(57)【要約】  本開示は、アルギナーゼアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）融合タンパク質、及びその調製方法と使用方法に関する。また、肥満、代謝障害、及び関連する合併症と併存症を治療するためにアルギニン枯渇を行う方法も提供される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）ポリペプチドおよびアルギナーゼポリペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項２】
前記ＡＢＤポリペプチドは、配列番号６６、配列番号６７又は配列番号６８と少なくとも９３％の配列相同性を有するポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記アルギナーゼポリペプチドは、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１又は配列番号７２と少なくとも９５％の配列相同性を有するポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記ＡＢＤポリペプチドは、配列番号６６、配列番号６７又は配列番号６８と少なくとも９３％の配列相同性を有するポリペプチド配列を含み、前記アルギナーゼポリペプチドは配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１又は配列番号７２と少なくとも９５％の相同性を有するポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記ＡＢＤポリペプチドは、配列番号６６と少なくとも９３％の配列相同性を有するポリペプチド配列を含み、前記アルギナーゼポリペプチドは配列番号６９と少なくとも９５％の配列相同性を有するポリペプチド配列を含む、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記ＡＢＤポリペプチドのＣ末端と、前記アルギナーゼポリペプチドのＮ末端とを接続するペプチドリンカーを更に含み、前記ペプチドリンカーは１〜２０個のアミノ酸を有する直鎖状ポリペプチドである、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記ペプチドリンカーは、配列番号７３又は配列番号７４と少なくとも９０％の配列相同性を有するポリペプチド配列を含む、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記ＡＢＤポリペプチドは配列番号６７と少なくとも９３％の配列相同性を有するポリペプチド配列を含み、前記アルギナーゼポリペプチドは配列番号７２と少なくとも９５％の相同性を有するポリペプチド配列を含む、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記ペプチドリンカーは、４〜８個のヒスチジンアミノ酸を有するポリヒスチジンリンカーである、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号７５又は配列番号７６と少なくとも９８％の配列相同性を有するポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
配列番号４９、配列番号５０、配列番号７５及び配列番号７６と少なくとも９８％の配列相同性を有するポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
配列番号４９、配列番号５０、配列番号７５及び配列番号７６から成る群から選択されるポリペプチドを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
請求項１に記載の融合タンパク質と、薬学的に許容し得る担体、賦形剤又はそれらの組み合わせとを含む医薬組成物。
【請求項１４】
癌の治療を必要とする対象において癌を治療する方法であって、請求項１に記載の融合タンパク質の治療有効量を前記対象に投与する工程を含む方法。
【請求項１５】
肥満、代謝障害及び関連する合併症から成る群から選択される少なくとも１種の病態の治療を必要とする対象においてその病態を治療する方法であって、アルギニン枯渇剤の治療有効量を前記対象に投与する工程を含む方法。
【請求項１６】
前記代謝障害は、肥満、耐糖能異常、高血糖症、真性糖尿病から成る群から選択され、前記関連する合併症は糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性脈管障害、糖尿病性神経障害、高コレステロール血症、脂質異常症、脂肪症、脂肪性肝炎、線維症、肝硬変、炎症、高血圧、循環器疾患及び褐色脂肪の白色化から成る群から選択される１種以上の病態である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記代謝障害はインスリン抵抗性である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
肥満の治療は脂肪量の増加を防ぐことと脂肪量を減少させることの内の少なくとも一を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記代謝障害は脂肪肝、腎脂肪症、膵臓脂肪症及び心臓脂肪症から成る群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象の血清中のアルギニン濃度を５０μＭ未満に維持する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記アルギニン枯渇剤は、アルギニン異化酵素である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記アルギニン異化酵素は、アルギナーゼタンパク質、アルギニンデイミナーゼタンパク質又はアルギニンデカルボキシラーゼタンパク質である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記アルギナーゼタンパク質、アルギニンデイミナーゼタンパク質又はアルギニンデカルボキシラーゼタンパク質は、１個以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基を更に含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記アルギナーゼタンパク質は、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３又は配列番号１０４の配列を有するポリペプチドを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記アルギナーゼタンパク質、アルギニンデイミナーゼタンパク質又はアルギニンデカルボキシラーゼタンパク質は、アルブミン結合ドメイン又はヒト血清アルブミン、又はヒトＩｇＧＦｃドメインを更に含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記アルギニン異化酵素は、ＡＢＤポリペプチドとアルギナーゼポリペプチド、ＡＢＤポリペプチドとアルギニンデイミナーゼポリペプチド、又はＡＢＤポリペプチドとアルギニンデカルボキシラーゼポリペプチドを含む融合タンパク質である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記アルギニン異化酵素は、請求項１に記載の融合タンパク質である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記アルギニン異化酵素は、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号７５又は配列番号７６と少なくとも９８％の配列相同性を有するポリペプチドを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ウイルス感染症、多発性硬化症、関節リウマチ、自己免疫疾患、先天性高アルギニン血症、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）及び炎症から成る群から選択される少なくとも１種の病態の治療を必要とする対象においてその病態を治療する方法であって、請求項１に記載の融合タンパク質の治療有効量を前記対象に投与する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１８年５月３１日出願の米国仮特許出願第６２／６７８，３００号の優先権を主張するものであり、本参照をもって当該仮出願の全内容を本明細書の一部を構成するものとする。
【０００２】
本開示は、アルギナーゼアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）融合タンパク質、及びその調製方法と使用方法に関する。また、肥満、代謝障害、及び／又は関連する合併症及び／又は併存症を治療するためにアルギニン枯渇を行う方法も提供される。
【背景技術】
【０００３】
アルギナーゼは、アルギニンからオルニチン及び尿素への異化を触媒する加水分解酵素であり、殆どの生物に存在する。ヒトにおいては、アルギナーゼの２種のアイソフォーム、即ち、アルギナーゼＩ型とＩＩ型が存在し、これらは組織分布と分子特性が異なる。
【０００４】
アルギナーゼＩは主に肝臓の細胞質で見られ、三量体として存在する３５ｋＤのタンパク質である。約３８．５ｋＤのタンパク質であるアルギナーゼＩＩは通常、細胞のミトコンドリアに存在し、細胞内のアルギニン／オルニチン濃度の調節に関与していると考えられる。
【０００５】
腫瘍のうち幾つかのタイプでは、アルギニン合成に必要なアルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ）及び／又はオルニチントランスカルバモイラーゼ（ＯＴＣ）が欠乏しているか又はその産生レベルが低いため、このような腫瘍はアルギニン栄養要求性である。アルギニンを欠乏させることによって、このような腫瘍細胞の著しい脆弱性を利用して腫瘍細胞の急速な死をもたらす。従って、酵素媒介のアルギニン枯渇は、腫瘍細胞を選択的に破壊するための潜在的な戦略として検討されてきた。
【０００６】
癌治療として、酵素媒介によるアルギニン枯渇を発生させる上での主な障害は、アルギナーゼの分子量が低い（＜５０ｋＤａ）ためにその循環半減期が短い（数分〜数時間）ことであり、そのため腎クリアランスによって迅速に排出される。体循環において有効な治療濃度を維持するために、頻繁な投薬スケジュールが必要となる場合があり、それは患者のコンプライアンスの問題を引き起こす可能性がある。
【０００７】
この問題を考慮し、治療用タンパク質の薬物動態特性を改善するために様々な戦略が展開されてきた。種々の治療用タンパク質にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を結合させること（即ち、ＰＥＧ化）によって、タンパク質の流体力学的半径が増加し、腎クリアランスによる排出を遅らせることが示されている。Ｆｃ新生児受容体（ＦｃＲｎ）のリサイクリング機序に基づく融合タンパク質戦略も検討されており、免疫グロブリン、アルブミン又はアルブミン結合ペプチドの断片結晶化可能（Ｆｃ）領域のタンパク質への融合によってタンパク質の循環半減期が増加することが示されている。しかし、薬物動態が改善されたアルギニン枯渇タンパク質の開発ニーズが依然として存在する。
【０００８】
肥満、代謝障害、及び関連する合併症と併存症は、２１世紀で最も深刻な世界規模の公衆衛生問題の一部と見なされており、大きな社会経済的負担となっている。更に、肥満の代謝結果は他の障害、例えば、２型糖尿病、耐糖能異常、インスリン抵抗性、高コレステロール血症、脂質異常症、高血圧、心血管疾患及び癌の原因となる。従って、肥満、代謝障害、及び関連する合併症と併存症の予防及び／又は治療のための安全で有効な方法が大いに必要とされている。肥満はエネルギーの摂取と消費の不均衡の結果である。生活習慣介入だけでは、個人が十分に減量したり、減量を持続させたりして健康を改善する上で有効とはなり得ない。オルリスタット（ゼニカル）、ロルカセリン（ベルビック）、フェンテルミンとトピラマートの合剤（クシミア）等の抗肥満薬を服用して、食欲を減らしたり脂肪吸収を減らしたりして減量することができる。しかし、このような薬物には、脂溶性ビタミンの吸収低下、頭痛、疲労、めまい、下痢及び便失禁等、様々な副作用がある。肥満外科手術、例えば、胃バンディング術を用いると、重度の肥満を治療して長期的な減量を果たすことができ、また、不要な局所性脂肪沈着物を除去するための脂肪吸引は、美容上の理由から人気を得ている。しかし、この種の侵襲的手法もかなりのリスクを伴う。従って、肥満、代謝障害、及び関連する合併症と併存症を治療する改良方法を開発する必要がある。
【発明の概要】
【０００９】
上述の必要性の１以上に対処するために提供されるのは、インビボ半減期とアルギニン異化活性が改善されたアルギナーゼＡＢＤ融合タンパク質である。本明細書に記載の融合タンパク質は、アルギニン枯渇が治療効果を有する疾患又は病態の治療、例えば、癌、ウイルス感染症、多発性硬化症、関節リウマチ、自己免疫疾患、先天性高アルギニン血症、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、炎症、肥満及び代謝障害、及び関連する合併症と併存症の治療に有用である。融合タンパク質は粗タンパク質から迅速に生成及び精製することができる。融合タンパク質は単独で使用することもでき、少なくとも１種の他の剤と併用して疾患の治療又は予防に相乗効果を与えることもできる。
【００１０】
また、対象のアルギニン濃度を枯渇させること（例えば、対象にアルギニン枯渇剤を投与すること）によって、肥満、代謝障害、及び／又は関連する合併症及び／又は併存症を治療する方法も提供される。
【００１１】
第１の様相において提供されるのは、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）ポリペプチドおよびアルギナーゼポリペプチドを含む融合タンパク質である。
【００１２】
第１の様相の第１の実施形態において提供されるのは、ＡＢＤポリペプチドが配列番号６６、配列番号６７又は配列番号６８と少なくとも９３％の配列相同性を有するポリペプチド配列を含む、第１の様相の融合タンパク質である。
【００１３】
第１の様相の第２の実施形態において提供されるのは、アルギナーゼポリペプチドが配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１又は配列番号７２と少なくとも９５％の配列相同性を有するポリペプチド配列を含む、第１の様相の融合タンパク質である。
【００１４】
第１の様相の第３の実施形態において提供されるのは、ＡＢＤポリペプチドが配列番号６６、配列番号６７又は配列番号６８と少なくとも９３％の配列相同性を有するポリペプチド配列を含み、アルギナーゼポリペプチドが配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１又は配列番号７２と少なくとも９５％の相同性を有するポリペプチド配列を含む、第１の様相の融合タンパク質である。
【００１５】
第１の様相の第４の実施形態において提供されるのは、ＡＢＤポリペプチドが配列番号６６と少なくとも９３％の配列相同性を有するポリペプチド配列を含み、アルギナーゼポリペプチドが配列番号６９と少なくとも９５％の配列相同性を有するポリペプチド配列を含む、第１の様相の第３の実施形態の融合タンパク質である。
【００１６】
第１の様相の第５の実施形態において提供されるのは、ＡＢＤポリペプチドのＣ末端とアルギナーゼポリペプチドのＮ末端を接続するペプチドリンカーを更に含み、ペプチドリンカーは１〜２０個のアミノ酸を有する直鎖状ポリペプチドである、第１の様相の第４の実施形態の融合タンパク質である。
【００１７】
第１の様相の第６の実施形態において提供されるのは、ペプチドリンカーが配列番号７３又は配列番号７４と少なくとも９０％の配列相同性を有するポリペプチド配列を含む、第１の様相の第５の実施形態の融合タンパク質である。
【００１８】
第１の様相の第７の実施形態において提供されるのは、ＡＢＤポリペプチドが配列番号６７と少なくとも９３％の配列相同性を有するポリペプチド配列を含み、アルギナーゼポリペプチドが配列番号７２と少なくとも９５％の相同性を有するポリペプチド配列を含む、第１の様相の第６の実施形態の融合タンパク質である。
【００１９】
第１の様相の第８の実施形態において提供されるのは、ペプチドリンカーが４〜８個のヒスチジンアミノ酸を有するポリヒスチジンリンカーである、第１の様相の第７の実施形態の融合タンパク質である。
【００２０】
第１の様相の第９の実施形態において提供されるのは、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号７５又は配列番号７６と少なくとも９８％の配列相同性を有するポリペプチド配列を含む、第１の様相の融合タンパク質である。
【００２１】
第１の様相の第１０の実施形態において提供されるのは、配列番号４９、配列番号５０、配列番号７５及び配列番号７６と少なくとも９８％の配列相同性を有するポリペプチド配列を含む、第１の様相の融合タンパク質である。
【００２２】
第１の様相の第１１の実施形態において提供されるのは、配列番号４９、配列番号５０、配列番号７５及び配列番号７６から成る群から選択されるポリペプチドを含む、第１の様相の融合タンパク質である。
【００２３】
第２の様相において提供されるのは、第１の様相の融合タンパク質と、薬学的に許容し得る担体、賦形剤又はそれらの組み合わせとを含む医薬組成物である。
【００２４】
第３の様相において提供されるのは、癌の治療を必要とする対象において癌を治療する方法であって、第１の様相の融合タンパク質の治療有効量を対象に投与する工程を含む方法である。
【００２５】
第４の様相において提供されるのは、肥満、代謝障害及び関連する合併症から成る群から選択される少なくとも１種の病態の治療を必要とする対象においてその病態を治療する方法であって、アルギニン枯渇剤の治療有効量を対象に投与する工程を含む方法である。
【００２６】
第４の様相の第１の実施形態において提供されるのは、代謝障害が肥満、耐糖能異常、高血糖症及び真性糖尿病から成る群から選択され、関連する合併症が糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性脈管障害、糖尿病性神経障害、高コレステロール血症、脂質異常症、高トリグリセリド血症、高レプチン血症、脂肪症、脂肪性肝炎、線維症、肝硬変、慢性低悪性度炎症、高血圧、循環器疾患及び褐色脂肪の白色化から成る群から選択される１種以上の病態である方法である。
【００２７】
第４の様相の第２の実施形態において提供されるのは、代謝障害がインスリン抵抗性である方法である。
【００２８】
第４の様相の第３の実施形態において提供されるのは、肥満の治療が脂肪量の増加を防ぐことと脂肪量を減少させることの内の少なくとも一を含む方法である。
【００２９】
第４の様相の第４の実施形態において提供されるのは、代謝障害が脂肪肝、腎脂肪症、膵臓脂肪症及び心臓脂肪症から成る群から選択される方法である。
【００３０】
第４の様相の第５の実施形態において提供されるのは、対象の血清中のアルギニン濃度を５０μＭ未満に維持する方法である。
【００３１】
第４の様相の第６の実施形態において提供されるのは、アルギニン枯渇剤がアルギニン異化酵素である方法である。
【００３２】
第４の様相の第７の実施形態において提供されるのは、アルギニン異化酵素がアルギナーゼタンパク質、アルギニンデイミナーゼタンパク質又はアルギニンデカルボキシラーゼタンパク質である、第４の様相の第６の実施形態の方法である。
【００３３】
第４の様相の第８の実施形態において提供されるのは、アルギナーゼタンパク質、アルギニンデイミナーゼタンパク質又はアルギニンデカルボキシラーゼタンパク質が１個以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基を更に含む、第４の様相の第７の実施形態の方法である。
【００３４】
第４の様相の第９の実施形態において提供されるのは、アルギナーゼタンパク質が配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３又は配列番号１０４を有するポリペプチドを含む、第４の様相の第８の実施形態の方法である。
【００３５】
第４の様相の第１０の実施形態において提供されるのは、アルギナーゼタンパク質、アルギニンデイミナーゼタンパク質又はアルギニンデカルボキシラーゼタンパク質が、アルブミン結合ドメイン又はヒト血清アルブミン、又はヒトＩｇＧＦｃドメインを更に含む、第４の様相の第７の実施形態の方法である。
【００３６】
第４の様相の第１１の実施形態において提供されるのは、アルギニン異化酵素がＡＢＤポリペプチドとアルギナーゼポリペプチド、ＡＢＤポリペプチドとアルギニンデイミナーゼポリペプチド、又はＡＢＤポリペプチドとアルギニンデカルボキシラーゼポリペプチドを含む融合タンパク質である、第４の様相の第１０の実施形態の方法である。
【００３７】
第４の様相の第１２の実施形態において提供されるのは、アルギニン異化酵素が第１の様相の融合タンパク質である、第４の様相の第１１の実施形態の方法である。
【００３８】
第４の様相の第１３の実施形態において提供されるのは、アルギニン異化酵素が、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号７５又は配列番号７６と少なくとも９８％の配列相同性を有するポリペプチドを含む、第４の様相の第１２の実施形態の方法である。
【００３９】
第５の様相において提供されるのは、ウイルス感染症、多発性硬化症、関節リウマチ、自己免疫疾患、先天性高アルギニン血症、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）及び炎症から成る群から選択される少なくとも１種の病態の治療を必要とする対象においてその病態を治療する方法であって、第１の様相の融合タンパク質の治療有効量を対象に投与する工程を含む方法である。
【００４０】
本開示の上述及び他の目的や特徴は、添付の図面と併せて本発明の以下の説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）組換えヒトアルギナーゼ（ｒｈＡｒｇ）融合タンパク質Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）の精製を示す。レーン１：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ低域マーカー（Ｂｉｏ−ｒａｄ社）、レーン２：Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）２０倍希釈、レーン３：Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）１０倍希釈。
【図２Ａ】プライマーの結合位置を示した、例示的なＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ遺伝子（配列番号３８）を示す。
【図２Ｂ】理論的ｐＩ／Ｍｗが６．０７／４２５５５．３８のＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）融合タンパク質のタンパク質配列を示す。
【図３】セリンからシステインへの単一部位変異とＣ末端ヒスチジンタグを有する、遺伝子操作したBacillus caldoveloxアルギナーゼＢＣＡ（Ｓ１６１Ｃ）−Ｈｉｓ（配列番号８９）のタンパク質配列を示す。１６１位のシステイン残基と６×Ｈｉｓタグをハイライトした。
【図４】ＣＬＵＳＴＡＬＷによるＢＣＡ（Ｓ１６１Ｃ）−Ｈｉｓ（配列番号８９）、ＢＣＡ−６×Ｈｉｓ−ＡＢＤ融合タンパク質ＢＨＡ（配列番号７５）及びＢＣＡ−ＡＢＤ−６×Ｈｉｓ融合タンパク質ＢＡＨ（配列番号７６）のタンパク質配列のアラインメントを示す。アラインメントスコア：  ＢＣＡ対ＢＨＡ：９９．６７２１、ＢＣＡ対ＢＡＨ：９８．０３２８、ＢＨＡ対ＢＡＨ：９７．５１３８。
【図５Ａ】ニッケル充填した５ｍＬのＨｉＴｒａｐキレーティングＨＰカラムクロマトグラフィー（一工程）による、５００ｍＬの振盪フラスコ培養で増殖させた大腸菌からのＢＨＡ（配列番号７５）精製の溶出プロファイルを示す。ｍＡＵ：ミリ吸収単位、１００％Ｂ＝０．５Ｍイミダゾール。
【図５Ｂ】ＢＨＡ（配列番号７５）用のニッケルアフィニティークロマトグラフィーからのカラム画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。Ｍ：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分子量マーカー、低域（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）、ＦＴ：フロースルー、Ｆ２〜Ｆ１０：カラムからの溶出画分。
【図５Ｃ】ニッケル充填した５ｍＬのＨｉＴｒａｐキレーティングＨＰカラムクロマトグラフィー（一工程）による、５００ｍＬの振盪フラスコ培養で増殖させた大腸菌菌体からのＢＡＨ（配列番号７６）精製の溶出プロファイルを示す。ｍＡＵ：ミリ吸収単位、１００％Ｂ＝０．５Ｍイミダゾール。
【図５Ｄ】ＢＡＨ（配列番号７６）用のニッケルアフィニティークロマトグラフィーからのカラム画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。Ｍ：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分子量マーカー、低域（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）、ＦＴ：フロースルー、Ｆ２〜Ｆ１４：カラムからの溶出画分。
【図６Ａ】総容積が１９６ｍＬのＸＫ５０ニッケルアフィニティーカラムを使用した、遺伝子操作したＢＣＡ（Ｓ１６１Ｃ）−Ｈｉｓ（配列番号８９）の大規模精製を示すクロマトグラムを示す。小規模精製と同様に、４セグメント溶出勾配を採用し、溶出プロファイルを２８０ｎｍにおける吸光度でモニターした。
【図６Ｂ】遺伝子操作したＢＣＡ（Ｓ１６１Ｃ）−Ｈｉｓ（配列番号８９）の大規模精製からの選択画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。レーン１は低分子量マーカーである。レーン２は細胞可溶化物からの総タンパク質である。レーン３は熱処理後に採取した可溶性タンパク質を表す。レーン４はＸＫ５０ニッケルアフィニティーカラムからのタンパク質フロースルーを示す。レーン５は非特異的結合タンパク質（Ａ６〜Ｃ３からのプールされた画分）である。レーン６〜１０はそれぞれ画分Ｅ２、Ｅ３、Ｆ７、Ｇ３及びＡ’５を表す。
【図７】非変性ＰＡＧＥにおけるＮ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ融合タンパク質（配列番号４９）とＨＳＡとの結合を示す。３０ピコモルのＨＳＡを、レーン５〜９にそれぞれ示すように７．５、１５、３０、６０及び１２０ピコモルのＮ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）と混合した。非変性ＰＡＧＥでの３０ピコモルのＨＳＡおよびＮ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）の移動度を、それぞれレーン２とレーン３に示す。レーン１は空又はブランクである。レーン１０は１２０ピコモルのＮ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）を示す。
【図８】非変性ＰＡＧＥにおけるＢＨＡ融合タンパク質（配列番号７５）とＨＳＡとの結合を示す。６０ピコモルのＨＳＡを、レーン１〜５にそれぞれ示すように６、１２、６０、３００及び６００ピコモルのＢＨＡ融合タンパク質（配列番号７５）と混合した。非変性ＰＡＧＥでの６０ピコモルのＨＳＡおよびＢＨＡ融合タンパク質（配列番号７５）の移動度をそれぞれレーン６とレーン７に示す。「ＢＣＡ−ＡＢＤ」と表示されたバンドはＢＨＡ（配列番号７５）である。
【図９】マウスの血漿アルギニンに対するＢＣＡ（Ｓ１６１Ｃ）−Ｈｉｓ（配列番号８９）とＢＨＡ融合タンパク質（配列番号７５）の薬力学を示す。各ＢＡＬＢ／ｃマウスに２５０ＵのＢＣＡ（Ｓ１６１Ｃ）−Ｈｉｓ（配列番号８９）又はＢＨＡ融合タンパク質（配列番号７５）を静脈内注射（ｉ．ｖ．）又は腹腔内注射（ｉ．ｐ．）によって投与した。血漿の採取は注射後の図示の時点で行った。時間０は注射前に採取した血漿試料を指す。各試料中のアルギニンの量はＢｉｏｃｈｒｏｍ３０アミノ酸分析計によって求める。これらのプロットでは、検出限界（３μＭ）未満のアルギニン濃度を０μＭと見なす。各点は３匹のマウスの平均±ＳＤを表す。
【図１０】Ｎ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）の単一用量（（Ａ）１２５Ｕ、（Ｂ）２５０Ｕ、及び（Ｃ）５００Ｕ）を腹腔内注射した後にＢｉｏｃｈｒｏｍ３０アミノ酸分析計で測定したＢＡＬＢ／ｃマウスの血漿中アルギニン濃度を示す。Ｎ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）を０日目に注射した。
【図１１】ＰＥＧ化されたＨｉｓ−ｒｈＡｒｇ（配列番号１０１）の生成のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。レーン１及び８：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ低分子量マーカー（Ｂｉｏ−ｒａｄ社）、レーン２及び３：Ｈｉｓ−ｒｈＡｒｇ（配列番号１０１）、レーン４及び５：６０％溶出、レーン６及び７：３０％溶出、レーン９及び１０：ＰＥＧ化Ｈｉｓ−ｒｈＡｒｇ（配列番号１０１）。ＰＥＧの分子量は５０００である。使用したＰＥＧは、メトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルプロピオネート（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ  ５０００）である。Ｈｉｓ−ｒｈＡｒｇ（配列番号１０１）のタンパク質表面リジン残基は、プロピオンアミジル（ＳＰＡ）リンカーを介してＰＥＧ（５０００ａｍｕ）に共有結合している（米国特許第８，６７９，８１０号に記載、本参照をもってこの特許を本明細書の一部を構成するものとする）。
【図１２】Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）の調製の結果を示す。レーン１：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分子量マーカー、レーン２：細胞可溶化物、レーン３：熱処理後、レーン４：フロースルー、レーン５：３０％溶出、レーン６：６０％溶出、レーン７：接線フロー濾過（ＴＦＦ）後。レーン６又はレーン７の主要なタンパク質バンドは精製されたＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）である。
【図１３】固形飼料を給餌したＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスの血漿中アルギニン濃度を示す。この濃度測定は、Ａｇｉｌｅｎｔ６４６０液体クロマトグラフィー／エレクトロスプレーイオン化三連四重極型質量分析計（検出限界：０．３μＭアルギニン）を使用し、単一用量５００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）の生理食塩水溶液を腹腔内注射した後の様々な時点で行ったが、この結果から、血漿中アルギニン濃度が１０日間に亘って１μＭ未満まで枯渇し得ることが分かった。各時点は５匹のマウスの平均±ＳＥＭを表す。
【図１４】単一用量５００ＵでＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）をＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスに注射した後の様々な時点でのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇの血漿中濃度を示す。この測定はＥＬＩＳＡによって行いヒトアルギナーゼを検出した（ｎ＝５）。この薬物の循環半減期は約４日である。各時点は５匹のマウスの平均±ＳＥＭを表す。
【図１５】固形飼料を給餌し、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）で処理した正常な痩せたＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウス［固形飼料（ｒｈＡｒｇ）群］における有意な脂肪減少を示す。（Ａ）ベヒクル（生理食塩水）処理対照［固形飼料（ベヒクル）群］と比較して、５００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）によって１０日間隔で４週間に亘って処理した後の内臓脂肪量と皮下脂肪量の有意な減少。＊Ｐ＜０．０５、独立ｔ検定。データは±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝５である。（Ｂ）Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）で処理したマウスの内臓白色脂肪組織（ＷＡＴ）のヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色パラフィン切片では、脂肪細胞サイズの顕著な減少が示された。
【図１６】リアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲを使用して測定した様々な組織における数種の重要な脂質生成関連遺伝子の発現レベルを示す。ベヒクル処理対照［固形飼料（ベヒクル）群］と比較して、５００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）によって１０日間隔で４週間に亘って処理［固形飼料（ｒｈＡｒｇ）群］した後の（Ａ）内臓白色脂肪組織（ＷＡＴ）と（Ｂ）肝臓における脂質生成関連遺伝子の有意なダウンレギュレーション。遺伝子発現レベルはベヒクル処理マウス［固形飼料（ベヒクル）群］（１に設定）と比較して表す。＊Ｐ＜０．０５、独立ｔ検定。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝５である。
【図１７】Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）による処理がインスリン感受性を有意に改善することを示す。（Ａ）インスリン負荷試験によって、１０日間隔で５００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）を注射したマウス［固形飼料（ｒｈＡｒｇ）群］では、ベヒクル処理対照［固形飼料（ベヒクル）群］と比較して、処理後２週間ですぐにインスリンの血糖降下作用に対する感受性が有意に増加したことが分かった。＊Ｐ＜０．０５対固形飼料（ｒｈＡｒｇ）群、独立ｔ検定。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝５である。（Ｂ）ＭＴＴアッセイによって、マウス初代肝細胞を５Ｕ／ｍＬのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）で４８時間処理しても、処理を行わなかった対照（ｃｏｎ）と比較して細胞生存率に影響を及ぼさなかったことが分かった。（Ｃ）１００ｎＭのインスリンへ２０分間曝露する前に５Ｕ／ｍＬのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）を用いて２４時間アルギニン枯渇させたマウス初代肝細胞におけるリン酸化Ａｋｔ（ｐＡｋｔ）（インスリンシグナル伝達のマーカー）のタンパク質濃度のウエスタンブロット分析。Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）で処理した肝細胞では、インスリンによる刺激時にＡｋｔのリン酸化レベルがより高くなったが、これはインスリンシグナル伝達の増強を示唆した。レーン１：ｃｏｎ、レーン２：５Ｕ／ｍＬのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）、レーン３：１００ｎＭインスリン、レーン４：５Ｕ／ｍＬのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）＋１００ｎＭインスリン。
【図１８】６０ｋｃａｌ％脂肪含有の高脂肪食（ＨＦＤ）を給餌したベヒクル処理Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウス（８週齢から１２週間）［ＨＦＤ（ベヒクル）群］では（Ａ）体重と（Ｂ）サイズが顕著に増加した一方、ＨＦＤ給餌雄性マウス（８週齢から１２週間）に対して同時に行った３００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）による処理［ＨＦＤ（ｒｈＡｒｇ）群］（週１回）によって、体重増加を効果的に防止することができたことを示す。その体重は、１０ｋｃａｌ％脂肪含有の対応低脂肪食（ＬＦＤ）を給餌したベヒクル処理の痩せた対照マウス［ＬＦＤ（ベヒクル）群］と同等のままであった。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝５である。
【図１９】ＨＦＤ給餌雄性マウスに対して同時に行った３００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）による処理［ＨＦＤ（ｒｈＡｒｇ）群］（週１回、１２週間）によって、ＨＦＤ誘発性の白色脂肪組織（ＷＡＴ）の増大を効果的に防止することができたことを示す。（Ａ）主な内臓（性腺周囲、腎周囲及び腸間膜）貯蔵と皮下（鼠径部）貯蔵の脂肪体の重量。（Ｂ）内臓ＷＡＴのＨ＆Ｅ染色切片から、同時に行ったＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇによる処理がＨＦＤ誘発性の白色脂肪細胞の肥大を防止したことが分かった。（Ｃ）ＷＡＴにおける数種の重要な脂質生成関連遺伝子の発現レベルを痩せた対照［ＬＦＤ（ベヒクル）群］（１に設定）と比較して表す。これらの遺伝子は、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇで処理したＨＦＤ給餌マウスで劇的にダウンレギュレートされた。＊Ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡに続いてフィッシャーのＬＳＤを行った。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝５である。
【図２０】脂質生成の転写調節因子（ＰｐａｒｇとＳｒｅｂｐ１ｃ）のＨＦＤ誘発性アップレギュレーションの抑制と、同時に起こる、３００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）で処理したマウス［ＨＦＤ（ｒｈＡｒｇ）群］（週１回、１２週間）の骨格筋における重要な脂質生成酵素（Ａｃｃ１とＳｃｄ１）のダウンレギュレーションを示す。＊Ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡに続いてフィッシャーのＬＳＤを行った。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝５である。
