(57)【要約】ヒトまたは動物に投与するための製剤およびそれらの調製方法が記載されている。特に、より安定な医薬製剤、例えば静脈内投与用のものなど、およびそれらの調製方法が記載されている。医薬品有効成分（ＡＰＩ）と、緩衝剤と、凍結乾燥保護剤とを有する凍結乾燥製剤も記載されており、ここでのＡＰＩは、哺乳動物の身体をｉｎ  ｖｉｖｏで光学的にイメージングするのに適した、少なくとも１種のｃＭｅｔ結合ペプチドを含むイメージング剤である。また、凍結乾燥製剤の調製方法、医薬組成物、および医薬組成物を調製するためのキットも記載されている。さらに、この製剤または医薬組成物を、がんなどの症状の検出、診断、手術、病期分類、治療、治療の監視、疾患進行の監視または監視療法などにおいて使用するイメージング方法が記載されている。
2021519300.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）医薬品有効成分（ＡＰＩ）と；
（ｉｉ）緩衝剤と；
（ｉｉｉ）凍結乾燥保護剤と
を含む凍結乾燥製剤であって、前記ＡＰＩが、哺乳動物の身体を光学的にイメージングするのに適した、少なくとも１種のｃＭｅｔ結合ペプチドを含むイメージング剤である、凍結乾燥製剤。
【請求項２】
前記イメージング剤が、緑色〜近赤外波長（４００〜１，２００ｎｍ）の光を使用するイメージングに適した少なくとも１種の光学レポーターを含む、請求項１に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項３】
イメージング剤が式Ｉの化合物を含む、請求項１または２に記載の凍結乾燥製剤：
【化１】
2021519300.tif 000038
（式中、
Ｚ１は、ｃＭＢＰのＮ末端に結合しており、ＨまたはＭＩＧである；
Ｚ２は、ｃＭＢＰのＣ末端に結合しており、ＯＨ、ＮＨ２、ＯＢｃ（Ｂｃは生体適合性カチオンである）またはＭＩＧである；
ｃＭＢＰは、１７〜３０個のアミノ酸のｃＭｅｔ結合環状ペプチドであり、下記のアミノ酸配列（配列番号１）を含む：
Ｃｙｓａ−Ｘａａ１−Ｃｙｓｃ−Ｘａａ２−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘａａ３−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓｄ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓｂ−Ｔｙｒ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６
（Ｘａａ１は、Ａｓｎ、ＨｉｓまたはＴｙｒである；
Ｘａａ２は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＡｓｎである；
Ｘａａ３は、ＴｈｒまたはＡｒｇである；
Ｘａａ４は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＳｅｒである；
Ｘａａ５は、ＳｅｒまたはＴｈｒである；
Ｘａａ６は、ＡｓｐまたはＧｌｕである；
Ｃｙｓａ−ｄはそれぞれシステイン残基であって、残基ａとｂと、ならびに残基ｃとｄとが環化して２つの別個のジスルフィド結合を形成している）；
ＭＩＧは代謝阻害基であって、前記ペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ代謝を阻害または抑制する生体適合性基である；
Ｌは、式−（Ａ）ｍ−の合成リンカー基である
（各Ａは、独立して、−ＣＲ２−、−ＣＲ＝ＣＲ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＲ２ＣＯ２−、−ＣＯ２ＣＲ２−、−ＮＲＣＯ−、−ＣＯＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ−、−ＳＯ２ＮＲ−、−ＮＲＳＯ２−、ＣＲ２ＯＣＲ２−、−ＣＲ２ＳＣＲ２−、ＣＲ２ＮＲＣＲ２−、Ｃ４−８シクロヘテロアルキレン基、Ｃ４−８シクロアルキレン基、Ｃ５−１２アリーレン基、Ｃ３−１２ヘテロアリーレン基、アミノ酸、糖または単分散ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ビルディングブロックである；
各Ｒは、独立して、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、Ｃ２−４アルケニル、Ｃ２−４アルキニル、Ｃ１−４アルコキシアルキルまたはＣ１−４ヒドロキシアルキルから選択される；
ｍは、値１〜２０の整数である）；
ｎは、値０または１の整数である；
ＩＭは、紫色〜近赤外波長（４００〜１，２００ｎｍ）の光を使用して哺乳動物の身体をイメージングするのに適した光学レポーターイメージング部位である）。
【請求項４】
配列番号１に加えて、前記ｃＭＢＰがさらに、Ｃ−またはＮ−ｃＭＢＰペプチド末端のいずれかの４個のアミノ酸残基内に、ＡｓｐもしくはＧｌｕ残基、またはそれらの類似体を含み、−（Ｌ）ｎＩＭがアミン基で官能化されており、このアミン基が前記ＡｓｐもしくはＧｌｕ残基、またはそれらの類似体のカルボキシル側鎖にコンジュゲートしてアミド結合を与えている、請求項３に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項５】
配列番号１に加えて、前記ｃＭＢＰが、Ｃ−またはＮ−ｃＭＢＰペプチド末端のいずれかの４個のアミノ酸残基内に、Ｌｙｓ残基、またはその類似体を含み、−（Ｌ）ｎＩＭがカルボキシル基で官能化されており、このカルボキシル基が前記Ｌｙｓ残基、またはその類似体のε−アミン側鎖にコンジュゲートしてアミド結合を与えている、請求項３または４に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項６】
ｃＭＢＰが、下記の配列番号２または配列番号３のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項３〜５のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤：
Ｓｅｒ−Ｃｙｓａ−Ｘａａ１−Ｃｙｓｃ−Ｘａａ２−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘａａ３−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓｄ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓｂ−Ｔｙｒ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６（配列番号２）；
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓａ−Ｘａａ１−Ｃｙｓｃ−Ｘａａ２−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘａａ３−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓｄ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓｂ−Ｔｙｒ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（配列番号３）。
【請求項７】
Ｘａａ３がＡｒｇである、請求項３〜６のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項８】
配列番号１、配列番号２または配列番号３に加えて、ｃＭＢＰがさらに、そのＮ−またはＣ−末端のいずれかに、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（配列番号４）、−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−（配列番号５）および−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ（配列番号６）から選択されるリンカーペプチドを含む、請求項３〜７のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項９】
ｃＭＢＰが、下記のアミノ酸配列（配列番号７）を含む、請求項３〜８のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤：
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓａ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓｃ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓｄ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓｂ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ。
【請求項１０】
Ｚ１およびＺ２の両方が、独立してＭＩＧである、請求項３〜９のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項１１】
Ｚ１がアセチルであり、Ｚ２が第一級アミドである、請求項３〜１０のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項１２】
ｎが０である、請求項３〜１１のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項１３】
ＩＭが、６００〜１，０００ｎｍの範囲の最大吸光度を有する染料である、請求項３〜１２のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項１４】
ＩＭがシアニン染料である、請求項１３に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項１５】
前記シアニン染料が式ＩＩＩを有する、請求項１４に記載の凍結乾燥製剤：
【化２】
2021519300.tif 000039
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、ＨまたはＳＯ３Ｍ１であり、Ｒ１およびＲ２のうちの少なくとも１つはＳＯ３Ｍ１（Ｍ１はＨまたはＢｃである）である；
Ｒ３およびＲ４は、独立して、Ｃ１−４アルキルまたはＣ１−６カルボキシアルキルである；
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立してＲａ基である（Ｒａは、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−６カルボキシアルキルまたは−（ＣＨ２）ｋＳＯ３Ｍ１（ｋは、値３または４の整数である）である）；
ただし、前記シアニン染料は、前記Ｒ１、Ｒ２およびＲａ基に合計１〜４個のＳＯ３Ｍ１置換基を有することを条件とする）。
【請求項１６】
復元したときに、約ｐＨ６．３〜約ｐＨ９の間、任意選択で約ｐＨ６．３〜約ｐＨ９の間、任意選択で約ｐＨ６．５〜約ｐＨ８．５の間、任意選択で約ｐＨ６．８〜約ｐＨ８．２の間、任意選択で約ｐＨ６．８〜約ｐＨ８の間、任意選択で約ｐＨ７〜約ｐＨ８の間のｐＨを有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項１７】
復元したときに、前記緩衝剤が、約ｐＨ６．３〜約ｐＨ９の間、任意選択で約ｐＨ６．３〜約ｐＨ９の間、任意選択で約ｐＨ６．５〜約ｐＨ８．５の間、任意選択で約ｐＨ６．８〜約ｐＨ８．２の間、任意選択で約ｐＨ６．８〜約ｐＨ８の間、任意選択で約ｐＨ７〜約ｐＨ８の間のｐＨを有する溶液を提供する量で存在する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項１８】
ＡＰＩ：緩衝剤のモル比が、ＡＰＩ約１モル：緩衝剤約１７〜約４７モル、任意選択でＡＰＩ約１モル：緩衝剤約２７〜約４７モル、任意選択でＡＰＩ約１モル：緩衝剤約３０〜約４７モル、任意選択でＡＰＩ約１モル：緩衝剤約３４〜約４７モル、任意選択でＡＰＩ約１モル：緩衝剤約２７〜約３８モル、任意選択でＡＰＩ約１モル：緩衝剤約３０〜約３８モル、任意選択でＡＰＩ約１モル：緩衝剤約３４〜約３８モルである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項１９】
ＡＰＩ：凍結乾燥保護剤のモル比が、ＡＰＩ約１モル：凍結乾燥保護剤約１０５〜約２１６モル、任意選択でＡＰＩ約１モル：凍結乾燥保護剤約１０５〜約１６３モル、任意選択でＡＰＩ約１モル：凍結乾燥保護剤約１０５〜約１５４モル、任意選択でＡＰＩ約１モル：凍結乾燥保護剤約１０５〜約１４５モル、任意選択でＡＰＩ約１モル：凍結乾燥保護剤約１０５〜約１４１モル、任意選択でＡＰＩ約１モル：凍結乾燥保護剤約１０５〜約１３２モル、任意選択でＡＰＩ約１モル：凍結乾燥保護剤約１０５〜約１２９モル、任意選択でＡＰＩ約１モル：凍結乾燥保護剤約１２９〜約２１６モル、任意選択でＡＰＩ約１モル：凍結乾燥保護剤約１２９〜約１６３モル、任意選択でＡＰＩ約１モル：凍結乾燥保護剤約１２９〜約１５４モル、任意選択でＡＰＩ約１モル：凍結乾燥保護剤約１２９〜約１４５モル、任意選択でＡＰＩ約１モル：凍結乾燥保護剤約１２９〜約１４１モル、任意選択でＡＰＩ約１モル：凍結乾燥保護剤約１２９〜約１３２モルである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項２０】
前記製剤が、ＡＰＩを約４〜約１２重量％、任意選択でＡＰＩを約８〜約１０重量％、任意選択でＡＰＩを約９重量％含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項２１】
前記製剤が、緩衝剤を約３〜約３５重量％、任意選択で緩衝剤を約７〜約３５重量％、任意選択で緩衝剤を約１２〜約３５重量％、任意選択で緩衝剤を約１５〜約３５重量％、任意選択で緩衝剤を約１８〜約３５重量％、任意選択で緩衝剤を約２５〜約３５重量％、任意選択で緩衝剤を約３２〜約３５重量％、任意選択で緩衝剤を約３２％含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項２２】
前記製剤が、凍結乾燥保護剤を約５６〜約９１重量％、任意選択で凍結乾燥保護剤を約５６〜約８２重量％、任意選択で凍結乾燥保護剤を約５６〜約７７重量％、任意選択で凍結乾燥保護剤を約５６〜約７５重量％、任意選択で凍結乾燥保護剤を約５６〜約７２重量％、任意選択で凍結乾燥保護剤を約５６〜約６６重量％、任意選択で凍結乾燥保護剤を約５６〜約５８重量％、任意選択で凍結乾燥保護剤を約５８重量％を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項２３】
前記緩衝剤が、リン酸緩衝剤およびアルカノールアミン緩衝剤のうちの少なくとも１つである、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項２４】
前記リン酸緩衝剤がリン酸水素およびリン酸二水素を含み、任意選択で前記リン酸緩衝剤が水和している、請求項２３に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項２５】
前記アルカノールアミン緩衝剤がトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンである、請求項２３または２４に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項２６】
前記凍結乾燥保護剤が、スクロースおよびマンニトール、ならびにそれらの誘導体のうちの少なくとも１つである、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項２７】
前記凍結乾燥保護剤がマンニトールまたはその誘導体である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項２８】
前記製剤がさらに張度調節剤を含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項２９】
前記凍結乾燥保護剤が張度調節剤としても作用する、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項３０】
凍結乾燥製剤の調製方法であって、
ａ）医薬品有効成分（ＡＰＩ）、緩衝剤、および凍結乾燥保護剤を凍結乾燥容器に供給する工程と；
ｂ）第１水分除去ステップを実行する工程と；
ｃ）第２水分除去ステップを実行する工程と
を含み、前記凍結乾燥を行う前に、前記凍結乾燥保護剤および前記緩衝剤を添加する、方法。
【請求項３１】
第１水分除去ステップを、約−３０℃以下、任意選択で約−３５℃以下、任意選択で約−３８℃以下の温度で行う、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
第２水分除去ステップを、約１０℃以上、任意選択で約１５℃以上、任意選択で約２０℃以上の温度で行う、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
第１および第２水分除去ステップのうちの少なくとも１つを、５０μｂａｒ以下の圧力で行う、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
第１および第２水分除去ステップの両方を、５０μｂａｒ以下の圧力で行う、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記凍結乾燥製剤が、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤である、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の方法によって調製された凍結乾燥製剤。
【請求項３７】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の製剤と生体適合性担体とを、哺乳動物への投与に適した形態で含む医薬組成物。
【請求項３８】
約ｐＨ６．３〜約ｐＨ９の間、任意選択で約ｐＨ６．３〜約ｐＨ９の間、任意選択で約ｐＨ６．５〜約ｐＨ８．５の間、任意選択で約ｐＨ６．８〜約ｐＨ８．２の間、任意選択で約ｐＨ７〜約ｐＨ８の間のｐＨを有する、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
請求項３７または３８に記載の医薬組成物を調製するためのキットであって、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の製剤を無菌固体形態で含み、請求項３７または３８に記載の生体適合性担体の無菌供給物で復元させると、溶解が起こり、前記所望の医薬組成物が得られるような、キット。
【請求項４０】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の製剤および請求項３７または３８に記載の医薬組成物のうちの少なくとも１つを使用することを含む、前記哺乳動物の身体のイメージング方法。
【請求項４１】
前記イメージングがｉｎ  ｖｉｖｏである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記イメージングが光学イメージングである、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記イメージングが、ｃＭｅｔの過剰発現部位または局在部位の画像を得るためのものである、請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の製剤または請求項３７もしくは３８に記載の医薬組成物を、前記哺乳動物の身体に前もって投与している、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の方法であって、
ａ）対象の組織表面を励起光で照らす工程と；
ｂ）前記イメージング剤の励起により発生した前記イメージング剤からの蛍光を検出する工程と；
ｃ）任意選択で、蛍光検出器によって検出した前記光をフィルタリングして蛍光成分を分離する工程と；
ｄ）工程（ｂ）または（ｃ）の蛍光から前記対象の組織表面の画像を形成する工程と
を含む、方法。
【請求項４６】
工程（ａ）の励起光が、本質的に連続波（ＣＷ）である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の方法であって、
ａ）前記哺乳動物の身体の不均一組成を有する光散乱生体組織を、所定の経時変化する強度の光源からの光にさらして前記イメージング剤を励起させる工程であって、前記組織が前記励起光を多重散乱させる工程と；
ｂ）前記露光に応答した前記組織からの多重散乱発光を検出する工程と；
ｃ）プロセッサを用いて複数の値を確立することにより、前記発光から前記組織全体の蛍光特性を定量化する工程であって、前記値が、前記組織内の異なる位置における前記蛍光特性のレベルにそれぞれ対応しており、前記蛍光特性のレベルが、前記組織の不均一組成によって変化するものである工程と；
ｄ）工程（ｃ）の値に従って前記組織の不均一組成をマッピングすることにより、前記組織の画像を生成する工程と
を含む、方法。
【請求項４８】
前記光学イメージング方法が、蛍光イメージング、任意選択で蛍光内視鏡検査を含む、請求項４０〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
検出、診断、手術、病期分類、治療、治療の監視、疾患進行の監視または監視療法を補助するために使用される、請求項４０〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前がん症状およびがんのうちの１つもしくは複数の、任意選択で結腸直腸がん、食道がん、乳がん、前立腺がん、頭部がん、頸部がん、卵巣がん、直腸がん、膵臓がん、甲状腺がん、胃がんおよび肉腫のうちの１つもしくは複数の検出、診断、手術、病期分類、治療、治療の監視、疾患進行の監視または監視療法を補助するために使用される、請求項４０〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
請求項４０〜５０のいずれか一項に記載のイメージング方法を含んでなる、検出、診断、手術、病期分類、治療、治療の監視、疾患進行の監視または監視療法の方法。
【請求項５２】
前記哺乳動物の身体のイメージングにおけるイメージング剤として使用するための、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の製剤、または請求項３７もしくは３８に記載の医薬組成物。
【請求項５３】
薬剤として使用するための、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の製剤、または請求項３７もしくは３８に記載の医薬組成物。
【請求項５４】
検出、診断、手術、病期分類、治療、治療の監視、疾患進行の監視または監視療法において使用するための、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の製剤、または請求項３７もしくは３８に記載の医薬組成物。
【請求項５５】
前がん症状およびがんのうちの１つもしくは複数の、任意選択で結腸直腸がん、食道がん、乳がん、前立腺がん、頭部がん、頸部がん、卵巣がん、直腸がん、膵臓がん、甲状腺がん、胃がんおよび肉腫のうちの１つもしくは複数の検出、診断、手術、病期分類、治療、治療の監視、疾患進行の監視または監視療法において使用するための、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の製剤、または請求項３７もしくは３８に記載の医薬組成物。
【請求項５６】
ｃＭｅｔの過剰発現部位または局在部位の検出、診断、手術、病期分類、治療、治療の監視、疾患進行の監視または監視療法において使用するための、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の製剤、または請求項３７もしくは３８に記載の医薬組成物。
【請求項５７】
ｃＭｅｔの過剰発現部位または局在部位の画像を、任意選択でｉｎ  ｖｉｖｏで得るために使用される、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の製剤、または請求項３７もしくは３８に記載の医薬組成物。
【請求項５８】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の製剤、および請求項３７または３８に記載の医薬組成物のうちの少なくとも１つを使用する、検出、診断、手術、病期分類、治療、治療の監視、疾患進行の監視または監視療法の方法。
【請求項５９】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の製剤、および請求項３７または３８に記載の医薬組成物のうちの少なくとも１つを使用する、哺乳動物の身体のイメージング方法。
【請求項６０】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の製剤、および請求項３７または３８に記載の医薬組成物のうちの少なくとも１つを使用する、前がん症状およびがんのうちの１つもしくは複数の、任意選択で結腸直腸がん、食道がん、乳がん、前立腺がん、頭部がん、頸部がん、卵巣がん、直腸がん、膵臓がん、甲状腺がん、胃がんおよび肉腫のうちの１つもしくは複数の検出、診断、手術、病期分類、治療、治療の監視、疾患進行の監視または監視療法の方法。
【請求項６１】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の製剤、および請求項３７または３８に記載の医薬組成物のうちの少なくとも１つを使用する、ｃＭｅｔの過剰発現部位または局在部位の検出、診断、手術、病期分類、治療、治療の監視、疾患進行の監視または監視療法の方法。
