(57)【要約】本発明は、中間体上の保護基の使用を排除し、グリコシル化の立体選択性を改善し、化合物を製造するのに必要なプロセス段階の数を減少させる、４’−エチニル２’−デオキシヌクレオシドおよびその類似体、例えばＥＦｄＡの酵素的合成に関する。また、当該プロセスで使用される新規中間体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
４’−エチニル２’−デオキシヌクレオシドまたはその類似体の合成方法であって、マンガン（ＩＩ）塩を含む緩衝液中で化合物６．５
【化１】
2021530479.tif 000051
［式中、２Ｘ＋は（ａ）２つのプロトン、（ｂ）１つのプロトンと１つの１価カチオン、（ｃ）同一または異なる２つの１価カチオン、または（ｄ）１つの２価カチオンである。］
をプリンヌクレオシドホスホリラ−ゼおよびヌクレオ塩基もしくはその類似体と組合せることを含む、前記方法。
【請求項２】
４’−エチニル２’−デオキシヌクレオシドまたはその類似体が
【化２】
2021530479.tif 000052
である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
化合物
【化３】
2021530479.tif 000053
を単離することをさらに含む、請求項１または２記載の方法
【請求項４】
マンガン（ＩＩ）塩を含む緩衝液中で化合物６
【化４】
2021530479.tif 000054
およびホスホペントムタ−ゼをプリンヌクレオシドホスホリラ−ゼおよびヌクレオシド塩基と組み合わせることをさらに含む、請求項１に記載の４’−エチニル２’−デオキシヌクレオシドまたはその類似体の合成方法。
【請求項５】
反応溶液から無機リン酸副生成物を除去することをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
（ａ）反応混合物にスクロ−スホスホリラ−ゼおよびスクロ−スを加えること、または、（ｂ）反応混合物にカルシウム、マグネシウムまたはマンガンを加えることにより、反応溶液から無機リン酸副生成物を除去することを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
４’−エチニル２’−デオキシヌクレオシドまたはその類似体を単離することをさらに含む、請求項４から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
４’−エチニル２’−デオキシヌクレオシドまたはその類似体が
【化５】
2021530479.tif 000055
である、請求項．４から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
化合物
【化６】
2021530479.tif 000056
を単離することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
化合物６を合成する工程をさらに含む請求項４に記載の方法であって、水溶液中で化合物５
【化７】
2021530479.tif 000057
［式中、２Ｘ＋は（ａ）２つのプロトン、（ｂ）１つのプロトンと１つの１価カチオン、（ｃ）同一または異なる２つの１価カチオン、または（ｄ）１つの２価カチオンである。］
をアセトアルデヒドおよびデオキシリボ−ス−リン酸アルドラ−ゼと組み合わせて化合物６を生成することを含む、前記方法。
【請求項１１】
反応が密閉容器で実施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
化合物５を合成する工程をさらに含む請求項１０または１１に記載の方法であって、化合物４
【化８】
2021530479.tif 000058
を、２価金属塩の存在下で緩衝液中のパントテン酸キナ−ゼと組み合わせ、その場で再生したＡＴＰをリン酸源として組み合わせて、化合物５を生成する前記方法。
【請求項１３】
（ａ）アセチルリン酸および酢酸キナ−ゼ、または（ｂ）ピルビン酸、リン酸および酸素の存在下でのピルビン酸オキシダ−ゼ、カタラ−ゼおよび酢酸キナ−ゼ、または（ｃ）それらの組合せを用いて、その場でＡＴＰを再生する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）パントテン酸キナ−ゼが固定されているか、または、（ｂ）パントテン酸キナ−ゼと酢酸キナ−ゼが固定されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
化合物４を合成する工程をさらに含む請求項１２に記載の方法であって、該合成が、酸素の存在下で、緩衝液中において、化合物３
【化９】
2021530479.tif 000059
をガラクト−スオキシダ−ゼ、銅、カタラ−ゼおよびパ−オキシダ−ゼまたは酸化剤と組み合わせて、化合物４を生成させることを含む、前記方法。
【請求項１６】
ガラクト−スオキシダ−ゼが固定されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
４’−エチニル２’−デオキシヌクレオシドまたはその類似体の合成方法であって、マンガン（ＩＩ）塩を含む緩衝液中において、化合物５
【化１０】
2021530479.tif 000060
［式中、２Ｘ＋は（ａ）２つのプロトン、（ｂ）１つのプロトンと１つの１価カチオン、（ｃ）同一または異なる２つの１価カチオン、または（ｄ）１つの２価カチオンである。］、
アセトアルデヒドおよびヌクレオ塩基またはその類似体を、デオキシリボ−ス−リン酸アルドラ−ゼ、ホスホペントムタ−ゼおよびプリンヌクレオシドホスホリラ−ゼと組み合わせることを含む、前記方法。
【請求項１８】
反応混合物から無機リン酸副生成物を除去することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）反応混合物にスクロ−スホスホリラ−ゼおよびスクロ−スを加えること、または、（ｂ）反応混合物にカルシウム、マグネシウムまたはマンガンを加えることにより、反応混合物から無機リン酸副生成物を除去することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
４’−エチニル２’−デオキシヌクレオシドを単離することをさらに含む、請求項１７から１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
４’−エチニル２’−デオキシヌクレオシドが
【化１１】
2021530479.tif 000061
である、請求項１７から１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
化合物
【化１２】
2021530479.tif 000062
を単離することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
化合物６．５
【化１３】
2021530479.tif 000063
［式中、２Ｘ＋は（ａ）２つのプロトン、（ｂ）１つのプロトンと１つの１価カチオン、（ｃ）同一または異なる２つの１価カチオン、または（ｄ）１つの２価カチオンである。］
を合成する方法であって、マンガン（ＩＩ）塩を含む緩衝液中において化合物６
【化１４】
2021530479.tif 000064
［式中、２Ｘ＋は（ａ）２つのプロトン、（ｂ）１つのプロトンと１つの１価カチオン、（ｃ）同一または異なる２つの１価カチオン、または（ｄ）１つの２価カチオンである。］
をホスホペントムタ−ゼと組み合わせることを含む、前記方法。
【請求項２４】
化合物６
【化１５】
2021530479.tif 000065
［式中、２Ｘ＋は（ａ）２つのプロトン、（ｂ）１つのプロトンと１つの１価カチオン、（ｃ）同一または異なる２つの１価カチオン、または（ｄ）１つの２価カチオンである。］
を合成する方法であって、化合物５
【化１６】
2021530479.tif 000066
［式中、２Ｘ＋は（ａ）２つのプロトン、（ｂ）１つのプロトンと１つの１価カチオン、（ｃ）同一または異なる２つの１価カチオン、または（ｄ）１つの２価カチオンである。］
を水溶液中でアセトアルデヒトおよびデオキシリボ−ス−リン酸アルドラ−ゼと組み合わせて化合物６を生成することを含む、前記方法。
【請求項２５】
化合物５
【化１７】
2021530479.tif 000067
［式中、２Ｘ＋は（ａ）２つのプロトン、（ｂ）１つのプロトンと１つの１価カチオン、（ｃ）同一または異なる２つの１価カチオン、または（ｄ）１つの２価カチオンである。］
を合成する方法であって、化合物４
【化１８】
2021530479.tif 000068
を、２価金属塩の存在下で緩衝液中のパントテン酸キナ−ゼと組合せ、その場で再生したＡＴＰをリン酸源として組み合わせることを含む、前記方法。
【請求項２６】
（ａ）アセチルリン酸および酢酸キナ−ゼ、または（ｂ）ピルビン酸、リン酸および酸素の存在下でのピルビン酸オキシダ−ゼ、カタラ−ゼおよび酢酸キナ−ゼ、または（ｃ）それらの組合せを用いて、その場でＡＴＰを再生する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
（ａ）パントテン酸キナ−ゼが固定されているか、または、（ｂ）パントテン酸キナ−ゼと酢酸キナ−ゼが固定されている、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
化合物４
【化１９】
2021530479.tif 000069
を合成する方法であって、化合物３
【化２０】
2021530479.tif 000070
を、ガラクト−スオキシダ−ゼ、銅、カタラ−ゼ、およびペルオキシダ−ゼ、または酸化剤と、酸素の存在下、緩衝溶液中で組み合わせて、化合物４を生成させることを含む、前記方法。
【請求項２９】
ガラクト−スオキシダ−ゼが固定されている、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
化合物４
【化２１】
2021530479.tif 000071
を単離する方法であって、
（１）酸素の不在下で、水と混和しない有機溶媒中で安定なＮ，Ｎ−アセタ−ルまたはＮ，Ｏ−アセタ−ルを生成するアミン、ジアミンまたはアミノアルコ−ルと化合物４を反応させてアミナ−ルを形成し、
（２）水と混和しない有機溶媒の存在下でアミナ−ルを有機酸または無機酸と反応させて化合物４を再生することを含む、前記方法。
【請求項３１】
化合物５
【化２２】
2021530479.tif 000072
［式中、２Ｘ＋は（ａ）２つのプロトン、（ｂ）１つのプロトンと１つの１価カチオン、（ｃ）同一または異なる２つの１価カチオン、または（ｄ）１つの２価カチオンである。］
を合成する方法であって、化合物９
【化２３】
2021530479.tif 000073
［式中、２Ｘ＋は（ａ）２つのプロトン、（ｂ）１つのプロトンと１つの１価カチオン、（ｃ）同一または異なる２つの１価カチオン、または（ｄ）１つの２価カチオンである。］
を、酸素、カタラ−ゼおよびペルオキシダ−ゼもしくは化学酸化剤のいずれかの存在下で、緩衝液中のガラクト−スオキシダ−ゼと組み合わせて化合物５を生成することを含む、前記方法。
【請求項３２】
化合物９
【化２４】
2021530479.tif 000074
［式中、２Ｘ＋は（ａ）２つのプロトン、（ｂ）１つのプロトンと１つの１価カチオン、（ｃ）同一または異なる２つの１価カチオン、または（ｄ）１つの２価カチオンである。］
を合成する方法であって、化合物３
【化２５】
2021530479.tif 000075
を、２価金属塩の存在下で緩衝液中のパントテン酸キナ−ゼと組み合わせ、その場で再生したＡＴＰをリン酸源として組み合わせて、化合物９を生成する前記方法。
【請求項３３】
下記式の化合物。
【化２６】
2021530479.tif 000076
【請求項３４】
下記式の化合物。
【化２７】
2021530479.tif 000077
【請求項３５】
下記式の化合物。
【化２８】
2021530479.tif 000078
［式中、２Ｘ＋は（ａ）２つのプロトン、（ｂ）１つのプロトンと１つの１価カチオン、（ｃ）同一または異なる２つの１価カチオン、または（ｄ）１つの２価カチオンである。］
【請求項３６】
下記式の化合物。
【化２９】
2021530479.tif 000079
［式中、２Ｘ＋は（ａ）２つのプロトン、（ｂ）１つのプロトンと１つの１価カチオン、（ｃ）同一または異なる２つの１価カチオン、または（ｄ）１つの２価カチオンである。］
【請求項３７】
下記式の化合物。
【化３０】
2021530479.tif 000080
［式中、２Ｘ＋は（ａ）２つのプロトン、（ｂ）１つのプロトンと１つの１価カチオン、（ｃ）同一または異なる２つの１価カチオン、または（ｄ）１つの２価カチオンである。］
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
【０００２】
４’−エチニル２’−デオキシヌクレオシド類似体は、ＨＩＶ、ＡＩＤＳおよび関連疾患に対する活性について知られている。
【化１】
2021530479.tif 000002
【０００３】
４’−エチニルヌクレオシド類似体の一例は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（Ｋａｗａｍｏｔｏ、Ｅ．、Ｓａｒａｆｉａｎｏｓ  Ｓ．  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．；  ４０（１１）：２４１０−２０［２００８］；  Ｏｈｒｕｉ、Ｈ．、Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ、２６，  １５４３−１５４６［２００７］）  およびｉｎ  ｖｉｖｏ  （Ｈａｔｔｏｒｉ、Ｓ．、Ｋ．、Ｎａｋａｔａ、Ｈ．  ｅｔ  ａｌ，  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ．  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，  ５３，  ３８８７−３８９３  ［２００９］）でのＨＩＶ−１およびＳＩＶウイルス複製を遮断するヌクレオシド逆転写酵素トランスロケ−ション阻害剤である、４’−エチニル２’−デオキシアデノシン（ＥＦｄＡ、別名ＭＫ−８５９１）である。ＥＦｄＡは、米国特許第７，３３９，０５３号（特許第’０５３号では、２’−デオキシ−４’−Ｃ−エチニル２−フルオロアデノシンと称されている）でクレ−ムされている。ＥＦｄＡは次のような化学構造をもつ。
【化２】
2021530479.tif 000003
【０００４】
ＥＦｄＡは細胞内で代謝され、ＨＩＶ逆転写酵素を阻害する活性三リン酸アナボライトになる。入ってくるヌクレオチドの結合を阻害する３’−ＯＨ基を欠く、ＨＩＶ感染症の治療に現在利用可能なヌクレオシド系逆転写酵素阻害薬（ＮｓＲＴＩ）やヌクレオチド系逆転写酵素阻害薬（ＮｔＲＴＩ）とは対照的に、ＥＦｄＡは３’−ＯＨ基を保持し、逆転写酵素（ＲＴ）活性部位におけるプライマ−：鋳型の転座を妨げ、入ってくるデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の結合を妨げることにより、鎖タ−ミネ−タ−として作用する。さらに、ＥＦｄＡの修飾リボ−ス環のパッカ−は、入ってくるヌクレオチドからのリン酸基転移が効率的でないベクタ−に３’−ＯＨを配置することにより、逆転写酵素の阻害に寄与すると考えられている。（Ｍｉｃｈａｉｌｉｄｉｓ  Ｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｂｙ  ４’−ethynyl−２−ｆｌｕｏｒｏ−２’−ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉphospate，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８４：３５６８１−３５６９１  ［２００９］；  Ｍｉｃｈａｉｌｉｄｉｓ  Ｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  ４’−ethynyl−２−ｆｌｕｏｒｏ−２’−ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ  （ＥＦｄＡ）  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ＨＩＶ−１  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８９：２４５３３−２４５４８  ［２０１４］）。
【０００５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＨＩＶ複製アッセイでは、ＥＦｄＡは強力な抗レトロウイルス薬であり、評価された全てのサブタイプにわたって臨床分離株に対して同等の抗ウイルス活性を示す。これは、リンパ系由来細胞株および末梢血単核細胞のいずれにおいても、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで速やかに活性三リン酸に同化され、ＥＦｄＡ三リン酸（ＥＦｄＡ−ＴＰ）の細胞内半減期は７２時間を超える。（Ｓｔｏｄｄａｒｔ，  Ｃ．  Ａ．，  Ｇａｌｋｉｎａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｒａｌ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ＥＦｄＡ  （４’−エチニル−２−Ｆｌｕｏｒｏ−２’−Ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ）  Ｐｒｏｖｉｄｅｓ  Ｒａｐｉｄ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＨＩＶ  Ｖｉｒｅｍｉａ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ｍｉｃｅ  ａｎｄ  Ｆａｖｏｒａｂｌｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｒｈｅｓｕｓ  Ｍａｃａｑｕｅ，  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，  ２０１５  Ｊｕｌ；  ５９（７）：  ４１９０−４１９８，オンライン２０１５年５月４日発行）。
【０００６】
ＥＦｄＡは、ヒト化マウスモデルおよびＳＩＶ感染アカゲザルモデルを含むＨＩＶ感染の動物モデルにおいて有効性を有することが示されている。マウスおよびアカゲザルに経口投与したＥＦｄＡの薬物動態試験では、速やかな吸収と高い血漿中濃度が示されている。アカゲザルから分離した末梢血単核細胞は、薬剤投与２４時間後にＳＩＶ感染に不応であったことから、長い細胞内半減期が示された。（同書）
【０００７】
ＥＦｄＡを含む４’−エチニルヌクレオシド類似体の従来の合成は、エチニルデオキシリボ−ス糖と２−フルオロアデニン（２−フルオロ−９Ｈ−プリン−６−アミンとも呼ばれる）ヌクレオ塩基との間のＣ−Ｎ結合の形成における低い立体選択性に悩まされている。従来の合成では、合成効率を低下させるグリコシル化反応を行うために保護基も必要である。
【０００８】
（Ｋｅｉ  Ｆｕｋｕｙａｍａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ    ＥＦｄＡ  ｖｉａ  ａ  Ｄｉａｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ａｌｄｏｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ３−Ｋｅｔｏ  Ｆｕｒａｎｏｓｅ，  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０１５，  １７（４），  ｐｐ．  ８２８−８３１；  ＤＯＩ：  １０．１０２１／ｏｌ５０３６５３５）に記載されている合成は、ジアステレオ選択的反応を用いて３つの立体中心を設定する、Ｄ−グルコ−スジアセトニドからの１４工程合成である。アノマ−中心の立体化学は、続いて加水分解と脱酸素によって除去される２′−アセトキシ配向基をもつことによって制御される。この経路には４回のクロマトグラフィ−による精製と、後期脱酸素に有毒な有機スズ試薬の化学量論的使用が必要である。
【０００９】
別の経路（Ｍａｒｋ  ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，    Ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ４′−ethyny.−２−ｆｌｕｏｒｏ−２′−ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ  （ＥＦｄＡ）  ｖｉａ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｄｅｓｙｍｍｅｔｒｉｚａｔｉｏｎ，  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０１７，  １９  （４），  ｐｐ．  ９２６−９２９参照）では、酵素による非対称化により立体選択的に完全置換４′カルビノ−ルが生成される。３’−立体中心は触媒的不斉移動水素化で設定され、アノマ−１’−結合は基質制御を用いて適度な立体選択性で確立され、立体化学的純度の向上は中間体の結晶化により達成される。この過程には１５工程を要し、保護基の使用が必要であり、低立体選択性（１．８：１）でヌクレオ塩基と糖断片の間のグリコシル結合を生成する。
【００１０】
Ｒ−グリセルアルデヒドアセトニドからＥＦｄＡを製造するための１２工程の合成が、Ｋａｇｅｙａｍａ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｎｔｉ−ＨＩＶ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ＥＦｄＡ，  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  ２０１２  ，  ７６，  ｐｐ．  １２１９  ー１２２５；  および  Ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｏｔｅｎｔ  Ａｎｔｉ−ＨＩＶ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ＥＦｄＡ，  Ｍａｓａｙｕｋｉ  Ｋａｇｅｙａｍａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０１１  １３  （１９），  ｐｐ．  ５２６４−５２６６  ［ＤＯＩ：  １０．１０２１／ｏｌ２０２１１６ｋ］に記載されている。この合成はキラルな出発物質を用いて、中程度のジアステレオ選択性をもつ３’立体中心を設定する。立体異性体をクロマトグラフィ−で分離した後、新しい立体中心を用いてジアステレオ選択的アルキン付加を誘導し、完全置換４′−立体中心を設定する。アノマ−１′−位は立体制御が少なく、アノマ−を分離するにはクロマトグラフィ−が必要である。この経路では、二つの異なる段階でジアステレオ異性体をクロマトグラフィ−で分離する必要があり、高価なキラル出発物質から出発する。
