(57)【要約】基質を酵素によりスルフリル化する方法を提供する。この方法は、腸内細菌科に属する細菌を含む培地中で、前記基質と３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸（ＰＡＰＳ）とを反応させて、前記基質の硫酸化誘導体を生成するステップと、前記培地から前記硫酸化誘導体を回収するステップと、を含み、前記細菌は、少なくとも、スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を産生し、かつ、ａｐｈＡ遺伝子、ｃｙｓＱ遺伝子、もしくはｃｐｄＢ遺伝子、またはこれらの組み合わせの発現を減弱させるように、改変されている。
2021529511.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基質を酵素によりスルフリル化する方法であって、
（ｉ）腸内細菌科に属する細菌を含む培地中で、前記基質と３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸とを反応させて、前記基質の硫酸化誘導体を生成することと、
（ｉｉ）前記培地から前記硫酸化誘導体を回収することと、
を含み、
前記細菌は、
（Ａ）少なくとも、スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を産生し、かつ、
（Ｂ）ａｐｈＡ遺伝子またはｃｙｓＱ遺伝子の発現を減弱させる
ように改変されている、方法。
【請求項２】
前記ａｐｈＡ遺伝子の発現を減弱させるように改変された前記細菌は、前記ｃｙｓＱ遺伝子、もしくはｃｐｄＢ遺伝子、またはこれらの組み合わせの発現を減弱させるように、さらに改変されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｃｙｓＱ遺伝子の発現を減弱させるように改変された前記細菌は、ａｐｈＡ遺伝子、もしくはｃｐｄＢ遺伝子、またはこれらの組み合わせの発現を減弱させるように、さらに改変されている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
スルホトランスフェラーゼ活性を有する前記タンパク質は、Ｏ−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質、Ｎ−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質、およびＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
Ｏ−スルホトランスフェラーゼ活性を有する前記タンパク質は、ヘパラン硫酸２−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質、ヘパラン硫酸３−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質、ヘパラン硫酸６−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細菌は、ヘパロサン−Ｎ−硫酸−グルクロン酸−５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を産生するように、さらに改変されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記細菌は、３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を産生するように、さらに改変されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記培地は、３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸−スルホトランスフェラーゼ活性を有する前記タンパク質を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記基質は、ヒドロキシ基およびアミノ基から選択される少なくとも１つの化学基を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記基質は、ヘパロサン、ヘパラン硫酸、およびヘパリンからなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記硫酸化誘導体は、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、コリン硫酸、およびデルマタン硫酸からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記細菌は、エシェリヒア属またはパントエア属に属する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記細菌は、大腸菌またはパントエア・アナナティスである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
基質の硫酸化誘導体を生成する方法であって、
（ｉ）腸内細菌科に属する細菌を含む培地中で、前記基質と３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸とを反応させて、前記基質の前記硫酸化誘導体を生成することと、
（ｉｉ）前記培地から前記硫酸化誘導体を回収することと、
を含み、
前記細菌は、
（Ａ）少なくとも、スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を産生し、かつ、
（Ｂ）ａｐｈＡ遺伝子またはｃｙｓＱ遺伝子の発現を減弱させる
ように改変されている、方法。
【請求項１５】
前記ａｐｈＡ遺伝子の発現を減弱させるように改変された前記細菌は、ｃｙｓＱ遺伝子、もしくはｃｐｄＢ遺伝子、またはこれらの組み合わせの発現を減弱させるように、さらに改変されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｃｙｓＱ遺伝子の発現を減弱させるように改変された前記細菌は、ａｐｈＡ遺伝子、もしくはｃｐｄＢ遺伝子、またはこれらの組み合わせの発現を減弱させるように、さらに改変されている、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物産業に関し、具体的には、アルコール類およびアミン類のＯ−およびＮ−硫酸化誘導体を生成するために、腸内細菌科に属する細菌を含む培地においてアルコール類およびアミン類を酵素によりスルフリル化する方法に関する。この方法は、例えば例えば、ヘパリンおよびヘパラン硫酸を生成するために用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
１つ以上の硫酸基を含む無機および有機分子が知られている。これらの無機および有機分子のうち、硫酸基を含み、かつ、生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たす生体分子が存在することが知られている。この生体分子として、例えば、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、コリン硫酸、およびデルマタン硫酸が挙げられる。ヘパリンおよびヘパラン硫酸は、医薬品産業において、例えば治療に使用することができるため、特に関心を集めている。
