(57)【要約】  本発明は式（Ｉ）の化合物のＡ結晶形及びＢ結晶形、並びにＨＢＶ関連疾患を治療する医薬の製造におけるその使用を開示する。【化１】2021529824.tif 000020
2021529824.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
粉末Ｘ線回折ＸＲＰＤスペクトルが以下の２θ角：５．５６±０．２°、１５．５６±０．２°及び１６．１７±０．２°において特徴的な回折ピークを有する、式（Ｉ）の化合物のＡ結晶形。
【化１】
2021529824.tif 000018
【請求項２】
粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：５．５６±０．２°、１０．８４±０．２°、１５．５６±０．２°、１６．１７±０．２°、２２．１４±０．２°、２２．７０±０．２°、２７．７６±０．２°及び２８．４４±０．２°において特徴的な回折ピークを有する、請求項１に記載のＡ結晶形。
【請求項３】
ＸＲＰＤスペクトルが図１に示された通りである、請求項２に記載のＡ結晶形。
【請求項４】
示差走査熱量曲線ＤＳＣが２２９．９５℃において吸熱ピークの開始点を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＡ結晶形。
【請求項５】
ＤＳＣスペクトルは図２に示された通りである、請求項４に記載のＡ結晶形。
【請求項６】
熱重量分析曲線ＴＧＡが６２±３℃の際に重量が０．３３８２％減少し；２３０±３℃の際に重量が０．８７５３減少する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＡ結晶形。
【請求項７】
ＴＧＡスペクトルは図３に示す通りである、請求項６に記載のＡ結晶形。
【請求項８】
粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：１２．７０±０．２°、１５．６４±０．２°及び２３．０３±０．２°において特徴的な回折ピークを有する、式（Ｉ）の化合物のＢ結晶形。
【化２】
2021529824.tif 000019
【請求項９】
粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：９．５６±０．２°、１２．７０±０．２°、１４．４１±０．２°、１５．６４±０．２°、１９．７０±０．２°、２３．０３±０．２°、２３．９８±０．２°及び２７．６５±０．２°において特徴的な回折ピークを有する、請求項８に記載のＢ結晶形。
【請求項１０】
ＸＲＰＤスペクトルが図４に示された通りである、請求項９に記載のＢ結晶形。
【請求項１１】
示差走査熱量曲線が２３３．５９℃において吸熱ピークの開始点を有する、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のＢ結晶形。
【請求項１２】
ＤＳＣスペクトルは図５に示された通りである、請求項１１に記載のＢ結晶形。
【請求項１３】
熱重量分析曲線はが１２０±３℃の際に重量が０．０４８９０％減少する、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のＢ結晶形。
【請求項１４】
ＴＧＡスペクトルが図６に示された通りである、請求項１３に記載のＢ結晶形。
【請求項１５】
ＨＢＶ関連疾患を治療するための医薬の製造における、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＡ結晶形又は請求項８〜１４のいずれか１項に記載のＢ結晶形の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は出願日が２０１８年８月２３日である中国特許出願ＣＮ２０１８１０９６９００６８の優先権を主張する。本出願は当該中国特許出願の全文を引用する。
【０００２】
本発明は式（Ｉ）の化合物のＡ結晶形及びＢ結晶形、並びにＨＢＶ関連疾患を治療する医薬の製造におけるその使用を開示する。
【背景技術】
【０００３】
Ｂ型肝炎は、Ｂ型肝炎ウイルスの侵入によって引き起こされる炎症反応であり、肝痛、肝脾腫大、肝線維症などの一連の問題を引き起こす可能性があり、厳重な場合、肝硬変、乃至は肝がんを引き起こすこともある。統計によると、世界には約３．５〜４億のＢ型肝炎ウイルスキャリアがあり、その３分の１のキャリアが中国にあり、中国では毎年、Ｂ型肝炎による死亡者数が５０万人を超えている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
今の段階で、全世界の範囲内でＢ型肝炎を治療する特効薬はまだなく、中国のＢ型肝炎治療の第一選択薬は主にヌクレオシド薬、インターフェロン及び漢方薬があるが、コストが高く、再発し易いなどの問題があるため、新しいタイプの抗Ｂ型肝炎薬を開発することは不可欠である。
【０００５】
国際公開第２００８１５４８１７Ａ１号はＧＬＳ４を開示し、その構造は以下の通りである。
【化１】
2021529824.tif 000003
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の開示）
本発明は粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：５．５６±０．２°、１５．５６±０．２°及び１６．１７±０．２°において特徴的な回折ピークを有する、式（Ｉ）の化合物のＡ結晶形を提供する。
【化２】
2021529824.tif 000004
【０００７】
本発明の幾つかの実施の態様において、前記Ａ結晶形の粉末Ｘ線回折スペクトルは以下の２θ角：５．５６±０．２°、１０．８４±０．２°、１５．５６±０．２°、１６．１７±０．２°、２２．１４±０．２°、２２．７０±０．２°、２７．７６±０．２°及び２８．４４±０．２°において特徴的な回折ピークを有する。
【０００８】
本発明の幾つかの実施の態様において、前記Ａ結晶形のＸＲＰＤスペクトルは図１に示された通りである。
【０００９】
本発明の幾つかの実施の態様において、前記Ａ結晶形のＸＲＰＤスペクトル解析データは表１に示された通りである。
【００１０】
【表１】
2021529824.tif 000005
【００１１】
本発明の幾つかの実施の態様において、前記Ａ結晶形の示差走査熱量曲線は２２９．９５℃において吸熱ピークの開始点を有する。
【００１２】
本発明の幾つかの実施の態様において、前記Ａ結晶形のＤＳＣスペクトルは図２に示された通りである。
【００１３】
本発明の幾つかの実施の態様において、前記Ａ結晶形の熱重量分析曲線は６２±３℃の際に重量が０．３３８２％減少し；２３０±３℃の際に重量が０．８７５３減少する。
【００１４】
本発明の幾つかの実施の態様において、前記Ａ結晶形のＴＧＡスペクトルは図３に示された通りである。
【００１５】
本発明は更に、粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：１２．７０±０．２°、１５．６４±０．２°及び２３．０３±０．２°において特徴的な回折ピークを有する、式（Ｉ）の化合物のＢ結晶形を提供する。
【００１６】
本発明の幾つかの実施の態様において、前記Ｂ結晶形の粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：９．５６±０．２°、１２．７０±０．２°、１４．４１±０．２°、１５．６４±０．２°、１９．７０±０．２°、２３．０３±０．２°、２３．９８±０．２°及び２７．６５±０．２°において特徴的な回折ピークを有する。
