(57)【要約】  金ナノ粒子を表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）基質として用い、非侵襲的な子宮頚部前癌検出のために、子宮頚部のスメア採取された細胞の生化学的情報を得る能力が、この特許文献に提示された。子宮頸がん検出のための微分スペクトルフィンガープリンティングの作成のために、ＳＥＲＳ試薬およびプラットフォームが開発され、最適化されている。ＳＥＲＳ測定は、以下の３つの群の子宮頚部剥離細胞試料で実施された：病理学的に子宮頸がん確認された患者の群（ｎ＝３６）、高悪性度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）を有する患者の別の群（ｎ＝４１）、および健康なボランティアの群（対象者、ｎ＝４７）。測定されたＳＥＲＳスペクトルにおけるラマンバンドの暫定的な割当から、子宮頸がん患者の細胞試料中のアミノ酸、核酸、カロテノイドの相対的な含有量が、健常者と比較して増加していることなどを含む、興味深い、がんに特異的な生体分子変化が示唆された。この研究からの結果は、金ナノ粒子に基づくＳＥＲＳ基質で採取された剥離子宮頚部スメア細胞の診断が、子宮頚部前癌病変の非侵襲的検出に大きな潜在的可能性を有することが実証された。【選択図】  図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ＳＥＲＳ基質として４０〜５０ｎｍの範囲のサイズを有する金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）と、
ｂ）保存液と、
ｃ）密度勾配溶液と、
ｄ）リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と、
ｄ）プレコーティングされたスライドガラスと、
を含む、子宮頸がんの異なるグレードをスクリーニングするためのキットであって、
前記ナノ粒子の濃度が８〜１０×１０１３個の粒子／ｍｌの範囲である、キット。
【請求項２】
試料をスライド上に固定するために用いられる前記保存液が、＞５０％のエタノール、メタノール、イソプロパノール、ホルムアルデヒド、生理食塩水、リン酸水素二カリウムを含む群から選択される、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記密度勾配溶液が、ＭｉｌｌｉＱ水中２０〜５０％（ｗ／ｖ）のスクロースである、請求項１に記載のキット。
【請求項４】
前記リン酸緩衝食塩水が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸二水素カリウムにより構成される、請求項１に記載のキット。
【請求項５】
スライドガラスが、ポリ−Ｌ−リジン、ＡＰＥＳ［（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン］を含む群から選択される化合物でプレコーティングされている、請求項１に記載のキット。
【請求項６】
前記子宮頸がんの異なるグレードが、ＮＲＭＬ（正常）、ＨＳＩＬ（高悪性度扁平上皮内病変）、ＣＳＣＣ（子宮頸部扁平上皮癌）からなる群から選択される、請求項１に記載のキット。
【請求項７】
以下のステップを含む、子宮頸がんの異なるグレードの検出方法：
ａ．＞５０％のエタノール、メタノール、イソプロパノール、ホルムアルデヒド、生理食塩水、リン酸水素二カリウムを含む保存液中に細胞試料を供給するステップと、
ｂ．ステップａにおいて得られた前記細胞試料を遠心分離して、ＭｉｌｌｉＱ水中２０〜５０％（ｗ／ｖ）のスクロースを含む密度勾配液を用いてペレットを得るステップと、
ｃ．ステップｂで得られた前記細胞ペレットを、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸二水素カリウムを含むＰＢＳバッファー中に再懸濁するステップと、
ｄ．ポリ−Ｌ−リジン、ＡＰＥＳ［（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン］を含む化合物でプレコーティングされたスライドガラスを供給するステップと、
ｅ．ステップｃで得られた細胞懸濁液を、ステップｄで得られたプレコーティングされたスライドガラス上へ滴下するステップと、
ｆ．ステップｅで得られた前記プレコーティングされたスライドガラス上へ滴下された前記細胞懸濁液をＡｕＮＰと１０〜３０分間、インキュベートするステップと、
ｇ．前記細胞試料から表面増強ラマン散乱を測定し、前記子宮頸がんの３つのグレード、すなわち、ＮＲＭＬ、ＨＳＩＬ、およびＣＳＣＣを識別するために該ラマンスペクトルパターンを分析するステップと、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異なるグレードの子宮頸がんを検出のためのスクリーニングキットに関する。より具体的には、本発明は、微分ラマンスペクトルパターンを用いて、子宮頚部から剥離した細胞中の子宮頚部の前癌性病変、すなわち、高悪性度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ：ｈｉｇｈ−ｇｒａｄｅ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｌｅｓｉｏｎ）および子宮頸部扁平上皮癌（ＣＳＣＣ：ｃｅｒｖｉｃａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）を同定するために開発された効率的なプラットフォームに関する。
【背景技術】
【０００２】