【請求項６２】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の製剤、および請求項３７または３８に記載の医薬組成物のうちの少なくとも１つを使用して、ｃＭｅｔの過剰発現部位または局在部位の画像を、任意選択でｉｎ  ｖｉｖｏで得る方法。
【請求項６３】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の製剤、および請求項３７または３８に記載の医薬組成物のうちの少なくとも１つの使用。
【請求項６４】
検出、診断、手術、病期分類、治療、治療の監視、疾患進行の監視または監視療法における、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の製剤、および請求項３７または３８に記載の医薬組成物の少なくとも１つの使用。
【請求項６５】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の製剤、および請求項３７または３８に記載の医薬組成物のうちの少なくとも１つの、イメージング剤としての使用。
【請求項６６】
前がん症状およびがんのうちの１つもしくは複数の、任意選択で結腸直腸がん、食道がん、乳がん、前立腺がん、頭部がん、頸部がん、卵巣がん、直腸がん、膵臓がん、甲状腺がん、胃がんおよび肉腫のうちの１つもしくは複数の検出、診断、手術、病期分類、治療、治療の監視、疾患進行の監視または監視療法における、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の製剤、および請求項３７または３８に記載の医薬組成物のうちの少なくとも１つの使用。
【請求項６７】
ｃＭｅｔの過剰発現部位または局在部位の検出、診断、手術、病期分類、治療、治療の監視、疾患進行の監視または監視療法における、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の製剤、および請求項３７または３８に記載の医薬組成物のうちの少なくとも１つの使用。
【請求項６８】
ｃＭｅｔの過剰発現部位または局在部位の画像を、任意選択でｉｎ  ｖｉｖｏで得る際の、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の製剤、および請求項３７または３８に記載の医薬組成物のうちの少なくとも１つの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトまたは動物に投与するための製剤およびその調製方法に関する。特に、本発明は、より安定な医薬製剤、例えば静脈内投与用のものなど、およびそれらの調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
国際公開第２００８／１３９２０７号（参照により本明細書に組み込まれる）は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの光学イメージングに適した標識ｃＭｅｔ結合ペプチドを記載している。このペプチドは、赤色〜近赤外領域でのイメージングに適した光学レポーター基で標識されている。また、静脈内投与用の光学分子イメージングｃＭｅｔ結合ペプチド、例えば結腸直腸がん（ＣＲＣ）の早期診断に使用することができるものなども記載されている。
【０００３】
より詳細には、国際公開第２００８／１３９２０７号は、ヒトｃＭｅｔに対して高い親和性を有する水溶性２６−アミノ酸環状ペプチドを記載しており、このペプチドは、哺乳動物の身体をｉｎ  ｖｉｖｏでイメージングするのに適した蛍光光学レポーターイメージング部位を含む。この部位は、６５３ｎｍでの励起ピークと６７５ｎｍでの発光ピークとを伴う強い蛍光シグナルを示し、これは、表在性病変のイメージングに最適な波長領域と考えられている。
【０００４】
しかしながら、本発明者らは、その記載されているイメージング剤は、溶液中での貯蔵寿命が短く、したがって静脈内注射前のイメージング剤の貯蔵および分解が問題となり得ることを確認している。さらに、静脈内使用では、イメージング剤は、静脈内投与に適切なｐＨおよび張度であることが有益である。
【０００５】
したがって、本発明の目的は、イメージング剤、特に光学イメージング剤、より具体的には国際公開第２００８／１３９２０７号に記載のようなペプチドを含む光学イメージング剤のためのより安定な製剤を提供することである。本発明のさらなる目的は、イメージング剤、特に光学イメージング剤、より具体的には国際公開第２００８／１３９２０７号に記載のようなペプチドを含む光学イメージング剤のための製剤であって、より良好な復元を、特に静脈内使用に適したｐＨおよび／または張度で示す製剤を提供することである。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の第１の態様によれば、
（ｉ）医薬品有効成分（ＡＰＩ）と；
（ｉｉ）緩衝剤と；
（ｉｉｉ）凍結乾燥保護剤と
を含む凍結乾燥製剤であって、ＡＰＩが、哺乳動物の身体をｉｎ  ｖｉｖｏで光学的にイメージングするのに適した、少なくとも１種のｃＭｅｔ結合ペプチドを含むイメージング剤である凍結乾燥製剤が提供される。
【０００７】
哺乳動物の身体の光学イメージングは、ｉｎ  ｖｉｖｏであり得る。
【０００８】
用語「緩衝剤」は、ｐＨ調整剤を意味する。緩衝剤は、溶解して緩衝液を形成する化合物または組成物（例えば、塩）であり得る。緩衝剤は、脱水緩衝塩であり得る。緩衝剤は、下記のもののうちの少なくとも１つであり得る：酸（典型的には弱酸）およびそれらの塩のうちの１つ、ならびに塩基（典型的には弱塩基）およびそれらの塩のうちの１つ。
【０００９】
用語が本発明の分野でしばしば交換可能に使用されることを考慮すると、「凍結乾燥保護剤」への言及は「凍結保護剤」を含み、逆もまた同様である。
【００１０】
イメージング剤は、紫色〜近赤外波長（４００〜１，２００ｎｍ）の光を使用してイメージングするのに適した少なくとも１つの光学レポーターを含み得る。
【００１１】
イメージング剤は、式Ｉの化合物を含み得る：
【化１】
2021519300.tif 000003
（式中、
Ｚ１は、ｃＭＢＰのＮ末端に結合しており、ＨまたはＭＩＧである；
Ｚ２は、ｃＭＢＰのＣ末端に結合しており、ＯＨ、ＮＨ２、ＯＢｃ（Ｂｃは生体適合性カチオンである）またはＭＩＧである；
ｃＭＢＰは、１７〜３０個のアミノ酸のｃＭｅｔ結合環状ペプチドであり、下記のアミノ酸配列（配列番号１）を含む：
Ｃｙｓａ−Ｘａａ１−Ｃｙｓｃ−Ｘａａ２−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘａａ３−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓｄ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓｂ−Ｔｙｒ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６
（Ｘａａ１は、Ａｓｎ、ＨｉｓまたはＴｙｒである；
Ｘａａ２は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＡｓｎである；
Ｘａａ３は、ＴｈｒまたはＡｒｇである；
Ｘａａ４は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＳｅｒである；
Ｘａａ５は、ＳｅｒまたはＴｈｒである；
Ｘａａ６は、ＡｓｐまたはＧｌｕである；
Ｃｙｓａ−ｄはそれぞれシステイン残基であって、残基ａとｂと、ならびに残基ｃとｄとが環化して２つの別個のジスルフィド結合を形成している）；
ＭＩＧは代謝阻害基であって、ペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ代謝を阻害または抑制する生体適合性基である；
Ｌは、式−（Ａ）ｍ−の合成リンカー基である
（各Ａは、独立して、−ＣＲ２−、−ＣＲ＝ＣＲ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＲ２ＣＯ２−、−ＣＯ２ＣＲ２−、−ＮＲＣＯ−、−ＣＯＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ−、−ＳＯ２ＮＲ−、−ＮＲＳＯ２−、ＣＲ２ＯＣＲ２−、−ＣＲ２ＳＣＲ２−、ＣＲ２ＮＲＣＲ２−、Ｃ４−８シクロヘテロアルキレン基、Ｃ４−８シクロアルキレン基、Ｃ５−１２アリーレン基、Ｃ３−１２ヘテロアリーレン基、アミノ酸、糖または単分散ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ビルディングブロックである；
各Ｒは、独立して、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、Ｃ２−４アルケニル、Ｃ２−４アルキニル、Ｃ１−４アルコキシアルキルまたはＣ１−４ヒドロキシアルキルから選択される；
ｍは、値１〜２０の整数である）；
ｎは、値０または１の整数である；
ＩＭは、緑色〜近赤外波長（４００〜１，２００ｎｍ）の光を使用して哺乳動物の身体をイメージングするのに適した光学レポーターイメージング部位である）。
【００１２】
用語「イメージング剤」は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで哺乳動物の身体をイメージングするのに適した化合物を意味する。Ｅｘ  ｖｉｖｏイメージングは、依然として哺乳動物の身体への投与を必要とするが、組織試料などを取り出し、その試料を体外でイメージングすることも伴い得る。そのような例では、製剤は、哺乳動物の身体に投与される限りにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで使用され、イメージングが哺乳動物の身体の外部で行われる限りにおいてｅｘ  ｖｉｖｏで使用される。哺乳動物は、ヒト被験体であり得る。イメージングは、侵襲的（例えば、手術中もしくは内視鏡的）または非侵襲的であり得る。イメージング方法は、内視鏡検査であり得る。式Ｉの化合物は、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングに適しているが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ用途（例えば、生体試料中のｃＭｅｔを定量するアッセイまたは組織試料中のｃＭｅｔの可視化）もあり得る。本イメージング剤は、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングに使用され得る。
【００１３】
Ｚ１基は、最後のアミノ酸残基のアミン基を置換する。したがって、Ｚ１がＨの場合、ｃＭＢＰのアミノ末端は、最後のアミノ酸残基の遊離ＮＨ２基で終端する。Ｚ２基は、最後のアミノ酸残基のカルボニル基を置換する。したがって、Ｚ２がＯＨの場合、ｃＭＢＰのカルボキシ末端は最後のアミノ酸残基の遊離ＣＯ２Ｈ基で終端し、Ｚ２がＯＢｃの場合、その末端カルボキシ基はＣＯ２Ｂｃ基としてイオン化されている。
【００１４】
用語「代謝阻害基」（ＭＩＧ）は、アミノ末端（Ｚ１）またはカルボキシ末端（Ｚ２）のいずれかにおいて、ｃＭＢＰペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ代謝を阻害または抑制する生体適合性基を意味する。そのような基は、当業者によく知られており、適切には、ペプチドのアミン末端では、Ｎ−アシル化基−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＲＧ（式中、アシル基−（Ｃ＝Ｏ）ＲＧは、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−１０アリール基から選択されるＲＧを有するか、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ビルディングブロックを含む）から選択される。適切なＰＥＧ基は、下記のリンカー基（Ｌ）で記載している。そのようなＰＥＧ基は、式ＩＡまたはＩＢの生体修飾基であり得る。そのようなアミノ末端ＭＩＧ基は、アセチル、ベンジルオキシカルボニルまたはトリフルオロアセチル、典型的にはアセチルであり得る。
【００１５】
ペプチドのカルボキシル末端に適した代謝阻害基には、カルボキサミド、ｔｅｒｔ−ブチルエステル、ベンジルエステル、シクロヘキシルエステル、アミノアルコールまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ビルディングブロックが挙げられる。ｃＭＢＰペプチドのカルボキシ末端アミノ酸残基に適したＭ基は、アミノ酸残基の末端アミンをＣ１−４アルキル基、任意にメチル基でＮ−アルキル化したものである。そのようなＭＩＧ基は、カルボキサミドまたはＰＥＧであり得、カルボキサミドであり得る。
【００１６】
式Ｉは、−（Ｌ）ｎ［ＩＭ］部位が、Ｚ１、Ｚ２またはｃＭＢＰの任意の適当な位置に結合していてもよいことを示す。Ｚ１またはＺ２については、Ｚ１／Ｚ２のいずれかがＭＩＧであるとき、−（Ｌ）ｎ［ＩＭ］部位は、どちらのＭＩＧ基にも結合し得る。Ｚ１がＨであるか、Ｚ２がＯＨであるとき、Ｚ１またはＺ２の位置に−（Ｌ）ｎ［ＩＭ］部位が結合すると、それぞれ式［ＩＭ］−（Ｌ）ｎ−［ｃＭＢＰ］−Ｚ２またはＺ１−［ｃＭＢＰ］−（Ｌ）ｎ−［ＩＭ］の化合物を与える。いずれかのペプチド末端でのｃＭＢＰの代謝の阻害は、このように−（Ｌ）ｎ−［ＩＭ］部位の結合によっても達成され得るが、−（Ｌ）ｎ−［ＩＭ］は、本明細書中のＭＩＧの定義の範囲外である。
【００１７】
式Ｉの−（Ｌ）ｎ−部位は、ＩＭの任意の適当な位置に結合し得る。この−（Ｌ）ｎ−部位は、ＩＭの既存の置換基の代わりになるか、ＩＭの既存の置換基に共有結合している。この−（Ｌ）ｎ−部位は、任意選択で、ＩＭのカルボキシアルキル置換基を介して結合している。
【００１８】
用語「ｃＭｅｔ結合環状ペプチド」（ｃＭＢＰ）は、ｃＭｅｔ（ｃ−Ｍｅｔまたは肝細胞増殖因子受容体）としても知られる肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）高親和性受容体に結合するペプチドを意味する。適切なｃＭＢＰペプチドでは、ｃＭｅｔ／ＨＧＦ複合体のｃＭｅｔに対する見かけのＫｄは約２μＭ未満である。ｃＭＢＰペプチドはプロリン残基を含み、かかる残基は、主鎖アミド結合のシス／トランス異性化を示し得ることが知られている。本明細書に記載のｃＭＢＰペプチドには、任意のそのような異性体が含まれる。
【００１９】
用語「生体適合性カチオン」（Ｂｃ）は、イオン化して負に荷電した基と塩を形成する正に荷電した対イオンを意味し、前記正に荷電した対イオンはさらに、非毒性であり、それ故に哺乳動物の身体、特に人体への投与に適したものである。適切な生体適合性カチオンの例としては、アルカリ金属であるナトリウムまたはカリウム；アルカリ土類金属であるカルシウムおよびマグネシウム；ならびにアンモニウムイオンが挙げられる。典型的な生体適合性カチオンは、ナトリウムおよびカリウムであり、典型的にはナトリウムである。
【００２０】
用語「アミノ酸」は、Ｌ−もしくはＤ−アミノ酸、アミノ酸類似体（例えば、ナフチルアラニン）またはアミノ酸模倣体を意味し、天然のものでも、純粋な合成品であってもよく、光学的に純粋なもの、すなわち単一のエナンチオマーであり、したがってキラルであってもよく、またはエナンチオマーの混合物であってもよい。本明細書では、アミノ酸について慣用の３文字または１文字の略語を使用している。使用するアミノ酸は、光学的に純粋であり得る。用語「アミノ酸模倣体」は、アイソスターである天然アミノ酸の合成類似体、すなわち天然化合物の立体構造および電子構造を模倣するように設計されたものを意味する。そのようなアイソスターは、当業者によく知られており、デプシペプチド、レトロインベルソペプチド、チオアミド、シクロアルカンまたは１，５−二置換テトラゾールが挙げられるが、これらに限定されない［Ｍ．  Ｇｏｏｄｍａｎ，  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，  ２４，  １３７，  （１９８５）を参照］。
【００２１】
用語「ペプチド」は、上記で定義したように、ペプチド結合（すなわち、あるアミノ酸のアミンと別のアミノ酸のカルボキシルとを連結するアミド結合）によって連結された２個以上のアミノ酸を含む化合物を意味する。用語「ペプチド模倣体」または「模倣体」は、ペプチドまたはタンパク質の生物活性を模倣するが、化学的性質がもはやペプチドではない生物活性化合物を指し、すなわち、それらはもはやペプチド結合（すなわち、アミノ酸間のアミド結合）を含まない。ここでは、ペプチド模倣体という用語はより広い意味で使用され、性質がもはや完全にはペプチドではない分子、例えば擬似ペプチド、半ペプチドおよびペプトイドなどを含む。
【００２２】
用語「光学レポーターイメージング部位」（ＩＭ）は、緑色〜近赤外波長（４００〜１，２００ｎｍ、任意選択で６００〜１，０００ｎｍ）の光を使用する光学イメージング手順において、直接的もしくは間接的に検出することが可能な蛍光染料または発色団を意味する。ＩＭは、蛍光特性を有し得る。
【００２３】
式Ｉのリンカー基−（Ａ）ｍ−の役割の１つは、ＩＭをｃＭＢＰペプチドの活性部位から遠ざけることであり得る。これは、イメージング部位が比較的かさ高い場合、酵素との相互作用が損なわれないように、特に重要である。これは、かさ高い基が活性部位から離れた位置に自らを位置付ける自由度を有するような柔軟性（例えば、単純アルキル鎖）および／またはＩＭを活性部位から離れた位置に配向させるシクロアルキルもしくはアリールスペーサーなどの硬直性を組み合わせることで達成され得る。リンカー基の性質は、イメージング剤の生体内分布を調整するためにも使用することができる。したがって、例えば、リンカー中にエーテル基を導入することは、血漿タンパク質の結合を調整するのに役立つ。−（Ａ）ｍ−がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ビルディングブロックまたは１〜１０個のアミノ酸残基のペプチド鎖を含む場合、リンカー基は、ｉｎ  ｖｉｖｏでイメージング剤の薬物動態および血中クリアランス速度を調整するように機能し得る。そのような「バイオモディファイア」リンカー基は、筋肉もしくは肝臓などのバックグラウンド組織、および／または血液からのイメージング剤のクリアランスを加速させ、バックグラウンド干渉を減少させることで、より良好な診断画像を与え得る。バイオモディファイアリンカー基を使用して、特定の排泄経路、例えば、肝臓経由ではなく腎臓経由を有利にすることもできる。
【００２４】
用語「糖」は、単糖、二糖または三糖を意味する。適切な糖には、グルコース、ガラクトース、マルトース、マンノース、およびラクトースが挙げられる。任意選択で、糖は、アミノ酸への容易なカップリングを可能にするように官能化されていてもよい。したがって、例えば、アミノ酸のグルコサミン誘導体は、ペプチド結合を介して他のアミノ酸にコンジュゲートすることができる。アスパラギンのグルコサミン誘導体（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍから市販されている）は、その一例である：
【化２】
2021519300.tif 000004
【００２５】
イメージング剤の分子量は、適切には最大８，０００ダルトンである。任意選択で、分子量は２，８００〜６，０００ダルトンの範囲であり、典型的には３，０００〜４，５００ダルトンであり、３，２００〜４，０００ダルトンが最も典型的である。
【００２６】
本発明のイメージング剤は、ペプチド末端の両方がＭＩＧ基によって保護され得、すなわち、任意選択でＺ１およびＺ２の両方がＭＩＧであり、これらは通常異なっている。上述したように、Ｚ１／Ｚ２のいずれかが、任意選択で−（Ｌ）ｎ［ＩＭ］に相当し得る。このようにペプチド末端の両方が保護されていることは、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング用途にとって重要であり、その理由は、そうでなければ急速な代謝が起こり、ｃＭｅｔに対する選択的結合親和性の喪失という結果を生じると予想されるためである。Ｚ１およびＺ２の両方がＭＩＧである場合、任意選択でＺ１はアセチルであり、Ｚ２は第一級アミドである。Ｚ１はアセチルであり得、Ｚ２は第一級アミドであり得、−（Ｌ）ｎ［ＩＭ］部位は、ｃＭＢＰのリシン残基のε−アミン側鎖に結合し得る。
【００２７】
本発明のｃＭＢＰペプチドは、ｃＭｅｔ／ＨＧＦ複合体に対するｃＭｅｔの結合についてのＫＤが約１０ｎＭ未満（蛍光偏光アッセイ測定に基づく）であり得、最も典型的には１〜５ｎＭの範囲であり、３ｎＭ未満が理想的である。
【００２８】
式ＩのｃＭＢＰの下記ペプチド配列（配列番号１）は、１７量体ペプチド配列であり、主にｃＭｅｔへの選択的結合に関与する：
Ｃｙｓａ−Ｘａａ１−Ｃｙｓｃ−Ｘａａ２−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘａａ３−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓｄ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓｂ−Ｔｙｒ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６
（配列番号１）。
本発明のｃＭＢＰペプチドが１７個を超えるアミノ酸残基を含むとき、残りのアミノ酸は、システイン以外の任意のアミノ酸であり得る。追加の無保護システイン残基は、定義したＣｙｓａ−ＣｙｓｂおよびＣｙｓｃ−Ｃｙｓｄジスルフィド架橋の不要なスクランブリングを引き起こす可能性がある。追加のペプチドは、好ましくは、−（Ｌ）ｎ［ＩＭ］部位の容易なコンジュゲーションに適した側鎖を有する少なくとも１個のアミノ酸残基を含む。そのような適切な残基としては、アミン官能化−（Ｌ）ｎ［ＩＭ］基とのコンジュゲーション用のＡｓｐもしくはＧＩｕ残基、またはカルボキシ官能化もしくは活性エステル官能化−（Ｌ）ｎ［ＩＭ］基とのコンジュゲーション用のＬｙｓ残基が挙げられる。−（Ｌ）ｎ［ＩＭ］のコンジュゲーション用のアミノ酸残基は、適切には、ｃＭＢＰペプチドの１７量体結合領域（配列番号１）から離れて位置しており、任意選択で、Ｃ−末端またはＮ−末端に位置している。任意選択で、コンジュゲーション用のアミノ酸残基はＬｙｓ残基である。
【００２９】
配列番号１のトリプトファン残基の置換を、既知アミノ酸置換体であるフェニルアラニンおよびナフチルアラニンで評価した。しかし、ｃＭｅｔ親和性の喪失が見出され、これはトリプトファン残基が活性にとって重要であることを示唆している。任意選択で、ｃＭＢＰペプチドはさらにＮ末端セリン残基を含み、下記の１８量体（配列番号２）を与える：
Ｓｅｒ−Ｃｙｓａ−Ｘａａ１−Ｃｙｓｃ−Ｘａａ２−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘａａ３−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓｄ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓｂ−Ｔｙｒ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６。
（配列番号２）
【００３０】
配列番号１、または配列番号２に加えて、ｃＭＢＰは、下記のいずれかをさらに含み得る：
（ｉ）ｃＭＢＰペプチドのＣ−またはＮ−ペプチド末端のいずれかの４個のアミノ酸残基内にあるＡｓｐもしくはＧｌｕ残基、またはそれらの類似体（−（Ｌ）ｎ［ＩＭ］はアミン基で官能化されており、このアミン基は前記ＡｓｐもしくはＧｌｕ残基、またはそれらの類似体のカルボキシル側鎖にコンジュゲートしてアミド結合を与えている）；
（ｉｉ）ｃＭＢＰペプチドのＣ−またはＮ−ペプチド末端のいずれかの４個のアミノ酸残基内にあるＬｙｓ残基、またはその類似体（−（Ｌ）ｎ［ＩＭ］はカルボキシル基で官能化されており、このカルボキシル基は前記Ｌｙｓ残基、またはその類似体のε−アミン側鎖にコンジュゲートしてアミド結合を与えている）。
【００３１】
Ａｓｐおよび／またはＧｌｕの類似体には、２−アミノブタン二酸、２−アミノヘキサン二酸、２−アミノヘプタン二酸、２−アミノオクタン二酸、２−アミノノナン二酸、２−アミノデカン二酸、２−アミノウンデカン二酸、および２−アミノドデカン二酸のうちの１種または複数種が挙げられ得る。
【００３２】
Ｌｙｓの類似体には、２，３−ジアミノプロパン酸、２，４−ジアミノブタン酸、２，５−ジアミノペンタン酸、２，７−ジアミノヘプタン酸、２，８−ジアミノオクタン酸、２，９−ジアミノノナン酸、２，１０−ジアミノデカン酸、２，１１−ジアミノウンデカン酸、２，１２−ジアミノドデカン酸のうちの１種または複数種が挙げられ得る。
【００３３】
ｃＭＢＰペプチドは、下記の２２量体アミノ酸配列（配列番号３）を含み得る：
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓａ−Ｘａａ１−Ｃｙｓｃ−Ｘａａ２−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘａａ３−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓｄ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓｂ−Ｔｙｒ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ。
（配列番号３）
【００３４】
ｃＭＢＰペプチドは、Ｘａａ３がＡｒｇに等しいものであり得る。
【００３５】
