(57)【要約】  本発明は、対象の未分化骨髄（ＢＭ）細胞中のＭＰＯレベルおよび／または活性をエクスビボおよび／またはインビボで調節することにより、哺乳動物対象におけるミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の発現および／または活性を調節する方法に関する。本発明は、ＭＰＯ関連障害を治療するための治療方法および組成物をさらに提供する。【選択図】図４Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物対象においてミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の発現および／または活性を調節する方法であって、
（ａ）前記対象の少なくとも１種の未分化骨髄（ＢＭ）細胞中のＭＰＯの発現および／または活性を調節するように適合された少なくとも１種の遺伝子編集化合物、および
（ｂ）ＭＰＯの調節された発現および／または活性を示す未分化ＢＭ細胞集団、
の少なくとも１種の有効量を前記対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項２】
前記未分化ＢＭ細胞が、造血幹細胞（ＨＳＣ）または前駆細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１種の遺伝子編集化合物が、少なくとも１種のプログラム可能遺伝子改変ヌクレアーゼ（ＰＥＮ）、前記ＰＥＮをコードする配列を含む任意の核酸分子、前記少なくとも１種のＰＥＮを含む、任意のキット、組成物またはビークル、または前記ＰＥＮをコードする核酸分子の少なくとも１種を含む、請求項１および２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＥＮが、少なくとも１種のクラスター化され規則的にに間隔を置かれる配短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ結合（ｃａｓ）タンパク質システムを含み、かつ
（ａ）少なくとも１種のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、または前記Ｃａｓタンパク質をコードする任意の核酸分子、および
（ｂ）前記ＭＰＯ遺伝子内のプロトスペーサーを標的とする少なくとも１種のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む少なくとも１種の核酸配列、または前記ｇＲＮＡをコードする任意の核酸配列、
または（ａ）および（ｂ）の少なくとも１種を含む任意のキット、組成物またはビークル、
の少なくとも１種の有効量を前記対象に投与するステップを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ｇＲＮＡが、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５配列番号４２、配列番号４７、配列番号５０、配列番号５５、配列番号６０、配列番号６３、配列番号６６、配列番号７１、配列番号７４、配列番号７７、配列番号８０、配列番号８５、配列番号８８および配列番号９１のいずれか１つにより表される核酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記未分化ＢＭ細胞集団が、前記細胞中のＭＰＯの発現および／または活性を調節できる少なくとも１種の遺伝子編集化合物で形質導入されたまたは遺伝子導入されたＢＭ細胞集団である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記未分化ＢＭ細胞集団が、自己源由来または同種間源由来である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記未分化ＢＭ細胞集団が、ＭＰＯの抑制されたまたは除去された発現および／または活性を示す同種対象のＢＭ細胞集団である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＭＰＯの発現および／または活性の調節が、前記対象におけるＭＰＯの発現および／または活性を抑制することまたは除去することを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
哺乳動物対象においてＭＰＯ関連状態を治療する、防止する、回復させる、抑制するまたはその発症を遅らせるための方法であって、
（ａ）前記対象の少なくとも１種の未分化ＢＭ細胞中のＭＰＯの発現および／または活性を調節するために適合された少なくとも１種の遺伝子編集化合物、および
（ｂ）ＭＰＯの調節された発現および／または活性を示す未分化ＢＭ細胞集団、
の少なくとも１種の治療的有効量を前記対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項１１】
前記未分化ＢＭ細胞集団が、前記細胞中のＭＰＯの発現および／または活性を調節できる少なくとも１種の遺伝子編集化合物で形質導入されたまたは遺伝子導入されたＢＭ細胞集団である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記未分化ＢＭ細胞集団が、自己源由来または同種間源由来である、請求項１０および１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記未分化ＢＭ細胞集団が、ＭＰＯの抑制されたまたは除去された発現および／または活性を示す同種対象のＢＭ細胞集団である、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記遺伝子編集化合物が、少なくとも１種のＰＥＮ、前記ＰＥＮをコードする配列を含む任意の核酸分子、前記少なくとも１種のＰＥＮを含む任意のキット、組成物またはビークル、または前記ＰＥＮをコードする任意の核酸配列の少なくとも１種を含む、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１種のＰＥＮが、少なくとも１種のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含み、かつ
（ａ）少なくとも１種のＣａｓタンパク質を含む少なくとも１種のポリペプチド、または前記Ｃａｓタンパク質をコードする任意の核酸分子を含む少なくとも１種のポリペプチド、および
（ｂ）前記ＭＰＯ遺伝子内のプロトスペーサーを標的とする少なくとも１種のｇＲＮＡ、または前記ｇＲＮＡをコードする任意の核酸配列、
または（ａ）および（ｂ）の少なくとも１種を含む任意のキット、組成物またはビークル、
の有効量を前記対象に投与するステップを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｇＲＮＡが、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号４２、配列番号４７、配列番号５０、配列番号５５、配列番号６０、配列番号６３、配列番号６６、配列番号７１、配列番号７４、配列番号７７、配列番号８０、配列番号８５、配列番号８８および配列番号９１のいずれか１つにより表される核酸配列を含む、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＭＰＯ関連状態が、神経変性疾患、免疫関連障害、呼吸障害、増殖性障害、血管障害またはこれらの任意の組み合わせの少なくとも１つである、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記神経変性疾患が、アルツハイマー病（ＡＤ）およびパーキンソン病（ＰＤ）のいずれか１つである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記免疫関連障害が、自己免疫疾患および炎症性疾患の少なくとも１つである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記自己免疫疾患が、多発性硬化症（ＭＳ）、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連障害、および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のいずれか１つである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記炎症性疾患が、アテローム性動脈硬化症および関節リウマチ（ＲＡ）のいずれか１つである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記呼吸障害が、肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記増殖性障害が、癌である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
（ａ）それを必要としている対象の少なくとも１種の未分化ＢＭ細胞中のＭＰＯの発現および／または活性を調節するように適合された少なくとも１種の遺伝子編集化合物、および
（ｂ）ＭＰＯの調節された発現および／または活性を示す未分化ＢＭ細胞集団、
の少なくとも１種の治療有効量を含む医薬組成物であって、薬学的に許容可能な担体、希釈剤および／または賦形剤の少なくとも１種を任意選択でさらに含む、医薬組成物。
【請求項２５】
前記遺伝子編集化合物が、少なくとも１種のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む少なくとも１種のＰＥＮであり、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが、
（ａ）少なくとも１種のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、または前記Ｃａｓタンパク質をコードする任意の核酸分子、および
（ｂ）前記ＭＰＯ遺伝子内のプロトスペーサーを標的とする少なくとも１種のｇＲＮＡを含む少なくとも１種の核酸配列、または前記ｇＲＮＡをコードする任意の核酸配列、
または（ａ）および（ｂ）の少なくとも１種を含む任意のキット、組成物またはビークル、
の少なくとも１種を含む、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記ｇＲＮＡが、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号４２、配列番号４７、配列番号５０、配列番号５５、配列番号６０、配列番号６３、配列番号６６、配列番号７１、配列番号７４、配列番号７７、配列番号８０、配列番号８５、配列番号８８および配列番号９１のいずれか１つにより表される核酸配列を含む、請求項２４または２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記未分化ＢＭ細胞集団が、前記細胞中のＭＰＯの発現および／または活性を調節できる少なくとも１種の遺伝子編集化合物で形質導入されたまたは遺伝子導入されたＢＭ細胞集団である、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記未分化ＢＭ細胞集団が、自己源由来または同種間源由来である、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記未分化ＢＭ細胞集団が、ＭＰＯの抑制されたまたは除去された発現および／または活性を示す同種対象のＢＭ細胞集団である、請求項２４〜２８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
哺乳動物対象においてＭＰＯ関連状態または疾患を治療する、防止する、回復させる、抑制するまたはその発症を遅延させるための方法での使用のための、請求項２４〜２９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記ＭＰＯ関連状態が、神経変性疾患、免疫関連障害、呼吸障害、増殖性障害、血管障害またはこれらの任意の組み合わせの少なくとも１つである、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記神経変性疾患が、ＡＤおよびＰＤのいずれか１つである、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記免疫関連障害が、自己免疫疾患および炎症性疾患の少なくとも１つである、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記神自己免疫疾患が、ＭＳ、ＡＮＣＡ関連障害およびＳＬＥのいずれか１つである、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
前記呼吸障害が、ＰＡＨである、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記増殖性障害が、癌である、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
前記細胞中のＭＰＯの発現および／または活性を調節できる少なくとも１種の遺伝子編集化合物で形質導入されたまたは遺伝子導入された少なくとも１種の未分化ＢＭ細胞。
【請求項３８】
前記細胞が、ＭＰＯ関連状態を罹患している対象由来である、請求項３７に記載の細胞。
【請求項３９】
哺乳動物対象におけるＭＰＯの発現および／または活性を調節するための方法での使用のための、請求項３７または３８に記載の細胞。
【請求項４０】
哺乳動物対象におけるＭＰＯ関連状態または疾患を治療する、防止する、回復させる、抑制するまたはその発症を遅延させる方法での使用のための、請求項３７〜３９のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項４１】
（ａ）前記対象の少なくとも１種の未分化ＢＭ細胞中のＭＰＯの発現および／または活性を調節するように適合された少なくとも１種の遺伝子編集化合物、および
（ｂ）哺乳動物対象におけるＭＰＯ関連状態を治療する、防止する、回復させる、抑制するまたはその発症を遅延させる方法での使用のための、ＭＰＯの調節された発現および／または活性を示す未分化ＢＭ細胞集団、
の少なくとも１種の治療的有効量。
【請求項４２】
請求項４１に記載の使用のための、前記（ａ）の少なくとも１種の遺伝子編集化合物および前記（ｂ）の未分化ＢＭ細胞集団の少なくとも１種の治療的有効量であって、前記未分化ＢＭ細胞集団が、前記細胞中のＭＰＯの発現および／または活性を調節できる少なくとも１種の遺伝子編集化合物で形質導入されたまたは遺伝子導入されたＢＭ細胞集団である、治療的有効量。
【請求項４３】
請求項４１または４２に記載の使用のための、前記（ａ）の少なくとも１種の遺伝子編集化合物および前記（ｂ）の未分化ＢＭ細胞集団の少なくとも１種の治療的有効量であって、前記遺伝子編集化合物が、少なくとも１種のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む少なくとも１種のＰＥＮであり、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが、
（ａ）少なくとも１種のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、または前記Ｃａｓタンパク質をコードする任意の核酸分子、および
（ｂ）前記ＭＰＯ遺伝子内のプロトスペーサーを標的とする少なくとも１種のｇＲＮＡを含む少なくとも１種の核酸配列、または前記ｇＲＮＡをコードする任意の核酸配列、
または（ａ）および（ｂ）の少なくとも１種を含む任意のキット、組成物またはビークル、
の少なくとも１種を含む、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
哺乳動物対象においてネトーシスおよび関連状態を抑制する方法であって、
（ａ）前記対象の少なくとも１種の未分化ＢＭ細胞中のＭＰＯの発現および／または活性を調節するように適合された少なくとも１種の遺伝子編集化合物、および
（ｂ）調節されたＭＰＯの発現および／または活性を示す未分化ＢＭ細胞集団、
の少なくとも１種の治療的有効量を前記対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項４５】
前記遺伝子編集化合物が、少なくとも１種のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む少なくとも１種のＰＥＮであり、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが、
（ａ）少なくとも１種のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、または前記Ｃａｓタンパク質をコードする任意の核酸分子、および
（ｂ）前記ＭＰＯ遺伝子内のプロトスペーサーを標的とする少なくとも１種のｇＲＮＡを含む少なくとも１種の核酸配列、または前記ｇＲＮＡをコードする任意の核酸配列、または（ａ）および（ｂ）の少なくとも１種を含む任意のキット、組成物またはビークル、
の少なくとも１種を含む、請求項４４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）発現を調節するための方法および組成物、ならびにＭＰＯ関連状態の治療におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術文献
背景技術として本明細書で開示の主題に関連すると考えられる文献を下記に挙げる：
［１］Ｎａｕｓｅｅｆ  ＷＭ，Ｂｏｒｒｅｇａａｒｄ  Ｎ．Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ａｔ  ｗｏｒｋ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４；１５：６０２−６１１．
［２］Ｄｅｌｇａｄｏ−Ｒｉｚｏ  Ｖ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｇｕｚｍａｎ  ＭＡ，Ｉｎｉｇｕｅｚ−Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ  Ｌ，Ｇａｒｃｉａ−Ｏｒｏｚｃｏ  Ａ，Ａｌｖａｒａｄｏ−Ｎａｖａｒｒｏ  Ａ，Ｆａｆｕｔｉｓ−Ｍｏｒｒｉｓ  Ｍ．Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｐｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ：Ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ．Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１７；８．
［３］Ｗｉｎｔｅｒｂｏｕｒｎ  ＣＣ，Ｋｅｔｔｌｅ  ＡＪ，Ｈａｍｐｔｏｎ  ＭＢ．Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｎｄ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１６；８５：７６５−７９２．
［４］Ｍｅｔｚｌｅｒ  ＫＤ，Ｇｏｏｓｍａｎｎ  Ｃ，Ｌｕｂｏｊｅｍｓｋａ  Ａ，Ｚｙｃｈｌｉｎｓｋｙ  Ａ，Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ  Ｖ．Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｅｌａｓｔａｓｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｎｄ  ａｃｔｉｎ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ＮＥＴｏｓｉｓ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２０１４；８：８８３−８９６．
［５］Ｓｔｒｚｅｐａａ  Ａ，Ｐｒｉｔｃｈａｒｄｃ  ＫＡ，Ｄｉｔｔｅｌ  ＢＭ．Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ：Ａ  ｎｅｗ  ｐｌａｙｅｒ  ｉｎ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１７；３１７：１−８．
［６］Ｋｈａｎ  ＡＡ，Ａｌｓａｈｌｉ  ＭＡ，Ｒａｈｍａｎｉ  ＡＨ．Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ａｓ  ａｎ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ：Ｒｅｃｅｎｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．２０１８  ６３３．
［７］Ｚｅｎａｒｏ  Ｅ，Ｐｉｅｔｒｏｎｉｇｒｏ  Ｅ，Ｂｉａｎｃａ  Ｖ  Ｄｅｌｌａ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ−ｌｉｋｅ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｄｅｃｌｉｎｅ  ｖｉａ  ＬＦＡ−１  ｉｎｔｅｇｒｉｎ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１５；２１（８）：８８０−８８６．
［８］Ａｚｅｖｅｄｏ  ＥＰＣ，Ｇｕｉｍａｒａｅｓ−Ｃｏｓｔａ  ＡＢ，Ｔｏｒｅｚａｎｉ  ＧＳ，ｅｔ  ａｌ．Ａｍｙｌｏｉｄ  ｆｉｂｒｉｌｓ  ｔｒｉｇｇｅｒ  ｔｈｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｐｓ（ＮＥＴｓ），ｃａｕｓｉｎｇ  ｆｉｂｒｉｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＮＥＴ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｅｌａｓｔａｓｅ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１２；２８７（４４）：３７２０６−３７２１８．
［９］Ｇｅｌｌｈａａｒ  Ｓ，Ｓｕｎｎｅｍａｒｋ  Ｄ，Ｅｒｉｋｓｓｏｎ  Ｈ，Ｏｌｓｏｎ  Ｌ，Ｇａｌｔｅｒ  Ｄ．Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ  ｃｅｌｌｓ  ａｒｅ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｉｎ  ｂｒａｉｎ  ａｒｅａｓ  ａｆｆｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ａｎｄ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．２０１７；３６９（３）：４４５−４５４．
［１０］Ｎａｅｇｅｌｅ  Ｍ，Ｔｉｌｌａｃｋ  Ｋ，Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ  Ｓ，Ｓｃｈｉｐｐｌｉｎｇ  Ｓ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｒ，Ｓｏｓｐｅｄｒａ  Ｍ．Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ａｒｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ  ａ  ｐｒｉｍｅｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２；２４２（１−２）：６０−７１．
［１１］Ｒｉｖｅｒｓ  ＴＭ．Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ａｔｔｅｍｐｔｓ  ｔｏ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ａｃｕｔｅ  ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｉｎ  ｍｏｎｋｅｙｓ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９３３；５８（１）：３９−５３．
［１２］Ｒｉｃｈａｒｄ  ＪＦ，Ｒｏｙ  Ｍ，Ａｕｄｏｙ−Ｒｅｍｕｓ  Ｊ，Ｔｒｅｍｂｌａｙ  Ｐ，Ｖａｌｌｉｅｒｅｓ  Ｌ．Ｃｒａｗｌｉｎｇ  ｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ  ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ  ａｆｔｅｒ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ｔｏｘｉｎ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＩＬ６，ＩＣＡＭ１  ａｎｄ  ＩＴＧαＭ．Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．２０１１；２１（６）：６６１−６７１．
［１３］Ｃａｒｌｓｏｎ  Ｔ，Ｋｒｏｅｎｋｅ  Ｍ，Ｒａｏ  Ｐ，Ｌａｎｅ  ＴＥ，Ｓｅｇａｌ  Ｂ．Ｔｈｅ  Ｔｈ１７−ＥＬＲ＋  ＣＸＣ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２００８；２０５（４）：８１１−８２３．
［１４］Ｗｕ  Ｆ，Ｃａｏ  Ｗ，Ｙａｎｇ  Ｙ，Ｌｉｕ  Ａ．Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｃｕｔｅ  ｐｈａｓｅ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｉｎ  Ｃ５７ＢＬ／６  ｍｉｃｅ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１０；１３３（３）：３１３−３２２．
［１５］Ａｕｂｅ  Ｂ，Ｌｅｖｅｓｑｕｅ  ＳＡ，Ｐａｒｅ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  Ｍｅｄｉａｔｅ  Ｂｌｏｏｄ−Ｓｐｉｎａｌ  Ｃｏｒｄ  Ｂａｒｒｉｅｒ  Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ  Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４；１９３（５）：２４３８−２４５４．
［１６］Ｐｕｎ  ＰＢＬ，Ｌｕ  Ｊ，Ｍｏｏｃｈｈａｌａ  Ｓ．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＲＯＳ  ｉｎ  ＢＢＢ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｒｅｓ．２００９；４３（４）：３４８−３６４．
［１７］Ｚｈａｎｇ  Ｈ，Ｒａｙ  Ａ，Ｍｉｌｌｅｒ  ＮＭ，Ｈａｒｔｗｉｇ  Ｄ，Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ  ＫＡ，Ｄｉｔｔｅｌ  ＢＮ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ａｔ  ｔｈｅ  ｐｅａｋ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｒｅｓｔｏｒｅｓ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ａｎｄ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２０１６；１３６（４）：８２６−８３６．
［１８］Ｋａｒｉｎ  Ｓｔｅｉｎｂａｃｈ，Ｍｅｌａｎｉｅ  Ｐｉｅｄａｖｅｎｔ，Ｓｉｍｏｎｅ  Ｂａｕｅｒ，Ｊｏｈａｎｎｅｓ  Ｔ．Ｎｅｕｍａｎｎ，ａｎｄ  Ｍａｎｕｅｌ  Ａ．Ｆｒｉｅｓｅ．Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  Ａｍｐｌｉｆｙ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅｓ  ｂｙ  Ｍａｔｕｒｉｎｇ  Ｌｏｃａｌ  ＡＰＣｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１３；１９１：４５３１−４５３９．
［１９］Ｍａｌｌｅ１  Ｅ，Ｆｕｒｔｍｕｌｌｅｒ  ＰＧ，Ｓａｔｔｌｅｒ  Ｗ，Ｏｂｉｎｇｅｒ  Ｃ．Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ：ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｎｅｗ  ｄｒｕｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２００７；１５２，８３８−８５４．
［２０］国際公開第２０１５１４８７１６号。
［２１］Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｖｅｅｎ  ＢＳ，Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ  ＆  ｒｅｄｏｘ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，２００９，１１．１１：２８９９−２９３７．
［２２］ＹＵ，Ｇｕｏｌｉａｎｇ；ＳＨＩＫＡＮ  ＺＨＥＮＧ，Ｈａｏ  Ｚｈａｎｇ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｂｙ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌ  ｌｙｓｙｌｔｙｒｏｓｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  ａｍｉｄｅ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ，２０１８，２９．３：２０８．
本明細書における上記文献の承認により、これらが本明細書で開示の主題の特許性に多少なりとも関連することを意味するものと推測されるべきではない。
【０００３】
発明の背景
好中球は、血流全体に広がる食作用顆粒含有細胞であり、自然免疫応答の中心的メディエーターとして知られている。細菌感染症または組織損傷から生じる早期の炎症開始シグナルにより、好中球は、血流から、内皮細胞バリアーを通って損傷部位に向けて移動し、早期炎症応答を媒介する。この応答は主に、細菌細胞または外来性物質の食作用、ならびにタンパク分解性酵素および活性酸素種（ＲＯＳ）を含むサイトカインおよび顆粒の放出に起因する［１］。最近になって確証された好中球の特徴は、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）を形成するそれらの能力である。ＮＥＴの産生（ネトーシスとして知られる）は、厳密に制御された機序であり、それにより、クロマチン脱凝縮後に、ＤＮＡが複数の殺菌性タンパク質と一緒に細胞から放出されて網状トラップを形成する［２］。
【０００４】
ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）は、いくつかの骨髄性細胞により発現されるヘム含有ペルオキシダーゼであり、好中球により発現される最も一般的なタンパク質である（好中球の純量の５％を構成する）。ＭＰＯは、毒性物質次亜塩素酸（ＨＣｌＯ）ならびに他の酸化性物質の形成を触媒する［３］。近年、マウス好中球のＭＰＯタイトレーションは、クロマチン脱凝縮およびＮＥＴ形成を促進することが示された。またさらに、ＭＰＯ欠損のヒトドナー由来の好中球はＮＥＴを産生できないことが明らかになり、ＭＰＯがＮＥＴ形成に不可欠であることが示された。
【０００５】
ＭＰＯは、心臓血管疾患、炎症性疾患、神経変性疾患、腎疾患および免疫介在疾患などの多くの状態の主要因であることが示された［５〜６］。Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｂｅｅｎらは、いくつかの疾患、特に、急性または慢性炎症を特徴とする疾患におけるＭＰＯの密接な関わりについて報告している［２１］。
【０００６】
さらに具体的には、アルツハイマー病（ＡＤ）および認知症は、記憶、見当識、判断、および論理的思考を含む全般的認知機能の低下を特徴とする進行性神経変性疾患であり、高齢者における認知症の最も一般的な形態である。免疫細胞は、ＡＤ病因に関与することが以前から知られており、および反応性グリア細胞は、Ａｌｏｉｓ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒにより以前に記述された。星状膠細胞およびミクログリア細胞は、ＡＤとの関連で広く研究され、アミロイドβプラークの周りでクラスター形成することが知られている。これらの細胞が活性化されると、それらは、種々の炎症性メディエーターを分泌し、神経および周辺血管組織に対する酸化的損傷を生じる可能性があり、慢性炎症を促進する。以前は、脳生理機能および病態には関連が少ないと見なされたが、ＡＤにおける周辺免疫細胞の役割は、近年ますます研究されている。この役割は、骨髄性細胞により発現された免疫関連遺伝子内の複数の座位をＡＤ感受性座位として特定する、昨年実施されたゲノムワイド関連解析により強力に裏付けられた。近年、Ｚｅｎａｒｏと共同研究者は、脳侵入好中球は、炎症促進性サイトカインＩＬ−１７を放出することにより、およびＮＥＴを産生することにより、２つのマウスモデルでＡＤ様病態を促進することを報告した。好中球枯渇またはＣＮＳ中への好中球遊走の抑制は、認知および記憶の改善ならびに神経炎症およびＡβ量の減少を生じた。最後には、彼らはまた、ＮＥＴ形成好中球は、健常者とは対照的に、ＡＤ患者の脳内で上昇することを報告した［７］。さらに、好中球からのＮＥＴ放出はまた、アミロイドフィブリルにより誘発されることが示され、神経変性脳中でのＮＥＴの形成［８］を裏付け、さらに、ＭＰＯ免疫反応性細胞は、ＡＤおよびＰＤ患者の脳中の、特定の神経変性領域中で報告された［９］。さらに、脳侵入好中球は、炎症促進性サイトカインＩＬ−１７の放出に付随して、およびＮＥＴを産生することにより、２つのＡＤマウスモデルでＡＤ様病態を促進することが示された。他方では、抗ＬＹ６Ｇを用いた好中球枯渇またはＣＮＳ中への好中球遊走の抑制は、認知および記憶の改善ならびに神経炎症およびアミロイドβレベルの減少を生じた。つい最近には、ＡＤモデルマウスの脳中で、脳血流を低下させる、皮質毛細血管中の好中球接着の増大が報告された。
【０００７】
またさらに、若年成人の最もよく認められる神経変性疾患である多発性硬化症（ＭＳ）は、脳血液関門（ＢＢＢ）を通したＴ細胞浸潤により主に媒介される脳および脊髄中のミエリン鞘の免疫攻撃を特徴とする、慢性自己免疫疾患である。ＭＳの病因論は、非自己免疫性神経変性疾患とは異なり、自然および後天性免疫細胞を含むが、いくつかの証拠は、好中球媒介組織損傷の関与を示している。ＭＳ由来の好中球は、増大した脱顆粒およびＮＥＴ形成および高められた酸化バーストに加えて、プライミングされた表現型を示す［１０］。複数の証拠はまた、ＭＳの実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）マウスモデルにおける好中球の関与を示す［１１］。ＥＡＥの間、好中球は、脳脈管構造に動員され［１２］、ＣＮＳに浸潤し［１３］、脱髄および軸索損傷領域内に蓄積する［１４］。さらに、好中球は、ＢＢＢおよび脳脊髄関門（ＢＳＣＢ）の破壊に結び付けられ、抗好中球抗体の投与は、ＥＡＥ発生を妨害することが示された［１５］。
【０００８】
好中球による内皮バリアー破壊は、白血球のＣＮＳへの侵入を可能にし、ＥＡＥ／ＭＳ病変を促進し得る。好中球は、臨床症状の発症の少し前にＣＮＳ中に蓄積し、病変局在化と相関することが示された［１３］。好中球による内皮バリアー破壊は、活性酸素種（ＲＯＳ）の放出により起こることが示唆された［１６］。従って、ＥＡＥの間のＭＰＯの抑制は、ＢＢＢの完全性を回復し、疾患重症度を改善することが示された［１７］。しかし、前臨床単一用量抗体媒介による好中球枯渇は、実験的自己免疫性脳脊髄炎の発症を遅らせ、連続的な枯渇は、その発生を弱めるが、ミエリン特異的Ｔ細胞応答の生成は、影響を受けないままであった。この研究では、ミエロペルオキシダーゼおよび好中球エラスターゼなどの好中球関連酵素は、それぞれのノックアウトマウスおよび阻害剤を用いた分析によると、ＣＮＳ炎症の発生に寄与しないことがさらに明らかになった［１８〜１９］。
【０００９】
活性ＭＰＯを阻害するために、以前にいくつかの方策が用いられた。例えば、アジド、ヒドラジドおよびヒドロキサム酸を用いて、ヘム部位を修飾することによりＭＰＯを阻害した［７］。またさらに、Ｙｕらは、ＥＡＥマウスモードを用いる、多発性硬化症の治療のためのＭＰＯの特異的阻害剤、Ｎ−アセチル  リシルチロシルシステインアミド（ＫＹＣ）について記載している［２２］。国際公開第２０１５１４８７１６号は、小分子薬物およびサイトカイン／成長因子の組み合わせを用いる、造血細胞のエクスビボ増殖のための方法および組成物を開示している。複数の遺伝子、特にＭＰＯが影響を受けた［２０］。
【００１０】
ＭＰＯのヘム活性部位の修飾を目的にする場合、先行技術の阻害剤は、ＭＰＯの他のドメインにより媒介される望ましくない作用に対処できない。さらに、このような阻害剤の使用は、ＡＤなどの病態での血管炎に繋がり得る抗ＭＰＯ抗体の形成を防止できない。従って、ＭＰＯ関連状態を罹患している対象においてＭＰＯ、およびその種々の活性を特異的におよび効率的に標的にするための、安全で、効率的でかつ特異的な方法および組成物を提供する必要性が存在する。
【発明の概要】
【００１１】
第１の態様では、本開示は、哺乳動物対象中のミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の発現および／または活性を調節する方法を提供する。より具体的には、本発明の方法は、（ａ）対象の少なくとも１種の未分化骨髄（ＢＭ）細胞中のＭＰＯの発現および／または活性を調節できるまたはその調節に適合された少なくとも１種の遺伝子編集化合物、の少なくとも１種の有効量を対象に投与するステップを含み得る。代わりにまたは追加して、方法は、対象に（ｂ）ＭＰＯの調節された発現および／または活性を示す未分化ＢＭ細胞集団を投与し得る。（ａ）および（ｂ）または（ａ）および（ｂ）の少なくとも１種を含む任意の組成物またはキットの投与も本発明の方法に包含されることに留意されたい。
【００１２】
さらなる態様では、本開示は、哺乳動物対象におけるＭＰＯ関連状態を治療、防止、回復、抑制またはその発症を遅らせる方法を提供する。本発明の方法は、（ａ）対象の少なくとも１種の未分化ＢＭ細胞中のＭＰＯの発現および／または活性を調節できる少なくとも１種の遺伝子編集化合物、および（ｂ）ＭＰＯの調節された発現および／または活性を示す未分化ＢＭ細胞集団、の少なくとも１種の治療有効量を対象に投与するステップを含み得る。（ａ）および（ｂ）または（ａ）および（ｂ）の少なくとも１種を含む任意の組成物またはキットの投与も本発明の方法に包含される。
【００１３】
そのいくつかのさらなる態様では、本発明は、（ａ）対象の少なくとも１種の未分化ＢＭ細胞中のＭＰＯの発現および／または活性を調節できる、またはその調節に適合された少なくとも１種の遺伝子編集化合物、および（ｂ）ＭＰＯの調節された発現および／または活性を示す未分化ＢＭ細胞集団、の少なくとも１種を含むキットを提供する。
【００１４】
そのいくつかのさらなる態様では、本開示は、（ａ）対象の少なくとも１種の未分化ＢＭ細胞中のＭＰＯの発現および／または活性を調節できる、またはその調節に適合された少なくとも１種の遺伝子編集化合物、および（ｂ）ＭＰＯの調節された発現および／または活性を示す未分化ＢＭ細胞集団、の少なくとも１種の治療有効量を含む医薬組成物を提供する。組成物は任意選択で、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、および／または賦形剤の少なくとも１種をさらに含み得る。
【００１５】
本発明のまたさらなる態様は、未分化ＢＭ細胞中のＭＰＯの発現および／または活性を調節できる少なくとも１種の遺伝子編集化合物で形質導入または遺伝子導入された少なくとも１種の上記細胞に関する。
【００１６】
本発明の他の態様は、ＭＰＯの発現および／または活性を調節するための方法での使用のための本発明の組成物、キットおよび細胞の少なくとも１種に関する。本発明のまたさらなる態様は、哺乳動物対象のＭＰＯ関連状態を治療、防止、回復、抑制するまたはその発症を遅延させるための治療方法での使用のための本発明の組成物、キットおよび細胞の少なくとも１種を提供する。
【００１７】
またいくつかのさらなる態様では、本発明は、哺乳動物対象のＭＰＯ関連状態を治療、防止、回復、抑制するまたはその発症を遅延させるための方法で使用するための、（ａ）前記対象の少なくとも１種の未分化ＢＭ細胞中のＭＰＯの発現および／または活性の調節に適合された少なくとも１種の遺伝子編集化合物、および（ｂ）ＭＰＯの調節された発現および／または活性を示す未分化ＢＭ細胞集団、の少なくとも１種の治療有効量を提供する。本発明は、ネトーシスおよび関連状態を抑制するための方法をさらに提供する。これらのおよび他の本発明の態様は、以下の説明により明らかになるであろう。
本明細書で開示される主題をよりよく理解するために、また、本発明をどのようにして実施し得るかを例示するために、以降で単なる非限定的例として添付の図面を参照しながら実施形態を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】Ｃ５７ＢＬ／６マウスでの実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルの樹立。示したミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質３５−５５（ＭＯＧ３５−５５）および百日咳毒素（ＰＴ）濃度でＥＡＥ疾患に誘導したＣ５７ＢＬ／６雌マウスの臨床スコア。群当たり４匹以上のマウス。
【図２】骨髄（ＢＭ）移植は照射Ｃ５７ＢＬ／６マウスの致死を救済する。致死放射線量（９Ｇｙ）に晒した後、ＷＴマウス由来のＢＭ細胞、Ｌｉｎ濃縮ＢＭ細胞、または生理食塩水を移植した２月齢の雄Ｃ５７／ＢＬ６マウスの体重追跡調査。
【図３Ａ−３Ｆ】５ｘＦＡＤマウスへのＭＰＯＴｍ１／Ｌｕｓ由来のＢＭの移植。  図３Ａは、照射およびＷＴマウス由来のＢＭの移植を受けた２月齢非遺伝子導入同腹仔の体重追跡調査を示すグラフである。  図３Ｂは、照射およびＭｐｏＴｍ１／Ｌｕｓマウス由来のＢＭの移植を受けた２月齢非遺伝子導入同腹仔の体重追跡調査を示すグラフである。  図３Ｃは、照射およびＷＴマウス由来のＢＭの移植を受けた２月齢５ｘＦＡＤ遺伝子導入マウスの体重追跡調査を示すグラフである。  図３Ｄは、照射およびＭｐｏＴｍ１／Ｌｕｓマウス由来のＢＭの移植を受けた２月齢５ｘＦＡＤ遺伝子導入マウスの体重追跡調査を示すグラフである。  図３Ｅは、ＷＴ−ＢＭ移植マウスの血液のペルオキシダーゼ活性アッセイである。  図３Ｆは、ＭｐｏＴｍ１／Ｌｕｓ−ＢＭ移植マウスの血液のペルオキシダーゼ活性アッセイである。
【図４Ａ−４Ｃ】ＭＰＯ欠損骨髄を有する５ＸＦＡＤマウスの生成。図４Ａは、次記マウス群の処理の模式図である。８週齢５ＸＦＡＤマウスおよびそれらの非遺伝子導入同腹仔に致死量照射し、ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６またはＭＰＯＴｍ１／Ｌｕｓマウス由来骨髄を移植した。各群のマウスの数を、括弧で示す。  図４Ｂは、１０月齢マウス由来の骨髄細胞のＭＰＯ  ｍＲＮＡ発現分析である。データは、平均±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。両側ｔ検定。  図４Ｃは、実験計画のスケジュール概略図である。
【図５Ａ−５Ｅ】ＭＰＯの欠損は５ＸＦＡＤマウスでの不安関連行動の増大を抑制する。  図５Ａは、オープンフィールド迷路試験に供した７月齢マウスのコーナーでの滞在時間を示すグラフである。  図５Ｂは、オープンフィールド迷路試験に供した７月齢マウスの中央での滞在時間を示すグラフである。  図５Ｃは、マウスが移動した総距離を示すグラフである。  図５Ｄは、高架式十字迷路試験に供したマウスのオープンアームでの滞在時間を示すグラフである。  図５Ｅは、高架式十字迷路試験に供したマウスのクローズドアームでの滞在時間を示すグラフである。  データは、平均±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。両側ｔ検定。
【図６Ａ−６Ｅ】ＭＰＯ欠損は５ＸＦＡＤマウスにおいて学習および記憶低下を保護することを示す。  図６Ａは、２種のＹ迷路試行を用いる７月齢マウスの新規アーム探索相対回数を示すグラフである（短期空間記憶を示す）。  図６Ｂは、２種のＹ迷路試行を用いる７月齢マウスの新規アーム探索時間を示すグラフである（短期空間記憶を示す）。  図６Ｃは、モリス水迷路試験における８月齢マウスの逃避潜時を示すグラフである（空間学習を示す）。  図６Ｄは、モリス水迷路試験における８月齢マウスの総移動距離を示すグラフである（空間学習を示す）。  図６Ｅは、９月齢マウスの恐怖条件づけテストにおけるフリージング行動を示すグラフである。  データは、平均±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。両側ｔ検定。
【図７Ａ−７Ｅ】ＭＰＯ欠損は５ＸＦＡＤマウス中のアミロイドβプラーク量に影響を与えない。  図７Ａは、ＷＴ骨髄細胞を移植したＷＴマウスのＤＡＰＩ／ＴｈｉｏＳで染色した海馬切片の代表的画像である。スケールバー＝２００μｍ。  図７Ｂは、ＷＴ骨髄細胞を移植した５ＸＦＡＤマウスのＤＡＰＩ／ＴｈｉｏＳで染色した海馬切片の代表的画像である。スケールバー＝２００μｍ。  図７Ｃは、ＭＰＯ−ＫＯ骨髄細胞を移植したＷＴマウスのＤＡＰＩ／ＴｈｉｏＳで染色した海馬切片の代表的画像である。スケールバー＝２００μｍ。  図７Ｄは、ＭＰＯ−ＫＯ骨髄細胞を移植した５ＸＦＡＤマウスのＤＡＰＩ／ＴｈｉｏＳで染色した海馬切片の代表的画像である。スケールバー＝２００μｍ。  図７Ｅは、ＴｈｉｏＳプラーク密度の定量化を示すグラフである。データは、平均±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。両側マン・ホイットニー検定。
【図８Ａ−８Ｎ】５ＸＦＡＤ  ＭＰＯ  ＫＯマウスにおける低Ｓ１００β発現。  図８Ａは、ＷＴ骨髄細胞を移植したＷＴマウスのＤＡＰＩで染色した海馬切片の代表的画像である。  図８Ｂは、ＷＴ骨髄細胞を移植した５ＸＦＡＤマウスのＤＡＰＩで染色した海馬切片の代表的画像である。  図８Ｃは、ＭＰＯ−ＫＯ骨髄細胞を移植したＷＴマウスのＤＡＰＩで染色した海馬切片の代表的画像である。  図８Ｄは、ＭＰＯ−ＫＯ骨髄細胞を移植した５ＸＦＡＤマウスのＤＡＰＩで染色した海馬切片の代表的画像である。  図８Ｅは、ＷＴ骨髄細胞を移植したＷＴマウスのＳ１００βで染色した海馬切片の代表的画像である。  図８Ｆは、ＷＴ骨髄細胞を移植した５ＸＦＡＤマウスのＳ１００βで染色した海馬切片の代表的画像である。  図８Ｇは、ＭＰＯ−ＫＯ骨髄細胞を移植したＷＴマウスのＳ１００βで染色した海馬切片の代表的画像である。  図８Ｈは、ＭＰＯ−ＫＯ骨髄細胞を移植した５ＸＦＡＤマウスのＳ１００βで染色した海馬切片の代表的画像である。  図８Ｉは、ＷＴ骨髄細胞を移植したＷＴマウスのＤＡＰＩ／Ｓ１００βで染色した海馬切片の代表的画像である。  図８Ｊは、ＷＴ骨髄細胞を移植した５ＸＦＡＤマウスのＤＡＰＩ／Ｓ１００βで染色した海馬切片の代表的画像である。  図８Ｋは、ＭＰＯ−ＫＯ骨髄細胞を移植したＷＴマウスのＤＡＰＩ／Ｓ１００βで染色した海馬切片の代表的画像である。  図８Ｌは、ＭＰＯ−ＫＯ骨髄細胞を移植した５ＸＦＡＤマウスのＤＡＰＩ／Ｓ１００βで染色した海馬切片の代表的画像である。  図８Ｍは、Ｓ１００β平均強度の定量化を示すグラフである。  図８Ｎは、海馬試料のＳ１００β  ｍＲＮＡ発現分析を示すグラフである。データは、平均±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。両側マン・ホイットニー検定。
