(57)【要約】本発明は、インビボ、インビトロおよびエクスビボでの使用を含む、Ｌｃｋを活性化するための組成物および方法に関する。【選択図】図８
2021523946.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌｃｋを活性化するためのペプチドであって、式Ｉ：
Ｒ／Ｋ’−ｘ１−Ｒ／Ｋ−ｘ２−Ｒ／Ｋ−ｘ３−ｘ４−ｘ５−ｘ６−Ｒ／Ｋ”      式Ｉ
のＬｃｋ活性化ポリペプチド部分またはその反転配列を含み、式中、
各Ｒ／Ｋは独立に、アルギニンまたはリシンアミノ酸残基であり；
Ｒ／Ｋ’は、アルギニンまたはリシンアミノ酸残基でありかつ存在するまたは非存在であり；
Ｒ／Ｋ”は、アルギニンまたはリシンアミノ酸残基でありかつ存在するまたは非存在であり；
ｘ１〜ｘ６はそれぞれ独立に、１個のアミノ酸であり；および
アミノ酸ｘ３〜ｘ６は、ひとまとめで存在するまたは非存在であり、かつＲ／Ｋ”は、アミノ酸ｘ３〜ｘ６が非存在である場合非存在である、
ペプチド。
【請求項２】
アミノ酸ｘ１〜ｘ６の１個または複数が、疎水性アミノ酸である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記Ｌｃｋ活性化ポリペプチド部分が、Ｌアミノ酸残基を含む、請求項１または請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
前記Ｌｃｋ活性化ポリペプチド部分が、Ｌアミノ酸残基からなる、請求項１または請求項２に記載のペプチド。
【請求項５】
前記Ｌｃｋ活性化ポリペプチド部分が、Ｄアミノ酸残基を含む、請求項１または請求項２に記載のペプチド。
【請求項６】
前記Ｌｃｋ活性化ポリペプチド部分が、Ｄアミノ酸残基からなる、請求項１または請求項２に記載のペプチド。
【請求項７】
前記Ｌｃｋ活性化ポリペプチド部分配列が、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ、ｒｓｋａｋｎｐｌｙ、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶ、およびｒｖｋｖｋｖｖｖｖからなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項８】
前記Ｌｃｋ活性化ポリペプチド部分のＮ末端またはＣ末端に結合された式ＩＩ：
【化１】
2021523946.tif 000019
式ＩＩ
の化合物をさらに含み、式中、
ｎは、化合物のモノマー単位の数でありかつ１〜５の整数であり、
各ｍは独立に、０〜１８の整数であり、および
各Ｒ基は独立に、ＨまたはＣ１〜Ｃ１８の側鎖である、
請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項９】
各モノマー単位の前記Ｒ基が独立に、Ｃ１〜Ｃ１８側鎖である、請求項８に記載のペプチド。
【請求項１０】
各Ｒ基が独立に、１８−ｍ炭素原子長さでありｍが、０〜１７の値を有する、請求項８に記載のペプチド。
【請求項１１】
前記Ｌｃｋ活性化ポリペプチド部分のＮ末端またはＣ末端に結合された化合物をさらに含み、前記化合物が、少なくとも１個の脂肪酸である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１２】
少なくとも４個の脂肪酸が、前記Ｌｃｋ活性化ポリペプチド部分のＣ末端に結合される、請求項１１に記載のペプチド。
【請求項１３】
２個以上の脂肪酸の前記結合が、線形である、請求項１２に記載のペプチド。
【請求項１４】
２個以上の脂肪酸の前記結合が、分岐している、請求項１２に記載のペプチド。
【請求項１５】
前記脂肪酸が、飽和される、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１６】
前記脂肪酸が、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸（デカン酸）、およびラウリン酸（ドデカン酸）からなる群より選択される、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１７】
最遠位脂肪酸が、アミド化される、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１８】
前記アミノ酸配列が、前記Ｌｃｋ活性化ポリペプチド部分のＣ末端でアミド化される、請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１９】
ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４、ｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ−（２Ａｄｏｄ）４、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶＲ−（２Ａｄｏｄ）４、およびｒｖｋｖｋｖｖｖｖｒ−（２Ａｄｏｄ）４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項２０】
ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４、ｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ−（２Ａｄｏｄ）４、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶＲ−（２Ａｄｏｄ）４、およびｒｖｋｖｋｖｖｖｖｒ−（２Ａｄｏｄ）４からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２１】
有効成分としての請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチドおよび薬学的に許容可能な希釈剤または担体を含む医薬組成物。
【請求項２２】
Ｌｃｋキナーゼの活性を高める方法であって、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２１に記載の医薬組成物とＬｃｋキナーゼを接触させることを含む、方法。
【請求項２３】
ＬｃｋキナーゼのＹ３９４リン酸化を増大させる方法であって、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２１に記載の医薬組成物とＬｃｋキナーゼを接触させることを含む、方法。
【請求項２４】
細胞または細胞の集団からのＩＬ−２分泌を増大させる方法であって、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２１に記載の医薬組成物と細胞または細胞の集団を接触させることを含む、方法。
【請求項２５】
細胞上のまたは細胞の集団中のＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）発現を増大させる方法であって、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２１に記載の医薬組成物と細胞または細胞の集団を接触させることを含む、方法。
【請求項２６】
細胞上のまたは細胞の集団中のＩＬ−２Ｒβ（ＣＤ１２２）の発現を増大させる方法であって、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２１に記載の医薬組成物と細胞または細胞の集団を接触させることを含む、方法。
【請求項２７】
細胞上のまたは細胞の集団中のＩＬ−２応答性を増大させる方法であって、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２１に記載の医薬組成物と細胞または細胞の集団を接触させることを含む、方法。
【請求項２８】
細胞上のまたは細胞の集団中のＩＬ−１５Ｒ発現を増大させる方法であって、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２１に記載の医薬組成物と細胞または細胞の集団を接触させることを含む、方法。
【請求項２９】
細胞のまたは細胞の集団中のＩＬ−１５応答性を増大させる方法であって、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２１に記載の医薬組成物と細胞または細胞の集団を接触させることを含む、方法。
【請求項３０】
細胞上のまたは細胞集団中のＣＤ２８発現を増大させる方法であって、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２１に記載の医薬組成物と細胞または細胞の集団を接触させることを含む、方法。
【請求項３１】
細胞または細胞の集団からのＩＬ−２１分泌を増大させる方法であって、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２１に記載の医薬組成物と細胞または細胞の集団を接触させることを含む、方法。
【請求項３２】
細胞上のまたは細胞の集団中のＩＬ−２１Ｒ（ＣＤ３６０）ＩＬ−２Ｒβ発現を増大させる方法であって、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２１に記載の医薬組成物と細胞または細胞の集団を接触させることを含む、方法。
【請求項３３】
細胞のまたは細胞の集団中のＩＬ−２１応答性を増大させる方法であって、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２１に記載の医薬組成物と細胞または細胞の集団を接触させることを含む、方法。
【請求項３４】
細胞上のまたは細胞の集団中のＩＬ−１２Ｒ発現を増大させる方法であって、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２１に記載の医薬組成物と細胞または細胞の集団を接触させることを含む、方法。
【請求項３５】
前記ＩＬ−１２Ｒが、ＩＬ−１２Ｒβ１および／またはＩＬ−１２Ｒβ２である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
細胞のまたは細胞の集団中のＩＬ−１２応答性を増大させる方法であって、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２１に記載の医薬組成物と細胞または細胞の集団を接触させることを含む、方法。
【請求項３７】
細胞または細胞の集団からのサイトカイン分泌を増大させる方法であって、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２１に記載の医薬組成物と細胞または細胞の集団を接触させることを含む、方法。
【請求項３８】
前記サイトカインが、ＩＦＮγまたはＴＮＦαである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
細胞または細胞の集団の増殖を誘導する方法であって、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２１に記載の医薬組成物と細胞または細胞の集団を接触させることを含む、方法。
【請求項４０】
細胞の集団の増殖を増大させる方法であって、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２１に記載の医薬組成物と細胞の集団を接触させることを含む、方法。
【請求項４１】
前記細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、または樹状細胞からなる群より選択される細胞である、または前記細胞の集団が、これらからなる群より選択される細胞を含む、請求項２２〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞でのＣＤ１０７ａの発現を増大させる方法であって、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２１に記載の医薬組成物とＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞を接触させることを含む、方法。
【請求項４３】
Ｔ細胞機能を強化する方法であって、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２１に記載の医薬組成物とＴ細胞またはＴ細胞の集団を接触させることを含む、方法。
【請求項４４】
前記細胞が、未感作細胞である、または前記細胞の集団が、未感作細胞を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項４５】
細胞傷害性細胞機能を強化する方法であって、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２１に記載の医薬組成物と細胞傷害性細胞または細胞傷害性細胞の集団を接触させることを含む、方法。
【請求項４６】
Ｔ細胞またはＴ細胞の集団の疲弊を低減させる方法であって、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２１に記載の医薬組成物とＴ細胞またはＴ細胞の集団を接触させることを含む、方法。
【請求項４７】
Ｔ細胞上のＣＤ４０Ｌ発現を増大させる方法であって、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２１に記載の医薬組成物とＴ細胞を接触させることを含む、方法。
【請求項４８】
ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を増大させる方法であって、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２１に記載の医薬組成物とＣＤ４＋Ｔ細胞を接触させることを含む、方法。
【請求項４９】
細胞集団中のＴｒｅｇ細胞の比率を増大させる方法であって、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２１に記載の医薬組成物とＴｒｅｇ含有細胞集団を接触させることを含む、方法。
【請求項５０】
前記Ｔｒｅｇ細胞が、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
チェックポイント阻害剤の存在下でＩＬ−２分泌を増大させる方法であって、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２１に記載の医薬組成物と細胞または細胞の集団を接触させることを含む、方法。
【請求項５２】
樹状細胞生存率を増大させる方法であって、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２１に記載の医薬組成物と樹状細胞を接触させることを含む、方法。
【請求項５３】
前記接触させることが、インビボまたはインビトロで実施される、請求項２２〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記方法が、エクスビボで実施される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
請求項２２〜５４のいずれか１項に記載の方法に由来する細胞または細胞の集団。
【請求項５６】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２１に記載の医薬組成物と細胞または細胞の集団を接触させることにより得られる細胞または細胞の集団に由来する細胞または細胞の集団。
【請求項５７】
前記ペプチドまたは医薬組成物が、インビボでＬｃｋの活性を高めるために対象または細胞に投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項５８】
対象におけるＬｃｋ活性を高める方法であって、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２１に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項５９】
対象における免疫応答を誘導する方法であって、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２１に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項６０】
対象におけるＬｃｋまたはＬｃｋ活性の抑制または下方制御を特徴とする疾患または状態に関連する少なくとも１つの症状を治療するおよび／または予防する方法であって、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２１に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項６１】
ＬｃｋまたはＬｃｋ活性の抑制または下方制御を特徴とする前記疾患または状態が、病原性感染症、病原性感染症に由来する敗血症（例えば、慢性敗血症）、免疫不全障害、低下した免疫応答、減少したＴ細胞数、Ｔ細胞異常、Ｔ細胞疲弊、およびＴ細胞チェックポイント阻害からなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項６２】
前記疾患または状態が、癌である、請求項６０または請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
それを必要としている対象にワクチン接種する方法であって、ワクチンと同時にまたは順次に請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２１に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項６４】
それを必要としている対象における癌を治療するおよび／または予防する方法であって、チェックポイント阻害剤と同時にまたは順次に請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２１に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項６５】
対象における免疫抑制を低減する方法であって、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２１に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項６６】
対象における加齢関連免疫機能不全を治療するおよび／または予防する方法であって、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２１に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項６７】
対象におけるＴｈ１応答を誘導する方法であって、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２１に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項６８】
対象におけるＨＩＶ感染症を治療する方法であって、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２１に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項６９】
対象における結核菌感染症を治療する方法であって、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物または請求項２１に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項７０】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチドを含むＬｃｋまたはＬｃｋ活性の抑制または下方制御を特徴とする疾患または状態に関連する少なくとも１つの症状の治療および／または予防のための投与単位剤形。
【請求項７１】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチドを含む癌の治療または予防のための投与単位剤形。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、Ｌｃｋ（リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ）活性の刺激および種々の疾患または状態の予防または治療に使用するためのＬｃｋ活性化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子生物学では、ＣＤ４（表面抗原分類４）は、ヘルパーＴ細胞、単球、マクロファージおよび樹状細胞などの免疫細胞の表面上で認められる糖タンパク質である。ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞は、免疫系の不可欠の部分である白血球であり、これは、ＣＤ８キラー細胞などの他の免疫細胞にシグナルを送り、感染性粒子を破壊する。Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および共受容体が抗原ペプチド：主要組織適合抗原（ＭＨＣ）に結合すると、ＴＣＲ複合体をクラスター化させて、細胞内カスケードを開始させる。Ｔ細胞活性化では、共受容体ＣＤ４およびＣＤ８の、それぞれ、クラスＩＩまたはクラスＩ  ＭＨＣ分子への結合が抗原に対するＴ細胞の感受性を高める。
【０００３】
Ｌｃｋは、Ｓｒｃファミリーキナーゼのメンバーであり、Ｔ細胞のエフェクター能力の発現、すなわち、効果的サイトカインの転写と共に、発生中の胸腺細胞および成熟Ｔ細胞の両方の増殖と分化に不可欠である（Ｌｏｖａｔｔ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ  ＆  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００６，２６（２２）：８６５５−８６６５）。
【０００４】
ＬｃｋによるＴＣＲのリン酸化は、細胞質ゾルキナーゼＺＡＰ７０（ゼータ鎖関連プロテインキナーゼ７０）を細胞膜に動員する結合部位を作り出すことにより、下流のシグナル伝達を開始させる（Ｉｗａｓｈｉｍａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４，２６３：１１３６−１１３９）。さらに具体的には、Ｌｃｋは、Ｌｃｋの不活性化をもたらすＴｙｒ５０５をリン酸化するＣ末端Ｓｒｃキナーゼ（Ｃｓｋ）、活性部位の再配置を介してＬｃｋのキナーゼ活性を活性化するＬｃｋ活性化ループのＴｙｒ３９４トランス自己リン酸化、およびホスファターゼによる脱リン酸化、により調節される（Ｆｕｌｏｐ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ  ＆  Ｈｅａｌｔｈｓｐａｎ，２０１２，１：６）。
【０００５】
ＴＣＲ刺激時には、ＣＤ４／ＣＤ８結合Ｌｃｋは、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体と近接し、ＣＤ３分子の免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）をリン酸化する。ＺＡＰ７０キナーゼがその後、リン酸化ＩＴＡＭへ動員され、続けて、Ｌｃｋにより活性化される。これは、最終的にＴ細胞活性化およびＩＬ−２産生に繋がる複数の経路の活性化をもたらす（Ｗａｎｇ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ，ＢｉｏＭｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２０１４，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１５５／２０１４／６８２０１０）。
【０００６】
加えて、Ｌｃｋの樹状細胞（ＤＣ）媒介活性化は、「ＴＣＲライセンシング」、同族ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ抗原複合体に対するＴＣＲ応答の感度と大きさを劇的に高めるプロセス、に繋がる（Ｍｅｒａｎｅｒ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ，２００７，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７８（４）：２２６２−２２７１）。このような上皮内ＤＥＴＣ細胞（樹枝状表皮Ｔ細胞）またはガンマ／デルタＴ細胞は、恒常性、組織修復、炎症および悪性腫瘍からの保護で有用な役割を果たす（Ｗｉｔｈｅｒｄｅｎ  ＤＡ  ＆  Ｈａｖｒａｎ  ＷＬ，Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ，２０１３，９４（１）：６９−７６）。
【発明の概要】
【０００７】
一態様では、本発明は、Ｌｃｋ活性化のためのペプチドを提供し、ペプチドは、式Ｉ：
Ｒ／Ｋ’−ｘ１−Ｒ／Ｋ−ｘ２−Ｒ／Ｋ−ｘ３−ｘ４−ｘ５−ｘ６−Ｒ／Ｋ”      式Ｉ
のＬｃｋ活性化ポリペプチド部分またはその反転配列を含み、式中、
各Ｒ／Ｋは、独立に、アルギニンまたはリシンアミノ酸残基であり；
Ｒ／Ｋ’は、アルギニンまたはリシンアミノ酸残基で、存在または非存在であり；Ｒ／Ｋ”は、アルギニンまたはリシンアミノ酸残基で、存在または非存在であり；ｘ１〜ｘ６はそれぞれ独立に、１個のアミノ酸であり；アミノ酸ｘ３〜ｘ６は、ひとまとめにして存在または非存在であり、アミノ酸ｘ３〜ｘ６が非存在である場合、Ｒ／Ｋ”は非存在である。
【０００８】
別の実施形態では、ｘ１〜ｘ６の内の１個または複数のアミノ酸は、疎水性アミノ酸である。別の実施形態では、Ｌｃｋ活性化ポリペプチド部分は、Ｌアミノ酸残基を含む。別の実施形態では、Ｌｃｋ活性化ポリペプチド部分は、Ｌアミノ酸残基からなる。別の実施形態では、Ｌｃｋ活性化ポリペプチド部分は、Ｄアミノ酸残基を含む。別の実施形態では、Ｌｃｋ活性化ポリペプチド部分は、Ｄアミノ酸残基からなる。
【０００９】
別の実施形態では、Ｌｃｋ活性化ポリペプチド部分は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ、ｒｓｋａｋｎｐｌｙ、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶ、およびｒｖｋｖｋｖｖｖｖからなる群より選択される。
【００１０】
別の実施形態では、Ｌｃｋを活性化するためのペプチドは、Ｌｃｋ活性化ポリペプチド部分のＮ末端またはＣ末端に結合した式ＩＩ：
【化１】
2021523946.tif 000003
式ＩＩ
の化合物をさらに含み、式中、
ｎは、化合物のモノマー単位の数で、１〜５の整数であり、
各ｍは、独立に、０〜１８の整数であり、および
各Ｒ基は、独立にＨまたはＣ１〜Ｃ１８の側鎖である。
【００１１】
別の実施形態では、各モノマー単位のＲ基は、独立にＣ１〜Ｃ１８側鎖である。
【００１２】
別の実施形態では、各Ｒ基は、独立に１８−ｍ炭素原子長さであり、式中、ｍは、０〜１７の値を有する。
【００１３】
別の実施形態では、Ｌｃｋを活性化するためのペプチドは、Ｌｃｋ活性化ポリペプチド部分のＮ末端またはＣ末端に結合した化合物をさらに含み、化合物は、少なくとも１個の脂肪酸である。
【００１４】
別の実施形態では、少なくとも４個の脂肪酸が、Ｌｃｋ活性化ポリペプチド部分のＣ末端に結合される。
【００１５】
別の実施形態では、２個以上の脂肪酸の結合は直鎖状である。
【００１６】
別の実施形態では、Ｌｃｋを活性化するためのペプチドは、２個以上の脂肪酸の結合が分岐している、本明細書に記載のさらなるペプチドである。
【００１７】
別の実施形態では、脂肪酸は飽和している。
【００１８】
別の実施形態では、脂肪酸は、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸（デカン酸）、およびラウリン酸（ドデカン酸）からなる群より選択される。
【００１９】
別の実施形態では、最遠位脂肪酸は、アミド化される。
【００２０】
別の実施形態では、アミノ酸配列は、Ｌｃｋ活性化ポリペプチド部分のＣ末端でアミド化される。
【００２１】
別の態様では、本発明は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４、ｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ−（２Ａｄｏｄ）４、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶＲ−（２Ａｄｏｄ）４、およびｒｖｋｖｋｖｖｖｖｒ−（２Ａｄｏｄ）４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドを提供する。
【００２２】
別の態様では、本発明は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４、ｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ−（２Ａｄｏｄ）４、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶＲ−（２Ａｄｏｄ）４、およびｒｖｋｖｋｖｖｖｖｒ−（２Ａｄｏｄ）４からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドを提供する。
【００２３】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の有効成分としてのペプチド、および薬学的に許容可能な希釈剤または担体を含む医薬組成物を提供する。
【００２４】
別の態様では、本発明は、Ｌｃｋキナーゼの活性を高める方法を提供し、方法は、Ｌｃｋキナーゼを、本明細書に記載のペプチドを含む組成物または本明細書に記載の医薬組成物と接触させることを含む。
【００２５】
別の態様では、本発明は、ＬｃｋキナーゼのＹ３９４リン酸化を増大させる方法を提供し、方法は、Ｌｃｋキナーゼを、本明細書に記載のペプチドを含む組成物または本明細書に記載の医薬組成物と接触させることを含む。
【００２６】
別の態様では、本発明は、細胞または細胞集団からのＩＬ−２分泌を増大させる方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のペプチドを含む組成物または本明細書に記載の医薬組成物と接触させることを含む。
【００２７】
別の態様では、本発明は、細胞上または細胞集団中のＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）の発現を増大させる方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のペプチドを含む組成物または本明細書に記載の医薬組成物と接触させることを含む。
【００２８】
別の態様では、本発明は、細胞上または細胞集団中のＩＬ−２Ｒβ（ＣＤ１２２）の発現を増大させる方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のペプチドを含む組成物または本明細書に記載の医薬組成物と接触させることを含む。
【００２９】
別の態様では、本発明は、細胞のまたは細胞集団中のＩＬ−２応答性を高める方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のペプチドを含む組成物または本明細書に記載の医薬組成物と接触させることを含む。
【００３０】
別の態様では、本発明は、細胞上のまたは細胞集団中のＩＬ−１５Ｒの発現を増大させる方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のペプチドを含む組成物または本明細書に記載の医薬組成物と接触させることを含む。
【００３１】
別の態様では、本発明は、細胞のまたは細胞集団中のＩＬ−１５の応答性を高める方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のペプチドを含む組成物または本明細書に記載の医薬組成物と接触させることを含む。
【００３２】
別の態様では、本発明は、細胞上または細胞集団中のＣＤ２８の発現を増大させる方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のペプチドを含む組成物または本明細書に記載の医薬組成物と接触させることを含む。
【００３３】
別の態様では、本発明は、細胞または細胞集団からのＩＬ−２１の分泌を増大させる方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のペプチドを含む組成物または本明細書に記載の医薬組成物と接触させることを含む。
【００３４】
別の態様では、本発明は、細胞上のまたは細胞集団中のＩＬ−２１Ｒ（ＣＤ３６０）ＩＬ−２Ｒβの発現を増大させる方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のペプチドを含む組成物または本明細書に記載の医薬組成物と接触させることを含む。
【００３５】
別の態様では、本発明は、細胞のまたは細胞集団中のＩＬ−２１の応答性を高める方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のペプチドを含む組成物または本明細書に記載の医薬組成物と接触させることを含む。
【００３６】
別の態様では、本発明は、細胞上のまたは細胞集団中のＩＬ−１２Ｒの発現を増大させる方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のペプチドを含む組成物または本明細書に記載の医薬組成物と接触させることを含む。
【００３７】
一実施形態では、ＩＬ−１２Ｒは、ＩＬ−１２Ｒβ１および／またはＩＬ−１２Ｒβ２である。
【００３８】
別の態様では、本発明は、細胞のまたは細胞集団中のＩＬ−１２の応答性を高める方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のペプチドを含む組成物または本明細書に記載の医薬組成物と接触させることを含む。
【００３９】
別の態様では、本発明は、細胞または細胞集団からのサイトカインの分泌を増大させる方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のペプチドを含む組成物または本明細書に記載の医薬組成物と接触させることを含む。
【００４０】
一実施形態では、サイトカインはＩＦＮγまたはＴＮＦαである。
【００４１】
別の態様では、本発明は、細胞または細胞集団の増殖を誘導する方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のペプチドを含む組成物または本明細書に記載の医薬組成物と接触させることを含む。
【００４２】
別の態様では、本発明は、細胞集団の増殖を増大させる方法を提供し、方法は、細胞集団を、本明細書に記載のペプチドを含む組成物または本明細書に記載の医薬組成物と接触させることを含む。
【００４３】
別の実施形態では、本発明は、細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、または樹状細胞からなる群より選択される細胞である、または細胞集団はこれらからなる群より選択される細胞を含む。
【００４４】
別の態様では、本発明は、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞中のＣＤ１０７ａの発現を増大させる方法を提供し、方法は、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、本明細書に記載のペプチドを含む組成物または本明細書に記載の医薬組成物と接触させることを含む。
【００４５】
別の態様では、本発明は、Ｔ細胞機能を高める方法を提供し、方法は、Ｔ細胞またはＴ細胞集団を、本明細書に記載のペプチドを含む組成物または本明細書に記載の医薬組成物と接触させることを含む。
【００４６】
一実施形態では、細胞は未感作細胞である、または細胞集団は未感作細胞を含む。
【００４７】
別の態様では、本発明は、細胞傷害性細胞機能を高める方法を提供し、方法は、細胞傷害性細胞または細胞傷害性細胞集団を、本明細書に記載のペプチドを含む組成物または本明細書に記載の医薬組成物と接触させることを含む。
【００４８】
別の態様では、本発明は、Ｔ細胞またはＴ細胞集団の疲弊を低減する方法を提供し、方法は、Ｔ細胞またはＴ細胞集団を、本明細書に記載のペプチドを含む組成物または本明細書に記載の医薬組成物と接触させることを含む。
【００４９】
別の態様では、本発明は、Ｔ細胞上のＣＤ４０Ｌ発現を増大させる方法を提供し、方法は、Ｔ細胞を、本明細書に記載のペプチドを含む組成物または本明細書に記載の医薬組成物と接触させることを含む。
【００５０】
別の態様では、本発明は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を高める方法を提供し、方法は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、本明細書に記載のペプチドを含む組成物または本明細書に記載の医薬組成物と接触させることを含む。
【００５１】
別の態様では、本発明は、細胞集団中のＴｒｅｇ細胞の比率を減らす方法を提供し、方法は、Ｔｒｅｇ含有細胞集団を、本明細書に記載のペプチドを含む組成物または本明細書に記載の医薬組成物と接触させることを含む。
【００５２】
一実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞はＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞である。
【００５３】
別の態様では、本発明は、チェックポイント阻害剤の存在下でＩＬ−２分泌を増大させる方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のペプチドを含む組成物または本明細書に記載の医薬組成物と接触させることを含む。
【００５４】
別の態様では、本発明は、樹状細胞生存率を増大させる方法を提供し、方法は、樹状細胞を、本明細書に記載のペプチドまたは本明細書に記載の医薬組成物と接触させることを含む。
【００５５】
一実施形態では、接触は、インビボまたはインビトロで実施される。
【００５６】
一実施形態では、方法は、エクスビボで実施される。
【００５７】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の方法により得られる細胞または細胞集団を提供する。
【００５８】
別の態様では、本発明は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のペプチドを含む組成物または本明細書に記載の医薬組成物と接触させることにより得られる細胞または細胞集団に由来する細胞または細胞集団を提供する。
【００５９】
別の態様では、本発明は、インビボでＬｃｋの活性を高めるために、ペプチドまたは医薬組成物が対象または細胞に投与される本明細書に記載の方法を提供する。
【００６０】
別の態様では、本発明は、対象のＬｃｋの活性を高める方法を提供し、方法は、本明細書に記載のペプチドを含む組成物または本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む。
【００６１】
別の態様では、本発明は、対象の免疫応答を誘導する方法を提供し、方法は、本明細書に記載のペプチドまたは本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む。
【００６２】
別の態様では、本発明は、対象中のＬｃｋまたはＬｃｋ活性の抑制または下方制御を特徴とする疾患または状態に関連する少なくとも１つの症状を治療および／または予防する方法を提供し、方法は、本明細書に記載のペプチドを含む組成物または本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む。
【００６３】
別の態様では、本発明は、ＬｃｋまたはＬｃｋ活性の抑制または下方制御を特徴とする疾患または状態が、病原性感染症、病原性感染症に由来する敗血症（例えば、慢性敗血症）、免疫不全障害、低下した免疫応答、減少したＴ細胞数、Ｔ細胞異常、Ｔ細胞疲弊、およびＴ細胞チェックポイント阻害からなる群より選択される、本明細書で記載の方法を提供する。
【００６４】
別の態様では、本発明は、疾患または状態が癌である、本明細書に記載の方法を提供する。
【００６５】
別の実施形態では、本発明は、ワクチン接種を必要としている対象にワクチンを接種する方法を提供し、方法は、本明細書に記載のペプチドを含む組成物または本明細書に記載の医薬組成物をワクチンと同時にまたは順次に対象に投与することを含む。
【００６６】
別の態様では、本発明は、癌の治療および／または予防を必要としている対象にそれを実施する方法を提供し、方法は、本明細書に記載のペプチドを含む組成物または本明細書に記載の医薬組成物をチェックポイント阻害剤と同時にまたは順次に対象に投与することを含む。
【００６７】
別の態様では、本発明は、対象の免疫抑制を低減する方法を提供し、方法は、本明細書に記載のペプチドを含む組成物または本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む。
【００６８】
別の態様では、本発明は、対象の加齢関連免疫機能不全を治療および／または予防する方法を提供し、方法は、本明細書に記載のペプチドを含む組成物または本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む。
【００６９】
別の態様では、本発明は、対象のＴｈ１応答を誘導する方法を提供し、方法は、本明細書に記載のペプチドまたは本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む。
【００７０】
別の態様では、本発明は、対象のＨＩＶ感染症を治療する方法を提供し、方法は、本明細書に記載のペプチドを含む組成物または本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む。
【００７１】
別の態様では、本発明は、対象の結核菌感染症を治療する方法を提供し、方法は、本明細書に記載のペプチドを含む組成物または本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む。
【００７２】
別の態様では、本発明は、ＬｃｋまたはＬｃｋ活性の抑制または下方制御を特徴とする疾患または状態に関連する少なくとも１つの症状を治療および／または予防するための投与単位剤形を提供し、投与単位剤形は、本明細書に記載のペプチドを含む。
【００７３】
別の態様では、本発明は、癌治療および／または予防のための投与単位剤形を提供し、投与単位剤形は、本明細書に記載のペプチドを含む。
【００７４】
本明細書の全体を通して、用語の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、記述した要素、整数もしくはステップまたは複数の要素、整数もしくはステップの群を含むが、いかなる他の要素、整数もしくはステップまたは複数の要素、整数もしくはステップの群も排除しないことを意味すると理解されよう。
【００７５】
本明細書に収載されている文書、法令、物質、装置、論文などの全ての考察は、本発明の背景を提供することのみを目的とするものである。これらの資料のいずれかまたはその全てが、本出願の優先日以前にオーストラリアまたは他のどこかで存在したとして、先行技術の根拠の一部を形成する、または本発明に関連する分野での共通の一般常識であったことを認めるものであると解釈されるべきではない。
【００７６】
本発明の特徴および利点は、添付図面と共に本発明の例示的実施形態の以下の詳細な説明からさらに明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】ＬｃｋをポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（ＩＫ１４００４）と接触させた場合のＬｃｋ活性の用量依存的活性化を示す。グラフは、ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲのＣ末端に結合された式ＩＩに従うポリアミド部分を含むＬｃｋ活性化剤の存在下でのＬｃｋの活性化を示す。Ｌｃｋ活性化は、約３０ｎＭのＬｃｋ活性化剤の濃度（対照のレベルより１８％高いレベル）で開始し、３０μＭのＬｃｋ活性化剤の濃度で対照レベルを超える９１４％の活性化に達した。
【図２】ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹ（「ＩＫ９４０００」）およびＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４）がＹ３９４でＬｃｋリン酸化を増大させることを示す。抗ｐＹ３９４抗体でプローブ後、用量依存的に１０μＭおよび３０μＭ（７および８）の濃度でペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹにより誘導されたチロシンＹ３９４でのＬｃｋのリン酸化を示す発色させたウェスタンブロットの写真を示す。ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲは、Ｌｃｋ活性化を誘導できず、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ配列のＣ末端アルギニンがＬｃｋの自己リン酸化を抑制することを示す。しかし、この抑制は、ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲのＣ末端への式ＩＩに従うポリアミド部分の結合により克服される。
【図３】ＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）が、ジャーカットＴ細胞を「４Ｃ１０」ポリアミド部分に結合されたペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２；「ＩＫ１４００４」）に暴露した場合ＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）＋イオノマイシン（１μｇ／ｍｌ）で９６時間刺激されたジャーカットＴ細胞中で顕著に発現上昇されることを示す。細胞をウェル（１２ウェルプレート、２ｍＬ体積）当たり１００万個で播種し、ＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍＬ）およびイオノマイシン（１μｇ／ｍＬ）で刺激した。細胞を次に、上記のようにＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２で処理した。試料をその後、３７℃で４８時間インキュベートした後、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤ならびにＰＰ２（１０μＭ）含有溶解液１００μＬで溶解した。集めた細胞ライセートをＢＣＡプロテインアッセイに供した。細胞ライセート（４０μｇタンパク質）をその後、ＩＬ−２ＲαについてＥＬＩＳＡで分析した。
【図４】ＣＤ３６０（ＩＬ−２１Ｒ）の発現が、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（ＩＫ１４００４」）による処理に応答してＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞中で高められることを示す。ＰＢＭＣを、抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）刺激および５種の試験濃度範囲（０〜１．２５μＭ）のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２と共に、７２時間培養した後、細胞をＣＤ３６０（ＩＬ−２１Ｒ）の発現についてフローサイトメトリーにより評価した。提示データは、ペプチド処理に応答したＣＤ４＋（パネルＡ）またはＣＤ８＋（パネルＢ）Ｔ細胞集団中のそれぞれの発現の平均、±ＳＥＭ、ｎ＝４を示す。データを、ダネット事後検定を伴う２元配置分散分析により解析した。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。赤色点線は、非刺激細胞を示す。Ａ．ＣＤ４＋Ｔ細胞。Ｂ．ＣＤ８＋Ｔ細胞。
【図５】ＣＤ３６０（ＩＬ−２１Ｒ）の発現が、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）による処理に応答して単離ＣＤ３ＮＥＧＣＤ５６＋ＮＫ細胞上で高められることを示す。単離ＮＫ細胞を、組換えＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）および５種の濃度範囲（０〜１．２５μＭ）のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２と共に、７２時間培養した後、ＣＤ３ｎｅｇＣＤ５６＋ＮＫ細胞をＩＬ−２１Ｒ発現についてフローサイトメトリーにより評価した。提示データは、ペプチド処理に応答したＮＫ細胞集団での発現の平均、±ＳＥＭ、ｎ＝４を示す。データを、ダネット事後検定を伴う２元配置分散分析により解析した。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図６】ＣＤ３６０（ＩＬ−２１Ｒ）の発現が、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）による処理に応答してｒＩＬ−２の含有／非含有下で培養した単離ＮＫ細胞中で高められることを示す。単離ＮＫ細胞を、ヒト組換えＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）の含有または非含有下で、５種の濃度範囲（０〜１．２５μＭ）のペプチドと共に、７２時間培養した後、ＣＤ３ＮＥＧＣＤ５６＋ＮＫ細胞をＩＬ−２１Ｒ発現についてフローサイトメトリーにより評価した。提示データは、ペプチド処理に応答したＮＫ細胞集団でのそれぞれの発現の平均、±ＳＥＭ、ｎ＝４を示す。データを、ダネット事後検定を伴う２元配置分散分析により解析した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図７】ＩＬ−２１産生が、刺激Ｔ細胞アッセイにおいて、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）による処理に応答して増大されることを示す。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激Ｔ細胞（ＣＤ３＋単離）を、５種の濃度範囲のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（０〜１．２５μＭ）＋ビークル対照と共に、７２時間培養した後、上清をＩＬ−２１についてＥＬＩＳＡにより評価した。提示データは、ペプチド処理に応答したｐｇ／ｍｌ値の平均、±ＳＥＭ、ｎ＝４を示す。データを、それぞれのペプチド濃度をビークルと比較するダネット事後検定を伴うＲＭ１元配置分散分析により解析した。＊ｐ＜０．０５。
【図８】ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）による処理は、ヒトＰＢＭＣ内の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ：Ｆｏｘｐ３＋）を抑制することを示す。ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２の存在下でヒトＰＢＭＣ内の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ：Ｆｏｘｐ３＋）の抑制パーセンテージ（ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＣＤ１２７ｌｏｗでゲートした細胞の）が示される。抗ＣＤ３刺激ＰＢＭＣを、５種の濃度範囲のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（０〜１．２５μＭ）＋ビークル対照と共に、４８時間培養した。Ｔｒｅｇ集団を、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ集団中の細胞のＦｏｘｐ３＋比率を測定することにより決定した。データを、ドナーの変動のために正規化した。提示データは、ペプチド処理に反応したＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ比率の倍率変化、±ＳＥＭ、ｎ＝４を示す。データを、それぞれのペプチド濃度を最も低い試験濃度と比較するダネット事後検定を伴うＲＭ２元配置分散分析により解析した。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。点線は、正規化用のビークル対照値を示す。
【図９】抗ＰＤ−１（ペムブロリズマブ）と組み合わせたＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）による処理がＰＢＭＣ内のＴｒｅｇ細胞（Ｆｏｘｐ３＋）の比率に与える相乗効果を示す。抗ＣＤ３刺激ＰＢＭＣを、抗ＰＤ−１（ペムブロリズマブ）またはアイソタイプ（ｈＩｇＧ４）と組み合わせた５種の濃度範囲のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（０〜１．２５μＭ）＋ビークル対照と共に、４８時間培養した後、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞をフローサイトメトリーにより評価した。Ｔｒｅｇ集団を、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ集団中の細胞のＦｏｘｐ３＋比率を測定することにより決定した。データは、ペプチドおよび抗ＰＤ−１併用療法に応答したＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ比率、±ＳＥＭ、ｎ＝４を示す。データを、各投与量でのｈＩｇＧ４との組み合わせに対する抗ＰＤ−１との組み合わせを比較するシダックの事後検定を伴うＲＭ２元配置分散分析により解析した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。点線は、正規化用のビークル対照値を示す。
【図１０】ＰＢＭＣ中のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上のＩＬ−１２Ｒβ２受容体発現が、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）による処理により高められることを示す。ＰＢＭＣを、抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）刺激および５種の濃度範囲のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（０〜１．２５μＭ）と共に、７２時間培養した後、ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞をＩＬ−１２Ｒβ２発現についてフローサイトメトリーにより評価した。提示データは、ペプチド処理に応答したＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞集団中のそれぞれの発現の平均、±ＳＥＭ、ｎ＝４を示す。データを、ダネット事後検定を伴う２元配置分散分析により解析した。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。赤色点線は、平均非刺激ＰＢＭＣ発現を示す。
【図１１】ナチュラルキラー細胞中のＩＬ−１２Ｒβ１／Ｒβ２受容体発現は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）による処理により誘導されることを示す。ＰＢＭＣを、抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）刺激および５種の濃度範囲のペプチド（０〜１．２５μＭ）と共に、７２時間培養した後、ＣＤ３ＮＥＧＣＤ５６＋ＮＫ細胞をＩＬ−１２Ｒβ１およびＩＬ−１２Ｒβ２の発現についてフローサイトメトリーにより評価した。提示データは、ペプチド処理に応答したＣＤ３ＮＥＧＣＤ５６＋ＮＫ細胞でのそれぞれの発現の平均、±ＳＥＭ、ｎ＝４を示す。データを、ダネット事後検定を伴う２元配置分散分析により解析した。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊＜０．０００１。点線は、平均非刺激ＰＢＭＣ発現を意味する。
【図１２】ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ４０Ｌ発現が、非刺激ＰＢＭＣアッセイにおいて、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）による処理により高められることを示す。非刺激ＰＢＭＣを、５種の濃度範囲のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（０〜１．２５μＭ）＋ビークル対照と共に、７２時間培養した後、ＣＤ４＋Ｔ細胞をＣＤ４０Ｌ発現についてフローサイトメトリーにより評価した。提示データは、ペプチド処理に応答したＣＤ４０Ｌの発現（ＭＦＩ）の平均、±ＳＥＭ、ｎ＝３を示す。データを、それぞれのペプチド濃度をビークルと比較するダネット事後検定を伴うＲＭ２元配置分散分析により解析した。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。点線は、ゲートをかけたアイソタイプ対照値を示す。
【図１３】ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ４０Ｌ発現が、刺激Ｔ細胞アッセイにおいて、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）による処理により高められることを示す。単離Ｔ細胞（ＣＤ３＋）を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）で刺激し、５種の濃度範囲のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（０〜１．２５μＭ）＋ビークル対照と共に、７２時間培養した後、ＣＤ４＋Ｔ細胞をＣＤ４０Ｌ発現についてフローサイトメトリーにより評価した。提示データは、ペプチド処理に応答した平均ＣＤ４０Ｌの発現（ＭＦＩ）の平均、±ＳＥＭ、ｎ＝３を示す。データを、それぞれのペプチド濃度をビークルと比較するダネット事後検定を伴うＲＭ２元配置分散分析により解析した。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。点線は、平均非刺激対照値を示す。
