(57)【要約】  本発明は、ユビキチンＣ末端タグが結合された生体分子を宿主細胞から組換え発現させて取得し、これをユビキチン化に関与するＥ１（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ）、Ｅ２（Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ）、Ｅ３（Ｌｉｇａｓｅ）タンパク質及び基質とともにインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でポリユビキチン化させて、２つ以上のユビキチンが共有結合によって形成されたポリユビキチン・スキャフォールドに生体分子が結合して形成された線形マルチマー生体分子重合体を提供する。本発明に係る重合体は、生体分子の分離・精製、前記生体分子と結合する目的物質の分離などに用いられ得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ユビキチンＣ末端タグ（ｔａｇ）が融合またはリンカーにより結合された生体分子（ｂｉｏ−ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）を原核細胞または真核細胞を含む宿主細胞から組換え発現させ、並びに、
（ｉｉ）前記宿主細胞の溶解物（ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅｓ）にユビキチン化のためのＥ１、Ｅ２及びＥ３酵素、またはＥ１及びＥ２酵素を加えて反応させることを含み、
２つ以上のユビキチンの共有結合によって形成されたポリユビキチン・スキャフォールド（ｐｏｌｙｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）に結合された生体分子であって、互いに異なる結合部位（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ）に対してそれぞれ特異的な２つ以上の結合モイアティ（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を含む、線形の多機能性マルチマー生体分子（ｌｉｎｅａｒ  ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）を製造する方法。
【請求項２】
前記Ｅ２酵素は、ユビキチンの４８番または６３番目のアミノ酸残基のリシンに結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｅ２酵素は、Ｅ２−２５Ｋユビキチン結合（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ）酵素である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｅ２酵素は、ユビキチン結合酵素複合体であるＵｃｂ１３−ＭＭＳ２である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記生体分子は、他の生体分子、低分子化合物（ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）またはナノ粒子などと特異的に結合する活性部位（ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅｓ）を有するものであって、酵素、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、抗体、抗体断片、ＤＮＡ及びＲＮＡからなる群から選ばれた一種以上である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記生体分子は、タンパク質Ａ（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ）、タンパク質Ｇ（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ）、リシン（ｌｙｓｉｎ）、エンドリシン（ｅｎｄｏｌｙｓｉｎ）、プロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅｓ）、ヒドロラーゼ（ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、酸化還元酵素（ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、リアーゼ（ｌｙａｓｅ）、親和性リガンド（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｌｉｇａｎｄ）及び受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）からなる群から選ばれた一種以上である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記生体分子は、インスリン、インスリン類似体、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド類（ＧＬＰ−ｌなど）、ＧＬＰ−１／グルカゴンデュアルアゴニスト、エキセンディン−４（ｅｘｅｎｄｉｎ−４）、エキセンディン−４（ｅｘｅｎｄｉｎ−４）類似体、インスリン分泌ペプチド及びその類似体、ヒト成長ホルモン（ｈｕｍａｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、成長ホルモン放出ペプチド、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、抗肥満ペプチド、Ｇタンパク質共役受容体（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｌｐｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、レプチン、ＧＩＰ（Ｇａｓｔｒｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、インターロイキン類、インターロイキン受容体類、インターロイキン結合タンパク質類、インターフェロン類、インターフェロン受容体類、サイトカイン結合タンパク質類、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンフォトキシン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、腫瘍抑制因子、転移成長因子、α−１アンチトリプシン、アルブミン、α−ラクトアルブミン、アポリポタンパクＥ、赤血球生成因子（ＥＰＯ）、高グリコシル化赤血球生成因子、アンジオポエチン類、ヘモグロビン、クロンビン、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモジュリン、血液第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子及び第ＸＩＩＩ因子、プラスミノーゲン活性因子、フィブリン−結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、タンパク質Ｃ、Ｃ−反応性タンパク質、レニンインヒビター、コラゲナーゼインヒビター、スーパーオキシドディスムターゼ、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンギオスタチン、アンジオテンシン、骨形成に関わる成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性因子、組織因子経路インヒビター、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、神経成長因子類、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、リラキシン、セクレチン、ソマトメジン、副腎皮質ホルモン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、受容体、受容体拮抗物質、線維芽細胞増殖因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、アディポネクチン（Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）、インターロイキン受容体拮抗薬（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）、細胞表面抗原、ウィルス由来ワクチン抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体及び抗体断片類からなる群から選ばれる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記組換え発現された生体分子は、ユビキチンＣ末端タグであるユビキチンのＮ末端から７６番目のアミノ酸残基のグリシンのＣ末端部が１〜５０個のアミノ酸で延長されたものであり、
（ｉｉ）の反応の前または後に、前記組換え発現された生体分子にＤＵＢ（Ｄｅｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）を加えることをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
前記生体分子は、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔａｔｅ）、６ｘＨｉｓ、キチン結合ドメイン（Ｃｈｉｔｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）、ＧＳＴ、トロンビン（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ）、ＦＬＡＧタグにより延長される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＤＵＢは、ＹＵＨ１、ＹＵＨ２、ＵＣＨ−Ｌ１、ＵＣＨ−Ｌ２またはＵＣＨ−Ｌ３である、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ユビキチンＣ末端タグは、これの任意の位置の一つのリシンを除いた他のリシンが削除されているか、あるいは、リシンではない他のアミノ酸に置換されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
前記ユビキチンのＮ末端Ｍｅｔ１から始まって１１番目、４８番目または６３番目のアミノ酸残基のリシンを除いた、ユビキチンのすべてのリシンがアルギニンに置換されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ユビキチンＣ末端タグは、２つ以上のユビキチンがヘッドトゥーテール（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ）状に繰り返し結合されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ヘッドトゥーテール状に結合されているユビキチンは、Ｎ末端から７５番目及び７６番目のアミノ酸残基のグリシンがバリンを含む他のアミノ酸に置換されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ユビキチンのＮ末端から７３番目の残基のロイシンがプロリンに置換されている、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
ポリユビキチン・スキャフォールド及び生体分子から構成された、互いに異なる結合部位（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ）に対して特異的な２つ以上の結合モイアティ（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を含む、線形多機能性生体分子重合体であって、
前記ポリユビキチン・スキャフォールドは、２つ以上のユビキチンが共有結合によって結合されて形成されており、前記生体分子は、他の生体分子、低分子化合物（ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）またはナノ粒子などと特異的に結合する活性部位（ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅｓ）を有し、前記ユビキチンのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方ともにそれぞれ結合されている、線形多機能性マルチマー生体分子重合体（ｌｉｎｅａｒ  ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｃｏｍｐｌｅｘ）。
【請求項１７】
前記線形マルチマー生体分子重合体は、２〜４個の生体分子から構成される、請求項１６に記載の線形多機能性マルチマー生体分子重合体。
【請求項１８】
前記生体分子は、前記ユビキチンのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方ともにリンカーにより結合されている、請求項１６または１７に記載の線形多機能性マルチマー生体分子重合体。
【請求項１９】
前記リンカーは、ＧＧＧＧＳまたはＥＡＡＡＫが１〜６個繰り返し組み合わせられている、請求項１８に記載の線形多機能性マルチマー生体分子重合体。
【請求項２０】
前記ユビキチンのＮ末端に結合された生体分子は、前記線形マルチマー生体分子重合体の遠位末端（ｄｉｓｔａｌ  ｅｎｄ）である、請求項１６に記載の線形多機能性マルチマー生体分子重合体。
【請求項２１】
前記ユビキチンのＣ末端またはＮ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方ともに結合された生体分子は、線形マルチマー生体分子重合体の近位末端（ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｅｎｄ）である、請求項１６に記載の線形多機能性マルチマー生体分子重合体。
【請求項２２】
前記ポリユビキチン・スキャフォールドは、ユビキチンのすべてのリシンがアルギニンに置換されたものである供与体ユビキチンと、Ｎ末端から１１番目、４８番目または６３番目のアミノ酸残基のリシンを除いたユビキチンのすべてのリシンがアルギニンに置換されたものである受容体ユビキチンとが共有結合によって結合されて形成されている、請求項１６または１７に記載の線形多機能性マルチマー生体分子重合体。
【請求項２３】
前記ユビキチンのＮ末端から７３番目のアミノ酸残基のロイシンが、プロリンに置換されている、請求項１６または１７に記載の線形多機能性マルチマー生体分子重合体。
【請求項２４】
前記受容体ユビキチンは、アスパラギン酸、６ｘＨｉｓタグ、またはＧＳＴタグにより延長される、請求項２２に記載の線形多機能性マルチマー生体分子重合体。
【請求項２５】
前記線形マルチマー生体分子重合体は、２〜２０個の生体分子から構成される、請求項１６に記載の線形多機能性マルチマー生体分子重合体。
