(57)【要約】  本明細書では、真核細胞内に存在するハプテンに対する第１結合特異性および細胞表面標的に対する第２結合特異性を有する組成物について報告をする。この組成物は、大核酸を真核細胞核へ標的指向送達するための、ヒストン、大核酸、ハプテン、および二重特異性結合分子の非共有複合体を含む。ここで、ヒストンおよび／または核酸はハプテンに共有結合し、ヒストンおよび大核酸は互いに（非共有結合で）結合し／非共有結合複合体を形成し、かつハプテンと二重特異性結合分子は、二重特異性結合分子の第１結合特異性によって互いに結合する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞核への大核酸の標的指向送達用の組成物であって、
−１つまたは複数のヒストンポリペプチド、
−大核酸
−ハプテン、および
−ハプテンに特異的に結合する第１結合部位と、真核細胞上に存在する細胞表面標的に特異的に結合する第２結合部位とを有する、二重特異性結合分子
を含み、
ここで
−ヒストンおよび／または核酸がハプテンに結合し、
−ヒストンと大核酸がヌクレオソームを形成し、および
−ハプテンと二重特異性結合分子は、二重特異性結合分子の第１結合部位によって互いに結合している、組成物。
【請求項２】
１つまたは複数のヒストンポリペプチドは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４の混合物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
１つまたは複数のヒストンポリペプチドは、ヒストンＨ２ＡとヒストンＨ３の混合物である、請求項１から２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４】
ヒストンポリペプチドは子牛の胸腺ヒストンポリペプチドである、請求項１から３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
ヒストンポリペプチドは組換えヒトヒストン３．１または３．３である、請求項１から３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
大核酸はプラスミドであり、１，５００〜１０，０００塩基対で構成されている、請求項１から５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
１つのハプテン分子を含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
ハプテンは、ビオチン、ジゴキシゲニン、テオフィリン、ブロモデオキシウリジン、およびフルオレセインから選択される、請求項１から７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
ハプテンはヒストンまたは大核酸に化学的に結合している、請求項１から８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
ハプテンは、大核酸に結合しているＤＮＡ結合ペプチドに結合している、請求項１から８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
二重特異性結合分子は二重特異性抗体である、請求項１から１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
二重特異性結合分子の１つまたは複数の分子を含む、請求項１から１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
大核酸は以下を含む、請求項１から１２のいずれか１項に記載の組成物：
−ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム核酸、および／または
−哺乳動物細胞に内因性のポリペプチド用の発現カセット、および／または
−治療機能を持つ酵素または他のタンパク質／ペプチドをコードするポリペプチド用の発現カセット、および／または
−マイクロＲＮＡ、短干渉ＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ、ＲＮＡデコイ、ＲＮＡアプタマー、およびリボザイムなどの治療機能を備えたノンコーディングＲＮＡ用の転写システム。
【請求項１４】
以下のステップを含む、真核細胞に大核酸を導入する方法：
ａ）二重特異性結合分子の第２結合特異性が請求項１から１３のいずれか一項に記載の組成物と特異的に結合する、細胞表面標的を提示する真核細胞をインキュベートするステップ、
ｂ）大核酸またはその機能的断片を含む細胞を単離し、それによって大核酸を真核細胞に導入するステップ。
【請求項１５】
真核細胞への大核酸の標的指向送達のための、請求項１から１３のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１６】
以下のステップを含む、真核細胞の集団の定義された亜集団を大核酸でトランスフェクトするための方法：
−請求項１から１３のいずれか一項に記載の組成物を有する少なくとも１つの細胞表面抗原が異なる少なくとも２つの亜集団を含む真核細胞の集団をインキュベートするステップであって、ここで、二重特異性結合分子の第２結合特異性は、真核細胞の集団の亜集団にのみ存在する細胞表面抗原に特異的に結合し、それにより、真核細胞の集団の定義された亜集団を大核酸でトランスフェクトする、ステップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸送達の分野に関する。本明細書では、真核細胞内に存在するハプテンに対する第１結合特異性および細胞表面標的に対する第２結合特異性を有する組成物について報告をする。この組成物は、大核酸を真核細胞核へ標的指向送達するための、ヒストン、大核酸、ハプテン、および二重特異性結合分子の非共有複合体を含む。
【背景技術】
【０００２】
背景
遺伝物質は核内で活動している。その輸送は、核膜が有糸分裂の過程で一時的に崩壊するとき細胞分裂中に偶然に起こる可能性があり、また積極的に行わなければならないときに起こるときもある。したがって、遺伝物質が生細胞核内への能動輸送は、それらが発現する期間の前に分裂を行わないあらゆる細胞内に移すために必要である。核酸の核輸送システムは、ほとんどまたはまったく分裂しない細胞へのＤＮＡの効率的な輸送を可能にするのに効果的であるため、非常に重要である。ほとんどの初代細胞はこのグループに属している。初代細胞は、２つの理由から科学的な興味としては最も重要である。その一、生物から新たに単離されたこれらの細胞は、それらに由来する細胞株よりも細胞型の機能状態をはるかによく反映している。その二、それらは遺伝子治療の標的細胞である。さらに、輸送開始から分析までの期間に分裂していない細胞が移入された遺伝物質を発現できるようにすることにより、核輸送システムは、確立された細胞株へのＤＮＡ輸送の効率を高める。
【０００３】
核を包む二層膜には細孔がある。小分子は拡散によってこれらの細孔を通過することができる。核に入ることができるようにするためには、約５０ｋＤａより大きいタンパク質は、輸送機構によって認識されなければならない核局在化シグナル（ＮＬＳ）を必要とする。ＮＬＳは、細胞質から細胞核への積荷（別のペプチドである可能性あり）の移動を仲介するシグナルペプチドである。通常、機能信号は４〜８個のアミノ酸で構成され、正電荷を持つアミノ酸であるアルギニンとリジンが多く、プロリンも含まれる。哺乳類のＮＬＳが酵母でも機能するように、進化においてこれらは頑丈に保存されている。古典ＮＬＳは、例えば、ＳＶ４０大Ｔ抗原コア配列ＰＫＫＫＲＫＶである。異種ＮＬＳは、標的分子を核に輸送するためのツールとしても使用できる。この目的のために、ＮＬＳを比較的ランダムな位置で細胞質タンパク質の配列に組み込むか、ＮＬＳペプチドをタンパク質または金粒子に化学的に結合させることができる（Ｇｏｒｌｉｃｈ、Ｄ．、ＥＭＢＯ  Ｊ．１７（１９９８）２７２１−２７２７でレビュー）。ＮＬＳについての概要は、Ｂｏｕｌｉｋａｓ（Ｂｏｕｌｉｋａｓ，Ｔ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｅｕｋａｒｙｏｔ．Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒ．３（１９９３）１９３−２２７）によって提供されている。
【０００４】
遺伝子の標的指向送達は、遺伝子産物を提供、または患者の遺伝的設定を変更することによって、後天性または遺伝性疾患に対処するための治療的アプローチである。現在では、遺伝子治療のためほとんどの核酸送達アプローチは、ウイルスベクターまたはトランスフェクションのような特性を持つカチオン性脂質およびポリマーのいずれかに基づく。抗体または抗体誘導体（ｓｃＦｖなど）またはその他の細胞または組織結合体は、核酸送達の標的特異性および有効性を改善する目的で、そのようなリポソームまたはウイルス送達体に接続することができる（例として、Ｋｉｍ，Ｋ．Ｓ．，ら．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．１５（２００８）３３１−３４０；Ｚｈａｎｇ，Ｙ．＆Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，Ｗ．Ｍ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２６（２００９）１０５９−１０６３；Ｘｕ，Ｌ．，Ｐｉｒｏｌｌｏ，Ｋ．Ｆ．＆Ｃｈａｎｇ，Ｅ．Ｈ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．７４（２００１）１１５−１２８を参照のこと）。
【０００５】
ウイルス由来の実体を介した遺伝子送達には、送達システムを生成するための複雑な手順が含まれる。これには、人間の免疫系が認識できるウイルス成分が含まれている。免疫原性は潜在的な安全性とＰＫの問題があり、標的遺伝子送達の有効性を妨げる可能性がある（Ｎａｙａｋ，Ｓ．＆Ｈｅｒｚｏｇ，Ｒ．Ｗ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１７（２０１０）２９５−３０４；Ｍｉｎｇｏｚｚｉ，Ｆ．＆Ｈｉｇｈ，Ｋ．Ａ．，Ｂｌｏｏｄ  １２２（２０１２）２３−３６）。
【０００６】
脂質またはポリマーと組み合わされたＤＮＡなどの合成送達複合体は、それほど複雑ではなく、ウイルス成分を含んでいない。しかしながら、それらはしばしばウイルス由来の実体を介した遺伝子送達よりも効果が低い。ナノ粒子および／またはトランスフェクションのような機能を持つ実体の生来の非特異的膜相互作用特性も、潜在的な安全性／ＰＫの問題を引き起こす（Ｂａｒｔｎｅｃｋ，Ｍ．，Ｗａｒｚｅｃｈａ，Ｋ．Ｔ．＆Ｔａｃｋｅ，Ｆ．，Ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ  Ｓｕｒｇ．Ｎｕｔｒ．３（２０１４）３６４−３７６）。
【０００７】
ウイルス由来および脂質／ポリマー由来の最新の送達媒介物は、本質的には生体膜と相互作用する。これは、核酸の細胞内取り込みおよび／またはエンドソーム脱出を可能にするために必要である。膜相互作用特性は、肝臓や肺などの膜が豊富な臓器への蓄積と送達をサポートすることができる。他方、それは他の標的器官、組織または細胞へ送達する際の障害でもある。
【０００８】
ＤＮＡトランスフェクションにおけるヒストンの有効性が説明されている（Ｂａｌｉｃｋｉ  ａｎｄ  Ｂｅｕｔｌｅｒ，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．３（１９９７）７８２−７８７；Ｂｕｄｋｅｒら．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３（１９９７）１３９−１４７；Ｃｈｅｎら．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５（１９９４）４２９−４３５；Ｆｒｉｔｚら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７（１９９６）１３９５−１４０４；Ｈａｇｓｔｒｏｍら．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １２８４（１９９６）４７−５５）。ヒストンＨ２Ａは、ＤＮＡトランスフェクションの媒介において、あらゆるヒストンサブクラスの中で群を抜いて最も効率的である（Ｂａｌｉｃｋｉ  ａｎｄ  Ｂｅｕｔｌｅｒ，ｓｕｐｒａ，１９９１）。
【０００９】
Ｎａｇａｓａｋｉら（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１４（２００３）２８２−２８６）は、プラスミドＤＮＡの核局在化は、ＤＮＡと古典カチオン性ＮＬＳの結合体を細胞質に注入することによっては実現できないことを示した。他方、核局在化シグナルを含むペプチドまたはタンパク質の助けを借りてトランスフェクション効率を高めると思われるいくつかの人工システムが記載されている。
【００１０】
非分裂細胞のリポフェクションによる核輸入の最終段階を改善するために、Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１９９９）８７３−８７７）は、非古典ＮＬＳとＳＶ４０Ｔ抗原コンセンサスＮＬＳのスクランブル配列に由来するカチオン性ペプチド足場の結合体を開示した。
【００１１】
ＵＳ５，６７０，３４７では、ＤＮＡ結合塩基性領域、可撓性ヒンジ領域、およびＮＬＳからなるペプチドを開示した。この場合もアミノ酸の正電荷によってＤＮＡ結合が達成されているため、この試薬はＤＮＡと複合体を形成し、同時に細胞膜を通過する輸送に役立っている。ＮＬＳ配列がＤＮＡの結合に関与してはならない理由は明らかではないが、核輸送タンパク質の実際のシグナルは、ペプチドがＤＮＡに結合している限り、ＤＮＡによってマスクされる可能性がある。さらに、生成された複合体は非常に大きくなる可能性があり、核膜孔を通る輸送を損なうことになる。
【００１２】
ＷＯ２０００／４０７４２では、ＤＮＡに特異的に結合するＤＮＡ結合部分と、実質的に中性の正味電荷を有する拡張核局在化シグナルとを含む核輸送物質を開示した。
【００１３】
ＷＯ２００１／３８５４７では、それぞれ核局在化シグナルまたはタンパク質形質導入ドメインを含む少なくとも２つのペプチドモノマーを含む、真核細胞への分子輸送のためのポリペプチドを開示した。使用される核局在化シグナルは、タンパク質で自然に起こる古典ＮＬＳである。
【００１４】
ＷＯ２００１／８１３７０では、一般にヒストンＨ２Ａ由来の遺伝子送達促進ペプチドが核酸と複合体を形成し、核酸を細胞、そして最終的には核へ効率的かつ安定な送達を行う遺伝子送達システムを開示した。このようなペプチド媒介の遺伝子送達は、ヒストン上の中和されていない正電荷がＤＮＡ上のリン酸骨格の負電荷と静電的に結合し、ヒストンの核標的シグナルは、ＤＮＡの転写のための核への輸送を改善するという原則に基づいている。ヒストンＨ２ＡのＮ末端領域に由来する少なくとも７アミノ酸、好ましくは１７アミノ酸を含む単離された遺伝子送達促進ペプチド（ここでは、ペプチドがトランスフェクション活性および核局在化活性を示す）がさらに開示されている。そのようなペプチドと核酸が形成した複合体も開示される。さらに、複合体およびトランスフェクション増強培地を含む溶液が開示される。
【００１５】
ＷＯ２００１／８１３７０では、アガロースゲル電気泳動で示されるように、テストしたすべてのカチオン性ポリマーがＤＮＡに結合することが開示された。だが、ＤＮＡ結合だけではトランスフェクションには不十分であり、ヒストンＨ２Ａのアミノ酸配列には、遺伝子送達を効率的に仲介する驚くべき能力の原因となる何か特別なものがある。さらに、ＷＯ２００１／８１３７０では、トランスフェクションと核局在化を促進するＨ２Ａの活性部分が残基１〜３６にまたがり、核局在化シグナル（ＮＬＳ）とＤＮＡクリップ特性の両方を持っていることが開示された。
【００１６】
ＷＯ２００２／０５５７２１では、トランスフェクトされる核酸にロードされた場合に核タンパク質フィラメント（ＮＰＦｓ）を形成することができるタンパク質を含むモジュラートランスフェクションシステムを開示した。ＮＰＦ形成タンパク質は、核酸の真核細胞核への輸送を改善するために、核局在化シグナルで修飾され得る。
【００１７】
ＷＯ２００８／０３１５９８では、核酸を真核細胞に輸送するための輸送物質および前記物質を作るための方法を開示した。輸送物質は、少なくとも１つの核酸分子と複合体を形成し、前記核酸分子を凝縮することができる複合体形成部分、および少なくとも１つの核局在化シグナルを含み、ほぼ中性の正味電荷を有する少なくとも１つの核局在化部分を含む。ＷＯ２００８／０３１５９８では、核酸分子を結合および凝縮する部分と、ＮＬＳを含むが実質的に中性の正味電荷を有する部分との組み合わせが、真核細胞への分子の非常に効率的な輸送を可能にする効果的な輸送物質をもたらすことが開示される。
【００１８】
しかし、古典核局在化シグナルの欠点は、それらが正電荷を介して核酸に結合する傾向があるため、これらの電荷がマスクされ、核輸送機構のシグナルとしての機能が著しく損なわれることである。
【００１９】
Ｃｒｉｓｔｉａｎｏ，Ｒ．Ｊ．らは、上皮成長因子受容体を介した肺癌細胞への上皮成長因子媒介ＤＮＡ送達を開示した（Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３（１９９６）４−１０）。Ｃｒｉｓｔｉａｎｏらのアプローチでは、細胞質または核への細胞内送達にウイルスを使用されている。ポリリジンを介した非特異的な電荷媒介相互作用は、ＤＮＡ（ＥＧＦまたはウイルス）に修飾を付加するために使用される。
【００２０】
Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｂ．らは、二重特異性ジゴキシゲニン結合抗体によって媒介される標的指向ｓｉＲＮＡ送達およびｍＲＮＡノックダウンを開示した（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  １（２０１２）ｅ４６）。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒらのアプローチで、脂質、化学的に生成されたナノ粒子、または細胞透過性ペプチドとの複合体は、細胞質または核への低分子ｓｉＲＮＡ分子の細胞内送達に使用される。
【００２１】
ＥＰ  ０  ７７９  ３６５  Ａ２では、治療または診断用のために核酸を細胞に導入する方法を開示した。これらの方法は、化学的に修飾されたＤＮＡと抗体で形成された複合体に基づいている。ＥＰ  ０  ７７９  ３６５Ａ２のアプローチでは、ウイルスまたは細菌起源のドメインは、細胞質または核への細胞内送達に使用されている。
【発明の概要】
【００２２】
概要
本明細書では、真核細胞に大核酸を導入するための組成物について報告をする。この方法は、ｓｉＲＮＡやＬＮＡなどの低分子核酸には適していない。導入された大核酸は、前記大核酸に含まれる構造遺伝子によってコードされるポリペプチドの一過性または安定した発現を促進することができる。
【００２３】
本発明は、正しく組み立てられ機能的なクロマチンのみが、大核酸を細胞へと首尾よく標的指向させるという発見に少なくとも部分的に基づいている。さらに、正しく組み立てられていないクロマチンも非特異的ヒストン凝集体も、大核酸の標的指向送達には機能しないことが見出された。
【００２４】
本発明による大核酸の標的指向送達のための実体は、ヒストンまたは細胞透過性ペプチドなどの非特異的に組み立てられた複合体と比較して、大核酸の細胞内送達においてより効率的である。
【００２５】
本発明による実体および方法は、ウイルス、細菌または化学合成起源の化合物または実体を含まない。
【００２６】
したがって、大核酸の効率的な細胞内送達のために、ヒストンは最初に正しく折りたたまれた機能的なクロマチンに組み立てられなければならず、次に標的ドメイン／実体と組み合わされなければならないことが見出された。
【００２７】
定義された「ヒストンを機能的クロマチンに組み立てる」は、送達される大核酸との明確な相互作用をもたらし、大核酸の細胞内送達に不可欠である。
【００２８】
当技術分野から知られているのは、例えば、トランスフェクション増強培地または緩衝液中のペプチドまたはポリペプチドによる「トランスフェクション」である。本明細書で報告される組成物は、従来の培地での標的化された取り込みに適している。本明細書で報告される組成物の使用を容易にする特定の媒体の設計は必要とされない。
【００２９】
当技術分野で知られているのは、ターゲティングを伴わない「トランスフェクション」（したがって、特異性を伴わない）であり、すなわち、溶液中に存在するすべての細胞は、それらの表現型とは無関係にトランスフェクトされる。したがって、当技術分野で知られている方法では、トランスフェクションのために細胞集団の特定の亜集団を選択することは不可能である。本明細書に報告されている組成物では、これは当てはまらない。ターゲティングにより、より大きな細胞集団内で、１つまたは複数の特定の細胞表面マーカー、すなわち細胞表面標的に陽性の細胞の亜集団を選択的に同定することが可能である。これにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで適用した場合の望ましくない「副作用」を回避できる。本明細書で報告される組成物は、それぞれの細胞表面標的を提示する細胞が存在しない場合、不活性であり、すなわちトランスフェクトされないことを指摘しなければならない。これにより、ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用時に安全性が高まる。
【００３０】
本発明は、少なくとも部分的に、本明細書で報告される組成物を用いて、大核酸の標的特異的送達を達成できるという発見に基づいている。
【００３１】
当技術分野から知られているのは、ヒストンおよびＤＮＡを含む未定義の複合体である。本明細書で報告される組成物は、（化学量論的に）定義された組成物である。本明細書で報告される組成物は、正しく定義され、組み立てられたヌクレオソームに基づいている。これにより、トランスフェクション効率が向上する。
【００３２】
本発明は、少なくとも部分的に、本明細書で報告される組成物では、トランスフェクション増強剤の添加は必要とされない、すなわち省略され得るという発見に基づいている。それにより、例えば、トランスフェクション後の細胞生存率への影響は、もしあれば、減少するか、あるいは無視できる程度にさえなる。
【００３３】
本発明は、少なくとも部分的に、本明細書で報告される組成物により、同等の条件下での既知の方法と比較したトランスフェクション効率が改善されるという発見に基づいている。
【００３４】
本発明は、細胞内標的指向送達および大核酸の細胞内機能性のための発現プラスミドを含む実体を含む。これらの実体は以下を含む：
（ｉ）送達される核酸、例えば、プラスミド、
（ｉｉ）核酸と機能的に組み立てられて１つまたは複数のヌクレオソームを形成する１つまたは複数のヒストン、
および
（ｉｉｉ）プラスミド−ヌクレオソームアセンブリに結合した細胞表面を標的とする実体（この細胞表面を標的とする実体により、定義された細胞集団への特定の送達が可能になる）。