【図１４】ジャーカット野生型（ＷＴ）細胞によるＩＬ−２分泌が、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）による処理により高められることを示す。細胞をウェル（１２ウェルプレート、２ｍＬ体積）当たり１００万個で播種し、ビオチン−ＣＤ３、ＣＤ２８、およびアビジン（５：５：１．２５μｇ）で刺激した。細胞を次に、示した３種の濃度のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２＋ビークル対照で処理した。細胞を次に、３７℃で４８時間インキュベートした後、上清をＩＬ−２含量についてＥＬＩＳＡにより分析した。
【図１５】ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）による処理により増大したジャーカット細胞によるＩＬ−２分泌（Ａ）およびＩＬ−２Ｒα発現（Ｂ）がＬｃｋ依存性であることを示す。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８で刺激したジャーカット野生型（ＷＴ）細胞およびＬｃｋ欠損ジャーカット細胞（ＪＣａＭ１．６）を示す。１２ウェルプレートをＰＢＳ（２００μＬ）中で作製した抗ＣＤ３（５μｇ／ｍＬ）溶液でコートし、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、抗ＣＤ３溶液を吸引し、ウェルを培地（１ｍＬ、１０分）で２回穏やかに洗浄した。ジャーカット細胞（ＷＴおよびＬｃｋ欠損）をウェル当たり１００万個の濃度で抗ＣＤ３コート１２ウェルプレートに播種し、抗ＣＤ２８（５μｇ／ｍＬ）でさらに刺激後、直ぐに、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（２．５μＭ）を用いて処理した。細胞を７２時間インキュベートした。ＩＬ−２アッセイのために、左、上清をＩＬ−２含量についてＥＬＩＳＡにより分析した。ＩＬ−２Ｒαアッセイのために、右、細胞をプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤ならびにＰＰ２（１０μＭ）含有溶解液１００μＬで溶解した。集めた細胞ライセートをＢＣＡプロテインアッセイに供した。その後、細胞ライセート（４０μｇタンパク質）をＩＬ−２ＲαについてＥＬＩＳＡで分析した。
【図１６】ＩＬ−２分泌のｒＰＤ−Ｌ１抑制は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）によりレスキューできることを示す。ウェル（１２ウェルプレート、２ｍＬ体積）当たり１００万個で播種しＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍＬ）およびイオノマイシン（１μｇ／ｍＬ）で刺激したジャーカット野性型細胞が示される。次に、上記のように、細胞をｒＰＤ−Ｌ１（５μｇ／ｍｌ）単独およびｒＰＤ−Ｌ１とＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（２．５μＭ）の組み合わせで処理した。試料を次に、３７℃で７２時間インキュベートした後、上清をＩＬ−２含量についてＥＬＩＳＡにより分析した。
【図１７】ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）およびｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫＤ１４００４」）は、疲弊ＣＤ４＋Ｔ細胞アッセイにおいて、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖およびＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ２５の発現を誘導することを示す。ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（左）およびｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（右）が、再刺激時に、疲弊ＣＤ４＋細胞に与える効果。細胞を、Ｋｉ６７およびＣＤ２５頻度を評価して発現レベルを示すために、７２時間後に培養物中でフローサイトメトリー用に染色した。生存可能集団内から、ＣＤ４＋細胞に注目するために細胞をゲートにかけ、その後、ＣＤ２５またはＫｉ６７＋集団についてゲートにかけた。データを、絶対値としての４回の生物学的反復実験から平均±ＳＥＭとして示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ダンの事後検定を伴うノンパラメトリック１元配置分散分析（Ｆｒｅｉｄｍａｎ）を用いて各投与レベルの群をビークルと比較した。
【図１８】ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）およびｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫＤ１４００４」）は、疲弊ＣＤ４＋Ｔ細胞アッセイにおいて、ＴＮＦαおよびＩＦＮγの産生を誘導することを示す。ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２およびｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２が、再刺激時に、疲弊ＣＤ４＋細胞に与える効果。培養物の上清を、７２時間後に採集して、マルチプレックスイムノアッセイにより測定してサイトカイン産生（ＴＮＦαまたはＩＦＮγ）を評価した。データを、４回の生物学的反復実験から平均＋ＳＥＭとして示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ダンの事後検定を伴うノンパラメトリック１元配置分散分析（Ｆｒｅｉｄｍａｎ）を用いて各投与レベルの群をビークルと比較した。
【図１９】ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）は、ＰＢＭＣ中のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒα）発現を誘導することを示す。刺激されたＰＢＭＣ由来のＣＤ４＋（左）およびＣＤ８＋（右）細胞中のＣＤ２５発現。新たに単離したＰＢＭＣを、示した濃度（μＭ）のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２の存在下、抗ＣＤ３（１μｇ／ｍＬ）含有または非含有（−ａＣＤ３）で、２４時間刺激した。データを、４人のドナーからの平均±ＳＥＭとして示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ダネット事後検定を伴う２元配置分散分析を用いて、各ペプチドの濃度（または非刺激細胞）をビークル（０）に対して比較した。
【図２０】ＣＤ２８が、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）による処理に応答して、ＣＤ４＋（パネルＡ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（パネルＢ）中で増大されることを示す。ＰＢＭＣを、抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）刺激および５種の試験濃度範囲（０〜１．２５μＭ）のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２と共に、７２時間培養した後、細胞をＣＤ２８の発現についてフローサイトメトリーにより評価した。Ａ；提示データは、ペプチド処理に応答したＣＤ８＋Ｔ細胞集団中のそれぞれの発現の平均、±ＳＥＭ、ｎ＝４を示す。データを、ダネット事後検定を伴う２元配置分散分析により解析した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＜０．００１。点線は、非刺激細胞を示す。Ｂ；提示データは、ペプチド処理に応答したＣＤ４＋Ｔ細胞中のそれぞれの発現の平均、±ＳＥＭ、ｎ＝４を示す。データを、ダネット事後検定を伴う２元配置分散分析により解析した。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。点線は、非刺激細胞を示す。
【図２１】末梢血ＮＫ細胞において、ヒト組換えＩＬ−２と比較して、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）による処理に応答して、ＮＫ細胞活性化受容体ＮＫｐ４４およびＮＫＧ２Ｄの増大した発現を示す。ＮＫ細胞をヒトＰＢＭＣから単離し、５種の濃度範囲のペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（０〜１．２５μＭ）＋ビークル対照（左）または組換えＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）＋ビークル対照（右）に２４時間暴露し、ＮＫｐ４４およびＮＫＧ２Ｄの表面発現についてフローサイトメトリーにより評価した。データは、平均表面マーカー発現±ＳＥＭ、ｎ＝４を示す。データを、ペプチド濃度および組換えＩＬ−２をそれぞれのビークル対照に対し比較する、ホルム−シダック多重比較事後検定を伴う反復測定（ＲＭ）２元配置分散分析を用いて解析した。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図２２】ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）およびｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫＤ１４００４」）は、それぞれ、腹腔内または経口投与された場合に肺転移を低減することを示す。Ａ：マウスをビークルおよびＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２で治療後、腹腔内投与された場合（４００μｇ／２００μＬ腹腔内の注射、週２回を２週間）、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２が、Ｂ１６黒色腫肺転移に与える効果。結節を、１５日目のマウスの回収時に数え、データを平均結節として表した（±ＳＥＭ；ｎ＝８匹のマウス／群）。統計解析を、１元配置分散分析およびダネットの事後検定を用いて実施した。＊Ｐ＝０．０４。Ｂ：経口投与された場合、ｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２が、Ｂ１６黒色腫肺転移に与える効果。マウスのビークルおよびｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（８００μｇ／２００μＬ経口胃管投与、週２回を２週間）で治療後のＢ１６Ｆ１０腫瘍結節数。結節を、１５日目のマウスの回収時に数え、データを平均結節として表した（±ＳＥＭ；ｎ＝９匹のマウス／群）。対応のないｔ検定を用いて、統計解析を実施した。＊Ｐ＝０．０４。
【図２３】ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（ＩＫ１４００４）の腹腔内投与は、ルイス肺癌（ＬＣＣ）転移モデルで、肺中の腫瘍面積を減らすことを示す。ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２を週２回を２週間にわたり腹腔内投与（４００μｇ）した後、Ｈ＆Ｅ切片を腫瘍浸潤の証拠について評価し、腫瘍量を健康な肺組織のパーセンテージとして計算した。データポイントは、試料毎の肺内の腫瘍塊の平均面積を示す。ｎ＝１６、＊＊ｐ＜０．０１、対応のない両側ｔ検定。
【図２４】ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）は、ルイス肺癌（ＬＬＣ）異種移植片モデルにおいて、異種移植片腫瘍体積および腫瘍細胞生存率を低下させ、腫瘍中のＣＤ４５＋の比率を増大させることを示す。Ａ：マウスに、Ｄ０で右脇腹の皮下に５ｘ１０５ＬＬＣ細胞を接種した。腫瘍を、矢印で示した各治療の時点でデジタルノギスで測定した。点線は、腫瘍および脾臓試料の採集のための１０ｍｍ直径の終了点を示す。データを、個別のデータポイントとして、±ＳＥＭ、ｎ＝８で示す。群を、シダック多重比較を伴う２元配置分散分析により比較した。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。Ｂ：各単細胞懸濁液内の腫瘍細胞生存率を、固定可能な細胞生存率測定用試薬を用いてフローサイトメトリーにより測定した。データを、個別のデータポイントとして、±ＳＥＭ、ｎ＝８で示す。対応のない両側ｔ検定を用いて、群を比較した。＊＊ｐ＜０．０１。Ｃ：各単細胞懸濁液内の生存可能ＣＤ４５陽性細胞の比率を、フローサイトメトリーにより測定した。データを、個別のデータポイントとして、±ＳＥＭ、ｎ＝８で示す。群を、対応のない両側ｔ検定を用いて比較した。＊＊ｐ＜０．０１。
【図２５】ＴＣＲ刺激後にＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）で治療したルイス肺癌マウス（転移モデル）から取り出した脾細胞からのＩＦＮγおよびＩＬ−２放出が増大することを示す。データは、ＴＣＲ刺激と共に培養後の脾細胞のＥＬＩＳＡで測定したサイトカイン（ＩＦＮγおよびＩＬ−２）の量を示す。ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２治療マウスからの脾細胞は、抗ＣＤ３刺激時に、ＩＦＮγ産生、および抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激によりＩＬ−２産生の有意な増大を示す（シダックの事後検定を伴う２元配置分散分析を用いて決定して、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図２６】ＩＬ−１２Ｒβ１およびＩＬ−１２Ｒβ２発現ＣＤ４＋Ｔ細胞の比率が、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）で治療したルイス肺癌マウス（転移モデル）から取り出した脾細胞のＴＣＲ刺激後に増大することを示す。  データは、一晩のＴＣＲ刺激後の、ＣＤ４＋細胞上のＩＬ−１２受容体分子β１およびβ２の相対発現を示す。ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２で治療したマウス由来のＣＤ４＋細胞は、両方の受容体成分の発現の有意な増大を示す（シダックの事後検定を伴う２元配置分散分析により決定、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図２７】脾細胞単細胞懸濁液（活性化されていない）中のＩＬ−１２Ｒβ２の発現が、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）で治療したルイス肺癌マウス（転移モデル）において増大することを示す。データは、適切な対照試料に比較して、ＩＬ−１２Ｒβ２陽性であると特定されたＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の比率を示す。ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２治療群では、ＩＬ−１２Ｒβ２発現ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の比率の有意な増大がある（両側ｔ検定、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図２８】ＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒα）、ＣＤ２１５（ＩＬ−１５Ｒ）、ＣＤ２８およびＫｉ６７の発現が、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）で治療したルイス肺癌マウス（転移モデル）由来の脾細胞中のＮＫ細胞上で増大することを示す。データは、フローサイトメトリーにより測定した、ＮＫ細胞上のＣＤ２５およびＣＤ２１５（それぞれ、パネルＡおよびＢ）の幾何平均蛍光強度（ＭＦＩ）；および適切な対照試料と比較して、ＣＤ２８およびＫｉ６７増殖マーカー（それぞれ、パネルＣおよびＤ）陽性であると特定されたＮＫ細胞の比率を示す。グラフは、群平均±ＳＥＭを有する個別のマウスの値を示す。ｎ＝１６、データを、対応のないｔ検定により解析した。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図２９】ＴＣＲ刺激の存在下でのＣＤ４＋Ｔ細胞上のＩＬ−１２Ｒβ２発現が、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）で腹腔内経路により治療したルイス肺癌マウス（転移モデル）において増大することを示す。フローサイトメトリーで測定される、抗ＣＤ３または抗ＣＤ３／ＣＤ２８で一晩のＴＣＲ刺激後のＣＤ４＋Ｔ細胞上のＩＬ−１２受容体（ＩＬ−１２Ｒβ２）の幾何学的ＭＦＩを示す。各ドットは、各条件での個別のマウスからの培養物技術的反復の平均であり、各群は、群の平均およびＳＥＭを有する。データを、シダックの事後検定比較を伴う２元配置分散分析により解析した。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２治療マウス由来のＣＤ４＋脾細胞は、抗ＣＤ２８で共刺激されたビークル治療マウス由来の脾細胞よりも、抗ＣＤ３活性化のみの後に、より多くのＩＬ−１２Ｒβ２を発現した。
【図３０】ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２中のアニオン性残基（右）の、Ａｒｇ（Ｒ）およびＬｙｓ（Ｋ）残基（左）による置換は、Ｌｃｋ活性化をもたらさないことを示す。
【図３１】ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）は、刺激ＰＢＭＣアッセイにおいて、ＮＫ細胞上のＩＬ−２Ｒβ（ＣＤ１２２）発現を増大させることを示す。健康なドナー由来のＰＢＭＣを、ペプチド（０．０８〜１．２５μＭ）またはビークル対照の存在下で、抗ＣＤ３（１μｇ／ｍＬ）で７２時間刺激した。培養期間の最後に、細胞を集め、ＣＤ３ｎｅｇＣＤ５６＋／ｄｉｍＮＫ細胞内のＩＬ−２Ｒβ（ＣＤ１２２）についてフローサイトメトリーにより評価した。データを、平均ＩＬ−２Ｒβ（ＣＤ１２２）発現（％陽性細胞またはＭＦＩ）±ＳＥＭ、ｎ＝４として示す。データを、試験物質をビークル対照に対し比較する、ホルム−シダック多重比較事後検定を伴う反復測定２元配置分散分析を用いて解析した。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。青色点線は、非刺激試料での平均発現を示す。
【図３２】ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）は、刺激ＰＢＭＣアッセイにおいて、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上のＩＬ−２Ｒβ（ＣＤ１２２）発現を増大させることを示す。健康なドナー由来のＰＢＭＣを、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（０．０８〜１．２５μＭ）またはビークル対照の存在下で、抗ＣＤ３（１μｇ／ｍＬ）で２４時間刺激した。培養期間の最後に、細胞を集め、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞内のＩＬ−２Ｒβ（ＣＤ１２２）についてフローサイトメトリーにより評価した。データを、平均ＩＬ−２Ｒβ（ＣＤ１２２）発現（％陽性細胞）±ＳＥＭ、ｎ＝４として示す。データを、試験物質をビークル対照に対し比較する、ホルム−シダック多重比較事後検定を伴う反復測定２元配置分散分析を用いて解析した。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。点線は、非刺激試料での平均発現を示す。
【図３３】ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）およびｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫＤ１４００４」）は、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞中の脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａの発現を増大させることを示す。Ａ＆Ｃ：ＰＢＭＣを、ペプチドを含有（０．０８〜１．２５μＭ）または非含有下で４８時間前処理した後、カルセインＡＭ染色Ｋ５６２細胞と５：１の比率で共培養し、さらに４時間インキュベートした。培養の終わりにＰＢＭＣを集め、ＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＤ１０７ａの発現（％陽性）についてフローサイトメトリーで評価した。示したデータは、平均発現陽性パーセンテージ±ＳＥＭ、ｎ＝４を示す。データを、ビークル対照によるペプチド処理と比較する、ホルム−シダックの事後検定を伴う反復測定２元配置分散分析により分析した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。点線は、アイソタイプ染色対照を示す。Ｂ：ＰＢＭＣを４８時間インキュベートした後、ヒト組換えＩＦＮα２Ａ（５ｎｇ／ｍＬ）による刺激のある場合とない場合についてカルセインＡＭ染色Ｋ５６２細胞と共に４時間共培養した。培養の終わりにＰＢＭＣを集め、ＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＤ１０７ａの発現（％陽性）についてフローサイトメトリーで評価した。示したデータは、平均発現陽性パーセンテージ±ＳＥＭ、ｎ＝４を示す。データをビークル対照と比較して対応のあるｔ検定により分析した。＊＊ｐ＜０．０１。
【図３４】非活性化ジャーカット細胞のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）による前処理は、その後の活性化時にＩＬ−２産生を増大させ、かつＩＬ−２誘導はＬｃｋ依存性であることを示す。２つの別の実験で、５００万個の非刺激ＪＣａｍ１．６（Ｌｃｋ欠損）および５００万個の６．１（ＷＴ）ジャーカット細胞をそれぞれ、Ｔ２５フラスコに播種した。細胞を、５μＭ、１０μＭおよび２０μＭの濃度のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２で１時間処理した後、細胞懸濁液を遠心分離し、新鮮培地で２回洗浄した。各実験に対し、５００μＬの培地中のビオチン−抗ＣＤ３およびアビジン（５：１．２５μｇ）の混合物を１２ウェルプレートのウェルに加えた。１０分後、非刺激の洗浄細胞をウェル当たり１００万個の濃度で播種し、細胞懸濁液を、培地を用いて２ｍＬの体積にした。その後、試料を抗ＣＤ２８（５μｇ／ｍＬ）でさらに刺激した後、試料を３７℃で４８時間インキュベートした。その後、上清（１００μＬ、ｎ＝３）をＩＬ−２含量について分析した。
【図３５】ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）は、１０日間の増殖後にＰＢＭＣ内のＣＤ８＋細胞集団を増大させることを示す。健康なドナー由来のＰＢＭＣまたは単離ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（０．０８〜１．２５μＭ）またはビークル対照の存在下で、ＴＣＲ＋ＩＬ−２を介して１０日間刺激した。培養期間の最後に、細胞を集め、ＣＤ８＋細胞比率についてフローサイトメトリーにより評価した。データを、平均発現パーセンテージ±ＳＥＭ、ｎ＝４として示す。データを、試験物質をビークル対照に対し比較する、ホルム−シダック多重比較事後検定を伴う反復測定２元配置分散分析を用いて解析した。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。点線は、非刺激試料での平均発現を示す。
【図３６】ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）は、単離未成熟ＤＣ培養物中の樹状細胞（ＤＣ）生存率を高めることを示す。未成熟単球由来ＤＣ（ｉＭｏＤＣ）を、Ｍｏ−ＤＣ分化培地中で７日間培養した単離ＣＤ１４＋単球から誘導した。ｉＭｏＤＣを、５点濃度曲線全体にわたる試験ペプチド（０〜１．２５μＭ）＋ビークルおよび抗ＣＤ３（１μｇ／ｍＬ）の存在下で、７２時間培養した。７２時間後、細胞を生存率についてフローサイトメトリーにより評価した。提示データは、ペプチド処理後の平均生存細胞パーセンテージ、±ＳＥＭ、ｎ＝４を示す。データを、それぞれのペプチド濃度をビークルと比較するダネット事後検定を伴うＲＭ２元配置分散分析により解析した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図３７】ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）は、刺激Ｔ細胞アッセイにおいて、ＩＬ−２産生を増大させることを示す。単離Ｔ細胞（ＣＤ３＋）を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）で刺激し、５種の濃度範囲のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（０〜１．２５μＭ）＋ビークル対照と共に、７２時間培養した後、上清を集め、ＩＬ−２についてＥＬＩＳＡにより評価した。提示されたデータは、平均ＩＬ−２ｐｇ／ｍｌおよび倍率変化（ビークルに対し正規化）±ＳＥＭ、ｎ＝４、を示す。データを、各ペプチド濃度をビークルと比較する、または正規化試験の場合には、濃度を最低試験濃度と比較する、ダネット事後検定を伴うＲＭ２元配置分散分析により解析した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。点線は、正規化データ用のビークル対照値を示す。
【図３８】ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）は、ＩＬ−２分泌をＬｃｋ依存的に増大させることを示す。１２ウェルプレートをＰＢＳ（２００μＬ）中で作製した抗ＣＤ３（５μｇ／ｍＬ）溶液でコートし、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、抗ＣＤ３溶液を吸引し、ウェルを培地（１ｍＬ、１０分）で２回穏やかに洗浄した。ジャーカット細胞（ＷＴおよびＬｃｋ欠損）をウェル当たり１００万個の濃度で抗ＣＤ３コート１２ウェルプレートに播種し、抗ＣＤ２８（５μｇ／ｍＬ）でさらに刺激後、直ぐに、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（２．５μＭ）で処理した。細胞を２４時間インキュベートした後、上清をＩＬ−２についてＥＬＩＳＡで分析した。
【図３９】ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）は、ＩＬ−２Ｒα発現をＬｃｋ依存的に増大させることを示す。１２ウェルプレートをＰＢＳ（２００μＬ）中で作製した抗ＣＤ３（５μｇ／ｍＬ）溶液でコートし、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、抗ＣＤ３溶液を吸引し、ウェルを培地（１ｍＬ、１０分）で２回穏やかに洗浄した。ジャーカット細胞（ＷＴおよびＬｃｋ欠損）をウェル当たり１００万個の濃度で抗ＣＤ３コート１２ウェルプレートに播種し、抗ＣＤ２８（５μｇ／ｍＬ）でさらに刺激後、直ぐに、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（２．５μＭ）で処理した。試料を２４間インキュベートした後、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤ならびにＰＰ２（１０μＭ）含有溶解液１００μＬで溶解した。集めた細胞ライセートをＢＣＡプロテインアッセイに供した。その後、細胞ライセート（４０μｇタンパク質）をＩＬ−２ＲαについてＥＬＩＳＡで分析した。
【図４０】ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）は、刺激ジャーカット細胞（抗ＣＤ３／ＣＤ２８）でＩＬ−２分泌を増大させるが、非刺激細胞では分泌を増大させないことを示す。１２ウェルプレートをＰＢＳ（２００μＬ）中で作製した抗ＣＤ３（５μｇ／ｍＬ）溶液でコートし、３７℃で一晩インキュベートした。その後、抗ＣＤ３溶液を吸引し、ウェルを培地で２回穏やかに洗浄した（１ｍＬ、１０分）。ジャーカット細胞をウェル当たり１００万個の濃度で播種し、抗ＣＤ２８（５μｇ／ｍＬ）でさらに刺激した後、直ぐに、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（２．５μＭ）を用いて処理した。細胞を７２時間インキュベートした後、上清をＩＬ−２についてＥＬＩＳＡで分析した。
【図４１】ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）による末梢血ＣＤ４＋Ｔ細胞中のＨＩＶ複製の抑制を示す。
【図４２Ａ】ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（「ＩＫ１４０００」）およびＲＳＫＡＫＮＰＬＹ（「ＩＫ９４０００」）は、ヒトＴリンパ球（ジャーカット）細胞株でのＩＬ−２分泌を増大させることを示す。
【図４２Ｂ】ｒｓｋａｋｎｐｌｙ（「ＩＫＤ９４０００」）は、ヒトＴリンパ球（ジャーカット）細胞株でのＩＬ−１２分泌を増大させるが、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（「ＩＫ１４０００」）は分泌を増大させないことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００７８】
哺乳動物の非受容体Ｓｒｃキナーゼファミリー（ＳＫＦ）のメンバーには、次の８種のキナーゼ：Ｓｒｃ、Ｆｙｎ、Ｙｅｓ、Ｆｇｒ、Ｌｙｎ、Ｈｃｋ、Ｌｃｋ、およびＢｌｋが含まれ、選択的Ｌｃｋ活性化剤は、特定されてこなかった（Ｂａｅ  Ｏ−Ｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２，３２（２１）：７２７８−７２８６）。
【００７９】
本発明は、１つまたは複数の実施形態では、本明細書に記載の式ＩのペプチドがＬｃｋの活性を刺激し得るという発見に関する。少なくともいくつかの実施形態では、本発明によるＬｃｋ活性化剤は、ＳＫＦメンバー中でＬｃｋのみの活性化を刺激し得る。Ｌｃｋ活性化剤、特に特異的Ｌｃｋ活性化剤に対する必要性は、加齢または非加齢関連の多様な状態に直接的に関連する。
【００８０】
従って、一態様では、本発明は、Ｌｃｋを活性化するためのペプチドを提供し、ペプチドは、式Ｉ：
Ｒ／Ｋ’−ｘ１−Ｒ／Ｋ−ｘ２−Ｒ／Ｋ−ｘ３−ｘ４−ｘ５−ｘ６−Ｒ／Ｋ”      式Ｉ
のＬｃｋ活性化ポリペプチド部分またはその反転配列を含み、式中、
各Ｒ／Ｋは、独立に、アルギニンまたはリシンアミノ酸残基であり；
Ｒ／Ｋ’は、アルギニンまたはリシンアミノ酸残基で、存在するまたは非存在であり；Ｒ／Ｋ”は、アルギニンまたはリシンアミノ酸残基で、存在するまたは非存在であり；ｘ１〜ｘ６はそれぞれ独立に、１個のアミノ酸であり；および
アミノ酸ｘ３〜ｘ６は、ひとまとめにして存在するまたは非存在であり、アミノ酸ｘ３〜ｘ６が非存在である場合、Ｒ／Ｋ”は非存在である。
【００８１】
本明細書で使用される場合、「活性化」という用語は、一般に、少なくとも１つの標的タンパク質の活性を高めることを意味する。キナーゼの特定の文脈では、この活性化は、少なくとも１つの標的基質または部位の増大したリン酸化に繋がる。この活性化は、限定されないが、プロテインキナーゼと、プロテインキナーゼの結合相手との間に複合体が形成される確率を増大させること、またはその標的に以前に結合したキナーゼの活性を増大させることを含む任意の手段により引き起こされ得る。このような活性化は、インビボあるいはインビトロで起こり得る。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「Ｌｃｋを活性化するためのペプチド」は、「Ｌｃｋ活性化ポリペプチド」または「Ｌｃｋ活性化剤」と同義に使用される。
【００８３】
Ｌｃｋは、ＬＣＫ癌原遺伝子、白血球Ｃ末端Ｓｒｃキナーゼ；リンパ球細胞特異的タンパク質チロシンキナーゼ；タンパク質ＹＴ１６；癌原遺伝子Ｌｃｋ；Ｔ細胞特異的タンパク質チロシンキナーゼ；およびｐ５６−ＬＣＫとも呼ばれる。
【００８４】
ヒトのＬｃｋの遺伝子およびタンパク質配列は、ＨＵＧＯ  Ｇｅｎｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＨＧＮＣ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｎａｍｅｓ．ｏｒｇ／）から得ることができる。ヒトのＳｒｃ（およびスプライスバリアント）のＨＧＮＣ番号は、ジェンバンク受入番号および遺伝子ＩＤと一緒に下表１に記載されている。
【表１】
2021523946.tif 000004
【００８５】
Ｌｃｋは、いくつかの活性を有する。Ｌｃｋは、その正の調節部位Ｔｙｒ３９４で自己リン酸化し、さらにＣＤ３受容体、ＣＥＡＣＡＭ１、ＺＡＰ−７０、ＳＬＰ−７６、ＩＬ−２受容体、レセプタータンパク質Ｃ、ＩＴＫ、ＰＬＣ、ＳＨＣ、ＲａｓＧＡＰ、Ｃｂｌ、Ｖａｖ１、およびＰＩ３Ｋを含む多数のタンパク質をリン酸化する。Ｌｃｋは、ＡＤＡＭ１５、ＣＤ２、ＣＤ４４、ＣＤ４、ＣＯＵＰ−ＴＦＩＩ、ＤＬＧ１、ＮＯＴＣＨ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＲＣ、ＵＮＣ１１９、ＳＹＫ、ＵＢＥ３Ａ、およびＺＡＰ７０と相互作用することが示されている。
【００８６】
本発明者らは、本明細書で記載の活性化剤は、Ｙ３９４でのＬｃｋのリン酸化、および増大したＩＬ−２産生を含むＬｃｋの活性を高めることができることを実証した。
【００８７】
従って、本明細書で使用される場合、「Ｌｃｋの活性」という用語は、Ｙ３９４でのＬｃｋのリン酸化、ＩＬ−２の産生、ＣＤ３受容体、ＣＥＡＣＡＭ１、ＺＡＰ−  ７０、ＳＬＰ−７６、ｔｈｅ  ＩＬ−２受容体、プロテインキナーゼＣ、ＩＴＫ、ＰＬＣ、ＳＨＣ、ＲａｓＧＡＰ、Ｃｂｌ、Ｖａｖ１、および／またはＰＩ３Ｋのリン酸化；ＡＤＡＭ１５、ＣＤ２、ＣＤ４４、ＣＤ４、ＣＯＵＰ−ＴＦＩＩ、ＤＬＧ１、ＮＯＴＣＨ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＲＣ、ＵＮＣ１１９、ＳＹＫ、ＵＢＥ３Ａ、ＺＡＰ７０との相互作用、および／またはＴＣＲのリン酸化を含む。
【００８８】
本発明により実施されるＬｃｋ活性化剤は、式Ｉのペプチド（Ｐ）単独からなり、または他の実施形態では、ペプチドと組み合わせてＬｃｋ活性を刺激するために、さらなる部分に結合したペプチドを含み得る。さらなる部分は、例えば、式ＩのペプチドのＬｃｋ刺激剤活性を強化し得る。他の実施形態では、ペプチド単独は、Ｌｃｋ活性を刺激せず、Ｌｃｋの活性は、ペプチドがさらなる部分に結合した場合に刺激されるのみである。通常、さらなる部分は、少なくとも１個の脂肪酸である。
【００８９】
少なくともいくつかの実施形態では、ペプチド（Ｐ）は、以下のアミノ酸配列：
Ｒ／Ｋ’−ｘ１−Ｒ／Ｋ−ｘ２−Ｒ／Ｋ−ｘ３−ｘ４−ｘ５−ｘ６−Ｒ／Ｋ”      式Ｉ
またはその反転配列を含み、式中、
各Ｒ／Ｋは、独立に、アルギニンまたはリシンアミノ酸残基であり；
Ｒ／Ｋ’は、アルギニンまたはリシンアミノ酸残基で、存在または非存在であり；Ｒ／Ｋ”は、アルギニンまたはリシンアミノ酸残基で、存在または非存在であり；ｘ１〜ｘ６はそれぞれ独立に、１個のアミノ酸であり；および
アミノ酸ｘ３〜ｘ６は、ひとまとめにして存在または非存在であり、アミノ酸ｘ３〜ｘ６が存在する場合、Ｒ／Ｋ”は非存在である。
【００９０】
通常、式Ｉのペプチド（Ｐ）では、
ｘ１、ｘ３およびｘ６は、独立に、アミノ酸から選択され、および
ｘ２、ｘ４、およびｘ５は、それぞれ独立に疎水性アミノ酸である。
【００９１】
少なくともいくつかの実施形態では、ｘ１、ｘ３およびｘ６は、親水性アミノ酸であり、ｘ２、ｘ４およびｘ５は、疎水性アミノ酸である。
【００９２】
他の実施形態では、ｘ３およびｘ６は、親水性アミノ酸であり、ｘ１、ｘ２、ｘ４およびｘ５は、疎水性アミノ酸である。
【００９３】
他の実施形態では、ｘ１およびｘ３は、親水性アミノ酸であり、ｘ２、ｘ４、ｘ５およびｘ６は、疎水性アミノ酸である。
【００９４】
さらにその他の実施形態では、アミノ酸ｘ１〜ｘ６は全て疎水性アミノ酸または少なくともアミノ酸ｘ１〜ｘ６の大部分は、疎水性アミノ酸である。
【００９５】
本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤のポリカチオン性ペプチドの親水性および疎水性アミノ酸は、遺伝子コードによりコードされ得るか、および／または合成アミノ酸を含み得る。通常、アミノ酸は、遺伝子コードによりコードされる。ポリカチオン性ペプチドの親水性アミノ酸は、極性、塩基性、および酸性アミノ酸から独立して選択できる。
【００９６】
極性アミノ酸は、例えば、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、アスパラギン（Ｎ）、およびグルタミン（Ｑ）アミノ酸残基からなる群より選択され得る。
【００９７】
塩基性アミノ酸は、例えば、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）およびオルニチンからなる群より選択され得る。
【００９８】
酸性アミノ酸は、例えば、グルタミン酸（Ｅ）およびアスパラギン酸（Ｄ）から選択され得る。
【００９９】
非極性疎水性アミノ酸は、例えば、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）およびグリシン（Ｇ）からなる群より選択され得る。通常、疎水性アミノ酸は、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）およびフェニルアラニン（Ｆ）から選択される。
【０１００】
通常、式Ｉのペプチド（Ｐ）中に、少なくとも１つのＲ／Ｋ’およびＲ／Ｋ”が存在する。
【０１０１】
最も典型的には、式Ｉのアミノ酸残基Ｒ／Ｋ’が存在する。
【０１０２】
少なくともいくつかの実施形態では、式Ｉのペプチド（Ｐ）は、下記からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む：
（ａ）Ｒ−ｘ１−Ｋ−ｘ２−Ｋ−ｘ３−ｘ４−ｘ５−ｘ６−Ｒ／Ｋ”；
（ｂ）Ｒ−ｘ１−Ｒ−ｘ２−Ｋ−ｘ３−ｘ４−ｘ５−ｘ６−Ｒ／Ｋ”；および
（ｃ）Ｋ−ｘ１−Ｋ−ｘ２−Ｋ−ｘ３−ｘ４−ｘ５−ｘ６−Ｒ／Ｋ”。
【０１０３】
通常、式Ｉａのペプチド（Ｐ）では、
ｘ１、ｘ３およびｘ６は、親水性アミノ酸であり、および
ｘ２、ｘ４、およびｘ５は、疎水性アミノ酸である。
【０１０４】
式Ｉａのペプチド（Ｐ）の少なくともいくつかの実施形態では、
ｘ１、ｘ３およびｘ６は、極性アミノ酸であり、および
ｘ２、ｘ４、およびｘ５は、非極性アミノ酸である。
【０１０５】
通常、式Ｉａのいくつかの実施形態では、
ｘ１はセリンであり；
ｘ２はアラニン、ロイシンまたはバリンであり；
ｘ３はアスパラギンであり；
ｘ４は、プロリン、バリンまたはアラニンであり；
ｘ５はロイシン、バリンまたはアラニンであり、および
ｘ６はチロシンである。
【０１０６】
最も典型的には、式Ｉａのいくつかの実施形態では、ｘ２はアラニン、ｘ４はプロリン、およびｘ５はロイシンである。
【０１０７】
通常、式Ｉｂのペプチド（Ｐ）では、
ｘ３およびｘ６は、親水性アミノ酸であり、および
ｘ１、ｘ２、ｘ４、およびｘ５は、疎水性アミノ酸である。
【０１０８】
式Ｉｂのペプチド（Ｐ）の少なくともいくつかの実施形態では、
ｘ３およびｘ６は、極性アミノ酸であり、および
ｘ１、ｘ２、ｘ４、およびｘ５は、非極性アミノ酸である。
【０１０９】
通常、式Ｉｂのいくつかの実施形態では、
ｘ１はアラニンまたはグルタミン酸であり；
ｘ２はアラニン、ロイシンまたはバリンであり；
ｘ３はアスパラギンであり；
ｘ４は、プロリン、バリンまたはアラニンであり；
ｘ５はロイシン、バリンまたはアラニンであり、および
ｘ６はチロシンである。
【０１１０】
最も典型的には、式Ｉｂのいくつかの実施形態では、ｘ２はアラニン、ｘ４はプロリン、およびｘ５はロイシンである。
【０１１１】
あるいは、式Ｉｂのペプチド（Ｐ）の少なくともいくつかの実施形態では、
ｘ１、ｘ３およびｘ６は、親水性アミノ酸であり、および
ｘ２、ｘ４、およびｘ５は、疎水性アミノ酸である。
【０１１２】
通常、式Ｉｂのこのような実施形態では、
ｘ１はセリンであり；
ｘ２はアラニン、ロイシン、またはバリンであり；
ｘ３はアスパラギンであり；
ｘ４は、プロリン、バリンまたはアラニンであり；
ｘ５はロイシン、バリンまたはアラニンであり、および
ｘ６はチロシンである。
【０１１３】
最も典型的には、式Ｉｂのこのような実施形態では、ｘ２はアラニン、ｘ４はプロリン、およびｘ５はロイシンである。
【０１１４】
式Ｉｃのペプチド（Ｐ）の少なくともいくつかの実施形態では、
ｘ１およびｘ３は、親水性アミノ酸であり、および
ｘ２、ｘ４、ｘ５およびｘ６は、疎水性アミノ酸である。
【０１１５】
通常、式Ｉｃのいくつかの実施形態では、
ｘ１はグルタミン酸、バリンまたはアラニンであり；
ｘ２はアラニン、ロイシンまたはバリンであり；
ｘ３はアスパラギンであり；
ｘ４は、プロリン、バリンまたはアラニンであり；
ｘ５はロイシン、バリンまたはアラニンであり、および
ｘ６はチロシンである。
【０１１６】
さらなる実施形態では、式Ｉのペプチド（Ｐ）は、次記を含み得る：
ｘ１はバリン、アラニン、グルタミン酸、およびセリンから独立に選択され；
ｘ２はバリン、アラニン、およびロイシンから独立に選択され；
ｘ３はバリン、アラニン、およびアスパラギンから独立に選択され；
ｘ４はバリン、アラニン、およびプロリンから独立に選択され；
ｘ５はバリン、アラニン、およびロイシンから独立に選択され；
ｘ６はバリン、アラニン、フェニルアラニンおよびチロシンから独立に選択される。
【０１１７】
少なくともいくつかの実施形態では、式Ｉのペプチド（Ｐ）は、アミノ酸配列Ｒ／Ｋ’−Ｓ−Ｒ／Ｋ−Ａ−Ｒ／Ｋ−Ｎ−Ｐ−Ｌ−Ｙ−Ｒ／Ｋ”（例えば、Ｒ／Ｋ−ＳＫＡＫＮＰＬＹ−Ｒ／Ｋ”）、またはその反転配列を含む。
【０１１８】
他の実施形態では、ペプチド（Ｐ）は、改変またはバリアント配列Ｒ／Ｋ’−ｘ１−Ｒ／Ｋ−ｘ２−Ｒ／Ｋ−ｘ３−ｘ４−ｘ５−ｘ６−Ｒ／Ｋ”を含む、またはそれからなり、式中、アミノ酸ｘ１〜ｘ６は、ペプチドＲ／Ｋ’−Ｓ−Ｒ／Ｋ−Ａ−Ｒ／Ｋ−Ｎ−Ｐ−Ｌ−Ｙ−Ｒ／Ｋ”の対応するアミノ酸と、３０％を超える、より一般的には５０％以上、より一般的には６５％を超える、および最も一般的には８０％を超える全体アミノ酸配列同一性を有する、または改変またはバリアント配列の反転配列を有する。このようなペプチドの例としては、ＫＥＫＬＫＮＰＬＦＫおよびＲＡＫＡＫＮＰＬＦが挙げられる。
【０１１９】
さらなる実施形態では、式Ｒ／Ｋ’−ｘ１−Ｒ／Ｋ−ｘ２−Ｒ／Ｋ−ｘ３−ｘ４−ｘ５−ｘ６−Ｒ／Ｋ”のペプチド（Ｐ）のアミノ酸ｘ１〜ｘ６は、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、およびグリシン（Ｇ）残基からなる群より独立に選択され得る。少なくともいくつかのこのような実施形態では、ペプチドは、位置ｘ１に、セリン（Ｓ）またはトレオニン（Ｔ）（これらの両方は、極性アミノ酸である）を有さない。通常、アミノ酸ｘ１〜ｘ６のそれぞれは、独立に非極性アミノ酸であり、最も典型的には、アラニン、バリンおよびセリンから選択される。通常、この実施形態では、アミノ酸ｘ１〜ｘ６のそれぞれは、独立に、アラニン（Ａ）およびバリン（Ｖ）から選択される。このようなペプチドの例としては、Ｒ／Ｋ’−ＡＫＡＫＡＡＡＡ−Ｒ／Ｋ”およびＲ／Ｋ’−ＶＫＶＫＶＶＶＶ−Ｒ／Ｋ”が挙げられる。
【０１２０】
通常、式Ｉのペプチドのアミノ酸Ｒ／Ｋ”は、存在しない。このようなペプチドの例としては、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹが挙げられる。
【０１２１】
少なくともいくつかの実施形態では、アミノ酸ｘ３〜ｘ６およびＲ／Ｋ”は存在しない。
【０１２２】
少なくともいくつかの実施形態では、アミノ酸ｘ３〜ｘ６は存在し、Ｒ／Ｋ”は存在しない。
【０１２３】
通常、Ｒ／Ｋ’は存在する。最も典型的には、Ｒ／Ｋ’はアルギニンである。
【０１２４】
通常、各Ｒ／Ｋは、それぞれリシンアミノ酸である。
【０１２５】
少なくともいくつかの実施形態では、アミノ酸ｘ１〜ｘ６は疎水性アミノ酸である。
【０１２６】
特に好ましい実施形態では、アミノ酸ｘ１〜ｘ６は同じである。
【０１２７】
さらに別の実施形態では、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤の式Ｉのペプチドは以下のペプチド：
Ｒ／Ｋ’−ｘ１−Ｒ／Ｋ−ｘ２−Ｒ／Ｋ      式Ｉ’
またはその反転配列を含み、式中、
Ｒ／Ｋ’は、アルギニンまたはリシンアミノ酸残基であり；
各Ｒ／Ｋは、独立に、アルギニンまたはリシンアミノ酸残基であり；および
ｘ１およびｘ２は、上述の式Ｉおよびその実施形態と同様に、それぞれ独立に１個のアミノ酸である。
【０１２８】
少なくともいくつかの実施形態では、式Ｉまたは式Ｉ’のペプチドは、Ｒ−ｘ１−Ｋ−ｘ２−Ｋを含む。
【０１２９】
特に好ましい実施形態では、式ＩまたはＩａのペプチドのアミノ酸ｘ１およびｘ２はそれぞれ独立に、疎水性アミノ酸（例えば、バリン（Ｖ）またはアラニン（Ａ））であり、通常、同じである。
【０１３０】
従って、上記から、ペプチド（Ｐ）は、式Ｉまたは式Ｉ’のペプチドを含む、またはそれからなり得る。従って、式ＩまたはＩ’のペプチドを含むペプチドは、式ＩまたはＩ’のペプチドと近接している１個または複数の追加のアミノ酸も同様に含むことが理解されよう。例えば、ペプチドは、ペプチドの片末端または両末端（例えば、Ｎ末端および／またはＣ末端）にそれぞれ結合した１個または複数の独立に選択されたアミノ酸を含み得る。
【０１３１】
本発明による式Ｉのペプチド（Ｐ）は、通常、最大約４０アミノ酸長さを有する。少なくともいくつかの実施形態では、ペプチド（Ｐ）は、少なくとも５アミノ酸長さであり得る（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０アミノ酸長さ）。少なくともいくつかの実施形態では、ペプチドは、約２５アミノ酸以下、またはより一般的には約２０、１５、１４、１３、１２、１１、または１０アミノ酸以下の長さを有する。同様に理解されるように、５〜最大で、例えば、４０アミノ酸またはそれを超えるアミノ酸の全ての長さの範囲も明示的に本明細書のために提供される。特に好ましい実施形態では、ペプチド（Ｐ）は、少なくとも９アミノ酸長さを有する。
【０１３２】
本明細書で使用される場合、用語の「反転配列」は、アミノ酸配列が逆転していることを意味する。例えば、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹの反転配列は、ＹＬＰＮＫＡＫＳＲである。従って、反転配列のアミノ酸配列は、逆順であり、それにより、例えば、元の配列のＮ末端は、反転配列のＣ末端になり、元の配列のＣ末端は、反転配列のＮ末端になる。通常、本発明の実施形態により利用されるペプチドは、少なくともそれらのカルボキシ末端でアミド化などを行って、タンパク分解に対して保護する。しかし、タンパク分解に対し保護するための任意の好適なＮまたはＣ末端修飾も採用できる（例えば、メチル化）。
【０１３３】
本明細書で使用される場合、用語の「アミノ酸配列」は、アミノ酸からなり、通常、アミド結合で連結された分子を意味する。この用語は、配列の「プロドラッグ」、配列の荷電および非荷電型、配列の薬学的に許容可能な塩、および本開示の方法および使用で機能活性を保持している、配列の骨格および／または末端に対する改変を含む配列に対する任意の他のバリアント、誘導体または改変体を含む。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、用語の「配列」は、分子を形成できるアミノ酸の数の最大長さを暗黙で指定するものと解釈されるべきではない。いくつかの実施形態では、最大長さは１０アミノ酸である。いくつかの実施形態では、最大長さは９アミノ酸である。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、配列は、単離または精製配列である。
【０１３６】
天然または組換え技術により生成された配列の「単離」および「精製」の方法は、当技術分野において、例えば、Ｃ−Ｈ  Ｌｅｅ，Ａ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｏｕｔｌｉｎｅ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ；２０１７，Ｍａｒｃｈ；３２（１）：１８、により既知である。さらに、用語の「単離」または「精製」は、合成およびその他の人為的に作製された配列を含む。配列の合成方法は、当技術分野において既知である。通常、配列は、１つのアミノ酸のカルボキシル基の別のアミノ基への縮合反応により化学的に合成される。配列の化学合成は、溶液相または固相技術を用いて実施できる。合成技術は、非天然アミノ酸配列、骨格修飾およびＤ−異性体を組み込んだ配列の作製を可能にする。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、本発明の配列は改変される。いくつかの実施形態では、改変は、配列の薬理学的特性を変える改変であり得る。いくつかの実施形態では、改変は、本発明の組成物または配列の半減期を延長する。いくつかの実施形態では、改変は、配列（および／または本発明の組成物）の生物活性を高め得る。いくつかの実施形態では、改変は、本発明の配列または組成物の選択性を高める改変であり得る。
【０１３８】
一実施形態では、改質は保護基の付加である。保護基は、Ｎ末端保護基、Ｃ末端保護基または側鎖保護基であり得る。本発明の配列は、これらの保護基の内の１個または複数を有し得る。当業者は、アミノ酸をこれらの保護基と反応させるための好適な技術を知っている。これらの基は、当該技術分野において既知の作製方法により付加できる。基は配列上に残してもよく、または使用もしくは投与前に除去してもよい。保護基は、合成中に付加してもよい。
【０１３９】
本発明者らは、Ｌｃｋ活性化ペプチドのアミド化が、意外にも、Ｌｃｋ活性レベルを高めることを実証した。従って、一実施形態では、本発明は、最遠位の脂肪酸がアミド化されている、本明細書に記載のペプチドを提供する。
【０１４０】
本明細書でポリペプチド配列の文脈で使用される場合、「ＮＨ２」は、ポリペプチドがアミド化されていることを示す。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、配列は、そのＣ末端でアミド化されている。アミド化は、逐次的内部および端部タンパク質分解によるグリシン延長基質のＮ−酸化切断のプロセスを意味する。アミド化配列をインビトロで作製する方法は、例えば、酵素的アミド化；組換えで作製された配列およびタンパク質のＣ末端の化学修飾；固相配列合成でのアミド樹脂の使用；アンモニアの存在下でカルボキシペプチダーゼの使用；および配列のＣ末端のメチルエステルへの変換、および低温でのアンモニアの付加などのように、当技術分野において既知である。好適な技術の開示の例としては、ＤＪ  Ｍｅｒｋｌｅｒ，Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ａｍｉｄａｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｍｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｙｃｉｎｅ−ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｍｉｄｅ  ｔｏ  ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ；Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９４，Ｊｕｎｅ；１６（６）：４５０−６およびＶ  Ｃｅｒｏｖｓｋｙ  ａｎｄ  Ｍ−Ｒ  Ｋｕｌａ  Ｃ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ａｍｉｄａｔｉｏｎ  Ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｂｙ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｆｌａｖｅｄｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ａｍｉｄａｓｅ；Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，１９９８，Ａｕｇｕｓｔ；３７（１３−１４）：１８８５、が挙げられる。
【０１４２】
Ｃ末端のアミド化により、Ｃ末端が非電荷になり、そのため、改変配列は、より厳密に未変性タンパク質を模倣する。これは、配列の細胞中に入るための高められた能力；配列のインビボでの代謝安定性の改善；アミノペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ、およびシンテターゼによる配列のインビボ酵素分解の低減；および配列の貯蔵寿命の改善、を含む一連の利点をもたらす。
【０１４３】
本明細書に記載のように、本発明者らは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ポリペプチドがＬおよびＤアミノ酸を含むことができ、生物活性を有することを明らかにした。従って、一実施形態では、本発明は、Ｌｃｋ活性化剤を本明細書に記載のアミノ酸配列がＬ−アルギニン残基を含むとして記述する。別の実施形態では、本発明は、Ｌｃｋ活性化剤を本明細書に記載のアミノ酸配列がＤ−アルギニン残基を含むとして記述する。
【０１４４】
従来技術で公知なように、アルファアミノ酸は、α位置にキラル炭素を含む。従って、全てのアルファアミノ酸は、グリシンを除いて、２つの鏡像異性体のＬ−またはＤ−異性体のいずれかとして存在できる。一般に、Ｌ−アミノ酸のみが、哺乳動物細胞中で製造され、タンパク質中に組み込まれる。Ｄ−アミノ酸は、人為的に合成され得るか、または細菌タンパク質中で見つけられることがある。ＬおよびＤ規則は、アミノ酸の立体化学に直接言及するためには使用されず、むしろ、それはアミノ酸配置の参照に使用され、およびアミノ酸それ自体の光学活性に言及しないで、むしろ、そのアミノ酸を合成し得る元の原料のグリセルアルデヒドの異性体の光学活性に言及する（Ｄ−グリセルアルデヒドは右旋性である；Ｌ−グリセルアルデヒドは左旋性である）。
【０１４５】
以下でさらに記載のように、ペプチドのアミノ酸は、Ｌ−アミノ酸および／またはＤ−アミノ酸であってよい。従って、反転配列のアミノ酸は、全てＬ−アミノ酸または全てＤ−アミノ酸であってよく、用語の「反転配列」は、レトロインベルソペプチドに拡張され、全てのアミノ酸は、Ｄ−アミノ酸であるが、これに限定されない。
【０１４６】
本明細書で言及される配列は、配列識別番号（配列番号）により表される。配列識別子の一覧を表２に示す。
【表２】
2021523946.tif 000005
2021523946.tif 000006
＊；小文字は、右旋性（ｄｅｘｔｒｏｒｏｔａｔｏｒｙ）（「右旋性（ｄｅｘｔｒｏ）」）アミノ酸を示す；２Ａｄｏｄは、２−アミノドデカン酸（例えば、（Ｓ）−２−アミノドデカン酸）を示す；１２Ａｄｏｄは、１２−アミノドデカン酸（例えば、（Ｓ）−１２−アミノドデカン酸）を示す；ＮＨ２はアミド化を示す；ＯＨは、非アミド化を示す。
【０１４７】
少なくともいくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤のペプチド（Ｐ）は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ、ＲＳＲＡＲＮＰＬＹ、ＲＡＲＡＫＮＰＬＹ、ＫＥＫＬＫＮＰＬＦ、ＫＥＫＬＫＮＰＬＦＫ、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶ、ＲＡＫＡＫＡＡＡＡ、ＲＡＫＡＫＮＰＬＦ、ＲＳＫＡＫ、ＲＡＫＡＫおよびＲＶＫＶＫからなる群より選択されるペプチド活性成分を含み得る、またはそれからなり得る。
【０１４８】
他の実施形態では、ペプチド（Ｐ）は、反転配列ＹＬＰＮＫＡＫＳＲ、ＲＹＬＰＮＫＡＫＳＲ、ＹＬＰＮＲＡＲＳＲ、ＹＬＰＮＫＡＲＡＲ、ＦＬＰＮＫＬＫＥＫ、ＫＦＬＰＮＫＬＫＥＫ、ＶＶＶＶＫＶＫＶＲ、ＡＡＡＡＫＡＫＡＲ、ＦＬＰＮＫＡＫＡＲ、ＫＡＫＳＲ、ＫＡＫＡＲおよびＫＶＫＶＲからなる群から選択され得る。
【０１４９】
最も典型的には、ペプチドは、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ、ＹＬＰＮＫＡＫＳＲ、ＲＳＫＡＫまたはＫＡＫＳＲを含む、またはそれらからなる。
【０１５０】
本発明者らは、意外にも、少なくとも１個の脂肪酸の、本明細書に記載のペプチドへの結合が、Ｌｃｋを活性化するための増大した能力をペプチドに付与することを実証した。
【０１５１】
従って、いくつかの実施形態では、Ｌｃｋを活性化するためのペプチドは、１個または複数の結合脂肪酸部分を含む。いくつかの実施形態では、Ｌｃｋの活性化剤は、４つの結合脂肪酸部分を含む。この結果は意外であり、その理由は、それら単独では、１〜４個の結合脂肪酸を含む脂肪酸部分はＬｃｋを活性化しないためである。いくつかの実施形態では、結合脂肪酸部分は、少なくとも１つのアミノドデカン酸部分を含む。いくつかの実施形態では、全ての脂肪酸部分は、アミノドデカン酸である。
【０１５２】
好ましい実施形態では、本発明は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４、ｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ−（２Ａｄｏｄ）４、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶＲ−（２Ａｄｏｄ）４、およびｒｖｋｖｋｖｖｖｖｒ−（２Ａｄｏｄ）４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドを提供する。
【０１５３】
