(57)【要約】本発明は、ＣＤ２４タンパク質の投与を必要とする対象にＣＤ２４タンパク質を投与することによりＨＩＶ−１／ＡＩＤＳを治療、緩和、最小化、又は予防する方法に関する。本開示ではまた、ＨＩＶ−１／ＡＩＤＳの治療のための薬剤の製造におけるＣＤ２４タンパク質の使用が提供される。本開示ではさらに、薬学的に許容される量のＣＤ２４タンパク質を含む医薬組成物が提供される。
2021523929.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ２４タンパク質の投与を必要とする対象へＣＤ２４タンパク質を投与することを含むＨＩＶ／ＡＩＤＳの治療方法。
【請求項２】
前記ＣＤ２４タンパク質が成熟ヒトＣＤ２４ポリペプチド又はそのバリアントを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記成熟ヒトＣＤ２４ポリペプチドが配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＣＤ２４タンパク質がプロテインタグをさらに含み、前記プロテインタグが前記ＣＤ２４タンパク質のＮ末端又はＣ末端に融合されている、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記プロテインタグが哺乳動物免疫グロブリン（Ｉｇ）タンパク質のＦｃ領域を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｉｇタンパク質がヒト免疫Ｉｇタンパク質である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｆｃ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、又はＩｇＡの、ヒンジ領域並びにＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｆｃ領域がＩｇＭのヒンジ領域並びにＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、及びＣＨ４ドメインを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ＣＤ２４タンパク質が配列番号６、配列番号１１、又は配列番号１２のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＣＤ２４タンパク質のアミノ酸配列が配列番号６、配列番号１１、又は配列番号１２の配列からなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＣＤ２４タンパク質が真核生物発現系を使用して生産される、請求項１〜請求項１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記発現系が、チャイニーズハムスター卵巣細胞系に含まれるベクター、又は複製欠損レトロウイルスベクターを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記複製欠損レトロウイルスベクターが真核細胞に安定的に組み込まれる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＣＤ２４タンパク質が可溶性である、請求項１〜請求項１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＣＤ２４タンパク質がグリコシル化されている、請求項１〜請求項１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
対象のＨＩＶ／ＡＩＤＳの治療のための薬剤の製造におけるＣＤ２４タンパク質の使用。
【請求項１７】
前記ＣＤ２４タンパク質が成熟ヒトＣＤ２４ポリペプチド又はそのバリアントを含む、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記成熟ヒトＣＤ２４ポリペプチドが配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記ＣＤ２４タンパク質がプロテインタグをさらに含み、前記プロテインタグが前記ＣＤ２４タンパク質のＮ末端又はＣ末端に融合されている、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記プロテインタグが哺乳動物免疫グロブリン（Ｉｇ）タンパク質のＦｃ領域を含む、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記免疫グロブリン（Ｉｇ）タンパク質がヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）タンパク質である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記Ｆｃ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、又はＩｇＡの、ヒンジ領域並びにＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記Ｆｃ領域がＩｇＭのヒンジ領域並びにＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、及びＣＨ４ドメインを含む、請求項２１に記載の使用。
【請求項２４】
前記ＣＤ２４タンパク質が配列番号６、配列番号１１、又は配列番号１２のアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の使用。
【請求項２５】
前記ＣＤ２４タンパク質のアミノ酸配列が配列番号６、配列番号１１、又は配列番号１２の配列からなる、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
前記ＣＤ２４タンパク質が真核生物発現系を使用して生産される、請求項１６〜請求項２５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２７】
前記発現系が、チャイニーズハムスター卵巣細胞系に含まれるベクター、又は複製欠損レトロウイルスベクターを含む、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
前記複製欠損レトロウイルスベクターが真核細胞に安定的に組み込まれる、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
前記ＣＤ２４タンパク質が可溶性である、請求項１６〜請求項２８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３０】
前記ＣＤ２４タンパク質がグリコシル化されている、請求項１６〜請求項２９のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は後天性免疫不全症候群（ＨＩＶ／ＡＩＤＳ）の治療のための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＩＶ−１／ＡＩＤＳは世界的な健康の最大の脅威の１つである。長期間のｃＡＲＴ（併用抗レトロウイルス薬療法）／ＨＡＡＲＴ（高活性抗レトロウイルス療法）は効果的に血漿中のウイルス量を検出限界未満に低下させたまま維持し、免疫系を部分的に再構築することができるが、患者の約２０％では適切な免疫再構築がおこらない（Kelley et al., 2009）。慢性的な免疫活性化（免疫系の持続的かつ異常な活性化）は病原性ＨＩＶ−１／ＳＩＶ感染の特徴であるだけでなく、ｃＡＲＴ使用下のＨＩＶ−１感染個体における、免疫再構築障害と関連する疾患進行の強力かつ独立した予測因子である（Pallikkuth et al., 2013）。一方では、慢性的な免疫活性化及び炎症は免疫細胞の細胞周期進行を促進し、成長及び分裂サイクルを通して免疫細胞を免疫老化へと導く（Deeks SG., et al., 2009）。他方で、継続する慢性的な免疫活性化及び炎症は悪循環を引き起こし、炎症組織微小環境の形成を促進し、最終的にはＨＩＶ感染患者に有害な体中への問題を引き起こす（Younas M et al., 2016; Rajasuriar et al., 2015）。長期的には、持続的な高度の炎症及び慢性的な免疫活性化は臓器に損傷を与え、癌、心血管疾患、肝疾患、腎疾患等の重篤な非ＡＩＤＳ症状の高いリスクとなる炎症関連疾患を引き起こし得る（Deeks et al., 2013;Rajasuriar et al., 2015）。最近では、ｃＡＲＴ、並びにサイトカインの生産及び機能の阻害は、慢性的な免疫活性化及び炎症を管理して全体的な健康状態を改善するための抗炎症薬及び免疫抑制剤を含み、ＨＩＶ免疫療法に重要な戦略となっている（Rajasuriar et al., 2013）。さらに、慢性的な免疫活性化及び炎症の制御は他の感染症の効果的な治療にも重要な役割を果たす（Hsu et al., 2016）。ＨＩＶ−１／ＳＩＶにおける慢性的な免疫活性化及び炎症には、ウイルス複製、共感染、又は日和見病原菌の産生、及び微生物トランスロケーションの産物等、多くの原因が寄与していることが報告されている（Paiardini et al., 2013）。バルガンシクロビル、抗ＬＰＳ抗体、セベラマー炭酸塩等、上記原因をターゲットとする様々な治療戦略が開発されてきたが、ＡＩＤＳ患者やＳＩＶ感染動物に対して効果にはばらつきがある（Hunt et al., 2011;Kristoff et al., 2014;Sandler et al., 2014）。したがって、慢性的な免疫活性化をコントロールすることによるＨＩＶ−１／ＡＩＤＳの治療には依然として大きなアンメットメディカルニーズが存在する。
【発明の概要】
【０００３】
本開示では、ＣＤ２４タンパク質の投与を必要とする対象にＣＤ２４タンパク質を投与することによりＨＩＶ−０１／ＡＩＤＳを治療、緩和、最小化、又は予防する方法が提供される。また、本開示では、ＨＩＶ−１／ＡＩＤＳの治療のための薬剤の製造におけるＣＤ２４タンパク質の使用が提供される。ＣＤ２４タンパク質は成熟ヒトＣＤ２４ポリペプチド又はそのバリアントを含んでいてもよい。成熟ヒトＣＤ２４ポリペプチドは配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含んでいてもよい。ＣＤ２４タンパク質はヒトＣＤ２４の任意の又は全ての細胞外ドメインを含んでいてもよい。ＣＤ２４タンパク質はシグナル配列を含んでいてもよく、当該シグナル配列は、当該タンパク質を発現している細胞からの放出を可能とするために配列番号４のアミノ酸配列を有していてもよい。シグナルペプチド配列は他の膜貫通又は分泌タンパク質にみられるものであってもよく、本技術分野において公知の既存のシグナルペプチドから改変されたものであってもよい。ＣＤ２４タンパク質は可溶性であってもよく、グリコシル化されていてもよい。ＣＤ２４タンパク質は真核生物タンパク質発現系を用いて製造されるものであってもよく、当該真核生物タンパク質発現系はチャイニーズハムスター卵巣細胞系に含まれるベクターを含んでもよく、複製欠損レトロウイルスベクターを含んでもよい。複製欠損レトロウイルスベクターは、真核生物のゲノムに安定して組み込まれるものであってもよい。
【０００４】
ＣＤ２４タンパク質はプロテインタグを含んでもよく、当該プロテインタグはＣＤ２４タンパク質のＮ末端又はＣ末端で融合されるものであってもよい。当該タンパク質は、哺乳動物免疫グロブリン（Ｉｇ）タンパク質の部分を含んでもよい。当該Ｉｇタンパク質の部分はＩｇタンパク質のＦｃ領域であってもよく、Ｉｇタンパク質はヒトＩｇタンパク質であってもよい。Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、又はＩｇＡの、ヒンジ領域、並びにＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含んでいてもよい。Ｆｃ領域はＩｇＭのヒンジ領域、並びにＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、及びＣＨ４ドメインを含んでいてもよい。ＣＤ２４タンパク質は配列番号５、６、８、９、１１、又は１２のアミノ酸配列を含んでいてもよい。ＣＤ２４タンパク質のアミノ酸配列は配列番号５、６、８、９、１１、又は１２の配列からなるものであってもよい。
【０００５】
