(57)【要約】  本発明はそれを必要とする哺乳類における癌を診断するための方法に関する。本方法は前記哺乳類から生体試料を採取する工程と、前記生体試料からＡＤＡＭＴＳＬ５遺伝子が過剰発現されているかを決定する工程と、前記遺伝子の過剰発現の決定から癌を診断する工程とを含む。本発明は哺乳類から得られた生体試料中のＡＤＡＭＴＳＬ５遺伝子の過剰発現を決定するためのキット、ＡＤＡＭＴＳＬ５またはＡＤＡＭＴＳＬ５経路を標的にする薬剤と癌の治療に使用するための薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物、および癌のバイオマーカーとしてのＡＤＡＭＴＳＬ５  ｍＲＮＡもしくはタンパク質の使用にも関する。【選択図】図９
2021519090.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする哺乳類における肝細胞癌を診断するための方法であって、
前記哺乳類から生体試料を採取する工程と、
前記生体試料からＡＤＡＭＴＳＬ５遺伝子が過剰発現されているかを決定する工程と、
前記遺伝子の過剰発現の決定から肝細胞癌を診断する工程と
を含む方法。
【請求項２】
前記生体試料は、血液、生検組織、血漿、血清、尿、便、痰、脳脊髄液または細胞溶解物の上澄みからなる群から選択され、好ましくは前記生体試料は組織生検、血液、血漿、血清または尿である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生体試料中のＡＤＡＭＴＳＬ５遺伝子の過剰発現は、前記生体試料中のＡＤＡＭＴＳＬ５タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルを測定することによって決定する、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記生体試料中の前記ＡＤＡＭＴＳＬ５タンパク質レベルは、少なくとも１種の抗ＡＤＡＭＴＳＬ５型抗体を前記生体試料に添加することによって測定する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記抗ＡＤＡＭＴＳＬ５型抗体は、アルカリホスファターゼ西洋わさびペルオキシダーゼまたは蛍光染料に結合されていないものまたは結合されているものからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記生体試料中の前記ＡＤＡＭＴＳＬ５タンパク質レベルは、免疫染色、免疫蛍光、ウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡを用いて測定する、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１種の抗ＡＤＡＭＴＳＬ５型抗体、前記生体試料を保持するための容器、および前記哺乳類から得られた生体試料中の前記ＡＤＡＭＴＳＬ５肝細胞癌マーカー遺伝子の過剰発現を測定するためのプロトコルを含む、それを必要とする哺乳類における肝細胞癌を診断するためのキット。
【請求項８】
前記抗ＡＤＡＭＴＳＬ５型抗体は、アルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼまたは蛍光染料に結合されていないものまたは結合／コンジュゲートされているものからなる群から選択される、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
前記生体試料中の前記ＡＤＡＭＴＳＬ５  ｍＲＮＡレベルは、マイクロアレイ、ＲＮＡ−ｓｅｑ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＲＮＡ−ｓｃｏｐｅならびに通常の半定量的もしくは定量的ＲＴ−ＰＣＲを含む前記生体試料に対するｍＲＮＡを検出するための利用可能な方法論によって測定する、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
ＡＤＡＭＴＳＬ５またはＡＤＡＭＴＳＬ５経路を標的にする薬剤と肝細胞癌の治療に使用するための薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物であって、ＡＤＡＭＴＳＬ５または前記ＡＤＡＭＴＳＬ５経路を標的にする薬剤は、阻止抗体、ペプチド、ｓｈ−ＲＮＡ、ｓｉ−ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、化学薬物、脱メチル化剤およびグリコシル化および／またはヘパリン結合を調節する薬剤からなる群から選択される医薬組成物。
【請求項１１】
肝細胞癌のバイオマーカーとしてのＡＤＡＭＴＳＬ５タンパク質の使用。
【請求項１２】