別の好ましい実施形態では、本発明は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４、ｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ−（２Ａｄｏｄ）４、ＲＶＫＶＫＶＶＶＶＲ−（２Ａｄｏｄ）４、およびｒｖｋｖｋｖｖｖｖｒ−（２Ａｄｏｄ）４からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドを提供する。
【０１５４】
本明細書に記載の式Ｉのペプチドに結合され得る化合物の例としては、脂質、直鎖または分岐鎖脂肪酸（例えば、ステアリン酸などの８〜１８個の炭素原子の脂肪酸鎖長を有する）およびポリアミドが挙げられる。
【０１５５】
別の好ましい実施形態では、２個以上の脂肪酸が式Ｉのポリペプチド部分のＣ末端に結合される。例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個またはそれを超える脂肪酸が式Ｉのポリペプチド部分に結合される。
【０１５６】
少なくとも１個の脂肪酸は、１個の脂肪酸鎖のアミノ基置換基と、次の脂肪酸の末端カルボキシル基との間のそれぞれのアミド結合を連続的に形成することにより、一緒に脂肪酸を結合して、それにより結合脂肪酸を得ることによりもたらされ得る。
【０１５７】
従って、脂肪酸のαまたはβ炭素上のアミノ基（ＮＨ２）置換基を有する脂肪酸は、特に結合に好適する。
【０１５８】
好ましい一実施形態では、本発明は、少なくとも４個の脂肪酸が、活性化剤のＣ末端に結合される、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを提供する。
【０１５９】
別の好ましい実施形態では、本発明は、最遠位の脂肪酸がアミド化されている、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを提供する。
【０１６０】
脂肪酸の結合は、直鎖および／または分岐であり得る。一実施形態では、本発明は、少なくとも４個の脂肪酸の結合が直鎖である、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを提供する。別の実施形態では、本発明は、少なくとも４個の脂肪酸の結合が分岐である、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを提供する。
【０１６１】
上記で考察したように、脂肪酸部分は、任意の位置でＬｃｋを活性化するためのペプチドに結合して、リポペプチドを形成できる。しかし、好ましい実施形態では、脂肪酸部分は、Ｌｃｋを活性化するためのペプチドのＣ末端に結合される。アミノ酸配列に結合した脂肪酸部分は、分岐脂肪酸または直鎖脂肪酸であり得る。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、少なくとも１、２、３または４つの脂肪酸部分は直鎖である。例えば、少なくとも１個の脂肪酸の結合が直鎖である場合、一実施形態では、少なくとも１個の脂肪酸は、Ｌｃｋを活性化するためのペプチドのＣ末端にアミド結合を介して結合する。
【０１６３】
本明細書で使用される場合、「直鎖」という用語は、脂肪酸の炭化水素鎖がＬｃｋ活性化するためのペプチドの骨格中に組み込まれていることを意味する。例えば、脂肪酸は、オメガ炭素の位置にアミノ基置換基を含むことができる。一実施形態では、１２アミノラウリン脂肪酸アミド（例えば、１２−アミノドデカン酸；「Ａｄｏｄ」）が使用され、従って、アミド結合は、炭素１２の位置のアミノ置換基と別の基（例えば、カルボキシル基）との間で形成できる。
【０１６４】
従って、別の実施形態では、少なくとも１個の脂肪酸の結合が直鎖である場合、第１の脂肪酸は、アミド結合を介して、Ｌｃｋを活性化するためのペプチドのＣ末端に結合し、さらなる脂肪酸は、脂肪酸の末端カルボキシル基とさらなる脂肪酸のアミノ基置換基（例えば、アミノドデカン酸）との間でアミド結合を形成することにより脂肪酸に結合する。別の実施形態では、第３の脂肪酸は、さらなる脂肪酸の末端カルボキシル基と第３の脂肪酸のアミノ基置換基との間でアミド結合を形成することによりさらなる酸に結合する。別の実施形態では、第４の脂肪酸は、第３の脂肪酸の末端カルボキシル基と第４の脂肪酸のアミノ基置換基との間でアミド結合を形成することにより第３の酸に結合する。
【０１６５】
任意の数の脂肪酸を、脂肪酸モノマーから、１個の脂肪酸の末端カルボキシル基と、Ｌｃｋを活性化するためのペプチドに結合されるべき別の脂肪酸のアミノ基置換基との間でアミド結合の形成により脂肪酸の直鎖ポリマー鎖を形成することにより、Ｌｃｋを活性化するためのペプチドの末端に結合できる。
【０１６６】
他の実施形態では、脂肪酸の炭化水素鎖は、「直鎖」ではなく、例えば、脂肪酸の炭化水素鎖の全てまたは一部は、Ｌｃｋを活性化するためのペプチドの骨格の一部ではない（例えば、Ｌｃｋを活性酸素ペプチドの骨格に「垂直」である）。例えば、脂肪酸は、脂肪酸のαまたはβ炭素の位置にアミノ基置換基を含むことができる。例えば、一実施形態では、２−アミノラウリン脂肪酸アミド（例えば、２−アミノドデカン酸；「Ａｄｏｄ」）が使用され、従って、アミド結合は、炭素２の位置のアミノ置換基と別の基（例えば、カルボキシル基）との間で形成できる。
【０１６７】
説明を容易にするために、ポリアミド部分は「ｎＣｙ」と呼ばれ、ｎはポリアミド部分の反復単位の数であり、Ｃｙは各反復単位中のＲ基の炭素原子数であり、各Ｒ基は、飽和、直鎖炭素鎖である。従って、本実施例では、「４Ｃ１０」は、４反復単位（ｎ＝４）を有し、各反復単位のＲ基は１０炭素長さの飽和炭素側鎖であるスキーム１に示すポリアミド部分（例えば、４個の２−アミノドデカン酸）を意味すると解釈されるべきである。
【０１６８】
本明細書で使用される場合、Ａｄｏｄという用語は、アミノドデカン酸を意味し、および「２Ａｄｏｄ」は、２−アミノドデカンを意味し、；「１２Ａｄｏｄ」は、１２−アミノドデカン酸を意味し、等々。２個以上の脂肪酸が結合される場合、結合した脂肪酸の数は、下付き文字で表記される。例えば、「（２Ａｄｏｄ）２」は、２個の２−アミノドデカン酸を意味する。従って、本明細書に記載の単一単位のポリアミド部分は、１個の２−アミノドデカン酸残基に対応する（本明細書では、「（２Ａｄｏｄ）１」とも表現される）。本明細書に記載の２単位のポリアミド部分は、２個の２−アミノドデカン酸残基に対応する（本明細書では、「（２Ａｄｏｄ）２」とも表現される）。本明細書に記載の３単位のポリアミド部分は、３個の２−アミノドデカン酸残基に対応する（本明細書では、「（２Ａｄｏｄ）３」とも表現される）。本明細書に記載の４単位のポリアミド部分は、４個の２−アミノドデカン酸残基に対応する（本明細書では、「（２Ａｄｏｄ）４」とも表現される）。
【０１６９】
他の実施形態では、脂肪酸は、脂肪酸の別の炭素の位置にアミノ基置換基を含むことができる。
【０１７０】
アミノ脂肪酸が１つのキラル中心を有するキラルである他の実施形態では、２つの可能な鏡像異性体（例えば、ＲおよびＳ）が存在する。従って、一実施形態では、本発明のＬｃｋを活性化するためのペプチドは、アミノ脂肪酸の１つの鏡像異性体またはもう一方の鏡像異性体、または１個または複数のアミノ脂肪酸のもう一つの鏡像異性体を含むことができる。
【０１７１】
従って、本発明は、直鎖および／または非直鎖（例えば、分岐方式）で結合した脂肪酸を含むＬｃｋを活性化するためのペプチドを提供する。
【０１７２】
本明細書で使用される場合、「分岐」という用語は、Ｌｃｋを活性化するためのペプチドの骨格に「直鎖」または「垂直」にならないように、アミノ酸残基に結合した、または最初の脂肪酸に結合した２個以上の脂肪酸を含む。
【０１７３】
一実施形態では、少なくとも１個の脂肪酸は、１３〜２１個の炭素原子を含む長鎖脂肪酸、６〜１２個の炭素原子を含む中鎖脂肪酸、または６個未満の炭素原子を有する短鎖脂肪酸である。好ましい実施形態では、脂肪酸は、約６〜１６炭素原子長さを含む。例えば、脂肪酸は、６〜１６個の炭素、８〜１４個の炭素または１０〜１２個の炭素を含む。
【０１７４】
一実施形態では、脂肪酸は、６個の炭素を含み、カプロン酸またはヘキサン酸である。例えば、一実施形態では、脂肪酸はアミノヘキサン酸である。
【０１７５】
別の実施形態では、脂肪酸は、８個の炭素を含み、カプリル酸またはオクタン酸である。例えば、一実施形態では、脂肪酸はアミノオクタン酸である。
【０１７６】
別の実施形態では、脂肪酸は、１０個の炭素を含み、カプリン酸またはデカン酸である。例えば、一実施形態では、脂肪酸はアミノデカン酸である。
【０１７７】
別の実施形態では、脂肪酸は、１２個の炭素を含み、ラウリン酸またはドデカン酸である。例えば、一実施形態では、脂肪酸はアミノドデカン酸（例えば、（Ｓ）−２−アミノドデカン酸）である。脂肪酸は、飽和であっても、または１個または複数の二重結合を有する不飽和であってもよい。好ましくは、脂肪酸は飽和している。
【０１７８】
一実施形態では、本発明は、Ｌｃｋを活性化するためのペプチドを提供し、このペプチドはさらにＬｃｋ活性化ポリペプチド部分のＮ末端またはＣ末端に結合した化合物を含み、この化合物は、少なくとも１個の脂肪酸である。
【０１７９】
一実施形態では、本発明は、少なくとも４個の脂肪酸が、Ｌｃｋ活性化ポリペプチド部分のＣ末端に結合される、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを提供する。
【０１８０】
一実施形態では、本発明は、２個以上の脂肪酸の結合が直鎖である、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを提供する。
【０１８１】
一実施形態では、本発明は、２個以上の脂肪酸の結合が分岐である、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを提供する。
【０１８２】
一実施形態では、本発明は、脂肪酸が飽和している、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを提供する。
【０１８３】
一実施形態では、本発明は、脂肪酸が、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸（デカン酸）、およびラウリン酸（ドデカン酸）からなる群より選択される、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを提供する。
【０１８４】
一実施形態では、本発明は、最遠位の脂肪酸がアミド化されている、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを提供する。
【０１８５】
一実施形態では、本発明は、アミノ酸配列が、Ｌｃｋ活性化ポリペプチド部分のＣ末端でアミド化されている、本明細書に記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドを提供する。
【０１８６】
特に好ましい実施形態では、化合物は、飽和または不飽和脂肪族化合物、脂肪酸、ポリアミドまたは最大２０原子またはそれ以上の長さの、１個または複数の側鎖を有してもよい他の骨格を含み得る。通常、骨格鎖は、約６〜２０原子（すなわち、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０原子）の範囲の長さを有し、１個または複数のヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏ、ＳおよびＰから独立に選択される）を含み得る。
分岐の場合、骨格鎖は通常、１〜５側鎖（例えば、１、２、３、４または５側鎖）を有し、これらのそれぞれは、独立に最大１８原子長さ（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８原子長さ）である。
通常、各側鎖は、独立に、飽和または不飽和脂肪族炭素鎖（例えば、Ｃ１〜Ｃ１８鎖）である。最も典型的には、促進剤部分は、脂肪族またはポリアミド骨格を有する。
【０１８７】
少なくともいくつかの実施形態では、化合物は、３〜５反復単位を有するポリアミドであり、各反復単位は独立に、３〜９原子長さ（すなわち、３、４、５、６、７、８、９原子の長さ）であり、側鎖がないか、または単一側鎖を有する。通常、それぞれの反復単位は３〜６原子長さであり、より典型的には、３〜６、３〜５、または３〜４原子長さであり、最も典型的には、３原子長さである。各反復単位の側鎖の長さは通常、独立に４〜１８炭素原子長さ（すなわち、Ｃ４〜Ｃ１８）、例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８炭素原子であり、より一般的には、８〜１８、８〜１６、８〜１４、８〜１２または８〜１０炭素原子長さである。各反復単位の側鎖は、通常、独立に、反復単位のαまたはβ炭素原子から伸びる。
【０１８８】
通常、本発明の実施形態により結合されるべき化合物は、以下の式ＩＩ：
【化２】
2021523946.tif 000007
式ＩＩ
の化合物を含み、式中、
ｎは、化合物のモノマー単位の数で、１〜５の整数であり、
各ｍは、独立に、０〜１８の整数であり、および
各Ｒ基は、独立にＨまたはＣ１〜Ｃ１８の側鎖である。
【０１８９】
通常、モノマー単位のＲ側鎖の長さは、そのモノマー単位のｍの値にほぼ反比例する。通常、各Ｒは、１８−ｍ炭素原子長さであり、式中、ｍは、０〜１７の値を有する。例えば、ｍが０の場合、ＲはＣ１８側鎖であり、ｍが２の場合、ＲはＣ１６側鎖であり、ｍが４の場合、ＲはＣ１４側鎖であり、等々。
【０１９０】
通常、式ＩＩの化合物では、ｎは２〜５であり、各ｍは独立に０、１、２または３であり；各Ｒは独立に脂肪族炭素鎖である。
【０１９１】
通常、各Ｒは独立に、４〜１８炭素原子長さの炭素鎖である。従って、少なくともいくつかの実施形態では、本発明によるＬｃｋ活性化剤は、以下の式ＩＩａ：
【化３】
2021523946.tif 000008
式ＩＩａ
のポリアミド部分（ＰＭ）であり、式中、
ｎは、化合物のモノマー単位の数で、３〜５の整数であり、
各ｍは独立に、０、１、２または３であり、および
各Ｒ基は独立に、４〜１８炭素原子長さの炭素鎖である。
【０１９２】
通常、式ＩＩまたは式ＩＩａの化合物では、各ｍは独立に、０、１または２である。より典型的には、ｍは０または１である。最も典型的には、ｍは０である。
【０１９３】
当然のことながら、本明細書に記載の式ＩＩの化合物のモノマー単位は、化合物の１個または複数の他のモノマー単位とは異なり得る。
【０１９４】
式ＩＩまたは式ＩＩａの化合物／ポリアミド部分は、例えば、式から分かるようにアミノ基置換基を有し、Ｒとｍは上記で記載の通りである、式Ｒ−ＣＨＮＨ２−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＨの脂肪酸を、１個の脂肪酸鎖のアミノ基置換基と、次の脂肪酸の末端カルボキシル基との間のそれぞれのアミド結合を連続的に形成することにより、一緒に脂肪酸を結合して、それにより、ポリアミド骨格を得て、そこから各脂肪酸のＲ基が側鎖として伸びることによりもたらされ得る。即ち、得られたポリアミド部分の各モノマー単位のＲ基側鎖は、それぞれの脂肪酸からポリアミド部分の骨格が形成される際のその脂肪酸の残部である。
【０１９５】
脂肪酸のαまたはβ炭素上のアミノ基（ＮＨ２）置換基を有する脂肪酸は、ポリアミド部分（ＰＭ）の合成での使用に特に好適し、それにより、得られたポリアミド部分は、αまたはβポリアミド骨格を有する。最も典型的には、式ＩＩの化合物では、各モノマー単位のｍは０である。従って、ポリアミド部分は、それぞれの脂肪酸の炭素原子がアミノ基で置換されている脂肪酸から形成できる。
【０１９６】
本発明のいくつかの実施形態では、各脂肪酸部分は、６〜１６個の炭素、８〜１４個の炭素または１０〜１２個の炭素を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの脂肪酸部分は、飽和、不飽和または多価不飽和である。好ましい実施形態では、１、２、３または４個の脂肪酸は飽和している。いくつかの実施形態では、脂肪酸は、カプロン酸（ヘキサン酸）、カプリル酸（オクタン酸）、カプリン酸（デカン酸）、およびラウリン酸（ドデカン酸）からなる群より選択される。好ましい実施形態では、脂肪酸は、ドデカン酸（アミノドデカン酸／ａｄｏｄ）である。
【０１９７】
本発明による方法で利用されるＬｃｋ活性化剤のいくつかの実施形態では、式ＩＩの化合物の各Ｒ基の炭素鎖は、独立に直鎖または分岐鎖であり得、および飽和または１個または複数の二重結合を有する不飽和であり得る。通常、各Ｒ基は、飽和炭素鎖である。
【０１９８】
通常、式ＩＩの化合物の各Ｒ基は独立に、８〜１８、８〜１６、より好ましくは８〜１４、および最も好ましくは８〜１２炭素原子長さの炭素鎖である。最も典型的には、各Ｒ基は独立に、８〜１０炭素原子長さの炭素鎖である。
【０１９９】
従って、例えば、２−アミノカプリンおよびラウリン脂肪酸（それぞれ、１０および１２炭素原子長さである）は、本明細書に記載の式ＩＩの化合物の提供での使用のために特に好適する。当然のことながら、カプリン酸脂肪酸の場合には、得られた式ＩＩの化合物のモノマー単位のＲ基は、カプリン脂肪酸鎖の炭素１および２（α炭素）が化合物の骨格中に組み込まれることを考慮すると、８炭素原子長さである。同様に、ラウリン脂肪酸の場合には、得られた化合物のモノマー単位（ｎ＝１）のＲ基は、１０炭素原子長さである。
【０２００】
式ＩＩの化合物のＲ基の炭素鎖の長さは、独立に、化合物の１つのモノマー単位から次へと次々変わり得る。通常、式ＩＩの化合物のＲ基の炭素鎖は、相互に同じ長さである。式ＩＩの化合物の提供で２−アミノラウリン脂肪酸アミドの使用は、特に好ましい。従って、この例での化合物の各モノマー単位のＲ基は、１０炭素原子長さである。
【０２０１】
通常、式ＩＩの化合物では、ｎは３、４または５であり、より典型的には、ｎは３または４であり、最も典型的には、ｎは４である。
【０２０２】
しかし、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤の式ＩＩの化合物の全ての変化は、明示的に包含される。通常、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤の式ＩＩａの化合物は、下記スキーム１に示すようにアミノ基（ＮＨ２）で終端する。
【化４】
2021523946.tif 000009
スキームＩ：式ＩＩの化合物
【０２０３】
他の実施形態では、水素原子またはＮＨ２以外の末端基で終端する式ＩＩの化合物（スキーム１のように）も採用し得、本発明は、明示的に、全ての好適な生理学的に許容可能なこのような化合物（生理学的に許容可能なその塩を含む）を含む治療薬の使用にまで及ぶ。
【０２０４】
本発明により利用される式ＩＩの化合物は、例えば、ＮＨ２、Ｈ、ＣＯＯＨ、ＯＨ、ハロ（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、ＳＨ、アルキル、低級アルキル、アルケニル、低級アルケニル、ＯＲ、ＮＨＲ’およびＮＲ’Ｒ”から選択される末端基を有し得、低アルキル基、低級アルケニル基、ＯＲ、ＮＨＲ’およびＮＲ’Ｒ”は、任意に置換されてもよく、およびＲ、Ｒ’およびＲ”は、それぞれ独立に任意に置換されてもよい低級アルキルまたは低級アルケニルである。
【０２０５】
低級アルキル、低級アルケニル、ＯＲ、ＮＨＲ’およびＮＲ’Ｒ”基の任意の置換基は、例えば、ＯＨ、ハロ（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、Ｃ１−Ｃ３アルキル（例えば、メチル）、ＣＯＯＨなどから選択され得る。
【０２０６】
「低級アルキル」は、Ｃ１−Ｃ６アルキル（例えば、直鎖または分岐であってよい、メチル、エチル、またはプロピル基など）を意味する。
【０２０７】
同様に、「低級アルケニル」は、その最長鎖中に１個または複数の二重結合を含むＣ２−Ｃ６アルケニル基を意味する。
【０２０８】
しかし、通常、式ＩＩの化合物は、ＮＨ２またはＣＯＯＨ基で終端する。
【０２０９】
式Ｉのペプチド（Ｐ）の改変またはバリアント型の間のアミノ酸差異は通常、保存的アミノ酸変化である。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基の、類似の立体化学的特性（例えば、構造体、電荷、酸性または塩基性特性）を有する別のアミノ酸による置換を意味し、これは、構造または特徴的生物学的機能の所望の状況を実質的にもたらさない。例えば、アスパラギン酸（Ｄ）などの酸性アミノ酸は、グルタミン酸残基（Ｅ）により置換され得、セリン（Ｓ）などの極性アミノ酸は、トレオニン（Ｔ）またはアスパラギン（Ｎ）等々の別の極性アミノ酸により置換され得る。
【０２１０】
本明細書に記載のアミノ酸配列間の配列同一性は、配列が比較のために最適に整列されている場合に、配列中の各位置でのアミノ酸を比較することにより決定できる。配列の整列は、任意の好適なプログラムまたはアルゴリズム、例えば、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０）を用いて実施できる。コンピュータ支援配列整列は、好都合にも、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．１（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）の一部であるＧＡＰなどの標準的ソフトウェアプログラムを使用し、５０のギャップ生成ペナルティ（ｇａｐ  ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）および３のギャップ伸張ペナルティ（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）のデフォルトスコアマトリックスを用いて実施できる。比較のためのアミノ酸配列の他の整列方法はまた、例えば、限定されないが、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，（１９８１）およびＰｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）のアルゴリズム、このようなアルゴリズムのコンピュータ−実装（例えば、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴ）、および配列のマニュアル整列および検査によりよく知られている。
【０２１１】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、式ＩＩの化合物（Ｃ）は、下記式ＩＩＩおよび式ＩＶで例示されるように、本明細書に記載の式Ｉのペプチド（Ｐ）のＮ末端またはＣ末端に結合できる。
Ｃ−Ｐ      式ＩＩＩ
Ｐ−Ｃ      式ＩＶ
【０２１２】
本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤のペプチド（Ｐ）および化合物（Ｃ）は、場合に応じて、それぞれのペプチド結合または他の好適な（例えば、共有またはイオン）結合により、正常に相互に直接結合される。他の実施形態では、ペプチドは、リンカー基（ＬＧ）を介して化合物に結合し得る。リンカーは、例えば、１〜１０原子またはそれ超（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０原子）の長さを有し、結合原子またはリンカー基（例えば、直鎖）の１個もしくは複数の原子は、例えば、Ｎ、ＳおよびＯから独立に選択される非炭素原子であってよい。しかし、任意の好適な結合系を用い得る。
【０２１３】
上記から、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤の少なくともいくつかの実施形態は、リポペプチドであるか、またはそれを含む。
【０２１４】
また、式ＩＩＩまたは式ＩＶのペプチド（Ｐ）は、式Ｉのペプチドの反転配列であり得ることも理解されよう。
【０２１５】
またさらなる実施形態では、本発明によるＬｃｋ活性化剤は、Ｌｃｋ活性化剤をＬｃｋ活性化剤の標的細胞へのおよび／または１つまたは複数の本明細書に記載の他のＬｃｋ活性化剤への標的化送達のためのターゲティング部分に結合するためのリンカー部分（ＬＭ）に結合し得る。リンカー基は、例えば、下記式Ｖ〜ＶＩＩで例示されているペプチド（Ｐ）のどちらかの末端に結合できる。
ＬＭ−Ｐ−Ｃ      式Ｖ
Ｃ−Ｐ−ＬＭ      式ＶＩ
Ｐ−Ｃ−ＬＭ      式ＶＩＩ
【０２１６】
いくつかの実施形態では、リンカー部分は、Ｌｃｋ活性化剤をターゲティング部分に直接結合できる。
【０２１７】
他の実施形態では、リンカー部分は、１対のＬｃｋ活性化剤を一緒に結合するための架橋部分を含むことができ、この場合、Ｌｃｋ活性化剤は相互に同じまたは異なる。
【０２１８】
リンカー部分（ＬＭ）は、任意選択で、下記に例示するように、標的細胞の表面でまたは標的細胞の細胞内で酵素切断してＬｃｋ活性化剤を放出するために、１つまたは複数の酵素切断部位をコードするアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【０２１９】
通常、リンカー部分は、リンカー部分のターゲティング部分への結合のために、結合部分を含む。
【０２２０】
結合部分は、ターゲティング部分に結合するために任意の好適なアミノ酸またはアミノ酸配列、例えば、システイン（Ｃ）アミノ酸残基（ターゲティング部分により提供される末端システイン残基とジスルフィド架橋を形成するために）、リシン残基（Ｋ）、または例えば、リシン（Ｋ）またはシステイン（Ｃ）残基に対してリンカー部分の酵素切断部位（存在する場合）から間隔をあけるために、ＫＡＡ、ＣＡＡからなる群より選択されるスペーサーアミノ酸配列を含み得る。スペーサーアミノ酸配列は、選択されたターゲティング部分に対する結合の判定のために、さらにマーカーとしての機能を果たすことができる。特に好ましい実施形態では、結合部分は、１個または複数のβアミノ酸（例えば、ＫＡＡおよびＣＡＡの場合には、アラニン残基がβアミノ酸であり得る）を含む。
【０２２１】
一実施形態では、結合部分はアジド部分である。
【０２２２】
別の実施形態では、結合部分（例えば、アジド部分）は、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）に結合する。
【０２２３】
リンカー部分（ＬＭ）の１つまたは複数の酵素切断部位は、カテプシン切断部位、例えば、ＧＦＬＧＦＫ（例えば、Ｏｒｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，２０１１，４１（２）：４６９−４８３を参照）、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）切断部位で、この例としてはＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２、例えば、ＧＰＬＧＩＡＧＱ、ＰＡＧＬＬＧＣおよびＧＰＬＧＬＷＡＱ（例えば、Ｋｒａｔｚ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００１，１１：２００１−２００６を参照）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）切断部位、例えば、ＫＧＩＳＳＱＹおよびＳＳＫＹＱＬ（Ｋｕｍａｒ  ＳＫ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ，２００８，１６（６）：２７６４−２７６８；Ｎｉｅｍｅｌａ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ，２００２，４８（８）：１２５７−１２６４）、およびグルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼなどの細胞内酵素により切断可能なジスルフィド架橋（−Ｓ−Ｓ−）からなる群から選択され得る。これらの全ての使用は明示的に本明細書に包含される。
【０２２４】
従って、リンカー部分（ＬＭ）は、特に、ＧＦＬＧＦＫ、ＫＡＡＧＦＬＧＦＫ、ＣＡＡＧＦＬＧＦＫ、ＧＰＬＧＩＡＧＱ、ＫＡＡＧＰＬＧＩＡＧＱ、ＣＡＡＧＰＬＧＧＩＡＧＱ、ＰＡＧＬＬＧＣ、ＫＡＡＰＡＧＬＬＧＣ、ＣＡＡＰＡＧＬＬＧＣ、ＧＰＬＧＬＷＡＱ、ＫＡＡＧＰＬＧＬＷＡＱおよびＣＡＡＧＰＬＧＬＷＡＱからなる群から選択されるように、例えば、本明細書に記載の結合部分および／または酵素切断部位の種々の組み合わせを含むか、またはそれからなる。少なくともいくつかの実施形態では、本明細書に記載のリンカー部分（ＬＭ）は、２つ以上の酵素切断部位を含み得る。
【０２２５】
本明細書に記載の実施形態に従って、リンカー部分（ＬＭ）により一緒に結合された１対のＬｃｋ活性化剤の例は、下記のスキームＩＩに示される。
【化５】
2021523946.tif 000010
スキームＩＩ：ダイマーＬｃｋ活性化剤の例
【０２２６】
スキームＩＩで示されるダイマーＬｃｋ活性化剤は、架橋部分により一緒に結合された本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤Ｌｃｋ１およびＬｃｋ２を含む。この例では、架橋部分は、グルタミン酸（Ｇｌｕ）部分を介して、以下でさらに記述されるように、ソルターゼＡ媒介ライゲーションによりＬｃｋ活性化剤をターゲティング部分に結合するための結合部分を形成する３個のグリシン（Ｇ）アミノ酸残基（Ｇｌｙ３）の配列に結合した酵素切断部位Ｘ１およびＸ２（例えば、ＰＳＡおよび／またはＭＭＰアミノ酸切断配列）を含む。酵素切断部位Ｘ１およびＸ２は、相互に異なっても同じでもよい。さらに、架橋部分は、例えば、Ｌｃｋ活性化剤の式Ｉのそれぞれのペプチド（Ｐ）の末端に、または式ＩＩのダイマーのそれぞれのＬｃｋ活性化剤の化合物に、結合できる。
【０２２７】
Ｇｌｙ３以外の結合部分は、本発明の実施形態でも採用できる。例えば、結合部分は、３〜５グリシンアミノ酸残基、別のアミノ酸配列（例えば、３〜５アミノ酸長さ）、または他の好適なリンカー鎖の配列を含み得る。
【０２２８】
さらにその他の実施形態では、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤、ダイマーまたはＬｃｋ活性化剤の他のマルチマーは、デンドリマーまたは他の生理学的に許容可能な足場／フレームワークにより、１つまたは複数の他の個別のＬｃｋ活性化剤またはＬｃｋ活性化剤マルチマーに結合し得る。
【０２２９】
本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤の細胞への侵入は、外側細胞膜を横切る核酸を介することを含む、いくつかの機序を介して起こり得、または、例えば、カテプシン酵素に富むリソソームを介することを含む、受容体媒介輸送または内部移行により起こり得る。
【０２３０】
本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤の標的化のためのターゲティング部分は、標的細胞の細胞表面または組織環境中で発現した受容体または他の分子に結合する、リガンド、結合ペプチド、抗体またはその結合フラグメント（ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２フラグメントなど）、または単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）などのターゲティング部分の使用により実現され得る。抗体ターゲティング部分の例としては、抗ＣＤ３および抗ＣＤ４抗体（例えば、ＴＲＸ１，Ｎｇ  ＣＨ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６，ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１１０９５−００５−８８１４−３）、およびＢＴ−０６１（Ｈｕｍｂｌｅｔ−Ｂａｒｏｎ  Ｓ  ＆  Ｂａｒｏｎ  Ｆ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ＆  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１５，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｉｃｂ．２０１４．１２０）が挙げられる。利用され得るターゲティング部分はまた、特に、トランスフェリン、ビオチン、葉酸、およびヒアルロン酸を含み得る。例えば、Ｏｊｉｍａ  Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｆｕｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ，２０１２，４（１）：３３−５０を参照。この文献の全内容は、相互参照により本明細書に組み込まれる。
【０２３１】
ＨＩＶ（例えば、ＨＩＶ−１）は、例えば、Ｔ細胞中に侵入するために、ウィルスエンベロープタンパク質ｇｐ１２０を介してＴリンパ球上に発現したＣＤ４に結合する。ＣＤ４への結合後にｇｐ１２０タンパク質で生じた立体構造変化は、ウィルスを、リンパ球の共受容体ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４に結合させ、ウィルスと細胞を融合可能にする。ＣＤ４、ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４は、本発明により治療薬をＴリンパ球に送達するために、本発明の実施形態により標的化され得る細胞表面受容体の例である。本発明により標的化され得る標的細胞上の細胞表面受容体または表面発現分子の他の例としては、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２８およびＣＤ４５（例えば、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢおよびＣＤ４５ＲＯアイソフォーム）が挙げられる。
【０２３２】
本発明の実施形態により治療薬の標的細胞への送達のために標的化され得るさらなる分子の例としては、インテグリンファミリーおよびそのサブユニットのメンバー、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）ホルモン受容体、神経伝達物質受容体、受容体チロシンキナーゼ受容体、Ｇ−タンパク質結合受容体、Ｇタンパク質結合受容体、成長因子受容体、膜貫通型プロテアーゼ受容体、細胞表面プロテオグリカン、ＣＤ４４、ＣＤ５５、Ｆｃｙ受容体、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ヒアルロネート受容体、トランスフェリン受容体、葉酸受容体、前立腺特異的膜抗原、血管細胞接着分子、フィブロネクチン、コラーゲンビトロネクチンおよびラミニンなどのマトリックスタンパク質が挙げられる。
【０２３３】
化学療法剤イバリズマブ（以前はＴＮＸ−３５５）（Ｂｒｕｎｏ  ＣＪ  ａｎｄ  Ｊａｃｏｂｓｏｎ  ＪＭ，Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１０，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｊａｃ／ｄｋｑ２６１）は、本発明による癌または他の疾患または状態の治療のための他の薬物のように、ＣＤ４を標的とし、本発明によるＬｃｋ活性化剤の標的細胞への送達のためのターゲティング部分として用い得る。同様に、ＣＤ４（例えば、ＯＫＴ４）またはＣＸＣＲ４に結合する抗体またはその抗体結合フラグメントも利用し得る。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、Ｌｃｋ活性化剤は、治療標的抗体と一緒に別々に、または抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）のように標的化抗体に結合させて投与し得る。例えば、腫瘍特異的Ｔ細胞上に発現した、これらの受容体のＴ細胞活性化およびＩＬ−２産生の抑制効果を阻害するプログラム死リガンド１（ＰＤ−１）受容体または細胞傷害性Ｔリンパ球結合タンパク質４（ＣＴＬＡ４）受容体に対する抗体、例えば、トレメリムマブ／イピリムマブ（ヤーボイ）またはＭＳＢ００１０７１８Ｃは、それぞれ、このような抗体により標的化された黒色腫、腎臓癌および肺癌などの癌の治療における使用のために、本明細書で記載のＬｃｋ活性化剤に結合してＡＤＣを形成し得る（Ｏｔｔ  ＰＡ，ＯｎｃＬｉｖｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２１，２０１４）。ＣＴＬＡ−４受容体の、Ｔ細胞の抑制剤から活性化剤への変換はまた、これまで、Ｌｃｋ活性化を介してその効果を媒介する二重特異的タンデム型ｓｃＦｖリガンドを用いて説明されてきた（Ｍａｄｒｅｎａｓ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００４，１７２：５９４８−５９５６およびＴｅｆｔ  ＷＡ  ｅｔ  ａｌ，ＢＭＣ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００９；ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１−２１７２−１０−２３，Ｔｅｆｔ  ＷＡ  ｅｔ  ａｌ，ＢＭＣ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００９；ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１−２１７２−１０−２３）。従って、ｓｃＦｖの本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤への結合は、本発明の実施形態によるＴ細胞活性化をさらに促進し得る。さらなる例として、当業者に既知の二重特異的抗体を用いて、例えば、本明細書に記載のＰＥＧ結合Ｌｃｋ活性化剤を、例えば、ＣＤ２８などの細胞表面受容体に対する抗体に結合させ得る。
【０２３５】
本発明の実施形態でターゲティング部分として使用される抗体またはその結合フラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２およびＦｖフラグメントなど）は、望ましくは、選択標的分子に対し特異的であり、そのため、通常、モノクローナル抗体またはその結合フラグメントを含む。モノクローナル抗体およびその結合フラグメントの産生は、よく知られている。キメラおよびヒト化モノクローナル抗体、およびその結合フラグメントは、特に好ましい。キメラ抗体は、例えば、標的分子に特異的な非ヒト抗体のＦｃ領域を、ヒト抗体のＦｃ領域で置換することによりもたらされ得る。ヒト化抗体は、非ヒト（例えば、マウス、ラット、ヒツジまたはヤギ）モノクローナル抗体のＦａｂフラグメントの可変領域中の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、同様に当該技術分野で既知の組換えＤＮＡ技術を用いてヒト抗体骨格中に継ぎ合わせることにより得ることができる。
【０２３６】
上記のように、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）およびそのマルチマー型、例えば、二価ｓｃＦｖ（例えば、タンデム型ｓｃＦｖおよびディアボディ）、三価ｓｃＦｖ（トリアボディ）および四価ｓｃＦｖ（テトラボディ）もまた、本発明の実施形態のターゲティング部分として利用し得、ディアボディの使用が特に好ましい。本発明の実施形態で有用なｓｃＦｖは、２つの可能な配向Ｖｌ−ＡＡＬ−ＶｈまたはＶｈ−ＡＡＬ−Ｖｌのいずれかで、アミノ酸リンカー配列（ＡＡＬ）により一緒に結合されたヒト化または天然抗体重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）を含み得る。リンカー配列の長さは、モノマーｓｃＦｖ、ディアボディ、トリアボディまたはテトラボディのいずれが形成されるべきかに応じて、変わり得る。ｓｃＦｖのリンカー配列（ＡＡＬ）は、通常、約５〜約３０アミノ酸の範囲の長さ、より一般的には、５〜２５アミノ酸の範囲の長さである。ディアボディの形成のために、リンカー配列は通常、約５アミノ酸長であり、それにより、ｓｃＦｖを二量体化させる。トリアボディに対しては、リンカー配列は、ただの１または２アミノ酸長さであり得る。インビボ画像処理および治療法で使用するための、ディアボディを含むｓｃＦｖの設計は、例えば、Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋａ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００１，Ｆｅｂ  １；２４８（１−２）：４７−６６，Ｗｏｒｎ  Ａ．ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００１，３０５，９８９−１０１０、およびＡｈｍｅｄ  Ｚ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２０１２，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ９８０２５０，Ｈｉｎｄａｗｉ  Ｐｕｂ．Ｃｏｒｐ．に記載されている。これらの全ての内容は、その全体が相互参照により本明細書に組み込まれる。
【０２３７】
ｓｃＦｖがターゲティング部分として採用される場合、本明細書に記載のそれぞれのＬｃｋ活性化剤は、本明細書に記載の１つまたは複数の酵素切断部位を含むリンカー部分を介してそのＶＨおよび／またはＶＬ鎖の遊離末端に結合できる。即ち、本明細書に記載の２つのＬｃｋ活性化剤が、ｓｃＦｖに結合し得、Ｌｃｋ活性化剤の１つは、ＶＨ鎖の遊離末端に結合し、もう一方は、ＶＬ鎖の遊離末端に結合し、この場合、Ｌｃｋ活性化剤は、同じであっても、または異なっていてもよい。
【０２３８】
同様に、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤は、通常、上述の１つまたは複数の酵素切断部位を含むリンカー部分を介して、任意の好適な方式で、抗体、その結合フラグメント、または他のターゲティング部分に結合できる。
【０２３９】
さらに他の実施形態では、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤は、組換えＤＮＡ技術を利用して、ターゲティング部分それ自体（例えば、抗体、抗体結合フラグメント、またはｓｃＦｖ）中に組み込んで提供できる。このような実施形態では、Ｌｃｋ活性化剤は、Ｌｃｋ活性化剤のそれぞれの末端で、酵素切断部位（例えば、カテプシン切断部位）を含むそれぞれの結合部分によりターゲティング部分に結合でき、これは、各末端のＬｃｋ活性化剤をターゲティング部分に連結する。このような実施形態では、Ｌｃｋ活性化剤は、ターゲティング部分の結合または標的化機能を損なわない、ターゲティング部分中の任意の好適な位置で組み込まれ得、使用中の酵素切断部位の切断を可能とする。例えば、本明細書に記載のそれぞれのＬｃｋ活性化剤は、ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬ鎖の片方または両方に、ｓｃＦｖの結合または標的化機能を保持しながら上記の方式で挿入され得、例えば、Ｌｃｋ活性化剤は、ＭＭＰおよびＰＳＡ切断配列から選択される酵素切断配列に挟まれている。β６インテグリンサブユニットを特異的に標的とし、他のαＶ結合βインテグリンサブユニットを標的にしない１７マーペプチド（すなわち、ＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡ）が、例えば、癌胎児抗原（ＣＥＡ）と反応性があるマウスｓｃＦｖである、ＭＦＥ−２３のＣＤＲ  Ｈ３ループ中に挿入された。
【０２４０】
オンターゲット組織または標的細胞上の異なる部位を標的化するために、または標的細胞に免疫エフェクター細胞を動員するための手段として、２つ以上のターゲティング部分を用いる二重特異的標的化プロトコルは、本発明により明示的に包含される（例えば、二重特異的抗体標的化は、Ｗｅｉｄｌｅ  ＵＨ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＆  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２０１３，１０：１−１８により最近概説された）。即ち、本明細書に記載の単一Ｌｃｋ活性化剤は、異なる標的分子を相互に標的とする２つの異なるターゲティング部分を組み込み得る。一例として、ＨＥＲ２およびＣＤ４などの２個の異なる標的分子を標的にするための二重特異的タンデム型ｂｉ−ｓｃＦｖを、例えば、それぞれの対のＶＨおよびＶＬ鎖の間の１つまたは複数の酵素（例えば、ＭＭＰおよび／またはＰＳＡ）切断配列を用いて得ることが可能である。
【０２４１】
本明細書に記載の式Ｉのペプチド（Ｐ）を含み、本明細書に記載のターゲティング部分および／または結合部分を含有または非含有である、キメラタンパク質（すなわち、融合タンパク質）の形のＬｃｋ活性化剤は、本発明の方法でこれらを使用する場合、明示的に包含される。
【０２４２】
例えば、細胞免疫反応が加齢と共に低下することはよく知られている。特に、リンパ球増殖は、高齢患者由来のＴリンパ球中で顕著に低下し、これは、Ｌｃｋ活性の大きな低下に関連していることが知られている（Ｆｕｌｏｐ  Ｔ  Ｊｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ，１９９９，３４（２）：１９７−２１６）。従って、特異的Ｌｃｋ活性化剤の予防薬投与は、年配者の消耗性感染症の発生または重症度の予防または低減に特に有益であり得る。さらに、適切なＴ細胞免疫応答の減少は、複数のチロシンキナーゼを標的にする癌療法に付随する免疫抑制を克服するために、Ｌｃｋ活性化剤を組み合わせて使用する必要性を強調する癌化学療法の副作用である。抗癌剤に対する薬剤耐性ならびに急性白血病および非ホジキンリンパ腫での細胞周期進行の抑制の克服におけるＬｃｋ活性化のための潜在的役割に加えて、Ｌｃｋ活性化は、多様な病原性感染（ウィルス、細菌、真菌、原生動物および寄生虫）ならびにＬｃｋ欠損に関連する種々の障害の管理にも重要である。
【０２４３】
免疫系のＴリンパ球は、胸腺で産生され、皮膚、リンパ節などの特定の組織、ならびに口内、肺気道、消化管、および膣などの粘膜組織中で循環および存在できる。上皮内Ｔ細胞は、恒常性および悪性病変からの保護で重要な役割を果たす。皮膚、消化管、肺などの上皮組織は、常時の環境暴露下にあり、微生物の侵入に対する第一線の防御を形成する。マウスでの上皮内Ｔ細胞（Ｌｃｋを発現することが知られている）の非存在は、腫瘍拒絶における欠陥を生じる。特に、上皮内のこのようなＴ細胞の存在は、黒色腫を含む上皮悪性腫瘍の下方制御に必要である（Ｇｉｒａｒｄｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，２９４（５５４２）：６０５−９；Ｓｃｈｏｎ  ＭＰ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，２００３，１２１：９５１−９６２）。胸腺内でのこのような組織特異的Ｔ細胞の成熟は、Ｌｃｋ依存性であり、この細胞は、病原性感染およびそれらの病理学的影響（例えば、マラリア）からの保護に寄与する（Ｉｎｏｕｅ  Ｓ−Ｉ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，２０１２，１０９：１２１２９−１２１３４）。さらに、ガンマ−デルタ（γ／δ）Ｔ細胞は、原生動物、寄生生物、細菌およびウィルスによる感染に対する免疫応答で重要な役割を果たす。このようなＴ細胞の組織特異的局在化は、皮膚での免疫監視のための要件である（Ｊａｍｉｅｓｏｎ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００４，９：２６４０−２６５１；Ｓｃｈｏｎ  ＭＰ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，２００３，１２１：９５１−９６２）。
【０２４４】
いくつかのＴ細胞株では、活性化Ｌｃｋタンパク質は、抗原刺激の非存在下で、Ｔ細胞活性化の証明である、インターロイキン２（ＩＬ−２）産生を刺激することが示された（Ｌｕｏ  Ｋ，ａｎｄ  Ｓｅｆｔｏｎ  ＢＭ，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１９９２，１２（１０）：４７２４−４７３２）。
【０２４５】
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、γ／δＴ細胞とは別のＴ細胞のサブセットであり、癌に対する免疫応答の抑制で重要な役割を果たす。Ｔｒｅｇは、末梢性ＣＤ４＋Ｔ細胞プールの５〜１０％を構成し、ＩＬ−２Ｒαおよび転写因子ＦＯＸＰ３の構成的発現により認識される。
【０２４６】
腫瘍浸潤リンパ球内のＦＯＸＰ３  Ｔｒｅｇ細胞の存在は、様々な種類のヒト癌での予後不良と相関し、ＩＬ−２１はＴ細胞応答を促進するその能力により、抗腫瘍免疫を促進して、免疫系に対するＴｒｅｇ媒介抑制性効果の影響を弱めることが知られている（Ｋａｎｎａｐｐａｎ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２０１７，６６（５）：６３７−６４５）。
【０２４７】
本発明者らは、本発明のＬｃｋ活性化ポリペプチドは、細胞からのＩＬ−２１分泌を増大させることを示した（例えば、図７）。従って、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ポリペプチドは、エクスビボまたはインビボでＴｒｅｇの数を低減させる潜在力を有する。実際に、本発明者らは、本明細書で記載のペプチドを活性化するＬｃｋがインビトロでＴｒｅｇを減らすことを示した。
【０２４８】
重要なのは、本発明者らが、意外にも、本明細書で記載のＬｃｋを活性化するためのペプチドは、選択的にＬｃｋを活性化し、他のＳｒｃファミリーキナーゼを活性化しないことを実証したことである。例えば、図２は、Ｂｌｋ、ｃＳｒｃ、Ｆｇｒ、Ｆｙｎ、Ｈｃｋ、ＬｙｎおよびＹｅｓは、本明細書で記載のＬｃｋを活性するためのペプチドにより活性化されないことを示している。
【０２４９】
一実施形態では、本発明は、Ｌｃｋキナーゼの活性を高める方法を提供し、方法は、Ｌｃｋキナーゼを、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。本発明はまた、ＬｃｋキナーゼのＹ３９４リン酸化を増大させる方法を提供し、方法は、Ｌｃｋキナーゼを、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０２５０】
一実施形態では、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させたＬｃｋ活性レベルを、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させていないＬｃｋ（例えば、対照）の活性と比較する場合、または本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触の前後のレベルを比較する場合、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させたＬｃｋの活性は増大している。同様に、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させたＬｃｋキナーゼのＹ３９４リン酸化レベルを、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させていないＬｃｋキナーゼ（例えば、対照）のＹ３９４リン酸化と比較する場合、または本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触の前後のレベルを比較する場合、ＬｃｋキナーゼのＹ３９４リン酸化のレベルは増大している。
【０２５１】
一実施形態では、インビボでのＬｃｋの活性を高めるために、ペプチドまたはペプチドを含む医薬組成物が対象に投与される。
【０２５２】
本明細書で使用される場合、「活性を高めること」および「を活性化する」という用語は通常、ホスホトランスフェラーゼ活性などのキナーゼの活性を高めること（例えば、ＬｃｋキナーゼのＹ３９４リン酸化を増やすこと）を意味する。例えば、キナーゼの酵素活性の活性化は、活性化剤の非存在下でのキナーゼ活性に比べて、活性化剤の存在下での同じキナーゼ活性の任意の増加を意味する。用語のプロテインキナーゼを活性化するは、自己リン酸化の増加、活性化時に、１つの細胞内位置からベルの位置へ移動の増加、キナーゼを所定の位置に固定している１個または複数のタンパク質への結合またはそれからの解放の増加、またはプロテインキナーゼの他の活性もしくは機能の増加も含む。この増加は、限定されないが、プロテインキナーゼと、プロテインキナーゼの結合相手との間に複合体が形成される確率を増大させること、またはその標的に以前に結合したキナーゼ活性の増大を含む任意の手段により引き起こされ得る。このような活性化は、インビボあるいはインビトロで起こり得る。
【０２５３】
キナーゼの酵素活性は、当業者に既知の種々の方法、例えば、Ｐａｒｋｅｒ，Ｌａｗ，ｅｔ  ａｌ．，（２０００），Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｓｓａｙｓ  ｕｓｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ：ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｋｉｎａｓｅ／ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ａｓｓａｙｓ，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ５（２）：７７−８８；Ｂａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ６（４）：２５５−６４）；Ｌｉｕ，Ｆ．，Ｘ．Ｈ．Ｍａ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）．“Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ  ５  ａｎｄ  ｃａｓｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  １  ｂｙ  ｍｅｔａｂｏｔｒｏｐｉｃ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．”  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９８（２０）：１１０６２−８；Ｅｖａｎｓ，Ｄ．Ｂ．，Ｋ．Ｂ．Ｒａｎｋ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）．“Ａ  ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｓｔｕｄｙｉｎｇ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｔａｕ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ＩＩ／Ｃｄｋ５  ｕｓｉｎｇ  ａ  ９６−ｗｅｌｌ  ｆｏｒｍａｔ．”  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５０（２−３）：１５１−６１で開示の方法により監視できる。
【０２５４】
このような標準的方法を用いて、目的のキナーゼを含む試料を適切な条件下で放射性ＡＴＰおよびリン酸化の位置を与えるための適切な組成の合成ペプチド基質に暴露する。次に、ペプチドに新しく結合した放射性リン酸を測定する。基質ペプチドに共有結合したビオチンなどの化学的部分を付加して、ストレプトアビジンコートビーズを基質ペプチドに結合させる。ビーズ結合ペプチドを単離して結合した放射能を測定できる、または基質ペプチドと結合した放射能をシンチレーション近接アッセイに好適するビーズを用いて直接測定できるのが好ましい。
【０２５５】
ペプチド基質のリン酸化はまた、リン酸化部位特異的抗体の直接結合を介して、リン酸化部位特異的抗体の競合リンペプチドからの移動を測定することにより、検出できる（例えば、Ｐａｒｋｅｒ，Ｌａｗ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｓｓａｙｓ  ｕｓｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ：ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｋｉｎａｓｅ／ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ａｓｓａｙｓ，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ５（２）：７７−８８を参照）。蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）または蛍光偏光法（ＦＰ）などの蛍光法を使用して、特定のリンペプチド−抗体複合体を検出できる。これらの方法は、結合種の単離に依存しないで、むしろ、溶液中の特異的結合のために起こる蛍光の変化に依存する「ホモジニアス」検出法を採用するという利点を有する。
【０２５６】
リン酸化部位特異的抗体の作製方法は、当該技術分野において周知である。一実施形態では、Ｂｉｂｂらにより１９９９年１０月１５日に出願された「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｔｈａｔ  Ｒｅｇｕｌａｔｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ／Ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｏｐａｍｉｎｅ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ」という名称の米国特許出願第０９／４１９，３７９号、およびＢｉｂｂらにより２０００年１０月１３日に出願された「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｔｈａｔ  Ｒｅｇｕｌａｔｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ／Ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｏｐａｍｉｎｅ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ」という名称の米国特許出願第０９／６８７，９５９号（これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）で開示される方法を使用して、リン酸化標的に対し特異性を有するリン酸化状態特異的抗体が作製される。
【０２５７】
