(57)【要約】  単一のＣＡＲ  Ｔ構築物を用いて癌細胞上の複数の標的を同時に標的とする、固形腫瘍の存在によって特徴づけられる癌を処置するための組成物および方法が開示されている。【選択図】図１Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一の腫瘍関連抗原を結合する第一の標的化部分に共有結合された第一の合成抗原を含む二機能性化合物または薬学的に許容され得るその塩もしくは立体異性体。
【請求項２】
前記標的化部分が、脳腫瘍関連抗原を特異的に結合する、請求項１に記載の二機能性化合物。
【請求項３】
前記標的化部分が、ＧＤ２、ＩＬ１３Ｒα２、ＨＥＲ２、ＰＤＧＦＲα、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＳＰＧ４、ＥｐｈＡ２およびＣＤ１３３からなる群から選択される脳腫瘍関連抗原を特異的に結合する、請求項２に記載の二機能性化合物。
【請求項４】
前記標的化部分が、血液腫瘍関連抗原を特異的に結合する、請求項１に記載の二機能性化合物。
【請求項５】
前記標的化部分が、ＣＤ３８、ＣＳ１、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１３８、ＣＤ４０、ＣＤ５６、ＣＤ７０およびＣＤ７４からなる群から選択される血液腫瘍関連抗原を特異的に結合する、請求項４に記載の二機能性化合物。
【請求項６】
前記標的化部分が、ＨＥＲ２に特異的に結合する、請求項１に記載の二機能性化合物。
【請求項７】
前記合成抗原が蛍光性分子である、請求項１に記載の二機能性化合物。
【請求項８】
前記蛍光性分子がフルオレセインまたはアントラセンである、請求項７に記載の二機能性化合物。
【請求項９】
前記合成抗原が、４−［（６−メチルピラジン−２−イル）オキシ］ベンゾエート（ＭＰＯＢ）、アントラキノン−２−カルボキシレート（ＡＱ）またはテトラキセタン（ＤＯＴＡ）である、請求項１に記載の二機能性化合物。
【請求項１０】
前記合成抗原が除去可能な保護基を含有する、請求項１に記載の二機能性化合物。
【請求項１１】
前記除去可能な保護基がボロン酸エステル基である、請求項１０に記載の二機能性化合物。
【請求項１２】
前記除去可能な保護基が光切断可能な基である、請求項１０に記載の二機能性化合物。
【請求項１３】
前記合成抗原がペプチド、グリコシドまたはヌクレオチド抗原である、請求項１に記載の二機能性化合物。
【請求項１４】
治療的有効量の、請求項１に記載の二機能性化合物または薬学的に許容され得る塩もしくは立体異性体と、薬学的に許容され得る担体とを含む薬学的組成物であって、前記二機能性化合物が第一の二機能性化合物である、薬学的組成物。
【請求項１５】
第一の腫瘍関連抗原を結合する第二の標的化部分に共有結合された前記第一の合成抗原を含む第二の二機能性化合物または薬学的に許容され得るその塩もしくは立体異性体をさらに含む、請求項１４に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
複数の治療的有効量の、二機能性化合物の部分集団であって、前記第一の二機能性化合物の第一の部分集団を含み、第二の腫瘍関連抗原を特異的に結合する第二の標的化部分に共有結合された前記第一の合成抗原を含む第二の二機能性化合物の少なくとも第二の部分集団をさらに含む二機能性化合物の部分集団またはそれらの薬学的に許容され得る塩もしくは立体異性体を含む薬学的組成物であって、前記第一および第二の標的化部分が異なる腫瘍関連抗原を特異的に結合し、ならびに前記組成物中の二機能性化合物の各部分集団が、前記組成物中の他の部分集団中に含有される二機能性化合物とは異なる腫瘍関連抗原を結合する、請求項１４に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
前記第一および第二の標的化部分が、ＧＤ２、ＩＬ１３Ｒα２、ＨＥＲ２、ＰＤＧＦＲα、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＳＰＧ４、ＥｐｈＡ２およびＣＤ１３３からなる群から選択される脳腫瘍関連抗原を特異的に結合する、請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
前記第一および第二の標的化部分の各々が、ＩＬ１３Ｒα２、ＥＧＦＲｖＩＩＩおよびＨＥＲ２からなる群から選択される脳腫瘍関連抗原を特異的に結合し、または前記第一および第二の標的化部分の各々が、ＧＤ２、ＰＤＧＦＲαおよびＣＤ１３３からなる群から選択される脳腫瘍関連抗原を特異的に結合し、または前記第一および第二の標的化部分の各々が、ＥｐｈＡ２およびＣＳＰＧ４からなる群から選択される脳腫瘍関連抗原を特異的に結合する、請求項１７に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
前記第一および第二の標的化部分が、ＣＤ３８、ＣＳ１、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１３８、ＣＤ４０、ＣＤ５６、ＣＤ７０およびＣＤ７４からなる群から選択される血液腫瘍関連抗原を特異的に結合する、請求項１４に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
前記第一および第二の標的化部分の各々が、ＣＤ３８、ＣＳ１およびＢＣＭＡからなる群から選択される血液腫瘍関連抗原を特異的に結合し、または前記第一および第二の標的化部分の各々が、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ２２からなる群から選択される血液腫瘍関連抗原を特異的に結合し、または前記第一および第二の標的化部分の各々が、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４およびＣＤ１３８からなる群から選択される血液腫瘍関連抗原を特異的に結合する、請求項１９に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
癌を処置する方法であって、ａ）複数の、二機能性分子の部分集団であって、前記複数がａ１）治療的有効量の、第一の腫瘍関連抗原を特異的に結合する第一の標的化部分に共有結合された合成抗原を含む二機能性化合物の第一の部分集団と、ａ２）治療的有効量の、第二の腫瘍関連抗原を特異的に結合する第二の標的化部分に共有結合された合成抗原を含む二機能性化合物の第二の部分集団とを含む二機能性分子の部分集団または薬学的に許容され得るその塩もしくは立体異性体と、ここで、前記第一および第二の標的化部分は、異なる腫瘍関連抗原を特異的に結合し、
ｂ）治療的有効数のＣＡＲ−Ｔ細胞であって、合成抗原を特異的に結合する細胞外リガンドを含むＣＡＲ−Ｔ細胞と、
を癌を処置することを必要とする被験体に併用投与することを含む、方法。
【請求項２２】
前記治療的有効量の前記複数の、二機能性化合物の部分集団が同時に投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記治療的有効量の前記複数の、二機能性化合物の部分集団が順次に投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記複数の、二機能性化合物の部分集団が、単一の組成物中で投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記複数の、二機能性化合物の部分集団が、異なる組成物中で投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
治療的有効量の、前記二機能性化合物の前記第一および／または第二の部分集団の少なくとも１回のその後の投与をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
二機能性化合物の前記第一および／または第二の部分集団の少なくとも１回のその後の投与において、前記第一の標的化部分が、従前の投与における前記第一の標的化部分と比べて同一の腫瘍関連抗原上の異なるエピトープを結合し、前記第二の標的化部分が、従前の投与における前記第二の標的化部分と比べて同一の腫瘍関連抗原上の異なるエピトープを結合する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記第一および第二の標的化部分と比べて異なる腫瘍関連抗原を結合する第三の標的化部分に共有結合された合成抗原を含む二機能性化合物の第三の部分集団を併用投与することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記合成抗原が除去可能な保護基を含有し、前記ＣＡＲ  Ｔ細胞の前記細胞外リガンドが除去可能な保護基の除去後に合成抗原を結合する、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記被験体が脳癌を有し、前記第一および第二の標的化部分が異なる脳腫瘍関連抗原を特異的に結合する、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
前記第一および第二の標的化部分の各々が、ＧＤ２、ＩＬ１３Ｒα２、ＨＥＲ２、ＰＤＧＦＲα、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＳＰＧ４、ＥｐｈＡ２およびＣＤ１３３からなる群から選択される脳腫瘍関連抗原を特異的に結合する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記第一および第二の標的化部分の各々が、ＩＬ１３Ｒα２、ＥＧＦＲｖＩＩＩおよびＨＥＲ２からなる群から選択される脳腫瘍関連抗原を特異的に結合し、または前記第一および第二の標的化部分の各々が、ＧＤ２、ＰＤＧＦＲαおよびＣＤ１３３からなる群から選択される脳腫瘍関連抗原を特異的に結合し、または前記第一および第二の標的化部分の各々が、ＥｐｈＡ２およびＣＳＰＧ４からなる群から選択される脳腫瘍関連抗原を特異的に結合する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記脳癌が神経膠腫である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記神経膠腫がびまん性内在性橋膠腫（ＤＩＰＧ）である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記脳癌が神経膠芽腫（ＧＢＭ）である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記被験体が血液癌を有し、前記第一および第二の標的化部分が異なる血液腫瘍関連抗原を特異的に結合する、請求項２１に記載の方法。
【請求項３７】
前記第一および第二の標的化部分の各々が、ＣＤ３８、ＣＳ１、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１３８、ＣＤ４０、ＣＤ５６、ＣＤ７０およびＣＤ７４からなる群から選択される血液腫瘍関連抗原を特異的に結合する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記第一および第二の標的化部分の各々が、ＣＤ３８、ＣＳ１およびＢＣＭＡからなる群から選択される血液腫瘍関連抗原を特異的に結合し、または前記第一および第二の標的化部分の各々が、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ２２からなる群から選択される血液腫瘍関連抗原を特異的に結合し、または前記第一および第二の標的化部分の各々が、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４およびＣＤ１３８からなる群から選択される血液腫瘍関連抗原を特異的に結合する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記血液癌が、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫または大顆粒リンパ球性（ＬＧＬ）白血病である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記癌がＨＥＲ２＋癌である、請求項２１に記載の方法。
【請求項４１】
前記癌が、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、脳癌、卵巣癌または膵臓癌である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ａ）およびｂ）より前に、前記被験体が一次癌処置を受けた、請求項２１に記載の方法。
【請求項４３】
前記一次癌処置が、抗原逃避の結果として無効となった、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記被験体がヒトである、請求項２１に記載の方法。
【請求項４５】
治療的有効量の複数の、二機能性化合物または薬学的に許容され得るその塩もしくは立体異性体の部分集団であって、第一の部分集団中の各二機能性化合物が、第一の腫瘍関連抗原を特異的に結合する第一の標的化部分に共有結合された第一の合成抗原を含み、および第二の部分集団中の各二機能性化合物が、第二の腫瘍関連抗原を特異的に結合する第二の標的化部分に共有結合された前記第一の合成抗原を含む部分集団と、ここで、前記第一および第二の標的化部分は異なる腫瘍関連抗原を特異的に結合し、ならびに患者に投与される二機能性化合物の各部分集団は前記第一の合成抗原を含有するが、異なる腫瘍関連抗原を特異的に結合し、前記複数の、二機能性化合物の部分集団は同一のまたは別個の容器中に配置されており、
ｂ）前記治療的有効量の複数の、二機能性化合物の部分集団、治療的有効数のＣＡＲ−Ｔ細胞であって、前記合成抗原を特異的に結合する細胞外リガンドを含むＣＡＲ−Ｔ細胞を癌患者に併用投与するための説明書と、
を備える、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、３５米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０１８年６月２８日に出願された米国仮出願第６２／６９１，４８６号および２０１８年７月１３日に出願された米国仮出願第６２／６９７，５２６号の優先権の恩典を主張し、これらの各々の全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府の実施権
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＤＫ１０５６０２−０１号およびＴ３２ＡＩ００７３８６号の下で政府の援助によって為された。合衆国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
癌免疫療法は進行した癌を有する患者中に持続的反応を誘導することができることが、臨床試験によって実証されている。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を用いたＢ細胞由来の白血病、リンパ腫および多発性骨髄腫（ＭＭ）の処置の成功の報告が数多く存在している。これらの遺伝子改変されたＴ細胞は、癌性Ｂ細胞の表面上に広く存在するが、正常な非癌性Ｂ細胞上にも存在する表面抗原分類１９（ＣＤ１９）、ＣＤ２２およびＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）受容体に対する特異性を有する。これらの癌に対する奏効率はなお高いが、より調節可能なＣＡＲ  Ｔ細胞系に対する要求がなお存在する（Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．３３：５４０−９（２０１５）、Ｍａｕｄｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １２５：４０１７−２３（２０１５）、Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２９（５）：５８５−６０１（２０１８）、Ｒａｊｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３８０（１８）：１７２６−３７（２０１９）、Ｆｒｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２４：２０−８（２０１８））。
【０００４】
脳癌は、有意義で持続的な治療に対する特に手ごわい敵として存在する。神経膠芽腫（ＧＢＭ）の場合には、例えば、全ての現在利用可能なＦＤＡによって承認された処置は本質的に対症療法的である。１３年前以来、新たに診断された患者に対する現在の治療標準として確立された放射線とテモゾロミド化学療法の組み合わせ（Ｓｔｕｐｐ  ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，３５２：９８７−９６（２００５））は１５ヶ月の生存期間中央値を与えるに過ぎないが、救援療法は再発した患者の生存を延長しない。
【０００５】
ＧＢＭ腫瘍の増殖を駆動する鍵となる遺伝的変異および調節不全となった細胞シグナル伝達経路の媒介物質への注目すべき洞察が得られている。しかしながら、癌を駆動する経路を遮断する生物学的治療は、経路活性化の重複的機序、腫瘍内不均一性、後天的耐性および中枢神経系（ＣＮＳ）中への血液脳関門を通じた乏しい送達など複数の理由のために、ＧＢＭ患者に対する臨床的有益性を一貫して与えることができなかった。同様に、ＧＢＭは最も血管新生能が高い癌の１つであるという事実に関わらず、血管内皮増殖因子の効果的な阻害は患者の生存を改善せず、その他の血管新生促進因子の代償性上方制御ならびに血管新生阻害後に発生する低酸素で栄養不足の微小環境に適合し、進行するＧＢＭ腫瘍の能力が原因である可能性が最も高い。残念であるが、このような結果はＧＢＭには前例がないことではなく、このため、この疾患の複雑さを明確に示している。
【０００６】
免疫チェックポイント封鎖、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、ワクチンおよび腫瘍溶解性ウイルスを含む様々な免疫療法アプローチは、幅広い癌適応症にわたって興味深い結果を達成してきた。残念なことに、ＧＢＭ患者に対するこのようなアプローチを評価する大規模な無作為３相試験の最近の結果は否定的であった。これらには、新たに診断された患者に対する単一の腫瘍特異的変異（上皮増殖因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ））を標的とするワクチン（Ｗｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ，１８：１３７３−８５（２０１７））および再発性患者に対する抗プログラム死１（ＰＤ−１）抗体の投与（Ｒｅａｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ（ＷＦＮＯＳ）Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（２０１７））が含まれる。
【０００７】
ＧＢＭの免疫生物学が高度に複雑であり、複数の内在性および適応性因子が抗腫瘍免疫応答を拮抗することに寄与していることを示すデータが相次いでいる。したがって、ＧＢＭ患者に対する免疫療法処置の成功には、この複雑さに対する鍵となる寄与因子のさらなる発見およびより深い理解ならびにこれに続く、これらの困難な要因を克服するために最適化された治療戦略の設計を必要とするであろう。
【０００８】
別の種類の脳癌である高悪性度小児神経膠腫は、小児期の最も悪性の高い腫瘍の１つである。小児神経膠腫を有する小児において何百もの臨床試験が実施されてきたが、奏効率または長期的転帰には限定的な改善が存在した。これは、脳幹の橋内に見出される神経膠腫であるびまん性内在性橋膠腫（ＤＩＰＧ）に特に当てはまる。ＤＩＰＧは、通例、４〜６歳の患者に診断され、これらの小児の大半は診断の１年以内に死亡する。
【０００９】
現在まで、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法は、脳腫瘍を含む固形腫瘍に対してわずかな成功を有するに過ぎなかった。さらに、ＣＡＲ  Ｔ細胞活性を調節することは、血液の悪性病変の治療を強化することができるであろう。したがって、ＭＭなどの血液癌ならびに固形腫瘍、特に、ＧＢＭおよびＤＩＰＧおよび脳癌の他の形態に対するより効果的な、ＣＡＲ  Ｔ細胞を基礎とする抗癌治療への要望がなお存在している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．３３：５４０−９（２０１５）
【非特許文献２】Ｍａｕｄｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １２５：４０１７−２３（２０１５）
【非特許文献３】Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２９（５）：５８５−６０１（２０１８）
【非特許文献４】Ｒａｊｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３８０（１８）：１７２６−３７（２０１９）
【非特許文献５】Ｆｒｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２４：２０−８（２０１８）
【非特許文献６】Ｓｔｕｐｐ  ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，３５２：９８７−９６（２００５）
【非特許文献７】Ｗｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ，１８：１３７３−８５（２０１７）