【００３５】
細胞表面を標的とする実体の核酸−ヌクレオソーム複合体への結合は、異なる方法で達成することができる。１つの可能性は、ハプテンをヒストン（例えば、化学的または遺伝的結合を介して）またはプラスミドＤＮＡ（たとえば、ＤＮＡ結合ペプチドを介して）に結合させた後、ハプテン結合二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）と複合体を形成することである。別の可能性としては、細胞表面を標的とする実体のヒストンへの直接組換え融合または化学的結合によるものである。
【００３６】
本発明による新しい送達実体は、ウイルス成分を含まない。さらに、これらの実体は、タンパク質成分がヒト配列（ヒトヒストンおよびヒト化抗体誘導体）から生成されるため、免疫原性のリスクが低くなる。さらに、これらの送達実体は、非特異的な膜相互作用特性をまったくまたは非常に低いだけで示す。これは、細胞表面を標的とする実体によって認識されない細胞への取り込みの欠如によって証明されている。細胞表面を標的とする実体によって認識される表面抗原を発現する細胞への遺伝子送達の有効性は、ウイルス送達に匹敵するレベルに達し、トランスフェクションのようなナノ粒子／ポリマー法と比較してより効率的である。
【００３７】
本明細書で報告される１つの態様は、真核細胞核への大核酸の標的指向送達のための組成物であり、以下を含む：
−ヒストン（１つまたは複数のヒストンポリペプチド）、
−大核酸、
−ハプテン、および
−ハプテンへの第１結合特異性（特異的に結合する第１の結合部位）および真核細胞上の抗原（存在する細胞表面標的）への第２結合特異性（第２結合部位）を有する二重特異性結合分子、
ここでは、
−ヒストンおよび／または核酸は／ハプテンに共有結合／結合している、
−ヒストンと大核酸は（非共有結合で）互いに結合している／非共有結合複合体を形成している／機能的なクロマチン複合体を形成している／（１つ以上の）ヌクレオソームを形成している、そして
−ハプテンと二重特異性結合分子は、二重特異性結合分子の最初の結合特異性によって互いに関連している／互いに結合している。
【００３８】
一実施形態では、ヒストンおよび大核酸は（機能的）クロマチンを形成する。
【００３９】
一実施形態では、組成物は細菌タンパク質を含まない。
【００４０】
一実施形態では、組成物は、大核酸を除いてウイルス要素を含まない。
【００４１】
一実施形態では、組成物の要素は、（化学量論的に）定義されたおよび／または安定なおよび／または分離可能な複合体を形成する。
【００４２】
一実施形態では、組成物は、非定義／非特異的ヒストン−核酸複合体、すなわち非機能性クロマチンを含む組成物の効率の少なくとも２倍の効率を有する。
【００４３】
一実施形態では、組成物は、大核酸を１つまたは複数のヌクレオソームに組み立てるために十分な数のヒストンポリペプチドをさらに含む。一実施形態では、組成物は、大核酸の１５０ｂｐあたり最大で／およそ／約１つのヌクレオソームを含む。
【００４４】
一実施形態では、組成物は、最大で１５０ｂｐの大核酸あたり約８つのヒストンポリペプチドをさらに含む。
【００４５】
一実施形態では、組成物は、最大で１５０ｂｐの大核酸あたり約１つのヌクレオソームをさらに含む。
【００４６】
一実施形態では、組成物中のヒストンは、２つまたは複数の異なるヒストンの混合物である。一実施形態では、混合物は、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４の混合物である。
【００４７】
一実施形態では、組成物中のヒストン／ヒストンは、子牛胸腺ヒストン、ニワトリ赤血球ヒストン、組換えヒトヒストン、またはそれらの混合物である。
【００４８】
一実施形態では、組成物中のヒストン／ヒストンは、ヒストンＨ２ＡおよびヒストンＨ３ポリペプチドの混合物である。
【００４９】
一実施形態では、組成物中のヒストンは、組換えヒトヒストンＨ３である。
【００５０】
一実施形態では、組成物中のヒストンは、組換えヒトヒストンＨ３．１またはＨ３．３である。
【００５１】
上記の実施形態で同定された異なるヒストンは、以下のアミノ酸配列を有する。
2021523727.tif 000003
【００５２】
一実施形態では、大核酸は、正確に１つの大核酸分子である。
【００５３】
一実施形態では、大核酸は、少なくとも１つの発現カセットおよび単離された発現カセットを含む発現プラスミドから選択される。
【００５４】
一実施形態では、大核酸は、１，０００から１００，０００のヌクレオチドまたは塩基対を含む。別の実施形態では、大核酸は、１，２５０〜２０，０００ヌクレオチドまたは塩基対を含む。さらなる実施形態において、大核酸は、１，５００から１０，０００のヌクレオチドまたは塩基対を含む。
【００５５】
一実施形態では、ヒストンは、ヒトヒストンＨ３．１またはＨ３．３または子牛胸腺ヒストンである。一実施形態では、ヒトヒストンは化学的に誘導体化されていない。一実施形態では、ヒトヒストンはハプテンに結合していない。
【００５６】
一実施形態では、ヒストンは子牛の胸腺ヒストンであり、大核酸１μｇあたり約２μｇのヒストンが使用される。
【００５７】
一実施形態では、ヒストンは組換えヒトヒストンであり、大核酸１μｇあたり約０．８〜１μｇのヒストンが使用される。
【００５８】
一実施形態では、ヒストンはニワトリ赤血球ヒストンであり、大核酸１μｇあたり約１μｇのヒストンが使用される。
【００５９】
一実施形態では、組成物は、少なくとも１つのハプテン分子をさらに含む。一実施形態では、組成物は２つまたは複数のハプテン分子を含み、２つまたは複数のハプテン分子は同じハプテン分子または異なるハプテン分子である。一実施形態では、ハプテン／ハプテン分子は、ビオチン、ジゴキシゲニン、テオフィリン、ブロモデオキシウリジン、フルオレセイン、ＤＯＴＡＭおよびヘリカーモチーフポリペプチドから選択される。
【００６０】
組成物の一実施形態では、ハプテンはさらにヒストンまたは大核酸に化学的に結合している。
【００６１】
組成物の一実施形態では、ハプテンは、大核酸に付着しているＤＮＡ結合ペプチドにさらに結合している。
【００６２】
組成物の一実施形態では、その／各ヒストンポリペプチドは、単一のハプテン分子にさらに結合され、および／または大核酸分子は、少なくとも１つのハプテン分子にさらに結合される。
【００６３】
組成物の一実施形態では、二重特異性結合分子は、二重特異性抗体、二重特異性足場、二重特異性ペプチド、二重特異性アプタマー、二重特異性低分子量構造から選択される。一実施形態では、二重特異性抗体は、二重特異性完全長抗体、二重特異性ＣｒｏｓｓＭａｂ、二重特異性Ｔ細胞二重特異性、ＤＡＦ、およびＤｕｔａＭａｂから選択される。一実施形態では、二重特異性抗体は二重特異性抗体フラグメントである。一実施形態では、二重特異性抗体フラグメントは、ＤｕｔａＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ、ｔａｎｄＡｂ、ｓｃＦｖ２−ＣＨ１／ＣＬ、およびＶＨＨ２−ＣＨ１／ＣＬから選択される。
【００６４】
組成物の一実施形態では、細胞表面標的は、内在化する細胞表面受容体である。一実施形態では、細胞表面標的は、細胞型特異的炭水化物、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＩＧＦ１Ｒなどの受容体チロシンキナーゼ、およびメソテリン、ＰＳＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ４４、ＴｆＲ、ＬＲＰ、ＩＬ受容体などの細胞型特異的抗原からなる群から選択される内在化細胞表面受容体である。
【００６５】
一実施形態では、組成物は、正確に１つの二重特異性結合分子または二重特異性結合分子の２つまたは複数のコピーをさらに含む。
【００６６】
組成物の一実施形態では、ハプテンはビオチンであり、二重特異性結合分子は二重特異性抗体であり、第１結合特異性は、以下を含む抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインの対である。（ａ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、および（ｆ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３。
【００６７】
組成物の一実施形態では、ハプテンはジゴキシゲニンであり、二重特異性結合分子は二重特異性抗体であり、第１結合特異性は、以下を含む抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインの対である。（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、および（ｆ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３。
【００６８】
組成物の一実施形態では、ハプテンはテオフィリンであり、二重特異性結合分子は二重特異性抗体であり、第１結合特異性は、以下を含む抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインの対である。（ａ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、および（ｆ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３。
【００６９】
組成物の一実施形態では、ハプテンはフルオレセインであり、二重特異性結合分子は二重特異性抗体であり、第１結合特異性は、以下を含む抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインの対である。（ａ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３（ｄ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、および（ｆ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３。
【００７０】
組成物の一実施形態では、ハプテンはブロモデオキシウリジンであり、二重特異性結合分子は二重特異性抗体であり、第１結合特異性は、以下を含む抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインの対である。（ａ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３（ｄ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、および（ｆ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３。
【００７１】
組成物の一実施形態では、ハプテンは配列番号５７のヘリカーモチーフポリペプチドであり、二重特異性結合分子は二重特異性抗体であり、第１結合特異性は、抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインの対である（配列番号５５のＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２およびＨＶＲ−Ｈ３、ならびに配列番号５６のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３を含む）。
【００７２】
組成物の一実施形態では、各ハプテンは、１つ／単一の二重特異性結合分子によってさらに特異的に結合される。
【００７３】
組成物の一実施形態では、大核酸はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をコードしている。
【００７４】
組成物の一実施形態では、大核酸はさらに以下を含む：
−ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム核酸、および／または
−哺乳動物細胞に内因性のポリペプチドの発現カセット、および／または
−治療機能を有する酵素または他のタンパク質／ペプチドをコードするポリペプチドの発現カセット、および／または
−マイクロＲＮＡ、短干渉ＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ、ＲＮＡデコイ、ＲＮＡアプタマー、リボザイムなどの治療機能を備えたノンコーディングＲＮＡの転写システム。
【００７５】
一実施形態では、ヒストンは、野生型アミノ酸配列を有する天然に存在するヒストンである。
【００７６】
一実施形態では、組成物は、送達される大核酸の配列を除いて、ウイルスまたは細菌起源の化合物を含まない。
【００７７】
本明細書で報告される１つの態様は、本明細書で報告される組成物および薬学的に許容される担体を含む医薬製剤である。
【００７８】
一実施形態では、医薬製剤はさらに薬剤として使用するためのものである。
【００７９】
一実施形態では、医薬製剤はさらに遺伝子治療で使用するためのものである。
【００８０】
本明細書で報告される１つの態様は、医薬品の製造における本明細書で報告される組成物の使用である。
【００８１】
本明細書で報告される一態様は、本明細書で報告される有効量の組成物を個体に投与することを含む、遺伝病を有する個体を治療する方法であり、ここで、大核酸は、（発現カセット内に）遺伝病を治療するために必要なポリペプチドをコードする構造遺伝子を含む。
【００８２】
本明細書で報告される一態様は、本明細書で報告される有効量の組成物を個体に投与することを含む、個体の細胞における遺伝子発現を改変する方法であり、ここで、大核酸は、（発現カセット内に）遺伝子発現を改変するために必要なポリペプチドをコードする構造遺伝子または治療用核酸のいずれかを含む。
【００８３】
本明細書で報告される一態様は、以下のステップを含む、本明細書で報告される組成物を調製するための方法である。
ａ）大核酸とヒストンをインキュベートして、大核酸またはヒストン、あるいはその両方が少なくとも１つのハプテン分子に結合している、大核酸−ヒストン複合体を形成する。
ｂ）ａ）で形成された複合体を二重特異性結合分子とインキュベートして、二重特異性結合分子−大核酸−ヒストン複合体を生成し、
ｃ）ステップｂ）で形成された複合体を単離および／または精製し、それにより、本明細書で報告される組成物を生成する。
【００８４】
本明細書で報告される一態様は、以下のステップを含む、真核細胞に大核酸を導入するための方法である。
ａ）細胞表面標的への二重特異性結合分子の結合に適した条件下で、本明細書に報告されている組成物で真核細胞をインキュベートし、
ｂ）大核酸またはその機能的断片を含む細胞を単離し、それによって大核酸を真核細胞に導入する。
【００８５】
本明細書で報告される一態様は、以下のステップを含む真核細胞をトランスフェクトするための方法である：
ａ）細胞表面標的への二重特異性結合分子の結合に適した条件下で、本明細書に報告されている組成物で真核細胞をインキュベートし、
ｂ）大核酸またはその機能的断片を含む細胞を単離し、それによって真核細胞をトランスフェクトする。
【００８６】
本明細書で報告される一態様は、以下のステップを含む、核酸を真核細胞に輸送するための方法である。
ａ）細胞表面標的への二重特異性結合分子の結合に適した条件下で、本明細書に報告されている組成物で真核細胞をインキュベートし、
ｂ）大核酸またはその機能的断片を含む細胞を単離し、それによって大核酸を真核細胞に輸送する。
【００８７】
本明細書で報告される一態様は、以下のステップを含む、真核細胞核に核酸を輸送するための方法である：
ａ）細胞表面標的への二重特異性結合分子の結合に適した条件下で、本明細書に報告されている組成物で真核細胞をインキュベートし、
ｂ）大核酸またはその機能的断片を含む細胞を単離し、それによって大核酸を真核細胞の核に輸送する。
【００８８】
本明細書で報告される一態様は、真核細胞への大核酸の標的指向送達のための本明細書で報告される組成物の使用である。
【００８９】
本明細書で報告される一態様は、真核細胞核への大核酸またはその機能的断片の導入のための、本明細書で報告される組成物の使用である。
【００９０】
一実施形態では、組成物はさらに、大核酸またはその機能的断片を真核細胞に導入するためのものである。
【００９１】
一実施形態では、組成物はさらに、大核酸またはその機能的断片による真核細胞のトランスフェクションのためのものである。
【００９２】
本明細書で報告される一態様は、本明細書で報告される組成物およびその子孫を使用する方法で得られる細胞である。
【００９３】
本明細書で報告される一態様は、真核細胞の集団の定義された亜集団をトランスフェクトするための方法であり、以下のステップを含む：
−本明細書で報告される組成物を有する少なくとも１つの細胞表面抗原が異なる少なくとも２つの亜集団を含む真核細胞の集団をインキュベートする。ここで、二重特異性結合分子の第２結合特異性は、（単一）真核細胞の集団の亜集団、およびそれによって真核細胞の集団の定義された亜集団をトランスフェクトする。
【００９４】
上で概説したハプテンに加えて、標的指向実体を大核酸に連結するための他の手段も使用することができる。これらには、これだけでは限定されないが、以下を含む：
−ヒストンへの結合体または融合、
−ハプテンまたは結合実体のＤＮＡ結合実体／ペプチドへの結合体または融合、
−ヒストンに結合する二重または多重特異性実体（例：抗ヒストンｂｓＡｂ）、
−ＤＮＡに結合する二重または多重特異性実体（例：抗ＤＮＡ  ｂｓＡｂ）、
−修飾ヌクレオチドに結合する二重または多重特異性実体（例：抗ＢｒｄＵ  ｂｓＡｂ）。
【００９５】
本発明による組成物の利点は、細胞アクセス、細胞内輸送、およびプラスミドの核内保持を伴う、レシピエント細胞または生物に対する最小の毒性である。
【００９６】
本発明による組成物は、プラスミド保持、エンドソーム捕捉の欠如、およびヌクレアーゼなどの細胞プロセスからの保護の利点を付与しながら、治療用ペプチド／核酸の核局在化を促進するのに役立つことができる。
【００９７】
本発明による組成物／輸送物質の提供もまた、遺伝子治療のための完全に人工的な遺伝子導入システムに向けた重要なステップである。このような遺伝子導入システムは、３つの機能コンポーネントを備えている必要がある。１つは細胞膜を通過するＤＮＡのコンポーネント、２つ目は（通常は非分裂）標的細胞核へのＤＮＡの転送、３つ目はＤＮＡのゲノムへの統合を仲介する。遺伝子治療に使用できる完全人工遺伝子導入組成物は、おそらく、現在適用されているウイルスシステムよりも製造が容易で安価であり、取り扱いが容易であり、これらのシステムの内在的なリスクの影響を受けない。
【００９８】
本発明による組成物はまた、培養細胞におけるトランスフェクション効率を増加させる。
【００９９】
本発明の好ましい実施形態において、上記の方法は、休止している、ゆっくりと分裂している、または分裂していない細胞、好ましくは初代細胞、および／または核酸としての少なくとも１つのＤＮＡ分子である真核細胞を用いて達成される。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】適用されたモジュールの概略図と、プラスミドの特異的かつ効率的な細胞内送達を可能にする、実体を生成するためのプロセスステップ。  Ａ：ハプテンはプラスミドクロマチンに化学的に結合している；  Ｂ：ハプテンはＤＮＡ結合ペプチドを介して結合する。
【図２】アガロースゲル電気泳動による組み立てられたクロマチンに対する分析；クロマチンは、子牛の胸腺ヒストン八量体とｅＧＦＰ発現プラスミドで組み立てられた。Ａ：ミクロコッカスヌクレアーゼ消化によるクロマチン品質の分析；ｐｅＧＦＰは、ヒストンアセンブリの前（ＤＮＡ）と後（クロマチン）に示された時点（２０、８０、および２７０秒）でＭＮａｓｅで処理された。Ｂ：プラスミドＤＮＡのみとクロマチンを指定の比率（ｎｇ（ヒストン）：ｎｇ（ＤＮＡ））で組み立てたＥＭＳＡシフトアッセイ。
【図３】ストレプトアビジンとの相互作用を介した化学的コンジュゲーションおよび分析によるハプテニル化プラスミドクロマチンの生成。８μｇ／ｍＬクロマチンをストレプトアビジンディップとともに１０分間インキュベートする（６０秒から６６０秒の時間枠で表示）。層の厚さの増加は、吸光度の増加によって測定されたオクテットシステムのディップへのクロマチンの結合を示す：  Ａ：リシン側共役によって生成されたビオチン化クロマチンのストレプトアビジン結合、  Ｂ：ヌクレオソームアセンブリ前のプラスミドＤＮＡのビオチン化によって生成されたビオチン化クロマチンとストレプトアビジンの結合。  Ｃ：クロマチンアセンブリのため、ビオチン化ヒストンを適用することによって生成されたビオチン化クロマチンとストレプトアビジンの結合。
【図４】ペプチドによるプラスミドＤＮＡの組み立てについて：Ａ：細胞透過性ペプチド：ゲルシフトのＤＮＡ結合特性を決定するためのＥＭＳＡシフトは、三角形で示されるように、ＤＮＡを一定量（０．５μｇ）にし、さまざまなペプチドを増加量（１μｇ、２μｇ、４μｇ）でインキュベートした後に実行を行った。Ｂ：マイクロスケール熱泳動分析（ＭＳＴ）：ＭＳＴは、５μＭおよび１０μＭのペプチド濃度で示されたペプチドに対して実行を行った。ＤＮＡをペプチドＦＡＬＬ  ＮＲＴＮとＣＰＸＭ２とともにインキュベートすると、蛍光が増加した。ＤＮＡを非荷電ＨｉｓＦＡＬＬペプチドとインキュベートしても、蛍光シグナルは増加しなかった。
【図５】ハプテニル化ＤＮＡ結合ペプチドの付着によるハプテニル化プラスミドヌクレオソームの生成：１０μｇ／ｍＬクロマチンをストレプトアビジンディップと１５分間インキュベートした。層の厚さの増加は、吸光度の増加によって測定されたＯｃｔｅｔシステムのディップへのクロマチンの結合を示す。この図では、ｂｉｏ−ＣＰＸＭ２ペプチドの付着によって生成されたビオチン化プラスミド−クロマチンを示している。
【図６】ビオチン化プラスミド−クロマチンとハプテン結合ｂｓＡｂとの複合体形成。プロテインＡディップはビオチンまたはジゴキシゲニン結合ｂｓＡｂに曝露そして結合された（第１結合曲線）。ビオチン化またはジゴキシゲニル化プラスミド−クロマチンへのその後の曝露および結合は、第２結合曲線で表す。Ａ：クロマチンの化学的結合によってビオチン化されたプラスミド−クロマチンとｂｓＡｂの複合体形成；Ｂ：クロマチンアセンブリ前のプラスミドＤＮＡの化学的結合によってビオチン化されたプラスミド−クロマチンとｂｓＡｂの複合体形成；Ｃ：ビオチン化ＤＮＡ結合ペプチドをプラスミドクロマチンに添加することによって得られたビオチン化プラスミドクロマチンとｂｓＡｂの複合体形成。Ｄ：ジゴキシゲニル化ＤＮＡ結合ペプチドをプラスミドクロマチンに付加することによって得られたジゴキシゲニル化プラスミドクロマチンとｂｓＡｂの複合体形成。
【図７】ｂｓＡｂを標的としたプラスミドとプラスミドクロマチンの標的細胞への送達：ＢｓＡｂ−ハプテニル化プラスミドＤＮＡ（ＬｅＹ−ＤＮＡ）の標的指向送達および内在化；ｂｓＡｂ−ペプチド付着を介してハプテニル化されたプラスミド−クロマチンの標的指向送達および内在化（ＬｅＹ−クロマチン）；コントロールｂｓＡｂおよびペプチド付着を介してハプテニル化されたプラスミドクロマチン（ＣＤ３３−クロマチン）による処理。
