(57)【要約】  ドメインＤ２及びＤ３を含むＧＦＲＡＬ細胞外ドメインが開示される。本開示は、本明細書に提供されるＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを使用して、ＧＤＦ１５ペプチド等のＧＦＲＡＬリガンドの活性をスクリーニング及び評価するための方法及び組成物に更に関する。本明細書に提供されるＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを使用して、肥満症を処置し、食欲を低減させ、且つ／又は体重を低減させるための方法及び組成物も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＤＦ１５ペプチドの活性を検出する方法であって、
（ｉ）
（ａ）細胞表面受容体キナーゼを発現する細胞を提供することと；
（ｂ）前記細胞を前記ＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬと接触させることであって、前記可溶性ＧＦＲＡＬは、ドメインＤ２及びＤ３を含むＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含む、接触させることと；
（ｃ）前記接触された細胞における生物学的応答を検出することと；又は
（ｉｉ）
（ａ）細胞表面受容体キナーゼ並びにドメインＤ２及びＤ３を含むＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを発現する細胞を提供することと；
（ｂ）前記細胞を前記ＧＤＦ１５ペプチドと接触させることと；
（ｃ）前記接触された細胞における生物学的応答を検出することと
を含む方法。
【請求項２】
前記ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、ドメインＤ１を欠く、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞表面受容体キナーゼ及びＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを発現する細胞を提供し、
（ｉ）前記ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、可溶性ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインであるか、又は
（ｉｉ）前記ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、テザーによって細胞表面に付着される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記テザーは、
（ｉ）ＧＦＲＡＬ膜貫通ドメイン又はその機能的断片であるか；
（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか；
（ｉｉｉ）前記ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインに融合された異種膜貫通ドメインであるか；
（ｉｖ）グリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）であるか；
（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体、配列番号２０のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号２１のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含むか；
（ｖｉ）膜挿入配列であるか；
（ｖｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号２３のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含むか；又は
（ｖｉｉｉ）膜挿入脂肪酸である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、シグナルペプチドを更に含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ及びｍｙｃタグから選択される親和性タグでタグ化される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか；
（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するか；
（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するか；
（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか；
（ｖ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するか；
（ｖｉ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するか；
（ｖｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか；又は
（ｖｉｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＧＤＦ１５ペプチド又はその機能的変異体は、
（ｉ）配列番号１３、１４、１５、１６若しくは１７のアミノ酸配列又はその機能的変異体含むか；
（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するか；又は
（ｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＧＤＦ１５ペプチドは、
（ｉ）アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ及びｍｙｃタグから選択される親和性タグでタグ化され；
（ｉｉ）ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−１−アンチトリプシンに融合され；
（ｉｉｉ）脂肪酸に抱合され；
（ｉｖ）ペグ化を有し；及び／又は
（ｖ）グリコシル化を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞表面受容体キナーゼは、
（ｉ）内因性細胞表面受容体キナーゼ；
（ｉｉ）外因性細胞表面受容体キナーゼ；及び／又は
（ｉｉｉ）ＲＥＴ受容体チロシンキナーゼ
である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞は、
（ｉ）内因性ＧＦＲＡＬ；
（ｉｉ）全長ＧＦＲＡＬ；及び／又は
（ｉｉｉ）内因性ＧＤＦ１５
を発現しない、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞は、無効ＧＤＦ１５遺伝子を含むＧＤＦ１５ノックアウト（ＫＯ）細胞である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記生物学的応答は、
（ｉ）前記ＧＤＦ１５ペプチド、前記可溶性ＧＦＲＡＬ又は前記ＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン及び前記細胞表面受容体キナーゼが三元複合体を形成するときに誘導され；
（ｉｉ）前記可溶性ＧＦＲＡＬの非存在下で前記ＧＤＦ１５ペプチドと接触された細胞において誘導されず；及び／又は
（ｉｉｉ）前記ＧＤＦ１５ペプチド及び／又は前記可溶性ＧＦＲＡＬと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した前記細胞内のタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記生物学的応答は、ＲＥＴ−ＥＲＫ、ＲＥＴ−ＡＫＴ、タンパク質キナーゼＣ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＪＮＫ、ｐ３８及びＲＡＣ１経路の１つ以上における細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞表面受容体キナーゼは、ＲＥＴ受容体チロシンキナーゼであり、及び前記タンパク質は、
（ｉ）ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ＳＨＣ１、ＦＲＳ２、ＧＲＢ２、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＯＳ、ＳＨＡＮＫ３、ＧＲＢ７、ＧＲＢ１０、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２又はその任意の下流標的から選択される、前記ＲＥＴ−ＥＲＫ経路における細胞内タンパク質であるか；又は
（ｉｉ）ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＳＲＣ、ＳＨＣ１、ＧＲＢ２、ＣＢＬ、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＨＡＮＫ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＳ、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＹＡＰ、ＢＡＤ、カスパーゼ−９、ＦｏｘＯ１、ＦｏｘＯ３、ＦｏｘＯ４、ＩＫＫα、ＣＲＥＢ、ＭＤＭ２、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ２７Ｋｉｐ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲ又はその任意の下流標的から選択される、前記ＲＥＴ−ＡＫＴ経路における細胞内タンパク質である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記生物学的応答は、前記ＧＤＦ１５ペプチド及び／又は前記可溶性ＧＦＲＡＬと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質キナーゼのリン酸化と比較した前記細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
（ｉ）前記タンパク質キナーゼは、前記細胞表面受容体キナーゼであるか；
（ｉｉ）前記タンパク質キナーゼ及び／又は細胞表面受容体キナーゼは、ＲＥＴ受容体チロシンキナーゼであるか；又は
（ｉｉｉ）前記タンパク質キナーゼは、細胞内タンパク質キナーゼであり、前記細胞内タンパク質キナーゼは、前記細胞表面受容体キナーゼによって直接又は間接的にリン酸化される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記タンパク質キナーゼは、
（ｉ）ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２又はその任意の下流標的から選択される、前記ＲＥＴ−ＥＲＫ経路における細胞内タンパク質キナーゼ；又は
（ｉｉ）ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＳＲＣ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲ又はその任意の下流標的から選択される、前記ＲＥＴ−ＡＫＴ経路における細胞内タンパク質キナーゼである、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＧＤＦ１５ペプチドの活性を検出するための単離及び改変された細胞であって、ドメインＤ２及びＤ３を含むＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン並びに細胞表面受容体キナーゼを発現する、単離及び改変された細胞。
【請求項２０】
前記ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、ドメインＤ１を欠く、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２１】
前記ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、
（ｉ）可溶性ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインであるか；又は
（ｉｉ）テザーによって細胞表面に付着される、請求項１９又は２０に記載の細胞。
【請求項２２】
前記テザーは、
（ｉ）ＧＦＲＡＬ膜貫通ドメイン又はその機能的断片であるか；
（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか；
（ｉｉｉ）前記ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインに融合された異種膜貫通ドメインであるか；
（ｉｖ）グリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）であるか；
（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体、配列番号２０のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号２１のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含むか；
（ｖｉ）膜挿入配列であるか；
（ｖｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号２３のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含むか；又は
（ｖｉｉｉ）膜挿入脂肪酸である、請求項２１に記載の細胞。
【請求項２３】
前記ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、シグナルペプチドを更に含む、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２４】
前記ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ及びｍｙｃタグから選択される親和性タグでタグ化される、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２５】
前記ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか；
（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するか；
（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するか；
（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか；
（ｖ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するか；
（ｖｉ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するか；
（ｖｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか；又は
（ｖｉｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２６】
前記細胞表面受容体キナーゼは、
（ｉ）内因性細胞表面受容体キナーゼ；
（ｉｉ）外因性細胞表面受容体キナーゼ；及び／又は
（ｉｉｉ）ＲＥＴ受容体チロシンキナーゼ
である、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２７】
（ｉ）内因性ＧＦＲＡＬ；
（ｉｉ）全長ＧＦＲＡＬ；及び／又は
（ｉｉｉ）内因性ＧＤＦ１５
を発現しない、請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２８】
無効ＧＤＦ１５遺伝子を含むＧＤＦ１５ノックアウト（ＫＯ）細胞である、請求項１９〜２７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２９】
哺乳動物細胞、ヒト細胞、ＭＣＦ７細胞、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞及びＨＥＫ２９３Ａ−ＧＤＦ１５  ＫＯ細胞から選択される、請求項１９〜２８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３０】
ＧＤＦ１５ペプチドの活性を検出するためのキットであって、前記ＧＤＦ１５ペプチドと接触するための、請求項１９〜２９のいずれか一項に記載の細胞と；前記接触された細胞における生物学的応答を検出する手段とを含むキット。
【請求項３１】
ドメインＤ２及びＤ３を含むＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含む可溶性ＧＦＲＡＬ。
【請求項３２】
前記ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、ドメインＤ１を欠く、請求項３１に記載の可溶性ＧＦＲＡＬ。
【請求項３３】
前記ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、シグナルペプチドを更に含む、請求項３１又は３２に記載の可溶性ＧＦＲＡＬ。
【請求項３４】
前記ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ及びｍｙｃタグから選択される親和性タグでタグ化される、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の可溶性ＧＦＲＡＬ。
【請求項３５】
前記ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか；
（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するか；
（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するか；
（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか；
（ｖ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するか；
（ｖｉ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するか；
（ｖｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか；又は
（ｖｉｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、請求項３１〜３４のいずれか一項に記載の可溶性ＧＦＲＡＬ。
【請求項３６】
ＧＤＦ１５活性を調節することができる薬剤を同定する方法であって、
（ａ）請求項１９〜２９のいずれか一項に記載の細胞を前記薬剤及びＧＤＦ１５ペプチドと接触させることと；
（ｂ）前記接触された細胞における生物学的応答を検出することと
を含み、前記薬剤は、前記接触された細胞における前記生物学的応答が、前記薬剤の非存在下で前記ＧＤＦ１５ペプチドと接触された細胞における前記生物学的応答に対して増大又は減少される場合、ＧＤＦ１５活性を調節すると決定される、方法。
【請求項３７】
ＧＤＦ１５活性を調節することができる薬剤を同定する方法であって、
（ａ）細胞表面受容体キナーゼを発現する細胞を提供することと；
（ｂ）前記細胞をＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬと接触させることであって、前記可溶性ＧＦＲＡＬは、ドメインＤ２及びＤ３を含むＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含み、且つドメインＤ１を欠く、接触させることと；
（ｃ）前記細胞を前記薬剤と接触させることと；
（ｄ）前記接触された細胞における生物学的応答を検出することと
を含み、前記薬剤は、
（ｉ）前記接触された細胞における前記生物学的応答が、前記ＧＤＦ１５ペプチド、前記可溶性ＧＦＲＡＬ及び前記薬剤の存在下において、前記薬剤の非存在下で前記ＧＤＦ１５ペプチド及び前記可溶性ＧＦＲＡＬと接触された細胞における前記生物学的応答に対して増大される場合、ＧＤＦ１５活性を調節するか又は増大させるか；又は
（ｉｉ）前記接触された細胞における前記生物学的応答が、前記ＧＤＦ１５ペプチド、前記可溶性ＧＦＲＡＬ及び前記薬剤の存在下において、前記薬剤の非存在下で前記ＧＤＦ１５ペプチド及び前記可溶性ＧＦＲＡＬと接触された細胞における前記生物学的応答に対して減少される場合、ＧＤＦ１５活性を調節するか又は減少させると決定される、方法。
【請求項３８】
前記ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ及びｍｙｃタグから選択される親和性タグでタグ化される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか；
（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するか；
（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するか；
（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか；
（ｖ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するか；
（ｖｉ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するか；
（ｖｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか；又は
（ｖｉｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、請求項３７又は３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記薬剤は、抗ＧＤＦ１５抗体及び抗ＧＦＲＡＬ抗体から選択される抗体である、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記生物学的応答は、ＲＥＴ−ＥＲＫ、ＲＥＴ−ＡＫＴ、タンパク質キナーゼＣ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＪＮＫ、ｐ３８及びＲＡＣ１経路の１つ以上における細胞内タンパク質の発現、活性又はリン酸化レベルの増大又は減少である、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞内タンパク質は、前記ＲＥＴ−ＥＲＫ経路にあり、且つＥＲＫ、ＳＨＣ１、ＦＲＳ２、ＧＲＢ２、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＯＳ、ＳＨＡＮＫ３、ＧＲＢ７、ＧＲＢ１０、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞内タンパク質は、前記ＲＥＴ−ＡＫＴ経路にあり、且つＡＫＴ、ＳＲＣ、ＳＨＣ１、ＧＲＢ２、ＣＢＬ、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＨＡＮＫ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＳ、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＹＡＰ、ＢＡＤ、カスパーゼ−９、ＦｏｘＯ１、ＦｏｘＯ３、ＦｏｘＯ４、ＩＫＫα、ＣＲＥＢ、ＭＤＭ２、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ２７Ｋｉｐ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲから選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＧＤＦ１５ペプチド又はその機能的変異体は、
（ｉ）配列番号１３、１４、１５、１６若しくは１７のアミノ酸配列又はその機能的変異体含むか；
（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するか；又は
（ｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項３６〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＧＤＦ１５ペプチドは、
（ｉ）アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ及びｍｙｃタグから選択される親和性タグでタグ化され；
（ｉｉ）ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−１−アンチトリプシンに融合され；
（ｉｉｉ）脂肪酸に抱合され；
（ｉｖ）ペグ化を有し；及び／又は
（ｖ）グリコシル化を有する、請求項３６〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン並びに本明細書に提供されるＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを使用するための方法及び組成物に関する。本開示は、ＧＦＲＡＬリガンド（例えば、ＧＤＦ１５ペプチド）の活性をスクリーニング及び評価するための細胞ベースのアッセイ並びにＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン及びＧＦＲＡＬリガンドを使用した処置方法に更に関する。ＧＦＲＡＬリガンド（例えば、ＧＤＦ１５ペプチド）の活性をスクリーニング及び評価するのに有用な細胞及びキットも提供される。
【背景技術】
【０００２】
成長／分化因子１５（ＧＤＦ１５）は、癌悪液質、腎及び心不全、アテローム性動脈硬化症及び代謝を含む様々な生物学的機能に関係しているトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）サイトカインスーパーファミリーの多様なメンバーである（Ｂｒｅｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ２０１１；２９（５）：１８７−９５）。ＧＤＦ１５と体重調節との関係は、当初、血清中のＧＤＦ１５レベルの増大が、進行性前立腺癌を有する個人の体重減少と相関するという観察に基づいて示唆された（Ｊｏｈｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００７；１３（１１）：１３３３−４０）。異種移植された前立腺腫瘍を有するマウスでは、上昇したＧＤＦ１５レベルは、食物摂取の減少により媒介される顕著な体重、脂肪及び除脂肪組織損失にも関連し、ＧＤＦ１５の抗体の投与により逆転させることができた（Ｊｏｈｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００７；１３（１１）：１３３３−４０）。加えて、マウスにおける長期間のＣＤＦ１５発現の上昇は、食物摂取、体重及び体脂肪蓄積の減少と同時に耐糖能の改善をもたらす（正常及び肥満を引き起こす食事状態の両方において）ことが示されている（Ｍａｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１２；７（４）：ｅ３４８６８）。食欲及び体重に関連したＧＤＦ１５の代謝作用は、ＧＤＦ１５を、肥満症及び／又は関連した併存症を患っている患者に対する有望な治療法とする。
【０００３】
ＧＦＲＡＬ、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）受容体αファミリーのオーファンメンバーは、ＧＤＦ１５に対する高親和性受容体である。ＧＦＲＡＬは、ＧＤＦ１５の食欲抑制効果にも必要であり得る。肥満症のマウスの食物摂取及び体重におけるＧＤＦ１５−媒介減少は、ＧＦＲＡＬノックアウトマウスで消失した（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２０１７；２３（１０）：１１５８−６６）。ＧＦＲＡＬは、ＧＤＦ１５刺激に対する応答において細胞内シグナリングを誘発するために共受容体ＲＥＴと関連する必要がある（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２０１７；２３（１０）：１１５８−６６）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
潜在的な治療薬としての組換えＧＤＦ１５タンパク質が報告されており、より多くのものが研究中である（Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ２０１７；９（４１２）：ｅａａｎ８７３２）。従って、そのような治療的タンパク質の活性を迅速且つ効果的に評価するアッセイは、望ましいスクリーニングツールであろう。ＧＤＦ１５及びＧＦＲＡＬに関するアッセイは、国際公開第２０１７／１２１８６５号パンフレット、国際公開第２０１７／１５２１０５号パンフレット及び国際公開第２０１８／０７１４９３号パンフレットに記載されている。同様に、治療的ＧＤＦ１５組成物の活性を改善するための新規な方法及び組成物も有益であろう。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は、様々な実施形態において、ＧＦＲＡＬリガンド（例えば、ＧＤＦ１５、例えばＧＤＦ１５ペプチド）の活性を検出及び試験するための新規な方法及びアッセイを提供する。ＧＦＲＡＬリガンド（例えば、本明細書に開示した方法に従って活性についてスクリーニングされたＧＤＦ１５ペプチド）を単独で又は可溶性ＧＦＲＡＬ（例えば、Ｄ２及びＤ３細胞外ドメインを含むが、Ｄ１細胞外ドメインを含まないもの）と組み合わせて使用する、肥満症及び関連する障害の処置のための方法及び組成物も開示する。
【０００６】
様々な実施形態において、本開示は、より詳細には、ＧＦＲＡＬリガンドの活性を評価するための細胞ベースの方法及びアッセイに関する。細胞ベースの効力アッセイは、多くの場合、生物学的生成物の生物学的活性を決定するための好ましいフォーマットであり、それは、それらが生成物により誘発される生物学的応答を測定することができ、動物ベースのアッセイと比較して短期間で結果を生成できるためである。加えて、多くの細胞ベースの効力アッセイは、生成物の作用機序との明白な相関を有する。従って、このようなアッセイは、広く使用されており、多くの場合に医薬品登録及び市販前承認のために医薬品管理当局に提供される。
【０００７】
様々な実施形態において、本明細書に開示した細胞ベースの方法及びアッセイは、細胞ベースのシグナル伝達アッセイであり、ＧＦＲＡＬリガンド（例えば、ＧＤＦ１５ペプチド）のＧＦＲＡＬシグナリング活性を決定するのに有用であり得る。様々な実施形態において、本開示は、ＧＤＦ１５ペプチドの活性を検出する方法を提供し、この方法は、（ａ）細胞表面受容体キナーゼを発現する細胞を提供することと；（ｂ）細胞をＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬと接触させることと；（ｃ）接触された細胞における生物学的応答を検出することとを含み、可溶性ＧＦＲＡＬは、ドメインＤ２及びＤ３を含むＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含む。
【０００８】
いくつかの実施形態では、可溶性ＧＦＲＡＬは、ドメインＤ１を欠いたＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、可溶性ＧＦＲＡＬは、シグナルペプチドを更に含む。いくつかの実施形態では、可溶性ＧＦＲＡＬは、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む。いくつかの実施形態では、可溶性ＧＦＲＡＬ又は機能的変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、可溶性ＧＦＲＡＬ又は機能的変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、可溶性ＧＦＲＡＬは、配列番号２のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む。いくつかの実施形態では、例えば、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含む可溶性ＧＦＲＡＬ又はその機能的変異体は、親和性タグを更に含む（例えば、親和性タグに融合される）。いくつかの実施形態では、親和性タグは、アミロイドβ前駆体タンパク質（Ａｐｐ）タグ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、ＦＬＡＧタグ若しくはｍｙｃタグ又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、可溶性ＧＦＲＡＬは、配列番号３のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号２５のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列又はその機能的変異体（配列番号１４、１５、１６又は１７のアミノ酸配列を含む）を含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド又は機能的変異体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド又は機能的変異体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチドは、親和性タグ、融合、抱合、ペグ化及び／又はグリコシル化を含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチドは、アミロイドβ前駆体タンパク質（Ａｐｐ）タグ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、ＦＬＡＧタグ若しくはｍｙｃタグ又はそれらの組み合わせでタグ化される。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチドは、ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−１−アンチトリプシンに融合される。他の実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチドは、脂肪酸に抱合される。
【００１０】
細胞ベースの方法及びアッセイのいくつかの実施形態では、細胞は、ＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬと同時に接触される。いくつかの他の実施形態では、細胞は、ＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬと連続で接触される。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬは、同じ組成物中にある。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬは、混合物中にある。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬは、複合体中にある。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬは、二元複合体中にある。
【００１１】
細胞ベースの方法及びアッセイのいくつかの実施形態では、細胞表面受容体キナーゼは、内因性細胞表面受容体キナーゼである。いくつかの他の実施形態では、細胞表面受容体キナーゼは、外因性細胞表面受容体キナーゼである。いくつかの実施形態では、細胞表面受容体キナーゼは、ＲＥＴ受容体チロシンキナーゼである。
【００１２】
細胞ベースの方法及びアッセイのいくつかの実施形態では、細胞は、内因性ＧＦＲＡＬを発現しない。細胞ベースの方法及びアッセイのいくつかの実施形態では、細胞は、部分又は全長ＧＦＲＡＬ（例えば、膜貫通ドメイン及び更に細胞質ドメインを含むヒトＧＦＲＡＬ）を発現しない。いくつかの実施形態では、細胞は、内因性ＧＤＦ１５を発現しない。いくつかの実施形態では、細胞は、無効ＧＤＦ１５遺伝子を含むＧＤＦ１５ノックアウト（ＫＯ）細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＭＣＦ７細胞（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−２２（商標））、乳癌細胞である（例えば、Ｃｏｍｓａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１５；３５（６）：３１４７−５４を参照されたい）。いくつかの実施形態では、細胞は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２２６６（商標））、骨髄神経芽腫細胞である。更に他の実施形態では、細胞は、ＨＥＫ２９３Ａ−ＧＤＦ１５ノックアウト（ＫＯ）細胞である。他の例示的な細胞型も本明細書に記載される。
【００１３】
いくつかの実施形態では、生物学的応答は、ＧＤＦ１５ペプチド、可溶性ＧＦＲＡＬ及び細胞表面受容体キナーゼ、例えばＲＥＴが三元複合体を形成するときに誘導される。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、可溶性ＧＦＲＡＬの非存在下でＧＤＦ１５ペプチドと接触された細胞において誘導されない。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、シグナル伝達応答（例えば、ＧＤＦ１５の下流のシグナル伝達応答、例えばＥＲＫ又はＡＫＴシグナリング）である。
【００１４】
生物学的応答は、いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド及び／又は可溶性ＧＦＲＡＬと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した細胞内のタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、ＲＥＴ−ＥＲＫ、ＲＥＴ−ＡＫＴ、タンパク質キナーゼＣ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＪＮＫ、ｐ３８及びＲＡＣ１経路の１つ以上における細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ＥＲＫ、ＳＨＣ１、ＦＲＳ２、ＧＲＢ２、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＯＳ、ＳＨＡＮＫ３、ＧＲＢ７、ＧＲＢ１０、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２から選択される、ＲＥＴ−ＥＲＫ経路における細胞内タンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ＡＫＴ、ＳＲＣ、ＳＨＣ１、ＧＲＢ２、ＣＢＬ、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＨＡＮＫ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＳ、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＹＡＰ、ＢＡＤ、カスパーゼ−９、ＦｏｘＯ１、ＦｏｘＯ３、ＦｏｘＯ４、ＩＫＫα、ＣＲＥＢ、ＭＤＭ２、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ２７Ｋｉｐ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲから選択される、ＲＥＴ−ＡＫＴ経路における細胞内タンパク質である。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、キナーゼ又は酵素活性アッセイ、全細胞の放射標識３２Ｐ−オルトホスフェートとのインキュベーション、２次元ゲル電気泳動、免疫ブロットアッセイ（例えば、ウェスタンブロット）、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、細胞ベースのＥＬＩＳＡアッセイ、細胞内フローサイトメトリー、免疫細胞化学（ＩＣＣ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、質量分析、多検体プロファイリング（例えば、ホスホ−タンパク質多重アッセイ）及び蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）から選択される１つ以上のアッセイを用いて検出される。
【００１５】
いくつかの実施形態では、細胞表面受容体キナーゼは、ＲＥＴ受容体チロシンキナーゼであり、及びタンパク質は、ＲＥＴ−ＥＲＫ経路における細胞内タンパク質である。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質は、ＥＲＫ、ＳＨＣ１、ＦＲＳ２、ＧＲＢ２、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＯＳ、ＳＨＡＮＫ３、ＧＲＢ７、ＧＲＢ１０、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２又はその任意の下流標的の１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質は、ＥＲＫ、ＳＨＣ１、ＦＲＳ２、ＧＲＢ２、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＯＳ、ＳＨＡＮＫ３、ＧＲＢ７、ＧＲＢ１０、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２の１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、ＥＲＫは、ＥＲＫ１又はＥＲＫ２である。いくつかの実施形態では、ＥＲＫは、ＥＲＫ１（ＭＡＰＫ３又はＰＲＫＭ３とも称される）である。いくつかの実施形態では、ＥＲＫは、ＥＲＫ２（ＭＡＰＫ１、ＰＲＫＭ１又はＰＲＫＭ２とも称される）である。
【００１６】
他の実施形態では、細胞表面受容体キナーゼは、ＲＥＴ受容体チロシンキナーゼであり、及びタンパク質は、ＲＥＴ−ＡＫＴ経路における細胞内タンパク質である。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質は、ＡＫＴ、ＳＲＣ、ＳＨＣ１、ＧＲＢ２、ＣＢＬ、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＨＡＮＫ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＳ、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＹＡＰ、ＢＡＤ、カスパーゼ−９、ＦｏｘＯ１、ＦｏｘＯ３、ＦｏｘＯ４、ＩＫＫα、ＣＲＥＢ、ＭＤＭ２、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ２７Ｋｉｐ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲ又はその任意の下流標的の１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質は、ＡＫＴ、ＳＲＣ、ＳＨＣ１、ＧＲＢ２、ＣＢＬ、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＨＡＮＫ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＳ、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＹＡＰ、ＢＡＤ、カスパーゼ−９、ＦｏｘＯ１、ＦｏｘＯ３、ＦｏｘＯ４、ＩＫＫα、ＣＲＥＢ、ＭＤＭ２、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ２７Ｋｉｐ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲの１つ以上から選択される。例示的な下流標的には、Ｓ６キナーゼが含まれるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、ＡＫＴ（ＰＫＢ又はＲＡＣとも称される）は、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２又はＡＫＴ３である。いくつかの実施形態では、ＲＡＳは、Ｈ−ＲＡＳ、Ｋ−ＲＡＳ又はＮ−ＲＡＳである。
【００１７】
生物学的応答は、いくつかの他の実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質キナーゼのリン酸化と比較した細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である。
【００１８】
いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼである。いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼ及び／又は細胞表面受容体キナーゼは、ＲＥＴ受容体チロシンキナーゼである。いくつかの他の実施形態では、タンパク質キナーゼは、細胞内タンパク質キナーゼであり、細胞内タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼによって直接又は間接的にリン酸化される。
【００１９】
いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、ＲＥＴ−ＥＲＫ経路における細胞内タンパク質キナーゼである。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質キナーゼは、ＥＲＫ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２又はその任意の下流標的の１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質キナーゼは、ＥＲＫ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２の１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質キナーゼは、ＥＲＫ（例えば、ＥＲＫ１又はＥＲＫ２）である。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質キナーゼは、ＥＲＫ１及び／又はＥＲＫ２である。
【００２０】
いくつかの他の実施形態では、タンパク質キナーゼは、ＲＥＴ−ＡＫＴ経路における細胞内タンパク質キナーゼである。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質キナーゼは、ＡＫＴ、ＳＲＣ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲ又はその任意の下流標的の１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質キナーゼは、ＡＫＴ、ＳＲＣ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質キナーゼは、ＡＫＴ（例えば、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２又はＡＫＴ３）である。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質キナーゼは、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２及び／又はＡＫＴ３である。いくつかの実施形態では、ＲＥＴ−ＡＫＴ経路における下流標的は、Ｓ６キナーゼである。
【００２１】
様々な他の実施形態において、本開示は、ＧＤＦ１５ペプチドの活性を検出する方法を提供し、この方法は、（ａ）ＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン（例えば、可溶性ＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン）及び細胞表面受容体キナーゼを発現する細胞を提供することと；（ｂ）細胞をＧＤＦ１５ペプチドと接触させることと；（ｃ）接触された細胞における生物学的応答を検出することとを含み、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、ドメインＤ２及びＤ３を含む。
【００２２】
様々な他の実施形態において、本開示は、ＧＤＦ１５ペプチドの活性を検出する方法を提供し、この方法は、（ａ）ＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン（例えば、可溶性ＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン）及び細胞表面受容体キナーゼを発現する細胞を提供することと；（ｂ）細胞をＧＤＦ１５ペプチドと接触させることと；（ｃ）接触された細胞における生物学的応答を検出することとを含み、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、ドメインＤ２及びＤ３を含み；細胞は、ＧＦＲＡＬを内因的に発現しない。
【００２３】
様々な実施形態において、接触された細胞における生物学的応答は、細胞シグナリング又はシグナル伝達（例えば、タンパク質キナーゼのリン酸化）に関連した応答である。様々な実施形態において、生物学的応答は、キナーゼ又は酵素活性アッセイ、全細胞の放射標識３２Ｐ−オルトホスフェートとのインキュベーション、２次元ゲル電気泳動、免疫ブロットアッセイ（例えば、ウェスタンブロット）、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、細胞ベースのＥＬＩＳＡアッセイ、細胞内フローサイトメトリー、免疫細胞化学（ＩＣＣ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、質量分析、多検体プロファイリング（例えば、ホスホ−タンパク質多重アッセイ）及び蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）から選択される１つ以上のアッセイを用いて検出される。他の例示的な生物学的応答には、遺伝子転写、タンパク質発現、毒性、サイトカイン放出、細胞増殖、細胞運動性若しくは形態、細胞成長停止又は細胞死（例えば、アポトーシス）に関連した細胞応答が含まれるが、これらに限定されない。
【００２４】
いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、ドメインＤ１を欠く。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、可溶性ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインである。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、テザーによって細胞表面に付着される。いくつかの実施形態では、テザーは、ＧＦＲＡＬ膜貫通ドメイン又はその機能的断片である。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン又はテザーは、天然ＧＦＲＡＬ膜貫通ドメインのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン又はテザーは、配列番号１８のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む。いくつかの実施形態では、テザーは、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインに融合された異種膜貫通ドメインである。
【００２５】