【０００３】
ヘパリンおよびヘパラン硫酸（略して「ＨＳ」）は、様々に硫酸化された二糖繰り返し単位を有する直鎖状多糖類である。ヘパリンは、主に動物の肥満細胞によって産生されるが、ＨＳは、ほとんどすべてのタイプの細胞によって生成される。ヘパリンおよびＨＳは、多くのタンパク質と相互作用し、様々な生物学的プロセス、例えば、細胞周期、細胞成長、細胞分化、細胞接着、運動性、脂質代謝、血管形成、血液凝固、グランザイムＢ（ＧｒＢ）による剥離活性の無効化、および腫瘍転移などを調節することができる。深部静脈血栓症、肺塞栓症、および動脈血栓塞栓症の治療および予防にヘパリンを使用することが知られている。また、ヘパリンは、心臓発作および不安定狭心症の治療においても使用される。
【０００４】
化学構造、つまり、ヘパリンおよびＨＳの分子を構成する基本的な多糖類成分の種類および数は、組織および発達段階に依存して変化しうる。したがって、共通のヘパリンおよびＨＳ構造はない。それにもかかわらず、二糖繰り返し単位の主な構造モチーフ（−４ＧｌｃＡ１β−４ＧｌｃＮＡｃα１−）および（−４）−α−Ｌ−ＩｄｏＡ２Ｓ−（１−４）−Ｄ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ−（１−）が、ヘパリンおよびＨＳのグリコシルアミノグリカン骨格に存在する（Ｋｕｂｅｒａｎ  Ｂ．ら，Ｃｈｅｍｏｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ  ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３，２７８（５２）：５２６１３−５２６２１；Ｍｕｌｌｏｙ  Ｂ．ら，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｈｅｐａｒｉｎ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｄｒｕｇｓ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．，２０１６，６８（１）：７６−１４１）。ヘパリンおよびＨＳの分子構造における基本的な違いが知られており、その違いとして、分子量、硫酸化率、およびイズロン酸（略して「ＩｄｏＡ」）残基含有量が挙げられる（例えば、Ｇａｌｌａｇｈｅｒ  Ｊ．Ｔ．およびＷａｌｋｅｒ  Ａ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｐｈａｔｅ  ａｎｄ  ｈｅｐａｒｉｎ．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｕｌｐｈａｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｉｎｄｉｃａｔｅｓ  ｔｈａｔ  ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｐｈａｔｅ  ａｎｄ  ｈｅｐａｒｉｎ  ａｒｅ  ｓｅｐａｒａｔｅ  ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｏｆ  Ｎ−ｓｕｌｐｈａｔｅｄ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，１９８５，２３０（３）：６６５−６７４；Ｓｈｒｉｖｅｒ  Ｚ．ら，Ｈｅｐａｒｉｎ  ａｎｄ  ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ：ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ，Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２０１２，２０７：１５９−１７６参照）。さらに、ヘパリンの抗凝固活性は、ＨＳの抗凝固活性よりも、約１００倍高い。
【０００５】
グルクロン酸（略して「ＧｌｃＡ」）およびＮ−アセチル化グルコース（略して「ＧｌｃＮＡｃ」）単位からヘパリンおよびヘパラン硫酸を生合成することについては、詳細に検討されてきた（例えば、Ｍｕｌｌｏｙ  Ｂ．ら，２０１６；Ｓｕｇａｈａｒａ  Ｋ．およびＫｉｔａｇａｗａ  Ｈ．，Ｈｅｐａｒｉｎ  ａｎｄ  ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＩＵＢＭＢ  Ｌｉｆｅ，２００２，５４（４）：１６３−１７５参照）。特に、ヘパリンとＨＳを生成するためにグリコシルアミノグリカン骨格（いわゆるヘパロサン）を改変する生合成について記載されている。ヘパリンとＨＳの生合成は、ｉ）ＨＳ／ヘパリン  ＧｌｃＮＡｃ  Ｎ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ（略して「ＮＤＮＳＴ」）によって触媒される、ＧｌｃＮＡｃ残基をＮ−脱アセチル化およびＮ−硫酸化するステップと、ｉｉ）グルクロン酸（略して「ＧｌｃＡ」）残基をＩｄｏＡ残基に変換するヘパロサン−Ｎ−硫酸−グルクロン酸−５−エピメラーゼ（略して「ＨＮＳＧ−５ｅｐｉ」、「Ｃ５−ｅｐｉ」）によって触媒される、グルクロニルＣ５位をエピメリ化するステップと、ｉｉｉ）それぞれ、ヘパラン硫酸２−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ（略して「ＨＳ  ２−ＯＳＴ」）、ヘパラン硫酸６−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ（略して「ＨＳ  ６−ＯＳＴ」）、およびヘパラン硫酸３−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ（略して「ＨＳ  ３−ＯＳＴ」）によって触媒される、ＩｄｏＡ残基のＣ２位ならびにＮ−スルホグルコサミン（略して「ＧｌｃＮＳ」）残基のＣ６位およびＣ３位に位置している各ヒドロキシ基を、連続してＯ−硫酸化するステップと、を含む。Ｎ−硫酸化およびＯ−硫酸化は、スルホ基のドナーである３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸（略して「ＰＡＰＳ」）の存在下で起こる。硫酸化率は、硫酸化される官能基の位置および種類に依存しうる（図１）。さらに、ヘパロサンからのヘパリンとＨＳへの生合成は均一ではなく、生合成の結果、多様な化学構造が生じうる。図２Ａは、ヘパリンの化学構造の一例を示す（ＰｕｂＣｈｅｍ  ＣＩＤ：７７２、ＰｕｂＣｈｅｍデータベース、アメリカ国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）、ｈｔｔｐｓ：／／ｐｕｂｃｈｅｍ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）。図２Ｂは、ＨＳの化学構造の一例を示す（ＰｕｂＣｈｅｍ  ＣＩＤ：５３４７７７１４）。
【０００６】