【図８】ｂｓＡｂを標的としたペプチド−プラスミドアセンブリの細胞内送達および細胞内機能性。ｂｓＡｂを標的とした細胞内プラスミド送達は、標的細胞（左パネル）ではＧＦＰ発現をするが、非標的細胞（右パネル）ではしない。
【図９】ｂｓＡｂを標的としたプラスミド−クロマチン複合体の細胞内送達と機能性：Ａ：ｂｓＡｂを標的としたペプチド−プラスミド−クロマチン送達成分の生成；Ｂ：２＋１  ＴｒｉＦａｂフォーマット；二重特異性ｔｒｉｐｌｅＦａｂによるクロマチン（ペプチド添加によりジゴキシゲニル化）送達とＰＥＩトランスフェクションの比較。Ｃ：２＋２  ｂｓＡｂフォーマット；二価二重特異性抗体によるクロマチン（ペプチド添加によりジゴキシゲニル化）のターゲティング；Ｄ：複合クロマチンと異なるｄｉｇ−ペプチドの送達効率の比較；Ｅ：二重特異性抗体とＣＰＸＭ２ペプチドによる標的クロマチンの蛍光顕微鏡画像。Ｆ：化学的コンジュゲーションによってビオチン化されたクロマチンのＴｒｉＦａｂ媒介ターゲティング：示された量のＮＨＳ−ビオチンで標識されたクロマチンを、抗ＬｅＹ抗ビオチンＴｒｉＦａｂとともにインキュベートした。ＭＣＦ７細胞は、最終濃度が８μｇクロマチン／ｍＬと１２０ｎＭ  ＴｒｉＦａｂまたは両方濃度の４分の１のプレインキュベートされたＴｒｉＦａｂ−クロマチンで処理された。
【図１０】ニワトリヒストンまたは組換えヒトヒストンを含むプラスミドクロマチンの標的指向送達：Ａ：ニワトリ赤血球ヒストンで組み立てられた二重特異性抗体、ペプチド、クロマチンを含むクロマチンターゲティングシステムによる処理。細胞表面ターゲティングコンストラクト（ＬｅＹ−クロマチン）で処理してから４８時間後、バックグラウンドレベルの蛍光シグナルを持つ非ターゲティングコンストラクト（ＣＤ３３−クロマチン）とは対照的に、１０％の蛍光細胞が得られる。Ｂ：さまざまな組換えヒストン八量体を子牛の胸腺ヒストンと比較した。未修飾ヒストン３．３サブユニットを持つ組換えヒストン八量体を含むターゲティングシステムは、子牛の胸腺ヒストンに匹敵する送達効率を示すが、サブユニット３．１を含むクロマチンはわずかに低下した送達効率を示す。サブユニットＨ３の特定のビオチン化は、それぞれの未修飾バージョンと比較して、送達効率を低下させる。Ｃ：上記のＢでテストされたヒストンで組み立てられたクロマチンの品質。明確なバンドパターンとわずかなサブヌクレオソームＤＮＡで示したように、子牛の胸腺ヒストン（１）、ヒトＨ３．１（２）およびヒトＨ３．３（４）との高品質組換えヒストン八量体を得られた。ヒトＨ３．１（３）およびヒトＨ３．３（５）を含む組換えヒストン八量体のビオチン化バージョンとのクロマチンアセンブリは、１つのバンドのみが優勢であり、かつ幅広いサブヌクレオソームスミアがあるため、低品質のクロマチンであった。
【図１１】抗体を標的としたプラスミドクロマチンの形で送達されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をコードするプラスミドの細胞内送達および活性。標的プラスミドの送達によるＤＰＨ１遺伝子の不活性化の結果として、ＬｅＹを標的としたプラスミドクロマチンに曝露されたＭＣＦ７細胞（ＬｅＹ＋＋＋、ＣＤ３３−）はＤＴ耐性を示した。ＤＰＨ１遺伝子の不活性化を示すＤＴ／耐性は、抗体によって細胞を標的とされなかったプラスミドクロマチンを投与された細胞集団では観察されなかった。
【図１２】分析的ヌクレアーゼ消化およびアガロースゲル電気泳動による高品質および低品質のプラスミドクロマチンの可視化。矢印は、ＭＮａｓｅのインキュベーション時間が増加していることを示している。分析的ヌクレアーゼ消化により、わずかなサブヌクレオソームＤＮＡのみを含む明確なバンドパターンが得られたため、高品質のプラスミドクロマチンがヒト組換えヒストン八量体で得られた。分析的ヌクレアーゼ消化により、わずかなサブヌクレオソームＤＮＡのみを含む明確なバンドパターンが得られなかったため、低品質のプラスミドクロマチンがビオチン化Ｈ３．３サブユニットを含むヒト組換えヒストン八量体で得られた。ヒストンの部分的および不規則な結合は、１５０〜２００ｂｐの支配的なバンドによって確認される。
【図１３】高品質と低品質クロマチンは、送達効果に向けてテストされた。低品質クロマチンサンプルは、送達効率の低下を示し、ＤＮＡ送達効率に対する適切なクロマチンアセンブリの重要性を強調している。
【図１４】送達特異性のフローサイトメトリーによる決定；抗体−Ｃｙ３とＤＮＡ−Ｃｙ５の結合と取り込み（クロマチンアセンブリの前後）を、１時間のインキュベーション後にフローサイトメトリーで分析した。標的（抗ＬｅＹ；赤点）および非標的（抗ＣＤ３３；青点）のＤＮＡ−Ｃｙ５複合体で処理した後のＭＣＦ７細胞のヒストグラム。Ｃｙ５シグナルは、標的ＤＮＡ−Ｃｙ５コンストラクトで処理した後にのみ検出された。
【図１５】送達特異性のフローサイトメトリーによる決定；抗体−Ｃｙ３とＤＮＡ−Ｃｙ５の結合と取り込み（クロマチンアセンブリの前後）を、１時間のインキュベーション後にフローサイトメトリーで分析した。標的（赤）および非標的（青）クロマチン−Ｃｙ５複合体で処理した後のＭＣＦ７細胞のヒストグラム。結果は、ＤＮＡ−Ｃｙ５送達後の結果に匹敵する。
【図１６】送達特異性のフローサイトメトリーによる決定；抗体−Ｃｙ３とＤＮＡ−Ｃｙ５の結合と取り込み（クロマチンアセンブリの前後）を、１時間のインキュベーション後にフローサイトメトリーで分析した。Ｃｙ３標識抗体およびＣｙ５標識ＤＮＡを含むさまざまな抗体クロマチン複合体で処理した後のＭＣＦ７Ｃｙ３（ｘ軸）およびＣｙ５（ｙ軸）シグナルの輪郭プロット。細胞は、細胞表面抗原に対して特異性のない抗体を含む複合体で処理したが、ＣＰＸＭ２ペプチドに対してはＣｙ３およびＣｙ５シグナル（青）を示さなかった。ｂｉｏ−ＣＰＸＭ２（抗ビオチンｂｓＡｂの代わりに抗ジゴキシゲニン）に対してではなく細胞表面に対して特異性を持つ抗体を含む複合体で処理された細胞は、Ｃｙ３シグナルを表示するが、Ｃｙ５シグナルは表示しない。これは、クロマチンではなく抗体が細胞表面に存在することを示している（緑色）。細胞表面に特異的な抗体とＣＰＸＭ２を含む複合体で処理された細胞は、Ｃｙ３シグナルとＣｙ５シグナルを示し、抗体とクロマチンが細胞表面に存在することを示す（赤）。
【発明を実施するための形態】
【０１０１】
発明の態様の詳細な説明
本発明は、少なくとも部分的に、本明細書で報告される組成物を用いて、ペプチドまたはポリペプチドをコードする大核酸による真核細胞のトランスフェクションが従来の培地で達成され得るという発見に基づいている。
【０１０２】
本発明は、少なくとも部分的に、本明細書で報告される組成物を用いて、それらの表現型に応じて、真核細胞集団による亜集団の標的化されたトランスフェクションが可能であるという発見に基づく。標的化により、より大きな細胞集団内で、１つまたは複数の特定の細胞表面マーカー、すなわち細胞表面標的に陽性の細胞の亜集団を選択的に同定することが可能である。これにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで適用した場合の望ましくない「副作用」を回避できる。これにより、ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用時に安全性が高まる。
【０１０３】
本発明は、少なくとも部分的に、本明細書で報告される組成物を用いて、大核酸の標的特異的送達を達成できるという発見に基づいている。
【０１０４】
本発明は、少なくとも部分的に、本明細書で報告される組成物では、トランスフェクション増強剤の添加は必要とされない、すなわち省略され得るという発見に基づいている。それにより、例えば、トランスフェクション後の細胞生存率への影響は、もしあれば、減少するか、あるいは無視できる程度にさえなる。
【０１０５】
本発明は、少なくとも部分的に、本明細書で報告される組成物により、同等の条件下での既知の方法と比較したトランスフェクション効率が改善されるという発見に基づいている。
【０１０６】
定義
Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ．；Ｒｉｄｇｗａｙ  Ｊ．Ｂ．Ｂ．；Ｐｒｅｓｔａ  Ｌ．Ｇ．：Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２，Ｎｕｍｂｅｒ  １，Ｆｅｂｒｕａｒｙ１９９６，ｐｐ．７３−７３（１）では、ノブイントゥホール二量体化モジュールおよび抗体工学におけるそれらの使用について説明する。
【０１０７】
抗体の重鎖のＣＨ３ドメインは、「ノブイントゥホール」技術によって変更することができる。これは、ＷＯ９６／０２７０１１，Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．，ら．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．９（１９９６）６１７−６２１；ａｎｄ  Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，ら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（１９９８）６７７−６８１でいくつかの例を使用して詳細に説明されている。この方法では、２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面を変更して、これら２つのＣＨ３ドメインのヘテロ二量体化を増加させ、それによってそれらを含むポリペプチドのヘテロ二量体化を増加させる。（２重鎖の）２つのＣＨ３ドメインのそれぞれを「ノブ」にすることができ、もう１つを「穴」にすることができる。ジスルフィド架橋の導入は、ヘテロダイマー（Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，ら．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６（１９９８）６７７−６８１；Ａｔｗｅｌｌ，Ｓ．，ら．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０（１９９７）２６−３５）をさらに安定化し、収率を高める。しかし、これは本発明の分子には存在しない。
【０１０８】
（抗体重鎖の）ＣＨ３ドメインの変異Ｔ３６６Ｗは、「ノブ変異」または「変異ノブ」として示され、（抗体重鎖の）ＣＨ３ドメインの変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖは、「ホール変異」または「変異ホール」（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）として示される。ＣＨ３ドメイン間の追加の鎖間ジスルフィド架橋（Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，ら．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６（１９９８）６７７−６８１）は、例えば、「ノブ変異」（「ノブ−ｃｙｓ−変異」または「変異ノブ−ｃｙｓ」として示される）を使用して重鎖のＣＨ３ドメインにＳ３５４Ｃ変異を導入するおよび「ホール変異」（「ホール−ｃｙｓ−変異」または「変異ホール−ｃｙｓ」として示される）を使用して重鎖のＣＨ３ドメインにＹ３４９Ｃ変異を導入する（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）ことによっても使用できる。しかし、これは本発明の分子には存在しない。
【０１０９】
ヒト免疫グロブリンの軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、次のとおりである。Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）。
【０１１０】
本明細書で使用される場合、重鎖および軽鎖のすべての定常領域およびドメインのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔら．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）にあり、ここでは「Ｋａｂａｔによる番号付け」と呼ばれる。具体的には、カッパおよびラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬにはＫａｂａｔナンバリングシステム（Ｋａｂａｔら．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）の６４７−６６０ページを参照のこと）が使用され、定常重鎖ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３、この場合、「Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け」を参照することでさらに明確になる）にはＫａｂａｔ  ＥＵインデックスナンバリングシステム（６６１−７２３ページを参照のこと）が使用される。
【０１１１】
本発明を実施するための有用な方法および技術は、以下に記載されている：例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（ｅｄ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ｔｏ  ＩＩＩ（１９９７）；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｎ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ｅｄ．，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（１９８５），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．（ｅｄ．），Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  −  ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９８６）；Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，ら，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＨＳＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９２）；Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｅ．Ｌ．，Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ；Ｎ．Ｙ．，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８７）；Ｃｅｌｉｓ，Ｊ．，ｅｄ．，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９８）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．（１９８７）。
【０１１２】
組換えＤＮＡ技術の使用は、核酸の誘導体の生成を可能にする。そのような誘導体は、例えば、置換、変更、交換、欠失または挿入によって、個々のまたはいくつかのヌクレオチド位置で修飾することができる。修飾または誘導体化は、例えば、部位特異的突然変異誘発によって実施することができる。そのような修正は、当業者によって容易に実行され得る。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（１９９９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｇ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  −  ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（１９８５）ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照のこと）。
【０１１３】
本明細書および添付の特許請求の範囲に使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数形の参照を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「ａ  ｃｅｌｌ」への言及は、当技術分野で知られている複数のそのようなセルおよびその同等物などを含む。同様に、「ａ」（または「ａｎ」）、「ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ」および「ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ」という用語は、本明細書では交換可能に使用することができる。「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」、および「ｈａｖｉｎｇ」という用語は、交換可能に使用できることにも留意されたい。
【０１１４】
「ａｂｏｕｔ」という用語は、その後の数値の＋／−２０％の範囲を意味する。一実施形態では、「ａｂｏｕｔ」という用語は、その後に続く数値の＋／−１０％の範囲を示す。一実施形態では、「ａｂｏｕｔ」という用語は、その後に続く数値の＋／−５％の範囲を示す。
【０１１５】
「抗体断片」とは、インタクトな抗体が結合する抗原に結合する、インタクトな抗体の一部分を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントの例には、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、線形抗体、一本鎖抗体分子（例：ｓｃＦｖ）、および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。特定の抗体フラグメントのレビューについては、Ｈｕｄｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．ら．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９（２００３）１２９−１３４を参照のこと。ｓｃＦｖフラグメントのレビューについては、例えば、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，Ｉｎ；Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４），ｐｐ．２６９−３１５を参照のこと；ＷＯ９３／１６１８５；ＵＳ  ５，５７１，８９４  ａｎｄ  ＵＳ  ５，５８７，４５８にも参照のこと。
【０１１６】
ダイアボディは、二価または二重特異性であってもよい、２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ  ０  ４０４  ０９７；ＷＯ１９９３／０１１６１；Ｈｕｄｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．ら．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９（２００３）１２９−１３４；ａｎｄ  Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０（１９９３）６４４４−６４４８を参照のこと。トライアボディとテトラボディもＨｕｄｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．ら．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９（２００３９  １２９−１３４）で説明されている。
【０１１７】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部または一部、あるいは軽鎖可変ドメインの全部または一部を含む抗体フラグメントである。特定の実施形態において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；ｅ．ｇ．，ＵＳ  ６，２４８，５１６を参照のこと）。
【０１１８】
抗体フラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質分解消化、ならびに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌またはファージ）による産生を含むがこれらに限定されない様々な技術によって作製することができる。
【０１１９】
「抗体フラグメント」という用語は、２つの異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む「二重作用Ｆａｂ」または「ＤＡＦ」も含む（例えば、ＵＳ２００８／００６９８２０を参照のこと）。
【０１２０】
「（抗原への）結合」という用語は、インビトロアッセイにおける抗体の結合を意味する。一実施形態では、結合は、抗体が表面に結合し、抗原の抗体への結合が表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される結合アッセイで決定される。結合とは、例えば１０−８Ｍ以下の結合親和性（ＫＤ）、１０−１３〜１０−８Ｍのいくつかの実施形態では、１０−１３〜１０−９Ｍのいくつかの実施形態。「結合」という用語は、「特異的に結合する」を含む。
【０１２１】
例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）アッセイの１つの可能な実施形態において、抗原は表面に結合され、抗体結合部位の結合は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される。結合の親和性は、ｋａ（結合定数：複合体を形成するための結合の速度定数）、ｋｄ（解離定数；複合体の解離の速度定数）、およびＫＤ（ｋｄ／ｋａ）という用語によって定義される。あるいは、ＳＰＲセンサーグラムの結合シグナルは、共鳴シグナルの高さおよび解離挙動に関して、参照の応答シグナルと直接比較することができる。
【０１２２】
本明細書で使用される「結合部位」という用語は、第２ポリペプチドに特異的に結合することができるポリペプチドまたはポリペプチドの対を意味する。一実施形態では、結合部位は、抗体重鎖可変ドメイン、抗体軽鎖可変ドメイン、抗体重鎖および抗体軽鎖可変ドメインの対、その受容体または機能的フラグメント、そのリガンドまたは機能的フラグメント、酵素またはその基質から選択される。「含む」という用語には、「からなる」という用語も含まれる。
【０１２３】
薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」とは、所望の治療的または予防的結果を実現するために必要な投薬量および期間での有効な量を指す。
【０１２４】
「全長抗体」、「インタクト抗体」および「全抗体」との用語は、天然抗体構造に実質的に類似した構造を有する抗体を指すために、本明細書で相互に置き換え可能に用いられる。
【０１２５】
