(57)【要約】本開示は、治療関連抗原に対する免疫応答を低減または増大させるために、脂質−ペプチドコンジュゲートを免疫細胞にｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで特異的に送達することに関する。脂質−ペプチド抗原は、ペプチド、脂質、および細胞内の生物環境内で分解されて、ＭＨＣ提示のためにペプチドを放出する官能基から構成され、ペプチドエピトープ単独よりも効率的な、抗原提示細胞による抗原エピトープの提示を提供する。本開示は、抗原提示細胞によるペプチドエピトープの提示を調節することによって、対応する疾患を処置するために使用するための、疾患関連抗原の１つまたは複数のペプチドエピトープを含む脂質ビヒクルに関する。
2021523209.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの脂質−ペプチドコンジュゲートを含む脂質ビヒクルであって、
前記脂質−ペプチドコンジュゲートが、リンカーによって共有結合的にコンジュゲートされた脂質部分およびペプチド部分を含み、
前記脂質部分が、コレステロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ペグ化コレステロール、ペグ化リン脂質、およびその任意の組合せからなる群より選択され、
前記ペプチド部分が、治療関連抗原、例えばアレルギー、自己免疫疾患、感染性疾患またはがんなどの疾患と関連する抗原のエピトープである、
脂質ビヒクル。
【請求項２】
少なくとも１つの脂質−ペプチドコンジュゲートおよびリポソームを含む脂質ビヒクルであって、
前記脂質−ペプチドコンジュゲートが、リンカーによって共有結合的にコンジュゲートされた脂質部分およびペプチド部分を含み、
前記リンカーが、ジスルフィド結合を含み、
前記ペプチド部分が、治療関連抗原、例えばアレルギー、自己免疫疾患、感染性疾患またはがんなどの疾患と関連する抗原のエピトープであり、
前記リポソームが、約５０〜９００ｎｍの直径を有する、
脂質ビヒクル。
【請求項３】
前記ペプチド部分が、６〜１０の間のアミノ酸長、８〜４０の間のアミノ酸長、８〜３０の間のアミノ酸長、８〜２０の間のアミノ酸長、または８〜１５の間のアミノ酸長を有する、請求項１または２に記載の脂質ビヒクル。
【請求項４】
前記リンカーが、生分解性であり、酸化還元感受性であり、低ｐＨ（例えば、７未満、６未満、または５未満）で加水分解され、かつ／または自壊性である、請求項１または２に記載の脂質ビヒクル。
【請求項５】
前記脂質−ペプチドコンジュゲートが、式（Ｉ）による構造：
脂質−Ｓ−Ｓ−ペプチド  （Ｉ）
を有する、請求項１または２に記載の脂質ビヒクル。
【請求項６】
前記脂質−ペプチドコンジュゲートが、式（ＩＩ）による構造：
【化４３】
2021523209.tif 000059
を有する、請求項１または２に記載の脂質ビヒクル。
【請求項７】
前記脂質−ペプチドコンジュゲートが、式（ＩＩＩ）による構造：
【化４４】
2021523209.tif 000060
を有する、請求項１または２に記載の脂質ビヒクル。
【請求項８】
前記脂質−ペプチドコンジュゲートが、式（ＩＶ）による構造：
脂質−Ｘ−ペプチド  （ＩＶ）
を有し、
Ｘが、エステル、チオエステル、オルトエステル、ケタール、およびイミンからなる群より選択される加水分解性官能基である、
請求項１または２に記載の脂質ビヒクル。
【請求項９】
前記ペプチド部分が、式（Ｖ）の構造：
【化４５】
2021523209.tif 000061
を有する化合物との反応によって、前記脂質部分にコンジュゲートされている、請求項１または２に記載の脂質ビヒクル。
【請求項１０】
前記脂質−ペプチドコンジュゲートが、式（ＶＩ）による構造：
【化４６】
2021523209.tif 000062
を有し、式中、
Ｙは、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、またはＣ＝ＮＨであり、
Ｘは、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルまたは分枝Ｃ１〜Ｃ１０アルキルであり、
ｍは、０〜１００から選択される整数であり、
Ｚは、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、またはＣＨ２であり、
ｋは、０〜５から選択される整数である、
請求項１または２に記載の脂質ビヒクル。
【請求項１１】
前記ペプチド部分が、式（ＶＩＩ）の構造：
【化４７】
2021523209.tif 000063
を有する化合物との反応によって、前記脂質部分にコンジュゲートされており、式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＨ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、分枝Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ＮＨ、ＳまたはＯからなる群より選択され、
ｍは、０〜１０から選択される整数であり、
ｎは、０〜１０から選択される整数であり、
Ｒは、水素、ＳＯ３Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルまたは分枝Ｃ１〜Ｃ１０アルキルである、
請求項１または２に記載の脂質ビヒクル。
【請求項１２】
前記ペプチド部分が、式（ＶＩＩＩ）の構造：
【化４８】
2021523209.tif 000064
を有する化合物との反応によって、前記脂質部分にコンジュゲートされており、式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＨ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、分枝Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ＮＨ、ＳまたはＯからなる群より選択され、
ｍは、０〜１０から選択される整数であり、
ｎは、０〜１０から選択される整数であり、
ｌは、０〜１０から選択される整数である、
請求項１または２に記載の脂質ビヒクル。
【請求項１３】
前記脂質−ペプチドコンジュゲートが、式（ＩＸ）による構造：
【化４９】
2021523209.tif 000065
を有し、式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＨ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、分枝Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ＮＨ、ＳまたはＯからなる群より選択され、
ｊは、０〜１０から選択される整数であり、
ｋは、０〜１０から選択される整数であり、
ｌは、０〜１０から選択される整数であり、
Ｒ１は、単結合であるか、または水素、ＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、分枝Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ＮＨ、ＳもしくはＯからなる群より選択される、
請求項１または２に記載の脂質ビヒクル。
【請求項１４】
前記脂質−ペプチドコンジュゲートが、式（Ｘ）による構造：
【化５０】
2021523209.tif 000066
を有し、式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＨ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、分枝Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ＮＨ、ＳまたはＯからなる群より選択され、
Ｒは、水素、ＳＯ３Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルまたは分枝Ｃ１〜Ｃ１０アルキルである、
請求項１または２に記載の脂質ビヒクル。
【請求項１５】
前記脂質−ペプチドコンジュゲートが、式（ＸＩ）による構造：
【化５１】
2021523209.tif 000067
を有し、式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＨ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、分枝Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ＮＨ、ＳまたはＯからなる群より選択され、
ｊは、０〜１０から選択される整数であり、
ｋは、０〜１０から選択される整数であり、
ｌは、０〜１０から選択される整数であり、
Ｒ１は、単結合であるか、または水素、ＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、分枝Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ＮＨ、ＳもしくはＯからなる群より選択され、
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、分枝Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、または環化Ｃ３〜Ｃ１０アルキルからなる群より選択される、
請求項１または２に記載の脂質ビヒクル。
【請求項１６】
前記脂質−ペプチドコンジュゲートが、式（ＸＩＩ）による構造：
【化５２】
2021523209.tif 000068
を有し、式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＨ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、分枝Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ＮＨ、ＳまたはＯからなる群より選択され、
ｌは、０〜１０から選択される整数であり、
ｍは、０〜１００から選択される整数であり、
Ｒ１は、単結合であるか、または水素、ＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、分枝Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ＮＨ、ＳもしくはＯからなる群より選択され、
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、分枝Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、または環化Ｃ３〜Ｃ１０アルキルからなる群より選択される、
請求項１または２に記載の脂質ビヒクル。
【請求項１７】
前記脂質−ペプチドコンジュゲートが、式（ＸＩＩＩ）による構造：
【化５３】
2021523209.tif 000069
を有し、式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＨ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、分枝Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ＮＨ、ＳまたはＯからなる群より選択され、
ｌは、０〜１０から選択される整数であり、
ｊは、０〜１００から選択される整数であり、
ｋは、０〜１０から選択される整数であり、
Ｒ１は、単結合であるか、または水素、ＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、分枝Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ＮＨ、ＳもしくはＯからなる群より選択され、
Ｒ２は、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、分枝Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、または環化Ｃ３〜Ｃ１０アルキルである、
請求項１または２に記載の脂質ビヒクル。
【請求項１８】
前記脂質−ペプチドコンジュゲートが、式（ＸＩＶ）による構造：
【化５４】
2021523209.tif 000070
を有し、式中、
Ｘは、Ｓ、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＨ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、分枝Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ＮＨ、ＳまたはＯであり、
ｌは、０〜１０から選択される整数であり、
ｍは、０〜１０から選択される整数である、
請求項１または２に記載の脂質ビヒクル。
【請求項１９】
前記脂質−ペプチドコンジュゲートが、式（ＸＶ）による構造：
【化５５】
2021523209.tif 000071
を有し、式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＨ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、分枝Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ＮＨ、ＳまたはＯからなる群より選択され、
ｊは、０〜１００から選択される整数であり、
ｋは、０〜１０から選択される整数であり、
Ｒは、水素、ＳＯ３Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルまたは分枝Ｃ１〜Ｃ１０アルキルである、
請求項１または２に記載の脂質ビヒクル。
【請求項２０】
前記脂質−ペプチドコンジュゲートが、式（ＸＶＩ）による構造
【化５６】
2021523209.tif 000072
を有し、式中、
ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＨ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、分枝Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ＮＨ、ＳまたはＯからなる群より選択され、
ｍは、０〜１０から選択される整数である、請求項１または２に記載の脂質ビヒクル。
【請求項２１】
少なくとも２個の別個の脂質−ペプチドコンジュゲート種、少なくとも５個の別個の脂質−ペプチドコンジュゲート種、少なくとも１０個の別個の脂質−ペプチドコンジュゲート種、または少なくとも５０個の別個の脂質−ペプチドコンジュゲート種を含み、好ましくは前記少なくとも２個の別個の脂質−ペプチドコンジュゲート種が、同じ抗原または異なる抗原の別個のエピトープを含む、請求項１または２に記載の脂質ビヒクル。
【請求項２２】
正味の正電荷を有する、請求項１または２に記載の脂質ビヒクル。
【請求項２３】
水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、ステアリルアミン（ＳＡ）、ラウリルトリメチルアンモニウムブロミド；セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ミリスチルトリメチルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、３６−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−コレステロール）、１，２−ジテトラデカノイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＭＴＡＰ）、１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＳＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）およびＤＯＴＡＰ誘導体、例えば１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−３−トリメチルアンモニウム−プロパンおよび１，２−ジヘキサデカノイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン、１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）およびＤＯＤＡＰ誘導体、例えば１，２−ジテトラデカノイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン、１，２−ジヘキサデカノイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン、および１，２−ジオクタデカノイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン、１，２−ジ−０−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、１，２−ジオレオイル−ｃ−（４’−トリメチルアンモニウム）−ブタノイル−ｓｎ−グリセロール（ＤＯＴＢ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン、ＳＡＩＮＴ−２、ポリカチオン性脂質２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＥＰＣ）およびＧＬ６７ＴＭ、ポリリシン脂質コンジュゲート、ポリアルギニン脂質コンジュゲートからなる群より選択される少なくとも１つのカチオン性脂質を含む、請求項１または２に記載の脂質ビヒクル。
【請求項２４】
前記脂質ビヒクルが、血中の抗原提示細胞に優先的に接着し、好ましくは前記ペプチド部分が、前記脂質ビヒクルから３０日以内、例えば２０日以内、１０日以内、または２日以内に放出され、好ましくは、生理的条件下において、前記ペプチドの好ましくは２０％未満が、前記脂質ビヒクルから２４時間後に放出され、前記ペプチドの少なくとも７０％が、前記脂質ビヒクルから２０日以内に放出され、好ましくは前記脂質ビヒクルが対象に投与された場合、非コンジュゲートペプチドよりも少なくとも３倍速く、例えば前記非コンジュゲートペプチドよりも少なくとも１０倍速く、例えば少なくとも３０倍速く、例えば少なくとも１００倍速く、抗原提示細胞によって内部移行される、請求項１または２に記載の脂質ビヒクル。
【請求項２５】
約５０〜５００ｎｍまたは約１００〜２００ｎｍの直径を有する、請求項１または２に記載の脂質ビヒクル。
【請求項２６】
ＨＳＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、コレステロール、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００、ＤＯＰＥ−ＰＥＧ２０００、ＤＳＴＡＰおよびＤＯＴＡＰクロリドの１つまたは複数を含む、請求項１または２に記載の脂質ビヒクル。
【請求項２７】
ＨＳＰＣ、コレステロールおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００の混合物を含む、請求項１または２に記載の脂質ビヒクル。
【請求項２８】
ＰＯＰＣ、コレステロール、ＤＯＴＡＰクロリドおよびＤＯＰＥ−ＰＥＧ２０００の混合物を含む、請求項１または２に記載の脂質ビヒクル。
【請求項２９】
免疫調節剤、好ましくは免疫刺激化合物をさらに含む、請求項１または２に記載の脂質ビヒクル。
【請求項３０】
前記免疫刺激化合物が、細胞内タンパク質および／または受容体に結合するリガンドであり、前記受容体が、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＳＴＩＮＧ、好ましくはＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７またはＴＬＲ９からなる群より選択され、より好ましくはＴＬＲ７である、請求項２９に記載の脂質ビヒクル。
【請求項３１】
前記免疫刺激化合物が、ポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）、ポリアデニル酸−ポリウリジル酸（ポリＡ：Ｕ）、ポリＩ：Ｃ−ポリ−Ｌ−リシン（ポリ−ＩＣＬＣ）、ポリ−ＩＣＲ、ＣＬ２６４、Ｎ−パルミトイル−Ｓ−［２，３−ビス（パルミトイルオキシ）−（２Ｒ，Ｓ）−プロピル］−（Ｒ）−システイン−（Ｓ）セリン−（Ｓ）リシン４（Ｐａｍ３Ｃｙｓ）、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）および他のリポ多糖、アルファガラクトシルセラミド（αＧＣ）、プロピリミン、イミキモド（Ｒ８３７）、レシキモド（Ｒ８４８）、ガーディキモド、ＴＭＸ、ＴＭＸ２０１、ＴＭＸ２０２、Ｒ８５０、Ｒ８５１、８５２Ａ、Ｓ−２７６１０、３Ｍ−００２（ＣＬ０７５）、３Ｍ−００３、３Ｍ−００５、３Ｍ−００６、３Ｍ−００７、３Ｍ−０１２、３Ｍ−１３、３Ｍ−０３１、３Ｍ−８５４、ＣＬ０９７、ＣＬ２６４、ＩＣ−３１、ロキソリビンおよび他のイミダゾキノリン、ｓｓＰｏｌｙＵ、ソチリモド、イサトリビン、ＡＮＡ９７５、ＳＭ３６０３２０、Ｒ１３５４一本鎖または二本鎖ＲＮＡ、ＯＲＮ０２（５’−ＵＵＡＵＵＡＵＵＡＵＵＡＵＵＡＵＵＡＵＵ−３’）、ＯＲＮ０６  ５’−ＵＵＧＵＵＧＵＵＧＵＵＧＵＵＧＵＵＧＵＵ−３’、ＣｐＧ−ＯＤＮ  ＤＳＬＩＭ、ＡＶＥ０６７５、ＣｐＧ  Ｂオリゴデオキシヌクレオチド１０１８、ＬＰＳ、ＡＺＤ１４１９、ＯＤＮ１９８２、ＣｐＧ  Ｂ  ＯＤＮ２００６、ＩＭＯ２１２５、ＣｐＧ  Ａ  ＯＤＮ２２１６、ＣｐＧ  Ａ  ＯＤＮ２３３６、ＣｐＧ２３９５、ＣｐＧ  ＯＤＮ７９０９、ＣｐＧ１０１０１、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ＡＶＥ０６７５、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ＨＹＢ２０９３、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ＨＹＢ２０５５、ＣｐＧ−ＯＤＮ  ＩＭＯ２１２５、ＣｐＧ  Ｃ  ＯＤＮ  Ｍ３６２、トラムバ（共有結合しているＣｐＧ  ＢクラスＯＤＮ１０１８を有するＡｍｂ  ａ１ブタクサアレルゲン）、ヘプリサブ、１０１８１ＳＳ  ＩＭ０２０５５  ＩＲＳ９５４、（フラゲリン、ムラミルジペプチド、サポニン、例えばＱＳ２１、リーシュマニア伸長因子、ＳＢ−ＡＳ４、スレオニル−ムラミルジペプチド、Ｌ１８−ＭＤＰ、ミファムルチド、およびＯＭ−１７４からなる群より選択される、請求項２９に記載の脂質ビヒクル。
【請求項３２】
前記免疫刺激化合物が、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）、イミキモド（Ｒ８３７）、レシキモド（Ｒ８４８）、ガーディキモド、ＴＭＸ、ＴＭＸ２０１、ＴＭＸ２０２、ロキソリビン、ソチリモド、イサトリビン、ＳＭ３６０３２０、ＣｐＧ  Ｂオリゴデオキシヌクレオチド１０１８、ＡＺＤ１４１９、ＯＤＮ１９８２、ＣｐＧ  Ｂ  ＯＤＮ２００６、ＬＰＳ、ＩＭＯ２１２５、ＣｐＧ  Ａ  ＯＤＮ２２１６、ＣｐＧ  Ａ  ＯＤＮ２３３６、ＣｐＧ２３９５、ＣｐＧ  ＯＤＮ７９０９、ＣｐＧ１０１０１、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ＡＶＥ０６７５、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ＨＹＢ２０９３、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ＨＹＢ２０５５、ＣｐＧ−ＯＤＮ  ＩＭＯ−２１２５、ＣｐＧ  Ｃ  ＯＤＮ  Ｍ３６２、トラムバ（共有結合しているＣｐＧ  ＢクラスＯＤＮ１０１８を有するＡｍｂ  ａ１ブタクサアレルゲン）、ヘプリサブ、ＱＳ２１、およびＯＭ−１７４からなる群より選択される、請求項２９に記載の脂質ビヒクル。
【請求項３３】
前記免疫調節剤が、免疫抑制化合物であり、好ましくは前記免疫抑制化合物が、ビタミンＤ３（１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３）およびレチノイン酸（ａｌｌ−ｔｒａｎｓおよび９−ｃｉｓレチノイン酸）およびそれらの関係する合成または天然アナログ、ヘミコハク酸ベタメタゾン、パルミチン酸デキサメタゾン、リン酸デキサメタゾン、リメタゾン、ヘミコハク酸メチルプレドニゾロン、パルミチン酸プレドニゾロン、ならびにリン酸プレドニゾロンからなる群より選択される、請求項２９に記載の脂質ビヒクル。
【請求項３４】
ペプチド、抗体、抗体断片およびヌクレオチドからなる群より選択される標的化部分をさらに含み、好ましくは前記標的化部分が、ＤＣＩＲ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４５、Ｌｙ６Ｃ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１５、Ｆ４／８０、ＣＤ６８、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ１６３、ＣＤ６８、ＣＤ１９、ＣＤ１ｃ、ＣＤ８３、ＣＤ１４１、ＣＤ２０９、ＭＨＣＩＩ、Ｇｒ１からなる群より選択される標的に対する親和性を有する、請求項１または２に記載の脂質ビヒクル。
【請求項３５】
請求項１または２に記載の脂質ビヒクルを含む、医薬組成物。
【請求項３６】
少なくとも１つの免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞および／またはＮＫ細胞をさらに含む、請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
ヒト対象において腫瘍抗原に特異的な免疫応答を刺激または増強することによって、がんを処置する方法であって、請求項３５に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項３８】
請求項１または２に記載の脂質ビヒクルを製造する方法であって、
リポソームを調製するステップと、
脂質ペプチドコンジュゲートが前記リポソームに挿入されるように、前記リポソームを前記脂質−ペプチドコンジュゲートと混合するステップと
を含む、方法。
【請求項３９】
請求項１または２に記載の脂質ビヒクルを製造する方法であって、
ペプチドと反応して脂質−ペプチドコンジュゲートを形成することができる官能基を表面上に有するリポソームを調製するステップと、
前記リポソームおよび前記ペプチドを混合して、前記リポソームと会合している脂質−ペプチドコンジュゲートを形成するステップと
を含む、方法。
【請求項４０】
Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで訓練する方法であって、
（ａ）単球および／または未成熟樹状細胞を、請求項１または２に記載の脂質ビヒクルと共にインキュベートし、それによって成熟樹状細胞を得るステップと、
（ｂ）前記成熟樹状細胞を未成熟Ｔ細胞と共に混合し、インキュベートして前記Ｔ細胞を活性化して、そのクローンを増大させるステップと、
（ｃ）必要に応じて、十分な量の反応性Ｔ細胞が得られるまで、好ましくは２〜３回、ステップ（ａ）および（ｂ）を反復するステップと
を含む、方法。
【請求項４１】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）を調製するための方法であって、
（ａ）単球、未成熟樹状細胞および／または樹状細胞の集団を、前記単球、未成熟樹状細胞および／または樹状細胞が、脂質ビヒクルの１つまたは複数を内部移行させるのに好適な条件下において、培地中で、複数の脂質ビヒクルと接触させるステップであって、前記脂質ビヒクルのそれぞれが、複数の脂質−ペプチドコンジュゲートを含み、このような各コンジュゲートが、リンカーによって共有結合的にコンジュゲートされた脂質部分およびペプチド部分を含み、各ペプチド部分が、抗原のペプチド断片を含む、ステップと、
（ｂ）前記単球、未成熟樹状細胞および／または樹状細胞を、前記単球の分化、前記未成熟樹状細胞の成熟、および／または前記樹状細胞の増大を誘導するのに好適な条件下において、１つまたは複数のサイトカインおよび／または増殖因子の存在下でインキュベートし、それによってＡＰＣの集団を調製するステップと
を含む、方法。
【請求項４２】
前記複数の脂質−ペプチドコンジュゲートのそれぞれが、単一抗原の同じペプチド断片を有するペプチド部分を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記複数の脂質−ペプチドコンジュゲートが、第１のペプチド部分を有する第１のコンジュゲート種および第２のペプチド部分を有する第２のコンジュゲート種を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記第１のペプチド部分および前記第２のペプチド部分が、同じ抗原の異なるペプチド断片である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記第１のペプチド部分および前記第２のペプチド部分が、異なる抗原の異なるペプチド断片である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
各ペプチド断片が、５個もしくはそれよりも多い、８個もしくはそれよりも多い、１０個もしくはそれよりも多い、１５個もしくはそれよりも多い、２０個もしくはそれよりも多い、５個、６個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、５〜１０個、５〜１５個、５〜２０個、６〜１０個、８〜１０個、８〜１２個、８〜１５個、８〜２０個、１０〜１５個、１０〜２０個、１５〜２０個、１０〜１００個、１０〜１５０個、または１０〜２００個のアミノ酸を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
前記複数の脂質−ペプチドコンジュゲートが、２個以上の抗原のペプチド断片に由来する複数の異なるペプチド部分を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ペプチド部分が、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２〜５個、２〜１０個、３〜１０個、４〜１０個、５〜１０個、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、または少なくとも６個の抗原のペプチド断片を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記ペプチド部分が、１つまたは複数の抗原のペプチドライブラリーからのペプチド断片を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
抗原特異的Ｔ細胞を調製するための方法であって、
（ａ）単球、未成熟樹状細胞および／または樹状細胞の集団を、前記単球、未成熟樹状細胞および／または樹状細胞が、脂質ビヒクルの１つまたは複数を内部移行させるのに好適な条件下において、培地中で、複数の脂質ビヒクルと接触させるステップであって、前記脂質ビヒクルのそれぞれが、複数の脂質−ペプチドコンジュゲートを含み、このような各コンジュゲートが、リンカーによって共有結合的にコンジュゲートされた脂質部分およびペプチド部分を含み、各ペプチド部分が、抗原のペプチド断片を含む、ステップと、
（ｂ）前記単球、未成熟樹状細胞および／または樹状細胞を、前記単球の分化、前記未成熟樹状細胞の成熟、および／または前記樹状細胞の増大を誘導するのに好適な条件下において、１つまたは複数のサイトカインおよび／または増殖因子の存在下でインキュベートし、それによってＡＰＣの集団を調製するステップと、
（ｃ）複数のＴ細胞を、前記Ｔ細胞の抗原プライミングおよび／または抗原特異的活性化に好適な条件下において、前記ＡＰＣと接触させ、それによって、前記ＡＰＣによって提示された前記抗原に特異的な、プライミングされたかつ／または活性化されたＴ細胞を含むＴ細胞の集団を調製するステップと、
（ｄ）必要に応じて、ステップ（ｃ）を１回または複数回反復するステップと
を含む、方法。
【請求項５１】
前記Ｔ細胞の集団が、単離Ｔ細胞、単離Ｔ細胞の増大させた集団、ＰＢＭＣに由来するＴ細胞、臍帯血に由来するＴ細胞、遺伝子操作されていないＴ細胞、遺伝子操作されたＴ細胞、ＣＡＲ−Ｔ細胞、エフェクターＴ細胞、活性化Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＴＬおよび／またはＮＫ  Ｔ細胞を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
免疫細胞と表面で会合した、請求項１または２に記載の１つまたは複数の脂質ビヒクルを含む、修飾された免疫細胞。
【請求項５３】
前記免疫細胞が、単球、未成熟樹状細胞、樹状細胞、Ｔ細胞、単離Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ＣＡＲ  Ｔ細胞、遺伝子操作されていない免疫細胞、遺伝子操作された免疫細胞、ＮＫ細胞、ＮＫ  Ｔ細胞、またはＢ細胞である、請求項５２に記載の修飾された免疫細胞。
【請求項５４】
前記１つまたは複数の脂質ビヒクルが、前記免疫細胞の表面と非共有結合的に会合している、請求項５２に記載の修飾された免疫細胞。
【請求項５５】
表面で会合した複数の脂質ビヒクルを含む、請求項５２に記載の修飾された免疫細胞。
【請求項５６】
請求項５２に記載の少なくとも１つの修飾された免疫細胞を含み、薬学的に許容される溶液、担体、賦形剤、または安定剤をさらに含む、医薬組成物。
【請求項５７】
疾患または障害の処置または予防を必要とする対象における免疫応答を刺激、増強、またはモジュレートすることによって、疾患または障害を処置または予防するための方法であって、前記対象に、請求項５２に記載の修飾された免疫細胞を含む組成物を投与するステップを含み、前記免疫細胞が、樹状細胞またはＴ細胞である、方法。
【請求項５８】
前記免疫細胞が、前記対象にとって自家である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
疾患または障害の処置または予防を必要とする対象における免疫応答を刺激、増強、またはモジュレートすることによって、疾患または障害を処置または予防するための方法であって、前記対象に、請求項１もしくは２に記載の脂質ビヒクルを含む第１の組成物、および／または請求項５２に記載の修飾された免疫細胞を含む第２の組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項６０】
前記免疫細胞が、前記対象にとって自家である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記第１の組成物および前記第２の組成物の両方を、別個にまたは単一組成物として投与するステップを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記第１の組成物および前記第２の組成物が、同時にまたは逐次的に投与される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
前記第１の組成物および前記第２の組成物が、逐次的に、好ましくは１時間以内に逐次的に投与されるか、または１〜１２時間、６〜１８時間、１２〜２４時間、１８〜３６時間、２４〜４８時間、３６〜７２時間、４８〜９０時間、１〜５日、３〜７日、５〜１０日、７〜１４日、１０〜２１日、１４〜３０日、２１〜６０日、３０〜９０日、６０〜１８０日、９０日〜１年、１８０日〜２年、１〜３年もしくは２〜５年おいて逐次的に投与される、請求項５９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年５月１４日に出願された米国仮出願第６２／６７０，９９５号に対する優先権および利益を主張し、これらの全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
ＥＦＳ−Ｗｅｂを通じて本出願と共に提出された、２０１９年５月１４日に作製された「１７４２８５＿０１１２０１ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ」と題される、３，２４０バイトのサイズのＡＳＣＩＩテキストファイルは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本開示は、抗原提示細胞によるペプチドエピトープの提示を調節することによって、対応する疾患を処置するために使用するための、疾患関連抗原の１つまたは複数のペプチドエピトープを含む脂質ビヒクルに関する。
【背景技術】
【０００４】
ワクチン製剤の目標は、典型的に、目的の抗原を有する病原体、ウイルス感染細胞、腫瘍細胞などと急速に反応するのに十分なＴ細胞およびＢ細胞の集団を生成することができる、抗原およびアジュバントの組合せを提供することである。
【０００５】
抗原ペプチドまたは炭水化物を脂質またはステロール誘導体に共有結合的に連結するための方法は、当技術分野で公知である。化学クロスリンカーは、数々の文献および目録において論じられている。例えば、Wong,  Chemistry  of  Protein  Conjugation  and  Cross-linking,  CRC  Press,  Boca  Raton,  Fla.,  1991を参照されたい。これらの試薬は、ペプチドのアミノ酸側鎖にカップリングする官能基をしばしば用いる。クロスリンカーの設計には、用いられる官能性部分の選択が関与し得る。官能性部分の選択は、架橋される分子種上で利用可能な標的部位に、完全に依存する。一部の分子種（例えば、タンパク質）は、標的化するためのいくつかの利用可能な部位（例えば、リシンのε−アミノ基、システインのスルフヒドリル基、グルタミン酸のカルボキシル基など）を提示することができ、目的の生物学的特性（例えば、抗体の結合親和性、酵素の触媒活性など）を最良の状態で維持するために、脂質またはステロール誘導体に含むための特定の官能性部分の選択が、経験的に行われ得る。
しかし、特に経験的な選択の難しさに起因して、抗原を脂質ビヒクルに製剤化するための従来の方法および組成物と関連する多くの不利益が公知である。さらに、正確な部位への抗原ペプチドの送達およびこれらの脂質ビヒクルへの活性剤の製剤化は、しばしば困難である。したがって、医薬製剤における代替のおよび／または改善された脂質ビヒクルが、依然として必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Wong,  Chemistry  of  Protein  Conjugation  and  Cross-linking,  CRC  Press,  Boca  Raton,  Fla.,  1991
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、脂質ビヒクル組成物、その製造方法、および対象（例えば、動物、ヒトなど）においてそれを使用するための方法に関する。対象への脂質ビヒクルの投与は、免疫応答を刺激および／または調節することができ、それによって、目的の抗原と急速に反応するのに十分なＴ細胞およびＢ細胞の集団を生成するという目標を達成することができる。
【０００８】
本開示の脂質ビヒクルは、疾患関連抗原のペプチドエピトープを有する、予め設計または操作された脂質ビヒクルを含むことができる。そのような製剤は、単球および樹状細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって認識され、選択的に取り込まれ、それによって、ＡＰＣにおいて主要組織適合複合体（ＭＨＣ）ＩまたはＭＨＣＩＩによるペプチド抗原の効率的な提示を可能にする様式で、疾患関連抗原を細胞に送達する能力を脂質ビヒクルに付与する。
【０００９】
一部の実施形態では、本開示は、脂質−ペプチドコンジュゲートを含む脂質ビヒクルを提供する。これらの脂質ビヒクルは、ペプチド抗原のＡＰＣへの送達およびそれによる提示のために使用することができる。一部の実施形態では、脂質ビヒクルは、アジュバントとして免疫調節剤をさらに含むことができる。脂質ビヒクルは、自己免疫性疾患、炎症性疾患、およびがんを含む多種多様な疾患、障害、および状態の処置のために使用することができる。
【００１０】
一態様では、少なくとも１つの脂質−ペプチドコンジュゲートを含む脂質ビヒクルであって、脂質−ペプチドコンジュゲートが、リンカーによって共有結合的にコンジュゲートされた脂質部分およびペプチド部分を含み、脂質部分が、コレステロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ペグ化コレステロール、ペグ化リン脂質、およびその任意の組合せからなる群より選択され、ペプチド部分が、治療関連抗原、例えばアレルギー、自己免疫疾患、感染性疾患またはがんなどの疾患と関連する抗原のエピトープである、脂質ビヒクルが提供される。
【００１１】