本開示ではまた、ＣＤ２４の投与を必要とする対象にＣＤ２４を投与することにより慢性的炎症及びＨＩＶウイルス量をコントロールする方法が説明される。ＣＤ２４Ｆｃは危険関連分子パターン（ＤＡＭＰ）及びＳｉｇｌｅｃと相互作用して炎症を減衰させるため、ＣＤ２４Ｆｃは、確立したサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ；ｓｉｍｉａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）を有する中国アカゲザル（ＣｈＲＭ；Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅ）を保護することが示された。これらの結果から、ＤＡＭＰに対する自然免疫応答の負の制御を増強させることが、ＨＩＶ感染者の治療に新たなアプローチとなることが示される。かかる見解を立証するため、ＨＩＶ感染ヒト化マウスでＣＤ２４Ｆｃの効果も試験し、そのデータから、ＣＤ２４Ｆｃは炎症性サイトカインの産生及びヒトＴ細胞の免疫活性化を顕著に減少させることがわかる。さらに、ＣＤ２４ＦｃはＨＩＶ感染マウスにおけるヒト幹細胞の造血を顕著に増加させる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１Ａ】図１Ａ〜Ｃは全長ＣＤ２４融合タンパク質であるＣＤ２４Ｆｃ（以下、ＣＤ２４Ｉｇともいう）（配列番号５）のアミノ酸組成を示す。下線を付した２６アミノ酸はＣＤ２４のシグナルペプチド（配列番号４）であり、当該タンパク質を発現する細胞から放出される際に切断され除去されるため、プロセシング後のタンパク質（配列番号６）には存在しない。配列の太字部分は、融合タンパク質に用いられる成熟ＣＤ２４タンパク質の細胞外ドメインである（配列番号２）。成熟ＣＤ２４タンパク質に通常存在する最後のアミノ酸（Ａ又はＶ）は免疫原性を避けるために構築物から除去されている。下線及び太字以外の文字はＩｇＧ１  Ｆｃの配列であり、ヒンジ領域、並びにＣＨ１ドメイン、及びＣＨ２ドメインが含まれる（配列番号７）。  図１ＢはＣＤ２４ｖＦｃの配列を表し（配列番号８）、ここで成熟ＣＤ２４タンパク質（太字）は配列番号１のバリン多型バリアントである。  図１ＣはＣＤ２４ＡＦｃの配列を表し（配列番号９）、ここで成熟ＣＤ２４タンパク質（太字）は配列番号１のアラニン多型バリアントである。図１Ｂ及び図１Ｃの融合タンパク質の各箇所は図１Ａと同様にマークされており、バリアントであるバリン／アラニンのアミノ酸には二重下線が付されている。
【図１Ｂ】同上
【図１Ｃ】同上
【０００７】
【図２】図２はマウス（配列番号３）及びヒト（配列番号２）の成熟ＣＤ２４タンパク質の間のアミノ酸配列の差異を示している。潜在的なＯ−グリコシル化部位は太字とし、Ｎ−グリコシル化部位には下線が付されている。
【０００８】
【図３】図３Ａ〜Ｃ。ＣＤ２４ＩｇＧ１（ＣＤ２４Ｆｃ）の薬物動態のＷｉｎＮｏｎｌｉｎコンパートメントモデリング分析。白丸は３匹のマウスの平均を表し、線は推定薬物動態曲線である。  図３Ａ：１ｍｇのＣＤ２４ＩｇＧ１の静脈内（ｉ．ｖ．）注射。  図３Ｂ：１ｍｇのＣＤ２４ＩｇＧ１（ＣＤ２４Ｆｃ）の皮下（ｓ．ｃ．）注射。  図３Ｃ：曲線下面積（ＡＵＣ）、半減期、及び最大血中濃度で測定される血中の抗体の総量の比較。差は統計的に有意ではないが、全体的に皮下注射のＡＵＣとＣｍａｘは静脈注射の約８０％である。
【０００９】
【図４】図４Ａ〜Ｂ。ＣＤ２４−ＳｉｇｌｅｃＧ（１０）相互作用は、ＰＡＭＰとＤＡＭＰとを区別する。  図４Ａ：ＰＡＭＰに対する宿主の応答は、ＣＤ２４−ＳｉｇｌｅｃＧ（１０）相互作用の影響を受けなかった。  図４Ｂ：ＣＤ２４−ＳｉｇｌｅｃＧ（１０）の相互作用は、ＤＡＭＰに対する宿主の応答を抑制する。これはおそらくＳｉｇｌｅｃＧ／１０に会合するＳＨＰ−１を介するものである。
【００１０】
【図５】図５Ａ〜５Ｃ。ＣＤ２４ＦｃはＳｉｇｌｅｃ１０とＨＭＧＢ１に結合し、ヒトＳｉｇｌｅｃ１０のマウス相同体であるＳｉｇｌｅｃＧを活性化する。  図５Ａ：ＣＤ２４Ｆｃ−Ｓｉｇｌｅｃ１０相互作用の親和性測定。  図５Ｂ：ＣＤ２４Ｆｃは、カチオン依存的にＨＭＧＢ−１と特異的に相互作用する。カチオンキレート剤であるＥＤＴＡの存在下又は非存在下で、０．１ｍＭのＣａＣｌ２及びＭｇＣｌ２中、ＨＭＧＢ１とともにＣＤ２４Ｆｃをインキュベートした。ＣＤ２４ＦｃをプロテインＧビーズでプルダウンし、ウェスタンブロットでＨＭＧＢ１、ＣＤ２４Ｆｃ、又はコントロールＦｃの量を決定する。  図５Ｃ：ＣＤ２４Ｆｃは、チロシンリン酸化の誘導（中央パネル）及びＳＨＰ−１との会合（上部パネル）によりマウスＳｉｇｌｅｃＧを活性化する。ＳｉｇｌｅｃＧの量は下部パネルに示される。ＣＤ２４−／−脾臓細胞を１μｇ／ｍｌのＣＤ２４−Ｆｃ、コントロールＦｃ又はビヒクル（ＰＢＳ）コントロールで３０分間刺激した。次に、ＳｉｇｌｅｃＧを免疫沈降し、抗ホスホチロシン又は抗ＳＨＰ−１でプローブした。
【００１１】
【図６】図６Ａ〜Ｂ。ＣＤ２４Ｆｃは、抗ＣＤ３活性化ヒトＴ細胞によるＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γの産生を阻害する。ＣＤ２４Ｆｃの存在下又は非存在下で、抗ＣＤ３でヒトＰＢＭＬを４日間刺激し、細胞培養液の上清中に放出されたＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの量をＥＬＩＳＡにより測定した。表示されているデータは、３回の平均である。エラーバー、ＳＥＭ。
【００１２】
【図７】図７Ａ〜Ｂ。ＣＤ２４は、ヒトマクロファージによる炎症性サイトカイン産生を阻害する。  図７Ａ：ＣＤ２４のＳｈＲＮＡサイレンシングにより、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、及びＩＬ−６が自然に産生される。混合された、又は２つの独立したＣＤ２４  ｓｈＲＮＡ分子をコードするレンチウイルスベクターでＴＨＰ１細胞を形質導入した。形質導入した細胞をＰＭＡ（１５ｎｇ／ｍｌ）とともに４日間培養して、マクロファージに分化させた。ＰＭＡ及び非接着細胞を洗い流した後、細胞をさらに２４時間培養して、サイトカインビーズアレイによる炎症性サイトカインの測定に供した。  図７Ｂ：所定濃度のＣＤ２４Ｆｃ又はコントロールＩｇＧ  Ｆｃを最後の２４時間でマクロファージに添加したことを除き、図７Ａと同様である。図７Ａに示されるデータは、３つの独立した実験からの平均と標準偏差（Ｓ．Ｄ．）であり、図７Ｂのデータは、少なくとも３つの独立した実験の代表を表す。
【００１３】
【図８】図８Ａ〜Ｅ。ＣＤ２４Ｆｃは、ＳＩＶｍａｃ２３９感染を原因とするＡＩＤＳから中国アカゲザルを保護する。  図８Ａ：実験スケジュールの概略図。  図８Ｂ：ビヒクル処置（左）又はＣＤ２４Ｆｃ処置（中央）後の、ＳＩＶｍａｃ２３９に感染したサルの体重減少。試験のサマリーデータが右パネルに示されている。  図８Ｃ〜Ｅ：ＣＤ２４ＦｃはＳＩＶｍａｃ２３９に感染したサルを消耗症候群（図８Ｃ）、下痢（図８Ｄ）、並びにＡＩＤＳ罹患及び致死（図８Ｅ）から保護する。コントロール群（黒）、ＣＤ２４Ｆｃ処置群（灰色）。  図８Ｂ（右）の統計的有意性は二元配置反復測定分散分析及びＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較試験を用いて決定し、図８Ｃ〜Ｅの統計的有意性は両側ｔ検定を用いて決定した。
【００１４】
【図９】図９Ａ〜Ｄ。ＣＤ２４Ｆｃは血漿中ウイルス量の上昇を遅らせ、プロウイルス量を低下させることができる。  図９Ａ：コントロール又はＣＤ２４Ｆｃで処置されたサルにおける血漿中ウイルス量。試験期間３２週に生存していたサルだけが分析に含まれる。  図９Ｂ：処置前のレベルを人工的に１．０としてウイルス量を正規化したことを除き図９Ａと同じである。  図９Ｃ：処置前及び処置後のプロウイルス量の変動。  図９Ｄ：組織内プロウイルス量。コントロール群（黒）、ＣＤ２４Ｆｃ処置群（灰色）。  図９Ａ〜Ｃの統計的有意性は二元配置反復測定分散分析及びＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較試験を用いて決定した。統計的有意性はスチューデントのｔ検定で決定した。
【００１５】
【図１０】図１０Ａ〜Ｄ。ＣＤ２４Ｆｃは消化管の炎症を低減することができる。  図１０Ａ：ＣＤ２４Ｆｃ（灰色）又はビヒクルコントロール（黒）の処置を受けたＳＩＶｍａｃ２３９に感染したサルの直腸における前炎症性因子の転写レベルである。ＧＡＰＤＨレベルは内部コントロールとして用いられている。  図１０Ｂ：免疫蛍光により測定されたＭＰＯ＋細胞数に基づく、回腸（ｎ＝１１）、結腸（ｎ＝１０）、直腸（ｎ＝１０）における顆粒球浸潤。示されているデータは平均及び標準偏差（Ｓ．Ｄ．）である。各データポイントは計測された少なくとも５個の高倍率視野の平均である。コントロール群（黒）、ＣＤ２４Ｆｃ処置群（灰色）。  図１０Ｃ：コントロール又はＣＤ２４Ｆｃで処置されたサルのＨＥ染色切片の代表的な画像。  図１０Ｄ：病理学的スコアのデータの概要。  図１０Ａ、Ｂ、及びＤの統計学的有意性はスチューデントのｔ検定で決定した。
【００１６】
【図１１】図１１Ａ〜Ｄ。ＣＤ２４Ｆｃ処置はＨＩＶ−１のウイルス量を低減し、急性ＨＩＶ感染を有するヒト化マウスの脾臓においてＣＤ４＋Ｔ細胞を枯渇から保護する。  図１１Ａ：感染後１日目、８日目、１５日目に５ｍｇ／ｋｇのＣＤ２４Ｆｃを腹腔内投与した、又はしなかったＲ３Ａ感染マウスにおける、血漿ＨＩＶ−１量に対するＣＤ２４Ｆｃ処置の影響。  図１１Ｂ：サマリーデータは、ＦＣ２４Ｆｃで処置された、又は処置されなかったＲ３Ａ感染マウスの末梢血におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の割合（％）を示す。  図１１Ｃ〜Ｄ：ＣＤ２４Ｆｃで処置された、又は処置されなかったＲ３Ａ感染マウスの脾臓における終了時のＣＤ４＋Ｔ細胞の絶対数（図１１Ｃ）及び全ヒトリンパ球の絶対数（図１１Ｄ）のサマリーデータ。  データは、平均及び標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）で示される。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１（スチューデントの対応のない両側ｔ検定による分析）。
【００１７】
【図１２】図１２Ａ〜Ｃ。ＣＤ２４Ｆｃ処置は慢性的ＨＩＶ感染ヒト化マウスにおいてＨＩＶ−１複製を低減した。  図１２Ａ：血漿中ＨＩＶ量に対するＣＤ２４Ｆｃ処置（感染７週後から開始して週に５ｍｇ／ｋｇを６週間）の効果。Ｐ値が示されている。データは平均と標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）で表される。＊Ｐ＜０．０５（スチューデントの対応のない両側ｔ検定による分析）。  図１２Ｂ：示されているドットプロットは、モック、ＨＩＶ−１、ＣＤ２４Ｆｃ処置をしたＨＩＶ−１、及びｃＡＲＴ処置をしたＨＩＶ−１を含む４群のリンパ節及び脾臓におけるＣＤ３＋ＣＤ８−Ｔ細胞によるｐ２４発現をそれぞれ示す。数値はｐ２４＋細胞サブセットの割合（％）を示す。サマリーデータは図１２Ｂの４群におけるｐ２４＋Ｔ細胞サブセットの割合を示す。各ドットあたり１マウスを表す。Ｐ＜０．０５が示されている（スチューデントの対応のない両側ｔ検定による分析）。
【００１８】
【図１３】図１３Ａ〜Ｂ。ＣＤ２４処置は慢性ＨＩＶ感染ヒト化マウスにおいてナイーブＴ細胞の割合を顕著に増加させた。  図１３Ａ：示されているドットプロットはモック、ＨＩＶ−１、ＣＤ２４Ｆｃ処置をしたＨＩＶ−１、及びｃＡＲＴ処置をしたＨＩＶ−１を含む４群におけるナイーブＴ細胞、並びにメモリーＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの分布を表す。数値は細胞サブセットの割合（％）を示す。  図１３Ｂ：サマリーデータは４群におけるメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの割合を示す。データは平均と標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）で表される。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントの対応のない両側ｔ検定による分析）。
【００１９】
【図１４】図１４Ａ〜Ｂ。ＣＤ２４Ｆｃ処置は慢性ＨＩＶ感染ヒト化マウスにおけるＴ細胞の過活性化を顕著に低減した。  図１４Ａ：示されているドットプロットはモック、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−１とＣＤ２４Ｆｃ、及びＨＩＶ−１とｃＡＲＴをそれぞれ受けた４群のヒト化マウスにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞サブセット及びＣＤ８＋Ｔ細胞サブセット上のＣＤ３８及びＨＬＡ−ＤＲの発現を表す。数値はＣＤ３８及びＨＬＡ−ＤＲ発現細胞サブセットの割合（％）を示す。  図１４Ｂ：サマリーデータは４群におけるＣＤ３８＋ＨＬＡ−ＤＲ＋ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞の割合（％）を示す。データは平均と標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）で表される。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントの対応のない両側ｔ検定による分析）。
【００２０】