【００１７】
本発明の幾つかの実施の態様において、前記Ｂ結晶形のＸＲＰＤスペクトルは図４に示された通りである。
【００１８】
本発明の幾つかの実施の態様において、前記Ｂ結晶形のＸＲＰＤスペクトル解析データは表２に示された通りである。
【００１９】
【表２】
2021529824.tif 000006
【００２０】
本発明の幾つかの実施の態様において、前記Ｂ結晶形の示差走査熱量曲線は２３３．５９℃において吸熱ピークの開始点を有する。
【００２１】
本発明の幾つかの実施の態様において、前記Ｂ結晶形のＤＳＣスペクトルは図５に示す通りである。
【００２２】
本発明の幾つかの実施の態様において、前記Ｂ結晶形の熱重量分析曲線は１２０±３℃の際に重量が０．０４８９０％減少する。
【００２３】
本発明の幾つかの実施の態様において、前記Ｂ結晶形のＴＧＡスペクトルは図６に示された通りである。
【００２４】
本発明は更に、ＨＢＶ関連疾患を治療するための医薬の製造における、前記Ａ結晶形及びＢ結晶形の使用を提供する。
【００２５】
［技術効果］
本発明の式（Ｉ）の化合物のＡ結晶形およびＢ結晶形は、安定であり、熱および湿度による影響が少なく、良好な生体内投与効果を有し、医薬に調製するための見通しがある。
【００２６】
［定義と説明］
特に説明しない限り、本明細書に用いられる以下の用語と句は下記の意味を含む。一つの特定の句又は用語は、特に定義されていない場合、不確定か不明であると考えられるものではなく、一般的な意味で理解すべきである。本明細書に商品名が現れる場合、その対応する商品又はその活性成分を表すことが意図される。
【００２７】
本発明の中間体化合物は、以下に挙げられる具体的な実施の態様、他の化学合成法と組み合わせた実施の態様、及び当業者に周知である等価の置き換え方式を含む、当業者に周知である複数の合成方法により調製することができ、好ましい実施の態様は、本発明の実施例が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２８】
本発明の具体的な実施の態様の化学反応は適当な溶剤において完成されるものであり、前記溶剤は本発明の化学変化及びその必要な試薬及び材料に適しなければならない。本発明の化合物を得るために、当業者は従来の実施の態様に基づき合成ステップ又は反応フローを変形又は選択する必要があることがある。
【００２９】
以下に実施の形態により本発明を詳しく説明するが、これらの実施の形態は本発明を何らか制限するものではない。
【００３０】
本発明に用いられる全ての溶剤は市販されるものであり、さらに精製することなく使用できる。
【００３１】
本発明に用いられる全ての溶剤は市販で入手できる。本発明は下記の略語を用いる：ＥｔＯＨはエタノールを表し；ＭｅＯＨはメタノールを表し；ＴＦＡはトリフルオロ酢酸を表し；ＴｓＯＨはｐ−トルエンスルホン酸を表し；ｍｐは融点を表し；ＥｔＳＯ３Ｈはエタンスルホン酸を表し；ＭｅＳＯ３Ｈはメタンスルホン酸を表し；ＴＨＦはテトラヒドロフランを表し；ＥｔＯＡｃは酢酸エチルを表し；ＴＨＦはテトラヒドロフランを表し；ＥＡは酢酸エチルを表し；ＤＭＡＰは４−ジメチルアミノピリジンを表し；ＤＣＭはジクロロメタンを表し；ＤＩＰＥＡはＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを表す。
【００３２】
粉末Ｘ線回折計（ＸＲＰＤ）
約１０〜２０ｍｇの試料をＸＲＰＤの検出に用いる。
【００３３】
詳細なＸＲＰＤパラメータは下記の通りである。
Ｘ線管：Ｃｕ，ｋα，（λ＝１．５４０５６Å）
管電圧：４０ｋＶ、管電流：４０ｍＡ
発散スリット：０．６０ｍｍ
センサスリット：１０．５０ｍｍ
散乱防止スリット：７．１０ｍｍ
走査範囲：３〜４０ｄｅｇ又は４〜４０ｄｅｇ
ステップ角：０．０２ｄｅｇ
ステップ幅：０．１２秒
試料パン回転速度：１５ｒｐｍ
示差走査熱量計（ＤＳＣ）
【００３４】
サンプル（０．５〜１ｍｇ）をＤＳＣアルミニウム製坩堝に量り取って測定を行い、方法は５０ｍＬ／ｍｉｎ  Ｎ２の条件下で、１０℃／ｍｉｎの昇温速度で、サンプルを３０℃から３００℃まで加熱する。
【００３５】
熱重量分析計（ＴＧＡ）
サンプル（２〜５ｍｇ）をＴＧＡ白金坩堝に量り取って測定を行い、２５ｍＬ／ｍｉｎ、Ｎ２の条件下で、１０℃／ｍｉｎの昇温速度で、サンプルを室温から３００℃まで、又は重量が２０％減少するまで加熱する。
【００３６】
動的水蒸気吸着分析（ＤＶＳ）
測定条件：約１０〜１５ｍｇの試料をＤＶＳサンプルパンに取って検出する。
【００３７】
詳細なＤＶＳパラメータは以下の通りである。
温度：２５℃
平衡：ｄｍ／ｄｔ＝０．０１％／分（最短：１０分、最長：１８０分）
乾燥：０％ＲＨ下で１２０分乾燥
ＲＨ（％）測定の勾配：１０％
ＲＨ（％）測定の勾配範囲：０％〜９０％〜０％
【００３８】
2021529824.tif 000007
【００３９】
＊２５℃／８０％ＲＨにおける吸湿性重量増加。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】式（Ｉ）の化合物のＡ結晶形のＣｕ−Ｋα線のＸＲＰＤスペクトルである。
【図２】式（Ｉ）の化合物のＡ結晶形のＤＳＣスペクトルである。
【図３】式（Ｉ）の化合物のＡ結晶形のＴＧＡスペクトルである。
【図４】式（Ｉ）の化合物のＢ結晶形のＣｕ−Ｋα線のＸＲＰＤスペクトルである。
【図５】式（Ｉ）の化合物のＢ結晶形のＤＳＣスペクトルである。
【図６】式（Ｉ）の化合物のＢ結晶形のＴＧＡスペクトルである。
【図７】血漿中のＢ型肝炎ウイルスのＤＮＡレベルであり；破線１はブランク対照を表し、１０％のｓｏｌｕｔｏｌ水溶液を１日１回（ＱＤ）で経口投与（ＰＯ）する方法で投与することを表し；破線２は、１５ｍｇ／ｋｇの用量のＷＸ−３２５を１日２回（ＢＩＤ）、毎回８時間間隔で経口投与（ＰＯ）する方法で投与することを表し；破線３は、５０ｍｇ／ｋｇの用量のＷＸ−３２５を１日２回（ＢＩＤ）、毎回８時間間隔で経口投与（ＰＯ）する方法で投与することを表し；破線５は、１５０ｍｇ／ｋｇの用量のＷＸ−３２５を１日２回（ＢＩＤ）、毎回８時間間隔で経口投与（ＰＯ）する方法で投与することを表し；破線６は、１５ｍｇ／ｋｇの用量の陽性化合物であるテノホビル（ＴＤＦ）を１日２回（ＢＩＤ）、毎回８時間間隔で経口投与（ＰＯ）する方法で投与することを表し；ＬＬＯＱは検出下限を表し、注：図７のＷＸ−３２５は本発明の式（Ｉ）の化合物を表す。
【図８】２８日目の肝臓におけるＢ型肝炎ウイルスのＤＮＡレベルであり；注：ＱＤは１日１回の投与を表し；ＢＩＤは１日２回の投与を表し；ＭＰＫはｍｇ／ｋｇを表し；Ｖｅｈｉｃｌｅはブランク対照群を表し；注：図８のＷＸ−３２５は本発明の式（Ｉ）の化合物を表す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明の内容がよりよく分かるように、以下に具体的な実施の形態を参照しながらさらに説明するが、具体的な実施の態様は本発明の内容を制限するものではない。
【００４２】
実施例１  式（Ｉ）の化合物の調製
【００４３】
【化３】
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【００４４】
合成スキーム：
【化４】
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【００４５】