いくつかの実施形態では、テザーは、グリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）又はＧＰＩリンカー付加を指示することが可能な配列である。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン又はテザーは、配列番号１９のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体、配列番号２０のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号２１のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含む。いくつかの実施形態では、テザーは、膜挿入配列である。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン又はテザーは、配列番号２２のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号２３のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含む。いくつかの他の実施形態では、テザーは、膜挿入脂肪酸である。
【００２６】
いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、シグナルペプチドを更に含む。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン又は機能的変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン又は機能的変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン又は機能的変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、例えば、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含むＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、親和性タグを更に含む（例えば、親和性タグに融合される）。いくつかの実施形態では、親和性タグは、アミロイドβ前駆体タンパク質（Ａｐｐ）タグ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、ＦＬＡＧタグ若しくはｍｙｃタグ又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号２５のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列又はその機能的変異体（配列番号１４、１５、１６又は１７のアミノ酸配列を含む）を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド又は機能的変異体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド又は機能的変異体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド又は機能的変異体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチドは、親和性タグ、融合、抱合、ペグ化及び／又はグリコシル化を更に含む（例えば、融合される）。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチドは、アミロイドβ前駆体タンパク質（Ａｐｐ）タグ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、ＦＬＡＧタグ若しくはｍｙｃタグ又はそれらの組み合わせでタグ化される。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチドは、ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−１−アンチトリプシンに融合される。他の実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチドは、脂肪酸に抱合される。
【００２８】
いくつかの実施形態では、細胞表面受容体キナーゼは、内因性細胞表面受容体キナーゼである。いくつかの他の実施形態では、細胞表面受容体キナーゼは、外因性細胞表面受容体キナーゼである。いくつかの実施形態では、細胞表面受容体キナーゼは、ＲＥＴ受容体チロシンキナーゼである。
【００２９】
いくつかの実施形態では、細胞は、内因性ＧＦＲＡＬを発現しない。いくつかの実施形態では、細胞は、全長ＧＦＲＡＬを発現しない。いくつかの実施形態では、細胞は、内因性ＧＤＦ１５を発現しない。いくつかの実施形態では、細胞は、無効ＧＤＦ１５遺伝子を含むＧＤＦ１５  ＫＯ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＭＣＦ７細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞である。更に他の実施形態では、細胞は、ＨＥＫ２９３Ａ−ＧＤＦ１５  ＫＯ細胞である。
【００３０】
いくつかの実施形態では、生物学的応答は、ＧＤＦ１５ペプチド、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン及び細胞表面受容体キナーゼ（例えば、ＲＥＴ）が三元複合体を形成するときに誘導される。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、シグナル伝達応答（例えば、ＧＤＦ１５の下流、例えばＥＲＫ又はＡＫＴシグナリングのシグナル伝達応答）である。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、ＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した細胞内のタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。増大又は減少した発現又は活性を有するタンパク質は、本明細書に記載される例示的なタンパク質のいずれか、例えばＲＥＴ−ＥＲＫ、ＲＥＴ−ＡＫＴ、タンパク質キナーゼＣ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＪＮＫ、ｐ３８及びＲＡＣ１経路の１つ以上における細胞内タンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、本明細書に開示した例示的なアッセイのいずれかを用いて検出される。
【００３１】
いくつかの実施形態では、生物学的応答は、ＲＥＴ−ＥＲＫ、ＲＥＴ−ＡＫＴ、タンパク質キナーゼＣ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＪＮＫ、ｐ３８及びＲＡＣ１経路の１つ以上における細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ＥＲＫ、ＳＨＣ１、ＦＲＳ２、ＧＲＢ２、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＯＳ、ＳＨＡＮＫ３、ＧＲＢ７、ＧＲＢ１０、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２から選択される、ＲＥＴ−ＥＲＫ経路における細胞内タンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ＡＫＴ、ＳＲＣ、ＳＨＣ１、ＧＲＢ２、ＣＢＬ、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＨＡＮＫ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＳ、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＹＡＰ、ＢＡＤ、カスパーゼ−９、ＦｏｘＯ１、ＦｏｘＯ３、ＦｏｘＯ４、ＩＫＫα、ＣＲＥＢ、ＭＤＭ２、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ２７Ｋｉｐ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲから選択される、ＲＥＴ−ＡＫＴ経路における細胞内タンパク質である。
【００３２】
いくつかの実施形態では、細胞表面受容体キナーゼは、ＲＥＴ受容体チロシンキナーゼであり、及びタンパク質は、ＲＥＴ−ＥＲＫ経路における細胞内タンパク質である。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質は、ＥＲＫ、ＳＨＣ１、ＦＲＳ２、ＧＲＢ２、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＯＳ、ＳＨＡＮＫ３、ＧＲＢ７、ＧＲＢ１０、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２又はその任意の下流標的の１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質は、ＥＲＫ、ＳＨＣ１、ＦＲＳ２、ＧＲＢ２、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＯＳ、ＳＨＡＮＫ３、ＧＲＢ７、ＧＲＢ１０、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２の１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、ＥＲＫは、ＥＲＫ１又はＥＲＫ２である。
【００３３】
他の実施形態では、細胞表面受容体キナーゼは、ＲＥＴ受容体チロシンキナーゼであり、及びタンパク質は、ＲＥＴ−ＡＫＴ経路における細胞内タンパク質である。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質は、ＡＫＴ、ＳＲＣ、ＳＨＣ１、ＧＲＢ２、ＣＢＬ、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＨＡＮＫ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＳ、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＹＡＰ、ＢＡＤ、カスパーゼ−９、ＦｏｘＯ１、ＦｏｘＯ３、ＦｏｘＯ４、ＩＫＫα、ＣＲＥＢ、ＭＤＭ２、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ２７Ｋｉｐ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲ又はその任意の下流標的の１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質は、ＡＫＴ、ＳＲＣ、ＳＨＣ１、ＧＲＢ２、ＣＢＬ、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＨＡＮＫ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＳ、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＹＡＰ、ＢＡＤ、カスパーゼ−９、ＦｏｘＯ１、ＦｏｘＯ３、ＦｏｘＯ４、ＩＫＫα、ＣＲＥＢ、ＭＤＭ２、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ２７Ｋｉｐ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、ＡＫＴは、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２又はＡＫＴ３である。
【００３４】
生物学的応答は、いくつかの他の実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質キナーゼのリン酸化と比較した細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である。
【００３５】
いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼである。いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼ及び／又は細胞表面受容体キナーゼは、ＲＥＴ受容体チロシンキナーゼである。いくつかの他の実施形態では、タンパク質キナーゼは、細胞内タンパク質キナーゼであり、細胞内タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼによって直接又は間接的にリン酸化される。
【００３６】
いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、ＲＥＴ−ＥＲＫ経路における細胞内タンパク質キナーゼである。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質キナーゼは、ＥＲＫ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２又はその任意の下流標的の１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質キナーゼは、ＥＲＫ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２の１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質キナーゼは、ＥＲＫ（例えば、ＥＲＫ１又はＥＲＫ２）である。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質キナーゼは、ＥＲＫ１及び／又はＥＲＫ２である。
【００３７】
いくつかの他の実施形態では、タンパク質キナーゼは、ＲＥＴ−ＡＫＴ経路における細胞内タンパク質キナーゼである。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質キナーゼは、ＡＫＴ、ＳＲＣ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲ又はその任意の下流標的の１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質キナーゼは、ＡＫＴ、ＳＲＣ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質キナーゼは、ＡＫＴ（例えば、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２又はＡＫＴ３）である。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質キナーゼは、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２及び／又はＡＫＴ３である。いくつかの実施形態では、ＲＥＴ−ＡＫＴ経路における下流標的は、Ｓ６キナーゼである。
【００３８】
様々な実施形態において、ＧＤＦ１５ペプチドの活性を検出するための単離及び改変された細胞が更に本明細書に提供される。様々な実施形態において、細胞は、ドメインＤ２及びＤ３を含むＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン並びに細胞表面受容体キナーゼを発現する。様々な実施形態において、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、ドメインＤ２及びＤ３を含むが、ドメインＤ１を欠く。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、シグナルペプチドを更に含む。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン又は機能的変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン又は機能的変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、例えば、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含むＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、親和性タグを更に含む（例えば、親和性タグに融合される）。いくつかの実施形態では、親和性タグは、アミロイドβ前駆体タンパク質（Ａｐｐ）タグ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、ＦＬＡＧタグ若しくはｍｙｃタグ又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号２５のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含む。
【００３９】
いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列又はその機能的変異体（配列番号１４、１５、１６又は１７のアミノ酸配列を含む）を含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド又は機能的変異体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド又は機能的変異体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチドは、親和性タグ、融合、抱合、ペグ化及び／又はグリコシル化を含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチドは、アミロイドβ前駆体タンパク質（Ａｐｐ）タグ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、ＦＬＡＧタグ若しくはｍｙｃタグ又はそれらの組み合わせでタグ化される。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチドは、ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−１−アンチトリプシンに融合される。他の実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチドは、脂肪酸に抱合される。
【００４０】
いくつかの実施形態では、細胞表面受容体キナーゼは、内因性細胞表面受容体キナーゼである。いくつかの他の実施形態では、細胞表面受容体キナーゼは、外因性細胞表面受容体キナーゼである。いくつかの実施形態では、細胞表面受容体キナーゼは、ＲＥＴ受容体チロシンキナーゼである。
【００４１】
いくつかの実施形態では、細胞は、内因性ＧＦＲＡＬを発現しない。いくつかの実施形態では、細胞は、全長ＧＦＲＡＬを発現しない。いくつかの実施形態では、細胞は、内因性ＧＤＦ１５を発現しない。いくつかの実施形態では、細胞は、無効ＧＤＦ１５遺伝子を含むＧＤＦ１５  ＫＯ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの他の実施形態では、細胞は、ＭＣＦ７細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞である。更に他の実施形態では、細胞は、ＨＥＫ２９３Ａ−ＧＤＦ１５  ＫＯ細胞である。
【００４２】
様々な実施形態において、ＧＤＦ１５ペプチドの活性を決定するためのキットが更に本明細書に提供される。様々な実施形態において、キットは、ＧＤＦ１５ペプチドと接触するための細胞と、接触された細胞における生物学的応答を検出する手段とを含む。様々な実施形態において、細胞は、ドメインＤ２及びＤ３を含むＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン並びに細胞表面受容体キナーゼを発現する、単離及び改変された細胞である。
【００４３】
様々な実施形態において、例えば肥満症又は肥満症関連の障害の処置における、食欲の低減及び／又は対象の体重の低減等における治療方法並びに本明細書に開示したＧＦＲＡＬリガンド（例えば、ＧＤＦ１５ペプチド）及びＧＦＲＡＬ細胞外ドメインの使用も本明細書に提供される。様々な実施形態において、本明細書に記載される治療方法及び使用は、肥満症又は肥満症関連の障害、例えば癌、体重障害並びに／又は代謝疾患及び障害の処置に有用である。肥満症と同時に発生し得るか、又は過剰な体重を有することの直接若しくは間接的な結果であり得る例示的な肥満症関連の障害及び状態は、本明細書に開示されている。これらには、癌、ＩＩ型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、高トリグリセリド血症及び心血管系疾患が含まれるが、これらに限定されない。
【００４４】
例えば、特定の態様において、本開示は、ＧＤＦ１５ペプチドを対象に投与することにより、肥満症又は肥満症関連の障害を処置する方法を提供し、ＧＤＦ１５ペプチドは、例えば、本明細書に記載される検出方法を用いて決定して、ＧＤＦ１５ペプチドと接触された細胞において生物学的応答を誘導し、且つ／又はＧＦＲＡＬシグナリング活性を有するものである。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、シグナル伝達応答（例えば、ＥＲＫ活性化若しくはシグナリング又はＡＫＴ活性化若しくはシグナリング）である。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、ＧＤＦ１５ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した細胞内のタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、ＲＥＴ−ＥＲＫ、ＲＥＴ−ＡＫＴ、タンパク質キナーゼＣ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＪＮＫ、ｐ３８及びＲＡＣ１経路の１つ以上における細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ＥＲＫ、ＳＨＣ１、ＦＲＳ２、ＧＲＢ２、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＯＳ、ＳＨＡＮＫ３、ＧＲＢ７、ＧＲＢ１０、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２から選択される、ＲＥＴ−ＥＲＫ経路における細胞内タンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ＡＫＴ、ＳＲＣ、ＳＨＣ１、ＧＲＢ２、ＣＢＬ、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＨＡＮＫ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＳ、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＹＡＰ、ＢＡＤ、カスパーゼ−９、ＦｏｘＯ１、ＦｏｘＯ３、ＦｏｘＯ４、ＩＫＫα、ＣＲＥＢ、ＭＤＭ２、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ２７Ｋｉｐ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲから選択される、ＲＥＴ−ＡＫＴ経路における細胞内タンパク質である。
【００４５】
いくつかの実施形態では、生物学的応答は、ＧＤＦ１５ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質キナーゼのリン酸化と比較した細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、細胞内タンパク質キナーゼであり、細胞内タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼによって直接又は間接的にリン酸化される。いくつかの実施形態では、対象は、過体重又は肥満である。いくつかの実施形態では、対象は、２５〜２９．９の肥満度指数を有する。いくつかの他の実施形態では、対象は、３０以上の肥満度指数を有する。いくつかの実施形態では、肥満症関連の障害は、癌、体重障害又は代謝疾患若しくは障害である。いくつかの実施形態では、肥満症関連の障害は、癌、Ｔ２ＤＭ、ＮＡＳＨ、高トリグリセリド血症又は心血管系疾患である。
【００４６】
特定の他の態様において、本開示は、対象の肥満症又は肥満症関連の障害の処置におけるＧＤＦ１５ペプチドの使用を提供し、ＧＤＦ１５ペプチドは、例えば、本明細書に記載される検出方法を用いて決定して、ＧＤＦ１５ペプチドと接触された細胞において生物学的応答を誘導し、且つ／又はＧＦＲＡＬシグナリング活性を有するものである。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、シグナル伝達応答（例えば、ＥＲＫ活性化若しくはシグナリング又はＡＫＴ活性化若しくはシグナリング）である。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、ＧＤＦ１５ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した細胞内のタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、ＲＥＴ−ＥＲＫ、ＲＥＴ−ＡＫＴ、タンパク質キナーゼＣ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＪＮＫ、ｐ３８及びＲＡＣ１経路の１つ以上における細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ＥＲＫ、ＳＨＣ１、ＦＲＳ２、ＧＲＢ２、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＯＳ、ＳＨＡＮＫ３、ＧＲＢ７、ＧＲＢ１０、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２から選択される、ＲＥＴ−ＥＲＫ経路における細胞内タンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ＡＫＴ、ＳＲＣ、ＳＨＣ１、ＧＲＢ２、ＣＢＬ、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＨＡＮＫ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＳ、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＹＡＰ、ＢＡＤ、カスパーゼ−９、ＦｏｘＯ１、ＦｏｘＯ３、ＦｏｘＯ４、ＩＫＫα、ＣＲＥＢ、ＭＤＭ２、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ２７Ｋｉｐ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲから選択される、ＲＥＴ−ＡＫＴ経路における細胞内タンパク質である。
【００４７】
いくつかの実施形態では、生物学的応答は、ＧＤＦ１５ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質キナーゼのリン酸化と比較した細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、細胞内タンパク質キナーゼであり、細胞内タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼによって直接又は間接的にリン酸化される。いくつかの実施形態では、対象は、過体重又は肥満である。いくつかの実施形態では、対象は、２５〜２９．９の肥満度指数を有する。いくつかの他の実施形態では、対象は、３０以上の肥満度指数を有する。いくつかの実施形態では、肥満症関連の障害は、癌、体重障害又は代謝疾患若しくは障害である。いくつかの実施形態では、肥満症関連の障害は、癌、Ｔ２ＤＭ、ＮＡＳＨ、高トリグリセリド血症又は心血管系疾患である。
【００４８】
特定の他の態様において、本開示は、ＧＤＦ１５ペプチドを対象に投与することにより、食欲及び／又は体重を低減させる方法を提供し、ＧＤＦ１５ペプチドは、例えば、本明細書に記載される検出方法を用いて決定して、ＧＤＦ１５ペプチドと接触された細胞において生物学的応答を誘導し、且つ／又はＧＦＲＡＬシグナリング活性を有するものである。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、シグナル伝達応答（例えば、ＥＲＫ活性化若しくはシグナリング又はＡＫＴ活性化若しくはシグナリング）である。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、ＧＤＦ１５ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した細胞内のタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、ＲＥＴ−ＥＲＫ、ＲＥＴ−ＡＫＴ、タンパク質キナーゼＣ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＪＮＫ、ｐ３８及びＲＡＣ１経路の１つ以上における細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ＥＲＫ、ＳＨＣ１、ＦＲＳ２、ＧＲＢ２、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＯＳ、ＳＨＡＮＫ３、ＧＲＢ７、ＧＲＢ１０、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２から選択される、ＲＥＴ−ＥＲＫ経路における細胞内タンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ＡＫＴ、ＳＲＣ、ＳＨＣ１、ＧＲＢ２、ＣＢＬ、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＨＡＮＫ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＳ、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＹＡＰ、ＢＡＤ、カスパーゼ−９、ＦｏｘＯ１、ＦｏｘＯ３、ＦｏｘＯ４、ＩＫＫα、ＣＲＥＢ、ＭＤＭ２、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ２７Ｋｉｐ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲから選択される、ＲＥＴ−ＡＫＴ経路における細胞内タンパク質である。
【００４９】
いくつかの実施形態では、生物学的応答は、ＧＤＦ１５ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質キナーゼのリン酸化と比較した細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、細胞内タンパク質キナーゼであり、細胞内タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼによって直接又は間接的にリン酸化される。いくつかの実施形態では、対象は、過体重又は肥満である。いくつかの実施形態では、対象は、２５〜２９．９の肥満度指数を有する。いくつかの他の実施形態では、対象は、３０以上の肥満度指数を有する。
【００５０】
特定の他の態様において、本開示は、対象の食欲及び／又は体重の低減におけるＧＤＦ１５ペプチドの使用を提供し、ＧＤＦ１５ペプチドは、例えば、本明細書に記載される検出方法を用いて決定して、ＧＤＦ１５ペプチドと接触された細胞において生物学的応答を誘導し、且つ／又はＧＦＲＡＬシグナリング活性を有するものである。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、シグナル伝達応答（例えば、ＥＲＫ活性化若しくはシグナリング又はＡＫＴ活性化若しくはシグナリング）である。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、ＧＤＦ１５ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した細胞内のタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、ＲＥＴ−ＥＲＫ、ＲＥＴ−ＡＫＴ、タンパク質キナーゼＣ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＪＮＫ、ｐ３８及びＲＡＣ１経路の１つ以上における細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ＥＲＫ、ＳＨＣ１、ＦＲＳ２、ＧＲＢ２、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＯＳ、ＳＨＡＮＫ３、ＧＲＢ７、ＧＲＢ１０、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２から選択される、ＲＥＴ−ＥＲＫ経路における細胞内タンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ＡＫＴ、ＳＲＣ、ＳＨＣ１、ＧＲＢ２、ＣＢＬ、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＨＡＮＫ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＳ、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＹＡＰ、ＢＡＤ、カスパーゼ−９、ＦｏｘＯ１、ＦｏｘＯ３、ＦｏｘＯ４、ＩＫＫα、ＣＲＥＢ、ＭＤＭ２、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ２７Ｋｉｐ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲから選択される、ＲＥＴ−ＡＫＴ経路における細胞内タンパク質である。
【００５１】
いくつかの実施形態では、生物学的応答は、ＧＤＦ１５ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質キナーゼのリン酸化と比較した細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、細胞内タンパク質キナーゼであり、細胞内タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼによって直接又は間接的にリン酸化される。いくつかの実施形態では、対象は、過体重又は肥満である。いくつかの実施形態では、対象は、２５〜２９．９の肥満度指数を有する。いくつかの他の実施形態では、対象は、３０以上の肥満度指数を有する。
【００５２】
特定の他の態様において、本開示は、肥満症又は肥満症関連の障害を処置する方法を提供し、この方法は、ＧＤＦ１５ペプチド及びＧＦＲＡＬ（例えば、可溶性ＧＦＲＡＬ）を対象に投与することを含み、ＧＤＦ１５ペプチドは、例えば、本明細書に記載される検出方法を用いて決定して、ＧＤＦ１５ペプチドと接触された細胞における生物学的応答を誘導し、且つ／又はＧＦＲＡＬシグナリング活性を有し、ＧＦＲＡＬは、ドメインＤ２及びＤ３を含むＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬは、可溶性ＧＦＲＡＬである。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬは、ドメインＤ１を欠いたＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬは、シグナルペプチドを更に含む。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬは、ドメインＤ１を欠いたＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン及び任意選択的にシグナルペプチドからなる。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬは、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ又は機能的変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ又は機能的変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬは、配列番号２のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬは、親和性タグを更に含む（例えば、親和性タグに融合される）。いくつかの実施形態では、例えば、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含むＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、親和性タグを更に含む（例えば、親和性タグに融合される）。いくつかの実施形態では、親和性タグは、アミロイドβ前駆体タンパク質（Ａｐｐ）タグ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、ＦＬＡＧタグ若しくはｍｙｃタグ又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号２５のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬは、ドメインＤ２及びＤ３を含むが、ドメインＤ１を欠いたＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含む可溶性ＧＦＲＡＬである。
【００５３】
いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド及びＧＦＲＡＬは、同時に投与される。いくつかの他の実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド及びＧＦＲＡＬは、連続で投与される。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド及びＧＦＲＡＬは、同じ組成物中にある。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド及びＧＦＲＡＬは、混合物中にある。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド及びＧＦＲＡＬは、複合体中にある。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド及びＧＦＲＡＬは、二元複合体中にある。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、シグナル伝達応答（例えば、ＥＲＫ活性化若しくはシグナリング又はＡＫＴ活性化若しくはシグナリング）である。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、ＧＤＦ１５ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した細胞内のタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、ＲＥＴ−ＥＲＫ、ＲＥＴ−ＡＫＴ、タンパク質キナーゼＣ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＪＮＫ、ｐ３８及びＲＡＣ１経路の１つ以上における細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ＥＲＫ、ＳＨＣ１、ＦＲＳ２、ＧＲＢ２、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＯＳ、ＳＨＡＮＫ３、ＧＲＢ７、ＧＲＢ１０、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２から選択される、ＲＥＴ−ＥＲＫ経路における細胞内タンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ＡＫＴ、ＳＲＣ、ＳＨＣ１、ＧＲＢ２、ＣＢＬ、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＨＡＮＫ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＳ、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＹＡＰ、ＢＡＤ、カスパーゼ−９、ＦｏｘＯ１、ＦｏｘＯ３、ＦｏｘＯ４、ＩＫＫα、ＣＲＥＢ、ＭＤＭ２、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ２７Ｋｉｐ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲから選択される、ＲＥＴ−ＡＫＴ経路における細胞内タンパク質である。
【００５４】
いくつかの実施形態では、生物学的応答は、ＧＤＦ１５ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質キナーゼのリン酸化と比較した細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、細胞内タンパク質キナーゼであり、細胞内タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼによって直接又は間接的にリン酸化される。ＧＤＦ１５ペプチド及びＧＦＲＡＬは、例えば、薬学的に許容され得る担体を含む１つ以上の好適な治療組成物中に処方され得るか、又は患者への投与のために再構成される前に保存のために包装（例えば、凍結乾燥）され得る。投与は、任意の好適な経路、例えば静脈内、皮下、非経口、筋内等により得る。いくつかの実施形態では、対象は、過体重又は肥満である。いくつかの実施形態では、対象は、２５〜２９．９の肥満度指数を有する。いくつかの他の実施形態では、対象は、３０以上の肥満度指数を有する。いくつかの実施形態では、肥満症関連の障害は、癌、体重障害又は代謝疾患若しくは障害である。いくつかの実施形態では、肥満症関連の障害は、癌、Ｔ２ＤＭ、ＮＡＳＨ、高トリグリセリド血症又は心血管系疾患である。
【００５５】
特定の他の態様において、本開示は、対象の肥満症又は肥満症関連の障害の処置におけるＧＤＦ１５ペプチド及びＧＦＲＡＬ（例えば、可溶性ＧＦＲＡＬ）の使用を提供し、ＧＤＦ１５ペプチドは、例えば、本明細書に記載される検出方法を用いて決定して、ＧＤＦ１５ペプチドと接触された細胞における生物学的応答を誘導し、且つ／又はＧＦＲＡＬシグナリング活性を有し、ＧＦＲＡＬは、ドメインＤ２及びＤ３を含むＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬは、可溶性ＧＦＲＡＬである。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬは、ドメインＤ１を欠いたＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬは、シグナルペプチドを更に含む。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬは、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ又は機能的変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ又は機能的変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬは、配列番号２のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、例えば、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含むＧＦＲＡＬは、親和性タグを更に含む（例えば、親和性タグに融合される）。いくつかの実施形態では、親和性タグは、アミロイドβ前駆体タンパク質（Ａｐｐ）タグ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、ＦＬＡＧタグ若しくはｍｙｃタグ又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬは、配列番号３のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号２５のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬは、ドメインＤ２及びＤ３を含むが、ドメインＤ１を欠いたＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含む可溶性ＧＦＲＡＬである。
【００５６】
いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド及びＧＦＲＡＬは、同時に投与される。いくつかの他の実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド及びＧＦＲＡＬは、連続で投与される。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬは、同じ組成物中にある。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド及びＧＦＲＡＬは、混合物中にある。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド及びＧＦＲＡＬは、複合体中にある。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド及びＧＦＲＡＬは、二元複合体中にある。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、シグナル伝達応答（例えば、ＥＲＫ活性化若しくはシグナリング又はＡＫＴ活性化若しくはシグナリング）である。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、ＧＤＦ１５ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した細胞内のタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、ＲＥＴ−ＥＲＫ、ＲＥＴ−ＡＫＴ、タンパク質キナーゼＣ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＪＮＫ、ｐ３８及びＲＡＣ１経路の１つ以上における細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ＥＲＫ、ＳＨＣ１、ＦＲＳ２、ＧＲＢ２、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＯＳ、ＳＨＡＮＫ３、ＧＲＢ７、ＧＲＢ１０、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２から選択される、ＲＥＴ−ＥＲＫ経路における細胞内タンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ＡＫＴ、ＳＲＣ、ＳＨＣ１、ＧＲＢ２、ＣＢＬ、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＨＡＮＫ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＳ、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＹＡＰ、ＢＡＤ、カスパーゼ−９、ＦｏｘＯ１、ＦｏｘＯ３、ＦｏｘＯ４、ＩＫＫα、ＣＲＥＢ、ＭＤＭ２、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ２７Ｋｉｐ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲから選択される、ＲＥＴ−ＡＫＴ経路における細胞内タンパク質である。
【００５７】
いくつかの実施形態では、生物学的応答は、ＧＤＦ１５ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質キナーゼのリン酸化と比較した細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、細胞内タンパク質キナーゼであり、細胞内タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼによって直接又は間接的にリン酸化される。いくつかの実施形態では、対象は、過体重又は肥満である。いくつかの実施形態では、対象は、２５〜２９．９の肥満度指数を有する。いくつかの他の実施形態では、対象は、３０以上の肥満度指数を有する。いくつかの実施形態では、肥満症関連の障害は、癌、体重障害又は代謝疾患若しくは障害である。いくつかの実施形態では、肥満症関連の障害は、癌、Ｔ２ＤＭ、ＮＡＳＨ、高トリグリセリド血症又は心血管系疾患である。
【００５８】
特定の他の態様において、本開示は、食欲及び／又は体重を低減させる方法を提供し、この方法は、ＧＤＦ１５ペプチド及びＧＦＲＡＬ（例えば、可溶性ＧＦＲＡＬ）を対象に投与することを含み、ＧＤＦ１５ペプチドは、例えば、本明細書に記載される検出方法を用いて決定して、ＧＤＦ１５ペプチドと接触された細胞における生物学的応答を誘導し、且つ／又はＧＦＲＡＬシグナリング活性を有し、ＧＦＲＡＬは、ドメインＤ２及びＤ３を含むＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬは、可溶性ＧＦＲＡＬである。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬは、ドメインＤ１を欠いたＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬは、シグナルペプチドを更に含む。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬは、ドメインＤ１を欠いたＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン及び任意選択的にシグナルペプチドからなる。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬは、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ又は機能的変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ又は機能的変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬは、配列番号２のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、例えば、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含むＧＦＲＡＬは、親和性タグを更に含む（例えば、親和性タグに融合される）。いくつかの実施形態では、親和性タグは、アミロイドβ前駆体タンパク質（Ａｐｐ）タグ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、ＦＬＡＧタグ若しくはｍｙｃタグ又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬは、配列番号３のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号２５のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬは、ドメインＤ２及びＤ３を含むが、ドメインＤ１を欠いたＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含む可溶性ＧＦＲＡＬである。
【００５９】
いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド及びＧＦＲＡＬは、同時に投与される。いくつかの他の実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド及びＧＦＲＡＬは、連続で投与される。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド及びＧＦＲＡＬは、同じ組成物中にある。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド及びＧＦＲＡＬは、混合物中にある。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド及びＧＦＲＡＬは、複合体中にある。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド及びＧＦＲＡＬは、二元複合体中にある。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、シグナル伝達応答（例えば、ＥＲＫ活性化若しくはシグナリング又はＡＫＴ活性化若しくはシグナリング）である。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、ＧＤＦ１５ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した細胞内のタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、ＲＥＴ−ＥＲＫ、ＲＥＴ−ＡＫＴ、タンパク質キナーゼＣ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＪＮＫ、ｐ３８及びＲＡＣ１経路の１つ以上における細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ＥＲＫ、ＳＨＣ１、ＦＲＳ２、ＧＲＢ２、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＯＳ、ＳＨＡＮＫ３、ＧＲＢ７、ＧＲＢ１０、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２から選択される、ＲＥＴ−ＥＲＫ経路における細胞内タンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ＡＫＴ、ＳＲＣ、ＳＨＣ１、ＧＲＢ２、ＣＢＬ、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＨＡＮＫ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＳ、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＹＡＰ、ＢＡＤ、カスパーゼ−９、ＦｏｘＯ１、ＦｏｘＯ３、ＦｏｘＯ４、ＩＫＫα、ＣＲＥＢ、ＭＤＭ２、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ２７Ｋｉｐ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲから選択される、ＲＥＴ−ＡＫＴ経路における細胞内タンパク質である。
【００６０】
いくつかの実施形態では、生物学的応答は、ＧＤＦ１５ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質キナーゼのリン酸化と比較した細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、細胞内タンパク質キナーゼであり、細胞内タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼによって直接又は間接的にリン酸化される。ＧＤＦ１５ペプチド及びＧＦＲＡＬは、例えば、薬学的に許容され得る担体を含む１つ以上の好適な治療組成物中に処方され得るか、又は患者への投与のために再構成される前に保存のために包装（例えば、凍結乾燥）され得る。投与は、任意の好適な経路、例えば静脈内、皮下、非経口、筋内等により得る。いくつかの実施形態では、対象は、過体重又は肥満である。いくつかの実施形態では、対象は、２５〜２９．９の肥満度指数を有する。いくつかの他の実施形態では、対象は、３０以上の肥満度指数を有する。
【００６１】
特定の他の態様において、本開示は、対象の食欲及び／又は体重の低減におけるＧＤＦ１５ペプチド及びＧＦＲＡＬ（例えば、可溶性ＧＦＲＡＬ）の使用を提供し、ＧＤＦ１５ペプチドは、例えば、本明細書に記載される検出方法を用いて決定して、ＧＤＦ１５ペプチドと接触された細胞における生物学的応答を誘導し、且つ／又はＧＦＲＡＬシグナリング活性を有し、ＧＦＲＡＬは、ドメインＤ２及びＤ３を含むＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬは、可溶性ＧＦＲＡＬである。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬは、ドメインＤ１を欠いたＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬは、シグナルペプチドを更に含む。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬは、ドメインＤ１を欠いたＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン及び任意選択的にシグナルペプチドからなる。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬは、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ又は機能的変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ又は機能的変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬは、配列番号２のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、例えば、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含むＧＦＲＡＬは、親和性タグを更に含む（例えば、親和性タグに融合される）。いくつかの実施形態では、親和性タグは、アミロイドβ前駆体タンパク質（Ａｐｐ）タグ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、ＦＬＡＧタグ若しくはｍｙｃタグ又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬは、配列番号３のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号２５のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬは、ドメインＤ２及びＤ３を含むが、ドメインＤ１を欠いたＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含む可溶性ＧＦＲＡＬである。
【００６２】
いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド及びＧＦＲＡＬは、同時に投与される。いくつかの他の実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド及びＧＦＲＡＬは、連続で投与される。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬは、同じ組成物中にある。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド及びＧＦＲＡＬは、混合物中にある。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド及びＧＦＲＡＬは、複合体中にある。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド及びＧＦＲＡＬは、二元複合体中にある。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、シグナル伝達応答（例えば、ＥＲＫ活性化若しくはシグナリング又はＡＫＴ活性化若しくはシグナリング）である。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、ＧＤＦ１５ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した細胞内のタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、ＲＥＴ−ＥＲＫ、ＲＥＴ−ＡＫＴ、タンパク質キナーゼＣ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＪＮＫ、ｐ３８及びＲＡＣ１経路の１つ以上における細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ＥＲＫ、ＳＨＣ１、ＦＲＳ２、ＧＲＢ２、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＯＳ、ＳＨＡＮＫ３、ＧＲＢ７、ＧＲＢ１０、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２から選択される、ＲＥＴ−ＥＲＫ経路における細胞内タンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ＡＫＴ、ＳＲＣ、ＳＨＣ１、ＧＲＢ２、ＣＢＬ、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＨＡＮＫ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＳ、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＹＡＰ、ＢＡＤ、カスパーゼ−９、ＦｏｘＯ１、ＦｏｘＯ３、ＦｏｘＯ４、ＩＫＫα、ＣＲＥＢ、ＭＤＭ２、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ２７Ｋｉｐ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲから選択される、ＲＥＴ−ＡＫＴ経路における細胞内タンパク質である。
【００６３】
いくつかの実施形態では、生物学的応答は、ＧＤＦ１５ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質キナーゼのリン酸化と比較した細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、細胞内タンパク質キナーゼであり、細胞内タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼによって直接又は間接的にリン酸化される。いくつかの実施形態では、対象は、過体重又は肥満である。いくつかの実施形態では、対象は、２５〜２９．９の肥満度指数を有する。いくつかの他の実施形態では、対象は、３０以上の肥満度指数を有する。
【００６４】
本明細書に記載される治療方法及び使用のいくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列又はその機能的変異体（配列番号１４、１５、１６又は１７のアミノ酸配列を含む）を含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド又は機能的変異体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド又は機能的変異体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチドは、親和性タグ、融合、抱合、ペグ化及び／又はグリコシル化を含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチドは、アミロイドβ前駆体タンパク質（Ａｐｐ）タグ、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ若しくはｍｙｃタグ又はそれらの組み合わせでタグ化される。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチドは、ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−１−アンチトリプシンに融合される。他の実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチドは、脂肪酸に抱合される。
【００６５】
更に他の態様では、本開示は、ＧＦＲＡＬリガンド（例えば、ＧＤＦ１５ペプチド）に結合することができるＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを提供する。本開示は、より詳細には、様々な実施形態において、ドメインＤ２及びＤ３を含むＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを提供する。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、ドメインＤ１を欠く。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、ドメインＤ２及びＤ３を含み、且つドメインＤ１を欠く。いくつかの実施形態では、ドメインＤ１を欠くＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、ドメインＤ１を含むＧＦＲＡＬ細胞外ドメインと比較してＧＤＦ１５への結合活性の増大を示す。いくつかの実施形態では、ドメインＤ１を欠くＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインがＧＤＦ１５に結合されるか又はＧＤＦ１５と複合体化されるとき、ドメインＤ１を含むＧＦＲＡＬ細胞外ドメインと比較してＲＥＴ活性化及び／又はシグナリングの効力の増大を示す。
【００６６】
いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、細胞表面上に発現されない。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、テザーによって細胞表面に付着される。いくつかの他の実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、可溶性である。
【００６７】
様々な実施形態において、本開示は、ドメインＤ２及びＤ３を含むＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含む可溶性ＧＦＲＡＬも提供する。いくつかの実施形態では、可溶性ＧＦＲＡＬは、ドメインＤ１を欠いたＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、可溶性ＧＦＲＡＬは、シグナルペプチドを更に含む。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬは、ドメインＤ１を欠いたＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン及び任意選択的にシグナルペプチドからなる。いくつかの実施形態では、可溶性ＧＦＲＡＬは、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、可溶性ＧＦＲＡＬ又は機能的変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、可溶性ＧＦＲＡＬ又は機能的変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、可溶性ＧＦＲＡＬは、配列番号２のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、例えば、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含む可溶性ＧＦＲＡＬ又はその機能的変異体は、親和性タグを更に含む（例えば、親和性タグに融合される）。いくつかの実施形態では、親和性タグは、アミロイドβ前駆体タンパク質（Ａｐｐ）タグ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、ＦＬＡＧタグ若しくはｍｙｃタグ又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、可溶性ＧＦＲＡＬ又はその機能的変異体は、配列番号３のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号２５のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含む。
【００６８】
更に他の態様では、本開示は、ＧＤＦ１５活性を調節することができる薬剤を同定する方法及びそのような薬剤を医薬組成物中に処方する方法を提供する。
【００６９】
例えば、特定の態様において、本開示は、ＧＤＦ１５活性を調節することができる薬剤を同定する方法を提供し、この方法は、（ａ）単離及び改変された細胞を薬剤及びＧＤＦ１５ペプチドと接触させることと；（ｂ）接触された細胞における生物学的応答を検出することとを含み、細胞は、ドメインＤ２及びＤ３を含むＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン並びに細胞表面受容体キナーゼを発現し；薬剤は、接触された細胞における生物学的応答が、薬剤の非存在下でＧＤＦ１５ペプチドと接触された細胞における生物学的応答に対して増大又は減少される場合、ＧＤＦ１５活性を調節すると決定される。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗ＧＤＦ１５抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗ＧＦＲＡＬ抗体である。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列又はその機能的変異体（配列番号１４、１５、１６又は１７のアミノ酸配列を含む）を含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド又は機能的変異体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド又は機能的変異体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチドは、親和性タグ、融合、抱合、ペグ化及び／又はグリコシル化を含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチドは、アミロイドβ前駆体タンパク質（Ａｐｐ）タグ、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ若しくはｍｙｃタグ又はそれらの組み合わせでタグ化される。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチドは、ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−１−アンチトリプシンに融合される。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチドは、脂肪酸に抱合される。
【００７０】
特定の態様において、本開示は、ＧＤＦ１５活性を調節することができる薬剤を同定する方法を提供し、この方法は、（ａ）細胞表面受容体キナーゼを発現する細胞を提供することと；（ｂ）細胞をＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬと接触させることと；（ｃ）前記細胞を薬剤と接触させることと；（ｄ）接触された細胞における生物学的応答を検出することとを含み、可溶性ＧＦＲＡＬは、ドメインＤ２及びＤ３を含むＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含み、且つドメインＤ１を欠く。いくつかの実施形態では、薬剤は、接触された細胞における生物学的応答が、ＧＤＦ１５ペプチド、可溶性ＧＦＲＡＬ及び薬剤の存在下において、薬剤の非存在下でＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬと接触された細胞における生物学的応答に対して増大される場合、ＧＤＦ１５活性を調節するか又は増大させると決定される。他の実施形態では、薬剤は、接触された細胞における生物学的応答が、ＧＤＦ１５ペプチド、可溶性ＧＦＲＡＬ及び薬剤の存在下において、薬剤の非存在下でＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬと接触された細胞における生物学的応答に対して減少される場合、ＧＤＦ１５活性を調節するか又は減少させると決定される。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗ＧＤＦ１５抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗ＧＦＲＡＬ抗体である。
【００７１】
いくつかの実施形態では、可溶性ＧＦＲＡＬは、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む。いくつかの実施形態では、可溶性ＧＦＲＡＬ又は機能的変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、可溶性ＧＦＲＡＬ又は機能的変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、例えば、配列番号１又は配列番号２を含む可溶性ＧＦＲＡＬは、親和性タグを更に含む（例えば、親和性タグに融合される）。いくつかの実施形態では、親和性タグは、アミロイドβ前駆体タンパク質（Ａｐｐ）タグ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、ＦＬＡＧタグ若しくはｍｙｃタグ又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、可溶性ＧＦＲＡＬ又はその機能的変異体は、配列番号３のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号２５のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含む。
【００７２】
いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列又はその機能的変異体（配列番号１４、１５、１６又は１７のアミノ酸配列を含む）を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド又は機能的変異体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド又は機能的変異体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド又は機能的変異体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチドは、親和性タグ、融合、抱合、ペグ化及び／又はグリコシル化を更に含む（例えば、融合される）。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチドは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ若しくはｍｙｃタグ又はそれらの組み合わせでタグ化される。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチドは、ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−１−アンチトリプシンに融合される。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチドは、脂肪酸に抱合される。
【００７３】
特定の他の態様において、本開示は、薬剤を含む医薬組成物を製造する方法であって、（ａ）本明細書に記載される例示的な同定方法のいずれかにより、ＧＤＦ１５活性を調節することができる薬剤を同定することと；（ｂ）薬剤を医薬組成物中に処方することとを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗ＧＤＦ１５抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗ＧＦＲＡＬ抗体である。
【００７４】
特定の他の態様において、本開示は、対象における肥満症又は肥満症関連の障害を処置する方法であって、（ａ）本明細書に記載される例示的な同定方法のいずれかにより、ＧＤＦ１５活性を調節することができる薬剤を同定することと；（ｂ）薬剤を対象に投与することとを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗ＧＤＦ１５抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗ＧＦＲＡＬ抗体である。いくつかの実施形態では、対象は、過体重又は肥満である。いくつかの実施形態では、対象は、２５〜２９．９の肥満度指数を有する。いくつかの実施形態では、対象は、３０以上の肥満度指数を有する。いくつかの実施形態では、肥満症関連の障害は、癌、体重障害又は代謝疾患若しくは障害である。いくつかの実施形態では、肥満症関連の障害は、癌、Ｔ２ＤＭ、ＮＡＳＨ、高トリグリセリド血症又は心血管系疾患である。
【００７５】
特定の他の態様において、本開示は、対象における食欲及び／又は体重を低減させる方法であって、（ａ）本明細書に記載される例示的な同定方法のいずれかにより、ＧＤＦ１５活性を調節することができる薬剤を同定することと；（ｂ）薬剤を対象に投与することとを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗ＧＤＦ１５抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗ＧＦＲＡＬ抗体である。いくつかの実施形態では、対象は、過体重又は肥満である。いくつかの実施形態では、対象は、２５〜２９．９の肥満度指数を有する。いくつかの実施形態では、対象は、３０以上の肥満度指数を有する。
【００７６】
一態様では、ＧＤＦ１５ペプチドの活性を検出する方法であって、（ｉ）（ａ）細胞表面受容体キナーゼを発現する細胞を提供することと；（ｂ）細胞をＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬと接触させることであって、可溶性ＧＦＲＡＬは、ドメインＤ２及びＤ３を含むＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含む、接触させることと；（ｃ）接触された細胞における生物学的応答を検出することと；又は（ｉｉ）（ａ）細胞表面受容体キナーゼ並びにドメインＤ２及びＤ３を含むＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを発現する細胞を提供することと；（ｂ）細胞をＧＤＦ１５ペプチドと接触させることと；（ｃ）接触された細胞における生物学的応答を検出することとを含む方法が本明細書に提供される。
【００７７】
いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、ドメインＤ１を欠く。いくつかの実施形態では、方法は、細胞表面受容体キナーゼ及びＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを発現する細胞を提供することを含み、（ｉ）ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、可溶性ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインであるか、又は（ｉｉ）ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、テザーによって細胞表面に付着される。
【００７８】
いくつかの実施形態では、テザーは、（ｉ）ＧＦＲＡＬ膜貫通ドメイン又はその機能的断片であるか；（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか；（ｉｉｉ）ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインに融合された異種膜貫通ドメインであるか；（ｉｖ）グリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）であるか；（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体、配列番号２０のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号２１のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含むか；（ｖｉ）膜挿入配列であるか、（ｖｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号２３のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含むか；又は（ｖｉｉｉ）膜挿入脂肪酸である。
【００７９】
いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、シグナルペプチドを更に含む。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ及びｍｙｃタグから選択される親和性タグでタグ化される。
【００８０】
いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか；（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するか；（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するか；（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか；（ｖ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するか；（ｖｉ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するか；（ｖｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか；又は（ｖｉｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む。
【００８１】
いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド又はその機能的変異体は、（ｉ）配列番号１３、１４、１５、１６若しくは１７のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか；（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するか；又は（ｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００８２】
いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチドは、（ｉ）アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ及びｍｙｃタグから選択される親和性タグでタグ化され；（ｉｉ）ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−１−アンチトリプシンに融合され；（ｉｉｉ）脂肪酸に抱合され；（ｉｖ）ペグ化を有し、及び／又は（ｖ）グリコシル化を有する。いくつかの実施形態では、細胞表面受容体キナーゼは、（ｉ）内因性細胞表面受容体キナーゼ；（ｉｉ）外因性細胞表面受容体キナーゼ；及び／又は（ｉｉｉ）ＲＥＴ受容体チロシンキナーゼである。
【００８３】
いくつかの実施形態では、細胞は、（ｉ）内因性ＧＦＲＡＬ；（ｉｉ）全長ＧＦＲＡＬ；及び／又は（ｉｉｉ）内因性ＧＤＦ１５を発現しない。いくつかの実施形態では、細胞は、無効ＧＤＦ１５遺伝子を含むＧＤＦ１５ノックアウト（ＫＯ）細胞である。
【００８４】
いくつかの実施形態では、生物学的応答は、（ｉ）ＧＤＦ１５ペプチド、可溶性ＧＦＲＡＬ又はＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン及び細胞表面受容体キナーゼが三元複合体を形成するときに誘導され；（ｉｉ）可溶性ＧＦＲＡＬの非存在下でＧＤＦ１５ペプチドと接触された細胞において誘導されず；及び／又は（ｉｉｉ）ＧＤＦ１５ペプチド及び／又は可溶性ＧＦＲＡＬと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した細胞内のタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、ＲＥＴ−ＥＲＫ、ＲＥＴ−ＡＫＴ、タンパク質キナーゼＣ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＪＮＫ、ｐ３８及びＲＡＣ１経路の１つ以上における細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。
【００８５】
いくつかの実施形態では、細胞表面受容体キナーゼは、ＲＥＴ受容体チロシンキナーゼであり、及びタンパク質は（ｉ）ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ＳＨＣ１、ＦＲＳ２、ＧＲＢ２、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＯＳ、ＳＨＡＮＫ３、ＧＲＢ７、ＧＲＢ１０、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２又はその任意の下流標的から選択される、ＲＥＴ−ＥＲＫ経路における細胞内タンパク質であるか；又は（ｉｉ）ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＳＲＣ、ＳＨＣ１、ＧＲＢ２、ＣＢＬ、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＨＡＮＫ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＳ、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＹＡＰ、ＢＡＤ、カスパーゼ−９、ＦｏｘＯ１、ＦｏｘＯ３、ＦｏｘＯ４、ＩＫＫα、ＣＲＥＢ、ＭＤＭ２、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ２７Ｋｉｐ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲ又はその任意の下流標的から選択される、ＲＥＴ−ＡＫＴ経路における細胞内タンパク質である。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、ＧＤＦ１５ペプチド及び／又は可溶性ＧＦＲＡＬと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質キナーゼのリン酸化と比較した細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である。
【００８６】
いくつかの実施形態では、（ｉ）タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼであるか；（ｉｉ）タンパク質キナーゼ及び／又は細胞表面受容体キナーゼは、ＲＥＴ受容体チロシンキナーゼであるか；又は（ｉｉｉ）タンパク質キナーゼは、細胞内タンパク質キナーゼであり、細胞内タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼによって直接又は間接的にリン酸化される。いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、（ｉ）ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２又はその任意の下流標的から選択される、ＲＥＴ−ＥＲＫ経路における細胞内タンパク質キナーゼであるか；又は（ｉｉ）ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＳＲＣ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲ又はその任意の下流標的から選択される、ＲＥＴ−ＡＫＴ経路における細胞内タンパク質キナーゼである。
【００８７】
一態様において、ＧＤＦ１５ペプチドの活性を検出するための単離及び改変された細胞が本明細書に提供され、細胞は、ドメインＤ２及びＤ３を含むＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン並びに細胞表面受容体キナーゼを発現する。
【００８８】
いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、ドメインＤ１を欠く。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、（ｉ）可溶性ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインであるか；又は（ｉｉ）テザーによって細胞表面に付着される。いくつかの実施形態では、テザーは、（ｉ）ＧＦＲＡＬ膜貫通ドメイン又はその機能的断片であるか；（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか；（ｉｉｉ）ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインに融合された異種膜貫通ドメインであるか；（ｉｖ）グリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）であるか；（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体、配列番号２０のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号２１のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含むか；（ｖｉ）膜挿入配列であるか；（ｖｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号２３のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含むか；又は（ｖｉｉｉ）膜挿入脂肪酸である。
【００８９】
いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、シグナルペプチドを更に含む。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ及びｍｙｃタグから選択される親和性タグでタグ化される。
【００９０】
いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか；（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するか；（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するか；（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか；（ｖ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するか；（ｖｉ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するか；（ｖｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか；又は（ｖｉｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む。いくつかの実施形態では、細胞表面受容体キナーゼは、（ｉ）内因性細胞表面受容体キナーゼ；（ｉｉ）外因性細胞表面受容体キナーゼ；及び／又は（ｉｉｉ）ＲＥＴ受容体チロシンキナーゼである。
【００９１】
いくつかの実施形態では、細胞は、（ｉ）内因性ＧＦＲＡＬ；（ｉｉ）全長ＧＦＲＡＬ；及び／又は（ｉｉｉ）内因性ＧＤＦ１５を発現しない。いくつかの実施形態では、細胞は、無効ＧＤＦ１５遺伝子を含むＧＤＦ１５ノックアウト（ＫＯ）細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞、ヒト細胞、ＭＣＦ７細胞、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞及びＨＥＫ２９３Ａ−ＧＤＦ１５  ＫＯ細胞から選択される。
【００９２】
一態様では、ＧＤＦ１５ペプチドの活性を決定するためのキットであって、ＧＤＦ１５ペプチドと接触するための、請求項１９〜２９のいずれか一項に記載の細胞と；接触された細胞における生物学的応答を検出する手段とを含むキットが本明細書に提供される。
【００９３】
一態様では、ドメインＤ２及びＤ３を含むＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含む可溶性ＧＦＲＡＬが本明細書に提供される。
【００９４】
いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、ドメインＤ１を欠く。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、シグナルペプチドを更に含む。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ及びｍｙｃタグから選択される親和性タグでタグ化される。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか；（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するか；（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するか；（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか；（ｖ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するか；（ｖｉ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するか；（ｖｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか；又は（ｖｉｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む。
【００９５】
一態様では、ＧＤＦ１５活性を調節することができる薬剤を同定する方法が本明細書に提供され、この方法は、（ａ）請求項１９〜２９のいずれか一項に記載の細胞を薬剤及びＧＤＦ１５ペプチドと接触させることと；（ｂ）接触された細胞における生物学的応答を検出することとを含み、薬剤は、接触された細胞における生物学的応答が、薬剤の非存在下でＧＤＦ１５ペプチドと接触された細胞における生物学的応答に対して増大又は減少される場合、ＧＤＦ１５活性を調節すると決定される。
【００９６】
一態様では、ＧＤＦ１５活性を調節することができる薬剤を同定する方法が本明細書に提供され、この方法は、（ａ）細胞表面受容体キナーゼを発現する細胞を提供することと；（ｂ）細胞をＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬと接触させることであって、可溶性ＧＦＲＡＬは、ドメインＤ２及びＤ３を含むＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含み、且つドメインＤ１を欠く、接触させることと；（ｃ）前記細胞を薬剤と接触させることと；（ｄ）接触された細胞における生物学的応答を検出することとを含み、薬剤は、（ｉ）接触された細胞における生物学的応答が、ＧＤＦ１５ペプチド、可溶性ＧＦＲＡＬ及び薬剤の存在下において、薬剤の非存在下でＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬと接触された細胞における生物学的応答に対して増大される場合、ＧＤＦ１５活性を調節するか又は増大させるか；又は（ｉｉ）接触された細胞における生物学的応答が、ＧＤＦ１５ペプチド、可溶性ＧＦＲＡＬ及び薬剤の存在下において、薬剤の非存在下でＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬと接触された細胞における生物学的応答に対して減少される場合、ＧＤＦ１５活性を調節するか又は減少させると決定される。
【００９７】
いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ及びｍｙｃタグから選択される親和性タグでタグ化される。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか；（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するか；（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するか；（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか；（ｖ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するか；（ｖｉ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するか；（ｖｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか；又は（ｖｉｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗ＧＤＦ１５抗体及び抗ＧＦＲＡＬ抗体から選択される抗体である。
【００９８】
いくつかの実施形態では、生物学的応答は、ＲＥＴ−ＥＲＫ、ＲＥＴ−ＡＫＴ、タンパク質キナーゼＣ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＪＮＫ、ｐ３８及びＲＡＣ１経路の１つ以上における細胞内タンパク質の発現、活性又はリン酸化レベルの増大又は減少である。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質は、ＲＥＴ−ＥＲＫ経路にあり、且つＥＲＫ、ＳＨＣ１、ＦＲＳ２、ＧＲＢ２、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＯＳ、ＳＨＡＮＫ３、ＧＲＢ７、ＧＲＢ１０、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２から選択される。いくつかの実施形態では、細胞内タンパク質は、ＲＥＴ−ＡＫＴ経路にあり、且つＡＫＴ、ＳＲＣ、ＳＨＣ１、ＧＲＢ２、ＣＢＬ、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＨＡＮＫ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＳ、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＹＡＰ、ＢＡＤ、カスパーゼ−９、ＦｏｘＯ１、ＦｏｘＯ３、ＦｏｘＯ４、ＩＫＫα、ＣＲＥＢ、ＭＤＭ２、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ２７Ｋｉｐ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲから選択される。
【００９９】
いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド又はその機能的変異体は、（ｉ）配列番号１３、１４、１５、１６若しくは１７のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含むか；（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するか；又は（ｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１００】
いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチドは、（ｉ）アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ及びｍｙｃタグから選択される親和性タグでタグ化され；（ｉｉ）ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−１−アンチトリプシンに融合され；（ｉｉｉ）脂肪酸に抱合され；（ｉｖ）ペグ化を有し；及び／又は（ｖ）グリコシル化を有する。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】例示的なヒトＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）コンストラクトを示す。全長ＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｈｉｓは、膜貫通ドメイン及びＣ末端細胞質テールの削除と、６−ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグの追加により作製した。ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐは、ドメインＤ１（ＧＤＮＦ受容体（ＧＦＲα１）相同体Ｄ１）及び膜近位領域（Ｘ）の削除と、アミロイドβ前駆体タンパク質（Ａｐｐ）エピトープタグの追加により作製した。ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ｈｉｓは、ドメインＤ１（ＧＤＮＦ受容体（ＧＦＲα１）相同体Ｄ１）及び膜近位領域（Ｘ）の削除と、６−ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグの追加により作製した。ＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｆｃは、ＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）をヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）定常領域（Ｆｃ）ドメインに融合することにより作製した。ヒトｃＲＥＴ（ＥＣＤ）−Ｆｃは、ヒトＲＥＴ細胞外ドメイン（ＲＥＴ−ＥＣＤ）をヒトＩｇＧ１  Ｆｃと融合することにより作製した。Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５、Ｎ末端６ヒスチジンタグ化ヒトＧＤＦ１５も作製した。略語：Ｓ．Ｐ．−  ＣＤ３３シグナルペプチド；Ｄ１〜Ｄ３  −  ＧＤＮＦ受容体（ＧＦＲα１）相同体のドメインＤ１〜Ｄ３；Ａｐｐ  −  アミロイドβ前駆体タンパク質；Ｘ  −  ドメインＤ３と膜貫通ドメインとの間の未知機能の領域；ＥＣＤ  −  細胞外ドメイン；ＲＥＴ  −  トランスフェクション中に再配列された。
【図２−１】図２：図２Ａは、例示的なＨｉｓ−ＧＤＦ１５及びＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐコンストラクトを示す。図２Ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による画分のスクリーニングを示す。図２Ｂに示す単一タンパク質バンドは、ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐモノマー（２４．６ｋＤ）及びＨｉｓ−ＧＤＦ１５ダイマー（ダイマーが２６．６ｋＤ、モノマーが１３．３ｋＤ）の両方を含む。
【図２−２】（上記の通り。）