【図１５】図１５Ａ〜Ｄ。ＣＤ２４処置はｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでＨＩＶ−１誘導性の炎症性サイトカイン産生を阻害した。ＴＨＰ細胞を、３日間ＣＤ２４Ｆｃ存在下又は非存在下でＲ３Ａストックに感染させた。細胞を収集してｐｒｅ−ＩＬ−１β及びＩＬ６のｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲを行い、上清を収集してＩＬ−１βのＥＬＩＺＡを行った。  図１５Ａ：ＣＤ２４Ｆｃはｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴＨＰ単球細胞によるＨＩＶ  Ｒ３Ａ誘導性のＩＬ−１β産生を阻害した。  図１５Ｂ：ＣＤ２４Ｆｃはｐｒｅ−ＩＬ−１β及びＩＬ６のｍＲＮＡ産生を阻害した。データは平均と標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）で表される。＊＊Ｐ  モックと比較して＜０．０１、＃＃Ｐ  Ｒ３Ａと比較して＜０．０１（スチューデントの対応のある両側ｔ検定による分析）。  図１５Ｃ：Ｒ３Ａ感染ヒト化マウス（各群ｎ＝３）におけるＣＤ２４Ｆｃ処置（５ｍｇ／ｋｇ）の概略。  図１５Ｄ：サマリーデータはＲ３Ａ急性感染１〜３週後（ｗｐｉ）における血漿の炎症性サイトカインレベル（ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮ−γ、及びＩＬ−１７ａを含む）を示す。データは平均と標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）で表される。＊Ｐ  各時点におけるＲ３Ａと比較して＜０．０５。
【００２１】
【図１６】ＣＤ２４Ｆｃ処置はｉｎ  ｖｉｖｏで慢性ＨＩＶ−１感染ヒト化マウスのＨＳＣの増殖をレスキューする。モックマウス（ｎ＝４）、ＨＩＶ−１感染マウス（ｎ＝５）、及びＣＤ２４Ｆｃ処置を行ったＨＩＶ−１感染マウス（ｎ＝４）のそれぞれにおける、ＣＤ３４＋ＨＳＣから発達したコロニー形成単位（ＣＦＵ）のサマリーデータ。ＣＤ２４Ｆｃは感染７週後から開始して週に５ｍｇ／ｋｇを６週間腹腔内投与した。エラーバーは標準誤差（ｓ．ｅ．）を表す。＊Ｐ＜０．０５（スチューデントの対応のない両側ｔ検定による分析）。ＣＦＵ−ＧＭ：コロニー形成単位−顆粒球、マクロファージ。ＣＦＵ−Ｅ：コロニー形成単位−赤血球。ＣＦＵ−ＧＥＭＭ：コロニー形成単位−顆粒球、赤血球、マクロファージ、巨核球。
【００２２】
【図１７】ヒト対象におけるＰＫ評価可能集団の治療による平均血漿ＣＤ２４Ｆｃ濃度（±ＳＤ）のプロットを示す。ＰＫ＝薬物動態、ＳＤ＝標準偏差。
【００２３】
【図１８】ＰＫ評価可能集団のＣＤ２４ＦｃのＣｍａｘ対用量の用量比例性プロットを示す。
【００２４】
【図１９】ＰＫ評価可能集団のＣＤ２４ＦｃのＡＵＣ０−４２ｄ対用量の用量比例性プロットを示す。
【００２５】
【図２０】ＰＫ評価可能集団のＣＤ２４Ｆｃ  ＡＵＣ０−ｉｎｆ対用量の用量比例性プロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
発明者らは、驚くべきことに、可溶型のＣＤ２４がＨＩＶ−１／ＡＩＤＳに非常に効果的であることを発見した。この効果はＤＡＭＰを介するものである可能性がある。パターン認識は、ＰＡＭＰ及びＤＡＭＰとそれぞれ呼ばれる、病原体関連分子パターン（pathogen-associated molecular pattern）及びダメージ関連分子パターン（damage-associated molecular pattern）のいずれにも引き起こされる炎症反応に関係している。発明者らは、最近の研究はＤＡＭＰに対する悪化した宿主応答が炎症性の自己免疫疾患の病因に関与している可能性を示していることに気づいた。動物モデルにおいて、ＤＡＭＰは、炎症性サイトカインの産生及び自己免疫疾患を促進することが判明しており、そのためＨＭＧＢ１及びＨＳＰ９０などのＤＡＭＰの阻害剤は、関節リウマチ（ＲＡ）を改善することが判明した（４−６）。ＴＬＲ、ＲＡＧＥ−Ｒ、ＤＮＧＲ（Ｃｌｅｃ９Ａにコードされる）、及びＭｉｎｃｌｅは、様々なＤＡＭＰにより始まる炎症の媒介を担う受容体であることが示されている（２、７−１４）。
【００２７】
発明者らの最近の研究では、ＣＤ２４−ＳｉｇｌｅｃＧ相互作用はＤＡＭＰに対する自然免疫とＰＡＭＰに対する自然免疫とを区別することを示した（１５、１６）。Ｓｉｇｌｅｃタンパク質は、様々なシアル酸含有構造を認識する膜結合免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーである。ほとんどのＳｉｇｌｅｃには、ＳＨＰ−１、ＳＨＰ−２、及びＣｂｌ−ｂと結合して炎症反応の重要な調節因子をコントロールする細胞内免疫チロシン抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）がある。発明者らは、ＣＤ２４を、Ｓｉｇｌｅｃ、具体的にはマウスのＳｉｇｌｅｃＧ及びヒトのＳｉｇｌｅｃ１０に対する最初の天然リガンドとして報告した（１５）。ＳｉｇｌｅｃＧはシアル酸化ＣＤ２４と相互作用して、ＳＨＰ−１／２シグナル伝達機構を介して、ＨＭＧＢ１などのＤＡＭＰに対するＴＬＲを介した宿主の応答を抑制する（１５）。
【００２８】
ヒトＣＤ２４は、ＣＤ２４遺伝子の２４０塩基対のオープンリーディングフレームによってコードされる小さなＧＰＩアンカー分子である（２８）。８０個のアミノ酸のうち、最初の２６個がシグナルペプチドを構成し、最後の２３個がＧＰＩテールの接続を可能にする切断用のシグナルとして機能する。結果として、成熟ヒトＣＤ２４分子は、３１個のみのアミノ酸を有する。３１個のアミノ酸のうちの１つは、ヒト集団の中で多型である。オープンリーディングフレームのヌクレオチド１７０でのＣからＴへの遷移は、アラニン（Ａ）をバリン（Ｖ）に置換させる。この残基は、切断部位のＮ末端側すぐに位置し、置換は非保存的であるため、これらの２つの対立遺伝子は、細胞表面で異なる効率で発現する可能性がある。実際に、ｃＤＮＡを用いたトランスフェクション研究により、ＣＤ２４ｖ対立遺伝子が、細胞表面でより効率的に発現することが示された（２８）。これと一致して、ＣＤ２４ｖ／ｖＰＢＬは、特にＴ細胞でより高いレベルのＣＤ２４を発現した。
【００２９】
発明者らは、ＣＤ２４が、組織又は臓器の損傷の結果として放出される細胞ＤＡＭＰに対する宿主応答を負に調節すること、及びこの活性は少なくとも２つの重複するメカニズムにより説明しうることを示してきた。第一に、ＣＤ２４はＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、ＨＭＧＢ１、及びヌクレオリンを含むいくつかのＤＡＭＰに結合し、これらのＤＡＭＰに対する宿主の応答を抑制する。これを行うには、ＣＤ２４が炎症性刺激を捕捉して、その受容体であるＴＬＲ又はＲＡＧＥとの相互作用を防ぐ可能性があると推測される。第二に、発明者らは、アセトアミノフェン誘発肝ネクローシスマウスモデルを使用して炎症を確実にすることで、ＣＤ２４は、その受容体であるＳｉｇｌｅｃＧとの相互作用により、組織損傷に対する宿主応答に対して強力な負の調節を提供することを示した。この活性を得るために、ＣＤ２４は、ＳｉｇｌｅｃＧに結合してシグナル伝達を刺激し、これによりＳｉｇｌｅｃＧに結合するＳＨＰ１が負の調節を引き起こす可能性がある。いずれか一方の遺伝子の標的変異を有するマウスははるかに強い炎症反応を起こすため、これらの両メカニズムは協調して作用する可能性がある。実際、ＣＤ２４−／−又はＳｉｇｌｅｃＧ−／−マウスの骨髄から培養した樹状細胞（ＤＣ）は、ＨＭＧＢ１、ＨＳＰ７０、又はＨＳＰ９０のいずれかで刺激すると、より高いレベルの炎症性サイトカインを産生した。発明者らの知る限り、ＣＤ２４は、ＤＡＭＰによって引き起こされる炎症を遮断できる唯一の阻害性ＤＡＭＰ受容体であり、組織損傷に対する宿主炎症応答を特異的に標的とする現在利用可能な薬物はない。さらに、本発明者らは、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、及び移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）のマウスモデルを使用して、ＤＡＭＰ介在性自己免疫疾患を緩和する外因性の可溶性ＣＤ２４タンパク質の能力を実証した。
【００３０】
個別に、又は他の刺激因子と共に、ＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体）及び／又はＮＬＲ（Ｎｏｄ様受容体）に作用することによって、ＤＡＭＰは、ネクローシス、パイロトーシス、アポトーシス及び損傷に引き続く二次的ネクローシスの過程で放出される。これらのＤＡＭＰは強力な自然免疫応答を引き起こし、そのため、少なくとも部分的に、慢性的免疫活性化及び全身性炎症に寄与している（Lotze et al., 2005;Chen et al., 2011）。これらは無菌性炎症の持続において病原的な役割を果たしており、また外傷、慢性的炎症疾患、自己免疫疾患、及び癌などの疾患に重要な役割を果たしている可能性がある（Venereau et al., 2016;Shin et al., 2015;Kang et al., 2015）。重要なことに、ネクローシス、パイロトーシス、細胞死、及び損傷はＨＩＶ感染及びＡＩＤＳの過程で頻繁に起きる。死に至る細胞からの可溶性因子が細胞の損傷に対する全身性免疫活性化に寄与していることが提案されており、これらは微生物トランスロケーション、細胞死、及び免疫活性化とも関連している（Troseid et al., 2011）。ＨＩＶ−１感染患者では、ＨＭＧＢ１等のＤＡＭＰ、ＨＳＰ７０、及び自己反応性抗体（Ａｂ）が増加し、ｃＡＲＴはＤＡＭＰの量を低下させる可能性はあるものの、これらはＤＡＭＰを正常レベルにまで引き戻すことはできない（Nowak et al., 2007;Anraku et al., 2012）。自己反応性抗体はナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞及び免疫細胞の急激な損失と関連しており、高レベルの自己反応性抗体は急速な疾患の進行と関連している（Troseid et al., 2010;Kocsis et al., 2003;Anraku et al., 2012;Espigares et al., 2006;Agnew et al., 2003;Rawson et al., 2007;Kuwata et al., 2009）。ＨＭＧＢ１はＴＬＲシグナル伝達経路を介して細菌産物と複合して免疫活性化を促進することができ、高レベルのＨＭＧＢ１は高いウイルス量と関連している（Troseid et al., 2013）。ＨＭＧＢ１とＬＰＳはいずれもＨＩＶ−１進行者におけるＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ３８密度と中程度に相関している（Troseid et al., 2013）。これらのデータに基づき、発明者らは、ＤＡＭＰがＨＩＶ−１感染患者の免疫活性化と炎症に重要な役割を果たしている可能性があること、及びこれらをターゲットとした薬剤はＨＩＶ−１／ＡＩＤＳ治療に用いられていないことを認識した。
【００３１】
様々なＴＬＲやＮＬＲを発現するマクロファージは食作用、抗体提示、及びサイトカイン放出作用を有する重要な自然免疫細胞である。ＰＡＭＰ、ＤＡＭＰに誘発されるか、又は刺激因子に活性化されると、１型マクロファージ（Ｍ１）は大量の炎症性サイトカインを放出し、免疫活性化、全身性炎症及び活性化誘導細胞死を引き起こしうる。一方、２型マクロファージ（Ｍ２）は高い食作用活性を有し、大量の抗炎症性サイトカインを産生し、組織修復に携わる。ＨＩＶ−１感染において、アポトーシス、二次的ネクローシス、及び潜在的なパイロトーシスを経ている、ウイルスに感染したＣＤ４＋Ｔ細胞は、高度な炎症性局所環境を形成する、炎症性サイトカイン、ウイルス複製産物、微生物トランスロケーション産物を放出する。これは、未治療のＡＩＤＳ患者に見られるように、マクロファージをより炎症性のＭ１表現型に偏らせる（Sattentau and Stevenson, et al）。したがって、マクロファージの分極、炎症、組織損傷、そして最終的には疾患進行といった悪循環が生じる。そのため、マクロファージの炎症性活性の阻害はＨＩＶ−１／ＡＩＤＳを治療及び進行を予防するための１つの戦略である。
【００３２】
発明者らはＣＤ２４タンパク質の可溶型がＤＡＭＰに誘発されるマクロファージの炎症性活性を阻害することができ、例えば体重減少の遅延、消耗症候群や下痢の低減も含み、ＡＩＤＳ又は死から保護することができることを示した。可溶性ＣＤ２４タンパク質はまた血漿中ウイルス量の増加を遅延させ、ＣＤ４＋Ｔ細胞数の回復及びＴ細胞サブセットの顕著な変化なしにＰＢＭＣ、骨髄、及び直腸のプロウイルス量を阻害することもできる。発明者らはさらに可溶性ＣＤ２４タンパク質が消化管の炎症を抑制しＣＤ８＋Ｔ細胞活性化を低減することができることを見出した。最後に、発明者らは効果的な可溶性ＣＤ２４タンパク質処置はｓＣＤ１４レベルの効果的なコントロール及びＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＨＬＡ−ＤＲ発現の穏やかなダウンレギュ―レーションと相関することを見出した。
【００３３】
１．定義
本開示で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図しているものではない。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用されるとき、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という単数形は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を包含する。