【図９Ａ−９Ｅ】５ＸＦＡＤ  ＭＰＯ  ＫＯマウスにおける低レベルの炎症性マーカー。  図９Ａは、海馬試料でのＩＬ−１βのｍＲＮＡ発現分析を示すグラフである。  図９Ｂは、海馬試料でのＣＸＣＬ１０のｍＲＮＡ発現分析を示すグラフである。  図９Ｃは、海馬試料でのＣＣＬ２のｍＲＮＡ発現分析を示すグラフである。  図９Ｄは、海馬試料でのＴＮＦαのｍＲＮＡ発現分析を示すグラフである。  図９Ｅは、海馬試料でのＶＣＡＭ１のｍＲＮＡ発現分析を示すグラフである。  データは、平均±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。両側マン・ホイットニー検定。
【図１０Ａ−１０Ｃ】５ＸＦＡＤ  ＭＰＯ  ＫＯマウスにおける低ＡＰＯＥレベル。  図１０Ａは、抗ＡＰＯＥ抗体を用いて検出した海馬細胞ライセートのウェスタンブロット分析の写真である。  図１０Ｂは、ＷＴ−ＷＴ群平均に対する各試料の％として表したウェスタンブロット分析データを示すグラフである。  図１０Ｃは、海馬試料でのＡＰＯＥのｍＲＮＡ発現分析を示すグラフである。  データは、平均±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。両側マン・ホイットニー検定。
【図１１Ａ−１１Ｎ】プラスミドクローニングおよびレンチウィルス作製。  図１１Ａは、２４時間後の単離非形質導入Ｌｉｎ−細胞のＦＡＣＳ分析である。  図１１Ｂは、２４時間後のＧＦＰコード粒子で形質導入した１０μＬの単離Ｌｉｎ−細胞のＦＡＣＳ分析である。  図１１Ｃは、２４時間後のＭＰＯ遺伝子中のｇＲＮＡ２（配列番号５）を標的とする１０μＬのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａ９コードレンチウィルス粒子で形質導入した単離Ｌｉｎ−細胞のＦＡＣＳ分析である。  図１１Ｄは、２４時間後のＭＰＯ遺伝子中のｇＲＮＡ６（配列番号６）を標的とする１０μＬのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａ９コードレンチウィルス粒子で形質導入した単離Ｌｉｎ−細胞のＦＡＣＳ分析である。  図１１Ｅは、４８時間後の単離非形質導入Ｌｉｎ−細胞のＦＡＣＳ分析である。  図１１Ｆは、４８時間後のＧＦＰコード粒子で形質導入した２μｌの単離Ｌｉｎ−細胞のＦＡＣＳ分析である。  図１１Ｇは、４８時間後のＭＰＯ遺伝子中のｇＲＮＡ２（配列番号５）を標的とする２μｌのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａ９コードレンチウィルス粒子で形質導入した単離Ｌｉｎ−細胞のＦＡＣＳ分析である。  図１１Ｈは、４８時間後のＭＰＯ遺伝子中のｇＲＮＡ６（配列番号６）を標的とする２μｌのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａ９コードレンチウィルス粒子で形質導入した単離Ｌｉｎ−細胞のＦＡＣＳ分析である。  図１１Ｉは、４８時間後のＧＦＰコード粒子で形質導入した５μｌの単離Ｌｉｎ−細胞のＦＡＣＳ分析である。  図１１Ｊは、４８時間後のＭＰＯ遺伝子中のｇＲＮＡ２（配列番号５）を標的とする５μｌのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａ９コードレンチウィルス粒子で形質導入した単離Ｌｉｎ−細胞のＦＡＣＳ分析である。  図１１Ｋは、４８時間後のＭＰＯ遺伝子中のｇＲＮＡ６（配列番号６）を標的とする５μｌのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａ９コードレンチウィルス粒子で形質導入した単離Ｌｉｎ−細胞のＦＡＣＳ分析である。  図１１Ｌは、４８時間後のＧＦＰコード粒子で形質導入した１０μｌの単離Ｌｉｎ−細胞のＦＡＣＳ分析である。  図１１Ｍは、４８時間後のＭＰＯ遺伝子中のｇＲＮＡ２（配列番号５）を標的とする１０μｌのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａ９コードレンチウィルス粒子で形質導入した単離Ｌｉｎ−細胞のＦＡＣＳ分析である。  図１１Ｎは、４８時間後のＭＰＯ遺伝子中のｇＲＮＡ６（配列番号６）を標的とする１０μｌのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａ９コードレンチウィルス粒子で形質導入した単離Ｌｉｎ−細胞のＦＡＣＳ分析である。
【図１２】ＭＰＯ切断のＴ７分析。  完全長ＤＮＡおよび切断産物のＴ７分析の生成物を示すアガロースゲルの写真である。ゲルは、使用したそれぞれのｃｒＲＮＡに対し、Ｃａｓ９およびｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡで編集した未処理細胞および選別細胞または非選別細胞を示す。  レーンＡ：未処理２９３細胞、Ｈ５０２座位周辺のプライマーで増幅。  レーンＢ：ＲＮＰ抗Ｔ１７３で処理した２９３細胞。  レーンＣ：ＲＮＰ抗Ｄ２６０で処理した２９３細胞。  レーンＤ：ＲＮＰ抗Ｈ５０２で処理した２９３細胞。  レーンＥ：ＲＮＰ抗Ｔ１７３で処理した２９３細胞、蛍光標識ｔｒａｃｒＲＮＡを濃縮。  レーンＦ：ＲＮＰ抗Ｄ２６０で処理した２９３細胞、蛍光標識ｔｒａｃｒＲＮＡを濃縮。  レーンＧ：ＲＮＰ抗Ｈ５０２で処理した２９３細胞、蛍光標識ｔｒａｃｒＲＮＡを濃縮。  レーンＨ：Ｔ７陰性対照。  レーンＩ：Ｔ７陽性対照。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）は、感染症に対する生体防御機序に関与するヘム含有タンパク質であり、主に好中球の顆粒中に位置している。ＭＰＯは、種々の免疫介在疾患、神経変性疾患および炎症性疾患に関与している。
【００２０】
ＭＰＯ  ＲＮＡは、骨髄でのみ検出され、これは、身体中の種々の標的組織に到達する唯一のＭＰＯタンパク質である。骨髄中で起こるＭＰＯ遺伝子のこの転写は、骨髄細胞分化の筋芽細胞段階中の早期に開始され、骨髄前駆物質が分化誘導される時点で停止される。
【００２１】
本発明者らにより、骨髄の原始未成熟細胞中のＭＰＯの遺伝子発現に特異的影響を与えることにより、ＭＰＯ発現およびその後のＭＰＯ活性を調節し、調節されたＭＰＯを有する好中球（ＭＰＯ発現および／または活性を除去する／抑制する、あるいは確立する／増大させる）を最終的にもたらすことが可能であることが示唆された。未成熟細胞中のＭＰＯの特異的骨髄遺伝子のその場での調節は従って、好中球および／またはマクロファージまたは任意の他の免疫系またはその成分に関連する細胞中で、効果的で、選択的で正確な、ＭＰＯ発現およびその後の活性に影響を与える方法として、本発明者らにより提案される。興味深いことに、いくつかの病態は、身体中の脳などの種々の臓器中のＭＰＯの蓄積に関連するが、本明細書に記載のＭＰＯの調節は、未分化ＢＭ、細胞中のＭＰＯコード遺伝子または転写物の遺伝子編集により実施され、標的臓器（例えば、脳または任意のその成分）中では実施されない。従って、インビボまたはエクスビボでの遺伝子編集経由の、ＢＭ細胞の好中球および／またはマクロファージ中のＭＰＯタンパク質調節の本明細書で記載の方法は、特定の標的組織に限定されない広範な調節方法を提供する。換言すれば、ＢＭ細胞中のＭＰＯを特異的に調節する（例えば、枯渇させる）こと、したがって対象の免疫系を調節することにより、本発明は、免疫系に直接的に関連するとは限らない他の臓器または組織に影響を与える障害を治療する強力な方法を提供する。
【００２２】
このような本明細書で記載の方法は、例えば、アジド、ヒドラジドおよびヒドロキサム酸などのＭＰＯタンパク質阻害剤を用いる他の方法より、種々の理由で有利であることがさらに示唆される。第１に、既知のＭＰＯタンパク質阻害剤を用いるＭＰＯ活性の実質的調節は、ＭＰＯを発現する好中球および／またはマクロファージの持続的な形成に対処するために持続的投与が必要である。第２に、既知のＭＰＯタンパク質阻害剤は通常、ＭＰＯ活性部位（例えば、ヘモグロビン結合部位）に結合し、それにより、タンパク質活性、特にペルオキシダーゼ活性に影響を与えるように設計されている。従って、この手法は、その活性部位により媒介されるＭＰＯ機能に限定される。この方法では、他のＭＰＯ活性の調節、例えば、以降でさらに詳述するネトーシスの抑制、または本発明で開示のＭＰＯの他の活性、特に、ＭＰＯ活性部位により媒介されない活性は対処されない。換言すれば、結合部位以外の、他のＭＰＯ部位により媒介されるＭＰＯ活性は、既知のＭＰＯ阻害剤を用いて調節できない。さらに、このような阻害剤の使用は、ＡＤなどの病態での血管炎に繋がり得る抗ＭＰＯ抗体の形成を防止できない。
【００２３】
従って、本開示は、必要としている対象においてＭＰＯを調節するために、およびさらに、転写部位で、すなわち、骨髄および特に、原始、未成熟未分化骨髄細胞中のＭＰＯ遺伝子発現を調節する化合物の開発のために、未分化ＢＭ細胞中のＭＰＯの発現および／または活性を調節する新規概念に基づく。従って、ＭＰＯのレベル、活性または発現を特異的に調節する（例えば、除去）ことによる対象の免疫系の標的化調節により、本発明は、他の臓器または組織（例えば、脳）中のＭＰＯレベルおよび／または活性に影響を与える方法、およびＭＰＯ発現および／または活性（強化された、低減されたあるいは正常レベルの）に直接的にまたは間接的に関連する障害の効果的治療のためのその使用を提供する。より具体的には、治療される対象の免疫系をインビボで操作することにより、または上記免疫系を、調節されたＭＰＯ発現を示す細胞（例えば、分化して好中球および／またはマクロファージを形成するＢＭ細胞）で置換することにより、本発明は、治療された対象の他の臓器および組織中のＭＰＯ発現および／または活性に影響を与え、それにより異なる臓器または組織中のＭＰＯ発現および／または活性に関連し得るまたはそれにより影響を受け得る障害または状態を治療するためのツールを提供する。
【００２４】
本発明により示されるように、調節されたＭＰＯ発現を有する骨髄細胞は、同種間または自己骨髄移植の効率的プラットフォームとしての機能を果たすことができる。
【００２５】
加えて、本明細書で開発された化合物ならびに調節された骨髄細胞集団は、ＭＰＯ発現および／または活性と直接的にまたは間接的に関連する種々の状態の治療に使用できる。例えば、低ＭＰＯ発現および／または活性に関連する障害または状態、高ＭＰＯ発現および／または活性に関連する状態、あるいは、正常レベルのＭＰＯ発現および／または活性を示すが、ＭＰＯレベル、発現または活性を高めるまたは低下させることにより影響を受ける可能性がある状態。
【００２６】
従って、第１の態様では、本開示は、哺乳動物対象におけるミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の発現および／または活性を調節する方法を提供する。より具体的には、本発明の方法は、（ａ）対象の少なくとも１種の未分化骨髄（ＢＭ）細胞中のＭＰＯの発現および／または活性を調節できるおよび／またはその調節に適合された少なくとも１種の遺伝子編集化合物、および（ｂ）ＭＰＯの調節された発現および／または活性を示す未分化ＢＭ細胞集団、の少なくとも１種の有効量を対象に投与するステップを含み得る。本発明の方法は、哺乳動物対象中のミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の発現および／または活性を調節する方法の使用のために、（ａ）対象の少なくとも１種の未分化骨髄（ＢＭ）細胞中のＭＰＯの発現および／または活性を調節できるおよび／またはその調節に適合された少なくとも１種の遺伝子編集化合物、および（ｂ）ＭＰＯの調節された発現および／または活性を示す未分化ＢＭ細胞集団、の少なくとも１種の有効量をさらに提供することをさらに理解されたい。
【００２７】
本発明は、ＭＰ１の発現および／または活性を調節するための、方法、組成物、細胞、キットおよびシステムを提供する。本明細書で使用される場合、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）は、好中球のアズール親和性顆粒中で見出される最も毒性の高い酵素である。ＭＰＯは、Ｈ２Ｏ２を利用して次亜塩素酸（ＨＣｌＯ）および他の反応性部分を生成し、これは、感染中に病原体を死滅させる。
【００２８】
ＭＰＯ遺伝子は、染色体１７の長腕部分ｑ１２〜２４上に位置し、この遺伝子の一次転写産物は、１１イントロンおよび１２エクソンからなる。ＭＰＯ  ｍＲＮＡの選択的スプライシングは、３．６および２．９ｋＢの２つの転写物を生ずる。一次転写産物は、８０ｋＤａの前駆体タンパク質であり、シグナルペプチドの切断、Ｎ結合型グリコシル化、および限定的な脱グリコシル化を含む一連の修飾を受けて触媒的に不活性なＭＰＯ前駆物質（ａｐｏｐｒｏＭＰＯ）を形成する。次のステップでは、ＭＰＯは、鉄−ヘム分子の触媒中心への組み込みにより触媒活性を獲得する。ヘムは、２つのエステル結合および、ヘム含有酵素としてはユニークな、１つのヘム分子を酵素ポケットに特異的に配向させる第３のスルホニウム結合により共有結合される。ヘム部分のユニークな配置は、ＭＰＯに極めて高い酸化潜在能力を付与し、生理学的ｐＨでの塩素化を可能にする。ｐｒｏＭＰＯの切断は、５９ｋＤａのα−サブユニットおよび１３．５ｋＤａのβ−サブユニットを生じ、これらは、ヘム部分を介して共有結合される。ジスルフィド架橋は、成熟１５０ｋＤのＭＰＯ中で２つの重−軽プロトマーを連結する。ＭＰＯ発現レベルは、プロモーター領域中のアレル多型に依存する。位置−４６３（Ｇ−４６３Ａ）でのＧからＡへの置換は、ＭＰＯ転写の２５倍の減少をもたらす。この置換は、Ａｌｕ受容体応答エレメント（ＡｌｕＲＲＥ）内で起こり、これは、核受容体結合部位のクラスターである。この置換は、Ｓｐ１転写因子のコンセンサス配列を変化させ、これは高められたＭＰＯ転写にとって不可欠である。ＭＰＯ転写の低減をもたらすＧからＡへの置換は、位置−１２９（Ｇ−１２９Ａ）でも認められる。好中球は、ＭＰＯの主供給源であり、ＭＰＯはこの細胞の乾燥重量の５％を占め、ＭＰＯを好中球中で最も豊富なタンパク質にしている。ＭＰＯは、骨髄での好中球分化中に前骨髄球中でのみ転写される。ＭＰＯ発現は、Ｇ−ＣＳＦにより誘導され、Ｇ−ＣＳＦは、転写因子Ｃ−ＥＢＰおよびＰＵ．１を調節することにより多能性前駆細胞の顆粒球への分化を促進する。Ｃ−ＥＢＰおよびＰＵ．１は、顆粒球−マクロファージ前駆細胞の好中球およびマクロファージへの拘束を亢進する。好中球分化は、低減したＭＰＯ転写をもたらし、これは、成熟細胞では検出できない。
【００２９】
前骨髄球中で、ＭＰＯは、いくつかの他の抗菌性タンパク質、セリンプロテアーゼおよびリソソーム加水分解酵素と一緒にアズール親和性顆粒中に詰め込まれる。アズール親和性顆粒中のタンパク質の詰め込みは、アズール親和性顆粒の異種集団の非同期的な形成である。前骨髄球では、アズール親和性顆粒の少なくとも３つの分類が存在する。低電子密度の有核アズール親和性顆粒は、均一なＭＰＯ分布を有し、一方、大きな球状顆粒のＭＰＯは、顆粒外周部で検出される。
【００３０】
加えて、ＭＰＯは、前骨髄単球により合成され、この場合、これは、総細胞タンパク質の１％を占める。循環中に放出される単球は、ＭＰＯ合成を停止させ、これは、それらのマクロファージへの分化中にさらに下方制御される。
【００３１】
本開示に関連して、特に指示がない限り、「ＭＰＯ」は、ＭＰＯ遺伝子およびＭＰＯタンパク質の両方を包含することをさらに理解されたい。ヒトＭＰＯ遺伝子は、受入番号：ＮＣ＿００００１７．１１により提供される配列を有する。またいくつかのさらなる特定の実施形態では、このような配列は、配列番号１により表される核酸配列を含み得る。またいくつかのさらなる実施形態では、ヒトＭＰＯタンパク質は、受入番号：ＮＰ＿０００２４１により表される。またさらにいくつかの実施形態では、ＭＰＯタンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み得る。またさらにいくつかの他の特定の実施形態では、本発明は、受入番号ＮＣ＿００００７７で表されるマウスＭＰＯコード配列をさらに提供する。これは、いくつかの実施形態では、配列番号１５で表される核酸配列を含み得る。またいくつかのさらなる実施形態では、マウスＭＰＯタンパク質は、受入番号：ＮＰ＿０３４９５４により表される。またさらにいくつかの実施形態では、マウスＭＰＯタンパク質は、配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含み得る。
【００３２】
本発明の方法は、対象の未分化ＢＭ細胞中のＭＰＯの発現および／または活性を調節する（インビボまたはエクスビボで）遺伝子編集システムの提供による、必要とする対象におけるＭＰＯレベルおよび／または活性の調節に基づく。あるいは、このような調節は、調節されたＭＰＯ発現および／または活性を有するＢＭ細胞（特に、同種対象から取得された）を提供することにより実施され得る。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「未分化骨髄細胞または未成熟骨髄細胞」という用語は、特定の特性を有する分化した細胞型に変わる能力を有する骨髄中の細胞を指す。骨髄（ＢＭ）は、骨の内部の空洞中で認められる柔らかく、海綿状でゼラチン状の組織であり、リンパ系、特に血液系の細胞の発生において、重要な役割を果たす。
【００３４】
いくつかの実施形態では、未分化ＢＭ細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）であり得る。ＨＳＣは、ＢＭ中の原始未成熟未分化細胞であり、自己複製および分化することができる。ＨＳＣは、骨髄前駆細胞およびリンパ系前駆細胞を介して、それぞれ骨髄および血液細胞のリンパ系へと分裂し、循環中に認められる３種類の血液細胞：白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）（白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ））、赤血球（ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）（赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ））、および血小板（ｐｌａｔｅｌｅｔ）（血小板（ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｅ））を含む全ての成熟血液細胞を産生する。いくつかの実施形態では、未分化ＢＭ細胞は前駆細胞である。前駆細胞は、骨髄の主要な機能性成分であり、血液に成熟する運命にある前駆細胞およびリンパ系細胞を含む。いくつかの実施形態では、未分化ＢＭ細胞は骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）である。ＣＭＰはまた、骨髄幹細胞としても表記され、ＨＳＣ後の細胞分化の最初の分岐である。骨髄およびリンパ系の両方は、樹状細胞形成に関与する。骨髄性細胞は、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、および巨核球から血小板までを含む。リンパ系細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、および（ナチュラルキラー細胞）を含む。
【００３５】
ＨＳＣおよび前駆細胞は例えば、いくつかの異なる細胞表面マーカーの組み合わせを使うことにより、フローサイトメトリーの使用により特定または単離できる。例えば、ＨＳＣは、成熟血液細胞マーカーの発現を欠く。さらに、ＨＳＣおよび前駆細胞の両方は例えば、表面抗原分類（ＣＤ）として表される特異的分子により特定または単離できる。
【００３６】
さらに具体的には、本明細書で使用される場合、表面抗原分類は、細胞の免疫表現型検査のための標的を提供する、表面分子の特定および検査に使用される命名法プロトコルを指す。ＣＤ分子は、細胞に重要な細胞受容体またはリガンドとして機能する。
【００３７】
いくつかの実施形態では、未分化ＢＭ細胞は、ＣＤ３４陽性細胞（ＣＤ３４＋）であることを特徴とし得る。表面抗原分類３４（ＣＤ３４）は、細胞表面糖タンパク質として造血幹細胞上に存在する膜貫通リン糖タンパク質であり、骨髄移植のための造血幹細胞の選択と濃縮に関連する。加えて、ＣＤ３４は、細胞−細胞接着因子として機能し、造血幹細胞の骨髄細胞外マトリックスへの結合または間質細胞への直接的結合の媒介もし得る。またいくつかの実施形態では、未分化ＢＭ細胞は、ＣＤ３８陽性細胞（ＣＤ３８＋）であることを特徴とし得る。表面抗原分類３８（ＣＤ３８）は、環状ＡＤＰリボース加水分解酵素としても知られ、多くの免疫細胞の表面上で見つかる糖タンパク質であり、白血病の予後マーカーとして使用されてきた。
【００３８】
いくつかの実施形態では、未分化ＢＭ細胞は、ＨＳＣまたは前駆細胞であり得る。いくつかの実施形態では、未分化ＢＭ細胞は、ＨＳＣと前駆細胞の任意の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、未分化ＢＭ細胞は、ＨＳＣとＣＭＰの任意の組み合わせを含み得る。またさらに、いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物は、好中球へと成熟し得るＣＤ３４＋中のＭＰＯ発現、レベルおよび／または活性を調節し得る。またいくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物は、マクロファージへと成熟し得るＣＤ３４＋中のＭＰＯ発現、レベルおよび／または活性を調節し得る。従って、いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物は、マクロファージおよび／または好中球の活性および機能の調節を提供することを理解されたい。
【００３９】
本開示では、哺乳動物対象は、ＢＭ細胞中のＭＰＯ発現および／または活性を調節し、それによりＭＰＯのインビボ調節を提供できる遺伝子編集システム、または代わりに、もしくは追加して、改変されたＭＰＯの発現または活性を示し、それによりエクスビボ調節を提供する細胞、を投与され得る。本発明は、インビボおよびエクスビボ手法およびいずれかのこれらの組み合わせを含む、対象におけるＭＰＯ調節をさらに包含することに留意されたい。このような投与は、対象中のＭＰＯの発現および／または活性の調節をもたらす。本明細書で使用される場合、遺伝子編集化合物は、体内で少なくとも単一遺伝子を調節できる化合物を指す。用語の「調節」は、特定の状態下で決定される発現／活性の対照のまたは正常なまたはベースラインのレベルと比較して、発現および／または活性の増大または低減などの体内での少なくとも１種の遺伝子中の何らかの変化または改変を包含する。いくつかの実施形態では、対象に投与される遺伝子編集化合物またはシステム、あるいは未分化ＢＭ細胞集団は、対象中のＭＰＯの発現および／または活性の抑制または除去をもたらし得る。
【００４０】
いくつかの代替実施形態では、対象に投与される遺伝子編集化合物／システム、あるいは未分化ＢＭ細胞集団は、対象中のＭＰＯの発現および／または活性の樹立、強化または増大をもたらし得ることに留意されたい。従って、対象の免疫系の標的化操作により、対象の種々の臓器および組織中のＭＰＯの活性および／またはレベルおよび発現の全般的操作が達成される。さらに、対象の免疫系の特異的および標的化操作により、ＭＰＯに関連する障害が治療される。
【００４１】
さらに特定の実施形態では、少なくとも１種の遺伝子編集化合物またはシステムが、対象中のＭＰＯの活性および／または発現を調節するために投与され得る。遺伝子編集化合物は、種々の機序によりＭＰＯの発現および／または活性を調節できる。例えば、遺伝子編集化合物は、ノックダウン細胞、生物などを生ずる染色体ＤＮＡの遺伝子改変によりＭＰＯ発現および／または活性を調節する。加えて、遺伝子編集化合物／システムは、一過的／一時的な改変（一過性ノックダウン）によりＭＰＯ発現および／または活性を調節する。
【００４２】
本発明の方法（ならびに、以下に記載の組成物、細胞、キットおよび使用）により使用される遺伝子編集化合物またはシステムは、いくつかの実施形態では、天然化合物（酵素、短鎖ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドなど）、合成化合物または化合物であり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１種の遺伝子編集化合物は、オリゴヌクレオチドであり得る。このようなオリゴヌクレオチドは、活性遺伝子またはその任意の転写物に結合し、例えば、転写の阻止（アンチセンスオリゴヌクレオチドによる遺伝子結合の場合）、ｍＲＮＡ転写物の分解（例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、またはＲＮアーゼ−Ｈ依存性アンチセンスによる）、またはｍｉＲＮＡを含むｍＲＮＡ翻訳、プレｍＲＮＡスプライシング部位、または他の機能性ＲＮＡの成熟のために使用されるヌクレアーゼ切断部位の遮断により（例えば、モルホリノオリゴまたは他のＲＮアーゼ−Ｈ独立アンチセンスにより）、低減された発現を生じさせ得る。
【００４３】
いくつかのさらなる実施形態では、本発明の遺伝子編集化合物は、任意の核酸モディファイヤータンパク質および少なくとも１種の標的認識配列を含み得る。より具体的には、またいくつかのさらなる実施形態では、本発明で適用可能な遺伝子編集システムは、少なくとも１種の核酸モディファイヤータンパク質および少なくとも１種の標的認識配列を含み得る。このような認識配列は、いくつかの実施形態では、モディファイヤータンパク質を標的遺伝子、特に、ＭＰＯコード遺伝子に特異的に向ける核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸モディファイヤータンパク質は、コードまたは非コード核酸配列を改変する任意のタンパク質またはタンパク質複合体を含み得る。いくつかのまたさらなる実施形態では、上記モディファイヤータンパク質により引き起こされる改変は、このようなモディファイヤーの標的核酸配列によりコードされる、あるいは制御されるＭＰＯタンパク質産物の発現を調節し得る。あるいは、本発明で適用可能なモディファイヤーは、このようなＭＰＯの安定性または活性を調節し得る。このような改変は、核酸分解切断（例えば、ヌクレアーゼによる）、メチル化、脱メチル化、（制御配列などのコードまたは非コード配列の）タンパク質発現の活性化または抑制などを含む。従って、いくつかの実施形態では、核酸モディファイヤーは、ヌクレアーゼ、メチルトランスフェラーゼ、脱メチル化酵素、転写因子、転写リプレッサー、それらの任意の融合タンパク質、および前記モディファイヤーの少なくとも１種を含む任意の複合体およびそれらの任意の組み合わせの少なくとも１種であり得る。
【００４４】
いくつかの実施形態では、本発明のモディファイヤータンパク質は、少なくとも１種のヌクレアーゼを含み得る。本明細書で使用される場合、用語の「ヌクレアーゼ」は、いくつかの実施形態では、核酸分解活性を有する活性ヌクレアーゼに関することを理解されたい。しかし、いくつかの実施形態では、本明細書で使用される場合、用語の「ヌクレアーゼ」は、ヌクレアーゼの構造的特徴を有するが、任意の核酸分子、特にＤＮＡまたはＲＮＡに対し、低減された、不完全な核酸分解活性を示すまたは核酸分解活性のない分子（本明細書においては、不活性ヌクレアーゼと称する）をさらに包含することを理解されたい。本明細書で使用される場合、不活性ヌクレアーゼは、不活性ヌクレアーゼの任意のフラグメント、変異体または融合タンパク質をさらに包含する。より具体的には、任意の他のタンパク質、例えば、本明細書の以後で詳述されるような、転写因子またはリプレッサー、メチルトランスフェラーゼ、脱メチル化酵素との不活性ヌクレアーゼの融合タンパク質である。
【００４５】
より具体的には、本明細書で使用される場合、「ヌクレアーゼ」という用語は、いくつかの実施形態では、核酸分解活性を示す、特に、核酸（例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）モノマー間のリン酸ジエステル結合を切断できる酵素である。ヌクレアーゼは、それらの標的分子中で、一本鎖および二本鎖破壊を種々引き起こす。活性の座位を基準にして２つの第一次分類が存在する。エキソヌクレアーゼは、両端から核酸を消化する。エンドヌクレアーゼは、標的分子の中ほどの領域に作用する。それらは、デオキシリボヌクレアーゼおよびリボヌクレアーゼとして、さらに下位分類される。前者は、ＤＮＡに作用し、後者は、ＲＮＡに作用する。ヌクレアーゼは、分子を切断する前に核酸と結合する必要があり、ある程度の認識を与える。ヌクレアーゼは、ホスホジエステラーゼ、リパーゼおよびホスファターゼと同様に、加水分解酵素の亜群のエステラーゼに属する。このグループはエキソヌクレアーゼを含み、これは、ポリヌクレオチド鎖の末端（エキソ）から一つずつヌクレオチドを切断することにより機能する酵素である。リン酸ジエステル結合を切断する加水分解反応が３’または５’末端で起こる。真核生物および原核生物は、ｍＲＮＡの通常の代謝回転に関与する３種のエキソヌクレアーゼ：５’→３’エキソヌクレアーゼ（Ｘｒｎ１）、これは依存性脱キャップタンパク質である；３’→５’エキソヌクレアーゼ、独立したタンパク質；およびポリ（Ａ）特異的３’→５’エキソヌクレアーゼ、を有する。このファミリーのメンバーは、５’−ホスホモノエステルを産生するエキソデオキシリボヌクレアーゼ、５’−ホスホモノエステルを産生するエキソリボヌクレアーゼ、３’−ホスホモノエステルを産生するエキソリボヌクレアーゼおよびリボ−またはデオキシ−の両方で活性なエキソヌクレアーゼを含む。このファミリーのメンバは、エキソヌクレアーゼ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、およびＶＩＩＩを含む。上述のように、エンドヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖内でリン酸ジエステル結合を切断する酵素である。デオキシリボヌクレアーゼＩなどのいくつかのエンドヌクレアーゼは、比較的非特異的にＤＮＡを切断し（配列と関係なく）、一方で制限エンドヌクレアーゼまたは制限酵素と呼ばれるものの多くは、極めて特異的なヌクレオチド配列のみで切断する。
【００４６】
いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、上で明記したように、核酸分解活性を有する活性酵素であり得る。いくつかの代替実施形態では、ヌクレアーゼは、欠陥酵素であり得る。
【００４７】
欠陥酵素（例えば、欠陥変異体、バリアントまたはフラグメント）は、活性ヌクレアーゼと比較して、約１％、２％、３％、４％、５％〜約１００％、具体的には、約５％〜約１０％、約１０％〜約１５％、約１５％〜約２０％、約２０％〜約２５％、約２５％〜約３０％、約３５％〜約４０％、約４０％〜約４５％、約４５％〜約５０％、約５０％〜約５５％、約５５％〜約６０％、約６５％〜約７０％、約７５％〜約８０％、約８０％〜約８５％、約８５％〜約９０％、約９０％〜約９５％、約９５％〜約９９．９％低下した活性、より具体的には、活性ヌクレアーゼと比較して、約９８％〜約１００％低下した活性を示す酵素に関連し得る。
【００４８】
上に示したように、本発明の遺伝子編集システムは、少なくとも１種の標的認識配列をさらに含む。本明細書で使用される場合、「標的認識配列」は、核酸モディファイヤータンパク質、例えば、ヌクレアーゼを、核酸配列内の特異的標的位置に向ける核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡ）である。標的認識配列による標的の認識は、いくつかの実施形態では、塩基対相互作用により促進される。これらの標的認識配列は、誘導型ヌクレアーゼの場合には特に重要である。いくつかの実施形態では、核酸分解活性を示すヌクレアーゼの場合、そのヌクレアーゼを特異的部位に向けることは、いくつかの実施形態では、その特異的破壊をもたらす核酸（例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）モノマー間のリン酸ジエステル結合の切断をもたらし得る。またいくつかの代替実施形態では、非活性ヌクレアーゼ、特にその融合タンパク質が使われる場合、認識配列によるこのような欠陥ヌクレアーゼの方向付けは、標的により標的化された標的核酸配列の標的化調節（例えば、活性化または抑制、メチル化または脱メチル化）をもたらし得る。標的認識配列は、約１０ヌクレオチド〜７０ヌクレオチド以上を含み得ることに留意されたい。またいくつかのさらなる実施形態では、標的認識配列は、以下のスペーサーとして指定されるような多数のヌクレオチドを含み得る。特定の実施形態では、本発明の方法により使用されるヌクレアーゼは、誘導型ヌクレアーゼであり得る。またいくつかの他の実施形態では、遺伝子編集化合物は、ポリペプチド、特に酵素を含み得る。いくつかの実施形態では、遺伝子編集化合物は、少なくとも１種のプログラマブル遺伝子改変ヌクレアーゼ（ＰＥＮ）またはその任意のバリアントまたはタンパク質を含み得る。本明細書で使用される場合、用語の「プログラマブル遺伝子改変ヌクレアーゼ（ＰＥＮ）」は、「分子ＤＮＡハサミ」としても知られ、高度標的化方式で、配列を置換、除去または改変するために使用される合成または天然酵素を指す。ＰＥＮは、ＤＮＡ配列などの特異的ゲノム配列（認識配列）を標的とし、切断する。少なくとも１種のＰＥＮは、天然のヌクレアーゼから誘導され、または人工酵素であり得、全て二本鎖ＤＮＡ損傷のＤＮＡ修復に関与し、直接的ゲノム編集を可能にし得る。いくつかの代替または追加の実施形態では、本開示による遺伝子編集化合物はまた、少なくとも１種のＰＥＮをコードする核酸配列を含む任意の核酸分子、または少なくとも１種のＰＥＮまたはＰＥＮをコードする任意の核酸配列を含む任意のキット、組成物またはビークルを包含する。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のＰＥＮは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターベースヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｆｏｋ１ヌクレアーゼ、またはクラスター化され規則的に間隔を置かれる短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）システム、またはこれらの任意の融合タンパク質またはキメラの少なくとも１種であり得る。
【００４９】
いくつかの実施形態では、少なくとも１種のＰＥＮは、メガヌクレアーゼであり得る。メガヌクレアーゼは、大きな認識部位（１２〜４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列）を特徴とするエンドデオキシリボヌクレアーゼであり、そのため、この部位は通常、任意の所与のゲノム中で１回のみ発生する。メガヌクレアーゼは、特異的な天然の制限酵素であり、特に、真核生物の単細胞生物のミトコンドリアおよび葉緑体中で主に認められる、ホーミングエンドヌクレアーゼのＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のＰＥＮは、メガＴＡＬであり得る。メガＴＡＬは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーなどのホーミングエンドヌクレアーゼをＴＡＬＥＮのモジュールＤＮＡ結合ドメインと組み合わせた融合タンパク質である。
【００５０】
特定の実施形態では、本発明の方法および組成物により使用されるヌクレアーゼは、誘導型ヌクレアーゼであり得る。またいくつかの特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、少なくとも１種の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。ＴＡＬＥＮは、ＤＮＡの特異的配列を切断するように遺伝子改変できる制限酵素である。それらは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをヌクレアーゼのＤＮＡ切断ドメインに融合することにより作製される。より具体的には、ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬ（転写活性化因子様）エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質から得られたＤＮＡ結合ドメイン（それぞれ約３４個のアミノ酸からなる複数のほぼ同一の反復）をＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの切断ドメインに融合することにより設計された人工エンドヌクレアーゼである。各ＴＡＬＥ反復は、反復が結合部位のヌクレオチド配列を直線的に表すように、２つの可変残基［反復可変ジ残基（ＲＶＤ）と呼ばれる］を有するその対応するヌクレオチド（ｎｔ）塩基を独立に認識する。
【００５１】
またいくつかのさらなる代替実施形態では、本発明の方法および組成物により使用される誘導型ヌクレアーゼは、少なくとも１種のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であり得る。ＺＦＮは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメイン切断ドメインに融合することにより生成された人工制限酵素である。ジンクフィンガードメインは、特異的所望ＤＮＡ配列を標的にするように遺伝子改変でき、これは、ジンクフィンガーヌクレアーゼが複合体ゲノム内のユニークな配列を標的にすることを可能にする。より具体的には、ＺＦＮは、小さいジンクフィンガー（ＺＦ；約３０アミノ酸）ＤＮＡ結合／認識ドメイン（Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２）を、ＦｏｋＩ制限酵素由来のＩＩＳ型非特異的ＤＮＡ切断ドメインと組み合わせることにより生成された人工エンドヌクレアーゼである。しかし、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの切断活性は、ダイマー化を必要とする。ＺＦモジュールは３ｂｐ配列を認識するので、各ＺＦＮモノマー中の複数のフィンガーがより長いＤＮＡ標的配列を認識し、それに結合するための前提条件が存在する。
【００５２】
またいくつかの他の実施形態では、本発明の方法および組成物により使用される誘導型ヌクレアーゼは、以下で考察されるように、Ｆｏｋ１ヌクレアーゼまたはその任意の融合タンパク質であり得る。酵素Ｆｏｋ１（Ｆｏｋ−１）は、天然では、フラボバクテリウム・オケアノコイテス中で見出され、Ｎ末端ＤＮＡ結合ドメインおよびＣ末端の非特異的ＤＮＡ切断ドメインからなる細菌性ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼである。本発明のいくつかの実施形態では、Ｆｏｋ１は、標的認識配列によりその標的（例えば、ＭＰＯ遺伝子での）に向けられ得る。上で考察したこのような標的認識配列は、いくつかの実施形態では、Ｆｏｋ１を標的部位に特異的に向ける核酸配列であり得る。認識配列は、直接的にまたは間接的に（すなわち、リンカーを介して）Ｆｏｋ１に結合され得る。従って、タンパク質が標的認識配列を介して二本鎖ＤＮＡに結合されると、ＤＮＡ切断ドメインは活性化され、標的部位の再近接ヌクレオチドの第１鎖の９ヌクレオチド下流、および第２鎖の１３ヌクレオチド上流を切断する。より具体的には、Ｆｏｋ１が本発明の核酸モディファイヤータンパク質として使用される場合には、ＭＰＯコード配列に対する特異的標的化は、特異的に標的部位にハイブリダイズする少なくとも１種の核酸配列（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）であり得る、少なくとも１種の標的認識配列をＦｏｋ１に直接的または間接的（例えば、リンカーを介して）に結合することにより実現し得る。またさらに、いくつかの実施形態では、少なくとも１種のＰＥＮは、クラスター化され規則的に間隔を置かれる短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）システムであり得る。いくつかの実施形態では、本明細書記載の方法は、ＣＲＩＳＰＲシステムをＭＰＯ発現および／または活性を調節するためのＰＥＮとして使用する。クラスター化され規則的に間隔を置かれる短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）システムは、ゲノムエンジニアリング用に改変された細菌性免疫系である。
【００５３】
いくつかの特定の実施形態では、本明細書記載の方法は、少なくとも１種のクラスター化されて規則的に間隔を置かれる短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ結合（ｃａｓ）タンパク質システムを含み得るＰＥＮを使用し得る。従って、さらに特定の実施形態では、本発明の方法は、（ａ）少なくとも１種のＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓタンパク質、または上記Ｃａｓタンパク質をコードする任意の核酸分子、および（ｂ）ＭＰＯ遺伝子内のプロトスペーサーを標的とする少なくとも１種のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む少なくとも１種の核酸配列、または前記ｇＲＮＡをコードする任意の核酸配列、の少なくとも１種の有効量を上記対象に投与するステップを含み得る。本発明の方法は任意選択で、（ａ）および（ｂ）の少なくとも１種を含む任意のキット、組成物またはビークルの使用を含み得る。
【００５４】
本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの両方の配列が核酸配列として提供される場合、それらは、２つ以上の核酸分子として別々に、あるいは両方の配列を含む単一の核酸分子、特に，（ａ）および（ｂ）の両方を含む構築物、ベクターまたは任意のビークルとして一緒に提供され得ることに留意されたい。
【００５５】
上で示したように、本発明は、そのいくつかの実施形態では、遺伝子編集システムの配列（例えば、ｇＲＮＡおよび／またはＣａｓタンパク質）、または少なくともその一部を核酸配列または分子として提供し得る。用語の「核酸」、「核酸配列」、または「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」は、ヌクレオチドのポリマーを指し、限定されないが、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、規則的におよび／または不規則に交互するデオキシリボシル部分およびリボシル部分（すなわち、交互のヌクレオチド単位は、糖部分の２’位置に、−ＯＨ、次に−Ｈ、次に−ＯＨ、次に−Ｈ、等々を有する）を含むＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、およびこれらのポリヌクレオチド類の修飾物を含み、任意の位置でのヌクレオチド単位への種々の物質または部分の結合が含まれる。この用語は、ヌクレオチド類似体から作製され、記載の実施形態に適用可能なＲＮＡまたはＤＮＡの等価物、類似体として、一本鎖（センスまたはアンチセンスなど）および二本鎖のポリヌクレオチドを含むことも理解されるべきである。核酸の作製は、当該技術分野においてよく知られている。本発明による核酸分子（またはポリヌクレオチド）は、化学合成により、または組換えＤＮＡ技術により製造できることに留意されたい。核酸分子の製造方法は当該技術分野において周知である。本発明による核酸は、可変ヌクレオチド長であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、本発明による核酸分子は、１〜１００ヌクレオチド、例えば、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、本発明による核酸分子は、１００〜１，０００ヌクレオチド、例えば、約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００ヌクレオチドを含む。さらなる実施形態では、本発明による核酸分子は、約１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００または１０，０００ヌクレオチドを含む。またさらなる実施形態では、本発明による核酸分子は、１０，０００ヌクレオチド超、例えば、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００または１００，０００ヌクレオチドを含む。
【００５６】
上述のように、構築物、ベクターまたは任意の他のビークル中に含まれる核酸分子が本発明で提供され得る。本明細書で使用される場合、ベクターは、宿主細胞中に導入され、それにより形質転換された宿主細胞を産生する特定の配列の核酸分子である。ベクターは、宿主細胞中でそれを複製可能にする、複製起点などの核酸配列を含み得る。ベクターはまた、１種または複数の選択可能マーカー遺伝子および核酸発現を誘導するプロモーター配列を含む当該技術分野で既知の他の遺伝子配列を含み得る。核酸を標的細胞、特にＢＭ細胞に移入するのに有用な多くのベクター、例えば、プラスミド、コスミド、ミニサークル、ファージ、ウィルス（下記で詳述）が本発明で適用可能であり得る。核酸を含むベクターは、エピソーム的に、例えば、プラスミド、ミニサークルＤＮＡ、トランスポゾン、サイトメガロウィルス、アデノウィルスなどのウィルスとして維持され得るか、またはそれらは、相同組換えまたはランダムインテグレーションにより標的細胞ゲノム中に一体化され得る（例えば、レンチウィルス、ＡＡＶ、ＭＭＬＶ、ＨＩＶ−１、ＡＬＶなどのレトロウィルス由来ベクター）。より具体的には、いくつかの実施形態では、ベクターは、ウィルスベクターであり得る。またいくつかの特定の実施形態では、このようなウィルスベクターは、組換えアデノ随伴ベクター（ｒＡＡＶ）、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）、自己相補的ｆＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）、サル空胞ウィルス４０（ＳＶ４０）ベクター、アデノウィルスベクター、ヘルパー依存性アデノウィルス、レトロウィルスベクターおよびレンチウィルスベクターのいずれか１種であり得る。
【００５７】
より具体的には、上で示したように、いくつかの実施形態では、ウィルスベクターは、本発明で適用可能である。用語の「ウィルスベクター」は、複製可能または複製欠損性ウィルス粒子を指し、核酸分子を宿主中に移入できる。
【００５８】