ヘパリンおよびＨＳを製造する方法が知られており、これらの方法として、例えば、化学技術、化学酵素技術、および生物工学の技術によって、哺乳類源および非哺乳類源からヘパリンを分離および精製する方法が挙げられる。動物からヘパリンを分離するための工業プロセスは１９２２年に始まり、今でもヘパリンを生成する主な方法とみなされている。ブタ、ウシ、イヌ、およびヒツジ（ｏｖｉｎｅ）を、ヘパリン源として用いる事ができる（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｅｒ  Ｊ．−Ｙ．ら，Ｆｒｏｍ  ｆａｒｍ  ｔｏ  ｐｈａｒｍａ：ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ｈｅｐａｒｉｎ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１７，２２（６）：１０２５）。しかし、哺乳類源から分離したヘパリンを用いる場合、宗教上および衛生上の問題がある。これらの問題は、ヘパリン源としてヒトコブラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ  ｄｒｏｍｅｄａｒｉｅｓ）を用いることにより多少解決した。動物源から分離したヘパリンは、例えば、動脈血栓症とともに出血やヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）などの望ましくない副作用を及ぼすにもかかわらず、今でも、脳卒中や心臓発作後のヒトを治療するための併用療法に使用されている。
【０００７】
ニワトリやシチメンチョウなどの家禽類、サケ（タイセイヨウサケ）などの魚類、および他の源からヘパリンを分離することによってヘパリンを生成する方法が知られている（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｅｒ  Ｊ．−Ｙ．ら。２０１７年。および、引用されている参考文献）。動物および海洋生物源からヘパリンを生成する方法を開示する特許文献が公開されている。例えば、周囲温度で原料の酵素加水分解ステップを用いて動物粘膜組織からヘパリンを抽出するための簡易な方法が知られている（米国特許第６２３２０９３号）。別の方法においては、分子量が非常に小さいヘパリン（Ｖｅｒｙ  Ｌｏｗ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｈｅｐａｒｉｎ：略して「ＶＬＭＷＨ」）を、クロマトグラフィ技術を用いて、魚類源から分離する（国際公開第２００６／１２０４２５号）。
【０００８】
バイオセイフティレベルでのヘパリンおよびヘパラン硫酸（ＨＳ）が、治療上、重要であるので、非動物源から、そのような物質を安価で大規模に商業生産するための方法が求められている。したがって、ヘパリンおよびＨＳを生成するための代わりの方法が開発されている。例えば、ＨＳの生合成に関連するクローニング酵素一式を使用して、迅速かつ容易にＨＳを合成することができる（Ｋｕｂｅｒａｎ  Ｂ．ら。２００３年）。しかし、この方法は、精製されたヒトのグルクロニルＣ５−エピメラーゼ、ヘパラン硫酸２−、３−、６−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ、およびスルホ基のドナーとしてのＰＡＰＳを必要とするので、労力を要し、かつ費用がかかる。他の例では、ｉ）ヘパロサンの部分的脱重合単一ステップおよびアミノ基のＮ−脱アセチル化を行うためにアルカリ水溶液で、ｉｉ）Ｎ−硫酸化を選択的に行うためにトリメチルアミン三酸化硫黄錯体で、ｉｉｉ）ＧｌｃＡ残基のＣ５原子でのカルボキシ基の異性化およびＩｄｏＡ残基の２−Ｏ−硫酸化を行うために、Ｃ５−エピメラーゼと２−Ｏ−スルホトランスフェラーゼの混合物で、ｉｖ）ＧｌｃＮＳ残基の６−Ｏ−硫酸化を行うために、６−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ類の混合物で、およびｖ）ＧｌｃＮＳ（６Ｓ）残基の３−Ｏ−硫酸化を行うために、３−Ｏ−スルホトランスフェラーゼで、ヘパロサンを処理するステップを含む化学酵素アプローチを用いて、ヘパロサンからバイオヘパリンが得られている（国際公開第２０１２／１１６０４８号）。この方法によって生成したバイオヘパリンは、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびＮ−スルホグルコサミンの含有量、数平均分子量（ＭＮ）、重量平均分子量（ＭＷ）、および多分散指数（Ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ：ＰＤＩ）に関して、医薬品ヘパリンとほぼ等しいものであった。この記載された方法では、非常に高価であり、よって、スルホ基のドナー（ＰＡＰＳ）を回復するために再生システムを用いた（Ｚｈａｎｇ  Ｚ．ら，Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｃｈｅｍｏｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｈｅｐａｒｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００８，１３０（３９）：１２９９８−１３００７）。
【０００９】
しかし、少なくとも、スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を産生し、かつ、ａｐｈＡ遺伝子、ｃｙｓＱ遺伝子、もしくはｃｐｄＢ遺伝子、またはこれらの組み合わせの発現を減弱させるように改変されている腸内細菌科に属する細菌を含む培地中で、スルホ基のドナーと基質とを反応させて、基質を酵素によりスルフリル化して、基質の硫酸化誘導体を生成する方法は、知られていない。
【発明の概要】
【００１０】
本開示の主題によれば、少なくとも１つのヒドロキシ基または少なくとも１つのアミノ基を有する基質を酵素によりスルフリル化して、それぞれの硫酸化誘導体、例えばＯ−硫酸化誘導体またはＮ−硫酸化誘導体などを生成する新規な方法を、本明細書において提供する。本明細書に記載の方法を説明するための実施形態において、ヘパロサン−Ｎ−硫酸塩をスルフリル化して、元のヘパロサン−Ｎ−硫酸塩に比して、さらに少なくとも１つのＯ−スルホ基を有する、ヘパロサン−Ｎ−硫酸塩のＯ−硫酸化誘導体、例えばヘパリンやヘパラン硫酸などを生成することができる。したがって、本開示の主題によれば、ヘパロサン−Ｎ−硫酸塩のＯ−硫酸化誘導体を、動物源を用いずに生成することができる。
【００１１】
本明細書に記載の方法は、腸内細菌科に属する細菌を含む培地中で、例えば３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸（ＰＡＰＳ）などのスルホ基のドナーと基質とを反応させるステップを含んでもよく、この細菌は、少なくとも、スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を産生し、かつ、ａｐｈＡ遺伝子、ｃｙｓＱ遺伝子、もしくはｃｐｄＢ遺伝子、またはこれらの組み合わせの発現を減弱させるように改変されている。この方法の利点は、細菌の細胞の粗ライセートが、所望の活性を有するタンパク質、例えばスルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質などを含み、したがって、粗ライセートを本明細書に記載の方法で首尾よく使用することができることである。すなわち、本明細書に記載の方法において、所望の活性を有する１つ以上のタンパク質を、事前に分離および／または精製することなく使用してもよい。したがって、本明細書に記載の方法を用いれば、アルコール類およびアミン類をスルフリル化するプロセスを簡易にすることができ、プロセスのコストを削減することができる。
