(57)【要約】親抗体（約２ｎＭの親和性）と比較して有意に高い親和性（５０ｐＭ未満）を示す親和性成熟抗ＣＤ２２ヒトモノクローナル抗体が記載されている。抗ＣＤ２２バリアント抗体または単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）などのその断片を、Ｂ細胞悪性腫瘍を処置するためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、免疫毒素または多重特異性抗体の抗原結合性部分として使用することができる。本開示は、ＣＤ２２に特異的なモノクローナル抗体の親和性成熟およびがん治療のためなどのその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖可変（ＶＨ）ドメインおよび軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む、ＣＤ２２に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片であって、
前記ＶＨドメインが、配列番号４の相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含み、
前記ＶＬドメインが、配列番号５のＣＤＲ配列を含む、
モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２】
前記ＣＤＲ配列が、ＩＭＧＴ、Ｋａｂａｔ、ＰａｒａｔｏｍｅまたはＣｈｏｔｈｉａ番号付けスキームを使用して決定される、請求項１に記載のモノクローナル抗体または抗原結合性断片。
【請求項３】
前記ＶＨドメインが、配列番号４の残基２６〜３５、５３〜６１および１００〜１１３を含み、
前記ＶＬドメインが、配列番号５の残基２７〜３２、５０〜５２および８９〜９７を含む、
請求項１または請求項２に記載のモノクローナル抗体または抗原結合性断片。
【請求項４】
前記ＶＨドメインのアミノ酸配列が、配列番号４と少なくとも９０％同一であるおよび配列番号４のＣＤＲ配列を含み、
前記ＶＬドメインのアミノ酸配列が、配列番号５と少なくとも９０％同一であるおよび配列番号５のＣＤＲ配列を含む、
請求項１から３までのいずれか一項に記載のモノクローナル抗体または抗原結合性断片。
【請求項５】
前記ＶＨドメインのアミノ酸配列が、配列番号４を含み、
前記ＶＬドメインのアミノ酸配列が、配列番号５を含む、
請求項１から４までのいずれか一項に記載のモノクローナル抗体または抗原結合性断片。
【請求項６】
Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）またはジスルフィド安定化可変断片（ｄｓＦｖ）である、請求項１から５までのいずれか一項に記載の抗原結合性断片。
【請求項７】
ＩｇＧである、請求項１から５までのいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】
完全ヒト抗体または抗原結合性断片である、請求項１から７までのいずれか一項に記載のモノクローナル抗体または抗原結合性断片。
【請求項９】
キメラまたは合成抗体または抗原結合性断片である、請求項１から７までのいずれか一項に記載のモノクローナル抗体または抗原結合性断片。
【請求項１０】
請求項１から９までのいずれか一項に記載のモノクローナル抗体または抗原結合性断片を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項１１】
ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達部分、シグナル伝達ドメイン、またはこれらの任意の組合せをさらに含む、請求項１０に記載のＣＡＲ。
【請求項１２】
請求項１０または請求項１１のいずれか一項に記載のＣＡＲを発現する単離された細胞。
【請求項１３】
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）である、請求項１２に記載の単離された細胞。
【請求項１４】
請求項１から９までのいずれか一項に記載のモノクローナル抗体または抗原結合性断片とエフェクター分子とを含む、免疫コンジュゲート。
【請求項１５】
前記エフェクター分子が、毒素である、請求項１４に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項１６】
前記毒素が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素またはそのバリアントである、請求項１５に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項１７】
前記エフェクター分子が、検出可能な標識である、請求項１４に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項１８】
前記検出可能な標識が、フルオロフォア、酵素または放射性同位元素を含む、請求項１７に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項１９】
請求項１から９までのいずれか一項に記載のモノクローナル抗体または抗原結合性断片とコンジュゲートした薬物を含む抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）。
【請求項２０】
前記薬物が、小分子である、請求項１９に記載のＡＤＣ。
【請求項２１】
前記薬物が、抗微小管剤、抗有糸分裂剤および／または細胞傷害性薬剤である、請求項１９または請求項２０に記載のＡＤＣ。
【請求項２２】
請求項１から９までのいずれかに記載のモノクローナル抗体または抗原結合性断片および少なくとも１つの追加のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を含む多重特異性抗体。
【請求項２３】
二重特異性抗体である、請求項２２に記載の多重特異性抗体。
【請求項２４】
三重特異性抗体である、請求項２２に記載の多重特異性抗体。
【請求項２５】
前記少なくとも１つの追加のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片が、Ｔ細胞受容体またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性化受容体の成分に特異的に結合する、請求項２２から２４までのいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項２６】
請求項１から９までのいずれか一項に記載のモノクローナル抗体または抗原結合性断片とコンジュゲートしたナノ粒子を含む、抗体−ナノ粒子コンジュゲート。
【請求項２７】
前記ナノ粒子が、ポリマーナノ粒子、ナノスフェア、ナノカプセル、リポソーム、デンドリマー、ポリマーミセル、またはニオソームを含む、請求項２６に記載の抗体−ナノ粒子コンジュゲート。
【請求項２８】
前記ナノ粒子が、細胞傷害性薬剤を含む、請求項２６または請求項２７に記載の抗体−ナノ粒子コンジュゲート。
【請求項２９】
請求項１から９までのいずれか一項に記載のモノクローナル抗体または抗原結合性断片と異種タンパク質またはペプチドとを含む融合タンパク質。
【請求項３０】
前記異種タンパク質が、Ｆｃタンパク質である、請求項２９に記載の融合タンパク質。
【請求項３１】
薬学的に許容される担体および請求項１から９までのいずれか一項に記載のモノクローナル抗体もしくは抗原結合性断片、請求項１０もしくは請求項１１に記載のＣＡＲ、請求項１２もしくは請求項１３に記載の単離された細胞、請求項１４から１８までのいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート、請求項１９から２１までのいずれか一項に記載のＡＤＣ、請求項２２から２５までのいずれか一項に記載の多重特異性抗体、請求項２６から２８までのいずれか一項に記載の抗体−ナノ粒子コンジュゲート、または請求項２９もしくは請求項３０に記載の融合タンパク質を含む組成物。
【請求項３２】
請求項１から９までのいずれか一項に記載のモノクローナル抗体もしくは抗原結合性断片、請求項１０もしくは請求項１１に記載のＣＡＲ、請求項１４から１８までのいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート、請求項２２から２５までのいずれか一項に記載の多重特異性抗体、または請求項２９もしくは請求項３０に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項３３】
プロモーターに作動可能に連結した、請求項３２に記載の核酸分子。
【請求項３４】
請求項３２または請求項３３に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項３５】
試料におけるＣＤ２２の発現を検出する方法であって、
前記試料を請求項１から９までのいずれかに記載のモノクローナル抗体または抗原結合性断片と接触させるステップと、
前記抗体の前記試料への結合を検出し、それにより、前記試料におけるＣＤ２２の発現を検出するステップと
を含む方法。
【請求項３６】
前記モノクローナル抗体または抗原結合性断片が、直接標識されている、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記モノクローナル抗体または抗原結合性断片を第２の抗体と接触させるステップと、
前記第２の抗体の前記モノクローナル抗体または抗原結合性断片への結合を検出し、それにより、前記試料におけるＣＤ２２の発現を検出するステップと
をさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
対象におけるＣＤ２２陽性がんを処置する方法であって、前記対象に請求項１から９までのいずれか一項に記載のモノクローナル抗体もしくは抗原結合性断片、請求項１０もしくは請求項１１に記載のＣＡＲ、請求項１２もしくは請求項１３に記載の単離された細胞、請求項１４から１８までのいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート、請求項１９から２１までのいずれか一項に記載のＡＤＣ、請求項２２から２５までのいずれか一項に記載の多重特異性抗体、請求項２６から２８までのいずれか一項に記載の抗体−ナノ粒子コンジュゲート、請求項２９もしくは請求項３０に記載の融合タンパク質、または請求項３１に記載の組成物の治療有効量を投与するステップを含み、それにより、前記ＣＤ２２陽性がんを処置する、方法。
【請求項３９】
前記ＣＤ２２陽性がんが、Ｂ細胞悪性腫瘍である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記Ｂ細胞悪性腫瘍が、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯リンパ腫、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）リンパ腫、有毛細胞白血病、慢性リンパ性白血病またはＢ細胞性前リンパ球性白血病である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記対象にブリオスタチン１の治療有効量を投与するステップをさらに含む、請求項３８から４０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
ブリオスタチン１を、前記モノクローナル抗体、抗原結合性断片、ＣＡＲ、単離された細胞、免疫コンジュゲート、ＡＤＣ、多重特異性抗体、抗体−ナノ粒子コンジュゲート、融合タンパク質または組成物を投与する前またはそれと同時に投与する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
請求項１から９までのいずれか一項に記載のモノクローナル抗体もしくは抗原結合性断片、請求項１０もしくは請求項１１に記載のＣＡＲ、請求項１２もしくは請求項１３に記載の単離された細胞、請求項１４から１８までのいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート、請求項１９から２１までのいずれか一項に記載のＡＤＣ、請求項２２から２５までのいずれか一項に記載の多重特異性抗体、請求項２６から２８までのいずれか一項に記載の抗体−ナノ粒子コンジュゲート、請求項２９もしくは請求項３０に記載の融合タンパク質、または請求項３１に記載の組成物と、
ＣＤ２２発現を上方調節する薬剤と、
必要に応じて抗がん剤と
を含むキット。
【請求項４４】
ＣＤ２２発現を上方調節する前記薬剤が、ブリオスタチン１を含む、またはそれからなる、請求項４３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年７月１２日出願の米国仮出願第６２／６９７，１８５号の利益を主張するものである。
【０００２】
分野
本開示は、ＣＤ２２に特異的なモノクローナル抗体の親和性成熟およびがん治療のためなどのその使用に関する。
【０００３】
政府支援の承認
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）から付与されたプロジェクト番号ＺＩＡ  ＢＣ  ０１０７０１の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に関して一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
背景
リスクに関して適合させた、多剤化学療法レジメンを用いて処置された小児Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の全生存率は５年時点で８５％を超えるが、その一方で再発した患者には良好な治療選択肢がない（Pui  et  al.,  J  Clin  Oncol.  2015;  33  (27):  2938-2948；Smith  et  al.,  Cancer.  2014;  120  (16):  2497-2506）。ＣＤ１９を標的としたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法は、高いパーセンテージの患者で寛解を誘導することができ、一部の患者に対しては潜在的に治癒的なものである（Davila  et  al.,  Sci  Transl  Med.  2014;  6  (224):  224ra25；Maude  et  al.,  N  Engl  J  Med.  2014;  371  (16):  1507-1517；Lee  et  al.,  Lancet.  2015;  385  (9967):  517-528）。しかし、より長期の追跡データから、寛解を得た患者の一部では、その後、不十分なＣＡＲ持続性か、または標的とされるＣＤ１９エピトープの消失で再発が生じることが示されている（Lee  et  al.,  Lancet.  2015;  385  (9967):  517-528；Grupp  et  al.,  N  Engl  J  Med.  2013;  368  (16):  1509-1518；Maude  et  al.,  Blood.  2015;  125  (26):  4017-4023；Gardner  et  al.,  Blood.  2016;  127  (20):  2406-2410）。代替的な、臨床的に確認されたＡＬＬ抗原である（Yilmaz  et  al.,  Ther  Adv  Hematol.  2015;  6  (5):  253-261）ＣＤ２２を標的とするＣＡＲを用いた処置（Haso  et  al.,  Blood.  2013;  121  (7):  1165-1174）により、ＣＤ１９  ＣＡＲ抵抗性ＡＬＬが再発している患者における活性を含めた生物活性がある用量で７０％の寛解誘導率がもたらされた（Fry  et  al.,  Nat  Med.  2018;  24  (1):  20-28）。ＣＤ１９  ＣＡＲＴと同様に、ＣＤ２２  ＣＡＲＴ後に寛解を得た患者のかなりの割合に、不十分なＣＡＲ持続性、またはより頻繁には標的抗原発現の変更に起因して再発が生じる。抗原発現の完全な消失が認められるＣＤ１９  ＣＡＲＴまたはブリナツモマブによる処置後の再発とは対照的に、ＣＤ２２  ＣＡＲＴ後の再発は、白血病の細胞表面上のＣＤ２２の減弱で生じる可能性がより高い（Fry  et  al.,  Nat  Med.  2018;  24  (1):  20-28）。
ＣＡＲの活性化に必要な抗原発現の閾値が前臨床モデルで同定されている（Walker  et  al.,  Mol  Ther.  2017;  25  (9):  2189-2201；Chmielewski  et  al.,  Gene  Ther.  2011;  18  (1):  62-72；Yoshida  et  al.,  Clin  Transl  Immunology.  2016;  5  (12):  e116；Watanabe  et  al.,  J  Immunol.  2015;  194  (3):  911-920）。標的抗原部位密度が低い場合には、共刺激分子での増強またはＣＡＲ  Ｔ細胞親和性結合の変更にもかかわらず、ＣＡＲ  Ｔ細胞の機能性は低く、ＩＦＮ−γまたはＩＬ−２などのサイトカインの産生が少ない（Chmielewski  et  al.,  Gene  Ther.  2011;  18  (1):  62-72）。この活性化に関する閾値は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）による活性化に必要なものと比較して高い。しかし、この部位密度の制限から派生する機能的影響は十分には探究されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Pui  et  al.,  J  Clin  Oncol.  2015;  33  (27):  2938-2948
【非特許文献２】Smith  et  al.,  Cancer.  2014;  120  (16):  2497-2506
【非特許文献３】Davila  et  al.,  Sci  Transl  Med.  2014;  6  (224):  224ra25
【非特許文献４】Maude  et  al.,  N  Engl  J  Med.  2014;  371  (16):  1507-1517
【非特許文献５】Lee  et  al.,  Lancet.  2015;  385  (9967):  517-528
【非特許文献６】Grupp  et  al.,  N  Engl  J  Med.  2013;  368  (16):  1509-1518
【非特許文献７】Maude  et  al.,  Blood.  2015;  125  (26):  4017-4023
【非特許文献８】Gardner  et  al.,  Blood.  2016;  127  (20):  2406-2410
【非特許文献９】Yilmaz  et  al.,  Ther  Adv  Hematol.  2015;  6  (5):  253-261
【非特許文献１０】Haso  et  al.,  Blood.  2013;  121  (7):  1165-1174
【非特許文献１１】Fry  et  al.,  Nat  Med.  2018;  24  (1):  20-28
【非特許文献１２】Walker  et  al.,  Mol  Ther.  2017;  25  (9):  2189-2201
【非特許文献１３】Chmielewski  et  al.,  Gene  Ther.  2011;  18  (1):  62-72
【非特許文献１４】Yoshida  et  al.,  Clin  Transl  Immunology.  2016;  5  (12):  e116
【非特許文献１５】Watanabe  et  al.,  J  Immunol.  2015;  194  (3):  911-920
【非特許文献１６】Chmielewski  et  al.,  Gene  Ther.  2011;  18  (1):  62-72
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
概要
親和性成熟させた、Ｂ細胞抗原ＣＤ２２に特異的なモノクローナル抗体の開発が記載されている。ｍ９７１−Ｌ７と称される親和性成熟抗体は、親抗体ｍ９７１と比較して有意に改善されたＣＤ２２結合親和性を有する（約２ｎＭから５０ｐＭ未満まで）。
【０００７】
ＣＤ２２に結合する、例えば特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片が本明細書で提供される。一部の実施形態では、モノクローナル抗体または抗原結合性断片は、ｍ９７１−Ｌ７のＶＨドメインおよびＶＬドメイン相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含む。開示されるモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を含むコンジュゲートも本明細書で提供される。一部の例では、本明細書に開示されるモノクローナル抗体または抗原結合性断片を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、免疫コンジュゲート、多重特異性抗体、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、抗体−ナノ粒子コンジュゲートおよび融合タンパク質が提供される。ＣＤ２２特異的モノクローナル抗体または抗原結合性断片および薬学的に許容される担体を含む組成物も本開示で提供される。
【０００８】
本明細書に開示されるＣＤ２２特異的モノクローナル抗体、ＣＡＲ、免疫コンジュゲート、多重特異性抗体および融合タンパク質をコードする核酸分子およびベクターも本明細書で提供される。
【０００９】
開示される抗体および抗原結合性断片を使用して試料におけるＣＤ２２の発現を検出する方法がさらに提供される。
【００１０】
本明細書に開示されるＣＤ２２特異的モノクローナル抗体、抗原結合性断片、ＣＡＲ、ＣＡＲを発現する単離された細胞、免疫コンジュゲート、ＡＤＣ、多重特異性抗体、抗体−ナノ粒子コンジュゲート、融合タンパク質または組成物を対象に投与することにより、対象におけるＢ細胞悪性腫瘍を処置する方法も提供される。そのような方法は、ＣＤ２２発現を上方調節する薬剤（ブリオスタチン１など）の投与をさらに含み得る。
【００１１】
対象から得た試料を開示されるＣＤ２２特異的モノクローナル抗体またはその断片と接触させることにより、対象がＢ細胞悪性腫瘍を有すると診断する、または対象におけるＢ細胞悪性腫瘍の診断を確実にする方法がさらに提供される。
【００１２】
（１）本明細書に開示されるＣＤ２２特異的モノクローナル抗体、抗原結合性断片、ＣＡＲ、ＣＡＲを発現する単離された細胞、免疫コンジュゲート、ＡＤＣ、多重特異性抗体、抗体−ナノ粒子コンジュゲート、融合タンパク質または組成物、（２）ＣＤ２２発現を上方調節する薬剤（ブリオスタチン１など）、および（３）必要に応じて抗がん剤を含むキットも提供される。
【００１３】
本発明の前述のおよび他の目的、特色、および利点は、添付図を参照して進める以下の詳細な説明からより明白になる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｆ：（図１Ａ）前駆Ｂ細胞ＡＬＬ患者由来の臨床試料を、ＣＤ１９およびＣＤ２２発現についてＱｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ−ＰＥビーズ評価を使用して評価した。試料を得た後、ＣＤ１９  ＣＡＲＴまたはＣＤ２２  ＣＡＲＴのいずれかで処理した。対応のないｔ検定を使用して統計解析を実施した。（図１Ｂ）ＣＤ２２  ＣＡＲＴを用いて処置した患者由来の試料を、ＣＤ２２部位密度についてＱｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ分析を使用して評価し、ＣＤ２２  ＣＡＲ発現についてフローサイトメトリーによって評価した。（図１Ｃ）患者のＣＡＲ  Ｔ細胞を、様々な部位密度の細胞株と１８時間にわたって共インキュベートした。上清を、様々な希釈度でＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびグランザイムＢについてマルチプレックスＥＬＩＳＡアッセイを使用して評価した。対応のないｔ検定を使用して統計解析を実施した。（図１Ｄ）様々な量のＣＤ２２を発現するＮａｌｍ６  ＡＬＬ腫瘍細胞（１×１０５個）をＣＤ２２  ＣＡＲＴ患者試料由来のＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞１×１０５個と１８時間にわたって共培養した。上清を、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ炎症促進性サイトカインパネルを使用して評価した。（図１Ｅ）ＣＤ２２ｎｅｇとＣＤ２２ｌｏおよびＮａｌｍ６白血病細胞担持マウスを異なるＣＡＲＴ用量で比較したカプラン・マイヤー曲線。（図１Ｆ）間隔をおいた時点でマウスから末梢血を採取し、ＣＡＲ増加についてフローサイトメトリーを使用して評価し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機で分析した。対応のないｔ検定を使用して統計的有意性を算出した（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．０００２、＊＊ｐ＜０．００２１）。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｆ：（図１Ａ）前駆Ｂ細胞ＡＬＬ患者由来の臨床試料を、ＣＤ１９およびＣＤ２２発現についてＱｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ−ＰＥビーズ評価を使用して評価した。試料を得た後、ＣＤ１９  ＣＡＲＴまたはＣＤ２２  ＣＡＲＴのいずれかで処理した。対応のないｔ検定を使用して統計解析を実施した。（図１Ｂ）ＣＤ２２  ＣＡＲＴを用いて処置した患者由来の試料を、ＣＤ２２部位密度についてＱｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ分析を使用して評価し、ＣＤ２２  ＣＡＲ発現についてフローサイトメトリーによって評価した。（図１Ｃ）患者のＣＡＲ  Ｔ細胞を、様々な部位密度の細胞株と１８時間にわたって共インキュベートした。上清を、様々な希釈度でＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびグランザイムＢについてマルチプレックスＥＬＩＳＡアッセイを使用して評価した。対応のないｔ検定を使用して統計解析を実施した。（図１Ｄ）様々な量のＣＤ２２を発現するＮａｌｍ６  ＡＬＬ腫瘍細胞（１×１０５個）をＣＤ２２  ＣＡＲＴ患者試料由来のＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞１×１０５個と１８時間にわたって共培養した。上清を、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ炎症促進性サイトカインパネルを使用して評価した。（図１Ｅ）ＣＤ２２ｎｅｇとＣＤ２２ｌｏおよびＮａｌｍ６白血病細胞担持マウスを異なるＣＡＲＴ用量で比較したカプラン・マイヤー曲線。（図１Ｆ）間隔をおいた時点でマウスから末梢血を採取し、ＣＡＲ増加についてフローサイトメトリーを使用して評価し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機で分析した。対応のないｔ検定を使用して統計的有意性を算出した（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．０００２、＊＊ｐ＜０．００２１）。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｆ：（図１Ａ）前駆Ｂ細胞ＡＬＬ患者由来の臨床試料を、ＣＤ１９およびＣＤ２２発現についてＱｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ−ＰＥビーズ評価を使用して評価した。試料を得た後、ＣＤ１９  ＣＡＲＴまたはＣＤ２２  ＣＡＲＴのいずれかで処理した。対応のないｔ検定を使用して統計解析を実施した。（図１Ｂ）ＣＤ２２  ＣＡＲＴを用いて処置した患者由来の試料を、ＣＤ２２部位密度についてＱｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ分析を使用して評価し、ＣＤ２２  ＣＡＲ発現についてフローサイトメトリーによって評価した。（図１Ｃ）患者のＣＡＲ  Ｔ細胞を、様々な部位密度の細胞株と１８時間にわたって共インキュベートした。上清を、様々な希釈度でＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびグランザイムＢについてマルチプレックスＥＬＩＳＡアッセイを使用して評価した。対応のないｔ検定を使用して統計解析を実施した。（図１Ｄ）様々な量のＣＤ２２を発現するＮａｌｍ６  ＡＬＬ腫瘍細胞（１×１０５個）をＣＤ２２  ＣＡＲＴ患者試料由来のＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞１×１０５個と１８時間にわたって共培養した。上清を、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ炎症促進性サイトカインパネルを使用して評価した。（図１Ｅ）ＣＤ２２ｎｅｇとＣＤ２２ｌｏおよびＮａｌｍ６白血病細胞担持マウスを異なるＣＡＲＴ用量で比較したカプラン・マイヤー曲線。（図１Ｆ）間隔をおいた時点でマウスから末梢血を採取し、ＣＡＲ増加についてフローサイトメトリーを使用して評価し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機で分析した。対応のないｔ検定を使用して統計的有意性を算出した（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．０００２、＊＊ｐ＜０．００２１）。
【図１Ｄ】図１Ａ〜１Ｆ：（図１Ａ）前駆Ｂ細胞ＡＬＬ患者由来の臨床試料を、ＣＤ１９およびＣＤ２２発現についてＱｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ−ＰＥビーズ評価を使用して評価した。試料を得た後、ＣＤ１９  ＣＡＲＴまたはＣＤ２２  ＣＡＲＴのいずれかで処理した。対応のないｔ検定を使用して統計解析を実施した。（図１Ｂ）ＣＤ２２  ＣＡＲＴを用いて処置した患者由来の試料を、ＣＤ２２部位密度についてＱｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ分析を使用して評価し、ＣＤ２２  ＣＡＲ発現についてフローサイトメトリーによって評価した。（図１Ｃ）患者のＣＡＲ  Ｔ細胞を、様々な部位密度の細胞株と１８時間にわたって共インキュベートした。上清を、様々な希釈度でＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびグランザイムＢについてマルチプレックスＥＬＩＳＡアッセイを使用して評価した。対応のないｔ検定を使用して統計解析を実施した。（図１Ｄ）様々な量のＣＤ２２を発現するＮａｌｍ６  ＡＬＬ腫瘍細胞（１×１０５個）をＣＤ２２  ＣＡＲＴ患者試料由来のＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞１×１０５個と１８時間にわたって共培養した。上清を、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ炎症促進性サイトカインパネルを使用して評価した。（図１Ｅ）ＣＤ２２ｎｅｇとＣＤ２２ｌｏおよびＮａｌｍ６白血病細胞担持マウスを異なるＣＡＲＴ用量で比較したカプラン・マイヤー曲線。（図１Ｆ）間隔をおいた時点でマウスから末梢血を採取し、ＣＡＲ増加についてフローサイトメトリーを使用して評価し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機で分析した。対応のないｔ検定を使用して統計的有意性を算出した（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．０００２、＊＊ｐ＜０．００２１）。
【図１Ｅ】図１Ａ〜１Ｆ：（図１Ａ）前駆Ｂ細胞ＡＬＬ患者由来の臨床試料を、ＣＤ１９およびＣＤ２２発現についてＱｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ−ＰＥビーズ評価を使用して評価した。試料を得た後、ＣＤ１９  ＣＡＲＴまたはＣＤ２２  ＣＡＲＴのいずれかで処理した。対応のないｔ検定を使用して統計解析を実施した。（図１Ｂ）ＣＤ２２  ＣＡＲＴを用いて処置した患者由来の試料を、ＣＤ２２部位密度についてＱｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ分析を使用して評価し、ＣＤ２２  ＣＡＲ発現についてフローサイトメトリーによって評価した。（図１Ｃ）患者のＣＡＲ  Ｔ細胞を、様々な部位密度の細胞株と１８時間にわたって共インキュベートした。上清を、様々な希釈度でＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびグランザイムＢについてマルチプレックスＥＬＩＳＡアッセイを使用して評価した。対応のないｔ検定を使用して統計解析を実施した。（図１Ｄ）様々な量のＣＤ２２を発現するＮａｌｍ６  ＡＬＬ腫瘍細胞（１×１０５個）をＣＤ２２  ＣＡＲＴ患者試料由来のＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞１×１０５個と１８時間にわたって共培養した。上清を、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ炎症促進性サイトカインパネルを使用して評価した。（図１Ｅ）ＣＤ２２ｎｅｇとＣＤ２２ｌｏおよびＮａｌｍ６白血病細胞担持マウスを異なるＣＡＲＴ用量で比較したカプラン・マイヤー曲線。（図１Ｆ）間隔をおいた時点でマウスから末梢血を採取し、ＣＡＲ増加についてフローサイトメトリーを使用して評価し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機で分析した。対応のないｔ検定を使用して統計的有意性を算出した（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．０００２、＊＊ｐ＜０．００２１）。