【図３】還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより明らかなように、数個の画分から濃縮した複合体が共発現ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ及びＨｉｓ−ＧＤＦ１５を含むことを示す。複合体は、２４．６ｋＤ  ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ及び１３．３ｋＤ  Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５を含む。
【図４−１】図４：図４Ａは、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した、Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｆｃ複合体を含む画分を示す。図４Ｂは、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより明らかなように、図４Ａの画分から濃縮した複合体がＨｉｓ−ＧＤＦ１５及びＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｆｃを含むことを示す。
【図４−２】（上記の通り。）
【図５】様々なタンパク質濃度（０〜５  ｌｏｇ１０ｐＭ）での、精製組換え可溶性ＧＦＲＡＬ  ＥＣＤ変異体と組み合わせた精製Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５複合体の、ｃＲＥＴ（ＥＣＤ）−Ｆｃ被覆プレートに対する結合活性を示す。
【図６】様々なタンパク質濃度（０〜５  ｌｏｇ１０ｐＭ）での、Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５及びＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｈｉｓ又はＨｉｓ−ＧＤＦ１５（Ｌ２９４Ｒ）及びＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｈｉｓの精製混合物の、ｃＲＥＴ（ＥＣＤ）−Ｆｃ被覆プレートに対する結合活性を示す。
【図７】ウェスタンブロットによって分析した、培地（レーン１）；ＧＤＮＦ  −  ３．３ｎＭ（ＧＦＲα／ＲＥＴの＋対照）（レーン２）；精製Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ複合体  −  ２７．８ｎＭ（レーン３）；精製Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ複合体  −  ８３．３ｎＭ（レーン４）；精製Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ複合体  −  ２５０ｎＭ（レーン５）；精製Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｆｃ複合体  −  ２７．８ｎＭ（レーン６）；精製Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｆｃ複合体  −  ８３．３ｎＭ（レーン７）；精製Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｆｃ複合体  −  ２５０ｎＭ（レーン８）；Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５単独  −  ２５０ｎＭ（レーン９）；ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ単独  −  ２５０ｎＭ（レーン１０）；ＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｆｃ単独  −  ２５０ｎＭ（レーン１１）；細胞への添加前に６０分間培地中で形成されたＨｉｓ−ＧＤＦ１５＋ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ  −  各成分２５０ｎＭ（レーン１２）で１５分処理した後のＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるＥＲＫ及びＡＫＴのリン酸化を示す。レーン３〜８の場合、ＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ複合体は、共トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｆ細胞の上清から共発現及び共精製された。
【図８】ウェスタンブロットによって分析した、培地（レーン１）；ＧＤＮＦ  −  ３．３ｎＭ（ＧＦＲα／ＲＥＴの＋対照）（レーン２）；精製Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ複合体  −  ２７．８ｎＭ（レーン３）；精製Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ複合体  −  ８３．３ｎＭ（レーン４）；精製Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ複合体  −  ２５０ｎＭ（レーン５）；精製Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｆｃ複合体  −  ２７．８ｎＭ（レーン６）；精製Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｆｃ複合体  −  ８３．３ｎＭ（レーン７）；精製Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｆｃ複合体  −  ２５０ｎＭ（レーン８）；Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５単独  −  ２５０ｎＭ（レーン９）；ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ単独  −  ２５０ｎＭ（レーン１０）；ＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｆｃ単独  −  ２５０ｎＭ（レーン１１）；及び細胞への添加前に６０分間培地中で形成されたＨｉｓ−ＧＤＦ１５＋ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ  −  各成分２５０ｎＭ（レーン１２）で１５分処理した後のＭＣＦ７細胞におけるＥＲＫ及びＡＫＴのリン酸化を示す。レーン３〜８の場合、ＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ複合体は、共トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｆ細胞の上清から共発現及び共精製された。
【図９】ウェスタンブロットによって分析した、培地（レーン１）；ＧＤＮＦ  −  ３．３ｎＭ（レーン２）；ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ＋Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５  −  ２８ｎＭ（各々）（レーン３）；ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ＋Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５  −  ８３ｎＭ（レーン４）；ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ＋Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５  −  ２５０ｎＭ（レーン５）；培地（レーン７）；ＧＤＮＦ  −  ３．３ｎＭ（レーン８）；ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ＋Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５  −  ２８ｎＭ（レーン９）；ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ＋Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５  −  ８３ｎＭ（レーン１０）；及びＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ＋Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５  −  ２５０ｎＭ（レーン１２）で１５分処理した後の、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ及びＭＣＦ７細胞におけるＥＲＫ及びＡＫＴの濃度依存的リン酸化を示す。ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ＋Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５は、培地中で混合し、処理前に室温で１時間インキュベートした。
【図１０−１】図１０：図１０Ａ〜Ｂは、ウェスタンブロットによって分析した、ＧＤＮＦ  −  １５分（レーン１）；培地  −  ５分（レーン２）；ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ＋Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５  −  ５分（レーン３）；培地  −  １０分（レーン４）；ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ＋Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５  −  １０分（レーン５）；培地  −  １５分（レーン６）；ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ＋Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５  −  １５分（レーン７）；培地  −  １５分（レーン８）；及びＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ＋Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５  −  １５分、複合体のプレインキュベーションなし（レーン９）で５〜１５分処理した後のＭＣＦ７細胞（図１０Ａ）及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（図１０Ｂ）におけるＥＲＫ及びＡＫＴのリン酸化を示す。
【図１０−２】（上記の通り。）
【図１１−１】図１１：図１１Ａ〜Ｂは、ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ又は全長ＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）と再構成（予備混合）した場合のＭＣＦ７細胞ＥＲＫリン酸化誘導に対する精製ＧＤＦ１５タンパク質の異なる形態の効力を示す。データは、絶対ホスホ−ＥＲＫ  ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイシグナル単位（図１１Ａ）及び培地対照と比較したリン酸化ＥＲＫシグナルの倍数増加（図１１Ｂ）として表される。
【図１１−２】（上記の通り。）
【図１２−１】図１２：図１２Ａ〜Ｂは、ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ又は全長ＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）と再構成（予備混合）した場合のＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞ＥＲＫリン酸化誘導に対する精製ＧＤＦ１５タンパク質の異なる形態の効力を示す。データは、絶対ホスホ−ＥＲＫ  ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイシグナル単位（図１２Ａ）及び培地対照と比較したリン酸化ＥＲＫシグナルの倍数増加（図１２Ｂ）として表される。
【図１２−２】（上記の通り。）
【発明を実施するための形態】
【０１０２】
本開示をより容易に理解できるようにするために、特定の用語が詳細な説明全体を通して定義されている。本明細書で特に定義しない限り、本開示に関連して使用される全ての科学及び技術用語は、当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【０１０３】
本明細書で使用される「ＧＦＲＡＬ」又は「ＧＤＮＦファミリー受容体α−様」は、（１）ＧＤＦ１５に結合し；及び（２）ＧＤＦ１５と複合体化されるとき、全長ＧＦＲＡＬに関連した生物学的応答、例えばＲＥＴ細胞表面受容体への結合及びその活性化を促進し、且つ／又はＧＤＦ１５刺激に対する応答おける細胞内シグナリング（例えば、ＲＥＴ−ＥＲＫシグナリング、ＲＥＴ−ＡＫＴシグナリング）を促進することができる、任意の天然に存在する全長ＧＦＲＡＬ受容体ポリペプチドのアミノ酸配列を有するＧＦＲＡＬ受容体ポリペプチド又はその任意の変異体若しくは機能性断片を指す。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬは、全長哺乳動物ＧＦＲＡＬ（例えば、ヒト、サル、ラット又はマウスＧＦＲＡＬ）又はその変異体若しくは機能性断片である。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬは、全長ヒトＧＦＲＡＬ又はその変異体若しくは機能性断片である。ヒトＧＦＲＡＬに関する例示的なアミノ酸及び核酸配列が本明細書に提供される。例えば、全長ヒトＧＦＲＡＬに関する例示的な配列（アミノ酸：配列番号９（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｒｅｆ．配列：Ｑ６ＵＸＶ０）；核酸：配列番号２４（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆ．配列：ＮＭ＿２０７４１０．２））並びにその例示的な変異体及び機能性断片を含む表１を参照されたい。例示的なヒトＧＦＲＡＬは、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ２００５；９５（２）：３６１−７６）及び国際公開第２００３／０７６５６９号パンフレットにも記載されている。
【０１０４】
本明細書で使用される用語「受容体」は、「リガンド」と呼ばれる生理活性分子に結合する細胞関連タンパク質を指す。いくつかの実施形態では、受容体は、ＧＦＲＡＬであり、リガンドは、ＧＤＦ１５である。本開示のＧＦＲＡＬ受容体ポリペプチドは、「膜結合」又は「可溶性」であり得る。
【０１０５】
本明細書で使用される「ＧＦＲＡＬリガンド」は、ＧＦＲＡＬ受容体ポリペプチドに結合する生理活性分子又はその変異体若しくは機能性断片を指す。ＧＦＲＡＬリガンドは、ＧＦＲＡＬの拮抗薬又は作動薬であり得る。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬリガンドは、ＧＤＦ１５ペプチドである。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチドは、全長ペプチド又はＧＦＲＡＬを作動若しくは拮抗する能力を保持するその断片であり得る。いくつかの実施形態では、ペプチド又は断片は、追加のペプチド又は他の治療的、薬物動態学的又は担体部分に更に抱合又は融合され得る。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチドは、脂肪酸に抱合され得る。例えば、脂肪酸抱合ＧＤＦ１５ペプチドは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／２０００７８号パンフレットに開示されている任意のそのようなペプチドであり得る。いくつかの他の実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチドは、血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又はマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）に融合され得る。更に他の実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチドは、α−１−アンチトリプシン又は免疫グロブリン定常領域（例えば、免疫グロブリンＧ１定常領域）に融合され得る。ＧＤＦ１５融合ペプチドは、例えば、両方とも参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／１９８１９９号パンフレット又は国際公開第２０１７／１０９７０６号パンフレットに開示されている任意のそのようなペプチドであり得る。いくつかの他の実施形態では、ペプチド又は断片は、修飾ペプチド又は断片が非修飾ＧＤＦ１５ペプチドの１つ以上の機能を保持するように、例えば配列バリエーションを組み込むことにより、ペプチド若しくは断片のＮ−及び／若しくはＣ末端に短いペプチド配列を付加することにより、且つ／又はペグ化及び／若しくはグリコシル化することにより、更に修飾され得る。
【０１０６】
本明細書で使用される「可溶性ＧＦＲＡＬ」は、細胞膜に結合しないか又は細胞膜中に固定されないＧＦＲＡＬ受容体ポリペプチド又はその変異体若しくは機能性断片を指す。可溶性受容体ポリペプチドは、通常、膜貫通及び細胞内ドメイン又は細胞膜に対する他の結合、例えばグリコホスホイノシトールを欠くリガンド結合受容体ポリペプチドである。可溶性受容体ポリペプチドは、追加のアミノ酸残基、例えば免疫グロブリン定常領域配列（例えば、ヒト免疫グロブリンＧ１  Ｆｃ配列）又はポリペプチドの精製を提供するか若しくは基質へのポリペプチドの付着のための部位を提供する親和性タグ（例えば、アミロイドβ前駆体タンパク質（Ａｐｐ）タグ又はヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ）を含むことができる。可溶性受容体ポリペプチドは、一般に、膜貫通及び細胞内ポリペプチドセグメントが、それぞれ膜固定又はシグナル伝達を提供するのに十分なセグメント部分を欠く場合、これらのセグメントを実質的に含まない。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬは、可溶性ＧＦＲＡＬ（例えば、可溶性ヒトＧＦＲＡＬ）である。いくつかの実施形態では、可溶性ＧＦＲＡＬは、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、可溶性ＧＦＲＡＬは、十分な長さの膜貫通ドメインを欠き、それにより細胞膜上に存在しないか又は細胞膜中に固定されないＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含む。
【０１０７】
本明細書で使用される「膜結合ＧＦＲＡＬ」は、細胞膜に結合するか又は細胞膜中に固定されているＧＦＲＡＬ受容体ポリペプチド又はその変異体若しくは機能性断片を指す。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬは、膜結合ＧＦＲＡＬ（例えば、膜結合ヒトＧＦＲＡＬ）である。いくつかの実施形態では、膜結合ＧＦＲＡＬは、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、膜結合ＧＦＲＡＬは、細胞表面に係留されたＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン含む。
【０１０８】
本明細書で使用される用語「係留される」は、ポリペプチドの物理的修飾（例えば、ポリペプチドを細胞表面に局在化させるドメイン又は脂肪アシル化部位の付加）を指す。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、テザーによって細胞表面に付着される。いくつかの実施形態では、テザーは、ＧＦＲＡＬ膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態では、テザーは、ＧＦＲＡＬ膜貫通ドメイン機能性断片である。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン又はテザーは、天然ＧＦＲＡＬ膜貫通ドメインのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン又はテザーは、配列番号１８のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む。いくつかの実施形態では、テザーは、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインに融合された異種膜貫通ドメインである。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、テザーは、グリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）又はＧＰＩリンカー付加を指示することが可能な配列である。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン又はテザーは、配列番号１９のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体、配列番号２０のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号２１のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含む。いくつかの実施形態では、テザーは、膜挿入配列、例えば自律的膜挿入配列又は参照により本明細書に組み込まれるＶｅｒｇｅｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９５；２７０（７）：３４１４−２２に記載されている配列である。例示的な膜挿入配列には、シトクロムｂ５の膜貫通Ｃ末端ドメイン（配列番号２２及び２３）（例えば、Ｖｅｒｇｅｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９５；２７０（７）：３４１４−２２を参照されたい）が含まれるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン又はテザーは、配列番号２２のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号２３のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含む。いくつかの他の実施形態では、テザーは、膜挿入脂肪酸である。いくつかの他の実施形態では、テザーは、ＧＦＲＡＬの細胞外ドメインに融合された異種膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを細胞表面に局在化させる。
【０１１０】
本明細書で使用される用語「変異体」は、参照（非改変）天然アミノ酸配列に関連して改変されている配列を指す。改変配列は、参照配列に関連した１つ以上のアミノ酸置換、欠失及び／又は挿入（又はコドンの対応する置換、欠失及び／若しくは挿入）を含む。変異体は、参照配列の物理的操作を必ずしも必要としない。配列は、参照配列と比較して異なるアミノ酸を含む限り、それがどのように合成されたかに関わらず、「変異体」と見なされる。特定の実施形態では、変異体は、参照配列と比較して高いアミノ酸配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、変異体は、ポリペプチドが参照配列又は参照配列の対応するセグメント（例えば、機能性断片）と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する限り、アミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を有するポリペプチドを包含する。参照配列は、例えば、ヒトＧＦＲＡＬ（配列番号９；ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｒｅｆ．配列：Ｑ６ＵＸＶ０）であり得る。参照配列は、例えば、ヒトＧＦＲＡＬの機能性断片、例えばＧＦＲＡＬの全長細胞外結合ドメイン（配列番号４；ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｒｅｆ．配列：Ｑ６ＵＸＶ０のアミノ酸２０〜３５１）でもあり得る。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、ヒトＧＦＲＡＬの全長細胞外結合ドメインの変異体である。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、ドメインＤ２及びＤ３を含むが、ドメインＤ１を欠く（例えば、配列番号１を参照されたい）。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号１である。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ及び／又はＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ及び／又はＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン配列は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ及び／又はＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ及び／又はＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、ドメインＤ２及びＤ３を含むが、ドメインＤ１を欠いたＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、シグナルペプチドを更に含む（例えば、配列番号２を参照されたい）。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号２である。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ及び／又はＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ及び／又はＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ及び／又はＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ及び／又はＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、ドメインＤ２及びＤ３を含むが、ドメインＤ１を欠いたＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、親和性タグを更に含む（例えば、親和性タグに融合される）（例えば、配列番号３又は配列番号２５を参照されたい）。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号３である。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号２５である。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ及び／又はＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、配列番号３又は配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ及び／又はＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、配列番号３又は配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ及び／又はＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、配列番号３又は配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ及び／又はＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、配列番号３又は配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１１４】
用語「同一性」又は「相同性」は、配列を比較することにより決定される、２つ以上のポリペプチドの配列間の関係を指す。「同一性」は、２つ以上のアミノ酸残基のストリングの一致数によっても決定される、ポリペプチド間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」は、数学的モデル又はコンピュータープログラム（即ちアルゴリズム）によって対処される、ギャップアライメント（存在する場合）を有する２つ以上の配列の小さい方の間の同一一致のパーセントを測定する。関連タンパク質の同一性は、既知の方法によって容易に計算することができる。そのような方法には、「Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｌｅｓｋ  ＡＭ，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８）；及び「Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ」（Ｓｍｉｔｈ  ＤＷ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３）に記載されているものが含まれるが、それらに限定されない。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物及び方法に使用されるＧＦＲＡＬは、ＧＦＲＡＬの変異体、例えばヒトＧＦＲＡＬの変異体又はその機能的断片である。そのような変異体は、用語「ＧＦＲＡＬ」により包含される。用語「ＧＦＲＡＬ変異体」は、（１）ＧＤＦ１５に結合し；及び（２）ＧＤＦ１５との複合体化にある場合、全長ＧＦＲＡＬの能力に関連した生物学的応答を促進する、例えばＲＥＴ細胞表面受容体に結合し且つ活性化し、及び／又は細胞内シグナリング（例えば、ＲＥＴ−ＥＲＫシグナリング、ＲＥＴ−ＡＫＴシグナリング）を促進する能力を保持するＧＦＲＡＬ変異体を指す。ＧＦＲＡＬ変異体は、切断ＧＦＲＡＬ、ＧＦＲＡＬ類似体又はＧＦＲＡＬ誘導体であり得る。用語「切断ＧＦＲＡＬ」は、野生型ＧＦＲＡＬの機能性断片を意味する。野生型ＧＦＲＡＬの機能性断片は、例えば、全長ＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン又はドメインＤ２及びＤ３のみを含むＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含むことができる。用語「ＧＦＲＡＬ類似体」は、野生型ＧＦＲＡＬの１つ以上のアミノ酸残基が他の天然若しくは非天然アミノ酸残基で置換されており、且つ／又は１つ以上の天然若しくは非天然アミノ酸残基が野生型ＧＦＲＡＬに追加されている、改変ＧＦＲＡＬを意味する。用語「ＧＦＲＡＬ誘導体」は、１つ以上の天然又は非天然アミノ酸残基の置換、追加又は欠失を有するか又は有さない、化学的に修飾された野生型ＧＦＲＡＬを意味し、ここで、少なくとも１つの置換基は、野生型ＧＦＲＡＬに存在しない。典型的な修飾には、アミド、炭水化物、アルキル基、アシル基、エステル及びペグ化が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１６】
本明細書で使用される「ＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン」は、膜貫通及び細胞内（細胞質）ドメインを欠くＧＦＲＡＬ受容体ポリペプチドを指す。ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、Ｎ末端シグナルペプチドを含み得るか又は含み得ず、任意の種に由来し得る。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、哺乳動物ＧＦＲＡＬ（例えば、ヒト、サル、ラット又はマウスＧＦＲＡＬ）の細胞外ドメインである。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、ヒトＧＦＲＡＬの細胞外ドメインである。用語「ＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン」は、野生型ＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン及びＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン変異体を含む。
【０１１７】
ＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン内には、３つの別個のシステインリッチサブドメイン：ドメイン１（Ｄ１）、ドメイン２（Ｄ２）及びドメイン３（Ｄ３）が存在する。ＧＦＲＡＬの特定の特性は、これらのサブドメインの活性及び／又は結合親和性に起因し得る。例えば、ドメインＤ２内のアミノ酸残基は、ＧＤＦ１５に結合するＧＦＲＡＬの相互作用界面アミノ酸として同定されている。同様に、ドメインＤ３内のアミノ酸残基は、ＲＥＴに結合するＧＦＲＡＬの相互作用界面アミノ酸として同定されている。例えば、国際公開第２０１７／１５２１０５号パンフレットを参照されたい。用語「ＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン」は、これらのドメイン（Ｄ１、Ｄ２及びＤ３）の１つ、２つ又は３つ全部を含むＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを包含する。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、ドメインＤ１、Ｄ２及びＤ３を含む。他の実施形態では、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、ドメインＤ２及びＤ３を含むが、ドメインＤ１を欠く。いくつかの実施形態では、ドメインＤ２及びＤ３を含むが、ドメインＤ１を欠いたＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、Ｎ末端シグナルペプチドを更に含む。
【０１１８】
例示的なＧＦＲＡＬ配列及びコンストラクトを表１に示す。
【０１１９】
【表１】
2021533743.tif 000002
【０１２０】
【表２】
2021533743.tif 000003
【０１２１】
【表３】
2021533743.tif 000004
【０１２２】
【表４】
2021533743.tif 000005
【０１２３】
本開示は、少なくとも部分的に、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインに対する特定の改変が、例えば、ＧＤＦ１５活性アッセイにおいて且つ治療的組み合わせにおいて、野生型ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを超える機能的利点を付与するという発見に基づいている。例えば、実施例３〜１１を参照されたい。いくつかの実施形態では、ドメインＤ２及びＤ３を含むが、ドメインＤ１を欠いたＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、ドメインＤ１を含む対応するＧＦＲＡＬ細胞外ドメインと比較してＧＤＦ１５への結合活性の増大を示す。いくつかの実施形態では、ドメインＤ２及びＤ３を含むが、ドメインＤ１を欠いたＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン（ＧＤＦ１５との複合体において）は、ドメインＤ１を含む対応するＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン（ＧＤＦ１５との複合体において）と比較してＥＴ活性化及びシグナリングにおける効力の増大を示す。
【０１２４】
ＧＦＲＡＬ  Ｄ１ドメインは、６つのＮ−グリコシル化部位を含み、異種Ｎ−グリコシル化及び全長ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインの分子質量の１８ｋＤまでの増加をもたらす（Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  ２０１４；８（６）：１８９４−１９０４）。ＧＦＲＡＬ  Ｄ２ドメインは、ＧＤＦ１５に結合し、ＲＥＴ細胞外ドメインの膜近位システインリッチ領域と相互作用することができる。理論に束縛されることを望むものではないが、ＧＦＲＡＬ  Ｄ１ドメイン上の炭水化物の存在と、全長ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインの折り畳みとは、ＧＤＦ１５及びＲＥＴ細胞外ドメインとのＧＦＲＡＬ  Ｄ２ドメインの相互作用を遮蔽又は阻害する可能性がある。
【０１２５】
例えば、本明細書に提供される実施例に記載されているように、全長ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインからドメインＤ１を除去した後、ＧＤＦ１５及びドメインＤ２及びＤ３を含むが、ドメインＤ１を欠いたＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン（ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３））は、ＧＤＦ１５及び全長ＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン（ＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ））よりも小さく、よりコンパクトな複合体を形成する可能性がある。理論に束縛されるものではないが、このより小さくよりコンパクトな複合体は、ＲＥＴ細胞外ドメインの二量体化によって形成されたポケット内により良好に適合し、ＲＥＴへのＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）／ＧＤＦ１５複合体の結合活性を増大させ得る。これは、ＲＥＴの活性化におけるＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）／ＧＤＦ１５複合体の効力の増大をもたらし、治療的及び細胞ベースのアッセイ目的の両方に利益を提供し得る。ＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）／ＧＤＦ１５のより大きい複合体は、安定性が比較的低い可能性がある。また、細胞表面上のＲＥＴとの結合後、表面ＲＥＴとのより大きい複合体の相互作用は、結合アッセイの観察に基づいてより小さい複合体ほど強くなく、従ってＲＥＴ活性化及びシグナリングにおける効力を減少させる可能性がある。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、ドメインＤ２及びＤ３を含むが、ドメインＤ１を欠いたＧＦＲＡＬ細胞外ドメインの利点は、ＧＤＦ１５ペプチドの効力又は有効性を評価するための増強されたアッセイを提供することができる。いくつかの実施形態では、ドメインＤ２及びＤ３を含むが、ドメインＤ１を欠いたＧＦＲＡＬ細胞外ドメインのこれらの利点は、ＧＦＲＡＬ単独又はＧＤＦ１５ペプチドとの組み合わせ（例えば、脂肪酸抱合又はアルブミン融合ＧＤＦ１５ペプチド）を投与することにより、肥満症又は関連障害の処置において改善された治療的利点を提供する可能性がある。
【０１２７】
特定の態様において、本明細書の開示は、（ａ）細胞表面受容体キナーゼを発現する細胞を提供することと；（ｂ）細胞をＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬと接触させることと；（ｃ）接触された細胞における生物学的応答を検出することとを含む、ＧＤＦ１５ペプチドの活性を検出するための細胞ベースのアッセイを特徴とし、ここで、可溶性ＧＦＲＡＬは、ドメインＤ２及びＤ３を含むＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含む。
【０１２８】
特定の他の態様において、本開示は、（ａ）ＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン（例えば、可溶性ＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン）及び細胞表面受容体キナーゼを発現する細胞を提供することと；（ｂ）細胞をＧＤＦ１５ペプチドと接触させることと；（ｃ）接触された細胞における生物学的応答を検出することとを含む、ＧＤＦ１５ペプチドの活性を検出するための細胞ベースのアッセイを特徴とし、ここで、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、ドメインＤ２及びＤ３を含む。
【０１２９】
本明細書で使用される「ＧＤＦ１５」及び「ＧＤＦ１５ペプチド」は、哺乳動物起源の任意のＧＤＦ１５ポリペプチド又はその変異体若しくは機能性断片を指す。様々な実施形態において、ＧＤＦ１５ペプチドは、ヒトＧＤＦ１５ペプチド又はその変異体若しくは機能性断片である。様々な実施形態において、ヒトＧＤＦ１５は、シグナルペプチド（アミノ酸１〜２９）、プロペプチド（アミノ酸３０〜１９６）及び１１２個のアミノ酸成熟ＧＤＦ１５ペプチド（アミノ酸１９７〜３０８（配列番号１３としても特定））を含む３０８個のアミノ酸前タンパク質（配列番号１２；ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｒｅｆ．配列：Ｑ９９９８８）として合成されるが（例えば、Ｂｏｏｔｃｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９７；９４（２１）：１１５１４−９を参照されたい）、これらのサブ配列間の境界は、僅かに異なり得る。例えば、様々な実施形態において、ヒトＧＤＦ１５前タンパク質（配列番号１２；ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｒｅｆ．配列：Ｑ９９９８８）は、シグナルペプチド（アミノ酸１〜２９）、プロペプチド（アミノ酸３０〜１９４）及び成熟ＧＤＦ１５ペプチド（アミノ酸１９５〜３０８）に細分され得る。様々な実施形態において、成熟ＧＤＦ１５ペプチドは、配列番号１２のアミノ酸１９７〜３０８を含み、本明細書で配列番号１３と特定される。様々な他の実施形態において、成熟ＧＤＦ１５ペプチドは、配列番号１２のアミノ酸２００〜３０８を含み、配列番号１４と特定される。
【０１３０】
加えて、配列バリエーションが報告されている。例えば、配列番号１２のアミノ酸２０２、２６９及び２８８は、それぞれＡｓｐ、Ｇｌｕ及びＡｌａとして報告されている（例えば、Ｈｒｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １９９７；１３５４（１）：４０−４；Ｌａｗｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １９９７；２０３（１）：１７−２６）を参照されたい）。アミノ酸２０２にＡｓｐ置換を含む例示的な配列変異体（「ＧＤＦ１５  Ｈ６Ｄ変異体」）は、例えば、Ａｍａｙａ−Ａｍａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ  ２０１５；２０１５：２７０７６３に記載されている。
【０１３１】
ＧＤＦ１５ペプチドの変異体又はその機能的断片は、１つ以上のアミノ酸欠失、追加及び／又は置換を任意の所望の組み合わせで含み得る。アミノ酸配列バリエーション（例えば、アミノ酸欠失、追加及び／又は置換による）の量は、成熟ＧＤＦ１５ペプチドの活性（例えば、ＧＦＲＡＬシグナリング活性）を保存するように制限される。いくつかの実施形態では、成熟ＧＤＦ１５ペプチドの変異体は、配列番号１３に対する約１〜約２０、約１〜約１８、約１〜約１７、約１〜約１６、約１〜約１５、約１〜約１４、約１〜約１３、約１〜約１２、約１〜約１１、約１〜約１０、約１〜約９、約１〜約８、約１〜約７、約１〜約６又は約１〜約５のアミノ酸欠失、追加又は置換を任意の所望の組み合わせで有する。代わりに又は加えて、変異体は、配列番号１３の全長にわたって測定した場合、配列番号１３と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％又は少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。様々な実施形態において、ＧＤＦ１５ペプチド又は変異体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する。様々な実施形態において、ＧＤＦ１５ペプチド又は変異体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する。様々な実施形態において、ＧＤＦ１５ペプチド又は変異体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。様々な実施形態において、ＧＤＦ１５ペプチド又は変異体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１３２】
本明細書に開示したＧＤＦ１５ペプチド及び変異体は、例えば、親和性タグ（例えば、Ｈｉｓタグ）、ペグ化、グリコシル化、融合（例えば、ヒト又はマウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域との）及び抱合（例えば、脂肪酸との）等の追加の修飾も含み得る。例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／２０００７８号パンフレットに開示されている抱合を参照されたく；また、両方とも参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／１９８１９９号パンフレット及び国際公開第２０１７／１０９７０６号パンフレットに開示されている融合も参照されたい。親和性タグ、ペグ化、グリコシル化、融合、抱合又はペプチドに対する所望の生理学的応答（例えば、所望のｐＫ、クリアランス、半減期、溶解度等）を支持し得る任意の追加の修飾を含むか又はそれらによって修飾されているＧＤＦ１５ペプチド及び変異体は、用語「ＧＤＦ１５ペプチド」に包含される。
【０１３３】
理論に束縛されることを望むものではないが、ＧＤＦ１５は、ＧＦＲＡＬ受容体に特異的に結合し、ＧＦＲＡＬ受容体は、ＧＤＦ１５刺激に対する応答における細胞内シグナリングを誘発するために、共受容体ＲＥＴとの関連を必要とすることが報告されている（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２０１７；２３（１０）：１１５８−１１６６）。生物学的に活性なＧＤＦ１５は、１つの鎖間ジスルフィド結合によって共有結合した成熟ペプチドの２５ｋＤホモダイマーであることも一般に知られている。従って、ＧＤＦ１５ペプチドがＧＤＦ１５の変異体である場合、いずれのアミノ酸欠失、追加及び／又は置換も、一般に、受容体結合又はペプチド−ペプチド界面に関与しない位置に存在する。例えば、配列番号１２の２１６、２２２、２２３、２２５、２３７、２３９、２４１、２５２、２５３、２５４、２５７、２５８、２６０、２６１、２６４、２６５、２６８、２６９、２７０、２７３、２７５、２７６、２７９、２９７、２９９、３００及び３０８位のアミノ酸は、ペプチド−ペプチド界面に関与すると考えられている。これらの位置の任意のアミノ酸置換は、一般に、望ましくなく、いずれの置換も一般に保存的置換である。表面に露出されるが、種間で保存されていないアミノ酸は、いくつかの実施形態では、ペプチドを折り畳むか又はその活性を破壊することなく他のアミノ酸で置換され得る。任意のそのようなＧＤＦ１５の変異体は、本開示のＧＤＦ１５ペプチドとして使用することができる。そのような変異体は、第２の薬剤、例えば治療薬、検出可能な標識並びに／又は望ましいｐＫ、クリアランス、半減期及び／若しくはペプチドに対する他の生理学的応答を支持する薬剤にも抱合され得る（例えば、ヒスチジンタグ化、アルブミンタグ化又は脂肪酸タグ化ＧＤＦ１５ペプチド変異体）。本明細書に開示したＧＤＦ１５ペプチド及び変異体は、ＧＤＦ１５の天然に存在する及び合成の変異体を含む。例示的な変異体には、（ｉ）ＧＤＦ１５  Ｈ６Ｄ変異体（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＡｍａｙａ−Ａｍａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ  ２０１５；２０１５：２７０７６３を参照されたい）；（ｉｉ）免疫グロブリン定常領域とのＧＤＦ１５の融合（例えば、両方とも参照により本明細書に組み込まれるＸｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ２０１７；９（４１２）：ｅａａｎ８７３２；及び国際公開第２０１２／１３８９１９号パンフレットを参照されたい）；（ｉｉｉ）α−１−アンチトリプシンとのＧＤＦ１５の融合（例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１６／１０２５８０号パンフレットを参照されたい）；（ｉｖ）ＧＤＦ１５  Ｎ−末端及び／又はＣ−末端への短ペプチドの追加（例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１７／２０２９３６号パンフレットを参照されたい）；（ｖ）例えば、溶解度を改善するための配列バリエーション（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，１６１，９６６号明細書を参照されたい）；及び（ｖｉ）ペグ化及び／又はグリコシル化（例えば、両方とも参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１５／００２３９��０  Ａ１号明細書及び米国特許第９，１６１，９６６号明細書を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３４】
追加の変異体には、本明細書に開示したもの（例えば、配列番号１５〜１７を参照されたい）並びに全て参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３／１４８１１７号パンフレット、国際公開第２０１４／１２０６１９号パンフレット、国際公開第２０１５／１９７４４６号パンフレット、国際公開第２０１５／１９８１９９号パンフレット、国際公開第２０１６／０６９９２１号パンフレット、国際公開第２０１６／０１８９３１号パンフレット及び国際公開第２０１６／１０２５８０号パンフレットに記載されている他のものが含まれる。国際公開第２０１３／１４８１１７号パンフレット、国際公開第２０１４／１２０６１９号パンフレット、国際公開第２０１５／１９７４４６号パンフレット、国際公開第２０１５／１９８１９９号パンフレット、国際公開第２０１６／０６９９２１号パンフレット、国際公開第２０１６／０１８９３１号パンフレット又は国際公開第２０１６／１０２５８０号パンフレットに記載されている任意のＧＤＦ１５ペプチド又は変異体を本開示のＧＤＦ１５ペプチドとして使用することができる。
【０１３５】
例示的なＧＤＦ１５配列を表２に示す。
【０１３６】
【表５】
2021533743.tif 000006
【０１３７】
本明細書で使用される「活性」は、ＧＦＲＡＬリガンド（例えば、ＧＤＦ１５ペプチド）が生物学的プロセスにおける変化を達成する能力を指す。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬリガンドの活性は、ＧＦＲＡＬリガンドが、そのリガンドと接触された細胞において、規定された生物学的応答を誘発又は誘導するか否かによって決定される。いくつかの実施形態では、細胞ベースの活性アッセイの結果は、試験分子を参照基準又は参照分子と比較した場合、「相対活性」として表される。相対活性の使用により、試験されるべき分子と参照分子との間の同じアッセイでの直接比較が可能となり、それにより最終的な報告するべき結果への影響又は実行毎の変動が低減される。
