(57)【要約】  本発明は、配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨおよび配列番号５のアミノ鎖配列を有するＶＬを含む、ヒト化ＢＣＭＡ１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を対象とする。本発明はまた、Ｎ末端からＣ末端まで：（ｉ）本発明の１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、（ｉｉ）膜貫通ドメイン、（ｉｉｉ）少なくとも１つの共刺激性ドメイン、および（ｉｖ）活性化ドメインを含むＢＣＭＡキメラ抗原受容体融合タンパク質を対象とする。このヒト化ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＢＣＭＡ陽性腫瘍細胞に対して特異的な死滅活性を有する。【選択図】図３
2021525063.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨおよび配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＬを含む、抗ヒトＢＣＭＡ抗体。
【請求項２】
配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨおよびアミノ酸配列番号５の配列を有するＶＬを含む、１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）。
【請求項３】
ＶＨとＶＬの間にリンカーをさらに含む、請求項２に記載のｓｃＦｖ。
【請求項４】
配列番号６のアミノ酸配列を有する、請求項３に記載のｓｃＦｖ。
【請求項５】
Ｎ末端からＣ末端まで：
（ｉ）請求項２に記載のｓｃＦｖ、
（ｉｉ）膜貫通ドメイン、
（ｉｉｉ）少なくとも１つの共刺激性ドメイン、および
（ｉｖ）活性化ドメイン
を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項６】
前記ｓｃＦｖが、配列番号６のアミノ酸配列を有する、請求項５に記載のＣＡＲ。
【請求項７】
前記共刺激性ドメインがＣＤ２８または４−１ＢＢである、請求項５に記載のＣＡＲ。
【請求項８】
前記活性化ドメインがＣＤ３ゼータである、請求項５に記載のＣＡＲ。
【請求項９】
配列番号１７のアミノ酸配列を有する、請求項５に記載のＣＡＲ。
【請求項１０】
請求項５に記載のＣＡＲをコードする核酸。
【請求項１１】
請求項５に記載のＣＡＲを発現するように改変されたＴ細胞またはナチュラルキラー細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列リスト、表またはコンピュータープログラムの参照
配列リストは、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して明細書と共にＡＳＣＩＩ形式のテキストファイルとして、ファイル名Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、作成日２０２０年１月１３日、サイズ４キロバイトで本明細書と同時に提出される。ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して出願された配列リストは本明細書の一部であり、参照によってその全体を本明細書に組み入れる。
【０００２】
本発明は、腫瘍の養子免疫遺伝子療法の分野で有用な、特に多発性骨髄腫の腫瘍増殖を減少させるヒト化ＢＣＭＡ抗体（ＰＭＣ３０６）およびＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞に関する。
【背景技術】
【０００３】
免疫療法は、がん治療のための非常に有望なアプローチであることが明らかになりつつなる。免疫系の攻撃部隊であるＴ細胞またはＴリンパ球は、常に外来抗原を探し、異常な細胞（がんまたは感染した細胞）を正常な細胞から区別する。ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）構築物でＴ細胞を遺伝子改変することは、腫瘍特異的Ｔ細胞を設計するための最も一般的なアプローチである。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を標的とするＣＡＲ−Ｔ細胞は、患者に注入することができ（養子細胞移植またはＡＣＴと呼ばれる）、効率的な免疫療法アプローチとなる（１、２）。化学療法または抗体と比較してＣＡＲ−Ｔ技術の利点は、再プログラムされ遺伝子操作されたＴ細胞は患者の中で増殖し、持続することができることである（「生きている薬」）（１、２）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
ＣＡＲは典型的に、Ｎ末端部分のモノクローナル抗体由来の１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ヒンジ、膜貫通ドメインおよび活性化ＣＤ３−ゼータドメインと並んだいくつかの細胞内共活性化ドメイン：（ｉ）ＣＤ２８、（ｉｉ）ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７またはその他の共刺激性ドメインで構成されている（図１）。ＣＡＲの進化は、第１世代（共刺激ドメインなし）から第２世代（１つの共刺激ドメインあり）、第３世代ＣＡＲ（いくつかの共刺激ドメインあり）へと進んだ。２つの共刺激性ドメイン（いわゆる第３世代ＣＡＲ）を使用してＣＡＲを生成すると、細胞溶解性ＣＡＲ−Ｔ細胞活性が増加し、ＣＡＲ−Ｔ細胞の持続性が向上し、抗腫瘍活性が増強した。
【０００５】
ＢＣＭＡ
Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）は、ＣＤ２６９および腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１７（ＴＮＦＲＳＦ１７）としても知られている細胞表面受容体であり、ＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子によってコードされている。この受容体は主に成熟Ｂリンパ球で発現し、ほとんどの場合、多発性骨髄腫（ＭＭ）で過剰発現される（４）。ＭＭにおいてＢＣＭＡを標的とする現在の療法には、モノクローナル抗体、二重特異性抗体およびＴ細胞免疫療法、ＣＡＲ−Ｔ療法が含まれる（４、５）。
【０００６】
ヒトＢＣＭＡタンパク質は、１８４個のアミノ酸：１〜５４−細胞外ドメイン；５５〜７７−膜貫通ドメイン；７８〜１８４−細胞質ドメインで構成されている。ＢＣＭＡのアミノ酸配列を図２に示す。ＢＣＭＡにはシグナルペプチドが欠如しており、その他の受容体であるＢＡＦＦ受容体および膜貫通活性化因子およびシクロフィリンリガンド相互作用因子およびカルシウム調節因子（ＴＡＣＩ）に類似している（４）。これらの受容体は、Ｂ細胞の成熟および形質細胞への分化において主要な役割を担っている。それらのリガンドには、ＭＭ患者で発現が増加しているＢＡＦＦおよびＡＰＲＩＬが含まれる（４）。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ＣＡＲの構造を示した図である（３）。左パネルは第１世代の構造（共刺激性ドメインなし）を示す。中央パネルは第２世代の構造（１つの共刺激ドメインＣＤ２８または４−ＢＢ）を示す。右パネルは第３世代の構造（２つまたはそれ以上の共刺激ドメイン）を示す。