別の態様では、少なくとも１つの脂質−ペプチドコンジュゲートおよびリポソームを含む脂質ビヒクルであって、脂質−ペプチドコンジュゲートが、リンカーによって共有結合的にコンジュゲートされた脂質部分およびペプチド部分を含み、リンカーが、ジスルフィド結合を含み、ペプチド部分が、治療関連抗原、例えばアレルギー、自己免疫疾患、感染性疾患またはがんなどの疾患と関連する抗原のエピトープであり、リポソームが、約５０〜９００ｎｍの直径を有する、脂質ビヒクルが提供される。
【００１２】
様々な実施形態では、本明細書に開示される脂質ビヒクルのいずれかにおけるペプチド部分は、６〜１０の間のアミノ酸長、８〜４０の間のアミノ酸長、８〜３０の間のアミノ酸長、８〜２０の間のアミノ酸長、または８〜１５の間のアミノ酸長を有する。
【００１３】
一部の実施形態では、リンカーは、生分解性であり、酸化還元感受性であり、低ｐＨ（例えば、７未満、６未満、または５未満）で加水分解され、かつ／または自壊性（self-immolative）である。
【００１４】
様々な実施形態では、脂質−ペプチドコンジュゲートは、本明細書に開示される式のいずれか１つによる構造を有する。
【００１５】
一部の実施形態では、脂質ビヒクルは、少なくとも２個の別個の脂質−ペプチドコンジュゲート種、少なくとも５個の別個の脂質−ペプチドコンジュゲート種、少なくとも１０個の別個の脂質−ペプチドコンジュゲート種、または少なくとも５０個の別個の脂質−ペプチドコンジュゲート種を含有することができ、好ましくは少なくとも２個の別個の脂質−ペプチドコンジュゲート種は、同じ抗原または異なる抗原の別個のエピトープを含む。
【００１６】
一部の実施形態では、脂質ビヒクルは、正味の正電荷を有する。ある特定の実施形態では、脂質ビヒクルは、水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、ステアリルアミン（ＳＡ）、ラウリルトリメチルアンモニウムブロミド；セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ミリスチルトリメチルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、３６−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−コレステロール）、１，２−ジテトラデカノイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＭＴＡＰ）、１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＳＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）およびＤＯＴＡＰ誘導体、例えば１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−３−トリメチルアンモニウム−プロパンおよび１，２−ジヘキサデカノイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン、１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）およびＤＯＤＡＰ誘導体、例えば１，２−ジテトラデカノイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン、１，２−ジヘキサデカノイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン、および１，２−ジオクタデカノイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン、１，２−ジ−０−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、１，２−ジオレオイル−ｃ−（４’−トリメチルアンモニウム）−ブタノイル−ｓｎ−グリセロール（ＤＯＴＢ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン、ＳＡＩＮＴ−２、ポリカチオン性脂質２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＥＰＣ）およびＧＬ６７ＴＭ、ポリリシン脂質コンジュゲート、ポリアルギニン脂質コンジュゲートからなる群より選択される少なくとも１つのカチオン性脂質を含む。
【００１７】
一部の実施形態では、脂質ビヒクルは、血中の抗原提示細胞に優先的に接着し、好ましくはペプチド部分は、３０日以内、例えば２０日以内、１０日以内、または２日以内に脂質ビヒクルから放出される。一部の実施形態では、生理的条件下において、ペプチドの２０％未満は、２４時間後に脂質ビヒクルから放出され、ペプチドの少なくとも７０％は、２０日以内に脂質ビヒクルから放出される。一部の実施形態では、脂質ビヒクルは、対象に投与された場合、非コンジュゲートペプチドよりも少なくとも３倍速く、例えば非コンジュゲートペプチドよりも少なくとも１０倍速く、例えば少なくとも３０倍速く、例えば少なくとも１００倍速く、抗原提示細胞によって内部移行される。
【００１８】
一部の実施形態では、脂質ビヒクルは、約５０〜５００ｎｍまたは約１００〜２００ｎｍの直径を有する。
【００１９】
一部の実施形態では、脂質ビヒクルは、（例えば、その脂質二重層中に）ＨＳＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、コレステロール、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００、ＤＯＰＥ−ＰＥＧ２０００、ＤＳＴＡＰおよびＤＯＴＡＰクロリドの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、脂質ビヒクルは、ＨＳＰＣ、コレステロールおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００の混合物を含む。一部の実施形態では、脂質ビヒクルは、ＰＯＰＣ、コレステロール、ＤＯＴＡＰクロリドおよびＤＯＰＥ−ＰＥＧ２０００の混合物を含む。
【００２０】
脂質ビヒクルは、免疫調節剤、例えば免疫刺激化合物をさらに含むことができる。一部の実施形態では、免疫刺激化合物は、細胞内タンパク質および／または受容体に結合するリガンドであり、前記受容体は、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＳＴＩＮＧ、好ましくはＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７またはＴＬＲ９からなる群より選択され、より好ましくはＴＬＲ７である。一部の実施形態では、免疫刺激化合物は、ポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）、ポリアデニル酸−ポリウリジル酸（ポリＡ：Ｕ）、ポリＩ：Ｃ−ポリ−Ｌ−リシン（ポリ−ＩＣＬＣ）、ポリ−ＩＣＲ、ＣＬ２６４、Ｎ−パルミトイル−Ｓ−［２，３−ビス（パルミトイルオキシ）−（２Ｒ，Ｓ）−プロピル］−（Ｒ）−システイン−（Ｓ）セリン−（Ｓ）リシン４（Ｐａｍ３Ｃｙｓ）、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）および他のリポ多糖、アルファガラクトシルセラミド（alphagalactosylceremaide）（αＧＣ）、プロピリミン（Propirimine）、イミキモド（Ｒ８３７）、レシキモド（Ｒ８４８）、ガーディキモド、ＴＭＸ、ＴＭＸ２０１、ＴＭＸ２０２、Ｒ８５０、Ｒ８５１、８５２Ａ、Ｓ−２７６１０、３Ｍ−００２（ＣＬ０７５）、３Ｍ−００３、３Ｍ−００５、３Ｍ−００６、３Ｍ−００７、３Ｍ−０１２、３Ｍ−１３、３Ｍ−０３１、３Ｍ−８５４、ＣＬ０９７、ＣＬ２６４、ＩＣ−３１、ロキソリビンおよび他のイミダゾキノリン、ｓｓＰｏｌｙＵ、ソチリモド、イサトリビン、ＡＮＡ９７５、ＳＭ３６０３２０、Ｒ１３５４一本鎖または二本鎖ＲＮＡ、ＯＲＮ０２（５’−ＵＵＡＵＵＡＵＵＡＵＵＡＵＵＡＵＵＡＵＵ−３’）、ＯＲＮ０６  ５’−ＵＵＧＵＵＧＵＵＧＵＵＧＵＵＧＵＵＧＵＵ−３’、ＣｐＧ−ＯＤＮ  ＤＳＬＩＭ、ＡＶＥ０６７５、ＣｐＧ  Ｂオリゴデオキシヌクレオチド１０１８、ＬＰＳ、ＡＺＤ１４１９、ＯＤＮ１９８２、ＣｐＧ  Ｂ  ＯＤＮ２００６、ＩＭＯ２１２５、ＣｐＧ  Ａ  ＯＤＮ２２１６、ＣｐＧ  Ａ  ＯＤＮ２３３６、ＣｐＧ２３９５、ＣｐＧ  ＯＤＮ７９０９、ＣｐＧ１０１０１、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ＡＶＥ０６７５、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ＨＹＢ２０９３、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ＨＹＢ２０５５、ＣｐＧ−ＯＤＮ  ＩＭＯ２１２５、ＣｐＧ  Ｃ  ＯＤＮ  Ｍ３６２、トラムバ（Tolamba）（共有結合しているＣｐＧ  ＢクラスＯＤＮ１０１８を有するＡｍｂ  ａ１ブタクサアレルゲン）、ヘプリサブ、１０１８１ＳＳ  ＩＭ０２０５５  ＩＲＳ９５４、（フラゲリン、ムラミルジペプチド、サポニン、例えばＱＳ２１、リーシュマニア伸長因子、ＳＢ−ＡＳ４、スレオニル−ムラミルジペプチド、Ｌ１８−ＭＤＰ、ミファムルチド、およびＯＭ−１７４からなる群より選択される。一部の実施形態では、免疫刺激化合物は、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）、イミキモド（Ｒ８３７）、レシキモド（Ｒ８４８）、ガーディキモド、ＴＭＸ、ＴＭＸ２０１、ＴＭＸ２０２、ロキソリビン、ソチリモド、イサトリビン、ＳＭ３６０３２０、ＣｐＧ  Ｂオリゴデオキシヌクレオチド１０１８、ＡＺＤ１４１９、ＯＤＮ１９８２、ＣｐＧ  Ｂ  ＯＤＮ２００６、ＬＰＳ、ＩＭＯ２１２５、ＣｐＧ  Ａ  ＯＤＮ２２１６、ＣｐＧ  Ａ  ＯＤＮ２３３６、ＣｐＧ２３９５、ＣｐＧ  ＯＤＮ７９０９、ＣｐＧ１０１０１、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ＡＶＥ０６７５、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ＨＹＢ２０９３、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ＨＹＢ２０５５、ＣｐＧ−ＯＤＮ  ＩＭＯ−２１２５、ＣｐＧ  Ｃ  ＯＤＮ  Ｍ３６２、トラムバ（共有結合しているＣｐＧ  ＢクラスＯＤＮ１０１８を有するＡｍｂ  ａ１ブタクサアレルゲン）、ヘプリサブ、ＱＳ２１、およびＯＭ−１７４からなる群より選択される。
【００２１】
一部の実施形態では、免疫調節剤は、免疫抑制化合物であり、好ましくは免疫抑制化合物は、ビタミンＤ３（１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３）およびレチノイン酸（ａｌｌ−ｔｒａｎｓおよび９−ｃｉｓレチノイン酸）およびそれらの関係する合成または天然アナログ、ヘミコハク酸ベタメタゾン、パルミチン酸デキサメタゾン、リン酸デキサメタゾン、リメタゾン（Limethasone）、ヘミコハク酸メチルプレドニゾロン、パルミチン酸プレドニゾロン、ならびにリン酸プレドニゾロンからなる群より選択される。
【００２２】
脂質ビヒクルは、ペプチド、抗体、抗体断片およびヌクレオチドからなる群より選択される標的化部分をさらに含むことができ、好ましくは標的化部分は、ＤＣＩＲ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４５、Ｌｙ６Ｃ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１５、Ｆ４／８０、ＣＤ６８、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ１６３、ＣＤ６８、ＣＤ１９、ＣＤ１ｃ、ＣＤ８３、ＣＤ１４１、ＣＤ２０９、ＭＨＣＩＩ、Ｇｒ１からなる群より選択される標的に対する親和性を有する。
【００２３】
さらなる態様は、本明細書に開示される脂質ビヒクルのいずれかを含む医薬組成物に関する。医薬組成物は、少なくとも１つの免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞および／またはＮＫ細胞をさらに含むことができる。
【００２４】
別の態様は、ヒト対象において腫瘍抗原に特異的な免疫応答を刺激または増強することによって、がんを処置する方法であって、本明細書に開示される医薬組成物のいずれかを、それを必要とする対象に投与するステップを含む、方法に関する。
【００２５】
さらなる態様は、本明細書に開示される脂質ビヒクルのいずれかを製造する方法であって、リポソームを調製するステップと、脂質ペプチドコンジュゲートがリポソームに挿入されるように、リポソームを脂質−ペプチドコンジュゲートと混合するステップとを含む、方法に関する。
【００２６】
別の態様は、本明細書に開示される脂質ビヒクルのいずれかを製造する方法であって、ペプチドと反応して脂質−ペプチドコンジュゲートを形成することができる官能基を表面上に有するリポソームを調製するステップと、リポソームおよびペプチドを混合して、リポソームと会合している脂質−ペプチドコンジュゲートを形成するステップとを含む、方法に関する。
【００２７】
また本明細書では、Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで訓練する方法であって、
（ａ）単球および／または未成熟樹状細胞を、本明細書に開示される脂質ビヒクルのいずれかと共にインキュベートし、それによって成熟樹状細胞を得るステップと、
（ｂ）成熟樹状細胞を未成熟Ｔ細胞と共に混合し、インキュベートしてＴ細胞を活性化して、そのクローンを増大させるステップと、
（ｃ）必要に応じて、十分な量の反応性Ｔ細胞が得られるまで、好ましくは２〜３回、ステップ（ａ）および（ｂ）を反復するステップと
を含む、方法が提供される。
【００２８】
また本明細書では、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を調製するための方法であって、
（ａ）単球、未成熟樹状細胞および／または樹状細胞の集団を、単球、未成熟樹状細胞および／または樹状細胞が、脂質ビヒクルの１つまたは複数を内部移行させるのに好適な条件下において、培地中で、本明細書に開示される複数の脂質ビヒクルと接触させるステップと、
（ｂ）単球、未成熟樹状細胞および／または樹状細胞を、単球の分化、未成熟樹状細胞の成熟、および／または樹状細胞の増大を誘導するのに好適な条件下において、１つまたは複数のサイトカインおよび／または増殖因子の存在下でインキュベートし、それによってＡＰＣの集団を調製するステップと
を含む、方法が提供される。
【００２９】
ある特定の実施形態では、複数の脂質−ペプチドコンジュゲートのそれぞれは、単一抗原の同じペプチド断片を有するペプチド部分を含む。一部の実施形態では、複数の脂質−ペプチドコンジュゲートは、第１のペプチド部分を有する第１のコンジュゲート種および第２のペプチド部分を有する第２のコンジュゲート種を含む。第１のペプチド部分および第２のペプチド部分は、同じ抗原の異なるペプチド断片であってよい。第１のペプチド部分および第２のペプチド部分はまた、異なる抗原の異なるペプチド断片であってよい。一部の実施形態では、各ペプチド断片は、５個もしくはそれよりも多い、８個もしくはそれよりも多い、１０個もしくはそれよりも多い、１５個もしくはそれよりも多い、２０個もしくはそれよりも多い、５個、６個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、５〜１０個、５〜１５個、５〜２０個、６〜１０個、８〜１０個、８〜１２個、８〜１５個、８〜２０個、１０〜１５個、１０〜２０個、１５〜２０個、１０〜１００個、１０〜１５０個、または１０〜２００個のアミノ酸を含む。
【００３０】
一部の実施形態では、複数の脂質−ペプチドコンジュゲートは、２個以上の抗原のペプチド断片に由来する複数の異なるペプチド部分を含む。ペプチド部分は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２〜５個、２〜１０個、３〜１０個、４〜１０個、５〜１０個、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、または少なくとも６個の抗原のペプチド断片を含むことができる。一部の実施形態では、ペプチド部分は、１つまたは複数の抗原のペプチドライブラリーからのペプチド断片を含むことができる。
【００３１】
また本明細書では、抗原特異的Ｔ細胞を調製するための方法であって、
（ａ）単球、未成熟樹状細胞および／または樹状細胞の集団を、単球、未成熟樹状細胞および／または樹状細胞が、脂質ビヒクルの１つまたは複数を内部移行させるのに好適な条件下において、培地中で、本明細書に開示される複数の脂質ビヒクルと接触させるステップと、
（ｂ）単球、未成熟樹状細胞および／または樹状細胞を、単球の分化、未成熟樹状細胞の成熟、および／または樹状細胞の増大を誘導するのに好適な条件下において、１つまたは複数のサイトカインおよび／または増殖因子の存在下でインキュベートし、それによってＡＰＣの集団を調製するステップと、
（ｃ）複数のＴ細胞を、Ｔ細胞の抗原プライミングおよび／または抗原特異的活性化に好適な条件下において、ＡＰＣと接触させ、それによって、ＡＰＣによって提示された抗原に特異的な、プライミングされたかつ／または活性化されたＴ細胞を含むＴ細胞の集団を調製するステップと、
（ｄ）必要に応じて、ステップ（ｃ）を１回または複数回反復するステップと
を含む、方法が提供される。
【００３２】
一部の実施形態では、Ｔ細胞の集団は、単離Ｔ細胞、単離Ｔ細胞の増大させた集団、ＰＢＭＣに由来するＴ細胞、臍帯血に由来するＴ細胞、遺伝子操作されていないＴ細胞、遺伝子操作されたＴ細胞、ＣＡＲ−Ｔ細胞、エフェクターＴ細胞、活性化Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＴＬおよび／またはＮＫ  Ｔ細胞を含む。
【００３３】
また本明細書では、１つまたは複数の表面で会合した脂質ビヒクル、例えば本明細書に開示される脂質ビヒクルのいずれかを含む、修飾された免疫細胞が提供される。一部の実施形態では、免疫細胞は、単球、未成熟樹状細胞、樹状細胞、Ｔ細胞、単離Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ＣＡＲ  Ｔ細胞、遺伝子操作されていない免疫細胞、遺伝子操作された免疫細胞、ＮＫ細胞、ＮＫ  Ｔ細胞、またはＢ細胞である。１つまたは複数の脂質ビヒクルは、免疫細胞の表面と非共有結合的に会合することができる。修飾された免疫細胞は、表面で会合した複数の脂質ビヒクルを有することができる。
【００３４】
また本明細書では、本明細書に開示される少なくとも１つの修飾された免疫細胞を含み、薬学的に許容される溶液、担体、賦形剤、または安定剤をさらに含む、医薬組成物が提供される。
【００３５】
別の態様は、それを必要とする対象における免疫応答を刺激、増強、またはモジュレートすることによって、疾患または障害を処置または予防するための方法であって、対象に、本明細書に開示される修飾された免疫細胞のいずれかを含む組成物を投与するステップを含み、好ましくは免疫細胞が、樹状細胞またはＴ細胞である、方法に関する。一部の実施形態では、免疫細胞は、対象にとって自家である。
【００３６】
さらなる態様は、それを必要とする対象における免疫応答を刺激、増強、またはモジュレートすることによって、疾患または障害を処置または予防するための方法であって、対象に、本明細書に開示される脂質ビヒクルのいずれかを含む第１の組成物、および／または本明細書に開示される修飾された免疫細胞のいずれかを含む第２の組成物を投与するステップを含む、方法に関する。一部の実施形態では、免疫細胞は、対象にとって自家である。第１の組成物および第２の組成物は、別個にまたは単一組成物として投与され得る。一部の実施形態では、第１の組成物および第２の組成物は、同時にまたは逐次的に投与される。例えば、第１の組成物および第２の組成物は、逐次的に、好ましくは１時間以内に逐次的に投与されるか、または１〜１２時間、６〜１８時間、１２〜２４時間、１８〜３６時間、２４〜４８時間、３６〜７２時間、４８〜９０時間、１〜５日、３〜７日、５〜１０日、７〜１４日、１０〜２１日、１４〜３０日、２１〜６０日、３０〜９０日、６０〜１８０日、９０日〜１年、１８０日〜２年、１〜３年もしくは２〜５年おいて逐次的に投与され得る。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、リポソーム製剤およびリンカーの特徴が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＢＭＤＣにおける抗原提示の強度および持続時間に影響を与えることを示す。
【図２−１】図２は、リポソームの抗原送達が、抗原特異的ＯＴ．１  Ｔ細胞との共培養において、プライミングの可能性があるＣＤ１１ｃ＋ＢＭＤＣを延長させることを示す。
【図２−２】同上。
【図２−３】同上。
【図３】図３は、ＴＬＲ７アゴニストと共に製剤化されたＣＤ４＋エピトープのリポソームの抗原送達が、ＢＭＤＣとの共培養アッセイにおける抗原特異的ＯＴ．２  Ｔ細胞の活性化および増殖を誘導できることを示す。
【図４】図４は、リポソームの抗原およびＴＬＲ７アゴニストと共に製剤化された静脈内ワクチン接種が、抗原の交差提示をブーストし、脾臓において樹状細胞による活性化マーカーの発現を強化することを示す。
【図５−１】図５は、リポソームの抗原およびＴＬＲ７アゴニストと共に製剤化された静脈内ワクチン接種が、養子移入された抗原特異的ナイーブＯＴ．１  Ｔ細胞の増大およびプライミングをもたらすことを示す。
【図５−２】同上。
【図５−３】同上。
【図６−１】図６は、リポソーム製剤およびリンカーの特徴が、同系Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ腫瘍モデルにおける養子移入されたナイーブＯＴ．１  Ｔ細胞と組み合わされた静脈内ワクチン接種の有効性に影響を与えることを示す。
【図６−２】同上。
【図７−１】図７は、リポソームの抗原およびＴＬＲ７アゴニストと共に製剤化されたワクチン接種が、別個の成分としての可溶性抗原およびＴＬＲ７アゴニストでのワクチン接種と比較して、確立されたＥＧ７−ＯＶＡおよびＢ１６−ＯＶＡ腫瘍の改善された制御および生存の延長をもたらすことを示す。
【図７−２】同上。
【図７−３】同上。
【図７−４】同上。
【図８−１】図８は、２つの別個のリポソーム製剤での静脈内への多価ワクチン接種が、確立されたＢ１６−ＯＶＡ腫瘍の改善された制御をもたらし、処置されたマウスの生存を延長させることを示す。
【図８−２】同上。
【図９】図９は、多価ワクチン接種が、養子移入された抗原特異的ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞の２つの集団の同時のプライミングおよび増大を誘導することを示す。
【図１０】図１０は、還元性リンカーを有するリポソームのペグ化リポペプチドが２４時間で抗原提示を増加させたことを示す。
【図１１】図１１は、ワクチンリポソームを有するＯＴ．１脾細胞が、同系Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ腫瘍モデルにおいて確立されたマウスの腫瘍の制御を効率的に媒介することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本明細書における一部の実施形態では、脂質および少なくとも１つの脂質−ペプチドコンジュゲートの組成物を含む脂質ビヒクルが提供される。これらの脂質ビヒクルは、抗原提示細胞によって内部移行され得る。脂質−ペプチドコンジュゲートの脂質部分は、脂質−ペプチドコンジュゲートを脂質ビヒクルと会合させる一助になり得る。ある特定の実施では、脂質−ペプチドコンジュゲートのペプチド部分は、８〜４０の間のアミノ酸長であってよい。ペプチド部分は、目的の様々な抗原に由来していてもよい。一部の実施形態では、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）は、抗原提示細胞内の細胞内プロセシング後に、脂質ビヒクルに封入されるかまたは組み込まれた脂質−ペプチドコンジュゲートのペプチド部分および／またはペプチドの一部またはすべてに結合し、それらを提示することができる。
【００３９】
ある特定の実施形態では、脂質ビヒクルは、複数の脂質−ペプチドコンジュゲート、例えば少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも２０個もしくは少なくとも５０個、またはそれらの間の任意の数の、別個の脂質−ペプチドコンジュゲートを含む。別個のコンジュゲートは、別個の脂質部分および／または別個の抗原部分を含有することができる。その結果として、ＡＰＣへの提示およびＡＰＣによる内部移行の後に、複数の抗原が、ＡＰＣによって免疫エフェクター細胞に提示され得る。
【００４０】
一部の実施形態では、脂質−ペプチドコンジュゲートのペプチド部分は、リンカーを介して脂質部分に共有結合的にコンジュゲートされる。リンカーは、生分解性または非還元性であり得る。生分解性リンカーは、生理的条件下において３０日以内または２０日以内または１０日以内または２日以内に切断され得る。例えば、リンカーは、酸化還元感受性共有結合を含むことができる。これらの実施形態では、リンカーは、還元性環境に対して敏感であり、環境誘導性の還元後に切断され得る。生分解性リンカーは、ペプチドと脂質部分の間で制御放出を可能にする、特異的な化学的性質を有することができる。例えば、ある特定の実施では、生分解性リンカーの２０％未満が、ヒト血清中、摂氏３７度で２４時間以内に切断され得る。一部の実施形態では、生分解性リンカーの少なくとも７０％が、抗原提示細胞内の生理的関連条件下において２０日以内に切断される。
【００４１】
様々な実施形態では、脂質−ペプチドコンジュゲートは、本明細書に開示される式のいずれか１つの構造を有することができる。例えば、リンカーは、ジスルフィド結合を含有することができる。
【００４２】
一部の実施形態では、脂質ビヒクルは、直径５００ｎｍ未満の平均サイズを有することができる。ビヒクルサイズは、動的光散乱によって測定することができる。脂質ビヒクルは、ヒト血清中で少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、または少なくとも４８時間安定なままであるように製剤化することができる。脂質ビヒクルの安定性には、安定なサイズが含まれ、例えばそのサイズは、ヒト血清中で少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、または少なくとも４８時間、著しく変化しない（例えば、±１０％の直径変化、±５％の直径変化など）。一部の実施形態では、脂質ビヒクルは、動的光散乱によって測定される通り、血清中、３７度で２４時間インキュベートする前の平均サイズの５０％未満サイズが変化する。
【００４３】
有利には、脂質ビヒクルは、ペプチド単独よりも高い割合でＡＰＣによって有効に内部移行され得る。例えば、脂質ビヒクルおよび脂質ビヒクルと会合した脂質−ペプチドコンジュゲートのＡＰＣによる内部移行は、ある一定の期間（例えば、５日、８日、１０日、１２日、１５日、または２０日）にわたって、同じ非コンジュゲートペプチド（例えば、脂質および／または脂質ビヒクルにコンジュゲートされていないペプチド）よりも少なくとも３倍高く、少なくとも５倍高く、少なくとも１０倍高く、少なくとも１５倍高く、少なくとも２０倍高く、少なくとも３０倍高く、少なくとも５０倍高く、または少なくとも１００倍高くてよい。
【００４４】
脂質ビヒクルは、ＡＰＣまたはＴ細胞などの企図された指定物を脂質ビヒクルの標的にする一助になり得る、ペプチド、抗体またはヌクレオチドなどの標的化部分をさらに含有することができる。標的化部分は、例えば、脂質または脂質−ＰＥＧコンジュゲートとの共有結合性連結によって、脂質ビヒクルの１つまたは複数の成分に共有結合的に結合することができる。標的化部分は、その結合パートナーとの親和性を有するリガンド、例えば抗体またはその抗原結合断片であってよい。標的化部分は、標的化部分を有していない脂質ビヒクルと比較して、例えば、少なくとも２倍高い、少なくとも５倍高い、または少なくとも１０倍高い割合で、ＡＰＣを効率的に、特異的に脂質ビヒクルの標的にすることができる。一部の実施形態では、標的化リガンドは、ＤＣＩＲ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４５、Ｌｙ６Ｃ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１５、Ｆ４／８０、ＣＤ６８、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ１６３、ＣＤ６８、ＣＤ１９、ＣＤ１ｃ、ＣＤ８３、ＣＤ１４１、ＣＤ２０９、ＭＨＣＩＩ、および／またはＧｒ１に対する親和性を有しており、それによって、標的化部分を有していない脂質ビヒクルと比較して増大した、ＡＰＣとの会合またはＡＰＣへの内部移行を提供する。ある特定の実施形態では、標的化リガンドは、ＣＤ４５、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ２５、ＣＤ４９ｂ、および／またはＣＤ６９に対する親和性を有しており、それによって、標的化部分を有していない脂質ビヒクルと比較して増大した、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの免疫エフェクター細胞との会合を提供する。
【００４５】
ある特定の実施形態では、脂質ビヒクルは、生理的条件で正味の正電荷を示すことができる。正味の正電荷は、ＡＰＣ、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの細胞との脂質ビヒクルの会合を、正味の正電荷を有していない脂質ビヒクルよりも、例えば、少なくとも２倍高い、少なくとも５高い、または少なくとも１０倍高い割合で増強することができる。
【００４６】
様々な実施形態では、脂質−ペプチドコンジュゲートにおいて、ペプチド部分は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）またはネオ抗原（腫瘍特異的な変異遺伝子によってコードされた抗原）などの治療関連抗原のエピトープを含むか、またはそのエピトープである。
【００４７】
また本明細書では、Ｔ細胞、脂質−ペプチドコンジュゲートおよびＴＬＲアゴニストを含む組成物であって、脂質−ペプチドコンジュゲートおよびＴＬＲアゴニストが、Ｔ細胞と共有結合または非共有結合的に会合している、組成物が開示される。ある特定の実施形態では、脂質−ペプチドコンジュゲートおよびＴＬＲアゴニストは、脂質ビヒクルをＴ細胞と、例えば３０分〜２４時間インキュベートすることによって、Ｔ細胞と共有結合または非共有結合的に会合することができる。一部の実施形態では、組成物は、凍結または凍結乾燥させることができる。ある特定の実施では、組成物は、スクロースなどの１つまたは複数の凍結乾燥剤（lyophilizing  agent）をさらに含む。
【００４８】
また本明細書では、ＮＫ細胞、脂質−ペプチドコンジュゲートおよびＴＬＲアゴニストを含む組成物であって、脂質−ペプチドコンジュゲートおよびＴＬＲアゴニストが、ＮＫ細胞と共有結合または非共有結合的に会合している、組成物が開示される。この会合は、脂質ビヒクルをＮＫ細胞と約３０分間〜２４時間インキュベートすることによって生じ得る。組成物は、凍結または凍結乾燥させることができる。ある特定の実施では、組成物は、スクロースなどの１つまたは複数の凍結乾燥剤をさらに含む。
【００４９】
また、本明細書に記載される組成物を使用して、がん患者を処置するための方法が提供される。ある特定の実施形態では、がん患者は、患者への注入前に本明細書に開示される脂質ビヒクルが会合している、Ｔ細胞の注入を受ける。
【００５０】
いくつかの実施形態では、脂質ビヒクルは、リポソームを脂質−ペプチドコンジュゲートミセルと混合することによって製造される。脂質−ペプチドコンジュゲートは、リポソーム組成物を、１つまたは複数の脂質−ペプチドコンジュゲート（例えば、組成物に製剤化された脂質−ペプチドなど）と共にインキュベートすることによって、リポソームに挿入することができる。インキュベーションは、摂氏３０度超（例えば、摂氏３７度）で少なくとも３０分間（例えば、３０分間〜２４時間など）行うことができ、または摂氏４５〜６０度で３０分間〜２４時間インキュベートすることによって行うことができる。
【００５１】
一部の実施形態では、脂質−ペプチドコンジュゲートは、脂質−ペプチドコンジュゲートミセル組成物の形態の脂質ビヒクルを、Ｔ細胞またはＮＫ細胞と共に摂氏３７度で３０分間〜２４時間インキュベートすることによって、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の原形質膜に挿入することができる。
【００５２】
ある特定の実施形態では、脂質−ペプチドコンジュゲートは、ＰＥＧ２０００でペグ化されているジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ−ＰＥＧ２０００）を含むペグ化ホスファチジルエタノールアミンなどの、リポソームを形成する脂質と混合して、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の原形質膜への脂質−ペプチドコンジュゲートの挿入を助けるミセルを形成する。
【００５３】
また、単球および未成熟樹状細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化するための方法であって、ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩにおいて脂質−ペプチドコンジュゲートの一部を提示するように細胞を活性化するために、本明細書に開示される脂質ビヒクルが細胞と共にインキュベートされる、方法が提供される。
【００５４】
また、樹状細胞を使用することによって、Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで訓練するための方法であって、
ｉ）単球および未成熟樹状細胞を、本明細書に開示される脂質ビヒクル（例えば、脂質−ペプチドコンジュゲートを含む脂質ビヒクル、脂質−ペプチドコンジュゲートおよび１つまたは複数のリポソーム脂質を含む脂質ビヒクルなど）と共にインキュベートするステップと、
ｉｉ）ステップｉ）で形成された成熟樹状細胞を、未成熟Ｔ細胞と混合するステップと、
ｉｉｉ）その混合物を、Ｔ細胞が樹状細胞によって活性化されるのに十分な時間インキュベートして、クローンを増大させるステップと
を含み、ステップのそれぞれが、十分に反応性のＴ細胞が達成されるまで複数回行われ得る、方法が提供される。ある特定の実施形態では、その方法は、２回または３回反復することができる。様々な実施では、その方法は、細胞を凍結させるステップをさらに含むことができる。
【００５５】
また、混合免疫細胞集団をがん患者に注入するための方法であって、
ｉ）患者から免疫細胞を、好ましくは血液から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）として単離するステップと、
ｉｉ）必要に応じて細胞を凍結および／または解凍するステップと、
ｉｉｉ）免疫細胞（例えば、ＰＢＭＣ）を脂質ビヒクルと共に摂氏３７度で３０分間〜２４時間インキュベートするステップと、
ｉｖ）必要に応じて細胞（例えば、ＰＢＭＣ）を凍結および／または解凍するステップと、
ｖ）混合細胞集団を患者に注入するステップと
を含む、方法が提供される。
【００５６】
また、静脈内または局所投与のいずれかによって本明細書に開示される脂質ビヒクルを患者に注入または注射するための方法が提供される。
【００５７】
本明細書に記載される態様および／または実施形態は、組み合わせられ得ることが当業者には明らかとなろう。
【００５８】
定義
別段定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が関係する分野の技術者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。以下の参考文献は、本発明において使用される用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する。Academic  Press  Dictionary  of  Science  and  Technology,  Morris  (Ed.),  Academic  Press  (1st  ed.,  1992)、Oxford  Dictionary  of  Biochemistry  and  Molecular  Biology,  Smith  et  al.  (Eds.),  Oxford  University  Press  (revised  ed.,  2000)、Encyclopaedic  Dictionary  of  Chemistry,  Kumar  (Ed.),  Anmol  Publications  Pvt.  Ltd.  (2002)、Dictionary  of  Microbiology  and  Molecular  Biology,  Singleton  et  al.  (Eds.),  John  Wiley  &  Sons  (3rd  ed.,  2002)、Dictionary  of  Chemistry,  Hunt  (Ed.),  Routledge  (1st  ed.,  1999)、Dictionary  of  Pharmaceutical  Medicine,  Nahler  (Ed.),  Springer-Verlag  Telos  (1994)、Dictionary  of  Organic  Chemistry,  Kumar  and  Anandand  (Eds.),  Anmol  Publications  Pvt.    Ltd.  (2002)、およびA  Dictionary  of  Biology  (Oxford  Paperback  Reference),  Martin  and  Hine  (Eds.),  Oxford  University  Press  (4th  ed.,  2000)。これらの用語のいくつかのさらなる明確化は、それらの用語が本開示に具体的に適用される場合に、本明細書に提供される。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」という冠詞は、１つまたは１つを上回る、例えば、少なくとも１つの、その冠詞の文法上の目的物を指す。本明細書において「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語とともに使用される場合、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という単語の使用は、「１つ」を意味し得るが、これはまた、「１つまたは複数」、「少なくとも１つ」、および「１つまたは１つを上回る」という意味とも一致する。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「約」および「およそ」とは、概して、測定の性質または正確さを考慮した、測定された量の許容可能な誤差の程度を意味する。例示的な誤差の程度は、所与の値の範囲の２０パーセント（％）以内であり、典型的には１０％以内であり、より典型的には５％以内である。「実質的に」という用語は、５０％を上回ることを意味し、好ましくは８０％を上回ることを意味し、最も好ましくは９０％または９５％を上回ることを意味する。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「含むこと」または「含む」という用語は、所与の実施形態に存在する組成物、方法、およびそのそれぞれの構成要素（複数可）に関して使用されるが、指定されていないエレメントを含むことも周知である。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という用語は、所与の実施形態にそれらのエレメントが必要とされることを指す。この用語は、本開示のその実施形態の基本的かつ新規なまたは機能的な特徴（複数可）に実質的に影響を及ぼさない追加のエレメントの存在を許容する。
【００６３】
「からなる」という用語は、実施形態のその説明において列挙されていないあらゆるエレメントを除外した、本明細書に記載される組成物、方法、およびそのそれぞれの構成要素を指す。
【００６４】
「脂質ビヒクル」は、ミセルまたはリポソーム形態の脂質凝集体を指す。本明細書で使用される場合、「脂質」という用語は、水に不溶性であるが非極性有機溶媒に可溶性であり、感触が油性であり、炭水化物およびタンパク質と一緒になって、生細胞の主要な構造材料を構築する、脂肪、油、ワックス、ステロール、およびトリグリセリドを含む有機化合物の群のいずれかを指す。
【００６５】
「ミセル」は、疎水性コアおよび脂質によって構成されている親水性表面を形成する、自己会合性脂質から作成された、人工的に調製されたビヒクルを指す。
【００６６】