【請求項２６】
生体分子が、酵素、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、抗体、抗体断片、ＤＮＡ及びＲＮＡからなる群から選ばれた一種以上である、請求項１６または１７に記載の線形多機能性マルチマー生体分子重合体。
【請求項２７】
前記生体分子は、タンパク質Ａ（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ）、タンパク質Ｇ（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ）、リシン（ｌｙｓｉｎ）、エンドリシン（ｅｎｄｏｌｙｓｉｎ）、プロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅｓ）、ヒドロラーゼ（ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、酸化還元酵素（ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、リアーゼ（ｌｙａｓｅ）、親和性リガンド（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｌｉｇａｎｄ）及び受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）からなる群から選ばれた一種以上である、請求項１８に記載の線形多機能性マルチマー生体分子重合体。
【請求項２８】
前記生体分子は、インスリン、インスリン類似体、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド類（ＧＬＰ−ｌなど）、ＧＬＰ−１／グルカゴンデュアルアゴニスト、エキセンディン−４（ｅｘｅｎｄｉｎ−４）、エキセンディン−４（ｅｘｅｎｄｉｎ−４）類似体、インスリン分泌ペプチド及びその類似体、ヒト成長ホルモン（ｈｕｍａｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、成長ホルモン放出ペプチド、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、抗肥満ペプチド、Ｇタンパク質共役受容体（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｌｐｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、レプチン、ＧＩＰ（Ｇａｓｔｒｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、インターロイキン類、インターロイキン受容体類、インターロイキン結合タンパク質類、インターフェロン類、インターフェロン受容体類、サイトカイン結合タンパク質類、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンフォトキシン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、腫瘍抑制因子、転移成長因子、α−１アンチトリプシン、アルブミン、α−ラクトアルブミン、アポリポタンパクＥ、赤血球生成因子（ＥＰＯ）、高グリコシル化赤血球生成因子、アンジオポエチン類、ヘモグロビン、クロンビン、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモジュリン、血液第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子及び第ＸＩＩＩ因子、プラスミノーゲン活性因子、フィブリン−結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、タンパク質Ｃ、Ｃ−反応性タンパク質、レニンインヒビター、コラゲナーゼインヒビター、スーパーオキシドディスムターゼ、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンギオスタチン、アンジオテンシン、骨形成に関わる成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性因子、組織因子経路インヒビター、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、神経成長因子類、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、リラキシン、セクレチン、ソマトメジン、副腎皮質ホルモン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、受容体、受容体拮抗物質、線維芽細胞増殖因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、アディポネクチン（Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）、インターロイキン受容体拮抗薬（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）、細胞表面抗原、ウィルス由来ワクチン抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体及び抗体断片類からなる群から選ばれる、請求項１６または１７に記載の線形多機能性マルチマー生体分子重合体。
【請求項２９】
前記線形マルチマー生体分子重合体が、Ｅ３、Ｅ２、Ｅ１、フリーのユビキチン（ｆｒｅｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）、または基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）から始まったものである、請求項１６または１７に記載の線形多機能性マルチマー生体分子重合体。
【請求項３０】
前記Ｅ３は、Ｒｓｐ５、ＷＷＰ１、ｎｅｄｄ４またはＸＩＡＰ、またはこれの最小触媒ドメイン（ｍｉｎｉｍａｌ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｄｏｍａｉｎ）であり、前記Ｅ２は、Ｕｂｃ７、Ｕｂｃｈ５ａ、Ｅ２−２５Ｋ、Ｕｂｃ１３−ＭＭＳ２複合体、またはこれの触媒ドメインである、請求項２９に記載の線形多機能性マルチマー生体分子重合体。
【請求項３１】
前記フリーのユビキチンは、これの任意の位置の一つのリシンを除いた他のリシンが削除されるか、あるいは、リシンではない他のアミノ酸に置換されている、請求項３０に記載の線形多機能性マルチマー生体分子重合体。
【請求項３２】
前記フリーのユビキチンは、これのＮ末端から１１番目、４８番目または６３番目のアミノ酸残基のリシンを除いたすべてのリシンがアルギニンに置換されている、請求項３１に記載の線形多機能性マルチマー生体分子重合体。
【請求項３３】
前記フリーのユビキチンは、これのＮ末端から７６番目のアミノ酸残基のグリシンのＣ末端部が１〜５０個のアミノ酸で延長されている、請求項３２に記載の線形多機能性マルチマー生体分子重合体。
【請求項３４】
前記フリーのユビキチンは、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔａｔｅ）、６ｘＨｉｓタグ、またはＧＳＴタグにより延長されている、請求項３３に記載の線形多機能性マルチマー生体分子重合体。
【請求項３５】
前記フリーのユビキチンのＮ末端Ｍｅｔ１に生体分子が結合されている、請求項３１に記載の線形多機能性マルチマー生体分子重合体。
【請求項３６】
前記生体分子の一つの末端にイニシエータとしてＥ３、Ｅ２、Ｅ１、フリーのユビキチン（ｆｒｅｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）または基質が付着されている、請求項３１に記載の線形多機能性マルチマー生体分子重合体。
【請求項３７】
前記基質は、Ｅ３リガーゼを認識するアミノ酸配列を含み、ユビキチンが結合し得るリシンを一つ以上含むタンパク質である、請求項２９に記載の線形多機能性マルチマー生体分子重合体。
【請求項３８】
前記タンパク質は、Ｒｓｐ５またはＮｅｄｄ４−１，２に対してＰＰＰＹを有する、請求項３７に記載の線形多機能性マルチマー生体分子重合体。
【請求項３９】
前記ユビキチンは、これの任意の位置の一つのリシンを除いた他のリシンが削除されるか、あるいは、リシンではない他のアミノ酸に置換されている、請求項３１に記載の線形多機能性マルチマー生体分子重合体。
【請求項４０】
前記生体分子が、分子量４０〜１００ｋＤａのタンパク質である、請求項１６または１７に記載の線形多機能性マルチマー生体分子重合体。
【請求項４１】
（ｉ）ユビキチンＣ末端タグ（ｔａｇ）であるユビキチンが融合またはリンカーにより結合された生体分子（ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）を宿主細胞から組換え発現させ、並びに、
（ｉｉ）前記宿主細胞の溶解物（ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅｓ）にユビキチン化のためのＥ１、Ｅ２及びＥ３酵素、またはＥ１及びＥ２酵素を加えて反応させることを含み、
互いに異なる結合部位（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ）に対してそれぞれ特異的な２つ以上の結合モイアティ（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を含む、２つ以上の生体分子を部位特異的（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）に結合するための、ポリユビキチン・スキャフォールド（ｐｏｌｙｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質を含む生体分子をマルチマー形態の重合体として製造する方法に関する。具体的に、本発明は、宿主細胞から組換え発現させた生体分子を、ユビキチン化システムを用いて線形多機能性マルチマー生体分子重合体として製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）、ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）、ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む生体分子（ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）及び／または小分子化合物（ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）をマルチマー形態（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ  ｆｏｒｍ）に製作することは、様々なメリットを有する。例えば、２以上の同種または異種のタンパク質を融合（ｆｕｓｉｏｎ）したり、あるいは架橋剤（ｃｒｏｓｓ  ｌｉｎｋｅｒ  ｏｒ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を用いて結合したりすることにより、タンパク質の溶解性、ゲル化、熱安定性及びｐＨ安定性などの物理化学的な特性を改善することができる。例えば、架橋剤を介して多重結合されて形成されたラッカーゼ（ｌａｃｃａｓｅ）、架橋酵素凝集体（ＣＬＥＡ；ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  ｅｎｚｙｍｅ  ａｇｇｒｅｇａｔｅ）は、澱粉の酸化の際により一層向上した安定性と性能を示し、他の酵素であるニトリルヒドラターゼ（ｎｉｔｒｉｌｅ  ｈｙｄｒａｔａｓｅ）の架橋酵素凝集体（ＣＬＥＡ）は、アクリロニトリル（ａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ）のアクリルアミド（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）への転換に卓越した活性の増加を示し、３６回にわたって再活用される間に活性を失わなかった。また、多くのタンパク質は、細胞内において複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）を形成して複雑な機能を行い、これは、タンパク質の近接効果（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ｅｆｆｅｃｔ）によることであると知られている。例えば、リグノセルロース（ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）の分解に必要な酵素であるセルラーゼ（ｃｅｌｌｕｌａｓｅ）、β−グルコシダーゼ（β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）、ヘミセルラーゼ（Ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌａｓｅ）などを、スキャフォールド（ｓｃａｆｆｏｌｄ）を用いて複合混合物の形態で製造したセルラーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ｃｅｌｌｉｃ(登録商標)  ＣＴｅｃ３）は、リグノセルロース（ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）の分解に際して３．５倍以上増加した効果を示すことが知られている。また、このようなマルチマー形態のタンパク質は、チャンネリング効果（ｃｈａｎｎｅｌｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔ）を示す。すなわち、カップリング反応（ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）に関与する酵素が隣り合って存在すれば、中間体の伝達が効率よく行われて全体反応の効率が大きく増加する。また、ビード（ｂｅａｄ）もしくは基板（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）に固定化されたタンパク質を用いて任意の物質を分析したり、検出の対象となる物質を分離及び／または精製したりするに当たっても、同種または異種のタンパク質をマルチマーの形態で用いることは、これの効率性の増大のために望ましいこととして提案されている。このように、マルチマー形態のタンパク質が産業的及び医薬的な用途において様々なメリットを与えるにも拘わらず、このような構造のタンパク質を製作することは困難であることが知られている。例えば、マルチマータンパク質を遺伝子段階においてインフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）でデザインして新たなヒュージョン酵素として開発・産生する方法が挙げられる。しかしながら、新たなタンパ���質をデザインして産生せねばならないため、開発時間が長引き、現実的に２つ以上の酵素を融合することは困難である。さらに、化学的な架橋剤（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒ）を用いたタンパク質マルチマー構造体（ＣＬＥＡ）の製作方法の場合には、化学的な結合が特定の部位において起こらず、タンパク質の表面のどこでも起こり兼ねないため、活性を阻害することがある。マルチマー構造を形成するタンパク質を合成または微生物の発現で製造できること、かつ、これらのタンパク質の活性部位（ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ）が妨げられないことが求められる。