【図２】ＢＣＭＡタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）を示した図である。細胞外ドメインには下線が引いてある。
【図３】ヒト化ＢＣＭＡ  ＣＡＲ構築物を示した図である。
【図４】ヒト化ＢＣＭＡ−ＣＡＲ構築物が、蛍光標識された組換えＢＣＭＡタンパク質を用いたＦＡＣＳ分析によって検出されたことを示した図である。レンチウイルスのヒト化ＢＣＭＡ−ＣＡＲをＴ細胞に形質導入した後、ヒト化ＢＣＭＡ−ＣＡＲ陽性細胞が検出された。
【図５Ａ】ヒト化ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞はＣＨＯ−ＢＣＭＡ細胞を致死させたが、ＣＨＯ細胞は致死させなかったことを示した図である。ＸＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅリアルタイム細胞毒性アッセイが、ヒト化ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞毒性の検出に使用された。正規化された細胞インデックスはＹ軸に表示され、時間はＸ軸に表示されている。図５Ａは、ＣＨＯ−ＢＣＭＡ標的細胞について示す。右は：上から下へ：Ｍｏｃｋ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、Ｔ細胞、標的細胞のみおよびヒト化ＣＡＲ−Ｔ細胞である。
【図５Ｂ】ヒト化ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞はＣＨＯ−ＢＣＭＡ細胞を致死させたが、ＣＨＯ細胞は致死させなかったことを示した図である。ＸＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅリアルタイム細胞毒性アッセイが、ヒト化ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞毒性の検出に使用された。正規化された細胞インデックスはＹ軸に表示され、時間はＸ軸に表示されている。図５Ｂは、ＣＨＯ標的細胞について示す。右は上から下へ、Ｍｏｃｋ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、ヒト化ＢＣＭＡ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、Ｔ細胞および標的細胞のみである。
【図６】ヒト化ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞が、ＣＨＯ−ＢＣＭＡ陽性細胞では高レベルのＩＦＮ−ガンマを分泌したが、ＢＣＭＡ陰性のＣＨＯ対照細胞では分泌しなかったことを示した図である。ｐ＜０．０５  ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞対Ｔ細胞およびＭｏｃｋ  ＣＡＲ−Ｔ細胞のＣＨＯ−ＢＣＭＡ細胞におけるＩＦＮ−ガンマ分泌。
【図７】ヒト化ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞が、多発性骨髄腫細胞に対して高レベルのＩＦＮ−ガンマを分泌したが、ＢＣＭＡ陰性のＫ５６２対照細胞に対しては分泌しなかったことを示した図である。＊ｐ＜０．０５、ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞対Ｔ細胞およびＭｏｃｋ−ＣＡＲ−Ｔ細胞の多発性骨髄腫細胞におけるＩＦＮ−ガンマ分泌。
【図８Ａ】ヒト化ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞がＲＰＭＩ８２２６異種移植腫瘍の増殖を顕著に減少させたことを示した図である。ＣＡＲ−Ｔ細胞は、７日目と２０日目にｉｖによって、１×１０＾７細胞／マウスで注射した。バーは平均腫瘍体積＋／−標準誤差を示す。＊ｐ＜０．０５、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ−Ｔ細胞対Ｍｏｃｋ  Ｔ細胞。
【図８Ｂ】ヒト化ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞はマウスの体重を減少させなかったことを示した図である。バーは平均マウス体重＋／−標準偏差を示す。
【図８Ｃ】ＢＣＭＡ組換えタンパク質を用いたＦＡＣＳにより、Ｍｏｃｋ−Ｃａｒ−Ｔ細胞ではなく、ヒト化ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞がマウス血液中で検出されたことを示した図である。末梢血細胞は、ヒトＢＣＭＡタンパク質およびヒトＴ（ＣＤ４＋／ＣＤ８＋）細胞に特異的な抗体への結合についての研究の最後に、フローサイトメトリーによって分析した。ＣＤ４抗体に結合する細胞のパーセンテージは図８Ｃの左パネルに示され、ＢＣＭＡタンパク質にも結合したそれらのヒトＴ細胞のパーセンテージは図８Ｃの右パネルに示されている。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
定義
本明細書で使用したように、「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」は、Ｔ細胞に特定のタンパク質を標的とする新しい能力を与えるように遺伝子操作された受容体タンパク質である。抗原結合機能およびＴ細胞活性化機能の両方を単一の受容体に組み合わせたので、受容体はキメラである。ＣＡＲは、抗原、膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの細胞内ドメインに結合することができる細胞外ドメインを含む融合タンパク質である。「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」は、「キメラ受容体」、「Ｔ体」または「キメラ免疫受容体（ＣＩＲ）」と呼ばれることもある。「抗原に結合することができる細胞外ドメイン」とは、ある種の抗原に結合することができる任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。「細胞内ドメイン」とは、細胞内の生物学的プロセスの活性化または阻害を引き起こすシグナルを伝達するドメインとして機能することが知られている任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。
【０００９】
本明細書で使用したように、「ドメイン」は、その他の領域とは独立して特定の構造に折りたたまれている、ポリペプチド内の１つの領域を意味する。
【００１０】
