(57)【要約】核酸を蝸牛および前庭細胞に効率的に送達するための物質および方法、ならびに遺伝子異常と関連する感覚トランスダクション障害を治療する方法を、本明細書に提供する。2021519609.tif 000041
2021519609.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列：TLAVPFKを含むカプシドと、TMC1、TMC2、MYO7A、USCH1C、CDH23、PCDH15、SANS、CIB2、USH2A、VLGR1、WHRN、CLRN1、PDZD7、KCNQ4、TMPRSS3、STRC、EYA4、ハーモニンa、bおよびc、OTOF、GPR98、MYO6、MYO15A、LOXHD1、POU3F4、EYA1、WFS1、ACTG1、TMIE、PJVK、SYNE4、ならびにFAM65Bからなる群より選択されるポリペプチドとをコードする、AAVベクター。
【請求項２】
TMC1、TMC2、MYO7A、USCH1C、CDH23、PCDH15、SANS、CIB2、USH2A、VLGR1、WHRN、CLRN1、PDZD7、KCNQ4、TMPRSS3、STRC、EYA4、ハーモニンa、bおよびc、OTOF、GPR98、MYO6、MYO15A、LOXHD1、POU3F4、EYA1、WFS1、ACTG1、TMIE、PJVK、SYNE4、ならびにFAM65Bからなる群より選択されるポリペプチドをコードする、AAV9-php.bベクター。
【請求項３】
Espinプロモーター、PCDH15プロモーター、PTPRQプロモーター、Myo6プロモーター、KCNQ4プロモーター、Myo7aプロモーター、シナプシンプロモーター、GFAPプロモーター、CMVプロモーター、CAGプロモーター、CBHプロモーター、CBAプロモーター、U6プロモーター、およびTMHS（LHFPL5）プロモーターからなる群より選択されるプロモーターをさらに含む、請求項1または2記載のベクター。
【請求項４】
内および外有毛細胞を少なくとも約70％またはより高い効率で形質導入する、請求項1記載のAAV9-php.bベクター。
【請求項５】
請求項1記載のAAV9-php.bベクターを含む細胞。
【請求項６】
外もしくは内有毛細胞、前庭有毛細胞、らせん神経節、または前庭神経節である、請求項5記載の細胞。
【請求項７】
対象における遺伝子異常と関連する内耳障害を治療する方法であって、該対象の細胞を請求項1または2記載のAAVベクターと接触させる工程を含む、方法。
【請求項８】
内耳障害がアッシャー症候群である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
対象における聴覚および／または前庭機能を増強、改善、または維持する、請求項7記載の方法。
【請求項１０】
欠陥を有する対象に欠陥遺伝子の野生型形態を導入するための方法であって、該対象の細胞を請求項1または2記載のAAVベクターと接触させる工程を含む、方法。
【請求項１１】
対象におけるアッシャー症候群を治療する方法であって、該対象の細胞をAAV9-php.bベクターと接触させる工程を含み、該ベクターが、Espinプロモーター、PCDH15プロモーター、PTPRQプロモーター、Myo6プロモーター、KCNQ4プロモーター、Myo7aプロモーター、シナプシンプロモーター、GFAPプロモーター、CMVプロモーター、CAGプロモーター、CBHプロモーター、CBAプロモーター、U6プロモーター、およびTMHS（LHFPL5）プロモーターからなる群より選択されるプロモーターを含み、該プロモーターが、ミオシン7a、ハーモニン、カドヘリン23、プロトカドヘリン15、USH2A、ADGRV1/VLGR1/GPR98、WHRN、CLRN1、HARS、SANS、およびカルシウムおよびインテグリン結合タンパク質2からなる群より選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を指示する、方法。
【請求項１２】
対象における遺伝子異常を治療する方法であって、該対象の細胞をAAV9-php.bベクターと接触させる工程を含み、該ベクターが、Espinプロモーター、PCDH15プロモーター、PTPRQプロモーター、Myo6プロモーター、KCNQ4プロモーター、Myo7aプロモーター、シナプシンプロモーター、GFAPプロモーター、CMVプロモーター、CAGプロモーター、CBHプロモーター、CBAプロモーター、U6プロモーター、およびTMHS（LHFPL5）プロモーターからなる群より選択されるプロモーターを含み、該プロモーターが、TMC1、TMC2、MYO7A、USCH1C、CDH23、PCDH15、SANS、CIB2、USH2A、VLGR1、WHRN、CLRN1、PDZD7、KCNQ4、TMPRSS3、STRC、EYA4、ハーモニンa、bおよびc、OTOF、GPR98、MYO6、MYO15A、LOXHD1、POU3F4、EYA1、WFS1、ACTG1、TMIE、PJVK、SYNE4、ならびにFAM65Bをコードするポリヌクレオチドの発現を指示する、方法。
【請求項１３】
細胞が内耳の細胞である、請求項11または12記載の方法。
【請求項１４】
投与が対象における聴覚および／または前庭機能を改善または維持する、請求項11または12記載の方法。
【請求項１５】
遺伝子異常が、部分的聴力損失、完全聴覚消失、または部分的もしくは完全な前庭機能不全と関連する、請求項11または12記載の方法。
【請求項１６】
聴覚機能の増強が、毛束形態の保存および／またはメカノトランスダクションの回復と関連する、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
対象における外もしくは内有毛細胞、前庭有毛細胞、らせん神経節、または前庭神経節を形質導入する方法であって、ベクターを該対象の卵形嚢に注入する工程を含む、方法。
【請求項１８】
ベクターが請求項1〜4のいずれか一項記載のベクターである、請求項17記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、その全内容が参照により本明細書に組み入れられる、以下2018年3月5日に出願された米国特許仮出願第62/638,697号の恩典を主張する。
【背景技術】
【０００２】
背景
遺伝性難聴は、人工内耳以外に治療選択肢が少ない深刻な障害である。遺伝性聴力障害は、多くの場合、単一遺伝子異常によるものである。言語習得前難聴は乳児の1/500において診断され、そのうち約50％が遺伝的病因を有する。それぞれが多数の異なる遺伝子のいずれかの変異によって生じ得る多数の異なる臨床サブタイプと関連するアッシャー症候群が、幼児期難聴の3〜6％の原因とされている。すべての遺伝性難聴の1〜2％であると推定される、より一般的な遺伝子異常の1つがTMC1遺伝子において発生する。アッシャー症候群のもっとも重篤な形態であるUSH1は、6つの遺伝子：USH1、MYO7A（ミオシン7a）、USH1C（harmonin「ハーモニン」）、CDH23（カドヘリン23）、PCDH15（プロトカドヘリン15）、SANS（sans；USH1Gとも知られる）、およびCIB2（カルシウムおよびインテグリン結合タンパク質2）の異常と関連する。
【０００３】
内耳、たとえば蝸牛、特に蝸牛中の内有毛細胞および外有毛細胞（IHCおよびOHC）は、様々な病因の聴力喪失および難聴、とりわけ、一遺伝子形態の遺伝性難聴に介入するためのポリヌクレオチド治療法にとって魅力的な標的である。しかし、IHCおよびOHCならびに遺伝子治療法に関連し得る他の内耳細胞を効率的に標的とし、形質導入することは難題であった。
【発明の概要】
【０００４】
概要
本発明は、関心対象のポリペプチド（たとえばTMC1、TMC2、MYO7A、USCH1C、CDH23、PCDH15、SANS、CIB2、USH2A、VLGR1、WHRN、CLRN1、PDZD7、KCNQ4、TMPRSS3、STRC、EYA4、USH1C（たとえばハーモニンa、bまたはc）、OTOF、GPR98、MYO6、MYO15A、LOXHD1、POU3F4、EYA1、WFS1、ACTG1、TMIE、PJVK、SYNE4およびFAM65B）をコードする導入遺伝子を含むAAV9-php.bベクターならびにそのベクターを、聴覚および／または前庭メカノセンセーションに遺伝子異常を有する対象の内耳に投与し、それによって対象を治療する方法を提供する。
【０００５】
本発明は、少なくとも部分的に、AAV9-php.b-CMV-GFP（AAV-php.b-CMV-GFPとも呼ばれる）が、インビボで、内および外有毛細胞を含む内耳の感覚細胞を効率的かつ特異的に標的とするという発見に基づく。
【０００６】
1つの局面において、本発明は、ミオシン7a、ハーモニン（たとえばハーモニンa、ハーモニンbまたはハーモニンc）、カドヘリン23、プロトカドヘリン15、USH2A、ADGRV1/VLGR1/GPR98、WHRN、CLRN1、HARS、SANSおよびカルシウムおよびインテグリン結合タンパク質2または本明細書に記載される任意の他のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するAAV9-php.bベクターを提供する。
【０００７】
別の局面において、本発明は、AAV9-php.bとで少なくとも約85％の配列同一性を有するカプシドをコードし、ヒトTMC1ポリヌクレオチドの発現を指示するプロモーターを含有するAAV9-php.bベクターを提供する。
【０００８】
別の局面において、本発明は、下流ポリヌクレオチドの発現を指示するEspinプロモーター、PCDH15プロモーター、PTPRQプロモーター、Myo6プロモーター、KCNQ4プロモーター、Myo7aプロモーター、シナプシンプロモーター、GFAPプロモーター、CMVプロモーター、CAGプロモーター、CBHプロモーター、CBAプロモーター、U6プロモーターまたはTMHS（LHFPL5）プロモーターであるプロモーターを含有するAAV9-php.bベクターを提供する。
【０００９】
別の局面において、本発明は、前記局面のAAV9-php.bベクターを含有する細胞を提供する。
【００１０】
別の局面において、本発明は、対象の内耳中でポリペプチドを発現させる方法を提供し、本方法は、内耳の細胞を、関心対象のポリペプチドをコードするAAV9-php.bベクターと接触させる工程を含み、AAV9-php.bベクターは、内および外有毛細胞の少なくとも約85、90、95％またはより多くをトランスフェクトする。
【００１１】
別の局面において、本発明は、対象の内耳中でポリペプチドを発現させる方法を提供し、本方法は、内耳の細胞を、関心対象のヒトポリペプチドをコードするAAV9-php.bベクターと接触させる工程を含む。
【００１２】
別の局面において、本発明は、対象における遺伝子異常と関連する内耳障害を治療する方法を提供し、本方法は、対象の細胞をAAV9-php.bベクターと接触させる工程を含み、ベクターは、ミオシン7a、ハーモニン、カドヘリン23、プロトカドヘリン15、USH2A、ADGRV1/VLGR1/GPR98、WHRN、CLRN1、HARS、SANSおよびカルシウムおよびインテグリン結合タンパク質2のいずれか1つまたは複数をコードするポリヌクレオチドを含有する。
【００１３】
別の局面において、本発明は、対象における遺伝子異常と関連する内耳障害を治療する方法を提供し、本方法は、対象の細胞をAAV9-php.bベクターと接触させる工程を含み、ベクターは、Espinプロモーター、PCDH15プロモーター、PTPRQプロモーター、Myo6プロモーター、KCNQ4プロモーター、Myo7aプロモーター、シナプシンプロモーター、GFAPプロモーター、CMVプロモーター、CAGプロモーター、CBHプロモーター、CBAプロモーター、U6プロモーターおよびTMHS（LHFPL5）プロモーターのいずれかであるプロモーターを含有する。
【００１４】
別の局面において、本発明は、対象における遺伝子異常と関連する内耳障害を治療する方法を提供し、本方法は、対象の細胞をAAV9-php.bベクターと接触させる工程を含み、ベクターは、AAV9-php.bとで少なくとも約85％の配列同一性を有するカプシドをコードし、ミオシン7a、ハーモニン、カドヘリン23、プロトカドヘリン15、USH2A、ADGRV1/VLGR1/GPR98、WHRN、CLRN1、HARS、SANSおよびカルシウムまたはインテグリン結合タンパク質2であるUSH1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーターを含有する。
【００１５】
本明細書に記載される発明の上記局面または任意の他の局面の様々な態様において、内耳障害とは、内耳中に発現するポリペプチドの遺伝子変異と関連する遺伝性疾患である。他の態様において、遺伝子異常は、部分的聴力損失、完全聴覚消失または部分的もしくは完全な前庭機能不全と関連する。上記局面の他の態様において、プロモーターは、Espinプロモーター、PCDH15プロモーター、PTPRQプロモーター、Myo6プロモーター、KCNQ4プロモーター、Myo7aプロモーター、シナプシンプロモーター、GFAPプロモーター、CMVプロモーター、CAGプロモーター、CBHプロモーター、CBAプロモーター、U6プロモーターおよびTMHS（LHFPL5）プロモーターのいずれか1つまたは複数である。上記局面の他の態様において、ベクターは、内および外有毛細胞、前庭有毛細胞、らせん神経節または前庭神経節を少なくとも約70％またはより高い効率で形質導入する。上記局面の他の態様において、ハーモニンポリペプチドは、ハーモニンa、ハーモニンbまたはハーモニンcである。上記局面の他の態様において、細胞は外もしくは内有毛細胞、前庭有毛細胞、らせん神経節または前庭神経節である。上記局面の他の態様において、ベクターは、下流ポリヌクレオチドの発現を指示するプロモーターを含有し、プロモーターは、Espinプロモーター、PCDH15プロモーター、PTPRQプロモーター、Myo6プロモーター、KCNQ4プロモーター、Myo7aプロモーター、シナプシンプロモーター、GFAPプロモーター、CMVプロモーター、CAGプロモーター、CBHプロモーター、CBAプロモーター、U6プロモーターまたはTMHS（LHFPL5）プロモーターである。上記局面の他の態様において、下流ポリヌクレオチドは、TMC1、TMC2または、ミオシン7a、ハーモニン、カドヘリン23、プロトカドヘリン15、USH2A、ADGRV1/VLGR1/GPR98、WHRN、CLRN1、HARS、SANSおよびカルシウムまたはインテグリン結合タンパク質2あるUSH1ポリペプチドである。上記局面の特定の態様において、ハーモニンポリペプチドはハーモニンa、ハーモニンbまたはハーモニンcである。上記局面の他の態様において、AAV9-php.bベクターは、少なくとも約70％、80％、90％、95％またはより高い効率、さらには100％の効率で、内および外有毛細胞を標的とする。上記局面の他の態様において、ヒトポリペプチドはTMC1、TMC2、ハーモニンa、ハーモニンbまたはハーモニンcである。上記局面の他の態様において、内耳障害は聴覚障害または前庭障害である。他の態様において、ベクターの投与は、対象における聴覚および／または前庭機能を改善または維持する。いくつかの態様において、改善または維持される聴覚および／または前庭機能は、毛束形態の保存および／またはメカノトランスダクションの回復と関連する。上記局面の他の態様において、内耳障害はアッシャー症候群である。