【００１１】
Ｋｏｈｇｏ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｓｉｇｎ，  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ａｎｄ  Ａｎｔｉ−ＨＩＶ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ４′−Ｃ−Ｃｙａｎｏ−  ａｎｄ  ４′−Ｃ−ethynyl−２′−ｄｅｏｘｙ  Ｐｕｒｉｎｅ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，  ２００４，  ２３，  ｐｐ．  ６７１−６９０  ［  ＤＯＩ：  １０．１０８１／ＮＣＮ−１２００３７５０８］は、既存のヌクレオシドから開始し、糖部分およびヌクレオ塩基部分の両方を修飾する合成経路を記載している。２−アミノ−２′−デオキシアデノシンから始まる１８工程の合成で、全収率は２．５％と低い。
【００１２】
プリンヌクレオシドホスホリラ−ゼ（ＰＮＰ、ＥＣ  ２．４．２．１）のような酵素は、高い立体選択性で、保護基を使用せずに、ヌクレオシドおよびヌクレオシド類似体中でグリコシル結合を形成できることが知られている。例えば、総説Ｎｅｗ  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，    Ｍｉｋｈａｉｌｏｐｕｌｏ，  Ｉ．Ａ．，  Ｍｉｒｏｓｈｎｉｋｏｖ，  Ａ．Ｉ，．  Ａｃｔａ  Ｎａｔｕｒａｅ  ２０１０，  ２，  ｐｐ．  ３６−５８．を参照。しかし、ＰＮＰによって触媒される反応を受けることができる糖断片の現在の範囲は、天然リボ−スおよびデオキシリボ−スのα−１−リン酸体とＣ２’およびＣ３’位置における小さなＨ、ＮＨ２、またはＦ置換基およびＣ５’  ＯＨ基の置換体を有する少数の類似体に限定されている。環上に炭素置換基をもつ糖、あるいはＣ４’位に何らかの置換を用いるＰＮＰによって触媒されるグリコシル化に成功した報告はない。
【００１３】
ＰＮＰ触媒グリコシル化のためのリボ−スおよびデオキシリボ−スα−１−リン酸基質へのアクセスは、酵素ホスホペントムタ−ゼ（ＰＰＭ、ＥＣ  ５．４．２．７）による５’−ヒドロキシル位から１’−ヒドロキシル位へのリン酸基の移動によって示されている（Ｍｉｋｈａｉｌｏｐｕｌｏ、Ｉ．Ａ．前出参照）。しかし、この反応を触媒することができる糖の範囲は、リボ−ス、アラビノ−ス、２−デオキシリボ−ス、および２，３−ジデオキシリボ−スに限定されている。他の置換基を含む糖リン酸との反応に成功した例は報告されていない。
【００１４】
デオキシリボ−スリン酸アルドラ−ゼ（ＤＥＲＡ、ＥＣ  ４．１．２．４）酵素は、他の短鎖アルデヒドへのアセトアルデヒドのアルド−ル付加を触媒することが知られている（総説：  Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｍ．  Ｄｅａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｌｄｏｌａｓｅ−Ｃａｔａｌ−Ｃａｔｈ．  Ｓｙｎｔｈ．  Ｃａｔａｌ．  ２００７，  ３４９，  ｐｐ．  １３０８  −  １３２０；  ＤＯＩ：  １０．１００２／ａｄｓｃ．２００７００１１５を参照）。しかし、アルデヒドへの完全置換炭素αを有するアルデヒドでの例は報告されていない。
【００１５】
米国特許７，２２９，７９７号は、プリンヌクレオシドホスホリラ−ゼ（ＰＮＰ）の使用により、さらにスクロ−スホスホリラ−ゼのような酵素を使用して無機リン酸副生成物を除去し、平衡を駆動することにより、天然の非置換デオキシリボ−ス１−リン酸からデオキシリボヌクレオシドを生成することを記載している。当文献は、非天然の４−エチニルＤ−２−デオキシリボ−ス１−リン酸からヌクレオシドを生成することができるＰＮＰ酵素の創製のための酵素工学を開示しておらず、また、ＰＰＭおよびＤＥＲＡ酵素の工学を介して、非天然の基質に作用するために、４−エチニルＤ−２−デオキシリボ−ス１−リン酸を生成することができるＰＮＰ酵素も開示していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国特許第７，３３９，０５３号
【特許文献２】米国特許７，２２９，  ７９７号
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｋａｗａｍｏｔｏ、Ｅ．、Ｓａｒａｆｉａｎｏｓ  Ｓ．  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．；  ４０（１１）：２４１０−２０［２００８］；
【非特許文献２】Ｏｈｒｕｉ、Ｈ．、Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ、２６，  １５４３−１５４６［２００７］）
【非特許文献３】Ｈａｔｔｏｒｉ、Ｓ．、Ｋ．、Ｎａｋａｔａ、Ｈ．  ｅｔ  ａｌ，  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ．  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，  ５３，  ３８８７−３８９３  ［２００９］
【非特許文献４】Ｍｉｃｈａｉｌｉｄｉｓ  Ｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｂｙ  ４’−ethynyl−２−ｆｌｕｏｒｏ−２’−ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｔｒiphosphate，    Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８４：３５６８１−３５６９１  ［２００９］
【非特許文献５】Ｍｉｃｈａｉｌｉｄｉｓ  Ｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  ４’−エチニル−２−ｆｌｕｏｒｏ−２’−ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ  （ＥＦｄＡ）  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ＨＩＶ−１  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８９：２４５３３−２４５４８  ［２０１４］）
【非特許文献６】Ｓｔｏｄｄａｒｔ，  Ｃ．  Ａ．，  Ｇａｌｋｉｎａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｒａｌ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ＥＦｄＡ  （４’−ethynyl−２−Ｆｌｕｏｒｏ−２’−Ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ）  Ｐｒｏｖｉｄｅｓ  Ｒａｐｉｄ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＨＩＶ  Ｖｉｒｅｍｉａ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ｍｉｃｅ  ａｎｄ  Ｆａｖｏｒａｂｌｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｒｈｅｓｕｓ  Ｍａｃａｑｕｅ，  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，  ２０１５  Ｊｕｌ；  ５９（７）：  ４１９０−４１９８，オンライン２０１５年５月４日発行
【非特許文献７】Ｋｅｉ  Ｆｕｋｕｙａｍａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ    ＥＦｄＡ  ｖｉａ  ａ  Ｄｉａｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ａｌｄｏｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ３−Ｋｅｔｏ  Ｆｕｒａｎｏｓｅ，  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０１５，  １７（４），  ｐｐ．  ８２８−８３１；  ＤＯＩ：  １０．１０２１／ｏｌ５０３６５３５
【非特許文献８】Ｍａｒｋ  ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，    Ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ４′−ethynyl−２−ｆｌｕｏｒｏ−２′−ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ  （ＥＦｄＡ）  ｖｉａ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｄｅｓｙｍｍｅｔｒｉｚａｔｉｏｎ，  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０１７，  １９  （４），  ｐｐ．  ９２６−９２９
【非特許文献９】Ｋａｇｅｙａｍａ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｎｔｉ−ＨＩＶ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ＥＦｄＡ，  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  ２０１２  ，  ７６，  ｐｐ．  １２１９  ー１２２５
【非特許文献１０】Ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｏｔｅｎｔ  Ａｎｔｉ−ＨＩＶ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ＥＦｄＡ，  Ｍａｓａｙｕｋｉ  Ｋａｇｅｙａｍａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０１１  １３  （１９），  ｐｐ．  ５２６４−５２６６  ［ＤＯＩ：  １０．１０２１／ｏｌ２０２１１６ｋ］
【非特許文献１２】Ｋｏｈｇｏ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｓｉｇｎ，  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ａｎｄ  Ａｎｔｉ−ＨＩＶ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ４′−Ｃ−Ｃｙａｎｏ−  ａｎｄ  ４′−Ｃ−ethynyel−２′−ｄｅｏｘｙ  Ｐｕｒｉｎｅ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，  ２００４，  ２３，  ｐｐ．  ６７１−６９０  ［  ＤＯＩ：  １０．１０８１／ＮＣＮ−１２００３７５０８］
【非特許文献１３】Ｎｅｗ  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，    Ｍｉｋｈａｉｌｏｐｕｌｏ，  Ｉ．Ａ．，  Ｍｉｒｏｓｈｎｉｋｏｖ，  Ａ．Ｉ，．  Ａｃｔａ  Ｎａｔｕｒａｅ  ２０１０，  ２，  ｐｐ．  ３６−５８．
【非特許文献１４】Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｍ．  Ｄｅａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｌｄｏｌａｓｅ−Ｃａｔａｌ−Ｃａｔｈ．  Ｓｙｎｔｈ．  Ｃａｔａｌ．  ２００７，  ３４９，  ｐｐ．  １３０８  −  １３２０；  ＤＯＩ：  １０．１００２／ａｄｓｃ．２００７００１１５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
４’−エチニルヌクレオシド類似体を製造するために現在までに開発された困難で長時間の合成オプションを考慮すると、プロセス工程の数を減らし、保護基の使用を最小限にし、グリコシル化の立体選択性を改善し、毒性物質の使用を回避する、ＥＦｄＡのような４’−エチニルヌクレオシド類似体のための改良された酵素合成を開発することが望ましいであろう。
【発明を解決するための手段】
【００１９】
驚くべきことに、ＰＰＭ酵素はリボ−ス上の４’位にある３−原子エチニル置換基に活性を有し、当該酵素に突然変異を導入することにより、ＰＰＭ酵素活性を改善し、ＰＰＭによって触媒された４−エチニルＤ−２−デオキシリボ−ス５−リン酸（６．）の異性化反応を成功裏に開発することができ、より効率的な４’−エチニル２−デオキシヌクレオシドの産生方法が可能となることが見いだされた。
【００２０】
さらに、ＰＮＰエンザイムは、デオキシリボ−ス上の４位にある３原子エチニル置換基に活性を有しており、当該酵素に突然変異を導入することにより、ＰＰＭ酵素活性を改善し、ＰＰＭによって触媒された糖修飾反応を改善し、より効率的な４’−エチニル２−デオキシヌクレオシドの産生方法が可能となることも見いだされた。
【００２１】
全体的な合成方法への更なる改良は、ＤＥＲＡ酵素、特にＳｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｈａｌｉｆａｘｅｎｓｉｓ由来のＤＥＲＡが、完全置換α−炭素を有する２−エチニル−グリセルアルデヒド３−リン酸とのアルド−ル反応の活性を有するという知見からもたらされた。この発見は、例えばＥＦｄＡを含む４’−エチニル２’−デオキシヌクレオシド類似体の前駆体である４−エチニルＤ−２−デオキシリボ−ス５−リン酸の効率的な合成を可能にした。
【００２２】
発明の概要
【００２３】
本発明は、中間体上の保護基の使用を排除し、グリコシル化の立体選択性を改善し、他のプロセス改善の中でもとりわけ、以前の方法と比較して前記化合物を作製するために必要とされるプロセス工程の数を大幅に減少させる、ＥＦｄＡを含む、４’−エチニル２’−デオキシヌクレオシド類似体の新規な酵素合成における操作された酵素の使用を含む。本発明は更に、酵素プロセスの不可欠な部分である新規中間体に関するものである。
【００２４】
全体的なプロセスは、以下の反応式１および反応式２に要約される。後者の反応式は、化合物５を作製するための代替的な方法を提供する。
【００２５】
【化３】
2021530479.tif 000004
【００２６】
【化４】
2021530479.tif 000005
【００２７】
リン酸中間体の酸形態または塩が、本明細書に記載されるプロセスにおいて使用することができ、本明細書のプロセス段階の例示で提供される特定の酸形態または塩形態に限定されるものではない。本明細書に記載される全てのリン酸中間体について、２Ｘ＋は、２つのプロトン、１つのプロトンと１つの他の一価のカチオン、２つの一価のカチオン（同一または異なる）または１つの二価のカチオンの任意の組み合わせを表す。
【００２８】
同様に、−ＨＯ３ＰＯで示されたリン酸中間体は、２つのプロトン、１つのプロトンと１つの他の一価のカチオン、２つの一価のカチオン（同一または異なった）または１つの二価のカチオンの任意の組合せを有することができる。例としては、カルシウム、マグネシウム、または亜鉛の塩；モノまたはジナトリウム塩、モノまたはジカリウム塩、モノまたはジリチウム塩；モノまたはジアンモニウム塩；または第一級、第二級または第三級アミンを有する一価または二価の塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
当技術分野でよく理解されているように、本明細書中の合成工程においてアルデヒドまたは水和物として本明細書中に示されるかまたは命名される中間化合物は、本明細書中に記載される反応において、そのような形態のいずれかの形態またはそのような形態の混合物で存在し得る。例えば、化合物（４）および（５）は、それぞれ反応式１において水和物およびアルデヒドとして描かれているが、それぞれが存在する反応段階において、水和物またはアルデヒド形態またはそれらの混合物として存在することができる。このような形態の各々は、本明細書の工程内の化合物番号（４）または（５）を参照することによって包含される。
【００３０】
【化５】
2021530479.tif 000006
【００３１】
化合物（３）はアキラルであり、本明細書中では以下のいずれかで示され得る。
【化６】
2021530479.tif 000007
【００３２】
化合物（６）は、その環状または開鎖アルデヒドもしくは水和物として、それぞれが存在する反応段階において、酸またはその塩として存在することができる。
【化７】
2021530479.tif 000008
【００３３】
発明の詳細な説明
【００３４】
アノマ−Ｃ−Ｎ結合を有する４−エチニル２−デオキシ核酸及びその類似体
【化８】
2021530479.tif 000009
は、ＨＩＶ、ＡＩＤＳおよび関連疾患に対する活性について探求されている。４’−エチニル２’−デオキシヌクレオシドおよびその類似体は、プリンまたはピリミジンヌクレオ塩基（アデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシル）または修飾プリンまたはピリミジンヌクレオ塩基へのアノマ−Ｃ−Ｎ結合を介して結合した４’−エチニル２’−デオキシリボ−スを含む。
【００３５】
４−エチニル２’−デオキシヌクレオシド類似体、例えばＥＦｄＡは、４−エチニルＤ−２−デオキシリボ−ス５−リン酸（６）と２つの酵素、ホスホペントムタ−ゼ（ＰＰＭ）  ［例えば、配列番号：８。但しこれに限定されない］およびプリンヌクレオシドホスホリラ−ゼ（ＰＮＰ）  ［例えば、配列番号：９、配列番号：１５］とを組み合わせることにより、最終段階のワンポット法を用いて合成できることが、反応式２に示されている。
【化９】
2021530479.tif 000010
【化１０】
2021530479.tif 000011
【００３６】
反応式２に示すように、合成の最終段階では、（３番目の酵素を用いてもよい）２酵素反応を用いて、反応の平衡を目的の最終生成物に向かわせる。最終段階は、化合物（６）またはその塩で始まり、ここで（６）は、上記のような環状の４−エチニル２−デオキシリボ−ス５−リン酸またはその開鎖アルデヒドもしくは水和物の形態である。
【００３７】
化合物（６）は、マンガン（ＩＩ）塩を含み適宜ｐＨ約６．５〜８．０、またはそれ以上、特に約７．０〜７．５の範囲に調整された緩衝溶液中で、ホスホペントムタ−ゼ（ＰＰＭ）、プリンヌクレオシドホスホリラ−ゼ（ＰＮＰ）、スクロ−スホスホリラ−ゼ、スクロ−ス、および非置換または置換アデニンなどのヌクレオ塩基と組み合わせられる。ショ糖：化合物（６）のモル比は、約１：１から４：１までであり得るが、これに限定されない。このワンポット反応の成分は、任意の順序で組み合わせることができる。
【００３８】
反応は、酵素を変性させない温度範囲内、例えば約３０〜４５℃で撹拌し、より詳細には約３５〜４５℃で撹拌する。ある程度までは、より冷たい温度で反応することがあるが、反応速度を遅くするであろう。
【００３９】
適切なｐＨを有し、マンガン（ＩＩ）塩を含有する任意の緩衝液が、反応において使用され得る。このような緩衝剤の例としては、トリエタノ−ルアミン；  ＰＩＰＥＳ、例えば、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）；  ＭＯＰＳ、例えば、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸または３−モルホリノプロパン−１−スルホン酸；  ＨＥＰＥＳ、例えば、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸または２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸；  ＴＲＩＳ、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンまたは２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオ−ル；およびＢＩＳ−ＴＲＩＳメタン、例えば、２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３ジオ−ルである。特に、緩衝液はトリエタノ−ルアミンである。緩衝剤中のマンガン（ＩＩ）塩分は、例えば、塩化マンガン、塩化マンガン水和物、臭化マンガン、ヨウ化マンガン、硝酸マンガン、および／または硫酸マンガンなどである。緩衝液中のマンガン濃度は約０．０５ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲にあり、特に約５ｍＭである。
【００４０】
平衡反応は、スクロ−スをＤ−フルクト−スとα−Ｄ−グルコ−ス−１−リン酸にリン酸化分解することによって、副生成物である無機リン酸塩を消費することによって最終生成物の高い変換に前進させることができる。これは、反応混合物に添加されたスクロ−スホスホリラ−ゼ（ＥＣ  ２．４．１．７）によって触媒される。しかし、スクロ−スホスホリラ−ゼおよびスクロ−スを用いる代わりに、リン酸塩を除去するための他の任意の選択肢、例えば、反応へのカルシウム、マグネシウム、またはマンガンの添加を用いてリン酸塩を沈殿させることができる。この非常に効率的で生態に優しい過程は、保護基や有機溶媒を使わずに非常に高い立体選択性で糖とヌクレオ塩基との間にアノマ−結合を形成し、ワンポット反応として行うことができるという利点がある。
【００４１】
一旦反応が完了すると、最終生成物の結晶化による単離および濾過による収集、または適当な溶媒への抽出後の結晶化など、限定されるわけではないが、当業者に知られている標準的な手順を用いて、最終生成物を単離することができる。
【００４２】
反応式２Ａに示すように、合成の最終段階では、（第４の酵素を用いてもよい）３酵素反応を用いて、反応の均衡を所望の最終生成物に向かって駆動することができる。最終段階は化合物（５）またはその塩で始まり、ここで（５）は（Ｒ）−２−エチニルグリセルアルデヒド３−リン酸またはその水和物の形態である。
【００４３】
