(57)【要約】本発明は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるポリペプチドをコードする核酸分子、（ｂ）配列番号２のヌクレオチド配列からなる核酸分子；（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％同一であるポリペプチドをコードする核酸分子；（ｄ）配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも７０％同一であり、好ましくは少なくとも８０％同一であり、より好ましくは少なくとも９０％同一であり、最も好ましくは少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列からなる核酸分子；（ｅ）（ｄ）の核酸分子に対して縮重したヌクレオチド配列からなる核酸分子；（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つの核酸分子の断片であって、前記断片が、少なくとも１５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも３００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも４５０ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも６００ヌクレオチドを含む核酸分子；または（ｇ）ＴがＵで置換されている、（ａ）〜（ｆ）のいずれか１つの核酸分子に対応する核酸分子に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫抑制剤として、腫瘍ワクチンとして、または妊娠促進剤として使用するための核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの組合せであって、
（Ｉ）  核酸分子が
（ａ）  配列番号１のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるポリペプチドをコードするか、または
（ｂ）  配列番号２のヌクレオチド配列からなるか、または
（ｃ）  配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％同一であるポリペプチドをコードするか、または
（ｄ）  配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも７０％同一であり、好ましくは少なくとも８０％同一であり、より好ましくは少なくとも９０％同一であり、最も好ましくは少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列からなるか、または
（ｅ）  （ｄ）の核酸分子に対して縮重したヌクレオチド配列からなるか、または
（ｆ）  （ａ）〜（ｅ）のいずれか１つに記載の核酸分子の断片であって、前記断片は、少なくとも１５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも３００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも４５０ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも６００ヌクレオチドを含むか、または
（ｇ）ＴがＵで置換されている、（ａ）〜（ｆ）のいずれかに記載の核酸分子に対応し；
（ＩＩ）  ベクターが、（Ｉ）の核酸分子を含み；
（ＩＩＩ）  宿主細胞が（ＩＩ）のベクターで形質転換、形質導入またはトランスフェクトされ、および
（ＩＶ）  （Ｉ）の核酸分子によってコードされるタンパク質またはペプチドである、
核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの組合せ。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸分子の阻害剤および／または請求項１に記載のタンパク質の結合分子であって、好ましくは免疫活性化剤として使用するための、好ましくは腫瘍の治療に使用するための、請求項１に記載のタンパク質の阻害剤。
【請求項３】
請求項２に記載の結合分子、好ましくは阻害剤であって、
（ｉ）  核酸分子の阻害剤が、低分子、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸分子、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ベースの構築物、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１ベースの構築物、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、および転写アクチベーター様（ＴＡＬ）エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼから選択されるか、および／または
（ｉｉ）  タンパク質の結合分子、好ましくはタンパク質の阻害剤が、低分子、抗体または抗体模倣物、アプタマーから選択され、ここで、抗体模倣物は好ましくはアフィボディ、アドネクチン、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ、アビマー、ナノフィチン、アフィリン、クニッツドメインペプチド、Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）、三重特異性結合分子およびプロボディから選択される、
結合分子、好ましくは阻害剤。
【請求項４】
請求項１（Ｉ）（ｇ）に記載の核酸分子の使用または請求項１に記載のタンパク質もしくはペプチドの使用であって、対象から得られた試料における、腫瘍を診断するための、および／または腫瘍を悪性度判定するための、腫瘍を予後診断するための、および／またはおよび／または腫瘍をＨＬＡ−Ｊ低発現腫瘍もしくはＨＬＡ−Ｊ高発現腫瘍として分類するための、および／または移植不全を診断するための使用。
【請求項５】
請求項１（Ｉ）（ｇ）に記載の核酸分子および／または請求項１に記載のタンパク質またはペプチドの存在を、対象から得られた試料中で検出することを含む、腫瘍を診断するための方法であって、請求項１（Ｉ）（ｇ）に記載の核酸分子および／または請求項１に記載のタンパク質の存在が、対象中の腫瘍を示す、方法。
【請求項６】
対象から得られた試料中の、請求項１（Ｉ）（ｇ）に記載の核酸分子のレベルおよび／または請求項１に記載のタンパク質またはペプチドのレベルを決定することを含む、腫瘍を悪性度判定するためのおよび／または腫瘍を予後診断するための方法であって、請求項１（Ｉ）（ｇ）に記載の核酸分子のレベルおよび／または請求項１に記載のタンパク質またはペプチドのレベルの、対照と比較した増加が、腫瘍のより高い悪性度判定および／または有害な腫瘍予後と相関する、方法。
【請求項７】
腫瘍を診断するための、および／または腫瘍を悪性度判定するための、および／または腫瘍を予後診断するためのキットであって、
（ａ）  対象から得られた試料における、請求項１（Ｉ）（ｇ）に記載の核酸分子および／または請求項１に記載のタンパク質またはペプチドの検出および／または定量のための手段、および
（ｂ）  キットの使用のための説明書
を含む、キット。
【請求項８】
腫瘍を有する対象において腫瘍治療の非有効性をモニターするための方法であって、
（ａ）治療の開始前に対象から得られた試料中の請求項１（Ｉ）（ｇ）に記載の核酸分子の量および／または請求項１に記載のタンパク質またはペプチドの量を決定すること；および
（ｂ）治療の開始後１回以上において、対象から得られた試料中の請求項１（Ｉ）（ｇ）に記載の核酸分子の量および／または請求項１に記載のタンパク質またはペプチドの量を決定することを含み、
ａ）と比較してｂ）における量の増加は、腫瘍治療の非有効性を示し、および／またはａ）と比較してｂ）における量の減少は、腫瘍治療の有効性を示す、方法。
【請求項９】
免疫抑制療法の非有効性を、該治療を必要とする対象においてモニターするための方法であって、
（ａ）治療開始前に対象から得られた試料中の請求項１（Ｉ）（ｇ）に記載の核酸分子の量および／または請求項１に記載のタンパク質もしくはペプチドの量を決定すること；および
（ｂ）治療開始後の１回以上において、対象から得られた試料中の請求項１（Ｉ）（ｇ）に記載の核酸分子の量および／または請求項１に記載のタンパク質もしくはペプチドの量を決定することを含み、
ａ）と比較してｂ）における量の減少は、免疫抑制療法の非有効性を示し、および／またはａ）と比較してｂ）における量の増加は、免疫抑制療法の有効性を示す、方法。
【請求項１０】
前記腫瘍ががんである、請求項１に記載の核酸分子、ベクター、宿主細胞、および／またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの組合せ、請求項２または３に記載の結合分子、好ましくは阻害剤、請求項４に記載の使用、請求項５、６または８に記載の方法、または請求項７に記載のキット。
【請求項１１】
前記がんが、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、膣がん、外陰部がん、膀胱がん、唾液腺がん、膵臓がん、甲状腺がん、腎臓がん、肺がん、上部消化管のがん、結腸がん、直腸結腸がん、前立腺がん、頭頸部の扁平上皮がん、子宮頸がん、神経膠芽腫、悪性腹水、リンパ腫および白血病からなる群から選択される、請求項１０に記載の核酸分子、ベクター、宿主細胞、および／またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの組合せ、結合分子、好ましくは阻害剤、使用、方法、またはキット。
【請求項１２】
前記がんが婦人科系がんである、請求項１０に記載の核酸分子、ベクター、宿主細胞、および／またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの組合せ、結合分子、好ましくは阻害剤、使用、方法、またはキット。
【請求項１３】
前記がんが乳がんまたは卵巣がんである、請求項１０に記載の核酸分子、ベクター、宿主細胞、および／またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの組合せ、結合分子、好ましくは阻害剤、使用、方法、またはキット。
【請求項１４】
前記試料が体液または臓器由来の組織試料である、上記請求項に記載の核酸分子、ベクター、宿主細胞、および／またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの組合せ、結合分子、好ましくは阻害剤、使用、方法、またはキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるポリペプチドをコードする核酸分子、（ｂ）配列番号２のヌクレオチド配列からなる核酸分子；（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であり、好ましくは少なくとも８０％同一であり、より好ましくは少なくとも９０％同一であり、最も好ましくは少なくとも９５％同一であるポリペプチドをコードする核酸分子；（ｄ）配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも７０％同一であり、好ましくは少なくとも８０％同一であり、より好ましくは少なくとも９０％同一であり、最も好ましくは少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列からなる核酸分子；（ｅ）（ｄ）の核酸分子に対して縮重したヌクレオチド配列からなる核酸分子；（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つの核酸分子の断片であって、前記断片が、少なくとも１５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも３００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも４５０ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも６００ヌクレオチドを含む核酸分子；または（ｇ）ＴがＵで置換されている、（ａ）〜（ｆ）のいずれか１つの核酸分子に対応する核酸分子に関する。
【０００２】
本明細書では、特許出願及び製造業者のマニュアルを含む多くの文献が引用されている。これらの文書の開示は、本発明の特許性に関連するとは考えられないが、その全体は本明細書に参照により援用される。より具体的には、全ての参照文書は、各個々の文書が参照により援用されることが具体的かつ個別に示された場合と同程度に、参照により援用される。
【０００３】
ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）系または複合体は、ヒトの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質をコードする遺伝子複合体である。これらの細胞表面タンパク質は、ヒトの免疫系の調節を担っている。ＨＬＡ遺伝子複合体は、染色体６ｐ２１内の３Ｍｂｐの領域に存在する。この複合体中の遺伝子は、３つの基本的なグループ：クラスＩ、クラスＩＩ、およびクラスＩＩＩに分類される。
【０００４】
ヒトには、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃとして知られる３つの主要なＭＨＣクラスＩ遺伝子がある。これらの遺伝子から産生されるタンパク質は、ほとんど全ての細胞の表面に存在する。細胞表面では、これらのタンパク質が細胞内からエキスポートされたタンパク質断片（ペプチド）に結合する。ＭＨＣクラスＩタンパク質は、これらのペプチドを免疫系に提示する。免疫系が外来ペプチド（ウイルスや細菌のペプチドなど）を認識すると、感染細胞を自己破壊の引き金にして応答する。
【０００５】
ヒトにはＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１の６つの主要なＭＨＣクラスＩＩ遺伝子が存在する。ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子は、ほとんど独占的に特定の免疫系細胞の表面だけに存在するタンパク質をつくるための指示を提供している。ＭＨＣクラスＩタンパク質と同様に、これらのタンパク質は免疫系にペプチドを提示する。
【０００６】
ＭＨＣクラスＩＩＩ遺伝子から産生されるタンパク質は多少異なった機能をもっており、炎症や他の免疫系活性に関与している。一部のＭＨＣ遺伝子の機能は不明である。
【０００７】
ＨＬＡ遺伝子には多くの可能な変異があり、各人の免疫系が広範囲の外来侵入物に反応できるようになっている。ＨＬＡ遺伝子の中には、数百の同定されたバージョン（対立遺伝子）をもつものがあり、その各々には特定番号（ＨＬＡ−Ｂ２７など）が与えられている。密接に関連した対立遺伝子は一緒に分類される。例えば、少なくとも４０の非常によく似た対立遺伝子はＨＬＡ−Ｂ２７のサブタイプである。これらのサブタイプはＨＬＡ−Ｂ＊２７０１〜ＨＬＡ−Ｂ＊２７４３と命名されている。
【０００８】
１００以上の疾患が、ＨＬＡ遺伝子の異なる対立遺伝子と関連している。例えば、ＨＬＡ−Ｂ２７対立遺伝子は、強直性脊椎炎と呼ばれる炎症性関節疾患を発症するリスクを増大させる。免疫機能の異常およびある種のがんを含む他の多くの疾患もまた、特異的ＨＬＡ対立遺伝子と関連している。しかし、これらの疾患の発症リスクにＨＬＡ遺伝子がどのような役割を果たしているかは不明なことが多い。
【０００９】
３つの主要なＭＨＣクラスＩ遺伝子であるに続いて、非古典的ＭＨＣクラスＩ分子ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−ＦおよびＨＬＡ−ＧはＨＬＡクラスＩ領域によってコードされている。ＨＬＡ−Ｇ、−Ｅ、および−Ｆの過剰発現は様々な悪性腫瘍にわたる一般的な所見である（Kochan et al., Oncoimmunology. 2013 Nov 1; 2(11): e26491.）。ＨＬＡ−ＧおよびＨＬＡ−Ｅはがんのバイオマーカーであり、がんの不良な臨床転帰と正の相関があると報告された。
【００１０】
ＨＬＡクラスＩ領域はさらに、クラスＩ偽遺伝子ならびに遺伝子断片を含むことが報告された（Hughes, Mol Biol Evol.1995 Mar; 12(2):247-58）。例えば、ＨＬＡ−Ｈ、Ｊ、ＫおよびＬはクラスＩ偽遺伝子として分類され、ＨＬＡ−Ｎ、ＳおよびＸは遺伝子断片として分類される。特に、ＨＬＡ−Ｊはエキソン２またはエキソン４のいずれかにおいて翻訳終結を生じる有害な突然変異により、偽遺伝子であることが Messer et al., J Immunol. 1992 Jun 15; 148(12):4043-53により報告された。
【００１１】
米国特許第 9,353,416 B2号は、ＨＬＡ−Ｊが乳がん罹患患者の術後予後のマーカーとして利用できると考察している。より具体的には、ＨＬＡ−Ｊが様々な他のマーカーとともに、過剰発現した場合に良好な予後を提供する。ＨＬＡ−Ｊ配列の性質に関しては、米国特許第9,353,416 B2号において、 Messer et al., J Immunol. 1992 Jun 15; 148(12):4043-53によって報告されているＨＬＡ−Ｊ配列が正しいと仮定されている。さらに、ＨＬＡ−Ｊが良好な予後のマーカーであるという仮定に沿って、米国特許第9,353,416 B2号は、腫瘍ワクチンとしてのＨＬＡ−Ｊの使用の可能性について沈黙している。
【００１２】
したがって、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子は、生物医学科学および治療における重要な標的として長い研究歴を有する。しかしながら、ＨＬＡシステムの臨床的重要性を考慮すると、ＨＬＡ遺伝子に焦点を当て、特に、ＨＬＡシステムに基づく生物医学および治療のさらなる標的を同定するための研究に焦点を合わせる必要がある。この必要性は、本発明によって対処される。本発明に関連して、驚くべきことに、ＨＬＡ−Ｊは偽遺伝子ではなく、ＨＬＡ−Ｊタンパク質をコードする機能的オープンリーディングフレームを含み、ＨＬＡ−Ｊは疾患、特に腫瘍の治療および検出のための標的であることが見出された。
【００１３】
よって、第一の態様において、本発明は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるポリペプチドをコードする核酸分子、（ｂ）配列番号２のヌクレオチド配列からなる核酸分子；（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であり、好ましくは少なくとも８０％同一であり、より好ましくは少なくとも９０％同一であり、最も好ましくは少なくとも９５％同一であるポリペプチドをコードする核酸分子；（ｄ）配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも７０％同一であり、好ましくは少なくとも８０％同一であり、より好ましくは少なくとも９０％同一であり、最も好ましくは少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列からなる核酸分子；（ｅ）（ｄ）の核酸分子に対して縮重したヌクレオチド配列からなる核酸分子；（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つの核酸分子の断片であって、前記断片が、少なくとも１５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも３００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも４５０ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも６００ヌクレオチドを含む核酸分子；または（ｇ）ＴがＵで置換されている、（ａ）〜（ｆ）のいずれか１つの核酸分子に対応する核酸分子に関する。
【００１４】
本発明による用語「核酸分子」は、ｃＤＮＡなどのＤＮＡ、または二本鎖もしくは一本鎖ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡを含む。この点に関して、「ＤＮＡ」（デオキシリボ核酸）は、ヌクレオチド塩基と呼ばれる、デオキシリボース糖骨格上で一緒に連結された、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）の化学構築ブロックの任意の鎖または配列を意味する。ＤＮＡは、ヌクレオチド塩基の一本鎖、または二重らせん構造を形成することができる２本の相補鎖を有することができる。「ＲＮＡ」（リボ核酸）は、リボース糖骨格上で一緒に連結されたヌクレオチド塩基と呼ばれる、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を構成する化学構築ブロックの任意の鎖または配列を意味する。ＲＮＡは、典型的にはｍＲＮＡのようなヌクレオチド塩基の一本鎖を有する。また、一本鎖および二本鎖ハイブリッド分子、すなわち、ＤＮＡーＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡも含まれる。核酸分子はまた、当該分野で公知の多くの手段によって改変され得る。このような修飾の非限定的な例としては、メチル化、「キャップ（ｃａｐｓ）」、１つ以上の天然に存在するヌクレオチドのアナログでの置換、およびヌクレオチド間修飾、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメートなど）および荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を有するものなどが挙げられる。核酸分子(以下においてポリヌクレオチドとも呼ばれる)には、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジン等）、インターカレーター（例えば、アクリジン、プソラレン等）、キレーター（例えば、金属、放射性金属、鉄、酸化的金属等）、及びアルキレーターのような、１つ以上の追加的な共有結合部分を含んでもよい。ポリヌクレオチドはメチルまたはエチルホスホトリエステルあるいはアルキルホスホルアミデート結合の形成によって誘導体化することができる。さらに、ＤＮＡまたはＲＮＡの合成または半合成誘導体および混合ポリマーなどの、当技術分野で公知の核酸模倣分子が含まれる。このような核酸模倣分子または核酸誘導体としては、ホスホロチオエート核酸、ホスホラミデート核酸、２´−Ｏ−メトキシエチルリボ核酸、モルホリノ核酸、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）およびロックド核酸（ＬＮＡ）が挙げられる（BraaschおよびCorey, Chem Biol 2001,8: 1を参照のこと）。ＬＮＡは、リボース環が２´−酸素と４´−炭素の間のメチレン結合によって拘束されているＲＮＡ誘導体である。また、修飾塩基を含む核酸、例えばチオウラシル、チオグアニンおよびフルオロウラシルが含まれる。核酸分子は、典型的にはタンパク質および／またはポリペプチドを作製するために細胞機構によって使用される情報を含む遺伝情報を保有する。
【００１５】
本発明の核酸分子はさらに、プロモーター、エンハンサー、応答エレメント、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、５´および３´非コード領域などを含み得る。本発明の核酸分子は、配列番号１のＨＬＡ−Ｊタンパク質に由来するポリペプチドまたはその断片をコードする。したがって、本発明の核酸分子は、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡであることが好ましい。ｍＲＮＡの場合、核酸分子はさらに、ポリＡテールを含み得る。
【００１６】
用語「タンパク質」は、本明細書中で用語「ポリペプチド」と互換的に使用される場合、少なくとも５０個のアミノ酸を含む、一本鎖タンパク質またはそれらの断片を含む、アミノ酸の線状分子鎖を表す。本明細書中で使用される用語「ペプチド」は４９個までのアミノ酸からなる分子の群を記載し、一方、本明細書中で使用される用語「ポリペプチド」（「タンパク質」とも呼ばれる）は、少なくとも５０個のアミノ酸からなる分子の群を記載する。本明細書で使用される「ペプチド」という用語は、好ましくは、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも２５アミノ酸、および少なくとも４０アミノ酸の分子群を表す。ペプチドおよびポリペプチドの群は、「（ポリ）ペプチド」という用語を用いて一緒に言及される。（ポリ）ペプチドはさらに、少なくとも２つの同一または異なる分子からなるオリゴマーを形成し得る。そのような多量体の対応する高次構造は、対応して、ホモ−またはヘテロ二量体、ホモ−またはヘテロ三量体などと呼ばれる。配列番号１のＨＬＡ−Ｊタンパク質は位置１３９、１７５および１８９にシステインを含み、したがって潜在的な二量体化部位を含む。さらに、アミノ酸および／またはペプチド結合が機能的アナログによって置換されている、このようなタンパク質／（ポリ）ペプチドのペプチド模倣物もまた、本発明に包含される。このような機能的類似体には、セレノシステインのような２０個の遺伝子コードアミノ酸以外の全ての公知のアミノ酸が含まれる。用語「（ポリ）ペプチド」および「タンパク質」はまた、天然に修飾された（ポリ）ペプチドおよびタンパク質をいい、ここで、修飾は例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化および当該分野で周知の類似の修飾によって達成される。
【００１７】
本発明によれば、「配列同一性パーセント（％）」という用語は、鋳型核酸またはアミノ酸配列の全長を構成するヌクレオチドまたはアミノ酸残基の数と比較した、２つ以上の整列した核酸またはアミノ酸配列の同一ヌクレオチド／アミノ酸の一致（「ヒット」）の数を表す。他の用語では、アラインメントを使用して、２つ以上の配列またはサブ配列について、同じ（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一）であるアミノ酸残基またはヌクレオチドのパーセンテージが比較の窓にわたって、または当技術分野で公知の配列比較アルゴリズムを使用して測定されるような指定された領域にわたって、または手動でアラインメントされ、視覚的に検査される場合に、（サブ）配列が比較され、そして最大対応についてアラインメントされる場合に決定され得る。この定義はまた、整列される任意の配列の相補体にも適用される。
【００１８】
本発明に関連するヌクレオチドおよびアミノ酸配列の分析およびアラインメントは、好ましくはＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Stephen F. Altschul, Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller,および David J. Lipman(1997), Nucleic Acids Res.25:3389-3402）を用いて行われる。ＢＬＡＳＴは、ヌクレオチド配列（ヌクレオチドＢＬＡＳＴ）およびアミノ酸配列（タンパク質ＢＬＡＳＴ）に使用することができる。当業者は、核酸配列を整列させるためのさらなる適切なプログラムを知っている。
【００１９】
