(57)【要約】  肝内皮細胞のフェネストレーション多孔度、フェネストレーション頻度またはフェネストレーション直径を調整するための組成物および方法が提供される。特に、肝内皮細胞のフェネストレーション多孔度、頻度または直径を調整するために、量子ドットと治療薬とのコンジュゲートが用いられる。【選択図】図１５Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における内皮細胞のフェネストレーションの多孔度、直径および頻度の１つまたは複数を調節するための組成物であって、該組成物は量子ドットと治療薬とを含む治療薬コンジュゲートを含んで成り、前記治療薬が、エンドセリン受容体拮抗薬、ホスホジエステラーゼ（PDE）阻害薬、カルシウムチャネル遮断薬、アクチンかく乱物質、脂質ラフトかく乱物質、5-HT受容体作動薬、TNF関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）、ニコチンアミドアデニンモノヌクレオチド（NMN）またはその組み合わせから選択される、組成物。
【請求項２】
前記量子ドットが、Ag2S、InP/ZnSまたはCuInS/ZnS 量子ドットである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記対象が、高齢の対象または加齢に伴う疾患もしくは状態を有する対象である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記量子ドットの平均直径が、約2 nm、3 nm、4 nm、5 nm、6 nm、7 nm、8 mn、9 nm、10 nm、11 nm、12 nm、13 nm、14 nm、15 nm、16 nm、17 nm、18 nmまたは20 nmである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記治療薬コンジュゲートが単分散である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記エンドセリン受容体拮抗薬が、ボセンタン、シタキセンタン、アンブリセンタン、アトラセンタン、ジボテンタン、マシテンタン、テゾセンタンおよびエドネンタンから選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記ホスホジエステラーゼ（PDE）阻害薬が、シルデナフィルまたはその活性類似体、タダラフィル、バルデナフィル、ウデナフィルおよびアバナフィルから選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記カルシウムチャネル遮断薬が、アムロジピン、アラニジピン、アゼルニジピン、バルニジピン、ベニジピン、シルニジピン、クレビジピン、エフォニジピン、フェロジピン、イスラジピン、ラシジピン、レルカニジピン、マニジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニルバジピン、ニモジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン、プラニジピン、フェンジリンから選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。別の実施形態では、カルシウムチャネル遮断薬はアムロジピンである。
【請求項９】
前記アクチンかく乱物質が、サイトカラシン、ラトランクリン、ジャスプラキノリド、ファロイジンおよびスウィンホリドから選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記脂質ラフトかく乱物質が、フィリピン、７−ケトコレステロール（7KC）およびメチル−β−シクロデキストリンから選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記5-HT受容体作動薬が、２，５−ジメトキシ−４−ヨードアンフェタミン（DOI）、ハロペリドール、アリピプラゾール、アセナピン、ブスピロン、ボルチオキセチン、ジプラシドン、メチルフェニデート、ジヒドロエルゴタミン、エルゴタミン、メチセルギド、アルモトリプタン、エレトリプタン、フロバトリプタン、ナラトリプタン、リザトリプタン、スマトリプタン、ゾルミトリプタン、ヨヒムビン、ラスミジタン、ナラトリプタン、ブフォテニン、エゴノバイン、リスリド、LSD、メスカリン、ミリスチシン、プシロシン、プシロシビン、フェンフルラミン、MDMA、ノルフェンフルラミン、メチルフェニデート、エルゴノビン、ロルカセリン、タゾドン、メチル−5−HT、キパジン、シニタプリド、シサプリド、タゾプリド、メトクロプラミド、モサプリド、プルカロプリド、レンザプリド、テガセロド、ザコプリド、エルゴタミンおよびバレレン酸から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
対象における内皮細胞のフェネストレーションの多孔度、直径および頻度の１つまたは複数を調節する方法であって、前記対象に請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物の有効量を投与することを含む方法。
【請求項１３】
前記対象が、加齢に伴う疾患または状態を有する対象である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記加齢に伴う疾患または状態が、アテローム性動脈硬化症、心血管疾患、関節炎、白内障、加齢性黄斑変性症、難聴、骨粗しょう症、変形性関節症、II型糖尿病、高血圧、パーキンソン病、認知症、アルツハイマー病、加齢に伴う肝微小循環の変化、加齢に伴う脂質異常症、インスリン抵抗性、脂肪肝、肝線維症、および肝硬変から選択される、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記対象が、内皮細胞の減少したフェネストレーション多孔度、直径および頻度の１つまたは複数に関連する疾患または状態を有する対象である、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記治療薬または治療薬コンジュゲートが内皮細胞と会合する、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記治療薬コンジュゲートが内皮細胞と選択的に会合する、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記内皮細胞が肝内皮細胞である、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記調節が、内皮細胞のフェネストレーションの多孔度、直径および頻度の１つまたは複数の増加である、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記増加が、少なくとも5％、10％、15％、20％、35％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％または100％である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
対象における内皮細胞のフェネストレーションの多孔度、直径および頻度の１つまたは複数を調節する医薬の製造のための、量子ドットと治療薬とを含む治療薬コンジュゲートの使用。
【請求項２２】
対象における内皮細胞のフェネストレーションの多孔度、直径および頻度の１つまたは複数を調節する方法であって、ホスホジエステラーゼ（PDE）阻害薬、カルシウムチャネル遮断薬、アクチンかく乱物質、脂質ラフトかく乱物質、5-HT受容体作動薬、TNF関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）、ニコチンアミドアデニンモノヌクレオチド（NMN）またはそれらの組み合わせの有効量を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項２３】
前記エンドセリン受容体拮抗薬が、ボセンタン、シタキセンタン、アンブリセンタン、アトラセンタン、ジボテンタン、マシテンタン、テゾセンタンおよびエドネンタンから選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ホスホジエステラーゼ（PDE）阻害薬が、シルデナフィルまたはその活性類似体、タダラフィル、バルデナフィル、ウデナフィルおよびアバナフィルから選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記カルシウムチャネル遮断薬が、アムロジピン、アラニジピン、アゼルニジピン、バルニジピン、ベニジピン、シルニジピン、クレビジピン、エフォニジピン、フェロジピン、イスラジピン、ラシジピン、レルカニジピン、マニジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニルバジピン、ニモジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン、プラニジピン、フェンジリンから選択される、請求項２３に記載の方法。別の実施形態では、カルシウムチャネル遮断薬はアムロジピンである。
【請求項２６】
前記アクチンかく乱物質が、サイトカラシン、ラトランクリン、ジャスプラキノリド、ファロイジンおよびスウィンホリドから選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記脂質ラフトかく乱物質が、フィリピン、７−ケトコレステロール（7KC）、およびメチル−β−シクロデキストリンから選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
5-HT受容体作動薬が、２，５−ジメトキシ−４−ヨードアンフェタミン（DOI）、ハロペリドール、アリピプラゾール、アセナピン、ブスピロン、ボルチオキセチン、ジプラシドン、メチルフェニデート、ジヒドロエルゴタミン、エルゴタミン、メチセルギド、アルモトリプタン、エレトリプタン、フロバトリプタン、ナラトリプタン、リザトリプタン、スマトリプタン、ゾルミトリプタン、ヨヒムビン、ラスミジタン、ナラトリプタン、ブフォテニン、エゴノビン、リスリド、LSD、メスカリン、ミリスチシン、プシロシン、プシロシビン、フェンフルラミン、MDMA、ノルフェンフラミン、メチルフェニデート、エルゴノビン、ロルカセリン、タゾドン、メチル−5-HT、キパジン、シニタプリド、シサプリド、ダゾプリド、メトクロプラミド、モサプリド、プルカロプリド、レンザプリド、テガセロド、ザコプリド、エルゴタミンおよびバレレン酸から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
対象における内皮細胞のフェネストレーションの多孔度、直径および頻度の１つまたは複数を調節する医薬の製造のための、ホスホジエステラーゼ（PDE）阻害薬、カルシウムチャネル遮断薬、アクチンかく乱物質、脂質ラフトかく乱物質、5-HT受容体作動薬、TNF関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）、ニコチンアミドアデニンモノヌクレオチド（NMN）またはそれらの組み合わせの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本技術は、例えば加齢に伴う機能低下の治療における、肝類洞上皮細胞中のフェネストレーションの多孔度と頻度のいずれか一方または両方を調節する（モジュレートする）ための量子ドットと治療薬とのコンジュゲート（複合体）の使用に関する。
関連出願
【０００２】
本出願は、2017年12月４日出願のオーストラリア国仮特許出願第2017904879号に基づいておりそれに対する優先権を主張する。その出願の全内容が参考により援用される。
【背景技術】
【０００３】
背景
【０００４】
大部分の疾患には加齢に伴う指数的増加が見られ、その結果として、加齢が疾患の最も重要なリスク因子として確立されている。75歳を超える人の約４分の３が糖尿病もしくは前糖尿病および／または高脂血症を患っている。それらは認知症、サルコペニア、フレイルおよび骨粗しょう症などの高齢者疾患のリスク因子としても認識されている。
【０００５】
肝臓の微小循環は、肝類洞中の肝細胞と血液との間の基質の双方向性置換を亢進するユニークな形態を有している。肝類洞内皮細胞（LESC）の細胞質伸展は非常に薄く、フェネストレーション（有窓：fenestration)として知られる細胞貫通孔により穿孔されている。LSECの表面の約２〜20％がフェネストレーションにより占有され、それらは内皮細胞表面を横断して個々に分散しているかまたは篩板（sieve plate）と呼ばれる集合体にクラスター化される。隔壁または下層の基底膜が全く存在しないため、フェネストレーションはLSECを非常に効率的なろ過システム、すなわち「篩」へと変容させ、溶解された粒状の基質のスムーズな輸送を可能にする。それらの並外れた効率のため、フェネストレーションは健全な正常肝臓における基質移動に与える影響が最小限である。
【０００６】
人は年を重ねるにつれ、LSEC、星細胞およびクッパー細胞を含む全ての肝類洞細胞において加齢に伴う機能低下が生じる。最も顕著には、高齢者のLSECは多孔度（フェネストレーションにより穿孔されたLESC表面積の％）が約50％ほど著しく減少し、LESCの横断面の厚さに同様な50％増加を伴う。この加齢に伴う「偽毛細血管化（pseudocapillarization)」は、老化の特徴であり、マウス、非ヒト霊長類およびヒトにおいて並びにトランスジェニックベルナー症候群（早期老化）マウスでは早期に、肝細胞の加齢関連の病理または星細胞の活性化を伴わずに起こる。
【０００７】
本発明者らは、多数の薬物が肝類洞内皮細胞におけるフェネストレーションの多孔度と頻度のいずれか一方または両方を調節するために使用できることを見出した。加えて、本発明者らは、肝類洞内皮細胞を標的とし、薬物を肝類洞内皮細胞へ標的送達するために使用することができる量子ドットを開発した。
【発明の概要】
【０００８】
要約
第一の態様では、対象における内皮細胞フェネストレーションの多孔度、直径および頻度の１つまたは複数を調節するための組成物であって、エンドセリン受容体拮抗薬、ホスホジエステラーゼ（PDE）阻害薬、カルシウムチャネル遮断薬、アクチンかく乱物質、脂質ラフトかく乱物質、5-HT受容体作動薬（アゴニスト）、TNF関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）、ニコチンアミドアデニンモノヌクレオチド（NMM）またはその組み合わせから選択された治療薬と量子ドットとを含む治療薬コンジュゲートを含んでなる組成物が提供される。
【０００９】
量子ドットはAg2S、InP/ZnS またはCuInS/ZnS 量子ドットであることができる。
【００１０】
対象は、高齢対象または加齢に伴う疾患または状態を有する対象であることができる。
【００１１】
量子ドットの平均直径は、約2 nm、3 nm、4 nm、5 nm、6 nm、7 nm、8 mn、9 nm、10 nm、11 nm、12 nm、13 nm、14 nm、15 nm、16 nm、17 nm、18 nmまたは20 nmであってよい。治療薬コンジュゲートは単分散であってよい。
【００１２】
エンドセリン受容体拮抗薬は、ボセンタン、シタキセンタン、アンブリセンタン、アトラセンタン、ジボテンタン、マシテンタン、テゾセンタンおよびエドネンタンであることができる。
【００１３】
ホスホジエステラーゼ（PDE）阻害剤は、シルデナフィルまたはそれの活性類似体、テダラフィル、バルデナフィル、ウデナフィルおよびアバナフィルから選択することができる。
【００１４】
カルシウムチャネル遮断薬は、アムロジピン、アラニジピン、アゼルニジピン、バルニジピン、ベニジピン、シルニジピン、クレビジピン、エフォニジピン、フェロジピン、イスラジピン、ラシジピン、レルカニジピン、マニジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニルバジピン、ニモジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン、プラニジピン、フェンジリンから選択することができる。別の実施形態では、カルシウムチャネル遮断薬はアムロジピンである。
【００１５】
アクチンかく乱物質は、サイトカラシン、ラトルンクリン、ジャスプラキノリド、ファロイジンおよびスウィンホリドから選択することができる。
【００１６】
脂質ラフトかく乱物質は、フィリピン、７−ケトコレステロール（7KC)およびメチル−β−シクロデキストリンから選択することができる。
【００１７】