【００３４】
本開示における数値範囲の記載において、該数値範囲の間の各数値は、同程度の精度で明示的に想定されている。例えば、６〜９の範囲では６と９に加えて７と８の数値も想定されており、６．０〜７．０の範囲では６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０の数値が明示的に想定されている。さらに、リストに記載された数値に規定された端点からなる範囲は明示的に想定されている。例えば、１、２、３、４のリストは１〜２、２〜３、３〜４、１〜４、１〜３、及び２〜４を規定する。別段の指定がない限り、端点はかかる範囲に含まれる。
【００３５】
「ペプチド」又は「ポリペプチド」は、アミノ酸の連結された配列であり、天然、合成、又は天然と合成の修飾若しくは組み合わせであり得る。
【００３６】
「実質的に同一」は、第１及び第２のアミノ酸配列が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、又は３００個のアミノ酸の領域にわたって、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であることを意味する。
【００３７】
「治療／処置（treatment）」又は「治療／処置すること（treating）」は、疾患から動物を守ることを指す場合、疾患を防止（preventing）、抑制（suppressing）、制圧（repressing）、又は完全に排除（eliminating）することを意味する。疾患を防止（preventing）することは、疾患の発症前に本発明の組成物を動物に投与することを含む。疾患を抑制すること（suppressing）は、疾患の誘発後であるがその臨床的出現の前に、本発明の組成物を動物に投与することを含む。疾患を制圧すること（repressing）は、疾患の臨床的出現後に本発明の組成物を動物に投与することを含む。
【００３８】
「バリアント」は、アミノ酸の挿入、欠失、又は保存的置換によりアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物学的活性を保持しているペプチド又はポリペプチドを意味し得る。「生物学的活性」の代表的な例には、ｔｏｌｌ様受容体に結合する能力及び特定の抗体が結合する能力が含まれる。バリアントはまた、少なくとも１つの生物学的活性を保持するアミノ酸配列を持つ参照タンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を持つタンパク質を意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸を類似の性質（例えば、親水性、荷電領域の程度及び分布）の異なるアミノ酸で置き換えることは、典型的に、軽微な変化を伴うことが当該技術分野で認識されている。これらの軽微な変化は、当該技術分野で理解されているように、一部はアミノ酸のハイドロパシー指数を考慮することにより特定することができる。Kyte et al.,J.Mol.Biol.157:105-132(1982)。アミノ酸のハイドロパシーインデックスは、その疎水性と電荷の考慮に基づいている。当該技術分野において、同様のハイドロパシー指数のアミノ酸は、置換してもタンパク質機能を依然として保持できることが知られている。一態様では、±２のハイドロパシー指数を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性は、生物学的機能を保持するタンパク質となる置換を明らかにするためにも使用できる。ペプチドの文脈においてアミノ酸の親水性を考慮することにより、抗原性及び免疫原性とよく相関すると報告されている有用な尺度である、そのペプチドの最大局所平均親水性（greatest local average hydrophilicity）の計算が可能になる。参照により本明細書に完全に組み込まれる米国特許第４，５５４，１０１号。同様の親水性値を有するアミノ酸の置換は、当該分野で理解されているように、生物学的活性、例えば免疫原性を保持するペプチドをもたらし得る。互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸で置換を行ってもよい。アミノ酸の疎水性指数と親水性値はいずれも、そのアミノ酸の特定の側鎖の影響を受ける。この観察と一致して、生物学的機能と両立するアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズ、及び他の特性によって明らかにされるように、アミノ酸、特にそれらのアミノ酸の側鎖の相対的類似性に依存すると理解される。
【００３９】
２．ＣＤ２４
本開示では、成熟ＣＤ２４ポリペプチド又はそのバリアントを含み得るＣＤ２４タンパク質が提供される。成熟ＣＤ２４ポリペプチドは、ＣＤ２４の細胞外ドメイン（ＥＣＤ；extracellular domain）に対応する。成熟ＣＤ２４ポリペプチドは、ヒト又は別の哺乳動物に由来し得る。上述のように、成熟ヒトＣＤ２４タンパク質は３１アミノ酸長で、Ｃ末端に可変のアラニン（Ａ）又はバリン（Ｖ）残基を有する：
【００４０】
ＳＥＴＴＴＧＴＳＳＮＳＳＱＳＴＳＮＳＧＬＡＰＮＰＴＮＡＴＴＫ（Ｖ／Ａ）（配列番号１）
【００４１】
Ｃ末端のバリン又はアラニンは免疫原性である可能性があり、ＣＤ２４タンパク質から除外されてもよく、これにより免疫原性が低下する可能性がある。したがって、ＣＤ２４タンパク質は、Ｃ末端アミノ酸を欠くヒトＣＤ２４のアミノ酸配列を含んでもよい：
【００４２】
ＳＥＴＴＴＧＴＳＳＮＳＳＱＳＴＳＮＳＧＬＡＰＮＰＴＮＡＴＴＫ（配列番号２）
【００４３】
マウス及びヒト由来の成熟ＣＤ２４タンパク質のアミノ酸配列にはかなりの配列の違いがあるが、ヒトＣＤ２４Ｆｃはマウスで活性があることが示されているため、これらは機能的に同等である。ヒトＣＤ２４  ＥＣＤのアミノ酸配列は、マウスタンパク質とのいくらかの配列保存性を示している（３９％の同一性、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０３３９７６）。しかしながら、ＣＤ２４  ＥＣＤの長さは種によるが２７〜３１アミノ酸長にすぎず、その受容体の一部、例えばＳｉｇｌｅｃ１０／Ｇなどへの結合はこの糖タンパク質のシアル酸及び／又はガラクトース糖によって媒介されるため、同一性のパーセントが高くないことは驚くことではない。ヒトＳｉｇｌｅｃ１０（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ３１０２３３）受容体タンパク質とそのマウス相同体Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿７６６４８８）受容体タンパク質の細胞外ドメイン間のアミノ酸配列同一性は６３％である（図２）。マウスＣＤ２４とヒトＣＤ２４とは主にＣ末端で配列保存されており、またグリコシル化部位の豊富さにおいて、特に変化がＣ末端の保存された残基に影響を与えない場合や、マウス又はヒトのＣＤ２４のいずれかのグリコシル化部位に影響を与えない場合、ＣＤ２４タンパク質を使用する際に、成熟ＣＤ２４タンパク質にはかなりの変化が許容される可能性がある。したがって、ＣＤ２４タンパク質は、成熟マウスＣＤ２４のアミノ酸配列を含んでいてもよい：
【００４４】
ＮＱＴＳＶＡＰＦＰＧＮＱＮＩＳＡＳＰＮＰＴＮＡＴＴＲＧ（配列番号３）
【００４５】
ヒトＣＤ２４  ＥＣＤのアミノ酸配列は、マウスよりもカニクイザルのタンパク質との間でより多い配列保存を示している（５２％の同一性、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｉ７ＧＫＫ１）。これらの種においてもＥＣＤは２９〜３１アミノ酸長にすぎず同一性割合（％）が高くないこと、及びその受容体への結合における糖残基の役割を考えると、これは驚くことではない。カニクイザルＳｉｇｌｅｃ１０受容体のアミノ酸配列は決定されていないが、ヒトとアカゲザルのＳｉｇｌｅｃ１０（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＰ＿００１１１６３５２）タンパク質との間のアミノ酸配列の同一性は８９％である。したがって、ＣＤ２４タンパク質は、成熟したカニクイザル（又はアカゲザル）のＣＤ２４のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００４６】
ＴＶＴＴＳＡＰＬＳＳＮＳＰＱＮＴＳＴＴＰＮＰＡＮＴＴＴＫＡ（配列番号１０）
【００４７】
ＣＤ２４タンパク質は可溶性であってもよい。ＣＤ２４タンパク質は、このタンパク質を発現する細胞からの分泌を可能にするために、Ｎ末端シグナルペプチドをさらに含んでいてもよい。シグナルペプチド配列は、アミノ酸配列  ＭＧＲＡＭＶＡＲＬＧＬＧＬＬＬＬＡＬＬＬＰＴＱＩＹＳ（配列番号４）を含んでもよい。あるいは、シグナル配列は、他の膜貫通タンパク質又は分泌タンパク質に見られる任意のものであってもよく、当該技術分野で既知の既存のシグナルペプチドから改変されたものであってもよい。
【００４８】
ａ．融合
ＣＤ２４タンパク質は、そのＮ末端又はＣ末端でプロテインタグに融合されていてもよく、プロテインタグは哺乳動物Ｉｇタンパク質の部分を含んでいてもよく、前記哺乳動物はヒトであってもマウスであってもその他の種であってもよい。前記部分はＩｇタンパク質のＦｃ領域を含んでいてもよい。前記Ｆｃ領域はＩｇタンパク質のヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、及びＣＨ４ドメインの少なくとも１つを含んでいてもよい。前記Ｉｇタンパク質は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、又はＩｇＡであってもよく、前記Ｆｃ領域は、Ｉｇのヒンジ領域、並びにＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含んでいてもよい。前記Ｆｃ領域は、ヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）アイソタイプ（配列番号７）を含んでいてもよい。Ｉｇタンパク質はＩｇＭであってもよく、前記Ｆｃ領域はＩｇＭのヒンジ領域、並びにＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、及びＣＨ４ドメインを含んでいてもよい。プロテインタグは、タンパク質の精製を支援する親和性タグ、及び／又は機能性タンパク質の溶解度と回収率を高める溶解度増強タグであってもよい。プロテインタグは、ＣＤ２４タンパク質の価数を高めるものであってもよい。プロテインタグには、ＧＳＴ、Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ、ＭＢＰ、ＮｕｓＡ、チオレドキシン（ＴＲＸ）、低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）、ユビキチン（Ｕｂ）、アルブミン、又はラクダ科動物Ｉｇを含んでいてもよい。融合タンパク質を作製し、融合タンパク質を精製する方法は、当該技術分野で周知である。
【００４９】
前臨床研究に基づいて、実施例で特定された融合タンパク質ＣＤ２４Ｆｃの構築のために、ＧＰＩシグナル切断部位の前の最後の多型アミノ酸を欠く３０アミノ酸の天然ＣＤ２４分子の切断型（すなわち、配列番号２を有する成熟ＣＤ２４タンパク質）が使用されている。成熟ヒトＣＤ２４配列は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（配列番号７）に融合している。完全長のＣＤ２４Ｆｃ融合タンパク質は配列番号５（図１）に提供され、細胞から分泌される（すなわち、切断されるシグナル配列を欠く）ＣＤ２４Ｆｃ融合タンパク質のプロセシング後のバージョンは配列番号６に提供される。ＩｇＧ１  Ｆｃに融合した成熟ＣＤ２４（すなわち、配列番号１を有する成熟ＣＤ２４タンパク質）のプロセシング後の多型バリアントは、配列番号１１又は１２を含むものであってもよい。
【００５０】
ｂ．産生
ＣＤ２４タンパク質は、高度にグリコシル化されていてもよく、免疫細胞の共刺激や損傷関連分子パターン分子（ＤＡＭＰ）との相互作用など、ＣＤ２４の機能に関与していてもよい。ＣＤ２４タンパク質は、真核生物発現系を使用して作製されてもよい。発現系は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞におけるベクターからの発現を伴っていてもよい。発現系はまた、真核細胞に感染するために使用され得る複製欠損レトロウイルスベクターなどの、ウイルスベクターであってもよい。ＣＤ２４タンパク質は、細胞ゲノムに組み込まれたベクター又はベクターの一部からＣＤ２４タンパク質を発現する安定細胞株から産生されてもよい。安定細胞株は、組み込まれた複製欠損レトロウイルスベクターからＣＤ２４タンパク質を発現してもよい。発現系は、ＧＰＥｘ（商標）であってもよい。
【００５１】
ｃ．医薬組成物
