体、短縮型（truncated）およびハイブリッドプロモーターを含む、選り抜きの宿主細胞において転写活性を示す任意の核酸配列であってもよく、宿主細胞に対して同種もしくは異種のいずれかである細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られ得る。
【００７６】
「適切な反応条件」という語句は、本発明のプリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチドが、基質を所望の生成物化合物に変換する能力を有する酵素的変換反応溶液中の条件（例えば、酵素添加量、基質添加量、温度、ｐＨ、緩衝液、共溶媒などの範囲）を指す。一部の例示的な「適切な反応条件」を本明細書に提供する。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「化合物添加量」または「酵素添加量」などにおける「添加量」は、反応の開始時の反応混合物中の成分の濃度または量を指す。
【００７８】
本明細書で使用される場合、酵素変換反応プロセスの文脈における「基質」は、本明細書に提供される操作された酵素（例えば、操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチド）が作用する化合物または分子を指す。
【００７９】
本明細書で使用される場合、反応からの生成物（例えば、デオキシリボースリン酸アナログ）の収量を「増加させること」は、反応の間に存在する特定の成分（例えば、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ酵素）が、同じ基質および他の置換基を用いるが、目的の成分が非存在の同じ条件下で実施される反応と比較して、より多くの生成物を生成させる。
【００８０】
反応は、反応の触媒に関与する他の酵素と比較して、その酵素の量が、約２％未満、約１％未満、または約０．１％（ｗｔ／ｗｔ）未満である場合に、特定の酵素を「実質的に含まない」と言う。
【００８１】
本明細書で使用される場合、液体（例えば、培養ブロス）を「分画すること」は、分離プロセス（例えば、塩析、カラムクロマトグラフィー、サイズ排除、および濾過）またはそのようなプロセスの組合せを適用して、所望のタンパク質が、最初の液体生成物よりも溶液中で総タンパク質のより大きいパーセンテージを占める溶液を提供することを意味する。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「出発組成物」は、少なくとも１つの基質を含む任意の組成物を指す。一部の実施形態では、出発組成物は、任意の適切な基質を含む。
【００８３】
本明細書で使用される場合、酵素変換プロセスの文脈における「生成物」は、基質に対する酵素的ポリペプチドの作用から生じる化合物または分子を指す。
【００８４】
本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「平衡」は、化学反応または酵素反応の順方向速度定数および逆方向速度定数によって決定される、立体異性体の相互変換を含む、化学反応または酵素反応（例えば、ＡおよびＢの２つの種の相互変換）において化学種の定常状態の濃度をもたらすプロセスを指す。
【００８５】
本明細書で使用される場合、「アルキル」は、直鎖状または分枝状のいずれかの、全てを含めて１〜１８個の炭素原子、より好ましくは、全てを含めて１〜８個の炭素原子、最も好ましくは、全てを含めて１〜６個の炭素原子の飽和炭化水素基を指す。特定の数の炭素原子を有するアルキルは、丸括弧内に示す（例えば、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルは１〜４個の炭素原子のアルキルを指す）。
【００８６】
本明細書で使用される場合、「アルケニル」は、少なくとも１つの二重結合を含有するが、必要に応じて２つ以上の二重結合を含有する、直鎖状または分枝状のいずれかの、全てを含めて２〜１２個の炭素原子の基を指す。
【００８７】
本明細書で使用される場合、「アルキニル」は、少なくとも１つの三重結合を含有するが、必要に応じて２つ以上の三重結合を含有し、追加で必要に応じて１つまたは複数の二重結合部分を含有する、直鎖状または分枝状のいずれかの、全てを含めて２〜１２個の炭素原子の基を指す。
【００８８】
本明細書で使用される場合、「ヘテロアルキル」、「ヘテロアルケニル」および「ヘテロアルキニル」は、１つまたは複数の炭素原子がそれぞれ独立して、同じもしくは異なるヘテロ原子またはヘテロ原子基で置き換えられる、本明細書で定義されるアルキル、アルケニルおよびアルキニルを指す。炭素原子を置き換え得るヘテロ原子および／またはヘテロ原子基としては、限定されるものではないが、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｏ−、−ＮＲα−、−ＰＨ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）ＮＲα−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲα−などが挙げられ（それらの組合せを含む）、式中、それぞれのＲαは、水素、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールから独立して選択される。
【００８９】
本明細書で使用される場合、「アルコキシ」は、基−ＯＲβを指し、式中、Ｒβは、本明細書でも定義される必要に応じて置換されたアルキル基を含む、上記で定義される通りのアルキル基である。
【００９０】
本明細書で使用される場合、「アリール」は、単環（例えば、フェニル）または複数の縮合環（例えば、ナフチルまたはアントリル）を有する全てを含めて６〜１２個の炭素原子の不飽和芳香族炭素環式基を指す。例示的なアリールとしては、フェニル、ピリジル、ナフチルなどが挙げられる。
【００９１】
本明細書で使用される場合、「アミノ」は、基−ＮＨ２を指す。置換アミノは、基−ＮＨＲδ、ＮＲδＲδ、およびＮＲδＲδＲδを指し、式中、それぞれのＲδは、置換または非置換の、アルキル、シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アシル、アルコキシカルボニル、スルファニル、スルフィニル、スルホニルなどから独立して選択される。典型的なアミノ基としては、限定されるものではないが（but  are  limited  to、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、メチルスルホニルアミノ、フラニル−オキシ−スルファミノなどが挙げられる。
【００９２】
本明細書で使用される場合、「オキソ」は、＝Ｏを指す。
【００９３】
本明細書で使用される場合、「オキシ」は、エーテルおよびエステルを含む異なるオキシ基を形成するためにさまざまな置換基を有していてもよい、二価の基の−Ｏ−を指す。
【００９４】
本明細書で使用される場合、「カルボキシ」は、−ＣＯＯＨを指す。
【００９５】
本明細書で使用される場合、「カルボニル」は、酸、酸ハロゲン化物、アルデヒド、アミド、エステルおよびケトンを含む異なるカルボニル基を形成するために種々の置換基を有していてもよい、−Ｃ（Ｏ）−を指す。
【００９６】
本明細書で使用される場合、「アルコキシカルボニル」は、−Ｃ（Ｏ）ＯＲεを指し、式中、Ｒεは、必要に応じて置換され得る本明細書に定義されるアルキル基である。
【００９７】
本明細書で使用される場合、「アミノカルボニル」は、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２を指す。置換アミノカルボニルは、−Ｃ（Ｏ）ＮＲδＲδを指し、式中、アミノ基ＮＲδＲδは、本明細書に定義される通りである。
【００９８】
本明細書で使用される場合、「ハロゲン」および「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを指す。
【００９９】
本明細書で使用される場合、「ヒドロキシ」は、−ＯＨを指す。
【０１００】
本明細書で使用される場合、「シアノ」は、−ＣＮを指す。
【０１０１】
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリール」は、環内に全てを含めて１〜１０個の炭素原子、ならびに酸素、窒素、および硫黄から選択される全てを含めて１〜４個のヘテロ原子の芳香族複素環式基を指す。そのようなヘテロアリール基は、単環（例えば、ピリジルまたはフリル）または複数の縮合環（例えば、インドリジニルまたはベンゾチエニル）を有することができる。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリールアルキル」は、好ましくは、アルキル部分に全てを含めて１〜６個の炭素原子、およびヘテロアリール部分に全てを含めて５〜１２個の環原子を有する、ヘテロアリールで置換されたアルキル（すなわち、ヘテロアリール−アルキル基）を指す。そのようなヘテロアリールアルキル基は、ピリジルメチルなどによって例示される。
【０１０３】
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリールアルケニル」は、好ましくは、アルケニル部分に全てを含めて２〜６個の炭素原子、およびヘテロアリール部分に全てを含めて５〜１２個の環原子を有する、ヘテロアリールで置換されたアルケニル（すなわち、ヘテロアリール−アルケニル基）を指す。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリールアルキニル」は、好ましくは、アルキニル部分に全てを含めて２〜６個の炭素原子、およびヘテロアリール部分に全てを含めて５〜１２個の環原子を有する、ヘテロアリールで置換されたアルキニル（すなわち、ヘテロアリール−アルキニル基）を指す。
【０１０５】
本明細書で使用される場合、「ヘテロ環」、「複素環」、および互換可能に「ヘテロシクロアルキル」は、環内に全てを含めて２〜１０個の炭素環原子、および窒素、硫黄または酸素から選択される全てを含めて１〜４個のヘテロ環原子の単環または複数の縮合環を有する飽和または不飽和の基を指す。そのような複素環式基は、単環（例えば、ピペリジニルまたはテトラヒドロフリル）または複数の縮合環（例えば、インドリニル、ジヒドロベンゾフランまたはキヌクリジニル）を有することができる。ヘテロ環の例としては、限定されるものではないが、フラン、チオフェン、チアゾール、オキサゾール、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチルピリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロリン、イソチアゾール、フェナジン、イソオキサゾール、フェノキサジン、フェノチアジン、イミダゾリジン、イミダゾリン、ピペリジン、ピペラジン、ピロリジン、インドリンなどが挙げられる。
【０１０６】
本明細書で使用される場合、「員環」は、任意の環状構造を包含することを意味する。「員」という用語に先行する数字は、環を構成する骨格原子の数を表す。したがって、例えば、シクロヘキシル、ピリジン、ピランおよびチオピランは、６員環であり、シクロペンチル、ピロール、フランおよびチオフェンは、５員環である。
【０１０７】
他に規定のない限り、前述の基において水素によって占められる位置は、限定されるものではないが、ヒドロキシ、オキソ、ニトロ、メトキシ、エトキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、トリフルオロメトキシ、ハロアルコキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、ハロ、メチル、エチル、プロピル、ブチル、アルキル、アルケニル、アルキニル、置換アルキル、トリフルオロメチル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、チオ、アルキルチオ、アシル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、カルボキサミド、置換カルボキサミド、アルキルスルホニル、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニルアミノ、スルホンアミド、置換スルホンアミド、シアノ、アミノ、置換アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、アシルアミノ、アミジノ、アミドキシモ（amidoximo）、ヒドロキサモイル、フェニル、アリール、置換アリール、アリールオキシ、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ピリジル、イミダゾリル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルキルオキシ、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリノ、ヘテロ環、（ヘテロ環）オキシおよび（ヘテロ環）アルキルによって例示される置換基でさらに置換され得、好ましいヘテロ原子は、酸素、窒素および硫黄である。開放原子価がこれらの置換基上に存在する場合、開放原子価がアルキル基、シクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基および／またはヘテロ環基でさらに置換され得ること、これらの開放原子価が炭素上に存在する場合、開放原子価がハロゲンならびに酸素、窒素、または硫黄に結合した置換基によってさらに置換され得ること、ならびに複数のそのような開放原子価が存在する場合、結合の直接形成または新たなヘテロ原子、好ましくは、酸素、窒素または硫黄への結合の形成のいずれかによって、これらの基が、結合して環を形成することができることが理解される。置換基による水素の置き換えが、本発明の分子に許容されない不安定性を導入せず、そうでなければ化学的に合理的であるという条件で、上記置換を行うことができることがさらに理解される。
【０１０８】
本明細書で使用される場合、「培養する」という用語は、任意の適切な条件下で（例えば、液体、ゲルまたは固体培地を使用する）、微生物細胞の集団を成長させることを指す。
【０１０９】