本明細書で使用したように、「ヒト化抗体」は、ヒトにおいて天然に産生される抗体バリアントとの類似性を高めるためにタンパク質配列が改変された非ヒト種に由来する抗体である。例えば、マウス抗体が開発された後、その抗体をコードするＤＮＡを配列決定することができる。次に、抗体ＣＤＲに対応するＤＮＡ配列を決定することができる。このＣＤＲ配列は、ヒト化抗体を製造するためにヒト抗体バリアントのＤＮＡを含有する構築物に挿入することができる。
【００１１】
本明細書で使用したように、「１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）」は、抗原に結合する能力を保持した、抗体に由来する１本鎖ポリペプチドを意味する。ｓｃＦｖの１例としては、組換えＤＮＡ技術により形成され、免疫グロブリン重鎖（Ｈ鎖）および軽鎖（Ｌ鎖）断片のＦｖ領域がスペーサー配列を介して連結されている抗体ポリペプチドが挙げられる。ｓｃＦｖを遺伝子操作するための様々な方法が当業者には知られている。
【００１２】
本明細書で使用したように、「腫瘍抗原」は、抗原性を有する生体分子を意味し、その発現はがんの原因となる。
【００１３】
本発明者らは、マウスモノクローナル抗体、クローン４Ｃ８Ａに由来するマウスモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖可変領域から始まるヒト化ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖを遺伝子操作した。マウス４Ｃ８Ａ抗体は、ヒトＢＣＭＡに対して強力かつ選択的な結合を示す（６）。本発明者らは、ＢＣＭＡ腫瘍抗原を過剰発現するがん細胞を標的とするために、ヒト化ＢＣＭＡ抗体をベースにしてＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞を作製した。本発明のＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞は、いくつかのがん細胞株に対して高い細胞毒性活性を有する。
【００１４】
本発明は、配列番号３のアミノ酸を有するＶＨおよび配列番号５のアミノ酸を有するＶＬを含むヒト化抗ヒトＢＣＭＡ抗体を対象とする。
【００１５】
一実施形態では、ヒト化抗ヒトＢＣＭＡ抗体は１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。ＳｃＦｖは、ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨである。
【００１６】
本発明はまた、Ｎ末端からＣ末端まで：（ｉ）ＶＨが配列番号３のアミノ酸配列を有し、ＶＬが配列番号５のアミノ酸を有するＢＣＭＡに対する１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、（ｉｉ）膜貫通ドメイン、（ｉｉｉ）少なくとも１つの共刺激性ドメイン、および（ｉｖ）活性化ドメインを含むキメラ抗原受容体融合タンパク質を対象とする。
【００１７】
一実施形態では、ＣＡＲ構造を図２に示す。
【００１８】
一実施形態では、共刺激性ドメインは、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ−１、ＣＤ２７、ＯＸ−４０およびＤＡＰ１０からなる群から選択される。好ましい共刺激性ドメインはＣＤ２８である。
【００１９】
好ましい活性化ドメインは、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ＺまたはＣＤ３ζ）である。
【００２０】
膜貫通ドメインは、天然ポリペプチドから得てもよいし、人工的に設計してもよい。天然ポリペプチドから得られた膜貫通ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質から得ることができる。例えば、Ｔ細胞受容体αまたはβ鎖の膜貫通ドメイン、ＣＤ３ゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４、またはＧＩＴＲを使用することができる。人工的に設計された膜貫通ドメインは、主にロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含むポリペプチドである。フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットが、合成膜貫通ドメインの各端に見いだされることが好ましい。場合により、短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカー、例えば、長さが２から１０アミノ酸のリンカーを、膜貫通ドメインと細胞内ドメインとの間に配置することができる。一実施形態では、グリシン−セリン連続配列を有するリンカー配列を使用することができる。
【００２１】
本発明は、ＢＣＭＡ−ＣＡＲをコードする核酸を提供する。ＣＡＲをコードする核酸は、従来の方法によって、指定されたＣＡＲのアミノ酸配列から製造することができる。アミノ酸配列をコードする塩基配列は、各ドメインのアミノ酸配列の前述のＮＣＢＩ参照配列番号またはジェンバンクの受入番号から取得することができ、本発明の核酸は、標準的な分子生物学的および／または化学的手法を使用して製造することができる。例えば、塩基配列に基づいて、核酸を合成することができ、本発明の核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用してｃＤＮＡライブラリーから得られるＤＮＡ断片を組み合わせることによって製造することができる。
【００２２】
本発明のＣＡＲをコードする核酸はベクターに挿入することができ、このベクターは細胞に導入することができる。例えば、レトロウイルスベクター（オンコレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターおよび偽型ベクターを含む）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、サルウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターまたはセンダイウイルスベクター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）ベクターおよびＨＳＶベクターなどのウイルスベクターを使用することができる。感染細胞内で自己複製しないようにするために、複製能力を欠くウイルスベクターを使用することが好ましい。
【００２３】
例えば、レトロウイルスベクターを使用する場合、パッケージング細胞を用いてレトロウイルス粒子を製造するために、ベクターが保有するＬＴＲ配列およびパッケージングシグナル配列をベースにした適切なパッケージング細胞を選択することができる。パッケージング細胞の例には、ＰＧ１３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０６８６）、ＰＡ３１７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０７８）、ＧＰ＋Ｅ−８６およびＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２ならびにＰｓｉ−Ｃｒｉｐが含まれる。レトロウイルス粒子は、トランスフェクション効率の高い２９３細胞または２９３Ｔ細胞を使用して製造することもできる。レトロウイルスをベースに作製された多種のレトロウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターのパッケージングに使用することができるパッケージング細胞は、多くの企業から広く市販されている。