本明細書で定義されるように、少なくとも７０％の同一、好ましくは少なくとも８０％の同一、より好ましくは少なくとも９０％の同一、および最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一が本発明によって想定される。しかし、本発明はまた、好ましくは、少なくとも９７．５％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、および１００％の配列同一性を想定する。
【００２０】
さらに、配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性または好ましいより高い同一性のいずれか１つを有するヌクレオチド配列内に、配列番号２の１６ヌクレオチド「ＴＣＡＣＡＣＡＴＴＴＣＴＧＧＡＡ」（配列番号３）が存在し、変化しないままであることが好ましい。図２から明らかなように、配列番号３は、配列番号２のＨＬＡ−Ｊ核酸分子にのみ見られるが、他のＨＬＡクラスの核酸分子には見られない１６ヌクレオチドの挿入突然変異に対応する。このようにして、１６ヌクレオチドの挿入はＨＬＡ−Ｊ核酸分子に対してユニークである。さらに、ヌクレオチド挿入は、フレームシフトを生じ、その結果、終止コドン「ＴＡＧ」を除く、挿入から配列番号２の３´末端までの核酸配列全体がユニークなペプチドをコードする。
【００２１】
したがって、配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性または好ましいより高い同一性のいずれか１つを有するヌクレオチド配列内に、配列番号２のヌクレオチド「ＴＣＡＣＡＣＡＴＴＴＣＴＧＧＡＡＡＣＴＴＣＴＣＡＡＧＧ  ＴＴＣＣＡＡＧＡＣＴＡＧＧＡＧＧＴＴＣＣＴＣ」（配列番号４）が存在し、変化しないままであることがより好ましい。配列番号４によってコードされるアミノ酸は、「ＨＴＦＬＥＴＳＱＧＳＫＴＲＲＦＬ」（配列番号５）である。したがって、配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列または好ましいより高い同一性のいずれか１つが、配列番号５を含むアミノ酸配列、好ましくはＣ末端をコードすることがより好ましい。
【００２２】
ＭＨＣクラスＩ分子は一般に、ＭＨＣアルファ鎖（重鎖）とベータ２ミクログロブリン鎖（軽鎖）の２つの鎖からなる。アルファ鎖のみが膜にまたがっている。アルファ鎖には３つの細胞外ドメインがある（アルファ１、２、３と命名され、アルファ１はＮ末端にある）。
ＨＬＡ−Ｊのアルファ鎖ドメインアルファ１およびアルファ３は、ＨＬＡ−Ｊの免疫抑制能力を主に決定し、ドメインアルファ３が最も重要であると考えられる。配列番号６および７のヌクレオチド配列は、それぞれＨＬＡ−Ｊのドメインアルファ１およびアルファ３をコードする。配列番号８および９のアミノ酸配列は、それぞれＨＬＡ−Ｊのドメインアルファ１およびアルファ３のアミノ酸配列である。したがって、配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一または、配列番号７と少なくとも９７．５％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、および１００％同一である、好ましさが増加したヌクレオチド配列を含む、好ましいより高い同一性のいずれか１つを有するヌクレオチド配列が好ましい。配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性または、配列番号９と少なくとも９７．５％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、および１００％同一である、好ましさが増加したヌクレオチド配列を含む、好ましいより高い同一性のいずれか１つを有するヌクレオチド配列が好ましい。配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性または、配列番号７と少なくとも９７．５％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、および１００％同一である、好ましさが増加したヌクレオチド配列を含む、および／または配列番号６と少なくとも９７．５％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、および１００％同一である、好ましさが増加したヌクレオチド配列を含む、好ましいより高い同一性のいずれか１つを有するヌクレオチド配列が好ましい。また、配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性または、配列番号９と少なくとも９７．５％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、および１００％同一である、好ましさが増加したヌクレオチド配列を含む、および／または配列番号８と少なくとも９７．５％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、および１００％同一である、好ましさが増加したヌクレオチド配列を含む、好ましいより高い同一性のいずれか１つを有するヌクレオチド配列が好ましい。
【００２３】
配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性または、（ｉ）配列番号３のヌクレオチド配列、好ましくは配列番号４のヌクレオチド配列であって、配列番号４は好ましくは３´末端であり、（ｉｉ）配列番号７と少なくとも９７．５％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、および１００％同一である、好ましさが増加したヌクレオチド配列であり、（ｉｉｉ）配列番号６と少なくとも９７．５％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、および１００％同一である、好ましさが増加したヌクレオチド配列、の２つまたは３つすべてを含む、好ましいより高い同一性のいずれか１つを有するヌクレオチド配列が最も好ましい。（ｉ）〜（ｉｉｉ）の２つの場合、２つは好ましくは（ｉ）および（ｉｉ）である。
【００２４】
本発明による「縮重」という用語は、遺伝暗号の縮重を指す。トリプレットコードは２０個のアミノ酸と終止コドンを指定し、遺伝情報をコードするのに利用される４個の塩基が存在するので、トリプレットコドンは少なくとも２１個の異なるコードをつくるのに必要である。トリプレット中の塩基の可能な４3の可能性は６４個の可能なコドンを与える。つまり、いくつかの縮重が存在しなければならないことを意味する。結果として、いくつかのアミノ酸は２つ以上のトリプレット、すなわち、６つまでによってコードされる。縮重は主に、トリプレットにおける第３の位置の変化から生じる。これは上記で特定されたものとは異なるヌクレオチド配列を有するが、依然として同じポリペプチドをコードする核酸分子が本発明の範囲内にあることを意味する。したがって、本発明の第１の態様に関して、当業者は、事項（ｅ）に列挙される「（ｄ）の核酸分子に対して縮重したヌクレオチド配列からなる」が事項（ｄ）の核酸分子と同じアミノ酸配列をコードする核酸分子を示すことを理解する。このアミノ酸配列は配列番号１のアミノ酸配列またはそれに由来するアミノ酸配列のいずれかであり、前記後者のアミノ酸配列は、主な実施形態の項目（ｄ）に列挙される配列同一性値によって必要とされ、暗示される程度まで、配列番号１と同一である。
【００２５】
（ａ）〜（ｆ）の断片核酸分子は、少なくとも１５０個のヌクレオチドを含む。
この点に関して、本発明による断片は、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも５５０、少なくとも６００、または少なくとも６５０ヌクレオチドのポリヌクレオチドであることが好ましく、断片が５´ＡＴＰ開始コドンおよび／または３´−ＴＡＧ終止コドンのみを欠く断片であることが最も好ましい。さらに、断片が配列番号３、好ましくは配列番号４、最も好ましくは配列番号５をコードするヌクレオチド配列を含むことが好ましい。配列番号５をコードするヌクレオチド配列は、好ましくは断片の３´末端に見出され、後にさらなるヌクレオチドが存在しないか、または終止コドンが存在する。同様に、本断片は、配列番号７と少なくとも９７．５％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、および１００％同一である好ましさが増加したヌクレオチド配列を含むか、または配列番号９と少なくとも９７．５％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、および１００％同一である好ましさが増加したアミノ酸配列をコードすることが好ましい。断片が、配列番号７と少なくとも９７．５％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、および１００％同一である好ましさが増加したヌクレオチド配列、および／または配列番号６と少なくとも９７．５％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、および１００％同一である好ましさが増加したヌクレオチド配列を含むことがより好ましい。同様に、本断片は配列番号９と少なくとも９７．５％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、および１００％同一である好ましさが増加したアミノ酸配列をコードし、および／または配列番号８と少なくとも９７．５％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、および１００％同一である好ましさが増加したアミノ酸配列をコードすることがより好ましい。断片は（ｉ）配列番号３のヌクレオチド配列、好ましくは配列番号４のヌクレオチド配列（ここで、配列番号４は好ましくは３´末端（ｉｉ）のヌクレオチド配列が配列番号７と少なくとも９７．５％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、および１００％同一であり、（ｉｉｉ）ヌクレオチド配列が配列番号６と少なくとも９７．５％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、および１００％同一であることが好ましい）の２つまたは３つすべてを含むことが最も好ましい。（ｉ）〜（ｉｉｉ）の２つの場合、２つは好ましくは（ｉ）および（ｉｉ）である。
【００２６】
1992年にMesser et al(J Immunol. 1992 Jun 15; 148(12):4043-53.) により、ＨＬＡ−Ｊはエキソン２またはエキソン４のいずれかにおいて翻訳終結を生じる有害な突然変異により、偽遺伝子であることが報告された。以来、ＨＬＡ−Ｊは偽遺伝子であると確信されていた。本明細書の以下の実施例から明らかなように、ＨＬＡ−Ｊヌクレオチド配列が、ＨＬＡ−Ｊタンパク質をコードすると安全に想定され得る機能的オープンリーディングフレーム（本明細書では「オープンリーディングフレーム３」または「ＯＲＦ３」と称される）を含むことが、今になってやっと、驚くべきことに発見された。機能的オープンリーディングフレームの配列を配列番号２に示し、それによってコードされるＨＬＡ−Ｊタンパク質を配列番号１に示す。したがって、２５年以上後に、ＨＬＡ−Ｊは偽遺伝子ではなく、機能的遺伝子であることが予想外に明らかにされた；実施例１を参照されたい。
【００２７】
さらに注目すべきことは、ＯＲＦ３がＨＬＡ−Ｊに特異的な１６ヌクレオチドの挿入を含むことである。他のＨＬＡは、類似の配列を含まない。この挿入のため、ＨＬＡ−ＪにはＨＬＡ−Ｇのエキソン４のホモログがなく、エキソンはアルファドメイン構造２をコードしている。アルファ２様ドメインはペプチド提示に重要である。さらに重要なことに、挿入は、ペプチド「ＨＴＦＬＥＴＳＱＧＳＫＴＲＲＦＬ（−Ｓｔｏｐ）」（配列番号５）をコードするＯＲＦ３にユニークな３末端をもたらす。このペプチド内の多数の荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸のために、ＨＬＡ−Ｊタンパク質が膜貫通領域またはアンカを含むことは安全に排除され得る。したがって、新たに同定されたＨＬＡ−Ｊタンパク質はＨＬＡ−Ｇに類似した特徴を有するが、アルファ２様ドメインが存在しないためにペプチド提示の能力を欠く分泌型タンパク質である；実施例１を参照されたい。
【００２８】
本発明の第１の態様の好ましい実施形態によれば、核酸分子は異種性ヌクレオチド配列に融合され、好ましくは異種性プロモーターに作動可能に連結される。
【００２９】
異種ヌクレオチド配列は、本発明の核酸分子に直接的または間接的に融合され得る。間接融合の場合、好ましくは、ペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列がＧＳ−リンカー（例えば、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ（配列番号５４）（式中、ｎは１〜３）が使用される。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、異種ヌクレオチド配列は、配列番号２のヌクレオチド配列に融合された天然には見出され得ない配列である。配列番号２がヒト由来であることに注目すると、異種ヌクレオチド配列もヒト由来であることが好ましい。
【００３１】
従って、異種プロモーターは、配列番号２のヌクレオチド配列に作動可能に連結された天然には見出され得ないプロモーターである。異種プロモーターは、好ましくはヒト由来である。プロモーターは特定の遺伝子の転写を開始する核酸配列であり、前記遺伝子は、配列番号２のＨＬＡ−Ｊ遺伝子に由来するか、または配列番号２である本発明による。これに関連して、「作動可能に連結された」とは、異種プロモーターが本発明の核酸分子に融合され、その結果、プロモーターを介して、本発明の核酸分子の転写が例えば、原核生物または真核生物細胞において開始され得ることを意味する。異種プロモーターは、構成的に活性なプロモーター、組織特異的または発生段階特異的なプロモーター、誘導性プロモーター、または合成プロモーターであり得る。構成的プロモーター事実上すべての組織で発現を指令し、完全ではないにしても、大部分は環境因子と発生因子とは無関係である。それらの発現は通常内因性因子によって条件づけられないので、構成的プロモーターは通常種を越えて、さらには界を越えて活性化されている。組織特異的または発生段階特異的プロモーター、特定の組織または発生のある段階における遺伝子の発現を指示する。誘導性プロモーターの活性は生物的または非生物的因子の有無により誘導される。誘導性プロモーターは、それらに機能的に連結された遺伝子の発現が必要に応じてオンになったりオフになったりできるので、遺伝子工学において非常に強力な道具である。合成プロモーターは、多様な起源由来のプロモーター領域の一次要素を一緒にすることによって構築される。
【００３２】
遺伝子を異種に発現させるために当技術分野で使用される異種プロモーターの非限定的な例は（哺乳動物系用）ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＨＳＶ、ＵＢＣ、ＥＦ１Ａ、ＰＧＫ、Ｖｌａｍｂｄａ１、ＲＳＶおよびＣＡＧＧ；（ショウジョウバエ系用）ＣＯＰＩＡおよびＡＣＴ５Ｃ；ならびに（酵母系用）ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＧＡＬ７、ＧＡＬ２であり、そしてまた本発明と関連して使用され得る。
【００３３】
代替的または付加的に、異種核酸配列は本発明の核酸配列が融合タンパク質を生じるようなコード配列であってもよい。このような融合タンパク質は、本明細書中で以下により詳細に議論される。
【００３４】
核酸分子が異種プロモーターに融合されない場合、発現の目的のために、核酸分子はそれ自体のプロモーターに融合される。
【００３５】
第２の態様において、本発明は、第１の態様の核酸分子を含むベクターに関する。
【００３６】
本発明による「ベクター」という用語は好ましくはプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、または、例えば、本発明の核酸分子を有する遺伝子工学において慣用的に使用される別のベクターを意味する。本発明の核酸分子は例えば、いくつかの市販のベクターに挿入され得る。非限定的な例としては、ｐＵＣシリーズ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＥＴシリーズの発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）またはｐＣＲＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ならびにｐＲＥＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ），ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ），ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ），ＥＢＯ−ｐＳＶ２ｎｅｏ，ｐＢＰＶ−１，ｐｄＢＰＶＭＭＴｎｅｏ，ｐＲＳＶｇｐｔ，ｐＲＳＶｎｅｏ，ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ，ｐＩＺＤ３５，ｐＬＸＩＮ，ｐＳＩＲ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），ｐＥＡＫ−１０（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ｐＴｒｉＥｘ−Ｈｙｇｒｏ（Ｎｏｖａｇｅｎ）およびｐＣＩＮｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）などの哺乳動物細胞における発現に適合するベクターが挙げられる。ピキア・パトリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）に適したプラスミドベクターの例は例えば、プラスミドｐＡＯ８１５、ｐＰＩＣ９ＫおよびｐＰＩＣ３．５Ｋ（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む。
【００３７】
ベクターに挿入された核酸分子は例えば、標準的な方法によって合成され得るか、または天然資源から単離され得る。コード配列の転写調節エレメントおよび／または他のアミノ酸コード配列へのライゲーションはまた、確立された方法を使用して実施され得る。原核細胞または真核細胞における発現を確実にする転写調節エレメント（発現カセットの一部）は、当業者に周知である。これらの元素は転写の開始を確実にする調節配列（例えば、翻訳開始コドン、天然関連または異種プロモーターおよび／またはインシュレーターなどのプロモーター；上記を参照のこと）、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）（Owens, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98(2001), 1471-1476）、および任意に転写の終結および転写物の安定化を確実にするポリＡシグナルを含む。さらなる調節エレメントには、転写ならびに翻訳エンハンサーが含まれ得る。好ましくは、本発明のポリペプチド／タンパク質または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが原核生物または真核生物細胞における発現を可能にするこのような発現制御配列に作動可能に連結される。ベクターは、さらなる調節エレメントとして分泌シグナルをコードする核酸配列をさらに含み得る。このような配列は、当業者に周知である。さらに、使用される発現系に依存して、発現されたポリペプチドを細胞内区画に指向し得るリーダー配列が、本発明のポリヌクレオチドのコード配列に付加され得る。そのようなリーダー配列は当技術分野でよく知られる。
【００３８】
さらに、ベクターは選択マーカーを含むことが好ましい。選択可能なマーカーの実施例としては、ネオマイシン、アンピシリン、ハイグロマイシン、およびカナマイシンに対する耐性をコードする遺伝子が挙げられる。具体的に設計されたベクターは細菌−真菌細胞または細菌−動物細胞（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎで入手可能なＧａｔｅｗａｙシステム）のような異なる宿主間でのＤＮＡのシャトリングを可能にする。本発明による発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドおよびコードされたペプチドまたは融合タンパク質の複製および発現を指示することができる。ファージベクターまたはウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）のようなベクターを介する導入とは別に、上記の核酸分子は直接導入のために、またはリポソームを介する細胞への導入のために設計され得る。さらに、バキュロウイルス系またはワクシニアウイルスまたはセムリキフォレストウイルスに基づく系を、本発明の核酸分子のための真核生物発現系として使用することができる。
【００３９】
第３の態様において、本発明は、第２の態様のベクターで形質転換、形質導入、またはトランスフェクトされた宿主細胞に関する。
【００４０】
「宿主細胞」という語は細胞によるタンパク質またはペプチドまたは融合タンパク質の産生のために、任意の方法で選択され、改変され、形質転換され、増殖され、または使用され、または操作される任意の生物の任意の細胞を意味する。
【００４１】
本発明の宿主細胞は典型的には本発明の核酸分子またはベクター（単数または複数）を宿主細胞に導入することによって産生され、その宿主細胞／その存在により、本発明のタンパク質またはペプチドまたは融合タンパク質をコードする本発明の核酸分子の発現が媒介される。宿主細胞が由来するかまたは単離される宿主は任意の原核細胞または真核細胞または生物であってよく、好ましくはヒト胚の破壊によって直接誘導されたヒト胚性幹細胞を除く。
【００４２】
本発明の宿主として有用な適切な原核生物（バクテリア）は例えば、大腸菌（例えば、大腸菌株ＢＬ２１、ＨＢ１０１、ＤＨ５ａ、ＸＬ１ブルー、Ｙ１０９０およびＪＭ１０１）、ネズミチフス菌（salmonella typhimurium）、セラチア・マルセッセンス、ブルクホルデリア・グルマエ、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・フルオレセス、シュードモナス・スタツェリ、ストレプトマイセス・リビダンス、ラクトコッカス・ラクチス、マイコバクテリウム・スメグマティス、ストレプトマイセス・コエリコールまたは枯草菌のようなクローニングおよび／または発現に一般的に使用されるものである。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は、当該分野で周知である。
【００４３】
適当な真核宿主細胞は、脊椎動物細胞、昆虫細胞、真菌／酵母細胞、線虫細胞または植物細胞であり得る。真菌／酵母細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ細胞、ピキア・パストリス細胞またはアスペルギルス細胞であり得る。本発明の核酸分子またはベクターを用いて遺伝子操作される宿主細胞の好ましい例は酵母、大腸菌および／またはバチルス属の種（例えば、枯草菌）の細胞である。１つの好ましい実施形態において、宿主細胞は酵母細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。
【００４４】
異なる好ましい実施形態では、宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウス骨髄腫リンパ芽球様細胞、ヒト胚腎細胞（ＨＥＫ−２９３）、ヒト胚網膜細胞（Ｃｒｕｃｅｌｌ´ｓ  Ｐｅｒ．Ｃ６）、またはヒト羊水細胞（ＧｌｙｃｏｔｏｐｅおよびＣＥＶＥＣ）などの哺乳動物宿主細胞である。細胞は、組換えタンパク質を産生するために当技術分野で頻繁に使用される。ＣＨＯ細胞は、ヒトのための組換えタンパク質治療薬の工業用産生のために最も一般的に使用される哺乳動物宿主細胞である。
【００４５】
第４の態様において、第１の態様の核酸分子によってコードされるタンパク質またはペプチドに関する。
【００４６】
用語「タンパク質」および「ペプチド」ならびにそれらの好ましい実施形態は、本明細書の第１の態様に関連して上に定義されている。これらの定義および好ましい実施形態は、第４の態様に準用する。第４の態様に従うペプチドは、配列番号１の部分配列と好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％同一である。最も好ましくは、ペプチドが配列番号５を含むか、またはそれからなる。
【００４７】
本発明のタンパク質またはペプチドは、当該分野で周知の分子クローニング技術によって生成され得る。組換え発現は例えば、本明細書中上記のようなベクターおよび宿主細胞を使用することによって達成され得る。
【００４８】
がん患者からの血中および組織試料中のタンパク質またはペプチドの検出を実施例４に示す。
【００４９】
好ましい実施形態によれば、タンパク質またはペプチドは融合タンパク質である。
【００５０】
本発明による「融合タンパク質」は、少なくとも１つのさらなる異種性アミノ酸配列を含む。しばしば、しかし必ずしも必要ではないが、これらのさらなる配列は（ポリ）ペプチドのＮ末端またはＣ末端に位置する。例えば、融合タンパク質を特異的にトリミングし、本発明の（ポリ）ペプチドを放出することができるプロテイナーゼによって、追加のアミノ酸残基を除去することができる融合タンパク質としてポリペプチドを最初に発現させることが好都合であり得る。アミノ酸配列化合物は、本発明の核酸分子に直接的または間接的に融合され得る。間接融合の場合、一般に、ＧＳ−リンカー（例えば、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ（配列番号５４）（式中、ｎは１〜３）が使用され得る。
【００５１】
前記融合タンパク質の少なくとも１つのさらなる異種アミノ酸配列は、修飾／増強された安定性、修飾／増強された溶解性および／または１つ以上の特異的細胞型を標的とする能力などの所望の特性を付与するアミノ酸配列を含む。例えば、抗体との融合タンパク質。「抗体」という語は、以下にさらに定義され、とりわけ、抗体断片および誘導体を含む。抗体は例えば、細胞表面マーカーに特異的であってもよく、または前記抗体の抗原認識断片であってもよい。本発明のタンパク質またはペプチドは、抗体の軽鎖および／または重鎖のＮ末端またはＣ末端に融合され得る。本発明のタンパク質またはペプチドは好ましくは抗体のＦｃ部分がＦｃ受容体に自由に結合するように、抗体の軽鎖および／または重鎖のＮ末端に融合される。
【００５２】
融合タンパク質はまた、シグナル伝達において機能することが知られている、および／またはタンパク質タンパク質相互作用に関与することが知られているタンパク質ドメインを含んでもよい。このようなドメインの実施例は、アンキリンリピート；アーム、Ｂｃｌ−ホモロジー、Ｂｒｏｍｏ、ＣＡＲＤ、ＣＨ、Ｃｈｒ、Ｃ１、Ｃ２、ＤＤ、ＤＥＤ、ＤＨ、ＥＦｈ、ＥＮＴＨ、Ｆ−ｂｏｘ、ＦＨＡ、ＦＹＶＥ、ＧＥＬ、ＧＹＦ、ｈｅｃｔ、ＬＩＭ、ＭＨ２、ＰＤＺ、ＰＢ１、ＰＨ、ＰＴＢ、ＰＸ、ＲＧＳ、ＲＩＮＧ、ＳＡＭ、ＳＣ、ＳＨ２、ＳＨ３、ＳＯＣＳ、ＳＴＡＲＴ、ＴＩＲ、ＴＰＲ、ＴＲＡＦ、ｔｓｎａｒｅ、Ｔｕｂｂｙ、ＵＢＡ、ＶＨＳ、Ｗ、ＷＷおよび１４−３−３ドメインである。これらおよび他のタンパク質ドメインについてのさらなる情報はデータベースInterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/, Mulder et al., 2003, Nucl. Acids. Res. 31: 315-318), Pfam (http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/, Bateman et al., 2002, Nucleic Acids Research 30(1): 276-280) および SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/, Letunic et al., 2002, Nucleic Acids Res. 30(1), 242-244)から入手可能である。