【非特許文献８】Ｒｅａｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ（ＷＦＮＯＳ）Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（２０１７）
【発明の概要】
【００１１】
本発明の第一の態様は、腫瘍細胞上に存在する腫瘍関連抗原を結合する標的化部分（本明細書において標的化リガンドとも称される）に共有結合されている本明細書において合成抗原とも称される小分子を含む二機能性化合物を対象とする。
【００１２】
いくつかの実施形態において、標的化部分は、脳腫瘍関連抗原を特異的に結合する。いくつかの実施形態において、腫瘍関連抗原は、ジシアロガングリオシドＧＤ２（ＧＤ２）、環状アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）リボースヒドロラーゼ（ＣＤ３８）、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）ファミリーメンバー７（ＳＬＡＭ７；ＣＳ１）、インターロイキン１３受容体α２（ＩＬ１３Ｒα２）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、血小板由来増殖因子受容体α（ＰＤＧＦＲα）、上皮増殖因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）、エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）、プロミニンー１（ＣＤ１３３）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、Ｂリンパ球抗原ＣＤ２０（ＣＤ２０）、Ｂリンパ球抗原ＣＤ１９（ＣＤ１９）およびＢ細胞受容体ＣＤ２２（ＣＤ２２）からなる群から選択される。
【００１３】
いくつかの実施形態において、合成抗原は、フルオレセイン（ＦＬ）などの蛍光性色素である。他の実施形態において、合成抗原は、４−［（６−メチルピラジン−２−イル）オキシ］ベンゾエート（ＭＰＯＢ）、アントラキノン−２−カルボキシレート（ＡＱ）またはテトラキセタン（ＤＯＴＡ）である。
【００１４】
いくつかの実施形態において、合成抗原は、例えば、光（可視（ＶＩＳ）、近赤外（ＮＩＲ）または紫外（ＵＶ））または活性酸素もしくは窒素種（ＲＯＳ、ＲＮＳ）の存在などのある種の条件下で除去可能である保護基を含有する。このような実施形態において、合成抗原は、本明細書ではプロ抗原（ｐｒｏ−ａｎｔｉｇｅｎ）と称される。プロ抗原は、抗体またはその機能的断片などの結合実体に接近可能でない。保護基の（例えば、切断による）除去は、遮蔽されていないまたはかごから出された合成抗原がこのような結合を受けやすいようにする。
【００１５】
本発明の別の態様は、治療的有効量の二機能性化合物と薬学的に許容され得る担体とを含む薬学的組成物を対象とする。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、二機能性化合物の複数の（２またはそれより多くの）部分集団を含有し、各部分集団において、合成抗原は同一であり得るが、各標的化部分は同じ腫瘍関連抗原の異なるエピトープを結合する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、二機能性化合物の複数の（２またはそれより多くの）部分集団を含有し、各部分集団において、合成抗原は同一であり得るが、各標的化部分は腫瘍細胞上に存在する異なる腫瘍関連抗原を結合する。したがって、薬学的組成物は、第一の腫瘍関連抗原を特異的に結合する第一の標的化部分を有する二機能性化合物の第一の部分集団と、第二の腫瘍関連抗原を特異的に結合する第二の標的化部分をそれぞれが有する二機能性化合物の第二の部分集団とを含有し得、前記第一および第二の標的化部分は異なる腫瘍関連抗原を結合する。他の実施形態において、二機能性化合物の複数の部分集団は、二機能性化合物の第三の、第四の、第五のなどの部分集団を含有し、これらのそれぞれは、腫瘍細胞上に存在する異なる腫瘍関連抗原を結合する。したがって、いくつかの実施形態において、所定の組成物は、同じ腫瘍関連抗原の１またはそれより多くのエピトープを標的とし得る。他の実施形態において、組成物は、２またはそれより多くの腫瘍関連抗原（およびこの２またはそれより多くの腫瘍関連抗原の任意の１つまたはそれより多くの２またはそれより多くのエピトープ）を標的とし得る。
【００１６】
いくつかの実施形態において、第一および第二の標的化部分は、脳腫瘍関連抗原を特異的に結合する。いくつかの実施形態において、脳腫瘍関連抗原は、ＧＤ２、ＩＬ１３Ｒα２、ＨＥＲ２、ＰＤＧＦＲα、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＳＰＧ４、ＥｐｈＡ２、ＣＤ１３３から選択され、第一および第二の標的化部分は脳腫瘍関連抗原を結合する。
【００１７】
いくつかの実施形態において、第一および第二の標的化部分は、血液腫瘍関連抗原を特異的に結合する。いくつかの実施形態において、二機能性化合物の部分集団によって標的とされる血液腫瘍関連抗原は、ＣＤ３８、ＣＳ１、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＤ４０、ＣＤ５６、ＣＤ７０およびＣＤ７４からなる群から選択される。
【００１８】
いくつかの実施形態において、第一または第二の標的化部分は、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、脳癌、卵巣癌および膵臓癌などのＨＥＲ２＋悪性病変上のＨＥＲ２に特異的に結合する。
本発明の別の態様は、癌を処置する方法であって、ａ）複数の、二機能性分子の部分集団であって、前記複数がａ１）治療的有効量の、第一の腫瘍関連抗原を特異的に結合する第一の標的化部分に共有結合された合成抗原を含む二機能性化合物の第一の部分集団と、ａ２）治療的有効量の、第二の腫瘍関連抗原を特異的に結合する第二の標的化部分に共有結合された合成抗原を含む二機能性化合物の第二の部分集団とを含む二機能性分子の部分集団または薬学的に許容され得るそれらの塩もしくは立体異性体と、ここで、前記第一および第二の標的化部分は、異なる腫瘍関連抗原を特異的に結合し、
ｂ）治療的有効数のＣＡＲ−Ｔ細胞であって、合成抗原を特異的に結合する細胞外リガンドを含むＣＡＲ−Ｔ細胞と、
を癌を処置することを必要とする被験体に併用投与することを含む、方法を対象とする。
【００１９】
治療的有効量の複数の、二機能性化合物の部分集団は同時にまたは順次に投与される。いくつかの実施形態において、二機能性化合物の部分集団は同時に投与され、複数の腫瘍抗原の標的化は、（同じ患者内でのまたは複数の患者間での）腫瘍関連抗原の一方または両方の不均一な発現のために、増加した有効性をもたらし得る。他の実施形態において、例えば、患者が、二機能性化合物の第一の（組）に対してもはや応答せず、治療的有効性を維持するために二機能性化合物の第二の系列が必要とされる場合には、二機能性化合物の複数の部分集団が順次に与えられる。
【００２０】
いくつかの実施形態において、癌は、固形腫瘍の存在を特徴とする。いくつかの実施形態において、癌は、ＧＢＭまたはＤＩＰＧなどの脳癌であり、第一および第二の部分集団中に存在する二機能性化合物の標的化部分は脳腫瘍関連抗原を特異的に結合する。いくつかの実施形態において、脳腫瘍関連抗原は、ＧＤ２、ＩＬ１３Ｒα２、ＨＥＲ２、ＰＤＧＦＲα、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＳＰＧ４、ＥｐｈＡ２およびＣＤ１３３から選択され、第一および第二の標的化部分は異なる脳腫瘍関連抗原を結合する。
【００２１】
いくつかの実施形態において、癌は、脳癌、肺癌、結腸直腸癌、脳癌、卵巣癌および膵臓癌などのＨＥＲ２＋悪性病変である。
【００２２】
いくつかの実施形態において、癌は血液癌である。いくつかの実施形態において、血液癌は、多発性骨髄腫、白血病およびリンパ腫であり、第一および第二の部分集団中に存在する二機能性化合物の標的化部分は血液腫瘍関連抗原を特異的に結合する。いくつかの実施形態において、血液腫瘍関連抗原は、ＣＤ３８、ＣＳ１、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１３８、ＣＤ４０、ＣＤ５６、ＣＤ７０およびＣＤ７４から選択され、第一および第二の標的化部分は異なる血液腫瘍関連抗原を結合する。
【００２３】
いくつかの実施形態において、これらの方法は、二機能性化合物の部分集団の１回より多い投与を伴い得る。このような事例では、二機能性化合物の複数の（例えば、第一および第二の）部分集団の各々中のそれぞれの標的化部分は、標的腫瘍関連抗原上の同じエピトープに結合する点で同一であり得る。いくつかの他の実施形態では、二機能性化合物の任意の部分集団は、部分集団が同じ標的腫瘍関連抗原上の異なるエピトープを結合する標的化部分を含むまたはさらに含むように、拡大され得または改変され得る。したがって、本発明の実施形態は、二機能性化合物の部分集団の第一の投与と、任意の１つまたは複数の部分集団の標的化部分が同じ腫瘍関連抗原の異なるエピトープに結合する点で第一の投与と異なる少なくとも第二の投与とを含み得、第一および第二の投与は同時または順次であり得る。このさらなる特徴は、抗原喪失／逃避を緩和し得、または毒性を軽減し得る。いくつかの実施形態において、前記方法は、二機能性化合物の第三、第四、第五などの部分集団の投与を伴い得、ここで、各部分集団は、異なる腫瘍関連抗原を標的とする。
【００２４】
本発明のさらなる態様は、二機能性化合物の複数の部分集団とＣＡＲ  Ｔ細胞とを含む系を対象とする。
【００２５】
本発明のさらなる態様は、治療的有効量の複数の、二機能性化合物または薬学的に許容され得るその塩もしくは立体異性体の部分集団であって、第一の部分集団中の各二機能性化合物が第一の腫瘍関連抗原を特異的に結合する第一の標的化部分に共有結合された第一の合成抗原を含み、および第二の部分集団中の各二機能性化合物が第二の腫瘍関連抗原を特異的に結合する第二の標的化部分に共有結合された前記第一の合成抗原を含む部分集団と、ここで、前記第一および第二の標的化部分は異なる腫瘍関連抗原を特異的に結合し、二機能性化合物の前記複数の部分集団は前記同一のまたは別個の容器中に配置されており、
ｂ）二機能性化合物の治療的有効量の複数の部分集団  治療的有効数のＣＡＲ−Ｔ細胞であって、前記合成抗原を特異的に結合する細胞外リガンドを含むＣＡＲ−Ｔ細胞を癌患者に併用投与するための説明書と、
を備える、キットを対象とする。上述されているように、いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、二機能性化合物の複数の（２またはそれより多くの）部分集団を含有し得、各部分集団において、合成抗原は同一であり得るが、各標的化部分は同じ腫瘍関連抗原の異なるエピトープを結合する。したがって、いくつかの実施形態において、所定の組成物は、同じ腫瘍関連抗原の１またはそれより多くのエピトープを標的とし得る。他の実施形態において、組成物は、２またはそれより多くの腫瘍関連抗原（およびこの２またはそれより多くの腫瘍関連抗原の任意の１つまたはそれより多くの２またはそれより多くのエピトープ）を標的とし得る。
【００２６】
図１Ａ〜図１Ｄに模式的に示されているように、本発明は、多重化可能かつ用量調節可能な（ｄｏｓｅａｂｌｅ）ＣＡＲ  Ｔ細胞プラットフォームとして記載され得る。ＤＩＰＧおよびＧＢＭなどの脳癌または多発性骨髄腫、白血病およびリンパ腫などの血液癌を含む固形腫瘍または血液腫瘍の存在によって特徴づけられる癌に対する現行のＣＡＲ  Ｔ細胞アプローチとは異なり、本発明は、たった１つのＣＡＲ  Ｔ構築物を用いて複数の腫瘍関連抗原を同時に標的とし得る。その際に、本発明は、増大された細胞毒性を与え、抗原逃避の可能性を低下させ、臨床的に使用される標的に関してより大きな多用途性を与え得、次いで、脳癌または血液癌、特にＧＢＭおよび多発性骨髄腫中に観察される多様な患者間および患者内不均一性にわたってＣＡＲ  Ｔ細胞の有効性を増加させ得る。さらに、本発明は、選択された標的であるありとあらゆる腫瘍関連抗原に対してＣＡＲ  Ｔ細胞を改変操作する必要性を省く。さらに、異なる空間分布を有する複数の異なる腫瘍標的化抗体を組み合わせることによって、本発明は、身体全体に低用量抗原を分布させることによって、健康な組織に対する毒性を低減し、または取り除き得る。したがって、固形または血液腫瘍を処置するためのこのアプローチは、効力を増加させ、治療の持続期間を増加させ、有害な副作用を低減させ得る。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１Ａ〜図１Ｅは、用量調整可能かつ多重な抗小分子ＣＡＲ  Ｔ細胞の利点を図解する一連の図表である。図１Ａは、伝統的なＣＡＲ  Ｔ細胞デザインと比較した、腫瘍細胞認識を腫瘍細胞死滅と切り離す抗小分子ＣＡＲ  Ｔ細胞の系を示す。図１Ｂは、図１Ａに示されている系からの多重抗体−小分子接合体を示す。図１Ｃは、この系が、不活性を上回り、毒性レベルを下回って細胞が働けるようにすることによって投薬を可能にすることを示す。図１Ｄは、本発明が、抗原逃避変異体を抑制し、抗原逃避変異体と戦うためにより大きな多用途性を可能にすることを示す。抗小分子ＣＡＲ  Ｔ細胞とともに、癌の再発を防ぐために、複数の抗体は同時にまたは順次に与えることができる。図１Ｅは、この系が、抗体−小分子接合体とＣＡＲ  Ｔ細胞の投与の経路を別々に調節することが可能であり得ることを示す。
【図２】図２Ａ〜図２Ｈは、小分子を使用するＣＡＲ  Ｔ細胞の柔軟性を示す一連の線グラフおよび棒グラフである。図２Ａは、そのそれぞれの標的を特異的に死滅される２つの異なるＣＡＲ  Ｔ細胞（抗ＭＰＯＢおよび抗ＦＬ  ＣＡＲ  Ｔ細胞）の代表的な例を示す。図２Ｂ〜図２Ｄは、小分子ＣＡＲ  Ｔ細胞が、異なる種類の腫瘍細胞中で発現された多くの異なる標的に向けて経路を変更できることを示す。図２Ｅは、ＣＡＲ  Ｔ細胞の増加する濃度に伴うＣＡＲ  Ｔ細胞用量応答性細胞毒性を実証する。図２Ｆおよび図２Ｇは、小分子が結合された抗体の増加する濃度に伴うＣＡＲ  Ｔ細胞用量応答性細胞毒性を示し、小分子が結合された抗体の量が増加するにつれて、異なるＣＡＲ  Ｔ細胞デザインが、細胞毒性の同じような増加を与えることを実証する。図２Ｈは、１またはそれより多くの腫瘍の種類を標的とするために、同じＣＡＲ  Ｔ細胞を別の目的に変更できることを実証する。棒グラフは、同じ抗原を発現しない２つの腫瘍集団：多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）および多発性骨髄腫（ＭＭ）とともに共インキュベートされた抗小分子ＣＡＲ  Ｔ細胞の死滅効率における比較を示す。腫瘍細胞が小分子接合抗体で完全に覆われると、両集団を標的とし、死滅させることができる。
【図３】図３Ａ〜図３Ｂは、表記タンパク質の発現レベルを示すヒートマップである。図３Ａは、Ａ１７２（ＧＢＭ細胞株）、ＢＴ１４５およびＢＴ３３３（Ｈ３．３  ＷＴ患者由来の成人ＧＢＭ株）およびＢＴ８６９（Ｈ３−Ｋ２７Ｍ患者由来の小児ＤＩＰＧ細胞株）中でのＧＤ２、ＰＤＧＦＲαおよびＩＬ１３Ｒα２の発現レベルを示すヒートマップである。図３Ｂは、多発性骨髄腫細胞株中のＣＤ３８、ＣＤ２０およびＣＳ１の発現レベルを示すヒートマップである。
【図４】図４Ａ〜図４Ｂは、部位特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞活性に対して小分子抗原を保護することができることを示す、それぞれ、化学モデルおよび棒グラフである。図４Ａは、遮蔽されていないフルオレセインへの抗フルオレセイン抗体（ＰＢＤ  ＩＤ：１Ｘ９Ｑ）の結合を示す化学モデルである。抗フルオレセイン抗体アミノ酸極性接触が、黄色の点線によって示されている。紫で示されたアミノ酸側鎖との接触は、結合を妨げるために、保護部分で遮蔽することができる。図４Ｂは、「かごに入った／遮蔽された」または「かごに入っていない／遮蔽されていない」フルオレセイン誘導体に結合された腫瘍標的化抗体を用い、光反応性ｏ−ニトロベンジル保護基を用いて、ヒト抗体フルオレセインＣＡＲ  Ｔ細胞のインビトロ細胞毒性を示すグラフである。ＣＡＲ  Ｔ細胞は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）または紫外線（ＵＶ）「かごに入っていない／遮蔽されていない」フルオレセイン誘導体に結合された市販の抗体によって結合された標的細胞を特異的に死滅させた。しかしながら、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、「かごに入った／遮蔽された」フルオレセイン誘導体によって結合された標的細胞を死滅させることができた。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
別段の定義がなければ、本明細書で使用されている全ての技術用語および科学用語は、当業者によって通常理解される意味と同一の意味を有する。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、反対のことが明記されていなければ、本発明の理解を容易にするために、以下の用語は表記された意味を有する。
【００２９】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別段の指示をしていなければ、複数表記を含む。したがって、例えば、「１つの組成物（ａ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」という表記は、２つまたはそれより多いこのような組成物の混合物を含み、「１つの阻害剤（ａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」という表記は、２つまたはそれより多くのこのような阻害剤の混合物を含むなど。
【００３０】
別段の記載がなければ、「約」という用語は、「約」という用語によって修飾された特定の値の１０％以内（例えば、５％、２％または１％以内）を意味する。
【００３１】
「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」または「によって特徴づけられる（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ）」と同義である「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という移行句は、包摂的または非限定的であり、さらなる述べられていない要素または方法の工程を除外しない。対照的に、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という移行句は、請求項中に明記されていない一切の要素、工程または成分を除外する。「から本質的になる」という移行句は、明記された物質または工程と、特許を請求された発明の「基本的および新規特徴に実質的に影響を及ぼさない物質または工程」とに請求項の範囲を限定する。
【００３２】
本発明の化合物に関して、本発明の化合物をさらに記載するために以下の用語が本明細書に使用される限度で、以下の定義が適用される。
【００３３】
標的化部分と固形腫瘍関連抗原の間の相互作用に関する場合、「特異的結合」という用語は、細胞表面上に存在する他のタンパク質性実体との標的化部分の結合が機能的にわずかであり得るという点で実質的に特異的である分子間相互作用を表す。
【００３４】
合成抗原（または遮蔽されていないプロ抗原）とＣＡＲ  Ｔ細胞上の細胞外リガンドとの間の相互作用に関する場合、「特異的結合」という用語は、任意の他の内在性タンパク質とのこれらの実体の結合が機能的にわずかであり得るという点で実質的に特異的である分子間相互作用を表す。
【００３５】
二機能性化合物
本発明の１つの枢要な側面は、腫瘍細胞死滅から腫瘍細胞標的化を切り離したことである。図１Ａに模式的に示されているように、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、腫瘍細胞に直接結合することなく腫瘍細胞を殺す。これは、その１つの機能的部分（合成抗原または遮蔽されていないプロ抗原）がＣＡＲ  Ｔ細胞によって結合され、その第二の機能的部分が固形腫瘍関連抗原を特異的に結合する二機能性化合物の使用によって達成される。
【００３６】
合成抗原
合成抗原は、ＣＡＲ−Ｔ細胞に対する標的としての役割を果たす小分子または代替的エピトープである。この抗原は、体内のいずれの正常な細胞上にも天然には存在しないという点で合成的であり、この抗原に結合するようにＣＡＲ  Ｔ細胞を設計することができるという意味で抗原性である。
【００３７】
一般に、「小分子」は、本分野において、サイズが約５キロダルトン（ｋＤａ）未満である有機分子であると理解されている。いくつかの実施形態において、小分子は、約４ｋＤａ、約３ｋＤａ、約２ｋＤａまたは約１ｋＤａ未満である。いくつかの実施形態において、小分子は、約８００ダルトン（Ｄａ）、約６００Ｄａ、約５００Ｄａ、約４００Ｄａ、約３００Ｄａ、約２００Ｄａまたは約１００Ｄａ未満である。
【００３８】
