(57)【要約】  ヒトのような哺乳動物におけるA群レンサ球菌細菌に対する粘膜の免疫応答の誘発において使用するための増強された粘膜免疫原性を有する、改変されたp145ペプチド。改変されたp145ペプチドの筋肉内投与は、特に有用であり得る。S2ペプチド又はバリアントを、改変されたp145ペプチドに同時投与して、免疫応答を増強してもよい。
2021505525.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物においてA群レンサ球菌細菌に対する免疫応答を誘発する方法であって、配列番号3の残基13及び17のアミノ酸置換を含む改変されたp145ペプチドアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質;単離されたタンパク質又はそのフラグメント若しくはバリアントに結合するか、又はそれに対して生じる抗体若しくは抗体フラグメント;或いは単離されたタンパク質又はそのフラグメント若しくはバリアントをコードする単離された核酸を哺乳動物に投与することにより、免疫応答を誘発する工程を含む方法。
【請求項２】
哺乳動物においてA群レンサ球菌細菌の感染症に対する免疫を誘導する方法であって、配列番号3の残基13及び17のアミノ酸置換を含む改変されたp145ペプチドアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質;単離されたタンパク質又はそのフラグメント若しくはバリアントに結合するか、又はそれに対して生じる抗体若しくは抗体フラグメント;或いは単離されたタンパク質又はそのフラグメント若しくはバリアントをコードする単離された核酸を、哺乳動物に投与することにより、哺乳動物においてA群レンサ球菌細菌の感染症に対する免疫を誘導する工程を含む方法。
【請求項３】
哺乳動物においてA群レンサ球菌細菌の感染症を処置又は予防する方法であって、配列番号3の残基13及び17のアミノ酸置換を含む改変されたp145ペプチドアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質;単離されたタンパク質又はそのフラグメント若しくはバリアントに結合するか、又はそれに対して生じる抗体若しくは抗体フラグメント;或いは単離されたタンパク質又はそのフラグメント若しくはバリアントをコードする単離された核酸を、哺乳動物に投与することにより、哺乳動物においてA群レンサ球菌細菌の感染症を予防又は処置する工程を含む方法。
【請求項４】
配列番号1のアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質又はそのフラグメント若しくはバリアント;単離されたタンパク質又はそのフラグメント若しくはバリアントに結合するか、又はそれに対して生じる抗体若しくは抗体フラグメント;或いは単離されたタンパク質又はそのフラグメント若しくはバリアントをコードする単離された核酸を投与する工程が、哺乳動物に筋肉内に投与される、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
免疫応答が、粘膜の免疫応答である、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
粘膜の免疫応答が、粘膜IgGの産生により特徴付けられる、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
粘膜の免疫応答が、粘膜IgAが実質的に存在しないこと、又はIgAの産生が少なくとも低減されることにより特徴付けられる、請求項5又は6に記載の方法。
【請求項８】
改変されたp145ペプチドアミノ酸配列が、残基13のアスパラギン(N)アミノ酸及び残基17のアルギニン(R)アミノ酸を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
改変されたp145ペプチドアミノ酸配列が、配列番号1に記載される、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
フラグメントが、配列番号2に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項8に記載の方法。
【請求項１１】
改変されたp145ペプチド、バリアント又はフラグメントが、担体タンパク質にコンジュゲート、カップリング、又はそうでなければ結合している、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
担体タンパク質が、ジフテリア毒素、CRMタンパク質又はそのフラグメントである、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
SpyCEPタンパク質の免疫原性フラグメントを投与する工程をさらに含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
SpyCEPのフラグメントが、S2ペプチド(配列番号23)若しくはそのバリアントであるか、又はそれを含む、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
バリアントが、K4S2ペプチド(配列番号24)である、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
配列番号3の残基13及び17のアミノ酸置換を含む改変されたp145ペプチドアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質、そのフラグメント若しくはバリアント、単離されたタンパク質又はそのフラグメント若しくはバリアントに結合するか、又はそれに対して生じる抗体又は抗体フラグメント、或いは単離されたタンパク質又はそのフラグメント若しくはバリアントをコードする単離された核酸;並びにSpyCEPタンパク質の免疫原性フラグメント又はそのバリアント、SpyCEP免疫原性フラグメント若しくはそのバリアントに結合するか、又はそれに対して生じる抗体又は抗体フラグメント、或いはSpyCEP免疫原性フラグメント若しくはそのバリアントをコードする単離された核酸、を含む単離されたタンパク質を含む、組成物。
【請求項１７】
改変されたp145ペプチドアミノ酸配列が、残基13のアスパラギン(N)アミノ酸及び残基17のアルギニン(R)アミノ酸を含む、請求項16に記載の組成物。
【請求項１８】
改変されたp145ペプチドアミノ酸配列が、配列番号1に記載される、請求項17に記載の組成物。
【請求項１９】
改変されたp145ペプチドのフラグメントが、配列番号2に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項18に記載の組成物。
【請求項２０】
改変されたp145ペプチド、バリアント又はフラグメントが、担体タンパク質にコンジュゲート、カップリング、又はそうでなければ結合している、請求項16から19のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
担体タンパク質が、ジフテリア毒素、CRMタンパク質又はそのフラグメントである、請求項20に記載の組成。
【請求項２２】
SpyCEPのフラグメントが、S2ペプチド(配列番号23)若しくはそのバリアントであるか、又はそれを含む、請求項16から21のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
バリアントが、K4S2ペプチド(配列番号24)である、請求項22に記載の組成物。
【請求項２４】
アジュバントをさらに含む、請求項16から23のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
筋肉内投与に適当である、請求項16から24のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
請求項1から15のいずれか一項に記載の方法による使用のための、請求項16から25のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、A群レンサ球菌(streptococcus)のレンサ球菌関連疾患及び状態の予防及び処置のための免疫原性ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
多数の感染性並びに非感染性疾患に対して予防及び防御するためのワクチンとして合成及び組換えペプチドが開発されている。それらの有用性は、外来又は宿主タンパク質上の天然のエピトープを模倣し、防御又は有害免疫応答を特異的に活性化又は調節するそれらの能力にある。癌、アレルギー、多発性硬化症並びに高血圧、糖尿病及びアルツハイマー病のような慢性疾患を含む、多数の非感染性疾患については著しい進歩がなされている(1)。しかしながら、それらの最も有望なのは、ワクチンが感染性疾患を予防することにある。ここで、それらの小さなサイズは、複数の標的抗原からのエピトープを組み込んでいる複数の成分ワクチン(2)、複数の対立遺伝子形態に存在する生物での感染を予防することができるワクチン(3)、及び生物により天然で誘導されないが、ワクチンにより誘導されると、生物に致死的である免疫応答の産生をもたらす、隠れた又は潜在的なエピトープを標的にすることができるワクチン(4)の設計を大いに促進する。
【０００３】
B及びT細胞により認識されるエピトープは小さく、それらのサイズに起因して、容易かつ安価に合成され得る。しかしながら、エピトープは小さいので、エピトープが刺激するB又はT細胞のレパートリーは、非常に制限され、それが、ペプチドベースのワクチンが、まだ開発されておらず、ヒト使用のため許可されていない主な理由である。
【０００４】
化膿性レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)(ランスフィールドのA群レンサ球菌;GAS)に対するワクチンは、細菌により引き起こされる衰弱性疾患、特に、リウマチ熱及びリウマチ性心疾患に起因すると長く考えられてきた。リウマチ熱は、大抵の先進国において今日稀な疾患であるが、発展途上国において小児、青少年及び若年成人における後天的心疾患の主要な原因のままである。加えて、浸潤性GAS疾患は、小児及び成人における敗血症の頻繁な原因であり、高い死亡率を有する。さらに、GAS疾患の負荷に加え、連鎖球菌(Streptococcal)後の糸球体腎炎があり、多くのGAS固有の領域における末期腎不全の高い割合に恐らく関与する。GAS咽頭炎及び膿痂疹は、各年、最大の絶対数のGAS感染症の原因となる。GAS咽頭炎は、年間、学齢児童のおよそ8%〜15%に影響し、GAS膿痂疹は、10〜50%の小児の有病率において非常に一般的な感染症である。重度のGAS関連疾患は、発展途上国においてばかりでなく、先進国においても問題であり、特に、標準抗生物質療法に対して抵抗性であり、重度の壊死性筋膜炎のような衰弱性疾患を引き起こす病原性GAS株が出現している。
【０００５】
A群レンサ球菌に対するペプチドベースのワクチンは、p145、J8及びJ14ペプチドのようなMタンパク質由来ペプチドに焦点を当てている。現在、酵母由来のらせんペプチド(GCN4)アミノ酸配列において包埋されたp145内の12個のアミノ酸の最小のエピトープを含むJ8ペプチドは、有力なワクチン候補である(12)。GCN4アミノ酸配列は、免疫系への最小のエピトープの提示を最適化するよう、ペプチドらせん性の維持を補助する。このワクチン候補はまた、皮膚疾患に対する保護を導くのに3回用量を必要とする(19)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開番号WO2017/070735
【特許文献２】国際公開番号WO99/02550
【特許文献３】国際公開番号WO97/45444
【特許文献４】米国特許第5,091,513号
【特許文献５】欧州特許第239,400号
【特許文献６】国際公開番号WO2007/062466
【特許文献７】米国特許第5,047,238号
【特許文献８】米国特許第5,785,973号
【特許文献９】国際公開番号WO2015/15782
【特許文献１０】米国特許第5,770,214号
【特許文献１１】米国特許第5,980,907号
【特許文献１２】米国特許第5,851,519号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Grahamら、2002、PNAS USA 99 13855
【非特許文献２】Altschulら、1997、Nucl. Acids Res. 25 3389頁
【非特許文献３】CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY編の第19.3章、Ausubelら(John Wiley & Sons Inc NY、1995〜1999)
【非特許文献４】CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE編の第15章、Coliganら(John Wiley & Sons NY 1995〜2008年)
【非特許文献５】SYNTHETIC VACCINES編の第9章、Nicholson (Blackwell Scientific Publications)
【非特許文献６】Sambrookら、MOLECULAR CLONING. A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press、1989)、特に第16及び17章
【非特許文献７】CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY編、Ausubelら、(John Wiley & Sons、Inc. NY、米国、1995〜2008)、特に、第10及び16章
【非特許文献８】Winter & Milsteinによる論文、1991、Nature 349:293頁
【非特許文献９】Holligerら、1993、Proc Natl Acad Sci USA 90 6444頁
【非特許文献１０】Kipriyanov、2009、Methods Mol Biol 562 177頁
【非特許文献１１】Coliganら、CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (John Wiley & Sons NY、1991〜1994年)第2章
【非特許文献１２】Harlow、E. & Lane、D. Antibody: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbour、Cold Spring Harbour Laboratory、1988
【非特許文献１３】Kohler & Milstein、1975、Nature 256、495頁
【非特許文献１４】DNA Vaccines、Methods and Protocols、第2編(Methods in Molecular Medicineシリーズの第127巻、Humana Press、2006)
【非特許文献１５】Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co. N.J. USA、1991)
