(57)【要約】内因性遺伝子の発現をモジュレートする天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質を含む組成物およびその使用の方法が、本明細書で提供される。一態様では、本出願は、細胞におけるＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を増加させる天然に存在しない転写因子をコードする配列を含む発現カセットを提供する。ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａの発現を増加させる転写因子は、転写活性化アッセイにおいてＳＣＮ１Ａ発現を少なくとも２０％増加させることが可能な標的部位に結合する。
2021505133.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞におけるＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を増加させる天然に存在しない転写因子をコードする配列を含む発現カセットであって、前記転写因子が、転写活性化アッセイにおいてＳＣＮ１Ａ発現を少なくとも２０％増加させることが可能な標的部位に結合し、高体温発作アッセイにおいてドラベ症候群のマウスモデルにおける発作頻度を少なくとも２０％低減することが可能である、発現カセット。
【請求項２】
前記転写因子が、１８〜２７ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項３】
前記転写因子が、ＤＮＡ結合ドメインを含む、請求項１または２のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項４】
前記転写因子が、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項５】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、その最も近いヒトカウンターパートに対して少なくとも８０％の配列同一性を含む、請求項３または４のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項６】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、その最も近いヒトカウンターパートに対して少なくとも９０％の配列同一性を含む、請求項５に記載の発現カセット。
【請求項７】
前記ＤＮＡ結合ドメインおよび前記転写活性化ドメインが共に、それらの最も近いヒトカウンターパートに対して少なくとも８０％の配列同一性を含む、請求項４または５のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項８】
前記ＤＮＡ結合ドメインおよび前記転写活性化ドメインが共に、それらの最も近いヒトカウンターパートに対して少なくとも９０％の配列同一性を含む、請求項７に記載の発現カセット。
【請求項９】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ガイドＲＮＡおよびヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓタンパク質を含む、請求項３または４のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項１０】
前記ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓタンパク質が、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９である、請求項９に記載の発現カセット。
【請求項１１】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガードメインを含む、請求項３から８のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項１２】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、６〜９個のジンクフィンガードメインを含む、請求項１１に記載の発現カセット。
【請求項１３】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、６個のジンクフィンガーを含む、請求項１２に記載の発現カセット。
【請求項１４】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、１８ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する、請求項１３に記載の発現カセット。
【請求項１５】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、９個のジンクフィンガーを含む、請求項１２に記載の発現カセット。
【請求項１６】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、２７ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する、請求項１５に記載の発現カセット。
【請求項１７】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号１３５、３７１、３７２または３７６のいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項３から８または１１から１２のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項１８】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号１３５、３７１、３７２または３７６のいずれか１つを有する配列を含む、請求項１７に記載の発現カセット。
【請求項１９】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ヒトＥＧＲ１またはヒトＥＧＲ３に由来する、請求項３から８または１１から１８のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項２０】
前記転写活性化ドメインが、ＶＰＲ、ＶＰ６４、ＣＩＴＥＤ２もしくはＣＩＴＥＤ４配列、またはそれらの機能的断片を含む、請求項４から８または１１から１９のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項２１】
前記転写活性化ドメインが、ヒトＣＩＴＥＤ２もしくはＣＩＴＥＤ４配列、またはそれらの機能的断片を含む、請求項４から８または１１から２０のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項２２】
他の細胞型よりもＰＶニューロンにおいてより高いレベルで前記転写因子の発現を駆動する調節エレメントをさらに含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項２３】
前記調節エレメントが、配列番号１８３、１８４、１８５または４１７のいずれか１つを有する配列を含む、請求項２２に記載の発現カセット。
【請求項２４】
前記調節エレメントが、配列番号１８３または１８５を有する配列を含む、請求項２３に記載の発現カセット。
【請求項２５】
ウイルスベクターの一部である、請求項１から２４のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項２６】
前記ウイルスベクターがＡＡＶウイルスである、請求項２５に記載の発現カセット。
【請求項２７】
前記ＡＡＶウイルスが、ＡＡＶ９ウイルスまたはｓｃＡＡＶ９ウイルスである、請求項２６に記載の発現カセット。
【請求項２８】
請求項１から２７のいずれか一項に記載の発現カセットを投与することによって、細胞におけるＳＣＮ１Ａの発現を増加させる方法。
【請求項２９】
前記細胞がＰＶニューロンである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞が対象内にある、請求項２８または２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記対象が哺乳動物である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記対象がヒトである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ＳＣＮ１Ａの発現を増加させることが、疾患、障害または症状を処置する、請求項２８から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記障害が中枢神経系障害である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記障害がドラベ症候群である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記中枢神経系障害の症状がニューロン活動亢進である、請求項３４または３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記中枢神経系障害を処置することが、ニューロン活動亢進を低減することを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記中枢神経系障害の症状が発作である、請求項３４または３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記中枢神経系障害を処置することが、発作の頻度を低減することを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記中枢神経系障害を処置することが、発作の重症度を低減することを含む、請求項３８または３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
細胞におけるＧＲＮ遺伝子の発現を増加させる天然に存在しない転写因子をコードする配列を含む発現カセット。
【請求項４２】
前記転写因子が、１８〜２７ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する、請求項４１に記載の発現カセット。
【請求項４３】
前記転写因子が、ＤＮＡ結合ドメインを含む、請求項４１または４２のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項４４】
前記転写因子が、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含む、請求項４１から４３のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項４５】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ガイドＲＮＡおよびヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓタンパク質を含む、請求項４３または４４のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項４６】
前記ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓタンパク質が、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９である、請求項４５に記載の発現カセット。
【請求項４７】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガードメインを含む、請求項４３または４４のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項４８】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、６〜９個のジンクフィンガードメインを含む、請求項４７に記載の発現カセット。
【請求項４９】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、６個のジンクフィンガーを含む、請求項４８に記載の発現カセット。
【請求項５０】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、１８ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する、請求項４９に記載の発現カセット。
【請求項５１】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、９個のジンクフィンガーを含む、請求項４８に記載の発現カセット。
【請求項５２】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、２７ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する、請求項５１に記載の発現カセット。
【請求項５３】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号１７１または４１２〜４１６のいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項４３から４４または４７から４８のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項５４】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号１７１または４１２〜４１６のいずれか１つを有する配列を含む、請求項５３に記載の発現カセット。
【請求項５５】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ヒトＥＧＲ１またはヒトＥＧＲ３に由来する、請求項４３から４４または４７から５４のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項５６】
前記転写活性化ドメインが、ＶＰＲ、ＶＰ６４、ＣＩＴＥＤ２もしくはＣＩＴＥＤ４配列、またはそれらの機能的断片を含む、請求項４４または４７から５５のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項５７】
前記転写因子の発現を駆動する調節エレメントをさらに含む、請求項４１から５６のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項５８】
前記調節エレメントが、細胞型選択的調節エレメントである、請求項５７に記載の発現カセット。
【請求項５９】
ウイルスベクターの一部である、請求項４１から５８のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項６０】
前記ウイルスベクターがＡＡＶウイルスである、請求項５９に記載の発現カセット。
【請求項６１】
前記ＡＡＶウイルスが、ＡＡＶ９ウイルスまたはｓｃＡＡＶ９ウイルスである、請求項６０に記載の発現カセット。
【請求項６２】
請求項４１から６１のいずれか一項に記載の発現カセットを投与することによって、細胞におけるＧＲＮの発現を増加させる方法。
【請求項６３】
３個またはそれよりも多くのジンクフィンガードメインを含むＤＮＡ結合ドメインを含む天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質をコードする発現カセットであって、前記ＤＮＡ結合タンパク質が、ＳＣＮ１Ａ以外の内因性遺伝子の発現を、少なくとも５倍だけ増加させまたは抑制し、その最も近いヒトカウンターパートに対して９０％またはそれよりも高い配列同一性を有する、発現カセット。
【請求項６４】
前記ＤＮＡ結合タンパク質が、前記ヒトカウンターパートタンパク質が天然には結合しないヒトゲノム中の標的部位に結合する、請求項６３に記載の発現カセット。
【請求項６５】
前記ヒトカウンターパートがＥＧＲ１である、請求項６３または６４に記載の発現カセット。
【請求項６６】
前記ヒトカウンターパートがＥＧＲ３である、請求項６３または６４に記載の発現カセット。
【請求項６７】
前記ＤＮＡ結合タンパク質が、少なくとも６個のジンクフィンガードメインを含む、請求項６３から６６のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項６８】
前記ＤＮＡ結合タンパク質が、９個のジンクフィンガードメインを含む、請求項６７に記載の発現カセット。
【請求項６９】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、１つまたは複数のジンクフィンガードメインの認識ヘリックスの−１位、２位、３位または６位において少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項６３から６８のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項７０】
前記ＤＮＡ結合タンパク質が、ＥＧＲ１またはＥＧＲ３に由来する１つまたは複数のジンクフィンガードメインを含む、請求項６３から６９のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項７１】
前記ＤＮＡ結合タンパク質が、転写エフェクタードメインをさらに含む、請求項６３から７０のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項７２】
前記転写エフェクタードメインが、ＣＩＴＥＤ２またはＣＩＴＥＤ４に由来する、請求項７１に記載の発現カセット。
【請求項７３】
前記転写エフェクタードメインが、前記ＤＮＡ結合タンパク質中の前記ＤＮＡ結合ドメインのＣ末端に位置する、請求項７１または７２に記載の発現カセット。
【請求項７４】
前記エフェクタードメインが、前記ＤＮＡ結合タンパク質中の前記ＤＮＡ結合ドメインのＮ末端に位置する、請求項７１または７２に記載の発現カセット。
【請求項７５】
前記ＤＮＡ結合タンパク質が、前記ＤＮＡ結合タンパク質中の前記ＤＮＡ結合ドメインのＮ末端に位置するエフェクタードメインおよび前記ＤＮＡ結合タンパク質中の前記ＤＮＡ結合ドメインのＣ末端に位置するエフェクタードメインを含む、請求項７１または７２に記載の発現カセット。
【請求項７６】
前記ＤＮＡ結合タンパク質が、１８ｂｐまたはそれよりも長い標的結合部位を認識する、請求項６３から７５のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項７７】
前記ＤＮＡ結合タンパク質が、２７ｂｐの標的結合部位を認識する、請求項７６に記載の発現カセット。
【請求項７８】
細胞型選択的調節エレメントをさらに含む、請求項６３から７７のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項７９】
ウイルスベクター中にある、請求項６３から７８のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項８０】
前記ウイルスベクターがＡＡＶである、請求項７９に記載の発現カセット。
【請求項８１】
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ９またはｓｃＡＡＶ９である、請求項８０に記載の発現カセット。
【請求項８２】
疾患または状態を処置する方法であって、請求項６３から８１のいずれか一項に記載の発現カセットを含む遺伝子治療を投与することを含む、方法。
【請求項８３】
前記ＤＮＡ結合タンパク質が、細胞中でまたはｉｎ  ｖｉｖｏで発現した場合に、低減したまたは最小の免疫応答を惹起する、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記細胞が対象内にある、請求項８２または８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記対象が哺乳動物である、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記対象がヒトである、請求項８５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１７年１２月１日出願の米国仮特許出願第６２／５９３，８２４号；２０１７年１２月２２日出願の米国仮特許出願第６２／６１０，０１４号；２０１８年３月２１日出願の米国仮特許出願第６２／６４６，１９８号；２０１８年１月１８日出願の米国仮特許出願第６２／６１８，９６６号；２０１８年３月１２日出願の米国仮特許出願第６２／６４１，８０６号；２０１８年４月３０日出願の米国仮特許出願第６２／６６４，８１４号；および２０１８年４月３０日出願の米国仮特許出願第６２／６６４，８１７号の利益を主張し、その各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
【０００２】
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された、その全体がこれにより参照により組み込まれる配列表を含む。このＡＳＣＩＩコピーは、２０１８年１１月３０日に作成され、名称は４６４８２−７１１＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは８６４，４５３バイトである。
【背景技術】
【０００３】
広範なヒト疾患が、遺伝子の異常な発現に関連する。一部の場合には、遺伝子中の遺伝的変異により、その遺伝子は、調節不全になり、下方調節されるようになり、または全く発現されなくなって、ハプロ不全を生じる。一部の場合には、遺伝子中の遺伝的変異により、その遺伝子は上方調節されるようになって、遺伝子の過剰発現を生じる。遺伝性の障害または疾患を処置するにあたり、多くの課題が存在する。１つのアプローチは遺伝子治療であり、これには、患者の細胞中への核酸の治療的送達が関与する。しかし、遺伝子治療に関連する種々の課題、例えば、遺伝子治療によって惹起される望ましくない免疫応答、オフターゲット（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）効果、遺伝子治療ビヒクル（例えば、ウイルス）のクローニング能についての制限、より長い期間にわたって治療効果を持続させることなどは、未解決のままである。中枢神経系（ＣＮＳ）は、遺伝子および／またはタンパク質発現における根底にある機能障害に対処する治療の開発にとっての多くの独自の課題を提起する。ＣＮＳ疾患／障害の症状を管理することを助ける薬物は存在するが、多くのＣＮＳ疾患／障害、例えば、ドラベ症候群または前頭側頭認知症は、特異的処置も治癒も欠いている。従って、疾患または障害の影響を逆転させることを助けるために任意の内因性遺伝子の発現をモジュレートすることが可能な新規組成物および方法、特に、免疫原性の低減、オフターゲット効果の低減、標的遺伝子に対する増加した特異性、および／または増加した治療有効性を有する治療が、必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一態様では、本出願は、細胞におけるＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を増加させる天然に存在しない転写因子をコードする配列を含む発現カセットを提供する。ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａの発現を増加させる転写因子は、転写活性化アッセイにおいてＳＣＮ１Ａ発現を少なくとも２０％増加させることが可能な標的部位に結合する。ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａの発現を増加させる転写因子は、高体温発作アッセイ（ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉｃ  ｓｅｉｚｕｒｅ  ａｓｓａｙ）においてドラベ症候群のマウスモデルにおけるけいれん頻度を少なくとも２０％低減することが可能である。ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａの発現を増加させる転写因子は、転写活性化アッセイにおいてＳＣＮ１Ａ発現を少なくとも２０％増加させることが可能な標的部位に結合し、高体温発作アッセイにおいてドラベ症候群のマウスモデルにおける発作頻度を少なくとも２０％低減することが可能である。
【０００５】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａの発現を増加させる転写因子は、第２染色体上のゲノム位置に結合する。ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａの発現を増加させる転写因子は、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の転写開始部位の上流または下流１１０ｋｂ以内にある第２染色体上のゲノム位置に結合する。ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａの発現を増加させる転写因子は、１６６１７９６５２〜１６５９８９５７１位の範囲内にある第２染色体上のゲノム位置に結合する（ＧＲＣｈ３８．ｐ１２を参照して）。ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａの発現を増加させる転写因子は、１６６１２８０５０〜１６６１２７９５８位の範囲内にある第２染色体上のゲノム位置に結合する（ＧＲＣｈ３８．ｐ１２を参照して）。ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａの発現を増加させる転写因子は、１６６１５５４１４〜１６６１４０５９０位の範囲内にある第２染色体上のゲノム位置に結合する（ＧＲＣｈ３８．ｐ１２を参照して）。ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａの発現を増加させる転写因子は、１６６１７９６５２〜１６６１７７７２７２位の範囲内にある第２染色体上のゲノム位置に結合する（ＧＲＣｈ３８．ｐ１２を参照して）。ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａの発現を増加させる転写因子は、１６５９９９０２４６〜１６５９８９５９２位の範囲内にある第２染色体上のゲノム位置に結合する（ＧＲＣｈ３８．ｐ１２を参照して）。ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａの発現を増加させる転写因子は、配列番号３５〜３７、１０５〜１１１、１３６、１９５〜２１１、２２４〜２３８、２４０〜２６７のいずれか１つの配列を有するゲノム位置の２００ｂｐ以内のゲノム領域に結合する。ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａの発現を増加させる転写因子は、配列番号３５〜３７、１０５〜１１１、１３６、１９５〜２１１、２２４〜２３８、２４０〜２６７のいずれか１つの配列を有するゲノム位置と少なくとも部分的に重複するゲノム領域に結合する。ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａの発現を増加させる転写因子は、配列番号３５〜３７、１０５〜１１１、１３６、１９５〜２１１、２２４〜２３８、２４０〜２６７のいずれか１つの配列を有するゲノム領域に結合する。ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａの発現を増加させる転写因子は、１８〜２７ヌクレオチド（例えば、少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチド）を有するゲノム領域に結合する。
【０００６】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａの発現を増加させる転写因子は、ＤＮＡ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａの発現を増加させる転写因子は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、その最も近いヒトカウンターパートに対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、その最も近いヒトカウンターパートに対して少なくとも９０％の配列同一性を含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインは共に、それらの最も近いヒトカウンターパートに対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインは共に、それらの最も近いヒトカウンターパートに対して少なくとも９０％の配列同一性を含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ガイドＲＮＡおよびヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓタンパク質を含む。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９である。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガードメインを含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、６〜９個のジンクフィンガードメインを含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、６個のジンクフィンガーを含む。ある特定の実施形態では、６個のフィンガーを含むＤＮＡ結合ドメインは、１８ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、９個のジンクフィンガーを含む。ある特定の実施形態では、９個のジンクフィンガーを含むＤＮＡ結合ドメインは、２７ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１３５、３７１、３７２または３７６のいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１３５、３７１、３７２または３７６のいずれか１つを有する配列を含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ヒトＥＧＲ１またはヒトＥＧＲ３に由来する。ある特定の実施形態では、転写活性化ドメインは、ＶＰＲ、ＶＰ６４、ＣＩＴＥＤ２もしくはＣＩＴＥＤ４配列、またはそれらの機能的断片を含む。ある特定の実施形態では、転写活性化ドメインは、ヒトＣＩＴＥＤ２もしくはＣＩＴＥＤ４配列、またはそれらの機能的断片を含む。
【０００７】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａの発現を増加させる転写因子をコードする発現カセットは、他の細胞型よりもＰＶニューロンにおいてより高いレベルで転写因子の発現を駆動する調節エレメントをさらに含む。ある特定の実施形態では、調節エレメントは、配列番号１８３、１８４、１８５または４１７のいずれか１つを有する配列を含む。ある特定の実施形態では、調節エレメントは、配列番号１８３または１８５を有する配列を含む。
【０００８】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａの発現を増加させる転写因子をコードする発現カセットは、ウイルスベクターの一部である。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶウイルスである。ある特定の実施形態では、ＡＡＶウイルスは、ＡＡＶ９ウイルスまたはｓｃＡＡＶ９ウイルスである。
【０００９】
別の態様では、本出願は、ＳＣＮ１Ａの発現を増加させる転写因子をコードする本明細書に記載される発現カセットのいずれかを投与することによって、細胞におけるＳＣＮ１Ａの発現を増加させる方法を提供する。ある特定の実施形態では、細胞は、ＰＶニューロンである。ある特定の実施形態では、細胞は、対象内にある。ある特定の実施形態では、対象は、哺乳動物である。ある特定の実施形態では、対象は、ヒトである。ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａの発現を増加させることは、疾患、障害または症状を処置する。ある特定の実施形態では、障害は、中枢神経系障害である。ある特定の実施形態では、障害は、ドラベ症候群である。ある特定の実施形態では、中枢神経系障害は、ニューロン活動亢進である。ある特定の実施形態では、中枢神経系障害を処置することは、ニューロン活動亢進を低減することを含む。ある特定の実施形態では、中枢神経系障害の症状は、発作である。ある特定の実施形態では、中枢神経系障害を処置することは、発作の頻度を低減することを含む。ある特定の実施形態では、中枢神経系障害を処置することは、発作の重症度を低減することを含む。ある特定の実施形態では、中枢神経系障害を処置することは、発作の重症度および頻度を低減することを含む。
【００１０】
別の態様では、本出願は、細胞におけるＧＲＮ遺伝子の発現を増加させる天然に存在しない転写因子をコードする配列を含む発現カセットを提供する。
【００１１】
ある特定の実施形態では、ＧＲＮの発現を増加させる転写因子は、１８〜２７ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する。
【００１２】
ある特定の実施形態では、ＧＲＮの発現を増加させる転写因子は、ＤＮＡ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ＧＲＮの発現を増加させる転写因子は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ガイドＲＮＡおよびヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓタンパク質を含む。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９である。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガードメインを含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、６〜９個のジンクフィンガードメインを含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、６個のジンクフィンガーを含む。ある特定の実施形態では、６個のジンクフィンガーを含むＤＮＡ結合ドメインは、１８ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、９個のジンクフィンガーを含む。ある特定の実施形態では、９個のジンクフィンガーを含むＤＮＡ結合ドメインは、２７ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１７１または４１２〜４１６のいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１７１または４１２〜４１６のいずれか１つを有する配列を含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ヒトＥＧＲ１またはヒトＥＧＲ３に由来する。ある特定の実施形態では、転写活性化ドメインは、ＶＰＲ、ＶＰ６４、ＣＩＴＥＤ２もしくはＣＩＴＥＤ４配列、またはそれらの機能的断片を含む。
【００１３】
ある特定の実施形態では、ＧＲＮの発現を増加させる転写因子をコードする発現カセットは、天然に存在しない転写モジュレーターの発現を駆動する調節エレメントをさらに含む。ある特定の実施形態では、調節エレメントは、細胞型選択的調節エレメントである。
【００１４】
ある特定の実施形態では、ＧＲＮの発現を増加させる転写因子をコードする発現カセットは、ウイルスベクターの一部である。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶウイルスである。ある特定の実施形態では、ＡＡＶウイルスは、ＡＡＶ９ウイルスまたはｓｃＡＡＶ９ウイルスである。
【００１５】
別の態様では、本出願は、ＧＲＮの発現を増加させる転写因子をコードする本明細書に記載される発現カセットのいずれかを投与することによって、細胞におけるＧＲＮの発現を増加させる方法を提供する。ある特定の実施形態では、ＧＲＮの発現を増加させることは、疾患、障害または症状を処置する。ある特定の実施形態では、細胞は、対象内にある。ある特定の実施形態では、対象は、哺乳動物である。ある特定の実施形態では、対象は、ヒトである。ある特定の実施形態では、細胞は、中枢神経系細胞、前頭皮質細胞、グリア細胞、ミクログリア細胞および線条体細胞からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ＧＲＮの発現をモジュレートすることは、疾患または障害を処置する。ある特定の実施形態では、障害は、中枢神経系障害である。ある特定の実施形態では、障害は、前頭側頭変性症（ＦＴＤ）、パーキンソン病、アルツハイマー病またはアテローム動脈硬化症である。ある特定の実施形態では、中枢神経系障害の症状は、レビー小体の存在、プログラニュリン（ＧＲＮ）のハプロ不全、社会性の欠如（ｓｏｃｉａｌ  ｄｅｆｉｃｉｔ）、リソソーム異常、記憶喪失、運動協調性の喪失、または筋振戦である。ある特定の実施形態では、中枢神経系障害を処置することは、筋振戦の頻度を低減することおよび／または筋振戦の重症度を低減することを含む。
【００１６】
別の態様では、本出願は、３個またはそれよりも多くのＤＮＡ結合ドメインを含むＤＮＡ結合ドメインを含む天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質をコードする発現カセットであって、ＤＮＡ結合タンパク質が、内因性遺伝子の発現を、少なくとも５倍だけ増加させまたは抑制し、その最も近いヒトカウンターパートに対して９０％またはそれよりも高い配列同一性を有する、発現カセットを提供する。例示的な実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、３個またはそれよりも多くのジンクフィンガードメインを含む。
【００１７】
ある特定の実施形態では、その最も近いヒトカウンターパートに対して９０％またはそれよりも高い配列同一性を有するＤＮＡ結合タンパク質は、ヒトカウンターパートタンパク質が天然には結合しないヒトゲノム中の標的部位に結合する。ある特定の実施形態では、ヒトカウンターパートは、ＥＧＲ１である。ある特定の実施形態では、ヒトカウンターパートは、ＥＧＲ３である。ある特定の実施形態では、その最も近いヒトカウンターパートに対して９０％またはそれよりも高い配列同一性を有するＤＮＡ結合タンパク質は、少なくとも６個のジンクフィンガードメインを含む。ある特定の実施形態では、その最も近いヒトカウンターパートに対して９０％またはそれよりも高い配列同一性を有するＤＮＡ結合タンパク質（ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）は、９個のジンクフィンガードメインを含む。ある特定の実施形態では、その最も近いヒトカウンターパートに対して９０％またはそれよりも高い配列同一性を有するＤＮＡ結合ドメインは、１つまたは複数のジンクフィンガードメインの認識ヘリックスの−１位、２位、３位または６位において少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。ある特定の実施形態では、その最も近いヒトカウンターパートに対して９０％またはそれよりも高い配列同一性を有するＤＮＡ結合タンパク質は、ＥＧＲ１またはＥＧＲ３に由来する１つまたは複数のジンクフィンガードメインを含む。
【００１８】
ある特定の実施形態では、その最も近いヒトカウンターパートに対して９０％またはそれよりも高い配列同一性を有するＤＮＡ結合タンパク質は、転写エフェクタードメインをさらに含む。ある特定の実施形態では、転写エフェクタードメインは、ＣＩＴＥＤ２またはＣＩＴＥＤ４に由来する。ある特定の実施形態では、転写エフェクタードメインは、ＤＮＡ結合タンパク質中のＤＮＡ結合ドメインのＣ末端に位置する。ある特定の実施形態では、エフェクタードメインは、ＤＮＡ結合タンパク質中のＤＮＡ結合ドメインのＮ末端に位置する。ある特定の実施形態では、その最も近いヒトカウンターパートに対して９０％またはそれよりも高い配列同一性を有するＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡ結合タンパク質中のＤＮＡ結合ドメインのＮ末端に位置するエフェクタードメインおよびＤＮＡ結合タンパク質中のＤＮＡ結合ドメインのＣ末端に位置するエフェクタードメインを含む。
【００１９】
ある特定の実施形態では、その最も近いヒトカウンターパートに対して９０％またはそれよりも高い配列同一性を有するＤＮＡ結合タンパク質は、１８ｂｐまたはそれよりも長い標的結合部位を認識する。ある特定の実施形態では、その最も近いヒトカウンターパートに対して９０％またはそれよりも高い配列同一性を有するＤＮＡ結合タンパク質は、２７ｂｐの標的結合部位を認識する。
【００２０】
ある特定の実施形態では、その最も近いヒトカウンターパートに対して９０％またはそれよりも高い配列同一性を有するＤＮＡ結合タンパク質をコードする発現カセットは、細胞型選択的調節エレメントをさらに含む。ある特定の実施形態では、その最も近いヒトカウンターパートに対して９０％またはそれよりも高い配列同一性を有するＤＮＡ結合タンパク質をコードする発現カセットは、他の細胞型よりもＰＶニューロンにおいてより高いレベルでＤＮＡ結合タンパク質の発現を駆動する調節エレメントをさらに含む。ある特定の実施形態では、調節エレメントは、配列番号１８３、１８４、１８５または４１７のいずれか１つを有する配列を含む。ある特定の実施形態では、調節エレメントは、配列番号１８３または１８５を有する配列を含む。
【００２１】
ある特定の実施形態では、その最も近いヒトカウンターパートに対して９０％またはそれよりも高い配列同一性を有するＤＮＡ結合タンパク質をコードする発現カセットは、ウイルスベクター中にある。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶである。ある特定の実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ９またはｓｃＡＡＶ９である。
【００２２】
別の態様では、本出願は、疾患または状態を処置する方法であって、その最も近いヒトカウンターパートに対して９０％またはそれよりも高い配列同一性を有するＤＮＡ結合タンパク質をコードする本明細書で提供される任意の発現カセットを含む遺伝子治療を投与することを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態では、その最も近いヒトカウンターパートに対して９０％またはそれよりも高い配列同一性を有するＤＮＡ結合タンパク質は、細胞中でまたはｉｎ  ｖｉｖｏで発現した場合に、低減したまたは最小の免疫応答を惹起する。ある特定の実施形態では、細胞は、対象内にある。ある特定の実施形態では、対象は、哺乳動物である。ある特定の実施形態では、対象は、ヒトである。ある特定の実施形態では、その最も近いヒトカウンターパートに対して９０％またはそれよりも高い配列同一性を有するＤＮＡ結合タンパク質は、内因性ＳＣＮ１Ａの発現を増加させる。ある特定の実施形態では、細胞は、ＰＶニューロンである。ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａの発現を増加させることは、疾患、障害または症状を処置する。ある特定の実施形態では、障害は、中枢神経系障害である。ある特定の実施形態では、障害は、ドラベ症候群である。ある特定の実施形態では、中枢神経系障害は、ニューロン活動亢進である。ある特定の実施形態では、中枢神経系障害を処置することは、ニューロン活動亢進を低減することを含む。ある特定の実施形態では、中枢神経系障害の症状は、発作である。ある特定の実施形態では、中枢神経系障害を処置することは、発作の頻度を低減することを含む。ある特定の実施形態では、中枢神経系障害を処置することは、発作の重症度を低減することを含む。ある特定の実施形態では、中枢神経系障害を処置することは、発作の重症度および頻度を低減することを含む。ある特定の実施形態では、その最も近いヒトカウンターパートに対して９０％またはそれよりも高い配列同一性を有するＤＮＡ結合タンパク質は、内因性ＧＲＮの発現を増加させる。ある特定の実施形態では、細胞は、中枢神経系細胞、前頭皮質細胞、グリア細胞、ミクログリア細胞および線条体細胞からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ＧＲＮの発現をモジュレートすることは、疾患または障害を処置する。ある特定の実施形態では、障害は、中枢神経系障害である。ある特定の実施形態では、障害は、前頭側頭変性症（ＦＴＤ）、パーキンソン病、アルツハイマー病またはアテローム動脈硬化症である。ある特定の実施形態では、中枢神経系障害の症状は、レビー小体の存在、プログラニュリン（ＧＲＮ）のハプロ不全、社会性の欠如、リソソーム異常、記憶喪失、運動協調性の喪失、または筋振戦である。ある特定の実施形態では、中枢神経系障害を処置することは、筋振戦の頻度を低減することおよび／または筋振戦の重症度を低減することを含む。
参照による組み込み
【００２３】
本明細書で言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許または特許出願が具体的かつ個々に参照により組み込まれるのと同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
【００２４】
本発明の新規の特徴は、特に添付の特許請求の範囲に記載される。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が活用されている例示的な場合について記載している以下の詳細な説明、および添付の図面を参照することによって得られる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、正規化ルシフェラーゼ活性に関して測定した、２９３Ｔ細胞におけるルシフェラーゼの発現における異なる調節エレメントの効果を示す。例えば、最小ＣＭＶ（ｍｉｎＣＭＶ）プロモーターとの組み合わせは、ｍｉｎＣＭＶプロモーター単独によって駆動される発現よりも約１．４倍高いおよびＳＣＰプロモーターによって駆動される発現よりも約６０倍高いレベルでのルシフェラーゼの発現を駆動した。同じ実験において、配列番号１７８をｍｉｎＣＭＶプロモーターと連結させることにより、ｍｉｎＣＭＶプロモーター単独よりも約３．５倍高いおよびＳＣＰプロモーターよりも約１４０倍高いレベルでのルシフェラーゼの発現が駆動された。
【００２６】
【図２】図２は、各調節エレメントのサイズ正規化活性（図１に示される正規化ルシフェラーゼ活性を、塩基対中の調節エレメントの長さで割ることによって計算される）を示す。
【００２７】
【図３】図３は、ＧＡＢＡ作動性選択的調節エレメント（ＲＥ）、例えば、パルブアルブミン（ＰＶ）細胞に対する選択的ＲＥの制御下でのｅＧＦＰの選択的発現を示す。ＥＦ１αプロモーターまたはＧＡＢＡ作動性／ＰＶ選択的ＲＥ、例えば、配列番号１８５を含む配列番号１８３、または配列番号１８４、のいずれかの制御下でｅＧＦＰを含有するＡＡＶＤＪベクターを、ＧＡＢＡ作動性／ＰＶ細胞中にｔｄＴｏｍａｔｏ（赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ））を発現するマウスに注射した。上段イメージは、ＥＦ１αプロモーター（配列番号１８６）、ＧＡＢＡ作動性／ＰＶ選択的ＲＥ（配列番号１８３または配列番号１８４）を含有する構築物から発現されるｅＧＦＰのパターンを示す。下段イメージは、ＧＡＢＡ作動性／ＰＶニューロンを示し、これはＧＡＤ２−陽性である。ｅＧＦＰおよびｔｄＴｏｍａｔｏの両方を発現する細胞は、上段イメージを下のイメージと重ね合せること、または上段イメージおよび下段イメージの両方における同じ位置からの蛍光を識別することのいずれかによって識別することができる。ｅＧＦＰおよびｔｄＴｏｍａｔｏの両方を発現する細胞の例は、矢印で示される。
【００２８】
【図４】図４は、（例えば、ｅＧＦＰも発現するｔｄＴｏｍａｔｏ発現細胞のパーセンテージとして測定した場合）図３におけるＧＡＢＡ作動性／ＰＶニューロンによるｅＧＦＰの発現の効率の定量を示す。
【００２９】
【図５】図５は、（例えば、ｔｄＴｏｍａｔｏ（またはＲＦＰ＋）も発現するｅＧＦＰ−発現細胞のパーセンテージとして測定した場合）図３におけるＧＡＢＡ作動性／ＰＶニューロンによるｅＧＦＰの発現の特異性の定量を示す。
【００３０】
【図６】図６は、染色体２上の様々な領域に結合する操作された転写因子を使用する内因性ＳＣＮ１Ａの上方調節を示す（ＧＲＣｈ３８．ｐ１２を参照）。データは、対照（ＥＧＦＰ−ＫＡＳＨ）条件に対するＳＣＮ１Ａ発現における変化倍率として提示される。
【００３１】
【図７】図７は、ｅＧＦＰ対照に対する、Ｌｏｇ１０での変化倍率として提示されるＳＣＮ１Ａの相対的発現を示す。
【００３２】
【図８】図８は、対照に対する変化倍率として提示される内因性ＳＣＮ１Ａ、ＴＴＣ２１Ｂ、ＳＣＮ９Ａ、ＳＮＣＡ、ＧＲＮ、ＵＴＲＮ、およびＴＴＮ転写物の相対的発現を示す。
【００３３】
【図９】図９Ａは、本明細書に開示されるｅＴＦの一実施形態であって、天然に存在するヒト転写因子（ＴＦ）のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）が、目的の遺伝子標的でまたはそれの近傍の標的結合部位を認識するように改変され、再プログラムされ、または操作されている、一実施形態を示す。上図は、目的の内因性遺伝子または遺伝子標的と関連する標的部位（黒色棒によって表される）との結合親和性がない天然に存在する転写因子を示す。下図は、あるｅＴＦを示し、ここで、ＤＢＤは、例えば、天然に存在するＤＢＤのジンクフィンガーを２倍にすることもしくは三重にすることおよび／またはジンクフィンガーにおいてアミノ酸置換を作ることによって、目的の遺伝子の標的部位に結合するように改変され、操作され、または再プログラムされている複数のジンクフィンガー（円柱によって表される）を含む。
【００３４】
図９Ｂは、ヒト共調節因子タンパク質または転写コファクターのトランス活性化ドメイン（ＴＡＤ）、例えば、ＣＩＴＥＤ２またはＣＩＴＥＤ４などのＣｂｐ／ｐ３００−相互作用トランス活性化因子タンパク質のＴＡＤに融合した天然に存在するヒトＴＦに由来するＤＢＤを含む、本明細書に開示されるｅＴＦ、またはハイブリッドｅＴＦの別の実施形態を示す。上図は、ヒトタンパク質に由来し、ゲノム（黒色棒）中の所望の標的部位に特異的に結合するように操作されているＤＢＤを示す。下図は、ＴＡＤ、例えば、ＣＩＴＥＤ２のＴＡＤに融合してハイブリッドｅＴＦを形成するＤＢＤを示す。そのようなハイブリッドｅＴＦは、ゲノム中の標的部位配列に結合することおよびｅＴＦ中のＴＡＤを介して遺伝子標的の転写をモジュレートすること（例えば、活性化すること）によって標的遺伝子の発現を駆動する。
【００３５】
【図１０】図１０は、様々な転写をモジュレートするタンパク質と天然に存在するヒトタンパク質との間の保存（または配列同一性）パーセンテージおよびそれらのサイズを塩基対（ｂｐ）で示す。様々な実施形態では、本開示のｅＴＦは、１，０００〜１，８００ｂｐの核酸配列によってコードされ得、また天然に存在するヒトタンパク質に対して＞９０％の大域的配列同一性（すなわち、ｅＴＦの完全長アミノ酸配列にわたる配列同一性）を含み、これにより、細胞にまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば、遺伝子治療を介して送達されるとき、免疫応答または免疫原性を低減することができる。それと比較して、非活性化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）ドメインを含むｄＣａｓ９ベースの転写因子は、内因性ヒトタンパク質に対して大域的配列同一性を有しておらず、サイズはより大きい。従来通りに構築されたジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）、またはｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで設計されたジンクフィンガーを含む人工のもしくは合成のＤＮＡ結合タンパク質は、サイズがより小さいが、内因性ヒトタンパク質に対してより低い配列同一性（約５５％）を有することができる。
【００３６】
【図１１】図１１は、内因性遺伝子をモジュレートするための様々なアプローチを示す。最初の図では、転写モジュレータータンパク質は、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで設計されたＺＦなどの、複数の合成ジンクフィンガー（ＺＦ）を含み、ＶＰ６４のトランス活性化ドメイン（ＴＡＤ）に融合したＤＢＤを含む。第２の図では、野生型ＴＦは、天然に存在するが、目的の遺伝子の標的部位には結合しない。第３の図では、ｅＴＦは、そのＤＢＤが、目的の遺伝子でまたはそれの近傍の１８ｎｔ標的部位に結合するように改変または再プログラムされている、天然に存在するＴＦを含み、ここでは、例えば、野生型ＴＦのＤＢＤが合成ジンクフィンガーで置き換えられる。第４の図では、ｅＴＦは、野生型ＴＦに由来し、ＤＢＤが、目的の遺伝子でまたはそれの近傍の９ｎｔ標的結合部位を認識するように操作されている。最後の図では、ｅＴＦは、野生型ＴＦに由来し、野生型ＴＦのＤＢＤが２倍にされ、（例えば、ＺＦ中のアミノ酸置換を介して）再プログラムされて目的の遺伝子でまたはそれの近傍の１８ｎｔ標的結合部位を認識する６−ジンクフィンガーＤＢＤを形成する。ｅＴＦのこれらの様々な実施形態は、遺伝子標的がレポート遺伝子（ｒｅｐｏｒｔ  ｇｅｎｅ）（例えば、ＥＧＦＰ）である、レポート活性化アッセイ（ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）を使用してアッセイすることができる。最初の、第３の、第４の、および第５の図中のｅＴＦは、レポーター遺伝子の発現を生じる。
【００３７】
【図１２】図１２Ａは、ＨＥＫ２９３細胞におけるＳＣＮ１Ａの発現が、ｅＴＦによるＳＣＮ１Ａ特異的標的結合部位への結合およびＳＣＮ１Ａ遺伝子発現の活性化の指標である、ＳＣＮ１Ａ活性化アッセイの概略図を示す。上図は、ＥＧＦＰレポーター遺伝子についてのＴＲＥ結合部位を認識するように操作されているｅＴＦを示し、これはＳＣＮ１Ａ標的結合部位への結合に失敗し、したがってＳＣＮ１Ａの発現に失敗する。下図は、天然に存在するヒトタンパク質に由来し、ヒトタンパク質に対して少なくとも９８％の配列同一性と、１８ｎｔ  ＳＣＮ１Ａ標的結合部位に結合するように操作されているＤＢＤとを含むｅＴＦは、ＳＣＮ１Ａ遺伝子活性化、したがってＳＣＮ１Ａ発現を生じることを示す。
【００３８】
図１２Ｂは、図１２Ａに示される例示的なｅＴＦでのＳＣＮ１Ａ活性化アッセイの定量の結果を示す。ＥＧＲ１に対して高いグローバルなまたは全体的な配列同一性を有する６つのジンクフィンガーを含み、そのＤＢＤが、内因性ＳＣＮ１Ａ遺伝子の近傍のまたはその遺伝子における特異的結合部位を認識するように操作されているｅＴＦ（配列番号６）は、そのＤＢＤが、ＴＲＥ結合部位を認識するが、ＳＣＮ１Ａ標的結合部位を認識しないように操作されている配列番号４と比較して、トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるＳＣＮ１Ａの２．５倍の発現をもたらした。
【００３９】
【図１３】図１３Ａは、各々が天然に存在するヒトタンパク質に由来する、２つの例示的なｅＴＦによるＳＣＮ１Ａ活性化の概略図を示す。上図は、天然に存在するヒトタンパク質（例えば、ＥＧＲ１またはＥＧＲ３）のＤＢＤが２倍にされて、６つのジンクフィンガーを有するＤＢＤを形成し、内因性ＳＣＮ１Ａ遺伝子の近傍のまたはその遺伝子における標的結合部位に結合するように改変または再プログラムされているｅＴＦを示す。下図は、天然に存在するヒトタンパク質のＤＢＤが３倍にされて、９つのジンクフィンガーを有するＤＢＤを形成し、内因性ＳＣＮ１Ａ遺伝子の近傍のまたはその遺伝子における標的結合部位に結合するように改変または再プログラムされているｅＴＦを示す。
【００４０】
図１３Ｂは、図１３Ａに示されるｅＴＦの各々により活性化される、相対的ＳＣＮ１Ａ発現の定量を示す。トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞では、ＥＧＲ１に対する高い配列同一性と、ＥＧＲ１に由来し、ＳＣＮ１Ａ標的結合部位を認識するように操作されている６−ジンクフィンガーＤＢＤとを含むｅＴＦ（配列番号７）は、空ベクター対照と比べて、約７倍のＳＣＮ１Ａ発現を生じる。ＥＧＲ１に対する高い配列同一性と、ＥＧＲ１に由来し、ＳＣＮ１Ａ標的結合部位を認識するように操作されている９−ジンクフィンガーＤＢＤとを含むｅＴＦ（配列番号９）は、対照と比べて、約２０倍のＳＣＮ１Ａ発現を生じる。
【００４１】
【図１４】図１４は、ウイルス活性化ドメインなどの別のタンパク質のＴＡＤまたはＣＩＴＥＤ２などの別のヒトタンパク質のＴＡＤに融合した天然に存在するヒトタンパク質に対して高い配列同一性を有するヒトＤＢＤを含むハイブリッドｅＴＦの様々な実施形態を示す。様々な実施形態では、ｅＴＦのＤＢＤと天然に存在するヒトタンパク質のＤＢＤとの間の局所的配列同一性は、少なくとも８５％である。そのようなＤＢＤは、様々な活性化ドメイン、例えば、ウイルス活性化ドメイン、例えば、ヒトタンパク質に対して０％配列同一性を有するＶＰ６４、またはＣＩＴＥＤ２活性化ドメイン、に融合させることができる。ＶＰ６４ドメインをヒトＣＩＴＥＤ配列で置き換えることにより、天然に存在するヒトタンパク質と比較して、第３列においてハイブリッドｅＴＦの全体的な配列同一性が増加する。
【００４２】
【図１５】図１５は、ＳＣＮ１Ａ特異的転写活性化因子を使用するＨＥＲＫ２９３細胞中の内因性ＳＣＮ１Ａの相対的発現を示す（実施例６中の表３３〜３４を参照されたい）。データは、対照条件に対する変化倍率として提示し、Ｌｏｇ１０スケールで示す。
【００４３】
【図１６】図１６Ａは、ＳＣＮ１Ａ特異的転写活性化因子（配列番号３６６）を使用するＧＡＢＡニューロン中の内因性ＳＣＮ１Ａの相対的発現を示す。データは、対照条件（ＣＢＡ−ＥＧＦＰ）に対する変化倍率として提示される。
【００４４】
図１６Ｂは、ＳＣＮ１Ａ特異的転写活性化因子（配列番号１３または配列番号１５）を使用するＧＡＢＡニューロン中の内因性ＳＣＮ１Ａの相対的発現を示す。データは、対照条件（ＣＢＡ−ＥＧＦＰ）に対する変化倍率としてＬｏｇ１０で提示される。
【００４５】
【図１７】図１７は、ＳＣＮ１Ａ特異的転写因子（配列番号３６６）により駆動される内因性ＳＣＮ１Ａおよび４０の最も近い隣接遺伝子の相対的発現を示す。データは、対照条件（ＣＢＡ−ＥＧＦＰ−ＫＡＳＨ）に対する変化倍率としてＬｏｇ１０で提示される。
【００４６】
【図１８】図１８Ａおよび図１８Ｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＳＣＮ１Ａ特異的転写活性化因子の発現を、ｅＧＦＰを発現した対照発現カセットと比較して示す。図１８Ａは、対照ｅＧＦＰ発現カセットまたは内因性ＳＣＮ１Ａ遺伝子からの発現の上方調節を生じる標的部位に結合する転写活性化因子を含む発現カセットＡのいずれかを注射したマウスにおける、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の相対的発現を示す。図１８Ｂは、平均ｅＧＦＰパーセンテージに関する、ＳＣＮ１Ａ発現における変化を示す。これらの実験は、発現カセットＡの転写活性化因子が、ＳＣＮ１Ａ発現の約２０〜３０％上方調節を生じることを示した。
【００４７】
【図１９−１】図１９Ａ、図１９Ｂ、および図１９Ｃは、いくつかのＳＣＮ１Ａ特異的転写因子を使用する、野生型マウスの海馬における内因性ＳＣＮ１Ａの上方調節を示す。図１９Ａ：発現カセットＡ；図１９Ｂ：発現カセットＢ；および図１９Ｃ：配列番号３６５または３６６。ＳＣＮ１Ａ転写因子を、対照ベクター（ＥＧＦＰ−ＫＡＳＨ）およびＣＢＡ−ＥＧＦＰ−ＫＡＳＨと比較した。データは、ＥＧＦＰ−ＫＡＳＨ条件に対する変化倍率として提示される。
【図１９−２】図１９Ａ、図１９Ｂ、および図１９Ｃは、いくつかのＳＣＮ１Ａ特異的転写因子を使用する、野生型マウスの海馬における内因性ＳＣＮ１Ａの上方調節を示す。図１９Ａ：発現カセットＡ；図１９Ｂ：発現カセットＢ；および図１９Ｃ：配列番号３６５または３６６。ＳＣＮ１Ａ転写因子を、対照ベクター（ＥＧＦＰ−ＫＡＳＨ）およびＣＢＡ−ＥＧＦＰ−ＫＡＳＨと比較した。データは、ＥＧＦＰ−ＫＡＳＨ条件に対する変化倍率として提示される。
【００４８】
【図２０−１】図２０Ａ、図２０Ｂ、図２０Ｃ、図２０Ｄ、および図２０Ｅは、対照と比較して、様々なＳＣＮ１Ａ特異的転写因子を使用する、ドラベ症候群のマウスモデルにおける高体温発作に対する効果を示す。Ｐ１  Ｓｃｎ１ａ＋／−マウスに、ＡＡＶ９−ＥＧＦＰまたはＳＣＮ１Ａ特異的転写因子（配列番号３０５〜３０９）を発現するＡＡＶ９ベクターのいずれかを注入した。Ｐ２６〜Ｐ２８を注入されたマウスに、高体温誘発発作アッセイ（ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｅｉｚｕｒｅ  ａｓｓａｙ）を実行して、それらマウスが強直間代性けいれん発作（ｔｏｎｉｃ−ｃｌｏｎｉｃ  ｓｅｉｚｕｒｅ）を経験した内部温度を記録した。
【図２０−２】図２０Ａ、図２０Ｂ、図２０Ｃ、図２０Ｄ、および図２０Ｅは、対照と比較して、様々なＳＣＮ１Ａ特異的転写因子を使用する、ドラベ症候群のマウスモデルにおける高体温発作に対する効果を示す。Ｐ１  Ｓｃｎ１ａ＋／−マウスに、ＡＡＶ９−ＥＧＦＰまたはＳＣＮ１Ａ特異的転写因子（配列番号３０５〜３０９）を発現するＡＡＶ９ベクターのいずれかを注入した。Ｐ２６〜Ｐ２８を注入されたマウスに、高体温誘発発作アッセイ（ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｅｉｚｕｒｅ  ａｓｓａｙ）を実行して、それらマウスが強直間代性けいれん発作（ｔｏｎｉｃ−ｃｌｏｎｉｃ  ｓｅｉｚｕｒｅ）を経験した内部温度を記録した。
【００４９】
【図２１−１】図２１Ａ、図２１Ｂ、図２１Ｃ、図２１Ｄ、および図２１Ｅは、様々な条件下での、ドラベ症候群のマウスモデルにおける生存率を示す。図２１Ａは、生存アッセイにおける野生型とＳｃｎ１ａ＋／−マウスとの間の比較を示す。Ｐ１  Ｓｃｎ１ａ＋／−（Ｎ＝５３）およびＳｃｎ１ａ＋／＋（Ｎ＝５４）マウスに、ＰＢＳを注入した。マウスを、それらマウスのホームケージにおいて毎日観察し、いかなる死亡のケースでも、その日付を記録した。Ｓｃｎ１ａ＋／−とＳｃｎ１ａ＋／＋動物との間に生存率の有意な差があった（Ｐ＜０．０００１）。図２１Ｂ〜Ｅは、対照と比較して、様々なＳＣＮ１Ａ特異的転写因子で処置したマウスについての、ドラベ症候群のマウスモデルの生存に対する効果を示す。Ｐ１  Ｓｃｎ１ａ＋／−マウスに、ＰＢＳまたはＳＣＮ１Ａ特異的転写因子（配列番号３０５〜３０７、または３０９）を発現するＡＡＶ９ベクターのいずれかを注入した。マウスを、それらマウスのホームケージにおいて毎日観察し、いかなる死亡のケースでも、その日付を記録した。
【図２１−２】図２１Ａ、図２１Ｂ、図２１Ｃ、図２１Ｄ、および図２１Ｅは、様々な条件下での、ドラベ症候群のマウスモデルにおける生存率を示す。図２１Ａは、生存アッセイにおける野生型とＳｃｎ１ａ＋／−マウスとの間の比較を示す。Ｐ１  Ｓｃｎ１ａ＋／−（Ｎ＝５３）およびＳｃｎ１ａ＋／＋（Ｎ＝５４）マウスに、ＰＢＳを注入した。マウスを、それらマウスのホームケージにおいて毎日観察し、いかなる死亡のケースでも、その日付を記録した。Ｓｃｎ１ａ＋／−とＳｃｎ１ａ＋／＋動物との間に生存率の有意な差があった（Ｐ＜０．０００１）。図２１Ｂ〜Ｅは、対照と比較して、様々なＳＣＮ１Ａ特異的転写因子で処置したマウスについての、ドラベ症候群のマウスモデルの生存に対する効果を示す。Ｐ１  Ｓｃｎ１ａ＋／−マウスに、ＰＢＳまたはＳＣＮ１Ａ特異的転写因子（配列番号３０５〜３０７、または３０９）を発現するＡＡＶ９ベクターのいずれかを注入した。マウスを、それらマウスのホームケージにおいて毎日観察し、いかなる死亡のケースでも、その日付を記録した。
【００５０】
【図２２】図２２は、２個体の未処置対照動物に対して正規化した、２個体のカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）に１．２×１０１２ｇｃ／動物で投与された、ＳＣＮ１Ａ特異的転写因子（配列番号３０５）をコードするＡＡＶ９ベクターの実質内送達後の異なる脳組織における相対的Ｓｃｎ１Ａ  ｍＲＮＡ発現を示す。全ての動物を注射の２８日後に屠殺し、Ｓｃｎ１Ａ  ｍＲＮＡをＴａｑｍａｎ  ＰＣＲによって組織試料において定量した。データを、脳からの異なる組織切片における標的ｍＲＮＡの正規化発現として報告する。同様に異なるセットのＳｃｎ１ａ遺伝子由来プライマー／プローブで類似の結果が記録された。
【００５１】
【図２３】図２３は、様々なゲノム領域に結合する操作された転写因子を使用する内因性ＧＲＮの上方調節を示す。
【００５２】
【図２４】図２４Ａおよび図２４Ｂは、各々がＧＲＮの転写活性化因子を含む、様々な発現カセットでのｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験を示す。図２４Ａは、対照に対する変化倍率として提示されるプログラニュリンの相対的発現を示す。図２４Ｂは、上清中のｈＰＧＲＮ（ｎｇ／ｍＬ）に関して表現される、プログラニュリンの様々な転写活性化因子でのＥＬＩＳＡ実験を示す。
【００５３】
【図２５】図２５は、２９３Ｔ細胞におけるルシフェラーゼの発現における、様々な調節エレメント（ＲＥ）の正規化ルシフェラーゼ活性を示す。例えば、調節エレメント配列番号１７８をｍｉｎＣＭＶプロモーターに作動可能に連結させることにより、ｍｉｎＣＭＶプロモーター単独よりも約３．５倍高いおよびＳＣＰプロモーターよりも約１４０倍高いレベルでのルシフェラーゼの発現が駆動された。
【００５４】
【図２６】図２６は、ＥＧＦＰまたはＧＲＮ特異的活性化因子（配列番号１０、１６、５９、６０、６３、６４、７２、７３、７７、Ｌ、または３４２）のいずれかを発現するプラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞においてｑＰＣＲによって測定したＰＧＲＮ転写物のレベルを示す。データは、対照条件に対する変化倍率として提示される。
【００５５】
【図２７】図２７は、ＥＧＦＰまたはＧＲＮ特異的活性化因子（配列番号１０または１６）のいずれかを発現するプラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞から分泌され、ＥＬＩＳＡによって測定したＰＧＲＮタンパク質のレベルを示す。データは、対照条件に対する変化倍率として提示される。
【００５６】
【図２８】図２８は、ＣＢＡプロモーターの制御下で、ＥＧＦＰまたはＧＲＮ特異的活性化因子（配列番号３４２）のいずれかを発現するＡＡＶベクター（血清型ＡＡＶ−ＤＪ）をトランスフェクトしたＧＡＢＡニューロンにおいてｑＰＣＲによって測定したＰＧＲＮ転写物のレベルを示す。データは、対照条件に対する変化倍率として提示される。
【００５７】
【図２９】図２９は、ＣＢＡプロモーターの制御下で、ＥＧＦＰまたはＧＲＮ特異的活性化因子（配列番号３４２）のいずれかを発現するＡＡＶベクター（血清型ＡＡＶ−ＤＪ）を低（０．５Ｅ１１ゲノムコピー／ウェル）および高（２Ｅ１１ゲノムコピー／ウェル）用量で感染させたＧＡＢＡニューロンから分泌され、ＥＬＩＳＡによって測定したＰＧＲＮタンパク質のレベルを示す。データは、対照条件に対する変化倍率として提示される。
【００５８】
【図３０】図３０は、ＰＢＳ対照と比較して、異なる用量で、各々がＧＲＮの転写活性化因子を含む、発現カセットＪまたはＧを含むＡＡＶ９で処置したマウスに関する、血漿ＰＧＲＮタンパク質（μｇ／ｍＬで測定される）のレベルを示す。
【００５９】
【図３１−１】図３１Ａは、空ベクター対照と比較して、相対的ＥＧＦＰ発現として表現される、様々なｅＴＦでのレポーター（ＥＧＦＰ）活性化アッセイの定量の結果を示す。強いウイルス活性化ドメインを含む人工の転写因子（配列番号５１）は、７０倍の相対的ＥＧＦＰ発現を生じた。未改変ヒト転写因子ＥＧＲ１（配列番号１）は、対照（空ベクター）と比べてレポーター遺伝子を活性化しなかった。６つの操作されたジンクフィンガーを含むＥＧＲ１（配列番号２）に由来するｅＴＦは、１０倍のＥＧＦＰ発現を生じた。そのジンクフィンガーに少なくとも１つまたは複数のアミノ酸変化を有する３つのジンクフィンガーを含むＥＧＲ１に由来するｅＴＦ（配列番号３）は、３倍の相対的ＥＧＦＰ発現を生じた。ＥＧＲ１フィンガー（配列番号４）においてジンクフィンガーを２倍にすることにより、１５倍の相対的ＥＧＦＰ発現を生じた。
【００６０】
【図３１−２】図３１Ｂは、図３１Ａにおいて定量したレポーター（ＥＧＦＰ）活性化アッセイの蛍光顕微鏡写真を示す。ＥＧＦＰを発現する細胞は、淡い灰色の外観を有する。
【００６１】
【図３２】図３２は、ＥＧＲ３に由来し、ＥＧＦＰレポート遺伝子の発現を生じる標的結合部位を認識するように操作されているｅＴＦの様々な実施形態を示す。ＥＧＲ３タンパク質に由来し、レポーターアッセイにおいてＴＲＥ結合部位を認識するように操作されている、６つのジンクフィンガーを含むｅＴＦ（配列番号１２）は、ＥＧＲ１に由来し、ＶＰ６４に由来するＴＡＤを含むｅＴＦ（配列番号５１）と同様に、ＥＧＦＰ発現を生じた。両方のｅＴＦは、活性化ドメインなしの改変ヒトＤＢＤを含む対照（配列番号１８７によってコードされる）と比較して、高いＥＧＦＰ発現を生じた。