【００２４】
ＣＡＲ−Ｔ細胞はＣＡＲを介して特定の抗原に結合し、それによってシグナルが細胞に伝達され、その結果、細胞が活性化される。ＣＡＲを発現する細胞の活性化は、宿主細胞の種類およびＣＡＲの細胞内ドメインに応じて変化し、指標として、例えば、サイトカインの放出、細胞増殖速度の改善、細胞表面分子の変化などに基づいて確認することができる。例えば、活性化された細胞からの細胞傷害性サイトカイン（腫瘍壊死因子、リンホトキシンなど）の放出は、抗原を発現する標的細胞の破壊を引き起こす。さらに、サイトカインの放出または細胞表面分子の変化は、その他の免疫細胞、例えば、Ｂ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞およびマクロファージを刺激する。
【００２５】
ＣＡＲを発現する細胞は、疾患の治療薬として使用することができる。治療薬は、ＣＡＲを活性成分として発現する細胞を含み、さらに適切な賦形剤を含むことができる。
【００２６】
本発明者らは、ＢＣＭＡを特異的に標的とするヒト化ＢＣＭＡ  ＳｃＦｖ配列をベースにしたＣＡＲ−Ｔ細胞を作製した。本発明者らは、ＢＣＭＡ腫瘍抗原を過剰発現するがん細胞を標的とするためにヒト化ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞を作製した。本発明のヒト化ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞は、多発性骨髄腫がん細胞に対して高レベルのサイトカインを分泌し、ＣＨＯ−ＢＣＭＡ陽性標的細胞を致死させるが、対照の親ＣＨＯ細胞を制御しない。
【００２７】
対応するマウスＳｃＦｖ配列に対する本発明のヒト化ＢＣＭＡ−ＳｃＦｖの利点には、ヒト化ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ配列のおかげでヒトに対する免疫原性が低いことが挙げられる。したがって、本発明のヒト化ＢＣＭＡ抗体は、多くの臨床応用における治療薬として非常に強力で有利である。
【００２８】
本発明のヒト化ＢＣＭＡ  ＳｃＦｖは、免疫療法の適用：毒素／薬物結合抗体、モノクローナル治療用抗体およびＣＡＲ−Ｔ細胞免疫療法のために使用することができる。
【００２９】
本発明のヒト化ＢＣＭＡ  ＳｃＦｖを使用するヒト化ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞は、卵巣がん、結腸がん、膵臓がん、黒色腫、子宮頸がんおよびその他のＢＣＭＡ陽性がんなどのＢＣＭＡ陽性がん細胞株におけるＢＣＭＡ抗原を効果的に標的とする。
【００３０】
ヒト化ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞は、様々な化学療法：チェックポイント阻害剤、標的療法、低分子阻害剤および抗体と組み合わせて使用することができる。
【００３１】
ヒト化ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＢＣＭＡ陽性がん細胞のために臨床的に使用することができる。
【００３２】
ＣＤ２８、４−１ＢＢなどの共活性化ドメインの改変を使用して、ＣＡＲ−Ｔ細胞の有効性を高めることができる。タグ結合ヒト化ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖはＣＡＲ生成に使用することができる。
【００３３】
ヒト化ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ｔ−ＥＧＦＲ、ＲＱＲ（リツキシマブ−ＣＤ３４−リツキシマブ）、誘導性カスパーゼ−９などの様々な安全スイッチを用いて使用することができる。
【００３４】
第３世代ＣＡＲ−Ｔまたはその他の共活性化シグナル伝達ドメインをヒト化ＢＣＭＡ−ｓｃＦｖと共に使用して、ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔを製造することができる。
【００３５】
ヒト化ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、その他の腫瘍抗原または腫瘍微小環境、例えば、ＶＥＧＦＲ−１−３、ＰＤＬ−１を標的とするＣＡＲと組み合わせることができる。ＢＣＭＡおよびＣＤ３またはその他の抗原に対する二重特異性抗体を療法のために生成することができる。
【００３６】
ヒト化ＢＣＭＡ−ＣＡＲは、ＢＣＭＡ陽性がんを標的とすることができるＣＡＲ−ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−マクロファージ、同種異系ＣＡＲ−Ｔ細胞、遺伝子編集Ｔ細胞およびその他のＢＣＭＡ−ＣＡＲ造血細胞などのその他の種類の細胞の生成のために使用することができる。
【００３７】
本発明は、ＢＣＭＡ−ＣＡＲを発現するように改変されたＴ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージまたは造血細胞を提供する。
【００３８】
ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞は、化学療法に対して最も耐性があり、攻撃的な腫瘍を形成するがん幹細胞および循環腫瘍幹細胞に対して使用することができる。
【００３９】
ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞、ＢＣＭＡ−ＮＫ細胞、ＢＣＭＡ−マクロファージおよびその他の細胞は、様々な種類のがんを標的とするために使用することができる。
【００４０】
ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞は、安全性を高めるために患者の腫瘍内に送達することができる。
【００４１】
以下の実施例はさらに本発明を例示する。これらの実施例は、本発明を例示することのみを目的としており、限定的であると解釈されるべきではない。
【実施例１】
【００４２】
ヒト化ＢＣＭＡ  ＶＨおよびＶＬおよびｓｃＦｖ配列
ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、ハイブリドーマクローン４Ｃ８Ａから得られた（国際公開第２０１９／１９５０１７号パンフレット）。マウスクローン４Ｃ８Ａの重鎖および軽鎖可変領域の配列は決定され、ヒト化ｓｃＦｖを構築するために使用された。
【００４３】
ヒト化ＢＣＭＡ（ＰＭＣ３０６）ｓｃＦｖの構造は、ＶＨ−リンカー−ＶＬであった。リンカーは、Ｇ４Ｓ×３であった。
【００４４】
太字は、ヒト化ＢＣＭＡ  ＰＭＣ３０６ＳｃＦｖクローン：ＶＨのヌクレオチド配列を強調する；下線はＶＬのヌクレオチド配列を強調する。その間（イタリック体）は、リンカーをコードするヌクレオチド配列である。
【化１】
2021525063.tif 000003
【００４５】