【非特許文献１６】New Generation Vaccines (1997、Levineら、Marcel Dekker、Inc. New York、Basel、香港)
【非特許文献１７】Aldertonら、Avian Diseases 35 435頁
【非特許文献１８】Rocheら、Mucosal Immunol、2015
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
驚くべきことに、本発明者らは、p145のアミノ酸配列を標的として改変することにより、p145ペプチドの免疫原性が実質的に増大し得ることを見出した。複数の免疫化よりむしろ、改変されたp145ペプチドの単回用量を用いた免疫化が、CovR/S変異株のような高病原性株によるA群レンサ球菌感染症に対してさせ保護することができる。予想外に、改変されたp145ペプチド、フラグメント又はバリアントは、哺乳動物への投与の際に粘膜の免疫応答を誘発する。粘膜の免疫応答は、IgGの産生により特徴付けられ、一方、IgA産生は、実質的に存在しないか、又はIgGの産生レベルと比較して比較的低減したレベルである。
【０００９】
本発明は、特に、粘膜の免疫応答を誘発するため、免疫原性を実質的に改善するか、又は増強する1個又は複数のアミノ酸配列改変を含むp145ペプチドに広く関する。好ましい形態において、ペプチドは、配列番号1に記載されるアミノ酸配列を含む。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の態様は、哺乳動物においてA群レンサ球菌細菌に対する免疫応答を誘発する方法であって、配列番号3の残基13及び17のアミノ酸置換を含む改変されたp145ペプチドアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質;単離されたタンパク質又はそのフラグメント若しくはバリアントに結合するか、又はそれに対して生じる抗体若しくは抗体フラグメント;或いは単離されたタンパク質又はそのフラグメント若しくはバリアントをコードする単離された核酸を哺乳動物に投与することにより、免疫応答を誘発する工程を含む方法を提供する。
【００１１】
本発明の別の態様は、哺乳動物においてA群レンサ球菌細菌の感染症に対する免疫を誘導する方法であって、配列番号3の残基13及び17のアミノ酸置換を含む改変されたp145ペプチドアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質;単離されたタンパク質又はそのフラグメント若しくはバリアントに結合するか、又はそれに対して生じる抗体若しくは抗体フラグメント;或いは単離されたタンパク質又はそのフラグメント若しくはバリアントをコードする単離された核酸を哺乳動物に投与することにより、哺乳動物においてA群レンサ球菌細菌の感染症に対する免疫を誘導する工程を含む方法を提供する。
【００１２】
本発明のさらなる態様は、哺乳動物においてA群レンサ球菌細菌の感染症を処置又は予防する方法であって、配列番号3の残基13及び17のアミノ酸置換を含む改変されたp145ペプチドアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質;単離されたタンパク質又はそのフラグメント若しくはバリアントに結合するか、又はそれに対して生じる抗体若しくは抗体フラグメント;或いは単離されたタンパク質又はそのフラグメント若しくはバリアントをコードする単離された核酸を哺乳動物に投与することにより、哺乳動物においてA群レンサ球菌細菌の感染症を予防又は処置する工程を含む方法を提供する。
【００１３】
改変されたp145ペプチド、フラグメント又はバリアントは、好適には、残基13のアスパラギン(N)アミノ酸及び残基17のアルギニン(R)アミノ酸を含む。
【００１４】
実施形態において、改変されたp145ペプチド、フラグメント又はバリアントは、配列番号1に記載されるアミノ酸配列を含む。
【００１５】
実施形態において、改変されたp145ペプチドフラグメントは、配列番号2に記載されるアミノ酸配列を含む。
【００１６】
好ましくは、改変されたp145ペプチド、フラグメント又はバリアントは、哺乳動物への投与の際に、粘膜の免疫応答を誘発する。
【００１７】
好適には、粘膜の免疫応答は、IgGの産生により特徴付けられる。典型的には、IgA産生は、実質的に存在しないか、又はIgGの産生レベルと比較して比較的低減したレベルである。
【００１８】
好ましくは、改変されたp145ペプチド、フラグメント又はバリアントは、哺乳動物への筋肉内投与の際に、粘膜の免疫応答を誘発する。
【００１９】
好ましくは、前述の態様の哺乳動物は、ヒトである。
【００２０】
前述の態様の特定の実施形態において、改変されたp145ペプチド、フラグメント又はバリアントは、SpyCEPタンパク質の免疫原性フラグメントと組み合わせて投与されてもよい。好ましくは、SpyCEPのフラグメントは、S2ペプチド(配列番号23)若しくはK4S2ペプチド(配列番号24)のようなバリアントであるか、又はそれを含む。
【００２１】
したがって、本発明の関連する態様は、配列番号3の残基13及び17のアミノ酸置換を含む改変されたp145ペプチドアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質、そのフラグメント又はバリアント、単離されたタンパク質又はそのフラグメント若しくはバリアントに結合するか、又はそれに対して生じる抗体又は抗体フラグメント、或いは単離されたタンパク質又はそのフラグメント若しくはバリアントをコードする単離された核酸;並びにSpyCEPタンパク質の免疫原性フラグメント又はそのバリアント、SpyCEP免疫原性フラグメント若しくはそのバリアントに結合するか、又は生じる抗体又は抗体フラグメント、或いはSpyCEP免疫原性フラグメント若しくはそのバリアントをコードする単離された核酸を含む組成物を提供する。
【００２２】
好適には、改変されたp145ペプチドアミノ酸配列は、配列番号1に記載されるアミノ酸配列を好ましくは含む、残基13のアスパラギン(N)アミノ酸及び残基17のアルギニン(R)アミノ酸を含む。好ましくは、改変されたp145ペプチドのフラグメントは、配列番号2に記載されるアミノ酸配列を含む。
【００２３】
好ましい実施形態において、SpyCEPのフラグメントは、配列番号23に記載されるアミノ酸配列を含むS2ペプチド、若しくはそのバリアントであるか、それを又は含む。バリアントは、配列番号24に記載されるアミノ酸配列を含むK4S2ペプチドであってもよい。
【００２４】
本明細書において使用される、不定冠詞「1つの(a)」及び「1つの(an)」は、単数若しくは複数の構成要素若しくは特性を指すか、又は包含するよう本明細書において使用され、「1つ」若しくは「単一」の構成要素又は特性を意味するか、又は定義すると捉えられるべきではない。
【００２５】
文脈が別段必要としない限り、用語「含む(comprise)」、「含む(comprises)」及び「含むこと」、又は類似の用語は、列挙されたリストの構成要素又は特性が、単に規定されたもの又は列挙された構成要素を含まないが、列挙されていないか、又は規定されていない他の構成要素又は特性を含み得るよう、包括的な包含を意味することが意図される。
【００２６】
アミノ酸配列の文脈における「から本質的になる」は、N又はC末端のさらに1、2、又は3個のアミノ酸と一緒、列挙されたアミノ酸配列を意味する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】ペプチドライブラリーの設計のグラフである。p145抗血清による様々なp145バリアントペプチドの認識: p145の86種のバリアントからなるペプチドライブラリーを、p145抗血清を用いてスクリーニングした。p145抗血清を、B10.D2マウスにおいて生じさせ、それぞれのペプチドに結合するp145抗血清の能力を、ELISAを使用して決定した。p145内由来の最小のエピトープ配列は、グラフの上部にあり、それぞれのアミノ酸において変異を受けているペプチド配列の数を、下の丸括弧内に表す。縦線は、同じ位置における変異に基づき、ペプチドを区別する。ペプチド87は、非特異的な対照ペプチド(pNS)である。
【図１Ｂ】ペプチドライブラリーの設計のグラフである。p145バリアントライブラリー内の免疫優性ペプチドの同定:ペプチド阻害ELISAを行い、p145バリアントのプール内の免疫優性ペプチドを同定した。0.25μg/mlの濃度の選択したペプチドを、p145抗血清と共にインキュベートした。次に、血清を、固定したp145に対するELISAにおいて使用した。抗原(p145)特異的血清を、過剰免疫したB10.D2マウスから集めた。それぞれの棒についてのデータは、平均±SEMである。
【図１Ｃ】ペプチドライブラリーの設計の図である。2つの変更を含むペプチドライブラリー2(L2)の設計:選択した7種のペプチドを利用して、親p145の免疫原性を増強することを同定した位置の2個のアミノ酸置換を含む新しいペプチドライブラリーを設計した。p145最小のエピトープ内の様々な位置の変異を示す得られたペプチドを示す。
【図２Ａ】二重に変異させたペプチドに対する免疫応答のグラフである。免疫ペプチドに対するELISA力価を示す、非近交系クェッケンブッシュマウスにおける選択したペプチドの免疫原性:マウスのコホートを、アジュバントと共に製剤したペプチド抗原を用いて、0、21及び28日目に皮下免疫した。1000未満の抗原特異的力価を有するコホートにおけるマウスに、35日目に、さらにブーストした("として示す)。20、27、34及び41日目に、マウスを出血させた。対照マウスは、オリジナルのp145又はPBSを受け取った。抗原特異的血清IgG力価を、ELISAを使用して決定し、ペプチド1〜5(1i)、6〜12(ii)及び13〜18(iii)についての平均±SEMを示す。
【図２Ｂ】二重に変異させたペプチドに対する免疫応答のグラフである。固定したp145への抗ペプチドIgGの結合:増大する濃度のp145ペプチドに結合する親和性精製したペプチド特異的血清IgGの能力を、ELISAにより決定した。ELISAプレートに固定したペプチドp145を、非近交系クェッケンブッシュマウス由来の異なるペプチド特異的精製血清IgGと共にインキュベートした。5μg/mlの濃度での抗体結合を、(i)ペプチド1〜5及び(ii)ペプチド6〜10(iii)ペプチド11〜13及び(iv)ペプチド15〜18について示す。平均吸光度(450nm)±SEMを示す。Holm-Sidak複数比較検定を用いたANOVAを使用して、p145への比較における有意性を計算した。
【図３】GASの表面へのペプチド特異的抗体の結合効率のグラフである。ペプチド特異的血清IgGの細菌全体に結合する能力を決定するために、フローサイトメトリー解析を、2種のGAS株(A)2031(emm1)及び(B)88/30(emm97)を使用して行った。抗ペプチド抗体とのインキュベーション後、FITCコンジュゲート抗マウスIgGを使用して、GASへの抗体の結合を決定した。結果を、それぞれの群における3種の複製物についての平均蛍光強度(MFI)の平均±SEMとして示す。図中の水平線は、p145 IgGへの比較における、p145への様々なペプチド特異的IgGの相対的な結合を示す。テューキー事後検定法を用いたANOVAを使用して、p145に対する比較における有意性を決定した。(C)GAS 2031、88/30及びJRS145(M陰性GAS株)へのp*17特異的IgGの結合を実証する代表的なヒストグラムを示す。
【図４】様々なGAS株を用いた表在性皮膚感染症に対する保護におけるp145-DT及びそのバリアントp*17-DTの免疫原性及び保護有効性のグラフである。BALB/cマウスのコホート(それぞれn=10匹のマウス)を、0日目に、p145-DT又はp*17-DT又はPBSミョウバン製剤30μgを用いて皮下免疫化した。血清試料を、免疫後20日目に1にて収集して、p145特異的IgG応答をアセスメントした。数匹の代表的なマウス(n=5)のデータを示す(A)。21日目に、マウスに、GAS 2031(B及びC)又はGAS 88/30(D及びE)を用いて感染皮膚経路を介して負荷した。感染後3及び6日目に、5匹のマウス/1群を犠牲にし、試料を収集して、皮膚(B及びD)並びに血液(C及びE)におけるGAS細菌負荷を決定した。結果を、それぞれの時点におけるそれぞれの群における5匹のマウスについての平均±SEMとして示す。テューキー事後検定法を用いたANOVAを使用して、それぞれの時点における全ての処置コホートと対照コホートとの間の有意性を決定した。*p<0.05、***p<0.001。
【図５Ａ】p145及びp*17ペプチドの構造の図である。残基3〜13のCAに基づくアライメントを用いて、50 ns MD刺激から得たp145(紫紅色)及びp*17(緑色)の代表的な構造のオーバーレイ(C末端アミノ酸を赤色で示し、N末端アミノ酸を青色で示す)。Lys-13 13は、p145におけるらせん特徴を破壊する。
【図５Ｂ】p145及びp*17ペプチドの構造のグラフである。らせん形構造に適合するペプチドの可能性を示し、p145が、p*17と比較して、らせん形構造をかなり低く形成する可能性があることを明らかにする。
【図５Ｃ】p145及びp*17ペプチドの構造のグラフである。ルーツが、p145の二重変動(RMSF)を意味し、比較におけるp*17を示す。p145は、p*17と比較して、有意により高い変動を示す。可動性における最大の相違を、p*17におけるAsn-13と比較して、p145におけるLys-13について観察し得る。
【図６】p145バリアントライブラリー内の免疫優性ペプチドの同定のグラフである。ペプチド阻害ELISAを行って、p145バリアントのプール内の免疫優性ペプチドを同定した。2.5μg/mlの濃度の選択したペプチドを、p145抗血清と共にインキュベートした。次に、血清を、固定したp145に対するELISAにおいて使用した。抗原(p145)特異的血清を、過剰免疫したB10.D2マウスから収集した。それぞれの棒についてのデータは、平均±SEMである。
【図７】ペプチド抗血清のヒトタンパク質との交差反応性のグラフである。ELISAを使用して、ヒト由来タンパク質(a)トロポミオシン、(b)ミオシン及び(c)ケラチンに対する二重に変異させたペプチド(L2)抗血清の交差反応性を決定した。平均吸光度(450nm)±SEMを示す。
【図８】1、2又は3回の免疫後のBALB/cマウスにおけるp145-DTの保護有効性のグラフである。BALB/cマウスのコホート(10匹のマウス/1群)は、0、21及び28日目に、アジュバントとのp145-DT又はPBSの1、2又は3回の皮下注射を受けた。88/30 GASを用いた皮膚負荷後のワクチンの有効性を、アセスメントした。マウスのコホートについて、それぞれ、感染後3及び6日目についての皮膚(A)及び血液(B)における細菌負荷を示す。1回の免疫後のp*17-DTの保護有効性:(C)BALB/cマウスのコホート(10匹のマウス/1群)は、0日目に、アジュバントと共にp*17-DT、加熱殺菌GAS(2031)又はPBSを用いて1回免疫を受けた。抗原特異的IgG力価を、免疫後20日目に決定した。加熱殺菌GAS 1を用いて免疫したマウスについての力価を、ELISAプレートに固定した組換えM1タンパク質に対して試験した。マン・ホイットニーの検定を使用して、2つのワクチン接種した群間の有意性、**p<0.01を決定した。(D)免疫後21日目に、マウスに、感染皮膚経路を介して、CovR/S変異体5448AP GASを負荷した。皮膚試料を、感染後3及び6日目に、細菌負荷についてアセスメントした。PBS対照コホートへの比較におけるp*17-DT又は加熱殺菌GAS免疫コホートにおける細菌カウントにおけるパーセント低減を示す。テューキー事後検定法を用いたANOVAを使用して、それぞれの時点における全てのワクチン接種したコホートと対照コホートとの間の有意性を決定した。**p<0.01、***p<0.001。