ホスホセリン、ホスホトレオニン、またはフォスフォチロシンに対するリン酸化状態特異的抗体は、市販品として入手できる。これらの抗体は、タンパク質が全体としてリン酸化されているかどうか、およびどの残基でリン酸化されているかを決定するのに有用である。このような抗体は、市販品入手源から入手できる（例えば、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，Ｓｉｇｍａ  ＲＢＩ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｕｐｓｔａｔｅ  ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびＺｙｍｅｄを含む、市販品入手源のリストについては、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  １５［４］：２４，Ｆｅｂ．１９，２００１を参照）。
【０２５８】
蛍光共鳴エネルギー転移、またはＦＲＥＴは、高分子の特異的結合を検出できるホモジニアスアッセイに広く使用されている。ＦＲＥＴは、放射光ではなく、励起「ドナー」蛍光の分子（フルオロフォア）のそれらの近くの「アクセプター」フルオロフォアへエネルギーを伝達する転移に依存する。従って、２つのフルオロフォアが基質標的に結合することにより空間中で１つにされる場合、通常のドナー波長で放出される蛍光は減少し、アクセプターフルオロフォアにより放出される蛍光は増加する。ドナー蛍光の減少またはアクセプター蛍光の増加を用いて、結合イベントを測定できる。
【０２５９】
キナーゼ活性を評価するための好適な方法である、Ｂａｄｅｒら（２００１，Ａ  ｃＧＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ６（４）：２５５−６４）で開示の方法を用いて、例えば、ホスホジエステラーゼ、キナーゼまたはタンパク質ホスファターゼの活性が決定される。Ｂａｄｅｒらは、時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（「ＦＲＥＴ」）をベースにした高スループットスクリーニングのためのｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼアッセイを開示し、これは、当業者なら分かるように、ホスホジエステラーゼまたはタンパク質ホスファターゼのアッセイに適応させ得る。目的のキナーゼを含む試料がキナーゼ特異的リン酸化部位およびアミノ末端ビオチン部分を有するＡＴＰおよび合成ペプチド基質に暴露される。リン酸化されたペプチドは、アロフィコシアニン標識ストレプトアビジン、リンペプチド特異的抗体およびユーロピウムキレート標識二次抗体を用いて検出される。ストレプトアビジンおよびリン酸化部位特異的抗体のリン酸化基質分子への同時結合は、蛍光共鳴エネルギー転移が起こり、６１５ｎｍ波長でのユーロピウム放射の減少として、および６６５ｎｍ波長でのアロフィコシアニン放射の増加として測定できるように、二次抗体上のユーロピウムキレート「ドナー」をアロフィコシアニンフルオロフォア「アクセプター」の十分近くに運ぶ。ユーロピウム−アロフィコシアニンのドナー−アクセプター対は、励起ユーロピウムの長い蛍光寿命を利用するためによく使われ、従って、シグナルは、時間分解される。
【０２６０】
クマリンとフルオレセインイソチオシアネートなどの他のフルオロフォア対も使用できる。蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）に関与できるこのような分子対は、ＦＲＥＴ対と呼ばれる。エネルギー転移が起こるためには、ドナーおよびアクセプター分子は通常、７０〜１００Åまでの近接状態でなければならない（Ｃｌｅｇｇ，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１１：３５３−３８８；Ｓｅｌｖｉｎ，１９９５，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４６：３００−３３４）。エネルギー転移の効率は、ドナーとアクセプター分子との間の距離と共に急速に低下する。ＦＲＥＴでよく使用される分子としては、フルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、２’７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、ローダミン、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、および５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）が挙げられる。フルオロフォアがドナーであるかアクセプターであるかは、その励起および発光スペクトル、およびそれと対形成するフルオロフォアにより決まる。例えば、ＦＡＭは、４８８ｎｍの波長の光により最も効率的に励起され、５００〜６５０ｎｍのスペクトルと、５２５ｎｍの最大発光を有する光を放出する。ＦＡＭは、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、およびＲＯＸ（これらの全ては、５１４ｎｍで最大励起を有する）と共に使用するのに好適なドナーフルオロフォアである。
【０２６１】
また、蛍光偏光測定もホスホジエステラーゼ、プロテインキナーゼまたはホスファターゼの活性の測定に使用できる（例えば、Ｐａｒｋｅｒ，Ｌａｗ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｓｓａｙｓ  ｕｓｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ：ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｋｉｎａｓｅ／ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ａｓｓａｙｓ，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ５（２）：７７−８８；Ｔｕｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９９：４５−５３を参照）。大きな特異的抗体の小さい蛍光リンペプチドへの結合は、そのタンブリング速度を遅らせ、蛍光偏光シグナルを高める。従って、蛍光偏光は、結合した蛍光のリンペプチドの量に比例する。このアッセイは、競合モードで使用でき、このモードでは、固定濃度の蛍光のペプチドおよび抗体が生体試料に加えられ、非蛍光リン酸化タンパク質またはリンペプチドの存在が、シグナルの減少として記録される。それは、直接結合モードでも使用でき、このモードでは、リン酸付加（例えば、キナーゼによる）または除去（例えば、ホスファターゼによる）が抗体結合を、従って、偏光シグナルを調節する。特定の実施形態では、蛍光偏光アッセイは、Ｔｕｒｅｋら（２００１，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９９：４５−５３）の方法を用いて実施され、この場合、生成物特異的抗リン酸化ペプチド特異的（例えば、抗リン酸化セリン）抗体が用いられる。
【０２６２】
キナーゼ活性を評価するための他の好適な方法としては、リン酸化のための細胞ベースアッセイが挙げられる。例えば、タンパク質リン酸化に基づくシグナル伝達は、例えば、単一生細胞中で、蛍光指示薬を使って、Ｓａｔｏら（２００２，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｉｎｇｌｅ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０（３）：２８７−９４）で開示されたものなどの方法を用いて、インビボで可視化される。このようなセンサーは、フレキシブルリンカーで分離された２個の蛍光タンパク質分子からなる。リンカーペプチドは、リン酸化部位およびリン酸化タンパク質認識要素を含む。リンカーのリン酸化は、立体構造変化を生じ、これが、２個の蛍光タンパク質を近接距離に動かし、ＦＲＥＴを生じさせ、系の蛍光出力を変える。
【０２６３】
加齢
Ｔ細胞は、細胞免疫で中心的な役割を果たし、加齢随伴病の多くは、免疫系の調節不全により影響を受け、その発生率は増加している。免疫応答、主にＴ細胞応答は、高齢化により調節不全になっていることを示唆する数多くの証拠が存在する（Ｆｕｌｏｐ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ  ＆  Ｈｅａｌｔｈｓｐａｎ，２０１２，１：６）。老化過程に関連するＴ細胞のシグナル伝達経路でのいくつかの変化が記載され、細胞膜（脂質ラフト）内のリン脂質構造体がＴＣＲカスケードの成分を集める働きをすることが提唱されている（Ｆｕｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ（前出参照）で概説されている）。さらにＬｃｋおよびその活性化型の脂質ラフトへの動員が高齢者由来の活性化Ｔ細胞中で低減していることが示された（Ｌａｒｂｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ，２００４，７５（２）：３７３−３８１）。
【０２６４】
Ｔ細胞活性化経路の加齢に伴う変化が、実験動物モデルおよびヒトで観察されており、最も重要な変化がＣＤ４＋Ｔ細胞中で起こり、サイトカインインターロイキン２（ＩＬ−２）の産生およびクローン増殖の低減をもたらす（Ｆｕｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ（前出参照）で概説されている）。
【０２６５】
ＩＬ−２系では、細胞内シグナル伝達がＩＬ−２受容体のベータ鎖により誘発され、Ｌｃｋの触媒ドメインの特異的部位と、ＩＬ−２Ｒβ受容体の細胞質ドメインとの間の結合の結果として、ＩＬ−２Ｒβ受容体がリン酸化Ｌｃｋによりリン酸化される（Ｈａｔａｋｅｙａｍａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５２：１５２３０８）。Ｌｃｋは、Ｔ細胞のＩＬ−２刺激時に活性化されることが示された唯一のＳｒｃファミリーキナーゼであり（Ｂｒｏｃｋｄｏｒｆｆ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ，２０００，１１（２）：２２５−３１）、活性化Ｌｃｋタンパク質は、抗原刺激の非存在下でＩＬ−２産生を刺激することが示された（Ｌｕｏ  Ｋ  ＆  Ｓｅｆｔｏｎ  ＢＭ，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１９９２，１２（１０）：４７２４−４７３２）。
【０２６６】
機能不全Ｔ細胞活性化および増殖は、加齢中の免疫機能低下における重要な変化であり（ＮＡＳＡ−Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｇｉｎｇ，Ｒｅｐｏｒｔ  ２０１６；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｓａ．ｇｏｖ／ｍｉｓｓｉｏｎ  ｐａｇｒｅｓ／ｓｔａｔｉｏｎ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｗｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ／８５７．ｈｔｍｌ）、宇宙飛行と地上操作との比較から得られた情報は、これに関与する特定の因子の理解および特定に対する洞察を提供する。宇宙飛行および模擬微小重力は、早期Ｔ細胞活性化における重要な遺伝子発現の顕著な低下をもたらすことが知られており、多数の宇宙飛行任務は、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン２受容体アルファ（ＩＬ−２ＲαまたはＣＤ２５）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）の顕著な低減を示した（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ＥＭ  ｅｔ  ａｌ，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｇｕｌ  Ｉｎｔｅｇｒ  Ｃｏｍｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，２０１５，３０８：Ｒ４８０−Ｒ４８８で概説されている）。
【０２６７】
宇宙飛行中の免疫抑制に関する懸念は、宇宙飛行関連免疫系弱体化が地球の軌道を超えた人の存在の拡大を妨げる可能性があるかどうかが疑問視されていることである（Ｇｕｅｇｕｉｎｏｕ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００９，ｄｏｉ：１０．１１８９／ｊｉｂ．０３０９１６７）。本明細書に記載のように、少なくともいくつかの実施形態では、上述のサイトカインの発現ならびにＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖は、通常および疲弊したＴ細胞の両方で、本明細書で記載の方法で利用される化合物により誘導され得る。従って、本発明の方法は、低および微小重力環境での使用にまで明示的に拡大される。
【０２６８】
本発明者らは、本明細書で記載のペプチドは、表３〜９および図１に示すように、Ｌｃｋを活性化し、図２に示すようにＹ３９４でのＬｃｋリン酸化を増大させることを示した。
【０２６９】
従って、一実施形態では、本発明は、Ｌｃｋキナーゼの活性を高める方法を提供し、方法は、Ｌｃｋキナーゼを、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０２７０】
Ｌｃｋ活性化の下流効果を含むＬｃｋの活性は、本明細書で記載される。
【０２７１】
本明細書で使用される場合、「接触させること」という用語は、インビトロ系またはインビボ系中で示した部分（例えば、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドとＬｃｋキナーゼ）を一緒にすることを意味する。例えば、プロテインキナーゼを本明細書に記載の活性化剤と「接触させること」は、本発明の化合物の、キナーゼを有するヒトなどの個体または患者への投与、ならびに、例えば、本明細書に記載の活性化剤を、キナーゼを含む細胞調製物または精製調製物を含む試料中に導入することを含む。
【０２７２】
別の実施形態では、本発明は、Ｌｃｋリン酸化を増大させる方法を提供し、方法は、Ｌｃｋキナーゼを、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０２７３】
本発明者らはまた、本明細書で記載のペプチドは、ヒトＴ細胞からのＩＬ−２分泌を増大させることも示した（図１４、図１５、図３７、図３８、図４０）。重要なのは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドによる細胞の前処理が、抗原刺激の前に、ヒトＴ細胞からのＩＬ−２分泌を増大させることである（例えば、図３４参照）。
【０２７４】
一実施形態では、本発明は、細胞または細胞集団からのＩＬ−２分泌を増大させる方法を提供し、方法は、細胞を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０２７５】
一実施形態では、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させた細胞または細胞集団からのＩＬ−２分泌レベルを、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させていない細胞または細胞集団（例えば、対照）からのＩＬ−２分泌のレベルと比較する場合、または本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触の前後のレベルを比較する場合、細胞または細胞集団からのＩＬ−２分泌のレベルは増大している。
【０２７６】
一実施形態では、細胞はＴ細胞である。
【０２７７】
本発明は、細胞の増殖を誘発する方法を提供し、方法は、細胞を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０２７８】
本明細書で使用される場合、増殖という用語は、細胞数の増大、または細胞または細胞集団の細胞分裂数の増大を含み、増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）と同義に使用される。一実施形態では、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させた細胞または細胞集団の細胞増殖レベルを、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させていない細胞または細胞集団（例えば、対照）の細胞増殖レベルと比較する場合、または本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触の前後のレベルを比較する場合、細胞または細胞集団の増殖レベルは増大している。
【０２７９】
別の実施形態では、本発明は、細胞集団の増殖を増大させる方法を提供し、方法は、細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０２８０】
一実施形態では、本発明は、細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、または樹状細胞からなる群より選択される細胞である、または細胞集団はこれらからなる群より選択される細胞を含む。
【０２８１】
別の実施形態では、細胞は未感作細胞である、または細胞集団は未感作細胞を含む。
【０２８２】
好ましい実施形態では、本方法は、細胞または細胞集団に対し、インビボでまたはインビトロで実施される。別の好ましい実施形態では、本方法は、細胞または細胞集団に対し、エクスビボで実施される。
【０２８３】
別の実施形態では、本発明は、動物の細胞または細胞集団の増殖を増大させる方法を提供し、方法は、動物に、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物を投与することを含む。
【０２８４】
本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物は、通常、有効量で投与される。本明細書で使用される場合、用語の「有効量」（例えば、「治療有効量」または「薬学的有効量」）は、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドの、Ｌｃｋキナーゼ活性の活性化を可能とする量、または分子または細胞応答を高めるまたは低減させる量を意味する。前記「有効量」は、個々の年齢および全身状態応じて、および治療または予防される特定の状態、治療期間、以前の治療、および状態の性質および既存期間などの因子により対象毎に変化する。
【０２８５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドは、通常、Ｌｃｋを活性化するために、有効量で疾患または状態の症状のない対象に、例えば、任意の年齢の健常者に投与される。
【０２８６】
具体的には、活性化剤の有効量は、過剰のまたは許容できない毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題または合併症なく、適度なベネフィットリスク比に見合っているが、本明細書全体を通して開示されるものなどの適切な技術で評価して、所望の効果を与えるのに十分な量で対象に投与できるＬｃｋ活性化ペプチドの量を規定する。従って、正確な有効量を指定するのは可能ではないが、当業者なら、定型実験および背景的一般知識を用いて、任意の個々の症例に適切な「有効」量を決定できる。これに関する治療結果には、症状の根絶または軽減が含まれる。治療結果は状態の完全な回復（すなわち、治癒）である必要はない。
【０２８７】
別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させた細胞または細胞集団に由来する細胞または細胞集団を提供する。例えば、本明細書に記載の方法よる（例えば、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と細胞または細胞集団とをインビボまたはインビトロ接触後）細胞または細胞集団に由来する、Ｔ細胞、ＮＫ細胞または樹状細胞、またはそれらの集団。別の態様では、本発明は、本明細書で記載の細胞または細胞集団の方法および使用を提供する。
【０２８８】
本発明者らはまた、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞（図１７、図１９）を含む、Ｔ細胞上のＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）発現を増大させることも示した（図３）。
【０２８９】
従って、一実施形態では、本発明は、細胞上のＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）発現を増大させる方法を提供し、方法は、細胞を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。一実施形態では、細胞はＴ細胞である。好ましい実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【０２９０】
上記で考察したように、本明細書記載の方法は、細胞または細胞集団に対し、インビボで（例えば、対象中で）またはインビトロで（例えば、エクスビボで）実施できる。同様に上述したように、本発明は、本明細書で記載の方法による細胞および細胞集団、および本明細書で記載の細胞または細胞集団の方法および使用を提供する。
【０２９１】
本明細書で記載のペプチドは、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖（図１７）、およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖（図３５）を増大させる。従って、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを用いて、例えば、養子免疫細胞療法のために、細胞および集団の増殖をインビボおよびインビトロで誘導できる。
【０２９２】
従って、一実施形態では、本発明は、Ｔ細胞の増殖を増大させる方法を提供し、方法は、Ｔ細胞を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。好ましい実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【０２９３】
人口統計学的進化は、公衆衛生に対する課題を示している。世界の住民、特に先進国の住民は、高齢化しており、６０歳を超える人口の比率は、１９５０年の８％から２０５０年の予測値２１％に増える見込みである（Ｃｏｍｐｔｅ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ，ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ，２０１３，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００６５３２５で概説されている）。免疫機能の低下は、加齢の特徴であり、高齢者は、細菌およびウィルス感染症、癌ならびに低いワクチン応答の比率および重症度が次第に増加する。
【０２９４】
ヒトの免疫系は年齢と共に次第に劣化し、この欠陥は、ワクチンおよび感染症に対する免疫記憶の誘導能力の低下として顕在化する。病原体および腫瘍発生からの保護は、多様なＴＣＲレパートリーの生成と維持に依存し、加齢でＴＣＲ多様性が顕著に低下することにより、新規病原体との戦いおよび反復感染に対する活発なリコール応答の開始が困難になる（Ｍｏｒｏ−Ｇａｒｃｉａ  ＭＡ  ｅｔ  ａｌ，Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１３，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１３．００１０７で概説されている）。
【０２９５】
病原体に対して戦う能力およびワクチン接種に応答する能力の低下は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞での観察される変化に反映され、加齢における獲得免疫反応の劣化の防止は、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団の「若返り」により実現され得ることが提案された（Ｍｏｒｏ−Ｇａｒｃｉａ  ＭＡ  ｅｔ  ａｌ，Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１３，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１３．００１０７）。
【０２９６】
ＣＤ２８発現の減少は、加齢に伴うＣＤ４＋Ｔ細胞機能の低下の証拠である。ＣＤ２８は、Ｔ細胞活性化中に、サイトカイン産生（ＩＬ−２）の誘導および細胞増殖の促進などの重要な役割を果たすので、活性化中のこの共刺激シグナルの欠如は、部分的な活性化のみ、あるいはＴ細胞のアネルギー性状態を生ずる（Ｇｏｄｌｏｖｅ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｘｐ  Ｇｅｒｏｎｔｏｌ，２００７，４２（５）：４１２−５）。このように、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞の蓄積は、高齢者における病原体およびワクチン剤に対する低減した全体免疫応答に関連し（Ｓａｕｅｒｗｅｉｎ−Ｔｅｉｓｓｌ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００２，１６８：５８９３−５８９９）、６５歳を超える一部の個人では、ＣＤ４＋／ＣＤ２８−Ｔ細胞は、総ＣＤ４＋Ｔ細胞コンパートメントの最大５０％を含む場合がある（Ｖａｌｌｅｊｏ  Ａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０００，１６５：６３０１−６３０７）。
【０２９７】
本発明者らは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドが、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ２８発現を高めることを示した（図２０）。
【０２９８】
一実施形態では、本発明は、細胞または細胞集団上のＣＤ２８発現を増大させる方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０２９９】
好ましい実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【０３００】
一実施形態では、細胞または細胞集団のＣＤ２８発現のレベルは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させた細胞または細胞集団上のＣＤ２８発現のレベルが本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させていない細胞または細胞集団（例えば、対照）上のＣＤ２８発現のレベルと比較される場合または本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物との接触の前後のレベルを比較する場合、増大される。
【０３０１】
哺乳動物の加齢中に、胸腺の健全性および機能が徐々に低下し、胸腺退縮は、免疫老化の重要な因子であると考えられる（Ｌｉ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４，１７２（５）：２９０９−２９１６）。マウス研究により、ＩＬ−１２ノックアウトマウスでの加速胸腺退縮が示され、高齢の野生型およびＩＬ−１２ノックアウトの両方のマウスで、ＩＬ−１２がＩＬ−２誘導胸腺細胞増殖を増強する強力な相乗的効果をもたらすことを示した（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ、前出参照）。
【０３０２】
別の実施形態では、本発明は、対象の加齢関連免疫機能不全の治療および／または予防方法を提供し、方法は、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。
【０３０３】
一実施形態では、ＬｃｋまたはＬｃｋ活性の抑制または下方制御を特徴とする疾患または状態は、病原性感染症、病原性感染症に由来する敗血症（例えば、慢性敗血症）、免疫不全障害、低下した免疫応答、減少したＴ細胞数、Ｔ細胞異常、Ｔ細胞疲弊、およびＴ細胞チェックポイント阻害からなる群より選択される。
【０３０４】
好ましい実施形態では、疾患または障害は、癌である。
【０３０５】
本明細書で使用される場合、「加齢関連免疫機能不全」という用語は、上述した加齢関連免疫変化を含む。
【０３０６】
別の実施形態では、本発明は、ＬｃｋまたはＬｃｋ活性の抑制または下方制御を特徴とする疾患または状態に関連する少なくとも１つの症状を治療および／または予防する方法を提供し、方法は、本明細書に記載のペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。
【０３０７】
本明細書で使用される場合、「治療」という用語は、治療処置ならびに予防処置（障害または障害の症状の発症（加齢関連変化を含む）全体の予防、または障害の症状の発生（加齢関連変化を含む）、もしくは前臨床で明らかな個別の障害の段階の遅延化）を含む。
【０３０８】
「予防」という用語は、障害または障害の症状の発症の全体的予防、または障害もしくは障害の症状の発生、または前臨床で明らかな個別の障害の段階の遅延化を含む。これには、例えば、癌などの疾患を発症する危険のある人の予防処置が含まれる。「予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」は予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）のもう一つの用語である。
【０３０９】
加えて、高齢者における損傷ＩＦＮガンマ産生も、免疫リスク表現型の一因となり、高齢者の細菌生成物またはウィルス抗原による刺激に対して、このサイトカインを産生する能力の低下もまた、加齢に伴う疾患感受性の一因である（Ｏｕｙａｎｇ  Ｑ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ，２００２，１３（４）：３９２−４）。特に、加齢マウスが、インフルエンザウィルスに対する漸減したＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を示すのは、一部は、低減したＩＬ−１８受容体（ＩＬ−１８Ｒ）ｍＲＮＡ発現が原因であると考えられ、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８の両方は、加齢マウスのＩＦＮガンマ産生を顕著に増大させることができ、それにより、加齢に伴うＣＤ８＋ＣＴＬ欠損を元に戻すことができる（Ｚｈａｎｇ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ＆  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ，２００４，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０８９／１０７９９９００１７５３２３８０９７）。
【０３１０】
本発明者らは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドが、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＦＮγ産生を増大することを示した（図１８）。
【０３１１】
従って、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドは、本明細書で記載のＩＦＮγの生理学的効果を高めるために使用できる。
【０３１２】
一実施形態では、本発明は、細胞または細胞集団からのサイトカイン分泌を増大させる方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０３１３】
好ましい実施形態では、サイトカインはＩＦＮγである。
【０３１４】
一実施形態では、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させた細胞または細胞集団からのサイトカイン（例えば、ＩＦＮγ）分泌レベルを、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させていない細胞または細胞集団（例えば、対照）から分泌されたサイトカイン（例えば、ＩＦＮγ）のレベルと比較する場合、または本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触の前後のレベルを比較する場合、細胞または細胞集団からのサイトカイン（例えば、ＩＦＮγ）分泌のレベルは増大している。
【０３１５】
好ましい実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞である。
【０３１６】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞はまた、感染症および癌に対する免疫で重要な役割を果たす。加齢関連機能的ＮＫ細胞欠損は、ヒトおよびマウスで文書による十分な裏づけがあり、可溶性ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα複合体の加齢マウス中への注射は、加齢関連ＮＫ細胞欠損を完全に回復することが示された（Ｃｈｉｕ  Ｂ−Ｃ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１３，ｄｏｉ：１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１３０１６２５）。さらに、ＩＬ−１５は、早期感染症に対する免疫応答で重要な役割を果たし、ＣＤ４＋ＣＤ２８−Ｔ細胞の細胞溶解性特性を高め、それらの抗原特異的応答を強化することが示された（Ａｌｏｎｓｏ−Ａｒｉａｓ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ，Ａｇｉｎｇ  Ｃｅｌｌ，２０１１，１０：８４４−８５２）。
【０３１７】
ＩＬ−１５は、ＮＫおよびＣＤ８＋Ｔ細胞の発生、機能および生存を促進し、ＩＬ−１５によるシグナル伝達は、ＣＤ２１５（ＩＬ−１５Ｒ）受容体を介して起こる。本発明者らは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドが、ＮＫ細胞上のＣＤ２１５発現を高めることを示した（図２８）。
【０３１８】
本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドは、本明細書で記載のＩＬ−１５ＲおよびＩＬ−１５の生理学的効果を強化するために使用できる。
【０３１９】
従って、一実施形態では、本発明は、細胞または細胞集団からのＩＬ−１５分泌を増大させる方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０３２０】
一実施形態では、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させた細胞または細胞集団からのＩＬ−１５分泌レベルを、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させていない細胞または細胞集団（例えば、対照）からのＩＬ−１５分泌のレベルと比較する場合、または本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触の前後のレベルを比較する場合、細胞または細胞集団からのＩＬ−１５分泌のレベルは増大している。
【０３２１】
一実施形態では、本発明は、細胞上のＩＬ−１５Ｒ（ＣＤ２１５）発現を増大させる方法を提供し、方法は、細胞を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０３２２】
一実施形態では、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させた細胞または細胞集団上のＩＬ−１５Ｒ発現のレベルを、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させていない細胞または細胞集団（例えば、対照）上のＩＬ−１５Ｒのレベルと比較する場合、または本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触の前後のレベルを比較する場合、細胞または細胞集団上のＩＬ−１５Ｒ発現レベルは増大している。
【０３２３】
別の実施形態では、本発明は、ＮＫ細胞のＩＬ−１５応答性を高める方法を提供し、方法は、ＮＫ細胞を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０３２４】
一実施形態では、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させた細胞または細胞集団のＩＬ−１５に対する応答性のレベルを、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させていない細胞または細胞集団（例えば、対照）のＩＬ−１５に対する応答性のレベルと比較する場合、または本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触の前後のレベルを比較する場合、細胞または細胞集団のＩＬ−１５に対する応答性のレベルは増大している。
【０３２５】
好ましい実施形態では、細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【０３２６】
別の実施形態では、本発明は、ＮＫ細胞のＩＬ−１５応答性を高める方法を提供し、方法は、ＮＫ細胞を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０３２７】
理論に束縛されることを意図するものではないが、ＩＬ−１５に対する増大した応答性は、ＮＫおよびＣＤ８＋Ｔ細胞の発生、機能および生存を調節することが予測される。
【０３２８】
本発明者らはまた、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドが、マウスにおいてＮＫ細胞の増殖を増大させることを示した（図２８）。
【０３２９】
従って、一実施形態では、本発明は、動物においてＮＫ細胞の増殖を増大させる方法を提供し、方法は、動物に、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物を投与することを含む。
【０３３０】
別の実施形態では、本発明は、ＮＫ細胞集団の増殖を増大させる方法を提供し、方法は、ＮＫ細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。好ましい実施形態では、本方法は、ＮＫ細胞またはＮＫ細胞集団に対し、インビボでまたはインビトロで実施される。別の好ましい実施形態では、本方法は、ＮＫ細胞またはＮＫ細胞集団に対し、エクスビボで実施される。別の実施形態では、本発明は、ＮＫ細胞の増殖を誘導する方法を提供し、方法は、ＮＫ細胞を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０３３１】
本発明者らはまた、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドが、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞（図３３）のＣＤ１０７ａ（脱顆粒マーカー）発現、ならびにＮＫ細胞（図２１）上のＮＫｐ４４およびＮＫＧ２Ｄの発現を高めることを示した。ＮＫｐ４４およびＮＫＧ２Ｄは、細胞溶解に関与する活性化受容体である。
【０３３２】
従って、一実施形態では、本発明は、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞中のＣＤ１０７ａの発現を増大させる方法を提供し、方法は、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０３３３】
理論に束縛されることを意図するものではないが、ＣＤ１０７ａは脱顆粒マーカーであるため、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞中のＣＤ１０７ａを増大させる方法は、細胞の細胞傷害性応答を増大させることが予測される。従って、一実施形態では、本発明は、対象の細胞傷害性応答を増大させる方法を提供し、方法は、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。
【０３３４】
インターロイキン−２（ＩＬ−２）は、主にヘルパーＴ細胞により産生され、細胞免疫および体液性免疫に関与する種々の細胞の成長および機能を調節する成長促進サイトカインである。ＩＬ−２の発現は、年齢と共に減少し、この減少は、免疫機能の加齢関連低下に対応することが示された（Ｐａｈｌａｖａｎｉ  ＭＡ  ＆  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  Ａ，Ｍｅｃｈ  Ａｇｅｉｎｇ  Ｄｅｖ，１９９６，８９（３）：１２５−５４）。さらに、加齢マウスへのＩＬ−２１投与は、新たに胸腺リンパ球形成を誘発することにより、それらの末梢Ｔ細胞プールを若返らせることが示された（Ａｌ−Ｃｈａｍｉ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ，Ａｇｉｎｇ  Ｃｅｌｌ，２０１６，１５（２）：３４９−６０）。例えば、ｒＩＬ−２１治療加齢マウス由来のＴ細胞の刺激は、Ｌｃｋキナーゼの活性化を強化したことを示し、これは、最終的に、対照加齢マウス由来のＴ細胞と比較して、それらのＩＬ−２産生、ＣＤ２５発現、および増殖能力を高めた（Ａｌ−Ｃｈａｍｉ  ｅｔ  ａｌ、前出参照）。
【０３３５】
本発明者らは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドが、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞（図１７、図１９）を含む、Ｔ細胞株上のＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）発現を増大させ（図３）、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖（図１７）および、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖（図３５）を増大させさせることを示した。
【０３３６】
従って、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドは、本明細書で記載のＩＬ−２Ｒの生理学的効果（例えば、ＩＬ−２に対する応答性）を高めるために使用できる。
【０３３７】
一実施形態では、本発明は、細胞または細胞集団のＩＬ−２応答性を増大させる方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０３３８】
一実施形態では、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させた細胞または細胞集団のＩＬ−２に対する応答性のレベルを、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させていない細胞または細胞集団（例えば、対照）のＩＬ−２に対する応答性のレベルと比較する場合、または本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触の前後のレベルを比較する場合、細胞または細胞集団のＩＬ−２に対する応答性のレベルは増大している。
【０３３９】
一実施形態では、細胞はＴ細胞である。好ましい実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【０３４０】
一実施形態では、細胞は未感作細胞である、または細胞集団は未感作細胞を含む。
【０３４１】
一実施形態では、本発明は、細胞上または細胞集団中のＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）発現を増大させる方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０３４２】
一実施形態では、本発明は、チェックポイント阻害剤の存在下で、ＣＤ２５発現を増大させる方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０３４３】
別の実施形態では、本発明は、細胞の増殖を誘発する方法を提供し、方法は、細胞を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。好ましい実施形態では、細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。
【０３４４】
別の実施形態では、本発明は、細胞集団の増殖を増大させる方法を提供し、方法は、細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。好ましい実施形態では、細胞集団はＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞の集団である。上記で示したように、本方法は、細胞または細胞集団に対し、インビボでまたはインビトロで実施できる。別の好ましい実施形態では、本方法は、細胞または細胞集団に対し、エクスビボで実施される。
【０３４５】
別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させた細胞または細胞集団に由来する細胞集団を提供する。例えば、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させた細胞または細胞集団に由来する、Ｔ細胞、ＮＫ細胞または樹状細胞、またはそれらの集団。
【０３４６】
一態様では、本発明は、本明細書で記載の細胞または細胞集団の方法および使用を提供する。例えば、本明細書で記載の細胞または細胞集団は、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法を含む養子免疫細胞療法のために使用できる。
【０３４７】
サイトカインＩＬ−２１は、狂犬病感染症に対する最適ワクチン誘導１次応答の発生に重要であり、  全細胞癌ワクチンでの強力な補助剤効力を有することが示された（Ｄｏｒｆｍｅｉｅｒ  ＣＬ  ｅｔ  ａｌ，ＰＬｏＳ  Ｎｅｇｌ  Ｔｒｏｐ  Ｄｉ，２０１３，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｎｔｄ．０００２１２９；Ｇｕ  Ｙ−Ｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ３２３５１）。
【０３４８】
本発明者らは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドが、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞（図４）、ＮＫ細胞（図５、図６）上のＩＬ−２１Ｒ（ＣＤ３６０）発現を増大させ、加えて、Ｔ細胞によるＩＬ−２１産生を増大させる（図７）ことを示した。
【０３４９】
一実施形態では、本発明は、細胞または細胞集団からのＩＬ−２１分泌を増大させる方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０３５０】
一実施形態では、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させた細胞または細胞集団からのＩＬ−２１分泌レベルを、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させていない細胞または細胞集団（例えば、対照）からのＩＬ−２１分泌のレベルと比較する場合、または本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触の前後のレベルを比較する場合、細胞または細胞集団からのＩＬ−２１分泌のレベルは増大している。
【０３５１】
一実施形態では、本発明は、対象の免疫応答を誘導する方法を提供し、方法は、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。
【０３５２】
一実施形態では、本発明は、細胞または細胞集団上のＩＬ−２１Ｒ（ＣＤ３６０）発現を増大させる方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０３５３】
一実施形態では、細胞または細胞集団のＩＬ−２１Ｒ発現レベルは、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させた細胞または細胞集団のＩＬ−２１Ｒ発現のレベルが本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させていない細胞または細胞集団（例えば、対照）のＩＬ−２１Ｒのレベルと比較される場合、または本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物との接触の前後のレベルを比較する場合、増大される。
【０３５４】
別の実施形態では、本発明は、細胞のＩＬ−２１応答性を高める方法を提供し、方法は、細胞を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。好ましい実施形態では、細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。
【０３５５】
一実施形態では、本発明は、細胞上のＩＬ−２１Ｒ（ＣＤ３６０）発現を増大させる方法を提供し、方法は、細胞を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。別の実施形態では、本発明は、細胞のＩＬ−２１応答性を高める方法を提供し、方法は、細胞を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０３５６】
一実施形態では、本発明は、ワクチン接種を必要としている対象にそれを実施する方法を提供し、方法は、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物を、ワクチンと同時にまたは順次に対象に投与することを含む。本発明はまた、ワクチン（例えば、ワクチン抗原）と共に処方された、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物を提供する。
【０３５７】
免疫抑制
多くの新規抗癌剤の望ましくない重要な副作用は、壊滅的な敗血症に繋がる免疫抑制である。例えば、転移性腎臓癌用の薬剤であるソラフェニブは、１０μＭ超の投与量で、休薬後でも、回復できないＴ細胞増殖性抑制を引き起こすことが報告された（Ｚｈａｏ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２００８，２２：１２２６−１２３３）。Ｌｃｋ発現上昇の増大は、例えば、チロシンキナーゼ阻害剤治療を受けている慢性骨髄性白血病患者の免疫応答を再刺激するための実施可能な選択肢であると提案された（Ｗａｎｇ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ，ＢｉｏＭｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２０１４，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１５５／２０１４／６８２０１０）。さらに、例えば、ＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼ抑制剤のイマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ，ＳＴ１５７１）は、慢性骨髄性白血病の治療に極めて効果的である。しかし、この薬物による慢性治療は、免疫抑制を誘導し、これは、主に、ＬｃｋおよびＺＡＰ７０などのチロシンキナーゼの抑制に伴うＴ細胞機能不全に起因する（Ｗａｎｇ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ、前出参照）。加えて、グルココルチコイドは、ＴＣＲ活性化に必要なシグナル伝達イベントを遮断する強力な免疫抑制剤として作用し、デキサメタゾンによるＬｃｋの抑制は、イノシトールホスフェート３下方制御し、それにより、ＴＣＲシグナル強度の低下により免疫応答を抑制することが示された（Ｈａｒｒ  ＭＷ  ｅｔ  ａｌ，ＪＢＣ，２００９，２８４：３１８６０−３１８７１）。急速に拡大している癌におけるチロシンキナーゼ阻害剤の開発と使用に伴い、これらの薬物の生じ得る副作用は、臨床的にかなり重要になっている。イマチニブに加えて、ニロチニブおよびダサチニブも、例えば、Ｌｃｋ抑制の原因とされる、Ｔ細胞機能の抑制が報告された。
【０３５８】
上記で考察したように、本発明者らは、本明細書で記載のペプチドは、表３〜１０および図１に示すように、Ｌｃｋ活性を高め、および図２に示すようにＹ３９４でのＬｃｋリン酸化を増大させ、ならびにＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖（図１７）およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖（図３５）を増大させることを示した。
【０３５９】
従って、癌療法は、細菌スーパー抗原などの免疫強化薬物との組み合わせ治療から恩恵を受ける可能性がある。しかし、細菌スーパー抗原は、Ｔ細胞の非特異的活性化および大量のサイトカイン放出をもたらし、毒性ショックおよび多臓器不全などの重度の命を脅かす症状に繋がる抗原のクラスである。ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）は、抗生物質関連下痢のよくある原因であるので、臨床現場での懸念材料である。ＳＥＡが原因の潜在的疾病率にもかかわらず、ＬｃｋがＳＥＡにより活性化されること（Ｗａｎｇ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ，ＢｉｏＭｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２０１４，２０１４：Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ６８２０１０）および選択的Ｌｃｋ活性化剤の事前の欠乏を考慮して、慢性骨髄性白血病のイマチニブ媒介Ｔ細胞免疫抑制防止のためにＳＥＡを使用すべきであることが提案されてきた。
【０３６０】
これらの報告は、Ｔ細胞発生および活性化および従って獲得免疫応答のためのＬｃｋの重要性を強調している（Ｓｔｉｒｎｗｅｉｓｓ  Ａ  ｅｔ  ａｌ，２０１３，Ｓｃｉ  Ｓｉｇｎａｌ，６（２６３）：ｒａ１３．Ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｓｉｇｎａｌ．２００３６０７）。Ｌｃｋの樹状細胞（ＤＣ）媒介活性化は、「ＴＣＲライセンシング」、同族ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ抗原複合体に対するＴＣＲ応答の感度と大きさを劇的に高めるプロセス、に繋がる（Ｍｅｒａｎｅｒ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ，２００７，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７８（４）：２２６２−２２７１）。しかし、例えば、イマチニブは、Ｌｃｋ活性の抑制によりＴＣＲ誘導増殖および活性化を低減させる（Ｓｅｇｇｅｗｉｓｓ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ，２００５，Ｂｌｏｏｄ，１０５：２４７３−２４７９）。これは、幹細胞移植後の、日和見感染および移植片対宿主または移植片対白血病反応の誘導という含意を有する（Ｓｅｇｇｅｗｉｓｓ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ，２００５，Ｂｌｏｏｄ，１０５：２４７３−２４７９）。
【０３６１】
Ｌｃｋ遺伝子異常および疾患
多数のヒト疾患ヒト疾患が、Ｌｃｋ座位の異常により引き起こされ、一例は、Ｔ細胞急性リンパ性白血病である（Ｃｏｎｖｅｒｓｅ  ＰＪ，２００３  Ｓｅｐｔ  ２４．Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ；Ｌｃｋ．Ｏｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ．，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｄｉｓｐｏｍｉｍ．ｃｇｉ？ｉｄ＝１５３３９０．ｉｎ）。      加えて、ＡＭＬ関連のほとんどのＤＮＡ変化は、誕生前に遺伝により受け継がれるのではなく、人の寿命の間に発生する。いくつかのこれらの後天性変化は、放射線または発癌化学薬品などの外的原因を有し得るが、ほとんどの事例では、それらが起こる理由は分かっていない。
【０３６２】
免疫反応応答におけるＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）軸
慢性感染症および癌では、Ｔ細胞は持続性抗原および／または炎症性シグナルに暴露される。このシナリオは、多くの場合、細胞機能の低下：「疲弊」と呼ばれる状態に関連する（Ｗｈｅｒｒｙ  ＥＪ  ＆  Ｋｕｒａｃｈｉ  Ｍ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１５，１５：４８６−４９９）。疲弊Ｔ細胞は、強固なエフェクター機能を失い、ＰＤ−１、ＬＡＧ３、ＣＤ１６０、または２Ｂ４などのシグナル伝達チェックポイントで複数の抑制性受容体を発現し、変化した転写プログラムにより規定される。しかし、疲弊Ｔ細胞の再活性化は免疫を再活性化でき、ＨＩＶ−１、Ｃ型肝炎ウィルス、およびなどの持続性感染症、および癌に対し、新しい治療標的を提供する（Ｗｈｅｒｒｙ  ＆  Ｋｕｒａｃｈｉ、前出参照）。
【０３６３】