「リポソーム」は、少なくとも１つの脂質二重層によって形成された、小胞または顕微鏡的粒子を指す。リポソームは、人工的に調製され得る。一部の実施形態では、リポソームは、約５０〜９００ｎｍ、約５０〜５００ｎｍ、約６０〜４８０ｎｍ、約８０〜４５０ｎｍ、約１００〜４００ｎｍ、約５０〜３００ｎｍ、約８０〜２５０ｎｍ、または約１００〜２００ｎｍの平均直径を有することができる。リポソームは、水性区画を包み込むことができ、細胞を標的化することができる薬物、抗原、ワクチン、酵素、アジュバントまたは別の物質を捕捉または収容することができる。
【００６７】
「脂質−ペプチドコンジュゲート」という用語は、本明細書で使用される場合、ペプチド部分に共有結合性により連結している（例えば、１つまたは複数の結合またはリンカーを介して）脂質部分を含有する構造を指す。様々な実施形態では、脂質とペプチド部分の間の連結は、共有結合性である。ある特定の実施形態では、ペプチド部分は、抗原全体またはその一部、例えば全抗原の一画分であり、本明細書では時に「抗原ペプチド」と呼ばれる、ペプチドエピトープである。抗原ペプチドは、単なる例として、ウイルス病原体、細菌毒素、細菌病原体、真菌病原体、および／またはがん細胞に由来し得る。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸に類似の方式で機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣体を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされたアミノ酸、ならびに後に修飾されているアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、ガンマ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸アナログは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合している炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのようなアナログは、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的化学構造とは異なるが、天然に存在するアミノ酸に類似の方式で機能する構造を有する化学化合物を指す。
【００６９】
「抗原」（Ａｇ）は、本明細書で使用される場合、すべてのタンパク質またはペプチドを含む、巨大分子を指す。一部の実施形態では、抗原は、ある特定の免疫細胞（免疫調節細胞を含む）の活性化および／または抗体の生成を惹起することができる分子である。ほぼすべてのタンパク質またはペプチドを含む、任意の巨大分子が、抗原となり得る。抗原はまた、ゲノムまたは組換えＤＮＡもしくはＲＮＡに由来し得る。例えば、免疫応答を惹起することができるタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡは、抗原をコードする。いくつかの実施形態では、抗原は、遺伝子の全長ヌクレオチド配列だけによってコードされる必要はなく、また抗原は、遺伝子によってコードされる必要もまったくない。いくつかの実施形態では、抗原は、合成することができるか、または生体試料、例えば、組織試料、腫瘍試料、細胞、もしくは他の生物学的成分を有する流体に由来し得る。本明細書で使用される場合、「腫瘍抗原」または交換可能に「がん抗原」には、免疫応答を惹起することができる、がん、例えば、がん細胞または腫瘍微小環境に存在するか、またはそれと関連する、任意の分子が含まれる。
【００７０】
「抗体」または「抗体分子」とは、本明細書で使用される場合、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む、タンパク質、例えば、免疫グロブリン鎖またはその断片を指す。抗体分子は、抗体（例えば、全長抗体）および抗体断片を包含する。ある実施形態では、抗体分子は、全長抗体または全長免疫グロブリン鎖の抗原結合性断片または機能性断片を含む。例えば、全長抗体は、天然に存在するか、または通常の免疫グロブリン遺伝子断片組換えプロセスによって形成された、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子（例えば、ＩｇＧ）である）。いくつかの実施形態では、抗体分子は、免疫グロブリン分子、例えば、抗体断片の免疫学的に活性な抗原結合性部分を指す。抗体断片、例えば、機能性断片は、抗体の一部分、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、可変断片（Ｆｖ）、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、または一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。機能性抗体断片は、インタクトな（例えば、全長）抗体によって認識されるものと同じ抗原に結合する。「抗体断片」または「機能性断片」という用語はまた、可変領域からなる単離された断片、例えば、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」断片、または軽鎖および重鎖可変領域がペプチドリンカーによって接続された組換え一本鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）も含む。一部の実施形態では、抗体断片は、抗原結合活性を有さない抗体の部分、例えば、Ｆｃ断片または単一アミノ酸残基を含まない。例示的な抗体分子としては、全長抗体および抗体断片、例えば、ｄＡｂ（ドメイン抗体）、一本鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２断片、ならびに一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）が挙げられる。「Ｆａｂ」および「Ｆａｂ断片」という用語は、互換可能に使用され、抗体のそれぞれの重鎖および軽鎖に由来する１つの定常ドメインおよび１つの可変ドメイン、すなわち、ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ、およびＣＨ１を含む、領域を指す。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「免疫グロブリン可変ドメイン配列」は、免疫グロブリン可変ドメインの構造を形成することができるアミノ酸配列を指す。例えば、この配列には、天然に存在する可変ドメインのアミノ酸配列のすべてまたは一部が含まれ得る。例えば、この配列は、１つ、２つ、もしくはそれを上回るＮ末端もしくはＣ末端アミノ酸を含んでも含まなくてもよく、またはタンパク質構造の形成と適合性のある他の変更を含んでもよい。
【００７２】
いくつかの実施形態では、抗体分子は、単一特異性であり、例えば、これは、単一のエピトープに対する結合特異性を含む。一部の実施形態では、抗体分子は、多特異性であり、例えば、これは、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第１のエピトープに対する結合特異性を有し、第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第２のエピトープに対する結合特異性を有する。一部の実施形態では、抗体分子は、二特異性抗体分子である。「二特異性抗体分子」は、本明細書で使用される場合、１つを上回る（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれを上回る）エピトープおよび／または抗原に対する特異性を有する抗体分子を指す。
【００７３】
抗体分子の「抗原結合性部位」または「抗原結合性断片」または「抗原結合性部分」（本明細書において互換可能に使用される）は、抗原結合に関与する、抗体分子、例えば、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、例えば、ＩｇＧの一部を指す。一部の実施形態では、抗原結合性部位は、重鎖（Ｈ）および軽鎖（Ｌ）の可変（Ｖ）領域のアミノ酸残基によって形成される。重鎖および軽鎖の可変領域内の３つの高度に多様なストレッチは、超可変領域と称されており、より保存されている「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれる隣接するストレッチの間に配置される。ＦＲは、天然には、免疫グロブリンにおける超可変領域の間に、それに隣接して見出される、アミノ酸配列である。いくつかの実施形態では、抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域は、三次元空間において、互いに対して、結合される抗原の三次元表面に対して相補性となる抗原結合性表面を形成するように配置されている。重鎖および軽鎖のそれぞれの３つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と称される。フレームワーク領域およびＣＤＲは、例えば、Kabat,  E.A.,  ら  (1991)  Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest,  Fifth  Edition,  U.S.  Department  of  Health  and  Human  Services,  NIH  Publication  No.  91-3242およびChothia,  C.  ら(1987)  J.  Mol.  Biol.  196:901-917において定義および説明されている。それぞれの可変鎖（例えば、可変重鎖および可変軽鎖）は、典型的に、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成されており、アミノ末端からカルボキシ末端へのアミノ酸の順で、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４と配置されている。可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲは、一般に、２７〜３２位（ＣＤＲ１）、５０〜５６位（ＣＤＲ２）、および９１〜９７位（ＣＤＲ３）の残基を含むと定義される。可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲは、一般に、２７〜３３位（ＣＤＲ１）、５２〜５６位（ＣＤＲ２）、および９５〜１０２位（ＣＤＲ３）の残基を含むと定義される。当業者であれば、ループが、抗体にわたって異なる長さのものであってもよく、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｉａなどの番号付けシステムは、フレームワークが抗体にわたって一貫した番号付けを有するように制御することを理解するであろう。
【００７４】
一部の実施形態では、抗体の抗原結合性断片（例えば、本開示の融合分子の一部として含まれる場合）は、全長Ｆｃドメインが欠如していてもよく、またはそれを含まなくてもよい。ある特定の実施形態では、抗体結合性断片は、全長ＩｇＧまたは全長Ｆｃを含まないが、軽鎖および／または重鎖に由来する１つまたは複数の定常領域（またはその断片）を含んでもよい。一部の実施形態では、抗原結合性断片は、あらゆるＦｃドメインを完全に含まなくてもよい。一部の実施形態では、抗原結合性断片は、全長Ｆｃドメインを実質的に含まなくてもよい。一部の実施形態では、抗原結合性断片は、全長Ｆｃドメインの一部分（例えば、ＣＨ２ドメインもしくはＣＨ３ドメイン、またはその一部分）を含んでもよい。一部の実施形態では、抗原結合性断片は、全長Ｆｃドメインを含んでもよい。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧドメイン、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。
【００７５】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、Ｔ細胞が認識することができる形態の抗原を提示することができる細胞である。免疫系は、マクロファージ、樹状細胞およびＢ細胞の３つのタイプのＡＰＣを含有する。プロフェッショナルＡＰＣとしても公知のこれらの細胞は、ＭＨＣクラスＩＩを発現し、過去にその抗原に一度も遭遇したことがないヘルパーＴ細胞を活性化することができる。ＡＰＣはまた、ＭＨＣクラスＩ経路を介して細胞傷害性Ｔ細胞に抗原を提示することができる。ＡＰＣは、ファゴサイトーシスと呼ばれるプロセス中に、抗原を急速に貪食することができる。Ｔ細胞がＭＨＣ分子複合体を認識し、それに結合すると、ＡＰＣは、さらなる共刺激性シグナルを送って、Ｔ細胞を活性化する。
【００７６】
樹状細胞（ＤＣ）は、哺乳動物の免疫系の一部を形成する免疫細胞である。それらの主な機能は、抗原材料をプロセシングし、それを免疫系の他の細胞に対して表面上に提示し、したがって抗原提示細胞として機能することである。樹状細胞は、自然免疫と適応免疫の間のメッセンジャーとして作用する。樹状細胞は、外部環境と接触する組織、主に皮膚（ランゲルハンス細胞と呼ばれる特化した樹状細胞型が存在する場所）、ならびに鼻、肺、胃および腸の内壁に、少量で存在する。樹状細胞は、血中に未成熟の状態でも見出され得る。樹状細胞は、活性化されると、リンパ節に遊走し、そこでＴ細胞およびＢ細胞と相互作用して、適応免疫応答を開始し、形成する。樹状細胞は、ある特定の発達段階では、分枝突起である樹状突起を成長させ、その名称が細胞に与えられている。しかしこれらの突起は、やはり類似の付属物を有するニューロンとはいかなる特別な関係もない。未成熟樹状細胞は、樹状突起ではなく大きい細胞質の「ベール」を有する場合には、ベール細胞とも呼ばれる。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「アジュバント」という用語は、ワクチンに添加される場合、標的抗原に対して対象の免疫系の応答を刺激する能力を有するが、個々には免疫を付与しない、薬理学的または免疫学的薬剤を指す。アジュバントは、免疫系に対するそれらの抗原提示において、それに限定されるものではないが免疫調節剤としての作用を含め、様々な方式で作用することができる。
【００７８】
「免疫調節剤」という用語は、本明細書で使用される場合、免疫学的応答をモジュレート（例えば、刺激または抑制）することができる薬剤を指す。免疫細胞または免疫応答に関する、「モジュレートする」という用語は、免疫細胞または免疫系によって媒介される活性または細胞プロセスの変化（例えば、マクロファージによる抗原プロセシングおよび提示、Ｔ細胞の活性化および増殖、ならびにサイトカインの産生）を指す。モジュレーションは、上方調節（すなわち、活性化または刺激）または下方調節（すなわち、阻害または抑制）であり得る。モジュレートされた活性または免疫応答の変化は、直接的（例えば、薬剤と細胞の結合を介する）または間接的（例えば、薬剤と、別の方式で細胞をモジュレートする別の分子または別の細胞との相互作用を介する）であり得る。
【００７９】
「免疫刺激化合物」という用語は、本明細書で使用される場合、自然免疫および／または適応免疫系を刺激または増強することができる化合物を指す。
【００８０】
「免疫抑制化合物」または「免疫寛容誘導化合物」という用語は、本発明の文脈において使用される場合、免疫学的応答を下方調節または阻害することができる化合物を指す。
【００８１】
本明細書で使用される場合、「免疫細胞」は、免疫系において、例えば、感染因子および外来物に対して保護するように機能する、様々な細胞のうちのいずれかを指す。いくつかの実施形態では、この用語は、白血球、例えば、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、および単球を含む。免疫細胞には、本明細書に記載される免疫調節細胞（例えば、Ｔｒｅｇ）および免疫エフェクター細胞が含まれる。免疫細胞には、免疫応答に関与する細胞の修飾されたバージョン、例えば、ＮＫ細胞系ＮＫ−９２（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−２４０７）、ｈａＮＫ（高親和性Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａ（１５８Ｖ）を発現するＮＫ−９２バリアント）およびｔａＮＫ（所与の腫瘍抗原に対するＣＡＲを発現する遺伝子をトランスフェクトした、標的化ＮＫ−９２細胞）を含む、修飾されたＮＫ細胞が含まれ得る。
【００８２】
「免疫エフェクター細胞」は、この用語が本明細書で使用される場合、免疫応答に関与する、例えば、免疫エフェクター応答の促進に関与する細胞を指す。免疫エフェクター細胞の例としては、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、アルファＴ細胞、ベータＴ細胞、ガンマＴ細胞、およびデルタＴ細胞；Ｂ細胞；ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞；ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞；樹状細胞；ならびにマスト細胞が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、例えば、がん抗原に結合するＣＡＲを含む、例えばそれを発現する、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）である。他の実施形態では、免疫細胞は、外因性高親和性Ｆｃ受容体を発現する。一部の実施形態では、免疫細胞は、操作されたＴ細胞受容体を含む、例えばそれを発現する。一部の実施形態では、免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球である。一部の実施形態では、免疫細胞は、免疫細胞の集団を含み、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する特異性が富化された、例えば目的のＴＡＡ、例えばＭＡＲＴ−１を呈示するＭＨＣに対する特異性を有するＴ細胞に関して選別することによって富化されたＴ細胞を含む。一部の実施形態では、免疫細胞は、免疫細胞の集団を含み、目的のＴＡＡペプチドを呈示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば樹状細胞によって、ＴＡＡに対する特異性を有するように訓練されているＴ細胞を含む。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＳＸ２、サバイビンなどのうちの１つまたは複数から選択されるＴＡＡに対して訓練されている。一部の実施形態では、免疫細胞は、目的の複数のＴＡＡペプチドを呈示するＡＰＣ、例えば樹状細胞によって、複数のＴＡＡに対する特異性を有するように訓練されているＴ細胞の集団を含む。一部の実施形態では、免疫細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞）である。一部の実施形態では、免疫細胞は、ヘルパーＴ細胞、例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。
【００８３】
「ｍｏｌ％」という用語は、本明細書で使用される場合、構成物のモル量を、混合物中のすべての構成物の全モル量で割って１００を掛けたものとして定義される。
【００８４】
「ＰＥＧ」という用語は、本明細書で使用される場合、ポリエーテル化合物であるポリエチレングリコールを指す。ＰＥＧは、現在、いくつかのサイズで利用可能であり、例えば、ＰＥＧ３５０、ＰＥＧ５５０、ＰＥＧ７５０、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ５０００、ＰＥＧ１００００、ＰＥＧ２００００およびＰＥＧ３００００から選択することができる。その数は、ポリエチレングリコールの分子量を指す。
【００８５】
「生理的条件」という用語は、本明細書で使用される場合、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件を模倣するか、またはｉｎ  ｖｉｖｏ条件となる条件を指す。生理系は、一般に、細胞外で約７．２のｐＨを有し、細胞内区画内でｐＨ４〜７を有する水性系から構成されるとみなされ、還元性環境となり得る。
【００８６】
「対象」という用語は、免疫応答が誘起され得る生物（例えば、哺乳動物、ヒト）を含む。一実施形態では、対象は、患者、例えば、免疫細胞療法を必要とする患者である。別の実施形態では、対象は、例えば、同種移植が意図される、免疫細胞のドナー、例えば、同種ドナーである。
【００８７】
「処置」という用語は、本明細書で使用される場合、疾患または障害と戦うことを指す。「処置」または「処置すること」は、本明細書で使用される場合、本明細書に記載される疾患または状態の症状または病理に対する任意の望ましい効果を含み、処置される疾患または状態の１つまたは複数の測定可能なマーカーの最小限の変化または改善を含むこともできる。「処置」または「処置すること」は、疾患もしくは状態、またはその関連症状の完全な根絶または治癒を必ずしも示すわけではない。
【００８８】
「がん」は、本明細書で使用される場合、あらゆる種類の発がん性プロセスおよび／またはがん性成長を包含し得る。いくつかの実施形態では、がんは、原発性腫瘍、ならびに転移性組織または悪性形質転換細胞、組織もしくは臓器を含む。いくつかの実施形態では、がんは、がんの、すべての組織病理およびステージ、例えば、侵襲性／重症度のステージを包含する。いくつかの実施形態では、がんは、再発および／または耐性がんを含む。「がん」および「腫瘍」という用語は、互換可能に使用することができる。例えば、いずれの用語も、固形腫瘍および液性腫瘍を包含する。本明細書で使用される場合、「がん」または「腫瘍」という用語は、前悪性ならびに悪性のがんおよび腫瘍を含む。
【００８９】
本明細書で使用される場合、「ワクチン」という用語は、抗原を含み、その投与が、そのような投与を受けた対象に免疫応答をもたらす、任意の組成物を意味するものである。ワクチンは、本明細書に開示される脂質ビヒクルであってよい。「ワクチン接種」は、ワクチンを投与し、免疫応答を引き起こすプロセスを指す。
【００９０】
本明細書で使用される場合、ペプチド、活性成分（例えば、薬物）および／またはアジュバント（例えば、免疫調節剤）を「ローディング」されたリポソームは、膜会合および／または小胞内ペプチドおよび／またはアジュバントのいずれかを用いて製剤化された生成物である。そのような「ローディングされたリポソーム」は、細胞をペプチド抗原で「ローディングする」ための送達ビヒクルとして使用される。したがって、「ローディングされた」細胞は、ペプチド抗原を有効に受け取ったまたは取り込んだ細胞である。ローディングされた抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子の文脈では、ペプチド抗原を取り込み、細胞表面において抗原を発現する、細胞である。
【００９１】
本明細書における化合物の説明は、当業者に公知の化学結合の原理によって制限されることを理解されよう。したがって、ある基が、いくつかの置換基の１つまたは複数によって置換され得る場合、そのような置換は、原子価などに関する化学結合原理に従い、本来的に不安定でない化合物をもたらすように選択される。例えば、任意の炭素原子は、炭素の４個の原子価電子と一致する、２個、３個、または４個の他の原子に結合する。
【００９２】
本開示の様々な態様を、以下にさらに詳説する。さらなる定義は、本明細書を通して記載される。
【００９３】
脂質−ペプチドコンジュゲート
一部の実施形態では、脂質−ペプチドコンジュゲートは、式（Ｉ）による構造を有し、脂質−ペプチドコンジュゲートを還元性環境に対して敏感にする酸化還元感受性の共有結合を含むリンカー分子を含有する。
脂質−Ｓ−Ｓ−ペプチド  式（Ｉ）
脂質部分は、ジスルフィド結合の一方のＳに共有結合することができる、リン脂質、ステロール、アルキルまたは他の疎水性部分であってよい（例えば、脂質は、式（Ｉ）のジスルフィド結合の１つのチオールに共有結合しているリンカー原子またはリンカー分子などを含有する）。ペプチド部分は、ジスルフィド結合の他方のＳに共有結合することができる（例えば、ペプチドは、システインアミノ酸などを含む）。コンジュゲートは、ペプチドと脂質の間に、式（Ｉ）のジスルフィド結合の一方のチオールに共有結合している１つまたは複数のさらなるリンカー分子を含有することができる。一実施形態では、このリンカー分子は、連結に適した官能基を有する、短い脂肪族鎖、芳香族環またはＰＥＧ分子であってよい。一部の実施形態では、ペプチド部分は、例えば、ペプチドのシステインを介して、リンカーにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、ペプチド部分は、アミノ酸の一方の末端（例えば、アミノ末端またはカルボン酸末端）にシステイン基を含む。ある特定の実施形態では、ペプチドは、エピトープの一方の末端（例えば、アミノ末端、カルボン酸末端）にコンジュゲートされたシステイン残基を含むことができる。
【００９４】
一実施形態では、脂質−ペプチドコンジュゲートは、式（ＩＩ）または式（ＩＩＩ）による構造を有することができ、脂質−ペプチドコンジュゲートを還元性環境または還元試薬に対して敏感にするジスルフィド共有結合を含むリンカー分子を含有する。
【化１−１】
2021523209.tif 000003
【化１−２】
2021523209.tif 000004
脂質部分は、必要に応じてリンカー原子またはリンカー分子を含有し、式（ＩＩ）のジスルフィド結合の一方のチオールまたは式（ＩＩＩ）のカルボニルに共有結合している、リン脂質、ステロール、アルキルまたは他の疎水性部分であってよい。ペプチドは、ペプチドのＮ末端位置にシステインアミノ酸を含有することができる。
【００９５】
様々な実施形態では、脂質−ペプチドコンジュゲートは、式（ＩＶ）による構造を有する。
脂質−Ｘ−ペプチド  式（ＩＶ）
【００９６】
いくつかの実施形態では、リンカーＸは、切断性リンカー、非切断性リンカー、ペプチドリンカー、可撓性リンカー、剛性リンカー、らせん状リンカー、または非らせん状リンカーから選択することができる。
【００９７】
一部の実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーである。ペプチドリンカーは、５〜２０、８〜１８、１０〜１５、または約８、９、１０、１１、１２、１３、１４もしくは１５のアミノ酸長であってよい。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、ＧｌｙおよびＳｅｒを含む。さらに別の実施形態では、リンカーは、酵素、例えばプロテアーゼ（例えば、ペプシン、トリプシン、サーモリシン（thermolysine）、マトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ（ＡＤＡＭ；例えば、ＡＤＡＭ−１０またはＡＤＡＭ−１７））、グリコシダーゼ（例えば、α−、β−、γ−アミラーゼ、α−、β−グルコシダーゼまたはラクターゼ）またはエステラーゼ（例えば、アセチルコリンエステラーゼ、偽コリンエステラーゼまたはアセチルエステラーゼ）によって切断されるように構成される。切断性リンカーを切断することができる他の酵素には、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、グランザイムＡ、グランザイムＢ、リソソーム酵素、カテプシン、前立腺特異的抗原、単純ヘルペスウイルスプロテアーゼ、サイトメガロウイルスプロテアーゼ、トロンビン、カスパーゼ、およびインターロイキン１ベータ変換酵素が含まれる。さらに別の例は、目的の組織における酵素、例えばプロテアーゼ（例えば、ペプシン、トリプシン）の過剰発現であり、それによって、特異的に設計されたペプチドリンカーは、目的の組織に到達すると切断される。さらに別の例では、目的の組織における酵素、例えばグリコシダーゼ（例えば、α−アミラーゼ）の過剰発現により、特異的に設計された炭水化物リンカーは、目的の組織に到達すると切断される。これに関して好適なリンカーの例示的な例は、−（α−１−４−Ｄ−グルコース）ｎ−（ｎ≧４）である。
【００９８】
他の実施形態では、リンカーは、非ペプチド化学的リンカーである。好適なクロスリンカーには、適切なスペーサによって分離された明確に反応性の２個の基を有する、ヘテロ二官能性のクロスリンカー（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）またはホモ二官能性のクロスリンカー（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）が含まれる。一部の実施形態では、リンカーは、生分解性または切断性リンカーであってよい。リンカーの切断は、関連組織内の生物学的活性化によって、または例えば電磁放射線、例えばＵＶ放射線などの外的刺激によって引き起こされ得る。一実施形態では、切断性リンカーは、細胞の外側での切断のために、例えば、細胞または組織の損傷または疾患と関連する状態で切断されるように構成される。そのような状態には、例えば、アシドーシス；壊死性状態（例えば、壊死細胞から溢出するカルパインまたは他のプロテアーゼにより切断される）を含む細胞内酵素（通常は細胞内に限局される）の存在；低酸素状態、例えば還元性環境；血栓症（例えば、リンカーは、トロンビンにより、または血液凝固カスケードと関連する別の酵素により、切断可能であり得る）；免疫系活性化（例えば、リンカーは、活性化された補体タンパク質の作用により切断可能であり得る）；または疾患もしくは傷害と関連する他の状態が含まれる。
【００９９】
一実施形態では、切断性リンカーは、Ｓ−Ｓ連結（ジスルフィド結合）を含むことができ、または金属が還元されるとバラバラになる遷移金属錯体を含むことができる。一実施形態は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，６０３，９４４号に開示されている。別の例は、酸（または塩基）不安定性部分、例えば酸不安定性エステル基などの加水分解を促進するｐＨの変化の際に、例えば低ｐＨで切断されるｐＨ感受性リンカーである。そのような状態は、罹患した、アポトーシス性のもしくは壊死性の細胞および組織などの、処置すべき状態を有する細胞の表面に見出されるもしくはそのような細胞の付近に放出されるプロテアーゼもしくは他の酵素による、または他の状態もしくは因子による、がん性細胞および組織の付近に見出され得るような酸性条件などの細胞外環境で、または低酸素もしくは虚血状態の細胞および組織の付近に見出され得るような還元性環境で見出され得る。酸不安定性リンカーは、例えば、ｃｉｓ−アコニット酸リンカーであり得る。ｐＨ感受性連結の他の例としては、アセタール、ケタール、活性化アミド、例えば、２，３ジメチルマレアミド酸（dimethylmaleamic  acid）のアミド、ビニルエーテル、他の活性化エーテルおよびエステル、例えば、エノールまたはシリルエーテルまたはエステル、イミン、イミニウム、オルトエステル、エナミン、カルバメート、ヒドラゾン、および当技術分野で公知の他の連結が挙げられる（例えば、参照によりすべて本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１２／１５５９２０およびＷＯ２０１９／０５０９７７、ならびにFranco  et  al.,  AIMS  Materials  Science,  3(1):  289-323を参照されたい）。「ｐＨ感受性」という表現は、問題の切断性リンカーが、酸性ｐＨ（例えば、６．０未満の、例えば４．０〜６．０の範囲のｐＨ）で実質的に切断されることを指す。
【０１００】
一部の実施形態では、リンカーＸは、加水分解（例えば、ｐＨ４〜ｐＨ７）によって分解される共有結合を含有することができる。共有結合は、加水分解によって分解される官能基の一部であってよい。脂質部分は、Ｘに共有結合しているリンカー原子またはリンカー分子を必要に応じて含有する、リン脂質、ステロール、アルキルまたは他の疎水性部分であってよい。一部の実施形態では、Ｘは、エステル、チオエステル、オルトエステル、ケタール、またはイミンなどの加水分解性官能基である。ペプチドは、直接的または間接的に別のリンカー分子を介して、Ｘに共有結合的に連結しているアミノ酸を含有することができる。ある特定の実施形態では、脂質−ペプチドコンジュゲートは、コンジュゲートの２０％未満が、ヒト血清中、摂氏３７度で２４時間以内に切断され、生分解性リンカーの少なくとも７０％が、抗原提示細胞内の生理的に関連する条件下において２０日以内に切断されるような様式で生分解性リンカーを含有するように、設計することができる。
【０１０１】
選択された実施形態では、脂質−ペプチドコンジュゲートは、ペグ化され得る。このことは、有利なことに、ＡＰＣ上の抗原提示を長引かせることが示された。例えば、コンジュゲート（conjucgate）は、式（ＶＩ）、（ＶＩ−１）、（ＶＩ−２）および（ＶＩ−３）のいずれか１つによる構造：
【化２】
2021523209.tif 000005
を有することができる
［式中、Ｙは、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、またはＣ＝ＮＨであり、
Ｘは、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルまたは分枝Ｃ１〜Ｃ１０アルキルであり、
ｍは、０〜１００から選択される整数であり、
Ｚは、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、またはＣＨ２であり、
ｋは、０〜５から選択される整数である］。
【０１０２】
一部の実施形態では、脂質−ペプチドコンジュゲートは、式（ＩＸ）、（ＩＸ−１）、または（ＩＸ−２）による構造：
【化３−１】
2021523209.tif 000006
【化３−２】
2021523209.tif 000007
を有する
［式中、ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＨ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、分枝Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ＮＨ、ＳまたはＯからなる群より選択され、
ｊは、０〜１０から選択される整数であり、
ｋは、０〜１０から選択される整数であり、
ｌは、０〜１０から選択される整数であり、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、単結合であるか、または水素、ＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、分枝Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ＮＨ、ＳもしくはＯからなる群より選択される］。
【０１０３】
一部の実施形態では、脂質−ペプチドコンジュゲートは、式（Ｘ）による構造：
【化４】
2021523209.tif 000008
を有する
［式中、ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＨ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、分枝Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ＮＨ、ＳまたはＯからなる群より選択され、
Ｒは、水素、ＳＯ３Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルまたは分枝Ｃ１〜Ｃ１０アルキルである］。
【０１０４】
一部の実施形態では、リンカーは、ケタールを含有することができる。例えば、脂質−ペプチドコンジュゲートは、式（ＸＩ）による構造：
【化５】
2021523209.tif 000009
を有することができる
［式中、ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＨ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、分枝Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ＮＨ、ＳまたはＯからなる群より選択され、
ｊは、０〜１０から選択される整数であり、
ｋは、０〜１０から選択される整数であり、
ｌは、０〜１０から選択される整数であり、
Ｒ１は、単結合であるか、または水素、ＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、分枝Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ＮＨ、ＳもしくはＯからなる群より選択され、
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、分枝Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、または環化Ｃ３〜Ｃ１０アルキルからなる群より選択される］。
【０１０５】
一部の実施形態では、リンカーは、ヒドラジンを含有することができる。例えば、脂質−ペプチドコンジュゲートは、式（ＸＩＩ）による構造：
【化６】
2021523209.tif 000010
を有することができる
［式中、ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＨ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、分枝Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ＮＨ、ＳまたはＯからなる群より選択され、
ｌは、０〜１０から選択される整数であり、
ｍは、０〜１００から選択される整数であり、
Ｒ１は、単結合であるか、または水素、ＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、分枝Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ＮＨ、ＳもしくはＯからなる群より選択され、
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、分枝Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、または環化Ｃ３〜Ｃ１０アルキルからなる群より選択される］。
【０１０６】
一部の実施形態では、リンカーは、イミンを含有することができる。例えば、脂質−ペプチドコンジュゲートは、式（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＩＩ−１）または（ＸＩＩＩ−２）による構造：
【化７−１】
2021523209.tif 000011
【化７−２】
2021523209.tif 000012
を有することができる
［式中、ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＨ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、分枝Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ＮＨ、ＳまたはＯからなる群より選択され、
ｌは、０〜１０から選択される整数であり、
ｊは、０〜１００から選択される整数であり、
ｋは、０〜１０から選択される整数であり、
ｍは、０〜１０から選択される整数であり、
Ｒ１は、単結合であるか、または水素、ＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、分枝Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ＮＨ、ＳもしくはＯからなる群より選択され、
Ｒ２は、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、分枝Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、または環化Ｃ３〜Ｃ１０アルキルである］。
【０１０７】
ある特定の実施形態では、リンカーは、還元不可能であってよく、例えば、ジビニルスルホン、マレイミド、および／またはハロゲン化アルキル基を含有するリンカーであってよい。一部の実施形態では、脂質−ペプチドコンジュゲートは、式（ＸＩＶ）、（ＸＩＶ−１）、または（ＸＩＶ−２）による構造：
【化８】
2021523209.tif 000013
を有する
［式中、Ｘは、Ｓ、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＨ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、分枝Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ＮＨ、ＳまたはＯであり、
ｌは、０〜１０から選択される整数であり、
ｍは、０〜１０から選択される整数である］。
【０１０８】
一部の実施形態では、脂質−ペプチドコンジュゲートは、式（ＸＶ）または（ＸＶ−１）による構造：
【化９】
2021523209.tif 000014
を有する