子宮頸がんは、世界中の女性の間で最もよく見られるがんの一つであり、インドにおいては女性の間で２番目に有病率の高いがんである。子宮頸がんは、子宮頚部が容易に検査しやすい臓器であり、浸潤性のがんが発生する１０〜１５年前に不均一なスペクトルの上皮異常（前癌病変）が出現することから、予防できるがんと考えられている（Ｓｕｊａｔｈａｎら）。子宮頚部のこれらの前癌病変の検出および根絶のためのパップスメアテスト（子宮頸がん細胞診）の意義が十分実証されている。これに基づいて、子宮頸がんについての体系的に組織化されたスクリーニングプログラムが、多くの先進国で実行されている。スウェーデン、デンマーク、フィンランドなど、組織化されたパップスメアスクリーニングプログラムによって女性が守られている国では、この疾患の発生率が急速に低下していることが観察されている。子宮頸部がんにおける高リスクＨＰＶの持続感染の役割は、今や十分確立されており、高リスクＨＰＶのうちの２つのＨＰＶに対する予防ワクチンが、現在、利用可能である。いくつかの他の女性の間で蔓延する高リスクのＨＰＶウイルス株を考慮すると、この疾患を効果的にコントロールするために、ワクチン、パップスメア試験およびＨＰＶ  ＤＮＡ試験が推奨されている。しかしながら、インドをはじめとする多くの資源の乏しい国々では、これらの対策はいまだ実行されておらず、子宮頸がんは、女性の生命に多大な影響を与え続けている。インドは、子宮頸がんの世界的負担の５分の１を占めている。子宮頸がんに関するＧｌｏｂｏｃａｎの報告によると、２０１２年には、約５２８，０００件の推定新症例と、２６６，０００件の死亡例が報告されている。子宮頸がんによる１０件の死亡のうち、ほぼ９件が、インドを含む低資源国で発生している。もし我々も集団スクリーニングプログラムを導入することができれば、女性の命を救うことができたと予想される。パップスメアによるスクリーニングプログラムを実行する上での大きな障害は、地域の対象となる女性のパップスメア（細胞診検体）を顕微鏡で分析するための訓練を受けた細胞学者が不足していることである。そのため、高度な訓練を受けた細胞学者を必要とすることなく、費用効果が高く、かつ信頼性の高い代替的なスクリーニング方法が緊急に必要とされている。
【０００３】
パップスメアテストは、子宮頚部の扁平円柱上皮接合部から自然に剥離した細胞を顕微鏡で分析する検査である。これらの細胞は、スパチュラで掻き取って採取した子宮頚管粘液に付着していることが多い。これらの細胞から、前癌病変（ＬＳＩＬ、ＨＳＩＬなど）や、悪性病変の様々な形態的特徴が調べられる。前癌病変は無症状であるため、定期的なスクリーニングプログラムを通してのみ見つけることができる。細胞の顕微鏡分析には、高度に訓練された細胞検査士が必要である。医師は、検査の際に、子宮頚部を可視化し、子宮頚部から細胞試料を採取し、保存液中に保存する。これらの細胞は、スライドガラス上に塗抹され、パップ染色で染色され、訓練された細胞検査士により顕微鏡下で形態的特徴について調べられ、正常、または前癌病変ＬＳＩＬ／ＨＳＩＬ陽性、または悪性病変陽性として報告される。全ての陽性試料はさらに、細胞病理学者によって確認される。スメアは、改変型ベセスダシステムに従って報告される場合が多い。前癌病変は、病変が進行していないことを確認するために計画的に治療・経過観察される。パップスメアを用いた定期的な組織的スクリーニングプログラムが行われている先進国の報告によれば、スメアの８５％以上が正常範囲内にあるとされる。このため、費用効果の高い方法によってこれらの正常なスメアを、熟練した細胞検査士を利用することなくスクリーニングで除くことができれば、その他の１５％は、資源の過剰な利用なしに、手作業での方法に供することができる。
【０００４】
熟練した細胞検査士を手配することが困難であり、また時間のかかる技術であるため、いくつかの他の代替技術の需要が高い。子宮頸がんの特異的かつ正確なスクリーニング対する需要が、高い選択性と感度を有する新しい診断プローブの開発を促進してきた。非弾性光散乱に基づくラマン分光法（ＲＳ）は、タンパク質、核酸、脂質などの高分子の重要な生化学的情報を提供することができる。これは、各分子が、ラマンシグネチャとして機能できる、独自の振動パターンを有するからである。ラマン分光法は、最近、組織内のがん検出、および新生物の異なるステージにおける悪性度の同定のための新しい非侵襲的な診断ツールとして登場した。いくつかのグループは、肺、胃、膀胱、乳房、副甲状腺、前立腺、および子宮頚部などの様々な身体部位において正常組織と悪性組織の識別におけるラマン分光法の適用を研究してきた。
【０００５】
しかしながら、ラマン散乱は、その本質的に小さな断面積のため、極めて効率が悪いという欠点がある。また、生物学的試料のラマンスペクトルは、しばしば強い蛍光バックグラウンドの上に重畳され、膨大となり、ラマンシグナルを抽出することが困難になる可能性がある。そのため、医療診断においては、これらの欠点が通常のラマン分光法の実用化に大きな問題となっている。表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）の発見により、過去２０年間、ラマン分光法に大きな関心が寄せられている。表面増強ラマン散乱は、１９７４年に、Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎらによって初めて報告された。最近の研究では、ＳＥＲＳ技術を用いてラマン活性分子をナノテクスチャー化した金属表面に付着させると、１０１０〜１０１４倍、ラマンシグナルが増強され、自己蛍光バックグラウンドが低下することが示されている。ＳＥＲＳテクノロジーは、ラマン分光法の検出感度を大きく向上させ、生物医学における大きな可能性を秘めていることから、注目を集めている。抗原と相補的な抗体との間の特異的相互作用に依存するＳＥＲＳに基づくイムノアッセイは、最新の腫瘍学適用のために開発されたストラテジーである。無標識ＳＥＲＳは膨大かつ複雑なデータセットを生成し、スペクトルデータから実質的な情報を採掘するために、より洗練された分析プロセスを必要とする。金ナノ粒子の様々な沈着および配向により生じる、強度および空間的散乱の大きな不一致は、得られたスペクトルデータの明確さを低下させる。そのような課題が存在するにもかかわらず、主成分分析（ＰＣＡ）、線形判別分析（ＬＤＡ）、クラスタ分析、サポートベクターマシン分析（ＳＶＭ）などの計量化学分析の導入により、分類と特性評価のためのスペクトルデータセットの質が強化または改善された。