本発明において使用するのに適切であり得る合成抗原の代表例としては、フルオレセイン、アントラセン、ローダミン、ロドール、ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ、アクリジン、キサンテン、ピラジン、アンフェタミン、ベンゾジアゼピン、ベンゾイルエクゴニン、ブプレノルフィン、オピオイド、カンナビノイド、フェンサイクリジン、三環系抗うつ薬、デキストロメトルファン、フェンタニル、メプロバメート、メタドン、メタンフェタミン、オキシコドン、テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）、トラマドール、ゾルピデム、ケタミン、リゼルグ酸ジエチルアミド（ＬＳＤ）、３，４−メチレンジオキシメタンフェタミン（ＭＤＭＡ）、メタクアロン、プロポキシフェンまたはノルケチミン（ｎｏｒｋｅｔｉｍｉｎｅ）および４−［（６−メチルピラジン−２−イル）オキシ］ベンゾエート（ＭＰＯＢ）、アントラキノン−２−カルボキシレート（ＡＱ）、テトラキセタン（ＤＯＴＡ）およびヒトの中で低い免疫原性を有するペプチド、グリコシドまたはヌクレオチド起源の任意の抗原（例えば、Ｌ−αアスパルチルーＬ−フェニルアラニンメチルエステルまたはアスパルテーム、１３−［（２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ］−エント−カウル−１６−エン−１９−オイク酸β−Ｄ−グルコピラノシルエステルまたはステビオシドおよびヌシネルセンまたはスピンラザなどの一般的（ｇｅｎｅｒｉｃ）ヌクレオチド）が挙げられる。合成抗原のさらなる代表例は、本分野において公知である。
【００３９】
本発明において使用するのに適切であり得るフルオレセイン類（すなわち、フルオレセインおよび誘導体）の代表例としては、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、５−（ヨードアセトアミド）フルオレセイン、５−（［４，６−ジクロロトリアジン−２−イル］アミノ）フルオレセイン塩酸塩、５−（ブロモメチル）フルオレセイン、フルオレセイン５（６）−イソチオシアネートおよびフルオレセイン５−カルバモイルメチルチオプロパン酸が挙げられる。
【００４０】
したがって、いくつかの実施形態において、合成抗原がフルオレセインである場合には、二機能性化合物は、式（Ｉ）または（ＩＩ）によって表される構造（リンカー（Ｌ）、存在する場合、および標的化部分は包括的に示されている）：
【化１】
2021530444.tif 000003
式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｏ、ＯＨまたはＨであり；Ｒ１’はＣ＝Ｏ、Ｏ、ＯＨまたはＨを表し；およびＲ３は、
【化２】
2021530444.tif 000004
【化３】
2021530444.tif 000005
【化４】
2021530444.tif 000006
を表し、
【化５】
2021530444.tif 000007
は不存在またはリンカーであり、ならびにｎは１〜１２である；
または薬学的に許容され得るそれらの塩もしくは立体異性体、を有し得る。
【００４１】
本発明において合成抗原として使用するのに適切であり得るアントラセン類の代表例としては、アントラキノン、アントラキノン−２−カルボキシレート、２−アミノアントラキノン、２−ヨードアントラキノン、２−クロロアントラキノン、２−ブロモアントラキノン、２−エチニルアントラキノン、２−シアノアントラキノン、アントラキノン−２−スルホネート、アントラキノン−２−カルボニルクロリドおよび２−ヒドロキシアントラキノンが挙げられる。
【００４２】
いくつかの実施形態において、合成抗原はアントラセンであり、二機能性化合物は式（ＩＩＩ）によって表される構造（リンカー（Ｌ）、存在する場合、および標的化部分は包括的に示されている）：
【化６】
2021530444.tif 000008
式中、
Ｒ４、Ｒ４’の各々は、独立にＯまたはＯＨであり；
およびＲ５は、
【化７】
2021530444.tif 000009
【化８】
2021530444.tif 000010
【化９】
2021530444.tif 000011
であり、
【化１０】
2021530444.tif 000012
は、不存在またはリンカーであり、および
ｎは、１〜１２である；
または薬学的に許容され得るその塩もしくは立体異性体、を有し得る。
【００４３】
小分子がアントラセンであるいくつかの他の実施形態において、二機能性化合物は、式（ＩＩＩ−１）によって表される構造：
【化１１】
2021530444.tif 000013
式中、
Ｒ４、Ｒ４’およびＲ５の各々は上に定義されているとおりである、
または薬学的に許容され得るその塩もしくは立体異性体、を有し得る。
【００４４】
いくつかの実施形態において、合成抗原がＭＰＯＢである場合には、二機能性化合物は、式（ＩＶ）によって表される構造：
【化１２】
2021530444.tif 000014
式中、
Ｒ６は、
【化１３】
2021530444.tif 000015
【化１４】
2021530444.tif 000016
【化１５】
2021530444.tif 000017
であり、
【化１６】
2021530444.tif 000018
は、不存在またはリンカーであり、および
ｎは、１〜１２である；
または薬学的に許容され得るその塩もしくは立体異性体を有し得る。
【００４５】
プロ合成抗原（プロ抗原）
いくつかの実施形態において、合成抗原は保護基を含有する。保護された合成抗原は、本明細書において、「プロ抗原」と称される。保護基は、本明細書において「遮蔽」または「かご」とも称される。プロ抗原は、適切な刺激への曝露に際して遮蔽されていないまたはかごに入れられていない状態にならなければ、それまで、ＣＡＲ−Ｔ細胞を結合せず、その活性化を引き起こさないという意味で不活性であり、その例としては、保護基の除去を引き起こすある波長の光および反応性化学種が挙げられる。したがって、これらの実施形態において、「遮蔽」または「かご」は、固形腫瘍の部位を除き、ＣＡＲ  Ｔ細胞反応性を抑制する。
【００４６】
いくつかの実施形態において、保護基ドメインは、反応性化学種、すなわち、反応性酸素種（ＲＯＳ）および／または反応性窒素種（ＲＮＳ）に対して感受性があるボロン酸エステルである。組織が外部光線照射（例えば、Ｘ線、γ線、より高い紫外線）に曝露されると、高レベルのＲＯＳおよび／またはＲＮＳがプロ抗原と反応し、これが遮蔽されていないプロ抗原をもたらし、これにより、ＣＡＲ  Ｔ細胞に接近可能な合成抗原を生成する。
【００４７】
いくつかの実施形態において、ボロン酸エステル基は、ボロン酸ピナコールエステルまたはボロン酸ピナンジオールである。ボロン酸エステルの代表例としては、
【化１７】
2021530444.tif 000019
が挙げられる。
【００４８】
したがって、いくつかの実施形態において、プロ抗原がフルオレセインである場合には、二機能性化合物は、式（Ｖ）または（ＶＩ）によって表される構造（リンカー（Ｌ）、存在する場合、および標的化部分は包括的に示されている）：
【化１８】
2021530444.tif 000020
または
式中、Ｒ１は、独立に、Ｏ、ＯＨまたは保護基であり、Ｒ１’は、独立に、Ｃ＝Ｏ、Ｏ、ＯＨまたは保護基であり、Ｒ２は、独立に、Ｏ、ＯＨまたは保護基であり；Ｒ３は、
【化１９】
2021530444.tif 000021
【化２０】
2021530444.tif 000022
【化２１】
2021530444.tif 000023
であり、
【化２２】
2021530444.tif 000024
は不存在またはリンカーであり、およびｎは１〜１２であり；但し、Ｒ１、Ｒ１’およびＲ２の少なくとも１つは保護基である；
または薬学的に許容され得るそれらの塩もしくは立体異性体、を有し得る。いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２の両方またはＲ１’およびＲ２の両方が保護基である。
【００４９】
いくつかの実施形態において、プロ抗原がボロン酸エステル保護基を含有するフルオレセインである場合、二機能性化合物は、式（ＶＩＩ）によって表される構造：
【化２３】
2021530444.tif 000025
式中、
Ｒ１は、Ｏ、ＯＨまたはボロン酸エステル保護基であり；
Ｒ２は、Ｏ、ＯＨまたはボロン酸エステル保護基であり；
但し、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは、ボロン酸エステル基であり、
Ｒ３は、
【化２４】
2021530444.tif 000026
【化２５】
2021530444.tif 000027
【化２６】
2021530444.tif 000028
であり、
【化２７】
2021530444.tif 000029
は不存在またはリンカーであり、および
ｎは、１〜１２であり；
ボロン酸エステル保護基は、
【化２８】
2021530444.tif 000030
である；
または薬学的に許容され得るその塩もしくは立体異性体、を有し得る。いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２の両方がボロン酸エステル保護基である。
【００５０】
いくつかの実施形態において、二機能性化合物は、式（ＶＩＩａ）によって表される構造：
【化２９】
2021530444.tif 000031
または薬学的に許容され得るその塩もしくは立体異性体、を有する。
【００５１】
いくつかの実施形態において、二機能性化合物は、式（ＶＩＩａ１）によって表される構造：
【化３０】
2021530444.tif 000032
または薬学的に許容され得るその塩もしくは立体異性体、を有する。
【００５２】
いくつかの実施形態において、二機能性化合物は、式（ＶＩＩｂ）によって表される構造：
【化３１】
2021530444.tif 000033
または薬学的に許容され得るその塩もしくは立体異性体、を有する。
【００５３】
いくつかの実施形態において、二機能性化合物は、式
【化３２】
2021530444.tif 000034
によって表される構造または薬学的に許容され得るその塩もしくは立体異性体、を有する。
【００５４】
いくつかの実施形態において、プロ抗原がアントラセンである場合、二機能性化合物は、式（ＶＩＩＩ）によって表される構造（リンカー（Ｌ）、存在する場合、および標的化部分は包括的に示されている）
【化３３】
2021530444.tif 000035
式中、Ｒ４およびＲ４’の各々は、独立に、Ｏまたは保護基であり、但し、Ｒ４およびＲ４’の少なくとも１つは保護基であり；ならびに
Ｒ５は、
【化３４】
2021530444.tif 000036
【化３５】
2021530444.tif 000037
【化３６】
2021530444.tif 000038
であり、
【化３７】
2021530444.tif 000039
は不存在またはリンカーであり、およびｎは１〜１２である；
または薬学的に許容され得るその塩もしくは立体異性体、を有し得る。いくつかの実施形態において、Ｒ４およびＲ４’の両方が保護基である。
【００５５】
いくつかの実施形態において、プロ抗原がボロン酸エステル保護基を含有するアントラセンである場合、二機能性化合物は、式（ＶＩＩＩ−１）によって表される構造：
【化３８】
2021530444.tif 000040
式中、Ｒ４およびＲ４’の各々は、独立に、Ｏまたはボロン酸エステル保護基であり；
但し、Ｒ４およびＲ４’の少なくとも１つは保護基であり；ならびに
Ｒ５は、
【化３９】
2021530444.tif 000041
【化４０】
2021530444.tif 000042
【化４１】
2021530444.tif 000043
であり、
【化４２】
2021530444.tif 000044
は不存在またはリンカーであり、およびｎは１〜１２であり；ボロン酸エステル保護基は、
【化４３】
2021530444.tif 000045
【化４４】
2021530444.tif 000046
である；
または薬学的に許容され得るその塩もしくは立体異性体、を有し得る。
【００５６】
いくつかの実施形態において、Ｒ４およびＲ４’の各々がボロン酸エステル保護基である。したがって、いくつかの実施形態において、二機能性化合物は、式（ＶＩＩＩ−１ａ）によって表される構造：
【化４５】
2021530444.tif 000047
または薬学的に許容され得るその塩もしくは立体異性体、を有する。
【００５７】
いくつかの実施形態において、二機能性化合物は、式（ＶＩＩＩ−１ｂ）によって表される構造：
【化４６】
2021530444.tif 000048
または薬学的に許容され得るその塩もしくは立体異性体、を有する。
【００５８】
いくつかの他の実施形態において、保護基は、全体的にまたは部分的に光感受性である、すなわち、光切断可能である。本明細書において使用される場合、「光感受性」および「光切断可能」という用語は互換的である。いくつかの実施形態において、保護ドメインは１またはそれより多くの光切断可能な基から構成される。光切断可能な基が適切な波長の光に曝露されると、プロ抗原は遮蔽が除去されて、それにより、合成抗原を生じる。当業者は、本分野において公知の技術にしたがって、適切な光保護基および対応する波長選択的脱保護を決定することができるであろう。例えば、Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．４４：３３５８−７７（２０１５）参照。
【００５９】
光切断可能な基の代表例としては、オルト−ニトロベンジルを基礎とする基、フェナシルエステルを基礎とする基、８−キノリニルベンゼンスルホネート基、ジクマリン基、６−ブロモ−７−アルコキシクマリン−４−イルメトキシカルボニル基、ビマンを基礎とする基およびビス−アリールヒドラゾンを基礎とする基が挙げられる。一般的な構造および切断条件は、以下のとおりである（破線は、切断の部位を示す）：
【化４７】
2021530444.tif 000049
【化４８】
2021530444.tif 000050
【００６０】
ある実施形態において、光切断可能な保護基は、
【化４９】
2021530444.tif 000051
式中、
ＸはＮＨまたはＯであり、ＲはＣ１−４アルキルまたはＨであり、およびｎは０〜３である、
である。いくつかの実施形態において、オルト−ニトロベンジルを基礎とする基は、
【化５０】
2021530444.tif 000052
であり、３００〜３６５ｎｍで切断される。
【００６１】
いくつかの実施形態において、光切断可能な保護基を有する二機能性化合物は、式（ＩＸ）によって表される構造：
【化５１】
2021530444.tif 000053
式中、
Ｒ６は、
【化５２】
2021530444.tif 000054
【化５３】
2021530444.tif 000055
【化５４】
2021530444.tif 000056
であり、
【化５５】
2021530444.tif 000057
は不存在またはリンカーであり、およびｎは１〜１２の整数である、
を有する。
【００６２】
いくつかの実施形態において、光切断可能な保護基を有する二機能性化合物は、式（ＩＸ−１）によって表される構造：
【化５６】
2021530444.tif 000058
または薬学的に許容され得るその塩もしくは立体異性体を有する。
【００６３】
本発明の二機能性化合物の合成において有用であり得る本分野で公知の方法は、Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．５２６：１９−４３（２０１３）（およびその中で参照されている刊行物）；Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２６（４７）：１５３９２−３（２００４）（およびその中で参照されている刊行物）；Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３２（１６）：５９０６−１５（２０１０）（およびその中で参照されている刊行物）；Ｄｅｂｏｗｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ２９（５）：７３５−４６（２０１６）；Ｒｉｏｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １０１：２８４−９５（２０１６）；およびＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．ＡＣＳ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ＆Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ  ７（４３）：２４１１０−１８（２０１５）に記載されている。
【００６４】
標的化部分
本発明の二機能性化合物の機能様式の１つを構成する標的化部分は、固形腫瘍関連抗原を特異的に結合する。
【００６５】
本発明による標的化部分は、腫瘍細胞上に存在し得る固形腫瘍関連抗原に対して結合特異性を有する。これらの腫瘍関連抗原は、正常な非罹病細胞中でのその発現に比して、腫瘍細胞中で過剰発現され得る。正常な組織上での発現が少ないほど、正常な組織上での合成抗原の利用可能性をより効率的に低下させる。したがって、本発明は、「標的上、腫瘍上の（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ，ｏｎ−ｔｕｍｏｒ）」標的化可能な抗原の数を増加させるだけでなく、「標的上、腫瘍外（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ，ｏｆｆ−ｔｕｍｏｒ）」毒性を低減させることによってより優れた調節も可能にする。
【００６６】
いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、癌細胞中で不適切に合成される細胞表面分子であり、例えば、正常な細胞上に発現される当該分子と比較して欠失、付加または変異を含有する分子である。いくつかの実施形態において、腫瘍関連抗原は、主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）提示されたペプチドである。通常、内在性タンパク質由来のペプチドは、ＭＨＣクラスＩ分子のポケットを満たし、ＣＤ８＋Ｔリンパ球上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって認識される。ＭＨＣクラスＩ複合体は、全ての有核細胞によって恒常的に発現されている。癌では、ウイルス特異的なおよび／または腫瘍特異的なペプチド／ＭＨＣ複合体は、免疫療法のための細胞表面標的の特有のクラスの代表である。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、正常な細胞と比べて癌細胞において過剰発現される、例えば、正常な細胞と比べて１倍過剰発現、２倍過剰発現、３倍過剰発現またはそれより多く過剰発現される細胞表面分子である。
【００６７】
標的化部分の代表例としては、抗体分子およびその機能的（すなわち、抗原結合）断片、受容体リガンド、ペプチド、ハプテン、アプタマー、アフィマー（ａｆｆｉｍｅｒ）、Ｔ細胞受容体四量体および当業者に公知の他の標的化分子が挙げられる。例えば、標的化部分としては、核酸、ポリペプチド、糖タンパク質、炭水化物または脂質が挙げられ得る。
【００６８】
ある実施形態において、標的化部分は抗体または抗体断片である。抗体の代表例としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２免疫グロブリン断片、合成の安定化されたＦｖ断片、例えば、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化されたＦｖ断片（ｄｓＦｖ）、単一可変領域ドメイン（ｄＡｂｓ）ミニボディ、コンビボディ（ｃｏｍｂｉｂｏｄｉｅｓ）ならびにダイアボディおよびマルチｓｃＦｖなどの多価抗体、ラクダ科動物からの単一ドメインまたは改変操作されたヒト等価物が挙げられる。「抗体」という用語には、免疫グロブリン結合ドメインに対して相同または概ね相同である結合ドメインを有する任意のタンパク質も含まれる。このようなタンパク質は、天然源に由来し得、または部分的にもしくは完全に合成的に作製され得る。
【００６９】
ある実施形態において、標的化部分はアフィマーである。アフィマータンパク質は、シスタチンタンパク質折り畳みを基礎とする安定なタンパク質である足場から構成される。アフィマータンパク質は、２つのペプチドループおよび抗体に類似する高い親和性および特異性で異なる標的タンパク質を結合するように無作為化されることができるＮ末端配列をディスプレイする。タンパク質足場上のペプチドの安定化は、ペプチドが取り得る可能な立体構造を制約し、したがって、遊離ペプチドのライブラリーと比較して結合親和性および特異性を増加させる。
【００７０】
ある実施形態において、標的化部分は、細胞種特異的マーカーに結合する核酸分子（例えば、アプタマー）である。アプタマーは、様々な分子標的に、例えば、小分子、ペプチド、タンパク質、核酸に、ならびに細胞および組織にさえ特異的に結合する短い合成一本鎖オリゴヌクレオチドである。これらの小さな核酸分子は、タンパク質またはその他の細胞標的を特異的に結合することができる二次および三次構造を形成することができ、本質的に抗体の化学的な等価物である。アプタマーは、高度に特異的であり、相対的にサイズが小さく、非免疫原性である。アプタマーは、一般的には、ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）として知られるバイオパニング法から選択される（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３４６（６２８７）：８１８−８２２（１９９０）；Ｔｕｅｒｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９（４９６８）：５０５−５１０（１９９０）；Ｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．（２０１１）；１８（２７）：４２０６−１４）。任意の所定の標的に対するアプタマーを生成する方法は、本分野において周知である。
【００７１】
いくつかの実施形態において、標的化部分は、細胞表面受容体に対する天然に存在するリガンドまたは合成リガンドである。
【００７２】