5-HT受容体作動薬は、２，５−ジメトキシ−４−ヨードアンフェタミン（DOI)、ハロペリドール、アリプラゾール、アセナピン、ブスピロン、ボルチオキセチン、ジプラシドン、メチルフェニデート、ジヒドロエルゴタミン、エルゴタミン、メチセルギド、アルモトリプタン、エレトリプタン、フロバトリプタン、ナラトリプタン、リザトリプタン、スマトリプタン、ゾルミトリプタン、ヨヒムビン、ラスミジタン、ナラトリプタン、ブフォテニン、エゴノビン、リスリド、LSD、メスカリン、ミリスチシン、プシロシン、プシロシビン、フェンフルラミン、MDMA、ノルフェンフラミン、メチルフェニデート、エルゴノビン、ロルカセリン、タゾドン、メチル−５−HT、キパジン、シニタプリド、シサプリド、ダゾプリド、メトクロプラミド、モサプリド、プルカロプリド、レンザプリド、テガセロド、ザコプリド、エルゴタミン、およびバレレン酸から選択することができる。
【００１８】
第二の態様では、対象における内皮細胞フェネストレーションの多孔度、直径および頻度の１つまたは複数を調節する方法であって、該対象に有効量の第一態様の組成物を投与することを含む方法が提供される。
【００１９】
対象は、高齢対象または加齢に伴う疾患または状態を有する対象であることができる。加齢に伴う疾患または状態は、アテローム性動脈硬化症、心血管疾患、関節炎、白内障、加齢に伴う黄斑変性症、難聴、骨粗しょう症、変形性関節炎、２型糖尿病、高血圧、パーキンソン病、認知症、アルツハイマー病、加齢に伴う肝微小循環の変化、加齢に伴う脂質異常症、インスリン抵抗性、脂肪肝、肝線維症、および肝硬変から選択することができる。
【００２０】
対象は、減少した内皮細胞フェネストレーションの多孔度、直径および頻度の１または複数に関連した疾患または状態を有する対象であり得る。
【００２１】
治療薬または治療薬コンジュゲートは、内皮細胞と会合し、例えば、治療薬コンジュゲートは、内皮細胞に選択的に会合する。幾つかの実施形態では、内皮細胞は肝内皮細胞である。
【００２２】
調節は、内皮細胞フェネストレーションの多孔度、直径および頻度の１つまたは複数の増加であることができる。例えば、増加は、少なくとも５％、10％、15％、20％、35％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％または100％であり得る。
【００２３】
第三の態様では、対象における内皮細胞のフェネストレーションの多孔度、直径および頻度の１または複数を調節する医薬の製造のための、量子ドットと治療薬との治療薬コンジュゲートの使用が提供される。
【００２４】
第四の態様では、対象における内皮細胞のフェネストレーションの多孔度、直径および頻度の１または複数を調節する方法であって、ホスホジエステラーゼ（PDE）阻害薬、カルシウムチャネル遮断薬、アクチンかく乱物質、脂質ラフトかく乱物質、5-HT受容体作動薬、TNF関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）、ニコチンアミドアデニンモノヌクレオチド（NMN）またはその組み合わせの有効量を対象に投与することを含む方法が提供される。
【００２５】
エンドセリン受容体拮抗薬は、ボセンタン、シタキセンタン、アンブリセンタン、アトラセンタン、ジボテンタン、マシテンタン、テゾセンタンおよびエドネンタンから選択され得る。
【００２６】
ホスホジエステラーゼ（PDE）阻害薬は、シルデナフィルまたはその活性類似体、タダラフィル、バルデナフィル、ウデナフィルおよびアバナフィルから選択され得る。
【００２７】
カルシウムチャネル遮断薬は、アムロジピン、アラニジピン、アゼルニジピン、バルニジピン、ベニジピン、シルニジピン、クレビジピン、エフォニジピン、フェロジピン、イスラジピン、ラシジピン、レルカニジピン、マニジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニルバジピン、ニモジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン、プラニジピン、フェンジリンから選択され得る。別の実施形態では、カルシウムチャネル遮断薬は、アムロジピンである。
【００２８】
アクチンかく乱物質はサイトカラシン、ラトランクリン、ジャスプラキノリド、ファロイジンおよびスウィンホリドから選択され得る。
【００２９】
脂質ラフトかく乱物質はフィリピン、７−ケトコレステロールおよびメチル−β−シクロデキストリンから選択され得る
【００３０】
５−HT受容体作動薬は、２，５−ジメトキシ−４−ヨードアンフェタミン (DOI)、ハロペリドール、アリピプラゾール、アセナピン、ブスピロン、ボルチオキセチン、ジプラシドン、メチルフェニデート、ジヒドロエルゴタミン、エルゴタミン、メチセルギド、アルモトリプタン、エレトリプタン、フロバトリプタン、ナラトリプタン、リザトリプタン、スマトリプタン、ゾルミトリプタン、ヨヒムビン、ラスミジタン、ナラトリプタン、ブフォテニン、エゴノビン、リスリド、LSD、メスカリン、ミリスチシン、プシロシン、プシロシビン、フェンフルラミン、MDMA、ノルフェンフラミン、メチルフェニデート、エルゴノビン、ロルカセリン、タゾドン、メチル−5-HT、キパジン、シニタプリド、シサプリド、ダゾプリド、メトクロプラミド、モサプリド、プルカロプリド、レンザプリド、テガセロド、ザコプリド、エルゴタミンおよびバレレン酸から選択され得る。
【００３１】
第五態様では、対象における内皮細胞フェネストレーションの多孔度、直径および頻度の１または複数を調節するための医薬の製造のための、ホスホジエステラーゼ（PDE）阻害薬、カルシウムチャネル遮断薬、アクチンかく乱物質、脂質ラフトかく乱物質、５−HT受容体作動薬、TNF関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）、ニコチンアミドアデニンモノヌクレオチド（NMM）またはその組み合わせの使用が提供される。
定義
【００３２】
下記は、本発明の説明を理解する上で有用となりうる、当業界で用いられる用語の幾つかの定義である。それらは一般定義として意図され、本発明の範囲をそれらの用語のみに限定するものでなく、下記の説明をより良く理解するために提供される。
【００３３】
文脈が別なものを要求とするかまたは具体的に異なって言及されない限り、本明細書において単数形の整数、段階または要素として言及される本発明の整数、段階または要素は、言及された整数、段階または要素の単数形と複数形の両方を明らかに包含する。
【００３４】
当業者は、本明細書に記載の発明が、具体的に記載されたもの以外の変形と改良を受けることができることを理解するだろう。本発明がそのような変更と修正の全てを包含することは理解すべきである。本発明は、本明細書中に個別にまたは集合的に言及または指摘された段階、特徴、組成物および化合物の全て、並びに前記段階、特徴、組成物および化合物のいずれか２以上のあらゆる組み合わせも包含する。
【００３５】
用語「薬理学的に許容される塩」は、妥当な医薬的判断の範囲内で、過度な毒性、炎症、アレルギー反応等を引き起こすことなくヒトや動物の組織と接触させた状態での使用に適当であり、合理的なリスク・ベネフィット比に見合うそれらの塩を指す。薬学的に許容される塩は当業界で周知である。S. M. Berge他は、J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66:1-19中に詳細に薬学的に許容される塩を記載している。適当な塩の概要については、Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use by Stahl and Wermuth (Wiley-VCH, 2002)を参照されたい。本発明の化合物の薬学的に許容される塩の製造方法は当業者に既知である。それらの塩は、本発明の化合物の最終的単離・精製の間にその場で（in situ）調製することができ、あるいは遊離塩基機能を適当な有機酸と反応させることにより別々に調製することができる。本発明の化合物の適当な薬学的に許容される酸付加塩は、無機酸からまたは有機酸から調製することができる。そのような無機酸の例は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、炭酸、硫酸およびリン酸である。適当な有機酸は、有機酸の脂肪族、脂環式、芳香族、複素環式カルボン酸およびスルホン酸クラスであり、その例は、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、フマル酸、マレイン酸、ピルビン酸、アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、メシル酸、メタンスルホン酸、サリチル酸、ｐ-ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、マンデル酸、アンボン酸、パモ酸、パントテン酸、スルファニル酸、シクロヘキシルアミノスルホン酸、ステアリン酸、アルゲン酸、β-ヒドロキシ酪酸、ガラクタル酸、およびガラクツロン酸である。本発明化合物の適当な薬学的に許容される塩基付加塩は、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アルミニウムおよび亜鉛から製造された金属塩、並びにコリン、ジエタノールアミン、モルホリンのような有機塩基から製造された有機塩類を含む。あるいは、Ｎ,Ｎ′−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（N-メチルグルカミン）、プロカイン、アンモニウム塩、第四級塩、例えばテトラメチルアンモニウム塩、アミノ酸付加塩、例えばグリシンおよびアルギニンとの塩が挙げられる。固体である化合物の場合、当業者は、本発明の化合物、薬剤および塩が異なる結晶形または多形で存在しうることを理解するだろう。それらの全てが本発明の範囲および特定された式の範囲内に入るものである。
【００３６】
本明細書中で用いる「治療する（処置する）」、「治療」および「療法」という用語は、治癒療法、予防療法、緩和療法（一次療法）、および予防療法を指す。よって、本開示の文脈において、「治療する」という用語は、医学的状態のまたはそれに伴う１もしくは複数の症状の重症度を治療する、軽減するまたは緩和することを包含する。
【００３７】
「治療的有効量」または「薬理学的有効量」または「有効量」という用語は、処置すべき対象において所望の治療効果または薬理効果を生じさせるのに十分である薬剤の量を指す。それらの用語は同義語であり、好ましくは、他の療法では通常随伴する副作用をはじめとする不利な副作用を回避または最小限に抑えながら、各々の薬剤が、それ自体での治療を上回る疾患重症度および／または発生頻度の改善という目標を達成するであろう各薬剤の量を限定することを意図するものである。当業者は、当業界で既知の情報と常法を使って有効量を決定することができる。
【００３８】
「医薬担体、希釈剤または賦形剤」としては、限定されないが、適当な水溶性有機担体、常用の溶媒、分散媒体、充填剤、固形担体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤を含む、任意の生理的緩衝（すなわち約pH 7.0〜7.4）溶媒が挙げられる。適当な水溶性有機担体としては、限定されないが、生理食塩水、ブドウ糖、コーン油、ジメチルスルホキシド、およびゼラチンカプセルが挙げられる。他の従来の添加剤としては、ラクトース、マンニトール、コーンスターチ、ポテトスターチ、結合剤、例えば微結晶セルロース、セルロース誘導体、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース、アカシア、ゼラチン、崩壊剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、および滑沢剤、例えばタルクまたはステアリン酸マグネシウムが挙げられる。
【００３９】
「対象」は、任意のヒトまたは非ヒト哺乳動物を包含する。よって、ヒトの治療に有用であることに加えて、本発明の組成物は、コンパニオンアニマル、家禽、例えば限定されないがイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジおよびブタを初めとする哺乳動物の獣医学的処置にも有用である。好ましい実施形態では、対象はヒトである。
【００４０】
本明細書に関しては、「投与すること」という用語並びに「投与する」および「投与」といったその用語の変形は、治療薬、QD、治療薬−QDコンジュゲートまたは組成物を任意の適当な手段により対象に接触させる、適用する、送達させるまたは提供することを含む。
【００４１】
本明細書に関しては、「〜と複合化させる」という用語は、治療薬、QDまたはQD−コンジュゲートとLSECのような別の要素とをアレンジして１つの集団を形成させることを指す。例えば、QDまたはQD−コンジュゲートとLSECとの複合化は、QDまたはQD−コンジュゲートをLSECと接触させると起こり、またはエンドサイトーシスによりLSEC中に内在化されると起こるだろう。
【００４２】
本明細書全体を通して、文脈が別のものを要求しない限り、「含む」という語または「含む」または「含んでいる」のような変形は、言及された要素、整数または段階の包含を意味するが、その他の任意要素の排除は意味しないものと解釈されるだろう。
【００４３】
本明細書中に含まれている文書、行為、材料、装置、文献のいずれの論述も、単に本発明の文脈を提供する目的のためである。それらの事項の一部または全てが、従来技術ベースの一部を構成する、または本明細書の各請求項の優先権日前に存在したような本発明に関連のある分野における通常の一般知識であったという承認として解釈すべきでない。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】幼若および高齢マウスにおけるLSECフェネストレーションおよび篩板に対するNO依存性経路を標的とする薬物治療の効果。スケールバーは１μmである。
【図２】幼若および高齢マウスにおけるフェネストレーションに対するアクチンまたは脂質ラフトかく乱物質、死受容体プロモーターおよびニコチンアミドモノヌクレオチドの効果。
【図３】（Ａ）幼若および（Ｂ）高齢マウスにおけるフェネストレーション多孔度に対する全ての薬物治療の効果。
【図４】（Ａ）幼若および（Ｂ）高齢マウスにおけるフェネストレーション直径に対する全ての薬物治療の効果。
【図５】（Ａ）幼若および（Ｂ）高齢マウスにおけるフェネストレーション頻度（数／μm2）に対する全ての薬物治療の効果。
【図６】対照およびNMN処置マウスについてのフェネストレーション直径の百分率での頻度のヒストグラム。各データ点は、n＝2のマウスから収集した3390〜4440個のフェネストレーション生データ点の総和を表す。
【図７】Ag2S量子ドットの位相差電子顕微鏡像。スケールバーは200 nmである。
【図８】ボックス内の十分に現像化された光子（Ａ）および約7 nmの平均直径（Ｂ）を示すAg2S QDのハイスループット（高解像度）透過型電子顕微鏡画像。
【図９】15分（Ａ）および１時間（Ｂ）インキュベーション後のAg2S 量子ドットによるLSECの標識。スケールバーは500 nmである。
【図１０】黒色の点として観察できるAg2S 量子ドットによる肝臓切片の標識。スケールバーは500 nmである。
【図１１】幼若および高齢マウスにおける、LSECフェネストレーションの多孔度および頻度に対する薬物治療の効果。（Ａ）幼若マウスにおける薬物治療のサンプルSEM画像。１μmのスケールバーが表示されている。対照画像は、篩板 (*)中に集合したフェネストレーションを示す。ボセンタン、TRAIL、アムロジピン、シルデナフィルおよびサイトカラシンＤ処置は、篩板を維持した。幼若（白色バー）および高齢（灰色バー）マウスに薬物療法を行った後の（Ｂ）フェネストレーション多孔度（％）および（Ｃ）頻度の変化（１μm2当たりの数；灰色のバー）。
【図１２】LSECフェネストレーション直径に影響を与える種々の薬物治療の効果。（ａ）幼若（白色バー）および高齢（灰色バー）マウスにおいて種々の薬物治療により誘発されたフェネストレーション直径の変化。薬物治療：シンバスタチン、ボセンタン、TRAIL、シルデナフィル、アムロジピン、NMN、７−ケトコレステロール、サイトカラシンＤおよびDOI。全ての治療は、溶解した薬物の有無の下でRPMIを使って37℃、5％CO2 で30分間インキュベートした。 10,000倍でのSEM画像を使ってフェネストレーション直径の手動計測を実施した。データは、対照のベースラインに比較した変化率（％）に相対して与えられる。各データ点は、処置あたり616-3312のフェネストレーション生データ点を使った８枚の画像の平均±SDを表す。＜30 nmのフェネストレーションおよび＞300 nmのギャップは全て解析から除外した。* は、幼若対照に比較したP＜0.05を示し； # は高齢対照に比較したP＜0.05を示す。全ての群でn＝3で、群間比較するために事後ダン(Dunn)検定を用いるクラスカル・ワリス検定を使って統計学を実施した。（ｂ）幼若および高齢マウスにおけるNMNと７−ケトコレステロール薬物治療のサンプルSEM画像。１μmのスケールバーが示される。ギャップ（#） (＞300 nm)は、７−ケトコレステロール処置に存在した。NMN処置は篩板を維持したが、一方で７−ケトコレステロール処置は脂質ラフト領域を減少させた。（ｃ）幼若対照（白色バー）、高齢対照（黒色バー）、幼若NMN（薄い灰色）、高齢NMN（濃い灰色）、幼若７−ケトコレステロール（水色）および高齢７−ケトコレステロール（青色）におけるフェネストレーション直径のヒストグラム。データは、表示の瓶範囲内での直径の頻度（％）を使用して与えられる。