【図２１】同時に行った３００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）による処理［ＨＦＤ（ｒｈＡｒｇ）群］（週１回）によって、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌性マウスにおけるＨＦＤ誘発性肥満を効果的に防止することができたことを示す。（Ａ）８週齢から１２週間に亘ってＨＦＤを給餌すると共にＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ又はベヒクルで処理したマウスの体重。ＬＦＤを給餌したベヒクル処理雌性マウスを痩せた対照［ＬＦＤ（ベヒクル）群］とした。（Ｂ）主な内臓（性腺周囲、腎周囲及び腸間膜）貯蔵と皮下（鼠径部）貯蔵の脂肪体の重量。＊Ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡに続いてフィッシャーのＬＳＤを行った。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝５である。
【図２２】同時に行った３００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）による処理［ＨＦＤ（ｒｈＡｒｇ）群］（週１回）によって、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌性マウスにおけるＨＦＤ誘発性のインスリン抵抗性と耐糖能障害を効果的に防止することができたことを示す。（Ａ）ＨＦＤの給餌７週目に行ったインスリン負荷試験（ＩＴＴ）。（Ｂ）ＨＦＤの給餌１１週間目に行ったブドウ糖負荷試験（ＧＴＴ）。ＩＴＴとＧＴＴの結果は曲線下面積（ＡＵＣ）で表す。＊Ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡに続いてフィッシャーのＬＳＤを行った。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝５である。
【図２３】Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）（ｒｈＡｒｇ）、ウシアルギナーゼ又は天然アルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ）を培地に添加することによるアルギニン枯渇、又はアルギニンを含まない培地を使用することによるアルギニン枯渇がマウス３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞から脂肪細胞への分化を阻害したことを示す。アルギナーゼ代謝産物であるＬ−オルニチン又は尿素、又はＡＤＩ代謝産物であるＬ−シトルリンを培地に添加しても、脂肪生成及び脂質生成に対する阻害効果はなかった。（＊培地は０．４ｍＭのＬ−アルギニンを含んでおり、アルギナーゼによって０．４ｍＭのＬ−オルニチンと０．４ｍＭの尿素に、ＡＤＩによって０．４ｍＭのＬ−シトルリンに転化される）。アルギニン枯渇剤又はアルギナーゼ／ＡＤＩの代謝産物を添加せずに培地で増殖させた細胞を対照とした。培地に添加した特定の分化誘導因子へ曝露させてから６日後にオイルレッドＯで細胞中の脂質を染色した。
【図２４】Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）が３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞における脂肪生成及び脂質生成遺伝子を抑制することができたことを示す。マウス３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞を特定の因子を添加した培地で６日間培養し、脂肪細胞への分化を誘導した（分化させた）。このような因子を含まない培地で増殖した細胞は未分化のままであった。培地に２Ｕ／ｍＬのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）（ｒｈＡｒｇ）を添加した。Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇを添加せずに培地で増殖させた細胞を対照とした。数種の重要な（Ａ）脂肪生成の転写調節因子と（Ｂ）脂質生成経路における酵素のｍＲＮＡ発現レベルをリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲによって求め、未分化（対照）群（１に設定）と比較して表した。＊Ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡに続いてフィッシャーのＬＳＤを行った。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝３である。
【図２５】各種濃度のアルギニンに対する３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞の応答を示す。アルギニンを含まない培地内で、各種濃度のＬ−アルギニンを添加するか又は添加せずにマウス３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞を６日間培養した。分化誘導因子を補充した通常のアルギニン含有培地で培養した細胞を分化の陽性（＋ｖｅ）対照とし、分化誘導因子を補充しない通常のアルギニン含有培地で培養した細胞を分化の陰性（−ｖｅ）対照とした。分化誘導因子を補充した通常のアルギニン含有培地で細胞の１群を培養し、５Ｕ／ｍＬのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）（ｒｈＡｒｇ）で処理して分化を阻害した。（Ａ）細胞の脂質をオイルレッドＯで染色し、光学濃度を測定して染色強度を定量化した（＋ｖｅ対照群に対する百分率で表す）。（Ｂ）数種の重要な脂質生成関連遺伝子のｍＲＮＡレベルは、アルギニンを含まない培地で培養した細胞（１に設定）と比較して表す。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝３である。
【図２６】ＨＦＤ給餌雄性マウスに対して同時に行った３００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）による処理［ＨＦＤ（ｒｈＡｒｇ）群］（週１回）によって、ＨＦＤ誘発性インスリン抵抗性を効果的に防止することができたことを示す。インスリン負荷試験（ＩＴＴ）はＨＦＤの給餌（Ａ）６週目と（Ｂ）１１週目に行ったが、結果を曲線下面積（ＡＵＣ）で表す。＊Ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡに続いてフィッシャーのＬＳＤを行った。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝５である。
【図２７】ＨＦＤ給餌雄性マウスに対して同時に行った３００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）による処理［ＨＦＤ（ｒｈＡｒｇ）群］（週１回）によって、ＨＦＤ誘発性耐糖能障害を効果的に防止することができたことを示す。ブドウ糖負荷試験（ＧＴＴ）はＨＦＤの給餌（Ａ）５週目と（Ｂ）１０週目に行ったが、結果を曲線下面積（ＡＵＣ）で表す。＊Ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡに続いてフィッシャーのＬＳＤを行った。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝５である。
【図２８】ＨＦＤ給餌雄性マウスに対して同時に行った３００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）による処理［ＨＦＤ（ｒｈＡｒｇ）群］（週１回）によって、ＨＦＤ誘発性の空腹時（Ａ）血糖（血糖値測定器を使用して測定）及び（Ｂ）血漿中インスリン濃度（ＥＬＩＳＡを使用して測定）の上昇を効果的に防止することができたことを示す。（Ｃ）ＨＯＭＡ−ＩＲスコア（インスリン抵抗性の測定値として標準式によって計算）から、同時に行ったＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇによる処理がＨＦＤ誘発性インスリン抵抗性の発症を防止したことが分かった。＊Ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡに続いてフィッシャーのＬＳＤを行った。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝５である。
【図２９】ＨＦＤ給餌雄性マウスに対して同時に行った３００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）による処理［ＨＦＤ（ｒｈＡｒｇ）群］（週１回）によって、ＨＦＤ誘発性の空腹時血漿中（Ａ）レプチン濃度、（Ｂ）総コレステロール濃度、（Ｃ）トリグリセリド濃度、及び（Ｄ）遊離脂肪酸濃度の上昇が防止／抑制されたことを示す。＊Ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡに続いてフィッシャーのＬＳＤを行った。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝５である。
【図３０】ＨＦＤ給餌雄性マウスに対して同時に行った３００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）による処理［ＨＦＤ（ｒｈＡｒｇ）群］（週１回、１２週間）によって、ＨＦＤ誘発性の肝臓肥大が防止されたことを示す。（Ａ）新鮮な肝臓全体の代表的な画像。（Ｂ）肝臓の重量。＊Ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡに続いてフィッシャーのＬＳＤを行った。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝５である。
【図３１】ＨＦＤ給餌雄性マウスに対して同時に行った３００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）による処理［ＨＦＤ（ｒｈＡｒｇ）群］（週１回、１２週間）によって、ＨＦＤ誘発性の脂肪肝を効果的に防止することができたことを示す。（Ａ）オイルレッドＯを用いた肝臓切片の染色によって、ＨＦＤ給餌のベヒクル処理マウス［ＨＦＤ（ベヒクル）群］では脂質の広範な蓄積が示されたが、これはＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇで処理したマウスには存在しなかった。（Ｂ）Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ処理によって、ＨＦＤ給餌マウスの肝臓におけるトリグリセリド濃度の上昇が防止された。（Ｃ）Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇは、肝臓における脂質生成関連遺伝子のＨＦＤ誘発性アップレギュレーションを抑制した。＊Ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡに続いてフィッシャーのＬＳＤを行った。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝５である。
【図３２】ＨＦＤ給餌雄性マウスに対して同時に行った３００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）による処理［ＨＦＤ（ｒｈＡｒｇ）群］（週１回、１２週間）によって、ＨＦＤ誘発性の血清中アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）濃度（通常、肝損傷のバイオマーカーとして測定）の上昇が防止されたことを示す。＊Ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡに続いてフィッシャーのＬＳＤを行った。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝５である。
【図３３】ＨＦＤ給餌雄性マウスに対して同時に行った３００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）による処理［ＨＦＤ（ｒｈＡｒｇ）群］（週１回、１２週間）によって、ＨＦＤ誘発性の（Ａ）腎臓、（Ｂ）膵臓、及び（Ｃ）心臓の重量の増加が防止されたことを示す。＊Ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡに続いてフィッシャーのＬＳＤを行った。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝５である。
【図３４】ＨＦＤ給餌雄性マウスに対して同時に行った３００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）による処理［ＨＦＤ（ｒｈＡｒｇ）群］（週１回、１２週間）によって、（Ａ）内臓ＷＡＴにおける炎症誘発性アディポカインのｍＲＮＡレベル（痩せた対照マウス［ＬＦＤ（ベヒクル）群］（１に設定）と比較して表す）のＨＦＤ誘発性アップレギュレーションを効果的に抑制することができ、（Ｂ）ＨＦＤ誘導性の炎症性サイトカイン血清濃度の上昇を抑制することができたことを示す。＊Ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡに続いてフィッシャーのＬＳＤを行った。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝５である。
【図３５】雄性マウスに対して同時に行った３００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）による処理［ＨＦＤ（ｒｈＡｒｇ）群］（週１回、１２週間）によって、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）のＨＦＤ誘発性白色化を効果的に防止することができたことを示す。（Ａ）新鮮な肩甲骨間ＢＡＴ全体の代表的な画像。（Ｂ）肩甲骨間ＢＡＴの重量。（Ｃ）Ｈ＆Ｅ染色パラフィン切片によって、大きな単一孔（脂質小球）を有する細胞（白色脂肪細胞の典型的な組織学的特徴である）がベヒクル処理のＨＦＤ給餌マウス［ＨＦＤ（ベヒクル）群］のＢＡＴでは豊富にある一方、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ処理のＨＦＤ給餌マウスのＢＡＴでは殆ど見られないことが分かった。＊Ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡに続いてフィッシャーのＬＳＤを行った。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝５である。
【図３６】雄性マウスに対して同時に行った３００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）による処理［ＨＦＤ（ｒｈＡｒｇ）群］（週１回、１２週間）によって、ＢＡＴにおける熱発生の主要な調節因子（Ｕｃｐ１とＰｇｃ１ａ）のｍＲＮＡレベルが有意にアップレギュレートされ、ＢＡＴにおける脂肪酸酸化遺伝子Ａｃｏｘ１のＨＦＤ誘発性ダウンレギュレーションが抑制されたことを示す。＊Ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡに続いてフィッシャーのＬＳＤを行った。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝５である。
【図３７】ＨＦＤの給餌（５週齢から１２週間）によって誘発された既存の肥満を有するＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスにおいて、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）による処理後に体重が顕著に減少したことを示す。（Ａ）６００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇで処理したマウス［ＨＦＤ（ｒｈＡｒｇ）群］（週１回、１２週間）の体重。（Ｂ）１２週間の処理後のマウスの代表的な画像。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝５である。
【図３８】既存のＨＦＤ誘発性肥満を有する雄性マウスに週１回、１２週間に亘って６００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）を投与する［ＨＦＤ（ｒｈＡｒｇ）群］ことによって白色脂肪組織を効果的に減少させることができたことを示す。（Ａ）肥満マウスの主な内臓（性腺周囲、腎周囲及び腸間膜）貯蔵と皮下（鼠径部）貯蔵の脂肪体の重量は、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇによる処理後の痩せた対照マウス［ＬＦＤ（ｒｈＡｒｇ）群］とほぼ同等であった。＊Ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡに続いてフィッシャーのＬＳＤを行った。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝５である。（Ｂ）内臓ＷＡＴのＨ＆Ｅ染色切片から、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇによる処理が肥満マウスの脂肪細胞サイズを著しく減少させることが分かった。
【図３９】既存のＨＦＤ誘発性肥満を有する雄性マウスに週１回、６００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）を投与する［ＨＦＤ（ｒｈＡｒｇ）群］ことによってインスリン抵抗性を効果的に逆行させることができたことを示す。インスリン負荷試験（ＩＴＴ）は、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇによる処理の前と処理の４週間後、８週間後及び１２週間後に行った。ＩＴＴの結果は曲線下面積（ＡＵＣ）で表す。＊Ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡに続いてフィッシャーのＬＳＤを行った。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝５である。
【図４０】既存のＨＦＤ誘発性肥満を有する雄性マウスに週１回、６００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）を投与する［ＨＦＤ（ｒｈＡｒｇ）群］ことによって耐糖能障害を効果的に逆行させることができたことを示す。ブドウ糖負荷試験（ＧＴＴ）は、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇによる処理の前と処理の３週間後、７週間後及び１１週間後に行った。ＧＴＴの結果は曲線下面積（ＡＵＣ）で表す。＊Ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡに続いてフィッシャーのＬＳＤを行った。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝５である。
【図４１】既存のＨＦＤ誘発性肥満を有する雄性マウスに週１回、６００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）を投与する［ＨＦＤ（ｒｈＡｒｇ）群］ことによって高血糖、高インスリン血症及びインスリン抵抗性を効果的に逆行させることができたことを示す。（Ａ）空腹時血糖、（Ｂ）空腹時血漿インスリン、及び（Ｃ）肥満マウスのＨＯＭＡ−ＩＲスコアは、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇによる処理後に正常に近いレベルまで補正された。＊Ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡに続いてフィッシャーのＬＳＤを行った。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝５である。
【図４２】既存のＨＦＤ誘発性肥満を有する雄性マウスに週１回、６００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）を投与する［ＨＦＤ（ｒｈＡｒｇ）群］ことによって高レプチン血症と高コレステロール血症を効果的に逆行させることができたことを示す。肥満マウスの（Ａ）空腹時血漿レプチンおよび（Ｂ）空腹時血漿総コレステロールは、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇによる処理後に正常に近いレベルまで補正された。＊Ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡに続いてフィッシャーのＬＳＤを行った。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝５である。
【図４３】既存のＨＦＤ誘発性肥満を有する雄性マウスに週１回、１２週間に亘って６００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）を投与する［ＨＦＤ（ｒｈＡｒｇ）群］ことによって肝臓肥大を効果的に逆行させることができたことを示す。（Ａ）新鮮な肝臓全体の代表的な画像から、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇの処理後に肥満マウスの肝臓が正常なサイズに戻ったことが分かった。（Ｂ）肥満マウスの肝臓重量は、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇによる処理後に劇的に減少し、痩せた対照マウス［ＬＦＤ（ｒｈＡｒｇ）群］と同等であった。＊Ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡに続いてフィッシャーのＬＳＤを行った。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝５である。
【図４４】既存のＨＦＤ誘発性肥満を有する雄性マウスに週１回、１２週間に亘って６００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）を投与する［ＨＦＤ（ｒｈＡｒｇ）群］ことによって脂肪肝を効果的に逆行させることができたことを示す。Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇで処理した肥満マウスの肝臓では、（Ａ）肝臓切片のオイルレッドＯ染色によって脂質の劇的なクリアランスが示され、（Ｂ）トリグリセリド濃度は痩せた対照マウス［ＬＦＤ（ベヒクル）］と同等のレベルまで低下し、（Ｃ）数種の重要な脂質生成関連遺伝子のｍＲＮＡレベルが有意にダウンレギュレートされた。発現レベルは痩せた対照（１に設定）と比較して表す。＊Ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡに続いてフィッシャーのＬＳＤを行った。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝５である。
【図４５】既存のＨＦＤ誘発性肥満を有する雄性マウスに週１回、１２週間に亘って６００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）を投与する［ＨＦＤ（ｒｈＡｒｇ）群］ことによって肝損傷の一般的なバイオマーカーであるアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）とアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）の血清中濃度を有意に低下させることができたことを示す。＊Ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡに続いてフィッシャーのＬＳＤを行った。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝５である。
【図４６】既存のＨＦＤ誘発性肥満を有する雄性マウスに週１回、１２週間に亘って６００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）を投与する［ＨＦＤ（ｒｈＡｒｇ）群］ことによって腎脂肪症を逆行させることができたことを示す。Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇで処理した肥満マウスでは、（Ａ）腎臓の重量、（Ｂ）腎臓中のトリグリセリド濃度、（Ｃ）Ｈ＆Ｅ染色した腎臓切片の腎尿細管内の空胞化構造、及び（Ｄ）オイルレッドＯ染色した腎臓切片の糸球体内の脂肪滴の異所性蓄積が顕著に低下した。＊Ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡに続いてフィッシャーのＬＳＤを行った。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝５である。
【図４７】既存のＨＦＤ誘発性肥満を有する雄性マウスに週１回、１２週間に亘って６００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）を投与する［ＨＦＤ（ｒｈＡｒｇ）群］ことによって膵臓脂肪症を逆行させることができたことを示す。Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇで処理した肥満マウスでは、（Ａ）膵臓の重量、（Ｂ）膵臓のＨ＆Ｅ染色切片に見られる白色脂肪組織の過剰な小葉間蓄積と小葉内蓄積、及び（Ｃ）膵臓中のトリグリセリド濃度が顕著に低下した。＊Ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡに続いてフィッシャーのＬＳＤを行った。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝５である。
【図４８】既存のＨＦＤ誘発性肥満を有する雄性マウスに週１回、１２週間に亘って６００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）を投与する［ＨＦＤ（ｒｈＡｒｇ）群］ことによって心臓脂肪症を逆行させることができたことを示す。Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇで処理した肥満マウスでは、（Ａ）心臓の重量、（Ｂ）心臓内の脂肪滴の過剰な蓄積、及び（Ｃ）心臓中のトリグリセリド濃度が顕著に低下した。＊Ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡに続いてフィッシャーのＬＳＤを行った。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝５である。
【図４９】既存のＨＦＤ誘発性肥満を有する雄性マウスに週１回、１２週間に亘って６００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）を投与する［ＨＦＤ（ｒｈＡｒｇ）群］ことによって骨格筋中のトリグリセリド濃度を有意に低下させることができたことを示す。＊Ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡに続いてフィッシャーのＬＳＤを行った。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝５である。
【図５０】既存のＨＦＤ誘発性肥満を有する雄性マウスに週１回、１２週間に亘って６００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）を投与する［ＨＦＤ（ｒｈＡｒｇ）群］ことによって（Ａ）内臓ＷＡＴにおける炎症誘発性アディポカインＭｃｐ１のｍＲＮＡレベル（痩せた対照マウス［ＬＦＤ（ベヒクル）群］（１に設定）と比較して表す）を有意にダウンレギュレートでき、（Ｂ）炎症誘発性サイトカインＭｃｐ１の血清中濃度を有意に低下させることができたことを示す。＊Ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡに続いてフィッシャーのＬＳＤを行った。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝５である。
【図５１】既存のＨＦＤ誘発性肥満を有する雄性マウスに週１回、１２週間に亘って６００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）を投与する［ＨＦＤ（ｒｈＡｒｇ）群］ことによって肝臓内の炎症と線維症を抑制することができたことを示す。Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇで処理した肥満マウスの肝臓では、（Ａ）炎症誘発性遺伝子と（Ｂ）線維化促進性遺伝子の有意なダウンレギュレーションが見られたが、（Ｃ）抗炎症性遺伝子のアップレギュレーションが見られた。ｍＲＮＡレベルは痩せた対照［ＬＦＤ（ベヒクル）］（１に設定）と比較して表す。＊Ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡに続いてフィッシャーのＬＳＤを行った。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝５である。
【図５２】既存のＨＦＤ誘発性肥満を有する雄性マウスに週１回、１２週間に亘って６００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）を投与する［ＨＦＤ（ｒｈＡｒｇ）］ことによって腎臓内の炎症と線維症を抑制することができたことを示す。Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇで処理した肥満マウスの腎臓では、（Ａ）炎症誘発性遺伝子と（Ｂ）線維化促進遺伝子の有意なダウンレギュレーションが見られ、（Ｃ）腎尿細管と糸球体周辺でのコラーゲン線維の過剰沈着の有意な抑制が見られた。ｍＲＮＡレベルは痩せた対照［ＬＦＤ（ベヒクル）群］（１に設定）と比較して表す。＊Ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡに続いてフィッシャーのＬＳＤを行った。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝５である。
【図５３】既存のＨＦＤ誘発性肥満を有する雄性マウスに週１回、１２週間に亘って６００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）を投与する［ＨＦＤ（ｒｈＡｒｇ）群］ことによって膵臓内の炎症と線維症を抑制することができたことを示す。Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇで処理した肥満マウスの膵臓では、（Ａ）炎症誘発性遺伝子と（Ｂ）線維化促進性遺伝子の有意なダウンレギュレーションが見られた。ｍＲＮＡレベルは痩せた対照［ＬＦＤ（ベヒクル）群］と比較して表す。＊Ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡに続いてフィッシャーのＬＳＤを行った。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝５である。
【図５４】既存のＨＦＤ誘発性肥満を有する雄性マウスに週１回、１２週間に亘って６００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）を投与する［ＨＦＤ（ｒｈＡｒｇ）群］ことによって褐色脂肪（ＢＡＴ）の白色化を効果的に逆行させることができたことを示す。Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇで処理した肥満マウスでは、（Ａ）肩甲骨間ＢＡＴの重量、（Ｂ）肩甲骨間ＢＡＴの形態とサイズ、及び（Ｃ）ＢＡＴのＨ＆Ｅ染色切片に示される組織学的特徴は痩せた対照マウスと同様であった。＊Ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡに続いてフィッシャーのＬＳＤを行った。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝５である。
【図５５】既存のＨＦＤ誘発性肥満を有する雄性マウスに週１回、６００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）を投与する［ＨＦＤ（ｒｈＡｒｇ）群］ことによって（Ａ）収縮期及び拡張期血圧と（Ｂ）肥満マウスの心拍数を薬物処理後５週間までに痩せた対照マウス［ＬＦＤ（ベヒクル）群］と同等のレベルまで有意に低下させることができたことを示す。＊Ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡに続いてフィッシャーのＬＳＤを行った。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝１０である。
【図５６】ＬＦＤを給餌し、５００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）の腹腔内注射を行ったＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウス［ＬＦＤ（ｒｈＡｒｇ）群］（週１回、５週齢から開始して８ヶ月間）では非中和抗薬物抗体が発生したことを示す。（Ａ）ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、平均抗体価が１０８の抗ｒｈＡｒｇ抗体をＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇで処理したＬＦＤ給餌マウスの血漿で検出することができた。（Ｂ）血漿を１０００Ｕ／ｍＬのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（ｒｈＡｒｇ＊）と共に１時間インキュベートした後、アルギナーゼ活性を測定した。アルギナーゼ活性の低下は見られなかったが、これはマウスで生成した薬物に対する抗体が中和抗体ではなかったことを示す。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝３である。
【図５７】ＬＦＤ給餌のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスに５００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）を投与［ＬＦＤ（ｒｈＡｒｇ）群］（週１回、５週齢から開始して８ヶ月間）しても肝臓と腎臓に有害作用を誘発しなかったことを示す。Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇで処理したＬＦＤ給餌マウスは、ベヒクルで処理したＬＦＤ給餌マウス［ＬＦＤ（ベヒクル）群］に対し（Ａ）アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）とアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の血清中濃度（通常、肝機能又は肝疾患を評価するためのバイオマーカーとして使用される）、及び（Ｂ）血清中クレアチニン濃度と尿中アルブミン／クレアチニン（通常、腎機能又は腎疾患を評価するためのバイオマーカーとして使用される）において何ら有意差を示さなかった。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝３である。
【図５８】ＬＦＤ給餌のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスに５００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）を投与［ＬＦＤ（ｒｈＡｒｇ）群］（週１回、５週齢から開始して８ヶ月間）しても血管への有害作用を誘発しなかったことを示す。Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇで処理したＬＦＤ給餌マウスは、ベヒクルで処理したＬＦＤ給餌マウス［ＬＦＤ（ベヒクル）群］に対し（Ａ）フェニレフリンによって引き起こされる血管平滑筋の収縮、（Ｂ）アセチルコリン誘発性の内皮依存性弛緩、及び（Ｃ）一酸化窒素ドナーであるニトロプルシドナトリウムに応答した内皮非依存性弛緩において何ら有意差を示さなかった。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝３である。
【図５９】既存のＨＦＤ誘発性肥満を有するＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスに週１回、４週間に亘って３００ＵのＰＥＧ化Ｈｉｓ−ｒｈＡｒｇ（配列番号１０１）を投与する［ＨＦＤ（ＰＥＧ−ｒｈＡｒｇ）群］ことによって、マウスの体重を固形飼料給餌のベヒクル処理の痩せた対照マウス［固形飼料（ベヒクル）群］と同等の重量まで効果的に減少させることができたことを示す。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝６である。
【図６０】既存のＨＦＤ誘発性肥満を有する雄性マウスに週１回、４週間に亘って３００ＵのＰＥＧ化Ｈｉｓ−ｒｈＡｒｇ（配列番号１０１）を投与する［ＨＦＤ（ＰＥＧ−ｒｈＡｒｇ）群］ことによって、主な内臓（性腺周囲、腎周囲及び腸間膜）貯蔵と皮下（鼠径部）貯蔵の脂肪量を効果的に減少でき、肝臓、腎臓、膵臓及び心臓の重量を減少させることができたことを示す。＊Ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡに続いてフィッシャーのＬＳＤを行った。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝４である。
【図６１】既存のＨＦＤ誘発性肥満を有する雄性マウスに週１回、３００ＵのＰＥＧ化Ｈｉｓ−ｒｈＡｒｇ（配列番号１０１）を投与する［ＨＦＤ（ＰＥＧ−ｒｈＡｒｇ）群］ことによって、薬物処理の２週間後に行ったインスリン負荷試験（ＩＴＴ）で（Ａ）空腹時血糖を有意に低下させ、（Ｂ）インスリン感受性を有意に上昇させることができたことを示す。ＩＴＴの結果は曲線下面積（ＡＵＣ）で表す。＊Ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡに続いてフィッシャーのＬＳＤを行った。データは平均±ＳＥＭで表し、各群ｎ＝６である。
【図６２】既存のＨＦＤ誘発性肥満を有するＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスに週１回、５週間に亘って２５〜１００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ−Ｃｏ２＋［配列番号５０（コバルト置換）］を投与することによって、マウスの体重を効果的に減少させることができたことを示す。データは平均±ＳＥＭで表し、ｎ＝３である。
