(57)【要約】  本明細書では、細胞リプログラミングのための組成物および方法を開示する。該組成物は、１つまたは複数のｍｉＲと、ＮＦκＢの活性化剤とを含む。また、細胞または対象において心筋細胞成熟を増進するまたは上方調節するための方法、および心筋細胞成熟を阻害するまたは下方調節するための方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ｍｉＲ−１（配列番号１１）、ｍｉＲ−１３３ａ（配列番号１４）、ｍｉＲ−２０８（配列番号１８）、およびｍｉｒ−４９９−５ｐ（配列番号２３）、ならびにそれらの組合せに対して少なくとも８０％配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む１つまたは複数のｍｉＲと
（ｂ）ＮＦκＢの活性化剤
とを含む、リプログラミング組成物。
【請求項２】
ＮＦκＢの活性化剤が、ＴＬＲ３アゴニストを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ＮＦκＢの活性化剤が、修飾された５’−三リン酸、２’−フルオロ修飾非線状ＲＮＡを含み、該ＲＮＡが少なくとも８ヌクレオチド対形成の完全なまたは部分的なハイブリダイゼーションから形成されたステムループを含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
非線状ＲＮＡが、ＩＣＲ２（配列番号３０）、ＩＣＲ４（配列番号３７）、ＩＣＲ４Ａ（配列番号３８）、ＩＣＲ５Ｘ（配列番号３９）、またはＩＣＲ５Ｙ（配列番号４０）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
非線状ＲＮＡが、ＩＣＲ２（配列番号３０）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
非線状ＲＮＡが、ＩＣＲ４（配列番号３７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
細胞質送達剤、リプログラミング培地、リプログラミング効率向上分子、またはそれらの任意の組合せをさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
１つまたは複数のｍｉＲが、ｍｉＲ−１（配列番号１１）、ｍｉＲ−１３３ａ（配列番号１４）、ｍｉＲ２０８（配列番号１８）、およびｍｉｒ−４９９−５ｐ（配列番号２３）から本質的になる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
１つまたは複数のｍｉＲが、プレ−ｍｉＲＮＡの一部分を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
有効量の請求項１〜９のいずれかに記載の組成物と１つまたは複数の薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１１】
細胞において心筋細胞成熟を増進するまたは上方調節する方法であって、細胞が心筋細胞へリプログラミングされるような十分な時間、細胞を有効量の請求項１に記載のリプログラミング組成物と接触させることを含む、方法。
【請求項１２】
細胞が、線維芽細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
細胞が、心臓線維性組織を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ＮＦκＢの活性化剤が、ＴＬＲ３アゴニストを含む、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ＮＦκＢの活性化剤が修飾された５’−三リン酸、２’−フルオロ修飾非線状ＲＮＡを含み、該ＲＮＡが少なくとも８個のヌクレオチド対形成の完全なまたは部分的なハイブリダイゼーションから形成されたステムループを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
非線状ＲＮＡが、ＩＣＲ２（配列番号３０）、ＩＣＲ４（配列番号３７）、ＩＣＲ４Ａ（配列番号３８）、ＩＣＲ５Ｘ（配列番号３９）、またはＩＣＲ５Ｙ（配列番号４０）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
非線状ＲＮＡが、ＩＣＲ２（配列番号３０）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
非線状ＲＮＡが、ＩＣＲ４（配列番号３７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
組成物が、細胞質送達剤、リプログラミング培地、リプログラミング効率向上分子、またはそれらの任意の組合せをさらに含む、請求項１１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
１つまたは複数のｍｉＲが、ｍｉＲ−１（配列番号１１）、ｍｉＲ−１３３ａ（配列番号１４）、ｍｉＲ２０８（配列番号１８）、およびｍｉｒ−４９９−５ｐ（配列番号２３）から本質的になる、請求項１１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
１つまたは複数のｍｉＲが、プレ−ｍｉＲＮＡの一部分を含む、請求項１１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
対象において心筋細胞成熟を増進するまたは上方調節する方法であって、（ｉ）有効量の請求項１に記載の組成物、または（ｉｉ）有効量の請求項１に記載の組成物と１つもしくは複数の薬学的に許容される担体、賦形剤、もしくは希釈剤とを含む医薬組成物を、投与することを含む、方法。
【請求項２３】
対象が、心臓血管系疾患を有するまたは心筋梗塞に罹患したことがある、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＮＦκＢの活性化剤が、ＴＬＲ３アゴニストを含む、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＮＦκＢの活性化剤が、修飾された５’−三リン酸、２’−フルオロ修飾非線状ＲＮＡを含み、該ＲＮＡが少なくとも８個のヌクレオチド対形成の完全なまたは部分的なハイブリダイゼーションから形成されたステムループを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
非線状ＲＮＡが、ＩＣＲ２（配列番号３０）、ＩＣＲ４（配列番号３７）、ＩＣＲ４Ａ（配列番号３８）、ＩＣＲ５Ｘ（配列番号３９）、またはＩＣＲ５Ｙ（配列番号４０）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
非線状ＲＮＡが、ＩＣＲ２（配列番号３０）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
非線状ＲＮＡが、ＩＣＲ４（配列番号３７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
組成物が、細胞質送達剤、リプログラミング培地、リプログラミング効率向上分子、またはそれらの任意の組合せをさらに含む、請求項２２〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
１つまたは複数のｍｉＲが、ｍｉＲ−１（配列番号１１）、ｍｉＲ−１３３ａ（配列番号１４）、ｍｉＲ２０８（配列番号１８）、およびｍｉｒ−４９９−５ｐ（配列番号２３）ｐから本質的になる、請求項２２〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
１つまたは複数のｍｉＲが、プレ−ｍｉＲＮＡの一部分を含む、請求項２２〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
細胞において心筋細胞成熟を阻害するまたは下方調節する方法であって、細胞において心筋細胞成熟が阻害されるまたは下方調節されるような十分な時間、細胞を、ＴＬＲ３阻害剤、ＮＦκＢ阻害剤、ｉｋｂｋｂ阻害剤、またはそれらの組合せを含む、有効量の組成物と接触させることを含む、方法。
【請求項３３】
細胞が、心筋細胞分化決定前駆体である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
細胞が、線維芽細胞である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
組成物が、ＴＬＲ３阻害剤を含む、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
ＴＬＲ３阻害剤が、ＴＬＲ３  ｓｉＲＮＡまたはＣＵ−ＣＰＴ−４ａである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
組成物が、ＮＦκＢ阻害剤を含む、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
ＮＦκＢ阻害剤が、ＮＦκＢ  ｓｉＲＮＡ、ＲｅｌＡ  ｓｉＲＮＡ、またはＢａｙ  １１−７０８５である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
組成物が、ｉｋｂｋｂ阻害剤を含む、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
ｉｋｂｋｂ阻害剤が、ｉｋｂｋｂ  ｓｉＲＮＡである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
組成物が、細胞質送達剤、細胞用培地、またはそれらの任意の組合せをさらに含む、請求項３２〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、それぞれの内容が全体として参照により本明細書に組み込まれている、２０１８年３月２１日出願の米国仮特許出願第６２／６４５，８４７号および２０１８年１２月２０日出願の同第６２／７８２，４８０号の優先権の利益を主張するものである。
政府支援の記載
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより授与された５Ｒ０１Ｈ７３１８１４−０２、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより授与されたＤＰ２ＯＤ００８５８６、およびＮａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎにより授与されたＣＢＥＴ−１１５１０３５のもと、政府支援によってなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
心臓疾患は、全世界で男女共に死因の第１位である。一般的に、心臓組織は、再生または自己複製のための能力が限られている。患者が心筋梗塞から回復した後、この器官には瘢痕が残り、心臓機能は低下する。損傷を受けた心臓などの器官を再生させる能力は、依然としてわかりにくい。したがって、当技術分野において、損傷を受けた器官の再生のための新規戦略を開発する必要に迫られている。
【発明の概要】
【０００３】
本明細書において、細胞リプログラミングのための組成物および方法を開示する。本発明の一態様は、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉｒ−２０６、ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−４９９、ｍｉｒ−４９９−５ｐ、およびそれらの組合せに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む１つまたは複数のｍｉＲと、ＮＦκＢの活性化剤とを含む、リプログラミング組成物である。
本発明の別の態様は、有効量の請求項１に記載の組成物と１つまたは複数の薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤とを含む、医薬組成物である。
本発明の別の態様は、細胞において心筋細胞成熟を増進するまたは上方調節する方法であって、細胞が心筋細胞へとリプログラミングされるような十分な時間、細胞を有効量の本明細書に記載の組成物のいずれかと接触させることを含む、方法である。
本発明の別の態様は、対象において心筋細胞成熟を増進するまたは上方調節する方法であって、（ｉ）有効量の記載の組成物のうちのいずれか、または（ｉｉ）有効量の記載の組成物のうちのいずれかと１つまたは複数の薬学的に許容される担体、賦形剤、もしくは希釈剤とを含む医薬組成物のいずれか、を投与することを含む、方法である。
本発明の別の態様は、細胞において心筋細胞成熟を阻害するまたは下方調節する方法であって、細胞において心筋細胞成熟が阻害されるまたは下方調節されるような十分な時間、細胞をＴＬＲ３阻害剤、ＮＦκＢ阻害剤、ｉｋｂｋｂ阻害剤、またはそれらの組合せを含む有効量の組成物と接触させることを含む、方法である。
本発明の非限定的な実施形態を添付の図面を参照しながら例として説明するが、これらの図面は概略図であり、一定の縮尺で描かれることを意図されていない。図では、例示した同一またはほぼ同一の構成要素は各々、通常、単一の数字によって表している。明瞭化するために、当業者に本発明を理解させるために例示が必要ではない場合、示した各図の構成要素のいずれも各本発明の実施形態の構成要素のいずれも、名称を表記しない。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１Ａ】図１Ａ〜図１Ｅｉｉｉは、ＴＬＲ３阻害が、リプログラミングされた線維芽細胞の心筋細胞への成熟を阻害することを示す図である。新生仔心臓線維芽細胞を陰性対照ｍｉＲ（ｎｅｇｍｉＲ）またはｍｉＲ  ｃｏｍｂｏでトランスフェクトした。トランスフェクションの翌日、培地を交換し、細胞を、ビヒクルまたはＴＬＲ３薬理学的阻害剤ＣＵ−ＣＰＴ−４ａ（１０μＭ）のいずれかと共に、さらに４日間インキュベートした。ＴＬＲ３薬理学的阻害剤とのインキュベーションの後、細胞を、通常の増殖培地で、さらに６日間、培養した。定量的ＰＣＲを使用して、心筋細胞サルコメアの１３種類の構成成分のｍＲＮＡレベルを解析した。図１Ａは、ｑＰＣＲ解析のヒートマップの概略図である。発現値は、ｎｅｇｍｉＲビヒクルサンプルの平均発現に対して正規化し、次いで平均した（Ｎ＝３  技術的反復実験（線維芽細胞は、１回の同腹仔から得、３つのウェルへ播種した））。次いで、各遺伝子の平均をＺスコアに変換した。クラスタリングおよび距離測定には、それぞれ重心リンケージおよびユークリッドの方法を用いた。