化合物（５）は、マンガン（ＩＩ）塩を含み適宜ｐＨを約４〜１０の範囲、または特に約６．５〜８．０、またはそれ以上、特に約７．０〜７．５の範囲に調整された緩衝溶液中で、デオキシリボ−ス−リン酸アルドラ−ゼ（ＤＥＲＡ）、アセトアルデヒド、ホスホペントムタ−ゼ（ＰＰＭ）、プリンヌクレオシドホスホリラ−ゼ（ＰＮＰ）、スクロ−スホスホリラ−ゼ、スクロ−ス、およびそれらのヌクレオ塩基または類似体、例えば非置換または置換アデニンと組み合わせられる。ショ糖：化合物（５）のモル比は、約１：１から４：１までであり得るが、これに限定されない。このワンポット反応の成分は、任意の順序で組み合わせることができる。
【００４４】
反応は、酵素を変性させない温度範囲内、例えば、約３０〜４５℃、または特に約３５〜４５℃で行われる。ある程度までは、より冷たい温度が働くことがあるが、反応速度を遅くするであろう。
【００４５】
アセトアルデヒドを溶液として加え、特に、イソプロピルアルコ−ル中の４０重量％溶液として加える。反応には、アセトアルデヒドまたはニ−ト（ｎｅａｔ）アセトアルデヒドの任意の適当な溶液を用いることができる。このような溶液の例としては、イソプロパノ−ル中のアセトアルデヒド溶液、エタノ−ル中のアセトアルデヒド溶液、水中のアセトアルデヒド溶液、ＴＨＦ中のアセトアルデヒド溶液が挙げられるが、これらに限定されない。アルデヒド：化合物（５）のモル比は、限定されるわけではないが、約０．５：１〜４：１、より詳細には１．５：１とすることができる。
【００４６】
適切なｐＨを有し、マンガン（ＩＩ）塩を含有する任意の緩衝液が、反応において使用され得る。このような緩衝剤の例としては、トリエタノ−ルアミン；  ＰＩＰＥＳ、例えば、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）；  ＭＯＰＳ、例えば、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸または３−モルホリノプロパン−１−スルホン酸；  ＨＥＰＥＳ、例えば、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸または２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸；  ＴＲＩＳ、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンまたは２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオ−ル；およびＢＩＳ−ＴＲＩＳメタン、例えば、２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオ−ルが含まれる。特に、緩衝液はトリエタノ−ルアミンである。緩衝剤中のマンガン（ＩＩ）塩分は、例えば、塩化マンガン、塩化マンガン水和物、臭化マンガン、ヨウ化マンガン、硝酸マンガン、および／または硫酸マンガンなどである。緩衝液中のマンガン濃度は約０．０５ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲にあり、特に約５ｍＭである。
【００４７】
平衡反応は、スクロ−スをＤ−フルクト−スとα−Ｄ−グルコ−ス−１−リン酸にリン酸化分解することによって、副生成物である無機リン酸塩を消費することによって最終生成物の高い変換に前進させることができる。これは、反応混合物に添加されたスクロ−スホスホリラ−ゼ（ＥＣ  ２．４．１．７）によって触媒される。しかし、スクロ−スホスホリラ−ゼおよびスクロ−スを用いる代わりに、リン酸塩を除去するための他の任意の選択肢、例えば、反応へのカルシウム、マグネシウム、またはマンガンの添加を用いて、リン酸塩を沈殿させることができる。この非常に効率的で生態に優しい過程は、保護基や有機溶媒を使わずに非常に高い立体選択性で糖とヌクレオ塩基との間にアノマ−結合を形成し、ワンポット反応として行うことができるという利点がある。
【００４８】
一旦反応が完了すると、最終生成物の結晶化による単離および濾過による収集、または適当な溶媒への抽出後の結晶化など、限定されるわけではないが、当業者に知られている標準的な手順を用いて、最終生成物を単離することができる。
【００４９】
最終生成物４’−エチニル２’−デオキシヌクレオシドおよびその類似体の合成のための本工程で使用されるいくつかの上流中間体も、反応式３（反応式３Ａおよび反応式３Ｂ）に示すような酵素反応法を用いて製造される。
【化１１】
2021530479.tif 000012
【化１２】
2021530479.tif 000013
【化１３】
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【００５０】
化合物４：オキシダ−ゼ反応
【００５１】
反応式３に示すように、（Ｒ）−２−エチニルグリセルアルデヒド（４）は、ガラクト−スオキシダ−ゼと２−エチニルプロパン−１，２，３−トリオ−ル（３）とを、ｐＨが約３〜１０、あるいはそれ以上、特に約６〜８の範囲になるように適宜調整した緩衝液中で反応させて調製する。適当なｐＨ範囲を有する任意の緩衝液、例えば、リン酸ナトリウム；酢酸ナトリウム；  ＰＩＰＥＳ、例えば、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）；  ＭＯＰＳ、例えば３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸または３−ピペラジンエタンスルホン酸；  ＨＥＰＥＳ、例えば４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンスルホン酸または２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸；  ＴＲＩＳ、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンまたは２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオ−ル；およびＴＲＩＳメタン、例えば２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオ−ル；ホウ酸；  ＣＡＰＳ、例えばＮ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸；  ＭＥＳ、例えば２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸；  ＣＨＥＳ、例えば、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸、グリシン、またはビシン（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン）；リン酸ナトリウムが好ましい。
【００５２】
銅とペルオキシダ−ゼは両方ともガラクト−スオキシダ−ゼ（ＧＯａｓｅ）を活性化する反応に使われる。銅はＣｕＳＯ４、Ｃｕ（ＯＡｃ）２、ＣｕＣｌ２、Ｃｕ（ＩＩ）またはＣｕ（Ｉ）の他の塩を加えることによって反応混合物に供給される。ペルオキシダ−ゼは西洋ワサビペルオキシダ−ゼ、または他の生物に由来するペルオキシダ−ゼであってもよいし、フェリシアニド、イリデ−ト、マンガン（ＩＩＩ）塩、過硫酸塩および他の１つまたは２つの電子酸化剤、または無機または有機酸化剤などの酸化剤によって置換することができる。好ましくは、ペルオキシダ−ゼは西洋ワサビペルオキシダ−ゼである。ＧＯａｓｅの不活性化を防ぐためにカタラ−ゼも加えられる。カタラ−ゼは、哺乳動物源（ウシ）から、またはコリネバクテリウム、アスペルギルス、またはこの目的のために当該技術分野で知られている他の生物などの細菌または真菌源からのものであり得る。
【００５３】
反応は酸素の存在下で進行する。１つの便利な方法は、空気との反応をスパ−ジ（ｓｐａｒｇｅ）することである。あるいは、過酸化水素／カタラ−ゼ、ス−パ−オキシド、またはこの目的のための当該分野で公知の他の方法の使用などの、酸素を生成するための他のシステムを使用することができる。
【００５４】
反応は、基質濃度が１０〜１８０ｇ／Ｌ程度、特に２０〜５０ｇ／Ｌ程度で行うことができる。この反応は約０〜４０℃、特に約１０〜３０℃の温度で行うことができる。
【００５５】
化合物８：アミナ−ル生成
【００５６】
反応式３Ａに例示されるように、（Ｒ）−２−エチニル−グリセルアルデヒド（４）は、それを、安定なＮ，Ｎ−アセタ−ルまたはＮ，Ｏ−アセタ−ルを形成する任意のアミン、ジアミンまたはアミノアルコ−ル、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエタン−１，２−ジアミン、Ｎ，Ｎ’−ジメチルエタン−１，２−ジアミン、Ｎ，Ｎ’−ジフェニルエタン−１，２−ジアミン、およびＮ−ベンジルエタノ−ルアミンと反応させることによって、そのアミン形態（例えば、化合物８）で単離することができるが、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエタン−１，２−ジアミンが好ましい。反応は、アミナ−ルの分解を避けるために、有機溶媒中、約５０℃以下、好ましくは２０〜３０℃の温度で行われる。水と混和しない任意の溶媒、例えば、ＭＴＢＥ、２−ＭｅＴＨＦ、ＣＰＭＥ、ジエチルエ−テル、ジイソプロピルエ−テル、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、トルエン、ＤＣＭ、またはこれらの混合物を用いることができるが、これらに限定されない。反応は、基質濃度が１０〜１００ｇ／Ｌ程度、特に２０〜５０ｇ／Ｌ程度で行うことができる。
【００５７】
任意に、有機溶媒、例えばＭＴＢＥ、２−ＭｅＴＨＦ、ＣＰＭＥ、ジエチルエ−テル、ジイソプロピルエ−テル、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、トルエン、ＤＣＭまたはこれらの混合物から結晶化することによりアミナ−ルをさらに精製することができ、ＭＴＢＥが好ましい。結晶化はアミナ−ルの分解を避けるために、例えば約４０℃で５０℃以下で行われる。
【００５８】
反応は酸素不在で進行する。１つの簡便な方法は、Ｎ２による反応の注入撹拌（ｓｐａｒｇｅ）である。あるいは、アルゴン、ヘリウム、またはこのために当技術分野で知られている他の方法の使用のような、酸素を排除するための他のシステムを使用することができる。
【００５９】
化合物４：アミナ−ル８からのアルデヒド４の再生
【００６０】
（Ｒ）−２−エチニルグリセルアルデヒド（４）は、アミナ−ルの分解を避けるために、水と混和しない有機溶媒の存在下、５０℃以下の温度、例えば約０〜１５℃で、有機または無機酸と反応させることによって、それぞれのアミナ−ルから再生することができる。任意の有機酸または無機酸、例えば、ｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、カンホレスルホン酸、酢酸、塩酸、リン酸、硫酸が使用され得るが、これらに限定されない。Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエタン−１，２−ジアミンビスｐ−トルエンスルホン酸塩の水への溶解度が低いため、アミナ−ル８との反応ではｐ−トルエンスルホン酸が好ましい。水と混和しない任意の溶媒、例えば、ＭＴＢＥ、２−ＭｅＴＨＦ、ＣＰＭＥ、ジエチルエ−テル、ジイソプロピルエ−テル、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、トルエン、ＤＣＭまたはこれらの混合物；ＭＴＢＥおよび２−ＭｅＴＨＦが好ましい。反応は、約５〜１００ｇ／Ｌ、特に２０〜５０ｇ／Ｌの基質濃度で行うことができる。
【００６１】
任意に、アルデヒド４溶液を樹脂でさらに処理して、過剰の有機酸または無機酸を除去することができる。樹脂処理は、ＤＯＷＥＸ（商標）  ＭＡＲＡＴＨＯＮ（商標）  Ａ樹脂（水酸化物型）やＡＭＢＥＲＬＹＳＴ（登録商標）  １５樹脂（水素型）などの塩基性樹脂、またはその混合物、望ましくはＤＯＷＥＸ（商標）  ＭＡＲＡＴＨＯＮ（商標）  Ａ樹脂（水酸化物型）とＡＭＢＥＲＬＹＳＴ（登録商標）  １５樹脂の混合物で行うことができる。
【００６２】
任意に、アルデヒド４溶液を真空下でさらに蒸発させるか、またはガスで掃引して、過剰の有機溶媒を除去することができる。
【００６３】
化合物５：キナ−ゼ反応
【化１４】
2021530479.tif 000015
図式３および図式３Ａに示すように、（Ｒ）−２−エチニルグリセルアルデヒド３−リン酸水和物（５）は、大腸菌由来のパントテン酸キナ−ゼ（ＰａｎＫ）野生型またはその変種を、適宜約４〜１０の範囲、好ましくは約６．５〜８．５、より好ましくは５．５〜８．５のｐＨに調整した緩衝溶液中において、化合物（４）と反応させることにより調製される。適当なｐＨ範囲を有する緩衝剤が使用でき、例えば（但し、これらに限定されるものではない）、リン酸ナトリウム、ＰＩＰＥＳ、例えば、ピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−エタンスルホン酸）；Ｂｉｓ−ＴＲＩＳメタン、例えば、２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオ−ル；ホウ酸塩、ＨＥＰＥＳ、例えば、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンスルホン酸又は２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸；トリエタノ−ルアミンおよびＴＲＩＳ、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンまたは２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオ−ルが使用でき、リン酸ナトリウムが好ましい。例えば、リン酸ナトリウムが好ましい。反応は、任意の適切な２価金属塩、例えば、マグネシウム塩、例えば塩化マグネシウム、およびコバルト、マンガン、亜鉛またはカルシウムの塩の存在下で行うことができるが、これらに限定されない。
【００６４】
この反応は、５’−三リン酸（ＡＴＰ）への再生を必要とするリン酸源としてアデノシン５’−二リン酸（ＡＤＰ）を利用する。ＡＴＰはその場で生成され、その後、ＡＤＰ、アデノシン５’−一リン酸（ＡＭＰ）またはアデノシンから公知の任意の方法によって再生され得る。たとえば、アセチルリン酸と酢酸キナ−ゼの組合せは、ＡＤＰをＡＴＰに再生するのに用いることができる。たとえば、ピルビン酸、リン酸、酸素の存在下では、ピルビン酸オキシダ−ゼとカタラ−ゼの組合せがアセチルリン酸を生成するので、酢酸キナ−ゼの存在下でＡＤＰをＡＴＰに再生するのに用いることができる。
【００６５】
反応は、約１０〜１００ｇ／Ｌ、特に約２０〜４０ｇ／Ｌの基質濃度で行うことができる。この反応は約０〜４０℃、特に約１０〜２５℃の温度で行うことができる。
【００６６】
反応は、樹脂に固定したパントテン酸キナ−ゼ（ＰａｎＫ）でも、あるいは樹脂に固定したＰａｎＫと酢酸キナ−ゼの両方でも行うことができる。当該技術分野で公知の任意の適切な酵素固定化方法、例えば、固定化金属イオンアフィニティ−クロマトグラフィ−（ＩＭＡＣ）樹脂、または他の生物学的タグを用いたアフィニティ−樹脂固定化、共価固定化、イオン樹脂上の固定化、吸着による固定化、カプセル化、および／または架橋酵素を用いるが、これらに限定されない。例えば、金属イオン親和性クロマトグラフィ−（ＩＭＡＣ）樹脂を使用することができ、またはＩＭＡＣ樹脂と二価カチオンの任意の適切な組合せを使用することができ、ここでカチオンは、例えば、ニッケル、コバルト、銅、亜鉛、鉄、および／またはアルミニウムであり得るが、これらに限定されない。特に、ニッケルを帯びたＩＭＡＣ樹脂が使用できる。好ましくは、酢酸キナ−ゼおよびパントテン酸キナ−ゼ（ＰａｎＫ）の両方が樹脂上に固定化される。
【００６７】
化合物９：キナ−ゼ反応
【化１５】
2021530479.tif 000016
【００６８】
反応式３Ｂに示すように、（Ｓ）−２−エチニルプロパン−１，３−トリオ−ル１−リン酸（９）は、大腸菌由来のパントテン酸キナ−ゼ（ＰａｎＫ）野生型またはその変種を、適宜ｐＨ約４〜１０の範囲、好ましくは約６．５〜８．５、より好ましくは５．５．〜８．５で調整した緩衝溶液中において、化合物（３）と反応させることにより調製される。適当なｐＨ範囲を有する緩衝剤が使用でき、例えば（但し、これらに限定されるものではない）、リン酸ナトリウム、ＰＩＰＥＳ、例えば、ピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−エタンスルホン酸）；Ｂｉｓ−ＴＲＩＳメタン、例えば、２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオ−ル；ホウ酸塩、ＨＥＰＥＳ、例えば、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンスルホン酸又は２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸；とりえたノ−ルアミンおよびＴＲＩＳ、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンまたは２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオ−ルが使用でき、リン酸ナトリウムが好ましい。例えば、リン酸ナトリウムが好ましい。反応は、任意の適切な二価金属塩、例えば、マグネシウム塩、例えば塩化マグネシウム、およびコバルト、マンガン、亜鉛またはカルシウムの塩の存在下で行うことができるが、これらに限定されない。
【００６９】
この反応は、５’−三リン酸（ＡＴＰ）への再生を必要とするリン酸源としてアデノシン５’−二リン酸（ＡＤＰ）を利用する。ＡＴＰはその場で生成され、その後、ＡＤＰ、アデノシン５’−一リン酸（ＡＭＰ）またはアデノシンから公知の任意の方法によって再生され得る。たとえば、アセチルリン酸と酢酸キナ−ゼの組合せは、ＡＤＰをＡＴＰに再生するのに用いることができる。代わりに、（ａ）ピルビン酸、リン酸および酸素の存在下でのピルビン酸オキシダ−ゼ、カタラ−ゼおよび酢酸キナ−ゼの組合せを用いてＡＤＰをＡＴＰに再生することができる、または（ｂ）ピルビン酸、リン酸および酢酸キナ−ゼの存在下でのピルビン酸オキシダ−ゼ、カタラ−ゼおよび酢酸キナ−ゼの組合せと、アセチルリン酸および酢酸キナ−ゼとの組合せを用いて、ＡＤＰからのＡＴＰ再生に用いることができる。
【００７０】
反応は、約１０〜１００ｇ／Ｌ、特に約２０〜４０ｇ／Ｌの基質濃度で行うことができる。この反応は約０〜４０℃、特に約１０〜２５℃の温度で行うことができる。
【００７１】
反応は、樹脂に固定したパントテン酸キナ−ゼ（ＰａｎＫ）でも、あるいは樹脂に固定したＰａｎＫと酢酸キナ−ゼの両方でも行うことができる。当該技術分野で公知の任意の適切な酵素固定化方法、例えば、固定化金属イオンアフィニティ−クロマトグラフィ−（ＩＭＡＣ）樹脂、または他の生物学的タグを用いたアフィニティ−樹脂固定化、共価固定化、イオン樹脂上の固定化、吸着による固定化、カプセル化、および／または架橋酵素を用いるが、これらに限定されない。例えば、金属イオン親和性クロマトグラフィ−（ＩＭＡＣ）樹脂を使用することができ、またはＩＭＡＣ樹脂と二価カチオンの任意の適切な組合せを使用することができ、ここでカチオンは、例えば、ニッケル、コバルト、銅、亜鉛、鉄、および／またはアルミニウムであり得るが、これらに限定されない。特に、ニッケルを帯びたＩＭＡＣ樹脂が使用できる。好ましくは、酢酸キナ−ゼおよびパントテン酸キナ−ゼ（ＰａｎＫ）の両方が樹脂上に固定化される。
【００７２】
化合物５：オキシダ−ゼ反応
【化１６】
2021530479.tif 000017
【００７３】
反応式３Ｂに示すように、（Ｒ）−２−エチニルグリセルアルデヒド水和物３−リン酸（５）は、ガラクト−スオキシダ−ゼと（Ｓ）−２−エチニルプロパン−１，２，３−トリオ−ル１−リン酸（９）とを、ｐＨを約３〜１０、あるいは特に約６〜８の範囲に調整した緩衝液中で反応させて調製する。適当なｐＨ範囲を有する任意の緩衝液が使用でき、例えば（但し、これらに限定されるものではない）、リン酸ナトリウム；酢酸ナトリウム；  ＰＩＰＥＳ、例えばピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）；ＭＯＰＳ、例えば３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸または３−ピペラジンエタンスルホン酸；  ＨＥＰＥＳ、例えば４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンスルホン酸または２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸；  ＴＲＩＳ、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンまたは２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオ−ル；Ｂｉｓ−ＴＲＩＳメタン、例えば、２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオ−ル；ホウ酸塩；ＣＡＰＳ、例えば、Ｎ−シクロエキシル−３−アミノプロパンスルホン酸；グリシン；またはビシン（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン）；リン酸ナトリウムが使用でき、リン酸ナトリウムが好ましい。
【００７４】
銅とペルオキシダ−ゼは両方ともガラクト−スオキシダ−ゼ（ＧＯａｓｅ）を活性化する反応に使われる。銅はＣｕＳＯ４、Ｃｕ（ＯＡｃ）２、ＣｕＣｌ２、またはＣｕ（ＩＩ）もしくはＣｕ（Ｉ）の他の塩を加えることによって反応混合物に供給される。ペルオキシダ−ゼは西洋ワサビペルオキシダ−ゼ、または他の生物に由来するペルオキシダ−ゼであってもよく、フェリシアニド、イリデ−ト、マンガン（ＩＩＩ）塩、過硫酸塩および他の１つまたは２つの電子酸化剤、または無機または有機酸化剤などの酸化剤によって置換することができる。好ましくは、ペルオキシダ−ゼは西洋ワサビペルオキシダ−ゼである。ＧＯａｓｅの不活性化を防ぐためにカタラ−ゼも加えられる。カタラ−ゼは、哺乳動物源（ウシ）から、またはコリネバクテリウム、アスペルギルス、またはこの目的のために当該技術分野で知られている他の生物などの細菌または真菌源からのものであり得る。
【００７５】
反応は酸素の存在下で進行する。１つの便利な方法は、空気との反応をスパ−ジ（ｓｐａｒｇｅ）することである。あるいは、過酸化水素／カタラ−ゼ、ス−パ−オキシド、またはこの目的のための当該分野で公知の他の方法の使用などの、酸素を生成するための他のシステムを使用することができる。
【００７６】
反応は、基質濃度が１０〜１８０ｇ／Ｌ程度、特に２０〜５０ｇ／Ｌ程度で行うことができる。この反応は約０〜４０℃、特に約１０〜３０℃の温度で行うことができる。
【００７７】
化合物６：デオキシリボ−ス−ホスフェイトアルドラス（ＤＥＲＡ）反応
【００７８】