【００６２】
【図３３−１】図３３Ａは、ＥＧＦＰレポーター活性化アッセイにおいてＴＲＥ結合配列を認識するように操作されている様々なｅＴＦの概略図を示す。第１の図は、ＴＲＥ結合部位を認識するように操作されているが、活性化ドメイン（配列番号５０）を欠き、ＥＧＦＰ発現のいかなる活性化も生じない、改変ヒトＤＢＤを示す。第２の図では、改変ヒトＤＢＤは、ＥＧＦＰ発現の活性化を生じる強いウイルス活性化ドメインＶＰ６４（配列番号９５）に融合する。第３および第４の図では、改変ヒトＤＢＤは、その両方がＥＧＦＰ発現を活性化する、ＣＩＴＥＤ２（配列番号９６）またはＣＩＴＥＤ４（配列番号９７）のいずれかのヒト活性化ドメインに融合する。
【００６３】
図３３Ｂは、図３３Ａに記載される各ｅＴＦについての相対的ＥＧＦＰ発現の定量を示す。配列番号５０は、レポーター単独対照と類似のレベルのＥＧＦＰ発現を生じた。配列番号５１〜５３の配列を有する各ｅＴＦは、それぞれレポーター単独対照と比較して、それぞれ、約４０、１５、および１０倍の相対的ＥＧＦＰ発現を生じた。
【００６４】
【図３３−２】図３３Ｃは、図３３Ａに示し、図３３Ｂにおいて定量したＥＧＦＰレポーター活性化アッセイにおける各ｅＴＦについての蛍光顕微鏡写真を示す。
【００６５】
【図３４】図３４は、広範囲の転写活性（または相対的レポーター発現）および天然に存在するヒトタンパク質との種々の程度の配列同一性（または保存）を有するｅＴＦの様々な実施形態の概要を示す。
【００６６】
【図３５】図３５Ａは、本明細書に開示されるｅＴＦの免疫原性を試験するＥｌｉｓｐｏｔアッセイの概略図を示す。Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイを使用して、正常な健康なドナーからのＴ細胞が、免疫原性であると予測されるペプチドを認識およびそれに反応できるかどうかを試験する。Ｔ細胞は、ｅｌｉｓｐｏｔウェル中で試験されるペプチドのプールとともに、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞またはＤＣ）と混合される。Ｔ細胞がペプチドを異物（ｆｏｒｅｉｇｎ）と認識する場合、Ｔ細胞は、活性化し、増殖し、サイトカイン（例えば、インターフェロン−ガンマ）を分泌する。発色試薬で処理後、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮγ）陽性スポットをカウントすることができる。対照（例えば、公知の非免疫原性ペプチドまたはバッファ単独）と比較して、より多数のスポットが、より高い免疫原性と関連付けられる。
【００６７】
図３５Ｂは、対照（左の環）と比較して、増加した免疫原性（右の環）を示すｅｌｉｓｐｏｔ結果のクローズアップした例を示す。ＩＦＮ−ガンマ陽性スポットは、黒色スポットとして示される。
【００６８】
【図３６】図３６は、天然に存在しない転写モジュレーターを含む発現カセットを含むベクターを示し、これは、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を増加させるための、ＶＰ６４の活性化ドメインに作動可能に連結した転写因子のＤＮＡ結合ドメインを含む。
【００６９】
【図３７】図３７は、発現カセットを含むＡＡＶベクターを示し、これは、天然に存在しない転写モジュレーター、例えば、ＶＰ６４の転写活性化ドメインに作動可能に連結したヌクレアーゼ不活性化ｄＳａＣａ９ドメインを含む。そのような発現カセットはまた、ｄＳａＣａｓ９導入遺伝子と発現されるガイドＲＮＡを含む。示される他のエレメントには、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、プロモーター、ＡＡＶ  ＩＴＲ、ポリＡシグナル、および選択マーカーが含まれる。
【発明を実施するための形態】
【００７０】
本開示の詳細な説明
天然に存在しない、ゲノム標的部位に結合し目的の内因性遺伝子の発現をモジュレートするように設計された操作された転写因子、即ちｅＴＦが、本明細書で提供される。かかるｅＴＦは、目的の遺伝子の発現（ＲＮＡおよび／またはタンパク質発現）を上方調節または下方調節するように設計され得る。
【００７１】
一態様では、本出願は、ナトリウム電位依存性チャネルアルファサブユニット１（ＳＣＮ１Ａ）遺伝子の発現を上方調節することが可能であり、その対応するタンパク質産物Ｎａｖ１．１の発現を増加させることが可能なｅＴＦ、およびＮａｖ１．１における欠損に関連する疾患または障害、例えば、ドラベ症候群などを処置するためのその使用の方法を提供する。
【００７２】
別の態様では、本出願は、プログラニュリン（ＧＲＮ）遺伝子の発現を上方調節することが可能であり、ＧＲＮタンパク質の発現を増加させることが可能なｅＴＦ、およびＧＲＮにおける欠損に関連する疾患または障害、例えば、前頭側頭認知症（ＦＴＤ）などを処置するためのその使用の方法を提供する。
【００７３】
別の態様では、本出願は、ゲノム標的部位に結合し、例えば、ＳＣＮ１ＡまたはＧＲＮを含む目的の任意の遺伝子の発現をモジュレート（上方調節または下方調節）するように設計され得るヒトタンパク質に対して高いパーセント配列同一性を有するｅＴＦを提供する。かかるｅＴＦは、対象に投与された場合に免疫原性をほとんど〜全く有さない、またはヒトタンパク質配列に対してより低いパーセント同一性を有するｅＴＦと比較して、低減した免疫原性を有する。
定義
【００７４】
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「この（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数形も同様に含むことを意図する。さらに、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｗｉｔｈ）」またはそれらの異形が詳細な説明および／または特許請求の範囲のいずれかにおいて使用される限りにおいて、かかる用語は、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同様の様式で包括的であることを意図する。
【００７５】
用語「約」または「およそ」は、その値が測定または決定される方法、即ち、測定システムの制限に一部依存する、当業者によって決定される特定の値について許容される誤差範囲内であることを意味する。例えば、「約」は、当該分野の実務に従って、１標準偏差以内または１よりも大きい標準偏差以内であることを意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大で２０％、最大で１５％、最大で１０％、最大で５％または最大で１％の範囲を意味し得る。
【００７６】
用語「決定する」、「測定する」、「評価する（ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ）」、「評価する（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）」、「アッセイする」、「分析する」およびそれらの文法的等価物は、任意の形態の測定を指すために本明細書で相互交換可能に使用し得、エレメントが存在するかしないかを決定すること（例えば、検出）を含む。これらの用語は、定量的決定および／または定性的決定の両方を含み得る。評価は、相対的または絶対的であり得る。
【００７７】
用語「発現」は、核酸配列もしくはポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（例えば、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物へと）転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡがペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質へと引き続いて翻訳されるプロセスを指す。転写物およびコードされたポリペプチドは、集合的に「遺伝子産物」と呼ばれ得る。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核生物細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
【００７８】
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結した」、「作動可能な連結」、「作用的に連結した」またはそれらの文法的等価物は、遺伝エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化配列などの並置であって、それらのエレメントが、予測された様式でそれらを作動させる関係にある並置を指す。例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー配列を含み得る調節エレメントは、その調節エレメントがコード配列の転写を開始することを助ける場合、コード領域に作用的に連結されている。この機能的関係が維持される限り、調節エレメントとコード領域との間に介在する残基が存在してもよい。
【００７９】
「ベクター」は、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドを含みまたはポリヌクレオチドに関連し、細胞へのポリヌクレオチドの送達を媒介するために使用し得る、高分子または高分子の会合を指す。ベクターの例には、プラスミド、ウイルスベクター、リポソームおよび他の遺伝子送達ビヒクルが含まれる。ベクターは、一般に、標的における遺伝子の発現を促進するために遺伝子に作用的に連結した遺伝エレメント、例えば、調節エレメントを含む。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「発現カセット」および「核酸カセット」は、一緒に発現されまたは発現のために作動可能に連結される核酸配列またはエレメントの組合せを指すために、相互交換可能に使用される。一部の場合には、発現カセットは、調節エレメントおよび発現のためにそれらが作動可能に連結される遺伝子（単数または複数）の組合せを指す。
【００８１】
用語「ＡＡＶ」は、アデノ随伴ウイルスの略称であり、ウイルス自体またはその誘導体を指すために使用し得る。用語は、他が要求される場合を除いて、全ての血清型、サブタイプ、ならびに天然に存在する形態および組換え形態の両方をカバーする。略称「ｒＡＡＶ」は、組換えＡＡＶベクター（または「ｒＡＡＶベクター」）とも呼ばれる組換えアデノ随伴ウイルスを指す。用語「ＡＡＶ」は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０、およびそれらのハイブリッド、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶならびにヒツジＡＡＶを含む。種々の血清型のＡＡＶのゲノム配列、ならびにネイティブの末端反復（ＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質およびカプシドサブユニットの配列は、当該分野で公知である。かかる配列は、文献中またはＧｅｎＢａｎｋなどの公的データベースにおいて見出すことができる。「ｒＡＡＶベクター」は、本明細書で使用される場合、ＡＡＶ起源のものではないポリヌクレオチド配列（即ち、ＡＡＶに対して異種のポリヌクレオチド）、典型的には、細胞の遺伝子形質転換のための目的の配列を含むＡＡＶベクターを指す。一般に、異種ポリヌクレオチドには、少なくとも１つの、一般には２つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する。ｒＡＡＶベクターは、一本鎖（ｓｓＡＡＶ）または自己相補的（ｓｃＡＡＶ）のいずれかであり得る。「ＡＡＶウイルス」または「ＡＡＶウイルス粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質およびカプシド封入されたポリヌクレオチドｒＡＡＶベクターから構成されるウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（即ち、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド、例えば、哺乳動物細胞中に送達される導入遺伝子）を含む場合、これは、典型的には、「ｒＡＡＶベクター粒子」または単に「ｒＡＡＶ粒子」と呼ばれる。従って、ｒＡＡＶ粒子の産生は、ｒＡＡＶベクターの産生を必然的に含むが、それは、かかるベクターが、ｒＡＡＶ粒子内に含まれるからである。
【００８２】
本明細書で使用される場合、用語「処置する」、「処置」、「治療」などは、疾患もしくは障害の進行を軽減、遅延もしくは遅くすること、疾患もしくは障害の予防、疾患もしくは障害の減弱、疾患もしくは障害の影響もしくは症状を低減すること、疾患もしくは障害の開始を予防すること、疾患もしくは障害を阻害することまたは疾患もしくは障害の開始を軽快させることを指す。本開示の方法は、任意の哺乳動物で使用し得る。例示的な哺乳動物には、ラット、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、およびより好ましくはヒトが含まれるがこれらに限定されない。治療利益には、処置されている根底にある障害の根絶または軽快が含まれる。また、治療利益は、対象が根底にある障害になおも苦しんでいる場合があるにもかかわらず、対象において改善が観察されるような、根底にある障害に関連する生理学的症状の１つまたは複数の根絶または軽快で達成される。一部の場合には、予防利益のために、治療薬が、特定の疾患を発達させるリスクがある対象、または疾患の生理学的症状の１つもしくは複数を報告する対象に、この疾患の診断がなされていない場合であっても、投与され得る。本開示の方法は、任意の哺乳動物で使用し得る。一部の場合には、処置は、症状の減少または休止（例えば、発作の頻度、持続時間および／または重症度における低減）を生じ得る。予防効果には、疾患もしくは状態の出現を遅延もしくは排除すること、疾患もしくは状態の症状の開始を遅延もしくは排除すること、疾患もしくは状態の進行を遅くする、停止させるもしくは逆転させること、またはそれらの任意の組合せが含まれる。
【００８３】
用語「有効量」または「治療有効量」は、以下に定義される疾患処置が含まれるがこれに限定されない意図した適用に影響を与えるのに十分な、本明細書に記載される組成物の量を指す。治療有効量は、当業者によって容易に決定することができる、意図した処置適用（ｉｎ  ｖｉｖｏ）、または処置されている対象および疾患状態、例えば、対象の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与の様式などに依存して変動し得る。用語は、標的細胞において特定の応答を誘導する用量にも当てはまる。具体的な用量は、選択された特定の組成物、従うべき投与レジメン、他の化合物と組み合わせて投与されるかどうか、投与のタイミング、それが投与される組織、およびそれを運搬する物理的送達系に依存して変動する。
【００８４】
ヌクレオチドまたはペプチド配列の「断片」は、参照または「全長」配列とは別の配列を指す。
【００８５】
分子の「バリアント」は、かかる配列の対立遺伝子バリエーション、即ち、分子全体またはその断片のいずれかと構造および生物活性が実質的に類似した配列を指す。
【００８６】
ＤＮＡまたはタンパク質配列の「機能的断片」は、全長ＤＮＡまたはタンパク質配列の生物活性と実質的に類似した生物活性（機能的または構造的のいずれか）を保持する断片を指す。ＤＮＡ配列の生物活性は、全長配列に起因する公知の様式で発現に影響を与えるその能力であり得る。
【００８７】
用語「対象」および「個体」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指すために、本明細書で相互交換可能に使用される。本明細書に記載される方法は、ヒト治療、獣医学適用、および／または疾患もしくは状態の動物モデルにおける前臨床研究において有用であり得る。
【００８８】
用語「ｉｎ  ｖｉｖｏ」は、対象の身体において起こる事象を指す。
【００８９】
用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」は、対象の身体の外側で起こる事象を指す。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、対象の外側で実行される任意のアッセイを包含する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、生きた細胞または死んだ細胞が使用される、細胞に基づくアッセイを包含する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、インタクトな細胞が使用されない無細胞アッセイもまた包含する。
【００９０】
一般に、相互交換可能に使用し得る「配列同一性」または「配列相同性」は、それぞれ２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列のヌクレオチド毎またはアミノ酸毎の正確な対応を指す。典型的には、配列同一性を決定するための技術は、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列を比較すること、およびそれらのパーセント同一性を決定することを含む。例えば、同一性を評価することを目的とした配列比較は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（例えば、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／において入手可能なＥＭＢＯＳＳ  Ｎｅｅｄｌｅアライナーを参照のこと。必要に応じてデフォルト設定を用いる）、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（例えば、ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉにおいて入手可能なＢＬＡＳＴアラインメントツールを参照のこと。必要に応じてデフォルト設定を用いる）およびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（例えば、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｗａｔｅｒ／において入手可能なＥＭＢＯＳＳ  Ｗａｔｅｒアライナーを参照のこと。必要に応じてデフォルト設定を用いる）が含まれるがこれらに限定されない任意の適切なアラインメントアルゴリズムによって実施され得る。最適なアラインメントは、デフォルトパラメーターを含む、選択されたアルゴリズムの任意の適切なパラメーターを使用して評価され得る。２つの配列間の「パーセント同一性」は、「パーセント相同性」とも呼ばれ、参照配列の長さによって除算し１００を乗算した、２つの最適にアラインされた配列間の正確なマッチの数として計算することができる。パーセント同一性は、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈから入手可能なバージョン２．２．９を含むａｄｖａｎｃｅｄ  ＢＬＡＳＴコンピュータープログラムを使用して配列情報を比較することによっても決定することができる。ＢＬＡＳＴプログラムは、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８  （１９９０）のアラインメント法に基づき、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０  （１９９０）；Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７  （１９９３）；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２  （１９９７）で議論されるとおりである。簡潔に述べると、ＢＬＡＳＴプログラムは、２つの配列のうち短い方における記号の総数によって除算した、同一のアラインされた記号（即ち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数として、同一性を定義する。プログラムは、比較されている配列の長さ全体にわたってパーセント同一性を決定するために使用し得る。デフォルトパラメーターは、例えば、ｂｌａｓｔｐプログラムを用いた、短いクエリー配列での検索を最適化するために提供される。プログラムはまた、Ｗｏｏｔｔｏｎ  ａｎｄ  Ｆｅｄｅｒｈｅｎ，  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅ���ｉｓｔｒｙ  １７：  １４９−１６３  （１９９３）のＳＥＧプログラムによって決定されるように、クエリー配列のセグメントをマスクオフするためのＳＥＧフィルターの使用を可能にする。高い配列同一性には、一般に、およそ８０％〜１００％の配列同一性の範囲、およびそれらの間の整数値が含まれる。
【００９１】
本明細書で使用される場合、タンパク質に関連して「操作された」は、天然に存在するタンパク質に由来するタンパク質、または天然に存在するタンパク質がある特定の特性を有するように改変もしくはリプログラミングされた場合が含まれるがこれらに限定されない、天然に存在しないタンパク質を指す。
【００９２】
本明細書で使用される場合、「合成」および「人工」は、天然に存在するヒトタンパク質に対して低い配列同一性（例えば、５０％未満の配列同一性）を有するタンパク質またはそのドメインを指すために、相互交換可能に使用される。例えば、ＶＰＲおよびＶＰ６４ドメインは、合成トランス活性化ドメインである。
【００９３】
本明細書で使用される場合、「操作された転写因子」または「ｅＴＦ」は、特異的標的結合部位に結合するようにおよび／または改変されたもしくは置き換えられた転写エフェクタードメインを含むように改変またはリプログラミングされた、天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質または天然に存在しない転写モジュレーターを指す。
【００９４】
本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ結合ドメイン」は、個々にまたは集合的にＤＮＡ結合タンパク質の一部としての、１つまたは複数のＤＮＡ結合モチーフ、例えば、ジンクフィンガーまたは塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス（ｂＨＬＨ）モチーフを指すために使用し得る。
【００９５】
用語「転写活性化（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）ドメイン」、「転写活性化（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）ドメイン」、「トランス活性化（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）ドメイン」、「トランス活性化（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）ドメイン」および「ＴＡＤ」は、本明細書で相互交換可能に使用され、ＤＮＡ結合ドメインとともに、直接またはコアクチベーターとして公知の他のタンパク質を介して転写機構（例えば、一般的な転写因子および／またはＲＮＡポリメラーゼ）を接触させることによって、プロモーターからの転写を活性化できる、タンパク質のドメインを指す。
【００９６】
用語「転写リプレッサー（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）ドメイン」、「転写リプレッサー（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）ドメイン」および「ＴＲＤ」は、本明細書で相互交換可能に使用され、ＤＮＡ結合ドメインとともに、直接またはコリプレッサーとして公知の他のタンパク質を介して転写機構（例えば、一般的な転写因子および／またはＲＮＡポリメラーゼ）を接触させることによって、プロモーターからの転写を抑制できる、タンパク質のドメインを指す。
【００９７】
用語「ＧＲＣｈ３８．ｐ１２」は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ受託番号ＧＣＡ＿０００００１４０５．２７および２０１７／１２／２１の日付を有する、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｕｉｌｄ  ３８パッチリリース１２（ＧＲＣｈ３８．ｐ１２）を指す。
【００９８】
他に示さない限り、本明細書で使用される全ての用語は、当業者にとってそれらが有するのと同じ意味を有し、本発明の実施は、当業者の知識の範囲内の分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡテクノロジーの従来技術を使用する。
操作された転写因子（ｅＴＦ）
【００９９】
転写因子（ＴＦ）は、ゲノム中の特異的配列に結合し、遺伝子の発現を制御するタンパク質である。本明細書で提供される操作された転写因子またはｅＴＦは、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、および転写モジュレーターである少なくとも１つのドメイン、例えば、転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）または転写リプレッサードメイン（ＴＲＤ）のいずれかを含む、天然に存在しないタンパク質である。一実施形態では、ｅＴＦは、１つのＤＢＤおよび１つのＴＡＤを含み得（例えば、ＴＡＤ−ＤＢＤまたはＤＢＤ−ＴＡＤ）、ＤＢＤおよびＴＡＤは、同じタンパク質または異なるタンパク質に由来し得る。別の実施形態では、ｅＴＦは、１つのＤＢＤおよび２つのＴＡＤを含み得、ここで、ＤＢＤおよびＴＡＤは、同じタンパク質に由来し、ＤＢＤは、第１のタンパク質に由来し、両方のＴＡＤは、第２のタンパク質に由来する、ＤＢＤおよび一方のＴＡＤは、第１のタンパク質に由来し、第２のＴＡＤは、第２のタンパク質に由来する、またはＤＢＤは、第１のタンパク質に由来し、一方のＴＡＤは、第２のタンパク質に由来し、第２のＴＡＤは、第３のタンパク質に由来する（例えば、ＴＡＤ１−ＤＢＤ−ＴＡＤ１またはＴＡＤ１−ＤＢＤ−ＴＡＤ２）。一実施形態では、ｅＴＦは、１つのＤＢＤおよび１つのＴＲＤを含み得（例えば、ＴＲＤ−ＤＢＤまたはＤＢＤ−ＴＲＤ）、ここで、ＤＢＤおよびＴＲＤは、同じタンパク質または異なるタンパク質に由来し得る。別の実施形態では、ｅＴＦは、１つのＤＢＤおよび２つのＴＲＤを含み得、ＤＢＤおよびＴＲＤは、同じタンパク質に由来し、ＤＢＤは、第１のタンパク質に由来し、両方のＴＲＤは、第２のタンパク質に由来する、ＤＢＤおよび一方のＴＲＤは、第１のタンパク質に由来し、第２のＴＲＤは、第２のタンパク質に由来する、またはＤＢＤは、第１のタンパク質に由来し、一方のＴＲＤは、第２のタンパク質に由来し、第２のＴＲＤは、第３のタンパク質に由来する（例えば、ＴＲＤ１−ＤＢＤ−ＴＲＤ１またはＴＲＤ１−ＤＢＤ−ＴＲＤ２）。ある特定の実施形態では、ＤＢＤは、複数のタンパク質由来のドメインを含む合成構築物であり得る。
【０１００】
ある特定の実施形態では、ＤＢＤおよびＴＡＤは、直接、例えば、介在するアミノ酸配列なしに、コンジュゲートされ得る。他の実施形態では、ＤＢＤおよびＴＡＤは、ペプチドリンカーを使用してコンジュゲートされ得る。ある特定の実施形態では、ＤＢＤは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、７５、８０、９０もしくは１００アミノ酸、または１〜５、１〜１０、１〜２０、１〜３０、１〜４０、１〜５０、１〜７５、１〜１００、５〜１０、５〜２０、５〜３０、５〜４０、５〜５０、５〜７５、５〜１００、１０〜２０、１０〜３０、１０〜４０、１０〜５０、１０〜７５、１０〜１００、２０〜３０、２０〜４０、２０〜５０、２０〜７５もしくは２０〜１００アミノ酸を有するリンカーを介してＴＡＤにコンジュゲートする。一部の場合には、ＤＢＤおよびＴＡＤは、それらのドメインが由来する天然に存在するタンパク質中に見出される天然に存在する介在する残基を介してコンジュゲートされる。他の実施形態では、ＤＢＤおよびＴＡＤは、合成または外因性リンカー配列を介してコンジュゲートされる。適切なリンカーは、可撓性、切断性、非切断性、親水性および／または疎水性であり得る。ある特定の実施形態では、ＤＢＤおよびＴＡＤは、複数のグリシンおよび／またはセリン残基を含むリンカーを介して一緒に融合され得る。グリシン／セリンペプチドリンカーの例には、［ＧＳ］ｎ、［ＧＧＧＳ］ｎ（配列番号４３６）、［ＧＧＧＧＳ］ｎ（配列番号４３７）、［ＧＧＳＧ］ｎ（配列番号４３８）が含まれ、式中、ｎは、１と等しいまたは１よりも大きい整数である。ある特定の実施形態では、ＤＢＤおよびＴＡＤをコンジュゲートするために有用なリンカーは、ＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号４１０）である。ある特定の実施形態では、ＤＢＤを２つのＴＡＤにコンジュゲートする場合、第１および第２のＴＡＤは、同じもしくは異なるリンカーを用いてＤＢＤにコンジュゲートしてよい、または一方のＴＡＤは、リンカーを用いてＤＢＤにコンジュゲートしてよく、他方のＴＡＤは、ＤＢＤに直接（例えば、介在するリンカー配列なしに）コンジュゲートする、または両方のＴＡＤは、ＤＢＤに直接（例えば、介在するリンカー配列なしに）コンジュゲートしてよい。
【０１０１】
本明細書で提供されるｅＴＦは、天然に存在する転写因子とは異なる特性を有する。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるｅＴＦは、ＤＢＤが、それが由来する天然に存在するタンパク質と比較して異なる標的部位に結合するように、かかる改変されたＤＢＤを含むｅＴＦが、そのＤＢＤが由来する天然に存在するタンパク質と比較して異なる遺伝子からの発現をモジュレートするように、および／またはかかる改変されたＤＢＤを含むｅＴＦが、そのＤＢＤが由来する天然に存在するタンパク質と比較して標的遺伝子の発現を異なってモジュレートする（例えば、上方調節する  対  下方調節する）ように改変された、天然に存在するタンパク質に由来するＤＢＤを含む。他の実施形態では、本明細書で提供されるｅＴＦは、かかる改変されたＴＡＤを含むｅＴＦが、そのＴＡＤが由来する天然に存在するタンパク質と比較して異なる遺伝子からの発現をモジュレートするように、および／またはかかる改変されたＴＡＤを含むｅＴＦが、そのＴＡＤが由来する天然に存在するタンパク質と比較して標的遺伝子（例えば、上方調節する  対  下方調節する）の発現を異なってモジュレートするように改変された、天然に存在するタンパク質に由来するＴＡＤを含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるｅＴＦは、天然に存在するタンパク質に由来するＤＢＤおよび天然に存在するタンパク質（同じタンパク質または異なるタンパク質のいずれか）に由来するＴＡＤを含み、ここで、ＤＢＤおよびＴＡＤは共に、改変されている。かかる実施形態では、ＤＢＤは、それが由来する天然に存在するタンパク質と比較して異なる標的部位に結合し得、かかる改変されたＤＢＤおよびＴＡＤを含むｅＴＦは、それらのドメインが由来する天然に存在するタンパク質と比較して異なる遺伝子からの発現をモジュレートし、および／またはかかる改変されたＤＢＤおよびＴＡＤを含むｅＴＦは、ＤＢＤおよびＴＡＤドメインが由来する天然に存在するタンパク質と比較して標的遺伝子の発現を異なってモジュレートする（例えば、上方調節する  対  下方調節する）。
ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）
【０１０２】
本明細書で提供されるｅＴＦは、目的の標的部位に結合する任意の適切なＤＢＤを含み得る。ある特定の実施形態では、ＤＢＤは、合成により設計されたＤＢＤであり得る。他の実施形態では、ＤＢＤは、天然に存在するタンパク質に由来し得る。ＤＢＤファミリーには、塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス（ｂＨＬＨ）（例えば、ｃ−Ｍｙｃ）、塩基性−ロイシンジッパー（例えば、Ｃ／ＥＢＰ）、ヘリックス−ターン−ヘリックス（例えば、Ｏｃｔ−１）およびジンクフィンガー（例えば、ＥＧＲ３）が含まれる。これらのファミリーは、広範なＤＮＡ結合特異性および遺伝子標的を示す。本明細書で企図する場合、公知のヒト転写因子タンパク質の任意の１つが、特異的標的部位を認識するようにＤＢＤを操作および／またはリプログラミングして目的の内因性遺伝子の発現のモジュレーションを生じさせるためのタンパク質プラットフォームとして機能し得る。例示的な実施形態では、本明細書で提供されるＤＢＤは、ジンクフィンガードメイン、ＴＡＬＥＮ結合ドメインまたはｇＲＮＡ／Ｃａｓ複合体を含む。
【０１０３】
本明細書で提供されるＤＢＤは、任意の目的の標的部位を認識するために設計され得る。例示的な実施形態では、ＤＢＤは、ｅＴＦが結合した場合に目的の遺伝子からの発現をモジュレート（例えば、上方調節または下方調節）することが可能な標的部位を認識するように操作される。例示的な実施形態では、ＤＢＤは、ゲノム位置を認識し、ｅＴＦが結合した場合に内因性遺伝子の発現をモジュレートするように設計される。ｅＴＦが結合した場合に目的の内因性遺伝子の発現をモジュレートすることが可能な結合部位は、標的遺伝子の遺伝子発現のモジュレーションを生じる、ゲノム中のどこにでも配置してよい。種々の実施形態では、結合部位は、目的の遺伝子（ｇｅｎｅ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ）とは異なる染色体上に、目的の遺伝子と同じ染色体上に、目的の遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）の上流に、目的の遺伝子のＴＳＳの下流に、目的の遺伝子のＴＳＳに対して近位に、目的の遺伝子に対して遠位に、目的の遺伝子のコード領域内に、目的の遺伝子のイントロン内に、目的の遺伝子のポリＡテイルの下流に、目的の遺伝子を調節するプロモーター配列内に、目的の遺伝子を調節するエンハンサー配列内に、または目的の遺伝子を調節するリプレッサー配列内に、配置してよい。
【０１０４】
ＤＢＤは、例えば、最小のオフターゲット結合を伴ってまたはオフターゲット結合を伴わずに、ＤＢＤによる標的結合部位配列の特異的認識をそれが提供する限り、任意の長さの標的結合部位に結合するように設計され得る。ある特定の実施形態では、標的結合部位は、全ての他の遺伝子と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、５００倍またはそれよりも高いレベルで、ｅＴＦが結合した場合の目的の内因性遺伝子の発現をモジュレートし得る。ある特定の実施形態では、標的結合部位は、４０個の最も近い近隣遺伝子（例えば、目的の遺伝子のコード配列の上流または下流のいずれかの、染色体上の最も近くに位置する４０個の遺伝子）と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、５００倍またはそれよりも高いレベルで、ｅＴＦが結合した場合の目的の内因性遺伝子の発現をモジュレートし得る。ある特定の実施形態では、標的結合部位は、少なくとも５ｂｐ、１０ｂｐ、１５ｂｐ、２０ｂｐ、２５ｂｐ、３０ｂｐ、３５ｂｐ、４０ｂｐ、４５ｂｐもしくは５０ｂｐまたはそれよりも長くてもよい。結合部位の具体的な長さは、ｅＴＦ中のＤＢＤの型によって通知される。一般に、結合部位の長さが長くなるほど、結合の特異性および遺伝子発現のモジュレーションは大きくなる（例えば、より長い結合部位は、より少ないオフターゲット効果を有する）。ある特定の実施形態では、より長い標的結合部位を認識するＤＢＤを有するｅＴＦは、より短い標的部位に結合するＤＢＤを有するｅＴＦで観察されるオフターゲット効果と比較して、非特異的結合に関連するより少ないオフターゲット効果（例えば、オフターゲット遺伝子、または目的の遺伝子以外の遺伝子の発現のモジュレーションなど）を有する。一部の場合には、オフターゲット結合における低減は、より短い標的結合部位を認識するＤＢＤを有する同等なｅＴＦと比較して、少なくとも１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９または１０倍低い。
【０１０５】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＤＢＤは、ＤＢＤにコンジュゲートされたＴＡＤが、目的の内因性遺伝子の発現レベルに対してより大きい影響を及ぼすために、より多くの転写因子を動員できるようにおよび／またはより長い期間にわたってかかる転写因子を動員できるようにより長い標的結合部位にそれが結合するように、増加した結合親和性を有するように改変され得る。ある特定の実施形態では、ｅＴＦは、ＤＢＤが標的結合部位に安定に結合し、内因性遺伝子を発現させるために必要な転写または転写機構を遮断するように、操作され得る。ある特定の実施形態では、ＤＢＤは、所望の標的部位へのその特異的結合（またはオンターゲット（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ）結合）を増加させるように改変され得、および／またはその非特異的もしくはオフターゲット結合を減少させるように改変され得る。
【０１０６】
種々の実施形態では、ＤＢＤまたはｅＴＦと標的結合部位との間の結合は、種々の方法を使用して決定することができる。ある特定の実施形態では、ＤＢＤまたはｅＴＦと標的結合部位との間の特異的結合は、移動度シフトアッセイ、ＤＮａｓｅ保護アッセイ、またはタンパク質−ＤＮＡ結合をアッセイするための当該分野で公知の任意の他のｉｎ  ｖｉｔｒｏ法を使用して決定することができる。他の実施形態では、ｅＴＦと標的結合部位との間の特異的結合は、例えば、標的結合部位にｅＴＦが結合した場合の遺伝子の発現（ＲＮＡまたはタンパク質）を測定することによって、機能的アッセイを使用して決定することができる。例えば、標的結合部位は、細胞中に含まれまたは細胞のゲノム中に組み込まれるベクター上のレポーター遺伝子（例えば、ｅＧＦＰなど）または目的の標的遺伝子の上流に配置することができ、ここで、細胞は、ｅＴＦを発現する。対照（例えば、ｅＴＦなし、または異なる標的部位を認識するｅＴＦ）と比較した、ｅＴＦの存在下でのレポーター遺伝子（または目的の標的遺伝子）の発現のより高いレベルは、ｅＴＦのＤＢＤが標的部位に結合することを示す。適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば、細胞に基づかない）転写系および翻訳系もまた、同様の様式で使用し得る。ある特定の実施形態では、標的部位に結合するｅＴＦは、対照（例えば、ｅＴＦなし、または異なる標的部位を認識するｅＴＦ）と比較して、レポーター遺伝子または目的の標的遺伝子の、少なくとも２倍、３倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍またはそれよりも高い発現を有し得る。
【０１０７】
他の実施形態では、本明細書で提供されるｅＴＦは、ジンクフィンガータンパク質からの、ジンクフィンガータンパク質由来の、またはヌクレアーゼ不活性化ジンクフィンガータンパク質（ａ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｓ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）であるＤＢＤを含み得る。ジンクフィンガーは、フォールディングを安定化するための１つまたは複数の亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）の配位を特徴とする、小さいタンパク質構造モチーフである。ジンクフィンガー（Ｚｎｆ）ドメインは、ＤＮＡ標的部位とタンデムに接触する複数のフィンガー様突出を含む、比較的小さいタンパク質モチーフである。ジンクフィンガーモチーフのモジュール性の性質は、ＤＮＡ配列の多数の組合せが、高い程度の親和性および特異性で結合するのを可能にし、従って、特異的ＤＮＡ配列に標的化され得それに結合し得るタンパク質を操作するのに、理想的に適している。多くの操作されたジンクフィンガーアレイは、マウス転写因子Ｚｉｆ２６８のジンクフィンガードメインに基づく。Ｚｉｆ２６８は、高い親和性で９ｂｐ配列に集合的に結合する３個の個々のジンクフィンガーモチーフを有する。広範なジンクフィンガータンパク質が同定されており、本明細書にさらに記載されるように、構造に基づいて異なる型へと特徴付けられる。任意のかかるジンクフィンガータンパク質が、本明細書に記載されるＤＢＤと関連して有用である。
【０１０８】
ジンクフィンガータンパク質を設計するための種々の方法が利用可能である。例えば、目的の標的ＤＮＡ配列に結合するようにジンクフィンガータンパク質を設計するための方法は記載されており、例えば、Ｌｉｕ  Ｑ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｄａｃｔｙｌ  ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｕｎｉｑｕｅ  ａｄｄｒｅｓｓｉｎｇ  ｗｉｔｈｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｇｅｎｏｍｅｓ，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  ９４  （１１）：  ５５２５−３０  （１９９７）；Ｗｒｉｇｈｔ  ＤＡ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ  ｒｅａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｂｙ  ｍｏｄｕｌａｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ，  Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ．  Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．  ２００６；１（３）：１６３７−５２；およびＣＡ  Ｇｅｒｓｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｔ  Ｇａｊ，  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｔｈｅ  Ａｄｖｅｎｔ  ｏｆ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  ４７：  ２３０９−２３１８  （２０１４）を参照のこと。さらに、目的のＤＮＡ標的配列に結合するようにジンクフィンガータンパク質を設計するための種々のウェブに基づくツールが公に入手可能であり、例えば、ｏｍｉｃｔｏｏｌｓ．ｃｏｍ／ｚｆｎｓ−ｃａｔｅｇｏｒｙにおいてワールドワイドウェブ上で入手可能なＯｍｉｃＸからのＺｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＴｏｏｌｓおよびＧｅｎｏｍｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓウェブサイト；ならびにｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ／ｂａｒｂａｓ／ｚｆｄｅｓｉｇｎ／ｚｆｄｅｓｉｇｎｈｏｍｅ．ｐｈｐにおいてワールドワイドウェブ上で入手可能なＳｃｒｉｐｐｓからのＺｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｔｏｏｌｓ設計ウェブサイトを参照のこと。さらに、目的のＤＮＡ標的配列に結合するようにジンクフィンガータンパク質を設計するための種々の市販のサービスが利用可能であり、例えば、Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌａｂｓによって提供される市販のサービスまたはキット（ｃｒｅａｔｉｖｅ−ｂｉｏｌａｂｓ．ｃｏｍ／Ｄｅｓｉｇｎ−ａｎｄ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−ｏｆ−Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ−Ｚｉｎｃ−Ｆｉｎｇｅｒ−Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．ｈｔｍｌにおけるワールドワイドウェブ）、Ａｄｄｇｅｎｅから入手可能なＺｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｋｉｔ（ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｋｉｔｓ／ｚｆｃ−ｍｏｄｕｌａｒ−ａｓｓｅｍｂｌｙ／におけるワールドワイドウェブ）、またはＳｉｇｍａ  ＡｌｄｒｉｃｈからのＣｏｍｐｏＺｒ  Ｃｕｓｔｏｍ  ＺＦＮ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｌｉｆｅ−ｓｃｉｅｎｃｅ／ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ−ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／ｃｕｓｔｏｍ−ｚｆｎ．ｈｔｍｌにおけるワールドワイドウェブ）を参照のこと。
【０１０９】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるｅＴＦは、１つもしくは複数のジンクフィンガーを含むＤＢＤを含み、またはジンクフィンガータンパク質のＤＢＤに由来する。一部の場合には、ＤＢＤは、複数のジンクフィンガーを含み、各ジンクフィンガーは、そのＮ末端もしくはＣ末端、または両方において、アミノ酸リンカーを介して別のジンクフィンガーまたは別のドメインに連結される。一部の場合には、本明細書で提供されるＤＢＤは、表５に記載されるジンクフィンガー型の１つまたは複数からの１つまたは複数のジンクフィンガーを含む。一部の場合には、本明細書で提供されるＤＢＤは、複数のジンクフィンガー構造またはモチーフ、あるいは配列番号１１５〜１３０もしくは１４１〜１６４のうち１つもしくは複数、またはそれらの任意の組合せを有する複数のジンクフィンガーを含む。ある特定の実施形態では、ＤＢＤは、Ｘ−［ＺＦ−Ｘ］ｎおよび／または［Ｘ−ＺＦ］ｎ−Ｘを含み、式中、ＺＦは、表５に列挙されるモチーフのいずれか１つ（例えば、配列番号３９〜４９のいずれか１つ）を有するジンクフィンガードメインであり、Ｘは、１〜５０アミノ酸を含むアミノ酸リンカーであり、ｎは、１〜１５の整数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５であり、各ＺＦは、ＤＢＤ中の他のＺＦ配列と同じ配列または異なる配列を独立して有し得、各リンカーＸは、ＤＢＤ中の他のＸ配列と同じ配列または異なる配列を独立して有し得る。各ジンクフィンガーは、そのＣ末端、Ｎ末端、または両方において、別の配列、ジンクフィンガーまたはドメインに連結され得る。ＤＢＤ中で、各リンカーＸは、配列、長さおよび／もしくは特性（例えば、可撓性または電荷）が同一であり得、または配列、長さおよび／もしくは特性が異なり得る。一部の場合には、２個またはそれよりも多くのリンカーが同一であり得るが、他のリンカーは異なる。例示的な実施形態では、リンカーは、表５に提供される１つまたは複数の天然に存在するジンクフィンガータンパク質中に見出されるジンクフィンガーを接続する配列から得ることができるかまたはそれに由来し得る。他の実施形態では、適切なリンカー配列には、例えば、５またはそれよりも多くのアミノ酸長のリンカーが含まれる。６またはそれよりも多くのアミノ酸長の例示的なリンカー配列については、その各々がそれらの全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号もまた参照のこと。本明細書で提供されるＤＢＤタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間に適切なリンカーの任意の組合せを含み得る。本明細書に記載されるＤＢＤタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間に適切なリンカーの任意の組合せを含み得る。
【０１１０】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＤＢＤは、１つまたは複数の古典的ジンクフィンガーを含む。古典的Ｃ２Ｈ２ジンクフィンガーは、亜鉛イオンが配位した、一方の鎖中の２つのシステインおよび別の鎖中の２つのヒスチジン残基を有する。古典的ジンクフィンガードメインは、２つのβ−シートおよび１つのα−ヘリックスを有し、α−ヘリックスは、ＤＮＡ分子と相互作用して、標的部位へのＤＢＤ結合の基礎を形成し、「認識ヘリックス」と呼ばれ得る。例示的な実施形態では、ジンクフィンガーの認識ヘリックスは、−１位、２位、３位または６位において少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、それにより、ジンクフィンガードメインの結合特異性を変化させる。他の実施形態では、本明細書で提供されるＤＢＤは、１つまたは複数の非古典的ジンクフィンガー、例えば、Ｃ２−Ｈ２、Ｃ２−ＣＨおよびＣ２−Ｃ２を含む。
【０１１１】
別の実施形態では、本明細書で提供されるＤＢＤドメインは、以下の構造を有するジンクフィンガーモチーフを含む：ＬＥＰＧＥＫＰ−［ＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳ  Ｘ  ＨＱＲＴＨ  ＴＧＥＫＰ］ｎ−ＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳ  Ｘ  ＨＱＲＴＨ−ＴＧＫＫＴＳ（配列番号４２１）、式中、ｎは、１〜１５の整数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５であり、各Ｘは独立して、３ｂｐの標的配列に結合することが可能な認識配列（例えば、認識ヘリックス）である。例示的な実施形態では、ｎは、３、６または９である。特に好ましい実施形態では、ｎは６である。種々の実施形態では、各Ｘは、ＤＢＤ中の他のＸ配列と比較して、同じアミノ酸配列または異なるアミノ酸配列を独立して有し得る。例示的な実施形態では、各Ｘは、ｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ／ｂａｒｂａｓ／ｚｆｄｅｓｉｇｎ／ｚｆｄｅｓｉｇｎｈｏｍｅ．ｐｈｐにおいてワールドワイドウェブ上にあるＳｃｒｉｐｐｓからのＺｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｔｏｏｌを使用して、３ｂｐの目的の標的結合部位と相互作用するように設計された７アミノ酸を含む配列である。
【０１１２】
ＤＢＤ内の各ジンクフィンガーは、３ｂｐを認識するので、ＤＢＤ中に含まれるジンクフィンガーの数は、ＤＢＤによって認識される結合部位の長さを通知する、例えば、１個のジンクフィンガーを有するＤＢＤは、３ｂｐを有する標的結合部位を認識し、２個のジンクフィンガーを有するＤＢＤは、６ｂｐを有する標的結合部位を認識し、３個のジンクフィンガーを有するＤＢＤは、９ｂｐを有する標的結合部位を認識し、４個のジンクフィンガーを有するＤＢＤは、１２ｂｐを有する標的結合部位を認識し、５個のジンクフィンガーを有するＤＢＤは、１５ｂｐを有する標的結合部位を認識し、６個のジンクフィンガーを有するＤＢＤは、１８ｂｐを有する標的結合部位を認識し、９個のジンクフィンガーを有するＤＢＤは、２７ｂｐを有する標的結合部位を認識する、などである。一般に、より長い標的結合部位を認識するＤＢＤは、より高い結合特異性（例えば、より少ないオフターゲットまたは非特異的結合）を示す。
【０１１３】
他の実施形態では、本明細書で提供されるＤＢＤは、ＤＢＤの結合特異性を変化させる（例えば、ＤＢＤによって認識される標的部位を変化させる）ために、ジンクフィンガードメインの認識ヘリックスの１つまたは複数において１つまたは複数のアミノ酸置換を行うことによって、天然に存在するジンクフィンガータンパク質から誘導される。本明細書で提供されるＤＢＤは、任意の天然に存在するジンクフィンガータンパク質に由来し得る。種々の実施形態では、かかるＤＢＤは、任意の種、例えば、マウス、ラット、ヒトなどのジンクフィンガータンパク質に由来し得る。例示的な実施形態では、本明細書で提供されるＤＢＤは、ヒトジンクフィンガータンパク質に由来する。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＤＢＤは、表５に列挙される天然に存在するタンパク質に由来する。例示的な実施形態では、本明細書で提供されるＤＢＤタンパク質は、ヒトＥＧＲジンクフィンガータンパク質、例えば、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＧＲ３またはＥＧＲ４に由来する。
【０１１４】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＤＢＤは、天然に存在するタンパク質のＤＢＤ内の１つまたは複数のジンクフィンガーを反復させることによってＤＢＤタンパク質中のジンクフィンガードメインの数を増加させるようにＤＢＤを改変することによって、天然に存在するタンパク質から誘導される。ある特定の実施形態では、かかる改変には、天然に存在するタンパク質のＤＢＤ内でのジンクフィンガーの、２倍、３倍、４倍またはさらなる増加（ｆｕｒｔｈｅｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ）が含まれる。一部の場合には、ヒトタンパク質のＤＢＤ由来の１つのジンクフィンガーの数を増やす（ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｄ）、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２コピーまたはそれよりも多くの同じジンクフィンガーモチーフが、ｅＴＦのＤＢＤにおいて反復される。一部の場合には、天然に存在するタンパク質のＤＢＤ由来のジンクフィンガーのセットの数を増やす、例えば、天然に存在するタンパク質のＤＢＤ由来の３個のジンクフィンガーのセットが、６個のジンクフィンガーを有するＤＢＤを有するｅＴＦを得るために２倍にされ、９個のジンクフィンガーを有するｅＴＦのＤＢＤを得るために３倍にされ、または１２個のジンクフィンガーを有するｅＴＦのＤＢＤを得るために４倍にされる、などである。一部の場合には、天然に存在するタンパク質のＤＢＤ由来の一群のジンクフィンガーが部分的に複製されて、より多くのジンクフィンガーを有するｅＴＦのＤＢＤを形成する、例えば、ｅＴＦのＤＢＤは、４個のジンクフィンガーを含み、ここで、これらのジンクフィンガーは、ｅＴＦのＤＢＤ中の合計で４個のジンクフィンガーについて、天然に存在するタンパク質由来の１コピーの第１のジンクフィンガー、１コピーの第２のジンクフィンガーおよび２コピーの第３のジンクフィンガーを示す。次いで、かかるＤＢＤは、ＤＢＤの結合特異性を変化させる（例えば、ＤＢＤによって認識される標的部位を変化させる）ために、ジンクフィンガードメインの認識ヘリックスの１つまたは複数において１つまたは複数のアミノ酸置換を行うことによって、さらに改変される。例示的な実施形態では、ＤＢＤは、天然に存在するヒトタンパク質、例えば、ヒトＥＧＲジンクフィンガータンパク質、例えば、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＧＲ３またはＥＧＲ４に由来する。
【０１１５】
ヒトＥＧＲ１およびＥＧＲ３は、３−フィンガーＣ２Ｈ２ジンクフィンガーＤＢＤを特徴とする。ジンクフィンガーについての一般的な結合規則は、３個全てのフィンガーが、各ジンクフィンガーのアルファヘリックス中の同じアミノ酸を使用して、類似の形状寸法を有するそのコグネートＤＮＡ配列と相互作用して、標的結合部位配列の特異性または認識を決定すると規定している。かかる結合規則により、ＥＧＲ１またはＥＧＲ３のＤＢＤを改変して、所望の標的結合部位を認識するＤＢＤを操作することが可能になる。一部の場合には、ＥＧＲ１またはＥＧＲ３のジンクフィンガーモチーフ中の７−アミノ酸ＤＮＡ認識ヘリックスが、公開されたジンクフィンガー設計規則に従って改変される。ある特定の実施形態では、ＥＧＲ１またはＥＧＲ３の３−フィンガーＤＢＤ中の各ジンクフィンガーは、例えば、１つもしくは複数の認識ヘリックスの配列を変更させることによって、および／またはＤＢＤ中のジンクフィンガーの数を増加させることによって、改変される。ある特定の実施形態では、ＥＧＲ１またはＥＧＲ３は、所望の標的部位における少なくとも９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６またはそれよりも多くの塩基対の標的結合部位を認識するようにリプログラミングされる。ある特定の実施形態では、ＥＲＧ１またはＥＧＲ３に由来するかかるＤＢＤは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個またはそれよりも多くのジンクフィンガーを含む。例示的な実施形態では、ＤＢＤ中のジンクフィンガーの１つまたは複数は、認識ヘリックスの−１位、２位、３位または６位において少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０１１６】
種々の実施形態では、ＥＧＲ１またはＥＧＲ３に由来するＤＢＤを含むｅＴＦは、天然に存在するＥＧＲ１またはＥＧＲ３の結合特異性とは異なるＤＮＡ結合特異性を有し、例えば、ＤＢＤは、未改変のＥＧＲ１またはＥＧＲ３によって認識される結合部位の配列：（ＧＣＧ（Ｔ／Ｇ）ＧＧＧＣＧ）とは異なる配列（配列番号３７３）を有する標的結合部位を認識する。
【０１１７】
他の実施形態では、本明細書で提供されるｅＴＦは、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ複合体であるＤＢＤを含む。ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）／Ｃａｓ９は、部位特異的ゲノム標的化を可能にするゲノム編集ツールである。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、部位特異的ＤＮＡ切断を誘導するようにＣａｓ９ヌクレアーゼをガイドする非コードＲＮＡを使用する原核生物適応免疫応答系である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、哺乳動物細胞におけるゲノム編集を媒介するための単純なＲＮＡプログラム可能な方法を作出するために役立てられてきた。シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体が次いで結合する特異的ゲノム位置へとＣａｓ９ヌクレアーゼを方向付けるように作製され得る。ｇＲＮＡは、種々の方法およびツールを使用して、目的の標的部位に結合するように設計され得る。例えば、目的の標的ＤＮＡ配列に結合するようにｇＲＮＡを設計するための方法は、Ａａｃｈ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｃａｓ９  ｔａｒｇｅｔｓ  ｉｎ  ｇｅｎｏｍｅｓ．  ＢｉｏＲｘｉｖ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｓ．  ｄｏｉ：  ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／００５０７４  （２０１４）；Ｂａｅ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｓ−ＯＦＦｉｎｄｅｒ：  ａ  ｆａｓｔ  ａｎｄ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｔｈａｔ  ｓｅａｒｃｈｅｓ  ｆｏｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｓ９  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ．  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．  ３０（１０）：１４７３−１４７５  （２０１４）；Ｄｏｅｎｃｈ，  Ｊ．  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｓｇＲＮＡ  ｄｅｓｉｇｎ  ｔｏ  ｍａｘｉｍｉｚｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｍｉｎｉｍｉｚｅ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ３４，  １８４−１９１  （２０１６）；Ｇｒａｔｚ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｉｇｈｌｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ．  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．  １９６（４）：９６１−９７１  （２０１４）；Ｈｅｉｇｗｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅ−ＣＲＩＳＰ：  ｆａｓｔ  ＣＲＩＳＰＲ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｉｔｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  １１（２）：１２２−１２３  （２０１４）；Ｍａ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｍｏｄｅｌ  ｏｒｇａｎｉｓｍ  ｇｅｎｏｍｅｓ．  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｉｎｔ．  ｄｏｉ：ｈｔｔｐ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１５５／２０１３／２７０８０５  （２０１３）；Ｍｏｎｔａｇｕｅ，  ｅｔ  ａｌ．  ＣＨＯＰＣＨＯＰ：  ａ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ａｎｄ  ＴＡＬＥＮ  ｗｅｂ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ４２（Ｗ１���：Ｗ４０１−Ｗ４０７  （２０１４）；Ｌｉｕ，  ｅｔ  ａｌ．  ＣＲＩＳＰＲ−ＥＲＡ：  ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ＣＲＩＳＰＲ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ，  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．  ３１（２２）：３６７６−３６７８  （２０１５）；Ｒａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９．  Ｎａｔｕｒｅ．  ５２０（７５４６）：１８６−１９１  （２０１５）；Ｗｕ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔａｒｇｅｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｑｕａｎｔ  Ｂｉｏｌ．  ２（２）：５９−７０  （２０１５）；Ｘｉａｏ，  ｅｔ  ａｌ．  ＣａｓＯＴ：  ａ  ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｓｅａｒｃｈｉｎｇ  ｔｏｏｌ．  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．  ３０（８）：１１８０−１１８２  （２０１４）；Ｚｅｔｓｃｈｅ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｐｆ１  ｉｓ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｏｆ  ａ  Ｃｌａｓｓ  ２  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  Ｓｙｓｔｅｍ．  Ｃｅｌｌ．  １６３（３）：７５９−７７１  （２０１５）に記載されている。さらに、目的のＤＮＡ標的配列に結合するようにｇＲＮＡを設計するための種々のウェブに基づくツールが公に入手可能であり、例えば、ａｔｕｍ．ｂｉｏ／ｅＣｏｍｍｅｒｃｅ／ｃａｓ９／ｉｎｐｕｔ？ｍｕｌｔｉｐｌｅＣｏｎｔａｃｔｓ＝ｆａｌｓｅにおいてワールドワイドウェブ上でＡＵＴＭから入手可能なＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡ  Ｄｅｓｉｇｎツール；ｐｏｒｔａｌｓ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇｐｐ／ｐｕｂｌｉｃ／ａｎａｌｙｓｉｓ−ｔｏｏｌｓ／ｓｇｒｎａ−ｄｅｓｉｇｎ−ｃｒｉｓｐｒａｉにおいてワールドワイドウェブ上でＢｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから入手可能なＣＲＩＳＰＲａ／ｉ  ｇＲＮＡ設計ツール；ｅ−ｃｒｉｓｐ．ｏｒｇ／Ｅ−ＣＲＩＳＰ／においてワールドワイドウェブ上で入手可能なＤＫＦＺ  Ｇｅｒｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒから入手可能なＥ−ＣＲＩＳＰ設計ツール；およびｄｅｓｉｇｎ．ｓｙｎｔｈｅｇｏ．ｃｏｍ／＃／においてワールドワイドウェブ上でＳｙｎｔｈｅｇｏから入手可能なＫｎｏｃｋｏｕｔ  Ｇｕｉｄｅ  Ｄｅｓｉｇｎツールを参照のこと。さらに、目的のＤＮＡ標的配列に結合するようにｇＲＮＡを設計するための種々の市販のサービスが利用可能であり、例えば、ＩＤＴ（ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ｓｉｔｅ／ｏｒｄｅｒ／ｄｅｓｉｇｎｔｏｏｌ／ｉｎｄｅｘ／ＣＲＩＳＰＲ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥにおけるワールドワイドウェブ）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｏｒｄｅｒ／ｃｕｓｔｏｍ−ｏｌｉｇｏ／ｃｒｉｓｐｒにおけるワールドワイドウェブ）およびＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ／ｇＲＮＡ−ｄｅｓｉｇｎ−ｔｏｏｌ．ｈｔｍｌにおけるワールドワイドウェブ）によって提供される市販のサービスを参照のこと。
【０１１８】
例示的な実施形態では、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ複合体であるＤＢＤは、ヌクレアーゼ非活性化Ｃａｓタンパク質即ちｄＣａｓ、例えば、ｄＣａｓ９、例えば、ヌクレアーゼ非活性化Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ｄＳａＣａｓ９）またはヌクレアーゼ非活性化Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９（ｄＳｐＣａｓ９）などを含む。ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ複合体を所望の標的部位へと標的化する標的化領域およびＣａｓタンパク質との相互作用を促進する足場領域を含む配列として提供される。任意の適切なｇＲＮＡ足場が、本明細書で提供されるｇＲＮＡと関連して使用し得る。例示的な実施形態では、ｇＲＮＡは、シングルｇＲＮＡ即ちｓｇＲＮＡであり、以下の足場配列を含む：５’−ＧＴＴＴＴＡＧＴＡＣＴＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＡＡＴＣＴＡＣＴＡＡＡＡＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴＧＣＣＧＴＧＴＴＴＡＴＣＴＣＧＴＣＡＡＣＴＴＧＴＴＧＧＣＧＡＧＡ−３’（配列番号１０２）。ガイドＲＮＡの標的化領域を足場配列の５’末端に結合して、完全なｓｇＲＮＡを形成する。ある特定の実施形態では、ｇＲＮＡおよびｄＣａｓタンパク質は、同じ発現カセットから発現され得る。ある特定の実施形態では、Ｕ６プロモーターが、ｇＲＮＡを発現させるために使用される。他の実施形態では、ｇＲＮＡは、例えば、ｄＣａｓをゲノム中に、または染色体外で安定に維持されるプラスミド上に安定に組み込むことによってｄＣａｓ−ＴＡＤタンパク質を安定に発現するように操作された細胞において発現され得る。
【０１１９】
他の実施形態では、本明細書で提供されるｅＴＦは、ＴＡＬＥＮからの、ＴＡＬＥＮに由来する、またはヌクレアーゼ不活性化ＴＡＬＥＮ（ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｓ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＴＡＬＥＮ）であるＤＢＤを含み得る。転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ＤＢＤ、およびＤＮＡの特異的配列を切断するように操作され得るヌクレアーゼドメインを含む制限酵素である。ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメイン（例えば、ヌクレアーゼ）にコンジュゲートすることによって作り出される。転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、所望の標的ＤＮＡ配列に結合するように操作され得、それによって、ヌクレアーゼドメインを特定の位置に向けさせる。