【図１Ｂ】図１Ｂｉ〜図１Ｃｉｉｉは、新生仔心臓線維芽細胞を、陰性対照ｍｉＲ（ｎｅｇｍｉＲ）またはｍｉＲ  ｃｏｍｂｏでトランスフェクトしたことを示す図である。トランスフェクションの翌日、培地を交換し、細胞をビヒクルまたはＴＬＲ３薬理学的阻害剤ＣＵ−ＣＰＴ−４ａ（１０μＭ）のいずれかと共に、さらに４日間インキュベートした。ＴＬＲ３薬理学的阻害剤とのインキュベーションの後、細胞を、通常の増殖培地で、さらに１０日間培養した。図１Ｂｉ〜図１Ｂｉｉｉは、ｑＰＣＲによって決定した、心筋細胞サルコメアの構成成分、Ｍｙｈ６（αミオシン重鎖）（図１Ｂｉ）、Ａｃｔｎ２（αサルコメアアクチニン）（図１Ｂｉｉ）、およびＴｎｎｉ３（心臓トロポニン−Ｉ）（図１Ｂｉｉｉ）のＲＮＡレベルを示すグラフである。Ｎ＝４  独立した実験。
【図１Ｃ】図１Ｃｉおよび図１Ｃｉｉは、ｍｉＲ  ｃｏｍｂｏ（図１Ｃｉ）またはｍｉＲ  ｃｏｍｂｏおよびＴＬＲ３アンタゴニスト（図１Ｃｉｉ）を与え、固定し、抗Ａｃｔｎ２抗体（赤）で染色した細胞の画像である。核は、ＤＡＰＩ（青）で染色した。スケールバー  ５０μｍ。図１Ｃｉｉｉは、免疫染色の定量化を示すグラフである。Ａｃｔｎ２を発現する細胞を数え、全細胞集団に対する百分率で表した。Ｎ＝６  独立した実験。
【図１Ｄ】図１Ｄ〜図１Ｅｉｉｉは、新生仔心臓線維芽細胞を、まず対照ｓｉＲＮＡまたはＴＬＲ３標的ｓｉＲＮＡのいずれかでトランスフェクトしたことを示すグラフである。２日後、細胞を、陰性対照ｍｉＲであるｎｅｇｍｉＲまたはｍｉＲ  ｃｏｍｂｏのいずれかで、再度トランスフェクトした。ｍｉＲＮＡでのトランスフェクションの翌日、培地を交換し、細胞を、通常の増殖培地で１４日間、培養した。図１Ｄは、ｑＰＣＲによるＴＬＲ３ノックダウンの定量化を示すグラフである。Ｎ＝３  独立した実験。
【図１Ｅ】図１Ｅｉ〜図１Ｅｉｉｉは、ｑＰＣＲによって決定した、心筋細胞構造タンパク質Ｍｙｈ６（αミオシン重鎖）（図１Ｅｉ）、Ａｃｔｎ２（αサルコメアアクチニン）（図１Ｅｉｉ）、およびＴｎｎｉ３（心臓トロポニン−Ｉ）（図１Ｅｉｉｉ）のＲＮＡレベルを示すグラフである。Ｎ＝４  独立した実験。データは、平均±ＳＥＭとして表した。***Ｐ＜０．００１、**Ｐ＜０．０１、*Ｐ＜０．０５、ｎｓ：有意ではない。Ａ、Ｂ、およびＤについては、各群についてｍｉＲ  ｃｏｍｂｏとｎｅｇｍｉＲとの間の比較を行う。Ｃについては、対照ｓｉＲＮＡとＴＬＲ３標的ｓｉＲＮＡとの間で比較を行う。
【図２Ａ】図２Ａｉ〜図２Ｂｉｖは、ＴＬＲ３阻害およびＴＬＲ３活性化のどちらも、初期の心臓リプログラミングには影響を与えないことを示すグラフである。図２Ａｉ〜図２Ａｉｖは、新生仔心臓線維芽細胞を、まず対照ｓｉＲＮＡまたはＴＬＲ３標的ｓｉＲＮＡのいずれかでトランスフェクトしたことを示すグラフである。２日後、細胞を、陰性対照ｍｉＲであるｎｅｇｍｉＲまたはｍｉＲ  ｃｏｍｂｏのいずれかで、再度トランスフェクトした。ｍｉＲＮＡでのトランスフェクションの翌日、培地を交換し、細胞を、通常の増殖培地で３日間、培養した。心筋細胞分化系列決定因子Ｇａｔａ４（図２Ａｉ）、Ｈａｎｄ２（図２Ａｉｉ）、Ｔｂｘ５（図２Ａｉｉｉ）、およびＭｅｆ２Ｃ（図２Ａｉｖ）のＲＮＡレベルを、ｑＰＣＲによって決定した。Ｎ＝９  独立した実験。ｍｉＲ  ｃｏｍｂｏ＋対照ｓｉＲＮＡとｍｉＲ  ｃｏｍｂｏ＋ＴＬＲ３  ｓｉＲＮＡとの間で比較を行う、ｎｓ：有意ではない。データは、平均±ＳＥＭとして表した。
【図２Ｂ】図２Ｂｉ〜図２Ｂｉｖは、新生仔心臓線維芽細胞を、陰性対照ｍｉＲ（ｎｅｇｍｉＲ）またはｍｉＲ  ｃｏｍｂｏでトランスフェクトしたことを示すグラフである。トランスフェクションの翌日、培地を交換し、細胞を、ビヒクルまたはＴＬＲ３アゴニストＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）ＬＭＷ（低分子量Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））と共に、さらに３日間インキュベートした。心筋細胞分化系列決定因子Ｇａｔａ４（図２Ｂｉ）、Ｈａｎｄ２（図２Ｂｉｉ）、Ｔｂｘ５（図２Ｂｉｉｉ）、およびＭｅｆ２Ｃ（図２Ｂｉｖ）のＲＮＡレベルを、ｑＰＣＲによって決定した。Ｎ＝６  独立した実験。ｍｉＲ  ｃｏｍｂｏ＋ビヒクルとｍｉＲ  ｃｏｍｂｏ＋ＴＬＲ３アゴニストとの間で比較を行う、ｎｓ：有意ではない。データは、平均±ＳＥＭとして表した。
【図３Ａ】図３Ａｉ〜図３Ｄｉｉｉは、ＮＦκＢが、ｍｉＲ  ｃｏｍｂｏリプログラミングに重要であることを示す図である。図３Ａｉ〜図３Ｂｉｉｉは、新生仔心臓線維芽細胞を、陰性対照ｍｉＲ（ｎｅｇｍｉＲ）またはｍｉＲ  ｃｏｍｂｏでトランスフェクトしたことを示す図である、トランスフェクションの翌日、培地を交換し、細胞をビヒクルまたはＮＦκＢアンタゴニストＢａｙ  １１−７０８５と共にインキュベートした。処理の１日後、培地を通常の増殖培地と交換し、細胞を、さらに１２日間培養した。図３Ａｉ〜図３Ａｉｉｉは、ｑＰＣＲによって決定した、ＮＦκＢアンタゴニストＢａｙ  １１−７０８５による処理後の、心筋細胞構造タンパク質Ｍｙｈ６（αミオシン重鎖）（図３Ａｉ）、Ａｃｔｎ２（αサルコメアアクチニン）（図３Ａｉｉ）、およびＴｎｎｉ３（心臓トロポニン−Ｉ）（図３Ａｉｉｉ）のＲＮＡレベルを示すグラフである。Ｎ＝３  独立した実験。
【図３Ｂ】図３Ｂｉ〜図３Ｂｉｉは、ｍｉＲ  ｃｏｍｂｏ（図３Ｂｉ）、またはｍｉＲ  ｃｏｍｂｏおよびＮＦκＢ阻害剤（図３Ｂｉｉ）を与え、固定し、抗Ａｃｔｎ２抗体（赤）で染色した細胞の画像である。核は、ＤＡＰＩ（青）で染色した。スケールバー  １００μｍ。挿入写真は、５倍拡大である。図３Ｂｉｉｉは、免疫染色の定量化を示すグラフである。Ａｃｔｎ２発現細胞を数え、全細胞集団に対する百分率で表した。Ｎ＝３  独立した実験。
【図３Ｃ】図３Ｃ〜図３Ｄｉｉｉは、新生仔心臓線維芽細胞を、マイクロＲＮＡ（ｎｅｇｍｉＲまたはｍｉＲ  ｃｏｍｂｏ）およびｓｉＲＮＡ（対照ｓｉＲＮＡまたはＩｋｂｋｂ標的ｓｉＲＮＡ）でトランスフェクトしたことを示すグラフである。ｍｉＲＮＡでのトランスフェクションの翌日、培地を交換し、細胞を、通常の増殖培地で、４日間（ノックダウン効率を評価するため）または１４日間（心筋細胞構造タンパク質のＲＮＡレベルを評価するため）、培養した。図３Ｃは、ｑＰＣＲによるＩｋｂｋｂノックダウンの定量化を示すグラフである。Ｎ＝３  独立した実験。
【図３Ｄ】図３Ｄｉ〜図３Ｄｉｉｉは、ｑＰＣＲによって決定した、心筋細胞構造タンパク質Ｍｙｈ６（αミオシン重鎖）（図３Ｄｉ）、Ａｃｔｎ２（αサルコメアアクチニン）（図３Ｄｉｉ）、およびＴｎｎｉ３（心臓トロポニン−Ｉ）（図３Ｄｉｉｉ）のＲＮＡレベルを示すグラフである。Ｎ＝３  独立した実験。データは、平均±ＳＥＭとして表した。各群について、ｍｉＲ  ｃｏｍｂｏとｎｅｇｍｉＲとの間で比較を行う、**Ｐ＜０．０１、*Ｐ＜０．０５、ｎｓ：有意ではない。
【図４Ａ】図４Ａ〜図４Ｄｉｉは、ＲｅｌＡがＮＦκＢの作用を媒介することを示す図である。新生仔心臓線維芽細胞を、まず対照ｓｉＲＮＡまたはＮＦκＢサブユニットＲｅｌＡ標的ｓｉＲＮＡのいずれかでトランスフェクトした。２日後、細胞を陰性対照ｍｉＲであるｎｅｇｍｉＲまたはｍｉＲ  ｃｏｍｂｏのいずれかで、再度トランスフェクトした。ｍｉＲＮＡでのトランスフェクションの翌日、培地を交換し、細胞を、通常の増殖培地で、１３日間培養した。図４Ａは、ｑＰＣＲによるＲｅｌＡノックダウンの定量化を示すグラフである。
【図４Ｂ】図４Ｂｉ〜図４Ｂｉｉは、ｍｉＲ  ｃｏｍｂｏおよび対照ｓｉＲＮＡ（図４Ｂｉ）、ならびにｍｉＲ  ｃｏｍｂｏ＋ＲｅｌＡ  ｓｉＲＮＡ（図４Ｂｉｉ）を与え、固定し、抗Ａｃｔｎ２抗体（赤）で染色した細胞の画像である。核は、ＤＡＰＩ（青）で染色した。スケールバー  １００μｍ。挿入写真は、５倍の拡大である。図４Ｂｉｉｉは、免疫染色の定量化を示すグラフである。Ａｃｔｎ２発現細胞を数え、全細胞集団に対する百分率で表した。Ｎ＝３  独立した実験。
【図４Ｃ】図４Ｃｉ〜図４Ｃｉｉｉは、ｑＰＣＲによって決定した、心筋細胞構造タンパク質Ｍｙｈ６（αミオシン重鎖）（図４Ｃｉ）、Ａｃｔｎ２（αサルコメアアクチニン）（図４Ｃｉｉ）、およびＴｎｎｉ３（心臓トロポニン−Ｉ）（図４Ｃｉｉｉ）のＲＮＡレベルを示すグラフである。Ｎ＝３  独立した実験。
【図４Ｄ】図４Ｄｉ〜図４Ｄｉｉは、ｑＰＣＲによって測定した、内胚葉マーカーＧａｔａ６（図４Ｄｉ）および分化の一般的なマーカーＴｇｆｂ２（図４Ｄｉｉ）のＲＮＡレベルを示すグラフである。Ｎ＝３  独立した実験。データは、平均±ＳＥＭとして表した。各群について、ｍｉＲ  ｃｏｍｂｏと陰性対照ｍｉＲ（ｎｅｇｍｉＲ）との間で比較を行う、**Ｐ＜０．０１、*Ｐ＜０．０５、ｎｓ：有意ではない。
【図５Ａ】図５Ａｉ〜図５Ｂｖｉｉｉは、ＮＦκＢサブユニットＲｅｌＡが、心筋細胞成熟遺伝子のプロモーターに結合することを示すグラフである。図５Ａｉ〜図５Ａｖｉｉｉは、新生仔心臓線維芽細胞を、ｎｅｇｍｉＲまたはｍｉＲ  ｃｏｍｂｏでトランスフェクトしたことを示すグラフである。７日後、クロマチンＤＮＡのＣｈＩＰ解析を行った。プライマーは、示した心筋細胞サルコメア遺伝子Ａｃｔｎ２（図５Ａｉ）、Ｍｙｈ６（図５Ａｉｉ）、Ｍｙｐｎ（図５Ａｉｉｉ）、Ｔｎｎｉ３（図５Ａｉｖ）、Ｔｔｎ（図５Ａｖ）、Ｍｙｏｚ２（図５Ａｖｉ）、Ｔｎｎｃ１（図５Ａｖｉｉ）、およびＴｎｎｔ２（図５Ａｖｉｉｉ）の最初の１Ｋｂを標的とするように設計した（−０１Ｋｂで表した）。結果は、ｎｅｇｍｉＲ対照のインプット率（％）を１とした場合のＲｅｌＡ結合の濃縮倍率として示した。Ｎ＝３  独立した実験。データは、平均±ＳＥＭとして表した。ｍｉＲ  ｃｏｍｂｏと陰性対照ｍｉＲ（ｎｅｇｍｉＲ）との間で比較を行う、**Ｐ＜０．０ｌ、*Ｐ＜０．０５、ｎｓ：有意ではない。
【図５Ｂ】図５Ｂｉ〜図５Ｂｖｉｉｉは、新生仔心臓線維芽細胞を、ｍｉＲ  ｃｏｍｂｏと対照ｓｉＲＮＡまたはＲｅｌＡ標的ｓｉＲＮＡのいずれかとによってトランスフェクトしたことを示すグラフである。７日後、クロマチンＤＮＡのＣｈＩＰ解析を行った。プライマーは、示した心筋細胞サルコメア遺伝子Ａｃｔｎ２（図５Ｂｉ）、Ｍｙｈ６（図５Ｂｉｉ）、Ｍｙｐｎ（図５Ｂｉｉｉ）、Ｔｎｎｉ３（図５Ｂｉｖ）、Ｔｔｎ（図５Ｂｖ）、Ｍｙｏｚ２（図５Ｂｖｉ）、Ｔｎｎｃ１（図５Ｂｖｉｉ）、およびＴｎｎｔ２（図５Ｂｖｉｉｉ）（−０１Ｋｂで表した）の最初の１Ｋｂを標的とするように設計した。結果は、クロマチンインプットに対する百分率として示している。Ｎ＝３  独立した実験。データは、平均±ＳＥＭとして表した。
【図６Ａ】図６Ａ〜図６Ｂは、マイクロＲＮＡがＴＬＲ３を活性化することを示すグラフである。図６Ａは、新生仔心臓線維芽細胞を、ｎｅｇｍｉＲまたはｍｉＲ  ｃｏｍｂｏでトランスフェクトしたことを示すグラフである。細胞に脂質試薬だけを加えたモックトランスフェクションも用いた。トランスフェクションの１日後に、ＴＬＲ３へのＲＮＡ結合に干渉するＴＬＲ３阻害剤ＣＵ−ＣＰＴ−４ａを加えた。トランスフェクションの４日後に培地中のＩＬ６濃度を評価し、値は総タンパク質量１μｇ当たりのｐｇ  ＩＬ６として表した。Ｎ＝４  独立した実験。データは、平均±ＳＥＭとして表した。それぞれモックトランスフェクト群に対して（*Ｐ＜０．０５、ｎｓ：有意ではない）、ｎｅｇｍｉＲとｍｉＲ  ｃｏｍｂｏとの間で比較を行う（†Ｐ＜０．０５）。
【図６Ｂ】新生仔心臓線維芽細胞を、マイクロＲＮＡ（モック、ｍｉＲ  ｃｏｍｂｏ）およびｓｉＲＮＡ（非標的対照、ＴＬＲ３標的、Ｉｋｂｋｂ標的）でトランスフェクトしたことを示すグラフである。トランスフェクションの４日後に培地中のＩＬ６濃度を評価し、値はｍｉＲ  ｃｏｍｂｏトランスフェクト細胞とモックトランスフェクト細胞との間の比率として表した。Ｎ＝３  独立した実験。データは、平均±ＳＥＭとして表した。ｍｉＲ  ｃｏｍｂｏ＋非標的対照ｓｉＲＮＡ群に対して比較を行う、**Ｐ＜０．０１、*Ｐ＜０．０５。
【図７Ａ】図７Ａｉ〜図７Ｄｉｉは、ＴＬＲ３アゴニストが、ｍｉＲ  ｃｏｍｂｏでリプログラミングされた心筋細胞の成熟を増進させることを示す図である。新生仔心臓線維芽細胞を、陰性対照ｍｉＲ（ｎｅｇｍｉＲ）またはｍｉＲ  ｃｏｍｂｏでトランスフェクトした。トランスフェクションの翌日、培地を交換し、細胞をビヒクルまたはＴＬＲ３アゴニストＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）ＬＭＷ（低分子量Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））と共に、さらに４日間インキュベートした。ＴＬＲ３アゴニストとのインキュベーションの後、細胞を、通常の増殖培地で、さらに１０日間培養した。図７Ａｉ〜図７Ａｉｉｉは、ｑＰＣＲによって決定した、心筋細胞構造タンパク質Ｍｙｈ６（αミオシン重鎖）（図７Ａｉ）、Ａｃｔｎ２（αサルコメアアクチニン）（図７Ａｉｉ）、およびＴｎｎｉ３（心臓トロポニン−Ｉ）（図７Ａｉｉｉ）のＲＮＡレベルを示す図である。Ｎ＝５−ｌ４。
【図７Ｂ】図７Ｂｉ〜図７Ｂｖｉは、ｍｉＲ  ｃｏｍｂｏ（図７Ｂｉ、図７Ｂｉｉ、および７Ｂｉｉｉ）、ならびにｍｉＲ  ｃｏｍｂｏおよびＴＬＲ３アゴニスト（図７Ｂｉｖ、図７Ｂｖ、および  ７Ｂｖｉ）を与え、固定し、抗Ａｃｔｎ２抗体（赤）で染色した細胞の画像である。核は、ＤＡＰＩ（青）で染色した。Ｎ＝６  独立した実験。スケールバー  ５０μｍ。挿入写真は、５倍拡大でサルコメア構造を示している。
【図７Ｃ】免疫染色の定量化を示す図である。Ａｃｔｎ２発現細胞を数え、全細胞集団に対する百分率で表した。
【図７Ｄ】図７Ｄｉ〜図７Ｄｉｉは、新生仔心臓線維芽細胞を、陰性対照ｍｉＲ（ｎｅｇｍｉＲ）またはｍｉＲ  ｃｏｍｂｏでトランスフェクトしたことを示す図である。トランスフェクションの翌日、培地を交換し、細胞を、分化培地（ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋ＩＴＳ＋ＡＡ）およびＴＬＲ３アゴニストＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）ＬＭＷと共に、示した期間（図７Ｄｉ）、インキュベートした。トランスフェクションの１４日後、鼓動しているコロニーの数を数えた。Ｎ＝４  独立した実験（図７Ｄｉｉ）。データは、平均±ＳＥＭとして表した。*各群について、ビヒクルとＴＬＲ３アゴニストとの間で比較を行う、***Ｐ＜０．００１、**Ｐ＜０．０１、*Ｐ＜０．０５。†各群について、ｍｉＲ  ｃｏｍｂｏとｎｅｇｍｉＲとの間で比較を行う、†††Ｐ＜０．００１、††Ｐ＜０．０１、†Ｐ＜０．０５。