【図１Ｆ】図１Ａ〜１Ｆ：（図１Ａ）前駆Ｂ細胞ＡＬＬ患者由来の臨床試料を、ＣＤ１９およびＣＤ２２発現についてＱｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ−ＰＥビーズ評価を使用して評価した。試料を得た後、ＣＤ１９  ＣＡＲＴまたはＣＤ２２  ＣＡＲＴのいずれかで処理した。対応のないｔ検定を使用して統計解析を実施した。（図１Ｂ）ＣＤ２２  ＣＡＲＴを用いて処置した患者由来の試料を、ＣＤ２２部位密度についてＱｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ分析を使用して評価し、ＣＤ２２  ＣＡＲ発現についてフローサイトメトリーによって評価した。（図１Ｃ）患者のＣＡＲ  Ｔ細胞を、様々な部位密度の細胞株と１８時間にわたって共インキュベートした。上清を、様々な希釈度でＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびグランザイムＢについてマルチプレックスＥＬＩＳＡアッセイを使用して評価した。対応のないｔ検定を使用して統計解析を実施した。（図１Ｄ）様々な量のＣＤ２２を発現するＮａｌｍ６  ＡＬＬ腫瘍細胞（１×１０５個）をＣＤ２２  ＣＡＲＴ患者試料由来のＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞１×１０５個と１８時間にわたって共培養した。上清を、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ炎症促進性サイトカインパネルを使用して評価した。（図１Ｅ）ＣＤ２２ｎｅｇとＣＤ２２ｌｏおよびＮａｌｍ６白血病細胞担持マウスを異なるＣＡＲＴ用量で比較したカプラン・マイヤー曲線。（図１Ｆ）間隔をおいた時点でマウスから末梢血を採取し、ＣＡＲ増加についてフローサイトメトリーを使用して評価し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機で分析した。対応のないｔ検定を使用して統計的有意性を算出した（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．０００２、＊＊ｐ＜０．００２１）。
【００１５】
【図２Ａ−Ｂ】図２Ａ〜２Ｇ：（図２Ａ）偽またはＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＣＤ２２ｎｅｇ、ＣＤ２２ｌｏまたはＮａｌｍ６細胞のいずれかとエフェクター対標的比１：１で共インキュベートした。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ分析を使用してＧＦＰ陽性細胞の消失によって細胞死をモニタリングした。（図２Ｂ）ＮＳＧマウスに、０日目にＧＰＦ陽性ＣＤ２２ｎｅｇ、ＣＤ２２ｌｏ、またはＮａｌｍ６腫瘍細胞１×１０６個を注射し、３日目に、ＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞５×１０６個を注射した。マウスに対して、ルシフェリン−ＤをＩＰ注射した後、ＩＶＩＳ技術を使用してイメージングを行った。（図２Ｃ〜２Ｅ）腫瘍注射の１６日後（図２Ｃ、２Ｄ、左側のパネル、および２Ｅ）または３０日後（図２Ｄ、右側のパネル）にＣＤ２２  ＣＡＲで処置したＣＤ２２ｌｏまたはＮａｌｍ６  ＮＳＧマウスから細胞を抽出した。細胞をフローサイトメトリーのために染色し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機で分析した。（図２Ｅ）部位密度細胞株を、ＣＤ２２  ＣＡＲＴと２４時間にわたって共インキュベートし、ＰＤ１発現に関してフローサイトメトリーのために染色し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機で分析した。ＭＦＩ＝平均蛍光強度。（図２Ｆ）ＣＤ２２  ＣＡＲをＣＤ２２ｌｏまたはＮａｌｍ６白血病細胞と８日間にわたってｉｎ  ｖｉｔｒｏで共培養し、細胞をフローサイトメトリーを使用して評価し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機で分析した。図２Ｇは、ＣＲＩＳＰＲにより編集されたＮａｌｍ６細胞株について、ＣＤ２２部位密度をフローサイトメトリーおよびＱｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ分析を使用して評価したことについて示すグラフである。
【図２Ｃ】図２Ａ〜２Ｇ：（図２Ａ）偽またはＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＣＤ２２ｎｅｇ、ＣＤ２２ｌｏまたはＮａｌｍ６細胞のいずれかとエフェクター対標的比１：１で共インキュベートした。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ分析を使用してＧＦＰ陽性細胞の消失によって細胞死をモニタリングした。（図２Ｂ）ＮＳＧマウスに、０日目にＧＰＦ陽性ＣＤ２２ｎｅｇ、ＣＤ２２ｌｏ、またはＮａｌｍ６腫瘍細胞１×１０６個を注射し、３日目に、ＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞５×１０６個を注射した。マウスに対して、ルシフェリン−ＤをＩＰ注射した後、ＩＶＩＳ技術を使用してイメージングを行った。（図２Ｃ〜２Ｅ）腫瘍注射の１６日後（図２Ｃ、２Ｄ、左側のパネル、および２Ｅ）または３０日後（図２Ｄ、右側のパネル）にＣＤ２２  ＣＡＲで処置したＣＤ２２ｌｏまたはＮａｌｍ６  ＮＳＧマウスから細胞を抽出した。細胞をフローサイトメトリーのために染色し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機で分析した。（図２Ｅ）部位密度細胞株を、ＣＤ２２  ＣＡＲＴと２４時間にわたって共インキュベートし、ＰＤ１発現に関してフローサイトメトリーのために染色し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機で分析した。ＭＦＩ＝平均蛍光強度。（図２Ｆ）ＣＤ２２  ＣＡＲをＣＤ２２ｌｏまたはＮａｌｍ６白血病細胞と８日間にわたってｉｎ  ｖｉｔｒｏで共培養し、細胞をフローサイトメトリーを使用して評価し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機で分析した。図２Ｇは、ＣＲＩＳＰＲにより編集されたＮａｌｍ６細胞株について、ＣＤ２２部位密度をフローサイトメトリーおよびＱｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ分析を使用して評価したことについて示すグラフである。
【図２Ｄ】図２Ａ〜２Ｇ：（図２Ａ）偽またはＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＣＤ２２ｎｅｇ、ＣＤ２２ｌｏまたはＮａｌｍ６細胞のいずれかとエフェクター対標的比１：１で共インキュベートした。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ分析を使用してＧＦＰ陽性細胞の消失によって細胞死をモニタリングした。（図２Ｂ）ＮＳＧマウスに、０日目にＧＰＦ陽性ＣＤ２２ｎｅｇ、ＣＤ２２ｌｏ、またはＮａｌｍ６腫瘍細胞１×１０６個を注射し、３日目に、ＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞５×１０６個を注射した。マウスに対して、ルシフェリン−ＤをＩＰ注射した後、ＩＶＩＳ技術を使用してイメージングを行った。（図２Ｃ〜２Ｅ）腫瘍注射の１６日後（図２Ｃ、２Ｄ、左側のパネル、および２Ｅ）または３０日後（図２Ｄ、右側のパネル）にＣＤ２２  ＣＡＲで処置したＣＤ２２ｌｏまたはＮａｌｍ６  ＮＳＧマウスから細胞を抽出した。細胞をフローサイトメトリーのために染色し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機で分析した。（図２Ｅ）部位密度細胞株を、ＣＤ２２  ＣＡＲＴと２４時間にわたって共インキュベートし、ＰＤ１発現に関してフローサイトメトリーのために染色し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機で分析した。ＭＦＩ＝平均蛍光強度。（図２Ｆ）ＣＤ２２  ＣＡＲをＣＤ２２ｌｏまたはＮａｌｍ６白血病細胞と８日間にわたってｉｎ  ｖｉｔｒｏで共培養し、細胞をフローサイトメトリーを使用して評価し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機で分析した。図２Ｇは、ＣＲＩＳＰＲにより編集されたＮａｌｍ６細胞株について、ＣＤ２２部位密度をフローサイトメトリーおよびＱｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ分析を使用して評価したことについて示すグラフである。
【図２Ｅ】図２Ａ〜２Ｇ：（図２Ａ）偽またはＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＣＤ２２ｎｅｇ、ＣＤ２２ｌｏまたはＮａｌｍ６細胞のいずれかとエフェクター対標的比１：１で共インキュベートした。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ分析を使用してＧＦＰ陽性細胞の消失によって細胞死をモニタリングした。（図２Ｂ）ＮＳＧマウスに、０日目にＧＰＦ陽性ＣＤ２２ｎｅｇ、ＣＤ２２ｌｏ、またはＮａｌｍ６腫瘍細胞１×１０６個を注射し、３日目に、ＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞５×１０６個を注射した。マウスに対して、ルシフェリン−ＤをＩＰ注射した後、ＩＶＩＳ技術を使用してイメージングを行った。（図２Ｃ〜２Ｅ）腫瘍注射の１６日後（図２Ｃ、２Ｄ、左側のパネル、および２Ｅ）または３０日後（図２Ｄ、右側のパネル）にＣＤ２２  ＣＡＲで処置したＣＤ２２ｌｏまたはＮａｌｍ６  ＮＳＧマウスから細胞を抽出した。細胞をフローサイトメトリーのために染色し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機で分析した。（図２Ｅ）部位密度細胞株を、ＣＤ２２  ＣＡＲＴと２４時間にわたって共インキュベートし、ＰＤ１発現に関してフローサイトメトリーのために染色し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機で分析した。ＭＦＩ＝平均蛍光強度。（図２Ｆ）ＣＤ２２  ＣＡＲをＣＤ２２ｌｏまたはＮａｌｍ６白血病細胞と８日間にわたってｉｎ  ｖｉｔｒｏで共培養し、細胞をフローサイトメトリーを使用して評価し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機で分析した。図２Ｇは、ＣＲＩＳＰＲにより編集されたＮａｌｍ６細胞株について、ＣＤ２２部位密度をフローサイトメトリーおよびＱｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ分析を使用して評価したことについて示すグラフである。
【図２Ｆ】図２Ａ〜２Ｇ：（図２Ａ）偽またはＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＣＤ２２ｎｅｇ、ＣＤ２２ｌｏまたはＮａｌｍ６細胞のいずれかとエフェクター対標的比１：１で共インキュベートした。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ分析を使用してＧＦＰ陽性細胞の消失によって細胞死をモニタリングした。（図２Ｂ）ＮＳＧマウスに、０日目にＧＰＦ陽性ＣＤ２２ｎｅｇ、ＣＤ２２ｌｏ、またはＮａｌｍ６腫瘍細胞１×１０６個を注射し、３日目に、ＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞５×１０６個を注射した。マウスに対して、ルシフェリン−ＤをＩＰ注射した後、ＩＶＩＳ技術を使用してイメージングを行った。（図２Ｃ〜２Ｅ）腫瘍注射の１６日後（図２Ｃ、２Ｄ、左側のパネル、および２Ｅ）または３０日後（図２Ｄ、右側のパネル）にＣＤ２２  ＣＡＲで処置したＣＤ２２ｌｏまたはＮａｌｍ６  ＮＳＧマウスから細胞を抽出した。細胞をフローサイトメトリーのために染色し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機で分析した。（図２Ｅ）部位密度細胞株を、ＣＤ２２  ＣＡＲＴと２４時間にわたって共インキュベートし、ＰＤ１発現に関してフローサイトメトリーのために染色し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機で分析した。ＭＦＩ＝平均蛍光強度。（図２Ｆ）ＣＤ２２  ＣＡＲをＣＤ２２ｌｏまたはＮａｌｍ６白血病細胞と８日間にわたってｉｎ  ｖｉｔｒｏで共培養し、細胞をフローサイトメトリーを使用して評価し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機で分析した。図２Ｇは、ＣＲＩＳＰＲにより編集されたＮａｌｍ６細胞株について、ＣＤ２２部位密度をフローサイトメトリーおよびＱｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ分析を使用して評価したことについて示すグラフである。
【図２Ｇ】図２Ａ〜２Ｇ：（図２Ａ）偽またはＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＣＤ２２ｎｅｇ、ＣＤ２２ｌｏまたはＮａｌｍ６細胞のいずれかとエフェクター対標的比１：１で共インキュベートした。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ分析を使用してＧＦＰ陽性細胞の消失によって細胞死をモニタリングした。（図２Ｂ）ＮＳＧマウスに、０日目にＧＰＦ陽性ＣＤ２２ｎｅｇ、ＣＤ２２ｌｏ、またはＮａｌｍ６腫瘍細胞１×１０６個を注射し、３日目に、ＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞５×１０６個を注射した。マウスに対して、ルシフェリン−ＤをＩＰ注射した後、ＩＶＩＳ技術を使用してイメージングを行った。（図２Ｃ〜２Ｅ）腫瘍注射の１６日後（図２Ｃ、２Ｄ、左側のパネル、および２Ｅ）または３０日後（図２Ｄ、右側のパネル）にＣＤ２２  ＣＡＲで処置したＣＤ２２ｌｏまたはＮａｌｍ６  ＮＳＧマウスから細胞を抽出した。細胞をフローサイトメトリーのために染色し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機で分析した。（図２Ｅ）部位密度細胞株を、ＣＤ２２  ＣＡＲＴと２４時間にわたって共インキュベートし、ＰＤ１発現に関してフローサイトメトリーのために染色し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機で分析した。ＭＦＩ＝平均蛍光強度。（図２Ｆ）ＣＤ２２  ＣＡＲをＣＤ２２ｌｏまたはＮａｌｍ６白血病細胞と８日間にわたってｉｎ  ｖｉｔｒｏで共培養し、細胞をフローサイトメトリーを使用して評価し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機で分析した。図２Ｇは、ＣＲＩＳＰＲにより編集されたＮａｌｍ６細胞株について、ＣＤ２２部位密度をフローサイトメトリーおよびＱｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ分析を使用して評価したことについて示すグラフである。
【００１６】
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｄ：（図３Ａ）４種の細胞株（Ｎａｌｍ６、Ｋｏｐｎ８、ＰｆｉｅｆｆｅｒおよびＴｏｌｄｅｏ）を１ｎｇ／ｍｌのブリオスタチン１と２４時間にわたって共インキュベートし、ブリオスタチン１曝露の１日後にフローサイトメトリーを使用して分析した。標準化されたＱｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ−ＰＥビーズを使用して部位密度を分析した。（図３Ｂ）細胞株を１ｎｇ／ｍｌのブリオスタチン１と２４時間にわたって共インキュベートし、洗浄し、ブリオスタチン１曝露の１日後および７日後にフローサイトメトリーを使用して分析した。倍率変化を部位密度に基づいて算出した：（ブリオスタチン１細胞株−ＤＭＳＯ細胞株）／ＤＭＳＯ細胞株。図３Ｃは、０日目にＮＳＧマウスにＧＰＦ陽性Ｎａｌｍ６白血病細胞１×１０６個を注射し、３日目にブリオスタチン１を０．８μｇ／ｋｇで投与したことについて示すグラフである。ブリオスタチン１注射の７日後および１２日後にマウスを屠殺し、ＣＤ２２をフローサイトメトリーによって評価した。（図３Ｄ）ＣＤ２２−低  再発ＰＤＸ細胞株を１ｎｍｏｌ／Ｌのブリオスタチン１と共に２４時間にわたってｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、ＣＤ２２発現についてＣＤ２２抗体を使用して測定した。
【図３Ｂ−Ｃ】図３Ａ〜３Ｄ：（図３Ａ）４種の細胞株（Ｎａｌｍ６、Ｋｏｐｎ８、ＰｆｉｅｆｆｅｒおよびＴｏｌｄｅｏ）を１ｎｇ／ｍｌのブリオスタチン１と２４時間にわたって共インキュベートし、ブリオスタチン１曝露の１日後にフローサイトメトリーを使用して分析した。標準化されたＱｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ−ＰＥビーズを使用して部位密度を分析した。（図３Ｂ）細胞株を１ｎｇ／ｍｌのブリオスタチン１と２４時間にわたって共インキュベートし、洗浄し、ブリオスタチン１曝露の１日後および７日後にフローサイトメトリーを使用して分析した。倍率変化を部位密度に基づいて算出した：（ブリオスタチン１細胞株−ＤＭＳＯ細胞株）／ＤＭＳＯ細胞株。図３Ｃは、０日目にＮＳＧマウスにＧＰＦ陽性Ｎａｌｍ６白血病細胞１×１０６個を注射し、３日目にブリオスタチン１を０．８μｇ／ｋｇで投与したことについて示すグラフである。ブリオスタチン１注射の７日後および１２日後にマウスを屠殺し、ＣＤ２２をフローサイトメトリーによって評価した。（図３Ｄ）ＣＤ２２−低  再発ＰＤＸ細胞株を１ｎｍｏｌ／Ｌのブリオスタチン１と共に２４時間にわたってｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、ＣＤ２２発現についてＣＤ２２抗体を使用して測定した。
【図３Ｄ】図３Ａ〜３Ｄ：（図３Ａ）４種の細胞株（Ｎａｌｍ６、Ｋｏｐｎ８、ＰｆｉｅｆｆｅｒおよびＴｏｌｄｅｏ）を１ｎｇ／ｍｌのブリオスタチン１と２４時間にわたって共インキュベートし、ブリオスタチン１曝露の１日後にフローサイトメトリーを使用して分析した。標準化されたＱｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ−ＰＥビーズを使用して部位密度を分析した。（図３Ｂ）細胞株を１ｎｇ／ｍｌのブリオスタチン１と２４時間にわたって共インキュベートし、洗浄し、ブリオスタチン１曝露の１日後および７日後にフローサイトメトリーを使用して分析した。倍率変化を部位密度に基づいて算出した：（ブリオスタチン１細胞株−ＤＭＳＯ細胞株）／ＤＭＳＯ細胞株。図３Ｃは、０日目にＮＳＧマウスにＧＰＦ陽性Ｎａｌｍ６白血病細胞１×１０６個を注射し、３日目にブリオスタチン１を０．８μｇ／ｋｇで投与したことについて示すグラフである。ブリオスタチン１注射の７日後および１２日後にマウスを屠殺し、ＣＤ２２をフローサイトメトリーによって評価した。（図３Ｄ）ＣＤ２２−低  再発ＰＤＸ細胞株を１ｎｍｏｌ／Ｌのブリオスタチン１と共に２４時間にわたってｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、ＣＤ２２発現についてＣＤ２２抗体を使用して測定した。
【００１７】
【図４Ａ−Ｂ】図４Ａ〜４Ｅ：（図４Ａ〜４Ｂ）ＫＯＰＮ８またはＳＥＭ細胞株をブリオスタチン１に１６時間、２４時間、４８時間、または７２時間にわたって曝露させた。細胞からＲＮＡを抽出し、ＲＮＡｓｅｑを使用して解析した。（図４Ｃ〜４Ｅ）細胞株を、１ｎｇ／ｍｌのブリオスタチン１と２４時間にわたって共インキュベートし、次いで、標的腫瘍細胞１×１０５個をＣＤ２２  ＣＡＲ、１×１０５個と１６時間にわたって共培養した。細胞培養上清からＩＬ−２（図４Ｃ）、ＩＦＮ−γ（図４Ｄ）、およびグランザイムＢ（図４Ｅ）をＥＬＩＳＡによって測定した。対応のないｔ検定を使用して統計的有意性を算出した（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．０００２、＊＊ｐ＜０．００２１、＊ｐ＜０．０３３２）。
【図４Ｃ−Ｄ】図４Ａ〜４Ｅ：（図４Ａ〜４Ｂ）ＫＯＰＮ８またはＳＥＭ細胞株をブリオスタチン１に１６時間、２４時間、４８時間、または７２時間にわたって曝露させた。細胞からＲＮＡを抽出し、ＲＮＡｓｅｑを使用して解析した。（図４Ｃ〜４Ｅ）細胞株を、１ｎｇ／ｍｌのブリオスタチン１と２４時間にわたって共インキュベートし、次いで、標的腫瘍細胞１×１０５個をＣＤ２２  ＣＡＲ、１×１０５個と１６時間にわたって共培養した。細胞培養上清からＩＬ−２（図４Ｃ）、ＩＦＮ−γ（図４Ｄ）、およびグランザイムＢ（図４Ｅ）をＥＬＩＳＡによって測定した。対応のないｔ検定を使用して統計的有意性を算出した（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．０００２、＊＊ｐ＜０．００２１、＊ｐ＜０．０３３２）。
【図４Ｅ】図４Ａ〜４Ｅ：（図４Ａ〜４Ｂ）ＫＯＰＮ８またはＳＥＭ細胞株をブリオスタチン１に１６時間、２４時間、４８時間、または７２時間にわたって曝露させた。細胞からＲＮＡを抽出し、ＲＮＡｓｅｑを使用して解析した。（図４Ｃ〜４Ｅ）細胞株を、１ｎｇ／ｍｌのブリオスタチン１と２４時間にわたって共インキュベートし、次いで、標的腫瘍細胞１×１０５個をＣＤ２２  ＣＡＲ、１×１０５個と１６時間にわたって共培養した。細胞培養上清からＩＬ−２（図４Ｃ）、ＩＦＮ−γ（図４Ｄ）、およびグランザイムＢ（図４Ｅ）をＥＬＩＳＡによって測定した。対応のないｔ検定を使用して統計的有意性を算出した（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．０００２、＊＊ｐ＜０．００２１、＊ｐ＜０．０３３２）。
【００１８】
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｄ：（図５Ａ〜５Ｂ）ＣＤ２２  ＣＡＲＴ細胞を１ｎｇ／ｍｌのブリオスタチン１と２４時間にわたって共インキュベートし、洗浄し、次いで、標的腫瘍細胞１×１０５個をＣＤ２２  ＣＡＲ、１×１０５個と１８時間にわたって共培養した。細胞培養上清からＩＦＮ−γ（図５Ａ）およびグランザイムＢ（図５Ｂ）をＥＬＩＳＡによって測定した。対応のないｔ検定を使用して統計解析を実施した（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．０００２、＊＊ｐ＜０．００２１、＊ｐ＜０．０３３２）。（図５Ｃ）偽またはＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞をＣＤ２２ｎｅｇ、ＣＤ２２ｌｏまたはＮａｌｍ６細胞のいずれかとエフェクター対標的比１：１で共インキュベートした。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ分析を使用してＧＦＰ陽性細胞の消失によって細胞死をモニタリングした。（図５Ｄ）ＮＳＧマウスに、０日目にＮａｌｍ６を注射し、３日目にＣＤ２２  ＣＡＲＴ細胞を注射し、次いで、ＤＭＳＯ対照またはブリオスタチン１を０．８μｇ／ｋｇで毎週、２週間にわたって与えた。ＩＶＩＳ技術およびルシフェリン−ＤのＩＰ注射を使用して白血病の増悪をモニタリングした。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｄ：（図５Ａ〜５Ｂ）ＣＤ２２  ＣＡＲＴ細胞を１ｎｇ／ｍｌのブリオスタチン１と２４時間にわたって共インキュベートし、洗浄し、次いで、標的腫瘍細胞１×１０５個をＣＤ２２  ＣＡＲ、１×１０５個と１８時間にわたって共培養した。細胞培養上清からＩＦＮ−γ（図５Ａ）およびグランザイムＢ（図５Ｂ）をＥＬＩＳＡによって測定した。対応のないｔ検定を使用して統計解析を実施した（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．０００２、＊＊ｐ＜０．００２１、＊ｐ＜０．０３３２）。（図５Ｃ）偽またはＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞をＣＤ２２ｎｅｇ、ＣＤ２２ｌｏまたはＮａｌｍ６細胞のいずれかとエフェクター対標的比１：１で共インキュベートした。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ分析を使用してＧＦＰ陽性細胞の消失によって細胞死をモニタリングした。（図５Ｄ）ＮＳＧマウスに、０日目にＮａｌｍ６を注射し、３日目にＣＤ２２  ＣＡＲＴ細胞を注射し、次いで、ＤＭＳＯ対照またはブリオスタチン１を０．８μｇ／ｋｇで毎週、２週間にわたって与えた。ＩＶＩＳ技術およびルシフェリン−ＤのＩＰ注射を使用して白血病の増悪をモニタリングした。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｄ：（図５Ａ〜５Ｂ）ＣＤ２２  ＣＡＲＴ細胞を１ｎｇ／ｍｌのブリオスタチン１と２４時間にわたって共インキュベートし、洗浄し、次いで、標的腫瘍細胞１×１０５個をＣＤ２２  ＣＡＲ、１×１０５個と１８時間にわたって共培養した。細胞培養上清からＩＦＮ−γ（図５Ａ）およびグランザイムＢ（図５Ｂ）をＥＬＩＳＡによって測定した。対応のないｔ検定を使用して統計解析を実施した（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．０００２、＊＊ｐ＜０．００２１、＊ｐ＜０．０３３２）。（図５Ｃ）偽またはＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞をＣＤ２２ｎｅｇ、ＣＤ２２ｌｏまたはＮａｌｍ６細胞のいずれかとエフェクター対標的比１：１で共インキュベートした。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ分析を使用してＧＦＰ陽性細胞の消失によって細胞死をモニタリングした。（図５Ｄ）ＮＳＧマウスに、０日目にＮａｌｍ６を注射し、３日目にＣＤ２２  ＣＡＲＴ細胞を注射し、次いで、ＤＭＳＯ対照またはブリオスタチン１を０．８μｇ／ｋｇで毎週、２週間にわたって与えた。ＩＶＩＳ技術およびルシフェリン−ＤのＩＰ注射を使用して白血病の増悪をモニタリングした。
【図５Ｄ】図５Ａ〜５Ｄ：（図５Ａ〜５Ｂ）ＣＤ２２  ＣＡＲＴ細胞を１ｎｇ／ｍｌのブリオスタチン１と２４時間にわたって共インキュベートし、洗浄し、次いで、標的腫瘍細胞１×１０５個をＣＤ２２  ＣＡＲ、１×１０５個と１８時間にわたって共培養した。細胞培養上清からＩＦＮ−γ（図５Ａ）およびグランザイムＢ（図５Ｂ）をＥＬＩＳＡによって測定した。対応のないｔ検定を使用して統計解析を実施した（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．０００２、＊＊ｐ＜０．００２１、＊ｐ＜０．０３３２）。（図５Ｃ）偽またはＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞をＣＤ２２ｎｅｇ、ＣＤ２２ｌｏまたはＮａｌｍ６細胞のいずれかとエフェクター対標的比１：１で共インキュベートした。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ分析を使用してＧＦＰ陽性細胞の消失によって細胞死をモニタリングした。（図５Ｄ）ＮＳＧマウスに、０日目にＮａｌｍ６を注射し、３日目にＣＤ２２  ＣＡＲＴ細胞を注射し、次いで、ＤＭＳＯ対照またはブリオスタチン１を０．８μｇ／ｋｇで毎週、２週間にわたって与えた。ＩＶＩＳ技術およびルシフェリン−ＤのＩＰ注射を使用して白血病の増悪をモニタリングした。
【００１９】
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｄ：ＣＡＲ注入前のブリオスタチン１による処理により、Ｔ細胞疲弊を伴わずにＴ細胞表現型が変更され、ＣＡＲ注入後では、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける寛解の耐久性が改善される。（図６Ａ）Ｎａｌｍ６細胞を１ｎｍｏｌ／Ｌのブリオスタチン１に２４時間にわたって曝露させ、次いで、０日目にマウスに注射した。３日目にＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞を投与し、１０日目にマウスを屠殺した。骨髄細胞をフローサイトメトリーのために染色し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機で分析した。対応のないｔ検定を使用して統計値を算出した（＊、Ｐ＜０．０３３２）。（図６Ｂ）ＮＳＧマウスに、０日目にＮａｌｍ６を注射し、３日目にＣＤ２２  ＣＡＲＴを注射し、次いで、ＤＭＳＯ対照またはブリオスタチン１のいずれかを４０μｇ／ｋｇで毎週、２週間にわたって与えた。腫瘍注射の３０日後にマウスを屠殺した。細胞をフローサイトメトリーのために染色し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機で分析した。（図６Ｃ）ＮＳＧマウスに、０日目にＧＰＦ陽性Ｎａｌｍ６またはＳＥＭ腫瘍細胞１×１０６個を注射した。３日目に、処置として偽またはＣＤ２２  ＣＡＲのいずれかを３×１０６個（Ｎａｌｍ６）または２×１０６個（ＳＥＭ）注射した。マウスに、４０μｇ／ｋｇのブリオスタチン１またはＤＭＳＯを毎週、２週間にわたって与えた。マウスに対してＩＶＩＳ技術およびルシフェリン−Ｄの腹腔内注射を使用してイメージングを行った。（図６Ｄ）ＮＳＧマウスに、０日目にＧＰＦ陽性ＰＤＸ腫瘍細胞１×１０６個を注射した。４２日目に、処置として偽またはＣＤ２２  ＣＡＲを３×１０６個注射した。マウスに、４０μｇ／ｋｇのブリオスタチン１またはＤＭＳＯを４５日目から開始して毎週、２週間にわたって与えた。マウスに対してＩＶＩＳ技術およびルシフェリン−Ｄの腹腔内注射を使用してイメージングを行った。
【図６Ｂ】図６Ａ〜６Ｄ：ＣＡＲ注入前のブリオスタチン１による処理により、Ｔ細胞疲弊を伴わずにＴ細胞表現型が変更され、ＣＡＲ注入後では、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける寛解の耐久性が改善される。（図６Ａ）Ｎａｌｍ６細胞を１ｎｍｏｌ／Ｌのブリオスタチン１に２４時間にわたって曝露させ、次いで、０日目にマウスに注射した。３日目にＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞を投与し、１０日目にマウスを屠殺した。骨髄細胞をフローサイトメトリーのために染色し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機で分析した。対応のないｔ検定を使用して統計値を算出した（＊、Ｐ＜０．０３３２）。（図６Ｂ）ＮＳＧマウスに、０日目にＮａｌｍ６を注射し、３日目にＣＤ２２  ＣＡＲＴを注射し、次いで、ＤＭＳＯ対照またはブリオスタチン１のいずれかを４０μｇ／ｋｇで毎週、２週間にわたって与えた。腫瘍注射の３０日後にマウスを屠殺した。細胞をフローサイトメトリーのために染色し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機で分析した。（図６Ｃ）ＮＳＧマウスに、０日目にＧＰＦ陽性Ｎａｌｍ６またはＳＥＭ腫瘍細胞１×１０６個を注射した。３日目に、処置として偽またはＣＤ２２  ＣＡＲのいずれかを３×１０６個（Ｎａｌｍ６）または２×１０６個（ＳＥＭ）注射した。マウスに、４０μｇ／ｋｇのブリオスタチン１またはＤＭＳＯを毎週、２週間にわたって与えた。マウスに対してＩＶＩＳ技術およびルシフェリン−Ｄの腹腔内注射を使用してイメージングを行った。（図６Ｄ）ＮＳＧマウスに、０日目にＧＰＦ陽性ＰＤＸ腫瘍細胞１×１０６個を注射した。４２日目に、処置として偽またはＣＤ２２  ＣＡＲを３×１０６個注射した。マウスに、４０μｇ／ｋｇのブリオスタチン１またはＤＭＳＯを４５日目から開始して毎週、２週間にわたって与えた。マウスに対してＩＶＩＳ技術およびルシフェリン−Ｄの腹腔内注射を使用してイメージングを行った。
【図６Ｃ−Ｄ】図６Ａ〜６Ｄ：ＣＡＲ注入前のブリオスタチン１による処理により、Ｔ細胞疲弊を伴わずにＴ細胞表現型が変更され、ＣＡＲ注入後では、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける寛解の耐久性が改善される。（図６Ａ）Ｎａｌｍ６細胞を１ｎｍｏｌ／Ｌのブリオスタチン１に２４時間にわたって曝露させ、次いで、０日目にマウスに注射した。３日目にＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞を投与し、１０日目にマウスを屠殺した。骨髄細胞をフローサイトメトリーのために染色し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機で分析した。対応のないｔ検定を使用して統計値を算出した（＊、Ｐ＜０．０３３２）。（図６Ｂ）ＮＳＧマウスに、０日目にＮａｌｍ６を注射し、３日目にＣＤ２２  ＣＡＲＴを注射し、次いで、ＤＭＳＯ対照またはブリオスタチン１のいずれかを４０μｇ／ｋｇで毎週、２週間にわたって与えた。腫瘍注射の３０日後にマウスを屠殺した。細胞をフローサイトメトリーのために染色し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機で分析した。（図６Ｃ）ＮＳＧマウスに、０日目にＧＰＦ陽性Ｎａｌｍ６またはＳＥＭ腫瘍細胞１×１０６個を注射した。３日目に、処置として偽またはＣＤ２２  ＣＡＲのいずれかを３×１０６個（Ｎａｌｍ６）または２×１０６個（ＳＥＭ）注射した。マウスに、４０μｇ／ｋｇのブリオスタチン１またはＤＭＳＯを毎週、２週間にわたって与えた。マウスに対してＩＶＩＳ技術およびルシフェリン−Ｄの腹腔内注射を使用してイメージングを行った。（図６Ｄ）ＮＳＧマウスに、０日目にＧＰＦ陽性ＰＤＸ腫瘍細胞１×１０６個を注射した。４２日目に、処置として偽またはＣＤ２２  ＣＡＲを３×１０６個注射した。マウスに、４０μｇ／ｋｇのブリオスタチン１またはＤＭＳＯを４５日目から開始して毎週、２週間にわたって与えた。マウスに対してＩＶＩＳ技術およびルシフェリン−Ｄの腹腔内注射を使用してイメージングを行った。