【０００３】
目的タンパク質を分離及び／または精製するための方法として、ユビキチンを用いる方法が提案されている。まず、ユビキチンと結合されたタンパク質をエンコード（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）する遺伝子を原核細胞（ｐｒｏｃａｒｙｏｔｉ  ｃｃｅｌｌｓ）において発現させてユビキチンと結合された融合タンパク質を製造し、これをユビキチン切断酵素で処理して目的タンパク質のみをユビキチン融合タンパク質から有効に分離及び精製する方法である。特許文献１には、組換え遺伝子の発現及び発現済みのタンパク質の精製に関するものであり、ユビキチン様タンパク質（Ｕｂｌ）のＣ末端ドメインをエンコードするヌクレオチドが目的タンパク質をエンコードするヌクレオチドに動作可能なように（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）結合された融合タンパク質を製造し、これを宿主細胞において発現させることについて開示されている。特許文献２には、組換えタンパク質を発現させるに当たって、ユビキチンを融合パートナーとして用いることについて開示されている。また、特許文献３には、タンパク質の精製にユビキチンカラムを用いることに関するものであり、ポリユビキチン鎖をカラムに搬入し、Ｅ２を含むインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）ユビキチン化を用いてタンパク質を精製することについて開示されている。さらに、特許文献４には、組換えタンパク質を発現させて製造するに当たっての問題点である水溶性とフォルディング（折り畳み）の問題を解決するためのものであり、組換えタンパク質の発現及び分離、精製を容易にし、かつ、タンパク質の活性を高めるために、Ｕｌｐ１プロテアーゼ（Ｕｂｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅａｓｅ１）により認識される切断部位を有するＳＵＭＯを用いることについて開示されている。しかしながら、これらの方法は、タンパク質の発現にユビキチンを用いることについて開示していることに留まり、マルチマー形態のタンパク質を製造することについて記述したり示唆したりしてはおらず、分離・精製しようとするタンパク質がユビキチンとランダムに結合するため、依然として分離または分析効率に限界を有する。
【０００４】
このため、本発明者らは、タンパク質の活性が阻害されることなく、高い集積度を有するマルチマー形態のタンパク質を製造する方法を開発すべく絶えず努力した末、ユビキチンと結合された生体分子を宿主細胞から組換え発現させ、これをユビキチン化に関わる酵素とインビトロにて反応させ、ポリユビキチン・スキャフォールドに結合された線形多機能性マルチマー生体分子重合体を形成することにより本発明を完成するに至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願第１０／５０４，７８５号
【特許文献２】大韓民国特許出願第１０−２００５−００５０８２４号
【非特許文献１】大韓民国特許出願第１０−２０１５−０１２０８５２号
【非特許文献２】米国特許出願第１２／２４９，３３４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このように、本発明は、ユビキチンＣ末端タグ（ＵＣＴ；Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｔａｇ）を用いてタンパク質などの生体分子をインビトロで固定化または架橋（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋ）する方法を提供することを目的としている。
【０００７】
本発明の他の目的は、ポリユビキチン・スキャフォールドに目的生体分子が結合された線形多機能性マルチマー生体分子（ｌｉｎｅａｒ  ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）及びこれを製造する方法を提供することである。
【０００８】
本発明のさらに他の目的は、前記線形多機能性マルチマー生体分子が固定化された構造体及びこれを製造する方法を提供することである。
【０００９】
本発明のさらに他の目的は、前記線形多機能性マルチマー生体分子を用いて目的物質を分離・精製する方法を提供することである。
【００１０】
本発明のさらに他の目的は、前記線形多機能性マルチマー生体分子を用いて、前記生体分子と結合する目的物質を分析したり、これを分離及び精製したりする方法を提供することである。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、ポリユビキチンをリンカーとして用いて、２つ以上の生体分子及び／または小分子化合物を部位特異的に結合する方法を提供することである。
【００１２】
本発明のさらに他の目的は、２つ以上の生体分子及び／または小分子化合物を部位特異的（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）に結合するためのポリユビキチンの用途を提供することである。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は、前記本発明の線形多機能性マルチマー生体分子を含む薬学組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記諸目的を達成するために、本発明は、（ｉ）ユビキチンＣ末端タグ（ｔａｇ）が融合またはリンカーにより結合された生体分子（ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）を原核細胞または真核細胞を含む宿主細胞から組換え発現させ、並びに、（ｉｉ）前記宿主細胞の溶解物（ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅｓ）にユビキチン化のためのＥ１、Ｅ２及びＥ３酵素、またはＥ１及びＥ２酵素を加えて反応させることを含み、２つ以上のユビキチンの共有結合によって形成されたポリユビキチン・スキャフォールド（ｐｏｌｙｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）に結合された生体分子であって、互いに異なる結合部位（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ）に対してそれぞれ特異的な２つ以上の結合モイアティ（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を含む、線形の多機能性マルチマー生体分子（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）を製造する方法を提供する。これにより、本発明において、線形多機能性マルチマー生体分子重合体または複合体の形成を開始するイニシエータ（ｉｎｉｔｉａｔｏｒ）は、Ｅ３、Ｅ２、Ｅ１、フリーのユビキチン（ｆｒｅｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）、またはＥ３の目的基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）であってもよい。ここで、前記Ｅ２酵素は、ユビキチンの４８番または６３番目のアミノ酸残基のリシンに結合してもよく、前記Ｅ２酵素は、Ｅ２−２５Ｋユビキチン結合（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ）酵素であってもよく、あるいは、ユビキチン結合酵素複合体Ｕｃｂ１３−ＭＭＳ２であってもよい。
【００１５】
これと関わる本発明の一実施形態において、前記組換え発現された生体分子は、ユビキチンＣ末端タグの７６番目のアミノ酸残基であるグリシンのＣ末端部が１〜５０個のアミノ酸で延長されたものであり、前記（ｉｉ）の反応の前または後に、前記組換え発現された生体分子にＤＵＢ（Ｄｅｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）、例えば、ＵＨ１、ＹＵＨ２、ＵＣＨ−Ｌ１、ＵＣＨ−Ｌ２またはＵＣＨ−Ｌ３を加えることをさらに含んでいてもよい。
【００１６】
これと関わる本発明の一実施形態において、前記生体分子は、他の生体分子、低分子化合物（ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）またはナノ粒子などと特異的に結合する活性部位（ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅｓ）を有するものであって、酵素、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、抗体、ＤＮＡ及びＲＮＡからなる群から選ばれた一種以上であってもよいが、これに制限されるものではなく、前記（ｉｉ）にＡＴＰをさらに加えて反応させてもよい。有利には、前記それぞれの酵素、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、抗体、ＤＮＡ及びＲＮＡは、同種または異種であってもよい。すなわち、本発明の線形多機能性マルチマー複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）を構成するモノマーがそれぞれ同種または異種のタンパク質、またはタンパク質とペプチドまたは抗体であってもよく、必要に応じて、様々な種類の生体分子のモノマーが線形多機能性マルチマー複合体として形成されてもよい。ここで、前記生体分子は、タンパク質Ａ（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ）、タンパク質Ｇ（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ）、リシン（ｌｙｓｉｎ）、エンドリシン（ｅｎｄｏｌｙｓｉｎ）、プロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅｓ）、ヒドロラーゼ（ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、酸化還元酵素（ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、リアーゼ（ｌｙａｓｅ）、親和性リガンド（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｌｉｇａｎｄ）及び受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）からなる群から選ばれた一種以上であってもよいが、これに制限されるものではない。また、前記生体分子は、インスリン、インスリン類似体、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド類（ＧＬＰ−ｌなど）、ＧＬＰ−１／グルカゴンデュアルアゴニスト、エキセンディン−４（ｅｘｅｎｄｉｎ−４）、エキセンディン−４（ｅｘｅｎｄｉｎ−４）類似体、インスリン分泌ペプチド及びその類似体、ヒト成長ホルモン（ｈｕｍａｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、成長ホルモン放出ペプチド、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、抗肥満ペプチド、Ｇタンパク質共役受容体（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｌｐｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、レプチン、ＧＩＰ（Ｇａｓｔｒｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、インターロイキン類、インターロイキン受容体類、インターロイキン結合タンパク質類、インターフェロン類、インターフェロン受容体類、サイトカイン結合タンパク質類、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンフォトキシン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、腫瘍抑制因子、転移成長因子、α−１アンチトリプシン、アルブミン、α−ラクトアルブミン、アポリポタンパクＥ、赤血球生成因子（ＥＰＯ）、高グリコシル化赤血球生成因子、アンジオポエチン類、ヘモグロビン、クロンビン、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモジュリン、血液第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子及び第ＸＩＩＩ因子、プラスミノーゲン活性因子、フィブリン−結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、タンパク質Ｃ、Ｃ−反応性タンパク質、レニンインヒビター、コラゲナーゼインヒビター��スーパーオキシドディスムターゼ、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンギオスタチン、アンジオテンシン、骨形成に関わる成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性因子、組織因子経路インヒビター、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、神経成長因子、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、リラキシン、セクレチン、ソマトメジン、副腎皮質ホルモン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、受容体、受容体拮抗物質、線維芽細胞増殖因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、アディポネクチン（Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）、インターロイキン受容体拮抗薬（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）、アスパラギン酸塩（ａｓｐａｒｔａｔｅ）、６ｘＨｉｓ、キチン結合ドメイン（Ｃｈｉｔｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）、ＧＳＴ、トロンビン（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ）、ＦＬＡＧタグ、細胞表面抗原、ウィルス由来ワクチン抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体及び抗体断片類からなる群から選ばれた一種以上であってもよく、これに制限されるものではない。