【図８】図８Ａ〜図８Ｄは、ＩＣＲ２活性化心筋細胞成熟を、Ａｃｔｎ２（図８Ａ）、Ｍｙｈ６（図８Ｂ）、Ｔｎｎｉ３（図８Ｃ）、およびＣａｃｎａ１ｃ（図８Ｄ）の発現を測定することによってｑＰＣＲにより評価したグラフである。
【図９】図９Ａ〜図９Ｄは、ＩＣＲ４活性化心筋細胞成熟を、Ａｃｔｎ２（図９Ａ）、Ｍｙｈ６（図９Ｂ）、Ｔｎｎｉ３（図９Ｃ）、およびＣａｃｎａ１ｃ（図９Ｄ）の発現を測定することによってｑＰＣＲにより評価したグラフである。
【図１０】細胞数の変化を測定することにより、高用量のｍｉＲ  ｃｏｍｂｏが正常な細胞機能を損なうことを示すグラフである。
【図１１】図１１Ａ〜図１１Ｂは、ａ−サルコメアアクチニンに対する抗体染色によって評価した、ＩＣＲ２（図１１Ａ）およびＰｏｌｙＩＣ（図１１Ｂ）によるｍｉＲ  ｃｏｍｂｏ媒介成熟を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
心筋細胞成熟は、パターン認識受容体アゴニストなどの先天免疫系のアゴニストによって増進もしくは上方調節され、またはアンタゴニストによって阻害もしくは下方調節されている可能性がある。実施例に示したように、心筋細胞成熟は、パターン認識受容体および関連したシグナル伝達経路を介して、分化決定された細胞前駆体において成熟の促進または遅延が効果的に制御されうる。
「パターン認識受容体」または「ＰＲＲ」は、病原体および／または細胞損傷に一般的な分子を検出するタンパク質受容体である。これらのタンパク質は、樹状細胞、マクロファージ、単球、好中球、および上皮細胞などの主に先天免疫系の細胞によって発現されている。ＰＲＲは、微生物病原体と関連する、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）、および、細胞が損傷を受ける間または死ぬ間に放出される宿主の細胞成分に関連する、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）を同定するために使われる。ＰＲＲは、ＰＡＭＰおよびＤＡＭＰに対する免疫応答を媒介し、炎症性サイトカインを放出させる。
【０００６】
「病原体関連分子パターン」または「ＰＡＭＰ」は、外因性分子を同定することによって免疫応答を活性化する。ＰＡＭＰの例としては、核酸、細菌性リポ多糖、エンドトキシン、細菌性フラジェリン、リポテイコ酸、ペプチドグリカン、および非メチル化ＣｐＧモチーフが挙げられるが、これらに限定されない。１つまたは複数の外因性分子に対する免疫応答の誘導は、感染の予防または感染からの回復を助けている。「損傷関連分子パターン」または「ＤＡＭＰ」は、宿主分子を同定することによって免疫応答を活性化する。ＤＡＭＰの例としては、細胞の外に放出された核または細胞質ゾルタンパク質、および核酸が挙げられるが、これらに限定されない。
Ｔｏｌｌ様受容体は、ＰＲＲの亜群である。「Ｔｏｌｌ様受容体」または「ＴＬＲ」は、ロイシンリッチ反復配列である共通の構造的モチーフを共有する細胞外膜結合型ＰＰＲの１種である。ＰＡＭＰまたはＤＡＭＰと相互作用するＴＬＲは、ＮＦκＢを通してシグナル伝達を誘発し、その結果、炎症性サイトカインの増加をもたらす。ＴＬＲには、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２、およびＴＬＲ１３が含まれる。「サイトカイン」には、典型的には約５〜約２０ｋＤａの間の、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、および腫瘍壊死因子などの細胞シグナル伝達に関係する広範な種類のタンパク質が含まれる。
【０００７】
「ＮＦκＢ」または「活性化Ｂ細胞の核内因子カッパ軽鎖エンハンサー」は、ＤＮＡの転写、サイトカイン生産、および細胞生存を制御するタンパク質複合体である。ＮＦκＢは、「即応性」の主要な転写因子、すなわち不活性状態で細胞中に存在し、活性化型となるために新たなタンパク質合成を要しない転写因子の部類に属しているため、細胞応答の調節において重要である。ＮＦκＢファミリーのタンパク質は、それらのＮ末端にＲｅｌホモロジードメインを共有している。ＲｅｌＡ、ＲｅｌＢ、およびｃ−Ｒｅｌを含むＮＦ−κＢタンパク質のサブファミリーは、それらのＣ末端にトランス活性化ドメインを有する。対照的に、ＮＦ−κＢ１およびＮＦ−κＢ２タンパク質は、ｐ１０５およびｐ１００の大きな前駆体として合成され、プロセシングを受けて、それぞれ、成熟ＮＦ−κＢサブユニットｐ５０およびｐ５２を生成する。
ＮＦκＢは、ＰＡＭＰおよびＤＡＭＰ、ならびに異種の核酸を含むその他の異種の化合物によって活性化されうる。「活性化剤」とは、酵素の活性を高める物質である。「ＮＦκＢの活性化剤」は、ＮＦκＢの活性を高める物質である。ＮＦκＢの活性化剤は、細胞と相互作用して、限定はされるが、ＴＬＲなどの様々なＰＰＲとの相互作用またはより具体的にはＴＬＲ３との相互作用を含む様々な機序を通してＮＦκＢの活性を高めることができる。「ＴＬＲ３」または「Ｔｏｌｌ様受容体３」は、先天免疫系のＰＲＲのＴｏｌｌ様受容体ファミリーのメンバーである、ＴＬＲ３遺伝子によってコードされている膜貫通型タンパク質である。ＴＬＲ３は、ウイルス感染に関連したｄｓＲＮＡなどの核酸を認識し、ＮＦκＢの活性化を誘導する。下記の実施例に示したように、ＮＦκＢ活性化または阻害は、心筋細胞成熟を促進するまたは遅延させるのに効果的に用いることができる。
【０００８】
心筋細胞成熟の増進または上方調節。
本発明の第１の態様は、前駆細胞のダイレクトリプログラミングによって心筋細胞成熟を増進するまたは上方調節するための組成物および方法である。心筋細胞成熟を増進するまたは上方調節するためのリプログラミング組成物は、（ｉ）ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉｒ−２０６、ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−４９９、ｍｉｒ−４９９５ｐ、およびそれらの組合せに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む１つまたは複数のｍｉＲと、（ｉｉ）ＮＦκＢの活性化剤とを含む。ＮＦκＢの活性化剤は、ＴＬＲ経路アゴニスト、好適にはＴＬＲ３経路アゴニストであってもよい。「ＴＬＲ経路アゴニスト」は、生物学的応答を誘導する、ＴＬＲ受容体またはＴＬＲ経路関連物質と相互作用することができる組成物または物質である。「ＴＬＲ３経路アゴニスト」は、生物学的応答を誘導する、ＴＬＲ３またはＴＬＲ３経路関連物質と相互作用することができる、ＴＬＲ経路アゴニストである。
【０００９】
「ｍｉＲ」、別名「ｍｉＲＮＡ」または「マイクロＲＮＡ」は、典型的には約１５〜約２５の間のヌクレオチドを有するＲＮＡを含む小さな非コードＲＮＡである。一部のｍｉＲは、自身をフォールディングし戻して、ｄｓＲＮＡに似せることができる。ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉｒ−２０６、ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−４９９、ｍｉｒ−４９９−５ｐは、ＮＦκＢを活性化できる可能性がある。ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉｒ−２０６、ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−４９９、ｍｉｒ−４９９−５ｐ、またはそれらの組合せは、ＮＦκＢを活性化するための使用に好適でありうるのだが、本明細書で使用される場合、「ＮＦκＢの活性化剤」としては、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉｒ−２０６、ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−４９９、ｍｉｒ−４９９−５ｐ、またはそれらの任意の組合せは除外する。細胞を心筋細胞および心筋細胞組織へダイレクトリプログラミングするためのｍｉＲの使用は、２０１４年１月９日に公開された米国特許公開第２０１４／００１１２８１号、および米国特許公開第２０１８／００４２９６９号に記載されており、その内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれている。
【００１０】
これらの好ましいオリゴヌクレオチド構築物または構築物の組合せ（およびそれらの対応する成熟型）のヌクレオチド配列を以下に列記する。好例となるオリゴマー化合物（ステムループ前駆体）は、５０〜９０ヌクレオチドの長さ（または、平均長が約７０ヌクレオチドである、５０〜９０ヌクレオチドの範囲内の任意の長さ）の範囲のサイズであり、好例となる成熟オリゴヌクレオチド化合物は、１７〜２５サブユニットの長さであり、例えば、オリゴマー化合物は、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５サブユニットの長さである。例えば、ステムループ前駆体は約７０ヌクレオチドであり、成熟ヌクレオチド生成物は約２２ヌクレオチドの長さである。大文字で書かれていない「ｍｉｒ−」はプレ−ｍｉＲＮＡを指し、一方、大文字で書かれた「ｍｉＲ−」は成熟型を指す。プレ−マイクロＲＮＡは、ステムループ二次構造を含む。
【００１１】
表１：ｍｉＲ
Ｍｍｕ−ｍｉＲ−１
ステムループ（配列番号１）
GCUUGGGACACAUACUUCUUUAUAUGCCCAUAUGAACCUGCUAAGCUAUGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAUUUCAGGC
成熟（配列番号２）
UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU
Ｍｍｕ−ｍｉＲ−１３３ａ
ステムループ（配列番号３）
GCUAAAGCUGGUAAAAUGGAACCAAAUCGCCUCUUCAAUGGAUUUGGUCCCCUUCAACCAGCUGUAGC
成熟（配列番号４）
UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUG
Ｍｍｕ−ｍｉＲ−２０６
ステムループ（配列番号５）
CCAGGCCACAUGCUUCUUUAUAUCCUCAUAGAUAUCUCAGCACUAUGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGGUUUUGG
成熟（配列番号６）
UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGG
Ｍｍｕ−ｍｉＲ−２０８ａ
ステムループ（配列番号７）
UUCCUUUGACGGGUGAGCUUUUGGCCCGGGUUAUACCUGACACUCACGUAUAAGACGAGCAAAAAGCUUGUUGGUCAGAGGAG
成熟（配列番号８）
AUAAGACGAGCAAAAAGCUUGU
ヒトｍｉＲ−１−１
ステムループ（配列番号９）
UGGGAAACAUACUUCUUUAUAUGCCCAUAUGGACCUGCUAAGCUAUGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAUCUCA
ヒトｍｉＲ−１−２
ステムループ（配列番号１０）
ACCUACUCAGAGUACAUACUUCUUUAUGUACCCAUAUGAACAUACAAUGCUAUGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAUUUUUGGUAGGC
ｍｉＲ１両ステムループの成熟配列：（配列番号１１）
UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU
ヒトｍｉＲ−１３３ａ
ヒトｍｉＲ−１３３ａ−１
ステムループ（配列番号１２）
ACAAUGCUUUGCUAGAGCUGGUAAAAUGGAACCAAAUCGCCUCUUCAAUGGAUUUGGUCCCCUUCAACCAGCUGUAGCUAUGCAUUGA
ヒトｍｉＲ−１３３ａ−２
ステムループ（配列番号１３）
GGGAGCCAAAUGCUUUGCUAGAGCUGGUAAAAUGGAACCAAAUCGACUGUCCAAUGGAUUUGGUCCCCUUCAACCAGCUGUAGCUGUGCAUUGAUGGCGCCG
ｍｉＲ１３３ａ両ステムループの成熟配列
（配列番号１４）
UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUG
ヒトｍｉＲ−２０６
ステムループ（配列番号１５）
UGCUUCCCGAGGCCACAUGCUUCUUUAUAUCCCCAUAUGGAUUACUUUGCUAUGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGGUUUCGGCAAGUG
ｍｉＲ−２０６の成熟配列（配列番号１６）
UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGG
ヒトｍｉＲ−２０８ａ
ステムループ（配列番号１７）
UGACGGGCGAGCUUUUGGCCCGGGUUAUACCUGAUGCUCACGUAUAAGACGAGCAAAAAGCUUGUUGGUCA
ｍｉＲ−２０８の成熟配列（配列番号１８）
AUAAGACGAGCAAAAAGCUUGU
ヒトｍｉＲ−１３８−１
ステムループ（配列番号１９）
CCCUGGCAUGGUGUGGUGGGGCAGCUGGUGUUGUGAAUCAGGCCGUUGCCAAUCAGAGAACGGCUACUUCACAACACCAGGGCCACACCACACUACAGG
ヒトｍｉＲ−１３８−２
ステムループ（配列番号２０）
CGUUGCUGCAGCUGGUGUUGUGAAUCAGGCCGACGAGCAGCGCAUCCUCUUACCCGGCUAUUUCACGACACCAGGGUUGCAUCA
ｍｉＲ−１３８−１およびｍｉＲ−１３８−２両方の成熟配列（配列番号２１）