【０１２０】
ＴＡＬエフェクターは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ細菌由来の細菌タンパク質である。ＤＮＡ結合ドメインは、多様な１２番目および１３番目のアミノ酸を有する、反復された高度に保存された３３〜３４アミノ酸の配列を含む。これら２つの位置は、反復可変二残基（Ｒｅｐｅａｔ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ）（ＲＶＤ）と呼ばれ、高度に可変性であり、特異的ヌクレオチド認識との強い相関を示す。アミノ酸配列とＤＮＡ認識との間のこの直接的な関連性は、適切なＲＶＤを含む反復セグメントの組合せを選択することによる、所望の配列を特異的に標的化するＤＢＤの操作を可能にする。
【０１２１】
ＴＡＬＥを設計するための種々の方法が利用可能である。例えば、目的の標的ＤＮＡ配列に結合するようにＴＡＬＥを設計するための方法は、Ｔ．  Ｃｅｒｍａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．  ３９  （１２）：  ｅ８２  （２０１１）；Ｆ．  Ｚｈａｎｇ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  ２９  （２）：  １４９−５３  （２０１１）；Ｒ．  Ｍｏｒｂｉｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．  ３９  （１３）：  ５７９０−９  （２０１１）；Ｔ．  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．  ３９  （１４）：  ６３１５−２５  （２０１１）；Ｒ．  Ｇｅｉｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ．  ６（５）：  ｅ１９５０９  （２０１１）；およびＥ．  Ｗｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ．  ６  （５）：  ｅ１９７２２  （２０１１）に記載されている。さらに、目的のＤＮＡ標的配列に結合するようにＴＡＬＥを設計するための種々のウェブに基づくツールが公に入手可能であり、例えば、ｅ−ｔａｌｅｎ．ｏｒｇ／Ｅ−ＴＡＬＥＮ／ＴＡＬにおいてワールドワイドウェブ（ｗｏｌｄ  ｗｉｄｅ  ｗｅｂ）上で入手可能なＥ−Ｔａｌｅｎ、およびｔａｌｅ−ｎｔ．ｃａｃ．ｃｏｒｎｅｌｌ．ｅｄｕ／ｎｏｄｅ／ａｄｄ／ｓｉｎｇｌｅ−ｔａｌｅにおいてワールドワイドウェブ上で入手可能なＥｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔａｒｇｅｔｅｒ  ２．０ツールを参照のこと。さらに、目的のＤＮＡ標的配列に結合するようにＴＡＬＥを設計するための種々の市販のサービスが利用可能であり、例えば、ＯｍｉｃＸ（ｏｍｉｃｔｏｏｌｓ．ｃｏｍ／におけるワールドワイドウェブ）、Ａｄｄｇｅｎｅ（ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｔａｌｅｎ／ｇｕｉｄｅ／におけるワールドワイドウェブ）またはＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｕｓ／ｅｎ／ｈｏｍｅ／ｌｉｆｅ−ｓｃｉｅｎｃｅ／ｇｅｎｏｍｅ−ｅｄｉｔｉｎｇ／ｇｅｎｅａｒｔ−ｔａｌｓ／ｔａｌ−ｄｅｓｉｇｎ−ｔｏｏｌ．ｈｔｍｌにおけるワールドワイドウェブ）によって提供される市販のサービスを参照のこと。さらに、公に入手可能なソフトウェアプログラム（ＤＮＡＷｏｒｋｓ）が、ＴＡＬＥのアセンブリに適切なオリゴヌクレオチドを設計するために使用し得る、例えば、Ｄ．  Ｈｏｏｖｅｒ  Ｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  ８５２：  ２１５−２３  （２０１２）を参照のこと。
転写モジュレーションドメイン
【０１２２】
本明細書で提供されるｅＴＦは、ｅＴＦがＤＢＤ（例えば、ジンクフィンガーＤＢＤ、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ  ＤＢＤまたはＴＡＬＥ  ＤＢＤ）を介して標的部位に結合した場合に目的の遺伝子からの転写をモジュレートし得る１つもしくは複数のタンパク質因子（例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＣＢＰ／ｐ３００、ＣＲＥＢまたはＫＲＡＢ）または目的の遺伝子からの遺伝子発現のレベルをモジュレートし得る１つもしくは複数のタンパク質因子を動員することが可能な任意の適切なドメインを含み得る。ある特定の実施形態では、かかるドメインは、目的の遺伝子の転写または遺伝子発現のレベルを増加させるタンパク質因子を動員し、かつそれは、転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）である。他の実施形態では、かかるドメインは、目的の遺伝子からの転写または遺伝子発現のレベルを減少させるタンパク質因子を動員し、かつそれは、転写リプレッサードメイン（ＴＲＤ）である。ある特定の実施形態では、転写モジュレーションドメイン（ＴＡＤまたはＴＲＤ）は、合成により設計されたドメインであり得る。他の実施形態では、転写モジュレーションドメイン（ＴＡＤまたはＴＲＤ）は、天然に存在するタンパク質、例えば、転写因子、転写コアクチベーター、転写コリプレッサーまたはサイレンサータンパク質に由来し得る。種々の実施形態では、転写モジュレーションドメイン（ＴＡＤまたはＴＲＤ）は、任意の種、例えば、マウス、ラット、サル、ウイルスまたはヒトのタンパク質に由来し得る。
【０１２３】
例示的な一実施形態では、本明細書で提供されるｅＴＦにおける使用に適切なＴＡＤは、ウイルスタンパク質に由来する。ウイルスタンパク質に由来する例示的なＴＡＤには、例えば、ＶＰ６４（配列番号９５）、ＶＰＲ（配列番号１１４）、ＶＰ１６、ＶＰ１２８、ｐ６５、ｐ３００のＴＡＤドメイン、またはそれらの任意の機能的断片もしくはバリアント、あるいはそれらに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列が含まれる。
【０１２４】
別の例示的な実施形態では、本明細書で提供されるｅＴＦにおける使用に適切なＴＡＤは、ヒトタンパク質に由来する。ヒトタンパク質に由来する例示的なＴＡＤには、例えば、ＣＢＰ／ｐ３００相互作用トランスアクチベーター２（ＣＩＴＥＤ２）（配列番号９６または９８）、ＣＢＰ／ｐ３００相互作用トランスアクチベーター４（ＣＩＴＥＤ４）（配列番号９７または１００）、ＥＧＲ１（配列番号１）もしくはＥＧＲ３（配列番号４２２）のＴＡＤドメイン、またはそれらの任意の機能的断片もしくはバリアント、あるいはそれらに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列が含まれる。
【０１２５】
別の実施形態では、本明細書で提供されるｅＴＦにおける使用に適切なＴＲＤは、転写を阻害するタンパク質を動員し得るＫＲＡＢドメイン、またはそれらの任意の機能的断片もしくはバリアント、あるいはそれらに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含む。
【０１２６】
ある特定の実施形態では、ジンクフィンガーＤＢＤは、以下にさらに記載されるように、転写モジュレーションドメイン、例えば、ＴＡＤまたはＴＲＤにコンジュゲートする。種々の実施形態では、ジンクフィンガーＤＢＤは、ウイルスタンパク質、例えば、ＶＰ６４もしくはＶＰＲ由来のＴＡＤ、またはヒトタンパク質、例えば、ＣＩＴＥＤ２もしくはＣＩＴＥＤ４由来のＴＡＤにコンジュゲートされ得る。ある特定の実施形態では、ヒトタンパク質、例えば、ＥＧＲ１またはＥＧＲ３に由来するジンクフィンガーＤＢＤは、ヒトタンパク質、例えば、ＣＩＴＥＤ２またはＣＩＴＥＤ４に由来するＴＡＤにコンジュゲートする。ある特定の実施形態では、ヒトタンパク質、例えば、ＥＧＲ１またはＥＧＲ３に由来するジンクフィンガーＤＢＤは、ＶＰ６４またはＶＰＲ  ＴＡＤにコンジュゲートする。ある特定の実施形態では、合成ジンクフィンガーＤＢＤ、またはヒトタンパク質、例えば、ＥＧＲ１もしくはＥＧＲ３に対して７５％未満の配列同一性を有するジンクフィンガーＤＢＤは、ヒトタンパク質、例えば、ＣＩＴＥＤ２またはＣＩＴＥＤ４に由来するＴＡＤにコンジュゲートする。ある特定の実施形態では、合成ジンクフィンガーＤＢＤ、またはヒトタンパク質、例えば、ＥＧＲ１もしくはＥＧＲ３に対して７５％未満の配列同一性を有するジンクフィンガーＤＢＤは、ＶＰ６４またはＶＰＲ  ＴＡＤにコンジュゲートする。
【０１２７】
ある特定の実施形態では、ｄＣａｓタンパク質は、以下にさらに記載されるように、転写モジュレーションドメイン、例えば、ＴＡＤまたはＴＲＤにコンジュゲートする。種々の実施形態では、ｄＣａｓ９は、ウイルスタンパク質、例えば、ＶＰ６４もしくはＶＰＲ由来のＴＡＤ、またはヒトタンパク質、例えば、ＣＩＴＥＤ２もしくはＣＩＴＥＤ４由来のＴＡＤにコンジュゲートされ得る。例示的な実施形態では、ｄＣａｓ９は、ＶＰ６４またはＶＰＲ  ＴＡＤにコンジュゲートする。
【０１２８】
ある特定の実施形態では、ＴＡＬＥタンパク質は、以下にさらに記載されるように、転写モジュレーションドメイン、例えば、ＴＡＤまたはＴＲＤにコンジュゲートする。種々の実施形態では、ＴＡＬＥは、ウイルスタンパク質、例えば、ＶＰ６４もしくはＶＰＲ由来のＴＡＤ、またはヒトタンパク質、例えば、ＣＩＴＥＤ２もしくはＣＩＴＥＤ４由来のＴＡＤにコンジュゲートされ得る。例示的な実施形態では、ＴＡＬＥは、ＶＰ６４またはＶＰＲ  ＴＡＤにコンジュゲートする。
ＳＣＮ１Ａを上方調節するｅＴＦ
【０１２９】
一態様では、本出願は、ナトリウム電位依存性チャネルアルファサブユニット１（ＳＣＮ１Ａ）遺伝子の発現を上方調節することが可能であり、その対応するタンパク質産物Ｎａｖ１．１の発現を増加させることが可能なｅＴＦを提供する。ＳＣＮ１Ａ遺伝子は、ナトリウムチャネルをアセンブルするために使用されるサブユニットをコードする遺伝子のファミリーに属する。正に荷電したナトリウムイオンを細胞中に輸送するこれらのチャネルは、細胞が電気的シグナルを生じそれを伝達する能力において重要な役割を果たす。ＳＣＮ１Ａ遺伝子は、Ｎａｖ１．１と呼ばれるナトリウムチャネルの１つの部分（アルファサブユニット）をコードする。これらのチャネルは、脳において主に見出され、この場所で、ナトリウムイオンの細胞中への流れを制御する。Ｎａｖ１．１チャネルは、１つの神経細胞（またはニューロン）から別の神経細胞（またはニューロン）へのシグナルの伝達に関与する。ＳＣＮ１Ａ遺伝子におけるいくつかの変異は、様々な重症度のさまざまな発作障害である遺伝性てんかん熱性けいれんプラス（ＧＥＦＳ＋）を引き起こすことが見出されている。これらの状態には、乳児期に開始し通常は５歳までに停止する単純熱性（発熱関連）けいれん、および熱性けいれんプラス（ＦＳ＋）が含まれる。ＦＳ＋には、小児期を超えて継続する、熱性けいれん、および発熱と関連しないもの（無熱性けいれん）を含む他の型の発作が関与する。ＧＥＦＳ＋スペクトルには、より長く持続し、制御が困難であり得るより重篤な発作を引き起こす他の状態、例えば、ドラベ症候群（乳児重症ミオクロニーてんかん即ちＳＭＥＩとしても公知）もまた含まれる。これらの再発性発作（てんかん）は、時間と共に悪化し得、脳機能における減退をしばしば伴う。多くの他の変異は、家族において生じる片頭痛の一形態である家族性片麻痺性片頭痛に関連付けられており、少なくとも１つの変異は、ある特定の抗発作薬物療法の有効性に関連付けられている。従って、ＳＣＮ１Ａの発現を増加させる本明細書で提供されるｅＴＦは、Ｎａｖ１．１チャネルにおける変異に関連する種々の疾患または障害を処置するために使用し得る。
【０１３０】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、サイズが少なくとも９ｂｐ、１２ｂｐ、１５ｂｐ、１８ｂｐ、２１ｂｐ、２４ｂｐ、２７ｂｐ、３０ｂｐ、３３ｂｐもしくは３６ｂｐである；９ｂｐ、１２ｂｐ、１５ｂｐ、１８ｂｐ、２１ｂｐ、２４ｂｐ、２７ｂｐもしくは３０ｂｐよりも長い；または９〜３３ｂｐ、９〜３０ｂｐ、９〜２７ｂｐ、９〜２４ｂｐ、９〜２１ｂｐ、９〜１８ｂｐ、９〜１５ｂｐ、９〜１２ｂｐ、１２〜３３ｂｐ、１２〜３０ｂｐ、１２〜２７ｂｐ、１２〜２４ｂｐ、１２〜２１ｂｐ、１２〜１８ｂｐ、１２〜１５ｂｐ、１５〜３３ｂｐ、１５〜３０ｂｐ、１５〜２７ｂｐ、１５〜２４ｂｐ、１５〜２１ｂｐ、１５〜１８ｂｐ、１８〜３３ｂｐ、１８〜３０ｂｐ、１８〜２７ｂｐ、１８〜２４ｂｐ、１８〜２１ｂｐ、２１〜３３ｂｐ、２１〜３０ｂｐ、２１〜２７ｂｐ、２１〜２４ｂｐ、２４〜３３ｂｐ、２４〜３０ｂｐ、２４〜２７ｂｐ、２７〜３３ｂｐ、２７〜３０ｂｐもしくは３０〜３３ｂｐである標的結合部位を認識する。例示的な実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、１８〜２７ｂｐ、１８ｂｐまたは２７ｂｐである標的結合部位を認識する。
【０１３１】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、第２染色体上に位置する標的結合部位を認識する。ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、ＳＣＮ１ＡのＴＳＳの上流または下流１１０ｋｂ、１００ｋｂ、９０ｋｂ、８０ｋｂ、７０ｋｂ、６０ｋｂ、５０ｋｂ、４０ｋｂ、３０ｋｂ、２０ｋｂ、１０ｋｂ、５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂまたは１ｋｂ以内にある第２染色体上に位置する標的結合部位を認識する。ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、ＳＣＮ１ＡのＴＳＳの上流１１０ｋｂ以内にある第２染色体上に位置する標的結合部位を認識する。ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、ＳＣＮ１ＡのＴＳＳの下流１１０ｋｂ以内にある第２染色体上に位置する標的結合部位を認識する。例示的な実施形態では、かかる標的結合部位は、１８〜２７ｂｐ、１８ｂｐまたは２７ｂｐである。
【０１３２】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、１６６１７９６５２〜１６５９８９５７１位の範囲内、１６６１２８０５０〜１６６１２７９５８位の範囲内、１６６１５５４１４〜１６６１４０５９０位の範囲内、１６６１７９６５２〜１６６１７７７２７２位の範囲内、または１６５９９９０２４６〜１６５９８９５９２位の範囲内にある第２染色体上に位置する標的結合部位を認識する（全てＧＲＣｈ３８．ｐ１２を参照して）。例示的な実施形態では、かかる標的結合部位は、１８〜２７ｂｐ、１８ｂｐまたは２７ｂｐである。
【０１３３】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、以下である標的結合部位を認識する：（ｉ）１８〜２７ｂｐ、１８ｂｐまたは２７ｂｐである、（ｉｉ）１６６１７８８８０、１６６１７８８７１、１６６１７７３６９、１６６１７７３６２、１６６１７７２９９、１６６１７７２９９、１６６１５５３９３、１６６１５５２６４、１６６１４９３７３、１６６１４９１７６、１６６１４９１６５、１６６１４９１１８、１６６１４８９５３、１６６１４８５６５、１６６１４２３９６、１６６１４２３９１、１６６１４２３４４、１６６１４２２３９、１６６１４１１６２、１６６１４０９２８、１６６１４０５９０、１６５９９００７６、１６５９８９６８４、１６５９８９５７１、１６６１５５２５５、１６６１５５０９９、１６６１４８８４３、１６６１４８３６１、１６６１４２２１９、１６６１４１０９０、１６５９９０２４６、１６５９９０１９３、１６６１４９１６８、１６６１２７９９１、１６６１２８００２、１６６１２８０３７または１６６１２８０２５から選択される第２染色体上の位置と重複する（全てＧＲＣｈ３８．ｐ１２を参照して）、および（ｉｉｉ）本明細書で開示されるｅＴＦが結合した場合にＳＣＮ１Ａの発現における少なくとも１．２倍の増加を生じることが可能である。
【０１３４】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、（ｉ）配列番号３５〜３７、１０１、１０５〜１１１、１３６、１９５〜２１１、２２４〜２３８もしくは２４０〜２６７のいずれかを含むまたはそれからなる標的部位に結合する、および（ｉｉ）本明細書で開示されるｅＴＦが結合した場合にＳＣＮ１Ａの発現における少なくとも１．２倍の増加を生じることが可能である。
【０１３５】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、以下である標的結合部位を認識する：（ｉ）１８〜２７ｂｐ、１８ｂｐまたは２７ｂｐである、（ｉｉ）１６６１５５２５５、１６６１５５０９９、１６６１４８８４３、１６６１４８３６１、１６６１４２２１９、１６６１４１０９０、１６５９９０２４６、１６５９９０１９３、１６６１４９１６８、１６６１２７９９１、１６６１２８００２、１６６１２８０３７または１６６１２８０２５から選択される第２染色体上の位置と重複する（全てＧＲＣｈ３８．ｐ１２を参照して）、および（ｉｉｉ）本明細書で開示されるｅＴＦが結合した場合にＳＣＮ１Ａの発現における少なくとも２倍の増加を生じることが可能である。
【０１３６】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、（ｉ）配列番号３５〜３６、１０８〜１０９、１３６、２０９〜２１０、２２６、２２８、２３３、２３６もしくは２４７〜２４８のいずれかを含むまたはそれからなる標的部位に結合する、および（ｉｉ）本明細書で開示されるｅＴＦが結合した場合にＳＣＮ１Ａの発現における少なくとも２倍の増加を生じることが可能である。
【０１３７】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、以下である標的結合部位を認識する：（ｉ）１８〜２７ｂｐ、１８ｂｐまたは２７ｂｐである、および（ｉｉ）１６６１４９１６８、１６６１２７９９１、１６６１２８００２、１６６１２８０３７または１６６１２８０２５から選択される第２染色体上の位置と重複する（全てＧＲＣｈ３８．ｐ１２を参照して）、および（ｉｉｉ）本明細書で開示されるｅＴＦが結合した場合にＳＣＮ１Ａの発現における少なくとも５倍の増加を生じることが可能である。
【０１３８】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、（ｉ）配列番号３５、３６、１０８、１０９もしくは１３６のいずれかを含むまたはそれからなる標的部位に結合する、および（ｉｉ）本明細書で開示されるｅＴＦが結合した場合にＳＣＮ１Ａの発現における少なくとも５倍の増加を生じることが可能である。
【０１３９】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、以下である標的結合部位を認識する：（ｉ）１８〜２７ｂｐ、１８ｂｐまたは２７ｂｐである、（ｉｉ）１６６１２８００２、１６６１２８０３７または１６６１２８０２５から選択される第２染色体上の位置と重複する（全てＧＲＣｈ３８．ｐ１２を参照して）、および（ｉｉｉ）本明細書で開示されるｅＴＦが結合した場合にＳＣＮ１Ａの発現における少なくとも１５倍の増加を生じることが可能である。
【０１４０】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、（ｉ）配列番号３６、１０８もしくは１０９のいずれかを含むまたはそれからなる標的部位に結合する、および（ｉｉ）本明細書で開示されるｅＴＦが結合した場合にＳＣＮ１Ａの発現における少なくとも１５倍の増加を生じることが可能である。
【０１４１】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、以下である標的結合部位を認識する：（ｉ）１８〜２７ｂｐ、１８ｂｐまたは２７ｂｐである、（ｉｉ）１６６１２８０３７または１６６１２８０２５から選択される第２染色体上の位置と重複する（全てＧＲＣｈ３８．ｐ１２を参照して）、および（ｉｉｉ）本明細書で開示されるｅＴＦが結合した場合にＳＣＮ１Ａの発現における少なくとも２０倍の増加を生じることが可能である。
【０１４２】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、（ｉ）配列番号３６もしくは１０９のいずれかを含むまたはそれからなる標的部位に結合する、および（ｉｉ）本明細書で開示されるｅＴＦが結合した場合にＳＣＮ１Ａの発現における少なくとも２０倍の増加を生じることが可能である。
【０１４３】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、以下である標的結合部位を認識する：（ｉ）１８〜２７ｂｐ、１８ｂｐまたは２７ｂｐである、（ｉｉ）１６６１２８０２５位における第２染色体上の位置と重複する、および（ｉｉｉ）本明細書で開示されるｅＴＦが結合した場合にＳＣＮ１Ａの発現における少なくとも２５倍の増加を生じることが可能である。
【０１４４】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、（ｉ）配列番号３６を含むまたはそれからなる標的部位に結合する、および（ｉｉ）本明細書で開示されるｅＴＦが結合した場合にＳＣＮ１Ａの発現における少なくとも２５倍の増加を生じることが可能である。
【０１４５】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、（ｉ）１８〜２７ｂｐ、１８ｂｐまたは２７ｂｐである標的結合部位を認識し、（ｉｉ）配列番号３５〜３７、１０１、１０５〜１１１、１３６、１９５〜２１１、２２４〜２３８または２４０〜２６７のいずれか１つの配列を有するゲノム位置の少なくとも１ｋｂ、７５０ｂｐ、５００ｂｐ、４００ｂｐ、３００ｂｐ、２００ｂｐ、１００ｂｐまたは５０ｂｐ以内にあるゲノム領域に結合する。ある特定の実施形態では、標的結合部位は、本明細書で開示されるｅＴＦが結合した場合にＳＣＮ１Ａの発現における少なくとも１．２倍、２倍、５倍、１５倍、２０倍または２５倍の増加を生じることが可能である。
【０１４６】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、（ｉ）１８〜２７ｂｐ、１８ｂｐまたは２７ｂｐである標的結合部位を認識し、（ｉｉ）配列番号３５〜３７、１０１、１０５〜１１１、１３６、１９５〜２１１、２２４〜２３８または２４０〜２６７のいずれか１つの配列を有するゲノム位置と少なくとも部分的に重複するゲノム領域に結合する。ある特定の実施形態では、標的結合部位は、本明細書で開示されるｅＴＦが結合した場合にＳＣＮ１Ａの発現における少なくとも１．２倍、２倍、５倍、１５倍、２０倍または２５倍の増加を生じることが可能である。
【０１４７】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、以下の配列のいずれか１つを有する標的結合部位を認識する：配列番号３５〜３７、１０１、１０５〜１１１、１３６、１９５〜２１１、２２４〜２３８または２４０〜２６７。ある特定の実施形態では、標的結合部位は、本明細書で開示されるｅＴＦが結合した場合にＳＣＮ１Ａの発現における少なくとも１．２倍、２倍、５倍、１５倍、２０倍または２５倍の増加を生じることが可能である。
【０１４８】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、対照（例えば、ｅＴＦなし、または標的部位を認識しないｅＴＦ）と比較して、細胞中でまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、ＳＣＮ１Ａ発現（ＳＣＮ１Ａ  ＲＮＡおよび／またはＮａｖ１．１タンパク質）の、少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、５０倍、１００倍もしくはそれよりも大きい、あるいは少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％またはそれよりも大きい上方調節を生じる。種々の実施形態では、ＳＣＮ１Ａ発現の上方調節は、ＰＣＲ法、ウエスタンブロットまたはイムノアッセイを使用して検出され得る。
【０１４９】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、転写活性化アッセイにおいて、ＳＣＮ１Ａ発現を、対照と比較して、少なくとも１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、８倍、１０倍、１２倍、１５倍、１８倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、１００倍もしくはそれよりも大きく、あるいは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％またはそれよりも大きく増加させることが可能な標的部位に結合する。例示的なＳＣＮ１Ａ転写活性化アッセイは、実施例３において本明細書で提供される。簡潔に述べると、ＨＥＫ２９３に、ｅＴＦを有するプラスミドまたは対照ｅＧＦＰレポーター構築物をトランスフェクトする。トランスフェクションの４８時間後、細胞が収集され、ＲＮＡが単離され、逆転写され、得られたｃＤＮＡ試料は、内因性ＳＣＮ１Ａ転写物のレベルを定量するために、ｑＰＣＲ（例えば、配列番号１９０および１９１を有するプライマーを使用する）によって分析される。ＧＡＰＤＨは、ＳＣＮ１Ａ発現の相対的レベルを決定するための参照遺伝子として使用し得る。
【０１５０】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、最小のオフターゲット効果、例えば、非特異的結合に関連するオフターゲット効果、例えば、オフターゲット遺伝子、またはＳＣＮ１Ａ以外の遺伝子の発現のモジュレーションなどを有する。一実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、ＳＣＮ１Ａを、対照と比較して１つまたは複数のオフターゲット遺伝子についてｅＴＦによって生じる発現よりも少なくとも５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍または５０倍大きく、対照と比較して特異的に上方調節する。例示的な実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、対照と比較したｅＴＦによって生じる４０個の最も近い近隣遺伝子（例えば、第２染色体上のＳＣＮ１Ａのコード配列に位置する４０個の最も近い遺伝子）、例えば、ＰＬＡ２Ｒ１、ＩＴＧＢ６、ＲＢＭＳ１、ＴＡＮＫ、ＰＳＭＤ１４、ＴＢＲ１、ＳＬＣ４Ａ１０、ＤＰＰ４、ＦＡＰ、ＩＦＩＨ１、ＧＣＡ、ＦＩＧＮ、ＧＲＢ１４、ＣＯＢＬＬ１、ＳＬＣ３８Ａ１１、ＳＣＮ３Ａ、ＳＣＮ２Ａ、ＣＳＲＮＰ３、ＧＡＬＮＴ３、ＴＴＣ２１Ｂ、ＳＣＮ９Ａ、ＳＣＮ７Ａ、Ｂ３ＧＡＬＴ１、ＳＴＫ３９、ＣＥＲＳ６、ＮＯＳＴＲＩＮ、ＳＰＣ２５、ＡＢＣＢ１１、ＤＨＲＳ９、ＢＢＳ５、ＫＬＨＬ４１、ＦＡＳＴＫＤ１、ＰＰＩＧ、ＣＣＤＣ１７３、ＰＨＯＳＰＨＯ２、ＫＬＨＬ２３、ＳＳＢ、ＭＥＴＴＬ５、ＵＢＲ３およびＭＹＯ３Ｂの転写よりも少なくとも１５倍大きく、対象と比較したＳＣＮ１Ａ遺伝子からの転写を特異的に上方調節する（表３３を参照のこと）。種々の実施形態では、ＳＣＮ１Ａ遺伝子からの転写の上方調節は、ＰＣＲ法を使用して検出され得る。
【０１５１】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、ドラベ症候群のＳｃｎ１ａｔｍ１ｋｅａマウスモデルにおける高体温発作（ＨＴＳ）アッセイにおいて発作の頻度を低減することが可能である。ある特定の実施形態では、本明細書で開示されるｅＴＦは、ＨＴＳアッセイにおける４２．６℃における発作の頻度を、対照（例えば、ＰＢＳ処置、またはｅＧＦＰをコードする配列を含むＡＡＶベクターによる処置）と比較して、少なくとも１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍もしくはそれよりも大きく、または少なくとも２０％、３０％  ４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％もしくはそれよりも大きく、低減することができる。ある特定の実施形態では、本明細書で開示されるｅＴＦは、アッセイにおいて実行したマウスの少なくとも６０％、６２％、６５％、７０％、７５％、７６％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％が４２．６℃において発作なしであるように、ＨＴＳアッセイにおける４２．６℃における発作の頻度を低減することができる。例示的なＨＴＳアッセイは、実施例１１において本明細書に記載される。簡潔に述べると、雌性Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスと交雑した雄性Ｓｃｎ１ａ＋／−マウスから生まれた仔の同腹仔に、Ｐ１における両側性ＩＣＶを介して、本明細書で提供されるＳＣＮ１Ａを上方調節するｅＴＦをコードするＡＡＶ９ベクターまたはｅＧＦＰをコードする対照ベクターが投与され得る。マウスに、約１．０Ｅ１０〜５．０Ｅ１２ｇｃ／マウスが投与され得る。ＨＴＳアッセイは、姿勢の喪失（ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｐｏｓｔｕｒｅ）を伴う最初の強直間代性けいれん発作の開始まで、または４３℃の体温に達するまで、マウスの体温を（制御された条件下で、体温モニタリングを伴って）２分毎に約０．５℃ずつ増加させることによって、混合１２９Ｓｔａｃ  Ｘ  Ｃ５７ＢＬ／６背景におけるＰ２６〜Ｐ２８のＳＣＮ１Ａヘテロ接合性マウスおよびＳＣＮ１Ａ野生型マウスにおいて実施される。姿勢の喪失を伴う発作が実験の全過程にわたって検出されない場合、マウスは発作なしとみなされる。
【０１５２】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、ＳＣＮ１Ａについてヘテロ接合性であるマウス、例えば、Ｓｃｎ１ａｔｍ１ｋｅａマウス系統の生存を増加させることが可能である。ある特定の実施形態では、本明細書で開示されるｅＴＦは、Ｐ１００におけるＳＣＮ１Ａヘテロ接合性マウスの生存率を、対照（例えば、ＰＢＳ処置、またはｅＧＦＰをコードする配列を含むＡＡＶベクターによる処置）と比較して、少なくとも１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍もしくはそれよりも大きく、または少なくとも２０％、３０％  ４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％もしくはそれよりも大きく、増加させることができる。ある特定の実施形態では、本明細書で開示されるｅＴＦは、アッセイにおいて実行したマウスの少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％が、Ｐ１００においてなおも生存しているように、Ｐ１００におけるＳＣＮ１Ａヘテロ接合性マウスの生存率を増加させることができる。例示的な生存アッセイは、実施例１２において本明細書に記載される。簡潔に述べると、雌性Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスと交雑した雄性Ｓｃｎ１ａ＋／−マウスから生まれた仔の同腹仔に、Ｐ１における両側性ＩＣＶを介して、ＡＡＶ９ベクターが投与され得る。マウスに、約１．０Ｅ１０〜５．０Ｅ１２ｇｃ／マウスが投与され得る。Ｐ１００まで生存したマウスの数が決定される。
【０１５３】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質に対して高いパーセント同一性を有する（以下にさらに記載されるとおり）。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の全体的配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質に対してより低い全体的パーセント配列同一性を有するｅＴＦと比較して、免疫原性の低減を示す。種々の実施形態では、免疫原性における低減は、ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ、イムノアッセイまたはｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ法を使用して測定し得る。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、ヒトＥＧＲ１またはＥＧＲ３に由来するＤＢＤおよびヒトＥＧＲ１、ＥＧＲ３、ＣＩＴＥＤ２またはＣＩＴＥＤ４に由来するＴＡＤを含み得る。
【０１５４】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、配列番号１１５〜１３０のいずれか１つを含む認識ヘリックスを含む１つまたは複数のジンクフィンガードメインを有するＤＮＡ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個のジンクフィンガードメインを有するＤＮＡ結合ドメインを含み、各ジンクフィンガードメイン（ｚｉｎｇｅｒ  ｆｉｎｇｅｒ  ｄｏｍａｉｎ）は、配列番号１１５〜１３０のいずれか１つを含む認識ヘリックスを独立して含む。ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、６個のジンクフィンガードメインを有するＤＮＡ結合ドメインを含み、各ジンクフィンガードメインは、配列番号１１５〜１３０のいずれか１つを含む認識ヘリックスを独立して含む。ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、９個のジンクフィンガードメインを有するＤＮＡ結合ドメインを含み、各ジンクフィンガードメインは、配列番号１１５〜１３０のいずれか１つを含む認識ヘリックスを独立して含む。例示的な実施形態では、かかるｅＴＦは、配列番号４２１を有するＤＮＡ結合ドメインを含み、各Ｘは、配列番号１１５〜１３０のいずれか１つから独立して選択され、ｎは６または９である。
【０１５５】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、以下のいずれか１つを有するＤＮＡ結合ドメインを含む：（ｉ）ＲＳＤＮＬＶＲ  ｘ  ＲＥＤＮＬＨＴ  ｘ  ＲＳＤＥＬＶＲ  ｘ  ＱＳＧＮＬＴＥ  ｘ  ＴＳＧＨＬＶＲ  ｘ  ＱＮＳＴＬＴＥ（配列番号１３５）を含む配列であって、式中、ｘは、１〜５０アミノ酸のリンカーであり得る、配列、（ｉｉ）配列番号１３５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する配列、または（ｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の機能的断片。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、ＶＰ６４、ＶＰＲ、ＣＩＴＥＤ２またはＣＩＴＥＤ４から選択される１つまたは複数のＴＡＤをさらに含む。一実施形態では、かかるｅＴＦは、ＤＢＤのＣ末端にコンジュゲートされたＶＰＲ  ＴＡＤドメインを含む。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、ＤＢＤのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端にコンジュゲートされたＣＩＴＥＤ２  ＴＡＤを含む。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、ＤＢＤのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端にコンジュゲートされたＣＩＴＥＤ４  ＴＡＤを含む。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、配列番号２５６を有する標的部位に結合することが可能であり、ＳＣＮ１Ａの発現を、対照と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍もしくはそれよりも大きく、あるいは対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％またはそれよりも大きく上方調節することが可能である。
【０１５６】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、以下のいずれか１つを有するＤＮＡ結合ドメインを含む：（ｉ）ＲＳＤＮＬＶＲ  ｘ  ＨＲＴＴＬＴＮ  ｘ  ＲＥＤＮＬＨＴ  ｘ  ＴＳＨＳＬＴＥ  ｘ  ＱＳＳＳＬＶＲ  ｘ  ＲＥＤＮＬＨＴ（配列番号３７１）を含む配列であって、式中、ｘは、１〜５０アミノ酸のリンカーであり得る、配列、（ｉｉ）配列番号３７１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する配列、または（ｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の機能的断片。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、ＶＰ６４、ＶＰＲ、ＣＩＴＥＤ２またはＣＩＴＥＤ４から選択される１つまたは複数のＴＡＤをさらに含む。一実施形態では、かかるｅＴＦは、ＤＢＤのＣ末端にコンジュゲートされたＶＰＲ  ＴＡＤドメインを含む。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、ＤＢＤのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端にコンジュゲートされたＣＩＴＥＤ２  ＴＡＤを含む。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、ＤＢＤのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端にコンジュゲートされたＣＩＴＥＤ４  ＴＡＤを含む。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、配列番号２６４を有する標的部位に結合することが可能であり、ＳＣＮ１Ａの発現を、対照と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍もしくはそれよりも大きく、あるいは対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％またはそれよりも大きく上方調節することが可能である。
【０１５７】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、以下のいずれか１つを有するＤＮＡ結合ドメインを含む：（ｉ）ＲＲＤＥＬＮＶ  ｘ  ＲＳＤＨＬＴＮ  ｘ  ＲＳＤＤＬＶＲ  ｘ  ＲＳＤＮＬＶＲ  ｘ  ＨＲＴＴＬＴＮ  ｘ  ＲＥＤＮＬＨＴ  ｘ  ＴＳＨＳＬＴＥ  ｘ  ＱＳＳＳＬＶＲ  ｘ  ＲＥＤＮＬＨＴ（配列番号３７２）を含む配列、（ｉｉ）配列番号３７２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する配列、または（ｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の機能的断片。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、ＶＰ６４、ＶＰＲ、ＣＩＴＥＤ２またはＣＩＴＥＤ４から選択される１つまたは複数のＴＡＤをさらに含む。一実施形態では、かかるｅＴＦは、ＤＢＤのＣ末端にコンジュゲートされたＶＰＲ  ＴＡＤドメインを含む。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、ＤＢＤのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端にコンジュゲートされたＣＩＴＥＤ２  ＴＡＤを含む。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、ＤＢＤのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端にコンジュゲートされたＣＩＴＥＤ４  ＴＡＤを含む。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、配列番号３７を有する標的部位に結合することが可能であり、ＳＣＮ１Ａの発現を、対照と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍もしくはそれよりも大きく、あるいは対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％またはそれよりも大きく、上方調節することが可能である。
【０１５８】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、以下のいずれか１つを有するＤＮＡ結合ドメインを含む：（ｉ）ＤＰＧＡＬＶＲ  ｘ  ＲＳＤＮＬＶＲ  ｘ  ＱＳＧＤＬＲＲ  ｘ  ＴＨＬＤＬＩＲ  ｘ  ＴＳＧＮＬＶＲ  ｘ  ＲＳＤＮＬＶＲ（配列番号３７６）を含む配列、（ｉｉ）配列番号３７６に対して少なくとも８９％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する配列、または（ｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の機能的断片。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、ＶＰ６４、ＶＰＲ、ＣＩＴＥＤ２またはＣＩＴＥＤ４から選択される１つまたは複数のＴＡＤをさらに含む。一実施形態では、かかるｅＴＦは、ＤＢＤのＣ末端にコンジュゲートされたＶＰＲ  ＴＡＤドメインを含む。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、ＤＢＤのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端にコンジュゲートされたＣＩＴＥＤ２  ＴＡＤを含む。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、ＤＢＤのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端にコンジュゲートされたＣＩＴＥＤ４  ＴＡＤを含む。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、配列番号１３６を有する標的部位に結合することが可能であり、ＳＣＮ１Ａの発現を、対照と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍もしくはそれよりも大きく、あるいは対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％またはそれよりも大きく、上方調節することが可能である。
【０１５９】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、以下のいずれか１つを含む：（ｉ）配列番号６〜９、１３〜１５、５７〜５８、６１〜６２、６７〜７１、７４〜７５、２６８〜２８２、２９５〜２９９、３０５〜３２５もしくは３６４〜３６６のいずれか１つを含む配列；（ｉｉ）配列番号２２〜２５、２９〜３１、８４〜８５、８８、９０〜９２、１３１〜１３５、３７１〜３７２、３７６、３９１〜４０９もしくは４２３〜４３５のいずれか１つを含む配列；（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の配列のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を含む配列；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の配列のいずれかの機能的断片もしくはバリアント。例示的な実施形態では、かかるｅＴＦは、ＳＣＮ１Ａ発現を、対照と比較して、少なくとも（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ａｔ  ｌｅａｓｔ）２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍もしくはそれよりも大きく、あるいは対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％またはそれよりも大きく上方調節することが可能である。
【０１６０】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、以下のいずれか１つを含む：（ｉ）配列番号２６８〜２８２、３０５〜３１２もしくは３６５〜３６６のいずれか１つを含む配列；（ｉｉ）配列番号１３１〜１３５、３７１〜３７２、３７６、３９１〜４０９もしくは４２３〜４２６のいずれか１つを含む配列；（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の配列のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を含む配列；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の配列のいずれかの機能的断片もしくはバリアント。例示的な実施形態では、かかるｅＴＦは、ＳＣＮ１Ａ発現を、対照と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍もしくはそれよりも大きく、あるいは対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％またはそれよりも大きく上方調節することが可能である。
【０１６１】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、以下のいずれか１つを含む：（ｉ）配列番号６〜９、１３〜１５、５７〜５８、６１〜６２、６７〜７１、７４〜７５、２９５〜２９９、３１３〜３２５もしくは３６４のいずれか１つを含む配列；（ｉｉ）配列番号２２〜２５、２９〜３１、８４〜８５、８８、９０〜９２もしくは４２７〜４３５のいずれか１つを含む配列；（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の配列のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を含む配列；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の配列のいずれかの機能的断片もしくはバリアント。例示的な実施形態では、かかるｅＴＦは、ＳＣＮ１Ａ発現を、対照と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍もしくはそれよりも大きく、あるいは対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％またはそれよりも大きく上方調節することが可能である。例示的な実施形態では、かかるｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の全体的配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質に対してより低い全体的パーセント配列同一性を有するｅＴＦと比較して、免疫原性の低減を示す。種々の実施形態では、免疫原性における低減は、ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ、イムノアッセイまたはｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ法を使用して測定し得る。
【０１６２】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、以下のいずれか１つを含む：（ｉ）配列番号３０５を含む配列；（ｉｉ）配列番号４２３を含む配列；（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を含む配列；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の配列のいずれかの機能的断片もしくはバリアント。例示的な実施形態では、かかるｅＴＦは、配列番号１３５を含み、配列番号２５６を有する標的部位に結合する。例示的な実施形態では、かかるｅＴＦは、ＳＣＮ１Ａ発現を、対照と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍もしくはそれよりも大きく、あるいは対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％またはそれよりも大きく上方調節することが可能である。
【０１６３】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、以下のいずれか１つを含む：（ｉ）配列番号３０６を含む配列；（ｉｉ）配列番号４２４を含む配列；（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を含む配列；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の配列のいずれかの機能的断片もしくはバリアント。例示的な実施形態では、かかるｅＴＦは、配列番号１３５を含み、配列番号２５６を有する標的部位に結合する。例示的な実施形態では、かかるｅＴＦは、ＳＣＮ１Ａ発現を、対照と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍もしくはそれよりも大きく、あるいは対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％またはそれよりも大きく上方調節することが可能である。
【０１６４】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、以下のいずれか１つを含む：（ｉ）配列番号３０８を含む配列；（ｉｉ）配列番号４２５を含む配列；（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を含む配列；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の配列のいずれかの機能的断片もしくはバリアント。例示的な実施形態では、かかるｅＴＦは、配列番号１３５を含み、配列番号２５６を有する標的部位に結合する。例示的な実施形態では、かかるｅＴＦは、ＳＣＮ１Ａ発現を、対照と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍もしくはそれよりも大きく、あるいは対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％またはそれよりも大きく上方調節することが可能である。
【０１６５】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、以下のいずれか１つを含む：（ｉ）配列番号３１３を含む配列；（ｉｉ）配列番号４２７を含む配列；（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を含む配列；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の配列のいずれかの機能的断片もしくはバリアント。例示的な実施形態では、かかるｅＴＦは、配列番号１３５を含み、配列番号２５６を有する標的部位に結合する。例示的な実施形態では、かかるｅＴＦは、ＳＣＮ１Ａ発現を、対照と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍もしくはそれよりも大きく、あるいは対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％またはそれよりも大きく上方調節することが可能である。例示的な実施形態では、かかるｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の全体的配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質に対してより低い全体的パーセント配列同一性を有するｅＴＦと比較して、免疫原性の低減を示す。種々の実施形態では、免疫原性における低減は、ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ、イムノアッセイまたはｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ法を使用して測定し得る。
【０１６６】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、以下のいずれか１つを含む：（ｉ）配列番号３１６を含む配列；（ｉｉ）配列番号４３０を含む配列；（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を含む配列；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の配列のいずれかの機能的断片もしくはバリアント。例示的な実施形態では、かかるｅＴＦは、配列番号１３５を含み、配列番号２５６を有する標的部位に結合する。例示的な実施形態では、かかるｅＴＦは、ＳＣＮ１Ａ発現を、対照と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍もしくはそれよりも大きく、あるいは対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％またはそれよりも大きく上方調節することが可能である。例示的な実施形態では、かかるｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の全体的配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質に対してより低い全体的パーセント配列同一性を有するｅＴＦと比較して、免疫原性の低減を示す。種々の実施形態では、免疫原性における低減は、ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ、イムノアッセイまたはｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ法を使用して測定し得る。
【０１６７】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、以下のいずれか１つを含む：（ｉ）配列番号３１７を含む配列；（ｉｉ）配列番号４３１を含む配列；（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を含む配列；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の配列のいずれかの機能的断片もしくはバリアント。例示的な実施形態では、かかるｅＴＦは、配列番号３７１を含み、配列番号２６４を有する標的部位に結合する。例示的な実施形態では、かかるｅＴＦは、ＳＣＮ１Ａ発現を、対照と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍もしくはそれよりも大きく、あるいは対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％またはそれよりも大きく上方調節することが可能である。例示的な実施形態では、かかるｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の全体的配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質に対してより低い全体的パーセント配列同一性を有するｅＴＦと比較して、免疫原性の低減を示す。種々の実施形態では、免疫原性における低減は、ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ、イムノアッセイまたはｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ法を使用して測定し得る。
【０１６８】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、以下のいずれか１つを含む：（ｉ）配列番号３１５を含む配列；（ｉｉ）配列番号４２９を含む配列；（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を含む配列；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の配列のいずれかの機能的断片もしくはバリアント。例示的な実施形態では、かかるｅＴＦは、配列番号１３５を含み、配列番号２５６を有する標的部位に結合する。例示的な実施形態では、かかるｅＴＦは、ＳＣＮ１Ａ発現を、対照と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍もしくはそれよりも大きく、あるいは対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％またはそれよりも大きく上方調節することが可能である。例示的な実施形態では、かかるｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の全体的配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質に対してより低い全体的パーセント配列同一性を有するｅＴＦと比較して、免疫原性の低減を示す。種々の実施形態では、免疫原性における低減は、ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ、イムノアッセイまたはｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ法を使用して測定し得る。
【０１６９】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、以下のいずれか１つを含む：（ｉ）配列番号３１９を含む配列；（ｉｉ）配列番号４３３を含む配列；（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を含む配列；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の配列のいずれかの機能的断片もしくはバリアント。例示的な実施形態では、かかるｅＴＦは、配列番号３７１を含み、配列番号２６４を有する標的部位に結合する。例示的な実施形態では、かかるｅＴＦは、ＳＣＮ１Ａ発現を、対照と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍もしくはそれよりも大きく、あるいは対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％またはそれよりも大きく上方調節することが可能である。例示的な実施形態では、かかるｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の全体的配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質に対してより低い全体的パーセント配列同一性を有するｅＴＦと比較して、免疫原性の低減を示す。種々の実施形態では、免疫原性における低減は、ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ、イムノアッセイまたはｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ法を使用して測定し得る。
【０１７０】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、以下のいずれか１つを含む：（ｉ）配列番号３１８を含む配列；（ｉｉ）配列番号４３２を含む配列；（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を含む配列；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の配列のいずれかの機能的断片もしくはバリアント。例示的な実施形態では、かかるｅＴＦは、配列番号３７１を含み、配列番号２６４を有する標的部位に結合する。例示的な実施形態では、かかるｅＴＦは、ＳＣＮ１Ａ発現を、対照と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍もしくはそれよりも大きく、あるいは対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％またはそれよりも大きく上方調節することが可能である。例示的な実施形態では、かかるｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の全体的配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質に対してより低い全体的パーセント配列同一性を有するｅＴＦと比較して、免疫原性の低減を示す。種々の実施形態では、免疫原性における低減は、ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ、イムノアッセイまたはｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ法を使用して測定し得る。
【０１７１】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、以下のいずれか１つを含む：（ｉ）配列番号３１４を含む配列；（ｉｉ）配列番号４２８を含む配列；（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を含む配列；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の配列のいずれかの機能的断片もしくはバリアント。例示的な実施形態では、かかるｅＴＦは、配列番号１３５を含み、配列番号２５６を有する標的部位に結合する。例示的な実施形態では、かかるｅＴＦは、ＳＣＮ１Ａ発現を、対照と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍もしくはそれよりも大きく、あるいは対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％またはそれよりも大きく上方調節することが可能である。例示的な実施形態では、かかるｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の全体的配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質に対してより低い全体的パーセント配列同一性を有するｅＴＦと比較して、免疫原性の低減を示す。種々の実施形態では、免疫原性における低減は、ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ、イムノアッセイまたはｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ法を使用して測定し得る。
【０１７２】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、以下のいずれか１つを含む：（ｉ）配列番号４４０を含む配列；（ｉｉ）配列番号４４１を含む配列；（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を含む配列；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の配列のいずれかの機能的断片もしくはバリアント。例示的な実施形態では、かかるｅＴＦは、配列番号１３５を含み、配列番号２５６を有する標的部位に結合する。例示的な実施形態では、かかるｅＴＦは、ＳＣＮ１Ａ発現を、対照と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍もしくはそれよりも大きく、あるいは対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％またはそれよりも大きく上方調節することが可能である。例示的な実施形態では、かかるｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の全体的配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質に対してより低い全体的パーセント配列同一性を有するｅＴＦと比較して、免疫原性の低減を示す。種々の実施形態では、免疫原性における低減は、ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ、イムノアッセイまたはｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ法を使用して測定し得る。
【０１７３】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、以下のいずれか１つを含む：（ｉ）配列番号３２５を含む配列；（ｉｉ）配列番号４３５を含む配列；（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を含む配列；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の配列のいずれかの機能的断片もしくはバリアント。例示的な実施形態では、かかるｅＴＦは、配列番号３７１を含み、配列番号２６４を有する標的部位に結合する。例示的な実施形態では、かかるｅＴＦは、ＳＣＮ１Ａ発現を、対照と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍もしくはそれよりも大きく、あるいは対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％またはそれよりも大きく上方調節することが可能である。例示的な実施形態では、かかるｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の全体的配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質に対してより低い全体的パーセント配列同一性を有するｅＴＦと比較して、免疫原性の低減を示す。種々の実施形態では、免疫原性における低減は、ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ、イムノアッセイまたはｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ法を使用して測定し得る。
【０１７４】
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ複合体を含むＤＢＤを含み、ｇＲＮＡは、配列番号１０５〜１１１、１１３、１９５〜２１１、２２４〜２３８または２４０〜２５１のいずれか１つを含む標的化配列を含む。ｇＲＮＡの標的配列は、以下の配列を有する足場配列の５’末端に結合される：５’−ＧＴＴＴＴＡＧＴＡＣＴＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＡＡＴＣＴＡＣＴＡＡＡＡＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴＧＣＣＧＴＧＴＴＴＡＴＣＴＣＧＴＣＡＡＣＴＴＧＴＴＧＧＣＧＡＧＡ−３’（配列番号１０２）。例示的な実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ非活性化Ｃａｓ９タンパク質である。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、Ｃａｓタンパク質にコンジュゲートされた１つまたは複数のＴＡＤをさらに含み、ＴＡＤは、ＶＰ６４、ＶＰＲ、ＣＩＴＥＤ２またはＣＩＴＥＤ４から選択される。一実施形態では、かかるｅＴＦは、Ｃａｓタンパク質のＣ末端にコンジュゲートされたＶＰＲ  ＴＡＤドメインを含む。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、Ｃａｓタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端にコンジュゲートされたＣＩＴＥＤ２  ＴＡＤを含む。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、Ｃａｓタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端にコンジュゲートされたＣＩＴＥＤ４  ＴＡＤを含む。例示的な実施形態では、かかるｅＴＦは、ＳＣＮ１Ａ発現を、対照と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍もしくはそれよりも大きく上方調節することが可能である。