【００１６】
定義
別段の定めがない限り、本明細書において使用されるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。以下の参考文献が、本発明において使用される用語の多くの一般的定義を当業者に提供する：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988)；The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Vcrlag (1991)およびHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書において使用される以下の用語は、別段の指定がない限り、以下それらに与えられる意味を有する。
【００１７】
「AAV9-php.bベクター」とは、内耳の細胞をトランスフェクトするAAV9-php.bポリヌクレオチドまたはその断片を含むウイルスベクターをいう。1つの態様において、AAV9-php.bベクターは、対象の内耳への投与または内耳由来の細胞とのインビトロでの接触ののち、内有毛細胞の少なくとも70％および外有毛細胞の少なくとも70％をトランスフェクトする。他の態様においては、内有毛細胞の少なくとも85％、90％、95％または事実上100％および／または外有毛細胞の少なくとも85％、90％、95％または事実上100％がトランスフェクトされる。トランスフェクション効率は、マウスモデルにおいてGFPをコードする遺伝子を使用して評価され得る。例示的なAAV9-php.bベクターの配列を以下に提供する。
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【００１８】
「メカノセンセーション」とは、機械的刺激に対する反応をいう。触覚、聴覚および平衡が、機械的刺激から神経シグナルへの変換の例である。メカノセンセーション入力は、「メカノトランスダクション」と呼ばれるプロセスを通して、機械的刺激に対する反応へと変換される。
【００１９】
「ミオシン6（Myo6）プロモーター」とは、外もしくは内有毛細胞、前庭有毛細胞、らせん神経節または前庭神経節中で下流ポリヌクレオチドの発現を指示するのに十分な核酸配列を含み、またはそれからなり、以下のヌクレオチド配列とで少なくとも約85％の配列同一性を有する調節ポリヌクレオチド配列をいう。
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【００２０】
「ミオシン7A（Myo7A）プロモーター」とは、外もしくは内有毛細胞、前庭有毛細胞、らせん神経節または前庭神経節中で下流ポリヌクレオチドの発現を指示するのに十分な核酸配列を含み、またはそれからなり、以下のヌクレオチド配列とで少なくとも約85％の配列同一性を有する調節ポリヌクレオチド配列をいう。
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【００２１】
「TMC1ポリペプチド」とは、メカノトランスダクションチャネル活性を有する、NCBI Reference Sequence: NP_619636.2に対して少なくとも約85％以上のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドまたはその断片をいう。TMC1の例示的アミノ酸配列を以下に提供する。
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【００２２】
「TMC1ポリヌクレオチド」とは、TMC1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをいう。例示的なTMC1ポリヌクレオチドの配列が、以下に再現されるNCBI Reference Sequence: NM_138691.2に提供されている。
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【００２３】
「TMC2ポリペプチド」とは、メカノセンセーションにおいて機能する、NCBI Reference Sequence: NP_542789に対して少なくとも約85％以上のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドまたはその断片をいう。TMC2の例示的アミノ酸配列を以下に提供する。
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【００２４】
「TMC2ポリヌクレオチド」とは、、TMC2ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをいう。例示的なポリヌクレオチド配列を以下に提供する。
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【００２５】
「ハーモニン」ポリペプチドとは、メカノセンセーションにおいて機能するまたはUSH1C、USH1G、CDH23、およびMYO7Aのいずれか1つもしくは複数と相互作用する、Q9Y6N9-1（アイソフォーム1）、Q9Y6N9-2、Q9Y6N9-3、Q9Y6N9-4、Q9Y6N9-5に対して少なくとも約85％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドまたはその断片をいう。例示的なハーモニンaポリペプチド（アイソフォーム1）の配列を以下に提供する。
＞sp|Q9Y6N9|USH1C_ヒトハーモニン OS=ホモサピエンス GN=USH1C PE=1 SV=3
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【００２６】
「Ush1Cポリヌクレオチド」とは、ハーモニンポリペプチドをコードする核酸分子をいう。例示的なUsh1CポリヌクレオチドNM_005709の配列を以下に提供する。
2021519609.tif 000018
【００２７】
他の例示的なハーモニン配列を以下に提供する。
ハーモニンB
＞XM 011519832.2  予測：ホモサピエンスUSH1タンパク質ネットワーク成分ハーモニン（USH1C）、転写産物変異体X3、mRNA
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【００２８】
ハーモニンBポリペプチド
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【００２９】
ハーモニンC
＞NM 001297764.1  ホモサピエンスUSH1タンパク質ネットワーク成分ハーモニン（USH1C）、転写産物変異体3、mRNA
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【００３０】
ハーモニンCポリペプチド
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【００３１】
「KCNQ4ポリペプチド」とは、カリウム電圧ゲートチャネル活性を有する、NP_004691.2とで少なくとも約85％の同一性を有するポリペプチドまたはその断片をいう。例示的なアミノ酸配列がNP_004691.2に提供され、その配列を以下に記す。
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【００３２】
KCNQ4ポリヌクレオチドとは、KCNQ4ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをいう。例示的なKCNQ4ポリヌクレオチド配列がNM_004700に提供され、以下のように再現される。
2021519609.tif 000024
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2021519609.tif 000026
【００３３】
「KCNQ4プロモーター」とは、外もしくは内有毛細胞、前庭有毛細胞、らせん神経節または前庭神経節中で下流ポリヌクレオチドの発現を指示するのに十分な核酸配列を含み、またはそれからなり、以下のヌクレオチド配列とで少なくとも約85％のヌクレオチド配列同一性を有する調節ポリヌクレオチド配列をいう。
2021519609.tif 000027
【００３４】
「TMPRSS3ポリペプチド」とは、プロテアーゼ活性を有する、NP_001243246とで少なくとも約85％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質またはその断片をいう。例示的なTMPRSS3配列を以下に記す。
膜貫通型プロテアーゼセリン3アイソフォーム4［ホモサピエンス］
NCBI Reference Sequence: NP_001243246.1
＞NP_001243246.1  膜貫通型プロテアーゼセリン3アイソフォーム4［ホモサピエンス］
2021519609.tif 000028
【００３５】
「TMPRSS3ポリヌクレオチド」とは、TMPRSS3ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをいう。例示的なTMPRSS3配列がNCBI NM_001256317に提供され、以下のように再現される。
＞NM_001256317.1  ホモサピエンス膜貫通型セリンプロテアーゼセリン3（TMPRSS3）、トランスクリプトバリアントF、mRNA
2021519609.tif 000029
【００３６】
「STRCポリペプチド」とは、内耳中の毛束と会合する、NP_714544とで少なくとも約85％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質またはその断片をいう。例示的なSTRCアミノ酸配列を以下に記す。
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【００３７】
「STRCポリヌクレオチド」とは、STRCポリペプチドをコードする核酸分子をいう。例示的なSTRCポリヌクレオチド配列を以下に記す。
＞NM_153700.2  ホモサピエンスステレオシリン（STRC）、mRNA
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【００３８】
「EYA4ポリペプチド」とは、転写調節活性を有する、NP_001287941.1とで少なくとも約85％の同一性を有するタンパク質またはその断片をいう。
＞NP_001287941.1 eyes absent homolog 4アイソフォームe［ホモサピエンス］
2021519609.tif 000034
【００３９】
「EYA4ポリヌクレオチド」とは、EYA4ポリペプチドをコードする核酸分子をいう。例示的なEYA4ポリヌクレオチド配列がNCBI Ref: NM_001301012.1に提供され、以下のように再現される。
＞NM_001301012.1  ホモサピエンスEYA転写コアクチベータおよびホスファターゼ4（EYA4）、トランスクリプトバリアント5、mRNA
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2021519609.tif 000036
【００４０】
「Espinプロモーター」とは、外もしくは内有毛細胞、前庭有毛細胞、らせん神経節または前庭神経節中で下流ポリヌクレオチドの発現を指示するのに十分である、NCBI Reference Sequence: NG_015866.1に由来する調節ポリヌクレオチド配列をいう。1つの態様において、Espinプロモーターは、Espinコード配列の上流の少なくとも約350、500、1000、2000、3000、4000、5000またはより多くの塩基対を含む、またはそれらからなる。
【００４１】
「プロトカドヘリン関連15（PCDH15）プロモーター」とは、外もしくは内有毛細胞、前庭有毛細胞、らせん神経節または前庭神経節中で下流ポリヌクレオチドの発現を指示するのに十分である、NCBI Reference Sequence: NG_009191に由来する調節ポリヌクレオチド配列をいう。1つの態様において、PCDH15プロモーターは、PCDH15コード配列の上流の少なくとも約350、500、1000、2000、3000、4000、5000またはより多くの塩基対を含む。いくつかの態様において、PCDH15プロモーターは、以下のヌクレオチド配列とで少なくとも約85％の配列同一性を有する核酸配列を含む、またはそれからなる。
2021519609.tif 000037
【００４２】
「タンパク質チロシンホスファターゼ受容体タイプQ（PTPRQ）プロモーター」とは、外もしくは内有毛細胞、前庭有毛細胞、らせん神経節または前庭神経節中で下流ポリヌクレオチドの発現を指示するのに十分である、GeneID: 374462に由来する調節ポリヌクレオチド配列をいう。1つの態様において、PTPRQプロモーターは、PTPRQコード配列の上流の少なくとも約350、500、1000、2000、3000、4000、5000またはより多くの塩基対を含む。いくつかの態様において、PTPRQプロモーターは、以下のヌクレオチド配列とで少なくとも約85％の配列同一性を有する核酸配列を含む、またはそれからなる。
2021519609.tif 000038
【００４３】
「脂肪腫HMGIC融合パートナ様5（LHFPL5）プロモーター」（「TMHSプロモーター」とも呼ばれる）とは、外もしくは内有毛細胞、前庭有毛細胞、らせん神経節または前庭神経節中で下流ポリヌクレオチドの発現を指示するのに十分である、NCBI Reference Sequence: GeneID: 222662に由来する調節ポリヌクレオチド配列をいう。1つの態様において、TMHSプロモーターは、PCDH15コード配列の上流の少なくとも約350、500、1000、2000、3000、4000、5000またはより多くの塩基対を含む。いくつかの態様において、TMHSプロモーターは、以下のヌクレオチド配列とで少なくとも約85％の配列同一性を有する核酸配列を含む、またはそれからなる。
2021519609.tif 000039
【００４４】
「シナプシンプロモーター」（「Synプロモーター」とも呼ばれる）とは、外もしくは内有毛細胞、前庭有毛細胞、らせん神経節または前庭神経節中で下流ポリヌクレオチドの発現を指示するのに十分な核酸配列を含み、またはそれらからなり、以下のヌクレオチド配列とで少なくとも約85％の配列同一性を有する調節ポリヌクレオチド配列をいう。
