(57)【要約】  ハイドロゲルを構造化するためのサブトラクティブ法であって、次の工程を含む；ベンゾフェノン（３）を含有するハイドロゲル層を基材（６）の上に作製する工程と；ハイドロゲル層を酸素タンク（４）と接触させる工程と；ハイドロゲル層の光が照射された領域を液体に変えるために、ベンゾフェノンを活性化することのできる光（５）をハイドロゲル層に選択的に照射する工程と；液体を除去する工程と；を含み、ハイドロゲルは、光開裂性基を有さない。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイドロゲルを構造化するためのサブトラクティブ法であって、
ベンゾフェノン（３）を含有するハイドロゲル層を基材（６）の上に作製する工程と、
前記ハイドロゲル層を酸素リザーバー（４）と接触させる工程と、
前記ベンゾフェノンを活性化することのできる光（５）を前記ハイドロゲル層に選択的に照射し、前記ハイドロゲル層の前記光が照射された領域を液体に変える工程と、
前記液体を除去する工程と、を含み、
前記ハイドロゲルは光開裂性基（ｐｈｏｔｏｃｌｅａｖａｂｌｅ  ｇｒｏｕｐ）を有さない、方法。
【請求項２】
前記ハイドロゲルはポリエチレングリコール（１）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ハイドロゲルはアガロースゲルである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ハイドロゲルは基底膜マトリックスの抽出物である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ハイドロゲル（１，２）はポリアクリルアミドである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記選択的な光線照射は、前記ハイドロゲルの中にのびるチャネルに沿って行われる、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記選択的な光線照射は、３１５〜４００ｎｍの光を発する光源によって得られる、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記光源は、３７５ｎｍで光（５）を発する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記選択的な光線照射は、顕微鏡を介して得られ、かつ前記顕微鏡の広視野にわたる、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ベンゾフェノン（３）は、ＰＬＰＰ（（４−ベンゾイルベンジル）トリメチルアンモニウムクロリド）である、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記光源は、連続レーザーと、空間変調器とを含む、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１２】
前記空間変調器は、マイクロミラーのアレイである、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光によってハイドロゲルを微細構造化するための一般的な方法またはプロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
光によるハイドロゲルのマイクロファブリケーションまたは微細構造化は、先行技術で知られている方法で行われ、特に特定のハイドロゲルについては、ゲル前駆体に直接グラフトされた光開裂性基（ｐｈｏｔｏｃｌｅａｖａｂｌｅ  ｇｒｏｕｐ）を用いる（非特許文献１参照）か、いわゆる「フェムト秒」超高出力赤外レーザーを任意のハイドロゲルの表面に点走査する（非特許文献２参照）ことによって行われている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】"Photo-degradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties", Science. April 3, 2009; 324(5923): 59-63
【非特許文献２】"Laser photo-ablation of guidance microchannels into hydrogels directs cell growth in three dimensions", Biophysical Journal Vol. 96, June 2009, 4743-4752
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、先行技術には、非常に多様な性質を有する（光開裂性基を持たない）ハイドロゲルを、全視野または広視野すなわち表面の多数の点で同時に分解するための手段は存在しない。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