工程１：化合物１−Ａの合成
無水ジクロロメタン（５Ｌ）を１０Ｌの乾燥した三ツ口フラスコに添加し、攪拌を開始させ、順次に化合物１−ＳＭＡ（５００．００ｇ）とニトロメタンを三ツ口フラスコに添加し、系をドライアイスエタノールバスに置き、−１０℃まで冷却させた。温度を−１０℃〜０℃に制御し、反応フラスコに三塩化アルミニウム（１．１５ｋｇ）をゆっくりと添加し、温度を−０℃未満に制御し、α，α−ジクロロジメチルメチルエーテル（４９５．００ｇ）をゆっくりと反応ケトルに添加し、ゆっくりと室温に昇温させ、１８時間攪拌した。ＴＬＣ（ＰＥ：ＥＡ３：１）で原料ポイントが消失し、極性の高い新しいポイントが生成したことをモニタリングした。反応溶液を吸引し、ゆっくりと１０％の硫酸水素カリウム溶液（３Ｌ）に滴下し、２０分間攪拌し、砕いた氷を入れて過熱を防止した。混合溶液を２５Ｌの分離漏斗に移し、静置して分層し、分層してジクロロメタン層を得、水相をジクロロメタン（２Ｌ×２）で抽出した。有機相を１０％の硫酸水素カリウム溶液（５Ｌ×２）で洗浄し、有機相を分離し、無水硫酸ナトリウム（１ｋｇ）で乾燥させた。有機相を減圧濃縮して、暗緑色の固体化合物１−Ａを得た。
【００４６】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、重水素化クロロホルム）δ＝９．９７（ｂｒｓ、１Ｈ）、９．８７〜９．８２（ｍ、１Ｈ）、７．５８（ｄｄ、Ｊ＝１．５、３．３Ｈｚ、１Ｈ）、７．３６〜７．２９（ｍ、１Ｈ）、４．３７（ｑ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、２Ｈ）、１．３８（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、３Ｈ）。
【００４７】
工程２：化合物１−Ｂの合成
化合物１−Ａ（２ｋｇ、１１．９６ｍｏｌ）のＴＨＦ（２０Ｌ）溶液にｐ−トルエンスルホニルヒドラジド（２．２３ｋｇ、１１．９６ｍｏｌ）を添加した。２０℃下で約１時間攪拌した。ＴＬＣは原料が消失したことを表し、反応系を６０℃に昇温させ、次にバッチにシアノ水素化ホウ素ナトリウム（９０２ｇ，１４．３６ｍｏｌ）を添加し、添加完了後、反応系を７０℃に昇温させ、３時間攪拌した。加熱を停止し、室温に冷却させた後、５Ｌの水を添加して反応をクエンチングさせ、減圧して大部分のＴＨＦを除去し、残留物を大量のＥＡ（１．５Ｌ×３）で抽出した。有機相合わせ、有機相を飽和塩化ナトリウムで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。濾過、減圧して溶媒を除去し、粗生成物をカラムクロマトグラフィーにより、淡黄色の固体化合物１−Ｂを得た。
【００４８】
工程３：化合物１−Ｃの合成
メタノール（３２Ｌ）を５０Ｌのジャケット付きのケトルに添加し、攪拌を開始させ、順次に化合物１−ＳＭＢ（４０００．００ｇ）とジイソプロピルエチルアミン（５．２５Ｌ）を添加し、内部温度を５〜１０℃に冷却させ、ゆっくりとベンジルメルカプタン（２４９０．００ｇ）を滴下し、内部温度を５〜１５℃に維持させた。滴下完了後、冷却システムを閉じ、自然に昇温させ、続いて２．５時間攪拌した。攪拌を停止し、回転速度を１００ｒｐｍに調整し、反応溶液を放出し、卓上フィルターで濾過し、濾過してケーキを得た。ケーキを水（５Ｌ）で３回洗浄した後、ＥｔＯＨ（３Ｌ）を添加して１回洗浄してケーキが粘稠でなくなるまで吸引濾過し、淡黄色の固体化合物１−Ｃを得た。
【００４９】
工程４：化合物１−Ｄの合成
ジクロロメタン（７．５Ｌ）を５０Ｌのチャンバーに添加し、攪拌を開始させ、化合物１−Ｃ（１５００ｇ）を添加し、内部温度を０〜１０℃に冷却させ、ＨＣｌ溶液（６Ｍ、４．１２Ｌ）を添加した。０〜１０℃の条件下で、開口して次亜塩素酸ナトリウム溶液（市販の８％の溶液、２３．０ｋｇ）の添加が完了し、滴下完了後、冷却系を閉じ、開口して続いて約１７時間撹拌した。次に、それに亜硫酸水素ナトリウム溶液（１０００ｇ、５Ｌの水溶液）を添加し、ヨウ化カリウムでんぷん紙で水相に酸化剤が残っていないことを検出した。攪拌を停止し、静置して分層し、ジクロロメタン層を収集し、水層をジクロロメタン（２．５Ｌ）で抽出し、ジクロロメタン層を合わせた。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧して溶媒を除去して、白色の固体化合物１−Ｄを得た。
【００５０】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、重水素化クロロホルム）δ＝８．５０〜８．４３（ｍ、２Ｈ）、８．３４（ｄ、Ｊ＝８．２Ｈｚ、１Ｈ）、４．０４（ｓ、３Ｈ）。
【００５１】
工程５：化合物１−Ｅの合成
テトラヒドロフラン（１０Ｌ）を５０Ｌの乾燥したジャケット付きのケトルに添加し、攪拌を開始させ、化合物１−Ｂ（２０００ｇ）を添加し、内部温度を０〜１０℃に冷却させた。１．５時間内に温度を０〜１５℃に維持させ、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（１ＭのＴＨＦ溶液、１５．６７Ｌ）を添加し、完了後、温度を約２０℃に昇温させ、続いて１時間撹拌した。温度を０〜１０℃に冷却させ、ゆっくりと化合物１−Ｄ（４３８０ｇ）のテトラヒドロフラン（１０Ｌ）溶液を添加した。添加完了後、温度をゆっくりと１５℃に昇温させ、続いて約１６時間攪拌した。酢酸エチル（１０Ｌ）を添加して抽出し、有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（１０Ｌ）で２回洗浄し、水相を合わせ、ＥＡ（５Ｌ）で抽出し、有機相を合わせた。有機相を減圧して溶媒を除去し、淡黄色の固体化合物１−Ｅを得た。
【００５２】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ＝８．５５（ｄ、Ｊ＝１．４Ｈｚ、１Ｈ）、８．３７（ｄｄ、Ｊ＝１．５、８．３Ｈｚ、１Ｈ）、７．９１（ｄ、Ｊ＝８．３Ｈｚ、１Ｈ）、７．６０（ｓ、１Ｈ）、７．１３（ｄ、Ｊ＝１．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．０２（ｑ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）、３．９３（ｓ、３Ｈ）、２．１０（ｓ、３Ｈ）、１．０８（ｔ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、３Ｈ）。
【００５３】
工程６：化合物１−ＳＭ１の合成
化合物１−Ｅ（１０００．０ｇ）を１０Ｌの乾燥した三ツ口フラスコに添加し、攪拌を開始させ、氷酢酸（５Ｌ）を添加し、反応の内部温度を２５〜３０℃に制御した。ゆっくりと鉄粉（１ｅｑ、１４０．９ｇ）を添加し、３０分間攪拌してから、ゆっくりと第２バッチの鉄粉（０．５ｅｑ、７０．４４ｇ）を添加し、続いて３０分間攪拌した後第３バッチの鉄粉（０．５ｅｑ、７０．４４ｇ）を添加し、また３０分間攪拌した後、第４バッチの鉄粉（０．５ｅｑ、７０．４４ｇ）を添加し、続いて原料が消失し、極性の高い新しいポイントが形成されるまで攪拌した。攪拌を停止し、反応溶液を２５Ｌに移して分離し、１０Ｌの酢酸エチルを添加し、飽和硫酸水素ナトリウム水溶液５Ｌ×２で洗浄し、分層し、水相を５Ｌの酢酸エチルで逆抽出した。有機相を合わせ、ｐＨ＞８になるまで有機相を１０％のＮａＯＨ水溶液で洗浄し、有機相を分離して収集した。有機相を減圧濃縮して、白色固体化合物１−ＳＭ１を得た。