【００１２】
さらに、本明細書に記載の方法において使用することができる細菌を、細菌が３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をも産生することができるように改変することによって、上記方法をさらに改善することができ、その結果、この方法では、高価かつ不安定なＰＡＰＳを容易に再生成し、再利用することができる。または、本明細書に記載の方法において使用することができる培地を、培地が、本明細書に記載の細菌と、３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質とを含有するように用いることによって、上記方法をさらに改善することができ、その結果、上記培地においてＰＡＰＳを再生成することができる。したがって、本開示の主題によれば、基質のＯ−およびＮ−硫酸化誘導体を、非常に低価格かつ高収率で生成することができる。
【００１３】
本発明の一態様は、基質を酵素によりスルフリル化する方法を提供することであって、この方法は、
（ｉ）腸内細菌科に属する細菌を含む培地中で、前記基質と３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸とを反応させて、前記基質の硫酸化誘導体を生成することと、
（ｉｉ）前記培地から前記硫酸化誘導体を回収することと、
を含み、
この細菌は、
（Ａ）少なくとも、スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を産生し、かつ、
（Ｂ）ａｐｈＡ遺伝子またはｃｙｓＱ遺伝子の発現を減弱させる
ように改変されている。
【００１４】
本発明の別の態様は、上述した方法を提供することであって、この方法において、ａｐｈＡ遺伝子の発現を減弱させるように改変された細菌は、ｃｙｓＱ遺伝子もしくはｃｐｄＢ遺伝子、またはこれらの組み合わせの発現を減弱させるように、さらに改変されている。
【００１５】
本発明の別の態様は、上述した方法を提供することであって、この方法において、ｃｙｓＱ遺伝子の発現を減弱させるように改変された細菌は、ａｐｈＡ遺伝子もしくはｃｐｄＢ遺伝子、またはこれらの組み合わせの発現を減弱させるように、さらに改変されている。
【００１６】
本発明の別の態様は、上述した方法を提供することであって、この方法において、スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質は、Ｏ−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質、Ｎ−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質、およびＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質からなる群から選択される。
【００１７】
本発明の別の態様は、上述した方法を提供することであって、この方法において、Ｏ−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質は、ヘパラン硫酸２−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質、ヘパラン硫酸３−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質、ヘパラン硫酸６−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１８】
本発明の別の態様は、上述した方法を提供することであって、この方法において、上記細菌は、ヘパロサン−Ｎ−硫酸−グルクロン酸５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を産生するように、さらに改変されている。
【００１９】
本発明の別の態様は、上述した方法を提供することであって、この方法において、上記細菌は、３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を産生するように、さらに改変されている。
【００２０】
本発明の別の態様は、上述した方法を提供することであって、この方法において、上記培地は、３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を含む。
【００２１】
本発明の別の態様は、上述した方法を提供することであって、この方法において、上記基質は、ヒドロキシ基およびアミノ基から選択される少なくとも１つの化学基を有する。
【００２２】
本発明の別の態様は、上述した方法を提供することであって、この方法において、上記基質は、ヘパロサン、ヘパラン硫酸、およびヘパリンからなる群から選択される。
【００２３】
本発明の別の態様は、上述した方法を提供することであって、この方法において、上記硫酸化誘導体は、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、コリン硫酸、およびデルマタン硫酸からなる群から選択される。
【００２４】
本発明の別の態様は、上述した方法を提供することであって、この方法において、上記細菌は、エシェリヒア属またはパントエア属に属する。
【００２５】
本発明の別の態様は、上述した方法を提供することであって、この方法において、上記細菌は、大腸菌またはパントエア・アナナティスである。
【００２６】
本発明の別の態様は、基質の硫酸化誘導体を生成する方法を提供することであって、この方法は、
（ｉ）腸内細菌科に属する細菌を含む培地中で、上記基質と３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸とを反応させて、上記基質の硫酸化誘導体を生成することと、
（ｉｉ）上記培地から上記硫酸化誘導体を回収することと、
を含み、
この細菌は、
（Ａ）少なくとも、スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を産生し、かつ、
（Ｂ）ａｐｈＡ遺伝子またはｃｙｓＱ遺伝子の発現を減弱させる
ように改変されている。
【００２７】
本発明の別の態様は、上述した方法を提供することであって、この方法において、ａｐｈＡ遺伝子の発現を減弱させるように改変された細菌は、ｃｙｓＱ遺伝子もしくはｃｐｄＢ遺伝子、またはこれらの組み合わせの発現を減弱させるように、さらに改変されている。
【００２８】
本発明の別の態様は、上述した方法を提供することであって、この方法において、ｃｙｓＱ遺伝子の発現を減弱させるように改変された細菌は、ａｐｈＡ遺伝子もしくはｃｐｄＢ遺伝子、またはこれらの組み合わせの発現を減弱させるように、さらに改変されている。
