(57)【要約】  トランスアミナーゼ突然変異体及びその応用を提供し、該トランスアミナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されるアミノ酸配列に突然変異が発生したアミノ酸配列であり、突然変異したアミノ酸部位は、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ部位を含む。上記突然変異体部位を有するトランスアミナーゼ突然変異体は、さらに、固定化技術によって固定化酵素に製造することができ、その固定化酵素の活性及び安定性が高く、複数回回収し再利用でき、充填層式連続フロー反応への応用に適合する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示される配列にアミノ酸突然変異が発生した配列を有し、前記アミノ酸突然変異が発生した部位がＴ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ部位を含むことを特徴とするトランスアミナーゼ突然変異体。
【請求項２】
前記アミノ酸突然変異が発生した部位は、Ｍ３５６Ｌ、Ｆ３６４Ｌ、Ｃ４０４Ｌ、Ｍ４３０Ｌ、Ｒ４０５Ｅ／Ａ、Ｋ９０Ｇ、Ｋ２１９Ｔ、Ｋ３０４Ｄ、Ｋ５１Ｒ、Ａ９５Ｐ、Ｅ３６８Ｐ、Ｑ３４６Ｅ、Ｈ３３３Ｋ、Ｄ３７１Ｇ、Ｅ２４６Ａ、Ｃ３２８Ａ、Ｎ４１２Ｇ、Ｔ４０２Ｐ、Ｔ１０７Ｆ／Ａ（「／」は「又は」を表す）、Ｇ１１０Ｐ、Ｋ６９Ｎ、Ｇ２０１Ｃ、Ｑ３８０Ｌ、Ｋ１９３Ｉ、Ｉ２９７Ｌ、Ｒ３０５Ｈ、Ｆ１１１Ｙ、Ｋ１９０Ｅ及びＡ２８６Ｔのうちの任意の１つ以上をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のトランスアミナーゼ突然変異体。
【請求項３】
前記アミノ酸突然変異が発生した部位は、Ｋ５１Ｒ＋Ｗ１８７Ｙ、Ｒ４０５Ｅ＋Ａ９５Ｐ、Ｒ４０５Ｅ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ、Ｒ４０５Ｅ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｅ３６８Ｐ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｑ３４６Ｅ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｈ３３３Ｋ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｄ３７１Ｇ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｅ２４６Ａ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｃ３２８Ａ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｎ４１２Ｇ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｔ４０２Ｐ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｔ１０７Ｆ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｔ１０７Ａ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｇ１１０Ｐ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ＋Ｅ３６８Ｐ＋Ｔ１０７Ａ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ＋Ａ２８６Ｔ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ＋Ｅ３６８Ｐ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ＋Ｅ３６８Ｐ＋Ｔ１０７Ａ＋Ｋ６９Ｎ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ＋Ｅ３６８Ｐ＋Ｔ１０７Ａ＋Ｇ２０１Ｃ及びＲ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ＋Ｅ３６８Ｐ＋Ｔ１０７Ａ＋Ａ２８６Ｔの突然変異部位組み合わせのいずれか１つをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のトランスアミナーゼ突然変異体。
【請求項４】
請求項１〜３のいすれか１項に記載のトランスアミナーゼ突然変異体をコードすることを特徴とするＤＮＡ分子。
【請求項５】
請求項４に記載のＤＮＡ分子が結合されていることを特徴とする組換えプラスミド。
【請求項６】
請求項１〜３のいすれか１項に記載のトランスアミナーゼ突然変異体を含むことを特徴とする固定化トランスアミナーゼ。
【請求項７】
前記トランスアミナーゼ突然変異体のトランスアミナーゼ架橋酵素凝集体であり、
好ましくは、前記トランスアミナーゼ突然変異体を沈殿させてトランスアミナーゼ凝集体が得られて、前記トランスアミナーゼ凝集体中の遊離しているアミノ基、フェノール基、イミダゾール基又はメルカプト基を、グルタルアルデヒド、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、ビスマレイミド及びデキストランから選択される任意の１種の架橋剤と架橋させて、前記トランスアミナーゼ架橋酵素凝集体が得られ、
好ましくは、前記トランスアミナーゼ架橋酵素凝集体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されるアミノ酸配列を基に、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ａ９５Ｐ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ＋Ｅ３６８Ｐ＋Ｔ１０７Ａ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ＋Ｅ３６８Ｐ＋Ｔ１０７Ａ＋Ａ２８６Ｔ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ＋Ｅ３６８Ｐ＋Ｔ１０７Ａ＋Ｋ６９Ｎ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｈ３３３Ｋ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｅ３６８Ｐ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｋ５１Ｒ＋Ｗ１８７Ｙ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｑ３４６Ｅ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｃ３２８Ａ及びＴ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌのアミノ酸突然変異部位を有するトランスアミナーゼ突然変異体の架橋酵素凝集体であり、
好ましくは、前記デキストランの分子量は、６ＫＤａ〜２００ＫＤａであり、
好ましくは、前記トランスアミナーゼ突然変異体をエタノールで沈殿させて前記トランスアミナーゼ凝集体が得られ、
好ましくは、前記トランスアミナーゼ凝集体中の遊離アミノ基をグルタルアルデヒドと架橋させて前記トランスアミナーゼ架橋酵素凝集体が得られることを特徴とする請求項６に記載の固定化トランスアミナーゼ。
【請求項８】
トランスアミナーゼ包埋−架橋固定化酵素であり、
好ましくは、前記トランスアミナーゼ包埋−架橋固定化酵素は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されるアミノ酸配列を基に、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ＋Ｅ３６８Ｐ＋Ｔ１０７Ａ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｑ３４６Ｅ、及びＴ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌのアミノ酸突然変異部位を有するトランスアミナーゼ突然変異体の包埋−架橋固定化酵素であり、
好ましくは、前記トランスアミナーゼ突然変異体中の遊離アミノ基とグルタルアルデヒドとでシッフ塩基を生成して架橋してトランスアミナーゼ架橋酵素が得られて、前記トランスアミナーゼ架橋酵素をポリアクリルアミドゲルマトリックスに包埋して前記トランスアミナーゼ包埋−架橋固定化酵素が得られることを特徴とする請求項６に記載の固定化トランスアミナーゼ。
【請求項９】
前記トランスアミナーゼ突然変異体を担体に共有結合させた共有結合固定化酵素であり、
好ましくは、前記共有結合固定化酵素は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されるアミノ酸配列を基に、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ａ９５Ｐ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｑ３８０Ｌ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｋ５１Ｒ＋Ｗ１８７Ｙ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｅ３６８Ｐ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｈ３３３Ｋ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ＋Ｅ３６８Ｐ＋Ｔ１０７Ａ及びＴ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ＋Ｅ３６８Ｐ＋Ｔ１０７Ａ＋Ａ２８６Ｔのアミノ酸突然変異部位を有するトランスアミナーゼ突然変異体の共有結合固定化酵素であり、
好ましくは、前記担体は、キトサン担体、又は樹脂担体であり、
より好ましくは、前記キトサン担体は、ヒドロキシル基及び／又はアミノ基により前記トランスアミナーゼ突然変異体と共有結合されて前記共有結合固定化酵素を形成し、
より好ましくは、前記樹脂担体は、スチレンとメタクリル酸エステルとの共重合体、ポリスチレン樹脂及びポリメタクリレート樹脂から選択される任意の１種であるマトリックスと、Ｃ２の短鎖アミノ基、Ｃ４の中鎖アミノ基、Ｃ６の長鎖アミノ基又はエポキシ基から選択される、前記マトリックスに結合される官能基とを含み、さらに好ましくは、前記樹脂担体は、ＥＣＲ８３０９、ＥＣＲ８３１５、ＥＣ−ＨＦＡ、ＬＸ−１０００ＨＡ、ＬＸ−１０００ＥＡ、ＥＣＲ８４０９、ＥＣＲ８４１５、ＥＣ−ＥＰ、ＥＣ ＥＰ４０３、ＥＸＥ１１９、ＬＸ−１０００ＥＰ、Ｉｍｍｏｂｅａｄ−１５０Ａ、Ｉｍｍｏｂｅａｄ−１５０Ｐ、Ｉｍｍｏｂｅａｄ３５０Ａ、ＥＣＲ８２０６、ＥＣＲ８２０９、ＥＣＲ８２１５又はＥＣＲ８２８５から選択されることを特徴とする請求項６に記載の固定化トランスアミナーゼ。
【請求項１０】
前記トランスアミナーゼ突然変異体及び担体を金属イオンによりキレート化して形成されるキレート化固定化酵素であり、
好ましくは、前記キレート化固定化酵素は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されるアミノ酸配列を基に、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ａ９５Ｐ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ＋Ｅ３６８Ｐ＋Ｔ１０７Ａ＋Ｇ２０１Ｃ及びＴ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ＋Ｅ３６８Ｐ＋Ｔ１０７Ａ＋Ａ２８６Ｔのアミノ酸突然変異部位を有するトランスアミナーゼ突然変異体のキレート化固定化酵素であり、
好ましくは、前記担体は、多孔質ガラス担体であり、
さらに好ましくは、前記多孔質ガラス担体は、ＥｚｉＧ−１０１、ＥｚｉＧ−１０２又はＥｚｉＧ−１０３であることを特徴とする請求項６に記載の固定化トランスアミナーゼ。
【請求項１１】
前記固定化トランスアミナーゼは、前記トランスアミナーゼ突然変異体及び担体を物理的吸着によって結合させた吸着固定化酵素であり、