［式中、ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＨ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、分枝Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ＮＨ、ＳまたはＯからなる群より選択され、
ｊは、０〜１００から選択される整数であり、
ｍは、０〜１００から選択される整数であり、
ｋは、０〜１０から選択される整数であり、
Ｒは、水素、ＳＯ３Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルまたは分枝Ｃ１〜Ｃ１０アルキルである］。
【０１０９】
一部の実施形態では、脂質−ペプチドコンジュゲートは、式（ＸＶＩ）、（ＸＶＩ−１）または（ＸＶＩ−２）による構造：
【化１０】
2021523209.tif 000015
を有する
［式中、ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＨ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、分枝Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ＮＨ、ＳまたはＯからなる群より選択され、
ｍは、０〜１０から選択される整数である］。
【０１１０】
一部の実施形態では、脂質−ペプチドコンジュゲートは、ペプチド（例えば、８〜４０のアミノ酸長ペプチド）、例えば目的の抗原のエピトープであるペプチドを、ペプチドと反応することができる１つまたは複数の官能基を有する修飾された脂質と混合することによって形成することができる。修飾された脂質は、脂質ビヒクル中に存在することができる。例えば、脂質ビヒクルは、式（Ｖ）のような構造を有する修飾された脂質を含有することができ（例えば、脂質組成物の０．１〜１０ｍｏｌ％で）、
【化１１】
2021523209.tif 000016
その脂質は、リン脂質、コレステロールもしくは脂肪酸などの脂質分子、または他の疎水性脂質部分であり、Ｘは、リンカー原子、例えばＮ、ＯもしくはＳ、またはリンカー分子、例えばＰＥＧである。
【０１１１】
式（Ｖ）の構造を有する化合物は、ペプチドが、ジスルフィド結合切断時の細胞内環化に起因してリンカーから任意の追加部分を伴わずに遊離することができる、化学的性質を含むことができる。したがって、一実施形態では、ペプチド抗原は、自壊性リンカーを介して脂質部分にコンジュゲートされる。他の例示的な自壊性リンカーは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるBlencowe  et  al.,  Polym.    Chem.,  2011,  2,  773-790に開示されている。
【０１１２】
一部の実施形態では、修飾された脂質は、式（ＶＩＩ）または（ＶＩＩ−１）による構造：
【化１２】
2021523209.tif 000017
を有することもできる
［式中、ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＨ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、分枝Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ＮＨ、ＳまたはＯからなる群より選択され、
ｍは、０〜１０から選択される整数であり、
ｎは、０〜１０から選択される整数であり、
Ｒは、水素、ＳＯ３Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルまたは分枝Ｃ１〜Ｃ１０アルキルであり、
Ｚは、脱離基、例えばトリフレート、トシル、Ｃｌ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよびイミダゾリドである］。
【０１１３】
一部の実施形態では、修飾された脂質は、式（ＶＩＩＩ）による構造：
【化１３】
2021523209.tif 000018
を有することもできる
［式中、ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＨ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、分枝Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ＮＨ、ＳまたはＯからなる群より選択され、
ｍは、０〜１０から選択される整数であり、
ｎは、０〜１０から選択される整数であり、
ｌは、０〜１０から選択される整数である］。
【０１１４】
式（Ｖ）、（ＶＩＩ）、および／または（ＶＩＩ）の修飾された脂質は、複数のペプチドエピトープまたは関連抗原、例えばいくつかの異なる腫瘍抗原の複数のエピトープと反応し、それによって、式（Ｖ）、（ＶＩＩ）、および／または（ＶＩＩ）を介して表面にコンジュゲートされた複数のエピトープを有する脂質ビヒクルを形成することもできる。ペプチドは、ペプチド内のリシン由来の第一級アミンまたはＮ末端アミンなどの反応性アミンを介して、これらの脂質にコンジュゲートされる。
【０１１５】
一部の実施形態では、本明細書に開示される脂質−ペプチドコンジュゲートは、本明細書に開示される生分解性または切断性リンカーを介して、脂質に共有結合的にコンジュゲートすることができる。切断は、例えば、生理的条件下において３０日以内、例えば２０日以内、１０日以内、または２日以内に生じ得る。この共有結合の切断は、ＡＰＣ内の還元的環境によって誘導され得るか、またはＡＰＣ内、例えばエンドソーム内のより低いｐＨに起因して、加水分解によって誘導され得る。
【０１１６】
脂質ビヒクル
本開示は、一態様では、脂質組成物を含む脂質ビヒクルに関する。脂質ビヒクルは、リポソームまたはミセルであってよい。脂質ビヒクルは、リン脂質、コレステロール、および他のアニオン性またはカチオン性脂質から構成され得る。
【０１１７】
脂質ビヒクルの脂質は、疎水性または両親媒性脂質、例えばリン脂質（例えば、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリンなど）、ステロール（例えば、コレステロールなど）、およびアルキル（例えば、Ｃ２〜Ｃ３０アルキル、Ｃ１０〜Ｃ３０アルキル、Ｃ１０〜Ｃ２０アルキルなど）であってよい。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される脂質ビヒクルは、少なくとも１つの脂質−ペプチドコンジュゲートを含有し、ここでペプチドは、８〜４０の間のアミノ酸長であり、腫瘍抗原、または自己免疫性もしくは感染性疾患に関係する抗原などの治療関連抗原のエピトープであり、すなわち、ペプチドは抗原ペプチドである。脂質ビヒクルは、免疫細胞、特に抗原提示細胞への脂質−ペプチドコンジュゲートの取込みを増強することができ、主要組織適合複合体は、抗原提示細胞内の細胞内プロセシング後にペプチドに結合し、ペプチドの一部を提示する。
【０１１８】
特定の実施形態では、脂質ビヒクルは、複数の脂質−ペプチドコンジュゲート、例えば少なくとも２個の別個の脂質−ペプチドコンジュゲート、例えば少なくとも５個の別個の脂質−ペプチドコンジュゲート、例えば少なくとも１０個の別個の脂質−ペプチドコンジュゲート、例えば少なくとも５０個の別個の脂質−ペプチドコンジュゲートを含む。これらの別個のペプチドエピトープは、同じ抗原のいくつかのエピトープであってよく、または複数の抗原に対する、例えばいくつかの異なる腫瘍抗原に対するエピトープから構成され得る。
【０１１９】
一実施形態では、脂質ビヒクルは、直径約９００ｎｍ未満、または約５００ｎｍ未満、例えば約５０〜５００ｎｍ、または約１００〜２００ｎｍの平均サイズを有するミセルまたはリポソームである。サイズは、動的光散乱によって測定することができる。一部の実施形態では、脂質ビヒクルは、ヒト血清中で少なくとも２４時間安定なままであり、すなわち、実質的にサイズが変化しない。一部の実施形態では、脂質ビヒクルは、血清中、３７度で２４時間インキュベートする前の平均サイズと比較して、そのサイズが約５０％未満変化する。
【０１２０】
ある特定の実施形態では、脂質ビヒクルは、抗原提示細胞によって有効に内部移行され、例えば、脂質ビヒクルおよび脂質ビヒクルと会合した脂質−ペプチド−コンジュゲートの抗原提示細胞による内部移行は、脂質および脂質ビヒクルにコンジュゲートされていない同じペプチドよりも少なくとも３倍高く、例えば少なくとも１０倍高く、例えば少なくとも３０倍高く、例えば少なくとも１００倍高い。
【０１２１】
一実施形態では、脂質ビヒクルは、生理的条件で、脂質−ペプチドコンジュゲートを含む脂質ビヒクルと抗原提示細胞の２４時間以内の会合が、正味の正電荷を有していない脂質ビヒクルよりも少なくとも２倍高く、例えば少なくとも５倍高く、例えば少なくとも１０倍高くなるように、脂質ビヒクルと抗原提示細胞の会合を増強する正味の正電荷を示す。
【０１２２】
一実施形態では、脂質ビヒクルは、脂質ビヒクルが、脂質−ペプチドコンジュゲートと抗原提示細胞との会合を増強するように、例えば２４時間以内の抗原提示細胞との会合が、正味の正電荷および標的化リガンドを有していない脂質ビヒクルよりも少なくとも２倍高く、例えば少なくとも５倍高く、例えば少なくとも１０倍高くなるように、生理的条件で正味の正電荷を示し、脂質または脂質−ＰＥＧコンジュゲートに結合した標的化リガンドをさらに含む。
【０１２３】
別の実施形態では、脂質ビヒクルは、生理的条件で正味の正電荷を示し、血中の他の細胞と比較して、２４時間以内に正味の正電荷を有していない脂質ビヒクルよりも少なくとも２倍高く、例えば少なくとも５倍高く、例えば少なくとも１０倍高く、血中の抗原提示細胞に優先的に接着する。
【０１２４】
特定の実施形態では、脂質ビヒクルは、生理的条件で、２４時間以内のＴ細胞またはＮＫ細胞との会合が、正味の正電荷を有していない脂質ビヒクルよりも少なくとも２倍高く、例えば少なくとも５倍高く、例えば少なくとも１０倍高くなるように、脂質−ペプチドコンジュゲートとＴ細胞またはＮＫ細胞の会合を増強する正味の正電荷を示す。
【０１２５】
別の実施形態では、脂質ビヒクルは、脂質ビヒクルが、脂質−ペプチド−コンジュゲートとＴ細胞またはＮＫ細胞との会合を増強し、２４時間以内のＴ細胞またはＮＫ細胞との会合が、正味の正電荷および標的化リガンドを有していない脂質ビヒクルよりも少なくとも２倍高く、例えば少なくとも５倍高く、例えば少なくとも１０倍高くなるように、生理的条件で正味の正電荷を示し、脂質または脂質−ＰＥＧコンジュゲートに結合した標的化リガンドをさらに含む。
【０１２６】
本開示による脂質ビヒクルは、ゼータ電位によって測定される通り、正味の正電荷を呈し得る。一部の実施形態では、脂質ビヒクルは、ステアリルアミン（ＳＡ）、ラウリルトリメチルアンモニウムブロミド；セチルトリメチル−アンモニウムブロミド、ミリスチルトリメチルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、３６−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−コレステロール）、１，２−ジテトラデカノイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＳＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、ＤＯＴＡＰクロリド（ＤＯＴＡＰ  Ｃｌ）およびＤＯＴＡＰ誘導体、例えば１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−３−トリメチルアンモニウム−プロパンおよび１，２−ジヘキサデカノイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン、１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）およびＤＯＤＡＰ誘導体、例えば１，２−ジテトラデカノイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン、１，２−ジヘキサデカノイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン、および１，２−ジオクタデカノイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン、１，２−ジ−０−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、１，２−ジオレオイル−ｃ−（４’−トリメチルアンモニウム）−ブタノイル−ｓｎ−グリセロール（ＤＯＴＢ）、ジオクタデシルアミド−グリシルスペルミン、ＳＡＩＮＴ−２、ポリカチオン性脂質２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミン−カルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＥＰＣ）およびＧＬ６７ＴＭ、ポリリシン脂質コンジュゲート、ポリアルギニン脂質コンジュゲートから選択されるカチオン性脂質を含む。
【０１２７】
別の実施形態では、脂質ビヒクルは、水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ペグ化リン脂質、例えばペグ化ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（例えば、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００など）およびペグ化ホスファチジルエタノールアミン（例えば、ＤＯＰＥ−ＰＥＧ２０００など）から選択される１つまたは複数の脂質を含む。一実施形態では、脂質ビヒクルは、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００の混合物、またはＰＯＰＣ、コレステロールおよびＤＰＳＥ−ＰＥＧ２０００の混合物を含む。
【０１２８】
一実施形態では、脂質ビヒクルは、本明細書に開示される標的化リガンドに結合することができる脂質、例えば、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−マレイミドまたは別のＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００コンジュゲートを含有し、ここで官能基は、標的化リガンド上のチオールまたはアミン反応性部分によって、ＰＥＧの遠位端にコンジュゲートされている。
【０１２９】
一実施形態では、脂質ビヒクルは、両親媒性ペプチドを含まない。
【０１３０】
リポソームおよびミセルは、当技術分野で公知の方法によって調製することができる。
【０１３１】
免疫調節剤
脂質ビヒクルは、１つまたは複数の免疫調節剤を含有するように調製することができる。免疫調節剤は、リポソームなどの脂質ビヒクルの内部に封入され得る。封入物は、脂質ビヒクル内部（例えば、水性内部）に可溶性であることも、または脂質ビヒクルの内側に沈殿することもある。封入は、受動的または能動的封入のいずれかによって達成することができる。受動的封入は、免疫調節剤が緩衝液中に存在しているときにリポソームが形成される封入である。能動的封入は、リポソーム形成後に免疫調節剤をリポソームにローディングするように、ｐＨなどの勾配が使用される封入である。
【０１３２】
１つの例示的な免疫調節剤は、ＴＬＲアゴニストである。Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、様々な細胞型上に発現される、あるクラスの受容体であり、自然免疫系において非常に重要な役割を果たす。ＴＬＲは、活性化されると、免疫活性化に関与するシグナル伝達経路を活性化する。いくつかの哺乳動物のＴＬＲおよびいくつかのそれらのアゴニストが特定されている。例えば、グアニンおよびウリジンが豊富な一本鎖ＲＮＡは、ｔｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ７）のための天然リガンドとして特定されている。さらに、イミダゾキノリンおよびプリン様分子を含むＴＬＲ７のいくつかの低分子量アクチベーターが特定されている。ＴＬＲ刺激は、一般的シグナル伝達カスケード（アダプタータンパク質ＭｙＤ８８、転写因子ＮＦκＢ、ならびに炎症促進性およびエフェクターサイトカインを伴う）を開始すると同時に、様々なＴＬＲが、多くの異なる細胞型によって発現される。ＴＬＲ７は、主に、単球、形質細胞様樹状細胞、骨髄系樹状細胞およびＢ細胞において発現され、エンドソーム膜に局在する。
【０１３３】
一部の実施形態では、脂質ビヒクルは、細胞内タンパク質および／または受容体に結合するリガンドを含むことができ、前記受容体は、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＳＴＩＮＧ、好ましくはＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７またはＴＬＲ９からなる群より選択され、より好ましくはＴＬＲ７である。
【０１３４】
ある特定の実施形態では、脂質ビヒクルは、ポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）、ポリアデニル酸−ポリウリジル酸（ポリＡ：Ｕ）、ポリＩ：Ｃ−ポリ−Ｌ−リシン（ポリ−ＩＣＬＣ）、ポリ−ＩＣＲ、ＣＬ２６４、Ｎ−パルミトイル−Ｓ−［２，３−ビス（パルミトイルオキシ）−（２Ｒ，Ｓ）−プロピル］−（Ｒ）−システイン−（Ｓ）セリン−（Ｓ）リシン４（Ｐａｍ３Ｃｙｓ）、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）および他のリポ多糖、アルファ−ガラクトシルセラミド（αＧＣ）、プロピリミン、イミキモド（Ｒ８３７）、レシキモド（Ｒ８４８）、ガーディキモド、ＴＭＸ、ＴＭＸ２０１、ＴＭＸ２０２、Ｒ８５０、Ｒ８５１、８５２Ａ、Ｓ−２７６１０、３Ｍ−００２（ＣＬ０７５）、３Ｍ−００３、３Ｍ−００５、３Ｍ−００６、３Ｍ−００７、３Ｍ−０１２、３Ｍ−１３、３Ｍ−０３１、３Ｍ−８５４、ＣＬ０９７、ＣＬ２６４、ＩＣ−３１、ロキソリビンおよび他のイミダゾキノリン、ｓｓＰｏｌｙＵ、ソチリモド、イサトリビン、ＡＮＡ９７５、ＳＭ３６０３２０、Ｒ１３５４一本鎖または二本鎖ＲＮＡ、ＯＲＮ０２（５’−ＵＵＡＵＵＡＵＵＡＵＵＡＵＵＡＵＵＡＵＵ−３’（配列番号１４））、ＯＲＮ０６  ５’−ＵＵＧＵＵＧＵＵＧＵＵＧＵＵＧＵＵＧＵＵ−３’（配列番号１５）、ＣｐＧ−ＯＤＮ  ＤＳＬＩＭ、ＡＶＥ０６７５、ＣｐＧ  Ｂオリゴデオキシヌクレオチド１０１８、ＬＰＳ、ＡＺＤ１４１９、ＯＤＮ１９８２、ＣｐＧ  Ｂ  ＯＤＮ２００６、ＩＭＯ２１２５、ＣｐＧ  Ａ  ＯＤＮ２２１６、ＣｐＧ  Ａ  ＯＤＮ２３３６、ＣｐＧ２３９５、ＣｐＧ  ＯＤＮ７９０９、ＣｐＧ１０１０１、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ＡＶＥ０６７５、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ＨＹＢ２０９３、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ＨＹＢ２０５５、ＣｐＧ−ＯＤＮ  ＩＭＯ２１２５、ＣｐＧ  Ｃ  ＯＤＮ  Ｍ３６２、トラムバ（共有結合しているＣｐＧ  ＢクラスＯＤＮ１０１８を有するＡｍｂ  ａ１ブタクサアレルゲン）、ヘプリサブ、１０１８１ＳＳ  ＩＭ０２０５５  ＩＲＳ９５４、（フラゲリン、ムラミルジペプチド、サポニン、例えばＱＳ２１、リーシュマニア伸長因子、ＳＢ−ＡＳ４、スレオニル−ムラミルジペプチド、Ｌ１８−ＭＤＰ、ミファムルチド、およびＯＭ−１７４からなる群より選択される免疫刺激化合物である少なくとも１つの活性成分を含有する。
【０１３５】
別の実施形態では、活性成分は、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）、イミキモド（Ｒ８３７）、レシキモド（Ｒ８４８）、ガーディキモド、ＴＭＸ、ＴＭＸ２０１、ＴＭＸ２０２、ロキソリビン、ソチリモド、イサトリビン、ＳＭ３６０３２０、ＣｐＧ  Ｂオリゴデオキシヌクレオチド１０１８、ＡＺＤ１４１９、ＯＤＮ１９８２、ＣｐＧ  Ｂ  ＯＤＮ２００６、ＬＰＳ、ＩＭＯ２１２５、ＣｐＧ  Ａ  ＯＤＮ２２１６、ＣｐＧ  Ａ  ＯＤＮ２３３６、ＣｐＧ２３９５、ＣｐＧ  ＯＤＮ７９０９、ＣｐＧ１０１０１、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ＡＶＥ０６７５、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ＨＹＢ２０９３、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ＨＹＢ２０５５、ＣｐＧ−ＯＤＮ  ＩＭＯ−２１２５、ＣｐＧ  Ｃ  ＯＤＮ  Ｍ３６２、トラムバ（共有結合しているＣｐＧ  ＢクラスＯＤＮ１０１８を有するＡｍｂ  ａ１ブタクサアレルゲン）、ヘプリサブ、ＱＳ２１、およびＯＭ−１７４からなる群より選択される免疫刺激化合物である。
【０１３６】
別の実施形態では、脂質ビヒクルは、免疫寛容誘導化合物である少なくとも１つの活性成分を含有する。
【０１３７】
別の実施形態では、脂質ビヒクルは、ビタミンＤ３（１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３）およびレチノイン酸（ａｌｌ−ｔｒａｎｓおよび９−ｃｉｓレチノイン酸）およびそれらの関係する合成または天然アナログ、ヘミコハク酸ベタメタゾン、パルミチン酸デキサメタゾン、リン酸デキサメタゾン、リメタゾン、ヘミコハク酸メチルプレドニゾロン、パルミチン酸プレドニゾロン、ならびにリン酸プレドニゾロンからなる群より選択される免疫寛容誘導化合物である少なくとも１つの活性成分を含有する。
【０１３８】
ペプチド抗原
様々な実施形態では、脂質−ペプチドコンジュゲートは、治療関連抗原、例えばアレルギー、自己免疫疾患、感染性疾患またはがんなどの疾患と関連する抗原のエピトープとしてペプチドを含み、それから本質的になり、またはそれからなる。
【０１３９】
ある特定の実施形態では、脂質−ペプチドコンジュゲートは、自己免疫疾患に関する治療関連抗原のエピトープとしてペプチドを含み、前記自己免疫疾患は、糖尿病、真性糖尿病、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎を含む）、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎および湿疹性皮膚炎を含む）、乾癬、シェーグレン症候群に続発する乾性角結膜炎を含むシェーグレン症候群、円形脱毛症、節足動物咬傷反応に起因するアレルギー応答、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー性喘息、皮膚エリテマトーデス、強皮症、腟炎、直腸炎、薬疹、ハンセン病逆転反応（ｌｅｐｒｏｓｙ  ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、らい性結節性紅斑、自己免疫性ぶどう膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側性進行性感音難聴、再生不良性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ウェゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎（pepatitis）、スティーブンス・ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、クローン病、グレーブス眼症、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ぶどう膜炎、および間質性肺線維症からなる群より選択される。
【０１４０】
一部の実施形態では、脂質−ペプチドコンジュゲートは、感染性疾患に関する治療関連抗原のエピトープとしてペプチドを含み、ここで感染は、大腸菌（E.coli）、ブドウ球菌（Staphylococcal）、クラミジア（Chlamydia）、連鎖球菌（Streptococcal）、シュードモナス（Pseudomonas）、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium  difficile）、レジオネラ（Legionella）、肺炎連鎖球菌（Pnetanococcus）、ヘモフィルス（Haemophilus）、クレブシエラ（Klebsiella）、エンテロバクター（Enterobacter）、シトロバクター（Citrobacter）、ナイセリア（Neisseria）、Ｂ型髄膜炎菌（Meningococcus  B）、赤痢菌（Shigella）、サルモネラ（Salmonella）、リステリア（Listeria）、パスツレラ（Pasteurella）、ストレプトバチルス（Streptobacillus）、スピリルム（Spirillum）、トレポネーマ（Treponema）、アクチノミセス（Actinomyces）、ボレリア（Borrelia）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、結核（Tuberculosis）、ノカルジア（Norcardia）、ガードネレラ（Gardnerella）、カンピロバクター（Campylobacter）、スピロヘータ（Spirochaeta）、プロテウス（Proteus）、バクテロイデス（Bacteroides）、エルシニア・ペスチス（Yersenia  pestis）、ピロリ菌（H.  pylori）、炭疽菌（anthrax）、ＨＩＶ、コロナウイルス（Coronavirus）、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、サイトメガロウイルス、デングウイルス、エボラウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒトメタニューモウイルス（Metapneumoniavirus）、エプスタイン・バーウイルス、ロタウイルス、アデノウイルス、インフルエンザウイルス（ユニバーサル、Ｈ１Ｎ１ｖ、Ｈ７Ｎ１、Ｈ９Ｎ２）、肺炎球菌（Pneumococcus）、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス、天然痘、サル痘、ウエストナイルウイルス、ＳＡＲＳ、カンジダ症、白癬、ヒストプラスマ症、ブラストミセス症、パラコクシジオイデス症、クリプトコッカス（crytococcosis）、アスペルギルス症、クロモミコーシス、菌腫感染、シュードアレシェリア症（pseudallescheriasis）、癜風、アメーバ症、トリパノソーマ・クルージ（trypanosome  cruzi）、肝蛭症、リーシュマニア症（Leishmanlasis）、プラスモジウム（Plasmodium）、オンコセルカ症、肺吸虫症、トリパノソーマ・ブルセイ（Trypanosoma  brucei）、ニューモシスチス（Pneumocystis）、腟トリコモナス（Trichomonas  viginalis）、条虫類（Taenia）、膜様条虫症（Hymenolepsis）、エキノコックス（Echinococcus）、住血吸虫症（Schistosomiasis）、神経嚢虫症、アメリカ鉤虫（Necator  americanus）、および鞭虫（Trichuris  trichiura）からなる群よりの感染によって引き起こされる。
【０１４１】
別の実施形態では、脂質−ペプチドコンジュゲートは、がん処置、例えばＢ細胞リンパ腫、バーキット（非ホジキン）リンパ腫、神経膠腫、膀胱がん、胆道がん、脳がん、乳がん、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸がん、絨毛癌、上皮細胞がん、腎臓がん、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、胃がん、肝細胞がん、白血病、肺がん、黒色腫、骨髄腫、非小細胞肺癌、上咽頭がん、卵巣がん、口腔咽頭がん、前立腺がん、膵臓がん、腎臓がん、皮膚がん、頸部および食道の扁平細胞がん、精巣がん、Ｔ細胞白血病、ならびに腟がんからなる群より選択されるがんに関する治療関連抗原のエピトープとしてペプチドを含む。
【０１４２】
別の実施形態では、脂質−ペプチドコンジュゲートは、治療関連抗原のエピトープとしてペプチドを含み、ここでペプチドは、治療関連腫瘍抗原、例えばがん疾患と関連する抗原のエピトープ、例えば以下の腫瘍抗原ＰＲＡＭＥ、ＮＹＥＳＯ、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＧＡＧＥおよびＬＡＧＥファミリー、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１、ＣＥＡ、ＷＴ１、ｈＴＥＲＴ、熱ショックタンパク質、ＨＳＰ９０（ｇｐ９６）、ＨＳＰ７０（ＨＳＰ／ｃ７０）、カルレティキュリン、およびＨＳＰ１７０（ｇｒｐ１７０）、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、Ｍａｒｔ１、ＭｅｌａｎＡ、ｒａｓ、ｂｃｒ、ａｂｌ、ｐ５３、ヒトパピローマウイルスによってコードされたＥ６およびＥ７タンパク質、エプスタイン−バーウイルス［ＥＢＶ］関連抗原、α−フェトプロテイン、サバイビン、チロシナーゼ、ｇｐ１００、ＴＲＰ−１（ｇｐ７５）、ならびにＴＲＰ−２の１つに関するエピトープである。
【０１４３】
別の実施形態では、脂質−ペプチドコンジュゲートは、抗原ががん疾患と関連する、治療関連抗原のエピトープ、例えばネオ抗原のエピトープとしてペプチドを含む。
【０１４４】
一部の実施形態では、ペプチドは、５個もしくはそれよりも多い、８個もしくはそれよりも多い、１０個もしくはそれよりも多い、１５個もしくはそれよりも多い、２０個もしくはそれよりも多い、５個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、１０〜１５個、５〜１０個、５〜１５個、５〜２０個、８〜１０個、８〜１５個、８〜２０個、１０〜２０個、１５〜２０個、１０〜１００個、１０〜１５０個、または１０〜２００個のアミノ酸を含むペプチドライブラリーから得ることができる。一部の実施形態では、ペプチドライブラリーは、１つまたは複数の抗原のペプチドまたはタンパク質断片を含む。一部の実施形態では、ペプチドライブラリーは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２〜５個、２〜１０個、３〜１０個、４〜１０個、５〜１０個、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、または少なくとも６個の抗原の断片を含む。
【０１４５】
一部の実施形態では、ペプチドは、ＰＲＡＭＥ、ＳＳＸ２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、サバイビン、ＷＴ−１およびＭＡＲＴからなる群より選択される１つまたは複数の腫瘍関連抗原の断片を含む。
【０１４６】
免疫細胞を標的化する部分
一部の実施形態では、脂質ビヒクルは、ペプチド、抗体またはヌクレオチドなどの標的化部分を含有する。標的化部分は、脂質または脂質−ＰＥＧコンジュゲートとの共有結合によって脂質ビヒクルに共有結合することができ、標的化リガンドは、標的化部分を有していない脂質ビヒクルと比較して、２４時間以内に抗原提示細胞への脂質ビヒクルの効率的な標的化を提供し、すなわち抗原提示細胞への標的化は、標的化部分を有していない脂質ビヒクルよりも少なくとも２倍高く、例えば少なくとも５倍高く、例えば少なくとも１０倍高い。
【０１４７】
別の実施形態では、脂質ビヒクルは、脂質または脂質−ＰＥＧコンジュゲートとの共有結合によって脂質ビヒクルに共有結合しているペプチド、抗体、抗体断片またはヌクレオチドなどの標的化部分を含有し、ここで標的化リガンドは、標的化部分を有していない脂質ビヒクルと比較して、２４時間以内に抗原提示細胞との会合または抗原提示細胞への内部移行を増大させ、すなわち抗原提示細胞による内部移行は、標的化部分を有していない脂質ビヒクルよりも少なくとも２倍高く、例えば少なくとも５倍高く、例えば少なくとも１０倍高い。
【０１４８】
特定の実施形態では、脂質ビヒクルは、脂質または脂質−ＰＥＧコンジュゲートとの共有結合によって脂質ビヒクルに共有結合している標的化部分を含有し、ここで標的化リガンドは、標的化部分を有していない脂質ビヒクルと比較して抗原提示細胞との会合または抗原提示細胞への内部移行の増大をもたらすＤＣＩＲ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４５、Ｌｙ６Ｃ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１５、Ｆ４／８０、ＣＤ６８、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ１６３、ＣＤ６８、ＣＤ１９、ＣＤ１ｃ、ＣＤ８３、ＣＤ１４１、ＣＤ２０９、ＭＨＣＩＩ、Ｇｒ１に対する親和性を有する。
【０１４９】
一実施形態では、脂質ビヒクルは、脂質または脂質−ＰＥＧコンジュゲートとの共有結合によって脂質ビヒクルに共有結合している標的化部分を含有し、ここで標的化リガンドは、標的化部分を有していない脂質ビヒクルと比較してＴ細胞またはＮＫ細胞との会合を増大させるＣＤ４５、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ２５、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ６９に対する親和性を有する。
【０１５０】
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される脂質ビヒクルは、免疫細胞標的化部分を含む。免疫細胞標的化部分は、抗体分子（例えば、本明細書に記載の抗原結合性ドメイン）、受容体もしくは受容体断片、またはリガンドもしくはリガンド断片、またはこれらの組合せから選択することができる。一部の実施形態では、免疫細胞標的化部分は、免疫細胞（例えば、免疫細胞の表面に存在する分子、例えば抗原）と会合する、例えば、結合する。ある特定の実施形態では、免疫細胞標的化部分は、本明細書で開示される脂質ビヒクルを標的とする、例えば、それを免疫（例えば、リンパ球、例えばＴ細胞）に誘導する。
【０１５１】
一部の実施形態では、免疫細胞標的化部分は、抗体分子（例えば、完全抗体（例えば、少なくとも１つ、好ましくは２つ、の完全重鎖と、少なくとも１つ、好ましくは２つ、の完全軽鎖とを含む抗体）、または抗原結合性断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ、単一ドメイン抗体、ダイアボディ（ｄＡｂ）、二価抗体、または二重特異性抗体もしくはその断片、その単一ドメインバリアント、またはラクダ抗体））、非抗体スキャフォールド、またはＣＤ４５受容体と結合するリガンドから選択される。
【０１５２】
一部の実施形態では、免疫細胞標的化部分は、免疫細胞の表面上に発現される、残留性の、存在量が多い、および／またはリサイクリング細胞表面受容体および分子に、脂質ビヒクルを向かわせる。これらの受容体／分子は、例えば、ＣＤ４５（例えば、ＢＣ８（ＡＣＣＴ：ＨＢ−１０５０７）、９．４（ＡＴＴＣ：ＨＢ−１０５０８）、ＧＡＰ８．３（ＡＴＴＣ：ＨＢ−１２）、モノクローナル抗体を介して）、ＣＤ８（ＯＫＴ８モノクローナル抗体を介して）、膜貫通型インテグリン分子ＣＤ１１ａ（ＭＨＭ２４モノクローナル抗体を介して）またはＣＤ１８（キメラ１Ｂ４モノクローナル抗体を介して）を含む。他の好ましい実施形態では、標的化部分は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ２２からなる群より選択されるマーカーに向けられる。一部の実施形態では、免疫細胞標的化部分は、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ１３７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１９７、ＣＤ３８、ＣＤ２７、ＣＤ１９６、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＤ８４、ＣＤ２２９、ＣＣＲ１、ＣＣＲ５、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６、ＣＣＲ８またはＣＣＲ１０と結合する抗体分子、例えば、抗原結合性ドメイン、非抗体スキャフォールド、またはリガンドから選択される。
【０１５３】
白血球共通抗原としても公知の「ＣＤ４５」は、ヒトＣＤ４５タンパク質および種、アイソフォーム、およびそれらの他の配列バリアントを指す。したがって、ＣＤ４５は、ネイティブ、完全長タンパク質であることもあり、またはネイティブタンパク質の少なくとも１つの生物活性を保持する、短縮化断片もしくは配列バリアント（例えば、天然に存在するアイソフォームもしくは組換えバリアント）であることもある。ＣＤ４５は、受容体連結型タンパク質チロシンホスファターゼであり、これは、白血球に発現され、これらの細胞の機能に重要な役割を果たす（参照により本明細書に組み込まれる、Altin,  JG  (1997)  Immunol  Cell  Biol.75(5):430-45において概説されている）。例えば、ＣＤ４５の細胞外ドメインは、Ｔ細胞上にいくつかの異なるアイソフォームで発現され、発現される特定のアイソフォーム（複数可）は、細胞の特定の亜集団、それらの成熟状態、および抗原露出に依存する。ＣＤ４５の発現は、ＴＣＲによるＴ細胞の活性化に重要であり、異なるＣＤ４５アイソフォームはＴ細胞活性化に対する異なる支持能力を表す。
【０１５４】
「ＣＤ４」は、Ｔヘルパー細胞、単球、マクロファージおよび樹状細胞などの、免疫細胞の表面に見出される、ＭＨＣクラスＩＩの（ＴＣＲ、Ｔ細胞受容体、との）共受容体である。ＣＤ４  Ｔ細胞は、病原体への調節された有効な免疫応答を達成するのに極めて重要である。ナイーブＣＤ４  Ｔ細胞は、抗原−ＭＨＣ複合体との相互作用後に活性化され、主として微小環境のサイトカイン環境に依存して、特異的サブタイプに分化する。古典的Ｔヘルパー１およびＴヘルパー２に加えて、他のサブセットが同定されており、そのようなサブセットとしては、Ｔヘルパー１７、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、濾胞性ヘルパーＴ細胞、およびＴヘルパー９が挙げられ、これらの各々が特有のサイトカインプロファイルを有する。ＣＤ４  Ｔ細胞は、自然免疫系の細胞、Ｂリンパ球、細胞傷害性Ｔ細胞はもちろん、非免疫細胞の活性化に及ぶ、複数の機能を実行し、免疫反応の抑制にも非常に重要な役割を果たす。例えば、Rishi  Vishalら  "CD4+  T  Cells:  Differentiation  and  Functions,"  Clinical  and  Developmental  Immunology,  vol.  2012,  Article  ID  925135,  12  pages,  2012.  doi:10.1155/2012/925135を参照されたい。
【０１５５】
「ＣＤ８」は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の共受容体としての機能を果たす、膜貫通糖タンパク質である。ＴＣＲと同様に、ＣＤ８は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子と結合するが、クラスＩのＭＨＣタンパク質に特異的である。このタンパク質には、アルファとベータという２つのアイソフォームがあり、これらの各々が異なる遺伝子によりコードされる。ヒトの場合、両方の遺伝子は、２ｐ１２位の２番染色体上に位置する。ＣＤ８共受容体は、主として、細胞傷害性Ｔ細胞の表面上に発現されるが、ナチュラルキラー細胞、皮質胸腺細胞、および樹状細胞上にも見出され得る。ＣＤ８は、Ｔ細胞リンパ芽球性リンパ腫および低色素性菌状息肉症に発現される。機能するために、ＣＤ８は、１対のＣＤ８鎖からなる二量体を形成する。ＣＤ８の最も一般的な形態は、ＣＤ８−αおよびＣＤ８−β鎖で構成されており、これら両方は、細いストークと細胞内テールとによって膜に接続されている免疫グロブリン可変（ＩｇＶ）様細胞外ドメインを有する免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。ＣＤ８−α鎖のあまり一般的でないホモ二量体も、一部の細胞上に発現される。ＣＤ８−αの細胞外ＩｇＶ様ドメインは、クラスＩのＭＨＣ分子のα３部分と相互作用する。この親和性により、細胞傷害性Ｔ細胞のＴ細胞受容体と標的細胞は、抗原特異的活性化の間に密接に結合された状態で保たれる。ＣＤ８表面タンパク質を有する細胞傷害性Ｔ細胞は、ＣＤ８  Ｔ細胞と呼ばれる。例えば、Leahy  DJら  (March  1992).  "Crystal  structure  of  a  soluble  form  of  the  human  T  cell  coreceptor  CD8  at  2.6  A  resolution".  Cell.68  (6):  1145-62;  Gao  Gら(2000).  "Molecular  interactions  of  coreceptor  CD8  and  MHC  class  I:  the  molecular  basis  for  functional  coordination  with  the  T-cell  receptor".  Immunol  Today.  21  (12):  630-6；およびDevine  Lら(1999)."Orientation  of  the  Ig  domains  of  CD8  alpha  beta  relative  to  MHC  class  I".J  Immunol.162  (2):  846-51を参照されたい。