本発明者らは、本発明のポリペプチドによる疲弊ＣＤ４＋細胞の治療が、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖、ＣＤ２５発現、およびＴＮＦαおよびＩＦＮγ産生を誘導することを示した（図１７および図１８）。
【０３６４】
従って、一実施形態では、本発明は、Ｔ細胞の疲弊を低減する方法を提供し、方法は、Ｔ細胞を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０３６５】
用語の「疲弊」は、多くの慢性感染症および癌の間に発生する持続的ＴＣＲシグナル伝達から生じるＴ細胞機能不全の状態としてのＴ細胞疲弊を意味する。これは、アネルギーが不完全なまたは欠陥シグナル伝達により生じないで、持続的シグナル伝達から生ずるという点で、アネルギーとは区別される。これは、不十分なエフェクター機能、抑制性受容体の持続性発現および機能的エフェクターまたは記憶Ｔ細胞とは異なる転写性状態の持続性発現により定義される。疲弊は、感染症および腫瘍の最適制御を妨げる。疲弊は、外因性負の調節経路（例えば、免疫調節性サイトカイン）ならびに細胞内因性負の調節（共刺激）経路（ＰＤ−１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、など）の両方から生じ得る。一実施形態では、疲弊の低減のレベルは、少なくとも１０％、あるいは、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％である。疲弊の測定方法は、当業者に既知である。
【０３６６】
一実施形態では、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させたＴ細胞またはＴ細胞集団のＴ細胞機能のレベルを、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させていないＴ細胞またはＴ細胞集団（例えば、対照のＴ細胞機能のレベルと比較する場合、または本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触の前後のレベルを比較する場合、Ｔ細胞またはＴ細胞集団の疲弊のレベルは減少している。
【０３６７】
別の実施形態では、本発明は、Ｔ細胞機能を高める方法を提供し、方法は、Ｔ細胞を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０３６８】
本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞機能を高めること」は、持続的なまたは増幅された生物学的機能を有するように、または疲弊したまたは不活性Ｔ細胞を再生もしくは再活性化するために、Ｔ細胞を誘導、誘発または刺激することを意味する。Ｔ細胞機能の強化の例としては、介入前のこのようなレベルと比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮγの分泌の増大、増殖の増大、抗原応答性（例えば、ウィルス、病原体、または腫瘍の除去）の増大、が挙げられる。一実施形態では、強化のレベルは、少なくとも５０％、あるいは、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、２００％である。この強化を測定する方法は、当業者に既知である。
【０３６９】
上記で考察したように、本明細書記載の方法は、細胞または細胞集団に対し、インビボで（例えば、対象中で）またはインビトロで（例えば、エクスビボで）実施できる。
【０３７０】
別の実施形態では、本発明は、Ｔ細胞からのＩＦＮγ分泌を増大させる方法を提供し、方法は、Ｔ細胞を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。好ましい実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞である。
【０３７１】
初期の活性化時に、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、爆発的にＩＬ−２を産生するが、その後、一過性の不応期に入り、その間、いくつかのエフェクター機能を維持するがＩＬ−２を産生する能力を失う。この期間中、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、それらの増殖の継続および完全な機能的能力の回復のために、ＣＤ４＋Ｔ細胞により供給される外因性ＩＬ−２に依存する（Ｃｏｘ  ＭＡ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００１，３２（４）：１８０−１８６で概説されている）。ＩＬ−２は、ＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒα）、ＣＤ１２２（ＩＬ−２Ｒβ）およびガンマサブユニットからなるトリマー受容体を介してシグナル伝達を行う。ＣＤ２５は、ＩＬ−１２およびＩＬ−２それ自体などの炎症性サイトカインに暴露後に発現上昇される。この炎症性サイトカインは、ＣＤ２５発現の量と期間を調節し、次に、応答細胞の能力を制御してＩＬ−２依存性シグナルを受信し、それにより、Ｔ細胞のエフェクターおよび記憶集団（ｍｅｍｏｒｙ  ｐｏｏｌ）の形成に影響を与える（Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ，前出参照）。
【０３７２】
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＩＬ−２の生来の産生細胞であり、ＣＤ８＋Ｔ細胞と一体になって応答の初期拡大ならびに耐久性のある防御二次反応を誘発できる記憶細胞形成を促進する。重要なのは、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−２の分泌が、ＣＤ８＋Ｔ細胞に応答することによりＣＤ２５発現を上方制御し、また、ＣＤ２５＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を増やすＩＬ−２源も提供する（Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ，ｖｉｄｅ  ｓｕｐｒａ，Ｏｂａｒ  ＪＪ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，２０１０，１０７（１）：１９３−１９８）。さらに、ＩＬ−２は、外来性の刺激の非存在下で、ＣＤ２５陰性Ｔリンパ球上のＩＬ−２受容体のアルファ鎖の用量依存性発現をもたらすことが示された（Ｓｅｒｅｔｉ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０００，９７（３）：２６６−７６）。従って、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ２５発現の非存在は、病原性特異的応答の拡大期を制限する。従って、ＣＤ２５などのサイトカイン受容体発現の調節が、ＣＤ２５のより高い発現により細胞がより強力なＩＬ−２シグナルを受けることを可能にするエフェクター細胞の生成における律速段階になる可能性が高い（Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ、前出参照）。
【０３７３】
慢性敗血症および癌に対して応答したエフェクターおよび記憶細胞の調節におけるＣＤ２５発現の重要性に加えて、ＣＤ２５発現ＣＤ８＋Ｔ細胞はまた、老齢期の効力の高い記憶細胞であることが明らかになり、高齢者でのこれらの細胞の蓄積は、老齢期の未感作Ｔ細胞の非存在下で、インタクト免疫応答性の前提条件であるように見える（Ｈｅｒｎｄｌｅｒ−Ｂｒａｎｄｓｔｅｔｔｅｒ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００５，１７５：１５６６−１５７４）。この知見は、高齢者集団における免疫コンピテントＣＤ８＋ＣＤ２５＋記憶Ｔ細胞の長期生存の支援を目的とする新規ワクチン接種手法の提案をもたらした（Ｈｅｒｎｄｌｅｒ−Ｂｒａｎｄｓｔｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ、前出参照）。
【０３７４】
本発明者らはまた、本明細書で記載のペプチドが、ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上の（図１０）および治療されたマウスにおけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上の（図２６、図２７および図２９）ＩＬ−１２Ｒβ２発現を高めることを示した。本明細書で記載のペプチドはまた、ＮＫ細胞上の（図１１）、および治療されたマウスにおけるＮＫ細胞上の（図２７）ＩＬ−１２Ｒβ１／ＩＬ−１２Ｒβ２発現を増大させる。
【０３７５】
別の実施形態では、本発明は、細胞または細胞集団のＩＬ−１２Ｒ発現を増大させる方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０３７６】
一実施形態では、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させた細胞または細胞集団のＩＬ−１２Ｒ発現のレベルを、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させていない細胞または細胞集団（例えば、対照）のＩＬ−１２Ｒのレベルと比較する場合、または本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触の前後のレベルを比較する場合、細胞または細胞集団のＩＬ−１２Ｒ発現レベルは増大している。
【０３７７】
別の実施形態では、本発明は、細胞のＩＬ−１２応答性を高める方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０３７８】
一実施形態では、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させた細胞または細胞集団のＩＬ−１２に対する応答性のレベルを、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させていない細胞または細胞集団（例えば、対照）のＩＬ−１２に対する応答性のレベルと比較する場合、または本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触の前後のレベルを比較する場合、細胞または細胞集団のＩＬ−１２に対する応答性のレベルは増大している。
【０３７９】
好ましい実施形態では、細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。
【０３８０】
上記で考察したように、本明細書記載の方法は、細胞または細胞集団に対し、インビボで（例えば、対象中で）またはインビトロで（例えば、エクスビボで）実施できる。
【０３８１】
慢性ウィルス感染症または担癌状態中に、Ｔ細胞記憶形成および機能は、最終的に宿主保護を付与する能力に影響を及ぼす、応答抗原特異的Ｔ細胞のエフェクター機能および増殖能力の段階的障害に起因してかなり変化する（Ｊｉｎ  Ｈ−Ｔ  ｅｔ  ａｌ，ＢＭＢ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１１，４４（４）：２１７−２３１）。腫瘍環境では、ＣＤ８＋腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）は、低レベルのＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒα）発現を示し、従って、ＩＬ−２シグナル伝達に対し不応性であり、それらは、増殖、エフェクターサイトカインの産生および機能的記憶細胞への分化ができない（Ｍｕｍｐｒｅｃｈｔ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，２００９，１１４：１５２８−１５３６）。例えば、ＣＭＬ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、レトロウィルス誘導マウスＣＭＬモデル化するにおけるＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＩＬ−２などのエフェクターサイトカインの産生低下を示す（Ｍｕｍｐｒｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ、前出参照）。
【０３８２】
本発明者らは、本発明のポリペプチドによる疲弊ＣＤ４＋細胞の治療が、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖、ＣＤ２５発現、およびＴＮＦαおよびＩＦＮγ産生（図１７および図１８）、ならびに治療マウス由来の脾細胞によるＩＦＮγ産生（図２７）を誘導することを示した。
【０３８３】
ＣＤ２５発現は、ＮＫ細胞の細胞傷害活性と正に相関する。本発明者らは、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＩＫ１４００４は、ルイス肺癌マウスの脾細胞中のＮＫ細胞上のＣＤ２５の相対発現を高めることを示した（図２８）。
【０３８４】
従って、一態様では、本発明は、細胞傷害性細胞機能を高める方法を提供し、方法は、細胞傷害性細胞または細胞傷害性細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させることを含む。
【０３８５】
一実施形態では、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させた細胞または細胞集団の細胞傷害性細胞機能のレベルを、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させていない細胞または細胞集団（例えば、対照）の細胞傷害性細胞機能のレベルと比較する場合、または本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触の前後のレベルを比較する場合、細胞または細胞集団の細胞傷害性細胞機能のレベルは高められている。
【０３８６】
別の実施形態では、本発明は、Ｔ細胞機能を高める方法を提供し、方法は、Ｔ細胞またはＴ細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０３８７】
本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞機能を高めること」は、持続的または増幅された生物学的機能を有するように、または疲弊したまたは不活性Ｔ細胞を再生もしくは再活性化するために、Ｔ細胞を誘導、誘発または刺激することを意味する。Ｔ細胞機能の強化の例はとしては、介入前のレベルと比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮγの分泌の増大、増殖の増大、抗原応答性（例えば、ウィルス、病原体、または腫瘍の除去）の増大、が挙げられる。一実施形態では、強化のレベルは、少なくとも５０％、あるいは、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、２００％である。この強化の測定方法は、当業者に既知である。
【０３８８】
一実施形態では、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させた細胞または細胞集団のＴ細胞機能のレベルを、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させていない細胞または細胞集団（例えば、対照）のＴ細胞機能のレベルと比較する場合、または本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触の前後のレベルを比較する場合、細胞または細胞集団のＴ細胞機能のレベルは高められている。
【０３８９】
代表的細胞傷害性細胞機能およびＴ細胞機能端本明細書で考察される。
【０３９０】
本明細書で記載のペプチドは、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖（図１７）、およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖（図３５）、および治療マウスのＮＫ細胞の増殖（図２８）を増大させる。
【０３９１】
ＣＤ４＋Ｔ細胞による樹状細胞のＣＤ４０Ｌ媒介ライセンシングは、強いＣＤ８＋応答の生成のために必要である。本発明者らは、本明細書で記載のペプチドが、ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ４０Ｌ発現を高めることを示した（図１２および図１３）。
【０３９２】
従って、一実施形態では、本発明は、Ｔ細胞上のＣＤ４０Ｌ発現を高める方法を提供し、方法は、Ｔ細胞を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０３９３】
別の実施形態では、本発明は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を高める方法を提供し、方法は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０３９４】
従って、一実施形態では、本発明は、Ｔ細胞の疲弊を低減する方法を提供し、方法は、Ｔ細胞を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０３９５】
別の実施形態では、本発明は、Ｔ細胞からのＴＮＦα分泌を増大させる方法を提供し、方法は、Ｔ細胞を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０３９６】
上記で考察したように、本明細書記載の方法は、細胞または細胞集団に対し、インビボで（例えば、対象中で）またはインビトロで（例えば、エクスビボで）実施できる。
【０３９７】
抗原および／または炎症が除去されている急性感染症の設定では、エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞は、二次感染症時に複数のサイトカイン（ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＩＬ−２）を産生でき、強いリコール応答を開始できる機能的記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞にさらに分化する。対照的に、慢性感染症中は、抗原および炎症はエフェクター作動相後にも持続する。感染症が継続し、Ｔ細胞刺激が継続されるので、Ｔ細胞は、階層的にエフェクター機能を失い、疲弊状態になる。通常、ＩＬ−２産生およびサイトカイン多機能性、ならびに高増殖能力などの機能は早期に失われる。この後に、ＩＦＮγおよびＴＮＦα産生の障害が続く。Ｔ細胞疲弊はまた、上記に示した抑制性受容体の量と多様性の漸進的増大に付随して起こり、これは、それらそれぞれのリガンドに結合時に、機能障害性Ｔ細胞を生ずる。
【０３９８】
複数の抑制性受容体の同時発現がＴ細胞疲弊の主要な特徴であることを考慮して、これらの受容体の同時標的化は、Ｔ細胞疲弊の相乗的逆転をもたらすことが示された（Ｗｈｅｒｒｙ  ＆  Ｋｕｒａｃｈｉ、前出参照）。例えば、慢性ＬＣＭＶ感染症では、マウスにおけるＩＬ−１０およびプログラム死受容体１（ＰＤ−１）経路の同時遮断は、ＣＤ８＋Ｔ細胞疲弊の相乗的逆転に繋がり、ＩＬ−２治療とＰＤ−１経路の遮断の組み合わせになるので、ウィルス制御を強化する。加えて、ＬＣＭＶマウスモデルでは、ＣＤ２５コンピテントＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＬＭＣＶで感染後、ＣＤ２５欠損Ｔ細胞よりも５倍大きい数にまで増殖することが示された（Ｂａｃｈｍａｎｎ  ＭＦ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００７，３７：１５０２−１５１２）。さらに、これらの研究者は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導および維持がＣＤ２５シグナル伝達とほとんど無関係である急性／既往感染と対照的に、ＣＤ２５シグナル伝達は、持続性ウィルス感染症中のウィルス特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の維持に重要であることを示した。
【０３９９】
別の抑制性受容体の、ＣＴＬＡ−４は、慢性ＨＩＶ感染症において、ＣＤ４＋Ｔ細胞中で選択的に発現上昇されているが、ＣＤ８＋Ｔ細胞中では発現上昇されておらず、これは、ウィルス抗原に反応したＴ細胞のＩＬ−２産生能力の低下と相関し、ＣＤ４＋Ｔ細胞機能不全と選択的に関連する可逆的調節経路を示している（Ｋａｕｆｍａｎｎ  ＤＥ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００７，８：１２４６−１２５４）。Ｔ細胞機能の階層的損失は、抗原暴露、炎症および抑制分子（ＰＤ−１、ＣＤ１６０、２Ｂ４）の発現増大の継続時間と関連している（Ｗｈｅｒｒｙ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１１）。さらには、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞によるサイトカインの分泌が減少する（例えば、ＩＬ−２、ＴＮＦαおよびＩＦＮγ）。同時に、慢性的感染ＨＩＶ−１患者などの慢性敗血症の状態では、ＨＩＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の表現型は、チェックポイント分子（例えば、ＰＤ−１、ＣＤ１６０）の蓄積を明らかにする。
【０４００】
Ｔ細胞疲弊は、慢性ＨＩＶ感染症の間の病原体除去失敗の重要な因子である可能性が高く、一部は、負の調節経路により調節される（Ｐｏｒｉｃｈｉｓ  Ｆ  ＆  Ｋａｕｆａｍｍ  ＤＥ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  ＨＩＶ  ＡＩＤＳ，２０１１，６（３）：１７４−１８０で概説されている）。例えば、ＨＩＶ感染対象では、ＣＴＬＡ−４抑制性免疫調節受容体ならびにプログラム細胞死受容体−１（ＰＤ−１）は、ＣＤ４＋Ｔ細胞中で発現上昇されているが、ＣＤ８＋Ｔ細胞中では、発現上昇されていない（Ｋａｕｆｍａｎｎ  ＤＥ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００７，８：１２６４−１２５４）。これは、ＣＤ４＋Ｔ細胞がウィルス抗原に反応してＩＬ−２を産生する能力がないことと相関する。ＨＩＶ患者由来のＴ細胞は、ＩＬ−２を産生する能力が障害され、リコール抗原に対する増殖性応答がＨＩＶ感染症では早期に妨害されており、ＩＬ−２によりインビトロで回復できる（Ｆａｕｅｒ  ＡＳ  ＆  Ｐａｎｔｅｌｅｏ  Ｇ（Ｅｄｓ），Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ＨＩＶ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，ｄｏｉ：１０．１００７／９７８−３−６４２−６０８６７−４，ｐｐ  ４１−４２）。
【０４０１】
従って、高レベルの抗原の場合、ＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖の抑制は、ウィルス特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の前駆細胞頻度が制限される機序によるものであり得る（ＭｃＮｅｉｌ  ＡＣ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，２００１，９８：１３８７８−３８８３）。さらに、ＰＤ−Ｌ１遮断抗体によるＰＤ−１経路の遮断は、ＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を増大させる（Ｐｏｒｉｃｈｉｓ  ＆  Ｋａｕｆｍａｎｎ、前出参照）。
【０４０２】
しかし、ＣＤ４＋Ｔ細胞のみが疲弊し、その後の抗原刺激に対し無効力になるだけでなく、ＣＤ８＋Ｔ細胞も同様である。ＨＩＶ感染症では、ＣＤ４＋Ｔ細胞の減少は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の疲弊の増加および疾患進行と関連し、ＣＤ８＋Ｔ細胞疲弊に対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答の変化の影響は、大いに関連性がある（Ｗｈｅｒｒｙ  ＥＪ  ＆  Ｋｕｒａｃｈｉ  Ｍ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２０１５，１５：４８６−４９９）。疲弊したＣＤ８＋Ｔ細胞はまた、高発現のＰＤ−１を有するが、一方、老化細胞は、それを有さない（Ｗｈｅｒｒｙ  ＆  Ｋｕｒａｃｈｉで概説、前出参照）。さらに、ＩＬ−２治療とＰＤ−１媒介阻害経路の遮断の組み合わせは、疲弊したＣＤ８＋Ｔ細胞を再活性化し、ウィルス量を低減するための顕著な相乗効果を有することが示された（Ｗｈｅｒｒｙ  ＆  Ｋｕｒａｃｈｉ、前出参照）。ＨＩＶ−１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のエクスビボ増殖は、ＩＬ−２に大きく依存する（Ｌｉｃｈｔｅｒｆｉｅｌｄ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，ＪＥＭ，２００４，２００：７０１−７１２）。まとめると、慢性感染症におけるＨＩＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞機能の低下は、ＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞ヘルパー機能の増強により、回復できる。
【０４０３】
Ｔ細胞疲弊の別の表現型マーカーは、Ｔｉｍ−３およびＰＤ−１が慢性ウィルス感染症におけるＣＤ８  Ｔ細胞機能不全を回復する最も効果的な手段である可能性があるという提案に繋がったＣＤ８＋Ｔ細胞上のＴｉｍ−３発現である（Ｊｉｎ  ＨＴ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，２０１０，１０７（３３）：１４７３３−８）。さらに、最近の文献は、Ｔｉｍ−３との関連で、ＣＤ８＋Ｔ細胞疲弊におけるＬｃｋの潜在的重要性を強調する。例えば、Ｔｉｍ−３の生理学的リガンドであるガレクチン−９は、受容体ホスファターゼＣＤ４５に結合し、これは、高レベルで存在する場合には、Ｌｃｋ上のＹ３９４を脱リン酸化し、それにより、Ｌｃｋ活性を低減させる（Ｃｌａｙｔｏｎ  ＫＬ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１４，１９２（２）：７８２−７９１）。
【０４０４】
さらに、ガレクチン−９は、Ｔｉｍ−３ならびにＣＤ３シグナル伝達ラフト内のＣＤ４５のレベルを高めることができ、シナプスでの高濃度のこのホスファターゼは、Ｌｃｋが負に制御され、ＴＣＲシグナル伝達の抑制に至る手段であるとして提案された（Ｃｌａｙｔｏｎ  ＫＬ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１４，１９２（２）：７８２−７９１）。加えて、ＴＣＲの抗ＣＤ３／ＣＤ２８とのライゲーションにより活性化されたＴ細胞由来の細胞ライセートの分析は、ＬｃｋのＴｉｍ−３への動員をもたらし、Ｔｉｍ−３によるＬｃｋの隔離は細胞内Ｌｃｋプールを枯渇させ、ＴＣＲ鎖上のＩＴＡＭモチーフのリン酸化を妨害することにより、ＴＣＲの不完全な活性化を生ずることも提唱された（Ｔｏｍｋｏｗｉｃｚ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ，２０１５，１０（１０）：ｅ０１４０６９４（ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１４０６９４）。
【０４０５】
癌の場合、今日では、腫瘍は、特定の免疫チェックポイント経路を、特に、腫瘍抗原に特異的なＴ細胞に対する免疫耐性の主要機序として利用することが明らかになっており、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）の抗体遮断薬を用いる臨床試験は、持続性のある臨床的応答を生成する潜在力を有する強化された抗腫瘍免疫を示した（Ｐａｒｄｏｌｌ  ＤＭ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ，２０１２，１２：２５２−２６４）。
【０４０６】
ＣＴＬＡ−４は活性化ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞により発現されるものではあるが、ＣＴＬＡ−４の主要な生理学的役割は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の２つの主要なサブセットに対する別々の効果：ヘルパーＴ細胞活性の抑制的調節および調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞免疫抑制活性の強化、を介するものであるように思われる。しかし、癌免疫療法でのＰＤ−１経路の遮断はまた、腫瘍内Ｔｒｅｇ細胞の数および／または抑制活性を漸減させることにより、免疫応答を高め得る（Ｐａｒｄｏｌｌ、前出参照）。さらに、ＰＤ−１遮断は、組織中および腫瘍微小環境中のエフェクターＴ細胞の活性を強化するのみでなく、おそらく、腫瘍中のナチュラルキラー細胞活性およびＰＤ−１  Ｂ細胞に対する直接的作用による抗体産生も強化する（Ｐａｒｄｏｌｌ、前出参照）。癌では、主要な発現ＰＤ−１リガンドは、ＰＤ−Ｌ１であり、ＰＤ−Ｌ１の高発現は、ほぼ全ての癌型で認められている（Ｐａｒｄｏｌｌ、前出参照）。従って、１つまたは複数の抑制性チェックポイントを単独でまたは組み合わせて標的とする治療は、癌の全身制御に対する大きな可能性を有すると考えられる（Ａｌｌｉｓｏｎ  ＪＰ，ＪＡＭＡ，２０１５，３１４（１１）：１１１３−１１１４；Ｃｒｅｅｌａｎ  ＢＣ，ｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌ，２０１４，２１（１）：８０−９）。
【０４０７】
本発明者らは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ポリペプチドは、チェックポイント阻害剤ＰＤ−Ｌ１の存在下で、ＩＬ−２分泌をレスキューできることを示した（図１６）。
【０４０８】
従って、一実施形態では、本発明は、対象の癌を治療または予防する方法を提供し、方法は、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。別の実施形態では、本発明は、対象の癌を治療または予防する方法を提供し、方法は、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物をチェックポイント阻害剤と順次にまたは同時に対象に投与することを含む。
【０４０９】
代表的癌は、本明細書で言及される。
【０４１０】
別の実施形態では、本発明は、対象の免疫応答を活性化する方法を提供し、方法は、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。
【０４１１】
本発明者らは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ポリペプチドが、Ｔｒｅｇ細胞の比率を減らし、抗ＰＤ１抗体と相乗的に作用することを示した（図９）。
【０４１２】
従って、一実施形態では、本発明は、細胞集団中のＴｒｅｇ細胞の比率を減らす方法を提供し、方法は、Ｔｒｅｇ含有細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０４１３】
一実施形態では、本発明は、対象のＴｒｅｇ細胞の比率を減らす方法を提供し、方法は、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。
【０４１４】
別の実施形態では、本発明は、対象の免疫抑制を低減させる方法を提供し、方法は、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。
【０４１５】
ＰＤ−１標的療法による疲弊したＣＤ８＋Ｔ細胞のレスキューは、ＣＤ２８依存性である。本発明者らは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ポリペプチドが、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞中のＣＤ２８の発現を高めることを示した。
【０４１６】
従って、一実施形態では、本発明は、対象のＴ細胞の疲弊を減らす方法を提供し、方法は、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。別の実施形態では、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物が、チェックポイント阻害剤と順次にまたは同時に投与される。
【０４１７】
癌
低減した細胞免疫は、多くの癌および高レベルのプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）に関連する。ホジキンリンパ腫におけるＣＤ４＋細胞は、インビトロでＴ細胞中のＰＧＥ２による健常者とは変化した類似の遺伝子調節を示し、これには、Ｌｃｋの不活性化およびＺＡＰ７０の低減したリン酸化を含むことが示された（Ｃｈｅｍｎｉｔｚ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６，６６：１１１４）。
【０４１８】
ホジキンリンパ腫および他の腫瘍では、機能不全ＣＤ４＋Ｔ細胞活性化のために細胞免疫が低下し、ホジキンリンパ腫に関連する高レベルのＰＧＥ２がＬｃｋを抑制することによりＣＤ４＋Ｔ細胞機能を抑制することが示唆された（Ｃｈｅｍｎｉｔｚ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ，２００６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，６６（２），＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｃｍｄ＝Ｒｅｔｒｉｅｖｅ＆ｄｂ＝ｐｕｂｍｅｄ＆ｄｏｐｔ＝Ａｂｓ  ｔｒａｃｔ＆ｌｉｓｔ＿ｕｉｄｓ＝１６４２４０４８＆ｑｕｅｒｙ＿ｈｌ＝５＆ｉｔｏｏｌ＝ｐｕｂｍｅｄ＿ｄｏｃｓｕｍ＞）。Ｌｃｋはまた、薬剤耐性でも重要な役割を果たし、Ｌｃｋ欠損のＴ細胞は抗癌剤に対し耐性があることが示された（Ｓａｍｒａｊ  ＡＫ  ｅｔ  ａｌ，２００６，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２５：１８６−１９７，＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｃｍｄ＝Ｒｅｔｒｉｅｖｅ＆ｄｂ＝ｐｕｂｍｅｄ＆ｄｏｐｔ＝Ａｂｓ  ｔｒａｃｔ＆ｌｉｓｔ＿ｕｉｄｓ＝１６１１６４７３＆ｑｕｅｒｙ＿ｈｌ＝１８＆ｉｔｏｏｌ＝ｐｕｂｍｅｄ＿ｄｏｃｓｕｍ＞）。  
【０４１９】
シタラビンは、急性骨髄性白血病の治療で使用される最も効果的な化学療法剤の１つである（Ｆｒｅｉ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１９６９，２９：１３２５−１３３２）。セリン／トレオニンキナーゼのｐ３４ｃｄｃ２キナーゼは、サイクリンＡおよびＢと複合体形成し、ｐ３４ｃｄｃ２活性は、細胞分裂の開始のために必要である。従って、ｐ３４ｃｄｃ２は、ＤＮＡ合成の完了およびＤＮＡ損傷の存在を監視する有糸分裂チェックポイントとなる（Ｎｕｒｓｅ  Ｐ，Ｎａｔｕｒｅ，１９９０，３４４：５０３−５０７）。しかし、ＤＮＡ複製の状態は、ｐ３４ｃｄｃ２のセリン／トレオニン活性に依存する一方で、これは、Ｔｙｒ１５上のｐ３４ｃｄｃ２のインビボでのリン酸化により調節され（Ａｔｈｅｒｔｏｎ−Ｆｅｓｓｌｅｒ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１９９３，１３：１６７５−１６８５）、ｐ３４ｃｄｃ２のセリン／トレオニン活性は、ｐ３４ｃｄｃ２の触媒サブユニット中のＴｙｒ１５のリン酸化により抑制されることが示された（Ｇｏｕｌｄ  Ｋ  ＆  Ｎｕｒｓｅ  Ｐ，Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３４２：３９−４４）。Ｌｃｋキナーゼは、ｐ３４ｃｄｃ２のＴｙｒ１５をリン酸化することが示され（Ｄｒａｅｔｔａ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，３３６：７３８−７４４）、白血病および他の固形癌の治療におけるＬｃｋ活性化剤の潜在的役割を示唆している。
【０４２０】
ゾレドロン酸およびＩＬ−２の組み合わせによる末梢血血中のリンパ球のエクスビボまたはインビボ刺激による癌免疫療法のためのγ／δ  Ｔリンパ球の標的化は、以前に記載され（Ｇｏｍｅｓ  ＡＱ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２０１０，ｄｏｉ：１０．１１５８／０００８−５４７２．ＣＡＮ−１０−３２３６；Ｄｉｅｌｉ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００７，６７（１５）：７４５０−７；Ｗｉｌｈｅｌｍ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，２００３，１０２（１）：２００−６）、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤は、γ／δＴ細胞をエクスビボで生成するためのＩＬ−２の使用の代替物として機能し、乳癌、前立腺癌からリンパ系悪性腫瘍までの範囲の悪性腫瘍の患者のための治療投与への用途を有し得る（Ｄｉｅｌｉ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ，ｖｉｄｅ  ｓｕｐｒａ；Ｗｉｌｈｅｍ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ  ｖｉｄｅ  ｓｕｐｒａ；Ｃａｐｉｅｔｔｏ  ＡＨ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１１，１８７（２）：１０３１−８）。加えて、腫瘍細胞に対するγ／δ  Ｔ細胞傷害性は、リツキシマブおよびトラスツズマブを含む組み合わせ方式で強化されることが示され（Ｔｏｋｕｙａｍａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，２００８，１２２（１１）：２５２６−３４３；Ｃａｐｉｅｔｔｏ  ＡＨ、前出参照）、本発明は、上述の抗癌剤、および／または本発明による癌または他の疾患もしくは状態のための他の薬物との併用療法による本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤の使用にまで及ぶ。
【０４２１】
本発明者らは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドが、
・腹腔内または経口投与される場合、肺転移を低減する（図２２）；
・ルイス肺癌（ＬＣＣ）モデルにおいて腫瘍面積を減らす（図２３）；
・ルイス肺癌モデルにおいて、異種移植片腫瘍体積および腫瘍細胞生存率を低下させ、腫瘍中のＣＤ４５＋細胞の比率を増大させる（図２４）；
ＴＣＲ刺激後に、ペプチド治療されたルイス肺癌マウスから取り出した脾細胞からのＩＦＮγおよびＩＬ−２放出を増大させる（図２５）；
・ペプチド治療されたルイス肺癌マウスから取り出した脾細胞のＴＣＲ刺激後に、ＩＬ−１２Ｒβ１およびＩＬ−１２Ｒβ２発現ＣＤ４＋Ｔ細胞の比率を増大させる（図２６）；
・ペプチド治療されたルイス肺癌マウス由来の脾細胞単細胞懸濁液（活性化されない）中のＩＬ−１２Ｒβ２の発現を増大させる（図２７）；
・ペプチド治療されたルイス肺癌マウス由来の脾細胞中のＮＫ細胞上のＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒα）、ＣＤ２１５（ＩＬ−１５Ｒ）、ＣＤ２８およびＮＫ細胞の発現を高める（図２８）；および
・ペプチド治療されたルイス肺癌マウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＣＲ刺激の存在下でＩＬ−１２Ｒβ２の発現を増大させる（図２９）
ことを示した。
【０４２２】
従って、一実施形態では、本発明は、対象の肺癌を治療する方法を提供し、方法は、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。
【０４２３】
従って、一実施形態では、本発明は、対象の肺癌を予防する方法を提供し、方法は、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。
【０４２４】
多発性骨髄腫／白血病／リンパ腫
ホジキンリンパ腫に対するＩＬ−２およびＩＬ−１２の同時標的化は、休止ＮＫ細胞および腫瘍細胞溶解の活性化を強化する（Ｈｏｍｂａｃｈ  Ａ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，２００５，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｉｊｃ．２０８２９）。本発明者らは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドが、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞中のＣＤ１０７ａ（脱顆粒マーカー）発現（図３３）、ならびにＮＫ細胞上のＮＫｐ４４およびＮＫＧ２Ｄの発現（図２１）を高めることを示した。ＮＫｐ４４およびＮＫＧ２Ｄは、細胞溶解に関与する活性化受容体である。
【０４２５】
本発明者らはまた、本明細書で記載のペプチドが、ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上の（図１０）および治療マウスのＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上の（図２６、図２７および図２９）ＩＬ−１２Ｒβ２発現を高めることを示した。本明細書で記載のペプチドはまた、ＮＫ細胞上の（図１１）、および治療マウスのＮＫ細胞上の（図２７）ＩＬ−１２Ｒβ１／ＩＬ−１２Ｒβ２発現を増大させる。本発明者らはまた、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞（図１７、図１９）を含む、Ｔ細胞上のＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）発現を増大させる（図３）ことも示した。
【０４２６】
急性骨髄性白血病では、乱れたＴ細胞機能の複数の側面が診断時に作用し、疲弊および老化が主要な過程である（Ｋｎａｕｓ  ＨＡ  ｅｔ  ａｌ，ＪＣＩ  Ｉｎｓｉｇｈｔ，２０１８，ｄｏｉ：１０．１１７２／ｊｃｉ．ｉｎｓｉｇｈｔ．１２０９７４）。実際に、急性および慢性白血病の患者のＴ細胞は、ＰＤ−１またはＴＩＭ−３などの疲弊マーカーを発現し、不十分な応答、例えば、機能不全増殖およびＩＬ−２およびＩＦＮγの低減した産生であり得る（Ｓｉｓｋａ  ＰＪ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，２０１４，１２４：４１２１）。本発明者らは、本発明のポリペプチドによる疲弊ＣＤ４＋細胞の治療が、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖、ＣＤ２５、およびＴＮＦαおよびＩＦＮγ産生発現を誘導することを示した（図１７および図１８）。
【０４２７】
本発明者らはまた、本明細書で記載のペプチドが、ヒトＴ細胞からのＩＬ−２分泌を増大させることも示した（図１４、図１５、図３７、図３８、図４０）。
【０４２８】
多発性骨髄腫（ＭＭ）は、悪性のプラズマ細胞のクローン増殖を特徴とする進行性Ｂ系統腫瘍である。多発性骨髄腫中のＴ細胞はまた、腫瘍部位で疲弊および老化の特徴を示し、Ｔ細胞サブセットの数と機能は、ＭＭ患者では異常であり；例えば、ＣＤ４：ＣＤ８比率は逆転し、ＣＤ４細胞中のヘルパーＴ細胞１型：２型（Ｔｈ１：Ｔｈ２）比率は異常であり、Ｔ細胞活性化に必要なＣＤ２８発現レベルは、Ｔ細胞中で下方制御されており、ＭＭ患者から循環する樹状細胞は機能障害性である（Ｓｈａｒａｂｉ  Ａ  ＆  Ｈａｒａｎ−Ｇｈｅｒａ  Ｎ，Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｒｅｓ，２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ２６９５１９で概説されている）。本発明者らは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドが、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ２８発現を高めることを示した（図２０）。
【０４２９】
重要なのは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドによる細胞の前処理が、抗原刺激の前に、ヒトＴ細胞からのＩＬ−２分泌を増大させることである（例えば、図３４参照）。
【０４３０】
従って、本発明は、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドが予防的に、例えば、疾患の症状の発生前に、抗原刺激の前に、病原体への暴露の前に、等々に、投与される、方法および使用を提供する。
【０４３１】
別の態様では、本発明は、疾患または障害のない個体における免疫機能を強化する方法を提供し、方法は、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドの有効量を対象に投与することを含む。
【０４３２】
加えて、骨髄腫腫瘍部位由来のＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ３／ＣＤ２８インビトロ刺激後にＩＦＮγを産生できず、Ｔ細胞刺激物質に応答して脱顆粒する能力の低下を示す（Ｚｅｌｌｅ−Ｒｉｅｓｅｒ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ＆  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０１６，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／ｓ１３０４５−０１６−０３４５−３０）。ＭＭにおける機能不全免疫応答は、ＭＭ患者の末梢血中の機能的に活性な免疫抑制Ｔｒｅｇの増大によりさらに強調される（Ｄｏｓａｎｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１５，５：ｅ３０６で概説されている）。
【０４３３】
本発明者らはまた、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ポリペプチドが、免疫抑制Ｔｒｅｇ細胞の比率を減らすことを示した（図８および図９）。
【０４３４】
腫瘍浸潤リンパ球中のＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の存在は、様々なタイプのヒト癌での予後不良と相関する。本発明者らは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ポリペプチドが、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞を減らすことを示した（図８および図９）。
【０４３５】
従って、本発明は、細胞集団中のＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の比率を減らす方法を提供し、方法は、細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０４３６】
ＩＬ−２１は、免疫抑制Ｔｒｅｇを抑制する。本発明者らは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ポリペプチドが、Ｔ細胞によるＩＬ−２１産生を高めることを示した（図７）。
【０４３７】
重要なことに、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２が抗ＰＤ−１抗体（ペムブロリズマブ）と組み合わされた場合、ＰＢＭＣ内のＴｒｅｇ（Ｆｏｘｐ３＋）の比率は意外にも有意にさらに低減され、抗ＰＤ−１抗体およびＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２が相乗的に作用することを示す（図９）。
【０４３８】
従って、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドは、本明細書で記載のＴｒｅｇ細胞の比率を減らす生理学的効果を強化するために使用できる。
【０４３９】
一実施形態では、本発明は、細胞集団中のＴｒｅｇ細胞の比率を減らす方法を提供し、方法は、Ｔｒｅｇ含有細胞集団を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０４４０】
一実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞はＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞である。
【０４４１】
一実施形態では、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させた細胞集団中のＴｒｅｇの比率を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドと接触させていない細胞集団（例えば、対照）中のＴｒｅｇの比率と比較する場合、または本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触の前後で比較する場合、細胞集団中のＴｒｅｇの比率は減少している。
【０４４２】
アルツハイマー病（ＡＤ）
アルツハイマー病は、認知症の主要な原因であり、神経の変性および消失ならびに老人斑および神経原線維濃縮体の生成を特徴とする。
【０４４３】
ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路チェックポイント阻害剤は、近年、遺伝子導入マウスモデルで、脳中の単球由来マクロファージ集団のＩＦＮγ依存性増大を誘発し、脳アミロイドの除去および認知障害の改善を行うことにより、ＡＤを回復させることが報告された（Ｂａｒｕｃｈ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ，２０１６，２２：１３５−３７）。本明細書に記載のように、少なくともいくつかの実施形態では、本発明で利用される化合物は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用により抑制された免疫応答をレスキューし得る。
【０４４４】
さらに、Ｌｃｋは、神経突起成長の調節に関与し、臨床的報告は、ＡＤ患者の海馬中のＬｃｋの下方調節レベルについて記載した（Ｈａｔａ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ，ＢＢＲＣ，２００１，２８４：３１０−３１６）。実際に、ヒトＬｃｋ遺伝子は、アルツハイマー病関連遺伝的結合領域１ｐ３４〜３６に位置している（Ｂｌａｃｋｅｒ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ，２００３，１２：２３−３２）。最近の哺乳動物脳中のＬｃｋのインビトロおよびインビボでの機能的特性評価は、Ｌｃｋが、記憶の取得と維持の重要なメディエーターであり、これは、ＡＤで最も顕著に障害されたプロセスであることをさらに示唆している（Ｋｉｍ  Ｅ−Ｊ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ，２０１２，ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ０００１８−１０２−１１６８−１）。
【０４４５】
本発明者らは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ポリペプチドは、チェックポイント阻害剤ＰＤ−Ｌ１の存在下で、ＩＬ−２分泌をレスキューできることを示した（図１６）。
【０４４６】
ＨＩＶ感染症
Ｌｃｋは、ＣＤ４とＣＤ８の両方に結合しているが、Ｌｃｋ活性は、ＣＤ４に結合した場合の方がより高い（Ｄｅｌｖｅｓ  ＰＪ  ａｎｄ  Ｒｏｉｔｔ  ＩＭ，ｅｄｉｔｏｒｓ．１９９８．Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）。ＨＩＶは、ＣＤ４＋細胞の枯渇を特徴とし、Ｎｅｆを欠くＨＩＶ株はＡＩＤＳにまで進行しない（Ｏｌｓｚｅｗｓｋｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ，２００４，ＰＮＡＳ．ＵＳＡ，１０１（３９）：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｎａｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｆｕｌｌ／１０１／３９／１４０７９）。ＨＩＶ感染症におけるＬｃｋの重要な役割は十分に認識されている。例えば、不活性Ｌｃｋ発現細胞は、加速されたウィルス複製を示すが、一方、通常のまたは高い酵素活性を有するＬｃｋ発現細胞は、初期内在性Ｌｃｋ酵素活性に比例して、ウィルス複製の遅延を示す（Ｙｏｕｓｅｆｉ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ，２００３，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ＆  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１３３（１）：７８−９０）。
【０４４７】
Ｎｅｆ遺伝子は、霊長類レンチウィルス（ヒト免疫不全１型（ＨＩＶ−１）、２型（ＨＩＶ−２）、およびサル免疫不全ウィルス（ＳＩＶ））に特有であり、約２５ｋｄのミリストイル化膜結合タンパク質をコードする（Ｇｒｅｅｎｗａｙ  ＡＬ  ｅｔ  ａｌ，１９９９，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．，７３（７）：６１５２−６１５８）。細胞レベルでは、Ｎｅｆは、ＣＤ４、インターロイキン２受容体、ＭＨＣクラスＩを含む細胞表面受容体のレベルを低減させ、細胞内シグナル伝達を妨害し、特定のサイトカイン産生を低下させる（Ｇｒｅｅｎｗａｙ  ＡＬ  ｅｔ  ａｌ，１９９９（前出参照）で概説されている）。
【０４４８】
Ｎｅｆは、Ｔ細胞拘束性Ｌｃｋチロシンキナーゼ（リンパ球タンパク質チロシンキナーゼ）と直接に相互作用し、インビトロおよびインタクト細胞中の両方でＬｃｋキナーゼ活性を低減させ、それにより、近位および遠位Ｌｃｋ媒介シグナル伝達イベントの両方の障害を生ずる（Ｃｏｌｌｅｔｔｅ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ，１９９６，ＪＢＣ，２７１：６３３３−６３４１）。ＬｃｋのＮｅｆへの結合は、他のビリオンまたは細胞質タンパク質を必要としない。その理由は、Ｌｃｋの触媒活性の抑制は、精製ＬｃｋとＨＩＶ−１  ＮｅｆまたはＳＩＶタンパク質との間で起こることが示されているためであり、Ｎｅｆ媒介病態形成の複雑さを示している。
【０４４９】
具体的には、ＮｅｆはＬｃｋのＳＨ３ドメインに結合し、Ｌｃｋ触媒活性の抑制をもたらし（Ｃｏｌｌｅｔｔｅ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ，１９９６，ＪＢＣ，２７１：６３３３−６３４１；Ｇｒｅｅｎｗａｙ  Ａ  ｅｔ  ａｌ，１９９６，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，７０（１０）：６７０１−６７０８；Ｇｒｅｅｎｗａｙ  ＡＬ  ｅｔ  ａｌ，１９９９，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，７３（７）：６１５２−６１５８）、Ｌｃｋの活性化剤の開発は、抗レトロウィルス治療法の開発を補完し得る。
【０４５０】
Ｌｃｋは、Ｔ細胞中でインターロイキン２（ＩＬ−２）刺激時に活性化される唯一のファミリーキナーゼである（Ｂｒｏｃｋｄｏｒｆｆ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，２０００，Ｅｕｒ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ．，１１（２）：２２５−２３１）にもかかわらず、以前の研究は、ＨＩＶ感染症の患者のＩＬ−２療法は抗レトロウィルス療法単独の使用を超える臨床的便益を付加しないことを示唆し、ＣＤ４＋細胞数のかなりの持続的増大が観察された（Ｔｈｅ  ＩＮＳＩＧＨＴ−ＥＳＰＲＩＴ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ  ａｎｄ  ＳＩＬＣＡＡＴ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ，Ｎ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ，２００９，３６１：１５４８−１５５９）。しかし、さらに最近のデータは、ＨＩＶ  ＤＮＡまたはタンパク質ワクチン剤と共に、ＩＬ−２のアジュバントとしての投与が、将来のＨＩＶワクチン試験デザインで考慮されるべきであることを示唆し（Ｂａｄｅｎ  ＬＲ  ｅｔ  ａｌ，２０１１，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，２０４（１０）：１５４１−１５４９）、いくつかの感染細胞株においてＩＬ−２は実際に、ＨＩＶ−１複製を抑制する（Ｒａｐｈａｅｌ  ＭＯ  ｅｔ  ａｌ，２０１３，ＪＢＣ，ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１３．４６８９７５）。
【０４５１】
これらの報告は、Ｔ細胞発生および活性化および従って獲得免疫応答のためのＬｃｋの重要性を強調している（Ｓｔｉｒｎｗｅｉｓｓ  Ａ  ｅｔ  ａｌ，２０１３，Ｓｃｉ  Ｓｉｇｎａｌ，６（２６３）：ｒａ１３．Ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｓｉｇｎａｌ．２００３６０７）。