【００５３】
本発明による融合タンパク質の少なくとも１つのさらなる異種アミノ酸配列は、（ａ）サイトカイン、（ｂ）ケモカイン、（ｃ）凝固促進因子、（ｄ）タンパク質性の毒性化合物、および／または（ｅ）プロドラッグ活性化のための酵素を含み得るか、またはそれらからなり得る。
【００５４】
サイトカインは、好ましくはＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−２４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、ＬＩＦ、ＣＤ８０、Ｂ７０、ＴＮＦβ、ＬＴ−β、ＣＤ−４０リガンド、Ｆａｓ−リガンド、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βからなる群から選択される。当技術分野で周知のように、サイトカインは、免疫系の炎症誘発性応答または抗炎症応答に有利であり得る。したがって、処置される疾患に応じて、炎症誘発性または抗炎症性サイトカインとの融合タンパク質のいずれかが有利であり得る。例えば、一般に炎症性疾患の治療のためには抗炎症性サイトカインを含む融合構築物が好ましく、がんの治療のためには一般に炎症誘発性サイトカインを含む融合構築物が好ましい。
【００５５】
ケモカインは、好ましくはＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＥＮＡ−７８、ＬＤＧＦ−ＰＢＰ、ＧＣＰ−２、ＰＦ４、Ｍｉｇ、ＩＰ−１０、ＳＤＦ−１α／β、ＢＵＮＺＯ／ＳＴＲＣ３３、Ｉ−ＴＡＣ、ＢＬＣ／ＢＣＡ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＤＣ、ＴＥＣＫ、ＴＡＲＣ、ＲＡＮＴＥＳ、ＨＣＣ−１、ＨＣＣ−４、ＤＣ−ＣＫ１、ＭＩＰ−３α、ＭＩＰ−３β、ＭＣＰ−１−５、エオタキシン、Ｅｏｔａｘｉｎ−２、Ｉ−３０９、ＭＰＩＦ−１、６Ｃｋｉｎｅ、ＣＴＡＣＫ、リンホタクチンおよびフラクタルキンからなる群より選択される。ケモカインの主要な役割は、細胞の遊走を誘導する化学誘引物質として作用することである。ケモカインによって誘引される細胞は、ケモカイン源に向かってケモカイン濃度が増加するシグナルに従う。その結果、融合タンパク質内で、ケモカインを使用して、例えば特異的な細胞型または身体部位への本発明のタンパク質またはペプチドの移動を誘導することができる。
【００５６】
凝固促進因子は、好ましくは組織因子である。凝固促進因子は血液が液体からゲルに変化して血餅を形成するプロセスを促進する。前凝固因子は例えば、創傷治癒を補助し得る。
【００５７】
タンパク質性毒性化合物は、好ましくはＲｉｃｉｎ−Ａ鎖、モデクシン、切断型シュードモナス外毒素Ａ、ジフテリア毒素および組換えゲロニンである。毒性化合物は、生物全体、ならびに特定の細胞型などの生物の下部構造に対して毒性効果を有することができる。毒性化合物は、腫瘍の治療にしばしば使用される。腫瘍細胞は一般に、正常の体細胞よりも速く増殖し、その結果、それらは、優先的に、毒性化合物を蓄積し、そしてより高い量で蓄積する。
【００５８】
プロドラッグ活性化のための酵素は、好ましくはカルボキシペプチダーゼ、グルクロニダーゼおよびグルコシダーゼからなる群より選択される酵素である。腫瘍治療について評価されている広範な遺伝子の中で、プロドラッグ活性化酵素をコードする遺伝子は、進行中の臨床化学療法レジメンを直接補完するため、特に魅力的である。これらの酵素は、細菌および酵母酵素の両方を使用して、低い固有毒性を有するプロドラッグを活性化し得るか、または哺乳動物酵素によるプロドラッグ活性化を増強し得る。
【００５９】
好ましい実施形態によれば、タンパク質またはペプチドは、異種非タンパク質性化合物に融合される。
【００６０】
本明細書中で使用される場合、異種性化合物は、配列番号１のアミノ酸配列に融合した天然に見出され得ない化合物である。
異種非タンパク質性化合物は、本発明の核酸分子に直接的または間接的に融合され得る。例えば、化学リンカーを使用することができる。化学リンカーは、第一級アミン、スルフヒドリル、酸、アルコールおよびブロマイドのような多様な官能基を含み得る。我々の架橋剤の多くは、アミンと反応するマレイミド（スルフヒドラル反応性）およびスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）またはイソチオシアネート（ＩＴＣ）基で官能化されている。
【００６１】
異種非タンパク質性化合物は、好ましくは薬学的に活性な化合物または診断的に活性な化合物である。医薬活性化合物または診断活性化合物は、好ましくは（ａ）蛍光色素、（ｂ）光増感剤、（ｃ）放射性核種、（ｄ）医療造影剤、（ｅ）毒性化合物、または（ｆ）ＡＣＥ阻害剤、レニン阻害剤、ＡＤＨ阻害剤、アルドステロン阻害剤、アンギオテンシン受容体遮断薬、ＴＳＨ受容体、ＬＨ−／ＨＣＧ受容体、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、アンドロゲン受容体、ＧｎＲＨ受容体、ＧＨ（成長ホルモン）受容体、またはＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩの受容体からなる群より選択される。
蛍光色素は、好ましくはＡｌｅｘａ  ＦｌｕｏｒまたはＣｙ色素から選択される成分である。
【００６２】
光増感剤は、好ましくは光毒性赤色蛍光タンパク質ＫｉｌｌｅｒＲｅｄまたはヘマトポルフィリンである。
放射性核種は、好ましくはガンマ線放出同位体群、より好ましくは99mＴｃ、123Ｉ、111Ｉｎ、および／またはポジトロンエミッタ群、より好ましくは18Ｆ、64Ｃｕ、68Ｇａ、86Ｙ、124Ｉ、および／またはベータエミッタ群、より好ましくは131Ｉ、90Ｙ、177Ｌｕ、67Ｃｕ、90Ｓｒ、またはアルファエミッタ群、好ましくは213Ｂｉ、211Ａｔのいずれかから選択される。
【００６３】
本明細書で使用される造影剤は、医用画像化において体内の構造または流体のコントラストを高めるために使用される物質である。一般的な造影剤は、Ｘ線減衰および磁気共鳴シグナル増強に基づいて作用する。
【００６４】
毒性化合物は好ましくは小有機化合物であり、より好ましくは、カリケアミシン、メイタンシノイド、ネオカルジノスタチン、エスペラマイシン、ダイネマイシン、ケダルシジン、マデュロペプチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、およびアウリスタチンからなる群より選択される毒性化合物である。本明細書において上記したタンパク質性毒性化合物とは対照的に、これらの毒性化合物は非タンパク質性である。
【００６５】
第５の態様において、本発明は第１の態様の核酸分子および／または結合分子、好ましくは第４の態様のタンパク質の阻害剤であって、（ｉ）本発明の第１の態様の核酸分子の阻害剤が好ましくは低分子、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸分子、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ベースの構築物、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１ベースの構築物、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、および転写アクチベーター様（ＴＡＬ）エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼから選択されるか、および／または（ｉｉ）本発明の第４の態様の結合分子、好ましくはタンパク質の阻害剤が、好ましくは低分子、抗体または抗体模倣物、アプタマーから選択され、ここで、抗体模倣物は好ましくはアフィボディ、アドネクチン、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ、アビマー、ナノフィチン、アフィリン、クニツドメインペプチド、Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）、三重特異性結合分子およびプロボディから選択される。
【００６６】
第４の態様のタンパク質の結合分子は、第４の態様のタンパク質に結合することができる化合物である。結合分子は、好ましくは第４の態様のタンパク質に特異的に結合する。特異的結合は、結合分子が本質的に、第４の態様のタンパク質以外の他のタンパク質またはペプチドに結合しないか、または本質的に結合しないことを示す。特に、結合分子は、ＨＬＡ−Ｊ以外の他のＨＬＡタンパク質に結合することができないことが好ましい。
【００６７】
結合分子は好ましくはＨＬＡ−ＪのＣ末端部分、すなわち、Messer at al., J Immunol.1992 Jun 15; 148(12):4043−53に報告されているように、誤って推定されたストップのＣ末端に結合する。誤って推定されたストップの正確な位置は図１に示され、実施例１でさらに説明される。第４の態様のタンパク質の結合分子は例えば、研究目的に適している。
例えば、第４の態様のタンパク質に結合する抗体は、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットなどの免疫測定法において使用することができる。これは、実施例４によって説明される。イムノアッセイは試料（例えば、溶液）中の第４の態様の存在または濃縮タンパク質を測定することができる生化学的試験である。第４の態様のタンパク質の結合分子は、好ましくは第４の態様のタンパク質を阻害することができる。この場合、結合分子は阻害剤と呼ばれる。
【００６８】
本発明の核酸分子および／またはタンパク質の発現を阻害する化合物は、（ｉ）本発明の核酸分子および／または本発明のタンパク質をコードする遺伝子の転写を低下または防止する化合物、または（ｉｉ）本発明のタンパク質をコードするｍＲＮＡの翻訳を低下または防止する化合物である。（ｉ）の化合物には、転写機構および／または該遺伝子のプロモーターおよび／またはエンハンサーのようなプロモーターから離れた発現制御エレメントとのその相互作用を妨害する化合物が含まれる。（ｉｉ）の化合物には、翻訳機構を妨害する化合物が含まれる。本発明の核酸分子および／またはタンパク質の発現を阻害する化合物は例えば、発現を制御するプロモーター領域を特異的に妨害することによって、本発明の核酸分子および／またはタンパク質の発現を特異的に阻害する。好ましくは、核酸分子および／または本発明のタンパク質の転写、または本発明のタンパク質の翻訳は、（例えば、化合物の非存在下での同じ実験設定と比較して）少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、例えば少なくとも９０％または９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは約１００％減少する。
【００６９】
本発明による核酸分子および／または本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物は前記核酸分子および／またはタンパク質に、その／それらの機能を低い効率で実行させる。
核酸分子の活性を阻害する化合物および／またはタンパク質は、前記核酸分子および／またはタンパク質の活性を特異的に阻害する。以下でさらに詳述するように、核酸分子の活性を阻害する化合物および／または本発明のタンパク質は核酸分子および／またはタンパク質自身と相互作用することによって、または前記核酸分子を産生し、かつ／または前記タンパク質を産生し、かつ／または前記タンパク質に結合する細胞を特異的に阻害する（好ましくは殺す）ことによって、前記核酸分子および／またはタンパク質の活性を特異的に阻害することができる。好ましくは、本発明の核酸分子および／またはタンパク質の活性が、（例えば、化合物の非存在下での同じ実験設定と比較して）少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、例えば少なくとも９０％または９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは約１００％減少する。
【００７０】
本発明の核酸分子および／またはタンパク質の活性は本発明によるものであり、好ましくは、がん患者における化学療法に対する耐性を誘導し、および／またはがん患者における無増悪ならびに全生存率を減少させるその能力である（添付の実施例も参照のこと）。
【００７１】
本明細書中で言及される化学療法は、アジュバント化学療法またはネオアジュバント化学療法であり得、そして好ましくはネオアジュバント化学療法である。化学療法はがん細胞を破壊したり、増殖を止めたり、症状を改善したりするために薬を使用する。ネオアジュバント化学療法（術前または初回化学療法とも呼ばれる）では、腫瘍の外科的摘出の前に薬物治療が行われる。これは、手術後の薬物治療であるアジュバント化学療法とは対照的である。この活性を決定するための手段および方法は当技術分野で確立されており、以下の実施例で説明される。したがって、本発明の医療態様によれば、本発明の核酸分子および／またはタンパク質のこれらの活性は阻害されるべきである。
【００７２】
阻害剤の抑制の有効性は、阻害剤の存在下での活性の濃度を阻害剤の非存在下での濃度と比較する方法によって定量することができる。例えば、形成される核酸分子の量および／またはタンパク質の変化を測定に用いることができる。いくつかの阻害剤の有効性は、ハイスループットフォーマットにおいて同時に決定され得る。ハイスループットアッセイは生化学的アッセイ、細胞アッセイ、または他のアッセイとは独立して、一般に、マイクロタイタープレートのウェル中で実施され得、ここで、各プレートは、９６、３８４、または１５３６ウェルを含み得る。周囲温度以外の温度でのインキュベーション、および試験化合物とアッセイ混合物との接触を含むプレートの取り扱いは、好ましくはピペット装置を含む１つ以上のコンピュータ制御ロボットシステムによって行われる。試験化合物の大きなライブラリーをスクリーニングし、および／またはスクリーニングを短時間で行う場合、例えば１０、２０、３０、４０、５０または１００個の試験化合物の混合物を各ウェルに添加することができる。ウェルが予想される活性を示すケースでは、試験化合物の前記混合物が前記活性を生じる前記混合物中の１つ以上の試験化合物を同定するためにデコンボリューションされてもよい。
【００７３】
核酸分子および／またはタンパク質の発現および／または活性を阻害する化合物は小胞（例えば、リポソームまたはエキソソーム）として処方され得る。リポソームは薬物送達の観点からそれらが提供する特異性および作用期間のために、大きな関心を集めている。リポソーム細胞型送達システムは核酸、例えば、ｓｉＲＮＡを細胞に効果的にｉｎ  ｖｉｖｏ送達するために使用されている(Zimmermann et al. (2006) Nature, 441:111-114)。リポソームは、親油性材料および水性内部から形成された膜を有する単層または多層小胞である。
【００７４】
水性部分は、送達される組成物を含有する。カチオン性リポソームは、細胞壁に融合することができるという利点を有する。非カチオン性リポソームは細胞壁と効率的に融合することはできないが、ｉｎ  ｖｉｖｏでマクロファージおよび他の細胞によって食作用を受ける。エキソソームは、ＲＮＡを含む種々の異なる分子を保有することができる脂質パッケージである (Alexander et al. (2015), Nat Commun; 6:7321)。その中に含まれる分子を含むエキソソームは、レシピエント細胞によって取り込まれ得る。したがって、エキソソームは細胞間情報伝達の重要なメディエーターであり、細胞ニッチのレギュレーターである。エキソソームは、送達ビヒクルとして、例えば造影剤または薬物として使用することができるので、診断および治療目的に有効である。
【００７５】
本発明の核酸分子および／またはタンパク質の発現および／または活性を阻害する化合物は、適当な投与量および／または治療有効量で対象に投与することができる。これは、本発明の医薬組成物に関連して、本明細書中で以下にさらに議論される。
【００７６】
変化を観察するために必要とされる治療の長さおよび奏効が生じる処置後の間隔は、所望の効果に依存して変化する。特定の量は、当業者に周知の従来の試験によって決定することができる。適切なテストは例えば、Tamhane and Logan(2002), "Multiple Test Procedures for Identifying the Minimum Effective and Maximum Safe Doses of a Drug", Journal of the American statistical association, 97(457):1-9に記載されている。
【００７７】
本発明の核酸分子および／またはタンパク質の発現および／または活性を阻害する化合物は、好ましくは薬学的に許容される担体または賦形剤と混合されて、医薬組成物を形成する。適切な薬学的に許容される担体または賦形剤ならびに医薬組成物の製剤は、本発明の医薬組成物に関連して本明細書において以下に議論される。
【００７８】
本明細書で使用される「低分子」は、好ましくは有機分子である。有機分子は炭素基礎を有する化合物のクラスに関連するか、または属し、炭素原子は、炭素−炭素結合によって一緒に連結される。化学化合物の供給源に関連する用語「有機」の本来の定義であり、有機化合物は植物または動物または微生物の供給源から得られる炭素含有化合物であり、一方、無機化合物は、鉱物源から得られたものである。有機化合物は、天然であっても合成であってもよい。有機分子は好ましくは芳香族分子であり、より好ましくはヘテロ芳香族分子である。有機化学では、芳香族性という用語が同じ原子セットを有する他の幾何学的または結合配列よりも安定性が高い共鳴結合の環を有する環状（環形状）、平面（平坦）分子を表すために使用される。芳香族分子は非常に安定であり、他の物質と反応するために容易に分解しない。複素芳香族分子において、芳香環中の原子の少なくとも１つは、炭素以外の原子、例えば、Ｎ、Ｓ、またはＯである。上記の全ての有機分子について、分子量は好ましくは２００Ｄａ〜１５００Ｄａの範囲であり、より好ましくは３００Ｄａ〜１０００Ｄａの範囲である。
【００７９】
あるいは、本発明に係る「低分子」が無機化合物であってもよい。無機化合物は鉱物源に由来し、炭素原子を持たないすべての化合物（二酸化炭素、一酸化炭素および炭酸塩を除く）を含む。好ましくは、低分子が約２０００Ｄａ未満、または約５００Ｄａ未満などの約１０００Ｄａ未満、さらにより好ましくは約Ｄａ  ａｍｕ未満の分子量を有する。低分子の大きさは、当技術分野でよく知られている方法、例えば質量分析によって決定することができる。低分子は、例えば、標的分子のクリスタル構造に基づいて設計することができ、ここでは、生物学的活性の原因と考えられる部位を同定し、ｉｎ  ｖｉｖｏハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）アッセイのようなｉｎ  ｖｉｖｏアッセイで検証することができる。
【００８０】
用語「抗体」は例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を含み、さらに、標的、例えば、配列番号１のＨＬＡ−Ｊタンパク質に対する結合特異性をなお保持する誘導体またはその断片もまた、用語「抗体」に含まれる。抗体断片または誘導体はとりわけ、ＦａｂまたはＦａｂ´断片、Ｆｄ、Ｆ（ａｂ´）２、ＦｖまたはｓｃＦｖ断片、ＶｈＨまたはＶ−ＮＡＲドメインなどの単一ドメインＶＨまたはＶ−様ドメイン、ならびにミニボディ、ダイアボディ、トリボディまたはトリプレボディ（ｔｒｉｐｌｅｂｏｄｉｅｓ）、テトラボディまたは化学的に結合したＦａｂ´−マルチマーなどの多量体フォーマットを含む（例えば, Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 198; Harlow and Lane "Using Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999; Altshuler EP, Serebryanaya DV, Katrukha AG. 2010, Biochemistry (Mosc)., vol.75(13), 1584; Holliger P, Hudson PJ.2005, Nat Biotechnol., vol.23(9), 1126を参照）。多量体フォーマットは特に、２つの異なったタイプの抗原に同時に結合することができる二重特異的抗体を含む。第１の抗原は、本発明のタンパク質上に見出すことができる。第２の抗原は例えば、がん細胞または特定の型のがん細胞上で特異的に発現される腫瘍マーカーであり得る。二重特異的抗体フォーマットの非限定的な例は、Biclonics（二重特異的、全長ヒトＩｇＧ抗体）、ＤＡＲＴ（Dual-affinity Re-targeting Antibody)およびBiTE(種々の抗体の2つの一本鎖可変断片(scFvs)からなる)分子である(Kontermann and Brinkmann (2015), Drug Discovery Today, 20(7):838-847）。
【００８１】
用語「抗体」はまた、キメラ（ヒト定常ドメイン、非ヒト可変ドメイン）、一本鎖およびヒト化（非ヒトＣＤＲを除くヒト抗体）抗体などの実施形態を含む。
抗体の産生のための様々な技術は当該分野で周知であり、そして例えば、Harlow and Lane(1988)および(1999)ならびにAltshuler et al. 2010（上掲）に記載される。従って、ポリクローナル抗体は添加剤およびアジュバントとの混合物中の抗原での免疫化の後に動物の血液から得られ得、そしてモノクローナル抗体は連続的な細胞株培養によって産生される抗体を提供する任意の技術によって産生され得る。このような技術の例は，例えば、 Harlow E and Lane D, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Harlow E and Lane D, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999に記載され、そしてヒトモノクローナル抗体を製造するための、最初にKohler and Milstein, 1975によって記載されたハイブリドーマ技術、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（例えばKozbor D, 1983, Immunology Today, vol.4, 7; Li J, et al. 2006, PNAS, vol. 103(10), 3557を参照)およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Cole et al., 1985, Alan R. Liss, Inc, 77-96)を含む。さらに、組換え抗体はモノクローナル抗体から得ることができ、またはファージ、リボソーム、ｍＲＮＡ、もしくは細胞ディスプレイなどの様々なディスプレイ方法を用いてｄｅ  ｎｏｖｏで調製することができる。組換え（ヒト化）抗体の発現に適したシステムは例えば、細菌、イースト、昆虫、哺乳動物細胞株、またはトランスジェニック動物もしくは植物から選択することができる（例えば、米国特許第6,080,560号; Holliger P, Hudson PJ.2005, Nat Biotechnol., vol.23(9), 11265を参照されたい）。さらに、一本鎖抗体の産生のために記載された技術（特に、米国特許第４，９４６，７７８号参照）は、ＨＬＡ−Ｊのエピトープに特異的な一本鎖抗体を産生するように適合され得る。ＢＩＡｃｏｒｅシステムで使用されるような表面プラズモン共鳴は、ファージ抗体の効率を増加させるために使用され得る。
【００８２】
本明細書中で使用される場合、「抗体模倣体」という語は抗体のように、抗原に特異的に結合することができる化合物、例えば、本願における配列番号１のＨＬＡ−Ｊタンパク質を指すが、抗体に構造的に関連しない。抗体模倣物は通常、約３〜２０ｋＤａのモル質量を有する人工ペプチドまたはタンパク質である。例えば、抗体模倣体は、アフィボディ、アドネクチン、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ、アビマー、ナノフィチン、アフィリン、クニッツドメインペプチド、Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）、三重特異性結合分子およびプロドディー（ｐｒｏｄｏｄｉｅｓ）からなる群より選択され得る。これらのポリペプチドは当該分野で周知であり、そして以下にさらに詳細に記載される。
【００８３】
本明細書で使用される「アフィボディ」という語は、ブドウ球菌タンパク質ＡのＺドメインに由来する抗体模倣物のファミリーを指す。構造的には、アフィボディ分子は融合タンパク質に組み込むこともできる３ヘリックスバンドル領域に基づいている。アフィボディはそれ自身、約６ｋＤａの分子量を有し、高温および酸性またはアルカリ性条件下で安定である。標的特異性は、親タンパク質領域の結合活性に関与する２つのαヘリックスに位置する１３のアミノ酸のランダム化によって得られる(Feldwisch J, Tolmachev V.; (2012) Methods:Mol Biol.899:103-26)。
【００８４】
用語「アドネクチン」（「モノボディ」とも呼ばれる）は、本明細書中で使用される場合、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ（１０Ｆｎ３）の１０番目の細胞外ドメインに基づく分子に関し、２〜３の露出したループを有する９４残基のＩｇ様βサンドイッチフォールドを採用するが、中央のジスルフィド架橋を欠く(Gebauer and Skerra (2009) Curr Opinion in Chemical Biology 13:245-255)。所望の標的特異性、すなわちＨＬＡ−Ｊに対するアドネクチンは、タンパク質の特異的ループに修飾を導入することによって遺伝子操作することができる。
【００８５】
本明細書中で使用される用語「アンチカリン」は、リポカリンに由来する改変タンパク質を指す(Beste G, Schmidt FS, Stibora T, Skerra A. (1999) Proc Natl Acad Sci U S A. 96(5):1898-903; Gebauer and Skerra (2009) Curr Opinion in Chemical Biology 13:245-255)。アンチカリンは８本鎖βバレルを有し、リポカリンの中で高度に保存されたコアユニットを形成し、開いた末端に４つの構造的に可変なループを介してリガンドに対する結合部位を天然に形成する。アンチカリンは、ＩｇＧスーパーファミリーとは相同ではないが、これまで抗体の結合部位に典型的と考えられてきた特徴を示す：（ｉ）配列変異の結果としての高い構造可塑性、（ｉｉ）立体配座柔軟性の上昇で、形状の異なる標的への誘導適合を可能にする。
【００８６】