【００２０】
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｂ：（図７Ａ）部位密度細胞株（Ｎａｌｍ６、ＣＤ２２ｎｅｇ、ＣＤ２２ｌｏおよびＣＤ２２ｈｉ）をＣＤ２２  ＣＡＲＴ細胞と共インキュベートした。ＥＬＩＳＡを使用して培養上清中のＩＬ−２を測定した。（図７Ｂ）ＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞療法前およびＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞療法後の患者試料をＣＤ２２発現についてＱｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ−ＰＥビーズ評価を使用して評価した。ウィルコクソン検定を使用して統計解析を実施した。
【図７Ｂ】図７Ａ〜７Ｂ：（図７Ａ）部位密度細胞株（Ｎａｌｍ６、ＣＤ２２ｎｅｇ、ＣＤ２２ｌｏおよびＣＤ２２ｈｉ）をＣＤ２２  ＣＡＲＴ細胞と共インキュベートした。ＥＬＩＳＡを使用して培養上清中のＩＬ−２を測定した。（図７Ｂ）ＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞療法前およびＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞療法後の患者試料をＣＤ２２発現についてＱｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ−ＰＥビーズ評価を使用して評価した。ウィルコクソン検定を使用して統計解析を実施した。
【００２１】
【図８】図８：腫瘍細胞（１×１０５個）をＣＤ２２  ＣＡＲＴ患者試料由来のＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞１×１０５個と１８時間にわたって共培養した。上清をＭｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ炎症促進性サイトカインパネルによって評価した。
【００２２】
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｆ：（図９Ａ〜９Ｂ）合計１×１０５個の腫瘍細胞を１×１０５個の偽、ＣＤ２２、またはＣＤ２２Ｖ１  ＣＡＲと共培養し、細胞培養上清からＩＦＮγおよびＩＬ２サイトカインについてＥＬＩＳＡによって評価したか（対応のあるｔ検定を使用して統計値を算出した（＊、Ｐ＜０．０３３２）；図９Ａ）、またはＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＺＯＯＭを使用してアネキシンＶ染色を経時的に評価した（図９Ｂ）。これらのデータは、２つの別々の実験を表し、２つの異なるエフェクター対標的比にわたって一貫していた。（図９Ｃ）ＮＳＧマウスに、０日目にＧＰＦ陽性ＣＤ２２ｎｅｇ、ＣＤ２２ｌｏ、またはＮａｌｍ６腫瘍細胞１×１０６個を注射し、３日目に、処置としてＣＤ２２またはＣＤ２２Ｖ１  ＣＡＲ、５×１０６個を注射した。マウスに対してＩＶＩＳ技術およびルシフェリン−Ｄの腹腔内注射を使用してイメージングを行った。発光定量化（luminescence  quantification）が右側に示されている。これらのデータは、２つの別々の実験を表す。（図９Ｄ）ＣＤ２２またはＣＤ２２Ｖ１  ＣＡＲＴを腫瘍細胞と共インキュベートした。１日目および８日目に、ＣＡＲを回収し、フローサイトメトリーのために染色し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機で分析した。対応のないｔ検定を使用して統計値を算出した（＊、Ｐ＜０．０３３２）。（図９Ｅ〜９Ｆ）マウスに、０日目にＣＤ２２ｌｏまたはＮａｌｍ６白血病細胞を注射し、３日目に合計５×１０６個のＣＤ２２  ＣＡＲＴ細胞を投与し、１６日目にマウスを屠殺した。骨髄細胞をフローサイトメトリーのために染色し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機で分析した。対応のないｔ検定を使用して統計値を算出した（＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１；＊、Ｐ＜０．０３３２）。
【図９Ｂ】図９Ａ〜９Ｆ：（図９Ａ〜９Ｂ）合計１×１０５個の腫瘍細胞を１×１０５個の偽、ＣＤ２２、またはＣＤ２２Ｖ１  ＣＡＲと共培養し、細胞培養上清からＩＦＮγおよびＩＬ２サイトカインについてＥＬＩＳＡによって評価したか（対応のあるｔ検定を使用して統計値を算出した（＊、Ｐ＜０．０３３２）；図９Ａ）、またはＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＺＯＯＭを使用してアネキシンＶ染色を経時的に評価した（図９Ｂ）。これらのデータは、２つの別々の実験を表し、２つの異なるエフェクター対標的比にわたって一貫していた。（図９Ｃ）ＮＳＧマウスに、０日目にＧＰＦ陽性ＣＤ２２ｎｅｇ、ＣＤ２２ｌｏ、またはＮａｌｍ６腫瘍細胞１×１０６個を注射し、３日目に、処置としてＣＤ２２またはＣＤ２２Ｖ１  ＣＡＲ、５×１０６個を注射した。マウスに対してＩＶＩＳ技術およびルシフェリン−Ｄの腹腔内注射を使用してイメージングを行った。発光定量化（luminescence  quantification）が右側に示されている。これらのデータは、２つの別々の実験を表す。（図９Ｄ）ＣＤ２２またはＣＤ２２Ｖ１  ＣＡＲＴを腫瘍細胞と共インキュベートした。１日目および８日目に、ＣＡＲを回収し、フローサイトメトリーのために染色し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機で分析した。対応のないｔ検定を使用して統計値を算出した（＊、Ｐ＜０．０３３２）。（図９Ｅ〜９Ｆ）マウスに、０日目にＣＤ２２ｌｏまたはＮａｌｍ６白血病細胞を注射し、３日目に合計５×１０６個のＣＤ２２  ＣＡＲＴ細胞を投与し、１６日目にマウスを屠殺した。骨髄細胞をフローサイトメトリーのために染色し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機で分析した。対応のないｔ検定を使用して統計値を算出した（＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１；＊、Ｐ＜０．０３３２）。
【図９Ｃ】図９Ａ〜９Ｆ：（図９Ａ〜９Ｂ）合計１×１０５個の腫瘍細胞を１×１０５個の偽、ＣＤ２２、またはＣＤ２２Ｖ１  ＣＡＲと共培養し、細胞培養上清からＩＦＮγおよびＩＬ２サイトカインについてＥＬＩＳＡによって評価したか（対応のあるｔ検定を使用して統計値を算出した（＊、Ｐ＜０．０３３２）；図９Ａ）、またはＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＺＯＯＭを使用してアネキシンＶ染色を経時的に評価した（図９Ｂ）。これらのデータは、２つの別々の実験を表し、２つの異なるエフェクター対標的比にわたって一貫していた。（図９Ｃ）ＮＳＧマウスに、０日目にＧＰＦ陽性ＣＤ２２ｎｅｇ、ＣＤ２２ｌｏ、またはＮａｌｍ６腫瘍細胞１×１０６個を注射し、３日目に、処置としてＣＤ２２またはＣＤ２２Ｖ１  ＣＡＲ、５×１０６個を注射した。マウスに対してＩＶＩＳ技術およびルシフェリン−Ｄの腹腔内注射を使用してイメージングを行った。発光定量化（luminescence  quantification）が右側に示されている。これらのデータは、２つの別々の実験を表す。（図９Ｄ）ＣＤ２２またはＣＤ２２Ｖ１  ＣＡＲＴを腫瘍細胞と共インキュベートした。１日目および８日目に、ＣＡＲを回収し、フローサイトメトリーのために染色し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機で分析した。対応のないｔ検定を使用して統計値を算出した（＊、Ｐ＜０．０３３２）。（図９Ｅ〜９Ｆ）マウスに、０日目にＣＤ２２ｌｏまたはＮａｌｍ６白血病細胞を注射し、３日目に合計５×１０６個のＣＤ２２  ＣＡＲＴ細胞を投与し、１６日目にマウスを屠殺した。骨髄細胞をフローサイトメトリーのために染色し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機で分析した。対応のないｔ検定を使用して統計値を算出した（＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１；＊、Ｐ＜０．０３３２）。
【図９Ｄ−Ｅ】図９Ａ〜９Ｆ：（図９Ａ〜９Ｂ）合計１×１０５個の腫瘍細胞を１×１０５個の偽、ＣＤ２２、またはＣＤ２２Ｖ１  ＣＡＲと共培養し、細胞培養上清からＩＦＮγおよびＩＬ２サイトカインについてＥＬＩＳＡによって評価したか（対応のあるｔ検定を使用して統計値を算出した（＊、Ｐ＜０．０３３２）；図９Ａ）、またはＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＺＯＯＭを使用してアネキシンＶ染色を経時的に評価した（図９Ｂ）。これらのデータは、２つの別々の実験を表し、２つの異なるエフェクター対標的比にわたって一貫していた。（図９Ｃ）ＮＳＧマウスに、０日目にＧＰＦ陽性ＣＤ２２ｎｅｇ、ＣＤ２２ｌｏ、またはＮａｌｍ６腫瘍細胞１×１０６個を注射し、３日目に、処置としてＣＤ２２またはＣＤ２２Ｖ１  ＣＡＲ、５×１０６個を注射した。マウスに対してＩＶＩＳ技術およびルシフェリン−Ｄの腹腔内注射を使用してイメージングを行った。発光定量化（luminescence  quantification）が右側に示されている。これらのデータは、２つの別々の実験を表す。（図９Ｄ）ＣＤ２２またはＣＤ２２Ｖ１  ＣＡＲＴを腫瘍細胞と共インキュベートした。１日目および８日目に、ＣＡＲを回収し、フローサイトメトリーのために染色し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機で分析した。対応のないｔ検定を使用して統計値を算出した（＊、Ｐ＜０．０３３２）。（図９Ｅ〜９Ｆ）マウスに、０日目にＣＤ２２ｌｏまたはＮａｌｍ６白血病細胞を注射し、３日目に合計５×１０６個のＣＤ２２  ＣＡＲＴ細胞を投与し、１６日目にマウスを屠殺した。骨髄細胞をフローサイトメトリーのために染色し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機で分析した。対応のないｔ検定を使用して統計値を算出した（＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１；＊、Ｐ＜０．０３３２）。
【図９Ｆ】図９Ａ〜９Ｆ：（図９Ａ〜９Ｂ）合計１×１０５個の腫瘍細胞を１×１０５個の偽、ＣＤ２２、またはＣＤ２２Ｖ１  ＣＡＲと共培養し、細胞培養上清からＩＦＮγおよびＩＬ２サイトカインについてＥＬＩＳＡによって評価したか（対応のあるｔ検定を使用して統計値を算出した（＊、Ｐ＜０．０３３２）；図９Ａ）、またはＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＺＯＯＭを使用してアネキシンＶ染色を経時的に評価した（図９Ｂ）。これらのデータは、２つの別々の実験を表し、２つの異なるエフェクター対標的比にわたって一貫していた。（図９Ｃ）ＮＳＧマウスに、０日目にＧＰＦ陽性ＣＤ２２ｎｅｇ、ＣＤ２２ｌｏ、またはＮａｌｍ６腫瘍細胞１×１０６個を注射し、３日目に、処置としてＣＤ２２またはＣＤ２２Ｖ１  ＣＡＲ、５×１０６個を注射した。マウスに対してＩＶＩＳ技術およびルシフェリン−Ｄの腹腔内注射を使用してイメージングを行った。発光定量化（luminescence  quantification）が右側に示されている。これらのデータは、２つの別々の実験を表す。（図９Ｄ）ＣＤ２２またはＣＤ２２Ｖ１  ＣＡＲＴを腫瘍細胞と共インキュベートした。１日目および８日目に、ＣＡＲを回収し、フローサイトメトリーのために染色し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機で分析した。対応のないｔ検定を使用して統計値を算出した（＊、Ｐ＜０．０３３２）。（図９Ｅ〜９Ｆ）マウスに、０日目にＣＤ２２ｌｏまたはＮａｌｍ６白血病細胞を注射し、３日目に合計５×１０６個のＣＤ２２  ＣＡＲＴ細胞を投与し、１６日目にマウスを屠殺した。骨髄細胞をフローサイトメトリーのために染色し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機で分析した。対応のないｔ検定を使用して統計値を算出した（＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１；＊、Ｐ＜０．０３３２）。
【００２３】
【図１０Ａ】図１０Ａ〜１０Ｅ：（図１０Ａ）３種の細胞株（Ｔｏｌｄｅｏ、Ｋｏｐｎ８およびＮａｌｍ６）を様々な濃度のブリオスタチン１と２４時間にわたって共インキュベートした。２４時間目に、細胞をウエスタンブロットによるプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）−βＩＩアイソフォーム分析のために収集した。（図１０Ｂ）ＫＯＰＮ８またはＳＥＭ細胞株をブリオスタチン１に１６時間、２４時間、４８時間または７２時間にわたって曝露させた。細胞からＲＮＡを抽出し、ＲＮＡｓｅｑを使用して解析した。（図１０Ｃ）ＣＤ２２の免疫蛍光染色を透過処理によって行い、その後、ＣＤ２２の染色を行ったことについて示す図である。（図１０Ｄ）４種の細胞株を、エンザスタウリン（１０μＭ）、スタウロスポリン（１００μＭ）、またはブリオスタチン１（１ｎＭ）の種々の組合せと２４時間にわたって共インキュベートした。フローサイトメトリーを使用してＣＤ２２発現を評価した。ＭＦＩ倍率変化＝ＣＤ２２  ＭＦＩブリオスタチン１／ＣＤ２２  ＭＦＩＤＭＳＯ。（図１０Ｅ）細胞株を、１ｎＭのブリオスタチン１と２４時間にわたって共インキュベートし、ＣＤ２２−ＰＥ抗体を使用してＣＤ２２発現を測定した。ＭＦＩ倍率変化＝ＣＤ２２  ＭＦＩブリオスタチン１／ＣＤ２２  ＭＦＩＤＭＳＯ。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜１０Ｅ：（図１０Ａ）３種の細胞株（Ｔｏｌｄｅｏ、Ｋｏｐｎ８およびＮａｌｍ６）を様々な濃度のブリオスタチン１と２４時間にわたって共インキュベートした。２４時間目に、細胞をウエスタンブロットによるプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）−βＩＩアイソフォーム分析のために収集した。（図１０Ｂ）ＫＯＰＮ８またはＳＥＭ細胞株をブリオスタチン１に１６時間、２４時間、４８時間または７２時間にわたって曝露させた。細胞からＲＮＡを抽出し、ＲＮＡｓｅｑを使用して解析した。（図１０Ｃ）ＣＤ２２の免疫蛍光染色を透過処理によって行い、その後、ＣＤ２２の染色を行ったことについて示す図である。（図１０Ｄ）４種の細胞株を、エンザスタウリン（１０μＭ）、スタウロスポリン（１００μＭ）、またはブリオスタチン１（１ｎＭ）の種々の組合せと２４時間にわたって共インキュベートした。フローサイトメトリーを使用してＣＤ２２発現を評価した。ＭＦＩ倍率変化＝ＣＤ２２  ＭＦＩブリオスタチン１／ＣＤ２２  ＭＦＩＤＭＳＯ。（図１０Ｅ）細胞株を、１ｎＭのブリオスタチン１と２４時間にわたって共インキュベートし、ＣＤ２２−ＰＥ抗体を使用してＣＤ２２発現を測定した。ＭＦＩ倍率変化＝ＣＤ２２  ＭＦＩブリオスタチン１／ＣＤ２２  ＭＦＩＤＭＳＯ。
【図１０Ｃ】図１０Ａ〜１０Ｅ：（図１０Ａ）３種の細胞株（Ｔｏｌｄｅｏ、Ｋｏｐｎ８およびＮａｌｍ６）を様々な濃度のブリオスタチン１と２４時間にわたって共インキュベートした。２４時間目に、細胞をウエスタンブロットによるプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）−βＩＩアイソフォーム分析のために収集した。（図１０Ｂ）ＫＯＰＮ８またはＳＥＭ細胞株をブリオスタチン１に１６時間、２４時間、４８時間または７２時間にわたって曝露させた。細胞からＲＮＡを抽出し、ＲＮＡｓｅｑを使用して解析した。（図１０Ｃ）ＣＤ２２の免疫蛍光染色を透過処理によって行い、その後、ＣＤ２２の染色を行ったことについて示す図である。（図１０Ｄ）４種の細胞株を、エンザスタウリン（１０μＭ）、スタウロスポリン（１００μＭ）、またはブリオスタチン１（１ｎＭ）の種々の組合せと２４時間にわたって共インキュベートした。フローサイトメトリーを使用してＣＤ２２発現を評価した。ＭＦＩ倍率変化＝ＣＤ２２  ＭＦＩブリオスタチン１／ＣＤ２２  ＭＦＩＤＭＳＯ。（図１０Ｅ）細胞株を、１ｎＭのブリオスタチン１と２４時間にわたって共インキュベートし、ＣＤ２２−ＰＥ抗体を使用してＣＤ２２発現を測定した。ＭＦＩ倍率変化＝ＣＤ２２  ＭＦＩブリオスタチン１／ＣＤ２２  ＭＦＩＤＭＳＯ。
【図１０Ｄ】図１０Ａ〜１０Ｅ：（図１０Ａ）３種の細胞株（Ｔｏｌｄｅｏ、Ｋｏｐｎ８およびＮａｌｍ６）を様々な濃度のブリオスタチン１と２４時間にわたって共インキュベートした。２４時間目に、細胞をウエスタンブロットによるプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）−βＩＩアイソフォーム分析のために収集した。（図１０Ｂ）ＫＯＰＮ８またはＳＥＭ細胞株をブリオスタチン１に１６時間、２４時間、４８時間または７２時間にわたって曝露させた。細胞からＲＮＡを抽出し、ＲＮＡｓｅｑを使用して解析した。（図１０Ｃ）ＣＤ２２の免疫蛍光染色を透過処理によって行い、その後、ＣＤ２２の染色を行ったことについて示す図である。（図１０Ｄ）４種の細胞株を、エンザスタウリン（１０μＭ）、スタウロスポリン（１００μＭ）、またはブリオスタチン１（１ｎＭ）の種々の組合せと２４時間にわたって共インキュベートした。フローサイトメトリーを使用してＣＤ２２発現を評価した。ＭＦＩ倍率変化＝ＣＤ２２  ＭＦＩブリオスタチン１／ＣＤ２２  ＭＦＩＤＭＳＯ。（図１０Ｅ）細胞株を、１ｎＭのブリオスタチン１と２４時間にわたって共インキュベートし、ＣＤ２２−ＰＥ抗体を使用してＣＤ２２発現を測定した。ＭＦＩ倍率変化＝ＣＤ２２  ＭＦＩブリオスタチン１／ＣＤ２２  ＭＦＩＤＭＳＯ。
【図１０Ｅ】図１０Ａ〜１０Ｅ：（図１０Ａ）３種の細胞株（Ｔｏｌｄｅｏ、Ｋｏｐｎ８およびＮａｌｍ６）を様々な濃度のブリオスタチン１と２４時間にわたって共インキュベートした。２４時間目に、細胞をウエスタンブロットによるプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）−βＩＩアイソフォーム分析のために収集した。（図１０Ｂ）ＫＯＰＮ８またはＳＥＭ細胞株をブリオスタチン１に１６時間、２４時間、４８時間または７２時間にわたって曝露させた。細胞からＲＮＡを抽出し、ＲＮＡｓｅｑを使用して解析した。（図１０Ｃ）ＣＤ２２の免疫蛍光染色を透過処理によって行い、その後、ＣＤ２２の染色を行ったことについて示す図である。（図１０Ｄ）４種の細胞株を、エンザスタウリン（１０μＭ）、スタウロスポリン（１００μＭ）、またはブリオスタチン１（１ｎＭ）の種々の組合せと２４時間にわたって共インキュベートした。フローサイトメトリーを使用してＣＤ２２発現を評価した。ＭＦＩ倍率変化＝ＣＤ２２  ＭＦＩブリオスタチン１／ＣＤ２２  ＭＦＩＤＭＳＯ。（図１０Ｅ）細胞株を、１ｎＭのブリオスタチン１と２４時間にわたって共インキュベートし、ＣＤ２２−ＰＥ抗体を使用してＣＤ２２発現を測定した。ＭＦＩ倍率変化＝ＣＤ２２  ＭＦＩブリオスタチン１／ＣＤ２２  ＭＦＩＤＭＳＯ。
【００２４】
【図１１】図１１：ＣＤ２２ｌｏまたは親Ｎａｌｍ６細胞株を１ｎｇ／ｍｌのブリオスタチン１に２４時間にわたって曝露させた。フローサイトメトリーを使用してＣＤ２２発現を評価した。
【００２５】
【図１２】図１２：抗ＣＤ２２  ｍ９７１  ｓｃＦｖと親和性成熟バリアントｍ９７１−Ｌ７  ｓｃＦｖのアミノ酸配列アラインメント。
【００２６】
【図１３Ａ】図１３Ａ〜１３Ｆ：（図１３Ａ）ＢＩＡｃｏｒｅ解析を使用して、種々のｓｃＦｖの会合および解離曲線を評価した。注：算出された解離速度定数ｋｄ（１．１×１０−６  １／ｓ）は本発明で使用したＢＩＡｃｏｒｅ  Ｘ−１００によって測定することができるｋｄ（１．０×１０−５  １／ｓ）よりも低い。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅによって測定された成熟バリアントＬ７（ＫＤ＜１．０×１０−５／５．６×１０５＝１．８×１０−１１Ｍ＝１８ｐＭ）の親和性は、元のｓｃＦｖ  ｍ９７１の親和性（ＫＤ＝３．１ｎＭ）の１０００倍を超える。親和性の改善はまた、親和性成熟プロセスの間に使用される選別条件によっても支持される。（図１３Ｂ）ＣＤ２２Ｖ１またはＣＤ２２  ＣＡＲＴをＣＤ２２ｎｅｇまたはＣＤ２２ｌｏ白血病細胞と共培養し、２４時間目にＰＤ１発現についてＦｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機でのフローサイトメトリーによって評価した。（図１３Ｃ〜１３Ｆ）マウスに、０日目にＣＤ２２ｌｏまたはＮａｌｍ６白血病細胞を注射し、３日目にＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞５×１０６個を投与し、１６日目にマウスを屠殺した。骨髄細胞をフローサイトメトリーのために染色し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機で分析した。対応のないｔ検定を使用して統計値を算出した（＊＊ｐ＜０．００２１）。
【図１３Ｂ−Ｃ】図１３Ａ〜１３Ｆ：（図１３Ａ）ＢＩＡｃｏｒｅ解析を使用して、種々のｓｃＦｖの会合および解離曲線を評価した。注：算出された解離速度定数ｋｄ（１．１×１０−６  １／ｓ）は本発明で使用したＢＩＡｃｏｒｅ  Ｘ−１００によって測定することができるｋｄ（１．０×１０−５  １／ｓ）よりも低い。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅによって測定された成熟バリアントＬ７（ＫＤ＜１．０×１０−５／５．６×１０５＝１．８×１０−１１Ｍ＝１８ｐＭ）の親和性は、元のｓｃＦｖ  ｍ９７１の親和性（ＫＤ＝３．１ｎＭ）の１０００倍を超える。親和性の改善はまた、親和性成熟プロセスの間に使用される選別条件によっても支持される。（図１３Ｂ）ＣＤ２２Ｖ１またはＣＤ２２  ＣＡＲＴをＣＤ２２ｎｅｇまたはＣＤ２２ｌｏ白血病細胞と共培養し、２４時間目にＰＤ１発現についてＦｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機でのフローサイトメトリーによって評価した。（図１３Ｃ〜１３Ｆ）マウスに、０日目にＣＤ２２ｌｏまたはＮａｌｍ６白血病細胞を注射し、３日目にＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞５×１０６個を投与し、１６日目にマウスを屠殺した。骨髄細胞をフローサイトメトリーのために染色し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機で分析した。対応のないｔ検定を使用して統計値を算出した（＊＊ｐ＜０．００２１）。
【図１３Ｄ】図１３Ａ〜１３Ｆ：（図１３Ａ）ＢＩＡｃｏｒｅ解析を使用して、種々のｓｃＦｖの会合および解離曲線を評価した。注：算出された解離速度定数ｋｄ（１．１×１０−６  １／ｓ）は本発明で使用したＢＩＡｃｏｒｅ  Ｘ−１００によって測定することができるｋｄ（１．０×１０−５  １／ｓ）よりも低い。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅによって測定された成熟バリアントＬ７（ＫＤ＜１．０×１０−５／５．６×１０５＝１．８×１０−１１Ｍ＝１８ｐＭ）の親和性は、元のｓｃＦｖ  ｍ９７１の親和性（ＫＤ＝３．１ｎＭ）の１０００倍を超える。親和性の改善はまた、親和性成熟プロセスの間に使用される選別条件によっても支持される。（図１３Ｂ）ＣＤ２２Ｖ１またはＣＤ２２  ＣＡＲＴをＣＤ２２ｎｅｇまたはＣＤ２２ｌｏ白血病細胞と共培養し、２４時間目にＰＤ１発現についてＦｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機でのフローサイトメトリーによって評価した。（図１３Ｃ〜１３Ｆ）マウスに、０日目にＣＤ２２ｌｏまたはＮａｌｍ６白血病細胞を注射し、３日目にＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞５×１０６個を投与し、１６日目にマウスを屠殺した。骨髄細胞をフローサイトメトリーのために染色し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機で分析した。対応のないｔ検定を使用して統計値を算出した（＊＊ｐ＜０．００２１）。
【図１３Ｅ−Ｆ】図１３Ａ〜１３Ｆ：（図１３Ａ）ＢＩＡｃｏｒｅ解析を使用して、種々のｓｃＦｖの会合および解離曲線を評価した。注：算出された解離速度定数ｋｄ（１．１×１０−６  １／ｓ）は本発明で使用したＢＩＡｃｏｒｅ  Ｘ−１００によって測定することができるｋｄ（１．０×１０−５  １／ｓ）よりも低い。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅによって測定された成熟バリアントＬ７（ＫＤ＜１．０×１０−５／５．６×１０５＝１．８×１０−１１Ｍ＝１８ｐＭ）の親和性は、元のｓｃＦｖ  ｍ９７１の親和性（ＫＤ＝３．１ｎＭ）の１０００倍を超える。親和性の改善はまた、親和性成熟プロセスの間に使用される選別条件によっても支持される。（図１３Ｂ）ＣＤ２２Ｖ１またはＣＤ２２  ＣＡＲＴをＣＤ２２ｎｅｇまたはＣＤ２２ｌｏ白血病細胞と共培養し、２４時間目にＰＤ１発現についてＦｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機でのフローサイトメトリーによって評価した。（図１３Ｃ〜１３Ｆ）マウスに、０日目にＣＤ２２ｌｏまたはＮａｌｍ６白血病細胞を注射し、３日目にＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞５×１０６個を投与し、１６日目にマウスを屠殺した。骨髄細胞をフローサイトメトリーのために染色し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ機で分析した。対応のないｔ検定を使用して統計値を算出した（＊＊ｐ＜０．００２１）。
【００２７】
【図１４Ａ−Ｂ】図１４Ａ〜１４Ｃ：（図１４Ａ）ＳＥＭ細胞を１ｎＭのブリオスタチン１に２４時間にわたって曝露させ、洗浄した。ＣＤ１９  ＣＡＲＴをＳＥＭと１６時間にわたって共インキュベートし、グランザイムＢについてのＥＬＩＳＡを実施した。（図１４Ｂ）ＮＳＧマウスに、０日目にＳＥＭを注射し、３日目にＣＤ１９  ＣＡＲＴを注射し、次いで、ＤＭＳＯ対照またはブリオスタチン１のいずれかを４０μｇ／ｋｇで毎週、２週間にわたって与えた。マウスに対してＩＶＩＳ技術およびルシフェリン−ＤのＩＰ注射を使用してイメージングを行った。（図１４Ｃ）ＮＳＧマウスに、０日目にＮａｌｍ６を注射し、３日目にＣＤ２２  ＣＡＲＴを注射し、次いで、ＤＭＳＯ対照またはブリオスタチン１のいずれかを４０μｇ／ｋｇで毎週、２週間にわたって与えた。腫瘍注射の３０日後にマウスを屠殺した。細胞をフローサイトメトリーのために染色し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  Ｆｌｏｗ機で分析した。
【図１４Ｃ】図１４Ａ〜１４Ｃ：（図１４Ａ）ＳＥＭ細胞を１ｎＭのブリオスタチン１に２４時間にわたって曝露させ、洗浄した。ＣＤ１９  ＣＡＲＴをＳＥＭと１６時間にわたって共インキュベートし、グランザイムＢについてのＥＬＩＳＡを実施した。（図１４Ｂ）ＮＳＧマウスに、０日目にＳＥＭを注射し、３日目にＣＤ１９  ＣＡＲＴを注射し、次いで、ＤＭＳＯ対照またはブリオスタチン１のいずれかを４０μｇ／ｋｇで毎週、２週間にわたって与えた。マウスに対してＩＶＩＳ技術およびルシフェリン−ＤのＩＰ注射を使用してイメージングを行った。（図１４Ｃ）ＮＳＧマウスに、０日目にＮａｌｍ６を注射し、３日目にＣＤ２２  ＣＡＲＴを注射し、次いで、ＤＭＳＯ対照またはブリオスタチン１のいずれかを４０μｇ／ｋｇで毎週、２週間にわたって与えた。腫瘍注射の３０日後にマウスを屠殺した。細胞をフローサイトメトリーのために染色し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  Ｆｌｏｗ機で分析した。
【００２８】
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｃ：（図１５Ａ〜Ｂ）ＮＳＧマウスに、０日目にＧＰＦ陽性Ｎａｌｍ６またはＳＥＭ腫瘍細胞１×１０６個を注射した。３日目に、処置として３×１０６個（図１５Ａ）または２×１０６個（図１５Ｂ）の偽またはＣＤ２２  ＣＡＲのいずれかを注射した。マウスに、４０μｇ／ｋｇのブリオスタチン１またはＤＭＳＯを毎週、２週間にわたって与えた。マウスに対してＩＶＩＳ技術およびルシフェリン−ＤのＩＰ注射を使用してイメージングを行った。発光定量化が示されている。（図１５Ｃ）ＮＳＧマウスに、０日目にＧＰＦ陽性ＰＤＸ腫瘍細胞１×１０６個を注射した。４２日目に、処置として偽またはＣＤ２２  ＣＡＲ、３×１０６個を注射した。マウスに４０μｇ／ｋｇのブリオスタチン１またはＤＭＳＯを４５日目から開始して毎週、２週間にわたって与えた。マウスに対してＩＶＩＳ技術およびルシフェリン−ＤのＩＰ注射を使用してイメージングを行った。発光定量化が示されている。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
配列表
添付の配列表に列挙されている核酸およびアミノ酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２において定義されている通り、ヌクレオチド塩基については標準の文字略語、およびアミノ酸については３文字コードを使用して示されている。各核酸配列の一方の鎖のみが示されているが、示されている鎖への言及のいずれにも相補鎖が含まれると理解されたい。配列表は、２０１９年６月２３日に作成された９．７４ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出され、参照により本明細書に組み込まれる。添付の配列表において：
【００３０】
配列番号１は、ｍ９７１  ＶＨドメインのアミノ酸配列である。
【００３１】
配列番号２は、ｍ９７１  ＶＬドメインのアミノ酸配列である。
【００３２】
配列番号３は、ｍ９７１  ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。
【００３３】
配列番号４は、ｍ９７１−Ｌ７  ＶＨドメインのアミノ酸配列である。
【００３４】
配列番号５は、ｍ９７１−Ｌ７  ＶＬドメインのアミノ酸配列である。
【００３５】
配列番号６は、ｍ９７１−Ｌ７  ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。
【００３６】
配列番号７〜１０は、オリゴヌクレオチドプライマーである。
【００３７】
詳細な説明
Ｉ．略語
ＡＤＣ  抗体薬物コンジュゲート
ＡＬＬ  急性リンパ芽球性白血病
ＣＡＲ  キメラ抗原受容体
ＣＡＲＴ  キメラ抗原受容体Ｔ細胞
ＣＤＲ  相補性決定領域
ＣＬＬ  慢性リンパ性白血病
ＣＲＩＳＰＲ  クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート
ＤＬＢＣＬ  びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫
ＤＭＳＯ  ジメチルスルホキシド
ＥＣＤ  細胞外ドメイン
ＥＬＩＳＡ  酵素結合免疫吸着アッセイ
ＧＦＰ  緑色蛍光タンパク質
ＧＳＥＡ  遺伝子セット富化解析
ＨＣＬ  有毛細胞白血病
ＩＦＮ  インターフェロン
ＩＬ  インターロイキン
ＩＰ  腹腔内
ＩＶＩＳ  インビボイメージングシステム
ＭＡＬＴ  粘膜関連リンパ組織
ＮＨＬ  非ホジキンリンパ腫
ＰＥ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素またはフィコエリトリン
ＰＫＣ  プロテインキナーゼＣ
ｓｃＦｖ  単鎖可変断片
ＴＣＲ  Ｔ細胞受容体
ＶＨ  重鎖可変
ＶＬ  軽鎖可変
【００３８】
ＩＩ．用語
特に断りのない限り、技術用語は、従来の使用に従って使用される。分子生物学における一般用語の定義は、Benjamin  Lewin,  Genes  V,  published  by  Oxford  University  Press,  1994  (ISBN  0-19-854287-9)；Kendrew  et  al.  (eds.)  ,  The  Encyclopedia  of  Molecular  Biology,  published  by  Blackwell  Science  Ltd.,  1994  (ISBN  0-632-02182-9)；およびRobert  A.  Meyers  (ed.)  ,  Molecular  Biology  and  Biotechnology:  a  Comprehensive  Desk  Reference,  published  by  VCH  Publishers,  Inc.,  1995  (ISBN  1-56081-569-8)において見ることができる。
本開示の種々の実施形態の精査を容易にするために、以下の特定の用語に関する説明が提示される：