【図１３】幼若マウスにおける、多孔度と頻度との間の相関関係、細胞生存率、および多孔度の変化に対する用量応答曲線。（ａ）幼若マウスと高齢マウスにおける、多孔度％と頻度との間の相関プロット。データは全ての処置データ点を示す（各群につきｎ＝３；20個の群）。（ｂ）対照に相対した百分率での細胞生存率。サンプルデータは三重複製にて収集し、エラーバーはSDを示す。(ｃ) フェネストレーションの多孔度％の変化に対する用量濃度曲線。幼若マウスについてのデータが示され、薬物濃度はlog関数として表示される。
【図１４】アクチン細胞骨格、一酸化窒素シンターゼおよびサイクリックGMPに対する薬物治療の効果。（Ａ）幼若マウスにおける種々の薬物治療により促進されるアクチン細胞骨格の形態変化を示す、dSTORM画像。画像は、40,000の画像収集の後に作成され、RapidSTORM ソフトウェア (45)を使って加工された。スケールバーは5μmであり、挿入図はアクチン内部のギャップと個々のフェネストレーションを示している。（Ｂ）幼若マウスにおける薬物治療により誘発されるアクチンデンシトメトリーの変化。データは、１μm2当たりのピクセル密度で棒グラフ（平均±SD）として与えられる。８枚の画像をdSTORM顕微鏡を使ってキャプチャし (サンプル画像がパネルＡに示される）；データ解析はImage Jソフトウェアを使って実行した。細胞全体に渡って取得した測定値を用いて、画像をバイナリデータに変換した。（Ｃ）幼若マウスにおける薬物治療により誘発されたNOSデンシトメトリーの変化。データは１μm2あたりのピクセル密度を用いた棒グラフ（平均±SD）として表した。５枚の画像をdSTORM顕微鏡を使ってキャプチャした；データ解析はImage J ソフトウェアを使って実施した。全細胞に渡って取得した測定値を用いて画像をバイナリデータに変換した。* は、群間比較するために事後ダン(Dunn)検定を伴うクラスカル・ワリス（Kruskal-Wallis）検定を用いたときのP＜0.05を示す。 データは２匹目のマウスにて複製して観察結果を確かめた。（Ｄ）細胞内cGMP、データはpmol/106 で表示され、エラーバーは標準偏差（SD）を示す。アッセイは生物学的複製物を用いて三重反復にて実施した。*** は、群間比較のために事後ダン(Dunn)検定を伴うクラスカル・ワリス検定を用いたときのP＜0.001を示す。（Ｅ）リン酸化NOS（緑）およびNOS（赤）が染色されたLSECの免疫蛍光画像。スケールバー: 30μm。対照、NMNおよびサイトカラシンＤは最小の染色を示し、シルデナフィル処置はリン酸化NOSとNOSの共局在化を亢進した（白の矢印）。
【図１５】肝細胞へのAg2S 量子ドットの局在化。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
実施態様の説明
肝類洞内皮の加齢に伴う偽毛細血管化は、脂質異常症およびインスリン抵抗性に寄与する。健全なLESCは、肝細胞への基質輸送を効率的に亢進するので、血管系の役割は、肝機能とクリアランスの生理学的モデルにおいて通常は無視されている。歴史的に、基質輸送におけるLSECの役割は肝硬変と線維症において研究されており、そこでは加齢とともに、フェネストレーションの喪失が認められる（加齢マウスでは認められない他の変化と関連付けられる）。肝臓病に関連があるフェネストレーションの喪失は、アルブミン、種々の薬物、胆汁酸塩およびリポタンパク質の、内皮輸送と肝クリアランスを減少させ、このことはフェネストレーションの喪失が基質輸送に影響を及ぼし得ることを確証する。
【００４６】
フェネストレーションは直径50-150 nmを有し、カイロミクロン残骸といった小さなリポタンパク質の通過は許容するが、 一方でカイロミクロンや血小板といった大型の粒子は排除する。カイロミクロン残骸の肝クリアランスの障害と、食後高トリグリセリド血症のその臨床兆候に、加齢が関連があるとされている。後者は悪性の心血管または微細血管臨床アウトカムにより密接に関連付けられている。
【００４７】
図１は、典型的な脂質異常症よりも高齢者におけるLSEC心血管アウトカムのフェネストレーションおよび多孔度の加齢性の減少の一例を示す。かん流ラット肝における多重インジケーター希釈法を使って、LSECを横断するリポタンパク質（平均直径53 nm）は、高齢動物の肝ではほとんど完全に廃止された。これは、加齢性の脂質異常症および食後高脂血症のメカニズムを提供し、そのメカニズムは加齢に伴う高脂血症における重要な因子として受け入れられる。本発明者らは、高齢者にフェネストレーション多孔度を維持するための方策が、脂質異常症を緩和できる可能性があり、そして高齢者における心血管および微小血管疾患の予防のための手段を提供すると考えている。
【００４８】
加齢はインスリン抵抗性と、糖尿病のリスクの著しい増加と関連付けられている。かん流肝における多重インジケーター希釈法は、LSECを横断するインスリン輸送が高齢者で損なわれることを確証した。高齢ラットは、インスリン分布の肝容積の有意な減少を示し、これは血管性隙間へのインスリンの制限と一致した。これは、高齢ラットにおいて減少した肝インスリン取込みを示す、インスリンとグルコース取込み研究によって確認された。肝臓のウエスタンブロット分析と蛍光プロテオーム解析は、高齢ラットにおけるインスリン受容体（IRS-1）およびインスリン経路の活性化の、矛盾の無い減少も証明した。グルコース忍容性、恒常性モデル評価指数（HOMA-IR)、インスリン、C-ペプチドおよびグルカゴンの血中濃度は、肝臓におけるインスリン作用の低下が、インスリンとグルコース代謝の全身的機能障害と関連付けられることを示した。これらの知見は、過度にフェネストレーションのあるPDGF-B欠損マウスの別の研究と一致して、肝インスリン輸送においてフェネストレーションが重要であることを明らかに示す。それらのマウスでのフェネストレーションの増加は、経内皮輸送の増加、大幅に低い血中インスリン濃度、インスリンクリアランスの増加およびインスリン感受性の改善と関連していた。
【００４９】
まとめると、これらの研究は、フェネストレーションが肝におけるインスリン輸送を亢進するという有力な証拠を提供する。反対に、加齢に伴う偽毛細血管形成に関連付けられたフェネストレーションの喪失は、類洞血液から肝細胞への内皮を貫通するリポタンパク質とインスリンの輸送を阻害することにより、血管性疾患（すなわち脂質異常症およびインスリン抵抗性）の重要な加齢性リスク因子に寄与する。
【００５０】
別の加齢性変化の不在下でのフェネストレーションの急性喪失は、脂質異常症とインスリン抵抗性を引き起こす。老化は多数の細胞経路の機能障害に至る複雑な過程である。加齢に伴うフェネストレーションの喪失が脂質異常症とインスリン抵抗性の一因となるという仮説を検定するために、本発明者らは、別の加齢性変化の不在下での急性フェネストレーション喪失（defenestration）の影響を評価しようと試みた。これは、単回腹腔内注射の24時間以内にフェネストレーションの30〜80％喪失を引き起こすことが認められた界面活性剤ポロキサマー407（P407）を使って試験した。P407投与は、血中リポタンパク質、特にトリグリセリドおよびカイロミクロン残骸の10倍増加を引き起こし、一方でLSECを貫通する小さなカイロミクロンの移動は阻害しなかった。より最近のインスリン研究では、P407がLSECを横切るインスリンの通過を妨害し、全身性インスリン抵抗性（上昇したHOMA-IR）とともにインスリン受容体基質（IRS-1）のリン酸化の減少を引き起こした。これらの結果は、ヒト肝機能と全身健康状態におけるフェネストレーションの重要な役割を果たす。
【００５１】
肝類洞内皮のフェネストレーションは、脂質ラフトによって制御される。高齢までフェネストレーションを維持するための薬物療法用の新薬開発につながるような標的を開発するために、フェネストレーションとそれらの密度を調節する近接の生物学的過程を更に調査した。フェネストレーションを増加させるために最も有力な既知薬物はVEGFであるが、VEGFはアクチン細胞骨格に対するその効果によって機能を果たすので、様々なアクチン細胞骨格かく乱物質も関連があるとされている。
【００５２】
フェネストレーションを含む篩板（sieve plates）は、膜の肥厚領域（脂質ラフト）の間に介在する。脂質ラフト蛍光染色（Bodipy FL C5ガングリオシドGM1）を使った3D-SIM研究は、篩板と脂質ラフトの間に非常に強い逆分布があり、フェネストレーションと篩板は非ラフト細胞膜にのみ観測されることを示した。
【００５３】
本明細書中に開示される通り、７−ケトコレステロール（脂質ラフトを枯渇させる）および／またはサイトカラシンＤ（アクチンかく乱物質）はフェネストレーションを増加させ、かつラフトを減少させ、一方でTriton X-100はフェネストレーションを減少させラフトを増加させた。重要なことには、アクチンの攪乱が膜ラフトに対するそれの作用によって直接的にフェネストレーションを増加させるとすれば、フェネストレーションに対するサイトカラシンＤの効果はTriton X-100の同時投与により廃止された。VEGFは脂質ラフトを枯渇させ、フェネストレーションを増加させた。
【００５４】
これらの結果は、アクチン細胞骨格および膜ラフトの膜安定化作用が減少すると、内皮細胞の非ラフト領域にフェネストレーションが形成する、という篩−ラフト相互作用モデルと一致している。
【００５５】
いずれの理論に縛られることなく、フェネストレーションに影響を及ぼす物質の大部分が、アクチン細胞骨格に対するそれらの効果〔VEGF、ボセンタンおよびDOI（２，５−ジメトキシ−４−ヨードアンフェタミン）のような血管作用薬〕または脂質ラフトに対する直接効果（７−ケトコレステロール、Triton X-100）のいずれかを介して機能すると考えられる。従って、脂質ラフトまたはアクチン細胞骨格による脂質ラフトの調節は、フェネストレーションに影響を及ぼす治療法のための標的である。
【００５６】
薬物療法を開発する上での基本的な課題は、所望の細胞型または組織に対して活性物質を標的指向する（ターゲティングする）ことである。幸いなことに、LSECは新薬を開発する標的として利用できるユニークな性質を有している。LSECは体内の最も活発で効率的なエンドサイトーシス細胞であり、血液が運ぶ多数の高分子廃棄物（例えばヒアルロナン、免疫グロブリン）のクリアランスを担っている主な細胞型である。LSECはクラスリン被覆小胞および多数のエンドサイトーシス受容体（例えばマンノース受容体、スタビリン受容体、Fcγ受容体IIb2）と共に高密度に密集して存在する。このエンドサイトーシス機構は、内因性および外因性廃棄物（全ての生物学的高分子の主要クラスを含む）の取り込みと分解にとって非常に効率的である。
【００５７】
本発明者らは、7 nm CdTe/CdS (テルル化カドミウム／硫化カドミウム）量子ドットが、数時間の投与の間、LSECによりほとんど排他的に取り込まれることを発見した。しかしながら、カドミウムベースの量子ドットに関連する主な課題は、それらの毒性である。
【００５８】
本明細書中に開示される通り、CdTe/CdS量子ドットよりも毒性がかなり低い、銀カルコゲニドベースの量子ドットが、LSECを標識しまたは標的指向するために用いられている。特に、LSECのフェネストレーションの多孔度および頻度を変更する治療薬を、銀カルコゲニドベースの量子ドットと接合させることができ、そして肝臓に標的を指し向けることができる。
【００５９】
要約すれば、本発明者らは、単独のまたは治療薬と接合させたAg2S量子ドットを使用してLSECをターゲティングすることにより、LESCおよびそのフェネストレーションの加齢性変化に関連したリポタンパク質とインスリン活性の加齢性変化を変更する方法を確立した。本発明者らは、様々な未結合の治療薬がLSECフェネストレーションの加齢に伴う変化を調節するのに有用であることも確立した。
量子ドット
【００６０】
量子ドット（QD）は、典型的には50 nm付近までの平均直径を有する微小な半導体粒子であり、それらは、小さいサイズがゆえに、同じ物質の大型粒子とは異なる光学的および電気的性質を有する。LSECのユニークな特徴は、QDがエンドサイトーシスによってLSECに取り込まれることである。従って、任意のタイプのQDが本明細書に記載の方法と組成物に使用できる。例えば、量子ドットはコア型QD、コア／シェル型QD、または合金QDであることができる。幾つかの実施形態では、QDは好ましくはヒトに対して無毒性であり、または限定された毒性を有する。
【００６１】
幾つかの実施形態では、QDは重金属不含有である。例えば、重金属不含有のQDは、Ag2S、InP/ZnS (リン化インジウム／硫化亜鉛）またはCuInS/ZnS（硫化銅インジウム／硫化亜鉛）QDである。
コア型量子ドット
【００６２】
量子ドットは、例えば、カドミウム、鉛または亜鉛のような金属のカルコゲニド（セレン化物、硫化物またはテルル化物）、例えばCdTe (テルル化カドミウム）またはPbS (硫化鉛)のような、均一な分子内組成を有する単一成分の物質であることができる。
コア／シェル型量子ドット
【００６３】
量子ドットはコア／シェル型QDであることができる。コア／シェル型QDは当業界で既知の任意方法により調製することができる。そのような方法は、典型的には、コアの周囲にバンドギャップの大きい半導体のシェル（保護層）の結晶を成長させることを含む。例えば、コア／シェル型QDは、コアにCdSeを有しシェルにZnSを有する。量子ドットをシェルで被覆することは、非放射性組換え部位を保護する（不動態化する）ことにより量子収率を改善し、処理条件に対してよりロバスト（堅牢）にする。 幾つかの実施形態では、毒性物質を含むコアの周囲に非毒性のシェルを積層させることができる。
合金量子ドット
【００６４】
量子ドットは、多数の物質を含む合金QDであることができる。合金QDは、バンドギャップエネルギーの異なる２種類の半導体を一緒に合金化することによって形成される。その２種の半導体は、それらのバルク相当物の性質と異なるだけでなく、それらの親の半導体のものとも異なる、興味深い性質を示す。例えば、組成がCdSxSe1-x/ZnS の合金量子ドットを本明細書に記載の方法および組成物に使用することができる。
QDの調製
【００６５】
QDは、本明細書に記載の組成物と方法における使用のために用意または作製することができる。QDの調製には任意の方法を使用でき、例えばコロイド合成、プラズマ合成、成形加工、および電気化学的アセンブリが挙げられる。
コロイド合成
【００６６】
コロイド合成は、前駆体物質の溶液を、該前駆体を熱分解させてモノマーを形成させるのに十分な高温に加熱し、次いで該モノマーの核を形成させてナノ結晶を作製することを含む。温度は、QDの形成と成長にとって最適な条件を決定する上で重要な因子であり、温度は、結晶成長を可能にしながら原子の再配列とアニーリングを許容するのに十分な程高くなければならない。モノマーの濃度も結晶成長の間コントロールされなければらない。
【００６７】
硫化鉛、セレン化鉛、セレン化カドミウム、硫化カドミウム、テルル化カドミウム、ヒ化インジウム、リン化インジウム、硫化銀、および硫化セレン化カドミウムのQDを作製するためにはコロイド法がある。それらのQDは100〜100,000原子ほどの少数の原子を含み、約1、2、3、4、5、6、7、8、9または約10 nmの直径を有しうる。
【００６８】
QDの大量バッチは、コロイド合成を介して合成でき、それによって商業用途に適した量でQDを生産することが可能である。
プラズマ合成
【００６９】
QDは、イオン・スパッタリング（ion sputtering）およびプラズマ化学気相成長法（PECVD）のような既知のプラズマ技術によって製造することもできる。例えばCuInSe2、ZnO、Si、SiC、GaAs、GaSbのQDはイオン・スパッタリング法により製造でき、そしてSi、Ge、GaNおよびInPのQDはPECVD法により製造できる。
成形加工
【００７０】