プログラニュリン（ＧＲＮ）を上方調節するｅＴＦ
【０１７５】
別の態様では、本出願は、プログラニュリン（ＧＲＮ）遺伝子からの発現を上方調節することが可能であり、ＧＲＮタンパク質の発現を増加させることが可能なｅＴＦを提供する。プログラニュリン（ＧＲＮまたはＰＧＲＮ）は、グラニュリン前駆体としても公知であり、成長因子様の特性を有する分泌型システインリッチ糖タンパク質である。ＧＲＮは、染色体１７ｑ２１．３１上に位置する（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿００００１７．１１）。グラニュリンは、血管新生、創傷修復、細胞増殖および炎症において役割を果たす。プログラニュリン遺伝子における変異および／または分泌型プログラニュリンにおける欠損は、種々の神経変性疾患および代謝疾患、例えば、前頭側頭葉変性症；前頭側頭変性症または前頭側頭認知症、部分的プログラニュリン欠損に関連する早期発症型神経変性疾患；進行性非流暢失語症；意味性認知症；パーキンソン病；アルツハイマー病；およびプログラニュリンにおける完全欠損を伴う神経セロイドリポフスチン症（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｃｅｒｏｉｄ  ｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎｏｉｓｉｓ）に関連する。プログラニュリンにおける変異および／または欠損は、脂質の蓄積および細胞増殖に起因する動脈壁の炎症および肥厚を特徴とする進行性疾患であるアテローム動脈硬化症にも関連付けられている。従って、ＧＲＮの発現を増加させる本明細書で提供されるｅＴＦは、ＧＲＮにおける変異に関連する種々の疾患または障害を処置するために使用し得る。
【０１７６】
ある特定の実施形態では、ＧＲＮを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、サイズが少なくとも９ｂｐ、１２ｂｐ、１５ｂｐ、１８ｂｐ、２１ｂｐ、２４ｂｐ、２７ｂｐ、３０ｂｐ、３３ｂｐもしくは３６ｂｐである；９ｂｐ、１２ｂｐ、１５ｂｐ、１８ｂｐ、２１ｂｐ、２４ｂｐ、２７ｂｐもしくは３０ｂｐよりも長い；または９〜３３ｂｐ、９〜３０ｂｐ、９〜２７ｂｐ、９〜２４ｂｐ、９〜２１ｂｐ、９〜１８ｂｐ、９〜１５ｂｐ、９〜１２ｂｐ、１２〜３３ｂｐ、１２〜３０ｂｐ、１２〜２７ｂｐ、１２〜２４ｂｐ、１２〜２１ｂｐ、１２〜１８ｂｐ、１２〜１５ｂｐ、１５〜３３ｂｐ、１５〜３０ｂｐ、１５〜２７ｂｐ、１５〜２４ｂｐ、１５〜２１ｂｐ、１５〜１８ｂｐ、１８〜３３ｂｐ、１８〜３０ｂｐ、１８〜２７ｂｐ、１８〜２４ｂｐ、１８〜２１ｂｐ、２１〜３３ｂｐ、２１〜３０ｂｐ、２１〜２７ｂｐ、２１〜２４ｂｐ、２４〜３３ｂｐ、２４〜３０ｂｐ、２４〜２７ｂｐ、２７〜３３ｂｐ、２７〜３０ｂｐもしくは３０〜３３ｂｐである標的結合部位を認識する。例示的な実施形態では、ＧＲＮを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、１８〜２７ｂｐ、１８ｂｐまたは２７ｂｐである標的結合部位を認識する。
【０１７７】
ある特定の実施形態では、ＧＲＮを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、第１７染色体上に位置する標的結合部位を認識する。ある特定の実施形態では、ＧＲＮを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、ＧＲＮのＴＳＳの上流または下流１１０ｋｂ、１００ｋｂ、９０ｋｂ、８０ｋｂ、７０ｋｂ、６０ｋｂ、５０ｋｂ、４０ｋｂ、３０ｋｂ、２０ｋｂ、１０ｋｂ、５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂまたは１ｋｂ以内にある第１７染色体上に位置する標的結合部位を認識する。例示的な実施形態では、かかる標的結合部位は、１８〜２７ｂｐ、１８ｂｐまたは２７ｂｐである。
【０１７８】
ある特定の実施形態では、ＧＲＮを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、４４，３４４，９６３〜４４，３４５，１７８位内の第１７染色体上に位置する標的結合部位を認識する（ＧＲＣｈ３８．ｐ１２を参照して）。例示的な実施形態では、かかる標的結合部位は、１８〜２７ｂｐ、１８ｂｐまたは２７ｂｐである。
【０１７９】
ある特定の実施形態では、ＧＲＮを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、（ｉ）１８〜２７ｂｐ、１８ｂｐまたは２７ｂｐである標的結合部位を認識し、（ｉｉ）配列番号３８、１１３または３３０〜３３６のいずれか１つの配列を有するゲノム位置の少なくとも１ｋｂ、７５０ｂｐ、５００ｂｐ、４００ｂｐ、３００ｂｐ、２００ｂｐ、１００ｂｐまたは５０ｂｐ以内にあるゲノム領域に結合する。ある特定の実施形態では、標的結合部位は、本明細書で開示されるｅＴＦが結合した場合にＧＲＮの発現における少なくとも１．２倍、２倍、５倍、１５倍、２０倍または２５倍の増加を生じることが可能である。
【０１８０】
ある特定の実施形態では、ＧＲＮを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、（ｉ）１８〜２７ｂｐ、１８ｂｐまたは２７ｂｐである標的結合部位を認識し、（ｉｉ）配列番号３８、１１３または３３０〜３３６のいずれか１つの配列を有するゲノム位置と少なくとも部分的に重複するゲノム領域に結合する。ある特定の実施形態では、標的結合部位は、本明細書で開示されるｅＴＦが結合した場合にＳＣＮ１Ａの発現における少なくとも１．２倍、２倍、５倍、１５倍、２０倍または２５倍の増加を生じることが可能である。
【０１８１】
ある特定の実施形態では、ＧＲＮを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、以下の配列のいずれか１つを有する標的結合部位を認識する：配列番号３８、１１３、３３０〜３３６。ある特定の実施形態では、標的結合部位は、本明細書で開示されるｅＴＦが結合した場合にＳＣＮ１Ａの発現における少なくとも１．２倍、２倍、５倍、１５倍、２０倍または２５倍の増加を生じることが可能である。
【０１８２】
ある特定の実施形態では、ＧＲＮを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、対照（例えば、ｅＴＦなし、または標的部位を認識しないｅＴＦ）と比較して、細胞中でまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、ＧＲＮ発現（ＧＲＮ  ＲＮＡおよび／またはタンパク質）の、少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、５０倍、１００倍もしくはそれよりも大きい、あるいは２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％またはそれよりも大きい上方調節をもたらす。種々の実施形態では、ＧＲＮ発現の上方調節は、ＰＣＲ法、ウエスタンブロットまたはイムノアッセイを使用して検出され得る。
【０１８３】
ある特定の実施形態では、ＧＲＮを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、最小のオフターゲット効果、例えば、非特異的結合に関連するオフターゲット効果、例えば、オフターゲット遺伝子、またはＧＲＮ以外の遺伝子の発現のモジュレーションなどを有する。一実施形態では、ＧＲＮを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、ＧＲＮを、対照と比較して１つまたは複数のオフターゲット遺伝子についてｅＴＦによって生じる発現よりも少なくとも５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍または５０倍大きく、対照と比較して特異的に上方調節する。例示的な実施形態では、ＧＲＮを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、対照と比較したｅＴＦによって生じる１０、２０、３０、４０または５０個の最も近い近隣遺伝子（例えば、第１７染色体上のＧＲＮのコード配列に位置する１０、２０、３０、４０または５０個の最も近い遺伝子）の転写よりも少なくとも５倍、１０倍、１５倍、２０倍またはそれよりも大きく、対象と比較したＧＲＮ遺伝子からの転写を特異的に上方調節する。種々の実施形態では、ＧＲＮ遺伝子からの転写の上方調節は、ＰＣＲ法を使用して決定することができる。
【０１８４】
ある特定の実施形態では、ＧＲＮを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質に対して高いパーセント同一性を有する（以下にさらに記載されるとおり）。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の全体的配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質に対してより低い全体的パーセント配列同一性を有するｅＴＦと比較して、免疫原性の低減を示す。種々の実施形態では、免疫原性における低減は、ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ、イムノアッセイまたはｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ法を使用して測定し得る。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、ヒトＥＧＲ１またはＥＧＲ３に由来するＤＢＤおよびヒトＥＧＲ１、ＥＧＲ３、ＣＩＴＥＤ２またはＣＩＴＥＤ４に由来するＴＡＤを含み得る。
【０１８５】
ある特定の実施形態では、ＧＲＮを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、配列番号１４１〜１６４のいずれか１つを含む認識ヘリックスを含む１つまたは複数のジンクフィンガードメインを有するＤＮＡ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ＧＲＮを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個のジンクフィンガードメインを有するＤＮＡ結合ドメインを含み、各ジンクフィンガードメインは、配列番号１４１〜１６４のいずれか１つを含む認識ヘリックスを独立して含む。ある特定の実施形態では、ＧＲＮを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、６個のジンクフィンガードメインを有するＤＮＡ結合ドメインを含み、各ジンクフィンガードメインは、配列番号１４１〜１６４のいずれか１つを含む認識ヘリックスを独立して含む。ある特定の実施形態では、ＧＲＮを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、９個のジンクフィンガードメインを有するＤＮＡ結合ドメインを含み、各ジンクフィンガードメインは、配列番号１４１〜１６４のいずれか１つを含む認識ヘリックスを独立して含む。例示的な実施形態では、かかるｅＴＦは、配列番号４２１を有するＤＮＡ結合ドメインを含み、式中、各Ｘは、配列番号１４１〜１６４のいずれか１つから独立して選択され、ｎは６または９である。
【０１８６】
ある特定の実施形態では、ＧＲＮを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、以下のいずれか１つを有するＤＮＡ結合ドメインを含む：（ｉ）ＲＮＤＴＬＴＥ  ｘ  ＤＰＧＡＬＶＲ  ｘ  ＴＳＧＥＬＶＲ  ｘ  ＲＳＤＮＬＶＲ  ｘ  ＴＳＧＥＬＶＲ  ｘ  ＴＫＮＳＬＴＥ（配列番号１７１）を含む配列、（ｉｉ）配列番号１７１に対して少なくとも８９％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する配列、または（ｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の機能的断片。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、ＶＰ６４、ＶＰＲ、ＣＩＴＥＤ２またはＣＩＴＥＤ４から選択される１つまたは複数のＴＡＤをさらに含む。一実施形態では、かかるｅＴＦは、ＤＢＤのＣ末端にコンジュゲートされたＶＰＲ  ＴＡＤドメインを含む。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、ＤＢＤのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端にコンジュゲートされたＣＩＴＥＤ２  ＴＡＤを含む。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、ＤＢＤのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端にコンジュゲートされたＣＩＴＥＤ４  ＴＡＤを含む。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、配列番号３３１を有する標的部位に結合することが可能であり、ＧＲＮの発現を、対照と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍もしくはそれよりも大きく、あるいは対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％またはそれよりも大きく上方調節することが可能である。
【０１８７】
ある特定の実施形態では、ＧＲＮを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、以下のいずれか１つを有するＤＮＡ結合ドメインを含む：（ｉ）ＲＳＤＮＬＶＲ  ｘ  ＤＰＧＨＬＶＲ  ｘ  ＲＳＤＨＬＴＴ  ｘ  ＲＳＤＥＬＶＲ  ｘ  ＲＳＤＫＬＶＲ  ｘ  ＴＴＧＮＬＴＶ（配列番号４１２）を含む配列、（ｉｉ）配列番号４１２に対して少なくとも８９％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する配列、または（ｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の機能的断片。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、ＶＰ６４、ＶＰＲ、ＣＩＴＥＤ２またはＣＩＴＥＤ４から選択される１つまたは複数のＴＡＤをさらに含む。一実施形態では、かかるｅＴＦは、ＤＢＤのＣ末端にコンジュゲートされたＶＰＲ  ＴＡＤドメインを含む。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、ＤＢＤのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端にコンジュゲートされたＣＩＴＥＤ２  ＴＡＤを含む。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、ＤＢＤのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端にコンジュゲートされたＣＩＴＥＤ４  ＴＡＤを含む。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、配列番号３３２を有する標的部位に結合することが可能であり、ＧＲＮの発現を、対照と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍もしくはそれよりも大きく、あるいは対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％またはそれよりも大きく上方調節することが可能である。
【０１８８】
ある特定の実施形態では、ＧＲＮを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、以下のいずれか１つを有するＤＮＡ結合ドメインを含む：（ｉ）ＲＳＤＨＬＴＴ  ｘ  ＲＳＤＥＬＶＲ  ｘ  ＲＳＤＫＬＶＲ  ｘ  ＴＴＧＮＬＴＶ  ｘ  ＱＬＡＨＬＲＡ  ｘ  ＴＫＮＳＬＴＥ（配列番号４１３）を含む配列、（ｉｉ）配列番号４１３に対して少なくとも８９％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する配列、または（ｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の機能的断片。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、ＶＰ６４、ＶＰＲ、ＣＩＴＥＤ２またはＣＩＴＥＤ４から選択される１つまたは複数のＴＡＤをさらに含む。一実施形態では、かかるｅＴＦは、ＤＢＤのＣ末端にコンジュゲートされたＶＰＲ  ＴＡＤドメインを含む。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、ＤＢＤのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端にコンジュゲートされたＣＩＴＥＤ２  ＴＡＤを含む。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、ＤＢＤのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端にコンジュゲートされたＣＩＴＥＤ４  ＴＡＤを含む。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、配列番号３３３を有する標的部位に結合することが可能であり、ＧＲＮの発現を、対照と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍もしくはそれよりも大きく、あるいは対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％またはそれよりも大きく上方調節することが可能である。
【０１８９】
ある特定の実施形態では、ＧＲＮを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、以下のいずれか１つを有するＤＮＡ結合ドメインを含む：（ｉ）ＳＰＡＤＬＴＲ  ｘ  ＤＳＧＮＬＲＶ  ｘ  ＱＬＡＨＬＲＡ  ｘ  ＱＲＡＮＬＲＡ  ｘ  ＲＥＤＮＬＨＴ  ｘ  ＲＳＤＮＬＶＲ（配列番号４１４）を含む配列、（ｉｉ）配列番号４１４に対して少なくとも８９％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する配列、または（ｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の機能的断片。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、ＶＰ６４、ＶＰＲ、ＣＩＴＥＤ２またはＣＩＴＥＤ４から選択される１つまたは複数のＴＡＤをさらに含む。一実施形態では、かかるｅＴＦは、ＤＢＤのＣ末端にコンジュゲートされたＶＰＲ  ＴＡＤドメインを含む。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、ＤＢＤのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端にコンジュゲートされたＣＩＴＥＤ２  ＴＡＤを含む。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、ＤＢＤのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端にコンジュゲートされたＣＩＴＥＤ４  ＴＡＤを含む。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、配列番号３８を有する標的部位に結合することが可能であり、ＧＲＮの発現を、対照と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍もしくはそれよりも大きく、あるいは対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％またはそれよりも大きく上方調節することが可能である。
【０１９０】
ある特定の実施形態では、ＧＲＮを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、以下のいずれか１つを有するＤＮＡ結合ドメインを含む：（ｉ）ＴＳＨＳＬＴＥ  ｘ  ＨＫＮＡＬＱＮ  ｘ  ＥＲＳＨＬＲＥ  ｘ  ＳＫＫＡＬＴＥ  ｘ  ＱＲＡＮＬＲＡ  ｘ  ＲＫＤＮＬＫＮ  ｘ  ＱＳＳＮＬＶＲ  ｘ  ＱＳＳＳＬＶＲ  ｘ  ＱＡＧＨＬＡＳ（配列番号４１５）を含む配列、（ｉｉ）配列番号４１５に対して少なくとも８９％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する配列、または（ｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の機能的断片。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、ＶＰ６４、ＶＰＲ、ＣＩＴＥＤ２またはＣＩＴＥＤ４から選択される１つまたは複数のＴＡＤをさらに含む。一実施形態では、かかるｅＴＦは、ＤＢＤのＣ末端にコンジュゲートされたＶＰＲ  ＴＡＤドメインを含む。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、ＤＢＤのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端にコンジュゲートされたＣＩＴＥＤ２  ＴＡＤを含む。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、ＤＢＤのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端にコンジュゲートされたＣＩＴＥＤ４  ＴＡＤを含む。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、配列番号３３４を有する標的部位に結合することが可能であり、ＧＲＮの発現を、対照と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍もしくはそれよりも大きく、あるいは対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％またはそれよりも大きく上方調節することが可能である。
【０１９１】
ある特定の実施形態では、ＧＲＮを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、以下のいずれか１つを有するＤＮＡ結合ドメインを含む：（ｉ）ＱＳＧＤＬＲＲ  ｘ  ＳＰＡＤＬＴＲ  ｘ  ＤＳＧＮＬＲＶ  ｘ  ＱＬＡＨＬＲＡ  ｘ  ＱＲＡＮＬＲＡ  ｘ  ＲＥＤＮＬＨＴ  ｘ  ＲＳＤＮＬＶＲ（配列番号４１６）を含む配列、（ｉｉ）配列番号４１６に対して少なくとも８９％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する配列、または（ｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の機能的断片。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、ＶＰ６４、ＶＰＲ、ＣＩＴＥＤ２またはＣＩＴＥＤ４から選択される１つまたは複数のＴＡＤをさらに含む。一実施形態では、かかるｅＴＦは、ＤＢＤのＣ末端にコンジュゲートされたＶＰＲ  ＴＡＤドメインを含む。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、ＤＢＤのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端にコンジュゲートされたＣＩＴＥＤ２  ＴＡＤを含む。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、ＤＢＤのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端にコンジュゲートされたＣＩＴＥＤ４  ＴＡＤを含む。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、配列番号３３５を有する標的部位に結合することが可能であり、ＧＲＮの発現を、対照と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍もしくはそれよりも大きく、あるいは対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％またはそれよりも大きく上方調節することが可能である。
【０１９２】
ある特定の実施形態では、ＧＲＮを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、以下のいずれか１つを含む：（ｉ）配列番号１０、１６、５９〜６０、６３〜６４、７２〜７３、７６〜７７もしくは３３７〜３５０のいずれか１つを含む配列；（ｉｉ）配列番号２６、３２、８６〜８９、９３、１６５〜１７１、３７７〜３９０もしくは４１２〜４１６のいずれか１つを含む配列；（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の配列のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を含む配列；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の配列のいずれかの機能的断片もしくはバリアント。例示的な実施形態では、かかるｅＴＦは、ＧＲＮ発現を、対照と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍もしくはそれよりも大きく、あるいは対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％またはそれよりも大きく上方調節することが可能である。
【０１９３】
ある特定の実施形態では、ＧＲＮを上方調節する本明細書で開示されるｅＴＦは、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ複合体を含むＤＢＤを含み、ここで、ｇＲＮＡは、配列番号１１３を含む標的化配列を含む。ｇＲＮＡの標的配列は、以下の配列を有する足場配列の５’末端に結合される：５’−ＧＴＴＴＴＡＧＴＡＣＴＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＡＡＴＣＴＡＣＴＡＡＡＡＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴＧＣＣＧＴＧＴＴＴＡＴＣＴＣＧＴＣＡＡＣＴＴＧＴＴＧＧＣＧＡＧＡ−３’（配列番号１０２）。例示的な実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ非活性化Ｃａｓ９タンパク質である。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、Ｃａｓタンパク質にコンジュゲートされた１つまたは複数のＴＡＤをさらに含み、ＴＡＤは、ＶＰ６４、ＶＰＲ、ＣＩＴＥＤ２またはＣＩＴＥＤ４から選択される。一実施形態では、かかるｅＴＦは、Ｃａｓタンパク質のＣ末端にコンジュゲートされたＶＰＲ  ＴＡＤドメインを含む。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、Ｃａｓタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端にコンジュゲートされたＣＩＴＥＤ２  ＴＡＤを含む。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、Ｃａｓタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端にコンジュゲートされたＣＩＴＥＤ４  ＴＡＤを含む。例示的な実施形態では、かかるｅＴＦは、ＧＲＮ発現を、対照と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍もしくはそれよりも大きく、あるいは対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％またはそれよりも大きく上方調節することが可能である。
ヒトタンパク質に対して高度に相同なｅＴＦ
【０１９４】
別の態様では、本出願は、ゲノム標的部位に結合し、例えば、ＳＣＮ１ＡまたはＧＲＮを含む目的の任意の遺伝子の発現をモジュレート（上方調節または下方調節）するように設計され得る１つまたは複数のヒトタンパク質に対して高いパーセント配列同一性を有するｅＴＦを提供する。かかるｅＴＦは、対象に投与された場合に免疫原性をほとんど〜全く有さない、または、ヒトタンパク質配列に対してより低いパーセント同一性を有するｅＴＦと比較して、低減した免疫原性を有する。
【０１９５】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。本明細書で提供されるｅＴＦが同じタンパク質に由来する１つのＤＢＤおよび１つのＴＡＤを含む場合、ヒトタンパク質に対するパーセント同一性は、ｅＴＦ中のアミノ酸残基の総数によって、それが由来するヒトタンパク質（例えば、ＥＧＲ１またはＥＧＲ３）にマッチするｅＴＦ中のアミノ酸残基の総数を除算して計算することによって決定することができる。提供されるｅＴＦが１つのヒトタンパク質からの１つのＤＢＤおよび１つの異なるヒトタンパク質に由来する１つのＴＡＤを含む場合、ヒトに対するパーセント同一性は、各ドメインのヒトに対するパーセント同一性を別々に計算し、その２つを一緒に合計すること、例えば、（ｉ）ｅＴＦ中のアミノ酸残基の総数によって、それが由来するヒトタンパク質（例えば、ＥＧＲ１またはＥＧＲ３）にマッチするＤＢＤ中のアミノ酸残基の総数を除算して計算すること；（ｉｉ）ｅＴＦ中のアミノ酸残基の総数によって、それが由来するヒトタンパク質（例えば、ＣＩＴＥＤ２またはＣＩＴＥＤ４）にマッチするＴＡＤ中のアミノ酸残基の総数を除算して計算すること；ならびに（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の総計を合計することによって決定することができる。かかる実施形態では、これらのドメインは、以下のように分割される：ｅＴＦのＮ末端から第２のドメインのコード配列の開始点まで伸びる第１のドメイン、および第２のドメインのコード配列の開始点からｅＴＦのＣ末端まで伸びる第２のドメイン（例えば、構成ＮＬＳ−ＤＢＤ−リンカー−ＮＬＳ−ＴＡＤを有するｅＴＦについて、第１のドメインはＮＬＳ−ＤＢＤ−リンカーであり、第２のドメインはＮＬＳ−ＴＡＤである）。本明細書で提供されるｅＴＦが１つのヒトタンパク質からの１つのＤＢＤおよび１つまたは複数の異なるヒトタンパク質に由来する２つのＴＡＤを含む場合、ヒトに対するパーセント同一性は、各ドメインのヒトに対するパーセント同一性を別々に計算し、３つ全てを一緒に合計すること、例えば、（ｉ）ｅＴＦ中のアミノ酸残基の総数によって、それが由来するヒトタンパク質（例えば、ＥＧＲ１またはＥＧＲ３）にマッチするＤＢＤ中のアミノ酸残基の総数を除算して計算すること；（ｉｉ）ｅＴＦ中のアミノ酸残基の総数によって、それが由来するヒトタンパク質（例えば、ＣＩＴＥＤ２またはＣＩＴＥＤ４）にマッチする第１のＴＡＤ中のアミノ酸残基の総数を除算して計算すること；（ｉｉｉ）ｅＴＦ中のアミノ酸残基の総数によって、それが由来するヒトタンパク質（例えば、ＣＩＴＥＤ２またはＣＩＴＥＤ４）にマッチする第２のＴＡＤ中のアミノ酸残基の総数を除算して計算すること；ならびに（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の総計を合計することによって決定することができる。かかる実施形態では、これらのドメインは、以下のように分割される：ｅＴＦのＮ末端から第２のドメインのコード配列の開始点まで伸びる第１のドメイン、第２のドメインのコード配列の開始点から第３のドメインのコード配列の開始点まで伸びる第２のドメイン、および第３のドメインのコード配列の開始点からｅＴＦのＣ末端まで伸びる第３のドメイン（例えば、構成ＮＬＳ−ＴＡＤ１−リンカー−ＮＬＳ−ＤＢＤ−リンカー−ＮＬＳ−ＴＡＤ２を有するｅＴＦについて、第１のドメインはＮＬＳ−ＴＡＤ１−リンカーであり、第２のドメインはＮＬＳ−ＤＢＤ−リンカーであり、第３のドメインはＮＬＳ−ＴＡＤ２である）。このセクションに記載される１つまたは複数のヒトタンパク質に対するパーセント同一性は、ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／におけるＮＣＢＩウェブサイトからのワールドワイドウェブ上で入手可能な、ＮＣＢＩから入手可能な標準的なタンパク質ＢＬＡＳＴツール（例えば、デフォルトパラメーターと共にｂｌａｓｔｐ（タンパク質→タンパク質）アルゴリズムを使用するｂｌａｓｔｐスイートアラインメントツール）を使用して得られるパーセント同一性出力を使用して決定することができる。
【０１９６】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるｅＴＦは、天然に存在するヒトタンパク質に対する高い程度の配列同一性に起因して、ヒト対象において有害な免疫応答をほとんど惹起しない、最小の有害な免疫応答を惹起する、または有害な免疫応答を惹起しないという利益を有する。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質に対してより低いパーセント同一性を含むｅＴＦ、例えば、１つまたは複数のヒトタンパク質に対して５０％、５５％、６５％または７０％未満の配列同一性を含むｅＴＦで観察された免疫原性と比較して免疫原性の低減、例えば、免疫原性において、少なくとも０．５、１、１．５、２、２．５、３分、３．５、４、４．５、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０倍またはそれより多くの倍数の低減を惹起する。一部の場合には、免疫原性における低減は、ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ、イムノアッセイまたはｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ法を使用して測定し得る。低いまたは最小の免疫原性を有する遺伝子治療は、改善された患者の耐容能、治療効果を達成するために必要な投与量の減少、１回の投与後の長期にわたる治療効果、必要な場合、複数回もしくは複数の用量で投与できること、投与当たりより長い期間にわたって治療有効性が持続すること、安定性んｐ増加、および／または遺伝子治療の有効性の増加を含む、いくつかの利点を有する。
【０１９７】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のヒトタンパク質に対して高いパーセント配列同一性を有する本明細書で提供されるｅＴＦは、１つまたは複数の天然に存在するヒトタンパク質に由来するＤＢＤおよびＴＡＤを含む。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、ＤＢＤを含む任意の天然に存在するヒトタンパク質に由来するＤＢＤを含み得る。例示的な実施形態では、１つまたは複数のヒトタンパク質に対して高いパーセント配列同一性を有する本明細書で提供されるｅＴＦは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質、例えば、表７に列挙されるジンクフィンガータンパク質のいずれか１つなどに由来するＤＢＤを含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のヒトタンパク質に対して高いパーセント配列同一性を有する本明細書で提供されるｅＴＦは、ヒトＥＧＲタンパク質、例えば、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＧＲ３またはＥＧＲ４に由来するＤＢＤを含む。例示的な実施形態では、１つまたは複数のヒトタンパク質に対して高いパーセント配列同一性を有する本明細書で提供されるｅＴＦは、ヒトＥＧＲ１またはＥＧＲ３に由来するＤＢＤを含む。種々の実施形態では、１つまたは複数のヒトタンパク質に対して高いパーセント配列同一性を有する本明細書で提供されるｅＴＦは、ヒトジンクフィンガータンパク質に由来するＤＢＤを含み、ここで、最小のアミノ酸変化（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、２〜３、２〜４、２〜５、２〜６、２〜７、３〜４、３〜５、３６もしくは３〜７アミノ酸の変化）が、目的の標的結合部位を認識するようにＤＢＤの結合特異性を変更するために、ＤＢＤの１つまたは複数のジンクフィンガードメインにおいて行われている。かかる配列改変は、好ましくは、ＤＢＤのジンクフィンガードメインの認識ヘリックスにおいて行われるが、ヒトジンクフィンガーＤＢＤまたはタンパク質（ＴＡＤを含む）の残りは、天然に存在するヒトタンパク質に対する可能な限り高い配列同一性を保つために未改変のままである。
【０１９８】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のヒトタンパク質に対して高いパーセント配列同一性を有する本明細書で提供されるｅＴＦは、ヒトタンパク質に由来するＤＢＤにコンジュゲートされた、ヒトタンパク質に由来する１つまたは複数の転写モジュレーションドメイン（例えば、ＴＡＤまたはＴＲＤ）を含む。種々の実施形態では、転写モジュレーションドメインは、ｅＴＦがＤＢＤを介して標的部位に結合した場合に目的の遺伝子からの転写をモジュレートし得る１つもしくは複数のタンパク質因子（例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、コアクチベータータンパク質またはコリプレッサータンパク質）または目的の遺伝子からの遺伝子発現のレベルをモジュレートし得る１つもしくは複数のタンパク質因子を動員することが可能なドメインを有する任意の天然に存在するヒトタンパク質に由来し得る。例示的な実施形態では、ＴＡＤは、ヒトＥＧＲタンパク質、例えば、ヒトＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＧＲ３もしくはＥＧＲ４など、またはヒトｃｉｔｅｄタンパク質、例えば、ヒトＣＩＴＥＤ２もしくはＣＩＴＥＤ４タンパク質などに由来する。例示的な実施形態では、１つまたは複数のヒトタンパク質に対して高いパーセント配列同一性を有する本明細書で提供されるｅＴＦは、ヒトＥＧＲ１またはＥＧＲ３タンパク質由来のＴＡＤを含む。別の例示的な実施形態では、１つまたは複数のヒトタンパク質に対して高いパーセント配列同一性を有する本明細書で提供されるｅＴＦは、ヒトＣＩＴＥＤ２またはＣＩＴＥＤ４タンパク質由来のＴＡＤを含む。
【０１９９】
一実施形態では、１つまたは複数のヒトタンパク質に対して高いパーセント配列同一性を有する本明細書で提供されるｅＴＦは、１つのヒトＤＢＤ（ｈＤＢＤ）および１つのヒトＴＡＤ（ｈＴＡＤ）を含み得（例えば、ｈＴＡＤ−ｈＤＢＤまたはｈＤＢＤ−ｈＴＡＤ）、このｈＤＢＤおよびｈＴＡＤは、同じヒトタンパク質または異なるヒトタンパク質に由来し得る。別の実施形態では、１つまたは複数のヒトタンパク質に対して高いパーセント配列同一性を有する本明細書で提供されるｅＴＦは、１つのｈＤＢＤおよび２つのｈＴＡＤを含み得、ｈＤＢＤおよびｈＴＡＤは、同じヒトタンパク質に由来する、ｈＤＢＤは、第１のヒトタンパク質に由来し、両方のｈＴＡＤは、第２のヒトタンパク質に由来する、ｈＤＢＤおよび一方のｈＴＡＤは、第１のヒトタンパク質に由来し、第２のｈＴＡＤは、第２のヒトタンパク質に由来する、またはｈＤＢＤは、第１のヒトタンパク質に由来し、一方のｈＴＡＤは、第２のヒトタンパク質に由来し、第２のｈＴＡＤは、第３のヒトタンパク質に由来する（例えば、ｈＴＡＤ１−ｈＤＢＤ−ｈＴＡＤ１またはｈＴＡＤ１−ｈＤＢＤ−ｈＴＡＤ２）。
【０２００】
例示的な実施形態では、１つまたは複数のヒトタンパク質に対して高いパーセント配列同一性を有する本明細書で提供されるｅＴＦは、以下の構成のいずれか１つを含む：（ｉ）共にヒトＥＧＲ１に由来する１つのｈＤＢＤおよび１つのｈＴＡＤ；（ｉｉ）共にヒトＥＧＲ３に由来する１つのｈＤＢＤおよび１つのｈＴＡＤ；（ｉｉｉ）ヒトＥＧＲ１に由来する１つのｈＤＢＤおよびＣＩＴＥＤ２に由来する１つのｈＴＡＤ（例えば、ｈＥＧＲ１  ＤＢＤ−ｈＣＩＴＥＤ２  ＴＡＤまたはｈＣＩＴＥＤ２  ＴＡＤ−ｈＥＧＲ１  ＤＢＤ）；（ｉｖ）ヒトＥＧＲ１に由来する１つのｈＤＢＤおよびヒトＣＩＴＥＤ４に由来する１つのｈＴＡＤ（例えば、ｈＥＧＲ１  ＤＢＤ−ｈＣＩＴＥＤ４  ＴＡＤまたはｈＣＩＴＥＤ４  ＴＡＤ−ｈＥＧＲ１  ＤＢＤ）；（ｖ）ヒトＥＧＲ３に由来する１つのｈＤＢＤおよびＣＩＴＥＤ２に由来する１つのｈＴＡＤ（例えば、ｈＥＧＲ３  ＤＢＤ−ｈＣＩＴＥＤ２  ＴＡＤまたはｈＣＩＴＥＤ２  ＴＡＤ−ｈＥＧＲ３  ＤＢＤ）；（ｖｉ）ヒトＥＧＲ３に由来する１つのｈＤＢＤおよびヒトＣＩＴＥＤ４に由来する１つのｈＴＡＤ（例えば、ｈＥＧＲ３  ＤＢＤ−ｈＣＩＴＥＤ４  ＴＡＤまたはｈＣＩＴＥＤ４  ＴＡＤ−ｈＥＧＲ３  ＤＢＤ）；（ｖｉｉ）ヒトＥＧＲ１に由来する１つのｈＤＢＤおよびＣＩＴＥＤ２に由来する２つのｈＴＡＤ（例えば、ｈＣＩＴＥＤ２  ＴＡＤ−ｈＥＧＲ１  ＤＢＤ−ｈＣＩＴＥＤ２  ＴＡＤ）；（ｖｉｉｉ）ヒトＥＧＲ１に由来する１つのｈＤＢＤおよびヒトＣＩＴＥＤ４に由来する２つのｈＴＡＤ（例えば、ｈＣＩＴＥＤ４  ＴＡＤ−ｈＥＧＲ１  ＤＢＤ−ｈＣＩＴＥＤ４  ＴＡＤ）；（ｉｘ）ヒトＥＧＲ３に由来する１つのｈＤＢＤおよびヒトＣＩＴＥＤ２に由来する２つのｈＴＡＤ（例えば、ｈＣＩＴＥＤ２  ＴＡＤ−ｈＥＧＲ３  ＤＢＤ−ｈＣＩＴＥＤ２  ＴＡＤ）；（ｘ）ヒトＥＧＲ３に由来する１つのｈＤＢＤおよびヒトＣＩＴＥＤ４に由来する２つのｈＴＡＤ（例えば、ｈＣＩＴＥＤ４  ＴＡＤ−ｈＥＧＲ３  ＤＢＤ−ｈＣＩＴＥＤ４  ＴＡＤ）；（ｘｉ）ヒトＥＧＲ１に由来する１つのｈＤＢＤ、ヒトＣＩＴＥＤ２に由来する第１のｈＴＡＤ、ヒトＣＩＴＥＤ４に由来する第２のｈＴＡＤ（例えば、ｈＣＩＴＥＤ２  ＴＡＤ−ｈＥＧＲ１  ＤＢＤ−ｈＣＩＴＥＤ４  ＴＡＤまたはｈＣＩＴＥＤ４  ＴＡＤ−ｈＥＧＲ１  ＤＢＤ−ｈＣＩＴＥＤ２  ＴＡＤ）；または（ｘｉｉ）ヒトＥＧＲ３に由来する１つのｈＤＢＤ、ヒトＣＩＴＥＤ２に由来する第１のｈＴＡＤ、ヒトＣＩＴＥＤ４に由来する第２のｈＴＡＤ（例えば、ｈＣＩＴＥＤ２  ＴＡＤ−ｈＥＧＲ３  ＤＢＤ−ｈＣＩＴＥＤ４  ＴＡＤまたはｈＣＩＴＥＤ４  ＴＡＤ−ｈＥＧＲ３  ＤＢＤ−ｈＣＩＴＥＤ２  ＴＡＤ）。
【０２０１】
別の実施形態では、１つまたは複数のヒトタンパク質に対して高いパーセント配列同一性を有する本明細書で提供されるｅＴＦは、１つのｈＤＢＤおよび１つのｈＴＲＤを含み得（例えば、ｈＴＲＤ−ｈＤＢＤまたはｈＤＢＤ−ｈＴＲＤ）、ｈＤＢＤおよびｈＴＲＤは、同じタンパク質または異なるタンパク質に由来し得る。別の実施形態では、１つまたは複数のヒトタンパク質に対して高いパーセント配列同一性を有する本明細書で提供されるｅＴＦは、１つのｈＤＢＤおよび２つのｈＴＲＤを含み得、ｈＤＢＤおよびｈＴＲＤは、同じヒトタンパク質に由来する、ｈＤＢＤは、第１のヒトタンパク質に由来し、両方のｈＴＲＤは、第２のヒトタンパク質に由来する、ｈＤＢＤおよび一方のｈＴＲＤは、第１のヒトタンパク質に由来し、第２のｈＴＲＤは、第２のヒトタンパク質に由来する、またはｈＤＢＤは、第１のヒトタンパク質に由来し、一方のｈＴＲＤは、第２のヒトタンパク質に由来し、第２のｈＴＲＤは、第３のヒトタンパク質に由来する（例えば、ｈＴＲＤ１−ｈＤＢＤ−ｈＴＲＤ１またはｈＴＲＤ１−ｈＤＢＤ−ｈＴＲＤ２）。
【０２０２】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のヒトタンパク質に対して高いパーセント配列同一性を有する本明細書で提供されるｅＴＦは、以下のいずれか１つを含む：（ｉ）配列番号６〜１０、１３〜１６、５７〜６４、６７〜７７、２９５〜２９９、３１３〜３２５、３４５〜３５０、３６４、４３６のいずれか１つを含む配列；（ｉｉ）配列番号２２〜２６、２９〜３２、８４〜９３、３８５〜３９０、４０６〜４０９、４２７〜４３５もしくは４３７のいずれか１つを含む配列；（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の配列のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を含む配列；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の配列のいずれかの機能的断片もしくはバリアント。例示的な実施形態では、かかるｅＴＦは、ＳＣＮ１ＡまたはＧＲＮ発現を、対照と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍もしくはそれよりも大きく、あるいは対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％またはそれよりも大きく上方調節することが可能である。例示的な実施形態では、かかるｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質に対して少なくとも（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ａｔ  ｌｅａｓｔ）７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の全体的配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、かかるｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質に対してより低い全体的パーセント配列同一性を有するｅＴＦと比較して、免疫原性の低減を示す。種々の実施形態では、免疫原性における低減は、ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ、イムノアッセイまたはｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ法を使用して測定し得る。
【０２０３】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のヒトタンパク質に対して高いパーセント配列同一性を有する本明細書で提供されるｅＴＦは、ＤＢＤおよびＴＡＤドメインに加えて、１つまたは複数のアミノ酸配列またはドメイン、例えば、核局在化シグナルまたはリンカーなどをさらに含み得る。さらに、１つまたは複数のヒトタンパク質に対して高いパーセント配列同一性を有する本明細書で提供されるｅＴＦをコードするポリヌクレオチドは、ｅＴＦのコード配列に加えて、１つまたは複数の核酸配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリＡテイルなどをさらに含み得る。かかる実施形態では、さらなるアミノ酸配列および／または核酸配列の１つまたは複数は、好ましくは、ヒト配列であり、ヒト配列に由来し、またはヒトタンパク質に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する。
ポリヌクレオチド
【０２０４】
別の態様では、本出願は、本明細書で開示されるｅＴＦのいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【０２０５】
ある特定の実施形態では、本出願は、以下のいずれか１つを含むポリヌクレオチドを提供する：（ｉ）配列番号６〜１０、１３〜１６、５７〜６４、６７〜７７、２６８〜２８２、３０５〜３２５、３３７〜３５０、３６４、２９５〜２９９もしくは３６５〜３６６のいずれか１つを含むｅＴＦ、またはそのバリアントもしくは機能的断片をコードする核酸配列；（ｉｉ）配列番号６〜１０、１３〜１６、５７〜６４、６７〜７７、２６８〜２８２、３０５〜３２５、３３７〜３５０、３６４、２９５〜２９９もしくは３６５〜３６６のいずれか１つを有するｅＴＦの機能的断片をコードする核酸；あるいは（ｉｉｉ）配列番号６〜１０、１３〜１６、５７〜６４、６７〜７７、１１２、２６８〜２８２、３０５〜３２５、３３７〜３５０、３６４、２９５〜２９９、３６５〜３６６のいずれか１つを有するｅＴＦ、またはそのバリアントもしくは機能的断片に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれよりも高い配列同一性を有するｅＴＦをコードする核酸であって、ｅＴＦは、ＳＣＮ１ＡまたはＧＲＮを上方調節することが可能である、核酸。
【０２０６】
ある特定の実施形態では、本出願は、以下のいずれか１つを含むポリヌクレオチドを提供する：（ｉ）配列番号２２〜２６、２９〜３２、８４〜９３、１３１〜１３５、１６５〜１７１、３７７〜４０９もしくは４２３〜４３５のいずれか１つを含むＤＢＤ、またはそのバリアントもしくは機能的断片をコードする核酸配列；（ｉｉ）配列番号２２〜２６、２９〜３２、８４〜９３、１３１〜１３５、１６５〜１７１、３７７〜４０９、４２３〜４３５のいずれか１つを有するＤＢＤの機能的断片をコードする核酸；あるいは（ｉｉｉ）配列番号２２〜２６、２９〜３２、８４〜９３、１１２、１３１〜１３５、１６５〜１７１、３７７〜４０９もしくは４３２〜４３５のいずれか１つを有するＤＢＤ、またはそのバリアントもしくは機能的断片に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれよりも高い配列同一性を有するＤＢＤをコードする核酸であって、ｅＴＦは、配列番号２２〜２６、２９〜３２、８４〜９３、１１２、１３１〜１３５、１６５〜１７１、３７７〜４０９、４２３〜４３５のいずれか１つが結合する標的部位に結合することが可能である、核酸。
【０２０７】
ある特定の実施形態では、本出願は、内因性ＳＣＮ１Ａを上方調節するｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、以下のいずれか１つを含む：（ｉ）配列番号６〜９、１３〜１５、５７〜５８、６１〜６２、６７〜７１、７４〜７５、２６８〜２８２、２９５〜２９９、３０５〜３２５もしくは３６４〜３６６のいずれか１つを含むｅＴＦをコードする核酸配列；（ｉｉ）配列番号６〜９、１３〜１５、５７〜５８、６１〜６２、６７〜７１、７４〜７５、２６８〜２８２、２９５〜２９９、３０５〜３２５もしくは３６４〜３６６のいずれか１つを有するｅＴＦの機能的断片をコードする核酸；または（ｉｉｉ）配列番号６〜９、１３〜１５、５７〜５８、６１〜６２、６７〜７１、７４〜７５、２６８〜２８２、２９５〜２９９、３０５〜３２５もしくは３６４〜３６６のいずれか１つを有するｅＴＦに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれよりも高い配列同一性を有するｅＴＦをコードする核酸であって、ｅＴＦは、ＳＣＮ１Ａを上方調節することが可能である、核酸。
【０２０８】
ある特定の実施形態では、本出願は、本明細書で開示されるｅＴＦが結合した場合に内因性ＳＣＮ１Ａを上方調節することが可能なゲノム標的部位に結合するＤＢＤをコードするポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、以下のいずれか１つを含む：（ｉ）配列番号２２〜２５、２９〜３１、８４〜８５、８８、９０〜９２、１３１〜１３５、３７１〜３７２、３７６、３９１〜４０９もしくは４２３〜４３５のいずれか１つを含むＤＢＤをコードする核酸配列；（ｉｉ）配列番号２２〜２５、２９〜３１、８４〜８５、８８、９０〜９２、１３１〜１３５、３７１〜３７２、３７６、３９１〜４０９もしくは４２３〜４３５のいずれか１つを有するＤＢＤの機能的断片をコードする核酸；または（ｉｉｉ）配列番号２２〜２５、２９〜３１、８４〜８５、８８、９０〜９２、１３１〜１３５、３７１〜３７２、３７６、３９１〜４０９もしくは４２３〜４３５のいずれか１つを有するＤＢＤに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれよりも高い配列同一性を有するｅＴＦをコードする核酸であって、ＤＢＤは、配列番号２２〜２５、２９〜３１、８４〜８５、８８、９０〜９２、１３１〜１３５、３７１〜３７２、３７６、３９１〜４０９もしくは４２３〜４３５のいずれか１つが結合する標的部位に結合することが可能である、核酸。
【０２０９】
ある特定の実施形態では、本出願は、本明細書で開示されるｅＴＦが結合した場合に内因性ＳＣＮ１Ａを上方調節することが可能なゲノム標的部位に結合するＤＢＤをコードするポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、以下のいずれか１つを含む：（ｉ）配列番号１３５、３７１、３７２もしくは３７６のいずれか１つを含むＤＢＤをコードする核酸配列；（ｉｉ）配列番号１３５、３７１、３７２もしくは３７６のいずれか１つを有するＤＢＤの機能的断片をコードする核酸；または（ｉｉｉ）配列番号１３５、３７１、３７２もしくは３７６のいずれか１つを有するＤＢＤに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するｅＴＦをコードする核酸であって、ＤＢＤは、配列番号２２〜２５、２９〜３１、８４〜８５、８８、９０〜９２、１３１〜１３５、３７１〜３７２、３７６もしくは３９１〜４０９のいずれか１つが結合する標的部位に結合することが可能である、核酸。
【０２１０】
ある特定の実施形態では、本出願は、内因性ＧＲＮを上方調節するｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、以下のいずれか１つを含む：（ｉ）配列番号１０、１６、５９〜６０、６３、６４、７２〜７３、７６、７７もしくは３３７〜３５０のいずれか１つを含むｅＴＦをコードする核酸配列；（ｉｉ）配列番号１０、１６、５９〜６０、６３、６４、７２〜７３、７６、７７もしくは３３７〜３５０のいずれか１つを有するｅＴＦの機能的断片をコードする核酸；または（ｉｉｉ）配列番号１０、１６、５９〜６０、６３、６４、７２〜７３、７６、７７もしくは３３７〜３５０のいずれか１つを有するｅＴＦに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれよりも高い配列同一性を有するｅＴＦをコードする核酸であって、ｅＴＦは、ＧＲＮを上方調節することが可能である、核酸。
【０２１１】
ある特定の実施形態では、本出願は、本明細書で開示されるｅＴＦが結合した場合に内因性ＧＲＮを上方調節することが可能なゲノム標的部位に結合するＤＢＤをコードするポリヌクレオチドを提供し、ここで、ポリヌクレオチドは、以下のいずれか１つを含む：（ｉ）配列番号２６、３２、８６〜８９、９３、１６５〜１７１もしくは３７７〜３９０のいずれか１つを含むＤＢＤをコードする核酸配列；（ｉｉ）配列番号２６、３２、８６〜８９、９３、１６５〜１７１もしくは３７７〜３９０のいずれか１つを有するＤＢＤの機能的断片をコードする核酸；または（ｉｉｉ）配列番号２６、３２、８６〜８９、９３、１６５〜１７１もしくは３７７〜３９０のいずれか１つを有するＤＢＤに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれよりも高い配列同一性を有するｅＴＦをコードする核酸であって、ＤＢＤは、配列番号２６、３２、８６〜８９、９３、１６５〜１７１もしくは３７７〜３９０のいずれか１つが結合する標的部位に結合することが可能である、核酸。
【０２１２】
ある特定の実施形態では、本出願は、内因性ＳＣＮ１Ａを調節することが可能なｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、以下のいずれか１つを含む：（ｉ）配列番号３５３〜３６３もしくは４５４のいずれかを有する核酸配列；（ｉｉ）配列番号４４２〜４５３のいずれか１つを有する核酸配列；（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の配列のいずれか１つの機能的断片を有する核酸；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の配列のいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれよりも高い配列同一性を有する核酸であって、ポリヌクレオチドは、ＳＣＮ１Ａを上方調節することが可能なｅＴＦをコードする、核酸。
【０２１３】
ある特定の実施形態では、本出願は、内因性ＳＣＮ１Ａを調節することが可能なｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、以下のいずれか１つを含む：（ｉ）配列番号３５３を有する核酸配列；（ｉｉ）配列番号４４２を有する核酸配列；（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の配列のいずれか１つの機能的断片を有する核酸；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の配列のいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれよりも高い配列同一性を有する核酸。例示的な実施形態では、かかるポリヌクレオチドは、配列番号３０５を有するｅＴＦ、またはＳＣＮ１Ａを上方調節することが可能なその機能的断片もしくはバリアントをコードする。
【０２１４】
ある特定の実施形態では、本出願は、内因性ＳＣＮ１Ａを調節することが可能なｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、以下のいずれか１つを含む：（ｉ）配列番号３５４を有する核酸配列；（ｉｉ）配列番号４４３を有する核酸配列；（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の配列のいずれか１つの機能的断片を有する核酸；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の配列のいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれよりも高い配列同一性を有する核酸。例示的な実施形態では、かかるポリヌクレオチドは、配列番号３０６を有するｅＴＦ、またはＳＣＮ１Ａを上方調節することが可能なその機能的断片もしくはバリアントをコードする。
【０２１５】
ある特定の実施形態では、本出願は、内因性ＳＣＮ１Ａを調節することが可能なｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、以下のいずれか１つを含む：（ｉ）配列番号３５５を有する核酸配列；（ｉｉ）配列番号４４４を有する核酸配列；（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の配列のいずれか１つの機能的断片を有する核酸；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の配列のいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれよりも高い配列同一性を有する核酸。例示的な実施形態では、かかるポリヌクレオチドは、配列番号３０８を有するｅＴＦ、またはＳＣＮ１Ａを上方調節することが可能なその機能的断片もしくはバリアントをコードする。
【０２１６】
ある特定の実施形態では、本出願は、内因性ＳＣＮ１Ａを調節することが可能なｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、以下のいずれか１つを含む：（ｉ）配列番号３５６を有する核酸配列；（ｉｉ）配列番号４４５を有する核酸配列；（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の配列のいずれか１つの機能的断片を有する核酸；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の配列のいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれよりも高い配列同一性を有する核酸。例示的な実施形態では、かかるポリヌクレオチドは、配列番号３１３を有するｅＴＦ、またはＳＣＮ１Ａを上方調節することが可能なその機能的断片もしくはバリアントをコードする。
【０２１７】
ある特定の実施形態では、本出願は、内因性ＳＣＮ１Ａを調節することが可能なｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、以下のいずれか１つを含む：（ｉ）配列番号３５７を有する核酸配列；（ｉｉ）配列番号４５１を有する核酸配列；（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の配列のいずれか１つの機能的断片を有する核酸；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の配列のいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれよりも高い配列同一性を有する核酸。例示的な実施形態では、かかるポリヌクレオチドは、配列番号３１４を有するｅＴＦ、またはＳＣＮ１Ａを上方調節することが可能なその機能的断片もしくはバリアントをコードする。
【０２１８】
ある特定の実施形態では、本出願は、内因性ＳＣＮ１Ａを調節することが可能なｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、以下のいずれか１つを含む：（ｉ）配列番号３５８を有する核酸配列；（ｉｉ）配列番号４４８を有する核酸配列；（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の配列のいずれか１つの機能的断片を有する核酸；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の配列のいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれよりも高い配列同一性を有する核酸。例示的な実施形態では、かかるポリヌクレオチドは、配列番号３１５を有するｅＴＦ、またはＳＣＮ１Ａを上方調節することが可能なその機能的断片もしくはバリアントをコードする。
【０２１９】
ある特定の実施形態では、本出願は、内因性ＳＣＮ１Ａを調節することが可能なｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、以下のいずれか１つを含む：（ｉ）配列番号３５９を有する核酸配列；（ｉｉ）配列番号４４６を有する核酸配列；（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の配列のいずれか１つの機能的断片を有する核酸；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の配列のいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれよりも高い配列同一性を有する核酸。例示的な実施形態では、かかるポリヌクレオチドは、配列番号３１６を有するｅＴＦ、またはＳＣＮ１Ａを上方調節することが可能なその機能的断片もしくはバリアントをコードする。
【０２２０】
ある特定の実施形態では、本出願は、内因性ＳＣＮ１Ａを調節することが可能なｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、以下のいずれか１つを含む：（ｉ）配列番号３６０を有する核酸配列；（ｉｉ）配列番号４４７を有する核酸配列；（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の配列のいずれか１つの機能的断片を有する核酸；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の配列のいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれよりも高い配列同一性を有する核酸。例示的な実施形態では、かかるポリヌクレオチドは、配列番号３１７を有するｅＴＦ、またはＳＣＮ１Ａを上方調節することが可能なその機能的断片もしくはバリアントをコードする。
【０２２１】
ある特定の実施形態では、本出願は、内因性ＳＣＮ１Ａを調節することが可能なｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、以下のいずれか１つを含む：（ｉ）配列番号３６１を有する核酸配列；（ｉｉ）配列番号４５０を有する核酸配列；（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の配列のいずれか１つの機能的断片を有する核酸；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の配列のいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれよりも高い配列同一性を有する核酸。例示的な実施形態では、かかるポリヌクレオチドは、配列番号３１８を有するｅＴＦ、またはＳＣＮ１Ａを上方調節することが可能なその機能的断片もしくはバリアントをコードする。
【０２２２】
ある特定の実施形態では、本出願は、内因性ＳＣＮ１Ａを調節することが可能なｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、以下のいずれか１つを含む：（ｉ）配列番号３６２を有する核酸配列；（ｉｉ）配列番号４４９を有する核酸配列；（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の配列のいずれか１つの機能的断片を有する核酸；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の配列のいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれよりも高い配列同一性を有する核酸。例示的な実施形態では、かかるポリヌクレオチドは、配列番号３１９を有するｅＴＦ、またはＳＣＮ１Ａを上方調節することが可能なその機能的断片もしくはバリアントをコードする。
【０２２３】
ある特定の実施形態では、本出願は、内因性ＳＣＮ１Ａを調節することが可能なｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、以下のいずれか１つを含む：（ｉ）配列番号４５４を有する核酸配列；（ｉｉ）配列番号４５２を有する核酸配列；（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の配列のいずれか１つの機能的断片を有する核酸；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の配列のいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれよりも高い配列同一性を有する核酸。例示的な実施形態では、かかるポリヌクレオチドは、配列番号４４０を有するｅＴＦ、またはＳＣＮ１Ａを上方調節することが可能なその機能的断片もしくはバリアントをコードする。
【０２２４】
ある特定の実施形態では、本出願は、内因性ＳＣＮ１Ａを調節することが可能なｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、以下のいずれか１つを含む：（ｉ）配列番号３６３を有する核酸配列；（ｉｉ）配列番号４５３を有する核酸配列；（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の配列のいずれか１つの機能的断片を有する核酸；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の配列のいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれよりも高い配列同一性を有する核酸。例示的な実施形態では、かかるポリヌクレオチドは、配列番号３２５を有するｅＴＦ、またはＳＣＮ１Ａを上方調節することが可能なその機能的断片もしくはバリアントをコードする。
発現カセット
【０２２５】
別の態様では、本出願は、本明細書で提供されるｅＴＦをコードするポリヌクレオチドおよび１つまたは複数の調節エレメントを含む発現カセットを提供する。
【０２２６】
ある特定の実施形態では、本明細書で開示されるｅＴＦをコードするポリヌクレオチドは、ｅＴＦをコードする配列に加えて１つまたは複数の調節エレメントを含む発現カセットの一部である。例示的な実施形態では、本明細書で開示されるｅＴＦをコードするポリヌクレオチドは、細胞においてｅＴＦの発現を駆動することが可能なように、ｅＴＦをコードする配列の上流に置かれたプロモーターを含む発現カセットの一部である。
【０２２７】
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される発現カセットは、細胞においてｅＴＦの発現を駆動することが可能なように、ｅＴＦをコードするポリヌクレオチドおよびｅＴＦをコードする配列の上流に置かれた構成的プロモーターを含む。構成的プロモーターの例には、ＧＡＤ２プロモーター、ヒトシナプシンプロモーター、ＣＢＡプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ｍｉｎＣＭＶプロモーター、ＴＡＴＡボックス、スーパーコア（ｓｕｐｅｒ  ｃｏｒｅ）プロモーターもしくはＥＦ１αプロモーター、またはそれらの組合せが含まれる。
【０２２８】