用語の「ウィルス」は、タンパク質合成機序またはエネルギー生成機序を持たない細胞内絶対寄生生物のいずれかを指す。ウィルスゲノムは、脂質膜タンパク質のコート構造体に包まれたＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。本発明での実施に有用なウィルスの例としては、バキュロウィルス科、パルボウィルス科、ピコルノウィルス科（ｐｉｃｏｒｎｏｖｉｒｉｄｉａｅ）、ヘルペスウィルス科、ポックスウィルス科、アデノウィルス科、ピコトマウィルス科（ｐｉｃｏｔｍａｖｉｒｉｄｉａｅ）が挙げられる。用語の組換えウィルスは、キメラ（あるいはマルチマー）ウィルス、すなわち、２種以上のウィルスサブタイプ由来の相補的コード配列を用いて構築したベクターを含む。
【００５９】
またいくつかの特定の実施形態では、レンチウィルスベクターが本発明で使用され得る。レンチウィルスベクターは、レトロウィルスのサブクラスであるレンチウィルス由来である。よく使われるレトロウィルスベクターは、「欠陥がある」、すなわち、増殖感染に必要なウィルスタンパク質を産生できない。むしろ、ベクターの複製は、パッケージング細胞株中での増殖を必要とする。本発明の核酸配列を含むウィルス粒子を生成するために、パッケージング細胞株により、核酸を含むレトロウィルス核酸がウィルスカプシド中にパッケージされる。異なるパッケージング細胞株は、異なるカプシド中に組み込まれるエンベロープタンパク質（同種志向性、両種性または異種指向性）を提供し、このエンベロープタンパク質は、細胞に対する特異性を決定する（マウスおよびラットに対しては同種志向性；ヒト、イヌおよびマウスを含むほとんどの哺乳動物細胞型に対しては両種性；およびハツカネズミ細胞を除くほとんどの哺乳動物細胞型マウス細胞に対しては異種指向性）。適切なパッケージング細胞株を使用して、パッケージされたウィルス粒子により細胞が標的化されることを確実にし得る。本発明の核酸配列を含むレトロウィルスベクターをパッケージング細胞株中に導入する方法、およびパッケージング株により生成されるウィルス粒子を収集する方法は、当該技術分野において周知である。
【００６０】
またさらなるいくつかの実施形態では、本発明で適用可能なウィルスベクターは、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）であり得る。用語の「アデノウィルス」は、用語「アデノウィルスベクター」と同義である。ＡＡＶは、パルボウィルス科のファミリーに属する小さい（約２０ｎｍ）タンパク質カプセルを有する一本鎖ＤＮＡウィルスであり、特に、アデノウィルス属のウィルスを指す。用語のアデノウィルス科は、ひとまとめにして、マストアデノウィルス属の動物アデノウィルスを指し、限定されないが、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ、ブタ、マウスおよびサルアデノウィルス亜属を含む。特に、ヒトアデノウィルスは、Ａ〜Ｆ亜属ならびにその個別の血清型を含み、個別の血清型およびＡ〜Ｆ亜属は、限定されないが、ヒトアデノウィルス型１、２、３、４、４ａ、５、６、７、８、９、１０、１１（Ａｄ  ＩＩＡおよびＡｄ  ＩＩＰ）、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、１９ａ、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３４ａ、３５、３５ｐ、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、および９１を含む。
【００６１】
ヘルパーウィルス共感染（通常、アデノウィルスまたはヘルペスウィルス感染）の非存在下で複製できないので、ＡＡＶは、多くの場合、ディペンドウィルスと呼ばれる。ＡＡＶ感染は、緩やかな免疫応答のみを生成し、非病原性であると見なされ、この事実は、他のよく使われるベクター系と比較して、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を取り扱う場合のバイオセーフティレベル要件の低下としても反映される。その低免疫原性および細胞傷害性応答の非存在のため、ＡＡＶベース発現系は、静止細胞中で数ヶ月間にわたり目的の遺伝子を発現させる可能性を提供する。
【００６２】
ｒＡＡＶベクターの作製システムは通常、目的のＤＮＡを含むＤＮＡベースベクターからなり、目的のＤＮＡは末端逆位配列に隣接される。構築物サイズは、約４．７〜５．０ｋｂに限定され、これは、野性型ＡＡＶゲノムの長さに対応する。ｒＡＡＶは、細胞株中で産生される。発現ベクターは、ウィルス複製に重要なＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子の発現を媒介するヘルパープラスミドおよびカプシド形成タンパク質をコードするｃａｐ遺伝子と同時遺伝子導入される。組換えアデノ随伴ウィルスベクターは、分裂および非分裂細胞に形質導入でき、異なるｒＡＡＶ血清型は、多様な細胞型に形質導入し得る。これらの一本鎖ＤＮＡウィルスベクターは、高い形質導入率を有し、宿主ゲノム中の二本鎖ＤＮＡを破壊することなく、内在性相同組換えを刺激するユニークな性質を有する。
【００６３】
本発明は、そのいくつかの実施形態では、ＭＰＯ遺伝子の特異的調節のためにＣＲＩＳＰＲシステムを利用する。上に示したように、本発明の遺伝子編集システムは、特に、送達ベクターまたはビークル中の核酸分子として提供され得る。しかし、使用されるいずれかの遺伝子編集システムはまた、本発明の場合に適用可能な特定の遺伝子編集システムに関連して以下に考察されるように、タンパク質として、あるいは、リボ核タンパク質複合体として、投与される場合もあることを理解されたい。
【００６４】
上記で示したように、いくつかの実施形態では、本発明に適用可能な遺伝子編集システムは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、２つのクラスに分類される。クラス１システムは、複数のＣａｓタンパク質の複合体を用いて外来性核酸を分解する。クラス２システムは、同じ目的のために単一の大きなＣａｓタンパク質を用いる。より具体的には、クラス１は、Ｉ、ＩＩＩ、およびＩＶ型に分類され得、クラス２は、ＩＩ、Ｖ、およびＶＩに分類され得る。
【００６５】
従って、いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、クラス１およびクラス２のＣＲＩＳＰＲ結合システムの少なくとも１つのメンバーであり得る。いくつかの実施形態では、ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型、Ｉ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型およびＶＩ型のいずれか１つのＣＲＩＳＰＲ結合システムの少なくとも１つのメンバーであり得る。本明細書で使用される場合、ＳＰＩＤＲ（スペーサー散在型ダイレクトリピート（Ｓｐａｃｅｒ  Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｒｅｐｅａｔｓ））としても知られるＣＲＩＳＰＲアレイは、通常、特定の細菌種に特異的なＤＮＡ座位ファミリーを構成する。ＣＲＩＳＰＲアレイは、大腸菌中で最初に認められた別個のクラスの散在型の短配列リピート（ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｅａｔｓ：ＳＳＲ）である。その後の数年間に、類似のＣＲＩＳＰＲアレイが結核菌、ハロフェラックス・メディテラネイ、タノカルドコックス・ヤンナスキイ、サーモトガ・マリティマならびに他の細菌および古細菌中で見つかった。本発明は、いずれか既知のＣＲＩＳＰＲシステム、特に、本明細書で開示のいずれかのＣＲＩＳＰＲシステムの使用を意図していることを理解されたい。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、原核生物でファージ攻撃および外来性ＤＮＡまたはＲＮＡ標的化による望ましくないプラスミド複製に対し保護するために発展した。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、反復間に存在するスペーサーと呼ばれる短い相同ＤＮＡ配列に基づいてＤＮＡ分子を標的にする。これらのスペーサーは、ＣＲＩＳＰＲ結合（Ｃａｓ）タンパク質を外来性ＤＮＡ内のプロトスペーサーと呼ばれるマッチング（および／または相補）配列に誘導し、これはその後切断される。スペーサーは、任意のＤＮＡ配列、例えば、ＭＰＯ遺伝子配列を標的にするように合理的に設計できる。さらに、この認識配列は、任意の所望の標的を別々に認識および標的化するように設計し得る。
【００６６】
いくつかの特定の実施形態では、本発明のシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲクラス２システムであり得る。またいくつかのさらなる特定の実施形態では、このようなクラス２システムは、ＣＲＩＳＰＲ  ＩＩ型システムであり得る。
【００６７】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、ＨＮＨ型システム（連鎖球菌様；髄膜炎菌血清型Ａ株Ｚ２４９１、またはＣＡＳＳ４の場合にはＮｍｅｎｉサブタイプとも呼ばれる）を含み、広く分布するＣａｓ１およびＣａｓ２に加えて、単一の非常に大きなタンパク質のＣａｓ９は、ｃｒＲＮＡ生成および標的ＤＮＡの切断に十分であると思われる。Ｃａｓ９は、少なくとも２つのヌクレアーゼドメイン、アミノ末端近くのＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインおよびタンパク質の中ほどのＨＮＨ（またはＭｃｒＡ様）ヌクレアーゼドメインを含むが、これらのドメインの機能は、まだ明らかになっていない。しかし、ＨＮＨヌクレアーゼドメインは制限酵素に富み、標的切断に関与するエンドヌクレアーゼ活性を有する。
【００６８】
またさらに、ＩＩ型システムは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１，Ｃａｓ２、ｃｓｎ２、およびＣａｓ４遺伝子の少なくとも１つを含むことに留意されたい。任意のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、特に、ＩＩ−ＡまたはＢ型のいずれか１つは、本発明に適用可能であることを理解されたい。従って、またいくつかのさらなるおよび代替実施形態では、本発明の方法、組成物、細胞、キット、使用およびシステムで使われる少なくとも１種のｃａｓ遺伝子は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム（ＩＩ−Ａ型またはＩＩ−Ｂ型）の少なくとも１種のｃａｓ遺伝子であり得る。さらに特定の実施形態では、本発明の方法およびシステムで使われるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムの少なくとも１種のｃａｓ遺伝子は、ｃａｓ９遺伝子であり得る。このようなシステムは、Ｃａｓ１，Ｃａｓ２、ｃｓｎ２、およびＣａｓ４遺伝子の少なくとも１つをさらに含み得ることを理解されたい。従って、いくつかの特定の実施形態では、本発明の方法により使用されるＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９またはその任意のフラグメント、変異体、バリアンまたは誘導体であり得る。
【００６９】
Ｃａｓ９による二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）切断は、「ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ」免疫系の特徴である。ＣＲＩＳＰＲ結合タンパク質Ｃａｓ９は、標的部位（プロトスペーサー）に対し相補的なＲＮＡ：ＤＮＡを使用するＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼである。Ｃａｓ９と標的配列との間を認識後、二重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の切断が起こり、二本鎖破壊（ＤＳＢ）が生ずる。
【００７０】
本明細書で使用されるＣＲＩＳＰＲ  ＩＩ型システムは、２つの不可欠な要素：「ガイド」ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）および非特異的ＣＲＩＳＰＲ結合エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）の包含を必要とする。ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９結合に必要な「足場」配列（ｔｒａｃｒＲＮＡとも呼ばれる）および、改変されるゲノム標的を決定する約２０ヌクレオチド長の「スペーサー」または「ターゲティング」配列から構成される短い合成ＲＮＡである。本明細書で使用されるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、内在性ｔｒａｃｒＲＮＡとターゲティング配列（ｃｒＲＮＡとも呼ばれる）との合成融合体を指し、Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよび標的化特異性のための足場／結合能力の両方を提供する。また、「シングルガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」とも呼ばれる。
【００７１】
ＣＲＩＳＰＲは、元々、種々の細胞型および生物での標的遺伝子の「ノックアウト」のために採用されたが、Ｃａｓ９酵素に対する改変は、ＣＲＩＳＰＲの応用を標的遺伝子の「ノックイン」、標的遺伝子の選択的活性化または抑制、ＤＮＡの特異的領域の精製、およびさらには蛍光顕微鏡法を使用する生細胞中のＤＮＡの画像形成に拡張した。さらに、ｇＲＮＡ生成の容易さは、ＣＲＩＳＰＲを最も規模拡大可能なゲノム編集技術の１つにし、最近では、ゲノムワイドスクリーニングに利用されている。ほとんどのＣＲＩＳＰＲシステムでは、編集されるべきゲノム内の標的配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の直ぐ上流に存在する必要がある。ＩＩＩ型などの他のシステムでは、ＰＡＭは存在しない。
【００７２】
ＣＲＩＳＰＲ  ＩＩ型のようなＰＡＭ配列認識に基づくＣＲＩＳＰＲシステムでは、ＰＡＭは標的結合のために絶対に必要であり、その正確な配列はＣａｓ９の種に依存する（化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９の場合には５’ＮＧＧ３’）。いくつかの実施形態では、本発明の方法で使用される核酸モディファイヤータンパク質はＣａｓ９である。特定の実施形態では、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９は、本発明の方法およびシステムで使用され得る。しかし、任意の既知のＣａｓ９も適用可能であり得ることを理解されたい。本開示で有用なＣａｓ９の非限定的例としては、限定されないが、化膿性連鎖球菌（ＳＰ）（本明細書ではＳｐＣａｓ９としても示される）、黄色ブドウ球菌（ＳＡ）（本明細書ではＳａＣａｓ９としても示される）、髄膜炎菌（ＮＭ）（本明細書でＮｍＣａｓ９としても示される）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（ＳＴ）（本明細書でＳｔＣａｓ９としても示される）、およびトレポネーマ・デンティコラ（ＴＤ）（ＴｄＣａｓ９としても示される）が挙げられる。またさらに、本開示のいくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、メタン産生古細菌Ｃ７、ジフテリア菌、コリネ菌ＹＳ−３１４、グルタミン酸産生菌（ＡＴＣＣ１３０３２）、グルタミン酸産生菌Ｒ、コリネバクテリウム・クロッペンステッティイ（ＤＳＭ４４３８５）、マイコバクテリウム・アブセサス（ＡＴＣＣ１９９７７）、ノカルジア・ファルシニカＩＦＭ１０１５２、ロドコッカス・エリスポリスＰＲ４、ロドコッカス・ジョスティイＲＦＩＡ１、ロドコッカス・オパカスＢ４（ｕｉｄ３６５７３）、アシドサーマス・セルロリティクス１１Ｂ、アルスロバクター・クロロフェノリカスＡ６、クリベラ・フラビダ（ＤＳＭ１７８３６）、サーモモノスポラ・クルバータ（ＤＳＭ４３１８３）、ビフィドバクテリウム・デンティウムＢｄ１、ビフィドバクテリウム・ロンガムＤＪＯ１０Ａ、スラッキア・ヘリオトリニレデューセンス（ＤＳＭ２０４７６）、パーセフォネラ・マリナＥＸ  Ｈ１、バクテロイデス・フラジリスＮＣＴＣ９４３４、カプノシトファガ・オクラチエ（ＤＳＭ７２７１）、フラボバクテリウム・サイクロフィルムＪＩＰ０２  ８６、アッカーマンシア・ムシニフィラ（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ８３５）、ロゼイフレクサス・キャステンホルツィイ（ＤＳＭ１３９４１）、ロゼイフレクサスＲＳ１、シネコシスティスＰＣＣ６８０３、エルシミクロビウム・ミヌトゥムＰｅｉ１９１、未培養シロアリグループ１細菌ファイロタイプＲｓ  Ｄ１７、フィブロバクター・サクシノゲネスＳ８５、バチルス・セレウス（ＡＴＣＣ１０９８７）、リステリア・イノキュア、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバシラス・ラムノーサス ラムノーサスＧＧ、ラクトバチルス・サリバリウスＵＣＣ１１８、ストレプトコッカス・アガラクチア−５−Ａ９０９、ストレプトコッカス・アガラクチアＮＥＭ３１６、ストレプトコッカス・アガラクチア２６０３、ストレプトコッカス・ディスガテクティアエ亜種エクイシミリスＧＧＳ１２４、ストレプトコッカス・エクイ亜種ズーエピデミカスＭＧＣＳ１０５６５、ストレプトコッカス・ガロリチカスＵＣＮ３４（ｕｉｄ４６０６１）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ  Ｃｈａｌｌ��ｓ  ｓｕｂｓｔ  ＣＨ１、ストレプトコッカス・ミュータンスＮＮ２０２５（ｕｉｄ４６３５３）、ストレプトコッカス・ミュータンス、化膿性連鎖球菌Ｍ１  ＧＡＳ、化膿性連鎖球菌ＭＧＡＳ５００５、化膿性連鎖球菌ＭＧＡＳ２０９６、化膿性連鎖球菌ＭＧＡＳ９４２９、化膿性連鎖球菌ＭＧＡＳ１０２７０、化膿性連鎖球菌ＭＧＡＳ６１８０、化膿性連鎖球菌ＭＧＡＳ３１５、化膿性連鎖球菌ＳＳＩ−１、化膿性連鎖球菌ＭＧＡＳ１０７５０、化膿性連鎖球菌ＮＺ１３１、ストレプトコッカス好熱性細菌ＣＮＲＺ１０６６、ストレプトコッカス好熱性細菌ＬＭＤ−９、ストレプトコッカス好熱性細菌ＬＭＧ１８３１１、ボツリヌス菌Ａ３  Ｌｏｃｈ  Ｍａｒｅｅ、ボツリヌス菌Ｂ  Ｅｋｌｕｎｄ  １７Ｂ、ボツリヌス菌Ｂａ４  ６５７、ボツリヌス菌Ｆ  Ｌａｎｇｅｌａｎｄ、クロストリジウム・セルロリティカムＨ１０、フィネゴルディア・マグナ（ＡＴＣＣ２９３２８）、ユーバクテリウム・レクタレ（ＡＴＣＣ３３６５６）、マイコプラズマ・ガリセプチカム、マイコプラズマ・モービレ１６３Ｋ、マイコプラズマ・ペネトランス、マイコプラズマ・シノビエ５３、ストレプトバシラス・モニリフォルミス（ＤＳＭ１２１１２）、ブラディリゾビウムＢＴＡｉｌ、ニトロバクター・ハンブルゲンシスＸ１４、ロドシュードモナス・パルストリスＢｉｓＢ１８、ロドシュードモナス・パルストリスＢｉｓＢ５、パルビバクラム・ラバメンティボランスＤＳ−１、ディノロセオバクター・シバエＤＦＬ１２、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクスＰａｌ  ５  ＦＡＰＥＲＪ、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクスＰａｌ  ５  ＪＧＩ、アゾスピリルムＢ５１０（ｕｉｄ４６０８５）、ロドスピリラム・ラブラム（ＡＴＣＣ１１１７０）、ディアフォロバクターＴＰＳＹ（ｕｉｄ２９９７５）、フェルミネフォロバクター・エイセニアエＥＦ０１−２、髄膜炎菌０５３４４２、髄膜炎菌  アルファ１４、髄膜炎菌Ｚ２４９１、デスルホビブリオ・サレキシゲンスＤＳＭ２６３８、カンピロバクター・ジェジュニｄｏｙｌｅｉ２６９９７、カンピロバクター・ジェジュニ８１１１６、カンピロバクター・ジェジュニ、カンピロバクター・ラリＲＭ２１００、ヘリコバクター・ヘパティカス、ウォリネラ・サクシノゲネス、トルモナス・アウエンシスＤＳＭ９１８７、シュードアルテロモナス・アトランティカＴ６ｃ、シューワネラ・ペアレアナ（ＡＴＣＣ７００３４５）、レジオネラ・ニューモフィラＰａｒｉｓ、アクチノバチルス・サクシノゲネス１３０Ｚ、シューワネラ・ペアレアナ、フランシセラ・ツラレンシス亜種ノビシダＵ１１２、フランシセラ・ツラレンシス亜種ハラークティカ、フランシセラ・ツラレンシスＦＳＣ１９８、フランシセラ・ツラレンシス亜種ツラレンシス、フランシセラ・ツラレンシスＷＹ９６３４１８、またはトレポネーマ・デンティコラ（ＡＴＣＣ３５４０５）由来のまたはそれらから発現されるＣａｓ９、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ６、Ｃｐｆ１、ＣＭＳ１タンパク質、またはその任意のバリアントであり得る。
【００７３】
いくつかの特定の非限定的実施形態では、化膿性連鎖球菌Ｍ１  ＧＡＳ、特に、タンパク質ｉｄ：ＡＡＫ３３９６３６．１のＣａｓ９は、本発明の方法、組成物、細胞、キット、使用およびシステムで適用可能であり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号３で表される核酸配列によりコードされ得る。さらなる特定の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号４で表されるアミノ酸配列、またはその誘導体、変異体、バリアントまたは任意の融合タンパク質を含み得る。 いったん発現されると、本発明の方法および組成物により提供されるＣａｓ９タンパク質およびｇＲＮＡは、ｇＲＮＡ「足場」ドメインと、Ｃａｓ９上の表面に露出した正帯電溝との間の相互作用を介してリボたんぱく質複合体を形成する。Ｃａｓ９は、ｇＲＮＡ結合時に、不活性な非ＤＮＡ結合構造から活性なＤＮＡ結合構造へ変化する立体構造変化を起こす。重要なことに、ｇＲＮＡの「スペーサー」配列は標的ＤＮＡと相互作用するように遊離状態のまま残される。Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体は、ＰＡＭを有する任意の標的ゲノム配列を結合するが、ｇＲＮＡスペーサーが標的ＤＮＡに一致する程度により、Ｃａｓ９が切断するか、あるいは、触媒的に不活性なＣａｓ９を含む融合タンパク質の場合いずれか他の操作を行うかが決定される。またいくつかの特定の実施形態では、塩基エディター酵素が、本発明の組成物および方法により使用され得る。より具体的には、Ｃａｓ９ベース塩基エディターは、酵素、特に、合成のおよび非天然の酵素であり、特異的ヌクレオチド置換を触媒する酵素に融合された触媒的に不活性なＣａｓ９を利用する。既知の塩基エディターは、ＣからＴに、ＡからＧに、ＴからＣに、およびＧからＡに置換できる。「塩基編集」酵素は、プログラム可能な方式で、ｄｓＤＮＡ骨格の切断またはドナーテンプレートを必要とせずに、１つの標的ＤＮＡ塩基の別の塩基への直接不可逆変換を可能にする。より具体的には、これらのキメラ酵素（本明細書では、融合タンパク質とも呼ばれる）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９と、ガイドＲＮＡにより標的化される能力を保持するがｄｓＤＮＡの破壊を誘導できないシチジンデアミナーゼ酵素との融合体をベースにする。従って、これらの酵素は、シチジンのウリジンへの直接変換を媒介し、それにより、Ｃ→Ｔ（またはＧ→Ａ）置換を行う。またさらに、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体が推定上のＤＮＡ標的を結合すると、ｇＲＮＡターゲティング配列の３’末端の「シード」配列が標的ＤＮＡへのアニールを開始する。シードと標的ＤＮＡ配列が一致する場合、ｇＲＮＡは３’から５’方向での標的ＤＮＡへのアニールを継続する。
【００７４】
Ｃａｓ９は、ｇＲＮＡスペーサーと標的配列との間に十分な相同性が存在する場合、標的を切断するのみである。またさらに、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、２つの機能性エンドヌクレアーゼドメイン：ＲｕｖＣおよびＨＮＨを有する。Ｃａｓ９は、標的結合時に、ヌクレアーゼドメインを標的ＤＮＡの逆ストランドを切断するように配置する、第２の立体構造変化を起こす。Ｃａｓ９媒介ＤＮＡ切断の最終成果は、ＰＡＭ配列の約３〜４ヌクレオチド上流で起こる標的ＤＮＡ内の二本鎖破壊（ＤＳＢ）である。
【００７５】
得られたＤＳＢは、その後、２つの通常の修復経路、効率的であるがエラーが発生しやすい非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路および効率で劣るが高忠実度の相同組み換え修復（ＨＤＲ）経路の１つにより修復され得る。ゲノム編集のためのプログラム可能な遺伝子改変ヌクレアーゼ（ＰＥＮ）戦略は、特異的二重鎖ＤＮＡ切断後のＨＤＲ機序の細胞活性化（ノックインシステム）またはＮＨＥＪ機序（ノックアウトシステム）に基づき得る。
【００７６】
いくつかの特定の実施形態では、ノックアウトされる標的化遺伝子、特に、ＭＰＯ遺伝子は、ＮＨＥＪ経路により修復され、ほとんどの場合、標的遺伝子の機能不全（欠失／挿入／ナンセンス変異、など）を生ずる。前に考察したように、Ｃａｓ９は、２つのヌクレアーゼドメイン、ＲｕｖＣおよびＨＮＨの組み合わせた活性により二本鎖破壊（ＤＳＢ）を起こす。エンドヌクレアーゼ活性に重要な各ヌクレアーゼドメイン中の正確なアミノ酸残基は既知であり（化膿レンサ球菌Ｃａｓ９の場合、ＨＮＨではＤ１０ＡおよびＲｕｖＣではＨ８４０Ａ）、１個のみの活性触媒ドメインのみを含むＣａｓ９酵素の改変型（「Ｃａｓ９ニッカーゼ」と呼ばれる）が生成された。Ｃａｓ９ニッカーゼは、ｇＲＮＡに基づいてまだＤＮＡを特異的に結合するが、ニッカーゼは、ＤＮＡ鎖の１つを切断できるのみであり、その結果ＤＳＢではなく、「ニック」、または一本鎖切断を生ずる。ＤＮＡニックは、テンプレートとして無傷の相補的ＤＮＡ鎖を用いてＨＤＲ（相同組み換え修復）により急速に修復される。従って、２つのニッカーゼ標的化逆ストランドが標的ＤＮＡ内のＤＳＢ生成に必要である（多くの場合、「ダブルニック」または「二重ニッカーゼ」ＣＲＩＳＰＲシステムと呼ばれる）。この要件は、標的特異性を劇的に増大させる。理由は、ＤＳＢを生じさせるのに十分に近接した範囲内で２つのオフターゲットニックが生成される可能性が低いためである。従って、本発明は、特異性を増大させかつオフターゲット効果を低減するために、ダブルニック誘導ＤＳＢを生成する二重ニッカーゼ手法を含むＣａｓ９の任意の変異体、バリアントまたは誘導体の使用をさらに包含することを理解されたい。従って、本発明は、本発明の方法、細胞および組成物において、特異性を増大させかつオフターゲット効果を低減するために、ダブルニック誘導ＤＳＢを生成する二重ニッカーゼ手法の使用をさらに包含することを理解されたい。特異性を増大させる具体例は、標的化ｇＲＮＡに対しリンカーとして機能するｄＣａｓ９に融合されたＦｏｋ１などのヌクレアーゼの使用である。より具体的には、よく特徴づけられたダイマー化依存性ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインがＲＮＡ誘導型触媒的不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）タンパク質に融合され、それによりＦｏｋ１のヌクレアーゼ活性に必要なダイマー化に起因して、高められた特異性を提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、同じまたは異なる標的、特にＭＰＯ遺伝子を標的にし得るいくつかの最終ｇＲＮＡ産物へと処理され得るプレｃｒＲＮＡを提供する選択肢をさらに包含する。またいくつかのより特定の実施形態では、本発明のｇＲＮＡ内に含まれるｃｒＲＮＡは、標的ゲノムＤＮＡ配列に相補的な一本鎖リボ核酸（ｓｓＲＮＡ）配列であり得る。いくつかの特定の実施形態では、ＭＰＯ遺伝子内の標的ゲノムＤＮＡ配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の直ぐ上流およびさらに上流に位置し得る。
【００７７】
いくつかの実施形態では、本発明の方法、組成物、細胞、キット、使用およびシステムにより使用されるｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡは、ヒトＭＰＯ遺伝子の配列番号４３、４４、４５、４６、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５および１０６のいずれか１つで表される核酸配列、またはそのいずれかのフラグメントを含むプロトスペーサーを標的にし得る。またいくつかのさらなる実施形態では、本発明の方法、組成物、細胞、キット、使用およびシステムにより使用されるｇＲＮＡは、ヒトＭＰＯ遺伝子の配列番号５、６、８、９、１０、１１、１２、１３、１４のいずれか１つで表される核酸配列、またはそのいずれかのフラグメントを含むプロトスペーサーを標的にし得る。またさらに、いくつかの実施形態では、本発明の方法で使用されるｇＲＮＡは、ＭＰＯタンパク質、特にヒトＭＰＯ遺伝子およびタンパク質中の種々のドメインをコードするＭＰＯ遺伝子中の種々の部位に対応する核酸配列を含むプロトスペーサーを標的にし得る。
【００７８】
いくつかの特定の実施形態では、ＭＰＯ遺伝子中の標的化特異的部位は、ＨＤＲがＭＰＯ遺伝子内の特異的残基または配列の置換に使用される場合は特に、全体ＭＰＯ分子のノックアウトをもたらし得る、あるいはその機能および活性を調節し得る。いくつかの実施形態では、本発明の方法で使用されるｇＲＮＡは、ＭＰＯの活性部位に対応する核酸配列を含むプロトスペーサーを標的にし得る。さらに特定の実施形態では、本発明のｇＲＮＡは、ヒトＭＰＯタンパク質、レベル、発現および／または活性を調節するように誘導される場合に特に、ＭＰＯの異なるドメインに位置するプロトスペーサーを標的にし得る。いくつかの特定の実施形態では、ヒトＭＰＯは、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む。このようなドメインまたは配列は、プロトマー生合成およびプロセッシングに必要なドメインまたは配列、ヒトＭＰＯ欠損を模倣するドメインまたは特異的残基、プロトマーヘム結合に必要なドメインまたは配列、および適切なタンパク質グリコシル化に必要なドメインまたは配列、を含み得る。さらに特定の実施形態では、本発明の方法で使用されるｇＲＮＡは、ドメインにより包含されるプロトスペーサーまたはプロトマー生合成およびプロセッシングに必要な残基をコードする核酸配列を含むプロトスペーサーを標的にし得る。このような配列は、ＭＰＯ、特に配列番号２で表されるヒトＭＰＯアミノ酸配列の残基１２０〜１９０または／および残基３２０〜３８０の間に存在する残基または配列を含むドメインをコードし得る。このような残基をコードするこのようなドメインまたは配列内に含まれるいずれかのプロトスペーサーを標的とするｇＲＮＡは従って、タンパク質の立体構造変化またはプロトマー生合成およびプロセッシングの変化をもたらす。さらに、いくつかの実施形態では、本発明の方法で使用されるｇＲＮＡは、ドメインにより包含されるプロトスペーサーまたはヒトＭＰＯ欠損置換を模倣する残基をコードする核酸配列を含むプロトスペーサーを標的にし得る。このようなプロトスペーサーは、配列番号２で表されるヒトＭＰＯの残基１５０〜２６０および／または配列番号２で表されるヒトＭＰＯの残基４８０〜５８０をコードする核酸配列内に位置し得る。またいくつかのさらなる実施形態では、本発明の方法で使用されるｇＲＮＡは、ドメインにより包含されるプロトスペーサーまたはプロトマーヘム結合に必要な残基をコードする核酸配列を含むプロトスペーサーを標的にし得る。いくつかの特定の実施形態では、このようなプロトスペースは、配列番号２で表されるヒトＭＰＯの残基２５０〜２７０および／または残基３９０〜５１０をコードする核酸配列内に位置し得る。またいくつかのさらなる実施形態では、本発明の方法で使用されるｇＲＮＡは、ドメインにより包含されるプロトスペーサーまたは適切なタンパク質グリコシル化に必要な残基をコードする核酸配列を含むプロトスペーサーを標的にし得る。このようなプロトスペーサーは、配列番号２で表されるヒトＭＰＯの残基３００〜３６０をコードする核酸配列内に位置し得る。いくつかの特定の実施形態では、本発明で使用されるｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡは、ヒトＭＰＯ遺伝子中の特異的プロトスペースを標的にする。本発明の方法、組成物、キットで標的化され得るヒトＭＰＯ遺伝子内の追加の標的部位は、配列番号２により表されるヒトＭＰＯの残基Ｃ１６７、Ｃ１８０、Ｃ３１９、Ｃ１５８、Ｒ１２８、Ｎ３５５、Ｔ１７３、Ｍ２５１、Ｒ５６９、Ｒ４９９、Ｇ５０１、Ｑ２５７、Ｄ２６０、Ｍ４０９、Ｅ４０８、Ｈ２６１、Ｈ５０２およびＮ３５５を含み得る。本発明は、本明細書で考察される標的としてのこれらの残基のいずれか１つの使用を包含することに留意されたい。いくつかのさらなる特定の実施形態では、本発明で標的認識配列として使われるｃｒＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、ヒトＭＰＯ内の対応する標的プロトスペースを標的とする配列番号３３（本明細書においては、Ｔ１７３と称する）、配列番号３４（本明細書においては、Ｄ２６０と称する）、配列番号３５（本明細書においては、Ｈ５０２と称する）、および配列番号４２（本明細書においては、Ｃ３１９と称する）のいずれか１つにより表される核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、本発明の配列番号３３のｃｒＲＮＡ配列は、配列ＴＧＣＡＣＡＴＣＣＣＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧ（配列番号４３としても表される）を含む配列を標的にし得る。いくつかのさらなる実施形態では、本発明の配列番号３４のｃｒＲＮＡ配列は、配列ＣＡＧＧＧＧＴＧＡＡＧＴＣＧＡＧＧＴＣＧ（配列番号４４としても表される）を含む配列を標的にし得る。またいくつかのさらなる実施形態では、本発明の配列番号３５のｃｒＲＮＡ配列は、配列ＧＧＡＴＧＡＧＧＧＴＧＴＧＧＣＣＧＴＡＧ（配列番号４５としても表される）を含む配列を標的とし得る。またいくつかのさらなる実施形態では、本発明の配列番号４２のｃｒＲＮＡ配列は、配列ＧＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＴＧＣＴＣＣＣＧＧＧＧ（配列番号４６としても表される）を含む配列を標的とし得る。またいくつかのさらなる実施形態では、本発明による標的認識配列として使用されるｃｒＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、４７、５０、５５、６０、６３、６６、７１、７４、７７、８０、８５、８８および９１のいずれか１つにより表される核酸配列を含み得る。またいくつかのさらなる実施形態では、これらのｇＲＮＡは、ヒトＭＰＯ核酸配列内のプロトスペーサーを標的とする。さらに特定の実施形態では、これらのプロトスペーサーは、それぞれ、配列番号９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、および１０６により表される核酸配列を含む。
【００７９】
またいくつかの他の特定の実施形態では、本発明で使用されるｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡは、マウスＭＰＯ遺伝子中の特異的プロトスペースを標的にする。いくつかの実施形態では、本発明のｇＲＮＡ配列は、配列ＣＣＣＣＡＡＣＧＡＴＣＡＧＣＴＧＡＣＣＡ（配列番号５としても表される）を含むプロトスペーサー配列を標的にし得る。いくつかの実施形態では、本発明のｇＲＮＡ配列は、配列ＣＡＧＣＧＧＧＧＴＧＴＡＣＧＧＣＡＧＣＧ（配列番号６としても表される）を含む配列を標的にし得る。またいくつかのさらなる実施形態では、本発明のｇＲＮＡ配列は、配列ＧＣＡＣＴＣＡＴＧＴＴＣＡＴＧＣＡＧＴＧ（配列番号８としても表される）を含む配列を標的にし得る。いくつかのさらなる実施形態では、本発明のｇＲＮＡ配列は、配列ＴＧＣＧＡＴＡＣＴＴＧＴＣＡＴＴＣＧＧＴ（配列番号９としても表される）を含む配列を標的にし得る。いくつかのさらなる実施形態では、本発明のｇＲＮＡ配列は、配列ＡＧＴＡＡＡＡＣＡＧＧＡＧＣＴＣＣＧＴＧ（配列番号１０としても表される）を含む配列を標的にし得る。いくつかのさらなる実施形態では、本発明のｇＲＮＡ配列は、配列ＡＣＧＣＴＴＣＣＡＡＧＡＣＡＡＴＧＧＣＡ（配列番号１１としても表される）を含む配列を標的にし得る。いくつかのさらなる実施形態では、本発明のｇＲＮＡ配列は、配列ＡＣＧＣＣＡＴＣＴＴＣＡＴＡＣＴＣＴＧＣ（配列番号１２としても表される）を含む配列を標的にし得る。いくつかのさらなる実施形態では、本発明のｇＲＮＡ配列は、配列ＡＴＣＡＡＧＣＧＧＡＧＣＣＴＣＣＡＡＡＧ（配列番号１３としても表される）を含む配列を標的にし得る。またいくつかのさらなる実施形態では、本発明のｇＲＮＡ配列は、配列ＡＧＡＧＴＡＣＣＴＧＴＡＡＣＡＴＴＧＡＡ（配列番号１４としても表される）を含む配列を標的にし得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、マウスＭＰＯの上記で定義のプロトスペーサー配列を標的にする配列番号５、配列番号６、配列番号８および配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４のいずれか１つで表される核酸配列を含む。いくつかのさらなる実施形態では、本発明による標的認識配列として使用されるｃｒＲＮＡは、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号４２、ならびに配列番号４７、５０、５５、６０、６３、６６、７１、７４、７７、８０、８５、８８および９１のいずれか１つにより表される核酸配列を含み得る。
【００８０】
本明細書で示すように、本発明の導入遺伝子により転写されるｇＲＮＡは、標的ゲノムＤＮＡ、特にＭＰＯ遺伝子内のいずれかのプロトスペーサーに対し、少なくとも部分的に相補的であり得る。特定の実施形態では、「相補性」は、それぞれロックアンドキー方式の、２つの構造体間の関連性を指す。天然では、相補性は、それが２つのＤＮＡまたはＲＮＡ配列間で共有される性質であるため、ＤＮＡ複製および転写の基本原理であり、そのため、それらが相互に逆平行に整列される場合、それらの配列中のそれぞれの位置でのヌクレオチド塩基は相補的である（例えば、ＡとＴまたはＵ、ＣとＧ）。またいくつかのさらなる実施形態では、本発明の方法で使用されるｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡは、標的プロトスペーサーの少なくとも一部の核酸配列を含み得る。
【００８１】
上で示したように、いくつかの特定の実施形態では、本発明のシステムのｇＲＮＡにより標的化されるゲノムＤＮＡ配列は、ＰＡＭ配列の直ぐ上流に位置し得る。
【００８２】
いくつかの実施形態では、本発明の方法、組成物、細胞、キット、使用およびシステムは、いくつかのｇＲＮＡ、特に２つ以上のｇＲＮＡを含み得る。従って、いくつかの実施形態では、本発明のｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００個のまたはそれより多い、特に、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００個のまたはそれより多いスペーサーを含み得る。すなわち、いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡコード配列は、ＭＰＯコード配列上の少なくとも２つ以上の異なる位置を標的にする１〜２００個のまたはそれより多い同じまたは異なるｇＲＮＡをコードし得る。本発明のｇＲＮＡをコードする核酸配列のスペーサーは、同じまたは異なるスペーサーであり得ることをさらに理解されたい。さらなる実施形態では、これらのスペーサーは、ＭＰＯ遺伝子内の同じまたは異なる標的プロトスペーサーを標的にし得る。またいくつかの他の実施形態では、このようなスペーサーは、ＭＰＯ遺伝子内の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００個のまたはそれより多い標的プロトスペーサーを標的にし得る。これらの標的配列は、ＭＰＯ遺伝子の単一領域または一部から誘導され得る、あるいはＭＰＯ遺伝子またはコード配列のいくつかの標的領域または部分から誘導され得る。
【００８３】
本明細書で使用される場合、「スペーサー」という用語は、特異的配列を標的にするように設計された非反復または反復スペーサー配列を指す。いくつかの特定の実施形態では、スペーサーは、約１５〜約５０個のヌクレオチド、特に、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個のまたはそれより多いヌクレオチドを含み得る。より具体的には、スペーサーは２０〜３５個のヌクレオチドを含み得る。
【００８４】
一般に、本発明のＣＲＩＳＰＲシステムによりコードされるガイドまたは標的化ＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含み得る。しかし、Ｃｐｆ１ベースＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムおよびＣＲＩＳＰＲ  Ｉ型〜Ｅ型などのいくつかの特定のＣＲＩＳＰＲシステムでは、ガイドＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡを含まないことに留意されたい。ＣＲＩＳＰＲスペーサーによりコードされる標的化ＲＮＡの配列は、それがＭＰＯ遺伝子内の標的配列（本明細書では「プロトスペーサー」とも呼ばれる）に向けられること（すなわち、標的配列に同じまたは相補的であるセグメントを有する）に対する要件以外は、特に限定されない。このようなプロトスペーサーは、本発明により提供される方法、組成物、細胞、キット、使用およびシステムのｇＲＮＡをコードする核酸配列内に含まれるＣＲＩＳＰＲスペーサーによりコードされる標的化ＲＮＡに対し十分な相補性を有する核酸配列を含む。従って、いくつかの実施形態では、コードされたｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡは、標的プロトスペーサーの核酸配列に少なくとも１部は同じである配列を含む。いくつかの他の実施形態では、本発明のシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼは、新規に特定されたシステムのクラスター化され規則的に間隔を置かれる短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）のいずれか１つであり得る。本発明は、Ｃａｓ９、特に配列番号４で表されるアミノ酸配列、またはそのいずれかのフラグメント、バリアント、誘導体および変異体、またはそのいずれかのキメラもしくは融合タンパク質を含むＣａｓ９の任意のフラグメント、誘導体、またはバリアントを提供することを理解されたい。本発明の方法、組成物、細胞、キットおよびシステムは、そのいくつかの実施形態では、遺伝子編集システムとして、Ｃａｓタンパク質、特にＣａｓ９タンパク質を提供することを理解されたい。「アミノ酸配列」または「ペプチド配列」は、ペプチド結合により結合されるアミノ酸残基がペプチドおよびタンパク質の鎖中で位置する順番であることに留意されたい。配列は通常、遊離アミノ基含有Ｎ末端からアミド含有Ｃ末端へ報告される。アミノ酸配列は、タンパク質の一次構造を表す場合、多くの場合、ペプチド、タンパク質配列と呼ばれるが、しかし、タンパク質は、特異的三次元配置へと折り畳まれたアミノ酸配列として定義され、通常、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、マノシル化、アミド化、カルボキシル化、スルフヒドリル結合形成、切断などの翻訳後修飾を受けているので、用語「アミノ酸配列」または「ペプチド配列」および「タンパク質」の間で区別する必要がある。「フラグメントまたはペプチド」は、上記Ｃａｓ９タンパク質の一部を意味する。本発明のアミノ酸配列のいずれかなどの分子の「フラグメント」は、Ｃａｓ９タンパク質の任意のアミノ酸サブセットを指す。これはまた、その「バリアント」または「誘導体」も含み得る。「ペプチド」は、機能活性を有する特定のアミノ酸サブセットを指すことが意図される。「機能的」は、同じ生物学的機能を有する、例えば、特異的ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ反応を行う能力を有することを意味する。
【００８５】
本発明は、本発明のＣａｓ９タンパク質の任意のバリアントまたは誘導体および実質的に同一またはホモログである任意のポリペプチドを包含することを理解されたい。用語の「誘導体」は、元のポリペプチドの活性を変えない、アミノ酸配列（ポリペプチド）に対する挿入、欠失、置換および修飾のいずれかを有するアミノ酸配列（ポリペプチド）を定義するために使用される。これに関連して、本発明により使用されるＣａｓ９タンパク質の誘導体またはフラグメントは、Ｃａｓ９タンパク質の活性を低減させないまたは変えない、特に配列番号４により表されるＣａｓ９タンパク質のいずれかの誘導体またはフラグメントであり得る。用語の「誘導体」は、その同族体、バリアントおよび類似体も指す。タンパク質オルソログまたは同族体は、本発明による目的のタンパク質に対し配列相同性または同一性を有し、特に本発明による目的のタンパク質、例えば、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むＣａｓ９タンパク質の全配列に比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％および特に、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、またはそれ超を共有し得る。特に、ホモログは、配列番号４に対して、特に配列番号４により表される全配列に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％および特に６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
【００８６】
いくつかの実施形態では、誘導体は、ポリペプチドを指し、これは、本発明中でアミノ酸残基の挿入、欠失または置換により特に定義されるポリペプチドとは異なる。本明細書で使用される場合、用語の「挿入」、「欠失」または「置換」は、それぞれ、本発明で開示の、１〜５０個のアミノ酸残基、２０〜１個のアミノ酸残基、および特に、１〜１０個のアミノ酸残基のポリペプチドに対する任意の付加、欠失または置換を意味することを理解されたい。より具体的には、挿入、欠失または置換は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸のいずれか１つであり得る。本発明により包含される挿入、欠失または置換は、改変ペプチドの任意の位置、ならびにそのＮ’またはＣ’末端のいずれかで発生し得ることに留意されたい。
【００８７】