ＰＭＣ３０６  ＶＨアミノ酸配列：（配列番号３）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＶＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＹＩＩＰＹＮＤＡＴＫＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＮＹＤＧＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【００４６】
リンカーアミノ酸配列（配列番号４）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
【００４７】
ＰＭＣ３０６  ＶＬアミノ酸配列：（配列番号５）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＩＳＤＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＹＡＳＱＳＩＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＮＧＨＳＦＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
【００４８】
ヒト化ＢＣＭＡ（ＰＭＣ３０６）ｓｃＦｖタンパク質：（配列番号６）
【化２】
2021525063.tif 000004
【実施例２】
【００４９】
ヒト化ＢＣＭＡ−ＣＡＲ配列
ヒト化（ＰＭＣ３０６）ＢＣＭＡ−ＣＡＲ構築物の設計図は図３に示されている。ヒト化ｓｃＦｖ  ＣＡＲ配列のクローニングには、ＥＦ１ａプロモーターを備えたレンチウイルスベクターを使用した。
【００５０】
ＢＣＭＡ−ＣＡＲ構造には、ヒトＣＤ８シグナルペプチド、ヒト化ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ（ＶＨ−リンカーＶＬ）、ＣＤ８ヒンジ、ＣＤ２８膜貫通、活性化ドメインＣＤ３ゼータが含まれる（図３）。
【００５１】
ＣＤ８シグナリング−ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ（ＶＨ−リンカー−ＶＬ）−ＣＤ８ヒンジ−ＣＤ２８ＴＭ−ＣＤ２８−ＣＤ３−ゼータのヌクレオチド配列およびいくつかのアミノ酸配列を以下に示した。
【００５２】
＜ＣＤ８リーダー＞
ヌクレオチド
ＡＴＧＧＣＣＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＣＣＧＣＣＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＧＣＣＴＴＧＣＴＧＣＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＡＧＧＣＣＧ（配列番号７）
【００５３】
アミノ酸
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号８）
【００５４】
＜ＮｈｅＩ部位＞
ｇｃｔａｇｃ
【００５５】
＜ヒト化ＢＣＭＡ、ＰＭＣ３０６ｓｃＦｖ＞
ＶＨ−リンカーＶＬ、核酸配列およびアミノ酸配列については実施例１を参照すること。
【００５６】
＜ＸｈｏＩ制限部位＞
ＣＴＣＧＡＧ
【００５７】
＜ＣＤ８ヒンジ＞
ヌクレオチド
ＡＡＧＣＣＣＡＣＣＡＣＧＡＣＧＣＣＡＧＣＧＣＣＧＣＧＡＣＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＧＧＣＧＣＣＣＡＣＣＡＴＣＧＣＧＴＣＧＣＡＧＣＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＣＧＣＣＣＡＧＡＧＧＣＧＡＧＣＣＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＧＧＧＧＣＧＣＡＧＴＧＣＡＣＡＣＧＡＧＧＧＧＧＣＴＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＧＴＧＡＴ（配列番号９）
【００５８】
アミノ酸
ＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＳＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＳＤ（配列番号１０）
【００５９】
＜ａａｇｃｃｃ＞
【００６０】
＜ＣＤ２８膜貫通＞
ヌクレオチド
ＴＴＴＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＴＧＧＣＴＴＧＣＴＡＴＡＧＣＴＴＧＣＴＡＧＴＡＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧ（配列番号１１）
【００６１】
アミノ酸
ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号１２）
【００６２】
＜ＣＤ２８共刺激性＞
ヌクレオチド
ＡＧＧＡＧＴＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＡＧＴＧＡＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡＣＴＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＧＣＡＡＧＣＡＴＴＡＣＣＡＧＣＣＣＴＡＴＧＣＣＣＣＡＣＣＡＣＧＣＧＡＣＴＴＣＧＣＡＧＣＣＴＡＴＣＧＣＴＣＣ（配列番号１３）
【００６３】
アミノ酸
ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号１４）
【００６４】
＜ＣＤ３ゼータ＞終止コドンに下線
ヌクレオチド
ＡＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＣＴＡＴＡＡＣＧＡＧＣＴＣＡＡＴＣＴＡＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＧＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＣＧＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＧＣＡＧＡＧＡＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＴＡＡＧＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＴＧＡＧＡＴＴＧＧＧＡＴＧＡＡＡＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＧＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＡＣＧＡＴＧＧＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＧＧＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＣＧＣＴＡＡｔａｇ  （配列番号１５）
【００６５】
アミノ酸