本明細書中で使用される用語「ＤＡＲＰｉｎ」は、設計されたアンキリンリピートドメイン（１６６残基）を指し、これは、典型的には３回の反復β−ターンから生じる硬い界面を提供する。ＤＡＲＰｉｎは通常、人工的なコンセンサス配列に対応する３つの反復配列をもっており、反復ごとに６つの位置がランダム化されている。そのため、ＤＡＲＰｉｎは構造的柔軟性を欠いている(Gebauer and Skerra, 2009)。
【００８７】
本明細書中で使用される用語「アビマー」は、種々の膜受容体のＡ−ドメインに由来し、リンカーペプチドによって連結される、各々３０〜３５アミノ酸の２つ以上のペプチド配列からなる抗体模倣物のクラスを指す。標的分子の結合はＡドメインを介して起こり、所望の結合特異性、すなわちＨＬＡ−Ｊに対するドメインは、例えばファージディスプレイ技術によって選択することができる。アビマーに含まれる異なるＡドメインの結合特異性は同一であってもよいが、同一である必要はない(Weidle UH, et al., (2013), Cancer Genomics Proteomics; 10(4): 155-68)。
【００８８】
「ナノフィチン」（別名アフィチン）は、スルホロブス・アシドカルダリウスのＤＮＡ結合タンパク質Ｓａｃ７ｄに由来する抗体模倣タンパク質である。ナノフィチンは通常、約７ｋＤａの分子量を有し、そして結合表面上のアミノ酸をランダム化することによって、標的分子（例えば、ＨＬＡ−Ｊ）に特異的に結合するように設計される(Mouratou B, Behar G, Paillard-Laurance L, Colinet S, Pecorari F., (2012) Methods: Mol Biol.; 805:315-31)。
【００８９】
本明細書で使用される「アフィリン」という語は、ガンマ−Ｂクリスタリン性またはユビキチンのいずれかを足場として使用し、ランダム突然変異誘発によってこれらのタンパク質の表面上のアミノ酸を修飾することによって開発される抗体模倣物を指す。所望の標的特異性、すなわちＨＬＡ−Ｊに対するアフィリンの選択は例えば、ファージディスプレイまたはリボソームディスプレイ技術によって行われる。足場にもよるが、アフィリンの分子量はおよそ１０または２０ｋＤａである。本明細書で使用される場合、用語アフィリンはまた、アフィリンの二量体型または多量体型を指す(Weidle UH, et al., (2013), Cancer Genomics Proteomics; 10(4):155−68)。
【００９０】
「クニッツドメインペプチド」は、ウシ膵臓トリプシン阻害剤（ＢＰＴＩ）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）または組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）のようなクニッツ型プロテアーゼ阻害剤のクニッツドメインに由来する。クニッツドメインは約６ｋＤＡの分子量を有し、必要な標的特異性、すなわちＨＬＡ−Ｊに対するドメインはファージディスプレイなどのディスプレイ技術によって選択することができる(Weidle et al., (2013), Cancer Genomics Proteomics; 10(4):155-68)。
【００９１】
本明細書中で使用される「Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）」という用語は、ヒトＦｙｎ  ＳＨ３ドメインに由来する非免疫グロブリン由来結合ポリペプチドを指す。Ｆｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチドは当該分野で周知であり、そして例えば、 Grabulovski et al. (2007) JBC, 282, p. 3196-3204, WO 2008/022759, Bertschinger et al (2007) Protein Eng Des Sel 20(2):57-68, Gebauer and Skerra (2009) Curr Opinion in Chemical Biology 13:245-255, またはSchlatter et al. (2012), MAbs 4:4, 1-12に記載されている。
【００９２】
本明細書で用いられる用語「三重特異性結合分子」は、ポリペプチド分子が三つの結合ドメインを有し、よって三つの異なったエピトープに対して結合、好ましくは特異的に結合することができることを意味する。これら３つのエピトープのうちの少なくとも１つは、本発明の第４の態様のタンパク質のエピトープである。２つの他のエピトープはまた、本態様の第４のタンパク質のエピトープであり得るか、または１つもしくは２つの異なった抗原のエピトープであり得る。三重特異性結合分子は、好ましくはＴｒｉＴａｃである。ＴｒｉＴａｃは、３つの結合ドメインから構成され、血清半減期が延長され、モノクローナル抗体の約３分の１の大きさである固形腫瘍のためのＴ細胞誘導（Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｎｇａｇｅｒ）である。
【００９３】
本明細書で使用される「プロボディ」という語は、プロテアーゼ活性化可能な抗体プロドラッグを指す。プロボディは、真正のＩｇＧ重鎖および修飾された軽鎖からなる。
マスキングペプチドは、腫瘍特異的プロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーを介して軽鎖に融合される。マスキングペプチドは健康な組織へのプローブ様結合を防止し、それによって毒性の副作用を最小限にする。
【００９４】
アプタマーは、特定の標的分子に結合する核酸分子またはペプチド分子である。アプタマーは通常、大きなランダムな配列プールからこれらを選択することにより作製されるが、天然のアプタマーも、リボスイッチに存在する。アプタマーは、基本研究および臨床目的の両方において、高分子薬物として用いることができる。アプタマーはリボザイムと組み合わせることができ、それらの標的分子の存在下で自己切断する。これらの化合物分子は、さらなる研究的、工業的および臨床用途を有する (Osborne et. al. (1997), Current Opinion in Chemical Biology, 1:5-9; Stull & Szoka (1995), Pharmaceutical Research, 12, 4:465-483)。
【００９５】
核酸アプタマーは、通常オリゴヌクレオチドの（通常は短い）鎖からなる核酸種である。典型的には、低分子、タンパク質、核酸、さらには細胞、組織および生物などの種々の分子標的に結合するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択の反復ラウンドまたは同等にＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの体系的進化）を介して改変されている。
【００９６】
ペプチドアプタマーは、通常、細胞内の他のタンパク質相互作用を妨害するように設計されたペプチドまたはタンパク質である。それらは、両端でタンパク質足場に結合した可変ペプチドループからなる。この二重構造束縛は、ペプチドアプタマーの結合親和性を、抗体に匹敵するレベルまで大きく増加させる（ナノモル範囲）。可変ペプチドループは典型的には１０〜２０個のアミノ酸を含み、足場は、良好な溶解特性を有する任意のタンパク質であり得る。現在、細菌タンパク質チオレドキシン−Ａは最も一般的に使用される足場タンパク質であり、可変ペプチドループは酸化還元活性部位内に挿入され、それは野生タンパク質中の−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ループ（配列番号５５）であり、２つのシステイン側鎖はジスルフィド架橋を形成することができる。ペプチドアプタマーの選択は異なるシステムを用いて行うことができるが、現在最も広く用いられているのは酵母ツーハイブリッドシステムである。
【００９７】
アプタマーは、一般的に使用される生体分子、特に抗体のそれらに匹敵する分子認識特性を提供するので、バイオテクノロジーおよび治療用途のための有用性を提供する。アプタマーは、その識別認識に加えて、試験管内で完全に改変することができ、化学合成により容易に生産され、望ましい貯蔵特性を有し、治療用途においてほとんどまたは全く免疫原性を誘発しないので、抗体よりも有利である。非修飾アプタマーは血流から速やかに除去され、半減期は数分から数時間である。これは主に、アプタマーが本来低分子量である結果、ヌクレアーゼの分解と腎臓による身体からのクリアランスのためである。非修飾アプタマーの応用は、現在、血液凝固のような一過性の状態の治療、または局所送達が可能な眼のような器官の治療に焦点を当てている。この迅速なクリアランスは、ｉｎ  ｖｉｖｏ画像診断などの応用において利点となりうる。２´−フッ素置換ピリミジン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）結合、アルブミンへの融合または他の半減期延長タンパク質などのいくつかの修飾が科学者に利用可能であり、アプタマーの半減期を数日間または数週間にわたって増加させることができる。
【００９８】
議論したように、上記の低分子、抗体または抗体模倣体およびアプタマーは、本発明の第４の態様のタンパク質に特異的に結合し得る。この結合は本発明の第４の態様のタンパク質の免疫抑制特性を遮断し得、そして好ましくは、がん患者において化学療法に対する耐性を誘導し、そして／またはがん患者において無増悪ならびに全生存率を減少させるその能力を遮断し得る。このケースでは低分子、抗体または抗体模倣物およびアプタマーは遮断低分子、抗体または抗体模倣物およびアプタマーとも呼ばれる。遮断低分子、抗体または抗体模倣物およびアプタマーは、本発明の第４の態様のタンパク質と通常相互作用するリガンドおよびレセプターのような他の細胞成分との本発明の第４の態様のタンパク質の相互作用を遮断する。
【００９９】
低分子、抗体または抗体模倣物およびアプタマーはまた、薬物−コンジュゲートのフォーマットで生成され得る。このケースでは低分子、抗体または抗体模倣物およびアプタマーはそれ自身、阻害効果を有さないかもしれないが、阻害効果は薬物によってのみ付与される。
低分子、抗体または抗体模倣物およびアプタマーは、本発明のタンパク質を産生および／または結合する細胞への薬物の部位特異性結合を付与する。薬物は、好ましくはタンパク質を産生および／または結合する細胞を殺すことができる。従って、本発明のタンパク質に結合する分子の標的化能力を薬物の細胞殺傷能力と組み合わせることによって、薬物複合体は、健常組織と疾患組織および細胞との間の識別を可能にするｉｎｈｉｂｏｒｓとなる。薬剤コンジュゲートをデザインするための開裂可能および非開裂可能リンカーは、当技術分野で公知である。細胞を殺傷することができる薬物の非限定的な例は、がん細胞に放射線を直接送達する細胞増殖抑制薬および放射性同位体である。
【０１００】
さらに、低分子、抗体または抗体模倣物およびアプタマーの結合および／または阻害活性を、特定の組織または細胞型、特に罹患組織または細胞型に限定することができる。例えば、プロボディを設計することができる。プロボディでは低分子、抗体または抗体模倣物またはアプタマーは本発明のタンパク質への結合を制限または防止するマスキングペプチドに結合され、このマスキングペプチドはプロテアーゼによって切断され得る。プロテアーゼは、基質として知られる特異的アミノ酸配列を切断することによってタンパク質をより小さな断片に消化する酵素である。正常の健康な組織では、プロテアーゼ活性は厳密に制御される。がん細胞では、プロテアーゼ活性はアップレギュレートされる。プロテアーゼ活性が調節され、最小限である健康な組織または細胞において、プロボディの標的結合部位はマスクされたままであり、したがって結合することができない。一方、プロテアーゼ活性がアップレギュレートされる疾患組織または細胞では、プロボディの標的結合部位はマスクされず、したがって結合および／または阻害することができる。
【０１０１】
本発明によれば、短鎖干渉ＲＮＡまたはサイレンシングＲＮＡとしても知られる「低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）」という用語は、生物学において様々な役割を果たす１８〜３０、好ましくは１９〜２５、最も好ましい２１〜２３またはさらに好ましい２１ヌクレオチド長二本鎖ＲＮＡ分子を指す。最も顕著なことは、ｓｉＲＮＡが特定の遺伝子の発現を妨害するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路に関与することである。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ経路における役割に加えて、ＲＮＡｉ関連経路においても、例えば、抗ウイルス機構として、またはゲノムのクロマチン構造を形成する際に、作用する。
【０１０２】
天然に存在するｓｉＲＮＡは、明確な構造をもっている。すなわち、両端に２ｎｔの３´突出部をもつ短い二本鎖のＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である。各鎖は５´ホスフェート基と３´ヒドロキシル（−ＯＨ）基をもつ。この構造は、長いｄｓＲＮＡか小さなヘアピンＲＮＡのどちらかをｓｉＲＮＡに変換する酵素であるダイサーによるプロセシングの結果である。ｓｉＲＮＡを細胞内に外因的に（人工的に）導入して、目的の遺伝子の特異的なノックダウンをもたらすこともできる。このようにして、配列が既知である本質的に任意の遺伝子を、適切に調整されたｓｉＲＮＡとの配列相補性に基づいて標的化することができる。二本鎖ＲＮＡ分子またはその代謝プロセシング産物は、標的特異的核酸修飾、特にＲＮＡ干渉および／またはＤＮＡメチル化を媒介することができる。外因的に導入されたｓｉＲＮＡは、その３´末端および５´末端に突出部を欠くことがあるが、しかしながら、少なくとも１つのＲＮＡ鎖が５´および／または３´−突出部を有することが好ましい。好適には、二本鎖の一方の末端は、１〜５ヌクレオチド、より好適には１〜３ヌクレオチド、最も好適には２ヌクレオチドの３´−突出部を有する。もう一方の末端は平滑末端であってもよいし、最大６ヌクレオチドの３´−突出部を有していてもよい。一般に、ｓｉＲＮＡとして作用するのに適した任意のＲＮＡ分子が、本発明において想定される。これまで最も効率的なサイレンシングは、２−ｎｔ  ３´突出部を有するように対になった２１−ｎｔセンスおよび２１−ｎｔアンチセンス鎖から構成されるｓｉＲＮＡ二重鎖で得られた。２−ｎｔの３´突出部の配列は、第１の塩基対に隣接する対になっていないヌクレオチドに限定された標的認識の特異性に少し寄与する(Elbashir et al. 2001)。３´突出部の２´−デオキシヌクレオチドはリボヌクレオチドと同程度に効率的であるが、合成がより安価で、おそらくヌクレアーゼ抵抗性がより高い。ｓｉＲＮＡの送達は当該分野で公知の任意の方法を使用して、例えば、ｓｉＲＮＡを生理食塩水と組み合わせ、組合せを静脈内または鼻腔内に投与することによって、またはｓｉＲＮＡをグルコース中に処方することによって（例えば、５％グルコースなど）、またはカチオン性脂質を使用して、ｓｉＲＮＡ送達ｉｎ  ｖｉｖｏのために、静脈内（ＩＶ）または腹腔内（ＩＰ）のいずれかで使用することができる(Fougerolles et al. (2008), Current Opinion in Pharmacology, 8:280-285; Lu et al. (2008), Methods in Molecular Biology, vol. 437: Drug Delivery Systems ー Chapter 3: Delivering Small Interfering RNA for Novel Therapeutics)。
【０１０３】
短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉を介して遺伝子発現をサイレンシングするために使用できる、緊密なヘアピンターンを作るＲＮＡの配列である。ｓｈＲＮＡは、細胞に導入されたベクターを使用し、Ｕ６プロモーターを利用して、常にｓｈＲＮＡが発現されるようにする。このベクターは通常娘細胞に受け継がれ、遺伝子サイレンシングを受け継ぐことができる。ｓｈＲＮＡヘアピン構造は細胞機構によってｓｉＲＮＡに切断され、次にＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に結合する。
【０１０４】
この複合体は結合しているｓｉＲＮＡに一致するｍＲＮＡに結合して切断する。本発明で使用されるｓｉ／ｓｈＲＮＡは、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイトおよび従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を用いて化学的に合成されることが望ましい。ＲＮＡ合成試薬の供給業者は、Proligo (Hamburg、ドイツ)、Dharmacon Research (Lafayette, CO, USA)、Pierce Chemical(Perbio Scienceの一部、Rockford, IL, USA)、Glen Research (Sterling, VA, USA)、ChemGenes (Ashland, MA, USA)およびCruachem (Glasgow, UK)である。最も好都合なことに、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、異なる品質およびコストのＲＮＡ合成生成物を販売する、市販のＲＮＡオリゴ合成供給業者から得られる。一般に、本発明で適用可能なＲＮＡは、従来技術で合成され、ＲＮＡｉに適した品質で容易に提供される。
【０１０５】
ＲＮＡｉに影響を及ぼすさらなる分子には、例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が含まれる。前記ＲＮＡ種は一本鎖ＲＮＡ分子である。内因的に存在するｍｉＲＮＡ分子は、相補的なｍＲＮＡ転写産物に結合し、ＲＮＡ干渉と同様のプロセスを通して、前記ｍＲＮＡ転写産物の分解の引き金を引くことによって、遺伝子発現を調節する。したがって、外因的ｍｉＲＮＡはそれぞれの細胞に導入した後に、ＨＬＡ−Ｊの阻害剤として使用され得る。
【０１０６】
リボザイム（リボ核酸酵素由来、ＲＮＡ酵素または触媒ＲＮＡとも呼ばれる）は、化学反応を触媒するＲＮＡ分子である。多くの天然リボザイムは、自身の切断または他のＲＮＡの切断のいずれかを触媒するが、リボソームのアミノトランスフェラーゼ活性を触媒することもわかっている。よく特徴づけられた小さな自己切断ＲＮＡの非限定的な例は、ハンマーヘッド、ヘアピン、肝炎デルタウイルス、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏで選択された鉛依存性リボザイムであるが、グループＩイントロンはより大きなリボザイムの例である。触媒による自己切断の原理は近年よく確立されるようになった。ハンマーヘッド型リボザイムは、リボザイム活性をもつＲＮＡ分子の中で最もよく特徴づけられている。ハンマーヘッド型構造が異種ＲＮＡ配列に組み込まれ、リボザイム活性がそれによってこれらの分子に移入され得ることが示されたので、標的配列が潜在的に一致する切断部位を含むならば、ほぼあらゆる標的配列に対する触媒的アンチセンス配列を作製することができるようである。ハンマーヘッド型リボザイムを構築する基本原理は以下の通りである：ＧＵＣ（またはＣＵＣ）トリプレットを含むＲＮＡの関心領域が選択される。通常６〜８ヌクレオチドの２本のオリゴヌクレオチド鎖が取られ、触媒ハンマーヘッド配列がそれらの間に挿入される。
【０１０７】
最良の結果は通常、短いリボザイムと標的配列で得られる。また、最近の発展は、ハンマーヘッド型リボザイムを有する小さな化合物を認識するアプタマーの組合せである。標的分子と結合したときにアプタマーに誘導される立体配座変化はリボザイムの触媒機能を調節することができる。
【０１０８】
用語「アンチセンス核酸分子」は、本明細書中で使用される場合、標的核酸に相補的である核酸を指す。本発明によるアンチセンス分子は、標的核酸と相互作用することができ、より具体的には、標的核酸とハイブリダイズすることができる。ハイブリッドの形成により、標的遺伝子の転写および／または標的ｍＲＮＡの翻訳が減少または遮断される。アンチセンス技術に関する標準的な方法が記載されている（例えば、Melaniら、Cancer Res.(1991)51:2897-2901を参照)。
【０１０９】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９はＣＲＩＳＰＲ‐Ｃｐｆ１と同様に、ほぼ全ての細胞／モデル生物に適用可能であり、ノックアウト突然変異、染色体欠失、ＤＮＡ配列の編集および遺伝子発現の調節に用いることができる。遺伝子発現の調節は、転写抑制因子と結合した触媒的に死んだＣａｓ９酵素（ｄＣａｓ９）を用いて、特定遺伝子、ここではＨＬＡ−Ｊ遺伝子の転写を抑制することによって操作することができる。同様に、触媒的に不活性な「死んだ」Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ（ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａおよびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ−１由来のＣＲＩＳＰＲ）を、合成転写リプレッサーまたはアクチベーターに融合させて、内因性プロモーター（例えば、ＨＬＡ−Ｊ発現を制御するプロモーター）をダウンレギュレートし得る。あるいは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）または転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）のＤＮＡ結合ドメインがＨＬＡ−Ｊ遺伝子またはそのプロモーター領域またはその５｀−ＵＴＲを特異的に認識し、それによってＨＬＡ−Ｊ遺伝子の発現を阻害するように設計することができる。
【０１１０】
ＨＬＡ−Ｊ遺伝子またはＨＬＡ−Ｊ発現に関与する調節分子を標的とする核酸分子を阻害するものとして提供される阻害剤も、本明細書において想定される。ＨＬＡ−Ｊまたは調節分子の発現を減少または消失させるこのような分子には限定されるものではないが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼおよび転写アクチベーター様（ＴＡＬ）ヌクレアーゼが含まれる。このような方法は Silva et al., Curr Gene Ther.2011;11(1):11-27; Miller et al., Nature biotechnology.2011;29(2):143-148, and Klug, Annual review of biochemistry.2010; 79:213-231に記載されている。
【０１１１】
第６の態様において、本発明は、（ａ）第３の態様の宿主細胞を培養すること、および（ｂ）第４の態様の産生されたタンパク質またはペプチドを単離することを含む、第４の態様のタンパク質またはペプチドの産生法に関する。
【０１１２】
用語「培養」は、宿主細胞が制御された条件下で増殖されるプロセスを特定する。これらの条件は、使用される宿主細胞に依存して変化し得る。当業者は、最適化された培養条件を確立するための方法をよく知っている。さらに、細胞培養物を確立し、維持し、そして操作するための方法は、当該分野で広範に記載されている。
【０１１３】
生成された（ポリ）ペプチドの単離方法は当技術分野において周知であり、限定されるものではないが、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー（サイズ排除クロマトグラフィー）、親和性クロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣ、ディスクゲル電気泳動または免疫沈降などの方法工程を含む。例えば、Sambrook, 2001, Molecular Cloning: A laboratory manual, 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York。
【０１１４】
本発明による「産生されたタンパク質またはペプチド」という語は、宿主細胞において、（ポリ）ペプチドをコードする核酸分子からの情報が本発明の（ポリ）ペプチドの合成において使用されるプロセスが誘導され得ることを意味するプロセスの産物を指す。当技術分野で公知の方法による本発明のペプチドの転写、ＲＮＡスプライシング、翻訳、および翻訳後修飾を含む、この過程におけるいくつかの工程を調節することができる。従って、このような調節は、産生される（ポリ）ペプチドの時期、位置、および量の制御を可能にし得る。
【０１１５】
第７の態様では、本発明が核酸分子、ベクター、宿主細胞、タンパク質またはペプチド、結合分子、好ましくは本発明の阻害剤またはその組合せを含む組成物、好ましくは医薬または診断組成物に関する。
【０１１６】
本明細書で使用される「組成物」という語は核酸分子、ベクター、宿主細胞、タンパク質またはペプチド、結合分子、好ましくは第５態様の阻害剤、またはそれらの組合せのうちの少なくとも１つを含む組成物を指し、これらは以下では化合物とも総称される。
【０１１７】
本発明によれば、用語「医薬組成物」は、患者、好ましくはヒト患者に投与するための組成物に関する。本発明の医薬組成物は、上記の化合物を含む。それは、任意に、本発明の化合物の特性を変化させることができ、それによって、例えば、それらの機能を安定化、調節および／または活性化することができるさらなる分子を含んでもよい。該組成物は、固体、液体または気体状であってよく、とりわけ、（単数又は複数の）粉末、（単数又は複数の）錠剤、（単数又は複数の）溶液または（単数又は複数の）エアロゾルの形成であってよい。本発明の薬学的組成物は任意におよび追加的に、薬学的に許容される担体を含むことができる。適切な薬学的担体の実施例は当技術分野で周知であり、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、エマルジョン（実施例えば、油／水エマルジョン）、種々のタイプの湿潤剤、滅菌溶液、ＤＭＳＯを含む有機溶媒などを含む。このような担体を含む組成物は、よく知られた従来の方法によって処方することができる。これらの医薬組成物は、適当な投与量で対象に投与することができる。用量の投与方法は、主治医および臨床的要因により決定する。医学分野でよく知られているように、任意の１人の患者に対する投与量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間および投与経路、全身の健康、ならびに同時に投与される他の薬物を含む多くの要因に依存する。所定の状況に対する治療有効量は、日常的な実験によって容易に決定され、通常の臨床医または医師の技能および判断の範囲内である。一般に、医薬組成物の規則的な投与としてのレジメンは、１日当たり１μｇ〜５ｇ単位の範囲であるべきである。しかし、より好ましい用量は、０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ、さらにより好ましくは０．０１ｍｇ〜５０ｍｇ、最も好ましくは０．０１ｍｇ〜１０ｍｇ／日であり得る。さらに、例えば、前記化合物がｓｉＲＮＡなどのｉＲＮＡ剤である場合、投与される医薬組成物の全薬学的有効量は、典型的には体重１ｋｇあたり約７５ｍｇ未満、例えば体重１ｋｇあたり約７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、または０．０００５ｍｇ未満である。より好ましくは、量は体重ｋｇ当たりｉＲＮＡ剤１５００、７５０、３００、１５０、７５、１５、７．５、１．５、０．７５、０．１５、０．０７５、０．０１５、０．００７５、０．００１５、０．０００７５または０．０００１５ｎｍｏｌ未満など、体重ｋｇ当たり２０００ｎｍｏｌ未満のｉＲＮＡ剤（例えば、約４．４×１０16コピー）であろう。変化を観察するために必要とされる治療の長さおよび奏効が生じる処置後の間隔は、所望の効果に依存して変化する。特定の量は、当業者に周知の従来の試験によって決定することができる。