好ましくは、前記吸着固定化酵素は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されるアミノ酸配列を基に、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ａ９５Ｐ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｈ３３３Ｋ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｑ３４６Ｅ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｎ４１２Ｇ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ＋Ｅ３６８Ｐ＋Ｔ１０７Ａ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ＋Ｅ３６８Ｐ＋Ｔ１０７Ａ＋Ａ２８６Ｔ及びＴ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ＋Ｅ３６８Ｐ＋Ｔ１０７Ａ＋Ｇ２０１Ｃのアミノ酸突然変異部位を有するトランスアミナーゼ突然変異体の吸着固定化酵素であり、
好ましくは、前記担体は、樹脂担体であり、
より好ましくは、前記樹脂担体は、スチレンとメタクリル酸エステルとの共重合体、ポリスチレン樹脂及びポリメタクリレート樹脂から選択される任意の１種であるマトリックスと、オクタデシル基の前記マトリックスに結合される官能基とを含み、さらに好ましくは、前記樹脂担体は、ＥＣＲ８８０６、ＥＣＲ１０３０、ＥＣＲ１０９０、ＥＣＲ１０６１、ＥＣＲ１０９１、ＥＣＲ８８０４、Ｉｍｍｏｂｅａｄ−ＥＣ１、Ｉｍｍｏｂｅａｄ−Ｓ６０Ｓ、Ｉｍｍｏｂｅａｄ−Ｓ８６１、Ｘ１７Ｓ０４０９、ＥＸＥ１２０又はＤｉａｉｏｎ  ＨＰ２ＭＧから選択されることを特徴とする請求項６に記載の固定化トランスアミナーゼ。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のトランスアミナーゼ突然変異体又は請求項６〜１１のいずれか１項に記載の固定化トランスアミナーゼを用いて、ケトン化合物及びアミノ基供与体に対してアミノ基転移反応を触媒するステップを含むことを特徴とするキラルアミンの製造方法。
【請求項１３】
前記トランスアミナーゼは、請求項１〜３のいずれか１項に記載のトランスアミナーゼ突然変異体であり、前記方法は、バッチ反応であり、好ましくは、前記バッチ反応の反応系は、水相反応系であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記トランスアミナーゼは、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の固定化トランスアミナーゼであり、前記方法は、連続的な反応であり、好ましくは、前記連続的な反応の反応系は、有機相反応系であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ケトン化合物は、
【化１】
2021505184.tif 000031
であり、ここで、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、Ｃ１〜Ｃ８アルキル基、Ｃ５〜Ｃ１０シクロアルキル基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基又はＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基であり、或いは、Ｒ１及びＲ２は、カルボニル基の炭素とともにＣ５〜Ｃ１０ヘテロ環基、Ｃ５〜Ｃ１０炭素環基又はＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基を形成し、前記Ｃ５〜Ｃ１０ヘテロ環基及びＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基中のヘテロ原子はそれぞれ独立して、窒素、酸素及び硫黄から選択される少なくとも１つであり、前記Ｃ６〜Ｃ１０アリール基中のアリール基、Ｃ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基中のヘテロアリール基、Ｃ５〜Ｃ１０炭素環基中の炭素環基又はＣ５〜Ｃ１０ヘテロ環基中のヘテロ環基はそれぞれが独立して、置換されていないか、又はハロゲン、アルコキシ基もしくはアルキル基のうちの少なくとも１つの基で置換され、好ましくは、前記ケトン化合物は
【化２】
2021505184.tif 000032
であり、アミノ基転移反応生成物は
【化３】
2021505184.tif 000033
であり、好ましくは、アミノ基供与体は、イソプロピルアミンであることを特徴とする請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素工学の分野に関し、具体的には、トランスアミナーゼ突然変異体及びその応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ω−トランスアミナーゼ（ω−ＴＡ）は、トランスアミナーゼ類に属し、他のトランスアミナーゼ類と同様に、アミノ基とケト基との交換過程を触媒する。多くの場合には、ω−トランスアミナーゼは、一種の酵素を指し、ある酵素により触媒されるアミノ基転移反応において、反応の基質又は生成物にはα-アミノ酸が含まない限り、該酵素をω−トランスアミナーゼと呼ぶことができる。ω−トランスアミナーゼは、ケトン化合物を原料とし、立体特異的なアミノ転移作用により、キラルアミンを効率的に製造することができる。鏡像異性体キラルアミンは、広範な生物学的活性を有する多くの医薬品化合物の重要な中間体である（ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ．９，２００８，３６３−３６５，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．４６，２０１０，５５６９−５５７１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０８，２０１１，１４７９−１４９３）。その基質は、相対的に安価であり、生成物の純度が高いという特徴を有するため、研究者から益々注目されている（Ｇｒｅｅｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１７，１９，２：３３３−３６０）。また、トランスアミナーゼは、キラルアミンの生産に応用する見込みが示されている（Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０１０，１４，２３４−２３７）。
【０００３】
トランスアミナーゼを使用してキラルアミンを生成する進行が大いに注目されているが、酵素学的方法は大規模生産の応用に多くの問題が存在する。例えば、酵素活性が低く酵素用量が大きいことにより発酵のコストが増加し、反応系における有機溶媒に容易に影響されて、変性失活などが引き起こされる。
【０００４】
また、生成物であるアミンを分離するには、酵素は変性失活し沈殿物を形成して除去し廃棄するしかないので、再利用することができない。あるいは、製品は有機溶媒で水溶液から抽出し、酵素は水溶液に残る。しかし、この場合に、ｐＨ及び溶媒などの多くの過酷な条件の影響により、酵素は失活し、再利用することができない。
【０００５】
従来技術に、固定化技術により酵素を固定化して酵素の回収再利用性を向上させるという課題が報告されている。しかしながら、現在、固定化技術について、リパーゼ、ペニシリンアシラーゼ、アミラーゼなどの分野における研究が多く、これらの酵素が他の酵素よりも高い安定性を有し、固定化後の酵素活性の損失が低いためである。大部分のトランスアミナーゼは、その安定性が低く、特に体系に有機相が存在する場合に、固定化操作過程において酵素活性の損失を引き起こしやすいため、トランスアミナーゼの固定化についての研究が少なく、連続的な反応に適する固定化のトランスアミナーゼについての研究がより少ない。
【０００６】
以下の基質１及び基質２を触媒してアミノ基変換反応を行うことができるトランスアミナーゼに対しては、遊離しているトランスアミナーゼで該反応を触媒すると、遊離酵素が回収できず、１回しか使用することができない。また、反応系に酵素タンパク質が存在するので、後処理において乳化現象が極めて深刻であり、生成物の分離が困難である。
【化１】
2021505184.tif 000002
【０００７】
使用されるトランスアミナーゼを固定化すれば、論理的に酵素の回収利用を実現できるが、基質１又は基質２を触媒する従来のトランスアミナーゼは、固定化した後の酵素活性回収率が依然として低い。また、従来の基質であるケトン（アミノ基受容体）の多くは水溶性が低く、純粋な水相において連続的な反応を行うことができない。連続的な反応を実現するために、十分な有機共溶媒を添加して基質を溶解させる必要があるが、従来のトランスアミナーゼは温度、ｐＨ及び有機溶媒に対する耐性が低く、有機溶媒により失活しやすい。したがって、その固定化処理を実現しにくい。
【０００８】
したがって、上記基質を触媒できる従来のトランスアミナーゼを改良して、その有機溶媒などの極限環境における安定性が低く応用が制限されるという問題を解決する必要がある。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、トランスアミナーゼ突然変異体及びその応用を提供して、従来技術におけるトランスアミナーゼ活性の極限環境における耐性が低く応用が制限されるという問題を解決することを主な目的とする。
【００１０】
上記目的を達成するために、本発明の１つの態様は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示される配列にアミノ酸突然変異が発生した配列を有し、アミノ酸突然変異が発生した部位がＴ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ部位を含むトランスアミナーゼ突然変異体を提供する。
【００１１】
さらに、アミノ酸突然変異が発生した部位は、Ｍ３５６Ｌ、Ｆ３６４Ｌ、Ｃ４０４Ｌ、Ｍ４３０Ｌ、Ｒ４０５Ｅ／（「／」は「又は」を表す）Ａ、Ｋ９０Ｇ、Ｋ２１９Ｔ、Ｋ３０４Ｄ、Ｋ５１Ｒ、Ａ９５Ｐ、Ｅ３６８Ｐ、Ｑ３４６Ｅ、Ｈ３３３Ｋ、Ｄ３７１Ｇ、Ｅ２４６Ａ、Ｃ３２８Ａ、Ｎ４１２Ｇ、Ｔ４０２Ｐ、Ｔ１０７Ｆ／Ａ、Ｇ１１０Ｐ、Ｋ６９Ｎ、Ｇ２０１Ｃ、Ｑ３８０Ｌ、Ｋ１９３Ｉ、Ｉ２９７Ｌ、Ｒ３０５Ｈ、Ｆ１１１Ｙ、Ｋ１９０Ｅ及びＡ２８６Ｔのうちの任意の１つ以上をさらに含む。
【００１２】
さらに、アミノ酸突然変異が発生した部位は、Ｋ５１Ｒ＋Ｗ１８７Ｙ、Ｒ４０５Ｅ＋Ａ９５Ｐ、Ｒ４０５Ｅ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ、Ｒ４０５Ｅ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｅ３６８Ｐ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｑ３４６Ｅ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｈ３３３Ｋ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｄ３７１Ｇ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｅ２４６Ａ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｃ３２８Ａ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｎ４１２Ｇ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｔ４０２Ｐ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｔ１０７Ｆ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｔ１０７Ａ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｇ１１０Ｐ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ＋Ｅ３６８Ｐ＋Ｔ１０７Ａ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ＋Ａ２８６Ｔ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ＋Ｅ３６８Ｐ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ＋Ｅ３６８Ｐ＋Ｔ１０７Ａ＋Ｋ６９Ｎ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ＋Ｅ３６８Ｐ＋Ｔ１０７Ａ＋Ｇ２０１Ｃ及びＲ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ＋Ｅ３６８Ｐ＋Ｔ１０７Ａ＋Ａ２８６Ｔという突然変異部位組み合わせのいずれかの１つをさらに含む。