いくつかの実施形態において、標的化部分は炭水化物である。炭水化物は、天然または合成であり得る。炭水化物は、誘導体化された天然の炭水化物であり得る。いくつかの実施形態において、炭水化物は、グルコース、フルクトース、ガラクトース、リボース、ラクトース、スクロース、マルトース、トレハロース、セルビオース（ｃｅｌｌｂｉｏｓｅ）、マンノース、キシロース、アラビノース、グルクロン酸、ガラクトロン酸（ｇａｌａｃｔｏｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、マンヌロン酸、グルコサミン、ガラトサミン（ｇａｌａｔｏｓａｍｉｎｅ）またはノイラミン酸を含むがこれらに限定されない単糖または二糖を含む。いくつかの実施形態において、炭水化物は、プルラン、セルロース、微結晶性セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシセルロース（ＨＣ）、メチルセルロース（ＭＣ）、デキストラン、シクロデキストラン、グリコーゲン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、カラギーナン、グリコン（ｇｌｙｃｏｎ）、アミロース、キトサン、Ｎ，Ｏ−カルボキシルメチルキトサン、アルギンおよびアルギン酸、テンプン、キチン、コンニャク、グルコマンナン、プスツラン、ヘパリン、ヒアルロン酸、カードランおよびキサンタンなどの、但しこれらに限定されない多糖である。いくつかの実施形態において、炭水化物は、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトールまたはラクチトールなどの、但しこれらに限定されない糖アルコールである。
【００７３】
ある実施形態において、標的化部分は、ＲＯＳおよび／またはＲＮＳの上昇したレベルを生じる固形腫瘍によって発現されるＴＡＡに向けられる。反応性化学種（ＲＯＳ／ＲＮＳ）の上昇した産生はほとんど全ての癌において検出されており、反応性化学種（ＲＯＳ／ＲＮＳ）は腫瘍の発達および進行の多くの側面を促進する（Ｌｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｒｅｓ．４４：４７９−４９６（２０１０）；Ｔｒａｃｈｏｏｔｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．８：５７９−５９１（２００９））。変化した細胞代謝は癌の特徴と考えられ、急速に治療的介入のための手段になりつつある。ミトコンドリアは、癌細胞の生体エネルギーおよび生合成需要を充足するために必要なＡＴＰおよび代謝物の主要な源であるので、最近、癌細胞の代謝的需要にエネルギーを与える重要な細胞区画と見られてきた。さらに、ミトコンドリアは、細胞死および反応性酸素種の主要な生成源の中心を成す（ＲＯＳ；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｘｉｄ．Ｍｅｄ．Ｃｅｌｌ．Ｌｏｎｇｅｖ．２０１８：１−１０（２０１８）；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｘｉｄ．Ｍｅｄ．Ｃｅｌｌ．Ｌｏｎｇｅｖ．２０１６：１６１６７８１（２０１６））。インビトロでの腫瘍細胞株の大規模な分析は、腫瘍細胞株が、通常、ｉ）細胞外スーパーオキシド陰イオン生成ならびにｉｉ）細胞間ＲＯＳシグナル伝達およびアポトーシスに対して細胞を保護する膜結合型カタラーゼの発現によって特徴づけられることを示した。
【００７４】
標的化部分および腫瘍細胞上のその対応する受容体の代表例が表１に記載されている：
【表１−１】
2021530444.tif 000059
【表１−２】
2021530444.tif 000060
【表１−３】
2021530444.tif 000061
【表１−４】
2021530444.tif 000062
【表１−５】
2021530444.tif 000063
【表１−６】
2021530444.tif 000064
【表１−７】
2021530444.tif 000065
【表１−８】
2021530444.tif 000066
【表１−９】
2021530444.tif 000067
【００７５】
いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、血液腫瘍関連抗原を結合する。例えば、本二機能性化合物によって標的化され得る多発性骨髄腫細胞上に存在する腫瘍関連抗原としては、ＣＤ３８、ＣＳ１、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１３８、ＣＤ４０、ＣＤ５６、ＣＤ７０およびＣＤ７４の任意のあらゆる組み合わせ、例えば、ＣＤ３８、ＣＳ１、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１３８、ＣＤ４０、ＣＤ５６、ＣＤ７０およびＣＤ７４の２またはそれより多くの組み合わせが挙げられる。
【００７６】
いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、脳腫瘍関連抗原を結合する。例えば、ＧＢＭ細胞上に存在する腫瘍関連抗原としては、ＡＣＶＲ１、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＩＬ１３Ｒα２およびＨＥＲ２が挙げられる。例えば、図１Ｂは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＩＬ１３Ｒα２およびＨＥＲ２を同時に標的とする脳癌を処置するための多重化アプローチを模式的に示す。脳癌に関係するとされており、本発明の二機能性化合物によって標的とされ得る他のタンパク質としては、ＥｐｈＡ２、ＣＳＰＧ４、ＧＤ２、ＰＤＧＦＲαおよびＧＲＰ７８が挙げられる。脳腫瘍関連抗原を結合する抗体および／またはその機能的断片は、本分野において公知である。例えば、とりわけ、ＡＣＶＲ１、ＰＤＧＦＲα、ＧＤ２およびＥｐｈＡ２を結合する抗体および／またはその断片を記載する上記表１を参照されたい。ＰＤＧＦＲαを結合する標的化部分は、オララツマブ（およびその結合バリアント）を基礎とするｓｃＦｖを含み得る。
【００７７】
いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、脳癌、卵巣癌および膵臓癌などのＨＥＲ２＋悪性病変上のＨＥＲ２に結合する。ＨＥＲを結合し、本発明において有用であり得る代表的な標的化リガンドとしては、それぞれ、ＨＥＲの細胞外ドメインＩＶおよびＩＩを結合するトラスツズマブおよびペルツズマブならびにそれらのＨＥＲ結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）が挙げられる。
【００７８】
ＥＧＦＲｖＩＩＩを結合する結合断片は、Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．９（３９９）：ｅａａａ０９８４（２０１７）に記載されている。ＥＧＦＲｖＩＩＩを結合する他の抗体またはその断片は、市販のシルツキシマブおよびｍＡｂ  ＤＨ８．３（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）である。本発明において有用であり得るＥＧＦＲｖＩＩＩを標的とするｓｃＦｖをコードするアミノ酸または遺伝子配列のさらなる代表例は、米国特許出願公開第２０１５／０２５９４２３号に見出される。
【００７９】
ＩＬ１３Ｒα２を結合する抗体断片は、Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３７５（２６）：２５６１−２５６９（２０１６）に記載されている。ＩＬ１３Ｒα２を結合する他の抗体またはその断片は、ＡｂｎｏｖａおよびＭｉｌｌｉｐｏｒｅから市販されている。
【００８０】
ＨＥＲ２を結合する抗体断片は、Ａｈｍｅｄ，ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＭＡ  Ｏｎｃｏｌ．３（８）：１０４９−１１０１（２０１７）に記載されている。トラスツズマブおよびＦＲＰ５などの、ＨＥＲ２を結合する他の抗体またはその断片は市販されている。本発明において有用であり得るＨＥＲ２を標的とするｓｃＦｖをコードするアミノ酸または遺伝子配列のさらなる代表例は、米国特許出願公開第２０１１／０３１３１３７号に見出される。
【００８１】
ＥｐｈＡ２を結合する抗体断片の別の例は、Ｃｈｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２１（３）：６２９−６３７（２０１３）に記載されている。ＥｐｈＡ２を結合するさらに他の抗体またはその断片は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ（ｍＡｂ４Ｈ５およびｍＡｂ  １Ｃ１１Ａ１２）およびＲＮＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓから市販されている。本発明において有用であり得るＥｐｈＡ２を標的とするｓｃＦｖをコードするアミノ酸または遺伝子配列のさらなる代表例は、米国特許出願公開第２０１０／４３６７８３号に記載されている。
【００８２】
ＣＳＰＧ４を結合する抗体断片は、Ｐｅｌｌｅｇａｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ，１０：ｅａａｏ２７３１（２０１８）に記載されている。ＣＳＰＧ４を結合する別の抗体は、Ｆｅｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｓ．２２（２）：１１７−２１（２０１５）に記載されている。ＣＳＰＧ４を結合する他の抗体またはその断片は、市販のベバシズマブおよびＣｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ｍＡｂ  ２２５．２８である。ＣＳＰＧ４を結合するさらに他の抗体またはその断片は、Ａｖｉｖａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙから市販されている。本発明において有用であり得るＣＳＰＧ４を標的とするｓｃＦｖをコードするアミノ酸または遺伝子配列のさらなる代表例は、米国特許第９，８０１，９２８号および米国特許出願公開第２０１９／０００８９４０号に記載されている。
【００８３】
ＧＤ２を結合する抗体断片の別の例は、Ｍｏｕｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２４：５７２−５７９（２０１８）に記載されている。ＧＤ２を結合する他の抗体またはその断片としては、ジヌツキシマブ、ｍＡｂ  ３Ｆ８、ｍＡｂ  １４ｇ２ａおよびｍＡｂ  １４．１８が挙げられる。本発明において有用であり得るＧＤ２を標的とするｓｃＦｖをコードするアミノ酸または遺伝子配列のさらなる代表例は、米国特許第４，６７５，２８７号に記載されている。
【００８４】
ＰＤＧＦＲαを結合する抗体断片の別の例は、Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，４（１１）：ｅ７７５２（２００９）に記載されている。ＰＤＧＦＲαを結合する他の抗体またはその断片は、Ａｂｃａｍ、ＬｉｆｅＳｐａｎ  Ｂｉｏ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ（ｓｃ−３３８）およびＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ（ｍＡｂ  ＡＰＡ５）から市販されている。本発明において有用であり得るＰＤＧＦＲαを標的とするｓｃＦｖをコードするアミノ酸または遺伝子配列のさらなる代表例は、米国特許出願公開第２０１２／００２７７６７号に記載されている。
【００８５】
ＧＲＰ７８を結合する抗体断片は、Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．６：３４９２２（２０１６）に記載されている。ＧＲＰ７８を結合する他の抗体またはその断片は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ（ＰＡ１−０１４Ａ）およびＡｂｃａｍ（Ｎ−２０）から市販されている。本発明において有用であり得るＧＲＰ７８を標的とするｓｃＦｖをコードするアミノ酸または遺伝子配列のさらなる代表例は、米国特許第１０，２５９，８８４号に記載されている。
【００８６】
脳癌に関係するとされており、本発明の二機能性化合物によって標的化され得るその他のタンパク質としては、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、表面抗原分類２７６（ＣＤ２７６）および神経外胚葉性幹細胞マーカー（ネスチン）が挙げられる。
【００８７】
ＮＣＡＭを結合する抗体は、Ｍｏｄａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：４０４８−４０５４（２００１）に記載されている。ＮＣＡＭを結合するその他の抗体またはその断片は、ｍＡｂ  ＵＪ１３ＡおよびｍＡｂ  ＥＲＩＣ−１である。本発明において有用であり得るＮＣＡＭを標的とするｓｃＦｖをコードするアミノ酸または遺伝子配列のさらなる代表例は、米国特許第７，４０２，５６０号に記載されている。
【００８８】
ＣＤ２７６を結合する抗体は、Ｍａｊｚｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２５（８）：２５６０−２５７４（２０１９）に記載されている。ＣＤ２７６を結合する他の抗体またはその断片は、Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌａｂｓから市販されている（ｍＡｂ  ８Ｈ９）。本発明において有用であり得るＣＤ２７６を標的とするｓｃＦｖをコードするアミノ酸または遺伝子配列のさらなる代表例は、米国特許出願公開第２０１８／０１８６８９０号に記載されている。
【００８９】
ネスチンを結合する抗体またはその断片は、Ａｂｃａｍ（ａｂ６１４２）およびＮｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（ＮＢ１００−１６０４）から市販されている。βＩＩＩ−チュブリンを結合する抗体またはその断片は、Ａｂｃａｍ（２Ｇ１０）およびＲＮＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ｍＡＢ  １１９５）から入手可能である。
【００９０】
ＣＤ３８を結合する抗体断片の別の例は、Ｍｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｏｎｃｏｌ．１０：１−４（２０１７）に記載されている。ＣＤ３８を結合する他の抗体またはその断片としては、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ（ＲＥＡ５７２およびＲＥＡ６７１）、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（ＨＩＴ２およびＨＢ−７）から得られる市販の抗体が挙げられる。本発明において有用であり得るＣＤ３８を標的とするｓｃＦｖをコードするアミノ酸または遺伝子配列のさらなる代表例は、米国特許第９，２４９，２２６号に記載されている。
【００９１】
ＣＳ−１を結合する抗体断片の別の例は、Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１２２：１４（２０１３）に記載されている。ＣＳ−１を結合するその他の抗体またはその断片は市販されており、ＲＥＡ１５０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）または１６２．１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）が挙げられる。本発明において有用であり得るＣＳ−１を標的とするｓｃＦｖをコードするアミノ酸または遺伝子配列のさらなる代表例は、国際公開第２００４／１００８９８号Ａ２に記載されている。
【００９２】
ＣＤ１３８を結合する抗体断片の別の例は、Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  １０（２４）：２３６９−２３８３（２０１９）に記載されている。ＣＤ１３８を結合するその他の抗体またはその断片は市販されており、４４Ｆ９（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）またはＤＬ−１０１およびＭＩ１５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）が挙げられる。本発明において有用であり得るＣＤ１３８を標的とするｓｃＦｖをコードするアミノ酸または遺伝子配列のさらなる代表例は、国際公開第２００９／０８０８２９号Ａ１に記載されている。
【００９３】
ＣＤ２０を結合する抗体断片の別の例は、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５（２）：１６０−７５（２０１４）に記載されている。ＣＤ２０を結合するその他の抗体またはその断片は市販されており、ＬＴ２０およびＲＥＡ７８０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）または２Ｈ７およびＳＡ２７１Ｇ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）が挙げられる。本発明において有用であり得るＣＤ２０を標的とするｓｃＦｖをコードするアミノ酸または遺伝子配列のさらなる代表例は、国際公開第２００４／０５６３１２号Ａ２に記載されている。
【００９４】
ＢＣＭＡを結合する抗体断片の別の例は、Ｒａｊｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３８０（１８）：１７２６−１７３７（２０１９）に記載されている。ＢＣＭＡを結合するその他の抗体またはその断片は市販されており、ＲＥＡ３１５（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）および１９Ｆ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）が挙げられる。本発明において有用であり得るＢＣＭＡを標的とするｓｃＦｖをコードするアミノ酸または遺伝子配列のさらなる代表例は、国際公開第２０１０／１０４９４９号Ａ２および国際公開第２００３／０１４２９４号Ａ２に記載されている。
【００９５】
ＣＤ１９を結合する抗体断片の別の例は、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ．３８５（９９６７）：５１７−５２８（２０１５）に記載されている。ＣＤ１９を結合するその他の抗体またはその断片は市販されており、ＬＴ１９、ＲＥＡ６７５（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）または４Ｇ７、ＨＩＢ１９、ＳＪ２５Ｃ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）が挙げられる。本発明において有用であり得るＣＤ１９を標的とするｓｃＦｖをコードするアミノ酸または遺伝子配列のさらなる代表例は、国際公開第２００５／０５２００４号Ａ２に記載されている。
【００９６】
ＣＤ２２を結合する抗体断片の別の例は、Ｈａｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １２１（７）：１１６５−１１７４（２０１３）に記載されている。ＣＤ２２を結合するその他の抗体またはその断片は市販されており、ＲＥＡ３４０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）またはＨＩＢ２２およびＳ−ＨＣＬ−１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）が挙げられる。本発明において有用であり得るＣＤ２２を標的とするｓｃＦｖをコードするアミノ酸または遺伝子配列のさらなる代表例は、米国特許第５，４８４，８９２号に記載されている。
【００９７】
ＣＤ３０を結合する抗体断片の別の例は、Ｒａｍｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １３２：６８０（２０１８）に記載されている。ＣＤ３０を結合するその他の抗体またはその断片は市販されており、ＲＥＡ１０８５およびＫｉ−２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）またはＢＹ８８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）が挙げられる。本発明において有用であり得るＣＤ３０を標的とするｓｃＦｖをコードするアミノ酸または遺伝子配列のさらなる代表例は、米国特許第７，０９０，８４３号に記載されている。
【００９８】
ＣＤ４０を結合する抗体断片の別の例は、Ｈｕｓｓｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ９５：８４５−８４８（２０１０）に記載されている。ＣＤ４０を結合するその他の抗体またはその断片は市販されており、ＲＥＡ７３３およびＨＢ１４（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）または５Ｃ３もしくはＨＢ１４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）が挙げられる。本発明において有用であり得るＣＤ４０を標的とするｓｃＦｖをコードするアミノ酸または遺伝子配列のさらなる代表例は、国際公開第２０１２／０７５１１１号Ａ１および国際公開第２０１６／０６９９１９号Ａ１に記載されている。
【００９９】