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される発現カセットは、ｅＴＦをコードするポリヌクレオチドおよび細胞におけるｅＴＦの発現を駆動することが可能な短いプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される核酸分子に従う使用に適切な短いプロモーターは、５００ｂｐ、４５０ｂｐ、４００ｂｐ、３５０ｂｐ、３００ｂｐ、２５０ｂｐ、２２５ｂｐ、２００ｂｐ、１７５ｂｐ、１５０ｂｐ、１４５ｂｐ、１４０ｂｐ、１３５ｂｐ、１３０ｂｐ、１２５ｂｐ、１２０ｂｐ、１１５ｂｐ、１１０ｂｐ、１０５ｂｐ、１００ｂｐ、９５ｂｐ、９０ｂｐ、８５ｂｐ、８０ｂｐもしくは７５ｂｐ未満、または約８０〜３００ｂｐ、８０〜２７５ｂｐ、８０〜２５０ｂｐ、８０〜２００ｂｐ、８０〜１５０ｂｐ、８０〜１２５ｂｐ、８０〜１２０ｂｐ、８０〜１１５ｂｐ、８０〜１１０ｂｐ、８０〜１０５ｂｐ、８０〜１００ｂｐ、８５〜３００ｂｐ、８５〜２７５ｂｐ、８５〜２５０ｂｐ、８５〜２００ｂｐ、８５〜１５０ｂｐ、８５〜１２５ｂｐ、８５〜１２０ｂｐ、８５〜１１５ｂｐ、８５〜１１０ｂｐ、８５〜１０５ｂｐ、８５〜１００ｂｐ、９０〜３００ｂｐ、９０〜２７５ｂｐ、９０〜２５０ｂｐ、９０〜２００ｂｐ、９０〜１５０ｂｐ、９０〜１２５ｂｐ、９０〜１２０ｂｐ、９０〜１１５ｂｐ、９０〜１１０ｂｐ、９０〜１０５ｂｐ、９０〜１００ｂｐ、９５〜３００ｂｐ、９５〜２７５ｂｐ、９５〜２５０ｂｐ、９５〜２００ｂｐ、９５〜１５０ｂｐ、９５〜１２５ｂｐ、９５〜１２０ｂｐ、９５〜１１５ｂｐ、９５〜１１０ｂｐ、９５〜１０５ｂｐ、９５〜１００ｂｐ、１００〜３００ｂｐ、１００〜２７５ｂｐ、１００〜２５０ｂｐ、１００〜２００ｂｐ、１００〜１５０ｂｐ、１００〜１２５ｂｐ、１００〜１２０ｂｐ、１００〜１１５ｂｐ、１００〜１１０ｂｐもしくは１００〜１０５ｂｐを含む。例示的な実施形態では、本明細書に記載される発現カセットに従う使用に適切な短いプロモーターは、約１００〜１２０ｂｐ、約１１７ｂｐまたは約１００ｂｐを含む。
【０２２９】
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される発現カセットは、本明細書で開示されるｅＴＦのいずれか１つをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、以下のいずれか１つを含むまたはそれからなる短いプロモーターを含む：（ｉ）配列番号１７８；（ｉｉ）そのバリアントもしくは機能的断片；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つに対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列。短いプロモーター配列の他の例は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１８／２１３７８６において見出され得る。
【０２３０】
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される発現カセットは、目的の細胞においてｅＴＦの発現を選択的に駆動することが可能なように、ｅＴＦをコードするポリヌクレオチドおよびｅＴＦをコードする配列の上流に置かれた細胞型選択的プロモーターを含む。ある特定の実施形態では、細胞型選択的プロモーターは、目的の任意の細胞型、例えば、心臓細胞、肝臓細胞、筋肉細胞、骨細胞、ニューロン、またはそれらの下位集団などについて選択的であり得る（例えば、かかる細胞型における発現を選択的に駆動し得る）。例示的な実施形態では、本明細書で開示される発現カセットは、ＰＶ細胞においてｅＴＦの発現を選択的に駆動することが可能なように、ｅＴＦをコードするポリヌクレオチドおよびｅＴＦをコードする配列の上流に置かれたＰＶ選択的調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサーならびに／またはプロモーターおよびエンハンサー）を含む。ＰＶ選択的調節エレメントは、ＰＶニューロンにおいて遺伝子発現を特異的にモジュレートする調節エレメントを指す。ある特定の実施形態では、ＰＶ選択的調節エレメントは、１つまたは複数の他のＣＮＳ細胞型と比較して、ＰＶニューロンにおいて発現を増強する。ある特定の実施形態では、ＰＶ選択的調節エレメントは、オフターゲット細胞型において転写および／または翻訳プロセスを抑制する。
【０２３１】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＰＶ選択的調節エレメントは、オフターゲット細胞型と比較して、ＰＶ細胞において選択的遺伝子発現を生じる。一部の場合には、オフターゲット細胞型には、興奮性ニューロン、非ＰＶ  ＣＮＳ細胞型および非ニューロンＣＮＳ細胞型が含まれるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、ＰＶ選択的調節エレメントは、少なくとも１、２、３、４、５種またはそれよりも多くの非ＰＶ  ＣＮＳ細胞型にわたって、ＰＶニューロンにおける選択的遺伝子発現をもたらす。一部の例では、非ＰＶ  ＣＮＳ細胞は、興奮性ニューロン、ドパミン作動性ニューロン、アストロサイト、ミクログリア、運動ニューロン、血管細胞、または非ＧＡＢＡ作動性ニューロン（例えば、ＧＡＤ２、ＧＡＤ１、ＮＫＸ２．１、ＤＬＸ１、ＤＬＸ５、ＳＳＴおよびＶＩＰのうち１つまたは複数を発現しない細胞）、非ＰＶニューロン（例えば、パルブアルブミンを発現しないＧＡＢＡ作動性ニューロン）、または他のＣＮＳ細胞（例えば、ＰＶ、ＧＡＤ２、ＧＡＤ１、ＮＫＸ２．１、ＤＬＸ１、ＤＬＸ５、ＳＳＴおよびＶＩＰのいずれも発現したことがないＣＮＳ細胞型）である。一部の場合には、本明細書で提供されるＰＶ選択的調節エレメントは、非ＰＶ  ＧＡＢＡ作動性細胞と比較して、ＰＶニューロンにおいて遺伝子発現における選択性の増加を生じる。一部の場合には、細胞型は、異なる細胞マーカー、形態（ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）、表現型、遺伝子型、機能を有すること、および／または細胞型を分類するための任意の他の手段によって識別される。
【０２３２】
ＰＶ選択的調節エレメントによって駆動される発現の選択性は、いくつかの方法で測定し得る。一実施形態では、ＰＶ細胞における遺伝子発現の非ＰＶ細胞を超える選択性は、ＰＶ選択的調節エレメントに作動可能に連結した遺伝子から検出可能なレベルの転写物を発現するＰＶ細胞の数を、その遺伝子を発現する細胞の総数と比較することによって（例えば、その遺伝子を発現するＰＶ  対  総細胞（ＰＶ＋非ＰＶ細胞）の比）、測定し得る。例えば、ＰＶニューロンについての選択性は、遺伝子発現を測定するためにＰＶ選択的調節エレメントに作動可能に連結した蛍光タンパク質（例えば、ｅＧＦＰ）をコードする遺伝子および第２の蛍光標識（例えば、赤色蛍光タンパク質）に連結したＰＶ細胞を同定する抗体（例えば、ＰＶニューロンと特異的に相互作用する抗ＰＶ抗体）を使用する免疫組織化学に基づく共局在化アッセイを使用して決定することができる。ＰＶ細胞における発現の選択性は、ＰＶおよびｅＧＦＰの両方を発現する細胞（例えば、ＰＶ細胞）の数を、ｅＧＦＰを発現する細胞（例えば、ＰＶ細胞および非ＰＶ細胞）の総数によって除算し、１００を乗算してパーセンテージに変換することによって、計算することができる。導入遺伝子を発現するＰＶ細胞のパーセンテージが高くなるほど、調節エレメントは、ＰＶ細胞についてより選択的になる。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＰＶ選択的調節エレメントは、ＰＶ細胞における発現について高度に選択的であり得る。例えば、本明細書で提供されるＰＶ選択的調節エレメントは、ＰＶニューロンについて、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、または約９９％よりも高い選択性（例えば、ＰＶニューロン／総細胞×１００）を示し得る。
【０２３３】
一部の場合には、本明細書で提供されるＰＶ選択的調節エレメントは、短い。一部の場合には、ＰＶ選択的調節エレメントのサイズは、導入遺伝子および１つまたは複数のＰＶ選択的調節エレメントの組み合わせたサイズが、ベクターのクローニング能を超えないように、ベクター、例えば、ウイルスベクターまたはｒＡＡＶのクローニング能と適合性である。一部の場合には、ＰＶ選択的調節エレメントは、最大で約２０５０ｂｐ、２０００ｂｐ、１９００ｂｐ、１８００ｂｐ、１７００ｂｐ、１６００ｂｐ、１５００ｂｐ、１４００ｂｐ、１３００ｂｐ、１２００ｂｐ、１１００ｂｐ、１０００ｂｐ、９００ｂｐ、８００ｂｐ、７００ｂｐ、６００ｂｐ、５００ｂｐ、４００ｂｐ、３００ｂｐ、２００ｂｐまたは１００ｂｐの長さを有する。一部の場合には、ＰＶ選択的調節エレメントは、約５００〜６００ｂｐ、５００〜７００ｂｐ、５００〜８００ｂｐ、５００〜９００ｂｐ、５００〜１０００ｂｐまたは５００〜１５００ｂｐの間である。
【０２３４】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＰＶ選択的調節エレメントは、以下のいずれか１つを含むまたはそれからなる：（ｉ）配列番号１８３〜１８５および４１７；（ｉｉ）それらのバリアント、機能的断片もしくは組合せ；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つに対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列。一部の場合には、調節エレメントは、配列番号１８３〜１８５および４１７のいずれか１つを含む。ＰＶ選択的調節エレメントの他の例は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１８／１８７３６３において見出され得る。
【０２３５】
例示的な実施形態では、本出願は、ＰＶ選択的調節エレメントの制御下に、ＳＣＮ１Ａ  ｅＴＦをコードする核酸配列を含む発現カセットを提供する。ある特定の実施形態では、本出願は、配列番号１８３〜１８５または４１７のいずれか１つを有するＰＶ選択的調節エレメントの制御下に、以下の配列のいずれか１つを有するＤＢＤを含むＳＣＮ１Ａ  ｅＴＦをコードする核酸配列を含む発現カセットを提供する：配列番号１３５、３７１〜３７２または３７６。ある特定の実施形態では、本出願は、配列番号１８３〜１８５または４１７のいずれか１つを有するＰＶ選択的調節エレメントの制御下に、以下の配列のいずれか１つを含むＳＣＮ１Ａ  ｅＴＦをコードする核酸配列を含む発現カセットを提供する：配列番号６〜９、１３〜１５、５７〜５８、６１〜６２、６７〜７１、７４〜７５、２６８〜２８２、２９５〜２９９、３０５〜３２５または３６４〜３６６。ある特定の実施形態では、本出願は、配列番号１８３〜１８５または４１７のいずれか１つを有するＰＶ選択的調節エレメントの制御下に、以下の配列のいずれか１つを含む核酸配列を含む発現カセットを提供する：配列番号３５３〜３６３。ある特定の実施形態では、本出願は、配列番号１８３または１８５のいずれか１つを有するＰＶ選択的調節エレメントの制御下に、以下の配列のいずれか１つを有するＤＢＤを含むＳＣＮ１Ａ  ｅＴＦをコードする核酸配列を含む発現カセットを提供する：配列番号１３５、３７１、３７２または３７６。ある特定の実施形態では、本出願は、配列番号１８３または１８５のいずれか１つを有するＰＶ選択的調節エレメントの制御下に、以下の配列のいずれか１つを含むＳＣＮ１Ａ  ｅＴＦをコードする核酸配列を含む発現カセットを提供する：配列番号６〜９、１３〜１５、５７〜５８、６１〜６２、６７〜７１、７４〜７５、２６８〜２８２、２９５〜２９９、３０５〜３２５または３６４〜３６６。ある特定の実施形態では、本出願は、配列番号１８３または１８５のいずれか１つを有するＰＶ選択的調節エレメントの制御下に、以下の配列のいずれか１つを含む核酸配列を含む発現カセットを提供する：配列番号３５３〜３６３。
【０２３６】
ある特定の実施形態では、本出願は、細胞型選択的調節エレメントの制御下に、ＧＲＮ  ｅＴＦをコードする核酸配列を含む発現カセットを提供する。ある特定の実施形態では、細胞型選択的調節エレメントは、他の細胞型（例えば、非ＣＮＳ細胞）と比較して、中枢神経系細胞、前頭皮質細胞、グリア細胞、ミクログリア細胞、プルキンエ細胞、錐体細胞（例えば、ベッツ細胞）、運動ニューロン、大脳皮質ニューロンおよび線条体細胞からなる群から選択される細胞においてより高いレベルでＧＲＮを上方調節するｅＴＦの発現を駆動し得る。
【０２３７】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される発現カセットは、プロモーターに加えて、１つまたは複数の（ｏｎｅ  ｍｏｒｅ）さらなる調節エレメント、例えば、転写の開始または終結に関連する配列、エンハンサー配列、および効率的なＲＮＡプロセシングシグナルなどを含み得る。例示的な調節エレメントには、例えば、イントロン、エンハンサー、ＵＴＲ、安定性エレメント、ＷＰＲＥ配列、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、翻訳後応答エレメント、ｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位もしくはポリアデニル化（ポリＡ）配列、またはそれらの組合せが含まれる。調節エレメントは、遺伝子発現の転写段階、転写後段階または翻訳段階において遺伝子発現をモジュレートするように機能し得る。ＲＮＡレベルにおいて、調節は、翻訳（例えば、翻訳のためにｍＲＮＡを安定化する安定性エレメント）、ＲＮＡ切断、ＲＮＡスプライシングおよび／または転写終結のレベルにおいて生じ得る。種々の実施形態では、調節エレメントは、コード領域に、目的の細胞型における遺伝子発現選択性を増加させる、ＲＮＡ転写物が産生される速度を増加させる、産生されたＲＮＡの安定性を増加させる、および／またはＲＮＡ転写物からのタンパク質合成の速度を増加させる転写因子を動員し得る。
【０２３８】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される発現カセットは、ポリＡ配列をさらに含む。適切なポリＡ配列には、例えば、約７５ｂｐ長である人工ポリＡ（ＰＡ７５）（例えば、ＷＯ２０１８／１２６１１６を参照のこと）、ウシ成長ホルモンポリＡ、ＳＶ４０初期ポリＡシグナル、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル、ウサギベータグロビンポリＡ、ＨＳＶチミジンキナーゼポリＡ、プロタミン遺伝子ポリＡ、アデノウイルス５  ＥＩｂポリＡ、成長ホルモンポリＡまたはＰＢＧＤポリＡが含まれる。例示的な実施形態では、本明細書で提供される発現カセットにおける使用に適切なポリＡ配列は、ｈＧＨポリＡ（配列番号３２７）または合成ポリＡ（配列番号３２６）である。典型的には、ポリＡ配列は、本明細書に記載される発現カセット中で、ｅＴＦをコードするポリヌクレオチドの下流に位置する。
【０２３９】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される発現カセットは、１つまたは複数の核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする１つまたは複数の核酸配列をさらに含む。任意のＮＬＳペプチドが結合しているタンパク質の細胞核中へのインポートを促進する任意のＮＬＳペプチドが使用し得る。ＮＬＳの例には、例えば、ＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳ、ヌクレオプラスミンＮＬＳ、ＥＧＬ−１３  ＮＬＳ、ｃ−Ｍｙｃ  ＮＬＳおよびＴＵＳタンパク質ＮＬＳが含まれる。例えば、Ｃ．  Ｄｉｎｇｗａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １０７：  ８４１−９  （１９８８）；Ｊ．Ｐ．  Ｍａｋｋｅｒｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．  ６：  １０２５−７  （１９９６）；およびＭ．  Ｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．  ２６：  １００４−７  （２０１５）を参照のこと。ＮＬＳは、ｅＴＦタンパク質配列上のどこにでも配置してよいが、好ましい実施形態では、ｅＴＦのＮ末端またはｅＴＦのドメインにコンジュゲートする。例示的な実施形態では、本明細書で提供される核酸カセットは、ｅＴＦのＮ末端に融合したＮＬＳを有するｅＴＦをコードする。他の実施形態では、本明細書で提供される核酸カセットは、ｅＴＦのＮ末端に融合した第１のＮＬＳおよびｅＴＦのＤＢＤとＴＡＤドメインとの間に位置する第２のＮＬＳを有するｅＴＦをコードする。
発現ベクター
【０２４０】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される発現カセットは、発現ベクター中に組み入れ得る。発現ベクターは、トランスフェクションまたは形質導入を介して標的細胞に発現カセットを送達するために使用し得る。ベクターは、組み込みまたは非組み込みベクターであり得、これは、宿主細胞のゲノム中に発現カセットまたは導入遺伝子を組み込むベクターの能力を指す。発現ベクターの例には、以下が含まれるがこれらに限定されない：（ａ）非ウイルスベクター、例えば、直鎖状オリゴヌクレオチドおよび環状プラスミドを含む核酸ベクター；人工染色体、例えば、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）および細菌人工染色体（ＢＡＣまたはＰＡＣ）；エピソームベクター；トランスポゾン（例えば、ＰｉｇｇｙＢａｃ）；ならびに（ｂ）ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター。
【０２４１】
発現ベクターは、直鎖状オリゴヌクレオチドまたは環状プラスミドであり得、物理的方法および化学的方法を含む種々のトランスフェクション法を介して、細胞に送達し得る。物理的方法は、一般に、遺伝子材料の細胞内送達を促進するにあたって、細胞膜障壁に対抗するために物理的力を使用する送達の方法を指す。物理的方法の例には、針の使用、弾道ＤＮＡ（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ＤＮＡ）、電気穿孔、ソノポレーション（ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、フォトポレーション（ｐｈｏｔｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、マグネトフェクションおよびハイドロポレーション（ｈｙｄｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）が含まれる。化学的方法は、一般に、化学的担体が核酸分子を細胞に送達する方法を指し、これには、無機粒子、脂質に基づくベクター、ポリマーに基づくベクターおよびペプチドに基づくベクターが含まれ得る。
【０２４２】
一部の実施形態では、発現ベクターは、カチオン性脂質（例えば、カチオン性リポソーム）を使用して、標的細胞に投与される。種々の型の脂質が、遺伝子送達、例えば、脂質ナノエマルジョン（例えば、これは、乳化剤によって安定化した別の不混和性液体中の１つの不混和性液体の分散物である）または固体脂質ナノ粒子などについて調査されている。
【０２４３】
一部の実施形態では、発現ベクターは、ペプチドに基づく送達ビヒクルを使用して、標的細胞に投与される。ペプチドに基づく送達ビヒクルは、送達される遺伝子材料を保護する、特異的細胞受容体を標的化する、エンドソーム膜を破壊する、および遺伝子材料を核中に送達するという利点を有し得る。一部の実施形態では、発現ベクターは、ポリマーに基づく送達ビヒクルを使用して、標的細胞に投与される。ポリマーに基づく送達ビヒクルは、天然のタンパク質、ペプチドおよび／もしくは多糖または合成ポリマーを含み得る。一実施形態では、ポリマーに基づく送達ビヒクルは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む。ＰＥＩは、アニオン性細胞表面残基に結合しエンドサイトーシスを介して細胞中に持ち込まれる正に荷電した粒子へと、ＤＮＡを凝縮させ得る。他の実施形態では、ポリマーに基づく送達ビヒクルは、ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）、ポリ（ＤＬ−乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコシド）（ＰＬＧＡ）、ポリオルニチン、ポリアルギニン、ヒストン、プロタミン、デンドリマー、キトサン、デキストランの合成アミノ誘導体、および／またはカチオン性アクリルポリマーを含み得る。ある特定の実施形態では、ポリマーに基づく送達ビヒクルは、ポリマー、例えば、ＰＥＧおよびＰＬＬなどの混合物を含み得る。
【０２４４】
ある特定の実施形態では、発現ベクターは、遺伝子治療に適切なウイルスベクターであり得る。ウイルス遺伝子治療ベクターまたは遺伝子送達ベクターの好ましい特徴には、再現性よく安定に繁殖および高い力価まで精製される能力；標的化された送達を媒介する能力（例えば、他の場所での広いベクター散在なしに目的の組織または臓器に導入遺伝子を特異的に送達する能力）；ならびに有害な副作用を誘導することなしに遺伝子送達および導入遺伝子発現を媒介する能力が含まれ得る。
【０２４５】
いくつかの型のウイルス、例えば、アデノ随伴ウイルスと呼ばれる非病原性パルボウイルスが、ウイルス感染経路を利用し、但し複製および毒性をもたらし得るウイルス遺伝子の引き続く発現を回避することによって、遺伝子治療を目的として操作により作製されている。かかるウイルスベクターは、ウイルスゲノムからコード領域の全てまたは一部を欠失させるが、機能、例えば、ウイルスカプシド中へのベクターゲノムのパッケージングまたは宿主クロマチン中へのベクター核酸（例えば、ＤＮＡ）の組み込みのために必要であり得るインタクトな配列（例えば、末端反復配列）を残すことによって得ることができる。
【０２４６】
種々の実施形態では、適切なウイルスベクターには、レトロウイルス（例えば、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型およびＤ型ウイルス）、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス即ちＡＡＶ）、コロナウイルス、マイナス鎖ＲＮＡウイルス、例えば、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病および水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹およびセンダイ）、プラス鎖ＲＮＡウイルス、例えば、ピコルナウイルスおよびアルファウイルス、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型および２型、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス）およびポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘およびカナリアポックス）を含む二本鎖ＤＮＡウイルスが含まれる。レトロウイルスの例には、トリ白血症肉腫ウイルス、ヒトＴリンパ球向性ウイルス１型（ＨＴＬＶ−１）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、レンチウイルスおよびスプーマウイルスが含まれる。他のウイルスには、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルスおよび肝炎ウイルスが含まれる。ウイルスベクターは、宿主ゲノム中に組み込まれるそれらの能力に従って、２つの群  −  組み込みおよび非組み込みに分類され得る。オンコレトロウイルス（ｏｎｃｏｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）およびレンチウイルスは、宿主細胞クロマチン中に組み込まれ得るが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびヘルペスウイルスは、細胞核中で染色体外エピソームとして優勢に存続する。
【０２４７】
ある特定の実施形態では、適切なウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。レトロウイルスは、レトロウイルス科のウイルスを指す。レトロウイルスの例には、オンコレトロウイルス、例えば、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、およびレンチウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）が含まれる。レトロウイルスゲノムは、一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡであり、シスまたはトランスで提供され得る種々の遺伝子を含む。例えば、レトロウイルスゲノムは、遺伝子発現、逆転写および宿主染色体中への組み込みのためのエレメントと共に、シス作用性配列、例えば、２つの長い末端反復（ＬＴＲ）を含み得る。他の成分には、新たに形成されたビリオン中への特異的ＲＮＡパッケージングのためのパッケージングシグナル（プサイ即ちψ）、および逆転写の間のプラス鎖ＤＮＡ合成の開始の部位であるポリプリントラクト（ＰＰＴ）が含まれる。さらに、レトロウイルスゲノムは、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含み得る。ｇａｇ遺伝子は、構造タンパク質をコードし、ｐｏｌ遺伝子は、ｓｓＲＮＡに付随しウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転写を実行する酵素をコードし、ｅｎｖ遺伝子は、ウイルスエンベロープをコードする。一般に、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖは、ウイルスの複製およびパッケージングのためにトランスで提供される。
【０２４８】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるレトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターであり得る。少なくとも５つの血清群または血清型のレンチウイルスが認識されている。異なる血清型のウイルスは、ある特定の細胞型および／または宿主に示差的に感染し得る。レンチウイルスには、例えば、霊長類レトロウイルスおよび非霊長類レトロウイルスが含まれる。霊長類レトロウイルスには、ＨＩＶおよびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が含まれる。非霊長類レトロウイルスには、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）およびビスナウイルスが含まれる。レンチウイルスまたはレンチベクターは、静止状態の細胞を形質導入することが可能であり得る。オンコレトロウイルスベクターと同様、レンチベクターの設計は、シス作用性配列およびトランス作用性配列の分離に基づき得る。
【０２４９】
ある特定の実施形態では、本出願は、最適化された治療的レトロウイルスベクターによる送達のために設計された発現ベクターを提供する。レトロウイルスベクターは、左（５’）ＬＴＲ；ウイルスのパッケージングおよび／または核インポートを補助する配列；プロモーター；必要に応じて１つまたは複数のさらなる調節エレメント（例えば、エンハンサーまたはポリＡ配列など）；必要に応じてレンチウイルス逆応答エレメント（ＲＲＥ）；ｅＴＦをコードする配列に作動可能に連結したＰＶ選択的調節エレメントを含む構築物；必要に応じてインスレーター；ならびに右（３’）レトロウイルスＬＴＲを含むレンチウイルスであり得る。
【０２５０】
例示的な実施形態では、本明細書で提供されるウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。ＡＡＶは、ヒトおよび一部の他の霊長類種に感染する小さい複製欠損非エンベロープ型動物ウイルスである。ＡＡＶは、ヒト疾患を引き起こさないことが公知であり、軽度の免疫応答を誘導する。ＡＡＶベクターはまた、宿主細胞ゲノム中に組み込まれることなしに、分裂細胞および静止状態の細胞の両方に感染できる。
【０２５１】
ＡＡＶゲノムは、約４．７ｋｂ長の直鎖状一本鎖ＤＮＡからなる。ゲノムは、約１４５ｂｐ長の逆位末端反復（ＩＴＲ）配列が隣接する２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からなる。ＩＴＲは、パリンドローム配列を含む５’末端におけるヌクレオチド配列（５’ＩＴＲ）および３’末端に位置するヌクレオチド配列（３’ＩＴＲ）からなる。これらのＩＴＲは、相補的塩基対合によって、第２鎖合成のためのＤＮＡ複製の開始の間にプライマーとして機能するＴ字型ヘアピン構造を形成するように折り畳まれることによって、シスで機能する。２つのオープンリーディングフレームは、ビリオンの複製およびパッケージングに関与するｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする。例示的な実施形態では、本明細書で提供されるＡＡＶベクターは、ｒｅｐ遺伝子もｃａｐ遺伝子も含まない。かかる遺伝子は、以下にさらに記載されるように、ビリオンを産生するためにトランスで提供され得る。
【０２５２】
ある特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、スタッファー核酸を含み得る。一部の実施形態では、スタッファー核酸は、緑色蛍光タンパク質またはカナマイシンもしくはアンピシリンなどの抗生物質耐性遺伝子をコードし得る。ある特定の実施形態では、スタッファー核酸は、ＩＴＲ配列の外側に配置してよい（例えば、５’ＩＴＲ配列と３’ＩＴＲ配列との間に位置するｅＴＦ導入遺伝子配列および調節配列と比較して）。
【０２５３】
ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２およびＡＡＶ１３を含む種々の血清型のＡＡＶが存在する。これらの血清型は、それらのトロピズム、またはそれらが感染する細胞の型が異なる。ＡＡＶは、複数の血清型由来のゲノムおよびカプシドを含み得る（例えば、シュードタイプ）。例えば、ＡＡＶは、血清型５または血清型９由来のカプシド中にパッケージングされた血清型２のゲノム（例えば、ＩＴＲ）を含み得る。シュードタイプは、形質導入効率を改善し得るだけでなく、トロピズムを変更させ得る。
【０２５４】
一部の場合には、血液脳関門を横断できまたはＣＮＳの細胞に感染できるＡＡＶ血清型が好ましい。一部の場合には、ＡＡＶ９またはそのバリアントが、ＳＣＮ１Ａを上方調節するｅＴＦをコードする導入遺伝子に作動可能に連結したＰＶ選択的調節エレメントを含む本開示の発現カセットを送達するために使用される。
【０２５５】
例示的な実施形態では、本出願は、ＡＡＶによる送達のために設計された発現ベクターを提供する。ＡＡＶは、任意の血清型、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ−ＤＪ、またはキメラ、ハイブリッドもしくはバリアントＡＡＶであり得る。ＡＡＶはまた、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）であり得る。ある特定の実施形態では、ＡＡＶによる送達のために設計された発現ベクターは、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲを含む。ある特定の実施形態では、ＡＡＶによる送達のために設計された発現ベクターは、５’ＩＴＲ、プロモーター、ｅＴＦをコードする導入遺伝子、および３’ＩＴＲを含む。ある特定の実施形態では、ＡＡＶによる送達のために設計された発現ベクターは、５’ＩＴＲ、エンハンサー、プロモーター、ｅＴＦをコードする導入遺伝子、ポリＡ配列、および３’ＩＴＲを含む。例示的なＡＡＶ発現ベクターは、図３６および図３７に示される。
宿主細胞
【０２５６】
別の態様では、本発明は、本発明のｅＴＦをコードする発現カセットまたは発現ベクターを含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞であり得る。例示的な実施形態では、宿主細胞は、目的のウイルスによる感染に対して感受性であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養に適した任意の細胞系を指す。
【０２５７】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される宿主細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子治療を目的として使用し得る。かかる実施形態では、細胞に、本発明のｅＴＦをコードする配列を含む核酸分子または発現ベクターをトランスフェクトし、患者または対象中に引き続いて移植する。移植された細胞は、自家、同種または異種の起源を有し得る。臨床使用のために、細胞単離は、一般に、優良医薬品製造基準（ＧＭＰ）条件下で実施される。移植前に、細胞の品質、および微生物もしくは他の夾雑物の非存在が、典型的にはチェックされ、放射線および／または免疫抑制処理などによるプレコンディショニングが実施され得る。さらに、宿主細胞は、細胞の増殖および／または分化を刺激するために、成長因子と一緒に移植され得る。
【０２５８】
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子治療に使用し得る。好ましくは、この細胞は、真核生物細胞、例えば、哺乳動物細胞であり、これらには、ヒト、非ヒト霊長類、例えば、類人猿；チンパンジー；サルおよびオランウータン、イヌおよびネコを含む飼い慣らされた動物、ならびに家畜、例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジおよびヤギ、またはマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスターが含まれるがこれらに限定されない他の哺乳動物種などが含まれるがこれらに限定されない。当業者は、移植される患者または対象に従って、より適切な細胞を選択する。
【０２５９】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される宿主細胞は、自己再生特性および多能性特性を有する細胞、例えば、幹細胞または人工多能性幹細胞であり得る。幹細胞は、好ましくは、間葉系幹細胞である。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞または筋細胞の少なくとも１つへと分化することが可能であり、任意の型の組織から単離され得る。一般に、ＭＳＣは、骨髄、脂肪組織、臍帯または末梢血から単離される。それを得るための方法は、当業者に周知である。人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣとしても公知）は、成体細胞から直接生成され得る多能性幹細胞の型である。Ｙａｍａｎａｋａらは、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃ遺伝子をマウスおよびヒトの線維芽細胞中に移入し、細胞にそれらの遺伝子を発現させることによって、ｉＰＳ細胞を誘導した（ＷＯ２００７／０６９６６６）。Ｔｈｏｍｓｏｎらは、引き続いて、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃの代わりにＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８を使用してヒトｉＰＳ細胞を産生した（ＷＯ２００８／１１８８２０）。
【０２６０】
例示的な実施形態では、本明細書で提供される宿主細胞は、パッケージング細胞である。この細胞は、接着細胞または浮遊細胞であり得る。パッケージング細胞、およびヘルパーベクターまたはウイルスまたはＤＮＡ構築物（複数可）は、ウイルスベクターの完全な複製およびパッケージングに必要とされる全ての欠けた機能をトランスで一緒に提供する。
【０２６１】
好ましくは、このパッケージング細胞は、真核生物細胞、例えば、サル、ヒト、イヌおよびげっ歯類の細胞を含む哺乳動物細胞である。ヒト細胞の例は、ＰＥＲ．Ｃ６細胞（ＷＯ０１／３８３６２）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１７１）、ＷＩ−３８（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−７５）、ＨＥＫ−２９３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）、ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）および胎仔アカゲザル肺細胞（ＡＴＣＣ  ＣＬ−１６０）である。非ヒト霊長類細胞の例は、Ｖｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ８１）、ＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０）またはＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５１）である。イヌ細胞の例は、ＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−３４）である。げっ歯類細胞の例は、ハムスター細胞、例えば、ＢＨＫ２１−Ｆ、ＨＫＣＣ細胞またはＣＨＯ細胞である。
【０２６２】
哺乳動物供給源の代替として、本発明における使用のための細胞系は、トリ供給源、例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラまたはキジに由来し得る。トリ細胞系の例には、トリ胚性幹細胞（ＷＯ０１／８５９３８およびＷＯ０３／０７６６０１）、不死化アヒル網膜細胞（ＷＯ２００５／０４２７２８）、およびニワトリ細胞（ＷＯ２００６／１０８８４６）またはアヒル細胞、例えば、ＥＢ６６細胞系（ＷＯ２００８／１２９０５８およびＷＯ２００８／１４２１２４）を含むトリ胚性幹細胞由来細胞が含まれる。
【０２６３】
別の実施形態では、この宿主細胞は、昆虫細胞、例えば、ＳＦ９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７１１）、Ｓｆ２１細胞（ＩＰＬＢ−Ｓｆ２１）、ＭＧ１細胞（ＢＴＩ−ＴＮ−ＭＧ１）またはＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（商標）細胞（ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４）である。
【０２６４】
ある特定の実施形態では、本発明の組換えＡＡＶベクター／ゲノム（例えば、ｅＴＦをコードする配列を含む）を含む本明細書で提供される宿主細胞は、１つまたは複数のさらなる核酸構築物、例えば、（ｉ）ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードするがＩＴＲ配列を有さない核酸構築物（例えば、ＡＡＶヘルパープラスミド）；ならびに／または（ｉｉ）ＡＡＶ複製に必要なアデノウイルス機能を提供する核酸構築物（例えば、プラスミド）、などをさらに含み得る。例示的な実施形態では、本明細書で提供される宿主細胞は、以下を含む：ｉ）本発明のｅＴＦをコードする配列を含む発現ベクター（即ち、組換えＡＡＶゲノム）；ｉｉ）ＩＴＲ配列を有さない、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする核酸構築物；ならびにｉｉｉ）アデノウイルスヘルパー遺伝子（以下にさらに記載される）を含む核酸構築物。
【０２６５】
ある特定の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子、ｃａｐ遺伝子およびアデノウイルスヘルパー遺伝子を、単一のプラスミド上で組み合すことができる（Ｂｌｏｕｉｎ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．  ２００４；  ６（ｓｕｐｐｌ）：  Ｓ２２３−Ｓ２２８；Ｇｒｉｍｍ  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２００３；  ７：  ８３９−８５０）。従って、別の例示的な実施形態では、本明細書で提供される宿主細胞は、以下を含む：ｉ）本発明のｅＴＦをコードする配列を含む発現ベクター（即ち、組換えＡＡＶゲノム）；ならびにｉｉ）ＩＴＲ配列を有さない、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードし、アデノウイルスヘルパー遺伝子をさらに含むプラスミド。
【０２６６】
別の実施形態では、本明細書で提供される宿主細胞は、以下を含む：ａ）本発明のｅＴＦをコードする配列を含む発現ベクター（即ち、組換えＡＡＶゲノム）；ｂ）ＩＴＲ配列を有さない、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードするプラスミド；ならびにｃ）アデノウイルスヘルパー遺伝子Ｅ２ａ、Ｅ４およびＶＡのＲＮＡを含むプラスミド；ここで、共トランスフェクションは、アデノウイルスＥ１遺伝子を構成的に発現しそれをトランス補完する（ｔｒａｎｓｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えば、ＨＥＫ−２９３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）において実施される。
【０２６７】
ある特定の実施形態では、ＡＡＶベクターの大規模産生に適切な宿主細胞は、組換えバキュロウイルスの組合せが感染し得る昆虫細胞である（Ｕｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２００２；  １３：  １９３５−１９４３）。例えば、ＳＦ９細胞を、パッケージングされるＡＡＶ  ｒｅｐ、ＡＡＶ  ｃａｐおよびＡＡＶベクターをそれぞれが発現する３つのバキュロウイルスベクターで共感染させ得る。これらの組換えバキュロウイルスベクターは、ウイルスの複製および／またはパッケージングに必要とされるウイルスヘルパー遺伝子機能を提供する。
【０２６８】
本発明に従う遺伝子治療のためのビリオンの構築および産生のためのさらなるガイダンスは、Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．  Ｓｅｒｉｅｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ７３７．  Ｍｅｒｔｅｎ  ａｎｄ  Ａｌ−Ｒｕｂｅａｉ  （Ｅｄｓ．）；  ２０１１  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）；Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｍ．  Ｇｉａｃｃａ．  ２０１０  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；Ｈｅｉｌｂｒｏｎｎ  Ｒ．  ａｎｄ  Ｗｅｇｅｒ  Ｓ．  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ：  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．  Ｉｎ：  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １９７；  Ｍ．  Ｓｃｈａｆｅｒ−Ｋｏｒｔｉｎｇ  （Ｅｄ．）．  ２０１０  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；  ｐｐ．  １４３−１７０；Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．  Ｒ．  Ｏ．  Ｓｎｙｄｅｒ  ａｎｄ  Ｐ．  Ｍｏｕｌｌｌｉｅｒ  （Ｅｄｓ）．  ２０１１  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）；Ｂｕｎｎｉｎｇ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅｃｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  Ｊ．  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．  ２００８；  １０：７１７−７３３；およびＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．  Ｍ．  Ｃｈｉｌｌｏｎ  ａｎｄ  Ａ．  Ｂｏｓｃｈ  （Ｅｄｓ．）；  Ｔｈｉｒｄ．  Ｅｄｉｔｉｏｎ．  ２０１４  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）において見出され得る。
ビリオンおよびビリオンを産生する方法
【０２６９】
ある特定の実施形態では、本出願は、本発明のｅＴＦをコードする配列を含むウイルスベクターを含むウイルス粒子を提供する。用語「ウイルス粒子」および「ビリオン」は、本明細書で相互交換可能に使用され、カプシド内、場合によっては、例えば、レトロウイルスについては、カプシドを取り囲む脂質エンベロープ内にパッケージングされたウイルスゲノム（例えば、ウイルス発現ベクター）を含む感染性の、典型的には複製欠損性のウイルス粒子に関する。「カプシド」は、ウイルスゲノムが中にパッケージングされる構造を指す。カプシドは、タンパク質でできた数個のオリゴマー構造サブユニットからなる。例えば、ＡＡＶは、３つのカプシドタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の相互作用によって形成された正二十面体カプシドを有する。一実施形態では、本明細書で提供されるビリオンは、本明細書に記載されるｅＴＦをコードする配列に作動可能に連結したＰＶ選択的調節エレメントを含むＡＡＶベクターをタンパク質シェル中にパッケージングすることによって得られた、組換えＡＡＶビリオン即ちｒＡＡＶビリオンである。
【０２７０】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される組換えＡＡＶビリオンは、同じ特定の血清型のＡＡＶに対応する天然のＣａｐタンパク質によって形成されるウイルス粒子中に、特定のＡＡＶ血清型に由来するＡＡＶゲノムをカプシド封入することによって調製され得る。他の実施形態では、本明細書で提供されるＡＡＶウイルス粒子は、異なる血清型由来のタンパク質中にパッケージングされた所与のＡＡＶ血清型のＩＴＲ（複数可）を含むウイルスベクターを含む。例えば、Ｂｕｎｎｉｎｇ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ  ２００８；  １０：  ７１７−７３３を参照のこと。例えば、所与のＡＡＶ血清型由来のＩＴＲを有するウイルスベクターは、以下へとパッケージングされ得る：ａ）同じもしくは異なるＡＡＶ血清型に由来するカプシドタンパク質から構成されるウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ２のＩＴＲおよびＡＡＶ９のカプシドタンパク質；ＡＡＶ２のＩＴＲおよびＡＡＶ８のカプシドタンパク質；など）；ｂ）異なるＡＡＶ血清型もしくは変異体由来のカプシドタンパク質の混合物から構成されるモザイクウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ１およびＡＡＶ９のカプシドタンパク質と共にＡＡＶ２のＩＴＲ）；ｃ）異なるＡＡＶ血清型もしくはバリアント間でのドメイン交換によって短縮されたカプシドタンパク質から構成されるキメラウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ９ドメインを有するＡＡＶ８のカプシドタンパク質と共にＡＡＶ２のＩＴＲ）；またはｄ）標的細胞特異的受容体とのストリンジェントな相互作用を可能にする選択的結合ドメインを呈するように操作された標的化されたウイルス粒子（例えば、ペプチドリガンドの挿入によって遺伝的に短縮されたＡＡＶ９のカプシドタンパク質と共にＡＡＶ５のＩＴＲ；またはカプシド表面へのペプチドリガンドのカップリングによって非遺伝的に改変されたＡＡＶ９のカプシドタンパク質）。
【０２７１】
当業者は、本明細書で提供されるＡＡＶビリオンが、任意のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質を含み得ることを理解する。一実施形態では、ウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９からなる群から選択されるＡＡＶ血清型由来のカプシドタンパク質を含み、これらは、ＣＮＳへの送達のためにより適切である（Ｍ．  Ｈｏｃｑｕｅｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２７（７）：  ４７８−４９６  （２０１６））。特定の実施形態では、ウイルス粒子は、本発明の発現カセットを含み、ここで、発現カセットの５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２血清型のものであり、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ９血清型のものである。
【０２７２】
トランスフェクション、安定な細胞系産生、ならびにアデノウイルス−ＡＡＶハイブリッド、ヘルペスウイルス−ＡＡＶハイブリッド（Ｃｏｎｗａｙ，  Ｊ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７１（１１）：８７８０−８７８９）およびバキュロウイルス−ＡＡＶハイブリッドを含む感染性ハイブリッドウイルス産生系を含む多数の方法が、ｒＡＡＶビリオンの産生のために当該分野で公知である。ｒＡＡＶウイルス粒子の産生のためのｒＡＡＶ産生培養は、全て以下を必要とする；１）例えば、ヒト由来細胞系、例えば、ＨｅＬａ、Ａ５４９もしくは２９３細胞、または昆虫由来細胞系、例えば、バキュロウイルス産生系の場合にはＳＦ−９を含む、適切な宿主細胞；２）野生型もしくは変異体アデノウイルス（例えば、温度感受性アデノウイルス）、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、またはヘルパー機能を提供するプラスミド構築物によって提供される、適切なヘルパーウイルス機能；３）ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐの遺伝子および遺伝子産物；４）ＡＡＶ  ＩＴＲ配列が隣接する導入遺伝子（例えば、本明細書に記載されるｅＴＦをコードする配列に作動可能に連結したプロモーター）；ならびに５）ｒＡＡＶ産生を支持するための適切な培地および培地成分。
【０２７３】
種々の実施形態では、本明細書に記載される宿主細胞は、以下の３つの成分を含む：（１）ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子、（２）ヘルパー機能を提供する遺伝子、ならびに（３）導入遺伝子（例えば、ＩＴＲが隣接する本明細書に記載されるｅＴＦをコードする配列に作動可能に連結したプロモーター）。ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子、およびヘルパー機能を提供する遺伝子は、これらの遺伝子をベクター、例えば、プラスミドなどの中に組み入れ、このベクターを宿主細胞中に導入することによって、細胞中に導入され得る。ｒｅｐ、ｃａｐおよびヘルパー機能遺伝子は、同じプラスミドまたは異なるプラスミド中に組み入れ得る。好ましい実施形態では、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子は、１つのプラスミド中に組み入れ、ヘルパー機能を提供する遺伝子は、別のプラスミド中に組み入れる。ビリオン産生のための宿主細胞の創製のための種々のプラスミド（例えば、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子、ヘルパー機能、または導入遺伝子を含む）は、当該分野で周知の任意の適切な方法を使用することによって、細胞中に導入され得る。トランスフェクション法の例には、リン酸カルシウムによる共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリブレン、電気穿孔、マイクロインジェクション、リポソーム媒介性融合、リポフェクション、レトロウイルス感染および遺伝子銃トランスフェクションが含まれるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子、ヘルパー機能ならびに導入遺伝子（例えば、ＩＴＲが隣接する本明細書で開示されるｅＴＦをコードする配列に作動可能に連結したプロモーター）を提供するプラスミドは、細胞中に同時に導入され得る。別の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子ならびにヘルパー機能を提供するプラスミドは、導入遺伝子を含むプラスミドの導入の前または後に、細胞中に導入され得る。例示的な実施形態では、細胞に、以下の３つのプラスミドを同時にトランスフェクトする（例えば、三重トランスフェクション法）：（１）導入遺伝子（例えば、ＩＴＲが隣接する本明細書で開示されるｅＴＦをコードする配列に作動可能に連結したプロモーター）を含むプラスミド、（２）ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含むプラスミド、ならびに（３）ヘルパー機能を提供する遺伝子を含むプラスミド。例示的な宿主細胞は、２９３、Ａ５４９またはＨｅＬａ細胞であり得る。
【０２７４】
他の実施形態では、（１）ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子、（２）ヘルパー機能を提供する遺伝子、ならびに（３）導入遺伝子、のうち１つまたは複数は、エピソームとして、および／またはパッケージング細胞のゲノム中に組み込まれて、パッケージング細胞によって保有され得る。一実施形態では、宿主細胞は、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子ならびにヘルパー機能が宿主細胞中で安定に維持されるパッケージング細胞であり得、宿主細胞に、導入遺伝子（例えば、ＩＴＲが隣接する本明細書で開示されるｅＴＦをコードする配列に作動可能に連結したプロモーター）を含むプラスミドを一過的にトランスフェクトする。別の実施形態では、宿主細胞は、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子が宿主細胞中で安定に維持されるパッケージング細胞であり、宿主細胞に、導入遺伝子（例えば、ＩＴＲが隣接する本明細書で開示されるｅＴＦをコードする配列に作動可能に連結したプロモーター）を含むプラスミドおよびヘルパー機能を含むプラスミドを一過的にトランスフェクトする。別の実施形態では、宿主細胞は、ヘルパー機能が宿主細胞中で安定に維持されるパッケージング細胞であり得、宿主細胞に、導入遺伝子（例えば、ＩＴＲが隣接する本明細書で開示されるｅＴＦをコードする配列に作動可能に連結したプロモーター）を含むプラスミドならびにｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含むプラスミドを一過的にトランスフェクトする。別の実施形態では、宿主細胞は、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子、ヘルパー機能ならびに導入遺伝子配列（例えば、ＩＴＲが隣接する本明細書で開示されるｅＴＦをコードする配列に作動可能に連結したプロモーター）で安定にトランスフェクトした産生細胞系であり得る。例示的なパッケージング細胞および産生細胞は、２９３、Ａ５４９またはＨｅＬａ細胞に由来し得る。
【０２７５】
別の実施形態では、産生細胞系は、Ｒｅｐタンパク質およびＣａｐタンパク質を提供するバキュロウイルス発現ベクターを感染させた昆虫細胞系（典型的にはＳｆ９細胞）である。この系は、アデノウイルスヘルパー遺伝子を必要としない（Ａｙｕｓｏ  Ｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２０１０，  １０：４２３−４３６）。
【０２７６】
用語「ｃａｐタンパク質」は、本明細書で使用される場合、ネイティブＡＡＶ  Ｃａｐタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）の少なくとも１つの機能的活性を有するポリペプチドを指す。ｃａｐタンパク質の機能的活性の例には、カプシドの形成を誘導する能力、一本鎖ＤＮＡの蓄積を促進する能力、カプシド中へのＡＡＶ  ＤＮＡのパッケージング（即ち、カプシド封入）を促進する能力、細胞受容体に結合する能力、および宿主細胞中へのビリオンの進入を促進する能力が含まれる。原則として、任意のＣａｐタンパク質が、本発明の文脈において使用し得る。
【０２７７】
ｃａｐタンパク質は、ＡＡＶウイルスの宿主トロピズム、細胞、組織または臓器特異性、受容体の使用法、感染効率および免疫原性に対して影響を有することが報告されている。従って、ｒＡＡＶにおける使用のためのＡＡＶ  ｃａｐは、例えば、対象の種（例えば、ヒトまたは非ヒト）、対象の免疫学的状態、長期もしくは短期処置への対象の適性、または特定の治療的適用（例えば、特定の疾患もしくは障害の処置、または特定の細胞、組織もしくは臓器への送達）を考慮して選択され得る。ある特定の実施形態では、ｃａｐタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９血清型からなる群のＡＡＶに由来する。例示的な実施形態では、ｃａｐタンパク質は、ＡＡＶ９に由来する。
【０２７８】
一部の実施形態では、本発明の方法における使用のためのＡＡＶ  Ｃａｐは、上述のＡＡＶ  ｃａｐまたはそのコード核酸のうち１つの変異誘発（即ち、挿入、欠失または置換による）によって生成され得る。一部の実施形態では、ＡＡＶ  ｃａｐは、上述のＡＡＶ  ｃａｐのうち１つまたは複数に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％のまたはそれより高い類似性がある。
【０２７９】
一部の実施形態では、ＡＡＶ  ｃａｐは、上述のＡＡＶ  ｃａｐのうち２個、３個、４個またはそれよりも多くに由来するドメインを含むキメラである。一部の実施形態では、ＡＡＶ  ｃａｐは、２個もしくは３個の異なるＡＡＶまたは組換えＡＡＶに由来するＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３モノマーのモザイクである。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ組成物は、上述のｃａｐのうち１つよりも多くを含む。
【０２８０】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンにおける使用のためのＡＡＶ  ｃａｐは、異種配列または他の改変を含むように操作される。例えば、選択的標的化または免疫回避を付与するペプチドまたはタンパク質配列が、ｃａｐタンパク質中に操作により導入され得る。あるいは、またはさらに、ｃａｐは、ｒＡＡＶの表面がポリエチレングリコール化（即ち、ペグ化）されるように化学的に改変され得、これにより、免疫回避を促進し得る。ｃａｐタンパク質はまた、（例えば、その天然の受容体結合を除去するために、または免疫原性エピトープをマスクするために）変異誘発され得る。
【０２８１】
用語「ｒｅｐタンパク質」は、本明細書で使用される場合、ネイティブＡＡＶ  ｒｅｐタンパク質（例えば、ｒｅｐ  ４０、５２、６８、７８）の少なくとも１つの機能的活性を有するポリペプチドを指す。ｒｅｐタンパク質の機能的活性の例には、ＡＡＶのＤＮＡ複製起点の認識、結合およびニック形成を介してＤＮＡの複製を促進すること、ならびにＤＮＡヘリカーゼ活性を含む、タンパク質の生理学的機能に関連する任意の活性が含まれる。さらなる機能には、ＡＡＶ（または他の異種）プロモーターからの転写のモジュレーション、および宿主染色体中へのＡＡＶ  ＤＮＡの部位特異的組み込みが含まれる。特定の実施形態では、ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０またはＡＡＶｒｈ１０由来；より好ましくは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９からなる群から選択されるＡＡＶ血清型由来であり得る。
【０２８２】
一部の実施形態では、本発明の方法における使用のためのＡＡＶ  ｒｅｐタンパク質は、上述のＡＡＶ  ｒｅｐまたはそのコード核酸のうち１つの変異誘発（即ち、挿入、欠失または置換による）によって生成され得る。一部の実施形態では、ＡＡＶ  ｒｅｐは、上述のＡＡＶ  ｒｅｐのうち１つまたは複数と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％のまたはそれより高い類似性がある。
【０２８３】
表現「ヘルパー機能」または「ヘルパー遺伝子」は、本明細書で使用される場合、複製のためにＡＡＶが依存するウイルスタンパク質を指す。ヘルパー機能には、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、ステージ特異的ＡＡＶ  ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ  ＤＮＡ複製、ｃａｐ発現産物の合成、およびＡＡＶカプシドアセンブリに関与するタンパク質が含まれるがこれらに限定されない、ＡＡＶ複製に必要とされるタンパク質が含まれる。ウイルスに基づくアクセサリー機能は、公知のヘルパーウイルス、例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型以外）およびワクシニアウイルスのいずれかに由来し得る。ヘルパー機能には、アデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ、ＶＡおよびＥ４またはヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬＢ、ＵＬ５２およびＵＬ２９、ならびにヘルペスウイルスポリメラーゼが含まれるがこれらに限定されない。好ましい実施形態では、複製のためにＡＡＶが依存するタンパク質は、アデノウイルスに由来する。
【０２８４】
一部の実施形態では、本発明の方法における使用のための、複製のためにＡＡＶが依存するウイルスタンパク質は、上述のウイルスタンパク質またはそのコード核酸のうち１つの変異誘発（即ち、挿入、欠失または置換による）によって生成され得る。一部の実施形態では、ウイルスタンパク質は、上述のウイルスタンパク質のうち１つまたは複数に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％のまたはそれより高い類似性がある。
【０２８５】
複製のためにＡＡＶが依存するｃａｐタンパク質、ｒｅｐタンパク質およびウイルスタンパク質の機能をアッセイするための方法は、当該分野で周知である。
【０２８６】
目的の導入遺伝子（例えば、ｅＴＦをコードする配列に作動可能に連結したプロモーター）を発現させるための宿主細胞を、ＡＡＶビリオンのアセンブリに適切な条件下で成長させることができる。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ＡＡＶビリオンのアセンブリおよび培地中へのビリオンの放出を促進するために、適切な期間にわたって成長させる。一般に、細胞を、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約７２時間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間または最大で約１０日間にわたって成長させることができる。約１０日後（または使用する培養条件および特定の宿主細胞に依存して、より早く）、産生のレベルは、一般に、有意に減少する。一般に、培養の時間は、ウイルス産生の観点から測定される。例えば、ＡＡＶの場合、ウイルス産生は、一般に、本明細書に記載されるように、適切な宿主細胞においてヘルパーウイルス機能を供給すると開始する。一般に、細胞は、ヘルパーウイルス感染の（またはウイルス産生が開始した）約４８〜約１００時間後、好ましくは約４８〜約９６時間後、好ましくは約７２〜約９６時間後、好ましくは約６８〜約７２時間後に回収される。
【０２８７】
ｒＡＡＶ産生培養物は、利用されている特定の宿主細胞に適切な種々の条件（広い温度範囲にわたって、様々な期間にわたって、など）下で成長させることができる。ｒＡＡＶ産生培養物には、適切な接着依存性容器（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｖｅｓｓｅｌ）、例えば、ローラーボトル、ホローファイバーフィルター、マイクロキャリア、および充填床または流動床バイオリアクターなどにおいて培養することができる接着依存性培養物が含まれる。ｒＡＡＶベクター産生培養物には、例えば、スピナーフラスコ、撹拌タンクバイオリアクター、および使い捨てシステム、例えば、Ｗａｖｅバッグシステムを含む種々の方法で培養することができる、浮遊に適応させ浮遊に適応されたた宿主細胞、例えば、ＨｅＬａ、２９３およびＳＦ−９細胞もまた含まれ得る。
【０２８８】
当該分野で公知の適切な培地が、ｒＡＡＶビリオンの産生のために使用し得る。これらの培地には、改変イーグル培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含む、Ｈｙｃｌｏｎｅ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓおよびＪＲＨにが生産する培地が含まれるがこれらに限定されず、これらの各々は、その全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ産生培養培地には、０．５％〜２０％（ｖ／ｖまたはｗ／ｖ）のレベルの血清または血清由来組換えタンパク質が補充され得る。あるいは、ｒＡＡＶベクターは、動物由来産物を含まない培地とも呼ばれ得る、無血清条件で産生され得る。
【０２８９】
ＡＡＶビリオン産生を可能にするために宿主細胞を培養した後、得られたビリオンを、回収および精製することができる。ある特定の実施形態では、ＡＡＶビリオンは、（１）宿主細胞の溶解によって産生培養物の宿主細胞から、および／または（２）トランスフェクション後一定期間の後、好ましくは７２時間後のこれらの細胞の培養培地から、得ることができる。ｒＡＡＶビリオンは、産生培養物由来の使用済みの培地から回収され得るが、ただし、細胞は、インタクトな細胞から培地中へのｒＡＡＶビリオンの放出を引き起こす条件下で培養される（例えば、米国特許第６，５６６，１１８号を参照のこと）。細胞を溶解させる適切な方法もまた、当該分野で公知であり、これには、例えば、複数回の凍結／解凍サイクル、超音波処理、マイクロ流体化、ならびに化学物質、例えば、界面活性剤および／またはプロテアーゼによる処理が含まれる。
【０２９０】
回収後、ｒＡＡＶビリオンを、精製することができる。用語「精製した」は、本明細書で使用される場合、ｒＡＡＶビリオンが天然に存在する場所またはそれらが当初そこから調製された場所にこれもまた存在し得る他の成分の少なくとも一部を欠くｒＡＡＶビリオンの調製物を含む。従って、例えば、精製したｒＡＡＶビリオンは、供給源混合物、例えば、培養溶解物または産生培養物上清からそれを富化するための単離技術を使用して調製され得る。富化は、例えば、溶液中に存在するＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）もしくはゲノムコピー（ｇｃ）の割合で、または感染力によるなどの種々の方法で測定し得、あるいは供給源混合物中に存在する第２の潜在的に干渉性の物質、例えば、ヘルパーウイルス、培地成分などを含む産生培養夾雑物もしくは工程内夾雑物を含む夾雑物に関連して測定し得る。
【０２９１】
ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ産生培養回収物は、宿主細胞デブリを除去するために清澄化され得る。一部の実施形態では、産生培養回収物は、種々の標準的な技術、例えば、遠心分離、または０．２μｍもしくはそれよりも大きいポアサイズのフィルター（例えば、酢酸セルロースフィルターまたは一連のデプスフィルター）を介した濾過を使用して、清澄化され得る。
【０２９２】
ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ産生培養回収物は、産生培養物中に存在する任意の高分子量ＤＮＡを消化するために、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）でさらに処理される。一部の実施形態では、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）消化は、標準的な条件、例えば、３０分間〜数時間の期間にわたって周囲〜３７℃の範囲の温度で１〜２．５単位／ｍｌの最終濃度のＢｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）の下で実施される。
【０２９３】
ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンを、以下の精製ステップの１つまたは複数を使用して単離または精製することができる：平衡遠心分離；フロースルーアニオン交換濾過；ｒＡＡＶ粒子を濃縮するための接線流濾過（ＴＦＦ）；アパタイトクロマトグラフィーによるｒＡＡＶ捕捉；ヘルパーウイルスの熱不活性化；疎水性相互作用クロマトグラフィーによるｒＡＡＶ捕捉；サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による緩衝液交換；ナノ濾過；およびアニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィーまたは親和性クロマトグラフィーによるｒＡＡＶ捕捉。これらのステップは、単独で、種々の組合せで、または異なる順序で使用し得る。ｒＡＡＶ粒子を精製するための方法は、例えば、Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７２：２２２４−２２３２；米国特許第６，９８９，２６４号および同第８，１３７，９４８号；ならびにＷＯ２０１０／１４８１４３において見出される。
【０２９４】
ある特定の実施形態では、精製したＡＡＶビリオンは、ＰＢＳに対して透析し、濾過し、−８０℃で貯蔵することができる。ウイルスゲノムの力価は、検量線として線状化プラスミドＤＮＡを使用する定量的ＰＣＲによって決定することができる（例えば、Ｌｏｃｋ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２０１０；  ２１：１２７３−１２８５を参照のこと）。
医薬組成物
【０２９５】
ある特定の実施形態では、本出願は、ｅＴＦをコードする配列および薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。他の実施形態では、本出願は、ｅＴＦをコードする配列を含むビリオンおよび薬学的に許容される担体を提供する。例示的な実施形態では、かかる組成物は、遺伝子治療適用に適切である。医薬組成物は、好ましくは、製造および貯蔵の条件下で、無菌かつ安定である。無菌の溶液は、例えば、無菌の濾過メンブレンを介した濾過によって達成され得る。
【０２９６】
医薬組成物中の許容される担体および賦形剤は、好ましくは、使用される投与量および濃度においてレシピエントにとって非毒性である。許容される担体および賦形剤には、バッファ、例えば、ホスフェート、シトレート、ＨＥＰＥＳおよびＴＡＥ、抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸およびメチオニン、防腐剤、例えば、塩化ヘキサメトニウム、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム（ｏｃｔａｄｅｃｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、レゾルシノールおよび塩化ベンザルコニウム、タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチン、デキストランおよび免疫グロブリン、親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン、アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、ヒスチジンおよびリシン、ならびに炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、スクロースおよびソルビトールが含まれ得る。本開示の医薬組成物は、注射可能な製剤の形態で非経口投与され得る。注射のための医薬組成物は、無菌の溶液または任意の薬学的に許容される液体をビヒクルとして使用して製剤化され得る。薬学的に許容されるビヒクルには、無菌の水および生理的食塩水が含まれるがこれらに限定されない。
【０２９７】
本開示の医薬組成物は、マイクロカプセル、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセル、およびポリメチルメタクリレートマイクロカプセル中で調製され得る。本開示の医薬組成物は、他の薬物送達系、例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル中でも調製され得る。遺伝子治療のための医薬組成物は、許容される希釈剤中にあってよく、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれた徐放性マトリックスを含んでよい。
【０２９８】
本明細書で提供される医薬組成物は、非経口投与、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、実質内投与、髄腔内投与（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、大槽内投与、脳室内投与または腹腔内投与のために製剤化され得る。医薬組成物はまた、経鼻、スプレー、経口、エアロゾル、直腸もしくは膣投与のために製剤化され得、またはそれを介して投与され得る。一実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物は、ＣＮＳまたは脳脊髄液（ＣＳＦ）に、即ち、実質内注射、髄腔内注射、大槽内注射または脳室内注射によって投与される。組織標的は、ＣＮＳなど、特異的であり得、またはいくつかの組織、例えば、筋肉およびＣＮＳ組織の組合せであり得る。例示的な組織または他の標的には、肝臓、骨格筋、心筋、脂肪沈着物、腎臓、肺、血管内皮、上皮、造血細胞、ＣＮＳおよび／またはＣＳＦが含まれ得る。好ましい実施形態では、ＳＣＮ１ＡまたはＧＲＮを上方調節するｅＴＦを含む本明細書で提供される医薬組成物は、ＣＮＳまたはＣＳＦ注射に、即ち、実質内注射、髄腔内注射、大槽内注射または脳室内注射によって投与される。これらの方法の１つまたは複数が、本開示の医薬組成物を投与するために使用し得る。
【０２９９】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物は、「有効量」または「治療有効量」を含む。本明細書で使用される場合、かかる量は、所望の治療的結果、例えば、ＳＣＮ１Ａ発現のレベルを増加させること、ならびに／または発作の頻度および／もしくは持続時間を減少させること、あるいはＧＲＮ発現のレベルを増加させること、ならびに／またはＧＲＮに関連する疾患もしくは障害、例えばＦＴＤを処置することを達成するのに必要な投与量において、およびそのような期間にわたって、有効な量を指す。
【０３００】
本開示の医薬組成物の投与量は、投与の経路、処置される疾患、および対象の肉体的特徴（例えば、年齢、体重、全体的健康）を含む因子に依存する。投与量は、最適な治療応答を提供するために調整され得る。典型的には、投与量は、顕著な毒性を誘導することなしに、疾患を有効に処置する量であり得る。一実施形態では、本明細書で提供されるＡＡＶベクターは、５×１０１１〜１×１０１４ｇｃ／ｋｇ（患者の体重１キログラム当たりのゲノムコピー数（ｇｃ／ｋｇ））の範囲内の量または用量で、ＳＣＮ１Ａ欠損（例えば、ドラベ症候群を含む）の処置またはＧＲＮ欠損（例えば、ＦＴＤを含む）の処置のために、患者に投与され得る。より特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、約５×１０１１ｇｃ／ｋｇ〜約３×１０１３ｇｃ／ｋｇもしくは約１×１０１２〜約１×１０１４ｇｃ／ｋｇもしくは約１×１０１２〜約１×１０１３ｇｃ／ｋｇの範囲内に含まれる量、または約５×１０１１ｇｃ／ｋｇ、１×１０１２ｇｃ／ｋｇ、１．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、２．０×１０１２ｇｃ／ｋｇ、２．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、３×１０１２ｇｃ／ｋｇ、３．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、４×１０１２ｇｃ／ｋｇ、４．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、５．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、６×１０１２ｇｃ／ｋｇ、６．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、７×１０１２ｇｃ／ｋｇ、７．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、８×１０１２ｇｃ／ｋｇ、８．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、９×１０１２ｇｃ／ｋｇもしくは９．５×１０１２ｇｃ／ｋｇの量で投与される。ｇｃ／ｋｇは、例えば、ｑＰＣＲまたはデジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって決定することができる（例えば、Ｍ．  Ｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ，  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２０１４  Ａｐｒ；２５（２）：  １１５−２５を参照のこと）。別の実施形態では、本明細書で提供されるＡＡＶベクターは、１×１０９〜１×１０１１ｉｕ／ｋｇ（ベクターの感染単位（ｉｕ）／対象または患者の体重（ｋｇ））の範囲内の量または用量で、ＳＣＮ１Ａ欠損（例えば、ドラベ症候群を含む）の処置のために、患者に投与され得る。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、必要に応じて単位用量で形成され得る。かかる単一の投与単位は、約１×１０９ｇｃ〜約１×１０１５ｇｃを含み得る。
【０３０１】
本開示の医薬組成物は、それを必要とする対象に、例えば、１または複数回（例えば、１〜１０回またはそれよりも多く）、毎日、毎週、毎月、年に２回、毎年、または医学的に必要な場合、投与され得る。例示的な実施形態では、単一回の投与が十分である。一実施形態では、ＳＣＮ１ＡまたはＧＲＮを上方調節するｅＴＦをコードする発現カセットを含む医薬組成物は、ヒト対象における使用に適切であり、実質内注射、髄腔内注射、大槽内注射または脳室内注射によって投与される。一実施形態では、医薬組成物は、ボーラス注射によって末梢静脈を介して送達される。他の実施形態では、医薬組成物は、約１０分間（±５分間）にわたる、約２０分間（±５分間）にわたる、約３０分間（±５分間）にわたる、約６０分間（±５分間）にわたるまたは約９０分間（±１０分間）にわたる注入によって、末梢静脈を介して送達される。
【０３０２】
別の態様では、本出願は、１つまたは複数のコンテナ中に本明細書に記載される核酸分子、ベクター、宿主細胞、ビリオンまたは医薬組成物を含むキットをさらに提供する。キットは、キット内に含まれる核酸分子、ベクター、宿主細胞またはビリオンを患者に投与する方法を記載する指示または包装材料を含み得る。キットのコンテナは、任意の適切な材料、例えば、ガラス、プラスチック、金属などのもの、および任意の適切なサイズ、形状または構成のものであり得る。ある特定の実施形態では、キットは、適切な液体または溶液形態で核酸分子、ベクター、宿主細胞、ビリオンまたは医薬組成物を含む１つまたは複数のアンプルまたはシリンジを含み得る。
処置の方法
【０３０３】
種々の実施形態では、本出願は、本明細書で開示されるｅＴＦを使用するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本出願は、細胞における目的の遺伝子の発現をモジュレートするために、本明細書で開示されるｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子を投与するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、ｅＴＦは、目的の遺伝子の発現を上方調節し得る。他の実施形態では、ｅＴＦは、目的の遺伝子の発現を下方調節し得る。種々の実施形態では、ｅＴＦは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで、細胞における目的の遺伝子の発現をモジュレートするために使用し得る。
【０３０４】
ある特定の実施形態では、本出願は、目的の遺伝子に関連する疾患または障害を処置するための方法であって、それを必要とする対象に、目的の遺伝子の発現をモジュレートするｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子を投与することによる方法を提供する。例示的な実施形態では、疾患または障害は、目的の遺伝子のハプロ不全に関連し、発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子は、目的の遺伝子の発現を上方調節するｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、疾患または障害を処置する方法は、そのような遺伝子の過剰発現または過少発現が、標準医療によって、修正され、健康な個体のレベルの範囲内に入り、または定義された正常範囲内に入るように、かかる疾患または障害に関連する目的の内因性遺伝子の発現をモジュレートするｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子を投与することを含む。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法は、遺伝子の異常な発現を生じる１つまたは複数の変異を含む内因性遺伝子に関連する疾患または障害を処置するために使用される。一部の場合には、かかる内因性遺伝子は、遺伝子治療において導入遺伝子として送達されるには大きすぎる、または導入遺伝子として送達された場合に不十分に発現する遺伝子である。
【０３０５】
ある特定の実施形態では、本出願は、疾患または障害に関連する症状を軽快させるための方法であって、それを必要とする対象に、かかる疾患または障害に関連する遺伝子の発現をモジュレートするｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子を投与することによる方法を提供する。
【０３０６】
例示的な実施形態では、本出願は、ＳＣＮ１Ａにおける変異、Ｎａｖ１．１における欠損および／またはＮａｖ１．１の活性が低減した疾患、障害または症状を処置するための方法であって、それを必要とする対象に、ＳＣＮ１Ａ遺伝子またはそのタンパク質産物Ｎａｖ１．１の発現を上方調節するｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子を投与することによる方法を提供する。電位依存性ナトリウムイオンチャネルは、横紋筋および神経組織における活動電位の生成および伝播にとって重要である。電位依存性ナトリウムイオンチャネルは、１つの大きい中心的ポア形成グリコシル化アルファサブユニットおよび２つのより小さい補助的ベータサブユニットからなるヘテロマー複合体である。ＳＣＮ１Ａ遺伝子によってコードされる大きいアルファサブユニットＮａｖ１．１サブユニットは、種々の疾患または障害、例えば、ドラベ症候群に関連している。Ｎａｖ１．１は、ニューロンにおいて発現され、ＳＣＮ１Ｂ遺伝子によって発現されるＮａｖβ１を含む種々のベータサブユニットとアセンブルされ得る。
【０３０７】
ある特定の実施形態では、本出願は、内因性ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を上方調節するｅＴＦを使用して、ＳＣＮ１Ａにおける変異またはＮａｖ１．１の活性の低減に関連する疾患を処置するための方法を提供する。ＳＣＮ１Ａ変異に関連する疾患および障害には、以下が含まれるがこれらに限定されない：ドラベ症候群、大田原症候群、てんかん、早期乳児てんかん性脳症６（ＥＩＥＥ６）、家族性熱性けいれん３Ａ（ＦＥＢ３Ａ）、全身性強直性間代性発作を伴う難治性小児てんかん（ｉｎｔｒａｃｔａｂｌｅ  ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  ｅｐｉｌｅｐｓｙ  ｗｉｔｈ  ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ  ｔｏｎｉｃ−ｃｌｏｎｉｃ  ｓｅｉｚｕｒｅｓ  ）（ＩＣＥＧＴＣ）、家族性片麻痺性片頭痛（ｍｉｇｒａｉｎｅ，  ｆａｍｉｌｉａｌ  ｈｅｍｉｐｌｅｇｉｃ）３（ＦＨＭ３）、パナイオトポウロス症候群（Ｐａｎａｙｉｏｔｏｐｏｕｌｏｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、家族性心房細動１３（ＡＴＦＢ１３）、熱性けいれんプラスを伴う全身性てんかん１型（ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ  ｅｐｉｌｅｐｓｙ  ｗｉｔｈ  ｆｅｂｒｉｌｅ  ｓｅｉｚｕｒｅｓ  ｐｌｕｓ  ｔｙｐｅ  １）（ｇｅｆｓ＋１型）、ブルガダ症候群、非特異的心伝導障害、熱性けいれんプラスを伴う全身性てんかん、良性家族性乳児発作、早期乳児てんかん性脳症１１（ＥＩＥＥ１１）、良性家族性乳児てんかん、神経変性、タウオパチーおよびアルツハイマー病。一部の場合には、神経学的状態は、ドラベ症候群である。ＳＣＮ１Ａにおける変異または異常は、発作障害、てんかん、自閉症、家族性片麻痺性片頭痛３型（ＦＨＭ３）、遺伝性てんかん熱性けいれんプラス（ＧＥＦＳ＋）、およびある特定の抗てんかん薬物療法の有効性にも関連付けられている。例えば、ＳＣＮ１ＡにおけるＩＣＳ５Ｎ＋５Ｇ＞Ａ変異は、抗てんかん薬フェニトインおよびカルバマゼピンの最大安全量（用量）に関連する。
【０３０８】
ある特定の実施形態では、本出願は、ＳＣＮ１Ａを上方調節するｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子を投与することによって、ドラベ症候群を有する対象またはドラベ症候群を発症するリスクがある対象を処置するための方法を提供する。ドラベ症候群は、小児の人生の最初の１年以内の長期にわたる熱性および非熱性けいれんによって特徴付けられている。この疾患は、ミオクローヌス発作および部分発作などの他の発作型、精神運動遅滞ならびに運動失調へと進行する。これは、認知機能障害、行動障害および運動障害を特徴とする。行動障害には、多動性および衝動性、ならびにより稀な症例では、自閉症様行動が含まれる場合が多い。ドラベ症候群は、傾眠および不眠症を含む睡眠障害にも関連する。多くの患者では、ドラベ症候群は、非機能的タンパク質の産生をもたらす遺伝的変異によって引き起こされる。遺伝的原因に関連する障害を処置することには、多くの課題が存在する。従って、既存の処置のほとんどは、発作および他の症状の予防的医学管理を対象にしてきた。
【０３０９】
患者の７０〜９０％では、ドラベ症候群は、未熟な停止コドンおよび従って非機能的タンパク質を生じる、ＳＣＮ１Ａ遺伝子におけるナンセンス変異によって引き起こされる。典型的には、ナトリウムチャネルポアのＳ５セグメントまたはＳ６セグメントのいずれかにおけるミスセンス変異は、チャネル機能の喪失およびドラベ症候群の発症を生じる。ＳＣＮ１Ａ変異のヘテロ接合性遺伝が、欠陥のあるナトリウムチャネルを生じさせるのに必要な全てである；ドラベ症候群を有する患者は、１つの正常コピーの遺伝子をなおも有する。従って、疾患は、ハプロ不全の１つとして特徴付けられ、ＳＣＮ１Ａの機能的なコピーの発現を増加させることで、Ｎａｖ１．１の正常な産生レベルを回復させることができた。
【０３１０】
ドラベ症候群に関連する症状には、発作、記憶障害、発育遅延、不十分な筋緊張および／または認知問題が含まれる。本明細書に記載される発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子（ｖｉｒｉａｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）による処置は、１つまたは複数の症状の改善、例えば、発作の回数、持続時間および／または強度における低減を生じ得る。ドラベ症候群を発症するリスクがある対象への本明細書に記載される遺伝子治療の投与は、ドラベの１つもしくは複数の症状の発症を予防できまたはその進行を遅くすることができる。
【０３１１】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるＳＣＮ１Ａを上方調節するｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子による処置は、発作の持続時間および／または頻度、例えば、ドラベ症候群に関連する発作を、未処置の対照と比較して、または処置前のレベルと比較して、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれよりも大きく低減する。
【０３１２】
一部のアルツハイマー患者では、多くのペプチドおよびプロテアーゼが関与するアミロイドβ（Ａβ）の産生が、ニューロンの興奮性に影響を与え得、発作、およびＰＶニューロンにおけるＮａｖ１．１ナトリウムチャネルの下方調節を引き起こす。別の実施形態では、本出願は、ＳＣＮ１Ａを上方調節するｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを含む本明細書に記載される発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子を投与することによって、アルツハイマー病に罹患している対象を処置するための方法を提供する。アルツハイマー病に関連する症状には、短期記憶喪失、認知困難、発作、ならびに言語、実行機能、知覚（失認）および動作の実行（失行）に関する困難が含まれる。ＳＣＮ１Ａを上方調節するｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子による処置は、１つまたは複数のアルツハイマー病症状の改善、例えば、記憶喪失の進行における低減、または１つもしくは複数の症状の予防を生じ得る。一部の場合には、処置は、高ガンマパワー（ｈｉｇｈ  ｇａｍｍａ  ｐｏｗｅｒ）脳活動の修正を生じ得る。処置は、処置なしと比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％またはそれよりも大きい、発作頻度および／もしくは発作の重症度における減少、または高ガンマパワー活動における減少を生じ得る。一部の場合には、処置は、認知機能における改善を生じ得る。学習および／または記憶は、処置なし、または本明細書で開示されるＳＣＮ１Ａを上方調節するｅＴＦをコードするポリヌクレオチドによる処置の前と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または１００％よりも大きく、改善され得る。
【０３１３】
一部の場合には、ＳＣＮ１Ａを上方調節するｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子による処置は、高ガンマパワー活動（例えば、アルツハイマー病に関連する高ガンマパワー活動）を、未処置の対照と比較して、または処置前のレベルと比較して、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％低減する。
【０３１４】
パーキンソニズムは、緩慢さ（動作緩慢）、こわばり（硬直）、振戦および不均衡（姿勢の不安定性）を含む、パーキンソン病（ＰＤ）において見出される徴候および症状の集合を指す。一部の場合には、パーキンソン病を発症するリスクがある対象またはそれに罹患している対象への、本明細書に記載されるＳＣＮ１Ａを上方調節するｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子の投与は、その１つもしくは複数の症状の発症を予防することができるか、または、処置なしと比較して、パーキンソン病の進行を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％減速することができる。
【０３１５】
ある特定の実施形態では、本出願は、疾患を発症するリスクがある対象を処置するために使用し得る方法を提供する。対象は、疾患、例えば、神経学的疾患、またはてんかん、発作および／もしくは脳症に関連する疾患に罹りやすいことが公知であり得る。対象は、遺伝事象に起因して、または既知のリスク因子に起因して、疾患に罹りやすい場合がある。例えば、対象は、ドラベ症候群に関連するＳＣＮ１Ａにおいて変異を有し得る。一部の場合には、対象は、対象の年齢に起因して、アルツハイマー病などの疾患に罹りやすい場合がある。一部の場合には、対象は、不十分な量のＳＣＮ１Ａタンパク質を有し得、ＳＣＮ１Ａに関連する疾患を処置することには、本明細書に記載される内因性ＳＣＮ１Ａを上方調節するｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子を投与することが関与する。
【０３１６】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される内因性ＳＣＮ１Ａを上方調節するｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子を使用する処置は、ドラベまたは他のＳＣＮ１Ａ関連疾患もしくは障害に関連する症状の減少または休止をもたらし得る。例えば、処置は、学習、記憶、認知機能および／もしくは運動機能を改善し得る；発作の頻度および／もしくは持続時間を低減させ得る；ならびに／または温度感受性を低減させ得る（もしくは発作を誘発する温度閾値を増加させ得る）。
【０３１７】
別の例示的な実施形態では、本出願は、ＧＲＮ遺伝子における変異またはＧＲＮタンパク質における欠損もしくは活性の低下に関連する疾患または障害を処置するための方法であって、それを必要とする対象に、ＧＲＮ遺伝子またはタンパク質産物の発現を上方調節するｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子を投与することによる方法を提供する。
【０３１８】
プログラニュリンは、成長因子様の特性を有する分泌型システインリッチ糖タンパク質であり、グラニュリンタンパク質のファミリーに属する。グラニュリン（例えば、グラニュリンＡ〜Ｇおよびパラグラニュリン（ｐａｒａｇｒａｎｕｌｉｎ））は、血管新生、創傷修復、細胞増殖および炎症において役割を果たす。プログラニュリン遺伝子における変異、または分泌型プログラニュリンにおける欠損は、種々の神経変性疾患および代謝疾患に関連する。中枢神経系（ＣＮＳ）における分泌型グラニュリンタンパク質の欠損は、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）；前頭側頭変性症または前頭側頭認知症（ＦＴＤ）、部分的プログラニュリン欠損に関連する早期発症型神経変性疾患；進行性非流暢失語症（ＰＮＦＡ）；意味性認知症；パーキンソン病；アルツハイマー病；およびプログラニュリンにおける完全欠損を伴う神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）を含む神経変性をもたらし得る。ＦＴＤは、行動および／または発話における変化、例えば、運動協調性の喪失、社会的機能不全、記憶喪失および筋振戦を生じる、前頭側頭葉の進行性の悪化を特徴とする複雑な神経変性疾患の一群を指す。
【０３１９】
一般に、１コピーのプログラニュリン遺伝子において１つまたは複数の病原性変異を有する患者は、ＦＴＬＤのサブタイプであるＦＴＤを発症する。ＦＴＬＤの臨床症状には、前頭前野および／または前側頭葉の萎縮、社会的および実行機能不全を特徴とする行動型前頭側頭型認知症（ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ  ｄｅｍｅｎｔｉａ）、意味性認知症、ならびに早期言語障害を伴う原発性進行性非流暢失語症が含まれる。ＦＴＤは、前頭葉認知症、パーキンソニズムおよび筋萎縮が後に続く成人発症性の行動障害である。
【０３２０】
プログラニュリンは、代謝疾患にも関連付けられており、食事誘発性肥満およびインスリン抵抗性に関与するアディポカインとして認識されている。プログラニュリンにおける変異または欠損は、脂質の蓄積および細胞増殖に起因する動脈壁の強い炎症性成分および肥厚を特徴とする進行性疾患であるアテローム動脈硬化症に関連付けられている。
【０３２１】
ＧＲＮにおける変異には、ナンセンス変異、スプライス部位変異；通常のリーディングフレームにおけるシフトをもたらす挿入および欠失；ならびに種々の点変異が含まれ得る。ナンセンス、スプライス部位およびフレームシフト変異は、転写物のナンセンス変異依存  ｍＲＮＡ  分解または核分解に起因して、ハプロ不全をもたらし得る。ミスセンス変異は、一部の孤発性ＦＴＬＤ、アルツハイマー病および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）患者において観察されている。疾患または障害に関連するＧＲＮにおける種々の変異は公知であり、これには、ＧＲＮコード領域における変異、例えば、−８＋５Ｇ＞Ｃ；−８＋３Ａ＞Ｔ；２Ｔ＞Ｃ、３Ｇ＞Ａ、２６ＣＡ（Ａ９Ｄ）；６３＿６４ｉｎｓＣ；９０＿９１ｉｎｓＣＴＧＣ；１０２ΔＣ；１３８＋１Ｇ＞Ａ；１５４ΔＡ；２３４＿２３５ΔＡＧ；２４３ΔＣ；３６１ΔＧ；３７３Ｃ＞Ｔ；３８０＿３８１ΔＣＴ；３８４＿３８７ΔＴＡＧＴ；３８８＿３９１ΔＣＡＧＴ；４６３−１Ｇ＞Ａ；４６８＿４７４ΔＣＴＧＣＴＧＴ；６７５＿６７６ΔＣＡ；７０８＋１Ｇ＞Ａ；７０７＋１Ｇ＞Ｃ；７０９−２Ａ＞Ｇ；７５９＿７６０ΔＴＧ；８１３＿８１６ΔＣＡＣＴ；８３５＿８３５＋１ｉｎｓＣＴＧＡ；８３６−１Ｇ＞Ｃ；９０９ΔＣ；９１０＿９１１ｉｎｓＴＧ；９１１Ｇ＞Ａ；９３３＋１Ｇ＞Ａ；９４２Ｃ＞Ａ；９９８ΔＧ；１０９５＿１０９６ΔＣＴ；１１４５ΔＣ；１１５７Ｇ＞Ａ；１２０１Ｃ＞Ｔ；１２３１＿１２３２ΔＧＴ；１２３２＿１２３３ｉｎｓＧＴ；１２５２Ｃ＞Ｔ；１３９５＿１２９６ｉｎｓＣ；１４０２Ｃ＞Ｔ；１４１４−１５＿１５９０Δ；１４７７Ｃ＞Ｔ；またはそれらの組合せが含まれる。Ｅｒｉｋｓｅｎ  ＪＬ，  Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ  ＩＲ．  Ｐｒｏｇｒａｎｕｌｉｎ：  ｎｏｒｍａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ２００８  Ｊａｎ；１０４（２）：２８７−９７を参照のこと。現在、かかるＧＲＮ関連の神経変性疾患および代謝疾患について、治癒は存在しない。ＧＲＮを標的化する処置選択肢、例えば、プログラニュリンのレベルおよび／または機能をｉｎ  ｖｉｖｏで増加させる治療が、必要とされている。
【０３２２】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される内因性ＧＲＮ発現を上方調節するｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子は、それを必要とする対象を処置するために使用し得、対象は、上に列挙したＧＲＮ変異のいずれか１つまたは複数を有する。一部の場合には、それを必要とする対象は、ＧＲＮにおけるハプロ不全またはＧＲＮにおける欠損を含む。一部の場合には、それを必要とする対象は、ＦＴＤ、アルツハイマー病、パーキンソン病および／もしくはアテローム動脈硬化症を有する、またはそのリスクがある。
【０３２３】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される内因性ＧＲＮ発現を上方調節するｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子は、ＦＴＤ、アルツハイマー病、パーキンソン病および／もしくはアテローム動脈硬化症を有する対象、またはそれを発症するリスクがある対象に投与され得る。別の例では、処置は、ＦＴＤ、アルツハイマー病、パーキンソン病および／またはアテローム動脈硬化症に罹患している対象に投与され得る。本明細書に記載される内因性ＧＲＮ発現を上方調節するｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子による処置は、ＦＴＤ、アルツハイマー病、パーキンソン病および／またはアテローム動脈硬化症に関連する１つまたは複数の症状の改善、例えば、ＦＴＤに起因する行動および／もしくは発話変化に関連する１つもしくは複数の症状における低減、またはアテローム動脈硬化症における動脈壁の厚さにおける低減を生じ得る。ＧＲＮ関連中枢神経系障害に関連する他の症状には、例えば、レビー小体の存在、プログラニュリン（ＧＲＮ）のハプロ不全、社会性の欠如、リソソーム異常、運動協調性の喪失、筋振戦が含まれる。ある特定の実施形態では、処置は、野生型ＧＲＮと比較して、ＧＲＮ発現レベルまたは機能の、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％または少なくとも７０％の回復を生じ得る。ある特定の実施形態では、処置は、処置前と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、または１００％よりも大きい、認知機能における改善、例えば、発話および／または記憶改善を生じ得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される内因性ＧＲＮ発現を上方調節するｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子による処置は、ＦＴＤ、アルツハイマー病、パーキンソン病および／またはアテローム動脈硬化症に関連する症状を遅延させることができる、またはその進行を停止させることができる。一部の場合には、本明細書に記載される内因性ＧＲＮ発現を上方調節するｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子による処置は、処置なしと比較して、ＣＮＳ、前頭皮質もしくは線条体における細胞修復を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも１００％増加させることができる、またはＣＮＳ、前頭皮質もしくは線条体における細胞損傷を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも１００％逆転させることができる。一部の場合には、ＧＲＮ関連中枢神経系障害を処置することは、筋振戦の頻度および／または重症度を低減することを含む。
【０３２４】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される内因性ＧＲＮ発現を上方調節するｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子は、疾患、例えば、ＧＲＮに関連する神経学的疾患もしくは神経変性疾患または代謝疾患を有すると診断された対象を処置するために使用し得る。対象は、ＦＴＤ、アルツハイマー病、パーキンソン病および／またはアテローム動脈硬化症に罹患している患者であり得る。一部の態様では、対象は、ＦＴＤを有する患者である。対象は、ＧＲＮ関連の疾患または状態、例えば、認知症または代謝疾患に罹患している患者であり得る。一部の場合には、遺伝子検査が、ＧＲＮ遺伝子における変異について患者をスクリーニングするために使用し得る。患者がＧＲＮにおいて病的変異を含む場合、本明細書に記載される内因性ＧＲＮ発現を上方調節するｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子は、神経変性または代謝疾患、例えば、ＦＴＤ、アルツハイマー病、パーキンソン病および／またはアテローム動脈硬化症の進行を予防、緩和または処置するために使用し得る。
【０３２５】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される内因性ＧＲＮ発現を上方調節するｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子によって処置される対象は、ＧＲＮにおいて変異または遺伝的異常を有すると診断された対象である。かかる変異は、タンパク質の発現、分泌、溶解度、活性および／またはタンパク質分解性切断にｉｎ  ｖｉｖｏで影響を与える、ホモ接合性もしくはヘテロ接合性、またはＧＲＮ遺伝子における１つもしくは複数の塩基の異常な挿入、欠失もしくは置換であり得る。
【０３２６】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される内因性ＧＲＮ発現を上方調節するｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子は、疾患、例えば、ＦＴＬＤ、ＦＴＤ、進行性非流暢失語症、意味性認知症、パーキンソン病、アルツハイマー病、ＮＣＬ、糖尿病またはアテローム動脈硬化症の影響を処置、予防または低減するためにＧＲＮの発現および／または機能をｉｎ  ｖｉｖｏで増加させるために、ＧＲＮの変異および／もしくは欠損に関連する神経変性疾患もしくは代謝疾患を有する対象またはそのリスクがある対象を処置するために使用し得る。一部の場合には、本明細書に記載される内因性ＧＲＮ発現を上方調節するｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子は、かかる疾患の症状、例えば、発話機能障害、社会性の欠如、障害された運動技能もしくは運動協調性、筋萎縮、筋振戦、神経萎縮、記憶喪失、パーキンソニズムおよび／またはリソソーム異常を、処置、軽快、低減または管理するために使用される。一部の場合には、かかる組成物は、炎症を減少させるため、細胞死を減少させるため、神経萎縮を減少させるため、運動ニューロン萎縮を減少させるため、および／あるいはＣＮＳ、または特に、前頭皮質もしくは線条体における細胞修復を増加させるために使用される。
【０３２７】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される内因性ＧＲＮ発現を上方調節するｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子は、神経変性疾患または代謝疾患を発症するリスクがある対象を処置するために使用し得る。対象は、ＧＲＮにおける遺伝的変異を探索する方法または分泌型ＧＲＮタンパク質のレベルについての血液検査を含む、種々のスクリーニングまたは診断方法を介して、疾患、例えば、神経学的疾患または代謝疾患に罹りやすいことが既知であり得る。対象は、遺伝事象に起因して、または既知のリスク因子に起因して、疾患に罹りやすい場合がある。例えば、対象は、ＦＴＤ、アルツハイマー病、パーキンソン病および／またはアテローム動脈硬化症に関連する、ＧＲＮにおける変異を有し得る。一部の場合には、対象は、不十分な量のＧＲＮタンパク質またはそのアイソフォームを有し得る。例えば、対象は、不十分な量のＧＲＮタンパク質を有することが既知であり得る。
【０３２８】
用語「対象」および「個体」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指すために、本明細書で相互交換可能に使用される。本明細書に記載される方法は、ヒト治療、獣医学適用、および／または疾患もしくは状態の動物モデルにおける前臨床研究において有用であり得る。種々の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置され得る対象は、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、スナネズミ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ロバ、ウマ、イヌ、ネコ、ラマ、サル（例えば、マカク、例えば、アカゲザルまたはカニクイザル）またはヒトなどである。例示的な実施形態では、対象は、ヒトである。
【０３２９】
以下の表は、本明細書で開示される配列を提供する。
表１：  ＳＣＮ１ＡおよびＧＲＮのゲノム遺伝子座およびタンパク質配列
【表１−１】
2021505133.tif 000003
【表１−２】
2021505133.tif 000004
表２：ヒトＥＧＲ１／ＥＧＲ３に対して高い配列同一性を有するｅＴＦの配列
【表２−１】
2021505133.tif 000005
【表２−２】
2021505133.tif 000006
【表２−３】
2021505133.tif 000007
表３：表２に開示されるｅＴＦのＤＢＤ配列
【表３−１】
2021505133.tif 000008
【表３−２】
2021505133.tif 000009
表４：表２に開示されるｅＴＦによって認識される標的部位配列
【表４−１】
2021505133.tif 000010
【表４−２】
2021505133.tif 000011
表５：  ｅＴＦを生成するための異なる型のジンクフィンガー構造およびタンパク質
【表５−１】
2021505133.tif 000012
【表５−２】
2021505133.tif 000013
表６：  ｅＴＦの全長アミノ酸配列の例
【表６−１】
2021505133.tif 000014
【表６−２】
2021505133.tif 000015
【表６−３】
2021505133.tif 000016
【表６−４】
2021505133.tif 000017
【表６−５】
2021505133.tif 000018
【表６−６】
2021505133.tif 000019
表７：表６に開示されるｅＴＦのＤＢＤ配列
【表７−１】
2021505133.tif 000020
【表７−２】
2021505133.tif 000021
表８：本明細書で開示されるｅＴＦの任意のＤＢＤに融合され得る例示的なＴＡＤのアミノ酸配列
【表８】
2021505133.tif 000022
表９：  ＴＡＤとタンパク質プラットフォームとの間のパーセント配列同一性
【表９−１】
2021505133.tif 000023
【表９−２】
2021505133.tif 000024
表１０：  ｅＴＦおよびそれらの標的部位配列の例
【表１０】
2021505133.tif 000025
表１１：内因性ＳＣＮ１Ａ遺伝子を上方調節することが可能な標的部位を標的化するためのｄＳａＣａｓ９タンパク質配列およびガイドＲＮＡの例
【表１１】
2021505133.tif 000026
表１２：  ＳＣＮ１Ａ遺伝子をモジュレートするためにｅＴＦ中で組み合わされ得るジンクフィンガーの例
【表１２−１】
2021505133.tif 000027
【表１２−２】
2021505133.tif 000028
表１３：  ＳＣＮ１ＡをモジュレートするためのｅＴＦのＤＢＤの例
【表１３−１】
2021505133.tif 000029
【表１３−２】
2021505133.tif 000030
【表１３−３】
2021505133.tif 000031
表１４：  ＳＣＮ１Ａをモジュレートする複数のジンクフィンガーを含むＤＮＡ結合ドメインの例
【表１４】
2021505133.tif 000032
表１５：  ＳＣＮ１Ａをモジュレートするための標的部位配列の例
【表１５−１】
2021505133.tif 000033
【表１５−２】
2021505133.tif 000034
表１６：  ＳＣＮ１Ａ発現を上方調節し得る本明細書で開示される例示的なｅＴＦの核酸配列
【表１６−１】
2021505133.tif 000035
【表１６−２】
2021505133.tif 000036
【表１６−３】
2021505133.tif 000037
【表１６−４】
2021505133.tif 000038
【表１６−５】
2021505133.tif 000039
【表１６−６】
2021505133.tif 000040
【表１６−７】
2021505133.tif 000041
【表１６−８】
2021505133.tif 000042
【表１６−９】
2021505133.tif 000043
【表１６−１０】
2021505133.tif 000044
【表１６−１１】
2021505133.tif 000045
【表１６−１２】
2021505133.tif 000046
【表１６−１３】
2021505133.tif 000047
【表１６−１４】
2021505133.tif 000048
表１７：  ＳＣＮ１Ａの発現を上方調節するｅＴＦの例
【表１７】
2021505133.tif 000049
表１８：  ＳＣＮ１Ａの発現を上方調節するｅＴＦの配列
【表１８−１】
2021505133.tif 000050
【表１８−２】
2021505133.tif 000051
【表１８−３】
2021505133.tif 000052
【表１８−４】
2021505133.tif 000053
【表１８−５】
2021505133.tif 000054
【表１８−６】
2021505133.tif 000055
表１９：本明細書で開示されるポリＡ配列
【表１９】
2021505133.tif 000056
表２０：内因性ＧＲＮ遺伝子の発現をモジュレートするためのジンクフィンガーの例
【表２０】
2021505133.tif 000057
表２１：複数のＺＦを含む、ＧＲＮの発現をモジュレートするｅＴＦのＤＢＤの例
【表２１−１】
2021505133.tif 000058
【表２１−２】
2021505133.tif 000059
表２２：  ＧＲＮの発現をモジュレートするための標的部位配列の例
【表２２】
2021505133.tif 000060
表２３：  ＧＲＮの発現をモジュレートするｅＴＦの例
【表２３−１】
2021505133.tif 000061
【表２３−２】
2021505133.tif 000062
表２４：本明細書で開示される調節エレメント（ＲＥ）の例
【表２４−１】
2021505133.tif 000063
【表２４−２】
2021505133.tif 000064
【表２４−３】
2021505133.tif 000065
表２５：本明細書で開示されるさらなる配列
【表２５−１】
2021505133.tif 000066
【表２５−２】
2021505133.tif 000067
【表２５−３】
2021505133.tif 000068
【表２５−４】
2021505133.tif 000069
表２６：  ｇＲＮＡおよびｄＣａｓタンパク質によって標的化されるＳＣＮ１Ａゲノム領域
【表２６】
2021505133.tif 000070
表２７：ジンクフィンガーｅＴＦによって標的化されるＳＣＮ１Ａゲノム領域の例
【表２７】
2021505133.tif 000071
表２８：  ＳＣＮ１Ａ標的部位を認識するｅＴＦのアミノ酸配列
【表２８】
2021505133.tif 000072
表２９：  ｅＴＦのＤＢＤのアミノ酸配列
【表２９】
2021505133.tif 000073
表３０：  ＧＲＮ標的領域およびＧＲＮの発現を上方調節するためのｅＴＦ
【表３０−１】
2021505133.tif 000074
【表３０−２】
2021505133.tif 000075
【表３０−３】
2021505133.tif 000076
【表３０−４】
2021505133.tif 000077
表３１：  ＧＲＮ発現を上方調節するためのｅＴＦの例示的なＤＢＤ
【表３１−１】
2021505133.tif 000078
【表３１−２】
2021505133.tif 000079
【実施例】
【０３３０】
以下の実施例は、本開示の一部の態様をさらに記載するために含めたのであり、本発明の範囲を限定するのに使用されるべきではない。
（実施例１）
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における遺伝子発現の増加
【０３３１】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、いくつかの異なる調節エレメント、すなわち、プロモーターなしの対照、ＳＣＰ、ＣＭＶ、ｍｉｎＣＭＶに作動可能に連結した配列番号１７８、ｍｉｎＣＭＶに作動可能に連結した配列番号１８２、およびＣＡＧのうちの１つの制御下でルシフェラーゼ遺伝子を含有するプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。各構築物からの正規化ルシフェラーゼ値は、図１に示される。各構築物からのサイズ正規化活性値は、図２に示される。配列番号１７８または１８２の調節エレメントに連結させたｍｉｎＣＭＶプロモーターを有する構築物は、ｍｉｎＣＭＶ単独およびＳＣＰ単独よりも高いレベルのルシフェラーゼ発現を駆動した。
【０３３２】
本実験は、配列番号１７８および１８２が、細胞において高い遺伝子発現を駆動するＲＥであることを示した。そのようなＲＥは、細胞において転写活性化因子の発現を増加させ、内因性ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現の増加を生じる、ＳＣＮ１Ａの天然に存在しない転写活性化因子を含む、本明細書に開示される発現カセットに付加することができる。一部の場合では、配列番号１７８および／または１８２から選択される１つまたは複数のＲＥが、細胞においてＳＣＮ１Ａ発現を増加させる、転写活性化因子に作動可能に連結される。そのような調節エレメントは、発現カセットにおいて転写活性化因子の上流および／または下流で発現カセットに付加することができる。
（実施例２）
パルブアルブミンニューロンに対する選択性
【０３３３】
ＧＡＢＡ作動性ニューロンの１種である、パルブアルブミン細胞に対する選択性を、蛍光イメージングを使用して決定した。対照プロモーター（ＥＦ１α）またはＰＶ選択的ＲＥのいずれかに作動可能に連結したｅＧＦＰを含有するＡＡＶベクター、およびＣＲＥ依存性ｔｄＴｏｍａｔｏを含有するＡＡＶベクターを、ＧＡＤ２−ＩＲＥＳ−ＣＲＥマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）に一緒に注射した。
【０３３４】
マウスに１．５μＬのＡＡＶベクター（５１２〜１１３ｇｃ／ｍｌ）を、背側および腹側海馬に両側性に注射後の４分の安静期間に０．３μＬ／分の速度で注入した。マウスを、注射のためにイソフルラン（２％、８００ｍＬ／分Ｏ２）を使用して麻酔した。ブピバカイン／エピネフリンを局所鎮痛に使用し、カルプロフェン（ｃａｒｐｒｏｆｅｎ）を術中／術後鎮痛に使用した。動物を、以下の座標を背側海馬（硬膜からＡＰ−２．０ｍｍ、側方±１．５、ＤＶ−１．４ｍｍ）および腹側海馬（硬膜からＡＰ−３．１ｍｍ、側方±２．８、ＤＶ−３．８ｍｍ）に使用して定位フレーム（Ｋｏｐｆ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＳＡ）に配置した。ハミルトンシリンジ（モデル番号８０３０８、１０μＬシリンジと対応する３０ｇａブラントチップ針）を、定位マイクロマニピュレーターとともに使用してバーホール（ｂｕｒ  ｈｏｌｅ）を指定し、ドリルした。ドリルは、骨を貫通させることのみに使用された。ドリル後、注入カニューレを、脳内の所望の位置の深さへと下降させた。マイクロ４コントローラーを備えたウルトラマイクロポンプＩＩＩ（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）についての注射設定は、注射容量：１．５μＬ、注入速度：０．３μＬ／分であった。針を、注入座標（それぞれ、背側海馬に対して−１．５ｍｍおよび腹側海馬に対して−３．９ｍｍ、次にＤＶ−１．４または−３．８に上昇させた）の下にＤＶ−０．１ｍｍに徐々に下降（約１分間かけて）させた。注入前に、針を、１分間平衡化した。送達が完了したら、針を４分放置し、次に約１分かけて抜きとった。全ての４回の注入が完了したら、皮膚切開を縫合で閉鎖した。処置したマウスは、残りの研究のために毎日の健康チェックを受け、毎週１回秤量して体重をモニターした。
【０３３５】
組織採取に関して、マウスを、過量のイソフルランを介して安楽死させ、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を灌流した。海馬を含有する脳組織の断片を採取し、４％ＰＦＡに４℃で少なくとも１２時間置いた。脳組織を、次に３０％スクロース（リン酸緩衝食塩水中）中４℃で、組織が管の底に沈むまで脱水した。脳組織を、クリオスタットにおける切片化のためにＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  ＯＣＴに包埋した。切片化した脳組織を、抗ＲＦＰポリクローナルウサギ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｓｓａｙ）および抗ｅＧＦＰポリクローナルニワトリ抗体（Ａｖｅｓ  Ｌａｂｓ）での標準免疫組織化学手順を使用して、ｅＧＦＰおよびｔｄＴｏｍａｔｏに関して染色した。
【０３３６】
図３は、その発現がＣｒｅリコンビナーゼ活性に依存するｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光レポーターを含有する第２のＡＡＶベクターとともに、ｅＧＦＰおよびＰＶ選択的エレメント（配列番号１８３または配列番号１８４）または構成的ＥＦ１α対照プロモーター（配列番号１８６）のいずれかを含有するＡＡＶベクターで処置したマウスからの代表的なイメージを示す。ＧＡＤ２は、ＰＶニューロンを含むＧＡＢＡ作動性ニューロン中で選択的に発現し、したがってｔｄＴｏｍａｔｏ発現は、ＧＡＢＡ作動性ニューロンを識別する（図３、下段）。
【０３３７】
図４は、各プロモーターまたは調節エレメントについてＰＶ細胞における発現の効率を示す。構成的プロモーターであるＥＦ１αによって駆動されるｅＧＦＰ発現は、約４０％の発現の効率を示した。対照的に、配列番号１８３（配列番号１８５の配列を有するプロモーターを含む）または配列番号１８４のいずれかによって駆動されるｅＧＦＰ発現は、約９０％の発現の効率を示し、ＥＦ１αプロモーターよりもはるかに高い効率を示した。
【０３３８】
図５は、異なる調節配列、配列番号１８３および１８４両方の発現の特異性が、パルブアルブミン（ＰＶ）細胞に関して１０％未満の特異性を示すＥＦ１αプロモーターと比較して、約７５％の特異性でＰＶ細胞においてｅＧＦＰの発現を駆動したことを示す。
【０３３９】
これらの実験は、ＧＡＢＡ作動性／ＰＶニューロンに関する配列番号１８３および１８４調節エレメントの選択性を確認し、ＧＡＢＡ作動性／ＰＶ細胞に関する選択性を測定するために使用することができるアッセイを示した。１つまたは複数の配列番号１８３〜１８４の調節エレメントは、上に記載のアッセイを使用して決定される、オフターゲット効果を最小化する非ＧＡＢＡ作動性細胞と比較して、ＧＡＢＡ作動性／ＰＶ細胞における転写活性化因子の選択的発現を増加させる本明細書に記載される発現カセットに含まれ得る。一部の場合では、ＰＶ細胞に対して選択的な１つまたは複数のＲＥは、上に記載のアッセイと類似のアッセイを使用して、非ＰＶ細胞と比較して、ＰＶ細胞における転写活性化因子の選択的発現を増加させる発現カセットに使用される。
（実施例３）
ＳＣＮ１Ａ特異的転写活性化因子を使用するＳＣＮ１Ａを上方調節することが可能である標的領域の同定
【０３４０】
内因性ＳＣＮ１Ａ発現を上方調節することが可能であるゲノムの領域を同定するために、様々な操作された転写因子（ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはｇＲＮＡ／ｄａＣａｓ９構築物のいずれか）を、上の表２６〜２９に記載されるゲノムの様々な領域を標的化するように設計した。ｇＲＮＡ／ｄａＣａｓ９構築物に関して、ｇＲＮＡが相補的なゲノム鎖を標的とするよう設計されたので、ｇＲＮＡは、標的領域と同じ配列を有する。ｄＣａｓ９タンパク質の配列は、配列番号１０４であり、またＮＬＳおよびＨＡタグを有する配列番号でもある。
【０３４１】
ＨＥＫ２９３細胞を標準方法で培養し、そこに、６ウェルプレートの１ウェル当たり操作された転写因子または対照構築物を保持する３ｕｇプラスミドをトランスフェクトした（ＦｕｇｅｎｅＨＤ、Ｐｒｏｍｅｇａ）。細胞に、上の表２６〜２９に示される構築物を発現するプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を採取し、ＲＮＡを単離（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット）し、ＤＮａｓｅ処理した。ＲＮＡ（３ｕｇ）を、ＯｌｉｇｏＤＴプライマー（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＶ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して逆転写した。ｃＤＮＡ試料を、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）およびＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを使用してｑＰＣＲによって分析した：（９８℃で３０秒、４０×［９８℃で１０秒、６６℃で１５秒、７２℃で１５秒］）。ＳＣＮ１Ａに対するプライマー（５’−ＴＧＴＣＴＣＧＧＣＡＴＴＧＡＧＡＡＣＡＴＴＣ−３’（配列番号１９０）、５’−ＡＴＴＧＧＴＧＧＧＡＧＧＣＣＡＴＴＧＴＡＴ−３’（配列番号１９１））を使用して、内因性ＳＣＮ１Ａ転写物のレベルを定量し、ＳＣＮ１Ａ発現の相対的レベルを、ＧＡＰＤＨを参照遺伝子（５’−ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ’−３’（配列番号１９２）、５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３’（配列番号１９３））とするデルタ−デルタＣｔ法によって決定した。データは、対照条件に対する変化倍率として提示される。
【０３４２】
結果は、以下の図６および表３２に、対照条件（例えば、ＥＧＦＰ−ＫＡＳＨレポーター構築物）に対する、ＳＣＮ１Ａ転写の変化倍率として示される。
表３２：異なるゲノムの標的部位および対応するｅＴＦの転写に対する効果
【表３２−１】
2021505133.tif 000080
【表３２−２】
2021505133.tif 000081
（実施例４）
発現カセットからのＳＣＮ１Ａの相対的発現
【０３４３】
この実施例は、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を増加させる、天然に存在しない転写モジュレーターを含む様々な発現カセットからのＳＣＮ１Ａの相対的発現を記載する。ＳＣＮ１Ａ遺伝子は、ナトリウムイオンチャネルを作る指示を提供する遺伝子のファミリーに属する。正に荷電したナトリウム原子（ナトリウムイオン）を細胞に輸送するこれらのチャネルは、細胞が電気的なシグナルを生じそれを伝達する能力において重要な役割を果たす。発現カセットを試験するために、ＨＥＫ２９３細胞を標準方法で培養し、そこに、６ウェルプレートの１ウェル当たり３μｇプラスミドをトランスフェクトした（ＰＥＩ）。トランスフェクションの４８時間後、細胞を採取し、ＲＮＡを単離（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット）し、ＤＮａｓｅ処理した。ＲＮＡ（３μｇ）を、ＯｌｉｇｏＤＴプライマー（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＶ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して逆転写した。ｃＤＮＡ試料を、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）およびＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを使用してｑＰＣＲによって分析した：（９８℃で３０秒、４０×［９８℃で１０秒、６６℃で１５秒、７２℃で１５秒］）。
【０３４４】
ｅＧＦＰレポーター導入遺伝子を含み、転写活性化因子を欠く対照発現カセット、および上の表１７に記載される発現カセットＡ〜Ｈを含む、様々な発現カセットを構築した。発現カセットＡ〜Ｆに関して、各々は、配列番号９５の配列を有するＶＰ６４転写活性化ドメインまたは配列番号１１４の配列を有するＶＰＲ転写活性化ドメインのいずれかに連結される配列番号１０３、１３１〜１３４に従う６〜９つのジンクフィンガーを含む天然に存在しないＤＮＡ結合ドメインを含んでいた。そのような天然に存在しない転写活性化因子を、配列番号３５〜３７、１０７〜１０８、もしくは１３６のいずれか１つの配列を有する標的部位または配列番号３５〜３７、１０７〜１０８、もしくは１３６のいずれか１つを含むゲノム領域に結合するよう操作した。発現カセットＧおよびＨは、配列番号９５の配列を有するＶＰ６４転写活性化ドメインに連結した配列番号１０３の配列を有するｄＳａＣａｓ９  ＤＮＡ結合ドメインを各々含んでいた。各ＧおよびＨ発現カセットはまた、各ｇＲＮＡが配列番号１０７〜１０８から選択される配列を含む、天然に存在しない転写活性化因子を標的化するためのｇＲＮＡを含んでいた。各発現カセットはまた、配列番号１７８の配列を有するＲＥを含んでいた。
【０３４５】
ＳＣＮ１Ａに対するプライマー（５’−ＴＧＴＣＴＣＧＧＣＡＴＴＧＡＧＡＡＣＡＴＴＣ−３’（配列番号１９０）、５’−ＡＴＴＧＧＴＧＧＧＡＧＧＣＣＡＴＴＧＴＡＴ−３’（配列番号１９１））を使用して、内因性ＳＣＮ１Ａ転写物のレベルを定量し、ＳＣＮ１Ａ発現の相対的レベルを、ＧＡＰＤＨを参照遺伝子（５’−ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ’３’（配列番号１９２）、５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３’（配列番号１９３））とするデルタ−デルタＣｔ法によって決定した。
【０３４６】
図７は、対照ｅＧＦＰ構築物に対する、変化倍率（Ｌｏｇ１０）として提示される、異なる発現カセットをトランスフェクトした細胞に関するＳＣＮ１Ａの相対的発現を示す。発現カセットＡ〜Ｈからの天然に存在しない転写活性化因子の発現は、対照発現カセットと比べて、ＨＥＫ２９３細胞においてＳＣＮ１Ａ遺伝子発現の増加を生じた。
【０３４７】
図８は、ＨＥＫ２９３細胞において、他の遺伝子と比較して、ＳＣＮ１Ａ  遺伝子の発現を増加させるのに使用された天然に存在しない転写活性化因子を含む発現カセットＡを示す。加えて、ＴＴＣ２１Ｂ（５’−ＧＧＴＣＡＣＧＴＡＣＡＧＣＴＴＣＧＣＡＴ−３’（配列番号２８３）、５’−ＣＴＧＧＴＴＴＣＴＧＧＣＴＣＧＴＧＧＡＧ−３’（配列番号２８４））、ＳＣＮ９Ａ（５’−ＡＡＧＣＣＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＧＣＡＧ−３’（配列番号２８５）、５’−ＡＧＧＴＧＴＧＧＣＡＴＴＧＡＡＡＣＧＧ−３’（配列番号２８６））、ＧＲＮ（５’−ＡＴＧＧＴＣＡＧＴＴＣＴＧＣＣＣＴＧＴＧ−３’（配列番号２８７）、５’−ＣＧＧＴＡＡＡＧＡＴＧＣＡＧＧＡＧＴＧＧＣ−３’（配列番号２８８））、ＵＴＲＮ（５’−ＴＧＡＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＡＡＣＧＡＡＴ−３’（配列番号２８９）、５’−ＴＧＣＡＧＣＡＣＴＣＴＧＴＴＧＡＣＧＴＴ（配列番号２９０））、およびＴＴＮ（５’−ＴＧＴＴＧＣＣＡＣＴＧＧＴＧＣＴＡＡＡＧ−３’（配列番号２９１）、５’−ＡＣＡＧＣＡＧＴＣＴＴＣＴＣＣＧＣＴＴＣ−３’（配列番号２９２））に対するプライマーを使用して、内因性ＴＴＣ２１Ｂ、ＳＣＮ９Ａ、ＧＲＮ、ＵＴＲＮ、およびＴＴＮ転写物のレベルを定量し、これらの遺伝子の発現の相対的レベルを、配列番号１９２〜１９３の配列を有するプライマーを使用して、ＧＡＰＤＨを参照遺伝子とするデルタ−デルタＣｔ法によって決定した。
【０３４８】
図８は、対照条件に対する変化倍率として提示される内因性ＳＣＮ１Ａ、ＴＴＣ２１Ｂ、ＳＣＮ９Ａ、ＧＲＮ、ＵＴＲＮ、およびＴＴＮ転写物の相対的発現を示す。上に記載される、発現カセットＡは、試験した他の遺伝子と比較して、ＳＣＮ１Ａ遺伝子またはＮａｖ１．１タンパク質の発現を特異的に増加させることができた。これは、発現カセットＡの転写活性化因子によって認識される標的部位が、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に特異的であり、したがってＨＥＫ２９３細胞においてＳＣＮ１Ａ遺伝子発現の増加を生じることを示した。
（実施例５）
ＳＣＮ１Ａ活性化
【０３４９】
ＨＥＫ２９３細胞を標準方法で培養し、そこに、３ｕｇの各々試験される活性化因子またはＥＧＦＰ対照をトランスフェクトした（ＦｕＧｅｎｅ  ＨＤ、Ｐｒｏｍｅｇａ）。トランスフェクションの４８時間後、細胞を採取し、ＲＮＡを単離（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット）し、ＤＮａｓｅ処理した。ＲＮＡ（３ｕｇ）を、ＯｌｉｇｏＤＴプライマー（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＶ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して逆転写した。ｃＤＮＡ試料を、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）およびＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを使用してｑＰＣＲによって分析した：（９８℃で３０秒、４０×［９８℃で１０秒、６８℃で１５秒、７２℃で１５秒］）。ヒトＳＣＮ１Ａに対するプライマー（５’−ＴＧＴＣＴＣＧＧＣＡＴＴＧＡＧＡＡＣＡＴＴＣ−３’（配列番号１９０）、５’−ＡＴＴＧＧＴＧＧＧＡＧＧＣＣＡＴＴＧＴＡＴ−３’（配列番号１９１））を使用して、レポーター駆動ＥＧＦＰ転写物のレベルを定量し、ＥＧＦＰ発現の相対的レベルを、ＧＡＰＤＨを参照遺伝子（５’−ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ−３’（配列番号１９２）、５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３’（配列番号１９３））とするデルタ−デルタＣｔ法によって決定した。データは、対照条件に対する変化倍率として提示される。図１２Ｂおよび図１３Ｂを参照されたい。配列番号６、７、および９は、ヒトＥＧＲ１タンパク質に由来し、内因性ＳＣＮ１Ａ遺伝子の近傍のまたはその遺伝子における標的部位に結合するように操作されているｅＴＦであり、ここで、標的部位は配列番号３５〜３７である。レポーターＥＧＦＰ対照と比較して、配列番号６、７、または９のいずれか１つを含むｅＴＦは、それぞれ、少なくとも２倍、７倍、または２０倍の相対的ＳＣＮ１Ａ発現を生じた。
（実施例６）
ＳＣＮ１Ａ特異的転写因子を使用するＨＥＫ２９３細胞における内因性ＳＣＮ１Ａの上方調節
【０３５０】
ＨＥＫ２９３細胞を標準方法で培養し、そこに、６ウェルプレートの１ウェル当たり操作された転写因子またはＥＧＦＰ対照構築物を保持する３ｕｇプラスミドをトランスフェクトした（ＦｕｇｅｎｅＨＤ、Ｐｒｏｍｅｇａ）。細胞に、下の表３３に示される構築物を含有するプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を採取し、ＲＮＡを単離（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット）し、ＤＮａｓｅ処理した。ＲＮＡ（３ｕｇ）を、ＯｌｉｇｏＤＴプライマー（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＶ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して逆転写した。ｃＤＮＡ試料を、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）およびＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを使用してｑＰＣＲによって分析した：（９８℃で３０秒、４０×［９８℃で１０秒、６６℃で１５秒、７２℃で１５秒］）。ＳＣＮ１Ａに対するプライマー（５’−ＴＧＴＣＴＣＧＧＣＡＴＴＧＡＧＡＡＣＡＴＴＣ−３’（配列番号１９０）、５’−ＡＴＴＧＧＴＧＧＧＡＧＧＣＣＡＴＴＧＴＡＴ−３’（配列番号１９１））を使用して、内因性ＳＣＮ１Ａ転写物のレベルを定量し、ＳＣＮ１Ａ発現の相対的レベルを、ＧＡＰＤＨを参照遺伝子（５’−ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ’３’（配列番号１９２）、５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３’（配列番号１９３））とするデルタ−デルタＣｔ法によって決定した。データは、対照条件に対する変化倍率として提示される（図１５を参照されたい）。ＥＧＦＰからなる対照構築物は、配列番号１７８に従う配列を有するプロモーターの制御下で発現した。操作された転写因子の送達により、ＥＧＦＰ条件に対する内因性ＳＣＮ１Ａ転写物の種々の程度の上方調節が誘導された。
表３３．実施例６および図１５に使用された構築物。
【表３３−１】
2021505133.tif 000082
【表３３−２】
2021505133.tif 000083
表３４：実施例６および図１５に使用された構築物。
【表３４】
2021505133.tif 000084
（実施例７）
ＳＣＮ１Ａ特異的転写因子を使用するＧＡＢＡニューロンにおける内因性ＳＣＮ１Ａの上方調節
【０３５１】