組換えポリペプチドは、当技術分野において公知の任意の適切な方法を使用して産生させることができる。目的の野生型ポリペプチドをコードする遺伝子は、プラスミドなどのベクターにおいてクローニングすることができ、Ｅ．ｃｏｌｉなどのような所望の宿主において発現させることができる。組換えポリペプチドのバリアントは、当技術分野において公知のさまざまな方法によって作成することができる。実際に、当業者に周知である広範な異なる変異誘発技法がある。加えて、変異誘発キットは、多くの市販の分子生物学供給業者から入手可能でもある。定義されたアミノ酸での特定の置換（部位特異的）、遺伝子の局所領域における特異的もしくはランダム変異（領域特異的）、または全遺伝子にわたるランダム変異誘発（例えば、飽和変異誘発）を行う方法が利用可能である。限定されるものではないが、ＰＣＲを使用する一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡの部位特異的変異誘発、カセット変異誘発、遺伝子合成、エラープローンＰＣＲ、シャッフリング、および化学的飽和変異誘発、または当技術分野において公知の任意の他の適切な方法を含む、酵素バリアントを作成するための多数の適切な方法が当業者に公知である。変異誘発および定向進化法を、酵素をコードするポリヌクレオチドに容易に適用して、発現させ、スクリーニングし、アッセイすることができるバリアントライブラリーを作成することができる。任意の適切な変異誘発および定向進化法は、本発明において使用され、当技術分野において周知である（例えば、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号、同第５，８３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号、同第５，８３７，４５８号、同第５，９２８，９０５号、同第６，０９６，５４８号、同第６，１１７，６７９号、同第６，１３２，９７０号、同第６，１６５，７９３号、同第６，１８０，４０６号、同第６，２５１，６７４号、同第６，２６５，２０１号、同第６，２７７，６３８号、同第６，２８７，８６１号、同第６，２８７，８６２号、同第６，２９１，２４２号、同第６，２９７，０５３号、同第６，３０３，３４４号、同第６，３０９，８８３号、同第６，３１９，７１３号、同第６，３１９，７１４号、同第６，３２３，０３０号、同第６，３２６，２０４号、同第６，３３５，１６０号、同第６，３３５，１９８号、同第６，３４４，３５６号、同第６，３５２，８５９号、同第６，３５５，４８４号、同第６，３５８，７４０号、同第６，３５８，７４２号、同第６，３６５，３７７号、同第６，３６５，４０８号、同第６，３６８，８６１号、同第６，３７２，４９７号、同第６，３３７，１８６号、同第６，３７６，２４６号、同第６，３７９，９６４号、同第６，３８７，７０２号、同第６，３９１，５５２号、同第６，３９１，６４０号、同第６，３９５，５４７号、同第６，４０６，８５５号、同第６，４０６，９１０号、同第６，４１３，７４５号、同第６，４１３，７７４号、同第６，４２０，１７５号、同第６，４２３，５４２号、同第６，４２６，２２４号、同第６，４３６，６７５号、同第６，４４４，４６８号、同第６，４５５，２５３号、同第６，４７９，６５２号、同第６，４８２，６４７号、同第６，４８３，０１１号、同第６，４８４，１０５号、同第６，４８９，１４６号、同第６，５００，６１７号、同第６，５００，６３９号、同第６，５０６，６０２号、同第６，５０６，６０３号、同第６，５１８，０６５号、同第６，５１９，０６５号、同第６，５２１，４５３号、同第６，５２８，３１１号、同第６，５３７，７４６号、同第６，５７３，０９８号、同第６，５７６，４６７号、同第６，５７９，６７８号、同第６，５８６，１８２号、同第６，６０２，９８６号、同第６，６０５，４３０号、同第６，６１３，５１４号、同第６，６５３，０７２号、同第６，６８６，５１５号、同第６，７０３，２４０号、同第６，７１６，６３１号、同第６，８２５，００１号、同第６，９０２，９２２号、同第６，９１７，８８２号、同第６，９４６，２９６号、同第６，９６１，６６４号、同第６，９９５，０１７号、同第７，０２４，３１２号、同第７，０５８，５１５号、同第７，１０５，２９７号、同第７，１４８，０５４号、同第７，２２０，５６６号、同第７，２８８，３７５号、同第７，３８４，３８７号、同第７，４２１，３４７号、同第７，４３０，４７７号、同第７，４６２，４６９号、同第７，５３４，５６４号、同第７，６２０，５００号、同第７，６２０，５０２号、同第７，６２９，１７０号、同第７，７０２，４６４号、同第７，７４７，３９１号、同第７，７４７，３９３号、同第７，７５１，９８６号、同第７，７７６，５９８号、同第７，７８３，４２８号、同第７，７９５，０３０号、同第７，８５３，４１０号、同第７，８６８，１３８号、同第７，７８３，４２８号、同第７，８７３，４７７号、同第７，８７３，４９９号、同第７，９０４，２４９号、同第７，９５７，９１２号、同第７，９８１，６１４号、同第８，０１４，９６１号、同第８，０２９，９８８号、同第８，０４８，６７４号、同第８，０５８，００１号、同第８，０７６，１３８号、同第８，１０８，１５０号、同第８，１７０，８０６号、同第８，２２４，５８０号、同第８，３７７，６８１号、同第８，３８３，３４６号、同第８，４５７，９０３号、同第８，５０４，４９８号、同第８，５８９，０８５号、同第８，７６２，０６６号、同第８，７６８，８７１号、同第９，５９３，３２６号、およびすべての関連する米国特許、ならびにＰＣＴおよび米国以外の対応特許；Ling  et  al.,  Anal.  Biochem.,  254(2):157-78  [1997]；Dale  et  al.,  Meth.  Mol.  Biol.,  57:369-74  [1996]；Smith,  Ann.  Rev.  Genet.,  19:423-462  [1985]；Botstein  et  al.,  Science,  229:1193-1201  [1985]；Carter,  Biochem.  J.,  237:1-7  [1986]；Kramer  et  al.,  Cell,  38:879-887  [1984]；Wells  et  al.,  Gene,  34:315-323  [1985]；Minshull  et  al.,  Curr.  Op.  Chem.  Biol.,  3:284-290  [1999]；Christians  et  al.,  Nat.  Biotechnol.,  17:259-264  [1999]；Crameri  et  al.,  Nature,  391:288-291  [1998]；Crameri,  et  al.,  Nat.  Biotechnol.,  15:436-438  [1997]；Zhang  et  al.,  Proc.  Nat.  Acad.  Sci.  U.S.A.,  94:4504-4509  [1997]；Crameri  et  al.,  Nat.  Biotechnol.,  14:315-319  [1996]；Stemmer,  Nature,  370:389-391  [1994]；Stemmer,  Proc.  Nat.  Acad.  Sci.  USA,  91:10747-10751  [1994]；国際公開第９５／２２６２５号；国際公開第９７／００７８号；国際公開第９７／３５９６６号；国際公開第９８／２７２３０号；国際公開第００／４２６５１号；国際公開第０１／７５７６７号；および国際公開第���００９／１５２３３６号を参照のこと、これらのすべては参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０１１０】
一部の実施形態では、変異誘発処理後に得られた酵素クローンは、酵素調製物を規定の温度（または他のアッセイ条件）に付すこと、および熱処理または他の適切なアッセイ条件後に残った酵素活性の量を測定することによってスクリーニングされる。次いで、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するクローンを、遺伝子から単離し、配列決定して、ヌクレオチド配列の変化（もしあれば）を同定し、宿主細胞において酵素を発現させるために使用する。発現ライブラリーから酵素活性を測定することは、当技術分野において公知の任意の適切な方法（例えば、ＨＰＬＣ分析などの標準的な生化学技法）を使用して行うことができる。
【０１１１】
バリアントが産生した後、それらは、任意の所望の性質（例えば、高いもしくは増加した活性、または低いもしくは低減された活性、増加した熱活性、増加した熱安定性、および／または酸性ｐＨ安定性など）についてスクリーニングすることができる。一部の実施形態では、「組換えプリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチド」（本明細書において「操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチド」、「バリアントプリンヌクレオシドホスホリラーゼ酵素」、「プリンヌクレオシドホスホリラーゼバリアント」および「プリンヌクレオシドホスホリラーゼコンビナトリアルバリアント」とも称する）が使用される。一部の実施形態では、「組換えプリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチド」（「操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチド」、「バリアントプリンヌクレオシドホスホリラーゼ酵素」、「プリンヌクレオシドホスホリラーゼバリアント」および「プリンヌクレオシドホスホリラーゼコンビナトリアルバリアント」とも称する）が使用される。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、「ベクター」は、ＤＮＡ配列を細胞に導入するためのＤＮＡ構築物である。一部の実施形態では、ベクターは、適切な宿主において、ＤＮＡ配列におけるコードされるポリペプチドの発現をもたらす能力を有する適切な制御配列に作動可能に連結された発現ベクターである。一部の実施形態では、「発現ベクター」は、宿主細胞において発現を駆動するためにＤＮＡ配列（例えば、導入遺伝子）に作動可能に連結されたプロモーター配列を有し、一部の実施形態では、転写ターミネーター配列も含む。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、限定されるものではないが、転写、転写後修飾、翻訳および翻訳後修飾を含む、ポリペプチドの産生に関与する任意のステップを含む。一部の実施形態では、この用語は、細胞からのポリペプチドの分泌も包含する。
【０１１４】
本明細書で使用される場合、「産生する」という用語は、細胞によるタンパク質および／または他の化合物の産生を指す。この用語は、限定されるものではないが、転写、転写後修飾、翻訳および翻訳後修飾を含む、ポリペプチドの産生に関与する任意のステップを包含することが意図される。一部の実施形態では、この用語は、細胞からのポリペプチドの分泌も包含する。
【０１１５】
本明細書で使用される場合、アミノ酸またはヌクレオチド配列（例えば、プロモーター配列、シグナルペプチド、ターミネーター配列など）は、２つの配列が天然で会合していない場合、それが作動可能に連結している別の配列に対して「異種」である。例えば、「異種ポリヌクレオチド」は、実験技法によって宿主細胞に導入される任意のポリヌクレオチドであり、宿主細胞から取り出され、実験操作に付され、次いで、宿主細胞に再導入されるポリヌクレオチドを含む。
【０１１６】
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」および「宿主株」という用語は、本明細書に提供されるＤＮＡ（例えば、プリンヌクレオシドホスホリラーゼバリアントをコードするポリヌクレオチド）を含む発現ベクターのための適切な宿主を指す。一部の実施形態では、宿主細胞は、当技術分野において公知である組換えＤＮＡ技法を使用して構築されたベクターで形質転換されたか、もしくはトランスフェクトされた、原核細胞または真核細胞である。
【０１１７】
「アナログ」という用語は、参照ポリペプチドに対して７０％より高い配列同一性であるが、１００％未満の配列同一性（例えば、７５％、７８％、８０％、８３％、８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％より高い配列同一性）を有するポリペプチドを意味する。一部の実施形態では、アナログは、限定されるものではないが、ホモアルギニン、オルニチンおよびノルバリンを含む、１つまたは複数の天然に存在しないアミノ酸残基、ならびに天然に存在するアミノ酸を含有するポリペプチドを意味する。一部の実施形態では、アナログは、１つまたは複数のＤ−アミノ酸残基、および２つまたはそれより多くのアミノ酸残基の間に非ペプチド結合も含む。
【０１１８】
「有効量」という用語は、所望の結果をもたらすために十分な量を意味する。当業者は、慣例の実験を使用することによって、有効量を決定し得る。
【０１１９】
「単離された」および「精製された」という用語は、それが天然に会合する少なくとも１つの他の成分から除去された分子（例えば、単離された核酸、ポリペプチドなど）または他の成分を指すために使用される。「精製された」という用語は、絶対純度は必要とせず、むしろこれは相対的な定義として意図される。
【０１２０】
本明細書で使用される場合、「立体選択性」は、別の立体異性体に対して１つの立体異性体の化学反応または酵素反応における優先的な形成を指す。立体選択性は、１つの立体異性体の形成が他の立体異性体より好ましい場合、部分的であり得るか、または唯一の立体異性体が形成される場合、完全であり得る。立体異性体がエナンチオマーである場合、立体選択性は、エナンチオ選択性と称され、両方の和における一方のエナンチオマーの画分（典型的には、パーセンテージとして報告される）である。あるいは、これは、通常、式［主たるエナンチオマー−少量のエナンチオマー］／［主たるエナンチオマー＋少量のエナンチオマー］に従って、それらから計算されたエナンチオマー過剰率（［ｅ．ｅ．］）として（典型的にパーセンテージとして）、当技術分野において報告される。立体異性体がジアステレオ異性体である場合、立体選択性は、ジアステレオ選択性と称され、２つのジアステレオマーの混合物における一方のジアステレオマーの画分（典型的には、パーセンテージとして報告される）であり、あるいは、通常、ジアステレオマー過剰率（「ｄ．ｅ．」）として報告される。エナンチオマー過剰率およびジアステレオマー過剰率は、立体異性体過剰率（stereomeric  excess）の種類である。
【０１２１】
本明細書で使用される場合、「位置選択性」および「位置選択的反応」は、結合の形成または切断の１つの方向が、すべての他の可能な方向に対して優先的に起こる反応を指す。反応は、判別が完全である場合、完全に（１００％）位置選択的であり得、１つの部位の反応の生成物が他の部位での反応の生成物に対して優勢である場合、実質的に位置選択的（少なくとも７５％）、または部分的に位置選択的（ｘ％、ここで、パーセンテージは、目的の反応に依存して設定される）であり得る。
【０１２２】
本明細書で使用される場合、「化学選択性」は、別の生成物に対して１つの生成物の化学反応または酵素反応における優先的な形成を指す。
【０１２３】
本明細書で使用される場合、「ｐＨ安定な」とは、高いまたは低いｐＨ（例えば、４．５〜６、または８〜１２）に一定期間（例えば、０．５〜２４時間）曝露後に、未処理の酵素と比較して、類似の活性（例えば、６０％〜８０％より高い）を維持するプリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチドを指す。
【０１２４】
本明細書で使用される場合、「熱安定な」とは、上昇した温度（例えば、４０〜８０℃）に一定期間（例えば、０．５〜２４時間）曝露後に、同じ上昇した温度に曝露された野生型酵素と比較して、類似の活性（例えば、６０％〜８０％より高い）を維持するプリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチドを指す。
【０１２５】
本明細書で使用される場合、「溶媒安定な」とは、様々な濃度（例えば、５〜９９％）の溶媒（エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド［ＤＭＳＯ］、テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフラン、アセトン、トルエン、酢酸ブチル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルなど）に一定期間（例えば、０．５〜２４時間）曝露後に、同じ溶媒の同じ濃度に曝露した野生型酵素と比較して、類似の活性（例えば、６０％〜８０％より高い）を維持するプリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチドを指す。
【０１２６】
本明細書で使用される場合、「熱および溶媒安定な」とは、熱安定および溶媒安定の両方であるプリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチドを指す。
【０１２７】
本明細書で使用される場合、「必要に応じた」および「必要に応じて」は、続いて記載される事象もしくは状況が起こってもよく、または起こらなくてもよいこと、ならびに記載が、事象または状況が起こる例、および起こらない例を含むことを意味する。当業者は、１つまたは複数の必要に応じた置換基を含有すると記載された任意の分子に関して、立体的に実用的および／または合成的に実現可能な化合物のみが含まれることを意味すると理解するはずである。
【０１２８】