アミノ酸配列に関して、当業者は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列に対する、コード配列中の単一アミノ酸または小さいパーセンテージのアミノ酸の変化、付加または欠失をもたらす個別の置換、欠失または付加は、「保存的改変バリアント」であり、変化は化学的に類似のアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらすことを理解するであろう。機能的に類似のアミノ酸をもたらす保存的置換表は、当該技術分野において周知である。このような保存的改変バリアントは、本発明の多形性バリアント、種間相同体、種間相同体、およびアレルに追加するものであり、これらを排除するものではない。例えば、置換は、脂肪族アミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｉ、ＬまたはＶ）がグループの別のメンバーにより置換される場合、または１個の極性残基の別の残基による置換、アルギニンによるリシンの置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸の置換、またはグルタミンによるアスパラギンの置換などの置換の場合に実施され得る。次の８つのグループのそれぞれは、相互に保存的置換である他の代表的アミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）。従って、いくつかの実施形態では、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質またはそのいずれかの誘導体、特に、配列番号４により表されるアミノ酸配列に対し、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個のまたはそれより多い保存的置換を含む誘導体を包含する。より具体的には、アミノ酸「置換」は、１個のアミノ酸の、類似の構造的および／または化学的特性を有する別のアミノ酸による置き換え、すなわち、保存的アミノ酸置き換えの結果である。アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒特性を基準にして実施され得る。例えば、非極性「疎水性」アミノ酸は、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、システイン（Ｃ）、アラニン（Ａ）、チロシン（Ｙ）、ヒスチジン（Ｈ）、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）、アルギニン（Ｒ）およびリシン（Ｋ）からなるグループより選択され、「極性」アミノ酸は、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）からなるグループより選択され、「正に帯電した」アミノ酸は、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）およびヒスチジン（Ｈ）からなるグループより選択され、「酸性」アミノ酸は、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン酸（Ｅ）およびグルタミン（Ｑ）からなるグループより選択される。
【００８８】
本発明のポリペプチドのバリアント、特に本発明により使用されるＣａｓ９は、アミノ酸レベルで、本発明の種々のポリペプチドなどの目的のタンパク質に対し、少なくとも８０％の配列類似性または同一性、多くの場合少なくとも８５％の配列類似性または同一性、９０％の配列類似性または同一性、または少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列類似性または同一性を有し得る。上で示したように、ヌクレアーゼおよび特に、本発明の方法、組成物、細胞、キット、使用およびシステムで使用されるＣａｓ９などの誘導型ヌクレアーゼは、いくつかの実施形態では、ＭＰＯのレベル、発現および／または活性のさらなる操作を可能にし得る本発明で開示の触媒的に不活性なヌクレアーゼまたはそのいずれかの融合タンパク質であり得る。このような場合、標的配列の標的化操作のために、これらの誘導型ヌクレアーゼの標的化特性のみが使用される（例えば、ｇＲＮＡを用いる標的核酸配列の標的化）。このような場合には核酸分解活性は望ましくない。いくつかの実施形態では、核酸分解活性を持たない誘導型ヌクレアーゼが使用され得る。従って、いくつかの特定の実施形態では、本発明のシステムのために使用されるＣａｓ９酵素は、全ての核酸分解活性を欠くＣａｓ９、例えば、ｄＣａｓ９などの欠陥酵素であり得る。ｄＣａｓ９は、ヌクレオチド鎖切断を欠く変異体Ｃａｓ９である。このような変異体の非限定的例は、Ｄ１０Ａ（位置１０でアスパラギン酸からアラニンへ）およびＨ８４０Ａ（位置８４０でヒスチジンからアラニンへ）の少なくとも１つに点変異を有する変異体であり得る。このような変異体は、細胞中で高度に特異的な様式でＤＮＡに異なるタンパク質エフェクターを動員するためのモジュールＲＮＡ誘導型プラットフォームとして使用できる（Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １５２：１１７３−１１８３（２０１３））。抑制的なおよび活性化する両エフェクターをｄＣａｓ９に融合して、遺伝子発現をそれぞれ抑制あるいは活性化できる。従って、いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ９および活性化エフェクター（例えば、転写因子または脱メチル化酵素）の融合タンパク質またはｄＣａｓ９とリプレッサーの融合を本発明の方法、組成物、細胞、キット、使用およびシステムで使用し得る。より具体的には、活性化または抑制は、相同塩基対のみに基づいて標的ＤＮＡ配列を認識するｓｇＲＮＡにより決定され得る。ｄＣａｓ９による抑制は、裸の変異導入タンパク質が標的に誘導されるときに達成される。この抑制は、ガイドがｄＣａｓ９を所望の遺伝子、特にＭＰＯ遺伝子のプロモーター領域に向ける場合、およびガイド配列が遺伝子の非テンプレート鎖に相補的である場合に、より効果的である。しかし、これは必須ではなく、いくつかの事例では、遺伝子中の異なる領域への誘導、または逆テンプレートも同様に効率的に抑制できる。
【００８９】
ｄＣａｓ９による抑制は、ｄＣａｓ９を既知のリプレッサーに融合することにより高めることができる。このようなリプレッサーの非限定的例は、標的の抑制を強化するＫｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメインであり得る（Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １５４：４４２−４５１（２０１３））。またいくつかの代替実施形態では、ＭＰＯの発現および／または活性の強化が望ましい場合には、ｄＣａｓ９による活性化は、転写活性化因子がそれに融合される場合に達成し得る。このような活性化剤の非限定的例は、ＶＰ１６としても知られる単純ヘルペスウィルスタンパク質ｖｍｗ６５であり得る（Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １５４：４４２−４５１（２０１３））。あるいは、ガイドＲＮＡそれ自体を、活性化剤またはリプレッサーを動員するように、従って、裸のｄＣａｓ９を動員し、結果を指示するように改変できる（ｄＣａｓ９の代わりにまたはそれに追加して）（Ｚａｌａｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １６０：３３９−３５０（２０１５））。例えば、ガイドは、特異的結合タンパク質を動員するＲＮＡドメインをコードできる。このＲＮＡ結合タンパク質は活性化剤（例えば、ＶＰ１６）またはリプレッサー（例えば、Ｋｒａｂ）に融合され得、従って、リプレッサーまたは活性化剤とｄＣａｓ９全部の動員は、所望の結果、特にＭＰＯ遺伝子の抑制または活性化をもたらす。
【００９０】
遺伝子編集システムが、本発明によりＭＰＯのレベル、発現および／または活性を操作するために使用される場合、このようなシステムは、このシステムの成分、例えば、Ｃａｓ９および特異的ｇＲＮＡをコードする核酸配列を含む構築物をコードする核酸配列として、送達され得ることを理解されたい。しかし、本発明は、そのいくつかの実施形態では、機能性複合体として送達される精製Ｃａｓ９および精製ｇＲＮＡを含むＣａｓ９／ｇＲＮＡリボ核タンパク質複合体（Ｃａｓ９  ＲＮＰ）を使用する選択肢をさらに包むことを理解されたい。いくつかの特定の実施形態では、精製ｇＲＮＡは、アニールされたｇＲＮＡオリゴのＰＣＲ増幅またはプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド４２２５０など）を含む直線化ｇＲＮＡのインビトロ転写により生成できる。Ｃａｓ９（または本明細書で考察されるＣａｓ９のいずれかのバリアント）は、細菌性Ｃａｓ９発現プラスミドの使用により細菌から精製できる。またいくつかのさらなる実施形態では、標的細胞へのＣａｓ９  ＲＮＰ送達は、いくつかの特定の非限定的実施形態では、脂質媒介遺伝子導入または電気穿孔を介して実施され得る。
【００９１】
上で示したように、本発明の方法、組成物、細胞、キット、使用およびシステムは、ＲＮＡを切断するヌクレアーゼの使用をさらに包含し得る。従って、いくつかの実施形態では、本発明により使用され得る誘導型ＲＮＡヌクレアーゼは、ＲＮＡを標的とするＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムであり、好都合である場合がある（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ＩＩ−Ａ型および新規特定ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  Ｃ２ｃ２）。上で示したように、本発明の方法は、本明細書で記載の遺伝子編集システムの使用、あるいは、調節されたＭＰＯ発現および／または活性を示す未分化ＢＭ細胞の使用を伴い得る。従って、いくつかの実施形態では、細胞が本発明の方法により使用される場合、本明細書で適用可能な未分化ＢＭ細胞集団は、これらの細胞中のＭＰＯの発現および／または活性を調節できる少なくとも１種の遺伝子編集化合物で形質導入または遺伝子導入されたＢＭ細胞集団であり得る。いくつかの実施形態では、このような未分化ＢＭ細胞集団は、自己源あるいは同種間源あるいは同系源由来であり得ることに留意されたい。またさらなる代替実施形態では、本発明の方法は、抑制されたまたは除去されたＭＰＯ発現および／または活性を示す同種対象の未分化ＢＭ細胞集団を使用し得る。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＭＰＯ発現および／または活性を除去するように遺伝子操作された未分化ＢＭ細胞集団を使用し得る。
【００９２】
従って、いくつかの実施形態では、本発明の方法に好適な細胞は、自己源由来であり得る。細胞の起源に関連する場合、用語の「自己」は、本発明の方法により治療される同じ対象から誘導または導入された細胞を指す。またいくつかのさらなる実施形態では、本発明の方法に好適な細胞は、自己源由来の細胞であり得る。細胞の起源に関連する場合、用語の「同種間」は、同じ種の、本明細書でドナーとして言及される、異なる対象から誘導または導入された細胞を指す。
【００９３】
より具体的には、上で示したように、本発明の方法はまた、ＭＰＯ遺伝子の改変がエクスビボで、対象の細胞に（自己源の細胞）あるいは同種源の細胞に対し実施され得る選択肢を包含することを理解されたい。またいくつかの他の代替実施形態では、調節されたＭＰＯ発現および／または活性を示す同種未分化ＢＭ細胞を使用し得る。従って、自己または同種（あるいは同系）起源由来の細胞は、養子移入により対象に投与され得る。本明細書で定義される用語の「養子移入」は、免疫系の成分、特に、すでに特異的免疫応答を開始できる細胞の導入からなる全ての治療法に当てはまる。またさらに、いくつかの実施形態では、本出願に好適な細胞は、固定化ＨＳＰであり得る。造血幹細胞（ＨＳＣ）は通常、骨髄中に存在するが、末梢血中の多数のＨＳＣを採取するために使用される骨髄可動化と呼ばれるプロセスにより、強制的に血液中に入れることができる。本発明に最適の稼働化剤（ｍｏｂｉｌｉｚｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）の１種は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）であり得る。得られたＨＳＣは、さらに可動化（ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）ＨＳＣと呼ばれる。
【００９４】
骨髄注射の場合、標的細胞はＨＳＰＣであり得、全身注射の場合、標的細胞は、可動化ＨＳＰＣであり得る（患者が固定化の前処理に供される場合）。遺伝子編集化合物の骨髄注射、およびいくつかの実施形態では、全身注射は、対象中のＭＰＯのインビボ操作に特に好適であり得ることに留意されたい。
【００９５】
本発明は、インビボで、本発明の遺伝子編集システムを用いて、またはエクスビボで改変された、特に低減されたＭＰＯの発現、レベルおよび／または活性を示すＢＭ細胞を移植（例えば、養子移入）することにより、未分化ＢＭ細胞中のＭＰＯの発現および／または活性を単に調節することにより、対象中の、特に上記対象のいずれかの組織または臓器中のＭＰＯのレベル、発現および活性を調節する、特に低減するための方法および組成物を提供する。従って、意外にも本発明により示されるように、特定の組織、例えば、ＰＤおよびＡＤの神経変性により冒された脳領域におけるＭＰＯ免疫反応性細胞の顕著な増大を示し得る脳組織のＭＰＯレベルおよび／または活性の効果的調節が、ＢＭ細胞中のＭＰＯレベルおよび／または活性を調節することにより達成され得る。より具体的には、いくつかの実施形態では、上記調節が標的脳組織またはその任意の成分、例えば、星状膠細胞、ミクログリアおよび／または神経中で実施されなかった場合、ＭＰＯの調節は、ＢＭ細胞中で実施された。本明細書に記載のように、本発明の方法は、治療される対象のＢＭ細胞中でのＭＰＯ発現および／または活性をインビボ調節できる少なくとも１種の遺伝子編集／システム、例えば、上記のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９であるＰＥＮを投与することにより、あるいは、調節されたＭＰＯ発現および／または活性を示す未分化ＢＭ細胞（エクスビボ操作またはＭＰＯ欠損同種間対象から得た）を投与することにより、ＭＰＯの発現および／または活性を調節することを含む。同様に本明細書で記載のように、用語の調節は、ＭＰＯ発現および／または活性の増大または低減などの、ＭＰＯの元の非調節発現および／または活性または対照または特定の条件下で測定したＭＰＯ発現／活性の通常もしくはベースラインレベルと比べて、何らかの変化または改良を指す。
【００９６】
従って、いくつかの実施形態では、ＭＰＯの発現および／または活性の調節は、上記対象中のＭＰＯのレベル、発現および／または活性の抑制または除去を含み得る。いくつかの実施形態では、ＭＰＯの発現またはレベルまたは活性の「低減」または「抑制」が示される場合、このような低減または抑制は、ＭＰＯの発現、レベル、安定性および／または活性の約１０％〜１００％の低下または減少であり得ることが意図される。本明細書で使用される場合、用語の「低減」または「抑制」は、連続的により小さなサイズ、量、数、または強度になる作用に関する。特にＭＰＯ発現、レベル、安定性および／または活性の、好適な対照、例えば、健康な対象の細胞中の、特に、ＭＰＯの正常なレベルおよび／または活性を示す健康な対象の細胞中の好適な対照に比べて、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または約１００％のまたはそれを超えるＭＰＯ発現、レベル、安定性および／または活性の低下、減少、除去、減弱化または抑制に関する。
【００９７】
しかし、ＭＰＯの発現および活性を調節する方法、組成物、細胞、キットおよびシステムを提供することにより、本発明は、そのいくつかの代替実施形態では、それを必要とする対象中のＭＰＯの発現および／または活性の強化、確立または増大を含み得るＭＰＯの発現および／または活性の調節をさらに包含することを理解されたい。
【００９８】
いくつかの実施形態では、ＭＰＯの発現またはレベルまたは活性の「増大」または「強化」を示す場合、このような増大または強化は、ＭＰＯの発現、および／または安定性の約１０％〜１００％の増大または強化であり得ることが意図される。本明細書で使用される場合、用語の「増大」、「増強」または「強化」は、連続的により大きなサイズ、量、数、または強度になる作用に関する。特に、好適な対照に比べて、ＭＰＯの発現、レベル、安定性および／または活性の、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７０％、８００％、９００％、１０００％のまたはそれを超える増大に関する。増大または上昇はまた、約２〜１０６倍のまたはそれを超える増大であり得ることにさらに留意されたい。またさらに、ＭＰＯの発現、レベル、安定性および／または活性の増大は、前記ＭＰＯの翻訳または安定性、および／または上記ＭＰＯの活性におけるものであり得ることを理解されたい。上記の場合、例えば、１０％、５０％、１２０％、５００％などのパーセンテージ値が提供される場合、これは、「倍率変化」値、すなわち、それぞれ、０．１、０．５、１．２、５、などと交換可能であることを理解されたい。従って、用語の増大は、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００倍のまたはそれを超える増大を指す。
【００９９】
上で示したように、本発明は、ＭＰＯの発現および／または活性を調節する（例えば、低減させるあるいは強化する）ための、方法、組成物、細胞、キットおよびシステムを提供する。本明細書で使用される場合、ＭＰＯ発現はまた、タンパク質の安定性を反映し得る。より具体的には、本明細書で使用される場合、「発現」は通常、遺伝子、特にＭＰＯ遺伝子コード情報が、細胞中に存在しおよび機能する構造体に変換されるプロセスを指す。従って、本発明では、遺伝子の「発現」は、特に、ポリヌクレオチドへの転写、タンパク質への翻訳、あるいはタンパク質の翻訳後修飾を指し得る。本明細書で使用される場合、タンパク質安定性は、タンパク質の物理的（熱力学的）安定性、および化学的安定性を指し、タンパク質がその天然の折り畳み構造にあるかまたは変性状態にあるかを決定するネットバランスに関する。より具体的には、細胞中のＭＰＯなどのタンパク質のレベルは、上で考察した合成速度によるのみでなく、細胞内のタンパク質の分解速度および数分から数日間にわたり広く変動する半減期によっても決定される。真核細胞では、２つの主要な経路、前に本明細書で言及したユビキチン−プロテアソーム経路、およびリソソームタンパク質分解、がタンパク質分解を媒介する。
【０１００】
またいくつかのさらなる実施形態では、本発明の方法は、ＭＰＯの活性を調節（低減あるいは強化）し得る。より具体的には、本明細書で使用される場合、ＭＰＯ活性は、ＭＰＯにより実施される任意の活性、例えば、次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）、次亜臭素酸（ＨＯＢｒ）、および次亜チオシアン酸（ＨＯＳＣＮ）、チロシルラジカルなどの反応性中間体、および過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）および塩化物アニオン（Ｃｌ−）、ブロミド（Ｂｒ−）、チオシアネート（ＳＣＮ−）、チロシンおよび亜硝酸塩から活性窒素中間体の産生を触媒するペルオキシダーゼ活性を指し得る。またいくつかのさらなる実施形態では、ＭＰＯ活性は、ＭＰＯ／ＨＯＣｌ系を介した好中球による細菌（例えば、緑膿菌）および真菌（例えば、カンジダ・アルビカンス）の細胞内死滅に関連し得る。
【０１０１】
またいくつかのさらなる実施形態では、ＭＰＯ活性はまた、ＭＰＯにより、少なくとも部分的に、引き起こされる、または直接的にまたは間接的に媒介されるいずれかのプロセスにも関する。以前に本明細書で示したように、このような活性は、ＭＰＯのヘムドメインにより、または任意の他のＭＰＯドメインにより媒介され得ることを理解されたい。このような活性の非限定的実施形態は、ＭＰＯにより媒介されるネトーシスに関する。より具体的には、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）は、主に、病原体を結合する好中球由来のＤＮＡから構成される細胞外繊維のネットワークである。ＮＥＴは、好中球が細胞外病原体を死滅させるのを可能にすると同時に、宿主細胞への損傷を最小限にする。
【０１０２】
ＮＥＴの活性化および放出、すなわち、ネトーシスは、２つの形式、特攻隊型ＮＥＴ放出（ｓｕｉｃｉｄａｌ  ＮＥＴｏｓｉｓ）およびサバイバル型ＮＥＴ放出（ｖｉｔａｌ  ＮＥＴｏｓｉｓ）がある動的プロセスである。全体として、プロセスの主要成分の多くは、両方のネトーシスのタイプについて類似しているが、しかし、刺激、タイミング、および最終的な結果の活性化経路に重要な違いが存在する−このプロセスは反応性酸素種（ＲＯＳ）中間体を介するタンパク質−アルギニンデイミナーゼ４（ＰＡＤ４）のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性化から始まる。ＰＡＤ４は、好中球中のヒストンのシトルリン化に関与し、クロマチンの脱凝縮をもたらす。次に、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）および好中球エラスターゼ（ＮＥ）などのアズール親和性顆粒タンパク質が核およびその後、脱凝縮プロセスに侵入し、核膜の破壊をもたらす。未縮合のクロマチンは、細胞質に侵入し、そこで、追加の顆粒および細胞質タンパク質が初期段階ＮＥＴに付加される。プロセスの最終結果は、どのネトーシス経路が活性化されるかに依存する。特攻隊型ＮＥＴ放出は、アポトーシスまたはネクローシスとは異なる経路によるＮＥＴの放出が好中球死を生ずることを指摘した研究で最初に記載された。特攻隊型ＮＥＴ放出では、細胞内のＮＥＴ形成に細胞膜の破壊が続き、それを細胞外間隙中に放出する。このネトーシス経路は、トール様受容体（ＴＬＲ）、Ｆｃ受容体、および補体受容体の抗体、ＰＭＡなどの種々のリガンドによる活性化により開始できる。これらの受容体の活性化時に、下流シグナル伝達により、小胞体からカルシウムが放出される。このカルシウムの細胞内流入は次に、ＮＡＤＰＨオキシダーゼを活性化し、上述のネトーシス経路が活性化される。サバイバル型ＮＥＴ放出は、ＴＬＲ２リガンドと並行して、細菌性リポ多糖類（ＬＰＳ）、他の細菌産物、ＴＬＲ４活性化血小板、または補体タンパク質により刺激され得る。サバイバル型ＮＥＴ放出は、核の小疱形成により可能になり、エキサイトーシスによって放出されるＤＮＡ充填小胞を生じ、細胞膜を無傷のまま残す。その急速な形成および放出は、好中球死を生じないが、しかし、細胞はＤＮＡがなく、ＤＮＡのない細胞を生きていると見なすことができるかどうかという疑問が生ずる。好中球は、サバイバル型ＮＥＴ放出後に、病原菌を貪食し死滅させ続けることができ、好中球の抗菌万能性を明確に示していることに留意されたい。上で詳述したように、ＭＰＯ活性は、ＭＰＯ触媒活性とは別である機序（「非酵素的作用」）により媒介され得る。いくつかの他の実施形態では、用語のＭＰＯ活性は、ＭＡＰＫおよびＮＦｋＢ活性、ＲＯＳ産生、表面インテグリン発現上昇、および脱顆粒、ならびに肺中の増大した炎症に繋がるアポトーシスの低減、の少なくとも１つを指す。いくつかの特定の実施形態では、用語のＭＰＯ活性は、ヒト好中球のアポトーシスの抑制を指す。いくつかの実施形態では、用語のＭＰＯ活性は、ＭＰＯのＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８インテグリンへの結合から生じるプロセスを包含する／プロセスに関連する。いくつかの実施形態では、ＭＰＯ活性は、多形核好中球（ＰＭＮ）シグナル伝達経路のＰＭＮ活性を誘導するためのシミ��レーションを指す。いくつかの他の実施形態では、ＭＰＯ活性は、ＭＰＯの好中球のための生存シグナルとしての役割を果たし、それにより炎症の延長に寄与する能力を指す。いくつかの他の実施形態では、用語のＭＰＯ活性は、内皮細胞活性化を指す。またいくつかの他の実施形態では、用語のＭＰＯ活性は、樹状細胞（ＤＣ）機能および適応免疫の抑制を指す。ＤＣは、哺乳動物免疫系の抗原提示細胞（アクセサリー細胞としても知られる）であり、それらの機能は、抗原物質を処理し、それを免疫系のＴ細胞に対し細胞表面上で提示することである。ＤＣは、自然免疫系と適応免疫系の間のメッセンジャーとして機能する。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、ＭＰＯ活性は、ＭＰＯの因子Ｈ（ＦＨ）への結合を介するＦＨの補体調節活性の効果を指す。ＭＰＯ−ＦＨ相互作用は、補体活性化副経路の活性化へ寄与することにより、（ＡＮＣＡ）関連血管炎（ＡＡＶ）の病因に関与し得ることが示唆された。いくつかの実施形態では、ＭＰＯ活性は、脈管構造中の高グルコース誘導内皮機能障害の増幅を指す。いくつかの実施形態では、ＭＰＯ活性は、ヒト血小板への結合、アクチン細胞骨格再構成の誘導、およびヒト血小板の機械的剛性に影響を及ぼすことを指す。これは、次に、ストア作動性Ｃａ２＋流入（ＳＯＣＥ）の増強およびアゴニスト誘導ヒト血小板凝集をもたらす。いくつかの実施形態では、ＭＰＯ活性は、内皮ＮＯ合成酵素（ｅＮＯＳ）のリン酸化の低下を指す。これは、さらにＮＯ産生の低下を起こし得、これは、そのニトロシル化を低減させることにより、結果的にカルパイン活性を高める。いくつかの実施形態では、ＭＰＯ活性は、ＭＰＯの赤血球（ＲＢＣ）膜への結合を指す。
【０１０４】
またいくつかのさらなる実施形態では、ＭＰＯ活性は、本明細書で前に示した脂質過酸化を指し、いくつかの実施形態では、特にＬＤＬ過酸化を指す。いくつかの実施形態では、ＭＰＯ活性は、脂質カルバミル化を指し得る。またいくつかのさらなる実施形態では、ＭＰＯ活性は、糖衣結合を指し得る。
【０１０５】
従って、いくつかの実施形態では、本発明の方法、細胞、組成物およびキットは、上で特定したＭＰＯ活性、またはそのいずれかの組み合わせの少なくとも１つを調節、特に、抑制、減少または低減し得る。本発明の方法は、特に、対象の未分化ＢＭ細胞内のインビボＭＰＯ発現および／または活性の操作をもたらす遺伝子編集ツールを対象に適用することにより、対象のＭＰＯ発現、レベルおよび／または活性の調節、特に低減または増大を可能にする。代わりにまたは追加して、対象は、必要とされるＭＰＯの調節された発現および／または活性を示す未分化ＢＭ細胞集団を投与され得る。操作はエクスビボで起こり得、同種または自己源のＢＭ細胞が本発明により提供される編集ツールと接触させられる場合、かつＭＰＯ発現および／または活性の操作後直ちに、細胞は対象に導入される（自己細胞の場合には、再導入される）ことに留意されたい。治療される対象へのこのようなＢＭ細胞の導入は、対象中のＭＰＯの発現および／または活性の操作をもたらす。あるいは、同様に実施例により示されるように、調節された（増大または低減された）ＭＰＯの発現および／または活性を示す同種対象のＢＭ細胞は対象に導入され、対象中のＭＰＯの操作をもたらし得る。従って、いくつかの実施形態では、このような操作は、本明細書で後に記載されるように、ＭＰＯの発現および／または活性のインビボ（すなわち、哺乳動物の身体中で）またはエクスビボ（すなわち、身体から取り出された細胞中で）操作を包含する。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも１種の遺伝子編集化合物を、それを必要としている対象へ投与し、それにより対象の未分化ＢＭ細胞中のＭＰＯのインビボ操作を可能にすることを含み得る。このような投与方法は、当技術分野において既知であり、以降でさらに詳述されることに留意されたい。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、方法はエクスビボ適用を含む。本開示との関連で、エクスビボは、本発明で提供される少なくとも１種の遺伝子編集化合物またはシステムを対象から取り出した、回収したまたは取得したＢＭ細胞と接触させるステップを指す。これらの細胞は、細胞中のＭＰＯの発現および／または活性を調節するのに好適な条件下で、遺伝子編集システムと接触させられ得る。本明細書で使用される場合、用語の「接触」は、一緒にする、寄せ集める、一緒にインキュベートするまたは混合することを意味する。従って、例えば、それらを相互に接触させるまたは混合することにより、第１の項目と第２の項目が一緒にされるまたは寄せ集められる場合、第１の項目が第２の項目と接触させられる。本発明との関連で、用語の「接触」は、本発明の遺伝子編集化合物と、細胞または、インビボで実施される場合は調節される対象との間の相互作用を可能にする全ての手段またはステップを含む。いくつかの実施形態では、接触ステップの前にまたは後で、ＢＭ細胞は、選別を受けて、未分化細胞を単離し得る。未分化ＢＭ細胞を、対象から取り出された、回収されたまたは取得されたＢＭから単離するステップは、任意のステップであることに留意されたい。いくつかの実施形態では、ＢＭ細胞は、少なくとも１種の遺伝子編集化合物、特に本発明により開示されるいずれかの遺伝子編集化合物またはシステムと接触させられ得る。いくつかの実施形態では、ＨＳＣおよび／または前駆細胞を含む単離未分化ＢＭ細胞集団は、少なくとも１種の遺伝子編集化合物と接触させられ得る。いくつかの代替実施形態では、ＢＭ細胞は、少なくとも１種の遺伝子編集化合物と接触させられ、ＨＳＣおよび／または前駆細胞を含む未分化ＢＭ細胞集団は単離される。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、少なくとも１種の遺伝子編集化合物はＢＭ細胞集団、特に未分化ＢＭ細胞集団と、ＭＰＯの調節を可能にしかつ改変されたＢＭ細胞集団を作製できる十分な時間にわたり接触させることができる。
【０１０９】
従って、いくつかのその態様では、本開示は、改変されたＢＭ細胞集団を提供し、いくつかの実施形態では、このようなＢＭ細胞集団中で、少なくとも一部の細胞（例えば、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上、あるいは１００％）、および好ましくは、ほとんどの細胞が、調節されたＭＰＯ発現および／または活性を示す。いくつかの実施形態では、改変されたＢＭ細胞集団は、未分化ＢＭ細胞、特に、調節されたＭＰＯ発現および／または活性を示すＨＳＣおよび／または前駆細胞を含み得る。いくつかの実施形態では、改変されたＢＭ細胞集団は、調節されたＭＰＯ発現および／または活性を有するＨＳＣを含み得る。本発明では、用語の「改変されたＢＭ細胞」または「改変されたＢＭ細胞集団」は、ＭＰＯ発現および／または活性を調節することによりエクスビボで改変されたＢＭ細胞を表すために使用される。
【０１１０】
上で示したように、本発明は、特に、対象の未分化ＢＭ細胞中のＭＰＯを標的化し、それにより上記対象の任意の組織および臓器中のＭＰＯレベルの操作をもたらすことにより、対象の免疫系を操作する方法を提供する。次の態様で示すように、本発明は治療適用のために、特にＭＰＯ関連状態の治療のために、このような調節をさらに使用する。従って、いくつかの特定の非限定的実施形態では、本発明は、調節されたＭＰＯのレベル、発現および／または活性を示すために、対象の、特に対象のＢＭ細胞の免疫系を操作することにより、対象のＭＰＯのレベル、発現および／または活性を調節するための方法、組成物およびキットを提供することを理解されたい。換言すれば、操作された免疫系（自己または同種または同系源の）を提供することにより、あるいは、本明細書で提供される遺伝子編集システムを使って対象の免疫系をインビボ操作すること（例えば、遺伝子編集システムの化合物を対象に投与すること）により、上記対象のＢＭ細胞集団は調節されたＭＰＯレベル、発現および／または活性を示す。従って、本発明のキットおよび組成物は、上記対象の任意の組織および臓器中のＭＰＯの発現および／または活性を調節するための先駆的戦略を提供する。この戦略は、明確な効果的治療適用を示す。またいくつかのさらなる特定の実施形態では、対象の免疫系のこのような操作は、ＭＰＯの調節されたレベル、発現、および／または活性を示すＢＭ細胞をそれを必要としている、いくつかの実施形態では、移植の前に免疫アブレーションを受ける対象に移植することにより達成され得る。ＭＰＯの調節された（例えば、低減されたまたは除去された）レベル、発現または活性を示すＢＭ細胞を移植することにより、移植された対象は、任意の組織および臓器中の調節されたＭＰＯの発現を示す。本発明により詳細に説明されるように、移植されるＢＭ細胞は、同じ対象から取得され、本発明の遺伝子編集システムを用いてエクスビボ操作されて、ＭＰＯのレベル、発現または活性を調節した自己ＢＭ細胞であり得ることを理解されたい。例えば、いくつかの特定の実施形態では、対象から取得されたＢＭ細胞は、ＭＰＯレベル、発現および／または活性の除去および低減をもたらし得る本発明の遺伝子編集システムにエクスビボで供され得る。あるいは、調節されたＭＰＯレベル、発現および／または活性を示す（天然で、または本発明の遺伝子編集システムを適用することにより）同種または同系源の未分化ＢＭ細胞を使用し得る。ＭＰＯ欠損のこのような自己または同種ＢＭ細胞は、免疫アブレーション化合物で処理され得る対象に再導入され、それにより、これらの操作され移植されたＢＭ細胞が対象の免疫系を置換する。この手順は、対象の任意の臓器または組織中のＭＰＯの枯渇を生ずる。ＭＰＯ枯渇ＢＭ細胞は、対象あるいは同種間対象から取得され得ることを理解されたい。より具体的には、これらの自己または同種ＢＭ細胞の対象への移植、または換言すれば、対象の免疫系細胞の、調節されたＭＰＯレベル、発現および／または活性（例えば、除去されたまたは低減されたＭＰＯレベル、発現および／または活性）を示すＢＭ細胞による置換は、上記対象の全ての組織および臓器中のＭＰＯレベル、発現および／または活性の調節をもたらす。ＭＰＯは、Ｍｐｏ−／−マウスでの高められたＴ細胞媒介皮膚遅延型過敏症および抗原誘導関節炎の２つのモデルにより示される適応免疫応答の抑制に関与する。機構的には、好中球から放出されたＭＰＯは、低減されたＩＬ−１２産生および結果としてのＣＤ８６発現により測定される、ＬＰＳ誘導ＤＣ活性化を抑制し、Ｔ細胞増殖性および炎症促進性サイトカイン産生を制限する。対照的に、自己免疫性炎症を促進するＭＰＯの病原的役割は、ＭＰＯ欠損マウスを用いて、低減された疾患重症度を示すＫ／ＢｘＮ関節炎およびコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）モデルで実証された。また、高められたＭＰＯレベルおよび活性は、多発性硬化症（ＭＳ）および関節リウマチ（ＲＡ）を含む多くの炎症状態および自己免疫疾患で観察された。ＭＰＯは、アテローム性動脈硬化症などの慢性血管疾患に関連する脈管構造機能の調節に関与する。細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中では、ＭＰＯは、内皮弛緩をもたらすＮＯを消費する一酸化窒素（ＮＯ）除去剤として機能する。アテローム血栓性組織中に存在するＭＰＯおよびその酸化性種は、脂質過酸化、ＬＤＬの高取込みアテローム生成型への変換を促進し、より劣化を受けやすい機能障害性ＨＤＬ粒子を生成するアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ａｐｏ−Ｉ）を選択的に調節し、コレステロール流出を促進するａｐｏＡ−Ｉの能力を低下させる。さらに、高い全身レベルのＭＰＯおよびその酸化生成物は、増大した心臓血管リスクと関連する。上で示したように、ＭＰＯは、種々の病態に結び付けられてきており、そのＭＰＯ発現の調節は、それにより引き起こされる障害または状態を治療するための特異的治療手段を提供する。
【０１１１】
本発明は、そのいくつかの実施形態では、少なくとも１つのＭＰＯ関連状態を罹患している対象のＭＰＯ発現および／または活性を調節する方法をさらに包含する。方法は、本明細書で上記した通りである。またいくつかのさらなる実施形態では、本発明は、本発明で開示のように、特に、それを必要としている対象の少なくとも１つのＭＰＯ関連障害の治療および抑制のための、ＭＰＯレベルおよび／または活性の調節方法の使用も包含する。
【０１１２】
従って、さらなる態様では、本開示は、哺乳動物対象におけるＭＰＯ関連状態を治療、防止、回復、抑制するまたはその発症を遅らせる方法を提供する。より具体的には、いくつかの実施形態では、本発明の方法は、（ａ）対象の少なくとも１種の未分化ＢＭ細胞中のＭＰＯの発現および／または活性を調節できる、またはそれに適合された、少なくとも１種の遺伝子編集化合物、および（ｂ）ＭＰＯの調節された発現および／または活性を示す未分化ＢＭ細胞集団、の少なくとも１種の治療有効量を上記対象に投与するステップを含み得る。本明細書で記載の方法は、ＭＰＯ関連状態を罹患している対象を（ａ）、（ｂ）またはこれらの任意の組み合わせで治療することを包含することを理解されたい。またさらに、いくつかのその態様では、本発明は、哺乳動物対象のＭＰＯ関連状態の治療、防止、回復、抑制または発症の遅延化方法で使用するための、（ａ）前記対象の少なくとも１種の未分化ＢＭ細胞中のＭＰＯの発現および／または活性を調節できる、またはそれに適合された少なくとも１種の遺伝子編集化合物、および（ｂ）ＭＰＯの調節された発現および／または活性を示す未分化ＢＭ細胞集団、の少なくとも１種の治療有効量を提供することを理解されたい。
【０１１３】
本明細書に記載のように、ＢＭ細胞集団および特に、未分化ＢＭ細胞集団は、いくつかの実施形態では、未分化未成熟ＢＭ細胞、特に、ＭＰＯの発現および／または活性が調節されるＨＳＣを指し得る。いくつかの実施形態では、細胞が本発明の方法により使用される場合、未分化ＢＭ細胞集団は、ＭＰＯ遺伝子が調節されるように、細胞中のＭＰＯの発現および／または活性を調節できる少なくとも１種の遺伝子編集化合物で形質導入または遺伝子導入される。
【０１１４】
未分化ＢＭ細胞集団は、それを必要としている対象に投与され、異常なＭＰＯ発現および／または活性を有する対象、特にＭＰＯ関連状態を示す対象中のＢＭ細胞を置換する。いくつかの実施形態では、治療される対象のＢＭ細胞集団の置換は、調節されたＭＰＯの発現、レベル、および／または活性を示すＢＭ細胞による対象の細胞集団の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％あるいは１００％の対象の細胞集団の置換を含み得ることを理解されたい。理解されるように、未分化ＢＭ細胞集団の投与は、本明細書のいくつかの実施形態では、骨髄移植と呼ばれる。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、ＢＭ細胞集団および特に未分化ＢＭ細胞集団は、自己源から、あるいは同種間源から取得され得る。いくつかの実施形態では、骨髄移植は、自己骨髄移植であり得る。用語の自己骨髄移植は、ＢＭ細胞が対象から取り出され、回収されまたは取得され、その後同じ対象に移植される移植を指す。本開示との関係で、自己骨髄移植は、いくつかの実施形態では、次の：（ａ）対象からＢＭ細胞を回収または取得するステップ；（ｂ）ＢＭ細胞を少なくとも１種の遺伝子編集化合物と、特に、ＭＰＯ発現および／または活性の操作に好適な条件下で接触させるステップ；および（ｃ）ＢＭ細胞を同じ対象に移植する（または再導入する）ステップ、を含み得る。いくつかの実施形態では、上記ステップ（ａ）は、ＨＳＣおよび／または前駆細胞の単離を続けて行い得る。いくつかの代替実施形態では、上記ステップ（ｂ）は、ＨＳＣおよび／または前駆細胞の単離を続けて行い得る。いくつかの特定の実施形態では、自己骨髄移植は、次の：（ａ）対象からＢＭ細胞を取り出す、回収するまたは取得するステップ；（ｂ）ＢＭ細胞からＨＳＣおよび／または前駆細胞などの未分化細胞を単離するステップ；（ｃ）未分化細胞を少なくとも１種の遺伝子編集化合物と接触させるステップ；および（ｄ）未分化細胞を同じ対象に移植するステップ、を含み得る。いくつかの実施形態では、骨髄移植は、同種骨髄移植であり得る。用語の同種骨髄移植は、ＢＭ細胞が対象（本明細書においては、ドナーと称する）から取り出され、その後異なる対象（本明細書においては、レシピエントと称する）に移植される移植を指す。
【０１１６】
本開示との関係で、同種骨髄移植は、次の：（ａ）ドナーからＢＭ細胞を取り出す、回収するまたは取得するステップ；（ｂ）任意選択で、ＢＭ細胞を本発明の少なくとも１種の遺伝子編集化合物と接触させるステップ；および（ｃ）ＢＭ細胞をレシピエントに移植するステップ、を含み得る。いくつかの実施形態では、上記ステップ（ａ）は、ＨＳＣおよび／または前駆細胞の単離を続けて行い得る。いくつかの代替実施形態では、上記ステップ（ｂ）は、ＨＳＣおよび／または前駆細胞の単離を続けて行い得る。いくつかの特定の実施形態では、同種骨髄移植は、次の：（ａ）ドナー対象からＢＭ細胞を取り出す、回収するまたは取得するステップ；（ｂ）ＢＭ細胞からＨＳＣおよび／または前駆細胞などの未分化細胞を単離するステップ；（ｃ）未分化細胞を少なくとも１種の遺伝子編集化合物と、ＭＰＯ操作を可能とする好適条件下で接触させるステップ；および（ｄ）未分化細胞をレシピエントに移植するステップ、を含み得る。
【０１１７】
自己骨髄移植および同種骨髄移植は、同じまたは異なる対象への移植ステップの前に、ＢＭ細胞または未分化ＢＭ細胞を貯蔵するステップを含み得ることに留意されたい。さらに別の代替ステップでは、ＢＭ細胞は、移植の前にさらに消費され得る。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、自己骨髄移植ならびに同種骨髄移植は、移植された対象の元（非調節）のＭＰＯ発現および／または活性と比べて、調節されたＭＰＯ発現および／または活性を特徴とすることに留意されたい。換言すれば、移植されるＢＭ細胞または移植される未分化ＢＭ細胞は、移植プロセスにより置換されるべきＢＭ細胞または未分化ＢＭと比べて、異なる、調節されたＭＰＯ発現および／または活性を有することを特徴とする。
【０１１９】
本開示による同種骨髄移植は、調節されたＭＰＯ発現および／または活性を示すドナーから取得されたＢＭ細胞の移植を包含する。いくつかの実施形態では、本発明の方法、組成物、キットおよびシステムにより同種骨髄移植に使用されるＢＭ細胞は、細胞中のＭＰＯの発現および／または活性を調節するために適合される少なくとも１種の遺伝子編集剤とＢＭ細胞とを接触させることにより得られる調節されたＭＰＯ発現および／または活性を有する未分化ＢＭ細胞であり得る。従って、いくつかの特定の実施形態では、同種骨髄移植の方法は、ドナーからＢＭ細胞を取り出す、回収するまたは取得するステップ、その細胞（任意選択で、未分化細胞、特に、ＨＳＣおよび／または前駆細胞）を少なくとも１種の遺伝子編集化合物と接触させて、調節されたＢＭ細胞を産生するステップを含み得る。いくつかの実施形態では、ＭＰＯ調節ＢＭ細胞は、レシピエント対象に移植され得る。またいくつかの代替実施形態では、同種骨髄移植用のＢＭ細胞または同種移植片は、異常なＭＰＯ発現および／または活性（調節された発現および／または活性）を示す対象から取得されたＢＭ細胞集団であり得る。これらのＢＭ細胞は、移植の前にさらに選別して、未分化ＢＭ細胞を単離できる。いくつかの特定の実施形態では、同種骨髄移植のための本発明の方法により使用される骨髄細胞は、抑制されたまたは除去されたＭＰＯ発現および／または活性を示す対象から取得されたＢＭ細胞集団であり得る。これは、移植された対象中のＭＰＯ発現および／または活性の低減または抑制をもたらす。またいくつかの代替実施形態では、同種骨髄移植用の骨髄細胞は、検出可能なまたは高められたＭＰＯ発現および／または活性を示す対象から取得されたＢＭ細胞集団であり得る。これは、移植された対象のＭＰＯ発現および／または活性の増大または上昇をもたらす。
【０１２０】
本発明は、特に、調節されたＭＰＯ発現および／または活性を可能にするように任意選択で操作される、遺伝的に同一である同じ種の対象の同系未分化ＢＭ細胞の使用をさらに包含することを理解されたい。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、同種骨髄移植用のＢＭ細胞は、異常なＭＰＯ発現および／または活性（調節された発現および／または活性）を示す対象から取得されたＢＭ細胞集団（任意選択で、未分化ＢＭ細胞）であり得、および調節されたＢＭ細胞を産生するために細胞（任意選択で、未分化細胞：ＨＳＣおよび／または前駆細胞）を少なくとも１種の遺伝子編集化合物と接触させることによりさらに調節され得る。
【０１２２】
これに関連して、ＢＭ細胞は、レシピエントと組織型適合性を示す必要があることに留意されたい。いくつかの実施形態では、本明細書で記載の方法は、投与の前に、特に、ＢＭ細胞の移植の前に、レシピエント対象に対する、化学療法剤および／または照射の適用、および／または抗体および／またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）結合アブレーションの使用など、またはこれらのいずれかの組み合わせをさらに含み得る。またいくつかのさらなる実施形態では、ドナーからＢＭ細胞を取得するために、方法は、本明細書で後に考察するように、細胞の固定化ステップをさらに含み得る。
【０１２３】
本開示との関連では、取得または移植は、当該技術分野における任意の既知の方法、例えば、骨髄生検および／または骨髄吸引により実施できる。骨髄吸引は、局所または全身麻酔下で実施できる。加えて、ＢＭ移植は、注入などの、当該技術分野で既知の任意の方法により実施できる。
【０１２４】
またさらに、骨髄注射の場合、標的細胞はＨＳＰＣであり得、全身注射の場合、標的細胞は、可動化ＨＳＰＣであり得る（患者が固定化の前処理に供される場合）。骨髄注射ならびに全身注射（例えば、静脈内ＩＶ）の両方は、ＭＰＯ発現および／または活性を操作する本発明の遺伝子編集化合物によるＢＭ細胞のインビボ操作および標的化に特に好適であり得ることに留意されたい。
【０１２５】
またいくつかのさらなる実施形態では、本発明の方法により治療される患者は、免疫アブレーションを含み得る前処理に供され得る。癌、自己免疫疾患などのいくつかのタイプの病状の治療は多くの場合、患者自身の免疫系を除去するために、例えば、骨髄細胞移植片の移植の前に、免疫アブレーションを伴う。免疫アブレーションは、全身照射または高用量化学療法、抗体の使用、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）結合アブレーションなど、またはこれらの任意の組み合わせにより実現できる。従って、用語の「免疫アブレーション（ｉｍｍｕｎｅ  ａｂｌａｔｉｏｎ）」または「免疫アブレーション（ｉｍｍｕｎｏａｂｌａｔｉｏｎ）」は、医学的目的のための患者の免疫耐性の破壊を指す。またさらに、いくつかの実施形態では、本発明の方法により治療される患者は、ステロイドによる前処理に供され得る。いくつかの実施形態では、このような処理は、ステロイド投与であり得、免疫応答を抑制するためにも使用される。薬理的（超生理学的）投与において、グルココルチコイドなどのステロイドが、種々のアレルギー疾患、炎症疾患、および自己免疫疾患を抑制するために使用される。
【０１２６】