【０００６】
子宮頸がんの場合、子宮頚部の剥離細胞を掻き取って生成されたスメアは、非侵襲的な方法で痛み伴うことなく、診断される患者の処置を通して簡便かつ継続的に行うことができ、生検は、高悪性度の病変や浸潤性癌の確認のために行われる、認められたスクリーニング方法である。以前に報告された全ての研究では、ラマン測定には、細胞試料ではなく組織試料を用いていた。しかし、組織試料の採取には、外科的処置を必要とするため、スクリーニング目的としては勧められない。金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）は、それらの好ましい物理的、化学的性質および生体適合性のため、本研究ではＳＥＲＳ基質として用いている。
【０００７】
本発明において、発明者らは、細胞内のアミノ酸と関連するタンパク質、脂質、核酸、ＤＮＡ、および変数である、アミドＩＩ、アミドＩＩＩなどの可変のラマンフィンガープリントにおける明瞭な変化により、ＮＲＭＬ患者、ＨＳＩＬ患者、およびＣＳＣＣ患者を識別することができる生化学的変化を見出すために、子宮頚部の剥離細胞におけるＳＥＲＳスペクトル評価のためのＡｕＮＰの使用を探索した。本発明者らの知る限りでは、これは、子宮頚部の前癌の検出のためのＡｕＮＰと無標識ナノ製剤を用いた子宮頚部剥離細胞のＳＥＲＳに基づく分析に関する最初の報告である。その結果は、単一細胞、細胞ペレット、抽出されたＤＮＡ測定を用いて、３つのクラス間での有意なレベルの識別を示した。
【０００８】
定義
ＡｕＮＰ  −  金ナノ粒子
ＮＲＭＬ  −  正常
ＨＳＩＬ  −  高悪性度扁平上皮内病変
ＣＳＣＣ  −  子宮頸部扁平上皮がん
【発明の概要】
【０００９】
発明の目的
本発明の主な目的は、異なるグレードの子宮頸がんのスクリーニングのためのキットに関する。
【００１０】
本発明の他の目的は、ラマンフィンガープリント分析により３つのグレード、すなわち、ＮＲＭＬ、ＨＳＩＬ、およびＣＳＣＣの存在量を提供することである。
【００１１】
本発明のさらに別の目的は、十分な数の患者試料を用いて、ピーク強度、ピークシフトに関して、アミノ酸に関連したタンパク質、脂質、核酸、ＤＮＡの存在などのシグネチャスペクトルの妥当性を検証することである。
【００１２】
本発明のさらに別の目的は、計量化学的分析により検証される分別認識、感度、特異性、および予測精度である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の要約
したがって、本発明は、健康な被験者と高悪性度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）患者および子宮頸部扁平上皮癌（ＣＳＣＣ）患者間の生体分子フィンガープリントの有意なラマンスペクトルパターンによって指定された、ＳＥＲＳ基質としての特定濃度のＡｕＮＰの簡単な処理および利用による、子宮頚部から得られる剥離細胞の３つの主要グレードについて、ＳＥＲＳに基づくプラットフォームにおいて有用な無標識検出キットを提供する。ＳＥＲＳバンドにおいて測定される特異的なピークの割当と共にラマン強度差は、良性および悪性の子宮頚部腫瘍が、ＤＮＡ、タンパク質、脂質などの様々な生体分子の相対的な量を含む、子宮頚部上皮細胞の構造的および特異的な生体分子の変化を生じさせたことを明らかにする。有意な強度をもつカロテノイドのピークは、がん試料の場合は高い。これらの変動は、正常試料から癌細胞への代謝変化と関連している可能性がある。この探索的研究による結果は、早期がん検出およびスクリーニングの診断のための、無標識の、非侵襲的で、簡便な臨床ツールとしてのＳＥＲＳに基づくプラットフォームによる子宮頸がんの大きな可能性を示している。
【００１４】
本発明の一実施形態では、子宮頸がんの異なるグレードのスクリーニング用キットであって、以下を含む、キットを提供する：
ａ）ＳＥＲＳ基質として４０〜５０ｎｍの範囲のサイズを有する金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）
ｂ）＞５０％のエタノール、メタノール、イソプロパノール、ホルムアルデヒド、生理食塩水、リン酸水素二カリウムを含む、保存液
ｃ）ＭｉｌｌｉＱ水中２０〜５０％（ｗ／ｖ）のスクロースを含む密度勾配溶液
ｄ）塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸二水素カリウムからなるリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）
ｅ）試料を効果的に付着するための、ポリ−Ｌ−リジン、ＡＰＥＳ［（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン］を含むプレコーティングされたスライドガラス（表面増強ラマン散乱プラットフォーム）。
【００１５】