【０１５６】
「インテグリンアルファＬ（ＩＴＧＡＬ）」および「ＬＦＡ−１のアルファサブユニット」としても公知の、「ＣＤ１１ａ」は、ＩＣＡＭ−１との相互作用により細胞間接着をもたらす膜糖タンパク質である。遺伝子ＩＴＧＡＬは、インテグリンアルファＬ鎖をコードする。インテグリンは、アルファ鎖およびベータ鎖で構成されているヘテロ二量体内在性膜タンパク質である。このＩドメイン含有アルファインテグリンは、ベータ２鎖（ＩＴＧＢ２）と結びついて、インテグリンリンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）を形成し、これは、すべての白血球上に発現される。ＬＦＡ−１は、そのリガンドであるＩＣＡＭ  １〜３（細胞間接着分子１〜３）との相互作用によって白血球細胞間接着に重要な役割（importantrole）を果たし、リンパ球共刺激シグナル伝達においても機能する。異なるアイソフォームをコードする２つの転写物バリアントが、この遺伝子について見出されている。例えば、Cornwell  RDら  Description  of  the  leukocyte  function-associated  antigen  1  (LFA-1  or  CD11a)  promoter.  Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America.  1993;90(9):4221-4225；およびBose  TOら  CD11a  Regulates  Effector  CD8  T  Cell  Differentiation  and  Central  Memory  Development  in  Response  to  Infection  with  Listeria  monocytogenes.  Flynn  JL,  ed.  Infection  and  Immunity.  2013;81(4):1140-1151.  doi:10.1128/IAI.00749-12を参照されたい。
【０１５７】
インテグリンベータ２鎖（ＩＴＧＢ２）としても公知の「ＣＤ１８」は、４つの異なる構造：ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａと対合される）；マクロファージ−１抗原（ＣＤ１１ｂと対合される）；インテグリンアルファＸベータ２（ＣＤ１１ｃと対合される）、およびインテグリンアルファＤベータ２（ＣＤ１１ｄと対合される）、のベータサブユニットである。ＣＤ１８が欠けているｎヒトは、血液から組織への白血球血管外遊出の欠如により定義される疾患である、白血球接着不全症を引き起こす。ベータ２インテグリンは、可溶性形態でも見つかっている。可溶性ベータ２インテグリンは、リガンド結合性であり、血漿レベルは、自己免疫疾患の脊椎関節炎では疾患活動性と逆相関する。例えば、Mazzone  A1  ら  Leukocyte  CD11/CD18  integrins:  biological  and  clinical  relevance.  Haematologica.1995  Mar-Apr;80(2):161-75；およびGjelstrupら(8  September  2010).  "Shedding  of  Large  Functionally  Active  CD11/CD18  Integrin  Complexes  from  Leukocyte  Membranes  during  Synovial  Inflammation  Distinguishes  Three  Types  of  Arthritis  through  Differential  Epitope  Exposure".  The  Journal  of  Immunology.  185  (7):  4154-4168を参照されたい。
【０１５８】
「ＣＤ２０」は、細胞膜内にカルシウムチャネルを形成して細胞活性化に必要なカルシウムの流入を可能にする、Ｂ細胞上に見出されるＩＩＩ型膜貫通タンパク質であって、Ｂ細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、およびＢ細胞慢性リンパ球性白血病において発現されるＩＩＩ型膜貫通タンパク質である。これらの疾患の治療に重要な、ＣＤ２０に対する抗体として、例えば、リツキシマブおよびオファツムマブが存在し、さらにいくつかが開発中である。同様に、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であるオクレリズマブは、多発性硬化症について治験中である。例えば、Cragg  MSら  (2005)."The  biology  of  CD20  and  its  potential  as  a  target  for  mAb  therapy".  Current  Directions  in  Autoimmunity.  Current  Directions  in  Autoimmunity.  8:  140-74；およびKuijpers  TWら  (January  2010).  "CD20  deficiency  in  humans  results  in  impaired  T  cell-independent  antibody  responses".  The  Journal  of  Clinical  Investigation.  120  (1):  214-22を参照されたい。
【０１５９】
組成物
脂質ビヒクルを含む医薬組成物を含む組成物が、本明細書において提供される。薬学的に許容される量で、薬学的に許容される組成で、組成物を製剤化することができる。「薬学的に許容される」という用語は、活性成分の生物活性の有効性に干渉しない非毒性の材料を意味する。そのような組成物は、一部の実施形態では、塩、緩衝化剤、保存剤、および必要に応じて他の治療剤を含有することがある。医薬組成物は、一部の実施形態では、好適な保存剤を含有することもある。医薬組成物を、一部の実施形態では、単位剤形で提供することができ、薬学技術分野において周知の方法のいずれかにより調製することができる。非経口投与に好適な医薬組成物は、一部の実施形態では、脂質ビヒクルおよび／または細胞治療剤の滅菌調製物であって、一部の実施形態では、レシピエント対象の血液と等張性である、滅菌調製物を含む。この調製物は、公知の方法に従って製剤化することができる。滅菌注射用調製物は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射用溶液または懸濁物であることもある。
【０１６０】
追加の組成物は、修飾された細胞、例えば、それらの細胞表面上に１つまたは複数の脂質ビヒクルをさらに含む、修飾された免疫細胞を含む。これは、養子細胞療法、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法、操作されたＴＣＲ  Ｔ細胞療法、腫瘍浸潤リンパ球療法、抗原訓練Ｔ細胞療法、富化抗原特異的Ｔ細胞療法、またはＮＫ細胞療法などの、細胞療法のｅｘ  ｖｉｖｏ調製に有用であり得る。
【０１６１】
一部の実施形態では、本開示の脂質ビヒクルは、それを必要とする患者に直接投与することができる。そのような直接投与は、全身投与（例えば、静脈内注射または注入などの非経口投与）または局所投与（例えば、腫瘍内投与、例えば、腫瘍微小環境への注射）である場合がある。「非経口投与」および「非経口投与される」という句は、本明細書で使用される場合、通常は注射または注入による、経腸（すなわち、消化管経由での）および局所投与以外の投与様式を指し、それに限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および注入を含む。
【０１６２】
一部の実施形態では、本開示の脂質ビヒクルは、（１）樹状細胞などのＡＰＣの成熟を誘導し、かつ／または（２）全身もしくは局所投与による、患者への投与もしくは再導入前に、単離された自家および同種異系細胞（例えば、Ｔ細胞）の活性化および増大を誘導するためのｅｘ  ｖｉｖｏ薬剤として、使用することができる。例えば、増大させた細胞を、ＡＣＴ（養子細胞移入）を含むＴ細胞療法において、およびまた他の重要な免疫細胞型と共に使用することができ、そのような免疫細胞型には、例えば、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ細胞、抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子操作されたＴ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞、腫瘍抗原、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）および／または抗原訓練Ｔ細胞（例えば、目的の抗原、例えば腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を呈示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）により「訓練」されたＴ細胞）に特異的なＴ細胞受容体を発現するように遺伝子操作されたＴ細胞が含まれる。
【０１６３】
治療的使用
脂質ビヒクルおよびそれらを含有する組成物には、例えば、がんおよび感染性疾患の処置を含む、非常に多くの治療的有用性がある。本開示は、中でも、がんを有する対象を処置するための、がんを有する対象において免疫応答を誘導するための方法を提供する。例示的な方法は、治療有効量の、本明細書に記載される脂質ビヒクルのいずれかを、対象に投与することを含み、ここで脂質ビヒクルは、腫瘍関連抗原などの特異的疾患関連抗原を提示するように選択および設計されている。様々な実施形態では、脂質ビヒクルは、有利なことに、（１）樹状細胞などのＡＰＣ上の抗原提示を増大させ、（２）抗原を提示する成熟樹状細胞の百分率もしくは量を増大させ、（３）Ｔ細胞、特に抗原訓練Ｔ細胞の活性化もしくは増大を引き起こし、（４）Ｔ細胞、特に抗原訓練Ｔ細胞の腫瘍浸潤を増大させ、（５）腫瘍成長を制御もしくは低減し、かつ／または（６）患者の生存を延長することができる。
【０１６４】
脂質ビヒクルは、一価モダリティ（例えば、単一脂質ビヒクル種）または多価モダリティ（例えば、２つまたはそれよりも多い別個の脂質ビヒクル種）として投与することができる。脂質ビヒクルは、単独で、または養子細胞療法（ＡＣＴ）と併用して（例えば、単一組成物としてＡＣＴと一緒になって同時に、または別個の組成物としてＡＣＴと一緒になって同時に、またはＡＣＴの後に順次）投与することができる。
【０１６５】
例えば、脂質ビヒクルまたは医薬組成物に含有されている抗原の適応となる疾患の処置のための、本明細書に開示される脂質ビヒクルまたは本明細書に開示される医薬組成物のいずれかの使用が提供される。本明細書に記載される使用および方法は、本明細書に記載される通り脂質ビヒクルを使用することによって、対象におけるがんを処置することを含む。また、対象におけるがんの症状を低減または改善するための方法、ならびにがんの成長を阻害するおよび／または１つもしくは複数のがん細胞を死滅させるための方法が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、本明細書に記載されるものまたは本明細書に記載される医薬組成物が投与された対象において、腫瘍のサイズを低減させ、生存を延長し、および／またはがん細胞の数を減少させる。
【０１６６】
実施形態では、がんは、血液がんである。実施形態では、血液がんは、白血病またはリンパ腫である。本明細書で使用される場合、「血液がん」は、造血組織またはリンパ系組織の腫瘍、例えば、血液、骨髄またはリンパ節に影響を及ぼす腫瘍を指す。例示的な血液悪性疾患としては、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ヘアリー細胞白血病、急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）、もしくは大顆粒リンパ球性白血病）、リンパ腫（例えば、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫（例えば、古典的ホジキンリンパ腫もしくは結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫）、菌状息肉症、非ホジキンリンパ腫（例えば、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（例えば、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、もしくはマントル細胞リンパ腫）もしくはＴ細胞非ホジキンリンパ腫（菌状息肉症、未分化大細胞型リンパ腫、もしくは前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫））、中枢神経系原発リンパ腫、セザリー症候群、ワルデンストレームマクログロブリン血症）、慢性骨髄増殖性新生物、ランゲルハンス細胞組織球症、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、骨髄異形成症候群、または骨髄異形成／骨髄増殖性新生物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６７】
実施形態では、がんは、固形がんである。例示的な固形がんとしては、卵巣がん、直腸がん、胃がん、精巣がん、肛門部のがん、子宮がん、結腸がん、直腸がん、腎細胞癌、肝臓がん、肺の非小細胞癌、小腸のがん、食道のがん、黒色腫、カポジ肉腫、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部のがん、皮膚もしくは眼内悪性黒色腫、子宮がん、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、類表皮がん、子宮頚部の癌、扁平上皮がん、卵管の癌、子宮内膜の癌、膣の癌、軟部組織の肉腫、尿道のがん、外陰部の癌、陰茎のがん、膀胱のがん、腎臓もしくは尿管のがん、腎盂の癌、脊髄軸腫瘍、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、前記がんの転移性病変、またはこれらの組合せが挙げれるが、それらに限定されない。
【０１６８】
実施形態では、脂質ビヒクル（または医薬組成物）は、処置または予防すべき疾患に適切な方法で投与される。投与の量および頻度は、患者の状態ならびに患者の疾患のタイプおよび重症度といった因子によって決定される。適切な投薬量は、臨床試験によって決定されうる。例えば、「有効量」または「治療量」が示されている場合、投与される医薬組成物（または脂質ビヒクル）の正確な量は、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、対象の年齢、体重および状態の個体差を考慮して医師により決定されうる。実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物を、体重１ｋｇ当たり細胞１０４〜１０９個、例えば体重１ｋｇ当たり細胞１０５〜１０６個（これらの範囲内のすべての整数値を含む）の投薬量で、投与することができる。実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物を、これらの投薬量で複数回、投与することができる。実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物を、免疫療法に関して記載された注入技法（例えば、Rosenbergら,  New  Eng.  J.  of  Med.319:1676,  1988を参照されたい）を使用して投与することができる。
【０１６９】
実施形態では、脂質ビヒクルまたは医薬組成物は、対象に非経口投与される。実施形態では、細胞は、対象に静脈内、皮下、腫瘍内、結節内、筋肉内、皮内または腹腔内投与される。実施形態では、細胞は、直接、腫瘍またはリンパ節に投与、例えば、注射される。実施形態では、細胞は、輸液（例えば、Rosenbergら,  New  Eng.  J.  of  Med.319:1676,  1988に記載されているとおり）または静注内プッシュとして投与される。実施形態では、細胞は、注射用デポー製剤として投与される。
【０１７０】
実施形態では、対象は、哺乳動物である。実施形態では、対象は、ヒト、サル、ブタ、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ラットまたはマウスである。実施形態では、対象は、ヒトである。実施形態では、対象は、小児対象であり、例えば、１８歳未満、例えば、１７歳未満、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１歳またはそれ未満である。実施形態では、対象は、成体、例えば、少なくとも１８歳、例えば、少なくとも１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、または８０〜９０歳である。
【０１７１】
一実施形態では、Ｔ細胞、脂質−ペプチド−コンジュゲートおよびＴＬＲアゴニストを含む組成物が形成され、ここで前記脂質−ペプチドコンジュゲートおよびＴＬＲアゴニストは、共有結合または非共有結合的にＴ細胞と会合しており、例えば脂質−ペプチドコンジュゲートおよびＴＬＲアゴニストは、脂質ビヒクルをＴ細胞と共に３０分間〜２４時間インキュベートすることによって、共有結合または非共有結合的にＴ細胞と会合する。ある特定の実施形態では、この組成物は、凍結させることができる。
【０１７２】
一実施形態では、ＮＫ細胞、脂質−ペプチドコンジュゲートおよびＴＬＲアゴニストを含む組成物が形成され、ここで前記脂質−ペプチドコンジュゲートおよびＴＬＲアゴニストは、脂質ビヒクルをＮＫ細胞と共に３０分間〜２４時間インキュベートすることによって、共有結合または非共有結合的にＮＫ細胞と会合する。ある特定の実施形態では、この組成物は、凍結させることができる。
【０１７３】
本開示の一実施形態では、がん患者を処置するための方法が提供され、ここで前記がん患者は、養子細胞療法（例えば、Ｔ細胞の注入）を受け、本開示に記載される脂質ビヒクルは、Ｔ細胞と会合した後に患者に注入される。別の実施形態では、養子細胞療法に続いて、脂質ビヒクルが投与される（例えば、静脈内注入）。
【０１７４】
実施形態では、併用療法は、どちらかの薬剤単独での単剤療法よりも効果がある処置をもたらすことができる。実施形態では、第１の処置と第２の処置の組合せは、単独での第１または第２の処置よりも効果がある（例えば、症状および／またはがん細胞のより大きな低減をもたらす）。実施形態では、併用療法は、単剤療法として投与されたときに同様の結果を達成するために通常必要とされる第１または第２の処置の用量と比較して低い第１または第２の処置の用量の使用を可能にする。実施形態では、併用療法には、部分的に相加的な効果、完全に相加的な効果、または相加効果より大きい効果を有する。
【０１７５】
一実施形態では、脂質ビヒクルは、療法、例えば、がん療法（例えば、抗がん剤、免疫療法、光線力学的療法（ＰＤＴ）、外科手術および／または放射線のうちの１つまたは複数）と組み合わせて投与される。用語「化学療法薬」、「化学療法剤」および「抗がん剤」は、本明細書では交換可能に使用される。免疫刺激性融合分子および療法、例えばがん療法の投与は、逐次的である（重なりがある、もしくはない）こともあり、同時的であることもある。脂質ビヒクルの投与は、療法（例えば、がん療法）の過程において継続的である場合もあり、または間欠的である場合もある。本明細書に記載される、ある特定の療法は、がんおよび非がん性疾患を処置するために使用することができる。例えば、本明細書に記載される方法および組成物を使用して、がん性および非がん性状態（例えば、結核）におけるＰＤＴ有効性を増強することができる（例えば、Agostinis,  P.  ら(2011)  CA  Cancer  J.  Clin.61:250-281において概説されている）。
【０１７６】
他の実施形態では、脂質ビヒクルは、低または小分子量化学療法剤と組み合わせて投与される。例示的な低または小分子量化学療法剤としては、１３−シス−レチノイン酸（イソトレチノイン、ＡＣＣＵＴＡＮＥ（登録商標））、２−ＣｄＡ（２−クロロデオキシアデノシン、クラドリビン、ＬＥＵＳＴＡＴＩＮ（商標））、５−アザシチジン（アザシチジン、ＶＩＤＡＺＡ（登録商標））、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ、フルオロウラシル、ＡＤＲＵＣＩＬ（登録商標））、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ、メルカプトプリン、ＰＵＲＩＮＥＴＨＯＬ（登録商標））、６−ＴＧ（６−チオグアニン、チオグアニン、ＴＨＩＯＧＵＡＮＩＮＥ  ＴＡＢＬＯＩＤ（登録商標））、アブラキサン（パクリタキセルタンパク質結合型）、アクチノマイシン−Ｄ（ダクチノマイシン、ＣＯＳＭＥＧＥＮ（登録商標））、アリトレチノイン（ＰＡＮＲＥＴＩＮ（登録商標））、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ、トレチノイン、ＶＥＳＡＮＯＩＤ（登録商標））、アルトレタミン（ヘキサメチルメラミン、ＨＭＭ、ＨＥＸＡＬＥＮ（登録商標））、アメトプテリン（メトトレキサート、メトトレキサートナトリウム、ＭＴＸ、ＴＲＥＸＡＬＬ（商標）、ＲＨＥＵＭＡＴＲＥＸ（登録商標））、アミフォスチン（ＥＴＨＹＯＬ（登録商標））、アラビノシルシトシン（Ａｒａ−Ｃ、シタラビン、ＣＹＴＯＳＡＲ−Ｕ（登録商標））、三酸化ヒ素（ＴＲＩＳＥＮＯＸ（登録商標））、アスパラギナーゼ（Ｅｒｗｉｎｉａ  Ｌ−アスパラギナーゼ、Ｌ−アスパラギナーゼ、ＥＬＳＰＡＲ（登録商標）、ＫＩＤＲＯＬＡＳＥ（登録商標））、ＢＣＮＵ（カルムスチン、ＢｉＣＮＵ（登録商標））、ベンダムスチン（ＴＲＥＡＮＤＡ（登録商標））、ベキサロテン（ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（登録商標））、ブレオマイシン（ＢＬＥＮＯＸＡＮＥ（登録商標））、ブスルファン（ＢＵＳＵＬＦＥＸ（登録商標）、ＭＹＬＥＲＡＮ（登録商標））、ロイコボリンカルシウム（シトロボラム因子、フォリン酸、ロイコボリン）、カンプトテシン−１１（ＣＰＴ−１１、イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、カルボプラチン（ＰＡＲＡＰＬＡＴＩＮ（登録商標））、カルムスチンウエハー（カルムスチンインプラントを含むプロリフェプロスパン２０、ＧＬＩＡＤＥＬ（登録商標）ウェハー）、ＣＣＩ−７７９（テムシロリムス、ＴＯＲＩＳＥＬ（登録商標））、ＣＣＮＵ（ロムスチン、ＣｅｅＮＵ）、ＣＤＤＰ（シスプラチン、ＰＬＡＴＩＮＯＬ（登録商標）、ＰＬＡＴＩＮＯＬ−ＡＱ（登録商標））、クロラムブシル（ロイケラン）、シクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）、ＮＥＯＳＡＲ（登録商標））、ダカルバジン（ＤＩＣ、ＤＴＩＣ、イミダゾールカルボキサミド、ＤＴＩＣ−ＤＯＭＥ（登録商標））、ダウノマイシン（ダウノルビシン、ダウノルビシン塩酸塩、ルビドマイシン塩酸塩、ＣＥＲＵＢＩＤＩＮＥ（登録商標））、デシタビン（ＤＡＣＯＧＥＮ（登録商標））、デクスラゾキサン（ＺＩＮＥＣＡＲＤ（登録商標））、ＤＨＡＤ（ミトキサントロン、ＮＯＶＡＮＴＲＯＮＥ（登録商標））、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））、ドキソルビシン��ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、ＲＵＢＥＸ（登録商標））、エピルビシン（ＥＬＬＥＮＣＥ（商標））、エストラムスチン（ＥＭＣＹＴ（登録商標））、エトポシド（ＶＰ−１６、エトポシドリン酸塩、ＴＯＰＯＳＡＲ（登録商標）、ＶＥＰＥＳＩＤ（登録商標）、ＥＴＯＰＯＰＨＯＳ（登録商標））、フロクスウリジン（ＦＵＤＲ（登録商標））、フルダラビン（ＦＬＵＤＡＲＡ（登録商標））、フルオロウラシル（クリーム）（ＣＡＲＡＣ（商標）、ＥＦＵＤＥＸ（登録商標）、ＦＬＵＯＲＯＰＬＥＸ（登録商標））、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、ヒドロキシ尿素（ＨＹＤＲＥＡ（登録商標）、ＤＲＯＸＩＡ（商標）、ＭＹＬＯＣＥＬ（商標））、イダルビシン（ＩＤＡＭＹＣＩＮ（登録商標））、イホスファミド（ＩＦＥＸ（登録商標））、イクサベピロン（ＩＸＥＭＰＲＡ（商標））、ＬＣＲ（ロイロクリスチン、ビンクリスチン、ＶＣＲ、ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標）、ＶＩＮＣＡＳＡＲ  ＰＦＳ（登録商標））、Ｌ−ＰＡＭ（Ｌ−サルコリシン、メルファラン、フェニルアラニンマスタード、ＡＬＫＥＲＡＮ（登録商標））、メクロレタミン（メクロレタミン塩酸塩、ムスチン、ナイトロジェンマスタード、ＭＵＳＴＡＲＧＥＮ（登録商標））、メスナ（ＭＥＳＮＥＸ（商標））、マイトマイシン（マイトマイシン−Ｃ、ＭＴＣ、ＭＵＴＡＭＹＣＩＮ（登録商標））、ネララビン（ＡＲＲＡＮＯＮ（登録商標））、オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、ＯＮＸＡＬ（商標））、ペグアスパルガーゼ（ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ、ＯＮＣＯＳＰＡＲ（登録商標））、ＰＥＭＥＴＲＥＸＥＤ（ＡＬＩＭＴＡ（登録商標））、ペントスタチン（ＮＩＰＥＮＴ（登録商標））、プロカルバジン（ＭＡＴＵＬＡＮＥ（登録商標））、ストレプトゾシン（ＺＡＮＯＳＡＲ（登録商標））、テモゾロミド（ＴＥＭＯＤＡＲ（登録商標））、テニポシド（ＶＭ−２６、ＶＵＭＯＮ（登録商標））、ＴＥＳＰＡ（チオホスホアミド、チオテパ、ＴＳＰＡ、ＴＨＩＯＰＬＥＸ（登録商標））、トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ビンブラスチン（ビンブラスチン硫酸塩、ビンカロイコブラスチン、ＶＬＢ、ＡＬＫＡＢＡＮ−ＡＱ（登録商標）、ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））、ビノレルビン（ビノレルビン酒石酸塩、ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））、およびボリノスタット（ＺＯＬＩＮＺＡ（登録商標））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７７】
別の実施形態では、免疫刺激性融合分子は、バイオ医薬品と併せて投与される。例示的バイオ医薬品としては、例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（トラスツズマブ）；ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標）（フルベストラント）；ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）（アナストロゾール）；Ａｒｏｍａｓｉｎ（登録商標）（エキセメスタン）；ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）（レトロゾール）；ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）（タモキシフェン）、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（ベバシズマブ）；およびＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標）（イブリツモマブチウキセタン）が挙げられる。
【０１７８】
製造方法
本開示の一実施形態では、脂質ビヒクルを製造する方法であって、脂質ペプチドコンジュゲートがリポソームに挿入されるように、リポソームを前記脂質−ペプチドコンジュゲートと混合するステップを含む、方法が提供される。一実施形態では、その方法は、リポソーム組成物を脂質−ペプチドコンジュゲート組成物と共に摂氏３７度で３０分間〜２４時間インキュベートするか、または摂氏４５〜６０度で３０分間〜２４時間インキュベートするステップを含む。
【０１７９】
脂質ビヒクルを製造する別の方法は、ペプチドと反応して脂質−ペプチドコンジュゲートを形成することができる官能基を表面上に有するリポソームを調製するステップと、リポソームおよびペプチドを混合して、リポソームと会合している脂質−ペプチドコンジュゲートを形成するステップとを含むことができる。
【０１８０】
本開示の一実施形態では、脂質−ペプチドコンジュゲートミセル組成物の形態の脂質ビヒクルを、Ｔ細胞またはＮＫ細胞と共に摂氏３７度で３０分間〜２４時間インキュベートすることによって、脂質−ペプチド−コンジュゲートがＴ細胞またはＮＫ細胞の原形質膜に挿入される、方法が提供される。
【０１８１】
本開示の一実施形態では、脂質−ペプチド−コンジュゲートをＤＯＰＥ−ＰＥＧ２０００と混合してミセルを形成し、それによって、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の原形質膜への脂質−ペプチドコンジュゲートの挿入を助ける、方法が提供される。
【０１８２】
本開示の一実施形態では、単球および未成熟樹状細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化するための方法であって、ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩにおいて脂質−ペプチドコンジュゲートの一部を提示するように細胞を活性化するために、脂質ビヒクルが細胞と共にインキュベートされる、方法が提供される。
【０１８３】
本開示の一実施形態では、樹状細胞を使用することによって、Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで訓練するための方法であって、
ｉ）単球および／または未成熟樹状細胞を、脂質ビヒクルと共にインキュベートするステップと、
ｉｉ）ステップｉ）からの成熟樹状細胞を、未成熟Ｔ細胞と混合し、Ｔ細胞が樹状細胞によって活性化されるのに十分な時間インキュベートして、クローンを増大させるステップと、
を含み、
それらのステップが、十分に反応性のＴ細胞が達成されるまで複数回、好ましくは２〜３回行われてよく、細胞が、必要な場合に凍結され得る、
方法が提供される。
【０１８４】
本開示の一実施形態では、混合免疫細胞集団をがん患者に注入するための方法であって、
ｉ）患者から単離された免疫細胞、好ましくは血液からのＰＢＭＣを提供するステップと、
ｉｉ）必要な場合には輸送のために、必要に応じて細胞を凍結させ、解凍するステップと、
ｉｉｉ）細胞を脂質ビヒクルと共に摂氏３７度で３０分間〜２４時間インキュベートするステップと、
ｉｖ）必要な場合には輸送のために、必要に応じて細胞を凍結させ、解凍するステップと、
ｖ）混合細胞集団を患者に注入するステップと
を含む、方法が提供される。
【０１８５】
本開示の一実施形態では、静脈内または局所投与のいずれかによって脂質ビヒクルを患者に注入または注射するための方法が提供される。
【実施例】
【０１８６】
（実施例１）
材料および一般的な方法
固相合成のための全てのアミノ酸および樹脂を、Ｉｒｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｇｍｂｈ（Ｍａｒｋｔｒｅｄｗｉｔｚ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、一方で化学合成のための他の試薬を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｉｇｍａ／Ｍｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。全ての溶媒を、ＨＰＬＣ品質でＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．から購入し、乾燥溶媒を、セプタムを有するクリンプボトルキャップ（Ｓｕｒｅ／Ｓｅａｌ（商標））で購入した。リポソーム製剤のための脂質（ＰＯＰＣ、コレステロール、ＤＯＴＡＰ塩化物、ＤＯＰＥ−Ｐｅｇ２０００、ＨＳＰＣ、およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）を、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃから購入した。Ａｔｔｏ４８８−ＤＰＰＥを、Ａｔｔｏ−ｔｅｃ  Ｇｍｂｈ（Ｓｉｅｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。ＴＭＸ−２０１を、Ｃｈｉｍｅｔｅ、（Ｔｏｒｔｏｎａ、Ｉｔａｌｙ）から購入した。ペグ化した脂質を、Ｎａｎｏｓｏｆｔ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｗｉｎｓｔｏｎ−Ｓａｌｅｍ、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ）から購入した。
【０１８７】
ＨＰＬＣ分析を、Ｗａｔｅｒｓ  ＸＢｒｉｄｇｅ（登録商標）Ｃ１８  ５μｍ（４．６×１５０ｍｍ）カラムを備えたＧｉｌｓｏｎ  ＨＰＬＣ（Ｇｉｌｓｏｎ  Ｖａｌｖｅｍａｔｅ、ＵＶ／ＶＩＳ−１５５、３２１ポンプ、２３４オートインジェクター）で、摂氏３０度で行った。溶離液：（Ａ）５％アセトニトリル、水中の０．１％ＴＦＡ、（Ｂ）アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ。勾配プロファイル；クロマトグラムにおいて点線によって示された、１５分にわたる０％のＢから２５％、５０％、または１００％のＢまでの直線勾配。流量；１ｍｌ／分。ＵＶ波長：２２０ｎｍおよび２８０ｎｍ。
【０１８８】
半分取用ＨＰＬＣを、Ｗａｔｅｒｓ  ６００  Ｃｏｎｔｏｌｌｅｒおよび５２ポンプ、およびＷａｔｅｒｓ  ２４８９  ＵＶ／可視検出器を備えたＷａｔｅｒｓ半分取用ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ社、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で実行し、Ｋｎａｕｅｒ  Ｅｕｒｏｓｐｈｅｒ  １００−５  Ｃ１８（２５０×２０ｍｍ）カラムまたはＷａｔｅｒｓ  Ｘｔｅｒｒａ  Ｃ８（１５０×１０ｍｍ）を用いて、室温で、分析ＨＰＬＣの場合と同じ溶離液系を用いて行われた。
【０１８９】
ＵＰＬＣＭＳ分析を、ＡＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８（１．７μｍ、２．１×５０ｍｍ）カラムを備えたＷａｔｅｒｓ  ＡＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣシステムで、４０℃で行った。溶離液：（Ａ）水中の０〜１％ＨＣＯ２Ｈ、（Ｂ）ＭｅＣＮ中の０．１％ＨＣＯ２Ｈ。流量：０．４ｍＬ／分。６分にわたる５％のＢから１００％のＢまでの直線勾配。この機器は、ＱＤａエレクトロスプレーＭＳ検出器を備えていた。
【０１９０】
ＮＭＲ分光法を、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｓｃｅｎｄ  ４００で行った（プロトンに対しては４００ＭＨｚで作動させ、炭素に対しては１０１ＭＨｚで作動させる）。この分光計は、１Ｈ−、１３Ｃ−、ＣＯＳＹ−、ＨＳＱＣ−、およびＨＭＢＣ−ＮＭＲスペクトルの記録のために使用された。化学シフト（δ）は、百万分率（ｐｐｍ）で報告され、結合定数（Ｊ）は、セクション１０でＨｚで報告される。溶媒として、重水素化ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ−ｄ６）またはクロロホルム（ＣＤＣｌ３）を使用した。
【０１９１】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｕｔｏｆｌｅｘ  ＴＯＦ／ＴＯＦ（商標）（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  ＧｍｂＨ、Ｌｅｉｐｚｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で、リフレクターモードで、１９．０ｋＶ／１６．７ｋＶのイオン加速を使用して行った。少なくとも１．８７２ｋＶの検出器電圧（検出器のゲイン６．０）でスペクトルを、５００ショット／秒の頻度での４０００ショットの平均として表して記録した。マトリクス：メタノール中の、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）（６０ｍｇ／ｍＬ）、トリフルオロ酢酸ナトリウム（１ｍｇ／ｍＬ）。
【０１９２】
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社によるＴＬＣシリカゲル６０Ｆ２５４でコーティングされたアルミニウムシートで行い、ＵＶで可視化するか、またはモリブデン酸アンモニウムセリウム溶液（ｃｅｍｏｌ染色）で染色した。
【０１９３】
固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を、標準的なＦｍｏｃ化学を使用したＢｉｏｔａｇｅ  Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ＋Ａｌｓｔｒａ自動化マイクロ波ペプチドシンセサイザーで行った。樹脂からの切断を、切断溶液Ａ（９５：２．５：２．５ｖ／ｖのＴＦＡ／ＴＩＰＳ／Ｈ２Ｏ）または切断溶液Ｂ（９４：２：２：２ｖ／ｖのＴＦＡ／ＴＩＰＳ／ＥＤＴ／Ｈ２Ｏ）のいずれかを使用して行った。
【０１９４】
リポソームのサイズ、多分散性、およびゼータ電位を、ＺｅｔａＰａｌｓシステム（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、ＮＹ、ＵＳＡ）を使用した光散乱によって分析した。試料を２００倍に希釈し（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｖｏｌ％スクロース緩衝液、ｐＨ７．４）、粒径分布を、それぞれ３０秒の５回の副次的な実行によって決定し、ゼータ電位を、０．０４の標的残差を用いた１０回の副次的な実行によって決定した。
【０１９５】
（実施例２）
合成
１．小分子
Ｍ０４７
【化１４】
2021523209.tif 000019
システアミン（１０００ｍｇ、１２．９６ｍｍｏｌ）を、撹拌しながら加熱還流することによってＴＨＦ（４０ｍＬ）中に溶解させ、次いで４℃に冷却した。コレステリルクロロホルメート（３８９４ｍｇ、８．６７ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（１５ｍＬ）中に溶解させ、２，４，６−トリメチルピリジン（１１５０μＬ、８．７０ｍｍｏｌ）を添加した。次いでこの混合物をシステアミンの溶液に添加して白色の混合物を形成し、これを４℃で５分間撹拌し、次いで３０分間還流したところ、ＴＬＣは完全な変換を示した（２０：２０：１のＨｅｘ／ＣＨＣｌ３／ＥｔＯＡｃ）。次いで混合物を濾過し、沈殿物をＤＣＭで濯ぎ、その後、合わせた濾液をセライト上で蒸発させ、ＤＣＶＣ（１１画分にわたり、８０：０：０→３０：５０：５のＨｅｘ／ＣＨＣｌ３／ＥｔＯＡｃ）によって精製した。３６１１ｍｇ（８５％）を白色の固体として得た。Ｒｆ＝０．３４（２０：２０：１のＨｅｘ／ＣＨＣｌ３／ＥｔＯＡｃ）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ３０Ｈ５１ＮＯ２Ｓの計算された質量＝４８９．３６。ｍ／ｚとしての［Ｍ＋Ｎａ］＋の実測値＝５１２．１９。
【０１９６】
1H  NMR  (400  MHz,  クロロホルム-d)  δ  5.37  (dt,  J  =  5.4,  2.0  Hz,  1H),  5.00  (s,  1H),  4.50  (dt,  J  =  11.4,  6.3  Hz,  1H),  3.35  (q,  J  =  6.3  Hz,  2H),  2.66  (dt,  J  =  8.5,  6.5  Hz,  2H),  2.41  -  2.18  (m,  2H),  2.08  -  1.75  (m,  5H),  1.64  -  0.79  (m,  36H),  0.67  (s,  3H).