「全長抗体」という用語は、天然の抗体構造に実質的に類似した構造を有する抗体を意味する。全長抗体は、それぞれが軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む２つの全長抗体軽鎖、ならびにそれぞれが重鎖可変ドメイン、第１定常ドメイン、ヒンジ領域、第２定常ドメインおよび第３定常ドメインを含む２つの全長抗体重鎖を含む。全長抗体は、全長抗体の１つまたは複数の鎖に結合したさらなるドメイン（例えば、追加のｓｃＦｖまたはｓｃＦａｂなど）を含み得る。これらの結合体は、全長抗体という用語にも含まれる。
【０１２６】
用語「真核細胞」、「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」とは、互換的に使用され、そのような細胞の子孫を含む、外因性核酸が導入された細胞を指す。宿主細胞は、「形質転換体」および「形質転換された細胞」を含み、これらは、継代数にかかわらず、初代の形質転換された細胞、および初代の形質転換された細胞から誘導された子孫を含む。子孫は、親細胞の核酸含有量と完全に同一でなくてもよいが、変異を含んでいてもよい。元々の形質転換された細胞についてスクリーニングされるか、または選択されるのと同じ機能または生体活性を有する変異体子孫が本発明に含まれる。
【０１２７】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲｓからのアミノ酸残基およびヒトＦＲｓからのアミノ酸残基を含む抗体を指す。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、実質的に少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインのすべてを含み、ここで、すべてまたは実質的にすべてのＨＶＲｓ（例えば、ＣＤＲｓ）は、非ヒト抗体のものに対応し、または実質的にすべてのＦＲがヒト抗体のＦＲに対応する。ヒト化抗体は、場合により、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。抗体、例えば非ヒト抗体の、「ヒト化型」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
【０１２８】
本明細書で使用される「超可変領域」または「ＨＶＲ」という用語は、配列が超可変（「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」）である、および／または構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する、および／または抗原接触残基（「抗原接触」）を含むアミノ酸残基ストレッチを含む抗体可変ドメインの各領域を指す。一般に、抗体は、６つのＨＶＲを含み、３つがＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）にあり、３つがＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）にある。
【０１２９】
ＨＶＲは以下を含む：
（ａ）アミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、および９６−１０１（Ｈ３）で発生する超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７）９０１−９１７）；
（ｂ）アミノ酸残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）、８９−９７（Ｌ３）、３１−３５ｂ（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）、および９５−１０２（Ｈ３）で発生するＣＤＲ（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１），ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２．）；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ−３６（Ｌ１）、４６−５５（Ｌ２）、８９−９６（Ｌ３）、３０−３５ｂ（Ｈ１）、４７−５８（Ｈ２）および９３−１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍら．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（１９９６））；ならびに
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、および／または（ｃ）の組合せ、アミノ酸残基４６〜５６（Ｌ２）、４７〜５６（Ｌ２）、４８〜５６（Ｌ２）、４９〜５６（Ｌ２）、２６〜３５（Ｈ１）、２６〜３５ｂ（Ｈ１）、４９〜６５（Ｈ２）、９３〜１０２（Ｈ３）、および９４〜１０２（Ｈ３）を含む。
【０１３０】
本明細書で別途示されない限り、可変ドメイン中のＨＶＲ残基および他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、Ｋａｂａｔら、上記参照に従って本明細書において番号付けされる。
【０１３１】
「個体」または「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌおよびウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウスおよびラット）が挙げられる。ある特定の実施形態では、個体または対象は、ヒトである。
【０１３２】
「隔離された」組成物は、その自然環境の構成要素から分離されたものである。いくつかの実施形態において、組成物は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換ＨＰＬＣまたは逆相ＨＰＬＣ）によって決定されるように、９５％または９９％を超える純度に精製される。例えば抗体の純度を評価する方法のレビューについては、例えばＦｌａｔｍａｎ，Ｓ．ら．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ｂ  ８４８（２００７）７９−８７を参照のこと。
【０１３３】
「単離核酸」は、その天然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、元々その核酸分子を含む細胞に含まれているが、その核酸分子が、染色体外に存在するか、またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する核酸分子を含む。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、同一であり、および／または同じエピトープに結合するが、例えば、自然発生突然変異を含有するか、またはモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる、起こり得る変異型抗体は例外であり、かかる変異型は一般的に少量で存在する。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、モノクローナル抗体製剤のそれぞれのモノクローナル抗体は、１つの抗原上の単一の決定基に対して指向する。したがって、修飾詞「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な組み立てから得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするように構築されない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含めた（これらに限定されない）多様な技法によって作製することができ、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法および他の例示的な方法が、本明細書に記載されている。
【０１３５】
「単一特異性抗体」は、１つの抗原に対して単一の結合特異性を有する抗体を意味する。単一特異性抗体は、完全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２）またはそれらの組み合わせ（例えば、完全長抗体と追加のｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメント）として調製することができる。
【０１３６】
「多重特異性抗体」は、同じ抗原または２つの異なる抗原上の少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体を意味する。多重特異性抗体は、完全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）またはそれらの組み合わせ（例えば、完全長抗体と追加のｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメント）として調製することができる。２つ、３つ、またはそれを越える（例えば４つ）の機能的抗原結合部位を有する操作された抗体も報告されている（例えば、ＵＳ２００２／０００４５８７  Ａ１を参照のこと）。１つの多重特異性抗体は二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、抗体のＦｃヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果を操作することによっても作製できる（ＷＯ２００９／０８９００４）。
【０１３７】
「ネイキッド多重特異性抗体」とは、部分（例えば、細胞毒性部分）または放射性標識に結合されていない多重特異性抗体を指す。ネイキッド多重特異性抗体は、医薬製剤中に存在し得る。
【０１３８】
「天然抗体」とは、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合されている２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖からなる約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖には可変領域（ＶＨ）があり、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれ、その後に３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）が続く。そして、第１および第２定常ドメインの間には、ヒンジ領域が位置している。同様に、ＮからＣ末端まで、各軽鎖は、可変軽ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、続いて定常軽（ＣＬ）ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２種類の１つに割り当てられてもよい。
【０１３９】
「ヌクレオソーム」という用語は、ＤＮＡとヒストンを含む粒子を意味する。クロマチンは、核ＤＮＡが細胞内にパッケージされている高分子状態である。ヌクレオソームはクロマチンの構造単位である。各ヌクレオソームは、約１５０ｂｐの二本鎖ＤＮＡと、各コアヒストン（Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４）の２つのコピーを含むヒストン八量体で構成されている。リンカーヒストンであるヒストンＨ１は、ヌクレオソーム間の結合に関与して、クロマチンをさらに圧縮する（Ｌｕｇｅｒ，Ｋ．，らＮａｔｕｒｅ  ３８９（１９９７）２５１−２６０；Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｈｙ，Ｓ．，ら．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５７９（２００５）８９５−８９８）。したがって、真核生物では、ヌクレオソームがＤＮＡパッキングの基本単位である。ヌクレオソームコア粒子は、ヒストン八量体の周りの左巻きの超らせんターンに包まれた約１５０塩基対（ｂｐ）のＤＮＡで構成されている。例えば、ヒストン八量体は、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４のそれぞれ２つのコピーからなり得る。コア粒子は一般に、いわゆる「リンカーＤＮＡ」のストレッチによって接続されている。このリンカーＤＮＡは最大約８０ｂｐｓを含むことができる。本明細書において、「ヌクレオソーム」という用語は、必要に応じてコア粒子に加えてリンカーＤＮＡの１つを意味する。１つまたは複数のヌクレオソームの存在は、機能的なクロマチンの要件である。
【０１４０】
用語「添付文書」とは、そのような治療製品の適応症、使用法、投薬量、投与、併用療法、禁忌症、および／またはその使用に関する警告についての情報を含有する、治療製品の商業用パッケージに通例含まれる指示書を指すために使用される。
【０１４１】
「パラトープ」という用語は、標的と結合部位との間の特異的結合に必要とされる所与の抗体分子のその部分を指す。パラトープは、アミノ酸残基の一次配列では連続的（すなわち、結合部位に存在する隣接するアミノ酸残基によって形成される）または不連続的（すなわち、異なる位置にあるアミノ酸残基によって形成される）である可能性があるが（アミノ酸残基のＣＤＲのアミノ酸配列など）、結合部位が採用する三次元構造では近接している可能性がある。
【０１４２】
「ペプチドリンカー」という用語は、天然および／または合成起源のリンカーを意味する。ペプチドリンカーは、アミノ酸の線形鎖で構成されており、２０個の天然に存在するアミノ酸は、ペプチド結合によって接続されている単量体の構成要素である。鎖の長さは１〜５０アミノ酸残基であり、１〜２８アミノ酸残基が好ましく、特に３〜２５アミノ酸残基が好ましい。ペプチドリンカーは、反復アミノ酸配列または天然に存在するポリペプチドの配列を含み得る。ペプチドリンカーは、環状融合ポリペプチドのドメインが、ドメインが正しく折りたたまれ、適切に提示されることを可能にすることによって、それらの生物学的活性を実行できることを確実にする機能を有する。好ましくは、ペプチドリンカーは、グリシン、グルタミン、および／またはセリン残基が豊富であると指定されている「合成ペプチドリンカー」である。これらの残基は、例えば最大５アミノ酸の小さな反復単位で配置される（例えば、ＧＧＧＳ（配列番号５８）、ＧＧＧＧＳ（配列番号５９）、ＱＱＱＧ（配列番号６０）、ＱＱＱＱＧ（配列番号６１）、ＳＳＳＧ（配列番号６２）またはＳＳＳＳＧ（配列番号６３））。この小さな反復単位を２〜５回繰り返して、多量体単位を形成することができる（例えば、（ＧＧＧＳ）２（配列番号６４）、（ＧＧＧＳ）３（配列番号６５）、（ＧＧＧＳ）４（配列番号６６）、（ＧＧＧＳ）５（配列番号６７）、（ＧＧＧＧＳ）２（配列番号６８）、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号６９）、（ＧＧＧＧＳ）４（配列番号７０）、（ＧＧＧＧＳ）４ＧＧ（配列番号７３）、ＧＧ（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号７２）および（ＧＧＧＧＳ）６（配列番号７４））。多量体ユニットのアミノ末端および／またはカルボキシ末端に、最大６つの追加の任意の天然に存在するアミノ酸を加えることができる。他の合成ペプチドリンカーは、１０〜２０回繰り返される単一のアミノ酸で構成され、アミノ末端および／またはカルボキシ末端に最大６つの追加の任意の天然アミノ酸を含み得る（例えば、リンカーＧＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＧのセリン（配列番号７１））。すべてのペプチドリンカーは、核酸分子によってコードされ得るため、組換え的に発現され得る。リンカーはそれ自体がペプチドであるため、抗融合性ペプチドは、２つのアミノ酸間で形成されるペプチド結合を介してリンカーに結合する。
【０１４３】
用語「薬学的製剤」とは、調製物中に含有される活性成分の生物活性が有効になるような形態であり、かつ製剤が投与される対象にとって許容できないほど有毒である追加の構成成分を全く含有しない調製物を指す。
【０１４４】
「薬学的に許容される担体」は、対象にとって無毒である、活性成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体としては、緩衝液、賦形剤、安定剤、または保存剤が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４５】
本明細書で使用される「組換え抗体」という用語は、組換え手段によって調製、発現、作製、または単離されるすべての抗体（キメラ、ヒト化およびヒト）を意味する。これには、ＮＳ０、ＨＥＫ、ＢＨＫ、ＣＨＯ細胞などの宿主細胞から、またはヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニックである動物（マウスなど）から単離された抗体、または宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現プラスミドを使用して発現された抗体が含まれる。そのような組換え抗体は、再配列された形で可変および定常領域を有する。本明細書で報告される組換え抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの体細胞超変異に供することができる。したがって、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し、ｉｎ  ｖｉｖｏでのヒト抗体生殖系列レパートリー内に自然に存在しない可能性がある。
【０１４６】
本明細書で使用される場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（および「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」などのその文法上の変形）とは、治療されている個体の自然経過を変更することを目的とした臨床介入を指し、予防のために、または臨床病理の経過中に行われ得る。所望の処置効果として、限定されないが、疾患の発生または再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的な病的状態、転移の予防、疾患の進行率を下げる、疾患状態の軽減または緩和、回復または改良された予後が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるために、または疾患の進行を遅らせるために使用される。
【０１４７】
本出願内で使用される「価」という用語は、（抗体）分子内に特定の数の結合部位が存在することを意味する。したがって、「二価」、「四価」、および「六価」という用語は、（抗体）分子内にそれぞれ２つの結合部位、４つの結合部位、および６つの結合部位が存在することを示す。本明細書で報告される本明細書で報告される二重特異性抗体は、１つの好ましい実施形態では「二価」である。
【０１４８】
「可変領域」または「可変ドメイン」との用語とは、抗原に対する抗体の結合に関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖および軽鎖（それぞれＶＨおよびＶＬ）の可変ドメインは一般に類似の構造を持ち、各ドメインは４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）および３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む（例えば、Ｋｉｎｄｔ，Ｔ．Ｊ．ら．Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．（２００７），ｐａｇｅ  ９１を参照のこと）。単一のＶＨまたはＶＬドメインは、抗原結合特異性を与えるのに十分かもしれない。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、抗原に結合する抗体からＶＨまたはＶＬドメインを使用して単離して、それぞれ相補的なＶＬまたはＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングすることができる（例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ，Ｓ．，ら．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０（１９９３）８８０−８８７；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．，ら．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２（１９９１）６２４−６２８を参照のこと）。
【０１４９】
用語「ベクター」とは、本明細書で使用される場合、連結している別の核酸を増殖することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製する核酸構造としてのベクター、および導入される宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。特定のベクターは、それらが機能的に連結されている核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。
【０１５０】
本明細書で使用される「ドメインクロスオーバー」という用語は、抗体重鎖ＶＨ−ＣＨ１フラグメントとそれに対応する同族抗体軽鎖のペアにおいて（つまり、抗体結合アーム内（つまり、Ｆａｂフラグメント内））、ドメイン配列は少なくとも１つの重鎖ドメインが対応する軽鎖ドメインで置換されている（およびその逆）という点で天然の配列とは異なるということを意味する。ドメインクロスオーバーには３つの一般的なタイプがある。（ｉ）ＣＨ１とＣＬドメインのクロスオーバー。これにより、ＶＬ−ＣＨ１ドメイン配列を持つドメインクロスオーバー軽鎖とＶＨ−ＣＬドメイン配列を持つドメインクロスオーバー重鎖フラグメント（またはＶＨ−ＣＬヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン配列を持つ完全長抗体重鎖）が生じる；（ｉｉ）ＶＨおよびＶＬドメインのドメインクロスオーバー。これにより、ＶＨ−ＣＬドメイン配列を持つドメインクロスオーバー軽鎖およびＶＬ−ＣＨ１ドメイン配列を持つドメインクロスオーバー重鎖フラグメントが生じる；および（ｉｉｉ）完全な軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）と完全なＶＨ−ＣＨ１重鎖フラグメントのドメインクロスオーバー（「Ｆａｂクロスオーバー」）。これにより、ＶＨ−ＣＨ１ドメイン配列を持つドメインクロスオーバー軽鎖とＶＬ−ＣＬドメイン配列を持つドメインクロスオーバー重鎖フラグメントが生じる（前述のすべてのドメイン配列は、Ｎ末端からＣ末端の方向に示されている）。
【０１５１】