【０１１８】
以下にさらに詳細に記載されるように、本発明の医薬組成物は例えば、腫瘍（特にがん）ならびにワクチンまたは免疫抑制剤を処置するために使用され得る。しかしながら、医薬組成物はまた、さらなる疾患の治療または予防のために使用されてもよい。例えば、タンパク質またはペプチドが融合タンパク質である場合、融合相手は、炎症性疾患に対する治療特異性を付与することができる。本明細書中上記で議論されるように、融合相手としてのサイトカインの使用は、炎症性疾患の処置に適した融合タンパク質を生じる。脳卒中、アルツハイマー病、自己免疫疾患、創傷治癒、および筋萎縮性側索硬化症の治療のための臨床試験に特異的サイトカインが導入されており、慢性疼痛の治療のために抗炎症性サイトカインまたは炎症性サイトカインアンタゴニストの局所または全身送達を利用することができる。また、本明細書中上記で議論されるように、融合相手としての凝固促進因子の使用は、傷の治癒に適した融合タンパク質を生じる。従って、融合タンパク質によって、融合相手によって与えられるさらなる治療的使用によって、タンパク質またはペプチドの治療的使用を補うことができ、潜在的に相乗的な治療効果をもたらすことさえできる。
【０１１９】
本明細書において、上記の放射性核種もまた、タンパク質またはペプチドの融合パートナーとして議論される。放射性核酸を構成する核融合タンパク質は放射性リガンド治療に使用されることができる。放射性リガンド治療では放射性医薬品（通常、ルテチウム−１７７などのβエミッターで標識される）は腫瘍標的構造（通常、表面分子）に特異的に結合する。例えば、放射性医薬品は腫瘍標的への特異的結合を付与し、それによって放射性核種を腫瘍に標的化する抗体をさらに含んでもよい。放射性リガンド治療は一般に、転移病変に用いられる全身治療の忍容性が良好である。放射性医薬品は一般に、治療される患者の末梢静脈に注入されるか、または注射される。
【０１２０】
また、ＨＬＡ−Ｊ核酸分子、ベクター、宿主細胞、結合分子のタンパク質またはペプチド、好ましくは本発明の第５の態様の阻害剤またはその組合せそのものが、さらなる治療選択肢を提供する可能性が高い。例えば、ＨＬＡ領域は、免疫系において重要な役割を果たすいくつかの分子をコードする。ＨＬＡ領域と自己免疫疾患（ＡＩＤ）との間の強力な関連は、５０年以上にわたって確立されている(Gough and Simmons, Curr Genomics. 2007 Nov; 8(7): 453ー465)。ｓｉｃ  ＡＩＤの非限定的な例は、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、多発性硬化症（ＭＳ）、リウマチ関節炎（ＲＡ）、グレーブス病（ＧＤ）、強直性脊椎炎（ＡＳ）および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である。
【０１２１】
骨髄移植または臓器移植の成功は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を予防するためにレシピエントのＨＬＡ表現型をドナーのＨＬＡ表現型と一致させることに大きく依存する。どのＨＬＡ遺伝子座が臨床的に重要であるかについては長い議論が続いている。臨床転帰データが蓄積されるにつれて、すべてのＨＬＡ遺伝子座が関連していることが明らかになる。
このように、ＨＬＡ−Ｊも役割を果たしていると安全に考えることができる。レシピエントのＨＬＡ−Ｊ表現型をドナーのＨＬＡ−Ｊ表現型に対して一致させることができない場合、本発明の医薬組成物の阻害は、ＧＶＨＤを予防するための手段であり得る。
【０１２２】
本発明による化粧品組成物は、非治療用途に使用するためのものである。化粧品組成物はまた、クレンジング、美化、魅力の促進、または外観の変更のために、人体上に擦る、注ぐ、散布する、または噴霧する、または他の方法で適用することを意図した組成物として、それらの意図した使用によって定義されてもよい。本発明による化粧品組成物の特定の製剤は限定されない。想定される製剤には、リンス溶液、エマルジョン、クリーム、ミルク、ハイドロゲルのようなゲル、軟膏、懸濁液、分散液、粉末、固体スティック、フォーム、スプレーおよびシャンプーが含まれる。この目的のために、本発明による化粧品組成物は、化粧品として許容可能な希釈剤および／または担体をさらに含むことができる。所望の製剤に応じて適切な担体および希釈剤を選択することは、当業者の技術の範囲内である。適切な化粧用に許容可能な希釈剤および担体は当技術分野で周知であり、Ｂｕｓｈｅｌｌら（ＷＯ２００６／０５３６１３）に言及されている薬剤を含む。前記化粧品組成物のための好ましい製剤は、リンス溶液およびクリームである。１回の適用で適用される本発明の化粧品組成物の好ましい量は、０．１〜１０ｇ、より好ましくは０．１〜１ｇ、最も好ましくは０．５ｇである。適用されるべき量はまた、治療されるべき領域の大きさに依存し、それに適合されなければならない。
【０１２３】
第８の態様において、本発明は、薬剤として、好ましくは免疫抑制剤として、ワクチンとして、または妊娠促進剤として使用するための、核酸分子、ベクター、宿主細胞、タンパク質またはペプチド、結合分子、好ましくは本発明の阻害剤またはその組合せに関する。
【０１２４】
本明細書において既に上述したように、免疫抑制剤は、免疫応答を抑制することができる薬物である。これらは、例えば、（ｉ）移植された臓器および組織（例えば、骨髄、心臓、腎臓、肝臓）の拒絶を防止するため、（ｉｉ）自己免疫起源である可能性が最も高い疾患または疾患（例えば、リウマチ関節炎、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬、白斑、全身性エリテマトーデス、サルコイドーシス、巣状分節性糸球体硬化症、クローン病、ベーチェット病、天疱瘡、強皮症および潰瘍性大腸炎）を治療するため、および／または（ｉｉｉ）非自己免疫炎症性疾患（例えば、長期アレルギー性喘息制御および強直性脊椎炎）を治療するために、免疫抑制療法において使用することができる。
【０１２５】
ワクチンは好ましくは既存の腫瘍を処置するために、または腫瘍の発生を予防するために使用され得る腫瘍ワクチンである。既存がんを治療するワクチンは、治療用がんワクチンとしても知られている。ワクチンは「自家（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）」であってもよく、すなわち、患者から採取された試料から調製され、その患者に特異的である。がんワクチン接種のアプローチは一般に、がん細胞からタンパク質を分離し、そのタンパク質を抗原として患者に免疫することであり、免疫系を刺激してがん細胞を死滅させることを目的とする。抗原は、ＨＬＡ−Ｊタンパク質／ペプチドに由来する本発明によるものである。
【０１２６】
したがって、本発明はまた、核酸分子、ベクター、宿主細胞、タンパク質またはペプチド、結合分子、好ましくは本発明の阻害剤またはその組合せを、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤、担体および／または希釈剤と混合することを含む、腫瘍ワクチンの調製方法に関する。
【０１２７】
実施例２および図４／５は、高濃度のＨＬＡ−Ｊ発現が卵巣がん患者の無増悪生存および全生存率を有意に低下させることと関連することを示す。このように、ＨＬＡ−Ｊ発現は腫瘍が免疫系から逃れるのを助けると安全に想定できる。これは次に、ＨＬＡ−Ｊが免疫抑制剤として作用することを示す。免疫抑制剤としてのＨＬＡ−Ｊの作用は腫瘍の状況において有害であるが、免疫抑制剤によって当技術分野において治療される上記の疾患の状況において有利であり得る。また、このことは、ＨＬＡ−Ｊを有する腫瘍患者のワクチン接種がＨＬＡ−Ｊ発現を介して腫瘍の免疫系からの逃避を抑制または阻止するのに役立つかもしれないことを、少なくとももっともらしくする。従って、本発明の核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチドもしくは組合せは、医薬として、好ましくは免疫抑制剤として、またはワクチンとして使用され得る。核酸分子は、好ましくは第１の態様の項目（ｇ）の核酸分子である。一方、以下にさらに詳述するように、結合分子、好ましくは第５態様の阻害剤は、例えば腫瘍を治療するために使用することができる。
【０１２８】
妊娠促進剤は、妊娠する可能性、特に胚着床の可能性を増加させる化合物である。着床とは、すでに受精した卵子が子宮の壁に付着する妊娠の段階のことである。この接着により、胚は成長できるように母親から酸素と栄養分を受け取る。ヒトでは、受精卵の着床は排卵後５〜６日前後に起こる可能性が最も高い。着床不全は、症例の２／３では子宮の受容能が不十分であること、もう１／３では胚自体に問題があることが原因と考えられている。これは母親の年齢にも依存する。不十分な子宮受容は若い母親に多く、胚そのもの問題（例えば、染色体異常）は高齢の母親（特に３５歳以上）に多い。不十分な子宮受容性は、異常なサイトカインおよびホルモンシグナル伝達ならびにエピジェネティックな変化によって引き起こされる可能性がある。再発性着床不全は女性不妊症の原因である。したがって、移植のための子宮内膜受容性を最適化することによって、妊娠率を改善することができる。核酸分子、ベクター、宿主細胞、タンパク質もしくはペプチド、またはそれらの組合せは、移植のための子宮内膜受容性を最適化し、それによって妊娠を促進するために使用され得ることが想定される。核酸分子は、好ましくは第１の態様の項目（ｇ）の核酸分子である。なぜなら、ＨＬＡ−Ｇは栄養膜細胞の浸潤を制御し、局所的な免疫寛容を維持するためにサイトカイン分泌を調節することにより、着床に重要な役割を果たすと考えられているからである(Roussev and Coulam and J Assist Reprod Genet 2007 Jul; 24(7): 288-295参照）。さらに、移植前胚は可溶性ＨＬＡ‐Ｇと可溶性ＨＬＡ‐Ｆを発現することが知られている。可溶性ＨＬＡ‐Ｇと可溶性ＨＬＡ‐Ｆの発現濃度が高いほど胚の着床率が高かった。従って、高レベルのＨＬＡ−Ｊ発現は着床の成功と一致するが、低レベルのＨＬＡ−Ｊ発現は着床の失敗と一致することも予想される。従って、核酸分子、ベクター、宿主細胞、タンパク質またはペプチド、結合分子、好ましくは本発明の第５の態様の阻害剤またはその組合せは例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精において使用され得、ここで、卵母細胞は核酸分子、ベクター、宿主細胞、タンパク質またはペプチド、またはそれらの組合せの存在下で培養された後、受精され、母体に移植される。
【０１２９】
第９の態様において、本発明は、結合分子、好ましくは医薬として、好ましくは腫瘍の治療に使用するための本発明の阻害剤に関する。
第９の態様はまた、結合分子、好ましくは、免疫活性化剤として、好ましくは腫瘍の治療に使用するための使用のための本発明の阻害剤に関する。
【０１３０】
免疫賦活剤とは、免疫応答を促進することができる薬物である。免疫活性化剤は免疫活性化治療において、例えば、疾患細胞に対する免疫応答を促進および／または開始するために使用され得る。免疫応答は、好ましくは疾患細胞に対する細胞傷害性免疫応答および／またはＴ細胞応答である。
【０１３１】
言及したように、免疫活性化因子は、好ましくは腫瘍の治療の状況において使用される。添付の実施例から明らかなように、ＨＬＡ−Ｊは腫瘍において発現される。ＨＬＡ−Ｊは分泌型タンパク質であり、以下の実施例のデータは、ＨＬＡ−Ｊが腫瘍細胞によって分泌され、それによってＨＬＡ−Ｊタンパク質の「雲」が腫瘍細胞の周囲に形成され、この雲は腫瘍細胞が認識され、免疫系によって除去されるのを防ぐことを示す。結合分子、好ましくは阻害剤はこの保護雲を腫瘍細胞から取り除き、それによって腫瘍細胞に対する免疫応答を促進および／または開始する。この免疫活性化機構は、腫瘍細胞以外の疾患細胞についても準用される。
【０１３２】
腫瘍は、生理学的機能を有さず、制御されない通常急速な細胞増殖から生じる、組織の異常な良性または悪性の新しい増殖である。腫瘍は好ましくはがんである。がんは生理学的機能を持たない組織の異常な悪性新生であり、制御されない通常急速な細胞増殖から生じる。
【０１３３】
前記がんが、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、膣がん、外陰部がん、膀胱がん、唾液腺がん、膵臓がん、甲状腺がん、腎臓がん、肺がん、上部消化管のがん、結腸がん、直腸結腸がん、前立腺がん、頭頸部の扁平上皮がん、子宮頸がん、神経膠芽腫、悪性腹水、リンパ腫および白血病からなる群から選択されることが好ましい。このがんリストの中で婦人科がん（すなわち、子宮頸がん、卵巣がん、子宮がん、膣がん、および外陰がん）が好ましく、乳がんおよび卵巣がんが最も好ましい。また、このがんのリストの中で好ましいのは膀胱がんである。
【０１３４】
腫瘍またはがんは、好ましくは固形腫瘍またはがんである。固形腫瘍またはがんは、液体のがんとは対照的に、通常はのう胞または液体の領域を含まない組織の異常な質量である。
【０１３５】
本明細書の実施例２に示されるように、また図４および５に示されるように、高レベルのＨＬＡ−Ｊ  ｍＲＮＡ発現は、卵巣がん患者の無症状生存および全生存率の有意な低下と関連する。同様に、化学療法前に高レベルのＨＬＡ−Ｊが検出された乳がん患者は、化学療法の奏効性が低いことが実施例３および図１０に示される。最後に、実施例５および図１８は、膀胱がんにおけるＨＬＡ−Ｊ  ｍＲＮＡ発現の高値を示す。したがって、ＨＬＡ−Ｊの抑制、例えば、ＨＬＡ−Ｊの発現および／または翻訳が、腫瘍の治療に適していることが、本発明に関連して驚くべきことに見出された。
【０１３６】
第１０の態様において、腫瘍を診断するため、および／または腫瘍を悪性度判定するため、腫瘍を予後診断するため、および／または腫瘍をＨＬＡ−Ｊ低発現腫瘍またはＨＬＡ−Ｊ高発現腫瘍として分類するため、および／または移植不全を診断するため、および／または診断するための、対象から得られた試料における第１の態様の項目（ｇ）の核酸分子または第４の態様のタンパク質もしくはペプチドの使用に関する。
【０１３７】
言及したように、腫瘍は好ましくはがんである。また、言及したように、本態様に関連して、腫瘍またはがんは、好ましくは固形腫瘍またはがんである。
【０１３８】
試料は、対象の体液または対象の臓器由来の組織試料であってもよい。体液の非限定的な例は、全血、血漿、血清、尿、腹膜液、および胸膜液、脳脊髄液、涙液、または溶液中のそれらからの細胞である。組織の非限定的な例は、結腸、肝臓、乳房、卵巣、および精巣である。組織サンプルは、吸引もしくは穿刺、切除によって、または生検もしくは切除された細胞材料につながる任意の他の外科的方法によって採取され得る。試料は処理された試料、例えば、凍結、固定、包埋等された試料であってもよい。好ましいタイプのサンプルは、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）サンプルである。ＦＦＰＥ試料の調製は標準的な医療行為であり、これらの試料は長期間保存することができる。
【０１３９】
本明細書中で使用される「診断する」という言葉は、疾患の症候を患っている対象における疾患の同定に向けられる。本発明によれば、疾患は腫瘍または移植不全である。本明細書で使用される「悪性度判定する」という語は、腫瘍を有すると診断された対象における腫瘍細胞の細胞退形成の程度の同定を意味する。がんの悪性度分類に最もよく用いられるシステムは、the American Joint Commission on Cancerのガイドラインに従ったシステムである。これらのガイドラインに従って、以下の悪性度分類カテゴリーが区別される：  ＧＸ（悪性度は評価できない）、Ｇ１（高分化；低悪性度）、Ｇ２（中分化；中悪性度）、Ｇ３（低分化、高悪性度）；Ｇ４（未分化、高悪性度）。本明細書で使用される「予後診断」という用語は、腫瘍などの疾患からの回復の見通しまたは機会に向けられ、および／または腫瘍などの疾患の生存の見通しまたは機会である。腫瘍の場合、予後は、標的病変の腫瘍サイズ変化、疾患特異的生存（ＤＳＳ）、無再発生存（ＲＦＳ）、無増悪生存（ＰＦＳ）および無遠隔再発生存の１つ以上を含み得、ここでＤＳＳが好ましい。
【０１４０】
本発明に関して用語「対象」は、哺乳動物、好ましくは家畜またはペット動物、例えばウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌまたはネコ、最も好ましくはヒトを指す。
【０１４１】
上述したように、腫瘍患者におけるＨＬＡ−Ｊ発現レベルの上昇は、腫瘍患者の無増悪生存期間および全生存期間の有意な短縮と関連している。したがって、ＨＬＡ−Ｊ発現のレベルは、より高い悪性度とも一致する。さらに、ＨＬＡ‐Ｊ発現が全ての腫瘍試料に認められたことから、ＨＬＡ‐Ｊ発現は予後マーカーとしてだけでなく、腫瘍の診断マーカーとしても役立つことを実証した。
【０１４２】
上記の使用において、陽性および／または陰性試料ならびに所定の基準が組み込まれ得る。
対照は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１５００、または少なくとも２０００対象などの１つまたは複数の対象の試料から得ることができる。所定の基準は、陽性および／または陰性試料から以前に得られた値を示す。
【０１４３】
腫瘍の診断には、健康な対象がＨＬＡ‐Ｊを発現しないことが期待されるため、全く基準を必要としないと考えられる。また、検討した全腫瘍患者例でＨＬＡ‐Ｊ発現が検出されたことを示した。それにもかかわらず、陽性および／または陰性試料ならびに所定の基準を、本発明の診断腫瘍用途に組み込むことができる。診断のために、陽性試料は、腫瘍、好ましくは診断されるべきものと同じ身体部位の腫瘍を有することが知られている１つ以上の対象に由来する。同様に、陰性試料は、腫瘍を有さないことが知られている１つ以上の対象に由来する。試料中の第１の態様の核酸分子または第４の態様のタンパク質もしくはペプチドの発現濃度が、陰性対照またはそれに由来する所定の基準と比較して、好ましくは少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍増加する場合、対象は腫瘍を有すると診断される。試料中の第１の態様の核酸分子または第４の態様のタンパク質もしくはペプチドの発現濃度が陽性対照またはそれに由来する所定の基準とは、好ましくは、５０％未満、２５％未満、および１０％未満異なる場合、対象は腫瘍を有すると診断される。例えば、陽性対照が１００％に設定される場合、１５０％〜５０％、好ましくは１２５％または７５％の値を示す患者は、腫瘍を有すると診断される。また、移植不良の診断のために、陽性および／または陰性試料ならびに所定の基準を使用してもよい。
【０１４４】
診断のために、陽性試料は、少なくとも１つの移植不全、好ましくは少なくとも２つの移植不全、最も好ましくは少なくとも３つの移植不全を有する１つ以上の雌対象からのものである。２つ以上の移植不全は、反復または反復移植不全とも呼ばれる。同様に、陰性試料は、少なくとも１つの成功した妊娠、好ましくは少なくとも２つの成功した妊娠、最も好ましくは少なくとも３つの成功した妊娠を有した１つ以上の雌対象からのものである。試料中の第１の態様の核酸分子または第４の態様のタンパク質もしくはペプチドの発現濃度が、陰性対照またはそれに由来する所定の基準と比較して、好ましくは少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍減少する場合、雌対象は移植不全であると診断される。試料中の第１の態様の核酸分子または第４の態様のタンパク質もしくはペプチドの発現濃度が陽性対照またはそれに由来する所定の基準とは、好ましくは、５０％未満、２５％未満、および１０％未満異なっている（すなわち、より高いまたはより低い）場合、対象は移植不全であると診断される。例えば、陽性対照が１００％に設定される場合、１２５％または７５％の値を表示する患者は、移植不全を有すると診断される。
【０１４５】
腫瘍をＨＬＡ−Ｊ低発現腫瘍またはＨＬＡ−Ｊ高発現腫瘍として分類することに関しては、各々の腫瘍および全ての腫瘍が実質的な量のＨＬＡ−Ｊを発現または発現すると予想されるわけではないことが注目される。したがって、腫瘍結合分子を有する対象において、好ましくは本発明の第５態様の阻害剤が治療選択肢となり得るかどうかを明らかにするために、腫瘍は、後の場合にのみ結合分子または阻害剤が選択肢でＨＬＡ−Ｊ低発現腫瘍またはＨＬＡ−Ｊ高発現として分類され得る。分類のために、制御はＨＬＡ−Ｊを発現する腫瘍を有することが知られており、好ましくは結合分子、好ましくは本発明の第５の態様の阻害剤によって治療可能であった腫瘍を有することが知られている１つ以上の対象からであってもよい。分類されるべき腫瘍のＨＬＡ−Ｊ発現が対照と比較して、好ましくは、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍および少なくとも５倍減少している症例において、腫瘍は、ＨＬＡ−Ｊ低発現腫瘍である。一方、分類すべき腫瘍のＨＬＡ−Ｊ発現は、対照と比較して、好ましくは、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍および少なくとも５倍増加している症例において、腫瘍はＨＬＡ−Ｊ高発現腫瘍である。
【０１４６】
予後診断については、陽性対照は、腫瘍（好ましくは、予後診断と同じ身体部位の腫瘍）で死亡した１人または複数の対象からのものであり得、陰性サンプルは、腫瘍（好ましくは、予後診断と同じ身体部位の腫瘍）の進行がないかなりの時間、腫瘍を生き延びた１人または複数の対象からのものであり得る。実質的な量は、好ましくは少なくとも１年、少なくとも２年、少なくとも３年、少なくとも４年および少なくとも５年を示す。試料中の第１の態様の核酸分子または第４の態様のタンパク質もしくはペプチドの発現濃度が、陽性対照またはそれに由来する所定の基準と比較して、好ましくは少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍減少することが好ましい場合、対象は好ましい予後診断を有する。また、対象は、試料中の第１の態様の核酸分子または第４の態様のタンパク質もしくはペプチドの発現濃度が陰性対照またはそれに由来する所定の基準とは異なり、５０％未満、２５％未満、および１０％未満である場合に、対象は好ましい予後診断を有する。試料中の第１の態様の核酸分子または第４の態様のタンパク質もしくはペプチドの発現濃度が、陰性対照またはそれに由来する所定の基準と比較して、好ましくは、少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍増加する場合、対象は好ましくない予後診断を有する。また、試料中の第１の態様の核酸分子または第４の態様のタンパク質もしくはペプチドの発現濃度が陽性対照またはそれに由来する所定の基準とは好ましくは、５０％未満、２５％未満、および１０％未満異なる場合、対象は好ましくない予後診断を有する。予後診断の態様に関して、実施例３および図９および図１０に示すように、乳がん患者におけるＨＬＡ−Ｊ発現の濃度が、化学療法中の奏効性の予後診断を示す指標であったことは注目すべきである。内腔乳がん患者はＨＬＡＪ発現が最も高く、これらの患者は化学療法にほとんど反応しなかった。従って、予後診断は好ましくは腫瘍治療の予想される治療の成功の予後診断であり、ここで、抗腫瘍治療は好ましくは化学療法であり、そして／または診断されるべき患者は、好ましくは乳がんを有する。
【０１４７】
悪性度判定するために、陽性試料は、Ｇ１〜Ｇ４のカテゴリーの１つに悪性度判定される１つ以上の対象からであってもよい。２つ以上の陽性試料を悪性度判定するために使用することができ、ここで、陽性試料は、２つ、好ましくは３つ、最も好ましくは４つのカテゴリーＧ１〜Ｇ４の全てである。試料中の第１の態様の核酸分子または第４の態様のタンパク質もしくはペプチドの発現レベルが陽性Ｇ１対照またはそれに由来する所定の基準との差が、好ましくは５０％未満、２５％未満、および１０％未満である場合、対象は、Ｇ１腫瘍を有すると悪性度判定される。これは、段階Ｇ２〜Ｇ４に準用される。
【０１４８】
第１の態様の核酸分子または第４の態様のタンパク質もしくはペプチドのレベルを得るための手段は当技術分野で確立されている。
【０１４９】
例えば、第１の態様の核酸分子のレベルは、リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）、電気泳動技術またはＤＮＡマイクロアレイ(Roth (2002), Curr.Issues Mol.Biol., 4: 93-100)によって得ることができ、ＲＴ−ｑＰＣＲが好ましい。これらの方法において、発現レベルは、試料中の１つ以上の基準遺伝子の（平均）発現レベルに対して正規化され得る。本明細書中で使用される「基準遺伝子」という言葉は、検査されている系、すなわちがん、におけるＲＮＡ転写産物／ｍＲＮＡレベル上で比較的不変なレベルの発現を有する遺伝子、を意味する。このような遺伝子はハウスキーピング遺伝子と呼ばれることがある。基準遺伝子の非限定的な例は、ＣＡＬＭ２、Ｂ２Ｍ、ＲＰＬ３７Ａ、ＧＵＳＢ、ＨＰＲＴ１およびＧＡＰＤＨ、好ましくはＣＡＬＭ２および／またはＢ２Ｍである。他の適切な参照遺伝子は、当業者に公知である。
【０１５０】
ＲＴ−ｑＰＣＲは、実施例によって示される。ＲＴ−ｑＰＣＲはサーマルサイクラーにおいて、各試料を少なくとも１つの特定波長の光線で照射し、励起された蛍光体によって発せられる蛍光を検出する能力を有して実施される。サーマルサイクラーはまた、試料を急速に加熱および冷却することができ、それによって、核酸およびＤＮＡポリメラーゼの物理化学的特性を利用する。リアルタイムｑＰＣＲにおけるＰＣＲ産物の検出のための２つの一般的な方法は（１）任意の二本鎖ＤＮＡとインターカレートする非特異的蛍光色素、および（２）プローブとその相補的配列（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ）とのハイブリダイゼーション後にのみ検出を可能にする蛍光レポーターで標識されたオリゴヌクレオチドからなる配列特異的ＤＮＡプローブである。後者の検出方法は、以下の実施例において使用される。プローブは一般に、蛍光標識プローブである。好ましくは、蛍光標識プローブが蛍光レポーター色素およびクエンチャー色素（＝二重標識プローブ）の両方で標識されたオリゴヌクレオチドからなる。適切な蛍光レポーターおよびクエンチャー色素／部分は当業者に公知であり、レポーター色素／部分６−ＦＡＭＴＭ、ＪＯＥＴＭ、Ｃｙ５（登録商標）、Ｃｙ３（登録商標）およびクエンチャー色素／部分ダブシル、ＴＡＭＲＡＴＭ、ＢＨＱＴＭ−１、−２または−３を含むが、これらに限定されない。好ましくは、本発明に従って使用するためのプライマーが１５〜３０ヌクレオチドの長さを有し、特にデオキシリボヌクレオチドである。一実施形態では、プライマーが（１）ＨＬＡ−Ｊの標的ｍＲＮＡ配列に特異的であるか、またはそれに由来する、（２）１２０ｂｐ未満（好ましくは１００ｂｐ未満）のアンプリコンサイズを提供する、（３）ｍＲＮＡ特異的である（エキソン／イントロンの考察；好ましくはゲノムＤＮＡの増幅なし）、（４）二量体化する傾向がない、および／または（５）５８℃〜６２℃（好ましくはＴmは約６０℃）の融点Ｔmを有するように設計される。より好ましくは、１つ以上のプライマーおよびプローブがＨＬＡ−ＪのＨＬＡ−Ｊ特異的エキソン４／エキソン５接合部に特異的に結合する（図３）。さらにより好ましくは実施例の表１に示すようなプライマーおよびプローブの１つ以上をＲＴ−ｑＰＣＲに使用し、より好ましくはそれぞれのプローブに関連して任意に使用することができる特異的プライマー対の１つを使用する。上述のように、プローブは（２）によるＲＴ−ｑＰＣＲに必要であるが、（１）によるＲＴ−ｑＰＣＲの場合、ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎなどのインターカレーター色素で置き換えることができる。表１のフォワードプライマーは配列番号１２〜２５、プローブは配列番号２６〜３９、リバースプライマーは配列番号４０〜５３に対応する。配列番号１２のフォワードプライマーおよび配列番号４０のリバースプライマーはプライマー対であり、配列番号２６は対応するプローブである。配列番号１３のフォワードプライマーおよび配列番号４１のリバースプライマーはプライマー対であり、配列番号２７は対応するプローブであるなど。最も好ましくは、配列番号１８および４６のプライマー対が任意に配列番号３２のプローブと一緒に使用される。このプ��イマー対とプローブは、ＨＬＡ−ＪのＨＬＡ−Ｊ特異的エキソン４／エキソン５接合に特異的である。