2021519609.tif 000040
【００４５】
「作用物質」とは、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは小さな化合物をいう。
【００４６】
「改善する」とは、疾患または障害の発症または進行を低下させる、抑制する、弱める、減らす、阻止する、または安定化することをいう。
【００４７】
「変性」とは、本明細書に記載されるものなどの標準的な既知の方法によって検出される、遺伝子またはポリペプチドの発現レベルまたは活性の変化（増減）をいう。本明細書において使用される変性は、発現レベルの10％の変化、好ましくは発現レベルの25％の変化、より好ましくは40％の変化、もっとも好ましくは50％以上の変化を含む。
【００４８】
本開示において、「含む」、「含み」、「含有し」、および「有し」などは、米国特許法においてそれらに与えられる意味を有することができ、「含む」、「含み」などを意味することができ；「から本質的になり」または「から本質的になる」などは、米国特許法において与えられる意味を有し、この用語は開放型であり、記載されるもの以外の存在によって記載されるものの基本的または新規な特徴が変わることがない限り、記載されるもの以外の存在をも許すが、従来技術態様を除外する。
【００４９】
「検出する」とは、検出されるべき分析対象物の存在、非存在または量を識別することをいう。
【００５０】
「疾患」とは、細胞、組織、または器官の正常な機能を損傷または妨害する任意の状態または障害をいう。疾患の例は、たとえば対象の内耳中に発現する、メカノセンセーショントランスダクションにおいて機能するタンパク質中の機能の損失を特徴とする遺伝子疾患を含む。別の態様において、疾患はアッシャー症候群（たとえばUSH1）または加齢性聴力喪失である。1つの態様において、疾患は、遺伝子異常、たとえばTMC1、TMC2、MYO7A、USCH1C、CDH23、PCDH15、SANS、CIB2、USH2A、VLGR1、WHRN、CLRN1、PDZD7、KCNQ4、TMPRSS3、STRC、EYA4、USH1C（たとえばハーモニンa、b、またはc）、OTOF、GPR98、MYO6、MYO15A、LOXHD1、POU3F4、EYA1、WFS1、ACTG1、TMIE、PJVK、SYNE4、およびFAM65Bの異常と関連する聴覚障害である。
【００５１】
「有効量」とは、未処置の患者に対して疾患の症状を改善するために必要な作用物質の量をいう。疾患の治療処置のために本発明を実施するために使用される活性物質の有効量は、投与方法、対象の年齢、体重および健康状態に依存して異なる。最終的には、主治医または獣医が適切な量および用法・用量を決定する。そのような量が「有効量」と呼ばれる。
【００５２】
「断片」とは、ポリペプチドまたは核酸分子の一部分をいう。この部分は、好ましくは、参照核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、または90％を含む。断片は、10、20、30、40、50、60、70、80、90または100、200、300、400、500、600、700、800、900、または1000のヌクレオチドまたはアミノ酸を含有し得る。
【００５３】
「ハイブリダイゼーション」とは、相補的核酸塩基間の、ワトソン・クリック型、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型水素結合であり得る水素結合をいう。たとえば、アデニンとチミンが、水素結合の形成を通して対を成す相補的核酸塩基である。
【００５４】
用語「単離された」、「精製された」、または「生物学的に高純度の」とは、自然な状態で見いだされたとき通常それに付随する成分を様々な程度に含まない物質をいう。「単離」とは、供給源または周囲からのある程度の分離を指す。
【００５５】
「精製」とは、単離よりも高い程度の分離を指す。「精製された」または「生物学的に高純度の」タンパク質は、任意の不純物がタンパク質の生物学的性質に実質的に影響しない、または他の有害な結果を生じさせない程度に十分に、他の物質を含まない。すなわち、本発明の核酸またはペプチドは、組換えDNA技術によって産生される場合、細胞物質、ウイルス物質、または培地を実質的に含まないならば、または化学合成される場合、化学的前駆体または他の薬品を含まないならば、精製されている。純度および均一性は通常は、分析化学技術、たとえばポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液クロマトグラフィーを使用して測定される。用語「精製された」は、電気泳動ゲル中で核酸またはタンパク質が本質的に1つのバンドしか生じさせないことを指すことができる。修飾、たとえばリン酸化またはグリコシル化に付されることができるタンパク質の場合、様々な修飾によって、別々に精製され得る様々な単離されたタンパク質が生じ得る。
【００５６】
「単離されたポリヌクレオチド」とは、本発明の核酸分子が由来する生物の天然ゲノム中で当該遺伝子に隣接する遺伝子を含まない核酸（たとえばDNA）をいう。したがって、この語は、たとえば、ベクターに組み込まれている組換えDNA；自律複製性プラスミドもしくはウイルスに組み込まれている組換えDNA；原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれている組換えDNA；または他の配列から独立した別個の分子（たとえば、PCRまたは制限エンドヌクレアーゼ消化によって産生されたcDNAまたはゲノムもしくcDNA断片）として存在する組換えDNAを含む。加えて、この用語は、DNA分子から転写されるRNA分子およびさらなるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAを含む。
【００５７】
「単離されたポリペプチド」とは、自然にはそれに付随する成分から分離されている本発明のポリペプチドをいう。概して、ポリペプチドは、少なくとも60重量％が、天然においてそれが会合しているタンパク質および天然の有機分子を含まないとき、単離されている。好ましくは、調製物は、少なくとも75％、より好ましくは少なくとも90％、もっとも好ましくは少なくとも99％が本発明のポリペプチドである。本発明の単離されたポリペプチドは、たとえば、天然の供給源からの抽出によって、そのようなポリペプチドをコードする組換え核酸の発現によって；または、タンパク質の化学合成によって、得られ得る。純度は、任意の適切な方法、たとえばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC分析によって計測することができる。
【００５８】
「マーカー」とは、疾患または障害と関連して発現レベルまたは活性の変化を示す任意のタンパク質またはポリヌクレオチドをいう。
【００５９】
本明細書において使用される「作用物質を得る」におけるような「得る」は、作用物質を合成する、購入する、または他のやり方で取得することを含む。
【００６０】
「プロモーター」とは、下流ポリヌクレオチドの転写を誘導するのに十分なポリヌクレオチドをいう。
【００６１】
「減少する」または「増加する」とは、少なくとも10％、25％、50％、75％、または100％の負または正の変化をいう。
【００６２】
「参照」とは、標準または対照条件をいう。
【００６３】
「参照配列」とは、配列比較のベースとして使用される規定の配列である。参照配列は、指定された配列のサブセットまたは全体；たとえば完全長cDNAもしくは遺伝子配列のセグメントまたは完全なcDNAもしく遺伝子配列であり得る。ポリペプチドの場合、参照ポリペプチド配列の長さは概して、少なくとも約16アミノ酸、好ましくは少なくとも約20アミノ酸、より好ましくは少なくとも約25アミノ酸、さらに好ましくは約35アミノ酸、約50アミノ酸、または約100アミノ酸である。核酸の場合、参照核酸配列の長さは概して、少なくとも約50ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約60ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約75ヌクレオチド、さらに好ましくは約100ヌクレオチドまたは約300ヌクレオチドまたはそれらの周辺もしくは間の任意の整数である。
【００６４】
本発明の方法に有用な核酸分子は、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする任意の核酸分子を含む。そのような核酸分子は、内在性核酸配列に対して100％同一である必要はないが、概して実質的な同一性を示す。内在性配列に対して「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは概して、二本鎖核酸分子の少なくとも1つの鎖とハイブリダイズすることができる。本発明の方法に有用な核酸分子は、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする任意の核酸分子を含む。そのような核酸分子は、内在性核酸配列に対して100％同一である必要はないが、概して実質的な同一性を示す。内在性配列に対して「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは概して、二本鎖核酸分子の少なくとも1つの鎖とハイブリダイズすることができる。
【００６５】
「ハイブリダイズする」とは、様々なストリンジェンシーの条件下、相補的ポリヌクレオチド配列（たとえば、本明細書に記載される遺伝子）間でまたはその部分の間で二本鎖分子を形成するために対を成すことをいう（たとえば、Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399；Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507を参照）。
【００６６】
たとえば、ストリンジェントな塩濃度は通常、約750mM NaClおよび75mMクエン酸三ナトリウム未満、好ましくは約500mM NaClおよび50mMクエン酸三ナトリウム未満、より好ましくは約250mM NaClおよび25mMクエン酸三ナトリウム未満である。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、有機溶媒、たとえばホルムアミドの非存在において得ることができ、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、少なくとも約35％ホルムアミド、より好ましくは少なくとも約50％ホルムアミドの存在において得ることができる。ストリンジェントな温度条件は通常、少なくとも約30℃、より好ましくは少なくとも約37℃、もっとも好ましくは少なくとも約42℃の温度を含む。様々なさらなるパラメータ、たとえばハイブリダイゼーション時間、洗浄剤、たとえばドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の濃度およびキャリヤDNAの包含または非包含が当業者に周知である。これら様々な条件を必要に応じて組み合わせることにより、様々なレベルのストリンジェンシーが達成される。好ましい態様において、ハイブリダイゼーションは、750mM NaCl、75mMクエン酸三ナトリウムおよび1％SDS中、30℃で実施される。より好ましい態様において、ハイブリダイゼーションは、500mM NaCl、50mMクエン酸三ナトリウム、1％SDS、35％ホルムアミドおよび100μg/ml変性サケ精子DNA（ssDNA）中、37℃で実施される。もっとも好ましい態様において、ハイブリダイゼーションは、250mM NaCl、25mMクエン酸三ナトリウム、1％SDS、50％ホルムアミドおよび200μg/ml ssDNA中、42℃で実施される。これらの条件に対する有用な変更が当業者には容易に理解されよう。
【００６７】
大部分の応用の場合、ハイブリダイゼーションに続く洗浄工程もまた、ストリンジェンシーにおいて異なる。洗浄ストリンジェンシー条件は、塩濃度および温度によって決めることができる。上記のように、洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度を下げることによって、または温度を上げることによって、高めることができる。たとえば、洗浄工程のためのストリンジェントな塩濃度は、好ましくは、約30mM NaClおよび3mMクエン酸三ナトリウム未満であり、もっとも好ましくは、約15mM NaClおよび1.5mMクエン酸三ナトリウム未満であろう。洗浄工程のためのストリンジェントな温度条件は通常、少なくとも約25℃、より好ましくは少なくとも約42℃、さらに好ましくは少なくとも約68℃を含む。好ましい態様において、洗浄工程は、30mM NaCl、3mMクエン酸三ナトリウムおよび0.1％SDS中、25℃で実施される。より好ましい態様において、洗浄工程は、15mM NaCl、1.5mMクエン酸三ナトリウムおよび0.1％SDS中、42℃で実施される。より好ましい態様において、洗浄工程は、15mM NaCl、1.5mMクエン酸三ナトリウムおよび0.1％SDS中、68℃で実施される。これらの条件に対するさらなる変更が当業者には容易に理解されよう。ハイブリダイゼーション技術は当業者に周知であり、たとえば、Benton and Davis（Science 196:180, 1977）；Grunstein and Hogness（Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975)；Ausubel et al.（Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001）；Berger and Kimmel（Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York）およびSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載されている。
【００６８】
「実質的に同一」とは、ポリペプチドまたは核酸分子が参照アミノ酸配列（たとえば、本明細書に記載されるアミノ酸配列のいずれか1つ）または核酸配列（たとえば、本明細書に記載される核酸配列のいずれか1つ）に対して少なくとも50％の同一性を示すことをいう。好ましくは、そのような配列は、比較に使用される配列に対してアミノ酸レベルまたは核酸において少なくとも60％、より好ましくは80％または85％、より好ましくは90％、95％、または99％同一である。
【００６９】