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＱＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号１６）
【００６６】
＜ＥｃｏＲＩ制限部位＞
ｇａａｔｔｃ
【００６７】
ヒト化ＢＣＭＡ−ＣＡＲタンパク質の翻訳したアミノ酸配列（配列番号１７）
Ｍ  Ａ  Ｌ  Ｐ  Ｖ  Ｔ  Ａ  Ｌ  Ｌ  Ｌ  Ｐ  Ｌ  Ａ  Ｌ  Ｌ  Ｌ  Ｈ  Ａ  Ａ  Ｒ  Ｐ  Ａ  Ｓ  Ｑ  Ｖ  Ｑ  Ｌ  Ｖ  Ｑ  Ｓ  Ｇ  Ａ  Ｅ  Ｖ  Ｋ  Ｋ  Ｐ  Ｇ  Ｓ  Ｓ  Ｖ  Ｋ  Ｖ  Ｓ  Ｃ  Ｋ  Ａ  Ｓ  Ｇ  Ｙ  Ｔ  Ｆ  Ｔ  Ｓ  Ｙ  Ｖ  Ｍ  Ｈ  Ｗ  Ｖ  Ｒ  Ｑ  Ａ  Ｐ  Ｇ  Ｑ  Ｇ  Ｌ  Ｅ  Ｗ  Ｍ  Ｇ  Ｙ  Ｉ  Ｉ  Ｐ  Ｙ  Ｎ  Ｄ  Ａ  Ｔ  Ｋ  Ｙ  Ｎ  Ｅ  Ｋ  Ｆ  Ｋ  Ｇ  Ｒ  Ｖ  Ｔ  Ｉ  Ｔ  Ａ  Ｄ  Ｋ  Ｓ  Ｔ  Ｓ  Ｔ  Ａ  Ｙ  Ｍ  Ｅ  Ｌ  Ｓ  Ｓ  Ｌ  Ｒ  Ｓ  Ｅ  Ｄ  Ｔ  Ａ  Ｖ  Ｙ  Ｙ  Ｃ  Ａ  Ｒ  Ｙ  Ｎ  Ｙ  Ｄ  Ｇ  Ｙ  Ｆ  Ｄ  Ｖ  Ｗ  Ｇ  Ｑ  Ｇ  Ｔ  Ｌ  Ｖ  Ｔ  Ｖ  Ｓ  Ｓ  Ｇ  Ｇ  Ｇ  Ｇ  Ｓ  Ｇ  Ｇ  Ｇ  Ｇ  Ｓ  Ｇ  Ｇ  Ｇ  Ｇ  Ｓ  Ｅ  Ｉ  Ｖ  Ｌ  Ｔ  Ｑ  Ｓ  Ｐ  Ａ  Ｔ  Ｌ  Ｓ  Ｌ  Ｓ  Ｐ  Ｇ  Ｅ  Ｒ  Ａ  Ｔ  Ｌ  Ｓ  Ｃ  Ｒ  Ａ  Ｓ  Ｑ  Ｓ  Ｉ  Ｓ  Ｄ  Ｙ  Ｌ  Ｈ  Ｗ  Ｙ  Ｑ  Ｑ  Ｋ  Ｐ  Ｇ  Ｑ  Ａ  Ｐ  Ｒ  Ｌ  Ｌ  Ｉ  Ｙ  Ｙ  Ａ  Ｓ  Ｑ  Ｓ  Ｉ  Ｔ  Ｇ  Ｉ  Ｐ  Ａ  Ｒ  Ｆ  Ｓ  Ｇ  Ｓ  Ｇ  Ｓ  Ｇ  Ｔ  Ｄ  Ｆ  Ｔ  Ｌ  Ｔ  Ｉ  Ｓ  Ｓ  Ｌ  Ｅ  Ｐ  Ｅ  Ｄ  Ｆ  Ａ  Ｖ  Ｙ  Ｙ  Ｃ  Ｑ  Ｎ  Ｇ  Ｈ  Ｓ  Ｆ  Ｐ  Ｐ  Ｔ  Ｆ  Ｇ  Ｇ  Ｇ  Ｔ  Ｋ  Ｖ  Ｅ  Ｉ  Ｋ  Ｌ  Ｅ  Ｋ  Ｐ  Ｔ  Ｔ  Ｔ  Ｐ  Ａ  Ｐ  Ｒ  Ｐ  Ｐ  Ｔ  Ｐ  Ａ  Ｐ  Ｔ  Ｉ  Ａ  Ｓ  Ｑ  Ｐ  Ｌ  Ｓ  Ｌ  Ｒ  Ｐ  Ｅ  Ａ  Ｓ  Ｒ  Ｐ  Ａ  Ａ  Ｇ  Ｇ  Ａ  Ｖ  Ｈ  Ｔ  Ｒ  Ｇ  Ｌ  Ｄ  Ｆ  Ａ  Ｓ  Ｄ  Ｋ  Ｐ  Ｆ  Ｗ  Ｖ  Ｌ  Ｖ  Ｖ  Ｖ  Ｇ  Ｇ  Ｖ  Ｌ  Ａ  Ｃ  Ｙ  Ｓ  Ｌ  Ｌ  Ｖ  Ｔ  Ｖ  Ａ  Ｆ  Ｉ  Ｉ  Ｆ  Ｗ  Ｖ  Ｒ  Ｓ  Ｋ  Ｒ  Ｓ  Ｒ  Ｌ  Ｌ  Ｈ  Ｓ  Ｄ  Ｙ  ＭＮ  Ｍ  Ｔ  Ｐ  Ｒ  Ｒ  Ｐ  Ｇ  Ｐ  Ｔ  Ｒ  Ｋ  Ｈ  Ｙ  Ｑ  Ｐ  Ｙ  Ａ  Ｐ  Ｐ  Ｒ  Ｄ  Ｆ  Ａ  Ａ  Ｙ  Ｒ  Ｓ  Ｒ  Ｖ  Ｋ  Ｆ  Ｓ  Ｒ  Ｓ  Ａ  Ｄ  Ａ  Ｐ  Ａ  Ｙ  Ｑ  Ｑ  Ｇ  Ｑ  Ｎ  Ｑ  Ｌ  Ｙ  Ｎ  Ｅ  Ｌ  Ｎ  Ｌ  Ｇ  Ｒ  Ｒ  Ｅ  Ｅ  Ｙ  Ｄ  Ｖ  Ｌ  Ｄ  Ｋ  Ｒ  Ｒ  Ｇ  Ｒ  Ｄ  Ｐ  Ｅ  Ｍ  Ｇ  Ｇ  Ｋ  Ｐ  Ｑ  Ｒ  Ｒ  Ｋ  Ｎ  Ｐ  Ｑ  Ｅ  Ｇ  Ｌ  Ｙ  Ｎ  Ｅ  Ｌ  Ｑ  Ｋ  Ｄ  Ｋ  Ｍ  Ａ  Ｅ  Ａ  Ｙ  Ｓ  Ｅ  Ｉ  Ｇ  Ｍ  Ｋ  Ｇ  Ｅ  Ｒ  Ｒ  Ｒ  Ｇ  Ｋ  Ｇ  Ｈ  Ｄ  Ｇ  Ｌ  Ｙ  Ｑ  Ｇ  Ｌ  Ｓ  Ｔ  Ａ  Ｔ  Ｋ  Ｄ  Ｔ  Ｙ  Ｄ  Ａ  Ｌ  Ｈ  Ｍ  Ｑ  Ａ  Ｌ  Ｐ  Ｐ  Ｒ（配列番号１７）
【実施例３】
【００６８】
ＣＡＲレンチウイルス作製
レンチウイルスは、［７］に記載されているように、２９３Ｔ細胞を使用した標準的手順によって作製された。本発明者らは、レンチウイルスベクター内に、レンチウイルスベクターのＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩ部位にクローニングされたヒト化ＢＣＭＡ−ＳｃＦｖ−ＣＡＲ構築物を生成した。ｐＣＤ５１０−ＦＭＣ６３−２８ｚレンチウイルスＣＡＲ構築物は、ＸｂａＩとＥｃｏＲＩのクローニング部位の間に、ヒト化ＢＣＭＡ  ＳｃＦｖ−ＣＤ２８−ＣＤ３ゼータ挿入物を含有していた。
【００６９】
レンチウイルスは２９３Ｔ細胞中で生成され、力価はＲＴ−ＰＣＲによって確立された。次に、等用量のレンチウイルスをＴ細胞の形質導入のために使用した。
【実施例４】
【００７０】
全血からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離
全血（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓｔａｎｆｏｒｄ、ＣＡ）は、個体または混合ドナー（必要な血液量に応じて）から１０ｍＬのヘパリンバキュテナー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中に収集した。全抗凝固血液約１０ｍｌを滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液と混合し、５０ｍｌ遠心管（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、Ｃａ＋２およびＭｇ＋２を含まない）中において総体積を２０ｍｌにした。血液／ＰＢＳ（２０ｍｌ）をコニカル遠心分離管中のＦｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅＰＬＵＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）１５ｍＬの上部に静かに重層し、サンプルを室温で４００×ｇで３０〜４０分間遠心分離した。希釈血漿／フィコール界面の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含有する細胞の層を取り出し、洗浄し、室温で２００×ｇで１０分間遠心分離した。細胞を血球計数器で計数した。ＰＢＭＣを、５％ＡＢ血清およびアンホテリシンＢ（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、ＣＡ）１．２５μｇ／ｍＬ、ペニシリン１００Ｕ／ｍＬおよびストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬを含むＣＡＲ−Ｔ培地（ＡＩＭ  Ｖ−ＡｌｂｕＭＡＸ（ＢＳＡ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で１回洗浄し、実験に使用するか、または−８０℃で凍結した。
【実施例５】
【００７１】
ＰＢＭＣからのＴ細胞活性化
単離したＰＢＭＣ細胞は、ｈｕＩＬ２（１０００×ストックから；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）３００Ｕ／ｍＬを含むＣＡＲ−Ｔ培地に再懸濁し、ＣＤ３−ＣＤ２８ビーズとビーズ対細胞比１：１で混合した。細胞は、ウイルス形質導入の前に、ＣＯ２の存在下で３７℃で２４時間インキュベートした。