ｃＭＢＰペプチドは、配列番号１、配列番号２または配列番号３に加えて、Ｎ−またはＣ−末端のいずれかにおいて、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−（配列番号４）、−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−（配列番号５）または−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−（配列番号６）から選択されるリンカーペプチドをさらに含み得る。
【００３６】
リンカーペプチドのＬｙｓ残基は、−（Ｌ）ｎ［ＩＭ］部位のコンジュゲーションの典型的な位置である。いくつかのｃＭＢＰペプチドは、配列番号４のリンカーペプチドとともに配列番号３を含み、下記の２６量体アミノ酸配列（配列番号７）を有している：
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓａ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓｃ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓｄ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓｂ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ。
（配列番号７）
【００３７】
配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号７のｃＭＢＰペプチドでは、Ｚ１＝Ｚ２＝ＭＩＧであり得、Ｚ１＝アセチルおよびＺ２＝第一級アミドであり得る。
【００３８】
適切には、−（Ｌ）ｎ［ＩＭ］部位は、Ｚ１もしくはＺ２基のいずれか、または配列番号１のｃＭｅｔ結合配列とは異なるｃＭＢＰペプチドのアミノ酸残基に結合している。可能なアミノ酸残基およびコンジュゲーション部位は、上述した通りである。−（Ｌ）ｎ［ＩＭ］部位がＺ１またはＺ２に結合するとき、それはＮ−もしくはＣ−末端へのコンジュゲーションによってＺ１またはＺ２に取って代わり、そのようにしてｉｎ  ｖｉｖｏ代謝を阻止することができる。
【００３９】
典型的なＩＭ基は、広範な非局在化電子系を有し、例えば  シアニン類、メロシアニン類、インドシアニン類、フタロシアニン類、ナフタロシアニン類、トリフェニルメチン類、ポルフィリン類、ピリリウム染料、チアピリリウム染料、スクアリリウム染料、クロコニウム染料、アズレニウム染料、インドアニリン類、ベンゾフェノキサジニウム染料、ベンゾチアフェノチアジニウム染料、アントラキノン類、ナフトキノン類、インダスレン類、フタロイルアクリドン類、トリスフェノキノン類、アゾ染料、分子内および分子間電荷移動染料および染料錯体、トロポン類、テトラジン類、ビス（ジチオレン）錯体、ビス（ベンゼン−ジチオレート）錯体、ヨードアニリン染料、ビス（Ｓ，Ｏ−ジチオレン）錯体が挙げられる。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光タンパク質、および異なる吸収／発光特性を有するＧＦＰの修飾物も有用である。特定の希土類金属（例えば、ユーロピウム、サマリウム、テルビウムまたはジスプロシウム）の錯体は、蛍光ナノ結晶（量子ドット）と同様に、特定の状況で使用される。
【００４０】
使用され得る発色団の例には、下記のものが挙げられる：Ａｔｔｏ  ６４７、ＣＦ６４０Ｒ、Ａｔｔｏ  ６４７Ｎ、ＳｉＲ６５０、ＣＦ６３３、Ｓｕｌｆｏ  Ｃｙ５、Ｔ７００−Ｈ、Ｔ７００−Ｆ、ＣＦ６４７  ＳＥ、Ｑｕａｓａｒ  ６７０、Ｃｈｒｏｍｅｏ  ６４２、Ｏｙｓｔｅｒ  ６４５、Ｏｙｓｔｅｒ  ６４７、Ｏｙｓｔｅｒ  ６５０、Ｉｒｉｓ  ５、ＣｙＡＬ  ５、ＩＲＤｙｅ  ６５０、ＮＩＲ４、ＡＯＩ９８７、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６５０／６６５、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６３３、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６５０、ＤＤＡＯ（７−ヒドロキシ−９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）、Ｃｈｒｏｍｉｓ  ６４５  Ｃ、Ｃｈｒｏｍｉｓ  ６４５  Ｚ、Ｃｈｒｏｍｉｓ  ６４５  Ａ、ＨｉＬｙｔｅ  ６４７、ＰｒｏｍｏＦｌｕｏｒ  ６４７Ｐ、Ｄｙ−６３０、Ｄｙ−６３１、Ｄｙ−６３２、Ｄｙ−６３３、Ｄｙ−６３６、Ｄｙ−６５０、Ｄｙ−６５１、Ｄｙ−６５２、Ｄｙ−６５４、Ｔｒａｃｙ  ６４５、Ｔｒａｃｙ  ６５２、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｒｅｄ ＮＩＲ  ７８２、Ａｔｔｏ  ６５５、Ａｔｔｏ  ６８０、ＣＦ６６０  Ｃ、ＣＦ６６０  Ｒ、Ｑｕａｓａｒ  ７０５、ＣＦ６８０、ＩＲＤｙｅ６８０ＲＤ、ＮＩＲ２、ＩＲＤｙｅ６８０ＬＴ、ＨｉＬｙｔｅ  ６８０、ＩＲＤｙｅ７００ＤＸ、Ｏｙｓｔｅｒ  ６８０、Ｉｒｉｓ  ５．５、ＨＲＯＭＩＳ  ＬＳＳ  ６７０Ｚ、ＣＨＲＯＭＩＳ  ＬＳＳ  ６９０Ｚ、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６８０（Ｐｉｅｒｃｅ）、マグネシウムフタロシアニン、Ｏｘａｚｉｎ  ７５０、ＳｅＴａ−６６５、ＳｅＴａ−６６７、ＳｅＴａ−６７０、ＰｒｏｍｏＦｌｕｏｒ  ６７０（Ｐｒｏｍｏ  Ｋｉｎｅ）、Ｄｙ−６８２、ＰｒｏｍｏＦｌｕｏｒ  ６８０、ＰｒｏｍｏＦｌｕｏｒ  ７００Ｐ、Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｂｌｕｅ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｒｅｄ  ＮＩＲ  ７３０  Ｒｅａｃｔｉｖｅ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｒｅｄ  ＮＩＲ  ７８１  Ｒｅａｃｔｉｖｅ、ＢＭ１０４、ＢＭ１０５（ＢＭ１０４のＮＨＳエステル）、ＳｉＲ７２０、Ａｔｔｏ  ７４０、ＣＦ７５０、Ｓｕｌｆｏ  Ｃｙ７、ＩＲＤｙｅ７５０、ＮＩＲ３、ＤｙＬｉｇｈｔ  ７５５、ＤＹ−７３２、ＤＹ−７３４、ＤＹ−７５２、ＰｒｏｍｏＦｌｕｏｒ  ７５０  Ｐ、ＨｉＬｙｔｅ  ７５０、ＤＹ−７７６、ＮＩＲ１、ＩＲＤｙｅ８００ＲＳ、ＰｒｏｍｏＦｌｕｏｒ  ７７０  Ｐ、ＤＹ−７７８、ＣＨＲＯＭＩＳ  ７７０  Ｃ、ＺＷ８００−１、ＺＷ８００−３、ＩＲＩＳ  ７Ｇ−ＷＳ、ＩＲ  ７８０、ＥＳＮＦ３１、ＣＦ７７０、Ｖｉｖｏｔａｇ  ８００、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７９０、ＣＦ７９０、Ｏｙｓｔｅｒ  ８００、ＣＨＲＯＭＩＳ  ７７０  Ａ、ＣＨＲＯＭＩＳ  ８００  Ｃ、ＣＨＲＯＭＩＳ  ８００  Ａ、ＣＨＲＯＭＩＳ  ８３０  Ｃ、ＣＨＲＯＭＩＳ  ８３０  Ａ、ＤｙＬｉｇｈｔ  ８００、ＤＹ−７７７、ＤＹ−７８２、ＤＹ−８００、ＰｒｏｍｏＦｌｕｏｒ  ７８０  Ｐ、ＮＩＲ−７９７、ＰｒｏｍｏＦｌｕｏｒ  ８４０  Ｐ、フルオレセイン、スルフォルホダミン１０１（テキサスレッド）、ローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ローダミン１９、インドシアニングリーン、Ｃｙ２、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ���Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５１４、ＴＡＭＲＡ（テトラメチルローダミン）、ＴＭＲ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０。典型的には、シアニン染料ならびにそれらの誘導体および類似体が使用され得る。
【００４１】
使用され得る発色団の特定の例には、下記のものが挙げられる：Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、Ａｔｔｏ  ６４７、ＣＦ６４０Ｒ、Ａｔｔｏ  ６４７Ｎ、ＳｉＲ６５０、ＣＦ６３３、Ｓｕｌｆｏ  Ｃｙ５、Ｔ７００−Ｈ、Ｔ７００−Ｆ、ＣＦ６４７  ＳＥ、Ｑｕａｓａｒ  ６７０、Ｃｈｒｏｍｅｏ  ６４２、Ｏｙｓｔｅｒ  ６４５、Ｏｙｓｔｅｒ  ６４７、Ｏｙｓｔｅｒ  ６５０、Ｉｒｉｓ  ５、ＣｙＡＬ  ５、ＩＲＤｙｅ  ６５０、ＮＩＲ４、ＡＯＩ９８７、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６５０／６６５、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６３３、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６５０、ＤＤＡＯ（７−ヒドロキシ−９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）、Ｃｈｒｏｍｉｓ  ６４５  Ｃ、Ｃｈｒｏｍｉｓ  ６４５  Ｚ、Ｃｈｒｏｍｉｓ  ６４５  Ａ、ＨｉＬｙｔｅ  ６４７、ＰｒｏｍｏＦｌｕｏｒ  ６４７Ｐ、Ｄｙ−６３０、Ｄｙ−６３１、Ｄｙ−６３２、Ｄｙ−６３３、Ｄｙ−６３６、Ｄｙ−６５０、Ｄｙ−６５１、Ｄｙ−６５２、Ｄｙ−６５４、Ｔｒａｃｙ  ６４５、Ｔｒａｃｙ  ６５２、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｒｅｄ ＮＩＲ  ７８２、Ａｔｔｏ  ６５５、Ａｔｔｏ  ６８０、ＣＦ６６０  Ｃ、ＣＦ６６０  Ｒ、Ｑｕａｓａｒ  ７０５、ＣＦ６８０、ＩＲＤｙｅ６８０ＲＤ、ＮＩＲ２、ＩＲＤｙｅ６８０ＬＴ、ＨｉＬｙｔｅ  ６８０、ＩＲＤｙｅ７００ＤＸ、Ｏｙｓｔｅｒ  ６８０、Ｉｒｉｓ  ５．５、ＨＲＯＭＩＳ  ＬＳＳ  ６７０Ｚ、ＣＨＲＯＭＩＳ  ＬＳＳ  ６９０Ｚ、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６８０（Ｐｉｅｒｃｅ）、マグネシウムフタロシアニン、Ｏｘａｚｉｎ  ７５０、ＳｅＴａ−６６５、ＳｅＴａ−６６７、ＳｅＴａ−６７０、ＰｒｏｍｏＦｌｕｏｒ  ６７０（Ｐｒｏｍｏ  Ｋｉｎｅ）、Ｄｙ−６８２、ＰｒｏｍｏＦｌｕｏｒ  ６８０、ＰｒｏｍｏＦｌｕｏｒ  ７００Ｐ、Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｂｌｕｅ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｒｅｄ  ＮＩＲ  ７３０  Ｒｅａｃｔｉｖｅ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｒｅｄ  ＮＩＲ  ７８１  Ｒｅａｃｔｉｖｅ、ＢＭ１０４、ＢＭ１０５（ＢＭ１０４のＮＨＳエステル）、ＳｉＲ７２０、Ａｔｔｏ  ７４０、ＣＦ７５０、Ｓｕｌｆｏ  Ｃｙ７、ＩＲＤｙｅ７５０、ＮＩＲ３、ＤｙＬｉｇｈｔ  ７５５、ＤＹ−７３２、ＤＹ−７３４、ＤＹ−７５２、ＰｒｏｍｏＦｌｕｏｒ  ７５０  Ｐ、ＨｉＬｙｔｅ  ７５０、ＤＹ−７７６、ＮＩＲ１、ＩＲＤｙｅ８００ＲＳ、ＰｒｏｍｏＦｌｕｏｒ  ７７０  Ｐ、ＤＹ−７７８、ＣＨＲＯＭＩＳ  ７７０  Ｃ、ＺＷ８００−１、ＺＷ８００−３、ＩＲＩＳ  ７Ｇ−ＷＳ、ＩＲ  ７８０、ＥＳＮＦ３１、ＣＦ７７０、Ｖｉｖｏｔａｇ  ８００、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７９０、ＣＦ７９０、Ｏｙｓｔｅｒ  ８００、ＣＨＲＯＭＩＳ  ７７０  Ａ、ＣＨＲＯＭＩＳ  ８００  Ｃ、ＣＨＲＯＭＩＳ  ８００  Ａ、ＣＨＲＯＭＩＳ  ８３０  Ｃ、ＣＨＲＯＭＩＳ  ８３０  Ａ、ＤｙＬｉｇｈｔ  ８００、ＤＹ−７７７、ＤＹ−７８２、ＤＹ−８００、ＰｒｏｍｏＦｌｕｏｒ  ７８０  Ｐ、ＮＩＲ−７９７、ＰｒｏｍｏＦｌｕｏｒ  ８４０  Ｐおよびインド��アニングリーン。Ｌｉｃｈａらは、ｉｎ  ｖｉｖｏ光学イメージングのための染料および染料コンジュゲートをレビューしている［Ｔｏｐｉｃｓ  Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．，  ２２２，  １−２９  （２００２）；  Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，  ５７，  １０８７−１１０８  （２００５）］。
【００４２】
使用され得る発色団のさらに特定の例には、下記のものが挙げられる：Ｃｙ５、Ｃｙ５＊＊、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）  ６３０、Ａｔｔｏ  ６４７、Ｏｙｓｔｅｒ  ６４７、ＩＲＤｙｅ６５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）  ６５０、ＤＹ６３１、ＤＹ６３２、Ｃｙ５．５、ＩＲＤｙｅ  ６８０ＲＤ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０。
【００４３】
シアニン染料は、式ＩＩのフルオロフォアであり得る：
【化３】
2021519300.tif 000005
（式中、  
各Ｘ’は、独立して、−Ｃ（ＣＨ３）２−、−Ｓ−、−Ｏ−または  
−Ｃ［（ＣＨ２）ａＣＨ３］［（ＣＨ２）ｂＭ］−から選択される（ａは値０〜５の整数であり、ｂは値１〜５の整数であり、ＭはＧ基であるか、ＳＯ３Ｍ１またはＨから選択される）；
各Ｙ’は、独立して、Ｈ、−ＣＨ２ＮＨ２、−ＳＯ３Ｍ１、−ＣＨ２ＣＯＯＭ１、−ＮＣＳおよびＦからなる群より選択される１〜４個の基を表し、Ｙ’基は、芳香環の任意の位置に位置している；
Ｑ’は、独立して、Ｈ、ＳＯ３Ｍ１、ＮＨ２、ＣＯＯＭ１、アンモニウム、エステル基、ベンジルおよびＧ基からなる群より選択される；
Ｍ１は、ＨまたはＢｃである；
Ｉは１〜３の整数である；
ｍは１〜５の整数である；
Ｘ’、Ｙ’およびＱ’のうちの少なくとも１つは、Ｇ基を含む；
Ｇは、ｃＭＢＰペプチドに結合するのに適した反応性または官能性基である）。
【００４４】
Ｇ基は、ｃＭＢＰペプチドの相補的な基と反応して、シアニン染料フルオロフォアとｃＭＢＰペプチドとの間に共有結合を形成する。Ｇは、ペプチドの相補的な官能基と反応し得る反応基であり得るか、あるいは、ｃＭＢＰペプチドの反応基と反応し得る官能基を含み得る。反応基および官能基の例には、活性エステル；イソチオシアネート；マレイミド；ハロアセトアミド；酸ハロゲン化物；ヒドラジド；ビニルスルホン；ジクロロトリアジン；ホスホラミダイト；ヒドロキシル；アミノ；スルフヒドリル；カルボニル；カルボン酸およびチオホスフェートが挙げられる。Ｇは、活性エステルであり得る。
【００４５】
用語「活性化エステル」または「活性エステル」は、良好な離脱基を含み、したがってアミンなどの求核剤と一層容易に反応するように設計された、関連するカルボン酸のエステル誘導体を意味する。適切な活性エステルの例は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、スルホスクシンイミジルエステル、ペンタフルオロフェノール、ペンタフルオロチオフェノール、パラニトロフェノール、ヒドロキシベンゾトリアゾールおよびＰｙＢＯＰ（すなわち、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）である。活性エステルは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドまたはペンタフルオロフェノールエステルであり得、特にＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであり得る。
【００４６】
式ＩＩの一実施形態：
各Ｘ’は、−Ｃ（ＣＨ３）２−および−Ｃ（ＣＨ３）［（ＣＨ２）４Ｍ］−（Ｍは、Ｇ基または−ＳＯ３Ｍ１である）からなる群より選択される；
各Ｙ’は、ＳＯ３Ｍ１、Ｈまたは１〜４個のＦ原子を表す；
各Ｑ’は、Ｇ基およびＳＯ３Ｍ１から選択される；
１は好ましくは２であり、ｍは好ましくは３、４または５である；
Ｘ’またはＱ’のいずれかがＧ基であるとき、それはスクシンイミジルエステルであり得る。
【００４７】
シアニン染料は、式ＩＩＩのものであり得る：
【化４】
2021519300.tif 000006
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、ＨまたはＳＯ３Ｍ１であり、Ｒ１およびＲ２のうちの少なくとも１つはＳＯ３Ｍ１（Ｍ１はＨまたはＢｃである）である；
Ｒ３およびＲ４は、独立して、Ｃ１−４アルキルまたはＣ１−６カルボキシアルキルである；
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立してＲａ基である（Ｒａは、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−６カルボキシアルキルまたは−（ＣＨ２）ｋＳＯ３Ｍ１（ｋは、値３または４の整数である）である）；
ただし、シアニン染料は、Ｒ１、Ｒ２およびＲａ基に合計１〜４個のＳＯ３Ｍ１置換基を有することを条件とする）。
【００４８】
式ＩＩＩの染料は、ｃＭＢＰへのコンジュゲーションを容易にするために、少なくとも１つのＣ１−６カルボキシアルキル基が存在するように選択され得る。
【００４９】
可能な式ＩＩＩの個々の染料を、表１に要約する：
【表１】
2021519300.tif 000007
【００５０】
典型的に使用される式ＩＩの染料は、Ｃｙ５＊＊およびＡｌｅｘａ６４７であり、Ｃｙ５＊＊が最も典型的である。
【００５１】
合成リンカー基（Ｌ）が存在するとき、それは、［ＩＭ］およびＺ１−［ｃＭＢＰ］−Ｚ２へのコンジュゲーションを容易にする末端官能基を含み得る。Ｌが１〜１０個のアミノ酸残基のペプチド鎖を含むとき、アミノ酸残基は、グリシン、リシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはセリンから選択され得る。ＬがＰＥＧ部位を含むとき、それは、下記の式ＩＡ（１７−アミノ−５−オキソ−６−アザ−３，９，１２，１５−テトラオキサヘプタデカン酸）またはＩＢの単分散ＰＥＧ様構造のオリゴマー化に由来する単位を含み得る：
【化５】
2021519300.tif 000008
（式中、ｐは１〜１０の整数である）。あるいは、式ＩＢのプロピオン酸誘導体に基づくＰＥＧ様構造を使用することもできる：
【化６】
2021519300.tif 000009
（式中、ｐは式ＩＡに関して定義した通りであり、ｑは３〜１５の整数である。式ＩＢにおいて、ｐは１または２であり得、ｑは５〜１２であり得る。
【００５２】
リンカー基がＰＥＧまたはペプチド鎖を含まないとき、Ｌ基は、２〜１０個の原子、最も好ましくは２〜５個の原子からなり、２〜３個の原子であることが特に好ましい−（Ａ）ｍ−部位を構成する連結原子の主鎖を有し得る。最小リンカー基主鎖が２原子であると、イメージング部位が十分に離れているため、望ましくない相互作用が最小限に抑えられるという利点が得られる。
【００５３】
式Ｉにおいて、ｎは０または１であり得、典型的には０であり、すなわちリンカー基は存在しない。
【００５４】
本明細書に記載されるようなイメージング剤は、式ＩＶ（配列番号７を含む）のものであり得る。
【化７】
2021519300.tif 000010
（式中、（Ｌ）ｎ［ＩＭ］基は、Ｌｙｓ残基のε−アミノ基に結合している。式ＩＶのイメージング剤は、Ｍ（Ｎ末端Ａｌａ）がアセチルに等しく、ＭＩＧ（Ｃ末端Ｌｙｓ）が第一級アミドに等しいものであり得る。式ＩＶにおいて、ｎはゼロであり得、ＩＭはシアニン染料、典型的には式ＩＩのシアニン染料であり得る。ＩＭ＝Ｃｙ５＊＊またはＡｌｅｘａ６４７、最も典型的にはＣｙ５＊＊を有する式ＩＶのイメージング剤が使用され得る。
【００５５】
式Ｚ１−［ｃＭＢＰ］−Ｚ２のペプチドは、下記工程を含む調製方法によって得ることができる：
（ｉ）所望のｃＭＢＰペプチドと同じペプチド配列を有し、ＣｙｓａおよびＣｙｓｂが保護されておらず、ＣｙｓｃおよびＣｙｓｄ残基がチオール保護基を有する直鎖ペプチドの固相ペプチド合成を行う工程と；
（ｉｉ）固体支持体からの開裂および工程（ｉ）のペプチドを溶液中の水性塩基で処理し、ＣｙｓａおよびＣｙｓｂを連結する第１ジスルフィド結合を有する単環ペプチドを得る工程と；
（ｉｉｉ）ＣｙｓｃおよびＣｙｓｄチオール保護基を除去して環化し、ＣｙｓｃおよびＣｙｓｄを連結する第２ジスルフィド結合を形成したものが、所望の二環式ペプチド生成物Ｚ１−［ｃＭＢＰ］−Ｚ２となる工程。
【００５６】
用語「保護基」は、望ましくない化学反応を阻害または抑制する基を意味するが、それは、分子の残りの部分を変質させない程度に温和な条件下で、問題の官能基から開裂させることができるほど十分に反応性があるように設計されている。脱保護後、所望の生成物が得られる。アミン保護基は、当業者にはよく知られており、適切には下記のものから選択される：Ｂｏｃ（Ｂｏｃはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルである）、Ｆｍｏｃ（Ｆｍｏｃはフルオレニルメトキシカルボニルである）、トリフルオロアセチル、アリルオキシカルボニル、Ｄｄｅ［すなわち、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）エチル］またはＮｐｙｓ（すなわち、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル）。適切なチオール保護基は、Ｔｒｔ（トリチル）、Ａｃｍ（アセトアミドメチル）、ｔ−Ｂｕ（ｔｅｒｔ−ブチル）、ｔｅｒｔ−ブチルチオ、メトキシベンジル、メチルベンジルまたはＮｐｙｓ（３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル）である。さらなる保護基の使用は、’Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ’，  Ｔｈｅｏｒｏｄｏｒａ  Ｗ．  Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒ  Ｇ．  Ｍ．  Ｗｕｔｓ，  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  １９９１）に記載されている。典型的なアミン保護基は、ＢｏｃおよびＦｍｏｃであり、最も典型的にはＢｏｃである。他の典型的なチオール保護基は、ＴｒｔおよびＡｃｍである。
【００５７】
実施例１および２は、さらに具体的な詳細を提供する。固相ペプチド合成のさらなる詳細は、Ｐ．  Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｆ．  Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ  ａｎｄ  Ｅ．  Ｇｉｒａｌｄ；  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９７に記載されている。ｃＭＢＰペプチドは、不活性雰囲気下で貯蔵し、冷凍庫で保存するのが最適である。溶液中で使用するとき、ジスルフィド架橋のスクランブリングのリスクがあるため、７より高いｐＨを避けるのが最善であり、ペプチドの凝集を誘発するため、低ｐＨを避けるのが最善である。
【００５８】
第１の態様のイメージング剤の一般的な調製方法は、工程（ｉ）〜（ｉｖ）のうちの１つを含む：
（ｉ）式Ｚ１−［ｃＭＢＰ］−Ｚ２のｃＭＢＰペプチド（式中、Ｚ１はＨであり、Ｚ２はＭＩＧである）と式Ｙ１−（Ｌ）ｎ−［ＩＭ］の化合物とを反応させて、Ｚ１の位置に［ＩＭ］がコンジュゲートしている式Ｉのイメージング剤を得る工程；
（ｉｉ）式Ｚ１−［ｃＭＢＰ］−Ｚ２のｃＭＢＰペプチド（式中、Ｚ１＝Ｚ２＝ＭＩＧであり、ｃＭＢＰは、Ｃ−またはＮ−ｃＭＢＰペプチド末端のいずれかの４個のアミノ酸残基内にＡｓｐもしくはＧｌｕ残基を含み、ｃＭＢＰペプチドの他の全てのＡｓｐ／Ｇｌｕ残基は保護されている）と式Ｙ２−（Ｌ）ｎ−［ＩＭ］の化合物とを反応させて、［ＩＭ］がｃＭＢＰペプチドの前記ＡｓｐまたはＧＩｕ残基にコンジュゲートしている式Ｉのイメージング剤を得る工程；
（ｉｉｉ）式Ｚ１−［ｃＭＢＰ］−Ｚ３のｃＭＢＰペプチド（式中、Ｚ１はＭＩＧであり、Ｚ３はＺ２基または活性化エステルであり、ｃＭＢＰペプチドの他の全てのＡｓｐ／Ｇｌｕ残基は保護されている）と式Ｙ２−（Ｌ）ｎ−［ＩＭ］の化合物とを反応させて、［ＩＭ］がＺ２の位置でコンジュゲートしている式Ｉのイメージング剤を得る工程；
（ｉｖ）式Ｚ１−［ｃＭＢＰ］−Ｚ２のｃＭＢＰペプチド（式中、Ｚ１＝Ｚ２＝ＭＩＧであり、ｃＭＢＰは、Ｃ−またはＮ−ｃＭＢＰペプチド末端のいずれかの４個のアミノ酸残基内にＬｙｓを含む）と式Ｙ１−（Ｌ）ｎ−［ＩＭ］の化合物とを反応させて、［ＩＭ］がｃＭＢＰペプチドのＬｙｓ残基にコンジュゲートしている式Ｉのイメージング剤を得る工程
（Ｚ、ｃＭＢＰ、Ｚ、Ｍ、Ｌ、ｎおよびＩＭは上記で定義した通りであり、Ｚ３はＺ２基または活性化エステルである；
Ｙ１は、カルボン酸、活性化エステル、イソチオシアネートまたはチオシアネート基である；
Ｙ２はアミン基である）。
【００５９】
用語「活性化エステル」または「活性エステル」およびそれらの実施形態は、上述した通りである。Ｙ２は、任意選択で第一級アミン基または第二級アミン基であり、典型的には第一級アミン基である。
【００６０】
化合物Ｚ１−［ｃＭＢＰ］−Ｚ２は、Ｚ１およびＺ２の両方がＭＩＧに等しいものであり得る。典型的なｃＭＢＰペプチドおよびＺ１／Ｚ２基は、上述した通りである。特に、上述の典型的なｃＭＢＰペプチドについて記載したようにコンジュゲーションを容易にするために、ｃＭＢＰペプチドがＡｓｐ、ＧＩｕまたはＬｙｓ残基を含むことが典型的である。工程（ｉｖ）に記載したように、ｃＭＢＰペプチドがＬｙｓ残基を含むことが最も典型的である。
【００６１】
Ｚ１−［ｃＭＢＰ］−Ｚ２の調製は、上述した通りである。Ｚ３が活性エステルであるＺ１−［ｃＭＢＰ］−Ｚ３ペプチドは、Ｚ２がＯＨまたは生体適合性カチオン（Ｂｃ）であるＺ１−［ｃＭＢＰ］−Ｚ２から、従来方法によって調製することができる。