配列同一性は一般的に、配列分析ソフトウェア（たとえば、Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705、BLAST、BESTFIT、GAPまたはPILEUP/PRETTYBOXプログラム）を使用して計測される。そのようなソフトウェアは、様々な置換、欠失および／または他の修飾にホモロジー度を割り当てることにより、同一または類似の配列をマッチさせる。保存的置換は一般的に以下のグループ内の置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニンおよびフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を測定するための例示的手法においてはBLASTプログラムが使用され得、e-3〜e-100の間の確率スコアが、密接に関連する配列を示す。
【００７０】
「対象」とは、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、たとえばウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、またはネコをはじめとする哺乳動物をいう。
【００７１】
「導入遺伝子」とは、作為的に細胞に挿入され、その細胞から発生する生物のゲノムの一部となるDNAの任意のピースをいう。そのような導入遺伝子は、トランスジェニック生物にとって部分的または完全に異種（すなわち外因性）である遺伝子を含み得る、または生物の内在性遺伝子に相同な遺伝子を表し得る。
【００７２】
本明細書に提供される範囲は、範囲内の値のすべてのための省略表現であると理解されよう。たとえば、1〜50の範囲は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、または部分範囲を含むことが理解されよう。
【００７３】
本明細書において使用される用語「治療する」、「治療」などは、障害および／またはそれに伴う症状を軽減または改善することをいう。障害または状態の治療は、障害、状態またはそれに伴う症状が完全に解消されることを要求しない（除外はされないが）ということが理解されよう。
【００７４】
具体的に述べられない、または文脈から明白でない限り、本明細書において使用される用語「または」は包括的であると理解されよう。具体的に述べられない、または文脈から明白でない限り、「1つの」、「ある」、および「その」は単数でも複数でもあるということが理解されよう。
【００７５】
具体的に述べられない、または文脈から明白でない限り、本明細書において使用される用語「約」は、当技術分野における通常の許容範囲内、たとえば平均値の2標準偏差内と理解されよう。「約」は、述べられた値の10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、または0.01％以内と理解することができる。そうでないことが文脈から明白でない限り、本明細書に提供されるすべての数値は用語「約」によって修飾される。
【００７６】
本明細書における変数の任意の定義における化学的グループのリストの記載は、任意の1つのグループまたはリストされたグループの組み合わせとしての当該変数の定義を含む。本明細書における変数または局面に関する態様の記載は、任意の1つの態様としての当該態様または任意の他の態様もしくはその部分との組み合わせとしての当該態様を含む。
【００７７】
本明細書に提供される任意の組成物または方法は、本明細書に提供される他の組成物および方法のいずれの1つまたは複数と組み合わされることができる。
【００７８】
別段の定めがない限り、本明細書において使用されるすべての科学技術用語は、方法および物質組成が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等である方法および材料を方法および物質組成の実施または試験に使用することもできるが、適当な方法および材料が本明細書に記載される。加えて、材料、方法および例は例示でしかなく、限定的であることを意図したものではない。本明細書において挙げられるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】AAV9-PHP.B CMV-GFPを形質導入された感覚有毛細胞を示す。左パネルは、AAV9-PHP.B CMV-GFPを形質導入され、ファロイジン赤で染色された感覚有毛細胞の画像である。右パネルは、内有毛細胞の100％がベクターを吸収し、緑色蛍光タンパク質（GFP）に関して陽性であったことを示す、AAV9-PHP.B CMV-GFPを形質導入された感覚有毛細胞の画像である。
【図２】異なるマウスおよび注入からAAV9-PHP.B CMV-GFPを形質導入された有毛細胞の画像である。内有毛細胞の100％および外有毛細胞の100％が形質導入され、GFP陽性である。GFPを発現する他の細胞は非常に少ない。4匹のマウスの内耳に注入を実施した。4匹のマウスのうち3匹は、以下、本明細書に記載される発現に類似する発現を示し、感覚有毛細胞の100％が形質導入された。4匹目が図1に示されている。
【図３】異なるマウスからの高倍率画像を示す。この場合、組織を、Myo7aで染色して有毛細胞細胞体を強調し（青）、ファロイジンで染色して毛束を染色した（赤）。上パネルは、3つすべてのカラーチャネルの組み合わせを示す。中間パネルは、内有毛細胞の100％が形質導入され、外有毛細胞の100％が形質導入されたGFP（緑）発現を示す。下パネルはMyo7aおよびファロイジンを示す。
【図４】マウスを形質導入するために使用された注入部位を示す内耳のイラストである。「P0-P4」および「>P5」は、それぞれ、ポストヒアリングステージP0〜P4での注入およびP5よりも後のポストヒアリングステージでの注入を指す。
【図５Ａ】図5A〜5Dは、Anc80-Cmv-eGFPの卵形嚢および正円窓膜（RWM）注入を比較する。図5Aは、P1で卵形嚢注入によってAAV2/Anc80L65-GFPを形質導入された蝸牛頂の共焦点画像である。
【図５Ｂ】図5A〜5Dは、Anc80-Cmv-eGFPの卵形嚢および正円窓膜（RWM）注入を比較する。図5Bは、P1でRWM注入によってAAV2/Anc80L65-GFPを形質導入された蝸牛頂の共焦点画像である。図5Aのスケールバーは図5Bにも適用され、0.2mmを表す。
【図５Ｃ】図5A〜5Dは、Anc80-Cmv-eGFPの卵形嚢および正円窓膜（RWM）注入を比較する。図5Cは、P1で卵形嚢およびRWM注入によってAnc80-GFPを形質導入された蝸牛の頂端（上行）、中間（中間行）および基底（下行）領域からの一連の高倍率（630×）共焦点画像である。上行に示すスケールバーは20μmを表す。
【図５Ｄ】図5A〜5Dは、Anc80-Cmv-eGFPの卵形嚢および正円窓膜（RWM）注入を比較する。図5Dは、卵形嚢（左）およびRWM（右）注入後の画像断面からのeGFP陽性内有毛細胞（IHC）および外有毛細胞（OHC）の割合のグラフ比較である。
【図６Ａ】図6A〜6Dは、PHP.B-Cmv-eGFPの卵形嚢およびRWM注入を比較する。図6Aは、Ecole Polytechnique Federale de Lausanne（EPFL）で作製されたAAV.9PHP.B-Cmv-eGFPをP1で卵形嚢注入された後の蝸牛頂の共焦点画像である。図6Aのスケールバーは図6A〜6Cにも適用され、0.2mmを表す。
【図６Ｂ】図6A〜6Dは、PHP.B-Cmv-eGFPの卵形嚢およびRWM注入を比較する。図6Aは、ボストン小児病院（BCH）で調製されたAAV.9PHP.B-Cmv-eGFPをP1で卵形嚢注入された後の蝸牛頂の共焦点画像である。
【図６Ｃ】図6A〜6Dは、PHP.B-Cmv-eGFPの卵形嚢およびRWM注入を比較する。図6Cは、P1でAAV.9PHP.B-Cmv-eGFPをRWM注入された後の蝸牛頂の共焦点画像である。
【図６Ｄ】図6A〜6Dは、PHP.B-Cmv-eGFPの卵形嚢およびRWM注入を比較する。図6Dは、EPFLで調製されたPHP.B-Cmv-eGFPをP1でRWMまたは卵形嚢注入された後の蝸牛の頂端、中間および基底領域の一連の100μm共焦点画像（63×）である。
【図６Ｅ】図6A〜6Dは、PHP.B-Cmv-eGFPの卵形嚢およびRWM注入を比較する。図6Eは、AAV9.PHP.B-CMV-eGFPの卵形嚢およびRWM注入後のeGFP陽性内有毛細胞（IHC）および外有毛細胞（OHC）の割合のグラフ比較である。
【図７Ａ】図7A〜7Cは、PHP.BおよびAnc80の有毛細胞の形質導入効率を同じ力価（3.5 E+12ウイルスゲノム/mL）で比較する。図7Aは、PHP.Bアデノ随伴ベクター（AAV）の卵形嚢注入後の蝸牛頂の共焦点画像である。スケールバーは図7Aおよび7Bにも適用され、0.2mmを表す。
【図７Ｂ】図7A〜7Cは、PHP.BおよびAnc80の有毛細胞の形質導入効率を同じ力価（3.5 E+12ウイルスゲノム/mL）で比較する。図7Bは、Anc80 AAVの卵形嚢注入後の蝸牛頂の共焦点画像である。
【図７Ｃ】図7A〜7Cは、PHP.BおよびAnc80の有毛細胞の形質導入効率を同じ力価（3.5 E+12ウイルスゲノム/mL）で比較する。図7Cは、PHP.B AAV（左）およびAnc80 AAV（右）の卵形嚢注入後のeGFP陽性内有毛細胞（IHC）および外有毛細胞（OHC）の割合のグラフ比較である。
【図８】図8Aおよび8Bは、AAV9.PHP.BがAnc80よりも高い特異性を有することを示す。図8Aは、P1で卵形嚢を介してAnc80-Cmv-eGFP-WPREを注入され、P15で採取されたマウス蝸牛の一連の共焦点画像である。図8Aのスケールバーは図8Bにも適用され、100μmを表す。図8Bは、P1で卵形嚢を介してPHP.B-Cmv-eGFPを注入され、P15で採取されたマウス蝸牛の一連の共焦点画像である。
【図９Ａ】図9Aおよび9Bは、PHP.B-Cmv-eGFPが出生後期および成熟期で内耳有毛細胞を標的とすることを示す。図9Aは、P7およびP16でPHP.B-GFPを卵形嚢注入された後の蝸牛の頂端、中間および基底領域の一連の100μm共焦点画像（63×）である。図9Aの上行中の画像中に存在するスケールバーが図9A中の全画像に適用され、20μmを表す。
【図９Ｂ】図9Aおよび9Bは、PHP.B-Cmv-eGFPが出生後期および成熟期で内耳有毛細胞を標的とすることを示す。図9Bは、図9Aの画像から計数されたeGFP陽性内および外有毛細胞の割合のグラフ比較である。
【図１０Ａ】図10A〜10Cは、野生型マウスにおける有毛細胞トランスダクションがP1におけるAAV9-Php.b-CMV-GFPの注入によって影響されなかったことを示す。図10Aは、P7におけるGFP陽性外有毛細胞（右パネル）、P7におけるGFP陽性内有毛細胞およびP29におけるGFP陽性内有毛細胞から毛束の機械的変位によって誘発される感覚トランスダクション電流の代表的な電流ファミリーを示す一連のグラフである。
【図１０Ｂ】図10A〜10Cは、野生型マウスにおける有毛細胞トランスダクションがP1におけるAAV9-Php.b-CMV-GFPの注入によって影響されなかったことを示す。図10Bは、GFP陰性およびGFP陽性細胞の場合のP7外有毛細胞（OHC）からのトランスダクション電流の電流変位プロットである。
【図１０Ｃ】図10A〜10Cは、野生型マウスにおける有毛細胞トランスダクションがP1におけるAAV9-Php.b-CMV-GFPの注入によって影響されなかったことを示す。図10Cは、振幅においてWT細胞と類似するGFP陽性細胞からのピークトランスダクション電流を示すチャートである（Landegger et al., Nat. Biotech, 2017）。
【図１１Ａ】図11A〜11Cは、聴性脳幹反応（ABR）および歪成分耳音響放射（DPOAE）閾値がP1、P7およびP16におけるPHP.B-Cmv-eGFPの注入によって影響されなかったことを示す。図11は、非注入WTマウス（黒い点線）およびP1（図11A）、P7（図11B）またはP16（図11C）でAnc80-Cmv-eGFP（淡いグレー）またはAAV9-Php.b-Cmv-eGFP（濃いグレー）を注入された後のWTマウスの場合に約P30で計測されたABRおよびDPOAE閾値を示すグラフのパネルを示す。
【図１１Ｂ】図11Aの説明を参照のこと。
【図１１Ｃ】図11Aの説明を参照のこと。
【図１２】図12Aおよび12Bは、P1、P7およびP16で注入されたPHP.B-Cmv-eGFPが、前庭有毛細胞中、Anc80-Cmv-eGFPよりも高い形質導入率を有することを示す。図8Aは、P1、P7およびP16でPHP.B-Cmv-eGFP（上行）およびAnc80-Cmv-eGFP（下行）を卵形嚢注入された後の卵形嚢ならびに水平稜および前稜の一連の共焦点画像である。図8Bは、P1、P7およびP16でPHP.B-Cmv-eGFP（上行）およびAnc80-Cmv-eGFP（下行）を卵形嚢注入された後の球形嚢の一連の共焦点画像である。図8Aのスケールバーがすべての画像に適用され、100μmを表す。
【図１３】P1、P7およびP16でPHP.B-Cmv-eGFP（上行）およびAnc80-Cmv-eGFP（下行）を卵形嚢注入された後の前庭形質導入を比較する一連の画像である。第一のパネルのスケールバーがすべてのパネルに適用され、100μmを表す。
【図１４】eGFP発現を駆動するベクターを卵形嚢を介して注入されたマウスの前庭凍結切片を示す一連の共焦点画像である。第一のパネルのスケールバーがすべてのパネルに適用され、200μmを表す。
【図１５】P1でPHP.B-Syn-eGFPを卵形嚢を介して注入されたC57マウスの蝸牛凍結切片（上行、スケールバーは100μmを表す）、前庭凍結切片（中間行、スケールバーは200μmを表す）およびホールマウント切片（下行、スケールバーは100μmを表す）の一連の共焦点画像である。
【図１６Ａ】図16Aおよび16Bは、AAV9-PHP.B-Cmv-TMC1がTMC1変異体マウスにおいて聴覚機能を回復させることを示す。図16Aは、聴性脳幹反応（ABR）閾値がAAV1-CMV-TMC1またはAnc80-CMV-TMC1のそれよりも優れていたことを示すグラフである。1つのトレース（エラーバーなし）は、PHP.B-CMV-TMC1を形質導入され、野生型（WT）に類似する閾値を示した。
【図１６Ｂ】図16Aおよび16Bは、AAV9-PHP.B-Cmv-TMC1がTMC1変異体マウスにおいて聴覚機能を回復させることを示す。図16Bは、AAV9-PHP.B-Cmv-Tmc1を注入された5匹のマウスの場合の歪成分耳音響放射（DPOAE）閾値を示すグラフである。
【図１７】図17A〜17Dは、内耳中で導入遺伝子の発現を駆動する様々なプロモーターの能力を示す。図17Aは、内および外有毛細胞中で導入遺伝子発現を駆動するPcdh15プロモーターの能力を示す一連の共焦点画像である。図17Bは、内および外有毛細胞中で導入遺伝子発現を駆動するMyo6プロモーターの能力を示す共焦点画像である。図17Cは、内および外有毛細胞中で発現を駆動するMyo7aプロモーターの能力を示す画像である。図17Dは、特に外有毛細胞中で導入遺伝子発現を駆動するKCNQ4プロモーターの能力を示す一連の画像である。