【００２９】
本発明のさらに別の目的、特徴、等価物、および付随する利点は、添付図面と組み合わせて、構築されている実施形態についての下記の詳細な説明を読めば、当業者には明らかであろう。
【００３０】
次に、本明細書に記載の発明について、単に例として挙げた、例示的実施形態を参照し、添付図面を参照しながら、詳述する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、Ｎ−およびＯ−スルホトランスフェラーゼを用いる、（−４ＧｌｃＡ１β−４ＧｌｃＮＡｃα１−）構造を有するグルコシルアミノグリカン単位のヒドロキシ基とアミノ基の硫酸化率を示す。硫酸化率（％）を括弧内に示し、硫酸化されやすいヒドロキシ基の位置を円内に示す。グルクロン酸（ＧｌｃＡ）残基のＣ５位にあるカルボキシ基の異性化を湾曲した矢印によって示す。
【図２Ａ】図２Ａは、ヘパリンの化学構造を例示する。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ヘパラン硫酸の化学構造を例示する。
【図３Ａ】図３Ａは、ｐＡＣＹＣ１８４−ＭＢＰ＊−２ＯＳＴＹ９４Ａ（Ｄ６９−Ｎ３５６）およびｐＳＵＭＯ−ｄｒｅＧｌｃｅ（Ｇ７０−Ｎ５８５）プラスミドを保持するΔ２−５−株の粗細胞ライセートの可溶性および不溶性画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。パネルＡは、可溶性画分を表し、パネルＢは、不溶性画分を表す。レーンＭは、示された分子量のマーカーを表し、レーン１および２は、Δ２株を表し、レーン３および４は、Δ３株を表し、レーン５および６は、Δ４株を表し、レーン７および８は、Δ５株を表す。ＨＳ  ２−ＯＳＴは、ＭＰＢ＊Ｎ−タグと融合したヘパラン硫酸２−Ｏ−スルホトランスフェラーゼを表し、ＨＮＳＧ−５ｅｐｉは、ＳＵＭＯ  Ｎ−タグと融合したヘパロサン−Ｎ−硫酸−グルクロン酸−５−エピメラーゼを表す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ｐＡＣＹＣ１８４−ＭＢＰ＊−２ＯＳＴＹ９４Ａ（Ｄ６９−Ｎ３５６）およびｐＳＵＭＯ−ｄｒｅＧｌｃｅ（Ｇ７０−Ｎ５８５）プラスミドを保持するΔ２−５−株の粗細胞ライセートの可溶性および不溶性画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。パネルＡは、可溶性画分を表し、パネルＢは、不溶性画分を表す。レーンＭは、示された分子量のマーカーを表し、レーン１および２は、Δ２株を表し、レーン３および４は、Δ３株を表し、レーン５および６は、Δ４株を表し、レーン７および８は、Δ５株を表す。ＨＳ  ２−ＯＳＴは、ＭＰＢ＊Ｎ−タグと融合したヘパラン硫酸２−Ｏ−スルホトランスフェラーゼを表し、ＨＮＳＧ−５ｅｐｉは、ＳＵＭＯ  Ｎ−タグと融合したヘパロサン−Ｎ−硫酸−グルクロン酸−５−エピメラーゼを表す。
【図４】図４は、スルホ基のドナーとしてΔ２−Δ５／ｐＳＴ１Ａ１株およびｐＮＰＳの粗細胞ライセートを用いてＰＡＰをスルフリル化した際の、反応混合物中のｐＮＰの蓄積の速度曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
１．細菌
本明細書に記載の方法において使用できる細菌は、少なくとも、スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を産生するように改変されている、腸内細菌科に属する細菌でありうる。ヘパロサンＮ−硫酸−グルクロン酸−５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質、および／または、３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を産生するように、細菌をさらに改変してもよい。また、本明細書に記載の方法において使用できる細菌は、ａｐｈＡ遺伝子、ｃｙｓＱ遺伝子、もしくはｃｐｄＢ遺伝子、またはこれらの組み合わせの発現を減弱させるように改変されている。
【００３３】
本明細書に記載の方法において、腸内細菌科に属する細菌は、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、モーガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）属、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属、フォトラブダス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）属、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属などに由来することができ、この細菌は、少なくとも、スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を産生することができ、また、ａｐｈＡ遺伝子、ｃｙｓＱ遺伝子、もしくはｃｐｄＢ遺伝子、またはこれらの組み合わせの発現を減弱させることができるように改変されていればよい。具体的には、ＮＣＢＩデータベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｔａｘｏｎｏｍｙ／Ｂｒｏｗｓｅｒ／ｗｗｗｔａｘ．ｃｇｉ？ｉｄ＝５４３）において用いられている分類法により腸内細菌科に分類されている細菌を用いることができる。改変されうる腸内細菌科の菌株の例として、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属の細菌が挙げられる。
【００３４】
本開示の主題によって、エシェリヒア属細菌を得るように改変されうるエシェリヒア属細菌の菌株は、特に制限されないが、具体的には、Ｎｅｉｄｈａｒｄｔらの著書（Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｂ．Ｊ．，Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｓｏｍｅ  ｍｕｔａｎｔ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２，ｐ．２４６０−２４８８．Ｉｎ  Ｆ．Ｃ．  Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら（編），Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ：ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ（第２版）．ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９９６）に記載されたものを使用できる。特に、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：Ｅ．ｃｏｌｉ）が、一例として挙げられる。