【図６３】ＭＫＮ４５胃癌細胞株に対するＢＨＡ融合タンパク質（配列番号７５）の抗癌効果を示す。ＭＫＮ４５の増殖は用量依存的に阻害された。生存率はＭＴＴエンドポイント比色アッセイによって求めた。データは平均±ＳＤで表し、ｎ＝３である。
【図６４】４Ｔ１乳癌異種移植ヌードマウスにおける腫瘍体積に対するＮ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）の効果を示す。「実験群」の曲線は、５００ＵのＮ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）を週に１回注射した実験群を表し、「対照群」の曲線は、ＰＢＳを週に１回注射した対照群を表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１対実験群、ｔ検定、ｎ＝４〜６。
【図６５】４Ｔ１乳癌異種移植ヌードマウスにおける相対腫瘍体積に対するＮ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）の効果を示す。「実験群」の曲線は、５００ＵのＮ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）を週に１回注射した実験群を表す。「対照群」の曲線は、ＰＢＳを週に１回注射した対照群を表す。＊Ｐ＜０．０５対実験群、ｔ検定、ｎ＝４〜６。
【図６６】実験群と対照群の腫瘍重量の有意差を示す。実験群には５００ＵのＮ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）を週に１回注射した。対照群にはＰＢＳを週に１回投与した。＊Ｐ＜０．０５対実験群、ｔ検定、ｎ＝４〜６。
【図６７】対照群とＮ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）処理群のヌードマウスから採取した腫瘍の写真を示す。
【図６８】４Ｔ１乳癌同種移植片における相対腫瘍体積に対するＮ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）の効果を示す。「５００Ｕ  ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ」の曲線は、５００ＵのＮ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）を週に１回注射した実験群を表す。「２５０Ｕ  ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ」の曲線は、２５０ＵのＮ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）を週に１回注射した実験群を表す。「５００Ｕ  ＰＥＧ−ｒｈＡｒｇ」の曲線は、５００ＵのＰＥＧ化Ｈｉｓ−ｒｈＡｒｇ（配列番号１０１）を週に１回注射した実験群を表す。「対照群」の曲線は、ＰＢＳを週に１回投与した対照群を表す。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１対実験群、ｔ検定、ｎ＝６〜８。
【図６９】実験群と対照群の腫瘍重量の有意差を示す。「５００Ｕ  ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ」のデータは、５００ＵのＮ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）を週に１回注射した群を表す。「２５０Ｕ  ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ」のデータは、２５０ＵのＮ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）を週に１回注射した群を表す。「５００Ｕ  ＰＥＧ−ｒｈＡｒｇ」のデータは、５００ＵのＰＥＧ化Ｈｉｓ−ｒｈＡｒｇ（配列番号１０１）を週に１回注射した群を表す。「対照群」のデータは、ＰＢＳを週に１回投与した対照群を表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１対実験群、ｔ検定、ｎ＝６〜８。
【図７０】４Ｔ１同種移植片の肺からの転移性小結節の平均数を示す。（Ａ）「５００Ｕ  ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ」のデータは、５００ＵのＮ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）を週に１回注射した群を表す。「２５０Ｕ  ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ」のデータは、２５０ＵのＮ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）を週に１回注射した群を表す。「５００Ｕ  ＰＥＧ−ｒｈＡｒｇ」のデータは、５００ＵのＰＥＧ化Ｈｉｓ−ｒｈＡｒｇ（配列番号１０１）を週に１回注射した群を表す。「対照群」のデータは、ＰＢＳを週に１回投与した対照群を表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１対実験群、ｔ検定、ｎ＝６〜８。（Ｂ）図７０Ａに示す４Ｔ１同種移植片の肺からの転移性小結節の数の散布図。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本開示は一般に、アルギナーゼポリペプチドとＡＢＤポリペプチドを含む融合タンパク質、その使用方法及びその調製方法に関する。本明細書に記載の融合タンパク質は非常に有効なアルギニン枯渇剤であり、ＡＢＤポリペプチドとの融合により、既知のアルギナーゼ及びアルギナーゼ誘導体と比較して半減期が大きく延長されている。開示された融合タンパク質は、アルギニン枯渇が治療効果をもたらす疾患及び病態の治療、例えば、癌、ウイルス感染症、多発性硬化症、関節リウマチ、自己免疫疾患、先天性高アルギニン血症、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、炎症、肥満、代謝障害、及び関連する合併症と併存症の治療に有用である。
【００４３】
また、本開示は一般に、肥満、代謝障害、及び関連する合併症と併存症の治療を必要とする対象において、対象のアルギニン濃度を枯渇させることによってその治療を行う方法にも関する。対象におけるアルギニンの枯渇は、体重及び脂肪量の減少、耐糖能及びインスリン応答性の改善、血糖値、内分泌及び代謝プロファイルの正常化、及び炎症、脂肪症及び線維症の軽減をもたらす。対象のアルギニンを枯渇させることが可能な任意の薬剤を、本明細書に記載の肥満、代謝障害、及び関連する合併症と併存症を治療する方法で使用することができる。
【００４４】
用語の定義
本明細書で使用される用語の定義には、バイオテクノロジーの分野で各用語について認識されている現在の技術水準の定義が組み込まれることが意図される。該当する場合には例示を記載する。個別の事例で限定されていない限り、これら定義は本明細書全体で使用される用語の個々に、或いは下位概念（サブクラス）としてのそれら用語に適用される。
【００４５】
本明細書で使用される「半減期」又は「１／２期」という用語は、薬剤、例えば、本明細書に記載の融合タンパク質又はアルギニン枯渇剤の濃度がインビトロ又はインビボで、例えば、哺乳動物への注射後に半分に低下するのに要する時間を意味する。特定の場合には、注射後の血漿中アルギニン濃度を薬剤の半減期の代理的指標として本明細書で使用する。そのような場合、「治療期間」という用語は、特定の投与量のアルギニン枯渇剤によって、血漿中アルギニン濃度が所望の治療効果が観察される特定の閾値濃度未満に維持できる時間の長さを指すのに使用される。特定の実施形態では、血漿中アルギニンの閾値濃度は５０μＭ未満、４０μＭ未満、３０μＭ未満、２０μＭ未満、１０μＭ未満、５μＭ未満、３μＭ未満、又は従来の分析機器の検出限界未満の濃度である。例えば、本明細書に記載のアルギニン異化酵素を注射して７日間で血漿中アルギニンがＢｉｏｃｈｒｏｍ３０アミノ酸分析計の検出限界（検出限界は３μＭ）未満の濃度まで枯渇した場合、治療期間は７日間であり、半減期は、例えば、約７日程度である。
【００４６】
本明細書で使用される「結合する」又は「結合した」という用語は、２個以上の化合物を共に保つための結合又は非結合相互作用によって連結又は一体化させることを意味し、この用語は、例えば、第１のポリペプチドを第２のポリペプチド又は他の分子に結合させるような直接的又は間接的結合を包含すると共に、ポリペプチド等の１個以上の中間化合物（例えば、リンカー）が第１のポリペプチドと第２のポリペプチド又は他の分子との間に配置される実施形態を包含する。
【００４７】
本明細書で使用される「タンパク質」又は「ポリペプチド」という用語は、２個以上のアミノ酸モノマー及び／又はその類似体で構成される有機ポリマーを示す。「ポリペプチド」という用語は、全長タンパク質及びペプチド、及びそれらの類似体及び断片を含む任意の長さのアミノ酸ポリマーを包含する。３個以上のアミノ酸のポリペプチドはオリゴペプチドとも称される。本明細書で使用される「アミノ酸」、「アミノ酸モノマー」又は「アミノ酸残基」という用語は、２０種の天然に存在するアミノ酸（非天然側鎖を有する合成アミノ酸を含み、Ｄ及びＬ光学異性体の両方を含む）のいずれかを意味する。「アミノ酸類似体」という用語は、１個以上の個々の原子が異なる原子、同位元素又は異なる官能基のいずれかで置換されてはいるが、それ以外はその天然アミノ酸類似体と同一であるアミノ酸を意味する。
【００４８】
本明細書で使用される「非天然アミノ酸」という用語は、２０種の一般的な天然アミノ酸の１種、セレノシステイン又はピロリジンではない任意のアミノ酸、修飾アミノ酸及び／又はアミノ酸類似体を意味する。
【００４９】
本明細書で使用される「融合タンパク質」という用語は、例えば、アミド、エステル、尿素、カルバメート、エーテル及び／又はジスルフィド結合によって共有結合された、異なる起源を有するタンパク質又は機能性タンパク質断片（例えば、アルギナーゼ又はその変異体）を含むキメラタンパク質を意味する。
【００５０】
本明細書で使用される「変異体」という用語は、参照核酸又はポリペプチドとは異なるが、その本質的な特性を保持しているポリヌクレオチド又は核酸を意味する。一般に、変異体は全体的に参照核酸又はポリペプチドと非常に類似しており、多くの領域で参照核酸又はポリペプチドと同一である。
【００５１】
変異体は、例えば、少なくとも１個の保存的アミノ酸が置換された親ポリペプチド配列のアミノ酸配列を含むことができる。或いは又は更には、変異体は、少なくとも１個の非保存的アミノ酸が置換された親ポリペプチド配列のアミノ酸配列を含むことができる。この場合、非保存的アミノ酸置換が機能性変異体の生物活性を妨害又は阻害しないことが好ましい。非保存的アミノ酸置換は変異体の生物活性を増強することができ、それによって変異体の生物活性は親ポリペプチドと比較して高くなる。
【００５２】
ポリペプチドに関して使用される場合の「機能的断片」という用語は、対象のポリペプチドの任意の部分を意味し、その部分は、それが一部を構成するポリペプチド（親ポリペプチド）の生物活性を保持する。機能的断片は、その生物活性が依然として親ポリペプチドの少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％であるか、或いは実質的に同等又はそれよりも高い場合には、機能的断片が一部を構成するポリペプチドの隣接アミノ酸を含む任意の断片とすることができる。親ポリペプチドに関して、機能的断片は、例えば、親ポリペプチドの約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又はそれ以上を含むことができる。
【００５３】
機能的断片はアミノ末端又はカルボキシ末端、又は両方の末端に更なるアミノ酸、例えば、親ポリペプチドのアミノ酸配列に見られないアミノ酸を含むことができる。
【００５４】
記載されたポリペプチドのアミノ酸置換は保存的アミノ酸置換とすることができる。保存的アミノ酸置換は当技術分野で知られており、例えば、特定の物理的及び／又は化学的特性を有する１個のアミノ酸を同一又は類似の化学的又は物理的特性を有する他のアミノ酸と交換するアミノ酸置換が挙げられる。例えば、保存的アミノ酸置換は、酸性／負に荷電した極性アミノ酸を他の酸性／負に荷電した極性アミノ酸（例えば、Ａｓｐ又はＧｌｕ）に置換すること、非極性側鎖を有するアミノ酸を他の非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ｖａｌ等）に置換すること、塩基性／正に荷電した極性アミノ酸を他の塩基性／正に荷電した極性アミノ酸（例えば、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ等）に置換すること、極性側鎖を有する非荷電アミノ酸を他の極性側鎖を有する非荷電アミノ酸（例えば、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ等）に置換すること、β分岐側鎖を有するアミノ酸を他のβ分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ）に置換すること、芳香族側鎖を有するアミノ酸を他の芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ）に置換すること等とすることができる。
【００５５】
「相同性（％）」及び「配列同一性（％）」という用語は、ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列に関して使用する場合、本明細書では、ポリヌクレオチド及びポリペプチド間の比較に言及するために交換可能に使用し、比較ウィンドウ上で２個の最適に整列された配列を比較することによって決定するが、この場合、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の部分には、参照配列（付加又は欠失を含まない）に対して付加又は欠失（即ち、ギャップ）を含めて２個の配列のアラインメントを最適にすることができる。パーセンテージは、両方の配列で同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が存在する位置の数を決定して一致する位置の数を得、一致する位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算する。相同性は、当技術分野で知られている様々な配列比較アルゴリズム及びプログラムのいずれかを使用して評価する。このようなアルゴリズム及びプログラムとしては、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ及びＣＬＵＳＴＡＬＷ［Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(8):2444-2448; Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215(3):403-410; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22(2):4673-4680; Higgins et al. 1996, Methods Enzymol. 266:383-402; Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215(3):403-410; Altschul et al., 1993, Nature Genetics 3:266-272］が挙げられるが、決してこれらに限定されない。特定の実施形態では、タンパク質及び核酸配列の相同性は当技術分野で周知の基本的なローカルアラインメント検索ツール（「ＢＬＡＳＴ」）を使用して評価する（例えば、Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2267-2268; Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Altschul et al., 1993, Nature Genetics 3:266-272; Altschul et al., 1997, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402を参照）。
【００５６】
本明細書で使用される「治療する」、「治療している」、「治療」等の用語は、障害／疾患及び／又はそれに関連する症状を軽減又は改善することを意味する。不可能ではないとはいえ、障害又は病態を治療することが障害、病態又はそれに関連する症状を完全に排除する必要がないことが理解されるであろう。特定の実施形態では、治療は障害又は病態、及び／又はそれに関連する症状の予防を包含する。本明細書で使用される「予防」又は「予防する」という用語は、障害、病態又はそれに関連する症状の発症を阻害するか、又はその発症を少なくとも遅らせるいずれかの措置を意味する。予防としては、一次、二次及び三次の予防レベルを挙げることができ、ａ）一次予防では疾患の発症を回避し、ｂ）二次予防活動は早期の疾患の治療を目的としているため、疾患の進行と症状の出現を防ぐための介入の機会が増え、ｃ）三次予防では、機能を回復し、疾患に関連する合併症を軽減することによって既に確立された疾患の悪影響を抑制する。
【００５７】
本明細書で使用される「異化作用」又は「異化」という用語は、ある分子が他の、例えば、より小さな分子になる化学反応を意味する。例えば、アルギニン異化酵素は、アルギニンと反応してアルギニンをオルニチン、シトルリン及びアグマチン等の他の分子に変換することができる任意の酵素を意味する。
【００５８】
本明細書で使用される「対象」という用語は、任意の動物（例えば、哺乳動物）（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ及び齧歯類が挙げられるが、これらに限定されない）を意味する。
【００５９】
本明細書で使用される「肥満度指数」又は「ＢＭＩ」という用語は、体重（Ｋｇ）を身長（メートル）の二乗で割ることで得られる割合を意味する。
【００６０】
本明細書で使用される「過体重」という用語は、成人における２５〜３０のＢＭＩを意味する。２０歳未満の人の場合、「過体重」は同じ年齢の人と比較して８５〜９５パーセントのＢＭＩとして定義される。
【００６１】
本明細書で使用される「肥満」という用語は、成人における３０〜４０のＢＭＩを意味する。２０歳未満の人の場合、「肥満」は同じ年齢の人と比較して９５パーセントを超えるＢＭＩとして定義される。本明細書で使用される場合、この用語は肥満と病的肥満の両方を包含し得る。
【００６２】
本明細書で使用される「病的肥満」という用語は、成人における４０を超えるＢＭＩを意味する。
【００６３】
本明細書で使用される「脂肪症」という用語は、脂肪が肝組織、腎組織、膵臓組織、心筋組織又は他の筋組織等の組織に蓄積する状態を意味する。
【００６４】
本明細書で使用される「線維症」という用語は、肝組織、腎組織、膵臓組織又は心臓組織等の器官又は組織において、コラーゲンを含む線維性結合組織の過剰な沈着が存在する状態を意味する。
【００６５】
本明細書で使用される「高コレステロール血症」という用語は、同じ民族的背景、年齢及び性別の各参照対象における血中コレステロールの正常な平均値と比較して血中コレステロール値が上昇している状態を意味する。ヒトに関しては、この用語は特に、約２００ｍｇ／ｄＬを超える、特に約２４０ｍｇ／ｄＬを超える血中総コレステロール値を意味する。
【００６６】
本明細書で使用される「脂質異常症」及び「高脂血症」という用語は、血流中のコレステロール、コレステロールエステル、リン脂質、トリグリセリド及び／又はリポタンパク質等の脂質／脂肪の値がそれぞれ異常であり、同じ民族的背景、年齢、性別の各参照対象における血中脂質／脂肪の正常な平均値と比較して上昇している状態を意味する。
【００６７】
本明細書に記載の融合タンパク質はアルギナーゼポリペプチドを含む。アルギナーゼポリペプチドは、アルギナーゼを発現する任意の生物によって発現されるアルギナーゼタンパク質に由来することができる。アルギナーゼの例としては、桿菌、アグロバクテリウム、シアノバクテリア及びマイコバクテリア等の細菌、及びウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、齧歯類及びヒト等の哺乳動物によって産生されるものが挙げられる。アルギナーゼポリペプチドがヒトアルギナーゼに由来する場合、アルギナーゼ１型（ＡＲＧ１）又はアルギナーゼ２型（ＡＲＧ２）とすることができる。
【００６８】
アルギナーゼポリペプチドは全長アルギナーゼポリペプチド又はその機能的断片及び／又は変異体を含むことができる。
【００６９】
アルギナーゼはマンガン含有酵素である。実施例３２に示すように、本明細書に記載の融合タンパク質に存在する１個以上のマンガンイオンを、１個以上のＣｏ２＋又はＮｉ２＋等の二価カチオン性金属で置換すると、融合タンパク質の触媒活性を高めることができる。従って、特定の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質はＣｏ２＋又はＮｉ２＋等のマンガン以外の二価金属を１個以上含む。特定の実施形態では、融合タンパク質はＣｏ２＋及びＮｉ２＋から選択される１個以上の金属を含む。特定の実施形態では、融合タンパク質は、２個のＣｏ２＋イオン又は２個のＮｉ２＋イオンを含む。他の実施形態では、融合タンパク質は２個のＭｎ２＋イオンを含む。
【００７０】
特定の実施形態では、アルギナーゼポリペプチドは野生型ヒトＡＲＧ１である。特定の実施形態では、アルギナーゼポリペプチドは配列番号６９と少なくとも９５％の配列相同性を有する配列を含む。例えば、アルギナーゼポリペプチドは配列番号６９と少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．４％又は９９．７％の相同性を有するポリペプチド配列を含むことができる。特定の実施形態では、アルギナーゼポリペプチドの配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５又は３０個のアミノ酸修飾（例えば、挿入、置換、欠失等）によって配列番号６９と異なっていてもよい。特定の実施形態では、アルギナーゼポリペプチドは、保存的アミノ酸置換、非保存的アミノ酸置換、又はそれらの組み合わせを有するポリペプチドを含む。
【００７１】
特定の実施形態では、アルギナーゼポリペプチドはBacillus caldoveloxアルギナーゼ（ＢＣＡ）である。特定の実施形態では、アルギナーゼポリペプチドは配列番号７０と少なくとも９５％の配列相同性を有する配列を含む。例えば、アルギナーゼポリペプチドは配列番号７０と少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、９９．３％又は９９．７％の相同性を有するポリペプチド配列を含むことができる。特定の実施形態では、アルギナーゼポリペプチドの配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５又は３０個のアミノ酸修飾（例えば、挿入、置換、欠失等）によって配列番号７０と異なっていてもよい。特定の実施形態では、アルギナーゼポリペプチドは、保存的アミノ酸置換、非保存的アミノ酸置換、又はそれらの組み合わせを有するポリペプチドを含む。
【００７２】
特定の実施形態では、アルギナーゼポリペプチドはＢＣＡであり、セリン１６１は配列番号７１と配列番号７２に示すようにシステインで置換されている。セリンをシステインで置換することによって、融合タンパク質の特性を更に改善することができる化学部分の部位特異的な取り込みが可能になる。例えば、システイン１６１の側鎖は適切に活性化されたＰＥＧ部分と反応させることができ、それによって、得られる融合タンパク質に組み込むことができるＰＥＧ化アルギナーゼを形成することができる。融合タンパク質のＰＥＧ化により、組織又は細胞内で活性な様々な分解機序から本明細書に記載の融合タンパク質を更に保護することによって、融合タンパク質の保持時間を更に増すことができ、その結果、融合タンパク質の治療可能性を改善する。従って、特定の実施形態では、アルギナーゼポリペプチドは配列番号７１又は配列番号７２と少なくとも９５％の配列相同性を有する配列を含む。例えば、アルギナーゼポリペプチドは配列番号７１又は配列番号７２と少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、９９．３％又は９９．７％の相同性を有するポリペプチド配列を含むことができる。特定の実施形態では、アルギナーゼポリペプチドの配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５又は３０個のアミノ酸修飾（例えば、挿入、置換、欠失等）によって配列番号７１又は配列番号７２と異なっていてもよい。特定の実施形態では、アルギナーゼポリペプチドは、保存的アミノ酸置換、非保存的アミノ酸置換、又はそれらの組み合わせを有するポリペプチドを含む。
【００７３】
本明細書に記載の融合タンパク質がＰＥＧ化されている場合、ＰＥＧ基の分子量は、約５０００〜約２００００ａｍｕ、約５０００〜約１５０００ａｍｕ、約５０００〜約１２０００ａｍｕ、約７０００〜約１２０００ａｍｕ、又は約７０００〜約１００００ａｍｕとすることができる。特定の実施形態では、ＰＥＧ基の分子量は約４０００ａｍｕ〜１００００ａｍｕである。特定の実施形態では、ＰＥＧ基はＰＥＧ４０００又はＰＥＧ７０００である。
【００７４】
ＰＥＧ基を融合タンパク質に直接、又はリンカーを介して共有結合させることができる。融合タンパク質に存在するシステイン又はリジン側鎖とＰＥＧ化試薬との反応によってＰＥＧ基を融合タンパク質に共有結合させることができる。或いは、ＰＥＧ基をタンパク質のＮ末端アミンに共有結合させることができる。
【００７５】
特定の実施形態では、融合タンパク質はプロピオン酸リンカーを介してＰＥＧに共有結合している。他の実施形態では、融合タンパク質はＣ２−Ｃ１０、Ｃ２−Ｃ９、Ｃ２−Ｃ８、Ｃ２−Ｃ７、Ｃ２−Ｃ６、Ｃ２−Ｃ５、又はＣ２−Ｃ４直鎖又は分岐鎖カルボン酸リンカーを介してＰＥＧに共有結合している。特定の実施形態では、ＰＥＧ基はアルギナーゼポリペプチドに結合している。
【００７６】
本明細書に記載の融合タンパク質はアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）ポリペプチドも含む。多くの研究によって、治療用タンパク質の半減期をより長くするためのアルブミン結合の可能性が示されている。しかし、ＡＢＤポリペプチドのタンパク質治療薬への融合は、タンパク質治療薬の有効性、ＡＢＤポリペプチドの結合親和性、及び融合タンパク質の溶解性に影響を及ぼす可能性があるため、ＡＢＤポリペプチドを含む融合タンパク質の設計は困難な場合がある。従って、ＡＢＤポリペプチドの選択、その結合部位の選択、及び必要なリンカーの構築は単純なプロセスではなく、所望の特性を有する融合特性を得るための試行錯誤に時間を要することが多い。例えば、図９、１０及び１３は、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）の治療期間（及び半減期）がＢＨＡやＢＡＨよりも予想外に遥かに長いことを示す。ＢＨＡ、ＢＡＨ及びＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇの全てが驚くほど長い治療期間（及び半減期）を示すが、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇがそのような長い治療期間（及び半減期）を有するとは予測できなかった。
【００７７】
一般に、薬物の作用は長いことが望ましい。リンカーの種類、長さ、可動性、及び半減期延長モジュールのＣ又はＮ末端への生物活性ペプチド又はタンパク質の融合は、融合タンパク質の活性に大きな影響を及ぼす可能性がある。本開示では、様々なアルギナーゼを適切なリンカーを介してＡＢＤ分子に融合し、ＡＢＤのアルブミン結合能力とアルギナーゼ酵素活性の両方を保持できるようにした。良好な安定性と溶解性も不可欠である。これを達成するのは非常に困難且つ挑戦的である。一般的なＨＳＡ又はＦｃ融合物とは異なり、ＡＢＤ融合物については殆ど知られていない。本開示は、機能的なアルギナーゼ−ＡＢＤ融合物を生成するのに使用することができるリンカー設計の例を提供する。遺伝子操作されたアルギナーゼ融合タンパク質（Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ、Ｎ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ等）の活性は、リンカーエンジニアリング又は半減期延長モジュール（ＡＢＤ）に対する生物活性タンパク質（アルギナーゼ）の位置のいずれか又はその両方によって本開示で最適化されている。
【００７８】
多くの場合、タンパク質工学を利用して活性の損失を克服することができる。一例では、リンカーエンジニアリングを利用してＩＦＮ−α２ｂをＨＳＡへ融合する際に損失した活性を回復させた［Prot Exp Purif. 2008; 61:73-7］。ＩＦＮ−α２ｂをＨＳＡに直接融合させると、生物活性が殆どない不安定なタンパク質が生成された。融合形式では、ＩＦＮ−α２ｂの活性に対する様々なリンカーの効果を試験した。ペプチドリンカーは融合タンパク質の発現、活性及び薬物動態に影響を及ぼすことが知られている［Adv Drug Deliv Rev. 2013; 65:1357-69］。ペプチドリンカーの主な２種は次の通りである。（ｉ）可動性リンカー（例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、ｎ＝１〜４）。（ｉｉ）α−ヘリカルリンカー［Ａ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡ］ｘ（ｎ＝２〜４及びｘ＝１又は２）、及びＸＰｎ（ＸはＡ、Ｋ又はＥのいずれか）等の剛性リンカー。可動性リンカーの場合、利点の１つは、同族の受容体に関して分子の生物活性部分の適切な配向を得るのに可動性が必要となり得ることである。しかし、可動性リンカーの場合、融合パートナーと生物活性タンパク質の間に大きいスペースが得られない。一方、剛性リンカーの場合には、より大きいスペースが得られるが、可動性に欠ける。ＩＦＮ−α２ｂ−ＨＳＡ融合タンパク質の場合、可動性リンカーでは天然ＩＦＮ−α２ｂと比較して約３９％の活性となった一方、剛性ＸＰリンカーとα−ヘリカルリンカーではそれぞれ天然ＩＦＮ−α２ｂの活性の６８％と１１５％となった［Prot Exp Purif. 2008;61:73-7］。
【００７９】
特定のリンカーは融合タンパク質の特性に悪影響を及ぼす場合がある。例えば、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）をトランスフェリン（Ｔｆ）に融合した短いロイシン−グルタミン酸（ＬＥ）リンカーを使用すると、天然Ｇ−ＣＳＦの活性の約１０％しか得られなかった。（Ｇ４Ｓ）３又はα−ヘリカル［Ａ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡ］ｍ（ｎ＝２〜４、ｍ＝１又は２）リンカーの挿入によって、Ｇ−ＣＳＦ−ＬＥ−Ｔｆよりも融合タンパク質の活性が大幅に増加した。リンカー（Ａ（ＥＡＡＡＫ）４ＡＬＥＡ−（ＥＡＡＡＫ）４Ａ）で構築された融合タンパク質の場合、天然Ｇ−ＣＳＦに近い生物活性が得られた［Pharm Res. 2006;23:2116-21］。他の例では、Ｆｃ部分のＣ末端をペプチド結合を介してＩＦＮ−β部分のＮ末端に直接結合できるが、Gillies et al［ＵＳ７，６７０，５９５Ｂ２］はリンカーペプチドを介してＦｃ部分とＩＦＮ−β部分とを更に連結させる。リンカーペプチドはＦｃ部分のＣ末端と成熟ＩＦＮ−β部分のＮ末端との間に位置している。この場合、リンカーペプチドは、アミノ酸配列Ｇ４ＳＧ４ＳＧ３ＳＧ等のセリン及びグリシン残基で構成されることが好ましい。このような知見は全て、融合タンパク質の研究開発プログラムを成功させるにはリンカー技術の試験が重要であることを示している。
【００８０】
別のアプローチを使用して活性に関する融合位置の重要性が実証されている［Curr Pharmaceut Biotechnol. 2014;15:856-63］。脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）を様々な形式でＨＳＡのＮ末端又はＣ末端に融合させた。その結果から、ＢＮＰ−ＨＳＡ、ＢＮＰ２−ＨＳＡ（ＢＮＰの２個のコピー）及びＢＮＰ４−ＨＳＡ（全てＨＳＡのＮ末端に融合した）は不活性であることが分かった。しかし、ＨＳＡのＣ末端に融合したＨＳＡ−ＢＮＰ２は天然ＢＮＰと同等な活性があり、持続性があった。
【００８１】
これらの例は、リンカーエンジニアリング、半減期延長モジュールに対する生物活性タンパク質又はペプチドの位置のいずれか、或いはその両方を通じて、融合タンパク質のリード最適化に多大な努力を払って活性を最適化することの重要性を示している。重要なのは、本発明で新しいＡＢＤ融合アプローチを使用してＡＢＤとアルギナーゼを互いに結合させ、アルギナーゼ活性を保持できるようにしたことである。ｐＨ依存的にＦｃＲｎに結合可能な安定で可溶性のアルギナーゼ−ＡＢＤ融合分子の生成に成功し、効率的なエンドソームのリサイクルが可能になった。例えば、本開示では驚くべきことに、ＡＢＤに融合したｒｈＡｒｇの場合、タンパク質の循環における終末半減期がマウスにおいて数分間から４日間へと劇的に延長したことを見出した。まとめると、アルギナーゼの薬物動態特性を微調整し、様々な病態に対して循環中の適切な滞留時間を確保するのに様々な異なるアプローチが利用可能である。治療用タンパク質の開発における他の重要な課題は、免疫原性を最小限に抑えて有害作用を回避することである。従って、ヒトアルギナーゼの低い免疫原性が観察されたこと、及びインビボ半減期を延長するための遺伝子融合パートナーとして本開示でも使用されたＡＢＤ（例えば、ＡＢＤ０９４）の脱免疫化が成功したことが重要である。
【００８２】
アルブミン結合タンパク質は、グラム陽性菌によって発現される様々な表面タンパク質に見られる３個のらせん状タンパク質のドメインである。連鎖球菌タンパク質Ｇに由来するアルブミン結合タンパク質は２１４個のアミノ酸を有し、ヒト血清アルブミンに結合して宿主の免疫系を回避するのに使用する３個のアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ１〜３）を含む。ＡＢＤ３は４６アミノ酸配列に相当し、ヒト血清アルブミンに結合することが実証されており、様々な特性（例えば、結合親和性や結合選択性）を有するＡＢＤポリペプチドを開発する上でヒト血清アルブミンに関する多くの研究と親和性成熟の対象となっている。このような研究によって、様々な特性を有する相当数のＡＢＤポリペプチドが生成された。
【００８３】
アルブミン結合タンパク質は他の細菌で見出される。例えば、天然に存在するアルブミン結合タンパク質としては、グラム陽性菌由来の特定の表面タンパク質、例えば、連鎖球菌Ｍタンパク質（例えば、Ｍ１／Ｅｍｍ１、Ｍ３  Ｅｍｍ３、Ｍ１２／Ｅｍｍｌ２、ＥｍｍＬ５５／Ｅｍｍ５５、Ｅｍｍ４９／ＥｍｍＬ４９及びタンパク質Ｈ）、連鎖球菌タンパク質Ｇ、ＭＡＧ及びＺＡＧ、及びFinegoldia magnaの特定の菌株由来のＰＰＬとＰＡＢが挙げられる。
【００８４】
特定の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、連鎖球菌タンパク質Ｇアルブミン結合ドメインに由来するＡＢＤポリペプチドを含む。特定の実施形態では、ＡＢＤポリペプチドは、完全連鎖球菌タンパク質Ｇアルブミン結合ドメイン３又はその機能的断片及び／又は変異体である。
【００８５】
特定の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６６と少なくとも９３％の配列相同性を有するポリペプチド配列を含むＡＢＤポリペプチドを含む。例えば、ＡＢＤポリペプチドは、配列番号６６と少なくとも９４％、９６％又は９８％の相同性を有するポリペプチド配列を含むことができる。特定の実施形態では、ＡＢＤポリペプチドの配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸修飾（例えば、挿入、置換、欠失等）によって配列番号６６と異なっていてもよい。特定の実施形態では、ＡＢＤポリペプチドは、保存的アミノ酸置換、非保存的アミノ酸置換、又はそれらの組み合わせを有するポリペプチドを含む。
【００８６】
特定の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６７と少なくとも９３％の配列相同性を有するポリペプチド配列を含むＡＢＤポリペプチドを含む。例えば、ＡＢＤポリペプチドは、配列番号６７と少なくとも９４％、９６％又は９８％の相同性を有するポリペプチド配列を含むことができる。特定の実施形態では、ＡＢＤポリペプチドの配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸修飾（例えば、挿入、置換、欠失等）によって配列番号６７と異なっていてもよい。特定の実施形態では、ＡＢＤポリペプチドは、保存的アミノ酸置換、非保存的アミノ酸置換、又はそれらの組み合わせを有するポリペプチドを含む。
【００８７】
特定の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６８と少なくとも９３％の配列相同性を有するポリペプチド配列を含むＡＢＤポリペプチドを含む。例えば、ＡＢＤポリペプチドは、配列番号６８と少なくとも９３％、９５％又は９７％の相同性を有するポリペプチド配列を含むことができる。特定の実施形態では、ＡＢＤポリペプチドの配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸修飾（例えば、挿入、置換、欠失等）によって配列番号６８と異なっていてもよい。特定の実施形態では、ＡＢＤポリペプチドは、保存的アミノ酸置換、非保存的アミノ酸置換、又はそれらの組み合わせを有するポリペプチドを含む。
【００８８】
ＡＢＤポリペプチドとアルギナーゼポリペプチドの相対位置は様々となり得る。例えば、ＡＢＤポリペプチドはアルギナーゼポリペプチドに先行することができ（例えば、アルギナーゼポリペプチドはＡＢＤポリペプチドのＣ末端から直接的又は間接的に結合することができる）、又はアルギナーゼポリペプチドはＡＢＤポリペプチドに先行することができる（例えば、ＡＢＤポリペプチドはアルギナーゼポリペプチドのＣ末端から直接的又は間接的に結合することができる）。
【００８９】
特定の実施形態では、融合タンパク質は１個以上のアルギナーゼポリペプチド及び／又は１個以上のＡＢＤポリペプチドを含むことができる。例えば、融合タンパク質は一般構造ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ−ＡＢＤ、ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ−ＡＢＤ０９４、ＡＢＤ−ＢＣＡ−ＡＢＤ、ＡＢＤ０９４−ＢＣＡ−ＡＢＤ０９４、ｒｈＡｒｇ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ、ｒｈＡｒｇ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ、ＢＣＡ−ＡＢＤ−ＢＣＡ、又はＢＣＡ−ＡＢＤ０９４−ＢＣＡを有することができる。