【００６２】
ペプチドへのコンジュゲーションに適するように官能化された光学レポーター染料（ＩＭ）は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ａｔｔｏ−Ｔｅｃ、Ｄｙｏｍｉｃｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓなどから市販されている。そのような染料のほとんどは、ＮＨＳエステルとして入手可能である。
【００６３】
適切な光学レポーター（ＩＭ）、特に染料をアミノ酸およびペプチドにコンジュゲートさせる方法は、Ｌｉｃｈａ（上記参照）、ならびにＦｌａｎａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ  ［Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，  ８，  ７５１−７５６  （１９９７）］；Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ，  ［ｉｂｉｄ，  １３，  ６０５−６１０  （２００２）］およびＺａｈｅｅｒ  ［Ｍｏｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ，  １（４），  ３５４−３６４  （２００２）］によって記載されている。リンカー基（Ｌ）をｃＭＢＰペプチドにコンジュゲートさせる方法は、染料単独の場合（上記参照）と類似の化学作用を使用するものであり、当技術分野で知られている。
【００６４】
配列番号１に加えて、ｃＭＢＰはさらに、Ｃ−またはＮ−ｃＭＢＰペプチド末端のいずれかの４個のアミノ酸残基内にＡｓｐまたはＧｌｕ残基を含んでいてもよく、−（Ｌ）ｎＩＭはアミン基で官能化されていてもよく、このアミン基が前記ＡｓｐまたはＧｌｕ残基のカルボキシル側鎖にコンジュゲートしてアミド結合を与えている。
【００６５】
配列番号１に加えて、ｃＭＢＰは、Ｃ−またはＮ−ｃＭＢＰペプチド末端のいずれかの４個のアミノ酸残基内にＬｙｓ残基を含んでいてもよく、−（Ｌ）ｎＩＭはカルボキシル基で官能化されていてもよく、このカルボキシル基が前記Ｌｙｓ残基のε−アミン側鎖にコンジュゲートしてアミド結合を与えている。
【００６６】
ｃＭＢＰは、下記の配列番号２または配列番号３のいずれかのアミノ酸配列を含み得る：
Ｓｅｒ−Ｃｙｓａ−Ｘａａ１−Ｃｙｓｃ−Ｘａａ２−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘａａ３−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓｄ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓｂ−Ｔｙｒ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６（配列番号２）；
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓａ−Ｘａａ１−Ｃｙｓｃ−Ｘａａ２−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘａａ３−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓｄ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓｂ−Ｔｙｒ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（配列番号３）。
【００６７】
Ｘａａ３はＡｒｇであり得る。
【００６８】
配列番号１、配列番号２または配列番号３に加えて、ｃＭＢＰはさらに、そのＮ−またはＣ−末端のいずれかに、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（配列番号４）、−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−（配列番号５）および−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ（配列番号６）から選択されるリンカーペプチドを含み得る。
【００６９】
ｃＭＢＰは、下記のアミノ酸配列（配列番号７）を含み得る：
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓａ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓｃ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓｄ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓｂ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ。
【００７０】
Ｚ１およびＺ２の両方とも、独立してＭＩＧであり得る。
【００７１】
Ｚ１はアセチルであり得、Ｚ２は第一級アミドであり得る。
【００７２】
ｎは０であり得る。
【００７３】
ＩＭは、６００〜１，０００ｎｍの範囲の最大吸光度を有する染料であり得る。
【００７４】
ＩＭはシアニン染料であり得る。
【００７５】
シアニン染料は、式ＩＩＩを有し得る：
【化８】
2021519300.tif 000011
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、ＨまたはＳＯ３Ｍ１であり、Ｒ１およびＲ２のうちの少なくとも１つはＳＯ３Ｍ１（Ｍ１はＨまたはＢｃである）である；
Ｒ３およびＲ４は、独立して、Ｃ１−４アルキルまたはＣ１−６カルボキシアルキルである；
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立してＲａ基である（Ｒａは、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−６カルボキシアルキルまたは−（ＣＨ２）ｋＳＯ３Ｍ１（ｋは、値３または４の整数である）である）；
ただし、シアニン染料は、Ｒ１、Ｒ２およびＲａ基に合計１〜４個のＳＯ３Ｍ１置換基を有することを条件とする）。
【００７６】
ｃＭＢＰは、下記のアミノ酸配列（配列番号７）を有し得る：
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓａ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓｃ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓｄ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓｂ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ；
Ｚ１はアセチルであり得、Ｚ２は第一級アミドであり得る；
ＩＭは、６００〜１，０００ｎｍの範囲の最大吸光度を有する染料であり得、任意選択でシアニン染料であり、任意選択で式ＩＩを有するシアニン染料であり得る：
【化９】
2021519300.tif 000012
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、ＨまたはＳＯ３Ｍ１であり、Ｒ１およびＲ２のうちの少なくとも１つはＳＯ３Ｍ１（Ｍ１はＨまたはＢｃである）である；
Ｒ３およびＲ４は、独立して、Ｃ１−４アルキルまたはＣ１−６カルボキシアルキルである；
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立してＲａ基である（Ｒａは、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−６カルボキシアルキルまたは−（ＣＨ２）ｋＳＯ３Ｍ１（ｋは、値３または４の整数である）である）；
ただし、シアニン染料は、Ｒ１、Ｒ２およびＲａ基に合計１〜４個のＳＯ３Ｍ１置換基を有することを条件とする）。
【００７７】
復元したときに、製剤は、約ｐＨ６．３〜約ｐＨ９の間、任意選択で約ｐＨ６．３〜約ｐＨ９の間、任意選択で約ｐＨ６．５〜約ｐＨ８．５の間、任意選択で約ｐＨ６．８〜約ｐＨ８．２の間、任意選択で約ｐＨ６．８〜約ｐＨ８の間、任意選択で約ｐＨ７〜約ｐＨ８の間のｐＨを有し得る。
【００７８】
復元したときに、緩衝剤は、約ｐＨ６．３〜約ｐＨ９の間、任意選択で約ｐＨ６．３〜約ｐＨ９の間、任意選択で約ｐＨ６．５〜約ｐＨ８．５の間、任意選択で約ｐＨ６．８〜約ｐＨ８．２の間、任意選択で約ｐＨ６．８〜約ｐＨ８の間、任意選択で約ｐＨ７〜約ｐＨ８の間のｐＨを有する溶液を提供する量で存在し得る。
【００７９】
ＡＰＩ：緩衝剤のモル比は、ＡＰＩ約１モル：緩衝剤約１７〜約４７モルであり得る。ＡＰＩ：緩衝剤のモル比は、ＡＰＩ約１モル：緩衝剤約２７〜約４７モルであり得る。ＡＰＩ：緩衝剤のモル比は、ＡＰＩ約１モル：緩衝剤約３０〜約４７モルであり得る。ＡＰＩ：緩衝剤のモル比は、ＡＰＩ約１モル：緩衝剤約３４〜約４７モルであり得る。
【００８０】
ＡＰＩ：緩衝剤のモル比は、ＡＰＩ約１モル：緩衝剤約２７〜約３８モルであり得る。ＡＰＩ：緩衝剤のモル比は、ＡＰＩ約１モル：緩衝剤約３０〜約３８モルであり得る。ＡＰＩ：緩衝剤のモル比は、ＡＰＩ約１モル：緩衝剤約３４〜約３８モルであり得る。
【００８１】
ＡＰＩ：緩衝剤のモル比は、ＡＰＩ約１モル：緩衝剤約３８モルであり得る。
【００８２】
ＡＰＩ：凍結乾燥保護剤のモル比は、ＡＰＩ約１モル：凍結乾燥保護剤約１０５〜約２１６モルであり得る。ＡＰＩ：凍結乾燥保護剤のモル比は、ＡＰＩ約１モル：凍結乾燥保護剤約１０５〜約１６３モルであり得る。ＡＰＩ：凍結乾燥保護剤のモル比は、ＡＰＩ約１モル：凍結乾燥保護剤約１０５〜約１５４モルであり得る。ＡＰＩ：凍結乾燥保護剤のモル比は、ＡＰＩ約１モル：凍結乾燥保護剤約１０５〜約１４５モルであり得る。ＡＰＩ：凍結乾燥保護剤のモル比は、ＡＰＩ約１モル：凍結乾燥保護剤約１０５〜約１４１モルであり得る。ＡＰＩ：凍結乾燥保護剤のモル比は、ＡＰＩ約１モル：凍結乾燥保護剤約１０５〜約１３２モルであり得る。ＡＰＩ：凍結乾燥保護剤のモル比は、ＡＰＩ約１モル：凍結乾燥保護剤約１０５〜約１２９モルであり得る。
【００８３】
ＡＰＩ：凍結乾燥保護剤のモル比は、ＡＰＩ約１モル：凍結乾燥保護剤約１２９〜約２１６モルであり得る。ＡＰＩ：凍結乾燥保護剤のモル比は、ＡＰＩ約１モル：凍結乾燥保護剤約１２９〜約１６３モルであり得る。ＡＰＩ：凍結乾燥保護剤のモル比は、ＡＰＩ約１モル：凍結乾燥保護剤約１２９〜約１５４モルであり得る。ＡＰＩ：凍結乾燥保護剤のモル比は、ＡＰＩ約１モル：凍結乾燥保護剤約１２９〜約１４５モルであり得る。ＡＰＩ：凍結乾燥保護剤のモル比は、ＡＰＩ約１モル：凍結乾燥保護剤約１２９〜約１４１モルであり得る。ＡＰＩ：凍結乾燥保護剤のモル比は、ＡＰＩ約１モル：凍結乾燥保護剤約１２９〜約１３２モルであり得る。
【００８４】
ＡＰＩ：凍結乾燥保護剤のモル比は、ＡＰＩ約１モル：凍結乾燥保護剤約１２９モルであり得る。
【００８５】
製剤は、ＡＰＩを約４〜約１２重量％、任意選択でＡＰＩを約８〜約１０重量％、任意選択でＡＰＩを約９重量％含み得る。
【００８６】
製剤は、緩衝剤を約３〜約３５重量％、任意選択で緩衝剤を約７〜約３５重量％、任意選択で緩衝剤を約１２〜約３５重量％、任意選択で緩衝剤を約１５〜約３５重量％、任意選択で緩衝剤を約１８〜約３５重量％、任意選択で緩衝剤を約２５〜約３５重量％、任意選択で緩衝剤を約３２〜約３５重量％、任意選択で緩衝剤を約３２％含み得る。
【００８７】
製剤は、凍結乾燥保護剤を約５６〜約９１重量％、任意選択で凍結乾燥保護剤を約５６〜約８２重量％、任意選択で凍結乾燥保護剤を約５６〜約７７重量％、任意選択で凍結乾燥保護剤を約５６〜約７５重量％、任意選択で凍結乾燥保護剤を約５６〜約７２重量％、任意選択で凍結乾燥保護剤を約５６〜約６６重量％、任意選択で凍結乾燥保護剤を約５６〜約５８重量％、任意選択で凍結乾燥保護剤を約５８重量％含み得る。
【００８８】
製剤の成分は、総量が１００重量％となるように選択されることが理解されよう。
【００８９】
製剤は、緩衝剤を少なくとも４０ｍＭ含み得る。
【００９０】
緩衝剤は、リン酸緩衝剤およびアルカノールアミン緩衝剤のうちの少なくとも１つであり得る。リン酸緩衝剤は、リン酸水素およびリン酸二水素を含み得る。リン酸緩衝剤は、水和したものであり得る。
【００９１】
アルカノールアミン緩衝剤は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含み得る。アルカノールアミン緩衝剤は、２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオールを含み得る。
【００９２】
凍結乾燥保護剤は、糖、アルコールおよび糖アルコール、ならびにそれらの誘導体のうちの少なくとも１つであり得る。任意選択で、凍結乾燥保護剤は、糖および糖アルコール、ならびにそれらの誘導体のうちの少なくとも１つである。任意選択で、凍結乾燥保護剤は、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、およびそれらの誘導体のうちの少なくとも１つである。凍結乾燥保護剤は、スクロースおよびマンニトール、ならびにそれらの誘導体のうちの少なくとも１つであり得る。凍結乾燥保護剤は、マンニトール、またはその誘導体であり得る。
【００９３】
製剤はさらに張度調節剤を含み得る。
【００９４】
凍結乾燥保護剤は張度調節剤としても作用することがあり、その場合、それは、凍結乾燥保護剤と張度調節剤との組み合わせである。
【００９５】
本発明の第２の態様によれば、凍結乾燥製剤の調製方法が提供され、本方法は、
ａ）医薬品有効成分（ＡＰＩ）、緩衝剤、および凍結乾燥保護剤を凍結乾燥容器に供給する工程と；
ｂ）第１水分除去ステップを実行する工程と；
ｃ）第２水分除去ステップを実行する工程と
を含み、凍結乾燥を行う前に、凍結乾燥保護剤を添加する。
【００９６】
第１水分除去ステップは、約−３０℃以下、任意選択で約−３５℃以下、任意選択で約−３８℃以下の温度で行うことができる。
【００９７】
第２水分除去ステップは、約１０℃以上、任意選択で約１５℃以上、任意選択で約２０℃以上の温度で行うことができる。
【００９８】
第１および第２水分除去ステップのうちの少なくとも１つは、５０μｂａｒ以下の圧力で行うことができる。任意選択で、第１および第２水分除去ステップの両方を、５０μｂａｒ以下の圧力で行うことができる。
【００９９】
凍結乾燥製剤は、本発明の第１の態様の凍結乾燥製剤であり得る。
【０１００】
本発明の一態様によれば、本発明の第２の態様により調製された凍結乾燥製剤が提供される。
【０１０１】
本発明の第３の態様によれば、本発明の第１の態様の製剤と生体適合性担体とを、哺乳動物への投与に適した形態で含む医薬組成物が提供される。
【０１０２】
生体適合性担体は溶媒であり得、典型的には水性溶媒、典型的には水であり得る。溶媒は、流体であり得る。
【０１０３】
「生体適合性担体」は、組成物が生理学的に許容可能であるように、すなわち、毒性または過度の不快感なしに哺乳動物の身体に投与することができるように、イメージング剤を懸濁または溶解させることができる流体、特に液体であり得る。生体適合性担体は、適切には、下記のものなどの注射可能な担体液である：無菌のパイロジェンフリー注射用水；生理食塩水などの水溶液（これは、注射用の最終生成物が等張になるように、有利に平衡させることができる）；１種以上の張度調節物質（例えば、血漿カチオンの生体適合性対イオンとの塩）、糖類（例えば、グルコースもしくはスクロース）、糖アルコール（例えば、ソルビトールもしくはマンニトール）、グリコール（例えば、グリセロール）、または他の非イオン性ポリオール物質（例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなど）の水溶液。生体適合性担体は、パイロジェンフリー注射用水または等張生理食塩水であり得る。イメージング剤および生体適合性担体はそれぞれ、無菌完全性および／または放射能安全性の維持を可能にする密閉容器を備え、任意選択で不活性ヘッドスペースガス（例えば、窒素またはアルゴン）が加えられており、一方でシリンジまたはカニューレによる溶液の添加および抜き取りを可能にする適切なバイアルまたは容器に供給される。そのような容器として好ましいのは、セプタム封止バイアルであり、気密性の高いクロージャは、オーバーシール（典型的にはアルミニウム製）でクリンプされている。クロージャは、無菌完全性を維持しながら、皮下注射針で単回または複数回穿刺するのに適したもの（例えば、クリンプオンセプタムシールクロージャ）である。そのような容器は、クロージャが、所望の場合（例えば、ヘッドスペースガスの変更または溶液のガス脱きのため）に真空に耐えることができ、酸素または水蒸気などの外部大気ガスの侵入を許すことなく、減圧などの圧力変化に耐えることができるという付加的利点を有する。
【０１０４】
医薬組成物は、一人の患者に適した投与量であり得、適切なシリンジまたは容器に入れて供給され得る。
【０１０５】
複数回投与容器は、複数の患者投与量を含有する単一のバルクバイアル（例えば、容積１０〜３０ｃｍ３）を含み、それにより、製剤の有効期間中、様々な時間間隔で、単一の患者投与量を臨床グレードのシリンジに抜き取ることが可能となり、臨床状況に合わせることができる。事前に充填されたシリンジは、単一のヒト用量、すなわち「単位用量」を含有するように設計されており、したがって、好ましくは、使い捨てシリンジまたは臨床使用に適した他のシリンジである。本発明の医薬組成物は、一人の患者に適した投与量であり得、上述のように、適切なシリンジまたは容器に入れて供給され得る。
【０１０６】
医薬組成物は、約ｐＨ６．３〜約ｐＨ９の間、任意選択で約ｐＨ６．３〜約ｐＨ９の間、任意選択で約ｐＨ６．５〜約ｐＨ８．５の間、任意選択で約ｐＨ６．８〜約ｐＨ８．２の間、任意選択で約ｐＨ７〜約ｐＨ８の間のｐＨを有し得る。
【０１０７】
本発明の第４の態様によれば、本発明の第３の態様の医薬組成物を調製するためのキットが提供され、このキットは、本発明の第１の態様の製剤を無菌固体形態で含み、本発明の第３の態様の生体適合性担体の無菌供給物で復元させると、溶解が起こり、所望の医薬組成物が得られるようなキットである。
【０１０８】
無菌固体形態は、凍結乾燥固体であり得る。
【０１０９】
本発明の第５の態様によれば、本発明の第１の態様の製剤および本発明の第３の態様の医薬組成物のうちの少なくとも１つを使用することを含む、哺乳動物の身体のイメージング方法が提供される。
【０１１０】
Ｉｎ  ｖｉｖｏで使用するために、例えば、生体適合性担体で復元させると、製剤は、哺乳動物の投与に適した形態になることが理解されよう。
【０１１１】
イメージングは、ｉｎ  ｖｉｖｏであり得る。
【０１１２】
イメージングは、光学イメージングであり得る。
【０１１３】
用語「光学イメージング」は、赤色〜近赤外領域（波長４００〜１，２００ｎｍ）の光との相互作用に基づいて、疾患の検出、病期分類または診断、疾患進行のフォローアップまたは疾患治療のフォローアップのための画像を形成する任意の方法を意味する。光学イメージングはさらに、いかなるデバイスも使用しない直接可視化、ならびに様々なスコープ、カテーテルおよび光学イメージング装置、例えば、断層撮影画像表示用コンピュータ支援ハードウェアなどのデバイスの使用を伴う直接可視化のあらゆる方法を包含する。モダリティおよび測定技法には、下記のものが含まれるが、これらに限定されない：蛍光イメージング、発光イメージング；内視鏡検査；蛍光内視鏡検査；光コヒーレンス断層撮影；透過率イメージング；時間分解透過率イメージング；共焦点イメージング；非線形顕微鏡検査；光音響イメージング；音響光学イメージング；分光法；反射分光法；干渉分光法；コヒーレンス干渉分光法；拡散光断層撮影および蛍光媒介拡散光断層撮影（連続波、時間領域および周波数領域システム）、および光散乱、吸収、偏光、発光、蛍光寿命、量子収率、および消光の測定。これらの技法のさらなる詳細は、以下に示されている：（Ｔｕａｎ  Ｖｏ−Ｄｉｎｈ  （ｅｄｉｔｏｒ）：  "Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ"  （２００３），  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ＬＣＣ；  Ｍｙｃｅｋ  ＆  Ｐｏｇｕｅ  （ｅｄｉｔｏｒｓ）：  "Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ"  （２００３），  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．；  Ｓｐｌｉｎｔｅｒ  ＆  Ｈｏｐｐｅｒ：  "Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｐｔｉｃｓ"  （２００７），  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ＬＣＣ。
【０１１４】
イメージングは、ｃＭｅｔの過剰発現部位または局在部位の画像を得るためのものであり得る。
【０１１５】
本発明の第１の態様の製剤または本発明の第３の態様の医薬組成物を、哺乳動物の身体に前もって投与していてもよい。
【０１１６】
光学イメージング方法は、蛍光反射イメージング（ＦＲＩ）を使用してもよい。ＦＲＩでは、本発明のイメージング剤を診断される被験体に投与し、その後、被験体の組織表面を、励起光で、通常は連続波（ＣＷ）励起で照らす。この光はレポーター分子（ＩＭ）を励起する。励起により発生したイメージング剤からの蛍光を、蛍光検出器を使用して検出する。戻り光を濾光し、蛍光成分を（単独または部分的に）分離する。蛍光から画像を形成する。通常、最小限の処理が行われ（寿命、量子収量などの光学パラメータを計算するためのプロセッサは不要）、画像は蛍光強度をマッピングする。イメージング剤は、疾患領域に集中して高い蛍光強度を生成するように設計されている。したがって、疾患領域は、蛍光強度画像において正のコントラストを生成する。画像は、リアルタイムイメージングが可能なように、ＣＣＤカメラまたはチップを使用して得ることもできる。
【０１１７】
励起波長は、使用する染料の種類に応じて変化する。励起光発生用の装置は、レーザー（例えば、イオンレーザー、染料レーザー、半導体レーザー）；ハロゲン光源またはキセノン光源などの従来の励起光源であればよい。最適な励起波長を得るために、様々な光学フィルターを任意選択で使用することができる。
【０１１８】
本方法は、
ａ）対象の組織表面を励起光で照らす工程と；
ｂ）イメージング剤の励起により発生したイメージング剤からの蛍光を検出する工程と；
ｃ）任意選択で、蛍光検出器によって検出した光をフィルタリングして蛍光成分を分離する工程と；
ｄ）工程（ｂ）または（ｃ）の蛍光から対象の組織表面の画像を形成する工程と
を含む。
【０１１９】
工程（ａ）の励起光は、本質的に連続波（ＣＷ）であり得る。
【０１２０】
工程（ａ）は、哺乳動物の身体内で行われ得る。
【０１２１】
代替的なイメージング方法は、ＦＤＰＭ（周波数領域光子移動）を使用する。これは、組織内のＩＭをより深い位置で検出することが重要である連続波（ＣＷ）法に比べて、利点がある［Ｓｅｖｉｃｋ−Ｍｕｒａｃａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，  ６，  ６４２−６５０  （２００２）］。そのような周波数／時間領域のイメージングは、イメージングされる病変の組織の深さと、使用する装置のタイプとに応じて変調させることができる蛍光特性をＩＭが有する場合に有利である。
【０１２２】
本方法は、
ａ）前記哺乳動物の身体の不均一組成を有する光散乱生体組織を、所定の経時変化する強度の光源からの光にさらしてイメージング剤を励起させる工程であって、組織が励起光を多重散乱させる工程と；
ｂ）前記露光に応答した組織からの多重散乱発光を検出する工程と；
ｃ）プロセッサを用いて複数の値を確立することにより、発光から組織全体の蛍光特性を定量化する工程であって、それら値が、組織内の異なる位置における蛍光特性のレベルにそれぞれ対応しており、蛍光特性のレベルが、組織の不均一組成によって変化するものである工程と；
ｄ）工程（ｃ）の値に従って組織の不均一組成をマッピングすることにより、組織の画像を生成する工程と
を含む。
【０１２３】
光学イメージング方法は、蛍光イメージング、任意選択で蛍光内視鏡検査を含み得る。
【０１２４】
本方法は、検出、診断、手術、病期分類、治療、治療の監視、疾患進行の監視または監視療法を補助するために使用され得る。
【０１２５】
本方法は、がん、任意選択で結腸直腸がんの検出、診断、手術、病期分類、治療、治療の監視、疾患進行の監視または監視療法を補助するために使用され得る。
【０１２６】
本発明のさらなる態様によれば、本発明の第５の態様のイメージング方法を含んでなる、検出、診断、手術、病期分類、治療、治療の監視、疾患進行の監視または監視療法の方法が提供される。
【０１２７】
本発明のさらなる態様によれば、哺乳動物の身体のイメージングにおけるイメージング剤として使用するための、本発明の第１の態様の製剤および本発明の第３の態様の医薬組成物のうちの少なくとも１つが提供される。
【０１２８】
本発明のさらなる態様によれば、薬剤として使用するための、本発明の第１の態様の製剤および本発明の第３の態様の医薬組成物のうちの少なくとも１つが提供される。
【０１２９】
本発明のさらなる態様によれば、検出、診断、手術、病期分類、治療、治療の監視、疾患進行の監視または監視療法において使用するための、本発明の第１の態様の製剤および本発明の第３の態様の医薬組成物のうちの少なくとも１つが提供される。
【０１３０】
本発明のさらなる態様によれば、前がん症状およびがんのうちの１つもしくは複数の、任意選択で結腸直腸がん、食道がん、乳がん、前立腺がん、頭部がん、頸部がん、卵巣がん、直腸がん、膵臓がん、甲状腺がん、胃がんおよび肉腫のうちの１つもしくは複数の検出、診断、手術、病期分類、治療、治療の監視、疾患進行の監視または監視療法において使用するための、本発明の第１の態様の製剤および本発明の第３の態様の医薬組成物のうちの少なくとも１つが提供される。