肝細胞癌に罹患している哺乳類の抗癌治療への応答を監視するためのインビトロ方法であって、前記抗癌治療中の２つ以上の時点で前記哺乳類の生体試料中のＡＤＡＭＴＳＬ５発現レベルを決定する工程を含み、先の時点で前記対象の生体試料において得られた参照値と比較した、後の時点での前記対象の生体試料中の等しいかそれよりも高いＡＤＡＭＴＳＬ５発現レベルは前記抗癌治療に対する前記対象の抵抗性を示し、より低いＡＤＡＭＴＳＬ５レベルは前記抗癌治療に対する前記対象の応答を示すことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はそれを必要とする哺乳類における癌を診断するための方法に関する。本発明に係る方法は、前記哺乳類から得られた生体試料中の特異的バイオマーカーの発現レベルを決定する工程を含む。本発明はそのような発現レベルを決定するためのキットおよび特異的バイオマーカー経路を阻害するための医薬組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は世界で２番目に多い死因である。世界的にほぼ６人に１人の死亡は癌によるものである。例えば２０１５年には８８０万人の人が癌で死亡した。従って、それを必要とする患者における癌の診断を向上させ、かつ特に彼らの治療応答を高めるために当該治療に対する彼らの感受性を予測し、それにより生存見込みを高めるための新しい方法を開発することが重要である。
【０００３】
エピジェネティクスは、ＤＮＡ配列の修飾を伴わず、かつ細胞分裂で継承され得る遺伝子活性における変化の研究である。ＤＮＡ配列に影響を与える突然変異とは異なり、エピジェネティック修飾は可逆的である。エピジェネティック異常によりヒトの疾患、特に癌の発生および進行が引き起こされることは周知の事実である。エピジェネティックプロセスは細胞分裂、分化、生存および移動度などの多くのイベントの調節に介入する。これらの機序の変化は健康な細胞を癌細胞に変えるのを促進し、故にあらゆるエピジェネティック異常は腫瘍原性に関わる場合がある。細胞におけるエピジェネティック異常に関連する結果の中には腫瘍抑制遺伝子のサイレンシングまたは癌原遺伝子などの癌遺伝子の過剰発現が含まれ、これらは異常なＤＮＡメチル化またはクロマチン修飾に関与する酵素をコードする遺伝子の突然変異を伴う。ＤＮＡメチル化は細胞における遺伝子発現レベルに影響を与える必須のエピジェネティック機序である。これらの変化により劇的な生物学的変化ならびに悪性の性質の獲得が生じる場合がある。癌のランドスケープは一般にＣｐＧアイランド（ＣＧＩ）として知られているＣｐＧ高頻度領域における広範囲のＤＮＡ低メチル化および限局的な過剰メチル化を特徴とする。一般にプロモーターにおけるＣＧＩ過剰メチル化は腫瘍抑制遺伝子として機能する遺伝子の転写を抑圧する。それにも関わらず、メチル化と遺伝子発現の上方制御との正相関によりＤＮＡメチル化の大部分が遺伝子本体ＣＧＩでも観察される。これは遺伝子本体ＣＧＩにおけるＤＮＡ過剰メチル化が腫瘍原性の正の調節因子として機能する遺伝子の上方制御に関連していることを暗示しており、これは癌細胞におけるそれらのいくつかの報告されている機能と矛盾しない。しかし、細胞の腫瘍原性へのいくつかの他の過剰メチル化および上方制御された遺伝子の関与は依然として未知のままである。
【０００４】
これらの発見により、エピドラッグ（ｅｐｉ−ｄｒｕｇ）またはエピ薬（ｅｐｉ−ｍｅｄｉｃｉｎｅ）と呼ばれるエピジェネティック調節因子を標的にする薬物の開発が失敗に終わった。特に化合物の２つの主要ファミリー、すなわち（ｉ）ＤＮＡメチル化を阻害する化合物および（ｉｉ）ヒストン修飾を標的にする化合物がこれまでに開発されてきた。しかし現在のところ、これらの種類の化合物は特異作用を欠いている。
【０００５】
上記を踏まえて、癌治療のための生物活性剤で調節するための新しい特異的バイオマーカーおよび／または標的として使用することができる遺伝子を同定することが依然として必要とされている。特に癌の新しい診断、予後診断および治療のための方法を開発することが依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
第１の態様によれば、本発明はそれを必要とする哺乳類における癌を診断するための方法に関する。本方法は、
−前記哺乳類から生体試料を採取する工程と、
−前記生体試料からＡＤＡＭＴＳＬ５遺伝子が過剰発現されているかを決定する工程と、
−前記遺伝子の過剰発現の決定から癌を診断する工程と
を含む。
【０００７】
第２の態様によれば、本発明は、哺乳類から得られた生体試料中のＡＤＡＭＴＳＬ５遺伝子の過剰発現を決定するためのキットに関する。本キットは、少なくとも１種の抗ＡＤＡＭＴＳＬ５型抗体、当該生体試料を保持するための容器、および哺乳類から得られた生体試料中のＡＤＡＭＴＳＬ５癌マーカー遺伝子、好ましくは肝細胞癌マーカー遺伝子の過剰発現を測定するためのプロトコルを含む。
【０００８】
第３の態様によれば、本発明は医薬組成物に関する。本医薬組成物は、ＡＤＡＭＴＳＬ５遺伝子それ自体および／またはＡＤＡＭＴＳＬ５が作用する経路を標的にする薬剤と、癌の治療に使用するための薬学的に許容される担体とを含む。
【０００９】
第４の態様によれば、本発明は癌のバイオマーカーとしてのＡＤＡＭＴＳＬ５タンパク質の使用に関する。
【００１０】
第５の態様では、本発明は、それを必要とする哺乳類における癌を治療するための方法に関する。当該癌は上に記載されているものと同じである。本方法は、それを必要とする哺乳類における癌を診断する第１の工程と、ＡＤＡＭＴＬＳ５阻害剤を投与することにより癌を治療する第２の工程とを含む。癌を診断する工程は、それを必要とする哺乳類における癌を診断するための方法において上に記載されているものと同じ工程を伴う。
【００１１】
第６の態様では、本発明は、癌に罹患している哺乳類の抗癌治療に対する応答を監視するためのインビトロ方法であって、前記抗癌治療中の２つ以上の時点で前記哺乳類の生体試料中のＡＤＡＭＴＳＬ５発現レベルを決定する工程を含み、ここでは先の時点で対象の生体試料において得られた参照値と比較した、後の時点での対象の生体試料中の等しいかそれよりも高いＡＤＡＭＴＳＬ５発現レベルは前記抗癌治療に対する対象の抵抗性を示し、より低いＡＤＡＭＴＳＬ５レベルは前記抗癌治療に対する対象の応答を示すことを特徴とする方法に関する。