【図９】筋肉内免疫化スケジュールの図である。マウスを、p*17-DT+K4S2-DT/ミョウバン及び5448AP(CovR/S MT株)を用いた鼻腔内負荷を用いて3回免疫化した。
【図１０】p*17ベースのワクチンを用いた筋中免疫後の免疫原性のグラフである。BALB/cマウス(n=15/1群;メス、4〜6週齢)を、0、21及び42日目に、p*17-DT/ミョウバン、p*17-DT+K4S2-DT/ミョウバン及びPBS/ミョウバンを用いて筋中免疫した。最終ブーストの1週間後、血清及び唾液試料を収集し、p*17特異的IgG(A及びC)及びIgA(B及びD)抗体応答を、ELISAにより測定し、平均±SEMとして表した。力価は、PBS/ミョウバンのみを受け取った対照コホートに対する比較である。
【図１１】鼻腔内感染症後の保護のグラフである。最終のワクチンブーストの2週間後、マウスを、covR/S変異体GAS(5448AP)を用いて鼻腔内感染させた。1〜3日目に、鼻の排出液(NS)を収集した。NSにおける細菌負荷を、5%ウマ脱線維素血を含有するコロンビア血液寒天(CBA)プレートにそれぞれのマウスの鼻孔を押しつけることにより決定し、発散された粒子に筋をつけた。1〜3日目に、NSを収集し、それぞれ個別の日の対数変換平均±SEM(A)及び合わせた全3日間の累積CFU(B)として表した。oは、15%以上の体重減少の2日後に選別したマウスを示す。
【図１２】鼻の排出液の細菌負荷におけるパーセント低減のグラフである。パーセント低減を、それぞれ個別の日のPBS/ミョウバン対照の総平均への比較において(A)及び合わせた全3日間の累積(B)として計算した。oは、15%以上の体重減少の2日後に選別したマウスを示す。
【図１３】鼻腔内感染症後の保護のグラフである。NSに加えて、1〜3日目に、咽頭スワブ(TS)を収集した。咽頭スワブについて、スワブアプリケーターを、無菌のPBSに入れて湿らせ、次に、マウスを固定して、咽頭を拭った。次に、スワブアプリケーターをPBSに懸濁し、連続希釈し、5%ウマ脱線維素血を含有するCBAプレートに二連で点で播いた。1〜3日目に、NSを収集し、それぞれ個別の日の対数変換平均cfu/ml±SEMとして(A)及び合わせた全3日間の累積CFU(B)として表した。oは、15%以上の体重減少の2日後に選別したマウスを示す。
【図１４】咽頭スワブにおける細菌負荷におけるパーセント低減のグラフである。パーセント低減を、それぞれ個別の日のPBS/ミョウバン対照の総平均への比較において(A)及び合わせた全3日間の累積(B)として計算した。oは、15%以上の体重減少の2日後に選別したマウスを示す。
【図１５】鼻腔内感染症後の保護のグラフである。感染後3日目に、全ての生存しているマウスを安楽死させ、NALT、肺、脾臓及び血液試料を収集して、GAS細菌負荷を決定し、データを、対数変換平均cfu/ml±SEMとして(A)及びPBS/ミョウバン対照への比較におけるパーセント低減(B)として表す。oは、15%以上の体重減少の2日後に選別したマウスを示す。
【図１６Ａ】J8ペプチド、p145及びp*17の構造比較のグラフである。らせん性パーセンテージに関してp*17及びJ8ペプチドの構造を含有するMD刺激。
【図１６Ｂ】J8ペプチド、p145及びp*17の構造比較のグラフである。RMS変動に関してp*17及びJ8ペプチドの構造を含有するMD刺激。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
配列の簡単な説明
配列番号1 LRRDLDASREAKNQVERALE
配列番号2 SREAKNQVERAL
配列番号3 LRRDLDASREAKKQVEKALE
配列番号4 SREAKKQVEKAL
配列番号5 LRRDLDAENEAKKQVEKALE
配列番号6 LRRDLDAEDEAKKQVEKALE
配列番号7 LRRDLDAEREAKNQVEKALE
配列番号8 LRRDLDAEREAKKQVERALE
配列番号9 LRRDLDAEREAKKQVEMALE
配列番号10 LRRDLDAVNEAKKQVEKALE
配列番号11 LRRDLDAVDEAKKQVEKALE
配列番号12 LRRDLDAVREAKNQVEKALE
配列番号13 LRRDLDAVREAKKQVERALE
配列番号14 LRRDLDAVREAKKQVEMALE
配列番号15 LRRDLDASNEAKNQVEKALE
配列番号16 LRRDLDASNEAKKQVERALE
配列番号17 LRRDLDASNEAKKQVEMALE
配列番号18 LRRDLDASDEAKNQVEKALE
配列番号19 LRRDLDASDEAKKQVERALE
配列番号20 LRRDLDASDEAKKQVEMALE
配列番号21 LRRDLDASREAKNQVEMALE
配列番号22 LRRDLDA
配列番号23 NSDNIKENQFEDFDEDWENF
配列番号24 KKKKNSDNIKENQFEDFDEDWENF  
配列番号25〜111  それぞれ、ペプチド1〜ペプチド87の下降番号順のTable 3(表3)ペプチドライブラリー
配列番号112 SGSGLRRDLDASREAKKQVEKALE
【００２９】
本発明は、p145ペプチドの特定のアミノ酸を改変して、A群レンサ球菌(streptococci)に対する免疫原性を実質的に改善し得ると言う発見に少なくとも部分的に基づく。複数の免疫化よりむしろ、改変されたp145ペプチドを用いた単回の免疫化は、CovR/S変異株のような高病原性株によるA群レンサ球菌感染症に対する保護をもたらす。より具体的には、改変されたp145ペプチドは、IgAよりむしろIgGの産生により特徴付けられる、粘膜免疫を誘導し得る。粘膜免疫は、ペプチドの筋肉内投与後に、誘発され得る。
【００３０】
本発明の広範な態様は、A群レンサ球菌細菌の感染症に対する免疫を誘導するか、又は誘発するための「p*17ペプチド」として本明細書において言及される、配列番号1のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドの使用に関する。好ましくは、単離されたペプチドは、A群レンサ球菌細菌の感染症に対する粘膜免疫を誘導する。
【００３１】
一部の実施形態において、p*17ペプチドは、SpyCEPタンパク質のフラグメントと組み合わせて投与されてもよい。SpyCEPフラグメントは、本明細書において以下でより詳細に記載される、「S2」ペプチド、例えば、配列番号23のアミノ酸配列を含む、又は配列番号24に記載されるようなアミノ酸配列を含むバリアントであってもよい。
【００３２】
本明細書において使用される、用語「A群レンサ球菌(group A streptococcus)」、「A群レンサ球菌(Group A Streptococci)」、「A群レンサ球菌(Group A Streptococcal)」、「A群レンサ球菌(Group A Strep)」及び略語「GAS」は、化膿性レンサ球菌種(species Streptococcus pyogenes)のグラム陽性β-溶血性細菌であるランスフィールドの血清型Aのレンサ球菌細菌を指す。GASの重要な病原性因子は、Mタンパク質であり、強力な抗食作用であり、血清因子Hに結合し、C3-変換酵素を破壊し、C3bによるオプソニン作用を妨げる。これらはまた、これに限定されることなく、Grahamら、2002、PNAS USA 99 13855に記載されるような、CovR/S又はCovRS変異体のような病原性「変異体」を含む。
【００３３】
A群レンサ球菌により引き起こされる疾患及び状態は、これらに限定されることなく、蜂巣炎、丹毒、膿痂疹、猩紅熱、急性咽頭炎(「レンサ球菌性咽頭炎」)のような咽喉感染症、菌血症、毒素性ショック症候群、壊死性筋膜炎、急性リウマチ熱及び急性糸球体腎炎を含む。
【００３４】
本発明の目的のため、「単離された」は、その天然の状態から取り出されたか、又はそうでなければ、ヒト操作に供された物質を意味する。単離された物質は、その天然の状態においてそれに通常付随する成分を実質的に若しくは本質的に含まないか、又はその天然の状態において通常付随する成分と一緒に人工状態にあるように操作されてもよい。単離された物質は、天然、化学合成又は組換え形態であってもよい。
【００３５】
「タンパク質」は、アミノ酸ポリマーを意味する。アミノ酸は、当該技術分野において十分に理解される、天然又は非天然のアミノ酸、D-又はL-アミノ酸であってもよい。
【００３６】
用語「タンパク質」は、「ペプチド」を含み、包含し、典型的には、それを使用して、50(50)以下のアミノ酸及び「ポリペプチド」を有するタンパク質を記載し、典型的には、それを使用して、50(50)より多いアミノ酸を有するタンパク質を記載する。
【００３７】
本発明者らは、「野生型」又は「改変されていない」p145ペプチドアミノ酸配列の改変は、ペプチドの免疫原性を実質的に改善又は増強することを示した。典型的には、改変は、p145ペプチドの1個又は複数のアミノ酸の置換を含む。
【００３８】
これは、ペプチドの所望のアルファ-らせん構造を維持するために異種性GCN4アミノ酸配列をp145ペプチドに加える必要をなくす。理論により結び付けられることを望まないが、分子動的刺激は、本明細書において開示される改変されたp145ペプチドは、野生型又は改変されていないp145と反対に、その構造における「ねじれ」を有さず、その改善された免疫原性に少なくとも部分的に関与し得ることを示す。
【００３９】
好適には、「野生型」又は改変されていないp145ペプチドは、アミノ酸配列LRRDLDASREAKKQVEKALE(配列番号3)を含む。最小のP145エピトープ配列は、SREAKKQVEKAL(配列番号4)である。
【００４０】
好ましくは、改変されたp145ペプチドは、配列番号3の残基13に対応するN残基及び配列番号3の残基17のRアミノ酸を含む。
【００４１】
好ましくは、改変されたp145の最小のエピトープは、配列番号1の残基6に対応するN残基及び配列番号1の残基10のRアミノ酸を含む。
【００４２】
一実施形態において、p*17ペプチドは、アミノ酸配列LRRDLDASREAKNQVERALE(配列番号1)を含む。
【００４３】
一実施形態において、p*17の改変された最小のエピトープは、アミノ酸配列SREAKNQVERAL(配列番号2)を含む。
【００４４】
本発明はまた、本明細書において開示される、改変されたp145ペプチドのフラグメントを提供する。
【００４５】
「フラグメント」は、タンパク質のアミノ酸配列の100%未満を構成する、タンパク質又はペプチドのセグメント、ドメイン、部分又は領域(例えば、配列番号1、配列番号2、SpyCEP、配列番号23若しくは配列番号24)である。フラグメントが、単一のフラグメントであり得るか、又は単独若しくは他のフラグメントと繰り返されてもよいことは、理解される。
【００４６】
一般に、フラグメントは、最大5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18又は19個の連続するアミノ酸(例えば、配列番号1、配列番号2、SpyCEP、配列番号23又は配列番号24のもの)を含む、から本質的になる、又はからなってもよい。一実施形態において、フラグメントは、配列番号1の残基13に対応するN残基及び配列番号1の残基17のRアミノ酸を含む。フラグメントの非限定的な例は、アミノ酸配列SREAKNQVERAL(配列番号2)を含む。
【００４７】
好適には、フラグメントは、免疫原性フラグメントである。本発明の関係において、本明細書において使用される、用語「免疫原性」は、哺乳動物への免疫原性フラグメントの投与の際に、p145に対応するMタンパク質又はMタンパク質エピトープのような、例えば、A群レンサ球菌又はその分子成分に対する免疫応答を生成するか、又は誘発する能力又は可能性を示す。好ましくは、免疫原性フラグメントにより誘発される免疫応答は、粘膜の免疫応答である。
【００４８】
「免疫応答を誘発する」は、細胞免疫系、抗体及び/又は自然免疫系を含めた免疫系の1種若しくは複数の構成要素の産生若しくは活性を生じるか、又は刺激することを意味する。好適には、免疫系の1種又は複数の構成要素は、Bリンパ球、抗体及び好中球を含む。好ましくは、免疫応答は、粘膜の免疫応答である。典型的には、粘膜の免疫応答は、IgGのような他の抗体アイソタイプの最小の産生と共に、IgAの産生により特徴付けられる。驚くべきことに、本明細書において開示されるp*17ペプチドにより誘発される粘膜の免疫応答は、IgGの産生により特徴付けられる。IgA産生は、IgG産生と比較して比較的低減されるか、又は実質的に存在しない。
【００４９】
本明細書において使用された、タンパク質「バリアント」は、参照アミノ酸配列と関連の定義できるヌクレオチド又はアミノ酸配列を共有する。参照アミノ酸配列は、配列番号1又は配列番号2又は配列番号23等のアミノ酸配列であってもよい。「バリアント」タンパク質は、異なるアミノ酸により欠損されるか、又は置換される参照アミノ酸配列の1個又は複数のアミノ酸を有してもよい。幾つかのアミノ酸が、免疫原性フラグメント及び/又はタンパク質の活性を変化させることなく置換されるか、又は欠損されてもよい(保存的置換)ことは、当該技術分野において十分に理解される。好ましくは、タンパク質バリアントは、参照アミノ酸配列と少なくとも70%若しくは75%、好ましくは、少なくとも80%若しくは85%又はより好ましくは、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の配列同一性を共有する。
【００５０】
特定の実施形態において、バリアントは、配列番号1の残基13に対応するN残基及び配列番号1の残基17に対応するRアミノ酸;又は配列番号2の残基6に対応するN残基及び配列番号2の残基10に対応するRアミノ酸を含んでもよい。したがって、配列番号1又は配列番号2の他の残基の1個又は複数は、バリアントが、配列番号1又は配列番号2の免疫原性を実質的に保持するように、保存的に改変されてもよい(例えば、アミノ酸置換又は欠損により)。この関連で、配列番号1の残基13及び17以外のアミノ酸の改変及び免疫原性に対するそれらの効果を記載するTable 2(表2)及び実施例を参照する。
【００５１】
1つの特定の実施形態において、バリアントタンパク質又はペプチドは、そのN及び/又はC末端に1個又は複数のリジン残基を含んでもよい。複数のリジン残基(例えば、ポリリジン)は、直鎖状配列のリジン残基であってもよいか、又は分岐鎖状配列のリジン残基であってもよい。これらの追加のリジン残基は、増大したペプチド溶解性を促進してもよい。かかるバリアントの非限定的な例は、「K4S2」(配列番号24)と呼ばれる。
【００５２】