【実施例６】
【００７２】
Ｔ細胞形質導入および増殖
ＰＢＭＣの活性化後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。１×１０６細胞の各ウェルに、レンチウイルス５×１０６およびＴｒａｎｓｐｌｕｓ培地（Ａｌｓｔｅｍ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）（最終希釈率１：５００）２μＬ／ｍＬを添加した。ウイルスの添加を繰り返す前に、細胞をさらに２４時間インキュベートした。次に、細胞を、ＩＬ−２を含むＩＬ−２新鮮培地３００Ｕ／ＭＬの継続的な存在下で、１２〜１４日間増殖させた（総インキュベーション時間は、必要なＣＡＲ−Ｔ細胞の最終数に応じた）。細胞濃度は２〜３日ごとに分析し、その時点で培地を添加して細胞懸濁液を１×１０６細胞／ｍＬに希釈した。
【実施例７】
【００７３】
ヒト化ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞はＢＣＭＡ  ｓｃＦｖを発現した。
本発明者らは、実施例２に示したヒト化ＢＣＭＡ−ＣＡＲＴ構築物を用いて、ヒト化ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞を設計した。無関係のＳｃＦｖと共にＭｏｃｋ  ｓｃＦｖを使用し、陰性対照としてＭｏｃｋ−ＣＡＲ−Ｔ細胞を生成した。レンチウイルスのヒト化ＢＣＭＡ−ＣＡＲをＴ細胞に形質導入した後、ヒト化ＢＣＭＡ−ＣＡＲ陽性細胞が検出された（図４）。
【実施例８】
【００７４】
ヒト化ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞はＣＨＯ−ＢＣＭＡ細胞を致死させたが、ＣＨＯ細胞は致死させなかった。
本発明者らは、ヒト化ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞を標的ＣＨＯ−ＢＣＭＡ細胞およびＣＨＯ（ＢＣＭＡ陰性）対照細胞と共にインキュベートした。ヒト化ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞はＣＨＯ−ＢＣＭＡ細胞を特異的に致死させた（図５Ａ）が、ＣＨＯ細胞は致死させなかった（図５Ｂ）。結果は、ＢＣＭＡ抗原を標的とし、ＢＣＭＡ陽性細胞を致死させるためのヒト化ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞の高い特異性を示す。
【実施例９】
【００７５】
ヒト化ＣＡＲ−Ｔ細胞は、標的ＣＨＯ−ＢＣＭＡ細胞に対してＩＦＮ−ガンマを顕著に分泌したが、ＣＨＯ細胞に対しては分泌しなかった。
本発明者らは、ヒト化ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞と標的ＣＨＯ−ＢＣＭＡおよび親ＣＨＯ細胞の同時インキュベーション後に上清を収集し、ＩＦＮ−ガンマアッセイを実施した。ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＨＯ−ＢＣＭＡ細胞ではＩＦＮ−ガンマを分泌したが、陰性対照ＣＨＯ細胞では分泌しなかった（図６）。結果は、ヒト化ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞の特異性を立証した。
【実施例１０】
【００７６】
ヒト化ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＢＣＭＡ陽性ＲＰＭＩ８２６６多発性骨髄腫細胞に対して高レベルのＩＦＮ−ガンマを分泌したが、ＢＣＭＡ陰性Ｋ５６２白血病細胞に対しては分泌しなかった。
本発明者らは、ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞を多発性骨髄腫がん細胞ＲＰＭＩ８２６６およびＢＣＭＡ陰性Ｋ５６２細胞（慢性骨髄性白血病細胞）と共にインキュベートし、ＩＦＮ−ガンマについてＦｉｓｈｅｒのキットを使用して製造元の手順に従ってＥＬＩＳＡを実施した。ヒト化ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＢＣＭＡ陽性多発性骨髄腫がん細胞に対して高レベルのＩＦＮ−ガンマを分泌したが、ＢＣＭＡ陰性Ｋ５６２細胞に対しては分泌しなかった（図７）。死滅のレベルおよびＩＦＮ−ガンマの分泌は、Ｔ細胞およびＭｏｃｋ  ＣＡＲ−Ｔ細胞よりもＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞の方が顕著に高かった。これは、造血ＢＣＭＡ陽性細胞に対するヒト化ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞の特異性を立証している。
【実施例１１】
【００７７】
ヒト化ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞は、インビボにおいてマウスモデルでＲＰＭＩ８２２６異種移植腫瘍の増殖を顕著に減少させた。
多発性骨髄腫ＲＰＭＩ８２２６細胞をＮＳＧマウス（１×１０＾７細胞／マウス）に皮下注射した後、ヒト化ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞をｉｖによって（１×１０＾７ＣＡＲ−Ｔ細胞／マウス）２回注射した。ヒト化ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞は、マウスにおけるＲＰＭＩ８２２６腫瘍の増殖を顕著に減少させた（図８Ａ）。ヒト化ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞で治療したマウスは、マウスの体重減少を引き起こさなかったので、ＣＡＲ−Ｔ細胞はマウスに対して毒性がないことが示唆された（図８Ｂ）。研究中、行動や目に見える変化は観察されなかった。
【００７８】
末梢血細胞は、ヒトＢＣＭＡタンパク質およびヒトＴ（ＣＤ４＋／ＣＤ８＋）細胞に特異的な抗体への結合についての研究の最後に、フローサイトメトリーによって分析した。ＣＤ４ｍＡｂ抗体に結合する細胞のパーセンテージは図８Ｃの左パネルに示され、ＢＣＭＡタンパク質にも結合したそれらのヒトＴ細胞のパーセンテージは図８Ｃの右パネルに示されている。結果は、ＢＣＭＡ組換えタンパク質を用いたＦＡＣＳにより、Ｍｏｃｋ−Ｃａｒ−Ｔ細胞ではなく、ヒト化ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞がマウス血液中で検出されたことを示す。
【００７９】
参考文献
1.  Maus, M.V., Haas, A.R., Beatty, G.L., Albelda, S.M., Levine, B.L., Liu, X., Zhao, Y., Kalos, M., and June, C.H. (2013). T cells expressing chimeric antigen receptors can cause anaphylaxis in humans. Cancer Immunol Res 1, 26-31.