【００３９】
４−１ＢＢ：Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）により活性化されたリンパ球によって、およびナチュラルキラー細胞を含めた他の細胞によって発現される共刺激分子。４−１ＢＢのライゲーションにより、シグナル伝達カスケードが誘導され、その結果、サイトカイン産生、抗アポトーシス分子の発現および免疫応答の増強がもたらされる。
【００４０】
投与：対象に治療剤（例えば、抗体）などの薬剤を任意の効果的な経路によって供給するまたは与えること。例示的な投与経路としては、これだけに限定されないが、注射または注入（例えば、皮下、腫瘍内、筋肉内、皮内、腹腔内、髄腔内、静脈内、脳室内、線状体内、頭蓋内および脊髄内など）、経口、腺管内、舌下、直腸、経皮的、鼻腔内、膣および吸入経路が挙げられる。
【００４１】
抗体：ＣＤ２２などの抗原のエピトープを認識し、それに結合する（例えば、特異的に認識し、特異的に結合する）少なくとも１つの可変領域を含むポリペプチドリガンド。哺乳動物免疫グロブリン分子は、重（Ｈ）鎖と軽（Ｌ）鎖で構成され、そのそれぞれが、それぞれ重鎖可変（ＶＨ）領域および軽鎖可変（ＶＬ）領域と称される可変領域を有する。まとめて、ＶＨ領域およびＶＬ領域は、抗体によって認識される抗原への結合に関与する。哺乳動物免疫グロブリンには主要な重鎖クラス（またはアイソタイプ）が５つ存在し、それにより抗体分子の機能的活性が決定される：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥ。哺乳動物では見いだされない抗体のアイソタイプとして、ＩｇＸ、ＩｇＹ、ＩｇＷおよびＩｇＮＡＲが挙げられる。ＩｇＹは、鳥類およびは虫類によって産生される主要な抗体であり、哺乳動物ＩｇＧおよびＩｇＥに対していくつかの機能的類似性を有する。ＩｇＷおよびＩｇＮＡＲ抗体は軟骨魚類によって産生され、一方、ＩｇＸ抗体は両生類において見いだされる。
【００４２】
抗体可変領域は、「フレームワーク」領域および「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」として公知の超可変領域を含有する。ＣＤＲは、抗原のエピトープへの結合に主に関与する。抗体のフレームワーク領域は、ＣＤＲを３次元空間に配置し整列させる機能を果たす。所与のＣＤＲのアミノ酸配列の境界は、Kabatら（Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest,  U.S.  Department  of  Health  and  Human  Services,  1991；「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）、Chothiaら（Chothia  and  Lesk,  J  Mol  Biol  196:  901-917,  1987；Chothia  et  al.,  Nature  342:  877,  1989；およびAl-Lazikani  et  al.,  (JMB  273,927-948,  1997を参照されたい；「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）、Kunikら（Kunik  et  al.,  PLoS  Comput  Biol  8:  e1002388,  2012；およびKunik  et  al.,  Nucleic  Acids  Res  40  (Web  Server  issue):  W521-524,  2012を参照されたい；「Ｐａｒａｔｏｍｅ  ＣＤＲ」）ならびにＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース（Lefranc,  Nucleic  Acids  Res  29:  207-9,  2001を参照されたい；「ＩＭＧＴ」番号付けスキーム）によって記載されているものを含めたいくつかの周知の番号付けスキームのいずれかを使用して容易に決定することができる。Ｋａｂａｔ、ＰａｒａｔｏｍｅおよびＩＭＧＴデータベースはオンラインで維持されている。
【００４３】
「単一ドメイン抗体」とは、追加の抗体ドメインの非存在下で抗原または抗原のエピトープに特異的に結合することができる単一ドメイン（可変ドメイン）を有する抗体を指す。単一ドメイン抗体としては、例えば、ＶＨドメイン抗体、ＶＮＡＲ抗体、ラクダＶＨＨ抗体、およびＶＬドメイン抗体が挙げられる。ＶＮＡＲ抗体は、コモリザメ、オオセ科のサメ、ツノザメ科のサメおよびイヌザメなどの軟骨魚類によって産生される。ラクダＶＨＨ抗体は、軽鎖を天然に欠く重鎖抗体を産生するラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、およびグアナコを含めたいくつかの種によって産生される。
【００４４】
「モノクローナル抗体」は、リンパ球の単一クローンによって、または単一抗体のコード配列がトランスフェクトされた細胞によって産生される抗体である。モノクローナル抗体は、当業者に公知の方法によって作製される。モノクローナル抗体は、ヒト化モノクローナル抗体を含む。
【００４５】
「キメラ抗体」は、ヒトなどの１つの種に由来するフレームワーク残基と別の種に由来するＣＤＲ（一般に抗原結合性を付与する）とを有する。
【００４６】
「ヒト化」抗体は、ヒトフレームワーク領域と非ヒト（例えば、マウス、ウサギ、ラット、サメまたは合成）免疫グロブリン由来の１つまたは複数のＣＤＲとを含む免疫グロブリンである。ＣＤＲを供給する非ヒト免疫グロブリンは「ドナー」と称され、フレームワークを供給するヒト免疫グロブリンは「アクセプター」と称される。一実施形態では、ヒト化免疫グロブリンの全てのＣＤＲがドナー免疫グロブリン由来のものである。定常領域は存在する必要はないが、存在する場合には、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、すなわち、少なくとも約８５〜９０％、例えば、約９５％またはそれよりも大きく同一でなければならない。したがって、ヒト化免疫グロブリンのおそらくＣＤＲ以外の全ての部分が、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。ヒト化抗体は、ＣＤＲを供給するドナー抗体と同じ抗原に結合する。ヒト化または他のモノクローナル抗体は、抗原結合または他の免疫グロブリン機能に実質的に影響を及ぼさない追加の保存的アミノ酸置換を有し得る。
【００４７】
Ｂ細胞悪性腫瘍：本明細書で使用される場合、「Ｂ細胞悪性腫瘍」は、任意の型のＢ細胞の白血病またはリンパ腫を含む。Ｂ細胞悪性腫瘍としては、これだけに限定されないが、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、脾臓辺縁帯リンパ腫、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）リンパ腫、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）およびＢ細胞性前リンパ球性白血病が挙げられる。
【００４８】
結合親和性：抗原に対する抗体の親和性。一実施形態では、親和性は、Frankel  et  al.,  Mol.  Immunol.,  16:  101-106,  1979によって記載されているスキャッチャード法の改変版によって算出される。別の実施形態では、結合親和性は、抗原／抗体解離速度によって測定される。別の実施形態では、高結合親和性は、競合ラジオイムノアッセイによって測定される。別の実施形態では、結合親和性は、ＥＬＩＳＡによって測定される。別の実施形態では、抗体親和性は、フローサイトメトリーによって測定される。抗原（ＣＤ２２など）に「特異的に結合する」抗体は、抗原に高い親和性で結合し、他の無関係の抗原には有意に結合しない抗体である。
【００４９】
ブリオスタチン１：海洋生物Ｂｕｇｕｌａ  ｎｅｒｉｔｉｎａから単離された抗がん大環状ラクトン。ブリオスタチン１は、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）に結合し、それを阻害し、その結果、腫瘍細胞の増殖の阻害、腫瘍細胞分化の促進および腫瘍細胞アポトーシスの誘導がもたらされる。ブリオスタチン１を用いた処置により、ＣＤ２２の細胞表面発現が増加し、ＣＤ２２−免疫毒素の毒性が増強される（例えば、Biberacher  et  al.,  Haematologica  97  (5):  771-779,  2012を参照されたい）。例示的な構造を以下に示す
【化１】
2021530987.tif 000002
【００５０】
ＣＤ２２：免疫グロブリンスーパーファミリーに属する系列制限されたＢ細胞抗原。ＣＤ２２は、Ｂ細胞リンパ腫および白血病の６０〜７０％で発現される。ＣＤ２２は、Ｂ細胞発生の初期には細胞表面上に存在せず、幹細胞上にも存在しない。本明細書で使用される場合、「ＣＤ２２」は、ＣＤ２２ポリペプチドまたはそのバリアントもしくは断片を指す。ヒトＣＤ２２の配列は公的に入手可能である（例えば、Torres  et  al.,  J.  Immunol.  149  (8):  2641-2649,  1992；およびWilson  et  al.,  J.  Exp.  Med.  173  (1):  137-146,  1991を参照されたい）。「ＣＤ２２」という用語は、ｓＣＤ２２と称される可溶性の形態のＣＤ２２も含む。
【００５１】
化学療法剤：異常な細胞成長によって特徴付けられる疾患の処置に関して治療的有用性がある任意の化学薬剤。そのような疾患としては、腫瘍、新生物、およびがん、ならびに乾癬などの過形成性成長によって特徴付けられる疾患が挙げられる。一実施形態では、化学療法剤は、放射性化合物である。一実施形態では、化学療法剤は、モノクローナル抗体などの生物学的製剤である。当業者は、有用な化学療法剤を容易に同定することができる（例えば、Slapak  and  Kufe,  Principles  of  Cancer  Therapy,  Chapter  86  in  Harrison's  Principles  of  Internal  Medicine,  14th  edition；Perry  et  al.,  Chemotherapy,  Ch.  17  in  Abeloff,  Clinical  Oncology  2nd  ed.,  (C)  2000  Churchill  Livingstone,  Inc；Baltzer,  L.,  Berkery,  R.  (eds.):  Oncology  Pocket  Guide  to  Chemotherapy,  2nd  ed.  St.  Louis,  Mosby-Year  Book,  1995；Fischer,  D.S.,  Knobf,  M.F.,  Durivage,  H.J.  (eds):  The  Cancer  Chemotherapy  Handbook,  4th  ed.  St.  Louis,  Mosby-Year  Book,  1993を参照されたい）。併用化学療法とは、がんを処置するために２種以上の薬剤を投与することである。１つの例は、使用するＣＡＲ  Ｔ細胞を、ブリオスタチン１などの、ＣＤ２２発現を増加させる薬剤などの放射性または化学化合物と組み合わせて投与することである。
【００５２】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）：抗原結合性部分（例えば、単一ドメイン抗体またはｓｃＦｖ）と、Ｔ細胞受容体由来のシグナル伝達ドメインなどのシグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ）とを含むキメラ分子。一般には、ＣＡＲは、抗原結合部分、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインで構成される。細胞内ドメインは、一般には、ＣＤ３ζまたはＦｃεＲＩγなどの免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を有するシグナル伝達鎖を含む。一部の例では、エンドドメインは、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ２７および／またはＤＡＰ１０などの少なくとも１つの追加の共刺激ドメインの細胞内部分をさらに含む。
【００５３】
慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）は、リンパ球増多症、リンパ節腫脹、および臓器肥大によって特徴付けられるリンパ球増殖性障害である。ＣＬＬは、末梢血が関与するリンパ腫である。
【００５４】
相補性決定領域（ＣＤＲ）：抗体の結合親和性および特異性を規定する超可変アミノ酸配列の領域。哺乳動物免疫グロブリンの軽鎖および重鎖はそれぞれが３つのＣＤＲを有し、それぞれＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ３およびＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３と称される。
【００５５】
保存的バリアント：「保存的」アミノ酸置換は、抗体などのタンパク質のＣＤ２２に対する親和性に実質的に影響を及ぼさないまたはそれを低下させない置換である。一例として、ＣＤ２２に特異的に結合するモノクローナル抗体は、最大で約１カ所、最大で約２カ所、最大で約５カ所、および最大で約１０カ所、または最大で約１５カ所の保存的置換を含み得、ＣＤ２２ポリペプチドに特異的に結合することができる。「保存的バリアント」という用語は、バリアントが活性を保持するという条件で、非置換親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を使用することも含む。非保存的置換は、タンパク質の活性が低下する置換である。
【００５６】
機能的に類似したアミノ酸を提示する保存的アミノ酸置換表が当業者には周知である。以下の６つの群は、互いに保存的置換とみなされるアミノ酸の例である：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００５７】
本明細書の一部の実施形態では、配列番号４、配列番号５、または配列番号６と比べて１０カ所以下、９カ所以下、８カ所以下、７カ所以下、６カ所以下、５カ所以下、４カ所以下、３カ所以下、２カ所以下または１カ所以下のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列が提供される。一部の実施形態では、置換は抗体のフレームワーク領域内にのみ存在する。
【００５８】
細胞傷害性薬剤：細胞を死滅させる任意の薬物または化合物。
【００５９】
細胞傷害性：生物体の残りの細胞とは対照的に標的になることが意図された細胞に対する分子の毒性。
【００６０】
縮重バリアント：遺伝暗号の結果として縮重した配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。２０種の天然アミノ酸が存在し、その大部分が１つよりも多くのコドンによって指定される。したがって、ポリペプチドのアミノ酸配列が変化しない限りは、全ての縮重ヌクレオチド配列が包含される。
【００６１】
エピトープ：抗原性決定因子。抗原性である、すなわち、特定の免疫応答を引き出す特定の化学基またはペプチド配列が分子上に存在する。抗体は、ポリペプチド上の特定の抗原エピトープに特異的に結合する。
【００６２】
フレームワーク領域：ＣＤＲ間に介在するアミノ酸配列。フレームワーク領域は、軽鎖可変および重鎖可変フレームワーク領域を含む。フレームワーク領域は、ＣＤＲを抗原結合のために適当な位置方向に保持する機能を果たす。
【００６３】
融合タンパク質：２つの異なる（異種）タンパク質の少なくとも一部分を含むタンパク質。
【００６４】
有毛細胞白血病（ＨＣＬ）は、小型Ｂリンパ球の悪性障害であり、これらの細胞内に細胞質突起が存在することから名付けられた。ＨＣＬを有する対象は、一般に、汎血球減少、脾腫および骨髄線維症を示す。末梢血は、通常は少数の有毛細胞を含有する。有毛細胞は、脾臓の赤脾髄で増殖し、したがって、脾腫が一般的である。
【００６５】
免疫応答：Ｂ細胞、Ｔ細胞、または単球などの免疫系の細胞の刺激に対する応答。一実施形態では、応答は、特定の抗原に対して特異的なものである（「抗原特異的応答」）。一実施形態では、免疫応答はＣＤ４＋応答またはＣＤ８＋応答などのＴ細胞応答である。別の実施形態では、応答はＢ細胞応答であり、特異的抗体の産生がもたらされる。
【００６６】
単離された：その成分が天然に存在する環境中（例えば、細胞など）の他の生物学的成分、すなわち、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質ならびに細胞小器官から実質的に分離または精製された、核酸、タンパク質（抗体を含む）または細胞小器官などの「単離された」生物学的成分。「単離された」核酸およびタンパク質は、標準の精製方法によって精製された核酸およびタンパク質を含む。この用語は、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸およびタンパク質ならびに化学的に合成された核酸も包含する。
【００６７】
標識：抗体またはタンパク質などの別の分子の検出を容易にするためにその分子に直接または間接的にコンジュゲートした検出可能な化合物または組成物。標識の非限定的な具体例として、蛍光タグ、酵素結合（enzymatic  linkage）、および放射性同位元素が挙げられる。一例では、「標識された抗体」は、抗体に別の分子が組み入れられていることを指す。例えば、標識は、放射標識されたアミノ酸の組み入れ、または、マークされたアビジン（例えば、光学的方法または比色定量法によって検出することができる蛍光マーカーまたは酵素活性を含有するストレプトアビジン）によって検出することができるビオチニル部分のポリペプチドへの結合などの、検出可能なマーカーである。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する種々の方法が当技術分野で公知であり、それらを使用することができる。ポリペプチドに対する標識の例としては、これだけに限定されないが、以下が挙げられる：放射性同位元素または放射性ヌクレオチド（例えば、３５Ｓ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、１９Ｆ、９９ｍＴｃ、１３１Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎおよび１２５Ｉなど）、蛍光標識（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、Ｃｙ５、Ｃｙ３、ランタニドリン光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合性部位、金属結合性ドメイン、エピトープタグ）、またはガドリニウムキレートなどの磁気剤。一部の実施形態では、潜在的な立体障害を低減するために、標識を種々の長さのスペーサーアームによって結合させる。
【００６８】
リンカー：一部の場合では、リンカーは、可変重鎖と可変軽鎖を間接的に結合させる働きをする、抗体結合性断片（例えば、Ｆｖ断片）内のペプチドである。ｓｃＦｖのＶＨドメインとＶＬドメインをつなぐためのリンカーの１つの例は、（ＧＧＧＳ）４（配列番号６の残基１２５〜１３９）である。「リンカー」は、抗体などの標的化部分と細胞毒または検出可能な標識などのエフェクター分子を連結する働きをするペプチドも指し得る。「コンジュゲートすること」、「つなぐこと」、「結合すること」または「連結すること」という用語は、２つのポリペプチドを１つの連続したポリペプチド分子にすること、または放射性核種もしくは他の分子をｓｃＦｖなどのポリペプチドに共有結合により付着させることを指す。特定の文脈では、この用語は、抗体部分などのリガンドとエフェクター分子をつなぐことへの言及を包含する。連結は、化学的手段によるものであっても組換え手段によるものであってもよい。「化学的手段」は、抗体部分とエフェクター分子の、２つの分子間に共有結合が形成されて、１つの分子が形成される反応を指す。
【００６９】
哺乳動物：この用語は、ヒトおよび非ヒト哺乳動物のどちらも包含する。同様に、「対象」という用語は、ヒトおよび動物対象のどちらも包含する。
【００７０】
新形成、悪性腫瘍、がんまたは腫瘍：新生物は、過剰な細胞分裂に起因する組織または細胞の異常な成長である。新生物の成長により、腫瘍が生じ得る。個体における腫瘍の量は、腫瘍の数、体積、または重量として測定することができる「腫瘍負荷」である。転移しない腫瘍は「良性」と称される。周囲の組織に浸潤し、かつ／または転移し得る腫瘍は「悪性」と称される。
【００７１】
非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）：主にＢリンパ球から生じるがんの不均一な群を指す。ＮＨＬの亜型は、一般には、それらの攻撃性、または組織学的グレードに基づいて３つの別個のカテゴリーに群分けされる。これらのカテゴリーは、無痛性（低悪性度）、アグレッシブ（中悪性度）および高度アグレッシブ（高悪性度）である。ＮＨＬとしては、これだけに限定されないが、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、ＭＡＬＴリンパ腫、濾胞性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫およびバーキットリンパ腫が挙げられる。
【００７２】
作動可能に連結した：第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的に関連して位置している場合、第１の核酸配列は第２の核酸配列に作動可能に連結している。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、そのプロモーターはコード配列に作動可能に連結している。一般に、作動可能に連結したＤＮＡ配列は連続しており、また、２つのタンパク質コード領域をつなぐために必要であれば、同じ読み枠内にある。
【００７３】
医薬剤：対象または細胞に適当に投与された場合に所望の治療効果または予防効果を誘導することができる化学化合物または組成物。
【００７４】
薬学的に許容される担体：有用な薬学的に許容される担体は、従来のものである。Remington's  Pharmaceutical  Sciences,  by  E.W.  Martin,  Mack  Publishing  Co.,  Easton,  PA,  15th  Edition,  1975には、ＣＤ２２抗体またはその断片を含むものなどの本明細書に開示される組成物の医薬送達に適した組成物および製剤が記載されている。
【００７５】
一般に、担体の性質は、使用される特定の投与形式に依存する。例えば、非経口用製剤は、通常、例えば、水、生理的食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどの薬学的にかつ生理的に許容される流体をビヒクルとして含む注射液を含む。固形組成物（例えば、散剤、丸剤、錠剤、またはカプセル剤の形態）に関しては、従来の無毒性の固形担体、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを含み得る。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、微量の無毒性の補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含有し得る。
【００７６】
疾患を防止する、処置するまたは好転させること：疾患を「防止すること」とは、疾患の完全な発症を阻害することを指す。「処置すること」は、疾患または病態が発症し始めた後にその徴候または症状を好転させる、例えば、腫瘍負荷を低減するまたは転移の数もしくはサイズを減少させる治療介入を指す。「好転させること」は、がんなどの疾患の徴候または症状の数または重症度の低減を指す。
【００７７】
精製された：精製されたという用語は、絶対的な純度を必要とするものではなく、相対語として意図されている。したがって、例えば、精製されたペプチド調製物は、ペプチドまたはタンパク質が、細胞内のその天然の環境中のペプチドまたはタンパク質よりも多く富化されているものである。一実施形態では、調製物は、タンパク質またはペプチドが調製物の総ペプチドまたはタンパク質含有量の少なくとも５０％を占めるように、精製されている。実質的な精製とは、他のタンパク質または細胞成分からの精製を意味する。実質的に精製されたタンパク質（例えば、本明細書で提供される抗体またはその抗原結合性断片）は、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％純粋である。したがって、１つの非限定的な具体例では、実質的に精製されたタンパク質は、９０％が他のタンパク質や細胞成分を含まない。
【００７８】
組換え：組換え核酸は、天然に存在しない配列を有する、または２つのそうでなければ分離されていた配列のセグメントの人工的な組合せによって作出された配列を有するものである。この人工的な組合せは、多くの場合、化学合成によって、または核酸の単離されたセグメントを例えば遺伝子工学技法によって人工的に操作することによって実現される。
【００７９】
試料（または生体試料）：対象から得た、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ（ｍＲＮＡを含む）、タンパク質、またはこれらの組合せを含有する生物検体。例としては、これだけに限定されないが、末梢血、組織、細胞、尿、唾液、組織生検材料、穿刺吸引材料、摘出検体、および剖検材料が挙げられる。一例では、試料は、腫瘍組織生検材料などの腫瘍生検材料を含む。
【００８０】
配列同一性：アミノ酸配列間または核酸配列間の類似性は、別段配列同一性と称される配列間の類似性に関して表される。配列同一性は、パーセンテージ同一性（または類似性もしくは相同性）に関して測定される頻度が高い。パーセンテージが高いほど、２つの配列の類似性が高い。ポリペプチドまたは核酸分子のホモログまたはバリアントは、標準の方法を使用してアラインメントした場合に、比較的高い程度の配列同一性を有する。
【００８１】
比較のために配列をアラインメントする方法は当技術分野で周知である。種々のプログラムおよびアラインメントアルゴリズムが、Smith  and  Waterman,  Adv.  Appl.  Math.  2:  482,  1981；Needleman  and  Wunsch,  J.  Mol.  Biol.  48:  443,  1970；Pearson  and  Lipman,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.  85:  2444,  1988；Higgins  and  Sharp,  Gene  73:  237,  1988；Higgins  and  Sharp,  CABIOS  5:  151,  1989；Corpet  et  al.,  Nucleic  Acids  Research  16:  10881,  1988；およびPearson  and  Lipman,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.  85:  2444,  1988に記載されている。Altschul  et  al.,  Nature  Genet.  6:  119,  1994には、配列アラインメント方法および相同性算出の詳細な考察が示されている。
【００８２】
ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Altschul  et  al.,  J.  Mol.  Biol.  215:  403,  1990）は、配列解析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘと関連して使用するために、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を含めたいくつかの供給源から、およびインターネット上で入手可能である。このプログラムを使用した配列同一性の決定の仕方に関する説明は、インターネット上のＮＣＢＩウェブサイトで入手可能である。
【００８３】
ＣＤ２２ポリペプチドに特異的に結合する抗体のＶＬまたはＶＨのホモログおよびバリアントは、一般には、ＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔ  ２．０、ギャップ付きｂｌａｓｔｐをデフォルトパラメーターに設定して使用し、抗体のアミノ酸配列との全長アラインメントにわたって計数して、少なくとも約７５％、例えば、少なくとも約８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有することによって特徴付けられる。約３０アミノ酸を超えるアミノ酸配列の比較に関しては、Ｂｌａｓｔ  ２配列関数にデフォルトのＢＬＯＳＵＭ６２行列をデフォルトパラメーター（ギャップ存在コスト１１、および１残基当たりのギャップコスト１）に設定して使用する。短いペプチド（約３０アミノ酸よりも短い）をアラインメントする場合には、Ｂｌａｓｔ  ２配列関数を使用し、ＰＡＭ３０行列をデフォルトパラメーター（ギャップ開始ペナルティ９、伸長ギャップペナルティ１）に設定して使用してアラインメントを実施すべきである。参照配列に対してさらに大きな類似性を有するタンパク質をこの方法によって評価すると、同一性のパーセンテージの上昇、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性が示される。配列全体未満を配列同一性について比較した場合、ホモログおよびバリアントは、一般には、１０〜２０アミノ酸の短いウィンドウにわたって少なくとも８０％の配列同一性を有し、参照配列に対するそれらの類似性に応じて少なくとも８５％または少なくとも９０％または９５％の配列同一性を有し得る。そのような短いウィンドウにわたって配列同一性を決定するための方法は、インターネット上のＮＣＢＩウェブサイトで入手可能である。これらの配列同一性の範囲は単に手引きとして提示され、提示される範囲外の非常に重要なホモログが得られ得ることが完全に可能であることが当業者には理解されよう。
【００８４】
可溶性ＣＤ２２（ｓＣＤ２２）：ヒトＢ細胞悪性腫瘍を含めたＢ細胞の表面上に存在する１３５ｋＤａのリン酸糖タンパク質接着分子であるＣＤ２２の膜に結合していない形態。可溶性ＣＤ２２は、膜に接続していないＣＤ２２タンパク質の任意の部分であり得、通常は短縮形態のＣＤ２２である。例えば、ｓＣＤ２２は、約１００ｋＤａであり得るが、約９０ｋＤａ以下もしくは約９０ｋＤａ以上、約８０ｋＤａ以下もしくは約８０ｋＤａ以上、約７０ｋＤａ以下もしくは約７０ｋＤａ以上、約６０ｋＤａ以下もしくは約６０ｋＤａ以上、約５０ｋＤａ以下もしくは約５０ｋＤａ以上、約４０ｋＤａ以下もしくは約４０ｋＤａ以上、または約３０ｋＤａ以下もしくは約３０ｋＤａ以上、あるいはそれよりも小さい可能性がある。ＣＤ２２の膜貫通ドメインを決定するために標準のソフトウェアが利用可能である。
【００８５】
対象：ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含めたヒトおよび動物対象のどちらも含むカテゴリーである、生きている多細胞脊椎動物生物体。一例では、開示されている方法を用いた処置を受ける対象は、Ｂ細胞悪性腫瘍を有する。
【００８６】
合成：実験室で人工的手段によって作製すること。例えば、合成核酸またはタンパク質（例えば、抗体）を実験室で化学的に合成することができる。
【００８７】
治療有効量：処置を受ける対象において所望の効果を実現するために十分な特定の物質の分量。例えば、これは、Ｂ細胞悪性腫瘍の増悪を阻害するまたは抑制するために必要な量であり得る。一実施形態では、治療有効量は、腫瘍を排除する、そのサイズを縮小する、またはその転移を防止するために必要な量である。対象に投与する場合、一般に、所望のｉｎ  ｖｉｔｒｏ効果が実現されることが示されている標的組織濃度（例えば、腫瘍中濃度）が実現される投与量を使用する。
【００８８】
ベクター：宿主細胞に導入されると、それにより、形質転換された宿主細胞を生じさせる核酸分子。ベクターは、複製起点などの、それが宿主細胞において複製することを可能にする核酸配列を含み得る。ベクターは、１つまたは複数の選択マーカー遺伝子および他の遺伝子エレメントも含み得る。
【００８９】
ＩＩＩ．いくつかの実施形態の概要
Ｂ細胞抗原ＣＤ２２に対して高い親和性を有する親和性成熟させたヒトモノクローナル抗体（ｍ９７１−Ｌ７）が本明細書に開示される。ｍ９７１−Ｌ７のＣＤ２２に対する結合親和性は５０ｐＭ未満であり、これは、親抗体ｍ９７１のＣＤ２２に対する結合親和性（約２ｎＭ）と比べて有意に改善されたものである。ｍ９７１−Ｌ７  ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、およびｓｃＦｖのアミノ酸配列を下に提示する。ＣＤＲ領域（ＩＭＧＴによって決定される）を下線で示し、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の残基を各配列の下に示す。太字の残基は、親抗体ｍ９７１と比べたアミノ酸置換を示す。ｓｃＦｖ配列では、ＶＨドメインとＶＬドメインの間のリンカー領域をイタリック体の残基によって示す。ＩＭＧＴによるＣＤＲ領域を下に示すが、当業者は、Ｋａｂａｔ、ＰａｒａｔｏｍｅまたはＣｈｏｔｈｉａ番号付けスキームなどの代替番号付けスキームを使用してＣＤＲ境界を容易に決定することができる。
【００９０】
ｍ９７１−Ｌ７  ＶＨドメイン（配列番号４）
【化２】
2021530987.tif 000003
ＣＤＲ１＝残基２６〜３５；ＣＤＲ２＝残基５３〜６１；およびＣＤＲ３＝残基１００〜１１３
【００９１】
ｍ９７１−Ｌ７  ＶＬドメイン（配列番号５）
【化３】
2021530987.tif 000004
ＣＤＲ１＝残基２７〜３２；ＣＤＲ２＝残基５０〜５２；およびＣＤＲ３＝残基８９〜９７
【００９２】
ｍ９７１−Ｌ７  ｓｃＦｖ（配列番号６）
【化４】
2021530987.tif 000005