【００５４】
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ＝７．７９〜７．７１（ｍ、２Ｈ）、７．５０（ｄ、Ｊ＝１．８Ｈｚ、１Ｈ）、７．１４（ｄｄ、Ｊ＝１．７、８．５Ｈｚ、１Ｈ）、６．９６（ｄ、Ｊ＝２．０Ｈｚ、１Ｈ）、６．４２（ｓ、２Ｈ）、４．１１（ｑ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、２Ｈ）、３．８４（ｓ、３Ｈ）、２．０４（ｓ、３Ｈ）、１．１６（ｔ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、３Ｈ）。
【００５５】
工程７：化合物１−Ｆの合成
トルエン（１２Ｌ）を５０Ｌの乾燥したジャケット付きのケトルに添加し、攪拌を開始させ、２−ブロモエタノール（９９３０ｇ）を添加し、その後、三フッ化ホウ素エーテル（２６８ｇ）を添加し、反応を３０〜３５℃に昇温させた。ゆっくりと化合物１−ＳＭＣ（３５００ｇ）を滴下し、約１．５時間で滴下を完了させ、この時、反応の内部温度は約５５〜６５℃に上昇し、ヒーターの温度を６０℃に調整して内部温度を５５〜６５℃で１時間維持させた。系の内部温度を約１０℃に冷却させ、反応系にゆっくりと約２０℃の水酸化ナトリウム水溶液（３７８３ｇ、水１７．５Ｌ）を添加し、内部温度を１０〜２０℃に維持させた。ＮａＯＨ溶液の添加が完了した後、温度制御を閉じ、反応を続いて約１６時間撹拌した。攪拌を停止し、静置し、分層し、水層を２−メチルテトラヒドロフラン（１０Ｌ）で抽出し、有機相を合わせ、水（１０Ｌ）で洗浄し、静置し、分層し、有機相を収集した。有機相を減圧濃縮して、無色のオイル状化合物１−Ｆを得た。
【００５６】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、重水素化クロロホルム）δ＝３．８７〜３．７１（ｍ、４Ｈ）、３．６６〜３．５９（ｍ、３Ｈ）、３．４２（ｄｄ、Ｊ＝６．０、１１．７Ｈｚ、１Ｈ）、３．２０〜３．１３（ｍ、１Ｈ）、２．７９（ｔ、Ｊ＝４．６Ｈｚ、１Ｈ）、２．６５〜２．５９（ｍ、１Ｈ）。
【００５７】
工程８：化合物１−Ｇの合成
水酸化ナトリウム（３２４０ｇ、水１５Ｌ）水溶液を５０Ｌの乾燥したジャケット付きのケトルに添加し、化合物１−Ｆ（４４３０ｇ）を添加し、加熱を開始させ、反応を９０℃に昇温させた後、続いて１時間撹拌した。冷却を開始させて約１５℃に冷却させ、ｐ−トルエンスルホニルクロリドテトラヒドロフラン溶液（６１８０ｇ、テトラヒドロフラン１５Ｌ）を添加し、温度制御を閉じ、続いて反応を約１５℃で約１６時間撹拌した。攪拌を停止し、静置し、分層し、水相を２−メチルテトラヒドロフラン（１０Ｌ）で抽出し、２−メチルテトラヒドロフラン相（白色の不溶性物質が存在し、水で洗浄した後消失した）を水（５Ｌ）で洗浄し、有機相を合わせた。有機相にＤＭＡＰ（５００ｇ）、トリエチルアミン（２．５Ｌ）を添加し、３０分間撹拌し、飽和塩化ナトリウム溶液（１０Ｌ）を添加して洗浄し、静置して分層し、水相を捨てた。有機相を硫酸水素カリウム溶液（３８００ｇ、水１５Ｌ）、飽和塩化ナトリウム溶液（５Ｌ×２回）で洗浄し、静置して分層し、有機相を収集した。有機相を減圧濃縮して溶媒を除去し、粗生成物化合物１−Ｇを得た。
【００５８】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、重水素化クロロホルム）δ＝７．７７（ｄ、Ｊ＝８．３Ｈｚ、２Ｈ）、７．３４（ｄ、Ｊ＝８．２Ｈｚ、２Ｈ）、４．０３〜３．９１（ｍ、２Ｈ）、３．８０〜３．４９（ｍ、８Ｈ）、３．３３（ｄｄ、Ｊ＝９．９、１１．４Ｈｚ、１Ｈ）、２．４３（ｓ、３Ｈ）。
【００５９】
工程９：化合物１−Ｈの合成
アセトン（３０Ｌ）をきれいな５０Ｌのジャケット付きのケトルに添加し、攪拌を開始させ、化合物１−Ｇ（４５００ｇ）を添加し、次にヨウ化ナトリウム（６１９０ｇ）を添加し、加熱を開始させ、反応を７５℃に昇温させた後、続いて１６時間撹拌した。室温まで冷却させた後、濾過し、濾液を５０℃で減圧濃縮した。濃縮した後の粗生成物に酢酸エチル（１５Ｌ）、水（１０Ｌ）を添加し、攪拌し、静置して分層し、有機相を０．５Ｍのチオ硫酸ナトリウム（１０Ｌ）で洗浄した。水相とチオ硫酸ナトリウム溶液を合わせた後、ＥｔＯＡｃ（５Ｌ）で抽出した。有機相を合わせ、飽和塩化ナトリウム溶液（１０Ｌ）で洗浄し、静止し、分層し、有機相を収集した。有機相を減圧濃縮して溶媒を除去し、粗生成物化合物１−Ｈを得た。
【００６０】
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、重水素化クロロホルム）δ＝３．９０〜３．８３（ｍ、２Ｈ）、３．８１〜３．７５（ｍ、２Ｈ）、３．７４〜３．６５（ｍ、５Ｈ）、３．６３〜３．４９（ｍ、７Ｈ）、３．３１〜３．１８（ｍ、３Ｈ）、３．０６〜３．０４（ｍ、２Ｈ）。
【００６１】
工程１０：化合物１−Ｉの合成
ＤＭＳＯ（２０Ｌ）をきれいな５０Ｌのジャケット付きのケトルに添加し、攪拌を開始させ、化合物１−Ｈ（４７００ｇ）を添加し、温度を３５℃に昇温させ、次にシアン化ナトリウム（１０１０ｇ）を添加し、反応温度を２０分以内に約６０℃に昇温させた。次に徐々に温度を３５℃まで冷却させ、続いて約１６時間撹拌した。反応系に炭酸水素ナトリウム溶液（炭酸水素ナトリウム２０００ｇ、水１０Ｌ）を添加し、続いて約５分間撹拌し、ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ（２０Ｌ、２Ｌ）を添加し、続いて２分間撹拌し、約１時間静置した。分層し、下層の溶液を約３０Ｌ分離して出し、ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨで２回（１回目は１５Ｌ：１．５Ｌ、２回目は５Ｌ：０．５Ｌ）抽出した。抽出した後の上層の有機相と残りの反応溶液の上層を合わせ、飽和塩化ナトリウム溶液（各１０Ｌ）で３回洗浄し、静止し、分層し、水相を捨て、有機相を収集した。減圧して有機相から溶媒を除去し、粗生成物をカラムクロマトグラフィーにより無色のオイル状化合物１−Ｉを得た。
【００６２】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、重水素化クロロホルム）δ＝３．８４〜３．６５（ｍ、６Ｈ）、３．６１〜３．５３（ｍ、２Ｈ）、３．３５（ｔ、Ｊ＝１０．５Ｈｚ、１Ｈ）、２．４９〜２．４４（ｍ、２Ｈ）。
【００６３】
工程１１：化合物１−Ｊの合成
アルゴンガスの保護下で、乾燥した水素化ボトルにラネーニッケル（１０．００ｇ、１１６．７３ｍｍｏｌ）とＥｔＯＨ（１５０ｍＬ）を添加し、次に系に１−Ｉ（２０ｇ、１５７．３１ｍｍｏｌ）、ＮＨ３．Ｈ２Ｏ（１３．６５ｇ、９７．３６ｍｍｏｌ、１５．００ｍＬ、純度：２５％）を添加し、その後置換し、反応を５０ｐｓｉ、５０℃で３．５時間撹拌した。反応溶液を硅藻土で濾過し、濾液を減圧濃縮して、黄色のオイル状化合物１−Ｊを得た。
【００６４】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、重水素化クロロホルム）δ＝３．８２〜３．５７（ｍ、６Ｈ）、３．３４−３．１８（ｍ、１Ｈ）、２．８６〜２．７２（ｍ、２Ｈ）、１．６０〜１．３８（ｍ、２Ｈ）。
【００６５】
工程１２：化合物１−ＳＭ２の合成