【０１３１】
本発明のさらなる態様によれば、ｃＭｅｔの過剰発現部位または局在部位の検出、診断、手術、病期分類、治療、治療の監視、疾患進行の監視または監視療法において使用するための、本発明の第１の態様の製剤および本発明の第３の態様の医薬組成物のうちの少なくとも１つが提供される。
【０１３２】
本発明のさらなる態様によれば、ｃＭｅｔの過剰発現部位または局在部位の画像を、任意選択でｉｎ  ｖｉｖｏで得るために使用される、本発明の第１の態様の製剤および本発明の第３の態様の医薬組成物のうちの少なくとも１つが提供される。
【０１３３】
本発明のさらなる態様によれば、本発明の第１の態様の製剤および本発明の第３の態様の医薬組成物のうちの少なくとも１つを使用する、検出、診断、手術、病期分類、治療、治療の監視、疾患進行の監視または監視療法の方法が提供される。
【０１３４】
本発明のさらなる態様によれば、本発明の第１の態様の製剤および本発明の第３の態様の医薬組成物のうちの少なくとも１つを使用する、哺乳動物の身体のイメージング方法が提供される。
【０１３５】
本発明のさらなる態様によれば、本発明の第１の態様の製剤および本発明の第３の態様の医薬組成物のうちの少なくとも１つを使用する、前がん症状およびがんのうちの１つもしくは複数の、任意選択で結腸直腸がん、食道がん、乳がん、前立腺がん、頭部がん、頸部がん、卵巣がん、直腸がん、膵臓がん、甲状腺がん、胃がんおよび肉腫のうちの１つもしくは複数の検出、診断、手術、病期分類、治療、治療の監視、疾患進行の監視または監視療法の方法が提供される。
【０１３６】
本発明のさらなる態様によれば、本発明の第１の態様の製剤および本発明の第３の態様の医薬組成物のうちの少なくとも１つを使用する、ｃＭｅｔの過剰発現部位または局在部位の検出、診断、手術、病期分類、治療、治療の監視、疾患進行の監視または監視療法の方法が提供される。
【０１３７】
本発明のさらなる態様によれば、本発明の第１の態様の製剤および本発明の第３の態様の医薬組成物のうちの少なくとも１つを使用して、ｃＭｅｔの過剰発現部位または局在部位の画像を、任意選択でｉｎ  ｖｉｖｏで得る方法が提供される。
【０１３８】
本発明のさらなる態様によれば、本発明の第１の態様の製剤および本発明の第３の態様の医薬組成物のうちの少なくとも１つの使用が提供される。
【０１３９】
本発明のさらなる態様によれば、検出、診断、手術、病期分類、治療、治療の監視、疾患進行の監視または監視療法における、本発明の第１の態様の製剤および本発明の第３の態様の医薬組成物のうちの少なくとも１つの使用が提供される。
【０１４０】
本発明のさらなる態様によれば、本発明の第１の態様の製剤および本発明の第３の態様の医薬組成物のうちの少なくとも１つの、イメージング剤としての使用が提供される。
【０１４１】
本発明のさらなる態様によれば、前がん症状およびがんのうちの１つもしくは複数の、任意選択で結腸直腸がん、食道がん、乳がん、前立腺がん、頭部がん、頸部がん、卵巣がん、直腸がん、膵臓がん、甲状腺がん、胃がんおよび肉腫のうちの１つもしくは複数の検出、診断、手術、病期分類、治療、治療の監視、疾患進行の監視または監視療法における、本発明の第１の態様の製剤および本発明の第３の態様の医薬組成物のうちの少なくとも１つの使用が提供される。
【０１４２】
本発明のさらなる態様によれば、ｃＭｅｔの過剰発現部位または局在部位の検出、診断、手術、病期分類、治療、治療の監視、疾患進行の監視または監視療法における、本発明の第１の態様の製剤および本発明の第３の態様の医薬組成物のうちの少なくとも１つの使用が提供される。
【０１４３】
本発明のさらなる態様によれば、ｃＭｅｔの過剰発現部位または局在部位の画像を、任意選択でｉｎ  ｖｉｖｏで得る際の、本発明の第１の態様の製剤および本発明の第３の態様の医薬組成物のうちの少なくとも１つの使用が提供される。
【０１４４】
説明した代替の特徴および様々な実施形態は、必要な変更を加えて、どの態様およびどの実施形態にも適用される。
次に、本発明の実施形態を、例として、以下の図面を参照して説明する：
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】ＡＰＩ（ＥＭＩ−１３７）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１４６】
国際公開第２００８／１３９２０７号に記載のような光学イメージング剤を使用して一連の実験を行い、より良好な復元を、特に静脈内使用に適したｐＨおよび／または張度で示す、より安定な製剤を見つけた。使用した化合物は、図１に示すように、ＥＭＩ−１３７であった。
【０１４７】
後述する実験では、ＥＭＩ−１３７の酢酸塩を使用したが、全ての重量および計算は、遊離イオンを使用して行った。
【０１４８】
復元後、静脈内製剤は等張溶液であり、静脈内投与に適した生理的ｐＨである必要がある。また、均一であり、凝集体を形成することなく可溶化する必要がある。しかし、水に溶解した場合、ＥＭＩ−１３７のｐＨは４．６であり、大きな構造体または凝集体の形成が顕著に見られる。この凝集は、溶液のｐＨを上げても一部しか可逆的ではないため、静脈内投与には不向きである。そのため、復元時に静脈内投与に適したｐＨになり、実質的に均一で、凝集体または粒子を実質的に含まない製剤が必要とされている。さらに、ＥＭＩ−１３７の貯蔵寿命はかなり短いため、実用性および安全性の目的で、単離された形態ではあまり使用することができない。したがって、ＥＭＩ−１３７の安定性および貯蔵寿命を延長する製剤が必要とされている。
【０１４９】
（ＥＭＩ−１３７の調製およびＥＭＩ−１３７を使用したイメージング）
実施例１は、ｃＭＢＰペプチド（化合物１（配列番号７を含む））の合成を提供する。実施例２は、化合物１のペプチド配列をスクランブリングして、下記のペプチド配列を有する化合物２を与える、陰性対照としての関連ペプチドの合成を提供する：
Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ
（配列番号８）。
【０１５０】
実施例３は、シアニン染料Ｃｙ５＊＊の合成を提供する。実施例４は、Ｃｙ５＊＊の活性エステルの合成を提供する。実施例５は、ペプチド（ｃＭＢＰペプチドおよび対照）に対するシアニン染料のコンジュゲーションを提供する。化合物３（配列番号７を含む）、４（配列番号８を含む）、５（配列番号７を含む）、６（配列番号７を含む）および７（配列番号８を含む）を、このようにして比較した。実施例６は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｃＭｅｔに対するペプチドの親和性を判定する方法を提供する。それらの結合は、光学レポーターイメージング部位（シアニン染料）が結合していても、選択的であることが結果として示されている。実施例７は、がんの動物モデルにおける化合物５および７のｉｎ  ｖｉｖｏ試験に関するデータを提供する。化合物５では、腫瘍：バックグラウンド比が優れていることがわかったが、化合物７（陰性対照）では、腫瘍とバックグラウンドとの区別がつかなかった。
【０１５１】
化合物の構造を下記の表２に示す。
【表２−１】
2021519300.tif 000013
【表２−２】
2021519300.tif 000014
【０１５２】
（実施例１：化合物１の合成）
（工程（ａ）：保護された前駆体直鎖ペプチドの合成）
前駆体直鎖ペプチドは、下記の構造を有する：
Ａｃ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（配列番号７を含む）。
【０１５３】
ペプチジル樹脂Ｈ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ΨＭｅ，Ｍｅｐｒｏ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ポリマー（配列番号７を含む）を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３３Ａペプチド合成装置上で、０．１ｍｍｏｌのＲｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  Ｎｏｖａｇｅｌ樹脂から開始するＦｍｏｃ化学を用いて組み立てた。カップリングステップでは、（ＨＢＴＵを使用して）予備活性化した過剰量の１ｍｍｏｌアミノ酸を適用した。Ｇｌｕ−Ｔｈｒ疑似プロリン（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ０５−２０−１１２２）を配列に組み込んだ。樹脂を窒素バブラー装置に移し、無水酢酸（１ｍｍｏｌ）およびＮＭＭ（１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解した溶液で６０分間処理した。無水溶液を濾過によって除去し、樹脂をＤＣＭで洗浄し、窒素流下で乾燥させた。
【０１５４】
側鎖保護基の除去および樹脂からのペプチドの開裂を同時に、２．５％のＴＩＳ、２．５％の４−チオクレゾールおよび２．５％の水を含有するＴＦＡ（１０ｍＬ）中で２時間３０分行った。濾過により樹脂を除去し、ＴＦＡを真空除去し、残渣にジエチルエーテルを加えた。形成された沈殿物をジエチルエーテルで洗浄し、風乾させ、クルードペプチド２６４ｍｇを得た。
【０１５５】
分取ＨＰＬＣによるクルードペプチドの精製（グラジエント：２０−３０％Ｂを４０分間、Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡおよびＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）、流量：１０ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ５μ  Ｃ１８（２）５０ｘ２１．２０ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：３０分）から、純粋な化合物１の直鎖前駆体１００ｍｇを得た。この純粋な生成物を、分析ＨＰＬＣで分析した（グラジエント：１０−４０％Ｂを１０分間、Ａ＝Ｈ２ＣＶＯ．１％ＴＦＡおよびＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ、流量：０．３ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ３μ  Ｃ１８（２）５０ｘ２ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：６．５４分）。さらなる生成物の特性評価を、エレクトロスプレー質量分析法を使用して行った（ＭＨ２２＋計算値：１４６４．６、ＭＨ２２＋実測値：１４６５．１）。
【０１５６】
（工程（ｂ）：単環式Ｃｙｓ４−１６ジスルフィド架橋の形成）
Ｃｙｓ４−１６；Ａｃ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（配列番号７を含む）。
【０１５７】
工程（ａ）の直鎖前駆体（１００ｍｇ）を５％ＤＭＳＯ／水（２００ｍＬ）に溶解し、アンモニアを用いて溶液をｐＨ６に調整した。反応混合液を５日間撹拌した。次いで、溶液をＴＦＡを用いてｐＨ２に調整し、溶媒の大部分を真空蒸発させて除去した。残渣（４０ｍＬ）を分取ＨＰＬＣカラムに分注し、精製した。
【０１５８】
分取ＨＰＬＣによる残渣の精製（グラジエント：０％Ｂを１０分間、その後０−４０％Ｂを４０分間、Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡおよびＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ、流量：１０ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ５μ  Ｃ１８（２）２５０ｘ２１．２０ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：４４分）から、純粋な化合物１の単環式前駆体７２ｍｇを得た。この純粋な生成物（異性体Ｐ１〜Ｐ３の混合物として）を、分析ＨＰＬＣで分析した（グラジエント：１０−４０％Ｂを１０分間、Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡおよびＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ、流量：０．３ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ３μ  Ｃ１８（２）５０ｘ２ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：５．３７分（Ｐ１）；５．６１分（Ｐ２）；６．０５分（Ｐ３））。さらなる生成物の特性評価を、エレクトロスプレー質量分析法を使用して行った（ＭＨ２２＋計算値：１４６３．６、ＭＨ２２＋実測値：１４６４．１（Ｐ１）；１４６４．４（Ｐ２）；１４６４．３（Ｐ３））。
【０１５９】
（工程（ｃ）：第２Ｃｙｓ６−１４ジスルフィド架橋の形成（化合物１））
工程（ｂ）からの単環式前駆体（７２ｍｇ）を、窒素ブランケット下で７５％ＡｃＯＨ／水（７２ｍＬ）に溶解した。１Ｍ  ＨＣｌ（７．２ｍＬ）およびＡｃＯＨ中の０．０５Ｍ  Ｉ２（４．８ｍＬ）をその順序で添加し、混合液を４５分間撹拌した。１Ｍアスコルビン酸（１ｍＬ）を加え、無色混合液を得た。溶媒の大部分を真空蒸発させ、残渣（１８ｍＬ）を水／０．１％ＴＦＡ（４ｍＬ）で希釈し、分取ＨＰＬＣを用いて生成物を精製した。 
【０１６０】
分取ＨＰＬＣによる残渣の精製（グラジエント：０％Ｂを１０分間、その後２０−３０％Ｂを４０分間、Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡおよびＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ、流量：１０ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ５μ  Ｃ１８（２）２５０ｘ２１．２０ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：４３〜５３分）から、５２ｍｇの純粋な化合物１を得た。この純粋な生成物を、分析用ＨＰＬＣで分析した（グラジエント：１０−４０％Ｂを１０分間、Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡおよびＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ、流量：０．３ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ３μ  Ｃ１８（２）５０ｘ２ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：６．５４分）。さらなる生成物の特性評価を、エレクトロスプレー質量分析法を使用して行った（ＭＨ２２＋計算値：１３９１．５、ＭＨ２２＋実測値：１３９２．５）。
【０１６１】
（実施例２：化合物２の合成）
Ａｃ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＮＨ２
化合物２（配列番号８を含む）は、化合物１のペプチド配列をスクランブリングした陰性対照である。
【０１６２】
（工程（ａ）：保護された前駆体直鎖ペプチドの合成）
ペプチジル樹脂Ｈ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ΨＭｅ，Ｍｅｐｒｏ）−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ポリマー（配列番号８を含む）を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３３Ａペプチド合成装置上で、０．１ｍｍｏｌのＲｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  Ｎｏｖａｇｅｌ樹脂から開始するＦｍｏｃ化学を用いて組み立てた。カップリングステップでは、（ＨＢＴＵを使用して）予備活性化した過剰量の１ｍｍｏｌアミノ酸を適用した。Ｔｙｒ−Ｓｅｒ疑似プロリン（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ０５−２０−１０１４）を配列に組み込んだ。樹脂を窒素バブラー装置に移し、無水酢酸（１ｍｍｏｌ）およびＮＭＭ（１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解した溶液で６０分間処理した。無水溶液を濾過によって除去し、樹脂をＤＣＭで洗浄し、窒素流下で乾燥させた。
【０１６３】
側鎖保護基の除去および樹脂からのペプチドの開裂を同時に、２．５％のＴＩＳ、２．５％の４−チオクレゾールおよび２．５％の水を含有するＴＦＡ（１０ｍＬ）中で２時間１０分行った。濾過により樹脂を除去し、ＴＦＡを真空除去し、残渣にジエチルエーテルを加えた。形成された沈殿物をジエチルエーテルで洗浄し、風乾させ、クルードペプチド２１６ｍｇを得た。
【０１６４】
分取ＨＰＬＣによるクルードペプチドの精製（グラジエント：２０−３０％Ｂを４０分間、Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡおよびＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ、流量：５０ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ５μ  Ｃ１８（２）２５０ｘ５０ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：３４．１分）から、２００ｍＬのＡＣＮ／水に溶解した純粋なＤＸ−１６６２陰性対照直鎖前駆体を得た。この純粋な生成物を、分析ＨＰＬＣで分析した（グラジエント：１０−４０％Ｂを５分間、Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡおよびＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ、流量：０．６ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ３μ  Ｃ１８（２）２０ｘ２ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：３．５２分）。さらなる生成物の特性評価を、エレクトロスプレー質量分析法を使用して行った（ＭＨ２２＋計算値：１４６４．６、ＭＨ２２＋実測値：１４６４．９）。
【０１６５】
（工程（ｂ）：単環式Ｃｖｓ４−１６ジスルフィド架橋の形成）
Ｃｙｓ４−１６；Ａｃ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（配列番号８を含む）。
【０１６６】
工程（ａ）の陰性対照直鎖前駆体溶液（２００ｍＬ、４．３．１を参照）にＤＭＳＯ（１０ｍＬ）を加え、アンモニアを用いて溶液をｐＨ７に調整した。反応混合液を４０℃で１８時間加熱した後、６０℃で６０分間加熱した。溶液をＴＦＡを用いてｐＨ２に調整し、ＡＣＮを真空蒸発させて除去した。残渣を分取ＨＰＬＣ精製にかけた。
【０１６７】
分取ＨＰＬＣによる残渣の精製（グラジエント：０％Ｂを５分間、その後２０−３０％Ｂを６０分間、Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡおよびＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ、流量：５０ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ５μ  Ｃ１８（２）２５０ｘ５０ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：２９．６分）から、ＡＣＮ／水１００ｍＬ中の純粋な陰性対照単環式前駆体を得た。この純粋な生成物を、分析ＨＰＬＣで分析した（グラジエント：１０−４０％Ｂを５分間、Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡおよびＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ、流量：０．６ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ３μ  Ｃ１８（２）２０ｘ２ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：３．４６分）。さらなる生成物の特性評価を、エレクトロスプレー質量分析法を使用して行った（ＭＨ２２＋計算値：１４６３．６、ＭＨ２２＋実測値：１４６３．７）。
【０１６８】
（工程（ｃ）：第２Ｃｖｓ６−１４ジスルフィド架橋の形成（化合物２））
Ｃｙｓ４−１６，６−１４；Ａｃ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（配列番号８を含む）。 
【０１６９】
工程（ｂ）からの陰性対照単環式前駆体溶液（１００ｍＬ）を、ＡｃＯＨ（１００ｍＬ）で希釈した。１Ｍ  ＨＣｌ（５ｍＬ）およびＡｃＯＨ中の０．０５Ｍ  Ｉ２（７ｍＬ）をその順序でアルゴンブランケット下で添加し、混合液を２０分間撹拌した。１Ｍアスコルビン酸（１ｍＬ）を加え、無色混合液を得た。溶媒の大部分を真空蒸発させ、残渣（３０ｍＬ）を水／０．１％ＴＦＡ（１００ｍＬ）で希釈し、分取ＨＰＬＣを用いて生成物を精製した。分取ＨＰＬＣによる残渣の精製（グラジエント：０％Ｂを１０分間、その後２０−３０％Ｂを６０分間、Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡおよびＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ、流量：５０ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ５μ  Ｃ１８（２）２５０ｘ５０ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：３２．８分）から、３０ｍｇの純粋な化合物２を得た。この純粋な生成物を、分析ＨＰＬＣで分析した（グラジエント：１０−４０％Ｂを１０分間、Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡおよびＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ、流量：０．３ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ３μ  Ｃ１８（２）５０ｘ２ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：６．５４分）。さらなる生成物の特性評価を、エレクトロスプレー質量分析法を使用して行った（ＭＨ２２＋計算値：１３９１．５、ＭＨ２２＋実測値：１３９２．５）。
【０１７０】
（実施例３：シアニン染料２−｛（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−［１−（５−カルボキシペンチル）−３，３−ジメチル−５−スルホ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン］ペンタ−１，３−ジエニル｝−３−メチル−１，３−ビス（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸塩（Ｃｙ５＊＊）の合成
【化１０】
2021519300.tif 000015
【０１７１】
（（３ａ）５−メチル−６−オキソヘプタン−１−スルホン酸）
【化１１】
2021519300.tif 000016
ＤＭＦ（２５ｍｌ）中の２−メチルアセト酢酸エチル（５０ｇ）を、ＤＭＦ（１００ｍｌ）中の水素化ナトリウム（鉱物油中の６０％ＮａＨ１２．０ｇ）の懸濁液に、氷浴冷却しながら１時間かけて滴加した（内部温度０〜４℃）。この混合液を、撹拌しながら４５分間かけて周囲温度まで暖め、再冷却した。次に、ＤＭＦ（２５ｍｌ）中の１，４−ブタンスルトン（４５ｇ）の溶液を１５分かけて滴加した。最終混合液を６０℃で１８時間加熱した。溶媒を回転蒸発により除去し、残渣を水およびジエチルエーテル間で分配した。水層を回収し、新しいジエチルエーテルで洗浄し、回転蒸発させて粘着性の泡を得た。この中間体を水（１００ｍｌ）に溶解し、水酸化ナトリウム（１７．８ｇ）を撹拌しながら１５分かけて添加した。この混合液を９０℃で１８時間加熱した。冷却した反応混合液を、濃塩酸（〜４０ｍｌ）の添加により〜ｐＨ２に調整した。溶液を回転蒸発させ、真空乾燥させた。黄色固体を、２％塩酸を含むエタノール洗浄した（３×１５０ｍｌ）で。エタノール溶液を濾過し、回転蒸発させ、真空乾燥させ、黄色固体を得た。収量７０ｇ。
【０１７２】
（（３ｂ）２，３−ジメチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドール−５−スルホン酸、二カリウム塩）
【化１２】
2021519300.tif 000017
４−ヒドラジノベンゼンスルホン酸（４０ｇ）、５−メチル−６−オキソヘプタン−１−スルホン酸（３ａから；６０ｇ）および酢酸（５００ｍｌ）を混合し、還流下で６時間加熱した。溶媒を濾過し、回転蒸発させ、真空乾燥させた。固体をメタノール（１Ｌ）に溶解した。これに２Ｍメタノール水酸化カリウム（３００ｍｌ）を加えた。混合液を３時間撹拌した後、回転蒸発を使用して溶媒の量を５０％減少させた。得られた沈殿物を濾過し、メタノールで洗浄し、真空乾燥させた。収量６０ｇ。ＭＳ（ＬＣＭＳ）：ＭＨ＋３６２。Ａｃｃ．  Ｍａｓｓ：実測値、３６２．０７２９。ＭＨ＋＝Ｃ１４Ｈ２ＯＮＯ６Ｓ２は、ｍ／ｚ  ３６２．０７３２（−０．８ｐｐｍ）を必要とする。