本明細書に記載の組成物および方法に有用なQDは、自己集合によって作製することもできる。幾つかの実施形態では、そのようなQDは約5 nm 〜約50 nmの平均直径を有する。幾つかの実施形態では、QDは、リソグラフィーでパターン描写されたゲート電極によって、または半導体のヘテロ構造に二次元電子ガスでエッチング加工を施すことにより、輪郭を定めることができる。
【００７１】
幾つかの実施形態では、QDは自己集合性であってよい。例えばQDは、ある物質を、それと格子整合されていない基板上で成長させた時、分子線エピタキシー（MBE）および有機金属気相成長エピタキシー（MOVPE）の間に一定の条件下で自然に核となることができる。生じたひずみ（strain）は、二次元の湿潤層の上のコヒーレントにひずんだアイランドを生成する。続いてこのアイランドを埋め込んで量子ドットを形成させることができる。
【００７２】
個々の量子ドットは、遠隔にドープ塗料が塗られた量子ウェルまたは格子量子ドットと呼ばれる半導体ヘテロ構造中に存在する二次元電子または正孔ガスから作製することができる。サンプル表面はレジストの薄層で被覆される。次いで格子パターンが電子線リソグラフィーによりレジスト中に規定される。次いでこのパターンを、エッチング加工により、または外部適用を可能にする金属電極を正確に配置することにより、電子または正孔ガスに転写することができる。
電気化学的集合
【００７３】
QDの規則配列は、電気化学的技術により自己集合させることができる。これらの方法では、電解液−金属界面でイオン反応を発生させて、金属上で量子ドットを含むナノ構造の自己集合を引き起こし、次いでそれを特定の基板上でナノ構造体をメサ・エッチング加工するためのマスクとして使用することにより、鋳型が製造される。
【００７４】
上記方法のいずれかにより製造されたQDは、非毒性化合物により被覆または保護することができる。例えば、硫化鉛QDは、オレイン酸、オレイルアミンおよびヒドロキシルリガンドの少なくとも１つで保護することができる。保護は、本明細書中に記載のQD−コンジュゲート（接合体）を作製するために治療薬と結合することができる基を提供するためにも使用できる。
硫化銀（Ag2S）量子ドット
【００７５】
硫化銀 (Ag2S) 量子ドットは、哺乳動物に対して毒性が低いかまたは無毒性であり、更に近赤外蛍光を有することがある。Ag2S量子ドットは疎水性であり、そのため治療方法にまたは治療薬との接合に利用可能にするには機能化（すなわち疎水性形態から親水性形態へと変換）する必要がある。Ag2S量子ドットは、改変するのが難しい超格子構造を有する。
【００７６】
QDは、1) 銀供給源と長鎖チオールから疎水性硫化銀量子ドットを調製する段階；および2) 硫化銀量子ドットの表面が親水性基と結合するように、極性有機溶媒中でその量子ドットを等量のまたは過剰量の有機硫黄化合物、チオールまたはメルカプト含有親水性試薬により機能化する段階を含む、二段階法で調製される。
【００７７】
銀供給源と長鎖チオールを反応させて疎水性硫化銀量子ドットを得る。次いで調製されたその疎水性硫化銀量子ドットを、硫黄含有親水性試薬によって表面を機能化する。
疎水性硫化銀量子ドットの調製
【００７８】
疎水性硫化銀量子ドットの調製は、次の段階を含む：
1) 銀供給源と長鎖チオールとを含む混合反応系を、密閉環境において50〜400℃の反応温度に加熱し、約１〜10またはそれ以上の時間の反応時間に渡り反応させ；そして
2) 前記反応系を室温に冷却し、次いで極性溶媒を添加し、遠心分離し、そして洗浄して疎水性量子ドットを得る。
【００７９】
銀供給源は、ジエチルジチオカルバメート、硝酸銀、ジエチルジチオカルバミン酸銀、ジヒドロカルビルジチオリン酸銀、ジオクチルスルホコハク酸銀、チオ安息香酸銀、酢酸銀、ドデカン酸銀、テトラデカン酸銀、およびオクタデカン酸銀の１または複数であり得る。
【００８０】
長鎖チオールは、オクタンチオール、ウンデカンチオール、ドデカンチオール、トリデカンチオール、テトラデカンチオール、ペンタデカンチオール、ヘキサデカンチオール、オクタデカンチオール、エイコサンチオール、ヘキサンチオール、１，６−ヘキサンジチオール、および１，８−オクタンジチオールの１つまたは複数であり得る。
【００８１】
反応温度は約50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375または約400℃であり得る。
【００８２】
混合反応系は、約5〜50℃／分の速度で反応温度にまで加熱することができる。例えば加熱速度は約5、10、15、20、25、30、35、40、45または50℃／分であり得る。
【００８３】
段階２において添加される極性溶媒は、エタノール、メタノール、アセトンおよび１−メチル−２−ピロリドンまたはそれの任意組み合わせのいずれか１つであることができる。
【００８４】
一実施形態では、加熱前に混合反応系から酸素が実質的に除去される。これは、例えば反応系を真空下に置き、窒素または他の気体またはその両者の組み合わせでパージすることによって達成することができる。一実施形態では、混合反応系は、反応時間の間、窒素または他の気体のもとに維持される。
【００８５】
反応時間は約1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10時間またはそれ以上の時間であることができる。
【００８６】
本明細書に記載の方法によって調製された疎水性Ag2S量子ドットは、単斜晶構造を有し、約2 nm、3 nm、4 nm、5 nm、6 nm、7 nm、8 mn、9 nmまたは10 nmの平均直径を有する。
機能化
【００８７】
本明細書に開示されるAg2S QDは、その表面に親水性基を結合させることで機能化することができる。親水性基は、メルカプトもしくはチオール含有親水性試薬、または有機硫黄化合物、例えばα−リポ酸（チオクト酸）、システインもしくはメチオニンから誘導される。親水性試薬は、メルカプト含有親水性試薬、例えばメルカプト酢酸、メルカプトプロピオン酸、システイン、システアミン、チオクト酸およびメルカプト酢酸アンモニウムまたはそれの任意組み合わせであることができる。別の実施形態では、親水性試薬はアルカンチオールのようなチオール含有親水性試薬であり得る。アルカンチオールはオクタンチオール、ドデカンチオール、tert−ドデカンチオール、エイコサンチオールまたはその任意組み合わせであることができる。別の実施形態では、親水性試薬は有機硫黄化合物、メルカプトおよびチオール含有親水性試薬の任意組み合わせであることができる。別の実施形態では、親水性試薬はチオクト酸である。
【００８８】
一実施形態では、親水性試薬のモル数は、疎水性硫化銀量子ドットのものより大きいかまたはそれに等しい。親水性試薬：疎水性硫化銀量子ドットのモル数の比は、調製過程の間の実際の必要条件に応じて調整することができる。
【００８９】
機能化は極性溶媒中で起こる。例えば極性有機溶媒は、シクロヘキサン、エタノール、メタノール、アセトンおよび１−メチル−２−ピロリドンおよびその任意組み合わせのいずれか１つであり得る。
【００９０】
一実施形態では、疎水性QDが極性有機溶媒中に分散され、そして親水性試薬が添加され、この混合系を約１〜80℃にて約1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10以上の時間に渡り反応させておく。
【００９１】
反応温度は約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、または80℃であることができる。
【００９２】
幾つかの実施形態では、混合系は反応の間、連続的にまたは断続的に音波処理することができる。
【００９３】
本明細書に記載の方法によって調製された機能化Ag2S QDは、単分散であり、凝集せず、親水性であり、安定であり、かつ肝細胞を標識するためまたはターゲティングするために使用することができる。特に、実施例７を参照すると、Ag2S QDは肝臓、特にLSECをターゲッティングする。幾つかの実施形態では、Ag2S QDsはLSECを特異的に標識する。
治療薬コンジュゲート
【００９４】
７−ケトコレステロールとサイトカラシンＤのようなある種の化合物は、LSECフェネストレーションの多孔度を増加させることが知られている。加えて、シルデナフィルやアムロジピンのような他の治療薬も、フェネストレーションの多孔度、頻度および直径の少なくとも１つを調節することが本明細書中で立証される。LSECフェネストレーションを調節することによって加齢に伴う疾患または老化を治療することに関して、そのような化合物の全身投与は、不必要なまたは望ましくない治療効果を伴うことがある。従って、治療薬とAg2S QDのコンジュゲートを使ってLSECに治療薬をターゲティングし、不必要なまたは望ましくない治療薬の副作用を回避することが有利である。
【００９５】
標準的なコンジュゲート形成化学は、機能化されたAg2S QDを治療薬にコンジュゲートする（接合する）ために利用することができる。治療薬−QDコンジュゲートの調製は、QDを提供し、カップリング剤を提供し、治療薬またはその誘導体を提供し、そしてその混合物をインキュベートして粗製の治療薬−QDコンジュゲートを形成させるという段階を含む。あるいは、機能化されたAg2S QDをカップリング剤と反応させた後、治療薬を添加してもよい。
【００９６】
次いで粗製治療薬−QDコンジュゲートを、例えばろ過または遠心分離によって精製し、本明細書に記載の方法に用いるのに適当な治療薬−QDコンジュゲートを得ることができる。
【００９７】
幾つかの実施形態では、治療薬は疎水性Ag2S QDに直接連結される。別の実施形態では、治療薬はQDを親水性にし、生体適合性にし、またはその両性質にするために用いられる有機層を介して機能化Ag2S QDに接合される。
【００９８】
治療薬は、アミド結合またはエステル結合を介して機能化Ag2S QDに接合することができる。しかしながら、別の結合を形成させてもよい（例えば共有結合または非共有結合の両結合）ことを理解すべきである。一実施形態では、治療薬は共有結合的に、物理的に、イオン結合により、またはファンデルワールス力の相互作用により、機能化Ag2S QDに接合されてよい。結合はアミド、エステル、チオエステルまたはチオール基によって形成させることができる。
【００９９】
治療薬を機能化Ag2S QDに複合化するために標準条件を使用できる。例えば、複合化（機能化Ag2S QDのカップリング剤への結合、または官能化Ag2S QDとカップリング剤および治療薬とのカップリング）は、約５分から約12時間までの時間に渡って緩衝液中で行われ得る。例えばカップリングは約５分、10分、20分、30分、40分、50分、１時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間または約10時間の時間に渡り起こり得る。。カップリング条件の温度は、約１℃から約100℃までであってよい。例えば温度は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99℃または約100℃であってよい。
【０１００】
複合化条件は、反応の間一定であっても変化してもよい。例えば反応を定温で行うことができ、または反応の間温度を変化させてもよく、または１以上の条件において段階的変化を使って反応を進めてもよい。
【０１０１】
カップリング剤は、QD上のカルボキシル機能と、治療薬上のカルボキシルまたはアミド末端基のいずれかとの間に、アミド基またはエステル基を形成させるために使用できる。リンカーまたはカップリング剤としては、ベンゾトリアゾリルオキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩（BOP）およびカルボジイミド、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、ジイソプロピルカルボジイミド（DIC)、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（EDC）、Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド、およびスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンアミドが挙げられる。
【０１０２】
一実施形態では、カップリング剤はNHC、EDCまたはその両方である。
【０１０３】
一実施形態では、カルボキシル末端基を有する量子ドットと治療薬とを、溶媒中で混合することができる。その混合物にNHSのようなカップリング剤を添加することができる。反応混合物を高温にてインキュベートすることができる。粗製の治療薬−QDコンジュゲートを精製に供し、本明細書中に記載の製剤と方法に使用できる治療薬−QDコンジュゲートを得ることができる。
【０１０４】
標準的な固体状態精製法を用いて、不要な試薬から治療薬−QDコンジュゲートを分離することができる。例えば過剰の未反応の治療薬とNHSを除去するために、適当な溶媒を使ったろ過と洗浄の数回のサイクルが必要かもしれない。代替的にまたは付加的に、治療薬−QDコンジュゲートを遠心分離によって沈殿させ、適当な溶媒中に再懸濁することができる。
【０１０５】
適当な溶媒には、水または緩衝生理食塩水、例えばリン酸塩緩衝生理食塩水のような任意の生体適合性液体が含まれる。
治療薬
【０１０６】
任意の治療薬を疎水性Ag2S QDまたは機能化Ag2S QDsに複合化することができる。
【０１０７】
治療薬はエンドセリン受容体拮抗薬であることができる。例えば、エンドセリン受容体拮抗薬は、ボセンタン（Tracleer（登録商標））、シタキセンタン、アンブリセンタン、アトラセンタン、BQ-123、ジボテンタン、マシテンタン、テゾセンタン、BQ-788、192621およびエドネンタンを含む群より選択することができる。一実施形態では、エンドセリン受容体拮抗薬はボセンタンである。
【０１０８】
治療薬はホスホジエステラーゼ（PDE）阻害薬であることができる。例えば、PDE阻害薬は、アミノフィリン、IBMX (３−イソブチル−１−メチルキサンチン）、パラキサンチン、ペントキシフィリン、テオブロミン、テオフィリン、メチル化キサンチン、ビンポセチン、EHNA（エリスロ−9−(2−ヒドロキシ−3−ノニル）アデニン）、BAY 60-7550（2−[(3,4−ジメトキシフェニル）メチル］−7−［ (1R)−１−ヒドロキシエチル］−4−フェニルブチル］−５−メチルイミダゾ［5,1-f］［1,2,4］トリアジン−4(1H)−オン）、オキシンドール、PDP（9−(6−フェニル−2−オキソヘキサ−3−イル）−2−(3,4−ジメトキシベンジル）プリン−6−オン）、イナムリノン、ミルリノン、エノキシモン、アナグレリド、シロスタゾール、ピモベンダン、メセンブレノン、ロリプラム、イブジラスト、ピクラミラスト、ルテオリン、ドロタベリン、ロフルミラスト、アプレミラスト、クリサボロール、シルデナフィル、シルデナフィルの活性類似体、タダラフィル、バルデナフィル、ウデナフィルアバナフィル、ジピリダモール、イカリイン、4−メチルピペラジン、およびピラゾロピリミジン−7−1、およびパパベリンから成る群より選択され得る。
【０１０９】
一実施形態では、PDE阻害薬は、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、ウデナフィルアバナフィルのうちの１または複数である。別の実施形態では、PDE阻害薬はシルデナフィルである。
【０１１０】
治療薬はカルシウムチャネル遮断薬であることができる。例えば、カルシウムチャネル遮断薬は、アムロジピン、アラニジピン、アゼルニジピン、バルニジピン、ベニジピン、シルニジピン、クレビジピン、エフォニジピン、フェロジピン、イスラジピン、ラシジピン、レルカニジピン、マニジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニルバジピン、ニモジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン、プラニジピン、フェンジリン、ガロパミル、ベラパミル、ジルチアゼム、ミベフラジル、ベプリジル、フルナリジン、およびフルスピリレンを含む群より選択され得る。
【０１１１】
一実施形態では、カルシウムチャネル遮断薬は、アムロジピン、アラニジピン、アゼルニジピン、バルニジピン、ベニジピン、シルニジピン、クレビジピン、エフォニジピン、フェロジピン、イスラジピン、ラシジピン、レルカニジピン、マニジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニルバジピン、ニモジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン、プラニジピン、フェンジリンを含む群より選択され得る。別の実施形態では、カルシウムチャネル遮断薬はアムロジピンである。
【０１１２】