【００１２】
有利には本発明に係るそれを必要とする哺乳類における癌を診断するための方法は、当該癌は脳癌、ＣＮＳ癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、皮膚癌、腎臓癌、胃腸癌、骨髄腫、リンパ腫、白血病、子宮頸癌、肝癌および肝細胞癌からなる群から選択され、好ましくは当該癌は肝細胞癌であり、当該生体試料は血液、生検組織、血漿、血清、尿、便、痰、脳脊髄液または細胞溶解物の上澄みからなる群から選択され、好ましくは当該生体試料は組織生検、血液、血漿、血清または尿であり、当該生体試料中のＡＤＡＭＴＳＬ５遺伝子の過剰発現は前記生体試料中のＡＤＡＭＴＳＬ５タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルを測定することによって決定し、当該生体試料中のＡＤＡＭＴＳＬ５タンパク質レベルは少なくとも１種の抗ＡＤＡＭＴＳＬ５型抗体を前記生体試料に添加することによって測定し、抗ＡＤＡＭＴＳＬ５型抗体はアルカリホスファターゼ西洋わさびペルオキシダーゼまたは蛍光染料に結合されていないものまたは結合されているものからなる群から選択され、当該生体試料中のＡＤＡＭＴＳＬ５タンパク質レベルは免疫染色、免疫蛍光、ウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡを用いて測定することを特徴とする。
【００１３】
有利には本発明に係るＡＤＡＭＴＳＬ５遺伝子の過剰発現を決定するためのキットは、抗ＡＤＡＭＴＳＬ５型抗体がアルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼまたは蛍光染料に結合されていないものまたは結合／コンジュゲートされているものからなる群から選択されることを特徴とする。
【００１４】
有利には本発明に係る医薬組成物は、ＡＤＡＭＴＳＬ５またはＡＤＡＭＴＳＬ５経路を標的にする薬剤が阻止抗体、ペプチド、ｓｈ−ＲＮＡ、ｓｉ−ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、化学薬物、脱メチル化剤およびグリコシル化および／またはヘパリン結合を調節する薬剤からなる群から選択されることを特徴とする。
【００１５】
本発明の他の特徴および態様は、以下の記載および添付の図面から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】臨床的に関連する癌マウスモデル（Ａｌｂ−Ｒ２６Ｍｅｔマウス）におけるＡＤＡＭＴＳＬ５の遺伝子本体ＣＧＩにおける過剰メチル化およびＡＤＡＭＴＳＬ５の過剰発現を示す。
【図２】臨床的に関連する癌マウスモデル（Ａｌｂ−Ｒ２６Ｍｅｔマウス）におけるＡＤＡＭＴＳＬ５  ｍＲＮＡおよびタンパク質の過剰発現を示す。
【図３】低いＡＤＡＭＴＳＬ５発現レベルを有する細胞と比較して高いＡＤＡＭＴＳＬ５発現レベルを有する臨床的に関連する癌マウスモデル（Ａｌｂ−Ｒ２６Ｍｅｔマウス）から確立された肝細胞癌（ＨＣＣ）細胞のインビトロ腫瘍化特性を示す。
【図４】ＡＤＡＭＴＳＬ５の下方制御後のＨＣＣ細胞の腫瘍化特性のインビボ喪失を示す。
【図５】ＡＤＡＭＴＳＬ５の過剰発現後の臨床的に関連するマウスモデル（Ｒ２６Ｍｅｔマウス）からの不死化肝細胞の腫瘍化特性のインビボ獲得を示す。
【図６】腫瘍形成の初期および最終段階における臨床的に関連する癌マウスモデル（Ａｌｂ−Ｒ２６Ｍｅｔマウス）におけるＡＤＡＭＴＳＬ５発現レベルを示す。
【図７】ＨＣＣ患者の５２％における高いＡＤＡＭＴＳＬ５  ｍＲＮＡレベルおよびアルコール摂取に関連づけられた患者の優勢を示す。
【図８】隣接する肝臓と比較した１０人中９人のＨＣＣ患者におけるＡＤＡＭＴＳＬ５タンパク質レベルの過剰発現を示す。
【図９】ヒトの癌細胞株におけるＡＤＡＭＴＳＬ５  ｍＲＮＡレベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、それを必要とする哺乳類における癌を診断および予後診断するための方法に関する。本方法は最初に前記哺乳類から生体試料を採取する工程と、次いで前記生体試料からＡＤＡＭＴＳＬ５遺伝子／タンパク質が過剰発現されているかを決定する工程と、次いで第３の工程に従って前記遺伝子またはタンパク質の過剰発現の決定から癌を診断／予後診断する工程を含む。
【００１８】
本発明によれば、当該哺乳類は特にヒトである。但し、ネコ、イヌ、ウマさえも含む全ての哺乳類またはマウスやラットなどの齧歯類が該当する。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態によれば、当該癌は、脳癌、中枢神経系（ＣＮＳ）における癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、皮膚癌、胃腸癌、腎臓癌、骨髄腫、リンパ腫、白血病、子宮頸癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）などの肝癌である。特に本発明に従って診断される癌はＨＣＣである。
【００２０】