【００９０】
ＡＢＤポリペプチドとアルギナーゼポリペプチドは、直接共有結合によって結合することもでき、ペプチドリンカーを介して間接的に結合することもできる。
【００９１】
ペプチドリンカー又はリンカーは、アミノ酸長さが通常約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれ以上の範囲のポリペプチドであり、これはＡＢＤポリペプチドとアルギナーゼポリペプチドを連結融合タンパク質にする機能的結合を容易にするように設計されている。機能的結合という用語は、ポリペプチドが三次元構造へ適切に折り畳まれることを容易にする結合を表し、この三次元構造によって、連結融合タンパク質がポリペプチド構成要素の由来元であるタンパク質の機能的側面又は生物活性の一部又は全てを示すことが可能になる。
【００９２】
ポリペプチドリンカーは、ＡＢＤポリペプチドのＮ末端とアルギナーゼポリペプチドのＣ末端との間に配置するか、或いはアルギナーゼポリペプチドのＮ末端とＡＢＤポリペプチドのＣ末端との間に配置することができる。
【００９３】
ペプチドリンカーは、天然に存在するアミノ酸、非天然アミノ酸、及びそれらの組み合わせを含むことができる。
【００９４】
特定の実施形態では、ペプチドリンカーはグリシン、セリン、アスパラギン又はそれらの組み合わせを含むことができる。ペプチドリンカーの例としては、ポリグリシン、（ＧＳ）ｎ及び（ＧＧＳ）ｎ（ｎは１〜３０）を含むリンカーが挙げられる。更なるペプチドリンカーの例としては、可動性リンカー（例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎ＝１〜４））、又は剛性リンカー（例えば、αヘリカルリンカー［Ａ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡ］ｘ（ｎ＝２〜４及びｘ＝１又は２、及びＸＰｎ（ＸはＡ、Ｋ又はＥのいずれかであり、ｎ＝１〜１０））が挙げられる。特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、（Ａ（ＥＡＡＡＫ）４ＡＬＥＡ−（ＥＡＡＡＫ）４Ａ）（配列番号１０５）、Ｇ４ＳＧ４ＳＧ３ＳＧ（配列番号１０６）、ＧＳ（Ｎ）ｎＧＳＧ（ｎ＝１〜１０）、及びＧＳ（Ｑ）ｎＧＳＧ（ｎ＝１〜１０）等である。特定の実施形態では、ペプチドリンカーは配列番号７３と少なくとも９０％の配列相同性を有するポリペプチド配列を含む。例えば、ペプチドリンカーは、配列番号７３と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するか又は配列番号７３と同一であるポリペプチドを含むことができる。
【００９５】
特定の実施形態では、ペプチドリンカーはグリシン、セリン、アスパラギン又はそれらの組み合わせを含むことができる。特定の実施形態では、ペプチドリンカーは配列番号７４と少なくとも９０％の配列相同性を有するポリペプチド配列を含む。例えば、ペプチドリンカーは、配列番号７４と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するか又は配列番号７４と同一であるポリペプチドを含むことができる。
【００９６】
精製タグを使用して、アフィニティークロマトグラフィー等による融合タンパク質の精製の容易さを改善することができる。よく知られている精製タグは、６個のヒスチジン残基の配列であるヘキサヒスチジン（６×Ｈｉｓ）タグである。従って、特定の実施形態では、融合タンパク質は４〜８個のヒスチジンアミノ酸を含むポリヒスチジン、例えば、６×Ｈｉｓタグを更に含む。ポリヒスチジンは融合タンパク質のＣ末端、融合タンパク質のＮ末端に存在するか、又はＡＢＤポリペプチドとアルギナーゼポリペプチドとの間に配置することができる。
【００９７】
ポリヒスチジンがＡＢＤポリペプチドとアルギナーゼポリペプチドとの間に配置されている場合、ポリヒスチジンはペプチドリンカーとして作用するか、或いはペプチドリンカーに加えて含ませることができる。例えば、配列番号７５の融合タンパク質は３００〜３０５位に６個のヒスチジンから成るポリペプチドリンカーを含むが、これはＡＢＤポリペプチドとアルギナーゼポリペプチドを連結させるのに役立ち、アフィニティークロマトグラフィーによって融合タンパク質を精製するのに有利に使用することができる。
【００９８】
ポリヒスチジンタグは、当技術分野で一般に知られている技術を用いて精製が完了した後に必要に応じて除去することができる。例えば、エキソペプチダーゼを使用してＮ末端ポリヒスチジンタグを除去することができ（例えば、Ｑｉａｇｅｎ  ＴＡＧＺｙｍｅ）、エンドペプチダーゼを使用したポリヒスチジンタグの除去を容易にする適切なアミノ酸配列をＣ末端ポリヒスチジンタグの前に置くことができる。従って、Ｎ末端及び／又はＣ末端ポリヒスチジンタグを除く融合タンパク質は本開示の範囲内に含まれる。
【００９９】
特定の実施形態では、ＡＢＤポリペプチドは、配列番号６６、配列番号６７又は配列番号６８と少なくとも９３％の配列相同性を有するポリペプチド配列を含み、アルギナーゼポリペプチドは、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１又は配列番号７２と少なくとも９５％の相同性を有するポリペプチド配列を含む。例えば、ＡＢＤポリペプチドは、配列番号６６、配列番号６７又は配列番号６８と少なくとも９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するか、又は配列番号６６、配列番号６７又は配列番号６８と同一であるポリペプチド配列を含み、アルギナーゼポリペプチドは、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１又は配列番号７２と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するか、又は配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１又は配列番号７２と同一であるポリペプチド配列を含む。
【０１００】
特定の実施形態では、ＡＢＤポリペプチドは、配列番号６６と少なくとも９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するか、又は配列番号６６と同一であるポリペプチド配列を含み、アルギナーゼポリペプチドは、配列番号６９と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するか、又は配列番号６９と同一であるポリペプチド配列を含む。
【０１０１】
特定の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号７３又は配列番号７４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するか、又は配列番号７３又は配列番号７４と同一であるポリペプチド配列を含むペプチドリンカーを更に含む。
【０１０２】
融合タンパク質の例としては、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号７５及び配列番号７６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を有するか、又はこれらの配列番号と同一である融合タンパク質が挙げられる。
【０１０３】
血漿中アルギニン濃度に対する融合タンパク質の効果の治療期間は投与する融合タンパク質の量に依存し、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日、又は約１５日又はそれ以上となり得る。特定の実施形態では、融合タンパク質の治療期間は、約５日〜約２０日、約５日〜約１９日、約５日〜約１８日、約５日〜約１７日、約５日〜約１６日、約５日〜約１５日、約６日〜約１５日、約７日〜約１５日、約７日〜約１４日、約７日〜約１３日、約７日〜約１２日、約７日〜約１１日、又は約８日〜約１１日である。
【０１０４】
特定の実施形態では、融合タンパク質の半減期は約１日〜約１０日、約１日〜約９日、約１日〜約８日、約１日〜約７日、約１日〜約６日、約１日〜約５日、約１日〜約４日、約１日〜約３日、又は約１日〜約２日である。他の実施形態では、融合タンパク質の半減期は約６時間〜約３０時間である。
【０１０５】
本明細書に記載の融合タンパク質のアルギナーゼ活性は、その由来元であるアルギナーゼポリペプチドの活性と実質的に同じであるか、より低いか又はより高くなり得る。アルギナーゼ活性の１単位は、標準的なアッセイ条件下で１分間当たり１μｍｏｌの尿素の生成を触媒する融合タンパク質［例えば、ＢＨＡ（配列番号７５）、ＢＡＨ（配列番号７６）、Ｎ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）、又はＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）］又はアルギナーゼ［例えば、ＢＣＡ（配列番号７０）］の量で定義される。酵素の比活性はタンパク質１ｍｇ当たりの活性単位で表す。標準的なジアセチルモノオキシム（ＤＡＭＯ）アッセイ条件下（３７℃、ｐＨ７．４）では、融合タンパク質は、それに組み込む対応アルギナーゼポリペプチドよりも比活性が約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％又は約４０％低いか又は高くなり得る。特定の実施形態では、融合タンパク質は、それに組み込む対応アルギナーゼポリペプチドよりも比活性が約５％〜約４０％、約１０％〜約４０％、約１０％〜約３５％、約１０％〜約３０％、約２０％〜約３０％、約２０％〜約３５％、約１５％〜約３０％、約１５％〜約２５％、又は約１０％〜約２０％低いか又は高くなり得る。
【０１０６】
特定の実施形態では、融合タンパク質のアルギナーゼ活性はＨＳＡの存在には実質的に影響を受けない。これが有利なのは、ＡＢＤ融合タンパク質のＨＳＡへの結合が融合タンパク質の活性に有害な影響を及ぼす可能性があるためである。
【０１０７】
単離ポリヌクレオチドとして、又は発現ベクターの一部として、又は線状ＤＮＡ配列（例えば、インビトロ転写／翻訳に使用される線状ＤＮＡ配列、原核生物又は真核生物の発現、分泌及び／又は組成物の表示に適合するベクター）の一部として、本明細書に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列も提供される。特定の例示的なポリヌクレオチドを本明細書で開示するが、所与の発現系でのコドン選択又は遺伝暗号の縮重を考慮すると、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする他のポリヌクレオチドも本開示の範囲内である。
【０１０８】
本明細書に記載のポリヌクレオチドは、自動ポリヌクレオチド合成機での固相ポリヌクレオチド合成等の化学合成によって生成し、完全な一本鎖又は二本鎖分子に構築することができる。或いは、本発明のポリヌクレオチドは、ＰＣＲとそれに続く通常のクローニング等の他の技術によって生成することができる。所与の既知の配列のポリヌクレオチドを生成又は取得するための技術は当技術分野で周知である。
【０１０９】
本明細書に記載のポリヌクレオチドは少なくとも１個の非コード配列、例えば、プロモーター又はエンハンサー配列、イントロン、ポリアデニル化シグナル等を含むことができる。また、ポリヌクレオチド配列は、例えば、マーカー又はタグ配列（例えば、タンパク質の精製又は検出を容易にするポリヒスチジン（６×Ｈｉｓ）又はＨＡタグ）、シグナル配列、融合タンパク質パートナー（例えば、生物活性剤をコードするｃＤＮＡ）等をコードする追加のアミノ酸をコードする追加の配列も含むことができる。
【０１１０】
他の実施形態において提供されるのは、本明細書に記載のポリヌクレオチドの少なくとも１種を含むベクターである。そのようなベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイルス発現用ベクター、トランスポゾンベースのベクター、又は任意の手段によって所与の生物又は遺伝的背景に本発明のポリヌクレオチドを導入するのに適した他の任意のベクターとすることができる。そのようなベクターは、そのベクターによってコードされるポリペプチドの発現を制御し、調節し、引き起こし又は可能にすることができる核酸配列要素を含む発現ベクターとすることができる。そのような要素は、転写エンハンサー結合部位、ＲＮＡポリメラーゼ開始部位、リボソーム結合部位、及び所与の発現系においてコードされたポリペプチドの発現を促進する他の部位を含むことができる。そのような発現系は、当技術分野で周知の細胞ベースの系又は無細胞系とすることができる。
【０１１１】
多くの細菌発現系では、開始コドンは通常メチオニンをコードし、その結果、このような発現系においてＮ末端メチオニンで開始するタンパク質を生成する。しかし、メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭｅｔＡＰ）等の特定の細菌酵素が、新たに合成されたポリペプチドからのＮ末端メチオニンの加水切断を触媒できることはよく知られている。これは隣のアミノ酸が、例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ又はＴｈｒである場合に一般に観察される［In vivo processing of N-terminal methionine in E. coli, FEBS Lett. 1990 Jun 18;266(1-2):1-3］。従って、本明細書に記載の融合タンパク質の特定の実施形態では、タンパク質のＮ末端メチオニンが存在しない変異体が含まれる。
【０１１２】
本明細書に記載の融合タンパク質は、捕捉、固定化、分配又は沈降に関して当技術分野で周知の分離手順を使用して単離することができ、商業的利用に必要な程度まで精製することができる。
【０１１３】
治療的使用の場合、本明細書に記載の融合タンパク質は、薬学的に許容し得る担体中に有効成分として本明細書に記載の融合タンパク質の治療有効量を含む医薬組成物として調製することができる。「担体」という用語は、有効化合物の投与に使用する希釈剤、アジュバント、賦形剤又はベヒクルを意味する。このようなベヒクルとしては、液体、例えば、水及び石油、動物、植物又は合成起源等の油（例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油等）を挙げることができる。例えば、０．９％生理食塩水と０．３％グリシンを使用することができる。このような溶液は無菌であり、一般に粒子状物質を含まない。このような溶液は、従来周知の滅菌技術（例えば、濾過）によって滅菌することができる。組成物は、生理学的条件に近似させるのに必要とされる薬学的に許容し得る補助物質、例えば、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤及び着色剤等を含むことができる。このような医薬製剤中の融合タンパク質の濃度は、例えば、約０．５重量％未満（通常は少なくとも約１重量％）から最大１５又は２０重量％まで大きく変動することがあり、主に選択した特定の投与方法に応じて必要な用量、液量、粘度等に基づいて選択される。適切なベヒクル及び製剤は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Troy, D. B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, Pa. 2006, Part 5, Pharmaceutical Manufacturing pp 691-1092（特にpp. 958-989参照）に記載されている。
【０１１４】
当技術分野で周知のように、本明細書に記載の融合タンパク質の治療的使用のための投与方法は薬剤を宿主に送達させる任意の適切な経路とすることができ、例えば、非経口投与（例えば、皮内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈内投与又は皮下投与、経肺投与）、経粘膜投与（経口投与、鼻腔内投与、膣内投与、直腸投与）、錠剤、カプセル、溶液、懸濁液、粉末、ゲル、粒子の製剤の使用、注射器、埋め込み型デバイス、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプへの含有、又は当業者に認められた他の手段とすることができる。部位特異的投与は、例えば、関節内送達、気管支内送達、腹腔内送達、嚢内送達、軟骨内送達、腔内送達、腹腔内送達、脳内送達、脳室内送達、結腸内送達、子宮頸内送達、胃内送達、肝内送達、心臓内送達、骨内送達、骨盤内送達、心膜内送達、腹腔内送達、胸膜内送達、前立腺内送達、肺内送達、直腸内送達、腎内送達、網膜内送達、脊髄内送達、滑膜内送達、胸腔内送達、子宮内送達、血管内送達、膀胱内送達、病巣内送達、膣送達、直腸送達、頬側送達、舌下送達、鼻腔内送達、又は経皮送達によって行うことができる。
【０１１５】
本明細書に記載の融合タンパク質はアルギニン枯渇剤として使用することができる。このような剤は、対象においてアルギニン枯渇が治療効果を有する疾患又は病態の治療、例えば、癌、特定のウイルス感染症、多発性硬化症、関節リウマチ、自己免疫疾患、先天性高アルギニン血症、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、及び本明細書で詳述のように、肥満、代謝障害、及び関連する合併症と併存症の治療に有用である。
【０１１６】
アルギニン栄養要求性腫瘍はＡＳＳ又はＯＴＣのダウンレギュレーションによって細胞外アルギニンに依存しており、生存のために細胞外アルギニン源に依存している。アルギニン枯渇剤は、アルギニン栄養要求性腫瘍に対して細胞毒性があることが示されており、癌治療におけるその使用は現在、臨床試験で検討されている。
【０１１７】
従って、本明細書に記載の融合タンパク質は癌の治療、例えば、膵臓癌、白血病、黒色腫、頭頸部癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、子宮頸癌、肝癌、鼻咽頭癌、食道癌、肉腫、胃癌、中皮腫、リンパ腫、膀胱癌、骨癌、子宮内膜癌、卵巣癌、腎臓癌、眼癌、神経芽細胞腫、神経膠芽腫、悪性末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ）、及び脳癌の治療に使用することができる。癌はアルギニン栄養要求性癌、例えば、ＡＳＳ及びＯＴＣの内の少なくとも１種のダウンレギュレーションを特徴とする癌とすることができる。
【０１１８】
本明細書に記載の融合タンパク質はウイルス感染症の治療、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、及びインフルエンザの治療にも使用することができる。
【０１１９】
本明細書で詳述するように、本明細書に記載の融合タンパク質は、肥満、代謝障害、及び関連する合併症及び／又は併存症から成る群から選択される少なくとも１種の病態の治療に使用することもできる。
【０１２０】
以下の実験で示すように、アルギニン枯渇は脂肪症を劇的に抑制することができる。本明細書では、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）、ＰＥＧ化Ｈｉｓ−ｒｈＡｒｇ（配列番号１０１）、及びＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ−Ｃｏ２＋［配列番号５０（コバルト置換）］等のＡＢＤアルギナーゼ融合タンパク質又はＰＥＧ化アルギナーゼを肥満及び関連する代謝障害の治療に使用して、アルギニン欠乏症の治療可能性を検討した。本明細書に提示のデータによって、例えば、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）によるアルギニン枯渇が、正常な痩せたマウスと肥満マウスにおいて脂肪量を有意に減少させ、脂質生成を抑制し、インスリン感受性を高めることが示されている。例えば、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）によるアルギニン欠乏によって、肥満、代謝障害、及び関連する合併症と併存症（例えば、インスリン抵抗性）を予防及び軽減できることが見出された。
【０１２１】
本明細書に示すアルギニン枯渇の効果は驚くべきものであり、予想外であるが、それは、アルギニンを含む幾つかのアミノ酸（ＡＡ）の食事摂取を増やすと、グルコースと脂質の代謝に大きく影響を及ぼし、ＡＡの補給によって体重を減少できることが多くの研究で示されているためである。更に、アルギニンは半必須アミノ酸であるため、その枯渇は対象に悪影響を及ぼさない。
【０１２２】
高脂肪食誘発性肥満（ＤＩＯ）のマウスモデルを使用した。高脂肪食を開始した痩せたマウスを同時にＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）で処理して、ＤＩＯ及び関連する代謝障害の発症の予防に対するその有効性を試験した。既存のＤＩＯを有するマウスをＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）で処理して、肥満、代謝障害、及び関連する合併症と併存症の軽減に対するその有効性を試験した。
【０１２３】
以下の実施例に示すように、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）による処理によって、体重と脂肪量が減少し、耐糖能とインスリン反応性が改善し、内分泌及び代謝プロファイルが正常化し、炎症、脂肪症及び線維症が緩和し、褐色脂肪の白色化を防止又は逆行させた。
【０１２４】
本明細書で提供されるのは、肥満及び／又は代謝障害の治療を必要とする対象においてそれを治療する方法であって、アルギニン枯渇剤の治療有効量を対象に投与する工程を含む方法である。
【０１２５】
アルギニン枯渇剤は、対象における血漿中及び／又は細胞中アルギニン濃度を低下させることが可能な、当技術分野で知られている任意のアルギニン枯渇剤とすることができる。アルギニン枯渇剤は小分子又はタンパク質とすることができる。
【０１２６】
タンパク質は、融合タンパク質及び／又は化学的に修飾されたタンパク質（例えば、ＰＥＧ化タンパク質）とすることができる。タンパク質の例としては、アルギニンの他の生成物への異化を触媒することが可能なタンパク質、例えば、アルギナーゼ活性、アルギニンデイミナーゼ活性、アルギニンデカルボキシラーゼ活性、又はアルギニン２モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。
【０１２７】
アルギナーゼは、当技術分野で知られている任意のアルギナーゼ、例えば、細菌、真菌、魚、ヒト、ウシ、ブタ、ウサギ、齧歯類、霊長類、ヒツジ及びヤギによって産生されるものとすることができる。例えば、Bacillus caldoveloxアルギナーゼ、Thermus thermophilusアルギナーゼ、Capra hircusアルギナーゼＩ、Heterocephalus glaberアルギナーゼＩ、Bos taurusアルギナーゼＩ、Sus scrofaアルギナーゼＩ、Plecoglossus altivelisアルギナーゼＩ、Salmo salarアルギナーゼＩ、Oncorhynchus mykissアルギナーゼＩ、Osmerus mordaxアルギナーゼＩ、Hyriopsis cumingiiアルギナーゼＩ、Rattus norvegicusアルギナーゼＩ、Mus musculusアルギナーゼＩ、Homo sapiens（ヒト）アルギナーゼＩ、Pan troglodytesアルギナーゼＩ、Oryctolagus cuniculusアルギナーゼＩ、Rattus norvegicusアルギナーゼＩＩ、Mus musculusアルギナーゼＩＩ、Homo sapiens（ヒト）アルギナーゼＩＩ、BostaurusアルギナーゼＩＩ、Heterocephalus glaberアルギナーゼＩＩ、Pan troglodytesアルギナーゼＩＩ、Oryctolagus cuniculusアルギナーゼＩＩ、Delftiaアルギナーゼ、Bacillus coagulansアルギナーゼ、Hoeflea phototrophicaアルギナーゼ及びRoseiflexus castenholziiアルギナーゼが挙げられる。他の例としては、Bacillus methanolicus、Bacillus sp. NRRL B-14911、Planococcus donghaensis、Paenibacillus dendritiformis、Desmospora sp.、Methylobacter tundripaludum、Stenotrophomonas sp.、Microbacterium laevaniformans、Porphyromonas uenonis、Agrobacterium sp.、Octadecabacter arcticus、Agrobacterium tumefaciens、Anoxybacillus flavithermus、Bacillus pumilus、Geobacillus thermoglucosidasius、Geobacillus thermoglucosidans、Brevibacillus laterosporus、Desulfotomaculum ruminis、Geobacillus kaustophilus、Geobacillus thermoleovorans、Geobacillus thermodenitrificans、Staphylococcus aureus、Halophilic archaeon DL31、Halopigerxanaduensis、Natrialba magadii、Plasmodium falciparum、Helicobacter pylori等由来のアルギナーゼが挙げられる。
【０１２８】
アルギニンデイミナーゼは、当技術分野で知られている任意のアルギニンデイミナーゼ、例えば、マイコプラズマ、ラクトコッカス、シュードモナス、ストレプトコッカス、エシェリキア、マイコバクテリウム又はバチルス微生物から産生されるものとすることができる。アルギニンデイミナーゼの例としては、Mycoplasma hominis、Mycoplasma arginini、Mycoplasma arthritidis、Clostridium perfringens、Bacillus licheniformis、Borrelia burgdorferi、Borrelia afzellii、Enterococcus faecalis、Lactococcus lactis、Bacillus cereus、Streptococcus pyogenes、Steptococcus pneumoniae、Lactobacillus sake、Giardia intestinalis、Mycobacterium tuberculosis、Pseudomonas plecoglossicida、Pseudomonas putida、Pseudomonas aeruginosa等によって産生されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２９】
アルギニンデカルボキシラーゼは、当技術分野で知られている任意のアルギニンデカルボキシラーゼ、例えば、Escherichia coli.、Salmonella typhimurium、Chlamydophila pneumoniae、Methanocaldococcus jannaschii、Paramecium bursaria Chlorella virus 1、Vibrio vulnificus YJ016、Campylobacter jejuni subsp.、Trypanosoma cruzi、Sulfolobus solfataricus、Bacillus licheniformis、Bacillus cereus、Carica papaya、Nicotianatobacum、Glycine max、Lotus coniculata、Vibrio vulnificus、Vibrio cholerae、Mus musculus、Thermotoga、Rattus norvegicus、Homo sapiens、Bos taurus、Susscrofa、Thermus thermophiles、Thermus parvatiensis、Thermus aquaticus、Thermus thermophilus、Thermus islandicus、Arabidopsis thaliana、Avena sativa等によって産生されるものとすることができる。
【０１３０】
アルギニン２−モノオキシゲナーゼは、当技術分野で知られている任意のアルギニン２−モノオキシゲナーゼ、例えば、Arthrobacter globiformisＩＦＯ１２１３７、Arthrobacter simplexＩＦＯ１２０６９、Brevibacterium helvolumＩＦＯ１２０７３、Helicobacter cinaediＣＣＵＧ１８８１８、Streptomyces griseus等から産生されるものとすることができる。
【０１３１】
アルギニンデカルボキシラーゼ、アルギニンデイミナーゼ、アルギニン２−モノオキシゲナーゼ及びアルギナーゼは、完全タンパク質又はその機能的断片及び／又は変異体とすることができる。アルギニンデカルボキシラーゼ、アルギニンデイミナーゼ、アルギニン２−モノオキシゲナーゼ及びアルギナーゼは、例えば、タンパク質又はその機能的断片及び／又は変異体とヒト血清アルブミン、アルブミン結合ドメイン、免疫グロブリンのＦｃ領域、ＰＥＧ基、又はこれらの組み合わせとの融合によって修飾して薬物動態特性を改善することができる。
【０１３２】
本明細書に記載のアルギニン異化酵素を遺伝子操作して、ＰＥＧが選択的に結合できる酵素の特定の部位を含むようにすることができる。選択したＰＥＧ化部位は、酵素の活性部位から除去された部位に位置することが好ましく、通常は溶媒に曝露してＰＥＧ化試薬との反応を可能にさせる。
【０１３３】
例えば、Ｃｙｓ４５−ヒトアルギナーゼＩ（ＨＡＩ）とＣｙｓ１６１−Bacillus caldoveloxアルギナーゼ（ＢＣＡ）はチオール特異的ＰＥＧ分子と反応するように生成することができる。修飾アルギナーゼの単一の遊離システイン残基とＰＥＧ化合物に結合したマレイミド基（ＭＡＬ）との結合によって、ＰＥＧ化合物と修飾アルギナーゼの遊離システインとの間に共有結合を形成することができる。配列番号１０２及び１０４はＣｙｓ４５部位特異的ＰＥＧ化用に設計した変異体（Ｃ１６８Ｓ／Ｃ３０３Ｓ）を含んでいるため、必要に応じてＰＥＧ化することができる。配列番号８９もＣｙｓ１６１部位特異的ＰＥＧ化用に設計した変異体（Ｓ１６１Ｃ）を含んでいるため、必要に応じてＰＥＧ化することができる。
【０１３４】
特定の実施形態では、アルギナーゼは配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３又は配列番号１０４を含むことができ、配列番号１０２と配列番号１０４は必要に応じてポリエチレングリコール基（ＰＥＧ）を含む。
【０１３５】
当技術分野で知られている任意のＰＥＧ化試薬を使用して、本明細書に記載のアルギニン異化酵素にＰＥＧを共有結合させることができる。ＰＥＧ化試薬の例としては、ｍＰＥＧ−ＡＬＤ（メトキシポリエチレングリコール−プロピオンアルデヒド）、ｍＰＥＧ−ＭＡＬ（メトキシポリエチレングリコール−マレイミド）、ｍＰＥＧ−ＮＨＳ（メトキシポリエチレングリコール−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）、ｍＰＥＧ−ＳＰＡ（メトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルプロピオネート）、及びｍＰＥＧ−ＣＮ（メトキシポリエチレングリコール−塩化シアヌル）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３６】
ＰＥＧ基の分子量は、約５０００〜約２００００ａｍｕ、約５０００〜約１５０００ａｍｕ、約５０００〜約１２０００ａｍｕ、約７０００〜約１２０００ａｍｕ、又は約７０００〜約１００００ａｍｕとすることができる。特定の実施形態では、ＰＥＧ基の分子量は約２０００ａｍｕ〜１００００ａｍｕである。特定の実施形態では、ＰＥＧ基はＰＥＧ４０００、ＰＥＧ５０００、ＰＥＧ６０００、又はＰＥＧ７０００である。
【０１３７】
ＰＥＧ基はアルギナーゼに直接又はリンカーを介して共有結合させることができる。特定の実施形態では、アルギナーゼはプロピオン酸リンカーを介してＰＥＧに共有結合している。他の実施形態では、アルギナーゼは、Ｃ２−Ｃ１０、Ｃ２−Ｃ９、Ｃ２−Ｃ８、Ｃ２−Ｃ７、Ｃ２−Ｃ６、Ｃ２−Ｃ５又はＣ２−Ｃ４直鎖又は分枝鎖カルボン酸リンカーを介してＰＥＧに共有結合している。
【０１３８】
別の実施形態では、肥満、代謝障害、及び関連する合併症及び／又は併存症から成る群から選択される少なくとも１種の病態の治療を必要とする対象においてその病態を治療する方法は、低アルギニン食又は実質的にアルギニンを含まない食を対象に投与することを含む。
【０１３９】
肥満、代謝障害、及び関連する合併症及び／又は併存症から成る群から選択される少なくとも１種の病態を治療する方法は、肥満、代謝障害、及び関連する合併症及び／又は併存症から成る群から選択される少なくとも１種の病態の予防を含むこともできる。
【０１４０】
代謝障害としては、肥満、高コレステロール血症、脂質異常症、脂肪症、インスリン抵抗性、耐糖能異常、高血糖症、及び糖尿病又はそれらの組み合わせを挙げることができ、関連する合併症及び／又は併存症としては、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、糖尿病性血管障害、糖尿病性神経障害、脂肪性肝炎、線維症、肝硬変、炎症、高血圧、心血管疾患、及び褐色脂肪の白色化又はそれらの組み合わせを挙げることができる。
【０１４１】
特定の実施形態では、代謝障害は、例えば、Ｉ型又は特にＩＩ型糖尿病を有する対象におけるインスリン抵抗性の治療及び／又は予防である。以下の実施例で示すように、アルギニン枯渇は対象のインスリン感受性の上昇をもたらす。
【０１４２】
肥満を治療する方法は、対象において脂肪量を減らすこと又は脂肪量の増加を防ぐことを含むことができる。アルギニン枯渇剤による対象の治療によって、高脂肪食で未治療の対象と比較して、内臓白色脂肪組織（ＷＡＴ）、肝臓及び骨格筋における数種の脂肪生成転写因子及び脂質生成酵素（例えば、Ｐｐａｒｇ、Ｓｒｅｂｐ１ｃ、Ａｃｃ及びＳｃｄ１）のｍＲＮＡ発現レベルを低下させることができる。特定の実施形態では、脂質生成調節因子のｍＲＮＡ発現レベルの低下の発現レベルは、高脂肪食で未治療の対象における対応するｍＲＮＡ発現レベルに対して、例えば、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％又は約９０％低下する。特定の実施形態では、アルギニン枯渇剤による対象の治療によって、対象のＷＡＴ、肝臓及び／又は骨格筋におけるＰｐａｒｇ、Ｓｒｅｂｐ１ｃ、Ａｃｃ及びＳｃｄ１から成る群から選択される１種以上の遺伝子のｍＲＮＡ発現が抑制される。
【０１４３】
肥満は、代謝障害（例えば、高血糖症、高インスリン血症）及び／又は過食、運動不足等の他の要因の結果であるか、及び／又はそれと関連する可能性がある。
【０１４４】
代謝障害は、対象における脂肪症、例えば、心臓脂肪症、脂肪肝、腎脂肪症、膵臓脂肪症及び筋肉脂肪症の治療及び／又は予防を含む可能性もある。
【０１４５】
代謝障害は、対象における線維症、例えば、肝線維症、腎線維症、膵線維症及び心臓線維症の治療及び／又は予防を含む可能性もある。
【０１４６】
代謝障害は、例えば、血漿中総コレステロール、ＬＤＬコレステロール、アポリポタンパク質Ｂ及び／又はトリグリセリドの濃度を低下させることによる高コレステロール血症、脂質異常症の治療を含むこともある。
【０１４７】
アルギニン枯渇剤による対象の治療によって、血漿中レプチン濃度をＨＦＤの未治療対象の対応する血漿中レプチン濃度に対し、例えば、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、又は約７０％低下させることができる。特定の実施形態では、血漿中レプチン濃度をＨＦＤの未治療対象の対応する血漿中レプチン濃度に対し、約１０％〜約７０％、約１０％〜約６０％、約１０％〜約５０％、約１０％〜約４０％、約１０％〜約３０％低下させることができる。
【０１４８】
アルギニン枯渇剤による対象の治療によって、血漿中トリグリセリド濃度をＨＦＤの未治療対象の対応する血漿中トリグリセリド濃度に対し、例えば、少なくとも約２０％、約３０％又は約４０％低下させることができる。特定の実施形態では、血漿中トリグリセリド濃度をＨＦＤの未治療対象の対応する血漿中トリグリセリド濃度に対し、約５％〜約４０％、約５％〜約３０％、又は約５％〜約２０％低下させることができる。
【０１４９】
アルギニン枯渇剤による対象の治療によって、血漿中総コレステロール濃度をＨＦＤの未治療対象の対応する血漿中総コレステロール濃度に対し、例えば、少なくとも約５％、約１０％、又は約１５％低下させることができる。特定の実施形態では、血漿中総コレステロール濃度をＨＦＤの未治療対象の対応する血漿中総コレステロール濃度に対し、約５％〜約１５％、約５％〜約１０％、又は約１０％〜約１５％低下させることができる。
【０１５０】
アルギニン枯渇剤による対象の治療によって、血漿中遊離脂肪酸濃度をＨＦＤの未治療対象の対応する血漿中遊離脂肪酸濃度に対し、例えば、少なくとも約５％、約１０％、約１５％、又は約２０％低下させることができる。特定の実施形態では、血漿中遊離脂肪酸濃度をＨＦＤの未治療対象の対応する血漿中遊離脂肪酸濃度に対し、約５％〜約２０％、約５％〜約１５％、又は約５％〜約１０％低下させることができる。
【０１５１】
治療効果を観察する必要がある対象の血漿中アルギニン濃度は、対象の病態、及び疾患の種類と重症度及び／又は病状及び／又は食事組成等の多くの要因に基づいて変動し得る。標的となる血漿中アルギニン濃度の選択は、十分に当業者の技能の範囲内である。特定の実施形態では、血漿中アルギニン濃度は、約１００μＭ未満、約９０μＭ未満、約８０μＭ未満、約７０μＭ未満、約６０μＭ未満、約５０μＭ未満、約４０μＭ未満、約３０μＭ未満、約２０μＭ未満、約１０μＭ未満、又は約５μＭ未満である。特定の実施形態では、血漿中アルギニン濃度は、約０．１μＭ〜約１００μＭ、約０．１μＭ〜約９０μＭ、約０．１μＭ〜約８０μＭ、約０．１μＭ〜約７０μＭ、約０．１μＭ〜約６０μＭ、約０．１μＭ〜約５０μＭ、約０．１μＭ〜約４０μＭ、約０．１μＭ〜約３０μＭ、約０．１μＭ〜約２０μＭ、又は約０．１μＭ〜約１０μＭである。特定の実施形態では、アルギニン濃度は、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ３０アミノ酸分析計の検出限界未満（例えば、約３μＭ未満）及び／又はＡｇｉｌｅｎｔ６４６０液体クロマトグラフィー／エレクトロスプレーイオン化三連四重極型質量分析計の検出限界未満（例えば、約０．３μＭ未満）である。
【０１５２】
治療期間（例えば、血漿中アルギニン濃度が対象において枯渇状態に維持される期間）の決定は十分に当業者の技能の範囲内である。特定の実施形態では、治療期間は、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約８週間、約１２週間、約１６週間、約２０週間、約２４週間、約２８週間、約３２週間、約３６週間、約４０週間、約４４週間、約４８週間、約５２週間、約５６週間又はそれ以上である。