【０１７３】
（（３ｃ）２，３−ジメチル−１３−ビス（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸、二カリウム塩）
【化１３】
2021519300.tif 000018
２，３−ジメチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドール−５−スルホン酸（３ｂから；６０ｇ）を、１，４ブタンスルトン（１８０ｇ）およびテトラメチレンスルホン（１４６ｍｌ）とともに１４０℃で１６時間加熱した。得られた赤色固体をジエチルエーテルで洗浄し、粉砕して粉末にし、真空乾燥させた。収量６０ｇ。
【０１７４】
（（３ｄ）Ｃｖ５＊＊、ＴＦＡ塩として）
１−（５’−カルボキシペンチル）−２，３，３−トリメチル−インドレニウムブロミド−５−スルホン酸、Ｋ＋塩（２．７ｇ）、マロンアルデヒドビス（フェニルイミン）一塩酸塩（９６０ｍｇ）、無水酢酸（３６ｍｌ）および酢酸（１８ｍｌ）を１２０℃で１時間加熱し、暗褐色−赤色溶液を得た。反応混合液を周囲温度まで冷却した。２，３−ジメチル−１，３−ビス（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート（３ｃから；８．１ｇ）および酢酸カリウム（４．５ｇ）を混合液に添加し、これを周囲温度で１８時間撹拌した。得られた青色溶液を酢酸エチルを用いて沈殿させ、真空乾燥させた。クルード染料を、液体クロマトグラフィーにより精製した（ＲＰＣ１８．水＋０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ＋０．１％ＴＦＡグラジエント）。主な染料ピークを含む画分を回収してプールし、真空蒸発させ、表題の染料２ｇを得た。ＵＶ／Ｖｉｓ（水＋０．１％ＴＦＡ）：６５０ｎｍ。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）：ＭＨ＋８８７。ＭＨ＋＝Ｃ３８Ｈ５０Ｎ２Ｏ１４Ｓ４は、ｍ／ｚ  ８８７．１を必要とする。
【０１７５】
（実施例４：２−［（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−（１−｛６−［２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ］−６−オキソヘキシル｝−３，３−ジメチル−５−スルホ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン］ペンタ−１，３−ジエニル］−３−メチル−１，３−ビス（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸、ジイソプロピルエチルアミン塩の合成（Ｃｙ５＊＊のＮＨＳエステル））
【化１４】
2021519300.tif 000019
Ｃｙ５＊＊（実施例３；１０ｍｇ）を無水ＤＭＳＯ（３ｍｌ）に溶解した；これにＨＳＰｙＵ（２０ｍｇ）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（８０μｌ）を加えた。得られた溶液を３時間混合すると、ＴＬＣ（ＲＰＣ１８．水／ＭｅＣＮ）は完全な反応を示した。酢酸エチル／ジエチルエーテル中での沈殿により染料を単離し、濾過し、酢酸エチルで洗浄し、真空乾燥させた。ＵＶ／Ｖｉｓ（水）６５０ｎｍ。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）ＭＨ＋  ９８３．ＭＨ＋＝Ｃ４２Ｈ５３Ｎ３Ｏ１６Ｓ４は、ｍ／ｚ  ９８４．１６を必要とする。
【０１７６】
（実施例５：染料のコンジュゲーション、化合物３〜７の合成）
Ｃｙｓ４−１６、６−１４；Ａｃ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｃｙ５）−ＮＨ２（化合物３）（配列番号７を含む）。
【０１７７】
化合物１（１０ｍｇ）、ＮＭＭ（４μＬ）およびＣｙ５  ＮＨＳエステル（５．７ｍｇ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＰＡｌ  ５１０４）をＮＭＰ（１ｍＬ）に溶解し、反応混合液を７時間撹拌した。反応混合液を５％ＡＣＮ／水（８ｍＬ）で希釈し、生成物を分取ＨＰＬＣで精製した。
【０１７８】
分取ＨＰＬＣによるクルードペプチドの精製（グラジエント：５−５０％Ｂを４０分間、Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＨＣＯＯＨおよびＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＨＣＯＯＨ、流量：１０ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ５μ  Ｃ１８（２）２５０ｘ２１．２０ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：３５．５分）から、８．１ｍｇの純粋な化合物３を得た。この純粋な生成物を、分析ＨＰＬＣで分析した（グラジエント：５−５０％Ｂを１０分間、Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＨＣＯＯＨおよびＢ＝ＡＣＮ／０．１％ＨＣＯＯＨ、流量：０．３ｍＬ／分、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ３μ  Ｃ１８（２）５０ｘ２ｍｍ、検出：ＵＶ２１４ｎｍ、生成物保持時間：８．１５分）。さらなる生成物の特性評価を、エレクトロスプレー質量分析法を使用して行った（ＭＨ２２＋計算値：１７１０．６、ＭＨ２２＋実測値：１７１１．０）。
【０１７９】
化合物４を、同様の方法で調製した  −  エレクトロスプレー質量分析法（ＭＨ２２＋計算値：１７１０．６、ＭＨ２２＋実測値：１７１０．９）。
【０１８０】
他の染料−ペプチドコンジュゲート（化合物５〜７）も、同様の方法で調製した。Ａｌｅｘａ６４７は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ａ２０１０６）から購入した。
化合物５（ＭＨ２２＋計算値：１８２５．７、ＭＨ２２＋実測値：１８２５．９）、
化合物６（ＭＨ２２＋計算値：１８１１．７、ＭＨ２２＋実測値：１８１２．０）、
化合物７（ＭＨ２２＋計算値：１８２５．７、ＭＨ２２＋実測値：１８２６．２）。
【０１８１】
（実施例６：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ蛍光偏光アッセイ）
蛍光偏光法の原理を簡単に説明すると、以下のようになり得る：
単色光が水平偏光フィルターを通過し、試料中の蛍光分子を励起する。垂直偏光面で適切に配向した分子のみが光を吸収し、励起され、次いで発光する。放出された光を水平面および垂直面の両方で測定する。異方性値（Ａ）は、下記の式に従う光強度の比である：
Ａ＝（水平偏光子での強度−垂直偏光子での強度）／（水平偏光子での強度＋２＊垂直偏光子での強度）。
【０１８２】
蛍光異方性の測定は、３８４ウェルマイクロプレートにおいて１０μＬの容量で、結合緩衝液（ＰＢＳ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ  ７．５）中、Ｔｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅ蛍光偏光プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ、米国）を使用して、ｅｘ６４６／ｅｍ６７８ｎｍで実施した。染料標識ペプチドの濃度を一定（２０ｎＭ）に保ち、ヒトまたはマウスのｃＭｅｔ／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）またはＳｅｍａｐｈｏｒｉｎ  ６Ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の濃度を０〜１５０ｎＭの間で変化させた。結合混合液をマイクロプレート中で１０分間３０℃で平衡させた。観察された異方性の変化を、下記の方程式に当てはめた：
【数１】
2021519300.tif 000020
（式中、ｒｏｂｓは観測された異方性であり、ｒｆｒｅｅは遊離ペプチドの異方性であり、ｒｂｏｕｎｄは結合ペプチドの異方性であり、ＫＤは解離定数であり、ｃＭｅｔは全ｃＭｅｔ濃度であり、Ｐは全染料標識ペプチド濃度である）。この方程式は、合成ペプチドおよび受容体が、溶液中で１：１の化学量論で可逆的な複合体を形成することを前提としている。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して非線形回帰によりデータフィッティングを行い、ＫＤ値（一部位結合）を得た。
【０１８３】
化合物３および４を、ヒトおよびマウスのｃＭｅｔ（Ｆｃキメラ）への結合について試験した。結果は、化合物３のヒトｃ−Ｍｅｔへの結合についてのＫＤが３±１ｎＭであることを示した。化合物４のヒトｃＭｅｔへの結合は認められなかった。さらに、化合物３および４は、試験範囲ではマウスｃＭｅｔへの結合を示さなかった。
【０１８４】
同じ方法を用いて、化合物５では、ヒトｃＭｅｔに対するＫＤが１．１ｎｍであることがわかった。
【０１８５】
（実施例７：化合物５および７のｉｎ  ｖｉｖｏ試験）
（（ａ）動物モデル）
雌のＢＡＬＢ  ｃ／Ａヌード（Ｂｏｍ）マウス５４匹を、試験に使用した。動物の使用は、地方倫理委員会によって承認された。ＢＡＬＢ  ｃ／Ａヌードは、他のヌードマウス系統と比較して、ヒト腫瘍の取り込み率が高い近交系免疫不全マウス系統である。マウスは、到着時に４週齢で、試験開始時の体重は約２０グラムであった。動物を、ＨＥＰＡフィルターで濾過された空気の個別換気ケージ（ＩＶＣ、Ｓｃａｎｂｕｒ  ＢＫ）に収容した。動物は、"Ｒａｔ  ａｎｄ  Ｍｏｕｓｅ  ｎｒ．  ３  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ"飼料（Ｓｃａｎｂｕｒ  ＢＫ）と、１ｍＭのモル濃度までＨＣｌを添加して酸性化した水道水（ｐＨ３．０）とを自由に摂取していた。
【０１８６】
結腸がん細胞ＨＣＴ−１５はヒト結腸がん由来であり、Ｚｅｎｇら［Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，  ２１，  ４０９−４１７．  （２００４）］によると、ｃＭｅｔを発現することが報告されている。この細胞株は、ヌードマウスに皮下接種した際に、腫瘍を形成することが証明された［Ｆｌａｔｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ４０，１５９３−１５９８  （２００４）］。
【０１８７】
ＨＣＴ−１５細胞を、１０％血清およびペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｒ０８８３）中で増殖させ、皮下接種用に調製した。継代数４（Ｐ４）でストックを作製し、５％ＤＭＳＯを含む培地中、３×１０７細胞／バイアルで液体窒素中に貯蔵するために凍結した。移植当日、細胞を３７℃の水浴中で急速に解凍し（約２分間）、洗浄し、ＰＢＳ／２％血清中に再懸濁させた（１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離）。細胞を投与用シリンジに吸引するたびに、確実にバイアル内の細胞を完全に混合するようにした。動物が軽いガス麻酔下にある間、０．１ｍｌの量の細胞懸濁液を、細口径針（２５Ｇ）を使用して肩と背中に皮下注射した。その後、動物をケージに戻し、腫瘍を１３〜１７日間増殖させた。動物には、接種処置の前に、少なくとも５日間の順化期間を与えた。
【０１８８】
（（ｂ）処置）
全ての試験物質を、凍結乾燥粉末からＰＢＳで復元した。白色プリンター用紙の小さな堆積物をイメージングし、照明の不均一性を補正するために使用するフラットフィールド画像を得た。試験物質を物理的固定時に側尾静脈内に静脈内注射した。注射量は０．１ｍｌであり、これは動物１匹あたり１ｎｍｏｌの試験物質の用量に相当する。注射後、動物をケージに戻した。動物は、イメージングの直前に、頸椎脱臼により屠殺した。各試験物質の最適なイメージング時点は、限られた数（ｎ＝１〜６）の動物の皮膚および筋肉組織におけるウォッシュアウト速度の比較に基づいて推定した。化合物３および４のイメージング時点は、注射後１２０分であった。各動物について、皮下増殖した腫瘍を死後に切除した。厚さ約１．６ｍｍ、直径約３〜４ｍｍの薄いスライスを、１つの腫瘍の端から切り取った。腫瘍のスライスを、その後、同じ動物の正常な結腸の領域に対してイメージングした。
【０１８９】
（（ｃ）イメージング）
イメージングは、レポーターを励起するための光源と、蛍光成分を抽出するためのフィルタリングシステムとを使用するように適合させた臨床腹腔鏡を介して実行した。レポーター分子の励起には６３５ｎｍレーザーを使用した。検出器にはＨａｍａｍａｔｓｕ  ＯＲＣＡ  ＥＲＧ  ＣＣＤカメラを使用した。カメラは、ゲイン０の２ｘ２ビニングモードで動作させた。結腸イメージングの標準露光時間は１０秒であった。システム較正の測定では、動物イメージングシステムでの１０秒の露光時間は、臨床的に意味のある光源、視野、および組織表面までの距離での４０ミリ秒の露光に対応することを示している。画像の強度分布を、システム較正データにより、照明の不均一性について補正した。標的およびバックグラウンド比は、腫瘍上にある関心領域、および正常な結腸のバックグラウンドから計算した。画像は、受信機動作特性解析に採用されている標準スコアリングシステムを使用して、視覚的にスコアリングした。
【０１９０】
（（ｄ）結果）
化合物５は腫瘍対正常比が１．４６：１であり、同じ染料を持つ対応するスクランブリング対照ペプチド（化合物７）は、比が１．０４：１であった。化合物５は容易に識別可能な腫瘍を有していたが、化合物７ではバックグラウンドに対して識別可能なものは何もなかった。
【０１９１】
（凍結乾燥ＥＭＩ−１３７製剤の調製）
製剤は、安定した均一固体を提供するために、効果的に（例えば、衝突または崩壊することなく）凍結乾燥させる必要がある。前述のように、水中でのＥＭＩ−１３７のｐＨは約４．６であり、これは静脈内投与には適していない。したがって、製剤のさらなる要件は、復元時に静脈内投与に適したｐＨであることである。さらに、復元時の製剤の張度は、静脈内投与に適していなければならない。さらなる利点は、製剤が冷蔵保存も可能であるが、室温で保存可能であることであろう。
【０１９２】
初期の製剤試験では、ｐＨが約６．８未満の製剤は凝集する傾向があることが示された。したがって、ｐＨが約６．８未満である製剤は許容できないと考えられた。さらに、約ｐＨ８を超える（場合によっては最大約ｐＨ９の）ｐＨでは、ジスルフィド架橋（ＥＭＩ−１３７には２つある）の分解のリスクがあることが知られている。したがって、復元時に、凝集を避けるのに十分高いｐＨでありながら、ジスルフィド架橋の分解のリスクを軽減するのに十分低いｐＨを提供する製剤に達することが有益であろう。
【０１９３】
したがって、復元時にＥＭＩ−１３７溶液のｐＨを許容範囲内に維持するためには、凍結乾燥の前に緩衝剤を含める必要がある。研究によると、ＥＭＩ−１３７溶液の粘度は、塩化カリウムに富むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の存在下で上昇し、実質的なゲル形成が発生することが示されている。このゲル化効果は、ＥＭＩ−１３７をｐＨ７．４のリン酸ナトリウム緩衝液に溶解した場合には観察されなかった。したがって、ＮａＣｌおよびＫＣｌの使用は、（ゲル化の問題のために）考慮から外した。
【０１９４】
表３で取り上げているように、凍結乾燥プロセスを実施した。
【表３】
2021519300.tif 000021
【０１９５】
凍結乾燥を、以下の通りに行った。
【０１９６】
下記の表４Ａ〜４Ｆで取り上げているような製剤の構成成分を、適切な凍結乾燥容器に添加した。記載の全ての成分（緩衝液を含む）を、凍結乾燥の前に添加したことに留意すること。
【０１９７】
積載段階は、約−４０℃で行われる。その後、温度を約−５５℃まで下げる。冷却速度は、毎分約１．５℃とすることができる。次いで、混合物を、定常凍結条件で少なくとも２時間置いておく。次いで、圧力を約４５分かけて５０μＢａｒまで低下させる。次いで、温度を約−３８℃まで上昇させて一次乾燥段階を行う。加熱速度は、毎分約１℃とすることができる。次いで、混合物は、約９日間、定常凍結条件で置いておく。次いで、１時間あたり約６．８℃の速度で、少なくとも１０時間にわたって、混合物を約３０℃まで加熱する（一次乾燥から二次乾燥への移行段階、すなわち「立ち上げ段階」）。次いで、混合物を、定常二次乾燥条件で約６時間置いておく。次いで、混合物を毎分約１℃の速度で約２０℃にまで冷却してから、ヘッドスペースガス（すなわち、アルゴンまたは窒素などの不活性ガス）を添加して、凍結乾燥容器内の真空を解放する。その後、製品を、５℃で荷下ろし／貯蔵する。
【０１９８】
一次乾燥ステップ、立ち上げ段階および二次乾燥ステップは全て、混合物を約５０μｂａｒの真空下に置くことで実施される。この圧力を一次乾燥段階で導入し、その後貯蔵／荷下ろし段階まで維持してもよい。
【０１９９】
リン酸ナトリウムなどの緩衝剤を使用すると、凍結中にｐＨが低ｐＨに移行することが知られており、したがって、凍結濃縮物のガラス転移温度が低いであろうことから、本製剤を崩壊させずに凍結乾燥することは困難であると予想されていた。そのため、本発明は、張度調節剤と凍結乾燥保護剤とを組み合わせたものを含む。マンニトールは、凍結乾燥で最も広く使用され、文書化されている増量剤の１つであるが、いくつかの熱的問題および結晶化の併発が報告されており、これは潜在的に生産および製品の安定性に影響を与える可能性がある。このように、マンニトール単独での使用は、通常、凍結乾燥に有利であるとは考えられず、いくつかの問題を生じさせることが知られている。
【０２００】
本発明の緩衝剤と凍結乾燥保護剤との組み合わせは、凍結乾燥ケーキの崩壊を経ずに凍結乾燥することが困難であったため、調整された凍結乾燥サイクルが必要であった。凍結乾燥サイクルは、低い氷温を達成するために十分に低い真空および棚温度を有し、凍結乾燥ケーキのこのメルトバック／崩壊を防ぐように選択した。凍結乾燥ケーキの崩壊は、凍結乾燥プロセスの乾燥ステップ中にＥＭＩ−１３７が大きな構造体／凝集体を形成するのを防ぐために、避けなければならない（これはｐＨ６．８未満で起こることが判明しており、完全に可逆的ではない）。
【０２０１】
いくつかの初期製剤試験の後、および上記を考慮して、さらなる試験のために以下の変数を選択した：
・緩衝液：リン酸ナトリウムまたはトリスＨＣｌ（２５、４０および５５ｍＭ）；
・凍結乾燥保護剤：スクロースまたはマンニトール。
【０２０２】
（凍結乾燥製剤の例）
表４Ａ〜４Ｆに示すように、４つの変数と混合レベルデザインとを組み合わせた要因計画を使用して、製剤候補を調査した。デザインは、４つの変数（試料１〜８）、４つの中心点（試料１０〜１３）についての画分的に２つのレベルデザイン、ならびに医薬品有効成分（ＡＰＩ）の３つのレベルと、緩衝剤のタイプおよび凍結乾燥保護剤のタイプのカテゴリー変数の２つのレベルとについての混合レベルデザイン（試料１４〜２１）から構成した。さらに、様々な参照試料を含めた（試料２２〜２４）。追加試料２つ（試料２５および２６）も調査した。試料２５は、１ｍＬの水中で凍結乾燥する前の溶液の組成物を指し、試料２６は、前の試料の結果に基づいて調製したさらなる典型的な製剤を指している。
【０２０３】
【表４Ａ】
2021519300.tif 000022
【０２０４】
【表４Ｂ】
2021519300.tif 000023
【０２０５】
【表４Ｃ】
2021519300.tif 000024
【０２０６】
【表４Ｄ】
2021519300.tif 000025
【０２０７】
【表４Ｅ】
2021519300.tif 000026
【０２０８】
【表４Ｆ】
2021519300.tif 000027
【０２０９】
上記表４Ａ〜４Ｆの（１）、（２）、（３）および（４）の参照は、以下の通りである：
（１）０．２５ｍｇ／ｍＬ無水ＮａＨ２ＰＯ４＋３．２５ｍｇ／ｍＬ無水Ｎａ２ＨＰＯ４ 
（２）０．５６ｍｇ／ｍＬ無水ＮａＨ２ＰＯ４＋７．１４ｍｇ／ｍＬ無水Ｎａ２ＨＰＯ４ 
（３）０．４１ｍｇ／ｍＬ無水ＮａＨ２ＰＯ４＋５．１９ｍｇ／ｍＬ無水Ｎａ２ＨＰＯ４ 
（４）０．５０８７７ｍｇ／ｍＬ無水ＮａＨ２ＰＯ４＋６．４９４６７ｍｇ／ｍＬ無水Ｎａ２ＨＰＯ４
【０２１０】
使用した無水および水和リン酸ナトリウムの量を、下記の表５に示す。
【表５】
2021519300.tif 000028
【０２１１】
製剤に使用したモル質量は、以下の通りであった：
・リン酸二水素ナトリウム（無水物）＝１１９．９８ｇ／ｍｏｌ
・リン酸水素二ナトリウム（無水物）＝１４１．９６ｇ／ｍｏｌ
・トリスＨＣｌ＝１２１．１４ｇ／ｍｏｌ
・マンニトール＝１８２．１７ｇ／ｍｏｌ
・スクロース＝３４２．２９ｇ／ｍｏｌ
・ＥＭＩ−１３７＝３，６５０．３ｇ／ｍｏｌ
【０２１２】
上記から、リン酸ナトリウム緩衝液の範囲＝凍結乾燥前に４．２６〜１８．２６％ｗ／ｗ、凍結乾燥後に９．７８〜３５．２２％ｗ／ｗ、それに対してトリスＨＣＬ緩衝液の範囲＝凍結乾燥前に３．２７〜１２．６３％ｗ／ｗ、凍結乾燥後に３．２７〜１２．６３％ｗ／ｗであることがわかる。          
【０２１３】
製剤に使用した材料を、下記の表６に示す。
【表６】
2021519300.tif 000029
【０２１４】
スクリーニング試験に続いて、４週間の予備安定性試験を２５℃および４０℃で実施した。一連の実験を、選択した緩衝剤と凍結乾燥保護剤の両方のスクリーニングを達成し、生産に関わるＡＰＩ濃度（標的４．８ｍｇ／ｍｌ）付近での頑健性を試験するようにデザインした。目標濃度±１０％の範囲で試験を行った。このデザインは、ＥＭＩ−１３７、緩衝剤および凍結乾燥保護剤間の潜在的な相互作用を明らかにするものでもある。全ての試料を等張にしたため、緩衝剤濃度および凍結乾燥保護剤濃度は共変量であった。試験パラメータを表７に示す。凍結乾燥前のバルク溶液の工程内試験に加えて、潜在的な不安定性が凍結または乾燥のプロセスに起因するかどうかを明らかにするために、凍結ステップからの試料も試験に含めた。
【０２１５】
【表７】
2021519300.tif 000030
【０２１６】
（凍結乾燥製剤の結果）
２〜８℃で１０２ヶ月、３０℃で６１ヶ月および４０℃で６ヶ月の安定性データを、それぞれ表８Ａ〜８Ｃ、９Ａ〜９Ｃ、および１０に示す（以下のキーワード／略語を使用する：Ａｍｂ＝周囲湿度、調整なし；ＮＭＴ＝以下；ＮＤ＝不検出；−−−：不実施；＊２４ヶ月試料採取時点は、夏季休暇のため延期；＊＊追加のサンプリング時点）。
【０２１７】
【表８Ａ】
2021519300.tif 000031
【０２１８】
【表８Ｂ】
2021519300.tif 000032
【０２１９】
【表８Ｃ】
2021519300.tif 000033
【０２２０】
【表９Ａ】
2021519300.tif 000034
【０２２１】
【表９Ｂ】
2021519300.tif 000035
【０２２２】
【表９Ｃ】
2021519300.tif 000036
【０２２３】
【表１０】
2021519300.tif 000037
【０２２４】
試験パラメータは、上記の通りである（表７）。純度は、６５０ｎｍでのＵＶ／可視検出を備えたＨＰＬＣにより試験し、％面積単位で表した。凝集は、光子相関分光法（ＰＣＳ）によって測定された散乱強度として表した。凍結乾燥後の復元および外観の評価では、凍結乾燥ケーキの様々な特性を記述するために開発された評価システムに従った。
【０２２５】
（凍結乾燥後の外観）
一般的に、マンニトールの良好な増量特性は、全てのマンニトール含有製剤に非常に良好な構造を与えた。マンニトール−リン酸塩含有ケーキは、マンニトール−トリス−ＨＣｌ製剤とは対照的に、バイアル壁に不均一な青／白っぽい色を呈しているように見えた。原薬は濃い青色をしているため、これらの色のグラデーションが非常に顕著になった。不均一な外観は、部分的にはもともとランダムな凍結の性質に、部分的には製剤の特性に起因するものと予想された。水で復元すると、製品は均一溶液となった。その他の分析結果は、初期および予備安定期間の両方で、不均一な外観が純粋に表面的な問題であると考えられることを示した。トリスＨＣｌと組み合わせたスクロースは、凍結乾燥中に様々な程度で崩壊／溶融する傾向があった。バッチの５０％で、凍結乾燥ケーキに明らかな崩壊がなかったように、バイアル間でかなりのばらつきが見られた。４０℃で貯蔵すると、プラグの部分的な崩壊は、徐々に材料の完全な崩壊へと発展し、７日後にはすでに観察されていた。これは、崩壊した材料の水分濃度が上昇したためと考えられる。貯蔵中に見られた大きな崩壊は、純度、復元および凝集体の形成傾向に悪影響を及ぼした。
【０２２６】
（凍結乾燥後の復元）
凍結乾燥保護剤を含む緩衝製剤は全て、数秒間非常に穏やかにかき混ぜることで容易に復元された。結果は、４週間の貯蔵（２５℃および４０℃）後、崩壊のない試料および中程度に崩壊したプラグを有する試料については、変化しなかった。大きく崩壊した凍結乾燥プラグは、復元するのが非常に困難であった。これらの製品は純度も低く、凝集体を含んでいた。凍結乾燥保護剤のない製剤（試料２２〜２４）は、復元するためにより多く混合するが必要であったが、それでも許容範囲内と見なされた。
【０２２７】
（ｐＨ）
リン酸ナトリウム緩衝製剤では、ｐＨは凍結乾燥中に安定していたが、４０℃での４週間の貯蔵中に低下した。トリスＨＣｌ緩衝製剤では凍結乾燥中にｐＨが低下したが、４０℃での貯蔵中はほとんどの場合より安定していた。ｐＨの結果は解釈が難しく、ケモメトリックス分析では明確な理解が得られなかった。マンニトールまたはスクロースに起因する傾向は見られなかった。しかし、リン酸緩衝剤の濃度を上げると、貯蔵中のｐＨ低下が緩和されることは明らかであった。緩衝液濃度が低い場合、ＥＭＩ−１３７濃度が高くなると、ｐＨ低下は激しくなる。トリスＨＣｌ製剤は、ＥＭＩ−１３７原薬濃度の増加に対してさらに敏感であった。このことは、試験範囲上限の緩衝液濃度を選択する必要があることを示している。