１−Ｊ（８００．００ｇ）を５Ｌの三ツ口フラスコに添加し、攪拌を開始させ、約０．５時間以内に酢酸エチル（８００ｍＬ）を添加し、系がｐＨ＜５になるまで、４ＭのＨＣｌ／ＥｔＯＡｃ（１．６Ｌ）をゆっくりと滴下し、内部温度を５〜１５℃に維持させた。冷却システムを閉じ、室温まで昇温させ、続いて１時間攪拌した。攪拌を停止し、卓上フィルターで濾過し、濾過してケーキを得た。ケーキを減圧濃縮（４０〜４５℃）して、粗生成物を得た。前記生成物にアセトニトリル（２ｍＬ／ｇ）を添加し、１時間スラリー化した。濾過し、ケーキを別々に収集し、減圧して有機溶液を除去し、白色の固体化合物１−ＳＭ２を得た。
【００６６】
１Ｈ  ＮＭＲ（３９９ＭＨｚ、ＭＥＴＨＡＮＯＬ−ｄ４）δ＝３．８８〜３．７２（ｍ、５Ｈ）、３．６７〜３．５９（ｍ、１Ｈ）、３．３６〜３．３１（ｍ、１Ｈ）、３．１４（ｔ、Ｊ＝６．７Ｈｚ、２Ｈ）、１．８７〜１．６７（ｍ、２Ｈ）。
【００６７】
工程１３：化合物１−１−Ａ及び化合物１−１−Ｂの合成
トルエン（２０Ｌ）を５０Ｌの乾燥したジャケット付きのケトルに添加し、攪拌を開始させ、化合物１−ＳＭ１（２５００ｇ）を添加し、内部温度を３０〜３５℃に昇温させた。窒素ガスのパージにより、ケトル内の不活性ガス雰囲気を維持し、トリメチルアルミニウム（３．０Ｌ、Ａｌ（ＣＨ３）３の添加によりケトル内の温度はゆっくりと上昇した）を滴下し、完了後、窒素ガスを閉じ、温度を８０〜８５℃に昇温させ、続いて１６時間攪拌した。冷却を開始させ、反応温度を２０〜３０℃に冷却させ、約１２Ｌである反応溶液の半分を移し、ＥｔＯＡｃ（１０Ｌ）を添加して均一に混合した。撹拌しながら、混合溶液を１０％のＫＨＳＯ４溶液（１０Ｌ）に添加し、２分間撹拌し、静止し、分層し、有機層を再び１０％のＫＨＳＯ４溶液（１０Ｌ）で洗浄し、水相を合わせ、ＤＣＭ（各７．５Ｌ）で２回抽出した。残り半分の反応溶液を約１２Ｌ移し、処理方法は上記と同じで、有機相を合わせ、有機相を減圧濃縮して粗生成物を得、２倍の容積のｎ−ヘプタンを添加して１時間スラリー化した。濾過し、真空で＞１２時間乾燥させ、温度は４０℃で、Ｐ≦−０．１Ｍｐａであった。得られた白色固体は、化合物１−１−Ａと化合物１−１−Ｂの混合物であった。
【００６８】
工程１４：化合物１−２の合成
テトラヒドロフラン（３８４０ｍＬ）を１０Ｌの三ツ口フラスコに添加し、攪拌を開始させ、化合物１−１−Ａと化合物１−１−Ｂの混合物（４８０．００ｇ）を添加し、ゆっくりとＬｉＯＨ．Ｈ２Ｏ（１１８．８４ｇ）のＨ２Ｏ（９６０ｍＬ）溶液を滴下した。滴下完了後、６０℃に昇温させ、１時間撹拌し、反応溶液に濃ＨＣｌを添加し、系のｐＨを２に調整し、撹拌を停止した。静置し、分離した。水相をＴＨＦ（６００ｍＬ）で２回抽出し、有機相を合わせた。有機相を減圧濃縮（４０〜４５℃）し、固体を純水（２ｍＬ／ｇ）で０．５時間スラリー化し、濾過し、ケーキを真空で＞１２時間乾燥させ、温度は４０℃で、Ｐ≦−０．１Ｍｐａで、淡黄色の固体化合物１−２を得た。
【００６９】
１Ｈ  ＮＭＲ（３９９ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ＝１１．１９（ｓ、１Ｈ）、８．０９（ｄ、Ｊ＝８．２Ｈｚ、１Ｈ）、８．００（ｄ、Ｊ＝１．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．８８（ｄｄ、Ｊ＝１．５、８．３Ｈｚ、１Ｈ）、７．３９（ｄｄ、Ｊ＝１．２、２．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．０１（ｄ、Ｊ＝２．０Ｈｚ、１Ｈ）、２．０５（ｓ、３Ｈ）。
【００７０】
工程１５：式（Ｉ）化合物の合成
ＤＭＦ（２．２５Ｌ）を５Ｌの三ツ口フラスコに添加し、攪拌を開始させ、順次に化合物１−２（４００．００ｇ）およびＨＡＴＵ（７４４．８３ｇ）を添加し、３０分間撹拌し、次に化合物１−ＳＭ２（２２９．８６ｇ）が添加した。１時間以内に室温でＤＩＰＥＡ（５６８．６８ｍＬ）をゆっくりと滴下し、滴下完了後、室温で攪拌し、１６時間攪拌した。反応溶液を分液漏斗に移し、酢酸エチル（２Ｌ）と純水（１Ｌ）を添加し、２分間撹拌した。静置し、水相を分離した。次に、純水（１Ｌ）を添加して洗浄し、攪拌し、静置し、分層した。水相を合わせてＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）で３回抽出し、有機相を合わせた。有機相を順次に炭酸ナトリウム溶液（１．５Ｌ）で２回洗浄し、硫酸水素カリウム溶液（１Ｌ）で２回洗浄し、純水（１Ｌ）で２回洗浄した。有機相を減圧濃縮（４０〜４５℃）して、粗生成物を得た。粗生成物に酢酸エチル（２ｍＬ／ｇ）を添加し、１時間スラリー化した。濾過し、ケーキを収集して式（Ｉ）化合物を得た。
【００７１】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ＝１１．１３（ｂｒｓ、１Ｈ）、８．７３（ｂｒｔ、Ｊ＝５．５Ｈｚ、１Ｈ）、８．０５（ｄ、Ｊ＝８．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．８３（ｄ、Ｊ＝１．３Ｈｚ、１Ｈ）、７．７４（ｄｄ、Ｊ＝１．５、８．４Ｈｚ、１Ｈ）、７．３６（ｓ、１Ｈ）、６．９８（ｄ、Ｊ＝２．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．７１〜３．４８（ｍ、５Ｈ）、３．４５〜３．３１（ｍ、１Ｈ）、３．４５〜３．３０（ｍ、１Ｈ）、３．２７〜３．２１（ｍ、１Ｈ）、３．１４（ｄｄ、Ｊ＝９．９、１１．２Ｈｚ、１Ｈ）、２．０３（ｓ、３Ｈ）、１．５３（ｑ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）。
【００７２】
実施例２．式（Ｉ）化合物のＡ結晶形の調製
３５ｍｇの式（Ｉ）の化合物１．５ｍＬを液相バイアルに量り取り、４００μＬのｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルを添加し、超音波で混合または溶解させた。懸濁液サンプルを恒温シェーカー（４０℃）に置き、３日間攪拌（光を避ける）した。次に、サンプル溶液を迅速に遠心分離し、遠心分離後の固体を３０℃の真空乾燥箱に入れて５時間乾燥させ、得られた乾燥サンプルをＸＲＰＤで検出して、式（Ｉ）の化合物のＡ結晶形を得た。
【００７３】
実施例３．式（Ｉ）の化合物のＢ結晶形の調製
式（Ｉ）化合物３５ｍｇを１．５ｍＬの液相バイアルに量り取り、４００μＬのアセトンを添加し、超音波で混合または溶解させた。懸濁液サンプルを恒温シェーカー（４０℃）に置き、３日間攪拌（光を避ける）した。次に、サンプル溶液を迅速に遠心分離し、遠心分離後の固体を３０℃の真空乾燥箱に入れて５時間乾燥させ、得られた乾燥サンプルをＸＲＰＤで検出して、式（Ｉ）の化合物のＢ結晶形を得た。
【００７４】
実施例４．式（Ｉ）の化合物のＢ結晶形の予備安定性試験
【００７５】
【表３】
2021529824.tif 000010
【００７６】
注：
Ｘは試験項目を表し、ＸＲＰＤ、含有量及び関連物質を含み、０日目のサンプルは−２０℃に保存し；
ＩＣＨは指導サンプルを放置した光照射条件を表し、即ち（光照射（総照度≧１．２×１０６Ｌｕｘ・ｈｒ／近紫外線≧２００ｗ・ｈｒ／ｍ２、開口）を表した。
【００７７】
実験ステップ：