【００１３】
上記目的を達成するために、本発明の第２の態様は、上記いすれか１種のトランスアミナーゼ突然変異体をコードするＤＮＡ分子を提供する。
【００１４】
本発明の第３の態様は、上記いすれか１種のＤＮＡ分子が結合されている組換えプラスミドを提供する。
【００１５】
本発明の第４の態様は、上記いすれか１種のトランスアミナーゼ突然変異体を含む固定化トランスアミナーゼを提供する。
【００１６】
さらに、固定化トランスアミナーゼは、トランスアミナーゼ突然変異体のトランスアミナーゼ架橋酵素凝集体であり、好ましくは、トランスアミナーゼ突然変異体を沈殿させてトランスアミナーゼ凝集体が得られて、トランスアミナーゼ凝集体中の遊離しているアミノ基、フェノール基、イミダゾール基又はメルカプト基を、グルタルアルデヒド、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、ビスマレイミド及びデキストランから選択される任意の１種の架橋剤と架橋させて、トランスアミナーゼ架橋酵素凝集体が得られ、好ましくは、トランスアミナーゼ架橋酵素凝集体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されるアミノ酸配列を基に、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ａ９５Ｐ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ＋Ｅ３６８Ｐ＋Ｔ１０７Ａ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ＋Ｅ３６８Ｐ＋Ｔ１０７Ａ＋Ａ２８６Ｔ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ＋Ｅ３６８Ｐ＋Ｔ１０７Ａ＋Ｋ６９Ｎ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｈ３３３Ｋ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｅ３６８Ｐ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｋ５１Ｒ＋Ｗ１８７Ｙ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｑ３４６Ｅ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｃ３２８Ａ及びＴ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌというアミノ酸突然変異部位を有するトランスアミナーゼ突然変異体の架橋酵素凝集体であり、好ましくは、デキストランの分子量は、６ＫＤａ〜２００ＫＤａであり、好ましくは、トランスアミナーゼ凝集体は、トランスアミナーゼ突然変異体をエタノール沈殿させて得られるものであり、好ましくは、トランスアミナーゼ凝集体中の遊離しているアミノ基をグルタルアルデヒドと架橋させてトランスアミナーゼ架橋酵素凝集体が得られる。
【００１７】
さらに、固定化トランスアミナーゼは、トランスアミナーゼ包埋−架橋固定化酵素であり、好ましくは、トランスアミナーゼ包埋−架橋酵素は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されるアミノ酸配列を基に、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ＋Ｅ３６８Ｐ＋Ｔ１０７Ａ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｑ３４６Ｅ、及びＴ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌというアミノ酸突然変異部位を有するトランスアミナーゼ突然変異体の包埋−架橋固定化酵素であり、好ましくは、トランスアミナーゼ突然変異体中の遊離アミノ基とグルタルアルデヒドとでシッフ塩基を生成して架橋してトランスアミナーゼ架橋酵素が得られて、トランスアミナーゼ架橋酵素をポリアクリルアミドゲル格子に包埋してトランスアミナーゼ包埋−架橋固定化酵素が得られる。
【００１８】
さらに、固定化トランスアミナーゼは、トランスアミナーゼ突然変異体を担体に共有結合させた共有結合固定化酵素であり、好ましくは、共有結合固定化酵素は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されるアミノ酸配列を基に、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ａ９５Ｐ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｑ３８０Ｌ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｋ５１Ｒ＋Ｗ１８７Ｙ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｅ３６８Ｐ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｈ３３３Ｋ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ＋Ｅ３６８Ｐ＋Ｔ１０７Ａ及びＴ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ＋Ｅ３６８Ｐ＋Ｔ１０７Ａ＋Ａ２８６Ｔというアミノ酸突然変異部位を有するトランスアミナーゼ突然変異体の共有結合固定化酵素であり、好ましくは、担体は、キトサン担体、樹脂担体であり、より好ましくは、キトサン担体は、ヒドロキシル基及び／又はアミノ基によりトランスアミナーゼ突然変異体と共有結合されて共有結合固定化酵素を形成し、より好ましくは、樹脂担体は、スチレンとメタクリル酸エステルとの共重合体、ポリスチレン樹脂及びポリメタクリレート樹脂から選択される任意の１種であるマトリックスと、Ｃ２の短鎖アミノ基、Ｃ４の中鎖アミノ基、Ｃ６の長鎖アミノ基又はエポキシ基から選択される、マトリックスに結合される官能基とを含み、さらに好ましくは、樹脂担体は、ＥＣＲ８３０９、ＥＣＲ８３１５、ＥＣ−ＨＦＡ、ＬＸ−１０００ＨＡ、ＬＸ−１０００ＥＡ、ＥＣＲ８４０９、ＥＣＲ８４１５、ＥＣ−ＥＰ、ＥＣ ＥＰ４０３、ＥＸＥ１１９、ＬＸ−１０００ＥＰ、Ｉｍｍｏｂｅａｄ−１５０Ａ、Ｉｍｍｏｂｅａｄ−１５０Ｐ、Ｉｍｍｏｂｅａｄ３５０Ａ、ＥＣＲ８２０６、ＥＣＲ８２０９、ＥＣＲ８２１５又はＥＣＲ８２８５から選択される。
【００１９】
さらに、固定化トランスアミナーゼは、トランスアミナーゼ突然変異体及び担体を金属イオンによりキレート化して形成されるキレート化固定化酵素であり、好ましくは、キレート化固定化酵素は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されるアミノ酸配列を基に、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ａ９５Ｐ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ＋Ｅ３６８Ｐ＋Ｔ１０７Ａ＋Ｇ２０１Ｃ及びＴ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ＋Ｅ３６８Ｐ＋Ｔ１０７Ａ＋Ａ２８６Ｔというアミノ酸突然変異部位を有するトランスアミナーゼ突然変異体のキレート化固定化酵素であり、好ましくは、担体は、多孔質ガラス担体であり、さらに好ましくは、多孔質ガラス担体は、ＥｚｉＧ−１０１、ＥｚｉＧ−１０２又はＥｚｉＧ−１０３である。
【００２０】
さらに、固定化トランスアミナーゼは、トランスアミナーゼ突然変異体及び担体を物理的吸着によって結合させた吸着固定化酵素であり、好ましくは、吸着固定化酵素は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されるアミノ酸配列を基に、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ａ９５Ｐ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｈ３３３Ｋ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｑ３４６Ｅ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｎ４１２Ｇ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ＋Ｅ３６８Ｐ＋Ｔ１０７Ａ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ＋Ｅ３６８Ｐ＋Ｔ１０７Ａ＋Ａ２８６Ｔ及びＴ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ＋Ｅ３６８Ｐ＋Ｔ１０７Ａ＋Ｇ２０１Ｃというアミノ酸突然変異部位を有するトランスアミナーゼ突然変異体の共有結合固定化酵素であり、好ましくは、担体は、樹脂担体であり、より好ましくは、樹脂担体は、スチレンとメタクリル酸エステルとの共重合体、ポリスチレン樹脂及びポリメタクリレート樹脂から選択される任意の１種であるマトリックスと、オクタデシル基というマトリックスに結合される官能基とを含み、さらに好ましくは、樹脂担体は、ＥＣＲ８８０６、ＥＣＲ１０３０、ＥＣＲ１０９０、ＥＣＲ１０６１、ＥＣＲ１０９１、ＥＣＲ８８０４、Ｉｍｍｏｂｅａｄ−ＥＣ１、Ｉｍｍｏｂｅａｄ−Ｓ６０Ｓ、Ｉｍｍｏｂｅａｄ−Ｓ８６１、Ｘ１７Ｓ０４０９、ＥＸＥ１２０又はＤｉａｉｏｎから選択される。
【００２１】
本発明の第５の態様は、上記いすれか１種のトランスアミナーゼ突然変異体又は上記いすれか１種の固定化トランスアミナーゼを用いて、ケトン化合物及びアミノ基供与体に対してアミノ基転移反応を触媒するステップを含むキラルアミンの製造方法を提供する。
【００２２】
さらに、トランスアミナーゼは、上記いずれか１種のトランスアミナーゼ突然変異体であり、上記方法は、バッチ反応であり、好ましくは、バッチ反応の反応系は、水相反応系である。
【００２３】
さらに、トランスアミナーゼは、上記いずれか１種の固定化トランスアミナーゼであり、上記方法は、連続的な反応であり、好ましくは、連続的な反応の反応系は、有機相反応系である。
【００２４】
さらに、ケトン化合物は、
【化２】
2021505184.tif 000003
であり、ここで、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、Ｃ１〜Ｃ８アルキル基、Ｃ５〜Ｃ１０シクロアルキル基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基又はＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基であり、或いは、Ｒ１及びＲ２は、カルボニル基の炭素とともにＣ５〜Ｃ１０ヘテロ環基、Ｃ５〜Ｃ１０炭素環基又はＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基を形成し、Ｃ５〜Ｃ１０ヘテロ環基及びＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基中のヘテロ原子はそれぞれ独立して、窒素、酸素及び硫黄から選択される少なくとも１つであり、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基中のアリール基、Ｃ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基中のヘテロアリール基、Ｃ５〜Ｃ１０炭素環基中の炭素環基又はＣ５〜Ｃ１０ヘテロ環基中のヘテロ環基はそれぞれが独立して、置換されていないか、又はハロゲン、アルコキシ基もしくはアルキル基のうちの少なくとも１つの基で置換され、好ましくは、ケトン化合物は