【０１５３】
アルギニンの枯渇は多くの病態で有効な治療法であることが示されており、病態の例としては、ウイルス感染症（米国特許第８，５０７，２４５号、本参照をもってその全内容を本明細書の一部を構成するものとする）、多発性硬化症、関節リウマチ、自己免疫疾患（米国特許第９，７８９，１６９号、本参照をもってその全内容を本明細書の一部を構成するものとする）、先天性高アルギニン血症（ClinicalTrials.gov Identifier: NCT02488044）、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）（Hallet W., et al., Exploiting arginase to prevent GVHD, Blood  2010  116:5440-5441）、炎症（Sahin E., et al., Macrophage PTEN regulates expression and secretion of arginase I modulating innate and adaptive immune responses, J Immunol. 2014 Aug 15;193(4):1717-27）、及び網膜神経血管変性（Fouda AY. et al., Arginase 1 promotes retinal neurovascular protection from ischemia through suppression of macrophage inflammatory responses Cell Death Dis. 2018 Sep 25;9(10):1001）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５４】
従って、本明細書で更に提供されるのは、ウイルス感染症、多発性硬化症、関節リウマチ、自己免疫疾患、先天性高アルギニン血症、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）及び炎症から成る群から選択される少なくとも１種の病態の治療を必要とする対象においてその病態を治療する方法であって、本明細書に記載の融合タンパク質の治療有効量を投与する工程を含む方法である。
【０１５５】
本開示の更なる目的、利点、及び新規の特徴は、限定することを意図していない以下の実施例を検討すれば、当業者には明らかになるであろう。
【実施例１】
【０１５６】
ＡＢＤ及びＡＢＤ０９４融合遺伝子の構築
Ｎ末端融合用Ｎ−ＡＢＤ遺伝子の構築は、表１に記載のプライマー０１〜０８（配列番号１〜８）（各プライマー：２０ｎＭまでの濃度）をｉＰｒｏｏｆ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏ−ｒａｄ社）の１×反応バッファー、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、及び０．５ユニットのｉＰｒｏｏｆ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏ−ｒａｄ社）と共に５０μＬの反応体積で混合し、ＰＣＲ反応によって行った。ＰＣＲプログラムは次のように設定した。（１）９８℃、１０秒間、（２）５０℃、２０秒間、（３）７２℃、１５秒間、（４）（１）〜（３）を３５回反復。次に、１μＬのＰＣＲ反応生成物をｉＰｒｏｏｆ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏ−ｒａｄ社）の１×反応バッファー、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、０．２μＭのプライマー（Ｎ−ＡＢＤＮｄｅ−Ｆ）：５’−ＧＡＴＣＴＴＡＡＧＣＡＴＡＴＧＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣ−３’（配列番号９）、プライマー（Ｎ−ＡＢＤＨｉｎｄ−Ｒ）：５’−ＡＣＡＧＣＴＡＡＡＡＧＣＴＴＡＴＣＡＧＣＣＴＡＧＧＡＴＣＣＧＣＣＧＣＴＡＣＣＡＴＴＧ−３’（配列番号９３）及び０．５ユニットのｉＰｒｏｏｆ  ＤＮＡポリメラーゼと共に５０μＬの反応体積で新しいＰＣＲ反応に供した。ＰＣＲプログラムは次のように設定した。（１）９８℃、１０秒間、（２）５０℃、２０秒間、（３）７２℃、１５秒間、（４）（１）〜（３）を３５回反復、（５）７２℃、５分間。Ｎ−ＡＢＤ０９４遺伝子の構築は、表１に記載のプライマー０１〜０８（配列番号１〜８）の代わりに表１に記載のプライマー０９〜１６（配列番号９〜１６）を使用したこと以外はＮ−ＡＢＤ遺伝子構築の手順と同様であった。
【０１５７】
Ｃ末端融合用Ｃ−ＡＢＤ遺伝子の構築は、表１に記載のプライマー１７〜２４（各プライマー：２０ｎＭまでの濃度）をｉＰｒｏｏｆ  ＤＮＡポリメラーゼの１×反応バッファー、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、及び０．５ユニットのｉＰｒｏｏｆ  ＤＮＡポリメラーゼと共に５０μＬの反応体積で混合し、ＰＣＲ反応によって行った。ＰＣＲプログラムは次のように設定した。（１）９８℃、１０秒間、（２）５０℃、２０秒間、（３）７２℃、１５秒間、（４）（１）〜（３）を３５回反復。次に、１μＬのＰＣＲ反応生成物をｉＰｒｏｏｆ  ＤＮＡポリメラーゼの１×反応バッファー、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、０．２μＭのプライマー（Ｃ−ＡＢＤＮｄｅ−Ｆ）：５’−ＴＡＧＣＴＧＡＴＣＡＴＡＴＧＴＴＡＴＧＣＧＡＴＧＧＡＴＣＣＡＧＴＡＡＣＡＡＣ−３’（配列番号９１）、０．２μＭのプライマー（Ｃ−ＡＢＤＨｉｎｄ−Ｒ）：５’−ＧＡＣＣＣＴＡＡＡＡＧＣＴＴＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧ−３’（配列番号９２）及び０．５ユニットのｉＰｒｏｏｆ  ＤＮＡポリメラーゼと共に５０μＬの反応体積で新しいＰＣＲ反応に供した。ＰＣＲプログラムは次のように設定した。（１）９８℃、１０秒間、（２）５０℃、２０秒間、（３）７２℃、１５秒間、（４）（１）〜（３）を３５回反復、（５）７２℃、５分間。Ｃ−ＡＢＤ０９４遺伝子の構築は、表１に記載のプライマー１７〜２４（配列番号１７〜２４）の代わりに表１に記載のプライマー２５〜３２（配列番号２５〜３２）を使用したこと以外はＣ−ＡＢＤ遺伝子構築の手順と同様であった。
【０１５８】
ＰＣＲ断片Ｎ−ＡＢＤ、Ｎ−ＡＢＤ０９４、Ｃ−ＡＢＤ又はＣ−ＡＢＤ０９４を制限酵素ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同じ酵素で前もって消化したベクターｐＲＳＥＴ−ｌａｃに連結させ、大腸菌Ｔｏｐ１０に形質転換してプラスミドｐＮ−ＡＢＤ、ｐＮ−ＡＢＤ０９４、ｐＣ−ＡＢＤ及びｐＣ−ＡＢＤ０９４をそれぞれ生成した。プラスミドｐＲＳＥＴ−ｌａｃは、Ｔ７プロモーターをｐＧＥＭＴ−Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）のｌａｃプロモーターに置換することによってｐＲＳＥＴ−Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）から改変した。
【０１５９】
ヒトアルギナーゼＩ遺伝子のＮ−ＡＢＤ又はＮ−ＡＢＤ０９４融合物の構築は、０．２μＭのプライマーＨＡＲＧＢａｍ−Ｆ（５’−ＴＴＡＧＣＴＧＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＡＧＴＣＣＡＧＡＡＣＣＡＴＡＧＧ−３’）（配列番号９３）、０．２μＭプライマーＨＡＲＧＨｉｎｄ−Ｒ（５’−ＧＡＧＡＴＣＡＡＡＧＣＴＴＡＣＴＴＡＧＧＴＧＧＧＴＴＡＡＧＧＴＡＧＴＣ−３’）（配列番号９４）と共にｉＰｒｏｏｆ  ＤＮＡポリメラーゼの１×反応バッファー、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、１００ｎｇのヒトアルギナーゼＩｃＤＮＡ、及び０．５ユニットのｉＰｒｏｏｆ  ＤＮＡポリメラーゼを５０μＬの反応体積で混合して行った。ＰＣＲプログラムは次のように設定した。（１）９８℃、１０秒間、（２）５０℃、２０秒間、（３）７２℃、３０秒間、（４）（１）〜（３）を３５回反復、（５）７２℃、５分間。ＰＣＲ断片ヒトアルギナーゼＩ遺伝子を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同じ酵素で前もって消化したベクターｐＮ−ＡＢＤ又はｐＮ−ＡＢＤ０９４に連結させ、大腸菌ＥＲ２５６６（ＮＥＢ）に形質転換してプラスミドｐＮ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ及びｐＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇをそれぞれ生成した。
【０１６０】
ヒトアルギナーゼＩ遺伝子のＣ−ＡＢＤ又はＣ−ＡＢＤ０９４融合物の構築は、０．２μＭのプライマーＨＡＲＧＮｄｅ−Ｆ（５’−ＴＡＧＧＣＴＧＣＡＴＡＴＧＡＧＣＧＣＣＡＡＧＴＣＣＡＧＡＡＣＣＡＴＡＧ−３’）（配列番号９５）、０．２μＭのプライマーＨＡＲＧＢａｍ−Ｒ（５’−ＡＴＣＡＧＣＴＡＧＧＡＴＣＣＣＴＴＡＧＧＴＧＧＧＴＴＡＡＧＧＴＡＧＴＣＡＡＴＡＧＧ−３’）（配列番号９６）と共にｉＰｒｏｏｆ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏ−ｒａｄ社）の１×反応バッファー、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、１００ｎｇのヒトアルギナーゼＩｃＤＮＡ、及び０．５ユニットのｉＰｒｏｏｆ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏ−ｒａｄ社）を５０μＬの反応体積で混合して行った。ＰＣＲプログラムは次のように設定した。（１）９８℃、１０秒間、（２）５０℃、２０秒間、（３）７２℃、３０秒間、（４）（１）〜（３）を３５回反復、（５）７２℃、５分間。ＰＣＲ断片ヒトアルギナーゼＩ遺伝子を制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化し、同じ酵素で前もって消化したベクターｐＣ−ＡＢＤ又はｐＣ−ＡＢＤ０９４に連結させ、大腸菌ＥＲ２５６６（ＮＥＢ）に形質転換してプラスミドｐＣ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ及びｐＣ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇをそれぞれ生成した。
【０１６１】
Bacillus caldoveloxアルギナーゼ（ＢＣＡ）遺伝子のＮ−ＡＢＤ又はＮ−ＡＢＤ０９４融合物の構築は、０．２μＭのプライマーＢＣＡＢａｍ−Ｆ（５’−ＡＴＧＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＧＣＣＡＡＴＴＴＣＡＡＴＴＡＴＣＧ−３’）（配列番号９７）、０．２μＭのプライマーＢＣＡＨｉｎｄ−Ｒ（５’−ＴＣＡＧＣＣＴＡＡＡＧＣＴＴＡＣＡＴＧＡＧＴＴＴＴＴＣＡＣＣＡＡＡＣＡＡＣＧ−３’）（配列番号）と共にｉＰｒｏｏｆ  ＤＮＡポリメラーゼの１×反応バッファー、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、１００ｎｇのBacillus caldoveloxゲノムＤＮＡ、及び０．５ユニットのｉＰｒｏｏｆ  ＤＮＡポリメラーゼを５０μＬの反応体積で混合して行った。ＰＣＲプログラムは次のように設定した。（１）９８℃、１０秒間、（２）５０℃、２０秒間、（３）７２℃、３０秒間、（４）（１）〜（３）を３５回反復、（５）７２℃、５分間。ＰＣＲ断片Bacillus caldoveloxアルギナーゼ遺伝子を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同じ酵素で前もって消化したベクターｐＮ−ＡＢＤ又はｐＮ−ＡＢＤ０９４に連結させ、大腸菌ＥＲ２５６６（ＮＥＢ）に形質転換してプラスミドｐＮ−ＡＢＤ−ＢＣＡ及びｐＮ−ＡＢＤ０９４−ＢＣＡをそれぞれ生成した。
【０１６２】
Bacillus caldoveloxアルギナーゼ（ＢＣＡ）遺伝子のＣ−ＡＢＤ又はＣ−ＡＢＤ０９４融合物の構築は、０．２μＭのプライマーＢＣＡＮｄｅ−Ｆ（５’−ＡＴＧＣＴＡＧＣＣＡＴＡＴＧＡＡＧＣＣＡＡＴＴＴＣＡＡＴＴＡＴＣＧＧＧ−３’）（配列番号９９）、０．２μＭのプライマーＢＣＡＢａｍ−Ｒ（５’−ＴＣＡＧＣＴＡＡＧＧＡＴＣＣＣＡＴＧＡＧＴＴＴＴＴＣＡＣＣＡＡＡＣＡＡＣＧ−３’）（配列番号１００）と共にｉＰｒｏｏｆ  ＤＮＡポリメラーゼの１×反応バッファー、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、１００ｎｇのBacillus caldoveloxゲノムＤＮＡ、及び０．５ユニットのｉＰｒｏｏｆ  ＤＮＡポリメラーゼを５０μＬの反応体積で混合して行った。ＰＣＲプログラムは次のように設定した。（１）９８℃、１０秒間、（２）５０℃、２０秒間、（３）７２℃、３０秒間、（４）（１）〜（３）を３５回反復、（５）７２℃、５分間。ＰＣＲ断片Bacillus caldoveloxアルギナーゼ遺伝子を制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化し、同じ酵素で前もって消化したベクターｐＣ−ＡＢＤ又はｐＣ−ＡＢＤ０９４に連結させ、大腸菌ＥＲ２５６６（ＮＥＢ）に形質転換してプラスミドｐＣ−ＡＢＤ−ＢＣＡ及びｐＣ−ＡＢＤ０９４−ＢＣＡをそれぞれ生成した。
【０１６３】
【表１−１】
2021525749.tif 000002
【０１６４】
【表１−２】
2021525749.tif 000003
【０１６５】
【表１−３】
2021525749.tif 000004
【実施例２】
【０１６６】
発酵によるＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ又はＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ融合タンパク質の発現と精製
Ｎ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）融合タンパク質を生成するため、ｐＮ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇで形質転換した大腸菌ＥＲ２５６６を５０ｍＬの種培地（１．５ｇの酵母エキス、０．２５ｇのＮａＣｌ及び５ｍｇのアンピシリン）中、３０℃でオービタルシェーカーにて２５０ｒｐｍで１６時間増殖させた。次に、種培養物を１Ｌの発酵培地（１０ｇの酵母エキス、１６ｇのトリプトン、６．７ｇのＮａ２ＨＰＯ４．７Ｈ２Ｏ、３．４１ｇのＫＨ２ＰＯ４、２．４１ｇのＮＨ４Ｃｌ、０．６７ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｇのグリセロール、１ｇのグルコース、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、１ｍＭのＣａＣｌ２及び０．１ｇのアンピシリン）に移し、１Ｌ／分で空気を供給して最低速度５００ｒｐｍにて２８℃で増殖させ、ｐＨを７．４に維持した。攪拌速度を自動的に上昇させて最小溶存酸素ｐＯ２を少なくとも２０％に維持した。培養物の６００ｎｍ波長での吸光度が光学濃度（ＯＤ）で１５に達した際に、５００ｍＬの培地（１０ｇの酵母エキス、１６ｇのトリプトン、２．４１ｇのＮＨ４Ｃｌ、０．６７ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｇのグリセロール）を３１．２５ｍＬ／時の速度で１６時間に亘って連続供給した。遠心分離によって細胞を回収し、Ｎｉ−ＩＤＡセファロースカラムによってタンパク質を精製した。通常、１ｇ／Ｌを超える精製タンパク質の培養物を得た。次に、ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４法［Aida Y. and Pabst M.J. (1990) Journal of Immunological Methods. 132: 191-195、本参照をもって本明細書の一部を構成するものとする］によって精製タンパク質から内毒素を除去した。融合タンパク質Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）、Ｃ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号５１）、Ｃ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５２）、Ｎ−ＡＢＤ−ＢＣＡ（配列番号５３）、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ＢＣＡ（配列番号５４）、Ｃ−ＡＢＤ−ＢＣＡ（配列番号５５）及びＣ−ＡＢＤ０９４−ＢＣＡ（配列番号５６）を生成する手順は、細胞をそれに応じて各プラスミドで形質転換したこと以外はＮ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）の生成手順と同様であった。図１及び表２は、上述のアルブミン結合ドメイン組換えヒトアルギナーゼ（ｒｈＡｒｇ）、即ち、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）のタンパク質精製の例を示す。
【０１６７】
【表２】
2021525749.tif 000005
【０１６８】
図１２は調製の結果を示す。７０９ｍｇのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）が得られ、比活性は２０５Ｕ／ｍｇ、タンパク質濃度は１０．５ｍｇ／ｍＬであった。
【実施例３】
【０１６９】
Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ遺伝子（配列番号３８）の構築及びクローニング
Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号３８）遺伝子は、Ｎ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ遺伝子（配列番号３７）に基づく重複伸長ＰＣＲによって合成した。２種のＰＣＲ反応を行った。先ず、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ遺伝子（配列番号３８）を有するｐＲＳＥＴ／ｌａｃプラスミドを使用した。ＡＢＤ０９４−０Ｆ（配列番号５７）とＨｕＡｒｇＨｉｎＢａｍ−Ｒ（配列番号６４）による最初のＰＣＲ反応でｒｈＡｒｇ領域を単離し、増幅した。ＰＣＲ生成物の単離と精製は、０．７％アガロースゲル（Ｂｉｏｒａｄ社）（１００Ｖで３０分間）とゲルバンド精製キット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）によって行った。次に、２回目のＰＣＲ反応によってＡＢＤ０９４をＰＣＲ生成物に添加した。ＡＢＤ０９４−０Ｆ、ＡＢＤ０９４−１Ｆ、ＡＢＤ０９４−２Ｆ、ＡＢＤ０９４−３Ｆ、ＡＢＤ０９４−４Ｆ及びＡＢＤ０９４−５Ｆ（配列番号５７〜６２）を含む２０倍希釈プライマー混合物を最初に滅菌ミリＱ水で調製した。プライマー混合物とａｂｄＮｄｅ−Ｆは互いに重複している。２回目のＰＣＲ反応は、ａｂｄＮｄｅ−Ｆ（配列番号６３）、ＨｕＡｒｇＨｉｎＢａｍ−Ｒ（配列番号６４）及び２０倍希釈プライマー混合物によって行った。ＰＣＲ生成物を上述と同じ方法で単離及び精製した。プライマーの配列を表３に示す。プライマーの結合位置を図２Ａに示す。得られたＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ融合遺伝子（配列番号３８）のＤＮＡ配列とそのタンパク質配列を図２Ｂに示す。
【０１７０】
【表３】
2021525749.tif 000006
【０１７１】
ＰＣＲ生成物とｐＲＳＥＴ／ｌａｃベクターをＢａｍＨＩ−ＨＦとＮｄｅＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社）によって３７℃で２時間二重消化した。インサートとベクターの両方の単離と精製は、０．７％アガロースゲル（Ｂｉｏｒａｄ社）（１００Ｖで３０分間）とゲルバンド精製キット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）によって行った。次に、インサートとベクターをＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社）によって室温で２０分間連結させた。コンピテント細胞を組換えＤＮＡで形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレートに広げた。ＬＢプレートを３７℃で一晩インキュベートした。８個のコロニーを選択し、ａｂｄＮｄｅ−ＦとＨｕＡｒｇＨｉｎＢａｍ−Ｒを用いたＰＣＲによってＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇの存在を確認した。ＰＣＲで陽性の結果が得られたコロニーを、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含む５ｍＬの２×ＴＹ中、３０℃で一晩更に増殖させた。細菌ブロスを１．７ｍＬの微量遠心機チューブ中、１６１００×ｇで１分間遠心分離した。細菌ペレットを可溶化バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｎＣｌ２、ｐＨ７．４）に再懸濁させ、液体窒素中で凍結と融解を繰り返すことにより破壊した。細胞可溶化物を遠心分離してタンパク質溶液を得た。ＤＡＭＯによるアルギナーゼ活性アッセイを行ってアルギナーゼの存在を試験した。
【実施例４】
【０１７２】
ＢＣＡ発現ベクターの構築
ＢＣＡ（Ｐｕｂｍｅｄ受入番号：Ｕ４８２２６）をコードする遺伝子はＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社（そこで新規に合成されｐＵＣ５７クローニングベクターに挿入）から入手した。単一のシステイン残基を部位特異的変異誘発によって導入し、６ヒスチジンタグをＣ末端に付加してタンパク質精製プロセスを容易にした。遺伝子操作したＢＣＡ遺伝子をｐＥＴ−３ａベクターにサブクローニングし、ＢＣＡ発現用ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞に形質転換した。ＢＣＡ（ＰＤＢ：２ＣＥＶ）の結晶構造はタンパク質データバンクから検索することができる。遺伝子操作したＢＣＡ（Ｓ１６１Ｃ）−Ｈｉｓ（配列番号８９）のタンパク質配列を図３に示す。
【実施例５】
【０１７３】
ＢＣＡ−ＡＢＤ発現ベクターの構築
重複ＰＣＲによってアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）をコードする一対のプライマーを構築し、増幅した。即ち、２００ｎｇのプライマーを鋳型として使用し、１ユニットのｉＰｒｏｏｆ高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）で増幅した。プライマーを９８℃で３０秒間インキュベートし、９８℃で１０秒間の熱変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で１５秒間の伸長を含む１５サイクルの増幅を行った。
【０１７４】
５’−センス−ＡＢＤ
ＧＣＧＣＡＧＣＡＴＧＡＴＧＡＡＧＣＣＧＴＧＧＡＴＧＣＧＡＡＣＡＧＣＴＴＡＧＣＴＧＡＡＧＣＴＡＡＡＧＴＣＴＴＡＧＣＴＡＡＣＡＧＡＧＡＡＣＴＴＧＡＣＡＡＡＴＡＴＧＧＡＧＴＡＡＧＴＧＡＣＴＡＴＴＡＣＡＡＧＡＡＣＣ（配列番号７７）
５’−アンチセンス−ＡＢＤ
ＴＴＡＡＧＧＴＡＡＴＧＣＡＧＣＴＡＡＡＡＴＴＴＣＡＴＣＴＡＴＣＡＧＴＧＣＴＴＴＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＡＣＡＧＴＴＴＴＧＧＣＡＴＴＧＴＴＧＡＴＴＡＧＧＴＴＣＴＴＧＴＡＡＴＡＧＴＣＡＣＴＴＡＣＴＣＣＡＴ（配列番号７８）
【０１７５】
この一対のプライマーによって構築したＡＢＤコード遺伝子を２種の異なるプライマーセットによって増幅し、ＢＣＡ−６×Ｈｉｓ−ＡＢＤ（ＢＨＡとも称する）（配列番号７５）とＢＣＡ−ＡＢＤ−６×Ｈｉｓ（ＢＡＨとも称する）（配列番号７６）を構築した。ＢＨＡを構築するため、ＡＢＤを先ず以下の一対のプライマーで増幅したが、順方向プライマーを６−ヒスチジンタグを介したＢＣＡとの重複ＰＣＲ用に設計し、逆方向プライマーを使用したｐＥＴ−３ａベクターとの連結用にＢａｍＨＩ制限部位と終止コドンを導入した。
【０１７６】
ＡＢＤクローニング用順方向プライマー：
５’−ＧＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＧＣＧＣＡＧＣＡＴＧＡＴＧＡＡＧ−３’（配列番号７９）
ＡＢＤクローニング用逆方向プライマー：
５’−ｃｇＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＧＧＴＡＡＴＧＣＡＧＣＴＡＡＡＡＴＴＴＣＡＴＣＴＡＴ−３’（配列番号８０）
【０１７７】
ＡＢＤの増幅によって得たＰＣＲ生成物を１．５％アガロースゲル電気泳動に供し、ＰＣＲ生成物を精製した。一方、余分な変異（Ｖ２０Ｐ）を有する遺伝子操作されたＢＣＡを、終止コドンを除去した以下の一対のプライマーを使用してクローン化した。
【０１７８】
ＢＣＡクローニング用順方向プライマー：
５’−ｇｇａａｔｔｃｃＣＡＴＡＴＧＡＡＧＣＣＡＡＴＴＴＣＡＡＴＴＡＴＣＧ−３'（配列番号８１）
ＢＣＡクローニング用逆方向プライマー：
５’−ＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＣＡ−３’（配列番号８２）
【０１７９】
上述のプライマーによって増幅したＢＣＡを１％アガロースゲル電気泳動に供し、ＰＣＲ生成物を精製した。上述のＢＣＡとＡＢＤのＰＣＲ生成物を重複ＰＣＲによって繋留した。同様に、２００ｎｇのＢＣＡとＡＢＤを鋳型として使用し、１ユニットのｉＰｒｏｏｆ高忠実度ＤＮＡポリメラーゼで増幅した。ＢＣＡとＡＢＤを９８℃で３０秒間インキュベートし、９８℃で１０秒間の熱変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で３０秒間の伸長を含む１５サイクルの増幅を行った。重複ＰＣＲによって得た生成物を鋳型として使用し、以下の一対のプライマーを使用して更なる増幅を行った。
【０１８０】
ＢＨＡクローニング用順方向プライマー：
５’−ｇｇａａｔｔｃｃＣＡＴＡＴＧＡＡＧＣＣＡＡＴＴＴＣＡＡＴＴＡＴＣＧ−３’（配列番号８３）
ＢＨＡクローニング用逆方向プライマー：
５’−ｃｇＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＧＧＴＡＡＴＧＣＡＧＣＴＡＡＡＡＴＴＴＣＡＴＣＴＡＴ−３’（配列番号８４）
【０１８１】
ＰＣＲ生成物を１％アガロースゲル電気泳動に供し、ＢＨＡに相当するバンドをゲルから切除して精製した。
【０１８２】
ＢＡＨを構築するため、ＡＢＤを先ず以下の一対のプライマーで増幅したが、順方向プライマーをＢＣＡとの直接重複ＰＣＲ用に設計し、逆方向プライマーを介してＢａｍＨＩ制限部位、６−ヒスチジンタグ及び終止コドンを導入した。
【０１８３】
ＡＢＤクローニング用順方向プライマー：
５’−ＣＧＴＴＧＴＴＴＧＧＴＧＡＡＡＡＡＣＴＣＡＴＧＧＣＧＣＡＧＣＡＴＧＡＴＧＡＡＧ−３’（配列番号８５）
ＡＢＤクローニング用逆方向プライマー：
５’−ｃｇＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＧＧＴＡＡＴＧＣＡＧＣＴＡＡＡＡＴＴＴＣＡＴＣＴＡＴ−３’（配列番号８６）
【０１８４】
ＡＢＤの増幅によって得たＰＣＲ生成物を１．５％アガロースゲル電気泳動に供し、ＰＣＲ生成物を精製した。余分な変異（Ｖ２０Ｐ）を有する遺伝子操作されたＢＣＡを、終止コドンと６−ヒスチジンタグを除去した以下の一対のプライマーを使用してクローン化した。
【０１８５】
ＢＣＡクローニング用順方向プライマー：
５’−ｇｇａａｔｔｃｃＣＡＴＡＴＧＡＡＧＣＣＡＡＴＴＴＣＡＡＴＴＡＴＣＧ−３’（配列番号８１）
ＢＣＡクローニング用逆方向プライマー：
５’−ＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＣＡ−３’（配列番号８２）
【０１８６】
上述のプライマーによって増幅したＢＣＡを１％アガロースゲル電気泳動に供し、ＰＣＲ生成物を精製した。上述のＢＣＡとＡＢＤのＰＣＲ生成物を重複ＰＣＲによって繋留した。同様に、２００ｎｇのＢＣＡとＡＢＤを鋳型として使用し、１ユニットのｉＰｒｏｏｆ高忠実度ＤＮＡポリメラーゼで増幅した。ＢＣＡとＡＢＤを９８℃で３０秒間インキュベートし、９８℃で１０秒間の熱変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で３０秒間の伸長を含む１５サイクルの増幅を行った。重複ＰＣＲによって得た生成物を鋳型として使用し、以下の一対のプライマーを使用して更なる増幅を行った。
【０１８７】
ＢＡＨクローニング用順方向プライマー：
５’−ｇｇａａｔｔｃｃＣＡＴＡＴＧＡＡＧＣＣＡＡＴＴＴＣＡＡＴＴＡＴＣＧ−３’（配列番号８７）
ＢＡＨクローニング用逆方向プライマー：
５’−ｃｇＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＧＧＴＡＡＴＧＣＡＧＣＴＡＡＡＡＴＴＴＣＡＴＣＴＡＴ−３’（配列番号８８）
【０１８８】
ＰＣＲ生成物を１％アガロースゲル電気泳動に供し、ＢＨＡに相当するバンドをゲルから切除して精製した。ＢＨＡとＢＡＨをコードするＰＣＲ生成物とｐＥＴ−３ａベクターをＮｄｅＩとＢａｍＨＩで二重消化した。ＢＨＡとＢＡＨをｐＥＴ−３ａベクターに連結させ、ＴＯＰ１０コンピテント大腸菌細胞に形質転換した。ＢＨＡとＢＡＨのヌクレオチド配列はＤＮＡ配列決定によって確認した。ＢＨＡ又はＢＡＨインサートを含むｐＥＴ−３ａベクターをタンパク質発現用ＢＬ２１（ＤＥ３）ベクターに形質転換した。
【実施例６】
【０１８９】
ＢＨＡとＢＡＨのタンパク質構築物
この研究で使用したＢＣＡのタンパク質配列は、Ｃ末端の６×ＨｉｓタグとＳ１６１Ｃ変異を含む以外は、Bewley et al.（Structure 7, 435-448, 1999）によって使用されたもの（ＰＤＢ  ＩＤ：２ＣＥＶ、本参照をもって本明細書の一部を構成するものとする）と同様である。ＢＣＡ−６×Ｈｉｓ−ＡＢＤ（ＢＨＡ）およびＢＣＡ−ＡＢＤ−６×Ｈｉｓ（ＢＡＨ）の両方の構築物を設計したが、大腸菌細胞ストックはＢＨＡおよびＢＡＨを発現することができる。ＢＨＡおよびＢＡＨの両方において、ＢＣＡ部分は２０位のバリン残基がプロリンに変異したＢＣＡの変異型（Ｖ２０Ｐ）であり、ＡＢＤ部分はリンカー配列（ＡＱＨＤＥＡＶＤＡＮＳ）を有するＡＢＤの野生型である（Jonsson et al., 2008, Protein Eng. Des. Sel. 21, 515-527）。ＡＢＤ部分は融合タンパク質のまさしくＣ末端に位置する（ＢＨＡの場合）か、ＢＣＡと６×ヒスチジンタグの間に融合されている（ＢＡＨの場合）。この研究で使用したＢＣＡ、ＢＨＡ及びＢＡＨのタンパク質配列のアラインメントを図４に示す。
【０１９０】
ＢＣＡ（野生型）アミノ酸配列（ＰＤＢ  ＩＤ：２ＣＥＶ）：
ＭＫＰＩＳＩＩＧＶＰＭＤＬＧＱＴＲＲＧＶＤＭＧＰＳＡＭＲＹＡＧＶＩＥＲＬＥＲＬＨＹＤＩＥＤＬＧＤＩＰＩＧＫＡＥＲＬＨＥＱＧＤＳＲＬＲＮＬＫＡＶＡＥＡＮＥＫＬＡＡＡＶＤＱＶＶＱＲＧＲＦＰＬＶＬＧＧＤＨＳＩＡＩＧＴＬＡＧＶＡＫＨＹＥＲＬＧＶＩＷＹＤＡＨＧＤＶＮＴＡＥＴＳＰＳＧＮＩＨＧＭＰＬＡＡＳＬＧＦＧＨＰＡＬＴＱＩＧＧＹＳＰＫＩＫＰＥＨＶＶＬＩＧＶＲＳＬＤＥＧＥＫＫＦＩＲＥＫＧＩＫＩＹＴＭＨＥＶＤＲＬＧＭＴＲＶＭＥＥＴＩＡＹＬＫＥＲＴＤＧＶＨＬＳＬＤＬＤＧＬＤＰＳＤＡＰＧＶＧＴＰＶＩＧＧＬＴＹＲＥＳＨＬＡＭＥＭＬＡＥＡＱＩＩＴＳＡＥＦＶＥＶＮＰＩＬＤＥＲＮＫＴＡＳＶＡＶＡＬＭＧＳＬＦＧＥＫＬＭ（配列番号７０）
【０１９１】
ＢＣＡ（Ｓ１６１Ｃ）−Ｈｉｓアミノ酸配列：
ＭＫＰＩＳＩＩＧＶＰＭＤＬＧＱＴＲＲＧＶＤＭＧＰＳＡＭＲＹＡＧＶＩＥＲＬＥＲＬＨＹＤＩＥＤＬＧＤＩＰＩＧＫＡＥＲＬＨＥＱＧＤＳＲＬＲＮＬＫＡＶＡＥＡＮＥＫＬＡＡＡＶＤＱＶＶＱＲＧＲＦＰＬＶＬＧＧＤＨＳＩＡＩＧＴＬＡＧＶＡＫＨＹＥＲＬＧＶＩＷＹＤＡＨＧＤＶＮＴＡＥＴＳＰＳＧＮＩＨＧＭＰＬＡＡＳＬＧＦＧＨＰＡＬＴＱＩＧＧＹＣＰＫＩＫＰＥＨＶＶＬＩＧＶＲＳＬＤＥＧＥＫＫＦＩＲＥＫＧＩＫＩＹＴＭＨＥＶＤＲＬＧＭＴＲＶＭＥＥＴＩＡＹＬＫＥＲＴＤＧＶＨＬＳＬＤＬＤＧＬＤＰＳＤＡＰＧＶＧＴＰＶＩＧＧＬＴＹＲＥＳＨＬＡＭＥＭＬＡＥＡＱＩＩＴＳＡＥＦＶＥＶＮＰＩＬＤＥＲＮＫＴＡＳＶＡＶＡＬＭＧＳＬＦＧＥＫＬＭＨＨＨＨＨＨ（配列番号７１）
【０１９２】
ＢＨＡアミノ酸配列：
ＭＫＰＩＳＩＩＧＶＰＭＤＬＧＱＴＲＲＧＰＤＭＧＰＳＡＭＲＹＡＧＶＩＥＲＬＥＲＬＨＹＤＩＥＤＬＧＤＩＰＩＧＫＡＥＲＬＨＥＱＧＤＳＲＬＲＮＬＫＡＶＡＥＡＮＥＫＬＡＡＡＶＤＱＶＶＱＲＧＲＦＰＬＶＬＧＧＤＨＳＩＡＩＧＴＬＡＧＶＡＫＨＹＥＲＬＧＶＩＷＹＤＡＨＧＤＶＮＴＡＥＴＳＰＳＧＮＩＨＧＭＰＬＡＡＳＬＧＦＧＨＰＡＬＴＱＩＧＧＹＣＰＫＩＫＰＥＨＶＶＬＩＧＶＲＳＬＤＥＧＥＫＫＦＩＲＥＫＧＩＫＩＹＴＭＨＥＶＤＲＬＧＭＴＲＶＭＥＥＴＩＡＹＬＫＥＲＴＤＧＶＨＬＳＬＤＬＤＧＬＤＰＳＤＡＰＧＶＧＴＰＶＩＧＧＬＴＹＲＥＳＨＬＡＭＥＭＬＡＥＡＱＩＩＴＳＡＥＦＶＥＶＮＰＩＬＤＥＲＮＫＴＡＳＶＡＶＡＬＭＧＳＬＦＧＥＫＬＭＨＨＨＨＨＨＡＱＨＤＥＡＶＤＡＮＳＬＡＥＡＫＶＬＡＮＲＥＬＤＫＹＧＶＳＤＹＹＫＮＬＩＮＮＡＫＴＶＥＧＶＫＡＬＩＤＥＩＬＡＡＬＰ（配列番号７５）
【０１９３】
ＢＡＨアミノ酸配列：
ＭＫＰＩＳＩＩＧＶＰＭＤＬＧＱＴＲＲＧＰＤＭＧＰＳＡＭＲＹＡＧＶＩＥＲＬＥＲＬＨＹＤＩＥＤＬＧＤＩＰＩＧＫＡＥＲＬＨＥＱＧＤＳＲＬＲＮＬＫＡＶＡＥＡＮＥＫＬＡＡＡＶＤＱＶＶＱＲＧＲＦＰＬＶＬＧＧＤＨＳＩＡＩＧＴＬＡＧＶＡＫＨＹＥＲＬＧＶＩＷＹＤＡＨＧＤＶＮＴＡＥＴＳＰＳＧＮＩＨＧＭＰＬＡＡＳＬＧＦＧＨＰＡＬＴＱＩＧＧＹＣＰＫＩＫＰＥＨＶＶＬＩＧＶＲＳＬＤＥＧＥＫＫＦＩＲＥＫＧＩＫＩＹＴＭＨＥＶＤＲＬＧＭＴＲＶＭＥＥＴＩＡＹＬＫＥＲＴＤＧＶＨＬＳＬＤＬＤＧＬＤＰＳＤＡＰＧＶＧＴＰＶＩＧＧＬＴＹＲＥＳＨＬＡＭＥＭＬＡＥＡＱＩＩＴＳＡＥＦＶＥＶＮＰＩＬＤＥＲＮＫＴＡＳＶＡＶＡＬＭＧＳＬＦＧＥＫＬＭＡＱＨＤＥＡＶＤＡＮＳＬＡＥＡＫＶＬＡＮＲＥＬＤＫＹＧＶＳＤＹＹＫＮＬＩＮＮＡＫＴＶＥＧＶＫＡＬＩＤＥＩＬＡＡＬＰＨＨＨＨＨＨ（配列番号７６）
【実施例７】
【０１９４】
ＢＨＡとＢＡＨの生成
ＢＨＡとＢＡＨを発現する大腸菌細胞ストックを使用した。種培養物を調製するため、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを補充した１０ｍＬのＬＢ培地に少量の大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）グリセロールストックを播種した。種培養物を７００ｒｐｍで振盪させながら３７℃で一晩（約１６時間）増殖させた。次に、一晩種培養物を２．５ｍＬ使用し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む２５０ｍＬのＬＢ培地に播種した。接種した細胞を２８０ｒｐｍで２〜４時間振盪させながら３７℃で増殖させ、これを波長６００ｎｍでの光学濃度（ＯＤ６００）が０．６〜０．８になるまで行った。次に、ＩＰＴＧ（０．２ｍＭ）を培地に添加し、標的タンパク質の過剰発現を誘発した。細胞を更に４時間増殖させ、４５００ｒｐｍで遠心分離を行って回収した。
【０１９５】
ニッケルアフィニティークロマトグラフィーによるタンパク質精製
大腸菌細胞ペレットを５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）を含むバッファーに再懸濁させ、超音波処理により破砕した。次に、遠心分離を１００００ｒｐｍで４０分間行って細胞片を除去した。Ｎｉ２＋を充填し、ＡＫＴＡピュリファイアを使用してバッファーＡ（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化させた５ｍＬのＨｉＴｒａｐキレーティングカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に上清を添加した。０〜０．５Ｍのイミダゾール勾配を用いてタンパク質を溶出させたが、これはバッファーＡとバッファーＢを各種比率で組み合わせて行った（バッファーＡ中０．５Ｍイミダゾール）。１２％ポリアクリルアミドゲルを使用したドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって画分を分析し、標的タンパク質を含むものをプールした。プールした画分を濃縮し、遠心濾過装置（Ａｍｉｃｏｎ社）又は接線流濾過（ＴＦＦ）装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を使用して、濃縮且つプールした画分のバッファーを２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）と置換した。ＢＨＡとＢＡＨの場合、膜のカットオフ値は３００００ＭＷであった。次に、残余分を所望の濃度に希釈し、０．２μｍシリンジフィルターで滅菌濾過し、４℃で保存した。
【０１９６】
ＢＨＡ精製のクロマトグラムによれば、イミダゾールの濃度を上昇させた溶出プロセス中に３個のピークが観察される（図５Ａ）。最初の２個のピークは融合し、イミダゾール濃度が約０．１３Ｍに達した際に発生する３番目のピークがそれに続く（図５Ａ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析すると、３番目のピークは主に約４０ｋＤａの標的タンパク質で構成されていることが分かる（図５Ｂ、レーンＦ４〜Ｆ８）。アミノ酸配列に基づいて計算したＢＨＡモノマーの分子量は３９．４４ｋＤａであるため、この標的タンパク質はＢＨＡである可能性が高い。従って、ＢＨＡの発現と精製に成功したことが示唆される。比較的純粋なＢＨＡを含む画分を共にプールして更なるプロセスに備えた。
【０１９７】
ＢＡＨ精製のクロマトグラムによれば、イミダゾールの濃度を上昇させた溶出プロセス中に３個のピークが観察される（図５Ｃ）。２番目と３番目のピークは融合し、イミダゾール濃度が約０．１８Ｍに達した際に発生する（図５Ｃ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析すると、この融合したピークは主に、ＢＡＨである可能性が高い約４０ｋＤａの標的タンパク質（図５Ｄ、レーンＦ６〜Ｆ１４）で構成されることが分かる。約０．１３Ｍのイミダゾールで溶出するＢＨＡと比較して、ＢＡＨはニッケルアフィニティーカラムにより強く結合すると思われる。これは恐らく、ＡＢＤドメインをＢＣＡと６×ヒスチジンタグの間に挿入すると６×ヒスチジンタグがより露出するように作用し、ＢＡＨがＢＨＡよりも効果的にカラム内のニッケルイオンと相互作用できるためである。比較的純粋なＢＡＨを含む画分を共にプールし、遠心濾過装置の代わりに接線流濾過（ＴＦＦ）装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を使用してバッファーを交換した。
【０１９８】