【００１７】
これと関わる本発明の一実施形態において、インビトロユビキチン化に用いられるＥ１、Ｅ２及びＥ３は、任意の組み合わせが選ばれて用いられてもよい。例えば、Ｅ２がＵＢＣＨ５Ａ（ＵＢＥ２Ｄ１）である場合、ＲＳＰ５（ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ．Ｐ３９９４０）、ＤＴＸ２（ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ．Ｑ８６ＵＷ９）、ＤＴＸ３（ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ．Ｑ８Ｎ９Ｉ９）、ＭＩＤ１（ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ．Ｏ１５３４４）、ＲＩＮＧ１（ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ．Ｑ０６５８７）、ＲＮＦ１１（ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ．Ｑ９Ｙ３Ｃ５）、ＲＮＦ１１１（ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ．Ｑ６ＺＮＡ４）、ＲＮＦ１２６（ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ．Ｑ９ＢＶ６８）、ＲＮＦ１１５（ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ．Ｑ９Ｙ４Ｌ５）、ＲＮＦ１４（ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ．Ｑ９ＵＢＳ８）、ＲＮＦ１８５（ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ．Ｑ９６ＧＦ１）、ＲＮＦ２（ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ．Ｑ９９４９６）、ＲＮＦ５（ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ．Ｑ９９９４２）、ＴＲＡＦ６（ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ．Ｑ９Ｙ４Ｋ３）、ＴＲＩＭ８（ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ．Ｑ９ＢＺＲ９）、ＺＮＲＦ１（ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ．Ｑ８ＮＤ２５）、ＸＩＡＰ（ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ．Ｐ９８１７０）、及びＴＲＩＭ３９（ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ．Ｑ９ＨＣＭ９）からなる群から選ばれてもよい。また、Ｅ２がＵＢＣ７である場合、Ｅ３は、ＤＯＡ１０（ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ．Ｐ４０３１８）、ＵＦＤ４（ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ．Ｐ３３２０２）、ＨＲＤ１（ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ．Ｑ０８１０９）またはＨＲＤ３（ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ．Ｑ０５７８７）であってもよく、Ｅ２がＵＢＥ２Ｗ（ＵＢＣ１６）である場合、これと相互作用をするＥ３として、ＭＡＲＣＨ５（ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ．Ｑ９ＮＸ４７）またはＲＮＦ５（ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ．Ｑ９９９４２）を用いてもよく、これに制限されないものではない。
【００１８】
これと関わる本発明の他の一実施形態において、有利には、前記ユビキチンＣ末端タグは、このユビキチンのＮ末端から４８番目のまたは６３番目のアミノ酸残基のリシンがアラニンに置換されるか、あるいは、より有利には、任意の位置の一つのリシンを除いた他のリシンがすべて削除されるか、あるいは、リシンではない他のアミノ酸に置換される。また、ユビキチンのＮ末端Ｍｅｔ１から始まって１１番目、４８番目または６３番目のアミノ酸残基のリシンを除いたユビキチンのすべてのリシンがアルギニンに置換されてもよい。さらに、前記ユビキチンＣ末端タグは、２つ以上のユビキチンがヘッドトゥーテール（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ）状に繰り返し結合されてもよい。この場合、前記ヘッドトゥーテール状に結合されているユビキチンは、Ｎ末端から７５番目及び７６番目のアミノ酸残基のグリシンがバリンを含む他のアミノ酸に置換されてもよく、あるいは、７３番目のアミノ酸残基のロイシンがプロリンに置換されてもよい。
【００１９】
これと関わる本発明のさらに他の一実施形態において、前記（ｉｉ）の反応は、ユビキチンの固定化のための基質または基板、またはビード（ｂｅａｄ）の存在下で行われ、前記生体分子の一つの末端にＥ３リガーゼ（ｌｉｇａｓｅ）が付着されていてもよい。
【００２０】
また、本発明は、ポリユビキチン・スキャフォールド及び生体分子から構成された線形マルチマー生体分子重合体であって、前記ポリユビキチン・スキャフォールドは、２つ以上のユビキチンが、例えば、共有結合によって結合されて形成され、前記生体分子は、前記ユビキチンにそれぞれ結合されている、線形マルチマー生体分子重合体を提供する。前記生体分子は、好ましくは、前記ユビキチンのＮ末端にそれぞれ結合する。線形マルチマー生体分子重合体の形成を開始するイニシエータ（ｉｎｉｔｉａｔｏｒ）が、Ｅ３、Ｅ２、Ｅ１、フリーのユビキチン（ｆｒｅｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）、または基質であってもよい。なお、前記線形マルチマー生体分子重合体は、２〜２０個の生体分子から構成されてもよい。
【００２１】
これと関わる本発明の一実施形態において、前記生体分子が、酵素、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、抗体、ＤＮＡ及びＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、及び小分子化合物（ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）からなる群から選ばれた一種以上であってもよい。有利には、前記それぞれのタンパク質、ペプチド、ポリペプチド、抗体、ＤＮＡ及びＲＮＡは、互いに異なる種類であってもよい。
【００２２】
これと関わる本発明の他の一実施形態において、前記線形多機能性マルチマー生体分子複合体または重合体は、Ｅ３、Ｅ２、Ｅ１、フリーのユビキチン（ｆｒｅｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）、または基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）から始まったものであってもよく、前記Ｅ３は、Ｒｓｐ５、ＷＷＰ１、ｎｅｄｄ４またはＸＩＡＰ、またはこれの最小触媒ドメイン（ｍｉｎｉｍａｌ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｄｏｍａｉｎ）であり、前記Ｅ２は、Ｕｂｃ７、Ｕｂｃｈ５ａ、Ｅ２−２５Ｋ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ−Ｕ５８５２２．１）、Ｕｂｃ１３−ＭＭＳ２（Ｕｎｉｐｏｔ  ＩＤ−Ｐ５２４９０）複合体、またはこれの最小触媒ドメインであってもよい。
【００２３】
これと関わる本発明のさらに他の一実施形態において、前記ユビキチンは、これのＮ末端から４８番目または６３番目のアミノ酸残基のリシンがアラニンに置換されるか、あるいは、より有利には、これの任意の位置の一つのリシンを除いた他のリシンが削除されるか、あるいは、リシンではない他のアミノ酸に置換される。また、前記フリーのユビキチンは、これの任意の位置の一つのリシンを除いた他のリシンが削除されるか、あるいは、リシンではない他のアミノ酸に置換されたものであってもよく、Ｎ末端から１１番目、４８番目または６３番目のアミノ酸残基のリシンを除いたすべてのリシンがアルギニンに置換されてもよい。さらに、前記フリーのユビキチンは、これのＮ末端から７６番目のアミノ酸残基のグリシンのＣ末端部が１〜５０個のアミノ酸で延長されたものであってもよく、前記アミノ酸は、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔａｔｅ）、６ｘＨｉｓタグ、またはＧＳＴタグであってもよく、前記タンパク質は、Ｒｓｐ５またはＮｅｄｄ４−１，２に対してＰＰＰＹを有するものであってもよい。前記生体分子は、前記フリーのユビキチンのＮ末端Ｍｅｔ１に結合されてもよく、前記生体分子の一つの末端にイニシエータ、例えば、Ｅ３、Ｅ２、Ｅ１、フリーのユビキチンまたは基質が付着されてもよい。なお、前記基質は、Ｅ３リガーゼを認識するアミノ酸配列を含み、ユビキチンが結合し得るリシンを一つ以上含むタンパク質であってもよい。
【００２４】
これと関わる本発明のさらに他の一実施形態において、本発明は、また、（ｉ）ユビキチンＣ末端タグが融合またはリンカーにより結合された生体分子を原核細胞、真核細胞または動物細胞を含む宿主細胞から組換え発現させ、並びに、（ｉｉ）前記宿主細胞の溶解物にユビキチン化のためのＥ１、Ｅ２及びＥ３タンパク質を加えて反応させて、２つ以上のユビキチンの共有結合によって形成されたポリユビキチン・スキャフォールドに分離及び精製しようとする生体分子が結合された線形多機能性マルチマー生体分子複合体を形成し、並びに、（ｉｉ）前記線形マルチマー生体分子複合体を分離することを含み、宿主細胞において発現された生体分子をインビトロで分離する方法を提供する。
【００２５】
これと関わる本発明の一実施形態において、前記生体分子は、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、抗体、ＤＮＡ及びＲＮＡからなる群から選ばれた一種以上であり、前記（ｉｉ）にＡＴＰをさらに加えて反応させる。有利には、前記それぞれのタンパク質、ペプチド、ポリペプチド、抗体、ＤＮＡ及びＲＮＡは、互いに異なる種類であってもよい。
【００２６】
これと関わる本発明の他の一実施形態において、有利には、前記ユビキチンＣ末端タグは、４８番目または６３番目のアミノ酸残基のリシンがアラニンに置換されるか、あるいは、より有利には、任意の位置の一つのリシンを除いた他のリシンがすべて削除されるか、あるいは、リシンではない他のアミノ酸に置換される。
【００２７】
これと関わる本発明の他の一実施形態において、前記（ｉｉ）の反応は、ユビキチンの固定化のための基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、基板またはビード（ｂｅａｄ）の存在下で行われ、前記生体分子の一つの末端にＥ３リガーゼが付着されてもよい。
【００２８】
本発明は、線形多機能性マルチマー生体分子複合体を含む分離カラム（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｃｏｌｕｍｎ）を提供する。これと関わる一実施形態において、前記生体分子は、タンパク質または抗体であってもよい。本発明において、リンカーは、３〜５０個のアミノ酸から構成されたペプチドであってもよいが、これに制限されるものではない。
【００２９】
本発明の他の一実施形態において、本発明は、ポリユビキチン・スキャフォールド及び生体分子から構成された、互いに異なる結合部位（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ）に対して特異的な２つ以上の結合モイアティ（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を含む、線形多機能性生体分子重合体であって、前記ポリユビキチン・スキャフォールドは、２つ以上のユビキチンが共有結合によって結合されて形成され、前記生体分子は、他の生体分子、低分子化合物（ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）またはナノ粒子などと特異的に結合する活性部位（ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅｓ）を有し、前記ユビキチンのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方ともにそれぞれ結合されている、線形の多機能性マルチマー生体分子（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）を提供する。ここで、前記生体分子重合体は、２〜４個の生体分子から構成されてもよく、前記生体分子は、前記ユビキチンのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方ともにリンカーにより結合されてもよい。前記リンカーは、ＧＧＧＧＳまたはＥＡＡＡＫが１〜６個繰り返し組み合わせられていてもよい。この場合、前記ユビキチンのＮ末端に結合された生体分子は、前記線形マルチマー生体分子重合体の遠位末端（ｄｉｓｔａｌ  ｅｎｄ）であり、前記ユビキチンのＣ末端またはＮ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方ともに結合された生体分子は、線形マルチマー生体分子重合体の近位末端（ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｅｎｄ）である。これと関わる他の一実施形態において、前記ポリユビキチン・スキャフォールドは、ユビキチンのすべてのリシンがアルギニンに置換されたものである供与体ユビキチンと、１１番目、４８番目または６３番目のアミノ酸残基のリシンを除いたユビキチンのすべてのリシンがアルギニンに置換されたものである受容体ユビキチンとが共有結合によって結合されて形成されてもよく、前記ユビキチンのＮ末端から７３番目のアミノ酸残基のロイシンがプロリンに置換されてもよい。
【００３０】
これと関わる他の一実施形態において、前記線形多機能性マルチマー生体分子重合体は、２〜２０個の生体分子から構成されてもよい。
【００３１】