本発明によれば、当該生体試料は、血液、組織生検、血漿、血清、尿、便、痰、脳脊髄液および細胞溶解物の上澄みからなる群から選択される。特に使用される生体試料は組織生検、血液、血漿、血清または尿である。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態によれば、それを必要とする当該哺乳類から得られた当該生体試料中のＡＤＡＭＴＳＬ５遺伝子の過剰発現は、前記生体試料中のＡＤＡＭＴＳＬ５タンパク質レベルまたはＲＮＡレベルを測定することによって決定する。「上方制御される」、「上方制御」、「過剰発現される」または「過剰発現」という用語は、遺伝子あるいは当該遺伝子のＲＮＡ転写物またはタンパク産物の発現、活性またはレベルが例えば１つ以上の陽性および／または陰性対照などの１つ以上の対照などに対して高いことを意味するように使用される。特にレベルが対照の健康な組織におけるものよりも高い場合にレベルが高いとみなされる。
【００２２】
実際に、哺乳類のゲノムは１〜２０の番号が付された１９種のＡＤＡＭＴＳ（Ａ  Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｎｄ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｗｉｔｈ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ（トロンボスポンジンを有するディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ））遺伝子を含む。それらの類縁すなわちマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）およびＡＤＡＭのように、ＡＤＡＭＴＳは亜鉛イオン依存性メタロプロテアーゼ活性部位に近い保存されたメチオニン残基にちなんで命名されたメトジンシンプロテアーゼスーパーファミリーに属する。ＡＤＡＭＴＳファミリーの代表は全ての後生動物において認められるが、それらは今日まで単細胞生物または植物では同定されていない。全てのＡＤＡＭＴＳ、すなわちアミノ末端からシグナルペプチドおよびその後の可変長さのプロ領域、メタロプロテアーゼドメイン、ディスインテグリン様ドメイン、中央トロンボスポンジン１型配列反復（ＴＳＲ）モチーフならびにシステイン高含有ドメインおよびその後のスペーサー領域を含む化合物ドメイン構成を有する細胞外酵素が分泌される。ＡＤＡＭＴＳとは別の７種類のＡＤＡＭＴＳ様遺伝子（ＡＤＡＭＴＳＬ）の別のファミリーは、ＡＤＡＭＴＳの付随的ドメインに類似しているタンパク質をコードするがそれらの触媒ドメインを欠いている。ＡＤＡＭＴＳＬ１〜６およびパピリン（ｐａｐｉｌｉｎ）を含むこれらのＡＤＡＭＴＳＬタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳの活性を調節するように機能することができる。ＡＤＡＭＴＳＬ５は２０００年代後半に発見されたタンパク質であり、フィブリリン−１に結合し、かつ線維形成を促進すると記載されている。細線維形成におけるＡＤＡＭＴＳＬ５の役割は、細胞外マトリックスにおける増殖因子の調節のための非常に重要な機序としてかなり興味深い。ＡＤＡＭＴＳＬ５はより詳細には、Ｎ末端トロンボスポンジン１型反復、システイン高含有モジュール、スペーサーモジュール、およびプロリン高含有セグメントによって当該スペーサーに結合されているＣ末端ネトリン様モジュールを含む固有のドメイン組成を有する分泌タンパク質である。ＡＤＡＭＴＳＬ５は乾癬などのいくつかの疾患に既に関与しているものとして知られているが、今日までＡＤＡＭＴＳＬ５は潜在的バイオマーカーまたは分子治療のための標的として癌に関連づけられていなかった。
【００２３】
本発明の文脈および好ましい実施形態では、ＡＤＡＭＴＳＬ５タンパク質レベルは少なくとも１種の抗体を前記生体試料に添加することによって測定する。ＡＤＡＭＴＳＬ５タンパク質レベルを測定するために特に使用される抗体は抗ＡＤＡＭＴＳＬ５型である。特に抗ＡＤＡＭＴＳＬ５抗体は、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）または蛍光染料に結合されていないものまたは結合／コンジュゲートされているものからなる群から選択される。
【００２４】
本発明によれば、それを必要とする哺乳類の生体試料中に存在するＡＤＡＭＴＳＬ５タンパク質レベルは、特に免疫染色、免疫蛍光、ウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡを用いて測定する。
【００２５】
生化学における免疫染色は、生体試料中の特異的タンパク質を検出するために抗体を用いる方法を使用するものとして知られている。免疫染色は、抗体を用いる染色方法を使用する組織学、細胞生物学および分子生物学で使用される広範囲の技術を包含する。免疫蛍光は蛍光顕微鏡による光学顕微鏡法のために使用される技術であり、主に微生物学的試料に対して使用される。この技術はそれらの抗原に対する抗体の特異性を使用して蛍光染料を細胞内の特異的生体分子標的に標的化し、従って当該試料により当該標的分子の分布の可視化を可能にする。
【００２６】
第２の態様によれば、本発明は哺乳類から得られた生体試料中のＡＤＡＭＴＳＬ５遺伝子の過剰発現を決定するためのキットを提供する。本キットは少なくとも１種の抗ＡＤＡＭＴＳＬ５型抗体と当該生体試料を保持するための容器とを含む。本キットで使用される抗ＡＤＡＭＴＳＬ５型抗体は上に記載されているものと同じである。