既知のプロセスよりも化合物（６）を生産するためのこの新しいル−トの重要な利点は、保護基を使用せずに正しい酸化状態で糖骨格を作り出すことである。
【００７９】
４−エチニルＤ−２−デオキシリボ−ス５−リン酸（６）は、デオキシリボ−ス−リン酸アルドラ−ゼ（ＤＥＲＡ）と（Ｒ）−２−エチニルグリセルアルデヒド３−リン酸（５）を酸又は塩とし、必要に応じてｐＨを約５〜９又はそれ以上、特に約６〜８の範囲に調整した水溶液中のアセトアルデヒドを反応させて調製する。（５）の塩の例には、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、モノ−もしくはジ−Ｎａ塩、モノ−もしくはジ−Ｋ塩、またはモノ−もしくはジ−Ｌｉ塩；モノ−もしくはジ−アンモニウムもしくは塩；または第一級、第二級もしくは第三級アミンを有する一価もしくは二価の塩が含まれるが、これらに限定されない。反応は開放容器で行うか、またはアセトアルデヒドの蒸発を防ぐため密閉容器で行うことが望ましい。
【００８０】
反応は約１０〜１００ｇ／Ｌ、特に約３０〜６０ｇ／Ｌの基質濃度で行うことができる。約０〜４０℃、特に約２５〜３５℃の温度で実施することができる。
【００８１】
この反応は緩衝剤なしで行うことができる。或いは、以下の緩衝剤を用いることができるが、これらに限定されるものではない：トリエタノ−ルアミン；リン酸塩；  ＭＯＰＳ、例えば、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸または３−モルホリノプロパン−１−スルホン酸；  ＨＥＰＥＳ、例えば、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸または２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸；  ＢＩＳ−ＴＲＩＳメタン、例えば、２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオ−ル；ホウ酸塩；  ＰＩＰＥＳ、例えば、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）；  ＭＥＳ、例えば、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸；およびホウ酸塩；または適切なｐＨ範囲を有し、一級アミン基を有さない他の緩衝剤。
【００８２】
１つ以上の酵素の使用を含む本明細書に記載されるプロセスの各工程および方法は、この１つ以上の酵素を変性させない温度で実施される。１つ以上の酵素の使用を含む本明細書に記載のプロセスの各工程および方法は、約３〜１０または約４〜１０の範囲のｐＨで行うことができる。
【００８３】
「ヌクレオ塩基」（または「窒素塩基」または「塩基」）は、ＤＮＡおよびＲＮＡなどの核酸のピリミジンまたはプリン複素環である。本明細書中で使用される場合、ヌクレオ塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシル、ならびに非天然修飾を有するヌクレオ塩基、例えば、塩基が１つ以上の非天然置換基を有するヌクレオ塩基、またはアノマ−Ｃ−Ｎ結合への任意の変化を除く塩基におけるヘテロ原子に影響を及ぼす修飾を含む。
【００８４】
４’−エチニル２’−デオキヌクレオシドはヌクレオ塩基を含む。本明細書中で使用される場合、４’−エチニル２’−デオキシヌクレオシドの類似体は、ヌクレオシドの塩基に対する非天然修飾、例えば、塩基が１つ以上の非天然置換基を有すること、またはアノマ−Ｃ−Ｎ結合への変換を除く塩基におけるヘテロ原子に影響する修飾を意味する。
【００８５】
本明細書中で使用される場合、「ホスホペントムタ−ゼ」（「ＰＰＭ」）酵素（例えば、ＥＣ  ５．４．２．７）は、リボ−ス１−リン酸からリボ−ス５−リン酸への可逆的異性化およびデオキシリボ−スリン酸およびリボ−スリン酸およびデオキシリボ−スリン酸の類似体などの関連化合物を触媒する酵素である。
【００８６】
本明細書中で用いる「プリンヌクレオシドホスホリラ−ゼ」（「ＰＮＰ」）酵素（ＥＣ  ２．４．２．２）は、プリンリボヌクレオシドおよび関連化合物（例えば、リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシドのデオキシリボヌクレオシドおよび類似体）の遊離プリン塩基およびリボ−ス−１−リン酸（およびその類似体）への可逆的リン酸化を触媒する酵素である。
【００８７】
本明細書中で使用される場合、「ショ糖ホスホリラ−ゼ」（「ＳＰ」）酵素（ＥＣ  ２．４．１．７）は、ショ糖のＤ−フルクト−ス塩基およびグルコ−ス−１−リン酸への可逆的リン酸化を触媒する酵素である（およびその類似体）。スクロ−スホスホリラ−ゼ（ＳＰ）とスクロ−スとの併用は、プリンヌクレオシドホスホリラ−ゼ（ＰＮＰ）およびホスホムタ−ゼ（ＰＰＭ）と併用して、反応から遊離リン酸イオンを除去するために用いられ、ここで、酵素の組合せはヌクレオシドＭＫ−８５９１（ＥＦｄＡ）の形成を触媒するが、いくつかの実施形態においては、当該技術分野で知られている他の方法で置き換えることができる。
【００８８】
本明細書中で用いる場合、「デオキシリボ−ス−リン酸アルドラ−ゼ」（「ＤＥＲＡ」）（例えば、ＥＣ  ４．１．２．４）は、可逆的に炭素−炭素結合を切断または生成するリア−ゼのファミリ−中の酵素を指す。本明細書中で使用されるデオキシリボ−ス−リン酸アルドラ−ゼは、天然に存在する（野生型）デオキシリボ−ス−リン酸アルドラ−ゼならびにヒト操作によって生成される非天然に存在する工学的ポリペプチドを含む。野生型デオキシリボ−ス−リン酸アルドラ−ゼは、２−デオキシ−Ｄ−リボ−ス５−リン酸からＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸とアセトアルデヒドへの可逆反応を触媒する。
【００８９】
本明細書中で用いる場合、「パントテン酸キナ−ゼ」、（「ＰａｎＫ」）は、天然形でパントテン酸をリン酸化して４’−ホスホパントテン酸を生成する酵素（ＥＣ  ２．７．１．３３）を指す。このようなＰａｎＫ酵素に由来する変異体酵素は、そのような変異体がパントテン酸に対して自然の機能を保持するかどうかにかかわらず、Ｄ−エチニルグリセルアルデヒドの３’ＯＨ−基に対する活性および立体選択性の改善を示す可能性がある。
【００９０】
本明細書で用いる場合、”ガラクト−スオキシダ−ゼ”（”ＧＯａｓｅ”；  ＥＣ  １．１．３．９）酵素は銅依存性酵素であり、二分子酸素の存在下では、第一級アルコ−ルの対応するアルデヒドへの酸化を触媒する。これらは位置特異的にもエナンチオ特異的にも作用し、官能基保護をほとんど、あるいは全く必要としない合成アプロ−チを可能にし、所望の立体異性体を生じる。酸化の様式は穏やかであり、活性がアルコ−ルの対応するカルボン酸への過剰酸化を導かないように制御されている。
【００９１】
本明細書中で用いられる場合、「西洋ワサビペルオキシダ−ゼ」（ＨＲＰ、ＥＣ  １．１１．１．７）酵素は、正常なＧＯａｓｅ触媒サイクルの間に生じる活性部位の不活性な酸化還元状態を酸化することによって、ＧＯａｓｅ触媒活性を活性化し、維持する鉄依存性酵素である。Ｉ型ＨＲＰは、本明細書に含まれる実施例において触媒様式で使用されるが、このクラスまたは他の酵素クラスに属する他の電子伝達酵素および同様の役割を果たす化学化合物を排除することを意図しない。
【００９２】
本明細書中で使用される場合、「カタラ−ゼ」は、ガラクト−スオキシダ−ゼまたはピルビン酸オキシダ−ゼ反応の副生成物である過酸化水素に作用するヘム依存性酵素（ＥＣ  １．１１．１．６）を指し、この過酸化水素はガラクト−スオキシダ−ゼまたはピルビン酸オキシダ−ゼ反応の副生成物であり、これら酵素を一定レベル以上で不活化する。カタラ−ゼは、過酸化水素を水および酸素に変換するために、本明細書の実施例において触媒維持酵素として使用され、一方、いくつかの実施形態では、過酸化水素の電気化学的分解などの他の方法で置き換えることができる。ヘム依存性カタラ−ゼは、本明細書に含まれる実施例において触媒様式で採用されているが、この役割を果たし得るこのクラスに属する他の酵素が存在するので、この役割に限定されることは意味されない。
【００９３】
ここで用いられる場合、「酢酸キナ−ゼ」（「ＡｃＫ」）は、酢酸およびアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）からのアセチルリン酸の生成を触媒する酵素（ＥＣ  ２．７．２．１）を意味する。逆反応も触媒でき、アセチルリン酸の存在下でアデノシン５’−二リン酸（ＡＤＰ）をアデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）にリン酸化する。酢酸キナ−ゼは、本明細書の実施例においてパントテン酸キナ−ゼ（ＰａｎＫ）によって必要とされるＡＴＰをリサイクルするために使用されるが、いくつかの実施形態においては、アセチルリン酸酢酸キナ−ゼリサイクリング組合せは、当該技術分野で知られている他の方法によって置き換えることができる。
【００９４】
本明細書中で用いる「ピルビン酸オキシダ−ゼ」（「ＰＯ」）は、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）およびチアミン二リン酸に依存する酵素（ＥＣ  １．２．３．３）を意味する。ピルビン酸オキシダ−ゼはオキシドレダクタ−ゼファミリ−に属する酵素であり、特に酸素を受容体とする供与体のアルデヒド基またはオキソ基に作用し、ピルビン酸、リン酸イオンと二分子酸素との化学反応を触媒してアセチルリン酸、二酸化炭素および過酸化水素を生成する。ピルビン酸オキシダ−ゼ（ＰＯ）は、本明細書の例において、酢酸キナ−ゼ（ＡｃＫ）および触媒性ＡＴＰ再生組合せとして、酢酸キナ−ゼ（ＡｃＫ）およびカタラ−ゼと組み合わせて用いられ、ここで、当該酵素の組合せは、酸素、ピルビン酸およびリン酸イオンの存在下でＡＤＰからＡＴＰの生成を触媒するが、一方、いくつかの実施形態においては、それは当技術分野で知られている他の方法で置き換えることができる。
【００９５】
本明細書中で使用される「野生型」および「天然に存在する」酵素は、天然中に見出される形態を意味する。例えば、野生型ポリペプチド配列とは、自然界の供給源から単離することができ、かつヒトの操作によって意図的に改変されていない生物に存在する配列である。
【００９６】
本明細書中で使用される場合、「操作された」、「変異体」、「突然変異体」および「非天然に存在する」とは、天然に存在しないであろう方法で改変された、ポリペプチドを含む酵素、または物質の天然もしくは天然の形態に対応する物質を指す。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドと同一であるが、合成材料および／または組換え技術を用いる操作によって産生または誘導される。
【００９７】
酵素に関する「配列同一性のパ−センテ−ジ」、「同一性のパ−センテ−ジ」、「同一性のパ−センテ−ジ」、および「同一性のパ−センテ−ジ」は、本明細書中では、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列間の比較を指して用いられ、比較ウインドウ上の２つの最適アラインメントされた配列を比較することによって決定され、ここで、比較ウインドウにおけるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適アラインメントのための参照配列と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パ−センテ−ジは、同一のヌクレオ塩基またはアミノ酸残基のいずれかが両方の配列で生じる位置の数、またはヌクレオ塩基またはアミノ酸残基がギャップと整列して一致した位置の数を求め、一致した位置の数を比較のウインドウにおける位置の総数で除し、結果に１００を乗じて配列同一性のパ−センテ−ジを生じることによって計算される。最適アラインメントおよびパ−セント配列同一性の決定は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムを用いて行われる（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：  ４０３−４１０およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７７，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３３８９−３４０２を参照されたい）。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトを通じて公開されている。
【００９８】
簡潔に言えば、ＢＬＡＳＴ分析は、まず、デ−タベ−スシ−クエンス中の同じ長さの単語と一致するか、または同じ長さの単語と一致するときにある正値閾値スコアＴを満足する、問合せシ−クエンス中の長さＷの短い単語を同定することによって、高スコアシ−クエンスペア（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは近隣単語スコア閾値（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）と呼ばれる。これらの最初の近傍単語ヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つけるための探索を開始するためのシ−ドとして作用する。次に、累積アラインメントスコアを増加できる限り、各シ−ケンスに沿って両方向に単語ヒットを拡張する。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメ−タＭ（１対のマッチング残基に対する報酬スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチング残基に対するペナルティスコア；常に＜０）を用いて算出される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアを算出する。各方向の単語ヒットの伸長は、以下の場合に停止される：累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘによって低下する；累積スコアがゼロまたはそれ以下になる、１つ以上のマイナススコアの残基アラインメントが蓄積する；またはどちらかのシ−ケンスの末端に到達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメ−タＷ、Ｔ、およびＸは、位置合わせの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の場合）では、語長（Ｗ）１１、期待ユ−ロング１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を欠損として使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３のワ−ルドレングス（Ｗ）、１０の期待ユ−ロ（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，  １９８９，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１０９１５参照）を欠損として使用する。
【００９９】
ＢＬＡＳＴと同様に機能する他の多くのアルゴリズムが、２つのシ−クエンスのパ−セント同一性を提供するために利用できる。比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，  １９８１，  Ａｄｖの局所的相同性アルゴリズム、１９８１、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．  ２：４８２，  Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，  １９７０，  Ｊ．  Ｍｏｌの相同性アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，  １９８８，  Ｐｒｏｃの類似性検索、アルゴリズム（ＧＣＧウィスコンシンソフトウェアパッケ−ジにおけるＧＡＰ，  ＢＥＳＴＦＩＴ，  ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュ−タ画像または目視検査（一般に、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．（１９９５  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）  （Ａｕｓｕｂｅｌ）との共同ベンチャ−を参照）によって、行うことができる。さらに、配列アラインメントおよびパ−セント配列同一性の決定は、ＧＣＧウィスコンシンソフトウェアパッケ−ジ（Ａｃｃｅｌｅｒｙｓ，  Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）のＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプログラムを使用することができる。この場合、デフォルトパラメ−タを使用する。
【０１００】
「実質的同一性」とは、少なくとも２０残基位置の比較ウィンドウ、しばしば少なくとも３０〜５０残基のウィンドウにわたる参照配列と比較して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列であって、比較ウィンドウにわたる参照配列の合計２０パ−セント以下の欠失または付加を含む配列と比較することによって、配列同一性のパ−センテ−ジが計算される、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を指す。ポリペプチドに適用される具体的な実施形態では、「実質的な同一性」という用語は、２つのポリペプチド配列が、デフォルトギャップ重みを用いたプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって、最適にアラインメントされた場合、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８９％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性（例えば、９９％の配列同一性）を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基の位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。
【０１０１】
「立体選択性」とは、ある立体異性体が別の立体異性体よりも化学的または酵素的に優先的に生成することをいう。立体選択性は部分的であり、一方の立体異性体の生成が他方より有利な場合もあれば、一方の立体異性体しか形成されない場合もある。立体異性体がエナンチオマ−である場合、立体選択性はエナンチオ選択性と呼ばれ、両方の合計における一方のエナンチオマ−の分率（典型的にはパ−センテ−ジとして報告される）である。公式［メジャ−エナンチオマ−−マイナ−エナンチオマ−］／［メジャ−エナンチオマ−＋マイナ−エナンチオマ−］に従って計算されたエナンチオマ−過剰（ｅ．）として当該技術分野で一般的に（典型的にはパ−センテ−ジとして）代替的に報告される。立体異性体がジアステレオ異性体である場合、立体選択性はジアステレオ選択性と呼ばれ、２つのジアステレオマ−の混合物中の１つのジアステレオマ−の割合（典型的にはパ−センテ−ジで報告される）であり、一般的にジアステレオマ−過剰（ｄ．ｅ．）として代替的に報告される。鏡像異性体過剰とジアステレオマ−過剰は立体異性体過剰のタイプである。
【０１０２】
語句「適切な反応条件」は、本発明で使用される各ポリペプチドが基質を所望の生成物化合物に変換することができる酵素変換反応溶液中の条件（例えば、酵素負荷、基質負荷、温度、ｐＨ、緩衝液、共溶媒などの範囲）を指す。いくつかの例示的な適当な反応条件が本明細書に提供される。
【０１０３】
本明細書中で使用される場合、酵素変換反応プロセスの文脈における「基質」は、本明細書中で使用される操作された酵素によって作用される化合物または分子を指す。
【０１０４】
本明細書中で使用される、酵素変換プロセスとの関連における「生成物」とは、基質に対する酵素ポリペプチドの作用に起因する化合物または分子を意味する。
【０１０５】
本明細書中で使用されるように、反応中に存在する特定の成分（例えば、酵素）が、目的の成分が存在しない場合と比較して、より多くの製品を生成させる場合に、反応からの製品（例えば、４’−エチニル２’−デオキシリボ−スリン酸類似体または４’−エチニル２’−デオキシヌクレオシド類似体）の収率を増加させる。
【０１０６】
本明細書中で使用される「平衡」または「平衡」とは、化学反応または酵素反応において化学種の定常状態濃度（例えば、２種のＡおよびＢの相互変換）をもたらす過程を指し、これには、化学反応または酵素反応の前進速度定数および逆速度定数によって決定される立体異性体の相互変換が含まれる。
【０１０７】
「鏡像異性体過剰」（ｅｅ）は、キラルな物質に用いられる純度の測定値である。これは、試料中に一方の鏡像異性体が他方の鏡像異性体よりも多く含まれている度合いを反映している。例えば、ラセミ体の混合物は鏡像異性体過剰０％であるが、完全に純粋なエナンチオマ−が１個の場合はｅ．ｅ．が１００％であり、一方のエナンチオマ−が７０％、他方のエナンチオマ−が３０％の試料ではｅ．ｅ．が４０％（７０％〜３０％）である。ジアステレオマ−過剰（ｄｅ）は、混合物中に２つのジアステレオ異性体のみが存在する場合と同様に計算される。
【０１０８】
「タンパク質」、「酵素」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は、本明細書中では、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化、脂質化、ミリスチル化、１０ユビキチン化など）にかかわらず、アミド結合によって共有結合した少なくとも２つのアミノ酸のポリマ−を意味するために互換的に使用される。この定義の中に含まれるものは、Ｄ−およびＬ−アミノ酸、ならびにＤ−およびＬ−アミノ酸の混合物である。
【０１０９】
ここでいう「約」とは、ある特定の値に対して許容可能な誤差を意味する。ある場合には、「約」とは、所定の値範囲の下端および上端において０．０５％、０．５％、１．０％または２．０％以内を意味する。ｐＨに関しては、「約」とは、プラスまたはマイナス０．５を意味する。
【０１１０】
