(57)【要約】本開示は、癌の治療に関与する方法及び物質を提供する。本開示は、例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）ポリペプチドの発現レベルを低下させたキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲＴ）が提供される。また、本開示は、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドの発現レベルを低下させたＣＡＲＴの作製方法及び使用方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）ポリペプチドの発現レベルを低下させたキメラ抗原受容体Ｔ細胞を作製する方法であって、
核酸構築物であって、（ａ）ＧＭ−ＣＳＦメッセンジャーＲＮＡに対して相補的なガイドＲＮＡをコードする核酸と、（ｂ）Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸と、（ｃ）キメラ抗原受容体をコードする核酸とを含む、該核酸構築物を、生体外Ｔ細胞に導入する導入ステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記ガイドＲＮＡが、配列番号１に記載の核酸配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、
前記Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼであることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の方法であって、
前記キメラ抗原受容体をコードする前記核酸が、配列番号２に記載の核酸配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の方法であって、
前記核酸構築物が、ウイルスベクターであることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターであることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の方法であって、
前記キメラ抗原受容体が、腫瘍関連抗原を標的とすることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、
前記腫瘍関連抗原が、ＣＤ１９であることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の方法であって、
前記導入ステップが、形質導入を含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）ポリペプチドの発現レベルを低下させたキメラ抗原受容体Ｔ細胞を作製する方法であって、
複合体であって、（ａ）ＧＭ−ＣＳＦメッセンジャーＲＮＡに対して相補的なガイドＲＮＡと、（ｂ）Ｃａｓヌクレアーゼとを含む、該複合体を、生体外Ｔ細胞に導入する第１の導入ステップと、
キメラ抗原受容体をコードする核酸を前記生体外Ｔ細胞に導入する第２の導入ステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、
前記ガイドＲＮＡが、配列番号１に記載の核酸配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載の方法であって、
前記Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼであることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法であって、
前記キメラ抗原受容体をコードする前記核酸が、配列番号２に記載の核酸配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１０〜１３のいずれかに記載の方法であって、
前記複合体が、リボ核タンパク質であることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１０〜１４のいずれかに記載の方法であって、
前記キメラ抗原受容体が、腫瘍関連抗原を標的とすることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、
前記腫瘍関連抗原が、ＣＤ１９であることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１０〜１６のいずれかに記載の方法であって、
前記第１の導入ステップ及び前記第２の導入ステップが、エレクトロポレーションを含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
癌を有する哺乳動物を治療する方法であって、
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）ポリペプチドの発現レベルを低下させたキメラ抗原受容体Ｔ細胞を、前記哺乳動物に投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、
前記哺乳動物が、ヒトであることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１８または１９に記載の方法であって、
前記癌が、リンパ腫であることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、
前記リンパ腫が、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫であることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１８または１９に記載の方法であって、
前記癌が、白血病であることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、
前記白血病が、急性リンパ芽球性白血病であることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項１８〜２３のいずれかに記載の方法であって、
前記キメラ抗原受容体が、腫瘍関連抗原を標的とすることを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、
前記腫瘍関連抗原が、ＣＤ１９であることを特徴とする方法。
【請求項２６】
サイトカインポリペプチドの発現レベルを低下させたキメラ抗原受容体Ｔ細胞を作製する方法であって、
核酸構築物であって、（ａ）ＧＭ−ＣＳＦメッセンジャーＲＮＡに対して相補的なガイドＲＮＡをコードする核酸と、（ｂ）Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸と、（ｃ）キメラ抗原受容体をコードする核酸とを含む、該核酸構築物を、生体外Ｔ細胞に導入する導入ステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法であって、
前記サイトカインポリペプチドが、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）ポリペプチド及び／またはインターロイキン６（ＩＬ−６）ポリペプチドを含むことを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、
前記サイトカインポリペプチドが、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）ポリペプチドであり、
前記ガイドＲＮＡが、配列番号１に記載の核酸配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項２６〜２８のいずれかに記載の方法であって、
前記Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼであることを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項２６〜２９のいずれかに記載の方法であって、
前記キメラ抗原受容体をコードする前記核酸が、配列番号２に記載の核酸配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項２６〜３０のいずれかに記載の方法であって、
前記核酸構築物が、ウイルスベクターであることを特徴とする方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法であって、
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターであることを特徴とする方法。
【請求項３３】
請求項２６〜３２のいずれかに記載の方法であって、
前記キメラ抗原受容体が、腫瘍関連抗原を標的とすることを特徴とする方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法であって、
前記腫瘍関連抗原が、ＣＤ１９であることを特徴とする方法。
【請求項３５】
請求項２６〜３３のいずれかに記載の方法であって、
前記導入ステップが、形質導入を含むことを特徴とする方法。
【請求項３６】
サイトカインポリペプチドの発現レベルを低下させたキメラ抗原受容体Ｔ細胞を作製する方法であって、
複合体であって、（ａ）ＧＭ−ＣＳＦメッセンジャーＲＮＡに対して相補的なガイドＲＮＡと、（ｂ）Ｃａｓヌクレアーゼとを含む、該複合体を、生体外Ｔ細胞に導入する第１の導入ステップと、
キメラ抗原受容体をコードする核酸を前記生体外Ｔ細胞に導入する第２の導入ステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の方法であって、
前記サイトカインポリペプチドが、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）ポリペプチド及び／またはインターロイキン６（ＩＬ−６）ポリペプチドを含むことを特徴とする方法。
【請求項３８】
請求項３７に記載の方法であって、
前記サイトカインポリペプチドが、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）ポリペプチドであり、
前記ガイドＲＮＡが、配列番号１に記載の核酸配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項３９】
請求項３６〜３８のいずれかに記載の方法であって、
前記Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼであることを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項３６〜３９のいずれかに記載の方法であって、
前記キメラ抗原受容体をコードする前記核酸が、配列番号２に記載の核酸配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項４１】
請求項３６〜４０のいずれかに記載の方法であって、
前記複合体が、リボ核タンパク質であることを特徴とする方法。
【請求項４２】
請求項３６〜４１のいずれかに記載の方法であって、
前記キメラ抗原受容体が、腫瘍関連抗原を標的とすることを特徴とする方法。
【請求項４３】
請求項４２に記載の方法であって、
前記腫瘍関連抗原が、ＣＤ１９であることを特徴とする方法。
【請求項４４】
請求項３６〜４３のいずれかに記載の方法であって、
前記第１の導入ステップ及び前記第２の導入ステップが、エレクトロポレーションを含むことを特徴とする方法。
【請求項４５】
癌を有する哺乳動物を治療する方法であって、
サイトカインポリペプチドの発現レベルを低下させたキメラ抗原受容体Ｔ細胞を、前記哺乳動物に投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項４６】
請求項４５に記載の方法であって、
前記サイトカインポリペプチドが、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）ポリペプチド及び／またはインターロイキン６（ＩＬ−６）ポリペプチドを含むことを特徴とする方法。
【請求項４７】
請求項４６に記載の方法であって、
前記サイトカインポリペプチドが、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）であることを特徴とする方法。
【請求項４８】
請求項４５〜４７のいずれかに記載の方法であって、
前記哺乳動物が、ヒトであることを特徴とする方法。
【請求項４９】
請求項４５〜４８のいずれかに記載の方法であって、
前記癌が、リンパ腫であることを特徴とする方法。
【請求項５０】
請求項４９に記載の方法であって、
前記リンパ腫が、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫であることを特徴とする方法。
【請求項５１】
請求項４５〜４８のいずれかに記載の方法であって、
前記癌が、白血病であることを特徴とする方法。
【請求項５２】
請求項５１に記載の方法であって、
前記白血病が、急性リンパ芽球性白血病であることを特徴とする方法。
【請求項５３】
請求項４５〜５２のいずれかに記載の方法であって、
前記キメラ抗原受容体が、腫瘍関連抗原を標的とすることを特徴とする方法。
【請求項５４】
請求項５３に記載の方法であって、
前記腫瘍関連抗原が、ＣＤ１９であることを特徴とする方法。
【請求項５５】
キメラ抗原受容体Ｔ細胞のＴ細胞エフェクター機能を改善する方法であって、
核酸構築物であって、（ａ）ＧＭ−ＣＳＦメッセンジャーＲＮＡに対して相補的なガイドＲＮＡをコードする核酸と、（ｂ）Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸と、（ｃ）キメラ抗原受容体をコードする核酸とを含む、該核酸構築物を、生体外Ｔ細胞に導入する導入ステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項５６】
キメラ抗原受容体Ｔ細胞のＴ細胞エフェクター機能を改善する方法であって、
複合体であって、（ａ）ＧＭ−ＣＳＦメッセンジャーＲＮＡに対して相補的なガイドＲＮＡと、（ｂ）Ｃａｓヌクレアーゼとを含む、該複合体を、生体外Ｔ細胞に導入する第１の導入ステップと、
キメラ抗原受容体をコードする核酸を前記生体外Ｔ細胞に導入する第２の導入ステップと、を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１８年６月１日出願の米国特許出願第６２／６７９、３４８号、及び、２０１８年１０月３１日出願の米国特許出願第６２／７５３、４８５号に基づく優先権を主張するものである。上記出願の開示内容は、本開示の一部と見なされる（参照により本明細書に援用される）。
【０００２】
（技術分野）
本開示は、癌の治療に関与する方法及び物質（薬剤）に関する。例えば、本開示は、癌を有する哺乳動物（例えば、ヒト）を治療するための養子細胞療法（例えば、キメラ抗原受容体Ｔ細胞療法）において、１以上のサイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）の発現レベルを低下させたキメラ抗原受容体Ｔ細胞を使用するための方法及び物質を提供する。
【背景技術】
【０００３】
ＣＤ１９指向性キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲＴ１９）の安全性及び有効性を評価するピボタル試験による前例のない結果により、再発難治性急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を治療薬としてのＣＡＲＴ１９（Ｔｉｓａｇｅｎｌｅｃｌｅｕｃｅｌ）、及び、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）の治療薬としてのＣＡＲＴ１９（Ａｘｉ−Ｃｅｌ）が、最近ＦＤＡに承認された。ＣＡＲＴ細胞療法の適用は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）及び神経毒性を引き起こす毒性を伴う。加えて、ＣＡＲＴ細胞療法の有効性は、リンパ腫では４０％の持続的寛解、急性白血病では５０〜６０％の持続的寛解に限られている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示は、１以上のサイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）ポリペプチドの発現レベルを低下させたＴ細胞（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞（ＣＡＲＴ））を作製するための方法及び物質を提供する。例えば、Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲＴ）を操作することにより、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドの発現を低下させることができる（例えば、養子細胞療法での使用のために）。いくつかの場合では、Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲＴ）を操作して、１以上のサイトカインポリペプチド（例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチド）をコードする核酸をノックアウト（ＫＯ）することにより、そのＴ細胞におけるサイトカインポリペプチド（例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチド）の発現を低下させることができる。本開示はまた、１以上のサイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチド）の発現レベルを低下させたＴ細胞（例えば、ＣＡＲＴ）を使用するための方法及び物質を提供する。例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドの発現レベルを低下させたＴ細胞（例えば、ＣＡＲＴ）を、癌を有する哺乳動物に投与することによって（例えば、養子細胞療法において）、哺乳動物を治療することができる。
【０００５】
本明細書で実証されるように、ＧＭ−ＣＳＦ  ＫＯ  ＣＡＲＴは、ＧＭ−ＣＳＦの発現レベルを低下させ、インビトロモデル及びインビボモデルの両方において正常に機能し続ける。また、本明細書で実証されるように、ＧＭ−ＣＳＦ  ＫＯ  ＣＡＲＴは、ＣＡＲＴ細胞機能及び抗腫瘍活性を増強することができる。例えば、ＣＡＲＴ細胞増殖及び抗腫瘍活性の増強が、ＧＭ−ＣＳＦ後に観察される。単球存在下でのＣＡＲＴ１９抗原特異的増殖が、ＧＭ−ＣＳＦ枯渇後に、インビトロで増加する。ＡＬＬ患者由来の異種移植片において、ＣＡＲＴ１９細胞は、レンジルマブとの併用により、より持続的な疾患制御をもたらすことができる。また、ＧＭ−ＣＳＦ  Ｋ０  ＣＡＲＴ細胞は、ＮＡＬＭ６異種移植片において、白血病の制御により効果的である。いくつかの場合では、ＧＭ−ＣＳＦ  ＫＯ  ＣＡＲＴを養子Ｔ細胞療法（例えば、ＣＡＲＴ細胞療法）に組み込むことにより、例えば、癌を有する哺乳動物を、ＣＲＳ及び／または神経毒性を生じることなく治療することができる。例えば、ＧＭ−ＣＳＦ  ＫＯ  ＣＡＲＴを養子Ｔ細胞療法（例えば、ＣＡＲＴ細胞療法）に組み込むことにより、ＣＡＲＴ細胞療法後の治療ウィンドウを向上させることができる。いくつかの場合では、単一の構築物を、細胞（例えば、Ｔ細胞）へのＣＡＲの導入と、その細胞における１以上のサイトカインポリペプチドの発現の低下またはノックアウトとの両方に使用することができる。
【０００６】