本明細書で上記したように、本発明の方法、組成物およびキットで使用される遺伝子編集化合物は、処理される対象の未分化ＢＭ細胞中のＭＰＯの発現および／または発現をインビボで、あるいは自己または同種ＢＭ細胞中のＭＰＯの発現および／または発現をエクスビボで調節し得る。本発明の方法では、少なくとも１種の遺伝子編集化合物は、少なくとも１種のＰＥＮ、上記ＰＥＮをコードする配列を含む任意の核酸分子または少なくとも１種のＰＥＮまたはこのようなＰＥＮをコードする核酸配列を含む任意のキット、組成物またはビークルを含み得る。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、少なくとも１種のＰＥＮは、少なくとも１種のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含み得る。このような実施形態では、本発明の方法は、（ａ）少なくとも１種のＣａｓタンパク質を含む少なくとも１種のポリペプチド、または上記Ｃａｓタンパク質をコードする任意の核酸配列、および（ｂ）ＭＰＯ遺伝子内のプロトスペーサーを標的とする少なくとも１種のｇＲＮＡを含む少なくとも１種の核酸配列、または上記ｇＲＮＡをコードする任意の核酸配列、の有効量を上記対象に投与するステップを含み得る。本発明の方法は、（ａ）および（ｂ）の少なくとも１種を含むキット、組成物またはビークルを使用し得る。
【０１２８】
本明細書に記載のように、いくつかの実施形態では、本発明の方法に適用可能なＣａｓタンパク質は、クラス１およびクラス２のＣＲＩＳＰＲ結合システムの少なくとも１つのメンバーであり得る。いくつかの特定の実施形態では、本発明の方法で使用され得るＣａｓタンパク質は、クラス２のＣＲＩＳＰＲ結合システムＩＩ型のメンバーであり得る。またいくつかのさらなる特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９またはその任意のフラグメント、変異体、バリアンまたは誘導体であり得る。本発明の他の態様に関連して本明細書で記載される全ての遺伝子編集システムは、本態様にも適用可能であることを理解されたい。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの要素として、少なくとも１種のｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、ならびに配列番号９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、および１０６のヒトＭＰＯ遺伝子、またはそれらの任意のフラグメントのいずれか１つにより表される核酸配列を含む少なくとも１種のプロトスペーサーを標的にし得る。このようなｃｒＲＮＡは、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号４２、配列番号４７、配列番号５０、配列番号５５、配列番号６０、配列番号６３、配列番号６６、配列番号７１、配列番号７４、配列番号７７、配列番号８０、配列番号８５、配列番号８８および配列番号９１のいずれか１つにより表される核酸配列を含む。またいくつかのさらなる特定の実施形態では、本発明の方法で使用されるｇＲＮＡは、マウスＭＰＯ遺伝子を標的にし得る。いくつかの特定の実施形態では、このようなｇＲＮＡは、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４、またはこれらの任意のフラグメントにより表される核酸配列を含むマウスＭＰＯ内のプロトスペーサーを標的にする。またいくつかのさらなる特定の実施形態では、本発明の方法により提供されるｇＲＮＡは、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４により表される核酸配列を含み得る。
【０１３０】
本発明により提供される治療方法は、ＭＰＯ関連状態に罹患している対象の治療に特に適用可能であり得る。本明細書で使用される場合、ＭＰＯ関連状態または疾患という用語は、ＭＰＯの増大、欠損または低減した異常な発現および／または活性に関連する状態を含む。換言すれば、本明細書記載の方法は、欠損または低減したＭＰＯ発現に関連する状態および／または活性あるいは、高められたＭＰＯ発現および／または活性に関連する状態の治療において効果的である。理解されるように、ＭＰＯ発現および／または活性を説明する相対的用語の「増大した」、「欠損した」、「減少した」または「低減した」は、特定の状態下で決定される発現／活性の対照または正常またはベースラインレベルに対比するものである。
【０１３１】
交換可能に使用される用語の「関連する（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）」、「関連する（ｌｉｎｋｅｄ）」および「関連する（ｒｅｌａｔｅｄ）」は、本明細書で病態に言及する場合、少なくとの１つの共有する因果関係が偶発的な回数より多く同時に存在する、または少なくとも１種の疾患、障害状態または病態が第２の疾患、障害、状態または病態の原因である場合の疾患、状態、または任意の病態を意味することを理解されたい。いくつかの特定の実施形態では、本発明の方法は、増大した（上昇した）ＭＰＯ発現および／または活性に関連するＭＰＯ関連状態に適用可能であり得る。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、通常の（上昇していないおよび低減されない）レベルのＭＰＯを示し得る対象に適用可能であり得るが、しかし、ＭＰＯの量の低減は、ＭＰＯレベルに関連すると限らない上記対象のいずれかの状態または障害に有益な効果を示し得ることを理解されたい。従って、いくつかの実施形態では、本発明の方法によるＭＰＯの調節は、ＭＰＯ発現および／または活性の抑制または低減をもたらし、それにより増大したまたは上昇したＭＰＯ発現に関連する状態を回復し得る。いくつかの実施形態では、本発明の方法により治療可能なＭＰＯ関連状態は、免疫関連障害、神経変性疾患、呼吸障害、増殖性障害、血管障害またはこれらの任意の組み合わせの少なくとも１つであり得る。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、ＭＰＯ関連状態は、免疫関連障害であり得る。本明細書で使用される場合、「免疫関連障害」または「免疫介在障害」は、より具体的には、免疫系の抑制または活性化を介して、対象の免疫系に関連する任意の状態、または対象の、適応または自然免疫応答などの免疫応答の特定の成分の分解を低減することにより治療、防止または回復できる任意の状態を包含する。免疫関連障害は、感染性状態（例えば、ウィルス感染症）、代謝障害、自己免疫疾患、血管炎、炎症および増殖性障害、特に癌を含み得る。いくつかの実施形態では、免疫関連状態は、自己免疫疾患であり得る。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、自己免疫疾患の治療において適用可能である。自己免疫疾患は、正常な体部位に対する異常な免疫応答から生ずる状態である。自己免疫疾患の例としては、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス（ループス）、１型糖尿病、乾癬／乾癬性関節炎、クローン病および潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、および血管炎が挙げられる。
【０１３３】
いくつかの特定の実施形態では、本発明の方法は、特に、多発性硬化症（ＭＳ）、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連障害、および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などの自己免疫疾患に適用可能である。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＭＳおよび任意の関連状態またはそれに関連する症状に適用可能である。本明細書で定義される用語の「多発性硬化症」（ＭＳ）は、ミエリン、乏突起膠細胞および軸索を破壊する中枢神経系の慢性炎症性神経変性疾患である。ＭＳは、若年成人の間で最もよくある神経疾患であり、通常、２０〜４０才の間に現れる。ＭＳの症状は、片方の眼の失明、複視などの視力障害の出現から筋力低下疲労、疼痛、痺れ、硬直および震え、協調運動障害および振戦、眩暈、不明瞭発語、嚥下困難、および情緒障害などの他の症状まで変化する。疾患が進行するのに伴い、患者は歩行運動能力を失い、認知機能低下、日々の活動の自己管理の喪失が生じ、重度障害および依存性になり得る。
【０１３５】
免疫系要素が脳細胞、特にグリアおよび／または神経を攻撃し、軸索の保護ミエリン鞘を損傷するので、ＭＳ症状は進行する。これらの攻撃が起こる領域は、脳を経由するメッセージの伝達を破壊する病変と呼ばれる。多発性硬化症は、疾患進行により特徴付けられる４つのタイプに分類される：（１）再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）、これは、再発（症状の悪化の発作）に続く、寛解（安定化および起こり得る回復の期間;ある寛解では、完全回復があり、他の寛解では部分的な回復があるかまたは回復がない）を特徴とする。ＲＲＭＳの症状は、軽度〜重度で多様であり得、再発は数日間または数ヶ月間続き得る。ＭＳの８０％を超える人が再発―寛解の循環から始まる；（２）二次性進行型ＭＳ（ＳＰＭＳ）は再発寛解型ＭＳの人で発症する。ＳＰＭＳでは、再発が起こるが、かなりの期間にわたる寛解（安定化）はなく、身体障害は継続的に悪化する；（３）一次進行型ＭＳ（ＰＰＭＳ）、これは、その発症からゆっくりと、着実に進行し、ＭＳ症例の２０％未満を占める。寛解の期間はなく、症状は通常、強度が低下しない：および（４）進行再発型ＭＳ（ＰＲＭＳ）。このタイプのＭＳでは、ヒトは、症状の着実な悪化および寛解期間中の発作を経験する。本発明の方法は、ＭＳ患者のいずれかのタイプ、段階または状態に適用可能であることを理解されたい。本発明の方法を用いる治療は、いくつかの実施形態では、いずれかの症状の回復および／または発作間の寛解期間の延長をもたらし得る。
【０１３６】
またいくつかのさらなる実施形態では、本発明の方法は、ＳＬＥおよび任意の関連状態またはそれに関連する症状に適用可能である。より具体的には、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、単にループスとしても知られる、自己免疫疾患である。症状は、人ごとに変化し、軽度から重度まであり得る。共通の症状としては、有痛性および、発熱、胸部痛、脱毛、口腔内潰瘍、リンパ節腫脹、疲労感、および顔面上の最もよくある赤い発疹が挙げられる。疾患は、紅斑と呼ばれる疾病の期間を特徴とし、寛解の期間中は、ほとんど症状がない。
【０１３７】
ＳＬＥの原因は明確ではないが、しかし、環境要因と共に遺伝に関連すると考えられている。円板状エリテマトーデス、新生児ループスおよび亜急性皮膚エリテマトーデスを含む多数の他のタイプのエリテマトーデスが存在する。本発明は、それぞれのこれらのタイプを包含することを理解されたい。
【０１３８】
またさらに、いくつかの実施形態では、本発明の方法は、他の自己免疫疾患に関連し得る。例えば、ＡＮＣＡ関連障害の治療に関連し得る。本明細書で使用される場合、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）は、主にＭＰＯまたはＥＧＰＡを標的とし、従って、ＭＰＯ−ＡＮＣＡとしても知られる核周辺抗好中球細胞質抗体（Ｐ−ＡＮＣＡ）；主にプロテイナーゼ３（ＰＲ３）タンパク質を標的にし、従って、ＰＲ３−ＡＮＣＡとしても知られ、主に、ＧＰＡに関連する細胞質抗好中球細胞質抗体（ｃ−ＡＮＣＡ）；およびｘ−ＡＮＣＡとしても知られ、主にＩｇＧタイプの好中球顆粒球（白血球の最もよくあるタイプ）および単球の細胞質中の抗原に対する自己抗体のグループである非定型ＡＮＣＡ（ａ−ＡＮＣＡ）を含む。ｐ−ＡＮＣＡはまた、いくつかの病状と関連し、これは、かなり特異的であるが、潰瘍性大腸炎；原発性硬化性胆管炎の大部分；巣状壊死性および半月体形成性糸球体腎炎；および関節リウマチに対し感受性でない。
【０１３９】
またさらに、これらのＡＮＣＡは、膜結合型ＰＲ３／ＭＰＯ結合により好中球および単球を活性化するのみでなく、内皮と相互作用して、接着因子の発現を高める。いくつかの研究は、血管炎寛解中の疾患再発の予測のＡＮＣＡ力価を調査したが、ＡＮＣＡ力価と、ＡＡＶの活性期での永久的透析要件との間の関連は十分に立証されなかった。アジアの国々では、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ関連血管炎は、ＰＲ３−ＡＮＣＡ関連血管炎よりも一般的である。それらは、多数の自己免疫疾患の血液検査として検出されるが、特に所謂ＡＮＣＡ関連血管炎（ＡＡＶ）である全身性血管炎に関連し、これは、多発血管炎を伴う肉芽腫症、顕微鏡的多発血管炎、一次性微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎（腎限局性顕微鏡的多発血管炎の１つのタイプ）、多発血管炎を伴うエオシン好性肉芽腫症（以前には、チャーグ・ストラウス症候群として知られる）および薬剤誘発性血管炎を含む。ＰＲ３誘導ｃ−ＡＮＣＡは、多発血管炎を伴う肉芽腫症の８０〜９０％に、顕微鏡的多発血管炎の２０〜４０％に、微量免疫型半月体形成性糸球体腎炎の２０〜４０％に、および多発血管炎を伴うエオシン好性肉芽腫症の３５％に存在する。ｃ−ＡＮＣＡ（非定型）は、嚢胞性線維症（標的抗原としてＢＰＩを有する）の８０％に、ならびに炎症性腸疾患、原発性硬化性胆管炎および関節リウマチ（複数の抗原性標的に対する抗体を有する）にも存在する。ＭＰＯ特異性を有するｐ−ＡＮＣＡは、顕微鏡的多発血管炎の５０％に、一次性微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎の５０％に、および多発血管炎を伴うエオシン好性肉芽腫症の３５％に認められる。他の抗原に対する特異性を有するｐ−ＡＮＣＡは、炎症性腸疾患、関節リウマチ、薬剤誘発性血管炎、自己免疫性肝疾患、薬剤誘発性症候群および寄生虫感染に関連する。非定型ＡＮＣＡは、薬剤誘発性全身性血管炎、炎症性腸疾患および関節リウマチに関連する。
【０１４０】
より具体的には、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎（ＡＶＶ）は、小血管の炎症およびネクローシスを特徴とする全身性疾患であり、複数臓器損傷および機能不全を生ずる。腎臓は、最も高頻度に冒される臓器であり、微量免疫型分節性壊死性半月体形成性糸球体腎炎をもたらし、これはＡＮＣＡ関連糸球体腎炎（ＡＡＧＮ）と呼ばれる。
【０１４１】
臨床的および実験的証拠は、ＡＮＣＡがヒトの微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎（ＮＣＧＮ）および全身性血管炎小血管を引き起こすことを示す。
【０１４２】
いくつかの特定の実施形態では、本発明により開示された本発明の方法、ならびに組成物、細胞およびキットは、Ｐ−ＡＮＣＡ関連障害に適用可能である。
【０１４３】
より具体的には、抗好中球細胞質抗体の主要な標的抗原の１つは、ＭＰＯである。ＭＰＯ−ＡＮＣＡは、単一エピトープを標的にしないが、むしろ、主に重鎖のカルボキシ末端中の少数のＭＰＯ領域を標的にする。従って、ＭＰＯの発現、レベル、および／または活性を除去することにより、本発明の方法、組成物、細胞およびキットは、ＭＰＯ中の自己抗体標的化エピトープのばらつきに対処する。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＡＮＣＡ関連血管炎であるＰ−ＡＮＣＡ関連障害に適用可能である。ＡＡＶは、臨床的特徴に応じて、４つのカテゴリー：顕微鏡的多発血管炎（ＭＰＡ）、多発血管炎を伴う肉芽腫症（ＧＰＡ）、エオシン好性ＧＰＡ（ＥＧＰＡ）および腎限局性血管炎（ＲＬＶ）に分類される。臓器病変は、ＡＡＶの種々のカテゴリーに多くの変化を生じ、臨床症状は特異性に欠ける。
【０１４５】
集団レベルでは、微量免疫型ＧＮの疫学および結果についてほとんど知られていない。ＰＩＣＧは、急速進行性糸球体腎炎（ＲＰＧＮ）の症例の最大８０％であり、米国では、その発生率は、１年当たり、百万人当たり７〜１０症例であると推定される。微量免疫型ＧＮ（ＰＩＣＧ）は、黒人に比べて、白人で好発し、男性と女性ではほぼ等しく現れる。
【０１４６】
治療しないと、微量免疫型ＧＮ−ＰＩＣＧは、８０％の１年死亡率である。しかし、積極的な免疫抑制を行うと、５年生存は最大７５％である。加齢、透析依存性、および肺出血は全て、生存の確率を悪化させる。例えば、不可逆性透析依存性腎不全は、５年生存率を３５％に低下させる。腎臓転帰の観点から、患者の約２５％は末期腎疾患（ＥＳＲＤ）とも呼ばれる腎不全に進行し、これは、慢性腎疾患の末期である。
【０１４７】
従って、いくつかの実施形態では、ＡＮＣＡ関連または関連障害は、限定されないが、ＡＮＣＡ関連血管炎（ＡＡＶ）、ＡＮＣＡ関連糸球体腎炎（ＡＡＧＮ）、半月体形成性糸球体腎炎（ＮＣＧＮ）、および急速進行性糸球体腎炎（ＲＰＧＮ）を含む。さらに、本発明の方法、組成物、細胞およびキットは、いくつかの実施形態では、本明細書で開示のＰ−ＡＮＣＡ関連障害のいずれかの治療に適用可能である。
【０１４８】
またいくつかのさらなる実施形態では、本発明の方法は、炎症性疾患などの免疫関連障害の治療に適用可能である。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、炎症性疾患の治療に適用可能である。用語の「炎症性疾患」または「炎症性関連状態」は、炎症性パラメーター、例えば、ＩＦＮガンマおよびＩＬ−２などの誘導、およびＩＬ−６レベルの低減の少なくとも１つの低減から恩恵を受けるいずれかの疾患または病理学的状態を指す。状態は、炎症に（主に）起因し得る、または炎症は別の生理学的原因により引き起こされる疾患の症状の１つであり得る。いくつかの実施形態では、本発明の方法に適用可能な炎症性疾患は、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ（ＲＡ）および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）のいずれか１つであり得る。実施例により開示されるように、本発明は、ＭＰＯ欠損５ＸＦＡＤが、ＭＰＯ発現５ＸＦＡＤマウスに比べて、優れた行動成績を示し、従って、制限された認知機能低下を反映していることを示す。本発明はまた、星状膠細胞活性化、ＡＰＯＥ発現レベルの低減、およびいくつかの炎症促進性サイトカインのレベルの低減に反映される、これらのマウスの脳でのより低い炎症反応も示す。
【０１４９】
従って、特定の実施形態では、本発明は、必要としている対象において認知機能低下を抑制または低減するための、方法、組成物、細胞およびキットを提供する。またいくつかのさらなる実施形態では、本発明は、それを必要としている対象、特に、ＡＤを罹患している対象に対し、脳の炎症反応の抑制または低減を実施するための方法、組成物、細胞およびキットを提供する。またさらに、いくつかの実施形態では、本発明は、必要としている対象において、星状膠細胞活性化のレベルの抑制または低減を実施するための方法、組成物、細胞およびキットを提供する。またいくつかのさらなる実施形態では、本発明は、必要としている対象において、ＡＰＯＥ発現の抑制または低減を実施するための、方法、組成物、細胞およびキットを提供する。またさらに、いくつかの実施形態では、本発明は、必要としている対象において、いくつかの炎症促進性サイトカインのレベルの抑制または低減を実施するための方法、組成物、細胞およびキットを提供する。このようなサイトカインは、いくつかの実施形態では、ＩＬ−１ベータ、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ２およびＴＮＦアルファの少なくとも１種である。いくつかの実施形態では、このような対象は、神経変性疾患を罹患している対象であり得る。またいくつかのさらに特定の実施形態では、このような神経変性疾患はＡＤであり得る。
【０１５０】
またさらに、好中球機能の中核を成し、神経変性でのその役割が長期にわたり疑われてきた、ＭＰＯは、ＡＤの好中球損傷の顕著なメディエーターとして存在する。実際に、ＭＰＯのＡＤとのいくつかの関連性が過去に報告されてきた。ヒトＭＰＯのプロモーター中の４６３Ｇ／Ａ座位の、ＭＰＯ発現の増大に関連する多型は、晩発性ＡＤを発症するリスクを上昇させた。さらに、ＭＰＯとＡＰＯＥ  ε４アレル（晩発性ＡＤの最もよくある遺伝的リスク因子）の間の相互作用が特定された。しかし、調査後、４６３Ｇ／Ａ多型のＡＤとの関係性に関する矛盾する調査結果を示した。Ｇｒｅｅｎと共同研究者は、その酸化生成物の増大した発生率に伴う、ＡＤ患者の皮質における上昇したＭＰＯ免疫反応性および活性を報告した。しかし、その調査でのＭＰＯ発現は、神経に帰された。Ｒｅｙｎｏｌｄｓおよび共同研究者は、アミロイドβプラークの周りのＣＤ６８発現細胞中にＭＰＯ発現を検出し、従って、それをミクログリア／マクロファージに帰した。最近になって、ＭＰＯ発現は、ＡＤ患者の脳中でアミロイドβプラークと関連して報告された。興味深いことに、これらの脳中ではＭＰＯ  ｍＲＮＡ発現は検出されず、観察されたＭＰＯの起源は、末梢の骨髄特質によるものであることを示唆する。これらの観察は、ＡＤ病因におけるＭＰＯの関与に対する有力な証拠を提供するが、発明者らの知る限りでは、本発明は、ＡＤの実験モデルでのＭＰＯ欠損の効果の最初の調査である。本発明は、造血枯渇および再増殖法を利用して、ＣＮＳ由来ＭＰＯに影響を与えることなく、末梢骨髄性細胞中のＭＰＯの欠損を樹立することにより、主に、好中球由来の末梢ＭＰＯに注力する。酸化ストレスおよび血管損傷は、ＡＤの病因の重要なイベントであると見なされる。これらは、血液脳関門機能不全、低減した脳血流、およびＣＮＳ内の実質的酸化性および炎症性の損傷に繋がる可能性がある。神経変性における好中球機能に関する最近の示唆は、過剰活性化および老化、皮質毛細血管での高められた接着、脳実質中の血管外漏出および脱顆粒ならびに重度の炎症反応に繋がるＮＥＴの形成を含む。本発明により開示されるデータはまた、血液学的ＭＰＯ欠損は炎症反応を制限することを示す。加えて、ＭＰＯ枯渇後の認知機能低下に対する重度の保護は、ＡＤにおける病理の重要な部分と見なされる好中球由来の酸化的損傷の低減を説明する。これに関連して、本明細書で開示の結果は、好中球枯渇後のＡＤマウスモデルの機能性保護を示すＺｅｎａｒｏらおよびＣｒｕｚ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚらによる最近の報告と一致する（Ｚｅｎａｒｏ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ−ｌｉｋｅ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｄｅｃｌｉｎｅ  ｖｉａ  ＬＦＡ−１  ｉｎｔｅｇｒｉｎ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２１，８８０−８８６（２０１５）、およびＣｒｕｚ  Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｉｎ  ｂｒａｉｎ  ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｆｌｏｗ  ａｎｄ  ｉｍｐａｉｒｓ  ｍｅｍｏｒｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ．Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２０１９）．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９３−０１８−０３２９−４）。
【０１５１】
ＭＰＯ機能は、心臓血管および腎疾患との関連で内皮機能障害および血管損傷に結びつけられている。活性化好中球により分泌される正に帯電したＭＰＯは、アニオン性糖衣とのその相互作用を介して、内皮および内皮下腔に沿って蓄積する。結合ＭＰＯ由来の酸化剤は、糖衣の厚さを減らし、内皮に損傷を与えることが示され、一方でＭＰＯは好中球動員および血管外移動を促進することも示された。これは、増幅されたＭＰＯ応答、およびインサイツ好中球蓄積を生じ得る。興味深いことに、発明者らは、ＭＰＯ欠損５ＸＦＡＤマウスの海馬試料中のＶＣＡＭ１発現の減少を見出し、内皮の炎症の増大が示唆された。しかし、ＭＰＯ欠損の毛細血管の内皮中の好中球動員に対する影響および毛細血管停止および脳血流、ならびに好中球遊走に対するその影響はまだ決定されていない。
【０１５２】
本発明により提示される結果は、好中球由来ＭＰＯが、５ＸＦＡＤマウスでのＡＤ様病因において中心的な役割を果たすことを明確に示す。これらの結果は、ＭＰＯ抑制をＡＤ治療のための新規の治療標的として提案する。
【０１５３】
従って、またいくつかのさらなる実施形態では、ＭＰＯ関連状態は、神経変性疾患であり得る。いくつかの特定の実施形態では、本発明の方法は、神経変性疾患の治療に適用可能である。いくつかの実施形態では、神経変性疾患は、炎症性および／または血管性原因をさらに含み得る。
【０１５４】
神経変性は、神経の構造体または機能の進行性消失のための包括的用語であり、シナプス機能不全およびニューロンの死を含む。アルツハイマー病およびパーキンソン病を含む多くの神経変性疾患は、神経変性プロセスに関連する。本明細書でまた適用可能な神経変性の他の例としては、フリードライヒ運動失調症、レビー小体病、脊髄性筋萎縮症、多発性硬化症、前頭側頭型認知症、大脳皮質基底核変性症、進行性核上麻痺、多系統萎縮症、遺伝性痙性対麻痺、アミロイドーシス、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、およびシャルコー・マリー・トゥース病が挙げられる。正常な老化過程は、進行性神経変性、特に加齢関連認知機能低下（ＡＣＤ）を含み、軽度認知障害（ＭＣＩ）はまた、本発明において適用可能であることを見落すべきではない。またいくつかのさらなる実施形態では、本発明の方法、キット、組成物および細胞は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、またはその任意の関連状態に適用可能である。またいくつかのさらなる実施形態では、本発明の方法、キット、組成物および細胞は、Ｂｅｃｋｅｒ筋ジストロフィーに適用可能である。またいくつかのさらなる実施形態では、本発明の方法、キット、組成物および細胞は、結節性硬化症（ＴＳＣ）に適用可能である。
【０１５５】
さらなる特定の実施形態では、本発明の方法は、アルツハイマー病またはパーキンソン病などの神経変性疾患の治療に適用可能である。
【０１５６】
本明細書で使用される場合、アルツハイマー病（ＡＤ）は通常、診断後３〜９年内に死亡に至る、記憶および他の認知ドメインの悪化を伴う障害を指す。アルツハイマー病の主要なリスク因子は年齢である。疾患の発生率は、６５才以降、５年ごとに２倍になる。疾患を有するヒトの最大５％が早期発症型ＡＤ（若年発症としても知られる）であり、４０〜５０才で発症する。アルツハイマー病では多くの分子損傷が検出されているが、データから現れる重要な主題は、加齢脳中で誤って折り畳まれたタンパク質の蓄積が酸化性および炎症性損傷をもたらし、これが、次に、エネルギー不足およびシナプス機能不全をもたらすことである。より具体的には、Ａβの蓄積が、アルツハイマー病の患者の脳から単離された構造的に損傷されたミトコンドリア中で示された。
【０１５７】
アルツハイマー病は、主に、シナプスの障害である。海馬シナプスは、軽度認知障害（限定された認知障害で、認知症に先行することが多い）の患者で減少し始める。この患者では、残っているシナプスの特性は、シナプスサイズの代償的な増大を示す。軽度アルツハイマー病では、シナプス前の小胞タンパク質シナプトフィジンの約２５％の減少がある。進行性疾患では、シナプスは、ニューロンに比較して不釣合いに失われ、この損失は、認知症と良好に相関する。加齢それ自体は、シナプスの減少を引き起こし、これは特に、海馬の歯状領域に影響する。
【０１５８】
アルツハイマー病を開始および推進し得るイベントまたは経路の既知の単一線形連鎖は存在しない。ＡＤは進行性疾患であり、認知症症状は長年にわたり徐々に悪化する。その初期段階では、記憶喪失は軽度であるが、後期ＡＤでは、個人は、会話を続ける能力および彼らの環境に応答する能力を失う。ＡＤの人は、それらの症状が他人に気付かれるようになった後に平均８年間生存するが、生存は、年齢および他の健康状態に応じて、２０年までの範囲である。
【０１５９】
ＡＤの変化は通常、学習および記憶に影響を与える脳の一部で始まるため、ＡＤの最もよくある初期症状は、新しく学習した情報の想起の困難である。ＡＤが脳全体に進行すると、それは、見当識障害；気分および行動の変化；イベント、時間および場所に関する混乱の深化；家族、友人および職業介護人に対する濡れ衣；より深刻な記憶喪失および行動変化；および会話、嚥下および歩行の障害、を含む重い症状に次第に進行する。
【０１６０】
国立神経障害およびコミュニケーション障害および脳卒中（ＮＩＮＣＤＳ）研究所ならびにアルツハイマー病および関連障害協会（ＡＤＲＤＡ、現在は、アルツハイマー病協会として知られる）は、最も一般的に使用されているＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡアルツハイマー診断基準を１９８４年に規定し、２００７年に広範に更新した。これらの基準は、認知機能障害の存在、および認知症症候群の疑いが、可能なまたは確度の高いＡＤの臨床診断のための神経心理学テストにより確認されることを必要とする。脳組織の顕微鏡検査を含む病理組織学的確認が確定診断のために必要である。良好な統計的信頼性および妥当性が診断基準と確定的病理組織学的確認の間で示された。次の８つの認知ドメインが、ＡＤで最もよく傷害される：記憶、言語、知覚能力、注意力、構成能力、見当識、問題解決能力および機能的能力。これらのドメインは、米国精神医学会により発表された精神障害の診断と統計のためのマニュアル（ＤＳＭ−ＩＶ−ＴＲ）に記載のＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡアルツハイマー病基準と等価である。認知症症状の悪化を一時的に遅らせるための対症療法以外に、ＡＤは現在の治療法がなく、現在の治療薬はＡＤの進行を止めることができない。本発明の方法ならびに本発明により提供される組成物、細胞およびキット、使用およびシステムは、本明細書で考察したＭＰＯ関連状態のいずれかのＡＤに関連する任意のステージ、状態または症状に適用可能であることを理解されたい。いくつかの実施形態では、本発明の方法、組成物、細胞およびキットは、ＡＤ患者における疾患の任意のステージ、タイプ、症状または程度に適用可能であることをさらに理解されたい。
【０１６１】
図５および６により示されるように、ＭＰＯ−ＫＯ  ＢＭ細胞のＡＤ動物（５ＸＦＡＤ）への養子移入は、空間学習および記憶、連合学習ならびに不安／リスク評価行動を明確に改善した。従って、いくつかの実施形態では、本発明の方法、組成物、細胞およびキットは、ＡＤ患者における疾患の空間学習の改善および強化に適用可能である。またいくつかのさらなる実施形態では、本発明の方法、組成物、細胞およびキットは、ＡＤ患者における疾患の記憶の改善および強化に適用可能である。またさらに、いくつかの実施形態では、本発明の方法、組成物、細胞およびキットは、ＡＤ患者における連合学習の改善および強化に適用可能である。いくつかのさらなる実施形態では、本発明の方法、組成物、細胞およびキットは、ＡＤ患者における不安／リスク評価行動の改善および強化に適用可能である。
【０１６２】
上で示したように、ＡＤは、タンパク質ミスフォールディング（例えば、Ａβペプチド）を伴う状態とみなされる。従って、またいくつかのさらなる実施形態では、本発明の方法、組成物、システム、キットおよび使用は、タンパク質ミスフォールディングに関連するいずれかの状態、例えば、シヌクレイン病およびタウオパチーに適用可能である。より具体的には、「αシヌクレイン病態障害」または「シヌクレイノパチー」は、ニューロンおよびグリアの選択的集団の細胞質中のαシヌクレインタンパク質の繊維状凝集体を特徴とする一群の神経変性疾患の命名に使用される。単量体、オリゴマー中間体を含むαシヌクレイン凝集体、または原繊維型は、パーキンソン病（ＰＤ）および他の多系統萎縮症（ＭＳＡ）およびレビー小体型認知症（ＤＬＢ）などのαシヌクレイノパチーの病因の重要なステップに関与すると考えられている。従って、いくつかの実施形態では、本発明の方法、組成物、システム、キットおよび使用は、本明細書で開示のいずれかのシヌクレイノパチーに適用可能である。またさらに、いくつかの実施形態では、本発明の方法、組成物、システム、キットおよび使用は、タウタンパク質の蓄積に関連するいずれかの状態に適用可能である。より具体的には、本明細書で使用される場合、「タウタンパク質」は、神経原線維濃縮体を指し、これは、錐体ニューロン中の繊維状封入体であり、タウオパチーと呼ばれるアルツハイマー病および他の神経変性疾患に特徴的なものである。それらの形成の機序の解明は、将来の治療法の標的をもたらし得る。対形成らせん状細線維としての高リン酸化タウタンパク質の錐体ニューロン中の蓄積は、アルツハイマー病の主要な特徴である。過剰リン酸化に加え、架橋などのタウタンパク質の他の改変は、タンパク分解に対するそれらの不溶性および耐性を含む対形成らせん状細線維の特徴に寄与する可能性がある。これらの神経原線維濃縮体は、高リン酸化および凝集型の微小管関連タンパク質タウからなる。
【０１６３】
実施例２で示すように、未分化ＭＰＯ  ＫＯ  ＢＭ細胞の養子移入は、ＡＤにおける認知機能障害の明確な抑制をもたらし、認知機能および連合学習を改善した。従って、いくつかの実施形態では、本発明の方法、組成物、システム、キットおよび使用は、認知機能低下または障害に関連するいずれかの状態に適用可能である。いくつかの実施形態では、本発明は、ＭＣＩに適用可能である。本明細書で使用される場合、「加齢に伴う軽度認知障害（ＭＣＩ）」は、認知変化を生じさせる状態である。主に記憶に影響を与えるＭＣＩは「健忘型ＭＣＩ」として分類され得、この場合、対象は、最近のイベント、約束または会話または最近のイベントに関係する情報の記憶の障害を経験する。記憶以外の思考能力に影響を与えるＭＣＩは、「非健忘型ＭＣＩ」として知られる。非健忘型ＭＣＩにより影響を受け得る思考能力は、正しい判断、複雑な作業を完結するために必要なステップの時間または順序を判断する能力、または視覚認知をおこなう能力を含む。
【０１６４】
通常の加齢は、多くの認知作業での種々の記憶能力の低下に関連し、現象は、加齢関連記憶障害（ＡＭＩ）、加齢に伴う記憶障害（ＡＡＭＩ）または加齢に伴う認知機能低下（ＡＣＤ）として知られる。イベントまたは事実の新しい記憶および作業記憶をコードする能力は、横断調査および縦断調査の両方で低下を示す。エピソード記憶、意味記憶、短期記憶および刺激に対する加齢の影響を比較する調査は、エピソード記憶が通常の加齢で特に障害され、いくつかのタイプの短期記憶も障害されることを明らかにした。障害は、最近処理した情報をリフレッシュする能力で認められる障害に関連し得る。通常、言語能力、いくつかの計算能力および一般知識などのいくつかの精神機能では加齢に伴う低下はほとんど存在しないが、他の精神能力は、中年以降、あるいはより早期から低下する。後者は、記憶、実行機能、処理速度および推論の側面を含む。従って、いくつかの実施形態では、本発明は、任意の認知機能低下、特に、年齢、特に、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５およびそれを超える年齢に関連する認知機能低下の治療のための方法および組成物を提供することを理解されたい。
【０１６５】
またいくつかのさらなる実施形態では、本発明の方法、組成物、システム、キットおよび使用は、ＤＬＢに適用可能である。本明細書で使用される場合、「レビー小体型認知症（ＤＬＢ）」は、比較的共通の原因による認知症であり、認知症症例の最大３０％を占めると推定され、７５才を超える人の最大５％が罹患する。病理学的には、これは、脳中のレビー小体を含むαシヌクレインの存在により定義されるが、それらの分布は、新皮質、大脳辺縁系および脳幹を冒す。臨床的には、ＤＬＢは、顕著な幻視および妄想を伴う進行性認知症、および動作緩慢および筋固縮を伴うが通常、振戦は最小限であるパーキンソニズムを特徴とする。顕著な認知変動は、この状態の共通の特徴であり、数時間の間にほぼ正常状態に戻り得る錯乱、過度の傾眠、および滅裂性言語の発症がある。
【０１６６】
いくつかのさらなる実施形態では、本発明の方法、組成物、システム、キットおよび使用は、ＰＤに適用可能である。本明細書で使用される場合、「パーキンソン病（ＰＤ）」は、中脳ドーパミンニューロンの変性および生存ニューロン中のレビー小体含有α−シヌクレインの蓄積から生じる神経変性疾患である。ＰＤの診断は、他の病原学的状態の非存在下での基本的な運動性特徴に基づく。これらの運動性特徴は、古典的な三徴候：動作緩慢、安静時の丸薬をまるめるような運動（ｒｅｓｔｉｎｇ  ｐｉｌｌ−ｒｏｌｌｉｎｇ  ｔｒｅｍｏｒ）、および筋固縮（通常は、仮面様顔貌、発声不全、小字症および姿勢調節障害と共に）を含む。ＰＤの非運動性特徴は、その診断に先行することさえあり、前駆期または前運動期ＰＤを構成する。これらの前運動期特徴は、嗅覚、便秘、気分および睡眠に関連する障害を含み、それらは、ＰＤの臨床診断後にさらに顕著になり得る。認知障害および認知症はまた、通常、ＰＤで発症し、診断から１０年間までに、ほぼ５０％を冒す。しかし、αシヌクレイノパチーのいくらかの個体では、顕著な認知障害がパーキンソニズム運動症状の発症に先行し、これらの症例は、臨床的にレビー小体型認知症の診断に分類される。これらの２つの状態の間には、臨床的および病理学的の両方で、明確に大きなオーバーラップが存在するが、現時点では、臨床的区別は、運動症状と認知症の発症の間の時間間隔に基づき、ＰＤの診断には、レビー小体認知症（ＤＬＢ）とは対照的に、最小で１年間の間隔が必要である。またさらに、いくつかの実施形態では、本発明の方法、組成物、システム、キットおよび使用は、ＭＳＡに適用可能である。「多系統萎縮症（ＭＳＡ）」は、黒質線条体および乏突起膠細胞中の原繊維のαシヌクレインを含むグリア細胞質封入体の形態をとるオリーブ橋小脳構造体中の細胞消失および神経膠症を含む神経病理学である。それは、種々の組み合わせのパーキンソニズムおよび小脳機能不全に加えて自律神経障害と共に存在し、その症状が主に小脳（ＭＳＡ−Ｃ）であるか、または主にパーキンソニズム（ＭＳＡ−Ｐ）であるとして臨床的に分類される。
【０１６７】
またさらに、上で示したように、神経変性疾患は、明確に血管および虚血状態に関連する。従って、いくつかの実施形態では、本発明の方法、組成物、システム、キットおよび使用は、いずれかの血管および／または虚血状態に適用可能である。より具体的には、脳虚血（または大脳虚血、脳血管虚血）は、脳の代謝需要を満たすには不十分な血流しかない状態である。これは、不十分な酸素供給または低酸素脳症をもたらし、従って、脳組織の死または脳梗塞／虚血性脳卒中をもたらす。それは、くも膜下出血および脳内出血と共に、脳卒中のサブタイプである。虚血は、脳代謝の変化、代謝率の低減、およびエネルギー危機をもたらす。次の２つのタイプの虚血が存在する：局所虚血、これは脳の特定の領域に限定される；および全虚血、これは脳組織の広い領域を包含する。
【０１６８】
主症状は、視覚、身体の動き、および発話の障害を伴う。脳虚血の原因は、鎌状赤血球貧血から先天性心疾患まで多様である。脳虚血の症状は、意識喪失、失明、協調に関する障害、および身体の脱力を含み得る。脳虚血から生じ得る他の影響は、脳卒中、心肺停止、および不可逆性脳損傷である。
【０１６９】
虚血性脳卒中では、脳の一部への血液供給路が低下し、その領域の脳組織の機能不全をもたらす。虚血性脳卒中に対し、次の４つの主要な原因が存在する：血栓症（局所的血餅形成による血管の閉塞）、塞栓症（身体の他の場所からの塞栓に起因する閉塞）、全身性低潅流（例えば、ショックによる血液供給路の全般的減少）、および脳静脈洞血栓症。
【０１７０】
急性虚血性脳卒中について種々の分類システムが存在する。オックスフォードコミュニティー脳卒中プロジェクト分類（ＯＣＳＰ、ＢａｍｆｏｒｄまたはＯｘｆｏｒｄ分類としてもしられる）は、主に、初期症状に依存し、症状の程度を基準にして、脳卒中発症は、脳全前部循環梗塞（ＴＡＣＩ）、脳部分前部循環梗塞（ＰＡＣＩ）、ラクナ梗塞（ＬＡＣＩ）または脳後部循環梗塞（ＰＯＣＩ）として分類される。これらの４つの要素は、脳卒中の程度、影響を受けた脳の面積、根底にある原因、および予後を予測する。ＴＯＡＳＴ（急性脳卒中治療におけるＯｒｇ  １０１７２の試験）分類は、臨床症状ならびにさらに検査結果を基準にし；脳卒中を、（１）大動脈のアテローム性動脈硬化症による血栓症または塞栓症、（２）心臓に起源を持つ塞栓症、（３）小血管の完全閉塞、（４）他の確定された原因、（５）未確定原因（２つの可能な原因、原因未特定、または不完全な検査）に起因するとして分類する。
【０１７１】
小さい慢性脳内出血（＜５〜１０ｍｍ直径）は、脳微小出血と命名される（ＣＭＨ；微小出血（ｍｉｃｒｏｂｌｅｅｄ）、多巣性シグナル損失病変（ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  ｓｉｇｎａｌ  ｌｏｓｓ  ｌｅｓｉｏｎ）、点状出血とも呼ばれる）。ＣＭＨは、小動脈、細動脈、および／または毛細管の破裂に起因する（ヒトＣＭＨでは、破裂血管の直径は、２００μｍ未満と推定され、細動脈および毛細管レベルで多くの出血が発生する）。ＣＭＨは、局在型ヘモシデリン沈着に対応する小さい楕円形低信号病変に見え、これは、Ｔ２＊強調グラジエントリコールエコー（Ｔ２＊−ＧＲＥ）ＭＲＩシーケンスを用いて最も良く検出できる。
【０１７２】
年齢は、ＣＭＨの最も重要な独立リスク因子である。ＣＭＨの発生率は、若い対象では低く、年齢と共に次第に増加する。ＣＭＨほとんどの調査は、高齢患者では、ＣＭＨの発生率は２４％〜５６％であることを報告している。高血圧は、ＣＭＨの別の大きな独立リスク因子である。脳アミロイド血管症およびアルツハイマー病（ＡＤ）はまた、ＣＭＨの重要なリスク因子を構成する。増殖糖尿病網膜症の１型糖尿病患者では、ＣＭＨの増大した発生率が報告され、全身性細小血管症が脳および網膜の両方の毛細血管傷害の一因であり得ることを示唆している。ＣＭＨはまた、皮質下梗塞と白質脳症を伴う常染色体優性脳動脈症（ＣＡＤＡＳＩＬ）に罹患している個体の半数近くでも見つかっており、これは、ノッチ３遺伝子の変異に起因する成人発症遺伝性脳卒中障害である。
【０１７３】
またさらに、いくつかの実施形態では、本発明の方法、組成物、システム、キットおよび使用は、ｃＳＶＤに適用可能である。脳小血管病（ｃＳＶＤ）は、小動脈、細動脈、毛細管、および小静脈を含む脳の小血管を冒す異なる病理過程に対して使用される用語である。ｃＳＶＤは、ラクナ性脳梗塞および深層出血もしくは皮質下出血において重要な役割を有する。認知機能低下および認知症に加えて、歩行障害もまた、ｃＳＶＤと高頻度に関連する。約１／５の症候性脳卒中がラクナ脳卒中症候群であり、これは、より過酷な種類の脳卒中である場合が多く、すなわち、自然発生的実質脳出血（ＰＢＨ）である。これらはｃＳＶＤに関連する。しかし、散発性ｃＳＶＤはＰＢＨの主要な原因ではあるが、根底にある毛細血管病態のトポグラフィーは、それぞれの症例で異なる。ｃＳＶＤは、２つの主要形態に分類される。第１は、アミロイド型であり、これには、慢性変性疾患である脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）が含まれる。第２の形態は、ｃＳＶＤの非アミロイド型として特徴付けられ、高齢、高血圧、糖尿病、および多くの他の因子などの共通の血管リスク因子に関連することが多い。
【０１７４】
脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）は、コンゴーレッド親和性血管障害としても知られ、血管障害の１形態であり、中枢神経系の血管壁中にアミロイド沈着物が生ずる。コンゴーレッド親和性という用語は、コンゴーレッドと呼ばれる特別な染色剤の適用後に脳組織の顕微鏡検査により異常なアミロイド凝集体の存在が示され得るため、使用される。アミロイド物質は、脳中でのみ見つかり、従って、この疾患は、他の形態のアミロイドーシスとは関連しない。
【０１７５】
ＣＡＡは、ｃＳＶＤの共通のアミロイド型である。ＣＡＡの発生率は、ほとんどが、高齢と関連する。それは、皮質壁および軟髄膜小動脈中のβアミロイドの進行性沈着に起因し、これは、血管機能不全および脳実質傷害をもたらす。βアミロイドの沈着は、血管閉塞および破裂に関与すると考えられる。ＣＡＡ関連脈管障害は、フィブリノイド壊死、平滑筋細胞の減少、壁肥厚化、毛細血管瘤形成、および結果として生じる生成物沈着を伴う血管周囲血液分解などの特徴を含む。アミロイド沈着の特定の場所およびアレル差異に基づいて、少なくとも２つのＣＡＡの病理学的サブタイプが特定された：皮質毛細血管中のアミロイドを特徴とするＣＡＡ  １型、およびアミロイド沈着が軟髄膜および皮質動脈に限定され、毛細管中にはないＣＡＡ  ２型。後頭葉中の低減した皮質灰色物質および脳底動脈中の低減したフラックスが、アミロイドーシスオランダ型の症候性遺伝性脳出血（ＨＣＨＷＡ−Ｄ）の患者で確認された。ＨＣＨＷＡ−Ｄの患者における皮質菲薄化の外観は、血管アミロイドが皮質萎縮に対する独立した寄与因子であることを示す。ＣＡＡ関連皮質萎縮は、血管機能不全により促進され、アルツハイマー病の非存在下でさえも観察された。さらに、アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）遺伝子多型は、２つのサブタイプのＣＡＡに関連する。ＡＰＯＥ  ε４アレルおよびＡＰＯＥ  ε２は、合理的に、１型および２型疾患にそれぞれ関連する。
【０１７６】
従って、本発明の方法、組成物、システム、キットおよび使用は、いずれかの虚血状態、特に、本明細書で開示のいずれかの状態に適用可能であることを理解されたい。
【０１７７】
またさらに、好中球は、病原体を貪食し死滅させる、および宿主を感染から保護する炎症応答を開始する自然免疫細胞として長期にわたり知られてきた。好中球細胞外ＤＮＡトラップ（ＮＥＴ）の形成は、炎症および免疫中の好中球に対する新しい役割を明確にしたが、癌生物学および血栓症を含む病的状態、ならびに関連状態（例えば、トルソー症候群）においても、同様である。好中球クロマチンの放出は、腫瘍増殖、血管新生、転移および免疫抑制を含む腫瘍成長の異なるステップに影響を与えることが示された。上で示したように、ＭＰＯは、好中球におけるＮＥＴ形成に関与する。従って、調節により、特にＭＰＯ発現、レベルおよび／または活性を抑制することにより、本発明は、対象のＮＥＴ形成を調節および抑制のための戦略を提供し、それにより、癌および関連障害の治療のための手法を提供する。従って、いくつかの実施形態では、高められたＭＰＯ発現または活性を伴い得るＭＰＯ関連状態は、増殖性障害であり得る。従って、いくつかの特定の実施形態では、本発明の方法は、増殖性障害の治療に適用可能である。本発明のいくつかの実施形態での増殖性障害は、癌および／または転移などの任意の関連病態であり得る。本明細書で使用される場合、「癌」、「腫瘍」および「悪性腫瘍」は全て、組織または臓器の過形成に等しく関連する。組織がリンパまたは免疫系の一部である場合、悪性細胞は、循環細胞の非固形腫瘍を含み得る。他の組織または臓器の悪性腫瘍は、固形腫瘍を産生し得る。一般に、本発明の方法および組成物は、非固形および固形腫瘍の治療において使用され得る。本発明で意図される悪性腫瘍は、癌腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫および肉腫のいずれか１種であり得る。
【０１７８】
本明細書で使用される場合、癌腫は、形質転換された上皮細胞からなる侵襲的悪性腫瘍を指す。あるいは、それは、未知の組織発生の形質転換細胞から構成される悪性腫瘍を指すが、これは、上皮細胞に関連する特定の分子または、サイトケラチンまたは細胞間架橋の生成などの組織学的特徴を有する。