ＣＤ２４タンパク質は、医薬組成物に含まれていてもよく、当該医薬組成物は薬学的に許容される量のＣＤ２４タンパク質を含んでいてもよい。医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含んでもよい。医薬組成物は溶媒を含んでもよく、当該溶媒はＣＤ２４タンパク質をより長期間にわたって安定に保つことができるものであってもよい。溶媒はＰＢＳであってもよく、当該ＰＢＳはＣＤ２４タンパク質を−２０℃（−１５〜−２５℃）で少なくとも６６か月間ＣＤ２４タンパク質を安定に保つものであってもよい。溶媒は、別の薬物と組み合わせてＣＤ２４タンパク質を収容するものであってもよい。
【００５２】
医薬組成物は、注射又は持続注入を含むがこれらに限定されない非経口投与のために製剤化してもよい。注射のための製剤は、油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、又はエマルションの形態であってもよく、懸濁剤、安定剤、及び分散剤を含むがこれらに限定されない製剤用の剤を含んでいてもよい。組成物はまた、滅菌のパイロジェンフリー水を含むがこれに限定されない適切なビヒクルで再構成するための粉末形態で提供されてもよい。
【００５３】
医薬組成物はデポ剤として処方されてもよく、当該デポ剤は移植又は筋肉内注射により投与されてもよい。組成物は、適切なポリマー材料又は疎水性材料とともに（例えば、許容される油中のエマルションとして）、イオン交換樹脂とともに、又は難溶性誘導体として（例えば、難溶性塩として）製剤化されてもよい。皮下注射のための製剤は、ループス及びその関連症状及び合併症のような適応症に特に適切であり得る。
【００５４】
ｄ．投与量
ＣＤ２４タンパク質の用量は、許容される毒性と臨床的有効性を有する用量を決定するための臨床試験を通じて最終的に決定されてもよい。初期臨床用量は、げっ歯類及び非ヒト霊長類の薬物動態及び毒性研究を通じて推定してもよい。ＣＤ２４タンパク質の用量は、免疫療法関連有害事象（ｉｒＡＥ）又は移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）に対する所望の効果及び投与経路に応じて、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇであってもよく、１〜５００ｍｇ／ｋｇであってもよい。ＣＤ２４タンパク質は、静脈内注入又は皮下、壁内（すなわち、腔又は臓器の壁内）、又は腹腔内注射によって投与してもよく、用量は、対象がヒトの場合、１０〜１０００ｍｇ、１０〜５００ｍｇ、１０〜２４０ｍｇ、１０〜１２０ｍｇ、又は１０、３０、６０、１２０、又は２４０ｍｇであってもよい。
【００５５】
３．治療方法
ａ．ＨＩＶ／ＡＩＤＳ
本開示において、ＣＤ２４タンパク質の投与を必要とする対象へＣＤ２４タンパク質を投与することによって後天性免疫不全症候群（ＨＩＶ／ＡＩＤＳ）を緩和又は治療する方法が提供される。ＣＤ２４タンパク質は、ＨＩＶ／ＡＩＤに罹患する対象又はそのリスクを有する対象に投与されてもよい。ＣＤ２４タンパク質は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳを防ぐために、又はＨＩＶ／ＡＩＤＳの臨床的兆候が表れる前に、予防的に使用されてもよい。ＣＤ２４たんぱく質は、臨床的兆候の診断後にＨＩＶ／ＡＩＤを治療するために治療的に投与されてもよい。
【００５６】
さらなる実施形態では、ＣＤ２４はＨＩＶ／ＡＩＤＳに伴う炎症を低減又は阻止するために用いられてもよく、これはＤＡＭＰに誘発されたマクロファージの炎症性活性を抑えること、消化管の炎症を低減すること、ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化を減少させること、ｓＣＤ１４レベルを制御すること、及びＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＨＬＡ−ＤＲの発現をダウンレギュレートすること、のうちの１又は複数を含んでいてもよい。
【００５７】
さらなる実施形態では、ＣＤ２４タンパク質は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳの影響を低減又は最小化するために使用されてもよく、当該ＨＩＶ／ＡＩＤＳの影響は、体重減少、消耗症候群、及び下痢のうちの１又は複数であってもよい。
【００５８】
さらなる実施形態では、ＣＤ２４タンパク質は、ＣＤ４＋Ｔ細胞数の回復及びＴ細胞のサブセットの顕著な変化なく、血漿中のウイルス量の上昇を遅らせ、ＰＢＭＣ、骨髄、及び直腸のうち１又は複数におけるプロウイルス量を阻害するために用いられてもよい。さらに、本開示に記載される使用又は治療のための薬剤の製造におけるＣＤ２４タンパク質の使用が提供される。
【００５９】
ｂ．投与
医薬組成物の投与経路は、非経口でもよい。非経口投与としては、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、髄腔内、関節内、及び直接注射が挙げられるが、これらに制限されない。医薬組成物はヒト患者、ネコ、イヌ、大動物、又は鳥類に投与されてもよい。組成物は、１日当たり１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２回投与されてもよい。
【００６０】
ｃ．併用療法
ＨＩＶ／ＡＩＤＳの進行に関連する慢性的免疫活性化及び炎症は、ＨＩＶ−１治療にとって最も大きな課題のうちの２つである（Appay et al., 2008）。適切なｃＡＲＴは血漿中ウイルス量を検出不能なレベルまで抑制することができるが、慢性的免疫活性化及び炎症はそれでも消滅せず、非ＡＩＤＳ指標疾患及び死に密接に関連している［Rajasuriar et al., 2015］。現在、臨床又は動物において、様々な免疫抑制剤（プレドビゾン（Ｐｒｅｄｂｉｓｏｎｅ）、ミコフェノール酸、シクロゾリン（Ｃｙｃｌｏｓｏｒｉｎｅ）、シロリムス／ラパマイシン）、抗炎症剤（アスピリン、セレコキシブ、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、ペントキシフィリン、サルサレート、アダリムマブ、インフリキシマブ／エタネルセプト）（Rajasuriar et al, 2013）、及びスタチン（アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン）が、抗慢性的免疫活性化効果及び抗炎症効果について試験されているが（Eckard et al., 2015）、これらの効果は様々な副作用と関連している。特に、免疫抑制剤のような非特異的な薬剤は、ウイルス量、慢性的免疫活性化及び炎症に対する効果にばらつきがあり、日和見感染のリスクも高い。また、非ステロイド性抗炎症薬は抗慢性的免疫活性化に効果があり、高い心血管疾患のリスクがある。さらに、スタチンも、炎症、免疫活性化、及び免疫老化を制御する利益はあるものの、心不全、筋肉痛、横紋筋融解症、精神的及び神経的症状、並びにがんの高いリスクを有する（Ravnskov et al., 2006;Rajasuriar et al., 2013）。一方、例えば抗ＴＮＦ−α抗体などの高度に特異的な投与による免疫療法はより効果的で副作用も少ない（Tabb et al., 2013）。そのため、治療の特異性を高めることにより、高い忍容性と低い副作用を維持しつつ治療の有効性を改善できる可能性がある。したがって、本開示で説明されるＣＤ２４タンパク質は、本開示で説明される治療方法において、これらの任意の他の治療と組み合わせて投与されてもよい。
【００６１】
そのような併用療法としては、抗レトロウイルス療法（ＡＲＴ）、例えば、高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）及び／又は併用抗レトロウイルス療法（ｃＡＲＴ）が挙げられる。ＡＲＴの例としては、侵入阻害剤、ヌクレオシド／ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）、インテグラーゼ阻害剤（インテグラーゼ核鎖転移阻害剤又はＩＮＳＴＩとしても知られる）、及びプロテアーゼ阻害剤が挙げられる。マラビロク、エンフビルチド等の侵入阻害剤（又は融合阻害剤）は、ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４、又はｇｐ４１などの、ＨＩＶのいくつかの標的の１つを遮断することで、ＨＩＶ−１の宿主細胞への結合、融合、及び侵入を阻害する。ＮＲＴＩは、ジドブジン、アバカビル、ラミブジン、エムトリシタビン、テノホビルなどの、ヌクレオシド及びヌクレオチド類似体であり、これらは逆転写を阻害し、これにより宿主細胞ゲノムへの組み込みを阻害する。ＮＮＲＴＩは逆転写酵素も阻害するが、当該逆転写酵素のアロステリック部位に結合することによってこれを阻害する。ＮＮＲＴＩとしては、ネビラピン、エファビレンツ、エトラビリン及びリルピビリンが挙げられる。ウイルス酵素インテグラーゼは感染細胞ＤＮＡへのウイルスＤＮＡの組み込みに関与している。したがってインテグラーゼ阻害剤、例えば、ラルテグラビル、エルビテグラビル、及びドルテグラビルは、ウイルス複製においてこの工程を遮断する。プロテアーゼ阻害剤は、ｇａｇ及びｇａｇ／ｐｏｌ前駆体タンパク質の切断を防ぐことにより、宿主の膜から芽を出して成熟ビリオンを生産するのに必要なウイルスプロテアーゼ酵素を阻害し、例えば、ロピナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、リトナビル、ダルナビル、及びアタザナビルが挙げられる。ＣＤ２４タンパク質と組み合わせて用いることができるＡＲＴの固定用量の組み合わせの例としては、コンビビル（Ｃｏｍｂｉｖｉｒ）（ラミブジン＋ジドブジン、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社）、カレトラ（Ｋａｌｅｔｒａ）（ロピナビル＋リトナビル、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、トリジビル（Ｔｒｉｚｉｖｉｒ）（アバカビル＋ラミブジン＋ジドブジン）、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社）、エピジコム／キベクサ（Ｅｐｚｉｃｏｍ／Ｋｉｖｅｘａ）（アバカビル＋ラミブジン、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社）、ツルバダ（Ｔｒｕｖａｄａ）（テノホビル  ジソプロキシルフマル酸塩＋エムトリシタビン、Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、アトリプラ（Ａｔｒｉｐｌａ）（エムトリシタビン＋テノホビル  ジソプロキシルフマル酸塩＋エファビレンツ、Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社及びＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ社）、コンプレラ／エビプレラ（Ｃｏｍｐｌｅｒａ／Ｅｖｉｐｌｅｒａ）（エムトリシタビン＋リルピビリン＋テノホビル  ジソプロキシルフマル酸塩、Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社及びＪａｎｓｓｅｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社）、スタリビルド（Ｓｔｒｉｂｉｌｄ）（エルビテグラビル＋コビシスタット＋エムトリシタビン＋テノホビル  ジソプロキシルフマル酸塩、Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、トリーメク（Ｔｒ��ｕｍｅｑ）（アバカビル＋ドルテグラビル＋ラミブジン、ＶｉｉＶ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）、エボタッツ（Ｅｖｏｔａｚ）（アタザナビル＋コビシスタット、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ社）、プレジコビックス（Ｐｒｅｚｃｏｂｉｘ）（ダルナビル＋コビシスタット、Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社）、デュトレビス（Ｄｕｔｒｅｂｉｓ）（ラミブジン＋ラルテグラビル、Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．）、ゲンボイヤ（Ｇｅｎｖｏｙａ）（エルビテグラビル＋コビシスタット＋エムトリシタビン＋テノホビル  アラフェナミドフマル酸塩、Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、及びデシコビ（Ｄｅｓｃｏｖｙ）（エムトリシタビン＋テノホビル  アラフェナミドフマル酸塩、Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）が挙げられる。その他の併用療法としては、バルガンシクロビル、抗ＬＰＳ抗体、及びセベラマー炭酸塩が挙げられる。
【００６２】
ＣＤ２４タンパク質は、他の処置と同時（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）又は規則的に（ｍｅｔｒｏｎｏｍｉｃａｌｌｙ）投与してもよい。本開示において、同時（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）又は同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）との用語は、ＣＤ２４タンパク質及び他の処置が、お互いに、４８時間以内、好ましくは２４時間以内、より好ましくは１２時間以内、さらに好ましくは６時間以内、最も好ましくは３時間以内に施されることを意味する。本開示において、規則的に（ｍｅｔｒｏｎｏｍｉｃａｌｌｙ）との用語は、他の処置とは異なる時点で、かつ反復投与に対して所定の頻度で行われる剤の投与を意味する。