一般的に、本開示の一態様は、サイトカインポリペプチドの発現レベルを低下させたＣＡＲＴ細胞を作製する方法を提供する。この方法は、核酸構築物であって、（ａ）サイトカインメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に対して相補的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸と、（ｂ）Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸と、（ｃ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸とを含む、該核酸構築物を、生体外Ｔ細胞に導入する導入ステップを含むか、または本質的に含む。サイトカインポリペプチドは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）ポリペプチド、インターロイキン６（ＩＬ−６）ポリペプチド、ＩＬ−１ポリペプチド、ｍ−ＣＳＦポリペプチド、及び／またはＭＩＰ−１Ｂポリペプチドを含み得る。サイトカインポリペプチドは、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドであり得る。ｇＲＮＡは、配列番号１に記載の核酸配列を含み得る。Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼであり得る。ＣＡＲをコードする核酸は、配列番号２に記載の核酸配列を含み得る。核酸構築物は、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）であり得る。ＣＡＲは、腫瘍関連抗原（例えば、ＣＤ１９）を標的とし得る。導入ステップは、形質導入を含み得る。
【０００７】
別の態様では、本開示は、サイトカインポリペプチドの発現レベルを低下させたＣＡＲＴ細胞を作製する方法を提供する。この方法は、複合体であって、（ａ）ＧＭ−ＣＳＦメッセンジャーＲＮＡに対して相補的なガイドＲＮＡと、（ｂ）Ｃａｓヌクレアーゼとを含む、該複合体を、生体外Ｔ細胞に導入する第１の導入ステップと、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を生体外Ｔ細胞に導入する第２の導入ステップと、を含むか、または本質的に含む。サイトカインポリペプチドは、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチド、及び／またはＩＬ−６ポリペプチドを含み得る。サイトカインポリペプチドは、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドであり得る。ｇＲＮＡは、配列番号１に記載の核酸配列を含み得る。Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼであり得る。ＣＡＲをコードする核酸は、配列番号２に記載の核酸配列を含み得る。複合体は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）であり得る。ＣＡＲは、腫瘍関連抗原（例えば、ＣＤ１９）を標的とし得る。第１の導入ステップ及び第２の導入ステップは、エレクトロポレーションを含み得る。
【０００８】
別の態様では、本開示は、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドの発現レベルを低下させたＣＡＲＴ細胞を作製する方法を提供する。この方法は、核酸構築物であって、（ａ）ＧＭ−ＣＳＦｍＲＮＡに対して相補的なガイドＲＮＡをコードする核酸と、（ｂ）Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸と、（ｃ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸とを含む、該核酸構築物を、生体外Ｔ細胞に導入する導入ステップを含む。ｇＲＮＡは、配列番号１に記載の核酸配列を含み得る。Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼであり得る。ＣＡＲをコードする核酸は、配列番号２に記載の核酸配列を含み得る。核酸構築物は、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）であり得る。ＣＡＲは、腫瘍関連抗原（例えば、ＣＤ１９）を標的とし得る。導入ステップは、形質導入を含み得る。
【０００９】
別の態様では、本開示は、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドの発現レベルを低下させたＣＡＲＴ細胞を作製する方法を提供する。この方法は、複合体であって、（ａ）ＧＭ−ＣＳＦメッセンジャーＲＮＡに対して相補的なガイドＲＮＡと、（ｂ）Ｃａｓヌクレアーゼとを含む、該複合体を、生体外Ｔ細胞に導入する第１の導入ステップと、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を生体外Ｔ細胞に導入する第２の導入ステップと、を含むか、または本質的に含む。ｇＲＮＡは、配列番号１に記載の核酸配列を含み得る。Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼであり得る。ＣＡＲをコードする核酸は、配列番号２に記載の核酸配列を含み得る。複合体は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）であり得る。ＣＡＲは、腫瘍関連抗原（例えば、ＣＤ１９）を標的とし得る。導入ステップは、エレクトロポレーションを含み得る。
【００１０】
別の態様では、本開示は、癌を有する哺乳動物を治療する方法を提供する。この方法は、サイトカインポリペプチドの発現レベルを低下させたキメラ抗原受容体Ｔ細胞を、哺乳動物に投与するステップを含むか、または本質的に含む。サイトカインポリペプチドは、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチド及び／またはＩＬ−６ポリペプチドを含み得る。サイトカインポリペプチドは、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドであり得る。ｇＲＮＡは、配列番号１に記載の核酸配列を含み得る。哺乳動物は、ヒトであり得る。癌は、リンパ腫（例えば、ＤＬＢＣＬ）であり得る。癌は、白血病（例えば、ＡＬＬ）であり得る。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、腫瘍関連抗原（例えば、ＣＤ１９）を標的とし得る。
【００１１】
別の態様では、本開示は、癌を有する哺乳動物を治療する方法を提供する。この方法は、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドの発現レベルを低下させたキメラ抗原受容体Ｔ細胞を、哺乳動物に投与するステップを含むか、または本質的に含む。哺乳動物は、ヒトであり得る。癌は、リンパ腫（例えば、ＤＬＢＣＬ）であり得る。癌は、白血病（例えば、ＡＬＬ）であり得る。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、腫瘍関連抗原（例えば、ＣＤ１９）を標的とし得る。
【００１２】
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての用語（専門用語、科学用語を含む）は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明を実施するために、本明細書に記載されたものと類似または同等の方法及び材料を使用することができるが、適切な方法及び材料については以下に記載する。本明細書に引用されたすべての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。矛盾が存在する場合、定義を含む、本明細書が優先する。加えて、材料、方法、及び実施例は、単なる例示にすぎず、限定を意図するものではない。
【００１３】
本発明の１以上の実施形態の詳細は、添付の図面及び以下の説明に記載される。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、本明細書の説明、図面、及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ＧＭ−ＣＳＦノックアウト（ＫＯ）細胞を操作するためにＣＲＩＳＰＲを使用する例示的な方法の概略図を含む。ＧＭ−ＣＳＦ（ＧＡＣＣＴＧＣＣＴＡＣＡＧＣＣＧＣＣ；配列番号１）のエクソン３を標的とするガイドＲＮＡ（コロニー刺激因子（ＣＳＦ２）としても知られている）を合成し、レンチウイルス（ＬＶ）プラスミドにクローニングした。このＬＶプラスミドを用いて２９３Ｔ細胞に形質導入し、その２４時間及び４８時間後に、レンチウイルス粒子を収集し、濃縮した。ＧＭ−ＣＳＦノックアウトＣＡＲＴ細胞を作製するために、０日目にＴ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激した。１日目に、Ｔ細胞にＣＡＲ１９レンチウイルス粒子を形質導入し、それと同時に、Ｔ細胞にＧＭＣＳＦノックアウトＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９レンチウイルス粒子を形質導入した。Ｔ細胞を８日間増殖させ、その後、回収した。
【図２Ａ】図２Ａ及び図２Ｂは、ＣＡＲ形質導入及びＧＭ−ＣＳＦノックアウト効率を示す。図２Ａは、ＧＭ−ＣＳＦのエクソン３を標的とするガイドＲＮＡを有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９レンチウイルスが２４．１％のノックアウト効率をもたらしたことを示すグラフを含む。増殖させた後に、ＣＡＲＴ細胞を回収し、ＤＮＡを単離し、配列決定のために送り、対照配列と比較した。その結果、ノックアウト効率は２４．１％であった。
【図２Ｂ】図２Ｂは、レンチウイルス形質導入後のＣＡＲ形質導入効率が７３％であったことを示すフローサイトメトリー分析を含む。フローサイトメトリー分析は、レンチウイルス形質導入後の６日目に行った。
【図３】図３は、ＧＭ−ＣＳＦＫＯＣＡＲＴ１９細胞が、ＣＡＲＴ細胞と比較してより少ないＧＭ−ＣＳＦを産生し、ＧＭ−ＣＳＦノックアウト対照Ｔ細胞が、対照非形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）と比較してより少ない量のＧＭ−ＣＳＦを産生することを示す。ＣＡＲＴ１９、ＧＭ−ＣＳＦＫＯＣＡＲＴ１９、ＵＴＤ、またはＧＭ−ＣＳＦＫＯＵＴＤを、ＣＤ１９陽性細胞株ＮＡＬＭ６と、１：５の比率で共培養した。４時間後、細胞を回収し、透過処理し、固定した。その後、サイトカインの細胞内染色を実施した。
【図４】図４は、ＧＭ−ＣＳＦＫＯＣＡＲＴ１９細胞が、ＣＡＲＴ１９と比較して、よりロバストに増殖することを示す。Ｔ細胞にウイルスを形質導入した後、その増殖速度を追跡した。ＧＭ−ＣＳＦＫＯは、ＣＡＲＴ１９単独と比較して、よりロバストに増殖する。
【図５】図５は、ＣＡＲ標的ＣＤ１９（ＣＡＲ１９）をコードする例示的核酸配列（配列番号２）を示す。
【図６Ａ】図６Ａ〜図６Ｄは、インビトロでのＧＭ−ＣＳＦ中和が、単球の存在下でＣＡＲ−Ｔ細胞増殖を増強し、かつ、ＣＡＲ−Ｔ細胞エフェクター機能を障害しないことを示す。図６Ａは、レンジルマブが、培地中でＣＡＲＴ１９単独と培養した、またはＮＡＬＭ６と共培養した３日後に多重検定すると、イソタイプ対照治療と比較して、インビトロでＧＭ−ＣＳＦを産生したＣＡＲ−Ｔ細胞を中和することを示すグラフを含む。ｎ＝２実験、１実験につき２回反復、代表的な実験を示す、＊＊＊ｐ＜０．００１、レンジルマブ及びイソタイプ対照治療間、ｔ検定、標準誤差（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＧＭ−ＣＳＦ中和抗体治療が、生きたＣＤ３細胞のＣＳＦＥフローサイトメトリー増殖アッセイによって分析された、ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖能を阻害しなかったことを示すグラフを含む。ｎ＝２実験、１実験につき２回反復、３日目の時点での代表的な実験を示す、ｎｓ  ｐ＞０．０５、レンジルマブ及びアイソタイプ対照治療間、ｔ検定、標準誤差。単独：媒体中でＣＡＲＴ１９単独、ＭＯＬＭ１３：ＣＡＲＴ１９＋ＭＯＬＭ１３、ＰＭＡ／ＩＯＮ：ＣＡＲＴ１９＋５ｎｇ／ｍＬ  ＰＭＡ／Ｏ．１μｇ／ｍＬ、ＩＯＮ／ＮＡＬＭ６：ＣＡＲＴ１９＋ＮＡＬＭ６。
【図６Ｃ】図６Ｃは、単球と共培養した場合、ＣＡＲＴ１９で治療したアイソタイプ対照と比較して、レンジルマブがＣＡＲＴ１９の増殖を増強したことを示すグラフを含む。３日目の時点でｎ＝３の生物学的複製物、１生物学的複製物につき２回反復、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、標準誤差。
【図６Ｄ】図６Ｄは、レンジルマブ治療が、ＮＡＬＭ６と培養した場合に、ＣＡＲＴ１９または非形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）の細胞毒性を阻害しなかったことを示すグラフを含む。ｎ＝２実験、１実験につき２回反復、４８時間の時点での代表的な実験を示す、ｎｓ  ｐ＞０．０５、レンジルマブ及びアイソタイプ対照治療間、ｔ検定、標準誤差。
【図７Ａ】図７Ａ〜図７Ｅは、ＧＭ−ＣＳＦのインビボでの中和が、異種移植片モデルにおいてＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍活性を増強することを示す。図７Ａは、ＮＳＧマウスに、ＣＤ１９＋ルシフェラーゼ＋細胞株ＮＡＬＭ６（マウスＩ．Ｖ．あたり１×１０６個の細胞）を投与した実験スキーマを含む。４〜６日後、マウスを画像化し、ランダム化し、１×１０６個のＣＡＲ−Ｔ１９またはそれと同等の数の対照ＵＴＤ細胞を投与し、その翌日、レンジルマブまたは対照ＩｇＧのいずれかを投与した（ＣＡＲ−Ｔの投与日から開始して１０日間にわたって、毎日１０ｍｇ／ｋｇをＩＰ投与）。マウスを連続生物発光イメージングで追跡し、ＣＡＲ‐Ｔ細胞投与後の７日目に始まる疾患負荷を評価し、全生存を追跡した。ＣＡＲ−Ｔ細胞投与後の７〜８日に、尾静脈出血を行った。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＧＭ−ＣＳＦ単一プレックスで分析したアイソタイプ対照治療と比較して、レンジルマブが、ＣＡＲ−Ｔ産生血清ＧＭ−ＣＳＦをインビボで中和することを示すグラフを含む。ｎ＝２実験、各群７〜８匹のマウス、代表的な実験、ＣＡＲ−Ｔ細胞／ＵＴＤ投与後８日目からの血清、＊＊＊ｐ＜０．００１、レンジルマブ及びアイソタイプ対照治療間、ｔ検定、標準誤差（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）。
【図７Ｃ】図７Ｃは、高腫瘍負荷再発性ＡＬＬ異種移植片モデルにおいて、ＣＡＲ−Ｔ投与後の７日目では、インビボにてレンジルマブで治療したＣＡＲ−Ｔがイソタイプ対照で治療したＣＡＲ−Ｔと比較して、腫瘍負荷を制御する上で同等に効果的であることを示すグラフを含む。ｎ＝２実験、各群７〜８匹のマウス、代表的な実験を示す、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊ｐ＜０．０５、ｎｓ  ｐ＞０．０５、ｔ検定、標準誤差。
【図７Ｄ】図７Ｄは、ＮＳＧマウスにＡＬＬ患者由来の芽球（マウスＩ．Ｖ．あたり１×１０６個の細胞）を投与したことを示す実験スキーマを含む。マウスを連続的に採血し、ＣＤ１９＋細胞数＞１／μｌの場合、マウスを、５×１０６個のＣＡＲＴ１９細胞（形質導入効率は約５０％である）またはＵＴＤ細胞と、レンジルマブまたは対照ＩｇＧのいずれかとの投与（ＣＡＲ−Ｔの投与日から開始して１０日間にわたって、毎日１０ｍｇ／ｋｇをＩＰ投与）を受けるようにランダム化した。マウスを連続尾静脈出血で追跡し、ＣＡＲ‐Ｔ細胞投与後の１４日目に始まる疾患負荷を評価し、全生存を追跡した。
【図７Ｅ】図７Ｅは、原発性急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）異種移植モデルにおいて、ＣＡＲ−Ｔ療法を用いたレンジルマブ治療が、ＣＡＲ−Ｔ療法を用いたアイソタイプ対照治療と比較して、長期間にわたってより持続的な腫瘍負荷の制御をもたらすことを示すグラフを含む。各群６匹のマウス、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、ｎｓ  ｐ＞０．０５、ｔ検定、標準誤差。
【図８】図８は、高腫瘍負荷再発性ＡＬＬ異種移植モデルにおいて、レンジルマブ＋ＣＡＲ−Ｔ細胞治療マウスが、イソタイプ対照＋ＣＡＲ−Ｔ細胞治療マウスと比較して、同等の生存率を有することを示すグラフを含む。ｎ＝２実験、各群７〜８匹のマウス、代表的な実験を示す、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊ｐ＜０．０５、対数順位検定。
【図９】ＧＭ−ＣＳＦ  ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９ノックアウトＣＡＲ−Ｔ細胞におけるゲノム変化を確認するための代表的なＴＩＤＥ配列を示すグラフを含む。ｎ＝２実験、代表的な実験を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜図１０Ｅは、ＧＭ−ＣＳＦＣＲＩＳＰＲノックアウトＣＡＲ−Ｔ細胞が、ＧＭ−ＣＳＦの発現低下、重要なサイトカインの同程度のレベル、及び抗腫瘍活性を増強することを示す。図１０Ａは、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９  ＧＭＣＳＦｋ／ｏＣＡＲ−Ｔが、野生型ＣＡＲＴ１９と比較して、ＧＭＣＳＦ産生の減少を示すが、他のサイトカイン産生及び脱顆粒は、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子破壊によって阻害されないことを示すグラフを含む。ｎ＝３実験、１実験につき２回反復、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊ｐ＜０．０５、ｎｓ  ｐ＞０．０５  ＧＭ−ＣＳＦｋ／ｏＣＡＲ−Ｔ及びＣＡＲ−Ｔと比較、ｔ検定、標準誤差（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＧＭ−ＣＳＦｋ／ｏＣＡＲ−Ｔが、ＣＡＲ−Ｔ療法と比較して、インビボで血清ヒトＧＭ−ＣＳＦの減少させたことを示すグラフを含む。多重化検定で評価、各郡５〜６匹のマウス（ＣＡＲＴ投与後の８日目の出血時には４〜６）、＊＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ＧＭ−ＣＳＦｋ／ｏＣＡＲ−Ｔ細胞及び野生型ＣＡＲＴ１９間、ｔ検定、標準誤差。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、ＧＭ−ＣＳＦ１ｋ／ｏＣＡＲＴ１９が、野生型ＣＡＲＴ１９と比較して、高腫瘍負荷再発性ＡＬＬ異種移植モデルにおいて、全生存を増強することを示すグラフを含む。各群５〜６匹のマウス、＊＊ｐ＜０．０１、対数順位検定。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、ヒトＧＭ−ＣＳＦ以外の血清の多重検定によるヒトサイトカインを示すヒートマップを含む。ＧＭ−ＣＳＦｋ／ｏＣＡＲ−Ｔ細胞と野生型ＣＡＲ−Ｔ細胞との間に統計的な差は見られず、重要なＴ細胞サイトカインがＧＭ−ＣＳＦ発現の低下によって有害に枯渇しないことを示唆している。各群５〜６匹のマウス（出血時には４〜６）、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｔ検定。
【図１０Ｅ】図１０Ｅは、ヒトＧＭ−ＣＳＦ以外の血清の多重検定によるマウスサイトカインを示すヒートマップを含む。ＧＭ−ＣＳＦｋ／ｏＣＡＲ−Ｔ細胞と野生型ＣＡＲ−Ｔ細胞との間に統計的な差は見られず、重要なＴ細胞サイトカインがＧＭ−ＣＳＦ発現の低下によって有害に枯渇しないことを示唆している。各群５〜６匹のマウス（出血時には４〜６）、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｔ検定。