【発明を実施するための形態】
【００８０】
詳細な説明
本発明は、聴覚および／または前庭機能を含むメカノセンセーションに必要なタンパク質（たとえばTMC1、TMC2、MYO7A、USCH1C、CDH23、PCDH15、SANS、CIB2、USH2A、VLGR1、WHRN、CLRN1、PDZD7、KCNQ4、TMPRSS3、STRC、EYA4、USH1C（たとえばハーモニンa、bまたはc）、OTOF、GPR98、MYO6、MYO15A、LOXHD1、POU3F4、EYA1、WFS1、ACTG1、TMIE、PJVK、SYNE4およびFAM65B）を、当該タンパク質のレベルまたは活性の損失または低下を有する対象の内耳の細胞、たとえば蝸牛細胞（たとえば内または外有毛細胞）中に送達し、発現させるための組成物および方法を提供する。
【００８１】
本発明は、少なくとも部分的に、7量体配列TLAVPFKを含むカプシドをコードするアデノ随伴ウイルスベクターAAV-PHP.Bが、内耳の内および外有毛細胞中で関心対象のタンパク質を発現させるのにきわめて効率的かつ特異的であるという発見に基づく。
【００８２】
AAV-PHP.B
AAV-PHP.Bベクターは、既定のCre発現性標的細胞集団（CREATEとも呼ばれる）を形質導入するカプシドを選択的に回収するためのCre組換え依存手法を使用して作製したものである。本発明の方法において有用なこの手法およびベクターは、Deverman et al., "Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain,” Nat Biotechnol. 2016 February; 34(2): 204-209および米国特許出願公開第20170166926号に記載されている。いずれも全体として参照により本明細書に組み入れられる。ランダム化配列（7量体）の7つのアミノ酸（AA）をAAV9カプシドのAA588とAA589との間（VP1位置）に挿入することにより、AAVバリアントのライブラリーを作製した。AAV-PHP.Bは7量体配列TLAVPFKをコードし、これを、蝸牛への効率的な導入遺伝子送達に関して試験すると、内および外有毛細胞中で著しく特異的かつロバストな発現が示された。
【００８３】
アッシャー症候群
ヒトアッシャー症候群（USH）は、盲聾の原因である希な遺伝子疾患である。常染色体劣性形質として遺伝し、米国において16,000〜20,000人を冒し、幼児期難聴の3〜6％の原因である。アッシャー症候群は、症状の重度にしたがって3つの臨床亜型（USH-1、2、および3）に分類される。USH1が最重症型である。USH1に冒された患者は、先天性の両側性重度感音性聴力喪失、前庭反射消失、および思春期前の網膜色素変性症（網膜の桿体および錐体機能の進行性両側性対称性縮退）を病む。人工内耳を装着しない限り、個体は一般的に発声能力を発達させない。現在、アッシャー患者のための生物学的治療は存在しないが、欠陥遺伝子の野生型形態の早期再導入が疾患の好転を許し得る。
【００８４】
6つのアッシャー遺伝子：MYO7A（ミオシン7a）、USH1C（ハーモニン）、CDH23（カドヘリン23）、PCDH15（プロトカドヘリン15）、SANS（sans）、およびCIB2（カルシウムおよびインテグリン結合タンパク質2）がUSH1と関連している。これらの遺伝子は、内耳中の毛束形態形成に関与し、インタラクトームの一部であるタンパク質をコードする（たとえば、Mathur & Yang, 2015, Biochim. Biophys. Acta, 1852:406-20を参照）。ハーモニンはUSH1インタラクトームの中心に存在し、そこで他のUsher1タンパク質に結合する。そのPDZ（PSD-59 95/Dlg/ZO-1）相互作用ドメインのために、ハーモニンは、足場タンパク質として機能することが提唱されてきた。インビトロの結合研究により、すべての他の既知のUSH1タンパク質が、USH2タンパク質の2つであるUsherinおよびVLGR1と同様、ハーモニンのPDZドメインに結合することを示した。USH1C遺伝子は28のエクソンからなり、これらのエクソンは、タンパク質のドメイン組成に依存して3つの異なるサブクラス（a、b、およびc）に分類される、ハーモニンの10種のオルタナティブスプライス形態をコードする。3つのアイソフォームは、PDZタンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、コイルドコイル（CC）ドメイン、およびプロリン−セリン−トレオニン（PST）リッチドメインの数において異なる。
【００８５】
USH1タンパク質は、多数の細胞外リンクによって相互接続された何百もの不動毛で構成されているメカノセンセーション毛束中の有毛細胞の頂端に局在化している。カドヘリン23およびプロトカドヘリン15は、Usher遺伝子（それぞれUSH1DおよびUSH1E）の産物であり、不動毛の遠位端に位置する感覚糸を形成する。ハーモニンbは、CDH23、PCDH15、Fアクチンおよびそれ自体に結合する。これは、有毛細胞の感覚糸挿入点の近くの不動毛の先端に見られ、そこで、有毛細胞中のトランスダクションおよび順応において機能的役割を演じると考えられている。ハーモニンbは出生後早期に発現するが、その発現は、蝸牛および前庭の両方において出生後30日（P30）ごろに減少する。ハーモニンaもまた、カドヘリン23に結合し、不動毛中に見られる。最近の報告がシナプスにおけるハーモニンaのさらなる役割（Cav1.3 Ca2＋チャネルと会合して、ユビキチン依存性経路を介するチャネル利用可能性を制限する）を明らかにした。
【００８６】
アッシャー症候群のいくつかのマウスモデルが過去10年にわたり同定または操作され、そのうちの7つはハーモニンに影響を及ぼす。これらのうち、1つのモデル、Ush1c c.216G＞Aモデルだけが、ヒトアッシャー症候群を特徴づける聴覚および網膜両方の異常を再現する。Ush1c c.216G＞Aは、フランス系アカディア人USH1C患者のコホートにおいて見られるものに類似する点変異のせいで、すべての従来のハーモニンアイソフォームの発現に影響するノックインマウスモデルである。変異は、Ush1c遺伝子のエクソン3の端部に隠れたスプライス部位を導入する。この隠れたスプライス部位の使用が、35bp欠失を有するフレームシフト転写産物を生成し、PDZ、PST、およびCCドメインを欠く重度に切断されたタンパク質の翻訳を生じさせる。ホモ接合型c.216AAノックインマウスは1月齢で重度の聴力喪失をこうむるが、ヘテロ接合型c.216GAマウスは任意の異常な表現型を呈しない。c.216AAマウスにおける蝸牛組織診は、P30で、中および基底回転中、崩壊した毛束、異常な細胞列ならびに内および外両方の有毛細胞の損失を示す。
【００８７】
AAV9-PHP.Bベクターは、有毛細胞に成功裏に形質導入し、有毛細胞内で関心対象のタンパク質（すなわちGFP）を発現させたことが、本明細書において実証される。従って、このベクターを用いて、アッシャー症候群および他の聴覚障害の治療のために、関心対象の他のタンパク質を有毛細胞に送達することができる。
【００８８】
TMC1/TMC2
難聴を生じさせる40を超える異なる変異がTMC1において同定されている。これらは、35の劣性変異および5つの優性変異へと細分される。劣性変異の大多数は重度の先天性聴力喪失を生じさせるが（たとえばDFNB7/11）、少数は晩期発症型の中〜重度の聴力喪失を生じさせる。優性変異のすべてが、十代半ばに発症する、進行性の聴力喪失を生じさせる（たとえばDFNA36）。特に、本明細書に記載されるAAV9-PHP.Bベクターは、非変異体（たとえば野生型）TMC1配列またはTMC2配列を送達し、それによって、聴力喪失（たとえば、さらなる聴力喪失）を予防する、および／または聴覚機能を回復させるために使用することができる。
【００８９】
聴力喪失の治療のための治療戦略
成体哺乳動物蝸牛の感覚細胞は自己修復能力を欠くため、現在の治療戦略（障害のレベルおよび正確な位置に依存する）は、増幅（補聴器）、より良い音声伝達（中耳プロテーゼ／アクティブインプラント）または直接神経刺激（人工内耳）に依存して、聴覚神経を形成し、音響情報を脳へと中継する一次感覚有毛細胞またはらせん神経節ニューロンへの永久的損傷を補償する。これらの手法は変革的であったが、現代生活にとって重要な複雑なヒト聴覚機能の回復においては依然、最適からはほど遠い。特に、主な問題はさらに、限られた周波数感度、不自然な音声知覚および騒がしい環境における限られた語音弁別を含む。
【００９０】
蝸牛への治療的遺伝子導入が、加齢性および環境誘発性の聴力喪失から遺伝的な難聴形態に及ぶ現在の標準的治療をさらに改善すると考えられてきた。300を超える遺伝子座が、記載された70を超える原因遺伝子による遺伝性聴力喪失と関連付けられている（Parker & Bitner-Glindzicz, 2015, Arch. Dis. Childhood, 100:271-8）。これらの手法における治療の成功は、蝸牛中のコルチ器中の関連する治療標的細胞への外因性遺伝子構築物の安全かつ効率的な送達に有意に依存する。
【００９１】
コルチ器は、2つのクラスの感覚有毛細胞：音によって運ばれた機械的情報を、ニューロン構造に伝達される電気シグナルへと変換する内有毛細胞；および蝸牛反応を増幅し、調整する（複雑な聴覚機能に必要なプロセス）ように働く外有毛細胞を含む。内耳中の他の潜在的標的は、らせん神経節ニューロン、らせん板縁の円柱細胞を含み、これらは、隣接する蓋膜または支持細胞（保護機能を有し、早期新生児期までに有毛細胞へと分化転換するように誘発されることができる）の維持に重要である。
【００９２】
高カリウム内リンパ液で満たされている蝸牛管への注入が有毛細胞への直接アクセスを提供することができる。しかし、この精巧な流体環境への変更は、蝸牛内電位を乱して、注入関連毒性のリスクを高めるおそれがある。蝸牛管、鼓室階、および前庭階を包囲する外リンパで満たされた空間は、中耳から、前庭窓膜または正円窓膜のいずれかを通してアクセスすることができる。内耳に通じる唯一の非骨質開口部である正円窓膜は、多くの動物モデルにおいて比較的容易にアクセス可能であり、この経路を使用するウイルスベクターの投与は良好に忍容される。ヒトにおいて、人工内耳の配置は慣例的に、RWMに通す外科的電極挿入に依存する。
【００９３】
器官型蝸牛外植片およびインビボ内耳注入においてAAV血清型を評価した以前の研究は、遺伝性難聴のマウスモデルにおいて部分的にのみ聴力のレスキューを生じさせている。予想外に、AAV9-PHP.Bベクターが高い効率で有毛細胞を形質導入した。この知見は、従来のAAV血清型を使用する蝸牛遺伝子療法の開発の成功を制限してきた低い形質導入効率を克服する。本明細書に記載されるAAV9-PHP.Bベクターは、内および外有毛細胞ならびに遺伝的な聴覚および平衡障害によって損なわれる他の様々な内耳細胞型への内耳遺伝子送達のための貴重なプラットフォームを提供する。
【００９４】
AAV9-PHP.Bベクターは、関心対象のタンパク質をコードする核酸の高効率送達を提供する。特に、本発明は、以下のプロモーターの1つを含むAAV9-PHP.Bベクターを提供する：Espinプロモーター、PCDH15プロモーター、PTPRQプロモーター、Myo6プロモーター、KCNQ4プロモーター、Myo7aプロモーター、シナプシンプロモーター、GFAPプロモーター、CMVプロモーター、CAGプロモーター、CBHプロモーター、CBAプロモーター、U6プロモーターまたはTMHS（LHFPL5）プロモーター。特定の態様において、プロモーターは、細胞、特に内耳内、たとえば蝸牛中の細胞（または蝸牛中の細胞もしく蝸牛細胞）への、TMC1、TMC2、MYO7A、USCH1C、CDH23、PCDH15、SANS、CIB2、USH2A、VLGR1、WHRN、CLRN1、PDZD7、KCNQ4、TMPRSS3、STRC、EYA4、USH1C（たとえばハーモニンa、bまたはc）OTOF、GPR98、MYO6、MYO15A、LOXHD1、POU3F4、EYA1、WFS1、ACTG1、TMIE、PJVK、SYNE4およびFAM65Bの1つまたは複数をコードするポリヌクレオチドの発現を指示する。本明細書において使用される内耳細胞とは、非限定的に、内有毛細胞（IHC）、外有毛細胞（OHC）、らせん神経節ニューロン、血管条、前庭有毛細胞、前庭神経節ニューロンおよび支持細胞をいう。支持細胞とは、興奮性ではない耳の中の細胞、たとえば、有毛細胞またはニューロンではない細胞をいう。支持細胞の一例がシュワン細胞である。
【００９５】
本明細書に記載される核酸の1つまたは複数の、内耳細胞への送達は、通常は部分的聴力損失または完全聴覚消失によって定義される、任意の数の遺伝性または後天性聴覚障害を治療するために使用することができる。本明細書に記載される方法は、聴覚障害、たとえば非限定的に、劣性難聴、優性難聴、アッシャー症候群および他の症候群性難聴ならびに外傷または加齢による聴力損失を治療するために使用することができる。
【００９６】
特定の導入遺伝子を保有するウイルスを作製する方法
本明細書に記載されるように、AAV-PHP.Bベクターは、核酸（たとえば、TMC1、TMC2、MYO7A、USCH1C、CDH23、PCDH15、SANS、CIB2、USH2A、VLGR1、WHRN、CLRN1、PDZD7、KCNQ4、TMPRSS3、STRC、EYA4、USH1C（たとえばハーモニンa、bまたはc）の1つまたは複数をコードするポリヌクレオチドをはじめとする導入遺伝子）を内耳細胞に送達する場合に特に効率的である。AAV-PHP.Bベクターは、好都合にも、内または外有毛細胞の約60％、70％、80％、90％、95％超または100％を形質導入した。
【００９７】
特定の態様において、AAV-PHP.Bベクターは、有毛細胞のための天然の、または操作された向性を有する。いくつかの態様において、AAV9-php.bは、導入遺伝子（たとえば、TMC1、TMC2、MYO7A、USCH1C、CDH23、PCDH15、SANS、CIB2、USH2A、VLGR1、WHRN、CLRN1、PDZD7、KCNQ4、TMPRSS3、STRC、EYA4、USH1C（たとえばハーモニンa、bまたはc）、OTOF、GPR98、MYO6、MYO15A、LOXHD1、POU3F4、EYA1、WFS1、ACTG1、TMIE、PJVK、SYNE4およびFAM65Bの1つまたは複数をコードするポリヌクレオチド）を対象の内耳に送達する。
【００９８】