これと関わる他の一実施形態において、前記生体分子は、酵素、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、抗体、抗体断片、ＤＮＡ及びＲＮＡからなる群から選ばれた一種以上であってもよく、タンパク質Ａ（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ）、タンパク質Ｇ（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ）、リシン（ｌｙｓｉｎ）、エンドリシン（ｅｎｄｏｌｙｓｉｎ）、プロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅｓ）、ヒドロラーゼ（ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、酸化還元酵素（ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、リアーゼ（ｌｙａｓｅ）、親和性リガンド（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｌｉｇａｎｄ）及び受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）からなる群から選ばれた一種以上であってもよい。また、前記生体分子は、インスリン、インスリン類似体、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド類（ＧＬＰ−ｌなど）、ＧＬＰ−１／グルカゴンデュアルアゴニスト、エキセンディン−４（ｅｘｅｎｄｉｎ−４）、エキセンディン−４（ｅｘｅｎｄｉｎ−４）類似体、インスリン分泌ペプチド及びその類似体、ヒト成長ホルモン（ｈｕｍａｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、成長ホルモン放出ペプチド、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、抗肥満ペプチド、Ｇタンパク質共役受容体（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｌｐｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、レプチン、ＧＩＰ（Ｇａｓｔｒｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、インターロイキン類、インターロイキン受容体類、インターロイキン結合タンパク質類、インターフェロン類、インターフェロン受容体類、サイトカイン結合タンパク質類、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンフォトキシン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、腫瘍抑制因子、転移成長因子、α−１アンチトリプシン、アルブミン、α−ラクトアルブミン、アポリポタンパクＥ、赤血球生成因子（ＥＰＯ）、高グリコシル化赤血球生成因子、アンジオポエチン類、ヘモグロビン、クロンビン、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモジュリン、血液第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子及び第ＸＩＩＩ因子、プラスミノーゲン活性因子、フィブリン−結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、タンパク質Ｃ、Ｃ−反応性タンパク質、レニンインヒビター、コラゲナーゼインヒビター、スーパーオキシドディスムターゼ、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンギオスタチン、アンジオテンシン、骨形成に関わる成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性因子、組織因子経路インヒビター、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、神経成長因子、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、リラキシン、セクレチン、ソマトメジン、副腎皮質ホルモン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、受容体、受容体拮抗物質、線維芽細胞増殖因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、アディポネクチン（Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）、インターロイキン受容体拮抗薬（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）、細胞表面抗原、ウィルス由来ワクチン抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体及び抗体断片類からなる群から選ばれたものであってもよい。
【００３２】
これと関わる他の一実施形態において、前記線形多機能性マルチマー生体分子重合体が、Ｅ３、Ｅ２、Ｅ１、フリーのユビキチン（ｆｒｅｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）、または基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）から始まったものであってもよく、前記Ｅ３は、Ｒｓｐ５、ＷＷＰ１、ｎｅｄｄ４またはＸＩＡＰ、またはこれの最小触媒ドメイン（ｍｉｎｉｍａｌ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｄｏｍａｉｎ）であり、前記Ｅ２は、Ｕｂｃ７、Ｕｂｃｈ５ａ、Ｅ２−２５Ｋ、Ｕｂｃ１３−ＭＭＳ２複合体、またはこれの最小触媒ドメインであってもよい。ここで、前記フリーのユビキチンは、これの任意の位置の一つのリシンを除いた他のリシンが削除されるか、あるいは、リシンではない他のアミノ酸に置換されてもよい。さらに、前記フリーのユビキチンは、これのＮ末端から１１番目、４８番目または６３番目のアミノ酸残基のリシンを除いたすべてのリシンがアルギニンに置換されたものであってもよく、これのＮ末端から７６番目のアミノ酸残基のグリシンのＣ末端部が１〜５０個のアミノ酸で延長されるか、あるいは、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔａｔｅ）、６ｘＨｉｓタグ、またはＧＳＴタグにより延長されるか、あるいは、これのＮ末端Ｍｅｔ１に生体分子が結合されてもよい。これと関わる他の一実施形態において、前記生体分子の一つの末端にイニシエータとしてＥ３、Ｅ２、Ｅ１、フリーのユビキチン（ｆｒｅｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）または基質が付着されていてもよく、前記基質は、Ｅ３リガーゼを認識するアミノ酸配列を含み、ユビキチンが結合し得るリシンを一つ以上含むタンパク質であってもよく、前記タンパク質は、Ｒｓｐ５またはＮｅｄｄ４−１，２に対してＰＰＰＹを含んでいてもよい。これと関わる他の一実施形態において、前記ユビキチンは、これの任意の位置の一つのリシンを除いた他のリシンが削除されてもよく、あるいは、リシンではない他のアミノ酸に置換されてもよい。
【００３３】
本発明の他の局面において、薬学組成物に提供されたが、前記組成物は、本発明の線形多機能性マルチマー生体分子及び薬学的に許容される担体を含んでおり、生体内の安定性が増大された。本発明に係る薬学的組成物は、経口、経皮、皮下、静脈内または筋肉内など様々な経路を介して体内に投与され得る。また、本発明に係る薬学的組成物は、当業界において広く知られている方法を用いて剤形化させ得る。剤形は、錠剤、丸剤、粉末、サシェ剤（ｓａｃｈｅｔ）、エリキシル剤（ｅｌｉｘｉｒ）、懸濁液、エマルジョン、溶液、シロップ、エアロゾル、軟質または硬質のゼラチンカプセル、滅菌注射溶液、滅菌粉末などであってもよい。製剤化に適した担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロール、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート及び鉱物油などが挙げられる。製剤は、また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などをさらに含んでいてもよい。本発明の生体分子の実際の投与量は、治療すべき疾患、投与経路、患者の年齢、性別及び体重、及び疾患の重さなどの色々な関連因子とともに、活性成分である生理活性ポリペプチドの種類に応じて決定される。
【００３４】
本発明において用いられた用語「多機能性（ｍｕｔｉｖａｌｅｎｔ）」は、「多機能（ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）」または「多価」と混用され、本発明において同じ意味を有するものと理解される。
【００３５】
本発明において用いられた用語「多機能性マルチマー生体分子（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  multimer ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は、互いに異なる結合部位（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ）に対してそれぞれ特異的な２つ以上の結合モイアティ（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を含む生体分子として定義される。
【００３６】
本発明において用いられた用語「複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）」、「重合体（ｐｏｌｙｍｅｒ）」、「結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」及び「構造体（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）」は、これらの用語がポリユビキチンにリンカーにより結合された本発明の線形多機能性マルチマー生体分子を意味するものであるとき、同じ意味を有するものとして本発明において混用される。
【００３７】
本発明において用いられた用語「ユビキチンＣ末端タグ（ｔａｇ）」は、ポリユビキチンを形成するに当たって、開始部を形成するユビキチンであるものと理解される。
【発明の効果】
【００３８】
本発明によれば、線形多機能性マルチマー生体分子重合体または複合体同士の結合は、ＵＣＴにより行われるので、ＵＣＴの結合により形成されるポリユビキチンは、ＵＣＴに結合された生体分子同士の間隔と方向性を保ってくれる堅いスキャフォールド（ｒｉｇｉｄ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）またはリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）として働くことができる。また、ＵＣＴ同士の結合に酵素反応（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）（Ｅ１−Ｅ２−Ｅ３）を用いるので、宿主細胞において発現された生体分子−ＵＣＴを別途の分離と精製の過程を経ることなく、細胞溶解物（ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ  ｍｉｘｔｕｒｅ）の形態で容易に用いることができる。また、本発明の生体分子は、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、抗体、抗体断片、ＤＮＡ及びＲＮＡからなる群から選ばれた一種以上であってもよく、例えば、異種のタンパク質を用いて線形多機能性マルチマー重合体にモジュール化した機能性を与えることができる。酵素近接効果（ｅｎｚｙｍｅ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ｅｆｆｅｃｔｓ）により線形重合体から製造された酵素は、触媒機能性と安定性においてさらに向上した効果を示す。結合反応（ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を構成する異種の酵素を線形マルチマー構造にすれば、チャンネリング効果（ｃｈａｎｎｅｌｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔ）によりバルクにおいて混ぜ合わせた状態よりも全体の反応の効率が高くなるという相乗効果を示す。また、目的生体分子−ＵＣＴを、酵素反応を用いて固定相に付着することができるので、生体分子−ＵＣＴは、純粋に精製・分離される必要がない。そこで、細胞溶解物や培養培地（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉａ）のように生体分子−ＵＣＴを含む粗混合物（ｃｒｕｄｅ−ｍｉｘｔｕｒｅ）において線形マルチマー構造体が合成されて固定化される。したがって、固定化酵素を経済的に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明の線形多機能性マルチマー融合タンパク質（Ｕｂｓｔａｃ）を製造する手順を示す概略図である。
【図２】本発明のＵｂｓｔａｃ反応により形成されたマルチマー形態のＵＣＴ融合タンパク質を確認した結果を示す図である。
【図３】本発明のＵｂｓｔａｃ反応により形成されたマルチマー形態のＵＣＴ融合タンパク質を確認した結果を示す図である。
【図４】本発明の線形多機能性マルチマー融合タンパク質の製造及びこれを固定化して用いる様子を示す概略図である。
【図５】Ｅ１−Ｅ２のみを用いたＵｂｓｔａｃの製造結果を示す図である。
【図６】本発明の線形多機能性マルチマー融合タンパク質の製造及びこれを固定化して用いる様子を示す概略図である。
【図７】ヘッドトゥーテール（Ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ）ＵＣＴ及びＵｂＳｔａｃの製造方法を示す概略図である。
【図８】本発明に従い製造したキシロース還元酵素（Ｘｙｌｏｓｅ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）（ＸＲ）をＧＰＣで精製した後にＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果である。
【図９】本発明に従い製造したオキサロ酢酸デカルボキシラーゼ（Ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）（ＯＡＣ）をＧＰＣで精製した後にＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果である。