大腸菌の具体例として、大腸菌Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ２７３２５）や大腸菌ＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ４７０７６）などが挙げられ、これらは、大腸菌Ｋ−１２株など原型野生型株から派生したものである。これらの菌株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、住所：Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １５４９，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１０８，米国）より入手可能である。すなわち、各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して菌株を発注することができる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／参照）。各菌株の登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。
【００３５】
エンテロバクター属細菌としては、例えば、エンテロバクター・アグロメランス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）やエンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）などが挙げられる。パントエア属細菌としては、例えば、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｎａｎａｔｉｓ：Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ）などが挙げられる。エンテロバクター・アグロメランスの菌株の幾つかの種は、近年、１６Ｓ  ｒＲＮＡのヌクレオチド配列分析などに基づき、パントエア・アグロメランス、パントエア・アナナティス、またはパントエア・ステワルティイ（Ｐａｎｔｏｅａ  ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）に再分類された。エンテロバクター属またはパントエア属のいずれかに属する細菌は、その細菌が腸内細菌科に分類される細菌である限り、使用してもよい。Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ菌株を遺伝子工学技術によって繁殖させる場合、Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ  ＡＪ１３３５５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６１４）、ＡＪ１３３５６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６１５）、ＡＪ１３６０１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２０７）、およびこれらの誘導体を用いることができる。これらの菌株を分離してエンテロバクター・アグロメランスであると同定し、エンテロバクター・アグロメランスとして蓄積させた。しかし、上記菌株は、上述したように、近年、１６Ｓ  ｒＲＮＡのヌクレオチド配列決定などに基づき、Ｐ．アナナティスとして再分類された。
【００３６】
本明細書に記載の方法において使用できる細菌は、所望の活性を有するタンパク質の活性を決定することができる細菌を意味する。例えば、スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を産生するように改変することができる細菌とは、スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質の活性を決定することができる細菌でありうる。本明細書において、「スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を産生するように改変されうる細菌」に関する説明は、本明細書に記載の方法において使用できるいずれの細菌、特に、所望の活性を有するタンパク質を産生するように改変されうる細菌、例えば、「ヘパロサンＮ−硫酸−グルクロン酸−５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を産生するように改変されうる細菌」および「３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を産生するように改変されうる細菌」などにも準用できる。
【００３７】
「スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質」とは、硫酸化またはスルホン化と称することもできるスルフリル化と称されるプロセスにおいて、ドナー分子（スルホ基のドナーとも称する）から、アルコール、アミン、またはアミノアルコールなどの基質へとスルホ基（−ＳＯ３Ｈ）の転移反応を触媒するタンパク質を意味する（ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ（ＥＣ）  ｎｕｍｂｅｒ：２．８．２．−；Ｃｈａｐｍａｎ  Ｅ．ら，Ｓｕｌｆｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｕｔｉｌｉｔｙ；Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，２００４，４３（２７）：３５２６−３５４８）。スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質はスルホトランスフェラーゼ（略して「ＳＴ」）と称することができる。本明細書に記載の方法において使用できるスルホトランスフェラーゼは、以下に記載するようにＯ−スルホトランスフェラーゼまたはＮ−スルホトランスフェラーゼであってもよいので、「スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質」とは、「Ｏ−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質」、および「Ｎ−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質」という意味を含む。したがって、「Ｏ−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質」とは、Ｏ−スルフリル化プロセスにおいて、ドナー分子から、アルコールまたはアミノアルコールなどである基質へのスルホ基の転移反応を触媒するタンパク質を意味し、「Ｎ−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質」とは、Ｎ−スルフリル化プロセスにおいて、ドナー分子から、アミンまたはアミノアルコールなどである基質へのスルホ基の転移反応を触媒するタンパク質を意味する。プロセスに関して、Ｏ−スルフリル化およびＮ−スルフリル化を、スルフリル化プロセスと総称することができる。
【００３８】