ｉＣｅｌｌ  ＧＡＢＡニューロン（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を６ウェルプレート中でプレート培養（約１Ｅ６細胞／ウェル）し、製造者の推奨するプロトコールで維持した。プレーティングの７２時間後、遍在性プロモーター（ＣＢＡプロモーター）の制御下でＥＧＦＰまたは活性化因子（図１６Ａ中の配列番号３６６または図１６Ｂ中の配列番号１３もしくは配列番号１５）を発現する組換えＡＡＶ（血清型ＡＡＶ−ＤＪ）を、培養培地に約２Ｅ１１ゲノムコピー／ウェルで添加した。感染から１週間後（図１６Ａ）または２週間後（図１６Ｂ）、ＲＮＡを、培養した細胞から単離（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット）し、ＤＮａｓｅ処理した。回収したＲＮＡを、ＯｌｉｇｏＤＴプライマー（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＶ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して逆転写した。ｃＤＮＡ試料を、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）およびＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを使用してｑＰＣＲによって分析した：（９８℃で３０秒、４０×［９８℃で１０秒、６６℃で１５秒、７２℃で１５秒］）。ＳＣＮ１Ａに対するプライマー（５’−ＴＧＴＣＴＣＧＧＣＡＴＴＧＡＧＡＡＣＡＴＴＣ−３’（配列番号１９０）、５’−ＡＴＴＧＧＴＧＧＧＡＧＧＣＣＡＴＴＧＴＡＴ−３’（配列番号１９１））を使用して、内因性ＳＣＮ１Ａ転写物のレベルを定量し、ＳＣＮ１Ａ発現の相対的レベルを、ＧＡＰＤＨを参照遺伝子（５’−ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ’３’（配列番号１９２）、５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３’（配列番号１９３））とするデルタ−デルタＣｔ法によって決定した。データは、対照条件に対する変化倍率として提示される（図１６Ａおよび図１６Ｂを参照されたい）。操作された転写因子のＡＡＶ駆動発現は、培養したｉＰＳ由来ＧＡＢＡニューロンにおける内因性ＳＣＮ１Ａ転写物の有意な上方調節を生じさせた。
（実施例８）
ＳＣＮ１Ａ特異的転写因子を使用するＧＡＢＡニューロンにおける内因性ＳＣＮ１Ａの特異的上方調節
【０３５２】
ｉＣｅｌｌ  ＧＡＢＡニューロン（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を６ウェルプレート中でプレート培養（約１Ｅ６細胞／ウェル）し、製造者の推奨するプロトコールで維持した。プレーティングから７２時間後、ＣＢＡプロモーターの制御下でＥＧＦＰまたは活性化因子（配列番号３６６、ＣＢＡプロモーターによって駆動されるＶＰＲ  ＴＡＤに融合したジンクフィンガーＤＢＤを含む）を発現する組換えＡＡＶ（血清型ＡＡＶ−ＤＪ）を、培養培地に約２Ｅ１１ゲノムコピー／ウェルで添加した。
【０３５３】
感染から１週間後、ＲＮＡを、培養した細胞から単離（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット）し、ＤＮａｓｅ処理した。ＲＮＡｓｅｑライブラリーを、ＴｒｕＳｅｑ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｍＲＮＡライブラリーキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、回収したＲＮＡから調製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ（２×７５サイクルペアドエンドシークエンシング）で配列決定した。シークエンシングリードをヒトゲノムとアラインメント（ＲＮＡＳＴＡＲ）し、差次的発現分析をＤＥＳｅｑ２で実施した。データは、対照（ＡＡＶＤＪ−ＣＢＡ−ＥＧＦＰ）試料に対する変化倍率として提示される（図１７を参照されたい）。結果は表３５に示され、図１７は対照条件に対する変化倍率として提示される内因性ＳＣＮ１Ａの相対的発現および４０の最も近い隣接遺伝子転写物を示す。上に記載される、配列番号３６６は、検査した他の遺伝子と比較して、ＳＣＮ１Ａ遺伝子またはＮａｖ１．１タンパク質の発現を特異的に増加させることができた。これは、配列番号３６６の転写活性化因子によって認識される標的部位が、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に特異的であり、したがってＧＡＢＡニューロンにおいてＳＣＮ１Ａ遺伝子発現の増加を生じることを示した。
表３５．  内因性ＳＣＮ１ＡおよびＳＣＮ１Ａ特異的転写因子（配列番号３６６）で処理されたＧＡＢＡニューロン中の４０の最も近い隣接遺伝子の転写に対する効果。
【表３５−１】
2021505133.tif 000085
【表３５−２】
2021505133.tif 000086
（実施例９）
ｉｎ  ｖｉｖｏでの発現カセットからのＳＣＮ１Ａの発現
【０３５４】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＳＣＮ１Ａの転写活性化因子の発現を試験するために、組換えＡＡＶ９ベクターをＶｅｃｔｏｒ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｍａｌｖｅｒｎ、ＰＡ）が作製した。雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（１群当たりＮ＝５、７〜８週齢）に、全体で４注射部位に関して、１．５ｕｌの精製ＡＡＶベクターを背側海馬（硬膜からＡＰ−２．０ｍｍ、側方±１．５、ＤＶ−１．４ｍｍ）および腹側海馬（硬膜からＡＰ−３．１ｍｍ、側方±２．８、ＤＶ−３．８ｍｍ）に両側性に注入した。ＡＡＶを、各注射後の４分（４ｍ）の安静期間に０．３ｕＬ／分の速度で送達した。処置から４週間後、マウスを安楽死させ、海馬組織を解剖した。各群に関して、左の海馬のみが採取され均質化された１動物を除くほとんどの動物（Ｎ＝４）において、左および右の海馬組織の両方から組織を採取し、均質化（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ）のためにプールした。ＲＮＡを、ホモジネートから単離（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット）し、ＤＮａｓｅ処理した。ＲＮＡ（３μｇ）を、ＯｌｉｇｏＤＴプライマー（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＶ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して逆転写した。ｃＤＮＡ試料を、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）およびＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを使用して、マウスＳＣＮ１Ａの発現についてｑＰＣＲによって分析した：（９８℃で３０秒、４０×［９８℃で１０秒、６４℃で１５秒、７２℃で１５秒］）。マウスＳＣＮ１Ａに対するプライマー（５’−ＣＡＡＡＡＡＡＧＣＣＡＣＡＡＡＡＧＣＣＴ−３’（配列番号３７４）、５’−ＴＴＡＧＣＴＣＣＧＣＡＡＧＡＡＡＣＡＴＣ−３’（配列番号３７５））を使用して、内因性ＳＣＮ１Ａ転写物のレベルを定量し、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＳＣＮ１Ａ発現の相対的レベルを、上の実施例１に記載される同じＧＡＰＤＨプライマーを使用して、ＧＡＰＤＨを参照遺伝子とするデルタ−デルタＣｔ法によって決定した。
【０３５５】
図１８Ａおよび図１８Ｂは、５個体の動物の結果の平均を示し、各々はＡＡＶ９構築物を注射された。ｅＧＦＰ対照構築物は、ｅＧＦＰレポーター導入遺伝子を含んでいた。発現カセットＡ（表１７を参照されたい）は、上の表１７に記載される、配列番号３５を含む標的配列を認識する転写活性化因子を含んでいた。図１８Ａは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＳＣＮ１Ａの相対的発現を示す。図１８Ｂは、平均ｅＧＦＰ発現のパーセンテージとしてのｉｎ  ｖｉｖｏでのＳＣＮ１Ａ発現における変化を示す。これらの結果は、発現カセットＡのＳＣＮ１Ａ転写活性化因子が、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＳＣＮ１Ａ発現の約２０％〜３０％上方調節を生じることを示した。
【０３５６】
そのような発現カセットは、ドラベ症候群、てんかん（ｅｐｉｌｅｐｓｙ）、発作（ｓｅｉｚｕｒｅ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ならびに／またはＳＣＮ１Ａの欠乏および／もしくは活性障害（ｉｍｐａｉｒｅｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）と関連する任意の他の疾患もしくは状態を処置するヒトでの使用のために適合させることができる。
（実施例１０）
ｑＰＣＲによって決定されたＳＣＮ１Ａ特異的転写因子を使用するＷＴマウス海馬における内因性ＳＣＮ１Ａ転写物の上方調節
【０３５７】
組換えＡＡＶ９ベクターを、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｍａｌｖｅｒｎ、ＰＡ）が作製した。雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（１群当たりＮ＝５、７〜８週齢）に、全体で４注射部位に関して、１．５ｕｌの精製ＡＡＶベクターを背側海馬（硬膜からＡＰ−２．０ｍｍ、側方±１．５、ＤＶ−１．４ｍｍ）および腹側海馬（硬膜からＡＰ−３．１ｍｍ、側方±２．８、ＤＶ−３．８ｍｍ）に両側性に注入した。様々なＳＣＮ１Ａ特異的転写因子を含有するＡＡＶベクター、すなわち：表１７の発現カセットＡ（図１９Ａ）、発現カセットＢ（図１９Ｂ）、ならびに配列番号３６６および配列番号３６５（図１９Ｃ）を、対照ベクター（同じプロモーターによって駆動されるＥＧＦＰ−ＫＡＳＨ）（図１９Ａ〜Ｃ）およびＣＢＡプロモーターによって駆動されるＥＧＦＰ−ＫＡＳＨ（図１９Ｃ）と比較して使用した。
【０３５８】
ＡＡＶを、各注射後の４分の安静期間に０．３ｕｌ／分の速度で送達した。処置から４週間後、マウスを安楽死させ、海馬組織を解剖した。各群に関して、左の海馬のみが採取され均質化された１動物を除くほとんどの動物（Ｎ＝４）において、左および右の海馬組織の両方から組織を採取し、均質化のためにプールした。ＲＮＡを、ホモジネートから単離（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット）し、ＤＮａｓｅ処理した。ＲＮＡ（３μｇ）を、ＯｌｉｇｏＤＴプライマー（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＶ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して逆転写した。ｃＤＮＡ試料を、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）およびＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを使用して、マウスＳＣＮ１Ａ（ｍＮａｖ１．１フォワードプライマー：５’−ＣＡＡＡＡＡＡＧＣＣＡＣＡＡＡＡＧＣＣＴ−３’（配列番号２９３）およびｍＮａｖ１．１リバースプライマー：５’−ＴＴＡＧＣＴＣＣＧＣＡＡＧＡＡＡＣＡＴＣ−３’（配列番号２９４））に関して、ｑＰＣＲによって分析した：（９８℃で３０秒、４０×［９８℃で１０秒、６４℃で１５秒、７２℃で１５秒］）。
【０３５９】
各々の操作された転写因子構築物を保持するＡＡＶの直接注射により、マウス海馬組織において内因性ＳＣＮ１Ａ転写物の上方調節を生じた。
（実施例１１）
ドラベ症候群のマウスモデルにおける高体温発作（ＨＴＳ）アッセイ
【０３６０】
発現カセットを使用するドラベ症候群および／またはその症状の処置を、Ｓｃｎ１ａｔｍ１Ｋｅａマウス系統で試験した。このマウス系統は、ドラベ症候群に関して確立されたマウスモデルである。Ｓｃｎ１ａｔｍ１Ｋｅａマウス系統は、ＣＲＥリコンビナーゼを必要としない。Ｓｃｎ１ａｔｍ１Ｋｅａマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手可能、Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，  ｖｏｌ．  ７：  １５３２７  （２０１７）に記載）は、ＳＣＮ１Ａの第１のコードエクソンの欠失を含む。ＳＣＮ１Ａノックアウト対立遺伝子に関してホモ接合性であるマウスは、振戦、運動失調、発作、および出生後１６日目までの死亡によって特徴づけられる。Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドのヘテロ接合性マウスは、自発性発作を発症し、また数週以内に死亡するパーセンテージが高い。そのようなマウス血統を使用して、てんかんおよびドラベ症候群の処置の安全性および有効性を研究することができる。追加の情報については、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｓ  Ｂｒａｉｎ  Ｂｅｈａｖ．  ２０１４  Ｆｅｂ；１３（２）：１６３−７２を参照されたい。
【０３６１】
Ｓｃｎ１ａｔｍ１Ｋｅａマウス系統における転写活性化因子の有効性を試験するために、雄Ｓｃｎ１ａ＋／−と雌Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊブリーディングとの交雑から産した同腹子に、Ｐ１で両側ＩＣＶを介してＡＡＶベクターを投与した。マウスに、下の表３６に要約した構築物を投与した。マウスを、Ｐ１８で離乳（ｗｅｅｎｉｎｇ）させるまで、それらの雌親とともにそのまま放置し、次にＨＴＳアッセイが始められるＰ２６〜Ｐ２８まで再度そのまま放置した。投与したＰ１マウスの別々の子を、Ｐ１８で離乳（ｗｅｅｎｅｄ）させ、毎日死亡率に関して観察した。高体温発作誘発を、混合１２９Ｓｔａｃ  Ｘ  Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドでのＰ２６〜Ｐ２８のＨＥＴおよびＷＴのＳｃｎ１ａマウスで実施した。アッセイ前に、マウスに、潤滑にした直腸温プローブ（Ｒｅｔ−４）を挿入し、加熱灯（ＨＬ−１）と直列に接続した温度制御モジュール（ＴＣＡＴ  ２ＤＦ、Ｐｈｙｓｉｔｅｍｐ）に接続した。マウスを、次に大きいガラスビーカー内に入れ、短時間で環境に慣らした。この後、体温を、姿勢の喪失を伴う最初の強直間代性けいれん発作の開始までまたは４３℃に達するまで２分毎に約０．５℃ずつ増加させた。マウスが姿勢の喪失を伴う発作を経験した場合には、実験を終了し、マウスの内部体温を記録した。姿勢の喪失を伴う発作が実験の全過程にわたって検出されなかった場合には、そのマウスは発作なしと考え、アッセイを結論づけた。組織試料を、マウスからＰ１で得て、マウスの遺伝子型決定（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）をリアルタイムＰＣＲを使用して実験の過程の間に実施した。アッセイが完了した後は、遺伝子型決定は非盲検であり、ＨＥＴまたはＷＴとしてのマウスの状態を、得られたデータと相関させた。データをＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線に対してプロットし、有意性をＭａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ検定により決定した。結果は、表３６および表３７ならびに図２０Ａ〜Ｅに示される。
表３６．  実施例１１に使用された条件の概要。
【表３６】
2021505133.tif 000087
表３７．  高体温発作アッセイの結果の概要。
【表３７】
2021505133.tif 000088
（実施例１２）
ドラベ症候群のマウスモデルにおける生存アッセイ
【０３６２】
Ｓｃｎ１ａｔｍ１Ｋｅａマウス系統における転写活性化因子の有効性を試験するために、雄Ｓｃｎ１ａ＋／−と雌Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊブリーディングとの交雑から産した同腹子に、Ｐ１で両側ＩＣＶを介してＡＡＶベクターを投与した。マウスを、離乳させるまで、それらの雌親とともにそのまま放置した。Ｓｃｎ１ａ＋／−マウスの健康状態の観察を、Ｐ１８での離乳後に毎日実施した。それらマウスのホームケージにおいて何らかの原因で死亡したことが見出されたマウスは、その日付を記録した。データをＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線に対してプロットし、有意性をＭａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ検定により決定した。
【０３６３】
結果は、表３８および図２１Ａ〜Ｅに示される。
表３８：生存アッセイについての条件および結果の概要。
【表３８】
2021505133.tif 000089
（実施例１３）
ＳＣＮ１Ａ特異的転写因子をコードするＡＡＶで処置後の非ヒト霊長類におけるＳＣＮ１Ａ転写レベル
【０３６４】
研究に、年齢２〜３の間の雄のカニクイザル（ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を使用した。動物を、ＡＡＶ９への交差反応性抗体に関して、研究への登録前に、細胞ベースの中和抗体アッセイによってプレスクリーニングした。ＳＣＮ１Ａ特異的転写因子（配列番号３０５）を発現するＡＡＶ９または対照を、ＰＢＳ中に希釈し、１．２Ｅ１２ｇｃ／動物で実質内に注射した。各半球中の３つの異なる定位座標、動物１個体当たり６注射部位、を、注射のために識別した。１０ｕｌ容量を、１部位当たり注射した。右半球における注射は、左における注射と対称的にした。２個体の未処置動物を、対照として使用した。
【０３６５】
Ｓｃｎ１Ａ  ｍＲＮＡ発現を評価するために、逆転写に続いてｑＰＣＲ法を行った。剖検時、投与２８日後、対照および処置動物の脳の様々な領域（前頭皮質、頭頂皮質、側頭皮質、後頭皮質、海馬、髄質、小脳；各２００ｍｇ）からの組織切片を、ＲＮＡｌａｔｅｒに採取し、次に凍結した。簡単に述べると、３０ｍｇの組織を切り離し、ＲＮＡを（Ｑｉａｇｅｎ  Ｒｎｅａｓｙ  Ｌｉｐｉｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ、カタログ番号１０２３５３９で）抽出し、（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｈｉｇｈ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔ、カタログ番号４３６８８１４を使用して）逆転写によってｃＤＮＡへと転換し、Ｓｃｎ１Ａおよびハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対するプライマー／プローブセット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号Ｒｈ０２６２１７４５−ｇＩ  ＦＡＭ）を使用してｑＰＣＲを実施した。
【０３６６】
ＳＣＮ１Ａに対するプライマー／プローブセットを以下に示す。
表３９：実施例１３に使用されたプライマー配列
【表３９】
2021505133.tif 000090
【０３６７】
ＳＣＮ１Ａに対するプライマー／プローブセットを以下に示す。各試験試料中のＳｃｎ１Ａの遺伝子発現を、比較Ｃｔ（ΔＣｔ）法を使用する相対定量（ＲＱ）によって決定した。この方法は、標的遺伝子とハウスキーピング遺伝子との間のＣｔ差（ΔＣｔ）を測定し、次に対照試料に対する処置試料のΔＣｔ値を比較する。
【０３６８】
ΔＣｔ＝標的遺伝子のＣｔ平均−ハウスキーピング遺伝子のＣｔ平均
【０３６９】
ΔΔＣｔ＝処置試料のΔＣｔ−ΔＣｔ対照試料
【０３７０】
相対的発現（処置試料）＝２−ΔΔＣｔ
【０３７１】
データは、脳からの異なる組織切片において標的ｍＲＮＡの正規化発現として報告される（図２２を参照されたい）。図２２に示されるように、実質内の注射部位の近位にある脳中の部位は、最高レベルのＳＣＮ１Ａ転写物発現を示した。
（実施例１４）
異なるマウス系統におけるドラベ症候群の処置
【０３７２】
本明細書に記載される発現カセットを使用するドラベ症候群および／またはその症状の処置を、様々なマウス系統、例えば、Ｂ６（Ｃｇ）−Ｓｃｎ１ａｔｍ１．１Ｄｓｆ／Ｊ、Ｓｃｎ１ａｔｍ１Ｋｅａ、およびＳｃｎ１ａ−Ｒ１４７０Ｘマウス系統で試験することができる。これらのマウス系統は、ドラベ症候群に関して確立されたマウスモデルである。Ｓｃｎ１ａｔｍ１ＫｅａおよびＳｃｎ１ａ−Ｒ１４７０Ｘマウス系統は、ＣＲＥリコンビナーゼを必要としない。
【０３７３】
Ｂ６（Ｃｇ）−Ｓｃｎ１ａｔｍ１．１Ｄｓｆ／Ｊマウスは、ドラベ症候群を処置することにおける本明細書に記載されるＳＣＮ１Ａ転写活性化因子組成物の安全性および有効性を研究するために、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを介してドラベ症候群欧州連合（Ｄｒａｖｅｔ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ）から得ることができる。これらのマウスは、ＳＣＮ１Ａのエクソン２４中にドラベ症候群関連性の変異（１７８３位でＡからＶ）を含有する。そのマウスは、野生型配列を有するｆｌｏｘｅｄエクソン２４も含有する。この血統のマウスは、マニピュレートされない場合に、ＳＣＮ１Ａの２コピーのＷＴ対立遺伝子を発現する。しかし、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するＡＡＶの送達またはこの血統とＣｒｅ発現マウス系統との交雑に際して、いずれかの細胞発現Ｃｒｅは、１コピーの変異型アレルを発現するよう切り換えることになる。変異体ＳＣＮ１Ａサブユニットの発現に際して、マウスは、４週内に自発性発作を発症する。Ｂ６（Ｃｇ）−Ｓｃｎ１ａｔｍ１．１Ｄｓｆ／Ｊマウス実験に関して、Ｂ６（Ｃｇ）−Ｓｃｎ１ａｔｍ１．１Ｄｓｆ／Ｊマウスおよび対照Ｃ５７Ｂｌ６マウスを使用することができる。
【０３７４】
Ｓｃｎ１ａｔｍ１Ｋｅａマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手可能、Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，  ｖｏｌ．  ７：  １５３２７  （２０１７）に記載）は、ＳＣＮ１Ａの第１のコードエクソンの欠失を含む。ＳＣＮ１Ａノックアウト対立遺伝子に関してホモ接合性であるマウスは、振戦、運動失調、発作、および出生後１６日目までの死亡によって特徴づけられる。Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドのヘテロ接合性マウスは、自発性発作を発症し、また数週以内に死亡する。そのようなマウス血統を使用して、てんかんおよびドラベ症候群の処置の安全性および有効性を研究することができる。追加の情報については、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｓ  Ｂｒａｉｎ  Ｂｅｈａｖ．  ２０１４  Ｆｅｂ；１３（２）：１６３−７２を参照されたい。
【０３７５】
Ｓｃｎ１ａ−Ｒ１４７０Ｘマウスは、ＳＣＮ１Ａ遺伝子のエクソン２１に未成熟終止コドンＲ１４０７Ｘを保持するノックインマウスである。同じ変異は、３個体の無関係なＳＭＥＩ患者において病原性変異として同定されている。Ｓｃｎ１ａＲＸ／ＲＸの子は、出生１２〜１６日後での強直間代性および間代性けいれん発作ならびに律動性攣縮運動（ｒｈｙｔｈｍｉｃ  ｊｅｒｋｉｎｇ  ｍｏｖｅｍｅｎｔ）および不随意筋収縮を含む、出生１２日後での再発性の自発性発作によって特徴づけられる。追加の情報については、Ｏｇｉｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｍａｙ  ３０，  ２００７，  ２７（２２）  ５９０３−５９１４を参照されたい。
【０３７６】
ｉｎ  ｖｉｖｏで発現するＳＣＮ１Ａを上方調節するｅＴＦを含む、ＡＡＶ遺伝子治療およびそのような遺伝子治療を使用する処置を含む、本明細書に記載される組成物を試験するために、上に記載のマウス血統の各々のドラベマウスおよび対照マウス（例えば、野生型ＳＣＮ１Ａを有するマウスまたはその血統に関する未処置ドラベマウス）に、ＥＧＦＰもしくは別のレポーター遺伝子、または内因性ＳＣＮ１Ａの近位にある標的結合配列に結合するｅＴＦを含む、発現カセット（例えば、本明細書に開示される任意の発現カセット）を発現するＡＡＶを注射する（例えば、腹腔内注射によって投与する）。一部のＡＡＶは、１つまたは複数の細胞型選択的調節エレメントをさらに含むことができる。
【０３７７】
ＡＡＶ注射後、マウス生存は、経時的にモニターされる。全てのマウスは、一般的な健康（例えば、体重、水分補給、毛づくろい、および機動性）を毎日モニターし、死亡を記録する。
【０３７８】
テレメトリ埋め込み（ｔｅｌｅｍｅｔｒｙ  ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）は、ＡＡＶ注射（Ｆ２０−ＥＥＴ、Ｄａｔａ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）直後に実施することができる。皮質脳波データは、手術１０日後から少なくとも１４日間連続的に記録し、モニターすることができる。全ての発作事象は、日付、開始時間、中止時間、持続時間、および重症度スコアを注記して、ＡＡＶ処置後少なくとも１４日間記録してもよい。ＥＧＦＰ対照または未処置対照と比較して、ＳＣＮ１Ａ転写活性化因子を含むＡＡＶで処置後の発作の頻度および／または持続時間の低減は、ドラベ症候群の症状および／または重症度の低減におけるＳＣＮ１Ａ転写活性化因子の有効性の指標である。
【０３７９】
ＡＡＶでのマウスの処置の後、ＳＣＮ１Ａの発現レベルは、様々なＰＣＲおよび／またはシークエンシング法を使用して、経時的にモニターして、ＳＣＮ１Ａ転写活性化因子を有するＡＡＶ処置が内因性ＳＣＮ１Ａ発現の増加を生じ得ることを示すことができる。ノーザンブロット分析およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏでＳＣＮ１Ａ発現を分析することもできる。Ｎａｖ１．１タンパク質のレベルを処置後にモニターして、ＳＣＮ１Ａ発現の増加がＮａｖ１．１タンパク質の増加と相関することを示すこともできる。Ｎａｖ１．１タンパク質は、ウエスタンブロット分析、免疫組織化学、免疫蛍光組織化学、および／またはＥＬＩＳＡアッセイを含むが、これらに限定されない様々な方法を使用してアッセイすることができる。機能的な電位依存性ナトリウムイオンチャネルの形成は、電流固定分析（ｃｕｒｒｅｎｔ−ｃｌａｍｐ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を使用してアッセイすることもできる。
【０３８０】
高体温誘発発作を評価して、野生型マウスおよび／または未処置ドラベマウスと本明細書に記載される発現カセットを含むＡＡＶ遺伝子治療処置したドラベマウスとを比較することができる。そのような実験では、深部体温（ｃｏｒｅ  ｂｏｄｙ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）は、ＲＥＴ−３直腸温プローブ（Ｐｈｙｓｉｔｅｍｐ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）でモニターされ、Ｐａｒｔｌｏｗ１１６０＋コントローラー（Ｗｅｓｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｂｒｉｇｈｔｏｎ、ＵＫ）で再構成されたげっ歯類温度レギュレーター（ＴＣＡＴ−２ＤＦ、Ｐｈｙｓｉｔｅｍｐ）に接続した加熱灯によって制御される。体温は、最初の間代性けいれんの開始まで、２分毎に０．５℃ずつ上昇する。ＳＣＮ１Ａ転写活性化因子を含むＡＡＶで処置したドラベマウスは、未処置ドラベマウスと比較して、最初の間代性けいれんの開始前に、より高い閾値温度を有すると期待される。
【０３８１】
発現カセットを含む異なる用量のＡＡＶをマウスに投与して、各遺伝子治療処置の安全性および有効性プロファイルを決定することもできる。これらの前臨床研究は、ドラベ症候群を処置するために使用する遺伝子治療の最適用量（複数可）を通知することもできる。
（実施例１５）
マウスにおけるアルツハイマー病の処置
【０３８２】
雌ＡＰＰ／ＰＳ１および野生型（ＷＴ）マウスは、ＰｓｙｃｈｏＧｅｎｉｃｓで交配されたアルツハイマー病の確立されたマウスモデルであり、アルツハイマー病を処置することにおける本明細書に記載されるＳＣＮ１Ａ転写活性化因子組成物の安全性および有効性を研究するために使用することができる。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、スウェーデン変異（６７０Ｇ−Ｔおよび６７１Ａ−Ｃ）を保有するアミロイドベータ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）およびＬ１６６Ｐ変異を含有するプレセニリン１（ＰＳＥＮ１）の両方に関するヒト導入遺伝子を、両方ともＴｈｙ１プロモーター制御下に含有する。これらのマウスは、アミロイドプラークおよび記憶障害を含む、アルツハイマー病の症状を発症する。これらのマウスのさらなる記載は、Ｒａｄｄｅ  ｅｔ  ａｌ，  ２００６  （Ｒａｄｄｅ，  Ｒｅｂｅｃｃａ，  ｅｔ  ａｌ．  ”Ａβ４２−ｄｒｉｖｅｎ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｅａｒｌｙ  ａｎｄ  ｒｏｂｕｓｔ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．”  ＥＭＢＯ  ｒｅｐｏｒｔｓ  ７．９  （２００６）：  ９４０−９４６）に見出すことができる。
【０３８３】
ＡＰＰ／ＰＳ１マウスおよび非トランスジェニック対照に、ＥＧＦＰを発現する対照ＡＡＶベクターまたはＳＣＮ１Ａ転写活性化因子を含む処置用ＡＡＶベクター（例えば、本明細書に開示される任意の発現カセット）のいずれかを注射する。一部のＡＡＶは、ＧＡＢＡ作動性選択的および／またはＰＶ選択的調節エレメントをさらに含むことができる。
【０３８４】
ＡＡＶ注射後、マウス生存は、経時的にモニターされる。全てのマウスは、一般的な健康（例えば、体重、水分補給、毛づくろい、および機動性）を毎日モニターし、死亡を記録する。ＡＡＶの注射後、マウスに、ＥＥＴトランスミッターも埋め込む。手術後少なくとも４週間の間に２４時間にわたって、脳活性を記録し、モニターすることができる。皮質脳波データを、自動的に分析することができ、異なる周波数帯域（５０〜１００Ｈｚ）の出力レベルを、上に記載されるＡＡＶ遺伝子治療で各々処置した、ＷＴマウス、未処置ＡＰＰ／ＰＳ１マウス、およびＡＡＶ−処置ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの異なる群にわたり比較することができる。増加した高ガンマパワー活動は、アルツハイマー患者およびてんかん患者における発作と関連する。したがって、未処置ＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、対照マウスよりも高いレベルの高ガンマパワー活動を示すと期待され、一方、この増加は、処置マウスに存在しないかまたは低減されると期待され、このことから、ＳＣＮ１Ａの転写活性化因子を含むＡＡＶ遺伝子治療での効果的な処置が示される。
【０３８５】
ＡＡＶでのマウスの処置の後、ＳＣＮ１Ａの発現レベルを、様々なＰＣＲおよび／またはシークエンシング法を使用して、経時的にモニターして、ＳＣＮ１Ａ転写活性化因子を有するＡＡＶ処置が内因性ＳＣＮ１Ａ発現の増加を生じ得ることを示すことができる。ノーザンブロット分析およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏでＳＣＮ１Ａ発現を分析することもできる。Ｎａｖ１．１タンパク質のレベルを処置後にモニターして、ＳＣＮ１Ａ発現の増加がＮａｖ１．１タンパク質の増加と相関することを示すこともできる。Ｎａｖ１．１タンパク質は、ウエスタンブロット分析、免疫組織化学、免疫蛍光組織化学、および／またはＥＬＩＳＡアッセイを含むが、これらに限定されない様々な方法を使用してアッセイすることができる。機能的な電位依存性ナトリウムイオンチャネルの形成は、電流固定分析を使用してアッセイすることもできる。
【０３８６】
発現カセットを含む異なる用量のＡＡＶをマウスに投与して、各遺伝子治療処置の安全性および有効性プロファイルを決定することもできる。これらの前臨床研究は、アルツハイマー病を処置するために使用する遺伝子治療の最適用量（複数可）を通知することもできる。
（実施例１６）
ＧＲＮ特異的転写活性化因子を使用するＧＲＮを上方調節することが可能である標的領域の同定
【０３８７】
内因性ＧＲＮ発現を上方調節することが可能であるゲノムの領域を同定するために、様々な操作された転写因子（ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはｇＲＮＡ／ｄａＣａｓ９構築物のいずれか）を、下の表４０に記載されるゲノムの様々な領域を標的化するように設計した。ｇＲＮＡ／ｄａＣａｓ９構築物に関して、ｇＲＮＡが、相補的なゲノム鎖を標的とするよう設計されたので、ｇＲＮＡは標的領域と同じ配列を有した。ＨＥＫ２９３細胞を標準方法で培養し、そこに、６ウェルプレートの１ウェル当たり操作された転写因子または対照構築物を保持する３ｕｇプラスミドをトランスフェクトした（ＦｕｇｅｎｅＨＤ、Ｐｒｏｍｅｇａ）。細胞に、下の表４０および表４１に示される構築物を発現するプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を採取し、ＲＮＡを単離（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット）し、ＤＮａｓｅ処理した。ＲＮＡ（３ｕｇ）を、ＯｌｉｇｏＤＴプライマー（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＶ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して逆転写した。ｃＤＮＡ試料を、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）およびＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを使用してｑＰＣＲによって分析した：（９８℃で３０秒、４０×［９８℃で１０秒、６６℃で１５秒、７２℃で１５秒］）。ＳＣＮ１Ａに対するプライマー（５’−ＴＧＴＣＴＣＧＧＣＡＴＴＧＡＧＡＡＣＡＴＴＣ−３’（配列番号１９０）、５’−ＡＴＴＧＧＴＧＧＧＡＧＧＣＣＡＴＴＧＴＡＴ−３’（配列番号１９１））を使用して、内因性ＳＣＮ１Ａ転写物のレベルを定量し、ＳＣＮ１Ａ発現の相対的レベルを、ＧＡＰＤＨを参照遺伝子（５’−ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ’３’（配列番号１９２）、５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３’（配列番号１９３））とするデルタ−デルタＣｔ法によって決定した。データは、対照条件に対する変化倍率として提示される。
【０３８８】
結果は、以下の図２３および表４０に、対照条件（例えば、ＥＧＦＰ−ＫＡＳＨ対照）に対する、ＧＲＮ転写の変化倍率として示される。
表４０：  ＧＲＮ標的領域および特定の転写因子を使用する内因性ＧＲＮの上方調節に対する効果。
【表４０】
2021505133.tif 000091
表４１：  ＧＲＮ  ＤＢＤ
【表４１】
2021505133.tif 000092
（実施例１７）
発現カセットからのＧＲＮの相対的発現
【０３８９】
この実施例は、ＨＥＫ２９３細胞において（ＧＲＮ  ＲＮＡによって測定される）ＧＲＮ遺伝子の発現を増加させる、天然に存在しない転写活性化因子を含む発現カセットからのＧＲＮの相対的発現を記載する。発現カセットＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、およびＭを構築し、各々は、上の表２３に記載される、ＶＰＲまたはＶＰ６４転写活性化ドメイン（例えば、配列番号９５または配列番号１１４）に連結され、配列番号１６５〜１７０および配列番号１１２から選択されるＤＮＡ結合ドメインを含む天然に存在しない転写モジュレーターを含む。各発現カセットはまた、配列番号１７８または１７９の配列を有する調節エレメントを含んでいた。発現カセットＪは、ＪがｅＧＦＰレポーターをさらに含むことを除いて、発現カセットＫと類似する。
【０３９０】
ＧＲＮ転写活性化因子を試験するために、ＨＥＫ２９３細胞を標準方法で培養し、そこに、６ウェルプレートの１ウェル当たり３μｇプラスミドをトランスフェクトした（ＰＥＩ）。トランスフェクションの４８時間後、細胞を採取し、ＲＮＡを単離（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット）し、ＤＮａｓｅ処理した。ＲＮＡ（３μｇ）を、ＯｌｉｇｏＤＴプライマー（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＶ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して逆転写した。ｃＤＮＡ試料を、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）およびＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを使用してｑＰＣＲによって分析した：（９８℃で３０秒、４０×［９８℃で１０秒、６６℃で１５秒、７２℃で１５秒］）。ＧＲＮに対するプライマー（５’−ＡＴＧＧＴＣＡＧＴＴＣＴＧＣＣＣＴＧＴＧ−３’（配列番号２８７）、５’−ＣＧＧＴＡＡＡＧＡＴＧＣＡＧＧＡＧＴＧＧＣ−３’（配列番号２８８））を使用して、内因性ＧＲＮ転写物のレベルを定量し、ＧＲＮ発現の相対的レベルを、ＧＡＰＤＨを参照遺伝子（５’−ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ−３’（配列番号１９２）、５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３’（配列番号１９３））とするデルタ−デルタＣｔ法によって決定した。
【０３９１】
対照は、配列番号ＸＸを含み、転写活性化因子を欠く発現カセットを指す。図２４Ａは、対照条件に対する、変化倍率として提示される、各発現カセットをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるＧＲＮの相対的発現を示す。本実験は、本明細書に記載される転写活性化因子が、内因性ＧＲＮ遺伝子から転写されるＲＮＡの上方調節を生じることを示した。試験した全ての転写活性化因子発現カセットは、ＨＥＫ２９３細胞においてＧＲＮ発現の増加を生じた。
【０３９２】
ＥＬＩＳＡ実験も実施して、細胞において分泌プログラニュリン（ｈＰＧＲＮ）タンパク質を増加させるＧＲＮの様々な転写活性化因子を含む発現カセットの能力を評価した。２９３Ｔ細胞に、表２３に記載されるある特定の発現カセットをトランスフェクトし、培養培地をトランスフェクション４８時間後採取した。細胞デブリを除去するために短時間でスピンした後、培養培地を、Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓからのヒトプログラニュリンＥＬＩＳＡキットを使用する、製造者の指示に従うＥＬＩＳＡ分析に供した。プログラニュリンの濃度を、キットマニュアルに記載された標準曲線分析に基づいて計算した。図２４Ｂは、上清（ｎｇ／ｍＬ）中のヒトプログラニュリン（ｈＰＧＲＮ）に関して試験した各発現カセットについて得られた３回の独立したＥＬＩＳＡ結果の平均を示す。試験した全ての転写活性化因子発現カセットは、対照発現カセットと比べて、細胞において分泌ｈＰＲＧＮの増加を生じた。
（実施例１８）
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における遺伝子発現の増加
【０３９３】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、いくつかの異なる調節エレメント、すなわち、プロモーターなしの対照、ＳＣＰ、ＣＭＶ、ｍｉｎＣＭＶに作動可能に連結した配列番号１７８、およびＣＡＧのうちの１つの制御下でルシフェラーゼ遺伝子を含有するプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。各構築物からの正規化ルシフェラーゼ値は、図２５に示される。ｍｉｎＣＭＶプロモーターに作動可能に連結した調節エレメント配列番号ＸＸは、ｍｉｎＣＭＶ単独およびＳＣＰ単独よりも高いレベルのルシフェラーゼ発現を駆動した。
【０３９４】
本実験は、配列番号１７８が、細胞において高い遺伝子発現を駆動するＲＥであることを示した。そのようなＲＥは、細胞において転写活性化因子の発現を増加させ、内因性ＧＲＮ遺伝子の発現の増加を生じる、ＧＲＮの天然に存在しない転写活性化因子を含む、本明細書に開示される発現カセットに付加することができる。一部の場合では、配列番号１７８の配列を有する１つまたは複数のＲＥが、細胞においてＧＲＮ発現を増加させる、転写活性化因子に作動可能に連結される。そのような調節エレメントは、発現カセットにおいて転写活性化因子の上流および／または下流で発現カセットに付加することができる。
（実施例１９）
プログラニュリン特異的転写因子を使用するＨＥＫ２９３細胞におけるプログラニュリン転写物およびタンパク質レベルの上方調節
【０３９５】
ＨＥＫ２９３細胞を標準方法で培養し、そこに、６ウェルプレートの１ウェル当たり３ｕｇプラスミドをトランスフェクトした（ＦｕｇｅｎｅＨＤ、Ｐｒｏｍｅｇａ）。細胞に、下の表４２に示される構築物を含有するプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、ＲＮＡをｑＰＣＲ分析のために単離し、感染させたウェルから培地を採取し、分泌ＰＧＲＮレベルをＥＬＩＳＡ分析によって定量した。
ｑＰＣＲ分析に関して、細胞を採取し、ＲＮＡを単離（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット）し、ＤＮａｓｅ処理した。ＲＮＡ（３ｕｇ）を、ＯｌｉｇｏＤＴプライマー（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＶ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して逆転写した。ｃＤＮＡ試料を、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）およびＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを使用してｑＰＣＲによって分析した：（９８℃で３０秒、４０×［９８℃で１０秒、６６℃で１５秒、７２℃で１５秒］）。ＰＧＲＮに対するプライマー（５’−ＡＴＧＧＴＣＡＧＴＴＣＴＧＣＣＣＴＧＴＧ−３’（配列番号２８７）、５’−ＣＧＧＴＡＡＡＧＡＴＧＣＡＧＧＡＧＴＧＧＣ−３’（配列番号２８８））を使用して、内因性ＰＧＲＮ転写物のレベルを定量し、ＰＧＲＮ発現の相対的レベルを、ＧＡＰＤＨを参照遺伝子（５’−ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ’３’（配列番号１９２）、５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３’（配列番号１９３））とするデルタ−デルタＣｔ法によって決定した。データは、対照条件に対する変化倍率として提示される（図２６を参照されたい）。操作された転写因子の送達により、ＥＧＦＰ対照条件に対する内因性ＧＲＮ転写物の種々の程度の上方調節が誘導された。
ＥＬＩＳＡ分析に関して、細胞培養培地を、ウイルス感染後の特定の日に採取し、ヒトＰＧＲＮ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ＤＰＧＲＮ０）を使用するＥＬＩＳＡ分析に供した。ＥＬＩＳＡ手順を、製造者の指示に従って実施した。データは、対照条件に対する変化倍率として提示される（図２７を参照されたい）。これらのデータは、操作された転写因子によるＧＲＮの上方調節が、ＰＧＲＮタンパク質の分泌の増加を生じたことを確認する。
表４２．  実施例１９に使用されたＧＲＮ構築物。
【表４２】
2021505133.tif 000093
（実施例２０）
プログラニュリン特異的転写因子を使用するＧＡＢＡニューロンにおけるプログラニュリン転写物およびタンパク質レベルの上方調節
【０３９６】
ｉＣｅｌｌ  ＧＡＢＡニューロン（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を６ウェルプレート中でプレート培養（約１Ｅ６細胞／ウェル）し、製造者の推奨するプロトコールで維持した。プレーティングの７２時間後、ＣＢＡプロモーターの制御下でＥＧＦＰまたは活性化因子（配列番号３４２）を発現する組換えＡＡＶ（血清型ＡＡＶ−ＤＪ）を、培養培地に約２Ｅ１１ゲノムコピー／ウェルで添加した。感染から１週間後、ＲＮＡをｑＰＣＲ分析のために単離し、感染させたウェルから培地を採取し、分泌ＰＧＲＮレベルをＥＬＩＳＡ分析によって定量した。
【０３９７】
ｑＰＣＲ分析に関して、ＲＮＡを、培養した細胞から単離（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  キット）し、ＤＮａｓｅ処理した。回収したＲＮＡを、ＯｌｉｇｏＤＴプライマー（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＶ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して逆転写した。ｃＤＮＡ試料を、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）およびＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを使用してｑＰＣＲによって分析した：（９８℃で３０秒、４０×［９８℃で１０秒、６６℃で１５秒、７２℃で１５秒］）。ＰＧＲＮに対するプライマー（５’−ＡＴＧＧＴＣＡＧＴＴＣＴＧＣＣＣＴＧＴＧ−３’（配列番号２８７）、５’−ＣＧＧＴＡＡＡＧＡＴＧＣＡＧＧＡＧＴＧＧＣ−３’（配列番号２８８））を使用して、内因性ＰＧＲＮ転写物のレベルを定量し、ＰＧＲＮ発現の相対的レベルを、ＧＡＰＤＨを参照遺伝子（５’−ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ’３’（配列番号１９２）、５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３’（配列番号１９３））とするデルタ−デルタＣｔ法によって決定した。データは、対照条件に対する変化倍率として提示される（図２８を参照されたい）。配列番号３４２の送達は、ＥＧＦＰ対照条件に対する内因性ＧＲＮ転写物のロバストな上方調節を生じさせた。
【０３９８】
ＥＬＩＳＡ分析に関して、細胞培養培地を、０．５Ｅ１１ゲノムコピー／ウェル（低用量条件）または２Ｅ１１ゲノムコピー／ウェル（高用量条件）のいずれかでのウイルス感染後の特定の日に採取し、ヒトＰＧＲＮ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ＤＰＧＲＮ０）を使用するＥＬＩＳＡ分析に供した。ＥＬＩＳＡ手順を、製造者の指示に従って実施した。データが、提示される（図２９を参照されたい）。これらのデータは、配列番号３４２によるＧＲＮの上方調節が、培養したニューロンにおけるＰＧＲＮタンパク質の分泌の増加を生じたことを確認する。
（実施例２１）
ｉｎ  ｖｉｖｏでの血漿ＧＲＮタンパク質の増加
【０３９９】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＧＲＮの転写活性化因子の発現を試験するために、上の表２３に記載される、発現カセットＪまたはＧを含むＡＡＶ９をマウスに注射した。精製したＡＡＶ９ウイルスは、ＶｅｃｔｏｒＢｉｏＬａｂｓで作製し、注射前に２００ｕｌ全容量に（ＰＢＳで）復元した。６〜９週齡の雄Ｃ５７ＢＬ６動物を、順化（ａｃｃｌａｍａｔｉｏｎ）期間後の尾静脈注射に使用した。生存中の血液採取を尾静脈出血を介して実施し、血漿試料をＫ２ＥＤＴＡ法を使用して生成した。ＥＬＩＳＡ分析を、マウスＰＧＲＮ  ＥＬＩＳＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で製造者のマニュアルに従って実施した。図３０は、注射から１週後、異なるＡＡＶ９構築物または対照で処置したマウスに関するμｇ／ｍＬで表される血漿ＧＲＮのＥＬＩＳＡ結果を示す。ＰＢＳ緩衝液対照と比較して、ＧＲＮ転写活性化因子を含むＡＡＶ９で処置した全てのマウスは、血漿ＧＲＮタンパク質レベルにおける顕著な増加を示した。異なる用量のＡＡＶ９−ＪおよびＡＡＶ９−Ｇを、試験した：マウス１匹当たり１Ｅ１１ゲノムコピー（ＧＣ）および５Ｅ１１  ＧＣ。ＡＡＶ９−Ｇに関して、マウス１匹当たりに注射されるゲノムコピーを増加させることにより、１Ｅ１１  ＧＣ／マウスでのより低い用量と比較して、血漿ＧＲＮタンパク質において少なくとも２倍の増加を生じた。
（実施例２２）
グリア細胞における高ＧＲＮ発現の駆動
【０４００】
グリア細胞、または特にミクログリア細胞に対する選択性は、蛍光イメージングを使用して決定することができる。ｅＧＦＰレポーター遺伝子を含有するＡＡＶベクターは、対照プロモーター（ＥＦ１α）またはグリアもしくはミクログリア選択的ＲＥのいずれかに作動可能に連結される。そのようなＡＡＶベクターを、ＣＲＥ−依存性ｔｄＴｏｍａｔｏベクターと一緒に、Ｃｒｅがグリアまたは特にミクログリア中に発現するＣＲＥマウスに注射する。
【０４０１】
マウスに１．５μＬのＡＡＶベクター（５１２〜１１３ｇｃ／ｍｌ）を、前頭皮質または線条体に両側性に注射後の４分の安静期間に０．３μＬ／分の速度で注入した。処置後、マウスの健康および体重を、各日モニターする。組織採取に関して、マウスを、過量のイソフルランを介して安楽死させ、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を灌流する。グリア細胞またはミクログリアにおけるレポーター遺伝子の選択的発現を分析するために、脳組織の断片を、前頭皮質または線条体から得て、切片化し、抗ＲＦＰポリクローナルウサギ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｓｓａｙ）および抗ｅＧＦＰポリクローナルニワトリ抗体（Ａｖｅｓ  Ｌａｂｓ）での標準免疫組織化学手順を使用して、ｅＧＦＰおよびｔｄＴｏｍａｔｏに関して染色した。蛍光顕微鏡法を使用することにより、対照と比較して、ｅＧＦＰレポーター遺伝子の蛍光とｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光との間の強い重ね合せは、グリア細胞またはミクログリアにおける選択的発現を示す。
【０４０２】
この方法を使用して、ＧＲＮ欠乏によって影響を受ける、前頭皮質または他のＣＮＳ細胞、例えば、プルキンエ細胞、錐体細胞（例えば、Ｂｅｔｚ細胞）、運動ニューロン、および大脳皮質ニューロンにおける高い遺伝子発現を標的とする調節エレメントを同定することができる。
【０４０３】
ＧＲＮ欠乏によってネガティブな影響を受けるＣＮＳ中のグリア細胞、ミクログリア、または任意の他の細胞型に対して選択的である調節エレメントを同定したら、そのような調節エレメントを、本明細書に記載される発現カセット中のＧＲＮ遺伝子を標的とする転写活性化因子に作動可能に連結して、ｉｎ  ｖｉｖｏで標的細胞または組織型におけるＧＲＮ発現を選択的に増加させることができる。例えば、グリア細胞またはミクログリア細胞に対する選択的ＲＥは、本明細書に記載される発現カセットの転写活性化因子のいずれか１つに作動可能に連結して、ｉｎ  ｖｉｖｏでＧＲＮを選択的に増加させることができる。
（実施例２３）
ｉｎ  ｖｉｖｏでの血漿ＧＲＮタンパク質の増加
【０４０４】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＧＲＮの転写活性化因子の発現を試験するための、本明細書に記載される任意の発現カセットを含むＡＡＶ９。精製したＡＡＶ９ウイルスは、ＶｅｃｔｏｒＢｉｏＬａｂｓで作製し、注射前に２００ｕｌ全容量に（ＰＢＳで）復元することができる。６〜９週齡の雄Ｃ５７ＢＬ６動物を、順化期間後の尾静脈注射に使用することができる。生存中の血液採取を尾静脈出血を介して実施し、血漿試料をＫ２ＥＤＴＡ法を使用して生成することができる。ＥＬＩＳＡ分析を、マウスＧＲＮ  ＥＬＩＳＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で製造者のマニュアルに従って実施することができる。ＰＢＳ緩衝液対照と比較して、ＧＲＮ転写活性化因子を含むＡＡＶ９で処置した全てのマウスは、血漿ＧＲＮタンパク質レベルにおける顕著な増加を示すと期待される。異なる用量のＡＡＶ９−ｅＴＦ、例えば、マウス１匹当たり１Ｅ１１ゲノムコピー（ＧＣ）および５Ｅ１１  ＧＣを試験することができる。
（実施例２４）
マウスにおけるＦＴＤ症状の処置
【０４０５】
ＦＴＤ症状、すなわち、ＧＲＮのハプロ不全（ｈａｐｌｏｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）を提示する、ヘテロ接合性のＧＲＮ−ノックアウトマウスは、本明細書に記載される組成物および方法を検証するためのｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルを提供する。本明細書に記載されるＡＡＶ発現カセットをマウスに注射して、ｉｎ  ｖｉｖｏでＧＲＮの発現レベルを増加させることによって、ＧＲＮハプロ不全をレスキューする。発現カセットが注射／注入を介してマウスに送達されたら、ＧＲＮハプロ不全のレスキューは、様々な方法、例えば、対照および／または未処置群と比較して、血液試料中の分泌ＧＲＮのレベルを測定すること、ＰＣＲ法を使用してＧＲＮの転写を測定すること、および／または処置マウスにおける行動変化（例えば、運動協調性、学習、他のマウスとの社会性、および他の認知機能）を測定することを使用して、経時的にモニターすることができる。
【０４０６】
類似の方法を、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびアテローム性動脈硬化症のマウスモデルに使用することができる（例えば、本明細書に記載される発現カセットを使用して、処置後のマウスにおける動脈壁肥厚の低減を測定すること）。
（実施例２５）
レポーター系スクリーニング
【０４０７】
ＨＥＫ２９３細胞を標準方法で培養し、そこに、テトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）接着プロモーターの制御下のＥＧＦＰからなる１．５ｕｇのレポータープラスミド、および１．５ｕｇの各々試験される活性化因子、または空ベクター対照（ｐＵＣ５７）を共トランスフェクトした（ＦｕＧｅｎｅ  ＨＤ、Ｐｒｏｍｅｇａ）。トランスフェクションの４８時間後、細胞に対して、ＧＦＰ発現について落射蛍光顕微鏡を使用してイメージングを行った。細胞を採取し、ＲＮＡを単離（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット）し、ＤＮａｓｅ処理した。ＲＮＡ（３ｕｇ）を、ＯｌｉｇｏＤＴプライマー（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＶ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して逆転写した。ｃＤＮＡ試料を、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）およびＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを使用してｑＰＣＲによって分析した：（９８℃で３０秒、４０×［９８℃で１０秒、６５℃で１５秒、７２℃で１５秒］）。ＥＧＦＰに対するプライマー（５’−ＧＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＡＴＧＡＡＧ−３’（配列番号３６９）、５’−ＴＣＴＴＧＴＡＧＴＴＧＣＣＧＴＣＧＴＣＣ−３’（配列番号３７０））を使用して、レポーター−駆動ＥＧＦＰ転写物のレベルを定量し、ＥＧＦＰ発現の相対的レベルを、ＧＡＰＤＨを参照遺伝子（５’−ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ−３’（配列番号１９２）、５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３’（配列番号１９３））とするデルタ−デルタＣｔ法によって決定した。
【０４０８】
データは、対照条件に対する変化倍率として提示される。配列番号２〜４のｅＴＦが、空ベクター対照と比較して、ＥＧＦＰ発現の増加を生じたことを示す図３１Ａおよび図３１Ｂを参照されたい。ウイルスＶＰ６４  ＴＡＤを含む配列番号５１のｅＴＦは、最高レベルの相対的ＥＧＦＰ発現を生じた。図３２に示されるように、配列番号１２を含むｅＴＦは、対照配列番号１８７と比較して、少なくとも５倍の相対的ＥＧＦＰ発現を生じた。図３３は、配列番号５１〜５３のｅＴＦが、レポーター単独またはＴＡＤなしの対照タンパク質（配列番号５０）と比較して、１０倍超の相対的ＥＧＦＰ発現を生じたことを示す。
【０４０９】
本開示の様々な実施形態が、以下の番号が付けられた節を参照して規定される：
１．３個またはそれよりも多くのＤＮＡ結合ドメインを含む天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸カセットであって、天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質が、内因性遺伝子の発現を、少なくとも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、２５、５０、もしくは１００倍だけ増加させまたは１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、２５、５０、もしくは１００倍だけ抑制し、天然に存在するヒトタンパク質の対応するドメイン（例えば、２つのタンパク質間のＤＮＡ結合ドメインまたは転写エフェクタードメイン内）に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の局所的配列同一性、または天然に存在するヒトタンパク質（例えば、ＥＧＲ１またはＥＧＲ３）に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の大域的配列同一性を有する、核酸カセット。
２．複数の結合ドメインを含む天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸カセットであって、ヒトゲノムにおいて少なくとも２１塩基に対して、集合的に結合し、天然に存在するヒトタンパク質の対応するドメイン（例えば、２つのタンパク質間のＤＮＡ結合ドメインまたは転写エフェクタードメイン内）に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の局所的配列同一性、または天然に存在するヒトタンパク質（例えば、ＥＧＲ１またはＥＧＲ３）に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の大域的配列同一性を有する、核酸カセット。
３．ＤＮＡ結合タンパク質が、ヒトカウンターパートが結合しない標的部位に結合する、節１または２に記載の核酸カセット。
４．ヒトカウンターパートが、ＥＧＲ１またはＥＧＲ３である、節１から３のいずれか１つに記載の核酸カセット。
５．結合ドメインが、ジンクフィンガーである、節１から４のいずれか１つに記載の核酸カセット。
６．結合ドメインが、２倍または３倍の、ヒトカウンターパートの結合ドメインを含む、節１から５のいずれか１つに記載の核酸カセット。
７．結合ドメインが、ヒトカウンターパートのＤＮＡ結合ドメインまたはジンクフィンガーの２、３、４、５、６、７、８、または９コピーを含む、節１から５のいずれか１つに記載の核酸カセット。
８．天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質が、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、または１２個のジンクフィンガーを含む、節１から７のいずれか１つに記載の核酸カセット。
９．内因性遺伝子が、ＳＣＮ１ＡまたはＧＲＮである、節１から８のいずれか１つに記載の核酸カセット。
１０．ＤＮＡ結合タンパク質が、あるゲノム位置で結合部位を認識し、その部位での結合が、ＤＮＡ結合タンパク質に内因性遺伝子の発現をモジュレートさせる、節１から９のいずれか１つに記載の核酸カセット。
１１．ＤＮＡ結合タンパク質が、内因性ＳＣＮ１ＡまたはＧＲＮ遺伝子遺伝子座にまたはそれに隣接して位置する結合部位を認識する、節１から１０のいずれか１つに記載の核酸カセット。
１２．ＤＮＡ結合タンパク質が、（ｉ）配列番号３５〜３８、１０５〜１１１、１１３、１３６、１９５〜２１１、２２４〜２３８、２４０〜２６７、もしくは３３０〜３３６、（ｉｉ）そのバリアント、（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列、または（ｉｖ）その５ｂｐ、１０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、もしくは５００ｂｐ内のゲノム領域の配列を有する結合部位を認識する、節１から１１のいずれか１つに記載の核酸カセット。
１３．ＤＮＡ結合タンパク質が、（ｉ）配列番号３６または３８、（ｉｉ）そのバリアント、（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列、または（ｉｖ）その５ｂｐ、１０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、もしくは５００ｂｐ内のゲノム領域の配列を有する結合部位を認識する、節１から１１のいずれか１つに記載の核酸カセット。
１４．ＤＮＡ結合タンパク質が、（ｉ）配列番号２２〜２６、２９〜３２、８４〜９３、１１２、１３１〜１３５、１６５〜１７１、３７１〜３７２、３７６〜４０９、もしくは４１２〜４１６、（ｉｉ）そのバリアントもしくは機能的な断片、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列の配列を有する、節１から１２のいずれか１つに記載の核酸カセット。
１５．ＤＮＡ結合タンパク質が、（ｉ）配列番号６〜１０、１３〜１６、５７〜６１、６３、６４、６７〜７３、７４〜７７、２６８〜２８２、２９５〜２９９、３３７〜３５０、もしくは３６５〜３６６、（ｉｉ）そのバリアントもしくは機能的な断片、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列の配列を有する、節１から１１および１３のいずれか１つに記載の核酸カセット。
１６．ＤＮＡ結合タンパク質が、ＥＧＲ１またはＥＧＲ３に由来する転写エフェクタードメインを含む、節１から１５のいずれか１つに記載の核酸カセット。
１７．ＤＮＡ結合タンパク質が、ＣＩＴＥＤ２またはＣＩＴＥＤ４に由来する転写エフェクタードメインを含む、節１から１５の１つに記載の核酸カセット。
１８．エフェクタードメインが、ＤＮＡ結合タンパク質中のＤＮＡ結合ドメインのＣ末端に位置する、節１６から１７の１つに記載の核酸カセット。
１９．エフェクタードメインが、ＤＮＡ結合タンパク質中のＤＮＡ結合ドメインのＮ末端に位置する、節１６から１７の１つに記載の核酸カセット。
２０．ＤＮＡ結合ドメインが、（ｉ）配列番号２２〜２６、２９〜３２、８４〜９３、１１２、１３１〜１３５、１６５〜１７１、３７１〜３７２、３７６〜４０９、もしくは４１２〜４１６、（ｉｉ）そのバリアントもしくは機能的な断片、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列の配列を集合的に含む、節１から１９の１つに記載の核酸カセット。
２１．ＤＮＡ結合タンパク質が、（ｉ）配列番号９５〜１００もしくは１１４、（ｉｉ）そのバリアントもしくは機能的な断片、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列の配列を有するエフェクタードメインを含む、節１から２０の１つに記載の核酸カセット。
２２．ＤＮＡ結合ドメインが、ドメイン中にジンクフィンガーの認識ヘリックスの−１位、２位、３位または６位において少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、節１から２１の１つに記載の核酸カセット。
２３．ＤＮＡ結合タンパク質が、１８ｎｔもしくはそれよりも長い、２１ｎｔもしくはそれよりも長い、または２４ｎｔもしくはそれよりも長い標的結合部位を認識する、節１から２２の１つに記載の核酸カセット。
２４．配列同一性が、ＢＬＡＳＴまたはＣｌｕｓｔａｌＷを使用して測定される、節１から２３の１つに記載の核酸カセット。
２５．ＤＮＡ結合タンパク質が、ウイルスベクター中にある、節１から２４の１つに記載の核酸カセット。
２６．ウイルスベクターがＡＡＶである、節２５に記載の核酸カセット。
２７．ＡＡＶがＡＡＶ９である、節２６に記載の核酸カセット。
２８．天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質が、ｅｌｉｓｐｏｔアッセイによって測定される、そのヒトカウンターパートに匹敵する免疫原性を有する（例えば、ここで、匹敵とは、天然に存在するヒトタンパク質によって生成される免疫応答の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％内の免疫原性レベルを指す）、節１から２７のいずれか１つに記載の核酸カセット。
２９．ヒトタンパク質に対して＞９０％の配列同一性、または天然に存在するヒトタンパク質の対応するドメイン（例えば、２つのタンパク質間のＤＮＡ結合ドメインまたは転写エフェクタードメイン内）に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の局所的配列同一性、または天然に存在するヒトタンパク質（例えば、ＥＧＲ１またはＥＧＲ３）に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の大域的配列同一性を有する天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸カセットと、＞９、＞１０、＞１１、＞１２、＞１３、＞１４、＞１５、＞１６、＞１７、＞１８、＞１９、＞２０、＞２１、＞２２、＞２３、＞２４、＞２５、＞２６、＞２７、＞２８、＞２９、または＞３０塩基に集合的に結合する複数の結合モチーフを含むＤＮＡ結合ドメインとを含むＡＡＶベクター。
３０．天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質が、ヒトタンパク質が結合しないヒトゲノム中の標的部位に結合する、節２９に記載のＡＡＶベクター。
３１．ヒトタンパク質が、ＥＧＲ１またはＥＧＲ３である、節２９から３０のいずれか１つに記載のＡＡＶベクター。
３２．ＤＮＡ結合ドメインが、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、または１２個のジンクフィンガーを含む、節２９から３１のいずれか１つに記載のＡＡＶベクター。
３３．ＤＮＡ結合ドメインが、ヒトタンパク質中に２倍、３倍または４倍のＤＮＡ結合ドメインを含む、節２９から３２のいずれか１つに記載のＡＡＶベクター。
３４．天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質が、ＳＣＮ１ＡもしくはＧＲＮのゲノム遺伝子座（例えば、表１に記載されるゲノム遺伝子座）の近傍もしくはその位置の、または内因性ＳＣＮ１ＡもしくはＧＲＮの開始コドンの上流の標的結合部位を認識する、節２９から３３のいずれか１つに記載のＡＡＶベクター。
３５．天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質が、内因性ＳＣＮ１ＡまたはＧＲＮの発現をモジュレート（例えば、発現を増加）する、節２９から３４のいずれか１つに記載のＡＡＶベクター。
３６．天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質が、（ｉ）配列番号３５〜３８、１０５〜１１１、１１３、１３６、１９５〜２１１、２２４〜２３８、２４０〜２６７、もしくは３３０〜３３６、（ｉｉ）そのバリアント、（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性（または少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有する配列、または（ｉｖ）その５ｂｐ、１０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、もしくは５００ｂｐ内のゲノム領域の配列を含む結合部位を認識する、節２９から３５のいずれか１つに記載のＡＡＶベクター。
３７．天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質が、（ｉ）配列番号６〜９、１３〜１５、４４〜４５、４８〜４９、５４〜５５、５８〜６２、６７〜７７、１０３、１１２、１１４、２６８〜２８２、３０５〜３２５、３３７〜３５０、３６４、２９５〜２９９、３６５〜３６６、（ｉｉ）そのバリアントもしくは機能的な断片、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性（または少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性）を有する配列の配列を含む、節２９から３６のいずれか１つに記載のＡＡＶベクター。