【０４５２】
重要なことに、本発明者らは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチド（ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２）が、末梢血Ｔ細胞中でＨＩＶ複製を抑制することを示した（例えば、図４２）。
【０４５３】
本発明者らはまた、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチド（ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２）が、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を誘導することを示した（例えば、図１７）。
【０４５４】
従って、一実施形態では、本発明は、対象のＨＩＶ感染症を治療する方法を提供し、方法は、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。
【０４５５】
その他の病原性感染症
ウィルス、細菌、原虫および寄生生物に起因する感染症に抵抗するための適切な免疫応答は、特定のキナーゼ活性の欠如によりそこなわれ、微生物の複製および細胞への侵入を容易にし、および／または効果的な免疫応答を抑制する。
【０４５６】
例えば、多くの細菌性病原菌が、宿主細胞と完全に結合する。一部は、細胞表面に結合したままで残るが、他のものは、内部移行する。腸内粘膜中のγ／δ上皮内Ｔ細胞は、隣接上皮細胞とのクロストークを介して侵入細菌の存在を検出でき、腸内微生物叢と共に恒常性を維持する免疫防御の階層の不可欠な要素である（Ｉｓｍａｉｌ  ＡＳ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ，２０１１，１０８：８７４３−８７４８）。
【０４５７】
細菌が浸潤後細胞内でそれらの生活環を確立できる高度に保存された進化手段は、細菌により産生されたＵＤＰ糖加水分解酵素を介する。これらは、ＵＤＰ糖加水分解酵素および５’−ヌクレオチダーゼ活性を有する二官能性の酵素である。例えば、大腸菌は、ＵＤＰ糖加水分解酵素を産生でき、この生成物は、Ｌｃｋ活性を著しく抑制する（Ｂｅｒｇｅｒ  ＳＡ  ｅｔ  ａｌ，ＪＢＣ，１９９６，２７１：２３４３１−２３４３７）。具体的には、ＨｅＬａ細胞の大腸菌による感染後、この比較的非特異的ヌクレオチダーゼは、アデノシンの蓄積を生じ、これは、Ｌｃｋ抑制に直接関与する。さらに、ＵＤＰ糖加水分解酵素の過剰発現は、一旦ＨｅＬａ細胞内に入った細菌の生存を強化することを示した。細胞内のＡＴＰの減少は、Ｌｃｋ抑制の原因ではなく、むしろ、原因は、ＡＤＰ、ＡＭＰおよびアデノシンの蓄積であり（Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ、前出参照）、これらの研究者により、他の病原体も、感染状況中にこの酵素を用い得ることが提唱された。実際に、カンジダ・アルビカンス培養物は、好中球機能を抑制する原因であることが示されたアデノシンを含む（Ｓｍａｉｌ  ＥＨ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９２，１４８：３５８８−３５９５）。
【０４５８】
細菌性赤痢の原因物質であるフレクスナー赤痢菌はまた、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞にインビトロで侵入し、化学誘引物質刺激に向かうＴ細胞遊走を抑制し、また、獲得免疫刺激部位内（すなわち、リンパ節）のインビトロＴ細胞動力学を低下させ、それにより、細菌に対する効率的免疫応答の誘導を妨げる（Ｎｏｔｈｅｌｆｅｒ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，２０１４，２１１（６）：１２１５；Ｓａｌｇａｄｏ−Ｐａｂｏｎ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ，２０１３，１１０：４４５８−４４６３、で概説されている）。さらに、細菌性赤痢マウスモデルでは、Ｕｎｃ１１９による治療は、赤痢菌感染症を抑制する（Ｖｅｐａｃｈｅｄｕ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ，ＰＬＯＳ  ｏｎｅ，２００９，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００５２１１）。逆に、Ｕｎｃ１１９ノックダウンは、細菌侵入および死亡率を高めることが示された。同様に、Ｕｎｃ１１９ノックダウン後のＴＨＰ−１のウシ結核菌ＢＣＧ感染症の高められた感染力が報告され、Ｕｎｃ１１９の作用は赤痢菌に特異的ではないことを示唆している（Ｖｅｐａｃｈｅｄｕ  ｅｔ  ａｌ、前出参照）。Ｕｎｃ１１９の抑制効果は、そのＡｂｌファミリーキナーゼとの相互作用が原因であり、Ｓｒｃファミリーキナーゼによる媒介によるものではなかった。これについては研究されなかった。さらに、Ｕｎｃ１１９ノックダウンは、用いた細胞株では、二重赤痢菌感染（ｄｏｕｂｌｅ  Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）であることが明らかになった。本発明まで、選択的Ｌｃｋ活性化剤は、以前に報告されたことがなかったと考えられている。（Ｂａｅ  Ｏ−Ｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２，３２（２１）：７２７８−７２８６）。最近報告されたデータは、Ｕｎｃ１１９はＴ細胞中のＬｃｋを活性化できることを示唆するが、Ｕｎｃ１１９およびそのＳＨ３ペプチドモチーフの両方は、Ｌｃｋだけでなく、Ｓｒｃキナーゼファミリー中のＨｃｋ、ＬｙｎおよびＦｙｎキナーゼメンバーも同様に活性化することが示された（Ｃｅｎ  Ｏ  ｅｔ  ａｌ，ＪＢＣ，２００３，２７８：８８３７−８８４５；Ｇｏｒｓｋａ  ＭＭ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，２００４，１９９（３）：３６９−３７９）。従って、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤は、代用抗生物質として作用し、または従来の抗生物質療法に対する補完療法として機能し得、本発明は、全てのこのような使用にまで拡張される。
【０４５９】
マラリアは、肝細胞および赤血球に感染するマラリア原虫種により引き起こされる非常に蔓延している疾患である。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、慢性血液期マラリアに対し保護し、ＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇は、寄生生物の除去を遅らせ、これらの細胞を慢性疾患に対する保護に関係づける（Ｗｙｋｅｓ  ＭＮ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１３，５：１２０４−１２１３で概説されている）。さらに、プログラム細胞死１受容体（ＰＤ−１）を介したシグナル伝達がＨＩＶ特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させると考えられているのと全く同じように、ＰＤ−１は、マラリア寄生生物特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の減少および枯渇、およびより少ない程度でＣＤ４＋Ｔ細胞の機能の低下を媒介することが示された（Ｗｙｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ、前出参照）。重要なのは、最近、ＰＤ−１ノックアウトマウスでは、ＣＤ８＋Ｔ細胞により高められたＩＦＮγ分泌は、マラリア感染に対する保護に関連付けられることが示され、将来のマラリアワクチン剤はＣＤ８＋Ｔ細胞の応答性を高めることを考慮すべきであるという提案に至ったことである（Ｗｙｋｅｓ  ＭＮ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１６，６：２６２１０）。本明細書に記載のように、少なくともいくつかの実施形態では、本発明の方法により利用される化合物は、例えば、疲弊したマウスＣＤ４＋Ｔ細胞、ヒト末梢血単核球および例えば、ＣＤ８＋発現ジャーカット細胞中のＩＦＮγ分泌を強化でき、それにより、マラリアの治療における一定の役割を示し、このための本明細書に記載の化合物の使用は、明示的に包含される。
【０４６０】
例えば、ヘルペスウィルスサイミリチロシンキナーゼ相互作用タンパク質（Ｔｉｐ）がＬｃｋと物理的に相互作用し、安定発現している細胞株中でＬｃｋ活性を抑制することを考慮すると、Ｔリンパ球向性ウィルス、例えば、ヘルペスウィルスは、Ｌｃｋ活性化剤のための、および本発明により実施される方法のための特定の標的である（Ｉｓａｋｏｖ  Ｎ  ａｎｄ  Ｂｉｅｓｉｎｇｅｒ  Ｂ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２０００，２６７（１２）：３４１３−２１）。
【０４６１】
さらに、エボラウィルス属およびマールブルグウィルス属で代表されるフィロウィルスは、ヒトおよび非ヒト霊長類の致死性出血熱の原因である。このウィルスは、Ｂリンパ球およびＴリンパ球の数を減らすことにより免疫系を攻撃する。ＣＤ４およびＣＤ８リンパ球などのＢ細胞およびＴ細胞は、免疫制御因子としてサイトカインを産生するのに必要であり、２，３日内に死亡する患者は、アポトーシスによりＢ細胞およびＴ細胞数が減少していることが示された。Ｔ細胞は、ウィルス感染細胞の破壊のためには、活性化される必要があり（Ｗａｕｑｕｉｅｒ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１０，４（１０）：８３７−８４７）、ヒト血液末梢単核球の不活化エボラザイールウィルスへの暴露は、低減したＩＬ−２産生をもたらすことが示された（Ｙａｄｄａｎａｐｕｄｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  ｊｏｕｒｎａｌ，２００６，２０：２５１９−２５３０）。従って、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤の使用は、これらの疾患に対抗して、Ｔ細胞活性化の刺激およびＩＬ−２産生への用途がある。
【０４６２】
さらに、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤の使用はまた、結核などの他の感染症でも一定の役割がある。例えば、ほとんどの個体は、ＭＴＢを根絶できないにしても、結核菌（ＭＴＢ）を制御するために、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を必要とする。ＣＤ４＋Ｔ細胞による認識を回避するために、ＭＴＢ壁に最も豊富な糖脂質の１つであるＭＴＢにより使用される分子機序は、糖脂質ＭａｎＬＡＭによるシグナル伝達であり、これは、Ｌｃｋリン酸化を抑制することによりＴＣＲシグナル伝達を妨害するが、Ｔｙｒ５０５のリン酸化は行わない（Ｍａｈｏｎ  ＲＮ  ｅｔ  ａｌ，２０１２，Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７５（１−２）：９８−１０５；Ｍａｈｏｎ  ＲＮ  ＩＩＩ，ＰｈＤ学位論文，２０１０，ｈｔｔｐ：／／ｒａｖｅ．ｏｈｉｏｌｉｎｋ．ｅｄｕ／ｅｔｄｃ／ｖｉｅｗ？ａｃｃ  ｎｕｍ＝ｃａｓｅ１２７５６６８６８６）。
【０４６３】
ＩＬ−１２ＲＢ１は、結核菌感染症に対するヒトの抵抗力にとって不可欠である。本発明者らは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドが、ＮＫ細胞のＩＬ−１２ＲＢ１発現を誘導することを示した。
【０４６４】
従って、一実施形態では、本発明は、対象の結核菌感染症を治療する方法を提供し、方法は、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。
【０４６５】
Ｌｃｋ活性の上方制御により本発明に従って抑制または治療され得る他の感染症には、ペストおよび肝炎ウィルスが挙げられる（例えば、Ｂ型肝炎ウィルスおよびＣ型肝炎ウィルス）。Ｂ型肝炎は、肝損傷および炎症などに繋がる最も蔓延しているウィルスであり、Ｃ型肝炎ウィルスは、Ｔ細胞疲弊に関連している（Ｙｅ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ＆  Ｄｉｓｅａｓｅ，２０１５，６，ｅ１６９４）。ペストのペスト菌病の原学的薬剤に対する重要な病原性因子は、チロシンホスファターゼＹｏｐＨである。細菌は、ＹｏｐＨを宿主細胞に注入し、Ｌｃｋは、活性ＹｏｐＨを含む細胞中のその正の調節部位Ｔｙｒ３９４で脱リン酸化されることが示された。Ｌｃｋを遮断することにより、そのごく最初のステップでＹｏｐＨはＴ細胞抗原受容体シグナル伝達を遮断し、この致死性疾患に対する防御免疫応答の発生を効果的に防止する（Ａｌｏｎｓｏ  Ａ  ｅｔ  ａｌ，２００３，ＪＢＣ，２７９：４９２２−４９２８）。Ｃ型肝炎では、Ｃ型肝炎ウィルスコアタンパク質がＴ細胞に結合し、Ｌｃｋ活性化を抑制し、コアタンパク質がＴ細胞活性化の極初期イベントを抑制することを示唆する（Ｙａｏ  ＳＱ  ｅｔ  ａｌ，２００４，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，７８（１２）：６４０９−６４１９）。
【０４６６】
全身感染、術後感染あるいは癌再発に対するかかりやすさの観点からの輸血の危険性は、１９７３年以来知られており、最近のメタアナリシスは、赤血球輸血後のこの健康管理関連感染のリスクを再確認している（Ｒｈｏｄｅ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ，ＪＡＭＡ，２０１４，３１１（１３）：１３１７−１３２６；Ｂｌｕｍｂｅｒｇ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，２００７，４７（４）：５７３−８１；Ｆｅｒｇｕｓｓｏｎ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎ  Ｊ  Ａｎａｅｓｔｈ，２００４，５１（５）：４１７−２４）。輸血誘導免疫調節の提案された機序は不明確なままであるが、一定の役割を果たすと見なされる実証された変化には、低減したＣＤ４／ＣＤ８比率および低減したＩＬ−２分泌が挙げられる（Ｋｉｒｋｌｅｙ  ＳＡ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９９，６（５）：６５２−６５７）。従って、輸血に組み込まれたＬｃｋ活性化剤の投与は、これらの状態の１つまたは複数のリスクを改善し得る。
【０４６７】
さらに、リンホカイン活性化キラー細胞を生成するための同系脾臓細胞のインビトロＩＬ−２治療は、熱傷マウスモデルの敗血症関連する死亡のＩＬ−２防止を強化することが示され、活性化Ｌｃｋは、抗原刺激の非存在下でＩＬ−２産生を刺激することが示された（Ｍｅｎｄｅｚ  ＭＶ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｒｅｓ，１９９３，５４（６）：５６５−７０；Ｌｕｏ  Ｋ  ａｎｄ  Ｓｅｆｔｏｎ  ＢＭ，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１９９２，１２（１０）：４７２４−４７３２）。さらに、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）は、敗血症中のＴ細胞抑制で重要な役割を果たすことが知られており、新生児スプラーグドーリーラットの敗血症中のＴ細胞抑制モデルでは、ＩＬ−２産生の低減が付随して起こることが示された。このような抑制はＣＯＸ−２阻害剤で改善され、それにより、ＰＧＥ２をこのプロセスに関連付けている。これを考慮して、およびＴ細胞のＰＧＥ２への暴露がＬｃｋの不活化およびＺＡＰ７０の低減したリン酸化に繋がるので（Ｄａｌｌａｌ  Ｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｌ  Ｎｅｐｏｎａｔｅ，２００３，８３（３）：２０１−７；Ｃｈｅｍｎｉｔｚ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００６，６６：１１１４）、本発明によるＬｃｋ活性化剤による治療は、Ｔ細胞活性の刺激を介した敗血症中の免疫応答の刺激、およびＩＬ−２産生刺激にも適用し得る。
【０４６８】
従って、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤は、一連の用途、特に、Ｌｃｋの活性化またはＬｃｋ活性の刺激を必要とするいずれかの用途で広く使用される。本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤によりおよび／または本発明により実施される方法により治療され得る疾患および状態としては、Ｌｃｋの最適未満の発現またはＬｃｋの抑制またはＬｃｋもしくはＬｃｋ活性の下方制御を特徴とする疾患および状態、上皮内および粘膜内常在性Ｔ細胞機能不全および／または病原性感染症（例えば、慢性感染症を含む）、病原性感染症由来の敗血症（例えば、慢性敗血症）および輸血関連敗血症、癌および皮膚性および上皮悪性腫瘍に反応したＴ細胞活性化に対する要求に関連する障害；リンパ腫、ホジキン病および白血病を含む癌一般（例えば、乳癌、結腸直腸癌、および前立腺癌）の予防または治療；Ｔ細胞機能を抑制する治療法（例えば、癌および非癌状態の治療法）に起因する免疫抑制；限定されないが、重症複合型免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、ＣＤ４／ＣＤ８  Ｔ細胞の生存を必要とする状態および細胞数を低下させる状態または障害（例えば、肺炎、インフルエンザ、ヘルペス感染症などの感染症）を含む免疫不全障害；ウィルス、細菌、真菌および寄生生物による病原性感染症；Ｔ細胞疲弊（例えば、癌または非癌状態（病原性感染症由来の敗血症（例えば、慢性敗血症）および／または癌または非癌状態の治療に関連する））、およびＴ細胞中のチェックポイント阻害（例えば、癌または慢性敗血症に関連する）、およびＴ細胞活性化経路の加齢に伴う変化が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４６９】
種々のリガンド−受容体相互作用は、チェックポイントシグナル伝達阻害の一因となることが知られており（例えば、Ｐａｒｄｏｌｌ  ＤＭ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ，２０１２，１２：２５２−２６４参照）、本発明の少なくともいくつかの実施形態では、Ｔ細胞機能は、これらの相互作用の１つまたは複数を抑制することにより回復され得る（例えば、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用）。従って、少なくともいくつかの実施形態では、本発明は、疲弊Ｔ細胞におけるＴ細胞シグナル伝達のチェックポイント阻害／抑制を克服するための、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤の投与にまで明示的に拡張される。
【０４７０】
病原体および病原性感染のさらなる例としては、ヘルペスウィルス、ミクソウィルス、レオウィルス、エンテロウィルス、コクサッキーウィルス、エコーウィルス、口蹄疫ウィルス、Ｃ型肝炎を引き起こすウィルス（例えば、Ａ型肝炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルスおよびＣ型肝炎ウィルス）、脳炎および脈絡髄膜炎、サル免疫不全ウィルス、ＳＡＲＳ、コロナウィルス、デング熱ウィルス、インフルエンザウィルスインフルエンザウィルス、黄熱病ウィルス、ウエストナイルウィルス、アレノウィルス、水泡性口内炎ウィルス、ライノウィルス、ヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）、呼吸器多核体ウィルス、ヒトサイトメガロウィルス、および水痘帯状疱疹ウィルス（ＶＺＶ）に加えて、ポックスウィルス、その他のＴリンパ球向性ウィルスなどによるウィルス感染症；結核（例えば、ハンセン病）、グラム陽性球菌およびグラム陰性球菌、およびグラム陰性桿菌および球桿菌などのグラム陽性およびグラム陰性菌により引き起こされる疾患、溶血性連鎖球菌、腸球菌、および破傷風、ジフテリア、ならびにクロストリジウムおよびボツリヌス中毒感染症などの毒素産生細菌に加えて、他のマイコバクテリア感染症などによる細菌感染症；アメーバ症、マラリア（この原因物質は、熱帯熱マラリア原虫である）、リーシュマニア症、トリパノソーマ症、トキソプラズマ症およびランブル鞭毛虫症などの原生動物感染症；および腸管寄生線虫、糸状虫、条虫（サナダムシ）および包虫などによる蠕虫感染症が挙げられる。
【０４７１】
上記の疾患または状態の予防または治療における本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤の使用に加えて、本発明の他の実施形態では、本発明によるＬｃｋ活性化剤は、幹細胞治療（例えば、心臓幹細胞治療）、胚性幹細胞自己複製、および胚性幹細胞（例えば、胚盤胞胚芽の）の多能性の維持に対してさらなる用途があり得るが、それらに限定されず、全てのこのような使用は、本発明により明示的に包含される。
【０４７２】
養子免疫細胞療法（ＡＣＴ）
難治性または進行性癌に対するワクチン接種の代用物は、養子Ｔ細胞療法（ＡＣＴ）、すなわち、エクスビボ処理Ｔ細胞の投与である（Ｋａａｒｔｉｎｅｎ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１７，１９（６）：６８９−７０２）。さらに、マウス試験から、ＡＣＴの前の、エクスビボ増殖中のＴ細胞のコンディショニングもまた、インビボ効力に影響を及ぼす重要なパラメーターであることも明になった（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ  ＭＰ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２０１５，６４（５）：５３９−５４９）。Ｔ細胞の養子移入は、患者中で強力な抗腫瘍および抗ウィルス免疫を媒介でき、このような療法は、Ｔ細胞受容体、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または他のエフェクター分子を含む遺伝子情報の移入に依存し得る（Ａｎｄｒｉｊａｕｓｋａｉｔｅ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，２０１５，２２（７）：３６０−３６７で概説されている）。
【０４７３】
インターロイキンは、Ｔ細胞のエクスビボ増殖中に培地中に取り込むと、Ｔ細胞機能を強化するためにうまく用いられた。例えば、ＩＬ−１２コンディショニングは、ＣＤ８＋Ｔ細胞のレトロウィルス媒介形質導入効率を改善し（Ａｎｄｒｉｊａｕｓｋａｉｔｅ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ、前出参照）；ＩＬ−２１の添加は培養物中のリンパ球のより大きな増殖、およびＣＤ８＋中枢記憶Ｔ細胞の増大した収率を誘導することが示され（Ｚｏｏｎ  ＣＫ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｓｃｉ，２０１５，１６：８７４４−８７６０）；ＩＬ−２１と共に培養したＣＡＲ＋Ｔ細胞の養子移入はマウスのＣＤ１９＋Ｂ細胞悪性腫瘍の制御を改善することが示された（Ｓｉｎｇｈ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２０１１，７１（１０：３５１６−３５２７）。
【０４７４】
養子免疫療法では、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８培養腫瘍灌流リンパ節（ｔｕｍｏｕｒ−ｄｒａｉｎｉｎｇ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ）細胞（ＴＤＬＮ）は、ＩＬ−１２またはＩＬ−１８単独生成Ｔ細胞より効率的に、肺転移を根絶することを示した（Ｌｉ  Ｑ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００５，６５（３）：１０６３−７０）。これは、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８を使って、抗体活性化ＴＤＬＮ細胞をＴｈ１表現型に対して相乗的に極性化させることにより、強力なＣＤ４＋およびＣＤ８＋抗腫瘍エフェクター細胞を生成できることを示す（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ、前出参照）。
【０４７５】
ＩＬ−１２受容体発現は、ＩＬ−１２結合およびＴｈ１免疫応答の誘導と相関する。本発明者らは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドが、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上の（図１０）、およびＮＫ細胞上の（図１１）ＩＬ−１２Ｒの発現を促進することを示した。
【０４７６】
従って、一実施形態では、本発明は、対象のＴｈ１応答を誘導する方法を提供し、方法は、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。
【０４７７】
Ｔ細胞は、ＩＬ−２１を使って、養子免疫細胞療法のためにインビトロ／エクスビボで増殖できる。本発明者らは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドが、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上のＩＬ−２１Ｒの発現を促進することを示した（図４）。本発明者らはまた、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドが、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を促進し（図３５）、およびＩＬ−２の存在下または非存在下でＮＫ細胞のＩＬ−２１Ｒの発現を高める（図５および図６）ことを示した。
【０４７８】
特に、誘導多能性細胞は、胚性幹細胞の定義特性の維持のために重要な遺伝子および因子を発現させることにより、胚性幹細胞様状態に遺伝的にリプログラミングされた成熟細胞である。成熟細胞が幹細胞になるように一旦プログラムされてしまうだけで、それらはその後、所望生殖細胞層に分化するように誘導できる。Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼのメンバーは、ヒト胚性幹細胞の分化に不可欠であるが、Ｌｃｋ発現レベルは、胚性幹細胞分化の関数として劇的に低下する（Ｚｈａｎｇ  Ｘ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ，２０１４，１３（３  Ｐｔ  Ａ）：３７９−３８９）。
【０４７９】
白血病抑制因子（ＬＩＦ）は、マウス胚性および誘導多能性幹細胞の培養と誘導のために使用される重要な外因性因子の１つであり、マウス胚性幹細胞自己複製の重要な制御因子である「シグナル伝達性転写因子３」（ＳＴＡＴ３）を活性化する（Ｄａｎｇ−Ｎｇｕｙｅｎ  ＴＱ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０１４，８１：２３０）。さらには、ＳＴＡＴ３は、系統特異的差別化プログラムの活性化を妨げることにより、中胚葉および内胚葉系統の両方への分化を抑制することが知られている（Ｇｒａｆ  Ｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅｓ，２０１１，２（１）：２８０−２９７）。従って、ＳＴＡＴ３は、未分化胚性幹細胞表現型の維持のために不可欠である（Ｒａｚ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，１９９９，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，９６：２８４６−２８５１）。
【０４８０】
重要なのは、ＳＴＡＴ３の活性化は、多能性の誘導のための制約要因であり、その過剰発現は、多能性を達成するための追加の因子に対する要求を排除する（Ｙａｎｇ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，２０１０，７（３）：３１９−３２８）。従って、ＳＴＡＴ３シグナル伝達は、ＳＴＡＴ３が自己複製因子の発現を推進することから、主にナイーブ多能性を指示するマスターリプログラミング因子の１つと見なされる（Ｌｉ  Ｙ−Ｑ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ，２０１０，１２（１）：３−１３）。Ｌｃｋは、ＳＴＡＴ３を直接活性化することが示され、外来性ＬｃｋによるＳＴＡＴ３の活性化は、Ｌｃｋ特異的抑制剤ＰＰ１により減弱される（Ｌｕｎｄ  ＴＣ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ，１９９９，１１（１１）：７８９−７９６）。従って、本発明によるＬｃｋ活性化剤は、Ｌｃｋ活性の刺激を介してＳＴＡＴ３活性を上方制御する働きをし得るので、幹細胞自己複製の促進と維持への用途がある。
【０４８１】
さらに、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤は、Ｔ細胞、細胞媒介免疫を含む免疫および免疫応答の増強、細胞の免疫レシュキュー、Ｔ細胞受容体シグナル伝達の上方制御、１つまたは複数のサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮγおよびＴＮＦαから選択される）産生の上方制御、Ｔ細胞の再活性化、Ｔ細胞免疫応答の再活性化への、および補助剤としての（例えば、ワクチン組成物に入れて、または個体に別々に投与して抗原に対する免疫応答を刺激するために）特定の用途がある。
【０４８２】
従って、個体のワクチン接種用のワクチン組成物がさらに本明細書で提供され、組成物は、薬学的に許容可能な担体と一緒に、本発明により実施される１種または複数のＬｃｋ活性化剤を含む。ワクチンは、ワクチンの投与により免疫応答が生成される任意の好適な抗原、および任意選択で、抗原に対する免疫応答を刺激するための任意の追加の補助剤を含む。
【０４８３】
少なくともいくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の刺激は、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤による治療に由来するＴ細胞の生理学的結果（例えば、高められたＩＬ−２サイトカイン産生、発現上昇したＴ細胞シグナル伝達、など）を達成するために必要であり得る。即ち、Ｌｃｋ活性化剤は、根本的にＴ細胞を活性化するのではなく、Ｔ細胞受容体刺激の生理学的結果を高めるように作用し得る。従って、本明細書で記載の方法の少なくともいくつかの実施形態では、Ｌｃｋ活性化剤の投与により治療されるＴ細胞は刺激Ｔ細胞である。
【０４８４】
本発明の１つまたは複数の実施形態によるＬｃｋ活性化剤に応答するＴ細胞集団は、例えば、上皮内Ｔ細胞、粘膜内Ｔ細胞、γ／δＴ細胞、樹枝状表皮Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ＮＫ細胞、樹状細胞、および前述の細胞集団の組み合わせからなる群より選択され得る。
【０４８５】
本発明者らは、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ペプチドが、樹状細胞の生存率を高めることを示した（図３６）。従って、一実施形態では、本発明は、樹状細胞生存率を増大させる方法を提供し、方法は、樹状細胞を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化ペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０４８６】
別の実施形態では、本発明は、樹状細胞または樹状細胞集団の増殖を誘導する方法を提供し、方法は、細胞または細胞集団を、本明細書に記載のペプチドを含む組成物と接触させることを含む。別の実施形態では、本発明は、樹状細胞集団の増殖を増大させる方法を提供し、方法は、細胞集団を、本明細書に記載のペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【０４８７】
本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤またはその成分（例えば、式Ｉのペプチド（Ｐ）および／または式ＩＩの化合物）は、当業者に周知の合成または組換え技術により得ることができる。さらに、本発明によるＬｃｋ活性化剤を含むペプチド（Ｐ）は、アミノ酸または遺伝子コードによりコードされていないアミノ酸、またはアミノ酸類似体を組み込むことができる。
【０４８８】
例えば、１個または複数のＤ−アミノ酸、ベータアミノ酸、および／またはホモアミノ酸は、Ｌ−アミノ酸の代わりに利用し得る。実際に、ペプチド（Ｐ）は、部分的にまたは全てＤアミノ酸、または例えば、Ｄ−アミノ酸、ベータアミノ酸、ホモアミノ酸、ベータホモアミノ酸、Ｌ−アミノ酸、およびＬ−またはＤ−ホモアミノ酸の内の１個または複数の組み合わせからなり得る。ベータアミノ酸の例としては、カチオン性アミノ酸のベータバリアント型を含む、ベータアラニン（ＮＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨ）、ベータフェニルアラニン、ベータトリプトファン、ベータチロシン、ベータロイシンなどが挙げられる。アミノ酸のホモバリアント型の例としては、Ｌ−システインと比較して追加のＣＨ２基を有するホモシステインが挙げられる。従って、いくつかの実施形態では、本発明により実施されるＬｃｋ活性化剤のペプチド（Ｐ）は、例えば、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸またはＬ−、Ｄ−アミノ酸の混合物および／または上述の他のアミノ酸型を含み得る。Ｄ−アミノ酸を含むペプチドの使用は、例えば、ペプチダーゼ活性（例えば、エンドペプチダーゼ）を抑制し、それにより、インビボでのペプチドおよびその結果としてのＬｃｋ活性化剤の安定性を高め、半減期を延長できる。
【０４８９】
本明細書に記載のペプチドまたは融合タンパク質は、本明細書に記載の方法で使用するために、三次元構造中で拘束され得る。例えば、それは、側鎖構造で合成され得る、あるいは既知のインビボで安定な構造を有する分子中に組み込まれ得る、または環化されてインビボで高められた剛性およびそれによる安定性を得る。環化ペプチド、融合タンパク質などのための種々の方法が既知である。ペプチドは、４種の異なる経路、すなわち、頭−尾（Ｃ末端からＮ末端）、頭−側鎖、側鎖−尾、または側鎖−側鎖により環化し得る。例えば、融合タンパク質のペプチドは、ペプチドまたは融合タンパク質に沿って相互に離した２個のシステイン残基を用意し、残基のチオール基チオール基を酸化してそれらの間にジスルフィド架橋を形成することにより環化して得てもよい。環化はまた、ペプチドのＮ末端とＣ末端アミノ酸または、例えば、リシン残基の側鎖上の正に帯電しているアミノ基と、グルタミン酸残基の側鎖上の負に帯電しているカルボキシル基との間で結合を形成することにより、実現し得る。環化を達成するために、アミノ酸間の直接化学結合の形成、または任意の好適なリンカーの使用もまた、十分に当業者の範囲内にある。本発明による環化を達成するために特に好ましい方法は、ラクタム基の形成およびラクタム化を使用した環化型のペプチドおよび／または本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤の形成は、明示的に包含される。好適なラクタム化方法を含む、環化を達成するための方法は、例えば、Ｗｈｉｔｅ  ＣＪ  ａｎｄ  Ｙｕｄｉｎ  ＡＫ．，Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｕｎｅ  ２０１１，ｐｐ．５０９、に記載されている。この文献の全内容は、相互参照により本明細書に組み込まれる。
【０４９０】
本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤を含む、ペプチドまたは融合タンパク質はまた、炭水化物部分の結合またはアミノ酸残基のアルキル化またはアセチル化を生じる化学反応または化学結合の形成を伴う他の変化などの翻訳後または合成後修飾も含み得る。
【０４９１】
本発明によるＬｃｋ活性化剤を含むペプチドのペプチド模倣体の使用も意図され、本明細書に明示的に包含される。ペプチド模倣体は、例えば、ペプチドの１個または複数のアミノ酸のアミノ酸類似体による置換を含み、アミノ酸類似体は、従来の活性、細胞毒性および／または他の好適なアッセイにより評価して、親ペプチドの活性を基本的に低減させない。
【０４９２】
本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤およびその成分は、化学的に合成、または従来の組換え技術を用いて製造できる。融合タンパク質をコードする核酸は、例えば、平滑末端化末端およびオリゴヌクレオチドリンカーを用い、必要に応じて消化して付着末端を得て、付着末端のライゲーションにより、所望のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする別々のｃＤＮＡフラグメントを連結することにより得られる。あるいは、後で一緒に連結できる相補的末端を有するアンプリコンを発生させるプライマーを用いて、ＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅を利用することができる。
【０４９３】
本明細書に記載のペプチドおよび融合タンパク質は、任意の好適な技術を利用して、インビトロで発現させ、哺乳動物対象への投与のために、または式ＩＩの化合物に結合させてＬｃｋ活性化剤を得て、本発明により実施される方法で使用するために、細胞培養液から精製され得る。
【０４９４】
ペプチド成分を一緒に結合する、および／またはターゲティング部分、例えば、ｓｃＦｖなどに結合するなどのために、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）、クリックケミストリーおよびブドウ球菌ソルターゼＡ媒介ペプチド−ペプチド融合プロトコル、または前述の組み合わせを利用して、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤を提供し得る。このような合成法のための種々のプロトコルがよく知られており、任意の好適なこのような方法を用い得る。
【０４９５】
治療薬の合成のためのＦｍｏｃまたはＴ−ｂｏｃまたは保護基を用いたＳＰＰＳ法は、特に好ましい。このような合成法は、よく知られ、脱保護ステップの前後で洗浄ステップを有する、結合および脱保護反復サイクルを含む。本明細書で記載の少なくともいくつかの実施形態では、治療薬の全体が、ＳＰＳＳにより固体担体上で合成できる。例えば、式ＩＩのポリアミド部分の合成では、例えば、Ｆｍｏｃを有する疑似脂肪酸構成単位、保護２−アミノ基は、順次一緒に結合され、それぞれが上述のＲ基側鎖を有する３〜５反復単位を有するポリアミド骨格部分を形成する。同様に、Ｌｃｋ活性化剤のペプチド成分はその後、ポリアミド部分（ＰＭ）に順次結合されて活性化剤がＣ末端でＮ末端方向に伸張された後、合成されたＬｃｋ活性化剤は固体担体から切り離され、収集され得る。
【０４９６】
ソルターゼＡ（Ｓｒｔ  Ａ）は、黄色ブドウ球菌で最初に記載された細菌性酵素であり、トレオニンとグリシンとの間の切断配列ＬＰＸＴＧで切断し、アシル酵素中間体を生成し、これは、その後、Ｎ末端グリシン残基と反応して、酵素を放出し、グリシンとＬＰＸＴＧタグ付き成分をペプチド結合により一緒に融合する。Ｌｅｖａｒｙ，Ｄ．Ａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ｃａｔａｌｙｓｅｄ  ｂｙ  ｓｏｒｔａｓｅ  Ａ”．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，Ａｐｒｉｌ  ２０１１，Ｖｏｌ．６（４）：１−６，ｅ１８３４２参照。また、例えば、Ｗｉｔｔｅ，Ｍ．Ｄ．，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｒｔａｓｅ−ｃａｔａｌｙｓｅｄ  ｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌｉｃｋ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｓｅｐ  ２０１３，８（９）：１８０８−１８１９、およびＢｅｎｔｌｙ  ＭＬ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２００８，２８３：１４７６２−１４７７１、およびＭａｚｍａｎｉａｎ  ＳＫ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５：７６０−７６３も参照されたい。ソルターゼＡ媒介タンパク質ライゲーションを介して蛍光タグまたは毒素に結合した組換えＨＥＲ１およびＨＥＲ２標的化抗体が記載された。例えば、Ｍａｄｅｊ  ＭＰ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１２，１０９：１４６１−１４７０，ａｎｄ  Ｋｏｒｎｂｅｒｇｅｒ  Ｐ．ａｎｄ  Ｓｋｅｒｉａ  Ａ．，２０１４，ｍＡｂｓ  ６（２）：３５４−３６６を参照されたい。前出の全ての内容は、相互参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０４９７】
クリックケミストリーは、１つの成分上の末端アジド基ともう一方の成分上のアジド基との間の金属触媒（例えば、Ｃｕ（Ｉ））アジド−アルキン付加環化反応により、成分がペプチド結合ではなく、１、２、３トリアゾール結合により一緒に結合されることによるなどの本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤の提供において、一緒に成分を結合するのに好適するもう一つの高収率法である。１、２、３トリアゾール結合は、従来のペプチド結合に対し生物学的等価体として機能し、それらは加水分解に耐性があるという優位性を有する。例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｃｋ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｂａｓｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｓｉｇｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１３，１８，ｐｐ：９７９７−９８１７；ｄｏｉ：１０．３３９０／ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ１８０８９７９７参照。ジベンゾビシクロオクチン（ＤＢＣＯ）などのシクロオクチンも同様に、アジドと高反応性であり、上述のアジド−アルキン環化付加に対する代替形態のクリックケミストリー反応を提供する、またはアジド−アルキン環化付加と組み合わせて使用して、本発明により実施されるＬｃｋ活性化剤を提供し得る。シクロオクチンベースクリック合成反応は、それらが銅またはその他の金属触媒なしで実施できるという点で有意性を有する。
【０４９８】
ｓｃＦｖ、抗体または抗体フラグメントなどのターゲティング部分は、例えば、最初に、２つの成分のシステイン誘導体を作製し、これを切断し、ＨＣｌ塩として精製後、マレイミド結合を採用し、溶液相中でシステインの遊離スルフヒドリルを利用して、それぞれのクリック試薬に結合させることにより、上述のＬｃｋ活性化剤のリンカー部分（ＬＭ）に結合させることができる。ターゲティング部分は、その後、アジドまたはアルキン（または、例えば、ＤＢＣＯ）試薬で誘導体化し、リンカー部分（ＬＭ）に結合した相補性試薬を介してクリックコンジュゲーションが起こる。
【０４９９】
他の実施形態では、本発明による治療処置（例えば、病原性感染の予防または治療）を実施することを目的として、宿主細胞の細胞転写エレメントおよび翻訳リボソーム複合体を利用して核酸をインビボ発現させるために、哺乳動物対象の標的細胞に、本明細書に記載の融合タンパク質（すなわち、キメラタンパク質）Ｌｃｋ活性化剤（例えば、本明細書に記載のペプチド（Ｐ）を含む）をコードする核酸を遺伝子導入し得る。
【０５００】
本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤をコードする核酸の発現のために、核酸は通常、最初にクローニングベクターに導入され、宿主細胞中で増幅され、その後、核酸は摘出され、細胞の遺伝子導入のために好適な発現ベクター中に組み込まれる。発現ベクターは、宿主細胞のゲノムＤＮＡとは無関係に、核酸挿入断片の発現のために、または宿主細胞のゲノムＤＮＡ中への部位特異的相同または異種の組換えにより宿主細胞中での核酸挿入断片のその後の発現のために、設計され得る。
【０５０１】
通常、クローニングベクター（例えば、コスミド）は、ベクターの効率的複製を可能とするための複製起点（ｏｒｉ）、ベクターで形質転換された宿主細胞の選択を可能とするためのレポーターまたはマーカー遺伝子、および目的の核酸配列の挿入およびその後の切除を容易にするための制限酵素切断部位を組み込む。好ましくはクローニングベクターは、一連の制限酵素部位を組み込んだポリリンカー配列を有する。マーカー遺伝子は、薬剤耐性遺伝子（例えば、アンピシリン耐性のＡｍｐｒ）、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ラクタマーゼ、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、ヒグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、または、例えば、大腸菌ＬａｃＺ遺伝子（ＬａｃＺ’）によりコードされるβ−ガラクトシダーゼなどの酵素をコードする遺伝子であり得る。酵母レポーター遺伝子としては、イミダゾールグリセリンリン酸デヒドラターゼ（ＨＩＳ３）、Ｎ−（５’−ホスホリボシル）アントラニレート異性化酵素（ＴＲＰ１）およびβ−イソプロピルマレート脱水素酵素（ＬＥＵ２）が挙げられる。発現ベクターはまた、このようなマーカー遺伝子を組み込んでもよい。使用可能なクローニングベクターとしては、哺乳動物用クローニングベクター、酵母および昆虫細胞が挙げられる。適用可能な特定のベクターとしては、ｐＢＲ３２２ベースベクターおよびｐＵＣ１１８およびｐＵＣ１１９などのｐＵＣベクターが挙げられる。
【０５０２】
好適な発現ベクターとしては、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）挿入断片の発現が可能なプラスミドが挙げられる。発現ベクターは通常、挿入された核酸配列が作動可能に連結される転写調節制御配列を含む。「作動可能に連結される」は、挿入断片の読み枠のずれなしに挿入配列の転写を可能とするために、核酸挿入断片が転写調節制御配列に連結されることを意味する。このような転写調節制御配列は、転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼの結合を容易にするためのプロモーター、リボソームの転写ｍＲＮＡへの結合を可能とする発現制御配列、およびプロモーター活性を調節するためのエンハンサーを含む。プロモーターは、特異的細胞系統でのみ核酸挿入断片の転写を容易にし、他の細胞型では容易にしない、またはこのような他の細胞型中では相対的に低レベルでのみ容易にする組織特異性プロモーターであり得る。発現ベクターの設計は、遺伝子導入されるべき宿主細胞、遺伝子導入方式、および核酸挿入断片の転写の所望のレベルに依存する。
【０５０３】
原核生物（例えば、細菌細胞）または真核生物（例えば、酵母、昆虫または哺乳動物細胞）の遺伝子導入に好適する多数の発現ベクターが当技術分野において既知である。
【０５０４】
真核細胞の遺伝子導入に好適する発現ベクターとしては、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＥＦ．ＰＧＫ．ｐｕｒｏ、ｐＴｋ２、ｐＲｃ／ＣＮＶ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ポリアデニル化部位および伸長因子１−ａプロモーターを組み込んだ非複製アデノウィルスシャトルベクターおよびサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーターを組み込んだものが最も好ましいｐＡｄＥａｓｙベース発現ベクターが挙げられる。昆虫細胞中での発現のために、バキュロウィルス発現ベクターを利用し得、この例としては、ｐＶＬ１３９２およびｐＶＬ９４１などのｐＶＬベースベクター、およびｐＡｃＵＷ１などのｐＡｃＵＷベースベクターが挙げられる。本発明の実施形態による哺乳動物細胞中での核酸挿入断片の発現のために好ましい発現ベクターとしては、ｐＥＦ．ＰＧＫ．ｐｕｒｏなどのＣＭＶまたは伸長因子１ａプロモーターを有するプラスミドが挙げられる（Ｈｕａｎｇ，Ｄａｖｉｄ  Ｃ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（１９９７）１４：４０５−４１４）。ｐＥＦ．ＰＧＫ．ｐｕｒｏプラスミドは、ＳＶ４０起点、ＥＦ−１ａプロモーター、ポリクローニング部位およびポリＡ領域を含み、本明細書に記載のペプチドまたはキメラタンパク質をコードする核酸挿入断片の発現に特に好ましい。
【０５０５】
種々の形態の発現ベクターが当技術分野において既知であり、このような任意の好適な発現構築物を意図する目的のために使用し得る。ウィルス移入方法も本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤をコードする核酸の標的細胞中へのインビトロまたはインビボでの導入を行うために使用できる。標的細胞への送達のために発現ベクターをパッケージ可能な好適なウィルスとしては、アデノウィルス、ワクシニアウィルス、トリのレトロウィルス、単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）およびＥＢＶを含むマウスおよびヒト起源ヘルペスウィルス、ＳＶ４０などのパポバウィルス、ならびにアデノ随伴ウィルスが挙げられる。本明細書で記載の方法で有用な特に好ましいウィルスとしては、複製能欠損型組換えアデノウィルスまたはその他のウィルスが挙げられる。組換えウィルスを、局所または全身投与して、ペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸の標的細胞への送達を行い得る。本明細書に記載のペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸はまた、当技術分野において既知の、従来の低温ショックまたはヒートショックまたは例えば、リン酸カルシウム共沈法電気穿孔プロトコルを用いて、細胞内にインビトロ送達し得る。
【０５０６】
遺伝子導入された細胞は、スクリーニングして、核酸挿入断片の安定で再現可能な発現、および付随するコードされたペプチドまたは融合タンパク質の産生を示す培養物または細胞株を特定できる。種々の宿主細胞内の核酸の安定な統合および発現は当該技術分野において周知である。本明細書に記載のペプチドまたは融合タンパク質の発現に使用できる宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、ラクチス乳酸菌、ストレプトマイセスおよびシュードモナス、ブレビバクテリウムおよび特にＢ．リネンス菌株などの細菌およびプロバイオティクス細菌、サッカロマイセスおよびピキアなどの酵母、昆虫細胞、鳥類細胞およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、ＨａＲａｓ、ＷＩ３８、ＳＷ４８０、およびＮＩＨ３Ｔ３細胞などの哺乳動物細胞が挙げられる。組換えタンパク質産生のための大腸菌の使用はよく知られており、このような発現系で使用するための好適なプロモーターとしては、Ｔ７、ｔｒｃおよびｌａｃＵＶ５（Ｔｅｇｅｌ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ，ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１１，２７８：７２９−７３９）が挙げられる。宿主細胞は、好適な培地中で、標準的精製技術を使用し得る場合は、宿主細胞、および／または上清由来の発現された産物の精製の前に、導入された核酸の発現を容易にするための条件下で培養される。さらに、発現産物は、下記の標的化ミニ細胞調製物が作製される宿主細胞（例えば、大腸菌などの細菌細胞）内でＥＬＩＳＡによる定量化のためにヒスチジンタグを含み得る（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，２００７，１１：４３１−４４５）。
【０５０７】
特に、ミニ細胞（例えば、Ｄｅ  Ｂｏｅｒ  ＰＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ａｎｄ  ｔｏｐｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｃｏｄｅｄ  ｆｏｒ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｍｉｎｉｃｅｌｌ  ｌｏｃｕｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｐｒｏｐｅｒ  ｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｓｅｐｔｕｍ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｃｅｌｌ，５６；６４１−６４９，１９８９）、リポソーム、ゴースト細菌細胞、ｃａｖｅｏｓｐｈｅｒｅ、合成ポリマー薬剤、超遠心分離ナノ粒子および他の無核ナノ粒子を、標的細胞へのカーゴの標的化送達のために、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤、核酸または発現ベクター（例えば、プラスミド）と共に添加し得る。このようなシャトルは、注射のために、または胃の酸環境を通過して、小腸を介するカーゴの放出と取り込みのための経口摂取のために、処方され得る。
【０５０８】
ミニ細胞は、正常細胞分裂を制御する遺伝子の変異により産生され得るナノサイズの細胞であり、細胞質を含み、従って、親細胞のタンパク質発現のための細胞質成分を含むが、これは無染色体であり、自己複製はできない。細胞分裂を制御する抑制（または上方制御）遺伝子によるミニ細胞の生成は、静脈内注射で通常使用されるよりも遙かに少ない投与量での腫瘍への薬物送達に対する解決策を提供することが示された（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，ＪＣ（２００７），Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ；１１；４３１−４４５）。本発明との関連でのミニ細胞は、遺伝子変異および／または関与する細胞成分の抑制によるなどの細胞分裂工程（例えば、二分裂）の乱れまたは障害から生ずる場合があるように、親細胞の異常細胞分裂により産生される任意の無染色体細胞であり得る。本明細書に記載の方法で使用するためのミニ細胞は、従来から既知の方法、例えば、国際公開第０３／０３３５１９号、米国特許第７，１８３，１０５号、およびＭａｃＤｉａｒｍｉｄ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，２００７に記載のものにより作製できる。これらの全ての内容は、相互参照によりその全体が明示的に本明細書に組み込まれる。細胞分裂を制御し、細菌性ミニ細胞を生成する細菌遺伝子の不活性化は、例えば、Ｄｅ  Ｂｏｅｒ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ａｎｄ  ａ  ｔｏｐｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒ  ｃｏｄｅｄ  ｆｏｒ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｍｉｎｉｃｅｌｌ  ｌｏｃｕｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｓｅｐｔｕｍ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ”．Ｃｅｌｌ  ５６，１９８９，ｐｐ．６４１−６４９でさらに記載されている。密度勾配遠心分離（例えば、オプティプレップ（登録商標）、Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ  ＰＬＣ，Ｄｕｎｄｅｅ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）およびクロスフロー濾過を利用するインタクトミニ細胞の精製方法は、米国特許第７，６１１，８８５号および同第８，００３，０９１号に記載されている。両特許の内容も、相互参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。
【０５０９】
本明細書で有用なミニ細胞が誘導される細菌細胞の例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（例えば、ＭｉｎＡ、ＭｉｎＢ、ｃｙａ、ｃｒｐ、ＭｕｋＡ１、またはＭｕｋｅＥに変異を有する、またはｍｉｎＢ、ｍｉｎＥ、ｆｌｓＺ、ｓｄｉを過剰発現するもの）、枯草菌属菌種（例えば、ｍｉｎＣ、ｍｉｎＤ、ｒｉｐＸに変異を有する、またはｓｍｃ変異またはＯｒｉＣ欠失を有する）、ラクトバチルス属菌種、およびシュードモナス属種種などの細菌が挙げられる。細菌は、グラム陽性（例えば、リステリア・モノサイトゲネス）またはグラム陰性（例えば、緑膿菌）であり得る。外膜中にポリンを有する細菌（すなわち、通常グラム陰性菌であるが、一部のグラム陽性菌もポリンを有する）から分離されたミニ細胞は、標的細胞に送達されるべき核酸、発現ベクターまたは本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤を含むミニ細胞の添加を容易にするために特に好ましい。ミニ細胞はまた、始原細菌または真核細胞からも誘導され得る。例えば、米国特許第７，１８３，１０５号を参照されたい。しかし、通常、細菌由来ミニ細胞、すなわち、細菌性親細胞から誘導されたミニ細胞が利用される。