本明細書で使用される場合、「必要に応じて置換された」とは、１つの用語または一連の化学基におけるすべての後続の修飾物質を指す。例えば、「必要に応じて置換されたアリールアルキル」という用語において、分子の「アルキル」部分および「アリール」部分が、置換されていてもよく、または置換されていなくてもよく、一連の「必要に応じて置換されたアルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリール」について、アルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリール基は、他とは独立して、置換されていてもよく、または置換されていなくてもよい。
【０１２９】
本発明の詳細な説明
本発明は、操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）酵素、ＰＮＰ活性を有するポリペプチド、およびこれらの酵素をコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含むベクターおよび宿主細胞を提供する。ＰＮＰ酵素を産生させるための方法も提供する。本発明は、ＰＮＰ酵素を含む組成物、および操作されたＰＮＰ酵素を使用する方法をさらに提供する。本発明は、医薬化合物の生成において特に使用される。
【０１３０】
一部の実施形態では、本発明は、ＭＫ−８５９１（Ｍｅｒｃｋ）などのヌクレオシドアナログの生成のための適切な酵素を提供する。本発明は、これらのヌクレオシドアナログを生成する酵素の潜在的な使用に対処するために、開発された。しかしながら、このアプローチによる１つの課題は、野生型酵素が、すべての必要な中間体の生成のために必要な、必要な基質アナログに最適ではない可能性があることを確認した。加えて、合成経路中のそれぞれの酵素は、それらを代用の基質および所望のヌクレオシドアナログの合成において使用されるプロセスに適合させるためのいくつかの操作を必要とする。
【０１３１】
一部の実施形態では、本発明は、化合物の生成において有用である酵素を提供し、これは、化合物（１）に示される非天然ヌクレオシドアナログのｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素合成のための方法を最終的にもたらす。
【化１】
2021530979.tif 000002
【０１３２】
非天然ヌクレオシドは、がんおよびウイルス感染症の処置のための薬物を含む薬物の多くの重要なクラスのための必須の基本要素である。販売中または臨床試験中の少なくとも１２のヌクレオシドアナログ薬がある（Jordheim  et  al.,  Nat.  Rev.  Drug  Discovery  12:447-464  [2013]）。化合物（１）を作製する１つの方法は、スキームＩに示されるように、エチニルリボース−１−リン酸、化合物（３）およびフルオロアデニン、化合物（２）のカップリングを触媒するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）による。
【化２】
2021530979.tif 000003
【０１３３】
化合物（３）などのデオキシリボース−１−リン酸化合物は、作製することが困難であり得る。しかしながら、対応するデオキシリボース−５−リン酸化合物は、酵素である２−デオキシリボース（deoxyrbose）−５−リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ）によって触媒される、アセトアルデヒドおよびＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸（またはそのアナログ）のカップリングを介して作製することができる（Barbas  et  al.,  J.  Am.  Chem.  Soc.  112:2013-2014  [1990]）。デオキシリボース−１−リン酸アナログが形成されると、スキームＩＩに示されるように、これを、酵素であるホスホペントムターゼ（ＰＰＭ）の作用によって、スキームＩのために必要な対応するデオキシリボース−５−リン酸アナログに変換または異性化させることができる。
【化３】
2021530979.tif 000004
【０１３４】
スキームＩに示されるＰＮＰおよびＰＰＭの反応の平衡位置は、典型的には、反応物（化合物２および４）が好ましく、生成物（化合物１および無機ホスフェート）ではない。より高い変換に反応を推進する１つの方法は、カップリングステップにおいて形成される無機ホスフェートを除去することである。これは、酵素であるスクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）によって触媒される、無機ホスフェートをスクロースなどの二糖と反応させることによって、達成することができる（例えば、米国特許第７，２２９，７９７号を参照のこと）。グルコース−１−リン酸およびフルクトースを生成するこの反応は、非常に好ましく、スキームＩＩＩに示されるように、反応全体を推進することができる。
【化４】
2021530979.tif 000005
【０１３５】
プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）酵素は、中でも、Ｅ．ｃｏｌｉ（Xie,  Xixian  et  al.,  Biotechnol  Lett  33:  1107-1112  [2011]、Lee  et  al.,  Protein  Expr.  Purif.  22:180-188  [2001]）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＸＭ２１０７（Xie,  Xixian  et  al.,  Biotechnol  Lett  33:  1107-1112  [2011]）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ  Ａｌｋ３６（Visser  et  al.,  Extremophiles  14:185-192  [2010]）、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（Schnick  et  al.,  Acta  Cryst.  D  61:1245-1254  [2005]）、およびヒト（Silva  et  al.,  Protein  Expr.  Purif.  27:158-164  [2003]）を含む多くの起源から、単離および／または組換え的に発現されている。Ｅ．ｃｏｌｉ（Mao  et  al.,  Structure  5:1373-1383  [1997]）およびヒト（Canduri  et  al.,  Biochem.  Biophys.  Res.  Commun.  26:335-338  [2005]）由来などのいくつかのＰＮＰの結晶構造も利用可能である。これらの酵素は、（２−デオキシ）プリンヌクレオシドの遊離塩基および（２’−デオキシ）リボース−１−リン酸への可逆的加リン酸分解を触媒する。６−オキソプリン（oxopruine）ヌクレオシドに特異的である三量体型は、より高次の生物および原核生物において見出されるが、６−オキソおよび６−アミノプリンヌクレオシドの両方に対して活性である六量体型は、より低次の生物においてのみ見出される（Bennett  et  al.,  J  Biol  Chem  278:47110-47118  [2003]）。野生型ＰＮＰ酵素の活性は、非天然ヌクレオシドに対して実証されているが（Schnick  et  al.,  Acta  Cryst.  D  61:1245-1254  [2005]、Visser  et  al.,  Extremophiles  14:185-192  [2010]、Birmingham  et  al.,  Nat.  Chem.  Biol.  10:392-399  [2014]）、典型的には、化合物（１）などの多くの非天然ヌクレオシドの商業的な量の生成のために十分に高くない。
【０１３６】
非天然ヌクレオシドおよび治療的に有用なヌクレオシドを作製するための非天然基質に対するＰＮＰの不十分な活性に起因して、改善された活性を有し、典型的な工業条件下で操作することができる操作されたＰＮＰについての必要性がある。本発明は、この必要性に対処し、工業条件下でのこれらの反応における使用のために適切な操作されたＰＮＰを提供する。
【０１３７】
操作されたＰＮＰポリペプチド
本発明は、操作されたＰＮＰポリペプチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチドを調製する方法、およびポリペプチドを使用するための方法を提供する。記載がポリペプチドに関する場合、これがポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも記載することが理解されるべきである。一部の実施形態では、本発明は、野生型ＰＮＰ酵素と比較して、改善された性質を有する、操作された天然に存在しないＰＮＰ酵素を提供する。任意の適切な反応条件が本発明において使用される。一部の実施形態では、方法を使用して、異性化反応を行うための操作されたポリペプチドの改善された特性を分析する。一部の実施形態では、反応条件は、下記および実施例においてさらに記載するように、操作されたＰＮＰの濃度もしくは量、基質（複数可）、緩衝液（複数可）、溶媒（複数可）、ｐＨ、温度および反応時間を含む条件、ならびに／または操作されたＰＮＰポリペプチドが固相支持体に固定される条件に関連して、修正される。
【０１３８】
一部の実施形態では、追加の反応成分または追加の技法を利用して、反応条件を補完する。一部の実施形態では、これらは、酵素を安定化するか、または酵素の不活化を防止する、生成物の阻害を低減する、反応の平衡を所望の生成物の形成にシフトさせるための手段を取ることを含む。
【０１３９】
一部のさらなる実施形態では、基質化合物の生成物化合物への変換のための上記に記載のプロセスのいずれかは、生成化合物（複数可）の抽出、単離、精製、結晶化、濾過および／もしくは凍結乾燥から選択される１つまたは複数のステップをさらに含むことができる。本明細書に提供されるプロセスによって生成した生体触媒反応混合物から生成物（複数可）を抽出、単離、精製および／または結晶化するための方法、技法、ならびにプロトコールは、当業者に公知であるか、および／または慣例の実験を通して利用可能である。加えて、例示的な方法を下記の実施例において提供する。
【０１４０】
操作されたポリペプチドをコードする操作されたＰＮＰポリヌクレオチド、発現ベクターおよび宿主細胞
本発明は、本明細書に記載の操作された酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドを、遺伝子発現を制御する１つまたは複数の異種調節配列に作動可能に連結させて、ポリペプチドを発現する能力を有する組換えポリヌクレオチドを作出する。一部の実施形態では、操作された酵素ポリペプチド（複数可）をコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含有する発現構築物を、適切な宿主細胞に導入して、対応する酵素ポリペプチド（複数可）を発現させる。
【０１４１】
当業者に明らかであるように、タンパク質配列の利用可能性、およびさまざまなアミノ酸に対応するコドンの知識は、対象のポリペプチドをコードする能力を有するすべてのポリヌクレオチドの説明を提供する。同じアミノ酸が代替または同義のコドンによってコードされる遺伝コードの縮重は、そのすべてが操作された酵素（例えば、ＰＮＰ）ポリペプチドをコードする極めて多数の核酸を作製することを可能にする。したがって、本発明は、可能性があるコドンの選択に基づいて組合せを選択することによって、本明細書に記載の酵素ポリペプチドをコードする、作製され得る酵素ポリヌクレオチドのそれぞれおよびすべての可能性のあるバリエーションの生成のための方法ならびに組成物を提供し、そのようなすべてのバリエーションは、実施例（例えば、さまざまな表中）に示されるアミノ酸配列を含む、本明細書に記載の任意のポリペプチドについて具体的に開示されると見なされるべきである。
【０１４２】
一部の実施形態では、コドンは、好ましくは、タンパク質産生のための選択された宿主細胞による利用のために最適化される。例えば、細菌において使用される好ましいコドンは、典型的には、細菌中での発現のために使用される。その結果、操作された酵素ポリペプチドをコードするコドン最適化されたポリヌクレオチドは、全長コード領域において約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９０％よりも多くのコドン位置に好ましいコドンを含有する。
【０１４３】
一部の実施形態では、酵素ポリヌクレオチドは、本明細書に開示される性質を有する酵素活性を有する操作されたポリペプチドをコードし、ここで、ポリペプチドは、本明細書に提供される配列番号から選択される参照配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、または任意のバリアント（例えば、実施例に提供されるバリアント）のアミノ酸配列、および参照ポリヌクレオチド（複数可）もしくは実施例に開示される任意のバリアントのアミノ酸配列と比較して、１つもしくは複数の残基の相違（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれよりも多くのアミノ酸残基の位置）を含む。一部の実施形態では、参照ポリペプチド配列は、配列番号２、６、１２６、２４２および６８４から選択される。
【０１４４】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に提供される任意のポリヌクレオチド配列から選択される参照ポリヌクレオチド配列、もしくはその相補体、または本明細書に提供されるバリアント酵素ポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド配列と、高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする能力を有する。一部の実施形態では、高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする能力を有するポリヌクレオチドは、参照配列と比較して、１つまたは複数の残基の相違を有するアミノ酸配列を含む酵素ポリペプチドをコードする。
【０１４５】