本明細書で使用される場合、対応する重鎖および軽鎖ドメインに関して「互いに置換された」という用語は、前述のドメインクロスオーバーを指す。そのため、ＣＨ１とＣＬドメインが「互いに置き換えられる」場合、項目（ｉ）で説明したドメインクロスオーバーと、結果として生じる重鎖および軽鎖ドメインシーケンスが参照される。したがって、ＶＨとＶＬが「相互に置き換えられる」場合、項目（ｉｉ）で説明したドメインクロスオーバーが参照される。また、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインが「相互に置き換えられ」、ＶＨ１ドメインとＶＬドメインが「相互に置き換えられた」場合、項目（ｉｉｉ）で説明したドメインクロスオーバーが参照される。たとえば、ＷＯ２００９／０８０２５１、ＷＯ２００９／０８０２５２、ＷＯ２００９／０８０２５３、ＷＯ２００９／０８０２５４およびＳｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．，ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０８（２０１１）１１１８７−１１１９２では、ドメインクロスオーバーを含む二重特異性抗体が報告されている。
【０１５２】
本明細書で報告される方法で産生される多重特異性抗体はまた、上記項目（ｉ）で述べたＣＨ１およびＣＬドメインのドメインクロスオーバー、または上記項目（ｉｉ）で述べたＶＨおよびＶＬドメインのドメインクロスオーバーを含むＦａｂフラグメントを含み得る。同じ抗原に特異的に結合するＦａｂフラグメントは、同じドメイン配列になるように構築される。したがって、ドメインクロスオーバーを伴う複数のＦａｂフラグメントが多重特異性抗体に含まれる場合、前記Ｆａｂフラグメントは同じ抗原に特異的に結合する。
【０１５３】
本明細書で使用される「結合部位」という用語は、第２ポリペプチドに特異的に結合することができるか、または特異的に結合することができるポリペプチドを意味する。一実施形態では、結合部位は、抗体重鎖可変ドメイン、抗体軽鎖可変ドメイン、抗体重鎖および抗体軽鎖可変ドメインの対、その受容体または機能的フラグメント、そのリガンドまたは機能的フラグメント、酵素またはその基質から選択される。
【０１５４】
遺伝子輸送
受容体を介したエンドサイトーシスプロセスにより、受容体が原形質膜から細胞内に移動する。このプロセスは、細胞表面受容体がリガンド誘導性の活性化に続いてモノユビキチン化されるときに始まる。その後、受容体はエンドサイトーシス小胞に取り込まれ、そこから分解のためにリソソームまたは液胞を標的とするか、原形質膜に再循環される。
【０１５５】
本発明に記載されるような非ウイルス遺伝子導入は、より低いレベルの毒性をもたらすことを目的とした効率的な遺伝子送達の代替方法を提供する。非ウイルス遺伝子治療の目標は、遺伝子送達に関連する毒性を最小限に抑えながら、標的遺伝子の効率的な発現をブロックする細胞障壁を克服するための成功したウイルスメカニズムを模倣することである。合成非ウイルスベクターの機能には、細胞表面への特異的結合、侵入、エンドソーム脱出、核への移行、および標的細胞ゲノムへの安定した組み込みが含まれる可能性がある。
【０１５６】
非ウイルス遺伝子送達技術の律速段階は、カプセル化されたプラスミドをエンドソームから核に移すことである（Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｓｃｉ．Ａｍ．２７６（１９９７）１０２−１０６）。この設定では、プラスミドは細胞によってエンドソームコンパートメントにエンドサイトーシスされる。このコンパートメントの酸性度は、そのヌクレアーゼ活性とともに、プラスミドを急速に分解すると予想される（Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｓｃｉ．Ａｍ．２７６（１９９７）１０２−１０６）。クロロキンはエンドソームの酸性ｐＨを上昇させることが知られており、エンドソーム放出を促進するために特定の遺伝子治療プロトコルで使用される（Ｆｒｉｔｚら．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７（１９９６）１３９５−１４０４）。
【０１５７】
本発明は、ＤＥＡＥデキストラン、ポリブレンおよびミネラルリン酸カルシウム、マイクロインジェクションおよびエレクトロポレーションを含む、化学的および物理的方法に関連する固有の欠点を克服する非ウイルス性遺伝子導入を提供する。本発明はさらに、リポソーム遺伝子導入よりも有用である。リポソーム遺伝子導入には、免疫原性の欠如、調製の容易さ、大きなＤＮＡ分子をパッケージングする能力など、いくつかの利点があるが、毒性凝集体の発生を回避するには、リポソーム／ＤＮＡの比率を注意深く制御する必要がある。さらに、リポソームは送達および遺伝子発現の効率が限られており、負に帯電した高分子との潜在的に有害な相互作用を持っている。
【０１５８】
タンパク質およびペプチド遺伝子輸送におけるＤＮＡとの複合体形成（すなわち、ポリプレックス形成（Ｆｅｉｇｎｅｒら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８（１９９７）５１１−５１２））は、正に帯電したリジンおよびアルギニン残基とＤＮＡ骨格の負に帯電したリン酸との間の静電相互作用によって媒介される（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５６（１９９４）３６１−３６６）。ペプチド遺伝子導入の例は、内在化のために受容体を介したエンドサイトーシスの生理学的細胞プロセスを利用する。
【０１５９】
受容体を介した遺伝子送達コンストラクトには、受容体結合リガンドとＤＮＡ結合部分（通常はポリ−Ｌ−リジン）が含まれる。細胞は、トランスフェリン、アシアロ糖タンパク質、免疫グロブリン、インスリン、ＥＧＦ受容体、インテグリン結合ペプチドなど、さまざまなリガンドを使用して標的化されている。ＤＮＡ結合要素には、プロタミン、ヒストンＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ３およびＨ４、ポリ−Ｌ−リジン、および反復配列を持つカチオン性両親媒性α−ヘリックスオリゴペプチドが含まれる（Ｎｉｉｄｏｍｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１９９７）１５３０７−１５３１２）。
【０１６０】
本発明のタンパク質／ペプチド遺伝子導入の潜在的な利点には、使用の容易さ、生産、および突然変異誘発、純度、均一性、特定の細胞型に核酸を標的指向する能力、費用効果の高い大規模製造、ターゲティングリガンドのモジュール式付着および送達できる核酸のサイズまたはタイプに制限がないことが含まれる。
【０１６１】
効率的な遺伝子送達のための重要なステップは、ポリプレックスの形成である。ポリプレックス形成の条件を最適化するために、粒径、タンパク質／ペプチド／ＤＮＡ電荷比、緩衝培地などを含むタンパク質／ペプチドとプラスミド間の相互作用の分析が必要である。（Ａｄａｍｉら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８７（１９９８）６７８−６８３；Ｄｕｇｕｉｄら．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７４（１９９８）２８０２−２８１４；Ｍｕｒｐｈｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５（１９９８）１５１７−１５２２；Ｗａｄｈｗａら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．８（１９９７）８１−８８）リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーション、脂質システムを含む現在利用可能な遺伝子送達方法とは対照的に、タンパク質／ペプチド遺伝子導入には、その特性を予測および制御でき、外因性核酸の侵入および持続的発現に必要な活性を高めるのに役立つ可能性のある送達用媒体の作製が含まれる。さらに、タンパク質／ペプチドを介したＤＮＡ凝縮は、多くのカチオン性リポソームとは異なり、製剤中にポリプレックスを安定化し、血清中でその構造を維持する（Ａｄａｍｉら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８７（１９９８）６７８−６８３；Ｗｉｌｋｅら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３（１９９６）１１３３−１１４２）。活性ペプチドモチーフが同定されると、それらを組み合わせて、ウイルスキャプシドの機能に類似した機能を備えた多機能複合体を得ることができる。
【０１６２】
オリゴヌクレオチドよりもサイズが大きいＤＮＡは、エンドサイトーシスが容易ではないため、細胞に効率的に入ることができる媒体にパッケージする必要がある（Ｂｏｎｇａｒｔｚら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２（１９９４）４６８１−４６８８；Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｓｃｉ．Ａｍ．２７６（１９９７）１０２−１０６）。細胞のＤＮＡ取り込みに対する主な障害は電荷である（Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｓｃｉ．Ａｍ．２７６（１９９７）１０２−１０６）。水溶液では、ＤＮＡは正味の負電荷を持っている。ＤＮＡも細胞膜が負に帯電しているため、細胞膜からはじかれる傾向がある。細胞がネイキッドＤＮＡを吸収できるように見えるいくつかの例外がある。これには、マウスへの直接筋肉注射後の標的タンパク質発現の成功が含まれる（Ｂｌａｕ  ａｎｄ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３３（１９９５）１５５４−１５５６；Ｃｏｈｅｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９（１９９３）１６９１−１６９２；Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｓｃｉ．Ａｍ．２７６（１９９７）１０２−１０６；Ｗｏｌｆｆら．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７（１９９０）１４６５−１４６８）。担体を使用しない限り、ほとんどの細胞はトランスフェクションに対して非常に耐性がある。
【０１６３】
組成物および方法
本明細書では、細胞へのおよび細胞への非常に効率的かつ特異的な標的遺伝子送達のための新規システムが報告されている。プラスミドＤＮＡとコアヒストンは、塩勾配透析によってクロマチンにアセンブルされている。このような「プラスミドクロマチン」の抗体媒介ターゲティングを可能にするために、二重特異性抗体誘導体とクロマチンが（例えば、核酸結合ペプチドブリッジを介して）結合される。このような組成／複合体を使用すると、クロマチンで組み立てられたプラスミドＤＮＡを高効率で細胞にターゲティングできる。
【０１６４】
通常の培養条件下でｎＭ濃度の細胞に抗体標的プラスミドクロマチンを適用すると、９０％を超える細胞で細胞内送達および核（発現）機能が可能になることがわかっている。ターゲティングおよび導入遺伝子の機能は、絶対的な特異性で観察され、異なる細胞株および異なる抗体標的に対して検出可能な細胞毒性はなかった。標的導入遺伝子送達および細胞内機能の例には、レポーターコンストラクトおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集をコードする導入遺伝子が含まれ、この標的遺伝子送達アプローチの幅広い適用性を示している。
【０１６５】
ハプテン結合ｂｓＡｂを適用する大核酸の標的指向送達のための媒体の生成および組成
図１は、適用される実体の例示的かつ非限定的な概要、プロセスステップ、プラスミドなどの大核酸の特異的標的化および効率的細胞内送達を可能にする、本発明による送達実体を生成するための異なるオプションを示した。
【０１６６】
本明細書で報告される標的指向送達実体および方法は、発現プラスミドみたいな大核酸の送達に特に適しているので、以下の例示的な説明は、発現プラスミドを使用して行われる。これは、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。それは単に本発明を例示するために行われる。本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。
【０１６７】
目的配列、遺伝子、または発現カセットをコードするプラスミドＤＮＡをヒストンと組み合わせてヌクレオソームを形成し、「プラスミドクロマチン」を生成した。
【０１６８】
その後、図１の左側のパネル「Ａ」に示すように、活性化ハプテン試薬（ＮＨＳ−ハプテンまたはマレイミド−ハプテンまたは他のハプテン誘導体など）をヌクレオソームに化学結合させることにより、ハプテンを結合させた。ハプテンをヌクレオソーム−プラスミド複合体に結合させる別の方法を、図１の右側のパネル「Ｂ」に示している。ここでは、ＤＮＡ結合機能を持つハプテニル化ヒトペプチドをヌクレオソーム組み立てられたプラスミドに添加して、ハプテニル化プラスミド−ヌクレオソーム−ペプチド複合体を形成した。
【０１６９】
最後に、使用したハプテンと細胞表面抗原を認識する二重特異性抗体を、ハプテン化プラスミドクロマチン（図１のＡまたはＢでハプテン化）に添加した。これらの二重特異性抗体は、ハプテン結合部分によってハプテン化プラスミドヌクレオソームに結合する。得られた二重特異性抗体−プラスミド−クロマチン複合体は、標的細胞の表面上の標的に対する結合特異性を有するｂｓＡｂの第２特異性の遊離結合実体を含む。
【０１７０】
ヒストンは、ＤＮＡ二本鎖をヒストン八量体に巻き付けることにより、ＤＮＡを高度に圧縮することができる。ヒストンはまた、細胞の取り込みを促進する配列／ドメインを含み得る（Ｗａｇｓｔａｆｆ，Ｋ．Ｍ．，ら．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５（２００７）７２１−７３１；Ｒｏｓｅｎｂｌｕｈ，Ｊ．ら．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４５（２００５）３８７−４００；Ｒｏｓｅｎｂｌｕｈ，Ｊ．，ら．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １６６４（２００４）２３０−２４０；Ｗａｇｓｔａｆｆ，Ｋ．Ｍ．ら，Ｆａｓｅｂ  Ｊ．２２（２００８）２２３２−２２４２）。ヒストン−ＤＮＡ複合体、すなわちヌクレオソームまたはクロマチンも、負に帯電した核酸と比較して、全体的な電荷が大幅に減少している。したがって、プラスミドＤＮＡをヌクレオソーム／プラスミドクロマチンに「パッケージ化」して、サイズの圧縮と負電荷の減少が細胞内プラスミド送達を促進できるかどうかを評価し、優先的に細胞または組織特異的送達と組み合わせた。
【０１７１】
ＤＮＡ上のヒストンの組み立ては、さまざまな規模でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ塩勾配透析によって効率的に達成できる。
【０１７２】
ヒストン八量体は、定義された方法でＤＮＡ上に組み立てる（約１４７塩基対が１つの八量体に巻き付く）。ヌクレオソーム／プラスミドクロマチンの形成に成功したら、ヒストン単独（正電荷）またはプラスミドＤＮＡ（負電荷）と比較して、クロマチンの全体的な電荷が減少している。ヌクレオソーム結合ＤＮＡもヌクレアーゼから保護されているため、プラスミドＤＮＡのヌクレアーゼ耐性は、プラスミドクロマチンの形成の成功を評価するための別のパラメーターとして機能する。
【０１７３】
コアヒストンは、塩勾配透析によってＤＮＡ上に効率的に組み立てることができることがわかっている。この方法は、プラスミドクロマチンを生成するためのスーパーコイルプラスミドＤＮＡにも適用できる。この方法は、ｅＧＦＰ発現プラスミドでプラスミドクロマチンを生成するために適用される。ヒストン八量体は高度に定義された方法でＤＮＡ上に組み立てるため（正確に１４７塩基対が１つの八量体に巻き付く）、ヌクレアーゼ消化とそれに続くアガロースゲル電気泳動によってクロマチンの品質を分析できる。効率的に組み立てられたクロマチンのヌクレアーゼ消化は、短い消化時間で１４７塩基対の倍数のＤＮＡフラグメントを生成し、複数のヒストンが１つのプラスミド上に近接して組み立てられたことを示す。さらに、１４７ｂｐより短いＤＮＡフラグメントは、遅い時点で最大でわずかに見えるように、ごくわずかな部分でのみ発生する。
【０１７４】
アセンブルされたプラスミドクロマチンの電荷およびヌクレアーゼ耐性の実験的評価を図２Ｂ（ＥＭＳＡ）および図２Ａ（ヌクレアーゼ耐性アッセイ）に示す。
【０１７５】
これらの分析の結果は、プラスミドクロマチンの生成の成功を明らかにした：ＥＭＳＡアッセイ（図２Ｂ）は、わずかな保持、つまりプラスミドＤＮＡのみと比較して組み立てられたクロマチンの電荷減少を明らかにした。ヌクレアーゼ感受性アッセイ（図２Ａ）は、１４７塩基対の倍数のＤＮＡフラグメントによって示されるように、プラスミドＤＮＡがヌクレアーゼ耐性になることも示した。これは、複数のヒストンが１つのプラスミド上で近接して組み立てられたことを示している。さらに、１４７ｂｐより短いＤＮＡフラグメントは、ごく一部でしか発生しなかった（すべての時点でわずかに見える）。
【０１７６】
ハプテンへの活用には、次のようなさまざまな同じようにうまく機能するアプローチが可能である。
（Ａ）リジン側鎖結合によるクロマチンのハプテニル化
（Ｂ）ヌクレオソーム組み立て前のプラスミドＤＮＡのハプテニル化によるクロマチンのハプテニル化
（Ｃ）クロマチン組み立てのためにハプテニル化ヒストンを適用することによるクロマチンのハプテニル化。
【０１７７】
例示的なハプテンとしてのビオチンについて、これらの異なるアプローチのそれぞれで得られた結果を図３に示す。図３Ａは、化学結合反応後、プラスミド−クロマチンがストレプトアビジンに結合することを示している。これは、ビオチンがプラスミドクロマチンに化学的に付着していることを証明している。図３Ｂは、ビオチンのプラスミドＤＮＡへの化学的結合が、ストレプトアビジンに結合する能力によって表されるように、ビオチン化プラスミドクロマチンももたらすことを示している。図３Ｃは、クロマチンアセンブリ反応でビオチン化ヒストンを使用して複合体を形成し、ビオチン化プラスミド−クロマチンを生成することを示している。
【０１７８】
Ｈａａｓら（例えばＷＯ２０１１／１５７７１５）の以前の研究では、分泌されたヒトタンパク質に由来する、核酸に結合する正に帯電したヒトペプチドが特定された（すなわち、ヒトにおける低い免疫原性が提案されている）（Ｈａａｓ，Ａ．Ｋ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．４４２（２０１２）５８３−５９３）。それらの正に帯電した両親媒性ペプチドのいくつかは、生体膜を通過する能力を示した。つまり、ヒト細胞透過性ペプチド（ｈｕＣＰＰ）と見なすことができる。他のペプチドには、同量の正電荷が含まれ、ＤＮＡが結合しているが、ＣＰＰ機能はない。
【０１７９】
ハプテンをプラスミドＤＮＡに結合するのに適したペプチドを特定するために、Ｈａａｓらによって記述されたペプチドのサブセットのプラスミド結合機能ならびにそのいくつかの変異誘導体が分析された。これらには、ハプテニル化（ジゴキシゲニル化）ＮＲＴＮ、ＡＳＭ３ＢおよびＣＰＸＭ２（有効なＣＰＰ機能）、ＷＮＴ（ＣＰＰ機能なし／低下）、ＦＡＬＬ（ＣＰＰ機能なし／低下）、および参照としてのＴＡＴペプチド（ＣＰＰ）、ｐ５３に由来するＤＮＡ結合ペプチド、およびリジンまたはアルギニンの代わりにヒスチジンを含む変異ＦＡＬＬペプチドが含まれていた。Ｈｉｓ−Ｆａｌｌと組み合わせたＮＲＴＮで構成される融合ペプチドも含まれていた。
【０１８０】
ペプチドとプラスミドＤＮＡの相互作用は、ＥＭＳＡシフトアッセイおよび／またはマイクロスケール熱泳動分析（ＭＳＴ）によって分析された。どちらの技術も、ＤＮＡに結合するペプチドと結合しないペプチドを区別する。これらの実験の結果（図４Ａ（ＥＭＳＡ）、図４Ｂ（ＭＳＴ）、下表）は、いくつかのヒトペプチドがプラスミドＤＮＡに結合するため、ハプテンをプラスミドＤＮＡに結合するために使用できることを示している。これらには、ヒトＰ５３、ＮＲＴＮ、ＦＡＬＬ、ＣＰＸＭ２、ＷＮＴ、ＡＳＭ３Ｂおよびそれらの誘導体に由来するペプチドが含まれる。
2021523727.tif 000004
【０１８１】
また、ハプテニル化ＤＮＡ結合ペプチドをプラスミドクロマチンに結合させることもできる。これにより、ペプチドに結合したハプテンがプラスミドヌクレオソームに組み込まれる。
【０１８２】
このアプローチを示すために使用された１つの例示的なペプチドは、ヒト細胞透過性ペプチドＣＰＸＭ２であった。このペプチドは、負に帯電したＤＮＡバックボーンとの電荷相互作用を介してプラスミドクロマチンを捕捉する。ハプテン（この場合はビオチン）のプラスミドクロマチンへの取り込みの成功は、上記で実証された。図５は、ビオチン化ペプチドがプラスミドクロマチンに結合し、ストレプトアビジンへの結合を可能にするバイオレイヤー干渉法（Ｏｃｔｅｔ）分析を示している。図５は、ｂｉｏ−ＣＰＸＭ２ペプチドの付着によるプラスミドクロマチンのビオチン化を示している。
【０１８３】
ヒトタンパク質由来およびＨａａｓらによって同定された核酸結合ペプチドＣＰＸＭ２は、負に帯電したＤＮＡバックボーンとの電荷相互作用を介してプラスミドＤＮＡまたはクロマチンを捕捉するための例示的な分子として使用することができる（Ｈａａｓ，Ａ．Ｋ．，ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．４４２（２０１２）５８３−５９３）。ＣＰＸＭ２ペプチドの抗体への結合を可能にするために、ＣＰＸＭ２ペプチドのハプテン化（例えばビオチン化）変異体およびハプテン（つまり、この例ではビオチン）結合二重特異性抗体を使用した。クロマチンに対する抗体−ペプチドコンストラクトの親和性は、マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）によって測定された。この方法では、アビディティ効果によりこのシステムの親和性に影響を与えるため、抗体やペプチドを捕捉する必要なしに、溶液中で親和性データが生成された。最も適切な抗体フォーマットを特定するために、一価ビオチン結合ｔｒｉＦａｂを、分子の架橋による親和性および潜在的な凝集に向けて、二価ビオチン結合二重特異性抗体と比較をした（Ｍａｙｅｒ，Ｋ．，ら．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．１６（２０１５）２７４９７−２７５０７；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｂ．，ら．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ１（２０１２）ｅ４６）。一価抗ビオチンｔｒｉＦａｂ〜ビオチンＣＰＸＭ２コンストラクトのクロマチンへの親和性は、３桁のナノモル範囲（３００ｎＭ）だった。二価抗ビオチン二重特異性抗体〜ビオチンＣＰＸＭ２構築物は、２つのＣＰＸＭ２ペプチドが１つの抗体によって結合される可能性があるため、おそらくアビディティ効果のために、この理論に結合されることなくさらなる安定化（２桁のｎＭアフィニティまで）を示した。両方の抗体−ペプチド構築物で凝集は観察されず、両方の抗体フォーマットで架橋が起こらないことを示している。特異性は、ペプチドを含まないそれぞれの対照によって証明された。ＭＳＴデータセットは次の表にまとめられている。