【００６３】
ＣＤ２４タンパク質は、別の処置の前の任意の時点で投与してよく、例えば、別の処置の約１２０時間、１１８時間、１１６時間、１１４時間、１１２時間、１１０時間、１０８時間、１０６時間、１０４時間、１０２時間、１００時間、９８時間、９６時間、９４時間、９２時間、９０時間、８８時間、８６時間、８４時間、８２時間、８０時間、７８時間、７６時間、７４時間、７２時間、７０時間、６８時間、６６時間、６４時間、６２時間、６０時間、５８時間、５６時間、５４時間、５２時間、５０時間、４８時間、４６時間、４４時間、４２時間、４０時間、３８時間、３６時間、３４時間、３２時間、３０時間、２８時間、２６時間、２４時間、２２時間、２０時間、１８時間、１６時間、１４時間、１２時間、１０時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、５５分、５０分、４５分、４０分、３５分、３０分、２５分、２０分、１５分、１０分、９分、８分、７分、６分、５分、４分、３分、２分、又は１分前に投与してもよい。
ＣＤ２４タンパク質は、ＣＤ２４タンパク質による第２の処置の前の任意の時点で投与してもよく、例えば、第２の処置の、約１２０時間、１１８時間、１１６時間、１１４時間、１１２時間、１１０時間、１０８時間、１０６時間、１０４時間、１０２時間、１００時間、９８時間、９６時間、９４時間、９２時間、９０時間、８８時間、８６時間、８４時間、８２時間、８０時間、７８時間、７６時間、７４時間、７２時間、７０時間、６８時間、６６時間、６４時間、６２時間、６０時間、５８時間、５６時間、５４時間、５２時間、５０時間、４８時間、４６時間、４４時間、４２時間、４０時間、３８時間、３６時間、３４時間、３２時間、３０時間、２８時間、２６時間、２４時間、２２時間、２０時間、１８時間、１６時間、１４時間、１２時間、１０時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、５５分、５０分、４５分、４０分、３５分、３０分、２５分、２０分、１５分、１０分、９分、８分、７分、６分、５分、４分、３分、２分、又は１分前に投与してもよい。
【００６４】
ＣＤ２４タンパク質は、別の処置の後の任意の時点で投与してよく、例えば、別の処置の約１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、２４時間、２６時間、２８時間、３０時間、３２時間、３４時間、３６時間、３８時間、４０時間、４２時間、４４時間、４６時間、４８時間、５０時間、５２時間、５４時間、５６時間、５８時間、６０時間、６２時間、６４時間、６６時間、６８時間、７０時間、７２時間、７４時間、７６時間、７８時間、８０時間、８２時間、８４時間、８６時間、８８時間、９０時間、９２時間、９４時間、９６時間、９８時間、１００時間、１０２時間、１０４時間、１０６時間、１０８時間、１１０時間、１１２時間、１１４時間、１１６時間、１１８時間、又は１２０時間後に投与してもよい。
ＣＤ２４タンパク質は、先立つＣＤ２４処置の後の任意の時点で投与してよく、例えば、先立つＣＤ２４処置の、約１２０時間、１１８時間、１１６時間、１１４時間、１１２時間、１１０時間、１０８時間、１０６時間、１０４時間、１０２時間、１００時間、９８時間、９６時間、９４時間、９２時間、９０時間、８８時間、８６時間、８４時間、８２時間、８０時間、７８時間、７６時間、７４時間、７２時間、７０時間、６８時間、６６時間、６４時間、６２時間、６０時間、５８時間、５６時間、５４時間、５２時間、５０時間、４８時間、４６時間、４４時間、４２時間、４０時間、３８時間、３６時間、３４時間、３２時間、３０時間、２８時間、２６時間、２４時間、２２時間、２０時間、１８時間、１６時間、１４時間、１２時間、１０時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、５５分、５０分、４５分、４０分、３５分、３０分、２５分、２０分、１５分、１０分、９分、８分、７分、６分、５分、４分、３分、２分、又は１分後に投与してもよい。
【実施例】
【００６５】
＜実施例１＞
〔マウスにおけるＣＤ２４薬物動態〕
１ｍｇのＣＤ２４Ｆｃ（ＣＤ２４Ｆｃ）をナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスに注入し、各時点で３匹のマウスにおいて、異なる時点（５分、１時間、４時間、２４時間、４８時間、７日、１４日、２１日）で血液試料を採取した。血清を１：１００に希釈し、ＣＤ２４Ｆｃのレベルを、捕捉抗体としての精製抗ヒトＣＤ２４（３．３μｇ／ｍｌ）、及び検出抗体としてのペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（５μｇ／ｍｌ）を使用するサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して検出した。図３Ａに示すように、ＣＤ２４Ｆｃの減衰曲線は、本タンパク質の典型的な二相減衰を明らかにした。最初の体内分布段階の半減期は１２．４時間であった。第２の相は、中央コンパートメントからの１次消去のモデルに従った。第２の相の半減期は９．５４日で、これはｉｎ  ｖｉｖｏでの抗体の半減期に類似する。これらのデータは、この融合タンパク質が血流中で非常に安定していることを示唆している。この融合タンパク質を皮下注射した別の研究では、９．５２日というほぼ同一の半減期が観察された（図３Ｂ）。さらに重要なことに、ＣＤ２４Ｆｃが血中でピークレベルに達するには約４８時間かかったが、ＡＵＣで測定される血中の融合タンパク質の総量は、どちらの注射経路でもほぼ同じであった。したがって、治療的観点からは、注射の異なる経路は薬物の治療効果に影響を与えないはずである。この観察により、霊長類の毒性及び臨床試験の実験計画が大幅に簡素化された。
【００６６】
＜実施例２＞
〔組織損傷に対する宿主の応答におけるＣＤ２４−Ｓｉｇｌｅｃ１０相互作用〕
２０年近く前、Ｍａｔｚｉｎｇｅｒは、一般に危険理論と呼ばれるものを提案した。骨子としては、彼女は、免疫系は宿主の危険を感知すると活性化すると主張した。当時は危険の本質は明確に定義されていなかったが、壊死がＤＡＭＰ（危険関連分子パターン
；danger-associated molecular pattern)と呼ばれるＨＭＧＢ１及び熱ショックタンパク質などの細胞内成分の放出に関連していることが判明してきた。ＤＡＭＰは、炎症性サイトカインの産生及び自己免疫疾患を促進することがわかっている。動物モデルでは、ＨＭＧＢ１及びＨＳＰ９０の阻害剤が関節リウマチ（ＲＡ）を改善することがわかった。ＤＡＭＰの関与により、ＲＡ療法について、ＤＡＭＰへの宿主の応答に対する負の調節が検討され得るという見通しが得られた。
【００６７】
アセトアミノフェン誘発肝臓壊死を用いて、炎症を確実にすることで、ＣＤ２４が、ＳｉｇｌｅｃＧとの相互作用により、組織損傷に対する宿主応答に対して強力な負の調節を提供することが観察された。ＣＤ２４は、造血細胞及びその他の組織幹細胞で広く発現するＧＰＩアンカー分子である。多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、ＲＡ、巨細胞性関節炎を含む、ヒトのさまざまな自己免疫疾患の遺伝子解析により、ＣＤ２４多型と自己免疫疾患のリスクとの間に有意な関連性が示された。ＳｉｇｌｅｃＧは、シアル酸含有構造を認識する能力によって定義されるＩ−レクチンファミリーのメンバーである。ＳｉｇｌｅｃＧは、ＣＤ２４上のシアル酸含有構造を認識し、樹状細胞による炎症性サイトカインの産生を負に調節する。ＣＤ２４と相互作用する能力の点では、ヒトＳｉｇｌｅｃ１０及びマウスＳｉｇｌｅｃＧは、機能的に同等である。しかしながら、マウスとヒトの相同体との間に１対１の相関関係があるかどうかは不明確である。メカニズムは依然として完全には解明されていないが、ＳｉｇｌｅｃＧに結合するＳＨＰ１が負の調節に関与している可能性がある。これらのデータは、ＣＤ２４−ＳｉｇｌｅｃＧ／１０相互作用が、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）をＤＡＭＰから識別するために重要な役割を果たし得る新しいモデルをもたらす（図４）。
【００６８】
少なくとも２つの重複するメカニズムにより、ＣＤ２４の機能を説明し得る。１つ目に、ＣＤ２４は、様々なＤＡＭＰに結合することにより、炎症性刺激を捕捉して、これらのＴＬＲ又はＲＡＧＥとの相互作用を予防する可能性がある。この概念は、ＣＤ２４がＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、ＨＭＧＢ１、及びヌクレオリンを含むいくつかのＤＡＭＰ分子に結合するという観察によって裏付けられる。２つ目に、ＣＤ２４は、おそらくＤＡＭＰに結合した後、ＳｉｇｌｅｃＧによるシグナル伝達を刺激する可能性がある。いずれかの遺伝子の標的変異を持つマウスははるかに強い炎症反応を起こすため、両方のメカニズムは、協調して作用する可能性がある。実際に、ＣＤ２４−／−又はＳｉｇｌｅｃＧ−／−マウスの骨髄から培養した樹状細胞（ＤＣ）は、ＨＭＧＢ１、ＨＳＰ７０、又はＨＳＰ９０のいずれかで刺激すると、はるかに高いレベルの炎症性サイトカインを産生した。対照的に、ＬＰＳ及びＰｏｌｙＩ：ＣなどのＰＡＭＰへの応答には影響が見られなかった。これらのデータは、自然免疫系が組織損傷から病原体を区別するメカニズムを提供するだけでなく、ＣＤ２４とＳｉｇｌｅｃＧが組織損傷に関連する疾患の潜在的な治療標的であることを示唆している。
【００６９】
＜実施例３＞
〔ＣＤ２４ＦｃはＨＭＧＢ１、Ｓｉｇｌｅｃ１０と相互作用し、ＳｉｇｌｅｃＧとＳＨＰ−１間の結合を誘導する〕
ＣＤ２４ＦｃとＳｉｇｌｅｃ１０の間の相互作用を測定するために、ＣＤ２４ＦｃをＣＨＩＰに固定化し、Ｂｉａｃｏｒｅを用いて様々な濃度のＳｉｇｌｅｃ１０Ｆｃの結合を測定した。図５ａに示されるように、ＣＤ２４ＦｃはＳｉｇｌｅｃ１０にＫｄ＝１．６ｘ１０−７Ｍで結合する。これはコントロールＦｃよりも１００倍高い親和性である。ＣＤ２４Ｆｃに結合するプロテインＧビーズを用いたプルダウン実験に引き続く、抗ＩｇＧ又は抗ＨＭＧＢ１を用いたウェスタンブロットによって、ＣＤ２４ＦｃとＨＭＧＢ１の間の相互作用を確認した。これらのデータは、ＣＤ２４ＦｃはＨＭＧＢ１に結合するがＦｃはＨＭＧＢ１に結合しないこと、及びこの結合がカチオン依存性であることを示している（図５ｂ）。ＣＤ２４ＦｃがＳｉｇｌｅｃＧ（ヒトのＳｉｇｌｅｃ１０に対応するマウスＳｉｇｌｅｃ）のアンタゴニストであるのかどうかを判定するために、ＣＤ２４−／−脾臓細胞をＣＤ２４Ｆｃ、コントロールＦｃ、又はビヒクル（ＰＢＳ）コントロールで３０分間刺激した。次にＳｉｇｌｅｃＧを免疫沈降し、抗ホスホチロシン又は抗ＳＨＰ−１でプローブした。図５ｃに示されるように、ＣＤ２４Ｆｃは、ＳｉｇｌｅｃＧの実質的なリン酸化、及び周知の適応免疫及び自然免疫の阻害物質であるＳＨＰ−１との結合を誘導した。
【００７０】
ＣＤ２４Ｆｃのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの有効性試験
【００７１】
ヒトＴ細胞による炎症性サイトカインの産生に対するＣＤ２４Ｆｃの影響を試験するため、様々な濃度のＣＤ２４Ｆｃ又はヒトＩｇＧ１  Ｆｃの存在下で、ヒトＰＢＭＬ中の成熟Ｔ細胞を、Ｔ細胞受容体の一般的なアゴニストである抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）で活性化した。４日後、上清を回収し、ＥＬＩＺＡ（酵素結合免疫吸着法）によりＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの産生を測定し、活性化を確認した。図６の結果は、２つの異なる製造ロットからのＣＤ２４Ｆｃが、コントロールＩｇＧ  Ｆｃコントロールと比較して、活性化したＰＢＭＬ中のＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの産生を顕著に減少させたことを示している。さらに、ＣＤ２４Ｆｃを添加すると、用量依存的にサイトカイン産生が阻害された。したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＣＤ２４Ｆｃは抗ＣＤ３に誘導されたＰＢＭＬ活性化を阻害できる。本試験は、ＣＤ２４Ｆｃの作用機序がＴ細胞活性化の阻害を介したものである可能性があることを示唆するとともに、薬剤の有効性及び安定性試験のための信頼性のあるバイオアッセイを確立するものであった。
【００７２】