一部の実施形態では、本明細書における操作された酵素ポリペプチドのいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドは、酵素ポリペプチドの発現を容易にするために種々の方法で処置される。一部の実施形態では、酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、１つまたは複数の制御配列が酵素ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を調節するために存在する発現ベクターを含む。単離されたポリヌクレオチドのベクターへの挿入前の処置は、利用される発現ベクターに応じて、望ましい場合もあり、必要な場合もある。組換えＤＮＡ法を利用するポリヌクレオチドおよび核酸配列を改変するための技法は、当技術分野において周知である。一部の実施形態では、制御配列としては、中でも、プロモーター、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターが挙げられる。一部の実施形態では、適切なプロモーターは、宿主細胞の選択に基づいて選択される。細菌宿主細胞のためには、本開示の核酸構築物の転写を指示するために適切なプロモーターとしては、限定されるものではないが、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃオペロン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓマルトース生成アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓアルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、および原核生物のベータ−ラクタマーゼ遺伝子（例えば、Villa-Kamaroff  et  al.,  Proc.  Natl  Acad.  Sci.  USA  75:  3727-3731  [1978]を参照のこと）、ならびにｔａｃプロモーター（例えば、DeBoer  et  al.,  Proc.  Natl  Acad.  Sci.  USA  80:  21-25  [1983]を参照のこと）から得られるプロモーターが挙げられる。糸状菌宿主細胞のための例示的なプロモーターとしては、限定されるものではないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  タカアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性アルファ−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ酸安定アルファ−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ（例えば、国際公開第９６／００７８７号を参照のこと）の遺伝子から得られるプロモーター、ならびにＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性アルファ−アミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子由来のプロモーターのハイブリッド）、ならびにそれらの変異体、短縮型、およびハイブリッドプロモーターが挙げられる。例示的な酵母細胞プロモーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３−ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子に由来し得る（can  be  from  the  genes  can  be  from  the  genes）。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは、当技術分野において公知である（例えば、Romanos  et  al.,  Yeast  8:423-488  [1992]を参照のこと）。
【０１４６】
一部の実施形態では、制御配列は、適切な転写ターミネーター配列（すなわち、転写を終結するために宿主細胞によって認識される配列）でもある。一部の実施形態では、ターミネーター配列は、酵素ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結される。選択される宿主細胞において機能する任意の適切なターミネーターが、本発明において使用される。糸状菌宿主細胞のための例示的な転写ターミネーターは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  タカアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒアルファ−グルコシダーゼおよびＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞のための例示的なターミネーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅチトクロムＣ（ＣＹＣ１）およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネーターは、当技術分野において公知である（例えば、Romanos  et  al.、上記を参照のこと）。
【０１４７】
一部の実施形態では、制御配列は、適切なリーダー配列（すなわち、宿主細胞による翻訳のために重要であるｍＲＮＡの非翻訳領域）でもある。一部の実施形態では、リーダー配列は、酵素ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動可能に連結される。選択される宿主細胞において機能する任意の適切なリーダー配列が、本発明において使用される。糸状菌宿主細胞のための例示的なリーダーは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  タカアミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための適切なリーダーは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ−因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られる。
【０１４８】
一部の実施形態では、制御配列は、ポリアデニル化配列（すなわち、核酸配列の３’末端に作動可能に連結され、転写されると、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するシグナルとして宿主細胞によって認識される配列）でもある。選択される宿主細胞において機能する任意の適切なポリアデニル化配列が、本発明において使用される。糸状菌宿主細胞のための例示的なポリアデニル化配列としては、限定されるものではないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  タカアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒアルファ−グルコシダーゼの遺伝子が挙げられる。酵母宿主細胞のために有用なポリアデニル化配列は公知である（例えば、Guo  and  Sherman,  Mol.  Cell.  Bio.,  15:5983-5990  [1995]を参照のこと）。
【０１４９】
一部の実施形態では、制御配列は、シグナルペプチド（すなわち、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードし、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に方向付けるコード領域）でもある。一部の実施形態では、核酸配列のコード配列の５’末端は、本質的に、翻訳リーディングフレームにおいて、分泌されたポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと天然に連結されたシグナルペプチドコード領域を含有する。あるいは、一部の実施形態では、コード配列の５’末端は、コード配列に対して外来であるシグナルペプチドコード領域を含有する。発現されたポリペプチドを選択される宿主細胞の分泌経路に方向付ける任意の適切なシグナルペプチドコード領域が、操作されたポリペプチド（複数可）の発現のために使用される。細菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域は、限定されるものではないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ＮＣｌＢ  １１８３７マルトース生成アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓアルファ−アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓサブチリシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓベータ−ラクタマーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｐｒｓＡの遺伝子から得られる領域を含む、シグナルペプチドコード領域である。さらなるシグナルペプチドは、当技術分野において公知である（例えば、Simonen  and  Palva,  Microbiol.  Rev.,  57:109-137  [1993]を参照のこと）。一部の実施形態では、糸状菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域としては、限定されるものではないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  タカアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓセルラーゼおよびＨｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域が挙げられる。酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドとしては、限定されるものではないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ−因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼの遺伝子由来のシグナルペプチドが挙げられる。
【０１５０】
一部の実施形態では、制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域でもある。得られたポリペプチドは、「プロ酵素」、「プロポリペプチド」または「酵素原」と称される。プロポリペプチドは、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的または自己触媒的切断によって、成熟活性ポリペプチドに変換することができる。プロペプチドコード領域としては、限定されるものではないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ−因子、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテアーゼおよびＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａラクターゼ（例えば、国際公開第９５／３３８３６号を参照のこと）の遺伝子を含む、任意の適切な供給源から得られ得る。シグナルペプチドおよびプロペプチド領域の両方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端の隣に位置し、シグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のアミノ末端の隣に位置する。
【０１５１】
一部の実施形態では、調節配列も利用される。これらの配列は、宿主細胞の成長に関連して、ポリペプチドの発現の調節を容易にする。調節系の例は、調節化合物の存在を含む、化学的もしくは物理的刺激に応答してオンまたはオフされる遺伝子の発現を引き起こす系である。原核宿主細胞では、適切な調節配列としては、限定されるものではないが、ｌａｃ、ｔａｃおよびｔｒｐオペレーター系が挙げられる。酵母宿主細胞では、適切な調節系としては、限定されるものではないが、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系が挙げられる。糸状菌では、適切な調節配列としては、限定されるものではないが、タカアルファ−アミラーゼプロモーター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼプロモーターおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅグルコアミラーゼプロモーターが挙げられる。
【０１５２】
別の態様では、本発明は、操作された酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにそれらが導入される宿主の種類に応じて、プロモーターおよびターミネーター、複製開始点などのような１つまたは複数の発現調節領域を含む、組換え発現ベクターを対象とする。一部の実施形態では、本明細書に記載のさまざまな核酸および制御配列を一緒に結合して、そのような部位で酵素ポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換を可能にするために１つまたは複数の好都合な制限部位を含む組換え発現ベクターを生成する。あるいは、一部の実施形態では、本発明の核酸配列は、核酸配列またはその配列を含む核酸構築物を、発現のための適切なベクターに挿入することによって発現される。発現ベクターの作出を含む一部の実施形態では、コード配列は、コード配列が発現のための適切な制御配列に作動可能に連結されるように、ベクターに配置される。
【０１５３】
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に好都合に付され、酵素ポリヌクレオチド配列の発現をもたらすことができる、任意の適切なベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターと、ベクターが導入される宿主細胞との適合性に依存する。ベクターは、線形または閉環状のプラスミドであってもよい。
【０１５４】
一部の実施形態では、発現ベクターは、自己複製ベクター（すなわち、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体または人工染色体などの、その複製が染色体の複製とは無関係である染色体外実体として存在するベクター）である。ベクターは、自己複製を確実にするための任意の手段を含有していてもよい。一部の代替の実施形態では、ベクターは、宿主細胞に導入されると、ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体（複数可）と一緒に複製されるベクターである。さらにまた、一部の実施形態では、宿主細胞のゲノムに導入される総ＤＮＡを一緒に含有する、単一のベクターもしくはプラスミド、または２つもしくはそれよりも多くのベクターもしくはプラスミド、および／あるいはトランスポゾンが利用される。
【０１５５】
一部の実施形態では、発現ベクターは、形質転換細胞の容易な選択を可能にする１つまたは複数の選択マーカーを含有する。「選択マーカー」は、その生成物が、殺生物剤もしくはウイルスに対する耐性、重金属に対する耐性、栄養要求株に対する原栄養性などを提供する遺伝子である。細菌の選択マーカーの例としては、限定されるものではないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のｄａｌ遺伝子、またはアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールもしくはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を付与するマーカーが挙げられる。酵母宿主細胞のための適切なマーカーとしては、限定されるものではないが、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１およびＵＲＡ３が挙げられる。糸状菌宿主細胞における使用のための選択マーカーとしては、限定されるものではないが、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ；例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡ．ｏｒｚｙａｅ由来）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ；例えば、Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ由来）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ；例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡ．ｏｒｚｙａｅ由来）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびにそれらの同等物が挙げられる。
【０１５６】