治療薬はアクチンかく乱物質または脂質ラフトかく乱物質であることができる。適当なアクチンかく乱物質の例はサイトカラシン、ラトランクリン、ジャスプラキノリド、ファロイジン、スウィンホリドである。幾つかの実施形態では、サイトカラシンはサイトカラシンA、B、C、D、E、F、H、G、J またはその任意組み合わせから選択される。一実施形態では、サイトカラシンはサイトカラシンDである。
【０１１３】
適当な脂質ラフトかく乱物質の例は、フィリピン、７−ケトコレステロール(7KC)、メチル−β−シクロデキストリンである。
【０１１４】
別の適当な治療薬としては、TNF関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）およびニコチンアミドアデニンモノヌクレオチド（NMN）が挙げられる。
【０１１５】
治療薬は5−HT受容体作動薬であることができる。例えば、5−HT受容体作動薬治療薬は、2,5−ジメトキシ−4−ヨードアンフェタミン (DOI)、ビラゾドン (viibryd)、フレシノキサン、ゲピロン、ハロペリドール、イプサピロン、ケチアピン、トラゾドン、ヨヒンビン、タンドスピロン、アリピプラゾール、アセナピン、ブスピロン、ボルチオキセチン、ジプラシドン、メチルフェニデート、ジヒドロエルゴタミン、エルゴタミン、メチセルギド、アルモトリプタン、エレトリプタン、フロバトリプタン、ナラトリプタン、リザトリプタン、スマトリプタン、ゾルミトリプタン、ヨヒンビン、ラスミジタン、ナラトリプタン、ブフォテニン、エゴノビン、リスリド、LSD、メスカリン、ミリスチシン、プシロシン、プシロシビン、フェンフラミン、MDMA、ノルフェンフラミン、メチルフェニデート、エルゴノビン、ロルカセリン、タゾドン、メチル-5-HT、キパジン、シニタプリド、シサプリド、ダゾプリド、メトクロプラミド、モサプリド、プルカロプリド、レンザプリド、テガセロド、ザコプリド、エルゴタミンおよびバレレン酸を含む群より選択され得る。
治療用途
【０１１６】
肝内皮には有意な加齢に伴う変化が存在する。例えば、肝臓の微小血管は、肝類洞において肝細胞と血液の間の基質の双方向性交換を亢進するユニークな形態を有している。肝類洞内皮細胞（LSEC）の細胞質への伸長は非常に薄く、フェネストレーションとして知られる細胞貫通孔によって穿孔されている。LSECの表面の2〜20％がフェネストレーションにより占められ、それらのフェネストレーションは内皮表面を横断して個別に散在しているかまたは篩板（sieve plate）と呼ばれる集合体へとクラスター化されている。隔壁または下層の基底膜は全く存在しないので、フェネストレーションは、LSECを非常に効率的なろ過システムである「篩」へと変容させ、それはサイズ閾値の範囲内の溶解した粒状基質のスムーズな移動を可能にする。それらの並外れた効率のため、フェネストレーションは健全な正常肝における基質移動に及ぼす影響が小さい。
【０１１７】
肝類洞の細胞：LSEC、星細胞およびクッパー細胞では全て、顕著であるが一定の加齢に伴う機能低下と構造変化が認められる (Le Couteur, DG他、2008. Old age and the hepatic sinusoid. Anat Rec (Hoboken) 291: 672-83)。最も顕著には、高齢者のLSECは多孔度（フェネストレーションにより穿孔されたLESC表面積の％）が約50％ほど著しく減少し、LESCの横断面の厚さに同様な50％増加を伴う。これらの形態学的変化は、フォン・ヴィレブランド病因子、ICAM-1、ラミミン、カベオリン−1、および種々のコラーゲンをはじめとする多数の血管タンパク質の発現変化を伴った。この加齢に伴う「偽毛細血管化（pseudocapillarization)」は、ラット、マウス、非ヒト霊長類およびヒト並びにトランスジェニックのベルナー症候群（早期老化）マウスにおける、老化の特徴である。
【０１１８】
QD、そのコンジュゲートまたは組成物は、内皮細胞、特に肝類洞内皮細胞（LSEC）におけるフェネストレーションの多孔度、直径および頻度の１または複数を調節するために対象に投与することができる。従って、一実施形態では、フェネストレーションの多孔度、直径および頻度の１つまたは複数を調整する方法が提供される。
【０１１９】
一実施形態では、減少したLSEC、フェネストレーションの多孔度、直径および頻度のうちの１または複数に関連した疾患または状態の治療方法であって、Ag2S QD−治療薬コンジュゲートまたはその組成物の有効量を前記対象に投与することを含む方法が提供される。
【０１２０】
幾つかの実施形態では、対象がヒトである。
【０１２１】
幾つかの実施形態では、対象が加齢に伴う疾患または状態を罹患している。
【０１２２】
加齢に伴う疾患は、年齢が高くなるにつれて増加する頻度で最も頻繁に見られる任意の疾患または状態であり、それらは１または複数の臓器の機能低下といった老化過程の結果を含み得る。加齢に伴う疾患の例としては、アテローム性動脈硬化症、心血管疾患、関節炎、白内障、加齢性黄斑変性症、難聴、骨粗しょう症、骨関節炎、２型糖尿病、高血圧、パーキンソン病、認知症、アルツハイマー病、肝微小循環の加齢に伴う変化、加齢性脂質異常症、インスリン抵抗性、脂肪肝、肝線維症、および肝硬変が挙げられる。
【０１２３】
本明細書中に記載のQD、治療薬および治療薬コンジュゲートは、担体、ビヒクルおよび希釈剤といった１または複数の薬学的に許容される賦形剤と共に、化合物の薬学的有効量を含む製剤として、投与することができる。ここでの「賦形剤」という用語は、治療薬を対象に送達させるための希釈剤、補助剤またはビヒクルとして使用されるか、あるいは取り扱いや保管性を高めるため、または経口、非経口、皮内、皮下もしくは局所適用に適当な錠剤、カプセル剤といった固形剤形または液剤もしくは懸濁液剤の形成を許容または促進するために医薬組成物に添加される任意物質を意味する。賦形剤としては、例示の目的であって限定のためでなく、希釈剤、崩壊剤、結合剤、接着剤、湿潤剤、ポリマー、滑沢剤、流動促進剤、安定化剤、および望ましくない味または臭いを隠すまたは中和するために加えられる物質、香味剤、色素、香料、並びに組成物の外観を良くするために加えられる物質が挙げられる。許容される賦形剤としては（限定されないが）、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウム塩およびカルシウム塩、炭酸マグネシウム、タルク、ゼラチン、アカシアゴム、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、デキストリン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、スクロース、でんぷん、ゼラチン、セルロース系材料、例えばアルカン酸のセルロースエステルおよびセルロースアルキルエステル、低融点ワックス、ココアバターまたは粉末、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールおよびポリエチレングリコールのようなポリマー、並びに他の薬学的に許容される物質が挙げられる。賦形剤およびそれらの使用の例はRemington's Pharmaceutical Sciences, 第20版(Lippincott Williams & Wilkins, 2000)中に記載されている。賦形剤の選択は、投与の特定様式、溶解度および安定性に対する賦形剤の効果、並びに剤形の性質といった多数の因子に大きく依存するだろう。
【０１２４】
本明細書に記載のQD、治療薬および治療薬コンジュゲートは、経口、注射用、直腸、非経口、皮下、静脈内または筋肉内投与のために製剤化することができる。特定の製剤の非限定例としては、錠剤、カプセル剤、カプレット、粉剤、粒剤、注射剤、アンプル、バイアル、すぐ使用できる液剤または懸濁液剤、凍結乾燥製剤、坐剤およびインプラントが挙げられる。錠剤やカプセル剤のような固体製剤は、上述したような多数の適当な薬学的に許容される賦形剤または担体を含むことができる。コンジュゲートは、持続性送達（徐放）のために製剤化されてもよい。
【０１２５】
経口投与用の錠剤およびカプセル剤は、単位用量剤形であってよく、常用の賦形剤、例えば結合剤、例えばアカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、またはポリビニルピロリドン；充填剤、例えばラクトース、糖類、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウム、ソルビトールまたはグリシン；錠剤化のための滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコールまたはシリカ；崩壊剤、例えばポテトスターチ；または許容可能な湿潤剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムを含むことができる。錠剤は、通常の製薬プラクチスにおいて周知である方法に従ってコーティングを施すことができる。
【０１２６】
経口液体製剤は、例えば、水性または油性懸濁液剤、液剤、乳剤、シロップ剤またはエリキシル剤の形であることができ、あるいは使用前に水または他の適当なビヒクルでの再構成のための乾燥品として提供することができる。そのような液体製剤は、従来の添加剤、例えば懸濁化剤、例えばソルビトール、メチルセルロース、グルコースシロップ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル、または水素化食用油脂、乳化剤、例えばレシチン、ソルビタンモノオレエート、またはアカシア；非水性ビヒクル（食用油を含む）、例えば落花生油、油性エステル、例えばグリセリン、プロピレングリコールまたはエチルアルコール；保存剤、例えばｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピル、またはソルビン酸；および所望であれば、常用の着香剤または着色剤を含有することができる。
【０１２７】
静脈内、筋肉内、皮下または腹腔内投与をはじめとする非経口投与には、QD、コンジュゲートおよび／または治療薬を無菌ビヒクル、典型的には、好ましくは対象の血液と等張である無菌水溶液と組み合わせることにより、液状の単位投与形態を調製することができる。使用するビヒクルおよび濃度に依存して、治療薬またはコンジュゲートはビヒクル中にまたは他の適当な溶媒中に懸濁または溶解することができる。溶液を調製する際に、治療薬またはコンジュゲートを注射用水に溶解させ、そして滅菌濾過したのち、適当なバイアルまたはアンプル中に充填しそして密封することができる。有利には、局所麻酔薬、保存剤、緩衝剤のような剤をビヒクル中に溶解することができる。安定性を高めるために、バイアル中に充填する前に組成物を凍結し、真空中で水を除去することができる。次いで凍結乾燥粉末をバイアル中に密封し、付属の注射用水のバイアルを供給して使用前に液体を再構成することができる。非経口懸濁液は、コンジュゲートを溶解する代わりにビヒクル中に懸濁させ、そしてろ過による滅菌を実施しないことを除き、実質的に同じ方法で調製することができる。コンジュゲートは、無菌ビヒクル中への懸濁前に、エチレンオキシドへの暴露によって滅菌することができる。化合物の一様分布を促進するために界面活性剤または湿潤剤を該組成物に含めることが可能である。
【０１２８】
治療薬、QDまたはQD−治療薬コンジュゲートは、局所的にまたは経皮経路により、例えば経皮パッチを使うことにより投与することができる。幾つかの実施形態では、経皮投与は、投薬レジメンを通して連続投与を達成するために用いられる。適当な経皮製剤は、治療薬、QDまたはQD−治療薬コンジュゲートを、チキソトロピーまたはゼラチン様キャリア、例えばセルロース系媒体、例えばメチルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロース中に組み込み、得られた製剤を、次いで対象の皮膚との皮膚接触で確実に固定するのに適合した経皮装置にパックすることができる。
【０１２９】
投与される治療薬またはコンジュゲートの治療的有効量、および本発明のコンジュゲートおよび／または医薬組成物による病的状態を治療するための投薬レジメンは、対象の年齢、体重、性別および病状、疾患の重症度、投与の経路および頻度、使用される特定のコンジュゲート、並びに処置される個体の薬物動態特性（例えば吸収、分布、代謝、排泄）をはじめとする、様々な要因に依存し、そのため広範囲に渡り異なり得る。そのような治療は、治療する医師によって必要と判断される期間に渡っておよび必要な頻度で施され得る。当業者は、投薬レジメンまたは投与すべき化合物の治療的有効量が各個人に合わせて最適化されなければならないことを認識するだろう。
【０１３０】
組成物は、約0.1 mg〜2000 mgの範囲内、典型的には約0.5 mg〜500 mgの範囲内、より典型的には約1 mg〜200 mgの範囲内で治療薬またはコンジュゲートを含むことができる。約0.01 mg/kg〜100 mg/kg体重、典型的には約0.1 mg/kg〜約50 mg/kg体重の１日量が適当であるが、これは投与の経路と頻度に依存する。１日量は典型的には１回または複数回、例えば１日あたり２回、３回または４回で投与されるだろう。
【０１３１】
上記に言及した通り、本明細書中に記載の治療薬またはコンジュゲートの投与により、内皮細胞、特に肝類洞内皮細胞（LSEC）におけるフェネストレーションの多孔度、直径および頻度の１つまたは複数を調節する方法が提供される。
【０１３２】
一実施形態では、本明細書に開示される方法は、内皮細胞、例えばLSEC中のフェネストレーションの多孔度を処置前の平均多孔度に比較して、5％、10％、15％、20％、35％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、または少なくとも100％増加させる。
【０１３３】
別の実施形態では、当該方法は内皮細胞、例えばLSEC中のフェネストレーション頻度を、処置前の平均フェネストレーション頻度に比較して5％、10％、15％、20％、35％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、または少なくとも100％増加させる。
【０１３４】
一実施形態では、当該方法は内皮細胞、例えばLSEC中のフェネストレーションの平均直径を5％、10％、15％、20％、35％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％または少なくとも100％増加させる。
【０１３５】
幾つかの実施形態では、高齢対象におけるフェネストレーションの多孔度、直径および頻度の少なくとも１つが、健常な非高齢対象において見られるレベルに回復されるかまたはそのレベルに維持される。
【０１３６】
高齢対象は45歳齢またはそれより高齢である対象である。幾つかの態様では、高齢対象は40歳齢またはそれより高齢である対象である。
【０１３７】
本明細書中に記載の治療薬またはコンジュゲートは、本明細書中に記載の医薬担体、希釈剤または賦形剤と一緒に投与することができる。あるいは、または加えて、治療薬またはコンジュゲートは、他の剤、例えば別の治療薬と組み合わせて投与することができる。
【０１３８】
本明細書に記載の治療薬または治療薬コンジュゲートと１もしくは複数の別の薬剤との使用を定義する上で用いられる用語「併用療法」または「補助療法」は、薬物の組み合わせの有益な効果を提供するであろうレジメンで、連続方式で各剤を投与することを包含する意味であり、そして実質的に同時方式で、例えばそれらの活性剤の固定比を有する単一製剤中で、または各剤の別々の複数製剤において、それらの剤を同時投与することも同様に包含する意味である。
【０１３９】
様々な実施態様によれば、複数のコンジュゲートを１もしくは複数の別の治療薬と併用して製剤化または投与することができる。よって、幾つかの実施形態では、１もしくは複数のコンジュゲートを別の既知治療または治療薬および／または補助薬または予防薬との併用療法レジメンに含めることができる。
【０１４０】
多数の剤が商業用途、臨床評価および前臨床研究開発に利用可能であり、それらは老化の治療または加齢に伴う疾患の治療のために選択することができる。
【０１４１】
併用療法に使用することができる適当な剤は、当業者に十分理解されるだろう。適当な剤は、例えば、Merck Index、An Encyclopaedia of Chemicals、Drugs and Biologicals 第12版1996年中に列挙されており、その全内容が参考により本明細書中に援用される。
【０１４２】
例えば、加齢に伴う疾患の治療、またはフェネストレーションの喪失を有する別の疾患の治療に用いる場合、本明細書に記載の治療薬コンジュゲートまたは治療薬は、追加の剤と共に投与することができる。
【０１４３】