本明細書中で使用される「実質的に純粋な」ポリペプチドまたは「精製された」タンパク質は、そのポリペプチド種が存在する優勢な種である（すなわち、モルまたは重量ベ−スでは、組成物中の他の任意の個々の高分子種よりも多い）組成を意味し、一般に、対象種がモルまたは重量％で存在する高分子種の少なくとも約５０％を含む場合に、実質的に精製された組成である。しかし、いくつかの実施形態において、ポリペプチドを含む組成物は、５０％未満の純度のポリペプチドを含む（例えば、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、または約５０％）。一般に、実質的に純粋なポリペプチド組成物は、組成物中に存在する全ての高分子種をモル％または重量％で、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上、および約９８％以上含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、本質的に均一性に精製され（すなわち、汚染種は、従来の検出方法によって組成物中で検出され得ない）、ここで、組成物は、本質的に単一の高分子種からなる。溶媒種、小分子（＜５００ダルトン）、元素イオン種は巨大分子種とは考えられない。いくつかの実施形態において、単離されたポリペプチドは実質的に純粋なポリペプチド組成物である。
【０１１１】
本明細書中で使用される場合、酵素の「改善された特性」は、酵素の少なくとも１つの改善された特性を指す。いくつかの実施形態において、本発明は、それぞれ、参照ＰＰＭ、ＰＮＰ、ＤＥＲＡ、ＰａｎＫ、ＡｃＫ、ＳＰまたはＧＯａｓｅポリペプチド、および／またはそれぞれ野生型ＰＰＭ、ＰＮＰ、ＤＥＲＡ、ＰａｎＫ、ＡｃＫ、ＳＰまたはＧＯａｓｅポリペプチド、および／またはそれぞれ、他の改変されたＰＰＭ、ＰＮＰ、ＤＥＲＡ、ＰａｎＫ、ＡｃＫ、ＳＰまたはＧＯａｓｅポリペプチドと比較していずれかの酵素特性の改善を示す組換えＰＰＭ、ＰＮＰ，ＤＥＲＡ、ＰａｎＫ、ＡｃＫ、ＳＰおよび／またはＧＯａｓｅポリパプチドを利用する。したがって、「改良」のレベルを決定し、野生型を含む種々のポリペプチドならびに操作されたポリペプチド間で比較することができる。改良された特性には、タンパク質発現の増加、意図された産物の産生の増加、基質特異性または親和性の増加（すなわち、基質に対する活性の増加）、熱活性の増加、熱安定性、ｐＨ活性の増加、安定性の増加、酵素活性の増加、比活性の増加、基質または最終産物阻害に対する抵抗性の増加、化学的安定性の増加、化学選択性の改善、溶媒安定性の改善、酸性ｐＨに対する耐性の増加、タンパク質分解活性に対する耐性の増加（すなわち、タンパク質分解に対する感受性の低下）、凝集の減少、溶解性の増加、および温度プロファイルの変化などの特性が含まれるが、これらに限定されない。追加の実施態様において、この用語は、ＰＰＭ、ＰＮＰ、ＤＥＲＡ、ＰａｎＫ、ＡｃＫ、ＳＰおよび／またはＧＯａｓｅ酵素の少なくとも１つの改良特性を参照して使用される。いくつかの実施形態において、本発明は、それぞれ参照ＰＰＭ、ＰＮＰ、ＤＥＲＡ、ＰａｎＫ、ＡｃＫ、ＳＰおよび／またはＧＯａｓｅポリペプチドと比較して、任意の酵素特性において改良を示す改良型ＰＰＭ、ＰＮＰ、ＤＥＲＡ、ＰａｎＫ、ＳＰおよび／またはＧＯａｓｅポリペプチド；および／または他の改変型ＰＰＭ、ＰＮＰ、ＤＥＲＡ、ＰａｎＫ、ＡｃＫ、ＳＰおよび／またはＧＯａｓｅポリペプチドをそれぞれ使用する。したがって、「改良」のレベルを決定し、野生型を含む種々のポリペプチドならびに操作されたポリペプチド間で比較することができる。
【０１１２】
ここでいう「変換」とは、対応する生成物への基質の酵素的変換（又は生体内変換）を意味し、「パ−セント」変換とは、特定の条件下で一定期間内に生成物に変換される基質のパ−セントを意味する。したがって、ポリペプチドの「酵素活性」又は「活性」は、特定の期間における生成物への基質のパ−セント変換として表すことができる。
【０１１３】
本明細書中で用いる「立体選択性」とは、ある立体異性体が別の立体異性体よりも化学的または酵素的反応で優先的に生成することを意味する。立体選択性は部分的であり、一方の立体異性体の生成が他方より有利な場合もあれば、一方の立体異性体しか形成されない場合もある。立体異性体がエナンチオマ−である場合、立体選択性はエナンチオ選択性と呼ばれ、両方の合計における一方のエナンチオマ−の分率（典型的にはパ−センテ−ジとして報告される）である。それは、公式［メジャ−エナンチオマ−−マイナ−エナンチオマ−］／［メジャ−エナンチオマ−＋マイナ−エナンチオマ−］に従って、そこから計算されるエナンチオマ−過剰（「ｅ．ｅ．」）として、当該技術分野において一般的に（典型的にパ−センテ−ジとして）代替的に報告される。立体異性体がジアステレオ異性体である場合、立体選択性はジアステレオ選択性と呼ばれ、２つのジアステレオマ−の混合物中の１つのジアステレオマ−の割合（典型的にはパ−センテ−ジで報告される）であり、一般的にジアステレオマ−過剰（”ｄ．ｅ．”）として代替的に報告される。鏡像異性体過剰とジアステレオマ−過剰は立体異性体過剰のタイプである。
【０１１４】
本発明は、操作されたＰＰＭ、ＰＮＰ、ＤＥＲＡ、ＰａｎＫ、ＡｃＫ、ＳＰおよびＧＯａｓｅポリペプチド、特に配列番号１〜２１を有するもの、および配列番号１〜２１の各々の保存的に修飾された変種と呼ばれる１つ以上の保存的アミノ酸置換を含む配列の使用を包含する。
【０１１５】
本明細書中で用いられる「保存的」アミノ酸置換とは、タンパク質の生物学的活性を変化させることなく頻繁に変化させることができるように、類似の特性（例えば、酸性、塩基性、正または負に荷電した、極性または非極性、側鎖サイズ、疎水性／親水性、骨格のコンホメ−ションおよび剛性など）を有するタンパク質中のアミノ酸の置換を指す。これには、ポリペプチド中のアミノ酸の、同一または類似の規定されたクラスのアミノ酸内の異なるアミノ酸による１つまたは複数の置換が含まれる。当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一アミノ酸置換は、生物活性を実質的に変化させないことを認識している（例えば、Ｗａｔｓｏｎら（１９８７）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，  Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．  Ｃｏ．，  ｐ．２２４（第４版）を参照されたい）。さらに、構造的または機能的に類似したアミノ酸の置換は、生物活性を破壊する可能性が低い。例を挙げ、限定するわけではないが、いくつかの実施形態において、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は別の脂肪族アミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン）で置換される；ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸は、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、セリンおよびトレオニン）で置換される；芳香族側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびヒスチジン）で置換される；塩基性側鎖を有するアミノ酸は、別のアミノ酸（例えば、リジンおよびアルギニン）で置換される；酸性側鎖を有するアミノ酸は、酸性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）で置換される；および／または疎水性または親水性アミノ酸は、それぞれ別の疎水性または親水性アミノ酸で置換される。さらなる例示的な保存的アミノ酸置換を表１に示す。
【０１１６】
【表１】
2021530479.tif 000018
【０１１７】
用語「アミノ酸置換セット」または「置換セット」とは、参照配列と比較して、ポリペプチド配列中のアミノ酸置換のグル−プを意味する。置換セットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上のアミノ酸置換を有することができる。
【０１１８】
「機能的フラグメント」とは、アミノ末端および／またはカルボキシ末端欠失および／または内部欠失を有するが、残りのアミノ酸配列が、それが比較される配列中の対応する位置と同一であり（例えば、本発明で使用される完全長の操作されたＰＰＭ、ＰＮＰ、ＤＥＲＡ、ＰａｎＫ、ＡｃＫ、ＳＰまたはＧＯａｓｅ酵素）、完全長ポリペプチドの活性の実質的に全てを保持するポリペプチドを指す。
【０１１９】
本明細書中で使用される「欠失」とは、参照ポリペプチドから１以上のアミノ酸を除去することによるポリペプチドの修飾を意味する。欠失は、１個以上のアミノ酸、２個以上のアミノ酸、５個以上のアミノ酸、１０個以上のアミノ酸、１５個以上のアミノ酸、または２０個以上のアミノ酸の除去、全アミノ酸数の最大１０％、または参照酵素を構成する全アミノ酸数の最大２０％を含むことができ、一方、酵素活性を保持し、および／または操作されたＰＰＭ、ＰＮＰ、ＤＥＲＡ、ＰａｎＫ、ＡｃＫ、ＳＰまたはＧＯａｓｅ酵素の改良された特性を保持することができる。欠失はポリペプチドの内部部分および／または末端部分に向けることができる。様々な実施形態において、欠失は連続セグメントを含み得るか、または不連続であり得る。欠失は典型的にはアミノ酸配列の”−”で示されている。
【０１２０】
本明細書中で使用される「挿入」とは、参照ポリペプチドからの１以上のアミノ酸の付加によるポリペプチドを意味する。挿入は、ポリペプチドの内部部分、またはカルボキシ末端もしくはアミノ末端にあり得る。本明細書中で使用される挿入物には、当該技術分野で公知である融合タンパク質が含まれる。挿入は、アミノ酸の連続したセグメントであってもよいし、自然界に存在するポリペプチド中の１つ以上のアミノ酸によって隔てられていてもよい。
【０１２１】
ここで使用される追加の頭字語および略語は以下の通りである：
【表２】
2021530479.tif 000019
【０１２２】
実験手順
２−エチニル−２−ヒドロキシプロパン−１，３−ジイルジアセテ−トの合成（２）
方法Ａ：
【化１７】
2021530479.tif 000020
ＴＨＦ  （１０００ｍＬ）中のジアセトキシアセトン（１）の−３５℃溶液（１５９ｇ、９１４．０ｍｍｏｌ）に、−２０℃以下に温度を維持したＴＨＦ中の塩化エチニルマグネシウム０．５Ｍ溶液１６００ｍＬを加えた。反応が完了した後、４００ｍＬのメチルｔｅｒｔ−ブチルエ−テル（ＭＴＢＥ）中の酢酸（７８ｍＬ）を−２０℃以下に保ちながら滴加した。その後、ＭＴＢＥ  （８００ｍＬ）を加え、室温まで加温した。水中の飽和ＮａＣｌ（１０００ｍＬ）を加え、続いて水中の飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液（１０５０ｍＬ）を加えた。有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４上に乾燥し、蒸発させて、化合物（２）を油状物として得た（１６０ｇ、８８％）。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３，  ５００  ＭＨｚ）：  δ  ４．２６  （ｄｄ，  ４  Ｈ），  ２．５５  （ｓ，  １Ｈ），  ２．１４  （ｓ，  ６Ｈ）．
【０１２３】
２−エチニルプロパン−１，２，３−トリオ−ルの合成（３）
方法Ｂ：
【化１８】
2021530479.tif 000021
２−エチニル２−ヒドロキシプロパン−１，３−ジイルジアセテ−ト（２）（７０ｇ、３５０ｍｍｏｌ）のエタノ−ル溶液に、メトキシレ−トナトリウムのメタノ−ル溶液（６９．９ｍＬ、３５．０ｍｍｏｌ）０．５Ｍを室温（ｒｔ）で加えた。反応はｒｔで２時間（ｈ）撹拌して終了した。溶媒を蒸発させ、残留物を１００ｍＬの水に再溶解し、３×５０ｍＬのＭＴＢＥで抽出した。水層を窒素で散布して残留溶媒を除去し、核磁気共鳴（ＮＭＲ）  （内部標準としてマレイン酸）で測定したところ、２−エチニルプロパン−１，２，３−トリオ−ル（３）（１０８ｇ、収率１００％）の４０．９％溶液を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （Ｄ２Ｏ，  ５００  ＭＨｚ）：  δ  ３．６０  （ｄｄ，  ４  Ｈ），  ２．８５  （ｓ，  １Ｈ）．
【０１２４】
（Ｒ）−２−エチニルグリセルアルデヒド  （４）  の代替調製
Ｃ１方法：
【化１９】
2021530479.tif 000022
攪拌した反応器中で、消泡剤２０４（Ｓｉｇｍａ  Ａ６４２６、１滴〜２０μＬ）を含むリン酸ナトリウム緩衝液（３０ｍＬ、１００ｍＭ、ｐＨ  ７．０）中の２−エチニルプロパン−１、２、３−トリオ−ル（３）（１．１ｇ、９．４７ｍｍｏｌ）を１２．５  ｓｃｃｍでスパ−グしながら３０℃に加温した。ガラクト−スオキシダ−ゼ（ＧＯＯア−ゼ、配列番号：１）（２５０ｍｇ）、ホ−スラジッシュペルオキシダ−ゼ（Ｉ型、５ｍｇ）およびウシカタラ−ゼ＊＊（５ｍｇ）をリン酸ナトリウム緩衝液（５ｍＬ、１００ｍＭ、ｐＨ  ７．０）に溶解し、その後ＣｕＳＯ４水溶液（１００ｍＭ、１５０μＬ）を加えた。反応混合物を空気散布しながら６００ｒｐｍで４７時間撹拌し、（Ｒ）−２−エチニルグリセルアルデヒド（４）を４７％転化率（ＮＭＲによる）および７２％  ｅ．ｅ．で得た。（本剤は単離されなかった。）１Ｈ  ＮＭＲ  （Ｄ２Ｏ，  ５００  ＭＨｚ）：  δ  ４．２９  （ｓ，  １Ｈ），  ３．６５  （ｄｄ，  ２Ｈ），  ２．８３  （ｓ，  １Ｈ）．
＊  西洋ワサビペルオキシダ−ゼ：ワサビ根（Ａｍｏｒａｃｉａ  ｒｕｓｔｉｃａｎａ）から単離したＳＩＧＭＡ  （Ｐ８１２５）から市販のワサビＩ型由来の野生型ペルオキシダ−ゼ。
＊＊  ウシカタラ−ゼ：ウシ供給源由来のヘム依存性カタラ−ゼ、シグマ（Ｃ１３４５）から市販
【０１２５】
Ｃ２方法：
【化２０】
2021530479.tif 000023
脱イオン水（５６．２ｋｇ）を入れた１００  Ｌのジャケット炉に、リン酸ナトリウム（１．２１２ｋｇ、１０mole）を加えた。２５℃で１０  Ｎ水酸化ナトリウム溶液（８５２．６ｇ）を用いてｐＨを７．０２に調整した。反応器にアンチフォ−ム２０４（Ａ６４２６、１０ｍＬ）を入れ、続いてＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（６．５ｇ）を入れた。ガラクト−スオキシダ−ゼ（４５１．２ｇ）  （配列番号１０）を添加し、空気でスパ−ジしながら１５分間撹拌した。西洋ワサビペルオキシダ−ゼ＊（２００．２ｇ）とカタラ−ゼ＊＊（５０２．６ｇ）を加え、反応器を水（２．０ｋｇ）で洗浄した。次に水（９．４８％、３０．３４ｋｇ、２４．７２ｍｏｌ）中の２−エチニルプロパン−１，２，３−トリオ−ル（３）溶液を加え、続いて消泡剤２０４（Ａ６４２６、１０ｍＬ）を追加した。反応は空気でスパ−ジし、一晩かき混ぜて（Ｒ）−２−エチニルグリセルアルデヒド（４）９４．０ｋｇを６６％変換（ＮＭＲによる）と８４％  ｅ．ｅ．で得た。分析の結果、６０％：  １Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２  Ｏ，  ５００ＭＨｚ）：  δ  ４．２９（ｓ，  １Ｈ）、３．６５（ｄｄ，  ２Ｈ）、２．８３（ｓ，  １Ｈ）となる。
＊  西洋ワサビペルオキシダ−ゼ：西洋ワサビ根（Ａｍｏｒａｃｉａ  ｒｕｓｔｉｃａｎａ）から単離されたトヨボ（ＰＥＯ−３０１）から市販されている、精製されたワサビ由来の野生型ペルオキシダ−ゼ。
＊＊  ウシカタラ−ゼ：ウシ供給源由来のヘム依存性カタラ−ゼで、Ｓｉｇｍａ  （Ｃ１３４５）から市販されている。
【０１２６】
上記反応はガラクト−スオキシダ−ゼ（配列番号１１）を用いても行い、生成物（４）は６７％変換（ＮＭＲによる）および８８％  ｅ．ｅ．で得られ、分析収率は５９％：  １Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２  Ｏ，  ５００ＭＨｚ）：  δ  ４．２９（ｓ，  １Ｈ）、３．６５（ｄｄ，  ２Ｈ）、２．８３（ｓ，  １Ｈ）であった。
【０１２７】
Ｃ３方法：
【化２１】
2021530479.tif 000024
【０１２８】
スパ−ジャ−（ｓｐａｒｇｅｒ）とフロ−コントロ−ラを搭載した１００ｍＬイ−ジ−マックス容器に、水（８２ｍＬ）とＰＩＰＥＳカリウム緩衝液（５ｍＬ、０．５Ｍ）を充填した。２５℃で５ＭのＫＯＨ液を用いてｐＨを７．５に調整した。消泡剤２０４（２００μＬ）を加え、続いて進化ガラクト−スオキシダ−ゼ（配列番号：１７、４５０ｍｇ酵素粉末）と硫酸銅（ＩＩ）五水和物（１００μＬ，１００ｍＭ）を加えた。反応混合物を１２５標準立方センチ／分（ｓｃｃｍ）の空気で１５分間スパ−ジした。ウシカタラ−ゼ（Ｃ１３４５、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、１５０ｍｇ、２０００〜５０００  Ｕ／ｍｇ、０．７５  ＭＵ）を加え、続いて西洋ワサビペルオキシダ−ゼ（ＨＲＰ、Ｔｏｙｏｂｏ  ＰＥＯ−３０１、１００ｍｇ、１３０  Ｕ／ｍｇ、１．３  ｋＵ）と２−エチニルプロパン−１、２、３−トリオ−ル（３）の水溶液（２５ｗｔ％，１２ｍＬ，２５．８  ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を１２５  ｓｃｃｍのエアレ−ションで３０℃でかき混ぜ、２０時間かけてＥａｓｙ  Ｓａｍｐｌｅｒを用いてサンプリングし、７０％転換が得られ、５８％アッセイ収率および９９％  ｅ．ｅ．で化合物（４）（（Ｒ）−２−エチニルグリセルアルデヒド）を生成した。１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２  Ｏ，５００ＭＨｚ）：  δ４．２９（ｓ，１Ｈ），３．６５（ｄｄ，２Ｈ），２．８３（ｓ，１Ｈ）。粗反応流は直接、次のリン酸化段階に運ばれた。
【０１２９】
Ｃ４方法：固定化ガラクト−スオキシダ−ゼによる酸化
【化２２】
2021530479.tif 000025
【０１３０】
酵素固定化手順：
Ｎｕｖｉａ  ＩＭＡＣ  Ｎｉ帯電樹脂（沈降容量に基づく１６ｍＬ）をフィルタ−漏斗に加え、バインディング緩衝液（１０カラム容量、１６０ｍＬ；  ５００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５ｍＭイミダゾ−ル、ｐＨ  ８．０）で洗浄し、樹脂保存液を除去した。容器内で進化したガラクト−スオキシダ−ゼ（配列番号：１７、２．００ｇ）凍結乾燥粉末を硫酸銅（ＩＩ）溶液（１００μＭ；５．００ｍＬ）に再懸濁し、結合緩衝液（５０ｍＬ）および樹脂を添加した。溶液は２０℃で５時間回転ミキサを用いて混合した。この樹脂を、結合緩衝液（１０カラム容量、１６０ｍＬ）およびカリウムＰＩＰＥＳ緩衝液（１０カラム容量、１６０ｍＬ；  ５０ｍＭ、ｐＨ  ７．５）でろ過洗浄し、反応中に直接使用した。
【０１３１】
反応手順：
スパ−ジャ−とフロ−コントロ−ラを搭載した１００ｍＬイ−ジ−マックス容器に、水（８２ｍＬ）とＰＩＰＥＳカリウム緩衝液（５ｍＬ、１Ｍ）を入れた。２５℃で５ＭのＫＯＨ液を用いてｐＨを７．５に調整した。消泡剤２０４（２００μＬ）を添加し、続いて樹脂に固定化した進化ガラクト−スオキシダ−ゼ（配列番号：１７、樹脂６ｍＬ当たり酵素粉末７５０ｍｇ）および硫酸銅（ＩＩ）五水和物（１００μＬ，１００ｍＭ）を添加した。反応混合物を１２５標準立方センチ／分（ｓｃｃｍ）の空気で１５分間スパ−ジした。ウシカタラ−ゼ（Ｃ１３４５、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、２１０ｍｇ、２０００〜５０００  Ｕ／ｍｇ、１．０５  ＭＵ）を加え、続いて西洋ワサビペルオキシダ−ゼ（ＨＲＰ、Ｔｏｙｏｂｏ  ＰＥＯ−３０１、１００ｍｇ、１３０  Ｕ／ｍｇ、１．３  ｋＵ）と２−エチニルプロパン−１、２、３−トリオ−ル（３）の水溶液（２５ｗｔ％，１３ｍＬ，２９．４  ｍｍｏｌ反応混合物を２５℃で撹拌し、曝気を１２５  ｓｃｃｍで行った。２２時間後に反応は９１％に達し、２００ｍＭ（Ｒ）−２−エチニルグリセルアルデヒド（４）溶液（１００ｍＬ、６８％アッセイ収率、９７％  ｅ．ｅ．１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２  Ｏ，５００ＭＨｚ）：  δ４．２９（ｓ，１Ｈ），３．６５（ｄｄ，２Ｈ），２．８３（ｓ，１Ｈ）となった。粗反応流は直接、次のリン酸化段階に運ばれた。
【０１３２】
Ｃ５方法：アミナ−ル（８）の生成を介したアルデヒドの任意単離
ステップ１：（Ｓ）−２−（１，３−ジベンジルイミダゾリジン−２−イル）ブト−３−エン−１，２−ジオ−ルの調製
【化２３】
2021530479.tif 000026
窒素バブラ−、機械的撹拌器および熱電対を備えた１００  Ｌジャケット付き円筒容器に、（Ｒ）−２−エチニルグリセルアルデヒド（４）、２６．０ｋｇ、１．８５重量％アルデヒド、３．６４ｍｏｌ）を含む粗オキシダ−ゼ反応流を入れ、Ｎ２雰囲気で不活性化した。水溶液を２０℃に加温し、Ｎ，Ｎ−ジメチルドデカン−１−アミンオキシド（ＤＤＡＯ）  （水中３０重量％、７９８ｇ、０．９６ｍｏｌ；）を加えた後、ＭＴＢＥ  （５５．３ｋｇ，７６  Ｌ）とＮ，Ｎ’−ジベンジルエタン−１，２−ジアミン（１．５５ｋｇ，６．４３ｍｏｌ）を加えた。茶色の二相性混合物を、窒素雰囲気下、２０℃で一晩撹拌した。１７時間後、撹拌を停止し、有機相を除去し、廃棄した。（Ｓ）−２−（１、３−ジベンジルイミダゾリジン−２−イル）しかし−３−イン−１、２−ジオ−ル（５６．５ｋｇ、２．０２重量％アミナ−ル、３．３９ｍｍｏｌ、９３％アッセイ収率）の淡褐色ＭＴＢＥ溶液を得た。
【０１３３】
６種類の同様のＭＴＢＥ溶液を、一回の蒸留および結晶化段階（合計３７４．４ｋｇの溶液中で、７．９１ｋｇのアミナ−ルを含む）で一緒に処理した。
【０１３４】