本発明の一実施形態において、本発明は、ナノ粒子の濃度が８〜１０×１０１３個の粒子／ｍｌの範囲であるキットを提供する。
【００１６】
本発明の一実施形態において、本発明は、スライド上の試料を固定するために用いられる保存液が、＞５０％エタノール、メタノール、イソプロパノール、ホルムアルデヒド、生理食塩水、リン酸水素二カリウムを含む群から選択される、キットを提供する。
【００１７】
本発明の一実施形態において、本発明は、密度勾配溶液がＭｉｌｌｉＱ水中２０〜５０％（ｗ／ｖ）のスクロースを含む、キットを提供する。
【００１８】
本発明の一実施形態において、リン酸緩衝食塩水が塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸二水素カリウムを含む、キットを提供する。
【００１９】
本発明の一実施形態において、本発明は、スライドガラスにおける細胞の接着のために、ポリ−Ｌ−リジン、ＡＰＥＳ［（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン］を含む群から選択される化合物でスライドガラスがコーティングされている、キットを提供する。
【００２０】
本発明のさらに別の実施形態において、本発明は、子宮頸がんの異なるグレードが、ＮＲＭＬ（正常）、ＨＳＩＬ（高悪性度扁平上皮内病変）、ＣＳＣＣ（子宮頸部扁平上皮癌）からなる群から選択される、キットを提供する。
【００２１】
本発明のさらに別の実施形態において、本発明は、子宮頸がんの異なるステージを検出するための方法であって、以下を含む、方法を提供する：
ａ．＞５０％のエタノール、メタノール、イソプロパノール、ホルムアルデヒド、生理食塩水、リン酸水素二カリウムを含む保存液中に細胞試料を供給するステップ、
ｂ．ステップａにおいて得られた細胞試料を遠心分離し、ＭｉｌｌｉＱ水中の２０〜５０％（ｗ／ｖ）のスクロースを含む密度勾配液を用いてペレットを得ることにより、高密度の上皮細胞をチューブの底部にペレットとして濃縮し、ＲＢＣ、多形、炎症細胞、粘液のようなあまり高密度ではない干渉細胞を上清として除去するステップ、
ｃ．ステップｂで得られた細胞ペレットを、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸二水素カリウムを含むＰＢＳバッファー中で再懸濁するステップ、
ｄ．ポリ−Ｌ−リジン、ＡＰＥＳ［（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン］を含む化合物でプレコーティングされたスライドガラスを供給するステップ、
ｅ．ステップｃで得られた懸濁液を、ステップｄで得られたプレコーティングされたスライドガラス上へ滴下するステップ、
ｆ．ステップｅで得られたプレコーティングされたスライドガラス上へ滴下された細胞懸濁液をＡｕＮＰで約１０〜３０分間、インキュベートするステップ、
ｇ．細胞試料からの表面増強ラマン散乱を測定し、ラマンスペクトルパターンを分析して、３つのグレード、すなわち、ＮＲＭＬ、ＨＳＩＬ、およびＣＳＣＣを識別するステップ。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
本発明の目的および特徴は、添付の図面と併せて参照することで、それぞれが示す以下の本発明の説明から明らかになるであろう：
【図１】４００ｃｍ−１から１８００ｃｍ−１までのＣＳＣＣ試料についての代表的なスペクトルを示す図である。
【図２】４００ｃｍ−１から１８００ｃｍ−１までのＨＳＩＬ試料についての代表的なスペクトルを示す図である。
【図３】４００ｃｍ−１から１８００ｃｍ−１までのＮＲＭＬ試料についての代表的なスペクトルを示す図である。
【図４】ＮＲＭＬ、ＨＳＩＬ、およびＣＳＣＣ由来のＤＮＡ試料についての微分スペクトル（５００ｃｍ−１〜１８００ｃｍ−１）およびそれのそれぞれのピーク割当を示す図である。
【図５】ａ）単一細胞、ｂ）細胞ペレット、ｃ）抽出ＤＮＡにおける線形判別分析を示す図である。
【図６】全体的な作業を表すスキームを示す図である。
【図７】ＮＲＭＬ試料、ＨＳＩＬ試料、およびＣＳＣＣ試料からの平均ＳＥＲＳスペクトルピークの比較を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
子宮頚部の剥離細胞のＮＲＭＬ、ＨＳＩＬ、およびＣＳＣＣを識別するための、ＳＥＲＳ基質として、金ナノ粒子、ＡｕＮＰ（４０〜５０ｎｍ）８〜１０×１０１３個の粒子／ｍｌを含むキットを用いたＳＥＲＳに基づく診断プラットフォームを展開した。本発明者らの究極の目標は、子宮頚部から採取された剥離細胞内で、ＨＳＩＬおよびＣＳＣＣ細胞をＮＲＭＬから明確に認識する、ＳＥＲＳナノ製剤を用いて微分スペクトルパターンを検証することである。この研究は現地の倫理委員会により承認された。検体採取に先立ち、全ての患者はインフォームドコンセントフォームに署名している。病理学的に確認された子宮頚部スメア、ＮＲＭＬ、ＨＳＩＬ、およびＣＳＣＣを、腟鏡を用いて、ＢＤ保存液中に採取する。密度勾配遠心分離を実施し、上皮細胞をペレットとして落下させた。その後、ペレットを、ＰＢＳバッファー中に再懸濁し、スライドガラスにスメアボタンとして滴下した。ＳＥＲＳスペクトル分析は、スペクトログラフ回折格子６００ｇｒ／ｍｍを有する６３３ｎｍレーザー励起源のダイオードレーザーを用いて、ＡｕＮＰと試料（８〜１０×１０１３個の粒子／ｍｌ）の９：１比率で、最大１０〜２０秒間の積分時間で約１０〜１５個程度の集積を行った。単一細胞、細胞ペレット、および抽出ＤＮＡを調査し、３つのカテゴリーに識別した。ＮＲＭＬは、その最高ピークに標準化された場合、ＨＳＩＬおよびＣＳＣＣ試料に比べ、比較的強度の低いピークを有する。