ＨＣＤＲ１＝残基２６〜３５；ＨＣＤＲ２＝残基５３〜６１；ＨＣＤＲ３＝残基１００〜１１３；リンカー＝残基１２５〜１３９；ＬＣＤＲ１＝残基１６６〜１７１；ＬＣＤＲ２＝残基１８９〜１９１；およびＬＣＤＲ３＝残基２２８〜２３６
【００９３】
細胞表面ＣＤ２２または可溶性ＣＤ２２などのＣＤ２２に結合する（例えば、特異的に結合する）モノクローナル抗体または抗原結合性断片が本明細書で提供される。一部の実施形態では、ＣＤ２２に結合するモノクローナル抗体または抗原結合性断片は、抗体ｍ９７１−Ｌ７由来のＣＤＲ配列を少なくとも１つ含む。一部の実施形態では、ＣＤＲ配列は、ＩＭＧＴ、Ｋａｂａｔ、ＰａｒａｔｏｍｅまたはＣｈｏｔｈｉａ番号付けスキームを使用して決定される。
【００９４】
一部の実施形態では、ＣＤ２２特異的モノクローナル抗体または抗原結合性断片は、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、抗体のＶＨドメインは、配列番号４のＣＤＲ配列のうちの１つ、２つもしくは３つ全てを含み、かつ／または、抗体のＶＬドメインは、配列番号５のＣＤＲ配列のうちの１つ、２つもしくは３つ全てを含む。一部の例では、ＶＨドメインは、配列番号４の残基２６〜３５、５３〜６１および１００〜１１３を含み、かつ／または、ＶＬドメインは、配列番号５の残基２７〜３２、５０〜５２および８９〜９７を含む。
【００９５】
特定の例では、ＶＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であり（同時に配列番号４の特定のＣＤＲ配列を保持する）、ＶＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である（同時に配列番号５の特定のＣＤＲ配列を保持する）。非限定的な具体例では、ＶＨドメインのアミノ酸配列は配列番号４を含み、ＶＬドメインのアミノ酸配列は配列番号５を含む。
【００９６】
ＶＨドメインおよびＶＬドメインの両方を含むＣＤ２２特異的抗原結合性断片は、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）またはジスルフィド安定化可変断片（ｄｓＦｖ）であってよい。一部の実施形態では、抗原結合性断片は、ｓｃＦｖである。一部の例では、ｓｃＦｖのアミノ酸配列は、配列番号６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である。
【００９７】
ＣＤ２２特異的モノクローナル抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥなどの任意のアイソタイプのものであってよい。一部の実施形態では、モノクローナル抗体は、ＩｇＧである。
【００９８】
一部の実施形態では、モノクローナル抗体または抗原結合性断片は、完全ヒト抗体または抗原結合性断片である。一部の実施形態では、モノクローナル抗体または抗原結合性断片は、キメラまたは合成抗体または抗原結合性断片である。
【００９９】
本明細書に開示されるモノクローナル抗体または抗原結合性断片を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も本明細書で提供される。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達部分、シグナル伝達ドメイン、またはこれらの任意の組合せをさらに含む。一部の例では、ヒンジ領域はＣＤ８ヒンジ領域を含み、膜貫通ドメインはＣＤ８膜貫通ドメインを含み、共刺激シグナル伝達部分は４−１ＢＢシグナル伝達部分を含み、かつ／または、シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。ＣＤ２２特異的ＣＡＲを発現する細胞がさらに提供される。一部の例では、細胞はＣＴＬである。ＣＡＲおよびＣＡＲを発現するＴ細胞に関してはセクションＩＶにさらに記載する。
【０１００】
本明細書に開示されるモノクローナル抗体または抗原結合性断片およびエフェクター分子を含む免疫コンジュゲートも本明細書で提供される。一部の実施形態では、エフェクター分子は、これだけに限定されないが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素またはそのバリアントなどの毒素である。他の実施形態では、エフェクター分子は、これだけに限定されないが、フルオロフォア、酵素または放射性同位元素などの検出可能な標識である。免疫コンジュゲートに関してはセクションＶにさらに記載する。
【０１０１】
本明細書に開示されるモノクローナル抗体または抗原結合性断片とコンジュゲートした薬物を含む抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）が本明細書でさらに提供される。一部の実施形態では、薬物は、小分子、例えば、抗微小管剤、抗有糸分裂剤および／または細胞傷害性薬剤である。一例では、薬物は、ブリオスタチン１である。ＡＤＣに関してはセクションＶＩにさらに記載する。
【０１０２】
本明細書に開示されるモノクローナル抗体または抗原結合性断片および少なくとも１つの追加のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を含む多重特異性抗体も本明細書で提供される。一部の実施形態では、多重特異性抗体は二重特異性抗体である。他の実施形態では、多重特異性抗体は三重特異性抗体である。一部の実施形態では、少なくとも１つの追加のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、Ｔ細胞受容体またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性化受容体の成分に特異的に結合する。多重特異性抗体に関してはセクションＶＩＩにさらに記載する。
【０１０３】
本明細書に開示されるモノクローナル抗体または抗原結合性断片とコンジュゲートしたナノ粒子を含む抗体−ナノ粒子コンジュゲートが本明細書でさらに提供される。一部の実施形態では、ナノ粒子は、ポリマーナノ粒子、ナノスフェア、ナノカプセル、リポソーム、デンドリマー、ポリマーミセル、またはニオソームを含む。一部の実施形態では、ナノ粒子は、細胞傷害性薬剤を含む。抗体−ナノ粒子コンジュゲート  に関してはセクションＶＩＩＩにさらに記載する。
【０１０４】
本明細書に開示されるモノクローナル抗体または抗原結合性断片および異種タンパク質またはペプチドを含む融合タンパク質も本明細書で提供される。一部の実施形態では、異種タンパク質は、Ｆｃタンパク質である。一部の例では、Ｆｃタンパク質は、マウスＦｃまたはヒトＦｃタンパク質である。一部の実施形態では、異種ペプチドは、ヒトに対して内在性ではない（例えば、異種ペプチドは、ペプチドネオエピトープである）。一部の実施形態では、異種ペプチドは、約８〜約２０アミノ酸の長さである。特定の例では、異種ペプチドは、約１４アミノ酸の長さである。
【０１０５】
薬学的に許容される担体および本明細書に開示されるモノクローナル抗体もしくは抗原結合性断片、ＣＡＲ、単離された細胞、免疫コンジュゲート、ＡＤＣ、多重特異性抗体、抗体−ナノ粒子コンジュゲート、または融合タンパク質を含む組成物がさらに本開示で提供される。
【０１０６】
本明細書に開示されるモノクローナル抗体または抗原結合性断片をコードする核酸分子も提供される。本明細書に開示されるＣＡＲ、免疫コンジュゲート、多重特異性抗体、または融合タンパク質をコードする核酸分子がさらに提供される。一部の実施形態では、核酸分子は、プロモーターに作動可能に連結している。核酸分子を含むベクターが本明細書でさらに提供される。
【０１０７】
対象におけるＢ細胞悪性腫瘍を処置する方法も本明細書で提供される。一部の実施形態では、方法は、対象に、本明細書に開示されるモノクローナル抗体もしくは抗原結合性断片を投与するステップ、または本明細書に開示されるモノクローナル抗体もしくは抗原結合性断片を含むＣＡＲ（またはＣＡＲを発現するＴ細胞）、免疫コンジュゲート、ＡＤＣ、多重特異性抗体、抗体−ナノ粒子コンジュゲート、融合タンパク質、もしくは組成物を投与するステップを含む。一部の例では、Ｂ細胞悪性腫瘍は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯リンパ腫、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）リンパ腫、有毛細胞白血病、慢性リンパ性白血病またはＢ細胞性前リンパ球性白血病である。一部の実施形態では、方法は、ＣＤ２２モノクローナル抗体またはそのコンジュゲートの効果を増強する薬剤などの第２の治療剤をさらに投与するステップをさらに含む。一部の例では、第２の治療剤は、ブリオスタチン１を含む。一部の例では、ブリオスタチン１を、モノクローナル抗体、抗原結合性断片、ＣＡＲ、単離された細胞、免疫コンジュゲート、ＡＤＣ、多重特異性抗体、抗体−ナノ粒子コンジュゲート、融合タンパク質または組成物を投与する前またはそれと同時に投与する。具体例では、対象におけるＢ細胞悪性腫瘍を処置する方法は、対象に、本明細書に開示されるＣＡＲ  Ｔ細胞およびブリオスタチン１を投与するステップを含む。
【０１０８】
試料におけるＣＤ２２の発現を検出する方法がさらに提供される。一部の実施形態では、方法は、試料を本明細書に開示されるモノクローナル抗体または抗原結合性断片と接触させるステップと、抗体の試料への結合を検出するステップとを含む。一部の例では、モノクローナル抗体または抗原結合性断片を直接標識する。他の例では、方法は、モノクローナル抗体または抗原結合性断片を第２の抗体と接触させるステップと、第２の抗体のモノクローナル抗体または抗原結合性断片への結合を検出するステップとをさらに含む。一部の例では、試料を、Ｂ細胞悪性腫瘍を有する疑いがある対象から得る。一部の例では、試料は、血液試料である。
【０１０９】
対象がＢ細胞悪性腫瘍を有すると診断する方法も提供される。一部の実施形態では、方法は、対象由来の試料を本明細書に開示されるＣＤ２２特異的モノクローナル抗体または抗原結合性断片と接触させるステップと、抗体の試料への結合を検出するステップとを含む。抗体の試料への結合が抗体の対照試料への結合と比較して増加することにより、対象がＢ細胞悪性腫瘍を有すると同定される。一部の例では、試料は血液試料である。
【０１１０】
対象におけるＢ細胞悪性腫瘍の診断を確実にする方法がさらに提供される。一部の実施形態では、方法は、Ｂ細胞悪性腫瘍の診断を受けた対象由来の試料を本明細書に開示されるＣＤ２２特異的モノクローナル抗体または抗原結合性断片と接触させるステップと、抗体の試料への結合を検出するステップとを含む。抗体の試料への結合が抗体の対照試料への結合と比較して増加することにより、対象におけるＢ細胞悪性腫瘍の診断を確実にする。一部の例では、試料は血液試料である。一部の例では、Ｂ細胞悪性腫瘍は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯リンパ腫、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）リンパ腫、有毛細胞白血病、慢性リンパ性白血病またはＢ細胞性前リンパ球性白血病である。
【０１１１】
本明細書に開示されるモノクローナル抗体もしくは抗原結合性断片、ＣＡＲ、単離された細胞、免疫コンジュゲート、ＡＤＣ、多重特異性抗体、抗体−ナノ粒子コンジュゲート、融合タンパク質、または組成物、およびＣＤ２２発現を上方調節する薬剤を含むキットがさらに提供される。一部の例では、キットは、抗がん剤をさらに含む。一部の例では、ＣＤ２２発現を上方調節する薬剤は、ブリオスタチン１を含む、またはそれからなる。
【０１１２】
ＩＶ．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
開示されるＣＤ２２モノクローナル抗体を使用して、ＣＡＲ（キメラＴ細胞受容体、人工Ｔ細胞受容体またはキメラ免疫受容体としても公知）を作製することができ、かつ／または、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を、ＣＡＲを発現するように操作することができる。一般に、ＣＡＲは、結合性部分、細胞外ヒンジおよびスペーサーエレメント、膜貫通領域ならびにシグナル伝達機能を果たすエンドドメインを含む（Cartellieri  et  al.,  J  Biomed  Biotechnol  2010:  956304,  2010）。多くの場合、結合性部分は、ｓｃＦｖなどのモノクローナル抗体の抗原結合性断片であるか、または単一ドメイン抗体である。ＣＡＲを生成するために、いくつかの異なるエンドドメインが使用されてきた。例えば、エンドドメインは、ＣＤ３ζまたはＦｃεＲＩγなどのＩＴＡＭを有するシグナル伝達鎖からなり得る。一部の例では、エンドドメインは、ＣＤ２８および／またはＣＤ１３７などの少なくとも１つの追加の共刺激ドメインの細胞内部分をさらに含む。
【０１１３】
ＣＡＲを発現するＣＴＬを使用して、腫瘍細胞などの特定の細胞型を標的とすることができる。したがって、腫瘍抗原特異的モノクローナル抗体を使用して、抗原特異的抗体の抗原結合性断片を含有するＣＡＲを発現するＣＴＬを操作し、それにより、操作されたＣＴＬを、腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞（例えば、ＣＤ２２を発現する腫瘍細胞など）にターゲティングすることができる。操作されたＴ細胞は、いくつかの型のがんに対する養子療法のために以前に使用されている（例えば、Park  et  al.,  Mol  Ther  15  (4):  825-833,  2007を参照されたい）。ＣＡＲを発現するＣＴＬはＨＬＡに制限されず、したがって、標的抗原を発現する腫瘍を有する任意の患者に対して使用することができるので、ＣＡＲを発現するＴ細胞を使用することは標準のＣＴＬに基づく免疫療法よりも普遍的である。
【０１１４】
したがって、ＣＤ２２抗体または抗原結合性断片を含むＣＡＲを発現するＴ細胞を使用して、ＣＤ２２を発現する腫瘍を直接標的とすることができる。一部の実施形態では、ＣＡＲは二重特異性ＣＡＲである。
【０１１５】
Ｖ．免疫コンジュゲート
開示されるＣＤ２２モノクローナル抗体を治療剤またはエフェクター分子とコンジュゲートすることができる。免疫コンジュゲートとしては、これだけに限定されないが、治療剤と抗体が共有結合により連結した分子が挙げられる。治療剤は、特定の標的分子または標的分子を有する細胞を対象とする特定の生物活性を有する薬剤である。治療剤は、例えばビンブラスチン、ダウノマイシンなどの種々の薬物、ネイティブなまたは改変されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素またはジフテリア毒素などの細胞毒、薬理学的組成物を含有する封入剤（例えば、リポソーム）、１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３Ｈおよび３５Ｓなどの放射性剤ならびに他の標識、標的部分ならびにリガンドを含み得ることが当業者には理解されよう。
【０１１６】
特定の治療剤の選択は、特定の標的分子または細胞、および所望の生物学的効果に依存する。したがって、例えば、治療剤は、特定の標的細胞（例えば、腫瘍細胞など）の死をもたらすために使用される細胞毒であり得る。逆に、非致死的な生物学的応答を引き起こすことが望まれる場合には、治療剤を非致死的な薬理学的薬剤または非致死的な薬理学的薬剤を含有するリポソームとコンジュゲートすることができる。
【０１１７】
当業者に公知の任意の数の手段を使用してエフェクター分子を目的の抗体と連結することができる。共有結合による付着手段および非共有結合による付着手段のどちらも使用することができる。エフェクター分子を抗体に結合させるための手順は、エフェクターの化学構造に応じて変動する。ポリペプチドは、一般には、エフェクター分子の結合をもたらすための抗体の適切な官能基との反応に利用可能な種々の官能基、例えば、カルボン酸（ＣＯＯＨ）基、遊離アミン（−ＮＨ２）基またはスルフヒドリル（−ＳＨ）基などを含有する。あるいは、抗体を誘導体化して、追加の反応性官能基を露出または結合させる。誘導体化は、いくつかの公知のリンカー分子のいずれかの結合を伴い得る。リンカーは、抗体とエフェクター分子をつなぐために使用される任意の分子であってよい。リンカーは、抗体およびエフェクター分子の両方と共有結合を形成することができるものである。適切なリンカーは当業者には周知であり、それらとして、これだけに限定されないが、直鎖もしくは分枝鎖炭素リンカー、複素環式炭素リンカー、またはペプチドリンカーが挙げられる。抗体およびエフェクター分子がポリペプチドである場合、リンカーを構成物であるアミノ酸とそれらの側基を通じて（例えば、システインとジスルフィド連結を通じて）または末端アミノ酸のアルファ炭素アミノ基およびカルボキシル基を通じてつなぐことができる。
【０１１８】
一部の状況では、免疫コンジュゲートがその標的部位に到達したら、エフェクター分子が抗体から遊離することが望ましい。したがって、これらの状況では、免疫コンジュゲートは、標的部位の付近で切断可能な連結を含む。抗体からエフェクター分子を放出するためのリンカーの切断は、免疫コンジュゲートが標的細胞の内側もしくは標的部位の付近のいずれかで受ける酵素活性または条件によって促進され得る。
【０１１９】
種々の放射線診断用化合物、放射線療法用化合物、標識（例えば、酵素または蛍光分子）、薬物、毒素、および他の薬剤を抗体に結合させるための報告されている多数の方法を考慮して、当業者は、所与の薬剤を抗体または他のポリペプチドに結合させるための適切な方法を決定することができる。
【０１２０】
抗体または抗体断片を誘導体化するかまたは別の分子（例えば、別のペプチドまたはタンパク質）と連結することができる。一般に、抗体またはその一部を、誘導体化または標識付けにより標的抗原への結合が不利な影響を受けないように誘導体化する。例えば、抗体を、別の抗体（例えば、二重特異性抗体またはダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ））、検出剤、医薬剤、および／または、抗体もしくは抗体部分と別の分子（例えば、ストレプトアビジンコア領域またはポリヒスチジンタグ）の会合を媒介することができるタンパク質もしくはペプチドなどの１つまたは複数の他の分子実体と機能的に連結することができる（化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合性の会合または別のやり方によって）。
【０１２１】
誘導体化された抗体の１つの型は、２つまたはそれよりも多くの抗体（同じ型のもの、または例えば二重特異性抗体を作り出すために異なる型のもの）を架橋結合することによって作製される。適切な架橋剤は、適当なスペーサー（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）によって隔てられた２つの別個に反応する基を有するヘテロ二官能性であるもの、またはホモ二官能性であるもの（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）を含む。そのようなリンカーは、市販されている。
【０１２２】
抗体を検出可能なマーカー、例えば、ＥＬＩＳＡ、分光測定、フローサイトメトリー、顕微鏡法または画像診断技法（例えば、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、コンピュータ体軸断層撮影法（ＣＡＴ）スキャン、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、核磁気共鳴画像法（ＮＭＲＩ）、磁気共鳴断層撮影法（ＭＴＲ）、超音波、光ファイバー検査、および腹腔鏡下検査）によって検出することができる検出可能なマーカーとコンジュゲートすることができる。検出可能なマーカーの非限定的な具体例として、フルオロフォア、化学発光剤、酵素結合、放射性同位元素および重金属または化合物（例えば、ＭＲＩによって検出するための超常磁性酸化鉄ナノ結晶）が挙げられる。例えば、有用な検出可能なマーカーとしては、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリトリン、ランタニドリン光体などを含めた蛍光化合物が挙げられる。ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）および黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）などの生物発光マーカーも有用である。抗体または抗原結合性断片を、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼなどの、検出に有用な酵素とコンジュゲートすることもできる。抗体または抗原結合性断片を検出可能な酵素とコンジュゲートした場合、見分けることができる反応生成物をその酵素が生成するために使用する、追加の試薬を添加することによって検出することができる。例えば、薬剤として西洋ワサビペルオキシダーゼが存在する場合、過酸化水素およびジアミノベンジジンの添加により、視覚的に検出可能な着色された反応生成物がもたらされる。抗体または抗原結合性断片をビオチンとコンジュゲートし、アビジンまたはストレプトアビジン結合の間接的測定によって検出することもできる。アビジン自体を酵素または蛍光標識とコンジュゲートすることができることに留意するべきである。
【０１２３】
抗体をガドリニウムなどの磁気剤で標識することができる。抗体をランタニド（例えば、ユウロピウムおよびジスプロシウム）、およびマンガンで標識することもできる。超常磁性酸化鉄などの常磁性粒子も標識として有用である。抗体を二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合性部位、金属結合性ドメイン、エピトープタグ）で標識することもできる。一部の実施形態では、潜在的な立体障害を低減するために、標識を種々の長さのスペーサーアームによって結合させる。
【０１２４】
抗体を放射標識されたアミノ酸で標識することもできる。放射標識は、診断目的および治療目的のどちらにも使用することができる。例えば、放射標識を使用して、標的抗原の発現をＸ線、発光スペクトル、または他の診断技法によって検出することができる。ポリペプチドに対する標識の例としては、これだけに限定されないが、以下の放射性同位元素または放射性ヌクレオチドが挙げられる：３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ。
【０１２５】
抗体をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチル基もしくはエチル基、または炭水化物基などの化学基で誘導体化することもできる。これらの基は、血清中半減期を増加させるため、または組織結合を増加させるためなど、抗体の生物学的特徴を改善するために有用であり得る。
【０１２６】
毒素をモノクローナル抗体と共に使用して、免疫毒素を生じさせることができる。例示的な毒素としては、リシン、アブリン、ジフテリア毒素およびそのサブユニット、ならびにボツリヌス毒素Ａ〜Ｆが挙げられる。これらの毒素は商業的な供給源（例えば、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から容易に入手可能である。意図されている毒素としては、本明細書に記載の毒素のバリアントも挙げられる（例えば、米国特許第５，０７９，１６３号および同第４，６８９，４０１号を参照されたい）。一実施形態では、毒素は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素（ＰＥ）（米国特許第５，６０２，０９５号）である。本明細書で使用される場合、「Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素」は、全長のネイティブな（天然に存在する）ＰＥまたは改変されたＰＥを指す。そのような改変としては、これだけに限定されないが、ドメインＩａの排除、ドメインＩｂ、ＩＩおよびＩＩＩ内の種々のアミノ酸欠失、単一のアミノ酸置換ならびにカルボキシル末端への１つまたは複数の配列の付加を挙げることができる（例えば、Siegall  et  al.,  J.  Biol.  Chem.  264:  14256-14261,  1989を参照されたい）。
【０１２７】
モノクローナル抗体と共に使用されるＰＥは、ネイティブな配列、ネイティブな配列の細胞傷害性断片、ならびにネイティブなＰＥの保存的に改変されたバリアントおよびその細胞傷害性断片を含み得る。ＰＥの細胞傷害性断片は、標的細胞においてその後のタンパク質分解または他のプロセシングを伴ってまたは伴わずに細胞傷害性であるものを含む。ＰＥの細胞傷害性断片としては、ＰＥ４０、ＰＥ３８、およびＰＥ３５が挙げられる。ＰＥおよびそのバリアントの追加の説明に関しては、例えば、米国特許第４，８９２，８２７号；同第５，５１２，６５８号；同第５，６０２，０９５号；同第５，６０８，０３９号；同第５，８２１，２３８号；および同第５，８５４，０４４号；米国特許出願公開第２０１５／００９９７０７号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／５１６４３号および同第ＷＯ２０１４／０５２０６４号；Pai  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  88:  3358-3362,  1991；Kondo  et  al.,  J.  Biol.  Chem.  263:  9470-9475,  1988；Pastan  et  al.,  Biochim.  Biophys.  Acta  1333:  C1-C6,  1997を参照されたい。
【０１２８】
プロテアーゼ抵抗性ＰＥバリアントおよび免疫原性が低下したＰＥバリアント、例えば、これだけに限定されないが、ＰＥ−ＬＲ、ＰＥ−６Ｘ、ＰＥ−８Ｘ、ＰＥ−ＬＲ／６ＸおよびＰＥ−ＬＲ／８Ｘも本明細書において意図されている（例えば、参照により本明細書に組み込まれるWeldon  et  al.,  Blood  113  (16):  3792-3800,  2009；Onda  et  al.,  Proc  Natl  Acad  Sci  USA  105  (32):  11311-11316,  2008；ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ２００７／０１６１５０号、同第ＷＯ２００９／０３２９５４号および同第ＷＯ２０１１／０３２０２２号を参照されたい）。
【０１２９】
一部の例では、ＰＥは、ＰＥ−ＬＲなどの、リソソーム分解に対して抵抗性のバリアントである（Weldon  et  al.,  Blood  113  (16):  3792-3800,  2009；ＰＣＴ公開第ＷＯ２００９／０３２９５４号）。他の例では、ＰＥは、ＰＥ−ＬＲ／６Ｘと称されるバリアントである（ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１１／０３２０２２号）。他の例では、ＰＥバリアントは、免疫原性が低下したＰＥである。さらに他の例では、ＰＥは、ＰＥ−ＬＲ／８Ｍと称されるバリアントである（ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１１／０３２０２２号）。
【０１３０】
ＰＥの改変は、ＰＥの細胞傷害性断片（例えば、ＰＥ３８、ＰＥ−ＬＲおよびＰＥ−ＬＲ／８Ｍ）を含めた、以前に記載されたバリアントのいずれに行うこともできる。改変されたＰＥは、ＰＥの１つもしくは複数のＴ細胞エピトープおよび／もしくはＢ細胞エピトープ内の１つもしくは複数のアミノ酸残基に対するものなどの任意の置換（複数可）、または１つもしくは複数のＴ細胞および／もしくはＢ細胞エピトープの欠失を含み得る（例えば、米国特許出願公開第２０１５／００９９７０７号を参照されたい）。
【０１３１】
意図されるＰＥの形態は、ＰＥの脱免疫された形態、例えば、ドメインＩＩが欠失したバージョン（例えば、ＰＥ２４）も含む。ＰＥの脱免疫された形態は、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／０５２００６号、同第ＷＯ２００７／０１６１５０号、同第ＷＯ２００７／０１４７４３号、同第ＷＯ２００７／０３１７４１号、同第ＷＯ２００９／３２９５４号、同第ＷＯ２０１１／３２０２２号、同第ＷＯ２０１２／１５４５３０号、および同第ＷＯ２０１２／１７０６１７号に記載されている。
【０１３２】
腫瘍抗原を表面に発現する細胞に任意の数の異なる診断用または治療用化合物を標的とするために抗体を使用することもできる。したがって、細胞表面抗原を発現する細胞に直接送達される薬物に抗体を直接またはリンカーを介して結合させることができる。これは、治療目的、診断目的または研究目的で行うことができる。治療剤としては、核酸、タンパク質、ペプチド、アミノ酸もしくは誘導体、糖タンパク質、放射性同位元素、脂質、炭水化物、または組換えウイルスなどの化合物が挙げられる。核酸治療用および診断用部分としては、アンチセンス核酸、単鎖または二重鎖ＤＮＡとの共有結合による架橋結合のための誘導体化されたオリゴヌクレオチド、および三重鎖形成性オリゴヌクレオチドが挙げられる。
【０１３３】
あるいは、抗体と連結する分子は、循環系への直接曝露から遮蔽されることが好ましい薬物、核酸（例えば、アンチセンス核酸）、または別の治療用部分などの治療用組成物を含有するナノ粒子、リポソームまたはミセルなどの封入系であってよい。抗体に付着させるリポソームを調製する手段は当業者には周知である（例えば、米国特許第４，９５７，７３５号；Connor  et  al.,  Pharm.  Ther.  28:  341-365,  1985を参照されたい）。
【０１３４】
抗体を検出可能な標識と共有結合または非共有結合により連結することもできる。そのような使用に適した検出可能な標識としては、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段または化学的手段によって検出可能な任意の組成物が挙げられる。有用な標識としては、磁気ビーズ、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質など）、放射標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびＥＬＩＳＡに一般に使用されるその他の酵素）、およびコロイド金または色ガラスまたはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズなどの比色標識が挙げられる。
【０１３５】
そのような標識を検出する手段は当業者には周知である。したがって、例えば、放射標識は、写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを使用して検出することができ、蛍光マーカーは、放出された照明を検出するための光検出器を使用して検出することができる。酵素標識は、一般には、酵素に基質を供給し、酵素の基質に対する作用によって生成される反応生成物を検出することによって検出され、比色標識は、着色された標識を単に可視化することによって検出される。
【０１３６】
ＶＩ．抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）
ＡＤＣは、抗原特異的、例えば腫瘍抗原特異的抗体（またはその抗原結合性断片）と、薬物、一般には抗微小管剤または架橋剤などの細胞傷害性薬剤とで構成される化合物である。ＡＤＣはがん細胞などの特定の細胞型を特異的に標的とすることができるので、薬物は、標準の化学療法に使用される薬剤よりもはるかに強力になり得る。ＡＤＣで現在使用されている最も一般的な細胞傷害性薬物のＩＣ５０は従来の化学療法剤よりも１００〜１０００倍強力である。一般的な細胞傷害性薬物としては、メイタンシノイドおよびアウリスタチン（例えば、アウリスタチンＥおよびアウリスタチンＦ）などの抗微小管剤が挙げられる。ＡＤＣに使用するための他の細胞毒としては、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＤＢ）が挙げられ、これは、ＤＮＡの副溝に共有結合により結合して、鎖間架橋結合を形成する。多くの場合、ＡＤＣの抗体と薬物の比は１：２〜１：４である（Bander,  Clinical  Advances  in  Hematology  &  Oncology  10  (8;  suppl  10):  3-7,  2012）。
【０１３７】
抗体と薬物は、切断可能なリンカーまたは切断不可能なリンカーによって連結することができる。しかし、一部の例では、重大なオフターゲット毒性が生じる可能性がある細胞傷害性薬物の全身放出を防止するために、循環中で安定なリンカーを有することが望ましい。切断不可能なリンカーにより、ＡＤＣが標的細胞に内部移行する前に細胞傷害性薬剤が放出されることが防止される。リソソームに入ったら、リソソームプロテアーゼにより抗体が消化され、その結果、細胞傷害性薬剤が放出される（Bander,  Clinical  Advances  in  Hematology  &  Oncology  10  (8;  suppl  10):  3-7,  2012）。
【０１３８】
薬物とモノクローナル抗体の部位特異的かつ安定なコンジュゲーションのための１つの方法は、グリカン操作によるものである。モノクローナル抗体は、各重鎖のＣＨ２ドメイン内のＡｓｎ２９７残基に保存されたＮ結合オリゴ糖鎖を１つ有する（Qasba  et  al.,  Biotechnol  Prog  24:  520-526,  2008）。変異体β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素（Ｙ２８９Ｌ−Ｇａｌ−Ｔ１；米国特許出願公開第２００７／０２５８９８６号および同第２００６／００８４１６２号、参照により本明細書に組み込まれる）を使用し、２−ケト−ガラクトースを抗体重鎖上の遊離のＧｌｃＮＡｃ残基に転移させて、コンジュゲーションのための化学的ハンドルをもたらす。
【０１３９】