機械的撹拌器、蒸留ヘッド（−２０℃の冷却器）および熱電対を備えた５０  Ｌのジャケット付き円筒容器にアミナ−ル溶液（４５  Ｌ）を装填し、容器（６５〜９５ｔｏｒｒ）に真空を加え、ジャケットを４０℃に設定した。溶媒は３５  Ｌの容量に達するまで蒸留により除去した。この時点で、内部温度は６．１℃で、オフホワイトの固体が結晶化し始めていた。残りのＭＴＢＥ溶液は、３５〜４０  Ｌの一定容積と０〜１０℃の内部温度を維持しながら、ゆっくりと加えた。ＭＴＢＥ溶液がすべて添加されると、容量は２５  Ｌに減少した。蒸留を停止し、容器に窒素を不活性化し、ジャケット温度を１０℃に低下させた。得られた淡黄色懸濁液をこの温度で２時間置き、固体をろ過により回収した。フィルタ−ケ−キを冷（−２℃）ＭＴＢＥ（１２．７ｋｇ）で洗浄した後、窒素流下で７時間乾燥した。（Ｓ）−２−（１、３−ジベンジルイミダゾリジン−２−イル）−しかし−３−イン−１、２−ジオ−ルをオフホワイト結晶固体（５．７５ｋｇ）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７．４２  −  ７．３５  （ｍ，  ４Ｈ），  ７．３２  （ｔｄ，  Ｊ  ＝  ７．５，  １．６  Ｈｚ，  ４Ｈ），  ７．２７  −  ７．２１  （ｍ，  ２Ｈ），  ５．１０  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．０３  （ｓ，  １Ｈ），  ４．２８  （ｄ，  Ｊ  ＝  １３．３Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．１６  （ｄ，  Ｊ  ＝  １３．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．７６  （ｓ，  １Ｈ），  ３．７０  −  ３．５８  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．２１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ０．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ２．９０  −  ２．８０  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．６０  −  ２．５１  （ｍ，  ２Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ  （１２６  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  １４０．０，  １４０．０，  １２８．５，  １２８．３，  １２８  ．２，  １２８．１，  １２６．８，  １２６．８，  ８８．６，  ８６．９，  ７５．０，  ７４．０，  ６６．４，  ６０．７，  ６０．５，  ５０．４，  ５０．３，  ３９．５．ＨＲ−ＭＳ（ＥＳＩ）アミナル（Ｍ  ＋  Ｈ＋）  Ｃ２１Ｈ２５Ｎ２Ｏ２＋３３７：計算値１９１１；３３７．検出値１９２２。
【０１３５】
ステップ２  アミナ−ル（８）から（Ｒ）−２−エチニル−グリセルアルデヒド（４）の調製
【化２４】
2021530479.tif 000027
窒素バブラ−と機械的撹拌器を備えた４Ｌジャケット付き円筒容器に、ＴｓＯＨ・Ｈ２Ｏ（１２．０ｇ、６３．１ｍｍｏｌ）、水（６０ｍＬ）、（Ｓ）−２−（１、３−ジベンジルイミダゾリジン−２−イル）ブタ−３−イン−１、２−ジオ−ル（１１０ｇ、３２７ｍｍｏｌ）とＭＴＢＥ  （１７００ｍＬ）を入れた。二相混合物を窒素下に置き、ジャケット温度を１５℃に設定した。ＴｓＯＨ・Ｈ２Ｏ（１１４ｇ、５９９．３ｍｍｏｌ）の水溶液（６００ｍＬ）をかき混ぜながら１．５時間かけて滴加した（２００ｒｐｍ）。添加終了後、ジャケット温度を５℃に下げ、得られたスラリ−を１時間置いたた。固形物はろ過により除去し、冷水（２７０ｍＬ）で洗浄した。二相溶液を分離漏斗に移し、有機相を除去し、廃棄した。水相をＤＯＷＥＸ（商標）  ＭＡＲＡＴＨＯＮ（商標）  Ａ樹脂（水酸化物形態、１１．０ｇ）およびＡＭＢＥＲＬＹＳＴ（登録商標）  １５樹脂（水素形態、１１．０ｇ）で処理し、一方、Ｎ２で２００  ｓｃｃｍの速度で２４時間スパ−ジし、残留ＭＴＢＥを除去した。この樹脂をろ過により除去し（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）ブタ−３−イナ−ル（７７４ｇ、４．６重量％アルデヒド、８２％収率）の無色水溶液を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  Ｄ２Ｏ）  δ  ５．０１  （ｓ，  １Ｈ），  ３．７７  （ｄ，  Ｊ  ＝  １１．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．７３  （ｄ，  Ｊ  ＝  １１．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ２．９２  （ｓ，  １Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ  （１２６ＭＨｚ，  Ｄ２Ｏ）  δ  １２９．４，  １２５．４，  ９０．３，  ８１．０，  ７６．０，  ７３．９，  ６５．３。ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ）  Ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｉｍｅｒ  （２Ｍ  ＋  Ｎａ＋）  Ｃ１０Ｈ１２ＮａＯ６＋  計算値  ２５１．０５２６；  検出値  ２５１．０５３０．
【０１３６】
（Ｒ）−２−エチニル−グリセルアルデヒド  ３−リン酸塩  （５）  の代替調製法：
Ｄ１方法：アセテ−トキナ−ゼ：  ＡＴＰ再生系
【化２５】
2021530479.tif 000028
撹拌リアクタ−内で、ＨＥＰＥＳ緩衝液（６６ｍＭ、ｐＨ  ７．５、３０ｍＬ）中のアデノシン二リン酸二ナトリウム塩（４０ｍｇ、０．０８７ｍｍｏｌ）および塩化マグネシウム（３８ｍｇ、０．４００ｍｍｏｌ）の溶液に（Ｒ）−２−エチニルグリセルアルデヒド（４）（１．９ｍＬ、水中２１０ｇ／Ｌ溶液、３．５１ｍｍｏｌ）を加え、続いて酢酸キナ−ゼ（配列番号３）（４０ｍｇ）、およびパントテン酸キナ−ゼ（配列番号２）（１２０  ｍｇ）を加えた。反応混合物を２５℃に加温し、ＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ  ７．５、１０ｍＬ）中のアセチルリン酸リチウムカリウム塩溶液（１．３ｇ、７．０１ｍｍｏｌ）を４時間かけて滴加し、５Ｍ水酸化ナトリウムを用いてｐＨを７．５に維持した。反応を１８時間撹拌して（Ｒ）−２−エチニルグリセルアルデヒド３−リン酸（５）を８５％変換（ＨＰＬＣによる）で与えた（生成物は単離されなかった）。１Ｈ  ＮＭＲ  （Ｄ２Ｏ，  ４００  ＭＨｚ）：  δ  ５．０２  （ｓ，  １Ｈ），  ４．００  （ｄｑ，  ２  Ｈ），  ２．８８  （ｓ，  １Ｈ）．ＬＣ−ＭＳ：  （ＥＳ，  ｍ／ｚ）：  Ｃ５Ｈ７Ｏ６Ｐ  （Ｍ−Ｈ）：  測定値１９３．１；  検出値  １９３．０．
【０１３７】
Ｄ２方法：ピルビン酸オキシダ−ゼＡＴＰ再生系
【化２６】
2021530479.tif 000029
攪拌反応器において、７６ｍＬの水ｐＨ  ７．５中のピルビン酸ナトリウム（３．１１ｇ、２８ｍｍｏｌ）およびリン酸（０．５２３ｍＬ、７．７１ｍｍｏｌ）の溶液に、（Ｒ）−２−エチニルグリセルアルデヒド（４）（３．８ｍＬ、水中２１０ｇ／Ｌ溶液、７．０１ｍｍｏｌ）、アデノシン二リン酸二ナトリウム塩（８０ｍｇ、０．１７４ｍｍｏｌ）、チアミンピロリン酸（４０ｍｇ、０．０８６ｍｍｏｌ）、フラビンアデニンジヌクレオチド二ナトリウム塩水和物（６４ｍｇ、０．０７７ｍｍｏｌ）、および塩化マグネシウム（４００μＬ、水中１Ｍ溶液、０．４ｍｍｏｌ）を入れた。ｐＨを５Ｍ水酸化ナトリウムで７．５に再調整し、反応容量を水で８０ｍＬに再調整した。酢酸キナ−ゼ（配列番号：３）（８０ｍｇ）、ピルビン酸オキシダ−ゼ（配列番号：４）（８０ｍｇ、凍結乾燥細胞遊離抽出物）、パントテン酸キナ−ゼ（配列番号：２）（４００ｍｇ）、およびカタラ−ゼ（８００  μＬ、硫酸アンモニウム懸濁液ＣＡＴ−１０１、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃｓ）を添加した。反応物を空気スパ−ジしながら５００ｒｐｍおよび３０℃で７２時間撹拌すると、９５％転化率（ＨＰＬＣによる）で（Ｒ）−２−エチニルグリセルアルデヒド３−リン酸５が得られた（生成物は単離されなかった）。１Ｈ  ＮＭＲ  （Ｄ２Ｏ，  ４００  ＭＨｚ）：  δ  ５．０２  （ｓ，  １Ｈ），  ４．００  （ｄｑ，  ２  Ｈ），  ２．８８  （ｓ，  １Ｈ）．ＬＣ−ＭＳ：  （ＥＳ，  ｍ／ｚ）：  ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｆｏｒ  Ｃ５Ｈ７Ｏ６Ｐ  （Ｍ−Ｈ）：  １９３．１；  検出値  １９３．０．
【０１３８】
上記反応はパントテン酸キナ−ゼ（配列番号１３）を用いても行い、生成物５は６６％変換で得られた。（本剤は単離されなかった。）１Ｈ  ＮＭＲ  （Ｄ２Ｏ，  ４００  ＭＨｚ）：  δ  ５．０２  （ｓ，  １Ｈ），  ４．００  （ｄｑ，  ２  Ｈ），  ２．８８  （ｓ，  １Ｈ）．
【０１３９】
Ｄ３方法：アセテ−トキナ−ゼ：固定化酵素を用いたＡＴＰ再生系
【化２７】
2021530479.tif 000030
【０１４０】
酵素固定化手順：
ＮＵＶＩＡ（登録商標）固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィ−（ＩＭＡＣ）ニッケル帯電樹脂（沈降容量に基づく１６８ｍＬ）をフィルタ−漏斗に加え、結合緩衝液（１．６Ｌ；塩化ナトリウム５００ｍＭ、リン酸ナトリウム５０ｍＭ、ｐＨ  ８．０）で洗浄した。容器中で、パントテン酸キナ−ゼ（８．４ｇ）  （配列番号：１２）および酢酸キナ−ゼ（２．８ｇ）  （配列番号：３）を結合緩衝液（５００ｍＬ）に溶解した。洗浄した樹脂を容器に仕込み、溶液を２０℃で４時間攪拌した。樹脂をろ過し、最初に結合緩衝液（１．６Ｌ）で洗浄し、続いてピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−エタンスルホン酸）  （ＰＩＰＥＳ）緩衝液（８４０ｍＬ；  ５０ｍＭ，  ｐＨ  ６．５）で洗浄した。洗浄した樹脂は次の段階で直接使用した。
【０１４１】
反応手順：
１Ｌ反応器に、水（６０８．７ｇ、４．６重量％、２１２ｍｍｏｌ）中の（Ｒ）−２−エチニルグリセルアルデヒド（４）の溶液を入れ、５℃に冷却した。冷却溶液ピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−エタンスルホン酸）  （ＰＩＰＥＳ）緩衝液（３２．７ｍＬ、１Ｍ、ｐＨ  ６．５、３２．７ｍｍｏｌ）、塩化マグネシウム（９．３３ｍＬ、１Ｍ、９．３３ｍｍｏｌ）、アセチルリン酸二アンモニウム塩（５１．８ｇ、２６５ｍｍｏｌ）、アデノシン二リン酸二ナトリウム塩水和物（１．１７ｇ、２．１２ｍｍｏｌ）及び水（１９２ｍＬ）を加えた。溶液を撹拌し、５ＮのＫＯＨを用いてｐＨを６．４に調整した。反応を２０℃に加温し、パントテン酸キナ−ゼ（配列番号１２）および酢酸キナ−ゼ（配列番号３）を固定化した樹脂１６８ｍＬを加えた。反応をｐＨ６．４に維持するために用いた５Ｎ  ＫＯＨで１０時間撹拌し、（Ｒ）−２−エチニルグリセルアルデヒド３−りん酸（５）を９２％変換（ＨＰＬＣによる）及び９１％収率（内部標準として塩化テトラフェニルホスホニウムによる３１Ｐ  ＮＭＲによる）で与えた（生成物は単離されなかった）。１Ｈ  ＮＭＲ  （Ｄ２Ｏ，  ４００  ＭＨｚ）：  δ  ５．０２  （ｓ，  １Ｈ），  ４．００  （ｄｑ，  ２  Ｈ），  ２．８８  （ｓ，  １Ｈ）．ＬＣ−ＭＳ：  （ＥＳ，  ｍ／ｚ）：  Ｃ５Ｈ７Ｏ６Ｐ  （Ｍ−Ｈ）：  計算値１９３．１；  検出値  １９３．０．
【０１４２】
４−エチニルＤ−２−デオキシリボ−ス５−リン酸（６）の合成
方法Ｅ：
【化２８】
2021530479.tif 000031
（Ｒ）−２−エチニルグリセルアルデヒド３−リン酸塩（５）（５、２０ｍＬ、５．３ｍｍｏｌ）の水溶液に、アセトアルデヒドの水溶液（４０  ｗｔ．％、２．０２ｍＬ、１５．９ｍｍｏｌ）を室温で加えた後トリエタノ−ルアミン塩酸塩緩衝液（１ｍＬ、１  Ｍ、ｐＨ  ７）中の２５ｍｇデオキシリボ−ス−リン酸塩アルドラ−ゼ  （ＤＥＲＡ）（配列番号６）を加えた。反応器を密封し、混合物を３０℃と６００ｒｐｍで一夜撹拌し、９９％  ｃｏｎｖ中に４−エチニルＤ−２−デオキシリボ−ス５−りん酸（６）を得た。９９％、すなわち１：１アノマ−混合物として９９％  ｄ．ｅ．（生成物は単離されなかった）。α−アノ−マ：  １Ｈ  ＮＭＲ  （Ｄ２Ｏ、６００ＭＨｚ）  δ５．３１（ｔ、１Ｈ）、４．１３（ｔ、１Ｈ）、３．８１〜３．７２（ｍ、２Ｈ）、２．８９（ｓ、１Ｈ）、２．４２〜２．３４（ｍ、１Ｈ）、１．８７〜１．７９（ｍ、１Ｈ）、１３Ｃ  ＮＭＲ  （Ｄ２Ｏ、１５１ＭＨｚ）  δ９７．７（ｓ）、８１．４（ｄ）、７９．４（ｓ）、７８．９（ｓ）、７１．１（ｓ）、６７．７（ｄ）、３９．６（ｓ）。β−アノ−マ：  １Ｈ  ＮＭＲ  （Ｄ２Ｏ、６００ＭＨｚ）  δ  ５．４０（ｄｄ、１Ｈ）、４．２８（ｔ、１Ｈ）、３．８８〜３．８０（ｍ、２Ｈ）、２．８７（ｓ、１Ｈ）、２．１３〜２．０６（ｍ、１Ｈ）、２．０４〜１．９７（ｍ、１Ｈ）、１３Ｃ  ＮＭＲ  （Ｄ２Ｏ、１５１ＭＨｚ）  δ  ９７．３（ｓ）、８２．２（ｄ）、７８．７（ｓ）、７８．５（ｓ）、７１．３（ｓ）、６８．４（ｄ）、３９．６（ｓ）。ＬＣ−ＭＳ：  （ＥＳ，  ｍ／ｚ）：  Ｃ７Ｈ１０Ｏ７Ｐ  （Ｍ−Ｈ）：  ２３７．０；  検出値  ２３７．０
【０１４３】
（２Ｒ，３Ｓ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−２−フルオロ−９Ｈ−プリン−９−イル）−２−エチニル２−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン−３−オ−ル一水和物（７）［別名４’−エチニル２−フルオロ−２’−デオキシアデノシンまたはＥＦｄＡ］の代替調製法
【０１４４】
Ｆ１方法
【化２９】
2021530479.tif 000032
【０１４５】
リン酸水素アンモニウム（（２Ｒ、３Ｓ）−２−エチニル３、５−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メチル（１．００ｇ、３．９１ｍｍｏｌ）をｐＨ  ７．５緩衝液（５ｍＭ  ＭｎＣｌ２を含む１００ｍＭ  ｔｒｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ・ＨＣｌ）１０ｍＬに溶解した。溶液のｐＨは５ＮのＮａＯＨで７．３に調整した。溶液に２−フルオロアデニン（０．５９９ｇ、３．９１ｍｍｏｌ）およびショ糖（２．６８ｇ、７．８２ｍｍｏｌ）を加えた。酵素溶液は、ホスホペントムタ−ゼ（配列番号：８）（１００ｍｇ）、プリンヌクレオシドホスホリラ−ゼ（配列番号：９）（５０ｍｇ）及びショ糖ホスホリラ−ゼ（配列番号：７）（１０ｍｇ）をｐＨ  ７．５緩衝液１０ｍＬに溶解して調製した。酵素溶液を試薬混合物に添加し、得られた懸濁液を４０℃で振盪した。２０時間後、懸濁液を０℃に冷却し、ろ過して冷水で洗浄した。固体を吸引乾燥し、標記化合物（１．１２ｇ，９２％）を単一異性体とした。
１Ｈ  ＮＭＲ：  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６，  ｐｐｍ）：  δ  ７．６８  （ｂｒ  ｓ，  ２Ｈ），  ７．３２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．４４  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．５２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ５．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．２７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．４４  （ｑ，  Ｊ  ＝  ６．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．６０  （ｑ，  Ｊ  ＝  ６．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．５３  （ｑ，  Ｊ  ＝  ６．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．４８  （ｓ，  １Ｈ），  ２．４８−２．４１  （ｍ，  １Ｈ），  ２．３７−２．３０  （ｍ，  １Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ  （１５０．９２  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６，  ｐｐｍ）  δ  １５８．５  （ｄ，  ＪＣＦ  ＝  ２０３．５），  １５７．６  （ｄ，  ＪＣＦ  ＝  ２１．２），  １５０．２  （ｄ，  ＪＣＦ  ＝  ２０．２），  １３９．７  （ｄ，  ＪＣＦ  ＝  ２．４），  １１７．４  （ｄ，  ＪＣＦ  ＝  ４．０），  ８５．１，  ８２．０，  ８１．４，  ７８．７，  ７０．１，  ６４．２，  ３８．１．ＬＣ−ＭＳ：  （ＥＳ，  ｍ／ｚ）：  Ｃ１２Ｈ１２ＦＮ５Ｏ３  （Ｍ＋Ｎａ）：  ３１６．０８２２；  計算値３１６．０８１８。
【０１４６】
このステップで使用したＰＰＭおよびＰＮＰ酵素は、それぞれ大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）由来の酵素からの突然変異に由来した。この段階で用いたスクロ−スホスホリラ−ゼ（ＳＰ）はアロスカルドビア・オンニコレンスに由来した；他の生物に由来するＳＰも用いることができた。
【０１４７】
Ｆ２方法：
【化３０】
2021530479.tif 000033
ピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−エタンスルホン酸）  （ＰＩＰＥＳ）緩衝液を含む（Ｒ）−２−エチニルグリセルアルデヒド３−リン酸（５）（９５０ｍＬ、１５７ｍｍｏｌ）の約５．５〜６．０のｐＨの水溶液にトリエタノ−ルアミン（７．０９ｇ、４７．５ｍｍｏｌ）を加えた。溶液のｐＨは、水酸化カリウム（８ｍＬ、８Ｍ）を用いて７．１から７．６に調整した。塩化マンガン（ＩＩ）水和物（０．５９２ｇ、４．７０ミリモル）を添加し、次いでスクロ−ス（１６１ｇ、４７０ミリモル）を添加し、ｐＨ７．５を得て、溶液に、以下の酵素：デオキシリボ−ス−リン酸アルドラ−ゼ（配列番号：１４）（４６１ｍｇ）、スクロ−スホスホリラ−ゼ（配列番号：７）（４９４ｍｇ）、ホスホペントムタ−ゼ（配列番号：８）（２．６３ｇ）、およびプリンヌクレオシドホスホリラ−ゼ（配列番号：１５）（６５９ｍｇ）を添加した。酵素が溶解したら、２−フルオロアデニン（１９．８０ｇ、１２５ｍｍｏｌ）を加えた。反応を３５℃に加熱し、アセトアルデヒドを加えた（イソプロピルアルコ−ル中４０ｗｔ％、２９．８ｍＬ、２３５ｍｍｏｌ）。２時間反応させた後、混合物にＥＦｄＡ結晶生成物（０．９６ｇ，２ｍｏｌ％）を播種した。３５℃で２６時間反応させた後、スラリ−を０℃に冷却し、固体を濾過、水で２回洗浄することによって収集した（４０ｍＬ  ｅａ．）。固体を窒素スイ−プ下で乾燥した。４３．２ｇ、９２重量％、９６．２％の補正値が得られる。１  Ｈ  ＮＭＲ：  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６，  ｐｐｍ）：  δ  ７．６８  （ｂｒ  ｓ，  ２Ｈ），  ７．３２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．４４  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．５２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ５．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．２７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．４４  （ｑ，  Ｊ  ＝  ６．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．６０  （ｑ，  Ｊ  ＝  ６．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．５３  （ｑ，  Ｊ  ＝  ６．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．４８  （ｓ，  １Ｈ），  ２．４８−２．４１  （ｍ，  １Ｈ），  ２．３７−２．３０  （ｍ，  １Ｈ）．１３  Ｃ核磁気共鳴（１５０．９２ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６，  ｐｐｍ）  δ１５８．５（ｄ，  ＪＣＦ  ＝  ２０３．５），１５７．６（ｄ，  ＪＣＦ  ＝  ２１．２），１５０．２（ｄ，  ＪＣＦ  ＝  ２０．２），１３９．７（ｄ，  ＪＣＦ  ＝  ２．４），１１７．４（ｄ，  ＪＣＦ  ＝  ４．０），８５．１，８２．０，８１．４，７８．７，７０．１，６４．２，３８．１。ＬＣ−ＭＳ：  （ＥＳ，  ｍ／ｚ）：  Ｃ１２Ｈ１２ＦＮ５Ｏ３  （Ｍ＋Ｎａ）：  ３１６．０８２２；計算値３１６．０８１８。
【０１４８】
（Ｓ）−２−エチニル−プロパン−１，２，３−トリオ−ル  １−リン酸塩  （９）  の代替調製方法
Ｇ１方法：アセテ−トキナ−ゼ：酵素配列番号２および配列番号３を用いたＡＴＰ再生系
【化３１】
2021530479.tif 000034
５０ｍＬのリアクタ−に２−エチニルプロパン−１，２，３−トリオ−ル（３）の水溶液（９．２９ｇ、９．４６ｗｔ％、７．５７ｍｍｏｌ）カリウムＰＩＰＥＳ緩衝液（１．０２ｍＬ、１Ｍ、ｐＨ  ６．５、１．０２ｍｍｏｌ）、塩化マグネシウム（２９２μＬ、１Ｍ、０．２９２ｍｍｏｌ）、アセチルリン酸二アンモニウム塩（１．８５１ｇ、８９ｗｔ％、９．４６ｍｍｏｌ）、アデノシン二リン酸二ナトリウム塩水和物（ＡＤＰ、４２ｍｇ、０．０７６ｍｍｏｌ、０．０１  ｅｑ）、および水（２８ｍL）を入れた。５ＭのＫＯＨを用いてｐＨを６．４に調整し、溶液を２０℃に加温し、進化した（evolved）パントテン酸キナ−ゼＰａｎＫ  配列番号２（２６４ｍｇ）および酢酸キナ−ゼＡｃＫ  配列番号３（８８ｍｇ）を追加した。反応は５ＮのＫＯＨを用いてｐＨを６．４に維持して１６時間撹拌した。最終反応含量は（Ｓ）−２−エチニルプロパン−１，２，３−トリオ−ル１−ホスフェ−ト（９）を＞９５％  ｅ．ｅ．及び９９％転化率（３１  Ｐ−ＮＭＲ）で与えた。生成物は単離されなかった。１  Ｈ  ＮＭＲ  （Ｄ２  Ｏ，  ５００  ＭＨｚ）  δ  ３．８９  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．７２  （ｄ，  Ｊ  ＝  １１．６  Ｈｚ，  １  Ｈ），  ３．６５  （ｄ，  Ｊ  ＝  １１．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ２．９３  （ｓ，  １Ｈ）．１３  Ｃ  ＮＭＲ  （Ｄ２  Ｏ，  １２６  ＭＨｚ）  δ  ８２．９  （ｓ），  ７５．１  （ｓ），  ７１．０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．９  Ｈｚ），  ６７．０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ４．５  Ｈｚ），  ６４．７  （ｓ）．３１Ｐ  ＮＭＲ  （Ｄ２  Ｏ，  ２０２  ＭＨｚ）  δ  ３．３９．ＨＲＭＳ：  （ＥＳＩ，  ｍ／ｚ）：  ［Ｍ−１］−  Ｃ５  Ｈ８  Ｏ６  Ｐ：  １９５．００５８；  検出値１９５．００６８  ［Ｍ−Ｈ］  −：  １９５．００５８。