1つの態様においては、TMC1、TMC2、MYO7A、CDH23、PCDH15、SANS、CIB2、USH2A、VLGR1、WHRN、CLRN1、PDZD7、KCNQ4、TMPRSS3、STRC、EYA4、USH1C（たとえばハーモニンa、bまたはc）、OTOF、GPR98、MYO6、MYO15A、LOXHD1、POU3F4、EYA1、WFS1、ACTG1、TMIE、PJVK、SYNE4およびFAM65Bの1つまたは複数をコードするポリヌクレオチドの発現を指示するプロモーター（たとえばEspinプロモーター、PCDH15プロモーター、PTPRQプロモーター、Myo6プロモーター、KCNQ4プロモーター、Myo7aプロモーター、シナプシンプロモーター、GFAPプロモーター、CMVプロモーター、CAGプロモーター、CBHプロモーター、CBAプロモーター、U6プロモーターおよびTMHS（LHFPL5）プロモーター）を含むAAV-PHP.Bベクターが、聴覚障害を治療するために使用される。発現のために細胞に送達される核酸配列はしばしば導入遺伝子と呼ばれる。内耳細胞に送達され、その中で発現することができる代表的な導入遺伝子は、非限定的に、聴覚および／または前庭メカノセンセーションにおいて機能するポリペプチド（たとえばTMC1、TMC2、MYO7A、USCH1C、CDH23、PCDH15、SANS、CIB2、USH2A、VLGR1、WHRN、CLRN1、PDZD7（たとえばハーモニンa、bまたはc）、OTOF、GPR98、MYO6、MYO15A、LOXHD1、POU3F4、EYA1、WFS1、ACTG1、TMIE、PJVK、SYNE4およびFAM65B）、KCNQ4、TMPRSS3、STRC、EYA4をコードする導入遺伝子、神経栄養因子（たとえばGDNV、BDNFまたはHSP70）をコードする導入遺伝子を含む。
【００９９】
導入遺伝子の発現は、その導入遺伝子の天然のプロモーター（すなわち、トランスジェニックコード配列とともに天然に見られるプロモーター）によって、または異種プロモーター（たとえばEspinプロモーター、PCDH15プロモーター、PTPRQプロモーター、Myo6プロモーター、KCNQ4プロモーター、Myo7aプロモーター、シナプシンプロモーター、GFAPプロモーター、CMVプロモーター、CAGプロモーター、CBHプロモーター、CBAプロモーター、U6プロモーターおよびTMHS（LHFPL5）プロモーター）によって指示され得る。たとえば、本明細書に記載される導入遺伝子はいずれも、その天然のプロモーターとともに使用されることができる。または、本明細書に記載される導入遺伝子はいずれも異種プロモーターとともに使用されることもできる。本明細書において使用される異種プロモーターとは、その配列の発現を自然には指示しない（すなわち、自然界においてその配列とともに見られない）プロモーターをいう。本明細書に示される導入遺伝子のいずれかの発現を指示するために使用することができる代表的な異種プロモーターは、たとえば、CMVプロモーター、CBAプロモーター、CASIプロモーター、PプロモーターおよびEF-1プロモーター、アルファ9ニコチン受容体プロモーター、プレスチンプロモーター、Gfi1プロモーターおよびVglut3プロモーターを含む。加えて、上記導入遺伝子の1つの発現を自然に指示するプロモーター（たとえばKCNQ4プロモーター、Myo7aプロモーター、Myo6プロモーターまたはAtoh1プロモーター）を、導入遺伝子の発現を指示するための異種プロモーターとして使用することもできる。他の態様において、プロモーターは、Espinプロモーター、PCDH15プロモーター、PTPRQプロモーター、Myo6プロモーター、KCNQ4プロモーター、Myo7aプロモーター、シナプシンプロモーター、GFAPプロモーター、CMVプロモーター、CAGプロモーター、CBHプロモーター、CBAプロモーター、U6プロモーターまたはTMHS（LHFPL5）プロモーターである。
【０１００】
AAV-PHP.Bベクター中にパッケージングするための導入遺伝子（たとえばTMC1、TMC2、USH1C（たとえばハーモニンa、bまたはc）、MYO7A、USCH1C、CDH23、PCDH15、SANS、CIB2、USH2A、VLGR1、WHRN、CLRN1、PDZD7、KCNQ4、TMPRSS3、STRC、EYA4）を作製する方法は当技術分野において公知であり、従来の分子生物学および組換え核酸技術を利用する。
【０１０１】
導入遺伝子は、たとえば、パッケージング宿主細胞を使用して、AAV-PHP.Bベクター中にパッケージングすることができる。本明細書に記載される1つまたは複数の構築物を使用して、ウイルス粒子の構成要素（たとえばrep配列、cap配列、逆位末端反復（ITR）配列）を一時的または安定的にパッケージング宿主細胞に導入することができる。
【０１０２】
概して、本明細書において使用される「核酸」は、DNAおよびRNAを含むことができ、1つまたは複数のヌクレオチド類似体または骨格修飾を含む核酸をも含むことができる。核酸は、通常はその所期の用途に依存して、一本鎖または二本鎖であることができる。本明細書に記載される方法に使用することができる核酸は、既知の核酸配列と同一であることもできるし、そのような既知の配列とは配列において異なることもできる。単に実例として、核酸（またはコードされるポリペプチド）は、既知の配列に対して少なくとも75％の配列同一性（たとえば、少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性）を有することができる。
【０１０３】
配列同一性％値を計算する際、2つの配列をアラインメントし、2つの配列の間でのヌクレオチドまたはアミノ酸残基の完全な一致の数を決定する。完全な一致の数をアラインメントされた領域の長さ（すなわち、アラインメントされたヌクレオチドまたはアミノ酸残基の数）で割り、100を掛けて、配列同一性％値を求める。アラインメントされた領域の長さが、最短の配列の完全長サイズまでの、一方または両方の配列の部分であることができることが理解されよう。また、1つの配列を、複数の他の配列に対してアラインメントすることができ、したがって、アラインメントされた各領域の間で異なる配列同一性％値を有することができることが理解されよう。
【０１０４】
配列同一性％値を決定するための2つ以上の配列のアラインメントは、コンピュータプログラムClustalWおよびデフォルトパラメータを使用して実施され、これは、核酸またはポリペプチド配列のアラインメントをその長さ全体で実施することを可能にする（グローバルアラインメント）。Chenna et al., 2003, Nucleic Acids Res., 31(13):3497-500。ClustalWは、クエリーと1つまたは複数の対象配列との間のベストマッチを計算し、それらをアラインメントして、同一性、類似性、および差が決定されるようにする。配列アラインメントを最大化するために、1つまたは複数の残基のギャップをクエリー配列、対象配列または両方に挿入することができる。核酸配列のペアワイズアラインメントの場合には、デフォルトパラメータを使用し（すなわち、ワードサイズ：2；ウィンドウサイズ：4；スコアリング法：％値；トップダイアゴナルの数：4；およびギャップペナルティ：5）；多重核酸配列のアラインメントの場合には、以下のパラメータ：ギャップ開始ペナルティ：10.0；ギャップ伸長ペナルティ：5.0；およびウエイトトランジション：あり、を使用する。ポリペプチド配列のペアワイズアラインメントの場合には、以下のパラメータ：ワードサイズ：1；ウィンドウサイズ：5；スコアリング法：％値；トップダイアゴナルの数：5およびギャップペナルティ：3、を使用する。ポリペプチド配列の多重アラインメントの場合には、以下のパラメータ：ウエイトマトリックス：BLOSUM（blocks substitution matrix）；ギャップ開始ペナルティ：10.0；ギャップ伸長ペナルティ：0.05；親水性ギャップ：オン；疎水性残基：Gly、Pro、Ser、Asn、Asp、Gln、Glu、ArgおよびLys；ならびに残基特異的ギャップペナルティ：オン、を使用する。ClustalWは、たとえば、World Wide Web上、Baylor College of Medicine Search LauncherウエブサイトまたはEuropean Bioinformatics Instituteウエブサイトで実行することができる。
【０１０５】
核酸配列に変更を導入することができ、それが、その核酸配列がコード配列である場合には、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列の変更をもたらすことができる。たとえば、変更は、変異誘発（たとえば部位特異的変異誘発、PCR媒介変異誘発）を使用することによって、またはそのような変更を有する核酸分子を化学合成することによって、核酸コード配列に導入することができる。そのような核酸変更は、1つまたは複数のアミノ酸残基における保存的および／または非保存的アミノ酸置換を招くことができる。「保存的アミノ酸置換」とは、1つのアミノ酸残基が、類似する側鎖を有する異なるアミノ酸残基で置換されることであり（たとえば、アミノ酸置換の頻度表を提供する、Dayhoffら（1978, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(Suppl. 3):345-352）を参照）、非保存的置換とは、アミノ酸残基が、類似する側鎖を有しないアミノ酸残基で置換されることである。
【０１０６】
核酸は、ベクターまたはプラスミドとも呼ばれ得る構築物内に含めることができる。構築物は、市販されてもいるし、当技術分野において慣例的な組換え技術によって作製することもできる。核酸を含有する構築物は、そのような核酸の発現を誘導および／または調節する発現エレメントを有することができ、また、構築物を維持するための配列（たとえば複製起点、選択マーカー）などの配列を含むこともできる。発現エレメントは、当技術分野において公知であり、たとえば、プロモーター、イントロン、エンハンサー配列、応答エレメントまたは誘導エレメントを含む。
【０１０７】
薬学的組成物
通常は生理学的に適合性の賦形剤中に懸濁した、プロモーター（たとえばEspinプロモーター、PCDH15プロモーター、PTPRQプロモーター、Myo6プロモーター、KCNQ4プロモーター、Myo7aプロモーター、シナプシンプロモーター、GFAPプロモーター、CMVプロモーター、CAGプロモーター、CBHプロモーター、CBAプロモーター、U6プロモーターおよびTMHS（LHFPL5）プロモーター）と、USH1、MYO7A、USH1C（ハーモニンa、b、c）、CDH23、PCDH15、SANSおよびCIB2の1つまたは複数であるポリヌクレオチドとを含むAAV-PHP.Bベクターは、正円窓または卵形嚢を通して対象の内耳に注入することにより、対象（たとえばヒトまたは非ヒト哺乳動物）に投与することができる。適当な担体は、多様な緩衝溶液（たとえばリン酸緩衝生理食塩水）、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチンおよび水とで調合され得る生理食塩水を含む。AAV-PHP.Bベクターは、細胞を形質導入し、または感染させ、過度な有害作用なしで治療的利益を提供するのに十分なレベルの遺伝子導入および発現を提供するのに十分な量で投与される。
【０１０８】
対象に投与されるAAV-PHP.Bベクターの用量は、主に、治療される病気ならびに対象の年齢、体重および健康状態などの要因に依存する。たとえば、ヒト対象に投与されるAAV-PHP.Bベクターの治療有効用量は一般に、AAVのゲノムコピー（GC）約1×101〜1×1012個（たとえばGC約1×103〜1×109個）の濃度を含む溶液約0.1ml〜約10mlの範囲である。
【０１０９】
核酸を内耳細胞に送達する方法
核酸を細胞に送達する方法は一般に当技術分野において公知であり、導入遺伝子を含有するウイルス（ウイルス粒子と呼ぶこともできる）をインビボで内耳細胞に送達する方法が本明細書に記載されている。本明細書に記載されるように、約108〜約1012個のウイルス粒子を対象に投与することができ、ウイルスは、適当な量（たとえば10μL、50μL、100μL、500μLまたは1000μL）の、たとえば人工外リンパ液内に懸濁させることができる。
【０１１０】
本明細書に記載される、プロモーター（たとえばEspinプロモーター、PCDH15プロモーター、PTPRQプロモーター、Myo6プロモーター、KCNQ4プロモーター、Myo7aプロモーター、シナプシンプロモーター、GFAPプロモーター、CMVプロモーター、CAGプロモーター、CBHプロモーター、CBAプロモーター、U6プロモーターおよびTMHS（LHFPL5）プロモーター）と、導入遺伝子（たとえばTMC1、TMC2、USH1C（たとえばハーモニンa、bまたはc）、MYO7A、USCH1C、CDH23、PCDH15、SANS、CIB2、USH2A、VLGR1、WHRN、CLRN1、PDZD7、KCNQ4、TMPRSS3、STRC、EYA4、OTOF、GPR98、MYO6、MYO15A、LOXHD1、POU3F4、EYA1、WFS1、ACTG1、TMIE、PJVK、SYNE4およびFAM65B）とを含有するウイルスは、任意の数の手段を使用して内耳細胞（たとえば蝸牛中の細胞）に送達することができる。たとえば、本明細書に記載される1つまたは複数の異なるタイプの導入遺伝子を含有するウイルス粒子を含む治療有効量の組成物を、一般的には比較的簡単な（たとえば外来）処置で、正円窓もしくは卵円窓または卵形嚢に通して注入することができる。いくつかの態様においては、本明細書に記載される、導入遺伝子を含有する治療有効数のウイルス粒子を含む、または異なるウイルス粒子の1つまたは複数のセットを含有する（セット中の各粒子は同じタイプの導入遺伝子を含有することができるが、粒子の各セットは他のセットとは異なるタイプの導入遺伝子を含有する）組成物を、外科手術（たとえばコクレオストミーまたはカナロストミー）中に耳内の適切な位置に送達することができる。
【０１１１】
1つの態様においては、プロモーター（たとえばEspinプロモーター、PCDH15プロモーター、PTPRQプロモーター、Myo6プロモーター、KCNQ4プロモーター、Myo7aプロモーター、シナプシンプロモーター、GFAPプロモーター、CMVプロモーター、CAGプロモーター、CBHプロモーター、CBAプロモーター、U6プロモーターまたはTMHS（LHFPL5）プロモーター）と、USH1、MYO7A、USH1C（ハーモニンa、b、c）、CDH23、PCDH15、SANSおよびCIB2の1つまたは複数であるポリヌクレオチドとを含むAAV-PHP.Bベクターを、それを必要とする対象の正円窓または卵形嚢に通して注入する。
【０１１２】
加えて、鼓膜を通過する、および／または正円窓もしくは卵形嚢を通る作用物質の移入を容易にする送達ビヒクル（たとえばポリマー）が利用可能であり、任意のそのような送達ビヒクルを、本明細書に記載されるウイルスを送達するために使用することができる。たとえば、Arnold et al., 2005, Audiol. Neurootol., 10:53-63を参照すること。
【０１１３】