この文脈において、本発明は、
ベンゾフェノンを含むハイドロゲル層を基材の上に作製する工程と、
ハイドロゲル層を酸素リザーバーと接触させる工程と、
ハイドロゲル層に選択的に光を照射し、ハイドロゲル層を液体に変える工程と、
液体を除去する工程と、
を含む、ハイドロゲルを構造化するためのサブトラクティブ法に関する。
【０００６】
上述したように、本発明は特に、光開裂性基を有しないハイドロゲル、すなわち光分解性を有しないハイドロゲルを対象とする。
ベンゾフェノンを活性化できる光をハイドロゲル層に照射することこそが、酸素の存在下、ベンゾフェノンの活性化を利用して、ハイドロゲル層のうち光が照射された領域を液体に変換することができるようにするのである。
【０００７】
本明細書において、「酸素リザーバー」とは、上述した変換に必要な酸素、より正確には、本発明者らによって発見されたハイドロゲルのマトリックスの光開裂（ｐｈｏｔｏ−ｓｃｉｓｓｉｏｎ）現象に必要な酸素が確実に存在するようにするための任意の手段をいう。空気が、この種の酸素リザーバーを構成してもよい。
【０００８】
本方法の変形例において、以下の規定が独立してまたは互いに組み合わせて採用される。
ハイドロゲルはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
ハイドロゲルはアガロースゲルである。
ハイドロゲルは基底膜マトリックスの抽出物である。
ハイドロゲルはポリアクリルアミドである。
選択的な光線照射は、ハイドロゲルの中にのびるチャネルに沿って行われる。
選択的な光線照射は、３１５ｎｍ〜４００ｎｍ、特に３７５ｎｍの光を発する光源によって得られる。
選択的な光線照射は、顕微鏡を介して得られ、顕微鏡の広い視野にわたる。
ベンゾフェノンは、ＰＬＰＰ（（４−ベンゾイルベンジル）トリメチルアンモニウムクロリド）である。
光源は、連続レーザーと空間変調器とを含む。
空間変調器は、マイクロミラーのアレイまたは「デジタルマイクロミラーデバイス」（ＤＭＤ）である。
【０００９】
上述した特徴および利点などは、以下に示す実施形態の詳細な説明を読めば、より一層明らかになるであろう。この詳細な説明では、添付の図面を参照する。しかしながら、本発明はこれらの例に限定されないことに注意されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本発明の方法に供されたハイドロゲルの２つの状態、すなわち第１の状態（Ａ）および第２の状態（Ｂ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
生理的条件下での細胞培養には、細胞を囲んで細胞の挙動を決定する化学信号、力、形状を再現するハイドロゲルの作製が必要である。
しかしながら、大きさを細かく適合および調節可能なハイドロゲルを作製するには、通常、化学および／または高出力の光学装置への多額の投資が求められる。
このため、大半のハイドロゲルでは、ハイドロゲルをその表面から除去して掘り出したり、ハイドロゲルからなる層の内部にマイクロチャネルを形成したりするために、特にサブトラクティブに、ハイドロゲルを微細加工することに応用可能で十分に一般的な手段に対する需要がある。
実際、この種の作製によって、こうして改変または機械加工されたハイドロゲル層で、特に細胞生物学で有用なニューロンまたは細胞株の増殖を想定できるようになる。
【００１２】
本願において、ハイドロゲルは、水溶液である液相と、低硬度または軟質または粘弾性の固相またはマトリックスとからなる軟質の二相集合体であると考えられる。
そうすると、本発明の大ざっぱな発明の概念は、この文脈において、液相が酸素とベンゾフェノンとを含有する（contain）またはこれらを含む（comprise）ハイドロゲルを選択的に光に曝露すなわち、当該ハイドロゲルに光を照射することである。実際、この操作に付随して、本発明者らはハイドロゲルのマトリックスの光開裂による新たな効果を発見した。それによって、光が照射されたハイドロゲルの固体部分が液体に変換されるか、ハイドロゲルの液相によって運ばれ、液相と一緒にハイドロゲルのマトリックスを通って輸送可能な小片またはラジカルに変換される。
その後、特に水で洗浄し、ハイドロゲルの光に曝露されて文字通り液状化した固体部分ならびにハイドロゲルの液相中に含まれるベンゾフェノンを除去することによって液相を除去して更新し、最終的に、光に曝露された部分と、それ以外では化学修飾がなされていないマトリックスで、サブトラクティブに物理的に構造化されたハイドロゲルを得ることができる。
【００１３】
本発明者らは、驚くべきことに、ベンゾフェノン（または光開始剤）および酸素の存在下での光開裂現象を様々なタイプのハイドロゲルに適用可能であり、少なくとも、その液相を介してマトリックス中で選択されたベンゾフェノンおよび酸素を拡散させることのできるハイドロゲルに、適用可能であることを発見した。