ＮＲＭＬ、ＨＳＩＬ、およびＣＳＣＣ間の有意なＳＥＲＳスペクトルシグネチャは、４８１、５７３、６６６、７２９、８２６、９５６、１００２、１０８０，１１６３、１１７５、１２８６、１３７３、および１５５８ｃｍ−１であることが観察された。トリプトファン、チロシン、およびフェニルアラニンのような全体的な芳香族アミノ酸ピークは、ＳＥＲＳスペクトルにおいて顕著であり、ＮＲＭＬと比較して、ＨＳＩＬおよびＣＳＣＣからの強度の顕著な増加を示した。核酸のリン酸骨格に対応する１０８０ｃｍ−１における顕著なピークは、ＮＲＭＬ試料において１０６６ｃｍ−１でのシフトを有するＣＳＣＣ試料において明らかであった。アミドＩＩＩのシグナルは、ＨＳＩＬおよびＣＳＣＣにおいて、より高いことが見出された一方、アミドＩＩは、ＮＲＭＬ試料とＨＳＩＬ試料とＣＳＣＣ試料との間でシフトを示した。線形判別分析では、ＮＲＭＬ試料とＣＳＣＣ試料との間で１４ｎｍシフト、ＮＲＭＬ試料とＨＳＩＬ試料の間では１１ｎｍシフト、ＨＳＩＬ試料とＣＳＣＣ試料の間では３ｎｍシフトを示した。線形判別分析は、全細胞、細胞ペレット、および抽出ＤＮＡにおいてＮＲＭＬ試料、ＨＳＩＬ試料、およびＣＳＣＣ試料との間で明確な識別が可能であった。加えて、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）分析による計量化学的分析では、単一細胞について、１％未満の標準偏差で９０％よりも大きい予測精度、細胞ペレットについて、１％未満の標準偏差で７５％よりも大きい予測精度、および抽出ＤＮＡについて、４％未満の標準偏差で９０％よりも大きい予測精度を示した。
【実施例】
【００２４】
以下の実施例は、本発明の例として提供されたものであり、したがって、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【００２５】
実施例１
ＳＥＲＳに基づくスクリーニングキットの調製
（ｉ）無標識検出のための金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）の合成およびその濃度の最適化。
金ナノ粒子（ＡｕＮＰ、約４０〜５０ｎｍのサイズ）を、十分確立されたクエン酸還元方法により調製した。合成されたナノ粒子の特性評価は、紫外可視（ＵＶ−ｖｉｓ）分光法、動的光散乱法（ＤＬＳ）、および高分解能透過電子顕微鏡法（ＨＲＴＥＭ）により実施した。
サイズは約４０〜５０ｎｍであり、最適なＳＥＲＳ基質として機能した。
（ｉｉ）最大ラマンシグナル強度を提供するＡｕＮＰの最適濃度；
最大のＳＥＲＳ強度が得られる最適濃度が評価された（ＡｕＮＰ  ８〜１０×１０１３個の粒子／ｍｌ）。
（ｉｉｉ）＞５０％のエタノール、メタノール、イソプロパノール、ホルムアルデヒド、生理食塩水、リン酸水素二カリウムを含む、採取された試料の保存および固定のための保存液を調製した。
（ｉｖ）試料中の上皮細胞を濃縮するための、ＭｉｌｌｉＱ水中の２０〜５０％（ｗ／ｖ）のスクロースを含む密度勾配溶液を調製した。
（ｖ）細胞ペレットの再懸濁のための、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸二水素カリウムを含むリン酸緩衝食塩水を調製した。
（ｖｉ）ＳＥＲＳプラットフォームは、スライドガラスにおける細胞試料を接着するために、ポリ−Ｌ−リジン、ＡＰＥＳ［（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン］を含む化合物でコーティングされたスライドガラスからなる。
【００２６】
実施例２
剥離細胞からのＳＥＲＳフィンガープリント
剥離細胞試料を、＞５０％のエタノール、メタノール、イソプロパノール、ホルムアルデヒド、生理食塩水、リン酸水素二カリウムを含む保存溶液中に採取した。子宮頚部スメア試料において上皮細胞を濃縮するために、スクロースを勾配溶液として用い、密度勾配遠心分離を実施した。得られたペレットを、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸二水素カリウムを含むＰＢＳバッファー中に再懸濁した。再懸濁された溶液を、ポリ−Ｌ−リジン、ＡＰＥＳ［（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン］でコーティングされたスライドガラスに滴下した。１０〜３０分間のインキュベーション後、余分な液体を捨て、スライドを、ＳＥＲＳ測定まで無水エタノール中に保存した。単一細胞は、明視野に焦点を当てており、スペクトルは、細胞の異なる領域から取得された。形態学的に正常細胞と異常細胞の同定が疑われた後、多くのスペクトルは、細胞のランダムな位置から、および、核からも取得されている。細胞質に対する核サイズの比率は、ＳＥＲＳ測定を行うための形態学的判別パラメータについての特徴として採用される。ＳＥＲＳスペクトル分析は、８〜１０×１０１３個の粒子／ｍｌの濃度を有するＡｕＮＰを用いて行われ、スペクトログラフ回折格子６００ｇｒ／ｍｍを有する６３３ｎｍレーザー励起源のダイオードレーザーによって、１０〜１５秒間の積分時間で１０〜２０個程度の集積を設定して分析される。レーザー出力は、３〜７ｍＷである。フィンガープリント領域４００ｃｍ−１〜１８００ｃｍ−１を、３つのクラス間でのスペクトル差について分析した。
−  十分な数の患者試料に関し、ピーク強度、ピークシフトに関しての、アミノ酸関連タンパク質、脂質、核酸、ＤＮＡの存在量により得られるシグネチャラマンスペクトル。
−  分別認識：計量化学的分析により得られる特異性と予測精度。
【００２７】
実施例３
子宮頸部扁平上皮癌（ＣＳＣＣ）からの単一細胞スペクトル分析