それぞれのタンパク質と核酸との間の配列関連を記載するために本明細書において一般的に使用される用語は、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」及び「実質的同一性」を含む。それぞれの核酸/タンパク質は、それぞれ、(1)核酸/タンパク質により共有される完全な核酸/タンパク質配列の1個又は複数の部分のみ、及び(2)核酸/タンパク質間の分岐である1個又は複数の部分を含み得るので、配列比較は、典型的には、「比較ウィンドウ」に対して配列を比較して、配列類似性の局所領域を同定し、比較することにより、行われる。「比較ウィンドウ」は、参照配列に比較される、典型的な6、9又は12個の連続する残基の概念的セグメントを指す。比較ウィンドウは、それぞれの配列の最適なアライメントのため参照配列と比較して、約20%以下の付加又は欠損(すなわち、ギャップ)を含んでもよい。比較ウィンドウを整列させるための配列の最適なアライメントは、コンピューターインプリメンテーションのアルゴリズム(Intelligenetics社によるGeneworksプログラム;Wisconsin Geneticsソフトウエアパッケージリリース7.0のGAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTA、Genetics Computer Group、575 Science Drive Madison、WI、米国、参照により本明細書に組み込まれる)により、又は選択された様々な方法のいずれかにより生成される検査及び最善のアライメント(すなわち、比較ウィンドウによる最大のパーセンテージ相同性を得る)により行われてもよい。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Altschulら、1997、Nucl. Acids Res. 25 3389頁により開示される、プログラムのBLASTファミリーを参照してもよい。配列解析の詳細な考察は、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY編の第19.3章、Ausubelら(John Wiley & Sons Inc NY、1995〜1999)において見ることができる。
【００５３】
用語「配列同一性」は、その最も広い意味で本明細書において使用され、標準アルゴリズムを使用して適切なアライメントを考慮し、配列が比較のウィンドウに対して同一である程度を考慮した、正確なヌクレオチド又はアミノ酸マッチの数を含む。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較のウィンドウに対して2個の最適に整列した配列を比較して、両方の配列で同一の核酸塩基(例えば、A、T、C、G、I)が、生じる位置の数を決定し、一致した位置の数を得て、一致した位置の数を、比較のウィンドウ(すなわち、ウィンドウサイズ)における位置の総数で割り、結果を100倍して、配列同一性のパーセンテージを得ることにより、計算される。例えば、「配列同一性」は、DNASISコンピュータープログラム(ウィンドウズ（登録商標）のバージョン2.5;Hitachi Software engineering Co.、Ltd.社、South San Francisco、California、米国より入手)により計算された「一致パーセンテージ」を意味すると理解され得る。
【００５４】
本発明はまた、本明細書において開示される改変されたp145ペプチドの誘導体を提供する。好適には、改変されたp145ペプチドは、配列番号1又は配列番号2に記載されるアミノ酸配列を含む。
【００５５】
本明細書において使用される、「誘導体」は、当該技術分野において理解される、翻訳後修飾(例えば、リン酸化、アセチル化等)、グリコシル化の修飾(例えば、グリコシル化を付加するか、除去するか、又は変化させること)、脂質修飾及び/又はさらなるアミノ酸配列の包含により、例えば、他の化学部分とコンジュゲートさせるか、又は複合体形成させることにより、変更されているタンパク質、そのフラグメント又はバリアントのような分子である。1つの特定の実施形態において、さらなるアミノ酸配列は、そのN及び/又はC末端に1個又は複数のリジン残基を含み得る。複数のリジン残基(例えば、ポリリジン)は、直鎖状配列のリジン残基であってもよいか、又は分岐鎖状配列のリジン残基であってもよい。これらのさらなるリジン残基は、増大したペプチド溶解性を促進してもよい。別の特定の誘導体は、ペプチドのジフテリア毒素(DT)へのコンジュゲートによる。これは、C末端のシステイン残基の付加により促進され得る。
【００５６】
さらなるアミノ酸配列は、融合タンパク質を生じる融合パートナーアミノ酸配列を含んでもよい。例示の目的で、融合パートナーアミノ酸配列は、単離された融合タンパク質の検出及び/又は精製を助けてもよい。非限定的な例は、金属結合(例えば、ポリヒスチジン)融合パートナー、マルトース結合タンパク質(MBP)、プロテインA、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)、蛍光タンパク質配列(例えば、GFP)、myc、FLAG及び赤血球凝集素タグのようなエピトープタグを含む。
【００５７】
他のさらなるアミノ酸配列は、ジフテリアトキソイド(DT)のような担体タンパク質若しくはそのフラグメント、又は国際公開番号WO2017/070735において記載されるようなCRMタンパク質フラグメントであってもよい。
【００５８】
本発明により企図される他の誘導体は、側鎖への修飾、ペプチド、若しくはタンパク質合成並びにクロスリンカー及び本発明の免疫原性タンパク質、フラグメント及びバリアント上の構造上の制約を強いる他の方法の使用中の非天然のアミノ酸の組込み及び/又はそれらの誘導体を含むが、これらに限定されない。
【００５９】
この関連で、当業者は、タンパク質の化学修飾に関するより包括的な方法論について、CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE編の第15章、Coliganら(John Wiley & Sons NY 1995〜2008)に言及する。
【００６０】
本発明の単離された免疫原性タンパク質、フラグメント及び/又は誘導体は、ペプチドフラグメントを生成するための化学合成、組換えDNAテクノロジー及びタンパク分解性切断を含むが、これらに限定されない、当該技術分野において公知の任意の手段により生成されてもよい。
【００６１】
化学合成は、固相及び液相合成を包含する。かかる方法は、当業者に周知であるが、SYNTHETIC VACCINES編の第9章、Nicholson (Blackwell Scientific Publications)及びCURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE編の第15章、Coliganら(John Wiley & Sons、Inc. NY USA 1995〜2008年)において提供される化学合成技術の例を参照する。この関連で、国際公開番号WO99/02550及び国際公開番号WO97/45444も参照する。
【００６２】
組換えタンパク質は、例えば、Sambrookら、MOLECULAR CLONING. A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press、1989)、特に第16及び17章;CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY編、Ausubelら、(John Wiley & Sons、Inc. NY、米国、1995〜2008年)、特に、第10及び16章;及びCURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE編、Coliganら、(John Wiley & Sons、Inc. NY、米国、1995〜2008年)、特に、第1、5及び6章に記載される標準プロトコールを使用して、当業者により便宜的に調製されてもよい。典型的には、組換えタンパク質調製は、適当な宿主細胞におけるタンパク質をコードする核酸の発現を含む。
【００６３】
本発明のさらなる態様は、配列番号1に記載されるアミノ酸配列を含む単離された免疫原性ペプチド又はそのフラグメント、バリアント若しくは誘導体に結合するか、又はそれに対して生じる抗体若しくは抗体フラグメントを提供する。
【００６４】
好適には、抗体又は抗体フラグメントは、配列番号1に記載されるアミノ酸配列を含む単離される免疫原性ペプチド、又は配列番号2のアミノ酸配列を含むフラグメントに特異的に結合する。一部の実施形態において、抗体又は抗体フラグメントは、p145ペプチドに対して生じた抗体より実質的により高い親和性を有する、p145ペプチド又は配列番号3若しくは配列番号4に記載されるもののような最小のエピトープ配列に結合する。この関係において、「実質的により高い親和性」により、特定の濃度のp145ペプチドにおいて少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9又は10倍より高い親和性を意味する。
【００６５】
抗体及び抗体フラグメントは、ポリクローナル若しくはモノクローナルの天然又は組換え体であってもよい。抗体フラグメントは、Fc、Fab若しくはF(ab)2フラグメントを含み、及び/又は1本鎖Fv抗体(scFvs)を含み得る。かかるscFvは、例えば、それぞれ、米国特許第5,091,513号、欧州特許第239,400号又はWinter & Milsteinによる論文、1991、Nature 349:293頁において記載される方法に従い、調製されてもよい。抗体はまた、複数のscFvを含む、ディアボディ、トリアボディ及び/又はテトラボディ、並びに二量体化活性化デミボディ(demibodies)のような多価の組換え抗体フラグメントを含み得る(例えば、国際公開番号WO2007/062466)。例示の目的で、かかる抗体は、Holligerら、1993、Proc Natl Acad Sci USA 90 6444頁;又はKipriyanov、2009、Methods Mol Biol 562 177頁に記載される方法に従い、調製され得る。抗体産生、精製及び使用に適用される周知のプロトコールは、例えば、Coliganら、CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (John Wiley & Sons NY、1991〜1994)第2章及びHarlow、E. & Lane、D. Antibody: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbour、Cold Spring Harbour Laboratory、1988において見られ得る。
【００６６】
ポリクローナル抗体を産生する方法は、当業者に周知である。使用され得る例示的なプロトコールは、例えば、Coliganら、CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY、上記、及びHarlow & Lane、1988年、上記において記載される。特定の実施形態において、抗SpyCEPポリクローナル抗体は、A群レンサ球菌に曝露される、又は感染した個体由来のヒト血清から得られるか、又は精製されてもよい。あるいは、ポリクローナル抗体は、ウマのような産生種において、精製若しくは組換えSpyCEP、又はその免疫原性フラグメントに対して生じ、次に、投与前に続いて精製されてもよい。
【００６７】
モノクローナル抗体は、本発明の単離されたタンパク質、フラグメント、バリアント又は誘導体の1種又は複数を接種された産生種からもたらされた脾臓又は他の抗体産生細胞を不死化することにより、例えば、Kohler & Milstein、1975、Nature 256、495頁による論文に元々記載された標準的方法を使用して、又は例えば、Coliganら、CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY、上記において記載されるより最近の改変により産生されてもよい。ある特定の実施形態において、モノクローナル抗体又はそのフラグメントは、組換え形態であってもよい。これは、モノクローナル抗体が、非ヒト哺乳類の脾臓細胞により初期に産生される場合に、モノクローナル抗体又はフラグメントを「ヒト化する」のに特に有利であり得る。
【００６８】
一部の実施形態において、抗体又は抗体フラグメントを哺乳類に投与して、A群レンサ球菌感染症に対する「受動」免疫をもたらしてもよい。
【００６９】
本発明のある特定のさらなる態様及び実施形態は、
(i)哺乳動物においてA群レンサ球菌細菌に対する免疫応答を誘発する;
(ii)A群レンサ球菌細菌に対して哺乳動物を免疫化する;及び/又は
(iii)哺乳動物におけるA群レンサ球菌細菌感染症を処置若しくは予防する
ための、配列番号1に記載されるアミノ酸配列を含む単離された免疫原性ペプチド又はそのフラグメント、バリアント若しくは誘導体をコードする1個又は複数の核酸の投与に関する。
【００７０】
本明細書において使用される、用語「核酸」は、1本鎖又は2本鎖DNA及びRNAを命名する。DNAは、ゲノムDNA及びcDNAを含む。RNAは、mRNA、RNA、RNAi、siRNA、cRNA及び自己触媒的RNAを含む。核酸はまた、DNA-RNAハイブリッドであり得る。核酸は、A、G、C、T又はU塩基を含むヌクレオチドを典型的には含むヌクレオチド配列を含む。しかしながら、ヌクレオチド配列は、改変されたプリン(例えば、イノシン、メチルイノシン及びメチルアデノシン)及び改変されたピリミジン(例えば、チオウリジン及びメチルシトシン)のような他の塩基を含んでもよい。
【００７１】
好ましい形態において、免疫原性ペプチド、そのフラグメント、バリアント又は誘導体をコードする単離された核酸は、ヒトのような哺乳動物への投与に適した遺伝子コンストラクトの形態である。好ましい形態において、遺伝子コンストラクトは、ヒトのような哺乳動物のDNAワクチン接種に適している。
【００７２】
好適には、遺伝子コンストラクトは、当該技術分野において十分に理解されている、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、酵母又は細菌の人工染色体の形態であるか、又はその遺伝子成分を含む。遺伝子コンストラクトはまた、組換えDNAテクノロジーによる操作のための、細菌又は他の宿主細胞における単離された核酸の維持及び伝播に適当であり得る。
【００７３】
タンパク質発現の目的のため、遺伝子コンストラクトは、発現コンストラクトである。好適には、発現コンストラクトは、発現ベクター中の1個又は複数のさらなる配列に作動可能に結合された1個又は複数の核酸を含む。「発現ベクター」は、プラスミドのような自己複製する染色体外ベクター、又は宿主ゲノムに統合するベクターのいずれかであり得る。
【００７４】
「作動可能に結合された又は結び付いた」は、前記さらなるヌクレオチド配列が、本発明の核酸に関連する位置にあり、好ましくは、転写を開始するか、制御するか、又はそれでなければ調節することを意味する。
【００７５】
制御ヌクレオチド配列は、一般に、発現が必要とされる宿主細胞又は組織に適当である。多種多様な宿主細胞についての、多数のタイプの適当な発現ベクター及び適当な制御配列が、当該技術分野において公知である。
【００７６】