【図１１】図１１は、インビボでＧＭ−ＣＳＦノックアウトＣＡＲ−Ｔ細胞が、高腫瘍負荷再発性ＡＬＬ異種移植モデルにおいて、ＣＡＲ−Ｔと比較して、腫瘍負荷の制御をわずかに増強することを示すグラフを含む。ｘ軸は、ＣＡＲ−Ｔ投与後の日数を示す、各群５〜６匹のマウス（ＵＴＤ群では２例が１３日目に残存した）、代表的な実験を示す、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊ｐ＜０．０５、２方向ＡＮＯＶＡ、標準誤差（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）。
【図１２Ａ】図１２Ａ〜図１２Ｄは、神経毒性及びサイトカイン放出症候群に対する患者由来の異種移植片モデルを示す。図１２Ａは、マウスが原発性ＡＬＬ患者の末梢血由来の１〜３×１０６個の原発性芽球の投与を受けたことを示す実験スキーマを含む。尾静脈出血により、約１０〜１３週間、マウスを生着についてモニターした。血清ＣＤ１９＋細胞が＞１０細胞／μｌの場合、マウスにＣＡＲＴ１９（２〜５×１０６個の細胞）を投与し、図示したように、合計１０日間の抗体治療を開始した。マウスの健康状態の尺度として、体重を毎日測定した。マウス脳ＭＲＩをＣＡＲＴ１９投与後の５〜６日目に行い、サイトカイン及びＴ細胞の分析のためにＣＡＲＴ１９投与後４〜１１日目に尾静脈出血を行い、２つの独立した実験を行った。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ＧＭ−ＣＳＦ中和とＣＡＲＴ１９との組み合わせが、ＡＬＬ細胞のＣＤ１９＋負荷の制御において、ＣＡＲＴ１９と組み合わせたアイソタイプ対照抗体と同等に効果的であることを示すグラフを含む。代表的な実験、各群３匹のマウス、ＣＡＲＴ１９投与の１１日後、＊ｐ＜０．０５、ＧＭ−ＣＳＦ中和及びＣＡＲＴ９とアイソタイプ対照間、＋ＣＡＲＴ９、ｔ検定、標準誤差（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、ＣＡＲＴ１９治療による脳ＭＲＩがＴ１増強を示し、脳血液脳関門破壊、及び浮腫の可能性を示唆する画像を含む。各群３匹のマウス、ＣＡＲＴ１９投与後の５〜６日目、代表画像。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、ＣＡＲＴ１９で治療した高腫瘍負荷初代ＡＬＬ異種移植片が、未治療ＰＤＸ対照と比較して、脳のヒトＣＤ３細胞浸潤を示すことを示すグラフを含む。各群３匹のマウス、代表画像。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜図１３Ｄは、インビボでのＧＭ−ＣＳＦ中和が、異種移植片モデルにおけるＣＡＲＴ１９治療後のサイトカイン放出症候群を改善することを示す。図１３Ａは、レンジルマブ及び抗マウスＧＭ−ＣＳＦ抗体が、ＣＡＲＴ１９及びアイソタイプ対照抗体で治療したマウスと比較して、ＣＲＳが誘導する体重減少を予防することを示すグラフを含む。各群３匹のマウス、２方向ＡＮＯＶＡ、標準誤差（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、ヒトＧＭ−ＣＳＦが、レンジルマブ及びマウスＧＭ−ＣＳＦ中和抗体で治療した患者由来異種移植片において中和されたことを示すグラフを含む。各群３匹のマウス、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊ｐ＜０．０５、ｔ検定、標準誤差。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、ＣＡＲＴ１９治療後に、ヒトサイトカイン（ＣＡＲＴ１１投与後１９日目に採取した血清）が、ＣＲＳにおいて典型的なサイトカインの増加を示すことを表すヒートマップを含む。図示のように、ＧＭ−ＣＳＦ中和は、ＧＭ−ＣＳＦ抗体及びアイソタイプ対照抗体で治療したマウスと比較して、いくつかのサイトカイン（例えば、いくつかの骨髄関連サイトカイン）の有意な減少をもたらした。各群３匹のマウス、ＣＡＲＴ１９投与後１１日目に採取した血清、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、ＧＭ−ＣＳＦ中和抗体治療マウス及びＣＡＲ−Ｔ細胞治療を受けたアイソタイプ対照治療マウスを比較、ｔ検定。
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、ＣＡＲＴ１９治療後に、マウスサイトカイン（ＣＡＲＴ１１投与後１９日目に採取した血清）が、ＣＲＳにおいて典型的なマウスサイトカインの増加を示すことを表すヒートマップを含む。図示のように、ＧＭ−ＣＳＦ中和は、ＧＭ−ＣＳＦ抗体及びアイソタイプ対照抗体で治療したマウスと比較して、いくつかのサイトカイン（例えば、いくつかの骨髄関連サイトカイン）の有意な減少をもたらした。各群３匹のマウス、ＣＡＲＴ１９投与後１１日目に採取した血清、＊ｐ＜０．０５、ＧＭ−ＣＳＦ中和抗体治療マウス及びＣＡＲ−Ｔ細胞治療を受けたアイソタイプ対照治療マウスを比較、ｔ検定。
【図１４Ａ】図１４Ａ〜図１４Ｄは、ＧＭ−ＣＳＦのインビボでの中和が、異種移植片モデルにおけるＣＡＲＴ１９治療後の神経毒性を改善することを示す。
【図１４Ｂ】図１４Ａ及び図１４Ｂは、ガドリニウム増強Ｔ１−高強度（立方ミリメートル）ＭＲＩにより、ＧＭ−ＣＳＦ中和が、アイソタイプ対照と比較して、脳の炎症、血液脳関門の破壊、及び浮腫の可能性の減少を助けることを示すことを表す。（Ａ）代表的画像、（Ｂ）各群３匹のマウス、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、１方向ＡＮＯＶＡ、標準誤差（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、ＣＡＲＴ１９療法による治療後に、ヒトＣＤ３Ｔ細胞が脳内に存在したことを示すグラフを含む。ＧＭ−ＣＳＦの中和は、脳半球におけるフローサイトメトリーによって分析されるように、脳におけるＣＤ３浸潤の減少傾向をもたらした。各群３匹のマウス、標準誤差。
【図１４Ｄ】図１４Ｄは、脳半球におけるフローサイトメトリーによる分析により、ＣＡＲ−Ｔ療法中にＧＭ−ＣＳＦ中和を受けたマウスの脳において、ＣＤ１１ｂ＋ブライトマクロファージが、ＣＡＲ−Ｔ療法中のアイソタイプ対照と比較して、減少したことを示すグラフを含む。各群３匹のマウス、標準誤差。
【図１５Ａ】図１５Ａ〜図１５Ｂは、ＧＭ−ＣＳＦｋ／ｏＣＡＲＴ１９細胞の例示的な作製を示す。実験スキーマはスキーマを表す。図１５Ａは、ＧＭ−ＣＳＦｋ／ｏＣＡＲＴ１９細胞の作製のためのＣＳＦ２（ＧＡＣＣＴＧＣＣＴＡＣＡＧＣＣＧＣＣ；配列番号１１）におけるｇＲＮＡ配列標的化位置を示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、ＧＭ−ＣＳＦｋ／ｏＣＡＲＴ１９細胞の作製に使用されるプライマー配列を示す。ＧＭ‐ＣＳＦｋ／ｏＣＡＲＴ１９細胞を作製するために、ＥＧ６プロモータの制御下でｇＲＮＡをＣａｓ９レンチウイルスベクターにクローニングし、レンチウイルス産生に使用した。正常ドナー由来のＴ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激し、その２４時間後にＣＡＲ１９ウイルス及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ウイルスを二重形質導入した。その後の６日目に、ＣＤ３／ＣＤ２８磁気ビーズを除去し、８日目に、ＧＭ−ＣＳＦｋ／ｏＣＡＲＴ１９細胞または対照ＣＡＲＴ１９細胞を凍結保存した。
【図１６】図１６は、ＲＮＡ配列決定に用いられる手順のフローチャートを示す。Ｉｌｌｕｍｉｎａｂｃｌ２ｆａｓｔｑソフトウェアを用いて、バイナリベースのコールデータをｆａｓｔｑに変換した。Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃを用いてアダプタ配列を削除し、ＦａｓｔＱＣを用いて品質をチェックした。最新のヒト（ＧＲＣｈ３８）及びマウス（ＧＲＣｍ３８）参照ゲノムを、ＮＣＢＩからダウンロードした。ＳＴＡＲ３０を用いてゲノムインデックスファイルを作成し、各条件についてペアエンドリードをゲノムにマッピングした。ＨＴＳｅｑを用いて各遺伝子の発現数を算出し、ＤｅＳｅｑ２を用いて差次的発現を算出した。Ｅｎｒｉｃｈｒを用いて、遺伝子オントロジーを評価した。
【図１７】図１７Ａ〜図１７Ｂは、ＧＭ−ＣＳＦ受容体が、刺激を与えるとにＴ細胞及びＣＡＲＴ細胞上でアップレギュレートされることを示す。図１７Ａは、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いた８日間のＴ細胞増殖プロトコル中における、Ｔ細胞及び休止Ｔ細胞（ネガティブ対照）上のＣＳＦ２ＲＡ（ＣＤ１１６）及びＣＳＦ２ＲＢ（ＣＤ１３１）の測定値を示す。ＣＳＦ２ＲＡ及びＣＳＦ２ＲＢの発現は、最初の刺激後に増加し、３日目にピークに達し、６日目の脱ビーズ化後にわずかに減少した。図１７Ｂは、ＣＡＲＴ１９及びＥＴＴＤ細胞上のＣＳＦ２ＲＡ（ＣＤ１１６）及びＣＳＦ２ＲＢ（ＣＤ１３１）の測定値を、８日間のＣＡＲＴ産生中の対照と比較して示す。発現は、１日目にわずかに減少し、３日目にピークに達した。
【図１８】図１８は、ＧＭ−ＣＳＦとＣＳＦ２受容体との相互作用が、β鎖（ＣＳＦ２ＲＢ）に依存することを示す。リン酸化Ｓｔａｔ５タンパク質の発現は、照射Ｎａｌｍ６及びＣＳＦ２ＲＡ遮断の存在下では増加したが、ＧＭ‐ＣＳＦ及びＣＳＦ２ＲＢ遮断の存在下では減少した。ＦＡＳは、ＣＳＦ２受容体経路の下流であり（例えば、「Takesono et ak, Journal of Cell Science 115:3039-3048 (2002)」参照）、その発現は、照射Ｎａｌｍ６及びＧＭ‐ＣＳＦ遮断の存在下ではわずかに減少したが、ＣＳＦ２ＲＡまたはＣＳＦ２ＲＢ遮断では減少しなかった。
【図１９】図１９Ａ〜図１９Ｃは、ＣＡＲＴ産生の８日目における、ＧＭ−ＣＳＦ１ｋ／ｏＣＡＲＴ１９とＣＡＲＴ１９との間のトランスクリプトームの差異を示す。図１９Ａは、有意に差次的に発現された２３６個の遺伝子を示す（Ｂｅｎｊａｍｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ補正ｐ値＜０．０５）。図１９Ｂは、ＧＭ−ＣＳＦ１ｋ／ｏＣＡＲＴ１９において、ＣＡＲＴ１９と比較して有意にダウンレギュレートされた遺伝子を示す。ボルケーノプロットは、ＧＭ−ＣＳＦ１ｋ／ｏＣＡＲＴ１９とＣＡＲＴ１９の間で有意にダウンレギュレートされた遺伝子の増加を示す。図１９Ｃは、ＣＡＲＴ１９のＧＭ−ＣＳＦノックアウトにより、遺伝子発現が正常化されたことを示す。
【図２０】図２０Ａ〜図２０Ｃは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９による正確なＣＳＦ２遺伝子特異的編集のための例示的な方法を示す。図２０Ａは、予想切断部位（ＰＡＭの３ｂｐ上流）と実際の切断部位（ＰＡＭの６ｂｐ上流）（上側パネル）を示す。参照配列（配列番号１）、欠失スキーマ（配列番号８）、及び挿入スキーマ（配列番号９）、並びに、ＣＡＲＴ１９の各生物学的複製における染色体５の塩基１３２０７４８２８における欠失及び挿入の頻度も示されている（下側パネル）。図２０Ｂは、対照（Ｔ細胞及びＣＡＲＴ１９細胞）と比較した、ＣＲＩＳＰＲノックアウト状態における一塩基変異体（ＳＮＶ）の数、及び、挿入／欠失（インデル）の数を示す。図２０Ｃは、ＣＲＩＳＰＲ編集細胞において検出された全変異体を、それらの各対照（ＣＡＲＴ１９またはＴ細胞）と比較して示す。交点における単一ＳＮＰは、ＣＳＦ２遺伝子の欠失である（図２０Ａ、側部パネル）。
【図２１】図２１は、Ｍ２マクロファージの存在下でのＧＭ−ＣＳＦ遮断が、イソタイプ対照での治療と比較して、ＣＤ１９刺激によるＣＡＲＴ１９の増殖を有意に増強することを示すグラフを含む。＊＊ｐ＜０．００５。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本開示は、１以上のサイトカインポリペプチド（例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチド）の発現レベルを低下させたＴ細胞（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞（ＣＡＲＴ））を作製するための方法及び物質を提供する。いくつかの場合では、Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲＴ）を操作して、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドをコードする核酸をノックアウト（ＫＯ）することにより、そのＴ細胞におけるＧＭ−ＣＳＦポリペプチドの発現を低下させることができる（例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドをコードする核酸をＫＯするように操作されないＴ細胞と比較して）。ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドをコードする核酸をＫＯするように操作したＴ細胞は、本明細書では、ＧＭ−ＣＳＦ  ＫＯ  Ｔ細胞と称する。いくつかの場合では、本開示により提供される方法及び物質は、骨髄系細胞を調節するのに用いることができる。いくつかの場合では、本開示により提供される方法及び物質を用いて、骨髄系細胞を枯渇させることができる。いくつかの場合では、本開示により提供される方法及び物質を用いて、Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲＴ）の効力を増強することができる。
【００１６】
本開示により提供されるＴ細胞（例えば、ＣＡＲＴ）は、任意の適切なサイトカインポリペプチドまたはサイトカインポリペプチドの組み合わせの発現レベルが低下するように設計される。例えば、本開示により提供されるＴ細胞（例えば、ＣＡＲＴ）は、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチド、インターロイキン６（ＩＬ−６）ポリペプチド、Ｇ−ＣＳＦ、インターフェロンγ（ＩＦＮ−ｇ）ポリペプチド、ＩＬ−１Ｂポリペプチド、ＩＬ−１０ポリペプチド、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）ポリペプチド、γ（ＭＩＧ）ポリペプチドによって誘導されるモノカイン、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）ポリペプチド（例えば、ＭＰＭｂポリペプチド）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−ａ）ポリペプチド、ＩＬ−２ポリペプチド、パーフォリンポリペプチド、または、これらの任意の組み合わせの発現レベルが低下するように設計される。例えば、Ｔ細胞は、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチド及びＩＬ−６ポリペプチドの両方の発現レベルが低下するように設計される。
【００１７】
「発現レベルを低下させる」という表現は、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）の発現レベルに関して本明細書で使用する場合、そのサイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）の基準発現レベルよりも低い任意の発現レベルにすることを指す。「基準レベル」という用語は、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）に関して本明細書で使用する場合、そのサイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）の発現レベルが低下するように操作されていない１以上の哺乳動物（例えば、ヒト）由来の試料（例えば、対照試料）において通常観察される、そのサイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）の発現レベルを指す。対照試料としては、これに限定しないが、野生型Ｔ細胞（例えば、ＧＭ−ＳＣＦ  ＫＯ  Ｔ細胞以外のＴ細胞）が挙げられる。いくつかの場合では、サイトカインポリペプチド（例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチド）の低下した発現レベルは、そのサイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）を検出不可能なレベルであり得る。いくつかの場合では、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドの低下した発現レベルは、ＧＭ−ＣＳＦの排除されたレベルであり得る。
【００１８】
いくつかの場合では、ＧＭ−ＣＳＦ  ＫＯ  Ｔ細胞などの１以上のサイトカインポリペプチドの発現レベルを低下させた（例えば、発現レベルが低下するように操作した）Ｔ細胞は、Ｔ細胞脱顆粒及びサイトカイン放出などの正常なＴ細胞機能を維持することができる（例えば、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチド）の発現レベルが低下するように操作されていないＣＡＲＴと比較して）。
【００１９】
いくつかの場合では、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドの発現レベルを低下させた（例えば、発現レベルが低下するように操作した）Ｔ細胞（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ  ＫＯ  Ｔ細胞）は、ＣＡＲＴ機能、例えば、抗腫瘍活性、増殖、細胞殺滅、サイトカイン産生、枯渇感受性、抗原特異的エフェクター機能、持続性、及び分化などを増強することができる（例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドの発現レベルが低下するように操作されていないＣＡＲＴと比較して）。
【００２０】
いくつかの場合では、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドの発現レベルを低下させた（例えば、発現レベルが低下するように操作した）Ｔ細胞（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ  ＫＯ  Ｔ細胞）は、Ｔ細胞の増殖を増強することができる（例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドの発現レベルが低下するように操作されていないＣＡＲＴと比較して）。
【００２１】
１以上のサイトカインの発現レベルを低下させた（例えば、発現レベルが低下するように操作した）Ｔ細胞（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ  ＫＯ  Ｔ細胞）は、任意の適切なＴ細胞であり得る。Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞であり得る。１以上のサイトカインの発現レベルが低下するように設計されたＴ細胞の例としては、これに限定しないが、細胞傷害性Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋ＣＴＬ、及び／またはＣＤ８＋ＣＴＬ）が挙げられる。例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドの発現レベルが低下するように操作したＴ細胞は、ＣＡＲＴであり得る。いくつかの場合では、１以上のＴ細胞は、哺乳動物（例えば、癌を有する哺乳動物）から取得することができる。例えば、Ｔ細胞は、本開示に係る物質及び方法で処理される哺乳動物から取得することができる。
【００２２】