【０２２８】
（凝集体（ＰＣＳ））
各製剤を、凍結乾燥の前後、および４週間の予備安定期間の終了時に、大きな構造体／凝集体の存在についてＰＣＳで試験した。中心点製剤（試料１０〜１３）についても、１週間後と２週間後に試験を行った。約２０ｋｓ／秒未満の値をバックグラウンドとみなし、凝集体とは判定しなかった。凍結乾燥前のバルク溶液では、いずれも凝集体は検出されなかった。凍結乾燥後、全ての凍結乾燥保護剤含有製剤に大きな構造体／凝集体はないと判定した。４０℃で４週間貯蔵した後でも、大きく崩壊した試料（試料１７）およびＥＭＩ−１３７を水中に含む非緩衝試料２４を除いて、全ての試料に凝集体４は含まれていなかった。後者の製剤は、ｐＨが４．２であった。低ｐＨでの凝集は、以前の初期の所見と一致していた。しかし、凍結乾燥保護剤（スクロースまたはマンニトール）を含まないリン酸緩衝剤製剤は、凍結乾燥後に凝集体を含んでいた（試料２３）。復元された試料の分析では、約１００ｎｍの大きな構造体の存在が示された。凍結後に取り出された試料には凝集体は見られなかったため、凝集体は、凍結ステップ中ではなく、乾燥プロセス中に形成されたものである。リン酸ナトリウム緩衝液は、リン酸塩の溶解度の違いおよび結晶化により、凍結中にｐＨ勾配を形成し、ｐＨを低い値に移行することが知られている。３．５という低いｐＨが報告されている。このｐＨでは、ＥＭＩ−１３７溶液中に凝集体が形成されることになる。凍結していても、凍結乾燥中にこのｐＨで長時間放置すると、凝集体が形成される可能性がある。マンニトールおよびスクロースがこれを防ぐと考えられた。（トリス−ＨＣｌ製剤では、凍結乾燥保護剤は必要なかった。トリスＨＣｌは、凍結中にｐＨを高ｐＨ（＞９）に移行させる）。著しいメルトバック／崩壊は製剤の凝集レベルに影響を与えるため、避けるべきであると結論づけられた。低ｐＨでは凝集体が形成されることが確認された。凍結乾燥中にリン酸緩衝液を成分として使用したとき、凍結乾燥プロセスの乾燥ステップ中にＥＭＩ−１３７が大きな構造／凝集体を形成するのを防ぐために、凍結乾燥保護剤が必要であった。
【０２２９】
（示差走査熱量測定（ＤＳＣ））
製剤設計の中心点を表す製剤を、凍結濃縮試料としてＤＳＣで分析した。約２０μｌの試料を密閉アルミニウム製るつぼに入れ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｄｉａｍｏｎｄ  ＤＳＣ装置を使用して分析した。試料を５℃／分で−８０℃に冷却し、−８０℃で１０分間置いた後、窒素雰囲気下で５℃／分で２４℃に加熱した。全ての計算は、加熱時に収集したデータに基づいて行った。
【０２３０】
（マンニトール製剤）
トリスＨＣｌ−マンニトール製剤のサーモグラムは複雑であり、３つの異なるガラス転移と２つの結晶化ピークを示した。−６０℃未満でガラス転移が１回発生したにもかかわらず、凍結乾燥ケーキの視覚的な崩壊は観察されなかった。これは、結晶化したマンニトールの増量特性によるものと思われる。リン酸塩−マンニトール製剤のサーモグラムは、２つのガラス転移と１つの結晶化ピークを示した。ガラス転移の１つは−５０℃〜−６０℃の間に発生したが、これは通常の凍結乾燥機の実用的な動作温度よりも著しく低い温度であった。もう１つのガラス転移は−４１℃付近で発生したが、これは凍結乾燥サイクルを設計する際の動作限界に近い温度である。凍結乾燥ケーキのわずかな収縮を除いて、リン酸塩−マンニトール製剤の巨視的なメルトバック／崩壊はなかった。マンニトールは部分的に結晶化しており、マンニトールの結晶化部分は凍結乾燥品に機械的安定性を与えるのに十分であると予想された。製剤の加熱時に、マンニトールのＴｇ’（−３３℃〜−２７℃）をわずかに上回って再結晶が起こり得るため、−２７．６℃で観察された発熱結晶化ピーク（Ｔ結晶化開始）は、マンニトールの可能性のある失透温度に対応している。
【０２３１】
（スクロース製剤）
スクロース含有製剤のサーモグラムは、−５０℃をはるかに下回るガラス転移と、約−３５℃〜−３７℃のガラス転移とそれぞれ一致する２つの熱事象を示した。結晶化または共晶融解ピークは、どのスクロース含有製剤でも観察されず、スクロースの含有量と一致していた。しかし、非常に小さな結晶化反応からの熱流は、水の吸熱溶融の低温側からのはるかに高い熱流と重なる場合、見分けがつかないであろう。著しい視覚的崩壊は、トリスＨＣｌ−スクロース含有バイアルのいくつかで見られたが、リン酸塩−スクロース含有製剤では見られなかった。ＤＳＣデータは、リン酸塩−スクロース含有製剤（試料１３）に有利に解釈できたが、リン酸塩−スクロース製剤で類似の問題が発生することが予想されるかどうかを判断するには、わずか１２本のバイアルのバッチサイズは小さすぎると結論づけられた。
【０２３２】
（近赤外分析（ＮＩＲ））
マンニトールは、冷却中および再加熱中の両方において、凍結水溶液から結晶化する傾向が強いことがよく知られており、また、凍結乾燥プロセスで、部分的に非晶質で部分的に結晶化した材料を生成する可能性があるため、凍結乾燥後も結晶化し続けることが観察されている。凍結乾燥中の結晶化は、異なる無水多形（α、β、δ）およびそれらの混合物をもたらすことができ、これは、貯蔵中の多形転移の余地を残す。
【０２３３】
主成分分析（ＰＣＡ）と組み合わせた予備的ＮＩＲ試験では、バイアル間の構造的な差異が存在し、これが様々な程度の結晶化に起因していることが示された。
【０２３４】
（ＨＰＬＣ純度）
ＨＰＬＣ純度プロファイルから、純粋なＥＭＩ−１３７と比較して、リン酸塩およびトリス−ＨＣｌの両方の製剤の純度プロファイルが非常に類似しており、分解パターンも類似していることが示された。また、スクロースおよびマンニトール含有製剤の純度プロファイルも類似していた。いくつかのピーク間には、いくつかの小さな比率の違いが見られた。ＥＭＩ−１３７原薬と比較したとき、いずれの製剤においても新たなピークは見られなかった。緩衝液濃度は、影響を与えないようであった。しかし、視覚的外観分析中に、一部のバイアルの外観が完全であったのに対し、他のバイアルでは凍結乾燥ケーキが著しく崩壊していたように、トリス−ＨＣｌと組み合わせたスクロースは、崩壊したバイアルに関して、バイアル間のばらつきを生じさせることが観察された。トリスＨＣｌとリン酸ナトリウムはどちらもＴｇ’が低い物質であるため、リン酸塩スクロース含有製剤の可能性のある類似の問題を明らかにするには、１２本のバイアルのバッチサイズは小さすぎると判断された。
【０２３５】
（ケモメトリックス分析の概要）
ケモメトリックスモデリングは、様々な凍結乾燥製剤に応じたＨＰＬＣ純度の、４０℃で最大４週間にわたる変化、分解した凍結乾燥バイアルと分解していない凍結乾燥バイアルにおける有意な変化を識別するためのＮＩＲスペクトルの化学変化、およびＰＣＳで測定された凝集体の変化に焦点を当てた。ケモメトリックスモデリングにより、トリス−ＨＣｌを含有する全ての製剤が、リン酸緩衝製剤と比較してより分解することが示されたが、これはＨＰＬＣ純度データの視覚的比較からは容易には検出できなかった。ケモメトリックス分析の応答曲面は、トリスＨＣｌ濃度の増加が分解と化学的相互作用との増加につながることを示している。一般的に、トリスＨＣｌ含有製剤は、リン酸塩よりも化学的分解に関して予測しにくいと結論づけられた。これは、試料１０〜１２（スクリーニング試験の中心点を表す）から得られたＮＩＲスペクトルの主成分分析（ＰＣＡ）、およびＮＩＲとＨＰＬＣ純度との相関によって支持された。
【０２３６】
リン酸ナトリウムを含有する製剤を用いて作成されたケモメトリックスモデルは、正確で信頼性の高いものであった。スクロースとの組み合わせでは、リン酸緩衝剤はほとんど分解が起こらず、試験した製剤空間内では化学的に非常に安定していた。しかし、凍結乾燥中の崩壊が潜在的な問題にならないことを確認するためには、より多くの試験が必要であった。マンニトールと組み合わせたリン酸ナトリウムは、分析された全てのパラメータから判断して、適切な製剤を提供すると結論づけられた。
【０２３７】
（頑健性／デザインスペース）
ＨＰＬＣトレースでは、緩衝液濃度は分解プロファイルに重要な影響を与えないと思われることが示されたが、ケモメトリックス分析では、マンニトールを含む製剤の場合、リン酸塩濃度を上げることで、より化学的に安定した製品が得られると期待できることが示された。応答曲面は、緩衝液濃度が４０ｍＭを超えると特に安定な領域を示し、分解はＥＭＩ−１３７濃度の影響をあまり受けなかった。ＥＭＩ−１３７の目標濃度付近±１０％のデザインスペースが試験された。これは、原薬の含有量の通常の仕様範囲をカバーしている。この範囲内でのＥＭＩ−１３７濃度の変動は、より高い緩衝液濃度では純度にほとんど影響を与えず、製造中の製剤に十分な頑健性を与えることがわかった。ｐＨ変化の応答曲面からは，リン酸ナトリウム緩衝液濃度を上げることで、貯蔵中のｐＨ変化が緩和することが示された。また、緩衝液濃度が低すぎると、ＥＭＩ−１３７濃度の変化に対して製剤が頑健にならないことも確認された。緩衝液濃度が４０ｍＭを超えると、ＥＭＩ−１３７濃度が目標濃度（４．８ｍｇ／ｍｌ）から±１０％変動した場合、ｐＨ変化は０．２  ｐＨ単位未満であった。５０ｍＭを超えると、貯蔵中の予測ｐＨ変化は小さく、ＥＭＩ−１３７濃度と緩衝液濃度の両方の変動に対して安定しており、製造中の製剤に良好な頑健性を与えた。多変量解析では、４．３〜５．３ｍｇ／ｍｌの間で変動する原薬濃度で、医薬品の品質に影響を与えることなく、緩衝液濃度を４０〜５５ｍＭの間で変動させることが可能であると示された。
【０２３８】
（ｃＭｅｔ受容体親和性ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験）
試料１１を、ｃ−Ｍｅｔ受容体に対する親和性について試験し、純粋なＥＭＩ−１３７原薬と同等の結合データを示した。マンニトール−４０ｍＭリン酸塩製剤は、ペプチドの標的受容体への結合に悪影響を及ぼさないと結論づけられた。
【０２３９】
（凍結乾燥製剤の結果の検討）
上の表に示すように、ＥＭＩ−１３７は、高温下でも長期間（１０２ヶ月）にわたって安定しており、貯蔵寿命が長くなっている。測定期間にわたって製品の分解傾向が見られないことも注目に値し、これは優れた安定性の証拠である。測定期間中に関連物質（すなわち、不純物）が実質的に形成されていないこと、つまり、これらの形成傾向がないことも驚くべきことである。さらに、復元すると、製剤は静脈内投与に適したｐＨ（約ｐＨ７．５）を有し、凝集することなく可溶化する。さらに、乾燥した凍結乾燥固体は、不均一な青色の外観を保持している。復元した製剤は、復元後２４時間まで安定しており、関連物質を実質的に含まないことも注目に値する。したがって、ＥＭＩ−１３７製剤は、乾燥（凍結乾燥）および復元形態の両方で非常に安定していることが示された。
【０２４０】
分析結果およびケモメトリックス分析に基づいて、下記の結論が導き出された。
【０２４１】
中性ｐＨを維持し、凝集を避けるためには、製剤の調製時および凍結乾燥時に緩衝剤を添加する必要がある。全ての結果のケモメトリックス分析に基づいて、リン酸ナトリウム緩衝剤は、トリスＨＣｌ製剤よりも頑健であると判断された。リン酸緩衝剤の最小濃度は４０ｍＭである必要がある。リン酸緩衝剤を凍結乾燥するためには、乾燥プロセス中の凝集体形成を防止するために、凍結乾燥保護剤が必要であった。マンニトールは、良好な凍結乾燥保護剤活性を有することが示された。大きく崩壊した凍結乾燥ケーキは、復元が難しく、純度が低く、凝集体を形成する傾向があった。これは、中程度ではあるが明らかにメルトバック／崩壊が見られるバイアルでは見られなかった。リン酸ナトリウム−スクロース含有製剤は、化学的に最も頑健な製剤と考えられていたが、凍結乾燥の観点から見ると、それほど頑健ではなかった可能性がある。凍結乾燥したリン酸ナトリウム−マンニトール製剤は、外観が不均一であり、凍結乾燥ケーキに色のグラデーションが現れるため、トリスＨＣｌ−マンニトール製剤よりも「薬理学的に洗練されて」はなかった。これは凍結段階に起因するものと予想され、製品は復元時に均一溶液を形成したため、許容範囲内であると結論づけられた。トリスＨＣｌ含有製剤は一般的に予測データが少なく、ケモメトリックス分析に基づいて、これらの製剤は潜在的にリスクの高い（それでも有効ではあるが）選択であると考えられた。本試験の全体的な結論は、リン酸ナトリウム−マンニトール含有製剤は、利用可能な限られた予備安定性データ、分析データのケモメトリックス分析、および頑健性の考慮に基づいて、リスク、予測可能性および受容性の十分なバランスを提供すると考えられるが、トリスＨＣｌおよびスクロースも、独立して代替品として使用される可能性があるというものであった。
【０２４２】
（要約）
本発明は、ＡＰＩの十分な安定性を得るためには、凍結乾燥製剤が必要であることを教示している。復元後の医薬品は、等張溶液であり、静脈内投与に適した生理的ｐＨを有することが必要である。水中のＥＭＩ−１３７はｐＨが４．６であり、大きな構造体または凝集体の形成が顕著に見られる。この凝集は、溶液のｐＨを上げても一部しか可逆的ではないため、静脈内投与には不向きである。そのため、ｐＨは６．８より大きく９未満（またはそれより低い可能性がある）が有利であり、その理由はこのｐＨ範囲では凝集体の形成が観察されないためである。このｐＨ範囲は常に維持する必要があり、バルク医薬品溶液の製造時にも適用する必要がある。したがって、ＥＭＩ−１３７溶液のｐＨを許容可能な範囲内に維持するために、凍結乾燥の前に緩衝剤を溶液に含めることが有益である。また、凍結乾燥中にＥＭＩ−１３７が分解しないようにするための凍結乾燥保護剤と、復元された製剤が等張および／または静脈内投与に適しているようにするための張度調節剤（これは、凍結乾燥保護剤と同じ材料であり得る）とを含めることも有益である。
【０２４３】
上記のような緩衝剤および凍結乾燥保護剤／張度調節剤を使用すると、安定で、復元時に静脈内投与に適したｐＨおよび張度である均一固体が得られる。さらに、記載されている製剤は、凍結乾燥中に十分なｐＨを保持し、凝集が起こるのを防ぎ、ＥＭＩ−１３７のジスルフィド架橋を破壊させることはない。さらに、この製剤は、顕著な分解を伴わずに長期間室温で保存可能であり、復元時および復元後も安定したままである。
【０２４４】
上述のように、復元時にＥＭＩ−１３７溶液のｐＨを許容可能な範囲内に維持するためには、凍結乾燥の前に緩衝剤を含めることが必要である。
【０２４５】
本発明の記載された実施形態に対する様々な修正および変形は、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本発明は、特定の実施形態に関連して記載してきたが、クレームされる発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、当業者にとって自明な本発明を実施するための記載されたモードの様々な修正は、本発明によってカバーされることが意図されている。
【０２４６】
（略語）
従来の１文字または３文字のアミノ酸の略語が使用されている。
Ａｃｍ：アセトアミドメチル
ＡＣＮ（またはＭｅＣＮ）：アセトニトリル
Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド  ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＢＴＵ：Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
ＨＳＰｙＵ：Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチレンウロニウムヘキサフルオロリン酸塩
ＮＨＳ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＮＭＭ：Ｎ−メチルモルホリン
ＮＭＰ：１−メチル−２−ピロリジノン
Ｐｂｆ：２，２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ｔＢｕ：ｔ−ブチル
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＩＳ：トリイソプロピルシラン
Ｔｒｔ：トリチル
トリスＨＣｌ：２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール塩酸塩
【０２４７】
（配列表フリーテキスト）
配列番号１
Ｃｙｓａ−Ｘａａ１−Ｃｙｓｃ−Ｘａａ２−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘａａ３−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓｄ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓｂ−Ｔｙｒ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６
Ｘａａ１は、Ａｓｎ、ＨｉｓまたはＴｙｒである；
Ｘａａ２は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＡｓｎである；
Ｘａａ３は、ＴｈｒまたはＡｒｇである；
Ｘａａ４は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＳｅｒである；
Ｘａａ５は、ＳｅｒまたはＴｈｒである；
Ｘａａ６は、ＡｓｐまたはＧｌｕである。
１７量体ｃＭＥＴ結合ペプチド
配列番号２
Ｓｅｒ−Ｃｙｓａ−Ｘａａ１−Ｃｙｓｃ−Ｘａａ２−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘａａ３−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓｄ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓｂ−Ｔｙｒ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６
Ｘａａ１は、Ａｓｎ、ＨｉｓまたはＴｙｒである；
Ｘａａ２は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＡｓｎである；
Ｘａａ３は、ＴｈｒまたはＡｒｇである；
Ｘａａ４は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＳｅｒである；
Ｘａａ５は、ＳｅｒまたはＴｈｒである；
Ｘａａ６は、ＡｓｐまたはＧｌｕである。
１８量体ｃＭＥＴ結合ペプチド
配列番号３
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓａ−Ｘａａ１−Ｃｙｓｃ−Ｘａａ２−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘａａ３−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓｄ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓｂ−Ｔｙｒ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ
Ｘａａ１は、Ａｓｎ、ＨｉｓまたはＴｙｒである；
Ｘａａ２は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＡｓｎである；
Ｘａａ３は、ＴｈｒまたはＡｒｇである；
Ｘａａ４は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＳｅｒである；
Ｘａａ５は、ＳｅｒまたはＴｈｒである；
Ｘａａ６は、ＡｓｐまたはＧｌｕである。
２２量体ｃＭＥＴ結合ペプチド。
配列番号４
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ
ｃＭＥＴ結合ペプチドの一部であるテトラペプチド配列。
配列番号５
Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ
ｃＭＥＴ結合ペプチドの一部であるテトラペプチド配列。
配列番号６
Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ
ｃＭＥＴ結合ペプチドの一部である５ペプチド配列。
配列番号７
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ
２６量体ｃＭＥＴ結合ペプチド
配列番号８
Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ
２６量体のスクランブリングされたｃＭＥＴ結合ペプチド（陰性対照）。
【図１】
2021519300.tif 000040
【配列表】
2021519300000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年4月3日(2020.4.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）医薬品有効成分（ＡＰＩ）と；
（ｉｉ）緩衝剤と；
（ｉｉｉ）凍結乾燥保護剤と
を含む凍結乾燥製剤であって、前記ＡＰＩが、哺乳動物の身体を光学的にイメージングするのに適した、少なくとも１種のｃＭｅｔ結合ペプチドを含むイメージング剤であり、前記イメージング剤が式Ｉの化合物を含み：
【化１】
2021519300.tif 000041
（式Ｉ）
（式中、
Ｚ１は、ｃＭＢＰのＮ末端に結合しており、ＨまたはＭＩＧである；
Ｚ２は、ｃＭＢＰのＣ末端に結合しており、ＯＨ、ＮＨ２、ＯＢｃ（Ｂｃは生体適合性カチオンである）またはＭＩＧである；
ｃＭＢＰは、１７〜３０個のアミノ酸のｃＭｅｔ結合環状ペプチドであり、下記のアミノ酸配列（配列番号１）を含む：
Ｃｙｓａ−Ｘａａ１−Ｃｙｓｃ−Ｘａａ２−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘａａ３−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓｄ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓｂ−Ｔｙｒ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６
（Ｘａａ１は、Ａｓｎ、ＨｉｓまたはＴｙｒである；
Ｘａａ２は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＡｓｎである；
Ｘａａ３は、ＴｈｒまたはＡｒｇである；
Ｘａａ４は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＳｅｒである；
Ｘａａ５は、ＳｅｒまたはＴｈｒである；
Ｘａａ６は、ＡｓｐまたはＧｌｕである；
Ｃｙｓａ−ｄはそれぞれシステイン残基であって、残基ａとｂと、ならびに残基ｃとｄとが環化して２つの別個のジスルフィド結合を形成している）；
ＭＩＧは代謝阻害基であって、前記ペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ代謝を阻害または抑制する生体適合性基である；
Ｌは、式−（Ａ）ｍ−の合成リンカー基である
（各Ａは、独立して、−ＣＲ２−、−ＣＲ＝ＣＲ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＲ２ＣＯ２−、−ＣＯ２ＣＲ２−、−ＮＲＣＯ−、−ＣＯＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ−、−ＳＯ２ＮＲ−、−ＮＲＳＯ２−、ＣＲ２ＯＣＲ２−、−ＣＲ２ＳＣＲ２−、ＣＲ２ＮＲＣＲ２−、Ｃ４−８シクロヘテロアルキレン基、Ｃ４−８シクロアルキレン基、Ｃ５−１２アリーレン基、Ｃ３−１２ヘテロアリーレン基、アミノ酸、糖または単分散ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ビルディングブロックである；
各Ｒは、独立して、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、Ｃ２−４アルケニル、Ｃ２−４アルキニル、Ｃ１−４アルコキシアルキルまたはＣ１−４ヒドロキシアルキルから選択される；
ｍは、値１〜２０の整数である）；
ｎは、値０または１の整数である；
ＩＭは、紫色〜近赤外波長（４００〜１，２００ｎｍ）の光を使用して哺乳動物の身体をイメージングするのに適した光学レポーターイメージング部位である）；
ＡＰＩを約４〜約１２重量％、緩衝剤を約３〜約３５重量％、凍結乾燥保護剤を約５６〜約９１重量％含み；復元したときに、約ｐＨ６．３〜約ｐＨ９の間のｐＨを有する、凍結乾燥製剤。
【請求項２】
配列番号１に加えて、前記ｃＭＢＰがさらに、Ｃ−またはＮ−ｃＭＢＰペプチド末端のいずれかの４個のアミノ酸残基内に、ＡｓｐもしくはＧｌｕ残基、またはそれらの類似体を含み、−（Ｌ）ｎＩＭがアミン基で官能化されており、このアミン基が前記ＡｓｐもしくはＧｌｕ残基、またはそれらの類似体のカルボキシル側鎖にコンジュゲートしてアミド結合を与えている、請求項１に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項３】
配列番号１に加えて、前記ｃＭＢＰが、Ｃ−またはＮ−ｃＭＢＰペプチド末端のいずれかの４個のアミノ酸残基内に、Ｌｙｓ残基、またはその類似体を含み、−（Ｌ）ｎＩＭがカルボキシル基で官能化されており、このカルボキシル基が前記Ｌｙｓ残基、またはその類似体のε−アミン側鎖にコンジュゲートしてアミド結合を与えている、請求項１または２に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項４】
ｃＭＢＰが、下記の配列番号２または配列番号３のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤：