１０ｍｇの式（Ｉ）の化合物のＢ結晶形を秤量して４０ｍＬのガラス瓶の底部に置き、薄層に広げ、アルミホイルで管口をよく縛り（光照射サンプルは除外）、刺して小さな穴を開け、サンプルが周囲の空気と十分に接触できるようにした。光照射サンプルは４０ｍＬのガラス瓶の底に置き、開口し、垂直にライトボックスに置き；遮光対照品は、開口し、垂直に置き、ガラス瓶の外はスズホイルで包んだ。各条件の時点で２部を並行して秤量し、他に適量のサンプル（秤量しない）をＸＲＰＤ検出のために使用し、準備済みのサンプルは以下の表に示す条件に放置し、それぞれ時間点に達した後サンプルを取り、ＨＰＬＣで分析し、分析方法をは表４に示す通りであり、実験結果は表５に示す通りであった。
【００７８】
ＨＰＬＣ分析：
１．１．希釈剤と移動相の調製
希釈剤：アセトニトリル：水（２：１）
【００７９】
例：１０００ｍＬのアセトニトリルと５００ｍＬの水を取り、均一に混合し、超音波で脱気し、室温まで冷却させた。
移動相Ａ：０．１％のトリフルオロ酢酸水溶液
【００８０】
例：２．０ｍＬのトリフルオロ酢酸を２Ｌの水に取、均一に混合し、超音波で脱気し、室温まで冷却させた。
移動相Ｂ：１００％アセトニトリル
【００８１】
１．２．対照サンプルとサンプル溶液の調製
式（Ｉ）の化合物のＢ結晶形を対照品とし、５ｍｇの式（Ｉ）の化合物のＢ結晶形を秤量してガラス瓶に置き、濃度が１ｍｇ／ｍＬになるまで５ｍＬの希釈剤を添加し、超音波でよく混合し、再び５倍に希釈し、対照品サンプル溶液ＳＴＤ１を得た。ＳＴＤ１を１、２、４、２０、２００倍に希釈して１％の対象品サンプル溶液とした。
【００８２】
１．３．試験サンプル溶液の調製
各試験サンプルに濃度が１０ｍＬになるまでに希釈剤を添加し、超音波で溶解させ、室温まで冷却させた後ＨＰＬＣ試験を行った。
【００８３】
同時に、サンプル溶液を５倍に希釈し、よく混合した後、ＨＰＬＣ試験を行い、分析方法は表４に示す通りであった。
【００８４】
【表４】
2021529824.tif 000011
【００８５】
【表５】
2021529824.tif 000012
【００８６】
注：“−”は検出されていないことを表し；
ＴＲＳは、メインピーク以外の残りの不純物の合計を表し；
Ａｓｓａｙはサンプルの含有量を表す。
【００８７】
実験結論：式（Ｉ）の化合物のＢ結晶形は、高温および高湿度条件下で安定であった。
【００８８】
実施例５．ＨＢＶの体外試験定量ｑＰＣＲ試験
１．実験目的：
リアルタイムの定量ｑＰＣＲ試験（ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ−ｑＰＣＲ）を利用してＨｅｐＧ２．２．１５細胞内のＨＢＶ  ＤＮＡ含有量を検出し、化合物のＥＣ５０値を指標として使用してＨＢＶに対する化合物の阻害効果を評価する。
【００８９】
２．実験材料：
２．１．細胞系：ＨｅｐＧ２．２．１５細胞
ＨｅｐＧ２．２．１５細胞培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−１１３３００５７；１０％の血清、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−１００９９１４１；１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのペニシリン及び１０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−１５１４０１２２；１％の非必須アミノ酸、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−１１１４００７６；２ｍＭのＬ−グルタミン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−２５０３００８１；３００μｇ／ｍｌのジェネティシン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−１０１３１０２７。
【００９０】
２．２．試薬：
パンクレアチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−２５３０００６２）
ＤＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ−ＳＨ３００２８．０１Ｂ）
ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ−Ｄ２６５０−１００ＭＬ）
ハイスループットＤＮＡ精製キット（ＱＩＡａｍｐ  ９６  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ−５１１６２）
ファストスタートユニバーサルプローブマスター（ＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｂｅ  Ｍａｓｔｅｒ、Ｒｏｃｈｅ−０４９１４０５８００１）
【００９１】
２．３．消耗品および機器：
９６ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ−３５９９）
ＣＯ２インキュベーター（ＨＥＲＡ−ＣＥＬＬ−２４０）
光学シールフィルム（ＡＢＩ−４３１１９７１）
定量ＰＣＲ９６ウェルプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ−４３０６７３７）
蛍光定量ＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ−７５００  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ）
【００９２】
３．実験のステップと方法：
３．１．ＨｅｐＧ２．２．１５細胞（４ｘ１０４セル／ウェル）を９６ウェルプレートに植え、３７℃、５％のＣＯ２で一晩インキュベーションした。
【００９３】
３．２．２日目に、化合物を希釈し、合計８つの濃度、３倍に勾配希釈した。異なる濃度の化合物を培養ウェルに添加し、２反複ウェルを設定した。培地のＤＭＳＯの最終濃度は１％であった。１μＭのＧＬＳ４を１００％阻害対照とし、１％のＤＭＳＯは０％阻害対照とした。
【００９４】
３．３．５日目に、化合物を含む新しい培地に変更した。
【００９５】
３．４．８日目に、培養ウェルの培養液を回収し、ハイスループットＤＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ−５１１６２）を使用してＤＮＡを抽出し、具体的な手順は製品のマニュアルを参照した。
【００９６】
３．５．ＰＣＲ反応溶液の調製は表６に示す通りであった。
【００９７】
【表６】
2021529824.tif 000013
【００９８】
上流のプライマー配列：ＧＴＧＴＣＴＧＣＧＧＣＧＴＴＴＴＡＴＣＡ（配列番号１）
下流のプライマー配列：ＧＡＣＡＡＡＣＧＧＧＣＡＡＣＡＴＡＣＣＴＴ（配列番号２）
プローブ配列：５´＋ＦＡＭ＋ＣＣＴＣＴＫＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＡＴＧＣＣＴＣＡＴＣ（配列番号３）＋ＴＡＭＲＡ−３´
【００９９】
３．６．９６ウェルＰＣＲプレートの各ウェルに１５μＬの反応混合物を添加し、次に各ウェルに１０μＬのサンプルＤＮＡまたはＨＢＶ  ＤＮＡの標準品を添加した。
【０１００】
３．７．ＰＣＲの反応条件は：９５℃で１０分間加熱し；次に９５℃で１５秒間変性させ、６０℃で１分間伸長させ、合計４０サイクルを行った。
【０１０１】
３．８．データ分析：