１以上のサイトカインポリペプチド（例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチド）の発現レベルを低下させた（例えば、発現レベルが低下するように操作した）Ｔ細胞（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ  ＫＯ  Ｔ細胞）は、任意の適切な方法を用いて作製することができる。いくつかの場合では、Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲＴ）を操作して、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドをコードする核酸をＫＯすることにより、そのＴ細胞におけるＧＭ−ＣＳＦポリペプチドの発現を低下させることができる。
【００２３】
いくつかの場合では、Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲＴ）を操作して、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチド）をコードする核酸をＫＯすることにより、そのＴ細胞におけるそのサイトカインポリペプチドの発現を低下させる場合には、任意の適切な方法を用いて、そのサイトカインをコードする核酸をＫＯすることができる。サイトカインポリペプチド（例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチド）をコードする核酸配列をノックアウトするのに使用することができる技術の例としては、これに限定しないが、遺伝子編集、相同的組み換え、非相同的末端結合、及びマイクロホモロジー末端結合が挙げられる。例えば、遺伝子編集によって（例えば、遺伝子操作したヌクレアーゼを用いて）、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドをコードする核酸をＫＯすることができる。ゲノム編集に有用なヌクレアーゼとしては、これに限定しないが、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼ、及びホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ；メガヌクレアーゼとも呼ばれる）が挙げられる。
【００２４】
いくつかの場合では、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）／Ｃａｓ系を使用して（例えば、１以上のＴ細胞に導入して）、サイトカインポリペプチド（例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチド）をコードする核酸をＫＯすることができる（例えば、図１及び実施例１を参照）。サイトカインポリペプチド（例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチド）をコードする核酸をＫＯするのに使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、任意の適切なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み得る。いくつかの場合では、ｇＲＮＡは、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチド（例えば、ＧＭ−ＣＳＦｍＲＮＡ）をコードする核酸に対して相補的であり得る。ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドをコードする核酸に対して特異的なｇＲＮＡの例としては、これに限定しないが、いくつかの場合では、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドをコードする核酸をＫＯするように設計されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のｇＲＮＡ成分が挙げられ、そのようなｇＲＮＡ成分は、配列番号１に記載の核酸配列を含み得る。
【００２５】
サイトカインポリペプチド（例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチド）をコードする核酸をＫＯするのに使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、任意の適切なＣａｓヌクレアーゼを含み得る。Ｃａｓヌクレアーゼの例としては、これに限定しないが、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、及びＣｐｆｌが挙げられる。いくつかの場合では、サイトカインポリペプチド（例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチド）をコードする核酸をＫＯするように設計されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のＣａｓ成分は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼであり得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系のＣａｓ９ヌクレアーゼは、レンチＣＲＩＳＰＲｖ２であり得る（例えば、「Shalem et al., 2014 Science 343:84-87; and Sanjana et al., 2014 Nature methods 11 : 783-784」参照）。
【００２６】
サイトカインポリペプチド（例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチド）をコードする核酸をＫＯするのに使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の成分（例えば、ｇＲＮＡ及びＣａｓヌクレアーゼ）は、任意の適切なフォーマットで１以上のＴ細胞（例えば、ＣＡＲＴ）に導入され得る。いくつかの場合では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の成分が、ｇＲＮＡをコードする核酸、及び／またはＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸として、１以上のＴ細胞に導入され得る。例えば、少なくとも１つのｇＲＮＡ（例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドをコードする核酸に対して特異的なｇＲＮＡ配列）をコードする核酸と、少なくとも１つのＣａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）をコードする核酸とが、１以上のＴ細胞に導入され得る。いくつかの場合では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の成分が、ｇＲＮＡ及び／またはＣａｓヌクレアーゼとして、１以上のＴ細胞に導入され得る。例えば、少なくとも１つのｇＲＮＡ（例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドをコードする核酸に対して特異的なｇＲＮＡ配列）と、少なくとも１つのＣａｓヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９ヌクレアーゼ）とが、１以上のＴ細胞に導入され得る。
【００２７】
いくつかの場合では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の成分（例えば、ｇＲＮＡ及びＣａｓヌクレアーゼ）を、それらをコードする核酸（例えば、ｇＲＮＡをコードする核酸及びＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸）として、１以上のＴ細胞に導入する場合、核酸は、任意の適切な形態であり得る。例えば、核酸は、構築物（例えば、発現構築物）であり得る。少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸、及び、少なくとも１つのＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸は、別個の核酸構築物上または同一の核酸構築物上に存在し得る。いくつかの場合では、少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸、及び、少なくとも１つのＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸は、単一の核酸構築物上に存在し得る。核酸構築物は、任意の適切なタイプの核酸構築物であり得る。少なくとも１つのｇＲＮＡ及び／または少なくとも１つのＣａｓヌクレアーゼを発現させるのに使用することができる核酸構築物としては、これに限定しないが、発現プラスミド及びウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）が挙げられる。少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸、及び、少なくとも１つのＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸が、別個の核酸構築物上に存在する場合、核酸構築物は、互いに同一のタイプの構築物または互いに異なるタイプの構築物であり得る。いくつかの場合では、サイトカインポリペプチド（例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチド）をコードする核酸に対して特異的な少なくとも１つのｇＲＮＡ配列をコードする核酸、及び、少なくとも１つのＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸は、単一のレンチウイルスベクター上に存在し得る。例えば、サイトカインポリペプチド（例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチド）をコードする核酸に対して特異的な少なくとも１つのｇＲＮＡ配列をコードし、配列番号１に記載の配列を含む少なくとも１つのｇＲＮＡをコードし、かつ、少なくとも１つのＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするレンチウイルスベクターが、そのサイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチド）の発現レベルを低下させるためのＴ細胞の生体外操作で使用され得る。
【００２８】
いくつかの場合では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の成分（例えば、ｇＲＮＡ及びＣａｓヌクレアーゼ）が、１以上のＴ細胞（例えば、ｇＲＮＡ及び／またはＣａｓヌクレアーゼとして）に直接導入され得る。ｇＲＮＡ及びＣａｓヌクレアーゼは、１以上のＴ細胞に別々にまたは一緒に導入され得る。ｇＲＮＡ及びＣａｓヌクレアーゼが１以上のＴ細胞に一緒に導入される場合、ｇＲＮＡ及びＣａｓヌクレアーゼは、複合体であり得る。ｇＲＮＡとＣａｓヌクレアーゼとが複合体を形成している場合、ｇＲＮＡとＣａｓヌクレアーゼとの結合は、共有結合であってもよいし、非共有結合であってもよい。いくつかの場合では、ｇＲＮＡ及びＣａｓヌクレアーゼを含む複合体は、１以上の別の成分も含み得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の成分（例えば、ｇＲＮＡ及びＣａｓヌクレアーゼ）を含む複合体の例としては、これに限定しないが、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）及びエフェクター複合体（例えば、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、Ｃａｓヌクレアーゼを含む）が挙げられる。例えば、少なくとも１つのｇＲＮＡと、少なくとも１つのＣａｓヌクレアーゼとが、ＲＮＰに含まれ得る。いくつかの場合では、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）は、ｇＲＮＡとＣａｓヌクレアーゼとを、約１：１〜約１０：１（例えば、約１：１〜約１０：１、約２：１〜約１０：１、約３：１〜約１０：１、約５：１〜約１０：１、約８：１〜約１０：１、約１：１〜約９：１、約１：１〜約７：１、約１：１〜約５：１、約１：１〜約４：１、約１：１〜約３：１、約１：１〜約２：１、約２：１〜約８：１、約３：１〜約６：１、約４：１〜約５：１、または約５：１〜約７：１）の比で含み得る。例えば、ＲＮＰは、ｇＲＮＡとＣａｓヌクレアーゼとを、約１：１の比で含み得る。例えば、ＲＮＰは、ｇＲＮＡとＣａｓヌクレアーゼとを、約２：１の比で含み得る。いくつかの場合では、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドをコードする核酸に対して特異的な少なくとも１つのｇＲＮＡ配列（例えば、配列番号１に記載の配列を含む少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする）と、少なくとも１つのＣａｓ９ヌクレアーゼとを含むＲＮＰを、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドの発現レベルを低下させるためのＴ細胞の生体外操作で使用することができる。
【００２９】
サイトカインポリペプチド（例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチド）をコードする核酸をＫＯするのに使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の成分（例えば、ｇＲＮＡ及びＣａｓヌクレアーゼ）は、任意の適切な方法を用いて、１以上のＴ細胞（例えば、ＣＡＲＴ）に導入することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の成分をＴ細胞に導入する方法は、物理的な方法であり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の成分をＴ細胞に導入する方法は、化学的な方法であり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の成分をＴ細胞に導入する方法は、粒子ベースの方法であり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の成分を１以上のＴ細胞に導入するのに用いることができる方法の例としては、これに限定しないが、エレクトロポレーション、トランスフェクション（例えば、リポフェクション）、形質導入（例えば、ウイルスベクター媒介形質導入）、マイクロインジェクション、及びヌクレオフェクションが挙げられる。いくつかの場合では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の成分が、その成分をコードする核酸として、１以上のＴ細胞に導入することによって、その成分をコードする核酸を１以上のＴ細胞に形質導入することができる。例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドをコードする核酸に対して特異的な少なくとも１つのｇＲＮＡ配列（例えば、配列番号１に記載の配列を含む少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする）と、少なくとも１つのＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするレンチウイルスベクターとを、Ｔ細胞（例えば、生体外Ｔ細胞）に形質導入することができる。いくつかの場合では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の成分を１以上のＴ細胞に直接導入することによって、その成分を１以上のＴ細胞に形質導入することができる。例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドをコードする核酸に対して特異的な少なくとも１つのｇＲＮＡ配列（例えば、配列番号１に記載の配列を含む少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする）と、少なくとも１つのＣａｓ９ヌクレアーゼとを含むＲＮＰを、Ｔ細胞（例えば、生体外Ｔ細胞）にエレクトロポレーションすることができる。いくつかの場合では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の成分を、１以上のＴ細胞に生体外で導入することができる。例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドの発現レベルを低下させたＴ細胞の生体外操作は、単離されたＴ細胞に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の成分をコードするレンチウイルスベクターを形質導入することを含み得る。例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドの発現レベルを低下させたＴ細胞の生体外操作は、単離されたＴ細胞に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の成分を含む複合体をエレクトロポレーションすることを含み得る。ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドの発現レベルが低下するようにＴ細胞を生体外操作する場合、そのＴ細胞は、任意の適切な供給源（例えば、治療される哺乳動物またはドナー哺乳動物などの哺乳動物、または細胞株）から取得することができる。
【００３０】
いくつかの場合では、Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲＴ）を、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチド発現またはＧＭ−ＣＳＦポリペプチド活性を阻害する１以上の阻害剤で処理することによって、そのＴ細胞におけるＧＭ−ＣＳＦポリペプチド発現を減少させることができる（例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチド発現またはＧＭ−ＣＳＦポリペプチド活性を阻害する１以上の阻害剤で処理しなかったＴ細胞と比較して）。ＧＭ−ＣＳＦポリペプチド発現またはＧＭ−ＣＳＦポリペプチド活性の阻害剤は、任意の適切な阻害剤であり得る。ＧＭ−ＣＳＦポリペプチド発現またはＧＭ−ＣＳＦポリペプチド活性の阻害剤の例としては、これに限定しないが、ＲＮＡ干渉（例えば、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子）を誘導するように設計された核酸分子、アンチセンス分子、ｍｉＲＮＡ、受容体遮断剤、及び抗体（例えば、アンタゴニスト抗体及び中和抗体）が挙げられる。
【００３１】