【０１５１】
ｑＰＣＲの代替として、電気泳動技術またはＤＮＡマイクロアレイを使用して、本発明の第１の態様の核酸分子のレベルを得ることもできる。ｍＲＮＡの同定と定量のための従来の手法は、大きさと配列特異的プロービングに関する情報を提供するゲル電気泳動の組合せによるものである。ノーザンブロットは、このクラスにおいて最も一般的に適用される技術である。リボヌクレアーゼ保護アッセイ（ＲＰＡ）はより感度が高く、ノーザンブロットに比して労働集約的でない代替法として開発された。ハイブリダイゼーションは、溶液中の標識リボヌクレオチドプローブを用いて行われ、その後、非ハイブリダイズ試料およびプローブは一本鎖ＲＮＡを選択的に分解するリボヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅ  ＡおよびＲＮａｓｅ  Ｔ１）の混合物で消化される。その後の変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動は定量のための手段を提供し、そしてまた、プローブによってハイブリダイズされた領域のサイズを与える。ノーザンブロットおよびＲＰＡの両方について、定量の正確さおよび精度は、検出方法および利用される記載または標準の関数である。最も一般的にはプローブが３２Ｐまたは３３Ｐで放射標識され、この場合、最終ゲルはＸ線フィルムまたは蛍光スクリーンに暴露され、各バンドの強度はそれぞれ、濃度計または蛍光イメージャーで定量化される。両方の場合において、露光時間は必要とされる感度に適合するように調整され得るが、蛍光体ベースの技術は一般に、より感度が高く、より大きなダイナミックレンジを有する。放射能を使用する代わりに、プローブを抗原またはハプテンで標識し、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ結合抗体によって結合させ、基板を添加した後、フィルムまたは蛍光イメージャー上の化学発光によって定量することができる。これらの画像化用途の全てにおいて、プローブなしのゲルの隣接領域からの背景の差し引きが行われるべきである。ゲルフォーマットの大きな長所は、任意の基準標準を試料と同時に画像化することができることである。同様に、ハウスキーピング遺伝子の検出は、全てのサンプルについて同じ条件下で行われる。ＤＮＡマイクロアレイの構築には、２つの技術が登場している。一般に、アレイの設計のための各場合における出発点は、プローブされるべき遺伝子または推定遺伝子に対応する配列のセットである。
【０１５２】
第１のアプローチでは、オリゴヌクレオチドプローブがガラス基板から化学的に合成される。ｃＤＮＡプローブに対するオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの可変効率のために、複数のオリゴヌクレオチドプローブが、目的の各遺伝子に相補的に合成される。さらに、アレイ上の各完全に相補的なオリゴヌクレオチドについて、単一のヌクレオチド位置にミスマッチを有するオリゴヌクレオチドが構築され、そして正規化のために使用される。オリゴヌクレオチドアレイは、約１０4−１０6プローブ／ｃｍ2の密度で日常的に作成される。ＤＮＡマイクロアレイ構築のための第２の主要な技術は、スライドガラスまたは他の適切な基材上へのｃＤＮＡプローブの直接的なロボットシステム印刷法である。ＤＮＡクローンを、目的の各遺伝子について得、精製し、そしてユニバーサルプライマーを使用するＰＣＲによって共通のベクターから増幅する。プローブは、大きさが５０〜２００μｍのオーダーのスポットにロボットにより被着される。この間隔で、例えば、約１０3プローブ／ｃｍ2の密度を達成することができる。
【０１５３】
第４の態様のタンパク質またはペプチドのレベルは例えば、「タンパク質またはペプチドに結合する分子」、および好ましくは「タンパク質またはペプチドに特異的に結合する分子」を使用することによって決定され得る。タンパク質またはペプチドに結合する分子は、既知の条件下で主にタンパク質またはペプチドに結合して生じる分子を示す。抗体、アプタマーなどのような、本明細書中上記の結合分子の１つ、好ましくは第４の態様のタンパク質またはペプチドの阻害剤の「タンパク質またはペプチドに結合する分子」が使用され得る。第４の態様のタンパク質またはペプチドのレベルはまた、ウエスタンブロット分析、質量分析、ＦＡＣＳ分析、およびＥＬＩＳＡを使用することによって得られ得る。これらの技術は、タンパク質またはペプチドを定性的、半定量的および／または定量的に検出するために使用され得る手段の非限定的な例である。
【０１５４】
ウエスタンブロット分析は所与の試料、例えば、組織ホモジネートまたは身体抽出物中の特異的タンパク質またはペプチドを検出するために使用される、普及している周知の分析技術である。それは、（ポリ）ペプチドの長さ（変性条件）によって、またはタンパク質の３−Ｄ構造（天然／非変性条件）によって、天然または変性タンパク質またはペプチドを分離するためにゲル電気泳動を使用する。次いで、タンパク質またはペプチドを膜（典型的にはニトロセルロースまたはＰＶＤＦ）に移し、そこで標的タンパク質に特異的な抗体を用いてプローブ（検出）する。
【０１５５】
また、質量分析（ＭＳ）分析は、荷電粒子の質量電荷比が測定される、普及している周知の分析技術である。
【０１５６】
質量分析は、粒子の質量を決定するため、試料または分子の元素構成を決定するため、およびタンパク質、ペプチドおよび他の化合物などの分子の化学構造を解明するために使用される。ＭＳ原則は化学化合物をイオン化して荷電分子または分子断片を生成し、それらの質量電荷比を測定することからなる。
【０１５７】
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析は普及している周知の分析技術であり、ここで、生物学的細胞は、各細胞の蛍光特性の特定の光散乱に基づいて選別される。細胞を４％ホルムアルデヒド中で固定し、０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００で透過性にし、フルオロフォア標識抗体（例えば、モノクローナルまたはポリクローナル抗ＨＬＡ−Ｊ抗体）と共にインキュベートすることができる。
【０１５８】
酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）は普及している周知の高感度分析技術であり、ここでは、特異的タンパク質またはペプチドの検知のためのマーカーとして、酵素が抗体または抗原に結合される。
【０１５９】
第１の態様の核酸分子または第４の態様のタンパク質もしくはペプチドの次に、対象から得られた試料中の１つ以上のさらなる化合物を、腫瘍の診断および／または腫瘍の悪性度判定および／または腫瘍の予後診断のために使用することができる。腫瘍を診断するための、および／または腫瘍を悪性度判定するための、および／または腫瘍予後のための、膨大な数のマーカーが当技術分野で公知であり、第１の態様の核酸分子または第４の態様のタンパク質もしくはペプチドと組み合わせて使用され得る。いくつかの腫瘍マーカーは、乳がんまたは結腸がんなどの特定の腫瘍を示す。腫瘍マーカーは例えば、the National Cancer Institute(https://www.cancer.gov/about-cancer/diagnosis-staging/diagnosis/tumor-markers-fact-sheet) またはthe integrated database of cancer genes and markers CGMD (http://cgmd.in/ )に列挙されている。１つ以上のさらなるマーカーの使用は一般的に、診断、悪性度判定または予後診断の信頼性を増加させる。
【０１６０】
第１１の態様において、本発明は対象から得られた試料中の第１の態様、項目（ｇ）の核酸分子および／または第４の態様のタンパク質もしくはペプチドの存在を検出することを含む、腫瘍を診断するための方法に関し、ここで、第１の態様、項目（ｇ）の核酸分子および／または第４の態様のタンパク質もしくはペプチドの存在は、対象中の腫瘍を示す。
【０１６１】
第１２の態様において、本発明は対象から得られた試料中の第１の態様項目（ｇ）の核酸分子、および／または第４の態様のタンパク質またはペプチドのレベルを決定することを含む、腫瘍を悪性度判定するための、および／または腫瘍予後のための方法に関し、ここで、対照と比較して、第１の態様項目（ｇ）の核酸分子、および／または第４の態様のタンパク質またはペプチドのレベルの増加は、腫瘍のより高い悪性度判定および／または有害な腫瘍予後診断と正に相関する。
【０１６２】
本発明の第１１および第１２の態様の手段は、手段のフォーマットにおいて本発明の第１０の態様の使用を実施する。したがって、本発明の第１０の態様に関連して本明細書において上記で提供された定義および好ましい実施形態は、本発明の第１１および第１２の態様に等しく適用可能である。
【０１６３】
第１３の態様において、本発明は、（ａ）第１の態様の核酸分子、項目（ｇ）、および／または対象から得られた試料中の第４の態様のタンパク質もしくはペプチドの検出および／または定量のための手段、ならびに（ｂ）キットの使用説明書を含む、腫瘍を診断するための、および／または腫瘍を悪性度判定するための、および／または腫瘍の予後診断のためのキットに関する。
【０１６４】
本発明の第１３の態様のキットは、キットのフォーマットにおいて、本発明の第１０の態様の使用を実施するために必要とされる手段を実施する。この理由のために、本発明の第１０の態様に関連して本明細書中で上記に提供される定義および好ましい実施形態は、本発明の第１３の態様のキットに等しく適用可能である。
【０１６５】
第１の態様の核酸分子の検出および／または定量のための手段は好ましくは実施例の表１に示すようなプライマーおよびプローブのうちの１つまたは複数であり、ＲＴ−ｑＰＣＲにおいて使用され、より好ましくは、それぞれのプローブに関連して任意に使用することができる特異的プライマー対のうちの１つである。第４の態様のタンパク質またはペプチドの検知のための方法は、好ましくは本明細書中上記のような抗体および／または抗体模倣体である。検出および／または定量のために、抗体および／または抗体模倣物は、例えば蛍光色素または放射性標識によって標識され得る。蛍光色素および放射性標識の実施例もまた、本明細書中上記に記載される。
【０１６６】
キットの様々な構成要素は、１つ以上のバイアルなどの１つ以上の容器に包装されてもよい。バイアルは、上記構成要素に加えて、保存用の防腐剤または緩衝液を含んでもよい。キットは、好ましくは腫瘍を診断するため、および／または腫瘍を悪性度判定するため、および／または腫瘍を予後診断するためにキットの構成要素をどのように使用するかを知らせる、キットをどのように使用するかの説明書を含んでもよい。
【０１６７】
第１４の態様において、腫瘍を有する対象における腫瘍治療の非有効性をモニターするための方法であって、（ａ）治療の開始前に対象から得られた試料中の第１の態様の核酸分子の量および／または第４の態様のタンパク質もしくはペプチドの量を決定すること；および（ｂ）治療の開始後１回以上において、対象から得られた試料中の第１の態様の核酸分子の量および／または第４の態様のタンパク質もしくはペプチドの量を決定することを含み、ａ）と比較してｂ）における量の増加は、腫瘍治療の非有効性を示し、および／またはａ）と比較してｂ）における量の減少は、腫瘍治療の有効性を示す。
【０１６８】
同様に、第１５の態様において、本発明は（ａ）治療の開始前に対象から得られた試料中の第１の態様の核酸分子の量および／または第４の態様のタンパク質もしくはペプチドの量を決定すること；および（ｂ）治療の開始後の１回以上において、対象から得られた試料中の第１の態様の核酸分子の量および／または第４の対象のタンパク質もしくはペプチドの量を決定することを含む、このような治療を必要とする態様における免疫抑制療法の非有効性をモニターするための方法に関し、ここで、ａ）と比較してｂ）における量の減少は、免疫抑制療法の非有効性を示し、および／またはａ）と比較してｂ）における量の増加は、免疫抑制療法の有効性を示す。
【０１６９】
本発明の他の態様に関連して本明細書で上記に提供された定義および好ましい実施形態は、本発明の第１４および第１５の態様に等しく適用可能である。例えば、第１の態様の核酸分子の量および／または第４の態様のタンパク質もしくはペプチドの量を決定するための手段および方法は、本明細書において、本発明の第１０の態様に関連して上記に記載されている。これらの手段および方法は、本発明の第１４および第１５の態様に関連して同様に使用することができる。
【０１７０】
腫瘍治療は任意の腫瘍治療、例えば、手術、放射線療法または化学療法であり得る。腫瘍治療は、好ましくは化学療法である。化学療法は、化学療法剤の投与を含む。本発明に従って使用することができる化学療法剤には、細胞増殖抑制化合物および細胞傷害性化合物が含まれる。伝統的な化学療法剤は急速に分裂する細胞を殺すことによって作用し、急速に分裂する細胞はほとんどのがん細胞の主要な特性の１つである。化学療法剤にはタキサン、ヌクレオシドアナログ、カンプトテシン類似体、アントラサイクリンおよびアントラサイクリン類似体、エトポシド、ブレオマイシン、ビノレルビン、シクロホスファミド、代謝拮抗剤、抗有糸分裂剤、およびアルキル化剤が含まれるが、これらに限定されない。化学療法はまた、白金ベースであり得、すなわち、白金ベースの化合物（例えば、シスプラチン）の投与を包含する。化学療法剤はしばしば組合せで、通常３〜６ヵ月間投与される。最も一般的な治療の１つは、ＡＣとして知られるシクロホスファミド＋ドキソルビシン（アドリアマイシン；アントラサイクリンおよびアントラサイクリン類似体のグループに属する）の投与を含む。ときには、ドセタキセルなどのタキサン系薬剤を追加し、そのレジメンをＣＡＴと呼ぶこともある。タキサンはがん細胞の微小管を攻撃する。同等の結果を生じる別の一般的な治療は、シクロホスファミド、代謝拮抗剤であるメトトレキサート、およびヌクレオシド類似体（ＣＭＦ）であるフルオロウラシルの投与を含む。別の標準的な化学療法処置はフルオロウラシル、エピルビシンおよびシクロホスファミド（ＦＥＣ）の投与を含み、これらは、タキサン（例えば、ドセタキセル）またはビノレルビンを補充され得る。
【０１７１】
腫瘍は第１４の態様によるものであり、好ましくは非管腔腫瘍である。非管腔腫瘍とは、ホルモン受容体（エストロゲン受容体および／またはプロゲステロン受容体）陰性の腫瘍または低レベルのホルモン受容体（エストロゲン受容体および／またはプロゲステロン受容体）を発現する腫瘍である。乳房腫瘍の場合、ルミナール  Ａ腫瘍はホルモン受容体陽性、Ｈｅｒ２陰性、Ｋｉ−６７低発現であり、ルミナール  Ｂ腫瘍は（ｉ）ホルモン受容体陽性、Ｈｅｒ２陰性、Ｋｉ−６７高発現であるか、または（ｉｉ）エストロゲン受容体陽性、プロゲステロン受容体陰性、Ｈｅｒ２陰性、Ｋｉ−６７低発現である。非管腔乳房腫瘍はＨＥＲ２陽性腫瘍およびＴＮＢＣ（トリプルネガティブ乳がん）に分けることができ、ＨＥＲ２陰性およびホルモン受容体（エストロゲン受容体および／またはプロゲステロン受容体）陰性である。
【０１７２】
同様に、免疫抑制療法もあらゆる免疫抑制療法となりうる。例えば、免疫抑制療法は例えば、グルココルチコイド、細胞増殖抑制薬および抗体から選択される、１つ以上の免疫抑制薬の投与を含んでもよい。第１５の態様に従って、対象は移植された臓器または組織（例えば、骨髄、心臓、腎臓、肝臓）を受けたか、または自己免疫疾患もしくは自己免疫由来である可能性が最も高い疾患（例えば、リウマチ関節炎、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬、白斑、全身性エリテマトーデス、サルコイドーシス、巣状分節性糸球体硬化症、クローン病、ベーチェット病、天疱瘡、強直性脊椎炎、および潰瘍性大腸炎）、または別の非自己免疫性炎症性疾患（例えば、長期アレルギー性喘息制御、または強直性脊椎炎）を有する可能性がある。
【０１７３】
実施例２および図４および５において、化学療法への卵巣がん細胞組織の曝露に際して、ＨＬＡ−Ｊ発現が８倍増加することが示される。同様に、乳がん患者において、化学療法中のＨＬＡ−Ｊ発現の有意なアップレギュレーションは、化学療法のサブトータルな（subtotal）奏効性と正に相関することが見出された；実施例３および図１２を参照されたい。ＨＬＡ‐Ｊ発現の上昇が高いほど、それぞれの腫瘍患者の無増悪生存率および全生存率は不良であった。特に、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも３倍、より好ましくは少なくとも４倍、さらにより好ましくは少なくとも６倍、最も好ましくは少なくとも８倍の増加は予後不良を示す。
【０１７４】
第１６の態様において、本発明は腫瘍治療の開始前に対象から得られた試料中の第１の態様、項目（ｇ）の核酸分子の、および／または第４の態様のタンパク質またはペプチドのレベルを決定することを含む、腫瘍を有する対象における腫瘍治療の有効性を予測するための方法に関し、ここで、陰性対照と比較して、第１の態様、項目（ｇ）の核酸分子の、および／または第４の態様のタンパク質またはペプチドの減少したレベルは腫瘍治療の有効性と正に相関し、および／または陽性対照と比較して、第１の態様、項目（ｇ）の核酸分子の、および／または第４の態様のタンパク質またはペプチドの実質的に相違がないレベルは腫瘍治療の有効性と正に相関する。
【０１７５】
本発明の他の態様に関連して本明細書に提供した定義および好ましい実施形態は、本発明の第１６の態様にも同様に適用可能である。例えば、第１の態様の核酸分子の量および／または第４の態様のタンパク質もしくはペプチドの量を決定するための手段および方法は、本明細書において、本発明の第１０の態様に関連して上記に記載されている。これらの手段および方法は、本発明の第１６の態様と同様に用いることができる。第１６の態様において、陰性対照は、腫瘍治療に奏効しなかった１以上の対象由来であってもよい。陽性対照は、腫瘍治療に奏効した１以上の対象由来であってもよい。また、対照については、１つ以上の対象のサンプルが腫瘍治療の開始に先立って得られるべきである。陰性および／または陽性対照の１つ以上の対象は好ましくは調査中の対象において使用されるものと同じ腫瘍治療を受け、そして／またはこれらの１つ以上の対象は調査中の対象と同じ身体部位／器官の腫瘍を有する。
【０１７６】
試料中の第１の態様の核酸分子または第４の態様のタンパク質もしくはペプチドの発現濃度が陰性対照またはそれに由来する所定の基準と比較して、好ましくは、少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍減少する場合、対象が腫瘍療法に奏効性であると予想される。また、試料中の第１の態様の核酸分子または第４の態様のタンパク質もしくはペプチドの発現濃度が陽性対照またはそれに由来する所定の基準とは、好ましくは、５０％未満、２５％未満、および１０％未満異なっている場合、対象が腫瘍療法に奏効することが予想される。
【０１７７】
腫瘍治療は、好ましくは化学療法である。腫瘍は好ましくは本明細書中上記で定義される通りであり、最も好ましくは、乳がんの第１６の態様に関連する。実施例３および図９および１０において、乳がん患者におけるＨＬＡ−Ｊ発現の濃度が、化学療法中の奏効性を予測するために指標となったことを示す。
【０１７８】
第１７の態様において、本発明は対象中の腫瘍が管腔腫瘍であるかどうかを予測するための方法であって、対象から得られた試料中の第１の態様、項目（ｇ）の核酸分子の、および／または第４の態様のタンパク質またはペプチドのレベルを決定することを含む方法であって、陰性対照と比較して、第１の態様、項目（ｇ）の核酸分子の、および／または第４の態様のタンパク質またはペプチドの増加したレベル、および／または陽性対照と比較して、第１の態様、項目（ｇ）の核酸分子のレベルおよび／または第４の態様のタンパク質またはペプチドのレベルが実質的に異ならないことは腫瘍が管腔腫瘍であることを示す方法に関する。
【０１７９】
本発明の他の態様に関連して本明細書に提供する定義および好ましい実施形態は、本発明の第１７の態様にも同様に適用可能である。例えば、第１の態様の核酸分子の量および／または第４の態様のタンパク質もしくはペプチドの量を決定するための手段および方法は、本明細書において、本発明の第１０の態様に関連して上記に記載されている。これらの手段および方法は、第１７の態様と同様に用いることができる。
【０１８０】
管腔腫瘍はエストロゲン受容体（ＥＲ）陽性であるが、非管腔腫瘍はＥＲ陰性である。管腔腫瘍は、好ましくは管腔乳がんである。管腔乳がんはＥＲ陽性、Ｈｅｒ２陰性である。補助内分泌療法および化学療法治療にもかかわらず、ＥＲ陽性腫瘍患者は再発の危険性が高く、早期再発および晩期再発の両方が起こりうる。したがって、ＥＲ陽性腫瘍患者を特定することは重要であり、これらの患者では、長期の補助ホルモン療法の恩恵を受けるため、補助化学療法を免れることができるからである。
【０１８１】
第１７の態様において、陰性対照が非管腔腫瘍を有する１以上の対象であってもよい。陽性対照は、管腔腫瘍を有する１以上の対象であってもよい。陰性および／または陽性対照の１つ以上の対象は、好ましくは調査中の対象と同じ身体部位の腫瘍を有する。
【０１８２】
試料中の第１の態様の核酸分子または第４の態様のタンパク質もしくはペプチドの発現濃度が、陰性対照またはそれに由来する所定の基準と比較して、好ましくは少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍増加する場合、対象が管腔腫瘍を有すると予想される。また、試料中の第１の態様の核酸分子または第４の態様のタンパク質もしくはペプチドの発現濃度が陽性対照またはそれに由来する所定の基準とは好ましくは、５０％未満、２５％未満、および１０％未満異なっている場合、対象が管腔腫瘍を有すると予想される。
【０１８３】
対象内の腫瘍が管腔腫瘍であるか否かを予測する方法では、その方法の感受性および特異性を高めることが期待される管腔腫瘍のさらなるマーカーを調べることができる。さらなるマーカーの非限定的な例は、ＥＳＲ１、ＰＧＲおよびＥＲＢＢ２である。エストロゲン受容体α（ＥＲα）はＥＳＲ１遺伝子によってコードされているため、ＥＳＲ１の発現は管腔腫瘍の指標となる。ＰｇＲ遺伝子はプロゲステロン受容体をコードしており、これは一般に管腔腫瘍でも発現している。最後に、ＥＲＢＢ２という遺伝子はＨＥＲ２をコードしている。ＥＲＢＢ２発現の欠如は、管腔腫瘍を示唆する。
【０１８４】
実施例３において、管腔乳がん患者が最も高いＨＬＡ−Ｊ発現量を有していたことから、乳がん患者からの試料中の高いＨＬＡ−Ｊ発現は、乳がんが管腔乳がんであることを示す。ＨＬＡ‐Ｊは管腔腫瘍の優れたマーカーであることが分かった。
【０１８５】
第１８の態様において、本発明は、対象における腫瘍が非管腔腫瘍であるか、または管腔腫瘍であるかを予測するための方法であって、（ａ）化学療法の前に対象から得られた試料中の第１の態様、項目（ｇ）の核酸分子のレベルおよび／または第４の態様のタンパク質またはペプチドのレベルを決定すること、（ｂ）化学療法の開始後、好ましくは化学療法の完了後に対象から得られた試料中の第１の態様、項目（ｇ）の核酸分子のレベルおよび／または第４の態様のタンパク質またはペプチドのレベルを決定することであって、（ａ）と比較して（ｂ）の第１の態様、項目（ｇ）の核酸分子のレベルおよび／または（ｂ）の第４の態様のタンパク質またはペプチドのレベルの増加は非管腔腫瘍を示すが、（ａ）と比較して（ｂ）の第１の態様、項目（ｇ）の核酸分子のレベルおよび／または第４の態様のタンパク質またはペプチドのレベルが実質的に異ならないことは管腔腫瘍を示す、方法に関する。
【０１８６】
本発明の他の態様に関連して本明細書に提供した定義および好ましい実施形態は、本発明の第１８の態様にも同様に適用可能である。例えば、第１の態様の核酸分子の量および／または第４の態様のタンパク質もしくはペプチドの量を決定するための手段および方法は、本明細書において、本発明の第１０の態様に関連して上記に記載されている。これらの手段および方法は、第１８の実施態様にも同様に用いることができる。
【０１８７】
試料中の第１の態様の核酸分子または第４の態様のタンパク質もしくはペプチドの発現レベルが（ｂ）のレベルを（ａ）のレベルと比較した場合に、好ましくは、少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍増加している場合、対象が非管腔腫瘍を有すると予想される。（ｂ）のレベルを（ａ）のレベルと比較した場合に、第１の態様の核酸分子または第４の態様のタンパク質もしくはペプチドの発現レベルが、好ましくは、５０％未満、２５％未満、および１０％未満の差異（すなわち、より高いかまたはより低いか）が場合、対象が管腔腫瘍を有することが予想される。
【０１８８】
非管腔および管腔腫瘍は、好ましくは非管腔および管腔乳がんである。実施例３に示すように、化学療法に際して、非管腔乳がん患者中のＨＬＡ−Ｊ発現レベルは増加するが、管腔乳がん患者中のそれらは本質的に化学療法の影響を受けない。
【０１８９】
最後の態様において、第１の態様の核酸分子および／または第２の態様のタンパク質もしくはペプチドの阻害剤を同定する方法であって：
（ａ）第１の態様の核酸分子を発現し、および／または第２の態様のタンパク質またはペプチドを産生する腫瘍細胞を、増殖条件下で免疫担当細胞の存在下で培養すること；（ｉ）試験薬剤の存在下で、および（ｉｉ）該試験薬剤の非存在下で培養すること；（ｂ）  ａ）ｉ）およびａ）ｉｉ）の腫瘍細胞の増殖を決定すること、（ｃ）工程ｂ）でａ）ｉ）について決定された増殖を工程ｂ）でａ）ｉｉ）について決定された増殖と比較すること、ここで、ａ）ｉｉ）の増殖と比較したａ）ｉ）の増殖の減少は、試験薬剤が第１の態様の核酸分子および／または第２の態様のタンパク質またはペプチドの阻害剤であることを示すことを含む方法に関する。
【０１９０】
増殖条件は各細胞型について広範に変化するが、細胞が培養される人工環境は常に、以下を含む適切な容器からなる：（ｉ）必須栄養素（アミノ酸、炭水化物、ビタミン、ミネラル）、（ｉｉ）増殖因子、（ｉｉｉ）ホルモン、（ｉｖ）ガス（Ｏ2，ＣＯ2）、（ｖ）調節された物理化学的環境（ｐＨ、浸透圧、温度）を供給する基質または培地。
【０１９１】
従って、任意の特定の腫瘍細胞についての増殖条件がまだ確立されていない場合であっても、腫瘍細胞が増殖する適切な条件を同定することは日常的な問題である。決定された細胞増殖を決定するための技術は、当技術分野で確立されている。細胞増殖は、種々の方法によって検出することができる。細胞数の増加は例えば、顕微鏡観察下での細胞の手動計数によって、生存細胞のみを計数するために色素排除法（すなわち、トリパンブルー）を使用して測定され得る。あまり強力でなく、スケーラブルな方法はサイトメーターの使用を含み、一方、フローサイトメトリーは細胞計数（「イベント」）を他の特異的パラメーターと組み合わせることを可能にする：膜、細胞質または核のための蛍光プローブは死細胞／生存細胞、細胞型、細胞分化、Ｋｉ６７のようなバイオマーカーの発現を識別することを可能にする。