【００１４】
本発明のすべての実施形態において、微細構造化されるハイドロゲルは、液相での拡散によってその更新を可能にする酸素リザーバーと接触されなければならない。本発明者らは、実際に、マトリックスの光開裂時に酸素が消費されるか、いずれにせよ液相中でその濃度が低下することを観察した。
【００１５】
本発明のすべての実施形態において、光開裂の光開始剤は水溶性であり、特に、光開裂の光開始剤は水溶性ベンゾフェノンであり、特に、光開裂の光開始剤はＰＬＰＰ型の水溶性ベンゾフェノンまたは（４−ベンゾイルベンジル）トリメチルアンモニウムクロリドである。
【００１６】
本発明のすべての実施形態において、深い構造化効果を得ることができるように、ハイドロゲルは使用される選択的な光線照射源に対して透明かつ酸素透過性であり、光が照射された体積全体にわたって光開裂が均一に起こると仮定される。
【００１７】
図１を参照すると、第１の実施形態では、ハイドロゲル、例えば、基材６に堆積されたＰＥＧハイドロゲルは本発明の方法に供され、第１の状態Ａから第２の状態Ｂに移行する。第１の状態Ａでは、ＰＥＧ１および水２を含有するか含むハイドロゲルは、ベンゾフェノン３および酸素４も含み、このハイドロゲルに、光５が照射される。曝露時間が経過して水洗した後、ハイドロゲルは第２の状態Ｂに移行する。このとき曝露箇所でハイドロゲルの物質が抜き取られ、ベンゾフェノン３が消失して、ハイドロゲル中に基材６まで空洞化されたチャネルまたは溝が残る。言い換えれば、ハイドロゲルの光が照射された部分からハイドロゲルが一様に除去され、基材６までハイドロゲルの中をくぼみが通るという意味で、抜き取られた物質が、基材６上に開口する穴または溝またはチャネルを形成する。
【００１８】
このように、この第１の実施形態では、ＰＥＧすなわちポリエチレングリコールのハイドロゲルが使用される。ＰＥＧは、実際には、その優れた生体適合性で知られており、タンパク質のマイクロプリントや生細胞の培養に選択される材料となっている。
このようにして、第１の状態Ａに到達するために、ベンゾフェノン３を含む水溶液にＰＥＧ層を均一に接触させる。典型的には、この層は、水溶性ベンゾフェノンＰＬＰＰを含む水溶液で洗浄される。
したがって、この予備的な洗浄の終了時には、ハイドロゲルの液相はベンゾフェノンを含有する。ベンゾフェノンの分子は小さいため、ハイドロゲルに付着することなく、ハイドロゲルのマトリックスに近づけることができる。
このようにして調製されたハイドロゲルは、本発明の意味では、ベンゾフェノンを含有するか含むハイドロゲルである（「含有するか、含む」は、その液相に適用される）。この定義は、すべての実施形態に当てはまる。
【００１９】
次に、公知の方法で、酸素リザーバーまたは貯蔵庫を介して、ＰＥＧ層を酸素の均一な層と接触させる。酸素の分子は、その後、ハイドロゲルの液相中でも拡散し、そうするとこれが、水、ベンゾフェノンおよび酸素４の混合物を含むことになる。
【００２０】
次に、ベンゾフェノンの吸収帯で発光する光源、例えばレーザーなど波長３７５ｎｍの光を発する光源によって、様々な時間、選択的にすなわち空間パターンに従って、ゲルまたはハイドロゲルに光５が照射される。
【００２１】
使用される光源は、例えば、波長３７５ｎｍで発光し、光出力７５ｍＷのリファレンスＴＯＰＴＩＣＡ  ｉＢｅａｍ−ＳＭＡＲＴ  ３７５−Ｓのレーザー光源である。しかしながら、前述の光源と同程度の大きさの出力を有する、ＵＶ−Ａ（３１５〜４００ｎｍの間で発光）の任意の光源が、ベンゾフェノンを活性化して光開裂機構を誘発することができるであろう。
【００２２】
特に注目すべきは、この光源がマトリックスを揮発させるようなパルス光源ではなく、むしろ連続レーザー光源としては低出力であることである。
【００２３】
さらに注目すべきは、使用される光源が光開裂効果を維持したまま顕微鏡の視野に分散され、したがって、この出力もハイドロゲルでの低レベルの光線照射に対応することである。これによって、使用される光源の光に対してハイドロゲルが透明であるか、そうでなければその表面に近い場合に、実験で約２００００秒であると推定される限られた時間であるが、視野のすべての点すなわち広視野で、したがってハイドロゲルの体積のすべての点で平行に、光開裂を得られるようになる。
【００２４】
また、選択的な光線照射は小さな開口数で実施できることに留意すべきであり、この特徴は、ある点での光線照射をさらに低下させるが、本発明の方法では、照射ビームの中間光線にほぼ平行な微細構造化された表面の切り欠きが得られ、特に本発明で直線的な側面を有するチャネルが得られるようになる。
したがって、パルスの持続時間に関連して高エネルギーのいわゆる「フェムト秒」レーザーすなわち、その性質上、できるだけ大きな開口数で、表面に可能なかぎり集束されるレーザーによるハイドロゲルの光アブレーションに基づいて、当業者がレーザーの出力を下げることで本発明を得ることはないであろう点に注意されたい。