13C  NMR  (101  MHz,  CDCl3)  δ  156.1,  139.9,  122.7,  74.7,  56.8,  56.3,  50.1,  44.0,  42.5,  39.9,  39.7,  38.7,  37.1,  36.7,  36.3,  35.9,  32.1,  32.0,  28.4,  28.3,  28.2,  25.2,  24.4,  24.0,  23.0,  22.7,  21.2,  19.5,  18.9,  12.0.
【０１９７】
Ｍ０８０
【化１５】
2021523209.tif 000020
２５ｍＬの丸底フラスコ中のＤＣＭ（１０ｍＬ）に、ジビニルスルホン（２６５μＬ、２．６４ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（３００μＬ、２．１５ｍｍｏｌ）を添加し、その後、ＤＣＭ（１０ｍＬ）中のＭ０４７（１０７８ｍｇ、２．２０ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。その後この混合物を、室温で、窒素下で２．５時間撹拌したところ、ＴＬＣは出発材料の完全な変換を示した。次いでこの溶液を水（２５ｍＬ）で洗浄し、これをＤＣＭ（２×２５ｍＬ）で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４を用いて乾燥させ、濾過し、濃縮して未精製の残留物を得て、これを、フラッシュカラムクロマトグラフィー（３０：１のＤＣＭ／ＥｔＯＡｃ）によって精製した。６５３ｍｇ（４９％）を白色の固体として得た。Ｒｆ＝０．２３（３０：１のＤＣＭ／ＥｔＯＡｃ）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ３４Ｈ５７ＮＯ４Ｓ２の計算された質量＝６０７．３７。ｍ／ｚとしての［Ｍ＋Ｎａ］＋の実測値＝６３０．３３。
【０１９８】
1H  NMR  (400  MHz,  クロロホルム-d)  δ  6.68  (dd,  J  =  16.6,  9.8  Hz,  1H),  6.48  (d,  J  =  16.6  Hz,  1H),  6.22  (d,  J  =  9.8  Hz,  1H),  5.38  (dt,  J  =  4.7,  2.0  Hz,  1H),  4.94  (s,  1H),  4.49  (dt,  J  =  11.5,  6.3  Hz,  1H),  3.36  (q,  J  =  6.2  Hz,  2H),  3.29  -  3.19  (m,  2H),  2.95  -  2.85  (m,  2H),  2.70  (t,  J  =  6.6  Hz,  2H),  2.39  -  2.22  (m,  2H),  2.05  -  1.76  (m,  5H),  1.65  -  0.80  (m,  33H),  0.67  (s,  3H).
13C  NMR  (101  MHz,  CDCl3)  δ  156.2,  139.9,  136.2,  131.5,  122.8,  74.8,  56.8,  56.3,  54.5,  50.2,  42.5,  40.0,  39.9,  39.7,  38.7,  37.1,  36.7,  36.3,  35.9,  32.6,  32.1,  32.0,  28.4,  28.3,  28.2,  24.4,  24.1,  24.0,  23.0,  22.7,  21.2,  19.5,  18.9,  12.0.
【０１９９】
Ｍ１０７
【化１６】
2021523209.tif 000021
４−アルドリチオール（３５９．８ｍｇ、０．９０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ中に溶解させ（８．９ｍＬ）、Ｎ２を通して１０分間泡立てながら５℃に冷却した。次いでこの混合物に、ＴＨＦ（８．１ｍＬ）中のＭ０４７（４００ｍｇ、０．８２ｍｍｏｌ）の溶液を１分にわたり一滴ずつ添加し、この混合物をその後、２０℃で３０分間撹拌した。次いで反応混合物を減圧下で濃縮して、未精製の残留物を得て、これから生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（４：１→１：１のＤＣＭ／ＥｔＯＡｃ）によって精製した。１６８．９ｍｇ（３５％）を白色の固体として得た。Ｒｆ＝０．２８（４：１のＤＣＭ／ＥｔＯＡｃ）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ３５Ｈ５４Ｎ２Ｏ２Ｓ２の計算された質量＝５９８．３６。ｍ／ｚとしての［Ｍ＋Ｈ］＋の実測値＝５９９．３９。
【０２００】
1H  NMR  (400  MHz,  クロロホルム-d)  δ  8.51  -  8.47  (m,  2H),  7.46  -  7.43  (m,  2H),  5.37  (dt,  J  =  5.0,  2.1  Hz,  1H),  4.91  (d,  J  =  6.2  Hz,  1H),  4.48  (tt,  J  =  10.3,  4.9  Hz,  1H),  3.46  (q,  J  =  6.3  Hz,  2H),  2.87  (t,  J  =  6.4  Hz,  2H),  2.30  (dddd,  J  =  24.5,  12.7,  5.9,  2.4  Hz,  2H),  2.06  -  1.75  (m,  6H),  1.63  -  0.82  (m,  32H),  0.67  (s,  3H).
13C  NMR  (101  MHz,  CDCl3)  δ  156.1,  149.8,  148.6,  139.8,  122.8,  121.4,  120.2,  74.9,  56.8,  56.3,  50.1,  42.5,  39.9,  39.7,  38.6,  38.3,  37.1,  36.7,  36.3,  35.9,  32.0,  32.0,  28.4,  28.3,  28.2,  24.4,  24.0,  23.0,  22.7,  21.2,  19.5,  18.9,  12.0.
【０２０１】
Ｍ１１７
【化１７】
2021523209.tif 000022
ＭｅＯＨ（６ｍＬ）中の２−アルドリチオール（２７５ｍｇ、１．２３ｍｍｏｌ）の溶液をＮ２で５分間脱気し、その後、ＣＨＣｌ３（８ｍＬ）中のＭ０４７（４００ｍｇ、０．８２ｍｍｏｌ）の溶液を５分にわたり一滴ずつ添加した。次いでこの混合物を２０℃で２時間撹拌したところ、ＴＬＣは、Ｍ４７の完全な変換を示した（２０：２０：１のヘキサン／ＣＨＣｌ３／ＥｔＯＡｃ、Ｃｅｍｏｌ染色）。次いで反応混合物を減圧下で濃縮し、ＣＨＣｌ３（２０ｍＬ）中に再溶解させ、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（３０ｍＬ）で洗浄し、これをＣＨＣｌ３（２×２０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４を用いて乾燥させ、濾過し、濃縮して残留物を得て、これを、シリカでのフラッシュカラムクロマトグラフィー（３：１のヘキサン／ＥｔＯＡｃ）によって精製した。３２１．９ｍｇ（６６％）を白色の固体として得た。Ｒｆ＝０．４３（２０：１のＤＣＭ／ＥｔＯＡｃ）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ３５Ｈ５４Ｎ２Ｏ２Ｓ２の計算された質量＝５９８．３６。ｍ／ｚとしての［Ｍ＋Ｈ］＋の実測値＝５９９．３３。
【０２０２】
1H  NMR  (400  MHz,  クロロホルム-d)  δ  8.58  -  8.46  (m,  1H),  7.61  (td,  J  =  7.7,  1.8  Hz,  1H),  7.53  (d,  J  =  8.0  Hz,  1H),  7.12  (ddd,  J  =  7.3,  4.9,  1.1  Hz,  1H),  6.08  (t,  J  =  6.1  Hz,  1H),  5.37  (dt,  J  =  5.5,  2.0  Hz,  1H),  4.49  (dq,  J  =  10.2,  5.0,  4.0  Hz,  1H),  3.47  (q,  J  =  5.9  Hz,  2H),  2.94  (t,  J  =  5.9  Hz,  2H),  2.41  -  2.22  (m,  2H),  2.06  -  1.77  (m,  5H),  1.62  -  0.82  (m,  33H),  0.68  (s,  3H).
13C  NMR  (101  MHz,  CDCl3)  δ  159.3,  156.3,  150.0,  140.0,  137.0,  122.6,  121.3,  120.8,  74.5,  56.8,  56.3,  50.2,  42.5,  39.9,  39.7,  39.6,  39.1,  38.7,  37.1,  36.7,  36.3,  35.9,  32.1,  32.0,  28.4,  28.3,  28.2,  24.4,  24.0,  23.0,  22.7,  21.2,  19.5,  18.9,  12.0.
【０２０３】
２．ペプチド
標準的なＦｍｏｃ固相ペプチド合成のための一般的な手順：
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）のいずれか（０．５Ｍ、４当量）、ＤＭＦ中のＨＡＴＵ（０．５Ｍ、３．９２当量）、および２，４，６−トリメチルピリジン（４．０Ｍ、８当量）からのアミノ酸溶液を、カップリングのために、室温で４５分間（システイン、ヒスチジン、およびアルギニン残基の場合）または７５℃で５分間（他の全ての残基）混合した。ＤＭＦ中の２０％ピペリジン（ｖ／ｖ）を、脱保護のために使用した。樹脂からの切断を、切断溶液Ｂ（９４：２：２：２ｖ／ｖのＴＦＡ／ＴＩＰＳ／ＥＤＴ／Ｈ２Ｏ）を使用して２時間行った。その後、粗製ペプチドを冷ジエチルエーテル中で切断濾液から沈殿させた。エーテル溶液を、１３０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠沈させた。最後に、エーテルをデカントした後、得られた粗製ペプチドを、半分取用ＨＰＬＣによって精製した。＞９５％純粋な生成物（ＨＰＬＣ）を含む生成物含有画分をプールし、凍結乾燥した。
【０２０４】
Ｍ０５３：ＣＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）
【化１８】
2021523209.tif 000023
Ｍ０５３を、０．５ｍｍｏｌのスケールで、標準的なＦｍｏｃ固相ペプチド合成手順に従って、事前にローディングしたＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｗａｎｇ樹脂（０．７０ｍｍｏｌ／ｇのローディング）を使用して合成した。４７０ｍｇ（８８％）のペプチドを、トリフルオロ酢酸塩として、ふわふわした白色の固体として得た。ＨＰＬＣ（＞９５％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ４８Ｈ７９Ｎ１１Ｏ１４Ｓの計算された質量＝１０６５．５５。ｍ／ｚとしての［Ｍ＋Ｈ］＋の実測値＝１０６６．５２；およびｍ／ｚとしての［Ｍ＋Ｎａ］＋の実測値＝１０８８．４９。
【０２０５】
Ａ０２０：ＣＳＩＩＴＦＥＫＬ（配列番号２）
【化１９】
2021523209.tif 000024
Ａ０２０を、０．５ｍｍｏｌのスケールで、標準的なＦｍｏｃ固相ペプチド合成手順に従って、事前にローディングしたＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｗａｎｇ樹脂（０．７０ｍｍｏｌ／ｇのローディング）を使用して合成した。１４２．２ｍｇ（２７％）のペプチドを、トリフルオロ酢酸塩として、ふわふわした白色の固体として得た。ＨＰＬＣ（＞９５％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ４８Ｈ８０Ｎ１０Ｏ１４Ｓの計算された質量＝１０５２．５６。ｍ／ｚとしての［Ｍ＋Ｈ］＋の実測値＝１０５３．３２；およびｍ／ｚとしての［Ｍ＋Ｎａ］＋の実測値＝１０７５．２９。
【０２０６】
Ａ０２１：Ｃ（Ｎｐｙｓ）ＳＩＩＶＦＥＫＬ（配列番号３）
【化２０】
2021523209.tif 000025
ＡＣ０２１を、０．２５ｍｍｏｌのスケールで、標準的なＦｍｏｃ固相ペプチド合成手順に従って、事前にローディングしたＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｗａｎｇ樹脂（０．７０ｍｍｏｌ／ｇのローディング）を使用して、ＤＭＦ中のＢｏｃ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）−ＯＨ（０．５Ｍ、４当量）、ＤＭＦ中のＯｘｙｍａ（０．５Ｍ、３．９８当量）およびＤＩＣ（３．９８当量）を使用したＮ末端Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）の一晩のカップリングにより合成した。２５６．０ｍｇ（８８％）のペプチドを、トリフルオロ酢酸塩として、ふわふわした白色の固体として得た。ＨＰＬＣ（＞９４％）。ＥＳＩ  ＬＣ−ＭＳ：Ｃ５４Ｈ８４Ｎ１２Ｏ１５Ｓ２の計算された質量＝１２０４．５６。ｍ／ｚとしての［Ｍ＋２Ｈ］２＋の実測値＝６０３．４。
【０２０７】
Ｍ０９６：ＣＫＶＰＲＮＱＤＷＬ（配列番号４）
【化２１】
2021523209.tif 000026
Ｍ０９６を、０．５ｍｍｏｌのスケールで、標準的なＦｍｏｃ固相ペプチド合成手順に従って、事前にローディングしたＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｗａｎｇ樹脂（０．７０ｍｍｏｌ／ｇのローディング）を使用して合成した。３４９．５ｍｇ（５６％）のペプチドを、トリフルオロ酢酸塩として、ふわふわした白色の固体として得た。ＨＰＬＣ（＞９５％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ５５Ｈ８７Ｎ１７Ｏ１５Ｓの計算された質量＝１２５７．６３。ｍ／ｚとしての［Ｍ＋Ｈ］＋の実測値＝１２５８．６４。
【０２０８】
Ｍ０９７：ＣＫＧＰＲＮＱＤＷＬ（配列番号５）
【化２２】
2021523209.tif 000027
Ｍ０９７を、０．５ｍｍｏｌのスケールで、標準的なＦｍｏｃ固相ペプチド合成手順に従って、事前にローディングしたＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｗａｎｇ樹脂（０．７０ｍｍｏｌ／ｇのローディング）を使用して合成した。３９２．８ｍｇ（６５％）のペプチドを、トリフルオロ酢酸塩として、ふわふわした白色の固体として得た。ＨＰＬＣ（＞９５％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ５１Ｈ７６Ｎ１６Ｏ１７Ｓの計算された質量＝１２１６．５３。ｍ／ｚとしての［Ｍ＋Ｈ］＋の実測値＝１２１７．７８。
【０２０９】
Ｍ１１１：ＣＬＧＧＬＬＴＭＶ（配列番号６）
【化２３】
2021523209.tif 000028
Ｍ１１１を、０．２２ｍｍｏｌのスケールで、標準的なＦｍｏｃ固相ペプチド合成手順に従って、事前にローディングしたＦｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｗａｎｇ樹脂（０．７０ｍｍｏｌ／ｇのローディング）を使用して合成した。９９．４ｍｇ（５０％）のペプチドを、トリフルオロ酢酸塩として、ふわふわした白色の固体として得た。ＨＰＬＣ（＞９９％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ３９Ｈ７１Ｎ９Ｏ１１Ｓ２の計算された質量＝９０５．４７。ｍ／ｚとしての［Ｍ＋Ｎａ］＋の実測値＝９２８．４６。
【０２１０】
Ｍ１１３：ＣＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴ（配列番号７）
【化２４】
2021523209.tif 000029
Ｍ１１３を、０．５ｍｍｏｌのスケールで、標準的なＦｍｏｃ固相ペプチド合成手順に従って、事前にローディングしたＦｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｗａｎｇ樹脂（０．８３ｍｍｏｌ／ｇのローディング）を使用して合成した。１２１．４ｍｇ（１８％）のペプチドを、トリフルオロ酢酸塩として、ふわふわした白色の固体として得た。ＨＰＬＣ（＞９９％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ５６Ｈ８８Ｎ１２Ｏ２０Ｓ２の計算された質量＝１３１２．５７。ｍ／ｚとしての［Ｍ＋Ｎａ］＋の実測値＝１３３５．５９。
【０２１１】
Ｍ１１４：ＣＶＬＤＧＬＤＶＬＬ（配列番号８）
【化２５】
2021523209.tif 000030
Ｍ１１４を、０．２１ｍｍｏｌのスケールで、標準的なＦｍｏｃ固相ペプチド合成手順に従って、事前にローディングしたＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｗａｎｇ樹脂（０．７０ｍｍｏｌ／ｇのローディング）を使用して合成した。２３．４ｍｇ（１１％）のペプチドを、トリフルオロ酢酸塩として、ふわふわした白色の固体として得た。ＨＰＬＣ（＞９２％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ４７Ｈ８２Ｎ１０Ｏ１５Ｓの計算された質量＝１０５８．５７。ｍ／ｚとしての［Ｍ＋Ｈ］＋の実測値＝１０５９．６０；およびｍ／ｚとしての［Ｍ＋Ｎａ］＋の実測値＝１０８１．５６。
【０２１２】
Ａ００１：ＣＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ（配列番号９）
【化２６】
2021523209.tif 000031
Ａ００１を、０．５ｍｍｏｌのスケールで、標準的なＦｍｏｃ固相ペプチド合成手順に従って、事前にローディングしたＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｗａｎｇ樹脂（０．６３ｍｍｏｌ／ｇのローディング）を使用して合成した。３０５ｍｇ（３３％）のペプチドを、トリフルオロ酢酸塩として、ふわふわした白色の固体として得た。ＨＰＬＣ（＞９５％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ７７Ｈ１２５Ｎ２７Ｏ２６Ｓの計算された質量＝１８７５．９０。ｍ／ｚとしての［Ｍ＋Ｈ］＋の実測値＝１８７６．９５。
【０２１３】
３．コレステロールリポペプチドコンジュゲート
３．１．還元性リンカー（＊）とのペプチドコンジュゲーションのための一般的な手順：
方法Ｉ：ペプチドチオールのｉｎ  ｓｉｔｕ活性化
システイン修飾ペプチド（１当量）を、ＮＭＰ中におよそ０．０１Ｍまで溶解させ、次いで４℃に冷却し、その後、ペプチド溶液に、ＮＭＰ中の４，４’−ジピリジルジスルフィド（４−ＰＤＳ）（１．２５当量）の０．１５Ｍ溶液を添加した。この混合物を、窒素下で、４℃で１５分間撹拌し、その後、ＮＭＰ中のＭ０４７（１．２５当量）の０．１５Ｍ溶液を添加した。粗生成物を冷ジエチルエーテル（３×４０ｍＬ）中でＮＭＰから沈殿させ、１３０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠沈させた。エーテルをデカントして除いた後、得られた白色の固体を、ＤＭＳＯ中に溶解させ、ＸｔｅｒｒａＣ８カラムでの分取用ＨＰＬＣによって精製した。＞９５％の純度（ＨＰＬＣ）を有する画分をプールし、凍結乾燥して、生成物を白色のふわふわした固体として得た。
【０２１４】
方法ＩＩ：事前に活性化された脂質チオール
システイン修飾ペプチド（１．１当量）を、ＮＭＰ中に２０ｍＭまで溶解させ、ＮＭＰ（２０ｍＭ）中のＭ１１７（１．０当量）の溶液を添加した。その後、混合物を２０℃で２時間撹拌した。精製を、ＸｔｅｒｒａＣ８カラムで直線勾配を用いて行った。＞９５％の純度（ＨＰＬＣ）を有する画分をプールし、凍結乾燥して、生成物を白色のふわふわした固体として得た。
【０２１５】
方法ＩＩＩ：事前に活性化されたペプチドチオール
粗製Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）修飾ペプチド（１当量）およびＭ０４７（１．３当量）を、４℃の冷ＮＭＰ中に溶解させて、４〜５ｍＭのペプチド溶液を得た。反応混合物を、最初にＮ２下で４℃で５分間撹拌した後、室温で２時間撹拌した。次いで粗製ペプチドを冷ジエチルエーテル（４０ｍＬ）中でＮＭＰから沈殿させ、１３０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠沈させた。エーテルをデカントして除いた後、得られた白色の固体をＮＭＰ中に溶解させ、ＸｔｅｒｒａＣ１８カラムでの分取用ＨＰＬＣによって精製した。＞９５％の純度（ＨＰＬＣ）を有する画分をプールし、凍結乾燥して、生成物を白色のふわふわした固体として得た。
【０２１６】
Ｍ０６２：Ｃｈｏｌ＊−ＣＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）
【化２７】
2021523209.tif 000032
Ｍ０６２を、方法Ｉを使用した一般的な手順に従って合成した：
ＮＭＰ（１６ｍＬ）中のＭ０５３（１４５ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）、ＮＭＰ（１．５ｍＬ）中の４−アルドリチオール（４９ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）、およびＮＭＰ（０．５ｍＬ）中のＭ０４７（３３ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）。この混合物を室温で５時間撹拌した。精製を、２０分にわたる直線勾配（６５：３５→３０：７０のＡ／Ｂ）を用いて行った。７８ｍｇ（３７％）を、ふわふわした白色の固体として得た。ＨＰＬＣ（＞９５％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ７８Ｈ１２８Ｎ１２Ｏ１６Ｓ２の計算された質量＝１５５２．９０。ｍ／ｚとしての［Ｍ＋Ｎａ］＋の実測値＝１５７５．８９；およびｍ／ｚとしての［Ｍ−Ｈ＋２Ｎａ］＋の実測値＝１５９７．８９。
【０２１７】
Ａ０２２：Ｃｈｏｌ＊−ＣＳＩＩＴＦＥＫＬ（配列番号２）
【化２８】
2021523209.tif 000033
Ａ０２２を、わずかに改変した方法Ｉを使用した一般的な手順に従って合成した：
Ａ０２２（１０６ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を、一般的な手順に従って、ＮＭＰ（２０ｍＬ）中に溶解させ、ＮＭＰ（１ｍＬ）中の４，４’−ジピリジルジスルフィド（３３ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、その後、ＮＭＰ（４０ｍＬ）中のＭ０４７（９８ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。反応物を室温で一晩撹拌した。精製を、４５分にわたる直線勾配（６５：３５→２０：８０のＡ／Ｂ）を用いて行った。２９ｍｇ（１９％）を、ふわふわした白色の固体として得た。ＨＰＬＣ（＞９５％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ７８Ｈ１２９Ｎ１１Ｏ１６Ｓ２の計算された質量＝１５３９．９１。ｍ／ｚとしての［Ｍ＋Ｈ］＋の実測値＝１５４０．３０；およびｍ／ｚとしての［Ｍ＋Ｎａ］＋の実測値＝１５６２．３０。
【０２１８】
Ａ０２３：Ｃｈｏｌ＊−ＣＳＩＩＶＦＥＫＬ（配列番号１０）
【化２９】
2021523209.tif 000034
Ａ０２３を、方法ＩＩＩを使用した一般的な手順に従って合成した：
丸底フラスコに、Ａ０２１（４２ｍｇ、０．１２５ｍｍｏｌ）およびＭ０４７（７８ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を入れ、方法ＩＩＩに従ってＮＭＰ（２７ｍＬ）を４℃で添加した。粗生成物を、５０℃に加熱したＸｔｅｒｒａＣ１８カラムでの分取用ＨＰＬＣによって精製した。溶離液：（Ａ）水中の５％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ、４％ＴＦＥ、（Ｂ）アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ、４％ＴＦＥ。精製を、４０分にわたる直線勾配（６０：４０→２０：８０のＡ／Ｂ）を用いて行った。８９ｍｇ（４６％）を、ふわふわした白色の固体として得た。ＨＰＬＣ（＞９５％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ７９Ｈ１３１Ｎ１１Ｏ１５Ｓ２の計算された質量＝１５３７．９３。ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋の実測値＝１５３８．２８および［Ｍ＋Ｎａ］＋の実測値＝１５６０．１４。
【０２１９】
Ｍ０９８：Ｃｈｏｌ＊−ＣＫＶＰＲＮＱＤＷＬ（配列番号４）
【化３０】
2021523209.tif 000035
Ｍ０９８を、方法Ｉを使用した一般的な手順に従って合成した：
１２ｍＬのＮＭＰ中のＭ０９６（１１８ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）、ＮＭＰ（０．７８２ｍＬ）中の４−アルドリチオール（２５．８ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）、およびＮＭＰ（０．７８２ｍＬ）中のＭ０４７（５７．４ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）。この混合物を２０℃で５時間撹拌した。精製を、２５分にわたる直線勾配（６０：４０→５：９５のＡ／Ｂ）を用いて行った。５６．９ｍｇ（３５％）を、ふわふわした白色の固体として得た。ＨＰＬＣ（＞９５％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ８５Ｈ１３６Ｎ１８Ｏ１７Ｓ２の計算された質量＝１７４４．９８。ｍ／ｚとしての［Ｍ＋Ｈ］＋の実測値＝１７４６．１５；およびｍ／ｚとしての［Ｍ＋Ｎａ］＋の実測値＝１７６８．２１
【０２２０】
Ｍ１００：Ｃｈｏｌ＊＊−ＣＥＧＰＲＮＱＤＷＬ（配列番号１１）
【化３１】
2021523209.tif 000036
Ｍ１００を、方法Ｉを使用した一般的な手順に従って合成した：
ＮＭＰ（９．８ｍＬ）中のＭ０９７（１２０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）、ＮＭＰ（０．８２１ｍＬ）中の４−アルドリチオール（２７．２ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）、およびＮＭＰ（０．８２１ｍＬ）中のＭ０４７（６０．３ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）。この混合物を２０℃で４時間撹拌した。精製を、２５分にわたる直線勾配（７０：３０→３０：７０のＡ／Ｂ）を用いて行った。４３．５ｍｇ（３６％）を、ふわふわした白色の固体として得た。ＨＰＬＣ（＞９５％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ８１Ｈ１２５Ｎ１７Ｏ１９Ｓ２の計算された質量＝１７０３．８８。ｍ／ｚとしての［Ｍ＋Ｎａ］＋の実測値＝１７２６．２６。
【０２２１】
Ｍ１２０：Ｃｈｏｌ＊−ＣＬＧＧＬＬＴＭＶ（配列番号６）
【化３２】
2021523209.tif 000037
Ｍ１２０を、方法ＩＩを使用した一般的な手順に従って合成した：
ＮＭＰ（２．７ｍＬ）中のＭ１１１（５０ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）およびＮＭＰ（２．５ｍＬ）中のＭ１１７（３０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）。混合物は即座に黄色になり、その後これを２０℃で２時間撹拌した。精製を、１５分にわたる直線勾配（５５：４５→１５：８５のＡ／Ｂ）を用いて行った。３９．１ｍｇ（５１％）を、ふわふわした白色の固体として得た。ＨＰＬＣ（＞９５％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ６９Ｈ１２０Ｎ１０Ｏ１３Ｓ３の計算された質量＝１３９２．８２。ｍ／ｚとしての［Ｍ＋Ｎａ］＋の実測値＝１４１５．８３。
【０２２２】
Ｍ１２１：Ｃｈｏｌ＊−ＣＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号１２）
【化３３】
2021523209.tif 000038
Ｍ１２１を、粗製ペプチドを使用して、方法ＩＩを使用した一般的な手順に従って合成した：
ペプチドＣＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号１２）を、０．０８ｍｍｏｌのスケールで、標準的なＦｍｏｃ固相ペプチド合成手順に従って、事前にローディングしたＦｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｗａｎｇ樹脂（０．７０ｍｍｏｌ／ｇのローディング）を使用して合成した。粗製ペプチドを、ＮＭＰ（６ｍＬ）中に溶解させた。ＮＭＰ（１２ｍＬ）中のＭ１１７（４９．５ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）。混合物はゆっくり黄色になり、これを２０℃で２時間撹拌した。精製を、１５分にわたる直線勾配（５５：４５→０：１００のＡ／Ｂ）を用いて行った。１０．５ｍｇ（合計１．３％）を、ふわふわした白色の固体として得た。ＨＰＬＣ（＞９５％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ７８Ｈ１３４Ｎ１２Ｏ１７Ｓ２の計算された質量＝１５７４．９４。ｍ／ｚとしての［Ｍ＋Ｎａ］＋の実測値＝１５９７．９２。
【０２２３】
Ｍ１２２：Ｃｈｏｌ＊−ＣＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴ（配列番号７）
【化３４】
2021523209.tif 000039
Ｍ１２２を、方法ＩＩを使用した一般的な手順に従って合成した：
ＮＭＰ（１．９ｍＬ）中のＭ１１３（５０ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）およびＮＭＰ（１．９ｍＬ）中のＭ１１７（２２．８ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）。混合物は即座に黄色になり、その後これを２０℃で２時間撹拌した。精製を、１５分にわたる直線勾配（５５：４５→１５：８５のＡ／Ｂ）を用いて行った。５５．６ｍｇ（８１％）を、ふわふわした白色の固体として得た。ＨＰＬＣ（＞９５％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ８６Ｈ１３７Ｎ１３Ｏ２２Ｓ３の計算された質量＝１７９９．９２。ｍ／ｚとしての［Ｍ＋Ｎａ］＋の実測値＝１８２１．３９。
【０２２４】
Ｍ１２３：Ｃｈｏｌ＊−ＣＶＬＤＧＬＤＶＬＬ（配列番号８）
【化３５】
2021523209.tif 000040
Ｍ１２３を、方法ＩＩを使用した一般的な手順に従って合成した：
ＮＭＰ（１．０ｍＬ）中のＭ１１４（２２ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）およびＮＭＰ（１．０ｍＬ）中のＭ１１７（１２．４ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）。混合物は即座に黄色になり、その後これを２０℃で２時間撹拌した。精製を、１５分にわたる直線勾配（５５：４５→１５：８５のＡ／Ｂ）を用いて行った。１３．７ｍｇ（４３％）を、ふわふわした白色の固体として得た。ＨＰＬＣ（＞９５％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ７７Ｈ１３１Ｎ１１Ｏ１７Ｓ２の計算された質量＝１５４５．９２。ｍ／ｚとしての［Ｍ＋Ｎａ］＋の実測値＝１５６８．９２。
【０２２５】
３．２．非還元性リンカー（＊＊）とのペプチドコンジュゲーションのための一般的な手順：
システイン修飾ペプチド（１当量）の溶液に、Ｍ０８０（１．２〜２当量）およびＥｔ３Ｎ（０．５当量）の溶液を添加した。粗生成物を冷ジエチルエーテル（３×４０ｍＬ）中で反応混合物から沈殿させ、１３０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠沈させた。エーテルをデカントして除いた後、得られた白色の固体をＤＭＳＯ中に溶解させ、ＸｔｅｒｒａＣ８カラムでの分取用ＨＰＬＣによって精製した。＞９５％の純度（ＨＰＬＣ）を有する画分をプールし、凍結乾燥して、生成物を白色のふわふわした固体として得た。