AGCUGGUGUUGUGAAUCAGGCCG
ヒトｍｉＲ−４９９−５ｐ
ステムループ（ＭＭｕ−ｍｉＲ−４９９）（配列番号２２）
GGGUGGGCAGCUGUUAAGACUUGCAGUGAUGUUUAGCUCCUCUGCAUGUGAACAUCACAGCAAGUCUGUGCUGCUGCCU
成熟（Ｍｍｕ−ｍｉＲ−４９９／Ｈｓａ−ｍｉＲ−４９９−５ｐ；配列は保存されている）（配列番号２３）
UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU
ヒトｍｉＲ−ｌ２６
ステムループ（Ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６）（配列番号４２）
CGCUGGCGACGGGACAUUAUUACUUUUGGUACGCGCUGUGACACUUCAAACUCGUACCGUGAGUAAUAAUGCGCCGUCCACGGCA
ｍｉＲ−１２６の成熟配列（配列番号４３）
UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG
ｍｉＲ−１２６−５ｐの成熟配列（配列番号４４）
CAUUAUUACUUUUGGUACGCG
【００１２】
下記の実施例に示したように、高用量のｍｉＲは、正常な細胞機能を害しうる。驚くべきことに、結果として、ｍｉＲを違うＮＦκＢの活性化剤と組み合わせた場合、高用量のｍｉＲによる有害作用なく、心筋細胞成熟を増進させるまたは上方調節することができることがわかった。好適には、細胞と接する１つまたは複数のｍｉＲは、約０．３０ｍＭより少ない量で存在し、好適には約０．２８ｍＭ、０．２６ｍＭ、０．２４ｎＭ、０．２２ｍＭ、０．２０ｍＭ、１．８ｍＭ、１．６ｍＭ、０．１４ｍＭ、０．１２ｍＭ、または０．１０ｍＭ以下の量で存在する。
【００１３】
１つまたは複数のｍｉＲは、好適には、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ１２６、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉｒ２０６、ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−４９９、およびｍｉｒ−４９９−５ｐに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む様々なｍｉＲから選択されうる。好適には、１つまたは複数のｍｉＲは、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ１２６、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉｒ２０６、ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−４９９、およびｍｉｒ−４９９−５ｐに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれより高い配列同一性を有するヌクレオチド配列が含まれうる。好適には、複数のｍｉＲの組合せは、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ１２６、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉｒ２０６、ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−４９９、およびｍｉｒ−４９９−５ｐに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより高い配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する任意の２つの、任意の３つの、または任意の４つのｍｉＲが含まれうる。好適には、該組合せは、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ２０８、およびｍｉｒ−４９９−５ｐに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより高い配列同一性を有する４つのｍｉＲが含まれうる。好適には、該組合せは、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ２０８、およびｍｉｒ−４９９−５ｐから本質的になる４つのｍｉＲが含まれうる。
【００１４】
好適には、１つまたは複数のｍｉＲは、ｍｉｒ１；ｍｉｒ１、ｍｉｒ１３３ａ、およびｍｉｒ２０８；ｍｉｒ１、ｍｉｒ１３３ａ、およびｍｉｒ２０６；ｍｉｒ１、ｍｉｒｌ３３ａ、ｍｉｒ２０８、およびｍｉｒ４９９−Ｓｐ；ｍｉｒ１、ｍｉｒ１３３ａ、ｍｉｒ２０６、およびｍｉｒ４９９−Ｓｐ；ｍｉｒ１およびｍｉｒ１３３；ｍｉｒ１およびｍｉｒ１３８；ｍｉｒ１およびｍｉｒ２０６；ｍｉｒ１およびｍｉｒ２０８；ｍｉｒ１３３およびｍｉｒ１３８；ｍｉｒ１３３およびｍｉｒ２０６；ｍｉｒ１３３およびｍｉｒ２０８；ｍｉｒ１３８およびｍｉｒ２０６；ｍｉｒ１３８およびｍｉｒ２０８；ｍｉｒ２０６およびｍｉｒ２０８；ｍｉｒ１、ｍｉｒ１３８、およびｍｉｒ２０８；ｍｉｒ１、ｍｉｒ２０６、およびｍｉｒ２０８；ｍｉｒ１３８、ｍｉｒ２０６、およびｍｉｒ２０８；ｍｉｒ１、ｍｉｒ１３３、およびｍｉｒ２０６；ｍｉｒ１、ｍｉｒ１３３、およびｍｉｒ２０８；ｍｉｒ１、ｍｉｒ１３８、およびｍｉｒ２０６；ｍｉｒ１３３、ｍｉｒ１３８、およびｍｉｒ２０８；ならびにｍｉｒ１３３、ｍｉｒ１３８、およびｍｉｒ２０６、を含む。ある実施形態において、１つまたは複数のｍｉＲは、ｍｉｒ１；ｍｉｒ１、ｍｉｒ１３３ａ、およびｍｉｒ２０８；ｍｉｒ１、ｍｉｒ１３３ａ、およびｍｉｒ２０６；ｍｉｒ１、ｍｉｒ１３３ａ、ｍｉｒ２０８、およびｍｉｒ４９９−Ｓｐ；ｍｉｒ１、ｍｉｒ１３３ａ、ｍｉｒ２０６、およびｍｉｒ４９９−Ｓｐ；ｍｉｒ１およびｍｉｒ１３３；ｍｉｒ１およびｍｉｒ１３８；ｍｉｒ１およびｍｉｒ２０６；ｍｉｒ１およびｍｉｒ２０８；ｍｉｒ１３３およびｍｉｒ１３８；ｍｉｒ１３３およびｍｉｒ２０６；ｍｉｒ１３３およびｍｉｒ２０８；ｍｉｒ１３８およびｍｉｒ２０６；ｍｉｒ１３８およびｍｉｒ２０８；ｍｉｒ２０６およびｍｉｒ２０８；ｍｉｒ１、ｍｉｒ１３８、およびｍｉｒ２０８；ｍｉｒ１、ｍｉｒ２０６、およびｍｉｒ２０８；ｍｉｒ１３８、ｍｉｒ２０６、およびｍｉｒ２０８；ｍｉｒ１、ｍｉｒ１３３、およびｍｉｒ２０６；ｍｉｒ１、ｍｉｒ１３３、およびｍｉｒ２０８；ｍｉｒ１、ｍｉｒ１３８、およびｍｉｒ２０６；ｍｉｒ１３３、ｍｉｒ１３８、およびｍｉｒ２０８；ならびにｍｉｒ１３３、ｍｉｒ１３８、およびｍｉｒ２０６、から本質的になる。
【００１５】
下記の実施例では、「ｍｉＲ  ｃｏｍｂｏ」とは、ｍｉｒ１、ｍｉｒ１３３ａ、ｍｉｒ２０８、およびｍｉｒ４９９−５ｐの組合せであり、一方、「ｎｅｇｍｉＲ」とは、ＴＬＲ３を標的としないｍｉＲＮＡであり、陰性対照として使用される。
【００１６】
好適には、組成物は、ＴＬＲアゴニストまたはＴＬＲ３アゴニストなどのＮＦκＢの活性化剤を含む。ＴＬＲ３アゴニストは、５’−三リン酸（ｔｒｉｐｈｏｓｐａｔｅ）、２’−フルオロ修飾非線状ＲＮＡなどのＲＮＡ組成物を含んでいてもよい。５’−三リン酸、２’−フルオロ修飾非線状ＲＮＡは、２’−フルオロ修飾ピリミジンまたは２’−フルオロ修飾プリンを含む。２’−フルオロ修飾は、少なくとも１つのピリミジンまたはプリンに存在していてもよく、すべてのピリミジン、すべてのプリン、またはすべてのピリミジンおよびプリンを含む、あらゆる数のピリミジンまたはプリンに存在していてもよい。好適には、２’−フルオロ修飾は、ピリミジンおよび／またはプリンの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％で、またはそれらの間の任意の範囲で存在する。２−フルオロ修飾は、ウリジン、シチジン、グアニン、アデニンに、またはそれらの任意の組合せに存在していてもよい。幾つかの実施形態において、ウリジンのみが２’−フルオロ修飾型である。一実施形態において、ＲＮＡ中のすべてのウリジンは２’−フルオロ修飾型であり、ＲＮＡ中のすべてのシチジンは２’−フルオロ修飾型であり、ＲＮＡ中のすべてのグアニンは２’−フルオロ修飾型であり、ＲＮＡ中のすべてのアデニンは２’−フルオロ修飾型であり、またはそれらの任意の組合せである。５’−三リン酸、２’−フルオロ修飾非線状ＲＮＡは、２０１３年１０月１１日公開の国際公開第２０１８／１８７３２８号に記載されており、その内容は全体として参照により本明細書に組み込まれている。
ＲＮＡ組成物は、硫黄原子でリン酸の非架橋酸素が置換されているホスホロチオエートで修飾されたヌクレオチドを含んでいてもよい。好適には、ホスホロチオエート修飾は、ヌクレオチドの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％で、またはそれらの間の任意の範囲で存在する。ある実施形態において、オリゴヌクレオチドの５’−および／または３’−末端の最後の３〜５ヌクレオチドは、ホスホロチオエート修飾されている。他の実施形態において、オリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオチドは、ホスホロチオエート修飾されている。
【００１７】
ＲＮＡ組成物は、平滑末端ステムループ、５’−オーバーハングを有するステムループ、３’−オーバーハングを有するステムループ、または５’−オーバーハングと３’−オーバーハングの両方を有するステムループを含んでいてもよい。平滑末端ステムループは、相互にハイブリダイズすることができる５’−末端ヌクレオチドと自身の３’−末端相補体とを含み、ステムループを形成する。５’−オーバーハングだけを有するステムループは、自身の相補体とハイブリダイズしてステムループを形成することができる３’−末端ヌクレオチドを含んでいる。３’−オーバーハングだけを有するステムループは、自身の相補体とハイブリダイズしてステムループを形成することができる５’−末端ヌクレオチドを含んでいる。５’−オーバーハングと３’−オーバーハングの両方を有するステムループの場合、５’−末端ヌクレオチドと３’−末端ヌクレオチドはいずれもステムループの一部を形成することはない。
【００１８】
５’−または３’−オーバーハングは、ＲＮＡ組成物が細胞増殖を阻害するまたは細胞死を誘導するのを可能にする、任意の長さであってもよい。好適には、５’−および／または３’−オーバーハングは、約１〜約５０ヌクレオチドの長さでありうる。幾つかの実施形態において、５’−および／または３’−オーバーハングは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ヌクレオチドの長さを含む約１〜約１０ヌクレオチドの長さ、またはそれらの間の任意の長さの範囲である。他の場合において、５’−および／または３’−オーバーハングは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０ヌクレオチドの長さを含む約１０〜約５０ヌクレオチドの長さ、またはそれらの間の任意の長さの範囲である。
ある実施形態において、ＲＮＡ組成物は、複数のステムループを含む。複数のステムループを有するＲＮＡ組成物は、第１のステムループ、第２のステムループ、およびステムループ間のスペーサーを最小限に含む。
【００１９】
ＲＮＡ組成物は、末端ヌクレオチドが自身の相補体とハイブリダイズして第１のステムループ、第２のステムループ、またはその両方を形成するのを可能にするヌクレオチド配列を含んでいてもよい。幾つかの実施形態において、ＲＮＡ組成物は、自身の相補的なヌクレオチドとハイブリダイズして第１または第２のステムループのいずれかを形成することができる５’−三リン酸修飾末端ヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態において、ＲＮＡ組成物は、自身の相補的なヌクレオチドとハイブリダイズしていずれかのステムループを形成することができる３’−末端ヌクレオチドを含む。
ＲＮＡ組成物は、第１のステムループと第２のステムループとのどちらかもしくは両方に関連した５’−または３’−オーバーハングを含んでいてもよい。第１のステムループもしくは第２のステムループに関連した５’−または３’−オーバーハングは、ＲＮＡ組成物が細胞増殖を阻害するまたは細胞死を誘導することを可能にする任意の長さであってもよい。好適には、５’−および／または３’−オーバーハングは、約１〜約５０ヌクレオチドの長さでありうる。幾つかの実施形態において、５’−および／または３’−オーバーハングは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ヌクレオチドの長さを含む約１〜約１０ヌクレオチドの長さ、またはそれらの間の任意の長さの範囲である。他の場合において、５’−および／または３’−オーバーハングは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ヌクレオチドの長さを含む約１０〜約５０ヌクレオチドの長さ、またはそれらの間の任意の長さの範囲である。
【００２０】
スペーサーは、マルチステムループ組成物においてステムループを連結する。幾つかの実施形態において、スペーサーは、ｓｓＲＮＡのセグメント、ｄｓＲＮＡのセグメント、またはそれらの組合せを含む。ｄｓＲＮＡセグメントは、第２のヌクレオチド配列と完全にまたは部分的にハイブリダイズした、第１のヌクレオチド配列のセグメントのセグメントを含んでいてもよい。部分的なハイブリダイゼーションのみを有するスペーサーは、スペーサーに沿った相補的なヌクレオチド間でヌクレオチド対形成を妨げる、任意の数のヌクレオチド対ミスマッチを有していてもよい。好ましくは、スペーサーは、生理的条件下で熱力学的にまたは動力学的に安定が保たれている。場合によって、ステムループは、１、２、３、４、５、またはそれより多いヌクレオチド対ミスマッチを有する。
スペーサーは、実質的にＩＦＮ生産を誘導せず細胞傷害性の利点を提供する任意の好適な長さであってもよい。好適には、スペーサーの長さは、ｓｓＲＮＡセグメントに沿った約５〜約１００の間のヌクレオチド、ｄｓＲＮＡセグメントに沿ってハイブリダイズしたもしくはミスマッチした約５〜約１００の間のヌクレオチド対、またはそれらの組合せを含みうる。幾つかの実施形態において、スペーサーの長さは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０ヌクレオチドの長さを含む約５〜約５０ヌクレオチド、またはそれらの間の任意の長さの範囲である。