【０１４９】
Ｇ２方法：アセテ−トキナ−ゼ：酵素配列番号２０および配列番号２１を用いたＡＴＰ再生系。
【化３２】
2021530479.tif 000035
ジャケット反応器水溶液に２−エチニルプロパン−１、２、３−トリオ−ル（３）（１１．４７ｋｇ、８．７重量％、８．６１モル）および水（７．５ｋｇ）を入れ、次いで１Ｍ  ＢＩＳ−ＴＲＩＳメタン緩衝液ｐＨ  ６．５（１Ｌ）および塩化マグネシウム（４１．４ｇ）を入れた。ＡＴＰ  （４８ｇ、０．０８６ｍｏｌ、０．０１当量）及びリン酸ジアンモニウムアセチル２．０２１ｋｇ、８９％、１０．３３ｍｍｏｌ）を加え、２０℃まで加温し、ＫＯＨ  （２７０．４ｇ）を用いてｐＨを６．８に再調整した。進化した（evolved）パントテン酸キナ−ゼ配列番号２０（２０．４ｇ）および進化した酢酸キナ−ゼ配列番号２１（３ｇ）を固体として装填した。この反応を２０℃で１６時間撹拌したところ、ｐＨは５．５に低下した。２−エチニルプロパン−１，２，３−トリオ−ル（３）の定量変換を１  Ｈと３１Ｐ  ＮＭＲで判断して得た。そのような調製された（Ｓ）−２−エチニルプロパン−１，２，３−トリオ−ル１−リン酸（９）液（３９７ｍＭ、２２．５ｋｇ、９８％の収率）は、さらなる浄化を行わずに、その後の酸化段階で使用した。１  Ｈ  ＮＭＲ  （Ｄ２  Ｏ，  ５００  ＭＨｚ）  δ  ３．８９  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．７２  （ｄ，  Ｊ  ＝  １１．６  Ｈｚ，  １  Ｈ），  ３．６５  （ｄ，  Ｊ  ＝  １１．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ２．９３  （ｓ，  １Ｈ）．
【０１５０】
Ｇ３方法：アセテ−トキナ−ゼ：酵素配列番号２０および配列番号２と重水素化化合物（３）を用いて絶対立体化学を帰属させ、脱対称性のリン酸化を実証する。
【化３３】
2021530479.tif 000036
【０１５１】
進化したパントテン酸キナ−ゼ配列番号２０（１０ｇ／Ｌ水溶液１００μＬ）と進化した酢酸キナ−ゼ配列番号２１（２ｇ／L水溶液１００μL）を、リン酸ジアンモニウムアセチル（４１ｍｇ）、２−エチニルプロパン−１、１−ｄ２−１、２、３−トリオ−ル（（Ｒ）−３−ｄ２、２０ｍｇ、１７０μｍｏｌ）、塩化マグネシウム（水中１Ｍ溶液１０μＬ）、ＡＤＰ  （水中１００ｇ／Ｌ溶液１０μＬ）及びリン酸ナトリウム緩衝液（水中１Ｍ溶液１０μＬ）を水中（８００μL）に含むｐH６．５の溶液に加えた。この反応をｒｔで２４時間インキュベ−トし、重水素化２−エチニルプロパン−１，２，３−トリオ−ル１−りん酸類似体（Ｓ）−９−（３，３−ｄ２）および（Ｓ）−９−（１，１−ｄ２）を９５：５比および９９％の全収率で得た。３１  Ｐ  ＮＭＲによりリン酸化化合物の比率を約９５：５と決定し、プロ−（Ｓ）ヒドロキシル基（すなわち脱対称性リン酸化）での２−エチニルプロパン−１、２、３−トリオ−ル（３）の立体選択的リン酸化を確認した。１  Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２  Ｏ、５００ＭＨｚ）  δ３．８９（ｍ、２Ｈ）、３．７２（ｄ、Ｊ  ＝  １１．６Ｈｚ、１Ｈ）、３．６５（ｄ、Ｊ  ＝  １１．６Ｈｚ、１Ｈ）、２．９３（ｓ，１Ｈ）。１３  Ｃ  ＮＭＲ  （Ｄ２  Ｏ，  １２６  ＭＨｚ）  δ  ８２．９  （ｓ），  ７５．１  （ｓ），  ７１．０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．９  Ｈｚ），  ６７．０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ４．５  Ｈｚ），  ６４．７  （ｓ）．
【０１５２】
Ｇ４方法：アセテ−トキナ−ゼ：固定化酵素配列番号２０および配列番号２１を用いたＡＴＰ再生系。
【化３４】
2021530479.tif 000037
酵素固定化手順：
Ｎｕｖｉａ  ＩＭＡＣ  Ｎｉ荷電樹脂（沈降容量に基づく７５ｍＬ）をフィルタ−漏斗に加え、水（９カラム容量、３×２２５ｍＬ）及び結合緩衝液（１カラム容量、７５ｍＬ；  ５００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５ｍＭイミダゾ−ル、ｐＨ  ８．０）で洗浄した。容器中でパントテン酸キナ−ゼ（配列番号：２０、６．０ｇ）凍結乾燥粉末を結合緩衝液（２００ｍＬ）に再懸濁し、洗浄した樹脂を加えた。２５℃で６時間回転ミキサ−を用いて混和した。この樹脂をろ過し、結合緩衝液（６カラム容量、６  ｘ  ２２５ｍＬ）およびＢＩＳ−ＴＲＩＳ緩衝液（８カラム容量、６００ｍＬ；  ５０ｍＭ、ｐＨ  ６．２）で洗浄した。
反応手順：
２−エチニルプロパン−１、２、３−トリオ−ル（３）（５７４ｇ、８．７％重量、０．４３０ｍｏｌ）と水（３５０ｍＬ）の水溶液をジャケット付き反応器に入れ、続いて１Ｍ  ＢＩＳ−ＴＲＩＳメタン緩衝液ｐＨ  ６．５（５０ｍＬ）と塩化マグネシウム（２．０３３ｇ，０．０１ｍｏｌ）を加えた。ＡＴＰ  （２．３７ｇ、０．００４３モル、０．０１当量）とリン酸ジアモニウム（１０１ｇ、８９％、０．５３０ｍｍｏｌ、１．２当量）を加え、２０℃まで加温し、５Ｍ  ＫＯＨを用いて液体のｐＨを６．８に再調整した。パントテン酸キナ−ゼ配列番号２０および進化した酢酸キナ−ゼ配列番号２１（０．１５ｇ）を固定化した樹脂（２５ｍＬ）を固体として装填した。反応は２０℃で１６時間撹拌し、その間ｐＨは５．５に低下した。２−エチニルプロパン−１、２、３−トリオ−ル（３）の（Ｓ）−２−エチニルプロパン−１、２、３−トリオ−ル１−りん酸（９）への定量的転換を１  Ｈと３１  Ｐ  ＮＭＲ（Ｄ２  Ｏ、５００ＭＨｚ）  δ３．８９（ｍ、２Ｈ）、３．７２（ｄ、Ｊ  ＝  １１．６Ｈｚ、１Ｈ）、３．６５（ｄ、Ｊ  ＝  １１．６Ｈｚ、１Ｈ）、２．９３（ｓ、１Ｈ）で判断して得た。
【０１５３】
（Ｒ）−２−エチニル−グリセルアルデヒド  ３−リン酸塩  （５）  の代替調製法：
Ｈ１方法：  固定化ガラクト−スオキシダ−ゼ配列番号１６
【化３５】
2021530479.tif 000038
酵素固定化手順：
Ｎｕｖｉａ  ＩＭＡＣ  Ｎｉ帯電樹脂（沈降容量に基づき１０ｍＬ）をフィルタ−漏斗に加え、バインディング緩衝液（１０カラム容量、１００ｍＬ；  ５００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５ｍＭイミダゾ−ル、ｐＨ  ８．０）で洗浄し、樹脂保存液を除去し、洗浄した樹脂１６ｇを得た。容器内で進化させたガラクト−スオキシダ−ゼ（配列番号：１６、７５０ｍｇ）凍結乾燥粉末を硫酸銅（ＩＩ）溶液（１００μＭ；５．００ｍＬ）に再懸濁し、結合緩衝液（２０ｍＬ）および洗浄した樹脂（３．０ｇ）を添加した。２０℃で５時間回転ミキサ−を用いて混和した。この樹脂をバインディング緩衝液（１０カラム容量、１００ｍＬ）およびＢＩＳ−ＴＲＩＳ緩衝液（１０カラム容量、１００ｍＬ；  ５０ｍＭ、ｐＨ  ７．５）でろ過洗浄し、グリコシル化反応に直接使用した。
【０１５４】
反応手順：
固定化ガラクト−スオキシダ−ゼ配列番号１６（３．０ｇ）の樹脂をＢＩＳ−ＴＲＩＳメタン緩衝液（３５ｍＭ、ｐＨ７．２に調整）中の（Ｓ）−２−エチニルプロパン−１、２、３−トリオ−ル１−りん酸（９、５．４ｍｍｏｌ、２７０ｍＭ、２０ｍＬ）の溶液に加え、続いて水中の硫酸銅（ＩＩ）溶液（３０μＬ、１００ｍＭ）、及び水（６００μＬ）中に再懸濁させた西洋ワサビペルオキシダ−ゼ（ＰＥＯ−３０１、１８ｍｇ）とウシカタラ−ゼ（Ｃ１３４５、１２０ｍｇ）を加えた。この反応物を気体透過性膜で封じ、２２℃で４日間激しく振り混ぜて７７％の最終転換に達し、（Ｒ）−２−エチニルグリセルアルデヒド３−リン酸（５）を９５％  ｅ．e．で得た。酵素樹脂をろ過し、（Ｒ）−２−エチニルグリセルアルデヒド３−リン酸（５）の溶液をグリコシル化反応に直接用いた。１Ｈ  ＮＭＲ  （Ｄ２Ｏ，  ４００  ＭＨｚ）：  δ  ５．０２  （ｓ，  １Ｈ），  ４．００  （ｄｑ，  ２  Ｈ），  ２．８８  （ｓ，  １Ｈ）．ＬＣ−ＭＳ：  （ＥＳ，  ｍ／ｚ）：  Ｃ５Ｈ７Ｏ６Ｐ  （Ｍ−Ｈ）：測定値  １９３．１；  検出値  １９３．０． 
【０１５５】
Ｈ２方法：  固定化ガラクト−スオキシダ−ゼ配列番号１７
【化３６】
2021530479.tif 000039
酵素固定化手順：
Ｎｕｖｉａ  ＩＭＡＣ  Ｎｉ帯電樹脂（沈降容量に基づき１０ｍＬ）をフィルタ−漏斗に加え、バインディング緩衝液（１０カラム容量、１００ｍＬ；  ５００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５ｍＭイミダゾ−ル、ｐＨ  ８．０）で洗浄し、樹脂保存液を除去し、洗浄した樹脂１６ｇを得た。容器内で、進化したガラクト−スオキシダ−ゼ（配列番号：１６、７５０ｍｇ）凍結乾燥粉末を硫酸銅（ＩＩ）溶液（１００μＭ；５．００ｍＬ）に再懸濁し、結合緩衝液（２０ｍＬ）と洗浄した樹脂（３．０ｇ）を添加した。２０℃で５時間回転ミキサ−を用いて混和した。この樹脂をバインディング緩衝液（１０カラム容量、１００ｍＬ）およびＢＩＳ−ＴＲＩＳメタン緩衝液（１０カラム容量、１００ｍＬ；  ５０ｍＭ、ｐＨ  ７．５）でろ過洗浄し、反応に直接使用した。
反応手順：
固定化されたガラクト−スオキシダ−ゼＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１７（３．０ｇ）を、ＢＩＳ−ＴＲＩＳメタン緩衝液（３５ｍＭ、ｐＨ７．２に調整）中の（Ｓ）−２−エチニルプロパン−１、２、３−トリオ−ル１−リン酸（９、５．４ｍｍｏｌ、２７０ｍＭ、２０ｍＬ）の溶液に加え、続いて水（３０μＬ、１００ｍＭ）中の硫酸銅（ＩＩ）溶液、及び水（６００μL）に再懸濁させた西洋ワサビペルオキシダ−ゼ（ＰＥＯ−３０１、１８ｍｇ）とウシカタラ−ゼ（Ｃ１３４５、１２０ｍｇ）を加えた。この反応を気体透過性膜で封じ、２２℃で４日間激しく振り混ぜて７７％の最終転換に達し、（Ｒ）−２−エチニルグリセルアルデヒド３−りん酸（５）を９５％  ｅ．ｅ．で得た。酵素樹脂を濾別し、（Ｒ）−２−エチニルグリセルアルデヒド３−ホスフェ−ト（５）の溶液をグリコシル化反応に直接使用した。１Ｈ  ＮＭＲ  （Ｄ２Ｏ，  ４００  ＭＨｚ）：  δ  ５．０２  （ｓ，  １Ｈ），  ４．００  （ｄｑ，  ２  Ｈ），  ２．８８  （ｓ，  １Ｈ）．ＬＣ−ＭＳ：  （ＥＳ，  ｍ／ｚ）：  ｒ  Ｃ５Ｈ７Ｏ６Ｐ  （Ｍ−Ｈ）：計算値  １９３．１；  検出値  １９３．０．
【０１５６】
Ｈ３方法：  固定化ガラクト−スオキシダ−ゼ配列番号１８
【化３７】
2021530479.tif 000040
酵素固定化手順：
Ｎｕｖｉａ  ＩＭＡＣ  Ｎｉ帯電樹脂（沈降容量に基づく３ｍＬ）をフィルタ−漏斗に加え、バインディング緩衝液（１０カラム容量、３０ｍＬ；  ５００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５ｍＭイミダゾ−ル、ｐＨ  ８．０）で洗浄し、樹脂保存液を除去し、洗浄した樹脂２．４ｇを得た。バイアル進化ガラクト−スオキシダ−ゼ（配列番号：１８、７５ｍｇ）凍結乾燥粉末を硫酸銅（ＩＩ）溶液（１００μＭ；１．００ｍＬ）に再懸濁し、結合緩衝液（５ｍＬ）と洗浄樹脂（４００ｍｇ）を添加した。２０℃で５時間回転ミキサ−を用いて混和した。この樹脂を、結合緩衝液（１０カラム容量、４ｍＬ）およびＢＩＳ−ＴＲＩＳメタン緩衝液（１０カラム容量、４ｍＬ；  ５０ｍＭ、ｐＨ  ７．５）でろ過洗浄し、反応に直接使用した。
反応手順：
固定化した進化したＧＯａｓｅ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１８（４００ｍｇ）をＢＩＳ−ＴＲＩＳメタン緩衝液（３５ｍＭ、ｐＨ７．２に調整）中の（Ｓ）−２−エチニル−ｐｒｏｐａｎｅ−１，２，３−ｔｒｉｏｌ  １−リン酸塩溶液（（９）、５．４ｍｍｏｌ、２７０ｍＭ、１ｍＬ）に添加した後、水（１００  μL）に再懸濁させた西洋ワサビペルオキシダ−ゼ（ＰＥＯ−３０１、１ｍｇ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来のカタラ−ゼ（ロシュ、凍結乾燥剤、＃１１６５０６４５１０３、３ｍｇ）を加えた。この反応を気体透過性膜で封じ、３０℃で４８時間激しく振とうした。２日後の最終変換は９０％変換に達し、（Ｒ）−２−エチニルグリセルアルデヒド３−りん酸（５）＞９９％  ｅ．ｅ．であった。酵素樹脂を濾別し、（Ｒ）−２−エチニルグリセルアルデヒド３−ホスフェ−ト（５）の溶液をさらに精製することなく直接使用した。１Ｈ  ＮＭＲ  （Ｄ２Ｏ，  ４００  ＭＨｚ）：  δ  ５．０２  （ｓ，  １Ｈ），  ４．００  （ｄｑ，  ２  Ｈ），  ２．８８  （ｓ，  １Ｈ）．ＬＣ−ＭＳ：  （ＥＳ，  ｍ／ｚ）：  ｒ  Ｃ５Ｈ７Ｏ６Ｐ  （Ｍ−Ｈ）：  計算値１９３．１；  検出値１９３．０．
【０１５７】
Ｈ４方法：  固定化ガラクト−スオキシダ−ゼ配列番号１９
【化３８】
2021530479.tif 000041
酵素固定化手順：
Ｎｕｖｉａ  ＩＭＡＣ  Ｎｉ帯電樹脂（沈降容量に基づく３ｍＬ）をフィルタ−漏斗に加え、バインディング緩衝液（１０カラム容量、３０ｍＬ；  ５００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５ｍＭイミダゾ−ル、ｐＨ  ８．０）で洗浄し、樹脂保存液を除去し、洗浄した樹脂２．４ｇを得た。容器に進化したガラクト−スオキシダ−ゼ（配列番号：１９、７５ｍｇ）凍結乾燥粉末を硫酸銅（ＩＩ）溶液（１００μＭ；１．００ｍＬ）に再懸濁し、結合緩衝液（５ｍＬ）と洗浄樹脂（４００ｍｇ）を添加した。２０℃で５時間回転ミキサ−を用いて混和した。この樹脂を、結合緩衝液（１０カラム容量、４ｍＬ）およびＢＩＳ−ＴＲＩＳメタン緩衝液（１０カラム容量、４ｍＬ；  ５０ｍＭ、ｐＨ  ７．５）でろ過洗浄し、反応に直接使用した。
反応手順：
固定化ＧＯａｓｅ  配列番号１８をＢＩＳ−ＴＲＩＳメタン緩衝液（３５ｍＭ、ｐＨ７．２に調整）中の（Ｓ）−２−エチニル−ｐｒｏｐａｎｅ−１，２，３−ｔｒｉｏｌ  １−リン酸塩溶液（９、５．４ｍｍｏｌ、２７０ｍＭ、１ｍＬ）に添加（４００ｍｇ）した後、水（１００μＬ）に再懸濁した西洋ワサビペルオキシダ−ゼ（ＰＥＯ−３０１、１ｍｇ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来のカタラ−ゼ（ロシュ、凍結乾燥剤、＃１１６５０６４５１０３、３ｍｇ）を加えた。この反応液を気体透過性膜で封じ、３０℃で４８時間激しく振とうした。２日後の最終変換は１００％の変換に達し、（Ｒ）−２−エチニルグリセルアルデヒド３−りん酸（５）は＞９９％  ｅ．ｅ．で得られた。酵素樹脂を濾別し、（Ｒ）−２−エチニルグリセルアルデヒド３−ホスフェ−ト（５）の溶液をさらに精製することなく直接使用した。１Ｈ  ＮＭＲ  （Ｄ２Ｏ，  ４００  ＭＨｚ）：  δ  ５．０２  （ｓ，  １Ｈ），  ４．００  （ｄｑ，  ２  Ｈ），  ２．８８  （ｓ，  １Ｈ）．ＬＣ−ＭＳ：  （ＥＳ，  ｍ／ｚ）：  Ｃ５Ｈ７Ｏ６Ｐ  （Ｍ−Ｈ）：  計算値１９３．１；  検出値１９３．０．
【０１５８】
「アミノ酸」は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨されている１文字記号のいずれかによって本明細書中で言及されている。本明細書中の記載の目的のために、本明細書中の方法で使用される酵素のために遺伝的にコ−ドされるアミノ酸のために使用されるコ−ドは、表２において慣用的である：
【表３】
2021530479.tif 000042
【０１５９】
本明細書に記載されるＥＦｄＡを合成するための工程および本明細書に記載される実験手順における例示された工程において使用される、または使用され得る酵素の配列番号が、表３のものに限定されるものではないが、提供される。
【表４】
2021530479.tif 000043
2021530479.tif 000044
2021530479.tif 000045
2021530479.tif 000046
2021530479.tif 000047
2021530479.tif 000048
2021530479.tif 000049
2021530479.tif 000050
【０１６０】
西洋ワサビペルオキシダ−ゼ：ワサビ根（Ａｍｏｒａｃｉａ  ｒｕｓｔｉｃａｎａ）から単離した、ＳＩＧＭＡ  （Ｐ８１２５）から市販のワサビＩ型由来の野生型ペルオキシダ−ゼ。
【０１６１】
カタラ−ゼ：（１）ＳＩＧＭＡ（Ｃ１３４５）から市販のウシ肝臓由来の野生型カタラ−ゼ；または（２）  ＣＡＴ−１０１、生体触媒；または（３）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  （Ｒｏｃｈｅ、＃１１６５０６４５１０３）由来。
【０１６２】
本発明の追加の実施形態は、限定されるものではないが、４’−エチニル２’−デオキシヌクレオシドまたはその類似体、例えば、ＥＦｄＡを産生するための本明細書に記載される合成プロセス段階における以下の酵素の使用を含む。
【０１６３】
Ａ．プリンヌクレオシドホスホリラ−ゼ。
１Ａ．    配列番号：９または配列番号：１５と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたプリンヌクレオシドホスホリラ−ゼであって、前記操作されたプリンヌクレオシドホスホリラ−ゼのポリペプチド配列が、配列番号：９または配列番号：１５と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換またはアミノ酸置換セットを含む、操作されたプリンヌクレオシドホスホリラ−ゼ。
２Ａ．前記操作されたプリンヌクレオシドホスホリラ−ゼが、配列番号９または配列番号１５と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるポリペプチド配列を含む、１Ａに記載の操作されたプリンヌクレオシドホスホリラ−ゼ。
３Ａ．操作されたプリンヌクレオシドホスホリラ−ゼであって、配列番号９又は配列番号１５に記載のポリペプチド配列を含むもの。
Ａ４．野生型大腸菌プリンヌクレオシドホスホリラ−ゼと比較して少なくとも１つの改良特性を含む、１Ａ〜３Ａのいずれか１つの操作されたプリンヌクレオシドホスホリラ−ゼ。
５Ａ．改良された特性が、野生型Ｅ．  ｃｏｌｉプリンヌクレオシドホスホリラ−ゼと比較して、基質化合物６．５（その環状または開鎖アルデヒドもしくは水和物、または前記のいずれかの塩）に対する改良された活性を含む、４Ａ記載の操作されたプリンヌクレオシドホスホリラ−ゼ。
６Ａ．改良された特性が、野生型Ｅ．  ｃｏｌｉプリンヌクレオシドホスホリラ−ゼと比較して、ＥＦｄＡ  （化合物７）の改良された産生を含む、４Ａ記載の操作されたプリンヌクレオシドホスホリラ−ゼ。
７Ａ．前記操作されたプリンヌクレオシドホスホリラ−ゼが精製される、Ａ１〜６Ａのいずれか一項に記載の操作されたプリンヌクレオシドホスホリラ−ゼ。
８Ａ．少なくとも１つのアミノ酸置換（すなわち、１つ以上のアミノ酸置換）が保存的アミノ酸置換である、１Ａ〜７Ａのいずれか１つの操作プリンヌクレオシドホスホリラ−ゼ。
【０１６４】
Ｂ．  ホスホペントムタ−ゼ。
１Ｂ．配列番号８と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含む操作されたホスホペントムタ−ゼであって、前記操作されたホスホペントムタ−ゼのポリペプチド配列が、配列番号８と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換またはアミノ酸置換セットを含む、操作されたホスホペントムタ−ゼ。
２Ｂ．遺伝子操作されたホスホペントムタ−ゼが、配列番号：８と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上が同一のポリペプチド配列を含む、１Ｂ記載の操作されたホスホペントムタ−ゼ。
３Ｂ．配列番号：８に記載のポリペプチド配列からなる、操作されたホスホペントムタ−ゼ。
４Ｂ．野生型Ｅ．  ｃｏｌｉホスホペントムタ−ゼと比較して少なくとも１つの改良特性を含む、１Ｂ〜３Ｂのいずれか１つの操作されたホスホペントムタ−ゼ。
５Ｂ．改良された特性が、野生型Ｅ．  ｃｏｌｉホスホペントムタ−ゼと比較して、基質化合物６（その環状または開鎖アルデヒドもしくは水和物、または前記のいずれかの塩）に対する改良された活性を含む、４Ｂ記載の操作されたホスホペントムタ−ゼ。
６Ｂ．改良された特性が、野生型Ｅ．  ｃｏｌｉホスホペントムタ−ゼと比較して、化合物６．５または化合物７（ＥＦｄＡ）の改良された産生を含む、４Ｂ記載の操作されたホスホペントムタ−ゼ。
７Ｂ．操作されたホスホペントムタ−ゼが精製される、１Ｂ〜６Ｂのいずれか１つの操作されたホスホペントムタ−ゼ。
８Ｂ．少なくとも１つのアミノ酸置換（すなわち、１つ以上のアミノ酸置換）が保存的アミノ酸置換である、１Ｂ〜７Ｂのいずれか１つの操作されたホスホペントムタ−ゼ。
【０１６５】
Ｃ．  デオキシリボ−ス−リン酸アルドラ−ゼ。
１Ｃ．配列番号：５に記載のＳｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｈａｌｉｆａｘｅｎｓｉｓポリペプチド配列由来の野生型からなるデオキシリボ−ス−リン酸アルドラ−ゼ。
２Ｃ．操作されたデオキシリボ−ス−リン酸アルドラ−ゼであって、配列番号：６又は配列番号：１４に記載のポリペプチド配列を含むもの。
３Ｃ．前記操作されたデオキシリボ−ス−リン酸アルドラ−ゼが、配列番号５、配列番号６または配列番号１４と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるポリペプチド配列を含む、操作されたデオキシリボ−ス−リン酸アルドラ−ゼ。
４Ｃ．配列番号：５、配列番号：６もしくは配列番号：１４に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有するポリペプチド配列、または配列番号：５、配列番号：６もしくは配列番号：１４に対して少なくとも１つのアミノ酸置換もしくはアミノ酸置換セットを含む、ポリペプチド配列を含む、操作されたデオキシリボ−ス−リン酸アルドラ−ゼ、またはその機能的フラグメント
５Ｃ．基質化合物５（（Ｒ）−２−エチニルグリセルアルデヒド３−リン酸、その水和物又は上記のいずれかの塩）に活動を有する１Ｃ〜４Ｃのいずれかのデオキシリボ−ス−リン酸アルドラ−ゼ。
６Ｃ．反応中に基質化合物５（（（Ｒ）−２−エチニルグリセルアルデヒド３−リン酸、その水和物、又は前記のいずれかの塩）上の保護基を必要とせずに化合物６（４−エチニルＤ−２−デオキシリボ−ス５−リン酸、又はその開鎖アルデヒドもしくは水和物形態、又は前記のいずれかの塩）を生成する能力を含む、１Ｃ〜５Ｃのいずれか１つのデオキシリボ−ス−リン酸アルドラ−ゼ。