１以上のサイトカインの発現レベルを低下させた（例えば、発現レベルが低下するように操作した）Ｔ細胞（例えばＧＭ−ＣＳＦ  ＫＯ  Ｔ細胞）は、任意の適切な抗原受容体を発現することができる。いくつかの場合では、抗原受容体は、異種抗原受容体であり得る。いくつかの場合では、抗原受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり得る。いくつかの場合では、抗原受容体は、腫瘍抗原（例えば、腫瘍特異的抗原）受容体であり得る。例えば、Ｔ細胞は、癌を有する哺乳動物において癌細胞によって発現した腫瘍特異的抗原（例えば、細胞表面腫瘍特異的抗原）を標的とする腫瘍特異的抗原受容体を発現するように操作される。サイトカインポリペプチド（例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチド）の発現レベルを低下させたＴ細胞において発現される抗原受容体によって認識される抗原の例としては、これに限定しないが、分化クラスター１９（ＣＤ１９）、ムチン１（ＭＵＣ−１）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ−２）、エストロゲン受容体（ＥＲ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ−１２５、上皮性腫瘍抗原（ＥＴＡ）、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＬＬ−１、Ｅ−カドヘリン、葉酸受容体α、葉酸受容体β、ＩＬ１３Ｒ、ＥＧＦＲｖｉｉｉ、ＣＤ２２、ＣＤ２０、κ軽鎖、λ軽鎖、デスモプレシン、ＣＤ４４ｖ、ＣＤ４５、ＣＤ３０、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＣＤ１３８、ＦＡＰ、ＣＳ−１、及びＣ−ｍｅｔが挙げられる。例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドの発現レベルを低下させたＴ細胞は、ＣＤ１９を標的とする抗原受容体を発現するように設計することができる。ＣＡＲ標的ＣＤ１９（ＣＡＲ１９）をコードする例示的な核酸配列を図５に示す。
【００３２】
任意の適切な方法を用いて、１以上のサイトカインポリペプチドの発現レベルを低下させた（例えば、発現レベルが低下するように操作した）Ｔ細胞（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ  ＫＯ  Ｔ細胞）上に抗原受容体を発現させることができる。例えば、抗原受容体をコードする核酸を、１以上のＴ細胞に導入することができる。いくつかの場合では、ウイルス形質導入を用いて、抗原受容体をコードする核酸を非分裂細胞に導入することができる。抗原受容体をコードする核酸は、任意の適切な方法を用いて、Ｔ細胞に導入することができる。いくつかの場合では、抗原受容体をコードする核酸は、形質導入（例えば、レンチウイルスベクターなどのレトロウイルスベクターを用いたウイルス形質導入）、またはトランスフェクションによって、Ｔ細胞に導入することができる。いくつかの場合では、抗原受容体をコードする核酸を、１以上のＴ細胞に、生体外で導入することができる。例えば、抗原受容体を発現するＴ細胞の生体外操作は、単離されたＴ細胞に、抗原受容体をコードするレンチウイルスベクターを形質導入することを含み得る。抗原受容体を発現するようにＴ細胞が生体外で操作する場合、そのＴ細胞は、任意の適切な供給源（例えば、治療される哺乳動物、ドナー哺乳動物などの哺乳動物、または細胞株）から取得することができる。
【００３３】
いくつかの場合では、１以上のサイトカインポリペプチドの発現レベルを低下させた（例えば、発現レベルが低下するように操作した）Ｔ細胞（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ  ＫＯ  Ｔ細胞）が抗原受容体も発現するように設計する（例えば、抗原受容体も発現するように操作する）場合、そのＴ細胞は、任意の適切な方法を用いて、そのサイトカインの発現レベルが低下し、かつ抗原受容体を発現するように操作される。いくつかの場合では、まず、Ｔ細胞を、サイトカインポリペプチド（例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチド）の発現レベルが低下するように操作し、次いで、抗原受容体を発現するように操作する（または、その逆も可能である）。いくつかの場合では、Ｔ細胞における、１以上のサイトカインポリペプチド（例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチド）の発現レベルを低下させる操作と、抗原受容体を発現させる操作とを同時に行ってもよい。例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドなどのサイトカインポリペプチドの発現を低下させるのに使用される１以上の核酸（例えば、そのサイトカインをコードする核酸に対して特異的な少なくとも１つのｇＲＮＡ配列をコードするレンチウイルスベクター、及び少なくとも１つのＣａｓ９ヌクレアーゼ、またはそのサイトカインのｍＲＮＡに対して相補的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドをコードする核酸）と、抗原受容体をコードする１以上の核酸（例えば、ＣＡＲ）とを、１以上のＴ細胞に同時に導入することができる。サイトカインポリペプチド（例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチド）の発現を低下させるのに使用される１以上の核酸、及び抗原受容体をコードする１以上の核酸は、別個の核酸構築物または単一の核酸構築物上で１以上のＴ細胞に導入することができる。いくつかの場合では、サイトカインポリペプチド（例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチド）の発現を低下させるのに使用される１以上の核酸、及び抗原受容体をコードする１以上の核酸は、単一の核酸構築物上の１以上のＴ細胞に導入することができる。いくつかの場合では、サイトカインポリペプチド（例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチド）の発現を低下させるのに使用される１以上の核酸、及び抗原受容体をコードする１以上の核酸は、１以上のＴ細胞に生体外で導入することができる。１以上のサイトカインポリペプチド（例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチド）の発現レベルが低下し、かつ抗原受容体を発現するようにＴ細胞を生体外で操作する場合、そのＴ細胞は、任意の適切な供給源（例えば、治療される哺乳動物、ドナー哺乳動物などの哺乳動物、または細胞株）から取得することができる。
【００３４】
いくつかの場合では、１以上のサイトカインポリペプチドの発現レベルを低下させた（例えば、発現レベルが低下するように操作した）Ｔ細胞（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ  ＫＯ  Ｔ細胞）を刺激することができる。Ｔ細胞は、１以上のサイトカインポリペプチドの発現レベルを低下させる操作と同時に刺激してもよいし、１以上のサイトカインポリペプチドの発現レベルを低下させる操作とは別々に操作してもよい。例えば、まず、養子細胞療法で使用されるＧＭ−ＣＳＦポリペプチドの発現レベルを低下させた１以上のＴ細胞を刺激し、次いで、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドの発現レベルが低下するように操作する（または、その逆も可能である）。いくつかの場合では、まず、養子細胞療法に使用されるサイトカインポリペプチド（例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチド）の発現レベルを低下させた１以上のＴ細胞を刺激し、次いで、そのサイトカインポリペプチドの発現レベルが低下するように操作する。Ｔ細胞は、任意の適切な方法を用いて刺激することができる。例えば、Ｔ細胞を１以上のＣＤポリペプチドと接触させることによって、Ｔ細胞を刺激することができる。Ｔ細胞を刺激するのに使用することができるＣＤポリペプチドの例としては、これに限定しないが、ＣＤ３、ＣＤ２８、誘導性Ｔ細胞補助刺激因子（ＩＣＯＳ）、ＣＤ１３７、ＣＤ２、０Ｘ４０、及びＣＤ２７が挙げられる。いくつかの場合では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の成分（例えば、ｇＲＮＡ及び／またはＣａｓヌクレアーゼ）をＴ細胞に導入して１以上のサイトカインポリペプチド（例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチド）をコードする核酸をＫＯする前に、ＣＤ３及びＣＤ２８でＴ細胞を刺激することができる。
【００３５】
本開示はまた、癌の治療に関与する方法及び物質を提供する。例えば、サイトカインポリペプチドの発現レベルを低下させた（例えば、発現レベルが低下するように操作した）Ｔ細胞（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ  ＫＯ  Ｔ細胞）を、癌を有する哺乳動物（例えば、ヒト）に投与することよって（例えば、ＣＡＲＴ療法などの養子細胞療法において）、哺乳動物を治療することができる。いくつかの場合では、本開示に係る、癌を有する哺乳動物を治療する方法は、哺乳動物の癌細胞（例えば、腫瘍抗原を発現する癌細胞）の数を減少させることができる。いくつかの場合では、本開示に係る、癌を有する哺乳動物を治療する方法は、哺乳動物の１以上の腫瘍（例えば、腫瘍抗原を発現する腫瘍）の大きさを減少させることができる。
【００３６】
いくつかの場合では、サイトカインポリペプチドの発現レベルを低下させた（例えば、発現レベルが低下するように操作した）Ｔ細胞（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ  ＫＯ  Ｔ細胞）を哺乳動物に投与しても、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）は生じない。
例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドの発現レベルを低下させたＴ細胞を哺乳動物に投与しても、ＣＲＳに関連するサイトカイン（例えば、ＣＲＳクリティカルサイトカイン）の放出は生じない。ＣＲＳに関連するサイトカインの例としては、これに限定しないが、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−１Ｂ、ＩＬ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＩＧ、ＭＩＰ、ＭＩＰ−１ｂ、ＴＮＦ−ａ、ＩＬ−２、及びパーフォリンが挙げられる。
【００３７】
いくつかの場合では、サイトカインポリペプチドの発現レベルを低下させた（例えば、発現レベルが低下するように操作した）Ｔ細胞（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ  ＫＯ  Ｔ細胞）を哺乳動物に投与しても、神経毒性は生じない。例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドの発現レベルを低下させたＴ細胞を哺乳動物に投与しても、神経毒と関連する白血球の分化及び／または活性化は生じない。その分化及び／または活性化が神経毒性と関連する白血球の例としては、これに限定しないが、単球、マクロファージ、Ｔ細胞、樹状細胞、ミクログリア、星状細胞、及び好中球が挙げられる。
【００３８】
癌を有する任意の適切な哺乳動物（例えば、ヒト）は、本開示の方法を用いて治療することができる。本開示の方法を用いて治療することができる哺乳動物の例としては、これに限定しないが、ヒト、霊長類（サルなど）、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、マウス、及びラットが挙げられる。例えば、癌を有するヒトは、例えば、本開示に係る方法及び物質を用いたＣＡＲＴ細胞療法などの養子Ｔ細胞療法において、サイトカインポリペプチド（例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチド）の発現レベルを低下させた（例えば、発現レベルが低下するように操作した）１以上のＴ細胞を用いて治療することができる。
【００３９】
癌を有する哺乳動物（例えば、ヒト）を本開示の方法を用いて治療する場合、癌は、任意の適切な癌であり得る。いくつかの場合では、本開示の方法を用いて治療される癌は、固形腫瘍であり得る。いくつかの場合では、本開示の方法を用いて治療される癌は、血液癌であり得る。いくつかの場合では、本開示の方法を用いて治療される癌は、原発性癌であり得る。いくつかの場合では、本開示の方法を用いて治療される癌は、転移性癌であり得る。いくつかの場合では、本開示の方法を用いて治療される癌は、難治性癌であり得る。いくつかの場合では、本開示の方法を用いて治療される癌は、再発癌であり得る。いくつかの場合では、本開示の方法を用いて治療される癌は、腫瘍関連抗原（例えば、癌細胞によって産生される抗原物質）を発現し得る。本開示の方法を用いて治療することができる癌の例としては、これに限定しないが、Ｂ細胞癌（例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、及びＢ細胞白血病）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫、頭頸部癌、肉腫、乳癌、消化管悪性腫瘍、膀胱癌、尿路上皮癌、腎臓癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、生殖器癌（例えば、男性生殖器癌及び女性生殖器癌）、及び骨癌が挙げられる。例えば、サイトカインポリペプチド（例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチド）の発現レベルを低下させた（例えば、発現レベルが低下するように操作した）１以上のＴ細胞（例えばＧＭ−ＣＳＦ  ＫＯ  Ｔ細胞）を使用して、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）を有する哺乳動物を治療することができる。例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドの発現レベルを低下させた（例えば、発現レベルが低下するように操作した）１以上のＴ細胞（例えばＧＭ−ＣＳＦ  ＫＯ  Ｔ細胞）を使用して、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を有する哺乳動物を治療することができる。
【００４０】
任意の適切な方法を用いて、癌を有する哺乳動物を識別することができる。例えば、イメージング技術及び生検技術を使用して、癌を有する哺乳動物（例えば、ヒト）を識別することができる。
【００４１】
癌（例えば、ＤＬＢＣＬまたはＡＬＬ）を有すると識別されると、哺乳動物に対して、サイトカインポリペプチドの発現レベルを低下させた（例えば、発現レベルが低下するように操作した）１以上のＴ細胞（例えばＧＭ−ＣＳＦ  ＫＯ  Ｔ細胞）を投与することができる。
【００４２】
例えば、サイトカインポリペプチドの発現レベルを低下させた（例えば、発現レベルが低下するように操作した）１以上のＴ細胞（例えばＧＭ−ＣＳＦ  ＫＯ  Ｔ細胞）を、癌を有する哺乳動物を治療するための養子Ｔ細胞療法（例えば、ＣＡＲＴ細胞療法）に使用することができる。例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドの発現レベルを低下させた１以上のＴ細胞を、哺乳動物（例えば、癌を有する哺乳動物）の任意の適切な抗原を標的とする養子Ｔ細胞療法（例えば、ＣＡＲＴ細胞療法）に使用することができる。いくつかの場合では、抗原は、腫瘍関連抗原（例えば、癌細胞によって産生される抗原物質）であり得る。本開示により提供される養子Ｔ細胞療法によって標的とすることができる腫瘍関連抗原の例としては、これに限定しないが、ＣＤ１９（ＤＬＢＣＬ、ＡＬＬ、及びＣＬＬに関連する）、ＡＦＰ（胚細胞腫瘍及び／または肝細胞癌に関連する）、ＣＥＡ（腸癌、肺癌、及び／または乳癌に関連する）、ＣＡ−１２５（卵巣癌に関連する）、ＭＵＣ−１（乳癌に関連する）、ＥＴＡ（乳癌に関連する）、ＭＡＧＥ（悪性黒色腫に関連する）、ＣＤ３３（ＡＭＬに関連する）、ＣＤ１２３（ＡＭＬに関連する）、ＣＬＬ−１（ＡＭＬに関連する）、Ｅ−カドヘリン（上皮性腫瘍に関連する）、葉酸受容体α（卵巣癌に関連する）、葉酸受容体ｆｅｔａ（卵巣癌及びＡＭＬに関連する）、ＩＬ１３Ｒ（脳腫瘍に関連する）、ＥＧＦＲｖｉｉｉ（脳腫瘍に関連する）、ＣＤ２２（Ｂ細胞癌に関連する）、ＣＤ２０（Ｂ細胞癌に関連する）、カッパ軽鎖（Ｂ細胞癌に関連する）、ラムダ軽鎖（Ｂ細胞癌に関連する）、ＣＤ４４ｖ（ＡＭＬに関連する）、ＣＤ４５（血液癌に関連する）、ＣＤ３０（ホジキンリンパ腫及びＴ細胞リンパ腫に関連する）、ＣＤ５（Ｔ細胞リンパ腫に関連する）、ＣＤ７（Ｔ細胞リンパ腫に関連する）、ＣＤ２（Ｔ細胞リンパ腫に関連する）、ＣＤ３８（多発性骨髄腫及びＡＭＬに関連する）、ＢＣＭＡ（多発性骨髄腫に関連する）、ＣＤ１３８（多発性骨髄腫及びＡＭＬに関連する）、ＦＡＰ（固形腫瘍に関連する）、ＣＳ−１（多発性骨髄腫に関連する）、及びｃ−Ｍｅｔ（乳癌に関連する）が挙げられる。例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドの発現レベルを低下させた１以上のＴ細胞を、癌を治療するためにＣＤ１９（例えば、ＣＡＲＴ１９細胞療法）を標的とするＣＡＲＴ細胞療法に用いることができる。
【００４３】
いくつかの場合では、サイトカインポリペプチドの発現レベルを低下させた（例えば、発現レベルが低下するように操作した）１以上のＴ細胞（例えばＧＭ−ＣＳＦ  ＫＯ  Ｔ細胞）を養子Ｔ細胞療法（例えば、ＣＡＲＴ細胞療法）に使用して、癌以外の疾患または障害を有する哺乳動物を治療することができる。例えば、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドの発現レベルを低下させた１以上のＴ細胞を、哺乳動物の任意の適切な疾患関連抗原（例えば、特定の疾患の影響を受けた細胞によって産生された抗原物質）を標的とする養子Ｔ細胞療法（例えば、ＣＡＲＴ細胞療法）に使用することができる。本開示により提供される養子Ｔ細胞療法によって標的化することができる疾患関連抗原の例としては、これに限定しないが、デスモプレシン（自己免疫性皮膚疾患に関連する）が挙げられる。
【００４４】
いくつかの場合では、養子Ｔ細胞療法に使用されるサイトカインポリペプチドの発現レベルを低下させた（例えば、発現レベルが低下するように操作した）１以上のＴ細胞（例えばＧＭ−ＣＳＦ  ＫＯ  Ｔ細胞）を、癌を有する哺乳動物に、癌を治療するために使用される１以上の追加の薬剤との併用療法として投与することができる。例えば、養子細胞療法で使用されるＧＭ−ＣＳＦポリペプチドの発現レベルを低下させた１以上のＴ細胞を、１以上の抗癌治療（例えば、手術、放射線療法、化学療法（例えば、ブスルファンなどのアルキル化剤）、標的療法（例えば、レンジルマブなどのＧＭ−ＣＳＦ阻害剤）、ホルモン療法、血管新生阻害薬、免疫抑制薬（例えば、トシリズマブなどのインターロイキン−６阻害剤））、及び／または、１以上のＣＲＳ治療（例えば、ルキソリチニブやイブルチニブ）と組み合わせて、哺乳動物に投与することができる。養子細胞療法で使用される、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドの発現レベルを低下させた１以上のＴ細胞を、癌を治療するための１以上の追加の薬剤と共に使用する場合、１以上の追加の薬剤は、Ｔ細胞と同時に、または、Ｔ細胞とは別々に投与することができる。いくつかの場合では、まず、養子細胞療法で使用されるＧＭ−ＣＳＦポリペプチドの発現レベルを低下させた１以上のＴ細胞を投与し、次いで、１以上の追加の薬剤を投与する（または、その逆も可能である）。
【００４５】
以下、実施例により本発明をさらに説明するが、以下に説明する実施例は、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定するものではない。
【００４６】
実施例
【００４７】
実施例１：ＣＡＲＴ細胞治療の治療指標を増加させるための欠損ＣＡＲＴ細胞へのサイトカインの生成。
【００４８】
本実施例は、ＧＭ−ＣＳＦノックアウト（ＧＭ−ＣＳＦ  ＫＯ）ＣＡＲＴ１９細胞の作製について説明し、その結果得られたＧＭ−ＣＳＦ  ＫＯ  ＣＡＲＴ１９細胞が正常に機能し、かつ増殖が増強されたことを示す。
【００４９】
実験計画：
【００５０】
Ｂ細胞白血病異種移植片のＣＡＲ１９を使用した。このプラスミドは、本明細書に記載されているように、パッケージング及びレンチウイルスの製造に使用した。マウスモデルとして、２つのモデルを用いた。