【化３】
2021505184.tif 000004
であり、アミノ基転移反応生成物は
【化４】
2021505184.tif 000005
であり、好ましくは、アミノ基供与体は、イソプロピルアミンである。
【００２５】
本発明の技術手段を応用して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されるアミノ酸配列のトランスアミナーゼに対して指向性進化を行うことにより、スクリーニングしてその酵素活性及び／又は安定性が大幅に向上した一連のトランスアミナーゼ突然変異体が得られ、これらの突然変異体のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されるアミノ酸配列が、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃを含む部位に突然変異が発生したアミノ酸配列である。上記突然変異部位を含むトランスアミナーゼ突然変異体は、相対的な極限環境において応用することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
なお、本願の実施例及び実施例の特徴は、矛盾しない限り、互いに組み合わせることができる。以下、実施例により本発明を詳細に説明する。
【００２７】
名称の解釈：
部位特異的な突然変異とは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの方法で標的ＤＮＡ断片（ゲノムであってもよいし、プラスミドであってもよい）に、塩基の添加、削除、部位突然変異などを含む所望の変化（一般的には、有利な方向への変化を表徴する）を導入することを指す。部位特異的な突然変異は、ＤＮＡで発現された標的タンパク質の性状及び表徴を迅速で効率的に向上させることができ、遺伝子研究において非常に有用な方法である。
【００２８】
全プラスミドＰＣＲで部位特異的な突然変異を導入する手段は、簡単かつ効率的であり、現在多く使われている手段である。その原理は、突然変異部位を含む一対のプライマー（フォワード、リバース）と、テンプレートプラスミドとをアニーリングした後、ポリメラーゼで「サイクル伸長」することである。いわゆるサイクル伸長とは、ポリメラーゼでテンプレートに従ってプライマーが伸長し、１回り伸長させた後、ポリメラーゼがプライマーの５’端に戻って伸長が終止し、さらに、加熱、アニール、伸長というサイクルを繰り返すことを経ることを指す。この反応は、ローリングサークル増幅とは異なり、複数のタンデムコピーを形成することがない。フォワードのプライマーの伸長生成物とリバースのプライマーの伸長生成物とがアニーリングされた後に、切れ込みを有する開環状プラスミドとなるようにペアリングする。ＤｐｎIで伸長生成物を酵素消化し、元のテンプレートプラスミドが通常の大腸菌に由来し、ｄａｍメチル化で修飾されているので、ＤｐｎIに高感受性で切断されやすく、一方、生体外で合成した突然変異配列を有するプラスミドは、メチル化されていないので、切られておらず、従って、それ以降の形質転換において形質転換に成功にし、突然変異プラスミドのクローンが得られ可能である。突然変異プラスミドを宿主細胞に移転し、目的タンパク質の発現を誘発する。
【００２９】
エラープローンＰＣＲとは、エラープローン条件下でのＰＣＲ、すなわち複製されたＤＮＡ配列にエラーが発生しやすいＰＣＲ技術と意味し、ミスマッチＰＣＲ又は傾向エラーＰＣＲとも呼ばれる。具体的には、低忠実度のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを利用しＰＣＲ反応条件を変更し、ＤＮＡ複製の忠実度を低減し、新たなＤＮＡ鎖合成の過程において塩基ミスマッチを増加させることにより、増幅産物に多くの点突然変異を発生させる、ＤＮＡ配列の変異をインビトロで誘導する方法を指す。
【００３０】
エラープローンＰＣＲは、現在、一番簡単かつ効果的な遺伝子インビトロランダム変異誘発技術であり、その原理は、塩基の異性化はミスマッチの可能性を提供し、ＤＮＡを構成する４種の塩基は、いずれも互変異性体を有し、そのうち、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）及びチミン（Ｔ）の３種の酸素含有塩基は、ケトン形態及びエノール形態の２種の互変異性体を有する。アデニン(Ａ)及びチミンの２種の窒素含有塩基は、アミン形態、イミド形態の２種の互変異性体を有する。Ｇ、Ｃ及びＴは、主にケトン形態の構造を有し、エノール形態の構造の比率が非常に低く、Ａ及びＴの２種の窒素含有塩基上の窒素原子は、主に、アミノ基（ＮＨ２）状態で存在して、イミノ基（ＮＨ）状態で存在する比率が非常に低い。異なる同分異性体では、水素原子の位置が異なり、同一の位置における電子雲の偏向が異なることにより、塩基のペアリング形態が変化し、このように、複製された子鎖にミスマッチが発生する可能性がある。例えば、チミンがケトン形態で存在する場合に、アデニンとペアリングするが、エノール形態で存在する場合、グアニンとペアリングし、このように、ＡがＣとペアリングすることができ、ＴがＧとペアリングすることができる不安定性の塩基対が出現し、ミスマッチになる。
【００３１】
既知のいくつかの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのうち、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのミスマッチ率が最も高い。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼは、発見された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのうちの活性が最も高い１種であり、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有し、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有さないため、合成において、いくつかの単一のヌクレオチドミスマッチに対して校正機能を有さないため、３’−５’校正活性を有するＤＮＡポリメラーゼよりもミスマッチ発生率が高い。ＤＮＡポリメラーゼの忠実度は、濃度が異なっている４種のｄＮＴＰの使用、Ｍｎ２＋の添加、Ｍｇ２＋濃度の増加などを含む多種の方法により低減することができる。各変異誘発方法は、増幅ＤＮＡ鎖に塩基変異を引き起こすメカニズムが異なる。ＭｎＣｌ２は、ＤＮＡポリメラーゼの変異誘発因子であり、Ｍｎ２＋の添加は、ポリメラーゼの鋳型に対する特異性を低減し、ミスマッチ率を向上させることができ；４種のｄＮＴＰｓの濃度のアンバランスにより、塩基が誤りに取り込まれる確率を向上させ、ミスマッチを実現することができ；Ｍｇ２＋は、Ｔａｑ酵素を活性化する作用を有し、Ｍｇ２＋の濃度を正常の用量を超えたように増加させることにより、非相補的な塩基対を安定させることができ；Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの用量を向上させ、そして、各循環延長の時間を増加させることは、ミスマッチ終端の延長する確率を増加させることができ；開始鋳型の濃度を低減することにより、後のＰＣＲ循環の変異鋳型の比率が増加させることができる。
【００３２】
固定化酵素とは、一定の空間内において、その触媒作用が繰り返し連続的に使用可能な酵素を指す。一般的に、酵素触媒作用は、いずれも水溶液において行われることに対して、固定化酵素は、水溶性酵素を水に溶解しないが、依然として酵素活性を有するように物理又は化学的方法で処理されたものである。酵素を固定化した後に、一般的に、安定性が増加し、反応系から分離しやすく、制御しやすく、複数回使用することができ、容易に輸送し貯蔵し、自動化生産に役立つが、活性が低下し、使用範囲が減少する。
【００３３】
固定化酵素担体マトリックスとは、固定化酵素担体の骨格を形成する材料を指す。
【００３４】
本発明に係る１ｗｔとは、いずれも基質１ｇの転化にトランスアミナーゼ突然変異体の組換え湿細胞１ｇを必要とすることを意味する。
【００３５】
本願において、かかる１Ｖは、反応系の体積／基質の質量に等しい。
【００３６】
本願は、従来技術におけるトランスアミナーゼ活性の極限環境における耐性が低く応用が制限されるという問題を解決するためである、本願の１つの典型的な実施態様は、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）に由来する、Ｒ４１６Ｔ部位に突然変異が発生したトランスアミナーゼに対して指向性進化を行った結果、一種類のトランスアミナーゼ突然変異体を得た。該トランスアミナーゼ突然変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示される配列にＴ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ部位を含む部位にアミノ酸突然変異が発生した配列を有する。相対的な極限環境において、Ｒ４１６Ｔ＋Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ部位に突然変異が発生したトランスアミナーゼ突然変異体のトランスアミナーゼ活性は、Ｒ４１６Ｔ突然変異体より顕著に向上している。
【００３７】
以下、試験により上記技術手段及び技術的効果を説明する。
【００３８】
一、極限環境に対する耐性が向上した突然変異体のスクリーニング
本願は、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）に由来するトランスアミナーゼを改善して、酵素活性が向上したＲ４１６Ｔ突然変異体であって、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ  ＮＯ：１に示されている如きＲ４１６Ｔ突然変異体を得る。該酵素は、活性が高いが、安定性は理想的ではない。該酵素の安定性を向上させるために、更にＲ４１６Ｔ突然変異体を鋳型として、Ｑ７８Ｃ＋Ａ３３０Ｃ、Ｖ１３７Ｃ＋Ｇ３１３Ｃ、Ａ２１７Ｃ＋Ｙ２５２Ｃ、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ、Ｌ２９５Ｃ＋３２８Ｃという５組の二重点突然変異が設計され、プライマー配列は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｅｓｉｇｎウェブページで設計されたものである。全プラスミドＰＣＲの方式により、突然変異体Ｒ４１６Ｔに突然変異部位を導入して、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）を発現ベクターとし、新たな突然変異部位を有する突然変異プラスミドを得る。
【００３９】
突然変異プラスミドを大腸菌細胞内に転換し、２５℃、０．１ｍＭのＩＰＴＧというトランスアミナーゼ誘発発現の最適な条件で、一晩越し誘発して、細胞を超音波処理によって破壊する方法で粗酵素を得る。突然変異菌株が発現した酵素液を、４５〜５０℃、ｐＨ９．５、２０％のＤＭＳＯの極限環境において１ｈ処理して、基質１又は基質２を添加し、１ｗｔの酵素量でこの条件で続いて１６ｈ反応させた後、転換率を検出する。この方式で安定性が向上した突然変異体がスクリーニングされ、そのうち、Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ部位の突然変異体（Ｒ４１６Ｔ＋Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ）活性がＲ４１６Ｔ突然変異体より顕著に向上し、この条件で、Ｒ４１６Ｔ触媒の転換率が１５％であり、突然変異体Ｒ４１６Ｔ＋Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ触媒の転換率が７２％であった。
【００４０】