併用レジメンは、活性剤を各場合に適当なように、活性剤を一緒に、連続的に、または間隔を空けて投与することを含み得る。本明細書に記載のQDとコンジュゲートを含む活性剤の組み合わせは、相乗的であることができる。
【０１４４】
本明細書に記載のQDとコンジュゲートの併用投与は、QDまたはコンジュゲートが別の活性剤と同じ単位用量中に存在することによって達成することができ、または投薬レジメンもしくはスケジュールに従って同時に、または同様な時点で、または異なる時点で投与される個々の別個の単位用量中に、QDもしくはコンジュゲートと１以上の別の活性剤とが存在してもよい。連続投与は、必要な場合は任意の順序であることができ、そして特に累積効果または相乗効果が望ましい場合には、第一または最初の化合物の継続中の生理的効果を、第二または後続の化合物を投与する時にも続行することを必要としうる。
【０１４５】
本発明の実施形態は、例示のためにのみ提供され、決して本発明の範囲を限定するものと見なされるべきでない実施例を参照して、より詳細に以下に論じることにする。
実施例
実施例１：LSEC形態のフェネストレーションの可視化
【０１４６】
インビトロLSECの形態学を研究するために、走査型電子顕微鏡（SEM）を使用した。幼若および高齢マウスから培養した初代LSECのLSECフェネストレーションおよび篩板を、SEMを使用して解像した。サンプル画像は、図１および図２の対照画像に示される。
【０１４７】
幼若および高齢C57Bl6マウス（n=3 の３〜４か月齢の幼若マウス、およびn=3 の20〜24か月齢の高齢マウス）を、完全SPF条件下および不断給餌下で維持した。この研究は、シドニー南西部保険局の動物福祉員会の承認を得た。20〜24か月のマウスは老化現象を示している。動物をCO2で犠牲にし、門脈に挿入された23ゲージの注射針を介して肝臓を直ちにかん流固定した。肝組織は、PBS（0.1 Mショ糖）中の１％グルタルアルデヒド／４％パラホルムアルデヒドで固定した。
【０１４８】
フェネストレーションは、30〜300 nmの範囲であり、平均直径は幼若マウス（３か月齢）では136 nm、そして高齢マウス (24 か月齢）では124 nmであった。
【０１４９】
フェネストレーションは、篩板（図１中、* で示される）に集団化し、幼若マウスでは10〜100のフェネストレーション、高齢マウスでは５〜50のフェネストレーションを含んだ。幼若マウスは、高齢マウスと比較して、フェネストレーションの多孔度と頻度の増加を示したが、一方で高齢マウスは、より大きなギャップの発現を示した（図１中、#により表示）（直径＞300 nmの穴）。
実施例２：薬物治療
【０１５０】
薬物治療および投薬（図１および図２中にそれらの対応画像上に重ね合わせて表示されている）は、溶解した薬物を含むまたは含まないRPMI培地を用いて37℃、5％CO2 で30分間肝細胞をインキュベートすることにより実施した。全ての画像は、2名の研究者が10,000倍のSEMを使用して盲検化のもと撮影したもので、1 μmのスケールバーが表示されている。
【０１５１】
対照画像は、篩板中に集団化されたフェネストレーション（*）を示す。幼若マウスと高齢マウスとの間でフェネストレーションの減少が観察された。ギャップ（#） (＞300 nm）は、高齢マウス対照に存在し、シンバスタチン処置で亢進された。ボセンタン、2,5−ジメトキシ−4−ヨードアンフェタミン(DOI)、アムロジピンおよびシルデナフィル処置は、幼若マウスと高齢マウスの両方で、篩板を維持し、フェネストレーション密度を増加させた。サイトカラシンＤ、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）およびニコチンアミドモノヌクレオチド（NMN）処置は、フェネストレーション密度の増加を亢進し、篩板のフェネストレーションクラスター化を維持した。
【０１５２】
高齢マウスは、サイトカラシンＤ、TRAILおよびNMNでの処置後、より大きなフェネストレーションの篩板集団化を示した。7−ケトコレステロール（7KC）処置はフェネストレーション増加を促したが、明確に限定できる篩板を制限した。7KCおよびNMN処置でフェネストレーション直径の増加が観察された。
【０１５３】
フェネストレーションの多孔度、直径および頻度に対する薬物治療の効果を図３〜５に示す。これらの図から、幼若対照マウスはフェネストレーション多孔度 4.8±0.4 ％（平均±SD）、平均直径 135.9±11.1 nm および頻度3.1 ± 0.6 (数／100μm2)を報告したことが見てとれる。高齢マウスは、幼若マウスと比較して、多孔度（2.4±0.1％；P＜0.05）および頻度（1.8±0.3；P＜0.05）の有意な減少を示し、直径には有意差が観察されなかった（高齢：124.4±6.2 nm；P＝0.20）。
【０１５４】
図３〜５は、LSECフェネストレーションの多孔度に対するシンバスタチン、ボセンタン、アムロジピン、シルデナフィル、TRAIL、7KC、NMN、DOIおよびサイトカラシンＤの効果を示す。各データ点は、８つの画像の平均±SDを表し（図１および２に示す通り）、処置ごとに616〜3312のフェネストレーション生データ点を収集した。＜30 nmのフェネストレーションおよび＞300 nmのギャップは、分析から除外された。*は対応のあるｔ検定を使用したP＜0.05を示し、対照、ボセンタン（1μM）、TRAIL群およびサイトカラシンＤ（これらの群はｎ＝３を有する）を除くすべての群でｎ＝２であった。
【０１５５】
サイトカラシンＤ (0.5μg/mL)、DOI (0.1μg/mL）および7KC（9μM）処置は、幼若マウス（DOIを除く）および高齢マウスにおいて多孔度の増加を示した（図３）。フェネストレーション直径の増加は、高齢マウスにおいて7KC (4.5μM)で処置したLSECのみに観察された（図４）。フェネストレーションの頻度は、サイトカラシンＤ処置後の幼若マウスと高齢マウスの両方で増加し、高齢マウスではDOIと7KC (9μM)処置によってのみ増加した（図５）。
【０１５６】
一酸化窒素 (NO)経路促進剤であるボセンタン (0.1 μM) とシルデナフィル (300 ng/mL)は、幼若マウス (それぞれ、5.4±0.1％； P＜0.05、7.1±2.2％；P＜0.05)および高齢マウス（それぞれ、4.2±0.4％；P＜0.05、5.4±1.9％；P＜0.05）の両方で同様なフェネストレーション多孔度の増加を亢進した。フェネストレーション頻度は、幼若マウスと高齢マウスの両方で同様の有意な増加を示した。フェネストレーション直径の変化は全く報告されなかった。Ca2+ 阻害剤であるアムロジピン（20 ng/mL）は、ボセンタンやシルデナフィルと同様に、幼若および高齢マウスのフェネストレーション多孔度と頻度を増加させた。フェネストレーション直径の減少は幼若マウスでのみ観察された（123.8±1.6 nm；P＜0.05) (図４)。クルッペル様因子２を介したNO経路促進剤であるシンバスタチンは、フェネストレーションの多孔度または頻度を有意に変化させなかったが、高齢マウスではシンバスタチン処置でフェネストレーション直径の増加（152.0±19.2 nm）が亢進された（図４）。
【０１５７】
死受容体4/5プロモーターTRAIL (1μg/mL）は、幼若マウスにおいてフェネストレーション多孔度と頻度を増加させ（7.2±1.5％；P＜0.05、 4.5±0.4；P＜0.05）、老齢マウスのみで多孔度を増加させた（2.7±0.1％；P＜0.05）。直径の変化は観察されなかった。
【０１５８】
NMNは、試験した薬物治療のうち最高の程度に、フェネストレーション多孔度と頻度を増加させた。幼若マウスで5 mg/mLの投薬量および高齢マウスで50μg/mLの投薬量が、最大の効果を示した。幼若マウスでは、NMN処置が多孔度を9.1±2.0％（P＜0.05）および頻度を5.9±0.1 (P＜0.05）に増加させた。高齢マウスでは、多孔度が6.6±2.2％（P＜0.05）に増加した。フェネストレーション直径の増加は高齢マウスにおいて有意に発生した (133.4 ± 0.9 nm；P＜0.05)；この直径は、幼若マウスで観察されたものと視覚的に類似していた（図２）。
【０１５９】
フェネストレーション頻度のヒストグラムは、幼若および高齢マウスにおける対照とNMN処置とを比較して作成された（図６）。高齢マウスでは、NMN処置が、瓶範囲101〜125 nmでピーク頻度が24％と報告された。この結果は、この範囲で22％のピーク頻度を有する幼若対照マウスと同様であった。高齢対照マウスは、瓶範囲76〜100 nmで24％のピーク頻度を示した。
実施例３： Ag2S 量子ドットを調節するための実験プロトコル
【０１６０】
水溶性NIR−Ag2S量子ドット（ナノ粒子約5〜10 nm）を、インビトロおよびインビボ研究のために調製した。
【０１６１】
使用した材料：ジエチルジチオカルバミン酸銀〔Ag(DDTC)〕、１−ドデカンチオール、シクロヘキサン、合成α−リポ酸（チオクト酸）、無水エタノール、脱イオン水。
【０１６２】
使用した装置：遠心分離機、秤量計、Corning Spin-X UF濃縮遠心フィルター、平底フラスコ、ゴム隔膜、磁気加熱プレート、磁気撹拌機（量子ドット分散体を混合）、N2 雰囲気、超音波処理機。
【０１６３】
Ag2S量子ドットは、以下のプロトコルに従って調製した。
【０１６４】
ステップ１：疎水性硫化銀量子ドット製剤は、以下のように調製した：
1． 0.02561 gのジエチルジチオカルバミン酸銀（ピリジンP.T.に可溶）と10 gのドデカンチオール（水に可溶）をフラスコ内で室温にて混合した。
2.  真空下で５分間激しく磁気攪拌して酸素を除去した。
3.  その溶液を15℃／分の加熱速度で200℃に加熱し、N2雰囲気下で200℃にて１時間維持した。
4.  溶液を自然に室温まで放冷した。続いてエタノール 50 mLを溶液に注いだ。
5.  次に、得られた混合物を6729×gで20分間遠心分離し、ペレットを洗浄し、シクロヘキサン中に分散させた。
【０１６５】
シクロヘキサン分散液は、Ｘ線回折および透過型電子顕微鏡法（TEM）を使用することによって識別できる単斜晶Ag2S 量子ドットを含む。図７および８を参照のこと。
【０１６６】
ステップ２：親水性硫化銀量子ドットの調製。
1．0.15 gのチオクト酸および15 mLのエタノールを、ステップ１からの0.05ミリモルのシクロヘキサン分散液に添加し、得られた混合物を超音波洗浄機中で４時間超音波処理した。（チオクト酸はエタノールに可溶）。
2. 超音波処理した混合物を2691×g で20分間遠心分離し、脱イオン水で洗浄し、そして脱イオン水に再分散した。サンプルは、直径約５〜10 nmの水溶性Ag2S粒子（量子ドット）を含んだ。該粒子は785 nmの入射波長で1100〜1200 nmで強い蛍光発光を示す。
実施例４：量子ドットと治療薬との複合化
【０１６７】
以下のプロトコルに従って、量子を治療薬（サイトカルシンＤ）と複合化（コンジュゲート）した：
1. 実施例１からの0.1 mgのAg2S量子ドット(QD)を、200μLのジメチルスルホキシド（DMSO）中に分散させた。
2. 50μLのDMSO中に溶解した1.15 mg (0.01ミリモル）のスルホ-N-ヒドロキシスクシンアミド (NHS)をステップ１からの混合物に添加し、攪拌により混合した。
3. １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDC）の1.91 mg (0.01ミリモル)サンプルを50μLのDMSOに溶解し、ステップ２のQD-NHS/DMSO溶液に加えた。
4. ステップ３の混合物を攪拌しながら暗所で１時間保持した。
5. ステップ４で生成された表面活性化Ag2S QDを遠心分離し、DMSOで２回洗浄し、さらにDMSO中に分散させた。
6. PBS緩衝液中の2×10-9 モルのサイトカラシンＤタンパク質を、ステップ５のEDC／NHS活性化Ag2S QDと複合化した。
実施例５： Ag2S QDはLSECを標識する
【０１６８】
単離されたLSECを96ウェルプレートに播種し (ウェルあたり1×104 細胞／ウェル)、続いて37℃で24時間インキュベートした。細胞を、実施例１からの25マイクログラムのAg2S QDと共に、37℃で15分間または24時間インキュベートした。
【０１６９】
インキュベーション後、細胞をPBS（pH 7.0）で３回洗浄して、結合していないQD を除去し、次に電子顕微鏡用に準備した。0.1 M カコジル酸緩衝液中2.5％グルタルアルデヒドを使用して細胞を室温で２時間固定し、0.1M カコジル酸緩衝液で洗浄し、四酸化オスミウム中で１時間、後固定した。漸増濃度のエタノールを使用して細胞の水を除去し、包埋のためにSpurr樹脂中に最終的に置換した。70 nmの超薄片をウルトラミクロトーム薄切片を使用して切断した。QDの存在の検出のために、FEI、／Philips CM-200電子顕微鏡で切片を調べた。
【０１７０】
量子ドットで標識されたLSECの電子顕微鏡写真を図９に示す。
実施例６： Ag2S QDは無傷の肝臓の細胞を標識する
【０１７１】
麻酔後、250マイクログラムのQDを含む、クレブス・ヘンゼライト（Krebs-Henseleit）重炭酸塩緩衝液（１％アルブミン、10 mMグルコース、pH 7.4）を使用して、門脈を介してマウスの肝臓をかん流させた。
【０１７２】
QDによるかん流の５分後、肝臓に固定液をかん流させ、透過型電子顕微鏡を使用して肝臓をQD分布について分析した。
【０１７３】
肝臓は、0.1 M カコジル酸ナトリウム緩衝液中3％グルタルアルデヒドおよび2％パラホルムアルデヒドでかん流固定し、次いでSpurr樹脂中に包埋した後、超薄片化し、FEI／Philips CM-200電子顕微鏡を使って検査した。
【０１７４】
量子ドットで標識された肝臓切片の電子顕微鏡写真を図10に示す。
実施例７：量子ドット（QD）調製のペーパードラフト法
Ag2S QD 合成
【０１７５】
上記の通り、Ag2S QDは、強力な磁気攪拌の下で混合された12 mLの１−ドデカンチオールを含む0.1〜0.3 gのジエチルジチオカルバミン酸銀を用いて合成した。混合物から酸素を除去するためにN2真空状態を構築し、混合物から酸素を除去し、続いてAr真空によりN2を除去した。Ag2S QD 溶液を10〜15℃／分の速度で180〜210℃に加熱し、この温度で１〜60分間保持した。合成後、50〜100 mLのEtOHを溶液に添加し、Ag2S QDを4000〜28000 RPMで30分間遠心分離した。
Ag2S QD洗浄
【０１７６】
Ag2S QDをシクロヘキサン中に再懸濁し、アセトンで２回、EtOHで２回洗浄した。各洗浄液から4000 RPMでAg2S QDを沈澱させた。あるいは、等量のMQとEtOHまたはアセトンを混合することにより、シクロヘキサン層中にAg2S QDを含む２層の非混和性溶液を提供した。 
Ag2S QDsの放射性同位体標識
【０１７７】
上記に記載の通り、Ag2S QDを合成し、洗浄し、シクロヘキサン中に分散させた。QD (50 mg) を、激しく攪拌しながらArガスの下で室温で5μCiの3H−オレイン酸と共に48時間インキュベートした。インキュベーション後、QDをアセトンで３回洗浄してQDを沈澱させ、 3000 RPMで５分間遠心分離し、そしてシクロヘキサン中に再懸濁した。
水相間移動
【０１７８】
シクロヘキサン中の放射性標識QDを、磁気攪拌の下でアセトンと１：１(v/v)混合した。50 mgのAg2S QDあたり1 mLの3-MPAを加えた。 Ag2S QDを室温で１時間インキュベートし、50 mlのエタノールと混合し、そして3000 RPMで５分間遠心分離した。次いでペレットを水中70％エタノールで３回洗浄し、そしてMQ中に分散させた。相間移動後、チューブからQDを回収し、その後の遮光保存のために４℃で４℃にて貯蔵した。
FSA コーティング
【０１７９】
10mM Ag2S QDを、激しく混合しながら反応バイアル中で10 mM EDCおよび10 mM NHSと共に１時間混合した。この後、pHを9に増加させ、その溶液に10 mMの線維芽細胞表面抗原（FSA）FSA-488 または FSA-647を添加した。その混合物を室温で４時間インキュベートした。混合物を3500〜10000分子量カットオフフィルター付のヘビ革透析チューブに移し、遮光下で４℃にて2〜3、5〜6および一晩の間、PBSに対して透析した。
【０１８０】
The Ag2S QDは次の特徴を有する：
表１：QDの特徴
【表１】
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【０１８１】
マウス強制投与