【００２１】
幾つかの実施形態において、スペーサーは、二次構造に関連していない。他の実施形態において、スペーサーは、二次構造と関連している。構造化されたスペーサーは、ステムループを含むことがあり、これによって、少なくとも第３のステムループを含むＲＮＡ組成物が生成される。第３のステムループは、ヌクレオチドの完全または部分的なハイブリダイゼーションから形成され、ヘアピン構造モチーフを生成しうる。ステムループは、約５〜約３０または約８〜約２５の間の任意の数のヌクレオチド対形成を含む、任意の好適な数のヌクレオチド対形成から形成されていてもよい。ある実施形態において、ステムループは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０ヌクレオチド対形成、またはそれらの間の任意の数のヌクレオチド対形成を含む。部分的なハイブリダイゼーションのみを有するステムループは、ステムループが生理的条件下で安定を保っている限りステムに沿った相補的ヌクレオチド間のヌクレオチド対形成を妨げる、任意の数のヌクレオチド対ミスマッチを有していてもよい。場合によって、ステムループは、１、２、３、４、もしくは５ヌクレオチド対ミスマッチ、またはそれらの間の任意の範囲のヌクレオチド対ミスマッチを有する。
【００２２】
好例となるＲＮＡオリゴヌクレオチドを表２に示す。２’Ｆピリミジン含有５’ｐｐｐ  ＲＮＡを含む免疫原性がん細胞死滅ＲＮＡ（ＩＣＲ）と呼ぶＲＮＡ組成物を設計し、５’ｐｐｐと、様々な長さの３’−オーバーハング型ヘアピン（ＩＣＲ１、ＩＣＲ１Ａ、ＩＣＲ１Ｂ、ＩＣＲ１Ｃ）、平滑末端型ヘアピン（ＩＣＲ２−３、ＩＣＲ２、ＩＣＲ２Ａ、ＩＣＲ２Ｂ）、５’オーバーハング型ヘアピン（ＩＣＲ３、ＩＣＲ３Ａ、ＩＣＲ３Ｂ、ＩＣＲ３Ｃ）、複数のステムループを含むｓｓＲＮＡ（ＩＣＲ４、ＩＣＲ４Ａ）、および複数のステムループを含むｄｓＲＮＡ（ＩＣＲ５、ＩＣＲ５ＸとＩＣＲ５Ｙとのハイブリダイゼーションから形成される）などの様々な予想される二次構造とを含有するように生成した。線状５’ｐｐｐ  ｓｓＲＮＡ（ＩＣＲ−Ｌ）および長いｄｓＲＮＡ（ｐＩＣ）もまた、比較のために生成した。当業者には明らかなように、ＩＣＲ１、ＩＣＲ１Ａ、ＩＣＲ１Ｂ、ＩＣＲ１Ｃ、ＩＣＲ２Ａ、ＩＣＲ２Ｂ、ＩＣＲ３、ＩＣＲ３Ａ、ＩＣＲ３Ｂ、ＩＣＲ３Ｃ、ＩＣＲ４、ＩＣＲ４Ａ、ＩＣＲ５Ｘ、およびＩＣＲ５Ｙは各々、ＩＣＲ２のオリゴヌクレオチド配列を含む。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
幾つかの実施形態において、ＲＮＡ組成物は、ステムループを形成することができるオリゴヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態において、ＲＮＡ組成物は、ＩＣＲ２に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドの完全なまたは部分的なハイブリダイゼーションから形成された、１つまたは複数のステムループを含む。特定の実施形態において、ＲＮＡ組成物は、ＩＣＲ２に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドの完全なまたは部分的なハイブリダイゼーションから形成された、１つまたは複数のステムループを含む。ＲＮＡ組成物はまた、ＩＣＲ２に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドの完全なまたは部分的なハイブリダイゼーションから形成された、１つまたは複数のステムループから本質的になっていてもよい。
【００２５】
幾つかの実施形態において、ＲＮＡ組成物は、ＩＣＲ１、ＩＣＲ１Ａ、ＩＣＲ１Ｂ、ＩＣＲ１Ｃ、ＩＣＲ２Ａ、ＩＣＲ２Ｂ、ＩＣＲ３、ＩＣＲ３Ａ、ＩＣＲ３Ｂ、ＩＣＲ３Ｃ、ＩＣＲ４、ＩＣＲ４Ａ、ＩＣＲ５Ｘ、またはＩＣＲ５Ｙに対して少なくとも５０％の配列同一性を有する、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、ＲＮＡ組成物は、ＩＣＲ１、ＩＣＲ１Ａ、ＩＣＲ１Ｂ、ＩＣＲ１Ｃ、ＩＣＲ２Ａ、ＩＣＲ２Ｂ、ＩＣＲ３、ＩＣＲ３Ａ、ＩＣＲ３Ｂ、ＩＣＲ３Ｃ、ＩＣＲ４、ＩＣＲ４Ａ、ＩＣＲ５Ｘ、またはＩＣＲ５Ｙのいずれかに対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを含む。ＲＮＡ組成物はまた、ＩＣＲ１、ＩＣＲ１Ａ、ＩＣＲ１Ｂ、ＩＣＲ１Ｃ、ＩＣＲ２Ａ、ＩＣＲ２Ｂ、ＩＣＲ３、ＩＣＲ３Ａ、ＩＣＲ３Ｂ、ＩＣＲ３Ｃ、ＩＣＲ４、ＩＣＲ４Ａ、ＩＣＲ５Ｘ、またはＩＣＲ５Ｙのいずれかに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドから本質的になっていてもよい。
【００２６】
幾つかの実施形態において、ＮＦκＢの活性化剤は、ＲＮＡ生成物以外の物質であってもよい。好適には、ＮＦκＢの活性化剤は、微生物（例えば、細菌またはウイルス）、微生物生成物（例えば、細菌生成物またはウイルス生成物）、サイトカイン、酸化ストレッサー、物理的ストレッサー、治療的に使用される薬物、修飾タンパク質、過剰発現させたタンパク質、過剰発現させたリガンド、アポトーシスメディエーター、マイトジェン、増殖因子、ホルモン、生理学的メディエーター、化学薬品であってもよい。好例となるＮＦκＢの活性化剤は、Pahl, H.L., Oncogene(1999)18, 6853-6866に記載されており、これは全体として参照により本明細書に組み込まれている。
ＴＬＲ経路アゴニストは、リプログラミング培地をさらに含んでもよい。リプログラミング培地は、体細胞をリプログラミングする、例えば線維芽細胞を心筋細胞へリプログラミングする量において、基本組織培養培地、インスリン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ）、またはアスコルビン酸を含む。リプログラミング培地は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはＬ−グルタミンをさらに含んでいてもよい。体細胞をリプログラミングする量のインスリン−トランスフェリン−セレンは、インスリンが１０ナノモル〜１０マイクロモルの量（例えば１００ｎＭ）で存在すること、トランスフェリンが１リットル当たり０．００２〜１グラムの量（例えば０．０５５ｇ／ｌ）で存在すること、およびセレンが１リットル当たり１〜１００μｇの量（例えば１リットル当たり６．７μｇ）で存在することを特徴とする。任意に、該培地は、０．２ｍＭ〜２０ｍＭ  Ｌ−グルタミン（例えば２ｍＭ）を含んでもよい。該培地はまた、例えば１００〜５００μＭといった、５０μＭ〜５０ミリモルのアスコルビン酸を、例えば２５０μＭアスコルビン酸を含んでもよい。細胞を心筋細胞および心筋細胞組織へダイレクトリプログラミングするためのリプログラミング培地の使用は、米国特許公開第２０１８／００４２９６９号に記載されており、その内容は全体として参照により本明細書に組み込まれている。
【００２７】
リプログラミング組成物は、１つまたは複数のリプログラミング効率向上分子を含んでいてもよい。「リプログラミング効率向上分子」は、心筋細胞への変換の効率を高めるのに好適な分子である。好例となるリプログラミング効率向上分子には、バルプロ酸、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、ヤヌスタンパク質チロシンキナーゼ（ＪＡＫ）阻害剤１、ＲＧ１０８、Ｒ（＋）Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４、ＰＳ４８、およびＡ８３−０１が含まれる。これらの薬剤は、対象に、ＴＬＲ経路アゴニストを送達する前に、後に、またはＴＬＲ経路アゴニストと一緒に、送達される（例えば、注入または注射される）。
リプログラミング組成物は、細胞質送達剤を含んでいてもよい。「細胞質送達剤」とは、膜を横切って、分子を、好適には核酸を輸送する薬剤である。好例となる細胞質送達剤には、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴなどのトランスフェクション剤、リポソーム、合成ポリマー、細胞透過性ペプチド、ナノ粒子、ウイルス粒子、エレクトロポレーション緩衝液、ヌクレオフェクション試薬、またはそれらの任意の組合せが含まれるが、これらだけに限定されない。
【００２８】
心筋細胞成熟を増進するまたは上方調節する方法は、細胞が心筋細胞へとリプログラミングされるような十分な時間、細胞を有効量の記載の組成物のいずれかと接触させることを含む。好適には、細胞は、線維芽細胞、例えば心臓線維芽細胞もしくは真皮線維芽細胞であり、かつ／または心臓線維性組織を含む。
対象において心筋細胞成熟を増進するまたは上方調節する方法は、有効量の記載の組成物のいずれかまたは記載の医薬組成物のいずれかを投与することを含む。好適には、対象は、症状を軽減するために、結果として生じる症状の原因作用を一時的または永続的に排除するために、かつ／または心臓線維性組織の結果として生じる症状の出現を予防するもしくは遅らせるまたは進行もしくは重症度を後退させるために、心筋細胞成熟を増進するまたは上方調節することを必要としている。好適には、細胞は、線維芽細胞、例えば心臓線維芽細胞もしくは真皮線維芽細胞であり、かつ／または心臓線維性組織を含む。
【００２９】
心筋細胞成熟の阻害または下方調節
本発明の別の態様は、心筋細胞成熟を阻害するまたは下方調節するための組成物および方法である。心筋細胞成熟を阻害するまたは下方調節するための組成物は、ＴＬＲ阻害剤、ＮＦκＢ阻害剤、ｉｋｂｋｂ阻害剤、またはそれらの任意の組合せを含む。
「ＴＬＲ阻害剤」は、生物学的応答を遮断するまたは弱める、ＴＬＲ受容体と特異的に相互作用することができる組成物または物質である。ＴＬＲ阻害剤は、ＴＬＲ３阻害剤であってもよい。好適には、ＴＬＲ阻害剤は、ＴＬＲアンタゴニストでありうる。「ＴＬＲ経路アンタゴニスト」は、生物学的応答を遮断するまたは弱める、ＴＬＲ受容体またはＴＬＲ経路関連物質と相互作用することができる組成物または物質である。「ＴＬＲ３経路アンタゴニスト」は、生物学的応答を遮断するまたは弱める、ＴＬＲ３またはＴＬＲ３経路関連物質と相互作用することができるＴＬＲ経路アンタゴニストである。好例となるＴＬＲまたはＴＬＲ３阻害剤には、ＣＵ−ＣＰＴ−４ａ、またはＴＬＲタンパク質の翻訳に干渉するｓｉＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない。
「ＮＦκＢ阻害剤」は、生物学的応答を遮断するまたは弱める、ＮＦκＢと特異的に相互作用することができる組成物または物質である。好例となるＮＦκＢ阻害剤には、Ｂａｙ  １１−７０８５、またはＲｅｌＡなどのＮＦκＢタンパク質の翻訳に干渉するｓｉＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない。
【００３０】
「ｉｋｂｋｂ阻害剤」または「ＮＦκＢキナーゼサブユニットベータの阻害剤」は、生物学的応答を遮断するまたは弱める、ｉｋｂｋｂと特異的に相互作用することができる組成物もしくは物質、またはｉｋｂｋｂタンパク質の翻訳に干渉するｓｉＲＮＡである。
好適には、ＴＬＲ阻害剤は、ＴＬＲ３阻害剤、例えば、ＴＬＲ３活性化および／またはシグナル伝達を遮断することができる、抗体、ｓｈＲＮＡ低分子、またはその他の競合阻害剤である。好適には、ＴＬＲ阻害剤は、実施例で使用したＣＵ−ＣＰＴ−４ａなどのＴＬＲ３阻害剤である。
好適には、組成物は、細胞質送達剤、細胞用培地、またはそれらの任意の組合せをさらに含みうる。
心筋細胞成熟を阻害するまたは下方調節する方法は、細胞において心筋細胞成熟が阻害されるまたは下方調節されるような十分な時間、細胞を有効量の記載の組成物のいずれかと接触させることを含む。好適には、細胞は、線維芽細胞、例えば心臓線維芽細胞もしくは真皮線維芽細胞であり、かつ／または心臓線維性組織を含む。
【００３１】
医薬組成物
本明細書において開示した方法において利用される組成物は、（ａ）治療的有効量の、本明細書において開示したような１つまたは複数の化合物と（ｂ）１つまたは複数の薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤とを含む医薬組成物として、製剤化してもよい。医薬組成物は、約０．５〜５００ｍｇまたは約１〜１００ｍｇなど、約０．１〜２０００ｍｇの範囲の本明細書において開示したような１つまたは複数の化合物を含んでいてもよい。医薬組成物は、約０．５〜２０ｍｇ／ｋｇ体重または約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重など、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の１日量で化合物を提供するように投与してもよい。幾つかの実施形態において、医薬組成物を患者に投与した後（例えば、投与の約１、２、３、４、５、または６時間後）。作用部位における化合物の濃度は、該作用部位において少なくとも一部の細胞が心筋細胞へ成熟したまたは成熟することとなる場合、組成物の有効量である。
本明細書において開示した方法において利用される化合物は、担体を含む医薬組成物として製剤化してもよい。例えば、担体は、タンパク質、炭水化物、糖、タルク、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、炭酸カルシウム、およびデンプン−ゼラチンペーストからなる群から選択されうる。
【００３２】
本明細書において開示した方法において利用される化合物は、１つまたは複数の結合剤、充填剤、潤滑剤、懸濁化剤、甘味料、香味料、防腐剤、緩衝液、湿潤剤、崩壊剤、および発泡剤を含む医薬組成物として製剤化してもよい。
好適な希釈剤は、微結晶セルロース、ラクトース、第二リン酸カルシウム、サッカライド、および前記のいずれかの混合物などの、薬学的に許容される不活性充填剤を含んでいてもよい。
本明細書において開示した方法において利用される化合物は、任意の好適な経路を経る送達のための医薬組成物として製剤化してもよい。例えば、医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所性、および経肺経路によって投与してもよい。