ＣＤ２４Ｆｃがヒト細胞系で炎症性サイトカイン産生を制御するかどうかを判定するため、まずヒト急性単球性白血病ＴＨＰ１細胞系におけるＣＤ２４をＲＮＡｉでサイレンシングし、続いてこれらをＰＭＡで処置することによってマクロファージへの分化を誘導した。図７ａに示されるように、ＣＤ２４サイレンシングによりＴＮＦα、ＩＬ−１β、及びＩＬ−６が実質的に増加した。これらのデータは、炎症性サイトカイン産生の抑制における、内因性ヒトＣＤ２４の重要な役割を示している。重要なことに、ＣＤ２４Ｆｃは、ＣＤ２４をサイレンシングした細胞系におけるＴＮＦα、並びにＩＬ−１β及びＩＬ−６の阻害を回復させた（図７ｂ）。これらのデータは、ヒト細胞の炎症反応におけるＣＤ２４の役割を示すだけでなく、ＣＤ２４Ｆｃの生物学的活性を評価するための簡便なアッセイを提供する。
【００７３】
総合すると、これらのデータはＣＤ２４Ｆｃが適応性刺激及び自然刺激に誘発されるサイトカイン産生を阻害する能力を有することを示している。しかしながら、この薬剤は自然免疫エフェクターによるサイトカイン産生の低減においてはるかに効果的であるため、この予防的機能の主なメカニズムは、移植の初期段階における組織損傷に誘発される炎症の防止であると考えられた。
【００７４】
＜実施例４＞
〔ＣＤ２４とＳＩＶの予防〕
ＣＤ２４ＦｃはＳＩＶに感染したアカゲザルを保護する
２群のＳＩＶ感染アカゲザル（ＣｈＲＭ：Chinese rhesus macaques）を、感染から週８、８．５、９．５、３０、３０．５、及び３１日後に、ビヒクルコントロール又はＣＤ２４Ｆｃ（１２．５ｍｇ／ｋｇ）で処置し、試験期間中、免疫活性化をモニターした（図８Ａ）。感染後０日目（ＤＡＩ；days after infection）、続いて５６日目、１０７日目、１５５日目、１８９日目、２０９日目、及び２２３日目に体重を測定した。感染後５６日目に対する相対的な体重減少を図８Ｂに示す。ＳＩＶ感染サルの体重に対する、非常に顕著なＣＤ２４Ｆｃの影響が観察された。コントロール群では、１０％を超える体重減少の割合は、感染後１５５日目、１８９日目、２０９日目、及び２３１日目において、２５％（１／４）、７５％（３／４）、７５％（３／４）、及び１００％（４／４）であった。感染後１０７日目に、コントロール群の１匹のサルが、１５％を超える体重減少（１５．６６％）を示し、１１９日目に死亡し、２匹のコントロール対象は２５％を超える体重減少（２９．１１％及び４３．６８％）を示した。ＣＤ２４Ｆｃ処置群では、感染後１５５日目、１８９日目、２０９日目、及び２３１日目において１０％を超える体重減少を示したサルの頻度は、それぞれの日において、０（０／６）、３３．３３％（２／６）、２０％（１／５）、及び２０％（１／５）であった。処置開始時にＣＤ４＋Ｔ細胞カウントが最も低かった１匹の対象が、感染後２０７日目に死亡した。１０％以上の体重減少をＡＩＤＳの消耗症候群のベースとして用いると、ＣＤ２４Ｆｃ処置はＡＩＤＳの消耗症候群を顕著に減少させた（Ｐ＝０．０１７３）（図８Ｃ）。
【００７５】
下痢は消化管機能不全性及び日和見性の感染に関連するＨＩＶ−１／ＡＩＤＳのもう１つの一般的な症状である。毎日サルの健康状態をチェックし記録した。持続性の下痢が２日間観察された場合に診断を確定し、サルにペニシリンを投与した。処置３日後に症状が軽減しなければ、セレクトリンを使用し、ペニシリンの用量を増加させた。１週間の処置後にも症状が持続していた場合には、これを難治性下痢と診断した。図８Ｄに示されるように、コントロール群では３匹のサルが難治性下痢を有し、うち１匹が２週間後に難治性下痢により死亡し、残りのサルは２５％を超える体重減少を示した。ＣＤ２４Ｆｃ群に割付けられたサルは、処置前に下痢を有していたが、急速に回復した。２匹のサルがＣＤ２４Ｆｃ処置後４週で下痢を発症したが、すぐに回復した。したがって、ＣＤ２４Ｆｃは、難治性下痢の進行から全てのサルを保護した。ログランク検定により、ＣＤ２４Ｆｃ群とコントロール群の間において、下痢の割合に統計的有意差が見出された（Ｐ＝０．００４６）。消耗症候群及び難治性下痢はＡＩＤＳの最も頻度の高い症状であるため、これらのいずれか又は両方の症状を有する対象はＡＩＤＳに屈したとみなされる。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ分析を用い、ＣＤ２４ＦｃによるＡＩＤＳに対する統計的に有意な保護が見出された（Ｐ＝０．０１１２）（図８Ｅ）。
【００７６】
ＣＤ２４Ｆｃは血漿中ウイルス量の上昇を遅らせ、ＰＢＭＣ、骨髄、及び消化管のプロウイルス量を減少させた
ウイルス複製に対するＣＤ２４Ｆｃの影響を評価するため、血漿中のウイルス量及び組織中のプロウイルス量を検出した。ＳＩＶ感染は、血漿中のウイルス量の急速な上昇と、その直後にウイルス量が最低レベルまで低下することに特徴付けられる。ウイルス複製が概ねコントロール下におかれた後の炎症の減衰の影響を調べることを目的としていたため、ウイルス力価が最低レベルであった感染後８週目に処置を開始した。予想通り、コントロール群では血漿中ウイルス量は徐々に増加した。驚くべきことに、ＣＤ２４Ｆｃ処置群ではウイルス量の増加は殆ど観察されず、２６週目及び３０週目において、処置前のレベルと比べてウイルス量の有意な減少がみられた（図９Ａ）。感染後８週目（１．０に正規化）と比べると、感染３０週後にＣＤ２４Ｆｃ処置群におけるウイルス量の最大増加量（８．７９±４．５４）が観察され、これはコントロール群で観察されたもの（３２．６８±１３．４５）よりも有意に低かった（Ｐ＝０．００１；図９Ｂ）。さらに、ＣＤ２４Ｆｃでは、その低下は統計学的に有意ではないものの、試験された全てのタイムポイントでＰＭＢＣにおけるプロウイルス量も低下しているようであった（図９Ｃ）。組織のプロウイルス量を比較すると、ＣＤ２４Ｆｃ処置群では、ウイルスの主な蓄積部位であることが知られている骨髄において有意に低いレベルを示した（Ｐ＝０．０００４）（図９Ｄ）。
【００７７】
ＣＤ２４Ｆｃは腸管における炎症を低減させる
ＳＩＶ感染サルにおける炎症因子の発現を用いて、炎症に対するＣＤ２４Ｆｃの影響を評価した。意外なことに、ＣＤ２４Ｆｃは縦断的解析においてＰＭＢＣ中のＩＦＮ−α、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、ＩＤＯ、及びＩＬ−１β発現に影響を与えなかった。したがって、炎症性サイトカインの全身的な減少はＣＤ２４Ｆｃの治療効果の説明とはならない可能性がある。内蔵の炎症性応答に対するＣＤ２４Ｆｃの影響を説明するため、ＳＩＶ感染から３０週後に、次ラウンドのＣＤ２４Ｆｃ処置を開始し（３０週目、３０．５週目、及び３１週目に、１２．５ｍｇ／ｋｇ×３回）、これらのサルを感染から３２週後に安楽死させ、炎症性サイトカインの転写産物と、消化管の病理を分析した。脾臓、骨髄、腸間膜リンパ節、鼡径リンパ節、又は回腸ＬＣにおけるＩＦＮ−α、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、ＩＤＯ、又はＩＬ−１β発現に対してＣＤ２４Ｆｃは何ら影響を与えなかった（データは示さず）。しかしながら、ＣＤ２４Ｆｃ処置は、直腸においてＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＤＯ、及びＩＬ−１βの発現を減衰させた（図１０Ａ）。これらの結果は、ＣＤ２４Ｆｃ処置が消化管の炎症を選択的に弱めることができることを示唆している。これらのデータを裏付けるため、回腸、結腸、及び直腸におけるＭＰＯ発現の免疫蛍光染色によって顆粒球の浸潤を分析した。コントロール群又はＣＤ２４Ｆｃ処置群の固体の全ての区画でＭＰＯ陽性細胞が検出されたが、ＣＤ２４Ｆｃ処置群では、コントロール群に比べて直腸と結腸におけるＭＰＯ＋細胞数が有意に低かった（図１０Ｂ）。
【００７８】
炎症性細胞浸潤、上皮の変化、及び粘膜構造は、消化管病理の３つの主なカテゴリーとして定義された［８３］（Geboes et al., 2000）。一般的に、白血球密度と白血球浸潤の増大は炎症細胞浸潤の２つの基準である。上皮の変化としては、陰窩上皮細胞過形成、杯細胞の喪失、陰窩炎、及び陰窩腫瘍が挙げられる。粘膜構造は、潰瘍、不規則な陰窩、又は肉芽組織の存在によりグレード付けられる。消化管からの切片の組織病理学的分析を行い、当該切片を二重盲検方式でスコア化した。代表的なＨＥ染色の画像を図１０Ｃに示し、サマリースコアを図１０Ｄに示す。小腸、結腸、及び直腸における組織学的試験では、無傷の上皮バリアの崩壊、回腸切片における内腔の腺上皮細胞の剥離（図１０Ｃａ）、結腸切片における、好中球、マクロファージ、及び好酸球の著しい浸潤を伴う上皮内及び上皮間の腫瘍形成（図１０Ｃｂ）、直腸切片における、筋層血管周囲のリンパ球浸潤（図１０Ｃｄ）、及び消化管浮腫（図１０Ｃｅ）がみられた。これらの病理学的変化は、コントロールＳＩＶ感染群における重篤な炎症を示している。一方、ＣＤ２４Ｆｃ処置群では、回腸における軽度の上皮剥離がみられるのみであった（図１０Ｃｆ）。ＣＤ２４Ｆｃ処置群では、結腸切片において、陰窩過形成は存在したものの（図１０Ｃｇ）、陰窩炎や陰窩腫瘍はみられなかった。結腸筋層における軽度のリンパ球浸潤及び軽度の消化管浮腫があった（図１０Ｃｉ）。病理スコアを結合すると、ＳＩＶ感染サルにおいてＣＤ２４Ｆｃが消化管の炎症を顕著に低減したことが明らかである。
【００７９】
結論として、これらのデータは、ＣＤ２４Ｆｃが、大きな消化管炎症、免疫活性化を低減することができ、ＳＩＶ特有のＣＤ４＋Ｔ細胞応答とＴ細胞増殖を制御することができること、及びＣＤ２４Ｆｃ投与がＳＩＶ感染動物に有用である可能性があることを示唆する。本試験はさらに、ＨＩＶ−１感染の病因におけるＤＡＭＰの重要性を強調しており、ＤＡＭＰに誘発される自然免疫を阻害することは、ＨＩＶ−１／ＡＩＤＳのコントロール／治療のための免疫治療戦略であり、ＣＤ２４ＦｃはＡＩＤＳ治療の潜在的な治療薬であることを示す。
【００８０】
＜実施例５＞
〔ヒト化マウスにおけるＨＩＶ感染のＣＤ２４処置〕
ＣＤ２４Ｆｃ処置はＨＩＶ−１ウイルス量を低減し、急性ＨＩＶ感染マウスの脾臓においてＣＤ４＋Ｔ細胞を枯渇から保護する
まず、ヒト化マウスを用いて、急性ＨＩＶ−１感染においてＣＤ２４Ｆｃ処置がＨＩＶ−１複製と免疫的病因に影響するかどうかをまず調べた。図１１Ａに示されるように、ビヒクル処置群ではＲ３Ａ複製が感染１週間後（ｗｐｉ；week post-infection）に１×１０６コピー／ｍＬにまで急速に増加し、その後、感染２〜３週間後には１０８コピー／ｍＬとなるまで徐々に増加した。ＣＤ２４Ｆｃ処置群では、最初の１週間のＲ３Ａの増加は影響を受けなかった。しかしながら、感染２週間後及び３週間後においてさらなる増加は観察されなかった。それにもかかわらず、ＣＤ２４Ｆｃ処置は、ＣＤ３＋Ｔ細胞中のＣＤ４  Ｔ細胞の頻度の減少を止めなかった（図１１Ｂ）。特筆すべきことに、ＣＤ２４Ｆｃ処置は、感染３週後、マウスを安楽死させる時点における脾臓中のＣＤ４＋Ｔ細胞数を有意に増加させた（図１１Ｃ）。このＣＤ４＋Ｔ細胞数の増加は、ヒト化マウスの脾臓における総ヒトリンパ球の増加と一致していた（図１１Ｄ）。これらのデータは、ＣＤ２４Ｆｃが、ＨＩＶ−１ウイルス量を低減する能力を有しうること、及び急性ＨＩＶ感染ヒト化マウスの脾臓においてＣＤ４＋Ｔ細胞を枯渇から保護しうることを示唆している。
【００８１】
慢性ＨＩＶ感染ヒト化マウスにおいて、ＣＤ２４Ｆｃ処置はＨＩＶ−１複製を低減させた
次に、ヒト化マウスにおいて、ＪＲ−ＣＳＦ感染後、ＣＤ２４Ｆｃ処置が慢性的ＨＩＶ−１複製に影響を与えるかどうかを調べた。これらのマウスにおける血漿中ＨＩＶ−１量を順次検出し、ＨＩＶ−１感染の開始以降、血漿中でＨＩＶ−１量が持続的に増加していたことを見出した。予想通り、併用抗レトロウイルス療法（ｃＡＲＴ）は、血漿中のＨＩＶ−１量を検出不能なレベルにまで完全に阻害した。ＣＤ２４Ｆｃ処置は血漿中ＨＩＶ−１量の増加を抑制することができ、これにより、処置マウスでは、ＨＩＶ−１感染マウスと比較して、ＨＩＶ−１量が有意に低いレベルであった（図１２Ａ）。マウスを安楽死させた際、様々なリンパ組織においてＣＤ４＋Ｔ細胞のｐ２４発現をさらに検出した（図１２Ｂ）。ＣＤ２４Ｆｃ処置は、ｐ２４発現細胞の割合（％）を５分の１より低いレベルまで減少させたことが観察された。これも予想された通り、ｃＡＲＴはさらにより効果的なようであり、１０分の１から２０分の１までの低下がみられた（図１２Ｂ）。各群６〜８個体のマウスを用いた複数の試験からの組合せデータは、脾臓とリンパ節におけるｐ２４発現細胞の有意な低下をさらに確認した（図１２Ｃ）。これらのデータは、ヒト化マウスにおいてＣＤ２４Ｆｃ処置が慢性的ＨＩＶ−１複製を抑制することを示唆している。
【００８２】
慢性ＨＩＶ−１感染ヒト化マウスにおいて、ＣＤ２４Ｆｃ処置はナイーブＴ細胞コンパートメントを補充した
ＨＩＶ−１感染ヒト化マウスにおいて、ＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＡをナイーブＴ細胞のマーカーとして用いて、ＣＤ４  Ｔ細胞サブセットに対するＣＤ２４Ｆｃ処置の影響を試験した（図１３Ａ）。コントロールＩｇ処置マウスでは、ＨＩＶ感染は、ＣＤ４  Ｔ細胞及びＣＤ８  Ｔ細胞のいずれにおいても、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋ナイーブＴ細胞の割合を有意に減少させ、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−エフェクターメモリーＴ細胞サブセットの割合を有意に増加させた。重要なことに、ＣＤ２４Ｆｃ処置は、ＨＩＶ−１感染ヒト化マウスの脾臓におけるＣＤ４  Ｔ細胞及びＣＤ８  Ｔ細胞サブセットのこの非対称な分布を劇的に逆転させた。特筆すべきことに、ＣＤ２４Ｆｃは、慢性的感染マウスにおいて、ナイーブＴ細胞の病理的喪失の防止においてｃＡＲＴと殆ど同程度に効果的であった（図１３Ｂ）。