【図１０】本発明に従い製造したキシリトール脱水素酵素（Ｘｙｌｉｔｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）（ＸＤＨ）をＧＰＣで精製した後にＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果である。
【図１１】本発明に従い製造したトリオースリン酸イソメラーゼ（Ｔｒｉｏｓｅ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ；ＴＩＭ）をＧＰＣで精製した後にＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果である。
【図１２】本発明に従い製造したアルドラーゼ（Ａｌｄｏｌａｓｅ；ＡＬＤ）をＧＰＣで精製した後にＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果である。
【図１３】本発明に従い製造したフルクトース１，６−ビスホスファターゼ（Ｆｒｕｃｔｏｓｅ  １，６−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；ＦＢＰ）をＧＰＣで精製した後にＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果である。
【図１４】本発明に従い製造したピルビン酸オキシダーゼ（Ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）（ＰＯＰＧ）をＧＰＣで精製した後にＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果である。
【図１５】キシロース還元酵素の活性を分析した結果である。
【図１６】キシロース還元酵素の安定性を分析した結果である。
【図１７】オキサロ酢酸デカルボキシラーゼの活性を分析した結果である。
【図１８】オキサロ酢酸デカルボキシラーゼの安定性を分析した結果である。
【図１９】キシリトール脱水素酵素の活性を分析した結果である。
【図２０】キシリトール脱水素酵素の安定性を分析した結果である。
【図２１】ピルビン酸オキシダーゼの活性を分析した結果である。
【図２２】３つの酵素、ＴＩＭ、ＡＬＤ及びＦＢＰが結合された構造のＵｂｓｔａｃ結果物を示す。
【図２３】ＴＩＭ、ＡＬＤ及びＦＢＰ酵素による相乗効果を示す図である。
【図２４】タンパク質Ａ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ）及びタンパク質Ｇ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ）の線形多機能性マルチマー複合体を製造し、その結果を確認した図である。
【図２５】ユビキチンＣ末端タグの７６番目のアミノ酸残基のグリシンのＣ末端部にアスパラギン酸（ａｓｐａｒｔａｔｅ）で延長されたｈＧＨを製造し、これを確認した結果である。
【図２６】Ｅ３から始まった重合体を製造し、これを確認したものである。
【図２７】ヘッドトゥーテール状に繰り返し結合されたＵＣＴのＣ末端にアスパラギン酸で延長された形態で発現されたｈＧＨの重合体を製造し、これを確認した図である。
【図２８】タンパク質Ａ単位体が固定化されたビードに比べて、タンパク質Ａ重合体が固定化されたビードへのヒト由来ＩｇＧの結合活性が増加されたことを示す図である。
【図２９】ユビキチンのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方ともにそれぞれ結合された線形の多機能性マルチマー生体分子重合体の構造を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明は、一実施形態において、（ｉ）ユビキチンＣ末端タグ（ｔａｇ）が融合またはリンカーにより結合された生体分子（ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）を原核細胞または真核細胞を含む宿主細胞から組換え発現させ、並びに、（ｉｉ）前記宿主細胞の溶解物（ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅｓ）にユビキチン化のためのＥ１、Ｅ２及びＥ３酵素、またはＥ１及びＥ２酵素を加えて反応させることを含み、２つ以上のユビキチンの共有結合によって形成されたポリユビキチン・スキャフォールド（ｐｏｌｙｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）に結合された生体分子であって、互いに異なる結合部位（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ）に対してそれぞれ特異的な２つ以上の結合モイアティ（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を含む、線形の多機能性マルチマー生体分子（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）を製造する方法を提供する。これにより、本発明において、線形多機能性マルチマー生体分子重合体または複合体の形成を開始するイニシエータ（ｉｎｉｔｉａｔｏｒ）は、Ｅ３、Ｅ２、Ｅ１、フリーのユビキチン（ｆｒｅｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）、またはＥ３の目的基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）であってもよい。ここで、前記Ｅ２酵素は、ユビキチンの４８番または６３番目のアミノ酸残基のリシンに結合してもよく、前記Ｅ２酵素は、Ｅ２−２５Ｋユビキチン結合（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ）酵素であってもよく、あるいは、ユビキチン結合酵素複合体Ｕｃｂ１３−ＭＭＳ２であってもよい。
【００４１】
本発明は、他の一実施形態において、ポリユビキチン・スキャフォールド及び生体分子から構成された線形マルチマー生体分子重合体であって、前記ポリユビキチン・スキャフォールドは、２つ以上のユビキチンが、例えば、共有結合によって結合されて形成され、前記生体分子は、前記ユビキチンにそれぞれ結合されている、線形多機能性マルチマー生体分子重合体を提供する。前記生体分子は、好ましくは、前記ユビキチンのＮ末端にそれぞれ結合する。線形マルチマー生体分子重合体の形成を開始するイニシエータ（ｉｎｉｔｉａｔｏｒ）が、Ｅ３、Ｅ２、Ｅ１、フリーのユビキチン（ｆｒｅｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）、または基質であってもよい。なお、前記線形マルチマー生体分子重合体は、２〜２０個の生体分子から構成されてもよい。
【００４２】
以下、実施例を挙げて本発明についてさらに具体的に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨に従い本発明の範囲がこれらの実施例により何ら制限されないということは当業界において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００４３】
製造例
製造例１：Ｃ末端融合タンパク質のクローニング、発現及び精製
本発明の実施例において用いられたＵＣＴ（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｔａｇ）（配列番号：１）タンパク質融合体をエンコードする遺伝子は、ジェンスクリプト（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  Ｉｎｃ．）社に依頼して製造した。
【００４４】
Ｃ末端にユビキチンタグを含まないＵｂ  ｏｕｔ遺伝子構造物を製造するために、ファストクローニングシステム（ｆａｓｔ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）（Ｌｉ  Ｃ，Ｗｅｎ  Ａ，Ｓｈｅｎ  Ｂ，Ｌｕ  Ｊ，Ｈｕａｎｇ  Ｙ，Ｃｈａｎｇ  Ｙ（２０１１）．Ｆａｓｔ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ−ｆｒｅｅ，ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ａｎｄ  ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＰＣＲ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １１，９２．）を用いた。この方法は、制限酵素及びリガーゼのない条件でＰＣＲ産物に直接的にＤｐｎ１のみを処理すると、Ｄｐｎ１がポリメラーゼとともに未だに判明していない機序によって制限酵素及びリガーゼの役割を果たして遺伝子が結合（挿入、除去または置換）可能な技術である。この方法において、ヒュージョンポリメラーゼ（Ｐｈｕｓｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と両末端とがオーバーラップするようにデザインされたプライマーを用いて、削除されるべき領域を除いてすべてのベクタの上においてＰＣＲ（９５℃３分、９５℃１５秒−５５℃１分−７２℃１分／ｋｂ  １８回繰り返し、７２℃５分、１２℃２０分）を行った。次いで、ＰＣＲ結果物に対するＤｐｎ１処理を１時間かけて３７℃で行い、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（Ｎｏｖａｇｅｎ）に軽質転換した後、目的プラスミドを得た。すべての遺伝子構成物を商業的なＤＮＡシーケンシングで確認した。
【００４５】
ＵＣＴ融合タンパク質の過発現のために、各遺伝子構成物をＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  ＤＥ３（Ｎｏｖａｇｅｎ）（ＸＲ，ＴＩＭ，ＡＬＤ）、Ｒｏｓｅｔｔａ  ｐＬｙｓＳ  ＤＥ３（Ｎｏｖａｇｅｎ）（ＸＤＨ，ＯＡＣ，ＰＯＰＧ）、Ｏｒｉｇａｍｉ２  ＤＥ３（Ｎｏｖａｇｅｎ）（ＦＢＰ）菌株に軽質転換した。タンパク質発現プラスミド（ｐＥＴ２１ａ、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）を含む細胞を３７℃、ＬＢ培地（Ｍｉｌｌｅｒ）においてインキュベーションした。ＯＤ600値が約０.６に達すると、タンパク質の発現を２５０μＭのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）（ＩＰＴＧ）を用いて、１６℃で２０時間かけて誘導した。次いで、遠心分離（３，５００ｒｐｍにて４℃で１５分）した後、細胞ペレットを溶解緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ2、２０ｍＭイミダゾール）の中に再懸濁し、ソニケーション（５０％振幅（ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）、パルスのオン３秒−オフ５秒、最終１５分）で溶解させた。次いで、前記溶解物を１４，０００ｒｐｍにて４℃で３０分間さらに遠心分離した。Ｎ末端Ｈｉｓタグを含むタンパク質の水溶性分画をニッケル馴染み及びＦＰＬＣ緩衝液（Ｎｉ−ＮＴＡ  Ａｇａｒｏｓｅ、ＱＩＡＧＥＮ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ2）で予め平衡化させたＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ｐｇゲルろ過カラム１６／６００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いるゲルろ過クロマトグラフィーで精製した。すべてのＵＣＴタンパク質を酵素活性の分析のために１００μＭに濃縮した。すべてのターゲットタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価した。図８から図１４は、ターゲット（目的）タンパク質を確認した結果を示す。本発明において用いられたＵＣＴ融合タンパク質は、下記の表１の通りである。
【００４６】
【表１】
2021525807.tif 000002
【００４７】
製造例２：Ｕｂｓｔａｃ線形構造体の製造
本発明において線形多機能性マルチマー形態の融合タンパク質を製造するための反応をＵｂｓｔａｃ反応とそれぞれ命名した。Ｕｂｓｔａｃ反応（全体の体積５０μＬ）をＵｂｓｔａｃ緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ）、ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ2）の中で行い、Ｕｂｓｔａｃ反応のためのＵｂｓｔａｃ混合物（０．５μ  ＭＥ１、５μＭ  Ｅ２、１μＭ  Ｅ３、４ｍＭ  ＡＴＰ）を本発明のＵＣＴタンパク質融合体に添加して反応を開始した。反応に用いられたタンパク質は、Ｅ３酵素１ｕＭ当たりにＵＣＴタンパク質融合体１０ｕＭ〜２０ｕＭ（１：１０〜１：２０の比率）の濃度にして反応を行い、これは、Ｕｂｓｔａｃ反応によって１時間内に最低でも１０個以上の融合体モノマーが線形多機能性マルチマーを形成するようにする目的で設定された条件であった。本発明において用いたＥ１、Ｅ２及びＥ３は、それぞれ次の通りである：
【００４８】
【表２】
2021525807.tif 000003
【００４９】
Ｕｂｓｔａｃ反応を室温で１時間かけて振とうして行った。図１は、本発明のＵｂｓｔａｃ反応を示す概略図であり、図２及び図３は、Ｕｂｓｔａｃ反応により形成されたマルチマー形態のＵＣＴ融合タンパク質を確認した結果を示す図である。
【００５０】
図４における第１図は、図１のように、ユビキチンＣ末端にタグ付けされた酵素（ｅｎｚｙｍｅ）とＵｂｓｔａｃ混合物とを反応された後、ろ過（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）してＵｂｓｔａｃ線形酵素ポリマーを製造する手順を示す概略図である。第２図は、ユビキチンＣ末端にタグ付けされた酵素とＵｂｓｔａｃ混合物とを反応させた後、架橋剤（ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ）とともに沈殿（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）させてＵｂｓｔａｃ酵素凝集体（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）を製造する手順を示す概略図である。第３図は、ユビキチンＣ末端にタグ付けされたタンパク質を基板またはビードの上に固定化させる手順を示す概略図である。
【００５１】
製造例３：Ｅ１−Ｅ２のみを用いたＵｂｓｔａｃの製造（Ｅ２プラットフォーム）