【００２５】
さらに、マトリックスに付着した化学ラジカルで修飾されたハイドロゲルで光開裂を実施する当業者は、ハイドロゲルの観点から物理的作用として現れ、したがって光開裂とは性質が異なる本発明の光開裂効果を得られないであろうことにも注意されたい。
【００２６】
第２の実施形態では、先行技術から知られているアガロースゲルを使用しても同様の結果が得られ、特にゲルに溝（すなわち、基材までゲルに掘られた細長いくぼみ）が形成されて、これらの形成の可能性は本発明のすべての実施形態に及ぶ。ＰＥＧの場合と同じ方法および装置を使用して、この種のアガロースゲルの構造化が得られた。アガロースハイドロゲルの光開裂時間は約２００００ｓ（秒）すなわち、ＰＥＧハイドロゲルの１０倍の持続時間であることが、実験によって明らかになった。
【００２７】
第３の実施形態では、商品名「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」で知られる基底膜から抽出されたハイドロゲルを使用した。このハイドロゲルは、十分な生体適合性があり、前記培養に好適な粘弾性を持つため、三次元（３Ｄ）細胞培養に非常に広く用いられている。しかしながら、このハイドロゲルには、ゲルの光分解と、それによる構造化を可能にする化学的官能基がない。また、光開始剤と混合すればＵＶ硬化が可能であるが、この操作によって粘弾性が変化するため、細胞培養での有用性が低下する。いずれにしろ、サブトラクティブにすなわち光を利用して物質を除去することによって微細構造化するための手段は、先行技術には存在しない。「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」の光開裂時間は、実験によって６０００ｓ（秒）と推定された。
【００２８】
本発明の方法またはプロセスは、上述した２つの実施形態と同じ様に実施することができる。さらに、ＰＥＧと「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」（「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」は、例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌａｂ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓｓ社またはＢＤ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社によって製造される）の不均一なハイドロゲルを得ることも可能である。事実、ＰＥＧでの光開裂よりも「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」での光開裂のほうが大幅に遅いことが実験で観察されている。したがって、ＰＥＧ層を、ガラス基材もしくはプラスチック基材またはＰＤＭＳの薄膜に適宜堆積された「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」層に堆積させて構成したい場合は、「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」層を基材として使用することが可能である。
【００２９】
また、本発明による方法で、基底膜マトリックスからの抽出物、特に「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」とＰＥＧの不均一なハイドロゲルを、ＰＥＧ層の平面に得ることも可能である。このために、まず、本発明の方法でＰＥＧ層にマイクロ流体チャネルの構造を作製し、これらのチャネルに「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」を充填した後、本発明の方法を「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」に対して繰り返し、ＰＥＧチャネルの構造でその構造化を得る。このためには、酸素と光開始剤に対して透過性があり、光線照射によって除去される部分と接触して配置された膜、特にＰＤＭＳの膜を使用すると都合がよい。この膜によって特に、層の平面におけるＭａｔｒｉｇｅｌの範囲を、ＰＥＧのチャネルの構造に限定できるようになる。ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）はＵＶを透過するため、特に、光開裂を得るために用いられる光をほとんどまたは全く透過しない基材で本発明を実施するために、最初に（基材を介してではなく）この膜を介して光の伝播方向に光を照射することを選択することがさらに可能になる。本発明のすべての実施形態において、膜が存在しない状態で、基材に透明性がほとんどないか全くない場合に、基材から最も遠い層を介して光を照射することも可能になる。