さらに、Ｒ４１６Ｔ＋Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ突然変異体を雌親とし、３３対の部位特異的突然変異誘発（具体的なプライマーはＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｅｓｉｇｎウェブページで設計される）（Ｍ３５６Ｌ、Ｗ３６０Ｌ、Ｆ３６４Ｌ、Ｃ４０４Ｌ、Ｍ４３０Ｌ、Ｍ４３８Ｌ、Ｃ４４５Ａ、Ｆ４４９Ｖ、Ｒ４０５Ｅ、Ｒ４０５Ａ、Ｋ９０Ｇ、Ｋ１９０Ｒ、Ｋ２１９Ｔ、Ｋ３０４Ｄ、Ｋ５１Ｒ、Ｗ１８７Ｙ、Ｋ１９３Ｅ、Ｋ１４３Ｒ、Ｎ１５１Ｍ、Ｓ８Ｐ、Ａ３３Ｐ、Ａ９５Ｐ、Ｅ３６８Ｐ、Ｑ３４６Ｅ、Ｈ３３３Ｋ、Ｄ３７１Ｇ、Ｅ２４６Ａ、Ｃ３２８Ａ、Ｎ４１２Ｇ、Ｔ４０２Ｐ、Ｔ１０７Ｆ、Ｔ１０７Ａ、Ｇ１１０Ｐ）を設計し、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｅｓｉｇｎウェブページでプライマー配列を設計し、部位特異的突然変異誘発手段を利用して、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）を発現ベクターとして、目的遺伝子を有する突然変異プラスミドを得る。突然変異プラスミドを大腸菌細胞内に転換し、２５℃、０．１ｍＭのＩＰＴＧというトランスアミナーゼ誘発発現の最適な条件で、一晩越し誘発する。細胞を超音波処理によって破壊する方法によって粗酵素を得る。
【００４１】
突然変異菌株が発現した酵素液を、３０〜４５℃、ｐＨ９．５〜１０、５０％のＤＭＳＯという極限環境において１ｈ処理して、基質１又は基質２を添加し、この条件で１６ｈ連続的に反応させて転換率を検出する。この方式で温度、ｐＨ及び有機溶媒の耐性が向上した突然変異体をスクリーニングする。スクリーニング結果は、突然変異部位がＭ３５６Ｌ、Ｆ３６４Ｌ、Ｃ４０４Ｌ、Ｍ４３０Ｌ、Ｒ４０５Ｅ、Ｒ４０５Ａ、Ｋ９０Ｇ、Ｋ２１９Ｔ、Ｋ３０４Ｄ、Ｋ５１Ｒ、Ａ９５Ｐ、Ｅ３６８Ｐ、Ｑ３４６Ｅ、Ｈ３３３Ｋ、Ｄ３７１Ｇ、Ｅ２４６Ａ、Ｃ３２８Ａ、Ｎ４１２Ｇ、Ｔ４０２Ｐ、Ｔ１０７Ｆ、Ｔ１０７Ａ、Ｇ１１０Ｐにある突然変異体は、３０℃、ｐＨ９．５、５０％のＤＭＳＯという環境に対する耐性がＲ４１６Ｔ＋Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ突然変異体より８％〜４０％向上したことである。いくつかの突然変異体は、４５℃、ｐＨ９．５、５０％のＤＭＳＯという環境に対する耐性がＲ４１６Ｔ＋Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ突然変異体より１．７倍〜２．１倍向上し、いくつかの突然変異体は、４０℃、ｐＨ１０、５０％のＤＭＳＯという環境に対する耐性がＲ４１６Ｔ＋Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ突然変異体より３．７倍〜３．９倍向上した。
【００４２】
Ｒ４１６Ｔ＋Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ突然変異体を雌親とし、部位特異的突然変異誘発してスクリーニングされた、異なる極限環境における耐性が向上した具体的な突然変異体は、表１及び表２に示す。
【００４３】
【表１】
2021505184.tif 000006
【００４４】
【表２】
2021505184.tif 000007
【００４５】
より理想的な突然変異体を簡単かつ効果的にスクリーニングするために、本願は、エラープローンＰＣＲ技術を用いてＲ４１６Ｔ＋Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ突然変異体に対してランダム突然変異を行う。
【００４６】
本願は、エラープローンＰＣＲ方法によって、得られる目的遺伝子断片をｐＥＴ−２２ｂに結合し、目的遺伝子を有する突然変異プラスミドを得る。突然変異プラスミドを大腸菌細胞内に転換し、２５℃、０．１ｍＭのＩＰＴＧというトランスアミナーゼ誘発発現の最適な条件で、一晩越し誘発する。最後に、細胞を超音波処理によって破壊する方法によって粗酵素を得る。
【００４７】
突然変異菌株が発現した酵素液を、３０〜４５℃、ｐＨ９〜１０、有機溶媒の濃度として５０％のＤＭＳＯ又は３５％のＭｅＯＨという極限環境において１ｈ処理して、基質１又は基質２を添加し、この条件で１６ｈ連続的に反応させて転換率を検出する。この方式で温度、ｐＨ及び有機溶媒に対する耐性が向上した突然変異体をスクリーニングする。スクリーニング結果は、突然変異部位がＫ６９Ｎ、Ｇ２０１Ｃ、Ｑ３８０Ｌ、Ｋ１９３Ｉ、Ｉ２９７Ｌ、Ｒ３０５Ｈ、Ｆ１１１Ｙ、Ｋ１９０Ｅ、Ａ２８６Ｔにある突然変異体は、３０℃、ｐＨ９．５、５０％のＤＭＳＯという環境に対する耐性がＲ４１６Ｔ＋Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ突然変異体より１６％〜４５％向上し、いくつかの突然変異体は、４０℃で、ｐＨが１０で、５０％のＤＭＳＯ環境に対する耐性がＲ４１６Ｔ＋Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ突然変異体より１１７％〜５３７％向上し、いくつかの突然変異体は、３０℃で、ｐＨが８で、３５％のＭｅＯＨ環境に対する耐性が雌親より２３３％〜６４９％向上した。
【００４８】
Ｒ４１６Ｔ＋Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ突然変異体を雌親とし、エラープローンＰＣＲによりスクリーニングされた、異なる極限環境における耐性が向上する具体的な突然変異体は、表３〜表５に示す。
【００４９】
【表３】
2021505184.tif 000008
【００５０】
【表４】
2021505184.tif 000009
【００５１】
【表５】
2021505184.tif 000010
【００５２】
安定性及び耐性がより高いトランスアミナーゼをさらに進化させるために、本願は、これらのトランスアミナーゼの安定性及び耐性が向上する部位に対して複数点組み合わせ突然変異を行って、指向性スクリーニングの方法により安定性及び耐性をさらに向上させる複数点突然変異体を得る。
【００５３】
組み合わせ突然変異を行う突然変異部位は、Ｋ５１Ｒ、Ｗ１８７Ｙ、Ｒ４０５Ｅ、Ｋ９０Ｇ、Ａ９５Ｐ、Ｋ３０４Ｄ、Ｑ３８０Ｌ、Ｅ３６８Ｐ、Ｑ３４６Ｅ、Ｈ３３３Ｋ、Ｄ３７１Ｇ、Ｅ２４６Ａ、Ｃ３２８Ａ、Ｎ４１２Ｇ、Ｔ４０２Ｐ、Ｔ１０７Ｆ、Ｔ１０７Ａ、Ｇ１１０Ｐ、Ｉ２９７Ｌ、Ｋ６９Ｎ、Ｇ２０１Ｃ、Ａ２８６Ｔに由来する。
【００５４】
該組み合わせ突然変異は、これらの部位を任意に組み合わせる。具体的には、Ｋ５１Ｒ＋Ｗ１８７Ｙ、Ｒ４０５Ｅ＋Ａ９５Ｐ、Ｒ４０５Ｅ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ、Ｒ４０５Ｅ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｅ３６８Ｐ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｑ３４６Ｅ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｈ３３３Ｋ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｄ３７１Ｇ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｅ２４６Ａ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｃ３２８Ａ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｎ４１２Ｇ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｔ４０２Ｐ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｔ１０７Ｆ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｔ１０７Ａ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｇ１１０Ｐ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ＋Ｅ３６８Ｐ＋Ｔ１０７Ａ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ＋Ａ２８６Ｔ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ＋Ｅ３６８Ｐ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ＋Ｅ３６８Ｐ＋Ｔ１０７Ａ＋Ｋ６９Ｎ、Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ＋Ｅ３６８Ｐ＋Ｔ１０７Ａ＋Ｇ２０１Ｃ及びＲ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ＋Ｅ３６８Ｐ＋Ｔ１０７Ａ＋Ａ２８６Ｔの突然変異組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【００５５】
突然変異プラスミドを大腸菌細胞内に転換し、２５℃、０．１ｍＭのＩＰＴＧというトランスアミナーゼ誘発発現の最適な条件で、一晩越し誘発する。細胞を超音波処理によって破壊する方法によって粗酵素を得る。
【００５６】
より極限な条件で、４５℃、ｐＨ９．５〜１０、５０％のＤＭＳＯ又は３５％のＭｅＯＨという環境において酵素液を１ｈ処理して、基質１を添加し、この条件で１６ｈ連続的に反応させて転換率を検出する。いくつかの組み合わせ突然変異体は、４０℃、ｐＨ１０、５０％のＤＭＳＯという環境に対する耐性が雌親より２３１％〜６１０％向上し、いくつかの突然変異体は、３０℃で、ｐＨが８で、３５％のＭｅＯＨ環境に対する耐性が雌親より２１３％〜９９０％向上し、いくつかの突然変異体は、４５℃で、ｐＨが８で、４０％のＭｅＯＨ環境に対する耐性が雌親より３０００％あまり向上する。具体的な耐性が向上する組み合わせ突然変異体は表６〜表８に示す。
【００５７】
【表６】
2021505184.tif 000011
【００５８】
【表７】
2021505184.tif 000012
【００５９】
【表８】
2021505184.tif 000013
【００６０】
二、本願のトランスアミナーゼ突然変異体に対する固定化
２．１トランスアミナーゼ架橋酵素凝集体（ＣＬＥＡｓ）の製造
本願において、Ｒ４１６Ｔ＋Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃという雌親突然変異体、雌親突然変異体に基づいてクリーニングされた単一点突然変異体及び組み合わせ突然変異体のトランスアミナーゼに対して架橋法による固定化を行って、トランスアミナーゼ架橋酵素凝集体を製造する。
【００６１】
一般的には、架橋酵素凝集体の製造は、主に、（１）酵素タンパク質凝集沈殿体の形成、（２）沈殿体間の架橋という２つのステップで行われる。
【００６２】
酵素タンパク質を、塩析法、等電点沈殿法、重金属塩沈殿法又は有機溶媒沈殿法などの方法により凝集沈殿させて、酵素タンパク質沈殿体（Ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）を得る。一般的には、このような酵素タンパク質は、可逆的沈殿物であり、水溶液において再度溶解することができる。
【００６３】
タンパク質が沈殿した後、架橋剤を添加してタンパク質沈殿体間を共有結合によりさらに結合し、水不溶性沈殿−架橋酵素凝集体を形成する。使用される架橋剤は、二官能試薬又は多官能試薬であり、二官能試薬は、グルタルアルデヒド、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡ）、ビスマレイミドなどを有し、多官能試薬は、デキストラン（分子量が６ＫＤａ〜２００ＫＤａである）を有する。酵素タンパク質の遊離しているアミノ基、フェノール基、イミダゾール基及びメルカプト基は、いずれも架橋反応に参加することができる。
【００６４】
固定化酵素液を調製する緩衝液には、０．４〜１ｍｇ／ｍＬのＰＬＰが含まれており、酵素液のｐＨが７．０〜８．０である。酵素タンパク質沈殿体を製造する沈殿剤は、エタノール、イソプロパノール及び／又は硫酸アンモニウムであり、沈殿剤の最終濃度は９０％である。酵素タンパク質の架橋凝集体を製造する架橋剤は、２５％のグルタルアルデヒド溶液であり、グルタルアルデヒドの最終濃度は２００ｍＭ〜５００ｍＭである。
【００６５】