本明細書において開示した方法において利用される化合物は、当技術分野で周知の従来手順に従って、有効成分を標準的な医薬担体または希釈剤と組み合わせることによって調製された従来の剤形で投与してもよい。
該化合物を含む医薬組成物は、任意の適切な経路による投与、例えば、経口（頬側または舌下を含む）、直腸、経鼻、局所（頬側、舌下、または経皮を含む）、膣、または非経口（皮下、筋肉内、静脈内、または皮内を含む）経路による投与に適合させてもよい。そのような製剤は、薬学の技術分野で既知の任意の方法によって、例えば、有効成分を担体または賦形剤と会合させることによって調製してもよい。
【００３３】
経口投与に適合させた医薬組成物は、カプセル剤もしくは錠剤；散剤もしくは顆粒剤；水性もしくは非水性液体の、水薬もしくは懸濁剤；食用泡もしくはホイップ；または水中油液体乳剤もしくは油中水液体乳剤などの、個別の単位として提供してもよい。
経皮投与に適合させた医薬組成物は、長期間、レシピエントの表皮に密着させたままにすることが意図された個別の貼付剤として提供してもよい。例えば、有効成分は、イオントフォレーシスによって貼付剤から送達してもよい。
非経口投与に適合させた医薬組成物には、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、および製剤を所期のレシピエントの血液と等張にする溶質を含有しうる、水性および非水性滅菌注射液；ならびに、懸濁化剤および増粘剤を含みうる、水性および非水性滅菌懸濁剤が含まれる。製剤は、単位用量または多回用量の容器、例えば密封したアンプルおよびバイアルで提供してもよく、使用直前に、例えば注入用の水などの滅菌液体担体の添加のみ必要となる、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ））状態で保管してもよい。即時調合注射液および懸濁剤を、滅菌した散剤、顆粒剤、および錠剤から調製してもよい。
【００３４】
本明細書において開示した組成物および方法は、医薬組成物として投与してもよく、したがって、化合物を包含する医薬組成物は、本明細書において開示した組成物の実施形態であるとみなされる。そのような組成物は、薬学的に許容されるあらゆる物理的形態をとることができ、例として、そのような組成物によって医薬組成物の経口投与が可能となる。そのような医薬組成物は、有効量の開示の化合物を含有する。ここで有効量とは、投与されるべき化合物の１日量に関する。各投与単位は、所与の化合物の１日量を含んでいてもよく、または各投与単位は、１日量の２分の１もしくは３分の１など、１日量の一部だけを含んでいてもよい。各投与単位に含まれるべき各化合物の量は、部分的には、治療のために選択された特定の化合物および所与の指標などのその他の因子が何であるかによって決定されうる。本明細書において開示した医薬組成物は、周知の手順を用いることによって、患者に投与した後、有効成分の迅速、徐放、または遅延放出が可能となるように製剤化してもよい。
【００３５】
本明細書において開示した方法に従って使用される化合物は、単一の組成物または化合物の組合せとして投与してもよい。例えば、心筋細胞成熟のための組成物は、単一化合物として、または心筋細胞成熟のための別の化合物もしくは異なる薬理学的活性を有する別の化合物と組み合わせて投与してもよい。
上記で指摘したように、化合物の薬学的に許容される塩が、企図され、また開示した方法において利用されうる。「薬学的に許容される塩」という用語は、本明細書で使用される場合、生体に対して実質的に非毒性である化合物の塩を指す。典型的な薬学的に許容される塩には、本明細書において開示したような化合物と、薬学的に許容される鉱物または有機酸または有機もしくは無機塩基との反応によって調製されたこれらの塩が含まれる。そのような塩は、酸付加および塩基付加塩として既知である。当業者の読者であれば、本明細書において開示したような化合物のほとんどまたはすべてが塩を形成することができること、および、製薬の塩形態は遊離酸または塩基よりも容易に結晶化され精製されることが多いため一般的に使用されることを、理解するであろう。
酸付加塩を形成するために一般的に使用される酸には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸などの無機酸、およびｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、ｐ−ブロモフェニルスルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸などの有機酸が含まれうる。好適な薬学的に許容される塩の例としては、硫酸塩、ピロ硫酸塩、硫酸水素塩、亜硫酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、一水素リン酸塩、二水素リン酸塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、ブロミド、ヨード、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、塩酸塩、二塩酸化合物、イソ酪酸塩、カプロン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオラート、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン−１，４−ジオアート、ヘキシン−１，６−ジオアート、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、キシレンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、アルファ−ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン−１−スルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩、マンデル酸塩などを挙げることができる。
【００３６】
塩基付加塩には、アンモニウムまたはアルカリもしくはアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩などの無機塩基からの誘導体が含まれる。そのような塩の調製において有用な塩基には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウムなどが含まれる。
本明細書において開示した化合物のうちの任意の塩の一部を形成する特定の対イオンは、全体としての塩が薬理学的に許容される限り、かつ、対イオンが全体としての塩に対して望ましくない特性をもたらさない限り、化合物の活性に対して重大である必要はない。望ましくない特性には、望ましくない溶解度または毒性が含まれうる。
化合物の薬学的に許容されるエステルおよびアミドもまた、本明細書において開示した組成物および方法において使用することができる。好適なエステルの例としては、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、ドテシルエステル、ベンジルエステルなどのアルキル、アリール、およびアラルキルエステルが挙げられる。好適なアミドの例としては、メチルアミド、ジメチルアミド、メチルエチルアミドなどの非置換アミド、一置換アミド、および二置換アミドが挙げられる。
【００３７】
また、本明細書において開示した方法は、化合物、またはそれらの塩、エステル、および／もしくはアミドの溶媒和物形態を使用して実行してもよい。溶媒和物形態には、エタノール溶媒和物、水和物などが含まれうる。
対象
本明細書で使用される場合、「対象」は、「患者」または「個体」と交換可能であり、動物を意味し、治療を必要とするヒトまたは非ヒト動物であってもよい。「治療を必要とする対象」には、本明細書において開示した組成物を用いる治療に対して応答性の疾患、障害、または状態を有する対象が含まれうる。例えば、「治療を必要とする対象」には、アテローム性動脈硬化症などの心臓血管系疾患を有する対象、または心筋梗塞に罹患したことがある対象が含まれうる。
【００３８】
治療の方法
本明細書で使用される場合、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療すること（ｔｏ  ｔｒｅａｔ）」という用語はいずれも、症状を軽減し、結果として生じる症状の原因作用を一時的または永続的に排除すること、および／または指定の疾患または障害の結果として生じる症状の出現を予防するもしくは遅らせるまたは進行もしくは重症度を後退させることを意味する。したがって、本明細書において開示した方法は、治療的および予防的投与の両方を包含する。
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、対象への単回または多回投与において、診断または治療下で対象において所望の効果をもたらす、化合物の量または用量を指す。開示した方法は、有効量の、心筋細胞成熟を誘導するまたは心筋細胞成熟を阻害するための開示された組成物（例えば、医薬組成物中に存在するものとしての）を投与することを含んでもよい。
有効量は、既知の技術を使用することによって、かつ類似の状況下で得られた結果を観察することによって、当業者としての担当の診断専門医によって容易に決定されうる。投与する化合物の有効量または用量の決定に際して、担当の診断専門医は、対象の種；対象の大きさ、年齢、および全般的な健康状態；関係した疾患または障害の、併発の程度または重症度；対象個々の反応；投与する特定の化合物；投与の方法；投与する製剤のバイオアベイラビリティ特性；選択する用量レジメン；併用薬剤の使用；ならびにその他の関連する状況などの、幾つかの因子を考慮することができる。
【００３９】
典型的な１日量には、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ（約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇおよび／または約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇなど）の本治療方法において使用される各化合物が含まれうる。
組成物は、各化合物を個々に約１〜約５００ｍｇ含有する単位剤形で、または約５〜約３００ｍｇ、約１０〜約１００ｍｇ、および／もしくは約２５ｍｇなどの単回単位剤形で製剤化してもよい。「単位剤形」という用語は、患者用の単位投与量として好適な物理的に分離した単位を指し、各単位は所望の治療効果を生み出すように計算された所定量の活性物質を、好適な医薬担体、希釈剤、または賦形剤と併せて含有する。
【実施例】
【００４０】
（実施例）心筋細胞成熟にはＴＬＲ３活性化ＮＦκＢが必要である
ＴＬＲ３阻害が心筋細胞成熟を遮断したことを実証する；心筋細胞系列に分化決定された前駆細胞は、成熟遺伝子を発現することができず、サルコメアは発生しなかった。ＴＬＲ３の心筋細胞成熟に対する作用は、ＮＦκＢのＲｅｌＡサブユニットに依存したことを確証するものである。重要なことには、成熟心筋細胞の発達を促進する条件下では、ＮＦκＢが心筋細胞成熟遺伝子のプロモーターにおいて著しく濃縮した。さらに、ＴＬＲ３−ＮＦκＢ経路の活性化によって心筋細胞成熟が増進された。したがって、本研究は、ＴＬＲ３−ＮＦκＢ経路が、成熟心筋細胞へ分化決定された前駆体の成熟に不可欠であることを実証するものである。
緒言
心筋細胞は、心臓の必須構成成分である。遺伝子操作によって、異常な心臓形態形成を生じさせることができ、通常、その結果、胚致死性となる。この胚致死性は、出生前に診断するのは難しく、前駆体が心臓系列への分化を決定し、十分に機能的な心筋細胞へ成熟する過程を理解することを制限している。この障害のため、多くの研究者が培養皿の中での心筋細胞発達を繰り返すことに従事してきた。リプログラミング戦略を含む様々な方法が用いられている［１〜８］［９〜１４］。
【００４１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのモデリングによって、心筋細胞発達には、開始期および成熟期の２つの段階があることが示唆されている［１５〜１８］。心筋細胞発達の開始期では、前駆細胞は、幾つかのいわゆるパイオニア転写因子を最初に発現する。これらのパイオニア転写因子は、顕著なエピジェネティックなリモデリングを誘導し、前駆体表現型が発現抑制され、心筋細胞系列への分化決定に不可欠な様々な遺伝子が活性化される。パイオニア転写因子は、Ｇａｔａ４、Ｔｂｘ５、Ｍｅｆ２Ｃ、およびＨａｎｄ１が同定されており、その複合発現が心筋細胞系列への最初の分化決定に不可欠である［１６］。心筋細胞発達の開始期における重要なエピジェネティックな機序は、ヒストンのメチル化である。Ｈ３Ｋ４がメチル化されるのに対し［１９］、Ｈ３Ｋ２７は脱メチル化される［１４］。これらのエピジェネティック修飾は、協調して作用して、心筋細胞系列への分化決定を安定させるのに不可欠な数多くの遺伝子を活性化し、抑制する。心筋細胞発達の開始期における段階はよく知られているのに対して、心筋細胞成熟の過程は詳しく研究されていない。
近年、２つの研究で、ＴＬＲ３が線維芽細胞のｉＰＳ［２０］および内皮細胞［２１］へのリプログラミングに重要であることが示された。具体的には、ＴＬＲ３の活性化は、ＤＮＡアクセシビリティを促進するエピジェネティックモディファイヤーの発現および活性、ならびに表現型の可変性における全般的変化を引き起こす。興味深いことに、ＴＬＲ３は炎症反応において役割を果たしており、また、炎症は損傷に対する心臓応答において主要な役割を果たしていることは既知である［２２、２３］。本明細書では、心筋細胞成熟にはＴＬＲ３活性化ＮＦκＢが必要であることを示す。心筋細胞系列に分化決定された前駆細胞は、ＴＬＲ３阻害剤またはＴＬＲ３ノックダウンによって、心筋細胞への成熟が妨げられた。さらなる実験によって、ＴＬＲ３はＮＦκＢを介して心筋細胞成熟を制御したことが実証される。ＮＦκＢの薬理学的阻害、およびＮＦκＢを活性化するＩｋｂｋｂ（核内因子カッパＢキナーゼの阻害剤）のノックダウンによって、心筋細胞成熟は妨げられた。さらに、心筋細胞形成を誘導する条件によって、ＮＦκＢが心筋細胞成熟遺伝子のプロモーターへ結合することが誘導された。さらに、マイクロＲＮＡがＴＬＲ３を活性化することがわかった。
【００４２】
材料および方法