Ｅ２−２５Ｋ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ−Ｕ５８５２２．１）（ｈｕｍａｎ  Ｅ２）、Ｕｃｂ１３（ｙｅａｓｔ  Ｅ２）−ＭＭＳ２（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ−Ｕ６６７２４．１）（ｙｅａｓｔ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｖａｒｉａｎｔ）（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ−Ｕ６６７２４．１）を用いてＥ２−Ｕｂｓｔａｃを製造した。組換えＤＮＡプラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）の合成をジェンスクリプト社に依頼した。Ｅ２−Ｕｂｓｔａｃ反応（全体の体積:５０μＬ）をＥ２−Ｕｂｓｔａｃ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2）の条件下で、Ｅ２−Ｕｂｓｔａｃ混合物（１ｕＭ  Ｅ１、１０ｕＭ  Ｅ２、４ｍＭ  ＡＴＰ）をフリーのユビキチン（ｆｒｅｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）溶液（２０μＭ）に添加して反応を開始した。Ｅ２−Ｕｂｓｔａｃ反応を室温で１時間かけて振とうして行った。図５にその結果を示す。
【００５２】
実施例
実施例１：キシロース還元酵素（ＸＲ；Ｘｙｌｏｓｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）の活性及び安定性の分析
１−（１）キシロース還元酵素の活性の分析
Ｕｂｓｔａｃ反応（全体の体積：５０μＬ）をＵｂｓｔａｃ緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ2）の中で行い、Ｕｂｓｔａｃ混合物（０．５μＭ  Ｅ１、５μＭ  Ｅ２、１μＭ  Ｅ３、４ｍＭ  ＡＴＰ）をＸＲタンパク質溶液に添加して反応を開始した。Ｕｂｓｔａｃ反応を室温で１時間かけて振とうして行った後、触媒活性を分析した。ＸＲの触媒活性をＮＡＤＨ酸化により誘導される３４０ｎｍにおける吸光度の変化を測定して分析した。触媒活性の分析のための反応は、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2及び０．０２％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する１００ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）内のＸＲ（１０ｕＭ）及びキシロース（２００ｍＭ）混合物にＮＡＤＨ（２ｍＭ）を添加して開始した。ＸＲ  ｕｂ  ｏｕｔは、ＸＲのＣ末端にユビキチンタグ（ｔａｇ）を含まないモノマー形態のサンプルであり、同じＵｂｓｔａｃ混合条件でポリマーを形成しなかった。統計分析は、Ｐｒｉｓｍ  ６（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ）を用いて行った。その結果を図１５に示す。図１５に示すように、本発明に係るＸＲが補助基質（ｃｏ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）としてＮＡＤＨを用いてＤ−キシロースをキシリトール（ｘｙｌｉｔｏｌ）に還元させることを促した。吸光度（ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）は、溶液中のＮＡＤＨの量を示す。ＸＲのＵｂｓｔａｃポリマー（赤色、下の曲線）は、モノマー形態（黒色、上の曲線）と比較してさらに早いＮＡＤＨの消耗を示している。２つの反応は、両方とも同じ量のモノマーを含有している。したがって、増加された反応速度は、もっぱらモノマー間の共有結合に依存している。この実施例において、ＸＲ  Ｕｂｓｔａｃポリマーの活性がユビキチンタグなしＸＲモノマー（ＸＲ  Ｕｂ  ｏｕｔ）と比較して１０倍増加したことが確認された。
【００５３】
１−（２）キシロース還元酵素のｐＨ安定性の分析
ＮＡＤＨ及びキシロースを添加して反応を開始する前に、ＸＲモノマー及びＵｂｓｔａｃポリマーの両方ともを３０分間指示されたｐＨで処理した。図１６に示すように、ｐＨ５．５及び６.５において、ＸＲ  ＵｂｓｔａｃポリマーがユビキチンタグなしモノマーＸＲ（ＸＲ  Ｕｂ  ｏｕｔ）と比較して著しく向上した安定性を示している。結果は、３回の実験の平均値を示す。
【００５４】
実施例２：オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ（Ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）（ＯＡＣ）の活性及び安定性の分析
２−（１）ＯＡＣの活性の分析
ブドウ糖新生過程（ｇｌｕｃｏｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ）に関与するＯＡＣは、ＡＳＴ−ＡＬＴとともに肝臓の損傷を調べるのに用いられる。Ｕｂｓｔａｃ反応（全体の体積：５０μＬ）をＵｂｓｔａｃ緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ2）で行い、Ｕｂｓｔａｃ混合物（０．５μＭ  Ｅ１、５μＭ  Ｅ２、１μＭ  Ｅ３、４ｍＭ  ＡＴＰ）をＯＡＣタンパク質溶液に添加して反応を開始した。Ｕｂｓｔａｃ反応を室温で１時間かけて振とうして行った後、触媒活性を分析した。ＯＡＣの活性の分析は、次の条件下で、ＮＡＤＨの消耗が進むことに従い吸光度（３４０ｎｍ）が減ることに基づいて行った：４５ｍＭ  ＴＥＡ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ８．０、０．４５ｍＭ  ＭｎＣｌ2、２ｍＭ  ＮＡＤＨ、１１  Ｕ  ｏｆ  ＬＤＨ、５μＭ  ＯＡＣ、２．５ｍＭ．ＯＡＣ  Ｕｂ  ｏｕｔは、ＯＡＣのＣ末端にユビキチンタグを含まないモノマー形態のサンプルであり、同じＵｂｓｔａｃの混合条件でポリマーを形成しなかった。統計分析は、Ｐｒｉｓｍ  ６（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ）を用いて行った。その結果を図１７に示す。図１７に示すように、Ｃ末端にＵｂがないモノマー（ＯＡＣ  Ｕｂ  ｏｕｔ）の活性とポリマー（ＯＡＣ  Ｕｂｓｔａｃ）の活性とを比較したところ、ポリマーの活性の方が９倍増加した。吸光度（ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）は、溶液中のＮＡＤＨの量を示す。ＯＡＣのＵｂｓｔａｃポリマー（赤色、下の曲線）は、モノマー形態（黒色、上の曲線）と比較してさらに早いＮＡＤＨの消耗を示している。２つの反応は、両方とも同じ量のモノマーを含有している。したがって、増加された反応速度は、もっぱらモノマー間の共有結合に依存している。この実施例において、ＯＡＣ  Ｕｂｓｔａｃポリマーの活性がユビキチンタグなしＯＡＣモノマー（ＯＡＣ  Ｕｂ  ｏｕｔ）と比較して９倍増加したことが確認された。
【００５５】
２−（２）ＯＡＣの安定性の分析
ＮＡＤＨ及びオキザロ酢酸（ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ）を添加して反応を開始する前に、ＯＡＣモノマー及びＵｂｓｔａｃポリマーの両方ともを３０分間指示されたｐＨで処理した。図１８に示すように、ｐＨ  ４．５〜６.５の低いｐＨにおいて、ＯＡＣ  ＵｂｓｔａｃポリマーがユビキチンタグなしモノマーＯＡＣ（ＯＡＣ  Ｕｂ  ｏｕｔ）と比較して著しく向上したｐＨ安定性を示している。結果は、３回の実験の平均値を示す。
【００５６】
実施例３：キシリトール脱水素酵素（ＸＤＨ；Ｘｙｌｉｔｏｌ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の活性及び安定性の分析
３−（１）ＸＤＨの活性の分析
ＸＤＨは、Ｄ−キシロース異化作用（ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ）経路に属する酵素であり、ＸＲの結果物であるキシリトールをＮＡＤ+を用いてキシルロース（ｘｙｌｕｌｏｓｅ）に転換するものであることが知られている。ＸＤＨの活性の分析のために、まず、Ｕｂｓｔａｃ反応（全体の体積：５０μＬ）をＵｂｓｔａｃ緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ2）で行い、Ｕｂｓｔａｃ混合物（０．５μＭ  Ｅ１、５μＭ  Ｅ２、１μＭ  Ｅ３、４ｍＭ  ＡＴＰ）をＸＤＨタンパク質溶液に添加して反応を開始した。Ｕｂｓｔａｃ反応を室温で１時間かけて振とうして行った後、触媒活性を分析した。ＸＤＨの活性を３４０ｎｍにおいてＮＡＤ+還元をモニターリングして測定した。反応は、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2及び０．０２％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する１００ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）中のＸＤＨ（２０μＭ）及びキシロース（２００ｍＭ）混合物にＮＡＤＨ（２ｍＭ）を添加することにより開始した。ＸＤＨ  ｕｂ  ｏｕｔは、ＸＤＨのＣ末端にユビキチンタグを含まないモノマー形態のサンプルであり、同じＵｂｓｔａｃの混合条件でポリマーを形成しなかった。統計分析は、Ｐｒｉｓｍ  ６（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ）を用いて行った。その結果を図１９に示す。図１９に示すように、ｐＨ５．５において、ＸＤＨ  Ｕｂｓｔａｃポリマー（赤色、上の曲線）は、これのモノマー形態（黒色、下の曲線）と比較して、さらに高いＮＡＤＨ+の消耗率を示している。２つの反応は、両方とも同じ量のモノマーを含有している。したがって、活性の違いは、もっぱらモノマー間の共有結合に依存している。この実施例において、ＸＤＨ  ＵｂＳｔａｃポリマーの活性がユビキチンタグなしＯＡＣモノマー（ＯＡＣ  Ｕｂ  ｏｕｔ）と比較して１０倍増加したことが確認された。
【００５７】
３−（２）ＸＤＨの安定性の分析
ＮＡＤ+及びキシリトールを加えて反応を開始する前に、ＸＤＨモノマー及びＵｂｓｔａｃポリマーの両方ともを３０分間指示されたｐＨで処理した。図２０に示すように、測定されたすべてのｐＨにおいて、ＸＲ  ＵｂｓｔａｃポリマーがＯＡＣ  Ｕｂ  ｏｕｔと比較して著しく増加したｐＨ安定性を示している。結果は、３回の実験の平均値を示す。
【００５８】
実施例４：ピルビン酸オキシダーゼ（Ｐｙｒｕｖａｔｅ  Ｏｘｉｄａｓｅ；ＰＯＰＧ）の活性の分析
ＰＯＰＧは、ブドウ糖新生過程に関与する酵素であるＡＳＴ−ＡＬＴのような酵素を検出して肝臓の損傷を調べるのに用いられることが知られている。ＰＯＰＧの活性の分析のために、まず、Ｕｂｓｔａｃ反応（全体の体積：５０μＬ）をＵｂｓｔａｃ緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ2）で行い、Ｕｂｓｔａｃ混合物（０．５ｕＭ  Ｅ１、５ｕＭ  Ｅ２、１ｕＭ  Ｅ３、４ｍＭ  ＡＴＰ）をＰＯＰＧタンパク質溶液に添加して反応を開始した。Ｕｂｓｔａｃ反応を室温で１時間かけて振とうして行った後、触媒活性を分析した。触媒活性を分析するために、ＡＢＴＳによるピルビン酸のＰＯＰＧの酸化過程により生成されるＨ2Ｏ2の量を測定した。反応は、リン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）緩衝液の中のピルビン酸（ｐｙｒｕｖａｔｅ）（１００ｍＭ）、ピロホスフェート（ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（６ｍＭ）、ＡＢＴＳ（２，２′−アジノ−ビス−（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸））（１０ｍＭ）及びＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）（０．２Ｕ／ｍＬ）混合物にＰＯＰＧ（５μＭ）を添加して開始した。ＰＯＰＧモノマー（ＰＯＰＧ  ｕｂ  ｏｕｔ）は、ＰＯＰＧのＣ末端にユビキチンタグを持たないモノマー形態のサンプルであり、同じＵｂｓｔａｃの混合条件でポリマーを形成しない。統計分析は、Ｐｒｉｓｍ  ６（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ）を用いて行った。図２１に示すように、ｐＨ５．５において、ＰＯＰＧ（赤色、上の曲線）は、これのモノマー形態（黒色、下の曲線）と比較してさらに高い活性を示している。２つの反応は、両方とも同じ量のモノマーを含有している。したがって、前記活性の違いは、もっぱらモノマー間の共有結合に依存している。このような特定の例において、ＰＯＰＧ  ＵｂＳｔａｃポリマーの活性がユビキチンタグなしＰＯＰＧモノマー（ＰＯＰＧ  Ｕｂ  ｏｕｔ）と比較して２倍増加した。
【００５９】
実施例５：ユビキチン酵素の相乗効果の分析
トリオースリン酸イソメラーゼ（ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）（ＴＩＭ）、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ（ｆｒｕｃｔｏｓｅ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｌｄｏｌａｓｅ）（ＡＬＤ）及びフルクトースビスホスファターゼ（ｆｒｕｃｔｏｓｅ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（ＦＢＰ）は、ＤＨＡＰ（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）から最終産物としてＦ６Ｐを生成するためのカスケード反応を形成することが知られている。Ｕｂｓｔａｃ酵素の相乗効果の分析をフルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）、ＴＩＭ生成物、ＡＬＤ及びＦＢＰ酵素複合体を測定して行った。Ｆ６Ｐは、グルコースリン酸イソメラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｓｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）（ＰＧＩ）によりグルコース−６−リン酸（Ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（Ｇ６Ｐ）に異性体化され、基質としての同量のＮＡＤ+は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）（Ｇ６ＰＤＨ）により変形される。本発明者らは、酵素活性を、ＨＥＰＥＳ緩衝液条件（２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．５ｍＭ  ＭｎＣｌ2、１ｍＭ  ＣａＣｌ2）下の４ｕＭ  ＴＩＭ、ＡＬＤ及びＦＢＰ酵素複合体混合物に２．５ｍＭの酵素複合体（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＤＨＡＰ）、２０Ｕ／ｍＬの分析酵素（ＰＧＩ及びＧ６ＰＤＨ）及び２．５ｍＭ  ＮＡＤ+酵素複合体を添加することにより新たに生成されたＮＡＤＨの量を３４０ｎｍにおいて測定して決定した。Ｕｂ  ｏｕｔ酵素複合体混合物は、酵素のＣ末端にユビキチンタグを持たず、かつ、同じＵｂｓｔａｃ混合物の条件でポリマーを形成しないモノマー形態のサンプルである。統計分析は、Ｐｒｉｓｍ  ６（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ）を用いて行った。指示された時点において、反応を終え、Ｆ６Ｐの量を、Ｆ６Ｐがグルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）に転換されるのにＮＡＤ+を用いるグルコースリン酸イソメラーゼ（ＰＧＩ）を用いて測定した。吸光度は、Ｆ６Ｐの量を示す。３つの異なる酵素のＵｂｓｔａｃポリマー（赤色、上の曲線）がモノマー酵素混合物（黒色、下の曲線）よりも５倍高い活性を示した。結果は、３回の実験の平均値を示す。図２３は、３つの酵素、ＴＩＭ、ＡＬＤ及びＦＢＰが結合された構造のＵｂｓｔａｃ結果物を示す図であり、図１２は、これらの酵素による相乗効果を示す図である。