３．８．１．阻害率の計算：％Ｉｎｈ．＝［１−（サンプル中のＤＮＡコピーの数−１μＭのＧＬＳ４中のＤＮＡコピーの数）／（ＤＭＳＯ対照群中のＤＮＡコピーの数−１μＭのＧＬＳ４中のＤＮＡコピーの数）］×１００。
【０１０２】
３．８．２．ＥＣ５０の計算：ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、ＨＢＶに対する化合物の５０％阻害濃度（ＥＣ５０）を計算した。
【０１０３】
４．実験結果は表７に示す通しであった。
【０１０４】
【表７】
2021529824.tif 000014
【０１０５】
結論：式（Ｉ）の化合物は、ＨＢＶに対して有意な阻害効果を有した。
【０１０６】
実施例６．シトクロムＰ４５０アイソザイムの阻害性研究
実験目的：ヒト肝臓ミクロソームシトクロームＰ４５０アイソザイム（ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ３Ａ４）の活性に対する試験化合物の阻害効果を検出する。
【０１０７】
実験操作：先ずは、試験化合物（１０ｍＭ）を勾配希釈して、作業溶液（１００×最終濃度）を調製し、作業溶液の濃度はそれぞれ：５、１．５、０．５、０．１５、０．０５、０．０１５、０．００５ｍＭで、同時に、Ｐ４５０アイソザイム（ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ３Ａ４）の各陽性阻害剤とそれらの特定の基質混合物（５  ｉｎ  １）の作業溶液を準備し；−８０℃の冷蔵庫で凍結したヒト肝臓ミクロソームを氷上で解凍し、ヒト肝臓ミクロソームが完全に溶解した後、ＰＢで希釈して所定濃度（０．２５３ｍｇ／ｍＬ）の作業溶液を調製し；２０ｕＬの基質混合溶液を反応プレート（Ｂｌａｎｋウェルに２０μｌのＰＢを添加）に添加し、同時に１５８μＬのヒト肝臓ミクロソーム作業溶液を反応プレートに添加し、反応プレートを氷上に置き、使用のために準備し；このとき、２μＬの各濃度の試験化合物（Ｎ＝１）と特異的阻害剤（Ｎ＝２）を対応するウェルに添加し、阻害剤のない（試験化合物または陽性阻害剤）群には対応する有機溶媒を添加して対照群サンプル（試験化合物対照サンプルは１：１のＤＭＳＯ：ＭｅＯＨで、陽性対照サンプルは１：９のＤＭＳＯ：ＭｅＯＨであった）とし；３７℃のウォーターバスで１０分間プレインキュベートした後、２０μＬのコエンザイムファクター（ＮＡＤＰＨ）溶液を反応プレートに添加し、３７℃のウォーターバスで１０分間インキュベートし；４００μＬの冷アセトニトリル溶液（内部標準は２００ｎｇ／ｍＬのＴｏｌｂｕｔａｍｉｄｅとＬａｂｅｔａｌｏｌであった）を添加して反応を停止させ；反応プレートをシェーカーに置き、１０分間振とうし；４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し；２００μＬの上澄みを取って１００μＬの水に添加してサンプルを希釈し；最後にプレートを密封し、振とうし、均一に振とうし、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳで検出した。実験結果は表８に示す通りであった。
【０１０８】
【表８】
2021529824.tif 000015
【０１０９】
実験結論：式（Ｉ）の化合物はＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ３Ａ４の全部に対して有意な阻害効果はなかった。
【０１１０】
実施例７．血漿タンパク結合率の研究
実験目的：ヒトおよびＣＤ−１マウス血漿中の試験化合物のタンパク質結合率を測定する。
【０１１１】
実験操作：ヒトおよびＣＤ−１マウスから７９６μＬのブランク血漿を採取し、４μＬの試験化合物の作業溶液（４００μＭ）またはワルファリン作業溶液（４００μＭ）を添加して、血漿サンプル中の試験化合物とワルファリンの最終濃度を２μＭにした。サンプルを十分に混合した。有機相中のＤＭＳＯの最終濃度は０．５％であり；５０μＬの試験化合物とワルファリン血漿サンプルをサンプル受容プレート（同じく３つ）に入れ、すぐに対応する容積のブランク血漿または緩衝液を添加して、各サンプルウェルの最終の容積を１００μＬにし、血漿：透析緩衝液の容積比は１：１であり、次に、これらのサンプルに４００μＬの停止液を添加し、当該サンプルを、Ｔ０サンプルとし、回収率と安定性の検出に使用した。Ｔ０サンプルを２〜８℃で保管し、他の透析済みのサンプルと一緒に後処理を行い；１５０μＬの試験化合物とワルファリン血漿サンプルを各透析ウェルの投与端に添加し、透析ウェルに対応する受容端に１５０μＬのブランク透析緩衝液を添加した。次に、透析プレートをガス透過性膜で密封し、湿潤な５％のＣＯ２インキュベーターに置いて、３７℃下で約１００ｒｐｍで振とうしながら４時間インキュベーションした。透析終了後、５０μＬの透析後の緩衝液サンプルと透析後の血漿サンプルを新しいサンプル受け取りプレートに移した。各サンプルウェルの最終容積が１００μＬになり、血漿：透析バッファーの容積比が１：１になるように、対応する容積のブランク血漿または緩衝液をサンプルに添加した。全部のサンプルはタンパク質沈殿後にＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を行い、公式：％Ｕｎｂｏｕｎｄ（非結合率）＝１００×ＦＣ／ＴＣ、％Ｂｏｕｎｄ（結合率）＝１００−％Ｕｎｂｏｕｎｄ、％Ｒｅｃｏｖｅｒｙ（回收率）＝１００×（ＦＣ＋ＴＣ）／Ｔ０を利用してタンパク質結合率及び回収率を計算した。実験結果は表９に示す通りであった。
【０１１２】
【表９】
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【０１１３】
実験結論：式（Ｉ）の化合物はヒト及びＣＤ−１マウス血漿でいずれも低いタンパク質結合率を示した。
【０１１４】
実施例８．生体内薬物動態研究
１．経口投与および静脈内注射によるＢａｌｂ／ｃマウスにおける式（Ｉ）の化合物の薬物動態研究
式（Ｉ）の化合物と５％のＤＭＳＯ／５５％のポリエチレングリコール４００／４０％の水溶液を混合し、ボルテックスおよび超音波処理して１ｍｇ／ｍＬのほぼ透明な溶液を調製し、使用のために微孔性膜で濾過した。７〜１０週齢のＢａｌｂ／ｃメスマウスを選択し、候補化合物溶液を１ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内注射した。式（Ｉ）の化合物と１０％のｓｏｌｕｔｏｌ（ポリエチレングリコール−１５ヒドロキシステアレート）水溶液を混合し、ボルテックスおよび超音波処理して１ｍｇ／ｍＬのほぼ透明な溶液を得、使用のために微孔性膜で濾過した。７〜１０週齢のＢａｌｂ／ｃメスマウスを選択し、候補化合物溶液を１０ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与した。
【０１１５】
一定時間の全血を収集し、調製して血漿を得、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法で薬物濃度を分析し、Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｗｉｎ  Ｎｏｎｌｉｎソフトウェア（米国Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社）を使用して薬物動態パラメーターを計算した。
【０１１６】
２．経口投与および静脈内注射によるＳＤラットにおける式（Ｉ）の化合物の薬物動態研究