化学製品：ＴＬＲアゴニストは、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎから購入した（マウスＴＬＲ１−９アゴニストキット、ｔｌｒｌ−ｋｉｔ１ｍｗ）。ＴＬＲ３アンタゴニストＣＵ−ＣＰＴ−４ａ、ＮＦκＢアンタゴニストＢａｙ  １１−７０８５、およびＡＰ１アンタゴニストＳＲ  １１３０２は、Ｔｏｃｒｉから購入した。
【００４３】
マイクロＲＮＡトランスフェクション：マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）新生仔心臓線維芽細胞を、Ｊａｙａｗａｒｄｅｎａらが略述した方法［１０］に従って２日齢マウス新生仔から分離した。分離後、線維芽細胞を、１５％ｖ／ｖ  ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｈｙｃｌｏｎｅウシ胎仔血清、カタログ番号  ＳＨ３００７１．０３、ロット番号  ＡＸＫ４９９５２）、および１％ｖ／ｖペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号  １５１４０−１２２、１００ユニットペニシリン、１００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシン）を補充したＤＭＥＭ（ＡＴＣＣ、カタログ番号  ３０−２００２）含有増殖培地で培養した。線維芽細胞が７０〜８０％コンフルエントに達すると、直ちに０．０５％ｗ／ｖトリプシン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号  ２５３００−０５４）を使用して細胞を継代した。新たに分離した線維芽細胞を、継代０と表示した。実験は、継代２の細胞を用いて行った。すべての実験について、細胞を５０００細胞／ｃｍ2で増殖培地に播種した。２４時間後、細胞を、トランスフェクション試薬（Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔ−Ｉ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）だけで、トランスフェクション試薬＋非標的マイクロＲＮＡ（ｎｅｇｍｉＲ）で、またはトランスフェクション試薬＋我々の既報の心臓リプログラミングマイクロＲＮＡの組合せ［９］（ｍｉＲ  ｃｏｍｂｏ、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−４９９）でトランスフェクトした。
【００４４】
ｑＰＣＲ：全ＲＮＡを、製造業者の使用説明書に従ってＱｕｉｃｋ−ＲＮＡ  ＭｉｎｉＰｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して抽出した。全ＲＮＡ（５０ｎｇ〜１００ｎｇ）は、大容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してｃＤＮＡに変換した。ｃＤＮＡを、ＦＡＭ結合遺伝子特異的プライマーおよびＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を含む標準的なｑＰＣＲ反応で使用した。ｑＰＣＲ用に以下のプライマーを使用した：Ｇａｐｄｈ（Ｍｍ９９９９９９１５＿ｍ１）、Ｔｎｎｉ３（Ｍｍ００４３７１６４＿ｍ１）、Ａｃｔｎ２（Ｍｍ００４７３６５７＿ｍ１）、Ｍｙｈ６（Ｍｍ００４４０３５９＿ｍ１）、Ｃａｃｎａ１ｃ  （Ｍｍ００４３７９１７＿ｍ１）、Ｍｅｆ２Ｃ（Ｍｍ０１３４０４８２＿ｍ１）、Ｔｂｘ５（Ｍｍ００８０３５１８＿ｍ１）、Ｇａｔａ４（Ｍｍ００４８４６８９＿ｍ１）、および  Ｈａｎｄ２（Ｍｍ００４３９２４７＿ｍ１）。
免疫蛍光法：細胞は、既述のように［２４］、２％ｖ／ｖパラホルムアルデヒド（ＥＭＳ）で固定した。固定した細胞を、抗体緩衝液（５％ｗ／ｖ  ＢＳＡ、０．ｌ％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ−２０、ＰＢＳ中）で、室温で１時間、ブロッキングした。ブロッキングした後、細胞を、抗体緩衝液中で、α−サルコメアアクチニン抗体（Ｓｉｇｍａ、Ａ７８１１、１：１００）と共に、４℃で一晩、インキュベートした。一晩インキュベートした後、細胞を抗体緩衝液で３回洗浄した。洗浄後、細胞を、抗体緩衝液で１：５００希釈したＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ結合二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ヤギ抗マウス５９４ｎｍ）と共に、室温で１時間、インキュベートした。核は、抗体緩衝液中で、室温で３０分間、１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩで染色した。ＰＢＳで洗浄して未結合の複合体を除去した後、免疫蛍光を、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ２００倒立顕微鏡を使用して測定した。
【００４５】
ｓｉＲＮＡノックダウン：ｓｉＲＮＡプール（４種の遺伝子標的ｓｉＲＮＡ）および陰性対照ｓｉＲＮＡを、Ｄｈａｒｍａｃｏｎから購入した。ｓｉＲＮＡを、ヌクレアーゼフリーの水で２０μＭにし、分注し、使用するまで−８０℃に保管した。トランスフェクションの１日前に、線維芽細胞を、１２ウェルプレートへウェル当たり２０，０００細胞で播種した。トランスフェクションの当日に、ｓｉＲＮＡを、ヌクレアーゼフリーの水で５μＭに希釈した。各ウェルについて、ｓｉＲＮＡ作業液５μｌをＯｐｔｉｍｅｍ−Ｓｅｒｕｍ  Ｆｒｅｅ培地９５μｌで希釈した。別のチューブで、Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔ−Ｉ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）５μｌをＯｐｔｉｍｅｍ−Ｓｅｒｕｍ  Ｆｒｅｅ培地９５μｌで希釈した。５分間インキュベートした後、２つの液を混合した。２０分後、抗生物質欠失完全培地（８００μｌ）を加え、トランスフェクション複合体を細胞に加えた。
【００４６】
ＣｈＩＰアッセイ：ＣｈＩＰアッセイは、製造業者の使用説明書に従って実行した（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ＳｉｍｐｌｅＣｈＩＰ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ＩＰ  ｋｉｔ  ＃９００３）。新生仔心臓線維芽細胞核を、４×１０6細胞当たり０．１ｕｌ小球菌ヌクレアーゼで消化した（小球菌ヌクレアーゼの量は、製造業者の使用説明書に従って経験的に決定した）。免疫沈降は、ＣｈＩＰ検証済み抗体：（１）ウサギＩｇＧ対照（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃２７２９）、（２）Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃４６２０）、および（３）ＲｅｌＡ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃８２４２）を使用して行った。免疫沈降したＤＮＡを、Ｍｙｈ６（Ｑｉａｇｅｎ、ＥｐｉＴｅｃｔ  ＣｈＩＰ  ｑＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｆｏｒ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｙｈ６、ＮＭ＿０１０８５６．３（−）０８Ｋｂ  ＃ＧＰＭ１０４５７３３（−）０８ＡおよびＥｐｉＴｅｃｔ  ＣｈＩＰ  ｑＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｆｏｒ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｙｈ６、ＮＭ＿０１０８５６．３（−）０１Ｋｂ  ＃ＧＰＭ１０４５７３３（−）０１Ａ）、Ａｃｔｎ２（Ｑｉａｇｅｎ、ＥｐｉＴｅｃｔ  ＣｈＩＰ  ｑＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｆｏｒ  Ｍｏｕｓｅ  Ａｃｔｎ２、ＮＭ＿０３３２６８．３（−）０１Ｋｂ、＃ＧＰＭ１０４４７８１（−）０１Ａ）、およびＴｎｎｉ３（Ｑｉａｇｅｎ、ＥｐｉＴｅｃｔ  ＣｈＩＰ  ｑＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｆｏｒ  Ｍｏｕｓｅ  Ｔｎｎｉ３、ＮＭ＿００９４０６．３（−）０１Ｋｂ、＃ＧＰＭ１０５２５９３（−）０１Ａ）のプロモーターのためのプライマーを用いて、ｑＰＣＲ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、＃４３６７６５９）によって定量化した。ＰＣＲ反応には、陽性対照Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ３サンプルおよび陰性対照ウサギＩｇＧサンプルを含めた。２％インプットクロマチンＤＮＡの段階希釈（非希釈、１：５、１：２５、１：１２５）を用いて検量線を作成し、増幅効率を決定した。インプット率（％）を算出し、陰性対照ＩｇＧ値を減じた。データは、ｍｉＲ  ｃｏｍｂｏおよびｎｅｇｍｉＲ処理サンプルの間のインプット率（％）の変化倍率として示した。
【００４７】
ＩＬ６  ＥＬＩＳＡ：ＩＬ６  ＥＬＩＳＡキットは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手した。ＩＬ６をアッセイする１日前に、新鮮な培地（１ｍｌ）を細胞に加えた。製造業者の使用説明書に従って、培地５０ｕｌをアッセイし、培養培地中のＩＬ６の量（ｐｇ／ｍｌ）を検量線から決定した。次いで、ＩＬ６のｐｇ／ｍｌ値を、各ウェル中の培地の全量（１ｍｌ）および全細胞タンパク質について調整して、細胞数の差を補正した［２５］。
【００４８】
リプログラミングされた拍動心筋細胞の作製：分離したマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）新生仔心臓線維芽細胞（継代２）を、増殖培地中１５０００細胞／ｃｍ2で１２ウェルディッシュに播種した。２４時間後、増殖培地を除去し、上記のように、細胞をｎｅｇｍｉＲまたはｍｉＲ  ｃｏｍｂｏでトランスフェクトした。１日後、トランスフェクション複合体を除去し、培地を、１ｕｇ／ｍｌ  Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（ＬＭＷ）含有リプログラミング用合成培地［１２］と交換した。次の４日間、細胞に、新鮮な１ｕｇ／ｍｌ  Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（ＬＭＷ）含有リプログラミング用合成培地［１２］を毎日与えた。この期間の後、細胞に、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（ＬＭＷ）を含有しないリプログラミング用合成培地［１２］をさらに１０日間与えた。培地は１日おきに交換した。拍動コロニーを、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００倒立顕微鏡を用いて確認した。
画像：画像は、ＣｏｒｅｌＤｒａｗおよびＺｅｉｓｓソフトウエア（Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｌ４．８およびＺｅｎ  Ｂｌｕｅ）で処理した。
統計：すべての統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄを使用して行った。２つの条件を含む実験については、ｔ検定を行った。３つ以上の条件の実験については、ＡＮＯＶＡを用いた後、各群間の比較にボンフェローニ事後検定を用いた。０．０５未満のＰ値を有意であるとみなした。
【００４９】
結果
ＴＬＲ３阻害は心臓リプログラミングの成熟期を遮断する。分化決定された細胞が心筋細胞へと成熟する機序ははっきりしていない。近年、２つの研究によって、ＴＬＲ３は、線維芽細胞をｉＰＳ［２０］および内皮細胞［２１］にリプログラミングするために重要であることが示された。さらに、ＴＬＲ３は炎症を誘導し、炎症は損傷において重要であることは既知である。その結果として、我々は、ＴＬＲ３が、成熟心筋細胞の発達においてこれまで未知の役割を果たしているのかどうかを自問した。受容体であるＴＬＲは心臓における炎症反応の重要なメディエーターであるため、ＴＬＲに関心をもった。
まず、特異的ＴＬＲ３薬理学的阻害剤ＣＵ−ＣＰＴ−４ａを用いて我々の仮説を検証した［２６、２７］。特に、心臓リプログラミングの成熟期に関心をもった。この目的のために、心筋細胞サルコメアの機能に関与するその構成成分のｍＲＮＡレベルについて、最初のスクリーニングを行った。我々の既述のｍｉＲ  ｃｏｍｂｏを用いて、心臓リプログラミングを誘導した。ｍｉＲ  ｃｏｍｂｏは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方において心臓リプログラミングを強く誘導する、４つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−１、−１３３、−２０８、−４９９）の組合せである［９、１１〜１４］。図１Ａに示したように、ｍｉＲ  ｃｏｍｂｏは、心筋細胞サルコメアの１３種の構成成分の発現を有意に誘導した。ｍｉＲ  ｃｏｍｂｏの心筋細胞サルコメア遺伝子発現に対する作用は、ＴＬＲ３薬理学的阻害剤ＣＵ−ＣＰＴ−４ａによって完全に消失された（図１）。
【００５０】
心筋細胞サルコメアの３つの構成成分：Ｍｙｈ６（αミオシン重鎖）、Ａｃｔｎ２（αサルコメアアクチニン）、およびＴｎｎｉ３（心臓トロポニン−Ｉ）のｍＲＮＡレベルを測定することによって、最初のスクリーニングを検証した。最初のスクリーニングで観察されたように、ＴＬＲ３の薬理学的阻害によって、Ｍｙｈ６、Ａｃｔｎ２、およびＴｎｎｉ３の発現に関して、ｍｉＲ  ｃｏｍｂｏリプログラミングは完全に阻害された（図１Ｂｉ〜１Ｂｉｉｉ）。次いで、リプログラミングされた線維芽細胞の成熟に対するＴＬＲ３阻害の作用を、細胞レベルで評価した。組織化したサルコメアを有する成熟心筋細胞を生成するｍｉＲ  ｃｏｍｂｏの能力は、ＣＵ−ＣＰＴ−４ａによって完全に阻害された（図１Ｃｉ〜１Ｃｉｉｉ）。次いで、これらの結果を、ｓｉＲＮＡが媒介したＴＬＲ３のノックダウンによって検証した。ｓｉＲＮＡによるＴＬＲ３のノックダウンは強いものであり（図１Ｄ）、Ｍｙｈ６、Ａｃｔｎ２、およびＴｎｎｉ３の発現に関して、ｍｉＲ  ｃｏｍｂｏリプログラミングを完全に抑制した（図１Ｅｉ〜１Ｅｉｉｉ）。