【０１３８】
細胞ベースの活性アッセイでは、参照分子を通常使用して相対活性を割り当てて、活性の測定値が、試験するべき様々な分子にわたって正規化されることを確実にする。本明細書で使用される場合、ＧＦＲＡＬリガンド活性アッセイの「参照分子」は、既知の生物学的活性を有するＧＦＲＡＬリガンドを指す。例えば、ＧＦＲＡＬリガンドは、既知の生物学的活性を有するＧＤＦ１５ペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、参照分子は、野生型又は組換え野生型ＧＤＦ１５ペプチド（例えば、ヒト又は組換えヒトＧＤＦ１５）である。他の実施形態では、参照分子は、野生型又は組換え野生型ＧＤＦ１５ペプチドの変異体（例えば、ヒト又は組換えヒトＧＤＦ１５の変異体、ここで、ＧＤＦ１５変異体の生物学的活性は、既知である）である。更に他の実施形態では、参照分子は、治療的使用のためのＧＤＦ１５の代表的なバッチである。いくつかの実施形態では、細胞は、培養プレート内で成長し、ある範囲の濃度にわたって試験されるべき参照分子及びＧＦＲＡＬリガンドによって刺激される。いくつかの実施形態では、濃度の範囲は、０〜最大濃度の用量応答の範囲全体を包含する。いくつかの他の実施形態では、全用量応答曲線は、Ｓ字形である。
【０１３９】
本明細書で使用される「生物学的応答」は、細胞がＧＦＲＡＬリガンド、例えばＧＤＦ１５ペプチドと接触した後の細胞における応答を指す。生物学的応答には、例えば、細胞シグナリング又はシグナル伝達（例えば、タンパク質キナーゼのリン酸化）、遺伝子転写、タンパク質発現、毒性、サイトカイン放出、細胞増殖、細胞運動性若しくは形態、細胞成長停止又は細胞死（例えば、アポトーシス）に関する任意の応答が含まれ得る。
【０１４０】
様々な実施形態において、ＧＤＦ１５ペプチド等のＧＦＲＡＬリガンドと接触させた後の細胞における生物学的応答は、本明細書に記載されるか又は当技術分野で既知の例示的なアッセイのいずれかを用いて評価又は測定され得る。様々な実施形態において、アッセイは、細胞又は細胞の培養物をＧＦＲＡＬリガンド（例えば、ＧＤＦ１５ペプチド）と接触させ、細胞又は培養物の１つ以上の特性が接触後に変化したか否かを決定することを含む。様々な実施形態において、変化は、ＲＮＡ発現のレベル、タンパク質発現のレベル、タンパク質活性のレベル、タンパク質修飾（例えば、タンパク質リン酸化）のレベル、レポーターシグナル、毒性、サイトカイン放出、細胞増殖、細胞運動性若しくは形態、細胞成長停止及び／又は細胞死（例えば、アポトーシス）のレベルにおいて検出され得る。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、生物学的応答は、ＧＦＲＡＬリガンド（例えば、ＧＤＦ１５ペプチド）と接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した、接触した細胞におけるタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、シグナル伝達応答である。いくつかの実施形態では、シグナル伝達応答は、細胞内タンパク質上のセリン、チロシン又はスレオニン残基のリン酸化を含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達応答は、ＥＲＫ（例えば、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２）のリン酸化を含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達応答は、ＡＫＴ（例えば、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３）のリン酸化を含む。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、生物学的応答は、タンパク質の発現、活性及び／又はリン酸化レベルを評価する１つ以上のアッセイを用いて検出される。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、キナーゼ又は酵素活性アッセイ、全細胞の放射標識３２Ｐ−オルトホスフェートとのインキュベーション、２次元ゲル電気泳動、免疫ブロットアッセイ（例えば、ウェスタンブロット）、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、細胞ベースのＥＬＩＳＡアッセイ、細胞内フローサイトメトリー、免疫細胞化学（ＩＣＣ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、質量分析、多検体プロファイリング（例えば、ホスホ−タンパク質多重アッセイ）及び蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）から選択される１つ以上のアッセイを用いて検出される。
【０１４３】
用語「シグナル伝達」は、細胞表面受容体を介して、特定の連続した一連の分子を介して、刺激に対する特定の細胞応答をもたらす核内の遺伝子への細胞外刺激の伝達を含む生化学的プロセスを指す。シグナル伝達は、一般に、細胞活性を管理し、細胞作用を調整する伝達システムの一部である。そのような伝達システムを介して、細胞は、細胞外状態における変化を認知し、それに応答することができる。本開示の様々な実施形態において、ＧＦＲＡＬリガンド（例えば、ＧＤＦ１５ペプチド）と接触された細胞は、シグナル伝達応答を開始することによってＧＦＲＡＬリガンドの存在に応答する。様々な実施形態において、ＧＦＲＡＬリガンド（例えば、ＧＤＦ１５ペプチド）及びＧＦＲＡＬ受容体ポリペプチド（例えば、可溶性ＧＦＲＡＬ）と接触された細胞は、シグナル伝達応答を開始することによってＧＦＲＡＬリガンド及びＧＦＲＡＬ受容体ポリペプチドの存在に応答する。様々な実施形態において、細胞は、内因的又は外因的に細胞表面受容体キナーゼを発現している細胞である。様々な実施形態において、細胞表面受容体キナーゼは、ＲＥＴ受容体チロシンキナーゼである。様々な実施形態において、細胞は、外因性ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインも発現する。
【０１４４】
ＧＦＲＡＬ、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）受容体αファミリーのオーファンメンバーは、ＧＤＦ１５に直接結合する受容体として同定されている。しかしながら、ＧＤＦ１５刺激に対する応答における細胞内シグナリングを誘発するために、ＧＤＦ１５との複合体のＧＦＲＡＬは、典型的にはＲＥＴ細胞表面受容体キナーゼに結合し、それを活性化する。ＧＤＦ１５は、典型的には、ＧＦＲＡＬのみ又はＲＥＴのみを発現している細胞において下流シグナルを誘導しないが、ＧＤＦ１５シグナルは、ＧＦＲＡＬ及びＲＥＴの両方を発現している細胞において検出され得る。理論に束縛されることを望むものではないが、ＧＤＦ１５のインビボ活性は、三元複合体を形成することによってＧＦＲＡＬ及びＲＥＴの両方によって媒介されると考えられる。様々な実施形態において、ＧＤＦ１５ペプチド及びＧＦＲＡＬ受容体ポリペプチド（例えば、可溶性ＧＦＲＡＬ）は、二元複合体を形成する。様々な実施形態において、二元複合体は、ＲＥＴに結合して三元複合体を形成する。様々な実施形態において、ＧＤＦ１５−ＧＦＲＡＬ−ＲＥＴ三元複合体の形成は、ＲＥＴを活性化し、ＲＥＴ媒介細胞内シグナリングを刺激する。
【０１４５】
本明細書で使用される用語「複合体」は、互いに親和性を有する少なくとも２つの部分間の非共有結合的関連（例えば、化学的又は生化学的）を指す。複合体の例としては、抗原／抗体、レクチン／アビジン、標的ポリヌクレオチド／プローブオリゴヌクレオチド、抗体／抗抗体、受容体／リガンド（例えば、ＧＦＲＡＬ及びＧＤＦ１５）、酵素／リガンド、ポリペプチド／ポリペプチド、ポリペプチド／ポリヌクレオチド、ポリペプチド／共因子、ポリペプチド／基質、ポリペプチド／阻害剤、ポリペプチド／小分子間等の非共有結合的関連が挙げられる。用語「二元複合体」は、２つのそのような部分、例えば受容体及びリガンド（例えば、ＧＦＲＡＬ及びＧＤＦ１５）間の非共有結合的関連を意味する。用語「三元複合体」は、３つの部分、例えば受容体、共受容体及びリガンド（例えば、ＧＦＲＡＬ、ＧＤＦ１５及びＲＥＴ）間の非共有結合的関連を意味する。
【０１４６】
本明細書で使用される「ＲＥＴ」は、ＧＤＦ１５と複合体化した場合にＧＦＲＡＬに結合することができ、ＧＦＲＡＬによって活性化される、任意の天然に存在する全長ＲＥＴ受容体ポリペプチドのアミノ酸配列又はその任意の変異体若しくは機能性断片を有するＲＥＴ受容体ポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、ＲＥＴは、全長哺乳動物ＲＥＴ（例えば、ヒト、サル、ラット又はマウスＲＥＴ）又はその変異体若しくは機能性断片である。いくつかの実施形態では、ＲＥＴは、全長ヒトＲＥＴである。
【０１４７】
「ＲＥＴ」は、「トランスフェクション中に再配列された」の略語であり、これは、ヒトリンパ腫細胞から採取したＤＮＡでトランスフェクトした後、３Ｔ３線維芽細胞株内でＲＥＴ遺伝子のＤＮＡ配列が再配列されることが最初に発見されたためである。ヒトＲＥＴ遺伝子の天然の選択的スプライシングは、タンパク質ＲＥＴの３つの異なるアイソフォーム：ＲＥＴ５１、ＲＥＴ４３及びＲＥＴ９の生成をもたらす。これら３つのアイソフォームは、同じ１０６３アミノ酸をそれらのＮ末端に共有するが、それらの細胞質Ｃ末端にそれぞれ５１、４３及び９個の異なるアミノ酸を含む。３つの全アイソフォームは、本明細書では用語「ＲＥＴ」に包含される。受容体チロシンキナーゼに典型的であるが、ＲＥＴは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内キナーゼドメインを有する。例えば、Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１４；１４（３）：１７３−８６を参照されたい。
【０１４８】
様々な実施形態において、ＲＥＴ活性化は、ＲＥＴがＧＤＦ１５との複合体のＧＦＲＡＬに結合されるときに起こる。様々な実施形態において、ＲＥＴ活性化は、ＧＤＦ１５、ＧＦＲＡＬ及びＲＥＴが三元複合体（即ちＧＤＦ１５−ＧＦＲＡＬ−ＲＥＴ三元複合体）を形成するときに起こる。様々な実施形態において、ＲＥＴ活性化は、ＲＥＴ二量体化と、ＲＥＴ細胞内キナーゼドメインにおける特定の残基のリン酸化とを含む。ＲＥＴ細胞内ドメインにおけるそのようなリン酸化された残基は、ホスホリパーゼＣγ（ＰＬＣγ）等のシグナリング分子又は様々なアダプタータンパク質との直接的な相互作用を促進し得、これは、多数の下流シグナリング経路の活性化に繋がり得る。
【０１４９】
ＧＦＲＡＬリガンド（例えば、ＧＤＦ１５ペプチド）の活性は、様々な実施形態において、それがリガンドと接触された細胞において規定された生物学的応答を誘発又は誘導するか否かによって決定される。いくつかの実施形態では、規定された生物学的応答は、シグナル伝達応答である。いくつかの実施形態では、シグナル伝達応答は、当技術分野で既知の方法に従って測定することができる、ＥＲＫ／ＭＡＰＫ経路、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路、タンパク質キナーゼＣ経路、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路、ＪＮＫ経路、ｐ３８経路及びＲＡＣ１経路の１つ以上の活性化を含む。
【０１５０】
シグナル伝達のための主な機構の１つは、タンパク質リン酸化を含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達応答は、ＧＦＲＡＬリガンドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質のリン酸化と比較した、ＧＦＲＡＬリガンド（例えば、ＧＤＦ１５ペプチド）と接触された細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である。
【０１５１】
本明細書で使用される「タンパク質キナーゼ」は、リン酸基をリン酸ドナーから基質タンパク質中のアクセプターアミノ酸に移動する酵素を指す。タンパク質キナーゼは、アクセプターアミノ酸特異性に基づいて分類され得る。２つの最もよく特徴付けられたタイプのタンパク質キナーゼは、タンパク質セリン／スレオニンキナーゼ（アクセプターとしてタンパク質アルコール基を有するタンパク質キナーゼ）及びタンパク質チロシンキナーゼ（アクセプターとしてタンパク質フェノール基を有するタンパク質キナーゼ）である。ＲＥＴ及び活性化ＲＥＴによって直接又は間接的にリン酸化される全タンパク質キナーゼは、用語「タンパク質キナーゼ」に包含されることが意図される。例示的なタンパク質キナーゼは、本明細書に記載されており、他のものは、当技術分野で既知である。ＲＥＴ受容体相互作用及びシグナル伝達経路は、例えば、Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１４；１４（３）：１７３−８６に概説されている。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、ＥＲＫ／ＭＡＰＫ経路（本明細書で「ＲＥＴ−ＥＲＫ」経路とも称される）の細胞内タンパク質キナーゼである。いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、ＥＲＫ（ＥＲＫ１、ＥＲＫ２）、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２又はその任意の下流標的の１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、ＥＲＫ（ＥＲＫ１、ＥＲＫ２）、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２の１つ以上から選択される。ＲＥＴ−ＥＲＫ経路における例示的な細胞内タンパク質は、ＥＲＫ、ＳＨＣ１、ＦＲＳ２、ＧＲＢ２、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＯＳ、ＳＨＡＮＫ３、ＧＲＢ７、ＧＲＢ１０、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２並びにその任意の上流モジュレーター及び下流標的を含む。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬリガンド（例えば、ＧＤＦ１５ペプチド）と接触された細胞内のシグナル伝達応答は、ＧＦＲＡＬリガンドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較したＲＥＴ−ＥＲＫ経路における任意の細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少であり得る。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路（本明細書で「ＲＥＴ−ＡＫＴ」経路とも称される）の細胞内タンパク質キナーゼである。いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、ＡＫＴ（ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３）、ＳＲＣ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲ又はその任意の下流標的の１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、ＡＫＴ（ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３）、ＳＲＣ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、ＲＥＴ−ＡＫＴ経路における下流標的は、Ｓ６キナーゼである。ＲＥＴ−ＡＫＴ経路における例示的な細胞内タンパク質は、ＡＫＴ、ＳＲＣ、ＳＨＣ１、ＧＲＢ２、ＣＢＬ、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＨＡＮＫ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＳ、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＹＡＰ、ＢＡＤ、カスパーゼ−９、ＦｏｘＯ１、ＦｏｘＯ３、ＦｏｘＯ４、ＩＫＫα、ＣＲＥＢ、ＭＤＭ２、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ２７Ｋｉｐ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲ並びにその任意の上流モジュレーター及び下流標的を含む。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬリガンド（例えば、ＧＤＦ１５ペプチド）と接触された細胞内のシグナル伝達応答は、ＧＦＲＡＬリガンドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較したＲＥＴ−ＡＫＴ経路における任意の細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少であり得る。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、タンパク質キナーゼＣ経路の細胞内タンパク質キナーゼである。いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、タンパク質キナーゼＣである。いくつかの実施形態では、ＲＥＴ活性化は、ホスホリパーゼＣγ（ＰＬＣγ）のリン酸化を含む。いくつかの実施形態では、リン酸化ＰＬＣγは、タンパク質キナーゼＣ経路を活性化する。例えば、Ｍｕｌｌｉｃａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２０１７；２３（１０）：１１５０−７を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬリガンド（例えば、ＧＤＦ１５ペプチド）と接触された細胞内のシグナル伝達応答は、ＧＦＲＡＬリガンドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較したタンパク質キナーゼＣ経路における任意の細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少であり得る。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の細胞内タンパク質キナーゼである。いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、ＪＡＫ１及びＪＡＫ２の１つ以上から選択される。ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路における例示的な細胞内タンパク質は、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２及びＳＴＡＴ３（ＲＥＴシグナリングに関与している（例えば、Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１４；１４（３）：１７３−８６を参照されたい））並びにＪＡＫ３、ＴＹＫ２、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２及びＳＴＡＴ５を含む。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬリガンド（例えば、ＧＤＦ１５ペプチド）と接触された細胞内のシグナル伝達応答は、ＧＦＲＡＬリガンドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較したＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路における任意の細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少であり得る。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、ＪＮＫ経路の細胞内タンパク質キナーゼである。いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、ＪＮＫ１、ＪＮＫ２、ＴＡＫ１、ＭＫＫ４及びＭＫＫ７の１つ以上から選択される。ＪＮＫ経路における例示的な細胞内タンパク質は、ＪＮＫ１、ＪＮＫ２、ＴＡＫ１、ＭＫＫ４及びＭＫＫ７を含む。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬリガンド（例えば、ＧＤＦ１５ペプチド）と接触された細胞内のシグナル伝達応答は、ＧＦＲＡＬリガンドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較したＪＮＫ経路における任意の細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少であり得る。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、ｐ３８経路の細胞内タンパク質キナーゼである。いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、ＭＫＫ３、ＭＫＫ６、ｐ３８  ＭＡＰＫ（例えば、ＭＡＰＫ１１、ＭＡＰＫ１２、ＭＡＰＫ１３及びＭＡＰＫ１４）、ＭＳＫ１、ＭＳＫ２、ＭＫ２、ＭＫ３、ＭＮＫ１及びＭＮＫ２の１つ以上から選択される。ｐ３８経路における例示的な細胞内タンパク質は、ＭＫＫ３、ＭＫＫ６、ｐ３８  ＭＡＰＫ（例えば、ＭＡＰＫ１１、ＭＡＰＫ１２、ＭＡＰＫ１３及びＭＡＰＫ１４）、ＭＳＫ１、ＭＳＫ２、ＭＫ２、ＭＫ３、ＭＮＫ１及びＭＮＫ２を含む。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬリガンド（例えば、ＧＤＦ１５ペプチド）と接触された細胞内のシグナル伝達応答は、ＧＦＲＡＬリガンドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較したｐ３８経路における任意の細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少であり得る。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、ＲＡＣ１経路の細胞内タンパク質キナーゼである。いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、ＰＫＮ２である。ＲＡＣ１経路における例示的な細胞内タンパク質は、ＲＡＣ１及びＰＫＮ２を含む。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬリガンド（例えば、ＧＤＦ１５ペプチド）と接触された細胞内のシグナル伝達応答は、ＧＦＲＡＬリガンドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較したＲＡＣ１経路における任意の細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少であり得る。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼである。いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼ及び／又は細胞表面受容体キナーゼは、ＲＥＴ受容体チロシンキナーゼである。
【０１６０】
様々なアッセイがタンパク質リン酸化を測定するために開発されている。リン酸化チロシン／セリン／スレオニン残基又は特定のリン酸化タンパク質キナーゼに対するホスホ特異的抗体の発見は、タンパク質キナーゼのリン酸化を測定する免疫学アッセイ、例えば免疫ブロットアッセイ（例えば、ウェスタンブロット）、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）アッセイ及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を可能にする。いくつかの他のアッセイは、セリン／スレオニンキナーゼ又はチロシンキナーゼが合成基質ポリペプチドをリン酸化する能力を測定する（例えば、Ｐｉｋｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １９８７；１４６：３５３−６２；Ｈｕｎｔｅｒ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９８２；２５７（９）：４８４３−８；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９２；２６７（２４）：１７３９０−６を参照されたい）。そのようなアッセイは、放射性標識を使用する場合がある。
【０１６１】
本開示の特定の態様において、ＧＦＲＡＬリガンドと接触される細胞は、内因的に又はコンストラクト若しくはベクターによるトランスフェクションを介して外因的に細胞表面受容体キナーゼを発現している細胞である。特定の態様において、細胞は、外因性ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインも発現する。いくつかの実施形態では、細胞は、内因性ＧＦＲＡＬ又は内因性ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを発現しない。いくつかの実施形態では、細胞は、内因性ＧＤＦ１５を発現しない。いくつかの実施形態では、細胞は、操作性ＧＤＦ１５遺伝子を含むＧＤＦ１５  ＫＯ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを外因的に発現するようにコンストラクト又はベクターでトランスフェクトされる。例示的な細胞には、動物細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、動物細胞は、哺乳動物、例えばヒト、霊長類又は齧歯類を起源とする。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＭＣＦ７細胞、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞又はＨＥＫ２９３Ａ−ＧＤＦ１５  ＫＯ細胞である。
【０１６２】
本明細書で使用される「発現」は、細胞による核酸分子の転写及び翻訳を指す。
【０１６３】
本明細書で使用される用語「コンストラクト」は、細胞内での特定の核酸の転写及び／又は翻訳を可能にする一連の特定の核酸エレメントを用いて、組換え手段又は直接化学合成を含むヒト介入によって生成された核酸分子を指す。コンストラクトは、プラスミド、ウイルス又は核酸断片の一部であり得る。コンストラクトは、組み込み可能なＤＮＡ断片（即ち遺伝的組換えによって宿主ゲノムに組み込み可能な断片）及び関心のある遺伝子又は核酸配列を含むＤＮＡ断片の組み込みを可能にする他のビヒクルも含むことができる。いくつかの実施形態では、コンストラクトは、制御エレメント及びＲＥＴ細胞表面受容体キナーゼをコードする遺伝子又は核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コンストラクトは、制御エレメント及びＧＦＲＡＬ細胞外ドメインをコードする遺伝子又は核酸配列を含む。例示的な制御エレメントには、プロモーター系、ｍＲＮＡ発現のレベルを制御するための調節エレメント、リボソーム結合部位をコードする配列並びに転写及び翻訳を終止する配列が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６４】
本明細書で使用される用語「内因性」は、生物を起源とするか又は生物内で生成される物質を指す。「内因性」遺伝子又はタンパク質は、種に存在し、またその種に由来する遺伝子又はタンパク質である。
【０１６５】
本明細書で使用される用語「外因性」は、生物の外部を起源とするか又は生物の外部で生成される物質又は分子を指す。外因性遺伝子は、トランスフェクトされた細胞に対して、異なる種由来（「異種」遺伝子）又は同じ種由来（「同種」遺伝子）であり得る。トランスフェクトされた細胞は、組換え細胞とも称され得る。
【０１６６】
本明細書で使用される用語「組換え」は、宿主細胞内に天然に存在しないポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。組換え分子は、天然に存在しない方法で互いに連結した２つ以上の天然に存在する配列を含み得る。組換え細胞は、組換えポリヌクレオチド又はポリペプチドを含む。
【０１６７】
本明細書に記載されるＧＦＲＡＬリガンド及びＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、様々な実施形態において、組換え発現方法を使用して生成することができる。宿主細胞を使用した組換えタンパク質発現は、当技術分野で日常的に使用されている。本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」は、ペプチドの配列をコードし、転写及び翻訳される核酸を含むように人工的に操作され、任意選択的にペプチドを細胞成長培地に分泌する細胞を指す。組換え生成を目的として、ペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸は、典型的には従来の方法によって合成又はクローン化され、発現ベクターに組み込まれるであろう。例示的な宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞（例えば、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＨＥＫ２９３Ｓ）、サル腎臓（ＣＯＳ）細胞（例えば、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞（例えば、ＢＨＫ−２１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＢＳＣ−１）、ＨｅＬａ細胞、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ０、６５３、ＳＰ２／０）、リンパ腫細胞、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又は他の細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び植物細胞又はそれらの任意の派生物、不死化又は形質転換細胞が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｆ又はＨＥＫ２９３Ｓ細胞である。いくつかの実施形態では、ＨＥＫ２９３Ｓ細胞は、変化したグリコシル化パターン（例えば、より短いグリコシル化鎖）を有する組換えタンパク質（例えば、組換えＧＦＲＡＬリガンド又はＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン）を生成し得る。
【０１６８】
治療方法及び組成物
本明細書に記載される新規なＧＦＲＡＬ受容体ポリペプチド及び細胞ベースの活性アッセイを使用して評価されたＧＤＦ１５ペプチドは、多くの治療的又は予防的用途に使用することができる。それらには、体脂肪蓄積の減少及び肥満症の処置、肥満症の発症の予防、体重の低減、体重増加の逆転又は遅延、食欲の低減、食料効率の減少及び代謝障害の処置が含まれるが、これらに限定されない。従って、本開示は、ＧＤＦ１５ペプチドを単独で又はＧＦＲＡＬ受容体ポリペプチド（例えば、可溶性ＧＦＲＡＬ）と組み合わせて投与することにより、肥満症及び肥満症関連の状態を処置する方法を提供する。本開示は、ＧＤＦ１５ペプチドを単独で又はＧＦＲＡＬ受容体ポリペプチド（例えば、可溶性ＧＦＲＡＬ）と組み合わせて投与することにより、例えば過体重又は肥満の対象において、食欲を低減させ、且つ／又は体重を低減させる方法を更に提供する。例えば、肥満症の処置、食欲の低減及び／又は体重の低減におけるＧＤＦ１５ペプチド単独又はＧＦＲＡＬ受容体ポリペプチドとの組み合わせの使用も提供される。本明細書に提供される治療方法及び使用は、肥満症並びに／又は過剰な体重に関連した任意の多様な障害及び状態の処置又は予防に有用であり得る。
【０１６９】
本明細書で使用される用語「処置する」及びその同根語は、疾患、障害若しくは状態（例えば、心不全）又はその少なくとも１つの識別可能な症状の寛解を指す。いくつかの実施形態では、「処置する」は、必ずしも患者により識別可能ではない、少なくとも１つの測定可能な物理的パラメーターの寛解を指す。いくつかの実施形態では「処置する」は、物理的に（例えば、識別可能な症状の安定化）、生理学的に（例えば、物理的パラメーターの安定化）又は両方で疾患、障害又は状態の進行を阻害することを指す。いくつかの実施形態では、「処置する」は、疾患、障害又は状態の進行を遅延させるか又はその進行を逆転させることを指す。本明細書で使用される「処置する」及びその同根語は、所与の疾患、障害若しくは状態の発症を遅延させるか又は獲得のリスクを低減することも包含する。
【０１７０】
用語「対象」及び「患者」は、任意のヒト又は非ヒト動物を指すために本明細書で互換的に使用される。非ヒト動物は、全脊椎動物（例えば、哺乳動物及び非哺乳動物）、例えば任意の哺乳動物を含む。哺乳動物の非限定的な例としては、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、サル及びブタが挙げられる。好ましい実施形態では、対象は、ヒトである。
【０１７１】
過体重又は肥満である対象は、多様な代謝障害のリスクの増大及び重大な健康上の問題を有する。これらは、多くの場合、最初に、代謝症候群の一部として現れ、代謝症候群は、血圧の上昇、高い血糖、腹部の周りの過剰な体脂肪及び異常な血中コレステロールレベルにより特徴付けられる。次いで、重大な健康上の問題、例えばＩＩ型糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、卒中、癌、変形性関節症、睡眠時無呼吸、脂質異常症、インスリンの上昇（インスリン抵抗性）及び低換気症候群が発症し得る。ＩＩ型糖尿病は、いくつかの他の重大な健康上の問題、例えば糖尿病性神経症、糖尿病性腎症及び糖尿病性網膜症を生じる場合もある。ＧＤＦ１５ペプチドを単独で又はＧＦＲＡＬ受容体ポリペプチド（例えば、可溶性ＧＦＲＡＬ）と組み合わせて使用する治療法を必要とする対象は、一般に、過体重又は肥満である。一般に、成人ヒトは、成人が２５〜２９．９の肥満度指数（ＢＭＩ）（人の体重（キログラム）をその人の身長（メートル）の２乗で除算することにより得られる測定値）を有する場合に過体重と見なされ、成人ヒトは、成人が３０以上のＢＭＩを有する場合に肥満と見なされる。しかしながら、このガイドラインは、人種差を考慮するように調整することができる。例えば、人種の調整により、２７．５以上のＢＭＩを有するアジア人は、肥満と見なされ得る（ＷＨＯ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎ，Ｌａｎｃｅｔ  ２００４；３６３（９４０３）：１５７−６３）。代謝障害を発症するリスクが増大した対象も、ＧＤＦ１５ペプチド単独又はＧＦＲＡＬ受容体ポリペプチド（例えば、可溶性ＧＦＲＡＬ）との組み合わせを使用する治療法の候補である。例えば、糖尿病前症又は１００〜１２５ｍｇ／ｄＬの高い空腹時血糖レベルを有する対象は、ＩＩ型糖尿病を有する対象（１２６ｍｇ／ｄＬ以上の空腹時血糖レベルを有するもの）と同様にこの治療法の候補である。
【０１７２】
特定の態様において、本開示は、対象における肥満症又は肥満症関連の障害を処置する方法に関する。本明細書で使用される用語「肥満症」は、過剰な体脂肪が健康に負の影響を有し得るほど蓄積した状態を指し、これは、次に、平均余命の減少及び／又は健康上の問題の増加を引き起こし得る。場合により、対象は、対象の肥満度指数（ＢＭＩ）が２０ｋｇ／ｍ２、２１ｋｇ／ｍ２、２２ｋｇ／ｍ２、２３ｋｇ／ｍ２、２４ｋｇ／ｍ２、２５ｋｇ／ｍ２、２６ｋｇ／ｍ２、２７ｋｇ／ｍ２、２８ｋｇ／ｍ２、２９ｋｇ／ｍ２又は３０ｋｇ／ｍ２を超える場合に肥満と見なされ得る。場合により、肥満症は、少なくとも１００ｍｇ／ｄＬの空腹時ブドウ糖レベル、少なくとも１５０ｍｇ／ｄＬの血漿トリグリセリドレベル、男性では４０ｍｇ／ｄＬ未満、女性では５０ｍｇ／ｄＬ未満のＨＤＬコレステロール、少なくとも１３０／８５ｍｍＨｇの血圧及び男性では４０インチを超える、女性では３５インチを超える腹部ウエスト周囲の１つ以上によっても特徴付けられ得る。
【０１７３】
用語「肥満症関連の障害」は、肥満症と同時に発生し得るか、又は過剰な体重を有することの直接若しくは間接的な結果であり得る任意の状態を指す。この用語は、代謝疾患及び障害に加えて、例えば癌、体重障害を包含する。いくつかの実施形態では、肥満症関連の障害は、癌、体重障害及び／又は代謝疾患若しくは障害である。例えば、癌、ＩＩ型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、高トリグリセリド血症及び心血管系疾患等、例示的な肥満症関連の障害は、本明細書に記載されている。
【０１７４】
本明細書で使用される用語「体重障害」は、過剰な体重及び／又は亢進した食欲に関連した状態を指す。対象の年齢、身長、性別及び健康状態を含む様々なパラメーターは、参照の健康な個人と比較して対象が過体重であるか否かを決定するために使用される。例えば、対象は、対象のＢＭＩの評価により、過体重又は肥満と見なされ得る。場合により、１８．５〜２４．９ｋｇ／ｍ２の範囲のＢＭＩを有する成人は、正常な体重を有すると見なされ得；２５〜２９．９のｋｇ／ｍ２のＢＭＩを有する成人は、過体重（肥満前）と見なされ得；３０ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩを有する成人は、肥満と見なされ得る。亢進した食欲は、多くの場合に過剰な体重に寄与する。例えば、夜食症候群を含む、亢進した食欲に関連したいくつかの状態が存在し、夜食症候群は、朝の食欲不振により特徴付けられ、夕方の多食は、多くの場合、不眠症に関連するが、視床下部への損傷に関連する場合がある。
【０１７５】
用語「代謝障害」及び本明細書で同様に使用される用語は、肥満症、ＩＩ型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能障害、高トリグリセリド血症、高血糖、代謝症候群、高血圧、心血管系疾患、アテローム性動脈硬化症、末梢動脈疾患、卒中、心不全、冠動脈心疾患、糖尿病合併症（慢性腎臓疾患を含むが、これに限定されない）、神経障害、胃不全麻痺及び他の代謝障害を含むが、これらに限定されない。
【０１７６】
用語「代謝疾患又は障害」は、高インスリン血症、異常な耐糖能、肥満症、腹部又は上半身コンパートメントへの脂肪の再分布、高血圧、高トリグリセリド、低高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）粒子及び高低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）粒子により特徴付けられる脂質異常症を含むが、これらに限定されない、関連した形質のクラスターを指す。代謝疾患又は障害を有する対象は、Ｔ２ＤＭ及び例えばアテローム性動脈硬化症を発症するリスクがある。
【０１７７】
本明細書で使用される用語「代謝症候群」は、心臓疾患並びに糖尿病及び卒中のような他の疾患のリスクを上昇させるリスク因子のクラスターを指す。これらのリスク因子には、腹部脂肪（即ち殆どの男性でウエストヒップ比＞０．９又はＢＭＩ＞３０ｋｇ／ｍ２）；高血糖（即ち絶食後少なくとも１００ｍｇ／ｄＬ）；高トリグリセリド（即ち血流中少なくとも１５０ｍｇ／ｄＬ）；低ＨＤＬ（即ち男性では４０ｍｇ／ｄＬ以下、女性では５０ｍｇ／ｄＬ以下）；及び１３０／８５ｍｍＨｇ以上の血圧（世界保健機構）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７８】
特定の態様において、本開示は、対象における遺伝的肥満症、例えばプラダー・ウィリー症候群、レプチン変異及び／又はメラノコルチン４受容体変異を処置する方法にも関する。
【０１７９】
例示的な実施形態は、ＧＤＦ１５ペプチドを対象に投与することにより、肥満症又は肥満症関連の障害を処置する方法であり、ＧＤＦ１５ペプチドは、本明細書に記載される検出方法を用いて決定して、ＧＤＦ１５ペプチドと接触された細胞における生物学的応答を誘導し、且つ／又はＧＦＲＡＬシグナリング活性を有する。ＧＤＦ１５ペプチドは、単独で又は第２の薬剤（例えば、ＧＦＲＡＬ受容体ポリペプチド、例えば可溶性ＧＦＲＡＬ）と組み合わせて投与され得、また任意の許容され得る製剤、投与量及び投与レジメンで投与され得る。
【０１８０】
別の例示的な実施形態は、ＧＤＦ１５ペプチドをＧＦＲＡＬと組み合わせて対象に投与することを含む、肥満症又は肥満症関連の障害を処置する方法であり、ＧＤＦ１５ペプチドは、本明細書に記載される検出方法を用いて決定して、ＧＤＦ１５ペプチドと接触された細胞における生物学的応答を誘導し、且つ／又はＧＦＲＡＬシグナリング活性を有し、ＧＦＲＡＬは、ドメインＤ２及びＤ３を含むＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬは、可溶性ＧＦＲＡＬである。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬは、ドメインＤ１を欠いたＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬは、シグナルペプチドを更に含む。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬは、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬは、配列番号２のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む。
【０１８１】
本明細書で使用される「組み合わせて」投与される又は「共投与される」は、２つ以上の異なる処置が、医学的状態（例えば、肥満症）を有する対象の苦痛中に対象に送達されることを意味する。例えば、いくつかの実施形態では、２つ以上の処置は、対象が疾患又は障害と診断された後、疾患又は障害が治癒又は排除される前に送達される。いくつかの実施形態では、１つの処置の送達は、第２の処置の送達が開始したときに依然として存在し、従って重なりが存在する。いくつかの実施形態では、第１及び第２の処置は、同時に開始される。これらのタイプの送達は、本明細書では「同時（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）」、「同時発生（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ）」又は「同時（ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ）」送達と称される場合がある。他の実施形態では、１つの処置の送達は、第２の処置の送達が開始する前に終了する。このタイプの送達は、本明細書では、「連続（ｓｕｃｃｅｓｉｖｅ）」又は「連続（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ）」送達と称される場合がある。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５ペプチド及びＧＦＲＡＬは、同時に投与される。いくつかの他の実施形態では、ＧＤＦ１５及びＧＦＲＡＬは、連続で投与される。
【０１８２】
同時投与のいくつかの実施形態では、２つの処置（例えば、ＧＤＦ１５ペプチド及びＧＦＲＡＬ）は、同じ製剤中に含まれる。そのような製剤は、任意の適切な形態において且つ任意の好適な経路によって投与することができる。いくつかの実施形態では、２つの処置（例えば、ＧＤＦ１５ペプチド及びＧＦＲＡＬ）は、混合物中に含まれる。いくつかの実施形態では、２つの処置（例えば、ＧＤＦ１５ペプチド及びＧＦＲＡＬ）は、複合体中にある。いくつかの実施形態では、２つの処置（例えば、ＧＤＦ１５ペプチド及びＧＦＲＡＬ）は、二元複合体中にある。いくつかの実施形態では、２つの処置は、ＧＤＦ１５ペプチド及びＧＦＲＡＬを含む。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ（例えば、可溶性ＧＦＲＡＬ）は、ドメインＤ２及びＤ３を含むが、ドメインＤ１を欠いたＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含む。
【０１８３】
同時投与の他の実施形態では、２つの処置（例えば、ＧＤＦ１５ペプチド及びＧＦＲＡＬ）は、任意の適切な形態において且つ任意の好適な経路により、別個の製剤として投与される。いくつかの実施形態では、２つの処置は、ＧＤＦ１５ペプチド及びＧＦＲＡＬを含む。いくつかの実施形態では、例えば、ＧＤＦ１５ペプチド及びＧＦＲＡＬは、同時発生的に又は任意の順序で異なる時点で連続して投与され得；いずれの場合にも、それらは、所望の治療又は予防効果を提供するために十分近い時間に投与されるべきである。いくつかの実施形態では、ＧＦＲＡＬ（例えば、可溶性ＧＦＲＡＬ）は、ドメインＤ２及びＤ３を含むが、ドメインＤ１を欠いたＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含む。
【０１８４】
ＧＤＦ１５抗体ペプチド及び／又はＧＦＲＡＬ受容体ポリペプチド（例えば、可溶性ＧＦＲＡＬ）を含む好適な製剤又は組成物を提供し、且つそのような組成物を対象又は実験動物に投与するために従来の製薬慣行が用いられる。医薬組成物を処方する方法は、当技術分野で既知である（例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡを参照されたい）。適切な製剤は、投与経路に依存する。
【実施例】
【０１８５】
以下の実施例は、本開示の説明的な実施形態を提供する。当業者は、本開示の趣旨又は範囲を変更することなくなされ得る多数の修正形態及び変形形態を認識するであろう。そのような修正形態及び変形形態は、本開示の範囲内に包含される。提供される実施例は、本開示を決して限定するものではない。
【０１８６】
実施例１：ＧＤＦ１５結合アッセイのために生成される組換え可溶性ＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン
方法：ヒトＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ（配列番号３）、ヒトＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ｈｉｓ（配列番号２５）、ヒトＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｈｉｓ（配列番号６）及びヒトＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｆｃ（配列番号７）遺伝子コンストラクト（図１）をジェンバンク及びＵｎｉＰｒｏｔデータベース（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆ．配列：ＮＭ＿２０７４１０．２；ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｒｅｆ．配列：Ｑ６ＵＸＶ０）からのヒトＧＦＲＡＬの遺伝子ヌクレオチド及びタンパク質配列に従って作製した。Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴｉソフトウエア及びＢｌａｓｔを使用することによって配列をシグナルペプチド（Ｓ．Ｐ．）及び機能性ドメインについて分析した。全長ヒトＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン（ＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ））、ヒトＧＦＲＡＬ細胞外ドメインのＤ２Ｄ３領域（ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３））及び精製タグ、例えばＨｉｓ（６ヒスチジン）、Ａｐｐ（アミロイドβ前駆体タンパク質）又はＦｃ（ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ）を含む遺伝子コンストラクトを設計し、合成し、ＨＥＫ２９３Ｔ若しくはＨＥＫ２９３Ｆ細胞内又はＣＨＯ細胞内での遺伝子発現のためのＣＭＶプロモーターの制御下でｐＲＳ５ａ発現ベクターバックボーンにクローン化した。ヒトＲＥＴ細胞外ドメイン（ＲＥＴ−ＥＣＤ）をヒトＩｇＧ１  Ｆｃと融合することにより、ヒトｃＲＥＴ（ＥＣＤ）−Ｆｃ（配列番号８）（図１）を作製した。ヒトＣＤ３３シグナルペプチド（配列番号１０）を各コンストラクトのＮ末端に融合して、タンパク質分泌を指示した。
【０１８７】
追加のコンストラクト、Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５を、Ｎ末端６ヒスチジンタグ化ヒトＧＤＦ１５（配列番号１１）をコードするように設計した（図１）。コンストラクトを合成し、ＧＤＦ１５−由来ＧＦＲＡＬ複合体の共トランスフェクション及び共精製のためにｐＲＳ５ａ発現ベクターバックボーンにクローン化した。
【０１８８】
新しいコンストラクト：
・ヒトＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ
・ヒトＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ｈｉｓ
・ヒトＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｈｉｓ
・ヒトＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｆｃ
・ヒトｃＲＥＴ（ＥＣＤ）−Ｆｃ
・ヒトＨｉｓ−ＧＤＦ１５
【０１８９】
細胞株：ヒト胚腎臓細胞縣濁液細胞株ＨＥＫ２９３Ｔ又はＨＥＫ２９３Ｆ若しくはＣＨＯ細胞を、一過性トランスフェクションと、組換えＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ、ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ｈｉｓ、ＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｈｉｓ、ＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｆｃ、ｃＲＥＴ（ＥＣＤ）−Ｆｃ及び本開示の他のタンパク質又はタンパク質複合体の生成とのためにフリースタイル２９３発現培地（ＦＳ２９３）中で３７℃において増殖させた。
【０１９０】
試薬：トランスフェクション及びタンパク質生成のために、ＰｕｒｅＬｉｎｋ  ＥｘｐｉエンドトキシンフリーＧｉｇａプラスミド精製キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ  ＭＡ）を使用して、エンドトキシンフリープラスミドＤＮＡを生成した。ポリエチレンイミン溶液（ＰＥＩ）をトランスフェクションに使用した。Ｎｉ−ＮＴＡスーパーフローカートリッジ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ  ＭＤ）及びＨｉＴｒａｐタンパク質Ａカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ  ＭＡ）をタンパク質精製に使用した。
【０１９１】