【０１７９】
本明細書で使用される場合、黒色腫は、メラノサイトの悪性腫瘍である。メラノサイトは、暗色顔料のメラニンを生成する細胞であり、皮膚の色に関与する。それらは、主に、皮膚で発生するが、腸および眼を含む身体の他の部分でも認められる。黒色腫は、メラノサイトを含む身体の任意の部分で発生し得る。
【０１８０】
白血病は、血液形成臓器の進行性悪性疾患を指し、通常、血液および骨髄中の白血球およびそれらの前駆物質の歪んだ増殖および発達を特徴とする。白血病は通常、（１）疾患の期間と特性−急性または慢性；（２）関与する細胞の型；骨髄（骨髄性）、リンパ性（リンパ向性）、または単球性；および（３）異常細胞の数の増加または非増加−白血病性または無白血病性（亜白血病性）、を基準にして臨床的に分類される。
【０１８１】
肉腫は、形質転換結合組織細胞から生じる癌である。これらの細胞は、胚性中胚葉、または中間層が起源であり、これは、骨、軟骨、および脂肪組織を形成する。これは、上皮中に起源を持つ癌腫と対照的である。上皮は、身体全体の構造体の表面を覆い、乳癌、結腸癌、および膵臓癌の起源である。本明細書で言及される骨髄腫は、プラズマ細胞の癌であり、通常、抗体の産生に関与する白血球の１つの型である。異常細胞の集まりは、骨中に蓄積して、そこで骨病変を生じ、および骨髄中に蓄積して、そこで正常な血液細胞の産生を妨害する。ほとんどの骨髄腫の症例はまた、腎臓障害を起こし正常抗体の産生を妨害し免疫不全をもたらし得る異常抗体のパラプロテインの産生を特徴とする。多くの場合、高カルシウム血症（高カルシウムレベル）が起こる。リンパ腫は、免疫系のリンパ細胞の癌である。通常、リンパ腫は、リンパ系細胞の固形腫瘍として存在する。これらの悪性細胞は、多くの場合、リンパ節を起源に持ち、ノードの拡大として現れる（腫瘍）。それは、他の臓器にも影響を与え、その場合、節外性リンパ腫と呼ばれる。リンパ腫の非限定的例としては、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫およびバーキットリンパ腫が挙げられる。
【０１８２】
本発明により治療または抑制され得る悪性腫瘍のさらなる非限定的例としては、非固形癌、例えば、全てのタイプの白血病、例えば、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、マスト細胞白血病、毛様細胞性白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫および多発性骨髄腫などの造血悪性腫瘍が挙げられる。本発明により治療または抑制され得る固形腫瘍の非限定的例としては、唇および口腔、咽頭、喉頭、副鼻腔、大唾液腺、甲状腺、食道、胃、小腸、結腸、結腸直腸、肛門管、肝臓、胆嚢、肝外胆管、ファーター膨大部、膵臓外分泌部、肺、胸膜中皮腫、骨、軟部肉腫、癌腫、および皮膚の悪性黒色腫、乳房、外陰、膣、子宮頸部、子宮体、卵巣、卵管、妊娠性絨毛性腫瘍、陰茎、前立腺、精巣、腎臓、腎盂、尿管、膀胱、尿道、眼瞼の癌腫、結膜の癌腫、結膜の悪性黒色腫、ぶどう膜の悪性黒色腫、網膜芽細胞腫、涙腺の癌腫、眼窩の肉腫、脳、脊髄、脈管構造、血管肉腫、およびカポジ肉腫の腫瘍が挙げられる。いくつかの実施形態では、癌は固形腫瘍である。いくつかの実施形態では、固形腫瘍は乳癌である。
【０１８３】
ＭＰＯは、アテローム性動脈硬化症および心臓血管疾患、腎疾患、肺炎症、関節リウマチ、皮膚炎症、神経疾患、および代謝症候群を含む複数の炎症性疾患の病因である。より具体的には、糸球体のおよび尿細管間質性疾患において、多形核−および単球−由来活性酸素種は、タンパク質、脂質、および核酸の酸化修飾の一因であり得る。一部には、活性酸素種により誘発されるプロセスは、アテローム性動脈硬化症の発生に繋がるイベントに匹敵する。従って、いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物は、アテローム性動脈硬化症、ならびに心臓血管疾患、例えば、内毒血症、心筋梗塞／虚血、血管機能不全および心房細動に適用可能である。
【０１８４】
またさらに、塩化物イオンの存在下で過酸化水素から次亜塩素酸／次亜塩素酸塩（ＨＯＣｌ／ＯＣｌ−）を生成するＭＰＯの能力は、ユニークであり、この酵素を特徴的付ける活性である。ＭＰＯ−過酸化水素−塩化物系は、種々の塩素化タンパク質および脂質付加物をもたらし、これらは、次に、腎臓の異なるコンパートメント中の細胞の機能不全を引き起こし得る。従って、いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物は、種々の腎疾患に適用可能であり、これは、慢性腎疾患、虚血／再潅流傷害、糸球体腎炎およびループス腎炎を含み得る。
【０１８５】
またいくつかのさらなる実施形態では、本発明の方法、組成物、細胞およびキットは、少なくとも１種の呼吸状態に適用可能である。本明細書で使用される場合、呼吸状態または疾患は、気道の一部である臓器および組織に影響を与える病的状態を包含する。これらの状態は、気管、気管支、細気管支、肺胞、胸膜、胸膜空洞、および呼吸神経および筋肉を含む気道の状態を含む。呼吸器疾患は、軽度および自然治癒するものから、命に関わる疾患にまで及び、慢性および急性状態を含む。慢性呼吸器疾患（ＣＲＤ）は、肺の気道および他の構造体の疾患である。それらは、高炎症細胞動員（好中球）および／または有害な感染サイクルを特徴とする。呼吸器疾患は、関与する臓器または組織により、関連徴候および症状のタイプとパターンにより、または疾患に原因により、などの多くの異なる方法により分類され得る。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、本発明により包含される呼吸状態としては、限定されないが、肺動脈性肺高血圧症（ＰＡＨ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）および慢性肉芽腫性疾患（ＧＣＤ）の少なくとも１種が挙げられる。より具体的には、Ｋｌｉｎｋｅら（Ｋｌｉｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１８）ＪＣＩ  Ｉｎｓｉｇｈｔ；３（１１）：ｅ９７５３０）は、ＭＰＯと機能不全肺性血管機能との間の機構的関連を示し、肺動脈高血圧症がＭＰＯ抑制により回復され得ることを示唆した。具体的には、彼らは、ＭＰＯが肺動脈高血圧症の患者中で上昇し、それが続いて生じる有害転帰と相関することを示した。加えて、彼らは、高ＭＰＯレベル（＞５８３ｐｍｏｌ／Ｌ）の患者は、低ＭＰＯレベルの患者に比べて、６５週の中央値に比較して生存が減少した（Ｐ＝０．０２３）。さらに、欠損ＭＰＯマウス（ＭＰＯ−／−）は、野生型マウスに比べて、低酸素時の右心室圧の増大が少なかった。Ｒｈｏキナーゼ経路−血管収縮および構造的血管再構築に関与する重要な細胞内シグナル伝達経路−の低酸素誘導活性化はＭＰＯ−／−マウスで弱められた。従って、この研究は、ＭＰＯ、Ｒｈｏキナーゼの活性化と、有害な肺血管機能との間の明確な機構的関連を示す。従って、いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＰＡＨを罹患している対象のＭＰＯレベルの低減に適用可能である。またいくつかのさらなる実施形態では、本発明の方法は、ＰＡＨを罹患している対象の治療に適用可能である。
【０１８７】
本明細書で使用される場合、肺動脈性肺高血圧症（ＰＡＨ）は、治癒のない、肺動脈の再構築および狭小化を特徴とする進行性疾患であり、これは、右心室圧の上昇、心不全、および死亡に繋がる。白血球由来ヘム酵素ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）は、血管壁の体液性機能不全の中枢メディエーターとして明確に確証されているので、ＰＡＨの潜在的メディエーターとなる。
【０１８８】
またさらに、ミエロペルオキシダーゼは、効力の高い抗菌およびアテローム生成促進特性を有する、好中球の一次顆粒中に貯蔵された、強力な酸化剤である。      ミエロペルオキシダーゼは、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の病因に結びつけられてきた。より具体的には、増大した血清ミエロペルオキシダーゼレベルは、ＣＯＰＤ患者の急速肺機能低下および不十分な心臓血管の転帰と関連し、これは、ＣＯＰＤ進行の病因におけるミエロペルオキシダーゼの新たに現れた役割を裏付ける。
【０１８９】
またさらに、ミエロペルオキシダーゼは、好中球顆粒中の主要なペルオキシダーゼ酵素であり、嚢胞性線維症の炎症性肺損傷の原因に結びつけられている。遊離ミエロペルオキシダーゼは、嚢胞性線維症肺液中に存在し、次亜塩素酸を生成する。従って、いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物は、嚢胞性線維症、ＣＯＰＤ、敗血症誘導性傷害、インフルエンザウィルス誘導性傷害、アスベスト誘発傷害および急性肺炎症を含む種々の肺炎症状態に適用可能である。
【０１９０】
本発明に起用可能な他の炎症性疾患は、関節リウマチおよび皮膚炎症を含む。必要としている対象中のＭＰＯ発現、レベル、および活性の調節のための方法および組成物の提供において、本発明は、減少したまたは低減したＭＰＯ発現および／または活性に関連する障害、または代わりにもしくは追加して、他の因子に関連するが、ＭＰＯ発現および／または活性の調節により回復し得るまたは影響を及ぼし得る障害または状態の治療の提供をさらに包含する。いくつかの実施形態では、このような状態または障害は、本明細書においては、ＭＰＯと間接的に関連すると称される。本発明の方法を用いて、ＭＰＯレベルを調節および高めることにより、本明細書は、例えば、ＲＯＳ欠損および／またはＭＰＯ欠損に関連する状態の治療のための方法をさらに提供する。従って、いくつかの実施形態では、本発明の方法が適用可能なＭＰＯ関連状態は、低減または欠損ＲＯＳレベルに関連し得る。他の因子、例えば、ＲＯＳに関連する障害の非限定例は、慢性肉芽腫性疾患（ＧＣＤ）であり、これは、活性酸素種（ＲＯＳ）産生貪食細胞ＮＡＤＰＨオキシダーゼＮＯＸ２中の遺伝子欠損として定義される。このような症例では、ＭＰＯのレベルを高めることが、ＲＯＳの上昇をもたらし、それにより、ＲＯＳ関連障害を治療するためのツールを提供し得る。
【０１９１】
従って、いくつかの特定の実施形態では、本発明は、ＲＯＳ障害に関連し得る慢性肉芽腫性疾患（ＣＧＤ）にさらに適用可能である。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＭＰＯ欠損関連状態またはＭＰＯ枯渇により直接的または間接的に引き起こされるいずれかの状態に適用可能である。
【０１９２】
本発明は、ＭＰＯに関連する障害、例えば、ＡＤ、ＭＳ、Ｐ−ＡＮＣＡ関連障害およびＰＡＨ、または本発明により開示のいずれかの障害を、対象の未分化ＢＭ細胞中のＭＰＯレベルを除去するまたは低減させることにより治療するための治療方法を提供することを理解されたい。上で開示のように、本発明は、特に、対象の未分化ＢＭ細胞中のＭＰＯを標的化し、それにより、上記対象の任意の組織および臓器中のＭＰＯレベルの操作に繋げることにより、対象の免疫系を操作する治療方法、組成物、キットおよび細胞を提供する。この態様で示されるように、このような調節は、治療適用のために、特に、ＡＤ、ＭＳ、Ｐ−ＡＮＣＡ関連障害およびＰＡＨなどのＭＰＯ関連状態の治療のために、本発明により効果的に使用される。従って、いくつかの特定の非限定的実施形態では、本発明は、調節されたＭＰＯのレベル、発現および／または活性を示すために、対象の、特に対象のＢＭ細胞の免疫系を操作することにより、ＭＰＯ関連状態、例えば、ＡＤ、ＭＳ、Ｐ−ＡＮＣＡ関連障害およびＰＡＨを罹患している対象を治療するための方法、組成物およびキットを提供することを理解されたい。より具体的には、本発明の治療方法は、操作された免疫系（自己または同種または同系源の）の提供に基づいている。あるいは、対象の免疫系は、本明細書で提供される遺伝子編集システムを用いてインビボで操作され得（例えば、遺伝子編集システムの化合物を対象への投与）、それにより、上記対象のＢＭ細胞集団は調節されたＭＰＯレベル、発現および／または活性を示す。従って、本発明の治療方法、キットおよび組成物は、このような病態を治療するための効果的な治療戦略を提供する。またいくつかのさらなる特定の実施形態では、このような治療戦略は、ＭＰＯの調節されたレベル、発現、および／または活性を示すＢＭ細胞をＭＰＯ関連状態、例えば、ＭＳまたはＡＤを罹患している対象、いくつかの実施形態では、移植前に免疫アブレーションに供された対象、に移植することにより、実施され得る。ＭＰＯの調節された（例えば、低減されたまたは除去された）レベル、発現または活性を示すＢＭ細胞を移植することにより、移植された対象は、任意の組織および臓器中の調節されたＭＰＯの発現を示す。本発明により詳細に説明されるように、移植されるＢＭ細胞は、同じ対象から取得され、ＭＰＯのレベル、発現または活性を調節するために本発明の遺伝子編集システムを用いてエクスビボ操作された自己ＢＭ細胞であり得ることを理解されたい。例えば、いくつかの特定の実施形態では、対象から取得されるＢＭ細胞は、本発明の遺伝子編集システムにエクスビボで供され得る。これは、ＭＰＯレベル、発現および／または活性の除去および低減をもたらし得る。あるいは、調節されたＭＰＯレベル、発現および／または活性を示す（天然で、または本発明の遺伝子編集システムを適用することにより）同種または同系源の未分化ＢＭ細胞を使用し得る。ＭＰＯ欠損のこのような自己または同種ＢＭ細胞は、いくつかの実施形態では、免疫アブレーション化合物で処理され得る対象に再導入され、それによりこれらの操作され、移植されたＢＭ細胞が対象の免疫系の、少なくとも一部を置換する。この手順は、対象の任意の臓器または組織中のＭＰＯの枯渇を生ずる。上で示したように、ＭＰＯ枯渇ＢＭ細胞は、対象あるいは同種間または同系対象から取得され得る。より具体的には、これらの自己または同種ＢＭ細胞の対象への移植、または、換言すれば、対象の免疫系細胞の、調節されたＭＰＯレベル、発現および／または活性（例えば、除去されたまたは低減されたＭＰＯレベル、発現および／または活性）を示すＢＭ細胞による置換は、上記対象の全ての組織および臓器中のＭＰＯレベル、発現および／または活性の調節に繋がり、それにより、任意のＭＰＯ関連障害または状態、特に、ＡＤ、ＭＳ、Ｐ−ＡＮＣＡ関連障害およびＰＡＨ、または本発明により開示されるいずれかの障害または状態の治療のための新規および独創的な手法を提供する。
【０１９３】
上述のように、本発明は、上で指定した障害を治療する方法を提供する。本明細書で使用される場合、「治療」という用語は、疾患に関連する望ましくない症状を回復するために効果的な、治療量の本発明の組成物、特に、上述のＣＲＩＳＰＲシステムまたは調節されたＭＰＯ発現を示すＢＭ細胞を、このような症状をそれらが発症する前に予防するために、その疾患の進行を遅らせるために、症状の悪化を遅らせるために、寛解期間の開始を促進するために、その疾患の進行性慢性段階に生じる不可逆的損傷を遅らせるために、上記進行性段階の開始を遅らせるために、重症度を下げるまたはその疾患を治癒させるために、生存率を改善するまたはより急速に回復させるために、またはその疾患の発生または上記の２つ以上の組み合わせを防止するために、投与することを指す。治療は、免疫関連自己免疫性、神経変性、呼吸性、炎症性または増殖性状態が最初に発生するときに行われ得る、または例えば、１日２回以上、１〜７日毎、７〜１５日毎、１５〜３０日毎、毎月〜２ヶ月毎、２ヶ月毎〜６ヶ月毎の、あるいはそれを超える投与による、継続投与であり得る。
【０１９４】
上述のように、本発明は、対象中のＭＰＯの発現および／または活性に基づいて、疾患の何らかの症状の出現の前であっても、ＭＰＯ関連障害を防止するための予防的ツールをさらに提供する。用語の「予防」は、研究者、獣医師、医師または他の臨床医により、組織、システム、動物またはヒト中で防止されることが求められる、生物学的または医学的イベントの発生のリスク、特に、免疫関連、自己免疫性、神経変性、炎症性状態、を防止または減らすことを指し、および用語の「予防有効量」は、投与される有効成分の量がこの目的を達成することを意味することが意図されている。従って、特定の実施形態では、本発明の方法は、特に、予防に、すなわち、本明細書で考察される、免疫関連、自己免疫性、神経変性、炎症性または増殖性障害に関連する状態の防止に効果的である。従って、本発明の方法により治療される、または組成物を投与される対象は、上記神経変性、血管および／または炎症性疾患に関連する症状を経験する可能性は少ない。また、過去にそれらを既に経験した対象では、それらが再発生する可能性は同様に低い。
【０１９５】
本明細書において言及される場合、用語の「回復」は、症状の低減、および本発明による組成物および方法により生じた対象の状態の改善を指し、上記改善は、本明細書で記載の免疫関連、自己免疫性、神経変性、炎症性または増殖性障害に関連する病的プロセスの抑制、それらの大きさの有意な低下、または病気の対象の生理学的状態の改善の形で顕在化し得る。
【０１９６】
用語の「抑制」およびこの用語の全ての変形は、病的症状または病的プロセスの進行、前記病的プロセス症状またはそれに関連するプロセスの進行および増悪の制限または禁止を包含することが意図されている。
【０１９７】
用語の「除去」は、任意選択で、本明細書で記載の本発明の方法による、病的症状および、場合により、病因の実質的根絶または除去に関する。
【０１９８】
用語の「遅延」または「発症の遅延」およびその全ての変形は、本発明による治療の非存在下の場合よりも遅く出現させるための、免疫関連、自己免疫性、神経変性、炎症性または増殖性障害およびそれらの症状に関連する障害の進行および／または増悪の遅延化、それらの進行、さらなる増悪または発生の遅延化を包含することが意図されている。
【０１９９】
上述のように、治療または防止は、疾患の発生の防止または遅延化、症状の発生の防止または遅延化および／または進展するまたは進展が予測されるこのような症状の重症度の低減を含む。これらは、既存の症状の回復、追加の症状の防止、および根底にある症状の代謝性原因の回復または防止をさらに含む。本明細書において言及される場合、用語の「抑制」、「軽減」、「低減」または「減弱化」は、プロセス、特に、免疫関連、自己免疫性、神経変性、炎症性または増殖性障害のいずれかの、約１％〜９９．９％、特に、約１％〜約５％、約５％〜１０％、約１０％〜１５％、約１５％〜２０％、約２０％〜２５％、約２５％〜３０％、約３０％〜３５％、約３５％〜４０％、約４０％〜４５％、約４５％〜５０％、約５０％〜５５％、約５５％〜６０％、約６０％〜６５％、約６５％〜７０％、約７５％〜８０％、約８０％〜８５％約８５％〜９０％、約９０％〜９５％、約９５％〜９９％、または約９９％〜９９．９％、１００％のまたはそれを超えるいずれか１つの遅延、制限または縮小に関することを理解されたい。
【０２００】
本発明は、それを必要としている対象、または患者の治療に関する。「患者」または「必要としている対象」は、上記状態を罹患し得るおよび本明細書で記載の防止および予防組成物および方法が望ましい任意の生物を意味する。より具体的には、本発明の組成物、キットおよび方法は、哺乳動物の病態を防止することが意図されている。「哺乳動物対象」は、提案された療法が望ましい、ヒト、イヌおよびネコ対象、ウシ、サル、ウマおよびマウス対象およびげっ歯類などの家畜および非家畜哺乳動物を含む任意の哺乳動物を意味する。具体的には、非ヒト対象の場合には、本発明の方法は、注射、飲料水、餌、噴霧、経口洗浄液による投与、および対象の消化管への直接の投与により実施され得ることに留意されたい。
【０２０１】
任意の全身性のまたは局所投与法が、本発明において適用可能であることを理解されたい。本発明のＭＰＯ標的化ＣＲＩＳＰＲシステムもしくはその任意の組成物または本発明のＢＭ細胞集団もしくはその任意の組成物の投与経路としては、限定されないが、ポンプデバイスを用いて、または用いずに、頭蓋内または脊椎内針および／またはカテーテルを介する送達による、直接ＢＭ注射または移植、脳内、脳室内、側脳室内、くも膜下腔内、嚢内、脊髄内および／または脊椎周辺投与経路が挙げられる。いくつかの実施形態では、任意のさらなる投与方法、例えば、腹腔内（ＩＰ）、静脈内（ＩＶ）および皮内、皮下、経鼻、肺性、経口および筋肉内投与が適用可能であることを理解されたい。
【０２０２】
またさらなる態様では、本発明は、遺伝子編集化合物、特に、本発明により提供される、遊離形態で、治療される対象に直接投与される、少なくともＭＰＯ標的化ＣＲＩＳＰＲシステムを含む医薬組成物に関する。あるいは、いくつかのさらなる実施形態では、本発明は、ＢＭ細胞集団および特に、すべてが調節されたＭＰＯ発現および／または活性を有する、調節されたＭＰＯ発現および／または活性を示すＨＳＣなどの未分化ＢＭ細胞を含む医薬組成物を提供する。従って、いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、（ａ）それを必要としている対象の少なくとも１種の未分化ＢＭ細胞中のＭＰＯの発現および／または活性を調節できる、またはそれに適合された、少なくとも１種の遺伝子編集化合物、および（ｂ）ＭＰＯの調節された発現および／または活性を示す未分化ＢＭ細胞集団、の少なくとも１種の治療有効量を含み得る。本発明の組成物は、任意選択で、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、および／または賦形剤の少なくとも１種をさらに含み得ることに留意されたい。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本発明の態様に従って、本明細書で上記した遺伝子編集化合物の少なくとも１種の治療有効量を含み得る。より具体的には、いくつかの実施形態では、少なくとも１種の遺伝子編集化合物は、少なくとも１種のＰＥＮ、または上記ＰＥＮをコードする配列を含む任意の核酸分子または少なくとも１種のＰＥＮまたはこのようなＰＥＮをコードする任意の核酸分子を含む任意のキット、組成物またはビークルである。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、少なくとも１種のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む少なくとも１種のＰＥＮであり得る遺伝子編集化合物を含み得る。さらに特定の実施形態では、本発明の組成物中に含まれるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、（ａ）少なくとも１種のＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓタンパク質、または上記Ｃａｓタンパク質をコードする任意の核酸分子、および（ｂ）ＭＰＯ遺伝子内のプロトスペーサーを標的とする少なくとも１種のｇＲＮＡを含む少なくとも１種の核酸配列、または前記ｇＲＮＡをコードする任意の核酸配列、の少なくとも１種を含み得る。本発明の組成物は、（ａ）および（ｂ）の少なくとも１種を含む任意のキット、組成物またはビークルを含み得ることを理解されたい。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物のｃａｓタンパク質は、クラス１およびクラス２のＣＲＩＳＰＲ結合システムの少なくとも１つのメンバーであり得る。いくつかの特定の実施形態では、本発明の組成物中に含まれるＣａｓタンパク質は、クラス１およびクラス２、特に、ＩＩ型、Ｉ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型およびＶＩ型のいずれか１つのＣＲＩＳＰＲ結合システムの少なくとも１つのメンバーであり得る。さらに特定の実施形態では、このようなｃａｓタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ結合システムクラス２のＩＩ型のメンバーであり得る。またさらに、いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、Ｃａｓタンパク質として、Ｃａｓ９またはその任意のフラグメント、変異体、バリアンまたは誘導体を含み得る。
【０２０５】
従って、いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムを含み得る。このシステムは、いくつかの実施形態では、２つの要素：少なくとも１種のｇＲＮＡ、および少なくとも１種のＣａｓ９、またはその任意の変異体、フラグメントまたはバリアントを含み得る。両要素は、ｇＲＮＡおよびポリペプチド（ｃａｓ９）として、またはこれらの要素をコードする核酸配列として提供され得ることを理解されたい。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡをコードする核酸配列は、単独でまたはＣａｓ９ポリペプチドをコードする核酸配列も含む核酸分子で、特に単一核酸分子またはベクターで、提供され得る。またいくつかのさらなる実施形態では、本発明の組成物は、任意選択で、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、および／または賦形剤の少なくとも１種をさらに含み得る。またいくつかのさらなる実施形態では、本発明の組成物は、ＭＰＯ遺伝子内のプロトスペーサーを標的とする少なくとも１種のｇＲＮＡを含み得る。より具体的には、いくつかの実施形態では、本発明のｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡは、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、ならびに配列番号９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、および１０６のヒトＭＰＯ遺伝子、またはそれらの任意のフラグメントにより表される核酸配列を含むプロトスペーサーを標的にし得る。またいくつかの特定の実施形態では、本発明の組成物に有用なｃｒＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号４２、４７、ならびに配列番号５０、５５、６０、６３、６６、７１、７４、７７、８０、８５、８８および９１のいずれか１つにより表される核酸配列を含み得る。またいくつかのさらなる実施形態では、マウスＭＰＯ遺伝子中のプロトスペーサーを標的とするｇＲＮＡが使用され、このようなｇＲＮＡは、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４のいずれか１つにより表される核酸配列を含み得る。上述のように、いくつか代替実施形態では、本発明の医薬組成物は、治療有効量のＢＭ細胞集団、特に、未分化ＢＭ細胞集団を含み、ＭＰＯの調節された発現および／または活性を示し得る。本発明の組成物は、上述した遺伝子編集化合物と共に、細胞集団またはその任意の組み合わせを含むキットを含み得る。いくつかの実施形態では、組成物は、任意選択で、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、および／または賦形剤の少なくとも１種をさらに含み得る。
【０２０６】
本明細書で上記したように、調節されたＭＰＯの発現および／または活性を示す未分化ＢＭ細胞集団は、単離ＨＳＣおよび／または前駆細胞を含み得る。またさらに、いくつかの実施形態では、本発明の組成物の未分化ＢＭ細胞は、上記細胞中のＭＰＯの発現および／または活性を調節できる少なくとも１種の遺伝子編集化合物で形質導入または遺伝子導入されたＢＭ細胞集団であり得る。いくつかの実施形態では、未分化ＢＭ細胞集団は、自己源または同種間源由来であり得ることを理解されたい。同系源の細胞の使用も、本発明により包含される。
【０２０７】
またいくつかのさらなる実施形態では、本発明の組成物方中に含まれる未分化ＢＭ細胞集団は、抑制されたまたは除去されたＭＰＯ発現および／または活性を示す同種対象のＢＭ細胞集団であり得る。本発明のいずれか他の態様に関連して本明細書で以前に開示の細胞のいずれかはまた、本態様に関連して、同様に適用可能であることを理解されたい。
【０２０８】
特定の実施形態では、本発明の組成物は、本明細書に記載の哺乳動物対象のＭＰＯ関連状態または疾患の治療、防止、回復、抑制または発症の遅延化方法での使用に適用可能である。より具体的には、いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、免疫関連障害、神経変性疾患、増殖性障害、呼吸障害、血管障害またはこれらの任意の組み合わせの少なくとも１つであり得るＭＰＯ関連状態の治療での使用に好適であり得る。またいくつかのさらに特定の実施形態では、このような免疫関連障害は、自己免疫疾患および炎症性疾患の少なくとも１種であり得る。特定の実施形態では、本発明は、ＭＳ、ＡＮＣＡ状態、特に、ＡＡＶ、ＡＡＧＮ、ＮＣＧＮ、およびＲＰＧＮ、およびＳＬＥのいずれか１つなどの自己免疫疾患の治療での使用のための組成物を提供する。またいくつかのさらなる特定の実施形態では、本発明の組成物は、神経変性疾患、いくつかの特定の実施形態では、ＡＤまたはＰＤなどの神経変性疾患に適用可能である。またいくつかのさらなる実施形態では、本発明の医薬組成物は、増殖性障害、特に癌の治療に適用可能である。またさらなる本発明の実施形態は、炎症性疾患、特に、アテローム性動脈硬化症、ＲＡおよびＩＢＤのいずれか１つの治療のための本発明の医薬組成物の使用を提供する。またいくつかのさらなる実施形態では、本発明は、呼吸器疾患の治療、特に、ＰＡＨの治療のための、本発明の医薬組成物の使用を提供する。いくつかの代替実施形態では、本発明は、ＭＰＯの発現および／または活性の増大に繋がる医薬組成物の提供を包含する。いくつかの実施形態では、本発明は、特に本明細書で前に考察したように、例えば、Ｈ２Ｏ２レベルの上昇を伴うＭＰＯ欠損に関連する障害の治療に使用するための組成物をさらに提供する。本発明の他の態様に関連して本発明により開示される障害または状態、またはそれに伴う任意の段階、症状のいずれかは、この態様にも、特に本発明の組成物に関連して同様に適用可能であることを理解されたい。
【０２０９】
本発明の医薬組成物は、投与前に、薬学的に許容可能な担体中に混合され得る。治療製剤は、任意の従来の剤形で投与され得る。製剤は通常、上で定義の少なくとも１種の有効成分を、他の成分と適合し、患者に有害ではないという意味で薬学的におよび生理学的に許容可能な１種または複数の担体と共に含む。いくつかの特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、注射に好適であり得る。注射による使用に好適な医薬品形態は、滅菌水溶液または滅菌分散液、および注射可能な滅菌溶液または滅菌分散液の即時の作製用の滅菌粉末を含む。全ての場合において、形態は無菌でなければならず、容易に注射可能な程度の流体でなければならない。ミセル製剤、リポソームおよびナノ粒子、例えば、金ナノ粒子を用いるナノスケール薬物送達システムは、合理的な薬物送達のためのエマージングテクノロジーであり、改善された薬物動態学的特性、薬物の制御および持続放出および、さらに重要な、より低い全身毒性を提供する。従って、いくつかの実施形態では、ナノ粒子ベース送達を本発明のＣＲＩＳＰＲシステムの送達に使用し得る。特に望ましい方策は、カプセル化化合物の放出の外部からの誘発を可能にする。外部からの制御放出は、ミセル、リポソーム高分子電解質多層カプセルなどの薬物送達担体がナノ粒子（ＮＰ）操作装置を組み込めば、達成できる。より具体的には、制御薬物送達システム（ＤＤＳ）は、従来の形式の薬物に比べて、いくつかの利点を有する。
【０２１０】
従って、本発明は、ミセル製剤、リポソーム、ポリマー、デンドリマー、金属、特に金、ケイ素または炭素材料、高分子ナノ粒子および磁気ナノ粒子を含む種々のナノ構造体の、薬物送達システムの担体としての使用をさらに包含することを理解されたい。用語の「ナノ構造体」または「ナノ粒子」は、本明細書では、約１００ｎｍ直径より小さい任意の顕微鏡的粒子を表すために使用される。いくつかの他の実施形態では、担体は、脂質の組織化された集合体である。本発明の医薬組成物は通常、緩衝剤、そのモル浸透圧濃度を調節する薬剤、および任意選択で、１種または複数の薬学的に許容可能な担体、賦形剤および／または当技術分野において既知の添加物を含む。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容可能な担体」は、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、などを含む。医薬活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該技術分野において既知である。任意の従来の媒体または薬剤が有効成分と相いれない場合を除き、治療用組成物中へのそれらの使用が意図されている。経口投与用の組成物および製剤としては、粉末または顆粒、懸濁液または、水溶液または非水性媒体中溶液、カプセル、サッシェ、または錠剤が挙げられる。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散剤または結合剤が望ましい場合がある。
【０２１１】
またいくつかのさらなる実施形態では、インビボ適用（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムまたはこれをコードする核酸配列）が開示される場合には特に、種々の投与方法が適用可能であり、従って、本発明の組成物は、本発明で開示されるいずれかの投与方法、特に、腹腔内（ＩＰ）、静脈内（ＩＶ）、非経口、および皮内、皮下、局所、経鼻、肺性、経口、髄内、筋肉内、舌下、頬側、直腸、腟、投与に適合され得る。またいくつかのさらなる実施形態では、特に、呼吸障害のために、肺内投与が好ましい投与方法と見なされる。用語の「投与」は、呼吸障害の治療に関連する場合、液体噴霧器、エアロゾルベース定量吸入器（ＭＤＩ）、もしくは乾燥粉末分散装置などの経口吸入による、または腹腔内注射による肺送達が好ましい。あるいは、投与は、舌下、頬側、非経口、静脈内、筋肉内、皮下、髄内、または経皮のいずれか１種であり得る。
【０２１２】
またさらに、別の態様では、本発明は、哺乳動物対象のＭＰＯ関連状態の治療、防止、回復、抑制または発症の遅延化方法で使用するための、（ａ）上記対象の少なくとも１種の未分化ＢＭ細胞中のＭＰＯの発現および／または活性の調節に適合された少なくとも１種の遺伝子編集化合物、および（ｂ）ＭＰＯの調節された発現および／または活性を示す未分化ＢＭ細胞集団、の少なくとも１種の治療有効量を提供する。いくつかの実施形態では、未分化ＢＭ細胞は、細胞中のＭＰＯの発現および／または活性を調節できる少なくとも１種の遺伝子編集化合物で形質導入または遺伝子導入されたＢＭ細胞集団である。
【０２１３】
またいくつかのさらなる実施形態では、遺伝子編集化合物は、少なくとも１種のＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓシステムを含む少なくとも１種のＰＥＮであり、上記ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓシステムは、（ａ）少なくとも１種のＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓタンパク質、または上記Ｃａｓタンパク質をコードする任意の核酸分子、および（ｂ）ＭＰＯ遺伝子内のプロトスペーサーを標的とする少なくとも１種のｇＲＮＡを含む少なくとも１種の核酸配列、または上記ｇＲＮＡをコードする任意の核酸配列、または（ａ）および（ｂ）の少なくとも１種を含むキット、組成物またはビークルのいずれか、の少なくとも１つを含む。
【０２１４】
またいくつかのさらなるその態様では、本発明は、哺乳動物対象のＭＰＯ関連状態または疾患の治療、防止、回復、抑制または発症の遅延化のための組成物の作製において、上記対象の少なくとも１種の未分化ＢＭ細胞中のＭＰＯの発現および／または活性を調節できる少なくとも１種の遺伝子編集の治療有効量の使用を提供する。
【０２１５】
またいくつかのさらなるその態様では、本発明は、哺乳動物対象のＭＰＯ関連状態または疾患の治療、防止、回復、抑制または発症の遅延化のための組成物の作製において、調節されたＭＰＯの発現および／または活性を示す未分化ＢＭ細胞集団の治療有効量の使用を提供する。
【０２１６】
またさらなる態様では、本発明は、（ａ）必要としている対象の少なくとも１種の未分化ＢＭ細胞中のＭＰＯの発現および／または活性を調節できる少なくとも１種の遺伝子編集化合物、および（ｂ）ＭＰＯの調節された発現および／または活性を示す未分化ＢＭ細胞集団、の少なくとも１種を含む治療キットを提供する。
【０２１７】
またさらに、いくつかの他の態様では、本発明は、細胞中のＭＰＯの発現および／または活性を調節できる少なくとも１種の遺伝子編集化合物で形質導入または遺伝子導入された少なくとも１種の未分化ＢＭ細胞に関する。
【０２１８】
いくつかの特定の実施形態では、細胞は、ＭＰＯ関連状態を罹患している対象由来であり得る。またいくつかのさらに代替物障害では、細胞は、同種または同系対象由来であり得る。本発明により開示されるいずれかの細胞およびいずれかの遺伝子編集化合物は、この態様にも同様に適用可能である。
【０２１９】
またいくつかのさらなる実施形態では、本発明は、哺乳動物対象のＭＰＯの発現および／または活性の調節のための方法における使用のために、本明細書で開示の細胞のいずれかを提供する。またいくつかのさらなる実施形態では、本発明は、哺乳動物対象のＭＰＯ関連状態の治療、防止、回復、抑制または発症の遅延化のための方法における使用のために、本明細書で開示の細胞のいずれかを提供する。
【０２２０】
本発明で開示のＭＰＯ障害のいずれかは、本態様にも同様に適用可能であることを理解されたい。またさらに、本発明の態様いずれかの態様に関連して本発明で開示の全ての細胞、遺伝子編集システムはまた、本発明で開示の任意の別の態様に適用可能であることを理解されたい。
【０２２１】
上で示したように、ＭＰＯは、ネトーシスに関与し、従って、ＭＰＯのレベル、発現および／または機能を調節することにより、本発明は、ネトーシスを調節するための手法をさらに提供する。従って、またいくつかのさらなる態様では、本発明は、特に対象において、ネトーシスを調節するための方法を提供する。またさらに、ＭＰＯ発現および／または活性を抑制する方法を提供することにより、本発明は、そのいくつかの実施形態では、特に必要としている対象においてネトーシスを抑制する、除去するまたは低減させるための方法および組成物をさらに提供する。またいくつかのさらなる実施形態では、本発明は、対象において任意のネトーシス関連障害および状態を治療および防止するための方法および組成物を提供することを理解されたい。刺激時に、好中球は急速にＮＡＤＰＨオキシダーゼを活性化し、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）に不均化する高度に反応性分子である超酸化物を生成する。Ｈ２Ｏ２は、ＭＰＯにより消費されて、次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）および他の酸化剤を産生する。ＭＰＯはまた、完全ＭＰＯ欠損のドナーで示されるように、ＮＥＴ形成にも必要であるが、その役割は不明確なままである。ＲＯＳは細胞傷害性であるが、それらはまた、特定のアミノ酸残基の酸化を介してタンパク質機能を調節する重要なシグナル伝達メディエーターでもある。しかし、ＲＯＳは、高度に反応性で短寿命分子あるために、それらがどのように特定細胞応答を産生できるのかは不明確である。特に、ＮＥＴ形成の間に、ＲＯＳがどのようにＮＥの顆粒から核への選択的移動を調節するかは知られていない。さらに、核は、ＮＥＴ形成中に脱凝縮を始めるので、好中球走化性は、未知の機序により停止される。従って、またさらなるその態様では、本発明は、好中球細胞の特性および機能を調節する方法を提供する。
【０２２２】
本明細書で使用される場合、用語の「約」は、最大１％、さらに特に５％、さらに特に１０％、さらに特に１５％、いくつかの事例では、参照される値より最大２０％高くまたは低く逸脱してもよい値を示し、逸脱範囲は、整数値、該当する場合は、非整数値も含んで連続的な範囲を構成する。いくつかの実施形態では、用語の「約」は、±１０％を指す。
【０２２３】
用語の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびそれらの同根語は、「含むが、それらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味する。この用語は、「からなる」および「から本質的になる」という用語を包含する。「から本質的になる」という表現は、組成物または方法に追加成分および／またはステップ、および／または部分が含まれ得ることを意味するが、その追加成分および／またはステップは、特許請求される組成物または方法の基本的かつ新規の特徴を実質的に変化させないものに限る。文脈上異なる解釈を要する場合を除き、本明細書および以下に続く実施例および請求項の全体を通して、用語の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記述される整数もしくはステップまたは複数の整数もしくはステップの群を含むが、いかなる他の整数もしくはステップまたは複数の整数もしくはステップの群も除外するものではないことを暗示すると理解されよう。
【０２２４】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、特に明示的に示されない限り、不定冠詞の「ａ」および「ａｎ」は、「少なくとも１つの」を意味するものと理解されるべきである。本明細書および添付の請求項で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈で明確に示されていない限り、複数の参照対象を含むことに留意されたい。
【０２２５】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、語句の「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」は、このように結合された要素の「一方または両方」、すなわち、いくつかの事例では接続的に存在する要素、その他の事例では離接的に存在する要素を意味すると理解されるべきである。「および／または」を用いて列挙される複数の要素は、同様に、すなわち、そのように結合された「１つまたは複数」の要素と解釈されるべきである。「および／または」節により具体的に特定された要素以外の、その他の要素は、特に特定されたこれらの要素に関連してもまたは非関連であっても、任意に存在してよい。したがって、非限定的例として、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、「含む」などのオープンエンド用語と共に使用される場合、一実施形態では、Ａのみ（任意選択で、Ｂ以外の要素を含む）；別の実施形態では、Ｂのみ（任意選択で、Ａ以外の要素を含む）；さらに別の実施形態では、ＡおよびＢの両方（任意選択で、その他の要素を含む）；などを指すことができる。
【０２２６】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「または（ｏｒ）」は、上で定義の「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト中の項目を分離する場合、「または（ｏｒ）」または「および／または」は、包括的であると解釈されるべきである、すなわち、少なくとも１つの数の要素またはリストの要素を含むと解釈されるべきであるが、また２つ以上の数の要素またはリストの要素、および任意選択で、追加の非リスト項目を含むと解釈されるべきである。それと反対に、「ただ１つの」または「正確に１つの」などの明確に示された「唯一（ｏｎｌｙ）」、または特許請求の範囲で使用される場合の「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語は、正確に１つの要素の数または１つのリストの要素を指す。一般に、本明細書で使用される場合、用語の「または（ｏｒ）」は、「どちらか」、「〜の１つ」、「〜の１つのみ」、または「正確に１つの」などの排他的用語が先行する場合、排他的選択肢（すなわち、「１つまたはもう一方であるが両方ではない」）を示すとのみ解釈されるものとする。特許請求の範囲で使われる場合、「本質的になる」は、特許法の分野で使用されるその通常の意味を有するものとする。
【０２２７】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、１つまたはそれを超える要素のリストに関連して、語句の「少なくとも１つの」は、要素のリスト中のいずれか１つまたはそれを超える要素から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、少なくとも１つのそれぞれのおよびすべての、要素のリスト内に具体的にリストされた要素を必ずしも含むとは限らず、要素のリスト中の要素の任意の組み合わせを排除しないと理解されるべきである。この定義はまた、語句の「少なくとも１つの」が指す要素リスト内で具体的に特定された要素以外の、これらの具体的に特定された要素に関連した、または関連していない要素が、任意選択で存在してもよいことを許容する。したがって、非限定的例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または、同じ意味で、「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または同じ意味で、「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、少なくとも１つの、任意選択で、２つ以上のＡを含みＢが存在しない（および任意選択でＢ以外の要素を含む）を指し；別の実施形態では、少なくとも１つの、任意選択で２つ以上のＢを含みＡが存在しない（および任意選択でＡ以外の要素を含む）；さらに別の実施形態では、少なくとも１つの、任意選択で２つ以上の、Ａを含み、および少なくとも１つの、任意選択で、２つ以上のＢ（および任意選択でその他の要素を含む）を含む；などを指すことができる。
【０２２８】
別義が明確に指示されない限り、２つ以上のステップを含む本明細書で請求された任意の方法では、ステップまたは行為の順序は、方法のステップまたは行為が記述された順序に限定されるとは限らないことも理解されるべきである。
【０２２９】
本明細書中で上に描かれるような、および、下記の請求項のセクションにおいて特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けを下記の実施例において見出す。
【０２３０】
開示されかつ記述されるように、本発明は、本明細書に開示される特定の実施例、方法のステップ、および組成物に限定されるものではなく、このような方法のステップおよび組成物は、いくらか変わり得ると理解されるべきである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲とその均等物によってのみ限定されることから、本明細書で用いた専門用語は、特定の実施形態を説明する目的でのみ用いられ、かつ限定することを意図しないことも理解されるべきである。
【０２３１】
以下の実施例は、本発明の態様を実施する際に本発明者らによって用いられた技術の代表例である。これらの技術は本発明の実行のための好適な実施形態の好例であり、本開示を踏まえて、当業者は多数の修正が本発明の趣旨および意図する範囲から逸脱することなく行われ得ることは理解されるべきである。
【０２３２】
実施例
試薬