モノクローナル抗体に結合させるオリゴ糖鎖は、末端ガラクトース残基に基づいて３つの群に分類することができる−完全ガラクトシル化（２つのガラクトース残基；ＩｇＧ−Ｇ２）、１つのガラクトース残基（ＩｇＧ−Ｇ１）または完全脱ガラクトシル化（ＩｇＧ−Ｇ０）。モノクローナル抗体をβ１，４−ガラクトシダーゼで処理することにより、抗体がＩｇＧ−Ｇ０グリコフォームに変換される。変異体β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素は、２−ケト−ガラクトースまたは２−アジド−ガラクトースをそれらのそれぞれのＵＤＰ誘導体からＩｇＧ−Ｇ１およびＩｇＧ−Ｇ０グリコフォーム上のＧｌｃＮＡｃ残基に転移させることができる。転移された糖の化学的ハンドルにより、種々の分子をモノクローナル抗体とグリカン残基を介してコンジュゲートすることが可能になる（Qasba  et  al.,  Biotechnol  Prog  24:  520-526,  2008）。
【０１４０】
一部の実施形態では、ＡＤＣは、ＣＤ２２陽性腫瘍を特異的に標的とするために、薬物とコンジュゲートした本明細書に開示されるＣＤ２２特異的抗体で構成される。一部の実施形態では、薬物は小分子である。一部の例では、薬物は、架橋剤、抗微小管剤および／もしくは抗有糸分裂剤、または腫瘍細胞の殺滅を媒介するために適した任意の細胞傷害性薬剤である。例示的な細胞傷害性薬剤としては、これだけに限定されないが、ＰＤＢ、アウリスタチン、メイタンシノイド、ドラスタチン、カリケアマイシン、ネモルビシンおよびその誘導体、ＰＮＵ−１５９６８２、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、タキサン、トリコテセン、ＣＣ１０６５、カンプトテシン、エリナフィド、コンブレタスタチン、ドラスタチン、デュオカルマイシン、エンジイン、ゲルダナマイシン、インドリノ−ベンゾジアゼピン二量体、ピューロマイシン、ツブリシン、ヘミアステリン、スプライセオスタチン、またはプラジエノライド、ならびに細胞傷害活性を有するこれらの立体異性体、アイソスター、類似体、および誘導体が挙げられる。
【０１４１】
一部の実施形態では、ＡＤＣは、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）を含む。天然物であるアントラマイシン（ａ  ＰＢＤ）は１９６５年に最初に報告された（Leimgruber  et  al.,  J  Am  Chem  Soc,  87:  5793-5795,  1965；Leimgruber  et  al.,  J  Am  Chem  Soc,  87:  5791-5793,  1965）。それ以来、天然に存在する類似体および合成類似体の両方のＰＢＤがいくつか報告されている（Gerratana,  Med  Res  Rev  32  (2):  254-293,  2012；ならびに米国特許第６，８８４，７９９号；同第７，０４９，３１１号；同第７，０６７，５１１号；同第７，２６５，１０５号；同第７，５１１，０３２号；同第７，５２８，１２６号；および同第７，５５７，０９９号）。一例として、ＰＤＢ二量体は、特定のＤＮＡ配列を認識し、それに結合し、また、細胞傷害性薬剤として有用であることが示されている。ＰＢＤ二量体が抗体とコンジュゲートされており、得られたＡＤＣは抗がん特性を有することが示されている（例えば、ＵＳ２０１０／０２０３００７を参照されたい）。ＰＢＤ二量体上の例示的な連結部位としては、ＰＢＤ単位間のつなぎ鎖である５員ピロロ環、およびＮ１０−Ｃ１１イミン基が挙げられる（ＷＯ２００９／０１６５１６；ＵＳ２００９／３０４７１０；ＵＳ２０１０／０４７２５７；ＵＳ２００９／０３６４３１；ＵＳ２０１１／０２５６１５７；およびＷＯ２０１１／１３０５９８を参照されたい）。
【０１４２】
一部の実施形態では、ＡＤＣは、１つまたは複数のメイタンシノイド分子とコンジュゲートした抗体を含む。メイタンシノイドは、メイタンシンの誘導体であり、チューブリン重合を阻害することによって作用する有糸分裂阻害剤である。メイタンシンは、東アフリカの低木であるＭａｙｔｅｎｕｓ  ｓｅｒｒａｔａから最初に単離された（米国特許第３，８９６，１１１号）。その後、ある特定の微生物もメイタンシノールおよびＣ−３メイタンシノールエステルなどのメイタンシノイドを産生することが発見された（米国特許第４，１５１，０４２号）。合成メイタンシノイドは、例えば、米国特許第４，１３７，２３０号；同第４，２４８，８７０号；同第４，２５６，７４６号；同第４，２６０，６０８号；同第４，２６５，８１４号；同第４，２９４，７５７号；同第４，３０７，０１６号；同第４，３０８，２６８号；同第４，３０８，２６９号；同第４，３０９，４２８号；同第４，３１３，９４６号；同第４，３１５，９２９号；同第４，３１７，８２１号；同第４，３２２，３４８号；同第４，３３１，５９８号；同第４，３６１，６５０号；同第４，３６４，８６６号；同第４，４２４，２１９号；同第４，４５０，２５４号；同第４，３６２，６６３号；および同第４，３７１，５３３号において開示されている。
【０１４３】
一部の実施形態では、ＡＤＣは、ドラスタチンもしくはアウリスタチン、またはこれらの類似体もしくは誘導体とコンジュゲートした抗体を含む（米国特許第５，６３５，４８３号；同第５，７８０，５８８号；同第５，７６７，２３７号；および同第６，１２４，４３１号を参照されたい）。アウリスタチンは、海洋軟体動物化合物であるドラスタチン−１０の誘導体である。ドラスタチンおよびアウリスタチンは、微小管ダイナミクス、ＧＴＰ加水分解、ならびに核および細胞分裂に干渉し（Woyke  et  al.,  Antimicrob  Agents  and  Chemother  45  (12):  3580-3584,  2001）、抗がん活性（米国特許第５，６６３，１４９号）および抗真菌活性を有する（Pettit  et  al.,  Antimicrob  Agents  Chemother  42:  2961-2965,  1998）ことが示されている。例示的なドラスタチンおよびアウリスタチンとしては、これだけに限定されないが、ドラスタチン１０、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、アウリスタチンＥＢ（ＡＥＢ）、アウリスタチンＥＦＰ（ＡＥＦＰ）、ＭＭＡＤ（モノメチルアウリスタチンＤまたはモノメチルドラスタチン１０）、ＭＭＡＦ（モノメチルアウリスタチンＦまたはＮ−メチルバリン−バリン−ドライソロイイン−ドラプロイン−フェニルアラニン）、ＭＭＡＥ（モノメチルアウリスタチンＥまたはＮ−メチルバリン−バリン−ドライソロイイン−ドラプロイン−ノルエフェドリン）、５−ベンゾイル吉草酸−ＡＥエステル（ＡＥＶＢ）、および他のアウリスタチンが挙げられる（例えば、米国公開第２０１３／０１２９７５３号を参照されたい）。
【０１４４】
一部の実施形態では、ＡＤＣは、１つまたは複数のカリケアマイシン分子とコンジュゲートした抗体を含む。抗生物質のカリケアマイシンファミリーおよびその類似体は、ピコモル濃度以下の濃度で二本鎖ＤＮＡ切断を生じさせることができる（Hinman  et  al.,  Cancer  Res  53:  3336-3342,  1993；Lode  et  al.,  Cancer  Res  58:  2925-2928,  1998）。カリケアマイシン薬物部分を用いてＡＤＣを調製するための典型的な方法は、米国特許第５，７１２，３７４号；同第５，７１４，５８６号；同第５，７３９，１１６号；および同第５，７６７，２８５号に記載されている。
【０１４５】
一部の実施形態では、ＡＤＣは、アントラサイクリンを含む。アントラサイクリンは、細胞傷害活性を示す抗生物質化合物である。アントラサイクリンは、薬物分子を細胞のＤＮＡにインターカレーションし、それにより、ＤＮＡ依存性核酸合成を阻害すること；細胞の巨大分子と反応して細胞損傷を引き起こすフリーラジカルの生成を誘導すること；および／または薬物分子と細胞膜の相互作用を含めたいくつかの異なる機序によって細胞を死滅させるように作動し得ると考えられている。非限定的な例示的なアントラサイクリンとしては、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ダウノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ネモルビシン、バルルビシンおよびミトキサントロン、ならびにこれらの誘導体が挙げられる。例えば、ＰＮＵ−１５９６８２は、ネモルビシンの強力な代謝産物（または誘導体）である（Quintieri  et  al.,  Clin  Cancer  Res  11  (4):  1608-1617,  2005）。ネモルビシンは、ドキソルビシンのアミノ配糖体に２−メトキシモルホリノ基を有するドキソルビシンの半合成類似体である（Grandi  et  al.,  Cancer  Treat  Rev  17:  133,  1990；Ripamonti  et  al.,  Br  J  Cancer  65:  703-707,  1992）。
【０１４６】
一部の実施形態では、ＡＤＣは、リンカーをさらに含み得る。一部の例では、リンカーは、１つまたは複数の薬物部分を抗体と連結して、ＡＤＣを形成するために使用することができる二官能性または多官能性部分である。一部の実施形態では、ＡＤＣは、薬物におよび抗体に共有結合により付着させるための反応性官能性を有するリンカーを使用して調製される。例えば、抗体のシステインチオールをリンカーまたは薬物−リンカー中間体の反応性官能基と結合させて、ＡＤＣを作製することができる。
【０１４７】
一部の例では、リンカーは、抗体に存在する遊離のシステインと反応して、共有結合を形成することができる官能性を有する。そのような反応性官能性を有する例示的なリンカーとしては、マレイミド、ハロアセトアミド、α−ハロアセチル、活性化エステル、例えばスクシンイミドエステル、４−ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、無水物、酸塩化物、スルホニルクロリド、イソシアネート、およびイソチオシアネートが挙げられる。
【０１４８】
一部の例では、リンカーは、抗体に存在する求電子基と反応することができる官能性を有する。そのような求電子基の例としては、これだけに限定されないが、アルデヒド基およびケトンカルボニル基が挙げられる。一部の場合では、リンカーの反応性官能性のヘテロ原子は、抗体の求電子基と反応し、抗体単位と共有結合を形成することができる。非限定的な例としては、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレートおよびアリールヒドラジドが挙げられる。
【０１４９】
一部の例では、リンカーは、薬物の放出を容易にする切断可能なリンカーである。切断可能なリンカーの例としては、酸に不安定なリンカー（例えば、ヒドラゾンを含む）、プロテアーゼ感受性リンカー（例えば、ペプチダーゼ感受性）、感光性リンカー、およびジスルフィド含有リンカーが挙げられる（Chari  et  al.,  Cancer  Res  52:  127-131,  1992；米国特許第５，２０８，０２０号）。
【０１５０】
ＶＩＩ．多重特異性抗体
多重特異性抗体は、２つまたはそれよりも多くの異なるモノクローナル抗体の抗原結合性断片で構成される組換えタンパク質である。例えば、二重特異性抗体は、２つの異なるモノクローナル抗体の抗原結合性断片で構成される。したがって、二重特異性抗体は２つの異なる抗原に結合し、三重特異性抗体は３つの異なる抗原に結合する。多重特異性抗体は、例えば、ＣＴＬ（例えば、ＣＤ３などのＣＴＬ受容体成分など）またはエフェクターナチュラルキラー（ＮＫ）細胞と、少なくとも１つの腫瘍抗原の両方を同時に標的とすることによるがん免疫療法に使用することができる。本明細書に開示される抗原特異的モノクローナル抗体を使用して、抗原（例えば、ＣＤ２２）とＣＴＬの両方を標的とする、または抗原とＮＫ細胞の両方を標的とする多重特異性（例えば、二重特異性または三重特異性）抗体を生成し、それにより、腫瘍抗原を発現するがんを処置する手段をもたらすことができる。
【０１５１】
二重特異性Ｔ細胞誘導（ＢｉＴＥ）は、二重特異性モノクローナル抗体の一種であり、特定の抗原を標的とする第１の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）と、Ｔ細胞に結合する、例えばＴ細胞上のＣＤ３に結合する第２のｓｃＦｖとの融合物である。本明細書の一部の実施形態では、ＢｉＴＥの結合性部分の一方（例えば、ｓｃＦｖ分子の一方）はＣＤ２２に特異的である。
【０１５２】
二重特異性キラー細胞誘導（ＢｉＫＥ）は、二重特異性モノクローナル抗体の一種であり、特定の抗原を標的とする第１のｓｃＦｖと、ＣＤ１６などのＮＫ細胞活性化受容体に結合する第２のｓｃＦｖとの融合物である。本明細書の一部の実施形態では、ＢｉＫＥの結合性部分の一方（例えば、ｓｃＦｖ分子の一方）はＣＤ２２に特異的である。
【０１５３】
ＣＤ２２特異的モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を含む多重特異性、例えば三重特異性または二重特異性モノクローナル抗体が本明細書で提供される。一部の実施形態では、多重特異性モノクローナル抗体は、ＣＤ３などのＴ細胞受容体の成分に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片をさらに含む。他の実施形態では、多重特異性モノクローナル抗体は、ＣＤ１６、Ｌｙ４９、またはＣＤ９４などのＮＫ細胞活性化受容体に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片をさらに含む。さらに他の実施形態では、多重特異性モノクローナル抗体は、腫瘍抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片をさらに含む。一部の例では、抗原結合性断片はｓｃＦｖである。多重特異性抗体をコードする単離された核酸分子およびベクター、ならびに核酸分子またはベクターを含む宿主細胞も提供される。
【０１５４】
ＶＩＩＩ．抗体−ナノ粒子コンジュゲート
腫瘍細胞の表面上に発現されたＣＤ２２への抗体の結合を介して細胞傷害性薬剤または他の抗がん剤を腫瘍細胞に直接送達するために、開示されるＣＤ２２特異的モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を種々の異なる型のナノ粒子とコンジュゲートすることができる。
【０１５５】
ナノ粒子の使用により、オフターゲットの副作用が低減し、また、薬物の生物学的利用能を改善し、治療効果を実現するために必要な薬物の用量を減少させることもできる。ナノ粒子製剤を、ナノ粒子内に保持させるかまたは封入する薬物に適するように調整することができる。例えば、疎水性分子をナノ粒子のコア内部に組み入れることができ、一方、親水性薬物をポリマーまたは脂質殻に保護された水性コア内に保持させることができる。ナノ粒子の例としては、これだけに限定されないが、ナノスフェア、ナノカプセル、リポソーム、デンドリマー、ポリマーミセル、ニオソーム、およびポリマーナノ粒子が挙げられる（Fay  and  Scott,  Immunotherapy  3  (3):  381-394,  2011）。
【０１５６】
リポソームは、現在、薬物送達のために使用されるナノ粒子の最も一般的な型の１つである。リポソームとコンジュゲートした抗体は、多くの場合、「免疫リポソーム」と称される。免疫リポソームのリポソーム成分は、一般には、１つまたは複数の同心性リン脂質二重層の脂質小胞である。一部の場合では、リン脂質は、疎水性薬物と親水性薬物の両方の封入が可能になるように、親水性頭部基と２つの疎水性鎖とで構成される。従来のリポソームは網内系（ＲＥＳ）のマクロファージによって急速に循環から除去される。長く循環するリポソームを生成するために、リポソームの組成、サイズおよび電荷をモジュレートすることができる。リポソームの表面を例えば糖脂質またはシアル酸を用いて修飾することもできる。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含めることにより、循環半減期が有意に増加する。薬物送達剤として使用するためのリポソームは、免疫リポソームの調製を含め、当技術分野において記載されている（例えば、Paszko  and  Senge,  Curr  Med  Chem  19  (31)  5239-5277,  2012；Immordino  et  al.,  Int  J  Nanomedicine  1  (3):  297-315,  2006；米国特許出願公開第２０１１／０２６８６５５号；同第２０１０／００３２９９８１号を参照されたい）。
【０１５７】
ニオソームは、リポソームと同様の構造を有する非イオン界面活性物質に基づく小胞である。ニオソームの膜は、ポリグリセリル−アルキルエーテルまたはＮ−パルミトイルグルコサミンなどの非イオン界面活性物質のみで構成される。ニオソームは、小さな単層粒子から大きな多重膜粒子までにわたる。これらのナノ粒子は、単分散であり、水溶性であり、化学的に安定であり、毒性が低く、生分解性かつ非免疫原性であり、また、封入された薬物の生物学的利用能を増加させるものである。
【０１５８】
デンドリマーは、様々な分枝ポリマー複合体を含む。これらのナノ粒子は、水溶性であり、生体適合性であり、また、ヒトへの使用のために十分に非免疫原性である。一般に、デンドリマーは、開始剤コアであって、そのコアにグラフトさせた選択されたポリマー層に囲まれた開始剤コアからなり、分枝高分子複合体を形成している。デンドリマーは、一般には、ポリ（アミドアミン）またはポリ（Ｌ−リシン）などのポリマーを使用して作製される。デンドリマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、バイオイメージング造影剤および化学療法剤の送達を含めた、種々の治療への適用および診断への適用に使用されている。
【０１５９】
ポリマーミセルは、水性環境に露出している親水性ポリマー鎖のコロナで囲まれた疎水性コア中に集合した両親媒性共重合体（親水性単量体単位と疎水性単量体単位の両方からなる）の凝集体で構成される。多くの場合、ポリマーミセルを調製するために使用されるポリマーは、粒子コアを形成するＰＥＧ、ポリ（ビニルピロリドン）および疎水性ポリ（Ｌ−ラクチド）またはポリ（Ｌ−リシン）の親水性ブロックで構成されるヘテロ二官能性共重合体である。ポリマーミセルは、溶解性が乏しい薬物を運搬するために使用することができる。これらのナノ粒子は、ドキソルビシンおよびカンプトテシンを含めたいくつかの抗がん薬を封入するために使用されている。ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を運搬するためのカチオン性ミセルも開発されている。
【０１６０】
ポリマーナノ粒子は、ナノスフェアおよびナノカプセルのどちらも含む。ナノスフェアは、ポリマーの固体マトリックスからなり、一方、ナノカプセルは、水性コアを含有する。選択される製剤は、一般には、運搬／封入される治療剤の溶解性に依存し、水溶性が乏しい薬物はナノスフェアにより容易に封入されるが、ＤＮＡおよびタンパク質などの水溶性かつ不安定な薬物はナノカプセルにより容易に封入される。これらのナノ粒子を作製するために使用されるポリマーとしては、例えば、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（エステル）、ポリ（アルキルシアノアクリレート）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、およびポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）が挙げられる。
【０１６１】
当技術分野で公知の標準の方法に従って抗体を適切なナノ粒子とコンジュゲートすることができる。例えば、コンジュゲーションは、共有結合性または非共有結合性であり得る。ナノ粒子がリポソームである一部の実施形態では、抗体を、立体的に安定化された長い循環リポソームにＰＥＧ鎖を介して結合させる。抗体または抗体断片とリポソームのカップリングはまた、例えばチオールとマレイミド基の反応によるチオエステル結合を伴い得る。架橋剤を使用して、抗体をナノ粒子に結合させるためのスルフヒドリル基を作り出すことができる（Paszko  and  Senge,  Curr  Med  Chem  19  (31)  5239-5277,  2012）。
【０１６２】
ＩＸ．組成物および使用方法
ＣＤ２２に結合する（例えば、特異的に結合する）開示される抗体の１つまたは複数を担体中に含む組成物が提供される。ＣＡＲ（およびＣＡＲを含むＴリンパ球）、ＡＤＣ、多重特異性（例えば、二重特異性または三重特異性）抗体、抗体−ナノ粒子コンジュゲート、免疫リポソームおよび免疫コンジュゲートを含む組成物も提供される。組成物を対象への投与のために単位剤形に調製することができる。投与の量およびタイミングについては、所望の転帰が得られるように、処置を行う臨床医の裁量にある。抗体、ＣＡＲ、ＡＤＣ、ＣＡＲを発現するＴリンパ球、多重特異性抗体、抗体−ナノ粒子コンジュゲート、免疫リポソームまたは免疫コンジュゲートを全身または局所投与用に製剤化することができる。一例では、抗体を静脈内投与などの非経口投与用に製剤化する。
【０１６３】
投与用の組成物は、抗体、抗原結合性断片、ＡＤＣ、ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴリンパ球、多重特異性（例えば、二重特異性または三重特異性）抗体、抗体−ナノ粒子コンジュゲート、免疫リポソームおよび／または免疫コンジュゲートの、水性担体などの薬学的に許容される担体中溶液を含み得る。種々の水性担体、例えば、緩衝食塩水などを使用することができる。これらの溶液は滅菌されており、一般に、望ましくない物質を含まない。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技法によって滅菌することができる。組成物は、必要に応じて、生理的条件に近づけるために、例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどの薬学的に許容される補助物質を含有し得る。これらの製剤中の抗体の濃度は広範に変動し得、選択される特定の投与形式および対象の必要性に応じて、主に液量、粘度、体重などに基づいて選択される。
【０１６４】
静脈内投与用の典型的な医薬組成物は、１日当たり１対象当たり約０．１〜１０ｍｇの抗体（またはＡＤＣ、ＣＡＲ、多重特異性抗体、抗体−ナノ粒子コンジュゲート、もしくは免疫コンジュゲート）を含む。特に、薬剤を循環またはリンパ系ではなく隔離された部位、例えば、体腔中または器官の内腔中に投与する場合には、１日当たり１対象当たり０．１ｍｇから約１００ｍｇまでの投与量を使用することができる。投与可能な組成物を調製するための実際の方法は当業者には分かるまたは明らかであり、また、Remington's  Pharmaceutical  Science,  19th  ed.,  Mack  Publishing  Company,  Easton,  PA  (1995)などの刊行物においてより詳細に記載されている。
【０１６５】
抗体（または他の治療用分子）は、凍結乾燥形態で提供され、投与前に滅菌水で再水分補給する場合もあるが、既知濃度の滅菌溶液でも提供される。次いで、抗体溶液を、０．９％塩化ナトリウム、ＵＳＰを含有する注入バッグに添加し、一部の場合では、体重１ｋｇ当たり０．５ｍｇから１５ｍｇまでの投与量で投与する。抗体薬物の投与に関して豊富な経験が当技術分野において利用可能であり、米国では１９９７年にＲＩＴＵＸＡＮ（商標）が承認されてから販売されている。抗体、ＡＤＣ、ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴリンパ球、多重特異性（例えば、二重特異性または三重特異性）抗体、抗体−ナノ粒子コンジュゲート、免疫リポソームおよび／または免疫コンジュゲートを静脈内プッシュまたはボーラスではなく緩徐な注入によって投与することができる。一例では、高負荷用量を投与し、その後、維持用量をより低いレベルで投与する。例えば、最初の負荷用量４ｍｇ／ｋｇをおよそ９０分にわたって注入し、その後、前の用量の忍容性が良好であれば、維持用量２ｍｇ／ｋｇの３０分間にわたる注入を毎週、４〜８週間行う。
【０１６６】
制御放出非経口用製剤を埋め込み物、油性注射、または粒子系として作製することができる。タンパク質送達系に関する広範な概要に関しては、Banga,  A.J.,  Therapeutic  Peptides  and  Proteins:  Formulation,  Processing,  and  Delivery  Systems,  Technomic  Publishing  Company,  Inc.,  Lancaster,  PA  (1995)を参照されたい。粒子系としては、例えば、マイクロスフェア、微小粒子、マイクロカプセル、ナノカプセル、ナノスフェア、およびナノ粒子が挙げられる。マイクロカプセルは、細胞毒または薬物などの治療用タンパク質を中心コアとして含有する。マイクロスフェア中で、治療薬は粒子全体を通して分散する。約１μｍよりも小さな粒子、マイクロスフェア、およびマイクロカプセルが、一般に、それぞれナノ粒子、ナノスフェア、およびナノカプセルと称される。毛細血管の直径はおよそ５μｍであり、したがって、静脈内にはナノ粒子のみが投与される。微小粒子は、一般には直径およそ１００μｍであり、皮下または筋肉内に投与される。例えば、Kreuter,  J.,  Colloidal  Drug  Delivery  Systems,  J.  Kreuter,  ed.,  Marcel  Dekker,  Inc.,  New  York,  NY,  pp.  219-342  (1994)；およびTice  &  Tabibi,  Treatise  on  Controlled  Drug  Delivery,  A.  Kydonieus,  ed.,  Marcel  Dekker,  Inc.  New  York,  NY,  pp.  315-339,  (1992)を参照されたい。
【０１６７】
本明細書に開示される抗体に基づく組成物のイオン制御放出のためにポリマーを使用することができる。制御薬物送達に使用するための種々の分解性および非分解性ポリマーマトリックスが当技術分野で公知である（Langer,  Accounts  Chem.  Res.  26:  537-542,  1993）。例えば、ブロック共重合体であるポロクサマー（polaxamer）４０７は、低温では粘性でさらにまた可動性の液体として存在するが、体温では半固体ゲルを形成する。これは、組換えインターロイキン−２およびウレアーゼの製剤化および持続送達のために有効なビヒクルであることが示されている（Johnston  et  al.,  Pharm.  Res.  9:  425-434,  1992；およびPec  et  al.,  J.  Parent.  Sci.  Tech.  44  (2):  58-65,  1990）。あるいは、タンパク質の制御放出のためのマイクロキャリアとしてヒドロキシアパタイトが使用されてきた（Ijntema  et  al.,  Int.  J.  Pharm.112:  215-224,  1994）。さらに別の態様では、脂質でカプセル化した薬物の制御放出ならびに薬物ターゲティングのためにリポソームを使用する（Betageri  et  al.,  Liposome  Drug  Delivery  Systems,  Technomic  Publishing  Co.,  Inc.,  Lancaster,  PA  (1993)）。治療用タンパク質の制御送達のための多数の追加の系が公知である（米国特許第５，０５５，３０３号；同第５，１８８，８３７号；同第４，２３５，８７１号；同第４，５０１，７２８号；同第４，８３７，０２８号；同第４，９５７，７３５号；同第５，０１９，３６９号；同第５，０５５，３０３号；同第５，５１４，６７０号；同第５，４１３，７９７号；同第５，２６８，１６４号；同第５，００４，６９７号；同第４，９０２，５０５号；同第５，５０６，２０６号；同第５，２７１，９６１号；同第５，２５４，３４２号および同第５，５３４，４９６号を参照されたい）。
【０１６８】
Ａ．治療方法
本明細書に開示される抗体および組成物を、腫瘍細胞の成長を遅くするもしくは阻害するため、または腫瘍細胞の転移を阻害するために投与することができる。これらの適用では、がん細胞の成長、複製もしくは転移を阻害するため、および／またはがんの徴候もしくは症状を阻害するために十分な量の治療有効量の組成物を対象に投与する。
【０１６９】
対象に、本明細書に開示されるＣＤ２２特異的抗体、免疫コンジュゲート、ＣＡＲ（例えば、ＣＡＲを発現するＣＴＬ）、ＡＤＣ、多重特異性（例えば、二重特異性または三重特異性）抗体、抗体−ナノ粒子コンジュゲート、免疫リポソームまたは組成物の治療有効量を投与することにより、対象におけるＢ細胞悪性腫瘍を処置する方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、Ｂ細胞悪性腫瘍は、ＡＬＬ、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯リンパ腫、ＭＡＬＴリンパ腫、有毛細胞白血病、慢性リンパ性白血病またはＢ細胞性前リンパ球性白血病である。
【０１７０】
本明細書に開示されるＣＤ２２特異的抗体または組成物の治療有効量は、疾患の重症度、疾患の型、および患者の健康の全般的な状態に依存する。抗体に基づく組成物の治療有効量は、症状（複数可）の自覚的な軽減または臨床医もしくは他の資格を有する観察者によって認められる客観的に同定可能な改善のいずれかがもたらされる量である。
【０１７１】
本明細書に開示される抗体、抗体コンジュゲートおよび組成物の投与に他の抗がん剤または治療的処置の投与も伴ってもよい。一部の実施形態では、ＣＤ２２特異的抗体、抗体コンジュゲートまたは組成物を、放射線治療、化学療法、ＡＤＣ、免疫毒素、ＣＡＲを発現するＴ細胞、または免疫チェックポイント標的化療法、例えば、抗細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗グルココルチコイド誘導性  ＴＮＦ受容体関連（ＧＩＴＲ）抗体、抗誘導性共刺激物質（ＩＣＯＳ）抗体、抗リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）抗体、抗Ｔ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ３）抗体、抗ＣＤ２７６（Ｂ７−Ｈ３）抗体、もしくはインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害剤と組み合わせて投与する。
【０１７２】
任意の適切な抗がん剤を本明細書に開示される抗体、組成物およびコンジュゲートと組み合わせて投与することができる。例示的な抗がん剤としては、これだけに限定されないが、化学療法剤、例えば、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗薬、挿入抗生物質、成長因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、抗生存剤（anti-survival  agent）、生物学的反応修飾物質、抗ホルモン薬（例えば、抗アンドロゲン薬）および抗血管新生剤が挙げられる。他の抗がん処置としては、放射線療法およびがん細胞を特異的に標的とする他の抗体が挙げられる。
【０１７３】
アルキル化剤の非限定的な例としては、ナイトロジェンマスタード（例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、ウラシルマスタードまたはクロラムブシル）、スルホン酸アルキル（例えば、ブスルファン）、ニトロソ尿素（例えば、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、またはダカルバジン）が挙げられる。
【０１７４】
代謝拮抗薬の非限定的な例としては、葉酸類似体（例えば、メトトレキサート）、ピリミジン類似体（例えば、５−ＦＵまたはシタラビン）、およびメルカプトプリンまたはチオグアニンなどのプリン類似体が挙げられる。
【０１７５】
天然物の非限定的な例としては、ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、またはビンデシン）、エピポドフィロトキシン（例えば、エトポシドまたはテニポシド）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、またはマイトマイシンＣ）、および酵素（例えば、Ｌ−アスパラギナーゼ）が挙げられる。
【０１７６】
種々の薬剤の非限定的な例としては、白金配位錯体（例えば、シスプラチンとしても公知のシス−ジアミン−ジクロロ白金ＩＩ）、置換尿素（例えば、ヒドロキシウレア）、メチルヒドラジン誘導体（例えば、プロカルバジン）、および副腎皮質抑制薬（例えば、ミトタンおよびアミノグルテチミド）が挙げられる。
【０１７７】
ホルモンおよびアンタゴニストの非限定的な例としては、副腎皮質ステロイド（例えば、プレドニゾン）、プロゲスチン（例えば、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、および酢酸メゲストロール（magestrol））、エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオール）、抗エストロゲン薬（例えば、タモキシフェン）、およびアンドロゲン（例えば、テストステロン（testerone）プロピオン酸エステルおよびフルオキシメステロン）が挙げられる。開示されるＣＤ２２抗体（またはその抗原結合性断片）と組み合わせて使用することができる例示的な化学療法薬としては、アドリアマイシン、アルケラン、Ａｒａ−Ｃ、ＢｉＣＮＵ、ブスルファン、ＣＣＮＵ、カルボプラチン、シスプラチン、シトキサン、ダウノルビシン、ＤＴＩＣ、５−ＦＵ、フルダラビン、ハイドレア、イダルビシン、イホスファミド、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ナイトロジェンマスタード、タキソール（またはドセタキセルなどの他のタキサン）、ベルバン、ビンクリスチン、ＶＰ−１６が挙げられる一方で、いくつかのより新しい薬物として、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ）、ハーセプチン、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ、ＣＰＴ−１１）、ロイスタチン、ナベルビン、リツキサンＳＴＩ−５７１、タキソテール、トポテカン（Ｈｙｃａｍｔｉｎ）、Ｘｅｌｏｄａ（カペシタビン）、Ｚｅｖｅｌｉｎおよびカルシトリオールが挙げられる。