組換えタンパク質の発現及び精製：精製組換えＧＦＲＡＬ及びｃＲＥＴタンパク質並びにこれらのタンパク質のＨｉｓ−ＧＤＦ１５との共発現複合体を生成するために、発現ベクターをＦＳ２９３培地中に希釈し、１：２．５（ｗ／ｗ）の比でＰＥＩ溶液と混合してＤＮＡ／ＰＥＩ複合体を形成した後、それに応じてＨＥＫ２９３Ｔ又はＨＥＫ２９３Ｆ細胞培養物又はＣＨＯ細胞培養物に添加した。例えば、１ｍｇの発現プラスミドＤＮＡを２．５ｍｇのＰＥＩと複合体化させて、１リットルのＨＥＫ２９３細胞培養物を一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの４日後、トランスフェクトした細胞培養物から上清を回収し、濾過し、適切な親和性カラムに通して組換えタンパク質を精製した。Ｈｉｓタグ化タンパク質は、Ｑｉａｇｅｎ  Ｎｉ−ＮＴＡスーパーフローカートリッジにより精製し、Ａｐｐタグ化タンパク質は、抗Ａｐｐ  ｍＡｂ（モノクローナル抗体）を抱合したセファロース樹脂により、Ｆｃ融合物は、タンパク質Ａカラムにより精製した。ニッケルカラムに結合したタンパク質を３５０ｍＭイミダゾールで溶出した。ＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｈｉｓコンストラクト単独について、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ  ＭＡ）によるサイズ排除クロマトグラフィーによってモノマー種の追加の精製を行った後、実験に使用した。抗Ａｐｐ  ｍＡｂ抱合セファロース樹脂又はタンパク質Ａカラムに結合したタンパク質を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌで補充した５０ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ  ３．０）で溶出した後、１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣＬで中和した。続いて、溶出したタンパク質画分を緩衝液交換し、Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）中で濃縮した。精製組換えＨｉｓ−ＧＤＦ１５を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を使用して米国特許第２０１７／２０４１４９号明細書に記載されているように生成し、プレートベースのｃＲＥＴ結合及び細胞アッセイのために、ビオチン化するか、又は組換えＧＦＲＡＬ  ＥＣＤタンパク質とのインビトロ再構成のためにそのままで使用した。
【０１９２】
実施例２：可溶性ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインタンパク質とＧＤＦ１５との共発現及び共精製
方法：ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ／Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５及びＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｆｃ／Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５複合体を生成するために、実施例１に記載したＰＥＩ方法を使用した３リットルのＨＥＫ２９３Ｔ又はＨＥＫ２９３Ｆ培養物の一過性トランスフェクションのためにＨｉｓ−ＧＤＦ１５ベクターＤＮＡを等量のｈＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐベクター又はｈＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｆｃベクターと混合した。トランスフェクションの４日後、ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ／Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５複合体（図２Ａ〜Ｂ及び３）及びＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｆｃ／Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５複合体（図４Ａ〜Ｂ）を、それぞれＮｉ−ＮＴＡカートリッジ及びタンパク質Ａカラムを通して精製した。溶出したタンパク質画分を緩衝液交換し、ＤＰＢＳ中で濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動、サイズ排除及び質量分析で分析した。
【０１９３】
ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ／Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５複合体を３０００ｍｌ培養培地から精製した（溶出プロファイルは示されない）。図２Ａは、例示的なＨｉｓ−ＧＤＦ１５及びＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐコンストラクトを示す。図２Ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による画分のスクリーニングを示す。図２Ｂに示す単一タンパク質バンドは、ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐモノマー（２４．６ｋＤ）及びＨｉｓ−ＧＤＦ１５ダイマーの両方を含む（ダイマーが２６．６ｋＤ、モノマーが１３．３ｋＤ）。
【０１９４】
共発現したＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ／Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５複合体を以下のように分析した：数個の画分から濃縮した複合体は、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより明らかなように、共発現ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ及びＨｉｓ−ＧＤＦ１５を含む（図３）。複合体は、２４．６ｋＤ  ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ及び１３．３ｋＤ  Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５を含む。共発現ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ／Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５複合体（２０μｇ）をサイズ排除により更に分析した（データは示さず）。ピークは、ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ／Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５複合体の存在を示す。二元複合体におけるＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ及びＨｉｓ−ＧＤＦ１５の分子質量も還元条件下で分析した。２４３５５ダルトンピークは、ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐポリペプチドであり、そこから精製プロセス中にグリシンをＮ末端から切り取り、アスパラギン酸及びセリンをＣ末端から切り取った。
【０１９５】
ＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｆｃ／Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５複合体をタンパク質Ａカラムから親和性精製した。図４Ａは、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した、Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｆｃ複合体を含む画分を示す。図４Ｂは、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより明らかなように、図４Ａの画分から濃縮した複合体がＨｉｓ−ＧＤＦ１５及びＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｆｃを含むことを示す。
【０１９６】
精製により、１．６ｍｇのＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ／Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５及び１４ｍｇのＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｆｃ／Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５複合体が得られた。これらを更にｃＲＥＴ−発現細胞活性化アッセイに使用した（図７及び８）。
【０１９７】
実施例３：可溶性組換えＧＦＲＡＬ変異体とのＧＤＦ１５複合体は、ＲＥＴ−Ｆｃタンパク質被覆プレートに結合する
ビオチン化組換えＨｉｓ−ＧＤＦ１５（ビオチン）を精製全長ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ、ＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｈｉｓ又はＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｆｃポリペプチド（実施例１に記載したように調製）と混合して、二元分子複合体を形成した。次いで、複合体を希釈し、組換えｃＲＥＴ（ＥＣＤ）−Ｆｃで被覆したプレートと共にインキュベートした。
【０１９８】
方法：可溶性ＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ複合体をインビトロで生成するために、実施例１で精製した組換えＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ、ＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｈｉｓ及びＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｆｃタンパク質を、５０μＭ  ＣａＣｌ２で補充したＤＰＢＳ中の等モル量のビオチン化Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５（１２５０ｐＭ）と新たに混合した。この混合物を室温で６０分間インキュベートして、複合体を形成させた。作製した複合体は、４℃で安定であり、更に精製することなく、プラスチックプレートに被覆したｃＲＥＴ（ＥＣＤ）−Ｆｃに対するインビトロ結合アッセイに直接使用した。Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５（ビオチン）／ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ、Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５（ビオチン）／ＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｈｉｓ及びＨｉｓ−ＧＤＦ１５（ビオチン）／ＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｆｃを含む３つの異なるＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ  ＥＣＤ複合体を同じ方法で調製した。精製組換えＨｉｓ−ＧＤＦ１５（Ｌ２９４Ｒ）、２９４位のロイシン残基がアルギニンに置き換わった非機能性突然変異（米国特許第２０１７／２０４１４９号を参照されたい）を野生型Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５と同じ方法で調製した。Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５（Ｌ２９４Ｒ）をＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｈｉｓと混合して、ＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ／ｃＲＥＴ相互作用についての陰性対照を生成した。
【０１９９】
野生型ＧＤＦ１５との複合体の可溶性ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインが、固定化ｃＲＥＴに結合できるか否かを決定するために、組換えヒトｃＲＥＴ（ＥＣＤ）−ＦｃをＤＰＢＳ中のメソスケールディスカバリー（ＭＳＤ）標準結合プレート（１μｇタンパク質／ｍｌ）上に４℃で一晩被覆した。洗浄及びブロッキング後、プレートを２Ｘ段階希釈の異なるＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ複合体及び対照と共に６０分間インキュベートし、次いでストレプトアビジンスルホタグと共にインキュベートした（図５）。
【０２００】
試薬：
・被覆プレートを洗浄するための緩衝液：５００μＭ  ＣａＣｌ２を含有するＤＰＢＳ
・被覆緩衝液：２５０μＭ  ＣａＣｌ２を含有するＤＰＢＳ
・ブロッキング緩衝液：ＤＰＢＳ、２５０μＭ  ＣａＣｌ２を含有する５％  ＢＳＡ
・希釈緩衝液：２％  ＢＳＡ、２５０μＭ  ＣａＣｌ２で補充した１Ｘ  ＴＢＳＴ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）
・洗浄溶液：５００μＭ  ＣａＣｌ２で補充した１Ｘ  ＴＢＳＴ
【０２０１】
結果：精製成分で新たに作製した全ＧＦＲＡＬ／ＧＤＦ１５複合体は、ストレプトアビジンで検出するプレート上に被覆したｃＲＥＴ（ＥＣＤ）−Ｆｃに結合することができた。ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ複合体は、全長ＧＦＲＡＬ−由来対応物（ＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｈｉｓ及びＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｆｃ）よりも僅かに強い、ＧＤＦ１５への結合活性を示した（図５）。
【０２０２】
実施例４：単独及び突然変異ＧＤＦ１５（Ｌ２９４Ｒ）と混合した可溶性ＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｈｉｓは、固定化ｃＲＥＴ（ＥＣＤ）−Ｆｃタンパク質に結合しない
方法：精製ビオチン化Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５及びＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｈｉｓ又はＨｉｓ−ＧＤＦ１５（Ｌ２９４Ｒ）及びＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｈｉｓの混合物を実施例３に記載したように調製した。個々のタンパク質Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５（Ｌ２９４Ｒ）及びＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｈｉｓも対照として含めた。ｃＲＥＴ（ＥＣＤ）−Ｆｃで被覆したプレートへのタンパク質の結合を、ビオチン化マウス抗６ｘＨｉｓタグモノクローナル抗体と、次いでストレプトアビジンスルホタグとを使用して検出し、実施例３に記載した方法により別様に検出した。
【０２０３】
結果：Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５（ビオチン）／ＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｈｉｓ複合体は、ｃＲＥＴ（ＥＣＤ）−Ｆｃへの強い結合を示した。対照的に、Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５（Ｌ２９４Ｒ）／ＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｈｉｓ混合物、Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５（Ｌ２９４Ｒ）突然変異単独及びＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｈｉｓ単独は、ｃＲＥＴ（ＥＣＤ）−Ｆｃへの有意な結合を示さなかった（図６）。
【０２０４】
実施例５：Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５と組み合わせた可溶性ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐは、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞においてｐＥＲＫ及びｐＡＫＴを誘導する
方法：共発現及び共精製Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ及びＨｉｓ−ＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｆｃ複合体を実施例２に記載したように生成した。再構成した可溶性Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ複合体を、各成分を培養培地中で予備混合し、室温で６０分間インキュベートすることにより別々に精製した成分から調製した。次いで、タンパク質複合体を使用してＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を直接刺激し、その後、免疫ブロットアッセイによるリン酸化ＥＲＫ及びＡＫＴタンパク質レベルの決定のために細胞溶解物を調製した。共発現共精製した複合体、予備混合した複合体及び個々のタンパク質を培養培地中で規定濃度に希釈し、次いでＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を１５分間刺激するために使用し、その後、検出した。ＧＦＲα１及びｃＲＥＴを介してシグナル伝達する組換えＧＤＮＦタンパク質（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ  ＮＪ）をＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞活性化の陽性対照として使用した。Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ複合体によるＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の活性化を、リン酸化ＥＲＫ及びリン酸化ＡＫＴに対する抗体を用いる免疫ブロットアッセイによって検出した。
【０２０５】
細胞培養及び処理方法：ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）ＣＲＬ−２２６６）を、１０％熱不活性化ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ；ＳＨ３００７１．０３）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；１５１４０−１２２）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２  Ｈａｍ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；１１３２０−０３３）中の１２ウェルポリ−ｄ−リシン被覆プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ；３５４４７０）に４００，０００細胞／ウェルで播種した。４８時間後、培地を上述したような且つ更に１．５μＭレチノイン酸を含む新鮮な培地と交換した。２４時間後、培地を無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２で２時間置き換えた。次いで、細胞をタンパク質又は対照で１５分間処理し、温ＤＰＢＳで洗浄し、液体窒素中で急速凍結した。
【０２０６】
ウェスタンブロット方法：細胞を、プロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｐｉｅｒｃｅ；７８４４１）を含有するＲＩＰＡ緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；８９９００）中で溶解した。溶解物を変性させ、還元し、ＮｕＰＡＧＥ  ４〜１２％ビス−トリスゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ＮＰ０３３６ＢＯＸ）中で１５０Ｖにおいて２時間泳動した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｉＢｌｏｔ  ２機器を使用して、タンパク質をニトロセルロース膜（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ＩＢ２３００１）に２５Ｖで６分間転写した。次いで、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ）を含有するトリス緩衝生理食塩水中の５％乾燥ミルク中において膜を室温で１時間ブロックし、続いて５％  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ；Ａ８０２２）を含有するＴＢＳＴ中の１次抗体中において４℃で一晩インキュベートした。膜をＴＢＳＴ中で室温において３回、各々１０分間洗浄し、次いで５％  ＢＳＡを含有するＴＢＳＴ中において室温で１時間、２次抗体中でインキュベートした。次いで、膜をＴＢＳＴ中で室温において３回、各々２０分間洗浄した。次いで、化学発光検出試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；ＲＰＮ２２３５；又はＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ；ＮＥＬ１０３００１ＥＡ）を使用してウェスタンブロットを可視化した。
【０２０７】
抗体：
・ホスホ−ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ；４０６０）−１：２０００希釈
・ホスホ−ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／２）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ；４３７０）−１：２０００希釈
・β−アクチン−ＨＲＰ（Ａｂｃａｍ；ａｂ４９９００）−１：１０，０００希釈
・抗ウサギＩｇＧ、ＨＲＰ−結合（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ；７０７４）−１：１０，０００希釈
【０２０８】
結果：共発現及び共精製Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ複合体と予備混合Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐとは、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞においてＥＲＫ及びＡＫＴのリン酸化を濃度依存的に誘導することができた（図７、レーン３〜５及び１２）。対照的に、共発現Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｆｃ複合体は、プレート上に固定化された組換えｃＲＥＴ（ＥＣＤ）−Ｆｃへの結合にも関わらず（図５）、同じ細胞内でＥＲＫ又はＡＫＴのリン酸化を刺激しなかった（図７、レーン６〜８）。理論に束縛されることを望むものではないが、ＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）のＣ末端のＦｃの存在は、ＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）と、細胞表面上のＲＥＴの細胞外領域との機能性シグナリング複合体の形成を妨げる立体障害を形成する可能性があり、従って（ＲＥＴ自動リン酸化及びシグナリングに必要不可欠な）ＲＥＴ二量体化をもたらさない。加えて、精製された個々の成分は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞においてＥＲＫ及びＡＫＴのリン酸化を刺激しなかった（図７、レーン９〜１１）。
【０２０９】
実施例６：ＧＤＦ１５と組み合わせた可溶性ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）は、ＭＣＦ７細胞においてｐＥＲＫ及びｐＡＫＴを誘導する
方法：共発現及び再構成（予備混合）Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ複合体を実施例２及び５に記載したように調製した。ＧＤＮＦタンパク質（ＧＦＲα１及びｃＲＥＴを介してシグナル伝達する）をＭＣＦ７細胞活性化の陽性対照として使用した。
【０２１０】
細胞培養及び処理方法：ＭＣＦ７細胞（ＡＴＣＣ；ＨＴＢ−２２）を、１０％熱不活性化ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ；ＳＨ３００７１．０３）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；１５１４０−１２２）を含有するＥＭＥＭ培地（ＡＴＣＣ；３０−２００３）中、１ウェル当たり１００，０００細胞で１２ウェル組織培養処理プレートに播種した。４８時間後、培地を無血清ＥＭＥＭに２４時間交換した。次いで、細胞をタンパク質又は対照で１５分間処理し、温ＤＰＢＳで洗浄し、液体窒素中で急速凍結した。
【０２１１】
ウェスタンブロット方法：ウェスタンブロットを実施例５に記載したように行った。
【０２１２】
結果：共発現Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ複合体は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞における結果とは対照的に（図７、レーン３〜５）、ＭＣＦ７細胞においてＥＲＫ及びＡＫＴのリン酸化を誘導するように見えなかった（図８、レーン３〜５）。しかしながら、個々の成分からの再構成（予備混合）Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐは、ＥＲＫ及びＡＫＴのリン酸化を誘導することができた（図８、レーン１２）。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞による結果と同様に、共発現Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｆｃ複合体は、ＭＣＦ７細胞においてリン酸化ＥＲＫ及びＡＫＴを誘導しなかった（図８、レーン６〜８）。精製した個々の成分もＭＣＦ７細胞においてＥＲＫ及びＡＫＴのリン酸化を刺激しなかった（図８、レーン９〜１１）。
【０２１３】
実施例７：ＳＨ−ＳＹ５Ｙ及びＭＣＦ７細胞におけるＥＲＫ及びＡＫＴリン酸化の誘導は、ＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）複合体の用量依存性である
方法：実施例５及び６では、再構成（予備混合）Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ複合体は、ＭＣＦ７及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞においてＥＲＫ及びＡＫＴリン酸化を刺激することができた。ＥＲＫ及びＡＫＴリン酸化が再構成Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ複合体の濃度に依存するか否かを決定するために、希釈した組換えＨｉｓ−ＧＤＦ１５（２８ｎＭ、８３ｎＭ及び２５０ｎＭ）を培養培地中で等量のＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐと混合した。この混合物を室温で６０分間インキュベートして、複合体を形成させた。次いで、タンパク質複合体を直接使用してＭＣＦ７及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を１５分間刺激した後、実施例５のように、免疫ブロットアッセイによるリン酸化ＥＲＫ及びＡＫＴレベルの決定のために細胞溶解物を調製した。ＧＤＮＦタンパク質をＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞及びＭＣＦ７細胞活性化の陽性対照として使用した。
【０２１４】
細胞培養及び処理方法：ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を実施例５に記載したように培養及び処理した。ＭＣＦ７細胞を実施例６に記載したように培養及び処理した。
【０２１５】
ウェスタンブロット方法：ウェスタンブロットを実施例５に記載したように行った。
【０２１６】
結果：ＭＣＦ７及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるＥＲＫ及びＡＫＴリン酸化の再構成Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ複合体誘導は、複合体の濃度に依存するように見える（図９）。刺激されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、刺激されたＭＣＦ７細胞よりも高い、ＥＲＫ及びＡＫＴのリン酸化の総レベルを示した。
【０２１７】
実施例８：Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５及びＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐのプレインキュベーションの延長は、ＭＣＦ７及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を活性化できる複合体を再構成するために必要ではない
以下の実験は、部分的には、再構成Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ複合体を使用した、ＭＣＦ７及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるＥＲＫ及びＡＫＴリン酸化の誘導に必要な刺激時間を決定するために行った。また、Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５及びＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ（ＭＣＦ７及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に添加する前）の共インキュベーションの延長がＥＲＫ及びＡＫＴリン酸化の誘導に必要であるか否かを評価するために実験を行った。
【０２１８】
方法：再構成Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ複合体を以下のように調製した。フォーマット（ａ）：３０ｎＭ（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞刺激の場合）又は１００ｎＭ（ＭＣＦ７細胞刺激の場合）のＨｉｓ−ＧＤＦ１５を培養培地中で等濃度のＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐと混合し、室温で６０分間インキュベートして複合体を形成させた後、ＭＣＦ７及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞培養物に添加した。フォーマット（ｂ）：同じ濃度のＨｉｓ−ＧＤＦ１５を培養培地中で等濃度のＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐと混合した後、ＭＣＦ７及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞培養物に直ちに添加した。フォーマット（ａ）の結果をフォーマット（ｂ）の結果と並行して比較した。ＧＤＮＦタンパク質を３．３ｎＭでＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞及びＭＣＦ７細胞活性化の陽性対照として使用した。
【０２１９】
細胞培養及び処理方法：ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を実施例５に記載したように培養及び処理した。ＭＣＦ７細胞を実施例６に記載したように培養及び処理した。
【０２２０】
ウェスタンブロット方法：ウェスタンブロットを実施例５に記載したように行った。
【０２２１】
結果：ＭＣＦ７細胞を１００ｎＭ複合体で５、１０及び１５分間（図１０Ａ、レーン３、５及び７）処理した際、１５分の時点（レーン７）が最高のリン酸化ＥＲＫ及びＡＫＴのレベルを得た。３０ｎＭ複合体で同じ時間処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞も同じであった（図１０Ｂ、レーン３、５及び７）。プレインキュベーション時間のなかった（即ち混合後、直ちに細胞に添加された）再構成（予備混合）Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−ＡｐｐでのＭＣＦ７及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の１５分間の刺激も高いレベルのリン酸化ＥＲＫ及びＡＫＴを生じた（図１０Ａ〜Ｂ、レーン９）。これらの結果は、Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５及びＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐが互いに急速に相互作用して、ＲＥＴを発現する細胞を刺激することができる複合体を形成し得ることを示唆している。Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５及びＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐに、共インキュベーション時間の延長は必要ではない。
【０２２２】
実施例９：ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−ＡｐｐのＨｉｓ−ＧＤＦ１５又は脂肪酸−ＧＤＦ１５との組み合わせは、ＭＣＦ７細胞におけるＥＲＫリン酸化を強く刺激する
以下の実験は、部分的には免疫ブロットベースのアッセイを高スループットのプレートベースのアッセイ（ＡｌｐｈａＬＩＳＡ）に変換するために、部分的にはＨｉｓ−ＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ及びＨｉｓ−ＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｈｉｓ複合体の効力を比較するために行った。
【０２２３】
方法：３つの形態のＧＤＦ１５をＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ又はＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｈｉｓと組み合わせて（実施例８に記載したように）、６つの異なるＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ複合体を生成し、その直後にＥＲＫリン酸化の誘導のためにＭＣＦ７細胞培養物に添加した。ＧＦＤ１５サンプルは、ＤＰＢＳ  ｐＨ  ７．４中でＨｉｓ−ＧＤＦ１５、脂肪酸−ＧＤＦ１５（国際公開第２０１５／２０００７８号パンフレットに記載されているような）及びＭＳＡ−ＧＤＦ１５（国際公開第２０１５／１９８１９９号パンフレット及び国際公開第２０１７／１０９７０６号パンフレットに記載されているようなマウス血清アルブミン−ＧＤＦ１５融合物）を含んでいた。ＧＤＮＦタンパク質をＭＣＦ７細胞活性化の陽性対照として使用した。
【０２２４】
細胞培養及び処理方法：ＭＣＦ７細胞を、１０％熱不活性化ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ；ＳＨ３００７１．０３）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；１５１４０−１２２）を含有するＥＭＥＭ培地（ＡＴＣＣ；３０−２００３）中、１ウェル当たり５，０００細胞で３８４ウェルポリ−ｄ−リシン被覆プレートに播種した。４８時間後、培地を無血清ＥＭＥＭに２４時間交換した。次いで、細胞をタンパク質又は対照で１５分間処理した。次いで、細胞を氷上に５分間配置し、溶解緩衝液（キットからの、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ；ＡＬＳＵ−ＰＥＲＫ−Ａ１０Ｋ）を各ウェルに加えた。次いで、細胞を３５０ＲＰＭで室温において１０分間振盪した。溶解物を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡを行うまで−８０℃で保存した。
【０２２５】
ＡｌｐｈａＬＩＳＡ方法：ホスホ−ＥＲＫレベルを、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ  ＳｕｒｅＦｉｒｅ  Ｕｌｔｒａキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ＡＬＳＵ−ＰＥＲＫ−Ａ１０Ｋ）を用いて検出し、アッセイを製造業者により説明されるように行った。簡単に言えば、５μｌの希釈アクセプタービーズを３８４ウェルＯｐｔｉＰｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、６００７２９０）の各ウェルに加え；次いで１０μｌの溶解物を加えた後、５μｌの希釈ドナービーズを加え；次いでプレートを１０００ＲＰＭで１０秒間遠心分離し、室温で２時間インキュベートし、次いで標準的なＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ設定を使用してＥｎｖｉｓｉｏｎ機器で読み取った。
【０２２６】
結果：ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐと複合体化したＨｉｓ−ＧＤＦ１５は、ＡｌｐｈａＬＩＳＡにより測定して、ＭＣＦ７細胞におけるＥＲＫリン酸化を用量依存的に誘導した（２８ｎＭ〜２５０ｎＭ）（図１１Ａ〜Ｂ）。２５０ｎＭ濃度でＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐと複合体化した脂肪酸−ＧＤＦ１５は、同様のＥＲＫリン酸化のレベルを誘導した。同じ濃度でＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐと複合体化したＭＳＡ−ＧＤＦ１５は、比較的少ないＥＲＫリン酸化を誘導したが、レベルは、培地のみの対照よりも僅かに上であった。この結果は、ＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ複合体と細胞表面ＲＥＴとの適切な相互作用を妨げる立体障害を形成し得る、ＧＤＦ１５ダイマーのＮ末端の２つの大きいＭＳＡポリペプチドの永続的な存在に起因する可能性がある。
【０２２７】
ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐタンパク質と比較して、全長ＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｈｉｓタンパク質（２５０ｎＭ濃度でＨｉｓ−ＧＤＦ１５又は脂肪酸−ＧＤＦ１５と複合体化される場合）は、培地対照レベルを超えるが、低いＥＲＫリン酸化誘導を示した。絶対ホスホ−ＥＲＫ  ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイシグナル単位（図１１Ａ）及び培地対照と比較したリン酸化ＥＲＫシグナルの倍数増加の両方を示すデータ（図１１Ｂ）である。
【０２２８】
実施例１０：ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−ＡｐｐのＨｉｓ−ＧＤＦ１５又は脂肪酸−ＧＤＦ１５との組み合わせは、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるＥＲＫリン酸化を強く刺激する
方法：以下の実験は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞培養物を試験した以外、実施例９に記載されているように行った。
【０２２９】
細胞培養及び処理方法：ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、１０％熱不活性化ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ；ＳＨ３００７１．０３）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；１５１４０−１２２）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２  Ｈａｍ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；１１３２０−０３３）中、１ウェル当たり１０，０００細胞で３８４ウェルポリ−ｄ−リシン被覆プレートに播種した。４８時間後、培地を上述したような且つ更に１．５μＭレチノイン酸を含む新鮮な培地と交換した。２４時間後、培地を無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２で２時間置き換えた。次いで、細胞をタンパク質又は対照で１５分間処理した。次いで、細胞を氷上に５分間配置し、溶解緩衝液（キットからの、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ；ＡＬＳＵ−ＰＥＲＫ−Ａ１０Ｋ）を各ウェルに加えた。細胞を３５０ＲＰＭで室温において１０分間振盪した。溶解物を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡを行うまで−８０℃で保存した。
【０２３０】
ＡｌｐｈａＬＩＳＡ方法：ホスホ−ＥＲＫレベルを実施例９に記載したように検出した。
【０２３１】
結果：ＭＣＦ７細胞と同様に、Ｈｉｓ−ＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ及び脂肪酸−ＧＤＦ１５／ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐ複合体は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるＥＲＫリン酸化の誘導において、それらのＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｈｉｓ対応物よりも強力であった（図１２Ａ〜Ｂ）。しかしながら、ＧＦＲＡＬ（ＥＣＤ）−Ｈｉｓを含む複合体の活性は、ＭＣＦ７細胞よりもＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞においてより高いように見えた。
【０２３２】
加えて、ＭＣＦ７細胞と同様に、ＧＦＲＡＬタンパク質と複合体化したＭＳＡ−ＧＤＦ１５は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞においてＥＲＫリン酸化の誘導を殆ど示さなかった。絶対ホスホ−ＥＲＫ  ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイシグナル単位（図１２Ａ）及び培地対照と比較したリン酸化ＥＲＫシグナルの倍数増加の両方を示すデータ（図１２Ｂ）である。
【０２３３】
実施例１１：ＭＣＦ７細胞におけるＥＲＫリン酸化は、ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）及び脂肪酸−ＧＤＦ１５の用量に依存する
方法：これらの実験では、脂肪酸−ＧＤＦ１５を様々な濃度でＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐと組み合わせて、ＭＣＦ７細胞においてＥＲＫリン酸化を誘導する各々の相対的な能力を比較した。実験方法は、実施例９に記載したように行った。
【０２３４】
細胞培養及び処理方法：ＭＣＦ７細胞を実施例９に記載したように培養及び処理した。
【０２３５】
ＡｌｐｈａＬＩＳＡ方法：ホスホ−ＥＲＫレベルを実施例９に記載したように検出した。
【０２３６】
結果：より高い濃度の脂肪酸−ＧＤＦ１５及びＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐの両方を含む複合体は、培地対照を超える、ＥＲＫリン酸化のより高い誘導をもたらした（表３）。
【０２３７】
最大ｐＥＲＫシグナルを達成する２つの比が存在し、脂肪酸−ＧＤＦ１５濃度をＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐの濃度に又はその濃度を超えて増大させると、ピーク値からのシグナルの減少をもたらし得る。この仮説は、三元複合体モデルと一致している。脂肪酸−ＧＤＦ１５濃度がＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）の濃度と一致するか又はその濃度を超えるにつれて、単一ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐタンパク質との脂肪酸−ＧＤＦ１５複合体の形成が増大し得る。そのような複合体は、二量体化し、且つ能動的にシグナル伝達する２つのＲＥＴタンパク質に結合することができる、２つのＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐタンパク質を有する脂肪酸−ＧＤＦ１５複合体とは対照的に、２つのＲＥＴタンパク質に結合すると予測されない。従って、アッセイ、が異なるＧＤＦ１５ベースの材料の効力を正確に比較するように、アッセイにおけるＧＤＦ１５コンストラクトの濃度は、ＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）コンストラクトの濃度を超えないことが理想的である。
【０２３８】
ＭＣＦ７細胞におけるＥＲＫリン酸化に対するＧＦＲＡＬ（Ｄ２Ｄ３）−Ａｐｐと組み合わせた脂肪酸−ＧＤＦ１５の用量依存的な結果は、再現性がある（表４）。
【０２３９】
【表６】
2021533743.tif 000007
【０２４０】
【表７】
2021533743.tif 000008
【０２４１】
番号付き実施形態
実施形態１．ＧＤＦ１５ペプチドの活性を検出する方法であって、
（ａ）細胞表面受容体キナーゼを発現する細胞を提供することと；
（ｂ）細胞をＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬと接触させることと；
（ｃ）接触された細胞における生物学的応答を検出することと
を含み、可溶性ＧＦＲＡＬは、ドメインＤ２及びＤ３を含むＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含む、方法。
【０２４２】
実施形態２．可溶性ＧＦＲＡＬは、ドメインＤ１を欠いたＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含む、実施形態１の方法。
【０２４３】
実施形態３．可溶性ＧＦＲＡＬは、シグナルペプチドを更に含む、実施形態１又は２の方法。
【０２４４】
実施形態４．可溶性ＧＦＲＡＬは、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態１〜３のいずれか１つの方法。
【０２４５】
実施形態５．可溶性ＧＦＲＡＬ又は機能的変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態１〜３のいずれか１つの方法。
【０２４６】
実施形態６．可溶性ＧＦＲＡＬ又は機能的変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態１〜３のいずれか１つの方法。
【０２４７】
実施形態７．可溶性ＧＦＲＡＬは、配列番号２のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態１〜３のいずれか１つの方法。
【０２４８】
実施形態８．可溶性ＧＦＲＡＬは、親和性タグを更に含む（例えば、親和性タグに融合される）、実施形態１〜７のいずれか１つの方法。
【０２４９】
実施形態９．親和性タグは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ又はｍｙｃタグを含む、実施形態８の方法。
【０２５０】
実施形態１０．ＧＤＦ１５ペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態１〜９のいずれか１つの方法。
【０２５１】
実施形態１１．ＧＤＦ１５ペプチド又は機能的変異体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態１〜９のいずれか１つの方法。
【０２５２】
実施形態１２．ＧＤＦ１５ペプチド又は機能的変異体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態１〜９のいずれか１つの方法。
【０２５３】
実施形態１３．ＧＤＦ１５ペプチドは、親和性タグ、融合、抱合、ペグ化及び／又はグリコシル化を含む、実施形態１〜１２のいずれか１つの方法。
【０２５４】
実施形態１４．ＧＤＦ１５ペプチドは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ又はｍｙｃタグでタグ化される、実施形態１〜１３のいずれか１つの方法。
【０２５５】
実施形態１５．ＧＤＦ１５ペプチドは、ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−１−アンチトリプシンに融合される、実施形態１〜１４のいずれか１つの方法。
【０２５６】
実施形態１６．ＧＤＦ１５ペプチドは、脂肪酸に抱合される、実施形態１〜１５のいずれか１つの方法。
【０２５７】
実施形態１７．細胞は、ＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬと同時に接触される、実施形態１〜１６のいずれか１つの方法。
【０２５８】
実施形態１８．細胞は、ＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬと連続で接触される、実施形態１〜１６のいずれか１つの方法。
【０２５９】
実施形態１９．ＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬは、同じ組成物中にある、実施形態１７の方法。
【０２６０】
実施形態２０．ＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬは、混合物中にある、実施形態１９の方法。
【０２６１】
実施形態２１．ＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬは、二元複合体中にある、実施形態１９の方法。
【０２６２】
実施形態２２．細胞表面受容体キナーゼは、内因性細胞表面受容体キナーゼである、実施形態１〜２１のいずれか１つの方法。
【０２６３】
実施形態２３．細胞表面受容体キナーゼは、外因性細胞表面受容体キナーゼである、実施形態１〜２１のいずれか１つの方法。
【０２６４】
実施形態２４．細胞表面受容体キナーゼは、ＲＥＴ受容体チロシンキナーゼである、実施形態１〜２３のいずれか１つの方法。
【０２６５】
実施形態２５．細胞は、内因性ＧＦＲＡＬを発現しない、実施形態１〜２４のいずれか１つの方法。
【０２６６】
実施形態２６．細胞は、全長ＧＦＲＡＬを発現しない、実施形態１〜２５のいずれか１つの方法。
【０２６７】
実施形態２７．細胞は、内因性ＧＤＦ１５を発現しない、実施形態１〜２６のいずれか１つの方法。
【０２６８】
実施形態２８．細胞は、無効ＧＤＦ１５遺伝子を含むＧＤＦ１５ノックアウト（ＫＯ）細胞である、実施形態１〜２７のいずれか１つの方法。
【０２６９】
実施形態２９．細胞は、哺乳動物細胞である、実施形態１〜２８のいずれか１つの方法。
【０２７０】
実施形態３０．細胞は、ヒト細胞である、実施形態１〜２９のいずれか１つの方法。
【０２７１】
実施形態３１．細胞は、ＭＣＦ７細胞である、実施形態１〜３０のいずれか１つの方法。
【０２７２】
実施形態３２．細胞は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞である、実施形態１〜３０のいずれか１つの方法。