ＭＯＧ３５−５５（Ｂｌａｖａｔｎｉｋ  ｃｅｎｔｅｒ，Ｔｅｌ  Ａｖｉｖ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）
ＩＦＡ（Ｓｉｇｍａ）
結核菌（ＭＴＢ、Ｈ３７Ｒａ、Ｄｉｆｃｏ）
百日咳毒素（ＰＴ、Ｓｉｇｍａ）
ケタミン（Ｂｒｅｍｅｒ）
キシラジン（Ｐｈｉｂｒｏ）
アジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）
Ｅｖａｎｓ  Ｂｌｕｅ色素（Ｓｉｇｍａ）
リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
【０２３３】
制限酵素
ＢｓｍＢＩ（ＮＥＢ）
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）
【０２３４】
プラスミド
ｐＬ−ＣＲＩＳＰＲ．ＥＦＳ．ＧＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅ、カタログ番号＃５７８１８）
【０２３５】
キット
磁気細胞分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）
ＤＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ）
ＶｉｒａＰｏｗｅｒ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒｌｅｓｓ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｇａｔｅｗａｙ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）
Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ｐ２４  Ｒａｐｉｄ  Ｔｉｔｅｒ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）
【０２３６】
抗体
マウス抗ミエロペルオキシダーゼ（ａｂｃａｍ）；ウサギ抗好中球エラスターゼ（ａｂｃａｍ）；ウサギ抗Ｉｂａ１（ａｂｃａｍ）；ラット抗ＧＦＡＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；ラット抗ＣＤ３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；マウス抗ＴＡＵ（ａｂｃａｍ）；マウス抗アミロイドベータ（Ｃｏｖａｎｃｅ）；マウス抗乏突起膠細胞（Ｍｅｒｃｋ）
【０２３７】
細胞
コンピテント大腸菌細胞（ＪＭ１０９，Ｐｒｏｍｅｇａ）、２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−３２１６（登録商標））
【０２３８】
培地およびサプリメント
Ｓｔｅｍｓｐａｍ  ＳＦＥＭ培地（Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＴＰＯ、ＳＣＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）
【０２３９】
動物
Ｃ５７ＢＬ／６（Ａｒｌａｎ）；
ＭｐｏＴｍ１／Ｌｕｓ（４２６５，Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｓ）、これらの変異体マウスは、ミエロペルオキシダーゼ欠損のため殺真菌活性障害を示す。高脂血症状態下で、変異体マウスは、対照マウスより大きな動脈硬化病変を発生する。これらのマウスは、病原体に対する全身性炎症の防御の研究のために有用である。
５ＸＦＡＤマウス（３４８４０、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｓ）
【０２４０】
実験手順
動物ハウジング
Ｃ５７ＢＬ／６、ＭｐｏＴｍ１／Ｌｕｓおよび５ＸＦＡＤマウスを光制御環境（１２時間の明暗周期）中に置き、個別換気ケージ（ＩＶＣ）に収容し、食物および水を自由に与えた。全ての動物調査は、Ｔｅｌ  Ａｖｉｖ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの動物管理使用審査委員会（補足資料Ｂ−承認番号０１−１７−０６９および０１−１８−０１０）により認可された。
【０２４１】
マウス照射および細胞移植
レシピエントマウスは、ガンマ線照射源（Ｂｉｏｂｅａｍ  ＧＭ）から９Ｇｙ（３Ｇｙ／分）の全身致死性照射を受けた。照射の２４時間後、２ｘ１０６個の新しく単離した骨髄細胞または５０００個のレンチウィルス形質導入ＨＳＣを、２７標準規格注射針を用いて、レシピエントマウスの尾静脈を介して静脈内注射した。次の８週間にわたり、１日置きにマウスを監視および秤量した。
【０２４２】
血液試料のＭＰＯ分析
ＭＰＯノックダウンの確認のために、移植の８週後に顔面静脈から２００μｌの血液を採取した。ＡＤＶＩＡ２１２０ｉ（Ｓｉｅｍｅｎｓ）血液検査システムを用いて、血液試料のペルオキシダーゼ活性を分析した。
【０２４３】
骨髄単離およびＨＳＣ濃縮
Ｃ５７ＢＬ／６（Ａｒｌａｎ）またはＭｐｏＴｍ１／Ｌｕｓ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｓ）ドナーマウスを屠殺し、２７標準規格注射針を用いて大腿骨、脛骨および上腕骨から骨髄を回収した。赤血球を溶解し、細胞を直ちに移植するか、または磁性細胞分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて系統細胞用に濃縮した。細胞を５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＯおよび１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補充したＳｔｅｍｓｐａｍ  ＳＦＥＭ培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した。
【０２４４】
ＥＡＥモデルの誘導
１４〜１６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの３箇所の注射部位に、４ｍｇ／ｍｌの結核菌（ＭＴＢ、Ｈ３７Ｒａ、Ｄｉｆｃｏ）を補充したＩＦＡ（Ｓｉｇｍａ）中で乳化したＭＯＧ３５−５５（配列番号７で表されるＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ、Ｂｌａｖａｔｎｉｋ  ｃｅｎｔｅｒ，Ｔｅｌ  Ａｖｉｖ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の３００μｇで皮下に免疫した。免疫後の０および２日目に、２００μｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の３００ｎｇの百日咳毒素（ＰＴ、Ｓｉｇｍａ）を腹腔内投与した。疾患重症度を毎日監視し、ＥＡＥ臨床疾患を次のスケールに従ってスコア化した：０、運動麻痺なし；０．５、尾部弾力性の部分的喪失；１、尾部弾力性の完全喪失；２、後肢脱力および後肢部分的運動麻痺；３、後肢完全運動麻痺；４、後肢運動麻痺および前肢脱力または部分的な前肢運動麻痺；５、瀕死状態；６、死亡。
【０２４５】
行動試験
７月齢から開始して行動試験を実施した。試験の開始の２週前に、マウスを逆転光環境に順化させた。各試行の前に、試行順化の開始の３０分前にマウスを行動試験室に移した。試行の順序は、４種の治療および遺伝子型間で均衡させた。試行間に、迷路を、Ｖｉｒｕｓｏｌｖｅを用いて洗浄した。自動化追跡システム（Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎ，Ｎｏｌｄｕｓ）により、オープンフィールド、高架式十字迷路、Ｙ迷路およびモリス水迷路試験を記録、監視および解析した。
【０２４６】
オープンフィールド試験を実施して、リスク評価／不安関連行動を評価した。試験を、白色パースペクスの空の活動領域（５０ｘ５０ｘ４０ｃｍ）中で実施した。マウスは活動領域の中央に置かれ、１５分間探索可能であった。移動した総距離、ならびに迷路の中央および迷路のコーナーで滞在した時間を測定した。
【０２４７】
高架式十字迷路試験を実施して、リスク評価／不安関連行動を評価した。試験を、床から４０ｃｍ持ち上げた、交差した形状の４本の白色パースペクスアーム（３５ｘ５ｃｍ）からなる装置で実施した。相互に対面する２つのアームを１５ｃｍの高い壁で囲い、一方、他の２つのアームは、オープンであった。マウスはクローズドアームの方に向いて迷路の中央に置かれ、７分間記録された。迷路のオープンまたはクローズドアームに滞在した時間が測定された。オープンアームから落下したマウスは、解析から除外された。
【０２４８】
Ｙ−迷路：２種の試行のＹ−迷路を実施し、空間記憶を評価した。試験を、アーム長さが３８ｃｍ、幅が５ｃｍ、高さが１５ｃｍの白色パースペクスＹ形状装置で行った。試験は、見本試行およびテスト試行からなる。見本試行では、壁の方向に向いた迷路１つのアームの末端にマウスを置き、同時に、迷路の１つのアームが遮断され、迷路の２つのアームは５分間探索可能であった。見本試行後に、５分間の試行間間隔を置いた。テスト試行では、マウスは迷路に戻され、全てのアームがさらに５分間開かれた。新規アーム進入（新規アーム進入の数／総アーム進入）および新規アーム探索時間（新規探索時間／総アーム探索時間）がテスト試行の最初の１分間測定された。
【０２４９】
モリス水迷路を実施し、空間学習を評価した。試験を、スキムミルクで不透明にした水を満たしたプール（１５０ｃｍ直径、３０ｃｍ深さ）中で実施した。黒色矩形、三角形および円形の目印をプール壁上に置いた。水温は２７±１℃であった。透明プラットフォーム（１２ｃｍｘ１２ｃｍ）をプールの１象限の中央で、水面の約２ｃｍ下に置いた。各マウスは、プラットフォームを含まない３つの象限の異なる象限から毎日出発して、１日に４回の試行を５日間連続して受けた。各試行では、マウスを水中に置き、隠れたプラットフォームを６０秒間見つけさせた。マウスが６０秒以内にプラットフォームを見つけられない場合には、ラットはプラットフォームに誘導され、そこに１０秒間留められた。各マウスについて、隠れたプラットフォームを６０秒以内に見つけるための潜時、ならびに移動した総距離を記録した。プラットフォームを見つけられなかったマウスは、６０秒でプラットフォームに到達したとしてスコア化した。
【０２５０】
恐怖条件づけテストを実施し、連想記憶を評価した。試験を、恐怖条件づけチャンバー（Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅ、１７ｘ１７ｘ２５ｃｍ）中で実施した。１日目に、馴化のために、マウスをチャンバー中に５分間置いた。２日目に、マウスを再度チャンバー中に３．５分間置いた。２分後に、マウスは２回のフットショック（０．８ｍＡ、２秒）を１分間隔で受けた。３日目に、マウスをチャンバー中に３分間置いた。恐怖条件づけを、すくみ行動（呼吸以外の全ての運動の存在しない状態）をスコア化することにより評価した。
【０２５１】
組織学的検査
マウスにケタミン／キシラジン（それぞれ、１００ｍ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射する。その後、電気ポンプを用いて、マウスの心臓内をＰＢＳ、続けて氷冷したＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で潅流する。脳を取り出し、４℃で４％ＰＦＡを用いて２４時間後固定した後、３０％スクロース中で凍結保存する。その後、脳を０．０２％アジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）含有ＰＢＳ中、４℃で免疫組織化学的処理まで保存する。スクロース処理脳を乾燥後、液体窒素中の２−メチルブタン中で急速凍結する。クライオスタットを用いて脳の切片（１０μｍ）を作り、分析のためにスライドに直接取り付ける。切片をブロックし、１０％の正常ヤギ血清、１％のウシ血清アルブミンおよび０．５％のトリトン１００を補充したＰＢＳを用いて１時間透過処理し、一次抗体と一晩インキュベートし、続けて、二次抗体と１時間インキュベートする。
【０２５２】
免疫染色
脳を液体窒素で冷却した２−メチルブタン中で急速凍結し、ＯＣＴコンパウンド中に埋め込んだ後に切断した。凍結滑走式ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ  ＣＭ１８５０）を用いて、冠状切片（１０μｍ）を切り取り、使用するまで−２０℃で貯蔵した。Ｓ１００β免疫染色法のために、スライドをＰＢＳで２回洗浄し、ブロックし、１％ウシ血清アルブミン、５％ヤギ血清（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｓｒａｅｌ）および０．０５％トリトンＸ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＰＢＳで１時間透過処理し、Ｓ１００β抗体（１：５００、ａｂ６６０２８，Ａｂｃａｍ）と共に４℃で一晩インキュベートした。スライドをＰＢＳで３回洗浄し、二次ヤギ抗マウス抗体（１／７００、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｏｕｒ）と共に室温で１時間インキュベートした。ＤＮＡをＤＡＰＩ（１：１０００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色した。チオフラビンＳ（ＴｈｉｏＳ）染色のために、スライドを５０％エタノール中の０．０１％ＴｈｉｏＳ溶液と共に８分間インキュベートした。その後、切片を手短に２回１０秒間８０％のエタノールと共にインキュベートし、再蒸留水（ＤＤＷ）で２回洗浄した。
【０２５３】
共焦点画像化
蛍光像を共焦点顕微鏡ＬＳＭ７１０（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｍｉｃｒｏ  Ｉｍａｇｉｎｇ）を用いて取得した。共焦点画像を１０ｘおよび２０ｘ対物レンズ（それぞれ、ＮＡ＝０．３、０．８、Ｐｌａｎ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ）を用いて捕捉した。ＥＧＦＰおよびＣＹ３についてそれぞれＡｒ４８８および５４３ｎｍのレーザー線から生じた蛍光発光を、製造業者により供給されたフィルターセットを用いて検出した。    ＤＡＰＩ検出のために、我々は、我々は、モードロックＴｉ：サファイア、フェムト秒パルスの多光子レーザー（Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩ，Ｃｏｈｅｒｅｎｔ，Ｉｎｃ．）を７２０ｎｍの波長で使用した。Ｚｅｉｓｓ  ＺＥＮ  ２０１１ソフトウェア（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｉｎｃ．）を用いて画像を生成した。全ての画像をＴＩＦで出力し、それらのコントラストおよび輝度を、ＩｍａｇｅＪを用いて最適化した。Ｓ１００β平均強度およびＴｈｉｏＳプラーク密度を、ＩｍａｇｅＪを用いて解析した。
【０２５４】
ＲＮＡおよびタンパク質分析用の組織収集
ＲＮＡおよびタンパク質分析のために、ケタミン／キシラジンでマウスを麻酔し、直ちにＰＢＳで潅流した。脳を取り出し、海馬を切開し、左と右半球に分割し、液体窒素中で急速凍結し、使用するまで−８０℃で貯蔵した。骨髄ＲＮＡ分析のために、大腿骨を採取し、２７標準規格注射針でＰＢＳ中に流水式洗浄することにより、骨髄を抽出した。骨髄細胞をＴｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ）中で凍結し、使用するまで−８０℃で貯蔵した。
【０２５５】
タンパク質抽出およびウェスタンブロット
海馬を解凍し、リシスバッファー（２００ｍＭのＨＥＰＥＳ、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を補充した５ｍＭのＥＤＴＡ、１％のノニデットＰ−４０、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、１ｍＭのＮａ２ＶＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび５０ｍＭのＮａＦ）中でホモジナイズした。細胞を４℃で１時間インキュベートした。タンパク質を４℃、１４，０００ｘｇで２０分間の遠心分離により清澄化した。Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標）ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、タンパク質濃度を定量化した。各試料からの２５μｇのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で分離した。ニトロセルロース転写膜を、５％ウシ血清アルブミンを含む０．１％ツイーン２０含有ＰＢＳと共に１時間ブロックし、ヤギ抗ＡＰＯＥ抗体（１：１０，０００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を用いて４℃で一晩検出し、ヤギ抗ＡＣＴＩＮ抗体（１：５０００、ＭＡＢ１５０１、Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）を用いて室温で１時間検出後、続いて、ヤギ抗マウス二次抗体（１：５，０００、Ｌｉｃｏｒ）を用いて室温で１時間インキュベーションした。バンド強度の可視化および分析をＯｄｙｓｓｅｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｃｏｒ）およびＩｍａｇｅ  Ｓｔｕｄｉｏ  Ｌｉｔｅ  ５．２ソフトウェアを用いて実施した。各試料について、ＡＰＯＥ結果をＡＣＴＩＮに対し正規化した。
【０２５６】
ＲＮＡ抽出およびリアルタイムＰＣＲ
海馬ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使って抽出した。以前記載したように、骨髄試料からＲＮＡを抽出し、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使って洗浄した。ｖｅｒｓｏ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＲＮＡを相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写した。Ｓｙｂｅｒ−Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および注文設計プライマーを用いて、半定量的ＰＣＲをＳｔｅｐ−Ｏｎｅ  Ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍで実施した。限界サイクル値を、３回繰り返して決定し、Ａｃｔｉｎと比較して、平均として提示した。倍率変化を２−ΔΔＣＴ法を使って計算した。
【０２５７】
プライマーセットのリスト（全てマウス遺伝子用）
ＡＰＯＥ順方向、５′−ＧＡＧＣＴＧＡＴＣＴＧＴＣＡＣＣＴＣＣＧ−３′（配列番号１７）および逆方向５′−ＧＡＣＴＴＧＴＴＴＣＧＧＡＡＧＧＡＧＣ−３′（配列番号１８）；ＣＣＬ２順方向、５′−ＧＧＧＡＴＣＡＴＣＴＴＧＣＴＧＧＴＧＡＡ−３′（配列番号１９）および逆方向５′−ＡＧＧＴＣＣＣＴＧＴＣＡＴＧＣＴＴＣＴＧ−３′（配列番号２０）；ＣＸＣＬ１０順方向、５′−ＡＡＣＴＧＣＡＴＣＣＡＴＡＴＣＧＡＴＧＡＣ−３′（配列番号２１）および逆方向５′−ＧＴＧＧＣＡＡＴＧＡＴＣＴＣＡＡＣＡＣ−３′（配列番号２２）；ＩＬ１β順方向、５′−ＧＧＡＧＡＡＣＣＡＡＧＣＡＡＣＧＡＣＡＡＡＡＴＡ−３′（配列番号２３）および逆方向５′−ＴＧＧＧＧＡＡＣＴＣＴＧＣＡＧＡＣＴＣＡＡＡＣ−３′（配列番号２４）；ＭＰＯ順方向、５′−ＴＧＧＴＧＧＣＣＴＧＣＡＧＡＧＴＡＴＧＡ−３′（配列番号２５）および逆方向５′−ＧＴＴＧＡＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＧＡＡＧＧ−３′（配列番号２６）；Ｓ１００β順方向、５′−ＴＴＧＣＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＴＣＣＡ−３′（配列番号２７）および逆方向５′−ＴＣＴＧＣＣＴＴＧＡＴＴＣＴＴＡＣＡＧＧＴＧＡＣ−３′（配列番号２８）；ＴＮＦα順方向、５′−ＡＧＧＧＴＣＴＧＧＧＣＣＡＴＡＧＡＡＣＴ−３′（配列番号２９）および逆方向５′−ＣＣＡＣＣＡＣＧＣＴＣＴＴＣＴＧＴＣＴＡＣ−３′（配列番号３０）；ＶＣＡＭ１順方向、５′−ＧＧＡＧＣＣＴＧＴＣＡＧＴＴＴＴＧＡＧＡＡＴＧ−３′（配列番号３１）および逆方向５′−ＴＴＧＧＧＧＡＡＡＧＡＧＴＡＧＡＴＧＴＣＣＡＣ−３′（配列番号３２）。
【０２５８】
統計分析
全データは平均±ＳＥＭとして表される。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ７を使って統計分析を行った。行動データならびに骨髄ＭＰＯ  ｍＲＮＡレベルを、独立スチューデントｔ−検定を用いて分析した。他のｍＲＮＡ分析、ブロッティング定量化、Ｓ１００β強度定量化およびＴｈｉｏＳプラーク密度を、マン・ホイットニーノンパラメトリック検定を用いて分析した。全ての検定に対し、統計的有意性閾値をｐ＜０．０５に設定した。
【０２５９】
ＢＢＢ透過性アッセイ
エバンスブルー色素の生理食塩水中の２％溶液（４ｍｌ／ｋｇ体重）をマウスの腹腔内に注射した。注射の１時間後に、マウスをＰＢＳで潅流し、脳および脊髄を採取し、ホモジナイズした。ホモジネート由来の上清を、エバンスブルー侵入を示す６１０での吸光度について測定した。
【０２６０】
ＭＰＯ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドクローニング
マウスＭＰＯ標的化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の配列番号５で表されるｇＲＮＡ−３（ＣＣＣＣＡＡＣＧＡＴＣＡＧＣＴＧＡＣＣＡ）および配列番号６で表されるｇＲＮＡ−４（ＣＡＧＣＧＧＧＧＴＧＴＡＣＧＧＣＡＧＣＧ）、ならびに配列番号８で表されるｇＲＮＡ−２（ＧＣＡＣＴＣＡＴＧＴＴＣＡＴＧＣＡＧＴＧ）および配列番号９で表されるｇＲＮＡ−６（ＴＧＣＧＡＴＡＣＴＴＧＴＣＡＴＴＣＧＧＴ）は、Ａｚｉｍｕｔｈ２．０３３ツールを用いて設計された。ｐＬ−ＣＲＩＳＰＲ．ＥＦＳ．ＧＦＰプラスミド（Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｅｂｅｒｔから譲り受けた、ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃５７８１８）をＢｓｍＢＩ（ＮＥＢ）で消化し、ｇＲＮＡ配列をＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いて結合した。結合したプラスミドをコンピテント大腸菌細胞（ＪＭ１０９、Ｐｒｏｍｅｇａ）中に形質転換し、アンピシリンを使って選択し、サンガー塩基配列決定法によりインサートの結合を確認した。ＭＰＯ標的化を、２９３Ｔ細胞への遺伝子導入と、これに続くＤＮＡ抽出（ＤＮｅａｓｙ、Ｑｉａｇｅｎ）およびサンガー塩基配列決定法により評価した。
【０２６１】
レンチウィルス粒子産生
結合プラスミドを、ＶｉｒａＰｏｗｅｒ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒｌｅｓｓ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｇａｔｅｗａｙ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてクローン化した。プラスミド（３μｇ）を、パッケージングプラスミド（９μｇ）：ｐＬＰ１、ｐＬＰ２、およびｐＬＰ／ＶＳＶＧと共にリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて２９３Ｔ産生細胞株に同時遺伝子導入した。Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ｐ２４  Ｒａｐｉｄ  Ｔｉｔｅｒ  Ｋｉｔおよび製造業者（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）の推奨手順を用いて、レンチウィルス力価を決定した。
【０２６２】
単離ＨＳＣのレンチウィルス形質導入
単離の２４時間後に、４μｇ／ｍｌのポリブレンおよび１μｇ／ｍｌのラパマイシンの存在下で、ＨＳＣにＭＰＯ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９レンチウィルスを形質導入した。形質導入細胞を直ちに致死量照射マウス中に移植するか、または、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９活性分析のためにエクスビボ増殖させた。ＧＦＰ発現は、培養物中で１日後に明らかであった。
【０２６３】
実施例１
多発性硬化症のＥＡＥモデル中のＭＰＯの標的化
ＥＡＥ、すなわち、実験的アレルギー性脳脊髄炎は、ヒトＣＮＳ脱髄性疾患の動物モデルとして広く受け入れられている中枢神経系（ＣＮＳ）の誘導された炎症性脱髄性疾患であり、これは、限定されないが、多発性硬化症（ＭＳ）および急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）を含む。ＥＡＥは、マウス、ラット、モルモット、ウサギおよび霊長類を含む、多くの種で誘導できる。疾患の誘導は通常、種々の抗原への動物の暴露により行われる。最も一般的に使用されている抗原は、脊髄ホモジネート（ＳＣＨ）、精製ミエリン、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ミエリンプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰまたはリポフィリン）、およびミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）などのミエリンタンパク質、またはこれらのタンパク質のペプチドであり、全ては免疫学および病態の両方に関して異なる疾患特性を有する別個のモデルを生成する。
【０２６４】
動物の使われる抗原および遺伝的要因に応じて、げっ歯類は、ＥＡＥの一相性の発作、再発寛解型、または慢性ＥＡＥを示すことができる。典型的な、影響を受けやすいげっ歯類は、免疫化のほぼ２週後に臨床症状を初めて現し、再発寛解型疾患の症状を呈する。多発性硬化症のモデル化は、Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスを用いて実施され得、疾患は、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチド（ＭＯＧ）で誘導される。このモデルは、進行型（慢性とも呼ばれる）の疾患を表す。実験操作で示される採点指標は、ＭＰＯ発現および／または活性を調節する、特に低減または抑制する本発明の組成物のおよびキットの治療効果を測定するために疾患の重症度および再発の開始の監視のために使用される。
【０２６５】
ＥＡＥモデルの確立
ＭＳのＥＡＥモデルを、百日咳毒素（ＰＴ）による２種の免疫化と一緒に、ＭＯＧ３５−５５ペプチドを含むアジュバントを用いて成体雌マウスの免疫化により誘導した。ＥＡＥモデルの確立に必要なこれらの物質の最小限の量を決定するために、Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスを２００ｎｇのＭＯＧ３５−５５および２００μｇのＰＴ、２００μｇのＭＯＧ３５−５５および３００ｎｇのＰＴまたは３００μｇのＭＯＧ３５−５５および３００ｎｇのＰＴで免疫した。最初の２種の投与量の間でマウス臨床スコアの差異は示されなかったが、より高い投与量の３００μｇのＭＯＧ３５−５５および３００ｎｇのＰＴは、全ての免疫マウスで重度の疾患を誘発した（図１）。この結果は、この投与量がＥＡＥ疾患を高めるのに最も好適であることを示す。
【０２６６】
ＢＭ移植は照射Ｃ５７ＢＬ／６マウスの致死を救済する
照射線量死亡率およびＢＭ細胞移植の造血再構成能力を特定するために、７匹の８週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに照射（９Ｇｙ）し、そのうちの５匹に１００万個の新しく単離したＢＭを、尾静脈を介して移植した。予測通り、全てのマウスは、４８時間後に、４〜１０％の体重の低下を示した（図２）。全ての移植マウスは、急激な回復を示し、２週間でそれらの初期体重への復帰を示したが、非移植マウスは、悪化し、１３〜１５日後に、死亡した。これらの結果は、９Ｇｙ照射が致死性であることを示す。さらに、ＢＭ細胞を移植された全ての５匹のマウスは、１４日後に回復でき、実際に完全な造血再構成が移植時に確立されたことを示す。
【０２６７】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介ＫＯ実験用により多くの均質細胞集団を樹立するために、ＢＭ細胞の造血前駆細胞をさらに濃縮した。これは、磁気活性化細胞分離（ＭＡＣＳ）を用いて、成熟造血細胞のマーカーを発現しないＢＭ細胞（すなわち、Ｌｉｎ−細胞）を濃縮することにより実施された。これらの細胞が造血再構成潜在能力を保持することを確認するために、これらの細胞も致死量照射Ｃ５７ＢＬ／６マウスに移植した。ＢＭ移植マウスと同様に、これらのマウスも４８時間後に体重の急激な低下と、それに続く回復および生存を示した（図２）。この結果は、Ｌｉｎ−造血前駆細胞がそれらの造血再構成潜在能力を保持し、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ＫＯ実験に好適であることを暗示する。
【０２６８】
ＭＰＯＴｍ１／Ｌｕｓ由来のＢＭのＥＡＥマウスへの移植
ＥＡＥマウスＭＳモデル中の骨髄ＭＰＯ欠損の影響を評価するために、２８匹の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを上述のように致死量照射し、正常にＭＰＯを発現するＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウス、またはＭＰＯノックアウトＭｐｏＴｍ１／Ｌｕｓマウス由来のＢＭ細胞（２００μｌ中の１ｘ１０６個）を、照射したＥＡＥマウスに移植した。表１は、この実験で使用された実験群をまとめる。
【表１】
2021529838.tif 000003
【０２６９】
ＥＡＥ疾患経過に対するＭＰＯ欠損の影響を、実験手順で記載のように疾患臨床スコアを測定することにより評価する。全ての実験群のマウスはまた、ニューロンの欠損、シナプスの減少および小神経膠細胞症ならびにＢＢＢ透過性、ＣＮＳ中への白血球浸潤、小神経膠細胞症およびネトーシス率などのＥＡＥ関連の側面を調査する死後分析によっても評価される。
【０２７０】
実施例２
アルツハイマー病（ＡＤ）のＦＡＤモデルにおけるＭＰＯの標的化
ＭＰＯＴｍ１／Ｌｕｓ由来のＢＭの５ｘＦＡＤマウスへの移植−ペルオキシダーゼ活性試験
ＡＤの５ＸＦＡＤマウスモデルにおける骨髄ＭＰＯ欠損の影響を評価するために、７０匹の雄５ＸＦＡＤならびにそれらの非遺伝子導入同腹仔を致死量照射し、正常にＭＰＯを発現するＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウス、またはＭＰＯノックアウト（ＫＯ）ＭｐｏＴｍ１／Ｌｕｓマウス由来のＢＭ細胞（２００μｌ中の１ｘ１０６個）を、照射したＡＤマウスに移植した。実験群を表２にまとめる。移植の４週後に、８４％のマウスが生存し、それらの初期体重に戻った（図３Ａ〜３Ｄ）。移植の８週後に、ＷＴまたはＭＰＯ  ＫＯ  ＢＭ細胞移植を受けたマウス由来の血液試料中のペルオキシダーゼ活性を測定した。実際に、ＭＰＯ  ＫＯマウスから取得したＢＭ細胞の移植を受けたマウスの血液試料は、より低いペルオキシダーゼ活性（図３Ｅ〜３Ｆ）を示し、これらのマウスにおけるＭＰＯ  ＫＯ細胞のＭＰＯ  ＫＯ造血再構成を確証した。
【表２】
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【０２７１】
ＭＰＯＴｍ１／Ｌｕｓ由来のＢＭの５ＸＦＡＤマウスへの移植−ＭＰＯ−ｍＲＮＡレベル試験
成体５ＸＦＡＤマウスおよび非遺伝子導入同腹仔において血液学的ＭＰＯの欠損が生成された。骨髄破壊的照射に暴露することにより、２月齢のマウスを造血アブレーションに供し、ＭＰＯ−ＫＯまたはＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の骨髄（ＢＭ）細胞を再増殖させた。これは、４種の実験群を形成した：（１）ＷＴ  ＢＭを有するＷＴ（ＷＴ−ＷＴ）、（２）ＭＰＯ−ＫＯ  ＢＭを有するＷＴ（ＷＴ−ＭＰＯ  ＫＯ）、（３）ＷＴ  ＢＭを有する５ＸＦＡＤマウス（５ＸＦＡＤ−ＷＴ）、（４）ＭＰＯ−ＫＯ  ＢＭを有する５ＸＦＡＤ（５ＸＦＡＤ−ＭＰＯ  ＫＯ）（図４Ａ）。ＭＰＯ−ＫＯ  ＢＭを注射したマウスでのＭＰＯ減少を確認するために、ＭＰＯ−ｍＲＮＡ発現分析を行った。ＷＴ−ＭＰＯ  ＫＯおよび５ＸＦＡＤ−ＭＰＯ  ＫＯマウス由来のＢＭ中では、対照中の高レベルに比べて、ほぼ検出不能のＭＰＯ−ｍＲＮＡレベルが検出され、移植マウス中の造血集団の効率的な交換を示している（図４Ｂ）。
【０２７２】
ＭＰＯ欠損は５ＸＦＡＤマウスにおいて認知機能障害を抑制する
５ＸＦＡＤマウスにおける認知機能障害に対するＭＰＯ  ＫＯの影響を調査した。この目的のために、移植マウスを７月齢から始まる一連の行動試験に供した（図４Ｃ）。オープンフィールド試験では、５ＸＦＡＤマウスは、迷路の末端ではなく、迷路の中央でのより長い時間の滞在により反映される機能不全リスク評価を示すことが知られている。実際に、５ＸＦＡＤ−ＷＴマウスは、ＷＴ−ＷＴマウスに比べて、迷路のコーナーで有意に短い時間滞在し、迷路の中央でより長い時間滞在した。対照的に、５ＸＦＡＤ−ＭＰＯ  ＫＯマウスは、５ＸＦＡＤ−ＷＴマウスに比べて、迷路の中央で有意により短い時間滞在し、対照ＷＴマウス群と同等の行動を示した（図５Ａ〜５Ｂ）。特に、４つの実験群間で、総移動距離の差異は測定されず、類似の移動能力を示した（図５Ｃ）。
【０２７３】
高架式十字迷路試験では、ＷＴマウスは、迷路のクローズドアーム中でより長い時間滞在する傾向があり、一方、５ＸＦＡＤマウスは、オープンな、露出したアームに向かう傾向があり、機能不全リスク／不安関連評価を反映している。この実験では、５ＸＦＡＤ−ＷＴおよび５ＸＦＡＤ−ＭＰＯ  ＫＯマウスは、オープンアーム中で有意に長い時間滞在し、混乱したリスク評価行動を反映している。しかし、５ＸＦＡＤ−ＭＰＯ  ＫＯマウスは、５ＸＦＡＤ−ＷＴマウスに比べて、迷路のオープンアーム中に有意により短い時間滞在した（図５Ｄ〜５Ｅ）。まとめると、これらの結果は、５ＸＦＡＤマウスで、ＭＰＯ  ＫＯがリスク評価／不安関連行動を減らすことを示す。
【０２７４】
次に、ＭＰＯ欠損が５ＸＦＡＤマウスで見られる認知機能低下を抑制するかどうかを試験した。Ｙ迷路試験では、５ＸＦＡＤ−ＷＴマウスは、ＷＴ−ＷＴに比べて、減少した探索時間および新規アームへのより少ない進入を示し、一方、５ＸＦＡＤ−ＭＰＯ  ＫＯマウスは、５ＸＦＡＤ−ＷＴに比べて、約５０％多い迷路の新規アームへの進入を示した（図６Ａ）。５ＸＦＡＤ−ＷＴと５ＸＦＡＤ−ＭＰＯ  ＫＯマウスとの間で、探索時間の有意差は測定されなかった（図６Ｂ）。その後、モリス水迷路試験でこれらのマウスの空間学習能力を試験した。試行の５日間の間、５ＸＦＡＤ−ＷＴは、３日目からプラットフォームを見つけ出すのに有意により長い潜時を示し、機能不全空間学習を反映している（図６Ｃ）。しかし、５ＸＦＡＤ−ＭＰＯ  ＫＯマウスは、より良好な顕著な学習能力を示し、５日目にプラットフォームを見つけ出すのに、５ＸＦＡＤ−ＷＴマウスに比べて、有意により短い潜時を示した（図６Ｃ）。ＷＴマウスの学習の改善は、早期にこれらのマウスが後の日より長い距離を移動したので、マウスによる総移動距離にも反映され得る。５ＸＦＡＤ−ＷＴマウスは、試行を通して比較的一定の移動距離を示したが、５ＸＦＡＤ−ＭＰＯ  ＫＯマウスは、ＷＴ群と同様に、試験が進行するに伴いより短い移動距離を示した（図６Ｄ）。最後に、連合学習を、恐怖条件づけテストを用いて評価した。この試験では、有害なフットショックでの条件づけ後１日目にフリージング行動を測定した。ＷＴ−ＷＴおよびＷＴ−ＭＰＯ  ＫＯマウスは、約４０％のフリージング行動を示し、妥当な連想記憶再統合を反映したが、５ＸＦＡＤ−ＷＴマウスは、有意に少ないフリージング行動を示した。特に、ＭＰＯ欠損マウスは、５ＸＦＡＤマウス中で２．４５倍多いフリージング行動を示す（図６Ｅ）。従って、血液学的ＭＰＯの欠損は、５ＸＦＡＤ  ＡＤモデルの認知機能障害を抑制することが、５種の異なる行動試験で実証された。
【０２７５】
ＭＰＯ  ＫＯマウス群は類似のアミロイドβプラーク量を示す
行動試験後に、マウスを屠殺し、脳切片にＴｈｉｏＳ染色を行って、プラーク密度に対するＭＰＯ  ＫＯの影響を測定した。ＷＴマウス群は、検出可能なＴｈｉｏＳ染色を示さなかったが、５ＸＦＡＤ−ＷＴおよび５ＸＦＡＤ−ＭＰＯ  ＫＯマウス群は、同等の高レベルのアミロイドβプラークを示し、ＭＰＯ  ＫＯは、５ＸＦＡＤマウスの脳中のアミロイドβ生成および蓄積に対し影響がないことを示す（図７Ａ〜７Ｅ）。
【０２７６】
５ＸＦＡＤ−ＭＰＯ  ＫＯマウスは低減された炎症を示す
脳炎に対するＭＰＯ欠損の影響を評価するために、海馬切片をＳ１００βに対する抗体で染色した。このタンパク質は、活性化星状膠細胞中で過剰発現されることが知られており、ＡＤの変性神経突起形成に結びつけられてきた。予測通り、５ＸＦＡＤ−ＷＴマウスは、ＷＴ−ＷＴマウスと比較すると、それらの海馬中で有意に高いＳ１００β発現を示した（図８Ａ〜８Ｍ）。しかし、５ＸＦＡＤ−ＭＰＯ  ＫＯマウスは、５ＸＦＡＤ−ＷＴマウスと同等の低いＳ１００βレベルを示し、これらのマウス中でのより限られた炎症応答を示している。海馬ｍＲＮＡ試料のリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）分析もまた、ＭＰＯ欠損５ＸＦＡＤマウス中の限定的な発現パターンにより反映される、ＷＴ−ＷＴマウスと比較して５ＸＦＡＤ−ＷＴマウスでのＳ１００β発現の有意な発現上昇も示した。
【０２７７】
炎症に対するＭＰＯ欠損の影響をさらに試験するために、ＲＴ−ＰＣＲを使って、いくつかの認識された炎症性マーカーの海馬ｍＲＮＡ発現を分析した。ＭＰＯ欠損５ＸＦＡＤマウスは、有意に減少された炎症促進性メディエーターＩＬ−１βおよびＣＸＣＬ１０の発現レベル（図９Ａ〜９Ｂ）およびある程度低減されたＣＣＬ２およびＴＮＦα発現を示す（図９Ｃ〜９Ｄ）。興味深いことに、５ＸＦＡＤ−ＷＴマウス中で強化されたＶＣＡＭ１レベルは、５ＸＦＡＤ−ＭＰＯ  ＫＯマウス中で減少した（図９Ｅ）。ＶＣＡＭ１の内皮障害との既知の関連を考慮すると、この結果は、ＭＰＯ  ＫＯの５ＸＦＡＤマウス中の内皮健全性に与えるＭＰＯ  ＫＯの有益な効果を示唆し得る。
【０２７８】
ＭＰＯ欠損は５ＸＦＡＤマウスにおけるＡＰＯＥ発現を低減する
ＡＰＯＥ遺伝子型のε４アレルは、孤発性成人発症型ＡＤの最大遺伝的リスク因子と見なされている。ＡＤにおけるＡＰＯＥの正確な役割はまだ議論中であるが、ＡＰＯＥは、明確に、ＡＤ進行に中心的な役割を果たし、アミロイド代謝および凝集ならびにタウ病態を含むＡＤに関連する多くの病理過程に結びつけられてきた。興味深いことに、ＡＰＯＥ発現は、５ＸＦＡＤマウスの脳中で大幅に増大することが明らかになった。実際に、海馬タンパク質溶解物のウェスタンブロット分析は、ＷＴ−ＷＴマウスに比べて、５ＸＦＡＤ−ＷＴマウスの脳中のＡＰＯＥレベルの有意な増大を示したが、５ＸＦＡＤ−ＭＰＯ  ＫＯマウス中では、ＡＰＯＥレベルは有意に低かった（図１０Ａ、図１０Ｂ）。この結果は、ＲＮＡレベルに関しさらに確証され（図１０Ｃ）、ＭＰＯ欠損はＣＮＳ内のＡＰＯＥ上昇を防止したことを示す。
【０２７９】
実施例３
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を用いる単離ＨＳＣにおけるＭＰＯノックアウト
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース遺伝子変化は、遺伝子ベース療法のための効率的プラットフォームと考えられる。標的細胞の単離およびエクスビボ培養は、この手法の造血系関連疾患に対する利用を促進する。従って、発明者らは、単離ＨＳＣ中のレンチウィルス媒介ＭＰＯノックアウトのためにこのプラットフォームを利用する。この目的のために、骨髄細胞を単離し、磁気ベース細胞選別を用いてＨＳＣを濃縮する。これらの細胞は、Ｃａｓ９タンパク質、ＧＦＰおよびＭＰＯ標的化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を発現しているレンチウィルスベクターで形質導入される。培養の２４時間後に、ＧＦＰ陽性細胞はＦＡＣＳ選別され、致死量照射モデル動物中に注射される。ＭＰＯ標的化レンチウィルスベクターの生成のために、種々のｇＲＮＡプライマーを設計し、ｐＬ−ＣＲＩＳＰＲ．ＥＦＳ．ＧＦＰプラスミド中に挿入した。適切なライゲーションを、サンガー塩基配列決定法を用いて検証した。次に、これらのプラスミドを、Ｖｉｒａｐｏｗｅｒ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いるレンチウィルス粒子の生成に使用した。適切なレンチウィルスの構築および造血幹細胞（ＨＳＣ）への統合を、単離ＨＳＣを漸増濃度（２００，００個の細胞当たり、０．５、２および１０μｌ）で形質導入することにより評価した。対照として、ＧＦＰ発現レンチウィルスを使用した。形質導入の２４および４８時間後のＧＦＰ分析により、ＨＳＣが実際に、形質導入され（図１１）、試験した最大濃度下で、培養の２４および４８時間後に、それぞれ、３３％および４５％のＧＦＰ＋細胞を示すことが確かめられた。これらの結果は、単離ＨＳＣが形質導入でき、照射マウスへの移植の２４時間後にＦＡＣＳ選択できることを示す。
【０２８０】
ＧＦＰ陽性細胞はＦＡＣＳ選別され致死量照射モデル動物中に注射される。
【０２８１】
レンチウィルス形質導入ＨＳＣを用いる次の動物実験が、ＥＡＥモデルおよび５ＸＦＡＤモデルの両方で実施される。ｇＲＮＡを発現していないレンチウィルスベクターが、これらの実験の対照として使用される。これらの実験のための分類は表３（ＥＡＥ実験）および表４（５ＸＦＡＤ実験）に記載される。
【表３】
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【表４】
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【０２８２】
実施例４
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を用いるヒト細胞（ＨＥＫ２９３）におけるＭＰＯノックアウト
ヒトＨＥＫ２９３細胞に、Ｃａｓ９タンパク質、蛍光標識ｔｒａｃｒＲＮＡおよびヒトＭＰＯコード配列（配列番号３３〜３５および４２）および対応するプロトスペーサー（それぞれ、配列番号４３〜４６）（ＰＡＭは太字で表示）を標的とする次記のｃｒＲＮＡ配列のそれぞれを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を遺伝子導入した：
Ｔ１７３：配列番号３３で表される、ＴＧＣＡＣＡＴＣＣＣＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧ；
Ｄ２６０：配列番号３４で表される、ＣＡＧＧＧＧＴＧＡＡＧＴＣＧＡＧＧＴＣＧ；
Ｈ５０２：配列番号３５で表される、ＧＧＡＴＧＡＧＧＧＴＧＴＧＧＣＣＧＴＡＧ；
Ｃ３１９：配列番号４２で表される、ＧＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＴＧＣＴＣＣＣＧ；
Ｔ１７３：配列番号４３で表される、ＴＧＣＡＣＡＴＣＣＣＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＣＧＧ；
Ｄ２６０：配列番号４４で表される、ＣＡＧＧＧＧＴＧＡＡＧＴＣＧＡＧＧＴＣＧＴＧＧ；
Ｈ５０２：配列番号４５で表される、ＧＧＡＴＧＡＧＧＧＴＧＴＧＧＣＣＧＴＡＧＣＧＧ；および
Ｃ３１９：配列番号４６で表される、ＧＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＴＧＣＴＣＣＣＧＧＧＧ。
【０２８３】
次の実施例５により示されるように、これらの特定の標的はまた、ＭＰＯ遺伝子のノックアウトのための標的に加えて、タンパク質の立体構造変化またはプロトマー生合成およびプロセッシングの変化を形成するアミノ酸置換（Ｃ３１９Ａ）、ヒトＭＰＯ欠損置換を模倣する置換（Ｔ１７３Ｃ）、プロトマーヘム結合Ｄ２６０ＡおよびＨ５０２Ａを妨害するアミノ酸置換をもたらすＨＤＲ標的としても使用される。遺伝子導入は、製造業者のプロトコル（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）に従い、Ａｌｔ−Ｒシステムを用いて実施された。遺伝子導入の７２時間後に、細胞をＤＮＡ抽出用に採取した、またはｔｒａｃｒＲＮＡで標識され、細胞の濃縮のためにＦＡＣＳ選別し、さらに７２時間培養後、ＤＮＡ抽出用に採取した。ＤＮＡ試料は、製造業者のプロトコル（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）に従い、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７ＥＩ）ミスマッチ検出アッセイを用いて分析された。より具体的には、Ｔ７ＥＩアッセイを使って、編集される細胞集団中の所与のガイドＲＮＡ標的部位のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９試薬の遺伝子編集効率を評価した。
【０２８４】
以下のプライマーをＴ７ＥＩアッセイに使用した：
１．Ｔ１７３  ｇＲＮＡ用：
Ｆｗプライマー（約１８２ｂｐ下流）：Ｔ１７３＿Ｔ７−Ｆｗ：配列番号３６で表される、ＴＣＴＴＣＣＴＣＣＡＧＧＧＡＧＴＣＴＣＡ。
Ｒｖプライマー（約６７３ｂｐ下流）Ｔ１７３＿Ｔ７＿Ｒｖ：配列番号３７で表される、ＧＣＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＡＧＧＴＣＡＴ。
アンプリコンサイズ：９１５
２．Ｄ２６０  ｇＲＮＡ用：
Ｆｗプライマー（約６２１ｂｐ下流）：Ｄ２６０＿Ｔ７−Ｆｗ：配列番号３６で表される、ＴＣＴＴＣＣＴＣＣＡＧＧＧＡＧＴＣＴＣＡ。
Ｒｖプライマー（約２３４ｂｐ下流）：Ｄ２６０＿Ｔ７＿Ｒｖ：配列番号３７で表される、ＧＣＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＡＧＧＴＣＡＴ。
アンプリコンサイズ：９１５
３．Ｃ３１９  ｇＲＮＡ用：
Ｆｗプライマー（約２６３ｂｐ下流）：Ｃ３１９＿Ｔ７＿Ｆｗ：配列番号３８で表される、ＣＣＡＧＧＴＴＣＣＣＡＧＴＴＣＡＧＴＧＴ。
Ｒｖプライマー（約５５８ｂｐ下流）：Ｃ３１９＿Ｔ７＿Ｒｖ：配列番号３９で表される、ＣＣＡＣＡＧＣＧＴＴＣＴＣＴＧＴＣＣＴＴ。
アンプリコンサイズ：８８１
４．Ｈ５０２  ｇＲＮＡ用：
Ｆｗプライマー（約２９７ｂｐ下流）：Ｈ５０２＿Ｔ７＿Ｆｗ：配列番号４０で表される、ＡＴＧＣＣＴＣＴＣＡＧＴＧＣＣＡＣＴＣＴ。
Ｒｖプライマー（約５６６ｂｐ下流）：Ｈ５０２＿Ｔ７＿Ｒｖ：配列番号４１で表される、ＡＧＣＣＡＧＧＴＣＡＧＧＧＧＡＡＧＴＡＴ。
アンプリコンサイズ：９２３。
【０２８５】
図１２に示されるように、ＭＰＯの切断がヒト細胞、特に、選別細胞で示されるように、Ｈ５０２を遺伝子導入した（２７．３）およびＴ１７３を遺伝子導入した（１９．８％）ｃｒＲＮＡで観察された。これらの結果は、特異的および効果的なヒト細胞中のＭＰＯの標的化の実現性を明確に示している。