ＣＳＣＣ試料を、＞５０％のエタノール、メタノール、イソプロパノール、ホルムアルデヒド、生理食塩水、リン酸水素二カリウムを含む保存溶液中に採取した。子宮頚部スメア試料において上皮細胞を濃縮するために、スクロースを勾配溶液として用い、密度勾配遠心分離を実施した。得られたペレットを、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸二水素カリウムを含むＰＢＳバッファー中に再懸濁した。再懸濁された溶液を、ポリ−Ｌ−リジン、ＡＰＥＳ［（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン］でコーティングされたスライドガラスに滴下した。１０〜３０分間のインキュベーションの後、余分の液体を捨て、スライドを、ＳＥＲＳ測定まで無水エタノール中に保存した。
【００２８】
ＣＳＣＣ細胞は、４８１ｃｍ−１、５７３ｃｍ−１、６６６ｃｍ−１、７２９ｃｍ−１、８２６ｃｍ−１、９２０ｃｍ−１、９５６ｃｍ−１、１００２ｃｍ−１、１０１２ｃｍ−１、１０８０ｃｍ−１、１１５６ｃｍ−１、１１６３ｃｍ−１、１１７５ｃｍ−１、１２８６ｃｍ−１、１３７３ｃｍ−１、１５４４ｃｍ−１を含む４００〜１８００ｃｍ−１の範囲に様々なピークを有する。芳香族アミノ酸、トリプトファン、チロシン、およびフェニルアラニンのピークは、ＣＳＣＣ試料において有意な強度を示した。トリプトファンの存在量は、５７３ｃｍ−１ピークにおけるピークから明らかであった。ＣＳＣＣ試料において、チロシンのピークは１１６３ｃｍ−１で顕著であった。全ての試料において、フェニルアラニンは１００２ｃｍ−１にピークがあり、ＨＳＩＬおよびＣＳＣＣ試料において、１０１２ｃｍ−１にショルダーピークを示した。カロテノイドのピークは９５６ｃｍ−１および１１５６ｃｍ−１に顕著な強度を示し、がん細胞が損傷するのに抵抗するのを助け、また、がん細胞が多量の糖タンパク質を合成するのを助けた。ＮＲＭＬ試料における１０６６ｃｍ−１での核酸のＰＯ２伸縮は、ＨＳＩＬ試料およびＣＳＣＣ試料において、それぞれ、有意に増加し、１０８０ｃｍ−１へのシフトを示した。ＤＮＡ含有量増加を示す８２６ｃｍ−１におけるＰＯ２伸縮ピークは、ＨＳＩＬ試料およびＣＳＣＣ試料において顕著であったが、ＮＲＭＬにおいては見られなかった。ＣＳＣＣ試料では、核酸塩基のシトシン、グアニン、アデニン、およびチミンのピークは、６６６ｃｍ−１、７２９ｃｍ−１、１１７５ｃｍ−１、１３７３ｃｍ−１において顕著であった。アミドＩＩＩのシグナルは、ＮＲＭＬ試料における１２６０ｃｍ−１からＣＳＣＣ試料における１２８６ｃｍ−１へシフトされ、ＣＳＣＣにおいて顕著であることが見出された一方、アミドＩＩのシグナルは、ＮＲＭＬ試料における１５５８ｃｍ−１からＣＳＣＣ試料における１５４４ｃｍ−１へのシフトを示した。線形判別分析では、単一細胞、細胞ペレット、および抽出ＤＮＡにおいて、ＮＲＭＬ試料、ＨＳＩＬ試料、およびＣＳＣＣ試料から癌腫試料の明確な識別が可能であった。
【００２９】
実施例４
高悪性度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）からの単一細胞スペクトル分析
ＨＳＩＬ試料を、＞５０％のエタノール、メタノール、イソプロパノール、ホルムアルデヒド、生理食塩水、リン酸水素二カリウムを含む保存溶液中に採取した。子宮頚部スメア試料において上皮細胞を濃縮するために、スクロース勾配溶液を用いて、密度勾配遠心分離を実施した。得られたペレットを、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸二水素カリウムを含むＰＢＳバッファー中に再懸濁した。再懸濁された溶液を、ポリ−Ｌ−リジン、ＡＰＥＳ［（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン］のいずれかでコーティングされたスライドガラスに滴下した。１０〜３０分間のインキュベーション後、余分な液体を捨て、スライドを、ＳＥＲＳ測定まで無水エタノール中に保存した。
【００３０】
ＨＳＩＬ由来の細胞は、４８１ｃｍ−１、５７３ｃｍ−１、６６６ｃｍ−１、７２９ｃｍ−１、８２６ｃｍ−１、９５６ｃｍ−１、１００２ｃｍ−１、１０１２ｃｍ−１、１０８０ｃｍ−１、１１６３ｃｍ−１、１１７５ｃｍ−１、１２８０ｃｍ−１、１３７３ｃｍ−１、および１５４７ｃｍ−１を含む、４００〜１８００ｃｍ−１の範囲に有意なシグネチャピークを有することが見出された。１０１２ｃｍ−１および５７３ｃｍ−１におけるピークが、それぞれフェニルアラニンおよびトリプトファンに起因するＨＳＩＬ試料における異常の活性の増加を示した。８２６ｃｍ−１における核酸のピークは、ＨＳＩＬ試料およびＣＳＣＣ試料においてシフトした。ＰＯ２伸縮に起因する１０８０ｃｍ−１におけるピークは、核酸の存在量の増加を示すものであるが、ＣＳＣＣ試料よりも少ない。１１７５ｃｍ−１におけるピークは、ＨＳＩＬ試料におけるシトシン、グアニンの増加を示した。１２８０ｃｍ−１のピークは、アミドＩＩＩに起因するものであり、これも、ＮＲＭＬおよびＣＳＣＣと比較してシフトしている。１５４７ｃｍ−１のピークは、アミドＩＩに起因するものであり、これも、ＣＳＣＣ試料における１５４４ｃｍ−１からわずかにシフトしている。
【００３１】
実施例５
正常（ＮＲＭＬ）からの単一細胞スペクトル分析