【０１７８】
使用することができる免疫調節薬の非限定的な例としては、ＡＳ−１０１（Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ  Ｌａｂｓ．）、ブロピリミン（Ｕｐｊｏｈｎ）、ガンマインターフェロン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＩＬ−２（ＣｅｔｕｓまたはＨｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）、ヒト免疫グロブリン（Ｃｕｔｔｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ＩＭＲＥＧ（Ｎｅｗ  Ｏｒｌｅａｎｓ、Ｌａ．のＩｍｒｅｇより）、ＳＫ＆Ｆ  １０６５２８、およびＴＮＦ（腫瘍壊死因子；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）が挙げられる。
【０１７９】
一部の実施形態では、対象に、ＣＤ２２の発現を増加させる薬剤を投与する。薬剤は、本明細書に開示される抗体または抗体コンジュゲートを投与する前に、またはそれと同時に投与することができる。特定の例では、ＣＤ２２の発現を上方調節する薬剤はブリオスタチン１である。
【０１８０】
いくつかの型のがんに対する別の一般的な処置は、外科的処置、例えば、がんまたはその一部の外科的切除である。処置の別の例は、放射線治療、例えば、外科的切除前に腫瘍の根絶またはその縮小を補助するために放射性材料またはエネルギー（例えば、外部照射治療）を腫瘍部位に投与することである。
【０１８１】
Ｂ．診断および検出のための方法
ＣＤ２２タンパク質をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで検出するための方法が本明細書で提供される。一部の場合では、生体試料におけるＣＤ２２発現を検出する。試料は、これだけに限定されないが、血液試料、生検材料由来組織、剖検材料および病理検体を含めた任意の試料であってよい。生体試料は、組織の切片、例えば、組織学的目的で取得した凍結切片も含む。生体試料は、血液、血清、血漿、喀痰、脊髄液または尿などの体液をさらに含む。生体試料は、一般には、ヒトまたは非ヒト霊長類などの哺乳動物から得られる。
【０１８２】
試料におけるＣＤ２２の発現を検出する方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、方法は、試料を本明細書に開示されるＣＤ２２特異的モノクローナル抗体または抗原結合性断片と接触させるステップと、抗体の試料への結合を検出するステップとを含む。一部の例では、試料は、血液、細胞または組織試料である。
【０１８３】
対象由来の試料を本明細書に開示されるＣＤ２２特異的モノクローナル抗体と接触させ、抗体の試料への結合を検出することにより、対象がＢ細胞悪性腫瘍を有するかどうかを決定する方法も本明細書で提供される。抗体の試料への結合が抗体の対照試料への結合と比較して増加することにより、対象がＢ細胞悪性腫瘍を有すると同定される。
【０１８４】
別の実施形態では、Ｂ細胞悪性腫瘍の診断を受けた対象由来の試料を本明細書に開示されるＣＤ２２特異的モノクローナル抗体と接触させ、抗体の試料への結合を検出することにより、対象におけるＢ細胞悪性腫瘍の診断を確実にする方法が提供される。抗体の試料への結合が抗体の対照試料への結合と比較して増加することにより、対象におけるＢ細胞悪性腫瘍の診断が確認される。
【０１８５】
開示されている方法の一部の例では、モノクローナル抗体を直接標識する。他の例では、方法は、モノクローナル抗体に特異的に結合する第２の抗体を試料と接触させるステップと、第２の抗体の結合を検出するステップとをさらに含む。第２の抗体の試料への結合が第２の抗体の対照試料への結合と比較して増加することにより、試料におけるＣＤ２２の発現が検出される。当業者には周知の通り、第２の抗体は、第１の抗体の特定の種およびクラスに特異的に結合することができるものが選択される。例えば、第１の抗体がヒトＩｇＧである場合には、二次抗体は抗ヒト−ＩｇＧであり得る。抗体に結合することができる他の分子としては、限定することなく、プロテインＡおよびプロテインＧが挙げられ、これらはどちらも市販されている。
【０１８６】
抗体または二次抗体に対する適切な標識としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、磁気剤および放射性材料が挙げられる。適切な酵素の非限定的な例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。適切な補欠分子族複合体の非限定的な例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる。適切な蛍光材料の非限定的な例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられる。非限定的な例示的な発光材料はルミノールである。非限定的な例示的な磁気剤はガドリニウムである。非限定的な例示的な放射性標識としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【０１８７】
代替の実施形態では、生体試料におけるＣＤ２２タンパク質を、検出可能な物質で標識されたＣＤ２２タンパク質標準物質およびＣＤ２２に特異的に結合する標識されていない抗体を利用した競合イムノアッセイによってアッセイすることができる。このアッセイでは、生体試料、標識されたＣＤ２２タンパク質標準物質およびＣＤ２２に特異的に結合する抗体を組み合わせ、標識されていない抗体が結合した標識されたＣＤ２２タンパク質標準物質の量を決定する。生体試料におけるＣＤ２２の量は、ＣＤ２２に特異的に結合する抗体が結合した標識されたＣＤ２２タンパク質標準物質の量に反比例する。
【０１８８】
本明細書に開示されるイムノアッセイおよび方法を、いくつかの目的のために使用することができる。一実施形態では、ＣＤ２２に特異的に結合する抗体を使用して、細胞培養下の細胞におけるＣＤ２２の産生を検出することができる。別の実施形態では、抗体を使用して、組織試料、または血液試料もしくは血清試料などの生体試料におけるＣＤ２２の量を検出することができる。一部の例では、ＣＤ２２は、細胞表面ＣＤ２２である。他の例では、ＣＤ２２は、可溶性である（例えば、細胞培養上清中または血液試料もしくは血清試料などの体液試料中）。
【０１８９】
一実施形態では、血液試料または組織試料などの生体試料におけるＣＤ２２を検出するためのキットが提供される。ポリペプチドを検出するためのキットは、一般には、本明細書に開示されるＣＤ２２抗体などの、ＣＤ２２に特異的に結合するモノクローナル抗体を含む。さらなる実施形態では、抗体は標識されている（例えば、蛍光標識、放射性標識、または酵素標識で）。
【０１９０】
一実施形態では、キットは、ＣＤ２２に結合する抗体を使用する手段を開示する説明用材料を含む。説明用材料は、電子形式で書かれたもの（例えば、コンピューターディスケットまたはコンパクトディスク）であってもよく、視覚的なもの（例えば、ビデオファイル）であってもよい。キットは、キットが設計される特定の適用を容易にするために追加の成分も含み得る。したがって、例えば、キットは、標識を検出する手段（例えば、酵素標識に対する酵素基質、蛍光標識を検出するためのフィルターセット、二次抗体などの適当な二次標識など）をさらに含有し得る。キットは、特定の方法を実施するために常套的に使用されるバッファおよび他の試薬をさらに含み得る。そのようなキットおよび適当な内容物は当業者には周知である。
【０１９１】
一実施形態では、診断用キットは、イムノアッセイを含む。イムノアッセイの詳細は使用される特定のフォーマットに伴って変動し得るが、生体試料におけるＣＤ２２を検出する方法は、一般に、生体試料を、免疫学的に反応性の条件下でＣＤ２２と特異的に反応する抗体と接触させるステップを含む。抗体を免疫学的に反応性の条件下で特異的に結合させて、免疫複合体を形成させ、免疫複合体（結合した抗体）の存在を直接または間接的に検出する。
【０１９２】
本明細書に開示される抗体は、これだけに限定されないが、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫沈降アッセイまたは免疫組織化学的アッセイなどのイムノアッセイに利用することもできる。抗体を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）に使用することもできる。ＦＡＣＳでは、細胞を分離または選別するために、他の精巧な検出レベルの中でも、複数のカラーチャネル、小角および鈍角光散乱検出チャネル、ならびにインピーダンスチャネルを使用する（米国特許第５，０６１，６２０号を参照されたい）。
【０１９３】
以下の実施例は、ある特定の特色および／または実施形態を例示するために提示される。これらの実施例は、本開示を記載されている特定の特色または実施形態に限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１９４】
（実施例１）
材料および方法
本実施例では、実施例２に記載の試験に使用した材料および実験手順を記載する。
【０１９５】
臨床試験および患者データ
ＮＣＩにおけるＣＤ１９  ＣＡＲＴ（ＮＣＴ０２０２８４５５）またはＣＤ２２  ＣＡＲＴ（ＮＣＴ０２３１５６１２）試験への登録のためにスクリーニングされた患者について、以前に記載されたフローサイトメトリー方法（Jasper  et  al.,  Cytometry  B  Clin  Cytom  80  (2):  83-90,  2011）を使用して測定された白血病芽球の表面のＣＤ１９抗原およびＣＤ２２抗原両方の部位密度を評価した。ＣＤ２２  ＣＡＲ試験で処置された患者に関しては登録の時点および再発時にＣＤ２２についての段階的な評価も行った。さらに、ＣＤ２２  ＣＡＲＴ試験患者４名について経時的にＣＡＲ  Ｔ細胞増加をフローサイトメトリーによって評価した。
【０１９６】
マウス、細胞株、患者由来異種移植片、および健康なドナーリンパ球
使用したＢ−ＡＬＬ細胞株には、Dr.  Crystal  Mackall、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｂｒａｎｃｈ、ＮＣＩ、ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤから入手したＧＦＰルシフェラーゼ形質導入Ｎａｌｍ６、ならびにDr.  Sarah  Tasian、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡから入手したＧＦＰルシフェラーゼ形質導入ＳＥＭおよびＧＦＰルシフェラーゼ形質導入Ｋｏｐｎ８が含まれた。ＣＤ２２ｎｅｇ、ＣＤ２２ｌｏ、およびＣＤ２２ｈｉを含めた、予め生成したＮａｌｍ６−ＧＦＰ＋細胞株のＣＲＩＳＰＲバリアントを使用した（Fry  et  al.,  Nat  Med.  2018;  24  (1):  20-28）。使用したＤＬＢＣＬ細胞株には、ＡＴＣＣから入手したＰｆｅｉｆｆｅｒおよびＴｏｌｅｄｏが含まれた。全ての細胞株をＭｙｃｏｐｌａｓｍａについてＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  Ｔｅｓｔ（Ｃａｍｂｒｅｘ  ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ）によって常套的に試験した。実験は全て細胞株を解凍してから２週間以内に行った。白血病細胞株およびリンパ腫細胞株を、１０％熱失活ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００Ｕ／ｍＬのストレプトマイシン、２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン、および１０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳを補充したＲＰＭＩ培地中で培養した。ヒト健康ドナー末梢血単核細胞をＮＩＨのＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅから治験審査委員会により承認されたプロトコールの下で得、１０％ＦＢＳ中で凍結させ、後で使用するために液体窒素中で保管した。患者由来異種移植片（ＰＤＸ）をＣＤ２２  ＣＡＲＴ後にＣＤ２２−低  白血病が再発した患者から開発した。患者ＡＬＬ細胞１×１０６〜１０×１０６個をＮＳＧマウス（ＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマ、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に静脈内注射することによってＰＤＸ細胞株を創製した。第２の継代後、細胞株にレンチ−ＧＦＰ−Ｌｕｃウイルスを形質導入し、ＧＦＰルシフェラーゼを発現する白血病細胞を選別した。
【０１９７】
部位密度モデルの生成
以前に記載されている通り、ＣＤ２２を除去するためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集によって部位密度モデル細胞株を開発した。具体的には、ガイドＲＮＡをＧｅＣＫＯヒトｓｇＲＮＡライブラリーから設計し、次いで、ＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ  ｖ２プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ５２９６１）にクローニングした。これらのガイドＲＮＡをＳｔｂｌ３細菌中に導入してそれを形質転換した。プラスミドをＬｅｎｔｉＸ  ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ、ＵＳＡ）にパッケージングプラスミドＲＲＥ、ｐＭＤ−Ｇ、およびＲＥＶと共トランスフェクトした。２日後に、ＣＲＩＳＰＲ上清を回収し、０．４５μｍの低タンパク質結合膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）を通して濾過した。上清をＬｅｎｔｉ−Ｘコンセントレーター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して濃縮し、ＰＢＳ中に再懸濁させ、すぐに使用したかまたは−８０℃で保管した。細胞表現型をフローサイトメトリーによって評価し、その後、表現型が変更された細胞の選別および単一細胞クローニングを行った。単一細胞クローンを配列決定して、遺伝子型の変更をＰｌａｔｉｎｕｍ  ＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって確認した（ｈＣＤ１９Ｆ  Ｓｅｑ：５’ＴＣＴＣＣＣＴＣＴＣＣＴＧＧＧＴＧ３’（配列番号７）、ｈＣＤ１９Ｒ  Ｓｅｑ：５’ＣＴＣＴＣＣＣＴＣＣＣＡＧＡＴＣＴＣＡＧ３’（配列番号８）、ｈＣＤ２２Ｆ  Ｓｅｑ：５’ＡＧＧＡＧＧＧＡＡＧＧＧＧＴＡＣＴＧ３’（配列番号９）、およびｈＣＤ２２Ｒ  Ｓｅｑ：５’ＡＧＣＣＡＡＣＧＴＴＴＴＧＧＡＴＣＴＴＣＡＧ３’（配列番号１０））。ｃＤＮＡヒトＣＤ２２プラスミドの完全な配列（Ｏｒｉｇｅｎｅ）を種々の濃度でＣＤ２２陰性細胞株に再形質導入して、種々のＣＤ２２部位密度を有する細胞株を得た。細胞株に単一細胞クローニングを行い、得られた細胞株には、ＣＤ２２陰性（ＣＤ２２ｎｅｇ）細胞株、ＣＤ２２−低  部位密度（ＣＤ２２ｌｏ）細胞株、およびＣＤ２２−高  部位密度（ＣＤ２２ｈｉ）細胞株が含まれた。ＱｕａｎｔｉＢＲＩＴＥ  Ｂｅａｄｓ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９により改変された細胞株の部位密度を確認した。
【０１９８】
ｍ９７１の親和性成熟
ＣＤ２２特異的モノクローナル抗体ｍ９７１（ＷＯ２００９／１２４１０９、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の親和性を増加させるために、エラープローンＰＣＲを使用してｓｃＦｖ遺伝子配列にランダム点変異を生じさせることにより、酵母ディスプレイｍ９７１変異体ｓｃＦｖライブラリーを作り出した。電気穿孔後、得られた変異体ライブラリーをＳＤＣＡＡ培地中、終夜３０℃で１６時間、次いで、ＳＧＣＡＡ培地に変えて３０℃でさらに１６時間、成長させた。ライブラリーの規模を縮小するため、およびＣＤ２２−Ｆｃに結合することができる変異体の集団を増加させるために、ＣＤ２２−Ｆｃを捕捉用抗原として用いたＭＡＣＳ（免疫磁気カラム、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）によって変異体ライブラリーを選別した。次いで、最も強力な結合体を抗ｃ−Ｍｙｃ−Ａｌｅｘａ  ４８８およびＣＤ２２−Ｆｃ／抗Ｈｕ−Ｆｃ  ＰＥコンジュゲートを用いてプールを二重染色し、ｃ−Ｍｙｃ発現シグナルに対する抗原結合シグナルが最も高い結合体についてゲーティングすることによって選別した。次いで、このプロセスを、酵母でディスプレイされるｍ９７１変異体が予測親和性に達するまでさらに２サイクル繰り返した。このプロセスの結果、ｍ９７１のＥＣ５０（ＣＤ２２−Ｆｃの酵母ディスプレイｓｃＦｖへの５０％結合に対する有効濃度）は０．５μｇ／ｍｌであったのが、親和性成熟させた変異体プールの親和性は＜０．０１μｇ／ｍｌまで増加した。親和性成熟させたプールから単一のクローンを選択し、ＤＮＡ配列決定および一連の結合アッセイによってさらに特徴付けた。親クローンおよび親和性成熟させた単一のクローン（ｍ９７１−Ｌ７を含む）の結合親和性をＢｉａｃｏｒｅによって測定した。
【０１９９】
ｍ９７１  ｓｃＦｖおよび親和性成熟させたクローンｍ９７１−Ｌ７のアミノ酸配列
親和性成熟させたクローンｍ９７１−Ｌ７をさらなる分析のために選択した。ｍ９７１−Ｌ７  ｓｃＦｖの配列決定により、親ｍ９７１  ｓｃＦｖと比較してアミノ酸の変化が７カ所同定された（図１２を参照されたい）。親ｍ９７１およびバリアントｍ９７１−Ｌ７のアミノ酸配列を下に提示する。ＣＤＲ配列に下線が引かれており、ｍ９７１−Ｌ７配列内の太字の残基はｍ９７１と比べたアミノ酸置換を示す。
【０２００】
ｍ９７１  ＶＨドメイン（配列番号１）
【化５】
2021530987.tif 000006
ＨＣＤＲ１＝残基２６〜３５；ＨＣＤＲ２＝残基５３〜６１；およびＨＣＤＲ３＝残基１００〜１１３
【０２０１】
ｍ９７１  ＶＬドメイン（配列番号２）
【化６】
2021530987.tif 000007
ＣＤＲ１＝残基２７〜３２；ＣＤＲ２＝残基５０〜５２；およびＣＤＲ３＝残基８９〜９７
【０２０２】
ｍ９７１  ｓｃＦｖ（配列番号３）
【化７】
2021530987.tif 000008
ＨＣＤＲ１＝残基２６〜３５；ＨＣＤＲ２＝残基５３〜６１；ＨＣＤＲ３＝残基１００〜１１３；リンカー＝残基１２５〜１３９；ＬＣＤＲ１＝残基１６６〜１７１；ＬＣＤＲ２＝残基１８９〜１９１；およびＬＣＤＲ３＝残基２２８〜２３６。
【０２０３】
ｍ９７１−Ｌ７  ＶＨドメイン（配列番号４）
【化８】
2021530987.tif 000009
ＣＤＲ１＝残基２６〜３５；ＣＤＲ２＝残基５３〜６１；およびＣＤＲ３＝残基１００〜１１３
【０２０４】
ｍ９７１−Ｌ７  ＶＬドメイン（配列番号５）
【化９】
2021530987.tif 000010
ＣＤＲ１＝残基２７〜３２；ＣＤＲ２＝残基５０〜５２；およびＣＤＲ３＝残基８９〜９７
【０２０５】
ｍ９７１−Ｌ７  ｓｃＦｖ（配列番号６）
【化１０】
2021530987.tif 000011
ＨＣＤＲ１＝残基２６〜３５；ＨＣＤＲ２＝残基５３〜６１；ＨＣＤＲ３＝残基１００〜１１３；リンカー＝残基１２５〜１３９；ＬＣＤＲ１＝残基１６６〜１７１；ＬＣＤＲ２＝残基１８９〜１９１；およびＬＣＤＲ３＝残基２２８〜２３６。
【０２０６】
表面プラズモン共鳴を用いたＣＤ２２  ｓｃＦｖの親和性の測定
ｍ９７１  ｓｃＦｖおよびそのバリアントのＣＤ２２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対する親和性をＢＩＡｃｏｒｅ  Ｘ１００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で測定した。精製したＣＤ２２  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質を１０ｍＭの酢酸緩衝液、ｐＨ５．０中に希釈し、アミンカップリングキットを使用してＣＭ５バイオセンサーチップに１４００ＲＵで固定化した。ランニング緩衝液はＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％の界面活性物質Ｐ２０）であった。ランニング緩衝液中に希釈したｓｃＦｖを０．３２ｎＭ、１．６ｎＭ、８ｎＭ、４０ｎＭおよび２００ｎＭの濃度で細胞中を流れるようにした。１０分間の解離後、１０ｍＭの酢酸、ｐＨ４．０、０．５ＭのＮａＣｌを用いてチップを再生した。データを１：１結合モデルに当てはめ、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて解離速度定数を推定した。
【０２０７】
ウエスタンブロット
細胞をＲＩＰＡ緩衝液で溶解させ、９８℃で５分間加熱することによって白血病細胞タンパク質抽出物を調製した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、ニトロセルロースメンブレンに転写した。メンブレンを、抗体ＰＫＣ−βＩＩおよびＧＡＰＤＨ（Ａｂｃａｍ）を用いて４℃で終夜免疫ブロットした。次いで、ブロットを適当な西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした二次抗体と一緒に室温で１時間インキュベートし、ＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）ＸＲＳ＋Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用して可視化した。
【０２０８】
免疫蛍光染色
μ−ディッシュ３５ｍｍ、高ガラスボトムディッシュ（Ｉｂｉｄｉ  Ｉｎｃ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）をポリ−Ｄ−リシンで２時間にわたってコーティングし、次いで、１ｎＭのブリオスタチン１またはＤＭＳＯ対照を用いて２４時間にわたって前処理した白血病細胞を５×１０５個播種した。播種のおよそ１２時間後に、細胞を４％パラホルムアルデヒド中に固定し、次いで、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００界面活性剤を用いて透過処理した。細胞をＣＤ２２−ＡＦ４８８抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いて１時間にわたって免疫染色し、次いで、ＤＡＰＩを用いて１５分間にわたって染色した。次いで、細胞を６３×ｐｌａｎ−ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ（Ｎ．Ａ．１．４）油浸対物レンズ、および微分干渉（ＤＩＣ）イメージング用のＴ−ＰＭＴを備えたＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ８８０共焦点顕微鏡を使用してイメージングした。
【０２０９】
ヒトＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の生成
ＣＤ２２−ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターを、２９３Ｔ細胞への一過性トランスフェクションによって作製した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し、２９３Ｔ細胞をパッキングおよびエンベロープベクターをコードするプラスミド（ｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ、ｐＭＤ．２Ｇ、ｐＲＳＶ−Ｒｅｖ、ｐ３０００）、ならびにＣＤ２２−ＣＡＲをコードするプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、４８時間後および７２時間後にトランスフェクトされた細胞からウイルス上清を回収し、３０００ＲＰＭで１０分間にわたって高速回転させて細胞片を除去し、−８０℃で凍結させた。次いで、ヒトＴ細胞を１×１０６個／ｍＬで解凍し、４０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２および細胞１個当たり３：１の比のＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＡＩＭ−Ｖ培地中で４８時間にわたって活性化させた。次いで、Ｔ細胞を１０ｍＬのレンチウイルス上清、５ｍＬのＡＩＭ−Ｖ、１００ＩＵのＩＬ−２、および１０μｇ／ｍＬの硫酸プロタミン中に２×１０６個／ｍＬで再懸濁させ、その後、６ウェルプレート中、３２℃、２０００ｇで２時間にわたって高速回転させた。次いで、プレートを３７℃で終夜インキュベートし、プロセスを２日目に繰り返した。第２の終夜インキュベーション後、ＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズを除去し、Ｔ細胞を、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含むＡＩＭ−Ｖ中に０．３×１０６個／ｍＬで再懸濁させ、さらに４８〜７２時間培養した後、実験に使用した。生成後、Ｔ細胞（ＣＡＲおよび偽の両方）を、５％熱失活ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００Ｕ／ｍＬのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、および１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を補充したＡＩＭ−Ｖ培地中で培養した。
【０２１０】
Ｎａｌｍ６異種移植片およびＰＤＸ  ｉｎ  ｖｉｖｏ試験
ＣＤ２２−ＣＡＲの機能性および抗白血病有効性を６〜１０週齢のＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙおよび社内飼育）を用いたＮａｌｍ６異種移植片またはＰＤＸモデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで評価した。０日目に、マウスにＧＦＰ＋ルシフェラーゼ＋腫瘍細胞（Ｎａｌｍ６、またはＮａｌｍ６  ＣＲＩＳＰＲバリアント、またはＰＤＸ）１×１０６個を静脈内に受けさせた。３日目に、マウスにＣＤ２２−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞または偽形質導入Ｔ細胞を、示されている分量で静脈内に受けさせた。白血病負荷をモニタリングするために、ルシフェリン−Ｄをマウスに腹腔内注射し、インビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ）技術（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してイメージングした。Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．１  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してマウスについての生物発光シグナルフラックス（発光）を測定した。
【０２１１】
ブリオスタチン１による処置
全てのｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験および腫瘍／ＣＡＲ前処理について、静脈内注射前にブリオスタチン１を１ｎｇ／ｍＬの濃度で細胞に投与した。対照処置細胞にはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ビヒクル対照を等体積で投与した。共培養または静脈内注射の前に、ブリオスタチン１で処置した細胞およびＤＭＳＯで処置した細胞を滅菌ＰＢＳで３回洗浄した。全てのｉｎ  ｖｉｖｏ実験について、ブリオスタチン１をＰＢＳ中に希釈し、４０μｇ／ｋｇ（１μｇ／マウス２５ｇ）の用量で腹腔内注射によって投与した。対照処置群に関しては、等体積のＤＭＳＯをＰＢＳ中に希釈し、同じ様式で投与した。
【０２１２】
ＲＮＡ配列決定およびデータ解析
１６のＲＮＡ−ｓｅｑ試料をプールし、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑ  Ｐｏｌｙ  Ａ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ  ｖ３を使用し、ペアエンド配列決定を用いたＮｅｘｔＳｅｑ高出力実行１回で配列決定した。全ての試料が３０００万を超えるパスフィルターリードを有し、９５％より多い塩基がＱ３０以上のベースコール品質であった。試料のリードをアダプターおよび低品質塩基に関してＴｒｉｍｍｏｍａｔｉｃソフトウェアを使用してトリミングした後、ＳＴＡＲを使用して参照ゲノムヒト−ｈｇ１９およびアノテートされた転写物によりアラインメントした。Ｐｉｃａｒｄソフトウェアを使用してマッピング品質統計値を算出し、Ｐｉｃａｒｄ’ｓ  ＭａｒｋＤｕｐｌｉｃａｔｅユーティリティーを使用し、マッピングされたリード内の独特の断片に関してライブラリーの複雑さを測定した。倍率変化および示差的に発現された遺伝子データを生成するため、ならびにデータ可視化のためにＰａｒｔｅｋ  Ｆｌｏｗインフォマティクスパイプラインを使用した。示差的に発現された遺伝子の遺伝子セット富化解析（ＧＳＥＡ）を以前に記載されている通り、標準のパラメーターを使用して実施した。
【０２１３】
フローサイトメトリー
細胞表面ＣＡＲおよびタンパク質発現のＦＡＣＳ分析をＬＳＲ  ＩＩ  Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して実施した。ＣＤ２２−ＣＡＲを、２２−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と一緒にインキュベートし、その後、ヒトＩｇＧ特異的ＰＥ−Ｆ（ａｂ）２（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と一緒にインキュベートすることによって検出した。細胞表面タンパク質を検出するために以下のヒトモノクローナル抗体を使用した：ＣＤ２２−ＡＰＣ、ＣＤ２２−ＰＥ、ＣＤ１９−Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５、ＣＤ３−ＡＰＣ／Ｃｙ７、ＰＤ１−ＰＥ／Ｃｙ７、ＬＡＧ３−ＡＰＣ、ＴＩＭ３−Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、ＣＤ８−ＡＰＣ、ＣＤ８−ＰＥ／Ｃｙ７、ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ、ＣＤ４５ＲＯ−ＰＥ／Ｃｙ７、ＣＣＲ７−Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、ＣＤ４−Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、ＣＤ６９−ＡＰＣ（全てＢｉｏＬｅｇｅｎｄより）。ＱｕａｎｔｉＢｒｉｔｅ−ＰＥビーズ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、以前に記載された方法（Jasper  et  al.,  Cytometry  B  Clin  Cytom  80  (2):  83-90,  2011）を使用してＣＤ２２部位密度を決定した。ｅＦｌｕｏｒ  ５０６固定可能な生存率色素（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して死細胞を同定した。ＧＦＰを発現する白血病細胞をＦＩＴＣチャネルによって同定した。
【０２１４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏサイトカインおよび白血病クリアランスアッセイ
サイトカイン産生アッセイのために、ＣＡＲまたは偽Ｔ細胞を洗浄してＩＬ−２を除去し、ＲＰＭＩ培地中に再懸濁させた。次いで、エフェクター細胞１×１０５個を腫瘍細胞とエフェクター対標的比１：１で、９６ウェルプレート中のＲＰＭＩ中で共培養し、３７℃で２０時間インキュベートした。プレートを１２００ＲＰＭで６分間にわたって高速回転させて細胞をペレットにし、培養上清中のサイトカイン濃度を、ＩＬ−２  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、またはグランザイムＢ  ＥＬＩＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）キットを使用し、製造者の指示に従って測定した。白血病クリアランスアッセイのために、ＣＡＲまたは偽Ｔ細胞１×１０５個を腫瘍細胞とエフェクター対標的比１：１で、９６ウェルプレート中のＲＰＭＩ中で共培養した。共培養の開始後、プレートをＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＺＯＯＭ中でインキュベートし、緑色オブジェクトコンフルエンス（green  object  confluence）（ＧＦＰ陽性白血病コンフルエンスを示す）を最大４０時間にわたって３〜６時間毎にイメージングした。
【０２１５】
統計解析
ＥＬＩＳＡの結果の有意性を、スチューデントの対応のないｔ検定を使用して算出した。骨髄、脾臓、および末梢血におけるＣＡＲタンパク質発現変化の有意性を、別段の指定のない限りマン・ホイットニー検定を使用して算出した。
【０２１６】
（実施例２）
親和性成熟抗ＣＤ２２モノクローナル抗体