典型的には、前記1個又は複数の制御ヌクレオチド配列は、プロモーター配列、リーダー又はシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終結配列、翻訳開始及び終結配列、並びにエンハンサー又は活性化因子配列を含み得るが、これらに限定されない。当該技術分野において公知の恒常的又は誘導可能なプロモーターが、本発明により企図される。発現コンストラクトはまた、本発明の組換えタンパク質が、本明細書において上で記載された、融合タンパク質として発現されるように、融合パートナー(典型的には、発現ベクターによりもたらされる)をコードするさらなるヌクレオチド配列を含んでもよい。
【００７７】
好適には、DNAワクチン接種は、1個又は複数のプラスミドDNA発現コンストラクトによる。プラスミドは、典型的には、ウイルスプロモーター(例えば、SV40、RSV又はCMVプロモーター)を含む。イントロンAを含むと、mRNA安定性を改善し、これにより、タンパク質発現を増大させてもよい。プラスミドは、複数のクローニング部位、ウシ成長ホルモン又はウサギベータ-グロブリンポリアデニル化配列のような、強力なポリアデニル化/転写終結シグナルをさらに含んでもよい。プラスミドは、HIV rev増大したエンベロープ発現を伴うか、又は伴わない、マソン・ファイザー・サルウイルスcis-作動転写エレメント(MPV-CTE)をさらに含んでもよい。発現を改善し得るさらなる改変は、ポリアデニル化及び/又は転写終結配列へのエンハンサー配列、合成イントロン、アデノウイルストリパータイトリーダー(TPL)配列及び/又は改変の挿入を含む。DNAワクチンプラスミドの非限定的な例は、Invivogen社から市販されているpVACである。
【００７８】
DNAワクチン学を記載する有用な参考文献は、DNA Vaccines、Methods and Protocols、第2編(Methods in Molecular Medicineシリーズの第127巻、Humana Press、2006)である。
【００７９】
本明細書において上で記載した通り、本発明は、哺乳動物におけるA群レンサ球菌関連疾患、障害又は状態に対して免疫化する、予防又は処置する組成物、ワクチン及び/又は方法を提供する。好適には、A群レンサ球菌関連疾患、障害又は状態に対して免疫化する、予防又は処置する組成物、ワクチン及び/又は方法は、哺乳動物に投与されると、粘膜の免疫応答を誘発する。好ましくは、粘膜の免疫応答は、より低いレベルのIgA、又は不存在のIgAと比較した、IgGの産生により特徴付けられる。
【００８０】
本明細書において一般に使用される、用語「免疫化する」、「ワクチン接種する」及び「ワクチン」は、A群レンサ球に対する保護免疫応答を誘発し、これにより、A群レンサ球によるその後の感染症が、少なくとも部分的に予防されるか、又は最小にされる、方法及び/又は組成物を指す。
【００８１】
本明細書において使用される、「処置すること」、「処置する」又は「処置」は、それが発症し始めた後に、A群レンサ球菌関連疾患、障害又は状態の症状又は病気の徴候を少なくとも部分的に改善するか、除去するか、又は低減する治療介入を指す。処置は、患者に有益であることが絶対的である必要はない。有益な効果は、当業者に公知の任意の方法又は標準を使用して、決定することができる。
【００８２】
本明細書において使用され、「予防すること」、「予防する」又は「予防」は、感染症を予防する、及び/又は症状若しくは病気の徴候を低減するように、A群レンサ球菌による感染、若しくは曝露に先立つ、及び/又はA群レンサ球菌関連疾患、障害若しくは状態の症状若しくは病気の徴候の開始前の、作用コースを指す。かかる予防することは、対象に有益であることが絶対的である必要はないことは、理解されるべきである。「予防」処置は、A群レンサ球菌関連疾患、障害又は状態の症状又は病気の兆候を発症するリスクを減少する目的のため、A群レンサ球菌関連疾患、障害若しくは状態の徴候を示さないか、又は早期の徴候のみを示す対象に投与される処置である。
【００８３】
本発明の関係において、「A群レンサ球菌関連疾患、障害又は状態」は、A群レンサ球菌による感染から生じる任意の臨床病理を意味し、蜂巣炎、丹毒、膿痂疹、猩紅熱、急性咽頭炎(「レンサ球菌性咽頭炎」)のような咽喉感染症、菌血症、毒素性ショック症候群、壊死性筋膜炎、急性リウマチ熱及び急性糸球体腎炎を含むが、これらに限定されない。
【００８４】
ある特定の態様及び実施形態において、本明細書において開示される、p*17ペプチド、フラグメント、バリアント若しくは誘導体、単離された核酸、遺伝子コンストラクト、抗体及び/又は抗体フラグメントは、哺乳動物に、別々に、又は組成物の形態の組み合わせで投与されてもよい。
【００８５】
好ましい形態において、組成物は、許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を含む。
【００８６】
「許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤」は、全身投与において安全に使用され得る、固体若しくは液体充填剤、希釈剤又は封入物質を意味する。特定の投与経路に依存して、当該技術分野において周知の多種多様な担体、希釈剤及び賦形剤が使用され得る。これらは、糖、デンプン、セルロース及びその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝溶液、乳化剤、等調食塩水並びに塩酸塩、臭化物塩及び硫酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩及びマロン酸塩のような有機酸を含む酸性鉱物塩のような塩、水並びにピロゲンフリーの水を含む群から選択されてもよい。
【００８７】
許容可能な担体、希釈剤及び賦形剤を記載する有用な参照文献は、参照により本明細書に組み込まれる、Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co. N.J. USA、1991)である。
【００８８】
好ましくは、免疫応答を誘発する目的のため、ある特定の免疫剤が、p*17ペプチド、フラグメント、バリアント又は誘導体との組み合わせで使用されてもよい。
【００８９】
用語「免疫剤」は、その範囲内に、当該技術分野において周知である担体、デリバリー剤、免疫刺激剤及び/又はアジュバントを含む。当該技術分野において理解される通り、免疫刺激剤及びアジュバントは、組成物の免疫原性及び/又は有効性を増強する1個又は複数の物質を指すか、又はそれらを含む。適当な免疫刺激剤及びアジュバントの非限定的な例は、スクアラン及びスクアレン(又は植物若しくは動物起源の他の油);ブロックコポリマー;Tween(登録商標)-80のような界面活性剤;Quil(登録商標)A、Drakeol又はMarcolのような鉱油、ピーナッツ油のような植物油;コリネバクテリウム・パルバム(Corynebacterium parvum)のようなコリネバクテリウム由来のアジュバント;プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acne)のようなプロピオニバクテリウム由来のアジュバント;マイコバクテリウム・ボビス(Mycobacterium bovis)(バシレ・カルメット(Bacille Calmette)及びゲラン又はBCG);ボルデテラ・パータシス(Bordetella pertussis)抗原;破傷風トキソイド;ジフテリアトキソイド;ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、オクタデシルアミノ酸エステル、リゾレシチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、N,N-ジコクタデシル-N'、N'ビス(2-ヒドロキシエチル-プロパンジアミン)、メトキシヘキサデシルグリセロール、及びプルロニックポリオールのような表面活性物質;ピラン、デキストラン硫酸塩、ポリICカルボポールのようなポリアミン;ムラミルジペプチド及び誘導体のようなペプチド、ジメチルグリシン、タフトシン;オイルエマルジョン;及びリン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム又はミョウバンのような鉱物ジェル;インターロイキン2及びインターロイキン12のようなインターロイキン;インターロイキン1のようなモノカイン;腫瘍壊死因子;ガンマインターフェロンのようなインターフェロン;CpG DNAのような免疫刺激性DNA、サポニン-水酸化アルミニウム又はQuil-A水酸化アルミニウムのような組合せ;リポソーム(例えば、国際公開番号WO2017/070735を参照);ISCOM(登録商標)及びISCOMATRIX(登録商標)アジュバント;マイコバクテリア細胞壁抽出物;ムラミルジペプチド又は他の誘導体のような合成糖ペプチド;アブリジン;脂質A誘導体;硫酸デキストラン;DEAE-デキストラン単独又はリン酸アルミニウムとのDEAE-デキストラン;カルボポールEMAのようなカルボキシポリメチレン;Neocryl A640(例えば、米国特許第5,047,238号)のようなアクリルコポリマーエマルジョン;Montanide ISA 720のような油中水型乳化剤;ポリオウィルス、ワクチン又は動物ポックスウイルスタンパク質;又はそれらの混合物を含む。
【００９０】
免疫剤は、サイログロブリン及びジフテリアトキソイド(DT)のような担体;ヒト血清アルブミンのようなアルブミン;トキシン、トキソイド又はテタヌス、ジフテリア、百日咳、シュードモナス(Pseudomonas)、大腸菌(E.coli)、ブドウ球菌(Staphylococcus)、及びレンサ球菌のトキシンの任意の変異交差反応性物質(CRM);ポリ(リジン:グルタミン酸)のようなポリアミノ酸;インフルエンザ;ロタウイルスVP6、パルボウイルスVP1及びVP2;B型肝炎ウイルスコアタンパク質;B型肝炎ウイルス組換えワクチン等を含み得る。或いは、担体タンパク質又は他の免疫原性タンパク質のフラグメント又はエピトープが使用され得る。例えば、細菌のトキシン、トキソイド又はCRMのT細胞エピトープが使用され得る。この関連で、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5,785,973号を参照してもよい。他の免疫剤は、Mタンパク質以外のA群レンサ球菌タンパク質由来の免疫原性ペプチド、例えば、国際公開番号WO2015/15782において記載されるSpyCEPペプチドを含んでもよい。
【００９１】
ワクチン組成物を産生する任意の適当な手順が、企図される。例示的な手順は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、New Generation Vaccines (1997、Levineら、Marcel Dekker、Inc. New York、Basel、香港)に記載されたものを含む。
【００９２】
一部の実施形態において、組成物及びワクチンは、p*17ペプチド、フラグメント、バリアント若しくは誘導体を発現するよう遺伝子改変され得る減弱若しくは不活化細菌、及び/又は好中球活性を保存若しくは増強することを促進する薬剤の形態で、哺乳動物に投与されてもよい。減弱細菌の非限定的な例は、サルモネラ種(Salmonella species)、例えば、サルモネラ・エンテリカ変種チフス(Salmonella enterica var. Typhimurium)又はサルモネラ・チフス(Salmonella typhi)を含む。或いは、シゲラ種(Shigella species)又は大腸菌のような他の腸の病原体は、減弱形態で使用されてもよい。減弱サルモネラ株は、芳香族アミノ酸生合成経路における遺伝子を不活性化することにより(Aldertonら、Avian Diseases 35 435頁)、芳香族アミノ酸生合成経路(例えば、米国特許第5,770,214号において記載される)における、又はhtrA(例えば、米国特許第5,980,907号において記載される)のような他の遺伝子における、又はompR(例えば、米国特許第5,851,519号において記載される)のような外膜タンパク質をコードする遺伝子における2種の遺伝子に変異を導入すること(例えば、米国特許第5,770,214号において記載される)により構築されている。
【００９３】
経口、直腸、非経口、舌下、口腔、静脈内、関節内、筋肉内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹腔内、脳室内、局所、粘膜及び経皮投与を含む、任意の安全な投与経路が用いられ得るが、これらに限定されない。
【００９４】
1つの特定の実施形態において、投与は、1種又は複数の筋内注射等による筋肉内である。典型的には、鼻腔内投与が、粘膜免疫を誘導するのに最適であると考えられる。驚くべきことに、p*17ペプチドの筋肉内投与は、A群レンサ球菌細菌への粘膜の免疫応答を誘発する。
【００９５】
剤形は、錠剤、分散剤、懸濁剤、注射剤、液剤、シロップ剤、トローチ剤、カプセル剤、鼻のスプレー、坐薬、エアロゾル、経皮パッチ剤等を含む。これらの剤形はまた、この目的のため具体的に設計された徐放性装置、又はこの様式でさらに作用するよう改変されたインプラントの他の形態を注射すること、又は移植することを含み得る。徐放は、アクリル樹脂、ワックス、高級脂肪族アルコール、ポリ乳酸及びポリグリコール酸並びにヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなある特定のセルロース誘導体を含む疎水性ポリマーを用いてコーティングすることにより、引き起こされてもよい。加えて、徐放は、他のポリマー物質、リポソーム及び/又は微小球を使用することにより、引き起こされてもよい。
【００９６】
組成物は、粉末若しくは顆粒として、又は水溶液、非水溶液、水中油型エマルジョン若しくは油中水型液体エマルジョン中の溶液若しくは懸濁液として、予め決定された量の本発明の1種又は複数の治療剤をそれぞれ含有する、カプセル剤、サシェ剤、機能性食品/餌又は錠剤のような別々の単位として提示されてもよい。かかる組成物は、薬学の方法のいずれかにより調製されてもよいが、全ての方法は、上で記載された1種又は複数の薬剤を、1種又は複数の必須の成分を構成する担体と関連付ける工程を含む。一般に、組成物は、本発明の薬剤を、液体担体若しくは細かく分割した固体担体又は両方と均一かつ密接に混合し、次に、必要に応じて、製品を所望のプレゼンテーションに成形することにより、調製される。
【００９７】
上記の組成物は、投薬製剤と適合する様式、及び有効な量で投与され得る。患者に投与される用量は、本発明の文脈で、適当な期間に渡り、患者において有益な応答を引き起こすのに十分であるべきである。投与されるべき薬剤の量は、その年齢、性別、体重及び一般的な健康状態、医師の判断に依存する要因を含む、処置されるべき対象に依存し得る。
【００９８】