製造された架橋酵素凝集体として、濾過された水含有架橋酵素をそのまま水相に利用して触媒反応させるか、又は凍結乾燥して乾燥粉末を得てから応用できる。凍結乾燥粉末は、有機溶媒相における反応に応用することもできる。架橋酵素凝集体は、一度使用された後に、遠心分離又は濾過などの方式により回収して再利用できる。第１回の使用に比べて活性の損失が＜５％の範囲内において再利用回数を統計したら、架橋酵素凝集体の水相反応における応用は、遊離酵素に比べて、活性の回収＞８０％であり、雌親Ｒ４１６Ｔ＋Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃは３回再利用することができるが、雌親に基づく単一点突然変異体及び／又は組み合わせ突然変異体の再利用回数が雌親より顕著に増加し、最も良い突然変異体の再利用回数が１３回であった。
【００６６】
いくつかの突然変異体の架橋酵素は、３５％のメタノール含有の体系の反応において少なくとも６回再利用することができる。突然変異体の遊離酵素活性の安定性が向上し、固定化後に酵素の活性回収及び再利用回数も増加する。
【００６７】
架橋酵素を使用して触媒反応させ、反応後処理を行って水相から有機溶媒を使用して製品を抽出し、乳化現象が顕著に軽減する。架橋酵素の製造は、担体を必要とせず、コストが低く、架橋酵素を使用して触媒反応させると、再利用回数が多く、使用回数を統計したら、酵素用量が低下し、使用コストが遊離酵素より低い。架橋酵素凍結乾燥粉末は、１００％の有機溶媒において反応し、雌親を２回目再利用する場合に、その活性が一回目より損失が＞１０％である。一方、いくつかの突然変異体の再利用が５回であり、活性が１回目より損失が＜５％である。
【００６８】
２．２トランスアミナーゼの包埋−架橋固定化方法
ＣＬＥＡｓは、担体の支持がなく、固定化酵素の粒子が小さく（＜１０μｍ）、機械的強度が低く、酵素を濾過し回収する過程において酵素が硬化しやすく、次回に使用する場合に、反応系においてうまく分散することができない。この問題を解決するために、架橋及び包埋の２種の技術を組み合わせてグルタルアルデヒドを架橋剤として用いて、酵素液、アクリルアミド及びメチレンビスアクリルアミドの混合液に、グルタルアルデヒドを滴下して自由酵素とでシッフ塩基を形成して架橋酵素凝集体が製造され、そして、開始剤である過硫酸アンモニウムを添加してポリアクリルアミドゲルを形成し、架橋酵素凝集体がポリアクリルアミドゲルマトリックス内に包埋されて、安定した固定化酵素を得る。
【００６９】
本願において、Ｒ４１６Ｔ＋Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃという雌親突然変異体、雌親突然変異体に基づいてクリーニングされて得られた単一点突然変異体及び組み合わせ突然変異体のトランスアミナーゼに対して包埋−架橋固定化を行って、包埋−架橋酵素を製造する。
【００７０】
製造された包埋−架橋酵素は、活性の回収が＞８０％であり、水相反応において１回使用した後に、濾過などの方式により非常に容易に回収して再利用でき、第１回の使用に比べて、活性の損失が＜５％の範囲内において再利用回数を統計したら、雌親Ｒ４１６Ｔ＋Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃは８回再利用することができるが、雌親に基づく単一点突然変異体及び／又は組み合わせ突然変異体の再利用回数が雌親より顕著に増加し、最も良い突然変異体の再利用回数が１８回であった。
【００７１】
いくつかの突然変異体の包埋−架橋酵素は、３５％のメタノール含有の体系の反応において少なくとも１２回再利用することができる。後処理を行って水相から有機溶媒を使用して製品を抽出し、乳化現象が顕著に軽減する。
【００７２】
２．３トランスアミナーゼの吸着固定化方法
酵素分子と水不溶性担体を静電作用、水素結合、疎水性作用及び他の方式により吸着し結合して吸着固定化酵素を製造することができる。該方法は、条件が温和であり、酵素の変性を引き起こしにくいが、水溶液において酵素が担体から容易に解離してしまい、回収して再利用できないため、吸着法により製造された固定化酵素は、主に、有機溶媒における反応に応用される。
【００７３】
吸着固定化酵素に使用可能な担体は、無機担体及び高分子担体の２類に分けられる。無機担体は、活性炭、多孔質ガラス、酸性白土、漂白土、カオリナイト、アルミナ、シリカゲル、ベントナイト、ハイドロキシアパタイト、リン酸カルシウム、金属酸化物などが挙げられ、高分子担体は、デンプン、グルテリン、マクロポーラス合成樹脂、セラミックなどが挙げられる。
【００７４】
本願で使用される担体は、マクロポーラス合成樹脂担体であり、ポリスチレン樹脂、ポリメタクリレート樹脂、又はスチレン及びメタクリル酸エステルの共重合体を含むが、これらに限定されないマトリックスと、該マトリックスを選択的に修飾する官能基を含む。そのほか、各種の担体は、オクタデシル基により修飾することができる。以下の表９に列挙されたものは、本願におけるトランスアミナーゼの吸着固定化に適用される担体である。
【００７５】
【表９】
2021505184.tif 000014
【００７６】
本願は、トランスアミナーゼをマクロポーラス樹脂担体と直接的に疎水性結合、水素結合などの物理的方式により結合する。
【００７７】
Ｒ４１６Ｔ＋Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃという雌親突然変異体、雌親突然変異体に基づいてクリーニングされて得られた単一点突然変異体及び組み合わせ突然変異体のトランスアミナーゼに対して物理的吸着結合方法による固定化を行う。
【００７８】
酵素溶液の調製に使用される緩衝液には、０．４−１ｍｇ／ｍＬのＰＬＰが含まれ、緩衝液のｐＨが７．０〜８．０であり、緩衝塩がＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４、Ｔｒｉｓ−Ｃｌ又はホウ酸−水酸化ナトリウムである。
【００７９】
製造される吸着固定化酵素は、窒素ガスによる通風乾燥、真空乾燥、凍結乾燥などの方式により乾燥処理される。
【００８０】
本願は、トランスアミナーゼを吸着の方式により上記担体に結合し、活性の回収が＞８０％であり、有機溶剤において反応し、固定化酵素を、濾過又は注射器により液体を吸い出す方式により回収し、再利用することができる。１回目の使用に比べて、活性の損失が＜５％の範囲内において再利用回数を統計したら、いくつかの突然変異体の固定化酵素については、６回再利用でき、活性の損失が＜５％であった。
【００８１】
２．４トランスアミナーゼの共有結合固定化方法
酵素の共有結合固定化は、酵素タンパク質の非必須基と水不溶性担体を共有結合により不可逆な結合を形成することであり、温和な条件でカップリング可能なタンパク質基は、アミノ基、カルボキシル基、システインのメルカプト基、ヒスチジンのイミダゾール基、チロシンのフェノール基、セリンの水酸基及びスレオニンの水酸基を含む。担体と共有結合される基は、一般的に、酵素が活性を生かすことに必要な基であってはいけない。
【００８２】
２．４．１共有結合固定化酵素担体
固定化酵素担体は、シリカ、ガラス、ミネラル及び珪藻土などのような無機材料であってもよく、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、アガロース、ペクチン、キトサンなどのような天然有機材料であってもよく、ポリスチレン樹脂、ポリメタクリレート樹脂、又はスチレン及びメタクリル酸エステルの共重合体などのような非天然有機合成ポリマーであってもよい。これらの担体は、タンパク質分子との結合に有利になるように、さらに官能基化し、例えば、担体にアミノ基、ヒドロキシル基、エポキシ基、オクタデシル基などの官能基を添加してもよい。そのうち、アミノ基及びヒドロキシル基が官能基化された担体は、酵素タンパク質分子と、イオン結合により結合でき、アミノ基型担体は、さらに酵素タンパク質分子と共有結合により結合でき、エポキシ基の官能基の担体は、主に、酵素タンパク質と、共有結合により結合され、オクタデシル基の官能基の担体は、酵素タンパク質と、疎水性作用により結合される。担体は、フィルム、チューブ、シート、ビーズ、粒子、チップ、光ファイバーなどのような任意の形状又は形態として用いることができる。
【００８３】
本願に使用される担体は、キトサン、樹脂及び多孔質ガラスである。
【００８４】
キトサンは、生体適合性が高く、形状可塑性が高く（ゲル、フィルム、繊維などの形状とすることができる）、毒性がなく、化学修飾されやすいなどの特性のため、酵素固定化の担体とすることができる（ＰｒｏｃｅｓｓＢｉｏｃｈｅｍ，２００５；４０：２８３３−４０）。キトサン自身は、水に溶解でき、水不溶性の担体粒子として製造する必要があり、製造方法は、溶媒蒸発法、乳化法及び凝集法などがある（ＭａｃｒｏｍｏｌＢｉｏｓｃｉ，２００３；３：５１１−２０）。乳化法により製造される担体は、粒子が小さく、均一であり、一般的に好ましいものである。キトサン分子は、活性的な水酸基及びアミノ基などを有し、酵素にイオン結合、水素結合及びファンデルワールス力などの作用により吸着結合できるが、吸着作用が低く、酵素が脱落しやすいので、一般的に架橋剤のホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなどによって活性化されてから酵素と共有結合により結合される。
【００８５】
本願に使用される樹脂担体は、ポリスチレン樹脂、ポリメタクリレート樹脂、ならびにスチレン及びメタクリル酸エステル共重合体を含むが、これらに限定されないマトリックスと、該マトリックスを修飾する官能基とを含む。このようなマトリックスの有する適切な官能基は、短鎖アミノ基、長鎖アミノ基及びエポキシ基を含むが、これらに限定されない。以下の表１０に列挙されたものは、本願におけるトランスアミナーゼの固定化に適用される担体である。
【００８６】
【表１０】
2021505184.tif 000015
【００８７】
本願は、トランスアミナーゼを、エポキシ基官能基を有する樹脂と共有結合により結合させたり、グルタルアルデヒドにより活性化されたアミノ基官能基を有する樹脂と共有結合により結合させたりする。
【００８８】
２．４．２共有結合固定化の方法
本願は、Ｒ４１６Ｔ＋Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃという雌親突然変異体、雌親突然変異体に基づいてクリーニングされて得られた単一点突然変異体及び組み合わせ突然変異体のトランスアミナーゼに対してそれぞれ共有結合方法による固定化を行う。
【００８９】
酵素溶液の調製に使用される緩衝液には、０．４−１ｍｇ／ｍＬのＰＬＰが含まれ、緩衝液のｐＨが７．０〜８．０であり、緩衝塩がＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４、Ｔｒｉｓ−Ｃｌ又はホウ酸−水酸化ナトリウムである。本願に使用されるキトサン分子は、３００〜５００ＫＤａを含むが、これらに限定されず、乳化法によって担体を製造し、担体をグルタルアルデヒドで活性化した後、酵素液を添加して２０℃で６時間インキュベートした後に、濾過又は遠心分離により沈殿物を収集し、緩衝液で洗浄する。
【００９０】
アミノ基担体に共有結合固定化する場合に、まず担体をグルタルアルデヒドで活性化して、酵素液を添加して２０℃で一晩越しインキュベートし、濾過し沈殿物を収集し、沈殿物を緩衝液で洗浄する。エポキシ基担体に共有結合固定化する場合に、まず酵素液及び担体を混合し、２０℃で一晩越しインキュベートし、２０ｈ静置し、濾過し沈殿物を収集し、沈殿物を緩衝液で洗浄する。
【００９１】
製造される固定化酵素は、窒素ガスによる通風乾燥、真空乾燥、凍結乾燥などの方式により乾燥処理される。
【００９２】
本願は、トランスアミナーゼを共有結合の方式により上記担体に固定化するが、キトサン担体に固定化した場合に、活性の回収が５０％〜６０％であり、短鎖アミノ基担体に固定化した場合に、活性の回収が５０％〜７０％であり、長鎖アミノ基担体に固定化した場合に、活性の回収が７０％〜８０％であり、エポキシ基担体に固定化した場合に、活性の回収が４０％〜６０％である。突然変異体の固定化酵素活性は、雌親固定化酵素より顕著に向上する。固定化酵素を、濾過又は注射器により液体を吸い出す方式により回収し、再利用することができる。１回目の使用に比べて、活性の損失が＜５％の範囲内において再利用回数を統計したら、キトサン担体に固定化したいくつかの酵素については、３回再利用でき、活性の損失が＜５％であり、短鎖アミノ基担体に固定化したいくつかの酵素については、５回再利用することができ、長鎖アミノ基担体に固定化したいくつかの突然変異体の酵素については、再利用回数が１１回となり、エポキシ基担体に固定化したいくつかの酵素については、６回再利用することができ、突然変異体の固定化酵素の再利用可能な回数は、雌親固定化酵素より顕著に向上する。共有結合固定化後のいくつかのトランスアミナーゼは、１００％有機溶媒において触媒作用が発揮でき、いくつかの突然変異体を固定化した後に、有機溶媒において反応させ、３回再利用し、活性の損失が＜５％である。３５％のメタノール溶液において触媒作用を発揮し、いくつかの突然変異体を固定化した後に、５回再利用し、活性の損失が＜５％である。