【０２７３】
実施形態３３．細胞は、ＨＥＫ２９３Ａ−ＧＤＦ１５  ＫＯ細胞である、実施形態１〜３０のいずれか１つの方法。
【０２７４】
実施形態３４．生物学的応答は、ＧＤＦ１５ペプチド、可溶性ＧＦＲＡＬ及び細胞表面受容体キナーゼが三元複合体を形成するときに誘導される、実施形態１〜３３のいずれか１つの方法。
【０２７５】
実施形態３５．生物学的応答は、可溶性ＧＦＲＡＬの非存在下でＧＤＦ１５ペプチドと接触された細胞において誘導されない、実施形態１〜３４のいずれか１つの方法。
【０２７６】
実施形態３６．生物学的応答は、ＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した細胞内のタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である、実施形態１〜３５のいずれか１つの方法。
【０２７７】
実施形態３７．生物学的応答は、ＲＥＴ−ＥＲＫ、ＲＥＴ−ＡＫＴ、タンパク質キナーゼＣ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＪＮＫ、ｐ３８及びＲＡＣ１経路の１つ以上における細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少である、実施形態１〜３６のいずれか１つの方法。
【０２７８】
実施形態３８．タンパク質は、ＥＲＫ、ＳＨＣ１、ＦＲＳ２、ＧＲＢ２、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＯＳ、ＳＨＡＮＫ３、ＧＲＢ７、ＧＲＢ１０、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２から選択される、ＲＥＴ−ＥＲＫ経路における細胞内タンパク質である、実施形態３６の方法。
【０２７９】
実施形態３９．タンパク質は、ＡＫＴ、ＳＲＣ、ＳＨＣ１、ＧＲＢ２、ＣＢＬ、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＨＡＮＫ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＳ、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＹＡＰ、ＢＡＤ、カスパーゼ−９、ＦｏｘＯ１、ＦｏｘＯ３、ＦｏｘＯ４、ＩＫＫα、ＣＲＥＢ、ＭＤＭ２、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ２７Ｋｉｐ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲから選択される、ＲＥＴ−ＡＫＴ経路における細胞内タンパク質である、実施形態３６の方法。
【０２８０】
実施形態４０．細胞表面受容体キナーゼは、ＲＥＴ受容体チロシンキナーゼであり、及びタンパク質は、ＲＥＴ−ＥＲＫ経路における細胞内タンパク質である、実施形態３６又は実施形態３８の方法。
【０２８１】
実施形態４１．細胞内タンパク質は、ＥＲＫ、ＳＨＣ１、ＦＲＳ２、ＧＲＢ２、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＯＳ、ＳＨＡＮＫ３、ＧＲＢ７、ＧＲＢ１０、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２又はその任意の下流標的の１つ以上から選択される、実施形態４０の方法。
【０２８２】
実施形態４２．細胞内タンパク質は、ＥＲＫ、ＳＨＣ１、ＦＲＳ２、ＧＲＢ２、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＯＳ、ＳＨＡＮＫ３、ＧＲＢ７、ＧＲＢ１０、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２の１つ以上から選択される、実施形態４０又は実施形態４１の方法。
【０２８３】
実施形態４３．ＥＲＫは、ＥＲＫ１又はＥＲＫ２である、実施形態４１又は実施形態４２の方法。
【０２８４】
実施形態４４．細胞表面受容体キナーゼは、ＲＥＴ受容体チロシンキナーゼであり、及びタンパク質は、ＲＥＴ−ＡＫＴ経路における細胞内タンパク質である、実施形態３６又は実施形態３９の方法。
【０２８５】
実施形態４５．細胞内タンパク質は、ＡＫＴ、ＳＲＣ、ＳＨＣ１、ＧＲＢ２、ＣＢＬ、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＨＡＮＫ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＳ、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＹＡＰ、ＢＡＤ、カスパーゼ−９、ＦｏｘＯ１、ＦｏｘＯ３、ＦｏｘＯ４、ＩＫＫα、ＣＲＥＢ、ＭＤＭ２、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ２７Ｋｉｐ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲ又はその任意の下流標的の１つ以上から選択される、実施形態４４の方法。
【０２８６】
実施形態４６．細胞内タンパク質は、ＡＫＴ、ＳＲＣ、ＳＨＣ１、ＧＲＢ２、ＣＢＬ、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＨＡＮＫ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＳ、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＹＡＰ、ＢＡＤ、カスパーゼ−９、ＦｏｘＯ１、ＦｏｘＯ３、ＦｏｘＯ４、ＩＫＫα、ＣＲＥＢ、ＭＤＭ２、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ２７Ｋｉｐ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲの１つ以上から選択される、実施形態４４又は実施形態４５の方法。
【０２８７】
実施形態４７．ＡＫＴは、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２又はＡＫＴ３である、実施形態４５又は実施形態４６の方法。
【０２８８】
実施形態４８．生物学的応答は、ＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質キナーゼのリン酸化と比較した細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である、実施形態１〜３５のいずれか１つの方法。
【０２８９】
実施形態４９．タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼである、実施形態４８の方法。
【０２９０】
実施形態５０．タンパク質キナーゼ及び／又は細胞表面受容体キナーゼは、ＲＥＴ受容体チロシンキナーゼである、実施形態４８又は実施形態４９の方法。
【０２９１】
実施形態５１．タンパク質キナーゼは、細胞内タンパク質キナーゼであり、細胞内タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼによって直接又は間接的にリン酸化される、実施形態４８の方法。
【０２９２】
実施形態５２．タンパク質キナーゼは、ＲＥＴ−ＥＲＫ経路における細胞内タンパク質キナーゼである、実施形態４８又は実施形態５１の方法。
【０２９３】
実施形態５３．細胞内タンパク質キナーゼは、ＥＲＫ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２又はその任意の下流標的の１つ以上から選択される、実施形態５２の方法。
【０２９４】
実施形態５４．細胞内タンパク質キナーゼは、ＥＲＫ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２の１つ以上から選択される、実施形態５２又は実施形態５３の方法。
【０２９５】
実施形態５５．細胞内タンパク質キナーゼは、ＥＲＫである、実施形態５２〜５４のいずれか１つの方法。
【０２９６】
実施形態５６．ＥＲＫは、ＥＲＫ１又はＥＲＫ２である、実施形態５３〜５５のいずれか１つの方法。
【０２９７】
実施形態５７．タンパク質キナーゼは、ＲＥＴ−ＡＫＴ経路における細胞内タンパク質キナーゼである、実施形態４８又は実施形態５１の方法。
【０２９８】
実施形態５８．細胞内タンパク質キナーゼは、ＡＫＴ、ＳＲＣ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲ又はその任意の下流標的の１つ以上から選択される、実施形態５７の方法。
【０２９９】
実施形態５９．細胞内タンパク質キナーゼは、ＡＫＴ、ＳＲＣ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲの１つ以上から選択される、実施形態５７又は実施形態５８の方法。
【０３００】
実施形態６０．細胞内タンパク質キナーゼは、ＡＫＴである、実施形態５７〜５９のいずれか１つの方法。
【０３０１】
実施形態６１．ＡＫＴは、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２又はＡＫＴ３である、実施形態５８〜６０のいずれか１つの方法。
【０３０２】
実施形態６２．ＧＤＦ１５ペプチドの活性を検出する方法であって、
（ａ）ＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン及び細胞表面受容体キナーゼを発現する細胞を提供することと；
（ｂ）細胞をＧＤＦ１５ペプチドと接触させることと；
（ｃ）接触された細胞における生物学的応答を検出することと
を含み、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、ドメインＤ２及びＤ３を含む、方法。
【０３０３】
実施形態６３．ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、ドメインＤ１を欠く、実施形態６２の方法。
【０３０４】
実施形態６４．ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、可溶性ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインである、実施形態６２又は実施形態６３の方法。
【０３０５】
実施形態６５．ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、テザーによって細胞表面に付着される、実施形態６２又は実施形態６３の方法。
【０３０６】
実施形態６６．テザーは、ＧＦＲＡＬ膜貫通ドメイン又はその機能的断片である、実施形態６５の方法。
【０３０７】
実施形態６７．ＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン又はテザーは、配列番号１８のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態６５又は実施形態６６の方法。
【０３０８】
実施形態６８．テザーは、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインに融合された異種膜貫通ドメインである、実施形態６５の方法。
【０３０９】
実施形態６９．テザーは、グリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）である、実施形態６５の方法。
【０３１０】
実施形態７０．ＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン又はテザーは、配列番号１９のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体、配列番号２０のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号２１のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含む、実施形態６５又は実施形態６９の方法。
【０３１１】
実施形態７１．テザーは、膜挿入配列である、実施形態６５の方法。
【０３１２】
実施形態７２．ＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン又はテザーは、配列番号２２のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号２３のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含む、実施形態６５又は実施形態７１の方法。
【０３１３】
実施形態７３．テザーは、膜挿入脂肪酸である、実施形態６５の方法。
【０３１４】
実施形態７４．ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、シグナルペプチドを更に含む、実施形態６２〜７３のいずれか１つの方法。
【０３１５】
実施形態７５．ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態６２〜７４のいずれか１つの方法。
【０３１６】
実施形態７６．ＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン又は機能的変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態６２〜７４のいずれか１つの方法。
【０３１７】
実施形態７７．ＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン又は機能的変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態６２〜７４のいずれか１つの方法。
【０３１８】
実施形態７８．ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態６２〜７４のいずれか１つの方法。
【０３１９】
実施形態７９．ＧＤＦ１５ペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態６２〜７８のいずれか１つの方法。
【０３２０】
実施形態８０．ＧＤＦ１５ペプチド又は機能的変異体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態６２〜７８のいずれか１つの方法。
【０３２１】
実施形態８１．ＧＤＦ１５ペプチド又は機能的変異体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態６２〜７８のいずれか１つの方法。
【０３２２】
実施形態８２．ＧＤＦ１５ペプチドは、親和性タグ、融合、抱合、ペグ化及び／又はグリコシル化を含む、実施形態６２〜８１のいずれか１つの方法。
【０３２３】
実施形態８３．ＧＤＦ１５ペプチドは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ又はｍｙｃタグでタグ化される、実施形態６２〜８２のいずれか１つの方法。
【０３２４】
実施形態８４．ＧＤＦ１５ペプチドは、ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−１−アンチトリプシンに融合される、実施形態６２〜８３のいずれか１つの方法。
【０３２５】
実施形態８５．ＧＤＦ１５ペプチドは、脂肪酸に抱合される、実施形態６２〜８４のいずれか１つの方法。
【０３２６】
実施形態８６．細胞表面受容体キナーゼは、内因性細胞表面受容体キナーゼである、実施形態６２〜８５のいずれか１つの方法。
【０３２７】
実施形態８７．細胞表面受容体キナーゼは、外因性細胞表面受容体キナーゼである、実施形態６２〜８５のいずれか１つの方法。
【０３２８】
実施形態８８．細胞表面受容体キナーゼは、ＲＥＴ受容体チロシンキナーゼである、実施形態６２〜８７のいずれか１つの方法。
【０３２９】
実施形態８９．細胞は、内因性ＧＦＲＡＬを発現しない、実施形態６２〜８８のいずれか１つの方法。
【０３３０】
実施形態９０．細胞は、全長ＧＦＲＡＬを発現しない、実施形態６２〜８９のいずれか１つの方法。
【０３３１】
実施形態９１．細胞は、内因性ＧＤＦ１５を発現しない、実施形態６２〜９０のいずれか１つの方法。
【０３３２】
実施形態９２．細胞は、無効ＧＤＦ１５遺伝子を含むＧＤＦ１５  ＫＯ細胞である、実施形態６２〜９１のいずれか１つの方法。
【０３３３】
実施形態９３．細胞は、哺乳動物細胞である、実施形態６２〜９２のいずれか１つの方法。
【０３３４】
実施形態９４．細胞は、ヒト細胞である、実施形態６２〜９３のいずれか１つの方法。
【０３３５】
実施形態９５．細胞は、ＭＣＦ７細胞である、実施形態６２〜９４のいずれか１つの方法。
【０３３６】
実施形態９６．細胞は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞である、実施形態６２〜９４のいずれか１つの方法。
【０３３７】
実施形態９７．細胞は、ＨＥＫ２９３Ａ−ＧＤＦ１５  ＫＯ細胞である、実施形態６２〜９４のいずれか１つの方法。
【０３３８】
実施形態９８．生物学的応答は、ＧＤＦ１５ペプチド、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン及び細胞表面受容体キナーゼが三元複合体を形成するときに誘導される、実施形態６２〜９７のいずれか１つの方法。
【０３３９】
実施形態９９．生物学的応答は、ＧＤＦ１５ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した細胞内のタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である、実施形態６２〜９８のいずれか１つの方法。
【０３４０】
実施形態１００．生物学的応答は、ＲＥＴ−ＥＲＫ、ＲＥＴ−ＡＫＴ、タンパク質キナーゼＣ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＪＮＫ、ｐ３８及びＲＡＣ１経路の１つ以上における細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少である、実施形態６２〜９９のいずれか１つの方法。
【０３４１】
実施形態１０１．タンパク質は、ＥＲＫ、ＳＨＣ１、ＦＲＳ２、ＧＲＢ２、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＯＳ、ＳＨＡＮＫ３、ＧＲＢ７、ＧＲＢ１０、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２から選択される、ＲＥＴ−ＥＲＫ経路における細胞内タンパク質である、実施形態９９の方法。
【０３４２】
実施形態１０２．タンパク質は、ＡＫＴ、ＳＲＣ、ＳＨＣ１、ＧＲＢ２、ＣＢＬ、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＨＡＮＫ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＳ、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＹＡＰ、ＢＡＤ、カスパーゼ−９、ＦｏｘＯ１、ＦｏｘＯ３、ＦｏｘＯ４、ＩＫＫα、ＣＲＥＢ、ＭＤＭ２、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ２７Ｋｉｐ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲから選択される、ＲＥＴ−ＡＫＴ経路における細胞内タンパク質である、実施形態９９の方法。
【０３４３】
実施形態１０３．細胞表面受容体キナーゼは、ＲＥＴ受容体チロシンキナーゼであり、及びタンパク質は、ＲＥＴ−ＥＲＫ経路における細胞内タンパク質である、実施形態９９又は実施形態１０１の方法。
【０３４４】
実施形態１０４．細胞内タンパク質は、ＥＲＫ、ＳＨＣ１、ＦＲＳ２、ＧＲＢ２、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＯＳ、ＳＨＡＮＫ３、ＧＲＢ７、ＧＲＢ１０、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２又はその任意の下流標的の１つ以上から選択される、実施形態１０３の方法。
【０３４５】
実施形態１０５．細胞内タンパク質は、ＥＲＫ、ＳＨＣ１、ＦＲＳ２、ＧＲＢ２、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＯＳ、ＳＨＡＮＫ３、ＧＲＢ７、ＧＲＢ１０、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２の１つ以上から選択される、実施形態１０３又は実施形態１０４の方法。
【０３４６】
実施形態１０６．ＥＲＫは、ＥＲＫ１又はＥＲＫ２である、実施形態１０４又は実施形態１０５の方法。
【０３４７】
実施形態１０７．細胞表面受容体キナーゼは、ＲＥＴ受容体チロシンキナーゼであり、及びタンパク質は、ＲＥＴ−ＡＫＴ経路における細胞内タンパク質である、実施形態９９又は実施形態１０２の方法。
【０３４８】
実施形態１０８．細胞内タンパク質は、ＡＫＴ、ＳＲＣ、ＳＨＣ１、ＧＲＢ２、ＣＢＬ、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＨＡＮＫ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＳ、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＹＡＰ、ＢＡＤ、カスパーゼ−９、ＦｏｘＯ１、ＦｏｘＯ３、ＦｏｘＯ４、ＩＫＫα、ＣＲＥＢ、ＭＤＭ２、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ２７Ｋｉｐ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲ又はその任意の下流標的の１つ以上から選択される、実施形態１０７の方法。
【０３４９】
実施形態１０９．細胞内タンパク質は、ＡＫＴ、ＳＲＣ、ＳＨＣ１、ＧＲＢ２、ＣＢＬ、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＨＡＮＫ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＳ、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＹＡＰ、ＢＡＤ、カスパーゼ−９、ＦｏｘＯ１、ＦｏｘＯ３、ＦｏｘＯ４、ＩＫＫα、ＣＲＥＢ、ＭＤＭ２、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ２７Ｋｉｐ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲの１つ以上から選択される、実施形態１０７又は実施形態１０８の方法。
【０３５０】
実施形態１１０．ＡＫＴは、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２又はＡＫＴ３である、実施形態１０８又は実施形態１０９の方法。
【０３５１】
実施形態１１１．生物学的応答は、ＧＤＦ１５ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質キナーゼのリン酸化と比較した細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である、実施形態６２〜９８のいずれか１つの方法。
【０３５２】
実施形態１１２．タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼである、実施形態１１１の方法。
【０３５３】
実施形態１１３．タンパク質キナーゼ及び／又は細胞表面受容体キナーゼは、ＲＥＴ受容体チロシンキナーゼである、実施形態１１１又は実施形態１１２の方法。
【０３５４】
実施形態１１４．タンパク質キナーゼは、細胞内タンパク質キナーゼであり、細胞内タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼによって直接又は間接的にリン酸化される、実施形態１１１の方法。
【０３５５】
実施形態１１５．タンパク質キナーゼは、ＲＥＴ−ＥＲＫ経路における細胞内タンパク質キナーゼである、実施形態１１１又は実施形態１１４の方法。
【０３５６】
実施形態１１６．細胞内タンパク質キナーゼは、ＥＲＫ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２又はその任意の下流標的の１つ以上から選択される、実施形態１１５の方法。
【０３５７】
実施形態１１７．細胞内タンパク質キナーゼは、ＥＲＫ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２の１つ以上から選択される、実施形態１１５又は実施形態１１６の方法。
【０３５８】
実施形態１１８．細胞内タンパク質キナーゼは、ＥＲＫである、実施形態１１５〜１１７のいずれか１つの方法。
【０３５９】
実施形態１１９．ＥＲＫは、ＥＲＫ１又はＥＲＫ２である、実施形態１１６〜１１８のいずれか１つの方法。
【０３６０】
実施形態１２０．タンパク質キナーゼは、ＲＥＴ−ＡＫＴ経路における細胞内タンパク質キナーゼである、実施形態１１１又は実施形態１１４の方法。
【０３６１】
実施形態１２１．細胞内タンパク質キナーゼは、ＡＫＴ、ＳＲＣ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲ又はその任意の下流標的の１つ以上から選択される、実施形態１２０の方法。
【０３６２】
実施形態１２２．細胞内タンパク質キナーゼは、ＡＫＴ、ＳＲＣ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲの１つ以上から選択される、実施形態１２０又は実施形態１２１の方法。
【０３６３】
実施形態１２３．細胞内タンパク質キナーゼは、ＡＫＴである、実施形態１２０〜１２２のいずれか１つの方法。
【０３６４】
実施形態１２４．ＡＫＴは、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２又はＡＫＴ３である、実施形態１２１〜１２３のいずれか１つの方法。
【０３６５】
実施形態１２５．ＧＤＦ１５ペプチドの活性を検出するための単離及び改変された細胞であって、ドメインＤ２及びＤ３を含むＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン並びに細胞表面受容体キナーゼを発現する、単離及び改変された細胞。
【０３６６】
実施形態１２６．ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、ドメインＤ１を欠く、実施形態１２５の細胞。
【０３６７】
実施形態１２７．ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、可溶性ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインである、実施形態１２５又は実施形態１２６の細胞。
【０３６８】
実施形態１２８．ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、テザーによって細胞表面に付着される、実施形態１２５又は実施形態１２６の細胞。
【０３６９】
実施形態１２９．テザーは、ＧＦＲＡＬ膜貫通ドメイン又はその機能的断片である、実施形態１２８の細胞。
【０３７０】
実施形態１３０．ＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン又はテザーは、配列番号１８のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態１２８又は実施形態１２９の細胞。
【０３７１】
実施形態１３１．テザーは、ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインに融合された異種膜貫通ドメインである、実施形態１２８の細胞。
【０３７２】
実施形態１３２．テザーは、グリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）である、実施形態１２８の細胞。
【０３７３】
実施形態１３３．ＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン又はテザーは、配列番号１９のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体、配列番号２０のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号２１のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含む、実施形態１２８又は実施形態１３２の細胞。
【０３７４】
実施形態１３４．テザーは、膜挿入配列である、実施形態１２８の細胞。
【０３７５】
実施形態１３５．ＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン又はテザーは、配列番号２２のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体又は配列番号２３のアミノ酸配列若しくはその機能的変異体を含む、実施形態１２８又は実施形態１３４の細胞。
【０３７６】
実施形態１３６．テザーは、膜挿入脂肪酸である、実施形態１２８の細胞。
【０３７７】
実施形態１３７．ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、シグナルペプチドを更に含む、実施形態１２５〜１３６のいずれか１つの細胞。
【０３７８】
実施形態１３８．ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態１２５〜１３７のいずれか１つの細胞。
【０３７９】
実施形態１３９．ＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン又は機能的変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態１２５〜１３７のいずれか１つの細胞。
【０３８０】
実施形態１４０．ＧＦＲＡＬ細胞外ドメイン又は機能的変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態１２５〜１３７のいずれか１つの細胞。
【０３８１】
実施形態１４１．ＧＦＲＡＬ細胞外ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態１２５〜１３７のいずれか１つの細胞。
【０３８２】
実施形態１４２．ＧＤＦ１５ペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態１２５〜１４１のいずれか１つの細胞。
【０３８３】
実施形態１４３．ＧＤＦ１５ペプチド又は機能的変異体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態１２５〜１４１のいずれか１つの細胞。
【０３８４】
実施形態１４４．ＧＤＦ１５ペプチド又は機能的変異体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態１２５〜１４１のいずれか１つの細胞。
【０３８５】
実施形態１４５．ＧＤＦ１５ペプチドは、親和性タグ、融合、抱合、ペグ化及び／又はグリコシル化を含む、実施形態１２５〜１４４のいずれか１つの細胞。
【０３８６】
実施形態１４６．ＧＤＦ１５ペプチドは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ又はｍｙｃタグでタグ化される、実施形態１２５〜１４５のいずれか１つの細胞。
【０３８７】
実施形態１４７．ＧＤＦ１５ペプチドは、ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−１−アンチトリプシンに融合される、実施形態１２５〜１４６のいずれか１つの細胞。
【０３８８】
実施形態１４８．ＧＤＦ１５ペプチドは、脂肪酸に抱合される、実施形態１２５〜１４７のいずれか１つの細胞。
【０３８９】
実施形態１４９．細胞表面受容体キナーゼは、内因性細胞表面受容体キナーゼである、実施形態１２５〜１４８のいずれか１つの細胞。
【０３９０】
実施形態１５０．細胞表面受容体キナーゼは、外因性細胞表面受容体キナーゼである、実施形態１２５〜１４８のいずれか１つの細胞。
【０３９１】
実施形態１５１．細胞表面受容体キナーゼは、ＲＥＴ受容体チロシンキナーゼである、実施形態１２５〜１５０のいずれか１つの細胞。
【０３９２】
実施形態１５２．内因性ＧＦＲＡＬを発現しない、実施形態１２５〜１５１のいずれか１つの細胞。
【０３９３】
実施形態１５３．全長ＧＦＲＡＬを発現しない、実施形態１２５〜１５２のいずれか１つの細胞。
【０３９４】
実施形態１５４．内因性ＧＤＦ１５を発現しない、実施形態１２５〜１５３のいずれか１つの細胞。
【０３９５】
実施形態１５５．無効ＧＤＦ１５遺伝子を含むＧＤＦ１５  ＫＯ細胞である、実施形態１２５〜１５４のいずれか１つの細胞。
【０３９６】
実施形態１５６．哺乳動物細胞である、実施形態１２５〜１５５のいずれか１つの細胞。
【０３９７】
実施形態１５７．ヒト細胞である、実施形態１２５〜１５６のいずれか１つの細胞。
【０３９８】
実施形態１５８．ＭＣＦ７細胞である、実施形態１２５〜１５７のいずれか１つの細胞。
【０３９９】
実施形態１５９．ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞である、実施形態１２５〜１５７のいずれか１つの細胞。
【０４００】
実施形態１６０．ＨＥＫ２９３Ａ−ＧＤＦ１５  ＫＯ細胞である、実施形態１２５〜１５７のいずれか１つの細胞。
【０４０１】
実施形態１６１．ＧＤＦ１５ペプチドの活性を決定するためのキットであって、ＧＤＦ１５ペプチドと接触するための、実施形態１２５〜１６０のいずれか１つの細胞と；接触された細胞における生物学的応答を検出する手段とを含むキット。
【０４０２】
実施形態１６２．肥満症又は肥満症関連の障害を処置する方法であって、ＧＤＦ１５ペプチドを対象に投与することを含み、ＧＤＦ１５ペプチドは、ＧＤＦ１５ペプチドと接触された細胞における生物学的応答を誘導し、生物学的応答は、実施形態１〜１２４のいずれか１つの方法によって検出されるか又は検出され得る、方法。
【０４０３】
実施形態１６３．ＧＤＦ１５ペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態１６２の方法。
【０４０４】
実施形態１６４．ＧＤＦ１５ペプチド又は機能的変異体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態１６２の方法。
【０４０５】
実施形態１６５．ＧＤＦ１５ペプチド又は機能的変異体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態１６２の方法。
【０４０６】
実施形態１６６．ＧＤＦ１５ペプチドは、親和性タグ、融合、抱合、ペグ化及び／又はグリコシル化を含む、実施形態１６２〜１６５のいずれか１つの方法。
【０４０７】
実施形態１６７．ＧＤＦ１５ペプチドは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ又はｍｙｃタグでタグ化される、実施形態１６２〜１６６のいずれか１つの方法。
【０４０８】
実施形態１６８．ＧＤＦ１５ペプチドは、ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−１−アンチトリプシンに融合される、実施形態１６２〜１６７のいずれか１つの方法。
【０４０９】
実施形態１６９．ＧＤＦ１５ペプチドは、脂肪酸に抱合される、実施形態１６２〜１６８のいずれか１つの方法。
【０４１０】
実施形態１７０．生物学的応答は、シグナル伝達応答である、実施形態１６２〜１６９のいずれか１つの方法。
【０４１１】
実施形態１７１．生物学的応答は、ＧＤＦ１５ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した細胞内のタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である、実施形態１６２〜１７０のいずれか１つの方法。
【０４１２】
実施形態１７２．生物学的応答は、ＲＥＴ−ＥＲＫ、ＲＥＴ−ＡＫＴ、タンパク質キナーゼＣ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＪＮＫ、ｐ３８及びＲＡＣ１経路の１つ以上における細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少である、実施形態１６２〜１７１のいずれか１つの方法。
【０４１３】
実施形態１７３．タンパク質は、ＥＲＫ、ＳＨＣ１、ＦＲＳ２、ＧＲＢ２、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＯＳ、ＳＨＡＮＫ３、ＧＲＢ７、ＧＲＢ１０、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２から選択される、ＲＥＴ−ＥＲＫ経路における細胞内タンパク質である、実施形態１７１の方法。
【０４１４】
実施形態１７４．タンパク質は、ＡＫＴ、ＳＲＣ、ＳＨＣ１、ＧＲＢ２、ＣＢＬ、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＨＡＮＫ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＳ、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＹＡＰ、ＢＡＤ、カスパーゼ−９、ＦｏｘＯ１、ＦｏｘＯ３、ＦｏｘＯ４、ＩＫＫα、ＣＲＥＢ、ＭＤＭ２、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ２７Ｋｉｐ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲから選択される、ＲＥＴ−ＡＫＴ経路における細胞内タンパク質である、実施形態１７１の方法。
【０４１５】
実施形態１７５．生物学的応答は、ＧＤＦ１５ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質キナーゼのリン酸化と比較した細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である、実施形態１６２〜１７０のいずれか１つの方法。
【０４１６】
実施形態１７６．タンパク質キナーゼは、細胞内タンパク質キナーゼであり、細胞内タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼによって直接又は間接的にリン酸化される、実施形態１７５の方法。
【０４１７】
実施形態１７７．対象は、過体重又は肥満である、実施形態１６２〜１７６のいずれか１つの方法。
【０４１８】
実施形態１７８．対象は、２５〜２９．９の肥満度指数を有する、実施形態１６２〜１７７のいずれか１つの方法。
【０４１９】
実施形態１７９．対象は、３０以上の肥満度指数を有する、実施形態１６２〜１７７のいずれか１つの方法。
【０４２０】
実施形態１８０．肥満症関連の障害は、癌、体重障害又は代謝疾患若しくは障害である、実施形態１６２〜１７９のいずれか１つの方法。
【０４２１】
実施形態１８１．肥満症関連の障害は、癌、ＩＩ型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、高トリグリセリド血症又は心血管系疾患である、実施形態１６２〜１８０のいずれか１つの方法。
【０４２２】
実施形態１８２．対象の肥満症又は肥満症関連の障害の処置におけるＧＤＦ１５ペプチドの使用であって、ＧＤＦ１５ペプチドは、ＧＤＦ１５ペプチドと接触された細胞における生物学的応答を誘導し、生物学的応答は、実施形態１〜１２４のいずれか１つの方法によって検出されるか又は検出され得る、使用。
【０４２３】
実施形態１８３．ＧＤＦ１５ペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態１８２の使用。
【０４２４】
実施形態１８４．ＧＤＦ１５ペプチド又は機能的変異体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態１８２の使用。
【０４２５】
実施形態１８５．ＧＤＦ１５ペプチド又は機能的変異体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態１８２の使用。
【０４２６】
実施形態１８６．ＧＤＦ１５ペプチドは、親和性タグ、融合、抱合、ペグ化及び／又はグリコシル化を含む、実施形態１８２〜１８５のいずれか１つの使用。
【０４２７】
実施形態１８７．ＧＤＦ１５ペプチドは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ又はｍｙｃタグでタグ化される、実施形態１８２〜１８６のいずれか１つの使用。
【０４２８】
実施形態１８８．ＧＤＦ１５ペプチドは、ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−１−アンチトリプシンに融合される、実施形態１８２〜１８７のいずれか１つの使用。
【０４２９】
実施形態１８９．ＧＤＦ１５ペプチドは、脂肪酸に抱合される、実施形態１８２〜１８８のいずれか１つの使用。
【０４３０】
実施形態１９０．生物学的応答は、シグナル伝達応答である、実施形態１８２〜１８９のいずれか１つの使用。
【０４３１】
実施形態１９１．生物学的応答は、ＧＤＦ１５ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した細胞内のタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である、実施形態１８２〜１９０のいずれか１つの使用。
【０４３２】
実施形態１９２．生物学的応答は、ＲＥＴ−ＥＲＫ、ＲＥＴ−ＡＫＴ、タンパク質キナーゼＣ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＪＮＫ、ｐ３８及びＲＡＣ１経路の１つ以上における細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少である、実施形態１８２〜１９１のいずれか１つの使用。
【０４３３】
実施形態１９３．タンパク質は、ＥＲＫ、ＳＨＣ１、ＦＲＳ２、ＧＲＢ２、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＯＳ、ＳＨＡＮＫ３、ＧＲＢ７、ＧＲＢ１０、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２から選択される、ＲＥＴ−ＥＲＫ経路における細胞内タンパク質である、実施形態１９１の使用。
【０４３４】
実施形態１９４．タンパク質は、ＡＫＴ、ＳＲＣ、ＳＨＣ１、ＧＲＢ２、ＣＢＬ、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＨＡＮＫ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＳ、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＹＡＰ、ＢＡＤ、カスパーゼ−９、ＦｏｘＯ１、ＦｏｘＯ３、ＦｏｘＯ４、ＩＫＫα、ＣＲＥＢ、ＭＤＭ２、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ２７Ｋｉｐ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲから選択される、ＲＥＴ−ＡＫＴ経路における細胞内タンパク質である、実施形態１９１の使用。
【０４３５】
実施形態１９５．生物学的応答は、ＧＤＦ１５ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質キナーゼのリン酸化と比較した細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である、実施形態１８２〜１９０のいずれか１つの使用。
【０４３６】
実施形態１９６．タンパク質キナーゼは、細胞内タンパク質キナーゼであり、細胞内タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼによって直接又は間接的にリン酸化される、実施形態１９５の使用。
【０４３７】
実施形態１９７．対象は、過体重又は肥満である、実施形態１８２〜１９６のいずれか１つの使用。
【０４３８】
実施形態１９８．対象は、２５〜２９．９の肥満度指数を有する、実施形態１８２〜１９７のいずれか１つの使用。
【０４３９】
実施形態１９９．対象は、３０以上の肥満度指数を有する、実施形態１８２〜１９７のいずれか１つの使用。
【０４４０】
実施形態２００．肥満症関連の障害は、癌、体重障害又は代謝疾患若しくは障害である、実施形態１８２〜１９９のいずれか１つの使用。
【０４４１】
実施形態２０１．肥満症関連の障害は、癌、ＩＩ型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、高トリグリセリド血症又は心血管系疾患である、実施形態１８２〜２００のいずれか１つの使用。
【０４４２】
実施形態２０２．食欲及び／又は体重を低減させる方法であって、ＧＤＦ１５ペプチドを対象に投与することを含み、ＧＤＦ１５ペプチドは、ＧＤＦ１５ペプチドと接触された細胞における生物学的応答を誘導し、生物学的応答は、実施形態１〜１２４のいずれか１つの方法によって検出されるか又は検出され得る、方法。
【０４４３】
実施形態２０３．ＧＤＦ１５ペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態２０２の方法。
【０４４４】
実施形態２０４．ＧＤＦ１５ペプチド又は機能的変異体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態２０２の方法。
【０４４５】
実施形態２０５．ＧＤＦ１５ペプチド又は機能的変異体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態２０２の方法。
【０４４６】
実施形態２０６．ＧＤＦ１５ペプチドは、親和性タグ、融合、抱合、ペグ化及び／又はグリコシル化を含む、実施形態２０２〜２０５のいずれか１つの方法。
【０４４７】
実施形態２０７．ＧＤＦ１５ペプチドは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ又はｍｙｃタグでタグ化される、実施形態２０２〜２０６のいずれか１つの方法。
【０４４８】
実施形態２０８．ＧＤＦ１５ペプチドは、ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−１−アンチトリプシンに融合される、実施形態２０２〜２０７のいずれか１つの方法。
【０４４９】
実施形態２０９．ＧＤＦ１５ペプチドは、脂肪酸に抱合される、実施形態２０２〜２０８のいずれか１つの方法。
【０４５０】
実施形態２１０．生物学的応答は、シグナル伝達応答である、実施形態２０２〜２０９のいずれか１つの方法。
【０４５１】
実施形態２１１．生物学的応答は、ＧＤＦ１５ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した細胞内のタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である、実施形態２０２〜２１０のいずれか１つの方法。
【０４５２】
実施形態２１２．生物学的応答は、ＲＥＴ−ＥＲＫ、ＲＥＴ−ＡＫＴ、タンパク質キナーゼＣ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＪＮＫ、ｐ３８及びＲＡＣ１経路の１つ以上における細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少である、実施形態２０２〜２１１のいずれか１つの方法。
【０４５３】
実施形態２１３．タンパク質は、ＥＲＫ、ＳＨＣ１、ＦＲＳ２、ＧＲＢ２、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＯＳ、ＳＨＡＮＫ３、ＧＲＢ７、ＧＲＢ１０、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２から選択される、ＲＥＴ−ＥＲＫ経路における細胞内タンパク質である、実施形態２１１の方法。
【０４５４】
実施形態２１４．タンパク質は、ＡＫＴ、ＳＲＣ、ＳＨＣ１、ＧＲＢ２、ＣＢＬ、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＨＡＮＫ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＳ、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＹＡＰ、ＢＡＤ、カスパーゼ−９、ＦｏｘＯ１、ＦｏｘＯ３、ＦｏｘＯ４、ＩＫＫα、ＣＲＥＢ、ＭＤＭ２、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ２７Ｋｉｐ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲから選択される、ＲＥＴ−ＡＫＴ経路における細胞内タンパク質である、実施形態２１１の方法。
【０４５５】
実施形態２１５．生物学的応答は、ＧＤＦ１５ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質キナーゼのリン酸化と比較した細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である、実施形態２０２〜２１０のいずれか１つの方法。
【０４５６】
実施形態２１６．タンパク質キナーゼは、細胞内タンパク質キナーゼであり、細胞内タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼによって直接又は間接的にリン酸化される、実施形態２１５の方法。
【０４５７】
実施形態２１７．対象は、過体重又は肥満である、実施形態２０２〜２１６のいずれか１つの方法。
【０４５８】
実施形態２１８．対象は、２５〜２９．９の肥満度指数を有する、実施形態２０２〜２１７のいずれか１つの方法。
【０４５９】
実施形態２１９．対象は、３０以上の肥満度指数を有する、実施形態２０２〜２１７のいずれか１つの方法。
【０４６０】
実施形態２２０．対象の食欲及び／又は体重の低減におけるＧＤＦ１５ペプチドの使用であって、ＧＤＦ１５ペプチドは、ＧＤＦ１５ペプチドと接触された細胞における生物学的応答を誘導し、生物学的応答は、実施形態１〜１２４のいずれか１つの方法によって検出されるか又は検出され得る、使用。
【０４６１】
実施形態２２１．ＧＤＦ１５ペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態２２０の使用。
【０４６２】
実施形態２２２．ＧＤＦ１５ペプチド又は機能的変異体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態２２０の使用。
【０４６３】
実施形態２２３．ＧＤＦ１５ペプチド又は機能的変異体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態２２０の使用。
【０４６４】
実施形態２２４．ＧＤＦ１５ペプチドは、親和性タグ、融合、抱合、ペグ化及び／又はグリコシル化を含む、実施形態２２０〜２２３のいずれか１つの使用。
【０４６５】
実施形態２２５．ＧＤＦ１５ペプチドは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ又はｍｙｃタグでタグ化される、実施形態２２０〜２２４のいずれか１つの使用。
【０４６６】
実施形態２２６．ＧＤＦ１５ペプチドは、ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−１−アンチトリプシンに融合される、実施形態２２０〜２２５のいずれか１つの使用。
【０４６７】
実施形態２２７．ＧＤＦ１５ペプチドは、脂肪酸に抱合される、実施形態２２０〜２２６のいずれか１つの使用。
【０４６８】
実施形態２２８．生物学的応答は、シグナル伝達応答である、実施形態２２０〜２２７のいずれか１つの使用。
【０４６９】
実施形態２２９．生物学的応答は、ＧＤＦ１５ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した細胞内のタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である、実施形態２２０〜２２８のいずれか１つの使用。