【００２７】
本発明によれば、それを必要とする哺乳類の生体試料中に存在するＡＤＡＭＴＳＬ５レベルは、例えばマイクロアレイ、ＲＮＡシーケンス（ＲＮＡ−ｓｅｑ）、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＲＮＡ−ｓｃｏｐｅならびに通常の半定量的もしくは定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いてＡＤＡＭＴＳＬ５  ｍＲＮＡレベルを測定することによって決定することもできる。
【００２８】
第３の態様によれば、本発明は医薬組成物に関する。本医薬組成物は、ＡＤＡＭＴＳＬ５それ自体またはＡＤＡＭＴＳＬ５経路を標的にする薬剤と癌の治療に使用するための薬学的に許容される担体とを含む。「ＡＤＡＭＴＳＬ５経路」という用語およびその文法的変形はＡＤＡＭＴＳＬ５遺伝子が関与する経路を指す。
【００２９】
ＡＤＡＭＴＳＬ５経路を標的にする使用される薬剤は、特に阻止抗体、ペプチド、ｓｈ−ＲＮＡ、ｓｉ−ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡおよび化学薬物である。それは、例えばデシタビンなどの脱メチル化剤あるいはグリコシル化および／またはヘパリン結合を調節する薬剤も含む。本発明に係る脱メチル化剤は、ＤＮＡメチル転移酵素を阻害することによってゲノムＤＮＡ低メチル化を引き起こす化合物である。
【００３０】
第４の態様では、本発明は、癌のバイオマーカーとしてのＡＤＡＭＴＳＬ５タンパク質の使用に関する。当該癌は上に記載されているものと同じである。
【００３１】
第５の態様では、本発明は、それを必要とする哺乳類における癌を治療するための方法に関する。当該癌は上に記載されているものと同じである。本方法は、それを必要とする哺乳類における癌を診断する第１の工程とＡＤＡＭＴＬＳ５阻害剤を投与することにより癌を治療する第２の工程とを含む。癌を診断する工程は、それを必要とする哺乳類における癌を診断するための方法において上に記載されているものと同じ工程を伴う。
【００３２】
第６の態様では、本発明は、癌に罹患している哺乳類の抗癌治療に対する応答を監視するためのインビトロ方法であって、前記抗癌治療中の２つ以上の時点で前記哺乳類の生体試料中のＡＤＡＭＴＳＬ５発現レベルを決定する工程を含み、ここでは先の時点で対象の生体試料において得られた参照値と比較した後の時点での対象の生体試料中の等しいかそれよりも高いＡＤＡＭＴＳＬ５発現レベルは前記抗癌治療に対する対象の抵抗性を示し、より低いＡＤＡＭＴＳＬ５レベルは前記抗癌治療に対する対象の応答を示すことを特徴とする方法に関する。
【実施例】
【００３３】
材料および方法：
以下の実施例では遺伝子改変されたマウスを使用した。これらのマウスでは、ヒトのＨＣＣの約５０％において活性化されたＭｅｔすなわち受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の発現レベルは組織／時間的に特異的な方法で遺伝子発現の調節を可能にする遺伝的手法に基づいて内因性レベルよりも僅かに高められている（Ｒ２６ｓｔｏｐＭｅｔマウス；Ｆａｎら  ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０１５；Ｆａｎら  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２０１７）。肝臓中の高められたメチル化（Ｍｅｔ）ＲＴＫ発現レベルが組織の恒常性を乱し、腫瘍発生およびＨＣＣへの進展が生じることが最近になって実証された（Ａｌｂ−Ｒ２６Ｍｅｔ）。Ａｌｂ−Ｒ２６Ｍｅｔ（ｎ＝３２）およびヒト（ｎ＝２４９）肝臓腫瘍におけるＭｅｔ発現レベルの比較に基づき、Ａｌｂ−Ｒ２６Ｍｅｔの遺伝的設定におけるＭｅｔレベル（対照肝臓に対して３．１６±０．０６）がＨＣＣ患者の約２０％（４８／２４９人）において認められたものに相当することが分かった。腫瘍試料（ｎ＝３２）のパネルにおいて９６種の異なる遺伝子を分析することによって、Ａｌｂ−Ｒ２６Ｍｅｔマウスによってモデル化された肝臓の腫瘍形成がＨＣＣ患者のサブセットに相当することが分かり、従ってＡｌｂ−Ｒ２６Ｍｅｔ  ＨＣＣマウスモデルの臨床的関連性が確立された。腫瘍形成に伴う転写スイッチに対するＤＮＡメチル化の影響を探求するためにＡｌｂ−Ｒ２６Ｍｅｔマウスモデルを使用した。ＣｐＧアイランド（ＣＧＩ）において同時に過剰メチル化され、かつ過剰発現された遺伝子の有意な濃縮が同定された。それらの中にＡＤＡＭＴＳＬ５が認められた。
【００３４】
実施例１：対照肝臓と比較したＡｌｂ−Ｒ２６Ｍｅｔ腫瘍モデルにおけるＡＤＡＭＴＳＬ５の遺伝子本体ＣＧＩにおける過剰メチル化およびｍＲＮＡ  ＡＤＡＭＴＳＬ５の過剰発現。
【００３５】
図１（Ａ）は、ＵＣＳＣゲノムブラウザからのＡＤＡＭＴＳＬ５転写物およびＣＧＩならびにＮＣＢＩ３７／ｍｍ９マウス参照に基づくＲｅｆｓｅｑ遺伝子アノテーションの概略図を示す。このスキームは、ＡｄａｍｔｓＬ５のエクソン、イントロンおよびＣＧＩの可視化を可能にし、腫瘍において過剰メチル化されていることが認められた遺伝子本体ＣＧＩを四角で強調している。
【００３６】
図１（Ｂ）は、Ｂａｄｅｌら  Ｍａｔｒｉｃ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１２からのヒトＡＤＡＭＴＳＬ５タンパク質の概略図である。