前述の方法及び組成物の特定の実施形態において、改変されたp145ペプチド、フラグメント又はバリアントは、SpyCEPタンパク質の免疫原性フラグメントと組み合わせて投与されてもよい。SpyCEPタンパク質フラグメントが、好中球の産生、遊走及び/若しくは走化性並びに/又は好中球の1種又は複数の免疫活性の増強又は保存を直接又は間接的に少なくとも部分的に増大させることにより、好中球活性の保存又は増強を促進する薬剤として作用してもよいことは、理解される。典型的には、SpyCEPフラグメントは、インターロイキン8をタンパク分解切断するSpyCEPセリンタンパク質分解酵素に対する阻害免疫応答を誘発する。SpyCEPは、ヒト病原体化膿性レンサ球菌の表面に発現した170-kDaの多ドメインセリンタンパク質分解酵素であり、好中球走化性因子インターロイキン-8の切断及び不活性化を触媒することにより、感染において重要な役割を果たす。SpyCEPアミノ酸配列の非限定的な例は、受託番号YP597949.1及び(化膿性レンサ球菌(S.pyogenes)MGAS10270)及びYP596076.1(化膿性レンサ球菌MGAS9429)の下で見られ得る。好ましくは、SpyCEPのフラグメントは、S2ペプチド(配列番号23)又はK4S2ペプチド(配列番号24)のようなバリアントであるか、又はそれを含む。
【００９９】
一部の実施形態において、改変されたp145ペプチド、フラグメント又はバリアント及びS2ペプチド、フラグメント又はバリアントは、単一のキメラペプチドとして提供されてもよい。この実施形態において、改変されたp145ペプチドは、S2ペプチドのN末端又はC末端であってもよい。
【０１００】
本明細書において一般的に使用される、用語「患者」、「個体」及び「対象」は、本明細書において開示される処置又は組成物の任意の哺乳動物レシピエントの関係で使用される。したがって、本明細書において開示される方法及び組成物は、医療及び/又は獣医適用を有してもよい。好ましい形態において、哺乳動物はヒトである。
【０１０１】
本発明が、完全に理解され、実際の効果に移し得るように、以下の非限定的な実施例を参照する。
【実施例】
【０１０２】
導入
小ペプチドエピトープの免疫原性を増強する能力は、一般に、ワクチン開発を促進する。抗体産生のための免疫原性を改善するために取るアプローチは、エピトープのより密接に似ている天然構造を生じる新規フォールディングテクノロジー(例えば、(5))又は抗原提示細胞(例えば、(6、7))又はヘルパーT細胞(8、9)を活性化するペプチドを有するさらなる分子を組み込むストラテジーを中心とする。
【０１０３】
その免疫原性を改善するためにペプチドの配列を変更するアプローチも考慮する。ヘテロクリティックなペプチドを、T細胞の免疫原性の増強について試験した(10)。しかしながら、ほぼ全てのワクチンが、保護抗体の産生に頼り、ここで改変したペプチドを大いに無視するが、最小の4-アミノ酸エピトープの外側のアミノ酸改変は、モノクローナル抗体によるペプチド認識を改善することができることを示し、これは、このアプローチが、ワクチン開発に有用であり得ることを示唆している(11)。免疫原性を改善するための複合体エピトープの配列改変及び最小のエピトープ内の改変は、有効性を増強する様式として試験していない。
【０１０４】
化膿性レンサ球菌のMタンパク質由来の保存ペプチドエピトープは、合理的に設計し、保護抗体を誘導する増強した複合体ペプチド免疫原を試験するストラテジーを開発するための理想的な焦点及び機会をもたらす。Mタンパク質は、保存カルボキシル末端領域、及びアルファらせん構造を有する20-アミノ酸ペプチド「p145」を有し、広範な株-保護抗体を含み得ることが記載されている((12)において概説される)。12個のアミノ酸の最小のB細胞エピトープは、p145内に存在する。しかしながら、20個のアミノ酸全体が、最小のエピトープのらせんフォールディングを維持することが必要である。このエピトープは、生物にとって潜在性である。
【０１０５】
化膿性レンサ球菌への曝露は、通常、p145に対する抗体の産生を生じない(13)、(14)が、ワクチン接種により最小のエピトープに対して誘導された抗体は、生物を死滅し得る。免疫は、複数ラウンドのワクチン接種を必要とし、保護は、免疫応答の強さと相関する(15)。
【０１０６】
本研究において、最小のB細胞エピトープ内での反復ラウンドの標的アミノ酸置換を行い、p145バリアントを生成した。結果として、単回の免疫化を、免疫を誘導するのに1回必要とするように、p145及びレンサ球菌に結合するペプチド-抗血清の免疫原性及び能力は、有意に増大し、ワクチン有効性を増強した。本発明者らは、親ペプチドを用いてワクチン接種した対照マウスと比較して、浸潤性レンサ球菌疾患からの10,000倍増強したレベルの保護を観察した。
【０１０７】
材料及び方法
ペプチド
ペプチドを、Mimotopes Pty Ltd社(Victoria、Australia)から得た。ペプチドライブラリー(p145を含む87種のペプチド)を、N5末端にカップリングしたビオチンを有する切断したPepSetとして購入し、4個のアミノ酸のリンカー(SGSG)を、ペプチドとビオチンとの間に加えた。ペプチドを、N末端を介してビオチン化して、リガンド結合との干渉を最小にした。p*1-p*18ペプチドを、最小純度>90%を有するカスタムペプチドとして得た。さらなるシステイン残基を、それぞれのペプチドのN末端に加えて、ゲルスピンカラムにカップリングすることを可能にした(以下を参照)。ELISAにおけるコーティングのため使用したp145を、QIMR Berghofer Medical Research Institute、DNA and Peptide Unit又はChina peptidesにて合成した。C末端のシステイン残基を有するp*17ペプチドをChina peptidesにて合成し、他で記載される通り、DTにコンジュゲートさせた(16)。
【０１０８】
抗血清
ペプチドスクリーニングのため使用した抗血清は、J8で免疫したB10.BR、J8-DTで免疫したBALB/c、又はp145で免疫したBALB/c、クェッケンブッシュ及びB10.D2マウス由来であった。
【０１０９】
細菌
GAS株、2031(emm1)は、プラハ委託センターの単離物であり、8830(emm97)は、オーストラリアのNorthern Territoryの臨床単離物である(17)。両方の株を、Menzies School of Health Research(MSHR)から得て、in vivo研究のためマウスに適合させ、ストレプトマイシン抵抗性(200μg/mL)を生じさせた。JRS145は、M-タンパク質陰性変異体である。
【０１１０】
酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)
ビオチン化ペプチドを用いたELISAを、製造元(Mimotopes社、オーストラリア)が推奨する通り、行った。簡単に言うと、水中の最終濃度5μg/mlのストレプトアビジン(Sigma-Aldrich社、オーストラリア)のアリコート100μlを、Oltrack活性化96ウェルマイクロタイタープレート(Concentrack社、オランダ)に加え、37℃にて一晩インキュベートした。ウェルを、1時間、RTにて、0.05% Tween20及び1%カゼインナトリウムを含有するPBS200μl、pH7.2を用いてブロッキングし、その後、PBS/Tween20を用いて洗浄した。ペプチドを、0.1%アジ化ナトリウムを含むPBS/Tween20において、作用濃度20μg/mlまで希釈し、それぞれ100μlをウェルに加え、1時間、RTにてインキュベートした。完全に洗浄後、マウスp145又はJ8抗血清を加えた。プレートを、1時間、RTにてインキュベートし、洗浄し、HRPコンジュゲートヤギ抗マウスIgG(Bio-Rad社、オーストラリア)(1/3000)を、さらに20分間、RTにて加えた。さらに洗浄後、OPD基質(Sigma-Aldrich社)を加え、OD450にて測定した。力価を、同じ希釈の正常マウス血清を含有する対照ウェルの平均ODより3標準偏差(SD)より大きい光学密度(OD)読み取り値を示す最高希釈として定義した(19)。
【０１１１】
阻害アッセイのため、マイクロタイタープレートを、75mM炭酸ナトリウム中、pH9.6の終濃度5μg/mlの精製p145 100μlで、4℃、一晩コーティングした。プレートを、洗浄バッファー(0.05%Tween20、pH7.2を有するPBS)を用いて洗浄し、90分間、37℃にて、5%スキムミルクを添加した洗浄バッファー(ブロッキングバッファー)を用いてブロッキングした。抗p145抗血清を、ペプチドライブラリーから選択した、変動する濃度(0.25μg/ml〜2.5μg/ml)のペプチドと、30分間、RTにてインキュベートした。その後、試験抗血清を、ブロッキングしたプレートに加え、90分間、37℃にてインキュベートした。プレートを、4回洗浄し、HRPコンジュゲートヤギ抗マウスIgG(Biorad社、オーストラリア)(1/3000)を加え、さらに90分間、37℃にてインキュベートした。さらに洗浄後、プレートを、上の通り発展させて、OD450にて測定した。
【０１１２】
ヒト心臓タンパク質との交差反応性についての解析において、5μg/mlトロポミオシン、ミオシン又はケラチン(Sigma-Aldrich社、オーストラリア)を、マイクロタイタープレートにおいて固定した。上の通りブロッキングし、洗浄後、プレートを、90分間、37°Cにて、それぞれ、3つ組みの抗ペプチド(p*1〜p*18)血清(1/100)とインキュイベートした。その後、2次抗体及び基質を、上の通り加えた。
【０１１３】
マウスの免疫化
全てのプロトコールは、オーストラリアのNational Health and Medical Research (NHMRC)ガイドラインに従い、QIMR Berghofer Medical Research Institute's Animal Ethics Committeeにより承認された。0日目に、クェッケンブッシュマウス(Animal Resources Centre、オーストラリア)(1群当たりn=3匹)に、総体積50μlにおいてフロイント完全アジュバント(CFA)と1:1で乳化した異なるペプチド30μgを尾部基部に皮下(s.c.)接種した。対照マウスは、無菌濾過したCFA中のPBSを受け取った。初回免疫化の3週間後、マウスは、1週間の間隔(21及び28日目)で与えた免疫原(無菌濾過したPBS中それぞれ30μg)の2回の追加免疫化を受けた。1000未満の抗体力価を有するマウスの群は、フロイント不完全アジュバントと1:1で乳化した第3のブーストを受けた。加熱殺菌GAS 2031(emm1)を、既に記載した通り、調製した(18)。皮膚負荷研究のため、BALB/cマウス(n=10匹/群)を、尾部にて、ミョウバンにおいて製剤化したp145-DT又はp*17-DT又は加熱殺菌2031GAS調製物30μgを用いて1回s.c.免疫した。p145用量範囲研究について、0日目でのp145-DT/ミョウバンを用いた初回免疫後、特定のコホートに、21及び28日目に1又は2回のブーストを投与した。対照マウスは、アジュバント単独を受けた。血液を、それぞれのマウスから、ブーストの1日前及び最終免疫化の1週間後に収集した。血液を、4℃にて少なくとも4時間、凝血させて、1000gにて10分間の遠心分離後、血清を収集した。血清を-20℃にて保存した。
【０１１４】
血清の親和性精製
ペプチド特異的血清の精製のため、Microlinkペプチドカップリングキット(Pierce社、米国)を、製造元の指示に従い使用した。簡単に言うと、それぞれのペプチドを、結合バッファー中0.6mg/mlまで希釈し、Ultralink  ヨードアセチルゲルスピンカラム(Pierce社、米国)に固定した。カラムを、カップリングバッファーを用いて徹底的に洗浄し、L-システインHCl(10mg/ml)を用いてブロッキングした。その後、カラムを、洗浄バッファー、続いてPBSを用いて洗浄した。親和性精製のため、異なるクェッケンブッシュ血清300μlを、それぞれのカラムに加え、回転しながら、4℃にて一晩インキュベートした。カラムを、PBSを用いて3回洗浄し、抗体を、溶出バッファー100μlを用いて溶出した。その後、カラムを洗浄し、上の通り再度ブロッキングし、さらなる血清を加えた。Nanodrop(Thermo Scientific社、米国)を使用することにより、溶出した免疫グロブリン(Ig)濃度を推定した。濃度5μg/mlの精製したIgG調製物、続いて2倍連続希釈液を、変動する濃度のp145へのそれらの結合についてアセスメントした。
【０１１５】
フローサイトメトリー
化膿性レンサ球菌へのペプチド抗体の結合を、フローサイトメトリーにより解析した。細菌を、1%ネオペプトンを含むトッド・ヒューウィット培地(THB)において一晩成長させ、PBSにおいて2回洗浄した。その後、細菌(3×107個のコロニー形成単位;cfu)を、Fcブロッカー100μlと、15分間、RTにて事前インキュベートし、続いて、濃度10mg/mlのペプチド抗体を加えた。30分間のRTでのインキュベーション後、細菌を、PBSにおいて2回洗浄し、続いて、FITCコンジュゲート抗マウスIgG(2%BSAを含むPBS中1/50希釈した)とインキュベートし、総体積100μlを、さらに30分間、RTにて加えた。細菌を洗浄し、1%ホルムアルデヒド(PBS中)300μlにて、15分間、RTにてインキュベートし、次に、FACS Calibur  フローサイトメーター1(Becton Dickinson社、米国)における読み取りまで、氷上に移した。
【０１１６】
FITCコンジュゲート抗マウスIgGを、解析したそれぞれの株についての陰性対照として別々に加え、加えて、非特異的マウスIgGを対照として含めた。
【０１１７】
GAS皮膚負荷の手順
化膿性レンサ球菌2031(emm1)、88/30(emm97)及び5448AP(emm1)を、1%ネオペプトン(THBN)を含むTHBにおいて一晩培養し、THBNにおいて2回洗浄し、オリジナルの体積の25%に再懸濁した。接種用量(CFU/ml)を、600nmにおける光学密度及び2%ウマ血液THB寒天上の細菌懸濁液の10倍希釈液を播種することにより、決定した。37℃での一晩のインキュベーション後、コロニーカウントを決定した。最終免疫化の2週間後、免疫化したマウス及び対照マウスに、選択したGAS株を、既に記載した通り(19)、皮膚の感染経路を介して負荷した。
【０１１８】
分子力学(MD)シミュレーション
ペプチドp*17及びP145の分子力学(MD)シミュレーションを行い、それらの免疫原性の可能性のある分子バイアスを調べた。結合したC末端のシステインを有するそれらの配列を、PEP-FOLDサーバー(20)に提出して、初期の構造モデルを構築した。これらのモデルを、MDシミュレーションのための開始点として使用し、GROMACS 5において行った(21)。全ての残基を、Amber ff14SB力場を用いてパラメーター表記した(22)。それぞれのペプチドを、溶質とボックスエッジとの間の最短距離1.2nmを有する十二面体のボックスに入れ、続いて、TIP3P水分子を用いて溶媒和させた(23)。次に、塩イオンを、濃度0.15Mまで、システムのバランスイオン電荷に加えた。エネルギー最小化を、急勾配で降下のインテグレーター及び続いてコンジュゲート勾配アルゴリズムを用いて行い、任意の原子上500kJ mol-1nm-1未満の最大力を達成した。Verletカットオフスキーム(24)を使用して、ファンデルワールスと0.8nmで切断した静電気相互作用との両方を用いて、狭い範囲の非結合相互作用を評価した。広範囲の静電気相互作用を、粒子メッシュEwald(PME)方法(25、26)により処理した。結合定数0.1psを用いてサーモスタットの再度スケールを確定した速さを使用して、温度を298Kにて維持し(27)、一方、結合定数1psを用いてBerendsen圧調節器を使用して、圧力を1.0atmにて維持した(28)。