ＣＤ７０を結合する抗体断片の別の例は、Ｓｈａｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１７：４３０４−１４（２０１１）に記載されている。ＣＤ７０を結合するその他の抗体またはその断片は市販されており、ＲＥＡ２９２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）または１１３−１６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）が挙げられる。本発明において有用であり得るＣＤ７０を標的とするｓｃＦｖをコードするアミノ酸または遺伝子配列のさらなる代表例は、国際公開第２００４／０７３６５６号Ａ２に記載されている。
【０１００】
ＣＤ７４を結合する抗体断片の別の例は、Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．１６３：４７８−４８６（２０１３）に記載されている。ＣＤ７４を結合するその他の抗体またはその断片は市販されており、５−３２９およびＲＥＡ１１０３（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）またはＬＮ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）が挙げられる。本発明において有用であり得るＣＤ７４を標的とするｓｃＦｖをコードするアミノ酸または遺伝子配列のさらなる代表例は、国際公開第２００３／０７４５６７号Ａ２に記載されている。
【０１０１】
本発明の二機能性化合物は、本分野において公知の方法にしたがって合成され得る。例えば、国際公開第２０１０／００８５１９号参照。例えば、合成抗原は、第一級アミン（例えば、ポリペプチドのＮ末端アミンまたはリジン）とまたはスルフヒドリル基（例えば、ポリペプチドのシステイン）と反応する化学基を有するように誘導体化することが可能であり、これらのポリペプチドが二機能性化合物の標的化部分を構成する。二機能性化合物は、化学的結合および化学的架橋剤などの技術を用いて、標的化部分を合成抗原（またはプロ抗原）に接合させることによって調製され得る。いくつかの実施形態において、合成抗原は、リンカーを介して標的化部分に接合され得る。リンカーを必要とさせ得る要因のいくつかには、ＣＡＲ−Ｔ細胞を改変操作するために使用される遮蔽されていないプロ抗原（すなわち、タグ）に対して抗体を産生するために使用される微小環境を再作製する必要性、小分子を溶媒に曝露し、ＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞外タグ結合ドメインに接近可能とする必要性が挙げられ、特に疎水性小分子は、親水性／極性リンカー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の使用が有益であり得る。リンカーの長さは変動し得るが、標的細胞に対して近位であるタグは、標的細胞に対するＣＡＲ−Ｔ細胞応答をよりよく惹起することができるので、より短いリンカーが好ましい。疎水性／非極性リンカーの代表例としては、グリシン、アミノヘプタン酸、アミノヘキサン酸、アミノペンタン酸およびアミノテトラン酸などの脂肪族リンカーが挙げられる。極性リンカーの代表例としては、例えば、１〜１２反復単位（例えば、２、４、６、８、１０または１２反復単位）を有するポリエチレングリコール部分が挙げられる。
【０１０２】
例えば、スキーム１に示されているように、６−アミノフルオレセインをマレイミド−ＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル）と反応させて、化合物（１）を形成することができる：
【０１０３】
スキーム１：
【化５７】
2021530444.tif 000068
【０１０４】
マレイミドフルオレセイン誘導体、化合物（１）は、次に、標的化部分のスルフヒドリル基と反応して、スキーム２に示されているとおりにチオエーテル結合を介して安定な接合体を形成する。
【０１０５】
スキーム２：
【化５８】
2021530444.tif 000069
【０１０６】
遮蔽されたプロ抗原を有する二機能性化合物の合成の代表例は、スキーム３および４に示されている：
【０１０７】
スキーム３：
【化５９】
2021530444.tif 000070
【０１０８】
スキーム４：
【化６０】
2021530444.tif 000071
【０１０９】
次いで、スキーム２に示されているように、化合物（１）に代えて、化合物（２）および（３）の各々を使用して、本発明の二機能性化合物を生成することができる。
【０１１０】
フルオレセインのＮＨＳエステル誘導体を使用する、遮蔽されたプロ抗原を有する二機能性化合物の合成の別の代表例が、スキーム５に示されている：
【０１１１】
スキーム５：
【化６１】
2021530444.tif 000072
式中、ＯＲはボロン酸エステルで置換されており、Ｒ’は標的化部分である。
【０１１２】
本明細書において記載されているように、二機能性化合物は、遊離の酸もしくは遊離の塩基または薬学的に許容され得る塩の形態であり得る。本明細書において使用される場合、塩に関する「薬学的に許容され得る」という用語は、化合物の生物学的活性または特性を抑制せず、相対的に非毒性である化合物の塩を表す、すなわち、塩形態の化合物は、望ましくない生物学的作用（めまいまたは胃のむかつきなど）を引き起こさずに、またはその塩がその中に含有されている組成物の他の成分のいずれとも有害な様式で相互作用せずに被験体に投与され得る。「薬学的に許容され得る塩」という用語は、適切な酸または塩基との、本明細書に記載されている化合物の反応によって得られた生成物を表す。本明細書に記載されている化合物の薬学的に許容され得る塩の例としては、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｃａ、Ｍｇ、Ｆｅ、Ｃｕ、Ａｌ、ＺｎおよびＭｎ塩などの適切な無機塩基に由来するものが挙げられる。薬学的に許容され得る無毒の酸付加塩の例は、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、イソニコチン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、パントテン酸塩、重酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチジン酸塩（ｇｅｎｔｉｓｉｎａｔｅ）、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルカロン酸塩（ｇｌｕｃａｒｏｎａｔｅ）、サッカリン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、４−メチルベンゼンスルホン酸塩またはｐ−トルエンスルホン酸塩などの無機酸とともに形成されたアミノ基の塩である。本明細書に記載されているある種の化合物は、リジン、アルギニン、グアニジン、ジエタノールアミンまたはメトホルミンなどの様々な有機塩基とともに薬学的に許容され得る塩を形成することができる。適切な塩基塩としては、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムまたは亜鉛塩が挙げられる。
【０１１３】
本明細書中の様々な構造において開示されているとおり、本明細書に記載されている二機能性化合物は、立体異性体の形態であり得、立体異性体は、本分野において公知であるとおり、空間中での化合物の原子の配置のみが異なる個々の化合物の異性体を表す。したがって、立体異性体という用語には、化合物の鏡像異性体（エナンチオマー）、化合物の鏡像異性体の混合物（エナンチオマーの物理的混合物、ラセミ体またはラセミ混合物）、化合物の幾何（シス／トランスまたはＥ／Ｚ、Ｒ／Ｓ）異性体および互いに鏡像でない、１より多いキラル中心を有する化合物の異性体（ジアステレオ異性体）が含まれる。本明細書に記載されている化合物は、個別の異性体の形態であり、他の異性体を実質的に含まない、または様々な異性体の混合物、例えば、立体異性体のラセミ混合物の形態であり得る。
【０１１４】
薬学的組成物
薬学的組成物は、治療的有効量の二機能性化合物と薬学的に許容され得る担体とを含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、同じ（例えば、第一の）腫瘍関連抗原の異なるエピトープを結合する第二の標的化部分に共有結合された第一の合成抗原を含む別の（第二の）二機能性化合物または薬学的に許容され得るその塩もしくは立体異性体をさらに含み得る。したがって、組成物は、２またはそれより多くの二機能性化合物を含み得、それらの全てが同じ腫瘍関連抗原を結合するが、二機能性化合物の少なくとも２つは同じ腫瘍関連抗原上の異なるエピトープを結合する。他の実施形態において、薬学的組成物は、異なる腫瘍関連抗原（例えば、第一のものとは異なる）を結合する第二の標的化部分に共有結合された合成抗原を含む別の（例えば、第二の）二機能性化合物または薬学的に許容され得るその塩もしくは立体異性体をさらに含み得る。したがって、組成物は、２またはそれより多くの二機能性化合物を含み得、それらの全てが異なる腫瘍関連抗原を結合し、二機能性化合物の少なくとも２つは異なる腫瘍関連抗原上の異なるエピトープを結合する。
【０１１５】
本発明の第二の重要な態様は、治療的有効量の複数の、二機能性化合物の部分集団であって、各部分集団が異なる腫瘍関連抗原に対して特異性を有するが、全ての部分集団がＣＡＲ  Ｔ細胞に対して同じ特異性を有する（例えば、全ての二機能性化合物が同じ合成抗原を含有する）部分集団の使用に関する。したがって、いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、治療的有効量の複数の、二機能性化合物の部分集団を含有し、各部分集団において、合成抗原（またはプロ抗原）は同一であるが、各標的化部分は腫瘍細胞上に存在する異なる腫瘍関連抗原を結合する点で異なる。したがって、薬学的組成物は、第一の腫瘍関連抗原を特異的に結合する第一の標的化部分に共有結合された合成抗原（またはプロ抗原）を有する二機能性化合物の第一の部分集団と、第二の腫瘍関連抗原を特異的に結合する第二の標的化部分に共有結合された合成抗原（またはプロ抗原）をそれぞれが有する二機能性化合物の第二の部分集団とを含有し得、前記第一および第二の腫瘍関連抗原は異なる。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、第一および第二の標的化部分は、脳腫瘍関連抗原を特異的に結合する。いくつかの実施形態において、脳腫瘍関連抗原は、ＧＤ２、ＩＬ１３Ｒα２、ＨＥＲ２、ＰＤＧＦＲα、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＳＰＧ４、ＥｐｈＡ２、ＣＤ１３３、ＧＲＰ７８、ＮＣＡＭ、ＣＤ２７６およびネスチンから選択され、第一および第二の標的化部分が同じ腫瘍関連抗原または異なる脳腫瘍関連抗原上の異なるエピトープを結合する。いくつかの実施形態において、二機能性化合物の複数の部分集団は、ＧＤ２、ＩＬ１３Ｒα２、ＨＥＲ２、ＰＤＧＦＲα、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＳＰＧ４、ＥｐｈＡ２およびＣＤ１３３から選択される２またはそれより多くの脳腫瘍関連抗原を標的とするように設計される。いくつかの実施形態において、複数の部分集団はＩＬ１３Ｒα２、ＥＧＦＲｖＩＩＩおよびＨＥＲ２の２またはそれより多くを標的とし、いくつかの他の実施形態において、複数の部分集団は、ＧＤ２、ＰＤＧＦＲαおよびＣＤ１３３の２またはそれより多くを標的とする。さらなる実施形態において、二機能性化合物の複数の部分集団はＥｐｈＡ２およびＣＳＰＧ４を標的とする。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、第一および第二の標的化部分は、血液腫瘍関連抗原を特異的に結合する。いくつかの実施形態において、血液腫瘍関連抗原は、ＣＤ３８、ＣＳ１、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１３８、ＣＤ４０、ＣＤ５６、ＣＤ７０およびＣＤ７４から選択され、第一および第二の標的化部分は、同じ腫瘍関連抗原または異なる血液腫瘍関連抗原上の異なるエピトープを結合する。いくつかの実施形態において、二機能性化合物の複数の部分集団は、ＣＤ３８、ＣＳ１、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１３８、ＣＤ４０、ＣＤ５６、ＣＤ７０およびＣＤ７４から選択される２またはそれより多くの血液腫瘍関連抗原を標的とするように設計される。いくつかの実施形態において、複数の部分集団はＣＤ３８、ＣＳ１およびＢＣＭＡの２またはそれより多くを標的とし、いくつかの他の実施形態において、複数の部分集団は、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ２２の２またはそれより多くを標的とする。さらなる実施形態において、複数の部分集団はＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４およびＣＤ１３８を標的とする。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、投与ごとに変動し得る。したがって、本発明の実施形態は、上記のとおりの第一の組成物と、任意の１またはそれより多くの部分集団の標的化部分が同じ腫瘍関連抗原の異なるエピトープに結合する点で第一の組成物と異なる第二の組成物とを含み得る。このさらなる特徴は、抗原喪失／逃避を緩和し得、または毒性を軽減し得る。
【０１１９】
ＣＡＲ  Ｔ細胞
ＣＡＲ  Ｔ細胞は、いずれの正常な細胞または癌細胞上にも天然に存在しない合成抗原または遮蔽されていないプロ抗原を結合するように改変操作される。したがって、腫瘍細胞標的化を腫瘍細胞死滅と切り離すことによって、（合成抗原または遮蔽されていないプロ抗原への）単一の特異性を有するＣＡＲ  Ｔ細胞は、複数の腫瘍関連抗原を同時に標的とすることができる。
【０１２０】
本発明の方法では、エフェクター細胞が使用され得る。エフェクター細胞は、自家、同系または同種異系であり得、処置されるべき疾患および疾患を処置するために利用可能な手段に応じて選択される。これらの方法において使用され得るエフェクター細胞の適切な集団としては、Ｔ細胞などの細胞溶解活性を有する任意の免疫細胞が挙げられる。Ｔ細胞の例示的な部分集団としては、ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＮＫＴ細胞などのＣＤ３＋を発現するものが挙げられる。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞はＨＬＡ−Ａ２＋末梢血単核球（ＰＢＭＣ）であるが、Ｔ細胞はＰＢＭＣ由来の任意のＨＬＡ背景のものであり得、自家、同系または同種異系の系において使用することができる。Ｔ細胞は、処置されている被験体の腫瘍外植片または処置されている被験体の腫瘍内Ｔ細胞からなど、任意の源からも単離され得る。便宜のために、本明細書の以下では、エフェクター細胞はＴ細胞と称されるが、本明細書におけるＴ細胞という全ての表記は、別段の指示がなければ、本明細書に定義されている全てのエフェクター細胞の種類を表すことが理解されるべきである。
【０１２１】
本明細書において使用される遺伝的に改変操作されたＴ細胞は、腫瘍関連抗原に結合する（抗体またはその機能的断片などの）標的化部分に接合されている特定の遮蔽されていないプロ抗原（本明細書において、タグとも称される）に対して結合特異性を有する。ＣＡＲのさらなる特徴としては、Ｔ細胞結合および活性化に際して効率的な標的溶解を誘導する活性化ドメインならびにＣＡＲのｓｃＦｖ部分を、本発明の遮蔽されていないプロ抗原またはタグの任意の１つに対して特異性を有するものと置換するまたは置き換える能力が挙げられる。ＣＡＲ  Ｔ細胞の設計および特異性に照らして、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ユニバーサルＣＡＲ−Ｔ細胞またはバイナリー活性化（Ｂｉｎａｒｙ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ）Ｔ細胞（ＢＡＴ−ＣＡＲ）と称され得る。
【０１２２】
ＢＡＴ−ＣＡＲポリペプチドは、典型的には、３つのドメインを含む。第一のドメインは細胞外リガンドまたはタグ結合ドメインであり、第二のドメインは、膜貫通（ＴＭ）ドメインであり、第三のドメインは、Ｔ細胞活性化ドメインである。
【０１２３】
細胞外リガンド
第一のドメインは、典型的には、ＢＡＴ−ＣＡＲポリペプチドのアミノ末端終末に存在し、したがって、Ｔ細胞の外側にあり、タグ結合ドメインが標的細胞に結合されているタグ化されたタンパク質へ自由に接近することを可能にする。タグ結合ドメインは、典型的には、抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、抗体はヒトもしくはヒト化抗体またはその抗原結合断片である。
【０１２４】
タグ結合ドメインは、標的細胞（例えば、癌細胞）を結合する標的化部分に共有結合されている合成抗原を特異的に結合するように設計される。例えば、合成抗原が保護基で誘導体化されているフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体である場合、タグ結合ドメインはかごに入っていないまたは遮蔽されていないフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体を特異的に結合するが、かごに入った分子には結合しない。このような結合部分の例は、本分野において公知であり、Ｍｉｄｅｌｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４３：６８５−７０１（２００４）に開示されている、例えば、４Ｍ５．３  ＳｃＦｖおよびＯｒｃｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３８（２）：２２３−２３３（２０１１）に開示されている２Ｄ１２．５、２Ｄ１２．５ｄｓまたはＣ８．２．５である。
【０１２５】
抗体の種類は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラまたはヒト化であり得る。抗体は任意の動物種、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌまたはネコから取得され得る。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＥ抗体を含む使用され得る抗体の特定のクラスに対する制約も存在しない。同じく使用され得る抗体断片としては、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片およびＦａｂ発現ライブラリーによって産生される断片が挙げられ、但し、抗体断片は選択されたタグを結合する能力を保持する。
【０１２６】
本発明のＢＡＴ−ＣＡＲは、少なくとも合成抗原が公知である限り、市販の細胞外リガンドを用いて作製され得る。または、合成抗原を特異的に結合する抗体およびその断片は、標準的な技術、例えば、モノクローナル抗体作製用の培養中の連続継代性細胞株を用いて調製することができる。代表的な技術としては、ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５））によって最初に記載されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２（１９８３）；Ｃｏｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ８０：２０２６−２０３０（１９８３））およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｎ．Ｙ．，ｐｐ  ７７−９６（１９８５））が挙げられる。「キメラ抗体」の作製のために開発された技術、すなわち、適切な抗原特異性および生物学的活性を有する分子を得るための、マウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子へのスプライシングも使用することができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４（１９８５））。本分野において公知であるとおり、ヒト化抗体または抗体断片は、典型的には、非ヒト源由来の抗体の可変ドメインからの１またはそれより多くのアミノ酸残基を有する。ヒト化抗体または抗体断片は、非ヒト免疫グロブリン分子由来の１またはそれより多くのＣＤＲと、ヒト生殖系列に完全にまたは大部分由来するフレームワーク領域とを含有し得る。抗体または抗体断片をヒト化するための技術は周知であり、ＣＤＲグラフティング、ベニアリングまたはリサーフェシングおよび鎖シャフッリングが挙げられる。Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８））も参照されたい。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、ＢＡＴ−ＣＡＲ−Ｔのタグ結合ドメインは、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。ｓｃＦｖは、抗体の重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域を含み、典型的には、最大約５０、例えば、約１０のアミノ酸残基を含む。リンカーは、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と接続することができ、またはその逆も可能である。ｓｃＦｖは、本分野において公知の方法にしたがって調製することができる（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６（１９８８）およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８）参照）。いくつかの実施形態において、リンカー配列はアミノ酸グリシンおよびセリンを含み、いくつかの事例では、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（ｎは、１以上の整数である）などのグリシンおよびセリン反復の組を含む。リンカーの長さおよびアミノ酸組成は、例えば、最適な折り畳みおよびＶＨとＶＬの間の相互作用を達成して、機能的なエピトープを作製するために変動し得る。例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４−６４４８（１９９３）参照。