【００３０】
本発明の方法またはプロセスは、水性ゲルであるハイドロゲル、またはポリアクリルアミド、すなわち化学式［−ＣＨ２−ＣＨ（−ＣＯＮＨ２）−］ｎのポリマー、のハイドロゲルを用いて、上述した実施形態の場合と同じ様に実施することができる。ポリアクリルアミドハイドロゲルの光開裂時間は、実験によって４０００ｓ（秒）と推定された。
【００３１】
このように、本発明による方法は、２Ｄ細胞培養または３Ｄ細胞培養のための均一または不均一なハイドロゲルで多数の構造体を作製することが可能なように思われる。
【００３２】
水（ひいてはハイドロゲル）に可溶なベンゾフェノンが拡散できるハイドロゲルを選択するには、本発明の方法を実施することなく、ベンゾフェノンのフォトルミネッセンスの特性を利用して、本発明のためのハイドロゲルの適合性を定量することが可能であろう。このために、公知の技術によれば、ハイドロゲルを選択するために、ベンゾフェノンのフォトルミネッセンスを時間の関数として１箇所以上の正確な点で測定することが可能になる。このため、ハイドロゲルマトリックス中のベンゾフェノンの拡散率が最も高いものが好ましい。
同様に、２種類のハイドロゲルの生体適合性を揃えるために、酸素の拡散率が他のものよりも大きいハイドロゲルが、本発明には好ましいであろう。
【００３３】
都合のよいことに、任意のパターンでハイドロゲルに光を照射し、様々な方法でハイドロゲルを構造化できるようにするために、本発明の光線照射システムは、顕微鏡とＤＭＤ（コンピュータによって個別に制御されたマイクロミラーのセットまたは自動化されたマイクロミラーのセット）を含むことになる。
【００３４】
本発明の教示内容は、様々な種類の基材にまで及ぶ。基材は、実際にはまったく光開裂の影響を受けないものであってもよく、基材が支持するハイドロゲルよりもゆっくりと光開裂で分解されるものであってもよい。光開裂の影響を受けない基材の例としては、ガラスおよびプラスチック、あるいは、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサンまたはジメチコン）の薄膜が挙げられる。基材の別の例によれば、上述したように、「ＰＥＧ」よりもはるかに遅い速度で光開裂される「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」層を、ＰＥＧハイドロゲル用の基材として使用することができ、これに比して、それはゆっくり光分解する。
【００３５】
また、本発明の教示内容は、基材の上に層状に重ねられた複数のハイドロゲルからなる構造化された積層体を得ることにも及び、本発明の方法によって得られる積層体自体にも及ぶ。
【００３６】
特に、本発明の教示内容は、光開裂時間が異なる少なくとも２つの層を含む積層体にも及ぶ。
そのような積層体を用いて、抜き取られる対象となる各層に本発明の方法を連続的に適用し、光線照射時間および光線照射パターンを光線照射対象となる層に合わせることで、実際、本発明の方法によって複雑な構造を得ることが可能になるであろう。
基材上の２つのハイドロゲル層の場合、犠牲層では、基材に向かって短くなる光開裂時間を選択することが可能であり、基材に向かって下降するステップでは、基材に向かって長くなる光開裂時間と基材に向かって小さくなる光線照射領域を選択することが可能である。
【００３７】
いずれの場合も、適用される原理は、光開裂時間を長くして、別のハイドロゲルを液化させることなく、ハイドロゲルの光があたった部分を液体にして除去することになる。
このように、本発明の方法を用いることで、当業者は、積層体に存在する各タイプのハイドロゲルの光開裂時間についての単純な知識に基づいて、ハイドロゲルの積層体をサブトラクティブに構造化できるようになる。
【００３８】
都合のよいことに、当業者であれば、積層体の１層について、あるいは一度に複数の層について、積層体での光開裂時間、光線照射時間、積層体での光線照射パターンに応じて、自動光線照射システムの全視野または広視野で、この構造化を１回で得ることができる。
【００３９】
したがって、本発明の方法および当該方法によって得られる多数の生成物は、最終的に、物質の除去によって、基材の上でハイドロゲル層またはハイドロゲル層の積層体を構造化する一般的な手段となる。
【００４０】
本発明による方法は、ハイドロゲル層上またはハイドロゲル層の積層体上での細胞の三次元（３Ｄ）培養の分野で産業上の利用が可能である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【国際調査報告】
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2021529241.tif 000008
2021529241.tif 000009
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