式（Ｉ）の化合物と５％のＤＭＳＯ／５５％のポリエチレングリコール４００／４０％の水溶液を混合し、ボルテックスおよび超音波処理して１ｍｇ／ｍＬのほぼ透明な溶液を調製し、使用のために微孔性膜で濾過した。７〜１０週齢のＳＤオスラットを選択し、候補化合物溶液を１ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内注射した。
【０１１７】
式（Ｉ）の化合物と１０％のｓｏｌｕｔｏｌ水溶液を混合し、ボルテックスおよび超音波処理して１ｍｇ／ｍＬのほぼ透明な溶液を調製し、使用のために微孔性膜で濾過した。７〜１０週齢のＳＤオスラットを選択し、候補化合物溶液を１０ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与した。
【０１１８】
所定時間の全血を収集し、調製して血漿を得、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法で薬物濃度を分析し、Ｐｈｏｅｎｉｘ  ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェア（米国Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社）を使用して薬物動態パラメーターを計算した。
【０１１９】
３．経口投与および静脈内注射によるビーグル犬における式（Ｉ）の化合物の薬物動態研究
式（Ｉ）の化合物と５％のＤＭＳＯ／５５％のポリエチレングリコール４００／４０％の水溶液を混合し、ボルテックスおよび超音波処理して１ｍｇ／ｍＬのほぼ透明な溶液を調製し、使用のために微孔性膜で濾過した。約１０ｋｇのオスビーグル犬を選択し、候補化合物溶液を１ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内注射した。
【０１２０】
式（Ｉ）の化合物と１０％のｓｏｌｕｔｏｌ水溶液を混合し、ボルテックスおよび超音波処理して２ｍｇ／ｍＬのほぼ透明な溶液を調製し、使用のために微孔性膜で濾過した。約１０ｋｇのオスビーグル犬を選択し、候補化合物溶液を１０ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与した。
【０１２１】
所定時間の全血を採取し、調製して血漿を得、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法で薬物濃度を分析し、Ｐｈｏｅｎｉｘ  ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェア（美国Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ公司）を使用して薬物動態パラメーターを計算した。
【０１２２】
実験結果は表１０に示す通りであった：
【０１２３】
【表１０】
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【０１２４】
注：Ｔ１／２は半減期を表し；Ｖｄｓｓは見かけの分布容積を表し；Ｃｌはクライアンスを表し；ＡＵＣ０−ｌａｓｔは薬物−時間曲線下面積を表し；Ｔｍａｘはピークに達する時間を表し；Ｃｍａｘはピークに達する濃度を表し；Ｆ％は経口バイオアベイラビリティを表し；ｉｖは静脈内注射を表し；ＰＯは経口投与を表し；ｍｐｋはｍｇ／ｋｇを表す。
【０１２５】
実験結論：式（Ｉ）の化合物は、良好なイヌ薬物動態の単一または部分的指標を有した。
【０１２６】
実施例９．生体内有効性研究
ＡＡＶ／ＨＢＶモデル
【０１２７】
実験目的：ＡＡＶ／ＨＢＶマウスモデルを使用して、マウス体内における化合物の抗Ｂ型肝炎ウイルス効果を検出する。
【０１２８】
実験操作：最初の投与日を０日目、投与前１日を−１日目、投与後１日を１日目というように設定した。投与の２８日前に、全部の動物に１＊１０１１ｖ．ｇ．ｒＡＡＶ８−１．３ＨＢＶウイルスを尾静脈に注射し、動物あたり２００μＬを注射した。投与の１４日前および投与の７日前に、ｒＡＡＶ８−１．３ＨＢＶウイルスを注射したすべてのマウスを顎下静脈から血液を採取して血清を収集した。収集した血液サンプルを３７℃で約３０分間置き、４℃、１３，２００ｇで３分間遠心分離し、上清を採取した。血清は、ＨＢＶ  ＤＮＡ、ＨＢｅＡｇ及びＨＢｓＡｇの含有量を検出するために使用した。ＨＢＶ  ＤＮＡ、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇのレベルが低いマウス、及び体重が軽いマウスは、この実験から除外される可能性があった。選択した２５匹のマウスを各群に均等に分け、各化合物処理群のマウスのウイルス注射後２１日目のＨＢＶ  ＤＮＡ、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇレベルおよび体重は、溶媒群と比較して統計的に差がない（Ｐ＞０．０５）ことを確保した。式（Ｉ）の化合物（ＷＸ−３２５）と１０％のｓｏｌｕｔｏｌ水溶液を混合し、ボルテックス及び超音波処理して均一な懸濁液に調製し、使用のために微孔性膜で濾過した。陽性化合物としてのテノホビルを生理食塩水に溶解させ、超音波で溶解するまで攪拌して、０．１ｍｇ／ｍＬの親溶液に調製し、生理食塩水で０．０１ｍｇ／ｍＬに希釈し、使用するまで４℃で保存した。式（Ｉ）の化合物（ＷＸ−３２５）は１日２回（ＢＩＤ）で、８時間の間隔で、経口投与（ＰＯ）した。参照化合物テノホビルは、１日２回経口の胃内投与した。二つの薬物とも２８日間投与し、そのうち投与後３、７、１０、２８日目の血液サンプルを採取し、ｑＰＣＲ法によって血漿中のＨＢＶＤＮＡのレベルを測定した。２８日目に、マウスをＣＯ２吸入により安楽死させ、肝臓を収集し、ｑＰＣＲ法によってマウスの肝臓中のＨＢＶＤＮＡレベルを検出した。実験結果は図７、図８に示す通りであった。
【０１２９】
実験結論：本発明の化合物は、良好な生体内有効性および用量依存的効果を示した。
【０１３０】
以上では本発明の具体的な実施形態を説明したが、当業者は、これらが単なる例であり、本発明の原理および本質から逸脱することなく、これらの実施形態に様々な変更または修正を加えることができることを理解すべきである。したがって、本発明の保護範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年3月8日(2021.3.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１５】
ＨＢＶ関連疾患を治療に使用するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＡ結晶形又は請求項８〜１４のいずれか１項に記載のＢ結晶形。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年9月6日(2021.9.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１５】
ＨＢＶ関連疾患を治療するための医薬の製造における、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＡ結晶形又は請求項８〜１４のいずれか１項に記載のＢ結晶形の使用。
【国際調査報告】
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