【００３７】
他のタンパク質とのＡＤＡＭＴＳＬ５相互作用の調節およびＡＤＡＭＴＳＬ５の生物学的機能に関与し得るＡＤＡＭＴＳＬ５タンパク質中に存在する異なるドメインが報告されている。
【００３８】
図１（Ｃ）および（Ｄ）は、対照肝臓（ｎ＝３）およびＡｌｂ−Ｒ２６Ｍｅｔ腫瘍（ｎ＝１０）におけるプロモーターＣＧＩ（図１（Ｃ））および遺伝子本体ＣＧＩ（図１（Ｄ））におけるＡＤＡＭＴＳＬ５のメチル化レベル（β値）を示す。プロモーターＣＧＩにおけるＡＤＡＭＴＳＬ５のメチル化レベルは対照および腫瘍試料において類似しているが、遺伝子本体ＣＧＩにおけるメチル化レベルは対照肝臓と比較してＡｌｂ−Ｒ２６Ｍｅｔ腫瘍において有意により高いことに気づく。腫瘍は遺伝子本体ＣＧＩにおけるＡＤＡＭＴＳＬ５の過剰メチル化を特徴とすると結論づけられる。
【００３９】
図１（Ｅ）は、ＲＮＡ−ｓｅｑによって対照肝臓と比較したＡｌｂ−Ｒ２６Ｍｅｔ腫瘍におけるＡＤＡＭＴＳＬ５  ｍＲＮＡ発現レベルを示す。これらのグラフは読み取り数（右側）およびＬｏｇ２ＦＣ（倍率変化）（左側）を示す。有意性：＊：Ｐ＜０．０５；ＦＤＲ（調整されたｐ値）＝４．３１Ｅ−１５。腫瘍はＡＤＡＭＴＳＬ５  ｍＲＮＡの過剰発現を特徴とすると結論づけられる。
【００４０】
図１（Ｆ）は、対照肝臓（ｎ＝５）に対するＡｌｂ−Ｒ２６Ｍｅｔ腫瘍（ｎ＝１６）におけるＡＤＡＭＴＳＬ５発現レベル（ＲＴ−ｑＰＣＲによる）を示す。対照肝臓と比較したＡｌｂ−２６Ｍｅｔ腫瘍における高いＡＤＡＭＴＳＬ５発現レベルに気づく。腫瘍はＡＤＡＭＴＳＬ５  ｍＲＮＡの一貫した過剰発現を特徴とすると結論づけられる。
【００４１】
実施例２：Ａｌｂ−Ｒ２６Ｍｅｔ腫瘍モデルにおけるＡＤＡＭＴＳＬ５  ｍＲＮＡおよびタンパク質の過剰発現。
【００４２】
図２（Ａ）は、腫瘍（Ａｌｂ−Ｒ２６Ｍｅｔマウスから切除されたもの）および対照肝臓（対照マウスから切除されたもの）におけるＡＤＡＭＴＳＬ５  ｍＲＮＡ発現レベルの代表的な画像（ＲＮＡ−ｓｃｏｐｅによる）を示す。強い染色がＡｌｂ−Ｒ２６Ｍｅｔ腫瘍では観察されたが対照肝臓では観察されなかった。ＲＮＡ−ｓｅｑおよびＲＴ−ｑＰＣＲ分析からのデータと同様に、腫瘍はＡＤＡＭＴＳＬ５  ｍＲＮＡの一貫した過剰発現を特徴とすると結論づけられる。
【００４３】
図２（Ｂ）は、腫瘍（Ａｌｂ−Ｒ２６Ｍｅｔマウスから切除されたもの）および対照肝臓（対照のマウスから切除されたもの）における免疫蛍光（左）および免疫染色（右）によるＡＤＡＭＴＳＬ５タンパク質レベルの代表的な画像を示す。対照肝臓と比較してＡｌｂ−Ｒ２６Ｍｅｔ腫瘍においてＡＤＡＭＴＳＬ５が過剰発現されていることに気づく。腫瘍は高いｍＲＮＡレベルと矛盾しないＡＤＡＭＴＳＬ５タンパク質の一貫した過剰発現を特徴とすると結論づけられる。
【００４４】
実施例３：ＡＤＡＭＴＳＬ５が過剰発現されているＡｌｂ−Ｒ２６Ｍｅｔ  ＨＣＣ細胞のインビトロ腫瘍化特性。＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１。
【００４５】
図３（Ａ）は、分子および機能研究のために使用されるＡｌｂ−Ｒ２６Ｍｅｔ  ＨＣＣ細胞株の確立の概略図である（Ｆａｎら  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２０１７）。このスキームは、生物学的アッセイにおけるそれらの分子特性評価およびそれらの使用のためにＨＣＣ細胞株をどのように樹立したかを要約している。当該プロトコルに従って、ＨＣＣ細胞株を異なるＡｌｂ−Ｒ２６Ｍｅｔマウスから切除された肝臓腫瘍から樹立したことがＦａｎら  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２０１７において確立および報告されている。簡単に言うと、切除された腫瘍を刻み、コラゲナーゼおよびＤＮａｓｅを含有する溶液中でインキュベートし、かつ１００μｍの無菌フィルタを用いて組織残屑を除去した。次いで細胞を直接に接着条件下で、あるいは１週間にわたって非接着条件下で添加物を含むＷｉｌｌｉａｍ  Ｅ培地で培養して腫瘍化特性を有する細胞を濃縮した。培養された細胞の増殖後にそれらの一部を凍結し、かつストックとして維持し、別の一部を分子（生化学、ＲＴ−ｑＰＣＲ）および機能（ヌードマウスにおいて腫瘍を形成するそれらの能力）について特性評価した。
【００４６】
図３（Ｂ）は、対照肝臓に対して３種類のＡｌｂ−Ｒ２６Ｍｅｔ  ＨＣＣ細胞株（ＨＣＣ３、ＨＣＣ１３およびＨＣＣ１４）におけるＡＤＡＭＴＳＬ５発現レベル（ＲＴ−ｑＰＣＲによる）を報告するグラフである。ＨＣＣ細胞は腫瘍において示されているようにＡＤＡＭＴＳＬ５  ｍＲＮＡの一貫した過剰発現を特徴とすると結論づけられる。
【００４７】
図３（Ｃ）は、対照に対してｓｈＲＮＡ標的配列を運ぶプラスミド（安定なクローン選択のためのピューロマイシン遺伝子も運ぶ）で安定にトランスフェクトされたＡｌｂ−Ｒ２６Ｍｅｔ  ＨＣＣ細胞中のＡＤＡＭＴＳＬ５のｍＲＮＡ発現レベルを示す。細胞を目的のプラスミドでトランスフェクトし、次いで４８時間後にプラスミドが安定に組み込まれた細胞を選択するためにピューロマイシンに７日間暴露する。ＡＤＡＭＴＳＬ５発現レベルがｓｈＲＮＡ標的配列によって下方制御されているクローンをＲＴ−ｑＰＣＲによって同定する。ＡＤＡＭＴＳＬ５に対するｓｈＲＮＡ標的配列によりＨＣＣ細胞中のＡＤＡＭＴＳＬ５  ｍＲＮＡレベルの効率的な下方制御が生じ、これによりＡＤＡＭＴＳＬ５タンパク質発現レベルが干渉されると結論づけられる。