別の態様では、本発明は、本発明の少なくとも１つの操作された酵素ポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供し、ポリヌクレオチド（複数可）が宿主細胞において操作された酵素（複数可）（engineered  enzyme  enzyme(s)）の発現のための１つまたは複数の制御配列に作動可能に連結されている。本発明の発現ベクターによってコードされるポリペプチドの発現における使用のために適切な宿主細胞は、当技術分野において周知であり、限定されるものではないが、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｌｕｖｉａｌｉｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞などの細菌細胞；酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣアクセッション番号２０１１７８））などの真菌細胞；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、２９３およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞などの動物細胞；ならびに植物細胞が挙げられる。例示的な宿主細胞としては、さまざまなＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株（例えば、Ｗ３１１０（ΔｆｈｕＡ）およびＢＬ２１）も挙げられる。細菌の選択マーカーの例としては、限定されるものではないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のｄａｌ遺伝子、またはアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールおよびもしくはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を付与するマーカーが挙げられる。
【０１５７】
一部の実施形態では、本発明の発現ベクターは、ベクターの宿主細胞のゲノムへの組込み、またはゲノムとは無関係の細胞におけるベクターの自己複製を可能にするエレメント（複数可）を含有する。宿主細胞ゲノムへの統合を含む一部の実施形態では、ベクターは、ポリペプチドをコードする核酸配列、または相同もしくは非相同組換えによるベクターのゲノムへの組込みのためのベクターの任意の他のエレメントに依拠する。
【０１５８】
一部の代替の実施形態では、発現ベクターは、宿主細胞のゲノムへの相同組換えによる組込みを指示するための追加の核酸配列を含有する。追加の核酸配列は、ベクターが、染色体（複数可）の正確な場所（複数可）で宿主細胞のゲノムに組み込まれることを可能にする。正確な場所での組込みの可能性を増加させるために、組込みエレメントは、好ましくは、相同組換えの確率を増強するために対応する標的配列と高度に相同である、１００〜１０，０００塩基対、好ましくは、４００〜１０，０００塩基対、最も好ましくは、８００〜１０，０００塩基対などの十分な数のヌクレオチドを含有する。組込みエレメントは、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同である任意の配列であり得る。さらにまた、組込みエレメントは、非コード核酸配列またはコード核酸配列であり得る。他方では、ベクターは、非相同組換えによって宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよい。
【０１５９】
自己複製のために、ベクターは、ベクターが問題の宿主細胞において自己複製することを可能にする複製開始点をさらに含んでいてもよい。細菌の複製開始点の例は、Ｐ１５Ａ  ｏｒｉもしくはプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣｌ７７（このプラスミドはＰ１５Ａ  ｏｒｉを有する）の複製開始点、またはＥ．ｃｏｌｉにおける複製を可能にするｐＡＣＹＣ１８４、およびＢａｃｉｌｌｕｓにおける複製を可能にするｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４もしくはｐＴＡ１０６０である。酵母宿主細胞における使用のための複製開始点の例は、２ミクロンの複製開始点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１およびＣＥＮ３の組合せ、ならびにＡＲＳ４およびＣＥＮ６の組合せである。複製開始点は、宿主細胞において温度感受性で機能するようになる変異を有するものであってもよい（例えば、Ehrlich,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  75:1433  [1978]を参照のこと）。
【０１６０】
一部の実施形態では、本発明の核酸配列の２つ以上のコピーは、遺伝子産物の産生を増加させるために、宿主細胞に挿入される。選択マーカー遺伝子の増幅されたコピー、およびそれにより、核酸配列の追加のコピーを含有する細胞を、細胞を適切な選択剤の存在下で培養することによって選択することができる場合、核酸配列のコピー数の増加は、配列の少なくとも１つの追加のコピーを宿主細胞のゲノム中に組み込むことによって、または、増幅可能な選択マーカー遺伝子を核酸配列と共に含めることによって得ることができる。
【０１６１】
本発明における使用のための多くの発現ベクターが市販されている。適切な市販の発現ベクターとしては、限定されるものではないが、ｐ３ｘＦＬＡＧＴＭ（商標）発現ベクター（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）が挙げられ、これは、ＣＭＶプロモーター、および哺乳動物宿主細胞における発現のためのｈＧＨポリアデニル化部位、およびｐＢＲ３２２複製開始点、およびＥ．ｃｏｌｉにおける増幅のためのアンピシリン耐性マーカーを含む。他の適切な発現ベクターとしては、限定されるものではないが、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）およびｐＢＫ−ＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ならびにｐＢＲ３２２（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ｐＵＣ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＰｏｌｙ（例えば、Lathe  et  al.,  Gene  57:193-201  [1987]を参照のこと）に由来するプラスミドが挙げられる。
【０１６２】
したがって、一部の実施形態では、少なくとも１つのバリアントプリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードする配列を含むベクターは、ベクターの増殖およびバリアントプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（複数可）の発現を可能にするために、宿主細胞に形質転換される。一部の実施形態では、バリアントプリンヌクレオシドホスホリラーゼを翻訳後修飾して、シグナルペプチドを除去し、一部の場合では、分泌後に切断してもよい。一部の実施形態では、上記に記載の形質転換された宿主細胞は、バリアントプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（複数可）の発現を可能にする条件下で、適切な栄養培地中で培養される。限定されるものではないが、適切な補充物を含有する最小培地または複合培地を含む、宿主細胞を培養するために有用な任意の適切な培地が本発明において使用される。一部の実施形態では、宿主細胞は、ＨＴＰ培地中で成長させる。適切な培地は、さまざまな商業的供給業者から入手可能であるか、または公開されたレシピ（例えば、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関のカタログ中）に従って調製されてもよい。
【０１６３】
別の態様では、本発明は、本明細書に提供される改善されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供し、ポリヌクレオチドは、宿主細胞においてプリンヌクレオシドホスホリラーゼ酵素の発現のための１つまたは複数の制御配列に作動可能に連結されている。本発明の発現ベクターによってコードされるプリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチドの発現における使用のための宿主細胞は、当技術分野において周知であり、限定されるものではないが、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞などの細菌細胞；酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣアクセッション番号２０１１７８））などの真菌細胞；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、２９３およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞などの動物細胞；ならびに植物細胞が挙げられる。上記に記載の宿主細胞のための適切な培養培地および成長条件は、当技術分野において周知である。
【０１６４】
プリンヌクレオシドホスホリラーゼの発現のためのポリヌクレオチドは、当技術分野において公知のさまざまな方法によって細胞に導入され得る。技法としては、中でも、電気穿孔、微粒子銃、リポソーム媒介トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクションおよびプロトプラスト融合が挙げられる。ポリヌクレオチドを細胞に導入するためのさまざまな方法は、当業者に公知である。
【０１６５】
一部の実施形態では、宿主細胞は、真核細胞である。適切な真核生物宿主細胞としては、限定されるものではないが、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞および植物細胞が挙げられる。適切な真菌宿主細胞としては、限定されるものではないが、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ、Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ、Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔａ、Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ、Ｆｕｎｇｉ  ｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉが挙げられる。一部の実施形態では、真菌宿主細胞は、酵母細胞および糸状菌細胞である。本発明の糸状菌宿主細胞は、Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ亜門およびＯｏｍｙｃｏｔａ亜門のすべての糸状形態を含む。糸状菌は、キチン、セルロースおよび他の複合多糖で構成される細胞壁を有する栄養菌糸によって特徴付けられる。本発明の糸状菌宿主細胞は、酵母とは形態学的に区別される。
【０１６６】
本発明の一部の実施形態では、糸状菌宿主細胞は、限定されるものではないが、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍｅｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍおよび／もしくはＶｏｌｖａｒｉｅｌｌａ、ならびに／またはそれらの完全世代もしくは無性世代、ならびに異名、バシオニムもしくは分類学的等価物を含む、任意の適切な属および種のものである。
【０１６７】
本発明の一部の実施形態では、宿主細胞は、限定されるものではないが、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、ＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓまたはＹａｒｒｏｗｉａ種の細胞を含む、酵母細胞である。本発明の一部の実施形態では、酵母細胞は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｄａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｑｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓまたはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａである。
【０１６８】
本発明の一部の実施形態では、宿主細胞は、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）およびＰｈｏｒｍｉｄｉｕｍ（Ｐ．ｓｐ．ＡＴＣＣ２９４０９）などの藻類細胞である。
【０１６９】
一部の他の実施形態では、宿主細胞は、原核細胞である。適切な原核細胞としては、限定されるものではないが、グラム陽性、グラム陰性およびグラム不定性の細菌細胞が挙げられる。限定されるものではないが、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｂｕｃｈｎｅｒａ、Ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ｃａｍｐｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ、Ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｘｙｌｅｌｌａ、ＹｅｒｓｉｎｉａおよびＺｙｍｏｍｏｎａｓを含む、任意の適切な細菌生物が本発明において使用される。一部の実施形態では、宿主細胞は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｃｈｎｅｒａ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓまたはＺｙｍｏｍｏｎａｓの種である。一部の実施形態では、細菌宿主株は、ヒトに対して非病原性である。一部の実施形態では、細菌宿主株は、工業用株である。多数の細菌工業用株が公知であり、本発明において適切である。本発明の一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（例えば、Ａ．ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ、Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓおよびＡ．ｒｕｂｉ）である。本発明の一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ種（例えば、Ａ．ａｕｒｅｓｃｅｎｓ、Ａ．ｃｉｔｒｅｕｓ、Ａ．ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ、Ａ．ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ、Ａ．ｍｙｓｏｒｅｎｓ、Ａ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ、Ａ．ｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ、Ａ．ｐｒｏｔｏｐｈｏｎｎｉａｅ、Ａ．ｒｏｓｅｏｐａｒｑｆｆｉｎｕｓ、Ａ．ｓｕｌｆｕｒｅｕｓおよびＡ．ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）である。本発明の一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種（例えば、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｅｎｓｉｓ、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ、Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｌａｕｔｕｓ、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｂ．ｆｉｒｍｕｓ、Ｂ．ａｌｋａｏｐｈｉｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓおよびＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、限定されるものではないが、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓまたはＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓを含む、工業用Ｂａｃｉｌｌｕｓ株である。一部の実施形態では、Ｂａｃｉｌｌｕｓ宿主細胞は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよび／またはＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓである。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種（例えば、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ  Ｅ８８、Ｃ．ｌｉｔｕｓｅｂｕｒｅｎｓｅ、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓおよびＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍおよびＣ．ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｅｒｗｉｎｉａ種（例えば、Ｅ．ｕｒｅｄｏｖｏｒａ、Ｅ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、Ｅ．ａｎａｎａｓ、Ｅ．ｈｅｒｂｉｃｏｌａ、Ｅ．ｐｕｎｃｔａｔａおよびＥ．ｔｅｒｒｅｕｓ）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｐａｎｔｏｅａ種（例えば、Ｐ．ｃｉｔｒｅａおよびＰ．ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉおよびＰ．ｓｐ．Ｄ−０ｌ  １０）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種（例えば、Ｓ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｅｓ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓおよびＳ．ｕｂｅｒｉｓ）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種（例えば、Ｓ．ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ、Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓおよびＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓおよびＺ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である。
【０１７０】
本発明において使用される多くの原核生物株および真核生物株は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）、ドイツ微生物培養細胞系統保存機関（ＤＳＭ）、オランダ微生物株保存センター（ＣＢＳ）、および農業研究局特許培養株保存機関、北部地域研究センター（ＮＲＲＬ）などの多くの菌株保存機関から、公的に容易に入手可能である。
【０１７１】
一部の実施形態では、宿主細胞は、タンパク質分泌、タンパク質安定性ならびに／またはタンパク質の発現および／もしくは分泌のために望ましい他の性質を改善する特性を有するように遺伝子改変される。遺伝子改変は、遺伝子操作技法および／または古典的な微生物学的技法（例えば、化学的またはＵＶ変異誘発、およびその後の選択）によって達成することができる。実際に、一部の実施形態では、組換え改変技法および古典的な選択技法の組合せを使用して、宿主細胞を生成させる。組換え技術を使用して、核酸分子を、宿主細胞内および／または培養培地中、プリンヌクレオシドホスホリラーゼバリアント（複数可）の収量の増加をもたらす様式で、導入、欠失、阻害または改変することができる。例えば、Ａｌｐ１機能のノックアウトは、プロテアーゼが欠損した細胞をもたらし、ｐｙｒ５機能のノックアウトは、ピリミジン欠損表現型を有する細胞をもたらす。１つの遺伝子工学アプローチでは、相同組換えを使用して、コードされるタンパク質の発現を抑制するためにｉｎ  ｖｉｖｏで遺伝子を特異的に標的化することによって、標的化遺伝子改変を誘導する。代替のアプローチでは、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスおよび／またはリボザイム技術は、遺伝子発現の阻害において使用される。限定されるものではないが、タンパク質をコードする遺伝子の全部または一部の欠失、および遺伝子産物の発現または活性を破壊する部位特異的変異誘発を含む、細胞におけるタンパク質の発現を低減するための種々の方法が当技術分野において公知である（例えば、Chaveroche  et  al.,  Nucl.  Acids  Res.,  28:22  e97  [2000]；Cho  et  al.,  Molec.  Plant  Microbe  Interact.,  19:7-15  [2006]；Maruyama  and  Kitamoto,  Biotechnol  Lett.,  30:1811-1817  [2008]；Takahashi  et  al.,  Mol.  Gen.  Genom.,  272:  344-352  [2004]；およびYou  et  al.,  Arch.  Micriobiol.,191:615-622  [2009]を参照のこと、これらのすべては参照によって本明細書に組み込まれる）。ランダム変異誘発、続く所望の変異についてのスクリーニングも使用される（例えば、Combier  et  al.,  FEMS  Microbiol.  Lett.,  220:141-8  [2003]；およびFiron  et  al.,  Eukary.  Cell  2:247-55  [2003]を参照のこと、これらは両方とも参照によって組み込まれる）。
【０１７２】
宿主細胞へのベクターまたはＤＮＡ構築物の導入は、限定されるものではないが、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、ＰＥＧ媒介形質転換、電気穿孔、または当技術分野において公知の他の一般的な技法を含む、当技術分野において公知の任意の適切な方法を使用して達成することができる。一部の実施形態では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ発現ベクターｐＣＫ１００９００ｉ（米国特許第９，７１４，４３７号を参照のこと、これは、参照によって本明細書に組み込まれる）が使用される。
【０１７３】
一部の実施形態では、本発明の操作された宿主細胞（すなわち、「組換え宿主細胞」）は、プロモーターを活性化するため、形質転換体を選択するため、またはプリンヌクレオシドホスホリラーゼポリヌクレオチドを増幅するために、必要により、改変された従来の栄養培地中で培養される。温度、ｐＨなどのような培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で以前使用したものであり、当業者に周知である。述べたように、多くの標準的な参照文献およびテキストは、細菌、植物、動物（特に、哺乳動物）および古細菌が起源の細胞を含む、多くの細胞の培養および生成のために利用可能である。
【０１７４】
一部の実施形態では、本発明のバリアントプリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチドを発現する細胞は、バッチまたは連続発酵条件下で成長させる。古典的な「バッチ発酵」は、閉鎖系であり、ここで、培地の組成は、発酵の開始時に設定され、発酵の間に人為的な変更に付されない。バッチ系のバリエーションは、「フェドバッチ発酵」であり、これも本発明において使用される。このバリエーションでは、基質を、発酵が進行するにつれて段階的に増量しながら添加する。フェドバッチ系は、異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害する可能性がある場合、および培地中の基質の量を制限することが望ましい場合に有用である。バッチおよびフェドバッチ発酵は、一般的であり、当技術分野において周知である。「連続発酵」は、開放系であり、ここで、規定の発酵培地を、バイオリアクターに連続的に添加し、等量の条件培地を処理のために同時に除去する。連続発酵は、一般に、細胞が主に対数増殖期にある一定の高密度で培養を維持する。連続発酵系は、定常状態の成長条件を維持することを目指す。連続発酵プロセスのために栄養分および成長因子を調整するための方法、ならびに生成物形成の速度を最大化するための技法は、工業微生物学の技術分野において周知である。
【０１７５】
本発明の一部の実施形態では、無細胞転写／翻訳系は、バリアントプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（複数可）の産生において使用される。いくつかの系が市販されており、方法は、当業者に周知である。
【０１７６】
本発明は、バリアントプリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチドまたは生物学的に活性なその断片を作製する方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、配列番号２、６、１２６、２４２、６８４と少なくとも約７０％（または少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％）の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードし、本明細書に提供される少なくとも１つの変異を含む、ポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞を提供すること；培養培地中で形質転換された宿主細胞を、該宿主細胞がそのコードされたバリアントプリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチドを発現する条件下で、培養すること；ならびに必要に応じて、発現したバリアントプリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチドを回収もしくは単離すること、および／または、発現したバリアントプリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチドを含有する培養培地を回収もしくは単離することを含む。一部の実施形態では、方法は、必要に応じて、コードされるプリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチドが発現した後に形質転換された宿主細胞を溶解すること、ならびに必要に応じて、発現したバリアントプリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチドを細胞溶解物から回収および／または単離することをさらに提供する。本発明は、バリアントプリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチドで形質転換された宿主細胞を、バリアントプリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチドの産生のために適切な条件下で培養すること、およびバリアントプリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチドを回収することを含む、バリアントプリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチドを作製する方法をさらに提供する。典型的には、プリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチドの回収または単離は、宿主細胞の培養培地、宿主細胞、またはその両方からであり、本明細書に記載されるものを含む当技術分野において周知のタンパク質回収技法を使用する。一部の実施形態では、宿主細胞を、遠心分離によって採取し、物理的または化学的手段によって破壊し、得られた粗抽出物をさらなる精製のために保持する。タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、限定されるものではないが、凍結解凍サイクル、超音波処理、機械的破壊および／または細胞溶解剤の使用、ならびに当業者に周知の多くの他の適切な方法を含む任意の好都合な方法によって、破壊することができる。
【０１７７】
宿主細胞において発現した操作されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼ酵素は、中でも、リゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、超遠心分離およびクロマトグラフィーを含むタンパク質精製のための当術分野において公知の任意の１つまたは複数の技法を使用して、細胞および／または培養培地から回収することができる。Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌由来のタンパク質の溶解および高効率の抽出のために適切な溶液は、商品名ＣｅｌＬｙｔｉｃ  Ｂ（商標）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で市販されている。したがって、一部の実施形態では、得られたポリペプチドを、回収／単離し、必要に応じて当技術分野において公知の多くの方法のいずれかによって精製する。例えば、一部の実施形態では、ポリペプチドを、限定されるものではないが、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水性相互作用、クロマト分画およびサイズ排除）、または沈殿を含む従来の手順によって、栄養培地から単離する。一部の実施形態では、タンパク質の再フォールディングステップを、所望により、成熟タンパク質の立体配置の完成において使用する。加えて、一部の実施形態では、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製ステップにおいて用いる。例えば、一部の実施形態では、当技術分野において公知の方法を、本発明において使用する（例えば、Parry  et  al.,  Biochem.  J.,  353:117  [2001]；およびHong  et  al.,  Appl.  Microbiol.  Biotechnol.,  73:1331  [2007]を参照のこと、これらは両方とも参照によって本明細書に組み込まれる）。実際に、当技術分野において公知の任意の適切な精製方法を本発明において使用する。
【０１７８】
プリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチドの単離のためのクロマトグラフィー技法としては、限定されるものではないが、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動およびアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。特定の酵素を精製するための条件は、正味電荷、疎水性、親水性、分子量、分子形状などのような要因に部分的に依存し、当業者に公知である。
【０１７９】