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【０１８４】
クロマチン、ペプチド、抗体間の相互作用は、オクテットシステムによって検証された。ペプチドが二価の二重特異性抗体フォーマットに結合したときに最も強い相互作用が観察されたため、このシステムはさらなる研究に使用された。抗体ペプチドコンストラクトは負に帯電したＤＮＡバックボーンと相互作用するため、この相互作用が抗体−ペプチド組み立て後のプラスミドクロマチンのヌクレアーゼ耐性を変化させるかどうかが確認されていた。クロマチンを抗体およびペプチドとインキュベートし、続いてヌクレアーゼ消化した後、２７０秒後の消化されたＤＮＡのパターンは、２０秒後のヌクレアーゼ処理クロマチンのみのパターンと同様だった。このデータは、標的クロマチン複合体の形成により、プラスミドＤＮＡがヌクレアーゼからさらに保護されることを明確に示している。
【０１８５】
細胞表面抗原およびハプテンに結合するＢｓＡｂは、ハプテン化されたペイロードを捕捉し、抗体−ペイロード複合体を形成することが以前に記載されている（例えば、ＷＯ２０１１／００３７８０；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｂ．ら，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  １（２０１２）ｅ４６；Ｄｅｎｇｌ，Ｓ．，ら．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２７０（２０１６）１６５−１７７を参照のこと）。
【０１８６】
上記の単純で堅牢な帯電反応を使用して、ビオチン化プラスミドクロマチンを、ビオチンおよびＬｅＹやＣＤ３３などの癌細胞の表面に存在する抗原に結合するｂｓＡｂに結合した。これには、ビオチン化プラスミド−クロマチンとｂｓＡｂを４対２５の比率で２５℃で３０分間インキュベートすることが含まれていた。癌細胞に存在する抗原に加えて、細胞の特定の亜集団に特異的な他の抗原を使用することができる。特に好ましいのは、細胞表面受容体の内在化である。
【０１８７】
図６に示すように、ｂｓＡｂとハプテニル化プラスミドクロマチンのアセンブリ反応をＳＰＲ分析（ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ）でモニターした。したがって、抗Ｌｅｙ／ビオチン二重特異性抗体（ｂｉｏ−ｂｓＡｂ（ＬｅＹ−Ｂｉｏ））がプロテインＡディップで捕捉され、続いて、追加されたビオチン化プラスミドクロマチンのビオチン結合ｂｓＡｂへの結合が評価された。
【０１８８】
図６Ａは、クロマチンの化学結合リジン側鎖によってビオチン化されたプラスミドクロマチンへのｂｓＡｂの結合の複雑な形成を示している。
【０１８９】
図６Ｂは、クロマチンアセンブリの前にプラスミドＤＮＡの化学的コンジュゲーションによってビオチン化されたプラスミドクロマチンへのｂｓＡｂの結合の複雑な形成を示している。
【０１９０】
図６Ｃは、ビオチン化ＤＮＡ結合ペプチドをプラスミドクロマチンに添加することによって得られたビオチン化プラスミドクロマチンへの結合の複雑な形成を示している。
【０１９１】
図６Ｄは、ジゴキシゲニル化ＤＮＡ結合ペプチドをプラスミドクロマチンに添加することによって得られた、ジゴキシゲニル化プラスミドクロマチンへの結合の複雑な形成を示している。この例では、ａｎｔｉ−Ｄｉｇ−ｂｓＡｂ（ＬｅＹ−Ｄｉｇ）がプロテインＡディップでキャプチャされた。
【０１９２】
ｂｓＡｂ−ＤＮＡ複合体およびｂｓＡｂ−クロマチン複合体の抗体を介したターゲティングは、それぞれのｂｓＡｂによって認識される標的抗原を運ぶ細胞で実証された。したがって、ＬｅＹ抗原とジゴキシゲニンに同時に結合するｂｓＡｂ、またはＬｅＹ抗原とビオチンに結合するｂｓＡｂを、ＬｅＹを発現するＭＣＦ７乳癌細胞と組み合わせて使用した。
【０１９３】
したがって、抗体−クロマチン複合体の特異的形成および延長されたヌクレアーゼ耐性に加えて、関連する抗体を介した細胞表面へのＤＮＡ送達が決定された。送達の有効性および特異性を決定するために、ビオチンに対する特異性に加えてＬｅｗｉｓ  ＹまたはＣＤ３３に対する特異性を有する抗体をＭＣＦ７細胞（ＬｅＹ＋＋＋／ＣＤ３３−）で比較した。さらに、Ｃｙ５フルオロフォアで標識されたプラスミドＤＮＡを使用して、細胞処理の１時間後にフローサイトメトリーによる細胞上のプラスミドＤＮＡの定量化を可能にした。クロマチンアセンブリが送達の特異性と有効性に及ぼす影響を詳しく説明するために、プラスミドＤＮＡの送達システムをクロマチンアセンブリの前後に適用した。図１４は、抗ＬｅＹ（赤の点線、右のピーク）および抗ＣＤ３３（青の点線、左のピーク）抗体と複合体を形成するクロマチンアセンブリの前にプラスミドＤＮＡで処理した後のＭＣＦ７細胞のＣｙ５シグナルを示している。抗ＬｅＹ−ＤＮＡ−Ｃｙ５複合体で処理した後、明確な蛍光シグナルが検出され、ＤＮＡ送達が非常に効率的であることを示している。対照的に、抗ＣＤ３３−ＤＮＡ−Ｃｙ５複合体は、Ｃｙ５陽性細胞をもたらさず、ＤＮＡ送達が特異的であり、抗体を介したもののみを標的としていることを証明した。クロマチンアセンブリ後、抗ＬｅＹ−クロマチン−Ｃｙ５複合体（図１５、赤色、右ピーク）での処理後に同じ明確な蛍光シグナルが観察され、抗ＣＤ３３−クロマチン−Ｃｙ５複合体（図１５、青色の実線、右のピーク）ではＣｙ５シグナルが検出されなかったため、プラスミドＤＮＡ送達の有効性と特異性は影響を受けなかった。送達システムに抗体が存在することを確認するために、Ｃｙ５標識クロマチンとともにＣｙ３フルオロフォアで標識された抗ＣＤ３３および抗ＬｅＹ抗体を使用した。図１６に示すように、抗ＣＤ３３−Ｃｙ３−クロマチン−Ｃｙ５複合体で処理されたＭＣＦ７細胞は、Ｃｙ５およびＣｙ３シグナルの上昇を示さず（青い輪郭、左下の象限）、抗体もクロマチンも細胞表面に存在しないことを示した。対照的に、抗ＬｅＹ−Ｃｙ３−クロマチン−Ｃｙ５処理は、Ｃｙ３とＣｙ５の異なる蛍光シグナルをもたらし（図１６、赤い輪郭、右下と右上の象限にまたがる）、細胞表面で抗体を証明し、クロマチンの送達が成功したことを確認した。最後に、ビオチンに対するターゲティング抗体の２番目の特異性をチェックした。したがって、ビオチン化ＣＰＸＭ２ペプチドを含む標的クロマチン送達システムを、ビオチン化ペプチドが間違ったハプテン（ジゴキシゲニン）を有するペプチドに対して交換された標的システムと比較した。図１６は、両方の複合体（ビオチン−ＣＰＸＭ２を含む左下の象限の青い輪郭とジゴキシゲニン−ＣＰＸＭ２を含む右下の象限の緑の輪郭）がＭＣＦ７細胞で明確なＣｙ３蛍光シグナルを生成するのに対し、Ｃｙ５シグナルは  複合体を含むビオチン−ＣＰＸＭ２強調した。これは、細胞表面の特異性にもかかわらず、ハプテンに対する２番目の特異性もクロマチン、したがってプラスミドＤＮＡの送達に必要であることを明確に示している。抗体とペプチド／クロマチンの間に非特異的な相互作用がないことに注意すべきである。
【０１９４】
プラスミドの標的指向送達（ヌクレオソーム／クロマチンアセンブリなし）を分析するために、Ｃｙ５で標識されたＧＦＰコードプラスミドをジゴキシゲニン標識ペプチド（ＣＰＸＭ２）とともにＰＢＳで１時間インキュベートした後、二重特異性抗ＬｅＹ／ジゴキシゲニン抗体と３０分間インキュベートした。サンプルは、８ウェルチャンバースライドに播種されたＭＣＦ７細胞に、最終濃度４μｇ／ｍＬのプラスミドＤＮＡ、２５０ｎＭのペプチドおよび１２５ｎＭの抗体を添加した。その後、細胞を共焦点顕微鏡で１時間、４時間、２４時間、４８時間後に画像化をした。
【０１９５】
これらの分析の結果を図７に示す。ＤＮＡの内在化によって示されるように、プラスミドＤＮＡがＭＣＦ７細胞に効率的に送達されたことがわかる。初期の時点では、抗体とＤＮＡは主に細胞表面に存在する。後の時点で、ＤＮＡは小胞コンパートメントに内在化されていることが分かった。
【０１９６】
ハプテニル化プラスミドクロマチンのｂｓＡｂを標的とした送達を分析するために、ＬｅＹ−Ｄｉｇ  ｂｓＡｂの複合体と、上記のようにペプチド付着を介して生成されたｄｉｇ−クロマチンに組み立てられたＣｙ５標識プラスミドをコードするＧＦＰをＭＣＦ７細胞に添加した。これらの細胞は、以下を含む複合体の最終濃度で８ウェルチャンバースライドに播種した：４μｇ／ｍＬプラスミドＤＮＡ、２５０ｎＭペプチドおよび１２５ｎＭ抗体を組み込んだプラスミドクロマチン。その後、細胞を共焦点顕微鏡で１時間、４時間、２４時間、４８時間後に画像化し、Ｃｙ５シグナルを介してプラスミドクロマチンを検出した。
【０１９７】
これらの分析結果は、細胞上のプラスミドクロマチンのＣｙ５シグナルによって示されるように、プラスミドＤＮＡがＭＣＦ７細胞に効率的に送達されたことを示している。初期の時点では、抗体とプラスミドクロマチンは主に細胞表面に存在する。後の時点で、プラスミドクロマチンが小胞コンパートメントに内在化されていることがわかり、ＧＦＰレポーター遺伝子の発現が検出され、プラスミドＤＮＡが核にも存在することが示された（図７、４８時間）。
【０１９８】
対照として、抗ＣＤ３３／ジゴキシゲニンｂｓＡｂも付着させ、ＣＤ３３陰性ＭＣＦ７細胞に添加した。この組み合わせでは、すなわち、それぞれの細胞表面受容体なしでは、プラスミド／クロマチンは細胞に送達されなかった。これは、標的指向送達が細胞表面抗原へのｂｓＡｂの特異的結合によることを証明している。
【０１９９】
二重特異性抗体−ＤＮＡ複合体の抗体を介したターゲティングにより、細胞への取り込みが可能になる。続いて、送達されたプラスミドの細胞内存在は、一過性の発現（実施例に示されるように）、または統合時に安定した発現および／または機能性を可能にする。
【０２００】
これは、ＬｅＹを発現するＭＣＦ７乳がん細胞を、ＬｅＹ抗原とジゴキシゲニンに同時に結合するｂｓＡｂに曝露し、ｄｉｇ−ペプチドの付着によってジゴキシゲニン化されたプラスミド（ｄｉｇ−ＮＲＴＮ）と複合体を形成することによって示されている。特定のターゲティングのコントロールとして、プラスミドを別の実験で、ＭＣＦ７細胞には存在しないＣＤ３３抗原を認識するｄｉｇ結合ｂｓＡｂと複合体を形成した。
【０２０１】
細胞内の取り込みと機能性は、ＭＣＦ７細胞内の送達されたプラスミド内の発現カセットにコードされているＧＦＰの発現を検出することによって示されていた。
【０２０２】
送達複合体が生成され、ＭＣＦ７細胞に適用され、続いて処理された細胞の蛍光顕微鏡イメージングが行われた。これらの分析の結果を図８に示す。イメージング蛍光顕微鏡法は、非ターゲティングＣＤ３３−ｂｓＡｂ−プラスミド複合体で処理された細胞集団に蛍光が完全に存在しないことを明らかにした。対照的に、ＧＦＰを発現した細胞は、ＬｅＹ−ｂｓＡｂ−プラスミド複合体を標的とする細胞表面を受け取ったＬｅＹ＋＋＋／ＣＤ３３−ＭＣＦ７細胞で検出可能であった。細胞表面抗原に対して、ＬｅＹは明確に単一のＧＦＰ発現細胞（母集団の約２％、左パネル）を示したが、ＣＤ３３に対する抗体を含む複合体で処理された細胞（右パネル）はバックグラウンドを超えるＧＦＰ発現を示さなかった。したがって、ｂｓＡｂを標的とした特定の送達およびハプテニル化ペプチド−ＤＮＡ複合体の蓄積は、細胞の細胞質／核への生産的な取り込みを可能にし、ある程度ＧＦＰ発現をもたらす。
【０２０３】
二重特異性抗体−プラスミド−クロマチン複合体の抗体媒介ターゲティングは、細胞への取り込みを可能にし、続いて送達されたｂｓＡｂ−クロマチン複合体の細胞内機能を可能にする。
【０２０４】
これは、ＬｅＹを発現するＭＣＦ７乳がん細胞を、ＬｅＹ抗原とジゴキシゲニンに同時に結合するｂｓＡｂに曝露し、ｄｉｇ−ペプチド（例えば、ジゴキシゲニン化ＣＰＸＭ２、ｐ５３など）の付着によってジゴキシゲニン化されたプラスミド−クロマチンアセンブリと複合体を形成することによって実験的に示されている。特定のターゲティングのコントロールとして、プラスミドクロマチンは別の実験でＭＣＦ７細胞に存在しないＣＤ３３抗原を認識するＤｉｇ結合ｂｓＡｂと複合体を形成した。
【０２０５】
実験のセットアップと送達用媒体の生成の概要を図９Ａに示す。
【０２０６】
細胞内の取り込みと機能（コード化されたＧＦＰ  ｍＲＮＡの転写と翻訳）は、ＦＡＣＳ分析でＧＦＰ発現細胞を検出および定量化することによって評価された。
【０２０７】
送達複合体は、ハプテン化プラスミド−クロマチン（ＧＦＰ発現プラスミドを含む）を二重特異性ＬｅＹ−ハプテン結合ｂｓＡｂとインキュベートすることによって生成された。２つの異なるｂｓＡｂ形式が使用された。適用された最初のフォーマットは、Ｍａｙｅｒらによって記述されたＴｒｉＦａｂフォーマットであった。（Ｍａｙｅｒ，Ｋ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．１６（２０１５）２７４９７−２７５０７）。このｂｓＡｂには、２つの細胞表面結合部位と１つのハプテン結合部位がある。第２のフォーマットは、２つの細胞表面結合部位と２つのハプテン結合部位がある四価のＩｇＧ誘導体であった（例えば、ＷＯ２０１１／００３７８０；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｂ．ら，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  １（２０１２）ｅ４６；Ｋｉｌｌｉａｎ，Ｔ．ら，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．７（２０１７）１５４８０を参照のこと）。細胞内送達と機能性を評価するために、ｂｓＡｂ−ハプテン−プラスミド−クロマチン複合体を、１２ウェルプレートに播種したＭＣＦ７細胞に、最終濃度８μｇ／ｍＬプラスミド−ＤＮＡ（ジゴキシゲニル化ＤＮＡ結合ペプチドの添加によりクロマチンに組み立てられた）、５００ｎＭペプチド、２５０ｎＭ抗体になるように添加した。
【０２０８】
細胞内活性は、ＭＣＦ７細胞の処理と、処理の４８時間後のフローサイトメトリーによるｅＧＦＰプラスミド発現の定量化によって対処された。これらの分析の結果を図９Ｂ−Ｅに示す。
【０２０９】
ペプチドと抗体を使用しないクロマチン処理後、ＧＦＰ発現細胞は検出されなかった。さらに、細胞表面に結合しないトリプルＦａｂ（抗ＣＤ３３）を含むクロマチン複合体での処理も、ＧＦＰ発現ＭＣＦ７細胞を生成しなかった。細胞表面結合トリプルＦａｂ（抗ＬｅＹ）によってクロマチンに組み立てられなかったＤＮＡの標的指向送達は、約０．５％の蛍光細胞をもたらした。対照的に、標的クロマチンコンストラクトは、ＰＥＩトランスフェクションポジティブコントロールよりも強いＧＦＰ送達効果を示た（図９Ｂ）。ハプテンに対して１価のトリプルＦａｂの代わりに二価ハプテン結合を持つ二重特異性抗体を使用すると、特異性を低下させることなく送達効率がさらに向上する（０％ＧＦＰ陽性細胞）（図９Ｃ）。クロマチンは、異なる配列のペプチドを介してハプテンをクロマチンに結合させることによって送達することができる。図９Ｄは、細胞への生産的な送達が、異なるペプチドとしてのペプチドの同一性に厳密に依存していないことを示している。ＣＰＸＭ２およびＰ５３由来のペプチドなどを適用して、標的細胞内送達用のハプテンを付着させることができる。
【０２１０】
図９Ｆに示すように、ハプテンが化学結合を介して結合しているプラスミドクロマチンも、ＭＣＦ７標的細胞に特異的に送達され、ＧＦＰ発現をもたらす。
【０２１１】
本発明による実体は、異なる供給源のヒストンで構築することができる。これには、組換えヒトヒストン、ならびに例えば、子牛の胸腺またはニワトリの赤血球からのヒストンなどの天然源から単離されたヒストンが含まれる。結果として、本明細書で報告される送達システムが一般に適用可能であり、特定のヒストンの使用に限定されないことを実証するために、本明細書で提供される実施例におけるプラスミド−クロマチンアセンブリに異なる供給源のヒストンが使用された。したがって、標的指向送達実体は、さまざまなソースのヒストンを使用して組み立てられた。結果を図１０に示す。
【０２１２】
図１０Ａは、ニワトリ赤血球からのヒストン（他のヒストン源には存在しないヒストンＨ１も含む）が、ＧＦＰ発現プラスミドの標的特異的細胞内送達を可能にしたことを示している。
【０２１３】
図１０Ｂは、未修飾のヒト組換えヒストンが子牛の胸腺ヒストンに匹敵する送達効率を示したことを示している。ヒト組換えヒストンのビオチン化バージョンを使用して、ＧＦＰ発現プラスミドの標的特異的細胞内送達を可能にする複合体を組み立てることもできる。組み立てられたクロマチンの品質分析は、ヒストンＨ３のビオチン化がクロマチンの組み立てに影響を及ぼし、品質の低いプラスミドクロマチンをもたらすことを示した（図１０Ｃ）。クロマチンの品質と送達効率の相関関係は、適切なヒストンアセンブリが、本明細書で報告されている組成物の機能的な細胞内送達の前提条件であることを示している。
【０２１４】
一実施形態では、ヒストンは、組換えヒトヒストンまたは子牛胸腺ヒストンである。一実施形態では、組換えヒトヒストンは修飾されていない、すなわち、化学的に誘導体化されていない。
【０２１５】
大核酸の細胞内送達および活性の別の例は、プラスミド上にコードされたＣＲＩＳＰＲ成分の細胞核への標的指向送達である。したがって、ＧＦＰ発現カセットは、ヒトＤＰＨ１遺伝子に対応するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９コンポーネントをコードする発現カセットに置き換えられた。ジフテリア毒素（ＤＴ）に対する細胞感受性の評価と組み合わせた、ＤＰＨ１の遺伝子編集を介した不活性化は、遺伝子編集の有効性を定量化するために使用できることが以前に説明されている（ＷＯ２０１８／０６０２３８；Ｋｉｌｌｉａｎ，Ｔ．ら，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．７（２０１７）１５４８０）。ＣＲＩＳＰＲを介した遺伝子編集には、コードする発現プラスミドが細胞に入り、十分なレベルで発現することが不可欠である。（遺伝子編集の結果として）ＤＰＨ１のすべての細胞コピーを不活性化すると、細胞はＤＴに耐性を持つ。これにより、非常に堅牢な読み出しが生成され、遺伝子編集後にＤＴ耐性コロニーをカウントすることで定量化できる。
【０２１６】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の細胞内標的指向送達を評価するために、ＤＰＨ１およびＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするプラスミドに対するｇＲＮＡを使用した。続いて、細胞内送達の効率および編集成分の発現を、細胞をＤＴに曝露し、その後、Ｋｉｌｌｉａｎらによって以前に記載されたようにＤＴ耐性コロニーを決定することによって評価した（Ｋｉｌｌｉａｎ，Ｔ．ら，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．７（２０１７）１５４８０；ＷＯ２０１８／０６０２３８）。結果を図１１に示す。
【０２１７】
図１１は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９実体をコードするプラスミドが特異的に標的化され、抗体標的化プラスミドクロマチンとして送達されると効果的な細胞内発現を誘発することを示している。細胞表面に対する抗体の標的となるプラスミドクロマチンは、標的遺伝子が編集／不活性化された高度の細胞につながる（ＤＴ耐性細胞のコロニー数が多い）。対照的に、細胞内送達およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介した編集は、細胞を標的としないプラスミドクロマチンを投与された細胞では観察されていない。
【０２１８】
したがって、本発明による複合体を用いて、細胞送達および特異性、ならびに高い核送達効率（フローサイトメトリーで細胞を発現するＧＦＰレポーター遺伝子によって定量化される）に関して効率的である。
【０２１９】
フローサイトメトリーによるＧＦＰレポーター遺伝子発現細胞による定量化により、細胞内プラスミドＤＮＡ送達に対するクロマチン集合の影響を直接描写することも可能である。これは、細胞ＤＮＡ送達のみがクロマチン集合の有無にかかわらず同等に効率的であるためである。レポーター遺伝子発現に対処するために、ＭＣＦ７細胞をさまざまな複合体で４８時間処理し、続いてＧＦＰ発現細胞をフローサイトメトリーで同定した。ＧＦＰ陽性細胞の比率は、それぞれの媒体または抗体のみの対照と比較することによって決定された。ＤＮＡまたはクロマチンの存在下でのＭＣＦ７細胞のインキュベーションは、検出可能なレベルのＧＦＰを発現する細胞を生成せず、クロマチンアセンブリの前後にプラスミドＤＮＡの非特異的な取り込みがないことを示している。さらに、抗ＣＤ３３−ＤＮＡおよび抗ＣＤ３３−クロマチン複合体で示されるように、抗体が細胞表面に結合しない場合、抗体−ペプチドコンストラクトの結合もＧＦＰ陽性細胞を生成しない（図１４〜１６を参照のこと；抗体−ＤＮＡおよび抗体−クロマチンの非特異的な取り込みは検出されなかった）。関連する抗体−ペプチドコンストラクトによるプラスミドＤＮＡのターゲティングは、単一のＧＦＰ陽性細胞を生成したが（顕微鏡で観察）、図１４に示すように、細胞表面への効率的な送達にもかかわらず、それほどではない。対照的に、現在クロマチンを標的としている同じ抗体−ペプチドコンストラクトは、ＧＦＰ陽性細胞の比率を単一の例外から広大な主要集団（９０％以上の陽性細胞）に引き上げる。最後に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎをポジティブコントロールとして使用した結果、約６０％のレポーター遺伝子発現細胞が得られた。
【０２２０】
次に、異なる処理の細胞毒性を、媒体対照および完全な細胞溶解と比較したＬＤＨ放出によって測定した。ほとんどのトランスフェクション試薬で示されているように、リポフェクションはある程度（溶解コントロールに対して約１５％）の細胞毒性を媒介していた。他の処理法はどれも検出可能な細胞毒性効果を示さなかった。
【０２２１】
したがって、機能的なプラスミドＤＮＡ送達に対するクロマチンアセンブリの影響は驚くほど高かった。
【０２２２】