【００４８】
図３（Ｄ）は、ＨＣＣ対照細胞またはＡＤＡＭＴＳＬ５を標的にするｓｈＲＮＡ配列を保有するＨＣＣ細胞のいずれかを用いて行われた足場非依存性増殖アッセイ（軟寒天アッセイ）の結果を示す。このアッセイにより非接着性条件下でコロニーを形成する細胞の能力を例証し、従ってそれらのインビトロ腫瘍化特性を明らかにする。結果から、ＡＤＡＭＴＳＬ５を標的にするｓｈＲＮＡ配列を保有するＡｌｂ−Ｒ２６Ｍｅｔ  ＨＣＣ細胞によって形成されたコロニーの数が対照細胞と比較して減少することが分かる。ＨＣＣ細胞中の高レベルのＡＤＡＭＴＳＬ５はそれらのインビトロ腫瘍化特性のために必要とされると結論づけられる。
【００４９】
図３（Ｅ）は、対照細胞からの条件培地によるＡＤＡＭＴＳＬ５標的化Ａｌｂ−Ｒ２６Ｍｅｔ  ＨＣＣ細胞のインビトロ腫瘍化特性のレスキューを部分的に示す足場非依存性増殖アッセイ（軟寒天アッセイ）を記述している。この結果は、細胞外ＡＤＡＭＴＳＬ５が低レベルのＡＤＡＭＴＳＬ５を発現している細胞に腫瘍原性を与えることを示している。分泌タンパク質であるＡＤＡＭＴＳＬ５が細胞外環境においてその機能を惹起し、かつ非細胞自律的にも作用することができると結論づけられる。
【００５０】
図３（Ｆ）は、対照およびＡＤＡＭＴＳＬ５標的化Ａｌｂ−Ｒ２６Ｍｅｔ  ＨＣＣ細胞（右）由来の腫瘍球の代表的な画像（左）および定量化（右）である。Ａｌｂ−Ｒ２６Ｍｅｔ  ＨＣＣｓｈＡｄａｍｔｓ１５細胞（ＡＤＡＭＴＳＬ５を標的にするｓｈＲＮＡ配列を保有している）と比較したより大きい数およびサイズの対照細胞から生成された腫瘍球に気づく。ＨＣＣ細胞中の高レベルのＡＤＡＭＴＳＬ５が自己複製能力を与えると結論づけられる。
【００５１】
実施例４：Ａｌｂ−Ｒ２６Ｍｅｔ  ＨＣＣ細胞におけるＡＤＡＭＴＳＬ５の下方制御後のＨＣＣ細胞のインビボ腫瘍化特性の喪失。＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ０．０１；＊＊＊：Ｐ０．００１。
【００５２】
図４（Ａ）は、Ａｌｂ−Ｒ２６Ｍｅｔ  ＨＣＣ細胞（上）またはＡｌｂ−Ｒ２６Ｍｅｔ−ｓｈＡＤＡＭＴＳＬ５  ＨＣＣ細胞（下）のいずれかが注射されたヌードマウスにおける異種移植片から切除された腫瘍の画像を含む。
【００５３】
ヌードマウスの側腹部におけるＡｌｂ−Ｒ２６ＭｅｔまたはＡｌｂ−Ｒ２６Ｍｅｔ−ｓｈＡｄａｍｔｓＬ５  ＨＣＣ細胞（５×１０６細胞）の皮下注射により異種移植片研究を行った。図４（Ａ）は、異種移植片の確立から８週間後に切除された腫瘍の画像を含む。Ａｌｂ−Ｒ２６Ｍｅｔ  ＨＣＣ細胞が皮下注射されたヌードマウスでは腫瘍が形成されたが、Ａｌｂ−Ｒ２６Ｍｅｔ−ｓｈＡＤＡＭＴＳＬ５  ＨＣＣ細胞が皮下注射されたマウスからの腫瘍は劇的に減少し、インビボ腫瘍化特性の低下を示していることに気づく。
【００５４】
図４（Ｂ）は、毎週測定されたグループごとの平均腫瘍体積を報告する異種移植片増殖曲線を含む。ＨＣＣ細胞におけるＡＤＡＭＴＳＬ５レベルの下方制御（ｓｈＲＮＡ標的配列の安定な形質移入によって達成される）がＨＣＣ細胞のインビボ腫瘍化特性を干渉すると結論づけられる。まとめると、これらの結果からＡＤＡＭＴＳＬ５発現レベルの下方制御が腫瘍の確立／進展を干渉することが分かる。
【００５５】
図４（Ｃ）には、細胞の注射から８週間後に切除された腫瘍の体積の定量的分析が示されている。各ドットは各腫瘍の体積に対応している。ＨＣＣ細胞におけるＡｄａｍｔｓＬ５レベルの下方制御（ｓｈＲＮＡ標的配列の安定な形質移入によって達成される）がインビボ腫瘍化特性を干渉すると結論づけられる。
【００５６】
実施例５：ｉｍｍｏｒｔｏ−Ｒ２６Ｍｅｔ感作肝細胞によるＡＤＡＭＴＳＬ５の過剰発現後のインビボ腫瘍化特性の獲得。
【００５７】
図５（Ａ）は、ｉｍｍｏｒｔｏ−Ｒ２６Ｍｅｔ感作肝細胞（高レベルのＭｅｔ  ＲＴＫを保有し、かつＳＶ４０ラージＴ抗原により不死化された胚肝細胞）の確立の概略図である。簡単に言うと、Ｅ１５．５マウスＲ２６Ｍｅｔ胎仔肝細胞から培養された肝細胞を不死化のためにＳＶ４０ラージＴ抗原（＋安定なクローン選択のためのネオマイシン遺伝子）を保有するレトロウイルスで感染させ、次いでその後に他の細胞型を枯渇させるために肝細胞に許容的な培地で７日間処理した。ｉｍｍｏｒｔｏ−Ｒ２６Ｍｅｔ肝細胞は野生型Ｍｅｔレベルの３倍の増加により感作されているが、異種移植片において腫瘍を形成する能力がないため腫瘍原性ではない。
【００５８】
図５（Ｂ）は異種移植片の確立から１１週間後のマウスの画像を含む。ｉｍｍｏｒｔｏ−Ｒ２６Ｍｅｔ  ｈｅｐａｏｖｅｒＡｄａｍｔｓ１５（ＡＤＡＭＴＳＬ５を過剰発現している細胞）の皮下注射により両側腹部において腫瘍を発生しているヌードマウスに気づく。
【００５９】
ヌードマウスの両側腹部におけるｉｍｍｏｒｔｏ−Ｒ２６Ｍｅｔ対照（ｉｍｍｏｒｔｏ−Ｒ２６Ｍｅｔ  ｈｅｐａＷＴ）またはＡＤＡＭＴＳＬ５過剰発現（ｉｍｍｏｒｔｏ−Ｒ２６Ｍｅｔ  ｈｅｐａｏｖｅｒＡｄａｍｔｓ１５）肝細胞（５×ｌ０６細胞）の皮下注射により異種移植片研究を行った。
【００６０】
図５（Ｃ）は、毎週測定されたグループごとの平均腫瘍体積を報告する異種移植片増殖曲線を含む。
【００６１】