【００６０】
実施例９：ユビキチンの多段階標識（ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃｓ）方法
まず、本発明の製造例に従い、ユビキチンＣ末端にタグ付けされた生体分子を合成した。次いで、ヒドロキシルアミン（ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ａｍｉｎｅ）を含むポリマー（ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ））を前記生体分子と反応させた。その結果、ポリマーがオキシム結合（ｏｘｉｍｅ  ｌｉｎｋａｇｅ）によりユビキチンにより標識されたことを確認した（結果は図示しない）。
【００６１】
実施例１０：タンパク質Ａ及びタンパク質Ｇ線形マルチマー重合体の製造
Ｕｂｓｔａｃ反応（全体の体積：５０μＬ）をＵｂｓｔａｃ緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ2）の中で行い、Ｕｂｓｔａｃ混合物（０．５μＭ  Ｅ１、５μＭ  Ｅ２、１μＭ  Ｅ３、４ｍＭ  ＡＴＰ）をタンパク質Ａ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ）またはタンパク質Ｇ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ）溶液に添加して反応を開始した。タンパク質Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ−ＡＡＢ０５７４３．１）、タンパク質Ｇ（ＣＡＡ２７６３８．１）に相当する配列を含んでいる組換えＤＮＡプラスミドの合成をジェンスクリプト社に依頼して製造した。Ｕｂｓｔａｃ反応を室温で１時間かけて振とうして行った後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。Ｕｂｓｔａｃ混合物を入れなかったサンプルと比較して、Ｕｂｓｔａｃ混合物を入れたサンプルにおいてタンパク質Ａまたはタンパク質Ｇモノマーバンド（ｍｏｎｏｍｅｒ  ｂａｎｄ）は減り、高分子質量のバンド（線形マルチマー重合体）が新たに現れたことを確認した（図２４を参照）。一部の線形マルチマー重合体は、分子量が数百ｋＤａまで増加してスタッキングゲル（ｓｔａｃｋｉｎｇ  ｇｅｌ）を通過できなかったことを確認した。
【００６２】
実施例１１：ユビキチンＣ末端タグの７６番目のアミノ酸残基のグリシンのＣ末端にアスパラギン酸で延長されたｈＧＨ
ＵＣＴ融合医薬品用タンパク質の過発現のために、各遺伝子構成物をＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  ＤＥ３（Ｎｏｖａｇｅｎ）菌株に軽質転換した。この実施例において、タンパク質としてｈＧＨ（配列番号：１８）を用いた。タンパク質発現プラスミド（ｐＥＴ２１ａ、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）を含む細胞を３７℃、ＬＢ培地（Ｍｉｌｌｅｒ）においてインキュベーションした。ＯＤ600値が約０.６に達すると、タンパク質の発現を２５０μＭのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）（ＩＰＴＧ）を用いて、１６℃で２０時間かけて誘導した。次いで、遠心分離（３５００ｒｐｍにて４℃で１５分）した後、細胞ペレットを溶解緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ2、２０ｍＭイミダゾール）の中に再懸濁し、ソニケーション（５０％振幅、パルスのオン３秒−オフ５秒、最終１５分）で溶解させた。次いで、前記溶解物を１４，０００ｒｐｍにて４℃で３０分間さらに遠心分離した。Ｎ末端Ｈｉｓタグを含むタンパク質の水溶性分画をニッケル馴染み及びＦＰＬＣ緩衝液（Ｎｉ−ＮＴＡ  Ａｇａｒｏｓｅ−ＱＩＡＧＥＮ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ2）で予め平衡化させたＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ｐｇゲルろ過カラム１６／６００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いるゲルろ過クロマトグラフィーで精製した。精製されたｈＧＨは、１００μＭに濃縮した。すべてのターゲットタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価した（図２５を参照）。
【００６３】
実施例１２：Ｅ３（Ｒｓｐ５）から始まったポリユビキチン・スキャフォールドの製造
Ｕｂｓｔａｃ反応（全体の体積：５０μＬ）をＵｂｓｔａｃ緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ2）の中で行い、Ｕｂｓｔａｃ混合物（０．５μＭ  Ｅ１、５μＭ  Ｅ２（Ｕｂｃｈ５ａまたはＵｂｃｈ７），１ｕＭ  Ｅ３、４ｍＭ  ＡＴＰ）をタンパク質溶液に添加して反応を開始した。Ｕｂｓｔａｃ反応を室温で１時間かけて振とうした後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。Ｕｂｓｔａｃ混合物なしサンプルと比較して、Ｕｂｓｔａｃを入れたサンプルにおいてＥ３の量が減ったことを確認した（図２６を参照）。これは、Ｅ３から始まったポリユビキチン・スキャフォールドの形成により分子の質量が増加したＥ３のバンドが上側に移動したためである。Ｕｂｃｈ５ａ  Ｅ２よりも反応性の弱いＵｂｃｈ７  Ｅ２を用いた結果においては、時間が経つにつれてＲｓｐ５にユビキチンが一つずつさらに結合されて分子量が増加する過程を確認した。
【００６４】
実施例１３：ヘッドトゥーテール（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ）状に繰り返し結合されたＵＣＴのＣ末端にアスパラギン酸（ａｓｐａｒｔａｔｅ）で延長された形態で発現されたｈＧＨの重合体の製造
図２７に示すように、ＤＵＢが共存する条件とＤＵＢが除外された条件とにおけるｈＧＨ（配列番号：１８）のＵｂｓｔａｃ反応を比較した。このときに用いられたｈＧＨは、Ｃ末端に２つのユビキチンタグがヘッドトゥーテール（ｈｅａｄ  ｔｏ  ｔａｉｌ）状に繰り返し結合されており、そのユビキチンタグのＣ末端は、アスパラギン酸で延長された形態である。したがって、ＤＵＢを用いてユビキチンタグＣ末端のアスパラギン酸を切断しなければ、Ｕｂｓｔａｃ反応が起こらない。医薬品用の生体分子であるｈＧＨの重合体の形成を確認するためのＵｂｓｔａｃ反応（全体の体積：５０μＬ）をＵｂｓｔａｃ緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ2）の中で行い、Ｕｂｓｔａｃ混合物（１μＭ  Ｅ１、５μＭ  Ｅ２（ｕｂｃｈ５ａ），１μＭ  Ｅ３、４ｍＭ  ＡＴＰ）を２０μＭ  ｈＧＨタンパク質溶液に添加して反応を開始した。Ｅ３が除外されたＥ２−Ｕｂｓｔａｃ反応（全体の体積：５０μＬ）をＥ２−Ｕｂｓｔａｃ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2）の中で行い、Ｅ２−Ｕｂｓｔａｃ混合物（１μＭ  Ｅ１、１０μＭ  Ｅ２（Ｕｃｂ１３−ＭＭＳ２複合体）、４ｍＭ  ＡＴＰ）を２０μＭ  ｈＧＨタンパク質溶液に添加して反応を開始した。ＤＵＢの活性を一緒に確認するために、反応は、ＤＵＢ（ＹＵＨ１）がない条件と、ＤＵＢ（ＹＵＨ１）が２μＭ入っている条件とにおいてそれぞれ同時に行った。すべての反応を室温で１〜４時間かけて振とうして行った後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。図２７に示すように、ＤＵＢがある条件下のみでｈＧＨの重合体が形成されることを確認し、ＤＵＢがない条件ではｈＧＨ  ＵＣＴのＣ末端のアスパラギン酸が切断されず、重合体が形成されなかったことを確認した。
【００６５】
実施例１４：ヘッドトゥーテール（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ）状に繰り返し結合されたＵＣＴのＣ末端にアスパラギン酸で延長された形態で発現されたｈＧＨの重合体の製造
タンパク質Ａ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ）重合体を製造するためのＵｂｓｔａｃ反応（全体の体積：５０μＬ）をＵｂｓｔａｃ緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ2）の中で行った。Ｕｂｓｔａｃ混合物（０．５μＭ  Ｅ１、５μＭ  Ｅ２（Ｕｂｃｈ５ａまたはＵｂｃｈ７）、１μＭ  Ｅ３、４ｍＭ  ＡＴＰ）をタンパク質Ａ溶液に添加して反応を開始した。Ｕｂｓｔａｃ反応を室温で１時間かけて振とうした後、５０％濃度のラテックスビード（Ｌａｔｅｘ  ｂｅａｄ）とともに１：１の割合で混ぜ合わせた後、常温で４時間かけて振とうしながらタンパク質Ａ重合体をビードに固定化させる反応を行った。固定化反応後に、固定化されていないタンパク質を除去するために、ＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4  ｐＨ７．４、１．８ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ）で３回にわたって洗浄を行った。洗浄後に、ヒトの血清から得られた免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を２ｍｇ／ｍＬの濃度でビードに添加してビードに固定化されたタンパク質Ａ重合体の結合活性の分析を行った。結合反応は、常温で１時間かけて振とうした後、前記洗浄方法と同様にしてＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。その結果、Ｕｂｓｔａｃ  ｍｉｘを添加せずに、残りの手順を上記と同様にして行ってタンパク質Ａ単位体が固定化されたビードに比べて、タンパク質Ａ重合体が固定化されたビードへのヒト由来ＩｇＧの結合活性が１５％以上増加したことを確認した（図２８を参照）。
【００６６】
実施例１５：ユビキチンのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方ともにそれぞれ結合された線形の多価生体分子重合体の製造
Ｎ末端にｈＧＨ（配列番号：１８）が結合された供与体ユビキチンと、Ｎ末端にｈＧＨ（図２９（ａ））、Ｃ末端にｈＧＨ（図２９（ｂ））が、Ｎ末端及びＣ末端にｓｕｍｏ（配列番号：１９）とｈＧＨがそれぞれ結合された（図２９（ｃ））受容体ユビキチンとを用いて、Ｕｂｓｔａｃダイマー（ｄｉｍｅｒ）の形成を確認した。用いられた受容体ユビキチンは、７３番目のアミノ酸残基のロイシンがプロリンに、４８番目（図２９（ｃ））または６３番目（図２９（ａ）、（ｂ））のアミノ酸残基のリシンを除いた残りのリシンはアルギニンに置換されている形態であり、Ｃ末端には、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔａｔｅ）または生体分子（ｈＧＨ）で延長されている形態である。Ｕｂｓｔａｃ反応（図２９（ａ）、（ｂ））（全体の体積：５０μＬ）をＵｂｓｔａｃ緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ2）の中で行い、Ｕｂｓｔａｃ混合物（１ｕＭ  Ｅ１、５ｕＭ  Ｅ２（Ｕｂｃ１３−ＭＭＳ２複合体）、４ｍＭ  ＡＴＰ）を１０ｕＭ受容体ユビキチンタンパク質と供与体ユビキチンタンパク質とが混合された溶液（総ユビキチンの濃度：２０ｕＭ）に添加して反応を開始した。Ｕｂｓｔａｃ反応（図２９（ｃ））は、前記反応と同じ条件下でＥ２をＵｂｃ１３−ＭＭＳ２複合体ではないＥ２−２５Ｋに、受容体ユビキチンは６３番目ではない４８番目のアミノ酸残基のリシンのみを有する形態のタンパク質に取り替えて反応を開始した。Ｕｂｓｔａｃ反応を２７℃で４時間かけて振とうして行った後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。Ｕｂｓｔａｃ反応（図２９（ｂ））では、Ｈｉｓ−ｓｕｍｏ−Ｕｂ−ｈＧＨの形態のタンパク質にＳＥＮＰ１酵素を用いてＨｉｓ−ｓｕｍｏを切断したＵｂ−ｈＧＨの形態の受容体ユビキチンが用いられ、このとき、残存するＳＥＮＰ１がＵｂｓｔａｃ反応に含まれて供与体ｈＧＨ、Ｕｂｃ１３とＭＭＳ２のＨｉｓ−ｓｕｍｏも一緒に切断して反応させた後、ダイマー及びＥ２（Ｕｂｃ１３、ＭＭＳ２）のバンドシフト（ｂａｎｄ  ｓｈｉｆｔ）が行われたことを確認した。図２９に示すように、生体分子がＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方ともにそれぞれ結合された形態のすべてにおいてＵｂｓｔａｃダイマーが形成されたことを確認した。この実施例において用いられたタンパク質などの配列番号は、次の通りである：Ｎ末端にｈＧＨが結合された供与体ユビキチン（配列番号：２０）；Ｎ末端にｈＧＨが結合された受容体ユビキチン（配列番号：２１）；Ｃ末端にｈＧＨが結合された受容体ユビキチン（配列番号：２２）；Ｎ末端にＳＵＭＯが、Ｃ末端にｈＧＨが結合された受容体ユビキチン（配列番号：２３）
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明は、生体内のユビキチン−プロテアソームタンパク質の分解作用に関与するＥ１−Ｅ２−Ｅ３システムを用いて、インビトロでユビキチンＣ末端タグ（ＵＣＴ）−生体分子を単位とする線形マルチマー生体分子重合体を製造する方法及びこのような方法により製造された線形マルチマー生体分子重合体に関する。このように、本発明の線形マルチマー生体分子重合体及びこれを製造する方法は、固定化タンパク質の産生、物質の分離・精製、及び分析が求められる産業分野及び医療分野において幅広く用いられ得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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