異なる複合体で処理した後の抗体とＤＮＡの細胞内分布に続いて、共焦点顕微鏡で評価した。図７は、標的（ＬｅＹ−）クロマチン、標的（ＬｅＹ−）ＤＮＡ、または非標的（ＣＤ３３−）クロマチンで処理してから４時間後の生細胞における抗体−Ｃｙ３（緑）とＤＮＡ−Ｃｙ５（赤）の分布を示している。クロマチンおよびＤＮＡを標的とした後、抗体およびＤＮＡが細胞表面および小胞系に存在した。両方の蛍光シグナルのオーバーレイは、抗体とＤＮＡのほとんどが共局在しており、分離されていないことを示している。これらのデータは、標的ＤＮＡが細胞表面に送達され、クロマチン集合の有無にかかわらず、標的抗体を介して内在化されることを明確に示していた。抗体もＤＮＡも細胞表面と小胞内で検出されなかったため、ターゲティングシステムの特異性は、非ターゲティングクロマチン複合体とのインキュベーション後のＭＣＦ７細胞の共焦点顕微鏡によって確認された。さらに、クロマチンターゲティングは、細胞表面および小胞系内での強力なＤＮＡ蓄積（シアン）だけでなく、ＧＦＰ発現（緑）ももたらす。３日後のＧＦＰシグナルのイメージングでは、標識として非標識抗体を使用し、クロマチン送達効率を低下させた。より詳細なイメージングで抗体を視覚化するために、細胞を固定し、抗体を抗ヒトＩｇＧ  Ｃｙ３抗体で対比染色した。小胞系内に抗体（赤）とＤＮＡ（疑似色表現）の蓄積が確認された。
【０２２３】
クロマチン送達が、より大きなサイズでより複雑な機能を持つプラスミドＤＮＡに適用できるかどうかも取り上げられていた。したがって、ジフタミド合成遺伝子１（ＤＰＨ１）に対するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックアウトシステムをコードするプラスミドは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介した遺伝子編集の定量化のために以前に公開されたジフテリア毒素（ＤＴ）ベースのアッセイと組み合わせて使用された（Ｋｉｌｌｉａｎ，Ｔ．ら，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．７（２０１７）１５４８０）。このアッセイは、Ｃａｓ９による遺伝子編集が成功した細胞クローンの同定にホモ接合ＤＰＨ１ノックアウトによって媒介されるＤＴ耐性を利用している。したがって、細胞のみがＤＰＨ１をノックアウトし、ホモ接合体で生存し、２週間の連続ＤＴ選択後にコロニー形成を示した。まず、ＤＰＨ１  ｇＲＮＡ  Ｃａｓ９発現プラスミド上のクロマチンアセンブリが転写され、それにより、アセンブリ条件がプラスミドに依存しない高品質のクロマチンを生成するのに適していることが実証された。その後、このクロマチンは、上記で概説したＧＦＰ発現プラスミドの場合と同じ方法で、Ｃａｓ９  ＤＰＨ１ｇＲＮＡをコードするプラスミドの送達に使用された。ＭＣＦ７細胞を非ターゲティング（ＬｅＹ−）Ｃａｓ９  ＤＰＨ１  ｇＲＮＡクロマチン、非ターゲティング（ＣＤ３３−）Ｃａｓ９  ＤＰＨ１  ｇＲＮＡクロマチン、および非ターゲティング（ＬｅＹ−）ＧＦＰクロマチンで処理し、３日間インキュベートした後、細胞をＤＴに２週間曝露した。最後に、細胞を固定し、顕微鏡下でコロニーを数えた。コロニー数と最初に播種された細胞の数の比率は、ＤＴ耐性クローンのパーセンテージとして表示され、したがってホモ接合型遺伝子ノックアウトを持つクローンのパーセンテージとして表示される。Ｃａｓ９  ＤＰＨ１  ｇＲＮＡクロマチンの標的指向送達はほぼ４％のＤＴ耐性クローンをもたらすが、ＧＦＰコントロールクロマチンの標的指向送達は耐性コロニーをもたらさず、コロニー形成はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集システムの発現によってのみ発生することが確認された。ＧＦＰに対する上記のクロマチンターゲティングシステムの特異性と一致して、非ターゲティング（ＣＤ３３−）Ｃａｓ９  ＤＰＨ１  ｇＲＮＡクロマチンによるＭＣＦ７処理も、ＤＴ耐性コロニーの形成をもたらさなかった。以前の実験で決定された絶対ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックアウト頻度と比較すると、ＤＴ耐性クローンの決定されたパーセンテージはＣａｓ９発現細胞の６０％以上に等しい。
【０２２４】
考察
標的遺伝子送達システムの開発は、いくつかのハードルを克服する必要があり、したがってバランスの取れた特性が必要であるため、複数の課題に直面している（Ｉｂｒａｈｅｅｍ，Ｄ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．４５９（２０１４）７０−８３；Ｍａｎｎ，Ａ．，ら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．１１（２０１４）６８３−６９６）。たとえば、ＤＮＡ送達システムは、ＤＮＡの取り込みを効率的に仲介して、ＤＮＡの損失を最小限に抑え、送達経路に沿ったオフターゲット効果を回避するために、標的細胞に親和性を持たなければならない（ただし、並行して、血清成分や他の細胞や組織の細胞膜と相互作用してはならない）（Ｍｏｆｆａｔｔ，Ｓ．ら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１３（２００６）７６１−７７２；Ｓｃｈａｔｚｌｅｉｎ，Ａ．Ｇ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００３）１４９−１５８；Ｖａｒｋｏｕｈｉ，Ａ．Ｋら．，Ｊ．Ｃｏｎｔ．Ｒｅｌ．１５１（２０１１）２２０−２２８）。さらに、ＤＮＡは細胞質ゾルに入り、最終的に核に到達して導入遺伝子の発現を可能にするために膜バリアを越えて転座する必要がある（Ｃｅｒｖｉａ，Ｌ．Ｄ．ら，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  １２（２０１７）ｅ０１７１６９９；Ｓａｎｄｅｒｓ，Ｎ．ら．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．６１（２００９）１１５−１２７）。したがって、ＤＮＡ転座に必要な膜相互作用は効率的であると同時に、細胞毒性を回避するのに十分穏やかでなければならない。
【０２２５】
これらの要件は、本発明による組成物によって満たされる。柔軟性が高く、モジュール式の遺伝子送達システムが提供される。プラスミドＤＮＡの取り込みは、標的細胞表面での抗体−抗原相互作用によってのみ媒介されることを示すことができる。これは、標的細胞を優先する他の送達システムとは対照的に、本発明による組成物は、血清成分の存在下で活性を有する絶対特異性を有するシステムを提供することを意味する（ｃｆ．Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．ａｎｄ  Ｒｏｚｅｍａ，Ｄ．Ｂ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６（２００８）８−１５；ＭｃＣａｓｋｉｌｌ，Ｊ．，ら，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ２（２０１３）ｅ９６；Ｎｏｖｏ，Ｌ．，ら，Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．１２（２０１５）５０７−５１２）。
【０２２６】
本発明による組成物は、細胞毒性なしに、処理された細胞の９０％以上において核プラスミドＤＮＡ送達を媒介する。したがって、最適化されたウイルス送達システムに匹敵する効率的でさらに穏やかなＤＮＡ膜移行のメカニズムが提供される（ｃｆ．Ｍｕｎｃｈ，Ｒ．Ｃ．ら，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２１（２０１３）１０９−１１８；Ｖｅｌｄｗｉｊｋ，Ｍ．Ｒ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７（２０００）５９７−６０４）。
【０２２７】
さらに、本発明による組成物で生成されたデータは、ＤＮＡ膜移行を促進する必須成分がプラスミドＤＮＡのプラスミドクロマチンへの組織化であることを明確に示している。クロマチンアセンブリの有無にかかわらず、プラスミドＤＮＡを同等の効率と特異性で標的細胞に送達することは可能だが、正しく組み立てられた（したがって機能的な）プラスミドクロマチンのみが高い比率の導入遺伝子発現細胞を媒介する。したがって、以前の観察とは対照的に、ヒストンアセンブリは非特異的な膜結合によるＤＮＡの取り込みに影響を与えないが、プラスミドクロマチンはヒストンサブユニットの操作を必要とせずに膜の転座と核ＤＮＡの輸送を促進する。（ｃｆ．Ｗａｇｓｔａｆｆ，Ｋ．Ｍ．，ら，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５（２００７）７２１−７３１  ａｎｄ  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２２（２００８）２２３２−２２４２）．さらに、抗体を介したＤＮＡまたはクロマチン細胞表面の結合に大きな違いは観察されなかった。
【０２２８】
注目すべきことに、非毒性、柔軟性、非常に強力かつ特異的であるにもかかわらず、本発明による遺伝子送達システム、すなわち組成物は、哺乳動物起源のタンパク質およびペプチドのみからなる。したがって、細菌またはウイルス由来の化合物の安全性および免疫原性のリスクに関する懸念はかなり低いと予想される。
【０２２９】
結論として、本明細書では、ウイルスベースのシステムのような効率と絶対的な特異性を備えたプラスミドＤＮＡを、毒性のない哺乳類の実体によってのみ送達する新しいシステムが報告されている。さらに、本発明による組成物は、レポーター遺伝子発現から処理に関連するシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）への標的ＤＮＡ送達を拡大することを可能にした。
【０２３０】
上記およびブローで提示された実験の結果は、プラスミドクロマチンのｂｓＡｂを標的とする送達が大核酸の非常に効果的な細胞内送達を可能にすることを示している。この送達システムは、最大８０％を超える効率（ＧＦＰ発現細胞）を可能にしている。つまり、ウイルストランスフェクションと同等の効果であり、ほとんどのナノ粒子／トランスフェクションアプローチよりも優れている。
【０２３１】
比較例
細胞内標的指向送達効率に対する適切なプラスミド−クロマチンアセンブリの影響が調べられた。
【０２３２】
不規則的または非特異的なヒストン結合を伴う不適切なクロマチンアセンブリが機能に影響を与えるかどうかという質問に対処するために、修飾ヒストンがアセンブリに使用され、それによって修飾がクロマチン形成に影響を及ぼす。本発明による組成物について上に概説したのと同じ条件下で集合反応を実施すると、修飾ヒストンを有するサンプルは、修飾されていないヒストンを有するサンプルと比較してプラスミドクロマチンの品質が低下する（図１２を参照のこと）。標的指向送達における両方のクロマチン品質の比較は、品質が低下したクロマチンは高品質クロマチンの半分の効力しかないため、適切な組み立てが送達効率にとって重要であることを明確に示している（図１３を参照のこと）。
【０２３３】
具体的な実施形態
１．真核細胞の核への大核酸の標的指向送達のための組成物、以下を含む：
−ヒストン（１つまたは複数のヒストンポリペプチド）、
−大核酸、
−ハプテン、および
−ハプテンへの第１結合特異性および真核細胞（ハプテンに特異的に結合する第１結合部位と真核細胞に存在する（細胞表面）標的に特異的に結合する第２結合部位を有する二重特異性結合分子）に存在する細胞表面標的への第２結合特異性を有する二重特異性結合分子、
ここでは、
−ヒストンおよび／または核酸は／ハプテンに共有結合／結合している、
−ヒストンと大核酸は（非共有結合で）互いに結合している／非共有結合の複合体を形成している／ヌクレオソームを形成している、および
−ハプテンと二重特異性結合分子は、二重特異性結合分子の最初の結合特異性によって互いに関連している／互いに結合している。
【０２３４】
２．実施形態１に記載の組成物、ここで、組成物は、大核酸を１つまたは複数のヌクレオソームに組み立てるために十分な数のヒストンポリペプチドを含む。
【０２３５】
３．実施形態１から２のいずれか１つに記載の組成物、ここで、１５０ｂｐの大核酸ＤＮＡ／プラスミドＤＮＡあたり最大／およそ／約１ヌクレオソームを含む。
【０２３６】
４．実施形態１から２のいずれか１つに記載の組成物、ここで、最大１５０ｂｐの大核酸あたり約８ヒストンポリペプチド／最大１５０ｂｐの大核酸あたり１ヌクレオソームを含む。
【０２３７】
５．実施形態１から４のいずれか１つに記載の組成物、ここで、ヒストンは（１つまたは複数のヒストンポリペプチドは）ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４（ポリペプチド）の混合物である。
【０２３８】
６．実施形態１から５のいずれか１つに記載の組成物、ここで、ヒストンポリペプチドは、子牛胸腺ヒストン、ニワトリ赤血球ヒストン、組換えヒトヒストン、またはそれらの混合物である。
【０２３９】
７．実施形態１から６のいずれか１つに記載の組成物、ここで、ヒストンは（１つまたは複数のヒストンポリペプチドは）組換えヒトヒストン（ポリペプチド）である。
【０２４０】
８．実施形態７に記載の組成物、ここで、組換えヒトヒストンポリペプチドは、化学的に誘導体化されておらず、ハプテンに結合されていない。
【０２４１】
９．実施形態１から６のいずれか１つに記載の組成物、ここで、ヒストンは（１つまたは複数のヒストンポリペプチドは）子牛の胸腺ヒストン（ポリペプチド）である。
【０２４２】
１０．実施形態１から９のいずれか１つに記載の組成物、ここで、ヒストンは（１つまたは複数のヒストンポリペプチドは）ヒストンＨ２ＡとヒストンＨ３（ポリペプチド）の混合物である。
【０２４３】
１１．実施形態１から１０のいずれか１つに記載の組成物、ここで、ヒストン（ポリペプチド）は組換えヒトヒストンＨ３である。
【０２４４】
１２．実施形態１１に記載の組成物、ここで、組換えヒトヒストン（ポリペプチド）は組換えヒトヒストン３．１または３．３である。
【０２４５】
１３．実施形態１から１２のいずれか１つに記載の組成物、ここで、
ｉ）ヒトヒストンＨ２Ａは配列番号０１のアミノ酸配列を持っている、
ｉｉ）ウシヒストンＨ２Ａは配列番号０２のアミノ酸配列を持っている、
ｉｉｉ）ニワトリヒストンＨ２Ａは配列番号０３のアミノ酸配列を持っている、
ｉｖ）ヒトヒストンＨ２Ｂは配列番号０４のアミノ酸配列を持っている、
ｖ）ウシヒストンＨ２Ｂは配列番号０５のアミノ酸配列を持っている、
ｖｉ）ニワトリヒストンＨ２Ｂは配列番号０６のアミノ酸配列を持っている、
ｖｉｉ）ヒトヒストンＨ３．１は配列番号０７のアミノ酸配列を持っている、
ｖｉｉｉ）ヒトヒストンＨ３．３は配列番号０８のアミノ酸配列を持っている、
ｉｘ）ウシヒストンＨ３．３は配列番号０９のアミノ酸配列を持っている、
ｘ）ニワトリヒストンＨ３．３は配列番号１０のアミノ酸配列を持っている、
ｘｉ）ヒトヒストンＨ４は配列番号１１のアミノ酸配列を持っている、
ｘｉｉ）ウシトリヒストンＨ４は配列番号１２のアミノ酸配列を持っている、
ｘｉｉｉ）ニワトリヒストンＨ４は配列番号１３のアミノ酸配列を持っている。
【０２４６】
１４．実施形態１から１３のいずれか１つに記載の組成物、ここで、大核酸は１つの大核酸分子である。
【０２４７】
１５．実施形態１から１４のいずれか１つに記載の組成物、ここで、大核酸は、少なくとも１つの発現カセットを含む発現プラスミドから選択される。
【０２４８】
１６．実施形態１から１５のいずれか１つに記載の組成物、ここで、大核酸は、１，０００から１００，０００のヌクレオチドまたは塩基対を含む。
【０２４９】
１７．実施形態１６に記載の組成物、ここで、大核酸は、１，２５０〜２０，０００ヌクレオチドまたは塩基対を含む。
【０２５０】
１８．実施形態１６から１７のいずれか１つに記載の組成物、ここで、大核酸は、１，５００〜１０，０００ヌクレオチドまたは塩基対を含む。
【０２５１】
１９．実施形態１から１８のいずれか１つに記載の組成物、ここで、ヒストンは子牛の胸腺ヒストンであり、組成物は大核酸１μｇあたり約２μｇのヒストンで構成されている。
【０２５２】
２０．実施形態１から１８のいずれか１つに記載の組成物、ここで、ヒストンは組換えヒトヒストンであり、組成物は１μｇの大核酸あたり約０．８〜１μｇのヒストンを含む。
【０２５３】
２１．実施形態１から１８のいずれか１つに記載の組成物、ここで、ヒストンはニワトリ赤血球ヒストンであり、組成物は大核酸１μｇあたり約１μｇのヒストンで構成されている。
【０２５４】
２２．実施形態１から２１のいずれか１つに記載の組成物、ここで、組成物は少なくとも１つのハプテン分子を含む。
【０２５５】
２３．実施形態１から２２のいずれか１つに記載の組成物、ここで、組成物は２つまたは複数のハプテン分子を含み、２つまたは複数のハプテン分子は同じハプテン分子または異なるハプテン分子である。
【０２５６】
２４．実施形態１から２３のいずれか１つに記載の組成物、ここで、ハプテンは、ビオチン、ジゴキシゲニン、テオフィリン、ブロモデオキシウリジン、フルオレセイン、ＤＯＴＡＭ、およびヘリカーモチーフポリペプチドから選択される。
【０２５７】
２５．実施形態１から２４のいずれか１つに記載の組成物、ここで、ハプテンは（１つまたは複数の）ヒストン（ポリペプチド）または大核酸に化学的に結合する。
【０２５８】
２６．実施形態１から２４のいずれか１つに記載の組成物、ここで、ハプテンは、大核酸に結合しているＤＮＡ結合ペプチドに結合する。
【０２５９】
２７．実施形態１から２６のいずれか１つに記載の組成物、ここで、各ヒストンポリペプチドは単一のハプテン分子に結合している、および／または大核酸分子は少なくとも１つのハプテン分子に結合している。
【０２６０】
２８．実施形態１から２７のいずれか１つに記載の組成物、ここで、二重特異性結合分子は、二重特異性抗体、二重特異性足場、二重特異性ペプチド、二重特異性アプタマー、二重特異性低分子量構造から選択される。
【０２６１】
２９．実施形態１から２８のいずれか１つに記載の組成物、ここで、二重特異性結合分子は、二重特異性完全長抗体、二重特異性ＣｒｏｓｓＭａｂ、二重特異性Ｔ細胞二重特異性、ＤＡＦ、およびＤｕｔａＭａｂから選択される。
【０２６２】
３０．実施形態１から２９のいずれか１つに記載の組成物、ここで、二重特異性結合分子は二重特異性結合分子フラグメントである。
【０２６３】
３１．実施形態１から３０のいずれか１つに記載の組成物、ここで、二重特異性結合分子フラグメントは、ＤｕｔａＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ、ｔａｎｄＡｂ、ｓｃＦｖ２−ＣＨ１／ＣＬ、およびＶＨＨ２−ＣＨ１／ＣＬから選択される。
【０２６４】
３２．実施形態１から３１のいずれか１つに記載の組成物、ここで、（細胞表面）標的は内在化する細胞表面受容体である。
【０２６５】
３３．実施形態１から３２のいずれか１つに記載の組成物、ここで、細胞表面標的は、細胞型特異的炭水化物、受容体チロシンキナーゼ（ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＩＧＦ１Ｒなど）、および細胞型特異的抗原（メソテリン、ＰＳＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ４４、ＴｆＲ、ＬＲＰ、ＩＬ受容体など）からなる群から選択される内在化細胞表面受容体である。
【０２６６】
３４．実施形態１から３３のいずれか１つに記載の組成物、ここで、組成物は、二重特異性結合分子の１つまたは複数の分子を含む。
【０２６７】
３５．実施形態１から３４のいずれか１つに記載の組成物、ここで、ハプテンはビオチンであり、二重特異性結合分子は二重特異性抗体であり、第１結合特異性は抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインの対であり、以下を含む：（ａ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２８のアミノ酸配列を取得ＨＶＲ−Ｌ２、および（ｆ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３。
【０２６８】
３６．実施形態１から３４のいずれか１つに記載の組成物、ここで、ハプテンはジゴキシゲニンであり、二重特異性結合分子は二重特異性抗体であり、第１結合特異性は抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインの対であり、以下を含む：（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２０のアミノ酸配列を取得ＨＶＲ−Ｌ２、および（ｆ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３。
【０２６９】
３７．実施形態１から３４のいずれか１つに記載の組成物、ここで、ハプテンはテオフィリンであり、二重特異性結合分子は二重特異性抗体であり、第１結合特異性は抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインの対であり、以下を含む：（ａ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号３６のアミノ酸配列を取得ＨＶＲ−Ｌ２、および（ｆ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３。
【０２７０】
３８．実施形態１から３４のいずれか１つに記載の組成物、ここで、ハプテンはフルオレセインであり、二重特異性結合分子は二重特異性抗体であり、第１結合特異性は抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインの対であり、以下を含む：（ａ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号４４のアミノ酸配列を取得ＨＶＲ−Ｌ２、および（ｆ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３。
【０２７１】
３９．実施形態１から３４のいずれか１つに記載の組成物、ここで、ハプテンはブロモデオキシウリジンであり、二重特異性結合分子は二重特異性抗体であり、第１結合特異性は抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインの対であり、以下を含む：（ａ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号５２のアミノ酸配列を取得ＨＶＲ−Ｌ２、および（ｆ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３。
【０２７２】
４０．実施形態１から３４のいずれか１つに記載の組成物、ここで、ハプテンは配列番号５７のヘリカーモチーフポリペプチドであり、二重特異性結合分子は二重特異性抗体であり、第１結合特異性は、抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインの対であり、以下を含む：配列番号５５のＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２およびＨＶＲ−Ｈ３、ならびに配列番号５６のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３。
【０２７３】
４１．実施形態１から４０のいずれか１つに記載の組成物、ここで、各ハプテンは、１つの二重特異性分子によって特異的に結合する。
【０２７４】