７Ｃ．デオキシリボ−ス−リン酸アルドラ−ゼが、野生型Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｈａｌｉｆａｘｅｎｓｉｓデオキシリボ−ス−リン酸アルドラ−ゼと比較して、化合物６（４−エチニルＤ−２−デオキシリボ−ス５−リン酸、またはその開鎖アルデヒドもしくは水和物形態、または前記のいずれかの塩）の改良された産生を含む改良された特性を有する、２Ｃ〜６Ｃのいずれか１つの操作されたデオキシリボ−ス−リン酸アルドラ−ゼ。
８Ｃ．デオキシリボ−ス−リン酸アルドラ−ゼが精製される、１Ｃ〜７Ｃのいずれか１つのデオキシリボ−ス−リン酸アルドラ−ゼ。
９Ｃ．少なくとも１つのアミノ酸置換（すなわち、１つ以上のアミノ酸置換）が保存的アミノ酸置換である、２Ｃ〜７Ｃのいずれか１つの操作されたデオキシリボ−ス−リン酸アルドラ−ゼ。
【０１６６】
Ｄ．パントテン酸キナ−ゼ。
１Ｄ．少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１３またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２０、またはそれらの機能性フラグメントに有するポリペプチド配列を含み、ここに、前記工学的パントテン酸キナ−ゼのポリペプチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１３またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２０と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換またはアミノ酸置換セットを含む、工学的パントテン酸キナ−ゼ。
２Ｄ．前記操作されたパントテン酸キナ−ゼが、配列番号２、配列番号１２、配列番号１３または配列番号２０と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるポリペプチド配列を含む、１Ｄに記載の操作されたパントテン酸キナ−ゼ。
３Ｄ．操作されたパントテン酸キナ−ゼであって、配列番号：２、配列番号：１２、配列番号：１３または配列番号：２０に記載のポリペプチド配列を含むもの。
４Ｄ．野生型Ｅ．  ｃｏｌｉパントテン酸キナ−ゼと比較して少なくとも１つの改良特性を含む、１Ｄ〜３Ｄのいずれか１つの操作されたパントテン酸キナ−ゼ。
５Ｄ．改良された特性が、野生型ｅと比較して基質化合物４（（Ｒ）−２−エチニルグリセルアルデヒドまたはその水和物形態）に対する改良された活動を含む、４Ｄ記載の操作されたパントテン酸キナ−ゼ。大腸菌のパントテン酸キナ−ゼ。
６Ｄ．改良された特性が、野生型パントテン酸キナ−ゼと比較して、化合物５（（Ｒ）−２−エチニルグリセルアルデヒド３−リン酸）の改良された産生を含む、５Ｄ記載の操作されたパントテン酸キナ−ゼ。
７Ｄ．改良された特性が、野生型ｅと比較して基質化合物３（２−エチニルプロパン−１，２，３−トリオ−ル）に対する改良された活性を含む、４Ｄ記載の操作されたパントテン酸キナ−ゼ。大腸菌のパントテン酸キナ−ゼ。
８Ｄ．改良された特性が、野生型パントテン酸キナ−ゼと比較して、化合物９（（Ｓ）−２−エチニルプロパン−１，２，３−トリオ−ル１−リン酸）の改良された産生を含む、７Ｄ記載の操作されたパントテン酸キナ−ゼ。
９Ｄ．パントテン酸キナ−ゼが精製される、１Ｄ〜８Ｄのいずれか１つの操作されたパントテン酸キナ−ゼ。
１０Ｄ．少なくとも１つのアミノ酸置換（すなわち、１つ以上のアミノ酸置換）が保存的アミノ酸置換である、１Ｄ〜９Ｄのいずれか１つの操作されたパントテン酸キナ−ゼ。
【０１６７】
Ｅ．ガラクト−スオキシダ−ゼ。
１Ｅ．少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ．：１、１０、１１、１６、１７、１８または１９に有するポリペプチド配列、またはそれらの機能性フラグメントを含む工学的ガラクト−スオキシダ−ゼであって、前記工学的ガラクト−スオキシダ−ゼのポリペプチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ．：１、１０、１１、１６、１７、１８または１９と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換またはアミノ酸置換セットを含む、工学的ガラクト−スオキシダ−ゼ。
２Ｅ．遺伝子操作されたガラクト−スオキシダ−ゼが、配列ＩＤ  ＮＯ：１、１０、１１、１６、１７、１８または１９と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上であるポリペプチド配列を含む、１Ｅ記載の操作されたガラクト−スオキシダ−ゼ。
３Ｅ．操作されたガラクト−スオキシダ−ゼであって、配列番号１、１０、１１、１６、１７、１８又は１９に示されるポリペプチド配列を含むもの。
４Ｅ．野生型Ｆ．  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍガラクト−スオキシダ−ゼと比較して少なくとも１つの改良特性を含む、１Ｅ〜３Ｅのいずれか１つの操作されたガラクト−スオキシダ−ゼ。
５Ｅ．改良された特性が、野生型Ｆ．  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍガラクト−スオキシダ−ゼと比較して、第一級アルコ−ルである基質に対する改良された活性を含む、４Ｅ記載の操作されたガラクト−スオキシダ−ゼ。 
６Ｅ．改良された特性が、野生型Ｆ．  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍガラクト−スオキシダ−ゼと比較して基質化合物３（２−エチニルプロパン−１，２，３−トリオ−ル）に対する改良された活動を含む、４Ｅの操作されたガラクト−スオキシダ−ゼ。
７Ｅ．改良された特性が、野生型Ｆ．  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍガラクト−スオキシダ−ゼと比較して、化合物４（（Ｒ）−２−エチニルグリセルアルデヒドまたはその水和物形態）の改良された生産を含む、６Ｅの操作されたガラクト−スオキシダ−ゼ。
８Ｅ．改良された特性が、野生型Ｆ．  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍガラクト−スオキシダ−ゼと比較して、基質化合物９（（（Ｓ）−２−エチニルプロパン−１，２，３−トリオ−ル１−リン酸）に対する改良された活性を含む、４Ｅの操作されたガラクト−スオキシダ−ゼ。
９Ｅ．改良された特性が、野生型Ｆ．  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍガラクト−スオキシダ−ゼと比較して、化合物５（（Ｒ）−２−エチニルグリセルアルデヒド３−リン酸またはその水和物形態）の改良された生産を含む、８Ｅ記載の操作されたガラクト−スオキシダ−ゼ。
１０Ｅ．前記ガラクト−スオキシダ−ゼが精製される、１Ｅ〜９Ｅのいずれか１つの操作されたガラクト−スオキシダ−ゼ。
１１Ｅ．少なくとも１つのアミノ酸置換（すなわち、１つ以上のアミノ酸置換）が保存的アミノ酸置換である、１Ｅ〜１０Ｅのいずれか１つの操作されたガラクト−スオキシダ−ゼ。
【０１６８】
Ｆ．酢酸キナ−ゼ。
１Ｆ．配列番号：３または配列番号：２１に記載のＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａポリペプチド配列由来の野生型からなる酢酸キナ−ゼ。
２Ｆ．操作されたアセテ−トキナ−ゼであって、前記操作されたアセテ−トキナ−ゼが、配列番号３または配列番号２１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるポリペプチド配列を含む、操作されたアセテ−トキナ−ゼ。
３Ｆ．配列番号：３または配列番号：  ２１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、操作された酢酸キナ−ゼ、ここで操作された酢酸キナ−ゼのポリペプチド配列は、配列番号：３または配列番号：  ２１と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換またはアミノ酸置換セットを含む、操作された酢酸キナ−ゼ。
４Ｆ．野生型Ｔ．  ｍａｒｉｔｉｍａ酢酸キナ−ゼと比較して少なくとも１つの改良特性を含む２Ｆまたは３Ｆの酢酸キナ−ゼ。
５Ｆ．改良された特性が、野生型Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ  ａｃｅｔａｔｅキナ−ゼと比較して、基質化合物４（（Ｒ）−２−エチニルグリセルアルデヒドまたはその水和物形態）上のリン酸化反応におけるＡＴＰ−補因子リサイクリングのための改良された活性を含む、４Ｆ記載の酢酸キナ−ゼ。
６Ｆ．改良された特性が、野生型Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ  ａｃｅｔａｔｅキナ−ゼと比較して、化合物５（（Ｒ）−２−エチニルグリセルアルデヒド３−リン酸またはその水和物形態、または前記のいずれかの塩）の改良された産生を含む、５Ｆ記載の酢酸キナ−ゼ。
７Ｆ．前記改良された特性が、野生型Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ  ａｃｅｔａｔｅキナ−ゼと比較して、基質化合物３（２−エチニルプロパン−１，２，３−トリオ−ル）上のリン酸化反応におけるＡＴＰ−補因子リサイクリングのための改良された活性を含む、４Ｆ記載の酢酸キナ−ゼ。
８Ｆ．前記改良された特性が、野生型Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ  ａｃｅｔａｔｅキナ−ゼと比較して、化合物９（（（Ｓ）−２エチニル−ｐｒｏｐａｎｅ−１，２，３−ｔｒｉｏｌ  １−リン酸塩）またはそのいずれかの塩の改良された生産を含む、７Ｆ記載の酢酸キナ−ゼ。
９Ｆ．前記酢酸キナ−ゼが精製される、１Ｆ〜８Ｆのいずれか一項に記載の酢酸キナ−ゼ。
１０Ｆ．少なくとも１つのアミノ酸置換（すなわち、１つ以上のアミノ酸置換）が保存的アミノ酸置換である、２Ｆ〜７Ｆのいずれか１つの操作された酢酸キナ−ゼ。
【手続補正書】
【提出日】令和3年3月2日(2021.3.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
４’−エチニル２’−デオキシヌクレオシドまたはその類似体の合成方法であって、マンガン（ＩＩ）塩を含む緩衝液中で化合物６．５
【化１】
2021530479.tif 000081
［式中、２Ｘ＋は（ａ）２つのプロトン、（ｂ）１つのプロトンと１つの１価カチオン、（ｃ）同一または異なる２つの１価カチオン、または（ｄ）１つの２価カチオンである。］
をプリンヌクレオシドホスホリラーゼおよびヌクレオ塩基もしくはその類似体と組合せることを含む、前記方法。
【請求項２】
４’−エチニル２’−デオキシヌクレオシドが
【化２】
2021530479.tif 000082
である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
化合物
【化３】
2021530479.tif 000083
を単離することをさらに含む、請求項２記載の方法
【請求項４】
マンガン（ＩＩ）塩を含む緩衝液中で化合物６
【化４】
2021530479.tif 000084
およびホスホペントムターゼをプリンヌクレオシドホスホリラーゼおよびヌクレオ塩基またはその類似体と組み合わせることをさらに含む、請求項１に記載の４’−エチニル２’−デオキシヌクレオシドまたはその類似体の合成方法。
【請求項５】
反応混合物から無機リン酸副生成物を除去することをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
（ａ）反応混合物にスクロースホスホリラーゼおよびスクロースを加えること、または、（ｂ）反応混合物にカルシウム、マグネシウムまたはマンガンを加えることにより、反応溶液から無機リン酸副生成物を除去することを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
４’−エチニル２’−デオキシヌクレオシドまたはその類似体を単離することをさらに含む、請求項４から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
４’−エチニル２’−デオキシヌクレオシドが
【化５】
2021530479.tif 000085
である、請求項．４から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
化合物
【化６】
2021530479.tif 000086
を単離することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
化合物６を合成する工程をさらに含む請求項４に記載の方法であって、水溶液中で化合物５
【化７】
2021530479.tif 000087
［式中、２Ｘ＋は（ａ）２つのプロトン、（ｂ）１つのプロトンと１つの１価カチオン、（ｃ）同一または異なる２つの１価カチオン、または（ｄ）１つの２価カチオンである。］
をアセトアルデヒドおよびデオキシリボース−リン酸アルドラーゼと組み合わせて化合物６を生成することを含む、前記方法。
【請求項１１】
反応が密閉容器で実施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
化合物５を合成する工程をさらに含む請求項１０または１１に記載の方法であって、化合物４
【化８】
2021530479.tif 000088
を、２価金属塩の存在下で緩衝液中のパントテン酸キナーゼと組み合わせ、その場で再生したＡＴＰをリン酸源として組み合わせて、化合物５を生成する前記方法。
【請求項１３】
（ａ）アセチルリン酸および酢酸キナーゼ、または（ｂ）ピルビン酸、リン酸および酸素の存在下でのピルビン酸オキシダーゼ、カタラーゼおよび酢酸キナーゼ、または（ｃ）それらの組合せを用いて、その場でＡＴＰを再生する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）パントテン酸キナーゼが固定されているか、または、（ｂ）パントテン酸キナーゼと酢酸キナーゼが固定されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
化合物４を合成する工程をさらに含む請求項１２に記載の方法であって、該合成が、酸素の存在下で、緩衝液中において、化合物３
【化９】
2021530479.tif 000089
を（ａ）ガラクトースオキシダーゼ、銅、カタラーゼおよび（ｂ）パーオキシダーゼまたは酸化剤と組み合わせて、化合物４を生成させることを含む、前記方法。
【請求項１６】
ガラクトースオキシダーゼが固定されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
４’−エチニル２’−デオキシヌクレオシドまたはその類似体の合成方法であって、マンガン（ＩＩ）塩を含む緩衝液中において、化合物５
【化１０】
2021530479.tif 000090
［式中、２Ｘ＋は（ａ）２つのプロトン、（ｂ）１つのプロトンと１つの１価カチオン、（ｃ）同一または異なる２つの１価カチオン、または（ｄ）１つの２価カチオンである。］、
アセトアルデヒドおよびヌクレオ塩基またはその類似体を、デオキシリボース−リン酸アルドラーゼ、ホスホペントムターゼおよびプリンヌクレオシドホスホリラーゼと組み合わせることを含む、前記方法。
【請求項１８】
反応混合物から無機リン酸副生成物を除去することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）反応混合物にスクロースホスホリラーゼおよびスクロースを加えること、または、（ｂ）反応混合物にカルシウム、マグネシウムまたはマンガンを加えることにより、反応混合物から無機リン酸副生成物を除去することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
４’−エチニル２’−デオキシヌクレオシドまたはその類似体を単離することをさらに含む、請求項１７から１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
４’−エチニル２’−デオキシヌクレオシドが
【化１１】
2021530479.tif 000091
である、請求項１７から１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
化合物
【化１２】
2021530479.tif 000092
を単離することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
化合物６．５
【化１３】
2021530479.tif 000093
［式中、２Ｘ＋は（ａ）２つのプロトン、（ｂ）１つのプロトンと１つの１価カチオン、（ｃ）同一または異なる２つの１価カチオン、または（ｄ）１つの２価カチオンである。］
を合成する方法であって、マンガン（ＩＩ）塩を含む緩衝液中において化合物６
【化１４】
2021530479.tif 000094
［式中、２Ｘ＋は（ａ）２つのプロトン、（ｂ）１つのプロトンと１つの１価カチオン、（ｃ）同一または異なる２つの１価カチオン、または（ｄ）１つの２価カチオンである。］
をホスホペントムターゼと組み合わせることを含む、前記方法。
【請求項２４】
化合物６
【化１５】
2021530479.tif 000095
［式中、２Ｘ＋は（ａ）２つのプロトン、（ｂ）１つのプロトンと１つの１価カチオン、（ｃ）同一または異なる２つの１価カチオン、または（ｄ）１つの２価カチオンである。］
を合成する方法であって、化合物５
【化１６】
2021530479.tif 000096
［式中、２Ｘ＋は（ａ）２つのプロトン、（ｂ）１つのプロトンと１つの１価カチオン、（ｃ）同一または異なる２つの１価カチオン、または（ｄ）１つの２価カチオンである。］
を水溶液中でアセトアルデヒトおよびデオキシリボース−リン酸アルドラーゼと組み合わせて化合物６を生成することを含む、前記方法。
【請求項２５】
化合物５
【化１７】
2021530479.tif 000097
［式中、２Ｘ＋は（ａ）２つのプロトン、（ｂ）１つのプロトンと１つの１価カチオン、（ｃ）同一または異なる２つの１価カチオン、または（ｄ）１つの２価カチオンである。］
を合成する方法であって、化合物４
【化１８】
2021530479.tif 000098
を、２価金属塩の存在下で緩衝液中のパントテン酸キナーゼと組合せ、その場で再生したＡＴＰをリン酸源として組み合わせることを含む、前記方法。
【請求項２６】
（ａ）アセチルリン酸および酢酸キナーゼ、または（ｂ）ピルビン酸、リン酸および酸素の存在下でのピルビン酸オキシダーゼ、カタラーゼおよび酢酸キナーゼ、または（ｃ）それらの組合せを用いて、その場でＡＴＰを再生する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
（ａ）パントテン酸キナーゼが固定されているか、または、（ｂ）パントテン酸キナーゼと酢酸キナーゼが固定されている、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
化合物４
【化１９】
2021530479.tif 000099
を合成する方法であって、化合物３
【化２０】
2021530479.tif 000100
を、（ａ）ガラクトースオキシダーゼ、銅、カタラーゼ、および（ｂ）ペルオキシダーゼ、または酸化剤と、酸素の存在下、緩衝溶液中で組み合わせて、化合物４を生成させることを含む、前記方法。
【請求項２９】
ガラクトースオキシダーゼが固定されている、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
化合物４
【化２１】
2021530479.tif 000101
を単離する方法であって、
（１）酸素の不在下で、水と混和しない有機溶媒中で安定なＮ，Ｎ−アセタールまたはＮ，Ｏ−アセタールを生成するアミン、ジアミンまたはアミノアルコールと化合物４を反応させてアミナールを形成し、
（２）水と混和しない有機溶媒の存在下でアミナールを有機酸または無機酸と反応させて化合物４を再生することを含む、前記方法。
【請求項３１】
化合物５
【化２２】
2021530479.tif 000102
［式中、２Ｘ＋は（ａ）２つのプロトン、（ｂ）１つのプロトンと１つの１価カチオン、（ｃ）同一または異なる２つの１価カチオン、または（ｄ）１つの２価カチオンである。］
を合成する方法であって、化合物９
【化２３】
2021530479.tif 000103
［式中、２Ｘ＋は（ａ）２つのプロトン、（ｂ）１つのプロトンと１つの１価カチオン、（ｃ）同一または異なる２つの１価カチオン、または（ｄ）１つの２価カチオンである。］
を、酸素、カタラーゼおよびペルオキシダーゼもしくは化学酸化剤のいずれかの存在下で、緩衝液中のガラクトースオキシダーゼと組み合わせて化合物５を生成することを含む、前記方法。
【請求項３２】
化合物９
【化２４】
2021530479.tif 000104
［式中、２Ｘ＋は（ａ）２つのプロトン、（ｂ）１つのプロトンと１つの１価カチオン、（ｃ）同一または異なる２つの１価カチオン、または（ｄ）１つの２価カチオンである。］
を合成する方法であって、化合物３
【化２５】
2021530479.tif 000105
を、２価金属塩の存在下で緩衝液中のパントテン酸キナーゼと組み合わせ、その場で再生したＡＴＰをリン酸源として組み合わせて、化合物９を生成する前記方法。
【請求項３３】
下記式の化合物。
【化２６】
2021530479.tif 000106
【請求項３４】
下記式の化合物。
【化２７】
2021530479.tif 000107
［式中、２Ｘ＋は（ａ）２つのプロトン、（ｂ）１つのプロトンと１つの１価カチオン、（ｃ）同一または異なる２つの１価カチオン、または（ｄ）１つの２価カチオンである。］
【請求項３５】
下記式の化合物。
【化２８】
2021530479.tif 000108
［式中、２Ｘ＋は（ａ）２つのプロトン、（ｂ）１つのプロトンと１つの１価カチオン、（ｃ）同一または異なる２つの１価カチオン、または（ｄ）１つの２価カチオンである。］
【請求項３６】
下記式の化合物。
【化２９】
2021530479.tif 000109
［式中、２Ｘ＋は（ａ）２つのプロトン、（ｂ）１つのプロトンと１つの１価カチオン、（ｃ）同一または異なる２つの１価カチオン、または（ｄ）１つの２価カチオンである。］
【国際調査報告】
2021530479.tif 000110
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