【００５１】
１．異種移植モデル。ＮＳＧマウスに、ＣＤ１９陽性ルシフェラーゼ陽性細胞株ＮＡＬＭ６を皮下移植した。移植は、生物発光イメージングによって確認した。マウスに、ヒトＰＢＭＣを静脈内投与し、かつ、レンチウイルス粒子を腫瘍内投与した。ＣＡＲＴ細胞の生成を、フローサイトメトリーで測定した。ＣＡＲＴの腫瘍部位への移動を評価し、疾患負荷の指標として抗腫瘍反応を生物発光イメージングによって測定した。
【００５２】
２．ジャクソン研究所から入手したヒト化免疫系（ＨＩＳ）マウス。これらのマウスは、新生児の頃に胎児ＣＤ３４＋細胞を注入され、そのため、ヒト造血系が発生した。これらのマウスに、以前に使用したように、ＣＤ１９＋細胞株ＮＡＬＭ６を移植した。同様に、レンチウイルス粒子を体腔内注入することにより、インビボ（生体内）でＣＡＲＴ１９を作製した。その後、ＮＡＬＭ６の根絶におけるＣＡＲＴ１９細胞の活性を測定し、エクスビボ（生体外）で作製したレンチウイルスが形質導入されたＣＡＲＴ１９細胞（現在、病院で使用されている）と比較した。
【００５３】
材料及び方法：
【００５４】
ＣＡＲプラスミドの作製：
【００５５】
抗ＣＤ１９クローンＦＭＣ６３を、４１ＢＢ及びＣＤ３ゼータを使用してＣＡＲバックボーンにデノボ合成し、次いで、第三世代レンチウイルスバックボーンにクローニングした。
【００５６】
対照ＣＡＲＴ１９細胞を作製するために、パンＴ細胞キットを使用して正常ドナーＴ細胞をネガティブ選択し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、培養初日に添加）を使用してエクスビボ（生体外）で増殖させた。Ｔ細胞を３の感染多重度（ＭＯＩ）で刺激した翌日に、Ｔ細胞にレンチウイルス上清を形質導入した。抗ＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズを６日目に除去し、Ｔ細胞をＴ細胞培地（Ｘ−ｖｉｖｏ  １５培地、ヒト血清５％、ペニシリン、ストレプトマイシン、及びグルタミン）中で最大１５日間増殖させ、その後、将来の実験のために凍結保存した。全ての実験に先立ち、Ｔ細胞を解凍し、３７℃で一晩静置した。
【００５７】
ＧＭ−ＣＳＦノックアウトＣＡＲＴ細胞の作製：
【００５８】
ＧＭ−ＣＳＦノックアウトＣＡＲＴ細胞を、下記の２つの方法論を用いて、ＣＲＩＳＲ−Ｃａｓ９系を使用して作製した。
【００５９】
１． ｇＲＮＡを作製し、Ｃａｓ９をコードするレンチウイルスベクターにクローニングした。Ｔ細胞の増殖中に、Ｔ細胞に、１日目に、同日に、及び、ＣＡＲ１９レンチウイルス粒子と同時に、このレンチウイルスを形質導入した。細胞を８日間培養し、その後、Ｔ細胞を採取し、ＤＮＡを単離及び配列決定し、ノックアウト効率を評価した。これらの細胞を凍結保存し、将来のインビトロ実験またはインビボ実験に使用した。これをコードする核酸配列を図５に示す。
【００６０】
２．ｇＲＮＡからｍＲＮＡを作製し、作製したｍＲＮＡを使用してＧＭ−ＣＳＦをノックアウトした。そのために、ｇＲＮＡをＲＮＰと１：１の比率で混合し、次いで、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズでの刺激後の３日目に、Ｔ細胞をエレクトロポレーションした。細胞を８日間培養し、その後、Ｔ細胞を採取し、ＤＮＡを単離及び配列決定し、ノックアウト効率を評価した。これらの細胞を凍結保存し、将来のインビトロ実験またはインビボ実験に使用した。
【００６１】
細胞：
【００６２】
ＮＡＬＭ６細胞株をＡＴＣＣから入手し、Ｒ１０培地（ＲＰＭＩ培地、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシン）中で維持した。ＥＦ１ａプロモーターの制御下でルシフェラーゼ−ＧＦＰ細胞が形質導入されたＮＡＬＭ６細胞を、いくつかの実験で使用した。非同定原発性ヒトＡＬＬ試料は、メイヨー・クリニック・バイオバンク（Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｂｉｏｂａｎｋ）から入手した。全ての試料は、書面によるインフォームドコンセントの後に取得した。全ての機能試験において、細胞は、分析の少なくとも１２時間前に解凍し、３７℃で一晩静置した。
【００６３】
フローサイトメトリー分析：
【００６４】
抗ヒト抗体は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、またはＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から購入した。細胞をインビトロ培養または動物から単離し、２％ウシ胎児血清を添加したＰＢＳ中で１回洗浄し、Ｆｃ受容体を遮断し、そして、４℃で染色した。細胞数の定量は、製造業者の指示書に従ってカウントブライトビーズ（Ｃｏｕｎｔｂｒｉｇｈｔ ｂｅａｄｓ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行った。全ての分析において、目的の集団は、前方対側方散乱特性に基づいてゲートし、続いて、一重項ゲートし、そして、ライブ／デッドアクア（Ｌｉｖｅ  Ｄｅａｄ  Ａｑｕａ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して生細胞をゲートした。抗ＣＤ１９ＣＡＲの表面発現は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ社から入手したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７共役ヤギ抗マウスＦ（ａｂ´）２抗体で染色することによって検出した。
【００６５】
Ｔ細胞機能アッセイ：
【００６６】
Ｔ細胞脱顆粒及び細胞内サイトカインアッセイ：
【００６７】
簡潔に説明すると、Ｔ細胞を標的細胞と１：５の比率でインキュベートした。ＣＡＲ発現の染色後；ＣＤ１０７ａ、ＣＤ２８、ＣＤ４９ｄ、及びモネンシンをインキュベーション時に添加した。４時間後、細胞を採取し、ＣＡＲ発現、ＣＤ３及びライブ／デッド染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のために染色した。細胞を固定し、透過処理し（ＦＩＸ＆ＰＥＲＭ（登録商標）  Ｃｅｌｌ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ＆Ｃｅｌｌ透過処理キット、Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、その後、細胞内サイトカイン染色を行った。
【００６８】
増殖アッセイ：
【００６９】
Ｔ細胞をＰＢＳ中で洗浄し、１×１０７個／ｍｌで再懸濁した後、１００μｌのＣＦＳＥ２．５μＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって３７℃で５分間標識した。その後、反応を冷たいＲ１０で急冷し、細胞を３回洗浄した。標的細胞を１００Ｇｙの線量で照射した。Ｔ細胞を、照射した標的細胞と１：１の割合で１２０時間インキュベートした。その後、細胞を採取し、ＣＤ３、ＣＡＲ、及びライブ／デッドアクア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、フローサイトメトリー分析前にカウントブライトビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した。
【００７０】
細胞毒性アッセイ：
【００７１】
ＮＡＬＭ６−Ｌｕｃ細胞またはＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識した原発性ＡＬＬ試料を細胞毒性アッセイに使用した。簡潔に説明すると、標的細胞を、エフェクターＴ細胞と、指定された比率で４時間、１６時間、２４時間、４８時間、及び／または７２時間インキュベートした。死滅は、Ｘｅｎｏｇｅｎ社製のＩＶＩＳ−２００スペクトラムカメラ上での生物発光イメージングまたはフローサイトメトリーのいずれかによって計算した。後者の場合、細胞を採取した；カウントブライトビーズ及び７−ＡＡＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を分析前に添加した。残存する、生きている標的細胞は、ＣＦＳＥ＋７−ＡＡＤ−であった。
【００７２】
分泌されたサイトカインの測定：
【００７３】
エフェクター細胞及び標的細胞を、Ｔ細胞培地中で１：１の割合で、２４時間または７２時間インキュベートした。上清を採取し、製造業者のプロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って、３０−ｐｌｅｘＬｕｍｉｎｅｘアレイによって分析した。
【００７４】
結果：
【００７５】
ＧＭ−ＣＳＦ  ＫＯ  ＣＡＲＴ細胞をＣＲＩＳＲ−Ｃａｓ９系を用いて作製した。Ｔ細胞増殖の間、Ｔ細胞に、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９をコードするレンチウイルス及びＣＡＲ１９をコードするレンチウイルスを形質導入した（１日目）。細胞を８日間培養した。８日後、Ｔ細胞を採取し、ＤＮＡを単離し、単離したＤＮＡを配列決定してノックアウト効率を評価した。例えば、図１を参照されたい。Ｔ細胞のノックアウト効率は２４．１％であり（図２Ａ）、ＣＡＲ形質導入効率は７３％（図２Ｂ）であった。
【００７６】
ＧＭ−ＣＳＦ  ＫＯ  ＣＡＲＴ細胞の細胞エフェクター機能を評価するために、ＣＡＲＴ１９、ＧＭ−ＣＳＦ  ＫＯ  ＣＡＲＴ１９、ＵＴＤ、またはＧＭ−ＣＳＦ  ＫＯＵＴＤを、ＣＤ１９陽性細胞株ＮＡＬＭ６と１：５の割合で共培養した。４時間後、細胞を採取し、透過処理し、固定し、そして、サイトカインを染色した（図３）。
【００７７】
ＧＭ−ＣＳＦ  ＫＯ  ＣＡＲＴ細胞の増殖を評価するために、Ｔ細胞に形質導入した後の増殖速度を追跡した。ＧＭ−ＣＳＦ  ＫＯ  ＣＡＲＴ細胞は、ＣＡＲＴ１９のみが形質導入された細胞と比べて、よりロバストに増殖する（図４）。
【００７８】
これらの結果は、ＧＭ−ＣＳＦノックアウトＣＡＲＴが、ＣＡＲＴ細胞の機能及び抗腫瘍活性を増強することを実証した。また、この結果は、ＧＭＣＳＦとＣＡＲＴ１９との組み合わせによる遮断が、ＣＡＲＴ細胞のエフェクター機能に影響を与えないことを実証した。
【００７９】
実施例２：ＣＡＲＴ治療中のＧＭ−ＣＳＦ枯渇は、サイトカイン放出症候群及び神経毒性を減少させ、ＣＡＲＴ細胞の機能を高めた。
【００８０】
本実施例は、ＣＡＲＴ細胞に関連する毒性を制御するための潜在的な戦略として、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び骨髄系細胞を枯渇させることを調べた。中和抗体によるＧＭ−ＣＳＦ遮断は、インビトロまたはインビボにおいてＣＡＲＴ機能を阻害しないことが分かった。また、ＧＭ−ＣＳＦ枯渇後の患者由来の異種移植片では、ＣＡＲＴ細胞の増殖がインビトロで促進され、白血病をより効率的に制御することができた。さらに、ＣＲＳ及びＮＴの原発性急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）異種移植モデルでは、ＧＭ−ＣＳＦ阻害により、脳内のＴ細胞及び骨髄系細胞の浸潤が減少し、ＣＲＳ及びＮＴの発症が改善された。最後に、ＧＭ−ＣＳＦノックアウトＣＡＲＴ細胞を、ＣＡＲＴ細胞の製造中にＧＭ−ＣＳＦをＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９で破壊することによって作製した。ＧＭ−ＣＳＦ  ＫＯ  ＣＡＲＴ細胞は、正常に機能し続け、インビボでの抗腫瘍活性は増強された。これらの結果は、ＧＭ−ＣＳＦを中和することにより、神経毒性やＣＲＳを消失させることができ、また、ＣＡＲＴ細胞の機能を増強させることができることを実証した。
【００８１】
材料及び方法：
【００８２】
細胞株及び初代細胞：
【００８３】
ＮＡＬＭ６及びＭＯＬＭ１３に、ＡＴＣＣ（米国バージニア州マナサス）から購入し、ルシフェラーゼ−ＺｓＧｒｅｅｎレンチウイルス（ａｄｄｇｅｎｅ）を形質導入し、１００％の純度にソートした。細胞株をＲ１０（ＲＰＭＩ、１０％ＦＣＳ（ｖ／ｖ）、１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（ｖ／ｖ））中で培養した。初代細胞は、施設内審査委員会により承認されたプロトコルに基づき、急性白血病患者のためのメイヨー・クリニック・バイオバンクから入手した。研究室での組換えＤＮＡの使用は、施設内バイオセーフティ委員会（ＩＢＣ）によって承認された。
【００８４】
初代Ｔ細胞及びＣＡＲＴ細胞：
【００８５】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＦＩＣＯＬＬプロトコルを用いて、非同定ドナー血液アフェレーシスコーンから単離した（例えば、「Dietz et al, 2006 Transfusion 46:2083-2089」を参照）。Ｔ細胞を、ネガティブ選択磁気ビーズ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて分離し、単球をＣＤ１４＋磁気ビーズ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてポジティブ選択した。初代細胞を、５％ヒト血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、グルタミン酸を添加したＸ−Ｖｉｖｏ１５培地中で培養した。ＣＤ１９指向性ＣＡＲＴ細胞は、後述するように、正常ドナーＴ細胞へのレンチウイルス形質導入により作製した。第二世代ＣＡＲ１９構築物をデノボ合成し（ＩＤＴ）、ＥＦ−１ａプロモーターの制御下で第三世代レンチウイルスにクローニングした。ＣＤ１９指向性一本鎖可変フラグメントを、クローンＦＭＣ６３から誘導した。第二世代の４１ＢＢ共刺激型（ＦＭＣ６３−４１ＢＢｚ）ＣＡＲ構築物を合成し、これらの実験に使用した。レンチウイルス粒子を、リポフェクタミン３０００、ＶＳＶ−Ｇ、及びパッケージングプラスミドの存在下で、２９３Ｔウイルス産生細胞へのプラスミドの一過性のトランスフェクションによって作製した。正常ドナーから単離したＴ細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激ビーズ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）を用いて１：３の比率で刺激し、次いで、刺激の２４時間後にレンチウイルス粒子を３．０の感染倍率で形質導入した。６日目に磁気ビーズを除去し、８日目にＣＡＲＴ細胞を採取し、将来の実験のために凍結保存した。ＣＡＲＴ細胞は、実験に使用する１２時間前に解凍し、Ｔ細胞培地に静置した。
【００８６】
ＧＭ−ＣＳＦ  ＫＯ  ＣＡＲＴ細胞の作製：
【００８７】
ヒトＧＭ−ＣＳＦのエクソン３を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を、ヒトＧＭ−ＣＳＦに対して高効率であることが以前に報告されているｇＲＮＡのスクリーニングにより選択した。このｇＲＮＡは、Ｕ６プロモーター（米国ニュージャージー州タウンシップ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）下で制御されたＣＡＳ９第三世代レンチウイルス構築物（ｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ２）中にオーダーされた。この構築物をコードするレンチウイルス粒子を、上述のようにして作製した。Ｔ細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激した２４時間後に、ＣＡＲ１９及びＧＭ−ＣＳＦｇＲＮＡ−ｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ２レンチウイルスで二重形質導入した。その後、ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖を、上述のようにして継続した。ＧＭ−ＣＳＦを標的化する効率を分析するために、ＰｕｒｅＬｉｎｋ  ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（米国カリフォルニア州カールスバッド、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＧＭ−ＣＳＦＫ／ＯＣＡＲＴ１９細胞からゲノムＤＮＡを抽出した。目的のＤＮＡを、Ｃｈｏｉｃｅ  Ｔａｑ  Ｂｌｕｅ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（米国ミネソタ州ミネアポリス、ＴｈｏｍａｓＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＰＣＲ増幅し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（米国メリーランド州ジャーマンタウン、Ｑｉａｇｅｎ）を使用してゲル抽出して、編集を決定した。ＰＣＲアンプリコンをＥｕｒｏｆｍｓシーケンシング（米国ケンタッキー州ルイビル）に送り、ｔｉｄｅ．ｎｋｉ．ｎｌから入手可能なＴＩＤＥ（分解によるインデルの追跡）ソフトウェアを使用して対立遺伝子修飾頻度を計算した。図１５は、ｇＲＮＡ配列、プライマー配列、及びＧＭ−ＣＳＦＫ／ＯＣＡＲＴ１９スキーマの生成のためのスキーマを説明するための図である。
【００８８】
ＧＭ−ＣＳＦ中和抗体及びアイソタイプ対照：
【００８９】
レンジルマブ（米国カリフォルニア州ブリスベン、Ｈｕｍａｎｉｇｅｎ）は、ヒトＧＭ−ＣＳＦを中和するヒト化抗体である。インビトロ実験では、レンジルマブ（ｌｅｎｚｉｌｕｍａｂ）またはアイソタイプ対照１０ｍｇ／ｍＬを使用した。インビボ実験では、レンジルマブまたはアイソタイプ対照として１０ｍｇ／ｋｇを投与し、そのスケジュール、経路、頻度を個々の実験スキーマに示した。いくつかの実験では、実験スキーマに示すように、抗マウスＧＭ−ＣＳＦ中和抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）も使用した。
【００９０】
Ｔ細胞機能実験：
【００９１】
サイトカインアッセイは、ＣＡＲＴ細胞と標的細胞とを１：１の割合で共培養した後、２４時間後または７２時間後に行った。ヒトＧＭ−ＣＳＦのシングルプレックス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、３０プレックスのヒトマルチプレックス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、または、３０プレックスのマウスマルチプレックス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、これらの実験から採取した上清に対して実施した。これをフローサイトメトリービーズアッセイまたはＬｕｍｉｎｅｘを用いて分析した。そして、ＣＡＲＴ細胞を標的細胞と１：５の比率で、モネンシン、ｈＣＤ４９ｄ及びｈＣＤ２８の存在下で、３７℃で４時間インキュベートした後に、細胞内サイトカイン分析及びＴ細胞脱顆粒アッセイを行った。４時間後、細胞を採取し、表面染色後に細胞内染色を行い、その後、細胞を固定し透過処理を行った（ＦＩＸ＆ＰＥＲＭ（登録商標）  Ｃｅｌｌ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ＆Ｃｅｌｌ透過処理キット、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。増殖アッセイについては、ＣＦＳＥ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で標識したエフェクター細胞（ＣＡＲＴ１９）と、照射した標的細胞とを１：１で共培養した。ＣＤ１４＋単球を用いたいくつかの実験では、１：１：１：１の比率で共培養に添加した。特定の実験で示されるように、細胞を３〜５日間共培養し、その後、細胞を採取し、抗ｈＣＤ３及びライブ／デッドアクアによる表面染色を行った。ＰＭＡ／イオノマイシンを、特定の実験で示されるように、様々な濃度で、Ｔ細胞の陽性非特異的刺激剤として使用した。死滅アッセイについては、特定の実験に記載されているように、ＣＤ１９＋ルシフェラーゼ＋ＡＬＬ細胞株ＮＡＬＭ６またはＣＤ１９−ルシフェラーゼ＋対照ＭＯＬＭ１３細胞をエフェクターＴ細胞と、指定された比率で２４時間または４８時間インキュベートした。死滅は、残留生細胞の指標として、Ｘｅｎｏｇｅｎ社製のＩＶＩＳ−２００スペクトラムカメラ（米国マサチューセッツ州ホプキントン、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）上の生物発光イメージングによって計算した。試料は、イメージングの１０分前に、１００ｍｌの試料体積あたり１μｌのＤ−ルシフェリン（３０μｇ／ｍＬ）で処理した。