３８．天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質が、（ｉ）配列番号２２〜２６、２９〜３２、８４〜９３、１１２、１３１〜１３５、１６５〜１７１、３７１〜３７２、３７６〜４０９、もしくは４１２〜４１６、（ｉｉ）そのバリアントもしくは機能的な断片、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性（または少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性）を有する配列の配列を含む、上記節のいずれか１つに記載のＡＡＶベクター。
３９．天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質が、ＥＧＲ１またはＥＧＲ３の転写エフェクタードメインを含む、節２９から３８のいずれか１つに記載のＡＡＶベクター。
４０．天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質が、ＣＩＴＥＤ２またはＣＩＴＥＤ４の転写エフェクタードメインを含む、節２９から３９のいずれか１つに記載のＡＡＶベクター。
４１．エフェクタードメインが、ＤＮＡ結合タンパク質中のＤＮＡ結合ドメインのＣ末端に位置する、節３９から４０のいずれか１つに記載のＡＡＶベクター。
４２．エフェクタードメインが、ＤＮＡ結合タンパク質中のＤＮＡ結合ドメインのＮ末端に位置する、節３９から４１のいずれか１つに記載のＡＡＶベクター。
４３．ＤＮＡ結合ドメインが、（ｉ）配列番号２２〜２６、２９〜３２、８４〜９３、１１２、１３１〜１３５、１６５〜１７１、３７１〜３７２、３７６〜４０９、もしくは４１２〜４１６、（ｉｉ）そのバリアントもしくは機能的な断片、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性（または少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性）を有する配列の配列を含む、節２９から４２のいずれか１つに記載のＡＡＶベクター。
４４．ＤＮＡ結合タンパク質が、（ｉ）配列番号９５〜１００もしくは１１４、（ｉｉ）そのバリアントもしくは機能的な断片、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性（または少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性）を有する配列の配列を有するエフェクタードメインを含む、節２９から４３のいずれか１つに記載のＡＡＶベクター。
４５．ＤＮＡ結合ドメインが、ドメイン中にジンクフィンガーの認識ヘリックスの−１位、２位、３位または６位において少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、節２９から４４のいずれか１つに記載のＡＡＶベクター。
４６．ＤＮＡ結合タンパク質が、１８ｎｔもしくはそれよりも長い、２１ｎｔもしくはそれよりも長い、または２４ｎｔもしくはそれよりも長い標的結合部位を認識する、節２９から４５のいずれか１つに記載のＡＡＶベクター。
４７．天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質が、ｅｌｉｓｐｏｔアッセイによって測定される、ヒトカウンターパートに匹敵する免疫原性を有する（例えば、ここで、匹敵とは、天然に存在するヒトタンパク質によって生成される免疫応答の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％内の免疫原性レベルを指す）、節２９から４６のいずれか１つに記載のＡＡＶベクター。
４８．配列同一性が、ＢＬＡＳＴまたはＣｌｕｓｔａｌＷを使用して測定される、節２９から４７のいずれか１つに記載のＡＡＶベクター。
４９．ＡＡＶが、ＡＡＶ９である、節２９から４８のいずれか１つに記載のＡＡＶベクター。
５０．ヒトタンパク質に対して９０％もしくはそれよりも高い配列同一性、または天然に存在するヒトタンパク質の対応するドメイン（例えば、２つのタンパク質間のＤＮＡ結合ドメインまたは転写エフェクタードメイン内）に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の局所的配列同一性、または天然に存在するヒトタンパク質（例えば、ＥＧＲ１またはＥＧＲ３）に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の大域的配列同一性を有する天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質をコードするベクターであって、ＤＮＡ結合タンパク質が、内因性ヒト遺伝子の発現をモジュレートすることが可能である、ベクター。
５１．天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質が、少なくとも９ｂｐ長の標的結合部位を認識するＤＮＡ結合ドメインを含む、節５０に記載のベクター。
５２．天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質が、少なくとも１２ｂｐ、１５ｂｐ、１８ｂｐ、２１ｂｐ、または２４ｂｐ長の標的結合部位を認識するＤＮＡ結合ドメインを含む、節５０から５１のいずれか１つに記載のベクター。
５３．ＤＮＡ結合タンパク質が、ヒトＥＧＲ１またはＥＧＲ３によって認識されないヒトゲノム中の標的部位に結合する、節５０から５２のいずれか１つに記載のベクター。
５４．内因性ヒト遺伝子が、ＳＣＮ１ＡまたはＧＲＮである、節５０から５３のいずれか１つに記載のベクター。
５５．ＤＮＡ結合タンパク質が、ＳＣＮ１ＡもしくはＧＲＮのゲノム遺伝子座（例えば、表１に記載されるゲノム遺伝子座）の近傍もしくはその位置の、または内因性ＳＣＮ１ＡもしくはＧＲＮの開始コドンの上流の標的結合部位を認識する、節５０から５４のいずれか１つに記載のベクター。
５６．ＤＮＡ結合タンパク質が、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、または１２個のジンクフィンガーを含む、節５０から５５のいずれか１つに記載のベクター。
５７．ＤＮＡ結合タンパク質が、２倍、３倍または４倍のＤＮＡ結合ドメインまたはＥＧＲ１もしくはＥＧＲ３の１つもしくは複数のジンクフィンガーを含む、節５０から５６のいずれか１つに記載のベクター。
５８．ＤＮＡ結合タンパク質が、（ｉ）配列番号３５〜３８、１０５〜１１１、１１３、１３６、１９５〜２１１、２２４〜２３８、２４０〜２６７、もしくは３３０〜３３６、（ｉｉ）そのバリアント、（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性（または少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性）を有する配列、または（ｉｖ）その５ｂｐ、１０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、もしくは５００ｂｐ内のゲノム領域の配列を含む結合部位を認識する、節５０から５７のいずれか１つに記載のベクター。
５９．ＤＮＡ結合タンパク質が、（ｉ）配列番号２２〜２６、２９〜３２、８４〜９３、１１２、１３１〜１３５、１６５〜１７１、３７１〜３７２、３７６〜４０９、もしくは４１２〜４１６、（ｉｉ）そのバリアントもしくは機能的な断片、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性（または少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有する配列の配列を含む、節５０から５８のいずれか１つに記載のベクター。
６０．ＤＮＡ結合タンパク質が、（ｉ）配列番号６〜９、１３〜１５、４４〜４５、４８〜４９、５４〜５５、５８〜６２、６７〜７７、１０３、１１２、１１４、２６８〜２８２、３０５〜３２５、３３７〜３５０、３６４、２９５〜２９９、もしくは３６５〜３６６、（ｉｉ）そのバリアントもしくは機能的な断片、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性（または少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性）を有する配列の配列を含む、上記節のいずれか１つに記載のベクター。
６１．配列同一性が、ＤＮＡ結合タンパク質中のＤＮＡ結合ドメインの局所的配列同一性およびＥＧＲ１またはＥＧＲ３の局所的配列同一性を指す、節５０から６０のいずれか１つに記載のベクター。
６２．ＤＮＡ結合タンパク質が、ＣＩＴＥＤ２またはＣＩＴＥＤ４に由来する転写エフェクタードメインを含む、節６１に記載のベクター。
６３．配列同一性が、ヒトＥＧＲ１またはＥＧＲ３と比較して、ＤＮＡ結合タンパク質の大域的配列同一性を指す、節５０から６２のいずれか１つに記載のベクター。
６４．ＤＮＡ結合タンパク質が、ＥＧＲ１またはＥＧＲ３に由来する転写エフェクタードメインを含む、節６３に記載のベクター。
６５．エフェクタードメインが、ＤＮＡ結合タンパク質中のＤＮＡ結合ドメインのＣ末端に位置する、節６２または６４に記載のベクター。
６６．エフェクタードメインが、ＤＮＡ結合タンパク質中のＤＮＡ結合ドメインのＮ末端に位置する、節６２または６４に記載のベクター。
６７．ＤＮＡ結合タンパク質が、（ｉ）配列番号２２〜２６、２９〜３２、８４〜９３、１１２、１３１〜１３５、１６５〜１７１、３７１〜３７２、３７６〜４０９、もしくは４１２〜４１６、（ｉｉ）そのバリアントもしくは機能的な断片、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性（または少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性）を有する配列の配列を有するＤＮＡ結合ドメインを含む、節５０から６６のいずれか１つに記載のベクター。
６８．エフェクタードメインが、（ｉ）配列番号９５〜１００もしくは１１４、（ｉｉ）そのバリアントもしくは機能的な断片、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性（または少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性）を有する配列の配列を有する、節５０から６７のいずれか１つに記載のベクター。
６９．ジンクフィンガーが、ジンクフィンガーの認識ヘリックスの−１位、２位、３位または６位において少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、節５０から６８のいずれか１つに記載のベクター。
７０．ＤＮＡ結合タンパク質が、ｅｌｉｓｐｏｔアッセイによって測定される、ヒトＥＧＲ１またはＥＲＧ３に匹敵する免疫原性を有する（例えば、ここで、匹敵とは、天然に存在するヒトタンパク質によって生成される免疫応答の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％内のレベルを指す）、節５０から６９のいずれか１つに記載のベクター。
７１．配列同一性が、ＢＬＡＳＴまたはＣｌｕｓｔａｌＷを使用して測定される、節５０から７０のいずれか１つに記載のベクター。
７２．ベクターが、ウイルスベクターである、節７０から７２のいずれか１つに記載のベクター。
７３．ウイルスベクターがＡＡＶである、節７２に記載のベクター。
７４．ＡＡＶが、ＡＡＶ９である、節７３に記載のベクター。
７５．天然に存在するヒトタンパク質に対して９０％もしくはそれよりも高い配列同一性、または天然に存在するヒトタンパク質の対応するドメイン（例えば、２つのタンパク質間のＤＮＡ結合ドメインまたは転写エフェクタードメイン内）に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の局所的配列同一性、または天然に存在するヒトタンパク質（例えば、ＥＧＲ１またはＥＧＲ３）に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の大域的配列同一性を有する天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸カセットであって、ＤＮＡ結合タンパク質が、ＳＣＮ１Ａの発現をモジュレートすることが可能である、核酸カセット。
７６．天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質が、配列番号３５〜３８、１０５〜１１１、１１３、１３６、１９５〜２１１、２２４〜２３８、２４０〜２６７、もしくは３３０〜３３６のいずれか１つを有する領域、またはその５ｂｐ、１０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、もしくは５００ｂｐ内の領域に選択的に結合する、節７５に記載の核酸カセット。
７７．天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質が、対照と比較して、ＳＣＮ１Ａの発現を少なくとも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、５０、または１００倍だけ増加させることができる、節７５から７６のいずれか１つに記載の核酸カセット。
７８．天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質が、（ｉ）配列番号２２〜２６、２９〜３２、８４〜９３、１１２、１３１〜１３５、１６５〜１７１、３７１〜３７２、３７６〜４０９、もしくは４１２〜４１６、（ｉｉ）そのバリアントもしくは機能的な断片、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性（または少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性）を有する配列の配列を有するＤＮＡ結合ドメインを含む、節７５から７７のいずれか１つに記載の核酸カセット。
７９．カセットが、ウイルスベクターである、節７５から７８のいずれか１つに記載の核酸カセット。
８０．カセットが、ＡＡＶベクター、例えば、ＡＡＶ９である、節７５から７９のいずれか１つに記載の核酸カセット。
８１．天然に存在するヒトタンパク質の対応するドメイン（例えば、２つのタンパク質間のＤＮＡ結合ドメインまたは転写エフェクタードメイン内）に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の局所的配列同一性、または天然に存在するヒトタンパク質（例えば、ＥＧＲ１またはＥＧＲ３）に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の大域的配列同一性を有する天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸カセットであって、ＤＮＡ結合タンパク質が、ＧＲＮの発現をモジュレートすることが可能である、核酸カセット。
８２．天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質が、配列番号３５〜３８、１０５〜１１１、１１３、１３６、１９５〜２１１、２２４〜２３８、２４０〜２６７、もしくは３３０〜３３６を有する領域、またはその５ｂｐ、１０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、もしくは５００ｂｐ内の領域に選択的に結合する、節８１に記載の核酸カセット。
８３．天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質が、対照と比較して、ＧＲＮの発現を少なくとも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、または１００倍だけ増加させることができる、節８１から８２のいずれか１つに記載の核酸カセット。
８４．天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質が、（ｉ）配列番号２２〜２６、２９〜３２、８４〜９３、１１２、１３１〜１３５、１６５〜１７１、３７１〜３７２、３７６〜４０９、もしくは４１２〜４１６、（ｉｉ）そのバリアントもしくは機能的な断片、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性（または少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性）を有する配列の配列を有するＤＮＡ結合ドメインを含む、節８１から８３のいずれか１つに記載の核酸カセット。
８５．ＤＮＡ結合タンパク質が、（ｉ）配列番号６〜９、１３〜１５、４４〜４５、４８〜４９、５４〜５５、５８〜６２、６７〜７７、１０３、１１２、１１４、２６８〜２８２、３０５〜３２５、３３７〜３５０、３６４、２９５〜２９９、３６５〜３６６、（ｉｉ）そのバリアントもしくは機能的な断片、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性（または少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性）を有する配列の配列を含む、節８１から８４のいずれか１つに記載の核酸カセット。
８６．カセットが、ウイルスベクターである、節８１から８５のいずれか１つに記載の核酸カセット。
８７．カセットが、ＡＡＶベクターである、節８１から８６のいずれか１つに記載の核酸カセット。
８８．ＳＣＮ１Ａをモジュレートするタンパク質をコードするベクターであって、タンパク質が、配列番号６〜９、１３、１５、５７、５８、６１〜６２、６７〜７１、７４〜７５、２６８〜２８２、２９５〜２９９、３０５〜３２５、または３６４〜３６６のアミノ酸配列を有する、ベクター。
８９．ＳＣＮ１Ａをモジュレートするタンパク質をコードするベクターであって、タンパク質が、配列番号２２〜２５、２９〜３１、８４〜８５、８８、９０〜９２、１３１〜１３５、３７１〜３７２、３７６、または３９１〜４０９の配列を有するＤＮＡ結合ドメインを含む、ベクター。
９０．タンパク質が、配列番号３５〜３７、１０１、１０５〜１１１、１３６、１９５〜２１１、２２４〜２３８、または２４０〜２６７の配列を含む標的結合配列を認識する、節８８から８９のいずれか１つに記載のベクター。
９１．ＧＲＮをモジュレートするタンパク質をコードするベクターであって、タンパク質が、配列番号１０、１６、５９〜６０、６３〜６４、７２〜７３、７６〜７７、１１２、または３３７〜３５０のアミノ酸配列を有する、ベクター。
９２．ＧＲＮをモジュレートするタンパク質をコードするベクターであって、タンパク質が、配列番号２６、３２、８６〜８９、９３、１６５〜１７１、１１２、または３７７〜３９０の配列を有するＤＮＡ結合ドメインを含む、ベクター。
９３．タンパク質が、配列番号３８、１１３、または３３０〜３３６の配列を含む標的結合配列を認識する、節９１から９２のいずれか１つに記載のベクター。
９４．ＤＮＡ結合ドメインが、ＣＩＴＥＤ２またはＣＩＴＥＤ４のトランス活性化ドメインに融合される、節９１から９３のいずれか１つに記載のベクター。
９５．細胞または対象を、節１から９４のいずれか１つを含む組成物と接触させることを含む、疾患または状態を処置する方法。
９６．対象が、動物、哺乳動物、またはヒトである、節９５に記載の方法。
９７．ＤＮＡ結合ドメインを含む天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸カセットを含む遺伝子治療を投与することを含む、疾患または状態を処置する方法であって、天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質が、内因性遺伝子の発現を、少なくとも５倍だけモジュレートし、天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質が、天然に存在するヒトタンパク質の対応するドメイン（例えば、２つのタンパク質間のＤＮＡ結合ドメインまたは転写エフェクタードメイン内）に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の局所的配列同一性、または天然に存在するヒトタンパク質（例えば、ＥＧＲ１またはＥＧＲ３）に対して、大域的配列同一性を有する、方法。
９８．天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質が、細胞中でまたはｉｎ  ｖｉｖｏで発現した場合に、低減したまたは最小の免疫応答を惹起する、節９７に記載の方法。
９９．天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質が、天然に存在するヒトタンパク質に匹敵する免疫応答を惹起し、匹敵とは、天然に存在するヒトタンパク質（例えば、ＥＧＲ１またはＥＧＲ３）によって生成される免疫応答の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％内のレベルを指す、節９８に記載の方法。
１００．免疫応答が、ｅｌｉｓｐｏｔアッセイを使用して測定される、節９２から９９のいずれか１つに記載の方法。
１０１．疾患または状態が、ドラベ症候群である、節９７から１００のいずれか１つに記載の方法。
１０２．疾患または状態が、前頭側頭認知症または認知症である、節９７から１００のいずれか１つに記載の方法。
１０３．疾患または状態が、ドラベ症候群、パーキンソン病、アルツハイマー病、ＧＡＢＡ作動性機能低下、ニューロン活動亢進、てんかん、および発作からなる群から選択される、節９７から１００のいずれか１つに記載の方法。
１０４．疾患または状態が、神経変性、神経炎症、前頭側頭葉変性症（ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ  ｌｏｂａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、前頭側頭認知症、認知症、パーキンソン病、アルツハイマー病、およびアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される、節９７から１００のいずれか１つに記載の方法。
１０５．ＤＮＡ結合タンパク質が、配列番号６〜９、１３〜１５、４４〜４５、４８〜４９、５４〜５５、５８〜６２、６７〜７７、１０３、１１２、１１４、２６８〜２８２、３０５〜３２５、３３７〜３５０、３６４、２９５〜２９９、３６５〜３６６のアミノ酸配列を有する、節９７から１０４のいずれか１つに記載の方法。
１０６．ＤＮＡ結合タンパク質が、配列番号２２〜２６、２９〜３２、８４〜９３、１１２、１３１〜１３５、１６５〜１７１、３７１〜３７２、３７６〜４０９、または４１２〜４１６のアミノ酸配列を有する、節９７から１０５のいずれか１つに記載の方法。
１０７．ＤＮＡ結合タンパク質が、配列番号２２〜２６、２９〜３２、８４〜９３、１１２、１３１〜１３５、１６５〜１７１、３７１〜３７２、３７６〜４０９、または４１２〜４１６の配列を有するＤＮＡ結合ドメインを含む、上記節のいずれか１つに記載の方法。
１０８．ＤＮＡ結合タンパク質が、配列番号３５〜３８、１０５〜１１１、１１３、１３６、１９５〜２１１、２２４〜２３８、２４０〜２６７、または３３０〜３３６の配列を含む標的結合配列を認識する、節９７から１０７のいずれか１つに記載の方法。
１０９．内因性遺伝子が、ＳＣＮ１ＡまたはＧＲＮである、上記節のいずれか１つに記載の方法。
１１０．遺伝子治療が、ＡＡＶである、上記節のいずれか１つに記載の方法。
１１１．内因性遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、ヒトゲノムにおいて少なくとも２１塩基を有する標的結合部位に集合的に結合し、天然に存在するヒトタンパク質の対応するドメイン（例えば、２つのタンパク質間のＤＮＡ結合ドメインまたは転写エフェクタードメイン内）に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の局所的配列同一性、または天然に存在するヒトタンパク質（例えば、ＥＧＲ１またはＥＧＲ３）に対して大域的配列同一性を有する複数のＤＮＡ結合ドメインを含む天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸カセットを投与することを含む、方法。
１１２．天然に存在するタンパク質が、ヒトＥＧＲ１またはＥＧＲ３である、節１１１に記載の方法。
１１３．ＤＮＡ結合タンパク質が、ＣＩＴＥＤ２またはＣＩＴＥＤ４のドメインを含む、節１１１から１１２のいずれか１つに記載の方法。
１１４．疾患または状態を処置する方法であって、天然に存在するヒトタンパク質の対応するドメイン（例えば、２つのタンパク質間のＤＮＡ結合ドメインまたは転写エフェクタードメイン内）に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の局所的配列同一性、または天然に存在するヒトタンパク質（例えば、ＥＧＲ１またはＥＧＲ３）に対して大域的配列同一性を有し、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２個のジンクフィンガーまたはＤＮＡ結合ドメインを含む、天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質を含むＡＡＶベクターを投与することを含む、方法。
１１５．ヒトタンパク質が、ＥＧＲ１またはＥＧＲ３である、節１１４に記載の方法。
１１６．疾患または状態が、ＣＮＳ疾患または状態である、節１１４から１１５のいずれか１つに記載の方法。
１１７．疾患または状態が、ドラベ症候群である、節１１６に記載の方法。
１１８．疾患または状態が、認知症または前頭側頭認知症である、節１１６に記載の方法。
１１９．配列同一性が、大域的配列同一性に関してＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して測定される、節１１４から１１５のいずれか１つに記載の方法。
１２０．配列同一性が、局所的配列同一性に関してＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して測定される、上記節のいずれか１つに記載の方法。
１２１．ドラベ症候群を処置する方法であって、天然に存在するヒトタンパク質の対応するドメイン（例えば、２つのタンパク質間のＤＮＡ結合ドメインまたは転写エフェクタードメイン内）に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の局所的配列同一性、または天然に存在するヒトタンパク質（例えば、ＥＧＲ１またはＥＧＲ３）に対して大域的配列同一性を有する、天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質をコードするベクターを投与することを含み、ＤＮＡ結合タンパク質が、内因性ＳＣＮ１Ａの発現を、活性化させるまたは増加させることが可能である、方法。
１２２．天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質が、配列番号３５〜３８、１０５〜１１１、１１３、１３６、１９５〜２１１、２２４〜２３８、２４０〜２６７、もしくは３３０〜３３６のいずれか１つを有する領域、またはその５ｂｐ、１０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、もしくは５００ｂｐ内の領域に選択的に結合する、節１２１に記載の方法。
１２３．天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質が、対照と比較して、ＳＣＮ１Ａの発現を少なくとも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、または１００倍だけ増加させることができる、節１２１から１２２のいずれか１つに記載の方法。
１２４．天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質が、（ｉ）配列番号２２〜２６、２９〜３２、８４〜９３、１１２、１３１〜１３５、１６５〜１７１、３７１〜３７２、３７６〜４０９、もしくは４１２〜４１６、（ｉｉ）そのバリアントもしくは機能的な断片、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性（または少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性）を有する配列の配列を有するＤＮＡ結合ドメインを含む、節１２１から１２３のいずれか１つに記載の方法。
１２５．ベクターが、ウイルスベクターである、節１２１から１２４のいずれか１つに記載の方法。
１２６．ベクターがＡＡＶベクターである、節１２５に記載の方法。
１２７．前頭側頭認知症または認知症を処置する方法であって、天然に存在するヒトタンパク質の対応するドメイン（例えば、２つのタンパク質間のＤＮＡ結合ドメインまたは転写エフェクタードメイン内）に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の局所的配列同一性、または天然に存在するヒトタンパク質（例えば、ＥＧＲ１またはＥＧＲ３）に対して大域的配列同一性を有する、天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質をコードするベクターを投与することを含み、ＤＮＡ結合タンパク質が、内因性ＧＲＮまたはそのアイソフォームの発現を、活性化させるまたは増加させることが可能である、方法。
１２８．天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質が、配列番号３８、１１３、もしくは３３０〜３３６を有する領域、またはその５ｂｐ、１０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、もしくは５００ｂｐ内の領域に選択的に結合する、節１２７に記載の方法。
１２９．天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質が、対照と比較して、ＧＲＮの発現を少なくとも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、または１００倍だけ増加させることができる、節１２７から１２８のいずれか１つに記載の方法。
１３０．天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質が、（ｉ）配列番号２６、３２、８６〜８９、９３、１６５〜１７１、１６５〜１７１、もしくは３７７〜３９０、（ｉｉ）そのバリアントもしくは機能的な断片、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性（または少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性）を有する配列の配列を有するＤＮＡ結合ドメインを含む、節１２７から１２９のいずれか１つに記載の方法。
１３１．ＤＮＡ結合タンパク質が、（ｉ）配列番号１０、１６、５９〜６０、６３〜６４、７２〜７３、７６、７７、１１２、もしくは３３７〜３５０、（ｉｉ）そのバリアントもしくは機能的な断片、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性（または少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性）を有する配列の配列を含む、節１２７から１３０のいずれか１つに記載の方法。
１３２．ベクターが、ウイルスベクターである、節１２７から１３１のいずれか１つに記載の方法。
１３３．ベクターがＡＡＶベクターである、節１３３に記載の方法。
【０４１０】
天然に存在しない転写モジュレーターを含む発現カセット、例えば、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を増加させる発現カセット、およびＳＣＮ１Ａ遺伝子と関連する状態の処置にその発現カセットを使用する方法が本明細書に提供される。神経学的なタンパク質、例えば、ＳＣＮ１Ａの発現をモジュレートする天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質も、本明細書に提供される。
【０４１１】
本開示の様々な実施形態が、以下の番号が付けられた節を参照して規定される：
１．ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を増加させる、天然に存在しない転写モジュレーターを含む発現カセット。
２．天然に存在しない転写モジュレーターが、配列番号３５〜３７、１０１、１０５〜１１１、１３６、１９５〜２１１、２２４〜２３８、もしくは２４０〜２６７からなる群から選択されるゲノム領域、またはその少なくとも２００ｂｐ内の領域に結合する、節１に記載の発現カセット。
３．天然に存在しない転写モジュレーターが、配列番号３５〜３７、１０１、１０５〜１１１、１３６、１９５〜２１１、２２４〜２３８、もしくは２４０〜２６７からなる群から選択されるゲノム領域、またはその少なくとも１００ｂｐ内の領域に結合する、節１から２に記載の発現カセット。
４．天然に存在しない転写モジュレーターが、配列番号３５〜３７、１０１、１０５〜１１１、１３６、１９５〜２１１、２２４〜２３８、もしくは２４０〜２６７からなる群から選択されるゲノム領域、またはその少なくとも５０ｂｐ内の領域に結合する、節１から２に記載の発現カセット。
５．天然に存在しない転写モジュレーターが、配列番号３５〜３７、１０１、１０５〜１１１、１３６、１９５〜２１１、２２４〜２３８、もしくは２４０〜２６７からなる群から選択されるゲノム領域、またはその少なくとも１０ｂｐ内の領域に結合する、節１から２に記載の発現カセット。
６．天然に存在しない転写モジュレーターが、配列番号３５〜３７、１０１、１０５〜１１１、１３６、１９５〜２１１、２２４〜２３８、または２４０〜２６７からなる群から選択される配列にマッチする、ｈｇ１９の領域に対応する、ゲノム領域に結合する、節１から２に記載の発現カセット。
７．ウイルスベクターの一部である、上記節のいずれか１つに記載の発現カセット。
８．ウイルスベクターがＡＡＶウイルスである、節６に記載の発現カセット。
９．ＡＡＶウイルスが、ＡＡＶ９ウイルスまたはｓｃＡＡＶ９ウイルスである、節７に記載の発現カセット。
１０．転写モジュレーターが、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含む、上記節のいずれか１つに記載の発現カセット。
１１．転写活性化ドメインが、ＶＰＲ、ＶＰ６４、ＶＰ１６、ＶＰ１２８、およびｐ３００からなるリストから選択される少なくとも１つのタンパク質の一部を含む、上記節のいずれか１つに記載の発現カセット。
１２．転写活性化ドメインが、９５〜１００もしくは１１４、またはそれに対して少なくとも８０％の配列類似性を有するドメインを含む、上記節のいずれか１つに記載の発現カセット。
１３．ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガードメインである、上記節のいずれか１つに記載の発現カセット。
１４．ＤＮＡ結合ドメインが、Ｃａｓタンパク質である、上記節のいずれか１つに記載の発現カセット。
１５．ｇＲＮＡをさらに含む、上記節のいずれか１つに記載の発現カセット。
１６．ｇＲＮＡが、配列番号３５〜３８、１０５〜１１１、１１３、１３６、１９５〜２１１、２２４〜２３８、２４０〜２６７、もしくは３３０〜３３６からなる群から選択される配列、またはそれに対して少なくとも８０％の配列類似性を有する配列を含む、上記節のいずれか１つに記載の発現カセット。
１７．ｇＲＮＡが、配列番号３５〜３８、１０５〜１１１、１１３、１３６、１９５〜２１１、２２４〜２３８、２４０〜２６７、もしくは３３０〜３３６からなる群から選択される配列、またはそれに対して少なくとも９０％の配列類似性を有する、それに対して少なくとも９５％の配列類似性を有する、もしくはそれに対して少なくとも９９％の配列類似性を有する配列を含む、節１６に記載の発現カセット。
１８．Ｃａｓタンパク質が、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓタンパク質である、上記節のいずれか１つに記載の発現カセット。
１９．ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓタンパク質が、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９である、節１８に記載の発現カセット。
２０．ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓタンパク質が、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ３である、節１９に記載の発現カセット。
２１．ＤＮＡ結合ドメインが、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインである、上記節のいずれか１つに記載の発現カセット。
２２．他の細胞型よりもＧＡＢＡ作動性ニューロンにおいてより高いレベルで、天然に存在しない転写モジュレーターの発現を駆動する調節エレメントをさらに含む、上記節のいずれか１つに記載の発現カセット。
２３．１００ｂｐ未満で、天然に存在しない転写モジュレーターの高い発現を駆動する調節エレメントをさらに含む、上記節のいずれか１つに記載の発現カセット。
２４．配列番号１７８〜１７９、１８２〜１８５、もしくは４１７からなる群から選択される少なくとも１つの調節エレメント、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列をさらに含む、上記節のいずれか１つに記載の発現カセット。
２５．天然に存在しない転写モジュレーターが、配列番号６〜９、１３〜１５、４４〜４５、４８〜４９、５４〜５５、５８〜６２、６７〜７７、１０３、１１２、１１４、２６８〜２８２、３０５〜３２５、３３７〜３５０、３６４、２９５〜２９９、３６５〜３６６からなる群から選択される、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、上記節のいずれかに記載の発現カセット。
２６．天然に存在しない転写モジュレーターが、配列番号２２〜２６、２９〜３２、８４〜９３、１１２、１３１〜１３５、１６５〜１７１、３７１〜３７２、３７６〜４０９、または４１２〜４１６からなる群から選択される、上記節のいずれかに記載の発現カセット。
２７．配列番号３５〜３８、１０５〜１１１、１１３、１３６、１９５〜２１１、２２４〜２３８、２４０〜２６７、もしくは３３０〜３３６からなる群から選択される少なくとも１つのゲノム位置、またはそれの２００ｂｐ内、１００ｂｐ内、もしくは５０ｂｐ内のゲノム位置に結合する、天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
２８．配列番号３５〜３８、１０５〜１１１、１１３、１３６、１９５〜２１１、２２４〜２３８、２４０〜２６７、または３３０〜３３６からなる群から選択される少なくとも１つのゲノム位置に結合する、上記節のいずれかに記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
２９．転写モジュレートドメインをさらに含む、上記節のいずれかに記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
３０．転写モジュレートドメインが、転写活性化ドメインである、節２９に記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
３１．転写活性化ドメインが、転写因子の転写活性化ドメインである、節２９から３０に記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
３２．転写活性化ドメインが、ジンクフィンガー転写因子の転写活性化ドメインを含む、上記節に記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
３３．転写活性化ドメインが、ＶＰＲ、ＶＰ６４、ＶＰ１６、およびＶＰ１２８からなるリストから選択される少なくとも１つのタンパク質、またはそれに相同的なタンパク質の一部を含む、上記節のいずれかに記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
３４．転写活性化ドメインが、配列番号９５〜１００もしくは１１４のいずれか１つ、またはそれに対して少なくとも８０％の配列類似性を有するドメインを含む、上記節のいずれかに記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
３５．転写活性化ドメインが、配列番号９５〜１００もしくは１１４のいずれか１つ、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列類似性を有するドメインを含む、上記節のいずれかに記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
３６．転写モジュレートドメインが、転写共活性化タンパク質、または転写共活性化ドメインのドメインを含む、上記節のいずれかに記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
３７．転写共活性化ドメインが、ｐ３００の全てまたは一部を含む、節３６に記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
３８．ＤＮＡ結合タンパク質が、ジンクフィンガードメインを含む、上記節のいずれかに記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
３９．ジンクフィンガードメインが、４個のジンクフィンガーを含む、上記節のいずれかに記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
４０．ジンクフィンガードメインが、５個のジンクフィンガーを含む、上記節のいずれかに記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
４１．ジンクフィンガードメインが、６個のジンクフィンガーを含む、上記節のいずれかに記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
４２．ジンクフィンガードメインが、７個のジンクフィンガーを含む、上記節のいずれかに記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
４３．ジンクフィンガードメインが、８個のジンクフィンガーを含む、上記節のいずれかに記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
４４．ジンクフィンガードメインが、９個のジンクフィンガーを含む、上記節のいずれかに記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
４５．ＤＮＡ結合タンパク質が、Ｃａｓタンパク質を含む、上記節のいずれかに記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
４６．Ｃａｓタンパク質が、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓタンパク質である、節４５に記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
４７．ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓタンパク質が、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９である、節４６に記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
４８．ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓタンパク質が、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ３である、節４６に記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
４９．ＤＮＡ結合タンパク質が、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む、上記節のいずれかに記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
５０．配列番号２２〜２６、２９〜３２、８４〜９３、１１２、１３１〜１３５、１６５〜１７１、３７１〜３７２、３７６〜４０９、もしくは４１２〜４１６からなる群から選択される、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、上記節のいずれかに記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
５１．細胞にトランスフェクトされる場合に、ＳＣＮ１Ａの発現をモジュレートする、上記節のいずれかに記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
５２．配列番号３５〜３７、１０１、１０５〜１１１、１３６、１９５〜２１１、２２４〜２３８、もしくは２４０〜２６７からなる群から選択される少なくとも１つのゲノム位置、またはその２００ｂｐ内、１００ｂｐ内、もしくは２０ｂｐ内のゲノム位置に結合する天然に存在しない転写モジュレーターを投与することによって、細胞におけるＳＣＮ１Ａの発現をモジュレートする方法。
５３．天然に存在しない転写モジュレーターが、配列番号３５〜３７、１０１、１０５〜１１１、１３６、１９５〜２１１、２２４〜２３８、または２４０〜２６７からなる群から選択される少なくとも１つのゲノム位置に結合する、節５２に記載の方法。
５４．天然に存在しない転写モジュレーターが、配列番号３５〜３７、１０１、１０５〜１１１、１３６、１９５〜２１１、２２４〜２３８、または２４０〜２６７からなる群から選択される配列に結合する、節５２から５３に記載の方法。
５５．天然に存在しない転写モジュレーターをコードする発現カセットを投与することによって、細胞におけるＳＣＮ１Ａの発現をモジュレートする方法。
５６．発現カセットが、ウイルスベクターの一部である、節５５に記載の方法。
５７．ウイルスベクターがＡＡＶウイルスである、節５６に記載の方法。
５８．ＡＡＶウイルスが、ＡＡＶ９ウイルスまたはｓｃＡＡＶ９ウイルスである、節５７に記載の方法。
５９．細胞がパルブアルブミン（ＰＶ）細胞である、上記節のいずれかに記載の方法。
６０．細胞が生物体中にある、上記節のいずれかに記載の方法。
６１．生物体が哺乳動物である、節６０に記載の方法。
６２．生物体がヒトである、節６０に記載の方法。
６３．ＳＣＮ１Ａの発現をモジュレートすることが、疾患または障害を処置する、節６０に記載の方法。
６４．障害が中枢神経系障害である、節６０に記載の方法。
６５．障害がパーキンソン病である、節６０に記載の方法。
６６．障害がドラベ症候群である、節６０に記載の方法。
６７．障害がアルツハイマー病である、節６０に記載の方法。
６８．中枢神経系障害の症状がＧＡＢＡ作動性機能低下である、節６０に記載の方法。
６９．中枢神経系障害を処置することが、ＰＶ細胞機能を増加させることを含む、上記節のいずれかに記載の方法。
７０．中枢神経系障害の症状がニューロン活動亢進である、上記節のいずれかに記載の方法。
７１．中枢神経系障害を処置することが、ニューロン活動亢進を低減することを含む、上記節のいずれかに記載の方法。
７２．中枢神経系障害の症状が発作である、上記節のいずれかに記載の方法。
７３．中枢神経系障害を処置することが、発作の頻度を低減することを含む、上記節のいずれかに記載の方法。
７４．中枢神経系障害を処置することが、発作の重症度を低減することを含む、上記節のいずれかに記載の方法。
７５．転写モジュレーターが、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含む、上記節のいずれかに記載の方法。
７６．転写活性化ドメインが、転写因子の転写活性化ドメインを含む、上記節のいずれかに記載の方法。
７７．転写活性化ドメインが、ジンクフィンガー転写因子の転写活性化ドメインを含む、上記節のいずれかに記載の方法。
７８．転写活性化ドメインが、ＶＰＲ、ＶＰ６４、ＶＰ１６、およびＶＰ１２８からなるリストから選択される少なくとも１つのタンパク質の一部を含む、上記節のいずれかに記載の方法。
７９．転写活性化ドメインが、９５〜１００もしくは１１４、またはそれに対して少なくとも８０％の配列類似性を有するドメインを含む、上記節のいずれかに記載の方法。
８０．転写活性化ドメインが、転写共活性化タンパク質、または転写共活性化ドメインのドメインを含む、上記節のいずれかに記載の方法。
８１．転写活性化ドメインが、ｐ３００を含む、上記節のいずれかに記載の方法。
８２．ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガードメインである、上記節のいずれかに記載の方法。
８３．ＤＮＡ結合ドメインが、Ｃａｓタンパク質である、上記節のいずれかに記載の方法。
８４．発現カセットが、ｇＲＮＡをさらに含む、上記節のいずれかに記載の方法。
８５．ｇＲＮＡが、配列番号１０５〜１１１もしくは１１３からなる群から選択される配列、またはそれに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、上記節のいずれかに記載の方法。
８６．Ｃａｓタンパク質が、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓタンパク質である、上記節のいずれかに記載の方法。
８７．ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓタンパク質が、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９である、上記節のいずれかに記載の方法。
８８．ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓタンパク質が、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ３である、上記節のいずれかに記載の方法。
８９．ＤＮＡ結合ドメインが、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインである、上記節のいずれかに記載の方法。
９０．発現カセットが、パルブアルブミン細胞に特異的な調節エレメントをさらに含む、上記節のいずれかに記載の方法。
９１．発現カセットが、１００ｂｐ未満で、高い発現を駆動する調節エレメントをさらに含む、上記節のいずれかに記載の方法。
９２．発現カセットが、配列番号１７８〜１７９、１８２〜１８５、もしくは４１７からなる群から選択される少なくとも１つの調節エレメント、またはそれに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列をさらに含む、上記節のいずれかに記載の方法。
９３．ＳＣＮ１Ａの発現をモジュレートすることが、ＳＣＮ１Ａ遺伝子またはＮａｖ１．１タンパク質の発現を増加させることを含む、上記節のいずれかに記載の方法。
９４．ＳＣＮ１Ａ遺伝子またはＮａｖ１．１タンパク質の発現における増加が、パルブアルブミン細胞に特異的に生じる、上記節のいずれかに記載の方法。
９５．ＳＣＮ１Ａ遺伝子またはＮａｖ１．１タンパク質の発現における増加が、パルブアルブミンニューロンに特異的に生じる、上記節のいずれかに記載の方法。
９６．天然に存在しない転写モジュレーターが、配列番号９５〜１００もしくは１１４からなる群から選択される、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、上記節のいずれか１つに記載の方法。
【０４１２】
プログラニュリン（ＧＲＮ）またはその機能的な断片もしくはバリアントの発現を増加させる、天然に存在しない転写モジュレーターを含む発現カセット、およびＧＲＮ遺伝子と関連する状態または疾患の処置にそのような組成物を使用する方法が、本明細書に提供される。細胞におけるＧＲＮの発現をモジュレートする天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質も、本明細書に提供される。
【０４１３】
本開示の様々な実施形態が、以下の番号が付けられた節を参照して規定される：
１．ＧＲＮ遺伝子の発現を増加させる、天然に存在しない転写モジュレーターを含む発現カセット。
２．天然に存在しない転写モジュレーターが、配列番号３８、１１３、もしくは３３０〜３３６からなる群から選択されるゲノム領域、またはその少なくとも２００ｂｐ内、少なくとも１００ｂｐ内、少なくとも５０ｂｐ内、もしくは少なくとも１０ｂｐ内の領域に結合する、節１に記載の発現カセット。
３．天然に存在しない転写モジュレーターが、配列番号３８、１１３、または３３０〜３３６からなる群から選択される配列にマッチする、ｈｇ１９の領域に対応する、ゲノム領域に結合する、上記節のいずれかに記載の発現カセット。
４．ウイルスベクターの一部である、上記節のいずれかに記載の発現カセット。
５．ウイルスベクターがＡＡＶウイルスである、節４に記載の発現カセット。
６．ＡＡＶウイルスが、ＡＡＶ９ウイルスまたはｓｃＡＡＶ９ウイルスである、節５に記載の発現カセット。
７．転写モジュレーターが、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含む、上記節のいずれかに記載の発現カセット。
８．転写活性化ドメインが、ＶＰＲ、ＶＰ６４、ＶＰ１６、ＶＰ１２８、ｐ６５、およびｐ３００からなるリストから選択される少なくとも１つのタンパク質の一部を含む、上記節のいずれかに記載の発現カセット。
９．転写活性化ドメインが、配列番号９５〜１００もしくは１１４、またはそれに対して少なくとも８０％の配列類似性を有するドメインを含む、上記節のいずれかに記載の発現カセット。
１０．ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガードメインである、上記節のいずれかに記載の発現カセット。
１１．ＤＮＡ結合ドメインが、Ｃａｓタンパク質である、上記節のいずれかに記載の発現カセット。
１２．ｇＲＮＡをさらに含む、上記節のいずれかに記載の発現カセット。
１３．ｇＲＮＡが、配列番号１１３からなる群から選択される配列、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列類似性を有する配列を含む、上記節のいずれかに記載の発現カセット。
１４．Ｃａｓタンパク質が、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓタンパク質（ｄＣａｓ）である、上記節のいずれかに記載の発現カセット。
１５．ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓタンパク質が、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）またはｄＳａＣａｓ９である、上記節のいずれかに記載の発現カセット。
１６．ＤＮＡ結合ドメインが、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインである、上記節のいずれかに記載の発現カセット。
１７．他の細胞型よりも中枢神経系細胞、前頭皮質細胞、グリア細胞、ミクログリア細胞、および線条体細胞からなる群から選択される細胞においてより高いレベルで、天然に存在しない転写モジュレーターの発現を駆動する調節エレメントをさらに含む、上記節のいずれかに記載の発現カセット。
１８．１００ｂｐ未満または５０ｂｐ未満で、天然に存在しない転写モジュレーターの高い発現を駆動する調節エレメントをさらに含む、上記節のいずれかに記載の発現カセット。
１９．配列番号１７８〜１７９、１８２〜１８５、もしくは４１７に従う配列、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列をさらに含む、上記節のいずれかに記載の発現カセット。
２０．天然に存在しない転写モジュレーターが、配列番号１０、１６、５９〜６０、６３〜６４、７２〜７３、７６〜７７、１１２、もしくは３３７〜３３５からなる群から選択される、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、上記節のいずれかに記載の発現カセット。
２１．配列番号３８、１１３、もしくは３３０〜３３６からなる群から選択される少なくとも１つのゲノム位置、またはそれの２００ｂｐ内、１００ｂｐ内、もしくは５０ｂｐ内、もしくは１０ｂｐ内のゲノム位置に結合する、天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
２２．配列番号３８、１１３、または３３０〜３３６からなる群から選択される少なくとも１つのゲノム位置に結合する、上記節のいずれかに記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
２３．転写モジュレートドメインをさらに含む、上記節のいずれかに記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
２４．転写モジュレートドメインが、転写活性化ドメインである、上記節のいずれかに記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
２５．転写活性化ドメインが、転写因子の転写活性化ドメインである、上記節のいずれかに記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
２６．転写活性化ドメインが、ジンクフィンガー転写因子の転写活性化ドメインを含む、上記節のいずれかに記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
２７．転写活性化ドメインが、ＶＰＲ、ＶＰ６４、ＶＰ１６、およびＶＰ１２８からなるリストから選択される少なくとも１つのタンパク質、またはそれに相同的なタンパク質の一部を含む、上記節のいずれかに記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
２８．転写活性化ドメインが、配列番号９５〜１００もしくは１１４、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列類似性を有するドメインを含む、上記節のいずれかに記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
２９．転写モジュレートドメインが、転写共活性化タンパク質、または転写共活性化ドメインのドメインを含む、上記節のいずれかに記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
３０．転写共活性化ドメインが、ｐ３００の全てまたは一部を含む、節２９に記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
３１．ＤＮＡ結合タンパク質が、ジンクフィンガードメインを含む、上記節のいずれかに記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
３２．ジンクフィンガードメインが、４個のジンクフィンガーを含む、上記節のいずれかに記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
３３．ジンクフィンガードメインが、５個のジンクフィンガーを含む、上記節のいずれかに記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
３４．ジンクフィンガードメインが、６個のジンクフィンガーを含む、上記節のいずれかに記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
３５．ジンクフィンガードメインが、７個のジンクフィンガーを含む、上記節のいずれかに記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
３６．ジンクフィンガードメインが、８個のジンクフィンガーを含む、上記節のいずれかに記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
３７．ジンクフィンガードメインが、９個のジンクフィンガーを含む、上記節のいずれかに記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
３８．ＤＮＡ結合タンパク質が、Ｃａｓタンパク質を含む、上記節のいずれかに記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
３９．Ｃａｓタンパク質が、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓタンパク質である、上記節のいずれかに記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
４０．ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓタンパク質が、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９である、上記節のいずれかに記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
４１．ＤＮＡ結合タンパク質が、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む、上記節のいずれかに記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
４２．配列番号２６、３２、８６〜８９、９３、１６５〜１７１、１１２、もしくは３７７〜３９０を含む群から選択される、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、上記節のいずれかに記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
４３．細胞にトランスフェクトされる場合に、ＧＲＮの発現をモジュレートする、上記節のいずれかに記載の天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質。
４４．配列番号３８、１１３、もしくは３３０〜３３６からなる群から選択される少なくとも１つのゲノム位置、またはその２００ｂｐ内、１００ｂｐ内、もしくは２０ｂｐ内のゲノム位置に結合する天然に存在しない転写モジュレーターを投与することによって、細胞におけるＧＲＮの発現をモジュレートする方法。
４５．天然に存在しない転写モジュレーターが、配列番号３８、１１３、または３３０〜３３６からなる配列に結合する、節４４に記載の方法。
４６．天然に存在しない転写モジュレーターをコードする発現カセットを投与することによって、細胞におけるＧＲＮの発現をモジュレートする方法。
４７．発現カセットが、ウイルスベクターの一部である、節４６に記載の方法。
４８．ウイルスベクターがＡＡＶウイルスである、節４７に記載の方法。
４９．ＡＡＶウイルスが、ＡＡＶ９ウイルスまたはｓｃＡＡＶ９ウイルスである、節４８に記載の方法。
５０．細胞が、中枢神経系細胞、前頭皮質細胞、グリア細胞、ミクログリア細胞、および線条体細胞からなる群から選択される、上記節のいずれかに記載の方法。
５１．細胞が生物体中にある、上記節のいずれかに記載の方法。
５２．生物体が哺乳動物である、節５１に記載の方法。
５３．生物体がヒトである、節５２に記載の方法。
５４．ＧＲＮの発現をモジュレートすることが、疾患または障害を処置する、上記節のいずれかに記載の方法。
５５．障害が中枢神経系障害である、上記節のいずれかに記載の方法。
５６．障害が前頭側頭変性症（ＦＴＤ）である、上記節のいずれかに記載の方法。
５７．障害がパーキンソン病である、上記節のいずれかに記載の方法。
５８．障害がアルツハイマー病である、上記節のいずれかに記載の方法。
５９．障害がアテローム性動脈硬化症である、上記節のいずれかに記載の方法。
６０．中枢神経系障害の症状がレビー小体の存在である、上記節のいずれかに記載の方法。
６１．中枢神経系障害の症状がプログラニュリン（ＧＲＮ）のハプロ不全である、上記節のいずれかに記載の方法。
６２．中枢神経系障害の症状が社会性の欠如である、上記節のいずれかに記載の方法。
６３．中枢神経系障害の症状がリソソーム異常である、上記節のいずれかに記載の方法。
６４．中枢神経系障害の症状が記憶喪失である、上記節のいずれかに記載の方法。
６５．中枢神経系障害の症状が運動協調性の喪失（ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｍｏｔｏｒ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ）である、上記節のいずれかに記載の方法。
６６．中枢神経系障害の症状が筋振戦である、上記節のいずれかに記載の方法。
６７．中枢神経系障害を処置することが、筋振戦の頻度を低減することを含む、上記節のいずれかに記載の方法。
６８．中枢神経系障害を処置することが、筋振戦の重症度を低減することを含む、上記節のいずれかに記載の方法。
６９．転写モジュレーターが、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含む、上記節のいずれかに記載の方法。
７０．転写活性化ドメインが、転写因子の転写活性化ドメインを含む、上記節のいずれかに記載の方法。
７１．転写活性化ドメインが、ジンクフィンガー転写因子の転写活性化ドメインを含む、上記節のいずれかに記載の方法。
７２．転写活性化ドメインが、ＶＰＲ、ＶＰ６４、ＶＰ１６、およびＶＰ１２８からなるリストから選択される少なくとも１つのタンパク質の一部を含む、上記節のいずれかに記載の方法。
７３．転写活性化ドメインが、配列番号９５〜１００もしくは１１４、またはそれに対して少なくとも８０％の配列類似性を有するドメインを含む、上記節のいずれかに記載の方法。
７４．転写活性化ドメインが、転写共活性化タンパク質、または転写共活性化ドメインのドメインを含む、上記節のいずれかに記載の方法。
７５．転写活性化ドメインが、ｐ３００を含む、上記節のいずれかに記載の方法。
７６．ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガードメインである、上記節のいずれかに記載の方法。
７７．ＤＮＡ結合ドメインが、Ｃａｓタンパク質である、上記節のいずれかに記載の方法。
７８．発現カセットが、ｇＲＮＡをさらに含む、上記節のいずれかに記載の方法。
７９．ｇＲＮＡが、配列番号１１３からなる群から選択される配列、またはそれに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、上記節のいずれかに記載の方法。
８０．Ｃａｓタンパク質が、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓタンパク質である、上記節のいずれかに記載の方法。
８１．ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓタンパク質が、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９である、上記節のいずれかに記載の方法。
８２．ＤＮＡ結合ドメインが、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインである、上記節のいずれかに記載の方法。
８３．発現カセットが、非細胞特異的調節エレメントをさらに含む、上記節のいずれかに記載の方法。
８４．発現カセットが、１００ｂｐ未満で、高い発現を駆動する調節エレメントをさらに含む、上記節のいずれかに記載の方法。
８５．発現カセットが、配列番号１７８〜１７９、１８２〜１８５、もしくは４１７に従う配列、またはそれに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む調節エレメントをさらに含む、上記節のいずれかに記載の方法。
８６．ＧＲＮの発現をモジュレートすることが、ＧＲＮ遺伝子またはプログラニュリンタンパク質の発現を増加させることを含む、上記節のいずれかに記載の方法。
８７．ＧＲＮ遺伝子またはプログラニュリンタンパク質の発現における増加が、複数の細胞型に生じる、上記節のいずれかに記載の方法。
８８．ＧＲＮ遺伝子またはプログラニュリンタンパク質の発現における増加が、他の細胞型よりも中枢神経系細胞、前頭皮質細胞、グリア細胞、ミクログリア細胞、および線条体細胞からなる群から選択される細胞において特異的に生じる、上記節のいずれかに記載の方法。
８９．天然に存在しない転写モジュレーターが、配列番号１０、１６、５９〜６０、７２〜７２、７６〜７７、１１２、もしくは３３７〜３５０からなる群から選択される、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、上記節のいずれかに記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３２】
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【図３３−１】
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【図３３−２】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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