４２．実施形態１から４１のいずれか１つに記載の組成物、ここで、大核酸はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をコードする。
【０２７５】
４３．実施形態１から４１のいずれか１つに記載の組成物、ここで、大核酸は以下を含む：
−ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム核酸、および／または
−哺乳類細胞内因性ポリペプチドの発現カセット、および／または
−治療機能を有する酵素または他のタンパク質／ペプチドをコードするポリペプチドの発現カセット、および／または
−マイクロＲＮＡ、短干渉ＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ、ＲＮＡデコイ、ＲＮＡアプタマー、リボザイムなどの治療機能を備えたノンコーディングＲＮＡの転写システム。
【０２７６】
４４．実施形態１から４３のいずれか１つに記載の組成物および薬学的に許容される担体を含む医薬製剤。
【０２７７】
４５．実施形態１から４３のいずれか１つに記載の薬剤として使用する組成物。
【０２７８】
４６．実施形態１から４３のいずれか１つに記載の遺伝子治療として使用する組成物。
【０２７９】
４７．実施形態１から４３のいずれか１つに記載の組成物の医薬品製造における使用。
【０２８０】
４８．実施形態１から４３のいずれか１つの記載による有効量の組成物を個体に投与することを含む、遺伝病を有する個体を治療する方法。
【０２８１】
４９．実施形態１から４３のいずれか１つの記載による遺伝子発現を改変するために、有効量の組成物を個体に投与することを含む、個体の細胞における遺伝子発現を改変する方法。
【０２８２】
５０．以下のステップを含む、実施形態１から４３のいずれか１つの記載による組成物を調製するための方法：
ａ）大核酸とヒストンをインキュベートして、大核酸またはヒストン、あるいはその両方が少なくとも１つのハプテン分子に結合している、大核酸−ヒストン複合体を形成する、
ｂ）ａ）で形成された大核酸−ヒストン複合体を二重特異性結合分子とインキュベートし、二重特異性分子−大核酸−ヒストン−複合体を生成する、
ｃ）ステップｂ）で形成された二重特異性結合分子−大核酸−ヒストン複合体を単離および／または精製し、それにより、実施形態１から４３のいずれか１つに記載の組成物を生成する。
【０２８３】
５１．以下のステップを含む、真核細胞に大核酸を導入する方法：
ａ）二重特異性結合分子と細胞表面標的の結合に適した条件下で、実施形態１から４３のいずれか１つに記載の組成物と共に真核細胞をインキュベートする、
ｂ）大核酸またはその機能的断片を含む細胞を単離し、それによって大核酸を真核細胞に導入する。
【０２８４】
５２．以下のステップを含む真核細胞をトランスフェクトするための方法：
ａ）二重特異性結合分子と細胞表面標的の結合に適した条件下で、実施形態１から４３のいずれか１つに記載の組成物と共に真核細胞をインキュベートする、
ｂ）大核酸またはその機能的断片を含む細胞を単離し、それによって真核細胞をトランスフェクトする。
【０２８５】
５３．以下のステップを含む、核酸を真核細胞に輸送する方法：
ａ）二重特異性結合分子と細胞表面標的の結合に適した条件下で、実施形態１から４３のいずれか１つに記載の組成物と共に真核細胞をインキュベートする、
ｂ）大核酸またはその機能的断片を含む細胞を単離し、それによって大核酸を真核細胞に輸送する。
【０２８６】
５４．核酸を真核細胞の核に輸送するための以下のステップを含む方法：
ａ）二重特異性結合分子と細胞表面標的の結合に適した条件下で、実施形態１から４３のいずれか１つに記載の組成物と共に真核細胞をインキュベートする、
ｂ）大核酸またはその機能的断片を含む細胞を単離し、それによって大核酸を真核細胞の核に輸送する。
【０２８７】
５５．実施形態１から４３のいずれか１つに記載の組成物の真核細胞への大核酸の標的指向送達における使用。
【０２８８】
５６．実施形態１から４３のいずれか１つに記載の組成物の真核細胞核への大核酸またはその機能的断片の導入における使用。
【０２８９】
５７．実施形態１から４３のいずれか１つに記載の組成物、ここで、組成物は、真核細胞に大核酸またはその機能的断片を導入するためのものである。
【０２９０】
５８．実施形態１から４３のいずれか１つに記載の組成物、ここで、組成物は、大核酸またはその機能的断片による真核細胞のトランスフェクション用である。
【０２９１】
５９．実施形態５１から５４のいずれか１つに記載の方法で得られた細胞およびその子孫。
【０２９２】
６０．真核細胞集団の定義された亜集団を大核酸でトランスフェクトする方法であり、以下のステップを含む：
−請求項１から４３のいずれか一項に記載の組成物を有する少なくとも１つの細胞表面抗原が異なる少なくとも２つの亜集団を含む真核細胞の集団をインキュベートする。ここで、二重特異性結合分子の第２結合特異性は、真核細胞集団の亜集団にのみ存在する細胞表面抗原に特異的に結合し、それにより、大核酸が真核細胞集団の定義された亜集団にトランスフェクトする。
【０２９３】
以下の実施例、配列および図は、本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の本意から逸脱しない限り、記載された手順に変更を加えることはできる。
【実施例】
【０２９４】
実施例１
プラスミドクロマチンを生成するためのヒストンによるプラスミドＤＮＡの組み立て
ヒストンとＤＮＡの組み立ては、さまざまな規模でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ塩勾配透析によって効率的に達成できる。
【０２９５】
反応混合物は、３００μＬ  ２００ｎｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）１倍低塩バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％ｗ／ｖ  Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ６３０）を使用した１５０〜４００μｇ／ｍＬプラスミドＤＮＡ、２Ｍ  ＮａＣｌ、および異なる量のヒストン八量体（子牛胸腺：ｐＥＧＦＰプラスミドＤＮＡまたはＣａｓ９  ＤＰＨ１ｇＲＮＡプラスミドＤＮＡ  １μｇあたり２μｇヒストン；ヒト組換えヒストン：ｐＥＧＦＰプラスミドＤＮＡ  １μｇあたり０．８−１μｇヒストン；ニワトリ赤血球ヒストン：ｐＥＧＦＰプラスミドＤＮＡ  １μｇあたり１μｇヒストン）で調製した。反応混合物を、高塩緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６，２Ｍ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．０５％  ｗ／ｖ  Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ６３０）で１５分間平衡化した３．５ｋＤａ  ＭＷＣＯミニ透析装置（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に移した。その後、１ｍＭベータメルカプトエタノールを含む３００ｍＬの高塩緩衝液で４Ｌビーカーを調製し、１ｍＭベータメルカプトエタノールを含む３Ｌの１倍低塩緩衝液で２番目のビーカーを調製した。高塩緩衝液を入れたビーカーにフローターとマグネチックスターラーを加えた。塩勾配透析は、４℃で一晩行った。したがって、ビーカーをマグネチックスターラーに置いてゆっくりと混合し、蠕動ポンプを設定し、３Ｌの低塩緩衝液を高塩緩衝液を含むビーカーに約３００ｍＬ／ｈの速度で移した。バッファー希釈後、サンプルをタンパク質低結合チューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に移し、ピペッティングによって体積を測定した。
【０２９６】
クロマチンアセンブリに使用されるプラスミドは、以下の要素で構成されていた。
−ｐＥＧＦＰ−ＡｍｐＲ（３９６７ｂｐ）：−ｅＧＦＰ発現カセット（ＣＭＶプロモーター；ｅＧＦＰコード配列；ＳＶ４０  ＰｏｌｙＡ）
−Ｆ１複製起点
−アンピシリン耐性遺伝子
−Ｃａｓ９  ＤＰＨ１  ｇＲＮＡ（８０３３  ｂｐ）：−ｈＵ６プロモーター
−ＤＰＨ１ｇＲＮＡの転写テンプレート
−Ｃａｓ９転写開始のためのＣＭＶプロモーター
−Ｍｙｃ−ＴａｇおよびＦｌａｇ−Ｔａｇを含むＣａｓ９コード配列
−ｐＢＲ３２２複製起点
−アンピシリン耐性遺伝子
【０２９７】
実施例２
ＥＭＳＡを用いた組み立てられたプラスミドクロマチンの耐電荷性の評価
クロマチンの全体的な電荷は、ＥＭＳＡシフトアッセイによって分析した。ＥＭＳＡシフトアッセイでは、ヒストンアセンブリの前後に５００ｎｇのＤＮＡを使用し、１％臭化エチジウムアガロースゲルにロードし、１８０Ｖで４５分間シフトした。
【０２９８】
実施例３
組み立てられたプラスミドクロマチンのヌクレアーゼ耐性の評価
ヌクレアーゼ感受性アッセイでは、クロマチンで組み立てられた２μｇのＤＮＡをバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、８０ｍＭ  ＫＣｌ、１０％ｖ／ｖグリセロール、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ）と１μＬのＢＳＡで希釈し、最終容量を５０μＬにした。反応を停止するために、１．５ｍＬのチューブを４μＬのストップバッファー（１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、４％ｗ／ｖドデシル硫酸ナトリウム）で調製した。ヌクレアーゼ消化は、５０μＬのＭＮａｓｅミックス（６ｍＭ  ＣａＣｌ２、２００ｎｇ／μＬのＢＳＡおよび４０Ｕ  ＭＮａｓｅ）の添加によって開始した。示された時点の後、３０μＬの反応混合物をストップバッファーを含むチューブに移した。１μＬのプロテイナーゼＫを添加し、５０℃で１時間インキュベートすることにより、ＤＮＡを除タンパクした。ＤＮＡはエタノール沈殿によって精製され、アガロースゲル電気泳動によって分析した。
【０２９９】
実施例４
ハプテニル化プラスミド−クロマチンの生成
ハプテンをプラスミド−クロマチンに結合するために、サイズ排除クロマトグラフィーによってヒストンをｅＧＦＰをコードするプラスミド（詳細は実施例１を参照のこと）と組み立てた後、クロマチンを精製した。続いて、ＮＨＳ−ビオチン試薬の化学的結合により、組み立てられたヒストン八量体のリジン側鎖にビオチンが結合した。したがって、精製後、クロマチンにアセンブルされた１００μｇのＤＮＡを、製造元の指示に従ってＢｉｏｔｉｎ−ＸＸ  Ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の反応に供した。ビオチン化後、未反応の遊離ビオチン化試薬を７ｋＤａ  ＭＷＣＯ  Ｚｅｂａスピン脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で除去した。続いて、ストレプトアビジンでコーティングされたディップを使用するＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔシステムを使用し、得られたコンジュゲートのストレプトアビジンへの結合を測定することにより、ビオチンのクロマチンへの付着を評価した。Ｏｃｔｅｔ分析では、ビオチン結合プラスミド−クロマチン（Ｂｉｏ−Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ）を２１０μＬ  ＰＢＳＴバッファーで最終濃度８μｇ／ｍＬに希釈した。その後の分析は、３０℃、１０００ｒｐｍで一定に振とうしながら行った。図３Ａは、化学結合反応後、プラスミド−クロマチンがストレプトアビジンに結合することを示している（Ｏｃｔｅｔ分析）。これは、ビオチンがプラスミドクロマチンに付着していることを証明している。
【０３００】
ビオチンをプラスミド−クロマチンに結合する別の方法は、実施例１に記載のヌクレオソーム／クロマチンアセンブリを実行する前に、ビオチンをプラスミド−ＤＮＡ（製造元の仕様に従って、Ｌａｂｅｌ  ＩＴ（登録商標）核酸ラベリングキット、Ｍｉｒｕｓを適用する）に化学的結合させることである。図３Ｂは、ストレプトアビジンに結合する能力によって表されるように、この手順によってビオチン化プラスミドクロマチンも生じることを示している。
【０３０１】
最後に、市販のビオチン化ヒストン（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ））を、実施例１に記載されているクロマチンアセンブリ反応に適用して、ビオチン化プラスミド−クロマチンを生成することができる（図３Ｃ）。
【０３０２】
実施例５
ヒトタンパク質由来のハプテニル化ペプチドのプラスミドＤＮＡとの結合
ペプチドとプラスミドＤＮＡの相互作用は、ＥＭＳＡシフトアッセイおよび／またはマイクロスケール熱泳動分析（ＭＳＴ）によって分析された。
【０３０３】
ＥＭＳＡの場合、５００ｎｇのＤＮＡをさまざまな量のペプチドと３０分間インキュベートした。ペプチドを含むまたは含まないＤＮＡサンプルを、１％アガロースゲルを含む臭化エチジウムにロードした。ＥＭＳＡシフトは１８０Ｖで４５分間行った。紫外線下でゲルイメージャー（ＢｉｏＲａｄ）で分析した。
【０３０４】
ＭＳＴは、温度勾配を適用した後のプラスミドＤＮＡの動きを測定する。リガンド（ペプチドなど）がプラスミドＤＮＡ分子に結合すると、この動きが変化する。したがって、ペプチドの存在下で動きが変化すると、ペプチドとＤＮＡの間の相互作用が発生する。ＭＳＴは、ペプチド濃度５μＭおよび１０μＭで２ｂｉｎｄ  ＧｍｂＨ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ）によって実行され、ペプチドのＤＮＡへの結合の読み出しとしてＤＮＡとのインキュベーションによる蛍光の増加を検出した。
【０３０５】
これらの分析の結果を図４Ａ（ＥＭＳＡシフトアッセイ）および図４Ｂ（ＭＳＴ）に示す。どちらの技術も、ＤＮＡに結合するペプチドと結合しないペプチドを区別する。これらの実験の結果（以下の表に要約されている）は、いくつかのヒトペプチドがプラスミドＤＮＡに結合するため、ハプテンをプラスミドＤＮＡに結合するために使用できることを示している。これらには、ヒトＰ５３、ＮＲＴＮ、ＦＡＬＬ、ＣＰＸＭ２、ＷＮＴ、ＡＳＭ３Ｂおよびそれらの誘導体に由来するペプチドが含まれる。
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【０３０６】
実施例６
ｂｓＡｂを標的としたペプチド−プラスミドアセンブリの細胞内送達と機能性
これは、ＬｅＹを発現するＭＣＦ７乳がん細胞を、ＬｅＹ抗原とジゴキシゲニンに同時に結合するｂｓＡｂに曝露し、ｄｉｇ−ペプチドの付着によってジゴキシゲニン化されたプラスミド（ｄｉｇ−ＮＲＴＮ）と複合体を形成することによって示されている。特定のターゲティングのコントロールとして、プラスミドを別の実験で、ＭＣＦ７細胞には存在しないＣＤ３３抗原を認識するｄｉｇ結合ｂｓＡｂと複合体を形成した。
【０３０７】
細胞内の取り込みと機能性は、ＭＣＦ７細胞内の送達されたプラスミド内の発現カセットにコードされているＧＦＰの発現を検出することによって示された。
【０３０８】
送達複合体は、ＧＦＰ発現プラスミドをＰＢＳ中で１時間、ジゴキシゲニン標識ＮＲＴＮ−ペプチドおよび二重特異性ＬｅＹ−Ｄｉｇ  ｂｓＡｂとともにインキュベートすることによって生成された。その後、複合体を９６ウェルプレートに播種したＭＣＦ７細胞に加え、最終濃度を４μｇ／ｍＬのプラスミドＤＮＡ、１０μＭのペプチド、３００ｎＭの抗体にした。これに続いて、４８時間後に処理細胞の蛍光顕微鏡イメージングが行われた。これらの分析の結果を図８に示す。イメージング蛍光顕微鏡法は、非ターゲティングＣＤ３３−ｂｓＡｂ−プラスミド複合体で処理された細胞集団に蛍光が完全に存在しないことを明らかにした。対照的に、ＧＦＰを発現した細胞は、ＬｅＹ−ｂｓＡｂ−プラスミド複合体を標的とする細胞表面を受け取ったＬｅＹ＋＋＋／ＣＤ３３−ＭＣＦ７細胞で検出可能であった。細胞表面抗原に対して、ＬｅＹは明確に単一のＧＦＰ発現細胞（母集団の約２％、左パネル）を示したが、ＣＤ３３に対する抗体を含む複合体で処理された細胞（右パネル）はバックグラウンドを超えるＧＦＰ発現を示さなかった。したがって、ｂｓＡｂを標的とした特定の送達およびハプテニル化ペプチド−ＤＮＡ複合体の蓄積は、細胞の細胞質／核への生産的な取り込みを可能にし、ある程度ＧＦＰ発現をもたらす。
【０３０９】
実施例７
ｂｓＡｂを標的としたペプチド−クロマチン集合体の細胞内送達と機能性
ｅＧＦＰ蛍光
ｂｓＡｂを標的としたペプチド−クロマチンアセンブリの細胞内送達と機能性を示すために、ＬｅＹを発現するＭＣＦ７乳がん細胞を、ＬｅＹ抗原とジゴキシゲニンまたはビオチンに同時に結合するｂｓＡｂに曝露し、ジゴキシゲニン化またはビオチン化ペプチド（例えば、Ｄｉｇ−ＣＰＸＭ２、Ｄｉｇ−ｐ５３およびＤｉｇ−Ｗｎｔｐ５３またはＢｉｏ−ＣＰＸＭ２）と複合体を形成した。特定のターゲティングのコントロールとして、プラスミドクロマチンを、別の実験で、ＭＣＦ７細胞には存在しないＣＤ３３抗原を認識するｄｉｇまたはｂｉｏ結合ｂｓＡｂと複合体を形成した。
【０３１０】
細胞内の取り込みと機能性は、ＭＣＦ７細胞内の送達されたプラスミド内の発現カセットにコードされているＧＦＰの発現を検出することによって示された。
【０３１１】
送達複合体は、ＧＦＰ発現プラスミドをＰＢＳ中で少なくとも１時間、ｄｉｇ／ｂｉｏ標識ペプチド（例えば、Ｄｉｇ−ＣＰＸＭ２またはＢｉｏ−ＣＰＸＭ２）および二重特異性ＬｅＹ−Ｄｉｇ／Ｂｉｏ  ｂｓＡｂまたは二重特異性ＣＤ３３−Ｄｉｇ／Ｂｉｏ  ｂｓＡｂと対照抗体としてインキュベートすることによって生成された。その後、複合体を、１２ウェルプレートに播種したＭＣＦ７細胞（８０，０００細胞／ウェル）に最大最終濃度（クロマチン、５００ｎＭペプチドおよび２５０ｎＭ抗体にアセンブルされた８μｇ／ｍＬプラスミドＤＮＡ）まで添加した。これに続いて、４８時間後にＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたフローサイトメトリーによる蛍光細胞の定量化が行われた。
【０３１２】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ：
同様に、細胞核へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックアウトシステムをコードするプラスミドの標的指向送達を分析し、本明細書に報告されている組成物による大核酸の細胞内送達および活性を示した。
【０３１３】
したがって、クロマチンアセンブリ反応は、ｅＧＦＰプラスミドの代わりにＤＰＨ１遺伝子に対するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９コード化プラスミドを使用して上記のように実行された。ジフテリア毒素（ＤＴ）に対する細胞感受性の評価と組み合わせて、ＤＰＨ１の遺伝子編集を介した不活性化を使用して、遺伝子編集の有効性を定量化できることは以前に説明されている（例えば、ＷＯ２０１８／０６０２３８；Ｋｉｌｌｉａｎ，Ｔ．ら，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．７（２０１７）１５４８０を参照のこと）。（遺伝子編集の結果として）ＤＰＨ１のすべての細胞コピーを不活性化すると、細胞はＤＴに耐性を持つ。これにより、非常に確実な読み出しが生成され、遺伝子編集後にＤＴ耐性コロニーをカウントすることで定量化できる。
【０３１４】
複合体を、１２ウェルプレートに播種したＭＣＦ７細胞（２，０００細胞／ウェル）に最大最終濃度（クロマチン、５００ｎＭペプチドおよび２５０ｎＭ抗体にアセンブルされた８μｇ／ｍＬプラスミドＤＮＡ）まで添加した。７２時間の処理後、培地を除去し、細胞を最終濃度２ｎＭのＤＴを含む培地に曝露した。ＤＴ曝露は２週間続けられ、３〜４日ごとに培地交換が行われた。この期間の後、細胞をメチレンブルーで染色し、細胞内送達の効率および編集成分の発現を、Ｋｉｌｌｉａｎら（Ｋｉｌｌｉａｎ，Ｔ．ら，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．７（２０１７）１５４８０；ＷＯ２０１８／０６０２３８）によって以前に記載されたようにＤＴ耐性コロニーの決定によって評価した。結果を図１１に示す。
【０３１５】
実施例８
共焦点顕微鏡でモニターされた標的プラスミドＤＮＡまたはクロマチンの細胞内ルーティングと機能性
プラスミドＤＮＡおよびプラスミドクロマチンのターゲティングとルーティングの蛍光顕微鏡分析を可能にするために、Ｃｙ５蛍光色素を、メーカーの仕様に従って、Ｌａｂｅｌ  ＩＴ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ＬａｂｅｌｉｎｇキットＭｉｒｕｓを適用してプラスミド−ＤＮＡと化学的に結合させた。蛍光プラスミドクロマチンを生成するために、実施例１に記載されているように、Ｃｙ５標識プラスミドを用いてクロマチンアセンブリを実施した。
【０３１６】
生細胞イメージングでは、ＭＣＦ７細胞（ＮＣＩ）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）と１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ培地で培養した。２０，０００細胞／ウェルを８ウェルチャンバースライド（Ｌａｂ−Ｔｅｋ（商標），Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に播種し、一晩接着させた。ガラス表面は、３７℃で１時間、ＰＢＳ中の３０μｇ／ｍｌフィブロネクチンでコーティングされていた。抗体プラスミドＤＮＡ−Ｃｙ５および抗体−プラスミドクロマチン−Ｃｙ５複合体は、実施例７に記載されているように形成された。サンプルは、４μｇ／ｍＬのプラスミドＤＮＡ、２５０ｎＭのペプチドおよび１２５ｎＭの抗体の最終濃度でＭＣＦ７に添加された。添加の１時間後、４時間後、２４時間後、および４８時間後に、抗体−クロマチン複合体の内在化とＧＦＰ発現に続いて、６３×／１．２ＮＡ水浸対物レンズ（Ｌｅｉｃａ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＬｅｉｃａ  ＳＰ５レーザー走査型共焦点顕微鏡で生細胞蛍光顕微鏡を実施した。温度、ＣＯ２レベルと湿度は、ステージトップのインキュベーションチャンバー（Ｏｋｏ−ｔｏｕｃｈ，Ｏｋｏｌａｂ，Ｏｔｔａｖｉａｎｏ，Ｉｔａｌｙ）を使用して３７°Ｃと５％ＣＯ２に維持した。シーケンシャルスキャンは、４８８ｎｍ（５６１ｎｍ）および６３３ｎｍでの白色光レーザー励起を使用して行った。蛍光発光は、ＨｙＤ検出器を使用して、４９５〜５４８ｎｍ（ＧＦＰ）、５７０〜６２８ｎｍ（Ｃｙ３）、および６４７〜７３２ｎｍ（Ｃｙ５）で検出した。画像はＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）で処理した。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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