３〜４か月齢の雄C57/BL6 マウスを、西オーストラリア州パースの動物資源センター（Animal Resource Centre）から入手した。動物は、ANZAC研究所の動物舎で12時間の明／暗サイクルで飼育し、餌と水の不断給餌を提供した。マウスは、100 mLの10 mM 3H-Ag2S-FSA-488 QDでの強制胃管投与の前に、断食期間を設けなかった。 強制投与後0、10、20および30分の時点で採血を行い、生理食塩水中の100 mg/kg ケタミンと10 mg/kg キシラジンの単回腹腔内注射で、強制投与後30〜60分にマウスを安楽死させた。肝臓、脾臓、腎臓、肺および小腸から200〜250 mgの組織を回収した。組織サンプルの重量を量り、反応容器の中で1 mLのSolvable溶液と混合し、60℃で２時間インキュベートして組織を溶解させた。0.2 mLの30％H2O2 をサンプルに加え、ダークカラーの彩度を下げた。サンプルを10 mLのシンチレーション液と混合した。
LSECの単離
【０１８２】
マウス肝細胞、LSEC、HSCおよびクッパー細胞を、コラーゲナーゼによる肝臓のかん流によって単離した。肝細胞は、50×gでの３回の10分間遠心分離によって除去した。実質細胞と死細胞を２段階のパーコール勾配により肝細胞とLSEC画分から除去し、クッパー細胞をプラスチックへの選択的付着によってLSEC画分から除去した。細胞をPBS中に懸濁した後、細胞をカウントし、遠心分離し、重量を測定した後、次のいずれかを行った(i) 反応容器中で1 mLのSolvable溶液と混合し、放射性標識検出用に上記の通り準備する；または(ii)フローサイトメトリーでの分析用に未修飾のままにする（フローサイトメトリー用サンプルは放射性標識しなかった）。
フローサイトメトリー
【０１８３】
フローサイトメトリーは、BD-Accuri（登録商標）フローサイトメーター（BD biosciences社製, オーストラリア）上で実施し、データはFlowJo（登録商標）(v10, FlowJo LLC,米国オンタリオ）で解析した。サンプルを更に２系列の倍々希釈により1.0×106 細胞/mLに希釈した。上記の単離準備に加えて、サイズ区分実行基準を適用した。サイズ区分基準に限定された事象を用いて希釈あたり100,000事象を収集した。図15Ａのデータは、サイズ区分実行後のサンプルデータを示す。
3H−放射性標識活性分析
【０１８４】
放射能はシンチレーションカウンター (Tri-Carb（登録商標）2100 TR) を使って測定した（サンプルあたり５分、5〜10 mLのシンチレーション液）。図15Ｂのデータは、放射性標識Ag2S QD単独に比較した、血中に存在する放射能のレベルを示す。Ag2S QDクリアランスは、組織重量に基づいてμg/mLあたりの臓器と血液サンプル間の放射能の表出によって測定した。全てのサンプルは３回反復で測定した。
【０１８５】
本発明の最も広範囲に記載した精神および範囲から逸脱することなく、特定の実施形態に示された本発明に対して多数の変更および／または修正を成しえることは、当業者に理解されるだろう。従って、本実施形態は、全ての面で例示的でありかつ非限定的なものとして見なすべきである。
実施例７：幼若および高齢マウスから単離されたLSECにおけるフェネストレーションに対する薬剤の効果
【０１８６】
本実施例は、幼若（3〜4か月齢）および高齢（18〜24か月齢）マウスから単離されたLSEC中のフェネストレーションに対する数種の薬剤の作用を調べるために行われ、(1)フェネストレーションを調節する様々なメカニズムを説明するため；および(2)加齢に伴うフェネストレーションの喪失を減少させる薬剤を同定するために行われる。走査型電子顕微鏡（SEM）およびdSTORMを使用して、マウスのNOに影響を与える経路に作用する薬物〔シルデナフィル、アムロジピン、シンバスタチン、セロトニン作動性経路／ホスホリパーゼＣ(DOI)、エンドセリン受容体（ボセンタン）、死受容体（TRAIL）およびNAD+（ニコチンアミドモノヌクレオチド(NMN)）〕を研究した。アクチン細胞骨格および脂質ラフトに対して作用する、確立されたフェネストレーション活性化剤（それぞれサイトカラシンＤおよび7−ケトコレステロール）を陽性対照として使用した。その結果は、NO経路を標的としそしてアクチン再構成を誘導することにより、高齢マウスで再フェネストレーション化が促進されたことを示した。加齢に伴うフェネストレーション喪失（defenestration）を軽減する薬剤は、加齢に伴う脂質異常症とインスリン抵抗性に対する治療可能性を有するだろう。
材料と方法
【０１８７】
３〜４か月齢および18〜24か月齢の雄C57/BL6マウスを、西オーストラリア州パースの動物資源センターから入手した。動物は、ANZAC研究所の動物舎で12時間の明／暗サイクルで飼育し、餌と水の不断給餌を提供した。マウスは、断食期間を設けずに、生理食塩水中の100 mg/kg ケタミンと10 mg/kg キシラジンの単回腹腔内注射で安楽死させた。本試験は、シドニー地方保険地区の動物福祉委員会によって承認され、科学研究のための動物の管理と使用に関するオーストラリア国実施規則（AWC 2016/009）に従って実施された。提供される全ての情報は、ARRIVEガイドラインに合致する。
【０１８８】
使用される試薬：コラーゲナーゼ (タイプ１、カタログ番号: 47D17410A、ProSciTech、オーストラリア)、RPMI-1640 (Sigma-Aldrich社、オーストラリア)、パーコール（Sigma-Aldrich社、オーストラリア）、サイトカラシンＤ（カタログ番号: c8273、Sigma-Aldrich社、オーストラリア）、TRAIL (カタログ番号: 375-TL-010、R&D systems社、オーストラリア）、ボセンタン（カタログ番号: S4220、Selleckchem社、米国テキサス州）、7−ケトコレステロール（カタログ番号: c2394、Sigma-Aldrich、オーストラリア)、2, 5−ジヒドロキシル−4−イソアンフェタミン（カタログ番号: 13885、Cayman Chemicals社、オーストラリア）、シンバスタチン（カタログ番号: S6196、Sigma-Aldrich社、オーストラリア）、クエン酸シルデナフィル（カタログ番号: PZ0003、Sigma-Aldrich社、オーストラリア）、ニコチンアミドモノヌクレオチド（Lindsay Wu博士からの進呈、オーストラリアUNSW）、ベシル酸アムロジピン（カタログ番号: A5605、Sigma-Aldrich社、オーストラリア）およびVEGF（カタログ番号: V4512、Sigma-Aldrich社、オーストラリア）。使用される色素： Alexa Fluor 488 ファロイジン（カタログ番号: A12379、Thermo Fisher社、オーストラリア）、リン酸化eNOS (カタログ番号: 9571、Cell signalling Technology社、オーストラリア）、eNOS (カタログ番号: 610296、BD Biosciences社、オーストラリア）、Alexa Fluor 488ヤギ抗ウサギ、Cy3ヤギ抗マウス（カタログ番号: R-37116, A-11003; Thermo Fisher社、オーストラリア）。アッセイは、MTTベースのインビトロ毒性試験キット（カタログ番号： TOX1-1KT、Sigma-Aldrich社、オーストラリア）およびサイクリックGMP ELISAキット (カタログ番号: 581021, Cayman Chemicals社、オーストラリア）を使って実施した。
【０１８９】
以前に記載されたように(Cogger他、J e52698, 2015 https://dx.doi.org/10.3791/52698)、コラーゲナーゼでの肝かん流によってマウスLSECを単離した。非実質細胞を２段階のパーコール勾配によって除去し、クッパー細胞をプラスチックへの選択的付着によって除去した。LSEC（0.5×106 細胞/cm2で播種）は、使用前に3.5時間、無血清RPMI-1640中で培養した（37℃、5％CO2）。
【０１９０】
細胞を様々な薬剤で30分間処理してフェネストレーションに対する効果を決定した。全ての薬剤を無血清RPMI培地中に溶解した。全ての実験は幼若マウスと高齢マウスの両方について三重反復で実施した。アクチンを0.5μg/mLのサイトカラシンＤで破壊し、脂質ラフトを3.6および1.8μg/mlの7−ケトコレステロールで破壊した；投薬量を選択した。NO経路はシルデナフィル (0.6、0.3、0.15、0.05および0.015μg/mL)、アムロジピン (40、20、10、5および1 ng/mL)およびシンバスタチン(1および0.1μg/mL）で促進された。セロトニン作動性／ホスホリパーゼＣ経路は DOI (0.1μg/mL)で促進され、エンドセリン受容体はボセンタン (550、55 および 5.5 ng/mL)で阻害された。死受容体4はTRAIL (100、10、1、0.1および0.01 ng/mL)で促進され、NAD+ はNMN (5000、50、10、1および0.1μg/mL)で促進された。
【０１９１】
SEMは以前に記載された通りに実施した(Corbin他、J Biol Chem 274: 13729-13732, 1999）。LSECを0.1 M カコジル酸ナトリウム緩衝液中の2.5％グルタルアルデヒドで固定し、オスミウム酸染色し、段階的エタノールとヘキサメチルジシラザン中で脱水し、スタブ上に装着し、白金でスパッタコーティングし、JEOL 6380 走査型電子顕微鏡 (JEOL Ltd, 日本）を使って検査した。倍率10,000×の画像を、盲検化された観察者によって収集し、Image J (NIH, 米国メリーランド州）を使ってLSECのフェネストレーション直径と多孔度を測定した。処置あたり616〜3312 のフェネストレーションをカウントした。30 nm未満のフェネストレーションと300 nmを超えるギャップは解析から除外した。多孔度は、フェネストレーションで覆われた細胞膜の割合（％）として定義された。頻度は1 μm2あたりのフェネストレーションの数として定義された。
【０１９２】
dSTORMイメージングは自社内顕微鏡を使用して実行した。LSECは、PBSで２回洗浄し、4％パラホルムアルデヒドで30分間固定することにより、dSTORM用に準備した。次に、LSECをPBSで２回洗浄し、Triton-X で90秒間透過性にし、5％ウシ血清アルブミンで１時間ブロックし、Alexa Flourファロイジン488 (1:40) で20分間染色してからイメージングを行った。細胞を0.1％Tweenを含むPBSで洗浄し、dSTORM可視化と画像取得のためにOxEA バッファー (30)の中に入れた。dSTORMは、ダイオード励起レーザー (Coherent Inc、米国カリフォルニア州)からの488 nmおよび647 nmの励起を使用した。励起光は、1.49NA 60×油浸TIRF対物レンズ (Olympus Australia、オーストラリア)を介して伝達された。蛍光は２つの別々のsCMOS カメラ（Imaging Development Systems GmbH、ドイツ）でキャプチャした。約75 fpsにて最大40,000画像のデータを収集した。各処置用量について１名の盲検化された観察者により５〜８枚の全細胞画像が収集され、rapidSTORMオープンソース・ソフトウェアを使用して加工された（Wolter他、Nat Methods 9: 1040, 2012）。各画像を全ての篩板とアクチン構造について検査した。5〜8枚のdSTORM画像を使用してデンシトメトリー測定を実行し、Image J ソフトウェア (NIH, 米国メリーランド州)を使用して画像を解析した。
【０１９３】
免疫蛍光分析は、4％パラホルムアルデヒドで固定したLSEC上で行った。LSECをTriton-Xで90秒間透過性にし、5％正常ヤギ血清で１時間ブロックし、そして (1:100)リン酸化-eNOS および (1:100) eNOSと共に4℃で一晩インキュベートした。LSECをPBSで２回洗浄し、Alexa Fluor抗ウサギ488二次抗体およびAlexa Fluor抗マウスCy3 二次抗体と共にインキュベートした。細胞をPBSで洗浄し、Vector Mountを使ってDAPIでマウントした。スライドを、タイプF液油（カタログ番号: 11513859)を用いて倍率63×でLeica SP8倒立走査型共焦点顕微鏡を使って検査し、LASソフトウェア (Leica Microsystems CMS GmbH、ドイツ)を使用して、盲検化された観察者により画像をキャプチャした。ImageJ (NIH、米国メリーランド州）を使って画像を解析した。
【０１９４】
MTTおよびcGMPに関するアッセイは、キットの教示通りに実施した。簡単に言えば、MTTアッセイは薬物治療直後に実施した。細胞をPBSで洗浄し、100μg MTT溶液を含むRPMI培地中でインキュベートした。細胞を37℃で４時間インキュベートし、200μLの可溶化溶液で溶解し、30分間発色させ、分光光度計を用いて570 nmで測定した。cGMPアッセイも薬物治療後に実施した。細胞をPBSで洗浄し、0.1M HClで溶解させた。サンプル回収後、サンプルをアセチル化し、キット試薬を使って調製した。サンプルを4℃で18時間インキュベートした後、分光光度計を用いて410 nmで検査した。
【０１９５】
薬物治療実験とアクチン／NOSデンシトメトリーの間の統計解析は、クラスカル・ワリス検定と事後(post hoc)ダン検定法（SPSS v21、IBM Analytics、オーストラリア)を使用して複数の群間比較を実行した；ここでP＜0.05を有意と見なし；その結果の中でP＜0.1が強調表示される。本研究に用いたマウスの数が原因で、ノンパラメトリック統計法を採用した。 以前のデータの解析から、このサンプルサイズが介入の結果間を識別するのに80〜95％の統計的検出力を有することが実証されている。個々の解析の明細は図中の凡例に記載される。全てのデータは平均±SDとして与えられる。実験計画と分析は、Curran-Everett & Benos DJ. Adv Physiol Educ 31: 295-298, 2007中に記載されているAPSガイドラインに従って実施した。
結果
幼若および高齢対照
【０１９６】
幼若および高齢マウスから単離されたLSECのSEMは、図11Ａに示されるようにLSEC調製の技術的成功を確証した。期待通り、高齢マウスからのLSECsは、幼若のLSECに比較して減少した多孔度を示し (多孔度：幼若4.6±0.3％ vs 高齢2.4±0.1％； P = 0.023、群あたり N = 3、図11Ｂ）、ギャップの数は増加した（直径＞300 nm、図11Ｄ中、#により表示)。加齢によりフェネストレーション直径には有意差が認められなかった (幼若130.9±7.2 nm vs 高齢 124.4±6.2 nm; P = 0.20、図２)。フェネストレーション頻度には加齢とともに減少が認められた(1μm2あたり幼若：3.1±0.6 個のフェネストレーション vs 高齢：1.8 ± 0.3個のフェネストレーション; P = 0.033、図11C）。これは、それらのマウスでの加齢に伴うフェネストレーション喪失（defenestration）が、主に、直径の減少よりもむしろフェネストレーション頻度の減少に続発したことを示している。図11の点線は、幼若対照と高齢対照レベルを示す。薬物治療：シンバスタチン、ボセンタン、TRAIL、シルデナフィル、アムロジピン、NMN、7−ケトコレステロール、サイトカラシンＤ、およびDOI。全ての処置は、溶解した薬物を含むまたは含まないRPMIを使用して、37℃、5％CO2 で30分間インキュベートした。２名の盲検化された研究者により倍率10,000倍でSEM画像を取得し（サンプル画像はパネルＡ、Ｄに示される）、それを用いてフェネストレーションの多孔度と頻度を手動でカウントした。各データ点は、８つの画像の平均±SDを表し、処置あたり616〜3312のフェネストレーション生データ点を使った。＜30 nmのフェネストレーションと＞300 nmのギャップは全て解析から除外した。* は幼若対照に比較したP＜0.05を示し； # は高齢対照に比較したP＜0.05を示す。クラスカル・ワリス検定と事後ダン検定法を使って統計解析を実施し、群間を比較した。全ての群はn = 3を有した。（Ｄ）高齢マウスにおける薬物治療のサンプルSEM画像。1μmのスケールバーが示されている。ギャップ(#) (＞300 nm)は、対照において観察され、シンバスタチン１μM処置で増加が認められた。
フェネストレーションに対する薬剤の効果
【０１９７】
シルデナフィル、NMNおよび７−ケトコレステロールでの処置は、幼若と高齢LSECの両者においてフェネストレーションの多孔度と頻度の有意な増加をもたらした（図11Ｂ〜Ｃ、表２と表３）。サイトカラシンＤは、幼若および高齢LSECにおいて頻度を有意に増加させたが多孔度は増加させなかった（図11Ｂ〜Ｃ、表２と３）。高齢マウスからのLSECだけが、ボセンタンとDOIに対して反応性であった。幼若マウスのLSECだけがTRAILおよびアムロジピン処置の後に多孔度と頻度の有意な増加を示した。幼若マウスに比較して、高齢マウスのLSECにおいて多孔度および頻度の全体的な大きな倍率変化が観察された。高齢マウスでの最大変化は、NMN 50μg/mL処置によって促進され、多孔度は2.5倍、頻度は2.25倍増加した（図11Ｂ〜Ｄ）。