【００９３】
２．５金属イオンキレート化固定化法
多孔質ガラスは、材料が不活性であり、透水性が高いなどの特徴のため、酵素固定化のマトリックスに非常に適用される。ガラス及びそのチャネルの表面のシラノール基は、結合部位として酵素と結合され、固定化を実現するが、従来のガラスの表面のシラノール基の密度が限られ、不均一に分布し、酵素が結合することに対する立体障害が大きく、タンパク質担持量が低く（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１０，３２９，３０５−３０９、ＪＣｈｒｏｍａｔｏｇｒ，１９７６，１２５，１１５−１２７）、また、酵素が失活になりやすい。多孔質ガラスの内外表面に一層の有機ポリマーフィルムを被覆し、酵素固定化により役立つ環境を形成することができる（Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００４，２０，１０６３９−１０６４７）。ポリマーフィルムは、必要に応じて、さらに修飾し、表面に固定化に適する各種の官能基を添加してもよい。
【００９４】
ヒスチジンタグを有するタンパク質は、固相金属アフィニティークロマトグラフィにより精製され、タンパク質におけるヒスチジン残基は、水不溶性マトリックス上にキレートされた金属イオン（Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｆｅ３＋）と、キレート化作用により結合されて、そして、イミダゾール含有の緩衝液を使用して目的タンパク質を溶離することができる（Ｎａｔｕｒｅ，１９７５，２５８，５９８−５９９）。この技術に基づいて、ヒスチジンタグを有する酵素と末端に金属イオンがキレート化された担体とを特異的にキレート化し、固定化の目的を達成するとともに、このような方法による固定化の特異性が高いので、夾雑タンパク質はほとんど固定されない。
【００９５】
本願に使用されるガラス担体は、ポリマーフィルムにより多孔質ガラスの内外表面に塗布したものであり、ポリマーフィルムは、親水性のもの、例えばアクリル酸ポリマー、半親水性のスチレン及びアクリロニトリルポリマー、及び疎水性のもの、例えばクロロメチルスチレンポリマーであってよい。フィルムの表面がアミノ基により修飾され、更に２，４−ジヒドロキシアセトフェノンでアシル化され、更に２，４−ジヒドロキシアセトフェノンのヒドロキシル基によって金属イオンとキレート化し、従って、２，４−ジヒドロキシアセトフェノンのアーム作用により、一端が担体と結合され、他端が金属イオンとキレート化される。よって、ガラス担体の末端に金属イオンが持たれて、ヒスチジンタグを有するタンパク質と親和性的に結合でき、特異性固定化を実現することができる（ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２０１４，５０（６５）：９１３４−７）。キレート化された金属イオンは、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｆｅ３＋を含むが、これらに限定されない。以下の表１１に列挙されたものは、本願におけるトランスアミナーゼの固定化に適用される担体である。
【００９６】
【表１１】
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【００９７】
本願は、Ｒ４１６Ｔ＋Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃという雌親突然変異体、雌親突然変異体に基づいてクリーニングされて得られた単一点突然変異体及び組み合わせ突然変異体のトランスアミナーゼに対してそれぞれ共有結合方法による固定化を行う。
【００９８】
酵素溶液の調製に使用される緩衝液には、０．４−１ｍｇ／ｍＬのＰＬＰが含まれ、緩衝液のｐＨが７．０〜８．０であり、緩衝塩がＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４、Ｔｒｉｓ−Ｃｌ又はホウ酸−水酸化ナトリウムである。
【００９９】
多孔質ガラス担体に共有結合固定化するに対して、酵素液及び担体を直接的に混合し、２０℃で４０〜６０ｍｉｎインキュベートし、濾過し沈殿物を収集し、沈殿物を緩衝液で洗浄する。
【０１００】
製造される固定化酵素は、窒素ガスによる通風乾燥、真空乾燥、凍結乾燥などの方式により乾燥処理される。
【０１０１】
本願は、トランスアミナーゼをキレート化の方式により上記担体に結合し、活性の回収が約７０％〜８０％であり、固定化酵素を、濾過又は注射器により液体を吸い出す方式により回収し、再利用することができる。水相溶媒において反応し、１回目の使用に比べて、活性の損失が＜５％の範囲内において再利用回数を統計したら、いくつかの突然変異体の固定化酵素については、１２回再利用でき、活性の損失が＜５％であり、有機溶媒において反応し、１回目の使用に比べて、活性の損失が＜５％の範囲内において再利用回数を統計したら、いくつかの突然変異体の固定化酵素については、８回再利用できる。
【０１０２】
三、固定化トランスアミナーゼの使用方法
本願の固定化トランスアミナーゼは、基質１及び基質２で示されるアミノ基受容体を対応する第一級アミンに転換することができ、使用されるアミノ基供与体がイソプロピルアミンである。
【０１０３】
本願の固定化トランスアミナーゼは、１００％水溶液、２０％〜５０％のＤＭＳＯを含有する溶媒、３５％のメタノールを含有する溶媒又は１００％の水飽和有機溶媒（例えば、１００％の水飽和メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル又は１００％水飽和酢酸イソプロピル）という溶媒において応用することができる。
【０１０４】
本願の固定化酵素は、撹拌形態のバッチ反応において応用されてもよく、管状反応器に充填される連続フロー反応に適用されてもよい。
【０１０５】
バッチ撹拌反応の操作方式は、原料、即ち、アミノ受容体、アミノ供与体、固定化酵素、補酵素ＰＬＰ及び溶媒を一度に反応容器に添加し、機械的撹拌により１６ｈ以上反応させることである。反応が終了した後に、濾過により固定化酵素を回収し、次回の反応に応用する。
【０１０６】
連続的反応の操作方式は、固定化酵素を管状反応器に充填し、原料、即ち、アミノ受容体、アミノ供与体及び補酵素ＰＬＰを適切な溶媒で完全に溶解して反応液に調製し、プランジャポンプで反応液を、固定化酵素が充填された管状反応器に適切な流速で注入し、出口で溶媒で製品溶液を受け取ることである。
【０１０７】
連続的反応の操作時に、溶媒は、３５％のメタノール溶液又は１００％の水飽和メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルであってもよい。
【０１０８】
以下、具体的な実施例により、本願の有益な効果をさらに説明する。
【０１０９】
（実施例１）
３０℃、ｐＨ９．５、５０％ＤＭＳＯに対する突然変異体の耐性の検出
粗酵素を３０℃、ｐＨ９．５、ＤＭＳＯ濃度５０％の環境で１ｈ処理して、１０ｍＬの反応フラスコに、０．１ｇの基質を添加し、４ｅｑのイソプロピルアミン塩酸塩及び０．６〜１ｍｇのＰＬＰ（ピリドキサール５'−リン酸）を添加して、上記処理された酵素を５ｍｇ添加し、３０℃、ｐＨ９．５、ＤＭＳＯ濃度５０％の環境で１６ｈ一定温度で撹拌する。体系について、ＨＰＬＣにより転換率を検出し、突然変異体の反応データを表１２で示す。
【０１１０】
【表１２】
2021505184.tif 000017
【０１１１】
（実施例２）
４５℃、ｐＨ１０、５０％のＤＭＳＯに対する突然変異体の耐性の検出
粗酵素を４５℃、ｐＨ１０、ＤＭＳＯ濃度５０％の環境で１ｈ処理して、１０ｍＬの反応フラスコに、０．１ｇの基質１を添加し、４ｅｑのイソプロピルアミン塩酸塩及び０．６〜１ｍｇのＰＬＰ（ピリドキサール５'−リン酸）を添加して、上記処理された酵素を５ｍｇ添加し、４５℃、ｐＨ１０、ＤＭＳＯ濃度５０％の環境で、１６ｈ一定温度で撹拌する。体系について、ＨＰＬＣにより転換率を検出し、突然変異体の反応データを表１３で示す。
【０１１２】
【表１３】
2021505184.tif 000018
【０１１３】
（実施例３）
３０℃、ｐＨ８、３５％のメタノールに対する突然変異体の耐性の検出
粗酵素を３０℃、ｐＨ８、ＭｅＯＨ濃度３５％の環境で１ｈ処理して、１０ｍＬの反応フラスコに、０．１ｇの基質１を添加し、４ｅｑのイソプロピルアミン塩酸塩及び０．６−１ｍｇのＰＬＰ（ピリドキサール５'−リン酸）を添加して、上記処理された酵素を５ｍｇ添加し、３０℃、ｐＨ８、ＭｅＯＨ濃度３５％の環境で、１６ｈ一定温度で連続的に撹拌する。体系について、ＨＰＬＣにより転換率を検出し、突然変異体の反応データを表１４で示す。
【０１１４】
【表１４】
2021505184.tif 000019
【０１１５】
（実施例４）
４５℃、ｐＨ８、４０％のメタノールに対する突然変異体の耐性の検出
粗酵素を４５℃、ｐＨ８、ＭｅＯＨ濃度４０％の環境で１ｈ処理して、１０ｍＬの反応フラスコに、０．１ｇの基質１を添加し、４ｅｑのイソプロピルアミン塩酸塩及び０．６−１ｍｇのＰＬＰ（ピリドキサール５'−リン酸）を添加して、上記処理された酵素を５ｍｇ添加し、４５℃、ｐＨ８、ＭｅＯＨ濃度４０％の環境で、１６ｈ一定温度で連続的に撹拌する。体系について、ＨＰＬＣにより転換率を検出し、突然変異体の反応データを表１５で示す。
【０１１６】
【表１５】
2021505184.tif 000020
【０１１７】
（実施例５）
架橋固定化
０．１ｇの酵素粉末を２ｍＬのリン酸緩衝液（０．１ＭのＰＢ、ｐＨ７．０〜８．０、０．４〜１ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ（ピリドキサール５'−リン酸）を含有する。）で溶解し、氷水浴で撹拌し１８ｍＬのエタノール又は１８ｍＬのイソプロパノール又は硫酸アンモニウム（最終飽和度が９０％）を沈殿剤としてゆっくりと添加し、１０ｍｉｎ撹拌した後に、１．１−２．７ｍＬの２５％グルタルアルデヒド溶液（最終濃度２００〜５００ｍＭ）を添加し、氷水浴で３０〜４０ｍｉｎ撹拌して、遠心分離又は濾過し、沈殿物をリン酸緩衝液で３回洗浄して、４℃で貯蔵し、水相反応において直接的に応用することができる。又は架橋酵素凝集体を凍結乾燥させ、凍結乾燥後に得られた架橋酵素凝集体の凍結乾燥粉末は、水相及び有機相反応において応用することができる。
【０１１８】
（実施例６）
架橋酵素凝集体の水相反応の活性検出
１０ｍＬの反応フラスコに０．３ｍＬのＤＭＳＯを添加し、０．１ｇの基質１を溶解し、４ｅｑのイソプロピルアミン塩酸塩と１．０ｍｇのＰＬＰ（ピリドキサール５’−リン酸）を添加し、反応溶液の最終容量が１ｍＬになるまでに０．１ＭのＰＢ７．０を追加して、５ｍｇの酵素又は５ｍｇの酵素で製造される架橋酵素凝集体の湿潤酵素又は架橋酵素凝集体の凍結乾燥粉末を添加し、４５℃で１６ｈ撹拌する。体系について、ＨＰＬＣにより転換率を検出し、反応データを表１６で示す。
【０１１９】
【表１６】
2021505184.tif 000021
【０１２０】
（実施例７）
架橋酵素の有機相反応の活性検出
１０ｍＬの反応フラスコに１ｍＬの水飽和メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルを添加して、１０ｍｇの基質１及び４ｅｑのイソプロピルアミンを添加して、１０ｍｇの酵素粉末で製造される架橋酵素凝集体の凍結乾燥粉末を添加し、３０℃で１６ｈ撹拌する。体系について、ＨＰＬＣにより転換率を検出し、反応データを表１７で示す。
【０１２１】
【表１７】
2021505184.tif 000022
【０１２２】
（実施例８）
トランスアミナーゼの包埋−架橋固定化酵素の水相反応の活性検出
１０ｍＬの反応フラスコに０．４ｍＬのＤＭＳＯ（ＤＭＳＯ最終濃度が４０％である）を添加し、０．１ｇの基質１を溶解し、４ｅｑのイソプロピルアミン塩酸塩と１．０ｍｇのＰＬＰ（ピリドキサール５’−リン酸）を添加し、反応溶液の最終容量が１ｍＬになるまでに０．１ＭのＰＢ７．０を追加して、５ｍｇの酵素又は５ｍｇの酵素で製造される包埋−架橋固定化酵素を添加し、４５℃で１６ｈ撹拌する。体系について、ＨＰＬＣにより転換率を検出し、反応データを表１８で示す。