ＮＲＭＬ試料を、＞５０％のエタノール、メタノール、イソプロパノール、ホルムアルデヒド、生理食塩水、リン酸水素二カリウムを含む保存溶液中に採取した。子宮頚部スメア試料において上皮細胞を濃縮するために、スクロース勾配溶液を用いて、密度勾配遠心分離を実施した。得られたペレットを、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸二水素カリウムを含むＰＢＳバッファー中に再懸濁した。再懸濁された溶液を、ポリ−Ｌ−リジン、ＡＰＥＳ［（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン］のいずれかでコーティングされたスライドガラスに滴下した。１０〜３０分間のインキュベーション後、余分な液体を捨て、スライドを、ＳＥＲＳ測定まで無水エタノール中に保存した。
【００３２】
正常細胞は、６６６ｃｍ−１、７２９ｃｍ−１、８５０ｃｍ−１、９５６ｃｍ−１、１００２ｃｍ−１、１０６６ｃｍ−１、１１６３ｃｍ−１、１２６０ｃｍ−１、１３７３ｃｍ−１、および１５５８ｃｍ−１を含む４００〜１８００ｃｍ−１の範囲にシグネチャピークを示した。１００２ｃｍ−１におけるピークは、フェニルアラニンの存在を示した。１０６６ｃｍ−１に軽微なピークが見出されたが、これは核酸ＰＯ２伸縮に関連したものであり、ＣＳＣＣ試料において顕著に１０８０ｃｍ−１へシフトされている。１１６３ｃｍ−１のピークは、脂質Ｃ＝Ｃ伸縮およびチロシンに関連していた。１２６０ｃｍ−１におけるアミドＩＩＩのピークは、正常試料において顕著であった。アミドＩＩのピークは、１５５８ｃｍ−１に示され、それは、ＨＳＩＬ試料およびＣＳＣＣ試料において有意にシフトされた。
【００３３】
実施例６
ＣＳＣＣ子宮頚部剥離細胞、ＨＳＩＬ子宮頚部剥離細胞、およびＮＲＭＬ子宮頚部剥離細胞の差異
【表１】
2021530718.tif 000003
【００３４】
実施例７
細胞ペレットスペクトル分析
剥離細胞試料を、＞５０％のエタノール、メタノール、イソプロパノール、ホルムアルデヒド、生理食塩水、リン酸水素二カリウムを含む保存溶液中に採取した。子宮頚部スメア試料において上皮細胞を濃縮するために、スクロース勾配溶液を用いて、密度勾配遠心分離を実施した。得られたペレットを、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸二水素カリウムを含むＰＢＳバッファー中に再懸濁した。
【００３５】
細胞ペレットを、ＡｕＮＰと直接混合し、ＳＥＲＳスペクトル分析を行った。正常細胞と異常細胞の両方を含むペレットは不均一な性質であるため、シグネチャラマンスペクトルの混合物を取得し、ＳＶＭ分析により７５％近い予測精度が得られた。
【００３６】
実施例８
ＤＮＡスペクトル分析
＞５０％のエタノール、メタノール、イソプロパノール、ホルムアルデヒド、生理食塩水、リン酸水素二カリウムを含む保存溶液中で、採取された異なるＮＲＭＬ試料、ＨＳＩＬ試料、およびＣＳＣＣ試料からＤＮＡを単離し、ＡｕＮＰを用いたＳＥＲＳスペクトル分析を行った。スペクトログラフ回折格子６００ｇｒ／ｍｍ／１２００ｇｒ／ｍｍを有する６３３／７８６ｎｍレーザー励起源のレーザーを用いて、１０〜１５秒間の積分時間で１０〜２０個程度の集積を行い、特定の割合のＡｕＮＰで、いくつかのスペクトルを取得した。レーザー出力は、３〜７ｍＷの間で用いられた。３つのクラス間のスペクトル差について、フィンガープリント領域４００〜１８００ｃｍ−１を分析した。核酸塩基に対応する７２９ｃｍ−１、１１７５ｃｍ−１、１４２１ｃｍ−１、および１５７８ｃｍ−１が、異常なＤＮＡ試料において顕著であった。核酸のリン酸骨格は、８２６ｃｍ−１および１０８０ｃｍ−１のピークにおいて有意に明らかであった。
【００３７】
実施例９
計量化学的分析
統計的分析によるＮＲＭＬとＨＳＩＬとＣＳＣＣとの間のスペクトル差の検証を行った。ＰＣＡ、ＬＤＡ、およびＳＶＭ分析を含む全ての統計的分析は、Ｒソフトウェアを用いて行われ。群内変動は、細胞からのラマンデータの獲得中のノイズにより発生する可能性があり、ＰＣＡの特異性の低下をもたらす原因となる。したがって、さらなる分析のためにＬＤＡおよびＳＶＭをさらに採用した。
【００３８】
線形判別分析（ＬＤＡ）
分類について、理論的および概念的には、ＬＤＡは、より優れている。ＬＤＡは、統計的に有意な群において変数を分析するために用いられる。全ての３つの試料間での明確な境界が、ＮＲＭＬ、ＨＳＩＬ、およびＣＳＣＣについて得られた。
【００３９】
サポートベクターマシン（ＳＶＭ）
サポートベクターマシンは、データを分類および回帰分析について分析するアルゴリズムを用いた、教師あり学習モデルまたは機械学習法である。分析は、訓練セットとしてスペクトルの７５％をランダムに選択することにより行い、残りの２５％をテストセットとして用いた。ＳＶＭ分析を、５００個の異なるランダム試料に関して繰り返し行い、平均予測精度を測定した。その結果、単一細胞について９０％より上、細胞ペレットについて７５％、および抽出ＤＮＡについて９０％の精度が得られた。
【表２】
2021530718.tif 000004
【００４０】
発明の利点
本発明の主な利点は以下の通りである。
１．ＮＲＭＬ、ＨＳＩＬ、およびＣＳＣＣのＳＥＲＳスペクトルパターンの有意な違いが、ＳＥＲＳに基づく無標識検出により見出された。
２．免疫染色は時間がかかり、正しい評価のために熟練した細胞検査士が必要とされ、ＨＰＶ  ＰＣＲは、それのグレードに無関係な、異常試料の非特異的増幅を引き起こし、かつ高価であるため、ＳＥＲＳは、その微分スペクトルにより、正常、ＨＳＩＬ、およびがん性試料を識別することができる、正確で、簡単で、信頼性の高い技術である。
３．表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）技術を用いた無標識検出プラットフォームにより、子宮頸がん剥離細胞のグレードを識別した診断スクリーニングキットを提供する。
４．スクリーニングキットは、３つのグレードの最大の分化を得るために、子宮頚部剥離細胞を濃縮する新しいＳＥＲＳ技術を採用した。