基質のヒドロキシ基をスルフリル化して、その硫酸化誘導体を生成することができるスルホトランスフェラーゼを、Ｏ−スルホトランスフェラーゼ（略して、「Ｏ−ＳＴ」または「ＯＳＴ」）と総称することができる。具体的には、Ｏ−スルホトランスフェラーゼは、基質のヒドロキシ基（−ＯＨ）へのスルホ基の転移反応を触媒する酵素であり、化学式Ｒ−ＯＳＯ３ＨまたはＲ−ＯＳＯ３−で表され、硫酸塩とも称される、その硫酸化誘導体を生成することができる酵素である。上記化学式中、「Ｒ」は、例えば、当業者に周知の有機基などの化学基を意味しうる。基質のアミノ基をスルフリル化して、その硫酸化誘導体を生成することができるスルホトランスフェラーゼを、Ｎ−スルホトランスフェラーゼ（略して、「Ｎ−ＳＴ」または「ＮＳＴ」）と総称することができる。具体的には、Ｎ−スルホトランスフェラーゼは、スルホ基を基質の第１級および／または第２級アミノ基（−ＮＨ２、−ＮＨＲ’）へと転移させる反応を触媒して、化学式Ｒ−ＮＨ−ＳＯ３ＨもしくはＲ−ＮＨ−ＳＯ３−、および／またはＲ−ＮＲ’−ＳＯ３ＨもしくはＲ−ＮＲ’−ＳＯ３−で表され、スルファミン酸塩とも称される、その硫酸化誘導体を生成することができる酵素である。上記化学式中、ＲおよびＲ’は、化学基Ｒを意味し、同じまたは異なる種類の化学基であってもよい。
【００３９】
様々な種類のＯＳＴおよびＮＳＴが知られており、これらの例として、限定はされないが、アリールスルホトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．２．１）、アルコールスルホトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．２．２）、アミンスルホトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．２．３）、ヘパラン硫酸−グルコサミン  Ｎ−スルホトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．２．８、略して「Ｎ−ＨＳＳＴ」）、コンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．２．１７）、ケラタンスルホトランスフェラーゼ（２．８．２．２１）、ヘパラン硫酸−グルコサミン３−スルホトランスフェラーゼアイソフォーム１、２、および３（それぞれ、ＥＣ２．８．２．２３、２．８．２．２９、および２．８．２．３０。略して「３−ＯＳＴ−１」、「３−ＯＳＴ−２」、および「３−ＯＳＴ−３」）などが挙げられ、これらは、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｅｎｚｙｍｅ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ＥＣ／２．８．２．−）において分類されている。
【００４０】
例えば、ヒトを含む哺乳動物、魚類、昆虫類、蠕虫類などの様々な生物に固有のスルホトランスフェラーゼが知られており、これらを、本明細書に記載の方法において用いてもよい。ＯＳＴの具体例として、限定はされないが、ヘパラン硫酸２−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ（ＨＳ  ２−ＯＳＴ）、ヘパラン硫酸３−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ（ＨＳ  ３−ＯＳＴ）、およびヘパラン硫酸６−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ（ＨＳ  ３−ＯＳＴ）が挙げられ、これらは、それぞれ、ヘパランＮ−硫酸塩中の、ヘキスロン酸残基（特に、Ｌ−イズロン酸（ＩｄｏＡ）残基）のＣ２位に、ならびに、Ｎ−スルホグルコサミン（ＧｌｃＮＳ）残基のＣ３位およびＣ６位に位置するヒドロキシ基をＯ−スルフリル化（または、Ｏ−硫酸化、Ｏ−スルホン化）することができる。
【００４１】
例えば、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベース、エントリ番号Ｑ７ＬＧＡ３）、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、エントリ番号Ｑ８Ｒ３Ｈ７）、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ、エントリ番号Ｑ７６ＫＢ１）、カエル（例えば、ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）、エントリ番号Ｏ９３３３６）、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ、エントリ番号Ａ１Ｌ１Ｐ８）、回虫（例えば、擬旋毛虫（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｐｓｅｕｄｏｓｐｉｒａｌｉｓ）、エントリ番号Ａ０Ａ０Ｖ１ＪＬＤ７）、および昆虫（例えば、メクラカメムシ（Ｌｙｇｕｓ  ｈｅｓｐｅｒｕｓ）、エントリ番号Ａ０Ａ１４６ＬＵ８６）などに固有のＨＳ  ２−ＯＳＴを用いることができる。
【００４２】
他の例において、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベース、エントリ番号Ｑ９Ｙ６６３）、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、エントリ番号Ｏ３５３１０）、ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、エントリ番号Ｑ８０Ｗ６６）、ミバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、エントリ番号Ｑ９ＶＷＪ７）、ヒドラ（Ｈｙｄｒａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ，Ｈｙｄｒａ  ａｔｔｅｎｕａｔａ、エントリ番号Ｔ２ＭＪ１９）、および線虫（例えばＴｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｍｕｒｒｅｌｌｉ、エントリ番号Ａ０Ａ０Ｖ０ＵＤＥ４）などに固有のＨＳ  ３−ＯＳＴを用いることができる。
【００４３】
他の例において、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベース、エントリ番号Ｏ６０２４３）、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、エントリ番号Ｑ９ＱＹＫ５）、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ、エントリ番号Ｑ７６ＫＢ２）、ウシ（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ、エントリ番号１ＢＮＷ３）、サル（例えば、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）、エントリ番号Ｆ７ＤＰ４２）、コウモリ（Ｍｙｏｔｉｓ  ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ、エントリ番号Ｇ１ＰＹ３３）、ミバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｐｅｒｓｉｍｉｌｉｓ、エントリ番号Ｂ４ＧＬ９０）、および線虫（例えばＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｂｒｉｇｇｓａｅ、エントリ番号Ａ８ＸＫＤ５）などに固有のＨＳ  ６−ＯＳＴを用いることができる。