2.  Maus, M.V., Grupp, S.A., Porter, D.L., and June, C.H. (2014). Antibody-modified T cells: CARs take the front seat for hematologic malignancies. Blood 123, 2625-2635.
3.  Golubovskaya V, Wu L. (2016) Different Subsets of T Cells, Memory, Effector   Functions, and CAR-T Immunotherapy. Cancers, 15, 8 (3). PMID: 26999211
4.  Ali, S.A., Shi, V., Maric, I., Wang, M., Stroncek, D.F., Rose, J.J., Brudno, J.N., Stetler-Stevenson, M., Feldman, S.A., Hansen, B.G., et al. (2016). T cells expressing an anti-B-cell maturation antigen chimeric antigen receptor cause remissions of multiple myeloma. Blood 128, 1688-1700.
5.  Tai, Y.T., and Anderson, K.C. (2015). Targeting B-cell maturation antigen in multiple myeloma. Immunotherapy.  7(11):1187-99. doi: 10.2217/imt.15.77. Epub 2015 Sep 15. Review. PMID: 26370838
6.  WO2019/195017   
7.  Berahovich R, Xu S, Zhou H, Harto H, Xu Q, Garcia A, Liu F, Golubovskaya VM, Wu L. FLAG-tagged CD19-specific CAR-T cells eliminate CD19-bearing solid tumor cells in vitro and in vivo. Front Biosci (Landmark Ed). 2017 Jun 1;22: 1644-1654
【図１】
2021525063.tif 000005
【図２】
2021525063.tif 000006
【図３】
2021525063.tif 000007
【図４】
2021525063.tif 000008
【図５Ａ】
2021525063.tif 000009
【図５Ｂ】
2021525063.tif 000010
【図６】
2021525063.tif 000011
【図７】
2021525063.tif 000012
【図８Ａ】
2021525063.tif 000013
【図８Ｂ】
2021525063.tif 000014
【図８Ｃ】
2021525063.tif 000015
【配列表】
2021525063000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年11月30日(2020.11.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶH）；および
配列番号５のアミノ酸配列を有する軽鎖鎖可変領域（ＶL）
を含む、抗ヒトＢＣＭＡ１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）。
【請求項２】
ＶHとＶLの間にリンカーをさらに含む、請求項１に記載のｓｃＦｖ。
【請求項３】
リンカーは、配列番号４のアミノ酸配列を有する、請求項２に記載のｓｃＦｖ。
【請求項４】
配列番号６のアミノ酸配列を有する、請求項３に記載のｓｃＦｖ。
【請求項５】
配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶH）；および
配列番号５のアミノ酸配列を有する軽鎖鎖可変領域（ＶL）
を含む、抗ＢＣＭＡ１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）;
膜貫通ドメイン；
共刺激性ドメイン；ならびに
活性化ドメイン
を含む、抗ＢＣＭＡキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項６】
膜貫通ドメインが、Ｔ細胞受容体α鎖、Ｔ細胞受容体β鎖、ＣＤ３ゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４、およびＧＩＴＲからなる群から選択される膜貫通ドメインである、請求項５に記載のＣＡＲ。
【請求項７】
膜貫通ドメインが、ＣＤ８の膜貫通ドメインを含む、請求項６に記載のＣＡＲ。
【請求項８】
共刺激性ドメインが、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ−１、ＣＤ２７、ＯＸ−４０、およびＤＡＰ１０からなる群から選択される共刺激性ドメインである、請求項５に記載のＣＡＲ。
【請求項９】
共刺激性ドメインが、４−１ＢＢ共刺激性ドメインを含む、請求項８に記載のＣＡＲ。
【請求項１０】
活性化ドメインが、ＣＤ３ゼータ活性化ドメインを含む、請求項５に記載のＣＡＲ。
【請求項１１】
膜貫通ドメインがＣＤ８の膜貫通ドメインを含み、共刺激性ドメインが４−１ＢＢ共刺激性ドメインを含み、および活性化ドメインがＣＤ３ゼータ活性化ドメインを含む、請求項５に記載のＣＡＲ。
【請求項１２】
配列番号１７のアミノ酸配列を有する、請求項５に記載のＣＡＲ。
【請求項１３】
請求項５に記載のＣＡＲをコードし、５’末端および３’末端を有する、核酸。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１５】
ベクターがウイルスベクターである、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
請求項５に記載のＣＡＲを含む、ＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項１７】
請求項１２に記載のＣＡＲを含む、請求項１６に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項１８】
ＢＣＭＡ陽性がん細胞を致死させる方法で使用するための、抗ＢＣＭＡキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、ヒト化ＣＡＲ−Ｔ細胞であって、前記方法は：
ＢＣＭＡ陽性がん細胞とヒト化ＣＡＲ−Ｔ細胞を接触させることを含み、前記ＣＡＲは：
配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶH）；および
配列番号５のアミノ酸配列を有する軽鎖鎖可変領域（ＶL）
を含む、抗ＢＣＭＡ１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）;
膜貫通ドメイン；
共刺激性ドメイン；ならびに
活性化ドメイン
を含む、
ヒト化ＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項１９】
接触はインビトロである、請求項１８に記載のヒト化ＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項２０】
ＢＣＭＡ陽性がん細胞は、多発性骨髄腫がん細胞を含む、請求項１８に記載のヒト化ＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項２１】
接触は腫瘍内である、請求項１８に記載のヒト化ＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項２２】
抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ−Ｔ細胞を製造する方法であって、
配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶH）；および
配列番号５のアミノ酸配列を有する軽鎖鎖可変領域（ＶL）
を含む、抗ＢＣＭＡ１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）;
膜貫通ドメイン；
共刺激性ドメイン；ならびに
活性化ドメイン
を含む抗ＢＣＭＡキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を、Ｔ細胞内に導入することを含む、方法。
【請求項２３】
核酸がインビトロでＴ細胞内に導入される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
核酸は、ウイルスベクターによってＴ細胞内に導入される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、サルウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、センダイウイルスベクター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）ベクター、およびＨＳＶベクターから成る群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【国際調査報告】
2021525063.tif 000016
2021525063.tif 000017