表２：幼若マウスのデータ：**はP＜0.01を示し、*はP＜0.05を示し；#はP＜0.1を示す；クラスカル・ワリス（Kruskal-Wallis）検定と事後ダン（Dunn）検定を使用して群間を比較した。全てのデータは平均±SDとして示される。
【表２】
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表３：高齢マウスのデータ：**はP＜0.01を示し、*はP＜0.05を示し、#はP＜0.1を示す；クラスカル・ワリス（Kruskal-Wallis）検定と事後ダン（Dunn）検定を使用して群間を比較した。全てのデータは平均±SDとして示される。
【表３】
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【０１９８】
異なる薬剤と投与量に対するLSECの応答に有意な差が認められた。幼若マウスでは、シルデナフィル(0.3μg/mL)、アムロジピン (20 ng/mL)およびTRAIL (1 ng/mL) がフェネストレーション数の増加を示し、篩板構造に対して幾らかの破壊を伴う全体的に穿孔した細胞領域を示した（図１）；シルデナフィルとTRAILの用量が高いほど、大きなフェネストレーションの多孔度と頻度の変化を促進しなかった。ギャップ形成は、アムロジピン、７−ケトコレステロールおよびNMNでの処置後に明白であった（図11Ａと図12Ｂ中、# により表示される）。NMN処置後、幾らか正常な篩板が維持されたが、篩板の間の細胞質面積の有意な減少が認められ、これは本実験において７−ケトコレステロールを使って観察された効果と同様に、高度にフェネストレーションのある形態をもたらした。７−ケトコレステロールは、幼若マウスと高齢マウスの両方でフェネストレーション直径の増加と関連付けられた（P＜0.05; 図12Ａ）。
【０１９９】
フェネストレーション直径の頻度分布に対する薬剤の影響が認められた。NMNは、幼若マウスにおいて篩板の縁に小さなフェネストレーション（直径75 nm未満）を誘発した（図12Ｂと12Ｃ）が、高齢マウスでは認められなかった。幼若マウスでは、NMN (5000μg/mL) が30〜100 nmおよび226〜500 nmのフェネストレーションの増加を誘導し、126〜200 nmのフェネストレーションは減少させた（図２Ｃ）。高齢マウスでは、NMN処置はフェネストレーションの直径を76〜100 nmピークから101〜125 nmピークへとシフトさせ、小さいフェネストレーション（直径30〜100 nm）の減少を伴った（図12Ｃ）。この効果は、７−ケトコレステロール（3.6μg/mL）処置では観察されず、代わりに右側へのシフトを有した。
【０２００】
多孔度は、主にフェネストレーションのサイズよりもむしろ数の増加の結果として増加した（図13Ａ）。細胞生存度をMTTアッセイを介して評価したところ、最大薬物投与量は細胞毒性を誘発しないことが証明された（図13Ｂ）。用量応答実験は、幼若マウスにおいてフェネストレーション多孔度を調節するのに活性であることが示された全ての薬物に関して実施した（図13Ｃ）。TRAILは最大活性を有し、MMNに対して同様な最大有効性を示したが、より有力であった（図13Ｃ）。しかしながら、シルデナフィル、アムロジピンおよびTRAILは、フェネストレーション多孔度に対してポジティブ効果を有する用量範囲が限定されていたが、NMNはより広域の用量範囲を有した。NMN処置は、幼若マウスのLSECにおいて4.6％から8.1％へのフェネストレーション多孔度の最大増加をもたらした。
アクチンと酸化窒素シンターゼに対する薬剤の効果
【０２０１】
対照LSECは、広範な円管状構造を含む原形質膜と細胞質の内部に中程度のアクチン染色を示した（図14Ａ）。LSECにおいてアクチン密度に全く変化は観察されなかった（図14Ｂ）。アクチン細胞アーキテクチャパターンには、処置群間に変化が観察された（表４）が、一方で細胞中のアクチンの全体的品質は不変であった。
表４：薬剤処置によるアクチンおよび酸化窒素シンターゼの変化
【表４】
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【０２０２】
サイトカラシンＤで処置したLSECは、原形質膜の広範なアクチン染色を有した（図14Ａ）。ストレスファイバーは核周辺領域内に存在した。サイトカラシンＤ、アムロジピン、NMNおよびシルデナフィルでの処置後に、細胞質を取り囲む平滑線維の喪失が認められた。
【０２０３】
シルデナフィル、アムロジピンおよびNMNは、細胞質膜の不規則で濃厚なアクチン染色と、細胞質内のアクチンのクラスター化を伴う、同様な表現型を示した（図14Ａ）。重要な特徴は次の通りであった：(1) あらゆる方向に突出した線維；(2) アクチンクラスター；(3) ギャップ形成；および(4) 一部の篩板に見ることのできる個々のフェネストレーション（図14Ａ挿入図）。TRAILは、強力なアクチンクラスター化が不在である以外は、シルデナフィル、アムロジピンおよびNMNと同様であった（表４、図14Ａ）。
【０２０４】
７−ケトコレステロール処置は、対照に類似した細胞質全体の組織的なアクチン構造に関連付けられた（図14Ａ）。しかしながら、アクチン細胞アーキテクチャ全体に大きなギャップが生成し、アクチン線維はそれらの連続的な相互接続した外観を維持していたが、本来の円筒形の構造を失っていた。原形質膜には中程度の染色が認められた。細胞質のアクチンに大きなギャップも検出された（図14Ａ、挿入図）。
【０２０５】
アクチン細胞骨格における変化は、増加したフェネストレーション多孔度と頻度に関連があった；しかしながら、全ての治療によりフェネストレーション増加に付随して起こる細胞骨格の変化に、何らかの特別なパターンは見られなかった。
【０２０６】
増加したNOSデンシトメトリーは、TRAIL、アムロジピンおよびシルデナフィルに観察された（図14Ｃ）。細胞内cGMPはシルデナフィル処置とTRAIL処置後に３倍増加した（図14Ｃ） (p＝0.001); NMNまたはアムロジピン処置細胞では全く変化は観察されなかった（図14Ｄ）。対照LSECおよびNMNで処置したLSECは、最少のNOS染色と非リン酸化NOS染色を示した（図14Ｅ）。TRAILとアムロジピンは、細胞質全体に渡ってNOS染色を示したが、リン酸化NOS染色は伴わなかった（図14Ｅ）。シルデナフィルおよびVEGF (100 ng/mL, 4時間処置)は、NOSとリン酸化NOSの両方の染色を示した（図14Ｅ、白い矢印）。
考察
【０２０７】
LSECのフェネストレーションの形態は、多様な薬理学的介入に応答し、この応答性は高齢になっても大部分維持される。本研究での高齢マウスから単離されたLSECは、減少したフェネストレーション多孔度と頻度を有しており、マウスだけでなくラット、ヒトおよび非ヒト霊長類における以前の研究結果と一致していた。NMN、シルデナフィルおよび７−ケトコレステロールは、幼若マウスでのフェネストレーション多孔度と頻度を増加させ、高齢マウスからのLSECでは、同様なまたはより大きな効果が認められた（要約データは表５に与えられる）。これは、加齢に伴うフェネストレーション喪失をインビトロで逆転させる（回復させる）ことができ、インビボ研究での有力な治療標的と成り得ることを示している。更に、それらの再フェネストレーション化剤の最適濃度が、高齢マウスからのLSECで同定され、インビボ研究に有力な標的用量を提供する。dSTORM研究の結果は、再フェネストレーション化が有意なアクチン再組織化と関連があることを示した。NOSタンパク質発現の増加は、アムロジピン、シルデナフィルおよびTRAILで処置したLSECにおいて認められたが、一方でNOSのリン酸化の増加に関連付けられた唯一の薬剤はシルデナフィルであった。まとめると、本研究は、フェネストレーションの増加がアクチン細胞骨格の変化と関連があり、ある場合には、NOの放出と関連があり；この反応性が高齢になっても維持されることが重要である。
表５：種々の薬物および剤により亢進されるフェネストレーションの多孔度、直径および頻度の変化。
↑＝増加（P＜0.05）；(ns)＝（P＜0.1）。
【表５】
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【０２０８】
高齢マウスでは、NMN (50μg/mL)がフェネストレーションの多孔度と頻度に最大の増加を引き起こした。NMNは、生合成ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD+）代謝産物であり、それはNAD+サルベージ経路を介したNAD+生合成の調節にとって重要である。NMNは、NMNアセチルトランスフェラーゼによりNAD+に変換され、そしてニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼの存在下でNAD+分解産物のニコチンアミドから生産される。このサルベージ過程は、核、ミトコンドリアおよび細胞質ゾルにて起こり、そして肝臓において高レベルのNAD+を維持する。NAD+の上昇は、雌マウスへの500 mg/kg NMNの単回腹腔内注射の15分後に亢進される。高齢ラットにおいて、この投与量が非毒性であり、耐糖性の向上を促すことが証明された。７日間連続投与された同様の投与量が、食事と老化により誘発される２型糖尿病のマウスモデルにおいて、インスリンの作用と分泌を改善することも示された。本明細書に与えられるデータは、グルコース／インスリン代謝に対するNMNの効果についての１つのメカニズムが、高齢LSECの再フェネストレーション化を伴う可能性があり、それが肝臓におけるインスリン感受性の増加を引き起こし得ることを示唆している。幼若LSECでは、NMN (5000μg/mL濃度）が増加したフェネストレーション多孔度および頻度の増加を生じ、直径の分布をシフトさせた。フェネストレーション直径のヒストグラム（図12Ｃ）は、処置30分後に小さな30〜100 nmのフェネストレーションの存在と大きい125〜300 nmのフェネストレーションの存在を強調している。NMNはフェネストレーション頻度をかなり増加させ、このことは、小さいフェネストレーションの比率の増加が、新規なフェネストレーションの形成を意味するのかもしれないことを示唆している。高齢マウスでは、NMN処置はフェネストレーションの直径を、フェネストレーション直径の増加を意味する右側へとシフトさせた。従って、NMNで処置した高齢マウスでの平均フェネストレーション直径は、幼若の対照マウスと同様であった（高齢NMN： 132±2 nm vs 幼若対照: 131±7 nm）。
【０２０９】
それらの薬剤は、dSTORMを使って可視化されたように、アクチン細胞骨格に対して様々な効果を有していた。アクチンの濃縮とクラスター化は、サイトカラシンＤ、アムロジピン、シルデナフィルおよびNMNでの処置後に同様であるように見えた。しかしながら、７−ケトコレステロールでの処置は、広範性の伸長したアクチン網状構造をもたらし、おそらくそれはアクチン細胞骨格に繋がれている脂質ラフトの陥凹により生じると思われ、フェネストレーション直径の有意な15 nm増加を伴った。この結果は、アクチン細胞骨格に対して上流に作用する剤が、フェネストレーションの頻度に大きな影響を及ぼし、そして脂質ラフトに直接作用する剤は、恐らく非脂質ラフト細胞膜の増加の結果として、フェネストレーションの直径を付加的に増加させ得ることを示唆している。
【０２１０】
最近になってLSECフェネストレーションの調節が再検討され、その主な調節経路はVEGFとNOにより媒介されると考えられている。NOSとNOに影響を及ぼす３つの薬剤が研究された：アムロジピン、シルデナフィルおよびシンバスタチン。シルデナフィルのみが幼若マウスと高齢マウスの両方でLSECに作用し、アムロジピンはフェネストレーション変化において同様なパターンを示したが、統計的有意差を示さなかった。シルデナフィルは、PKE5の阻害を介してcGMP とPKGを活性化し、NOアバイラビリティ（利用能）の増加をもたらす。アムロジピンは、cGMP経由とCa2+チャネルの阻害によるのとNOに対して二元作用を有する。シルデナフィルはCa2+ 流入を阻害しない。シンバスタチンは、Akt依存性経路を介して内皮からのNOの放出を促進し、Rho GTPキナーゼを阻害してcGMPとPKGの活性化を間接的に促進する。シンバスタチンはCa2+ 流入を促進しない。この研究は、シルデナフィル、および程度は弱いがアムロジピンが、フェネストレーションの多孔度と頻度の変化を促進し、NOS発現を増加させることを示した。シンバスタチンは対照的に、フェネストレーション直径の有意でない増加を促した。これらの知見は、提唱されたNO-cGMP-PKG経路を裏付けるが、cGMPとPLGのシグナル伝達の直接ターゲティング（シルデナフィルやアムロジピンによるような）が、より大きいフェネストレーション多孔度を促進し、そしてAkt依存性NO放出をターゲッティングすることが、フェネストレーション直径を増加させることができることを示唆している。これらの薬剤が高齢動物においてインビボでフェネストレーションを増加させるかどうか、そしてそれが血中インスリンおよびリポタンパク質の肝クリアランスの増加を誘導するかどうかを決定するために更なる研究が必要である。
【０２１１】
TRAILの効果についても調べた。TRAILは死受容体作動薬であり、カスパーゼ−8依存性プログラム細胞死を促進する。高齢マウスでは、TRAILはLSECに対して最小の効果しか与えない；しかし幼若マウスでは、TRAILはフェネストレーションの多孔度に60％増加およびフェネストレーション頻度に40％増加と関連付けられた。TRAILは、フェネストレーション頻度と直径、アクチンおよびNOSに対する効果の点で、シルデナフィルと同様の効果を有した。TRAILは、ヒト臍静脈内皮細胞において１μg/mL処置の15分後にNOSおよびリン酸化NOSをアップレギュレートすることが報告された。それらの結果は、総合すると、別の確立された効果の中でも特に、TRAILは内皮細胞でのNOS発現にも影響を与えることを示している。
【０２１２】
以前、サイトカラシンＤ、７−ケトコレステロールおよびDOIが、フェネストレーション直径に対して有意な影響を及ぼすことなく幼若マウスにおいてフェネストレーション多孔度を増加させることを報告した。最近の研究において、本発明者らは７−ケトコレステロールのみ多孔度の増加を観察したが、しかしながらサイトカラシンＤは33％増加を示したが有意ではなかった（P = 0.08）。高齢マウスのLSECにおいてサイトカラシンＤ、７−ケトコレステロールはフェネストレーションを増加させたが、DOIは増加させないことも観察された。しかし、DOIの生体内投与が幼若（７か月齢）マウスにおいてのみフェネストレーションを増加させ、高齢（24か月齢）マウスではフェネストレーションを増加させなかったことを以前報告した。これらの結果の相違は、おそらく、それらの研究に使用した方法論（インビボ対インビトロ）および年齢（18か月対24か月）の相違を反映しているのだろう。 
【０２１３】
結論として、本発明者らは、NMN、シルデナフィルおよび７−ケトコレステロールでのインビトロ薬物治療が、幼若マウスと高齢マウスから単離されたLSECにおいて、フェネストレーション多孔度と頻度を増加させることを証明した。フェネストレーションの調節は、NO依存性および非依存性経路によって媒介され得る。加齢に伴う偽毛細血管化に関連するフェネストレーション喪失（defenestration）は、数種類の異なる薬剤によって回復させることができ、それが加齢に伴う脂質異常症および肝インスリン耐性に対して影響を与え得る。
【０２１４】
当業者は、広範囲に渡り記載される本発明の精神と範囲から逸脱することなく、特定の実施形態に示されるような本発明に対して多数の変更および／または修正を行い得ることを理解するだろう。従って、本実施形態は、全ての点に関して例示的であって限定的でないと見なされるべきである。
【０２１５】
本発明を好ましい実施形態に関して記載してきたが、当業者は本発明が多数の他の形態で具現化され得ることを認めるだろう。広範囲に記載される技術の精神または範囲から逸脱することなく、特定の実施形態に示されるような技術に対して多数の変更および／または修正を成し得ることは、当業者によって理解されるだろう。従って、本実施形態は全ての点で例示的であって限定的でないと見なされるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【国際調査報告】
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