【０１１９】
シミュレーションを、タイムステップ2fsを用いて行い、水素原子を含む全ての結合を、並行の直線制約ソルバ(P-LINCS)により強いた(29)。それぞれのシステムを、100psについての一定体積(NVT)アンサンブル下、及び100psの一定圧(NPT)アンサンブル下で平衡化した。力の定数1000kJ mol-1nm-2
を用いた調和位置抑制を、非溶媒分子の全ての重原子に適用した。平衡後、抑制なしのそれぞれのシステムについて100ns間、産生MDシミュレーションを行った。3回の複製MD実行を初期の速さの生成のための乱数シードを変動させることにより、それぞれのシステムについて実行した。平衡を可能にするためのそれぞれの100-nsの実行の最終40nsにてGROMACS 5の本来のプログラムにより、MD軌跡の解析を行った。
【０１２０】
統計的分析
標準公式を使用して、平均及び標準誤差を計算した。マン・ホイットニーの検定を使用して、2群間の抗体力価を比較した。別段指定しない限り、複数の比較のためのボンフェローニ方法を使用して、P値を訂正した。テューキー事後検定法を用いたANOVAを使用して、それぞれの時点における試験した全てと対照コホートとの間の有意性を決定した。
【０１２１】
結果
本発明者らの目標は、p145内の最小の12個のアミノ酸エピトープ内の変異配列の反復ラウンドの選択を使用して、p145と比較して、GASに対する優れたペプチド免疫原を設計することであった(Table1(表1))。当初、本発明者らは、変異ペプチドライブラリー(L1)を設計して、p145の抗原性が単一の変異と共に増大し得るかどうかを問うた。本発明者らは、抗原性を増強するが、公知のヒトタンパク質に似ている配列を生じることなく、変異を同定することを考えた。
【０１２２】
L1において、1個のアミノ酸を、一度に変化させ、アミノ酸置換を、アルファらせんとしてフォールディングしたペプチドを維持することと関連するそれらの物理化学特性に基づき選択した(5、11、30)。得られたライブラリーは、p145の86種のバリアント及びオリジナルのp145からなっていた(Table 3(表3))。加えて、非特異的ペプチド(pNS[#87])を対照として含めた。それぞれのペプチドへのp145抗血清の結合を、ELISAを使用して解析した。これらの研究において、同量のそれぞれのペプチドがプレートに結合したことを確実にするために、本発明者らは、ストレプトアビジンを介してプレートに結合した、ビオチン化ペプチドを使用した。4個のアミノ酸ペプチドリンカーを、変異ペプチドとビオチンとの間に置き、抗体認識に十分な空間を確実にした。抗血清を、p145で免疫化したB10.D2、BALB/c及び非近交系クェッケンブッシュマウスから得た。3種の異なるマウス株のそれぞれについて、バリアントペプチドへの抗血清の結合は、最小であるものから、p145へのそれらの結合と比較してわずかに増強したものの範囲にあった(図1A)。大抵の置換は、低減した結合を生じた。さらに、類似の結果を、それぞれ、B10.BR又はBALB/cマウスから採取したJ8又はJ8-DT抗血清を用いて得た(データは示していない)。
【０１２３】
非特異的ペプチドを、全てのペプチドの最小ウェルに認識した。本発明者らは、p145特異的抗血清が、p145と類似又はより良好な結合を示した17種のペプチドを同定し、溶液中のこれらのペプチドが、親p145ペプチドへのp145特異的抗血清の結合を阻害するかどうかを問うた。これらのペプチドは、2種の異なる濃度(0.25μg/ml及び2.5μg/ml)にて、阻害ELISAにて試験した場合、用量依存性応答を示した(図1B及び図6)。両方の濃度にて、ペプチドは、恐らく、p145に類似するフォールディングを保持していたことに起因して、p145と同程度まで溶液中の抗p145抗体の結合を阻害したが、明らかに優れたものはなかった(図1B及び図6)。
【０１２４】
ヒト特異的抗体の誘導を回避するために、本発明者らは、アミノ酸置換が、バイオインフォマティクスプログラム(BLASTP及びClustal Omega社)を使用して、ヒトタンパク質に密接に関連した配列を生じたかどうかを解析した。3種のペプチド(2、9及び41)を、ルートレチン(毛様体ルートレットコイルドコイルタンパク質)、ダイナクチン1、B細胞受容体関連タンパク質29、微小管-アクチン架橋結合因子1及びミオシン(重ポリペプチド7B、心筋、ベータ、アイソフォームCRA_c)を含むヒトタンパク質との類似性(>50%配列同一性)に起因し、さらなる考察から排除した。故に、7種のペプチドが、初代スクリーニング(5、6、11、13、40、66、及び72)から出現し、p145最小エピトープ内の4つの位置:S1E、S1V、R2N、R2D、K6N、K10R及びK10Mにて変異を含んでいた(図1C)。
【０１２５】
これらのペプチドにおける単一の変異が、p145-抗血清によるわずかに増強した認識をもたらしたことを理由に、次に、本発明者らは、第2のライブラリー、L2を設計し、それは、上で同定した7種のアミノ酸変異から2種の変異の全ての可能性のある組合せを含む18種のペプチドを含有していた。これにより、p*1〜18と命名したペプチドを得た(Table 2(表2))。
【０１２６】
本発明者らは、非近交系(クェッケンブッシュ)マウスにおいてこれらの二重に変異させたペプチドの免疫原性を調べた。ペプチドの免疫原性は、変動したが、p*14及びp*16と命名した抗体を除く全てが、3回の免疫化後1 105〜106の間の力価を最も生じる免疫化ペプチドに対する抗体を生じた(図2A)。p*14、p*15及びp*16を除く全てのペプチドは、p145より有意に免疫原性であった。最も免疫原性のペプチドは、p*17であった。次に、p*14及びp*16を除く全てのペプチドに対する抗体を、免疫化ペプチドを使用して親和性精製し、本発明者らは、プラスチックに固定したp145ペプチドのタイトレーション濃度に対する抗体それぞれの相対的結合を確認した。それぞれのプレートを、5μg/mlの精製抗体とインキュベートした。
【０１２７】
7種のペプチド(p*2、p*4、p*6、p*10、p*13、p*17、及びp*18)により誘導された抗体は、p145により誘導された抗体より高い親和性、固定したp145への有意により強い結合を示した(図2B)。本発明者らは、これらの7種のペプチドのうち5種(p*4、p*10、p*13、p*17及びp*18)が、K10変異を有していたことに気付いた。次に、本発明者らは、フローサイトメトリーを使用して、共に正確に同じp145配列を含有する、異なるemmタンパク質-2031(emm1)及び88/30(emm97)を発現するレンサ球菌の表面にそれぞれ同じ濃度での親和性精製抗体の結合を調べた。
【０１２８】
p*2、p*4、p*17、及びp*18に対する抗体は、両方のGAS株に、最大の結合を示す抗p*17 IgGを有する、p145により誘導された抗体と比較してずっとより高い程度まで結合した(図3A〜3B)。大抵のペプチド抗血清について、p145への結合と細菌表面への結合との間に相関が存在し、p*17に対する抗血清は、p145とレンサ球菌両方への最大の結合を示している(図2B及び図3)。この抗血清をまた、emm-陰性株(JRS145)に対して試験した。この株に対して結合を観察せず(図3C)、抗体が、Mタンパク質内のエピトープを認識したことを確かにした。
【０１２９】
大抵の有効なペプチド(p*2、p*4、p*17、及びp*18)のうち、ペプチド*2及び*4は、これらのペプチド両方に対する抗体が、アルファらせん繊毛ヒトタンパク質を認識したので、さらには考慮に入れなかった(図7)。したがって、2種のペプチド、p*17及びp*18をさらなる考慮に止め、本発明者らは、その優れた免疫原性に起因して、p*17に焦点を当てた。
【０１３０】
p*17が、p145より免疫原性であったこと、p*17への抗体が、p145自体により誘導された抗体より、より高いp145への親和性を実証したこと、及びそれらが、p145により誘導された抗体より強く、レンサ球菌の異なる株に結合したことを示し、本発明者らは、p*17が、p145への優れたワクチンであるかどうかを問うた。ジフテリアトキソイドにコンジュゲートしたp145(p145-DT)は、レンサ球菌皮膚負荷に対して保護することができるが、3回用量のワクチンを必要とする(補足の図3A及び図3B)。したがって、p*17を、ジフテリアトキソイドにコンジュゲートさせ、単回用量のワクチンのみを使用して、p145-DTを用いた接戦の研究において比較した。本発明者らは、コンジュゲートペプチドを使用して、抗ペプチド応答について類似の程度のヘルパーT細胞をもたらし、これが、本発明者らが、B細胞についてペプチドの免疫原性を直接比較することを可能にする。
【０１３１】
BALB/cマウスを、それぞれミョウバンにおいて製剤したp*17-DT、p145-DT又はPBSを用いて皮下免疫化した。免疫原はDTにコンジュゲートしたが、本発明者らは、p*17-DTにより誘導されるp145特異的抗体力価が、ワクチン接種の3週間後に測定したとき、p145-DTにより誘導されたものより有意に高いことに気付いた(図4A)。次に、マウスに、皮膚経路を介して、GASの2031(emm1)又は88/30(emm97)株を負荷して、ワクチン有効性を決定した。再度、2031又は88/30GASに対するp145-DTの単回用量を用いたワクチン接種により、保護を与えなかった(図4B及び図4D)。しかしながら、p*17-DTを用いたワクチン接種は、p145-DTを用いてワクチン接種したマウスと比較して、負荷の6日後の皮膚細菌負荷における100〜1000分の1の低減を生じた(図4B及び図4D)。さらに、p*17-DTワクチン接種は、マウスにおける2031GASに起因して、菌血症からの無菌保護を生じた(p145-DTを用いて接種したマウスと比較して、細菌血液負荷における>10,000分の1の低減)(図4C)。加えて、p*17-DTをワクチン接種したコホートは、感染の6日後まで、88/30に起因して、全身感染を完全に解決し、一方、p145及びPBSを用いて免疫したコホートは、依然として有意により高い菌血症を有していた(図4E)。
【０１３２】
p*17-DTの保護能力を、CovR/S変異株を利用する1種の別の研究においてさらに示した。p*17-DTを用いた1回のワクチン接種は、高ペプチド特異的力価を誘導し(図8C)、PBS対照コホートとの比較において、皮膚細菌負荷における>90%の低減を生じた(図8D)。さらに、保護のレベルを、加熱殺菌GASにより生じたものと比較して、有意により良好であった(図8D)。
【０１３３】
したがって、p*17、p145の非天然の誘導体は、p145自体がし得る、力価及び親和性に関して、p145に対する優れた抗体反応を誘導することができ、レンサ球菌を認識し、それに対して保護する抗体の誘導に関して、p145に対する有意に優れた免疫原である。有意な構造の相違が、この矛盾を説明し得るp145とp*17との間に存在するかどうかを問うために、本発明者らは、分子動力学(MD)シミュレーションを使用して、ペプチドを解析した。シミュレーションにより、p145におけるらせんが、おそらく、12位及び13位の正に荷電したKsの破壊効果に起因して、12位と14位との間で破壊することを明らかになった(図5A)。p*17は、13位の荷電していないアスパラギン(N)を有し、らせんのフォールディングを促進する。データはまた、p145ペプチドが、恐らく、p*17よりらせん構造に適合すること(<50のらせん性パーセンテージ対<80;図5B)を実証し、より高い柔軟性を示した(RMS変動;図5C)。
【０１３４】
図9におけるスケジュールに従ったさらなる実験において、p*17単独又はS2ペプチドと一緒の筋肉内免疫化を調べた。マウスを、p*17-DT+K4S2-DT/ミョウバンを用いて3回免疫化し、5448AP(CovR/S MT株)を用いて鼻腔内負荷した。図10は、p*17ベースのワクチンを用いたi.m.免疫後の免疫原性を示す。BALB/cマウス(n=15匹/群;メス、4〜6週齢)を、0、21及び42日目に、p*17-DT/ミョウバン、p*17-DT+K4S2-DT/ミョウバン及びPBS/ミョウバンを用いて、i.m.免疫した。最終ブーストの1週間後、血清及び唾液試料を収集し、p*17特異的IgG(A及びC)及びIgA(B及びD)抗体応答を、ELISAにより測定し、平均±SEMとして表す。力価は、PBS/ミョウバンのみを受け取った対照コホートへの比較においてである。
【０１３５】
図11は、鼻腔内感染後の保護を示す。最終ワクチンブーストの2週間後、マウスを、covR/S変異体GAS(5448AP)を用いて鼻腔内感染させた。1〜3日目に、鼻の排出液(NS)を収集した。NSにおける細菌負荷を、5%ウマ脱線維素血を含有するコロンビア血液寒天(CBA)プレートにそれぞれのマウスの鼻孔をプレスすることにより決定し、発散された粒子を画線した。1〜3日目に、NSを収集し、それぞれの個別の日の対数変換平均±SEMとして(A)、及び合わせた全3日間の累積CFU(B)として表した。鼻の排出液の細菌負荷におけるパーセント低減を、図12に示す。
【０１３６】
図13は、鼻腔内感染後の保護を示す。1〜3日目のNSに加えて、咽頭スワブ(TS)を収集した。咽頭スワブについて、スワブアプリケーターを、無菌のPBSに入れて湿らせ、次に、マウスを固定し、咽頭を拭った。次に、スワブアプリケーターを、PBSに懸濁し、連続希釈し、5%ウマ脱線維素血を含有するCBAプレートに二連で点で播種した。1〜3日目に、NSを収集し、それぞれの個別の日の対数変換平均cfu/ml±SEMとして(A)、及び合わせた全3日間の累積CFU(B)として表す。図14は、咽頭スワブにおける細菌負荷の低減を示す。
【０１３７】
図15は、鼻腔内感染後の保護を示す。感染の3日後、全ての生存マウスを安楽死させ、NALT、肺、脾臓及び血液試料を収集して、GAS細菌負荷を決定し、データは、対数変換平均cfu/ml±SEMとして(A)、及びPBS/ミョウバン対照への比較におけるパーセント低減として(B)表す。
【０１３８】
本発明者らは、p*17-DT/ミョウバンを用いた3×i.m.免疫が、GASを用いた鼻腔内負荷に対して保護したことをさらに観察した。それぞれ、鼻の排出液と咽頭スワブにおける細菌負荷において70%〜90%の低減が存在した。加えて、全身細菌負荷における70%より高い低減が存在した。これは、これらのマウスが、血清又は唾液IgAを誘導しないという事実にも関わらずであった。興味深いことに、本発明者らは、i.m.免疫後に唾液IgGの誘導を観察した。抗体応答の決定のため、本発明者らは、エンドポイントの力価として定義した半定量的解析(ELISA)を行った。p*17-DT(K4S2を含むか、又は含まない)を用いた筋肉内ワクチン接種を利用した実験において、粘膜IgA応答は検出可能でなく、一方、粘膜IgG応答は、少なくとも10倍高かった。
【０１３９】