本実施例では、ＣＡＲ機能性に対する抗原部位密度の影響、および、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）においてＣＤ２２発現を上方調節することが以前示された治療剤を使用して部位密度を増加させることによってＣＡＲ  Ｔ細胞の有効性を増強する潜在性の評価を記載する（Viola  Biberacher  et  al.,  Haematologica.  2012;  97  (5):  771-779）。抗原を低密度で発現する白血病に応答したＣＡＲ  Ｔ細胞活性の低下の同定に加えて、本明細書に開示されるデータから、抗原部位密度が低い白血病へのｉｎ  ｖｉｖｏでの曝露後にＣＡＲ  Ｔ細胞の持続性の短縮およびＣＡＲ  Ｔ細胞表現型の差異も実証される。海洋のコケムシＢｕｇｕｌａ  ｎｅｒｉｔｉｎａから最初に単離された天然物であるブリオスタチン１（George  et  al.,  J  Am  Chem  Soc.  1982;  104  (24):  6846-6848）により、前駆Ｂ細胞ＡＬＬおよびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）におけるＣＤ２２発現が増加し、抗白血病ＣＡＲ  Ｔ細胞応答、メモリー形成、および応答の耐久性が改善される。これは、標的抗原のモジュレーションによってＣＡＲＴ療法の有効性を増強するための臨床的に実行可能であり、関連する手法を提供する最初の報告である。
【０２１７】
前駆Ｂ細胞ＡＬＬにおけるＣＤ２２部位密度の低下はＣＤ２２指向性ＣＡＲ  Ｔ細胞機能性に影響を及ぼす
ＣＤ１９およびＣＤ２２  ＣＡＲＴ試験からの患者試料の評価により、原発性ヒト前駆Ｂ細胞ＡＬＬにおけるベースラインＣＤ２２部位密度がＣＤ１９部位密度よりも統計学的に低いことが示された（３０７９対１０４５０分子／細胞、図１Ａ）。さらに、ＣＤ２２  ＣＡＲＴ後に再発する患者では、ＣＤ２２部位密度がベースラインと比較して有意に低下した（図７Ａ）。さらに、最初のＣＤ２２部位密度はＣＤ２２  ＣＡＲＴ増加の変化とも相関した。部位密度が低い一部の患者では、ＣＡＲ増加が低減し、その後の白血病を取り除く能力が限定された（図１Ｃ）。ＣＤ２２部位密度がＣＡＲ機能に直接影響を及ぼすかどうかを決定するために、実施例１に記載の通りＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を使用し、様々な量のＣＤ２２を発現するＮａｌｍ６  ＡＬＬ細胞株を生成した（ＣＤ２２陰性（ＣＤ２２ｎｅｇ）、ＣＤ２２−低（ＣＤ２２ｌｏ）およびＣＤ２２−高（ＣＤ２２ｈｉ））（図７Ａ）（Fry  et  al.,  Nat  Med.  2018;  24  (1):  20-28）。健康なドナー由来ＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞によるＩＦＮ−γおよびＩＬ−２産生は、発現するＣＤ２２抗原部位密度が低いＮａｌｍ６に応答して徐々に減少した（図１Ｄ）。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてグランザイムＢ産生によって評価される細胞傷害性も、ＣＤ２２部位密度が低いＡＬＬへの曝露で低減した（図１Ｄ）。最後に、ＣＡＲ  Ｔ細胞機能性におけるドナー変動性を説明するために、ＣＤ２２  ＣＡＲＴ試験に登録された患者１７名由来のＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞を評価し、様々な部位密度を発現する標的細胞に応答したＩＬ−２産生の同様の漸次的移行が観察された（図１Ｅ）。部位密度が低下する細胞株に応答してＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞による種々の他のＴ細胞活性化サイトカイン産生が低減するという一貫した傾向があった（図８）。
【０２１８】
部位密度は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ有効性、持続性、およびメモリー表現型に影響を及ぼす
部位密度はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＡＬＬのＣＡＲ  Ｔ細胞媒介性枯渇には影響を及ぼさないが（図２Ａ）、ＣＤ２２  ＣＡＲは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＣＤ２２ｌｏ  ＡＬＬを取り除くことができない（図２Ｂ）。さらに、ＣＤ２２ｌｏ  ＡＬＬの根絶はＣＤ２２  ＣＡＲＴの用量の増加によってレスキューされなかった（図１Ｅ）。ＣＤ２２  ＣＡＲＴのＣＤ２２ｌｏ  ＡＬＬを取り除く能力の減退は、ＣＡＲＴの初期の増加が不十分であることに関連付けられ（図１Ｆ）、これは、ＣＤ２２  ＣＡＲＴで処置した患者における観察と一致した（図１Ｂ）。ＣＡＲ  Ｔ細胞の存在下でのＣＤ２２ｌｏ  ＡＬＬの増悪の遅延に基づいて、部位密度がＣＡＲ  Ｔ細胞の持続性および／または表現型に影響を及ぼす可能性があることが仮定された。実際に、ＣＡＲ注射後１６日目に、ＣＤ２２ｌｏ白血病担持マウスの骨髄中のＣＤ２２  ＣＡＲ細胞は、親Ｎａｌｍ６担持マウスと比較して有意に減少した（図２Ｃ、ｐ＜０．０００１）。
【０２１９】
次に、最初の増加の間のＣＡＲＴの活性化に対する部位密度の影響を評価した。ＣＡＲＴにおけるＰＤ１発現は、ＣＤ２２ｌｏ  ＡＬＬとｉｎ  ｖｉｔｒｏで２４時間共培養した後、親Ｎａｌｍ６と比較して３０％低減した（図２Ｅ）。８日間のｉｎ  ｖｉｔｒｏ共培養後、ＣＤ２２ｌｏに曝露したＣＡＲは、ナイーブな細胞（ＣＣＲ７＋およびＣＤ４５ＲＡ＋）のパーセンテージがＮａｌｍ６に曝露したＣＡＲと比較して高かった（図２Ｆ）。１６日目にＰＤ１発現には差異はなかったが、３０日目までに、Ｎａｌｍ６担持群ではＣＤ２２ｌｏ白血病群と比較してＰＤ１発現が増加する傾向があった（図２Ｄ）。さらに、ＣＡＲのＣＤ２２ｌｏ白血病細胞への曝露により、Ｎａｌｍ６への曝露と比較して、セントラルメモリー細胞およびエフェクターメモリー細胞が少ない傾向がもたらされた（図２Ｅ）。このｉｎ  ｖｉｔｒｏデータとｉｎ  ｖｉｖｏデータの組合せにより、低抗原密度の存在下では、ＣＡＲＴがメモリー表現型に切り替わることができず、それにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける応答の耐久性の低減がもたらされる可能性があることが示される。
【０２２０】
ＣＡＲ親和性の増加により低部位密度白血病に対するＣＡＲ感受性は改善されなかった
ＣＤ２２  ＣＡＲの構築に使用されるＣＤ２２特異的ｓｃＦｖ（ｍ９７１）は、結合親和性が比較的低い（Haso  et  al.,  Blood.  2013;  121  (7):  1165-1174；Xiao  et  al.,  MAbs  1:  297-303,  2009）。したがって、抗ＣＤ２２  ｓｃＦｖ（ｍ９７１−Ｌ７）を改変して、低抗原密度での結合が改善された一方で同じ４１ＢＢ共刺激ドメインを維持する、より親和性が高いＣＤ２２  ＣＡＲ（ＣＤ２２Ｖ１  ＣＡＲ；図１３Ａ）を生成した。しかし、このｓｃＦｖ改変では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるサイトカイン産生または細胞傷害性は増強されなかった（図９Ａ〜９Ｂ）。さらに、ＣＤ２２Ｖ１  ＣＡＲにより異種移植片におけるＣＤ２２ｌｏ白血病細胞のクリアランスは改善されなかった（図９Ｃ）。このｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける活性の増強の欠如の原因を評価するために、ＣＤ２２Ｖ１  ＣＡＲを発現するＴ細胞を持続性、活性化、疲弊、およびメモリー表現型についてｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で評価した。ＣＤ２２ｌｏ白血病と共培養した１日後に、ＣＤ２２Ｖ１  ＣＡＲは、元のＣＡＲと同様のＰＤ１発現を有した（図１３Ｂ）。しかし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける共培養の１日目および８日目の両方で、元のＣＤ２２  ＣＡＲと比較して高いパーセンテージのＣＤ２２Ｖ１  ＣＡＲＴがナイーブのままであった（図９Ｄ）。ＣＤ２２Ｖ１  ＣＡＲＴはｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＣＤ２２ｌｏ白血病の存在下で１６日目に持続し（図９Ｅ）、ＰＤ１、ＴＩＭ３、およびＬＡＧ３の発現は元のＣＡＲと比較して同様であった（図１３Ｃ）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの所見と同様に、ＣＤ２２ｌｏおよび親Ｎａｌｍ６白血病のどちらに応答した場合でも、元のＣＤ２２  ＣＡＲと比較して高いパーセンテージのＣＤ２２Ｖ１  ＣＡＲＴがナイーブのままであった（図９Ｆ；図１３Ｅ）。最後に、最終分化と一致して、ＥＭＲＡ  ＣＡＲＴ（ＣＣＲ７−、ＣＤ４５ＲＡ＋）の集団がＣＤ２２Ｖ１  ＣＡＲにおいて現れ、これは、元のＣＤ２２  ＣＡＲには存在せず、また、ＣＤ２２ｌｏ白血病を標的とした場合により顕著であった（図９Ｆ；図１３Ｆ）。
【０２２１】
ブリオスタチン１により、ＡＬＬおよびＤＬＢＣＬ細胞株におけるＣＤ２２抗原発現が増加する
次に、抗原発現における薬物媒介性増加によりＣＡＲ活性が改善されるかどうかを評価した。ブリオスタチン１は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）におけるＣＤ２２発現を増加させることが示されている（Viola  Biberacher  et  al.,  Haematologica.  2012;  97  (5):  771-779）。したがって、ブリオスタチン１のＣＤ２２発現に対する影響を２種の前駆Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病細胞株および２種のびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）細胞株において試験した。４種全ての細胞株でブリオスタチン１に曝露した際のＣＤ２２発現の有意な増加が実証された（図３Ａ）。ブリオスタチン１によりＡＬＬにおけるＣＤ１９発現は変更されなかったが、ＤＬＢＣＬでは若干の増加が認められた（図３Ａ）。ＣＤ２２発現の増加はブリオスタチン１の除去後１週間持続した（図３Ｂ）。さらに、腹腔内に（Ｉ．Ｐ．）投与した単回用量のブリオスタチン１により、１週間の時点でＮａｌｍ６におけるＣＤ２２  ＭＦＩが増加し、その後、薬物投与の１２日後にベースライン発現に戻った（図３Ｃ）。最後に、ブリオスタチン１によりＣＤ２２−低  再発患者由来ＡＬＬ異種移植片においてＣＤ２２が上方調節されることが確認された（図３Ｄ）。
【０２２２】
ブリオスタチン１媒介性ＣＤ２２上方調節は、ＰＫＣ阻害によって媒介されるＣＤ２２遺伝子発現の増加以外の機序によって起こる可能性がある
ブリオスタチン１に関して、ＣＤ２２上方調節の状況におけるＣＬＬに対して影響を及ぼすことが以前に記載されている通り（Viola  Biberacher  et  al.,  Haematologica.  2012;  97  (5):  771-779）、ブリオスタチン１に曝露するとＡＬＬにおけるＰＫＣβＩＩタンパク質レベルが低下し（図１０）、これにより、同様のＰＫＣ駆動機序が示される。しかし、ＰＫＣβＩＩ阻害剤であるエンザスタウリンによっても広範なＰＫＣ阻害剤であるスタウロスポリンによってもＣＤ２２を上方調節することができなかった（図１０Ｄ）。ＣＤ２２上方調節の潜在的な機序をさらに調査するために、ブリオスタチン１で処理した、および処理していないＡＬＬ細胞株ＫＯＰＮ８（ＭＬＬ−ＭＬＬＴ１融合がん遺伝子）およびＳＥＭ（ＭＬＬ−ＡＦＦ１融合がん遺伝子）に対してＲＮＡ−配列解析（ＲＮＡｓｅｑ）を行い、どちらもブリオスタチン１曝露でＣＤ２２の頑強な上方調節を示した（図１０Ｅ）。２つの細胞株の間でブリオスタチン１に対する転写応答の大きさに顕著な差異があった（図４Ａ）。ＫＯＰＮ８では、２４時間の時点で２倍を超える変化を有する遺伝子が１５２４種実証された。ＳＥＭではブリオスタチン１への曝露で２倍の変化が実証された遺伝子は１種だけであったが、ＣＤ８２、ＦＬＴ１、ＦＧＦＲ１、およびＴＬＲ１０などのいくつかの細胞表面タンパク質を含めた共通の遺伝子セットが両方の細胞株において上方調節された。いずれの細胞株もブリオスタチン１による処理の経過にわたってＣＤ２２  ｍＲＮＡには変化を示さなかった（図４Ｂ）。ＫＯＰＮ８およびＧＳＥＡにおいて対照に対して発現が２倍になった７５６種の遺伝子を使用し、原形質膜の内因性成分として公知の遺伝子の有意な富化が見いだされた。この観察およびＣＤ２２  ＲＮＡ発現が変更されなかったことに基づいて、ブリオスタチン１は、膜結合タンパク質の輸送を変更することによってＣＤ２２を増加させる可能性があることが仮定された。これと一致して、ブリオスタチン１で処理した細胞では、曝露の２４時間後にＤＭＳＯ対照と比較してＣＤ２２の空腔化が少ないことが実証された（図１０Ｃ）。
【０２２３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＣＤ２２  ＣＡＲＴの機能性は白血病細胞のブリオスタチン１によるプライミング後に増強されるが、ＣＤ１９  ＣＡＲＴの機能性は増強されない
追加の試験により、白血病におけるＣＤ２２部位密度のブリオスタチン１媒介性増加によりＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の機能性を増強することができるかどうかを決定しようとした。Ｂ−ＡＬＬおよびＤＬＢＣＬのどちらにおいても、ブリオスタチン１による前処理により、ＣＤ２２  ＣＡＲによるＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、およびグランザイムＢの産生が有意に増強された（図４Ｃ〜４Ｄ）。さらに、グランザイムＢによって測定されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性が増強された（図４Ｅ）。逆に、ＣＤ１９  ＣＡＲは、白血病をブリオスタチン１に曝露させてもグランザイムＢ産生の改善が示されなかった（図１４Ａ）。しかし、ＣＤ１９  ＣＡＲのｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性はブリオスタチン１により低下しなかった（図１４Ｂ）。
【０２２４】
ＣＡＲＴのブリオスタチン１への曝露により、サイトカイン産生が減弱するが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性は影響を受けない
ブリオスタチン１は、Ｔ細胞受容体シグナル伝達経路において重要な役割を果たすＰＫＣアイソフォームのモジュレーターとして特徴付けられている（Tuttle  et  al.,  J  Surg  Res.  1992;  52  (6):  543-548；Drexler  et  al.,  Blood.  1989;  74  (5):  1747-1757）。ブリオスタチン１をＣＡＲ療法と併せて利用することを臨床的な目標として、ブリオスタチン１による処理が、白血病部位密度に対するその効果とは独立してＣＤ２２  ＣＡＲ機能性に直接影響を及ぼすかどうかを評価した。ブリオスタチン１で前処理したＣＤ２２  ＣＡＲは、ＡＬＬまたはＤＬＢＣＬ細胞株と共培養した場合のＩＦＮ−γの産生レベルがＤＭＳＯ対照で前処理したＣＤ２２  ＣＡＲと比較して減弱したが、グランザイムＢの産生レベルは有意に上昇した（図５Ａ〜５Ｂ）。ＣＤ２２  ＣＡＲによるサイトカインおよびグランザイムＢ産生に対するブリオスタチン１の影響を決定するために、ブリオスタチン１に曝露したＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害性を評価し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける白血病クリアランスのカイネティクスに変化は見いだされなかった（図５Ｃ）。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣＡＲ活性に対するブリオスタチン１の影響を、ＣＤ２２ｌｏ白血病細胞を使用して標的抗原モジュレーションの非存在下で評価し、それにより、ブリオスタチン１曝露後のＣＤ２２発現の増加は実証されなかった（図１１）。図５Ｄに示されている通り、ブリオスタチン１は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＣＤ２２ｌｏ白血病の増悪を減弱させるＣＤ２２−ＣＡＲの能力に影響を及ぼさなかった。まとめると、これらの所見から、ＣＤ２２  ＣＡＲをブリオスタチン１に曝露することにより、サイトカインおよびグランザイムＢ分泌が変化するが、全体的なＣＡＲ機能性は負の影響を受けないことが示される。
【０２２５】
ブリオスタチン１は、ＣＡＲ  Ｔ細胞の持続性、メモリー表現型に影響を及ぼし、白血病応答の耐久性を改善する
ＣＤ２２部位密度のブリオスタチン１媒介性増加のｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣＡＲ持続性および機能性に対する影響を、サイトカイン応答を最大にするために十分なＣＤ２２を発現せず（図２Ｇ）、ブリオスタチン１に応答してＣＤ２２発現をモジュレートしない（図３）親Ｎａｌｍ６を使用して評価した。ＣＡＲＴ注入前の「プライミング療法」としてのブリオスタチン１の投与を試験した。マウスに、ブリオスタチン１で前処理した腫瘍細胞を注射し、その後、ＣＡＲＴを注射した。ＣＤ２２  ＣＡＲ注射の７日後に、Ｔ細胞表現型を評価した。ブリオスタチン１で前処理したＮａｌｍ６を受けたマウスの脾臓では、ＣＤ８＋ＣＡＲＴ集団内でセントラルメモリー（ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ−）細胞およびエフェクターメモリー（ＣＣＲ７−、ＣＤ４５ＲＡ−）細胞の有意な累積的富化が見いだされ、また、ナイーブな細胞がより少なかった（図６Ａ）。ブリオスタチン１に曝露すると、ＣＡＲＴは、ＴＩＭ３またはＬＡＧ３の増加を伴わない安定なＰＤ１発現によって証明される通り、疲弊のエビデンスを伴わずに同様の活性化を示した（図１４Ｃ）。３０日の時点で、ＣＡＲＴ注射後にブリオスタチン１で処置したマウスでは、骨髄においてＣＤ２２  ＣＡＲＴがわずかに増加した（図６Ｂ）。次いで、治癒下の用量のＣＤ２２  ＣＡＲＴ注入後２週間にわたるブリオスタチン１投与をＮａｌｍ６（図６Ｃ；図１５Ａ）およびＳＥＭ（図６Ｃ；図１５Ｂ）において試験し、これにより、ブリオスタチン１により、寛解の耐久性が改善され、ブリオスタチン１の停止を超えて延長されることが実証された。最後に、ＣＤ２２  ＣＡＲＴ注入後のブリオスタチン１投与の影響をＣＤ２２−低  再発ＰＤＸモデルにおいて試験し、これにより、白血病を取り除く能力が改善されることが実証された（図６Ｄ；図１５Ｃ）。集合的に、これらの結果から、ブリオスタチン１が、ＣＡＲ  Ｔ細胞注入前に抗原発現を増加させるためのプライミング療法として、およびＣＤ２２  ＣＡＲ抵抗性白血病の出現後のレスキューとしてのどちらでも有効であることが実証される。
【０２２６】
治療への適用
再発したまたは難治性前駆Ｂ細胞ＡＬＬ患者は、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法に関して潜在的に治癒的な治療選択肢を有するが、これらの患者の一部は、標的抗原のモジュレーションにより再発した。さらに、最近の試験により、低抗原部位密度の状況でのＣＡＲ活性の限定が同定されている（Walker  et  al.,  Mol  Ther.  2017;  25  (9):  2189-2201；Chmielewski  et  al.,  Gene  Ther.  2011;  18  (1):  62-72；Yoshida  et  al.,  Clin  Transl  Immunology.  2016;  5  (12):  e116；Watanabe  et  al.,  J  Immunol.  2015;  194  (3):  911-920；Weijtens  et  al.,  Gene  Ther.  2000;  7  (1):  35-42；Turatti  et  al.,  J  Immunother.  2007;  30  (7):  684-693；James  et  al.,  J  Immunol.  2008;  180  (10):  7028-7038；Anurathapan  et  al.,  Mol  Ther.  2014;  22  (3):  623-633；Caruso  et  al.,  Cancer  Res.  2015;  75  (17):  3505-3518；Hombach  et  al.,  Mol  Ther.  2016;  24  (8):  1423-1434；Hegde  et  al.,  J  Clin  Invest.  2016;  126  (8):  3036-3052）。臨床経験から、ＣＡＲ標的化療法からのエスケープ、ならびに潜在的にＣＡＲ−Ｔ細胞の増加および機能性の低減の機序として低抗原密度が支持される（Fry  et  al.,  Nat  Med.  2018;  24  (1):  20-28）。本明細書に開示される試験では、特にＣＡＲの機能および持続性に対する低部位密度の影響に焦点を当て、低部位密度の状況におけるＣＡＲの不首尾の特徴を評価する。さらに、本開示は、そのような限定を克服するための治療的抗原モジュレーションの使用を支持する最初の前臨床的エビデンスを提供する。データから２つの重要な所見が確立された：（Ａ）腫瘍細胞における低部位密度により、ＣＡＲ  Ｔ細胞の持続性および表現型に有意な変化がもたらされ、（Ｂ）部位密度の増加によりＣＡＲ  Ｔ細胞機能性が改善される。
【０２２７】
前駆Ｂ細胞ＡＬＬの患者をＣＤ２２  ＣＡＲＴを使用して処置することには、多くの場合、ＣＤ２２  ＣＡＲＴ細胞に応答する患者の高い割合で低ＣＤ２２を発現する白血病の進行または再発が伴うことが以前に実証されている。さらに、免疫療法圧力に曝露する前であっても前駆Ｂ細胞ＡＬＬのベースラインＣＤ２２発現はＣＤ１９発現よりも有意に低い。本開示によりサイトカイン産生および細胞傷害性に対する部位密度の特異的影響が実証され、これは以前の試験と一致する（Walker  et  al.,  Mol  Ther.  2017;  25  (9):  2189-2201；Watanabe  et  al.,  J  Immunol.  2015;  194  (3):  911-920；Hombach  et  al.,  Mol  Ther.  2016;  24  (8):  1423-1434；Hegde  et  al.,  J  Clin  Invest.  2016;  126  (8):  3036-3052）。この部位密度と関連したＣＡＲ  Ｔ細胞効力の分析はｉｎ  ｖｉｖｏ系に拡張され、それにより、増悪は遅延するが、抗原を低部位密度で発現する白血病を取り除くことはできないことが実証される。ＣＡＲ  Ｔ細胞の持続性および表現型に対する低部位密度の影響も定義される。活性化マーカーに有意な変更はなかったが、部位密度がより高い白血病では、持続しているＣＡＲ  Ｔ細胞の数の増加ならびにより高い割合のセントラルおよびエフェクターメモリーＣＤ８＋ＣＡＲ  Ｔ細胞がもたらされた。これは、部位密度がＣＡＲ  Ｔ細胞の短期活性に影響を及ぼすだけでなく、より長期間の持続性およびメモリー発生にも影響を及ぼし、ＣＡＲ  Ｔにより誘導される寛解の耐久性に対して密接な関係を有するという最初の明白なエビデンスである。
【０２２８】
抗原の低部位密度によって課される細胞療法の限定を克服するための戦略を、ＣＤ２２  ＣＡＲの親和性を増強して低部位密度に対するＣＡＲの感受性を改善することによるものを含め、評価した。結合親和性は抗体に基づく治療薬（therapeutics）にとって重要であるが、ＣＤ２２  ＣＡＲの親和性の増強では低部位密度白血病に対する応答、またはそのクリアランスが増強されなかった。しかし、他のＣＡＲ構築物および対応する標的とされる抗原については当てはまらない場合がある（Turatti  et  al.,  J  Immunother.  2007;  30  (7):  684-693；Lynn  et  al.,  Leukemia.  2016;  30  (6):  1355-1364）。第２に、ＡＬＬおよびＤＬＢＣＬ細胞株におけるＣＤ２２発現を上方調節し、それにより、ＣＡＲＴによるサイトカイン産生およびメモリー表現型を改善する薬物としてブリオスタチン１が同定された。ブリオスタチン１は、ＰＫＣのモジュレーターとして、曝露パラメーターに基づいてＰＫＣレベルに多様な影響を有する（Isakov  et  al.,  J  Immunol.  1993;  150  (4):  1195-1204；Lee  et  al.,  Am  J  Physiol.  1996;  271  (1  Pt  1):  C304-311；Grant,  Front  Biosci.  1997;  2:  d242-252；Grant  et  al.,  Cancer  Res.  1992;  52  (22):  6270-6278；Jarvis  et  al.,  Biochem  Pharmacol.  1994;  47  (5):  839-852）。ＣＬＬでは、ＣＤ２２のブリオスタチン１媒介性上方調節はＰＫＣの低減と相関した（Viola  Biberacher  et  al.,  Haematologica.  2012;  97  (5):  771-779）。ブリオスタチン１の作用機序に関する最初の評価により、ＰＫＣ−βＩＩレベルの低下が観察されたが、ＰＫＣモジュレーションがＣＤ２２調節の唯一の原因ではない可能性があることが見いだされた。具体的には、ブリオスタチン１で処理したＡＬＬ細胞株においてＣＤ２２  ｍＲＮＡレベルに有意な変更は認められないこと、および多数の細胞表面分子が上方調節されることが見いだされた。
【０２２９】
ＣＡＲ機能性はブリオスタチン１によって媒介されるＣＤ２２発現の増加によって有意に改善されること、およびブリオスタチン１がＴ細胞機能への影響に以前に関係付けられていることから（Tuttle  et  al.,  J  Surg  Res.  1992;  52  (6):  543-548；Drexler  et  al.,  Blood.  1989;  74  (5):  1747-1757）、標的抗原モジュレーションとは独立した、Ｔ細胞機能に対するブリオスタチン１の直接の影響を分析した。ブリオスタチン１によりＩＦＮ−γ産生は減弱しなかったが、グランザイムＢ産生も増加し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでもｉｎ  ｖｉｖｏでも細胞傷害性に対する負の影響はなかった。したがって、ＣＡＲＴおよび白血病に対するブリオスタチン１の正味の影響により、サイトカイン産生および細胞傷害性の全体的な強化、ならびに応答の耐久性の改善がもたらされた。これらの所見は、ブリオスタチン１をＣＡＲＴ療法と組み合わせることに関する確証をもたらすものである。ＣＡＲＴ療法の前に腫瘍をプライムするため、またはＣＡＲＴ後に抗原発現の低減に起因して再発した患者をレスキューするために、ブリオスタチン１を使用することができる。
【０２３０】
（実施例３）
対象におけるＢ細胞悪性腫瘍を検出するため、または対象におけるＢ細胞悪性腫瘍の診断を確実にするためのＣＤ２２特異的モノクローナル抗体
本実施例では、対象におけるＢ細胞悪性腫瘍を検出するための、ＣＤ２２特異的ヒトモノクローナル抗体の例示的な使用を記載する。本実施例では、対象におけるＢ細胞悪性腫瘍の診断を確実にするための、これらの抗体の使用をさらに記載する。
【０２３１】
Ｂ細胞悪性腫瘍を有する対象では、健康な対象と比べて可溶性ＣＤ２２のレベルが上昇する。したがって、対象におけるＢ細胞悪性腫瘍を検出するまたはＢ細胞悪性腫瘍の診断を確実にするために、Ｂ細胞悪性腫瘍の診断を受けたまたはそれを有する疑いがある患者におけるｓＣＤ２２の検出および定量を使用することができる。Ｂ細胞悪性腫瘍の診断を受けたまたはそれを有する疑いがある患者から血液試料を得る。Ｂ細胞悪性腫瘍を有さない患者から取得した血液試料を対照として使用することができる。
【０２３２】
本実施例では、サンドイッチＥＬＩＳＡを実施して、血液試料中のｓＣＤ２２を検出する。ヒトモノクローナル抗ＣＤ２２抗体（例えば、ｍ９７１−Ｌ７）をマルチウェル平底プレート（例えば、９６ウェルプレートまたは３６４ウェルプレート）の表面に、そのプレートに抗体をコーティングし、室温で２時間インキュベートすることによって固定化する。プレートを０．０２％Ｔｗｅｅｎ  ＰＢＳ（Ｔ−ＰＢＳ）で２回洗浄した後、プレートを１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）−ＰＢＳでブロッキングして、非特異的結合を排除し、次いで、Ｔ−ＰＢＳで２回洗浄する。患者試料および対照試料をウェルに添加し、およそ１５〜２０時間インキュベートする。Ｔ−ＰＢＳで３回洗浄した後、標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））で直接標識された二次抗ＣＤ２２抗体をプレートに添加する。Ｔ−ＰＢＳでさらに３回洗浄した後、１０，０００倍希釈したＡｖｉｄｉｎｅ−ＨＲＰ溶液（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）１００μｌを添加し、室温で１時間インキュベートする。Ｔ−ＰＢＳでさらに３回洗浄した後、ＴＭＢ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）１００μｌおよびＨ２Ｏ２  １００μｌを添加し（例えば、ＨＲＰが標識の場合）、５分間インキュベートし、その後、２ＮのＨ２ＳＯ４  １００μｌを添加して発色を停止させる（例えば、ＨＲＰが標識の場合）。４５０ｎｍ（または使用する標識に応じて他の波長）における光学濃度（ＯＤ）値を測定することによってｓＣＤ２２のレベルを決定する。
【０２３３】
患者試料におけるｓＣＤ２２のレベルが対照試料と比べて上昇していることにより、その対象がＢ細胞悪性腫瘍を有することが示される。したがって、対象におけるＢ細胞悪性腫瘍を検出するため、または対象におけるＢ細胞悪性腫瘍の診断を確実にするために、ｓＣＤ２２の検出を使用することができる。
【０２３４】
本開示の原理を適用することができる多くの可能性のある実施形態を考慮して、例示されている実施形態は単に本発明の例であり、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではないことが理解されるべきであ。そうではなく、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって定義される。したがって、これらの特許請求の範囲の範囲および主旨に入る全てが本発明者らの発明であるものと主張する。
【図１Ａ】
2021530987.tif 000012
【図１Ｂ】
2021530987.tif 000013
【図１Ｃ】
2021530987.tif 000014
【図１Ｄ】
2021530987.tif 000015
【図１Ｅ】
2021530987.tif 000016
【図１Ｆ】
2021530987.tif 000017
【図２Ａ−Ｂ】
2021530987.tif 000018
【図２Ｃ】
2021530987.tif 000019
【図２Ｄ】
2021530987.tif 000020
【図２Ｅ】
2021530987.tif 000021
【図２Ｆ】
2021530987.tif 000022
【図２Ｇ】
2021530987.tif 000023
【図３Ａ】
2021530987.tif 000024
【図３Ｂ−Ｃ】
2021530987.tif 000025
【図３Ｄ】
2021530987.tif 000026
【図４Ａ−Ｂ】
2021530987.tif 000027
【図４Ｃ−Ｄ】
2021530987.tif 000028
【図４Ｅ】
2021530987.tif 000029
【図５Ａ】
2021530987.tif 000030
【図５Ｂ】
2021530987.tif 000031
【図５Ｃ】
2021530987.tif 000032
【図５Ｄ】
2021530987.tif 000033
【図６Ａ】
2021530987.tif 000034
【図６Ｂ】
2021530987.tif 000035
【図６Ｃ−Ｄ】
2021530987.tif 000036
【図７Ａ】
2021530987.tif 000037
【図７Ｂ】
2021530987.tif 000038
【図８】
2021530987.tif 000039
【図９Ａ】
2021530987.tif 000040
【図９Ｂ】
2021530987.tif 000041
【図９Ｃ】
2021530987.tif 000042
【図９Ｄ−Ｅ】
2021530987.tif 000043
【図９Ｆ】
2021530987.tif 000044
【図１０Ａ】
2021530987.tif 000045
【図１０Ｂ】
2021530987.tif 000046
【図１０Ｃ】
2021530987.tif 000047
【図１０Ｄ】
2021530987.tif 000048
【図１０Ｅ】
2021530987.tif 000049
【図１１】
2021530987.tif 000050
【図１２】
2021530987.tif 000051
【図１３Ａ】
2021530987.tif 000052
【図１３Ｂ−Ｃ】
2021530987.tif 000053
【図１３Ｄ】
2021530987.tif 000054
【図１３Ｅ−Ｆ】
2021530987.tif 000055
【図１４Ａ−Ｂ】
2021530987.tif 000056
【図１４Ｃ】
2021530987.tif 000057
【図１５】
2021530987.tif 000058
【配列表】
2021530987000001.app
【国際調査報告】
2021530987.tif 000059
2021530987.tif 000060
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