【０１２３】
【表１８】
2021505184.tif 000023
【０１２４】
（実施例９）
トランスアミナーゼの包埋−架橋固定化酵素の３５％ＭｅＯＨの水溶液における反応の活性検出
１０ｍＬの反応フラスコに０．３５ｍＬのメタノール（メタノール最終濃度が４０％である）を添加し、０．１ｇの基質１を溶解し、４ｅｑのイソプロピルアミン塩酸塩と１．０ｍｇのＰＬＰ（ピリドキサール５’−リン酸）を添加し、反応溶液の最終容量が１ｍＬになるまでに０．１ＭのＰＢ７．０を追加して、１０ｍｇの酵素又は１０ｍｇの酵素で製造される包埋−架橋固定化酵素を添加し、３０℃で１６ｈ撹拌する。体系について、ＨＰＬＣにより転換率を検出し、反応データを表１９で示す。
【０１２５】
【表１９】
2021505184.tif 000024
【０１２６】
（実施例１０）
トランスアミナーゼの吸着固定化方法
担体において４ｍＬの０．４ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ含有のＰＢ緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．０）を添加するとともに、０．１ｇの酵素を添加し、２０℃で８０ｒｐｍの低速度で一晩越し撹拌する。上清液を除去し、沈殿物を緩衝液で３〜４回洗浄し、更に上清液を除去し、沈殿物を窒素ガスで通風乾燥させるか、又は凍結乾燥法で乾燥させ、４℃で貯蔵する。
【０１２７】
（実施例１１）
トランスアミナーゼの吸着固定化酵素の有機相反応の活性検出
１０ｍＬの反応フラスコに１ｍＬの水飽和メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルを添加して、１０ｍｇの基質１及び４ｅｑのイソプロピルアミンを添加して、２０ｍｇの酵素で製造される固定化トランスアミナーゼを添加し、３０℃で１６ｈ撹拌する。体系について、ＨＰＬＣにより転換率を検出し、反応データを表２０で示す。
【０１２８】
【表２０】
2021505184.tif 000025
【０１２９】
（実施例１２）
キトサンが担体である固定化トランスアミナーゼ
キトサン担体の製造：５ｇのキトサン（分子量が３００ＫＤａ〜５００ＫＤａである）を２５０ｍＬの１％酢酸溶液に添加し、電子レンジで加熱溶解して水相を調製する。３００ｍＬのトルエンを２．２ｇのスパン８０及び１．２ｍＬのｎ−ヘキサノールと均一に混合し、室温で２ｈ撹拌して油相を調製する。水相を撹拌しながら油相にゆっくりと滴下して乳剤を調製して、乳剤を１．５Ｌの１２％のＮａＯＨ溶液に注ぎ、３ｈ撹拌し、１Ｌのエタノールを添加し、濾過し、濾過ケークを純水で十分に洗浄して約４０ｇの湿潤担体を得て、湿潤担体を１４０ｍＬの純水に浸して４℃で貯蔵する。
【０１３０】
活性化担体：１ミリリットル当たりの湿潤担体に、１．１ｍＬの２５％グルタルアルデヒド（グルタルアルデヒド最終濃度が２．５％である）を添加する。
【０１３１】
固定化：０．２ｇの酵素を活性化された担体に添加し、２０〜２５℃で６ｈ撹拌し、担体を洗浄し、遠心分離し、上清液を除去し、沈殿を固定化酵素として得て、４℃で貯蔵する。
【０１３２】
（実施例１３）
Ｃ６型アミノ基担体の固定化トランスアミナーゼ
活性化担体：１ｇの担体ＥＣＲ８４０９を２０ｍＭの低イオン強度の緩衝液で１〜２回洗浄し、上清液を除去し、４ｍＬの２％グルタルアルデヒド（２０ｍＭの低イオン強度の緩衝液で試薬グレードの２５％グルタルアルデヒドを希釈して調製される）を添加し、２０℃で、８０ｒｐｍで１ｈ活性化し、２０ｍＭの緩衝液で１〜２回洗浄し、上清液を除去する。
【０１３３】
固定化：活性化された担体において４ｍＬの０．４ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ含有のＰＢ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．０）を添加するとともに、０．１〜０．２ｇの酵素を添加し、２０℃で８０ｒｐｍの低速度で一晩越し撹拌する。上清液を除去し、沈殿物を緩衝液で３〜４回洗浄し、更に上清液を除去し、沈殿物を窒素ガスで通風乾燥させるか、又は凍結乾燥法で乾燥させ、４℃で貯蔵する。
【０１３４】
（実施例１４）
エポキシ基担体の固定化トランスアミナーゼ
１ｇの担体ＥＣＲ８２８５を１００ｍＭのＰＢ緩衝液で１〜２回洗浄し、上清液を除去し、４ｍＬのＢｕｆｆｅｒ（１００ｍＭのＰＢ、ｐＨ７．０、１ＭのＮａＣｌを含有する。）を添加するとともに、０．１ｇ〜０．２ｇの酵素を添加し、２０℃で８０ｒｐｍの低速度で一晩越し撹拌して（１８〜２０ｈ）、４℃で２０ｈ静置する。上清液を除去し、沈殿物をＢｕｆｆｅｒで３〜４回洗浄し、窒素ガスで通風乾燥させ、４℃で貯蔵する。
【０１３５】
（実施例１５）
共有結合固定化トランスアミナーゼの水相反応の活性検出
１０ｍＬの反応フラスコに０．４ｍＬのＤＭＳＯ（ＤＭＳＯ最終濃度が４０％である）を添加し、０．１ｇの基質１を溶解し、４ｅｑのイソプロピルアミン塩酸塩と１．０ｍｇのＰＬＰ（ピリドキサール５’−リン酸）を添加し、反応溶液の最終容量が１ｍＬになるまでに０．１ＭのＰＢ７．０を追加して、５ｍｇの酵素又は５ｍｇの酵素で製造される固定化トランスアミナーゼを添加し、４５℃で１６ｈ撹拌する。体系について、ＨＰＬＣにより転換率を検出し、反応データを表２１で示す。
【０１３６】
【表２１】
2021505184.tif 000026
【０１３７】
（実施例１６）
共有結合固定化トランスアミナーゼの３５％ＭｅＯＨの水溶液における反応の活性検出
１０ｍＬの反応フラスコに０．３５ｍＬのメタノール（メタノール最終濃度が４０％である）を添加し、０．１ｇの基質１を溶解し、４ｅｑのイソプロピルアミン塩酸塩と１．０ｍｇのＰＬＰ（ピリドキサール５’−リン酸）を添加し、反応溶液の最終容量が１ｍＬになるまでに０．１ＭのＰＢ７．０を追加して、１０ｍｇの酵素又は１０ｍｇの酵素で製造される固定化トランスアミナーゼを添加し、３０℃で１６ｈ撹拌する。体系について、ＨＰＬＣにより転換率を検出し、反応データを表２２で示す。
【０１３８】
【表２２】
2021505184.tif 000027
【０１３９】
（実施例１７）
共有結合固定化トランスアミナーゼの有機相反応の活性検出
１０ｍＬの反応フラスコに１ｍＬの水飽和酢酸イソプロピルを添加して、１０ｍｇの基質１及び４ｅｑのイソプロピルアミンを添加して、２０ｍｇの酵素又は２０ｍｇの酵素で製造される固定化トランスアミナーゼを添加し、３０℃で１６ｈ撹拌する。体系について、ＨＰＬＣにより転換率を検出し、反応データを表２３で示す。
【０１４０】
【表２３】
2021505184.tif 000028
【０１４１】
（実施例１８）
共有結合固定化トランスアミナーゼの充填層での連続的な反応（メタノールを基質の溶解補助剤とする）
７５ｇの突然変異体Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７ＬをＥＣＲ８４０９担体に固定化する固定化酵素を反応器に充填し、カラム容量（ＣＶ）が１５０ｍＬで、プランジャーポンプを使用して２ＣＶの緩衝液（０．１ＭのＰＢ７．０、５ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ、２Ｍのイソプロピルアミン塩酸塩を含有する）を充填層に注入する。調製される反応液（０．５Ｍの基質１、２Ｍのイソプロピルアミン塩酸塩、５ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ、３５％のＭｅＯＨ）をプランジャーポンプで充填層に注入し、４０℃の水浴で、流速が０．２５ｍＬ／ｍｉｎで、保持時間が約６００ｍｉｎで、転換率が＞９８％で、２４０ｈ連続的に操作し、転換率が低下しない。
【０１４２】
（実施例１９）
ガラス担体のキレート化トランスアミナーゼ
１ｇのＥｚｉＧ−１０１、ＥｚｉＧ−１０１又はＥｚｉＧ−１０３多孔質ガラス担体を緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ ８．５）で１〜２回洗浄し、上清液を除去し、担体に２０ｍＬのＢｕｆｆｅｒを追加するとともに、酵素粉末又は酵素液を添加し、２０℃で、８０ｒｐｍの低速で１ｈ撹拌し、上清液を除去し、沈殿物をＢｕｆｆｅｒで３〜４回洗浄し、濾過し、真空乾燥させ、４℃で貯蔵する。
【０１４３】
（実施例２０）
ＥｚｉＧ−１０１多孔質ガラス担体にキレートされた固定化トランスアミナーゼの水相反応の活性検出
１０ｍＬの反応フラスコに０．２ｍＬのＤＭＳＯを添加し、０．１ｇの基質１を溶解し、４ｅｑのイソプロピルアミン塩酸塩と０．５ｍｇのＰＬＰ（ピリドキサール５’−リン酸）を添加し、反応溶液の最終容量が１ｍＬになるまでに０．１ＭのＰＢ７．０を追加して、０．１ｇの酵素粉末又は０．１ｇの酵素粉末からＥｚｉＧ−１０１担体キレート法で製造される固定化酵素を添加し、４５℃で１６ｈ撹拌する。体系について、ＨＰＬＣにより転換率を検出し、反応データを表２４で示す。
【０１４４】
【表２４】
2021505184.tif 000029
【０１４５】
（実施例２１）
多孔質ガラス担体にキレートされた固定化トランスアミナーゼの有機相反応の活性検出
１０ｍＬの反応フラスコに１ｍＬの水飽和メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルを添加して、１０ｍｇの基質１及び４ｅｑのイソプロピルアミンを添加して、２０ｍｇの酵素又は２０ｍｇの酵素で製造される固定化トランスアミナーゼを添加し、３０℃で１６ｈ撹拌する。体系について、ＨＰＬＣにより転換率を検出し、反応データを表２５で示す。
【０１４６】
【表２５】
2021505184.tif 000030
【０１４７】
以上の実施例から分かるように、本願に係る指向性進化によってクリーニングされた、活性、安定性、及び温度、ｐＨ及び有機溶媒に対するする耐性が向上した突然変異体は、生産応用における酵素使用量を低減するだけでなく、各種の固定化酵素を製造する可能性を大幅に向上させる。また、本願は、上記指向性進化後のトランスアミナーゼを固定化することにより（自身架橋又は担体共有結合）、固定化トランスアミナーゼの水相反応及び有機相反応における応用を実現することにより、酵素を反応系から分離しやすく、かつ反応後処理過程において酵素タンパク質が残ることによる乳化現象を低減するとともに、固定化トランスアミナーゼ突然変異体が各種の極限環境に耐えることができ、活性の損質が低く、再利用回数が高く、従って、基質１及び基質２の連続的なアミノ基転移反応を実現する。
【０１４８】
以上は、本願の好ましい実施例に過ぎず、本願を限定するものではなく、当業者であれば、本願に様々な変更及び変化を行うことができる。本願の精神及び原則内に行われるいかなる修正、同等置換、改善等は、いずれも本願の保護範囲に含まれるべきである。
【配列表】
2021505184000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年6月10日(2020.6.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１６】
【表１５】
2021505184.tif 000034
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４２】
（実施例１９）
ガラス担体のキレート化トランスアミナーゼ
１ｇのＥｚｉＧ−１０１、ＥｚｉＧ−１０２又はＥｚｉＧ−１０３多孔質ガラス担体を緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ ８．５）で１〜２回洗浄し、上清液を除去し、担体に２０ｍＬのＢｕｆｆｅｒを追加するとともに、酵素粉末又は酵素液を添加し、２０℃で、８０ｒｐｍの低速で１ｈ撹拌し、上清液を除去し、沈殿物をＢｕｆｆｅｒで３〜４回洗浄し、濾過し、真空乾燥させ、４℃で貯蔵する。
【国際調査報告】
2021505184.tif 000035
2021505184.tif 000036
2021505184.tif 000037
2021505184.tif 000038
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2021505184.tif 000040
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2021505184.tif 000042