p*17の増強した免疫原性をさらに支持するJ8とp*17ペプチドとの間の相違を示唆する、J8ペプチド、p145及びp*17の構造比較を行った。J8は、28-merであり、一方、p*17は、20-merペプチドである。2種のペプチドは、10個のアミノ酸を共有し、太字で示すレンサ球菌のアミノ酸である、天然のペプチドp145(図16)からもたらされる。J8とp*17を比較するMDシミュレーション研究は、両方のペプチドがらせんとしてフォールディングするが、J8が、p*17への比較においてより柔軟であることを実証した。本発明者らは、p*17の全体的な3次元構造が、それをより安定にし、これが、宿主分子とのより良好な相互作用を促進すると考える。さらに、p*17(J8よりレンサ球菌配列に、より類似)のアミノ酸組成物は、恐らく、J8より良好な生物の天然の構造を認識する抗体を誘導する。
【０１４０】
考察
ペプチドワクチンの開発は、ペプチドの免疫原性を増大させる技術により非常に促進されるであろう。選択的アミノ酸置換を使用して免疫原性を改変する研究は非常に希であり、試験する場合はこれらは、CD8+T細胞の刺激を増強するためのエピトープ改変に焦点を当てており、その結果は様々であった。ここで、本発明者らは、化膿性レンサ球菌由来の複合体12個のアミノ酸らせん合成ペプチドの免疫原性を有意に増強する戦略を記載する。いくつかの二重に改変したペプチドは、免疫化ペプチド及び親ペプチドに対する抗体を誘導することに関して、有意に増強した免疫原性を実証し、幾つかの抗血清はまた、レンサ球菌の表面への増強した結合を示した。親ペプチドと生物(抗p*17)の両方に最も強く結合した抗血清を含むペプチドを、ワクチンとして試験して、レンサ球菌感染症を予防し、ここで、本発明者らは、単回の免疫化が、皮膚及び浸潤性疾患からの有意に増強した保護を生じることを観察した(皮膚レンサ球菌の生物負荷における100倍より多い低減及び血液細菌負荷に対する>10,000分の1の低減)。
【０１４１】
本発明者らは、それぞれのペプチドにおける1個のアミノ酸変化を有する86種のペプチドのペプチドライブラリーの抗原性の本発明者らの初期の観察に基づき、p*17を命名した。最小のらせんエピトープの12種のアミノ酸の4種のアミノ酸は、少なくとも認識されたペプチドの構築及び親配列に関連する。これらの1回変異させたペプチドは、親ペプチド、p145、抗p145抗血清により最小の改善した認識を示したが、2個の変異を有する新規ペプチドは、p145より免疫原としてずっと優れていた。しかし、より驚くべきことに、これらの二重に変異させたペプチドにより生成した抗体は、p145自体により誘導される抗体より有意に高い親和性でp145を認識した。さらに、いくつかのペプチド抗血清は、p145ワクチン接種により誘導された抗体より、レンサ球菌の表面をより貪欲に認識した。
【０１４２】
なおさらに、1つのかかるペプチド、p*17の保護有効性は、このペプチドが、優れたワクチン候補であることを示す。p*17を用いた1回の免疫は、高いレベルの自己及びp145特異的抗体を誘導し、それは、複数のGAS株に対する保護であった。加えて、ペプチドはまた、浸潤性の感染症に広く関与する高病原性GAS株に対して保護した。現在、酵母らせんペプチド内で提示され、J8として言及する、p145内の最小のエピトープは、レンサ球菌の主要なワクチン候補である(12)。このワクチン候補はまた、皮膚疾患に対する保護を誘導するのに3回用量を必要とする(19)。
【０１４３】
MDシミュレーションにより、p*17が、p145よりらせんとしてフォールディングし、より安定性を有する可能性があることを明らかになった。増強した安定性は、恐らく、それをp145より免疫原性にして、生物の天然の構造を認識する抗体を誘導する可能性があり、ここで、エピトープは、らせんとして保持される。p145配列とは異なるMタンパク質に沿って、他のエピトープへのp*17抗体の立体構造結合はまた、p*17の増強した有効性を部分的に占めることができた。しかしながら、抗p*17抗体が、p145自体に対して生じた抗体より良好にp145を認識することは、奇妙である。抗p*17抗体が、p145をらせんにフォールディングすることができることが可能である。
【０１４４】
本発明者らは、2つの位置が、共に、荷電したアミノ酸により占有されないように、より高い力価とより高い親和性との両方の抗p145抗体を誘導した7種のバリアントペプチドのうち、4種(p*10、p*13、p*17及びp*18)が、位置において及び/又は最小のエピトープの変異を含有することを見出した。最小のエピトープにおけるこれらの位置は、らせんペプチドの親水性側に一緒にある7つのモチーフにおけるf位及びc位に対応し、これは、恐らく、これらの構造をより安定にする。本発明者らは、他のペプチドについてMDシミュレーションを行って、本発明者らが焦点を当てたこれが、ヒトタンパク質(p*17)と配列相同性を共有しない最も免疫原性のものであることを確認しなかった。
【０１４５】
本発明者らはまた、粘膜表面での保護が、唾液IgGの誘導に起因すると仮定する。粘膜表面におけるIgGは、凝集によるコロニー形成を防ぎ、これにより、細菌のクリアランスを防ぐことが示されている(Rocheら、Mucosal Immunol、2015)。さらに、p*17-DTは、K4S2-DTと組み合わせた場合、唾液IgGを誘導することができ、組合せワクチンは、p*17-DT単独より有意に良好に高病原性CovR/S変異体GAS 5448APに対して保護することができた。
【０１４６】
J8及びp*17を比較するMDシミュレーション研究は、両方のペプチドが、らせんとしてフォールディングしたが、J8が、p*17との比較においてより柔軟であることを実証した。本発明者らは、p*17の全体的な3次元構造が、それをより安定にし、これが、宿主分子のより良好な相互作用を促進すると考える。さらに、p*17のアミノ酸組成物(J8よりレンサ球菌配列に類似する)は、J8より良好な生物の天然の構造を認識する抗体を誘導する可能性がある。
【０１４７】
結論として、本発明者らは、免疫グロブリン受容体とのエピトープの残基を相互作用するが、エピトープとB細胞Ig受容体の間の非特異的イオン性の力と相互作用しない改変と関連しない機序を介して、有意に増強した免疫原性を有するペプチドを設計するストラテジーを定義した。本発明者らが記載する遺伝子ストラテジーは、多くの複合ペプチドエピトープの免疫原性を改善し得た。
【０１４８】
本明細書を通じて、任意の1つの実施形態又は特定の特性の集合物に本発明を制限することなく、本発明の好ましい実施形態を記載することを目的にする。様々な変化及び修飾は、本発明の広範な精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書において記載され、説明される実施形態になされ得る。
【０１４９】
本明細書において参照される全てのコンピュータープログラム、アルゴリズム、特許及び科学文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５０】
参照文献
【０１５１】
【表１】
2021505525.tif 000003
【０１５２】
【表２】
2021505525.tif 000004
【０１５３】
【表３Ａ】
2021505525.tif 000005
【０１５４】
【表３Ｂ】
2021505525.tif 000006
【０１５５】
【表３Ｃ】
2021505525.tif 000007
【図１Ａ】
2021505525.tif 000008
【図１Ｂ】
2021505525.tif 000009
【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５ＢＣ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年5月10日(2019.5.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物においてA群レンサ球菌細菌に対する粘膜の免疫応答を誘発する方法であって、配列番号3の残基13及び17のアミノ酸置換を含む改変されたp145ペプチドアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質;単離されたタンパク質又はそのフラグメント若しくはバリアントに結合するか、又はそれに対して生じる抗体若しくは抗体フラグメント;或いは単離されたタンパク質又はそのフラグメント若しくはバリアントをコードする単離された核酸を哺乳動物に投与することにより、粘膜の免疫応答を誘発する工程を含む方法。
【請求項２】
哺乳動物においてA群レンサ球菌細菌の感染症に対する粘膜の免疫を誘導する方法であって、配列番号3の残基13及び17のアミノ酸置換を含む改変されたp145ペプチドアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質;単離されたタンパク質又はそのフラグメント若しくはバリアントに結合するか、又はそれに対して生じる抗体若しくは抗体フラグメント;或いは単離されたタンパク質又はそのフラグメント若しくはバリアントをコードする単離された核酸を、哺乳動物に投与することにより、哺乳動物においてA群レンサ球菌細菌の感染症に対する粘膜の免疫を誘導する工程を含む方法。
【請求項３】
哺乳動物においてA群レンサ球菌細菌の感染症を処置又は予防する方法であって、配列番号3の残基13及び17のアミノ酸置換を含む改変されたp145ペプチドアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質;単離されたタンパク質又はそのフラグメント若しくはバリアントに結合するか、又はそれに対して生じる抗体若しくは抗体フラグメント;或いは単離されたタンパク質又はそのフラグメント若しくはバリアントをコードする単離された核酸を、哺乳動物に投与することにより、哺乳動物においてA群レンサ球菌細菌の感染症を予防又は処置する工程を含み、単離されたタンパク質の投与が、哺乳動物において粘膜の免疫応答を誘発し、及び/又はA群レンサ球菌細菌の感染症に対する粘膜の免疫を誘導する、方法。
【請求項４】
配列番号1のアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質又はそのフラグメント若しくはバリアント;単離されたタンパク質又はそのフラグメント若しくはバリアントに結合するか、又はそれに対して生じる抗体若しくは抗体フラグメント;或いは単離されたタンパク質又はそのフラグメント若しくはバリアントをコードする単離された核酸を投与する工程が、哺乳動物に筋肉内及び/又は皮下に投与される、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
粘膜の免疫又は粘膜の免疫応答が、粘膜IgGの産生により特徴付けられる、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
粘膜の免疫又は粘膜の免疫応答が、粘膜IgAが実質的に存在しないこと、又はIgAの産生が少なくとも低減されることにより特徴付けられる、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
改変されたp145ペプチドアミノ酸配列が、残基13のアスパラギン(N)アミノ酸及び残基17のアルギニン(R)アミノ酸を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
改変されたp145ペプチドアミノ酸配列が、配列番号1に記載される、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
フラグメントが、配列番号2に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項7に記載の方法。
【請求項１０】
改変されたp145ペプチド、バリアント又はフラグメントが、担体タンパク質にコンジュゲート、カップリング、又はそうでなければ結合している、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
担体タンパク質が、ジフテリア毒素、CRMタンパク質又はそのフラグメントである、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
SpyCEPタンパク質の免疫原性フラグメントを投与する工程をさらに含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
SpyCEPのフラグメントが、S2ペプチド(配列番号23)若しくはそのバリアントであるか、又はそれを含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
バリアントが、K4S2ペプチド(配列番号24)である、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
配列番号3の残基13及び17のアミノ酸置換を含む改変されたp145ペプチドアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質、そのフラグメント若しくはバリアント、単離されたタンパク質又はそのフラグメント若しくはバリアントに結合するか、又はそれに対して生じる抗体又は抗体フラグメント、或いは単離されたタンパク質又はそのフラグメント若しくはバリアントをコードする単離された核酸;並びにSpyCEPタンパク質の免疫原性フラグメント又はそのバリアント、SpyCEP免疫原性フラグメント若しくはそのバリアントに結合するか、又はそれに対して生じる抗体又は抗体フラグメント、或いはSpyCEP免疫原性フラグメント若しくはそのバリアントをコードする単離された核酸、を含む単離されたタンパク質を含む、組成物。
【請求項１６】
改変されたp145ペプチドアミノ酸配列が、残基13のアスパラギン(N)アミノ酸及び残基17のアルギニン(R)アミノ酸を含む、請求項15に記載の組成物。
【請求項１７】
改変されたp145ペプチドアミノ酸配列が、配列番号1に記載される、請求項16に記載の組成物。
【請求項１８】
改変されたp145ペプチドのフラグメントが、配列番号2に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項17に記載の組成物。
【請求項１９】
改変されたp145ペプチド、バリアント又はフラグメントが、担体タンパク質にコンジュゲート、カップリング、又はそうでなければ結合している、請求項15から18のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
担体タンパク質が、ジフテリア毒素、CRMタンパク質又はそのフラグメントである、請求項19に記載の組成物。
【請求項２１】
SpyCEPのフラグメントが、S2ペプチド(配列番号23)若しくはそのバリアントであるか、又はそれを含む、請求項15から20のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
バリアントが、K4S2ペプチド(配列番号24)である、請求項21に記載の組成物。
【請求項２３】
アジュバントをさらに含む、請求項15から22のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
筋肉内投与及び/又は皮下投与に適当である、請求項15から23のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
請求項1から15のいずれか一項に記載の方法による使用のための、請求項15から24のいずれか一項に記載の組成物。
【国際調査報告】
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