本明細書に記載される組成物および方法は、内耳細胞、たとえば蝸牛細胞への核酸の高効率送達を可能にする。たとえば、本明細書に記載される組成物および方法は、内有毛細胞の少なくとも80％（たとえば少なくとも85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99％）への導入遺伝子の送達およびその中での発現または外有毛細胞の少なくとも80％（たとえば少なくとも85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99％）への導入遺伝子の送達およびその中での発現を可能にする。
【０１１４】
本明細書において実証されるように、AAV-PHP.Bベクターを使用して送達された導入遺伝子の発現は、内有毛細胞（IHC）、外有毛細胞（OHC）、らせん神経節ニューロン、血管条、前庭有毛細胞、および／または前庭神経節ニューロン（たとえばAtoh1、NF2）の再生を生じさせて、聴覚または前庭機能が長期間（たとえば数ヶ月、数年、数十年間、一生涯）回復されるようにすることができる。
【０１１５】
キット
本発明はまた、プロモーター（たとえばEspinプロモーター、PCDH15プロモーター、PTPRQプロモーター、Myo6プロモーター、KCNQ4プロモーター、Myo7aプロモーター、シナプシンプロモーター、GFAPプロモーター、CMVプロモーター、CAGプロモーター、CBHプロモーター、CBAプロモーター、U6プロモーターおよびTMHS（LHFPL5）プロモーター）と、USH1、MYO7A、USH1C（ハーモニンa、b、c）、CDH23、PCDH15、SANSおよびCIB2の1つまたは複数であるポリヌクレオチドとを含むAAV-PHP.Bベクターを含む、本発明の薬学的組成物の成分の1つまたは複数で満たされた1つまたは複数の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。このような容器には、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知が添付されることができ、この通知は、ヒトへの投与に関する製造、使用または販売の、当該機関による承認を反映する。
【０１１６】
本発明はまた、聴覚および／または前庭メカノセンセーションの異常と関連する疾患または障害（またはそれらの症状）の治療または予防のためのキットを提供する。1つの態様において、キットは、プロモーター（たとえばEspinプロモーター、PCDH15プロモーター、PTPRQプロモーター、Myo6プロモーター、KCNQ4プロモーター、Myo7aプロモーター、シナプシンプロモーター、GFAPプロモーター、CMVプロモーター、CAGプロモーター、CBHプロモーター、CBAプロモーター、U6プロモーターおよびTMHS（LHFPL5）プロモーター）と、USH1、MYO7A、USH1C（ハーモニンa、b、c）、CDH23、PCDH15、SANSおよびCIB2の1つまたは複数であるポリヌクレオチドとを含む、単位剤形にある有効量のAAV-PHP.Bベクターを、聴覚障害を伴う疾患もしくは障害またはその症状を病む、またはそれを罹患しやすい対象にAAV-PHP.Bベクターを投与するための指示書とともに含む。好ましい態様において、キットは、AAV-PHP.Bベクターを収容する無菌容器を含み；そのような容器は、箱、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、パウチ、ブリスタパックまたは当技術分野において公知の他の適当な容器であることができる。そのような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔または薬剤を保持するのに適した他の材料でできていることができる。指示書は一般に、聴覚障害を伴う疾患もしくは障害またはその症状の治療のためのAAV-PHP.Bベクターの使用に関する情報を含む。指示書は、容器（存在する場合）に直接印刷されてもよいし、容器に貼り付けられるラベルとして提供されてもよいし、容器中に提供される、または容器とともに提供される別個のシート、パンフレット、カードまたはフォルダとして提供されてもよい。
【０１１７】
当業者の技能の範囲内の従来の分子生物学、微生物学、生化学および組換えDNA技術を本開示にしたがって使用することができる。そのような技術は文献において十分に説明されている。本発明は、請求の範囲に記載される方法および物質組成の範囲を限定しない以下の実施例においてさらに説明される。
【実施例】
【０１１８】
実施例1―AAV-PHP.Bベクターは外有毛細胞および内有毛細胞における導入遺伝子の発現を導く
インビボ注入
仔マウス（P0〜P2）に対し、斜角研磨したガラスマイクロインジェクションピペットを使用して、正円窓膜（RWM）を介して、AAV-PHP.BベクターCMV GFP注入を実施した。P-2000ピペットプラー（Sutter Instrument, Novato, CA）上、ガラス毛管（WPI）からピペットを引き、マイクロピペットベベラ（Sutter Instrument, Novato, CA）を使用して斜角研磨した（先端径約20μm、角度28°）。手術部位（左乳様突起）を覆うために無菌スワブを使用して、鎮痛のためにEMLAクリーム（リドカイン2.5％およびプリロカイン2.5％）を外部から塗布した。術前、加温パッド上で体温を38℃に維持した。仔マウスを、氷／水中で2〜3分間、急速な低体温誘導によって麻酔して意識消失させ、手術中、この状態を冷却プラットフォーム上で5〜10分間維持した。べタジンでスクラブし、70％エタノールで拭くことを3回繰り返すことにより、手術部位を消毒した。耳後部の切開を実施して透明な耳胞を露出させ、マイクロピペットを手で耳胞およびその上の筋膜に通し、マイクロピペットの先端をRWMに通した。ウイルス約1μLを、1分以内に、C57BL/6動物の左耳だけに手で注入した。注入後、6-0黒色モノフィラメント縫合糸（Surgical Specialties, Wyomissing, PA）を使用して皮膚切開創を閉じた。その後、仔マウスを38℃の加温パッドに戻して5〜10分おき、次いで、飼育のために母マウスに戻した。
【０１１９】
AAV-PHP.Bベクターは、高い特異性でほぼ100％のIHCおよび100％のOHCに形質導入した（図1〜3）、すなわち非有毛細胞はほどんど形質導入されなかった。
【０１２０】
AAV-PHP.B CMV GFPベクターで形質導入した試料を、その後固定し、ファロイジンまたはMyo7で染色して、共焦点顕微鏡で画像化した。外有毛細胞および内有毛細胞のターゲッティングは、効率的な形質導入を説明するものである。
【０１２１】
実施例2―有毛細胞電気生理学
関心対象の遺伝子をコードする導入遺伝子を含むAAV-PHP.Bベクターの形質導入に続き、有毛細胞の電気生理を分析した。蝸牛を切除し、カバーガラスに載せ、63×水浸対物レンズおよび微分干渉コントラストオプティクスを備えたAxio Examiner.A1正立顕微鏡（Carl Zeiss, Oberkochen, Germany）で観察する。MEM（Life Technologies, Carlsbad, CA）のように、137 NaCl、5.8 KCl、10 HEPES、0.7 NaH2PO4、1.3 CaCl2、0.9 MgCl2および5.6 D-グルコース（mM単位）、ビタミン（1：100）およびアミノ酸（1：50）を含有する標準液（pH7.4；約310mOsm/kg）中、室温（22℃〜24℃）で電気生理学的記録を実施する。記録電極（3〜4MΩ）をR-6ガラス（King Precision Glass, Claremont, CA）から引き、140CsCl、5EGTA-KOH、5HEPES、2.5Na2ATP、3.5MgCl2および0.1CaCl2（mM単位）を含有する細胞内液（pH7.4；約280mOsm/kg）で満たす。ホールセルタイトシール技術を使用して、Axopatch 200B（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）を使用してメカノトランスダクション電流を記録する。有毛細胞を−84mVに維持した。ローパスBesselフィルタによって電流を5kHzでフィルタリングし、12ビット収集ボード（Digidata 1440A、Molecular Devices, Sunnyvale, CA）によって≧20kHzでデジタル化し、pCLAMP10ソフトウェア（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）を使用して記録した。LVPZT増幅器（E-500.00、Physik Instrumente, Karlsruhe, Germany）によって駆動されるPICMAチップピエゾアクチュエータ（Physik Instrumente, Karlsruhe, Germany）に取り付けた堅いガラスプローブを使用して、IHCおよびOHCからの毛束を偏向させ、8ポールBesselフィルタ（Model 3384フィルタ、Krohn-Hite Corporation, Brokton, MA）によって40kHzでフィルタリングして、残留ピペット共振を除去した。堅いガラスプローブは、全束記録のために有毛細胞不動毛の列の凹側面に嵌まるように設計されたものである（OHCの場合には直径3〜4μm、IHCの場合には直径4〜5μm）。＞P10での全細胞電気生理学記録のために、P5〜7で蝸牛組織を解体し、MEM（1×）＋1％FBSを含むGlutaMAXTM-I培地中、37℃、5％CO2で30日間までインキュベートする。
【０１２２】
実施例3―聴力検査
聴力は、遺伝的に聴覚障害を有するマウスに形質導入したのちにアッセイする。聴性脳幹反応（ABR）および歪成分耳音響放射（DPOAE）データを収集する。DPOAEは、正しい蝸牛増幅および同調のためのアッセイであり、外有毛細胞の生存可能性の高感度な尺度である。麻酔したマウスにおいて試験した刺激は、5.6、8、11.3、16、22.6および32kHzの周波数で音圧レベル10から90dBまで変化させた。ABRを誘発するために必要な最小限の音閾値をプロットする。
【０１２３】
実施例4―ロータロッド試験
ロータロッド装置上での平衡行動に関してマウスを試験する。前庭機能が損傷したマウスは、ロータロッド装置上でのパフォーマンスが良くないことが知られている。以前の研究が、一方の耳のみが障害を有する場合に平衡機能不全を検出する、このロータロッド試験の能力を強調している。マウスに対し、P1で注入を実施し、P36で試験し、非注入対照マウスをP79で試験する。以下のロータロッドプロトコルを使用してすべてのマウスを試験する。1日目、マウスを、4RPMで回転するロッド上で5分間の平衡を保つよう、訓練する。2日目、マウスを5回の試行（5分間隔）で試験する。試行ごとに、ロッドを2RPMの開始速度から1RPMずつ加速する。マウスが装置から落ちるまでの時間（秒単位）を記録する。
【０１２４】
蝸牛の外リンパ液は前庭迷路の外リンパ液と連続しているため、蝸牛RWMを介して注入された関心対象のタンパク質を発現するAAV-PHP.Bベクターが前庭感覚器官に形質導入するかどうかを評価する。したがって、AAV-PHP.Bベクターの形質導入が平衡に影響し得るという安全性の懸念に対処するために、前庭発現を確認された注入マウスは、前庭機能に関するロータロッド試験に関し、非注入対照に相当するパフォーマンスを見せる。
【０１２５】
実施例5−アッシャー症候群のマウスモデル
組織標本
電気生理学的研究のために、Ush1c c.216G＞Aヘテロ接合型またはホモ接合型変異体マウスからの卵形嚢およびコルチ器を出生後0〜8日（P0〜P8）で採取する。出生後の仔マウスを迅速な断頭によって屠殺する。側頭骨を切除し、10mM HEPES（pH7.4）を添加したMEM（Invitrogen, Carlsbad, CA）に浸漬する。前記（53）のように、酵素を使用せずにコルチ器を切り出す。0.1mg/mlのプロテアーゼ（Protease XXIV, Sigma）による10分間の処理ののち、卵形嚢を取り出す。切除した器官を丸いカバーガラスに載せる。事前にカバーガラスに接着しておいた一対の細いガラス繊維を組織の縁に配置して、組織をフラットな位置で安定させる。組織は、すぐに使用するか、1％ウシ胎仔血清の存在下で培養するかのいずれかである。インビトロでのウイルスベクター感染を伴う実験のために、培養を7〜8日間維持し、培地を2〜3日ごとに交換する。
【０１２６】
動物
Ush1c c.216G＞Aノックインマウスをルイジアナ州立大学Health Science Centerから入手した。C57BL6バックグラウンド上のインポートされた株を事前にCdh23（Ahl）変異から育種して、加齢性聴力喪失を生じさせた（48、49）。トウクリップ（P8の前）またはイヤーパンチ（P8の後）を使用してマウスの遺伝子型を決定し、前記（32）のようにPCRを実施する。すべての試験に関し、雄雌マウスをほぼ等しい割合で使用した。他の点では無作為化パラダイムは適用しない。
【０１２７】
正円窓膜（RWM）注入
選択したプロモーター下で関心対象の遺伝子を発現するAAV-PHP.Bベクターを作製する。ベクター0.8μl〜1ulをP0〜P1およびP10〜P12の新生仔マウスに注入する。最初に、P0〜P1マウスを低体温曝露によって麻酔し、P10〜P12マウスをイソフルランによって麻酔する。麻酔中、耳後部切開を実施して耳胞を露出させ、蝸牛を可視化する。マイクロマニピュレータ（Askew et al., 2015）によって制御されるガラスマイクロピペットを用いて、RWMを通して注入を実施する。10分間、注入物質の量をおよそ0.02μl／分に制御する。標準的な術後ケアを適用する。試料サイズを最適化し、分散を減らすために、インビボ実験のための試料サイズを連続的に測定した。
【０１２８】
電気生理学的記録
144 NaCl、0.7 NaH2PO4、5.8 KCl、1.3 CaCl2、0.9 MgCl2、5.6 D-グルコースおよび10 HEPES-NaOH（mM単位）を含有する、pH7.4および320mOsmol/kgに調節された標準人工外リンパ液中で記録を実施する。濃縮物（Invitrogen, Carlsbad, CA）からビタミン（1：50）およびアミノ酸（1：100）を添加した。63×水浸対物レンズおよび微分干渉コントラストオプティクスを備えたAxioskop FS正立顕微鏡（Zeiss, Oberkochen, Germany）を使用して、頂端面から有毛細胞を観察した。記録ピペット（3〜5MΩ）をホウケイ酸ガラス毛管（Garner Glass, Claremont, CA）から引き、135 KCl、5 EGTA-KOH、10 HEPES、2.5 K2ATP、3.5 MgCl2、0.1 CaCl2（mM単位）を含有するpH7.4の細胞内液で満たした。全細胞電圧固定下、室温で−64mVの保持電位で電流を記録した。Axopatch Multiclamp 700AまたはAxopatch 200A（Molecular Devices, Palo Alto, CA）を使用してデータを取得し、ローパスBesselフィルタによって10kHzでフィルタリングし、12ビット収集ボード（Digidata 1322）ならびにpClamp8.2および10.5（Molecular Devices, Palo Alto, CA）を用いて≧20kHzでデジタル化した。OriginLabソフトウエアによってデータをオフラインで分析した。別段の記載がない限り、平均値±標準偏差として表す。