【０１９２】
試験物質としては、低分子、抗体または抗体模倣体、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、またはアンチセンス核酸分子を用いることができる。これらの化合物の性質は、本明細書の第５の態様に関連して上記に詳述されている。本発明は第５の態様に従って使用される阻害剤が第１の態様の核酸分子および／または第４の態様のタンパク質またはペプチドの阻害剤であることがすでに知られているが、試験薬剤はそのような阻害剤である能力について、本発明の最後の態様の手段において試験される。
【０１９３】
例えば、本発明の第５の態様によれば、第１の態様の核酸分子および／または第４の態様のタンパク質もしくはペプチドを阻害することが知られている低分子が使用され、一方、最後の態様によれば、本発明では、第１の態様の核酸分子および／または第４の態様のタンパク質もしくはペプチドを阻害することができるかどうかが未だ知られていない低分子が実施される。低分子は、このような阻害剤である能力について、本発明の最後の態様の方法において試験される。
【０１９４】
免疫担当細胞は、体内の抗原への曝露後に免疫反応をｉｎ  ｖｉｖｏ産生することができる細胞である。免疫担当細胞は、好ましくはマクロファージまたはリンパ球、より好ましくはリンパ球、最も好ましくはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。リンパ球、特にＮＫ細胞は腫瘍細胞を特異的に認識し、死滅させることができる。
【０１９５】
いくつかの試験薬剤の有効性は高処理量フォーマットにおいて同時に決定することができ、そのフォーマットは、本発明の第５の態様に関連して上記でより詳細に記載されている。
【０１９６】
上記のように、および以下の例から得ることができるように、第１の態様の核酸分子および／または第４の態様のタンパク質またはペプチドは、免疫担当細胞による認識から腫瘍細胞を保護することによって腫瘍細胞の増殖を促進し、そのため、第１の態様の核酸分子および／または第４の態様のタンパク質またはペプチドを阻害すると、免疫担当細胞は腫瘍細胞をよりよく認識し、次に阻害または殺すことができるので、腫瘍細胞の増殖が減少することが期待できる。ａ）ｉｉ）の増殖と比較して、ａ）ｉ）の増殖が、好ましくは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、および少なくとも９５％減少する場合、試験薬剤は阻害剤として適格である。最も好ましくは、試験薬剤が腫瘍細胞の細胞増殖を完全にまたは本質的に完全に無効にする。
【０１９７】
第１の態様の核酸分子および／または第４の態様のタンパク質もしくはペプチドに対する試験薬剤の特異性を確実にするために、最後の態様の手段は、好ましくはａ）ｉｉ）と比較して、ａ）ｉ）における第１の態様の核酸分子の量および／または第４の態様のタンパク質もしくはペプチドの量を決定する追加の工程を含む。試験薬剤の存在下で、その非存在と比較して減少した量または活性は、第１の態様の核酸分子および／または第４の態様のタンパク質もしくはペプチドに対する試験薬剤の特異性を示す。
【０１９８】
本明細書で特徴付けられる実施形態に関して、特に請求項では、従属請求項で言及される各実施形態が、各請求項の各実施形態（独立または従属）と組み合わせられることが意図されている。本明細書で特徴付けられる実施形態に関して、特に請求項では、従属請求項で言及される各実施形態が、各請求項の各実施形態（独立または従属）と組み合わせられることが意図されている。例えば、独立請求項１が３つの代替案Ａ、Ｂ及びＣを記載し、従属請求項２が３つの選択肢Ｄ、Ｅ及びＦを記載し、請求項３が請求項１および２に従属し、且つ３つ代替案Ｇ、Ｈ及びＩを記載する場合には、本明細書が、特に言及しない限り、組み合わせA, D, G; A, D, H; A, D, I; A, E, G; A, E, H; A, E, I; A, F, G; A, F, H; A, F, I; B, D, G; B, D, H; B, D, I; B, E, G; B, E, H; B, E, I; B, F, G; B, F, H; B, F, I; C, D, G; C, D, H; C, D, I; C, E, G; C, E, H; C, E, I; C, F, G; C, F, H; C, F, Iに対応する実施形態を明確に開示していることを理解されたい。
【０１９９】
同様に、また、独立請求項及び／又は従属請求項が選択肢を記載していない場合においても、従属請求項が複数の先行する請求項に遡って参照している場合、それによってカバーされる対象事項の組合せは、明示的に開示されているとみなされることが理解される。例えば、独立請求項１、請求項１をさかのぼって参照する従属請求項２、および請求項２および１の両方をさかのぼって参照する従属請求項３の場合、請求項３及び１の対象事項の組合せは、請求項３、２及び１の対象事項の組合せと同様に明確かつ明白に開示されることになる。請求項１〜３のいずれか１項を参照するさらなる従属請求項４が存在する場合、請求項４及び１、請求項４、２及び１、請求項４、３及び１並びに請求項４、３、２及び１の対象事項の組合せは、明確かつ明白に開示されることになる。
【図面の簡単な説明】
【０２００】
【図１】潜在的翻訳開始部位におけるＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−Ｆ１、ＨＬＡ−Ｆ２およびＨＬＡ−Ｆ３の配列アラインメント。潜在的開始コドンは、明るい灰色のバックグラウンドによって示される。公開されているコンセンサス配列との、開始コドンの相違点には黄色のバックグラウンドが付いている。スプライス部位は、灰色の背景によって描かれている。記載されているＨＬＡ−Ｊの早期（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ）終止コドンは、灰色の背景と灰色の文字でマークされている。
【図２】膜貫通ドメインへの移行部のＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−Ｆ１、ＨＬＡ−Ｆ２およびＨＬＡ−Ｆ３の配列アラインメント。スプライス部位は、灰色の背景によって描かれている。エキソン５−エキソン６のドナー受容部位間に長く広がっているのは、ＨＬＡ−Ｊユニーク配列の挿入に由来する。本明細書に開示されるＨＬＡ−Ｊの新規終止コドンは、灰色の背景および灰色の文字でマークされる。
【図３】ＨＬＡ−Ｊ特異的エキソン４／エキソン５接合部におけるＲＴ−ｑＰＣＲアッセイにより定量されるＨＬＡ−Ｊ  ｍＲＮＡ発現。ＣＡＬＭ２を基準遺伝子とした４０−ＤＣＴ法により、相対的ｍＲＮＡ発現を測定する。４０‐ＤＣＴ値が高いほど遺伝子発現が高かった。ＰＣＲ法の指数関数的な性質により、それぞれ１ずつ増加すると、遺伝子発現が２倍になる。３ＤＣＴ値の増加は、ＨＬＡ−Ｊ  ｍＲＮＡ発現が８倍増加することを意味する。
【図４】ＨＬＡ−Ｊ特異的エキソン４／エキソン５接合部におけるＲＴ−ｑＰＣＲ法により定量化したＨＬＡ−Ｊ  ｍＲＮＡ発現による階層化に基づいて、術前補助療法を受けた卵巣がん患者の無増悪生存率を示すカプランマイヤープロット。ＣＡＬＭ２を基準遺伝子とした４０−ＤＣＴ法により、相対的ｍＲＮＡ発現を測定する。治療前と治療後の発現レベルの差は、４０−ＤＣＴ計算に基づいて測定した（上記参照）。２以上のＤＣＴ変化（すなわち、＞＝２．１）は、卵巣がん組織が化学療法に暴露された際のＨＬＡ−Ｊの８倍を超える増加を反映している。
【図５】ＨＬＡ−Ｊ特異的エキソン４／エキソン５接合部におけるＲＴ−ｑＰＣＲ法により定量化したＨＬＡ−Ｊ  ｍＲＮＡ発現による階層化に基づいて、術前補助療法を受けた卵巣がん患者の全生存確率を示すカプランマイヤープロット。ＣＡＬＭ２を基準遺伝子とした４０−ＤＣＴ法により、相対的ｍＲＮＡ発現を測定する。治療前と治療後の発現レベルの差は、４０−ＤＣＴ計算に基づいて測定した（上記参照）。２，１を超えるＤＣＴ変化は、卵巣がん組織を化学療法に曝露した際のＨＬＡ−Ｊの８倍を超える増加を反映している。
【図６】ＨＬＡ−Ｊ特異的エキソン４／エキソン５接合部におけるＲＴ−ｑＰＣＲアッセイにより定量されるＨＬＡ−Ｊ  ｍＲＮＡ発現。ＣＡＬＭ２を基準遺伝子とした４０−ＤＣＴ法により、相対的ｍＲＮＡ発現を測定する。４０‐ＤＣＴ値が高いほど遺伝子発現が高かった。
【図７】乳がん組織の化学療法歴のない治療前コア針生検におけるＨＬＡ−Ｊ  ｍＲＮＡ発現と乳がんサブタイピングの主要マーカーとの相関。
【図８】化学療法後の残存乳がん組織の手術標本におけるＨＬＡ−Ｊ  ｍＲＮＡ発現と乳がんサブタイピングの重要なマーカーとの相関。
【図９】乳がん患者からの治療前コア針生検試料における腫瘍退縮グレード（ＴＲＧ）状態およびＨＬＡ‐Ｊ、ＥＳＲ１、ＥＲＢＢ２およびＫＲＴ５  ｍＲＮＡのｍＲＮＡ発現濃度のデータ分布。
【図１０】乳がん患者の治療前コア針生検標本におけるＴＲＧ状態とＨＬＡ−Ｊ、ＥＳＲ１、ＥＲＢＢ２、ＫＲＴ５  ｍＲＮＡのｍＲＮＡ発現値とのスピアマン相関。
【図１１】術前化学療法後の乳房腫瘍のＴＲＧ状態とＨＬＡ‐Ｊ，ＥＳＲ１，ＥＲＢＢ２及びＫＲＴ５  ｍＲＮＡのｍＲＮＡ発現レベルのデータ分布。術前補助化学療法に限定的な奏効性を有する腫瘍組織は、暗灰色で強調される。
【図１２】術前化学療法後の乳がん患者の腫瘍組織におけるＴＲＧ状態とＨＬＡ‐Ｊ，ＥＳＲ１，ＥＲＢＢ２及びＫＲＴ５  ｍＲＮＡのｍＲＮＡ発現レベルのスピアマン相関。
【図１３】術前補助化学療法の前（左図）と後（右図）の乳がん患者の腫瘍組織におけるＴＲＧの状態（ｘ軸）によるＨＬＡ−Ｊ  ｍＲＮＡ発現（ｙ軸）の散布図。
【図１４】乳がん患者の腫瘍組織におけるＴＲＧ状態（ｘ軸）による化学療法前後のＨＬＡ‐Ｊ  ｍＲＮＡ発現差（ｙ軸）の散布図。
【図１５】ＨＬＡ−Ｊ特異的エキソン４／エキソン５接合部におけるＲＴ−ｑＰＣＲ法により定量化したＨＬＡ−Ｊ  ｍＲＮＡ発現による層別化に基づいて、術前補助療法を受けた乳がん患者の無増悪生存率を示すカプランマイヤープロット。ＣＡＬＭ２を基準遺伝子とした４０−ＤＣＴ法により、相対的ｍＲＮＡ発現を測定する。治療前と治療後の発現値の相違点は、４０−ＤＣＴに基づいて決定した（上記参照）。乳がん組織を化学療法に曝露した際のＨＬＡ−Ｊの１６倍以上の増加を反映する３，５を超えるＤＣＴの変化。
【図１６】α２および３ドメインの領域、膜貫通ドメインおよび細胞質領域との対応する結合ペプチドにおける、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆアイソフォーム、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−ＨおよびＨＬＡ−Ｊのタンパク質配列のまとめ。コンセンサス配列は、整列した配列の上に灰色で強調されている。ＨＬＡペプチド配列の相違点も灰色で強調されている。ＨＬＡ−Ｊの予測されるα３ドメインは他のＨＬＡ遺伝子のこれらのドメインとは異なり、灰色で強調されている。ＨＬＡ−Ｊ特異的抗体の生成のためのペプチド配列は、「ＪＵＬＹ抗体」と名付けられた矢印として描かれている。
【図１７】（Ａ）化学療法抵抗性腫瘍に罹患した患者（ｎ＝４；患者ＩＤ：１０７，１１４，１１６及び１２８）由来の卵巣がん組織におけるウェスタンブロット解析によるＨＬＡ‐Ｊタンパク質発現のエビデンス。それぞれの患者について、ＨＬＡ−Ｊタンパク質発現を術前化学療法前（ｐｒｅ）および術後（ｐｏｓｔ）に評価している。（Ｂ）卵巣がん（「ＯＣ」）、乳がん（「ＢＣ」）、尿路上皮／黒色腫がん（「ＵＣ」）および胎盤組織（「Ｐｌ」）におけるウエスタンブロット分析によるＨＬＡ−Ｊタンパク質発現のエビデンス。
【図１８】術前化学療法後の３人のがん患者からの膀胱切除標本（ＣＹＳ）生検標本におけるＨＬＡ−Ｊの腫瘍特異的発現は、化学療法治療前の対応する経尿道的切除（ＴＵＲ）生検標本ならびに正常組織からの「マッピング」陰性対照標本において発現は検出されなかった。
【実施例】
【０２０１】
実施例により本発明を説明する。
実施例１：非偽遺伝子としてのＨＬＡ−Ｊの同定およびそれぞれのエキソン／エキソン境界におけるＨＬＡ−Ｊ特異的領域の決定
ゲノム解析および配列アラインメントは、ＵＣＳＣゲノムブラウザ（https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway）にアクセスし、HLA‐J(NR_024240.1)の推定配列とともに、HLA-A1 (NM_002116.7), HLA-A2 (NM_001242758.1), HLA-G (NM_002127.5), HLA-F1 (NM_001098479.1), HLA-F2 (NM_018950.2), HLA-F3 (NM_001098478.1)のゲノミック配列ダウンロードすることにより行った。初期アラインメント解析は、潜在的翻訳開始領域と細胞外アルファドメインから膜貫通領域への潜在的移行部に焦点を当てた。Ｍｅｓｓｅｒらの以前の刊行物（Messer G, Zemmour J, Orr HT, Parham P, Weiss EH, Girdlestone J. HLA-J, a second inactivated class I HLA gene related to HLA-G and HLA-A.Implications for the evolution of the HLA-A-related genes.J Immunol.1992 Jun 15; 148(12):4043-53.）によれば、ＨＬＡ−Ｊは、エキソン２又はエキソン４のいずれかで翻訳終結を生じる有害な突然変異のため、偽遺伝子であると考えられている。潜在的なリーディングフレームを分析するために、開始コドン（リボソームによって翻訳されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写産物の最初のコドン）を分析した。Ｍｅｓｓｅｒらは、コンセンサス開始部位に対するそれらの配列解釈に基づいて、ＡＴＧ−ＧＧＧ−ＧＴＣ−ＡＴＧ−ＧＣＧ−ＣＣＣ−ＣＧＡ−ＡＣＣ−Ｃ（配列番号１０）（図１、ＨＬＡ−Ｇ配列中の明るい灰色のバックグラウンドを有するＡＴＧ）を示した。彼らのグループによってクローニングされたＨＬＡ−Ｊのそれらの配列分析によれば、有害点突然変異がヌクレオチド位置４で観察され得、ここでＧは欠失しており（図１、ＨＬＡ−Ｊ配列中の灰色「−」）、それは実際にフレームシフトＡＴＧ−ＧＧＧ−ＴＣＡ−ＴＧＧ−ＣＧＣ−ＣＣＣ−ＧＡＡ−ＣＣＣ（配列番号１１）をもたらす。Ｍｅｓｓｅｒらによって記載されるように、これは、エキソン２におけるタンパク質配列の早期終結を生じる。しかしながら、本明細書中に記載されるさらなる研究は驚くべきことに、位置１０に第２の潜在的開始部位が存在することを明らかにした。配列分析は、５´および３´末端の第２のＡＴＧの周囲のヌクレオチドがコザック配列の要件と一致することを明らかにした。さらに、公表された開始コドンコンセンサスを比較すると、ＨＬＡ−ＦはＭｅｓｓｅｒらによって記載されるようにコンセンサス開始コドンを欠くが、本発明によると、ＨＬＡ−Ｊの真の翻訳開始部位である第２の開始部位を有する。配列アラインメントを分析し、位置１０で開始し、２番目のＡＴＧ位置に翻訳開始コドンを有する場合、ＨＬＡ−Ｊは、任意の早期停止を生じるフレームシフト欠失を有さず、ＨＬＡ−Ｇと実質的に類似したタンパク質となることがわかった。コンセンサスアラインメントの「オープンリーディングフレーム３」（ＯＲＦ３）が、関連するリーディングフレームであることが同定され、それが既報の「偽遺伝子」を真の遺伝子配列に変換した。
【０２０２】
アルファドメインから膜貫通ドメインへの移行部におけるＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−Ｆ１、ＨＬＡ−Ｆ２、ＨＬＡ−Ｆ３およびＨＬＡ−Ｊの配列アラインメントを図２に示す。ＮＣＢＩ命名法に基づきエキソン５はＨＬＡ−ｓのアルファ２３ドメインをコードし、エキソン６は膜貫通ドメインをコードする。エキソン５とエキソン６の間の連結部でスプライス部位を見ると（図２のＨＬＡ−Ｇ配列に灰色文字で灰色の背景色で示してある）、ＨＬＡ−Ｊ内に１６ヌクレオチドが挿入されると、このスプライシングドナー部位と受容部位が破壊される一方で、ＨＬＡ−Ｊに特有の配列がつくられることが明らかになる。他のＨＬＡは、この位置または配列全体の他のどこにも類似の配列を有さない。  重要なことに、この領域は真のエキソン領域に由来し、ＨＬＡ−Ｊ特異的ドナー部位とスプライシングの受容部位の間に約５７０ｂｐのイントロン長がある。従って、この部位は、腫瘍および正常組織サンプル中に分泌型ＨＬＡ−Ｊ  ｍＲＮＡが存在することを証明するために特に興味深いものであるように選択された（実施例２を参照のこと）。
【０２０３】
偽遺伝子でないＨＬＡ−ＪとＨＬＡ−Ｇのエキソン構造を比較すると、ＨＬＡ−Ｊはアルファドメイン構造２をコードするエキソン４ホモログを特に欠いており、ＨＬＡ−Ｇのゲノム決定されたスプライス変異体のホモログとして機能していることが明らかになった。さらにより重要なことにはＯＲＦ３に基づく推定アミノ酸配列、すなわち「ＨＴＦＬＥＴＳＱＧＳＫＴＲＲＦＬ（−Ｓｔｏｐ）」（配列番号５）（複数の荷電アミノ酸（例えば、Ｅ、Ｋ、Ｒ）および芳香族アミノ酸（Ｆ）を含み、これによりこの配列が膜貫通領域またはアンカーであることが除外される。それにより、新たに同定されたＨＬＡ−ＪはＨＬＡ−Ｇに類似した特徴を有する明らかな分泌型タンパク質が、ペプチド提示のために大切なアルファ２様ドメインを欠く。
【０２０４】
実施例２：術前補助療法の治療を受けた卵巣がん患者コホートにおける逆転写（ＲＴ）定量ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）法によるＨＬＡ−Ｊ  ｍＲＮＡ発現量の測定
組織学的に確認されたＦＩＧＯ病期ＩＩＩ〜ＩＶの上皮性卵巣がん腫または腹膜がん腫で、最善の先行手術に不適で、術前化学療法の候補となっている患者（以下、前記がん腫を卵巣がんと表記する場合もある）４５例を２００４年９月〜２００７年１２月に本試験に登録した。その他の試験参加基準は、年齢＞１８歳、白金製剤をベースとした化学療法に十分な血液学的、腎臓、肝臓および心臓の機能であった。除外基準は、Karnofsky performance status（ＫＰＳ）が７０％未満、他の悪性腫瘍の既往歴、手術禁忌とした。ベースライン時にオープン腹腔鏡検査により至適減量手術の可能性は除外された。生検試料がマイクロアレイ解析に不十分であった９人の患者および組織学的修正後に腹膜中皮腫と診断されたため不適格であることが判明した１人の患者を除外した後、４５人の患者の最初の研究集団は３５人に限定された。カルボプラチンＡＵＣ５およびパクリタキセル１７５ｍｇ／ｍ２  Ｑ３を３時間かけて３週間ごとに投与する標準レジメンが、術前補助療法として６サイクル実施された。７５歳を超える患者３人および全身状態が不良な患者１人（ＫＰＳ７０％）では、組合せ化学療法よりもカルボプラチン単剤の方が好ましかった。
【０２０５】
手術後に、手術試料分析を行い、組織病理学的奏効を評価した。現在までのところ、卵巣がんにおける術前補助化学療法後の治療応答を記述するための組織病理学的基準は確立されていない。卵巣における初回化学療法の奏効性に関する文献(Le et al.2007, Sassen et al.2007)および乳がん(Ogston et al.2003)によると、病理学的完全奏効としては手術標本にがん細胞が認められないこと、非常に良好な部分寛解としては、小さな集塊（＜１ｃｍ）または個々のがん細胞の残存のみで、術後に肉眼的残存が認められないことが考えられた。部分病理学的寛解は初回診断的腹腔鏡検査と比較して、手術時の腫瘍量が３０％〜９０％減少した場合と定義されたが、安定疾患は手術時の腫瘍量の減少または３０％未満の減少が認められない場合と定義された。完全かつ非常に良好な部分寛解が得られた患者のみが病理学的奏効例とみなされたが、他の症例はすべて病理学的非奏効例とみなされた。生存分析では、初期診断から進行（ＰＦＳ）または死亡（ＯＳ）までの時間、または進行と死亡の間の時間（ＰＤＴ）を、カプランマイヤー生存推定とコックス回帰分析に使用した。４０名の患者の全生存率が得られた。データ閉鎖時でのＰＦＳ中央値は１４．７ヵ月、ＯＳ中央値は３３．５ヵ月であり、これは試験登録時の病期が非常に進行したステージであったこと（切除不能なＦＩＧＯ  ＩＩＩ〜ＩＶ）を考慮すると高い。
【０２０６】
ｍＲＮＡ検出のために、収集した組織を急速凍結し、分析まで液体窒素中に保存した。凍結卵巣腫瘍組織約２０〜１００ｍｇを液体窒素中で粉砕した。ＲＮＡは市販キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出し、ＲＮＡ完全性はAgilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA）を用いて、ｃＤＮＡはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎキット(Invitrogen Corp.)を用いて、１ｍｇのトータルＲＮＡから合成し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａマイクロアレイ(Affymetrix Inc., Santa Clara, CA, USA)を用いて分析した（Ihnen et al.2008）。
【０２０７】
バリデーションの目的のために、独立した技術的アプローチによってアレイデータを確認するために、ＲＴ−ｑＰＣＲを、上記のように同一の新鮮な組織生検から単離された全ＲＮＡに適用した。ＨＬＡ−Ｊの発現の評価のために、遺伝子特異的ＴａｑＭａｎベースのプライマー／プローブセットを使用した。ＲＴ−ｑＰＣＲ法による遺伝子発現の詳細な解析のために、目的の部位に隣接するプライマーおよび中間でハイブリダイズする蛍光標識プローブを利用した。標的特異的プライマーおよびプローブを、ＮＣＢＩプライマー設計ツール（www.ncbi.nlm.nih.go)を使用して選択した。ＲＮＡ特異的プライマー／プローブ配列を使用して、プライマー／プローブ配列をエキソン／エキソン境界を横切って位置させることによってＲＮＡ具体的な測定可能にした。さらに、既知の多型（ＳＮＰ）を有する配列領域に結合しないようにプライマー／プローブを選択した。同じ遺伝子の複数のアイソフォームが存在する場合、プライマーを選択して、全ての関連するまたは選択されたスプライス変異体を適切に増幅した。全てのプライマー対を、従来のＰＣＲ反応によって特異性についてチェックした。プライマー／プローブをさらに最適化した後、表１に列挙したプライマーおよびプローブが最良の結果を与えた。これらのプライマー／プローブは例えば、特異性および増幅効率の点で、先行技術から公知のプライマー／プローブよりも優れている。試料ＲＮＡの量を標準化するために、ＣＡＬＭ２を基準遺伝子として選択したが、これは分析した試料において差次的に調節されなかったからである。治療前未加工の生検または治療後切除のため、ＲＮＡ含量が低い（すなわち、ＣＡＬＭ２の未加工のＣＴ値が２２未満）ペア検体は除外した。
【０２０８】
2021522337.tif 000002
【０２０９】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）検証実験が行われ、ターゲットとコントロールの増幅の効率がほぼ等しいことが示され、これは比較ΔＣＴ法による遺伝子発現の相対的定量化の前提条件である。生物学的試料内の目的の遺伝子の発現解析を行うために、２つの特定のアッセイのそれぞれのプライマー／プローブを混合することによって、４×二重（ｄｕｐｌｅｘ）アッセイ混合物を調製した。ＣＴ値を別々に検出するために、アッセイプローブを異なる蛍光プローブで修飾した。各４×アッセイ混合は、２μＭの未修飾フォワードおよびリバースプライマーおよび１．２μＭのプローブを含んでいた。各反応について、ＦＦＰＥ切片（上記参照）から抽出した２．５μｌの全ＲＮＡを、９６ウェル光学反応プレートの１つのウェル中で、２．５μｌのアッセイミックス、２．５μｌの酵素ミックスおよび２．５μｌの水と混合した。ＰＣＲ反応の測定は、Versant qPCR Cycler(Siemens)またはLight Cycler 480(Roche)を用いて、製造業者の指示に従って、適切な条件（５分５０℃、１サイクル；２０秒９５℃、１サイクル；１５秒９５℃；１分６０℃、４０サイクル）下で行った。
【０２１０】
図３に示すように、全ての卵巣がん試料はＨＬＡ−Ｊを発現した。ＨＬＡ−Ｊ  ｍＲＮＡ発現のダイナミックレンジは５  ＤＣＴ値を含み、これは、卵巣がん特異的ＨＬＡ−Ｊ発現の２5までのアップレギュレーション（すなわち、３０倍）を意味する。重要なことに、このアップレギュレーションは進行卵巣がんにおける術前化学療法治療後に頻繁に発生した（術前補助化学療法前のＨＬＡ−Ｊ  ｍＲＮＡレベルについての明るいバーと、術前補助化学療法後のＨＬＡ−Ｊ  ｍＲＮＡレベルについての暗いバーを比較する）。一致した試料対の２６のうち１４（〜５０％）で、化学療法後に実質的なＨＬＡ‐Ｊアップレギュレーションが観察されたが、ダウンレギュレーションは患者＃１０７でのみ観察できた。さらに、ＨＬＡ−Ｊ発現の大幅な増加は、より不良な転帰と一致した。例えば、ＨＬＡ−Ｊ  ｍＲＮＡ発現患者＃１０６、患者＃１０８および患者＃１１２が最も高く（すなわち８倍以上）増加した３人の患者の無増悪生存期間は、それぞれ８．７カ月、９．２カ月および７．９カ月であった。同様に、初診から死亡までの時間の全生存時間は、それぞれ１０．６カ月、１２．５カ月、１０．３カ月であった。対照的に、ＨＬＡ‐Ｊ  ｍＲＮＡ発現の顕著な低下を示す患者＃１０７は、１５．１か月の無増悪生存期間と４３．０か月の全生存期間を有した。比較のため、ＰＦＳ中央値は１４．７ヵ月、ＯＳ中央値は３３．５ヵ月であった。
【０２１１】
次に、化学療法後の切除例におけるＨＬＡ‐Ｊ  ｍＲＮＡ発現の４倍以上の上昇を見ると、ＨＬＡ‐Ｊ  ｍＲＮＡ発現の変化が術前補助療法を受けた卵巣がん患者において予後予想能があるかどうかを解析した。このあらかじめ定義された状況では、１６％の腫瘍がＨＬＡ‐Ｊ発現の顕著な増加を示した。実際、このような患者の無増悪生存期間および全生存期間は、図４および５に示すように有意に不良であった。
【０２１２】
これらのデータは、ＨＬＡ−Ｊの分泌型が卵巣がんにおいて過剰発現されることを実証する。さらに、その発現は、化学療法薬による卵巣がんへの曝露（患者の５０％以上）時に高頻度に増大することが実証されている。さらに、これらのデータから、極端なアップレギュレーション（８倍以上）は、化学療法に対する抵抗性のほか、無増悪および全生存の低下と一貫して関連していることが実証されている。
【０２１３】
事前に定義された仮説によれば、以前は誤って分類されていた「偽遺伝子」の発現が、卵巣がんで実証されているようにがんにおいて機能的でありおよび予後予測能があることを研究者らは証明することができた。がんの退縮に対する術前補助療法の効果については、長い間議論が続いている。腫瘍細胞の破壊は抗原およびネオアンチゲンの免疫系への曝露に結果としてなり、それにより、全身性の中期から長期の抗腫瘍反応を誘発し、最終的に生存期間の延長につながると想定される。それでもなお、腫瘍がこれらの抗腫瘍効果をどのように逃れ、免疫細胞誘導性排除から逃れるかは未解決である。
【０２１４】
ここでは、１つの機構が分泌型ＨＬＡ‐Ｊアイソフォームのアップレギュレーションであることを示した。これらの小さなＨＬＡ−Ｇ様タンパク質はアルファ２ドメインを欠き、それにより、細胞毒性および抗腫瘍性免疫細胞（Ｔ細胞など）の提示および活性化のためにペプチドを結合することができないようである。しかし、抗原提示機能を欠くが、免疫細胞に結合できるタンパク質の分泌は免疫細胞の活性化過程を妨げることができ、それによって免疫寛容を誘導することによって腫瘍細胞の逃避を可能にする。