【００８３】
慢性ＨＩＶ−１感染ヒト化マウスにおいて、ＣＤ２４Ｆｃ処置はｉｎ  ｖｉｖｏで免疫過活性化を低減した
ＣＤ２４Ｆｃ処置に、ＨＩＶ−１に誘導される免疫的病因をレスキューする潜在的能力があるかどうかをさらに試験した。慢性ＨＩＶ−１感染を有するヒトにおいて、免疫過活性化は疾患進行のホールマークとなることが示されている。そのため、様々なリンパ組織においてＣＤ４  Ｔ細胞及びＣＤ８  Ｔ細胞の活性化を検出した（図１４Ａ）。ＨＩＶ−１感染患者と同様、ＨＩＶ−１感染は、モックマウスと比べて、ヒト化マウスのリンパ節、脾臓、及び骨髄においてＣＤ３８＋ＨＬＡ−ＤＲ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞及ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を有意に増加させた。予想通り、ｃＡＲＴは、ＨＩＶ−１感染マウスの試験した全てのリンパ組織において、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化をほぼ正常レベルにまで低下させた。重要なことに、ＣＤ２４Ｆｃ処置はまた、リンパ節におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を有意に減少させ、ＨＩＶ感染中において、リンパ節及び脾臓からＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化させた（図１４Ｂ）。これらのデータは、ＣＤ２４Ｆｃが持続的ＨＩＶ−１感染に誘導される免疫過活性化と炎症を抑制する潜在的能力を有することを示している。
【００８４】
ＣＤ２４Ｆｃ処置は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで、ＨＩＶ−１誘導性の炎症性サイトカイン産生をブロックする
ＣＤ２４Ｆｃが炎症性サイトカインを減少させることができるかどうかを試験した。図１５Ａに示されるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、Ｒ３Ａ感染は炎症性サイトカインであるＩＬ−１βタンパク質を誘導し、この誘導はＣＤ２４Ｆｃにより概ね消失した（図１５Ａ）。同様に、Ｃ２４ＦｃはＩＬ６及びＰｒｏ−ＩＬ−１β  ｍＲＮＡを有意に減少させた（図１５Ｂ）。図１５Ｃに概略が示されるように、急性ＨＩＶ−１感染におけるＴ細胞活性化及び炎症性サイトカインに対するＣＤ２４Ｆｃ処置の影響をさらに試験した。重要なことに、ＣＤ２４Ｆｃ処置は、血漿中ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮ−γ、及びＩＬ−１７ａを有意に阻害した（図１５Ｄ）。
【００８５】
ＣＤ２４Ｆｃ処置は、持続的ＨＩＶ−１感染に誘導される造血抑制をレスキューする
最後に、ＨＩＶ−１感染中の骨髄（ＢＭ）造血抑制に対するＣＤ２４Ｆｃ処置の影響を評価した。コロニー形成アッセイのため、顆粒球／マクロファージ（ＧＭ）、赤血球（Ｅ）、及び顆粒球／赤血球／マクロファージ／巨核球（ＧＥＭＭ）サブセットを含む、Ｌｉｎ−ＣＤ３４＋細胞を精製した。この結果より、ＣＤ２４Ｆｃ処置はまた、ＨＩＶ−１感染単独と比較して、全集合及び各個別のコロニータイプのＣＦＵ活性を有意に増加させたことが示された（図１６）。
【００８６】
＜実施例６＞
〔ヒトにおけるＣＤ２４の薬物動態〕
本実施例ではヒトにおけるＣＤ２４タンパク質の薬物動態の分析を示す。これは、健康な男性及び女性の成人対象におけるＣＤ２４Ｆｃの安全性、忍容性、及び薬物動態（ＰＫ）を評価するための、第Ｉ相無作為割付二重盲検プラセボ対照単回用量漸増試験に由来する。この試験には、各８名の被験者からなる５つのコホートで合計４０名の被験者が登録された。各コホートの８名の被験者のうち６名に試験薬を投与し、２名の被験者にプラセボ（０．９％塩化ナトリウム、生理食塩水）を投与した。第１のコホートには１０ｍｇを投与した。後続のコホートには、３０ｍｇ、６０ｍｇ、１２０ｍｇ、及び２４０ｍｇのＣＤ２４Ｆｃ又はマッチングプラセボを投与し、以前の各コホートの安全性と忍容性のデータを確認するために、少なくとも３週間おきに投与した。適切な安全性と忍容性が実証された場合にのみ、新しい被験者のコホートへの次の高用量の投与が許可された。
【００８７】
各コホートでは、最初の２名の被験者は１日目に試験薬の投与を受ける１名とプラセボの投与を受ける１名であった。３人目〜５人目及び６人目〜８人目までの被験者は、７日目より後（サブグループ間で最低２４時間離れて）に投与を受けた。同じサブグループでは各被験者は少なくとも１時間離れて投与を受けた。必要に応じて、そのコホートの１番目又は２番目のサブグループを含む投与後期間中に発生した可能性のあるいずれかの重大な安全性問題のレビューを待って、残りの被験者の投与を遅らせた。後続のコホートは、その前のコホートの少なくとも３週間後に投与を受けた。
【００８８】
スクリーニング期間：
スクリーニング来院（来院１）は、アクティブな治療期間の開始の２１日前までに行われた。インフォームドコンセントを提供した後、被験者は適格性のスクリーニング手順を受けた。
【００８９】
治療期間：
被験者は−１日目（来院２）に臨床薬理学ユニット（ＣＰＵ）に入院し、最低１０時間の一晩の絶食に続いて１日目に無作為割付された治療期間が開始された。被験者は、単回投与としてのＣＤ２４Ｆｃ又はプラセボによる治療にランダムに割り当てられた。被験者は４日目の朝まで入院した。
【００９０】
フォローアップ：
全ての被験者は、フォローアップ来院（来院３、来院４、来院５、来院６、及び来院７）のために７日目、１４日目、２１日目、２８日目、及び４２日目（±１日）にＣＰＵに戻った。全ての被験者において来院７が最終来院であった。
【００９１】
治療期間：各被験者の総試験期間は最大６３日であった。単回投与は１日目に行われた。
【００９２】
被験者数：
予定：４０名の被験者
スクリーニング：２２４名の被験者
無作為割付：４０名の被験者
完了：３９名の被験者
中止：１名の被験者
【００９３】
診断及び主な選択基準：本試験のための集団は、１８ｋｇ／ｍ２〜３０ｋｇ／ｍ２（上限と下限を含む）の体格指数を有し、１８〜５５歳（上限と下限を含む）の、健康な男性及び女性であった。
【００９４】
試験薬及び比較薬の情報：
ＣＤ２４Ｆｃ：ＩＶ注入により投与される１０ｍｇ、３０ｍｇ、６０ｍｇ、１２０ｍｇ、又は２４０ｍｇの単回投与。ロット番号：０９ＭＭ−０３６。ＣＤ２４Ｆｃは、ヒトＣＤ２４の成熟配列とヒト免疫グロブリンＧ１の結晶化可能領域断片（ＩｇＧ１Ｆｃ）からなる完全ヒト化融合タンパク質であった。ＣＤ２４Ｆｃは、ＩＶ投与用の無菌、透明、無色、防腐剤フリーの水溶液として供給された。ＣＤ２４Ｆｃは、濃度１０ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．２の単回投与注射液として製剤化された。各ＣＤ２４Ｆｃバイアルには、１６ｍＬ±０．２ｍＬのＣＤ２４Ｆｃ中、１６０ｍｇのＣＤ２４Ｆｃ、５．３ｍｇの塩化ナトリウム、３２．６ｍｇのリン酸ナトリウム二塩基性七水和物、及び１４０ｍｇのリン酸ナトリウム一塩基性一水和物が含まれていた。ＣＤ２４Ｆｃは、クロロブチルゴムストッパーとアルミニウムフリップオフシール付きの透明なホウケイ酸ガラスバイアルで供給された。
【００９５】
ＩＶ注入により投与されたマッチングプラセボ（０．９％塩化ナトリウム、生理食塩水）；ロット番号：Ｐ２９６８５５、Ｐ３１１８５２、Ｐ３００７１５、Ｐ３１５９５２。
【００９６】
ＩＴＴ（ｉｎｔｅｎｔ−ｔｏ−ｔｒｅａｔ）集団は、少なくとも１回の試験薬を投与された全被験者で構成された。ＩＴＴ集団は、被験者情報と安全性評価の主要な解析集団であった。
【００９７】
臨床検査評価（化学、血液学、及び尿検査）は治療及び来院ごとに要約した。ベースラインからの変化も要約した。バイタルサイン（血圧、心拍数、呼吸数、及び体温）は治療と時点別に要約した。ベースラインからの変化も要約された。全ての身体検査データをリストした。心電図パラメータとベースラインからの変化を要約した。総合的解釈をリストした。
【００９８】
血漿ＣＤ２４Ｆｃ濃度
図１７に示すように、ＣＤ２４Ｆｃの平均血漿濃度は、投与されたＣＤ２４Ｆｃの用量に比例して増加した。１２０ｍｇを除く全ての投与群について、投与後１時間でＣＤ２４Ｆｃの最大平均血漿濃度に達した。１２０ｍｇ群のＣＤ２４Ｆｃの最大平均血漿濃度は、投与後２時間で到達した。４２日目（９８４時間）までに、全ての群のＣＤ２４Ｆｃの平均血漿濃度は、最大平均血漿濃度の２％〜４％にまで減少した。
【００９９】
表１は、ＰＫ評価可能集団の治療ごとの血漿ＣＤ２４Ｆｃ  ＰＫパラメータを要約したものである。
【０１００】
【表１Ａ】
2021523929.tif 000003
【０１０１】
【表１Ｂ】
2021523929.tif 000004
【０１０２】
血漿中ＣＤ２４Ｆｃ用量比例性解析
図１８はＰＫ評価可能集団の用量に対するＣＤ２４ＦｃのＣｍａｘの用量比例性プロットを表す。図１９はＰＫ評価可能集団の用量に対するＣＤ２４ＦｃのＡＵＣ０−４２ｄの用量比例性プロットを表す。図２０はＰＫ評価可能集団の用量に対するＣＤ２４ＦｃのＡＵＣ０−ｉｎｆの用量比例性プロットを表す。表２は用量比例性の検出力分析を示す。
【０１０３】
【表２】
2021523929.tif 000005
【０１０４】
Ｃｍａｘの勾配推定は１．１０５〜１．２４０の９０％信頼区間（ＣＩ）で１．１７２であった。ＡＵＣ０−４２ｄの勾配推定は１．０２７〜１．１４８の９０％信頼区間で１．０８８であった。ＡＵＣ０−ｉｎｆの勾配推定は１．０２６〜１．１の９０％信頼区間で１．０８７であった。
【０１０５】
薬物動態の結論
マウス、サル、及びヒトにおいて、血漿中ＣＤ２４ＦｃのＣｍａｘ及びＡＵＣは用量比例的に増加した。血漿中ＣＤ２４Ｆｃは１．０１〜１．３４時間でＴｍａｘに達した。血漿中ＣＤ２４の半減期（ｔ１／２）は２８０．８３〜３２７．１０時間であった。
【０１０６】
＜実施例７＞
〔ＣＤ２４は移植片対宿主病に用いることができる〕
本実施例では、ＣＤ２４が、移植細胞の移植片対宿主（ＧＶＬ）効果に影響することなく、細胞ＤＡＭＰに対する宿主の応答を負に制御することにより、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の治療又は予防に用いることができることを示す。ＮＫ細胞は同種異系の造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）後の生着を増強し宿主対白血病を仲介するが、ＨＳＣＴ後の自然再構成ＮＫ細胞に仲介される移植片対白血病の効果は制限されている。前臨床試験ではＮＫ細胞の活性化が受容体発現の活性化をアップレギュレートし殺能力を増強することが示されている（Shah et al 2015）。これはその後、超高リスク固形腫瘍を有する小児及び若年成人における、ＨＬＡを適合させたＴ細胞欠損非骨髄破壊的末梢血幹細胞移植後の、ドナー由来の活性化ＮＫ細胞（ａＮＫ−ＤＬＩ）の養子移植を研究する臨床試験で試験された。ａＮＫ−ＤＬＩは強力な殺能力を示し、高レベルの活性化受容体発現を示した。しかし、９名中５名の移植受容者は、ａＮＫ−ＤＬＩ後に急性の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を示し、うち３名ではグレード４のＧＶＨＤが観察された。ＧＶＨＤは、適合させた兄弟姉妹ドナーの受容者に対して、適合させた血縁関係のないドナーの受容者においてより頻度が高く、高いドナーＣＤ３のキメラ性と関連していた。本条件下ではＴ細胞量がＧＶＨＤに必要な境界値を下回っていたことを考慮すると、ａＮＫ−ＤＬＩが、おそらくＴ細胞のアロ反応性を増強することにより、観察されたＧＶＨＤに寄与していたと結論付けられた。したがって、本開示におけるＣＤ２４タンパク質は動物においてＧｖＨＤを治療又は予防するために使用しうる。
【０１０７】
参照文献
【０１０８】
【化１】
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【０１０９】
【化２】
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【０１１０】
【化３】
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【０１１１】
【化４】
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【０１１２】
【化５】
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【化６】
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【０１１４】
【化７】
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【０１１５】
【化８】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021523929.tif 000037
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