【０１２８】
本発明において有用であり得る遮蔽されていないプロ抗原に対して特異性を有する抗体断片の他の種類としては、Ｆｖ、Ｆａｂおよび（Ｆａｂ’）２断片が挙げられる。例えば、米国特許第４，９４６，７８８号を参照。
【０１２９】
第二のドメインは、ＢＡＴ−ＣＡＲをＴ細胞の細胞膜中に固着させることが可能な膜貫通（ＴＭ）ドメインである。ＢＡＴ−ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに付着される膜貫通ドメインを含むように設計することができる。膜貫通ドメインは、ＣＡＲの他のドメイン（例えば、シグナル伝達ドメイン、共刺激ドメインおよびヒンジドメイン）が由来する同じタンパク質または異なるタンパク質に由来し得る。膜貫通ドメインは、天然または組換え源に由来し得る。源が天然である場合には、ドメインは、任意の膜結合または膜貫通タンパク質に由来し得る。本発明において有用であり得る膜貫通ドメインの代表例としては、Ｔ細胞受容体のα、βまたはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の膜貫通領域が挙げられる。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ヒンジ、例えば、ヒトタンパク質からのヒンジを介して、ＣＡＲの細胞外領域、例えば、ＣＡＲの抗原結合ドメインに付着される。ヒンジドメインの源としては、ヒトＩｇ（免疫グロブリン）ヒンジ（例えば、ＩｇＧ４ヒンジ、ＩｇＤヒンジ）およびＣＤ８（例えば、ＣＤ８αヒンジ）が挙げられる。
【０１３１】
ＢＡＴ−ＣＡＲの第三のドメインは、細胞内シグナル伝達ドメインとしても知られるＴ細胞活性化ドメインであり、標的細胞に結合されているタグ化されたタンパク質へのＣＡＲの結合に際して、Ｔ細胞活性化を補助する。細胞内シグナル伝達ドメインは、一般に、ＣＡＲがその中に導入されたエフェクター細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化に関与する。本発明のＣＡＲ中で使用するための細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の細胞質配列および抗原受容体会合後のシグナル伝達を開始するために協調して作用する共受容体が挙げられる。ＴＣＲ単独を通じて生成された信号は、Ｔ細胞の完全な活性化のために不十分であり、したがって、二次的または共刺激信号も必要とされる。したがって、Ｔ細胞活性化は、細胞質シグナル伝達配列、すなわち、ＴＣＲを通じた抗原依存性の一次活性化を開始する細胞質シグナル伝達配列（すなわち、一次細胞内シグナル伝達ドメイン）および抗原非依存性様式で、二次または共刺激信号を与えるために作用する細胞質シグナル伝達配列（すなわち、二次細胞質または共刺激ドメイン）という２つの異なるクラスによって媒介される。一次シグナル伝達ドメインは、刺激的な様式または阻害的な様式のいずれかで、ＴＣＲ複合体の一次活性化を制御する。刺激的様式で作用する一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）として知られるシグナル伝達モチーフを含有し得る。本発明において使用するのに適切であり得るＩＴＡＭ含有一次細胞内シグナル伝達ドメインの代表例としては、ＣＤ３ζ、共通ＦｃＲγ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、Ｆｃ−γ  ＲＩＩａ、ＦｃＲ−β（Ｆｃ−ε  Ｒ１ｂ）、ＣＤ３γ、ＣＤ３δおよびＣＤ３εのものが挙げられる。いくつかの実施形態において、ＢＡＴ−ＣＡＲには、ＣＤ３ζの一次シグナル伝達ドメインを含有する細胞内シグナル伝達ドメインが挙げられる。
【０１３２】
ＢＡＴ−ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインとしては、少なくとも１つの他の細胞内シグナル伝達または共刺激ドメインも挙げられ得る。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答のために必要とされる抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。本発明のＢＡＴ−ＣＡＲにおいて有用であり得る共刺激ドメインの代表例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２ＣおよびＢ７−Ｈ３が挙げられる。ＣＤ２７共刺激は、例えば、インビトロで、ヒトＣＡＲＴ細胞の増殖、エフェクター機能および生存を強化し、インビボでのヒトＴ細胞の持続性および抗腫瘍活性を増強することが実証されている（Ｓｏｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１９（３）：６９６−７０６（２０１２））。
【０１３３】
細胞内シグナル伝達ドメインは、必要に応じてリンカー分子を介して、指定されたまたは無作為の順序で互いに連結され得る、１またはそれより多い、例えば、１、２、３、４、５またはそれより多い共刺激シグナル伝達ドメインを含むように設計され得る。長さ約１〜１０アミノ酸であるポリペプチドリンカーは、連続的細胞内シグナル伝達配列を連結し得る。このようなリンカーの例としては、Ｇｌｙ−Ｓｅｒなどのダブレットおよび単一アミノ酸、例えば、ＡｌａおよびＧｌｙが挙げられる。Ｔ細胞活性化ドメインを構成し得る組み合わせは、Ｔ細胞生存および増殖を強化する役割を果たすＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＯＸ４０およびＨＶＥＭの細胞質領域ならびにＴ細胞活性化を誘導するＣＤ３  ＣＤ３ζおよびＦｃＲεを基礎とし得る。例えば、３つのＩＴＡＭを含有するＣＤ３ζは、ＣＡＲの最も一般に使用される細胞内ドメイン成分であり、抗原が結合された後に、活性化シグナルをＴ細胞に伝達する。しかしながら、さらなる共刺激シグナル伝達を与えるために、ＢＡＴ−ＣＡＲ  Ｔ細胞が増殖／生存シグナルを伝達することを可能にするＣＤ２８およびＯＸ４０ドメインをＣＤ３ζとともに使用することができる。
【０１３４】
抗ＦＬ  ＣＡＲ−ＣＤ２８−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζをコードするポリヌクレオチドの代表例は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１として表記される配列を有する。
【０１３５】
ＡＴＧＧＣＴＣＴＧＣＣＴＧＴＧＡＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＴＣＴＧＧＣＴＣＴＧＣＴＴＣＴＧＣＡＴＧＣＣＧＣＣＡＧＡＣＣＴＧＡＣＧＴＧＧＴＣＡＴＧＡＣＡＣＡＧＡＣＡＣＣＴＣＴＧＡＧＣＣＴＧＣＣＴＧＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＡＧＡＴＣＡＧＧＣＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＡＴＣＴＡＧＣＣＡＧＡＧＣＣＴＧＧＴＧＣＡＣＡＧＣＡＡＣＧＧＣＡＡＣＡＣＣＴＡＣＣＴＧＣＧＧＴＧＧＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧＴＣＴＣＣＴＡＡＧＧＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＧＡＧＴＧＴＣＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＧＡＴＡＧＡＴＴＴＴＣＴＧＧＣＡＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＡＧＡＴＣＡＡＴＡＧＡＧＴＧＧＡＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＣＴＧＧＧＣＧＴＧＴＡＣＴＴＣＴＧＴＡＧＣＣＡＧＴＣＴＡＣＣＣＡＣＧＴＧＣＣＡＴＧＧＡＣＣＴＴＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＧＣＣＧＡＣＧＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＧＧＡＣＧＣＣＧＣＴＡＡＧＡＡＧＧＡＴＧＡＣＧＣＣＡＡＡＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＣＣＡＡＡＡＡＧＧＡＴＧＧＣＧＧＣＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧＡＣＧＡＡＡＣＡＧＧＣＧＧＡＧＧＡＣＴＴＧＴＴＣＡＧＣＣＴＧＧＣＧＧＡＧＣＣＡＴＧＡＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＴＧＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＧＧＣＣＡＣＴＡＣＴＧＧＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＡＣＡＧＡＧＣＣＣＴＧＡＧＡＡＡＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＣＧＣＣＣＡＧＴＴＣＡＧＡＡＡＣＡＡＧＣＣＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＧＡＡＡＣＣＴＡＣＴＡＣＡＧＣＧＡＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＣＧＧＧＡＣＧＡＣＡＧＣＡＡＧＴＣＣＡＧＣＧＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＡＡＣＣＴＧＣＧＣＧＴＧＧＡＡＧＡＴＡＣＣＧＧＣＡＴＣＴＡＣＴＡＣＴＧＴＡＣＣＧＧＣＧＣＣＡＧＣＴＡＣＧＧＣＡＴＧＧＡＡＴＡＴＣＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＧＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＴＡＣＡＡＣＡＡＣＣＣＣＴＧＣＴＣＣＴＣＧＧＣＣＴＣＣＴＡＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＡＣＡＡＴＴＧＣＣＡＧＣＣＡＧＣＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＡＧＧＣＣＣＧＡＡＧＣＴＴＧＴＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧＡＧＣＣＧＴＧＣＡＴＡＣＡＡＧＡＧＧＡＣＴＧＧＡＴＴＴＣＧＣＣＴＧＣＧＡＣＴＴＣＴＧＧＧＴＧＣＴＣＧＴＧＧＴＴＧＴＴＧＧＣＧＧＡＧＴＧＣＴＧＧＣＴＴＧＴＴＡＣＴＣＣＣＴＧＣＴＧＧＴＴＡＣＣＧＴＧＧＣＣＴＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＴＴＧＧＧＴＣＣＧＡＡＧＣＡＡＧＣＧＧＡＧＣＣＧＧＣＴＧＣＴＧＣＡＣＡＧＣＧＡＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡＣＣＣＣＴＡＧＡＣＧＧＣＣＣＧＧＡＣＣＴＡＣＣＡＧＡＡＡＧＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＣＴＴＡＣＧＣＴＣＣＴＣＣＴＡＧＡＧＡＣＴＴＣＧＣＣＧＣＣＴＡＣＡＧＡＴＣＣＡＡＧＣＧＧＧＧＣＡＧＡＡＡＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＴＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＧＣＡＧＣＣＣＴＴＣＡＴＧＣＧＧＣＣＣＧＴＧＣＡＧＡＣＣＡＣＡＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＴＧＣＴＣＣＴＧＣＡＧＡＴＴＣＣＣＣＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＣＧＧＣＴＧＣＧＡＧＣＴＧＡＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＡＴＣＣＧＣＣＧＡＣＧＣＴＣＣＴＧＣＣＴＡＴＣＡＧＣＡＧＧＧＡＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＧＧＡＧＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＴＡＣＧＡＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＣＧＧＡＧＡＧＧＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＣＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＡＧＣＧＧＡＧＡＡＡＧＡＡＴＣＣＴＣＡＡＧＡＧＧＧＣＣＴＧＴＡＴＡＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＣＡＡＧＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＣＧＡＧＡＴＣＧＧＡＡＴＧＡＡＧＧＧＣＧＡＧＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＧＣＡＡＧＧＧＡＣＡＣＧＡＴＧＧＡＣＴＧＴＡＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＴＡＣＣＴＡＴＧＡＴＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＡＣＣＴＡＧＡＴＧＡＴＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）
【０１３６】
Ｔ細胞は、公知の技術にしたがって、ＢＡＴ−ＣＡＲを発現するように改変操作され得る。一般的に、ＢＡＴ−ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドベクターは構築され、ベクターはＴ細胞の集団中に形質移入される。次いで、Ｔ細胞によるＢＡＴ−ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドの発現を促進する条件下で、細胞を増殖する。成功した形質移入（またはウイルスによって媒介される遺伝子組み込みを表す形質導入）およびＴ細胞によるＢＡＴ−ＣＡＲのディスプレイは、標準的な技術を介して実施され得る。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、選択されたＢＡＴ−ＣＡＲをコードするレトロウイルスベクターをまず構築することによってＢＡＴ−ＣＡＲを産生するように改変操作され得る。レトロウイルスの形質導入は、公知の技術を用いて実施され得る（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １１４：５３５−５４６（２００９））。形質導入されたＴ細胞上でのＢＡＴ−ＣＡＲの表面発現は、例えば、フローサイトメトリーによって決定され得る。
【０１３８】
ＢＡＴ−ＣＡＲ  Ｔ細胞の集団は、公知の技術を用いて、被験体に投与するために調合され得る。ＢＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞の集団を含む調合物は、１またはそれより多くの薬学的に許容され得る賦形剤を含み得る。調合物中に含まれる賦形剤は、例えば、タグ結合ドメインの性質、使用されるＴ細胞の部分集団および投与の様式に応じて、異なる目的を有し得る。賦形剤の代表例としては、生理食塩水、緩衝化された生理食塩水、デキストロース、注射用水、グリセロール、エタノールおよびこれらの組み合わせ、安定化剤、可溶化剤および界面活性剤、緩衝剤および防腐剤、等張化剤、増量剤および潤滑剤が挙げられる。ＢＡＴ−ＣＡＲ  Ｔ細胞の集団を含む調合物は、典型的には、動物血清などの任意の非ヒト成分（例えば、ウシ血清アルブミン）の不存在下で調製および培養される。
【０１３９】
系およびキット
本発明のさらなる態様は、二機能性化合物の複数の部分集団と、自家、同種異系または同系であり得るＣＡＲ  Ｔ細胞とを含む系を対象とする。
【０１４０】
本明細書に記載されている組成物のいずれもが、キット中に含まれ得る。キットは、ａ）治療的有効量の複数の、二機能性化合物または薬学的に許容され得るその塩もしくは立体異性体の部分集団であって、第一の部分集団中の各二機能性化合物が、第一の腫瘍関連抗原を特異的に結合する第一の標的化部分に共有結合された第一の合成抗原を含み、および第二の部分集団中の各二機能性化合物が、第二の腫瘍関連抗原を特異的に結合する第二の標的化部分に共有結合された前記第一の合成抗原を含む部分集団と、ここで、前記第一および第二の標的化部分は異なる腫瘍関連抗原を特異的に結合し、ならびに患者に投与される二機能性化合物の各部分集団は前記第一の合成抗原を含有するが、異なる固形腫瘍関連抗原を特異的に結合し、前記複数の、二機能性化合物の部分集団は同一のまたは別個の容器中に配置されており、
ｂ）治療的有効量の複数の、二機能性化合物の部分集団  治療的有効数のＣＡＲ−Ｔ細胞であって、前記合成抗原を特異的に結合する細胞外リガンドを含むＣＡＲ−Ｔ細胞を癌患者に併用投与するための説明書と、
を含み得る。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、キットは、細胞療法において使用するための１またはそれより多くの細胞をさらに含み得、および／または組換え発現ベクターを保有する細胞療法において使用するための１またはそれより多くの細胞を生成するための試薬がキットまたは系中に含まれ得る。さらに別の実施形態において、キットは、治療的有効数の同種異系ＣＡＲ−Ｔ細胞をさらに含む。上記実施形態のいずれにおいても、キットは、プロ抗原中に含有される保護基を切断する試薬（例えば、ＲＯＳ／ＲＮＳ生成剤）を必要に応じて含む。キット成分は、１またはそれより多くの適切な容器手段中で提供される。
【０１４２】
キットのいくつかの成分は、水性媒体中にまたは凍結乾燥された形態で梱包され得る。キットの容器手段は、一般的には、その中に成分が配置され得る、好ましくは適切に分割量とされ得る少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、シリンジまたはその他の容器手段を含むであろう。キット中に１より多くの成分が存在する場合には、キットは、さらなる成分がその中に別個に配置され得る第二、第三またはその他のさらなる容器も一般に含有するであろう。しかしながら、成分の様々な組み合わせがバイアル中に含まれ得る。本発明のキットは、商業的販売のために、緊密に閉じ込めて成分を含有するための手段も典型的に含むであろう。このような容器としては、所望のバイアルがその中に保持される射出または中空成形プラスチック容器が挙げられ得る。
【０１４３】
キットの成分が１および／またはそれより多い液体溶液中に与えられる場合、液体溶液は水溶液であり、無菌水溶液は特に有用である。いくつかの事例では、容器手段自体が、そこから調合物が身体の感染した領域に適用され得る、動物中に注射され得る、ならびに／またはキットの他の成分に適用されおよび／もしくは混合され得る、シリンジ、ピペットおよび／またはその他のこのような類似の器具であり得る。
【０１４４】
しかしながら、キットの成分は、乾燥された粉末として与えられ得る。試薬および／または成分が乾燥粉末として与えられる場合には、粉末は、適切な溶媒の添加によって再構成され得る。別の溶液手段に入れて溶媒が与えられ得ることも想定される。キットは、無菌の、薬学的に許容され得る緩衝剤および／または希釈剤を含有するための第二の容器手段も含み得る。
【０１４５】
特定の実施形態において、個体から１またはそれより多くの試料を抽出するのに適した１またはそれより多くの器具がキット中に存在する。器具としては、シリンジ、メスなどが含まれ得る。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、キットは、別個の容器を手段として、薬学的に許容され得る担体とともにその中に調合され得る第二の抗癌剤をさらに含み得る。
【０１４７】
方法
本発明の方法は、癌を処置する方法を対象とする。この方法は、ａ）複数の、二機能性分子の部分集団であって、前記複数がａ１）治療的有効量の、第一の腫瘍関連抗原を特異的に結合する第一の標的化部分に共有結合された合成抗原を含む二機能性化合物の第一の部分集団と、ａ２）治療的有効量の、第二の腫瘍関連抗原を特異的に結合する第二の標的化部分に共有結合された合成抗原を含む二機能性化合物の第二の部分集団とを含む二機能性分子の部分集団または薬学的に許容され得るそれらの塩もしくは立体異性体と、ここで、前記第一および第二の標的化部分は、異なる腫瘍関連抗原を特異的に結合し、
ｂ）治療的有効数のＣＡＲ−Ｔ細胞であって、合成抗原を特異的に結合する細胞外リガンドを含むＣＡＲ−Ｔ細胞と、