【００９２】
マルチパラメトリックフローサイトメトリー：
【００９３】
抗ヒト抗体は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、またはＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から購入した。細胞をインビトロ培養または動物の末梢血から単離し（ＡＣＫ溶解後）、２％ウシ胎児血清を添加したリン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄し、４℃で染色した。細胞数の定量は、製造者の指示に従ってカウントブライトビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行った。全ての分析において、目的の集団は、前方対側方散乱特性に基づいてゲートし、続いて、一重項ゲートし、そして、ライブ／デッドアクア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して生細胞をゲートした。ＣＡＲの表面発現は、ヤギ抗マウスＦ（ａｂ´）２抗体で染色することによって検出した。フローサイトメトリーは、４レーザーＣａｎｔｏＩＩアナライザー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて行った。全ての分析は、ＦｌｏｗＪｏ  Ｘｌ０．０．７ｒ２を用いて行った。
【００９４】
異種マウスモデル：
【００９５】
雄及び雌の８〜１２週齢のＮＯＤ−ＳＣＩＤ−ＩＬ２ｒγ−／−（ＮＳＧ）マウスは、メイヨー・クリニックの比較医学部門で、動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）により承認された飼育プロトコル下で繁殖及び飼育した。マウスは、ＢＳＬ２＋レベル実験のための施設内バイオセーフティ委員会（ＩＢＣ）によって承認された動物バリアスペースで維持した。
【００９６】
ＮＡＬＭ６細胞株異種移植片：
【００９７】
ＣＤ１９＋、ルシフェラーゼ＋ＡＬＬ  ＮＡＬＭ６細胞株を用いてＡＬＬ異種移植片を確立した。これらの異種移植実験は、別のＩＡＣＵＣプロトコルによって承認されている。ここでは、１×１０６個の細胞を尾静脈注射により静脈内に投与した。注入の６日後、Ｘｅｎｏｇｅｎ社製のＩＶＩＳ−２００スペクトラムカメラを使用して、マウスの生物発光イメージングを行い、移植を確認した。イメージングは、１０μｌ／ｇのＤ−ルシフェリン（１５ｍｇ／ｍｌ）を腹腔内投与（ＩＰ投与）した後に行った。その後、特定の実験で概説されているように様々な治療を受けるために、マウスを、それらの生物発光イメージングに基づいて無作為化した。一般的に、１〜２×１０６個のＣＡＲＴ細胞またはＵＴＤ細胞を注入する。正確な用量は、特定の実験の詳細に列挙されている。週１回のイメージングを行い、疾患負担の評価及び追跡調査を行った。Ｔ細胞の増殖を評価するために、尾静脈出血を、ＣＡＲＴ細胞の注入の７〜１０日後に行い、また、その後も必要に応じて行った。マウス末梢血を、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いて溶解し、その後、フローサイトメトリー研究に使用した。生物発光画像を、Ｘｅｎｏｇｅｎ社製のＩＶＩＳ−２００スペクトラムカメラ（米国マサチューセッツ州ホプキントン、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて取得し、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  バージョン４．４（ＣａｌｉｐｅｒＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて分析した。抗体治療マウスについては、抗体治療（１０ｍｇ／ｋｇのレンジルマブまたはアイソタイプ対照）をＩＰ投与で開始し、合計１０日間行った。
【００９８】
患者由来原発性ＡＬＬ異種移植片：
【００９９】
原発性ＡＬＬ異種移植片を確立するために、まず、ＮＳＧマウスに３０ｍｇ／ｋｇのブスルファンをＩＰ投与した。翌日、マウスに、再発難治性ＡＬＬ患者の末梢血由来の２×１０６個の原発性芽球を投与した。生着についてマウスを４〜６週間モニタし、血中にＣＤ１９＋細胞が一貫して観察された場合（＞１細胞／μｌ）には、それらのマウスを、抗体治療を伴うまたは伴わない、ＣＡＲＴ１９またはＵＴＤ（１×１０６個の細胞）の様々な治療を受けるように無作為に割り付けた（１０ｍｇ／ｋｇのレンジルマブまたはアイソタイプ対照のＩＰ投与を、ＣＡＲＴ細胞治療を受けた日から合計１０日間受けるようにした）。マウスを、尾静脈出血により、白血病負荷について定期的にモニタした。
【０１００】
ＣＲＳ／ＮＴの患者由来原発性ＡＬＬ異種移植片：
【０１０１】
上記の実験と同様に、マウスに３０ｍｇ／ｋｇのブスルファンをＩＰ投与した。翌日、再発難治性ＡＬＬ患者の末梢血由来の２×１０６個の原発性芽球を投与した。生着についてマウスを４〜６週間モニタし、ＣＤ１９＋細胞レベルが高い場合（１０細胞／μｌ以上）には、ＣＡＲＴ１９（２〜５×１０６個の細胞）を投与し、特定の実験の詳細に示すように、合計１０日間の抗体治療を開始した。マウスの健康状態の評価基準として、マウスの体重を毎日測定した。ＣＡＲＴ投与後の５〜６日目にマウスのブライアンＭＲＩを行い、ＣＡＲＴ投与後の４〜１１日目に尾静脈出血を行った。脳のＭＲＩ画像を、Ａｚａｌｙｚｅを用いて分析した。
【０１０２】
ＭＲＩ取得：
【０１０３】
中枢神経系（ＣＮＳ）の血管透過性を評価するために、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ＩＩ  ７  Ｔｅｓｌａ垂直孔小動物ＭＲＩ装置（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｂｉｏｓｐｉｎ）を用いて画像を取得した。３〜４％のイソフルランを用いて、吸入麻酔を誘導及び維持した。ＭＲＩ適合のバイタルサインモニタリングシステム（Ｍｏｄｅｌ  １０３０；米国ニューヨーク州ストーニーブルック、ＳＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、取得セッション中に呼吸数をモニタした。マウスに１００ｍｇ／ｋｇの体重ベース投与によってガドリニウムをＩＰ投与し、１５分間の標準遅延後、体積取得Ｔ１−重み付けスピンエコーシーケンス（繰り返し時間＝１５０ｍｓ、エコー時間＝８ｍｓ、視野：３２ｍｍ×１９．２ｍｍ×１９．２ｍｍ、マトリックス：１６０×９６×９６；平均数＝１）を用いてＴ１−重み付け画像を取得した。ガドリニウム増強ＭＲＩの変化は、血液脳関門障害を示した。容積分析は、メイヨー・クリニックの生物医学イメージングリソースが開発したＡｎａｌｙｚｅソフトウェアパッケージを用いて実施した。
【０１０４】
マウス脳組織のＲＮＡシーケンシング：
【０１０５】
ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏ  ｋｉｔ（米国メリーランド州ゲイザースバーグ、Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＲＮＡを単離し、ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  Ｓｅｔ（米国メリーランド州ゲイザースバーグ、Ｑｉａｇｅｎ）により処理した。ＲＮＡシーケンシング（配列決定）は、メイヨー・クリニックのゲノム解析コアにより、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨＴＳｅｑ  ４０００（米国カリフォルニア州サンディエゴ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて行った。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ｂｃｌ２ｆａｓｔｑソフトウェアを用いて、バイナリベースのコールデータをｆａｓｔｑに変換した。Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃを用いてアダプタ配列を除去し、ＦａｓｔＱＣを用いて品質を確認した。最新のヒト（ＧＲＣｈ３８）及びマウス（ＧＲＣｍ３８）の基準ゲノムを、ＮＣＢＩからダウンロードした。ＳＴＡＲを用いてゲノムインデックスファイルを作成し、各条件についてペアエンドリードをゲノムにマッピングした。ＨＴＳｅｑ３１を用いて各遺伝子の発現数を算出し、ＤｅＳｅｑ２を用いて差次的発現を算出した。Ｅｎｒｉｃｈｒを用いて遺伝子オントロジーを評価した。図１６は、上記のステップの詳細を要約したものである。ＲＮＡ配列データは、遺伝子発現情報データベースからアクセッション番号ＧＳＥ１２１５９１で公開されている。
【０１０６】
統計情報：
【０１０７】
Ｐｒｉｓｍ  Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ及びＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌをデータ分析に使用した。Ｐｒｉｓｍを用いて、ヒートマップの高サイトカイン濃度は「１」に、低濃度は「０」に正規化した。統計的検定は、図に記載した。
【０１０８】
結果：
【０１０９】
ＧＭ−ＣＳＦをインビトロで中和すると、単球の存在下でＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖が促進され、ＣＡＲ−Ｔ細胞のエフェクター機能は損なわれない：
【０１１０】
ＣＡＲ−Ｔ細胞治療後のＧＭ−ＣＳＦの中和がＣＲＳ及びＮＴを予防するストラテジーとして用いられる場合、それはＣＡＲ−Ｔ細胞の効力を阻害してはならない。そのため、ＧＭ−ＣＳＦ中和がＣＡＲ−Ｔ細胞のエフェクター機能に与える影響を調べることを目的とした初期実験を行った。ここで、ＣＡＲＴ１９細胞を、レンジルマブ（ＧＭ−ＣＳＦ中和抗体）またはアイソタイプ対照（ＩｇＧ）の存在下で、ＣＤ１９＋ＡＬＬ細胞株ＮＡＬＭ６と共にまたはＣＤ１９＋ＡＬＬ細胞株ＮＡＬＭ６なしで共培養した。ＩｇＧ対照抗体ではそうではなかったが、レンジルマブは、ＧＭ−ＣＳＦを完全に中和することができ（図６Ａ）、かつ、ＣＡＲ−Ｔ細胞抗原特異的増殖を阻害しないこと（図６Ｂ）が実証された。ＣＡＲＴ１９細胞を単球の存在下でＣＤ１９＋細胞株ＮＡＬＭ６と共培養した場合、ＣＡＲＴ１９と組み合わせたレンジルマブが、ＣＡＲＴ１９＋アイソタイプ対照ＩｇＧと比較して、抗原特異的ＣＡＲＴ１９増殖の指数関数的な増加を示すことが実証された（Ｐ＜０．０００１、図６Ｃ）。ＣＡＲ−Ｔ特異的細胞毒性を調べるために、ＣＡＲＴ１９または対照ＵＴＤＴ細胞のいずれかを、ルシフェラーゼ＋ＣＤ１９＋ＮＡＬＭ６細胞株と共に培養し、アイソタイプ対照抗体またはＧＭ−ＣＳＦ中和抗体のいずれかで処理した（図１Ｄ）。ＧＭ−ＣＳＦ中和抗体処理は、ＣＡＲ−Ｔ細胞がＮＡＬＭ６標的細胞を殺滅する能力を阻害しなかった（図６Ｄ）。以上の結果から、レンジルマブは、インビトロにおいてＣＡＲ−Ｔ細胞の機能を阻害せず、単球の存在下においてＣＡＲＴ１９細胞の増殖を増強することが示された。また、ＧＭ−ＣＳＦを中和することにより、ＣＡＲ−Ｔ細胞媒介効果が向上することが示唆された。
【０１１１】
インビボでのＧＭ−ＣＳＦの中和は、異種移植モデルにおけるＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍活性を増強する：
【０１１２】
ＧＭ−ＣＳＦ枯渇がＣＡＲＴ１９エフェクター機能を阻害しないことを確認するために、異種移植モデルにおけるレンジルマブによるＧＭ−ＣＳＦ中和がＣＡＲＴ１９抗腫瘍活性に及ぼす役割を調べた。第１に、ＣＡＲＴ１９細胞の抗腫瘍活性がＧＭ−ＣＳＦ中和によって影響を受けるか否かを精力的に調べることを目的として再発モデルを用いた。ＮＳＧマウスに、１×１０６個のルシフェラーゼ＋ＮＡＬＭ６細胞を投与し、６日後に画像化し、マウスが非常に高い腫瘍負担を達成するために十分な時間を与えた。ＣＡＲＴ１９またはＵＴＤ細胞のいずれかの単回投与と、アイソタイプ対照抗体またはレンジルマブ（図７Ａ）のいずれかの１０日間の投与を受けるように、マウスを無作為化した。ＣＡＲＴ１９投与の８日後に採取した血清のＧＭ−ＣＳＦアッセイにより、レンジルマブがＣＡＲＴ１９治療においてＧＭ−ＣＳＦを成功裏に中和することが明らかになった（図７Ｂ）。ＣＡＲＴ１９投与の１週間後の生物発光イメージングにより、この高腫瘍負担の再発モデルにおいて、ＣＡＲＴ１９とレンジルマブとの組み合わせが白血病を効果的に制御し、対照ＵＴＤ細胞よりも有意に良好であることが分かった（図７Ｃ）。レンジルマブと組み合わせたＣＡＲＴ１９治療は、ＧＭ−ＣＳＦレベルが中和されたにもかかわらず、対照抗体を用いたＣＡＲＴ１９と同様に、強力な抗腫瘍活性及び全生存率の改善をもたらし、インビボでのＣＡＲ−Ｔ細胞の活性を損なわないことを示した（図８）。第２に、これらの実験は、ヒトＰＢＭＣの存在下で、原発性ＡＬＬ患者由来の異種移植モデル（これは、より関連性の高い異種モデルを表す）で実施した。ブスルファンによる移植前処置（化学療法によるコンディショニング）の後、マウスに再発ＡＬＬ患者由来の芽球を投与した。連続的な尾静脈出血により、マウスを生着について数週間モニタした。そして、血中のＣＤ１９＋芽球が１／μＬ以上になったときに、ＣＡＲＴ１９またはＵＴＤ治療を、ＣＡＲＴ１９投与の日から１０日間、レンジルマブ＋抗マウスＧＭ−ＣＳＦ中和抗体またはアイソタイプ対照ＩｇＧ抗体のいずれかを用いたＰＢＭＣと組み合わせて受けるように、マウスを無作為化した（図７Ｄ）。この原発性ＡＬＬ異種移植モデルでは、ＧＭ−ＣＳＦ中和をＣＡＲＴ１９療法と組み合わせた場合、ＣＡＲＴ１９療法とアイソタイプ対照とを組み合わせた場合と比較して、ＣＡＲＴ１９投与後に３５日間以上にわたって白血病制御の有意な改善をもたらした（図７Ｅ）。このことは、ＧＭ−ＣＳＦの中和が、ＣＡＲＴ１９細胞療法後の再発を減少させ、かつ、恒久的な完全寛解を増加させる役割を果たすことを示唆する。
【０１１３】
ＧＭ−ＣＳＦ  ＣＲＩＳＰＲノックアウトＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＧＭ−ＣＳＦの発現低下、主要なサイトカインの同程度のレベル、及び、抗腫瘍活性の増強を示した：
【０１１４】
ＣＡＲ−Ｔ細胞の機能に重要なＧＭ−ＣＳＦの役割を明確に排除するために、ＣＡＲ−Ｔ細胞の製造中に、高効率をもたらすことが報告されているｇＲＮＡを用いてＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を破壊し、ＣＲＩＳＰＲレンチウイルスバックボーンにクローニングした。このｇＲＮＡを用いて、ＣＡＲＴ１９細胞において約６０％のノックアウト効率を達成した（図９）。ＣＡＲ−Ｔ細胞をＣＤ１９＋細胞株ＮＡＬＭ６で刺激すると、ＧＭ−ＣＳＦｋ／ｏＣＡＲ−Ｔ細胞は、野生型ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子座（「野生型ＣＡＲＴ１９細胞」）を有するＣＡＲＴ１９と比較して、統計的に有意に少ないＧＭ−ＣＳＦを産生した。ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＧＭ−ＣＳＦノックアウトは、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−２、またはＣＡＲ−Ｔ細胞抗原特異的脱顆粒（ＣＤ１０７ａ）を含む他の主要なＴ細胞サイトカインの産生を損なわなかったが（図１０Ａ）、ＧＭ−ＣＳＦの発現低下を示した（図１０Ｂ）。ＧＭ−ＣＳＦ  ＫＯ  ＣＡＲＴ細胞が正常な機能を発揮し続けることを確認するために、高腫瘍負担再発異種移植ＡＬＬモデル（図７Ａに記載されているような）におけるそれらのインビボでの有効性を試験した。この異種移植モデルでは、野生型ＣＡＲＴ１９の代わりにＧＭ−ＣＳＦＫ／ＯＣＡＲＴ１９を使用すると、ＣＡＲＴ１９処理後の７日目にヒトＧＭ−ＣＳＦの血清レベルが著しく低下した（図１０Ｂ）。生物発光イメージングデータは、ＧＭ−ＣＳＦＫ／ＯＣＡＲＴ１９細胞が、このモデルのＣＡＲＴ１９と比較して、白血病制御の増強を示すことを示唆した（図１１）。重要なことには、ＧＭ−ＣＳＦＫ／ＯＣＡＲＴＴ１９細胞は、野生型ＣＡＲＴ１９細胞と比較して、全生存率の有意な改善を示した（図１０Ｃ）。ＧＭ−ＣＳＦ以外では、ヒト（図１０Ｄ）またはマウス（図１０Ｅ）のいずれのサイトカインにおいても、統計的に有意な変化は検出されなかった。まとめると、これらの結果は図６及び図７の結果を裏付け、ＧＭ−ＣＳＦ枯渇がＣＡＲ−Ｔの効能に重要なサイトカインを阻害しないことを示す。加えて、図１０の結果は、ＧＭ−ＣＳＦＫ／ＯＣＡＲＴが、ＣＡＲ−Ｔ細胞製造中の改変としてのＧＭ−ＣＳＦ制御を「組み込む（built in）」ための治療選択肢を提示し得ることを示す。
【０１１５】
神経毒性及びサイトカイン放出症候群についての患者由来異種移植モデル：
【０１１６】
このモデルでは、馴化ＮＳＧマウスに初代ＡＬＬ芽球を移植し、高疾患負荷を発症するまでの数週間、生着についてモニタした（図１２Ａ）。末梢血中のＣＤ１９＋芽球のレベルが１０／μＬ以上であった場合、示されたような様々な治療を受けるようにマウスを無作為化した（図１２Ａ）。ＣＡＲＴ１９治療（対照ＩｇＧ抗体またはＧＭ−ＣＳＦ中和抗体を用いた）は、この病気を成功裏に根絶した（図１２Ｂ）。ＣＡＲＴ１９投与後の４〜６日以内に、マウスは、ＣＲＳ及びＮＴと一致する症状である、運動麻痺、体のこわばり、体重減少を発症した。これは、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法後のヒトＣＲＳで見られるものと同様に、ＣＡＲＴ１９投与後の４〜１１日目の主要な血清サイトカインの上昇と関連していた（ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−ａ、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＰ−１０、ＭＤＣ、ＭＣＰ−１、ＭＰＭａ、ＭＩＲ−Ｉｂ、及び、マウスＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−９、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、及びＭＩＧを含む）。また、ＣＡＲＴ１９を投与したこれらのマウスは、ＮＴも発症した。脳のＭＲＩ分析により、Ｔ１の異常な増強が明らかになり、血液脳関門の障害や脳浮腫の可能性が示唆された（図１２Ｄ）。また、採取した脳のフローサイトメトリー分析により、ヒトＣＡＲＴ１９細胞の浸潤が明らかになった（図１２Ｅ）。加えて、ＮＴのこれらの徴候を発現したマウスから採取した脳切片をＲＮＡ配列解析したところ、Ｔ細胞受容体、サイトカイン受容体、Ｔ細胞免疫活性化、Ｔ細胞トラフィッキング、並びに、Ｔ細胞及び骨髄系細胞分化を制御する遺伝子の、有意なアップレギュレーションが認められた（表１）。
【０１１７】
表１．ＣＡＲＴ１９細胞での治療後に患者由来異種移植片から得られた脳切片において変化した標準経路の表。
【０１１８】
【表１−１】
2021525519.tif 000002
【０１１９】
【表１−２】
2021525519.tif 000003
【０１２０】