５．トリプトファン、フェニルアラニン、およびチロシンのような芳香族アミノ酸が豊富に含まれ、ＮＲＭＬとＨＳＩＬとＣＳＣＣの間を有意に識別する特定のピークシフトが得られる
６．ＣＳＣＣ試料において顕著な、６６６ｃｍ−１、７２９ｃｍ−１、１１７５ｃｍ−１、１３７３ｃｍ−１における核酸塩基、すなわち、シトシン、グアニン、アデニンのピークを提供する。
７．正常試料では顕著ではなかった、ＣＳＣＣ試料で得られた、高強度での９５６ｃｍ−１および１１５６ｃｍ−１におけるカロテノイドのピークの主要な同定を提供する。
８．ＨＳＩＬ陽性試料およびＣＳＣＣ陽性試料に対してのみ特異的な１０７０〜１０９０ｃｍ−１範囲に見られるＤＮＡの増加を示した核酸のＰＯ２伸縮の同定。
９．１２６０ｃｍ−１および１５５８ｃｍ−１におけるアミドＩＩＩのピークと１２６アミドＩＩのピークが、ＨＳＩＬ試料およびＣＳＣＣ試料において顕著なシフトを示したことを提供する。
１０．ラマンスペクトルが、計量化学的分析によって評価され、細胞試料において８０％より高い感度を示し、子宮頚部前癌病変のスクリーニングのための参照スペクトルとして利用さることを提供する。
【図１】
2021530718.tif 000005
【図２】
2021530718.tif 000006
【図３】
2021530718.tif 000007
【図４】
2021530718.tif 000008
【図５ａ）】
2021530718.tif 000009
【図５ｂ）】
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【図５ｃ）】
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【図６】
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【図７】
2021530718.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】令和2年1月20日(2020.1.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ＳＥＲＳ基質として４０〜５０ｎｍの範囲のサイズを有する金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）と、
ｂ）保存液と、
ｃ）密度勾配溶液と、
ｄ）リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と、
ｅ）プレコーティングされたスライドガラスと、
を含む、子宮頸がんの異なるグレードをスクリーニングするためのキット。
【請求項２】
前記ナノ粒子の濃度が８〜１０×１０１３個の粒子／ｍＬの範囲である、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
試料をスライド上に固定するために用いられる前記保存液が、＞５０％のエタノール、メタノール、イソプロパノール、ホルムアルデヒド、生理食塩水、リン酸水素二カリウムを含む群から選択される、請求項１に記載のキット。
【請求項４】
前記密度勾配溶液が、ＭｉｌｌｉＱ水中２０〜５０％（ｗ／ｖ）のスクロースである、請求項１に記載のキット。
【請求項５】
前記リン酸緩衝食塩水が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸二水素カリウムにより構成される、請求項１に記載のキット。
【請求項６】
スライドガラスが、ポリ−Ｌ−リジン、ＡＰＥＳ［（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン］を含む群から選択される化合物でプレコーティングされている、請求項１に記載のキット。
【請求項７】
前記子宮頸がんの異なるグレードが、ＮＲＭＬ（正常）、ＨＳＩＬ（高悪性度扁平上皮内病変）、ＣＳＣＣ（子宮頸部扁平上皮癌）からなる群から選択される、請求項１に記載のキット。
【請求項８】
以下のステップを含む、子宮頸がんの異なるグレードの検出方法：
ａ．＞５０％のエタノール、メタノール、イソプロパノール、ホルムアルデヒド、生理食塩水、リン酸水素二カリウムを含む保存液中に細胞試料を供給するステップと、
ｂ．ステップａにおいて得られた前記細胞試料を遠心分離して、ＭｉｌｌｉＱ水中２０〜５０％（ｗ／ｖ）のスクロースを含む密度勾配液を用いてペレットを得るステップと、
ｃ．ステップｂで得られた前記細胞ペレットを、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸二水素カリウムを含むＰＢＳバッファー中に再懸濁するステップと、
ｄ．ポリ−Ｌ−リジン、ＡＰＥＳ［（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン］を含む化合物でプレコーティングされたスライドガラスを供給するステップと、
ｅ．ステップｃで得られた細胞懸濁液を、ステップｄで得られたプレコーティングされたスライドガラス上へ滴下するステップと、
ｆ．ステップｅで得られた前記プレコーティングされたスライドガラス上へ滴下された前記細胞懸濁液をＡｕＮＰと１０〜３０分間、インキュベートするステップと、
ｇ．前記細胞試料から表面増強ラマン散乱を測定し、前記子宮頸がんの３つのグレード、すなわち、ＮＲＭＬ、ＨＳＩＬ、およびＣＳＣＣを識別するために該ラマンスペクトルパターンを分析するステップと、
を含む、方法。
【国際調査報告】
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