ＴＬＲ３阻害およびＴＬＲ３活性化はどちらも心臓リプログラミングの開始期に影響を及ぼさない。これらの結果に続き、ＴＬＲ３がリプログラミングされた細胞の成熟に影響を与える機序をさらに詳しく調べた。心臓が発達する間、前駆体が心筋細胞へ分化する開始期において、エピジェネティックな過程が作用して、心筋細胞分化系列決定因子Ｇａｔａ４、Ｈａｎｄ２、Ｔｂｘ５、およびＭｅｆ２Ｃの発現のスイッチを入れ、これらが発現される［２８］。同様に、線維芽細胞でのこれらの心筋細胞分化系列決定因子の発現の増加は、心臓リプログラミングの開始期を意味している［１〜６、９、１２、１４］。ｍｉＲ  ｃｏｍｂｏによって誘導された心筋細胞分化系列決定因子Ｇａｔａ４、Ｈａｎｄ２、Ｔｂｘ５、およびＭｅｆ２Ｃの発現は、ＴＬＲ３ノックダウンによっても（図２Ａｉ〜２Ａｉｖ）ＴＬＲ３活性化によっても（図２Ｂｉ〜２Ｂｉｖ）影響を受けないことがわかった。このデータは、ＴＬＲ３の心臓リプログラミングに対する作用は、心臓リプログラミングの開始期における変更のためではないことを示している。
【００５１】
ＴＬＲ３はＮＦκＢのＲｅｌＡサブユニットを介して心臓リプログラミングの成熟期を制御する。ＴＬＲ３は、幾つかの転写因子活性化を媒介する［２２］。これらの転写因子のうち、ＡＰ１およびＮＦκＢの２つが、ＴＬＲ３の作用の大部分を媒介している［２２］。よって、ＴＬＲ３はＡＰ１および／またはＮＦκＢを介してリプログラミングされた細胞の成熟に影響を与えるのではないかという仮説を立てた。ＡＰ１の薬理学的阻害によって、ｍｉＲ  ｃｏｍｂｏが線維芽細胞をリプログラミングする能力に影響はなかった（データ非表示）。対照的に、ＮＦκＢの薬理学的阻害によって、ｍｉＲ  ｃｏｍｂｏリプログラミングは、ＲＮＡ（図３Ａｉ〜３Ａｉｉｉ）およびタンパク質（図３Ｂｉ〜３Ｂｉｉｉ）の両レベルで完全に阻害された。
さらに、リプログラミングされた細胞の成熟におけるＮＦκＢの役割を、ＮＦκＢ活性化に不可欠なキナーゼである標的Ｉｋｂｋｂによって検証した［２９］。Ｉｋｂｋｂのノックダウンは、強いものであった（図３Ｃ）。重要なことには、Ｉｋｂｋｂのノックダウンによって、ｍｉＲ  ｃｏｍｂｏリプログラミングは、心筋細胞成熟マーカーＭｙｈ６、Ａｃｔｎ２、およびＴｎｎｉ３（図３Ｄｉ〜３Ｄｉｉｉ）の発現に関して完全に阻害された。上記の研究と一致して、Ｉｋｂｋｂノックダウンによって、心臓リプログラミングの開始期に影響はなかった（データ非表示）。さらに、Ｉｋｂｋｂノックダウンによって、ｍｉＲ  ｃｏｍｂｏが媒介する内胚葉、外胚葉、および血管マーカーの抑制に影響はなかった（データ非表示）。
【００５２】
ＮＦκＢタンパク質には、ＮＦ−κＢ１（ｐ１０５／ｐ５０）、ＮＦ−κＢ２（ｐ１００／ｐ５２）、ＲｅｌＡ（ｐ６５）、ＲｅｌＢ、およびｃ−Ｒｅｌの５つがある。ＲｅｌＡ、ＲｅｌＢ、およびｃ−Ｒｅｌだけが転写を誘導する。ＲｅｌＡが最も高く発現されるＲｅｌタンパク質であるため、ＲｅｌＡに着目した。ＲｅｌＡのノックダウンは強固であることがわかり（図４Ａ）、これによって、ｍｉＲ  ｃｏｍｂｏでトランスフェクトした線維芽細胞においてＡｃｔｎ２（＋）細胞出現が妨げられた（図４Ｂｉ〜４Ｂｉｉｉ）。タンパク質レベルでの作用はｍＲＮＡレベルでも観察され、ｓｉＲＮＡでＲｅｌＡを標的化することによって、ｍｉＲ  ｃｏｍｂｏリプログラミングは、サルコメア関連遺伝子発現に関して、完全に阻害された（図４Ｃｉ〜４Ｃｉｉｉ）。ＲｅｌＡノックダウンによって、内胚葉マーカーＧａｔａ６または一般的な分化マーカーＴｇｆｂ２の発現に影響がなかったことも認められた（図４Ｄｉ〜４Ｄｉｉ）。
【００５３】
最後に、ＲｅｌＡがどのように心筋細胞成熟遺伝子の発現を制御するのかを確かめたかった。よって、ＣｈＩＰアッセイを用いて、ｍｉＲ  ｃｏｍｂｏが、ＲｅｌＡの心筋細胞サルコメアの構成成分のプロモーターへの結合を誘導するかどうかを確認した。ｍｉＲ  ｃｏｍｂｏ処理の後、Ａｃｔｎ２、Ｍｙｈ６、Ｍｙｐｎ、およびＴｎｎｉ３プロモーターにおいて、ＲｅｌＡの有意な濃縮が観察された（図５Ａｉ〜５Ａｉｖ）。同様の濃縮が、Ｔｔｎ、Ｍｙｏｚ２、Ｔｎｎｃ１、およびＴｎｎｔ２プロモーターについても観察されたが、これはＰ＜０．０５有意性に達し得なかった（図５Ａｖ〜５Ａｖｉｉｉ）。無関係の遺伝子ＲＰＬ３０の濃縮はみられなかった（データ非表示）。ＲｅｌＡ標的ノックダウンによって、ＣｈＩＰシグナルは完全に消失した。この結果から、ＲｅｌＡが、心筋細胞サルコメア遺伝子のプロモーターに実際に結合していたことが証明された（図５Ｂｉ〜５Ｂｖｉｉｉ）。
【００５４】
マイクロＲＮＡはＴＬＲ３を活性化する。薬理学的阻害剤およびｓｉＲＮＡ媒介ノックダウン実験によって、ｍｉＲ  ｃｏｍｂｏがＴＬＲ３を活性化したことが示唆された。さらにこれを検証するために、細胞をマイクロＲＮＡでトランスフェクトし、培地中へのＩＬ６分泌を測定することによってＴＬＲ３活性を評価した。ＩＬ６分泌は、ＴＬＲ３を含むＴＬＲの活性の公認測定値である［３０〜３７］。モックトランスフェクトした線維芽細胞と比較した場合、対照の非標的ｍｉＲＮＡ（ｎｅｇｍｉＲ）およびｍｉＲ  ｃｏｍｂｏはいずれも、ＩＬ６分泌を有意に誘導した（図６Ａ）。ｎｅｇｍｉＲとｍｉＲ  ｃｏｍｂｏとの間の比較によって、ｍｉＲ  ｃｏｍｂｏがより強く作用したことが示された。マイクロＲＮＡによるＩＬ６分泌の誘導は、ＴＬＲ３依存性であり、ＲＮＡとＴＬＲ３との間の相互作用を阻害するＴＬＲ３阻害剤ＣＵ−ＣＰＴ−４ａの付加によって、ｎｅｇｍｉＲおよびｍｉＲ  ｃｏｍｂｏのＩＬ６分泌に対する作用は完全に除去された（図６Ａ）。ＴＬＲ３またはＩｋｂｋｂ標的ノックダウンによって、ｍｉＲ  ｃｏｍｂｏが誘導したＩＬ６分泌が阻害され、このことは、ｍｉＲ  ｃｏｍｂｏがＴＬＲ３−ＮＦκＢ経路を活性化したことをさらに実証するものである（図６Ｂ）。
【００５５】
ＴＬＲ３の薬理学的活性化はリプログラミングされた線維芽細胞の成熟を増進させる。ＴＬＲ３がｍｉＲ  ｃｏｍｂｏリプログラミングを制御した機序を確認した後、次に、ＴＬＲ３の刺激が、ｍｉＲ  ｃｏｍｂｏの能力を増強することができるかどうかを調べた。予想された通り、ｍｉＲ  ｃｏｍｂｏは、Ｍｙｈ６、Ａｃｔｎ２、およびＴｎｎｉ３のＲＮＡレベルを上昇させた（図７Ａｉ〜７Ａｉｉｉ）。ｍｉＲ  ｃｏｍｂｏのＭｙｈ６、Ａｃｔｎ２、およびＴｎｎｉ３発現に対する作用は、ＴＬＲ３アゴニストＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の付加によって有意に増強された（図７Ａｉ〜７Ａｉｉｉ）。興味深いことに、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）はまた、対照ｎｅｇｍｉＲサンプルにおいても、Ｍｙｈ６、Ａｃｔｎ２、およびＴｎｎｉ３の発現を誘導した（図７Ａｉ〜７Ａｉｉｉ）。Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は心筋細胞分化系列決定因子の発現に影響していないことを考慮すると、この作用は、ＴＬＲ３経路が心臓リプログラミングの成熟期を制御するということのさらなる証拠である。次いで、ＲＮＡレベルでの作用がタンパク質レベルでも観察されるか確認するために、免疫染色を行った。実際に、ｍｉＲ  ｃｏｍｂｏ処理に反応して形成したＡｃｔｎ２（＋）細胞の数が、ＴＬＲ３アゴニストＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）によって増加したことがわかった（図７Ｂｉ〜７Ｂｖｉ、図７Ｃには定量化を示した）。また、ＴＬＲ３活性化によって、サルコメア成熟が増進されたことも認められた（図７Ｂｉ〜７Ｂｖｉの挿入図を参照されたい）。
【００５６】
我々のこれまでの研究［９］と一致して、線維芽細胞をｍｉＲ  ｃｏｍｂｏでトランスフェクトした結果、自発的に拍動するコロニーの出現がもたらされたことがわかった（図７Ｄｉ〜７Ｄｉｉ）。自発的に拍動するコロニーを形成させるｍｉＲ  ｃｏｍｂｏの能力は、ＴＬＲ３アゴニストＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の付加によって３倍増加した（図７Ｄｉ〜７Ｄｉｉ）。重要なことには、トランスフェクションして１週間以内に、成熟した拍動コロニーが観察された。
考察
本研究では、ＴＬＲ３活性化ＮＦκＢが、分化決定された前駆体の心筋細胞への成熟のために、重要な機序であることを実証する。
我々の研究では、特に心臓リプログラミングの成熟期におけるＴＬＲ３活性化ＮＦκＢの役割を明確に同定した。これは、ＴＬＲ３活性化ＮＫκＢをｉＰＳ［２０］または内皮細胞［２１］へのリプログラミングに関連付けた以前の研究とは異なる。これらの以前の研究では、ＴＬＲ３−ＮＦκＢが、ＤＮＡアクセシビリティの向上を促進するエピジェネティックモディファイヤーの発現および活性の全般的変化を引き起こすことを実証している。この開いたクロマチン構成では、山中因子による多能性プログラミングの活性化［２０］、または分化転換因子による内皮系列の誘導［２１］が促進される。これらの研究では、ＮＦκＢの薬理学的または分子アンタゴニストを使用して示したように、ＴＬＲ３活性化によって誘導されるエピジェネティックな可塑性は、ＮＦκＢが多分に媒介している。
【００５７】
心筋細胞前駆体の成熟におけるＴＬＲの役割を調べることによって、本研究を拡大させた。ＴＬＲ３活性化は、ＮＦκＢの心筋細胞サルコメア遺伝子への直接的な結合を増加させたことがわかった。対照的に、ＴＬＲ３は、前駆体の心筋細胞系列への分化決定において役割を果たしていなかったことがわかった。ＴＬＲ３阻害またはノックダウンは、心筋細胞系列への分化決定のために不可欠な様々な転写因子の発現には影響を与えなかった。
上記のように、ｍｉＲ  ｃｏｍｂｏが、心筋細胞サルコメアの様々な構成成分のプロモーターへのＲｅｌＡの結合を誘導したことがわかった。古典的ＲｅｌＡ結合部位は、Ｍｙｈ６プロモーターには存在するが、Ａｃｔｎ２、Ｍｙｐｎ、およびＴｎｎｉ３遺伝子のプロモーターには存在しない。非古典的ＲｅｌＡ結合部位は、その他の遺伝子で同定されており［４３］、またＡｃｔｎ２、Ｍｙｐｎ、およびＴｎｎｉ３遺伝子プロモーターに存在する。しかしながら、ＲｅｌＡは間接的な機序を通して心臓遺伝子発現に影響を与える可能性もある。ＲｅｌＡおよびＮＦκＢは、エピジェネティックな装置の活性を調節することによるだけでなく、他のタンパク質への結合を通して遺伝子発現を調節することが示されている［４４〜４６］。ＮＦκＢのＲｅｌＡサブユニットは、心筋細胞成熟において、同様の役割を果たしている可能性がある。
【００５８】
我々の研究は、マイクロＲＮＡがＴＬＲ３を直接的に活性化することを示唆している。幾つかのＴＬＲ：ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９が核酸に結合することが知られている［４７］。ＴＬＲ３は２本鎖（ｄｓ）ＲＮＡを認識するのに対し、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８は１本鎖ＲＮＡに結合する。対照的に、ＴＬＲ９は、ＤＮＡ分子の非メチル化ＣｐＧ配列によって活性化される［４７］。マイクロＲＮＡがＴＬＲに結合することを実証した報告数は限られている。マイクロＲＮＡはｄｓＲＮＡ分子ではあるものの、マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２９ａ、およびＬｅｔ−７ｂは、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８に結合し、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８を活性化する［４８、４９］。ＴＬＲ３に関して、マイクロＲＮＡは有効な二量体化を誘導してＴＬＲ３の活性化を誘導するには小さすぎるかもしれないと、当初は示唆された［５０］。しかしながら、この仮定は、我々の結果、ならびに植物由来のマイクロＲＮＡ、ＦｖｍｉＲｌ６８が樹状細胞のＴＬＲ３に結合するという最近の報告［５１］の両方をかんがみて、見直す必要がありそうである。ｍｉＲ  ｃｏｍｂｏは、我々の研究で使用した陰性対照マイクロＲＮＡより強力にＴＬＲ３を誘導したことがわかった。これは、マイクロＲＮＡによるＴＬＲ３活性化が配列依存性であることを示唆しうるものである。この考えを支持するものとして、ｓｉＲＮＡが媒介したＴＬＲの活性化が配列依存性であることが示されている［５２］。
【００５９】
（実施例）ＴＬＲ３活性化は心筋細胞成熟を増進させる
心臓線維芽細胞を、ｍｉＲ  ｃｏｍｂｏまたはｎｅｇｍｉＲ（対照）でトランスフェクトし、様々な濃度のＩＣＲ２（図８Ａ〜８Ｄ）またはＩＣＲ４（図９Ａ〜９Ｄ）と共に、４日間インキュベートした。サルコメア機能に不可欠な遺伝子（例えば、Ａｃｔｎ２、Ｍｙｈ６、Ｔｎｎｉ３）および心臓イオンチャネルに不可欠な遺伝子（Ｃａｃｎａ１ｃ）の発現を測定するｑＰＣＲによって、リプログラミングを評価した。１４日目に遺伝子発現を評価した。ＩＣＲ２が成熟を誘導したことをさらに確証するために、心臓線維芽細胞を、ＰｏｌｙＩＣまたはＩＣＲ２にｍｉＲ  ｃｏｍｂｏを加えて、１４日間インキュベートした。サルコメアを、ａ−サルコメアアクチニンの抗体染色によって可視化した（図１１Ａおよび１１Ｂ）。
【００６０】
（実施例）高用量のｍｉＲ  ｃｏｍｂｏは正常な細胞機能を損なわせる
新生仔心臓線維芽細胞を、０．１ｍＭまたは０．３ｍＭのｍｉＲ  ｃｏｍｂｏでトランスフェクトした。同等濃度の非標的ｍｉＲＮＡを対照として使用した。細胞数は、０日目および１４日目のＧＡＰＤＨ発現から導いた変化倍率として表す（図１０）。点線は、０日目の細胞数を示す。細胞数は、対照ｍｉＲの濃度およびｍｉＲ  ｃｏｍｂｏの標準濃度いずれでも有意に増加した。高濃度のｍｉＲ  ｃｏｍｂｏでは、細胞増殖が阻害されるまたは細胞死の速度が速まることによって、正常な細胞数の成長が損なわれた。Ｎ＝２。
参考文献
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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