【０５１０】
本発明による治療を実施するための細胞に対するミニ細胞の標的化は、任意の好適なターゲティング部分の使用により（例えば、ミニ細胞またはリポソームなど上の二重特異性抗体、ｓｃＦｖ標的化ペプチドなどを介して）達成され得る。ターゲティング部分は、ミニ細胞の表面上に発現できる、または、例えば、ミニ細胞は、１個または複数の選択ターゲティング部分でタグ付けまたは標識できる。特に好ましい実施形態では、ミニ細胞の腫瘍細胞への標的化は、ミニ細胞表面リポ多糖類のＯ抗原成分および標的化される哺乳動物細胞に特異的な細胞表面受容体（例えば、ＥＦＧＲ）を認識する二重特異的抗体複合体の形のターゲティング部分を用いて達成され得、複合体の２個の抗体はプロテインＡ／Ｇを使用して、Ｆｃ領域を介して一緒に結合されている（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，ＪＣ（２００７），Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ；１１；４３１−４４５、および国際公開第０３／０３３５１９号を参照）。しかし、本発明はこれに限定されず、上述の他のターゲティング部分も採用し得る。
【０５１１】
本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤は、ミニ細胞内で、またはミニ細胞上で標的細胞または組織に輸送される。例えば、Ｌｃｋ活性化剤は、ミニ細胞中に添加され、ミニ細胞の膜中で発現され、またはミニ細胞の膜上で、例えば、電荷会合により運搬され得る。
【０５１２】
ミニ細胞は、Ｌｃｋ活性化剤または核酸を含むインキュベーション培地中でのミニ細胞のインキュベーションを介した受動的拡散により、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤または核酸（例えば、発現ベクター）と共に添加され得る。添加を支援するために、Ｌｃｋ活性化剤または核酸をミニ細胞に対し透過性に（例えば、ミニ細胞に穴を開ける）し得る、または薬剤のミニ細胞透過性を従来から既知の技術によるなどの他の方法で増大または強化し得る。
【０５１３】
特に、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤および核酸の細菌性ミニ細胞の膜を介した侵入を、種々の既知の可逆的および不可逆的方法を使用して容易にし得る。これらには、電気穿孔（Ｍｉｌｌｅｒ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ，Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，２００５，４：１−７）、ジギトニン（Ｍｅｌｏ  ＲＦ．ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，１９９８，１６：９９−１０５）、ＮＳＡＩＤ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ  Ｔ，Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，２００８，２８：１００−１０５）、トリトン−Ｘ１００（ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｅｎ  ＡＬ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｐｔｉｃｓ，２００９，１４（２）：１−１０）、植物サポニン（Ｂａｃｈｒａｎ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ，Ｍｉｎｉ−Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００８，８：５７５−５８４）、乳酸（Ａｌａｋｏｍｉ  ＨＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０００，６６（５）：２００１−５）などへの暴露が挙げられる。
【０５１４】
あるいは、ミニ細胞が産生され得る細菌または他の細胞は、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤の発現の発現ベクターで遺伝子導入され得、産生されるとミニ細胞は、発現したＬｃｋ活性化剤と共に添加される。
【０５１５】
ミニ細胞の含有物またはカーゴの標的細胞への侵入は、ミニ細胞と、ＮＫ細胞、ＤＣ、Ｔ細胞などの標的細胞上に発現した細胞表面受容体との相互作用から生ずる食作用（例えば、好中球およびマクロファージによる）またはエンドサイトーシス（クラスリン媒介またはクラスリン非依存性エンドサイトーシス）によるミニ細胞の標的細胞中への移動、およびその後のミニ細胞の分解とミニ細胞の内容物の標的細胞の細胞質中への放出（例えば、細胞内区画、例えば、エンドソームおよび／またはリソソームから）により行われる。
【０５１６】
ミニ細胞の添加を支援するために、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤の実施形態のペプチド成分は、細菌由来ミニ細胞上に存在するＬａｍＢポリンを介した輸送を容易にするために、炭水化物部分、例えば、グルコース（ＤまたはＬ異性体）に結合できる。ポリンスーパーファミリーは、グラム陰性菌の外側細胞膜を横切る水充填細孔を形成する多数のホモトリマー膜貫通型タンパク質を含む。ほとんどのポリンは、環境変化により調節される通常の非特異的チャネルを形成する。マルトポリン（ＬａｍＢポリン）は、マルトースおよびマルトデキストリンの大腸菌細胞中への誘導拡散に関与する。特に、ＬａｍＢタンパク質はまた、グルコースの拡散を容易にでき（ｖｏｎ  Ｍｅｙｅｒｂｕｒｇ  Ｋ  ａｎｄ  Ｎｉｋａｉｄｏ  Ｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．７８：ｐｐ１１００−１１０７，（１９７７））、グルコースは広範囲の試験糖類由来のＬａｍＢタンパク質をインビトロで横切る最速の拡散速度を有することが明らかになった（Ｌｕｃｋｅｙ  Ｍ  ａｎｄ  Ｎｉｋａｉｄｏ  Ｈ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  Ｖｏｌ．７７：ｐｐ１６７−  １７１，（１９８０））。本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤、融合タンパク質およびそのペプチド成分は、超音波処理または界面活性剤を用いた細胞膜の破壊、遠心分離による膜および固体断片の除去、および適用可能な場合には、親和性または免疫親和性クロマトグラフィーにより、当該技術分野において既知の方法で溶液または上清からの精製により細胞培養物から精製できる。使用可能なこのような好適な固体基材および支持体としては、限定されないが、アガロース、セファロースおよび他の商業的に入手できる支持体（例えば、ラテックス、ポリスチレン、またはデキストランなどのビーズ）が挙げられる。その後の溶出およびそれからの濃縮のために、本発明のペプチドまたは融合タンパク質を固体支持体上に固定するための抗体、その結合フラグメントまたは他の好適な結合分子を、一般に用いられるアミドまたはエステルリンカーを利用して、または吸着により、固体基材に共有結合させ得る。
【０５１７】
さらに、リポソーム、高分子、固体金属含有ナノ粒子などとしての使用に好適するアルブミン、ゼラチン、リン脂質などのナノ粒子を、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤の送達のために利用し得る（例えば、Ｄｅ  Ｊｏｎｇ  ＷＨ  ＆  Ｂｏｒｍ  ＰＪＡ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００８，３（２）：１３３−１４９を参照）。標的細胞の種々のリガンドまたは受容体に対する抗体を用いたナノ粒子の外側コーティングの技術は、十分に認められており、本発明の実施形態でも用いることができる。
【０５１８】
特に、本発明によるＬｃｋ活性化剤の脂質送達は、リポソーム、固体脂質ナノ粒子、逆脂質ミセル、脂質微小管および脂質マイクロシリンダーによるものを含む（Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｍ  Ｊ  ＆  Ｅｈｒｈａｒｄｔ  Ｃ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ，２０１２，９（１２）：１４８９−１５０３）。ペプチドカーゴ含有リポソームは、例えば、噴霧器として経皮送達用に、鼻腔内用に、眼および頬側経路用に、および経口用に、非経口および肺性経路用に提案されてきた（Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｍ  Ｊ  ＆  Ｅｈｒｈａｒｄｔ  Ｃ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ，２０１２，９（１２）：１４８９−１５０３で概説されている）。リポソームは、薬物および遺伝子送達担体として、さらに最近は、ペプチド送達担体として広範に研究され（Ｐｈａｒｍａｇａｐ  Ｉｎｃより２０１２年８月２１日出願の国際公開第２０１３／０３３８３８Ａ１号、発明者：Ｓｏｋｏｌｉ  Ｋ  ＆  Ｃｈａｂｏｔ  ＪＭ）、ペグ化リポソーム製剤は、大抵の場合、中性脂質とアニオン性脂質の混合物を含む。
【０５１９】
多数の臨床的に実証されたリポソームベース薬物療法が利用でき、非標的化リポソームと比較して、標的化リポソームは、腫瘍組織中で高められた細胞内薬物送達を達成する（Ｋｉｒｐｏｔｉｎ  ＤＢ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００６，６６：６７３２）。さらに、神経膠腫の治療のために、血液脳関門を横切るリポソーム媒介遺伝子送達の成功が最近報告された（Ｙｕｅ  Ｐ−Ｊ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ，２０１４，１３：１９１）。リポソームベース細胞標的化と、細胞内部移行手法との組み合わせは、本発明の方法によるＬｃｋ活性化剤の細胞への送達に利用できる（例えば、免疫系を増強するためにＴ細胞へ／免疫応答を高めるために、例えば、病原体または癌細胞などへ）
【０５２０】
本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤の標的細胞（例えば、免疫細胞）への送達を改善する方法は、ＣＤ３またはヒト化抗ＣＤ４抗体（ＴＮＸ−３５５、現在ではイバリズマブ（ＴＭＢ−３５５）として知られる。Ｚｈａｎｇ  Ｘ−Ｑ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，２００６，５０（６）：ｐｐ  ２２３１−２２３３、により記載された）などの免疫細胞により選択的に発現された受容体を認識する標的化リガンドでのリポソームの表面の官能化を含む。イバリズマブは、ＨＩＶの一次受容体のＣＤ４に結合する非免疫抑制モノクローナル抗体であり、ウィルス侵入プロセスを抑制する（イバリズマブ（ＴＭＢ−３５５）：ＴａｉＭｅｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ．２００９−０９−０９）。リポソームの外表面上のペグ化はまた、免疫細胞または癌細胞上のＰＥＧユニットおよび受容体を同時に標的化する二重特異的抗体またはその誘導体の使用を容易にする。本明細書で記載のＬｃｋ活性化ポリペプチドを切断するＭＭＰ９／２切断配列に結合したＬｃｋ活性化剤で癌細胞を標的化することにより、腫瘍浸潤リンパ球抗癌活性を強化できる。発明者らは、ＭＭＰ９／２は、本明細書で記載のＬｃｋ活性化剤ポリペプチドを切断しないことを示した。従って、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤は、標的細胞（例えば、癌細胞または免疫細胞）上に発現されたＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）または別の抗原などの表面抗原を標的にするリポソーム内に封入され得る。
【０５２１】
本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤、ペプチド、融合タンパク質、遺伝子改変抗体および他の結合部分（例えば、ｓｃＦｖ）は、例えば、それらの精製および／またはそれらの細胞株に対する結合能力の評価のために、当該技術分野において公知のタグ（例えば、ｃ−ｍｙｃおよびポリヒスチジンタグ）と共に宿主細胞中で発現させ得る。このようなタグが利用される場合、コードされたＬｃｋ活性化剤、ペプチドなどは、エンドペプチダーゼを用いてタグの除去を容易にする好適なアミノ酸配列をさらに含み得る。同様に、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤、ペプチド、融合タンパク質などをコードする核酸は、上述の親和性クロマトグラフィーによる精製のために宿主細胞からの翻訳産物の分泌を容易にするために、シグナルペプチド配列をさらに含み得る。免疫親和性クロマトグラフィーおよび親和性クロマトグラフィープロトコル用の固体基材の作製のためのプロトコルは、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ａｕｓｕｂｅｌ  ＦＭ．ｅｔ  ａｌ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８およびその後の最新情報に記載されている。
【０５２２】
本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤、そのペプチド成分、融合タンパク質、および核酸は、単離または精製された形態で提供できる。本明細書で使用される場合、用語の「精製された」は、例えば、電気泳動および／または他の技術で評価して、８０％純度超のレベル、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、またはそれ超（例えば、９９％以上）のレベルまでの部分精製を包含する。
【０５２３】
またさらなる実施形態では、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤のペプチド成分の遊離末端は、例えば、メチル化、アセチル化、または複数のエチレングリコールモノマー単位でペグ化され、そのインビボでのプロテアーゼによる分解に対する耐性を小さくする、またはＬｃｋ活性化剤の腎臓を介した循環からの除去を抑制し得る。ポリペプチド／ペプチドのペグ化方法は、当該技術分野において周知であり、全てのこのような方法は明示的に包含される。通常、本発明により実施される方法で使用されるペグ化ポリペプチドは、２個以上のモノマー単位のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、通常、約２〜約１１ＰＥＧモノマーに結合される（すなわち、（ＰＥＧ）ｎのｎは２〜１１に等しい）。通常、ｎは２である。
【０５２４】
さらに、本発明により実施されるＬｃｋ活性化剤を含むペプチドは、環化されて剛性、およびその結果としてのインビボ安定性が高められ、種々のこのような方法は、当技術分野において既知である。
【０５２５】
本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤は、本発明により適用可能な疾患または状態の予防または治療のために、単一の薬物として対象に投与され得るが、少なくともいくつかの実施形態では、治療薬は、疾患または状態の治療のための１種または複数の他の薬物（すなわち、予防薬または治療薬）と組み合わせて投与し得る。特定の疾患または状態の治療に従来使用されたチェックポイント遮断薬などの任意の好適な薬物を本明細書に記載の治療薬と共に併用療法として利用し得る。
【０５２６】
本発明による併用療法で使用され得る従来の抗ウィルス薬は、例えば、レトロウィルス薬物、プロテアーゼ阻害剤、インテグラーゼ阻害剤、細胞進入阻害剤、およびノイラミニダーゼ阻害剤から選択され得る。例としては、ジドブジン（ＡＺＴ）、アバカビル、ラミブジン、エムトリシタビンおよびアシクロビルなどのヌクレオシド逆転写酵素阻害剤；テノホビルなどのヌクレオチド逆転写酵素阻害剤；ネビラピンおよびエファビレンツなどの非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤；マラビロクおよびエンフビルチドなどの細胞進入阻害剤；ラルテグラビル、エルビテグラビル、およびドルテグラビルなどのインテグラーゼ阻害剤；ダルナビル、アタザナビル、インジナビル、ロピナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、およびリトナビルなどのプロテアーゼ阻害剤；ならびにザナミビルおよびオセルタミビルなどのノイラミニダーゼ阻害剤が挙げられる。
【０５２７】
少なくともいくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤は、コンビビル（ジドブジンおよびラミブジン）、トリジビル（アバカビル、ジドブジンおよびラミブジン）、カレトラ（ロピナビルおよびリトナビル）、エプジコム（アバカビルおよびラミブジン）、ツルバダ（テノホビルおよびエムトリシタビン）、アトリプラ（エファビレンツ、テノホビルおよびエムトリシタビン）、スタリビルド（エルビテグラビル、コビシスタット、テノホビルおよびエムトリシタビン）およびトリーメク（ドルテグラビル、アバカビルおよびラミブジン）からなる群から選択され得るものなどのＨＩＶまたは他のレトロウィルス感染症の治療のための従来の併用療法剤に含まれ得る。
【０５２８】
本発明による併用療法で使用され得る従来の抗菌薬は、例えば、ペニシリン、セファロスポリン、カルバペネム、アミノグリコシド、スルホンアミド、キノロン、およびオキサゾリジノンなどの抗生物質からなる群より選択され得る。
【０５２９】
本発明の方法による併用療法で使用され得る従来の抗原虫薬は、例えば、メトロニダゾール、オルニダゾール、エフロルニチン、フラゾリドン、メラルソプロール、チニダゾールおよびピリメタミンからなる群より選択され得る。
【０５３０】
本明細書に記載の併用療法で使用され得る従来の蠕虫駆虫薬としては、アルベンダゾール、メベンダゾール、トリクラベンダゾール、フルベンダゾール、およびフェンベンダゾールなどのベンゾイミダゾールが挙げられる。
【０５３１】
本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤はまた、別の疾患または状態のための従来の薬物による治療から生ずる日和見感染の治療にも使用され得る。例えば、慢性骨髄性白血病の治療によく使用される薬物グリベック（イマチニブ、ＳＴ１５７１）は、強力なチロシンキナーゼの阻害剤であり、Ｌｃｋ活性の抑制を介してＴＣＲ誘導増殖および活性化を低減させ（Ｓｅｇｇｅｗｉｓｓ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ，２００５，Ｂｌｏｏｄ，１０５：２４７３−２４７９）、これは、日和見感染の誘導の意味を有する。これはまた、イマチニブ、ニロチニブまたはダサチニブなどの他のチロシンキナーゼ阻害剤からの副作用の改善に同様に当てはまる。例えば、細菌スーパー抗原（例えば、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ））などの免疫強化薬物が病的状態の原因である可能性があるにもかかわらず、ＬｃｋがＳＥＡにより活性化されること、および選択的Ｌｃｋ活性化剤の欠乏を考慮して、慢性骨髄性白血病におけるイマチニブ媒介Ｔ細胞免疫抑制の予防にＳＥＡを使用すべきとの提案がなされてきた（Ｗａｎｇ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ，ＢｉｏＭｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２０１４，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ６８２０１０）。
【０５３２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の病原性感染または他の疾患または状態の予防または治療のための従来の薬物は、例えば、共有結合により、電荷引力により、または好適なリンカーの使用により、本発明によるＬｃｋ活性化剤と複合体を形成し得る。薬物をＬｃｋ活性化剤に結合するための好適なリンカーとしては、例えば、１〜１０原子長さのリンカー、スルフヒドリルリンカーおよび／または好ましくは、薬物の放出のための、標的細胞または組織で、またはそれら内で、１つまたは複数の酵素切断部位（例えば、ＭＭＰ切断部位）を設定したアミノ酸またはアミノ酸配列が挙げられる。
【０５３３】
本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤の細胞に対する活性および／または細胞毒性プロファイルは、細胞形態の評価、トリパンブルー色素排除法、アポトーシスの評価、細胞増殖試験（例えば、細胞数、３Ｈ−チミジン取り込みおよびＭＴＴアッセイ）、キナーゼ活性アッセイ、ウェスタンブロットおよび免疫蛍光法試験の１種または複数などの種々の従来から既知のアッセイにより測定し得る。
【０５３４】
本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤は、本発明の方法により哺乳動物に投与でき、または細胞をＬｃｋ活性化剤とインビトロで接触させることができる。同様に、本発明は、エクスビボ治療を提供し、この場合、細胞は、Ｌｃｋ活性化剤で哺乳動物の外部で治療され、その後、哺乳動物に戻す、哺乳動物に投与する、または細胞を哺乳動物中に移植する。
【０５３５】
本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤、ベクター（例えば、発現ベクター）または核酸は、目的の対象への投与のために、薬学的に許容可能な担体および／または賦形剤を含む医薬組成物として提供できる。Ｌｃｋ活性化剤または核酸は、経口、鼻腔内、吸入により（例えば、エアロゾル噴霧により）、静脈内、非経口、直腸内、皮下、注入により、局所、筋肉内、腹腔内、脊髄内、眼内、または任意の他の適切と見なされる経路を介して、投与できる。
【０５３６】
直腸および／または結腸は、エナミン（フェニルアラニンおよびフェニルグリシン）、５−アミノまたは−メトキシサリチレート、キレート化剤、中鎖脂肪酸、シクロデキストリン、ｐＨ感受性高分子コート薬物、アゾポリマープロドラッグなどの、ペプチドに結合した種々の吸収促進薬を用いてペプチドの薬物吸収を高める経路を提供し（例えば、Ｔｉｗａｒｉ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２０１０，２：０１−１１；Ｋｏｌｔｅ  ＢＰ  ｅｔ  ａｌ，Ａｓｉａｎ  Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ＆  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１２，２（１４）：２１−２８；Ｐｈｉｌｉｐ  ＡＫ  ｅｔ  ａｌ，ＯＭＪ，２０１０，２５：７０−７８；およびＬａｋｓｈｍｉ  ＰＪ  ｅｔ  ａｌ．２０１２，Ａｓｉａｎ  Ｊ  Ｒｅｓ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ，２（４）：１４３−１４９を参照）、このような投与方法および本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤の形態も同様に本明細書に明示的に包含される。
【０５３７】
医薬組成物は、例えば、液体、懸濁剤、乳剤、シロップ、クリーム、摂取可能錠剤、カプセル、丸薬、坐剤、粉剤、トローチ剤、エリキシル剤、または選択投与経路に適切な他の形態であり得る。
【０５３８】
本発明による方法に有用な医薬組成物には、医薬水溶液が含まれる。注射可能組成物は、通針性が存在する程度に流体であり、通常、製造後の貯蔵を可能とするために、所定の期間の間、常態で安定である。さらに、薬学的に許容可能な担体は、任意の好適な従来から既知の溶媒、分散媒、水、生理食塩水および等張性配合物または溶液、界面活性剤を含み得、任意の好適な薬学的に許容可能な担体（例えば、経口または局所的に許容可能な担体）を利用し得る。好適な分散媒は、例えば、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール、など）、植物油およびこれらの混合物の内の１種または複数を含み得る。特に、Ｌｃｋ活性化剤または核酸は、例えば、不活性希釈剤、同化可能な食用担体と共に処方でき、および／またはそれは、硬または軟シェルゼラチンゲル中に封入し得る。
【０５３９】
本明細書に記載の医薬組成物浜田、インビボおよび／または局所投与に好適する１種または複数の、パラベン、クロロブタノール、ソルビン酸、およびチメロサールなどの保存剤を組み込むことができる。加えて、組成物の持続的吸収は、アルミニウムモノステアレートおよびゼラチンなどの吸収を遅らせる薬剤組成物中で使用することにより生じさせ得る。本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤または核酸を含む錠剤、トローチ剤、丸薬、カプセル剤などはまた、１種または複数の次記を含むことができる：トラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチンなどの結合剤；コーンスターチ、ジャガイモデンプンまたはアルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；スクロース、ラクトースまたはサッカリンなどの甘味剤；および香味料。
【０５４０】
医薬組成物中での上述の成分および媒体の使用は、よく知られている。任意の従来の媒体または成分が本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤と適合しない場合を除いて、本明細書に記載の治療および予防医薬組成物中でのそれらの使用が含まれる。
【０５４１】
本明細書で使用される場合、「併用療法」は、同じまたは異なる経路による他の薬物と同じまたは異なる配合物中の本発明によるＬｃｋ活性化剤または核酸の事前、同時または逐次投与を意味し、それによって、Ｌｃｋ活性化剤および／または核酸は、重なり合う治療濃度域中でそれらの効果を働かせる。
【０５４２】
投与および投与量の均一性の達成を容易にするために、非経口組成物を投薬単位形態で処方することが特に好ましい。本明細書で使用される場合、投与単位剤形は、治療すべき対象にとって単位投与量として適している物理的に別々の単位を意味しており、各単位が、使われた適切な担体および／または賦形剤と共同して所望の治療または予防効果を生じるように計算された、所定量の少なくとも１種の本発明によるＬｃｋ活性化剤または核酸を含む。投与単位剤形が、例えば、カプセル剤、錠剤または丸薬である場合、種々の成分は、投与単位の物理的形態を別の状態に変えるための、または対象への投与を容易にするためのコーティング（例えば、シェラック、糖類またはその両方）として使用し得る。
【０５４３】
医薬組成物は通常、少なくとも約１重量％の本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤を含む。パーセンテージは変わってもよく、通常は、組成物または製剤の約５重量％〜約８０重量％であり得る。この場合も、本発明によるＬｃｋ活性化剤または核酸の量は、提案された投与経路を考慮して、好適な有効投与量が対象に送達されるような量である。好ましい経口医薬組成物は、約０．１μｇ〜１５ｇのＬｃｋ活性化剤を含む。
【０５４４】
本発明によるＬｃｋ活性化剤または核酸の投与量は、Ｌｃｋ活性化剤または核酸が予防的用途で投与さるのかまたは治療的用途で投与されるのか、意図される薬剤投与の疾患、状態または目的、疾患または状態の重症度、対象の年齢、ならびに対象の体重および認められた原則に従って医師または看護助手により決定され得る総体的な健康などの関連因子を含む多くの因子に依存する。例えば、初期には、低投与量で投与され、これは、その後、対象の応答の評価後に投与毎に増大される。同様に、投与頻度は、同様の方法、すなわち、各投与間で対象の応答を継続的に監視し、さらに必要に応じて、投与頻度を増やす、あるいは投与頻度を減らすことにより、決定され得る。
【０５４５】
通常、本明細書に記載のＬｃｋ活性化剤は、本発明により実施される方法に従って投与して、最大約１００ｍｇ／ｋｇの個々の体重、より一般的には、最大約５０ｍｇ／ｋｇ体重、および最も一般的には、約５ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲のＬｃｋ活性化剤の投与量を与えるように投与される。少なくともいくつかの実施形態では、Ｌｃｋ活性化剤は、約５〜２５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、通常約５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの範囲、および最も一般的には、約１０ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲のＬｃｋ活性化剤の投与量を与えるように投与される。経口投与される場合には、１日当たり最大約２０ｇのＬｃｋ活性化剤が投与され得る（例えば、１日当たり４経口用量で、各用量は５ｇのＬｃｋ活性化剤を含む）。
【０５４６】
静脈内経路については、特に好適な経路は、Ｌｃｋ活性化剤または核酸の血管中への全身分布のための注射を介したもので、これは、治療されるべき組織または特定の臓器に供給する。さらに、Ｌｃｋ活性化剤は、任意の好適な注入または灌流技術によっても送達できる。Ｌｃｋ活性化剤または核酸（例えば、細菌由来ミニ細胞中に添加された発現ベクター）はまた、例えば、胸膜腔または腹膜腔などの腔中に送達されるか、または治療される組織中に直接注射される。
【０５４７】
本明細書で記載の方法で有用な好適なクローニングおよび発現ベクターおよびそれらの作製および送達方法は、当業者によく知られたマニュアルおよびハンドブックに記載されており、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ，Ｖｏｌ．１  ａｎｄ  ２，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９２；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ならびにリプリントおよびその最新情報を参照されたい。これらの内容は、相互参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。同様に、好適な薬学的に許容可能な担体および本明細書に記載の組成物に有用な配合物は、例えば、当業者に周知のハンドブックおよびテキスト、例えば、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，１９９５）”、ならびにその任意のリプリントおよび最新情報で見つけることができる。細胞の遺伝子導入および核酸挿入断片のインビボ発現の方法およびプロトコルは、例えば、国際公開第２００６／３１９９６号、同第２００６／３１６８９号、同第２００６／２９９８１号、同第２００６／２９００５号、米国特許出願公開第２００６／００６３７３１号、同第２００６／００６３９２４号に記載されている。全ての前述の刊行物、上記マニュアルおよびハンドブックは、相互参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０５４８】
本明細書に記載のように治療される哺乳動物は、本発明により治療可能な任意の哺乳動物であり得る。例えば、哺乳動物は、ウシ、ブタ、ヒツジまたはウマファミリーのメンバー、マウス、ウサギ、モルモット、ネコまたはイヌなどの臨床試験動物、または霊長類もしくはヒトであり得る。通常、哺乳動物はヒトである。
【０５４９】
本発明の別の態様は、本明細書で言及される疾患および／または状態（加齢関連変化を含む）を治療および／または予防に使用するための薬物の製造における本明細書で記載のＬｃｋ活性化ポリペプチドの使用を提供する。
【０５５０】
本発明の別の態様は、本明細書で言及される疾患および／または状態（加齢関連変化を含む）の治療および／または予防に使用するための、本明細書で記載のＬｃｋ活性化ポリペプチドの使用を提供する。
【０５５１】
本発明は、多くの非限定的実施例により以降でさらに説明される。
【０５５２】
実施例
実施例１：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドによるリンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（Ｌｃｋ）のインビトロ活性化。
本発明のポリペプチドのＬｃｋを活性化する能力をインビトロで調査した。Ｌｃｋは、チロシンキナーゼのＳｒｃファミリーのメンバーである。インビトロＬｃｋ活性化キナーゼ試験は、ペプチド基質（ＫＶＥＫＩＧＥＧＴＹＧＶＶＹＫ）および片対数用量範囲の試験ポリペプチドの存在下で、１５μＭの見かけのＫｍ内のＡＴＰ濃度を用いて、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｐｈａｒｍａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  ＵＫ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｄｕｎｄｅｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐａｒｋ，Ｄｕｎｄｅｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）で実施した。実施例Ｘの全ての結果は、対照（１００％）に対するパーセンテージＬｃｋ活性である。
【０５５３】
表３は、ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲが、１μＭ、１０μＭまたは３０μＭのペプチド濃度でＬｃｋを活性化しないことを示す。
【表３】
2021523946.tif 000011
【０５５４】
意外にも、ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹが、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲのＣ末端アルギニンなしで、１０μＭまたは３０μＭのペプチド濃度でＬｃｋを活性化するが、１μＭの濃度では活性化しないことが示された。従って、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹのカルボキシ末端での単一アルギニン残基の存在は、Ｌｃｋの刺激／活性化を消滅させる。
【０５５５】
本発明のポリペプチドのＳｒｃファミリーキナーゼを活性化する能力をインビトロで調査した。Ｌｃｋ活性化試験を上記のように実施し、全ての活性値を、対照に対するパーセンテージとして示す。簡単に説明すると、表４および表５は、１０μＭの濃度のペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹの存在下での、Ｓｒｃファミリーキナーゼ中のＬｃｋの選択的活性化を示す。
【表４】
2021523946.tif 000012
【０５５６】
表４は、Ｌｃｋが、ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹにより選択的に活性化され、Ｌｃｋ以外のＳｒｃファミリーキナーゼ（ＳＦＫ）は、１０μＭのペプチド濃度のペプチドにより活性化されないことを示す。表３と一致して、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹのカルボキシ末端での単一アルギニン残基の存在は、Ｌｃｋの刺激／活性化を消滅させる。
【０５５７】
表５は、ポリペプチドＲＶＫＶＫＶＶＶＶが、１μＭおよび１０μＭのペプチドの濃度でＬｃｋを活性化し、ＬｃｋはポリペプチドＲＶＫＶＫＶＶＶＶにより活性化され、Ｌｃｋ以外のＳｒｃファミリーキナーゼ（ＳＦＫ）は、１μＭまたは１０μＭの濃度のペプチドにより活性化されないことを示す。
【表５】
2021523946.tif 000013
【０５５８】
このデータは、Ｌｃｋ活性化ペプチドが選択的にＬｃｋを活性化し、Ｂｌｋ、ｃＳｒｃ、Ｆｇｒ、Ｆｙｎ、Ｈｃｋ、ＬｙｎまたはＹｅｓを活性化しないことを示す。
【０５５９】
１０ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹのカチオン性アミノ酸位置の改変および置換の効果を調査した。簡単に説明すると、ペプチドＰｅｐ９（ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ）と比較してアミノ酸配列変化を有するペプチドを、Ｌｃｋ活性を刺激する能力について評価した。Ｌｃｋ活性化調査を、実施例１に記載のように実施し、結果を表６に示す。全ての結果を、対照（１００％）に対するパーセンテージとして示す。
【０５６０】
表６は、アミノ酸配列ＮＰＬＹの存在は、ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹの位置１、３および５（太字）のカチオン性アミノ酸残基のいずれか１つがアラニン残基で置換される場合、Ｌｃｋの刺激に十分ではないことを示す。さらに、Ｎ末端アルギニンが非存在の場合（（ＳＫＡＫＮＰＬＹＲ）で示されるように）、Ｃ末端アルギニンの存在もＬｃｋ活性化に十分ではない。
加えて、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹペプチドの改変９マーアミノ酸配列、すなわち、位置３と５がカチオン性アミノ酸ではないＲＹＬＰＮＫＡＫＳは、Ｌｃｋの刺激に対する効力がない。
【表６】
2021523946.tif 000014
【０５６１】
実施例２：脂肪酸に結合されたＬｃｋ活性化ポリペプチドによるリンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（Ｌｃｋ）の選択的活性化。
１５ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲに結合された式ＩＩによるポリアミド部分（ＰＭ）「４Ｃ１０」（ｍ＝０で、上記スキーム１による末端アミノ基を有する）（例えば、「ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−４Ｃ１０」または「ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４」；これは４個の２−アミノドデカン酸残基に結合されたＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲである）がＬｃｋ活性に与える効果を図１に示す。
【０５６２】
Ｌｃｋ活性を実施例１に記載のように評価し、全てのキナーゼ活性値を、対照（１００％）に対するパーセンテージとして示す。説明を容易にするために、ポリアミド部分は「ｎＣｙ」と呼ばれ、ｎはポリアミド部分の反復単位の数であり、Ｃｙは各反復単位中のＲ基の炭素原子数であり、各Ｒ基は、飽和、直鎖炭素鎖である。従って、本実施例では、「４Ｃ１０」は、４反復単位（ｎ＝４）を有し、各反復単位のＲ基は１０炭素長さの飽和炭素側鎖である、上記スキーム１に示すポリアミド部分（例えば、４個の２−アミノドデカン酸）を指すと解釈されるべきである。
【０５６３】
驚くべきことに、図１に示すように、非Ｌｃｋ活性化ペプチド、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲのＣ末端に結合されたポリアミドアミド部分の存在は、約３０ｎＭの濃度の化合物（対照のレベルより１８％高いレベル）で始まり３０μＭの濃度で対照レベルを超える９１４％の活性化に達する強力なＬｃｋ活性化を誘導した。さらに、４Ｃ１０部分をＲＳＫＡＫＮＰＹＬＲペプチドに結合した場合も、Ｃ末端結合で観察された値より低い程度ではあるが（１μＭの濃度で４３５％の活性化、１０μＭの濃度で４１０％の活性化）（データは示さず）、Ｌｃｋ活性化が誘導された。
【０５６４】
このデータは、４個の脂肪酸残基（４個の２−アミノドデカン酸残基）がＬｃｋを活性化しないペプチド（ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ）に結合される場合、この４個の脂肪酸残基はポリペプチドに対しＬｃｋを活性化する能力を付与することを示す。
【０５６５】
下表５に列挙されたポリアミド部分（ＰＭ）それ自体の効果も評価した。再度述べると、ポリアミド部分は上記スキーム１で示される化合物であり（式中ｍ＝０）、式「ｎＣｙ」と呼ばれ、ｎはポリアミド部分の反復単位の数であり、Ｃｙは各反復単位中のＲ基の炭素原子数であり、各Ｒ基は、飽和、直鎖炭素鎖であるが、ただし、この例では、ポリアミド部分は、ＮＨ２基ではなく、ヒドロキシル基を有し、ペプチドのＣ末端への結合ではなく、先頭末端水素を有する。
【０５６６】
従って、Ｈ−１Ｃ１０−ＯＨは、単一単位の本明細書に記載のポリアミド部分のみを含み、１個の２−アミノドデカン酸残基に相当する（本明細書では、「Ｈ−（２Ａｄｏｄ）１−ＯＨ」または「（２Ａｄｏｄ）１」とも表現される）。Ｈ−２Ｃ１０−ＯＨは、２単位の本明細書に記載のポリアミド部分を含み、２個の２−アミノドデカン酸残基に相当する（本明細書では、「Ｈ−（２Ａｄｏｄ）２−ＯＨ」または「（２Ａｄｏｄ）２」とも表現される）。Ｈ−３Ｃ１０−ＯＨは、３単位の本明細書に記載のポリアミド部分を含み、３個の２−アミノドデカン酸残基に相当する（本明細書では、「Ｈ−（２Ａｄｏｄ）３−ＯＨ」または「（２Ａｄｏｄ）３」とも表現される）。Ｈ−４Ｃ１０−ＯＨは、４単位の本明細書に記載のポリアミド部分を含み、４個の２−アミノドデカン酸残基に相当する（本明細書では、「Ｈ−（２Ａｄｏｄ）４−ＯＨ」または「（２Ａｄｏｄ）４」とも表現される）。
【表７】
2021523946.tif 000015
【０５６７】
表７に示すように、化合物Ｈ−２Ｃ１０−ＯＨのみが、１０μＭの化合物の濃度でＬｃｋのわずかな低レベル活性化を示した。
【０５６８】
ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（表３参照）ならびに４Ｃ１０およびＨ−１Ｃ１０−ＯＨポリアミド部分単独は、無細胞Ｌｃｋキナーゼ活性アッセイでＬｃｋに対し何らの効果もなかったことを考慮すると、上記の結果は、非Ｌｃｋ活性化ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲの非Ｌｃｋ活性化ポリアミド部分４Ｃ１０−ＯＨへの結合により、予想外の相乗的効果が得られることを示す。
【０５６９】
ポリアミド部分４Ｃ１０（すなわち、４個の２−アミノドデカン酸残基）のペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲのＣ末端への結合がＬｃｋ活性に与える効果を、上記のポリアミド部分−１Ｃ１０−ＯＨ（１個の２−アミノドデカン酸残基）の結合の効果と比較して、表８に示す。
【表８】
2021523946.tif 000016
【０５７０】
この調査で、および表８に示すように、ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−４Ｃ１０によるＬｃｋの大幅な刺激が観察され、１μＭの濃度での対照を超える５１９％から、３０μＭの濃度での８１６％に増大した。Ｌｃｋ活性の刺激は１μＭのペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−１Ｃ１０−ＯＨでは観察されず、１０μＭおよび３０μＭのこの化合物の濃度でかなりのＬｃｋ活性化が観察されたが、ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−４Ｃ１０で得られた値より低レベルであった。これらの結果は、ポリアミド部分４Ｃ１０または−１Ｃ１０−ＯＨへのペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲの結合により、相乗的効果が得られることを示す。
【０５７１】
ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲに結合されたポリアミド部分４Ｃ１０（４個の２−アミノドデカン酸残基）に対するアミド化がＬｃｋ活性に与える効果を表９に示す。
【表９】
2021523946.tif 000017
【０５７２】
このデータは、非Ｌｃｋ活性化ポリアミド部分４Ｃ１０−ＯＨへの非Ｌｃｋ活性化ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲの結合により得られた予想外の相乗的効果が、さらに驚くべきことに、ペプチドに結合された最遠位脂肪酸のアミド化により強化できることを示す。このデータはまた、最遠位脂肪酸がアミド化されない場合、Ｌｃｋ活性化のレベルは、最遠位脂肪酸がアミド化された場合に観察される活性のレベルの約５０％であることを示す。
【０５７３】
Ｌｃｋ活性化に与えるポリアミド部分の線形結合および非線形（例えば、垂直）結合の効果を調査した。Ｌｃｋ活性に与えるＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲへの結合の効果を表９および表１０に示す。簡単に説明すると、４個の脂肪酸残基（４個の１２アミノドデカン酸残基）を、線形方式でＬｃｋ（ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ）を活性化しないペプチドに結合した場合、この４個の脂肪酸残基は、ポリペプチドに対しＬｃｋを活性化する能力を付与する。
【０５７４】
【表１０】
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＊位置：１、３、５、１０でのアニオン性残基［位置１、１０＝Ｄ（アスパラギン酸）；位置３、５＝Ｅ（グルタミン酸）；Ａｄｏｄ＝ドデカン酸（ラウリン）酸；Ａｄｅｃ＝デカン酸（カプリン）酸］。
【０５７５】
表１０は、表９および表８と一致して、４個の脂肪酸残基（４個の２−アミノドデカン酸残基）がＬｃｋを活性化しないペプチド（ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ）に非線形の垂直に結合される場合、この４個の脂肪酸残基はポリペプチドに対しＬｃｋを活性化する能力を付与することを示す。
【０５７６】
表１０はまた、４個の２−アミノドデカン酸（「Ａｄｅｃ」）残基がＬｃｋを活性化しないペプチド（ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ）に垂直に結合される場合、この４個の脂肪酸残基はポリペプチドに対しＬｃｋを活性化する能力を付与することを示す。
【０５７７】
実施例３：脂肪酸に結合されたＬｃｋ活性化ポリペプチドは、Ｌｃｋリン酸化を増大させ、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドは、Ｙ３９４でのＬｃｋリン酸化を増大させる。
ＬｃｋのＴｙｒ３９４のリン酸化は、Ｌｃｋキナーゼを活性化する高次構造開口部（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｏｐｅｎｉｎｇ）を生じる。
【０５７８】
ウェスタンブロット調査をＥｕｒｏｆｉｎｓ  Ｐｈａｒｍａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  ＵＫ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｄｕｎｄｅｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）により実施した。簡単に説明すると、Ｌｃｋ（ｈ）を試験ペプチドの存在下で標準的ＫｉｎａｓｅＰｒｏｆｉｌｅｒ（登録商標）反応条件（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｐｈａｒｍａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  ＵＫ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）を用いて、１５μＭのＫｍ内のＡＴＰ濃度でインキュベートした。反応を室温で４０分間進行させた後、ＳＤＳサンプルバッファーの添加により停止させた。それぞれの場合で、Ｌｃｋ酵素を２５μｌの反応当たり２０ｎｇが得られるように希釈した。化合物およびペプチドの非存在下で適切な対照、ならびにＬｃｋ（ｈ）およびＬｃｋ（ｈ）活性化キナーゼ両方の未処理試料も同様に実験した。その後、得られた試料を、抗体４Ｇ１０（抗リン酸化チロシン抗体）（図３参照）および抗ｐＹ３９４  Ｌｃｋ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＭＡＢ７５００）（図２参照）を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析に供した。二次検出抗体（抗マウスＨＲＰ）を用いて、追加のブロットも実施した。膜をＰｏｎｃｅａｕ  Ｓにより染色し、試料装填および効果的タンパク質転写を確認した。４Ｇ１０抗体は、一般的な抗リン酸化チロシン抗体であり、Ｌｃｋ中にはいくつかのチロシン残基が存在するが、自己リン酸化チロシン残基がただ１個、すなわち、Ｙ３９４の位置に存在する。従って、抗ｐｙ３９４抗体は、Ｌｃｋの自己リン酸化を特異的に検出する。試料は以下の通り（数字は、ゲルのレーンに対応する）：
１．分子量マーカー
２．標準Ｌｃｋ（酵素のみ）
３．標準Ｌｃｋ−ペプチド基質＋ＡＴＰ（試験ペプチドなし）
４．標準Ｌｃｋ＋ペプチド基質＋ＡＴＰ（試験ペプチドなし）
５．標準Ｌｃｋ＋ＡＴＰ＋ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ  １０μＭ（ペプチド基質なし）
６．標準Ｌｃｋ＋ＡＴＰ＋ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ  ３０μＭ（ペプチド基質なし）
７．標準Ｌｃｋ＋ＡＴＰ＋ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ  １０μＭ（ペプチド基質なし）
８．標準Ｌｃｋ＋ＡＴＰ＋ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ  ３０μＭ（ペプチド基質なし）
９．標準Ｌｃｋ＋ＡＴＰ＋ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−４Ｃ１０  １０μＭ（ペプチド基質なし）
１０．標準Ｌｃｋ＋ＡＴＰ＋ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−４Ｃ１０  ３０μＭ（ペプチド基質なし）
【０５７９】
ウェスタンブロットプロトコルのステップは以下の通り：
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル：２００Ｖで５０分
ウェスタンブロット転写：２５Ｖで９０分
膜：ニトロセルロースプレカットブロッティング膜：０．２μｍ細孔径（ＬＣ２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ））
ポンソー染色：５％酢酸中の０．１％ポンソーＳ（ｗ／ｖ）
【０５８０】
膜を１０ｍＬのＰＢＳＴおよび１０％ＢＳＡで１時間ブロックし、その後、一次および二次抗体を適用した。
【０５８１】
一次抗体：
抗−ｐＹ３９４  Ｌｃｋ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＭＡＢ７５００、ブロッキング緩衝液中で希釈１／２５００）を膜と共に一晩４℃でインキュベートした後、４ｘ２０ｍｌのＴＢＳＴで洗浄した。
【０５８２】
二次抗体：
抗マウス−ＨＲＰ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、７０７６、ブロッキング緩衝液中で希釈１／５０００）を膜と共に室温で１時間インキュベートした後、４ｘ２０ｍｌのＴＢＳＴで洗浄した。
【０５８３】
図２は、１０μＭおよび３０μＭのペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲへのＬｃｋの暴露で増大しない、ＡＴＰの存在下におけるＹ３９４でのＬｃｋの弱い自己リン酸化を示す（それぞれ、レーン３および５／６）。対照的に、１０μＭおよび３０μＭのペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹへのＬｃｋの暴露は、Ｌｃｋの用量依存性自己リン酸化を誘導し（それぞれ、レーン７および８）、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲのＣ末端アルギニンがＬｃｋの自己リン酸化を抑制することを示す。しかし、この抑制は、ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−４Ｃ１０）のＣ末端への４Ｃ１０ポリアミド部分の結合により克服される。さらに、１０μＭのＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−４Ｃ１０の存在下で観察されたＬｃｋの自己リン酸化は、同じ濃度のＲＳＫＡＫＮＰＬＹ単独で観察された自己リン酸化を超えた。
【０５８４】
これらのデータはまた、Ｌｃｋを選択的に活性化するポリペプチドがＬｃｋの自己リン酸化を高め、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドがＬｃｋの自己リン酸化を用量依存的に高めることを示す。
【０５８５】
実施例４：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドは、ヒトＴリンパ球（ジャーカット）細胞株中のＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒα）発現を増大させる。
Ｔ細胞株上のＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）発現に対するＬｃｋ活性化ポリペプチドの効果を調査した。
【０５８６】
簡単に説明すると、野性型ジャーカット細胞（１ｘ１０６細胞）を標準的ＲＰＭＩ媒体および上記の１０％胎児の仔ウシ血清中で、非刺激またはＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびイオノマイシンで刺激した場合について、９６時間にわたり培養した。細胞を試験ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（２．５μＭまたは５μＭ濃度のいずれかで）に、全体で９６時間の培養期間にわたり暴露し、細胞ライセート中のＩＬ−２Ｒαレベルを上記の標準的な市販のＥＬＩＳＡフォーマットを用いて測定した。
【０５８７】
図３は、ＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）発現が、刺激細胞をＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）に暴露した場合に増大されたことを示す。これらのデータは、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドが、Ｔ細胞刺激（例えば、イオノマイシンおよびＰＭＡ）の非存在下では基本的にＴ細胞を活性化しないが、Ｔ細胞刺激の存在下ではＩＬ−２Ｒα発現を高めることができることを示す。
【０５８８】
実施例５：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドは単離ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上のＩＬ−２１Ｒの発現を増大させる。
単離ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上のＩＬ−２１Ｒ発現に与えるＬｃｋ活性化ポリペプチドの効果を調査した。
【０５８９】
簡単に説明すると、ＰＢＭＣを、抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）刺激および５種の試験濃度範囲（０〜１．２５μＭ）の試験ペプチドと共に、７２時間培養した後、細胞をＣＤ３６０（ＩＬ−２１Ｒ）の発現についてフローサイトメトリーにより評価した。提示データは、ペプチド処理に応答したＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞集団中のそれぞれの発現の平均、±ＳＥＭ、ｎ＝４を示す。データを、ダネット事後検定を伴う２元配置分散分析により解析した。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。点線は、非刺激細胞を示す。
【０５９０】
図４は、Ｌｃｋ活性化融合ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）が、対照に比較して、ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上のＩＬ−２１Ｒ発現を誘導することを示す。
【０５９１】
実施例６：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドは、ＣＤ３６０（ＩＬ−２１Ｒ）陽性ＣＤ３ｎｅｇＣＤ５６＋ＮＫ細胞集団を増大させる。
ＣＤ３６０（ＩＬ−２１Ｒ）陽性ＣＤ３ｎｅｇＣＤ５６＋ＮＫ細胞の比率を増大させるＬｃｋ活性化ポリペプチドの能力を調査した。簡単に説明すると、単離ＮＫ細胞を、組換えＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）および５種の濃度範囲（０〜１．２５μＭ）のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）と共に、７２時間培養した後、ＣＤ３ｎｅｇＣＤ５６＋ＮＫ細胞をＩＬ−２１Ｒの発現についてフローサイトメトリーにより評価した。提示データは、ペプチド処理に反応したＮＫ細胞集団での発現の平均、±ＳＥＭ、ｎ＝４を示す。データを、ダネット事後検定を伴う２元配置分散分析により解析した。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【０５９２】
図５は、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）が、ＣＤ３６０陽性ヒトＣＤ３ｎｅｇＣＤ５６＋ＮＫ細胞集団を増大させ、ＣＤ３６０（ＩＬ−２１Ｒ）の発現がＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２により増大されたことを示す。