酵素活性の１単位は、標準的なアッセイ条件下で１分間当たり１μｍｏｌの尿素の生成を触媒する酵素（ＢＣＡ、ＢＨＡ又はＢＡＨ）の量で定義される。酵素の比活性はタンパク質１ｍｇ当たりの活性単位で表す。標準的なＤＡＭＯアッセイ条件下（３７℃、ｐＨ７．４）では、新たに精製したＢＨＡ（配列番号７５）の比活性値は２２０．６±１５．８Ｕ／ｍｇであり、これはＢＣＡ（Ｓ１６１Ｃ）−Ｈｉｓ（配列番号８９）の値（２４３．３０Ｕ／ｍｇ）に近い。
【０１９９】
ＢＣＡポリペプチドとＡＢＤポリペプチドを含む融合タンパク質の場合、振盪フラスコ培養物１Ｌ当たり約２９０ｍｇのタンパク質という非常に高いタンパク質収量がＢＨＡ（配列番号７５）の場合に得られた。ＡＢＤ融合タンパク質の収量は使用する発現系に大きく依存する。ｓＣＲ１と融合したＡＢＤの収量は、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養物１ｍＬ当たり２４時間毎に０．４〜１．１μｇの範囲であることが報告されている（Makrides et al., 1996, J. Pharmacol. Exp. Ther. 277, 534-542）。どのＨＥＫ２９３細胞培養物１Ｌからも約２〜１５ｍｇの一本鎖二重特異性抗体−ＡＢＤ融合タンパク質を得ることができる（Hopp et al., 2010, Protein Eng. Des. Sel. 23, 827-834; Stork et al., 2007, Protein Eng. Des. Sel. 20, 569-576）。大腸菌ＢＬ２１宿主で発現したＡＢＤ−ＴｏｌＡ融合タンパク質の収量は２０ｍｇ／Ｌ（ＬＢブロス培地）である（Ahmad et al., 2012, Proteins 80, 774-789）。比較すると、ＢＨＡの収量は遥かに高い。我々の結果から、ＢＨＡ（配列番号７５）の生成が簡単であり、費用対効果が高いことが分かった。
【実施例８】
【０２００】
ＢＣＡ（Ｓ１６１Ｃ）−Ｈｉｓ（配列番号８９）の発現と精製
プラスミドｐＥＴ−３ａ−ＢＣＡ（Ｓ１６１Ｃ）−Ｈｉｓで形質転換した大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳのオーバーナイト種培養物を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む５ｍＬのＬＢ培地で調製し、振盪フラスコ中、２８０ｒｐｍで振盪させながら３７℃で１６時間増殖させた。１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む２５０ｍＬのＬＢ培地の場合、２．５ｍＬの一晩培養物を添加し、光学濃度（ＯＤ６００）が６００ｎｍで０．８〜０．９に達するまで２８０ｒｐｍで振盪させながら３７℃で培養した。イソプロピルβ−Ｄ−チオ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度が０．２ｍＭとなるように添加した。誘発を４時間行った後、１２０００×ｇで２０分間、４℃で遠心分離して細胞を回収した。細胞ペレットは、超音波処理によって破砕して精製まで進めるか、又は必要になるまで−２０℃で保存することができた。１０ｍＭのＭｎＣｌ２を含む２０ｍＬの可溶化バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に細胞ペレットを懸濁させた。先ず、４０％の振幅で３０秒毎にパルスを発生させた超音波処理を氷上で１０分間行って細胞を破砕した。１２０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離を行って細胞片を除去した。上清を７０℃で１５分間インキュベートし、熱処理工程中に形成した沈殿物を遠心分離によって除去した。可溶性画分を０．２２μｍフィルターで濾過した後、５ｍＬのＨｉｓＴｒａｐキレーティングＨＰカラムにロードした。試料ローディング中にフロースルー画分を回収し、未結合のタンパク質を５カラム体積（ＣＶ）の開始バッファーによって、又はベースラインが安定するまで洗い流した。イミダゾール（開始バッファー中の０．５Ｍイミダゾール）を使用した競合勾配溶出によってカラムに結合した標的タンパク質を溶出させた。カットオフ値が１０ｋＤａＭＷのＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心濾過ユニットを使用し、製造元の指示に従って、ｐＨ７．４の２０ｍＭリン酸ナトリウムでバッファー交換する標的画分を特定して合一してプールした。試料を滅菌条件下で０．２２μｍフィルターによって濾過し、必要になるまで４℃で保存した。
【実施例９】
【０２０１】
流加バッチ発酵からのＢＣＡ（Ｓ１６１Ｃ）−Ｈｉｓ（配列番号８９）の精製
５Ｌのバイオリアクター内でのＢＣＡ（Ｓ１６１Ｃ）−Ｈｉｓ発現大腸菌細胞の発酵によって湿細胞重量が２４８．８６ｇとなった。デオキシリボヌクレアーゼとリボヌクレアーゼを含む可溶化バッファーに細胞ペレットを再懸濁させ、均質化によって放出された大量のＤＮＡとＲＮＡをこれらの酵素によって分解し、細胞可溶化物の粘度を低下させた。細胞可溶化物をホモジナイザーを３回通過させた後、３７℃で１５分間インキュベートして粘度を更に低下させ、続いて遠心分離を行って可溶性画分を得た。精製の最初の工程では、熱処理を７０℃で１５分間行って非標的不純物を除去し、熱不安定性のタンパク質を沈殿させ、熱安定性ＢＣＡ（Ｓ１６１Ｃ）−Ｈｉｓ（配列番号８９）を遠心分離によって回収した。
【０２０２】
ＸＫ５０カラムに充填された総容積が１９６ｍＬのＮｉアフィニティーカラムによって標的タンパク質を含む可溶性画分を更に精製した。即ち、４セグメント溶出プログラムを使用してＢＣＡ（Ｓ１６１Ｃ）−Ｈｉｓ（配列番号８９）をＮｉアフィニティーカラムから溶出させた。溶出バッファーの０〜３０％の第１の溶出勾配は、カラムに非特異的に結合したタンパク質を除去することを目的とした。第２のセグメントを３０％に維持し、これによって非特異的な結合タンパク質を完全に溶出させた。溶出バッファーの濃度を３０％から７０％に上げることによって第３のセグメントでは標的タンパク質を溶出させた。７０〜１００％の溶出バッファーである第４のセグメントでは、カラムに依然として結合している残りのタンパク質を溶出させた。ＵＶ波長２８０ｎｍに吸光度を有する画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、標的タンパク質を含むＥ１〜Ａ’５の２４個の画分（各５０ｍＬ）を共にプールした（図６Ａ及び６Ｂ）。ＢＣＡ（野生型）（配列番号７０）の六量体構造の理解に基づき、高濃度のイミダゾールを含むプールした画分を接線流濾過（ＴＦＦ）システムによって脱塩し、３０ｋＤａのＮＭＷＣの膜をＴＦＦに使用した。精製したＢＣＡ（Ｓ１６１Ｃ）−Ｈｉｓ（配列番号８９）をＰＢＳバッファー中に保持し、滅菌条件下で０．２μｍフィルターによって濾過し、使用するまで４℃で保存した。２工程のパイロット規模精製によって約１０９６ｍｇのＢＣＡ（Ｓ１６１Ｃ）−Ｈｉｓ（配列番号８９）タンパク質が得たが、比活性は２６４Ｕ／ｍｇであることが確認された。
【実施例１０】
【０２０３】
アルギナーゼ酵素活性の確認
酵素反応における生成物である尿素の量を決定するジアセチルモノオキシム（ＤＡＭＯ）を使用した直接比色法によって、ＢＣＡ（Ｓ１６１Ｃ）−Ｈｉｓ（配列番号８９）の活性をアッセイした。即ち、０．３ｍＬのＢＣＡ溶液と０．１５ｍＬの水及び７２０ｍＭのアルギニン基質（ｐＨ７．４）の工程希釈液を３７℃で１０分間、別々にプレインキュベートした。０．３ｍＬのアルギニン基質をプレインキュベートした酵素溶液に添加して酵素反応を行った。反応混合物を３７℃で正確に５分間インキュベートし、反応停止試薬［５０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）］を添加して反応を停止させた。試料ブランクを同様の方法で調製したが、同量の酵素溶液をＴＣＡ溶液の後に添加した。
【０２０４】
上述の反応で形成された尿素は、世界保健機関（ＷＨＯ）によって記載されたＤＡＭＯ直接比色法を用いて定量化した。このプロトコルは、血中尿素濃度を測定するための標準操作手順（ＳＯＰ）としてＷＨＯによって採用されている。ＳＯＰに従って数種の試薬を調製し、混合酸試薬の調製は、１００ｍＬの濃硫酸を４００ｍＬの蒸留水にゆっくりと添加した後、０．３ｍＬの酸試薬原液（１５ｍＬの蒸留水に０．５ｇの塩化第二鉄六水和物を溶解し、濃リン酸によって２５ｍＬとしたもの）を添加して行った。混合発色試薬の調製は、３５ｍＬの発色試薬原液Ａ（５０ｍＬの蒸留水に１ｇのＤＡＭＯを溶解）と３５ｍＬの発色試薬原液Ｂ（５０ｍＬの蒸留水に０．２５ｇのチオセミカルバジドを溶解）を混合し、蒸留水で５００ｍＬにすることによって行った。作業用尿素標準液の調製は、５ｍＬの尿素標準原液（５０ｍＬの安息香酸に０．５ｇの尿素を溶解）を４５ｍＬの安息香酸に添加して行った（１ｇ／ｄＬ）。ＤＡＭＯアッセイは、１００μＬの２０倍希釈反応混合物をガラス製試験管に添加した後、蒸留水、混合発色試薬及び混合酸試薬を１：１：１の比率で混合して新たに調製した発色試薬を３ｍＬ添加して行った。試験管を１００℃で１５分間インキュベートし、室温まで５分間冷却させた。５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。アルギナーゼの１単位は、３７℃、ｐＨ７．４で１分間当たり１マイクロモルのアルギニンをオルニチンと尿素に転換する酵素の量として定義される。以下の式を使用して酵素活性を計算し、試料の吸光度値をブランクから差し引いた。
【０２０５】
ΔＡ５４０ｎｍ試料＝Ａ５４０ｎｍ試料−Ａ５４０ｎｍ試料ブランク
生成した尿素の量は標準曲線から計算する。
単位／ｍＬ酵素＝（遊離した尿素のμmol）（ｄｆ）／（５）（０．３）
ｄｆ＝酵素の希釈係数
０．３＝使用した酵素の体積（mL）
５＝単位定義当たりのアッセイ時間（min）
【実施例１１】
【０２０６】
タンパク質濃度の測定
タンパク質濃度はブラッドフォードアッセイによって求めた。タンパク質アッセイ色素試薬濃縮物（Ｂｉｏ−ｒａｄ社）を使用前に５倍希釈した。２０μＬの試料を１ｍＬの希釈色素試薬と混合し、室温で１０分間インキュベートした。タンパク質濃度を求めるため、クイックスタートウシ血清アルブミン標準セット（Ｂｉｏ−ｒａｄ社）を標準品として０〜１ｍｇ／ｍＬの範囲で用い、混合物を５９５ｎｍで測定した。
【実施例１２】
【０２０７】
ＢＨＡ（配列番号７５）融合タンパク質の酵素活性
酵素活性がＨＳＡの存在下で影響を受けるかどうか見出すため、ＢＨＡ（配列番号７５）のアルギニン異化活性をアッセイした。結果から、ＢＨＡ（配列番号７５）の活性が活性アッセイに添加した各量のＨＳＡに影響を受けないことが分かった。結合に関する研究で試験したＢＨＡ：ＨＳＡのモル比は１：１０、１：５、１：１、５：１及び１０：１であった。これら全ての条件下で、ＢＨＡ（配列番号７５）単独とＢＨＡ−ＨＳＡ複合体の測定した比活性は非常に類似しており、約２００Ｕ／ｍｇであった。
【実施例１３】
【０２０８】
非変性ＰＡＧＥ分析によって明らかになったＨＳＡへのＮ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）又はＢＨＡ（配列番号７５）の結合
ＡＢＤをｒｈＡｒｇ又はＢＣＡに融合させる場合、融合タンパク質がアルブミン結合能と酵素活性の両方を保持することが重要である。融合タンパク質におけるＡＢＤの結合能を実証するため、一定量のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）をＮ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）又はＢＨＡ（配列番号７５）と共に各種モル比でインキュベートした。反応混合物の分析は、タンパク質をサイズと立体構造によって分離する非変性ＰＡＧＥによって天然状態で行った。
【０２０９】
図７では、ＨＳＡとＮ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）の各々の移動度のみが非変性ＰＡＧＥのレーン２及び３にそれぞれ示されている（図７）。一定量のＨＳＡ（３０ピコモル）をＮ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）に対して各種モル比で滴定したが、結果をレーン５〜９に示す。結合反応におけるＮ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）の量を増加させることによって遊離ＨＳＡの量は比例して減少したが、これはＮ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）のＨＳＡへの特異的結合を示す。図８では、ＨＳＡとＢＨＡ（配列番号７５）の各々の移動度のみが非変性ＰＡＧＥのレーン６及び７にそれぞれ示されている（図８）。一定量のＨＳＡ（６０ピコモル）をＢＨＡ（配列番号７５）に対して各種モル比で滴定したが、結果をレーン１〜５に示す。結合反応におけるＢＨＡ（配列番号７５）の量を増加させることによって遊離ＨＳＡの量は比例して減少したが、これはＢＨＡ（配列番号７５）のＨＳＡへの特異的結合を示す。
【実施例１４】
【０２１０】
ＢＨＡ（配列番号７５）のインビボ研究
８週齢の６匹のＢＡＬＢ／ｃマウスをＢＨＡ（配列番号７５）のインビボ研究に使用した。ＢＨＡ（配列番号７５）を注射する前に血液試料を各マウスから採取し、対照として使用した（０時間）。マウスを無作為に２群に分け、それぞれ腹腔内（ｉ．ｐ．）注射用及び静脈内（ｉ．ｖ．）注射用とした。ＢＨＡ（配列番号７５）（２５０Ｕ）を各マウスに注射し、注射から６時間後、２４時間後、７２時間後、及び１２０時間後に血液試料を採取した。各血液試料の血漿（１６μＬ）をアミノ酸分析計（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ社）で分析し、アルギニンとオルニチンの含有量を得た。
【０２１１】
図９に示すように、ＢＨＡ（ＢＨＡ配列番号７５）のインビボアルギニン枯渇効果をＢＡＬＢ／ｃマウスで研究し、ＢＣＡ（Ｓ１６１Ｃ）−Ｈｉｓ（配列番号８９）の場合と比較した。この結果によれば、ＢＣＡ（Ｓ１６１Ｃ）−Ｈｉｓ（配列番号８９）の注射後２４時間以内に血漿中アルギニン濃度は迅速に正常に戻る（図９）。これに対し、ＢＨＡ（配列番号７５）の注射後少なくとも２４時間は、血漿中アルギニン濃度は検出不可能なレベルに維持されている（図９）。この結果から、ＡＢＤの融合がインビボでのＢＣＡ（Ｓ１６１Ｃ）−Ｈｉｓ（配列番号８９）の循環半減期を延長させたことが分かる。この結果から、ＡＢＤ融合がアルギニン枯渇酵素の薬力学的特性を改善するのに実現可能で有望な戦略であることが分かる。投与経路はインビボでのＢＨＡ（配列番号７５）のアルギニン枯渇効果に影響を及ぼさないように思われる（図９）。更に、明らかな副作用が観察されておらず、全てのマウスはＢＨＡ（配列番号７５）の投与に対して良好な耐性を示した。まとめると、ＢＨＡ（配列番号７５）等の本明細書に記載の融合タンパク質は、天然ＢＣＡ（Ｓ１６１Ｃ）−Ｈｉｓ（配列番号８９）をＡＢＤ融合なしで使用した場合（８時間）と比べて遥かに長い期間（少なくとも２４時間）に亘って血漿中アルギニンを検出不可能なレベルまで低下させることによって、ＡＢＤ融合戦略の実現可能性を証明した。
【実施例１５】
【０２１２】
Ｎ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）のインビボ薬力学研究
アルギナーゼの抗癌効果はかなり昔から検討されていた（Greenberg and Sassenrath, 1953, Cancer Res. 13, 709-715）。アルギナーゼはインビトロで非常に良好な抗癌効果があることが分かった。しかし、血漿中半減期が短いため、インビボでは効果が殆ど観察されなかった。血漿中アルギニンは、Ｃ３Ｈマウスに天然アルギナーゼを注射してから３時間後に最低レベルまで低下した。同じモデルで注射から５時間後にアルギニンは正常な基礎レベルまで上昇した（Greenberg and Sassenrath, 1953, Cancer Res. 13, 709-715）。従って、アルギナーゼは血漿中半減期が短いため、無効な抗癌剤と見なされていた。これは、血漿中半減期がインビボでの酵素薬の効力に影響を及ぼし得ることを示唆した。Ｎ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）とＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）は同様の比活性を示した。我々は、ＡＢＤとの融合によるｒｈＡｒｇ（配列番号１０３）の血漿中半減期の延長が効果的な方法であることを見出した。血漿中半減期が延長したｒｈＡｒｇ（配列番号１０３）の製造コストを削減するため、Ｎ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）とＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）を開発した。
【０２１３】
この研究では１５匹の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（１０週齢）を使用した。１ケージ当たり５匹の群に保った。単一用量のＮ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）（それぞれ５００Ｕ、２５０Ｕ及び１２５Ｕ）を腹腔内注射によってマウスに投与した。ヘパリン処理した毛細管を使用して伏在静脈から血液試料を採取し、８００×ｇで遠心分離して血漿を得た。Ｂｉｏｃｈｒｏｍ３０アミノ酸分析計を使用し、１６マイクロリットルの血漿試料をＬ−アルギニン濃度測定に供した。結果を図１０に示す。血漿中アルギニン濃度を測定すると、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、５００ＵのＮ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）が血漿中アルギニンをＢｉｏｃｈｒｏｍ３０アミノ酸分析計の検出限界（３μＭ）未満のレベルまで少なくとも９日間枯渇させることができ、２５０ＵのＮ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）が血清中アルギニンをＢｉｏｃｈｒｏｍ３０アミノ酸分析計の検出限界未満のレベルまで少なくとも７日間枯渇させることができ、１２５ＵのＮ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）が血清中アルギニンをＢｉｏｃｈｒｏｍ３０アミノ酸分析計の検出限界未満のレベルまで少なくとも３日間枯渇させることができることが分かった。これらの結果は、ＡＢＤとの融合によってｒｈＡｒｇの血漿中半減期が延長できることを明確に示唆する。ＢＨＡ（配列番号７５）（図９）と比較して、Ｎ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）は、かなり長期間に亘ってマウスでアルギニンを非常に低いレベルまで枯渇させることができるが、これは融合タンパク質の合理的設計の要件の重要性を強調している。
【実施例１６】
【０２１４】
Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）のインビボ薬力学及び薬物動態研究
この研究では５０匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウス（１０〜１２週齢）を使用した。５００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）を単一用量腹腔内注射によってマウスに投与した。ヘパリン処理した毛細管を使用して伏在静脈から血液試料を採取し、８００×ｇで遠心分離して血漿を得た。Ａｇｉｌｅｎｔ６４６０液体クロマトグラフィー／エレクトロスプレーイオン化三連四重極型質量分析計（検出限界：０．３μＭ  Ｌ−アルギニン）を使用し、５マイクロリットルの血漿試料を液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析によるＬ−アルギニン濃度の測定に供した。ヒトアルギナーゼを特異的に検出し、マウスアルギナーゼとは反応しないヒトアルギナーゼＩ  ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）キット（Ａｂｃａｍ社）を使用して、５マイクロリットルの血漿試料をＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）濃度の測定に供した。
【０２１５】
注射後、血清の採取を２時間目、４時間目、８時間目、１６時間目、２４時間目（１日目）、２日目〜１２日目は２４時間間隔で、１２日目〜３０日目は７２時間間隔で行った。使用するマウスの数のバランスを取り、採血の結果としてマウスからＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）を除去することに起因する薬物動態及び薬力学研究の結果への影響を最小限に抑えるため、マウスを１０群（各群でｎ＝５）に分け、以下の括弧内に示す時点での採血に供した。群１（２時間目）、群２（４時間目）、群３（８時間目）、群４（１６時間目）、群５（２４時間目）、群６（２日目、７日目、１２日目）、群７（３日目、８日目、１８日目）、群８（４日目、９日目、２１日目）、群９（５日目、１０日目、１５日目、２４日目）、群１０（０日目、６日目、１１日目、２７日目、３０日目）。薬力学及び薬物動態の結果をそれぞれ図１３と図１４に示す。
【０２１６】
血漿中アルギニン濃度の測定結果から、５００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）を腹腔内注射によって投与すると、注射後２時間以内に血漿中アルギニン濃度を１μＭまで枯渇させることができたことが分かった（図１３）。血漿中アルギニン濃度は１μＭ以下で１０日間維持された後、数日間で徐々に上昇した（表４）。血漿中アルギニン濃度は１８日目〜２１日目の間に基礎レベルの半分まで戻った。これらの結果は、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）が、かなり長期間に亘ってマウスで血漿中アルギニンを非常に低いレベル（１μＭ以下）に維持できることを示唆する。
【０２１７】
【表４】
2021525749.tif 000007
【０２１８】
薬物動態パラメータは２コンパートメントモデルで計算する。
【０２１９】
排出速度定数ｋｅは次の式で計算する。
【数１】
2021525749.tif 000008
【０２２０】
血漿中半減期ｔ１／２は次の式で計算する。
【数２】
2021525749.tif 000009
【０２２１】
曲線下面積（ＡＵＣ）は次の式を使用し、台形公式によって計算する。
【数３】
2021525749.tif 000010
【０２２２】
比較のために、文献で報告されている天然ｒｈＡｒｇの半減期を使用する。融合タンパク質Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）の排出半減期は３．９±０．３日であり（図１４）、これは、半減期が非常に短い非融合タンパク質ｒｈＡｒｇよりも遥かにゆっくりと排除されることを意味する。具体的に比較すると、ヒトアルギナーゼは循環中の半減期が僅か数分であり（Georgiou et al.、ＵＳ８４４０，１８４Ｂ２）、これは結合によって循環時間が劇的に延長することを示す。これらの結果は、ｒｈＡｒｇの血漿中半減期がＡＢＤとの融合によって大幅に延長できることを明確に示唆する。天然ＡＤＩの循環半減期（数時間）はＰＥＧ化によって延長された（Ensor et al., Cancer Res 2002, 62:5443-5450）。ＰＥＧ化ＡＤＩの循環半減期は２〜３日であり、ＰＥＧ化ＡＤＩ（天然ＡＤＩではない）のみがインビボでの腫瘍の増殖を阻害するのに有効であった。腹腔内注射によってラットに投与した天然ｒｈＡｒｇとＰＥＧ化ｒｈＡｒｇを比較した場合、ラット１匹当たり１５００ＵのＰＥＧ化ｒｈＡｒｇ（６Ｕ／ｇラット）により、６日間に亘って循環アルギニンをアミノ酸分析計の検出限界（３μＭ）未満のレベルまで枯渇させることができたのに対し、天然ｒｈＡｒｇは高用量（７５００Ｕ／ラット）でも注射３時間以内で循環アルギニンは約２０μＭまでにしか低下せず、注射後約２日でアルギニンは基礎レベルに戻った（Tsui et al., Cancer Cell Int. 2009 Apr 17;9:9）。天然アルギナーゼは数分以内に循環から排除される（Savoca et al., Cancer Biochem. Biophy's. 7:261-268, 1984）。臨床使用の場合、循環中に何日間又は何週間も持続されるようにアルギナーゼを設計することが不可欠である。何ら修飾を施さなければ、ヒトアルギナーゼの半減期は循環中僅か数分であるが、これはアルギナーゼのサイズが腎臓による濾過を回避するのに十分な大きさではないためである（Georgiou et al.、ＵＳ８４４０，１８４Ｂ２）。従って、本発明では、治療的使用のために循環持続性が劇的に改善された、完全に新しく高度に改良されたアルギナーゼ形態を開発した。
【実施例１７】
【０２２３】
Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）による処理は、正常な痩せたマウスにおいて脂肪量を減らし、脂質生成を抑制し、インスリン感受性を改善する。
【０２２４】
マウスモデルに関する我々のデータから、５００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）を８週齢の正常な痩せたＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスに単独腹腔内注射すると、血漿中アルギニン濃度を１μＭ以下に少なくとも１０日間維持することができたが、これはＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）の循環半減期が長いことを示す（図１３）。従って、通常の固形飼料を給餌した正常な痩せたＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスを５００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）の腹腔内注射によって１０日間隔で４週間処理した。４週間処理した後、ベヒクル（生理食塩水）を注射した対照マウスと比較して、内臓（性腺周囲、腎周囲及び腸間膜脂肪体）と皮下（鼠径部脂肪体）の脂肪量が２５％超減少した（図１５Ａ）。内臓白色脂肪組織（ＷＡＴ）の組織学的検査によって、脂肪細胞のサイズが顕著に減少したことが分かった（図１５Ｂ）。更に脂質生成を分析したところ、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）で処理したマウスでは、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ１（Ａｃｃ１）、脂肪酸シンターゼ（Ｆａｓｎ）及びステアロイル−ＣｏＡデサチュラーゼ１（Ｓｃｄ１）等、数種の重要な脂質生成酵素のｍＲＮＡレベルが内臓ＷＡＴ（図１６Ａ）及び肝臓（図１６Ｂ）で劇的に抑制されたことが分かった。
【０２２５】
肥満はインスリン抵抗性と非常に関連している。従って、インビボとインビトロの両方で研究を行い、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）処理がインスリン感受性に影響を及ぼすかどうか確認した。インスリン負荷試験（ＩＴＴ）の結果から、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）で処理したマウスにおいて、２週間の薬物処理後にインスリン感受性が有意に上昇したことが分かった（図１７Ａ）。次に、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスから調製した初代肝細胞を５Ｕ／ｍＬのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）を含む培地で処理することによって、肝臓のインスリン感受性を具体的に検討したが、この濃度では細胞生存率に影響を及ぼさなかった（図１７Ｂ）。Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）又は対照（Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇを添加しない）培地で培養してから２４時間後に、初代肝細胞を１００ｎＭのインスリンで２０分間刺激した。次に、細胞を回収してウエスタンブロット分析を行い、インスリンシグナル伝達マーカーとして通常使用されるリン酸化プロテインキナーゼＢ（ｐＡｋｔ）を検出した。結果から、対照群と比較してＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）処理群ではＡｋｔのリン酸化が顕著に増加したことが分かったが、これは肝臓インスリンシグナル伝達の増強を示す（図１７Ｃ）。
【０２２６】
正常な痩せたマウスでの知見から、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）は長い循環半減期を有し、脂肪量を減らし、脂質生成を抑制し、インビボとインビトロの両方でインスリン感受性を改善できることが分かった。これらの結果は、ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ融合タンパク質が肥満及び関連する代謝障害（例えば、インスリン抵抗性や肝脂肪変性（脂肪肝））の予防と治療に使用可能であることを裏付けている。
【実施例１８】
【０２２７】
Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）による処理はＨＦＤ誘発性肥満を効果的に予防する
組換えヒトアルギナーゼ［Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）］による処理によって、正常な痩せたマウスの脂肪量を大幅に減らし、脂質生成を抑制し、インスリン感受性を改善することができる。
【０２２８】
肥満動物の脂肪症及び様々な代謝パラメータに対するＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）の効果を試験した。高脂肪食誘発性肥満（ＤＩＯ）マウスモデル［Wang and Liao, 2012, Methods Mol. Biol. 821:421-433］（このモデルはヒトの肥満と多くの特徴を共有し、将来の抗肥満剤の試験に広く使用されている［Vickers et al., 2011, Br. J. Pharmacol. 164(4):1248-1262］）を使用した。具体的には、多遺伝子性肥満モデルで最も一般的に使用されているマウス株であるＣ５７ＢＬ／６Ｊを研究に使用した。高脂肪食給餌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスは顕著な体重増加を示し、肥満になり、高インスリン血症、高血糖症、耐糖能障害及びインスリン抵抗性を発症することがよく報告されている［Gallou-Kabani et al., 2007, Obesity 15(8):1996-2005］。
【０２２９】
マウスを食餌誘発性肥満及び関連する代謝障害から予防するＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）の有効性を確認するため、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスに６０ｋｃａｌ％脂肪含有の高脂肪食（ＨＦＤ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ社、Ｄ１２４９２）を給餌し（８週齢から１２週間）、同時に２００〜３００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）又はベヒクル対照としての生理食塩水を７日間隔で腹腔内注射した。１０ｋｃａｌ％脂肪含有の対応する低脂肪食（ＬＦＤ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ社、Ｄ１２４５０Ｊ）を給餌し、生理食塩水を注射したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを各種測定の痩せた対照とした。
【０２３０】
２個のコホート（各群ｎ＝５）で別々に行った。マウスを５匹の群に収容した。２個の独立したコホートで同様の結果が得られた。マウスの１個のコホートのデータを実施例１８〜２２に要約した。
【０２３１】
ＬＦＤを給餌し、ベヒクルで処理した痩せた対照［ＬＦＤ（ベヒクル）群と称する］と比較して、ＨＦＤ給餌のベヒクル処理雄性マウス［ＨＦＤ（ベヒクル）群と称する］では体重（図１８Ａ）とサイズ（図１８Ｂ）で顕著な増加を示し、主な内臓（性腺周囲、腎周囲及び腸間膜）貯蔵と皮下（鼠径部）貯蔵で白色脂肪組織（ＷＡＴ）量が有意に増加した（図１９Ａ）。しかし、ＨＦＤを給餌したが同時にＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）で処理したマウス［ＨＦＤ（ｒｈＡｒｇ）群と称する］では、ＨＦＤ摂取に起因する体重増加とＷＡＴの肥大を効果的に防ぐことができた。ＷＡＴの組織学的検査によって、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）処理が脂肪細胞肥大を顕著に抑制したことが明らかになった（図１９Ｂ）。ｇＷＡＴにおけるリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲを使用したｍＲＮＡ発現レベルの分析によって、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（Ｐｐａｒｇ）及びステロール調節エレメント結合タンパク質１ｃ（Ｓｒｅｂｐ１ｃ）、及び脂質生成酵素（Ａｃｃ１とＳｃｄ１）等の数種の重要な脂肪生成転写因子の劇的なダウンレギュレーションが更に示された（図１９Ｃ）。また、これらの遺伝子はＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）で処理したＨＦＤ給餌マウスの骨格筋でも有意にダウンレギュレートされた（図２０）が、これはＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）の抗脂質生成効果がＷＡＴに限定されないことを示唆する。
【０２３２】
雄性マウスに対するＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）の抗肥満効果を確認した後、雌性マウス（各群ｎ＝５）に対するＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）の効果を研究して性差があるかどうか確認した。結果から、同時に行ったＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）による処理は、ＨＦＤ給餌の雌性マウス（８週齢から開始して１２週間）の体重増加（図２１Ａ）及び主な内臓（性腺周囲、腎周囲及び腸間膜）貯蔵と皮下（鼠径部）貯蔵でＷＡＴの過剰蓄積（図２１Ｂ）から保護するのに同様に有効であり、インスリン感受性（図２２Ａ）と耐糖能（図２２Ｂ）を改善することができたことが分かった。
【０２３３】
脂肪細胞に対するＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）の効果を試験するため、脂肪生成を研究するための細胞ベースのモデルとして通常使用される［Green and Meuth, 1974, Cell 3:127-133］マウス３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞を使用した。Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）は３Ｔ３−Ｌ１細胞における脂肪生成と脂質生成を効果的に阻害し（図２３）、数種の脂肪生成転写因子（図２４Ａ）と脂質生成酵素（図２４Ｂ）のｍＲＮＡレベルを有意に抑制できることが分かった。３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞をウシアルギナーゼ、又は他のアルギニン枯渇酵素−アルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ）、又はアルギニンを含まない培地で培養した場合にも同様の阻害効果が観察された（図２３）。アルギナーゼはＬ−アルギニンをＬ−オルニチンと尿素に変換するが、ＡＤＩはＬ−アルギニンをＬ−シトルリンに変換する。しかし、Ｌ−オルニチン、尿素又はＬ−シトルリンは、３Ｔ３−Ｌ１細胞における脂肪生成と脂質生成を阻害することができなかった（図２３）。
【０２３４】
更に、アルギニンを含まない培地に各種濃度のＬ−アルギニンを補充すると、脂肪生成と脂質生成に対するアルギニンの用量依存的効果が実証され（図２５Ａ）、Ｃｅｂｐａ及びＰｐａｒｇ及び脂質生成酵素Ｓｃｄ１等の重要な脂肪生成転写因子を活性化のためのアルギニン閾値濃度は１０〜４０μＭであった（図２５Ｂ）。
【０２３５】
即ち、これらの知見から、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）の抗脂肪生成及び抗脂質生成効果がアルギニン欠乏を介してもたらされることが分かる。
【０２３６】
まとめると、これらの知見は、ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ融合タンパク質又は他のアルギナーゼ形態（例えば、ｒｈＡｒｇ−ＰＥＧ、ＢＣＡ−ＰＥＧ又はＢＣＡ−ＡＢＤ）又はアルギニン枯渇酵素（例えば、ＡＤＩ−ＰＥＧ、ＡＤＩ−ＡＢＤ、ＡＤＣ−ＰＥＧ又はＡＤＣ−ＡＢＤ）によるアルギニン枯渇が予防的な抗肥満療法として使用できることを裏付ける。
【実施例１９】
【０２３７】
Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）による処理はＨＦＤ誘発性のインスリン抵抗性、耐糖能障害及び代謝障害を予防する
肥満は一般にインスリン抵抗性、耐糖能障害及び代謝障害に関連している。実際、ＬＦＤ給餌でベヒクル処理の痩せた対照マウスと比較して、ＨＦＤ給餌のベヒクル処理マウスでは、ＨＦＤの給餌から６週間後に行ったインスリン負荷試験（ＩＴＴ）において、注射したインスリンの血糖低下効果に対する感受性で有意な低下を示し（図２６Ａ）、１１週目で更に悪化した（図２６Ｂ）。インスリン感受性の低下に伴い、これらマウスでは、ＨＦＤの給餌から５週間後までに耐糖能試験（ＧＴＴ）でＤ−グルコースを注射した後、血糖値を基礎レベルまで戻す効率が有意に低下した（図２７Ａ）が、これは耐糖能障害の発症を意味しており、ＨＦＤ消費の１０週間後に更に悪化した（図２７Ｂ）。実際、空腹時（５時間）血糖（図２８Ａ）と空腹時血漿中インスリン濃度（図２８Ｂ）は有意に上昇し、インスリン抵抗性の測定値であるＨＯＭＡ−ＩＲスコア（図２８Ｃ）は、痩せた対照マウスと比較してベヒクル処理のＨＦＤ給餌マウスの方が高かった。空腹時血漿中レプチン濃度（図２９Ａ）、総コレステロール濃度（図２９Ｂ）、トリグリセリド濃度（図２９Ｃ）、及び遊離脂肪酸濃度（図２９Ｄ）は、ＨＦＤ給餌から１２週間後に測定した際に有意に上昇した。注目すべきことに、同時に行ったＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）による処理によって、ＨＦＤによって誘発されるインスリン抵抗性、耐糖能障害、高血糖症、高インスリン血症、高レプチン血症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、及び高遊離脂肪酸血症の発症を完全に防ぐことができた。