図５（Ｄ）には、細胞の注射から１１週間後に切除された腫瘍の体積の定量的分析が示されている。各ドットは各腫瘍の体積に対応している。ｉｍｍｏｒｔｏ−Ｆ２６Ｍｅｔ  ｈｅｐａＷＴが注射されたマウスとは対照的に、ｉｍｍｏｒｔｏ−Ｆ２６Ｍｅｔ  ｈｅｐａｏｖｅｒＡｄａｍｔｓ１５が注射された全てのマウスが腫瘍を形成したことに気づく。異種移植片において腫瘍を形成する能力がないため腫瘍原性でないｉｍｍｏｒｔｏ−肝細胞におけるＡＤＡＭＴＳＬ５の過剰発現レベルは、それらにインビボ細胞腫瘍化特性を与えるのに十分であると結論づけられる。
【００６２】
実施例６：初期および最終段階のＡｌｂ−Ｒ２６Ｍｅｔ腫瘍におけるＡＤＡＭＴＳＬ５発現レベル。
【００６３】
図６（Ａ）は、ＡＤＡＭＴＳＬ５レベルのＲＴ−ｑＰＣＲ分析のために使用される組織試料の概略図である。使用される試料は、対照の野生型肝臓（ＷＴ）、健康なＡｌｂ−Ｒ２６Ｍｅｔ肝臓、初期および進行段階のＡｌｂ−Ｒ２６Ｍｅｔ腫瘍である。
【００６４】
図６（Ｂ）では、これらのグラフはＡＤＡＭＴＳＬ５、ＡＦＰ（α−フェトプロテイン）、ＧＰＣ３（グリピカン３）（２種類のＨＣＣマーカー）、およびＫｉ６７（増殖マーカー）の発現レベル（ＲＴ−ｑＰＣＲによる）を報告している。野生型および健康なＡｌｂ−Ｒ２６Ｍｅｔ肝臓におけるＡＤＡＭＴＳＬ５ならびに他の分析されるマーカーの同程度に低い発現レベルに気づく。対照的に、転写物レベルは初期段階のＡｌｂ−Ｒ２６Ｍｅｔ腫瘍中では既に増加している。ＡＤＡＭＴＳＬ５転写物レベルを使用して健康な試料を初期の腫瘍原性状態にある既に腫瘍性の試料と識別することができると結論づけられる。
【００６５】
実施例７：高いＡＤＡＭＴＳＬ５  ｍＲＮＡレベルがＨＣＣ患者の５２％において存在し、アルコール摂取に関連づけられた患者が優勢である。
【００６６】
図７（Ａ）では、ＡＤＡＭＴＳＬ５  ｍＲＮＡレベルに関してＨＣＣ患者（３７１人の患者）のコホートが上に報告されており、２１％はＡＤＡＭＴＳＬ５の下方制御を特徴とし（白色、左）、２７％は変化なしを特徴とし（黒色の線を有する白色、中央）、およびＨＣＣ患者の５２％はＡＤＡＭＴＳＬ５  ｍＲＮＡレベルの上方制御を有する（黒色、右）。下のグラフは低い、変化なしおよび高いＡＤＡＭＴＳＬ５発現レベル（数および割合が示されている）に従うＨＣＣ患者の３つのサブグループを報告している。データは３７１人のＨＣＣ患者のコホート（ＴＣＧＡから）のＲＮＡ−ｓｅｑ研究に対応している。ＡＤＡＭＴＳＬ５は３７１人のＨＣＣ患者のうちの１９３人（５２％；Ｌｏｇ２ＦＣ＞１；ＦＤＲ＜０．０５）において過剰発現されている。ＨＣＣ患者の５０％超において高いＡＤＡＭＴＳＬ５転写物レベルを検出することができると結論づけられる。
【００６７】
図７（Ｂ）では、その表は３７１人全ての分析された患者における主要なＨＣＣ危険因子の存在（黒色の線）または非存在を報告している。高いＡＤＡＭＴＳＬ５レベルを有するＨＣＣ患者は、限定されるものではないがアルコールの摂取と有意に関連づけられることに留意されたい。ＡＤＡＭＴＳＬ５の高いｍＲＮＡレベルがいくつかの危険因子を特徴とする大部分の患者において存在すると共にアルコール摂取に関連づけられた患者が優勢であると結論づけられる。
【００６８】
実施例８：ＨＣＣ分析された患者の大多数においてＡＤＡＭＴＳＬ５タンパク質レベルが過剰発現されている。
【００６９】
この図は、隣接する肝臓と比較した腫瘍試料における抗ＡＤＡＭＴＳＬ５抗体による免疫染色を報告している。全ての分析されたＨＣＣ患者（＃８の患者を除く）における強いＡＤＡＭＴＳＬ５タンパク質レベル（濃い染色；Ｆａｓｔ  Ｒｅｄによる）に留意されたい。高いＡＤＡＭＴＳＬ５タンパク質レベルはＨＣＣ患者の大多数を特徴づけていると結論づけられる。
【００７０】
実施例９：ヒト癌細胞株のパネルにおけるＡＤＡＭＴＳＬ５の過剰発現。
【００７１】
このグラフは、ヒトＨＣＣ細胞株のパネル、すなわちＭＫＮ（胃癌）細胞株、ヒト乳房細胞株、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸部）癌細胞株およびＨＥＲ（ヒト胎生腎）細胞株におけるＡＤＡＭＴＳＬ５のｍＲＮＡ発現レベルを示す。３回の独立した実験の平均値。ＡＤＡＭＴＳＬ５の高いｍＲＮＡレベルが異なる由来を有する癌細胞に存在すると結論づけられる。
【図１】
2021519090.tif 000003
【図２】
2021519090.tif 000004
【図３】
2021519090.tif 000005
【図４−１】
2021519090.tif 000006
【図４−２】
2021519090.tif 000007
【図５−１】
2021519090.tif 000008
【図５−２】
2021519090.tif 000009
【図６−１】
2021519090.tif 000010
【図６−２】
2021519090.tif 000011
【図７−１】
2021519090.tif 000012
【図７−２】
2021519090.tif 000013
【図８−１】
2021519090.tif 000014
【図８−２】
2021519090.tif 000015
【図９−１】
2021519090.tif 000016
【図９−２】
2021519090.tif 000017
【国際調査報告】
2021519090.tif 000018
2021519090.tif 000019
2021519090.tif 000020