【０２１５】
分泌型アイソフォームは膜に結合していないので、浸潤している免疫細胞に結合する免疫活性リガンドの濃度勾配をつくり上げ、それがエフェクター活性を修飾する。
極端な場合には、免疫細胞を抗腫瘍活性から腫瘍促進作用に切り替えることができる。
これらの分泌型ＨＬＡアイソフォームはサイズが小さいため、パラクリンおよび遠隔の様式で活性を示す。血液中にこのような断片が検出されれば、抗腫瘍活性のモニタリングが可能となり、耐性が生じた場合のそれぞれの治療法の変更が可能となる。さらに、これらの免疫活性リガンドをブロックすることによって、免疫療法剤（例えば、チェックポイント阻害剤）を含むが、これに限定されない、従来のおよび／または他の抗腫瘍性治療の有効性が増大され得る。
【０２１６】
実施例３：術前補助療法を受けた乳がん（ＢＣ）患者コホートにおける逆転写（ＲＴ）定量ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）法によるＨＬＡ−Ｊ  ｍＲＮＡ発現量の測定
化学療法および乳房手術に十分な医学的状態を有する新たに診断された早期／局所進行ＢＣ患者を本試験に適格とした。また、治療計画に乳房手術後の化学療法が含まれていれば、少数転移性ＢＣ患者も適格とした。針生検によりＢＣの組織学的診断を確認した。身体的検査、マンモグラフィー、乳房超音波研究、乳房ＭＲＩ、胸腹部ＣＴスキャン、骨スキャンおよび１８Ｆ−ＦＤＧ−ＰＥＴ／ＣＴ研究は、全患者でベースライン時に入手した。身体診察、マンモグラフィー、乳房超音波検査および１８Ｆ−ＦＤＧ−ＰＥＴ／ＣＴ検査は、２回のＰＣＴ（術前化学療法）サイクル後および手術前に再度実施した。
【０２１７】
患者は６〜８サイクルのアントラサイクリン系およびタキサン系ＰＣＴを受けた。ＰＣＴ終了後に手術（腋窩リンパ節郭清を含む）を施行した。乳房温存術を受けた患者はその後放射線療法を受けた。
【０２１８】
化学療法後に採取した新鮮な手術標本（乳房および腋窩リンパ節）を経験豊富な乳房病理医が評価した。Ｍｉｌｌｅｒ−Ｐａｙｎｅ分類は、ＰＣＴに対する組織学的奏効を評価するために使用される等級付けシステムであった。エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）およびヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）が調べた分子マーカであった。免疫組織化学（ＩＨＣ）をＥＲおよびＰＲの評価に用いた；陽性であるためには、腫瘍核細胞の１０％以上が染色されなければならなかった。ＨＥＲ２状態をＩＨＣで評価した；ＨＥＲ２陽性（ＨＥＲ２＋ｉｖｅ）は、ＩＨＣによる３＋または蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）による遺伝子増幅を伴うＩＨＣの２＋と定義した。さらに、ＥＳＲ１およびＥＲＢＢ２の状態のＲＴ−ｑＰＣＲに基づく評価が、ＨＬＡ遺伝子発現と異なる乳がんサブタイプとの関連を決定するための乳がん生物学の重要なパラメータの定量的評価を得るために実施されている。
【０２１９】
２００４年７月から２０１１年３月にかけて、主な特徴を表２に示す初発ＢＣ患者６０例を登録した。ＰＣＴは、患者９人（１５％）を対象にアントラサイクリン系およびタキサン系の６サイクルのレジメンと、患者４５人（７５％）を対象にアントラサイクリン系およびタキサン系の逐次４サイクルを計８サイクル実施した。最後の化学療法サイクルから３１日（ｄ）（範囲１１−５２ｄ）の中央値間隔で、２人を除くすべての患者が手術を受けた。化学療法終了後、全般的に至適病理学的奏効（ｐＲ）が１３人の患者（２２％）で観察され、病理学的非奏功（ｐＮＲ）が４７人の患者（７８％）で生じた。
【０２２０】
2021522337.tif 000003
【０２２１】
ｍＲＮＡ検出のために、収集した組織を急速凍結し、分析まで液体窒素中に保存した。治療後のコア針生検および治療後の組織切除物を液体窒素中で粉砕した。ＲＮＡは市販キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出し、ＲＮＡ完全性を、Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)を用いて評価し、ｃＤＮＡをインビトロゲンキット（Invitrogen Corp.)を用いて１ｍｇ  のトータルＲＮＡから合成し、Affymetrix HG-U133A microarrays (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA, USA)  で分析し、これは他で記載したとおりである（Ihnen et al., Breast Cancer Res Treat. 2008, Volume 112, Issue 3, pp 419ー427)。
【０２２２】
バリデーションの目的のために、独立した技術的アプローチによってアレイデータを確認するために、ＲＴ−ｑＰＣＲを、上記のように同一の新鮮な組織生検および腫瘍切除物から単離された全ＲＮＡに適用した。ＨＬＡ−Ｊの発現の評価のために、遺伝子特異的ＴａｑＭａｎベースのプライマー／プローブセットを使用した。ＲＴ−ｑＰＣＲ法による遺伝子発現の詳細な解析のために、目的の部位に隣接するプライマーおよび中間でハイブリダイズする蛍光標識プローブを利用した。試料ＲＮＡの量を標準化するために、ＣＡＬＭ２、ＲＰＬ３７Ａおよび／またはＧＡＰＤＨを基準遺伝子として選択したが、これはそれらが分析される試料において差次的に調節されなかったからである。治療前未加工の生検または治療後切除のため、ＲＮＡ含量が低い（すなわち、ＣＡＬＭ２の未加工のＣＴ値が２２未満）ペア検体は除外した。１９名の患者から、治療前後のペア試料を採取し、ＲＮＡの質が充分なものを入手した。重要なことに、ＨＬＡ−Ｊ  ＲＴ−ｑＰＣＲアッセイに加えて、さらなるＲＴ−ｑＰＣＲ測定を行い、腫瘍の侵攻性を評価するために、表２に示されるように、浸潤マーカーＭＭＰ１およびＭＭＰ７と同様に、ＥＳＲ１、ＭＬＰＨ、ＥＲＢＢ２、ＫＲＴ５などのサブタイプ特異的マーカーを定量した。ＥＳＲ１ステータス定義およびサブタイプ決定は以前の記載のように実施された(Pentheroudakis et al.. Breast Cancer Res Treat. 2008 Jul 31; Koutoula et al., Virchows Arch. 2013 Feb; 462(2):141-54, Noske et al., Breast Cancer Res Treat.2011 Feb; 126(1): 109-17, Wirtz et al., Breast Cancer Res Treat.2016 Jun;157(3):437-46.)。
【０２２３】
2021522337.tif 000004
【０２２４】
表３のプローブは配列番号５６〜６８に対応し、フォワードプライマーは配列番号６９〜８１に対応し、リバースプライマーは配列番号８２〜９４に対応する。例えば、ＲＰＬ３７Ａのためのプローブおよびプライマーは、配列番号５６、６９および８２、ならびにＧＡＰＤＨの配列番号５７、７０および８３である。ＴａｑＭａｎ（登録商標）検証実験が行われ、ターゲットとコントロールの増幅の効率がほぼ等しいことが示され、これは比較ΔＣＴ法による遺伝子発現の相対的定量化の前提条件である。生物学的試料内の目的の遺伝子の発現解析を行うために、２つの特定のアッセイのそれぞれのプライマー／プローブを混合することによって、４×二重（ｄｕｐｌｅｘ）アッセイ混合物を調製した。ＣＴ値を別々に検出するために、アッセイプローブを異なる蛍光プローブで修飾した。各４×アッセイ混合は、２μＭの未修飾フォワードおよびリバースプライマーおよび１．２μＭのプローブを含んでいた。各反応について、凍結組織およびホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）切片（上記参照）から抽出した２．５μｌの全ＲＮＡを、９６ウェル光学反応プレートの１つのウェル中で、２．５μｌのアッセイミックス、２．５μｌの酵素ミックスおよび２．５μｌの水と混合した。ＰＣＲ反応の測定は、Versant qPCR Cycler(Siemens)またはLight Cycler 480(Roche)を用いて、製造業者の指示に従って、適切な条件（５分５０℃、１サイクル；２０秒９５℃、１サイクル；１５秒９５℃；１分６０℃、４０サイクル）下で行った。
【０２２５】
図６に示したように、卵巣がんにおける結果（図３参照）と同様に、全ての乳がん試料がＨＬＡ−Ｊを発現した。再度、ＨＬＡ−Ｊ  ｍＲＮＡ発現のダイナミックレンジは７ＤＣＴ値を含んで広く、これは、乳がんにおけるＨＬＡ−Ｊ発現の２7までのアップレギュレーション（すなわち、１２８倍）を意味する。重要なことに、このアップレギュレーションは、進行性乳がんにおける術前補助化学療法治療後に頻繁に発生した（術前補助化学療法前のＨＬＡ−Ｊ  ｍＲＮＡレベルについての明るいバーと、術前補助化学療法後のＨＬＡ−Ｊ  ｍＲＮＡレベルについての暗いバーを比較する）。一致した試料対の１９のうち１０（〜５０％）で、化学療法後に実質的なＨＬＡ‐Ｊアップレギュレーションが観察されたが、ダウンレギュレーションは患者＃２５と＃２９でのみ観察できた。
【０２２６】
ＥＳＲ１  ｍＲＮＡの状態はあらかじめ定義されたカットオフ設定により決定され、このコホートにおける半定量的ＩＨＣ測定と良く相関した。予想通り、ＥＳＲ１  ｍＲＮＡの状態は、ＷＮＴ依存性浸潤過程に関与するマトリックスメタロプロテアーゼであるトリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）マーカーＭＭＰ７（スピアマン  Ｒｈｏ  ０．３６５６；ｐ＝０．０４９８）と逆相関していた。さらに、ＥＲＢＢ２陽性腫瘍の半数はＥＳＲ１を過剰発現するが、他の半数は発現しないことから、ＥＳＲ１  ｍＲＮＡは予想されるＥＲＢＢ２  ｍＲＮＡ過剰発現と関連していなかった。これにより、分析した乳がんコホートの妥当性および代表性が実証される。
【０２２７】
ノンパラメトリックスピアマン相関解析の結果、術前補助化学療法前の針生検試料中のＨＬＡ‐Ｊ発現はＥＳＲ１  ｍＲＮＡ状態の過剰発現と有意に関連し（スピアマン  Ｒｈｏ  ０．５６７９；ｐ＝０．００９０），ＥＳ１  ｍＲＮＡの定量測定と有意に関連する傾向があった（スピアマン  Ｒｈｏ  ０．４４３６；  ｐ＝０．０５０１）。
【０２２８】
重要なことに、治療前のＨＬＡ‐Ｊ  ｍＲＮＡ発現もＫＲＴ５  ｍＲＮＡと強く相関した（スピアマンＲｈｏ  ０．６１２１；  ｐ＝０．００４１）。ＫＲＴ５は、ＴＮＢＣ、ＥＲＢＢ２を生じる乳がんおよびルミナールＢ腫瘍における基底様の特徴と関連していると考えられている。このことは、基底様の特徴を有する進行管腔腫瘍が化学療法未治療の状態で主にＨＬＡ‐Ｊを発現することを示し、浸潤リンパ球の制御に関与するｄｅ  ｎｏｖｏ  ＨＬＡ‐Ｊ発現を示している。
【０２２９】
次に、術前化学療法後の腫瘍組織中のＨＬＡ‐Ｊ  ｍＲＮＡ発現を用いて、残存腫瘍組織の病理組織学的奏効に応じた分子サブタイピングに用いる治療前バイオマーカーの相関を調べた。
【０２３０】
驚くべきことに、治療後のＨＬＡ−Ｊ  ｍＲＮＡ発現量に関して、サブタイプ特異的マーカー遺伝子発現の治療前の関連性の完全なシフトが観察された。例として、化学療法歴のない組織におけるＨＬＡ−Ｊ  ｍＲＮＡ発現と治療前のＥＳＲ１  ｍＲＮＡ状態との強力かつ有意な関連（スピアマン  Ｒｈｏ  ０．５６７９；ｐ＝０．００９０）は消失しただけでなく、逆方向にほぼ有意に達した（スピアマン  Ｒｈｏ  −０．４１６３；ｐ＝０．０６７９）。同様に、治療前のＨＬＡ−Ｊ  ｍＲＮＡ発現とＫＲＴ５  ｍＲＮＡ発現との強い関連（スピアマンＲｈｏ  ０．６１２１；  ｐ＝０．００４１）は乳がん組織の化学療法治療ｉｎ  ｖｉｖｏ時に逆転していたが、この比較的小さな患者集団では有意性には達していなかった（スピアマンＲｈｏ  −０．３３９２；ｐ＝０．０１４３４）。これらの知見は非管腔およびトリプルネガティブ乳がんが化学療法治療時にＨＬＡ‐Ｊ  ｍＲＮＡ発現を劇的にアップレギュレートするが、一方でＨＬＡ‐Ｊ  ｍＲＮＡ発現は管腔腫瘍において同等に増大せず、影響を受けないままであることを実証する。これは、管腔腫瘍およびトリプルネガティブ腫瘍においてサブタイプ特異的な新規発現を示し、腫瘍細胞浸潤が減少していることが知られている管腔腫瘍においてアップレギュレーションがないことから、非常に重要である（Schmidtら、Cancer Res 2008 Jul 1;68(13):5405-13)。治療前のサンプルのみに焦点を当てたこれらの以前の研究とは対照的に、ここで採取したユニークなアプローチは、治療に伴う腫瘍駆動性免疫細胞調節の動態を解明する。重要なことに、腫瘍組織のカウンター調節は、未治療の設定でこの原動を新たに持たない腫瘍サブタイプで特に明白になる。
【０２３１】
次に、ＨＬＡ−Ｊ発現の治療前レベルを、Ogston et al., Breast.2003 Oct; 12(5):320-7の「腫瘍退縮グレード」（ＴＲＧ）に従って、化学療法の奏効性と相関させた。
このＴＲＧシステムは以下のように、腫瘍退縮グレードで、治療した際の腫瘍サイズの縮小の程度を定量化する：
ＴＲＧ  １：個々の悪性細胞に何らかの変化がみられるが、全体的な細胞充実性の低下はみられない。
ＴＲＧ  ２：腫瘍細胞のわずかな消失であるが、全体的な細胞充実性は依然として高い；３０％未満の消失。
ＴＲＧ  ３：腫瘍細胞が３０〜９０％減少。
ＴＲＧ  ４：腫瘍細胞の９０％以上の消失。
【０２３２】
図９に示されるように、 Miller and Pyne分類（すなわち、ＴＲＧ１およびＴＲＧ２；暗灰色によって強調される）による減少の徴候を示さなかった乳房腫瘍は、同時に最も高いＨＬＡ−Ｊ  ｍＲＮＡ発現を示した。さらに、これらの腫瘍では、ＥＳＲ１  ｍＲＮＡのレベルが高く、ＥＲＢＢ２  ｍＲＮＡのレベルが低かった。このことから、術前補助化学療法にほとんど反応しない管腔腫瘍は管腔の特徴を有し、治療前のＨＬＡ−Ｊ  ｍＲＮＡレベルが最も高いことが実証される。従って、治療前のＨＬＡ‐Ｊ  ｍＲＮＡレベルは化学療法の奏効性を予測すると結論される。
【０２３３】
特定のバイオマーカーおよび／または標的遺伝子のｍＲＮＡ発現と化学療法の奏効性判定との関連性を比較するために、それぞれの連続変数を用いてスピアマン相関が実施されている。
これまでのところ、ＥＳＲ１  ｍＲＮＡおよびＥＲＢＢ２は、複数の大規模術前補助試験でレトロスペクティブおよびプロスペクティブに検証されているように(Denkert et al., Annals of Oncology 2012)、乳がんにおける術前化学療法に対する乳房腫瘍の奏効性を予測するための最良の奏効性マーカーの一部であることが知られている。このサンプルセットにおけるスピアマン相関はＥＳＲ１が腫瘍退縮グレードと逆相関し、高いＥＳＲ１  ｍＲＮＡレベルが低い腫瘍退縮グレードと関連することを示す。これは以前の報告と一致するが、このより小さいサンプルセットにおいて統計的有意性には達しない（スピアマン  Ｒｈｏ−０．２２７２；  ｐ＝０．３４９５）。予想通り、ＥＲＢＢ２  ｍＲＮＡ発現は腫瘍退縮グレードと正に相関し、高ＥＲＢＢ２  ｍＲＮＡレベルは高腫瘍退縮グレードと関連している。これは以前の報告と一致するが、このより小さいサンプルセットにおいて統計的有意性には達しない（スピアマン  Ｒｈｏ  ０．２７５１；ｐ＝０．２５４３）。対照的に、ＨＬＡ‐Ｊ  ｍＲＮＡ発現は、高度に有意に腫瘍退縮グレードと逆相関する（スピアマン  Ｒｈｏ‐０．６０９４；  ｐ＝０．００５６）。このことから、術前化学療法の奏効性を予測するためには、治療前のＨＬＡ−Ｊ  ｍＲＮＡレベルが従来の乳がんマーカーよりも優れており、治療前のコア針生検でＨＬＡ−Ｊレベルが高値であれば、化学療法が奏功しないことが示されることが実証される。
【０２３４】
次に、存留腫瘍組織におけるＨＬＡ‐Ｊ  ｍＲＮＡの化学療法後ｍＲＮＡレベルが術前補助化学療法の奏効性と関連するかどうかを分析した。
【０２３５】
興味深いことに、術前化学療法に奏効しないか、あってもごくわずかである乳がんのｍＲＮＡレベルから、ＥＳＲ１とＨＬＡ−ＪのｍＲＮＡ発現のレベルはほぼ同じであることが明らかになった（図９と比較する）。対照的に、化学療法レジメンにより攻撃された腫瘍（薄い灰色）はＨＬＡ‐Ｊ発現の顕著な上昇を示した。注目すべきことに、腫瘍の５０％は治療前のＨＬＡ−Ｊ  ｍＲＮＡレベルが最高値を上回っていた。同時に、低レベルのＨＬＡ‐Ｊを有する腫瘍の発生頻度は劇的に減少した。
【０２３６】
グレード３および４の腫瘍退縮は、原発部位の腫瘍量の完全な減少ではないものの、顕著な減少と関連していることに注意することが重要である。しかしながら、化学療法に対して完全に近い奏効または不完全奏効のみを示す腫瘍は、生存率が良好ではない。完全奏効のみが優れた無増悪生存および全生存と関連しているためである。
【０２３７】
興味深いことに、化学療法に対して完全に近い奏効性を有する、バイオマーカーおよび／または標的遺伝子発現腫瘍の治療後のｍＲＮＡレベルを見ると、存在する基底様腫瘍細胞で高まっており、同時にHLA‐J mRNAの有意なアップレギュレーションが示された。ＫＲＴ５とＨＬＡ‐Ｊの治療後ｍＲＮＡ発現の上昇は高ＴＲＧ状態と関連していた（それぞれスピアマン  Ｒｈｏ  ０．５２３９；  ｐ＝０．０２５６とスピアマン  Ｒｈｏ  ０．５８２１；  ｐ＝０．００８９）。
【０２３８】
この知見はＴＲＧ状態に基づくＨＬＡ‐Ｊ  ｍＲＮＡ発現の散布図解析によりさらに検討した。図１３に示すように、術前補助化学療法前にＴＲＧ２とＴＲＧ３およびＴＲＧ４腫瘍を比較すると、針生検ではＨＬＡ−Ｊ  ｍＲＮＡ発現中央値が段階的に減少する。対照的に、化学療法後には、術前化学療法後の原発巣残存のＨＬＡ−Ｊ  ｍＲＮＡ発現中央値が段階的に増加する。
【０２３９】
結論として、化学療法治療時に（Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００８により記載されているように）免疫浸潤が増加している非管腔性腫瘍において、ＨＬＡ−Ｊ  ｍＲＮＡ発現は４倍から３２倍増大し、これに加えて奏効の程度と直線的に相関する。これは、腫瘍細胞の実質的な破壊および浸潤する樹状細胞またはマクロファージによる腫瘍抗原の露出によって引き起こされる圧倒的な免疫応答に対する腫瘍組織の対抗反応とみなすことができる。
【０２４０】
化学療法時のＨＬＡ−Ｊ  ｍＲＮＡ発現の変化の最も大きい予測値は、個々の腫瘍ペアについて治療後のＨＬＡ−Ｊ  ｍＲＮＡレベルから治療前を差し引くことによって示すことができる（図１４参照）。
【０２４１】
最後に、ＨＬＡ‐Ｊ  ｍＲＮＡ発現の変化が乳がん患者の無増悪生存期間に及ぼす関連性を検討した。カプランマイヤー解析により、３、５  ＤＤＣＴ値を超えるＨＬＡ‐Ｊ  ｍＲＮＡ発現の増加は、より悪い無増悪生存を示すことが明らかとなった（ｐ＝０．００９６）。
【０２４２】
まとめると、これらの結果は、治療前のＨＬＡ‐Ｊ  ｍＲＮＡ発現は、乳がんの治療成績と化学療法の有効性を予測することを示した。さらに、卵巣がんにおける状況（実施例１参照）と同様に、化学療法処理に際してＨＬＡ−Ｊ発現に動的な違いがあり、化学療法が誘導する腫瘍細胞の破壊およびその後の腫瘍病変の認識に際して、免疫浸潤の増加による排除を防止するための腫瘍組織の逆反応を実証する。卵巣がんにおける状況と同様に、逆反応の程度は予後不良と関連している。それにより、腫瘍が治療から逃れることによって免疫認識および破棄が誘導される一般的な機構が同定された。このメカニズムの決定は、臨床ルーチン設定において容易に適応可能で単純で高度に再現性のあるアッセイ系に縮小された。さらに、この一般機構の腫瘍特異的差異は、イラストの方法によって同定された管腔腫瘍間の差異を示すこと、限定されないで、ＥＳＲ１、ＥＲＢＢ２および／またはＫＲＴ５発現レベルを測定することによって実証される。以前に、ＥＳＲ１  ｍＲＮＡ決定に例示的に縮小された分子サブタイピングはまた、乳がん(PCT/EP2014/067675; EP20140755642)、卵巣がん(WO2009068655A1; PCT/EP2008/066449)、膀胱がん(WO 2016/131875 A1; PCT/EP 2016/053372)および肺がん(US 9,683,229 B2; EP10721373.8)のようなあらゆる種類の腫瘍における治療有効性に関して予後予測能および予測能があることが示された。したがって、例として示され、乳がんに限定されない本発明は基礎をなす類似の腫瘍生物学のために、他の原発腫瘍部位に由来する管腔および非管腔基底腫瘍にも関連がある。したがって、本明細書中に開示されるエスケープ機構の阻害はまた、多様ながん適応症における現在の治療に重要な補助を果たす。
【０２４３】
実施例４：がん患者検体中のＨＬＡ−Ｊ抗体を介したＨＬＡ−Ｊタンパク質の検出
古典的（ＨＬＡ−ＡからＣ）、非古典的（ＨＬＡ−ＥからＧ）および偽遺伝子（ＨＬＡ−ＪおよびＨ）のペプチド配列相同性の分析がＧｅｎｅｉｏｕｓアラインメントモードのＧｅｎｅｉｏｕｓソフトウェアで行われている。コンセンサス配列は、灰色で強調され、とりわけ分析された配列で強調されている。コンセンサス配列に対するペプチド配列の相違点も灰色で強調されている。ＨＬＡ−Ｊのアルファ３ドメイン、連結ペプチドおよびそれに対応する膜貫通ドメインは、ほぼ連続的に灰色で強調され、これらの領域が偽遺伝子ＨＬＡ−Ｈおよび古典的および非古典的ＨＬＡペプチド配列と比較して、ＨＬＡ−Ｊに特有であることを示すことが観察され得る。このユニークさのため、ＨＬＡ−Ｊのユニークなアルファ３のｃ末端および膜貫通ドメインに対してＨＬＡ−Ｊ抗体が生成されている（図１６）。ペプチド配列は、アルファ３ドメイン、連結ペプチドおよび膜貫通ドメインのＮ末端にわたる２２アミノ酸を含む。
【０２４４】
化学療法に反応しなかった患者（ｎ＝４；患者ＩＤ： 107, 114, 116, 128）の卵巣がん組織を用いて、ＨＬＡ−Ｊウエスタンブロット分析の予測タンパク質の存在を証明する目的で実施されている（図１７Ａ）。それぞれの患者について、ＨＬＡ−Ｊタンパク質発現が化学療法の前（ｐｒｅ）と後（ｐｏｓｔ）に評価されている。１５μｇのタンパク質組織溶解物を、変性条件下で１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で分離し、そしてニトロセルロース膜に湿った状態で移した。特異的抗ＨＬＡ−Ｊ抗体「ＪＵＬＹ」とのインキュベーション後、ＨＰＲと結合した抗ウサギ抗体とのインキュベーション後、続いてＴＭＢ基質の適用後に、紫色沈殿物が観察された。ウエスタンブロット分析では、約５５ｋＤａの大きさのＨＬＡ‐Ｊタンパク質が認められた。試料１０７ｐｏｓｔに関しては、さらなるバンドを約１００ｋＤａで検出することができる。計算されたＨＬＡ‐Ｊのタンパク質サイズは２６，７ｋＤａ程度である。これらの知見は、ＨＬＡ‐Ｊがジスルフィド結合を作り出すシステイン残基によって引き起こされる二量体および四量体コンホメーションで主に存在することを示す。驚くべきことに、１０７、１１６および１２８の患者内で、タンパク質発現の変化が、化学療法の前（ｐｒｅ）および後（ｐｏｓｔ）の組織間で観察され得る。タンパク質発現は、患者＃１０７および＃１１６において、試料前から試料後にわずかに増加する。ｍＲＮＡ発現解析で観察されるように、患者＃１２８において、ＨＬＡ−Ｊタンパク質発現の強い増加を、術前補助治療がん組織前から後まで観察することができる。この結果は、ＨＬＡ‐Ｊが特に術前補助化学療法後の免疫回避に寄与し、化学療法治療に対する不十分な反応を生じることを示す。  ＨＬＡ−Ｊタンパク質が他のタイプのがんに存在するかどうかを決定するために、多様ながん診断およびヒト胎盤組織由来のタンパク質溶解物を、上記と同様のウェスタンブロットテクノロジーによって分析した（図１７Ｂ）。  重要なことに、ＨＬＡ−Ｊタンパク質は、卵巣がん（「ＯＣ」）、乳がん（「ＢＣ」）、尿路上皮／黒色腫がん（「ＵＣ」）および胎盤組織（「Ｐｌ」）で検出できた。これは、ＨＬＡ−Ｊタンパク質発現が非生理的条件下（例えば、がん）および限定された生理的条件下（例えば、「妊娠」）で起こることを示す。
【０２４５】
実施例５：非婦人科がんにおけるＨＬＡ−Ｊ発現の予測値
化学療法治療時のＨＬＡ−Ｊアップレギュレーションが非婦人科がんでも起こるかどうかを評価するために、進行した筋層浸潤性膀胱がんに罹患している患者（男女とも）からの組織試料を、化学療法前（「ＴＵＲ」；経尿路生検）および化学療法後（「ＣＹＳ」；膀胱切除組織）に採取し、加えて、膀胱切除の切除物からＨＬＡ−Ｊ非腫瘍組織の腫瘍特異的発現の証明（「マッピング」、同一の患者を形成する正常組織試料）を採取した。最初のコホートは、組織学的に確認されたＭＩＢＣ、ＵＩＣＣステージＩＩ期およびＩＩＩ期（ｃＴ２−３およびｃＮ０またはｃＮ＋Ｍ０）の患者２０人からの適合組織標本で構成された。全患者にゲムシタビン１２５０ｍｇ／ｍ2（ｄ１；ｄ８）シスプラチン７０ｍｇ／ｍ2（ｄ１）の術前補助療法３サイクルを行い、続いて根治的膀胱摘除術を行った。経尿道的切除（「ＴＵＲ」）生検および膀胱切除標本（「ＣＹＳ」標本）のために、腫瘍内容が５０％以上（最小腫瘍サイズが５ｘ５ｍｍ）の代表的なホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ブロックを選択し、境界明瞭で、壊死領域または肉芽腫性炎症を伴わないものを選択した。組織病理学的に確認された正常組織対照について、同じ膀胱切除標本からの腫瘍のない領域を、典型的なＦＦＰＥブロック（「マッピング」試料）を調製するために選択した。市販のビーズベースの抽出法(XTRACTキット; STRATIFYER Molecular Pathology GmbH, Cologne, Germany)によって処理した１０μｍ切片を用いて、ＲＮＡをＦＦＰＥ組織から抽出した。ＲＮＡを１００μｌの溶出緩衝液で溶出し、ＲＮＡ溶出物を分析した。ＲＴ−ｑＰＣＲは、上述の遺伝子固有のＴａｑＭａｎ（登録商標）ベースのアッセイを用いて、ＨＬＡ−Ｊ  ｍＲＮＡおよびＣＡＬＭ２（ハウスキーピング遺伝子）発現の相対的な定量化に適用した。実験は、以下のプロトコールに従ってRoche Light Cycler LC480(Roche, Germany)で行った：５０℃で５分間、９５℃で２０秒間、続いて９５℃で１５秒間、および６０℃で６０秒間の４０サイクル。４０回の増幅サイクルを適用し、３つのマーカーのサイクル定量化閾値（Ｃｔ）値および各試料についての１つの参照遺伝子を、３回の測定の平均として推定した。Ｃｔ値は、標的遺伝子のＣｔ値（ΔＣｔ）からハウスキーピング遺伝子ＣＡＬＭ２のＣｔ値を差し引くことにより正規化した。ＨＬＡ−Ｊ特異的ｍＲＮＡ発現は、上記のように適合ＴＵＲ生検、ＣＹＳ試料およびマッピング作成試料からの単一工程ＲＴ−ｑＰＣＲを用いた重複測定により測定した。相対的な遺伝子発現は、上記の４０−ＤＣＴ法を用いて決定した。
【０２４６】
重要なことに、ＨＬＡ−Ｊの腫瘍特殊発現を証明するＨＬＡ−Ｊ発現を示すマッピング試料はいずれも存在しなかった。しかし、患者２０例中３例では術前化学療法後のＣＹＳ検体からＨＬＡ−Ｊの腫瘍特異的発現が検出されたが、化学療法前の対応するＴＵＲ生検検体からは発現は検出されなかった（図１８）。このことは、腫瘍特異的ＨＬＡ‐Ｊ発現がこれらの腫瘍の化学療法抵抗性表現型に寄与する化学療法により誘導されたことを示す。これは、術前化学療法後のＨＬＡ−Ｊ発現の増加が乳がんや卵巣がんだけでなく、膀胱がんなどの婦人科以外のがんでも起こることを証明している。従って、ＨＬＡ‐Ｊ発現は、多くの婦人科腫瘍および非婦人科腫瘍に存在するより一般的な耐性機序であると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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