を必要とする被験体に併用投与することを含む。本明細書において使用される「併用投与する」という用語は、二機能性化合物の複数の部分集団に関する場合、同じ処置レジメンの間に投与することを含む。複数の部分集団は、同時にまたは順次に（例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞および二機能性化合物の第一の部分集団の組み合わせに対して患者がもはや応答しなくなった後に投与され得る。
【０１４８】
本明細書において使用される場合、「処置する」、「処置している」および「処置」という用語は、それらの通常かつ慣用の意味を有し、被験体中の癌を阻止すること、軽減すること、またはその重篤度をおよび／もしくはその症候の頻度を低減することの１またはそれより多くを含む。いくつかの実施形態において、処置を受けている被験体はヒトである。他の実施形態において、被験体は、非ヒト動物、例えば、非ヒト霊長類、鳥、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコもしくはげっ歯類などの愛玩動物またはその他の哺乳動物である。
【０１４９】
本発明の処置様式を用いた処置に適し得る癌は、固形または血液腫瘍の存在によって特徴づけられる。広くは、固形または血液腫瘍には、成体および小児の両方の、腺腫、癌腫、肉腫ならびに多発性骨髄腫、白血病およびリンパ腫のような血液の悪性病変が含まれる。癌は、血管形成され、または未だ実質的に血管形成されていないまたは血管形成されない腫瘍であり得る。
【０１５０】
処置されるべき癌には、原発性腫瘍および、例えば、肺、乳房、脳または前立腺から移転した続発性または転移性腫瘍ならびに再発性または難治性腫瘍が含まれる。再発性腫瘍は、このような因子での処置によって阻害されるように見受けられるが、処置が中止されてから最大５年後に、または最大１０年後にまたはそれより長い後に再発する腫瘍を包含する。難治性腫瘍は、特定の腫瘍の種類に対する１またはそれより多くの慣用の、承認されたまたは実験的な治療での処置に対して非応答性または抵抗性であった腫瘍である。
【０１５１】
本発明の治療方法は、「一次」、すなわち、単独でまたは他の処置と組み合わせて、一切の抗癌処置を未だ受けていない患者における初期処置であり得る。本発明の治療方法は、少なくとも１つの従前の抗癌処置レジメン、例えば、単独でのまたは他の処置と組み合わせた、化学療法、放射免疫療法、毒素療法、プロドラッグ活性化酵素療法、抗体療法、外科的療法、免疫療法、放射線療法、標的化療法またはこれらの任意の組み合わせを受けたことがある患者に施されるという意味において「二次」治療としても有利に使用され得る。いくつかの事例では、患者が特定の処置に対して不耐容となった場合、特に、一次治療が抗原喪失／逃避のためにもはや有効でない場合、従前の治療は不成功であったまたは部分的に成功したことがあり得る。本発明の方法は、例えば、現在検出可能でない疾患を有するまたは腫瘍の外科的除去後の患者での癌の再発を阻害するために、補助処置としても使用され得る。
【０１５２】
本発明にしたがって処置され得る固形腫瘍によって特徴づけられる癌の代表例としては、乳房（ＨＥＲ２＋および転移性を含む）、結腸直腸（例えば、結腸）、食道、胆管、肺（小細胞および非小細胞肺腫瘍、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌腫を含む）、肝臓、類表皮腫瘍、扁平上皮腫瘍、例えば、頭部および頸部腫瘍、上皮性扁平上皮癌、甲状腺、子宮頸部、卵巣、神経内分泌腫瘍、褐色細胞腫（ｐｈｅｏｃｈｒｏｍａｃｙｔｏｍａ）、腹膜の癌、肝芽腫、肝細胞癌腫、肝細胞癌、膀胱癌、肝細胞腫、子宮内膜または子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓または腎癌、骨癌、軟部組織肉腫（胎児性および胞巣状横紋筋肉腫、直腸、膵臓、前立腺、胃腸（胃の（ｇａｓｔｒｉｃ）および胃を含む）、胞状軟部肉腫および明細胞肉腫を含む）、胆管細胞癌腫、胆嚢癌腫、骨髄腫、外陰癌、陰茎癌腫、網膜、アンドロゲン依存性腫瘍、アンドロゲン非依存性腫瘍、カポジ肉腫、滑膜肉腫、血管作動性腸ペプチド分泌腫瘍、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、黒色腫、ウィルムス癌、ユーイング癌、骨肉腫、ＰＮＴ、ラブドイド、網膜芽細胞腫、副腎癌、副腎腫瘍、平滑筋肉腫、および胎児性横紋筋肉腫、胞巣状横紋筋肉腫、ブドウ状横紋筋肉腫、多形性横紋筋肉腫を含む横紋筋肉腫、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫および大顆粒リンパ性（ＬＧＬ）白血病が挙げられる。
【０１５３】
ＲＯＳ／ＲＮＳに対して反応性である１またはそれより多くのボロン酸エステル保護基（例えば、ボロン酸エステル）を有するプロ抗原を含有する二機能性化合物での処置に特に適し得る高ＲＯＳ／ＲＮＳ生成癌の代表例としては、膵臓癌、前立腺癌、カポジ肉腫、肝臓癌、乳癌、胆管細胞癌腫、胃癌、肺腺癌、膵管腺癌、乳癌腫、肺の癌腫、甲状腺癌腫および肉腫、黒色腫、腎臓、胃、結腸、肝臓、膵臓および膀胱の癌腫、神経芽腫、前立腺の癌腫、卵巣癌腫、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）陽性子宮頸癌腫、骨原性肉腫、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、繊維肉腫、軟骨肉腫および神経分泌腫瘍（Ｂａｕｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３４：１４６７−１４８２（２０１４））が挙げられる。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、本発明の様式は、脳癌を処置するために使用される。脳癌の代表例としては、ＤＩＰＧ、毛細血管芽腫、髄膜腫および脳転移（ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ）、神経膠腫、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）および神経芽腫、髄芽腫および上衣腫が挙げられる。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、本発明の様式は、血液癌を処置するために使用される。血液癌の代表例としては、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫および大顆粒リンパ球性（ＬＧＬ）白血病が挙げられる。
【０１５６】
本発明の様式を用いて処置可能であり得る神経膠腫の代表例としては、神経膠芽腫、未分化星状細胞腫および退形成乏突起膠腫を含む再発性高悪性度神経膠腫ならびにＤＩＰＧなどの高悪性度小児性神経膠腫が挙げられる。
【０１５７】
本発明の様式で処置可能であり得る神経膠芽腫の代表例としてはグレードＩＩ（低悪性度星状細胞腫）、グレードＩＩＩ（未分化星状細胞腫）およびグレードＩＶ（神経膠芽腫）神経膠芽腫および多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）が挙げられる。
【０１５８】
本発明の様式による脳癌の処置は、いくつかの実施形態において、ＧＤ２、ＩＬ１３Ｒα２、ＨＥＲ２、ＰＤＧＦＲα、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＳＰＧ４、ＥｐｈＡ２およびＣＤ１３３から選択される２またはそれより多くの脳腫瘍関連抗原の同時標的化を含む。いくつかの実施形態において、脳癌の処置は、ＩＬ１３Ｒα２、ＥＧＦＲｖＩＩＩおよびＨＥＲ２の同時標的化を含み得る。いくつかの他の実施形態において、脳癌の処置は、ＧＤ２、ＰＤＧＦＲαおよびＣＤ１３３の同時標的化を含み得る。いくつかの他の実施形態において、脳癌の処置は、ＥｐｈＡ２およびＣＳＰＧ４の同時標的化を含み得る。いくつかの実施形態において、複数の標的化は、順次様式で実施される。
【０１５９】
本発明の様式による血液癌の処置は、いくつかの実施形態において、ＣＤ３８、ＣＳ１、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１３８、ＣＤ４０、ＣＤ５６、ＣＤ７０およびＣＤ７４から選択される２またはそれより多くの血液腫瘍関連抗原の同時標的化を含み得る。いくつかの実施形態において、血液癌の処置は、ＣＤ３８、ＣＳ１およびＢＣＭＡの同時標的化を含み得る。いくつかの他の実施形態において、血液癌の処置は、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ２２の同時標的化を含み得る。いくつかの他の実施形態において、血液癌の処置は、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４およびＣＤ１３８の同時標的化を含み得る。いくつかの実施形態において、複数の標的化は、順次様式で実施される。
【０１６０】
調合物は、特定の癌の処置に有効である数で、ＢＡＴ−ＣＡＲ  Ｔ細胞を含有する。したがって、ＢＡＴ−ＣＡＲ  Ｔ細胞の治療的に有効な集団が被験体に投与される。被験体に投与されるＢＡＴ−ＣＡＲ  Ｔ細胞の数は、癌の位置、種類および重度、処置されるべき個体の年齢および症状などに応じて、幅広い限界の間を変動するであろう。医師が、使用されるべき適切な投薬量を最終的に決定するであろう。一般に、約１×１０４〜約１×１０１０のＢＡＴ−ＣＡＲ  Ｔ細胞を含有する調合物が投与される。いくつかの実施形態において、調合物は、約１×１０５〜約１×１０９のＢＡＴ−ＣＡＲ  Ｔ細胞、約５×１０５〜約５×１０８のＢＡＴ−ＣＡＲ  Ｔ細胞または約１×１０６〜約１×１０７のＢＡＴ−ＣＡＲ  Ｔ細胞を含有する。
【０１６１】
ＢＡＴ−ＣＡＲ  Ｔ細胞の調合物は、許容され得る医療行為にしたがって、それを必要とする被験体に投与され得る。例示的な投与の様式は、静脈内注射である。他の様式としては、腫瘍内、皮内、皮下（ｓ．ｃ．、ｓ．ｑ．、ｓｕｂ−Ｑ、Ｈｙｐｏ）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、動脈内、髄内、心臓内、関節内（関節）、滑膜内（滑液領域）、頭蓋内（対流強化輸送を含む）、脊髄内および髄腔内（脊髄液）が挙げられる。このような投与の様式に影響を与えるために、調合物の非経口注射または注入にとって有用な任意の公知の装置を使用することができる。このような調合物は、中性緩衝化生理食塩水、ホスフェート緩衝化生理食塩水などの緩衝剤；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および防腐剤を含み得る。
【０１６２】
二機能性化合物およびＢＡＴ−ＣＡＲ  Ｔ細胞は被験体に併用投与され、併用投与は、本発明において、同じ処置レジメンの間での投与を含む。化合物が標的細胞を結合し、ＢＡＴ−ＣＡＲ細胞が遮蔽されていないプロ抗原またはタグを結合するように、化合物は、ＢＡＴ−ＣＡＲ  Ｔ細胞の投与前に、投与と同時的に（例えば、同時の）または投与後に、被験体に投与され得る。いくつかの実施形態において、二機能性化合物は、遮蔽で保護され、ＢＡＴ−ＣＡＲ細胞は、抗原が遮蔽されていないようになった場合にのみ化合物に結合する。
【０１６３】
二機能性化合物を含有する調合物は、特定の癌を処置するのに有効である量で、被験体に投与され得る。化合物は、当業者に公知の技術を用いて被験体に投与するために調合され得る。化合物の調合物は、標的化部分、プロ抗原の性質および投与の様式などの要因に基づいて選択され得る薬学的に許容され得る担体を含み得る。一般的に使用される担体の代表例としては、生理食塩水、緩衝化された生理食塩水、デキストロース、注射用水、グリセロール、エタノールおよびこれらの組み合わせ、安定化剤、可溶化剤および界面活性剤、緩衝剤および防腐剤、等張化剤、増量剤および潤滑剤が挙げられる。
【０１６４】
一般に、被験体に投与される二機能性化合物の治療的有効量は、癌の位置、源、同一性、程度および重度、処置されるべき個体の年齢および症状などに応じて、幅広い限界の間を変動するであろう。医師が、使用されるべき適切な投薬量を最終的に決定するであろう。典型的には、調合物は、投与の経路、症候などを考慮に入れて、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の化合物、いくつかの実施形態では、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の化合物を含有し得る。一般的には、癌などの疾患または障害を処置するために被験体に投与される本願の化合物の投薬量は、０．０１〜５００ｍｇ／ｋｇ被験体の体重の範囲、例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ被験体の体重の範囲である。例えば、被験体に投与される化合物の投薬量は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ被験体の体重の範囲であり得、より好ましくは、０．１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇ患者の体重の範囲であり得る。別の例では、患者中の癌を予防し、処置し、および／または管理するために被験体に投与される本発明の化合物の投薬量は、５００ｍｇ／ｋｇ被験体の体重もしくはそれ未満、好ましくは、２５０ｍｇ／ｋｇ被験体の体重もしくはそれ未満、１００ｍｇ／ｋｇ被験体の体重もしくはそれ未満、９５ｍｇ／ｋｇ被験体の体重もしくはそれ未満、９０ｍｇ／ｋｇ被験体の体重もしくはそれ未満、８５ｍｇ／ｋｇ被験体の体重もしくはそれ未満、８０ｍｇ／ｋｇ被験体の体重もしくはそれ未満、７５ｍｇ／ｋｇ被験体の体重もしくはそれ未満、７０ｍｇ／ｋｇ被験体の体重もしくはそれ未満、６５ｍｇ／ｋｇ被験体の体重もしくはそれ未満、６０ｍｇ／ｋｇ被験体の体重もしくはそれ未満、５５ｍｇ／ｋｇ被験体の体重もしくはそれ未満、５０ｍｇ／ｋｇ被験体の体重もしくはそれ未満、４５ｍｇ／ｋｇ被験体の体重もしくはそれ未満、４０ｍｇ／ｋｇ被験体の体重もしくはそれ未満、３５ｍｇ／ｋｇ被験体の体重もしくはそれ未満、３０ｍｇ／ｋｇ被験体の体重もしくはそれ未満、２５ｍｇ／ｋｇ被験体の体重もしくはそれ未満、２０ｍｇ／ｋｇ被験体の体重もしくはそれ未満、１５ｍｇ／ｋｇ被験体の体重もしくはそれ未満、１０ｍｇ／ｋｇ被験体の体重もしくはそれ未満、５ｍｇ／ｋｇ被験体の体重もしくはそれ未満、２．５ｍｇ／ｋｇ被験体の体重もしくはそれ未満、２ｍｇ／ｋｇ被験体の体重もしくはそれ未満、１．５ｍｇ／ｋｇ被験体の体重もしくはそれ未満または１ｍｇ／ｋｇ被験者の体重もしくはそれ未満である。
【０１６５】
二機能性化合物は、許容され得る医療行為にしたがって、それを必要とする被験体に投与され得る。例示的な投与の様式は、静脈内注射である。他の様式としては、腫瘍内、皮内、皮下（ｓ．ｃ．、ｓ．ｑ．、ｓｕｂ−Ｑ、Ｈｙｐｏ）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、動脈内、髄内、心臓内、関節内（関節）、滑膜内（滑液領域）、頭蓋内、脊髄内および髄腔内（脊髄液）が挙げられる。二機能性化合物の投与を実施するために、調合物の非経口注射または注入にとって有用な任意の公知の装置を使用することができる。
【０１６６】
二機能性化合物がＲＯＳ／ＲＮＳによって除去可能である保護基を含有するプロ抗原を含有する実施形態において、プロ抗原の活性化は、癌処置のいくつかの実施形態において、単純に腫瘍微小環境中のＲＯＳ／ＲＮＳの上昇したレベルのために達成され得る。しかしながら、全ての腫瘍が、ＲＯＳ／ＲＮＳの上昇した量を自然に産生するわけではない。したがって、本発明のいくつかの実施形態において、これらの方法は、ＲＯＳ／ＲＮＳレベルを上昇させてプロ抗原を活性化しまたは遮蔽を除去するために、腫瘍部位におけるまたは腫瘍部位の近傍における、１またはそれより多くの因子の局在的な投与をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、腫瘍の微小環境中のＲＯＳ／ＲＮＳの量は、放射線によって有利に増加させ得る。放射線は、体外光線の形態でまたは密封小線源治療もしくは放射性核種の投与を介して投与され得る。腫瘍微小環境に送達されたときにＲＯＳ／ＲＮＳのレベルを増加させることができる放射性核種の代表例としては、ガリウム−６８、ルテチウム−１７７、炭素−１１、インジウム−１１１およびイットリウム−９０が挙げられる。他の実施形態において、ＲＯＳ／ＲＮＳのレベルは、ランタニドナノ粒子の投与によって増加させ得る。このようなナノ粒子の使用は、増加されたＲＯＳ／ＲＮＳレベルを生成するために必要とされる放射線の量を低下させる点で有利であり得る。いくつかの実施形態において、ランタニドナノ粒子は、ある種の脳細胞、例えば、小膠細胞によって優先的に取り込まれ得、これらの細胞中で増加されたＲＯＳ／ＲＮＳをもたらし、このため、これらの細胞をＢＡＴ−ＣＡＲ−Ｔ細胞に対する優先的な標的とする。
【０１６７】
放射線に代えてまたは放射線と一緒に、本方法は、ＲＯＳ／ＲＮＳ生成剤の投与を含み得る。このような生成剤は、本分野で公知である。例えば、米国特許出願公開第２０１４／０２２８２９０号および同第２００６／０２３５０８０号を参照。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、ＲＯＳ／ＲＮＳ生成剤は、ＣＤ４４の阻害剤である。このタンパク質は、そのスプライスバリアントとともに、腫瘍および腫瘍開始細胞上でしばしば過剰発現されることが見出されている。ＣＤ４４またはＣＤ４４バリアントを発現するまたは過剰発現する腫瘍の代表例としては、胆管細胞癌腫、胃癌、神経膠芽腫、肺腺癌、幹および幹様癌細胞、乳癌、膵管腺癌および神経内分泌腫瘍が挙げられる。ＣＤ４４は、システイン／グルタミン交換輸送体として機能し、グルタミンを細胞の外に汲み出し、システインを細胞内に汲み入れて、グルタチオンの細胞内産生をもたらし、腫瘍細胞が上昇したＲＯＳ／ＲＮＳを処置することを補助する。腫瘍細胞とは対照的に、正常な細胞中の抗酸化剤の内在レベルはＲＯＳ／ＲＮＳの正常なレベルを取り扱うことが可能であるという事実のために、正常な細胞は余分のグルタチオンを必要としない。
【０１６９】
ＢＡＴ−ＣＡＲ−Ｔ細胞の集団を含有する調合物、化合物の調合物および必要に応じてＲＯＳ／ＲＮＳ生成剤の投与頻度は、処置されている疾患、ＢＡＴ−ＣＡＲ−Ｔ細胞および化合物の構造ならびに投与の様式を含み得る要因に応じて変動するであろう。各調合物は、１日に４、３、２または１回、２日ごとに、３日ごとに、４日ごとに、５日ごとに、６日ごとに、１週間に１回、８日ごとに、９日ごとに、１０日ごとに、２週間ごとに、毎月および２ヶ月ごとに、独立に投与され得る。処置の期間も変動し、例えば、処置されている疾患を基礎とし、担当医によって最良に決定される。しかしながら、処置の継続は、何日間、何週間または何ヶ月間も続くことが想定される。
【０１７０】
本願の方法は、単一の、１回投薬で、または複数回投薬（例えば、２、３、４、５、６、７、８、１０、１５、２０またはそれより多くの投薬）での、化合物、ＢＡＴ−ＣＡＲ−Ｔ細胞および必要に応じてＲＯＳ／ＲＮＳ生成剤の被験体への独立した投与または併用投与を含み得る。したがって、併用投与の頻度は、１回から最大８週ごとに約１回の範囲であり得る。別の例では、投与の頻度は、１週に約１回から最大６週ごとに約１回の範囲である。いくつかの実施形態では、投与の頻度は、３週ごとに約１回から最大４週ごとに約１回の範囲である。他の実施形態において、ＢＡＴ−ＣＡＲ−Ｔ細胞は、単一の、１回投薬で投与され得るが、二機能性化合物および必要に応じてＲＯＳ−ＲＮＳ生成剤の投与の頻度は、単回投薬から１日に１回、週に１回、最大４〜６週ごとに約１回の範囲であり得る。したがって、他の実施形態において、ＢＡＴ−ＣＡＲ−Ｔ細胞は、１回より多く、すなわち、複数回投薬（例えば、２、３、４、５、６、７、８、１０、１５、２０またはそれより多い投薬）で投与される。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、これらの方法は、それぞれ、治療的有効量の二機能性化合物と薬学的に許容され得る担体とを含む複数の薬学的組成物の同時投与を含み、各組成物において、標的化部分は異なる腫瘍関連抗原に結合する。いくつかの他の実施形態において、同時投与は、二機能性化合物の複数の（２またはそれより多く）部分集団を含有する単一の薬学的組成物の使用を含み、各部分集団において、合成抗原は同一であり得るが、各標的化部分は腫瘍細胞上に存在する異なる腫瘍関連抗原を結合する。したがって、薬学的組成物は、第一の腫瘍関連抗原を特異的に結合する第一の標的化部分を有する二機能性化合物の第一の部分集団と、第二の腫瘍関連抗原を特異的に結合する第二の標的化部分をそれぞれが有する二機能性化合物の第二の部分集団とを含有し得、前記第一および第二の標的化部分は異なる腫瘍関連抗原を結合する。他の実施形態において、二機能性化合物の複数の部分集団は、二機能性化合物の第三の、第四の、第五のなどの部分集団を含有し、これらのそれぞれは、腫瘍細胞上に存在する異なる腫瘍関連抗原を結合する。
【０１７２】
いくつかの実施形態は、組成物のいずれかの種類の順次投与を含み、少なくとも１つのこのような順次投与において、組成物または二機能性化合物の部分集団の少なくとも１つは、従前の投与のエピトープと比べて同じ腫瘍関連抗原上の異なるエピトープを結合する標的化部分を置換するように修飾されている。したがって、本発明の実施形態は、「単一の」組成物の第一の投与と、任意の１またはそれより多くの部分集団の標的化部分が同じ腫瘍関連抗原の異なるエピトープに結合する点で第一の投与と異なる第二の投与とを含み得る。このさらなる特徴は、抗原喪失／逃避を緩和し得、または毒性を軽減し得る。
【０１７３】
併用療法