【０４７０】
実施形態２３０．生物学的応答は、ＲＥＴ−ＥＲＫ、ＲＥＴ−ＡＫＴ、タンパク質キナーゼＣ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＪＮＫ、ｐ３８及びＲＡＣ１経路の１つ以上における細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少である、実施形態２２０〜２２９のいずれか１つの使用。
【０４７１】
実施形態２３１．タンパク質は、ＥＲＫ、ＳＨＣ１、ＦＲＳ２、ＧＲＢ２、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＯＳ、ＳＨＡＮＫ３、ＧＲＢ７、ＧＲＢ１０、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２から選択される、ＲＥＴ−ＥＲＫ経路における細胞内タンパク質である、実施形態２２９の使用。
【０４７２】
実施形態２３２．タンパク質は、ＡＫＴ、ＳＲＣ、ＳＨＣ１、ＧＲＢ２、ＣＢＬ、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＨＡＮＫ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＳ、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＹＡＰ、ＢＡＤ、カスパーゼ−９、ＦｏｘＯ１、ＦｏｘＯ３、ＦｏｘＯ４、ＩＫＫα、ＣＲＥＢ、ＭＤＭ２、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ２７Ｋｉｐ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲから選択される、ＲＥＴ−ＡＫＴ経路における細胞内タンパク質である、実施形態２２９の使用。
【０４７３】
実施形態２３３．生物学的応答は、ＧＤＦ１５ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質キナーゼのリン酸化と比較した細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である、実施形態２２０〜２２８のいずれか１つの使用。
【０４７４】
実施形態２３４．タンパク質キナーゼは、細胞内タンパク質キナーゼであり、細胞内タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼによって直接又は間接的にリン酸化される、実施形態２３３の使用。
【０４７５】
実施形態２３５．対象は、過体重又は肥満である、実施形態２２０〜２３４のいずれか１つの使用。
【０４７６】
実施形態２３６．対象は、２５〜２９．９の肥満度指数を有する、実施形態２２０〜２３５のいずれか１つの使用。
【０４７７】
実施形態２３７．対象は、３０以上の肥満度指数を有する、実施形態２２０〜２３５のいずれか１つの使用。
【０４７８】
実施形態２３８．ドメインＤ２及びＤ３を含むＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含む可溶性ＧＦＲＡＬ。
【０４７９】
実施形態２３９．ドメインＤ１を欠いたＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含む、実施形態２３８の可溶性ＧＦＲＡＬ。
【０４８０】
実施形態２４０．シグナルペプチドを更に含む、実施形態２３８又は実施形態２３９の可溶性ＧＦＲＡＬ。
【０４８１】
実施形態２４１．配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態２３８〜２４０のいずれか１つの可溶性ＧＦＲＡＬ。
【０４８２】
実施形態２４２．可溶性ＧＦＲＡＬ又は機能的変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態２３８〜２４０のいずれか１つの可溶性ＧＦＲＡＬ。
【０４８３】
実施形態２４３．可溶性ＧＦＲＡＬ又は機能的変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態２３８〜２４０のいずれか１つの可溶性ＧＦＲＡＬ。
【０４８４】
実施形態２４４．配列番号２のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態２３８〜２４０のいずれか１つの可溶性ＧＦＲＡＬ。
【０４８５】
実施形態２４５．親和性タグを更に含む（例えば、親和性タグに融合される）、実施形態２３８〜２４４のいずれか１つの可溶性ＧＦＲＡＬ。
【０４８６】
実施形態２４６．親和性タグは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ又はｍｙｃタグを含む、実施形態２４５の可溶性ＧＦＲＡＬ。
【０４８７】
実施形態２４７．肥満症又は肥満症関連の障害を処置する方法であって、ＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬを対象に投与することを含み、ＧＤＦ１５ペプチドは、ＧＤＦ１５ペプチドと接触された細胞における生物学的応答を誘導し、可溶性ＧＦＲＡＬは、ドメインＤ２及びＤ３を含むＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含む、方法。
【０４８８】
実施形態２４８．可溶性ＧＦＲＡＬは、ドメインＤ１を欠いたＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含む、実施形態２４７の方法。
【０４８９】
実施形態２４９．可溶性ＧＦＲＡＬは、シグナルペプチドを更に含む、実施形態２４７又は実施形態２４８の方法。
【０４９０】
実施形態２５０．可溶性ＧＦＲＡＬは、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態２４７〜２４９のいずれか１つの方法。
【０４９１】
実施形態２５１．可溶性ＧＦＲＡＬ又は機能的変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態２４７〜２４９のいずれか１つの方法。
【０４９２】
実施形態２５２．可溶性ＧＦＲＡＬ又は機能的変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態２４７〜２４９のいずれか１つの方法。
【０４９３】
実施形態２５３．可溶性ＧＦＲＡＬは、配列番号２のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態２４７〜２４９のいずれか１つの方法。
【０４９４】
実施形態２５４．可溶性ＧＦＲＡＬは、親和性タグを更に含む（例えば、親和性タグに融合される）、実施形態２４７〜２５３のいずれか１つの方法。
【０４９５】
実施形態２５５．親和性タグは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ又はｍｙｃタグを含む、実施形態２５４の方法。
【０４９６】
実施形態２５６．ＧＤＦ１５ペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態２４７〜２５５のいずれか１つの方法。
【０４９７】
実施形態２５７．ＧＤＦ１５ペプチド又は機能的変異体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態２４７〜２５５のいずれか１つの方法。
【０４９８】
実施形態２５８．ＧＤＦ１５ペプチド又は機能的変異体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態２４７〜２５５のいずれか１つの方法。
【０４９９】
実施形態２５９．ＧＤＦ１５ペプチドは、親和性タグ、融合、抱合、ペグ化及び／又はグリコシル化を含む、実施形態２４７〜２５８のいずれか１つの方法。
【０５００】
実施形態２６０．ＧＤＦ１５ペプチドは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ又はｍｙｃタグでタグ化される、実施形態２４７〜２５９のいずれか１つの方法。
【０５０１】
実施形態２６１．ＧＤＦ１５ペプチドは、ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−１−アンチトリプシンに融合される、実施形態２４７〜２６０のいずれか１つの方法。
【０５０２】
実施形態２６２．ＧＤＦ１５ペプチドは、脂肪酸に抱合される、実施形態２４７〜２６１のいずれか１つの方法。
【０５０３】
実施形態２６３．ＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬは、同時に投与される、実施形態２４７〜２６２のいずれか１つの方法。
【０５０４】
実施形態２６４．ＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬは、連続で投与される、実施形態２４７〜２６２のいずれか１つの方法。
【０５０５】
実施形態２６５．ＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬは、同じ組成物中にある、実施形態２６３の方法。
【０５０６】
実施形態２６６．ＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬは、混合物中にある、実施形態２６５の方法。
【０５０７】
実施形態２６７．ＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬは、二元複合体中にある、実施形態２６５の方法。
【０５０８】
実施形態２６８．生物学的応答は、シグナル伝達応答である、実施形態２４７〜２６７のいずれか１つの方法。
【０５０９】
実施形態２６９．生物学的応答は、ＧＤＦ１５ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した細胞内のタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である、実施形態２４７〜２６８のいずれか１つの方法。
【０５１０】
実施形態２７０．生物学的応答は、ＲＥＴ−ＥＲＫ、ＲＥＴ−ＡＫＴ、タンパク質キナーゼＣ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＪＮＫ、ｐ３８及びＲＡＣ１経路の１つ以上における細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少である、実施形態２４７〜２６９のいずれか１つの方法。
【０５１１】
実施形態２７１．タンパク質は、ＥＲＫ、ＳＨＣ１、ＦＲＳ２、ＧＲＢ２、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＯＳ、ＳＨＡＮＫ３、ＧＲＢ７、ＧＲＢ１０、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２から選択される、ＲＥＴ−ＥＲＫ経路における細胞内タンパク質である、実施形態２６９の方法。
【０５１２】
実施形態２７２．タンパク質は、ＡＫＴ、ＳＲＣ、ＳＨＣ１、ＧＲＢ２、ＣＢＬ、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＨＡＮＫ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＳ、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＹＡＰ、ＢＡＤ、カスパーゼ−９、ＦｏｘＯ１、ＦｏｘＯ３、ＦｏｘＯ４、ＩＫＫα、ＣＲＥＢ、ＭＤＭ２、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ２７Ｋｉｐ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲから選択される、ＲＥＴ−ＡＫＴ経路における細胞内タンパク質である、実施形態２６９の方法。
【０５１３】
実施形態２７３．生物学的応答は、ＧＤＦ１５ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質キナーゼのリン酸化と比較した細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である、実施形態２４７〜２６８のいずれか１つの方法。
【０５１４】
実施形態２７４．タンパク質キナーゼは、細胞内タンパク質キナーゼであり、細胞内タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼによって直接又は間接的にリン酸化される、実施形態２７３の方法。
【０５１５】
実施形態２７５．対象は、過体重又は肥満である、実施形態２４７〜２７４のいずれか１つの方法。
【０５１６】
実施形態２７６．対象は、２５〜２９．９の肥満度指数を有する、実施形態２４７〜２７５のいずれか１つの方法。
【０５１７】
実施形態２７７．対象は、３０以上の肥満度指数を有する、実施形態２４７〜２７５のいずれか１つの方法。
【０５１８】
実施形態２７８．肥満症関連の障害は、癌、体重障害又は代謝疾患若しくは障害である、実施形態２４７〜２７７のいずれか１つの方法。
【０５１９】
実施形態２７９．肥満症関連の障害は、癌、ＩＩ型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、高トリグリセリド血症又は心血管系疾患である、実施形態２４７〜２７８のいずれか１つの方法。
【０５２０】
実施形態２８０．対象の肥満症又は肥満症関連の障害の処置におけるＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬの使用であって、ＧＤＦ１５ペプチドは、ＧＤＦ１５ペプチドと接触された細胞における生物学的応答を誘導し、可溶性ＧＦＲＡＬは、ドメインＤ２及びＤ３を含むＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含む、使用。
【０５２１】
実施形態２８１．可溶性ＧＦＲＡＬは、ドメインＤ１を欠いたＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含む、実施形態２８０の使用。
【０５２２】
実施形態２８２．可溶性ＧＦＲＡＬは、シグナルペプチドを更に含む、実施形態２８０又は実施形態２８１の使用。
【０５２３】
実施形態２８３．可溶性ＧＦＲＡＬは、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態２８０〜２８２のいずれか１つの使用。
【０５２４】
実施形態２８４．可溶性ＧＦＲＡＬ又は機能的変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態２８０〜２８２のいずれか１つの使用。
【０５２５】
実施形態２８５．可溶性ＧＦＲＡＬ又は機能的変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態２８０〜２８２のいずれか１つの使用。
【０５２６】
実施形態２８６．可溶性ＧＦＲＡＬは、配列番号２のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態２８０〜２８２のいずれか１つの使用。
【０５２７】
実施形態２８７．可溶性ＧＦＲＡＬは、親和性タグを更に含む（例えば、親和性タグに融合される）、実施形態２８０〜２８６のいずれか１つの使用。
【０５２８】
実施形態２８８．親和性タグは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ又はｍｙｃタグを含む、実施形態２８７の使用。
【０５２９】
実施形態２８９．ＧＤＦ１５ペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態２８０〜２８８のいずれか１つの使用。
【０５３０】
実施形態２９０．ＧＤＦ１５ペプチド又は機能的変異体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態２８０〜２８８のいずれか１つの使用。
【０５３１】
実施形態２９１．ＧＤＦ１５ペプチド又は機能的変異体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態２８０〜２８８のいずれか１つの使用。
【０５３２】
実施形態２９２．ＧＤＦ１５ペプチドは、親和性タグ、融合、抱合、ペグ化及び／又はグリコシル化を含む、実施形態２８０〜２９１のいずれか１つの使用。
【０５３３】
実施形態２９３．ＧＤＦ１５ペプチドは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ又はｍｙｃタグでタグ化される、実施形態２８０〜２９２のいずれか１つの使用。
【０５３４】
実施形態２９４．ＧＤＦ１５ペプチドは、ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−１−アンチトリプシンに融合される、実施形態２８０〜２９３のいずれか１つの使用。
【０５３５】
実施形態２９５．ＧＤＦ１５ペプチドは、脂肪酸に抱合される、実施形態２８０〜２９４のいずれか１つの使用。
【０５３６】
実施形態２９６．ＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬは、同時に投与される、実施形態２８０〜２９５のいずれか１つの使用。
【０５３７】
実施形態２９７．ＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬは、連続で投与される、実施形態２８０〜２９５のいずれか１つの使用。
【０５３８】
実施形態２９８．ＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬは、同じ組成物中にある、実施形態２９６の使用。
【０５３９】
実施形態２９９．ＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬは、混合物中にある、実施形態２９８の使用。
【０５４０】
実施形態３００．ＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬは、二元複合体中にある、実施形態２９８の使用。
【０５４１】
実施形態３０１．生物学的応答は、シグナル伝達応答である、実施形態２８０〜３００のいずれか１つの使用。
【０５４２】
実施形態３０２．生物学的応答は、ＧＤＦ１５ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した細胞内のタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である、実施形態２８０〜３０１のいずれか１つの使用。
【０５４３】
実施形態３０３．生物学的応答は、ＲＥＴ−ＥＲＫ、ＲＥＴ−ＡＫＴ、タンパク質キナーゼＣ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＪＮＫ、ｐ３８及びＲＡＣ１経路の１つ以上における細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少である、実施形態２８０〜３０２のいずれか１つの使用。
【０５４４】
実施形態３０４．タンパク質は、ＥＲＫ、ＳＨＣ１、ＦＲＳ２、ＧＲＢ２、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＯＳ、ＳＨＡＮＫ３、ＧＲＢ７、ＧＲＢ１０、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２から選択される、ＲＥＴ−ＥＲＫ経路における細胞内タンパク質である、実施形態３０２の使用。
【０５４５】
実施形態３０５．タンパク質は、ＡＫＴ、ＳＲＣ、ＳＨＣ１、ＧＲＢ２、ＣＢＬ、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＨＡＮＫ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＳ、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＹＡＰ、ＢＡＤ、カスパーゼ−９、ＦｏｘＯ１、ＦｏｘＯ３、ＦｏｘＯ４、ＩＫＫα、ＣＲＥＢ、ＭＤＭ２、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ２７Ｋｉｐ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲから選択される、ＲＥＴ−ＡＫＴ経路における細胞内タンパク質である、実施形態３０２の使用。
【０５４６】
実施形態３０６．生物学的応答は、ＧＤＦ１５ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質キナーゼのリン酸化と比較した細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である、実施形態２８０〜３０１のいずれか１つの使用。
【０５４７】
実施形態３０７．タンパク質キナーゼは、細胞内タンパク質キナーゼであり、細胞内タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼによって直接又は間接的にリン酸化される、実施形態３０６の使用。
【０５４８】
実施形態３０８．対象は、過体重又は肥満である、実施形態２８０〜３０７のいずれか１つの使用。
【０５４９】
実施形態３０９．対象は、２５〜２９．９の肥満度指数を有する、実施形態２８０〜３０８のいずれか１つの使用。
【０５５０】
実施形態３１０．対象は、３０以上の肥満度指数を有する、実施形態２８０〜３０８のいずれか１つの使用。
【０５５１】
実施形態３１１．肥満症関連の障害は、癌、体重障害又は代謝疾患若しくは障害である、実施形態２８０〜３１０のいずれか１つの使用。
【０５５２】
実施形態３１２．肥満症関連の障害は、癌、ＩＩ型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、高トリグリセリド血症又は心血管系疾患である、実施形態２８０〜３１１のいずれか１つの使用。
【０５５３】
実施形態３１３．食欲及び／又は体重を低減させる方法であって、ＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬを対象に投与することを含み、ＧＤＦ１５ペプチドは、ＧＤＦ１５ペプチドと接触された細胞における生物学的応答を誘導し、可溶性ＧＦＲＡＬは、ドメインＤ２及びＤ３を含むＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含む、方法。
【０５５４】
実施形態３１４．可溶性ＧＦＲＡＬは、ドメインＤ１を欠いたＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含む、実施形態３１３の方法。
【０５５５】
実施形態３１５．可溶性ＧＦＲＡＬは、シグナルペプチドを更に含む、実施形態３１３又は実施形態３１４の方法。
【０５５６】
実施形態３１６．可溶性ＧＦＲＡＬは、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態３１３〜３１５のいずれか１つの方法。
【０５５７】
実施形態３１７．可溶性ＧＦＲＡＬ又は機能的変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態３１３〜３１５のいずれか１つの方法。
【０５５８】
実施形態３１８．可溶性ＧＦＲＡＬ又は機能的変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態３１３〜３１５のいずれか１つの方法。
【０５５９】
実施形態３１９．可溶性ＧＦＲＡＬは、配列番号２のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態３１３〜３１５のいずれか１つの方法。
【０５６０】
実施形態３２０．可溶性ＧＦＲＡＬは、親和性タグを更に含む（例えば、親和性タグに融合される）、実施形態３１３〜３１９のいずれか１つの方法。
【０５６１】
実施形態３２１．親和性タグは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ又はｍｙｃタグを含む、実施形態３２０の方法。
【０５６２】
実施形態３２２．ＧＤＦ１５ペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態３１３〜３２１のいずれか１つの方法。
【０５６３】
実施形態３２３．ＧＤＦ１５ペプチド又は機能的変異体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態３１３〜３２１のいずれか１つの方法。
【０５６４】
実施形態３２４．ＧＤＦ１５ペプチド又は機能的変異体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態３１３〜３２１のいずれか１つの方法。
【０５６５】
実施形態３２５．ＧＤＦ１５ペプチドは、親和性タグ、融合、抱合、ペグ化及び／又はグリコシル化を含む、実施形態３１３〜３２４のいずれか１つの方法。
【０５６６】
実施形態３２６．ＧＤＦ１５ペプチドは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ又はｍｙｃタグでタグ化される、実施形態３１３〜３２５のいずれか１つの方法。
【０５６７】
実施形態３２７．ＧＤＦ１５ペプチドは、ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−１−アンチトリプシンに融合される、実施形態３１３〜３２６のいずれか１つの方法。
【０５６８】
実施形態３２８．ＧＤＦ１５ペプチドは、脂肪酸に抱合される、実施形態３１３〜３２７のいずれか１つの方法。
【０５６９】
実施形態３２９．ＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬは、同時に投与される、実施形態３１３〜３２８のいずれか１つの方法。
【０５７０】
実施形態３３０．ＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬは、連続で投与される、実施形態３１３〜３２８のいずれか１つの方法。
【０５７１】
実施形態３３１．ＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬは、同じ組成物中にある、実施形態３２９の方法。
【０５７２】
実施形態３３２．ＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬは、混合物中にある、実施形態３３１の方法。
【０５７３】
実施形態３３３．ＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬは、二元複合体中にある、実施形態３３１の方法。
【０５７４】
実施形態３３４．生物学的応答は、シグナル伝達応答である、実施形態３１３〜３３３のいずれか１つの方法。
【０５７５】
実施形態３３５．生物学的応答は、ＧＤＦ１５ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した細胞内のタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である、実施形態３１３〜３３４のいずれか１つの方法。
【０５７６】
実施形態３３６．生物学的応答は、ＲＥＴ−ＥＲＫ、ＲＥＴ−ＡＫＴ、タンパク質キナーゼＣ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＪＮＫ、ｐ３８及びＲＡＣ１経路の１つ以上における細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少である、実施形態３１３〜３３５のいずれか１つの方法。
【０５７７】
実施形態３３７．タンパク質は、ＥＲＫ、ＳＨＣ１、ＦＲＳ２、ＧＲＢ２、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＯＳ、ＳＨＡＮＫ３、ＧＲＢ７、ＧＲＢ１０、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２から選択される、ＲＥＴ−ＥＲＫ経路における細胞内タンパク質である、実施形態３３５の方法。
【０５７８】
実施形態３３８．タンパク質は、ＡＫＴ、ＳＲＣ、ＳＨＣ１、ＧＲＢ２、ＣＢＬ、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＨＡＮＫ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＳ、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＹＡＰ、ＢＡＤ、カスパーゼ−９、ＦｏｘＯ１、ＦｏｘＯ３、ＦｏｘＯ４、ＩＫＫα、ＣＲＥＢ、ＭＤＭ２、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ２７Ｋｉｐ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲから選択される、ＲＥＴ−ＡＫＴ経路における細胞内タンパク質である、実施形態３３５の方法。
【０５７９】
実施形態３３９．生物学的応答は、ＧＤＦ１５ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質キナーゼのリン酸化と比較した細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である、実施形態３１３〜３３４のいずれか１つの方法。
【０５８０】
実施形態３４０．タンパク質キナーゼは、細胞内タンパク質キナーゼであり、細胞内タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼによって直接又は間接的にリン酸化される、実施形態３３９の方法。
【０５８１】
実施形態３４１．対象は、過体重又は肥満である、実施形態３１３〜３４０のいずれか１つの方法。
【０５８２】
実施形態３４２．対象は、２５〜２９．９の肥満度指数を有する、実施形態３１３〜３４１のいずれか１つの方法。
【０５８３】
実施形態３４３．対象は、３０以上の肥満度指数を有する、実施形態３１３〜３４１のいずれか１つの方法。
【０５８４】
実施形態３４４．対象の食欲及び／又は体重の低減におけるＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬの使用であって、ＧＤＦ１５ペプチドは、ＧＤＦ１５ペプチドと接触された細胞における生物学的応答を誘導し、可溶性ＧＦＲＡＬは、ドメインＤ２及びＤ３を含むＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含む、使用。
【０５８５】
実施形態３４５．可溶性ＧＦＲＡＬは、ドメインＤ１を欠いたＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含む、実施形態３４４の使用。
【０５８６】
実施形態３４６．可溶性ＧＦＲＡＬは、シグナルペプチドを更に含む、実施形態３４４又は実施形態３４５の使用。
【０５８７】
実施形態３４７．可溶性ＧＦＲＡＬは、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態３４４〜３４６のいずれか１つの使用。
【０５８８】
実施形態３４８．可溶性ＧＦＲＡＬ又は機能的変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態３４４〜３４６のいずれか１つの使用。
【０５８９】
実施形態３４９．可溶性ＧＦＲＡＬ又は機能的変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態３４４〜３４６のいずれか１つの使用。
【０５９０】
実施形態３５０．可溶性ＧＦＲＡＬは、配列番号２のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態３４４〜３４６のいずれか１つの使用。
【０５９１】
実施形態３５１．可溶性ＧＦＲＡＬは、親和性タグを更に含む（例えば、親和性タグに融合される）、実施形態３４４〜３５０のいずれか１つの使用。
【０５９２】
実施形態３５２．親和性タグは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ又はｍｙｃタグを含む、実施形態３５１の使用。
【０５９３】
実施形態３５３．ＧＤＦ１５ペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態３４４〜３５２のいずれか１つの使用。
【０５９４】
実施形態３５４．ＧＤＦ１５ペプチド又は機能的変異体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態３４４〜３５２のいずれか１つの使用。
【０５９５】
実施形態３５５．ＧＤＦ１５ペプチド又は機能的変異体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態３４４〜３５２のいずれか１つの使用。
【０５９６】
実施形態３５６．ＧＤＦ１５ペプチドは、親和性タグ、融合、抱合、ペグ化及び／又はグリコシル化を含む、実施形態３４４〜３５５のいずれか１つの使用。
【０５９７】
実施形態３５７．ＧＤＦ１５ペプチドは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ又はｍｙｃタグでタグ化される、実施形態３４４〜３５６のいずれか１つの使用。
【０５９８】
実施形態３５８．ＧＤＦ１５ペプチドは、ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−１−アンチトリプシンに融合される、実施形態３４４〜３５７のいずれか１つの使用。
【０５９９】
実施形態３５９．ＧＤＦ１５ペプチドは、脂肪酸に抱合される、実施形態３４４〜３５８のいずれか１つの使用。
【０６００】
実施形態３６０．ＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬは、同時に投与される、実施形態３４４〜３５９のいずれか１つの使用。
【０６０１】
実施形態３６１．ＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬは、連続で投与される、実施形態３４４〜３５９のいずれか１つの使用。
【０６０２】
実施形態３６２．ＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬは、同じ組成物中にある、実施形態３６０の使用。
【０６０３】
実施形態３６３．ＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬは、混合物中にある、実施形態３６２の使用。
【０６０４】
実施形態３６４．ＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬは、二元複合体中にある、実施形態３６２の使用。
【０６０５】
実施形態３６５．生物学的応答は、シグナル伝達応答である、実施形態３４４〜３６４のいずれか１つの使用。
【０６０６】
実施形態３６６．生物学的応答は、ＧＤＦ１５ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質の発現又は活性と比較した細胞内のタンパク質の発現又は活性の増大又は減少である、実施形態３４４〜３６５のいずれか１つの使用。
【０６０７】
実施形態３６７．生物学的応答は、ＲＥＴ−ＥＲＫ、ＲＥＴ−ＡＫＴ、タンパク質キナーゼＣ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＪＮＫ、ｐ３８及びＲＡＣ１経路の１つ以上における細胞内タンパク質の発現又は活性の増大又は減少である、実施形態３４４〜３６６のいずれか１つの使用。
【０６０８】
実施形態３６８．タンパク質は、ＥＲＫ、ＳＨＣ１、ＦＲＳ２、ＧＲＢ２、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＯＳ、ＳＨＡＮＫ３、ＧＲＢ７、ＧＲＢ１０、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２から選択される、ＲＥＴ−ＥＲＫ経路における細胞内タンパク質である、実施形態３６６の使用。
【０６０９】
実施形態３６９．タンパク質は、ＡＫＴ、ＳＲＣ、ＳＨＣ１、ＧＲＢ２、ＣＢＬ、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＨＡＮＫ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＳ、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＹＡＰ、ＢＡＤ、カスパーゼ−９、ＦｏｘＯ１、ＦｏｘＯ３、ＦｏｘＯ４、ＩＫＫα、ＣＲＥＢ、ＭＤＭ２、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ２７Ｋｉｐ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲから選択される、ＲＥＴ−ＡＫＴ経路における細胞内タンパク質である、実施形態３６６の使用。
【０６１０】
実施形態３７０．生物学的応答は、ＧＤＦ１５ペプチドと接触されていない対照細胞内の同じタンパク質キナーゼのリン酸化と比較した細胞内のタンパク質キナーゼのリン酸化の増大又は減少である、実施形態３４４〜３６５のいずれか１つの使用。
【０６１１】
実施形態３７１．タンパク質キナーゼは、細胞内タンパク質キナーゼであり、細胞内タンパク質キナーゼは、細胞表面受容体キナーゼによって直接又は間接的にリン酸化される、実施形態３７０の使用。
【０６１２】
実施形態３７２．対象は、過体重又は肥満である、実施形態３４４〜３７１のいずれか１つの使用。
【０６１３】
実施形態３７３．対象は、２５〜２９．９の肥満度指数を有する、実施形態３４４〜３７２のいずれか１つの使用。
【０６１４】
実施形態３７４．対象は、３０以上の肥満度指数を有する、実施形態３４４〜３７２のいずれか１つの使用。
【０６１５】
実施形態３７５．ＧＤＦ１５活性を調節することができる薬剤を同定する方法であって、
（ａ）実施形態１２５〜１６０のいずれか１つの細胞を薬剤及びＧＤＦ１５ペプチドと接触させることと；
（ｂ）接触された細胞における生物学的応答を検出することと
を含み、薬剤は、接触された細胞における生物学的応答が、薬剤の非存在下でＧＤＦ１５ペプチドと接触された細胞における生物学的応答に対して増大又は減少される場合、ＧＤＦ１５活性を調節すると決定される、方法。
【０６１６】
実施形態３７６．薬剤は、抗体である、実施形態３７５の方法。
【０６１７】
実施形態３７７．薬剤は、抗ＧＤＦ１５抗体である、実施形態３７５又は実施形態３７６の方法。
【０６１８】
実施形態３７８．薬剤は、抗ＧＦＲＡＬ抗体である、実施形態３７５又は実施形態３７６の方法。
【０６１９】
実施形態３７９．生物学的応答は、ＲＥＴ−ＥＲＫ、ＲＥＴ−ＡＫＴ、タンパク質キナーゼＣ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＪＮＫ、ｐ３８及びＲＡＣ１経路の１つ以上における細胞内タンパク質の発現、活性又はリン酸化レベルの増大又は減少である、実施形態３７５〜３７８のいずれか１つの方法。
【０６２０】
実施形態３８０．細胞内タンパク質は、ＲＥＴ−ＥＲＫ経路にあり、且つＥＲＫ、ＳＨＣ１、ＦＲＳ２、ＧＲＢ２、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＯＳ、ＳＨＡＮＫ３、ＧＲＢ７、ＧＲＢ１０、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２から選択される、実施形態３７９の方法。
【０６２１】
実施形態３８１．細胞内タンパク質は、ＲＥＴ−ＡＫＴ経路にあり、且つＡＫＴ、ＳＲＣ、ＳＨＣ１、ＧＲＢ２、ＣＢＬ、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＨＡＮＫ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＳ、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＹＡＰ、ＢＡＤ、カスパーゼ−９、ＦｏｘＯ１、ＦｏｘＯ３、ＦｏｘＯ４、ＩＫＫα、ＣＲＥＢ、ＭＤＭ２、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ２７Ｋｉｐ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲから選択される、実施形態３７９の方法。
【０６２２】
実施形態３８２．ＧＤＦ１５ペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態３７５〜３８１のいずれか１つの方法。
【０６２３】
実施形態３８３．ＧＤＦ１５ペプチド又は機能的変異体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態３７５〜３８１のいずれか１つの方法。
【０６２４】
実施形態３８４．ＧＤＦ１５ペプチド又は機能的変異体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態３７５〜３８１のいずれか１つの方法。
【０６２５】
実施形態３８５．ＧＤＦ１５ペプチドは、親和性タグ、融合、抱合、ペグ化及び／又はグリコシル化を含む、実施形態３７５〜３８４のいずれか１つの方法。
【０６２６】
実施形態３８６．ＧＤＦ１５ペプチドは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ又はｍｙｃタグでタグ化される、実施形態３７５〜３８５のいずれか１つの方法。
【０６２７】
実施形態３８７．ＧＤＦ１５ペプチドは、ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−１−アンチトリプシンに融合される、実施形態３７５〜３８６のいずれか１つの方法。
【０６２８】
実施形態３８８．ＧＤＦ１５ペプチドは、脂肪酸に抱合される、実施形態３７５〜３８７のいずれか１つの方法。
【０６２９】
実施形態３８９．ＧＤＦ１５活性を調節することができる薬剤を同定する方法であって、
（ａ）細胞表面受容体キナーゼを発現する細胞を提供することと；
（ｂ）細胞をＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬと接触させることと；
（ｃ）細胞を薬剤と接触させることと；
（ｄ）接触された細胞における生物学的応答を検出することと
を含み、可溶性ＧＦＲＡＬは、ドメインＤ２及びＤ３を含むＧＦＲＡＬ細胞外ドメインを含み、且つドメインＤ１を欠く、方法。
【０６３０】
実施形態３９０．薬剤は、接触された細胞における生物学的応答が、ＧＤＦ１５ペプチド、可溶性ＧＦＲＡＬ及び薬剤の存在下において、薬剤の非存在下でＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬと接触された細胞における生物学的応答に対して増大される場合、ＧＤＦ１５活性を調節するか又は増大させると決定される、実施形態３８９の方法。
【０６３１】
実施形態３９１．薬剤は、接触された細胞における生物学的応答が、ＧＤＦ１５ペプチド、可溶性ＧＦＲＡＬ及び薬剤の存在下において、薬剤の非存在下でＧＤＦ１５ペプチド及び可溶性ＧＦＲＡＬと接触された細胞における生物学的応答に対して減少される場合、ＧＤＦ１５活性を調節するか又は減少させると決定される、実施形態３８９の方法。
【０６３２】
実施形態３９２．薬剤は、抗体である、実施形態３８９〜３９１のいずれか１つの方法。
【０６３３】
実施形態３９３．薬剤は、抗ＧＤＦ１５抗体である、実施形態３８９〜３９２のいずれか１つの方法。
【０６３４】
実施形態３９４．薬剤は、抗ＧＦＲＡＬ抗体である、実施形態３８９〜３９２のいずれか１つの方法。
【０６３５】
実施形態３９５．生物学的応答は、ＲＥＴ−ＥＲＫ、ＲＥＴ−ＡＫＴ、タンパク質キナーゼＣ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＪＮＫ、ｐ３８及びＲＡＣ１経路の１つ以上における細胞内タンパク質の発現、活性又はリン酸化レベルの増大又は減少である、実施形態３８９〜３９４のいずれか１つの方法。
【０６３６】
実施形態３９６．細胞内タンパク質は、ＲＥＴ−ＥＲＫ経路にあり、且つＥＲＫ、ＳＨＣ１、ＦＲＳ２、ＧＲＢ２、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＯＳ、ＳＨＡＮＫ３、ＧＲＢ７、ＧＲＢ１０、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＦ、ＲＡＳ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＳＫ１及びＭＳＫ２から選択される、実施形態３９５の方法。
【０６３７】
実施形態３９７．細胞内タンパク質は、ＲＥＴ−ＡＫＴ経路にあり、且つＡＫＴ、ＳＲＣ、ＳＨＣ１、ＧＲＢ２、ＣＢＬ、ＧＡＢ１、ＧＡＢ２、ＳＨＡＮＫ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＲＡＳ、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、ＹＡＰ、ＢＡＤ、カスパーゼ−９、ＦｏｘＯ１、ＦｏｘＯ３、ＦｏｘＯ４、ＩＫＫα、ＣＲＥＢ、ＭＤＭ２、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ２７Ｋｉｐ１、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β及びｍＴＯＲから選択される、実施形態３９５の方法。
【０６３８】
実施形態３９８．可溶性ＧＦＲＡＬは、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態３８９〜３９７のいずれか１つの方法。
【０６３９】
実施形態３９９．可溶性ＧＦＲＡＬ又は機能的変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態３８９〜３９７のいずれか１つの方法。
【０６４０】
実施形態４００．可溶性ＧＦＲＡＬ又は機能的変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態３８９〜３９７のいずれか１つの方法。
【０６４１】
実施形態４０１．可溶性ＧＦＲＡＬは、親和性タグを更に含む（例えば、親和性タグに融合される）、実施形態３８９〜４００のいずれか１つの方法。
【０６４２】
実施形態４０２．親和性タグは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ又はｍｙｃタグを含む、実施形態４０１の方法。
【０６４３】
実施形態４０３．ＧＤＦ１５ペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む、実施形態３８９〜４０２のいずれか１つの方法。
【０６４４】
実施形態４０４．ＧＤＦ１５ペプチド又は機能的変異体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態３８９〜４０２のいずれか１つの方法。
【０６４５】
実施形態４０５．ＧＤＦ１５ペプチド又は機能的変異体は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態３８９〜４０２のいずれか１つの方法。
【０６４６】
実施形態４０６．ＧＤＦ１５ペプチドは、親和性タグ、融合、抱合、ペグ化及び／又はグリコシル化を含む、実施形態３８９〜４０５のいずれか１つの方法。
【０６４７】
実施形態４０７．ＧＤＦ１５ペプチドは、アミロイドβ前駆体タンパク質タグ、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ又はｍｙｃタグでタグ化される、実施形態３８９〜４０６のいずれか１つの方法。
【０６４８】
実施形態４０８．ＧＤＦ１５ペプチドは、ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、免疫グロブリン定常領域又はα−１−アンチトリプシンに融合される、実施形態３８９〜４０７のいずれか１つの方法。
【０６４９】
実施形態４０９．ＧＤＦ１５ペプチドは、脂肪酸に抱合される、実施形態３８９〜４０８のいずれか１つの方法。
【０６５０】
実施形態４１０．薬剤を含む医薬組成物を製造する方法であって、
（ａ）実施形態３７５〜４０９のいずれか１つの方法により、ＧＤＦ１５活性を調節することができる薬剤を同定することと；
（ｂ）薬剤を医薬組成物中に処方することと
を含む方法。
【０６５１】
実施形態４１１．薬剤は、抗体である、実施形態４１０の方法。
【０６５２】
実施形態４１２．薬剤は、抗ＧＤＦ１５抗体である、実施形態４１０又は実施形態４１１の方法。
【０６５３】
実施形態４１３．薬剤は、抗ＧＦＲＡＬ抗体である、実施形態４１０又は実施形態４１１の方法。
【０６５４】
実施形態４１４．対象における肥満症又は肥満症関連の障害を処置する方法であって、
（ａ）実施形態３７５〜４０９のいずれか１つの方法により、ＧＤＦ１５活性を調節することができる薬剤を同定することと；
（ｂ）薬剤を対象に投与することと
を含む方法。
【０６５５】
実施形態４１５．薬剤は、抗体である、実施形態４１４の方法。
【０６５６】
実施形態４１６．薬剤は、抗ＧＤＦ１５抗体である、実施形態４１４又は実施形態４１５の方法。
【０６５７】
実施形態４１７．薬剤は、抗ＧＦＲＡＬ抗体である、実施形態４１４又は実施形態４１５の方法。
【０６５８】
実施形態４１８．対象は、過体重又は肥満である、実施形態４１４〜４１７のいずれか１つの方法。
【０６５９】
実施形態４１９．対象は、２５〜２９．９の肥満度指数を有する、実施形態４１４〜４１８のいずれか１つの方法。
【０６６０】
実施形態４２０．対象は、３０以上の肥満度指数を有する、実施形態４１４〜４１８のいずれか１つの方法。
【０６６１】
実施形態４２１．肥満症関連の障害は、癌、体重障害又は代謝疾患若しくは障害である、実施形態４１４〜４２０のいずれか１つの方法。
【０６６２】
実施形態４２２．肥満症関連の障害は、癌、ＩＩ型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、高トリグリセリド血症又は心血管系疾患である、実施形態４１４〜４２１のいずれか１つの方法。
【０６６３】
実施形態４２３．対象における食欲及び／又は体重を低減させる方法であって、
（ａ）実施形態３７５〜４０９のいずれか１つの方法により、ＧＤＦ１５活性を調節することができる薬剤を同定することと；
（ｂ）薬剤を対象に投与することと
を含む方法。
【０６６４】
実施形態４２４．薬剤は、抗体である、実施形態４２３の方法。
【０６６５】
実施形態４２５．薬剤は、抗ＧＤＦ１５抗体である、実施形態４２３又は実施形態４２４の方法。
【０６６６】
実施形態４２６．薬剤は、抗ＧＦＲＡＬ抗体である、実施形態４２３又は実施形態４２４の方法。
【０６６７】
実施形態４２７．対象は、過体重又は肥満である、実施形態４２３〜４２６のいずれか１つの方法。
【０６６８】
実施形態４２８．対象は、２５〜２９．９の肥満度指数を有する、実施形態４２３〜４２７のいずれか１つの方法。
【０６６９】
実施形態４２９．対象は、３０以上の肥満度指数を有する、実施形態４２３〜４２７のいずれか１つの方法。
【図１】
2021533743.tif 000009
【図２−１】
2021533743.tif 000010
【図２−２】
2021533743.tif 000011
【図３】
2021533743.tif 000012
【図４−１】
2021533743.tif 000013
【図４−２】
2021533743.tif 000014
【図５】
2021533743.tif 000015
【図６】
2021533743.tif 000016
【図７】
2021533743.tif 000017
【図８】
2021533743.tif 000018
【図９】
2021533743.tif 000019
【図１０−１】
2021533743.tif 000020
【図１０−２】
2021533743.tif 000021
【図１１−１】
2021533743.tif 000022
【図１１−２】
2021533743.tif 000023
【図１２−１】
2021533743.tif 000024
【図１２−２】
2021533743.tif 000025
【配列表】
2021533743000001.app
【国際調査報告】
2021533743.tif 000026
2021533743.tif 000027
2021533743.tif 000028
2021533743.tif 000029