【０２２６】
Ｍ０８４：Ｃｈｏｌ＊＊−ＣＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）
【化３６】
2021523209.tif 000041
Ｍ０８４を一般的な手順に従って合成した：
ＮＭＰ（１ｍＬ）中のＭ０５３（５６ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）およびＮＭＰ（１ｍＬ）中のＭ０８０（３９ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）。混合物を室温で一晩撹拌した。精製を、２０分にわたる直線勾配（６５：３５→３０：７０のＡ／Ｂ）を用いて行った。１０ｍｇ（１１％）を、ふわふわした白色の固体として得た。ＨＰＬＣ（＞９５％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ８２Ｈ１３６Ｎ１２Ｏ１８Ｓ３の計算された質量＝１６７２．９３。ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｎａ］＋の実測値＝１６９５．９７。
【０２２７】
Ｍ０９９：Ｃｈｏｌ＊＊−ＣＫＶＰＲＮＱＤＷＬ（配列番号４）
【化３７】
2021523209.tif 000042
Ｍ０９９を、Ｅｔ３Ｎの添加を含む一般的な手順に従って合成した：
ＮＭＰ（１ｍＬ）中のＭ０９６（５０ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）およびＮＭＰ（１ｍＬ）中のＭ０８０（４８．３ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）。Ｅｔ３Ｎ（０．００２ｍＬ）を添加した。混合物を８０℃で１４時間撹拌した。精製を、２５分にわたる直線勾配（７０：３０→３０：７０のＡ／Ｂ）を用いて行った。４５．６ｍｇ（６１％）を、ふわふわした白色の固体として得た。ＨＰＬＣ（＞９５％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ８９Ｈ１４４Ｎ１８Ｏ１９Ｓ３の計算された質量＝１８６５．００。ｍ／ｚとしての［Ｍ＋Ｎａ］＋の実測値＝１８８９．２４。
【０２２８】
Ｍ１０１：Ｃｈｏｌ＊＊−ＣＥＧＰＲＮＱＤＷＬ（配列番号１１）
【化３８】
2021523209.tif 000043
Ｍ１０１を、Ｅｔ３Ｎの添加を含む一般的な手順に従って合成した：
ＮＭＰ（１ｍＬ）中のＭ０９７（５０ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）およびＮＭＰ（１ｍＬ）中のＭ０８０（４９．９ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）。Ｅｔ３Ｎ（０．００１ｍＬ）を添加した。混合物を７５℃で８時間撹拌した。精製を、２５分にわたる直線勾配（７０：３０→３０：７０のＡ／Ｂ）を用いて行った。１６．８ｍｇ（２２％）を、ふわふわした白色の固体として得た。ＨＰＬＣ（＞９５％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ８５Ｈ１３３Ｎ１７Ｏ２１Ｓ３の計算された質量＝１８２３．９０。ｍ／ｚとしての［Ｍ＋Ｈ］＋の実測値＝１８２５．０４。
【０２２９】
４．ペグ化したペプチドおよびリポペプチドのコンジュゲート
４．１．非還元性リンカー（＊＊）とのペグ化したペプチドおよびリポペプチドのコンストラクトを以下のように合成した：
【０２３０】
Ｍ１４４：ＰＥＧ７５０＊＊−ＣＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）
【化３９】
2021523209.tif 000044
４ｍＬのバイアルに、メトキシポリエチレングリコールマレイミド（ＰＥＧ７５０−Ｍａｌ、２０．０ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）およびＭ０５３（２４．８ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）を入れた。次いでこの混合物に、ＤＭＦ（１．５ｍＬ）を添加し、両方の材料が完全に溶解するまで短時間加熱した。次いで混合物を３０分間撹拌しながら周囲温度にした。溶液を１：１のＨ２Ｏ／ＭｅＣＮで５ｍＬに希釈し、濾過し、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  Ｃ１８カラムでの半分取用ＨＰＬＣによって、３０分にわたる直線勾配（８０：２０→５０：５０のＡ／Ｂ）を用いて精製した。３１．３ｍｇ（６６％）を、ふわふわした白色の固体として得た。ＨＰＬＣ（＞９５％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ８７Ｈ１５２Ｎ１２Ｏ３３Ｓの計算された質量＝１９２５．０３。ＰＥＧ分布を有する、ｍ／ｚとしての［Ｍ＋Ｈ＋／−ｎ＊４４．０３］＋の実測値＝１９２６．０６；およびｍ／ｚとしての［Ｍ＋Ｎａ＋／−ｎ＊４４．０３］＋の実測値＝１９４８．０２であり、ｎ＝０、１、２、３、および４である。
【０２３１】
Ｍ１１０：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００＊＊−ＣＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）
【化４０】
2021523209.tif 000045
ＤＭＦ（２．７ｍＬ）中のＭ０５３（１６．３ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）の溶液を、ＤＭＦ（２．７ｍＬ）中のＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−マレイミド（３０．０ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。次いでこの混合物を７０℃に加熱し、その後６時間撹拌しながら周囲温度にした。その後、粗生成物を冷Ｅｔ２Ｏ中で沈殿させ、６０００ｒｐｍで５分間遠沈させ、上清をデカントして乾燥させた。粗生成物を１ｍＬのＤＭＳＯ中に溶解させ、これをＭｅＣＮで４ｍＬに希釈し、濾過し、ＸｔｅｒｒａＣ８カラム（１０×１５０ｍｍ）での半分取用ＨＰＬＣによって、１５分にわたる直線勾配（６５：３５→１０：９０のＡ／Ｂ）を使用して精製した。１６．６ｍｇ（４０％）を、ふわふわした白色の固体として得た。ＨＰＬＣ（＞９５％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ１９０Ｈ３５３Ｎ１４Ｏ７１ＰＳの計算された質量＝４０３０．３９。ｍ／ｚとしての［Ｍ＋Ｈ］＋の実測値＝４０３１．０２；およびｍ／ｚとしての［Ｍ＋Ｎａ］＋の実測値＝４０５２．４８、それらの隣接するピークはＰＥＧ分布に対応する。
【０２３２】
４．２．還元性リンカー（＊）を有するペグ化リポペプチドを以下のように合成した：
【０２３３】
Ｍ１４２：Ｃｈｏｌ−ＰＥＧ２０００＊−ＣＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）
【化４１】
2021523209.tif 000046
Ｍ０５３（１５．１ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）を、ＮＭＰ（０．６００ｍＬ）中に溶解させ、４℃に冷却し、次いでＮＭＰ（０．１１９ｍＬ）中の２−アルドリチオール（２．６１ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。次いで、１分後にＮＭＰ（０．６００ｍＬ）中のコレステロール−ＰＥＧ２０００−ＳＨ（３０ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、この混合物を２０℃で１８時間撹拌した。その後、粗生成物を、２０分にわたる直線勾配（６５：３５→３０：７０のＡ／Ｂ）を使用してＸＴｅｒｒａＣ８カラムでの半分取用ＨＰＬＣによって精製した。４．４ｍｇ（１０％）を、ふわふわした白色の固体として得た。ＨＰＬＣ（＞９３％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ１７１Ｈ３１２Ｎ１２Ｏ６３Ｓ２の計算された質量＝３６０６．１０。ｍ／ｚとしての［Ｍ＋Ｈ］＋の実測値＝３６０７．２９；およびｍ／ｚとしての［Ｍ＋Ｎａ］＋の実測値＝３６３０．２６、それらの隣接するピークはＰＥＧ分布に対応する。
【０２３４】
Ｍ１４３：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００＊−ＣＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）
【化４２】
2021523209.tif 000047
ＮＭＰ（０．３０ｍＬ）中のＭ０５３（１１．３ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）の溶液は、このペプチドに、ＮＭＰ（０．１０６ｍＬ）中の４−アルドリチオール（２．３ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）の溶液を添加した際、４℃で撹拌しておいた。次いで１分後に、ＮＭＰ（０．３００ｍＬ）中のＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＳＨ（２０．０ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、この混合物を室温にし、その後２４時間撹拌した。次いでこの溶液を５００ｕＬのＭｅＣＮおよび５００ｕＬのＨ２Ｏで希釈し、濾過し、ＸｔｅｒｒａＣ８カラム（１０×１５０ｍｍ）での半分取用ＨＰＬＣによって、１５分にわたる直線勾配（６５：３５→１０：９０のＡ／Ｂ）を使用して精製した。５．２ｍｇ（１９％）を、ふわふわした白色の固体として得た。ＨＰＬＣ（＞９３％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：Ｃ１８２Ｈ３４３Ｎ１２Ｏ６９ＰＳ２の計算された質量＝３８９６．２９。ｍ／ｚとしての［Ｍ＋Ｈ］＋の実測値＝３８９７．９６；およびｍ／ｚとしての［Ｍ＋Ｎａ］＋の実測値＝３９１８．９２、それらの隣接するピークはＰＥＧ分布に対応する。
【０２３５】
５．リポソーム調製物
脂質のｔｅｒｔ−ブタノール／水（９：１）混合物を凍結乾燥し、続いて、緩衝液（ｐＨ７．４の、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｖｏｌ％スクロース）で、製剤１および２の場合は６５℃で、製剤３および４の場合は５５℃で４０ｍＭの脂質濃度まで再度湿潤化することによって、リポソームを調製した。その後、圧力押出機で、製剤１＋２および３＋４の場合、それぞれ７０℃または５５℃で、２×１００ｎｍのポリカーボネートフィルターを通して押し出すことを６回繰り返すことによって、多層小胞のサイズを小さくした。
製剤１：ＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００／ＴＭＸ−２０１−５６：３８：５：０．５（ｍｏｌ／ｍｏｌ）
製剤２：ＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−５６：３８：５（ｍｏｌ／ｍｏｌ）
製剤３：ＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＯＴＡＰ  Ｃｌ／ＤＯＰＥ−ＰＥＧ２０００／ＴＭＸ−２０１−３９．５：３０：２５：５：０．５（ｍｏｌ／ｍｏｌ）
製剤４：ＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＯＴＡＰ  Ｃｌ／ＤＯＰＥ−ＰＥＧ２０００−４０：３０：２５：５（ｍｏｌ／ｍｏｌ）。
凍結乾燥の前に、全ての４つの製剤に、０．１モル％のＤＰＰＥ−Ａｔｔｏ４８８を添加した。
【０２３６】
６．抗原の後挿入のための一般的な手順：
脂質−ペプチドコンジュゲートの形態の抗原をＤＭＳＯ中に１０ｍＭまで溶解させ、これを、製剤１および２に４５℃で、製剤３および４に室温で、２．５モル％のモル組成までゆっくり添加した。次いで製剤を、これらの温度で１５時間撹拌し、その後、得られた製剤を、製剤の少なくとも１００倍体積の緩衝液（ｐＨ７．４の、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｖｏｌ％スクロース）に対して少なくとも１２時間透析した。次いで得られた抗原を含有するリポソーム製剤を４５０ｎｍナイロンフィルターにゆっくり通過させて濾過し、続いて、サイズ、ゼータ電位を特徴付け、脂質、抗原、およびアジュバント濃度を測定した。
【０２３７】
（実施例３）
リポソーム製剤およびリンカーの特徴は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＢＭＤＣにおける抗原提示の強度および持続時間に影響を与える
実施例１および２に記載される化合物および手順を使用して、実験を実行した。
【０２３８】
Ｍ０６２を、一般的な手順に従って製剤１中に後挿入して、ＭＫ０６２  ＴＭＸ製剤を形成した。Ｍ０６２を、一般的な手順に従って製剤２中に後挿入して、ＭＫ０６２製剤を形成した。Ｍ０８４を、一般的な手順に従って製剤１中に後挿入して、ＭＫ０８４  ＴＭＸ製剤を形成した。
【０２３９】
３つの異なるリポソーム製剤：アジュバント非含有のＭＫ０６２、ＴＬＲ７アゴニストＴＭＸを含有するＭＫ０６２  ＴＭＸ、およびリンカーが非還元性であるＭＫ０８４  ＴＭＸを使用した。リポソームのアジュバントも、対応する濃度でＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１３）ペプチド試料に添加した。
【０２４０】
製剤１を、比較のために後挿入なしで使用して、ＴＭＸ製剤を得た。
【表１】
2021523209.tif 000048
【０２４１】
骨髄由来の樹状細胞（ＢＭＤＣ）を、抗原でパルスする前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させた。骨髄細胞を、Ｊａｎｖｉｅｒ  ＳＡＳから得られたＣ５７ｂｌ／６ＪｒＪマウスからの脛骨および大腿骨から単離した。マウスを頸部脱臼によって屠殺した後、骨を単離し、組織保存溶液（ＭＡＣＳ  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）中で維持した。骨を、７０％エタノール中で２分滅菌した後、２９ｇのインスリンシリンジを使用することによって培地で洗浄したメスの先端でその両端を切断した。単離後、骨髄細胞を、２０ｎｇ／ｍｌのマウス組換えＧＭ−ＣＳＦを補充した完全ＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。３日目に、細胞に、ＧＭ−ＣＳＦを含有する新鮮な培地を補充した。６日目に、未成熟ＢＭＤＣを回収し、再度平板培養し、１μＭのリポソーム（ＭＫ０６２またはＭＫ０６２  ＴＭＸ）または可溶性ＳＩＩＮＦＥＫＬエピトープと共にインキュベートした。２４または４８時間後、フローサイトメトリー分析のためにＢＭＤＣを回収した。細胞２００万個／試料を、０．５％ＢＳＡおよび０．１％ＮａＮ３を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ＦＡＣＳ緩衝液）で洗浄し、Ｆｃブロックに再懸濁して、非特異的な抗体結合を回避した。氷上で５分間ブロックした後、細胞を樹状細胞マーカーＣＤ１１ｃに対する抗体で染色し、ＭＨＣ  Ｉ分子上に提示されたＳＩＩＮＦＥＫＬを認識する抗体（Ｈ−２ｋｂ）によって抗原提示に関して評価した。染色を、４℃で３０分行った。その後、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に懸濁し、フローサイトメトリー分析（ＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ２０）に供した。分析をＦｌｏｗＪｏ  Ｖ．１０で行い、データをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン７．３でプロットした。
【０２４２】
図１中のグラフは、平均±標準偏差（ｎ＝６〜８）として表された、ＢＭＤＣのＣＤ１１ｃ＋画分中のＭＨＣ：ＳＩＩＮＦＥＫＬのＭＦＩ値を要約する。２〜３回の独立した実験によって結果を確認した。＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１（対応のないスチューデントのｔ検定、多重比較のための補正を伴う）。
【０２４３】
２４時間の時点で、ＭＫ０６２  ＴＭＸ製剤は、可溶性ＳＩＩＮＦＥＫＬ抗原および別個のリポソームのアジュバントと比較して、抗原提示を中程度に増加させた。その後の時点で（４８時間から９６時間）、ＭＫ０６２  ＴＭＸで処置したＢＭＤＣの場合、抗原提示は高いままであったが、それに対して、可溶性ペプチドおよびアジュバントで処置したＢＭＤＣの場合、提示は著しく減少した。
【０２４４】
２４時間後、ＴＬＲ７アゴニストＴＭＸを含有するＭＫ０６２  ＴＭＸで処置したＢＭＤＣについて、ＭＫ０６２抗原のみを含有するリポソームと比較して、より高度な抗原提示が観察された。さらに、還元性リンカーを有することは、ＭＫ０８４  ＴＭＸで処置したＢＭＤＣにおける抗原提示がより低いことにより証明された通り、ＣＤ１１ｃ＋ＢＭＤＣ上への抗原提示を改善した。
【０２４５】
（実施例４）
リポソームの抗原は、抗原特異的ＯＴ．１  Ｔ細胞との共培養において、プライミングの可能性があるＣＤ１１ｃ＋ＢＭＤＣを延長させる
実施例１および２に記載される化合物および手順を使用して、実験を実行した。
【０２４６】
Ｍ０６２を、一般的な手順に従って製剤１中に後挿入して、製剤ＭＫ０６２  ＴＭＸを形成した。製剤１を、比較のために後挿入なしで使用して、ＴＭＸ製剤を得た。
【表２】
2021523209.tif 000049
【０２４７】
骨髄由来の樹状細胞（ＢＭＤＣ）を、抗原でパルスする前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させた。骨髄細胞を、Ｊａｎｖｉｅｒ  ＳＡＳから得られたＣ５７ｂｌ／６ＪｒＪマウスからの脛骨および大腿骨から単離した。マウスを頸部脱臼によって屠殺した後、骨を単離し、組織保存溶液（ＭＡＣＳ  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）中で維持した。骨を、７０％エタノール中で２分滅菌した後、２９ｇのインスリンシリンジを使用することによって培地で洗浄したメスの先端でその両端で切り開いた。単離後、骨髄細胞を、２０ｎｇ／ｍｌのマウス組換えＧＭ−ＣＳＦを補充した完全ＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。３日目に、細胞に、ＧＭ−ＣＳＦを含有する新鮮な培地を補充した。その後、６日目に、未成熟ＢＭＤＣを、両方ともアジュバント非含有の０．１μＭのＭＫ０６２または０．１μＭの可溶性ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドと共にインキュベートした。パルスされていないＢＭＤＣを対照として使用した。７２時間後、ＢＭＤＣを回収し、共培養のために再懸濁した。
【０２４８】
６週齢のＴＣＲトランスジェニック「ＯＴ．１」マウス（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）１００Ｍｊｂ／Ｊ）を、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから得た。脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞の単離のために、頸部脱臼の後、ＯＴ．１ＴＣＲトランスジェニックマウスから脾臓を回収し、小さい断片に切り刻み、３〜５ｍＬの冷ＰＢＳ中に機械的に分散させた。細胞を、７０μｍのセルストレーナーで濾過した後、遠心分離し、溶解緩衝液に再懸濁して、赤血球を除去した。冷ＰＢＳ中で洗浄した後、脾細胞を計数し、０．５％ＢＳＡおよび０．１％ＮａＮ３を含有する滅菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ＦＡＣＳ緩衝液）に再懸濁した。ＣＤ８＋Ｔリンパ球を、マイクロビーズ単離キット、それに続いて磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）を、製造元の説明書（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に従って使用して精製した。単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞を洗浄し、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ細胞増殖キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、温かいＰＢＳ中の２．５μＭの色素と共に、細胞５×１０６個／ｍＬの密度で、細胞を、３７Ｃで２０分インキュベートすることによって染色し、それに続き、５倍の染色体積の完全培地で洗浄した。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ色素は、シグナルが各細胞分裂につき半分になって娘細胞間に均一に分散されるので、細胞生成の推測のために使用することができる。
【０２４９】
共培養のために、１％ＩＴＳ（インスリン−トランスフェリン−セレン）溶液を含む完全１６４０ＲＭＰＩ培地中の６ウェルの平底組織培養プレート中で、１×１０６個のＢＭＤＣを、３×１０６個のＣＤ８＋Ｔ細胞と共に平板培養した。４日の共培養後、フローサイトメトリー分析のために試料を回収した。細胞を、０．５％ＢＳＡおよび０．１％ＮａＮ３を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ＦＡＣＳ緩衝液）で洗浄し、Ｆｃブロックに再懸濁した。氷上で５分間ブロックした後、細胞を蛍光抗体で染色して、生きたＣＤ１１ｃ−、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋およびＣｅｌｌ  ｔｒａｃｅ＋陽性細胞を可視化した。分析をＦｌｏｗＪｏ  Ｖ．１０で行い、データをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン７．３にプロットした。ｎｓ：Ｐ＞０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１（一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続いてテューキーの事後検定）。増殖は、ヒストグラム（代表的なプロットは以下に示される）によって可視化される。増大指数をＦｌｏｗＪｏ  Ｖ．１０ソフトウェアを使用して計算した。
【０２５０】
図２で示されるように、７２時間の抗原パルス後に添加した場合、抗原特異的ＯＴ．１  Ｔ細胞は、ＭＫ０６２  ＴＭＸで処置したＢＭＤＣとの共培養で増殖し、それより低い程度であるが、別個の成分として可溶性ＳＩＩＮＦＥＫＬ抗原およびアジュバントで処置したＢＭＤＣとの共培養でも増殖した。抗原の非存在下で（ＴＭＸアジュバントのみ）、ＢＭＤＣは、ＯＴ．１  Ｔ細胞増殖を刺激しなかった。
【０２５１】
（実施例５）
ＴＬＲ７アゴニストと共に製剤化されたＣＤ４＋エピトープのリポソームの抗原送達は、ＢＭＤＣとの共培養アッセイにおける抗原特異的ＯＴ．２  Ｔ細胞の活性化および増殖を誘導することができる
実施例１および２に記載される化合物および手順を使用して、実験を実行した。
【０２５２】
Ａ００１を、一般的な手順に従って製剤１中に後挿入して、ＡＣ００１：ＴＭＸ製剤を形成した。製剤１を、比較のために後挿入なしで使用して、ＴＭＸ製剤を得た。
【表３】
2021523209.tif 000050
【０２５３】
骨髄由来の樹状細胞（ＢＭＤＣ）を、抗原でパルスする前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させた。骨髄細胞を、Ｊａｎｖｉｅｒ  ＳＡＳから得られたＣ５７ｂｌ／６ＪｒＪマウスからの脛骨および大腿骨から単離した。マウスを頸部脱臼によって屠殺した後、骨を単離し、組織保存溶液（ＭＡＣＳ  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）中で維持した。骨を、７０％エタノール中で２分滅菌した後、２９ｇのインスリンシリンジを使用することによって培地で洗浄したメスの先端でその両端で切り開いた。単離後、骨髄細胞を、２０ｎｇ／ｍｌのマウス組換えＧＭ−ＣＳＦを補充した完全ＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。３日目に、細胞に、ＧＭ−ＣＳＦを含有する新鮮な培地を補充した。６日目に、未成熟ＢＭＤＣを、リポソームの抗原と共にインキュベートした。
【０２５４】
６週齢のＴＣＲトランスジェニック「ＯＴ．２」マウス（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）４２５Ｃｂｎ／Ｃｒｌ）を、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから得た。脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞の単離のために、頸部脱臼の後、ＯＴ．２ＴＣＲトランスジェニックマウスから脾臓を回収した、小さい断片に切り刻み、３〜５ｍｌの冷ＰＢＳ中に機械的に分散させた。細胞を、７０μｍのセルストレーナーで濾過した後、遠心分離し、溶解緩衝液に再懸濁して、赤血球を除去した。冷ＰＢＳ中で洗浄した後、脾細胞を計数し、０．５％ＢＳＡおよび０．１％ＮａＮ３を含有する滅菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ＦＡＣＳ緩衝液）に再懸濁した。ＣＤ４＋Ｔリンパ球を、マイクロビーズ単離キット、それに続いて磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）を、製造元の説明書（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に従って使用して精製した。単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞を洗浄し、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ細胞増殖キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、温かいＰＢＳ中の２．５μＭの色素と共に、細胞５×１０６個／ｍｌの密度で、細胞を、３７Ｃで２０分インキュベートすることによって染色し、それに続き、５倍の染色体積の完全培地で洗浄した。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ色素は、シグナルが各細胞分裂につき半分になって娘細胞間に均一に分散されるので、細胞生成の推測のために使用することができる。
【０２５５】
共培養のために、１％ＩＴＳ（インスリン−トランスフェリン−セレン）溶液を含む完全１６４０ＲＭＰＩ培地中の６ウェルの平底組織培養プレート中で、１×１０６個のＢＭＤＣを、２×１０６個のＣＤ４＋Ｔ細胞と共に平板培養した。ＣＤ４＋Ｔ細胞活性化を、共培養の２４時間後に、早期活性化マーカーＣＤ６９の発現を定量することによって評価し、増殖を、共培養の９６時間後に、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔシグナルを評価することによって評価した。フローサイトメトリー分析のために、細胞を、０．５％ＢＳＡおよび０．１％ＮａＮ３を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ＦＡＣＳ緩衝液）で洗浄し、Ｆｃブロックに再懸濁した。氷上で５分間ブロックした後、細胞を蛍光抗体で染色して、生きたＣＤ１１ｃ−、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋およびＣｅｌｌ  ｔｒａｃｅ＋陽性細胞を可視化した。分析をＦｌｏｗＪｏ  Ｖ．１０で行い、データをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン７．３にプロットした。増殖は、ＦｌｏｗＪｏ  Ｖ．１０ソフトウェアを使用して計算された増大指数として例示される。＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１（一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続いてテューキーの事後検定）。
【０２５６】
図３で示されるように、２４時間後、ＡＣ０１：ＴＭＸで処置したＢＭＤＣと共培養したＣＤ４＋Ｔ細胞は、パルスされていないＢＭＤＣと共に培養されたＣＤ４＋Ｔ細胞より高いＣＤ６９発現を有していた。加えて、９６時間後、ＡＣ００１：ＴＭＸでパルスされたＢＭＤＣと共に培養されたＣＤ４＋Ｔ細胞は、対照より高い程度に増殖した。
【０２５７】
（実施例６）
リポソームの抗原およびＴＬＲ７アゴニストと共に製剤化された静脈内ワクチン接種は、抗原の交差提示をブーストし、脾臓において樹状細胞による活性化マーカーの発現を強化する。
実施例１および２に記載される化合物および手順を使用して、実験を実行した。
【０２５８】
Ｍ０６２を、一般的な手順に従って製剤１中に後挿入して、製剤ＭＫ０６２  ＴＭＸを形成した。製剤１を、比較のために後挿入なしで使用して、ＴＭＸ製剤を得た。
【表４】
2021523209.tif 000051
【０２５９】
Ｃ５７ｂｌ／６雌を、可溶性ペプチド［１０ｕｇ］、リポソームのアジュバント  ＴＭＸ、またはＭＫ０６２  ＴＭＸ製剤のいずれかの単回の静脈内（ｉ．ｖ．）、尾静脈投与で免疫化した。
【０２６０】
ワクチン用量を受けた２４および４８時間後、マウスを屠殺し、フローサイトメトリー分析のために脾臓を回収した。臓器を７０ｕＭのセルストレーナーを通過させることによる機械的な破壊によって、単一細胞の懸濁物をマウス臓器から得た。細胞１０００万個／試料を、０．５％ＢＳＡおよび０．１％ＮａＮ３を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ＦＡＣＳ緩衝液）で洗浄し、Ｆｃブロックに再懸濁した。氷上で５分間ブロックした後、細胞を、蛍光色素コンジュゲート抗体と共に４℃で３０分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、ＰＢＳに懸濁し、フローサイトメトリー分析（ＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ）に供した。脾臓樹状細胞のサブセットｃＤＣ１を、ＣＤ４５＋、ＣＤ６４−、ＣＤ２６＋、ＭＨＣ  ＩＩｈｉ、ＣＤ１１ｃｈｉ、ＸＣＲ１＋、ＣＤ１７２ａ−としてゲーティングし、抗原提示を、ＭＨＣ  Ｉ（Ｈ−２ｋｂ）分子上に提示されたＳＩＩＮＦＥＫＬを認識する抗体で評価した。分析をＦｌｏｗＪｏ  Ｖ．１０で行い、データをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン７．３にプロットした。ｎｓ：Ｐ＞０．０５、＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１（一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続いてテューキーの事後検定）。
【０２６１】
図４で示されるように、ＭＫ０６２  ＴＭＸリポソームでのワクチン接種は、別個の処置としての可溶性ペプチドまたはリポソームのアジュバントと比較して、抗原を提示する脾臓ｃＤＣ１細胞のパーセンテージを増加させた。樹状細胞の活性化はまた、ＴＭＸおよびＭＫ０６２  ＴＭＸで処置した群の両方において、表面マーカーＣＤ８６のレベルの増加としても検出された。
【０２６２】
（実施例７）
リポソームの抗原およびＴＬＲ７アゴニストと共に製剤化された静脈内ワクチン接種は養子移入された抗原特異的ナイーブＯＴ．１  Ｔ細胞の増大およびプライミングをもたらす
実施例１および２に記載される化合物および手順を使用して、実験を実行した。
【０２６３】
Ｍ０６２を、一般的な手順に従って製剤１中に後挿入して、製剤ＭＫ０６２  ＴＭＸを形成した。
【表５】
2021523209.tif 000052
【０２６４】