【０５９３】
ＩＬ−２の非存在下で、単離ヒトＣＤ３ｎｅｇＣＤ５６＋ＮＫ細胞のＣＤ３６０の発現を増大させるＬｃｋ活性化ポリペプチドの能力も調査した。簡単に説明すると、単離ＮＫ細胞を、組換えＩＬ−２不含であるが、５種の濃度範囲（０〜１．２５μＭ）のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２と共に、７２時間培養した後、ＣＤ３ｎｅｇＣＤ５６＋ＮＫ細胞をＩＬ−２１Ｒの発現についてフローサイトメトリーにより評価した。提示データは、ペプチド処理に反応したＮＫ細胞集団での発現の平均、±ＳＥＭ、ｎ＝４を示す。データを、ダネット事後検定を伴う２元配置分散分析により解析した。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【０５９４】
図６は、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）が、ＩＬ−２の非存在下で、ＩＬ−２１Ｒ陽性ヒトＣＤ３ｎｅｇＣＤ５６＋ＮＫ細胞集団を増大させ、ＩＬ−２はＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２によりＣＤ３６０の発現を増大させるために必ずしも必要でないことを示す。
【０５９５】
実施例７：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２は、ヒトＴ細胞からのＩＬ−２１分泌を増大させる。
Ｔ細胞からのＩＬ−２１分泌に与えるＬｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２の効果を調査した。
【０５９６】
簡単に説明すると、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激Ｔ細胞（ＣＤ３＋単離）を、５種の濃度範囲のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）（０〜１．２５μＭ）＋ビークル対照と共に、７２時間培養した後、上清をＩＬ−２１についてＥＬＩＳＡにより分析した。提示データは、ペプチド処理に反応したｐｇ／ｍｌ値の平均、±ＳＥＭ、ｎ＝４を示す。データを、それぞれのペプチド濃度をビークルと比較するダネット事後検定を伴うＲＭ１元配置分散分析により解析した。＊ｐ＜０．０５。
【０５９７】
図７は、ＩＬ−２１分泌がＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）により増大されることを示す。
【０５９８】
実施例８：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２は、ヒトＰＢＭＣ内の制御性Ｔ細胞のパーセンテージを低減させる。
ヒトＰＢＭＣ内の制御性Ｔ細胞数に与えるＬｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２の効果を調査した。
【０５９９】
簡単に説明すると、抗ＣＤ３刺激ＰＢＭＣを、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）と一緒に、４８時間培養した後、Ｔｒｅｇ集団を、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ集団内の細胞のＦｏｘｐ３＋比率を測定することにより決定した。
【０６００】
図８は、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）が、Ｔｒｅｇ（Ｆｏｘｐ３＋）の比率を低減させることを示す。
【０６０１】
実施例９：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２はＰＢＭＣ内のＴｒｅｇ細胞の比率を低減させる。  
抗ＰＤ−１抗体（ペムブロリズマブ）と組み合わせた場合の、ヒトＰＢＭＣ内の制御性Ｔ細胞数に対するＬｃｋ活性化ポリペプチドの効果を調査した。
【０６０２】
簡単に説明すると、抗ＣＤ３刺激ＰＢＭＣを、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）と、抗ＰＤ−１（ペムブロリズマブ；「抗ＰＤ１」）またはアイソタイプ対照（「ｈＩｇＧ４」）との組み合わせと一緒に、４８時間培養した後、Ｔｒｅｇ集団を、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ集団中の細胞のＦｏｘｐ３＋比率を測定することにより決定した。データをドナーの変動のため正規化した。提示データは、抗ＰＤ１またはアイソタイプに応答した発現倍率変化（％陽性およびＭＦＩ）およびＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ比率、±ＳＥＭを示し、抗ＰＤ１とｈＩｇＧ４を比較する対応のあるｔ検定により分析された。
【０６０３】
図９は、抗ＰＤ−１抗体およびアイソタイプ対照（ｈＩｇＧ４）が、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２の非存在下で、ＰＢＭＣ内の同じ比率のＴｒｅｇ細胞を生じることを示す。
【０６０４】
Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２は、アイソタイプ対照と組み合わせた場合、ＰＢＭＣ内のＴｒｅｇ（Ｆｏｘｐ３＋）の比率を低減させる。
【０６０５】
重要なことに、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）を抗ＰＤ−１抗体（ペムブロリズマブ）と組み合わせた場合、ＰＢＭＣ内のＴｒｅｇ（Ｆｏｘｐ３＋）の比率が意外にも有意にさらに低減され、抗ＰＤ−１抗体およびＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２が相乗的に作用することを示す。
【０６０６】
実施例１０：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２は、刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞、ならびにＩＬ−１２Ｒβ１およびＩＬ−１２Ｒβ２  ＮＫ細胞でのＩＬ−１２Ｒβ分泌を増大させる。
ＩＬ−１２受容体サブユニットβ２（ＩＬ−１２Ｒβ２）発現を変えるＬｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２の能力を調査した。
【０６０７】
簡単に説明すると、抗ＣＤ３刺激ＰＢＭＣを、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２＋ビークル対照と共に７２時間培養した後、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞（ＣＤ３ｎｅｇＣＤ５６＋細胞）をＩＬ−１２Ｒβ２およびＩＬ−１２Ｒβ１発現についてフローサイトメトリーにより評価した。
【０６０８】
図１０は、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）が、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞中のＩＬ−１２Ｒβ２発現を誘導することを示す。
【０６０９】
図１１は、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）が、ＮＫ細胞中のＩＬ−１２Ｒβ１およびＩＬ−１２Ｒβ２発現を誘導することを示す。
【０６１０】
実施例１１：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２は、非刺激および刺激Ｔ細胞中の両アッセイにおいて、ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ４０Ｌ発現を増大させる。
ＬＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ４０Ｌ発現を増大させるｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２の能力を、非刺激および刺激Ｔ細胞の両アッセイにおいて調査した。
【０６１１】
簡単に説明すると、非刺激ＰＢＭＣを、５種の濃度範囲のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（０〜１．２５μＭ）＋ビークル対照と共に、７２時間培養した後、ＣＤ４＋Ｔ細胞をＣＤ４０Ｌ発現についてフローサイトメトリーにより評価した。図１２は、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）が、非刺激ＰＢＭＣ中のＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ４０Ｌ発現を増大させたことを示す。
【０６１２】
刺激Ｔ細胞を調査するために、単離Ｔ細胞（ＣＤ３＋）を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）で刺激し、５種の濃度範囲のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（０〜１．２５μＭ）＋ビークル対照と共に、７２時間培養した後、ＣＤ４＋Ｔ細胞をＣＤ４０Ｌ発現についてフローサイトメトリーにより評価した。図１３は、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）が、刺激Ｔ細胞中のＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ４０Ｌ発現を増大させたことを示す。
【０６１３】
実施例１２：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２は、ヒトＴリンパ球（ジャーカット）細胞株でのＩＬ−２分泌を増大させる。
ＩＬ−２分泌を変えるＬｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２の能力を調査した。
【０６１４】
簡単に説明すると、野性型ジャーカット細胞（ヒトＴリンパ球細胞の不死化系）を、抗ＣＤ２８抗体およびアビジンの存在下で、ビオチン化抗ＣＤ３抗体への暴露により刺激した。培養期間（４８時間）中、細胞を試験ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２に暴露した。細胞上清を、上述の標準的な市販ＥＬＩＳＡキットを用いて４８時間時間の終わりにＩＬ−２についてアッセイした。
【０６１５】
図１４は、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）が、４８時間の暴露後に、野性型ジャーカット細胞で対照に比較してＩＬ−２分泌を誘導することを示す。
【０６１６】
以下で考察するように、図４２Ａは、ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲおよびＲＳＫＡＫＮＰＬＹは、ヒトＴリンパ球（ジャーカット）細胞株でのＩＬ−２分泌を増大させることを示し、および図４２Ｂは、ｒｓｋａｋｎｐｌｙはヒトＴリンパ球（ジャーカット）細胞株でのＩＬ−１２分泌を高めるが、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲはＩＬ−１２分泌を高めないことを示す。
【０６１７】
実施例１３：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２は、ヒトＴリンパ球（ジャーカット）細胞株でのＩＬ−２分泌、およびＩＬ−２Ｒα発現を増大させる。
ＩＬ−２分泌を変えるＬｃｋ活性化ポリペプチドの能力を調査した。簡単に説明すると、野性型ジャーカット細胞（ヒトＴリンパ球細胞の不死化系）を、抗ＣＤ２８抗体およびアビジンの存在下で、ビオチン化抗ＣＤ３抗体への暴露により刺激した。培養期間（７２時間）中、細胞をＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２に暴露した。細胞上清を、上述の標準的な市販ＥＬＩＳＡキットを用いて７２時間時間の終わりにＩＬ−２についてアッセイした。
【０６１８】
図１５Ａは、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）が、７２時間の暴露後、野性型ジャーカット細胞で対照に比較してＩＬ−２分泌を誘導することを示す。図１５Ｂは、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）が、７２時間の暴露後、野性型ジャーカット細胞中で対照に比較してＩＬ−２Ｒα発現を誘導することを示す。
【０６１９】
ＩＬ−２分泌およびＩＬ−２Ｒα発現を変えるＬｃｋ活性化ポリペプチドの能力におけるＬｃｋの役割も調査した。簡単に説明すると、Ｌｃｋ欠損ジャーカット細胞（Ｊ．ＣａＭ１．６）を、抗ＣＤ２８抗体およびアビジンの存在下で、ビオチン化抗ＣＤ３抗体への暴露により刺激した。細胞上清を、培養期間（７２時間）中、細胞をＬｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）に暴露した。上述の標準的な市販ＥＬＩＳＡキットを用いて７２時間時間の終わりにＩＬ−２およびＩＬ−２Ｒαについてアッセイした。
【０６２０】
図１５Ａは、７２時間の暴露後の野性型ジャーカット細胞中の対照に比較したＩＬ−２分泌の誘導は、Ｌｃｋに依存することを示す。図１５Ｂは、７２時間の暴露後の野性型ジャーカット細胞での対照に比較したＩＬ−２Ｒα発現の誘導は、Ｌｃｋに依存することを示す。両方の場合で、構成的Ｌｃｋ発現の非存在下では、応答は観察されなかった。
【０６２１】
実施例１４：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２は、チェックポイント阻害からヒトＴ細胞株をレスキューする。
免疫系の過剰活性化を防ぐために、プログラム死１（ＰＤ−１）経路はＴ細胞活性化を制御するためのチェックポイントとして機能する。リガンドＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２がＰＤ−１受容体に結合すると、経路が活性化され、Ｔ細胞活性化および増殖の可逆的抑制であるＴ細胞の「疲弊」が生じる。Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２を、ＰＤ−Ｌ１により誘導されたチェックポイント阻害からヒトＴ細胞をレスキューする能力について調査した。
【０６２２】
簡単に説明すると、ジャーカット細胞を１０ｎｇ／ｍＬのＰＭＡおよびイオノマイシン（１μｇ／ｍＬ）で刺激しすることにより活性化して、プログラム細胞死受容体１（ＰＤ−１）の表面発現を誘導し、添加物の非存在下で、または細胞中のチェックポイント阻害を誘導するために２．５μＭのペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２単独、５μｇ／ｍｌの組換えＰＤ−Ｌ１（ＰＤ−１のリガンド）単独と共に、またはＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２＋組換えＰＤ−Ｌ１と共に、４８時間培養した。ＩＬ−２を、上述の市販の標準的ＥＬＩＳＡキットにより細胞ライセート中で測定した。
【０６２３】
重要なことに、図１６は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）の添加が、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用により誘導されたＩＬ−２の抑制をレスキューし、本発明のＬｃｋ活性化融合ポリペプチドが、ＰＤ−Ｌ１により誘導されるチェックポイント阻害からヒトＴ細胞をレスキューできることを示す。
【０６２４】
実施例１５：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２およびｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２は、再刺激時に、疲弊したＣＤ４＋細胞上のＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）発現を増大させ、かつＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を増大させる。
Ｔ細胞疲弊は、Ｔ細胞機能の段階的および進行性消失を特徴とし、結果的に応答細胞の物理的欠損に至り得る。インターロイキン２（ＩＬ−２）産生は、失われる最初のエフェクター作用の１つで、その後に、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）産生の消失が続き、一方、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）を産生する能力は、不活性化に対してより高い抵抗性がある。
【０６２５】
Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）およびｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫＤ１４００４」；これは、Ｄアミノ酸を含むＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２である）のＩＬ−２Ｒα発現に与える効果を調査した。
【０６２６】
簡単に説明すると、細胞を、７２時間培養後、Ｋｉ６７およびＣＤ２５の出現頻度を評価し発現レベルを示すために、フローサイトメトリー用に染色した。Ｋｉ６７は、所与の細胞集団、この場合ＣＤ４＋細胞、の成長画分を決定するために使用される増殖マーカーである。生存可能集団内から、細胞を、ＣＤ４＋細胞に注目するためにゲートにかけ、その後、Ｋｉ６７集団のＣＤ２５＋についてゲートにかけた。
【０６２７】
マウスモデル（Ｔｇ４  Ｌｙ５．１（ＭＢＰトラッカーマウス）、Ｂ１０ＰｌｘＣ５７ＢＬ／６）を用いたＣＤ４＋Ｔ細胞疲弊アッセイを使用して、ＣＤ４＋Ｔ細胞受容体遺伝子導入Ｔ細胞を野性型ミエリン塩基性タンパク質ペプチド（ＷＴ−ＭＢＰ）で刺激し、完全応答性エフェクターＴ細胞を産生する、または改変ペプチドリガンド−ペプチドＭＢＰ（ＡＰＬ−ＭＢＰ）で刺激し、疲弊Ｔ細胞を産生する。これらは、ＩＬ−２中で静置させた後、調査下のいずれかの処理（例えば、ペプチド）と共にＡＰＣ、単一用量のＡＰＬ−ＭＢＰペプチドで二次刺激する。
【０６２８】
マウスから脾臓を取り出し、処理して脾細胞の単細胞懸濁液を生成した。ＭＢＰトラッカー脾細胞を３ｘ１０６／ｍＬで再懸濁し、ＷＴ−ＭＢＰ（対照、非疲弊細胞）またはＡＰＬ−ＭＢＰ（疲弊細胞を生成するために）で刺激した。細胞を７２時間刺激した。刺激後、Ｔ細胞をフィコール密度勾配により精製し、その後、２０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２中で２ｘ１０６／ｍＬで４日間再播種した。この静置期間の終わりに、細胞を再懸濁し（４ｘ１０５／ｍＬ、最終２ｘ１０４／ウェル）、照射ＡＰＣ（Ｂ１０ＰＬｘＣ５７ＢＬ／６マウス、４ｘ１０６／ｍＬ、最終濃度２ｘ１０５細胞／ウェル）、単一用量のＡＰＬ−ＭＢＰペプチドおよび一連の濃度の試験ペプチドを用いて再刺激した。培養の７２時間後、フローサイトメトリーにより細胞のＩＬ−２Ｒαおよび増殖マーカー（それぞれ、ＣＤ２５およびＫｉ−６７）を評価し、ＥＬＩＳＡまたは多重化イムノアッセイによるサイトカイン産生（ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α）の評価のために上清を集めた。
【０６２９】
図１７は、Ｌｃｋ活性化融合ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）およびｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫＤ１４００４」、これはＤアミノ酸を含む）で再刺激時に、疲弊ＣＤ４＋Ｔ細胞中で、ＣＤ２５の発現が増大することを示す。これらのデータは、Ｌｃｋ活性化ペプチドが、再刺激された疲弊Ｔ細胞における生理学的制御の結果（例えば、ＩＬ−２Ｒα発現）を強化できることを示している。これらのデータはまた、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドは、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖集団を増大させることを示す。
【０６３０】
実施例１６：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドは、ＴＮＦαおよびＩＦＮγ分泌を誘導する。
Ｔ細胞疲弊は、Ｔ細胞機能の段階的および進行性消失を特徴とし、結果的に応答細胞の物理的欠損に至り得る。インターロイキン２（ＩＬ−２）産生は、失われる最初のエフェクター作用の１つであり、その後に、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）産生の消失が続き、一方、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）を産生する能力は、不活性化に対してより高い抵抗性がある。
【０６３１】
Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）およびｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫＤ１４００４」；これは、Ｄアミノ酸を含むＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２である）のＴＮＦαおよびＩＦＮγ産生に与える効果を調査した。
【０６３２】
細胞を、ＴＮＦαおよびＩＦＮγ産生を評価するために、培養の７２時間後にフローサイトメトリー用に染色した。
【０６３３】
図１８は、ＩＦＮγおよびＴＮＦαの発現が、Ｌｃｋ活性化融合ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）およびｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫＤ１４００４」）で再刺激時に、疲弊ＣＤ４＋Ｔ細胞中で増大されることを示す。
【０６３４】
実施例１７：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２はヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上のＩＬ−２Ｒαの発現を増大させる。
単離Ｔ細胞（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞）上のＩＬ−２Ｒα発現に与えるＬｃｋ活性化ポリペプチドの効果を調査した。
【０６３５】
簡単に説明すると、新たに単離したＰＢＭＣを、示した濃度（μＭ）の試験ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）の存在下、抗ＣＤ３（１μｇ／ｍＬ）含有または非含有（−ａＣＤ３）の場合について、２４時間刺激した。
【０６３６】
図１９は、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）が、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上のＩＬ−２Ｒαの発現を増大させることを示す。
【０６３７】
実施例１８：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞中のＣＤ２８発現を増大させる。
Ｌｃｋ活性化ポリペプチドのＣＤ２８発現を変える能力を調査した。簡単に説明すると、抗ＣＤ３刺激ＰＢＭＣを、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２と一緒に、７２時間培養した後、フローサイトメトリーにより細胞のＣＤ２８発現を評価した。
【０６３８】
図２０Ａは、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）が、非刺激細胞に比べて、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ２８発現を誘導することを示す。
【０６３９】
図２０Ｂは、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）が、非刺激細胞に比べて、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ２８発現を誘導することを示す。
【０６４０】
実施例１９：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２は、ＮＫ細胞上のＮＫｐ４４およびＮＫＧ２Ｄの発現を増大させる。
Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２を、ＮＫ細胞により発現され腫瘍細胞溶解に関与するＮＫｐ４４およびＮＫＧ２Ｄ活性化受容体の発現を増大させる能力について調査した。
【０６４１】
簡単に説明すると、ＮＫ細胞をヒトＰＢＭＣから単離し、５種の濃度範囲のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（０〜１．２５μＭ）＋ビークル対照（左）または組換えＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）＋ビークル対照（右）に暴露し、ＮＫｐ４４およびＮＫＧ２Ｄの表面発現についてフローサイトメトリーにより評価した。
【０６４２】
図２１は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）が、末梢血ＮＫ細胞上のＮＫｐ４４およびＮＫＧ２Ｄの発現を増大させることを示す。重要なことに、発現の増大は、組換えＩＬ−２で観察された増大のレベルと同等である。
【０６４３】
実施例２０：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２は、マウスに投与された場合、肺のＢ１６黒色腫腫瘍結節の樹立を抑制する。
癌の樹立を抑制するＬｃｋ活性化ポリペプチドの能力を調査した。
【０６４４】
８匹の８週齢雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＰＢＳ中の２ｘ１０（ｘ５）Ｂ１６Ｆ１０細胞を尾静脈経由で接種し、マウスの腹腔内にＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（水中に溶解；４００μｇ）を２週間にわたり、１、４、８および１１日目に投与し、続いてマウスを１５日目に安楽死させた。肺を取り出し、ＰＢＳですすぎ、フェケテ溶液で固定し、肺腫瘍結節を計数した（対照マウスは、同時に同じ経路により２００μｌの水の投与を受けた）。別の試験では、８００μｇの２００μｌの水中に溶解したｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２を、上記時点に従って、経管栄養により投与した。
【０６４５】
図２２Ａは、腹腔内に投与される場合、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）が、マウスの肺中のＢ１６Ｆ１０腫瘍結節数（腫瘍結節）を抑制することを示す。
【０６４６】
図２２Ｂは、経口投与される場合、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）が、マウスの肺中のＢ１６Ｆ１０腫瘍結節数（腫瘍結節）を抑制することを示す。
【０６４７】
実施例２１：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２は、マウスに投与された場合、ルイス肺癌マウス（転移モデル）の腫瘍量を低減させる。
ルイス肺癌（ＬＬＣ）（転移モデル）マウスの腫瘍量を低減させるＬｃｋ活性化ポリペプチドの能力を調査した。
【０６４８】
ＡＴＣＣから入手したＬＬＣ細胞をＤＭＥＭ中で７０％集密度に増殖し、剥離させた後、ＰＢＳで洗浄した。０日目に、各マウスは、０．５ｘ１０６個のＬＬＣ細胞を尾静脈内注射により投与を受けた。治療薬（ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２の２００μｌの水中の４００μｇ）を週２回腹腔内投与した（細胞導入後、１、４、８、および１１日目）。細胞導入の１５日後に、マウスを安楽死させ、肺を取り出しブアン固定液中に入れて肺組織を固定し、腫瘍を区別する。表面腫瘍転移をマニュアルで計数し、画像を、組織学的検査の前にサイズを推定するために取得した。
【０６４９】
図２３は、腹腔内に投与され場合、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）が、対照と比較して、腫瘍塊の平均面積を低減させることを示す。
【０６５０】
実施例２２：ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２は、ルイス肺癌（ＬＬＣ）（異種移植片）モデルにおいて、異種移植片腫瘍体積および腫瘍細胞生存率を低下させ、腫瘍中のＣＤ４５＋細胞の比率を増大させる。
ルイス肺癌（ＬＬＣ）マウスの異種移植片腫瘍を調節するＬｃｋ活性化ポリペプチドの能力を調査した。
【０６５１】
ルイス肺癌細胞株を約７０％集密度まで培養した後、細胞を集め、計数して、５ｘ１０６／ｍＬで無菌ＨＢＳＳ中に再懸濁させた。Ｃ５７ＢＬ／６の右脇腹に５ｘ１０５細胞（１００μｌ）を皮下注射した。腫瘍細胞移植の５日後に、２つの群間で平均腫瘍サイズがほぼ等しくなるようにマウスをランダムに治療群に割り付けた。試験物質ＩＫ１４００４（２００μｌの水中４００μｇ）またはビークル（水）を、腫瘍細胞移植後５日目から、ビークル治療群で腫瘍の直径が平均１０ｍｍに達するまで、週２回（月曜と木曜）腹腔内（ｉ．ｐ）注射により投与した。腫瘍をデジタルノギスを用いて週３回（月曜、水曜、および金曜）、治療群に関して知らされていない技術者が測定した。ビークル群の平均腫瘍サイズが直径１０ｍｍに達すると、マウスを頸椎脱臼により屠殺し、腫瘍および脾臓を収集した。
【０６５２】
腫瘍を、２ｍＬのコラゲナーゼＤ（２ｍｇ／ｍＬ、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｏｔ＃  ２８９６０１２６）およびＤＮアーゼＩ（１００μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ  Ｌｏｔ＃  ＳＬＢＶ１４４６）を含むＲＰＭＩ−１６４０中に入れ、機械的に消化した後、８０ｒｐｍの振盪インキュベーター中、３７℃で３０分間インキュベートした。消化腫瘍試料を７０μｍのストレーナーを通し、氷冷ＲＰＭＩ−１０で２回洗浄した。試料を遠心分離し、赤血球溶解を実施した後、洗浄し、ＲＰＭＩ−１０に再懸濁させた。腫瘍細胞をトリパンブルー色素排除により計数し、免疫細胞マーカーＣＤ４５（ＡＦ７００）用として染色した。
【０６５３】
図２４は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）が、ルイス肺癌（ＬＬＣ）異種移植片モデルにおいて、異種移植片腫瘍体積および腫瘍細胞生存率を低下させ、腫瘍中のＣＤ４５＋細胞の比率を増大させることを示す。
【０６５４】
実施例２３：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドを投与されたルイス肺癌（転移モデル）マウス由来の脾細胞は、ＴＣＲ刺激時に、ＩＦＮγ産生を増大させる。
Ｌｃｋ活性化ポリペプチドによる治療の、治療ルイス肺癌マウスの脾細胞からのサイトカイン放出に与える効果を調査した。
【０６５５】
簡単に説明すると、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２で治療したルイス肺癌マウス由来の脾細胞を抗ＣＤ３ならびに抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体の存在下で培養し、細胞培養上清中のＩＦＮγおよびＩＬ−２のレベルを調べた。脾臓を採取し、単細胞懸濁液中で処理した。新しい細胞懸濁液を、脾臓採取の直後にまたはウェル当たり２００，０００個の細胞を播種しＴＣＲ刺激の有る場合と無い場合（抗ＣＤ３単独、または抗ＣＤ２８と組み合わせて、両方とも２μｇ／ｍＬの濃度で）で一晩培養の直後に、フローサイトメトリーで評価した。一晩の培養後、上澄みを集め、ＥＬＩＳＡによりＩＦＮγおよびＩＬ−２について評価した。新しい非刺激細胞懸濁液または一晩刺激後の細胞を、次のマーカーについて染色した：生存率、ＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ１．１、ＣＤ２５、Ｋｉ６７、ＣＤ２８、ＣＤ２１５、ＩＬ−２１Ｒ、ＩＬ−１２Ｒβ１およびＩＬ−１２Ｒβ２。
【０６５６】
図２５は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）で治療したマウスは、抗ＣＤ３刺激時にＩＦＮγ産生の有意な増大を示し、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８刺激時に、ＩＬ−２産生を有意に増大させることを示す。重要なことに、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２治療マウス由来のＣＤ４＋脾細胞は、抗ＣＤ２８で共刺激されたビークル治療マウス由来の脾細胞よりも、抗ＣＤ３活性化のみの後に、より多くのＩＬ−１２Ｒβ２を発現した。
【０６５７】
実施例２４：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドを投与されたルイス肺癌（転移モデル）マウスのＣＤ４＋Ｔ細胞は、増大されたＩＬ−１２Ｒβ２の発現レベルを有する。
ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２による治療の、治療されたルイス肺癌マウス（転移モデル）の活性化脾細胞中のＩＬ−１２Ｒβ１およびＩＬ−１２Ｒβ２を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の比率に与える効果を調査した。
【０６５８】
簡単に説明すると、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２で治療したルイス肺癌マウス由来の脾細胞を、抗ＣＤ３ならびに抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体の存在下で培養し、ＩＬ−１２Ｒβ１およびＩＬ−１２Ｒβ２を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞のレベルを調査した。
【０６５９】
図２６は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）で治療したマウスは、抗ＣＤ３刺激時にＣＤ４＋Ｔ細胞でのＩＬ−１２Ｒβ２の発現のレベルの有意な増大、および抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８刺激時にＣＤ４＋Ｔ細胞でのＩＬ−１２Ｒβ１およびＩＬ−１２Ｒβ２発現レベルの有意な増大を示すことを示す。
【０６６０】
実施例２５：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドを投与されたルイス肺癌（転移モデル）マウスは、ＩＬ−１２Ｒβ２を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の増大した比率を有する。
ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２による治療の、治療されたルイス肺癌マウスの非活性化脾細胞中のＩＬ−１２Ｒβ２を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の比率に与える効果を調査した。
【０６６１】
簡単に説明すると、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２で治療したルイス肺癌マウスから脾細胞を単離し、ＩＬ−１２Ｒβ２を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞のレベルを調査した。
【０６６２】
図２７は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）で治療したマウスは、ＩＬ−１２Ｒβ２を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞のレベルの有意な増大を示すことを示す。
【０６６３】
実施例２６：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドを投与されたルイス肺癌（転移モデル）マウスは、増大したレベルのＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−１５Ｒ、およびＣＤ２８を発現するＮＫ細胞、および増大したＮＫ細胞増殖を有する。
Ｌｃｋ活性化ポリペプチドによる治療の、非刺激治療ルイス肺癌マウス中のＣＤ２５＋、ＣＤ２１５、ＣＤ２８＋ＮＫ細胞の比率、およびＮＫ細胞の増殖に与える効果を調べた。
【０６６４】
簡単に説明すると、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２で治療したルイス肺癌マウスから非刺激脾細胞を単離し、非刺激治療ルイス肺癌マウスのＣＤ２５＋、ＣＤ２１５＋、ＣＤ２８＋ＮＫ細胞の比率、およびＮＫ細胞の増殖を調査した。  
【０６６５】
図２８は、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドで治療したマウスは、ＣＤ２５＋、ＣＤ２１５＋、およびＣＤ２８＋ＮＫ細胞のレベルの有意な増大、および刺激の非存在下での増殖ＮＫ細胞の比率の増大を示すことを示す。
【０６６６】
実施例２７：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドを投与されたルイス肺癌（転移モデル）マウスは、ＩＬ−１２Ｒβ２を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の増大した比率を有する。
ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２による治療の、治療されたルイス肺癌マウスの活性化脾細胞中のＩＬ−１２Ｒβ２を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の比率に与える効果を調査した。
【０６６７】
簡単に説明すると、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２の腹腔内投与で治療したルイス肺癌マウスから脾細胞を単離し、ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＩＬ−１２Ｒβ２発現のレベルを調査した。
【０６６８】
図２９は、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドで治療したマウスは、抗ＣＤ３刺激時、ならびに抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８刺激時に、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＬ−１２Ｒβ２の発現のレベルの有意な増大を示すことを示す。
【０６６９】
重要なことに、ＩＫ１４００４治療マウス由来のＣＤ４＋脾細胞は、抗ＣＤ２８で同様に共刺激されたビークル治療マウス由来の脾細胞よりも、抗ＣＤ３活性化のみの後に、より多くのＩＬ−１２Ｒβ２を発現した。
【０６７０】
実施例２８：アニオン性残基を含むペプチドは、Ｌｃｋを活性化しない。
Ｌｃｋを活性化するアニオン性残基を含むペプチドの能力を調査した。
【０６７１】
図３０は、ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２はＬｃｋを活性化するが、アニオン性残基を含むＤＳＥＡＥＮＰＬＹＤ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫＤＥ００４」）はＬｃｋの活性を高めないことを示す。
【０６７２】
実施例２９：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドは、刺激ＰＢＭＣアッセイにおいて、ＮＫ細胞上のＩＬ−２Ｒβ（ＣＤ１２２）発現を増大させる。
Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２の、ＮＫ細胞上のＩＬ−２受容体サブユニットベータ２（ＩＬ−２Ｒβ）発現を変える能力を調査した。
【０６７３】
簡単に説明すると、健康なドナー由来のＰＢＭＣを、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（０．０８〜１．２５μＭ）またはビークル対照の存在下で、抗ＣＤ３（１μｇ／ｍＬ）で７２時間刺激した。培養期間の最後に、細胞を集め、ＣＤ３ｎｅｇＣＤ５６＋／ｄｉｍＮＫ細胞内のＩＬ−２Ｒβ（ＣＤ１２２）発現についてフローサイトメトリーにより評価した。
【０６７４】
図３１は、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）が、ＩＬ−２Ｒβ発現（ＭＦＩ、および％陽性細胞）ＣＤ３ｎｅｇＣＤ５６＋／ｄｉｍＮＫ細胞を誘導することを示す。
【０６７５】
実施例３０：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドは、刺激ＰＢＭＣアッセイにおいて、Ｔ細胞上のＩＬ−２Ｒβ（ＣＤ１２２）発現を増大させる。
Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２の、Ｔ細胞上のＩＬ−２受容体サブユニットベータ２（ＩＬ−２Ｒβ）発現を変える能力を調査した。
【０６７６】
簡単に説明すると、健康なドナー由来のＰＢＭＣを、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（０．０８〜１．２５μＭ）またはビークル対照の存在下で、抗ＣＤ３（１μｇ／ｍＬ）で７２時間刺激した。培養期間の最後に、細胞を集め、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞内のＩＬ−２Ｒβ（ＣＤ１２２）発現についてフローサイトメトリーにより評価した。
【０６７７】
図３２は、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）が、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞中のＩＬ−２Ｒβ発現（％陽性細胞）を誘導することを示す。
【０６７８】
実施例３１：ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２およびｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２は、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞中の脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａの発現を増大させる。
Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２およびｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（Ｄアミノ酸を含むＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２）の、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞のＣＤ１０７ａ発現に与える効果を調査した。
【０６７９】
図３３は、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）およびｒｓｋａｋｎｐｌｙｒ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫＤ１４００４」）が、ＩＦＮαと類似のレベルにＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞中の脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａの発現を増大させることを示す。
【０６８０】
実施例３２：抗原刺激の前に提供されるＬｃｋ活性化ポリペプチドは、ヒトＴリンパ球（ジャーカット）細胞株中のＩＬ−２分泌を誘導するが、Ｌｃｋ欠損細胞中では誘導しない。
Ｌｃｋ活性化ポリペプチドの、ヒトＴリンパ球（ジャーカット）細胞株、およびＬｃｋ欠損（ＪＣａｍ１．６）細胞株によるＩＬ−２産生を誘導する能力を調査した。
【０６８１】
簡単に説明すると、５００万個の細胞をＴ２５フラスコ中に播種し、上記表に示すように種々の濃度のＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２で１時間処理した後、細胞懸濁液を遠心分離し、新鮮培地で２回洗浄した。５００μＬの培地中のビオチン−抗ＣＤ３およびアビジン（５：１．２５μｇ）の混合物を１２ウェルプレートのウェルに加えた。１０分後、細胞をウェル当たり１００万個の濃度で播種し、細胞懸濁液を培地を用いて２ｍＬの体積にした。その後、試料を抗ＣＤ２８（５μｇ／ｍＬ）でさらに刺激して、３７℃で４８時間インキュベートした後、上清（１００μＬ、ｎ＝３）のＩＬ−２含量をＥＬＩＳＡで分析した。
【０６８２】
図３４は、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）が、抗原刺激の前に投与される場合、ヒトＴ細胞株によるＩＬ−２産生を誘導するが、Ｌｃｋ欠損細胞では誘導しないことを示す。
【０６８３】
実施例３３：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドは、ＣＤ８＋細胞集団の増殖を誘発する。
Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２の、ＰＢＭＣ内のＣＤ８＋細胞集団の増殖を誘発する能力を調査した。
【０６８４】
簡単に説明すると、健康なドナー由来のＰＢＭＣを、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（０．０８〜１．２５μＭ）またはビークル対照の存在下でＴＣＲ＋ＩＬ−２を介して１０日間刺激した。培養期間の最後に、細胞を集め、ＣＤ８＋細胞比率についてフローサイトメトリーにより評価した。
【０６８５】
図３５は、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）が、対照と比較してＰＢＭＣ内のＣＤ８＋細胞集団の増殖を誘発することを示す。
【０６８６】
実施例３４：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドは、樹状細胞（ＤＣ）の生存率を高める。
樹状細胞の生存率を高めるＬｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２の能力を調査した。
【０６８７】
簡単に説明すると、未成熟単球由来ＤＣ（ｉＭｏＤＣ）を、Ｍｏ−ＤＣ分化培地中で７日間培養した単離ＣＤ１４＋単球から誘導した。ｉＭｏＤＣを、５点濃度曲線全体にわたる試験ペプチド（０〜１．２５μＭ）＋ビークルおよび抗ＣＤ３（１μｇ／ｍＬ）の存在下で、７２時間培養した。７２時間後、細胞を、生存率についてフローサイトメトリーにより評価した。提示データは、ペプチド処理後の平均生存細胞パーセンテージを示す。
【０６８８】
図３６は、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）が、単球由来ＤＣの生存率を高めることを示す。
【０６８９】
実施例３５：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２は単離ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞からのＩＬ−２分泌を増大させる。
単離Ｔ細胞（ＣＤ３＋Ｔ細胞）からのＩＬ−２分泌に与えるＬｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２の効果を調査した。
【０６９０】
簡単に説明すると、単離Ｔ細胞（ＣＤ３＋）を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）で刺激し、５種の濃度範囲のＬｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（０〜１．２５μＭ）＋ビークル対照と一緒に、７２時間培養した後、上清を集め、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−２についてアッセイした。
【０６９１】
図３７は、Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）が、単離ヒトＴ細胞中で対照に比較してＩＬ−２分泌を誘導することを示す。
【０６９２】
実施例３６：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２は、ヒトＴリンパ球（ジャーカット）細胞株でのＩＬ−２分泌を増大させる。
ＩＬ−２分泌を変えるＬｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２の能力におけるＬｃｋの役割を調査した。
【０６９３】
簡単に説明すると、野生型ジャーカット細胞およびＬｃｋ欠損ジャーカット細胞（Ｊ．Ｃａｍ１．６）を、抗ＣＤ２８抗体およびアビジンの存在下で、ビオチン化抗ＣＤ３抗体への暴露により刺激した。培養期間（２４時間）中、細胞をＬｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２に暴露した。細胞上清を、上述の標準的な市販ＥＬＩＳＡキットを用いて２４時間の終わりにＩＬ−２についてアッセイした。
【０６９４】
図３８は、対照と比較してジャーカット細胞でのＩＬ−２分泌を誘導するＬｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）の能力が、Ｌｃｋに依存することを示す。このデータは、Ｌｃｋ活性化融合ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２によるヒトＴ細胞株中のＩＬ−２分泌が、Ｌｃｋに依存することを示す。
【０６９５】
実施例３７：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２は、ヒトＴリンパ球（ジャーカット）細胞株のＩＬ−２Ｒα発現を増大させる。
ジャーカット細胞上のＩＬ−２Ｒα発現を変えるＬｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２の能力におけるＬｃｋの役割を調査した。
【０６９６】
簡単に説明すると、野生型ジャーカット細胞およびＬｃｋ欠損ジャーカット細胞（Ｊ．Ｃａｍ１．６）を、抗ＣＤ２８抗体およびアビジンの存在下で、ビオチン化抗ＣＤ３抗体への暴露により刺激した。培養期間（２４時間）中、細胞をＬｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２に暴露した。細胞ライセートを、上述の標準的な市販ＥＬＩＳＡキットを用いて２４時間の終わりにＩＬ−２Ｒαについてアッセイした。
【０６９７】
図３９は、対照と比較してジャーカット細胞上でＩＬ−２Ｒα発現を誘導するＬｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）の能力が、Ｌｃｋに依存することを示す。このデータは、Ｌｃｋ活性化融合ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２によるヒトＴ細胞株上のＩＬ−２Ｒα発現が、Ｌｃｋにより強化されることを示す。
【０６９８】
実施例３８：Ｌｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２による、ヒトＴリンパ球（ジャーカット）細胞株でのＩＬ−２分泌の増大は、ＴＣＲ刺激に依存する。
ＩＬ−２分泌を変えるＬｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２の能力におけるＬｃｋの役割を調査した。
【０６９９】
簡単に説明すると、ジャーカット細胞を、抗ＣＤ２８抗体およびアビジンの存在下でビオチン化抗ＣＤ３抗体への暴露により刺激した、または刺激しなかった。培養期間（２４時間）中、細胞をＬｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２に暴露した。細胞培養上清を、上述の標準的な市販ＥＬＩＳＡキットを用いて２４時間の終わりにＩＬ−２についてアッセイした。
【０７００】
図４０は、対照と比較してジャーカット細胞でのＩＬ−２分泌を誘導するＬｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」）の能力が、ＴＣＲ刺激に依存することを示す。
【０７０１】
実施例３９：末梢血ＣＤ４＋細胞中のＨＩＶ複製の抑制。
末梢血ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ複製を抑制するＬｃｋ活性化ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２の能力を調査した。
【０７０２】
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｒｅｄ  Ｃｒｏｓｓにより提供された「バフィーコート」から単離した。細胞を１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体で刺激した。細胞を３７℃で２日間インキュベートし、ＣＤ４＋細胞をＣＤ４＋ＭＡＣＳにより単離した。一部のＣＤ４＋細胞をＨＩＶ−１（株ＡＤ８、ＣＣＲ５指向性）に感染させた。
【０７０３】
試験ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２のＨＩＶ−１複製に与える効果を、急性的に感染させた初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞（感染後３日）を用いて試験した。処理培養液を４８時間インキュベートし、培養上清中に存在するＨＩＶ−１カプシドの量をＥＬＩＳＡにより測定した。ウィルス粒子は細胞膜から出芽するので、培養上清中に存在するカプシドは、ＨＩＶ−１複製の指標である。この結果を、図４１に示す。ネビラピン（ＮＶＰ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ）は、商業的に入手できる非ヌクレオシド逆転写酵素抑制剤であり、陽性対照として使用された。試験ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２は、図４１でＩＫ５として特定される。
【０７０４】
ＣＤ４＋細胞モデルは、培養上清中で測定可能な量のウィルスを産生するために、ＨＩＶ−１感染細胞から非感染細胞へのウィルス拡散を必要とする。このモデルは、従って、ウィルス複製の全ステップでの試験薬剤の効果を検出できる。図４１に示すように、１０μＭのＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２（「ＩＫ１４００４」；「ＩＫ５」）ペプチドは、陰性対照（薬物なし）に比較して、約５倍ＨＩＶ−１複製を抑制した。
【０７０５】
実施例４０：ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲおよびＲＳＫＡＫＮＰＬＹは、ヒトＴリンパ球（ジャーカット）細胞株中のＩＬ−２分泌を増大させ、およびｒｓｋａｋｎｐｌｙは、ヒトＴリンパ球（ジャーカット）細胞株中のＩＬ−１２分泌を高めるが、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲは、ＩＬ−１２分泌を高めない。
ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（「１４０００」）、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹ（「ＩＫ９４０００」）およびｒｓｋａｋｎｐｌｙ（「ＩＫＤ９４０００」）のＩＬ−２およびＩＬ−１２分泌を変える能力を調査した。
【０７０６】
簡単に説明すると、野性型ジャーカット細胞（ヒトＴリンパ球細胞の不死化系）を、抗ＣＤ２８抗体およびアビジンの存在下で、ビオチン化抗ＣＤ３抗体への暴露により刺激した。ウェル（１２ウェルプレート、２ｍＬ体積）当たり１００万個で細胞を播種し、ビオチン−ＣＤ３、抗ＣＤ２８、およびアビジン（５：５：１．２５μｇ）で刺激した。次に、細胞を試験ペプチドで処理した後、３７℃で４８時間インキュベートした。その後、上清（１００μｌ、ｎ＝３）のＩＬ−２およびＩＬ−１２含量を分析した。培養期間（４８時間）中、細胞を試験ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ−（２Ａｄｏｄ）４−ＮＨ２に暴露した。４８時間の終わりに、上述の標準的な市販ＥＬＩＳＡキットを用いて細胞上清のＩＬ−２およびＩＬ−１２をアッセイした。
【０７０７】
図４２Ａは、ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲおよびＲＳＫＡＫＮＰＬＹが、ヒトＴリンパ球（ジャーカット）細胞株中のＩＬ−２分泌を増大させることを示す。
【０７０８】
図４２Ｂは、ｒｓｋａｋｎｐｌｙは、ヒトＴリンパ球（ジャーカット）細胞株のＩＬ−１２分泌を増大させるが、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲは分泌を増大させないことを示す。
【０７０９】
多くの本発明の実施形態が上記で説明されてきたが、本発明の範囲から逸脱することなく、さまざまな修正および変更がなされ得ることは理解されよう。上記の実施形態は、従って、例示に過ぎず、限定するものと解釈されるべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【国際調査報告】
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