ある実施形態において、癌を処置する本発明の方法は、被験体が別の抗癌剤でも処置される併用療法の一部であり得る。「抗癌」剤は、例えば、癌細胞を死滅させ、癌細胞中にアポトーシスを誘導し、癌細胞の増殖速度を低下させ、転移の発生率もしくは数を低下させ、腫瘍サイズを低下させ、腫瘍増殖を阻害し、腫瘍もしくは癌細胞への血液供給を低下させ、癌細胞もしくは腫瘍に対する免疫応答を促進し、癌の進行を抑制もしくは阻害し、または癌を有する被験体の寿命を増加させることによって、被験体中の癌に悪影響を与えることができる。より一般的には、これらの他の組成物は、細胞を死滅させまたは細胞の増殖を阻害するのに有効な合わせた量で与えられるであろう。この過程は、癌細胞を、発現構築物および薬剤または複数の因子と同時に接触させることを含み得る。これは、両薬剤を含む単一の組成物もしくは薬理学的調合物と細胞を接触させることによって、または一方の組成物が発現構築物を含み、他方が第二の薬剤を含む２つの異なる組成物もしくは調合物と細胞を同時に接触させることによって達成され得る。
【０１７４】
化学療法および放射線療法剤に対する腫瘍細胞耐性は、臨床腫瘍学における主要な問題である。現在の癌研究の１つの最終目標は、化学療法および放射線療法を他の療法組み合わせることによって、化学療法および放射線療法の有効性を改善するための方法を見出すことである。本発明において、細胞療法は、化学療法、放射線療法または免疫療法の介入およびアポトーシス促進剤または細胞周期制御剤と併用して同様に使用することができることが想定される。
【０１７５】
または、本発明の療法は、分から週までの範囲の間隔で、他の薬剤処置に先行し得、または後続し得る。他の薬剤および本発明が個体へ別々に適用される実施形態では、薬剤と本発明の療法が細胞に対して有利に併用効果をなお発揮することができるように、一般に、各送達の時点間で著しい期間が過ぎないようにする。このような事例では、互いに約１２〜２４時間以内に、より好ましくは、互いに約６〜１２時間以内に、細胞を両様式と接触させ得ることが想定される。いくつかの状況では、処置のための期間を著しく延長することが望ましいことがあり得るが、各投与の間に数日（２、３、４、５、６または７）〜数週（１、２、３、４、５、６、７または８）が経過する。
【０１７６】
処置サイクルが必要に応じて反復されることが予想される。様々な標準的治療および外科的介入が本発明の細胞療法と組み合わせて適用され得ることも想定される。
【０１７７】
化学療法
癌療法は、化学および放射線の両方を基礎とする処置との様々な併用療法も含む。併用化学療法としては、例えば、アブラキサン、アルトレタミン、ドセタキセル、ハーセプチン、メトトレキサート、ノバントロン、ゾラデックス、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合剤、タキソール、ゲムシタビエン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｅｎ）、ナベルビン、ファルネシルタンパク質転移酵素阻害剤、トランスプラチナム（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキサートまたは前述の任意の類縁体または誘導体バリアントおよびこれらの組み合わせも挙げられる。
【０１７８】
特定の実施形態において、個体に対する化学療法は、例えば、本発明の投与前、投与中および／または投与後に、本発明とともに利用される。
【０１７９】
放射線療法
ＤＮＡ損傷を引き起こし、広く使用されてきた他の因子としては、ガンマ線、Ｘ線および／または腫瘍細胞への放射性同位体の誘導された送達として一般的に知られるものが挙げられる。マイクロ波およびＵＶ照射などのＤＮＡ損傷因子の他の形態も想定される。これらの因子の全ては、ＤＮＡに対して、ＤＮＡの前駆体に対して、ＤＮＡの複製および修復に対して、ならびに染色体の組み立ておよび維持に対して幅広い損傷をもたらす可能性が最も高い。Ｘ線に対する投薬量範囲は、長期間（３〜４週）の５０〜２００レントゲンの１日線量から２０００〜６０００レントゲンの単回線量の範囲である。放射性同位体に対する投薬量範囲は広く変動し、同位体の半減期、放出される放射線の強さおよび種類ならびに新生物細胞による取り込みに依存する。
【０１８０】
免疫療法
免疫療法は、一般に、癌細胞を標的とし、破壊するために、免疫エフェクター細胞および分子の使用に依存する。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上のあるマーカーに対して特異的な抗体であり得る。抗体単独で、治療のエフェクターとしての役割を果たし得、または実際に細胞死滅をもたらす他の細胞を補充し得る。抗体は、薬物または毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）にも接合され得、単に標的化剤として役割を果たし得る。または、エフェクターは、直接的にまたは間接的に、腫瘍細胞標的と相互作用する表面分子を保有するリンパ球であり得る。様々なエフェクター細胞としては、細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞が挙げられる。
【０１８１】
本明細書に記載されている本発明の治療以外の免疫療法は、本発明の細胞療法と組み合わされて、併用療法の一部として使用され得る。モノクローナル抗体などによって標的化され得る一般的な腫瘍マーカーとしては、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、癌胎児抗原、前立腺特異抗原、尿腫瘍関連抗原、胎児抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、エストロゲン受容体、ラミニン受容体、ｅｒｂ  Ｂおよびｐ１５５が挙げられる。
【０１８２】
遺伝子
さらに別の実施形態において、二次処置は、本発明の臨床実施形態の前、後または同時に治療用ポリヌクレオチドが投与される遺伝子治療である。細胞増殖の誘導物質、細胞増殖の阻害剤またはプログラムされた細胞死の制御物質を含む様々な発現産物が本発明に包含される。
【０１８３】
手術
癌を有する者のおよそ６０％がある種類の手術を受け、予防的、診断的またはステージ決定の、治療的および対症療法的手術が含まれる。治療的手術は、他の治療、例えば、本発明の処置、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子治療、免疫療法および／または代替的療法と組み合わせ使用され得る癌処置である。
【０１８４】
治療的手術は、癌組織の全部または一部が物理的に除去され、切除され、および／または破壊される摘出を含む。腫瘍摘出は、腫瘍の少なくとも一部の物理的除去を表す。腫瘍摘出に加えて、手術による処置には、レーザー手術、凍結手術、電気手術および顕微鏡的に調節された手術（モース術）が含まれる。本発明は、表在性癌、前癌または正常な組織の偶発的な量の除去と組み合わせて使用され得ることがさらに想定される。
【０１８５】
癌細胞、組織または腫瘍の全部の一部（ｐａｒｔ  ｏｆ  ａｌｌ）の切除に際して、空洞が体内中に形成され得る。処置は、さらなる抗癌治療による当該領域の灌流、直接注射または局所的適用によって達成され得る。このような処置は、例えば、１、２、３、４、５、６もしくは７日ごとに、または１、２、３、４および５週ごとに、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２ヶ月ごとに反復され得る。これらの処置も、様々な投薬量であり得る。
【０１８６】
他の薬剤
処置の治療的有効性を改善するために、他の薬剤が本発明とともに併用され得ることが想定される。これらのさらなる薬剤には、免疫調節剤、細胞表面受容体およびＧＡＰジャンクションの上方制御に影響を与える薬剤、細胞分裂停止および分化剤、細胞接着の阻害剤またはアポトーシス誘導物質への過剰増殖性細胞の感度を増加させる薬剤が挙げられる。免疫調節剤としては、腫瘍壊死因子、インターフェロンα、βおよびγ；ＩＬ−２およびその他のサイトカイン；Ｆ４２Ｋおよびその他のサイトカイン類縁体；またはＭＩＰ−１、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳおよびその他のケモカインが含まれる。細胞表面受容体またはＦａｓ／Ｆａｓリガンド、ＤＲ４またはＤＲ５／ＴＲＡＩＬなどの細胞表面受容体のリガンドの上方制御は、過剰増殖性細胞に対する自己分泌または傍分泌効果の確立によって、本発明のアポトーシス誘導能を強化するであろうことがさらに想定される。ＧＡＰジャンクションの数を上昇させることによる細胞間シグナル伝達の増加は、隣接する過剰増殖性細胞集団に対する抗過剰増殖性効果を増加させるであろう。他の実施形態において、細胞分裂停止または分化剤は、処置の抗過剰増殖性効力を改善させるために、本発明とともに併用することができる。細胞接着の阻害剤は、本発明の効力を改善させることが想定される。細胞接着阻害剤の例は、接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤およびロバスタチンである。抗体ｃ２２５などの、アポトーシスに対する過剰増殖性細胞の感度を増加させる他の薬剤は、処置の有効性を改善させるために、本発明とともに併用され得ることがさらに想定される。
【０１８７】
いくつかの実施形態において、本発明が、脳癌、例えば、ＤＩＰＧまたはＧＢＭを処置するために使用される場合、１またはそれより多くのさらなる活性因子は全体の治療の一部として含まれ得る。例えば、ＤＩＰＧの場合には、治療は、放射線療法も含み得る。ＧＢＭの場合には、治療は、テモゾロミドを用いた化学療法も含み得る。脳癌の処置において使用することが知られ、本発明と協力して使用され得るさらなる薬剤の代表例としては、カルムスチン、ＢｉＣＮＵ、プロカルバジン、マツレン（Ｍａｔｕｌａｎｅ）、ラパチニブジトイシレート（ｌａｐａｔｉｎｉｂ  ｄｉｔｏｙｓｙｌａｔｅ）、テラメプロコール、インドキシモド、メルファラン、カルボプラチン、エトポシドホスフェート、ミベフラジル二塩酸塩、ＯＫＮ−００７、ＡＱ４Ｎおよびネルフィナビルメシレートが挙げられる。
【０１８８】
本発明のある特定の実施形態を例示することが意図され、特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定することは意図されていない以下の実施例を検討すると、本発明のこれらおよびその他の態様がさらに理解されるであろう。
【実施例】
【０１８９】
実施例１：異なる小分子を用いたＣＡＲ  Ｔ細胞の滴定可能な活性化
【０１９０】
健康なドナーの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を採集して、他の文献に記載されているとおりに（Ｎｅｗｒｚｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．（２００９））、フルオレセイン分子（４Ｍ５．３  ｓｃＦｖ−ＣＤ８αヒンジ−ＣＤ２８膜貫通−ＣＤ２８細胞内ドメイン−４１ＢＢ細胞内ドメイン−ＣＤ３ｚ細胞内ドメイン）または４−［（６−メチルピラジン−２−イル）オキシ］安息香酸分子（αＭＰＯＢ  ｓｃＦｖ−ＣＤ８αヒンジ−ＣＤ２８膜貫通−ＣＤ２８細胞内ドメイン−４１ＢＢ細胞内ドメイン−ＣＤ３ｚ細胞内ドメイン）のいずれかに対する第三世代ＣＡＲを発現するレトロウイルスで形質導入した。レポーター遺伝子を同時発現した陽性に形質導入された細胞を、ＦＡＣＳ（ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）ＩＩ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（ＵＳＡ））で精製し、ＣＴＶ標識されたＢＴ１４５  ＧＢＭ腫瘍細胞またはＥＬ４リンパ腫細胞（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とともに、３７℃、５％ＣＯ２で、４時間、共インキュベートし、光から保護した。フルオレセイン（ＦＩＴＣ）またはＭＰＯＢのいずれかで標識された、抗ＧＤ２または抗マウスＨ−２Ｋｂ抗体で、これらの腫瘍細胞を被覆した。ＣＡＲ  Ｔ（エフェクター細胞、Ｅ）および腫瘍細胞（標的細胞、Ｔ）が、２つ組または３つ組で、０．５：１〜２０：１のＥ：Ｔ比でインキュベートされたときに、アッセイが開始した。共インキュベーション後、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ（商標）７８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標），Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＵＳＡ）で、全ての細胞を染色し、無菌のＰＢＳ／５％  ＦＢＳ中のＦｉｘａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（登録商標），Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（ＵＳＡ））の１：１希釈物で固定した。以下の式にしたがって、死んだ標的細胞の百分率を計数した：死滅効率＝［（％死亡細胞）試料−（％死亡細胞）対照］／［１００−（％死亡細胞）対照］×１００。対照については、適切な標的化抗体で染色されたが、ＣＡＲ  Ｔ細胞なしの細胞を使用した。
【０１９１】
結果は、等しい効率および特異性でその腫瘍標的を死滅させるために、ヒトＴ細胞を異なるＣＡＲ構築物で改変操作できることを明らかに示した。これらの結果は、異なる小分子に対する特異性を有して、ＣＡＲ  Ｔ細胞を設計することができることも実証した（図２Ａ〜図２Ｂ）。
【０１９２】
実施例２：特異的なＣＡＲ  Ｔ細胞に対する標的の特定および検証
【０１９３】
実施例１に記載されているように、その死滅特性に関してＣＡＲ  Ｔ細胞をアッセイした。この事例では、異なる腫瘍の種類：Ａ６７３（ユーイング肉腫細胞）、ＨＣＣ１９５４（乳癌細胞）、ＢＴ１４５およびＢＴ２８６（ＧＢＭ細胞）、ＢＴ８６９およびＤＩＰＧ１３（ＤＩＰＧ細胞）ならびにＨ９２９（ＭＭ細胞）に由来する細胞とともに、ＣＡＲを共インキュベートした。標的とされる表面抗原は、ＨＬＡ、ＣＤ９９、ＨＥＲ２、ＧＤ２、ＣＤ１３３、ＩＬ１３Ｒα２、ＣＳ−１およびＣＤ３８であった。データは、第三世代抗フルオレセインＣＡＲ  Ｔ細胞で改変操作されたヒトＴ細胞（実施例１参照）は、癌の種類および標的とされる標的抗原とは無関係に、フルオレセイン被覆された腫瘍標的を効率的に死滅させることを実証した（図２Ｃ〜図２Ｅ）。
【０１９４】
実施例３：小分子を用いたＣＡＲ  Ｔ細胞の滴定可能な活性化
【０１９５】
実施例１に記載されているとおりに、共インキュベーション死滅アッセイのためにＣＡＲ  Ｔ細胞を調製した。抗フルオレセイン第三世代ＣＡＲ  Ｔならびに漸増濃度の、ＧＤ２、ＣＤ１３３、ＩＬ１３Ｒα２およびＣＤ３８に対するフルオレセイン標識された抗体とともに、ＤＩＰＧ、ＧＢＭまたはＭＭ細胞を共インキュベートした。結果は、本発明の感度および柔軟性を、被覆された抗原の量の関数として実証した。ＣＡＲ  Ｔ細胞は、２〜４桁にわたって定常の（ｐｌａｔｅａｕ）死滅効率および４桁にわたって滴定可能な応答を示した。これは、本発明が可変の抗体濃度で動作することができ、治療応答を最適化して毒性に対する有効性を調節するためにその活性を調節できることを示した（図２Ｆ〜図２Ｇ）。
【０１９６】
実施例４：小分子を用いた異なる世代のＣＡＲ  Ｔ細胞の滴定可能な活性化
【０１９７】
実施例１に記載されているとおりに、共インキュベーション死滅アッセイのためにＣＡＲ  Ｔ細胞を調製した。ＦＩＴＣに接合された増加する濃度の抗ヒトＨＬＡ抗体で被覆されたＧＢＭ細胞を、２つの異なる第二世代ＣＡＲ  Ｔ細胞（４Ｍ５．３  ｓｃＦｖ−ＣＤ８αヒンジ−ＣＤ２８膜貫通−ＣＤ２８細胞内ドメイン−ＣＤ３ｚ細胞内ドメインおよび４Ｍ５．３  ｓｃＦｖ−ＣＤ８αヒンジ−ＣＤ２８膜貫通−４１ＢＢ細胞内ドメイン−ＣＤ３ｚ細胞内ドメイン）とともに共インキュベートした。結果は、ＣＡＲ世代とは無関係に、ＣＡＲ  Ｔ細胞応答を与えることが可能であることを実証した（図２Ｈ）。
【０１９８】
実施例１に記載されているとおりに、共インキュベーション死滅アッセイのためにＣＡＲ  Ｔ細胞を調製した。抗フルオレセイン第三世代ＣＡＲ  Ｔ細胞を、２０：１の比で、同じ腫瘍抗原を共有しなかったＧＢＭまたはＭＭ腫瘍由来細胞とともに共インキュベートした。データは、フルオレセイン標識された腫瘍標的化部分を単に交換することによって、同じＣＡＲ  Ｔ細胞を異なる腫瘍抗原に対して標的化し直すことの容易さを実証する：ＭＭ標的化抗体のみが存在する場合（抗ＣＤ３８または抗体ＣＳ−１のいずれか）、ＭＭ細胞のみが死滅した（図２Ｉ）。同様に、ＧＢＭ標的化部分のみが存在する場合（抗ＧＤ２または抗ＩＬ１３Ｒα２のいずれか）、脳細胞のみが標的とされる。各株に対して特異的な少なくとも１つの抗体が存在する場合にのみ、細胞の最大の死滅が得られる。このデータと合致して、腫瘍特異的抗体を遍在性ＨＬＡ分子に対する抗体で置換すると、全ての細胞が標的とされ、死滅した。その結果、本発明を用いて、高度に不均一な腫瘍を標的とすることができる（図２Ｉ）。
【０１９９】
実施例５：ＦＬ特異的なＣＡＲ  Ｔ細胞に対する標的の特定および検証
【０２００】
腫瘍細胞株（ＧＢＭ：Ａ１７２；ＭＭ：ＡＲＰ１、Ｈ９２９、Ｕ２６６、Ｕ２６６ＭＳ、ＪＪＮ３、ＸＧ１、ＫＭＳ１２、Ｈ９２９−ｌｕｃ）および患者由来培養物（ＧＢＭ：ＢＴ１４５およびＢＴ３３３；ＤＩＰＧ：ＢＴ８６９）を、一群の関心対象の標的に対して特性決定し、フローサイトメトリーを介して染色強度を測定した。標的細胞株のおよそ１０万細胞を、Ｕ底９６ウェルプレートのウェル中に一定の分割量で加え、１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液（滅菌ろ過されたＰＢＳ、５％  ＦＢＳ）中の１μｇの腫瘍標的化抗体の溶液中に再懸濁した。４℃で２０分間、暗所にて、細胞を抗体とともにインキュベートした。インキュベーション後、ＦＡＣＳ緩衝液で細胞を洗浄し、無菌ＰＢＳ、５％  ＦＢＳ中のＦｉｘａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（登録商標）、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（ＵＳＡ））の１：１希釈物で固定した。各抗体／発蛍光団の組み合わせを、その対応するアイソタイプ対照とともに分析した。各腫瘍マーカーに対して、式ｌｏｇ２（（ＭＦＩ）試料−（ＭＦＩ）アイソタイプ）にしたがって計算されたスコアを帰属させた。スコアを少数第一位に近似し、ＧｒａｐｈＰａｄ（登録商標）ソフトウェアによって、色コードを帰属させた。
【０２０１】
結果は、細胞株および患者由来培養物、特に脳腫瘍の間での腫瘍抗原の大きな可変性を実証した。「古典的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）」腫瘍は非遍在性であったのみならず、その発現レベルは変動した。本発明は、患者内および患者間変動性を有する抗原に効率的に適合することができる次世代ＣＡＲ  Ｔ細胞プラットフォームを手段する解決策を与え得る。
【０２０２】
実施例６：遮蔽されていない小分子のみに対するＣＡＲ  Ｔ細胞の滴定可能な活性化
【０２０３】
実施例１に記載されているとおりに、およそ４時間、２０：１のエフェクター対標的比で、ヒトα−フルオレセインＣＡＲ  Ｔ細胞を、抗ＣＤ９９で被覆されたヒトＣＤ９９＋ユーイング肉腫細胞株（Ａ６７３）または陰性対照抗体とともに共培養した。市販のαＣＤ９９−ＦＩＴＣで、その対応するアイソタイプで、またはそのままの（かごに入ったＦＬ）もしくは３６５ｎｍのＵＶ光での前処置後に前処置された（かごに入っていないＦＬ）かごに入ったフルオレセインに結合されたαＣＤ９９抗体でＡ６７３腫瘍細胞を被覆した。遮蔽されていない抗ＣＤ９９フルオレセインを介して標的化されたときに、Ａ６７３腫瘍細胞が特異的に死滅したが、抗ＣＤ９９抗体上のかごがそのままであれば特異的に死滅しなかった。かごに入った抗ＣＤ９９フルオレセインで標的化されたＡ６７３細胞と陰性対照抗体（ＩｇＧアイソタイプ対照ＦＩＴＣ）で標的化されたＡ６７３細胞との間には、統計的に有意な差は観察されなかった。Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ片側分散分析に加えて、予め選択された対比較を用いて、統計的有意性を計算した（＊ｐ＜０．０５）。この実験は、４つの反復測定で行った。
【０２０４】
結果は、遮蔽されていないフルオレセイン誘導体へのヒト第三世代抗フルオレセインＣＡＲ−Ｔ細胞の特異的なインビトロ細胞毒性とともに、図４Ｂに示されている。結果は、ＣＡＲ−Ｔ細胞が遮蔽されていないフルオレセインを特異的に死滅させたが、保護されたフルオレセイン誘導体によって結合された標的を死滅させなかったことを示す。
【０２０５】
全ての特許刊行物および非特許刊行物は、当業者の技術水準を示す。全てのこれらの刊行物（参照されている任意の特定のその一部を含む）は、それぞれの個別の刊行物が参照によって組み込まれるものとして具体的にかつ個別的に示されているのと同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２０６】
本明細書において、具体的な実施形態を参照しながら本発明を記載してきたが、これらの実施形態は本発明の原理および用途の単なる例示であることが理解されるべきである。したがって、例示的な実施形態に対して、多数の改変を施し得ること、ならびに添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、他の構成も考案されることが理解されるべきである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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