ＧＭ−ＣＳＦのインビボでの中和は、異種移植モデルにおけるＣＡＲＴ１９治療後のサイトカイン放出症候群及び神経毒性を改善した：
【０１２１】
図４Ａに示すＮＴ及びＣＲＳの異種移植患者由来モデルを用いて、ＣＡＲＴ１９毒性に対するＧＭ−ＣＳＦ中和の効果を調べた。マウスＧＭ−ＣＳＦの交絡効果を除外するために、マウスに、ＣＡＲＴ１９細胞を、１０日間のＧＭ−ＣＳＦ抗体療法（１０ｍｇ／ｋｇレンジルマブ及び１０ｍｇ／ｋｇ抗マウスＧＭ−ＣＳＦ中和抗体）またはアイソタイプ対照抗体と組み合わせて投与した。ＧＭ−ＣＳＦ中和抗体療法は、ＣＡＲＴ１９療法後のＣＲＳ誘導体重減少を防止した（図１３Ａ）。ＣＡＲＴ１９細胞療法の１１日後のサイトカイン分析は、ヒトＧＭ−ＣＳＦが抗体によって中和されたことを示した（図１３Ｂ）。加えて、ＧＭ−ＣＳＦ中和は、いくつかのヒト（ＩＰ−１０、ＩＬ−３、ＩＬ−２、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−１２ｐ４０、ＶＥＧＦ、ＧＭ−ＣＳＦ）（図５Ｃ）、及びマウス（ＭＩＧ、ＭＣＰ−１、ＫＣ、ＩＰ−１０）（図１３Ｄ）のサイトカインの有意な減少をもたらした。インターフェロンγ誘導性タンパク質（ＩＰ−１０、ＣＸＣＬ１０）は、他の細胞型の中でもとりわけ単球によって産生され、単球、マクロファージ、及びＴ細胞などの様々な細胞型に対する化学吸引物質としての機能を果たす。ＩＬ−３は、骨髄前駆細胞の分化に関与する。ＩＬ−２は、重要なＴ細胞サイトカインである。インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）は、ＩＬ−１を阻害する（ＩＬ−１は、マクロファージによって産生され、重要な炎症性サイトカインのファミリーである）。ＩＬ−１２ｐ４０は、ＩＬ−１２のサブユニットであり、他の細胞型の中でもとりわけマクロファージによって産生され、Ｔｈ１の分化を促進することができる。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、血管形成を促進する。ガンマ・インターフェロン（ＭＩＧ、ＣＸＣＬ９）によって誘導されたモノカインは、Ｔ細胞化学吸引物質である。単球化学吸引性タンパク質１（ＭＣＰ−１、ＣＣＬ２）は、単球、Ｔ細胞、樹状細胞を引き寄せる。ＫＣ（ＣＸＣＬ１）は、他の細胞の中でもとりわけマクロファージによって産生され、好中球などの骨髄系細胞を引き寄せる。また、ＧＭ−ＣＳＦ中和後、他のいくつかのヒト及びマウスのサイトカインも減少傾向があった。このことは、ＧＭ−ＣＳＦが、ＣＲＳ及びＮＴの結果をもたらすカスケードに関与するいくつかのサイトカインの下流活性において役割を果たしていることを示唆している。
【０１２２】
ＣＡＲ１９投与後の５日目の脳ＭＲＩにより、ＧＭ−ＣＳＦの中和によって、ＣＡＲＴ１９＋対照抗体と比較して、脳の炎症、血液脳関門障害、及びおそらく浮腫の指標としてのＴ１増強が減少したことが分かった。ＧＭ−ＣＳＦ中和後（レンジルマブ及び抗マウスＧＭ−ＣＳＦ抗体を使用）のＭＲＩ画像は、ベースラインの治療前スキャンと類似しており、このことは、ＧＭ−ＣＳＦ中和がＣＡＲＴ１９治療に関連するＮＴの無効化を効果的に助けることを示唆している（図１４Ａ、図１４Ｂ）。この患者由来異種移植モデルにおけるヒトＡＬＬ芽球及びヒトＣＡＲＴ１９を用いて、ＣＡＲＴ１９後のＧＭ−ＣＳＦの中和により、ＣＡＲＴ１９プラスアイソタイプ対照と比較して、神経炎症が５９％減少した（図１４Ｂ）。これは重要な発見であり、ＣＡＲＴ１９によって引き起こされるＮＴが効果的に無効化されることがインビボで初めて実証された。フローサイトメトリーで測定したところ、ＣＡＲＴ１９治療後の脳内にはヒトＣＤ３Ｔ細胞が存在しており、ＧＭ−ＣＳＦの中和により、脳内ＣＤ３Ｔ細胞が減少する傾向が見られた（図１４Ｃ）。最後に、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法中にＧＭ−ＣＳＦを中和したマウスの脳では、ＣＡＲ−Ｔ療法中のアイソタイプ対照と比較して、ＣＤ１１ｂ＋ブライトマクロファージの減少傾向が観察され（図１４Ｄ）、これは、ＧＭ−ＣＳＦ中和が脳内のマクロファージの減少を助けていることを示唆している。
【０１２３】
実施例３：ＧＭ−ＣＳＦ受容体とＧＭ−ＣＳＦとの相互作用
【０１２４】
材料及び方法：
【０１２５】
ＧＭ−ＣＳＦ受容体（ＣＳＦ２Ｒ）分析：
【０１２６】
Ｔ細胞の増殖。単離したＴ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激した。ＣＳＦ２受容体ＣＳＦ２ＲＡ（ＣＤ１１６）及びＣＳＦ２ＲＢ（ＣＤ１３１）の発現を、０日目、１日目、３日目、６日目及び８日目にフローサイトメトリーにより測定した。休止Ｔ細胞を、陰性対照として使用した。
【０１２７】
ＣＡＲＴの作製。ＣＡＲＴ１９を作製し、ＣＳＦ２ＲＡ（ＣＤ１１６）及びＣＳＦ２ＲＢ（ＣＤ１３１）の発現を、０日目、１日目、３日目、及び６日目にフローサイトメトリーにより測定した。休止Ｔ細胞を陰性対照として使用し、Ｎａｌｍ６細胞株を陽性対照として使用した。
【０１２８】
ウエスタンブロット：
【０１２９】
ＣＡＲＴ１９／ＵＴＤ細胞と照射Ｎａｌｍ６細胞とを、１：１の比率で共培養した。抗体を１０μｇ／ｍＬの用量で細胞に添加した。培養条件は、ＵＴＤ、ＣＡＲＴ１９、ＣＡＲＴ１９＋ＧＭ−ＣＳＦ遮断、ＣＡＲＴ１９＋ＣＳＦ２ＲＡ遮断、ＣＡＲＴ１９＋ＣＳＦ２ＲＢ遮断であった。これらの培養条件を、培地対照対Ｎａｌｍ６刺激で試験した。
【０１３０】
抗体と共に２４時間培養した後、マイクロビーズを用いてＣＡＲＴ１９を単離した。ＣＡＲＴ１９の純度（９８〜１００％）は、フローサイトメトリーを用いて確認した。細胞ペレットをスピンダウンして細胞を回収し、ウエスタンブロットに使用するために細胞からポリペプチドを単離した。
【０１３１】
結果：
【０１３２】
ＧＭ−ＣＳＦ受容体は、刺激を与えると、Ｔ細胞及びＣＡＲＴ細胞上でアップレギュレートされた。Ｔ細胞上のＧＭ−ＣＳＦ受容体ＣＳＦ２ＲＡ（ＣＤ１１６）及びＣＳＦ２ＲＢ（ＣＤ１３１）のレベルを測定し、８日間のＴ細胞増殖プロトコル中に休止Ｔ細胞（陰性対照）上のＣＳＦ２ＲＡ（ＣＤ１１６）及びＣＳＦ２ＲＢ（ＣＤ１３１）のレベルと比較した。ＣＳＦ２ＲＡ及びＣＳＦ２ＲＢの発現は、最初の刺激後に増加し、３日目にピークに達し、６日目の脱ビーズ化後にわずかに減少した（図１７Ａ）。また、ＣＳＦ２ＲＡ（ＣＤ１１６）及びＣＳＦ２ＲＢ（ＣＤ１３１）のレベルも、ＣＡＲＴ１９及びＵＴＤ細胞上で測定し、８日間のＣＡＲＴ産生中の対照細胞上のＣＳＦ２ＲＡ（ＣＤ１１６）及びＣＳＦ２ＲＢ（ＣＤ１３１）のレベルと比較した。発現は、１日目にわずかに減少したが、３日目にピークを迎えた（図１７Ｂ）。
【０１３３】
ＧＭ−ＣＳＦとＣＳＦ２受容体との相互作用は、β鎖（ＣＳＦ２ＲＢ）に依存する。リン酸化Ｓｔａｔ５及びリン酸化Ｊａｋ２タンパク質の発現は、照射Ｎａｌｍ６及びＣＳＦ２ＲＡ遮断の存在下では増加したが、ＧＭ−ＣＳＦ及びＣＳＦ２ＲＢ遮断の存在下では減少した（図１８）。ＦＡＳは、ＣＳＦ２受容体経路の下流であり、その発現は、照射Ｎａｌｍ６及びＧＭ−ＣＳＦ遮断の存在下ではわずかに減少するが、ＣＳＦ２ＲＡまたはＣＳＦ２ＲＢ遮断の存在下では減少しなかった（図１８）。
【０１３４】
これらの結果は、ＣＳＦ２Ｒが、活性化されたＴ細胞及びＣＡＲＴ細胞上で発現したことを実証する。これらの結果はまた、ＧＭ−ＣＳＦの中和が、ｐ−ＳＴＡＴ５を阻害したことを実証する。ＧＭ−ＣＳＦ受容体βを遮断した場合も同様の阻害が観察され、このことは、活性化されたＣＡＲＴ細胞上のＧＭ−ＣＳＦとＧＭ−ＣＳＦ受容体βとの相互作用によってシグナル伝達が駆動されていることを示唆する。
【０１３５】
実施例４：ＧＭ−ＣＳＦ及びＣＡＲＴ１９細胞転写
【０１３６】
材料及び方法：
【０１３７】
ＲＮＡシーケンシング：
【０１３８】
ＲＮＡの単離及びＲＮＡシーケンシング。ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、非形質導入Ｔ細胞、ＣＡＲＴ１９、及びＧＭ−ＣＳＦｋ／ｏＣＡＲＴ１９について、３つの生物学的複製物（正常ドナー１０５、１１５及び１１６）から全ＲＮＡを単離し、ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  Ｓｅｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて処理した。ペアエンドのＲＮＡシーケンシングを、メイヨー・クリニックのゲノム解析コアにより、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨＴＳｅｑ  ４０００を用いて行った。
【０１３９】
品質。バイナリベースのコールデータを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ｂｃｌ２ｆａｓｔｑソフトウェアを用いてｆａｓｔｑに変換した。Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃを用いてアダプタ配列を除去した。ＦａｓｔＱＣを用いて品質を確認した。
【０１４０】
アライメント。最新のヒト基準ゲノムはＮＣＢＩ（ＨＧ３８）からダウンロードした。ＳＴＡＲを用いてゲノムインデックスファイルを作成し、各条件についてペアエンドリードをゲノムにマッピングした。
【０１４１】
差次的発現。ＨＴＳｅｑを用いて各遺伝子の発現数を算出し、ＤｅＳｅｑ２を用いて差次的発現を算出した。総転写産物数が１０未満の条件はフィルタ除去した。ＧＭ−ＣＳＦｋ／０ＣＡＲＴ１９とＣＡＲＴ１９との間の調整ｐ値を、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を用いて算出した。
【０１４２】
結果：
【０１４３】
ＲＮＡシーケンシングによって、ＣＡＲＴ産生の８日目における、ＧＭ−ＣＳＦｋ／ｏＣＡＲＴ１９細胞とＣＡＲＴ１９細胞との間のトランスクリプトームの差異を識別した。２３６個の遺伝子が、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ補正ｐ値＜０．０５で有意に差次的発現を示す遺伝子として識別された（図１９Ａ）。下記の３つの異なる遺伝子発現パターンが識別された：ＧＭ−ＣＳＦＫ／ＯＣＡＲＴ１９細胞において、ＣＡＲＴ１９細胞及びＵＴＤ細胞と比較してアップレギュレーションされた遺伝子（図１９Ａ、上）；ＧＭ−ＣＳＦＫ／ＯＣＡＲＴ１９細胞において、ＣＡＲＴ１９細胞及びＵＴＤ細胞と比較してダウンレギュレーションされた遺伝子（図１９Ａ、中）；及び、ＧＭ−ＣＳＦＫ／ＯＣＡＲＴ１９細胞において、ＣＡＲＴ１９細胞及びＵＴＤ細胞と比較してＵＴＤ細胞のレベルに正規化された遺伝子（図１９Ａ、下）。中間プロファイルの遺伝子の中では、とりわけ、ＦＡＳが、Ｔｅｃキナーゼ経路一部であり、アポトーシスの誘導に関与している。また、ＧＭ−ＣＳＦＫ／ＯＣＡＲＴ１９細胞において、ＣＡＲＴ１９細胞と比較して有意にダウンレギュレーションされた遺伝子が識別された（図１９Ｂ）。注目すべきことに、ＣＡＲＴ１９細胞におけるＧＭ−ＣＳＦノックアウトにより、ＣＡＲＴ１９細胞で見られた差次的遺伝子発現が正常化された（図１９Ｃ）。主成分分析により、ＧＭ−ＣＳＦＫ／ＯＣＡＲＴ１９細胞の全体的な遺伝子発現パターンは、ＣＡＲＴ１９細胞よりもＵＴＤ細胞に近いことが分かった。
【０１４４】
これらの結果は、ＧＭ−ＣＳＦＫ／Ｏ細胞が、ＧＭ−ＣＳＦＫ／ＯＣＡＲＴ１９細胞においてダウンレギュレートされた遺伝子の増加を伴う明瞭な遺伝子発現パターンを有することを示している。
【０１４５】
実施例５：ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９によるＧＭ−ＣＳＦ編集
【０１４６】
材料及び方法：
【０１４７】
全エクソームシーケンシング（ＷＥＳ）：
【０１４８】
試料処理。ＤＮＡを、ＰｕｒｅＬｉｎｋ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いて、非形質導入Ｔ細胞、ＧＭ−ＣＳＦＫ／ＯＴ細胞、ＣＡＲＴ１９細胞、及びＧＭ−ＣＳＦＫ／ＯＣＡＲＴ１９細胞のそれぞれ３つの生物学的複製物から単離した。抽出したＤＮＡを、ＷＥＳのために、メイヨー・クリニックの医学ゲノム施設のゲノム解析コアに提出した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ４０００を用いて、試料を配列決定した。
【０１４９】
一次分析。一次分析は、ゲノム解析コアにて、バイナリベースコールデータを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ｂｃｌ２ｆａｓｔｑソフトウェアを用いてｆａｓｔｑに変換して行った。
【０１５０】
二次分析。ｆａｓｔｑファイルを、ＢＷＡ−Ｍｅｍアライナーを用いて、ヒト基準ゲノムＨＧ３８に対して整列させた。二次分析は、生物医学統計情報部門にて、ゲノム解析ツールキット（ＧＡＴＫ）を用いて変異体を呼び出し、生のＶＣＦデータを生成することにより行った。
【０１５１】
オフターゲット候補者。ＳＡＳ９．４のカスタムコードを使用して、試料間の編集の差異を検出した。まず、ＣＳＦ２標的遺伝子における特異的な編集を調べた。続いて、ＧＭ−ＣＳＦＫ／Ｏ条件では発見されたが、それらの対照（非形質導入Ｔ細胞及びＣＡＲＴ１９）では発見されなかった変異体を、（非形質導入Ｔ細胞に存在する）個人のゲノムに固有の変異体を除いて比較した。次に、これらのリストを相互参照し、候補のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集を、ＴＣｅｌｌのみ、ＣＡＲＴ１９のみ、または、ＴＣｅｌｌ及びＣＡＲＴ１９の両方に分類した。対立遺伝子頻度が１０％未満のもの、読み取り深度が１０未満のＳＮＰ、及び、品質フィルタ（ＶＱＳＱＲＴ分析）をパス（合格）しなかった試料は除外した。これは、Ｒ言語のＶｅｎｎダイアグラムパッケージを使用して描いた。
【０１５２】
オフターゲット予測。次の３つの異なるオフターゲット編集予測ツールを使用した。Ｃａｓ−ＯＦＦｉｎｄｅｒ、ＣＲＩＳＴＡ、及びＣＣＴｏｐである。Ｃａｓ−ＯＦＦｉｎｄｅｒで生成された１５、６３２個の予測値（クエリ配列設定：６以下はミスマッチ、ＤＮＡ／ＲＮＡバルジサイズは２以下）には、ＣＲＩＳＴＡまたはＣＣＴｏｐで生成された全ての予測値が含まれている。そのため、Ｃａｓ−ＯＦＦｉｎｄｅｒの予測値のみを分析に使用した。候補となるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集を、変異体位置と染色体とのマッチングによって、ＣＡＳ−ＯＦＦｉｎｄｅｒのオフターゲット予測と比較した。
【０１５３】
ゲノム有病率。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集候補リストを、同じ生物学的複製物の以前に生成したＲＮＡ−Ｓｅｑデータと相互参照した。また、候補リストを、１０００ゲノムプロジェクトで定義されたゲノム有病率でフィルタリングした（１％未満の対立遺伝子頻度は、まれと見なした）。
【０１５４】
仮説検証。非形質導入Ｔ細胞における一塩基変異体（置換）またはインデル（挿入／欠失）の数をノックアウトＴ細胞と比較し、ＣＡＲＴ１９細胞におけるそれらの数をノックアウトＣＡＲＴ１９細胞と比較し、全ての対照におけるそれらの数を全てのノックアウト細胞と比較した。一塩基変異体とインデルとにおける差異を、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用のＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ８．１．１を用いて、バイオリンプロットで描いた。試料は依存性であるので、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ符号順位検定を用いた。
【０１５５】
結果：
【０１５６】
ＷＥＳを用いて、正確なＣＳＦ２遺伝子編集位置を特定したところ、ＰＡＭ部位の３ｂｐ上流に切断部位を有することが予想された（図２０Ａ、上側パネル）。実際の切断部位は、ＰＡＭ部位の６ｂｐ上流に位置することが判明し、染色体５スキーマの塩基１３２０７４８２８に挿入及び欠失を生じた（図２０Ａ、下側パネル）。Ｃａｓ９切断部位の差異は、逆鎖上の隣接するＰＡＭサイトに起因すると思われる。ＣＡＲＴ１９の各生物学的複製物における挿入及び欠失の頻度を、図２０Ａの下側パネルに示す。
【０１５７】
対照（Ｔ細胞及びＣＡＲＴ１９細胞）と比較した、ＣＲＩＳＰＲノックアウト条件における一塩基変異体（ＳＮＶ）の数、及び、挿入／欠失（インデル）の数を確認した（図２０Ｂ）。グループ間に有意差は認められなかった（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ符号順位検定、ｐ値＝０．１６）。
【０１５８】
また、ＣＲＩＳＰＲ編集細胞において検出された全変異体を、それらの各対照（ＣＡＲＴ１９またはＴ細胞）と比較して表したものも確認した。ＳＮＰを、集団におけるゲノム有病率（１０００ゲノムプロジェクトでは１％未満）と、３つの生物学的複製物の全てにおける存在についてフィルタリングした。０．００４％（４）のＳＮＰがＣＡＲＴ１９細胞のみで検出され、０．００６％（５）のＳＮＰがＴ細胞のみで検出され、０．０００１％（１）のＳＮＰがＣＡＲＴ１９細胞及びＴ細胞の両方で検出され、９９％（１２、４３９）のＳＮＰがフィルタ除去された（図２０Ｃ）。Ｔ細胞及びＣＡＲＴ１９細胞の両方に存在するＳＮＰ（図２０Ｃの交点）が、図２０Ａの下側パネルに示されるＣＳＦ２遺伝子の欠失として確認された。
【０１５９】
これらの結果は、ＣａｓＯＦＦｉｎｄｅｒのオフターゲット予測と一致する唯一の編集は、ＣＳＦ２編集であり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＣＡＲＴ１９細胞におけるＧＭ−ＣＳＦ破壊がＧＭ−ＣＳＦをノックアウトする安全な方法であることを実証した。
【０１６０】
実施例６：ＧＭ−ＣＳＦ及びＣＡＲＴ１９の単球分化
【０１６１】
材料及び方法：
【０１６２】
ＰＢＭＣを単離し、Ｃｌａｓｓｉｃａｌ単球分離キット（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を使用して単球を分離した。次いで、ＣｅｌｌＸＶｉｖｏヒトＭｌまたはＭ２マクロファージ分化キット（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ社）を使用して、単球をＭｌマクロファージまたはＭ２マクロファージに分化させた。
【０１６３】
ＣＡＲＴ１９細胞、Ｎａｌｍ６、及び、ＭｌマクロファージまたはＭ２マクロファージを、１：１：１の割合で共培養した。細胞を３日目に採取し、ＣＤ３及びライブ／デッドアクア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。絶対的定量のために、フローサイトメトリー分析前にカウントブライトビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した。
【０１６４】
結果：
【０１６５】
Ｍ１マクロファージ存在下でのＧＭ−ＣＳＦの中和は、ＣＤ１９刺激によるＣＡＲＴ１９の増殖は統計的に有意に変化しなかった。しかしながら、ＧＭ−ＣＳＦの中和は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖が促進される傾向が認められた。ＧＭ−ＣＳＦ遮断は、Ｍ２マクロファージの存在下でＣＤ１９を刺激したときに、ＣＡＲＴ１９の増殖を統計的に有意に増強した（図２１）。
【０１６６】
他の実施形態
【０１６７】
以上、本発明を、その詳細な説明に関連して説明したが、上述の説明は、例示することを意図しており、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するのではないことを理解されたい。他の態様、利点、及び改変も、添付の特許請求の範囲に含まれる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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