【０１２９】
実施例6―聴覚性驚愕反応
Startle Monitor（Kinder Scientific）を使用して聴覚性驚愕反応（ASR）を計測する。マウスを、圧電／プレキシガラス感知アセンブリに固定された小型の非制限的な立方体プレキシガラス記録チャンバ（27cm×10cm×652 12.5cm）に入れ、60dB SPLバックグラウンドホワイトノイズで5分間順化させる。各セッションは35回の試行からなり、その間、10dB SPL強度が60〜120db SPLの範囲である1つのノイズパルスを平均30秒（25〜35秒範囲）の試行間隔で印加する。外部ノイズ干渉を制限するために、パルスは、一定の60dB SPLバックグラウンドノイズ上、擬似ランダムな順序で並べる。Startle Monitorシステムが、ピーク驚愕反応（ASR振幅）および刺激からピーク驚愕反応までの時間（ASR潜時）の計算のために、各パルスへの反応を第一N、最大Nおよび反応の最大時間（ms）の計測値へと換算した。ASRはすべて盲検的に実施した。
【０１３０】
ABR/DPOAE回復が聴覚機能の行動的に関連する回復を生じさせるかどうかを評価するために、AAV-PHP.Bベクターのみを注入されて関心対象のタンパク質を発現するマウス、および両ベクターを注入されたマウスにおいて聴覚性驚愕反応を計測する。ホワイトノイズに対する驚愕反応の分析は6週齢マウスにおける反応レスキューについて評価する。
【０１３１】
実施例7―免疫蛍光検査
AAV-PHP.Bベクターによって送達された導入遺伝子の発現の分布を決定するために免疫染色を実施する。そうするために、解体したばかりのコルチ器を、PBS中に希釈した4％パラホルムアルデヒドによって室温で1時間浸漬固定して、免疫染色を実施する。次いで、組織をPBS中で洗浄し、0.01〜0.1％Triton X-100で30分間透過処理し、AlexaFluor546ファロイジン（Molecular Probes、1：200希釈）で1時間対比染色して、フィラメント状アクチンを標識する。
【０１３２】
外因的に発現したTMC::FLAG融合タンパク質の局在化のために、2％BSAおよび5％ヤギ正常血清を使用して組織を1時間ブロックし、FLAGモチーフに対する抗体（BD Biosciences、1：200希釈）とともに4℃で一晩インキュベートする。有毛細胞計数のために、組織をヤギ正常血清中で1時間ブロックし、ウサギ抗ミオシンVIIa一次抗体（Proteus Biosciences、1：1000希釈）で4℃で一晩染色し、AlexaFluor488（Life Technologies、1：200希釈）にコンジュゲートしたヤギ抗ウサギ抗体で1時間標識する。試料をVectashield封入剤（Vector Laboratories）によってカバーガラスに封入し、Zeiss LSM700共焦点顕微鏡を使用して10×〜63×の倍率で画像化する。
【０１３３】
実施例8−卵形嚢注入
治療ベクターを内耳に送達するための新規な注入法を開発した。以前の注入法は、正円窓膜、卵円窓または後半規管を通してベクターを送達するものであった。いくらかは効果的であるが、これらの方法はすべて、外科的にアクセスし難い標的、不均一なウイルス分散および外リンパまたは内リンパ空間を標的とするときの有意な可変性を含む有意な欠点を抱えている。これらの制限を回避するために、聴覚または前庭機能不全を生じさせることなく内耳空間への効率的な送達を可能にする新規な方法を設計した。
【０１３４】
この方法は、注入のために卵形嚢（前庭器官の1つ）を標的とすることを含む。注入は内リンパ腔への注入である。マウスの年齢に応じて2つの異なる経路を送達に使用した。以下に示すように、P0とP5との間で、外側半規管と後半規管との間で卵形嚢に接近した。P5よりも後の段階で、正円窓と卵円窓との間で卵形嚢に注入を実施した（図4）。卵形嚢の流体で満たされた空間は他の前庭器官および蝸牛と連続しているため、内耳全体を通して有意に改善されたウイルス分散が認められた。
【０１３５】
この新たな方法を、正円窓膜（RWM）へ注入する既存の方法と比較するために、P1マウスに対し、AAV2-Anc80L65-GFPを卵形嚢またはRWMに注入した。イメージングのために4週齢で側頭骨を採取した。有毛細胞を抗ミオシンVIIa抗体で染色した。図5Aおよび5Bを参照すると、卵形嚢およびRWM注入をそれぞれ受けたマウスの蝸牛頂で発現が検出されている。蝸牛の頂端、中間および基底領域の高解像度画像は、卵形嚢注入を実施されたマウスにおいて、RWM注入を受けたマウスと比べて高められたGFP発現を示した（図5Cおよび5D）。
【０１３６】
PHB.B-Cmv-eGFPが卵形嚢またはRWM注入によって効率的かつ特異的にマウスを形質導入したかどうかを決定するために、P1で、マウスに対し、AAV9.PHP.B-Cmv-eGFPを卵形嚢またはRWMのいずれかに注入した。図6Aおよび6Bを参照すると、それぞれEcole Polytechnique Federale de Lausanne（EPFL）で調製されたウイルスおよびボストン小児病院（BCH）で調製されたウイルスをP1で卵形嚢注入されたP14マウスから採取された側頭骨において効率的かつ特異的な形質導入が認められた。EPFLウイルスのRWM形質導入もまた効率的かつ特異的であった（図6C）。卵形嚢注入とRWM注入の両方で、蝸牛の頂端、中間および基部領域において類似の割合の形質導入された細胞が認められた（図6DおよびE）。
【０１３７】
AAV9-PHP.BベクターはAnc80ベクターよりも高い率でマウスを形質導入する。P1で、マウスに対し、AAV9.PHP.B-Cmv-eGFPまたはAAV-Anc80-Cmv-eGFPの卵形嚢注入を実施した。P14で側頭骨を採取し、蝸牛中（図7Aおよび7B）ならびに蝸牛の頂端、中間および基底領域の内および外有毛細胞中（図7C）で検出された蛍光によって測定すると、Anc80と比べ、PHP.Bの場合に増大した形質導入率が認められた。
【０１３８】
PHP.BがAnc80よりも高い特異性を有するかどうかを決定するために、P1マウスに対し、Anc80-Cmv-eGFP-EPREまたはPHP.B-Cmv-eGFPの卵形嚢注入を実施した。P15マウスで蝸牛を採取し、横断切片を調製した。図8Aおよび8Bを参照すると、下中央パネルに認められる緑色の蛍光によって示されるように、PHP.Bの場合に増大した特異性が認められた。
【０１３９】
PHP.B-Cmv-eGFPが内および外有毛細胞を標的とする発達段階を決定するために、P7およびP16で、マウスに対し、PHP.Bベクターの卵形嚢注入を実施した。図9Aを参照すると、P16と比べ、P7で注入を受けたマウスにおいて増加したeGFP陽性細胞が認められた。しかし、PHP.B-Cmv-eGFPは出生後期と成熟期の両方で内耳有毛細胞を標的とした（図9B）。
【０１４０】
野生型マウスにおける有毛細胞トランスダクションに対するAAV9-PHP.B-Cmv-GFP注入の効果を評価した。P1で、マウスに対し、ベクターの卵形嚢注入を実施した。図10Aは、GFP陽性細胞からの毛束の機械的変位によって誘発される感覚トランスダクション電流の代表的な電流ファミリーを表す。図10Bは、P7でGFP陽性外有毛細胞とGFP陰性外有毛細胞との間で感度の差がなかったことを示す。加えて、GFP陽性内および外有毛細胞とGFP陰性内および外有毛細胞とで電流振幅の差は認められなかった（図10C）。
【０１４１】
聴性脳幹反応（ABR）および歪成分耳音響放射（DPOAE）閾値を評価した。図11Aは、P28〜P31で試験された4匹のC57非注入マウス（黒い点線）、P1でAnc80-eGFPの卵形嚢注入を実施され、P30で試験された4匹のC57マウス（淡いグレー）およびP1でAAV9.PHP.B-Cmv-eGFP（BCHによって調製）の卵形嚢注入を実施され、P29で試験された4匹のC57マウス（濃いグレー）の場合に観察されたABRおよびDPOAE閾値を示す。図11Bを参照すると、P28〜P31で試験された4匹のC57非注入マウス（黒い点線）、P7でAnc80-eGFPの卵形嚢注入を実施され、P30で試験された4匹のC57マウス（淡いグレー）およびP7でPHP.B-eGFP（EPFL）の卵形嚢注入を実施され、P27〜P28で試験された9匹のC57マウス（濃いグレー）の場合にABR（左）およびDPOAE（右）の閾値が観察されている。図11Cを参照すると、P28〜P31で試験された4匹のC57非注入マウス（黒い点線）、P16でAnc80-eGFPの卵形嚢注入を実施され、P31で試験された4匹のC57マウス（淡いグレー）およびP16でPHP.B-eGFP（EPFL）の卵形嚢注入を実施され、P28で試験された4匹のC57マウス（濃いグレー）の場合にABR（左）およびDPOAE（右）の閾値が観察されている。合わせると、これらのデータは、ABRおよびDPOAE閾値がP1、P7またはP16でのAAV9.PHP.B-Cmv-eGFPの注入によって影響を受けなかったことを示す。
【０１４２】
PHP.BおよびAnc80形質導入に対する注入タイミングの影響を比較した。P1、P7およびP16で、マウスに対し、AAV9.PHP.B-Cmv-eGFPまたはAnc80-Cmv-eGFPを卵形嚢に注入した。図12Aおよび12Bを参照すると、PHP.B-Cmv-eGFPは、それぞれ卵形嚢および球形嚢において、Anc80構築物よりも高い形質導入率を示した。また、eGFP発現は、定性的に、Anc80-Cmv-eGFPを投与されたマウスと比べ、PHP.B-Cmv-eGFPを投与されたマウスにおいて、よりロバストかつ後半規管の有毛細胞に特異的であった（図13）。
【０１４３】
様々な事業主体によって調製されたウイルスのベクターを評価した。P1で、C57マウスに対し、Anc80-Cmv-eGFP、BCHで調製されたPHP.B-Cmv-eGFPまたはEPFLで調製されたPHP.B-Cmv-eGFPの卵形嚢注入を実施した。P15で組織を採取した。図14を参照すると、PHP.B-Cmv-eGFP（特に、BCHで調製されたベクター）は、前庭有毛細胞中、Anc80ベクターよりも高い形質導入率を示した。
【０１４４】
実施例9：ニューロン形質導入
蝸牛および前庭ニューロンを効果的に形質導入することができるかどうかを決定するために、AAV9-PHP.Bベクターを、シナプシンプロモーターを含むように改変した。P1で、C57マウスに対し、PHP.B-Syn-eGFPの卵形嚢注入を実施した。P15で組織を採取し、横断切片およびホールマウント切片を調製した。図15を参照すると、蝸牛および前庭横断切片ならびにホールマウント切片は、AAV-PHP.B-Syn-eGFPが、らせん神経節および前庭ニューロンを形質導入する場合に高い特異性および効率を有することを示す。
【０１４５】
実施例10：聴覚機能の回復
治療ポリペプチドの発現を駆動するPHP.Bベクターの能力をホモ接合型Tmc1変異体マウスにおいて評価した。P1でマウスに注入を実施し、P30で聴覚機能を計測した。ABRおよびDPOAE閾値によって計測されたように、AAV9-PHP.B-Cmv-Tmc1ベクターは、変異体マウスにおいて聴覚機能を回復させた（図16Aおよび16B）。このベクターはAAV1-Cmv-Tmc1およびAnc80-Cmv-Tmc1の性能を上回り、AAV9-PHP.B-Cmv-Tmc1ベクターを投与された1匹のマウスは野生型と同様の性能を示した（図16A）。
【０１４６】
実施例11：内および外有毛細胞において導入遺伝子を発現させるためのプロモーター
特定の細胞または組織中で発現を駆動するプロモーターは、治療導入遺伝子の標的化送達およびオフターゲット発現の最小化にとって特に貴重である。特に前庭細胞中で発現を駆動するいくつかのプロモーターの能力を調べた。図17A〜17Cを参照すると、Pcdh15、ミオシン6およびミオシン7aプロモーターが内および外有毛細胞中で発現を駆動している。KCNQ4プロモーターは外有毛細胞中で特異的に発現を駆動する（図17D）。
【０１４７】
他の態様
本明細書において、方法および物質組成はいくつかの異なる局面に関連して説明されたが、様々な局面の前記説明は、方法および物質組成を例示することを意図したものであり、方法および物質組成の範囲を限定することを意図したものではないことが理解されよう。他の局面、利点および変形が以下の請求項の範囲内である。
【０１４８】
本明細書における変数の任意の定義における要素のリストの記載は、任意の1つの要素またはリストされた要素の組み合わせ（またはサブコンビネーション）としての当該変数の定義を含む。本明細書における態様の記載は、任意の1つの態様としての当該態様または任意の他の態様もしくはその部分との組み合わせとしての当該態様を含む。
【０１４９】
本明細書において挙げられるすべての特許および刊行物は、各個の特許および刊行物が参照により組み入れられることが明確かつ個別に示される場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１５０】
開示されるものは、開示される方法および組成物のために使用することができる、開示される方法および組成物とともに使用することができる、開示される方法および組成物の調製において使用することができる、または開示される方法および組成物の産物である、方法および組成物である。これらおよび他の物質が本明細書に開示され、これらの方法および組成物の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示されるということが理解されよう。すなわち、これらの組成物および方法の各様々な個々のおよび集合的な組み合わせおよび置換への具体的言及が明示的に開示されていないとしても、それぞれは本明細書において具体的に考慮され、記載されている。たとえば、特定の物質組成または特定の方法が開示され、記載され、多数の組成物または方法が述べられているならば、別段の指示がない限り、それらの組成物および方法の各組み合わせおよび置換が具体的に考慮されている。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせが同じく具体的に考慮され、開示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年11月5日(2020.11.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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