一部の実施形態では、アフィニティー技法が、改善されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼ酵素の単離において使用される。アフィニティークロマトグラフィー精製のために、プリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチドに特異的に結合する任意の抗体を使用してもよい。抗体の産生のために、限定されるものではないが、ウサギ、マウス、ラットなどを含むさまざまな宿主動物を、プリンヌクレオシドホスホリラーゼによる注射によって免疫してもよい。プリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチドは、側鎖官能基、または側鎖官能基に結合させたリンカーによって、ＢＳＡなどの適切な担体に結合させてもよい。限定されるものではないが、フロイント（完全および不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムなどの無機ゲル、リゾレシチンなどの表面活性物質、プルロニック（登録商標）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍなどの潜在的に有用なヒトアジュバントを含むさまざまなアジュバントを、宿主種に応じて、免疫学的応答を増加させるために使用してもよい。
【０１８０】
一部の実施形態では、プリンヌクレオシドホスホリラーゼバリアントを調製し、酵素を発現する細胞の形態で、粗抽出物として、または単離もしくは精製された調製物として使用する。一部の実施形態では、プリンヌクレオシドホスホリラーゼバリアントは、凍結乾燥物として、粉末形態（例えば、アセトン粉末）で調製され、または酵素溶液として調製される。一部の実施形態では、プリンヌクレオシドホスホリラーゼバリアントは、実質的に純粋な調製物の形態である。
【０１８１】
一部の実施形態では、プリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチドは、任意の適切な固体基材に付着させる。固体基材としては、限定されるものではないが、固相、表面および／または膜が挙げられる。固体支持体としては、限定されるものではないが、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシおよびポリアクリルアミド、ならびにそれらのコポリマーおよびグラフトなどの有機ポリマーが挙げられる。固体支持体はまた、ガラス、シリカ、制御細孔ガラス（ＣＰＧ）、逆相シリカ、または金もしくは白金などの金属などの無機物であり得る。基材の形状は、ビーズ、球、粒子、顆粒、ゲル、膜または面の形態であり得る。面は、平面、実質的に平面、または非平面であり得る。固体支持体は、多孔性または非多孔性であり得、膨潤特性または非膨潤特性を有し得る。固体支持体は、ウェル、窪みまたは他の容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）、容器（ｖｅｓｓｅｌ）、フィーチャまたは場所の形態で形作ることができる。複数の支持体は、試薬のロボット送達のため、または検出方法および／もしくは装置によって対処可能なさまざまな場所で、アレイ上に配置され得る。
【０１８２】
一部の実施形態では、免疫学的方法を使用して、プリンヌクレオシドホスホリラーゼバリアントを精製する。１つのアプローチでは、従来の方法を使用してバリアントプリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチドに対して（例えば、配列番号２、６、１２６、２４２および／もしくは６８４のいずれかを含むポリペプチド、ならびに／またはそれらの免疫原性断片に対して）生じさせた抗体を、ビーズ上に固定し、バリアントプリンヌクレオシドホスホリラーゼが結合する条件下で、細胞培養培地と混合し、沈殿させる。関連するアプローチでは、免疫クロマトグラフィーが使用される。
【０１８３】
一部の実施形態では、バリアントプリンヌクレオシドホスホリラーゼは、非酵素部分を含む融合タンパク質として発現される。一部の実施形態では、バリアントプリンヌクレオシドホスホリラーゼ配列は、精製を容易にするドメインと融合されている。本明細書で使用される場合、「精製を容易にするドメイン」という用語は、それが融合しているポリペプチドの精製を媒介するドメインを指す。適切な精製ドメインとしては、限定されるものではないが、金属キレート化ペプチド、固定された金属上での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュール、グルタチオンに結合する配列（例えば、ＧＳＴ）、赤血球凝集素（ＨＡ）タグ（インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する；例えば、Wilson  et  al.,  Cell  37:767  [1984]を参照のこと）、マルトース結合性タンパク質配列、ＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティー精製システムにおいて利用されるＦＬＡＧエピトープ（例えば、Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐから入手可能なシステム）などが挙げられる。本明細書に記載の組成物および方法における使用について意図される１つの発現ベクターを、エンテロキナーゼ切断部位によって分離されるポリヒスチジン領域と融合した本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質の発現のために提供する。ヒスチジン残基は、ＩＭＩＡＣ（固定された金属イオンアフィニティークロマトグラフィー；例えば、Porath  et  al.,  Prot.  Exp.  Purif.,  3:263-281  [1992]を参照のこと）における精製を容易にする一方で、エンテロキナーゼ切断部位は、バリアントプリンヌクレオシドホスホリラーゼポリペプチドを融合タンパク質から分離するための手段を提供する。ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）はまた、外来ポリペプチドをグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させるために使用され得る。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、溶解細胞から、リガンド−アガロースビーズ（例えば、ＧＳＴ融合物の場合では、グルタチオン−アガロース）への吸着、続く遊離リガンドの存在下での溶出によって、容易に精製することができる。
【０１８４】
したがって、別の態様では、本発明は、操作された酵素ポリペプチドを産生させる方法であって、方法が、ポリペプチドの発現のために適切な条件下で、操作された酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現する能力を有する宿主細胞を培養することを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、本明細書に記載の酵素ポリペプチドを単離および／または精製するステップをさらに含む。
【０１８５】
宿主細胞のための適切な培養培地および成長条件は、当技術分野において周知である。酵素ポリペプチドの発現のためにポリヌクレオチドを細胞に導入するための任意の適切な方法を本発明において使用することが企図される。適切な技法としては、限定されるものではないが、電気穿孔、微粒子銃、リポソーム媒介トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクションおよびプロトプラスト融合が挙げられる。
【０１８６】
本発明のさまざまな特徴および実施形態を以下の代表的な実施例において説明し、これらは例示的なものであって、限定するものではないことを意図する。
【実施例】
【０１８７】
実験
実験および達成された結果を含む以下の実施例は、例示の目的のためにのみ提供され、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。実際に、下記に記載の多くの試薬および機器についてさまざまな適切な供給源がある。本発明が、任意の試薬または機器の品目について任意の特定の供給源に限定されることを意図しない。一部の実施形態では、Ｃ末端のヒスチジンタグ（すなわち、６個のヒスチジン残基）は、ポリペプチド配列に含まれる。本明細書と共に提出された配列表は、このヒスチジンタグなしのポリペプチド配列を含む。
【０１８８】
下記の実験の開示では、以下の略記が適用される：Ｍ（モル濃度）；ｍＭ（ミリモル濃度）、ｕＭおよびμＭ（マイクロモル濃度）；ｎＭ（ナノモル濃度）；ｍｏｌ（モル）；ｇｍおよびｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｕｇおよびμｇ（マイクログラム）；Ｌおよびｌ（リットル）；ｍｌおよびｍＬ（ミリリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；ｕｍおよびμｍ（マイクロメートル）；ｓｅｃ．（秒）；ｍｉｎ（分）；ｈおよびｈｒ（時間）；Ｕ（単位）；ＭＷ（分子量）；ｒｐｍ（毎分回転数）；ｐｓｉおよびＰＳＩ（平方インチあたりポンド）；℃（摂氏温度）；ＲＴおよびｒｔ（室温）；ＣＶ（変動係数）；ＣＡＭおよびｃａｍ（クロラムフェニコール）；ＰＭＢＳ（硫酸ポリミキシンＢ）；ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−ｌ−チオガラクトピラノシド）；ＬＢ（溶原ブロス）；ＴＢ（テリフィックブロス）；ＳＦＰ（振とうフラスコ粉末）；ＣＤＳ（コード配列）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ＲＮＡ（リボ核酸）；ｎｔ（ヌクレオチド；ポリヌクレオチド）；ａａ（アミノ酸；ポリペプチド）；Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（一般に使用される実験室Ｅ．ｃｏｌｉ株、ｔｈｅ  Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ［ＣＧＳＣ］、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、ＣＴから入手可能）；ＨＴＰ（ハイスループット）；ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー）；ＨＰＬＣ−ＵＶ（ＨＰＬＣ−紫外可視検出器）；１Ｈ  ＮＭＲ（プロトン核磁気共鳴分光法）；ＦＩＯＰＣ（陽性対照に対する倍数改善）；ＳｉｇｍａおよびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ；Ｄｉｆｃｏ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）；Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｗｅｓｔｗｏｏｄ、ＭＡ）；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの一員、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）；Ａｍｒｅｓｃｏ（Ａｍｒｅｓｃｏ，ＬＬＣ、Ｓｏｌｏｎ、ＯＨ）；Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ，Ｌｔｄ．、Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ、ＵＫ）；Ｖａｒｉａｎ（Ｖａｒｉａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）；Ａｇｉｌｅｎｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）；Ｉｎｆｏｒｓ（Ｉｎｆｏｒｓ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．、Ａｎｎａｐｏｌｉｓ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ、ＭＤ）；ならびにＴｈｅｒｍｏｔｒｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｈｏｌｌａｎｄ、ＭＩ）。
【０１８９】
（実施例１）
ＨＴＰ  ＰＮＰを含有する湿細胞ペレットの調製
本発明のバリアントを産生するために使用されるＰＮＰ（配列番号２）酵素のための親遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムから得て、ｐＣＫ１１０９００ベクターにクローニングした。Ｗ３１１０  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、ＰＮＰをコードする遺伝子を含有するそれぞれのプラスミドで形質転換し、１％のグルコースおよび３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（ＣＡＭ）を含有するＬＢ寒天プレートに蒔き、３７℃で終夜成長させた。モノクローナルコロニーを採集し、１％のグルコースおよび３０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含有する１８０μｌのＬＢに接種し、９６ウェルのシャローウェルマイクロタイタープレートに入れた。プレートをＯ２透過性シールでシールし、培養物を、３０℃、２００ｒｐｍおよび８５％湿度で終夜成長させた。次いで、１０μｌのそれぞれの細胞培養物を、３９０μｌのＴＢおよび３０μｇ／ｍＬのＣＡＭを含有する９６ウェルのディープウェルプレートのウェルに移した。ディープウェルプレートを、Ｏ２透過性シールでシールし、０．６〜０．８のＯＤ６００に達するまで、３０℃、２５０ｒｐｍおよび８５％湿度でインキュベートした。次いで、細胞培養物を、イソプロピルチオグリコシド（ＩＰＴＧ）を添加することによって１ｍＭの最終濃度に誘導し、３０℃、２５０ｒｐｍでの振とうで終夜インキュベートした。次いで、細胞を、４，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を使用してペレット化した。上清を廃棄し、ペレットを溶解前に−８０℃で凍結させた。
【０１９０】
（実施例２）
ＨＴＰ  ＰＮＰ含有細胞溶解物の調製
実施例１に記載のようにして調製された凍結ペレットを、１００ｍＭのトリエタノールアミン緩衝液、ｐＨ７．５、１ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、０．５ｍｇ／ｍＬのＰＭＢＳおよび５ｍＭのＭｎＣｌ２を含有する２００μｌの溶解緩衝液を用いて溶解した。溶解混合物を、室温で２時間、振とうした。次いで、プレートを４０００ｒｐｍおよび４℃で１５分間遠心分離した。次いで、上清を、活性レベルを決定するために、澄明な溶解物として生体触媒反応において使用した。
【０１９１】
（実施例３）
振とうフラスコ（ＳＦ）培養物由来の凍結乾燥溶解物の調製
１％のグルコースおよび３０μｇ／ｍｌのＣＡＭを含むＬＢ寒天プレートから採集し、３７℃で終夜インキュベートした所望の遺伝子を含有する単一コロニーを、１％のグルコースおよび３０μｇ／ｍｌのＣＡＭを含む６ｍｌのＬＢに移した。培養物を、３０℃、２５０ｒｐｍで１８時間成長させ、約０．０５の最終ＯＤ６００まで、３０μｇ／ｍｌのＣＡＭを含有する２５０ｍｌのＴＢにおよそ１：５０で継代培養した。継代培養物を、０．６〜０．８の間のＯＤ６００まで、３０℃、２５０ｒｐｍでおよそ１９５分間成長させ、１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて誘導した。次いで、継代培養物を３０℃、２５０ｒｐｍで２０時間成長させた。継代培養物を４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを、５ｍＭのＭｎＣｌ２を含む３５ｍｌの２５ｍＭのトリエタノールアミン緩衝液、ｐＨ７．５に再懸濁させた。細胞を、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（登録商標）プロセッサーシステム（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を１８，０００ｐｓｉで使用して溶解させた。溶解物をペレット化し（１０，０００ｒｐｍ×６０分）、上清を凍結し、凍結乾燥して、振とうフラスコ（ＳＦ）酵素粉末を作成した。