【０２８６】
実施例５
ヒトＭＰＯ機能およびレベルを操作するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの使用
本発明の遺伝子編集システムを用いたヒト細胞中のＭＰＯのノックアウトの成功に勇気づけられて、発明者らは、次に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを、ＭＰＯ生合成および機能の変化を誘発するヒトＭＰＯ中の特定のアミノ酸残基を置換するツールとして使用する。特定の標的アミノ酸残基は、次のグループに細分される：
１．タンパク質における立体構造変化またはプロトマー生合成およびプロセッシングにおける変化を形成するアミノ酸置換−Ｃ１６７Ａ、Ｃ１８０Ａ、Ｃ３１９Ａ、Ｃ１５８Ａ、Ｒ１２８Ａ、Ｎ３５５Ａ。
２．ヒトＭＰＯ欠損置換を模倣するアミノ酸置換−Ｔ１７３Ｃ、Ｍ２５１Ｔ、Ｒ５６９Ｗ、Ｒ４９９Ｃ、Ｇ５０１Ｓ。
３．プロトマーヘム結合を妨げるアミノ酸置換−Ｑ２５７Ａ、Ｄ２６０Ａ、Ｍ４０９Ａ、Ｅ４０８Ａ、Ｈ２６１Ａ、Ｈ５０２Ａ。
４．適切なタンパク質グリコシル化を妨げるアミノ酸−Ｎ３５５Ａ。
本明細書で指定される標的残基は、配列番号２で表されるヒトＭＰＯアミノ酸配列に関する。
【０２８７】
システイン１６７
システイン１６７は、Ｃ１８０とジスルフィド架橋を形成するＭＰＯの軽鎖中の保存的アミノ酸である。このアミノ酸の中性アミノ酸による置換は、ジスルフィド架橋の形成を防止する。
システインからアラニンへの置換、Ｃ１６７Ａ（ＴＧＣのＧＣＣ／ＧＣＡ／ＧＣＴ／ＧＣＧへの変更）は、本明細書に記載のように行われる。
システイン１６７のコドン配列内のＣａｓ９媒介二重鎖切断（ＤＳＢ）は、次のｇＲＮＡ配列を用いて実施される：
Ｃ１６７Ａ−１：配列番号４７で表される、ＧＧＡＣＧＴＧＧＧＧＧＴＧＡＣＴＴ＾ＧＣＣ。このｇＲＮＡは、配列番号９４で表される、核酸配列ＧＧＡＣＧＴＧＧＧＧＧＴＧＡＣＴＴ＾ＧＣＣＣＧＧを含むプロトスペーサーを標的とする。
切断前：配列番号４８で表される、ＣＡＧＧＡＣＧＴＧＧＧＧＧＴＧＡＣＴＴＧＣ１６７ＣＣＧＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＡＡ。
切断後：配列番号４８で表される、ＣＡＧＧＡＣＧＴＧＧＧＧＧＴＧＡＣＴＴ＾ＧＣ１６７ＣＣＧＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＡＡ。
（ＰＡＭ配列は下線が引かれ、＾は切断部位を示し、太字は置換されるコドンを示す）。
【０２８８】
一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）は、ＨＤＲ用のテンプレートとして使用される。ｓｓＯＤＮは、新しいコドン配列に隣接する２つの相同性アームを含む。相同性アームは対称であり、ＰＡＭの両端から５０塩基を有する。
さらに、ＣＲＩＳＰＲ再切断を防ぐために、ＰＡＭブロッキング変異がＰＡＭ配列に導入される。
Ｃ１６７Ａ用のテンプレートｓｓＯＤＮオリゴは、次記を含む：
配列番号４９で表される、ＧＴＴＧＴＣＣＡＡＧＴＣＡＡＧＣＧＧＣＴＧＣＧＣＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＧＴＧＧＧＧＧＴＧＡＣＴＧＣＣ１６７ＣＣＴＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＡＡＴＡＣＣＧＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＧＧＧＡＴＧＴＧＣＡＡＣＡＡＣＡＧＧＴＧＣＧＧＣ。
【０２８９】
システイン１８０
システイン１８０は、Ｃ１６７とジスルフィド架橋を形成するＭＰＯの軽鎖中の保存的アミノ酸である。このアミノ酸の中性アミノ酸による置換は、ジスルフィド架橋の形成を防止する。
システインからアラニンへの置換Ｃ１８０Ａ（ＴＧＣのＧＣＣ／ＧＣＡ／ＧＣＴ／ＧＣＧへの変更）は、次のｇＲＮＡ配列を使って、システイン１８０のコドン配列内でＣａｓ９媒介ＤＳＢにより実施される：
Ｃ１８０Ａ−１：配列番号５０により表される、ＴＣＡＣＣＧＧＧＡＴＧＴＧＣＡＡＣ＾ＡＡＣ。このｇＲＮＡは、配列番号９５で表される、核酸配列ＴＣＡＣＣＧＧＧＡＴＧＴＧＣＡＡＣ＾ＡＡＣＡＧＧを含むプロトスペーサーを標的とする。
切断前：配列番号５１で表される、ＡＣＣＡＴＣＡＣＣＧＧＧＡＴＧＴＧＣ１８０ＡＡＣＡＡＣＡＧＧＴＧＣＧＧＣＴＧＧＣＴＧ。
切断後：配列番号５１で表される、ＡＣＣＡＴＣＡＣＣＧＧＧＡＴＧＴＧＣ１８０ＡＡＣ＾ＡＡＣＡＧＧＴＧＣＧＧＣＴＧＧＣＴＧ。
（ＰＡＭ配列は下線が引かれ、＾は切断部位を示し、太字は置換されるコドンを示す）。
【０２９０】
一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）は、ＨＤＲ用のテンプレートとして使用される。ｓｓＯＤＮは、新しいコドン配列に隣接する２つの相同性アームを含む。相同性アームは対称であり、ＰＡＭの両端から５０塩基を有する。
さらに、ＣＲＩＳＰＲ再切断を防ぐために、ＰＡＭブロッキング変異がＰＡＭ配列に導入される。
Ｃ１８０Ａ用のテンプレートｓｓＯＤＮオリゴは、次記を含む：
配列番号５２で表される、ＣＴＴＧＣＣＣＧＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＡＡＴＡＣＣＧＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＧＧＧＡＴＧＧＣＣ１８０ＡＡＣＡＡＣＡＧＣＴＧＣＧＧＣＴＧＧＣＴＧＧＧＧＧＴＧＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＣＣＧＧＧＣＴＣＡＧＡＧＡＧＧＣＧＴＣＣＣＧ。
【０２９１】
チロシン１７３
システインへの置換を生じるチロシン１７３のコドンのミスセンス変異は、ＭＰＯ欠損をもたらし、その分解に繋がる異常なタンパク質プロセッシングを引き起こすことが以前に報告された。
従って、実施例４により示されるように、チロシンからシステイン置換Ｙ１７３Ｃ（ＴＡＣのＴＧＴ／ＴＧＣへの変更）は、次のｇＲＮＡ配列を使って、チロシン１７３のコドン配列内でＣａｓ９媒介ＤＳＢにより実施される：
Ｙ１７３Ｃ−１：配列番号４３で表される核酸配列：ＴＧＣＡＣＡＴＣＣＣＧＧＴＧＡＴＧ＾ＧＴＧＣＧＧを含むプロトスペーサーを標的とする、配列番号３３で表される、ＴＧＣＡＣＡＴＣＣＣＧＧＴＧＡＴＧ＾ＧＴＧ。
切断前：配列番号５３で表される、ＴＧＣＣＣＧＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＡＡＴＡＣ１７３ＣＧＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＧＧＧ。
切断後：配列番号５３で表される、ＴＧＣＣＣＧＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＡＡＴＡＣ１７３ＣＧＣＡＣ＾ＣＡＴＣＡＣＣＧＧＧ。
（ＰＡＭ配列は下線が引かれ、＾は切断部位を示し、太字は置換されるコドンを示す）。
【０２９２】
一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）は、ＨＤＲ用のテンプレートとして使用された。ｓｓＯＤＮは、新しいコドン配列に隣接する２つの相同性アームを含む。相同性アームは対称であり、ＰＡＭの両端から５０塩基を有する。
さらに、ＣＲＩＳＰＲ再切断を防ぐために、ＰＡＭブロッキング変異がＰＡＭ配列に導入された。
Ｙ１７３Ｃ用のテンプレートｓｓＯＤＮオリゴ：
配列番号５４で表される、ＧＧＣＴＧＣＧＣＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＧＴＧＧＧＧＧＴＧＡＣＴＴＧＣＣＣＧＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＡＡＴＧＴ１７３ＣＧＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＧＧＧＡＴＧＴＧＣＡＡＣＡＡＣＡＧＧＴＧＣＧＧＣＴＧＧＣＴＧＧＧＧＧＴＧＧＣＴＧ。
【０２９３】
グルタミン２５７
グルタミン２５７は、ヘム空洞と水素結合を形成し、かつハロゲン化物結合に関与すると報告された。このアミノ酸の中性アミノ酸による置換は、そのカルボニル残基の水分子に対する相互作用および水素結合の形成を防止する。
グルタミンからアラニンへの置換、Ｑ２５７Ａ（ＣＡＧのＧＣＣ／ＧＣＡ／ＧＣＴ／ＧＣＧへの変更）は、次のｇＲＮＡ配列を使って、グルタミン２５７のコドン配列内でＣａｓ９媒介ＤＳＢにより実施される：
Ｑ２５７Ａ−１：配列番号５５で表される、ＣＡＴＧＣＡＡＴＧＧＧＧＣＣＡＧＣ＾ＴＧＴ。このｇＲＮＡは、配列番号９６で表される、核酸配列ＣＡＴＧＣＡＡＴＧＧＧＧＣＣＡＧＣ＾ＴＧＴＴＧＧを含むプロトスペーサーを標的とする。
切断前：配列番号５６で表される、ＣＡＴＧＴＴＣＡＴＧＣＡＡＴＧＧＧＧＣＣＡＧ２５７ＣＴＧＴＴＧＧＡＣＣＡＣＧＡ。
切断後：配列番号５６で表される、ＣＡＴＧＴＴＣＡＴＧＣＡＡＴＧＧＧＧＣＣＡＧ２５７Ｃ＾ＴＧＴＴＧＧＡＣＣＡＣＧＡ。
（ＰＡＭ配列は下線が引かれ、＾は切断部位を示し、太字は置換されるコドンを示す）。
【０２９４】
一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）は、ＨＤＲ用のテンプレートとして使用される。ｓｓＯＤＮは、新しいコドン配列に隣接する２つの相同性アームを含む。相同性アームは対称であり、ＰＡＭの両端から５０塩基を有する。
さらに、ＣＲＩＳＰＲ再切断を防ぐために、ＰＡＭブロッキング変異がＰＡＭ配列に導入される。
Ｑ２５７Ａ用のテンプレートｓｓＯＤＮオリゴ：
配列番号５７で表される、ＧＡＣＴＣＣＧＧＡＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＴＣＡＣＴＣＡＴＧＴＴＣＡＴＧＣＡＡＴＧＧＧＧＣＧＣＧ２５７ＣＴＧＴＴＴＧＡＣＣＡＣＧＡＣＣＴＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＣＴＧＡＧＣＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＣＴＣＣＴＴＣＧＴＣ。
【０２９５】
アスパラギン酸２６０
アスパラギン酸２６０は、ヘムのピロール基とエステル結合を形成し、おそらく、ＭＰＯ軽鎖のヘム基への唯一の共有結合である。このアミノ酸残基の中性アミノ酸による置換は、タンパク質−ヘム相互作用を防止する。
アスパラギン酸からアラニンへの置換、Ｄ２６０Ａ（ＧＡＣのＧＣＣ／ＧＣＡ／ＧＣＴ／ＧＣＧへの変更）は、次のｇＲＮＡ配列を使って、アスパラギン酸２６０のコドン配列内でＣａｓ９媒介ＤＳＢを用いて、実施例４で開示のように実施された：
Ｄ２６０Ａ−１：配列番号４４で表される核酸配列：ＣＡＧＧＧＧＴＧＡＡＧＴＣＧＡＧＧ＾ＴＣＧＴＧＧを含むプロトスペーサーを標的とする、配列番号３４で表される、ＣＡＧＧＧＧＴＧＡＡＧＴＣＧＡＧＧ＾ＴＣＧ。
切断前：配列番号５８で表される、ＧＣＡＡＴＧＧＧＧＣＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＣ２６０ＣＡＣＧＡＣＣＴＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＣＴ。
切断後：配列番号５８で表される、ＧＣＡＡＴＧＧＧＧＣＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＣ２６０ＣＡＣＧＡ＾ＣＣＴＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＣＴ。
（ＰＡＭ配列は下線が引かれ、＾は切断部位を示し、太字は置換されるコドンを示す）。
【０２９６】
一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）は、ＨＤＲ用のテンプレートとして使用された。ｓｓＯＤＮは、新しいコドン配列に隣接する２つの相同性アームを含む。相同性アームは対称であり、ＰＡＭの両端から５０塩基を有する。
さらに、ＣＲＩＳＰＲ再切断を防ぐために、ＰＡＭブロッキング変異がＰＡＭ配列に導入された。
Ｑ２６０Ａ用のテンプレートｓｓＯＤＮオリゴ：
配列番号５９で表される、ＣＣＧＧＡＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＴＣＡＣＴＣＡＴＧＴＴＣＡＴＧＣＡＡＴＧＧＧＧＣＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＣＡ２６０ＣＡＣＧＡＣＣＴＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＣＴＧＡＧＣＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＣＴＣＣＴＴＣＧＴＣＡＣＴＧ。
【０２９７】
メチオニン４０９
メチオニン４０９は、ヘムのピロール基とエステル結合を形成し、おそらく、ＭＰＯ軽鎖のヘム基への唯一の共有結合である。このアミノ酸残基の中性アミノ酸による置換は、このタンパク質−ヘム相互作用を防止する。
メチオニンからアラニンへの置換、Ｍ４０９Ａ（ＡＴＧのＧＣＣ／ＧＣＡ／ＧＣＴ／ＧＣＧへの変更）は、次のｇＲＮＡ配列を使って、メチオニン４０９のコドン配列内でＣａｓ９媒介ＤＳＢにより実施される：
Ｍ４０９Ａ−１：配列番号６０で表される、ＧＧＴＧＡＧＣＴＣＧＧＧＣＡＴＣＴ＾ＣＡＣ。このｇＲＮＡは、配列番号９７で表される核酸配列：ＧＧＴＧＡＧＣＴＣＧＧＧＣＡＴＣＴ＾ＣＡＣＴＧＧを含むプロトスペーサーを標的とする。
切断前：配列番号６１で表される、ＡＧＧＧＧＡＣＡＣＣＣＧＴＴＣＣＡＧＴＧＡＧＡＴＧ４０９ＣＣＣＧＡＧＣＴＣＡＣＣＴＣＣＡ。
切断後：配列番号６１で表される、ＡＧＧＧＧＡＣＡＣＣＣＧＴＴＣＣＡＧＴＧ＾ＡＧＡＴＧ４０９ＣＣＣＧＡＧＣＴＣＡＣＣＴＣＣＡ。
（ＰＡＭ配列は下線が引かれ、＾は切断部位を示し、太字は置換されるコドンを示す）。
【０２９８】
一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）は、ＨＤＲ用のテンプレートとして使用される。ｓｓＯＤＮは、新しいコドン配列に隣接する２つの相同性アームを含む。相同性アームは対称であり、ＰＡＭの両端から５０塩基を有する。
さらに、ＣＲＩＳＰＲ再切断を防ぐために、ＰＡＭブロッキング変異がＰＡＭ配列に導入される。
Ｍ４０９Ａ用のテンプレートｓｓＯＤＮオリゴ：
配列番号６２で表される、ＧＡＧＧＣＣＴＴＡＡＧＡＡＴＧＡＣＡＧＴＧＧＣＴＴＴＴＧＣＣＴＣＣＣＣＡＡＧＧＧＧＡＣＡＣＣＣＧＴＴＡＣＡＧＴＧＡＧＧＣＧ４０９ＣＣＣＧＡＧＣＴＣＡＣＣＴＣＣＡＴＧＣＡＣＡＣＣＣＴＣＴＴＡＣＴＴＣＧＧＧＡＧＣＡＣ。
【０２９９】
グルタミン酸４０８
グルタミン酸４０８は、ヘムのピロール基とエステル結合を形成する。このアミノ酸残基の中性アミノ酸による置換は、このタンパク質−ヘム相互作用を防止する。
グルタミン酸からアラニンへの置換、ｅ４０８ａ（ＧＡＧのＧＣＣ／ＧＣＡ／ＧＣＴ／ＧＣＧへの変更）は、次のｇＲＮＡ配列を使って、グルタミン酸４０８のコドン配列内でＣａｓ９媒介ＤＳＢにより実施される：
Ｅ４０８Ａ−１：配列番号６３で表される、ＧＧＴＧＡＧＣＴＣＧＧＧＣＡＴＣＴ＾ＣＡＣ。
このｇＲＮＡは、配列番号９８で表される核酸配列：ＧＧＴＧＡＧＣＴＣＧＧＧＣＡＴＣＴ＾ＣＡＣＴＧＧを含むプロトスペーサーを標的とする。
切断前：配列番号６４で表される、ＡＧＧＧＧＡＣＡＣＣＣＧＴＴＣＣＡＧＴＧＡＧ４０８ＡＴＧＣＣＣＧＡＧＣＴＣＡＣＣＴＣＣＡ。
切断後：配列番号６４で表される、ＡＧＧＧＧＡＣＡＣＣＣＧＴＴＣＣＡＧＴＧ＾ＡＧ４０８ＡＴＧＣＣＣＧＡＧＣＴＣＡＣＣＴＣＣＡ。
（ＰＡＭ配列は下線が引かれ、＾は切断部位を示し、太字は置換されるコドンを示す）。
【０３００】
一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）は、ＨＤＲ用のテンプレートとして使用される。ｓｓＯＤＮは、新しいコドン配列に隣接する２つの相同性アームを含む。相同性アームは対称であり、ＰＡＭの両端から５０塩基を有する。
さらに、ＣＲＩＳＰＲ再切断を防ぐために、ＰＡＭブロッキング変異がＰＡＭ配列に導入される。
Ｅ４０８Ａ用のテンプレートｓｓＯＤＮオリゴ：
配列番号６５で表される、ＧＡＧＧＣＣＴＴＡＡＧＡＡＴＧＡＣＡＧＴＧＧＣＴＴＴＴＧＣＣＴＣＣＣＣＡＡＧＧＧＧＡＣＡＣＣＣＧＴＴＡＣＡＧＴＧＣＧ４０８ＡＴＧＣＣＣＧＡＧＣＴＣＡＣＣＴＣＣＡＴＧＣＡＣＡＣＣＣＴＣＴＴＡＣＴＴＣＧＧＧＡＧＣＡＣ。
【０３０１】
ヒスチジン２６１
ヒスチジン２６１は、ヘム鉄に配位結合する遠位リガンドである。このアミノ酸残基の中性アミノ酸による置換は、このタンパク質−ヘム相互作用を防止する。
ヒスチジンからアラニンへの置換、Ｈ２６１Ａ（ＣＡＣのＧＣＣ／ＧＣＡ／ＧＣＴ／ＧＣＧへの変更）は、次のｇＲＮＡ配列を使って、ヒスチジン２６１のコドン配列内でＣａｓ９媒介ＤＳＢにより実施される：
Ｈ２６１Ａ−１：配列番号６６で表される、ＣＡＧＧＧＧＴＧＡＡＧＴＣＧＡＧＧ＾ＴＣＧ。このｇＲＮＡは、配列番号９９で表される核酸配列：ＣＡＧＧＧＧＴＧＡＡＧＴＣＧＡＧＧ＾ＴＣＧＴＧＧＣＡＧＧＧＧＴＧＡＡＧＴＣＧＡＧＧ＾ＴＣＧＴＧＧを含むプロトスペーサーを標的とする。
切断前：配列番号６７で表される、ＧＣＡＧＣＧＣＡＧＣＡＧＧＧＡＣＣＡＣ２６１ＧＡＣＣＴＣＣＣＡＧＧＴＧＡＧＧＧＧＣＴ。
切断後：配列番号６７で表される、ＧＣＡＧＣＧＣＡＧＣＡＧＧＧＡＣＣＡＣ２６１ＧＡ＾ＣＣＴＣＣＣＡＧＧＴＧＡＧＧＧＧＣＴ。
（ＰＡＭ配列は下線が引かれ、＾は切断部位を示し、太字は置換されるコドンを示す）。
【０３０２】
一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）は、ＨＤＲ用のテンプレートとして使用される。ｓｓＯＤＮは、新しいコドン配列に隣接する２つの相同性アームを含む。相同性アームは対称であり、ＰＡＭの両端から５０塩基を有する。
さらに、ＣＲＩＳＰＲ再切断を防ぐために、ＰＡＭブロッキング変異がＰＡＭ配列に導入される。
Ｈ２６１Ａ用のテンプレートｓｓＯＤＮオリゴ：
配列番号６８で表される、ＡＴＧＡＧＧＡＴＴＧＧＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＣＴＣＴＧＡＡＣＡＴＧＣＡＧＣＧＣＡＧＣＡＧＧＧＡＣＧＣＣ２６１ＧＡＣＣＴＣＣＣＡＧＧＴＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＣＣＣＣＴＧＡＴＧＣＴＣＡＣＣＴＣＣＣＣ。
【０３０３】
システイン３１９
システイン３１９は、ＭＰＯホモダイマーを含む２つのプロトマー間で唯一のジスルフィド架橋を形成する。システイン３１９のアラニンへの置換変異は、ＭＰＯ生合成を妨害し、そのペルオキシダーゼ活性を漸減させる。
システインからアラニンへの置換、Ｃ３１９Ａ（ＴＧＣのＧＣＣ／ＧＣＡ／ＧＣＴ／ＧＣＧへの変更）は、次のｇＲＮＡ配列を使って、システイン３１９のコドン配列内でＣａｓ９媒介ＤＳＢを用いて、実施例４で示したように実施された：
Ｃ３１９Ａ−１：配列番号４６で表される核酸配列ＧＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＴＧＣＴＣ＾ＣＣＧＧＧＧを含むプロトスペーサーを標的とする、配列番号４２で表される、ＧＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＴＧＣＴＣ＾ＣＣＧ。
切断前：配列番号６９で表される、ＣＣＴＧＧＣＣＣＡＧＡＴＣＴＣＡＴＴＧＣ３１９ＣＣＣＧＧＡＴＣＡＴＣＴＧＣＧＡＣＡＡ。
切断後：配列番号６９で表される、ＣＣＴＧＧＣＣＣＡＧＡＴＣＴＣＡＴＴＧＣ３１９ＣＣＣＧＧ＾ＡＴＣＡＴＣＴＧＣＧＡＣＡＡ。
（ＰＡＭ配列は下線が引かれ、＾は切断部位を示し、太字は置換されるコドンを示す）。
【０３０４】
一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）は、ＨＤＲ用のテンプレートとして使用された。ｓｓＯＤＮは、新しいコドン配列に隣接する２つの相同性アームを含む。相同性アームは対称であり、ＰＡＭの両端から５０塩基を有する。
さらに、ＣＲＩＳＰＲ再切断を防ぐために、ＰＡＭブロッキング変異がＰＡＭ配列に導入された。
Ｃ３１９Ａ用のテンプレートｓｓＯＤＮオリゴ：
配列番号７０で表される、ＧＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＣＡＴＧＣＡＧＣＡＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＡＧＡＴＣＴＣＡＴＧＣＣ３１９ＡＣＣＧＧＡＴＣＡＴＣＴＧＣＧＡＣＡＡＣＡＣＡＧＧＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＧＴＧＴＣＴＡＡＧＡＡＣＡＡＣＡＴ。 
【０３０５】
メチオニン２５１
トレオニンへの置換を生ずるメチオニン２５１のコード領域中のミスセンス変異は、遺伝性ＭＰＯ欠損を生じさせる。インビトロデータは、Ｍ２５１Ｔ置換が、ＭＰＯプロセッシングに影響を及ぼし、ペルオキシダーゼ活性を低減することを示唆する。
メチオニンからトレオニンへの置換、Ｍ２５１Ａ（ＡＴＧのＡＣＣ／ＡＣＡ／ＡＣＴ／ＡＣＧへの変更）は、次のｇＲＮＡ配列を使って、メチオニン２５１のコドン配列内でＣａｓ９媒介ＤＳＢを使って実施される：
Ｍ２５１Ａ−１：配列番号７１で表される、ＧＣＴＣＡＣＴＣＡＴＧＴＴＣＡＴＧ＾ＣＡＡ。このｇＲＮＡは、配列番号１００で表される核酸配列：ＧＣＴＣＡＣＴＣＡＴＧＴＴＣＡＴＧ＾ＣＡＡＴＧＧを含むプロトスペーサーを標的とする。
切断前：配列番号７２で表される、ＧＡＧＣＧＣＴＣＡＣＴＣＡＴＧ２５１ＴＴＣＡＴＧＣＡＡＴＧＧＧＧＣＣＡＧＣＴＧＴＴＧ。
切断後：配列番号７２で表される、ＧＡＧＣＧＣＴＣＡＣＴＣＡＴＧ２５１ＴＴＣＡＴＧ＾ＣＡＡＴＧＧＧＧＣＣＡＧＣＴＧＴＴＧ。
（ＰＡＭ配列は下線が引かれ、＾は切断部位を示し、太字は置換されるコドンを示す）。
【０３０６】
一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）は、ＨＤＲ用のテンプレートとして使用される。ｓｓＯＤＮは、新しいコドン配列に隣接する２つの相同性アームを含む。相同性アームは対称であり、ＰＡＭの両端から５０塩基を有する。
さらに、ＣＲＩＳＰＲ再切断を防ぐために、ＰＡＭブロッキング変異がＰＡＭ配列に導入される。
Ｍ２５１Ａ用のテンプレートｓｓＯＤＮオリゴ：
配列番号７３で表される、ＣＣＡＣＴＧＡＴＣＡＧＣＴＧＡＣＴＣＣＧＧＡＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＴＣＡＣＴＣＡＣＧ２５１ＴＴＣＡＴＧＣＡＡＴＧＴＧＧＣＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＣＣＡＣＧＡＣＣＴＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＣＴＧＡＧＣＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧ。
【０３０７】
アルギニン５６９
トリプトファンへの置換を生ずるアルギニン５６９のコード領域中のミスセンス変異は、遺伝性ＭＰＯ欠損を生じさせる。インビトロデータは、Ｒ５６９Ｗ置換が、ＭＰＯプロセッシングに影響を及ぼし、ヘム組み込みを妨害し、ペルオキシダーゼ活性を漸減させることを示唆する。
アルギニンからトレオニンへの置換、Ｒ５６９Ｗ（ＣＧＧからＴＧＧへの変更）は、次のｇＲＮＡ配列を使って、アルギニン５６９のコドン配列内でＣａｓ９媒介ＤＳＢを使って実施される：
Ｒ５６９Ｗ−１：配列番号７４で表される、ＡＡＴＴＧＣＡＧＴＧＧＡＴＧＡＧＡ＾ＴＣＣＧＧＧ。このｇＲＮＡは、配列番号１０１で表される核酸配列：ＡＡＴＴＧＣＡＧＴＧＧＡＴＧＡＧＡ＾ＴＣＣＧＧＧを含むプロトスペーサーを標的とする。
切断前：配列番号７５で表される、ＧＣＡＧＴＧＧＡＴＧＡＧＡＴＣＣＧＧ５６９ＧＡＧＣＧＡＴＴＧＴＴＴＧＡＧＣＡＧＧ。
切断後：配列番号７５で表される、ＧＣＡＧＴＧＧＡＴＧＡＧＡ＾ＴＣＣＧＧ５６９ＧＡＧＣＧＡＴＴＧＴＴＴＧＡＧＣＡＧＧ。
（ＰＡＭ配列は下線が引かれ、＾は切断部位を示し、太字は置換されるコドンを示す）。
【０３０８】
一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）は、ＨＤＲ用のテンプレートとして使用される。ｓｓＯＤＮは、新しいコドン配列に隣接する２つの相同性アームを含む。相同性アームは対称であり、ＰＡＭの両端から５０塩基を有する。
さらに、ＣＲＩＳＰＲ再切断を防ぐために、ＰＡＭブロッキング変異がＰＡＭ配列に導入される。
Ｒ５６９Ｗ用のテンプレートｓｓＯＤＮオリゴ：
配列番号７６で表される、ＣＡＣＣＣＣＴＧＣＣＡＡＧＣＴＧＡＡＴＣＧＴＣＡＧＡＡＣＣＡＡＡＴＴＧＣＡＧＴＧＧＡＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡ５６９ＧＡＧＣＧＡＴＴＧＴＴＴＧＡＧＣＡＧＧＴＣＡＴＧＡＧＧＡＴＴＧＧＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＣＴＣＴＧ。
【０３０９】
アルギニン４９９
位置４９９のアルギニンのシステインへの遺伝性置換変異は、ＭＰＯ欠損を生じる。アルギニン４９９は、不可欠のヒスチジン５０２の安定化に重要であることが示された。
アルギニンからシステインへの置換、Ｒ４９９Ｃ（ＣＧＣからＴＧＴ／ＴＧＣへの変更）は、次のｇＲＮＡ配列を使って、アルギニン４９９のコドン配列内でＣａｓ９媒介ＤＳＢを使って実施される：
Ｒ４９９Ｃ−１：配列番号７７で表される、ＴＴＣＡＣＣＡＡＴＧＣＣＴＴＣＣＧ＾ＣＴＡ。このｇＲＮＡは、配列番号１０２で表される核酸配列：ＴＴＣＡＣＣＡＡＴＧＣＣＴＴＣＣＧ＾ＣＴＡＣＧＧを含むプロトスペーサーを標的とする。
切断前：配列番号７８で表される、ＡＣＣＡＡＴＧＣＣＴＴＣＣＧＣ４９９ＴＡＣＧＧＣＣＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＣ。
切断後：配列番号７８で表される、ＡＣＣＡＡＴＧＣＣＴＴＣＣＧ＾Ｃ４９９ＴＡＣＧＧＣＣＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＣ。
（ＰＡＭ配列は下線が引かれ、＾は切断部位を示し、太字は置換されるコドンを示す）。
【０３１０】
一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）は、ＨＤＲ用のテンプレートとして使用される。ｓｓＯＤＮは、新しいコドン配列に隣接する２つの相同性アームを含む。相同性アームは対称であり、ＰＡＭの両端から５０塩基を有する。
さらに、ＣＲＩＳＰＲ再切断を防ぐために、ＰＡＭブロッキング変異がＰＡＭ配列に導入される。
Ｒ４９９Ｃ用のテンプレートｓｓＯＤＮオリゴ：
配列番号７９で表される、ＧＡＣＴＣＡＧＴＧＧＡＣＣＣＡＣＧＣＡＴＣＧＣＣＡＡＣＧＴＣＴＴＣＡＣＣＡＡＴＧＣＣＴＴＣＴＧＣ４９９ＴＡＣＣＧＣＣＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＣＣＡＡＣＣＣＴＴＣＡＴＧＴＴＣＣＧＣＣＴＧＧＡＣＡＡＴＣＧＧＴＡＣＣＡＧＣ。
【０３１１】
グリシン５０１
位置５０１のグリシンのセリンへの遺伝性置換変異は、ＭＰＯ欠損を生じる。アルギニン５０１は、不可欠のヒスチジン５０２の安定化に重要であることが示された。
グリシンからセリンへの置換、Ｇ５０１Ｓ（ＧＧＣのＡＧＴ／ＡＧＣへの変更）は、次のｇＲＮＡ配列を使って、グリシン５０１のコドン配列内でＣａｓ９媒介ＤＳＢにより実施される：
Ｇ５０１Ｓ−１：配列番号８０で表される、ＴＴＣＡＣＣＡＡＴＧＣＣＴＴＣＣＧ＾ＣＴＡ。このｇＲＮＡは、配列番号１０３で表される核酸配列：ＴＴＣＡＣＣＡＡＴＧＣＣＴＴＣＣＧ＾ＣＴＡＣＧＧを含むプロトスペーサーを標的とする。
切断前：配列番号８１で表される、ＡＣＣＡＡＴＧＣＣＴＴＣＣＧＣＴＡＣＧＧＣ５０１ＣＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＣ。
切断後：配列番号８１で表される、ＡＣＣＡＡＴＧＣＣＴＴＣＣＧ＾ＣＴＡＣＧＧＣ５０１ＣＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＣ。
（ＰＡＭ配列は下線が引かれ、＾は切断部位を示し、太字は置換されるコドンを示す）。
【０３１２】
一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）は、ＨＤＲ用のテンプレートとして使用される。ｓｓＯＤＮは、新しいコドン配列に隣接する２つの相同性アームを含む。相同性アームは対称であり、ＰＡＭの両端から５０塩基を有する。
さらに、ＣＲＩＳＰＲ再切断を防ぐために、ＰＡＭブロッキング変異がＰＡＭ配列に導入される。
Ｇ５０１Ｓ用のテンプレートｓｓＯＤＮオリゴ：
配列番号８２で表される、ＧＡＣＴＣＡＧＴＧＧＡＣＣＣＡＣＧＣＡＴＣＧＣＣＡＡＣＧＴＣＴＴＣＡＣＣＡＡＴＧＣＣＴＴＣＣＧＣＴＡＣＡＧＣ５０１ＣＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＣＣＡＡＣＣＣＴＴＣＡＴＧＴＴＣＣＧＣＣＴＧＧＡＣＡＡＴＣＧＧＴＡＣＣＡＧＣＣ。
【０３１３】
ヒスチジン５０２
ヒスチジン５０２は、ヘム鉄に配位結合する近位リガンドである。ヒスチジン５０２は、ＭＰＯヘム結合に不可欠である。
ヒスチジンからアラニンへの置換、Ｈ５０２Ａ（ＣＡＣのＧＣＣ／ＧＣＡ／ＧＣＴ／ＧＣＧへの変更）は、次のｇＲＮＡ配列を使って、ヒスチジン５０２のコドン配列内でＣａｓ９媒介ＤＳＢを用いて、実施例４で示したように実施された：
Ｈ５０２Ａ−１：配列番号４５で表される核酸配列ＧＧＡＴＧＡＧＧＧＴＧＴＧＧＣＣＧ＾ＴＡＧＣＧＧを含むプロトスペーサーを標的とする、配列番号３５で表される、ＧＧＡＴＧＡＧＧＧＴＧＴＧＧＣＣＧ＾ＴＡＧ。
切断前：配列番号８３で表される、ＡＣＣＡＡＴＧＣＣＴＴＣＣＧＣＴＡＣＧＧＣＣＡＣ５０２ＡＣＣＣＴＣＡＴＣＣＡ。
切断後：配列番号８３で表される、ＡＣＣＡＡＴＧＣＣＴＴＣＣＧＣＴＡ＾ＣＧＧＣＣＡＣ５０２ＡＣＣＣＴＣＡＴＣＣＡ。
（ＰＡＭ配列は下線が引かれ、＾は切断部位を示し、太字は置換されるコドンを示す）。
【０３１４】
一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）は、ＨＤＲ用のテンプレートとして使用された。ｓｓＯＤＮは、新しいコドン配列に隣接する２つの相同性アームを含む。相同性アームは対称であり、ＰＡＭの両端から５０塩基を有する。
さらに、ＣＲＩＳＰＲ再切断を防ぐために、ＰＡＭブロッキング変異がＰＡＭ配列に導入された。
Ｈ５０２Ａ用のテンプレートｓｓＯＤＮオリゴ：
配列番号８４で表される、ＴＡＣＡＡＴＧＡＣＴＣＡＧＴＧＧＡＣＣＣＡＣＧＣＡＴＣＧＣＣＡＡＣＧＴＣＴＴＣＡＣＣＡＡＴＧＣＣＴＴＡＣＧＣＴＡＣＧＧＣＧＣＣ５０２ＡＣＣＣＴＣＡＴＣＣＡＡＣＣＣＴＴＣＡＴＧＴＴＣＣＧＣＣＴＧＧＡＣＡＡＴＣＧＧＴ。
【０３１５】
システイン１５８
システイン１５８は、プロペプチド中でシステイン３１９とジスルフィド架橋を形成し、その変異はＭＰＯプロセッシングおよび放出を妨害する。
システインからアラニンへの置換Ｃ１５８Ａ（ＴＧＣのＧＣＣ／ＧＣＡ／ＧＣＴ／ＧＣＧへの変更）は、次のｇＲＮＡ配列を使って、システイン１５８のコドン配列内でＣａｓ９媒介ＤＳＢにより実施される：
Ｃ１５８Ａ−１：配列番号８５で表される、ＧＴＣＡＡＧＣＧＧＣＴＧＣＧＣＣＴ＾ＡＣＣ。このｇＲＮＡは、配列番号１０４で表される核酸配列：ＧＴＣＡＡＧＣＧＧＣＴＧＣＧＣＣＴ＾ＡＣＣＡＧＧを含むプロトスペーサーを標的とする。
切断前：配列番号８６で表される、ＧＴＣＣＡＡＧＴＣＡＡＧＣＧＧＣＴＧＣ１５８ＧＣＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＧＴＧＧＧＧ。
切断後：配列番号８６で表される、ＧＴＣＣＡＡＧＴＣＡＡＧＣＧＧＣＴＧＣ１５８ＧＣＣＴ＾ＡＣＣＡＧＧＡＣＧＴＧＧＧＧ。
（ＰＡＭ配列は下線が引かれ、＾は切断部位を示し、太字は置換されるコドンを示す）。
【０３１６】
一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）は、ＨＤＲ用のテンプレートとして使用される。ｓｓＯＤＮは、新しいコドン配列に隣接する２つの相同性アームを含む。相同性アームは対称であり、ＰＡＭの両端から５０塩基を有する。
さらに、ＣＲＩＳＰＲ再切断を防ぐために、ＰＡＭブロッキング変異がＰＡＭ配列に導入される。
Ｃ１５８Ａ用のテンプレートｓｓＯＤＮオリゴ：
配列番号８７で表される、ＧＡＣＧＣＣＣＧＣＣＣＡＧＣＴＧＡＡＴＧＴＧＴＴＧＴＣＣＡＡＧＴＣＡＡＧＣＧＧＣＧＣＣ１５８ＧＣＣＴＡＣＣＡＴＧＡＣＧＴＧＧＧＧＧＴＧＡＣＴＴＧＣＣＣＧＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＡＡＴＡＣＣＧＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＧＧＧ。
【０３１７】
アスパラギン３５５
アスパラギン３５５は、グリコシル化されることが知られている６個のアスパラギン残基の１個である。アスパラギン３５５の脱グリコシル化は、ＭＰＯ酵素活性を低下させることが示された。
アスパラギンからアラニンへの置換、Ｎ３５５Ａ（ＡＡＣのＧＣＣ／ＧＣＡ／ＧＣＴ／ＧＣＧへの変更）は、次のｇＲＮＡ配列を使って、アスパラギン３５５のコドン配列内でＣａｓ９媒介ＤＳＢを用いて実施される：
Ｎ３５５Ａ−１：配列番号８８で表される、ＧＣＴＧＧＴＴＧＧＡＣＡＴＧＴＴＧ＾ＣＧＣ。このｇＲＮＡは、配列番号１０５で表される核酸配列：ＧＣＴＧＧＴＴＧＧＡＣＡＴＧＴＴＧ＾ＣＧＣＡＧＧを含むプロトスペーサーを標的とする。
切断前：配列番号８９で表される、ＣＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＡＡＣＣＴＧＣＧＣＡＡＣ３５５ＡＴＧＴＣＣＡＡＣＣＡＧＣＴＧ。
切断後：配列番号８９で表される、ＣＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＡＡＣＣＴＧＣＧ＾ＣＡＡＣ３５５ＡＴＧＴＣＣＡＡＣＣＡＧＣＴＧ。
（ＰＡＭ配列は下線が引かれ、＾は切断部位を示し、太字は置換されるコドンを示す）。
【０３１８】
一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）は、ＨＤＲ用のテンプレートとして使用される。ｓｓＯＤＮは、新しいコドン配列に隣接する２つの相同性アームを含む。相同性アームは対称であり、ＰＡＭの両端から５０塩基を有する。
さらに、ＣＲＩＳＰＲ再切断を防ぐために、ＰＡＭブロッキング変異がＰＡＭ配列に導入される。
Ｎ３５５Ａ用のテンプレートｓｓＯＤＮオリゴ：
配列番号９０で表される、ＴＴＣＧＴＧＧＡＣＧＣＣＡＧＣＡＴＧＧＴＧＴＡＣＧＧＣＡＧＣＧＡＧＧＡＧＣＣＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＣＧＣＧＣＣ３５５ＡＴＧＴＣＣＡＡＣＣＡＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣＣＧＴＣＡＡＣＣＡＧＣＧＣＴＴＣＣ。 
【０３１９】
アルギニン１２８
スブチリシン様プロペプチドコンバターゼによるＭＰＯプロペプチド切断は、ＭＰＯ生合成のために必要である。アルギニン１２８は、スブチリシン様プロペプチドコンバターゼ認識部位の一部であり、別のアミノ酸によるその置換は、プロペプチド切断を防ぐはずである。
アルギニンからアラニンへの置換、Ｒ１２８Ａ（ＡＧＧのＧＣＣ／ＧＣＡ／ＧＣＴ／ＧＣＧへの変更）は、次のｇＲＮＡ配列を使って、アルギニン１２８のコドン配列内でＣａｓ９媒介ＤＳＢを用いて実施される：
Ｒ１２８Ａ−１：配列番号９１で表される、ＴＧＧＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧ＾ＧＡＧＡＧＧ。このｇＲＮＡは、配列番号１０６で表される核酸配列：ＴＧＧＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧ＾ＧＡＧＡＧＧを含むプロトスペーサーを標的とする。 
切断前：配列番号９２で表される、ＴＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＡＧＧ１２８ＡＡＧＣＴＧＣＧＧＴＣＣＣＴＧ。
切断後：配列番号９２で表される、ＴＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧ＾ＧＡＧＡＧＧ１２８ＡＡＧＣＴＧＣＧＧＴＣＣＣＴＧ。
（ＰＡＭ配列および置換されるコード配列は下線が引かれ、＾は切断部位を示す）。
【０３２０】
一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）は、ＨＤＲ用のテンプレートとして使用される。ｓｓＯＤＮは、新しいコドン配列に隣接する２つの相同性アームを含む。相同性アームは対称であり、ＰＡＭの両端から５０塩基を有する。
さらに、ＣＲＩＳＰＲ再切断を防ぐために、ＰＡＭブロッキング変異がＰＡＭ配列に導入される。
Ｒ１２８Ａ用のテンプレートｓｓＯＤＮオリゴ：
配列番号９３で表される、ＣＧＧＣＧＧＴＧＡＧＧＧＣＣＧＣＴＧＡＣＴＡＣＣＴＧＣＡＣＧＴＧＧＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＧＣＧ１２８ＡＡＧＣＴＧＣＧＧＴＣＣＣＴＧＴＧＧＣＧＡＡＧＧＣＣＡＴＴＣＡＡＴＧＴＣＡＣＴＧＡＴＧＴＧＣＴＧＡＣ。
【０３２１】
実施例６
ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集と組み合わせた造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）：臨床試験
患者適格性の評価
患者は、年齢、病状、臨床評価およびカルノフスキーパフォーマンススコアなどの機能評価に基づいて、ＨＳＣＴに対する身体的適格性を評価される。患者はまた、ＭＰＯ標的化ｇＲＮＡ配列に対する遺伝的適合性を確認するために、ＭＰＯ座位で配列決定される。
【０３２２】
ＣＤ３４＋可動化およびアフェレーシスによる採取
ＨＳＰＣは、腸骨稜骨髄吸引物から抽出されるまたは化学療法剤と顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）とを組み合わせた末梢血可動化法（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｍｅｎ）を用いて可動化でき、ＣＤ３４＋細胞が採集され、アフェレーシスにより赤血球および白血球から単離され、注入バッグ中に貯蔵される。収集された細胞の１ｋｇ当たり、２ｘ１０６個の臨界数の細胞を予備として２０％ＤＭＳＯで凍結保存した。
【０３２３】
ＣＤ３４＋遺伝子編集および遺伝子導入細胞の濃縮
濃縮ＣＤ３４＋細胞は、サイトカインで予備刺激され、ＭＰＯ遺伝子標的化遺伝子編集ベクターで処理され、例えば、適切なｃｒＲＮＡおよび蛍光標識蛍光標識ｔｒａｃｒＲＮＡと複合化したＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９リボ核タンパク質を用いて電気穿孔処理される。ＲＮＰ複合体のインキュベーション後に、ＣＤ３４＋細胞は、ｔｒａｃｒＲＮＡ由来またはベクター由来蛍光により、または他の適用可能な選択方法により濃縮される。
【０３２４】
編集されたＣＤ３４＋細胞の品質試験
ＭＰＯ編集ＣＤ３４＋細胞は、細菌または真菌混入、エンドトキシンおよびマイコプラズマの確認、ならびに細胞生存率の評価のために検査される。ＣＤ３４＋細胞内のＨＳＰＣ長期再増殖能力は、フローサイトメトリーにより評価され得る。
【０３２５】
遺伝子編集された細胞の拡張
ＭＰＯ編集ＣＤ３４＋細胞は、サイトカイン、金属キレート剤または小分子などの化合物を用いてエクスビボ拡張され、これは、移植のための臨界細胞数を得るために必要である、または生着率を改善するため好ましい場合がある。
【０３２６】
移植前処置
遺伝子編集ＨＳＰＣの注入の前に、患者は、骨髄細胞を抑制しドナー幹細胞の拒絶を防止するために、全身照射をしないでまたは全身照射に加えて、化学療法剤およびＡＴＧ（抗胸腺細胞グロブリン）を含む移植前処置を受ける。この手順は、骨髄破壊的または非骨髄破壊的治療計画を伴い得る。自己幹細胞移植の場合には、Ｇ−ＣＳＦによるＣＤ３４細胞の可動化およびＣＤ３４＋細胞のアフェレーシス後に、全身照射をしてまたはしないで、シトキサンおよびＡＴＧによる前処置が実施される。
【０３２７】
細胞投与
ＨＳＰＣ評価および移植前処置後に、患者は、少なくともｋｇ当たり、２ｘ１０６個の用量の細胞を静脈内投与される。
【０３２８】
移植後処理および監視
シクロスポリンタクロリムスなどの薬物を使用して、移植後免疫抑制療法が移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の防止のために適用される。予防的薬物投与が重度感染症の予防のために適用される。患者は、集中的看護で監視され、ＨＳＣＴまたは免疫抑制の起こり得る合併症、例えば、感染症、ＧＶＨＤなど、および治療の起こり得る副作用に対し治療がなされる。造血回復および生着率が評価され、成長因子を用いて促進される。
【０３２９】
実施例７
肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）の治療におけるＭＰＯノックアウト
さらなるＭＰＯ関連状態に対する有望な療法として提案されたＭＰＯ  ＫＯ未分化骨髄細胞の適用性を評価するために、次に、ラットのＰＡＨなどの血管障害に対するＭＰＯ  ＫＯの効果を調査した。具体的には、ラットのＳｕｇｅｎ５４１６／低酸素誘導（ＳｕＨｘ誘導）肺高血圧症モデルが使用される。ＳｕＨｘは、肺小動脈（ＰＡ）の血管筋肉化（ＲＶＳＰ）の顕著な増大、右心室の収縮期圧（ＲＶＳＰ）および右心室肥大（ＲＶＨ）の増大を引き起こす。
【０３３０】
より具体的には、ＳｕＨｘラットを、骨髄破壊的照射に暴露することにより、造血アブレーションに供し、続いて、ＭＰＯ−ＫＯまたはＷＴラット由来の骨髄（ＢＭ）細胞を再増殖させる。これにより、次の４種の実験群が生ずる：（１）ＷＴ  ＢＭを有するＷＴ（ＷＴ−ＷＴ）、（２）ＭＰＯ−ＫＯ  ＢＭを有するＷＴ（ＷＴ−ＭＰＯ  ＫＯ）、（３）ＷＴ  ＢＭを有するＳｕＨｘラット（ＳｕＨｘ−ＷＴ）および（４）ＭＰＯ−ＫＯ  ＢＭを有するＳｕＨｘラット（ＳｕＨｘ−ＭＰＯ  ＫＯ）。並行実験で、ＭＰＯ−ＫＯ  ＢＭの効果を、本発明の遺伝子編集システムを用いて操作される未分化ＭＰＯ−ＫＯ  ＢＭ細胞を使って、このラットＰＨＡモデルで評価する。
【０３３１】
ＰＨＡに対する未分化ＭＰＯ−ＫＯ  ＢＭ細胞の効果を評価するために、多形核好中球（ＰＭＮ）の活性化および脱顆粒を上に示した４種の実験群で測定する。またさらに、肺動脈圧（ＰＡ圧力）およびＲＶＳＰを測定し、肺組織中の炎症関連遺伝子のｍＲＮＡも全実験群のラット由来の肺ホモジネート中で定量する。
【０３３２】
血管収縮作用に対するＭＰＯ  ＫＯの効果もまた、各実験群から得た単離肺動脈（ＰＡ）セグメントのプロスタグランジンＦ２α（ＰＧＦ２α）への暴露により試験する。ＰＡＨのＭＰＯ依存性血管収縮の役割が、右心室圧−容積ループからの実効大動脈弾性率（Ｅａ）を評価することにより、さらに調査される。実効Ｅａは、脳室後負荷の定着パラメーターであり、従って、血管抵抗および血管コンプライアンスを反映している。
【０３３３】
免疫組織化学的試験を行って、４種全ての実験群で、肺細動脈の増大した血管の筋肉化の存在を比較する。
【０３３４】
実施例８
半月体形成性糸球体腎炎（ＣＧＮ）の治療におけるＭＰＯノックアウト
さらなるＭＰＯ関連状態に対する有望な療法として提案されたＭＰＯ  ＫＯ未分化骨髄細胞の適用性を評価するために、次に、ラットモデルで、腎機能の急激な低下により表される症候群である、半月体形成性糸球体腎炎（ＣＧＮ）に対するＭＰＯ  ＫＯの効果を調査する。具体的には、ヒトＭＰＯ−ＡＮＣＡで予備免疫化され、その後、リソソーム抽出物およびＨ２Ｏ２で潅流されるラットは、ＣＧＮを発症することが知られている。ヒトＭＰＯ−ＡＮＣＡによる予備免疫化は、ＩｇＧおよびＣ３沈着を起こし、かつ組織学的糸球体傷害が観察される場合があり、これは、ＩｇＧ免疫沈着物の量に比例する。
【０３３５】
より具体的には、予備免疫化ラットを、骨髄破壊的照射に暴露することにより造血アブレーションに供し、続いて、ＭＰＯ−ＫＯまたはＷＴラット由来の骨髄（ＢＭ）細胞を再増殖させる。これにより、次の４種の実験群が生ずる：（１）ＷＴ  ＢＭを有するＷＴ（ＷＴ−ＷＴ）、（２）ＭＰＯ−ＫＯ  ＢＭを有するＷＴ（ＷＴ−ＭＰＯ  ＫＯ）、（３）ＷＴ  ＢＭを有する予備免疫化ラット（Ｐｒｅｉｍｍ−ＷＴ）および（４）ＭＰＯ−ＫＯ  ＢＭを有する予備免疫化ラット（Ｐｒｅｉｍｍ−ＭＰＯ  ＫＯ）。並行実験で、ＭＰＯ−ＫＯ  ＢＭの効果を、本発明の遺伝子編集システムを用いて操作される未分化ＭＰＯ−ＫＯ  ＢＭ細胞を使って、このラットＣＧＮモデルで評価する。
【０３３６】
ＣＧＮに対する未分化ＭＰＯ−ＫＯ  ＢＭ細胞の効果を評価するために、上で指定した４種の実験群で、ラットの腎臓をアブレーションし、ＩｇＧおよびＣ３沈着ならびに組織学的糸球体傷害を調査する。
【図１】
2021529838.tif 000007
【図２】
2021529838.tif 000008
【図３】
2021529838.tif 000009
【図４】
2021529838.tif 000010
【図５】
2021529838.tif 000011
【図６】
2021529838.tif 000012
【図７】
2021529838.tif 000013
【図８】
2021529838.tif 000014
【図９】
2021529838.tif 000015
【図１０】
2021529838.tif 000016
【図１１Ａ】
2021529838.tif 000017
【図１１Ｂ】
2021529838.tif 000018
【図１１Ｃ】
2021529838.tif 000019
【図１１Ｄ】
2021529838.tif 000020
【図１１Ｅ】
2021529838.tif 000021
【図１１Ｆ】
2021529838.tif 000022
【図１１Ｇ】
2021529838.tif 000023
【図１１Ｈ】
2021529838.tif 000024
【図１１Ｉ】
2021529838.tif 000025
【図１１Ｊ】
2021529838.tif 000026
【図１１Ｋ】
2021529838.tif 000027
【図１１Ｌ】
2021529838.tif 000028
【図１１Ｍ】
2021529838.tif 000029
【図１１Ｎ】
2021529838.tif 000030
【図１２】
2021529838.tif 000031
【手続補正書】
【提出日】令和3年3月22日(2021.3.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021529838000001.app
【国際調査報告】
2021529838.tif 000032
2021529838.tif 000033
2021529838.tif 000034
2021529838.tif 000035
2021529838.tif 000036
2021529838.tif 000037
2021529838.tif 000038
2021529838.tif 000039
2021529838.tif 000040
2021529838.tif 000041
2021529838.tif 000042
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