マウス胸腺腫細胞株Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡを、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ＣＲＬ−２１１３）から得て、０．４ｍｇ／ｍｌのゲネチシン選択的抗生物質（Ｇ４１８）が補充された完全ＲＰＭＩ１６４０培地中で維持した。Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ腫瘍モデルの場合、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、０日目に３×１０５個のＥ．Ｇ７−ＯＶＡ生存細胞のｓ．ｃ．注射を受けた。処置開始前の７日間にわたり腫瘍を確立させた。
【０２６５】
６週齢のＴＣＲトランスジェニック「ＯＴ．１」マウス（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）１００Ｍｊｂ／Ｊ）を、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから得た。脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞の単離のために、頸部脱臼の後、ＯＴ．１ＴＣＲトランスジェニックマウスから脾臓を回収し、小さい断片に切り刻み、３〜５ｍｌの冷ＰＢＳ中に機械的に分散させた。細胞を、７０μｍのセルストレーナーで濾過した後、遠心分離し、溶解緩衝液に再懸濁して、赤血球を除去した。
【０２６６】
残存する脾細胞を洗浄し、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ細胞増殖キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、温かいＰＢＳ中の２．５μＭの色素と共に、細胞５×１０６個／ｍｌの密度で、細胞を、３７Ｃで２０分インキュベートすることによって染色し、それに続き、５倍の染色体積の完全培地で洗浄した。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ色素は、シグナルが各細胞分裂につき半分になって娘細胞間に均一に分散されるので、細胞生成の推測のために使用することができる。
【０２６７】
確立されたＥ．Ｇ７−ＯＶＡ腫瘍を有するマウスは、約０．５×１０６個のナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞に相当する５×１０６個の脾細胞の総用量を受けた。養子細胞移入の１日後、ＭＫ０６２  ＴＭＸリポソーム［０．５ｕｇ］でのワクチン接種を、尾静脈へのｉ．ｖ．注射によって行った。
【０２６８】
ワクチン用量を受けた後の様々な時点で、マウスを屠殺し、フローサイトメトリー分析ならびにＴ細胞の増殖および／または浸潤の評価のために臓器を回収した。単一細胞の懸濁物を、機械的な破壊（脾臓）または酵素による消化（腫瘍）によって、マウス臓器から得た。細胞１０００万個／試料を、０．５％ＢＳＡおよび０．１％ＮａＮ３を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ＦＡＣＳ緩衝液）で洗浄し、Ｆｃブロックに再懸濁した。氷上で５分間ブロックした後、細胞を、蛍光色素コンジュゲート抗体と共に、４℃で３０分インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、ＰＢＳに懸濁し、フローサイトメトリー分析（ＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ）に供した。脾臓および腫瘍中の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージおよび増殖を、ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的なＴ細胞を認識する蛍光標識したＭＨＣ多量体（ＩｍｍｕＤｅｘ）をＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ染料と組み合わせて使用して評価した。分析をＦｌｏｗＪｏ  Ｖ．１０で行い、データをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン７．３にプロットした。ｎｓ：Ｐ＞０．０５、＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１（対応のないスチューデントのｔ検定、多重比較のための補正を伴う）。
【０２６９】
図５で示されるように、ＭＫ０６２  ＴＭＸでのワクチン接種は、ＯＴ．１  Ｔ細胞単独での処置と比較して、脾臓におけるＯＴ．１  Ｔ細胞増大の増加、続いてＯＴ．１  Ｔ細胞の腫瘍浸潤の増加をもたらした。
【０２７０】
（実施例８）
リポソーム製剤およびリンカーの特徴は、同系Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ腫瘍モデルにおいて、養子移入されたナイーブＯＴ．１  Ｔ細胞と組み合わされた静脈内ワクチン接種の有効性に影響を与える
実施例１および２に記載される化合物および手順を使用して、実験を実行した。
【０２７１】
Ｍ０６２を、一般的な手順に従って製剤１中に後挿入して、製剤ＭＫ０６２  ＴＭＸを形成した。Ｍ０６２を、一般的な手順に従って製剤２中に後挿入して、製剤ＭＫ０６２を形成した。Ｍ０８４を、一般的な手順に従って製剤１中に後挿入して、製剤ＭＫ０８４  ＴＭＸを形成した。
【表６】
2021523209.tif 000053
【０２７２】
マウス胸腺腫細胞株Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡを、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ＣＲＬ−２１１３）から得て、０．４ｍｇ／ｍｌのゲネチシン選択的抗生物質（Ｇ４１８）が補充された完全ＲＰＭＩ１６４０培地中で維持した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、０日目に３×１０５個のＥ．Ｇ７−ＯＶＡ生存細胞のｓ．ｃ．注射を受けた。処置開始前の７日間にわたり腫瘍を確立させた。
【０２７３】
６週齢のＴＣＲトランスジェニック「ＯＴ．１」マウス（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）１００Ｍｊｂ／Ｊ）を、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから得た。処置のために、頸部脱臼の後、ＯＴ．１ＴＣＲトランスジェニックマウスから脾臓を回収し、小さい断片に切り刻み、３〜５ｍｌの冷ＰＢＳ中に機械的に分散させた。細胞を、７０μｍのセルストレーナーで濾過した後、遠心分離し、溶解緩衝液に再懸濁して、赤血球を除去した。確立されたＥ．Ｇ７−ＯＶＡまたはＢ１６−ＯＶＡ腫瘍を有するマウスは、約０．５×１０６個のナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞に相当する５×１０６個の脾細胞の総用量を受けた。養子細胞移入の１日後、ＭＫ０６２  ＴＭＸまたはＭＫ０８４：ＴＭＸリポソーム［０．５ｕｇ抗原］でのワクチン接種を、尾静脈へのｉ．ｖ．注射によって行った。
【０２７４】
図６で示されるように、ナイーブＯＴ．１  Ｔ細胞での処置後のＭＫ０６２：ＴＭＸでのワクチン接種は、ＭＫ０８４：ＴＭＸリポソームまたはステルス：ＴＭＸリポソームでの処置と比較して、腫瘍制御の改善と生存の延長をもたらした。ＯＴ．１  Ｔ細胞処置なしでのＭＫ０６２：ＴＭＸリポソームでのワクチン接種は、腫瘍増殖または生存に影響を与えなかった。
【０２７５】
（実施例９）
リポソームの抗原およびＴＬＲ７アゴニストと共に製剤化されたワクチン接種が、別個の成分としての可溶性抗原およびＴＬＲ７アゴニストでのワクチン接種と比較して、確立されたＥＧ７−ＯＶＡおよびＢ１６−ＯＶＡ腫瘍の改善された制御および生存の延長をもたらす。
実施例１および２に記載される化合物および手順を使用して、実験を実行した。
【０２７６】
Ｍ０６２およびＭ０９８を、一般的な手順に従って製剤１中に後挿入して、ＭＫ０６２  ＴＭＸ製剤およびＭＫ０９８  ＴＭＸ製剤をそれぞれ形成した。
【表７】
2021523209.tif 000054
【０２７７】
マウス胸腺腫細胞株Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡを、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ＣＲＬ−２１１３）から得て、マウス黒色腫細胞株Ｂ１６−ＯＶＡは、Ｍａｒｉａｎｎｅ  Ｈｏｋｌａｎｄから贈られたものであった。両方の細胞株を０．４ｍｇ／ｍｌのゲネチシン選択的抗生物質（Ｇ４１８）が補充された完全ＲＰＭＩ１６４０培地中で維持した。両方の腫瘍モデルで、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、０日目に３×１０５個の生存細胞のｓ．ｃ．注射を受けた。処置開始前の、Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡの場合は７日間にわたり、Ｂ１６−ＯＶＡの場合は１０日間にわたり、腫瘍を確立させた。
【０２７８】
６週齢のＴＣＲトランスジェニック「ＯＴ．１」マウス（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）１００Ｍｊｂ／Ｊ）を、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから得た。処置のために、頸部脱臼の後、ＯＴ．１ＴＣＲトランスジェニックマウスから脾臓を回収し、小さい断片に切り刻み、３〜５ｍｌの冷ＰＢＳ中に機械的に分散させた。細胞を、７０μｍのセルストレーナーで濾過した後、遠心分離し、溶解緩衝液に再懸濁して、赤血球を除去した。確立されたＥ．Ｇ７−ＯＶＡまたはＢ１６−ＯＶＡ腫瘍を有するマウスは、約０．５×１０６個のナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞に相当する５×１０６個の脾細胞の総用量を受けた。養子細胞移入の１日後、ＭＫ０６２  ＴＭＸリポソーム［０．５ｕｇ抗原］でのワクチン接種を、尾静脈へのｉ．ｖ．注射によって行った。
【０２７９】
図７で示されるように、ナイーブＯＴ．１  Ｔ細胞での処置後のＭＫ０６２：ＴＭＸでのワクチン接種は、Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡおよびＢ１６−ＯＶＡの両方において、別個の成分としての可溶性（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）抗原およびＴＲＬ７リポソームでのワクチン接種と比較して腫瘍制御の改善と生存の延長をもたらした。
【０２８０】
（実施例１０）
２つの別個のリポソーム製剤での静脈内への多価ワクチン接種は、確立されたＢ１６−ＯＶＡ腫瘍の改善された制御をもたらし、処置されたマウスの生存を延長させる
実施例１および２に記載される化合物および手順を使用して、実験を実行した。
【０２８１】
Ｍ０６２およびＭ０９８を、一般的な手順に従って製剤１中に後挿入して、ＭＫ０６２  ＴＭＸ製剤およびＭＫ０９８  ＴＭＸ製剤をそれぞれ形成した。
【表８】
2021523209.tif 000055
【０２８２】
マウス黒色腫細胞株Ｂ１６−ＯＶＡは、Ｍａｒｉａｎｎｅ  Ｈｏｋｌａｎｄから贈られたものであり、これを、０．４ｍｇ／ｍｌのゲネチシン選択的抗生物質（Ｇ４１８）が補充された完全ＲＰＭＩ１６４０培地中で維持した。Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍モデルの場合、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、０日目に３×１０５個の生存細胞のｓ．ｃ．注射を受けた。処置開始前の１０日間にわたり腫瘍を確立させた。
【０２８３】
６週齢のＴＣＲトランスジェニック「ＯＴ．１」マウス（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）１００Ｍｊｂ／Ｊ）を、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから得て、６週齢のＴＣＲトランスジェニック「ＰＭＥＬ」（Ｂ６．Ｃｇ−Ｔｈｙ１ａ／Ｃｙ  Ｔｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）８Ｒｅｓｔ／Ｊ）マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得た。頸部脱臼の後、ＯＴ．１またはｐｍｅｌ  ＴＣＲトランスジェニックマウスから脾臓を回収し、小さい断片に切り刻み、３〜５ｍｌの冷ＰＢＳ中に機械的に分散させた。細胞を、７０μｍのセルストレーナーを通して濾過した後、遠心分離し、溶解緩衝液に再懸濁して、赤血球を除去した。
【０２８４】
確立されたＢ１６−ＯＶＡ腫瘍を有するマウスは、ＯＴ．１および／またはＰＭＥＬマウスからの５×１０６個の脾細胞の総用量（約０．５×１０６個のナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞に相当する）を受けた。養子細胞移入の１日後、ＭＫ０６２  ＴＭＸリポソーム［０．５ｕｇ］および／またはＭＫ０９８  ＴＭＸリポソーム［１０ｕｇ］でのワクチン接種を、尾静脈へのｉ．ｖ．注射によって行った。
【０２８５】
処置のために、頸部脱臼の後、ＯＴ．１およびＰＭＥＬ  ＴＣＲトランスジェニックマウスから脾臓を回収し、小さい断片に切り刻み、３〜５ｍｌの冷ＰＢＳ中に機械的に分散させた。細胞を、７０μｍのセルストレーナーで濾過した後、遠心分離し、溶解緩衝液に再懸濁して、赤血球を除去した。確立されたＢ１６−ＯＶＡ腫瘍を有するマウスは、約０．５×１０６個のナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞に相当する５×１０６個の脾細胞の総用量を受けた。養子細胞移入の１日後、マウスに、尾静脈へのｉ．ｖ．注射によって実行されるＭＫ０６２  ＴＭＸ［０．５ｕｇ抗原］および／またはＭＫ０９８：ＴＭＸ［０．５ｕｇ抗原］リポソームでのワクチン接種を行った。
【０２８６】
図８で示されるように、ＯＴ．１およびＰＭＥＬ  Ｔ細胞の養子移入と組み合わされた多価ワクチン接種（ＭＫ０６２：ＴＭＸおよびＭＫ０９８：ＴＭＸリポソームの両方での）は、それぞれＯＴ．１またはＰＭＥＬ  Ｔ細胞と組み合わされた一価ワクチンで処置したマウスと比較して、確立されたＢ１６−ＯＶＡ腫瘍の改善された制御および生存の延長をもたらした。
【０２８７】
（実施例１１）
多価ワクチン接種は、養子移入された抗原特異的ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞の２つの集団の同時のプライミングおよび増大を誘導する
実施例１および２に記載される化合物および手順を使用して、実験を実行した。
【０２８８】
Ｍ０６２およびＭ０９８を、一般的な手順に従って製剤１中に後挿入して、それぞれＭＫ０６２  ＴＭＸ製剤およびＭＫ０９８  ＴＭＸ製剤を形成した。
【表９】
2021523209.tif 000056
【０２８９】
マウス黒色腫細胞株Ｂ１６−ＯＶＡは、Ｍａｒｉａｎｎｅ  Ｈｏｋｌａｎｄから贈られたものであり、これを、０．４ｍｇ／ｍｌのゲネチシン選択的抗生物質（Ｇ４１８）が補充された完全ＲＰＭＩ１６４０培地中で維持した。Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍モデルの場合、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、０日目に３×１０５個のＢ１６−ＯＶＡ生存細胞のｓ．ｃ．注射を受けた。処置開始前の１１日間にわたり腫瘍を確立させた。
【０２９０】
６週齢のＴＣＲトランスジェニック「ＯＴ．１」マウス（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）１００Ｍｊｂ／Ｊ）を、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから得て、６週齢のＴＣＲトランスジェニック「ＰＭＥＬ」（Ｂ６．Ｃｇ−Ｔｈｙ１ａ／Ｃｙ  Ｔｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）８Ｒｅｓｔ／Ｊ）マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得た。頸部脱臼の後、ＯＴ．１ＴＣＲまたはｐｍｅｌ  ＴＣＲトランスジェニックマウスから脾臓を回収し、小さい断片に切り刻み、３〜５ｍｌの冷ＰＢＳ中に機械的に分散させた。細胞を、７０μｍのセルストレーナーを通して濾過した後、遠心分離し、溶解緩衝液に再懸濁して、赤血球を除去した。
【０２９１】
確立されたＢ１６−ＯＶＡ腫瘍を有するマウスは、ＯＴ．１および／またはＰＭＥＬマウスからの５×１０６個の脾細胞の総用量（約０．５×１０６個のナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞に相当する）を受けた。養子細胞移入の１日後、ＭＫ０６２  ＴＭＸリポソーム［０．５ｕｇ］および／またはＭＫ０９８  ＴＭＸリポソーム［１０ｕｇ］でのワクチン接種を、尾静脈へのｉ．ｖ．注射によって行った。
【０２９２】
ワクチン接種の５日後、マウスを屠殺し、フローサイトメトリー分析ならびにＯＴ．１およびＰＭＥＬ腫瘍浸潤の評価のために腫瘍を回収した。単一細胞の懸濁物を、酵素による消化によって、腫瘍から得た。細胞１０００万個／試料を、０．５％ＢＳＡおよび０．１％ＮａＮ３を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ＦＡＣＳ緩衝液）で洗浄し、Ｆｃブロックに再懸濁した。氷上で５分間ブロックした後、細胞を、蛍光色素コンジュゲート抗体と共に、４℃で３０分インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、ＰＢＳに懸濁し、フローサイトメトリー分析（ＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ２０）に供した。ＯＴ．１  Ｔ細胞の浸潤を、ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的なＴ細胞を認識する蛍光標識したＭＨＣ多量体（ＩｍｍｕＤｅｘ）を使用して評価し、ＰＭＥＬ  Ｔ細胞の浸潤を、ＰＭＥＬ  Ｔ細胞によって選択的に発現されるＣＤ９０／Ｔｈｙ１を認識する抗体を使用して評価した。
【０２９３】
図９で示されるように、ＭＫ０９８：ＴＭＸでのワクチン接種は、ＰＭＥＬ処置単独と比較して、ＰＭＥＬ  Ｔ細胞の腫瘍浸潤の増加をもたらした。同様に、ＯＴ．１  Ｔ細胞の高いパーセンテージが、ＭＫ０６２：ＴＭＸでワクチン接種したマウスで観察された。ＭＫ０６２：ＴＭＸおよびＭＫ０９８：ＴＭＸリポソームでの多価ワクチン接種は、ワクチン接種されていないマウスと比較して、腫瘍においてＯＴ．１およびＰＭＥＬ  Ｔ細胞の両方の同時の増加をもたらした。
【０２９４】
（実施例１２）
還元性リンカーを有するリポソームのペグ化リポペプチドが２４時間で抗原提示を増加させた
Ｍ１４４を、ＰＢＳ中に溶解させた。実施例１および２に記載される化合物および手順を使用して、実験を実行した。
【０２９５】
Ｍ０６２を、一般的な手順に従って製剤１中に後挿入して、製剤ＭＫ０６２  ＴＭＸを形成した。Ｍ０１１０を、一般的な手順に従って製剤１中に後挿入して、製剤ＭＫ１１０  ＴＭＸを形成した。Ｍ１４２を、一般的な手順に従って製剤１中に後挿入して、製剤ＭＫ１４２  ＴＭＸを形成した。Ｍ１４３を、一般的な手順に従って製剤１中に後挿入して、製剤ＭＫ１４３  ＴＭＸを形成した。
【表１０】
2021523209.tif 000057
【０２９６】
骨髄由来の樹状細胞（ＢＭＤＣ）を、抗原でパルスする前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させた。骨髄細胞を、Ｊａｎｖｉｅｒ  ＳＡＳから得られたＣ５７ｂｌ／６ＪｒＪマウスからの脛骨および大腿骨から単離した。マウスを頸部脱臼によって屠殺した後、骨を単離し、組織保存溶液（ＭＡＣＳ  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）中で維持した。骨を、７０％エタノール中で２分滅菌した後、２９ｇのインスリンシリンジを使用することによって培地で洗浄したメスの先端でその両端を切断した。単離後、骨髄細胞を、２０ｎｇ／ｍｌのマウス組換えＧＭ−ＣＳＦを補充した完全ＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。３日目に、細胞に、ＧＭ−ＣＳＦを含有する新鮮な培地を補充した。６日目に、未成熟ＢＭＤＣを回収し、再度平板培養し、１μＭのリポソームまたは可溶性ＳＩＩＮＦＥＫＬ抗原と共にインキュベートした。
【０２９７】
抗原でのパルスの２４時間後、フローサイトメトリー分析による抗原提示の定量化のために、ＢＭＤＣを回収した。細胞２００万個／試料を、０．５％ＢＳＡおよび０．１％ＮａＮ３を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ＦＡＣＳ緩衝液）で洗浄し、Ｆｃブロックに再懸濁して、非特異的な抗体結合を回避した。氷上で５分間ブロックした後、細胞を樹状細胞マーカーＣＤ１１ｃに対する抗体で染色し、ＭＨＣ  Ｉ分子上に提示されたＳＩＩＮＦＥＫＬを認識する抗体（Ｈ−２ｋｂ）によって抗原提示に関して評価した。染色を、４℃で３０分行った。その後、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に懸濁し、フローサイトメトリー分析（ＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ２０）に供した。分析をＦｌｏｗＪｏ  Ｖ．１０で行い、データをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン７．３にプロットした。
【０２９８】
図１０で示されるように、抗原でのパルスの２４時間後、ＭＫ１４４、ＭＫ０６２：ＴＭＸおよびＭＫ１１０でパルスされたＢＭＤＣによる抗原提示は、ＳＩＩＮＦＥＫＬ＋ステルス：ＴＭＸでパルスされたＢＭＤＣで観察されたレベルと同等であった。しかしながら、抗原提示は、他の製剤およびＳＩＩＮＦＥＫＬ＋ステルス：ＴＭＸと比較して、ＭＫ１４２：ＴＭＸによって有意に改善され、ＭＫ１４３：ＴＭＸによってより一層高い程度に改善された。
【０２９９】
（実施例１３）
ワクチンリポソームを有するＯＴ．１脾細胞が、同系Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ腫瘍モデルにおいて確立されたマウスの腫瘍の制御を効率的に媒介する
実施例１および２に記載される化合物および手順を使用して、実験を実行した。
【表１１】
2021523209.tif 000058
【０３００】
マウス胸腺腫細胞株Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡを、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ＣＲＬ−２１１３）から得て、０．４ｍｇ／ｍｌのゲネチシン選択的抗生物質（Ｇ４１８）が補充された完全ＲＰＭＩ１６４０培地中で維持した。Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ腫瘍モデルの場合、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、０日目に３×１０５個のＥ．Ｇ７−ＯＶＡ生存細胞のｓ．ｃ．注射を受けた。処置開始前の７日間にわたり腫瘍を確立させた。
【０３０１】
６週齢のＴＣＲトランスジェニック「ＯＴ．１」マウス（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）１００Ｍｊｂ／Ｊ）を、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから得た。脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞の単離のために、頸部脱臼の後、ＯＴ．１ＴＣＲトランスジェニックマウスから脾臓を回収し、小さい断片に切り刻み、３〜５ｍｌの冷ＰＢＳ中に機械的に分散させた。細胞を、７０μｍのセルストレーナーで濾過した後、遠心分離し、溶解緩衝液に再懸濁して、赤血球を除去した。
【０３０２】
αＣＤ４５−ワクチンリポソームでのローディングのために、脾細胞を、無血清ＲＰＭＩ１６４０培地中に、細胞１０７個／ｍｌで再懸濁した。２μＭのａＣＤ４５濃度に相当するリポソーム製剤を、細胞懸濁物に添加し、ＣＯ２インキュベーター中で、摂氏３７度でローディングを行った。ローディングされていない脾細胞を、同じインキュベーションプロトコールに従って、ただし培養培地へのリポソームの添加を行わずに、対照として調製した。インキュベーション後、細胞を計数し、洗浄し、注射のために細胞５×１０７個／ｍｌの濃度でＨＢＳＳに再懸濁した。
【０３０３】
確立されたＥ．Ｇ７−ＯＶＡ腫瘍を有するマウスは、尾静脈へのｉｖ．注射として与えられた５×１０６個の脾細胞の総用量を受けた。
【０３０４】
図１１で示されるように、ナイーブＯＴ．１  Ｔ細胞を含むａＣＤ４５：ＭＫ０６２：ＴＭＸでの処置は、ローディングなしのナイーブＯＴ．１  Ｔ細胞での処置と比較して、腫瘍制御の改善と生存の延長をもたらした。
【０３０５】
（実施例１４）
ＣＤ８＋Ｔ細胞を有するワクチンを用いたＴ細胞療法は、改善された腫瘍制御のためのｉｎ  ｓｉｔｕワクチン接種および内因性Ｔ細胞応答のプライミングの効力を増す
実験は、実施例１および２に記載される化合物および手順を使用して実行することができる。
【０３０６】
マウス黒色腫細胞株Ｂ１６−ＯＶＡは、Ｍａｒｉａｎｎｅ  Ｈｏｋｌａｎｄから贈られたものであり、これを、０．４ｍｇ／ｍｌのゲネチシン選択的抗生物質（Ｇ４１８）が補充された完全ＲＰＭＩ１６４０培地中で維持した。Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍モデルの場合、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、０日目に３×１０５個のＢ１６−ＯＶＡ生存細胞のｓ．ｃ．注射を受けた。処置開始前の９日間にわたり腫瘍を確立させた。
【０３０７】
６週齢のＴＣＲトランスジェニック「ＰＭＥＬ」（Ｂ６．Ｃｇ−Ｔｈｙ１ａ／Ｃｙ  Ｔｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）８Ｒｅｓｔ／Ｊ）マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得た。頸部脱臼の後、ＯＴ．１またはｐｍｅｌ  ＴＣＲトランスジェニックマウスから脾臓を回収し、小さい断片に切り刻み、３〜５ｍｌの冷ＰＢＳ中に機械的に分散させた。細胞を、７０μｍのセルストレーナーを通して濾過した後、遠心分離し、溶解緩衝液に再懸濁して、赤血球を除去した。
【０３０８】
ＣＤ８＋Ｔリンパ球を、マイクロビーズ単離キット、それに続いて磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）を、製造元の説明書（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に従って使用して精製した。培養の１日前に、６ウェルプレートを、抗ＣＤ３（クローン２Ｃ１１）および抗ＣＤ２８（クローン３７．５１）抗体（ＢｉｏＸｃｅｌｌ）で、滅菌ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌの濃度で、４Ｃでコーティングした。
【０３０９】
単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞を、ａＣＤ３／ａＣＤ２８でコーティングされた６ウェルプレート中に、１％ＩＴＳ溶液を含む完全ＲＰＭＩ−１６４０培地中、細胞１×１０６個／ｍＬの濃度で平板培養した。翌日（１日目）、培地に組換えマウスＩＬ−２［２０ｎｇ／ｍｌ］およびＩＬ−７［５ｎｇ／ｍｌ］を補充した。２日目に、プレートから細胞を除去し、冷ＰＢＳ中で洗浄し、次いでＩＬ−２およびＩＬ−７を含有する新鮮な培地に再懸濁した。３日目に、細胞に、ＩＬ−２１［１０ｎｇ／ｍｌ］を含有する新鮮な培地を補充した。４日目に、細胞を回収した。αＣＤ４５−ワクチンリポソームでのローディングのために、脾細胞を、無血清ＲＰＭＩ１６４０培地中に、細胞１０７個／ｍｌで再懸濁した。２μＭのαＣＤ４５濃度に相当するリポソーム製剤を、細胞懸濁物に添加し、ＣＯ２インキュベーター中で、摂氏３７度で３０分間ローディングを行った。ローディングされていないＴ細胞を、同じインキュベーションプロトコールに従って、ただし培養培地へのリポソームの添加を行わずに、対照として調製した。インキュベーション後、細胞を計数し、洗浄し、注射のために細胞５×１０７個／ｍｌの濃度でＨＢＳＳに再懸濁した。レシピエントマウスに、５×１０６個のＣＤ８＋Ｔ細胞に相当する１００μｌの細胞懸濁物を尾静脈にｉ．ｖ．注射した。
【０３１０】
抗腫瘍有効性の評価のために、マウスを、腫瘍増殖および生存に関してモニターした。腫瘍を、カリパスを用いて２つの寸法で週３回測定した。腫瘍体積を、式：腫瘍サイズ＝０．５×長さ×幅２を使用して計算した。腫瘍が１０００ｍｍ３の体積に達したとき、動物施設の規則に従ってマウスを屠殺した。ワクチンリポソームがローディングされたＰＭＥＬ  Ｔ細胞での処置が、ローディングなしのＰＭＥＬ  Ｔ細胞での処置と比較して、改善した治療有効性をもたらすことが予測される。これは、免疫細胞が、αＣＤ４５含有製剤を使用してワクチンリポソームを効率的にローディングできることを示す先立つ研究（実施例１３）、およびＢ１６．Ｏｖａモデルにおいて複数の抗原の同時標的化が優れていることを実証している研究（実施例１０）に基づいている。
【０３１１】
ワクチン応答の評価のために、マウスを屠殺し、フローサイトメトリー分析のために、処置の１、４および８日後に臓器を回収した。単一細胞の懸濁物を、マウス臓器から、機械的な破壊（脾臓および腫瘍流入領域リンパ節）または酵素による消化（腫瘍）によって得た。細胞１０００万個／試料を、０．５％ＢＳＡおよび０．１％ＮａＮ３を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ＦＡＣＳ緩衝液）で洗浄し、Ｆｃブロックに再懸濁した。氷上で５分間ブロックした後、細胞を、蛍光色素コンジュゲート抗体と共に４℃で３０分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、ＰＢＳに懸濁し、フローサイトメトリー分析（ＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ）に供した。脾臓樹状細胞のサブセットｃＤＣ１を、ＣＤ４５＋、ＣＤ６４−、ＣＤ２６＋、ＭＨＣ  Ｉｉｈｉ、ＣＤ１１ｃｈｉ、ＸＣＲ１＋としてゲーティングし、ＭＨＣ  Ｉ分子上に提示されたＳＩＩＮＦＥＫＬを認識する抗体を用いて抗原提示を評価した。腫瘍中の抗原特異的な細胞のパーセンテージを、ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的なＴ細胞を認識する蛍光標識したＭＨＣ多量体（ＩｍｍｕＤｅｘ）を使用して評価した。ワクチンリポソームでローディングされたＰＭＥＬ  Ｔ細胞での処置は、リンパ系器官において抗原提示の増加および樹状細胞の機能的な成熟をもたらすと予想される。これは、樹状細胞によるリポソームの抗原の提示を詳述する先立つ研究に基づく（実施例６）。ワクチンリポソームでローディングされたＰＭＥＬ  Ｔ細胞での処置は、内因性および／または移入されたナイーブＯＴ．１  Ｔ細胞のプライミングおよび増大をもたらすと予想される（ＯＴ．１  Ｔ細胞も活性化され得る）。これは、ワクチンリポソームによるＴ細胞プライミングの動力学を詳述する先立つ研究に基づく（実施例７）。
【０３１２】
本開示の範囲および趣旨から逸脱しない、本開示の記載した方法および組成物の修飾形態および変形形態は、当業者には明らかである。特定の実施形態に関連して本開示を説明したが、特許請求された本開示をそのような特定の実施形態に不当に限定すべきでないことは理解すべきである。実際、本開示を実施するための記載した方法の様々な修飾形態が意図されており、そのような修飾形態が、後続の特許請求の範囲によって示される本開示の範囲内であることは、本開示が属する関連分野の当業者には理解される。
【０３１３】
参照による取り込み
本明細書で述べられた全ての特許および刊行物は、それぞれ独立した特許および公報が参照により組み入れられると具体的かつ個々に示された場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み入れられる。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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