【０２３８】
即ち、これらの結果から、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）は２型糖尿病発症の前兆であるインスリン抵抗性と耐糖能障害を効果的に予防できることが分かる。また、レプチン抵抗性や肥満に関連する脂質異常症等の他の代謝障害を予防することもできる。
【０２３９】
まとめると、これらの結果は、ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ融合タンパク質又は他のアルギナーゼ形態（例えば、ｒｈＡｒｇ−ＰＥＧ、ＢＣＡ−ＰＥＧ又はＢＣＡ−ＡＢＤ）又はアルギニン枯渇酵素（例えば、ＡＤＩ−ＰＥＧ、ＡＤＩ−ＡＢＤ、ＡＤＣ−ＰＥＧ又はＡＤＣ−ＡＢＤ）によるアルギニン枯渇が予防的な抗糖尿病療法、抗脂質異常症療法、抗アテローム性動脈硬化症療法、及び抗代謝障害療法として使用できることを裏付ける。
【実施例２０】
【０２４０】
Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）による処理はＨＦＤ誘発性脂肪症を予防する
脂肪症とは細胞内での脂質の異常な貯留を意味する。非アルコール性肝脂肪変性（非アルコール性脂肪肝）は肥満に関連する一般的な併存症である。初期工程では無症候性のこともあるが、肝臓が炎症を起こすと脂肪性肝炎になり、線維症に進行し、更に進行した工程では肝硬変となる場合があり、肝細胞癌になるリスクが大幅に高まる。実際、ＨＦＤ給餌のベヒクル処理マウスでは、肝臓が顕著に肥大して色が薄くなり（図３０Ａ）、痩せた対照マウスに比べて重量がほぼ２倍になったことが分かった（図３０Ｂ）。オイルレッドＯで肝臓切片を染色すると、大きな脂肪滴が広範囲に蓄積したことが分かり（図３１Ａ）、それに応じてトリグリセリド濃度が１０倍に上昇した（図３１Ｂ）。これらの知見に付随するように、肝損傷のバイオマーカーとして一般に測定されるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の血清中濃度が有意に上昇した（図３２）。注目すべきことに、同時に行ったＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）による処理によって、ＨＦＤ給餌マウスの肝臓における脂質の過剰な蓄積を効果的に防ぐことができ、肝臓の重量とトリグリセリド含有量、及び血清中ＡＬＴ濃度は痩せた対照と同等であった。これらの知見と一致して、ＨＦＤは肝臓において数種の重要な脂肪生成転写因子と脂質生成酵素の有意なアップレギュレーションを誘発する一方、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）による処理はこれらの遺伝子のアップレギュレーションを有意に抑制できたことが分かった（図３１Ｃ）。即ち、これらの結果から、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）が脂肪肝を予防する上で非常に効果的であることが分かる。
【０２４１】
肥満は、肝臓以外にも腎臓（腎脂肪症）、膵臓（膵臓脂肪症）及び心臓（心臓脂肪症）に脂質が過剰に蓄積することと関連しており、これらの臓器の脂肪毒性と機能障害を引き起こす。実際、ＨＦＤ給餌のベヒクル処理マウスでは、腎臓（図３３Ａ）、膵臓（図３３Ｂ）及び心臓（図３３Ｃ）の重量に有意な増加があったことが分かった。同時に行ったＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）による処理によって、これらの臓器の重量増加を効果的に防ぐことができたが、これは、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）がこれらの臓器における脂質の過剰な蓄積と脂肪毒性を防ぐことができることを示唆する。
【０２４２】
まとめると、これらの結果は、ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ融合タンパク質が脂肪症を効果的に予防することができ、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）又は他のアルギナーゼ形態（例えば、ｒｈＡｒｇ−ＰＥＧ、ＢＣＡ−ＰＥＧ又はＢＣＡ−ＡＢＤ）又はアルギニン枯渇酵素（例えば、ＡＤＩ−ＰＥＧ、ＡＤＩ−ＡＢＤ、ＡＤＣ−ＰＥＧ又はＡＤＣ−ＡＢＤ）によるアルギニン枯渇を予防的な抗脂肪症療法として使用できることを裏付けている。
【実施例２１】
【０２４３】
Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）による処理はＨＦＤ誘発性の慢性炎症を予防する
ＷＡＴが過剰に肥大すると多くのアディポカインの生成が増加し、これによってインスリン抵抗性の発症に寄与する慢性の低度の炎症が引き起こされる。単球走化性タンパク質−１（Ｍｃｐ１）は、ＷＡＴから分泌される主要な炎症誘発性アディポカインの１種であり、マクロファージのＷＡＴへの浸潤、肥満におけるインスリン抵抗性及び脂肪肝を制御する。実際、ＨＦＤ給餌のベヒクル処理マウスの性腺周囲ＷＡＴにおいてＭｃｐ１のｍＲＮＡレベルが有意にアップレギュレートされたことを見出した（図３４Ａ）。これに付随するように、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）で測定した循環Ｍｃｐ１の血清中濃度は痩せた対照と比較して有意に上昇した（図３４Ｂ）。インターロイキン１β（Ｉｌ１ｂ）や腫瘍壊死因子α（Ｔｎｆａ）等の他の炎症誘発性アディポカインも性腺周囲ＷＡＴにおいて高いｍＲＮＡ発現を示した（図３４Ａ）。注目すべきことに、同時に行ったＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）による処理によって、性腺周囲ＷＡＴにおけるこれらのアディポカインのアップレギュレーションを抑制し、血清中Ｍｃｐ１濃度の上昇を抑制することができた。
【０２４４】
これらの結果は、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）が肥満に関連する慢性の低度の炎症を予防できることを実証し、ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ融合タンパク質又は他のアルギナーゼ形態（例えば、ｒｈＡｒｇ−ＰＥＧ、ＢＣＡ−ＰＥＧ又はＢＣＡ−ＡＢＤ）又はアルギニン枯渇酵素（例えば、ＡＤＩ−ＰＥＧ、ＡＤＩ−ＡＢＤ、ＡＤＣ−ＰＥＧ又はＡＤＣ−ＡＢＤ）によるアルギニン枯渇の予防的な抗炎症療法としての可能性を裏付ける。
【実施例２２】
【０２４５】
Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）による処理は褐色脂肪組織におけるＨＦＤ誘発性の白色化と脂肪酸酸化の脱制御を防ぎ、非震え熱産生を高める
褐色脂肪組織（ＢＡＴ）は酸化性燃料を熱に散逸する働きをする（非震え熱産生）。最近の研究から、この熱生産は肥満に対抗するエネルギー消費において大きな能力を有することが分かっている。これに対し、ＢＡＴの白色化は肥満と関連しており、ＢＡＴの機能を損なう。実際、ＨＦＤ給餌のベヒクル処理マウスでは肩甲骨間ＢＡＴが顕著に肥大し（図３５Ａ）、痩せた対照マウスに比べて重量が２倍になったことが分かった（図３５Ｂ）。組織学的検査から、多葉性褐色脂肪細胞間に散在する大きな単小葉細胞が広範囲に蓄積していることが分かった（図３５Ｃ）が、これは褐色脂肪細胞の白色様細胞への変換を示唆する。しかし、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）で同時に処理したＨＦＤ給餌マウスでは、ＢＡＴの重量、サイズ及び組織学的外観は痩せた対照マウスと同様であった。Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）による処理によって、熱産生に重要なＢＡＴ特異的遺伝子脱共役タンパク質１（Ｕｃｐ１）が有意にアップレギュレートされ、褐色脂肪細胞におけるＵｃｐ１の重要な転写調節因子であるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクチベーター１−α（Ｐｇｃ１α）もアップレギュレートされた一方、脂肪酸酸化に関与する主要な遺伝子であるアシル−ＣｏＡオキシダーゼ１（Ａｃｏｘ１）のＨＦＤ誘導性ダウンレギュレーションが抑制されたことが更に分かった（図３６）。Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）処理はＡｃｏｘ１のダウンレギュレーションを阻止できたことが分かったが、これはＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）が脂肪酸酸化を正常にする可能性を示す。
【０２４６】
即ち、これらの結果から、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）処理によって、肥満に関連するＢＡＴにおける褐色脂肪の白色化と脂肪酸酸化の脱制御を効果的に防止することができ、ＨＦＤの脂肪症作用と戦うための非震え熱産生が高められることが分かる。
【０２４７】
これらの知見は、ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ融合タンパク質又は他のアルギナーゼ形態（例えば、ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ、ＢＣＡ−ＰＥＧ又はＢＣＡ−ＡＢＤ）又はアルギニン枯渇酵素（例えば、ＡＤＩ−ＰＥＧ、ＡＤＩ−ＡＢＤ、ＡＤＣ−ＰＥＧ又はＡＤＣ−ＡＢＤ）によるアルギニン枯渇の予防的な抗肥満療法としての可能性を裏付ける。
【実施例２３】
【０２４８】
Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）による処理はＨＦＤ誘発性肥満を効果的に抑制する
同時に行ったＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）による処理によってＨＦＤ誘発性肥満及び関連する合併症と併存症（例えば、インスリン抵抗性、耐糖能障害、高血糖症、脂質異常症、脂肪肝、慢性炎症、及びＢＡＴの白色化）を効果的に予防できることを確認した後、既存の食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）を有するマウスにおいて、肥満を抑制し、これらの障害を逆行させる上でのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）の有効性を研究した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスにＨＦＤを給餌し（５週齢から１２週間）、肥満及び関連する合併症と併存症を誘発させた。次に、体重に応じてマウスを２群に分類し、ＨＦＤを給餌し続けながら、６００〜７００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）又はベヒクル対照として生理食塩水によって７日間隔で１２週間処理を行った。１群のマウスには対応する低脂肪食（ＬＦＤ）を給餌し、研究全体を通じて生理食塩水を注射して各種測定の痩せた対照とした。２個のコホート（各群ｎ＝５）で別々に行った。マウスを５匹の群に収容した。２個の独立したコホートで同様の結果が得られた。マウスの１個のコホートのデータを実施例２３〜２８に要約した。
【０２４９】
１２週間のＨＦＤ給餌によって、雄性マウスの体重を５０ｇ超に増加させることができたが、これはＬＦＤ給餌の痩せた対照雄性マウスよりも大幅に重かった（図３７Ａ及び３７Ｂ）。Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）で処理した後、ＨＦＤ誘発性肥満マウスの体重は徐々に減少した。５週間までに体重は３０％超減少し、痩せた対照マウスと同様であった。１２週間の処理が完了するまで体重はこのレベルに維持された。Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）で処理したＤＩＯマウスでは、主な内臓貯蔵（性腺周囲、腎周囲及び腸間膜ＷＡＴ）と皮下貯蔵（鼠径部ＷＡＴ）で脂肪体の重量は有意に減少し、痩せた対照マウスとかなり類似していた（図３８Ａ）。ＷＡＴの組織学的検査によって、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）で処理したＤＩＯマウスにおいて脂肪細胞の顕著な減少が明らかになった（図３８Ｂ）。
【０２５０】
実施例１８の結果と共に、これらの知見は、ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ融合タンパク質又は他のアルギナーゼ形態（例えば、ｒｈＡｒｇ−ＰＥＧ、ＢＣＡ−ＰＥＧ又はＢＣＡ−ＡＢＤ）又はアルギニン枯渇酵素（例えば、ＡＤＩ−ＰＥＧ、ＡＤＩ−ＡＢＤ、ＡＤＣ−ＰＥＧ又はＡＤＣ−ＡＢＤ）が肥満の治療的処理に使用できることを裏付ける。
【実施例２４】
【０２５１】
Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）による処理はＨＦＤ誘発性のインスリン抵抗性と耐糖能障害を逆行させ、代謝障害を正常化する
ＨＦＤを１２週間給餌したマウスは処理前に、痩せた対照マウスと比較して、前糖尿病の特徴である末梢インスリン抵抗性（図３９）と耐糖能障害（図４０）を発症した。しかし、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）による処理から４週間後までに、ＤＩＯマウスはインスリン感受性の顕著な増加を示し、痩せた対照マウスに匹敵する程度になった。Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）投与マウスでのインスリンに対する感受性の正常化は、ＨＦＤを継続的に給餌しながら１２週間の薬物処理の終了時まで持続させることができた。更に、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）で処理したマウスでは、３週間の処理で耐糖能が有意に改善し、７週間の処理で痩せた対照マウスと同様のレベルまで完全に回復した。このような改善と一致して、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）で処理したＤＩＯマウスの空腹時血糖（図４１Ａ）と空腹時血漿中インスリン（図４１Ｂ）は、４週間のｒｈＡｒｇ処理までに痩せた対照マウスと同様のレベルまで回復し、処理が終了するまで正常範囲内に維持された。これによって、ＨＯＭＡ−ＩＲスコアが処理前のマウスの３５．１から処理４週間後のマウスの１．２まで劇的に低下し（図４１Ｃ）、インスリン抵抗性の回復が示唆された。空腹時血漿中レプチン濃度（図４２Ａ）と空腹時総コレステロール濃度（図４２Ｂ）も正常レベルまで著しく低下した。
【０２５２】
まとめると、我々の知見によって、処理４週間以内にインスリン抵抗性、耐糖能障害、高血糖症、高インスリン血症、高レプチン血症及び高コレステロール血症を逆行させるＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）の高い有効性が実証される。
【０２５３】
即ち、これらの知見は、ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ融合タンパク質又は他のアルギナーゼ形態（例えば、ｒｈＡｒｇ−ＰＥＧ、ＢＣＡ−ＰＥＧ又はＢＣＡ−ＡＢＤ）又はアルギニン枯渇酵素（例えば、ＡＤＩ−ＰＥＧ、ＡＤＩ−ＡＢＤ、ＡＤＣ−ＰＥＧ又はＡＤＣ−ＡＢＤ）によるアルギニン枯渇がインスリン感受性改善剤として使用できると共に、インスリン抵抗性、耐糖能障害及び高血糖症を特徴とする前糖尿病と２型糖尿病、及びインスリン抵抗性に関連する他の障害の治療的処理に使用できることを裏付ける。また、高レプチン血症と高コレステロール血症の治療的処理にも使用することができる。
【実施例２５】
【０２５４】
Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）による処理はＨＦＤ誘発性脂肪症を逆行させる
１２週間のＨＦＤ給餌によって雄性マウスで脂肪肝が誘発された（図３０及び３１）。ＨＦＤ給餌を１２週間延長した後、肝臓は更に肥大し、色が薄く見えた（図４３Ａ）。肝臓重量は痩せた対照マウスの２倍を超えた（図４３Ｂ）。大量の脂質蓄積が肝臓全体に広がり（図４４Ａ）、それに応じてトリグリセリド含有量が増加した（図４４Ｂ）。重要な脂肪生成転写因子Ｐｐａｒｇ及びＳｒｅｂｐ１ｃの発現レベルは痩せた対照と同等のレベルまでダウンレギュレートされ、脂質生成酵素Ａｃｃ１の発現レベルは更に低下し、Ｓｃｄ１は大幅に抑制された（図４４Ｃ）。ＨＦＤを１２週間給餌したマウス（実施例２０、図３２）と比較して、ＨＦＤを２４週間給餌したマウスでは血清中アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）濃度が更に上昇し、血清中アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）濃度も有意に上昇した（図４５）が、これは肝損傷の更なる進行を示す。しかし、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）で処理したＤＩＯマウスでは、肝臓のサイズは顕著に低下し、その重量は痩せた対照と同程度となった（図４３Ｂ）。更に、肝臓は赤みがかった色に回復した（図４３Ａ）が、これは脂肪滴の劇的なクリアランス（図４４Ａ）とよく相関し、トリグリセリド濃度は痩せた対照と同等のレベルまで低下した（図４４Ｂ）。注目すべきことに、血漿中ＡＬＴ及びＡＳＴ濃度は痩せた対照と同等であったが、これはＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）による処理が更なる進行を防止し、既存の肝損傷を正常化できることを示唆する。まとめると、我々の知見から、脂肪肝の逆行に対するＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）の顕著な効果が明らかである。
【０２５５】
肥満は、肝臓以外にも腎臓（腎脂肪症）、膵臓（膵臓脂肪症）及び心臓（心臓脂肪症）に脂質が過剰に蓄積することと関連しており、これらの重要な臓器の脂肪毒性と機能障害を引き起こす。実際、ベヒクル処理したＤＩＯマウスにおいて、腎臓（図４６Ａ）、膵臓（図４７Ａ）及び心臓（図４８Ａ）の重量に有意な増加があった。組織学的検査によって腎尿細管における脂肪滴に類似する液胞の蓄積が明らかになった（図４６Ｃ）。腎臓切片のオイルレッドＯ染色によって糸球体に脂質の異所性蓄積があったことが分かった（図４６Ｄ）。膵臓においてＷＡＴパッチの広範な小葉内及び小葉間蓄積があり（図４７Ｂ）、心筋線維間に白い脂肪細胞の島が見られた（図４８Ｂ）。腎臓（図４６Ｂ）、膵臓（図４７Ｃ）、心臓（図４８Ｃ）においてトリグリセリド濃度が有意に上昇した。更に、トリグリセリド濃度の有意な上昇が骨格筋でも見られた（図４９）。これらの知見から、ベヒクル処理したＤＩＯマウスのこれらの器官における脂肪症の発症が分かる。しかし、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）による処理によって、ＤＩＯマウスの腎臓（図４６Ａ）、膵臓（図４７Ａ）及び心臓（図４８Ａ）の重量を痩せた対照と同等のレベルまで有意に減少させることができた。組織学的検査から、腎尿細管の液胞（図４６Ｃ）及びオイルレッドＯ染色で特定された腎臓の糸球体の脂質（図４６Ｄ）に顕著な減少が確認された。膵臓（図４７Ｂ）及び心臓（図４８Ｂ）内でＷＡＴの顕著な減少が見られた。Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）で処理したＤＩＯマウスの腎臓（図４６Ｂ）、膵臓（図４７Ｃ）、心臓（図４８Ｃ）及び骨格筋（図４９）におけるトリグリセリド濃度は痩せた対照と同等のレベルまで回復した。これらの知見から、Ｎ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）が腎臓、膵臓及び心臓、そして恐らく他の臓器の脂肪症も効果的に逆行させることができることが分かる。
【０２５６】
まとめると、これらの知見は、ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ融合タンパク質又は他のアルギナーゼ形態（例えば、ｒｈＡｒｇ−ＰＥＧ、ＢＣＡ−ＰＥＧ又はＢＣＡ−ＡＢＤ）又はアルギニン枯渇酵素（例えば、ＡＤＩ−ＰＥＧ、ＡＤＩ−ＡＢＤ、ＡＤＣ−ＰＥＧ又はＡＤＣ−ＡＢＤ）が脂肪症の治療的処理に使用できることを裏付ける。
【実施例２６】
【０２５７】
Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）による処理はＨＦＤ誘発性の慢性炎症と線維症を軽減する
実施例２１に示すように、ＨＦＤ給餌は慢性炎症を誘発する。ベヒクル処理したＤＩＯマウスでは、性腺周囲ＷＡＴにおける炎症誘発性アディポカインＭｃｐ１の発現がアップレギュレートされた（図５０Ａ）のに伴って、血清中Ｍｃｐ１濃度が有意に上昇した（図５０Ｂ）。一方、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）で処理したＤＩＯマウスでは、性腺周囲ＷＡＴにおけるＭｃｐ１発現は有意にダウンレギュレートされ、血清中Ｍｃｐ１濃度は痩せた対照マウスと同等のレベルまで正常化された（図５０Ｂ）が、これはＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ処理がＷＡＴにおけるＨＦＤ誘発性慢性炎症を軽減できることを示唆する。
【０２５８】
ベヒクル処理ＤＩＯマウスの肝臓では、インターロイキン１α及び１β（Ｉｌ１ａ及びＩｌ１ｂ）を含む数種の炎症誘発性遺伝子の有意なアップレギュレーションがあった（図５１Ａ）。慢性炎症は線維症に関連している。実際、重要な線維化促進遺伝子であるトランスフォーミング増殖因子β（Ｔｇｆｂ）の有意なアップレギュレーションがあった（図５１Ｂ）。Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）による処理によって、これらの炎症誘発性遺伝子を有意にダウンレギュレートし、インターロイキン１０（Ｉｌ１０）、インターロイキン２２（Ｉｌ２２）及びインターフェロンγ（Ｉｎｆｇ）等の数種の抗炎症遺伝子を顕著にアップレギュレートすることができた（図５１Ｃ）。線維化促進遺伝子Ｔｇｆｂの発現は痩せた対照と同等のレベルまで回復した。肝臓と同様に、ベヒクル処理したＤＩＯマウスの腎臓では、Ｍｃｐ１、腫瘍壊死因子α（Ｔｎｆａ）及びＩｌ１ｂ等の数種の炎症誘発性遺伝子の有意なアップレギュレーションがあった（図５２Ａ）。線維化促進遺伝子コラーゲン１型α１鎖（Ｃｏｌ１ａ１）も有意にアップレギュレートされたが、これは、腎臓においてシリウスレッド染色で特定されたコラーゲン線維の過剰沈着の所見と一致している（図５２Ｃ）。注目すべきことに、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）によるＤＩＯマウスの処理によって、これらの炎症誘発性遺伝子の発現を痩せた対照と同等のレベルまでダウンレギュレートすることができた。線維化促進遺伝子Ｃｏｌ１ａ１は大幅に抑制され、コラーゲン線維の量は著しく減少した。同様に、膵臓では、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）による処理によって、Ｍｃｐ１等の炎症誘発性遺伝子（図５２Ａ）及び重要な線維化促進遺伝子Ｔｇｆｂ（図５３Ｂ）を有意にダウンレギュレートすることができた。
【０２５９】
まとめると、これらの知見から、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ処理が慢性炎症、及び肝臓、腎臓、膵臓、そして恐らく他の臓器の線維症も効果的に軽減できることが分かる。
【０２６０】
脂肪肝（肝脂肪変性）は初期工程では無症候性の場合がある。肝臓が炎症を起こすと脂肪性肝炎になり、線維症に進行し、更に進行した工程では肝硬変となる場合があり、肝細胞癌になるリスクが大幅に高まる。我々の知見は、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ処理が肝疾患の進行を止め、肝損傷を逆行させることができることを示唆する。
【０２６１】
即ち、これらの結果は、ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ融合タンパク質又は他のアルギナーゼ形態（例えば、ｒｈＡｒｇ−ＰＥＧ、ＢＣＡ−ＰＥＧ、ＢＣＡ−ＡＢＤ）又はアルギニン枯渇酵素（例えば、ＡＤＩ−ＰＥＧ、ＡＢＤ−ＡＤＩ、ＡＤＣ−ＰＥＧ又はＡＤＣ−ＡＢＤ）によるアルギニン枯渇が慢性炎症及び線維症の治療的処理に使用できることを裏付ける。
【実施例２７】
【０２６２】
Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）による処理は褐色脂肪の白色化を逆行させる
ＨＦＤ給餌を長期間行った後、痩せた対照マウスと比較して、ベヒクル処理ＤＩＯマウスでは肩甲骨間ＢＡＴのサイズ（図５４Ａ）と重量（図５４Ｂ）が更に増加したが、これは大量の肥大した白色様単房細胞の存在（図５４Ｃ）と相関した。これに対し、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）によるＤＩＯマウスの処理によって、肩甲骨間ＢＡＴを痩せた対照マウスと同等のサイズと重量まで劇的に回復させ、白色様の単房細胞をほぼ完全に寛解させることができた。まとめると、これらの知見から、褐色脂肪の白色化を逆行させるＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）の優れた能力が分かる。
【０２６３】
まとめると、これらの結果は、ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ融合タンパク質又は他のアルギナーゼ形態（例えば、ｒｈＡｒｇ−ＰＥＧ、ＢＣＡ−ＰＥＧ又はＢＣＡ−ＡＢＤ）又はアルギニン枯渇酵素（例えば、ＡＤＩ−ＰＥＧ、ＡＤＩ−ＡＢＤ、ＡＤＣ−ＰＥＧ又はＡＤＣ−ＡＢＤ）が褐色脂肪白色化の逆行を介した肥満の治療的処理に使用できることを裏付ける。
【実施例２８】
【０２６４】
Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）による処理は血圧を低下させる
肥満は心血管疾患と高血圧に関連している。６００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）によって７日間隔で５週間処理したＤＩＯマウスを、ＣＯＤＡ非侵襲性血圧システム（Ｋｅｎｔｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用したテールカフ法による血圧測定に供した。Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）で処理したＤＩＯマウスの収縮期血圧及び拡張期血圧（図５５Ａ）と心拍数（図５５Ｂ）は、ベヒクルで処理したＤＩＯマウスよりも有意に低く、痩せた対照マウスとかなり類似することが分かった。実施例２５から、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）が腎臓及び心臓の脂肪症を効果的に逆行させることができ、これが血圧の低下に有益な効果をもたらし得ることが分かる。
【０２６５】
まとめると、これらの知見は、ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ融合タンパク質又は他のアルギナーゼ形態（例えば、ｒｈＡｒｇ−ＰＥＧ、ＢＣＡ−ＰＥＧ又はＢＣＡ−ＡＢＤ）又はアルギニン枯渇酵素（例えば、ＡＤＩ−ＰＥＧ、ＡＤＩ−ＡＢＤ、ＡＤＣ−ＰＥＧ又はＡＤＣ−ＡＢＤ）が高血圧の治療的処理に使用できることを裏付ける。
【実施例２９】
【０２６６】
Ｎ−ＡＢＤ００９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）は中和抗体を誘導せず、長期使用にも有効性を維持する
中和抗体の生成は、薬物の薬力学、薬物動態、安定性及び有効性に影響を及ぼすことがある。免疫原性応答を確認するため、ＬＦＤ給餌の８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスに５００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）又はベヒクル対照としての生理食塩水を７日間隔で８ヶ月間腹腔内注射した。Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）に対する抗薬物抗体の存在（図５６Ａ）にもかかわらず、これらの抗体はアルギナーゼ活性に対して中和効果を有さなかった（図５６Ｂ）ことが分かったが、これは、研究期間を通じてＢｉｏｃｈｒｏｍ３０アミノ酸分析計の検出限界（３μＭ）未満のレベルに血漿中アルギニン濃度を維持できたという知見と一致している。
【０２６７】
長期使用の安全性を評価するため、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）で８ヶ月間処理したＬＦＤ給餌マウスから血清試料と尿試料を採取して、一般に使用される肝損傷のバイオマーカーであるＡＬＴとＡＳＴの分析、及び腎機能を評価するための血清クレアチニンと尿中アルブミン／クレアチニン比の分析を行った。薬物処理のＬＦＤ給餌マウスは、これら全てのパラメータにおいてベヒクル処理のＬＦＤ給餌マウスと有意差を示さなかった（図５７Ａ及び５７Ｂ）ことが分かった。更に、ワイヤーミオグラフィーを使用して単離動脈の機能的応答と血管反応性を調べた際、フェニレフリンによって引き起こされる血管平滑筋収縮（図５８Ａ）、アセチルコリン誘発性の内皮依存性弛緩（図５８Ｂ）、及び一酸化窒素ドナーであるニトロプルシドナトリウムに応答した内皮非依存性弛緩（図５８Ｃ）に関してＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）で処理したＬＦＤ給餌マウスとベヒクル処理したＬＦＤ給餌マウスとの間に有意差はなかった。
【０２６８】
食餌誘発性肥満Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスにＨＦＤを給餌し続けながら６００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）で２０週間処理した別の研究では、５週間までに体重が痩せた対照マウスと同等のレベルまで減少し、リバウンドすることなくこのレベルで維持し続けた。血漿中アルギニン濃度の定期的なモニタリングによって、アルギニンがＢｉｏｃｈｒｏｍ３０アミノ酸分析計の検出限界（３μＭ）未満のレベルのままであったことが分かった。これらの結果は、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）が処理期間を通じて有効であり続けたことを裏付けている。即ち、これらの知見は、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）が安全且つ長期間の使用に効果的であることを裏付けている。
【実施例３０】
【０２６９】
組換えヒトアルギナーゼ（ｒｈＡｒｇ）のＰＥＧ化プロトコル
組換えヒトアルギナーゼ（Ｈｉｓ−ｒｈＡｒｇ配列番号１０１）はアフィニティークロマトグラフィーを使用した精製によって得た。ＰＥＧ化の前に、精製したＨｉｓ−ｒｈＡｒｇ（配列番号１０１）を２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）に対してダイアフィルトレーションし、タンパク質濃度を２ｍｇ／ｍＬに調整した。ＰＥＧ化試薬を２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）で調製した。ＰＥＧ試薬とｒｈＡｒｇのモル比を２０：１とした。ＰＥＧ試薬をＨｉｓ−ｒｈＡｒｇ（配列番号１０１）に添加した後、撹拌しながら室温で４時間インキュベートした。次に、接線流濾過（ＴＦＦ）によって反応混合物を２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）に対してダイアフィルトレーションした。アフィニティークロマトグラフィーによってフロースルーで過剰のＰＥＧを除去し、タンパク質を０．５Ｍのイミダゾールで溶出させてＰＥＧ化Ｈｉｓ−ｒｈＡｒｇ（配列番号１０１）を回収した。非誘導体化Ｈｉｓ−ｒｈＡｒｇ（配列番号１０１）は、別の回のアフィニティークロマトグラフィーによって分離した。次に、反応混合物を１２％ポリアクリルアミドゲル使用のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ゲルの染色は、分子量特定用のクーマシーブルー、又は遊離ＰＥＧ検出用の０．１Ｍのヨウ素溶液で行った。
【０２７０】
例えば、調製物において、比活性が２４５Ｕ／ｍｇで濃度が７．５ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ化Ｈｉｓ−ｒｈＡｒｇ（配列番号１０１）を１５０ｍｇ得た。図１１及び表５はＰＥＧ−ｒｈＡｒｇの生成とその分析の例を示す。
【０２７１】
【表５】
2021525749.tif 000011
【実施例３１】
【０２７２】
ＰＥＧ化Ｈｉｓ−ｒｈＡｒｇ［配列番号１０１］による処理は肥満を抑制し、インスリン感受性を改善する
ＰＥＧ化Ｈｉｓ−ｒｈＡｒｇ（配列番号１０１）の生成については実施例３０に記載されている。既存の食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）を有するＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスに、ＨＦＤ給餌を継続させながら、３００ＵのＰＥＧ化Ｈｉｓ−ｒｈＡｒｇ［配列番号１０１］又はベヒクル対照としての生理食塩水を７日間隔で５週間腹腔内注射した。ＰＥＧ化Ｈｉｓ−ｒｈＡｒｇ（配列番号１０１）で処理したマウスの体重は徐々に３０ｇまで減少したが、これは、固形飼料を給餌したベヒクル処理の痩せた対照マウスと同等であった（図５９）。主な内臓貯蔵（性腺周囲、腎周囲及び腸間膜ＷＡＴ）と皮下貯蔵（鼠径部ＷＡＴ）で脂肪体の重量は有意に減少し、研究終了時には痩せた対照マウスと同等であった（図６０）。肝臓、腎臓、膵臓及び心臓の重量は、ベヒクルで処理したＤＩＯマウスよりも有意に低く、痩せた対照マウスと同等であった（図６０）。血漿中アルギニン濃度の定期的なモニタリングによって、アルギニンが研究全体を通じてＢｉｏｃｈｒｏｍ３０アミノ酸分析計の検出限界（３μＭ）未満のレベルのままであったことが確認された。
【０２７３】
ＰＥＧ化Ｈｉｓ−ｒｈＡｒｇ［配列番号１０１］処理の２週間後、ＤＩＯマウスでは、ベヒクル処理のＤＩＯマウスと比較して既に空腹時血糖値が低く（図６１Ａ）、インスリン感受性が有意に高かった（図６１Ｂ）。
【０２７４】
即ち、これらの知見は、ＰＥＧ化Ｈｉｓ−ｒｈＡｒｇ［配列番号１０１］がＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ［配列番号５０］と同様の抗脂肪症効果とインスリン抵抗性改善効果を有することを裏付ける。ＰＥＧ化Ｈｉｓ−ｒｈＡｒｇ（配列番号１０１）によるアルギニン欠乏は、インスリン抵抗性に関連する肥満及び疾患を処理する治療効果を有する。
【実施例３２】
【０２７５】
金属イオン置換
野生型アルギナーゼは通常、Ｍｎ２＋金属イオンを含んでいる（D'Antonio & Christianson, 2011, Biochemistry, 50:8018-27）。金属イオン置換は、より強力な形態のＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（低いＫｍ値及び高いｋｃａｔ／Ｋｍ値）を調製する方法であることが分かっている。２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．４）に溶解した精製Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）を２０ｍＭの異なる二価金属イオン（Ｍｎ２＋、Ｎｉ２＋又はＣｏ２＋）と混合し、５２〜５５℃で１５〜６０分間インキュベートした後、バッファーをＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）と交換した。
【０２７６】
試料を酵素活性及び酵素動態の研究に供し、比活性と触媒効率（ｋｃａｔ／Ｋｍ）を求めた。試料を誘導結合プラズマ原子発光分析（ＩＣＰ−ＯＥＳ、Ａｇｉｌｅｎｔ７００シリーズＩＣＰ発光分光計）に適用して金属含有量を定量分析した。
【０２７７】
各タンパク質試料（１００〜２００μＬ）を１０ｍＬの１％ｗ／ｖＨＮＯ３に添加した後、ＩＣＰ−ＯＥＳ分析用に様々な元素と波長を選択した。金属対タンパク質比は金属濃度をタンパク質濃度で割って求めた。Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡタンパク質アッセイを使用し、製造元の指示（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に従ってタンパク質濃度を評価した。
【０２７８】
Ｃｏ２＋又はＮｉ２＋金属イオンをＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）に添加するとＭｎ２＋の除去とＣｏ２＋又はＮｉ２＋の取り込みが良好に行われた。
【０２７９】
コバルト置換酵素（Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ−Ｃｏ２＋）は、Ｋｍが遥かに小さく（０．２７〜０．３５ｍＭ）、ｋｃａｔが高く（２５０〜３１６ｓ−１）、触媒効率ｋｃａｔ／Ｋｍが高い（９０５〜９１７ｓ−１ｍＭ−１）ことが分かった。元の酵素（Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ−Ｍｎ２＋）の場合、Ｋｍは１．３７〜１．８９ｍＭ、ｋｃａｔは８２〜９８ｓ−１、ｋｃａｔ／Ｋｍは４４〜７２ｓ−１ｍＭ−１である。金属置換法によってＭｎ２＋をＣｏ２＋に置換することができ、飽和Ｃｏ２＋対タンパク質比は約２〜４対１になった。これらのデータは、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）又は本明細書に記載の他の融合タンパク質のより強力な形態が、他の二価金属イオン（例えば、Ｎｉ２＋又はＣｏ２＋）との置換によって製造できることを示唆する。
【実施例３３】
【０２８０】
Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ−Ｃｏ２＋［配列番号５０（コバルト置換）］による処理は肥満を抑制する
Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ−Ｃｏ２＋［配列番号５０（コバルト置換）］の生成については実施例３２に記載されている。既存の食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）を有するＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスに、ＨＦＤ給餌を継続させながら、２５〜１００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ−Ｃｏ２＋［配列番号５０（コバルト置換）］を５週間腹腔内注射した。マウスの体重は、６００〜７００ＵのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇの効果（図３７）と同様に、処理５週間以内で５５ｇから３０ｇまで徐々に減少した（図６２）。この結果は、Ｍｎ２＋をＣｏ２＋で置換すると、体重を減少させる上でＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ融合タンパク質の効力が著しく高まることを裏付ける。
【実施例３４】
【０２８１】
哺乳動物細胞培養と増殖アッセイ
癌細胞株（例えば、ＭＫＮ４５、ＡＧＳ、ＢＧＣ８２３、ＨＣＴ−１５及びＨＣＴ−１１６）を、標準プロトコルによって１０％ＦＢＳと１００ユニット／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ培地で保持した。
【０２８２】
細胞増殖アッセイでは、１００μＬの増殖培地中の癌細胞（５×１０３個）を９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、２４時間インキュベートした。培養培地の補充は、アルギニンを含まない培地（ＡＦＭ）に各種濃度のアルギニンを添加した培地、各種濃度の異なるアルギニン枯渇酵素を含む新鮮な培地によって行い、このような酵素をシトルリンと併用して行った。プレートを９５％空気と５％ＣＯ２の加湿雰囲気を含む恒温器中、３７℃で更に１〜３日間インキュベートした。
【０２８３】
定量的細胞増殖アッセイは、他所で広く説明されているように、ＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイを使用して行った。培養物中の細胞の５０％を死滅させるのに必要なアルギニン枯渇酵素の量をＩＣ５０と定義した。
【実施例３５】
【０２８４】
各種アルギニン枯渇酵素（ＡＤＩ、ＢＣＡ及びＡＤＣ）による様々なヒト癌細胞株の増殖の阻害
アルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ）、細菌アルギナーゼ（ＢＣＡ）及びアルギニンデカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）の細胞毒性は、５種の腫瘍細胞株（Ａ３７５、ＨｅＬａ、ＢｘＰＣ−３、ＰＡＮＣ−１及びＨＣＴ１１６）における比較研究で確認した。
【０２８５】
ＡＤＩとＢＣＡの両方が触媒する反応は尿素回路の工程であるため、ＡＤＩとＢＣＡの抗腫瘍効果は両方とも細胞中ＡＳＳ濃度に関連している。これに対し、ＡＤＣの触媒生成物はいずれも尿素回路の中間体ではないため、ＡＤＣの抗腫瘍効果はＡＳＳの存在による影響が比較的少ない場合がある。我々の結果から、ＡＤＩ、ＢＣＡ及びＡＤＣは全て研究した細胞株で阻害効果を発揮することが分かる。ＡＤＩはＡ３７５、ＨＣＴ１１６、ＢｘＰＣ−３、ＰＡＮＣ−１に対して有効であるが、ＨｅＬａ細胞に対しては有効ではない一方、ＢＣＡとＡＤＣの両方は、試験したこれら５種の癌細胞株全てに対して有効である（表６）。ＡＤＣは最も効力の弱いアルギニン枯渇酵素であるが、特にＡＳＳ陽性癌細胞では有効性の点でＡＤＩやＢＣＡよりも有利である（表６）。
【０２８６】
ＡＤＩに対する腫瘍細胞の感受性は細胞中ＡＳＳ濃度と明確な関係を示す（表６）。まとめると、ＡＤＣとＢＣＡは、ＡＤＩと比較してＡＳＳに依存しない方法でヒト癌細胞株の増殖を阻害することができる。
【０２８７】
表６．  ５種のヒト癌細胞株に対するＡＤＩ、ＢＣＡ及びＡＤＣのＩＣ５０と最大細胞毒性。ＭＴＴ分析の前に細胞を７２時間処理した。データは３回行った３種の実験の平均である。ＩＣ５０値は、細胞生存率を５０％阻害するのに必要な酵素の量で定義される。最大細胞毒性は、各酵素によって得られた生育不能細胞の最大割合で表される。ＡＤＩ耐性細胞は、試験したＡＤＩの最大用量で５０％超が生存する細胞として定義される。
【表６】
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【実施例３６】
【０２８８】
胃癌細胞に対するＢＨＡ（配列番号７５）の細胞毒性
アルブミン結合アルギナーゼＢＨＡ（配列番号７５）のインビトロ有効性の試験は、ＭＫＮ４５胃癌細胞株を各種濃度のＢＨＡ（配列番号７５）と共に７２時間インキュベートし、ＭＴＴアッセイによるＭＫＮ４５の生存率を確認することによって行った。図６３に示すように、ＭＫＮ４５癌細胞の増殖はＢＨＡ（配列番号７５）によって用量依存的に阻害された。これによって、培地にウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加し、アルブミンや他の異なるタンパク質を含む培養条件でのアルギニン枯渇融合タンパク質の細胞毒性が更に確認された。
【実施例３７】
【０２８９】
アネキシンＶ−ＦＩＴＣ及びＰＩ二重染色によるアポトーシスの評価
ＢＣＡアルギナーゼ（配列番号７１）によるアポトーシスの誘導を評価するため、様々な処理条件の１日前に３×１０５個の細胞を６ウェルプレートに播種した。培地を除去し、各濃度のＢＣＡ（配列番号７１）を添加した完全培地で補充した。ＢＣＡに２４時間、４８時間及び７２時間曝露した後、浮遊細胞と付着細胞の両方を回収した。即ち、培地中の浮遊細胞を１００×ｇで３分間、室温で遠心分離して回収する一方、付着細胞をＰＢＳで洗浄し、０．２５％トリプシン溶液と共に３７℃で３分間インキュベートして除去した。完全培地を添加した後、遠心分離によって細胞を回収した。細胞をＰＢＳで洗浄し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）とアネキシンＶ−ＦＩＴＣを含む０．１ｍＬの結合バッファー（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１４ＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＣａＣｌ２）に再懸濁させた。細胞を暗所にて室温で１５分間染色し、０．４ｍＬの結合バッファーを各チューブに添加した後、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用したフローサイトメトリー分析を行った。各試料について１００００個の細胞からデータを取得するように血球計算器を設定し、データをＦＡＣＳＡｒｉａソフトウェアによって分析した。
【０２９０】
フローサイトメトリーの結果によれば、ＢＣＡ（配列番号７１）処理（５０μｇ／ｍＬのＢＣＡ）の際、時間依存的にＨＣＴ１１６ヒト結腸癌細胞でアポトーシスが誘導された。ＢＣＡ処理から２４時間、４８時間及び７２時間後に、ＨＣＴ１１６癌細胞の約１６％、２１％及び２５％がそれぞれアポトーシスを起こした。
【実施例３８】
【０２９１】
細胞生存率アッセイと併用薬物の効果
これらの研究では、乳癌細胞株（例えば、ヒトＭＣＦ−７細胞及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞）を使用した。癌細胞（５×１０３個）を１００μＬの完全培地を含む９６ウェルプレート（ＴＰＰ）に播種した。プレートを恒温器内で一晩インキュベートし、細胞をプレートに付着させた。次に、Ｈｉｓ−ｒｈＡｒｇアルギナーゼ（配列番号１０１）（２Ｕ／ｍＬ〜０．００３２Ｕ／ｍＬ）とオートファジー阻害剤クロロキン（ＣＱ、１００μＭ〜０．１６μＭ）を９６ウェルプレートに添加した。薬物併用群については、Ｈｉｓ−ｒｈＡｒｇ（配列番号１０１）（２Ｕ／ｍＬ〜０．００３２Ｕ／ｍＬ）を２０μＭのＣＱ（非一定比率法）と共にウェルに添加した。各投薬を３個のウェルで３回行って細胞生存率の平均変化を得た。６８時間のインキュベーション後、１０μＬの５ｍｇ／ｍＬ  ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド］溶液を添加した。プレートを恒温器に戻し、更に４時間インキュベートした。ＭＴＴによって形成された不溶性化合物であるホルマザンを溶解するため、１０％ＳＤＳの０．０１ＭＨＣｌ溶液を１００μＬ添加した。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。色の変化は５７０ｎｍで分光光度計によって測定した。対照セットアップ（薬物なし）をベースとして使用して細胞生存率を計算し、これを用いてソフトウェアＰｒｉｓｍ６．０（ＧｒａｐｈＰａｄ社）によって用量反応曲線をプロットし、ＩＣ５０値を見出した。Ｈｉｓ−ｒｈＡｒｇ（配列番号１０１）とＣＱの相互作用又は併用効果は、組み合わせ指数（ＣＩ）によって計算することができる。ＣａｌｃｕＳｙｎソフトウェア（Ｂｉｏｓｏｆｔ社）を使用してＣＩ値を計算した。
【０２９２】
ＭＣＦ−７癌細胞はアルギナーゼによるアルギニン飢餓に対し７２時間に亘って感受性があった（表７）。ＣＱはＭＣＦ−７に対する細胞毒性効果も示した（表８）。薬剤併用群では、Ｈｉｓ−ｒｈＡｒｇ（配列番号１０１）とＣＱの間に相乗効果（ＣＩ＜１）があった（表９）。表１０は、ＭＣＦ−７癌細胞に対するＨｉｓ−ｒｈＡｒｇ（配列番号１０１）、ＣＱ、及びｒｈＡｒｇ＋ＣＱのＩＣ５０を示す。
【０２９３】
【表７】
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【０２９４】
【表８】
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【０２９５】
【表９】
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【０２９６】
【表１０】
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【０２９７】
実験データから、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞はＨｉｓ−ｒｈＡｒｇ（配列番号１０１）とＣＱ（表１１及び表１２）によるアルギニン飢餓に対して感受性があることが分かった。Ｈｉｓ−ｒｈＡｒｇ（配列番号１０１）とＣＱの併用もＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対して相乗的な細胞毒性を示した。ＣＩ値は１未満であった（表１３）。表１４は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞に対するＨｉｓ−ｒｈＡｒｇ（配列番号１０１）、ＣＱ、及びＨｉｓ−ｒｈＡｒｇ（配列番号１０１）＋ＣＱのＩＣ５０を示す。
【０２９８】
【表１１】
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【０２９９】
【表１２】
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【０３００】
【表１３】
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【０３０１】
【表１４】
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【０３０２】
ヒト肝癌細胞株「ＲｅｄＦｌｕＨｅｐＧ２」に対するＨｉｓ−ｒｈＡｒｇ（配列番号１０１）（０．０１６、０．０８又は０．４Ｕ／ｍＬ）とＣＱ（２０μＭ）の薬剤併用についても試験した。相乗効果（ＣＩ値が１未満）も観察された。
【実施例３９】
【０３０３】
トランスウェル遊走アッセイと浸潤アッセイ
これらの研究では、乳癌細胞株（ヒトＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞とマウス４Ｔ１細胞）を使用した。遊走アッセイと浸潤アッセイの両方を、２４ウェルＣｏｓｔａｒ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）トランスウェルシステム（ポリカーボネート膜インサート、孔径８．０μｍ）で実施した。アッセイを行う前に、細胞を適切な無血清培地で少なくとも２４時間培養した。細胞を上部チャンバーに播種する１日前に、１００μＬの希釈マトリゲルをインサートの上部チャンバーに添加して浸潤アッセイに備えた。無血清培地（１００μＬ）を遊走アッセイに使用する上部チャンバーに添加した。２４ウェルプレートを恒温器内で一晩インキュベートした。翌日、細胞をトリプシン処理して計数した。研究では、３×１０４個の４Ｔ１細胞又は５×１０４個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を２００μＬの適切な無血清培地と共に上部チャンバーに播種した。適切な完全培地（７５０μＬ）を下部チャンバーに添加した。薬物処理群では、１Ｕ／ｍＬのＨｉｓ−ｒｈＡｒｇ（配列番号１０１）を両方のチャンバーに添加した。２４ウェルプレートを３７℃の５％ＣＯ２加湿雰囲気で２０時間（４Ｔ１細胞）又は２４時間（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞）インキュベートした。
【０３０４】
インキュベーション後、上部チャンバーの培地を除去した。トランスウェルインサートを１×ＰＢＳで２回洗浄した。冷１００％メタノールを上部チャンバーと下部チャンバーの両方に１０分間添加して細胞を固定した。インサートを１×ＰＢＳで２回洗浄した。その後、１％クリスタルバイオレットの１×ＰＢＳ溶液を両方のチャンバーに１５分間添加して細胞を染色した。インサートを１×ＰＢＳで２回洗浄した。上部チャンバー表面の細胞を綿棒で除去した。インサートを一晩風乾した。共焦点顕微鏡で写真を撮影した。結果から、細胞を１Ｕ／ｍＬのＨｉｓ−ｒｈＡｒｇ（配列番号１０１）で処理すると、トランスウェルインサートを介して遊走及び浸潤可能な癌細胞の数が減少することが分かったが、これはアルギナーゼによるアルギニン枯渇が癌細胞の遊走と浸潤を阻害できることを示す。
【実施例４０】
【０３０５】
Ｎ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）はインビボで高悪性度の乳癌細胞の増殖と転移を阻害する
高悪性度の４Ｔ１乳癌細胞異種移植モデル研究では、１０匹の雌性ヌードマウス（１１〜１２週齢）を使用した。マウスを１ケージ当たり５匹の群に分け、食餌と水を自由に与えた。４Ｔ１癌細胞をトリプシン処理によって回収し、１×ＰＢＳで２回洗浄し、１×ＰＢＳに再懸濁させて接種に備えた。癌細胞（１×１０６個の４Ｔ１細胞）をマウスの左側腹部に皮下注射した。接種３日後に腫瘍の平均長さが６ｍｍになった際、マウスを無作為に２群に分けた。５００Ｕ（３．２ｍｇ、２３０μＬ）のＮ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）又は１×ＰＢＳのいずれかをマウスに週１回注射した。伏在静脈から血液試料を採取した。マウスの腫瘍サイズと体重を定期的にモニターした。腫瘍体積は次の式によって推定した。
腫瘍体積（ｍｍ３）＝長さ×幅２／２
【０３０６】
ＰＢＳ注射の対照群では腫瘍が壊死したため、癌細胞接種の１６日後（即ち、実験開始から１３日後）にマウスを屠殺した。屠殺後、腫瘍をマウスから採取し、腫瘍の重量を測定した。肺も採取し、１×ＰＢＳで洗浄した。肺をブアン固定液で一晩固定し、固定後に１×ＰＢＳで洗浄した。肺転移小結節の数を測定した。
【０３０７】
重要なのは、５００Ｕのアルブミン結合アルギナーゼＮ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）がＢＡＬＢ／ｃマウスで少なくとも１０日間、アルギニンをＢｉｏｃｈｒｏｍ３０アミノ酸分析計の検出限界（３μＭ）未満のレベルまで枯渇させたことである（図１０）。従って、５００ＵのＮ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）を４Ｔ１乳癌異種移植ヌードマウスに週１回、腹腔内注射で投与して有効性の研究を行った。表１５は、５００ＵのＮ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）が実験中にアルギニンを検出不能なレベルまで枯渇させたことを示す。
【０３０８】
【表１５】
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【０３０９】
図６４〜６７は、５００ＵのＮ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）がヌードマウスにおける４Ｔ１乳癌異種移植片の増殖を阻害できることを示す。実験開始から１２日後と１３日後に対照群と実験群との間で推定腫瘍体積に有意差があった（図６４及び６５）。２群間で腫瘍サイズにも顕著な差があった（図６６及び６７）。
【０３１０】
これらの結果は、５００ＵのＮ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）を週１回注射することによるアルギニン枯渇が、ヌードマウスにおける４Ｔ１高悪性度乳癌の異種移植片の増殖を有意に阻害できることを示唆した。インビボ研究によって、Ｎ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）が安全且つ効率的にヌードマウスにおける癌の増殖を阻害できることが分かった。
【０３１１】
更に、アルギニン飢餓が４Ｔ１乳癌細胞の転移を阻害できることを見出したが、これはインビトロの結果と一致していた。処理群のマウスを屠殺した後、これらマウスの肺を採取して転移の徴候について注意深く調べた。対照群の３個の異なる肺で３個の肺転移小結節が見られたが、Ｎ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）処理群では転移性小結節は見られなかった（表１６）。この結果から、Ｎ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）によるアルギニン飢餓が腫瘍転移を阻害できることが説得力を持って示された。これは、アルギニンが細胞遊走と腫瘍転移に重要な役割を果たす可能性があることを示唆した。Ｎ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）によるアルギニン枯渇は、癌細胞の転移に重要な幾つかの経路を阻害することがある（Knott et al., 2018, Nature, 554:378-381）。
【０３１２】
【表１６】
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【実施例４１】
【０３１３】
Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）融合酵素によるヒト結腸癌細胞株に対する細胞毒性
ＡＢＤとｒｈＡｒｇの融合タンパク質のインビトロ有効性をヒト結腸癌細胞株で試験した。ヒト結腸癌細胞株（ＨＣＴ１１６、ＬＯＶＯ及びＨＴ２９）を５×１０３個／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種した。インキュベーションの１日後、培地を各濃度（２、０．４、０．０８、０．０１６及び０．００３２Ｕ／ｍＬ）のＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）を含む培地で置換した。３日目［Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）処理の３日後］にＭＴＴアッセイを行ってＩＣ５０値を求めた。培地をＭＴＴ溶液（１ｍｇ／ｍＬ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で置換し、３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーション後、ＭＴＴ溶液をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で置換し、６５０ｎｍを基準として５７０ｎｍでの吸光度を測定した。Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ処理細胞の吸光度を未処理細胞の平均吸光度で割って細胞生存率を求めた。癌細胞株に対するＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）のＩＣ５０値（９５％信頼区間）をソフトウェアＰｒｉｓｍ６．０で分析した。３個の独立した実験セット（ｎ＝３）を各細胞株に対して行った。結果を表１７に示す。
【０３１４】
【表１７】
2021525749.tif 000023
【０３１５】
試験した全ての結腸癌細胞株はインビトロでＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）融合酵素に対して非常に感受性があり、ＩＣ５０値は０．２２〜０．５８Ｕ／ｍＬであった。ＨＣＴ１１６はＩＣ５０が０．２２Ｕ／ｍＬの最も感受性の高い腫瘍であった。ＬＯＶＯとＨＴ２９のＩＣ５０値はそれぞれ０．３８Ｕ／ｍＬと０．５８Ｕ／ｍＬであった。
【実施例４２】
【０３１６】
Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）とクロロキンの併用はヒト結腸癌細胞株に対して相乗的な細胞毒性効果を発揮する
オートファジー阻害剤クロロキン（ＣＱ）のＩＣ５０値は次のように求めた。結腸癌細胞株ＨＣＴ１１６、ＬＯＶＯ及びＨＴ２９を別々に播種し、インキュベーションの１日後、培地を各濃度のＣＱ（１００、２０、４、０．８、０．１６μＭ）を含む培地で置換した。ＭＴＴアッセイを３日目に行った。３個の独立した実験セット（ｎ＝３）を各細胞株に対して行った。結果を表１８に示す。
【０３１７】
【表１８】
2021525749.tif 000024
【０３１８】
ＨＣＴ１１６、ＬＯＶＯ及びＨＴ２９に対するＣＱのＩＣ５０値はそれぞれ＞１００μＭ、１５μＭ及び７１μＭであった。薬物併用アッセイでは非一定比率分析を行った（Hastak et al., 2010, Cancer Res. 70(20):7970-7980）。結腸癌細胞を播種し、インキュベーションの１日後、培地を各濃度のＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）（２、０．４、０．０８、０．０１６、０．００３２Ｕ／ｍＬ）とそのＩＣ５０に従った一定量のＣＱの組み合わせを含む培地で置換した。ＭＴＴアッセイを３日目に行った。Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）とＣＱの併用処理の組み合わせ指数（ＣＩ）をソフトウェアＣａｌｃｕＳｙｎバージョン２．１で分析した。３個の独立した実験セット（ｎ＝３）を各細胞株に対して行った。結果を表１９に示す。
【０３１９】
【表１９】
2021525749.tif 000025
【０３２０】
結果から、０．０８Ｕ／ｍＬ又は０．４Ｕ／ｍＬのＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）を２０μＭのＣＱと併用した場合、３種の結腸癌細胞株全てでＣＩ値が＜１．０であったことが分かる。これは、Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）が単独でも有効であり、ＣＱと併用すると相乗的であることを示唆する。まとめると、オートファジー阻害剤クロロキン（ＣＱ）は、ヒト結腸癌細胞におけるＮ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ（配列番号５０）融合タンパク質の細胞死誘導効果を増強する。
【実施例４３】
【０３２１】
Ｎ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）とＰＥＧ化Ｈｉｓ−ｒｈＡｒｇ（配列番号１０１）は両方ともインビボで高悪性度の乳癌細胞の増殖と転移を阻害する
他の４Ｔ１乳癌同種移植研究では、雌性ヌードマウス（５〜６週齢）を使用した。マウスを１ケージ当たり５匹の群に分け、食餌と水を自由に与えた。４Ｔ１乳癌細胞（１×１０５個）をマウスの右側腹部に皮下注射した。接種１１日後に腫瘍の平均長さが８ｍｍになった際、マウスを無作為に４群に分けた。１個の対照群（ｎ＝８）と３個の実験群、即ち、５００ＵのＰＥＧ化Ｈｉｓ−ｒｈＡｒｇ（配列番号１０１）（ｎ＝８）、５００ＵのＮ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）（ｎ＝６）及び２５０ＵのＮ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ（配列番号４９）（ｎ＝８）とした。対照群のマウスには毎週１×ＰＢＳを注射した。５００ＵのＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ群と２５０ＵのＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ群では、マウスにそれぞれ５００Ｕと２５０ＵのＡＢＤ−ｒｈＡｒｇを週１回注射し、１群には５００ＵのＰＥＧ−ｒｈＡｒｇを週１回注射した。ＰＢＳ対照群では腫瘍が壊死したため、接種の２４日後（即ち、実験開始から１４日後）にマウスを屠殺した。屠殺した後、マウスを解剖した。マウスから腫瘍を採取し、その重量を測定した。肺も採取し、１×ＰＢＳで洗浄した。肺をブアン固定液で一晩固定し、固定後に１×ＰＢＳで洗浄した。肺転移小結節の数を測定した。
【０３２２】
結果に関して、図６８は、５００ＵのＡＢＤ−ｒｈＡｒｇと５００ＵのＰＥＧ−ｒｈＡｒｇの両方が高悪性度の４Ｔ１固形腫瘍の成長を有意に阻害したことを示す。しかし、低用量２５０ＵのＡＢＤ−ｒｈＡｒｇは腫瘍の成長を阻害しなかった。この結果は異なる群での腫瘍重量の変化とも一致した（図６９）。従って、ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇは用量依存的に腫瘍成長を阻害した。重要なことに、データから、（ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ又はＰＥＧ−ｒｈＡｒｇのいずれかによる）アルギニン飢餓が肺への腫瘍転移を阻害又は抑制したことが明確に分かった（図７０Ａと図７０Ｂ）。５００ＵのＰＥＧ−ｒｈＡｒｇ群と５００ＵのＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ群の両方の肺に由来する転移性小結節は対照群と比較して非常に有意に減少した。ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色による肺の組織学的切片から、小結節が一連の高密度の乳癌細胞によって形成されたことが分かった。この結果は小結節が転移巣であったことを示唆した。まとめると、長時間作用性アルギナーゼによるアルギニン枯渇はマウスモデルにおける高悪性度の癌細胞の転移を阻害する。癌の転移は患者の主な死因である（Knott et al., 2018, Nature, 554:378-381）ため、この知見はより効果的な癌療法の新しい可能性があろう。
【配列表フリーテキスト】
【０３２３】
配列番号１：  ＡＢＤプライマー１、実験室で合成
配列番号２：  ＡＢＤプライマー２、実験室で合成
配列番号３：  ＡＢＤプライマー３、実験室で合成
配列番号４：  ＡＢＤプライマー４、実験室で合成
配列番号５：  ＡＢＤプライマー５、実験室で合成
配列番号６：  ＡＢＤプライマー６、実験室で合成
配列番号７：  ＡＢＤプライマー７、実験室で合成
配列番号８：  ＡＢＤプライマー８、実験室で合成
配列番号９：  ＡＢＤプライマー９、実験室で合成
配列番号１０：  ＡＢＤプライマー１０、実験室で合成
配列番号１１：  ＡＢＤプライマー１１、実験室で合成
配列番号１２：  ＡＢＤプライマー１２、実験室で合成
配列番号１３：  ＡＢＤプライマー１３、実験室で合成
配列番号１４：  ＡＢＤプライマー１４、実験室で合成
配列番号１５：  ＡＢＤプライマー１５、実験室で合成
配列番号１６：  ＡＢＤプライマー１６、実験室で合成
配列番号１７：  ＡＢＤプライマー１７、実験室で合成
配列番号１８：  ＡＢＤプライマー１８、実験室で合成
配列番号１９：：  ＡＢＤプライマー１９、実験室で合成
配列番号２０：  ＡＢＤプライマー２０、実験室で合成
配列番号２１：  ＡＢＤプライマー２１、実験室で合成
配列番号２２：  ＡＢＤプライマー２２、実験室で合成
配列番号２３：  ＡＢＤプライマー２３、実験室で合成
配列番号２４：  ＡＢＤプライマー２４、実験室で合成
配列番号２５：  ＡＢＤプライマー２５、実験室で合成
配列番号２６：  ＡＢＤプライマー２６、実験室で合成
配列番号２７：  ＡＢＤプライマー２７、実験室で合成
配列番号２８：  ＡＢＤプライマー２８、実験室で合成
配列番号２９：  ＡＢＤプライマー２９、実験室で合成
配列番号３０：  ＡＢＤプライマー３０、実験室で合成
配列番号３１：  ＡＢＤプライマー３１、実験室で合成
配列番号３２：  ＡＢＤプライマー３２、実験室で合成
配列番号３３：  Ｈｉｓ−ＡＢＤ−リンカー、実験室で合成
配列番号３４：  Ｈｉｓ−ＡＢＤ０９４−リンカー、実験室で合成
配列番号３５：  リンカー−ＡＢＤ−Ｈｉｓ、実験室で合成
配列番号３６：  リンカー−ＡＢＤ０９４−Ｈｉｓ、実験室で合成
配列番号３７：  Ｎ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ遺伝子、実験室で合成
配列番号３８：  Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ遺伝子、実験室で合成
配列番号３９：  Ｃ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ遺伝子、実験室で合成
配列番号４０：  Ｃ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ遺伝子、実験室で合成
配列番号４１：  Ｎ−ＡＢＤ−ＢＣＡ遺伝子、実験室で合成
配列番号４２：  Ｎ−ＡＢＤ０９４−ＢＣＡ遺伝子、実験室で合成
配列番号４３：  Ｃ−ＡＢＤ−ＢＣＡ遺伝子、実験室で合成
配列番号４４：  Ｃ−ＡＢＤ０９４−ＢＣＡ遺伝子、実験室で合成
配列番号４５：  Ｈｉｓ−ＡＢＤ−リンカー、実験室で合成
配列番号４６：  Ｈｉｓ−ＡＢＤ０９４−リンカー、実験室で合成
配列番号４７：  リンカー−ＡＢＤ−Ｈｉｓ、実験室で合成
配列番号４８：  リンカー−ＡＢＤ０９４−Ｈｉｓ、実験室で合成
配列番号４９：  Ｎ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ、実験室で合成
配列番号５０：  Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ、実験室で合成
配列番号５１：  Ｃ−ＡＢＤ−ｒｈＡｒｇ、実験室で合成
配列番号５２：  Ｃ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ、実験室で合成
配列番号５３：  Ｎ−ＡＢＤ−ＢＣＡ、実験室で合成
配列番号５４：  Ｎ−ＡＢＤ０９４−ＢＣＡ、実験室で合成
配列番号５５：  Ｃ−ＡＢＤ−ＢＣＡ、実験室で合成
配列番号５６：  Ｃ−ＡＢＤ０９４−ＢＣＡ、実験室で合成
配列番号５７：  ＡＢＤ０９４−０Ｆプライマー、実験室で合成
配列番号５８：  ＡＢＤ０９４−１Ｆプライマー、実験室で合成
配列番号５９：  ＡＢＤ０９４−２Ｆプライマー、実験室で合成
配列番号６０：  ＡＢＤ０９４−３Ｆプライマー、実験室で合成
配列番号６１：  ＡＢＤ０９４−４Ｆプライマー、実験室で合成
配列番号６２：  ＡＢＤ０９４−５Ｆプライマー、実験室で合成
配列番号６３：  ａｂｄＮｄｅ−Ｆプライマー、実験室で合成
配列番号６４：  ＨｕＡｒｇＨｉｎＢａｍ−Ｒプライマー、実験室で合成
配列番号６５：  Ｎ−ＡＢＤ０９４−ｒｈＡｒｇ遺伝子、実験室で合成
配列番号６６：  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  Ｇ１４８に基づくＡＢＤ、実験室で合成
配列番号６７：  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  Ｇ１４８に基づくＡＢＤ、実験室で合成
配列番号６８：  リンカー無しのＡＢＤ０９４、実験室で合成
配列番号６９：  １位のＸａａはメチオニンまたは不存在
配列番号７１：  ＢＣＡ  （Ｓ１６１Ｃ）アルギナーゼ、実験室で合成
配列番号７２：  ＢＣＡ  （Ｖ２０Ｐ，  Ｓ１６１Ｃ）アルギナーゼ、実験室で合成
配列番号７３：  リンカー配列１、実験室で合成
配列番号７４：  リンカー配列２、実験室で合成
配列番号７５：  ＢＨＡ融合タンパク質、実験室で合成
配列番号７６：  ＢＡＨ融合タンパク質、実験室で合成
配列番号７７：  ５’−センス−ＡＢＤプライマー、実験室で合成
配列番号７８：  ５’−アンチセンス−ＡＢＤプライマー、実験室で合成
配列番号７９：  ＡＢＤのクローニング用のフォワードプライマー、実験室で合成
配列番号８０：  ＡＢＤのクローニング用のリバースプライマー、実験室で合成
配列番号８１：  ＢＣＡのクローニング用のフォワードプライマー、実験室で合成
配列番号８２：  ＢＣＡのクローニング用のリバースプライマー、実験室で合成
配列番号８３：  ＢＨＡのクローニング用のフォワードプライマー、実験室で合成
配列番号８４：  ＢＨＡのクローニング用のリバースプライマー、実験室で合成
配列番号８５：  ＡＢＤのクローニング用のフォワードプライマー、実験室で合成
配列番号８６：  ＡＢＤのクローニング用のリバースプライマー、実験室で合成
配列番号８７：  ＢＡＨのクローニング用のフォワードプライマー、実験室で合成
配列番号８８：  ＢＡＨのクローニング用のリバースプライマー、実験室で合成
配列番号８９：  ＢＣＡ  （Ｓ１６１Ｃ）−Ｈｉｓ、実験室で合成
配列番号９０：  Ｎ−ＡＢＤＨｉｎｄ−Ｒプライマー、実験室で合成
配列番号９１：  Ｃ−ＡＢＤＮｄｅ−Ｆプライマー、実験室で合成
配列番号９２：  Ｃ−ＡＢＤＨｉｎｄ−Ｒ、実験室で合成
配列番号９３：  ＨＡＲＧＢａｍ−Ｆプライマー、実験室で合成
配列番号９４：  ＨＡＲＧＨｉｎｄ−Ｒプライマー、実験室で合成
配列番号９５：  ＨＡＲＧＮｄｅ−Ｆ、実験室で合成
配列番号９６：  ＨＡＲＧＢａｍ−Ｒプライマー、実験室で合成
配列番号９７：  ＢＣＡＢａｍ−Ｆプライマー、実験室で合成
配列番号９８：  ＢＣＡＨｉｎｄ−Ｒプライマー、実験室で合成
配列番号９９：  ＢＣＡＮｄｅ−Ｆプライマー、実験室で合成
配列番号１００：  ＢＣＡＢａｍ−Ｒプライマー、実験室で合成
配列番号１０１：  Ｈｉｓ−ｒｈＡｒｇ、実験室で合成
配列番号１０２：  Ｈｉｓ−ｒｈＡｒｇ−ｍｏｎｏ−Ｃｙｓ、実験室で合成
配列番号１０４：  ｒｈＡｒｇ−ｍｏｎｏ−Ｃｙｓ、実験室で合成
配列番号１０５：  Ａ（ＥＡＡＡＫ）４ＡＬＥＡ−（ＥＡＡＡＫ）４Ａペプチドリンカー、実験室で合成
配列番号１０６：  Ｇ４ＳＧ４ＳＧ３ＳＧペプチドリンカー、実験室で合成
【図１】
2021525749.tif 000026
【図２Ａ】
2021525749.tif 000027
【図２Ｂ】
2021525749.tif 000028
【図３】
2021525749.tif 000029
【図４】
2021525749.tif 000030
【図５Ａ】
2021525749.tif 000031
【図５Ｂ】
2021525749.tif 000032
【図５Ｃ】
2021525749.tif 000033
【図５Ｄ】
2021525749.tif 000034
【図６Ａ】
2021525749.tif 000035
【図６Ｂ】
2021525749.tif 000036
【図７】
2021525749.tif 000037
【図８】
2021525749.tif 000038
【図９】
2021525749.tif 000039
【図１０】
2021525749.tif 000040
【図１１】
2021525749.tif 000041
【図１２】
2021525749.tif 000042
【図１３】
2021525749.tif 000043
【図１４】
2021525749.tif 000044
【図１５】
2021525749.tif 000045
【図１６】
2021525749.tif 000046
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
2021525749.tif 000049
【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
2021525749.tif 000055
【図２６】
2021525749.tif 000056
【図２７】
2021525749.tif 000057
【図２８】
2021525749.tif 000058
【図２９】
2021525749.tif 000059
【図３０】
2021525749.tif 000060
【図３１】
2021525749.tif 000061
【図３２】
2021525749.tif 000062
【図３３】
2021525749.tif 000063
【図３４】
2021525749.tif 000064
【図３５】
2021525749.tif 000065
【図３６】
2021525749.tif 000066
【図３７】
2021525749.tif 000067
【図３８】
2021525749.tif 000068
【図３９】
2021525749.tif 000069
【図４０】
2021525749.tif 000070
【図４１】
2021525749.tif 000071
【図４２】
2021525749.tif 000072
【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
2021525749.tif 000075
【図４６】
2021525749.tif 000076
【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
2021525749.tif 000082
【図５３】
2021525749.tif 000083
【図５４】
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【図５５】
2021525749.tif 000085
【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
2021525749.tif 000088
【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
2021525749.tif 000091
【図６２】
2021525749.tif 000092
【図６３】
2021525749.tif 000093
【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
2021525749.tif 000096
【図６７】
2021525749.tif 000097
【図６８】
2021525749.tif 000098
【図６９】
2021525749.tif 000099
【図７０】
2021525749.tif 000100
【配列表】
2021525749000001.app
【国際調査報告】
2021525749.tif 000101
2021525749.tif 000102
2021525749.tif 000103
2021525749.tif 000104