Ｓｅｒ−Ｃｙｓａ−Ｘａａ１−Ｃｙｓｃ−Ｘａａ２−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘａａ３−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓｄ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓｂ−Ｔｙｒ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６（配列番号２）；
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓａ−Ｘａａ１−Ｃｙｓｃ−Ｘａａ２−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘａａ３−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓｄ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓｂ−Ｔｙｒ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（配列番号３）。
【請求項５】
Ｘａａ３がＡｒｇである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項６】
配列番号１、配列番号２または配列番号３に加えて、ｃＭＢＰがさらに、そのＮ−またはＣ−末端のいずれかに、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（配列番号４）、−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−（配列番号５）および−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ（配列番号６）から選択されるリンカーペプチドを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項７】
ｃＭＢＰが、下記のアミノ酸配列（配列番号７）を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤：
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓａ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓｃ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓｄ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓｂ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ。
【請求項８】
Ｚ１およびＺ２の両方が、独立してＭＩＧである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項９】
Ｚ１がアセチルであり、Ｚ２が第一級アミドである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項１０】
ｎが０である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項１１】
ＩＭが、６００〜１，０００ｎｍの範囲の最大吸光度を有する染料である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項１２】
ＩＭがシアニン染料である、請求項１１に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項１３】
前記シアニン染料が式ＩＩＩを有する、請求項１２に記載の凍結乾燥製剤：
【化２】
2021519300.tif 000042
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、ＨまたはＳＯ３Ｍ１であり、Ｒ１およびＲ２のうちの少なくとも１つはＳＯ３Ｍ１（Ｍ１はＨまたはＢｃである）である；
Ｒ３およびＲ４は、独立して、Ｃ１−４アルキルまたはＣ１−６カルボキシアルキルである；
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立してＲａ基である（Ｒａは、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−６カルボキシアルキルまたは−（ＣＨ２）ｋＳＯ３Ｍ１（ｋは、値３または４の整数である）である）；
ただし、前記シアニン染料は、前記Ｒ１、Ｒ２およびＲａ基に合計１〜４個のＳＯ３Ｍ１置換基を有することを条件とする）。
【請求項１４】
復元したときに、約ｐＨ６．５〜約ｐＨ８．５の間、任意選択で約ｐＨ６．８〜約ｐＨ８．２の間、任意選択で約ｐＨ６．８〜約ｐＨ８の間、任意選択で約ｐＨ７〜約ｐＨ８の間のｐＨを有する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項１５】
復元したときに、前記緩衝剤が、約ｐＨ６．３〜約ｐＨ９の間、任意選択で約ｐＨ６．３〜約ｐＨ９の間、任意選択で約ｐＨ６．５〜約ｐＨ８．５の間、任意選択で約ｐＨ６．８〜約ｐＨ８．２の間、任意選択で約ｐＨ６．８〜約ｐＨ８の間、任意選択で約ｐＨ７〜約ｐＨ８の間のｐＨを有する溶液を提供する量で存在する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項１６】
ＡＰＩ：緩衝剤のモル比が、ＡＰＩ約１モル：緩衝剤約１７〜約４７モル、任意選択でＡＰＩ約１モル：緩衝剤約２７〜約４７モル、任意選択でＡＰＩ約１モル：緩衝剤約３０〜約４７モル、任意選択でＡＰＩ約１モル：緩衝剤約３４〜約４７モル、任意選択でＡＰＩ約１モル：緩衝剤約２７〜約３８モル、任意選択でＡＰＩ約１モル：緩衝剤約３０〜約３８モル、任意選択でＡＰＩ約１モル：緩衝剤約３４〜約３８モルである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項１７】
ＡＰＩ：凍結乾燥保護剤のモル比が、ＡＰＩ約１モル：凍結乾燥保護剤約１０５〜約２１６モル、任意選択でＡＰＩ約１モル：凍結乾燥保護剤約１０５〜約１６３モル、任意選択でＡＰＩ約１モル：凍結乾燥保護剤約１０５〜約１５４モル、任意選択でＡＰＩ約１モル：凍結乾燥保護剤約１０５〜約１４５モル、任意選択でＡＰＩ約１モル：凍結乾燥保護剤約１０５〜約１４１モル、任意選択でＡＰＩ約１モル：凍結乾燥保護剤約１０５〜約１３２モル、任意選択でＡＰＩ約１モル：凍結乾燥保護剤約１０５〜約１２９モル、任意選択でＡＰＩ約１モル：凍結乾燥保護剤約１２９〜約２１６モル、任意選択でＡＰＩ約１モル：凍結乾燥保護剤約１２９〜約１６３モル、任意選択でＡＰＩ約１モル：凍結乾燥保護剤約１２９〜約１５４モル、任意選択でＡＰＩ約１モル：凍結乾燥保護剤約１２９〜約１４５モル、任意選択でＡＰＩ約１モル：凍結乾燥保護剤約１２９〜約１４１モル、任意選択でＡＰＩ約１モル：凍結乾燥保護剤約１２９〜約１３２モルである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項１８】
前記製剤が、ＡＰＩを約４〜約１２重量％、任意選択でＡＰＩを約８〜約１０重量％、任意選択でＡＰＩを約９重量％含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項１９】
前記製剤が、任意選択で緩衝剤を約７〜約３５重量％、任意選択で緩衝剤を約１２〜約３５重量％、任意選択で緩衝剤を約１５〜約３５重量％、任意選択で緩衝剤を約１８〜約３５重量％、任意選択で緩衝剤を約２５〜約３５重量％、任意選択で緩衝剤を約３２〜約３５重量％、任意選択で緩衝剤を約３２％含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項２０】
前記製剤が、任意選択で凍結乾燥保護剤を約５６〜約８２重量％、任意選択で凍結乾燥保護剤を約５６〜約７７重量％、任意選択で凍結乾燥保護剤を約５６〜約７５重量％、任意選択で凍結乾燥保護剤を約５６〜約７２重量％、任意選択で凍結乾燥保護剤を約５６〜約６６重量％、任意選択で凍結乾燥保護剤を約５６〜約５８重量％、任意選択で凍結乾燥保護剤を約５８重量％を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項２１】
前記緩衝剤が、リン酸緩衝剤およびアルカノールアミン緩衝剤のうちの少なくとも１つである、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項２２】
前記リン酸緩衝剤がリン酸水素およびリン酸二水素を含み、任意選択で前記リン酸緩衝剤が水和している、請求項２１に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項２３】
前記アルカノールアミン緩衝剤がトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンである、請求項２１または２２に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項２４】
前記凍結乾燥保護剤が、スクロースおよびマンニトール、ならびにそれらの誘導体のうちの少なくとも１つである、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項２５】
前記凍結乾燥保護剤がマンニトールまたはその誘導体である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項２６】
前記製剤がさらに張度調節剤を含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項２７】
前記凍結乾燥保護剤が張度調節剤としても作用する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項２８】
凍結乾燥製剤の調製方法であって、
ａ）医薬品有効成分（ＡＰＩ）、緩衝剤、および凍結乾燥保護剤を凍結乾燥容器に供給する工程と；
ｂ）第１水分除去ステップを実行する工程と；
ｃ）第２水分除去ステップを実行する工程と
を含み、前記凍結乾燥を行う前に、前記凍結乾燥保護剤および前記緩衝剤を添加する方法であり、前記ＡＰＩが、哺乳動物の身体を光学的にイメージングするのに適した、少なくとも１種のｃＭｅｔ結合ペプチドを含むイメージング剤であり、前記イメージング剤が式Ｉの化合物を含み：
【化３】
2021519300.tif 000043
（式Ｉ）
（式中、
Ｚ１は、ｃＭＢＰのＮ末端に結合しており、ＨまたはＭＩＧである；
Ｚ２は、ｃＭＢＰのＣ末端に結合しており、ＯＨ、ＮＨ２、ＯＢｃ（Ｂｃは生体適合性カチオンである）またはＭＩＧである；
ｃＭＢＰは、１７〜３０個のアミノ酸のｃＭｅｔ結合環状ペプチドであり、下記のアミノ酸配列（配列番号１）を含む：
Ｃｙｓａ−Ｘａａ１−Ｃｙｓｃ−Ｘａａ２−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘａａ３−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓｄ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓｂ−Ｔｙｒ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６
（Ｘａａ１は、Ａｓｎ、ＨｉｓまたはＴｙｒである；
Ｘａａ２は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＡｓｎである；
Ｘａａ３は、ＴｈｒまたはＡｒｇである；
Ｘａａ４は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＳｅｒである；
Ｘａａ５は、ＳｅｒまたはＴｈｒである；
Ｘａａ６は、ＡｓｐまたはＧｌｕである；
Ｃｙｓａ−ｄはそれぞれシステイン残基であって、残基ａとｂと、ならびに残基ｃとｄとが環化して２つの別個のジスルフィド結合を形成している）；
ＭＩＧは代謝阻害基であって、前記ペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ代謝を阻害または抑制する生体適合性基である；
Ｌは、式−（Ａ）ｍ−の合成リンカー基である
（各Ａは、独立して、−ＣＲ２−、−ＣＲ＝ＣＲ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＲ２ＣＯ２−、−ＣＯ２ＣＲ２−、−ＮＲＣＯ−、−ＣＯＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ−、−ＳＯ２ＮＲ−、−ＮＲＳＯ２−、ＣＲ２ＯＣＲ２−、−ＣＲ２ＳＣＲ２−、ＣＲ２ＮＲＣＲ２−、Ｃ４−８シクロヘテロアルキレン基、Ｃ４−８シクロアルキレン基、Ｃ５−１２アリーレン基、Ｃ３−１２ヘテロアリーレン基、アミノ酸、糖または単分散ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ビルディングブロックである；
各Ｒは、独立して、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、Ｃ２−４アルケニル、Ｃ２−４アルキニル、Ｃ１−４アルコキシアルキルまたはＣ１−４ヒドロキシアルキルから選択される；
ｍは、値１〜２０の整数である）；
ｎは、値０または１の整数である；
ＩＭは、紫色〜近赤外波長（４００〜１，２００ｎｍ）の光を使用して哺乳動物の身体をイメージングするのに適した光学レポーターイメージング部位である）；
前記製剤が、ＡＰＩを約４〜約１２重量％、緩衝剤を約３〜約３５重量％、凍結乾燥保護剤を約５６〜約９１重量％含み；前記製剤が、復元したときに、約ｐＨ６．３〜約ｐＨ９の間のｐＨを有する、方法。
【請求項２９】
第１水分除去ステップを、約−３０℃以下、任意選択で約−３５℃以下、任意選択で約−３８℃以下の温度で行う、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
第２水分除去ステップを、約１０℃以上、任意選択で約１５℃以上、任意選択で約２０℃以上の温度で行う、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
第１および第２水分除去ステップのうちの少なくとも１つを、５０μｂａｒ以下の圧力で行う、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
第１および第２水分除去ステップの両方を、５０μｂａｒ以下の圧力で行う、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記凍結乾燥製剤が、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤である、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の方法によって調製された凍結乾燥製剤。
【請求項３５】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載の製剤と生体適合性担体とを、哺乳動物への投与に適した形態で含む医薬組成物。
【請求項３６】
約ｐＨ６．３〜約ｐＨ９の間、任意選択で約ｐＨ６．３〜約ｐＨ９の間、任意選択で約ｐＨ６．５〜約ｐＨ８．５の間、任意選択で約ｐＨ６．８〜約ｐＨ８．２の間、任意選択で約ｐＨ７〜約ｐＨ８の間のｐＨを有する、請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
請求項３５または３６に記載の医薬組成物を調製するためのキットであって、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の製剤を無菌固体形態で含み、請求項３５または３６に記載の生体適合性担体の無菌供給物で復元させると、溶解が起こり、前記所望の医薬組成物が得られるような、キット。
【請求項３８】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載の製剤および請求項３５または３６に記載の医薬組成物のうちの少なくとも１つを使用することを含む、前記哺乳動物の身体のイメージング方法。
【請求項３９】
前記イメージングがｉｎ  ｖｉｖｏである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記イメージングが光学イメージングである、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記イメージングが、ｃＭｅｔの過剰発現部位または局在部位の画像を得るためのものである、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載の製剤または請求項３５もしくは３６に記載の医薬組成物を、前記哺乳動物の身体に前もって投与している、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
請求項３８〜４２のいずれか一項に記載の方法であって、
（ａ）対象の組織表面を励起光で照らす工程と；
（ｂ）前記イメージング剤の励起により発生した前記イメージング剤からの蛍光を検出する工程と；
（ｃ）任意選択で、蛍光検出器によって検出した前記光をフィルタリングして蛍光成分を分離する工程と；
（ｄ）工程（ｂ）または（ｃ）の蛍光から前記対象の組織表面の画像を形成する工程と
を含む、方法。
【請求項４４】
工程（ａ）の励起光が、本質的に連続波（ＣＷ）である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
請求項３８〜４２のいずれか一項に記載の方法であって、
（ａ）前記哺乳動物の身体の不均一組成を有する光散乱生体組織を、所定の経時変化する強度の光源からの光にさらして前記イメージング剤を励起させる工程であって、前記組織が前記励起光を多重散乱させる工程と；
（ｂ）前記露光に応答した前記組織からの多重散乱発光を検出する工程と；
（ｃ）プロセッサを用いて複数の値を確立することにより、前記発光から前記組織全体の蛍光特性を定量化する工程であって、前記値が、前記組織内の異なる位置における前記蛍光特性のレベルにそれぞれ対応しており、前記蛍光特性のレベルが、前記組織の不均一組成によって変化するものである工程と；
（ｄ）工程（ｃ）の値に従って前記組織の不均一組成をマッピングすることにより、前記組織の画像を生成する工程と
を含む、方法。
【請求項４６】
前記光学イメージング方法が、蛍光イメージング、任意選択で蛍光内視鏡検査を含む、請求項３８〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
検出、診断、手術、病期分類、治療、治療の監視、疾患進行の監視または監視療法を補助するために使用される、請求項３８〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前がん症状およびがんのうちの１つもしくは複数の、任意選択で結腸直腸がん、食道がん、乳がん、前立腺がん、頭部がん、頸部がん、卵巣がん、直腸がん、膵臓がん、甲状腺がん、胃がんおよび肉腫のうちの１つもしくは複数の検出、診断、手術、病期分類、治療、治療の監視、疾患進行の監視または監視療法を補助するために使用される、請求項３８〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
請求項３８〜４８のいずれか一項に記載のイメージング方法を含んでなる、検出、診断、手術、病期分類、治療、治療の監視、疾患進行の監視または監視療法の方法。
【請求項５０】
前記哺乳動物の身体のイメージングにおけるイメージング剤として使用するための、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の製剤、または請求項３５もしくは３６に記載の医薬組成物。
【請求項５１】
薬剤として使用するための、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の製剤、または請求項３５もしくは３６に記載の医薬組成物。
【請求項５２】
検出、診断、手術、病期分類、治療、治療の監視、疾患進行の監視または監視療法において使用するための、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の製剤、または請求項３５もしくは３６に記載の医薬組成物。
【請求項５３】
前がん症状およびがんのうちの１つもしくは複数の、任意選択で結腸直腸がん、食道がん、乳がん、前立腺がん、頭部がん、頸部がん、卵巣がん、直腸がん、膵臓がん、甲状腺がん、胃がんおよび肉腫のうちの１つもしくは複数の検出、診断、手術、病期分類、治療、治療の監視、疾患進行の監視または監視療法において使用するための、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の製剤、または請求項３５もしくは３６に記載の医薬組成物。
【請求項５４】
ｃＭｅｔの過剰発現部位または局在部位の検出、診断、手術、病期分類、治療、治療の監視、疾患進行の監視または監視療法において使用するための、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の製剤、または請求項３５もしくは３６に記載の医薬組成物。
【請求項５５】
ｃＭｅｔの過剰発現部位または局在部位の画像を、任意選択でｉｎ  ｖｉｖｏで得るために使用される、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の製剤、または請求項３５もしくは３６に記載の医薬組成物。
【請求項５６】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載の製剤、および請求項３５または３６に記載の医薬組成物のうちの少なくとも１つを使用する、検出、診断、手術、病期分類、治療、治療の監視、疾患進行の監視または監視療法の方法。
【請求項５７】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載の製剤、および請求項３５または３６に記載の医薬組成物のうちの少なくとも１つを使用する、哺乳動物の身体のイメージング方法。
【請求項５８】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載の製剤、および請求項３５または３６に記載の医薬組成物のうちの少なくとも１つを使用する、前がん症状およびがんのうちの１つもしくは複数の、任意選択で結腸直腸がん、食道がん、乳がん、前立腺がん、頭部がん、頸部がん、卵巣がん、直腸がん、膵臓がん、甲状腺がん、胃がんおよび肉腫のうちの１つもしくは複数の検出、診断、手術、病期分類、治療、治療の監視、疾患進行の監視または監視療法の方法。
【請求項５９】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載の製剤、および請求項３５または３６に記載の医薬組成物のうちの少なくとも１つを使用する、ｃＭｅｔの過剰発現部位または局在部位の検出、診断、手術、病期分類、治療、治療の監視、疾患進行の監視または監視療法の方法。
【請求項６０】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載の製剤、および請求項３５または３６に記載の医薬組成物のうちの少なくとも１つを使用して、ｃＭｅｔの過剰発現部位または局在部位の画像を、任意選択でｉｎ  ｖｉｖｏで得る方法。
【請求項６１】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載の製剤、および請求項３５または３６に記載の医薬組成物のうちの少なくとも１つの使用。
【請求項６２】
検出、診断、手術、病期分類、治療、治療の監視、疾患進行の監視または監視療法における、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の製剤、および請求項３５または３６に記載の医薬組成物の少なくとも１つの使用。
【請求項６３】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載の製剤、および請求項３５または３６に記載の医薬組成物のうちの少なくとも１つの、イメージング剤としての使用。
【請求項６４】
前がん症状およびがんのうちの１つもしくは複数の、任意選択で結腸直腸がん、食道がん、乳がん、前立腺がん、頭部がん、頸部がん、卵巣がん、直腸がん、膵臓がん、甲状腺がん、胃がんおよび肉腫のうちの１つもしくは複数の検出、診断、手術、病期分類、治療、治療の監視、疾患進行の監視または監視療法における、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の製剤、および請求項３５または３６に記載の医薬組成物のうちの少なくとも１つの使用。
【請求項６５】
ｃＭｅｔの過剰発現部位または局在部位の検出、診断、手術、病期分類、治療、治療の監視、疾患進行の監視または監視療法における、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の製剤、および請求項３５または３６に記載の医薬組成物のうちの少なくとも１つの使用。
【請求項６６】
ｃＭｅｔの過剰発現部位または局在部位の画像を、任意選択でｉｎ  ｖｉｖｏで得る際の、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の製剤、および請求項３５または３６に記載の医薬組成物のうちの少なくとも１つの使用。
【国際調査報告】
2021519300.tif 000044
2021519300.tif 000045
2021519300.tif 000046
2021519300.tif 000047
2021519300.tif 000048
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2021519300.tif 000050