【０１９２】
（実施例４）
化合物１の生成のための改善されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼバリアント
これらの実験のために、配列番号２を親酵素として選択した。操作された遺伝子のライブラリーを、十分に確立された技法（例えば、飽和変異誘発、および以前に特定された有益な変異の組換え）を使用して、生成した。それぞれの遺伝子によってコードされるポリペプチドを、実施例１に記載されるようにして、ＨＴＰ中で産生させ、澄明な溶解物を、実施例２に記載されるようにして、作成した。
【０１９３】
それぞれの酵素について、澄明な細胞溶解物を、５０ｍＭのＴＥｏＡ、５ｍＭのＭｎＣｌ２、ｐＨ７．５に８倍希釈した。それぞれ１００μＬの反応を、５０％（ｖ／ｖ）の希釈溶解物、３０ｍＭの化合物４、３６ｍＭの化合物２、５ｇ／ＬのＰＰＭ（配列番号１００４）、１００ｍＭのＴＥｏＡ緩衝液および５．０ｍＭのＭｎＣｌ２、ｐＨ７．５を含む９６ウェルのシャローウェルマイクロタイタープレートにおいて行った。プレートをヒートシールし、４５℃でインキュベートし、Ｉｎｆｏｒｓ  Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎ（登録商標）シェーカー中、５００ＲＰＭで終夜撹拌した。プレートを取り出し、１体積の１：１のＤＭＳＯ：１ＭのＫＯＨを添加することによってクエンチし、化合物が溶解するまでよく混合し、次いで、分析前に２５：７５ｖ：ｖのアセトニトリル：０．１ＭのＴＥｏＡ、ｐＨ７に１０倍希釈した。
【０１９４】
配列番号２に対する活性を、配列番号２によって生成した変換パーセントと比較して、バリアント酵素によって形成された生成物の変換パーセントとして計算した。変換パーセントを、ＨＰＬＣ分析によって決定されるように、生成物のピークの面積を基質および生成物のピークの面積の合計によって除算することによって定量した。
【表４−１】
2021530979.tif 000006
【表４−２】
2021530979.tif 000007
【表４−３】
2021530979.tif 000008
【０１９５】
（実施例５）
化合物１０の生成のための改善されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼバリアント
【化５】
2021530979.tif 000009
代替の塩基交換ハイスループットスクリーニング法を、分析のロバスト性改善のために開発した。スクリーニング条件に５００ｍＭの臭化カリウムを含めることによって、ＰＮＰバリアントも、臭化カリウム耐性における改善についてスクリーニングした。これらの実験のために、配列番号６を親酵素として選択した。操作された遺伝子のライブラリーを、十分に確立された技法（例えば、飽和変異誘発、および以前に特定された有益な変異の組換え）を使用して、生成した。それぞれの遺伝子によってコードされるポリペプチドを、実施例１に記載されるようにして、ＨＴＰ中で産生させ、澄明な溶解物を、実施例２に記載されるようにして、２００μＬの溶解緩衝液の代わりに４００μＬ、および追加の４００μＬの溶解物を用いて、作成した。
【０１９６】
それぞれ１００μＬの反応を、１００ｍＭのＴＥｏＡ緩衝液、ｐＨ７．５中の５μＬの溶解物、１３ｍＭの化合物（８）、１５ｍＭの化合物（９）、５００ｍＭの臭化カリウムおよび５ｍＭのリン酸アンモニウムを含む９６ウェルのディープウェルマイクロタイタープレート（２ｍＬ体積）において行った。プレートを、ヒートシールし、４０℃でインキュベートし、Ｉｎｆｏｒｓ  Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎ（登録商標）シェーカー中、６００ＲＰＭで終夜撹拌した。プレートを取り出し、１体積のアセトニトリルを添加することによってクエンチし、化合物が溶解するまでよく混合し、次いで、８００μＬの１００ｍＭのＴＥｏＡ緩衝液、ｐＨ７．５を添加することによって、５倍希釈した。４０μＬの希釈されたクエンチされた試料を、１６０μＬの１００ｍＭのＴＥｏＡ緩衝液、ｐＨ７．５であらかじめ満たされた９６ウェルのＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルタープレート（０．４５μｍの細孔サイズ）に移し、混合し、４℃で５分間、４０００ｒｐｍで遠心分離した後、ＨＰＬＣによって溶出液を分析した。
【０１９７】
配列番号６に対する活性を、配列番号６によって生成した変換パーセントと比較して、バリアント酵素によって形成される化合物１０の変換パーセントとして計算した。変換パーセントを、表９．３に記載のＨＰＬＣ分析によって決定されるように、生成物のピークの面積を基質および生成物のピークの面積の合計によって除算することによって定量した。
【表５−１】
2021530979.tif 000010
【表５−２】
2021530979.tif 000011
【０１９８】
（実施例６）
化合物１０の生成のための改善されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼバリアント
【化６】
2021530979.tif 000012
代替の塩基交換ハイスループットスクリーニング法を、分析のロバスト性改善のために開発した。スクリーニング条件に５００ｍＭの臭化カリウムを含めることによって、ＰＮＰバリアントも、臭化カリウム耐性における改善についてスクリーニングした。これらの実験のために、配列番号６を親酵素として選択した。操作された遺伝子のライブラリーを、十分に確立された技法（例えば、飽和変異誘発、および以前に特定された有益な変異の組換え）を使用して、生成した。それぞれの遺伝子によってコードされるポリペプチドを、実施例１に記載されるようにして、ＨＴＰ中で産生させ、澄明な溶解物を、実施例２に記載されるようにして、２００μＬの溶解緩衝液の代わりに４００μＬの溶解緩衝液を用いて、作成した。
【０１９９】
それぞれ１００μＬの反応を、１００ｍＭのＴＥｏＡ緩衝液、ｐＨ７．５中の５μＬの溶解物、１３ｍＭの化合物（８）、１５ｍＭの化合物（９）、５００ｍＭの臭化カリウムおよび５ｍＭのリン酸アンモニウムを含む９６ウェルのディープウェルマイクロタイタープレート（２ｍＬ体積）において行った。プレートを、ヒートシールし、４０℃でインキュベートし、Ｉｎｆｏｒｓ  Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎ（登録商標）シェーカー中、６００ＲＰＭで終夜撹拌した。プレートを取り出し、１体積のアセトニトリルを添加することによってクエンチし、化合物が溶解するまでよく混合し、次いで、８００μＬの１００ｍＭのＴＥｏＡ緩衝液、ｐＨ７．５を添加することによって、５倍希釈した。４０μＬの希釈されたクエンチされた試料を、１６０μＬの１００ｍＭのＴＥｏＡ緩衝液、ｐＨ７．５であらかじめ満たされた９６ウェルのＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルタープレート（０．４５μｍの細孔サイズ）に移し、混合し、４℃で５分間、４０００ｒｐｍで遠心分離した後、ＨＰＬＣによって溶出液を分析した。
【０２００】
配列番号１２６に対する活性を、配列番号１２６によって生成した変換パーセントと比較して、バリアント酵素によって形成される化合物１０の変換パーセントとして計算した。変換パーセントを、表９．３に記載のＨＰＬＣ分析によって決定されるように、生成物のピークの面積を基質および生成物のピークの面積の合計によって除算することによって定量した。
【表６−１】
2021530979.tif 000013
【表６−２】
2021530979.tif 000014
【表６−３】
2021530979.tif 000015
【表６−４】
2021530979.tif 000016
【表６−５】
2021530979.tif 000017
【表６−６】
2021530979.tif 000018
【０２０１】
（実施例７）
化合物１の生成のための改善されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼバリアント
これらの実験のために、配列番号２４２を親酵素として選択した。操作された遺伝子のライブラリーを、十分に確立された技法（例えば、飽和変異誘発、および以前に特定された有益な変異の組換え）を使用して、生成した。それぞれの遺伝子によってコードされるポリペプチドを、実施例１に記載されるようにして、ＨＴＰ中で産生させ、澄明な溶解物を、実施例２に記載されるようにして、２００μＬの溶解緩衝液の代わりに４００μＬの溶解緩衝液を用いて、作成した。
【０２０２】
それぞれの酵素について、澄明な細胞溶解物を、１００ｍＭのＴＥｏＡ、５ｍＭのＭｎＣｌ２、ｐＨ７．５に１２８倍希釈した。それぞれ１００μＬの反応を、２０μＬの希釈溶解物、９８ｍＭの化合物４、１９６ｍＭの化合物２、１０ｇ／ＬのＰＰＭ発酵粉末（配列番号１００６）、０．２５ｇ／ＬのスクロースホスホリラーゼＳＵＰ００１（ＥＣ  ２．４．１．７、Ａｌｌｏｓｃａｒｄｏｖｉａ  ｏｍｎｉｃｏｌｅｎｓ  ＳＰ１５４、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＷＰ＿０２１６１７４６８．１）、１９６ｍＭのスクロース、１００ｍＭの硫酸カリウム、１００ｍＭのＴＥｏＡ緩衝液および５．０ｍＭのＭｎＣｌ２、ｐＨ７．５を含む９６ウェルのシャローウェルマイクロタイタープレートにおいて行った。プレートを、ヒートシールし、４０℃でインキュベートし、Ｉｎｆｏｒｓ  Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎ（登録商標）シェーカー中、８００ＲＰＭで終夜撹拌した。プレートを取り出し、２００μＬの１：１のＤＭＳＯ：１ＭのＫＯＨを添加することによってクエンチし、化合物が溶解するまでよく混合した。１０μＬの希釈されたクエンチされた試料を、１９０μＬの７５：２５の１００ｍＭのＴＥｏＡ緩衝液、ｐＨ７．５：アセトニトリルの混合物であらかじめ満たされた９６ウェルのＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルタープレート（０．４５μｍの細孔サイズ）に移し、混合し、４℃で５分間、４０００ｒｐｍで遠心分離した後、ＨＰＬＣによって溶出液を分析した。
【０２０３】
配列番号２４２に対する活性を、配列番号２４２によって生成した変換パーセントと比較して、バリアント酵素によって形成される化合物１の変換パーセントとして計算した。変換パーセントを、表９．２に記載のＨＰＬＣ分析によって決定されるように、生成物のピークの面積を基質および生成物のピークの面積の合計によって除算することによって定量した。
【表７−１】
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【表７−２】
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【表７−３】
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【０２０４】
（実施例８）
化合物１の生成のための改善されたプリンヌクレオシドホスホリラーゼバリアント
これらの実験のために、配列番号６８４を親酵素として選択した。操作された遺伝子のライブラリーを、十分に確立された技法（例えば、飽和変異誘発、および以前に特定された有益な変異の組換え）を使用して、生成した。それぞれの遺伝子によってコードされるポリペプチドを、実施例１に記載されるようにして、ＨＴＰ中で産生させ、澄明な溶解物を、実施例２に記載されるようにして、２００μＬの溶解緩衝液の代わりに４００μＬの溶解緩衝液を用いて、作成した。
【０２０５】
それぞれの酵素について、澄明な細胞溶解物を、１００ｍＭのＴＥｏＡ、５ｍＭのＭｎＣｌ２、ｐＨ７．５に３２倍希釈した。それぞれ１００μＬの反応を、２０μＬの希釈溶解物、９８ｍＭの化合物４、１９６ｍＭの化合物２、１０ｇ／ＬのＰＰＭ４６発酵粉末（配列番号５１４）、０．２５ｇ／ＬのスクロースホスホリラーゼＳＵＰ００１、１９６ｍＭのスクロース、１００ｍＭの硫酸カリウム、１００ｍＭのＴＥｏＡ緩衝液および５．０ｍＭのＭｎＣｌ２、ｐＨ７．５を含む９６ウェルのシャローウェルマイクロタイタープレートにおいて行った。プレートを、ヒートシールし、４０℃でインキュベートし、Ｉｎｆｏｒｓ  Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎ（登録商標）シェーカー中、８００ＲＰＭで終夜撹拌した。プレートを取り出し、３００μＬの１：１のＤＭＳＯ：１ＭのＫＯＨを添加することによってクエンチし、化合物が溶解するまでよく混合した。１０μＬの希釈されたクエンチされた試料を、１９０μＬの７５：２５の１００ｍＭのＴＥｏＡ緩衝液、ｐＨ７．５：アセトニトリルの混合物であらかじめ満たされた９６ウェルのＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルタープレート（０．４５μｍの細孔サイズ）に移し、混合し、４℃で５分間、４０００ｒｐｍで遠心分離した後、ＨＰＬＣによって溶出液を分析した。
【０２０６】
配列番号６８４に対する活性を、配列番号６８４によって生成した変換パーセントと比較して、バリアント酵素によって形成される化合物１の変換パーセントとして計算した。変換パーセントを、表９．２に記載のＨＰＬＣ分析によって決定されるように、生成物のピークの面積を基質および生成物のピークの面積の合計によって除算することによって定量した。
【表８−１】
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【表８−２】
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【０２０７】
（実施例９）
分析方法
この実施例は、上記の実施例で提供されたデータを収集するために使用した方法を提供する。実施例４に記載の得られたデータは、表９．１における分析方法を使用して収集した。実施例６に記載の得られたデータは、表９．２における分析方法を使用して収集した。実施例５に記載の得られたデータは、表９．３における分析方法を使用して収集した。この実施例において提供される方法は、本発明を使用して産生するバリアントの分析において使用される。しかしながら、他の適切な方法が当業者に公知であるので、本発明が本明細書に記載の方法に限定されることは意図しない。
【表９−１】
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【表９−２】
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【表９−３】
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【０２０８】
本出願において引用されたすべての刊行物、特許、特許出願および他の文書は、個々の刊行物、特許、特許出願または他の文書のそれぞれがすべての目的のために参照によって組み込まれることが個々に示されたものと同じ程度に、すべての目的のために、それらの全体がこれにより参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２０９】
さまざまな特定の実施形態を説明し、記載してきたが、本発明（複数可）の趣旨および範囲から逸脱することなく、さまざまな変更を行うことができることが理解される。
【配列表】
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【国際調査報告】
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