【００４４】
ＮＳＴの具体例として、限定はされないが、アミンスルホトランスフェラーゼおよびアリールアミンスルホトランスフェラーゼが挙げられ、これらは、例えばアニリン、フェニルアミン、ベンゼンアミン、アリールアミン、２−ナフチルアミンなど、アミノ基含有基質の第１級および第２級アミノ基をＮ−スルフリル化（または、Ｎ−硫酸化、Ｎ−スルホン化）することができる。例えば、オオミジンコ（Ｄａｐｈｎｉａ  ｍａｇｎａ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベース、エントリ番号Ａ０Ａ０Ｐ５ＶＣ４３）やミバエ（例えば、ウリミバエ（Ｚｅｕｇｏｄａｃｕｓ  ｃｕｃｕｒｂｉｔａｅ）、エントリ番号Ａ０Ａ０Ａ１Ｘ０Ｕ６）などに固有のＮＳＴを用いることができ、これらは、Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ（ＫＥＧＧ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｄｂｇｅｔ−ｂｉｎ／ｗｗｗ＿ｂｇｅｔ？ｅｃ：２．８．２．３）などに記載されている。
【００４５】
Ｎ−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質は、その特性に加えて、Ｎ−脱アセチル活性を有しうることが知られている。したがって、特定の場合、Ｎ−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を、Ｎ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質と称することもでき、また、本明細書に記載の方法において使用できる。「Ｎ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質」とは、ヘパラン硫酸中のグリコサミノグリカンのグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基のＮ−脱アセチル化およびＮ−硫酸化反応を触媒するタンパク質を意味しうる（ヘパラン硫酸Ｎ−デアセチラーゼは、ＥＣ３．−．−．−、ヘパラン硫酸Ｎ−スルホトランスフェラーゼはＥＣ２．８．２．−）。Ｎ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を、二官能性のＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ（略して「ＮＤＳＴ」）と称することができる。
【００４６】
ＮＤＳＴの具体例として、限定はされないが、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベース、エントリ番号Ｐ５２８４８）、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、エントリ番号Ｑ３ＵＨＮ９）、ブタ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ、エントリ番号Ｆ６ＸＹ５０）、ヒツジ（Ｏｖｉｓ  ａｒｉｅｓ、エントリ番号ＵＰＩ０００７２Ｆ９６６５）、ウマ（Ｅｑｕｕｓ  ｃａｂａｌｌｕｓ、エントリ番号Ｆ６ＳＨＱ３）、および、トリ（例えば、ジャノメドリ（Ｅｕｒｙｐｙｇａ  ｈｅｌｉａｓ）、エントリ番号ＵＰＩ０００５２８８Ｃ４Ａ）などに固有のＮＤＳＴが挙げられ、これらのタンパク質は、本明細書に記載の方法において用いることができる。
【００４７】
［３５Ｓ］３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸を用いる放射性同位体技術およびシンチレーションカウンティング（Ｈａｂｕｃｈｉ  Ｈ．ら，Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｐｈａｔｅ  ｗｉｔｈ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ：ｔｗｏ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ  ｓｐｌｉｃｅｄ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｐｈａｔｅ  ６−Ｏ−ｓｕｌｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−２  ｈａｖｉｎｇ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２００３，３７１（Ｐｔ  １）：１３１−１４２）、または、アリールスルホトランスフェラーゼとスルホ基のドナーとしてのｐ−ニトロフェニル硫酸（ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｓｕｌｆａｔｅ。略して「ｐＮＰＳ」）とを用いる共役二酵素比色分析（Ｓｔｅｒｎｅｒ  Ｅ．ら，Ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ａｎｄ  ｈｅｐａｒｉｎ  Ｏ−ｓｕｌｆｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１４，４０６（２）：５２５−５３６）によって、スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質の活性を決定することができる。タンパク濃度は、標準としてのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびクーマシー染料を用いる、ブラッドフォードタンパク質分析またはローリー法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｍ．Ｍ．，  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９７６，７２：２４８−２５４；Ｌｏｗｒｙ  Ｏ．Ｈ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９５１，１９３：２６５−２７５）によって決定することができる。
【００４８】
本明細書に記載の方法において使用できる基質は、ＯＳＴもしくはＮＳＴ、またはこれらの組み合わせを用いて、基質をスルフリル化して、基質の硫酸化誘導体を生成することができる限り、少なくとも１つのヒドロキシ基、少なくとも１つのアミノ基、またはこれらの組み合わせを有する任意の基質（すなわち、任意の分子）でありうる。また、基質は、ＮＤＳＴを用いて基質をスルフリル化することができる限り、単独で、または１つ以上のヒドロキシ基および／もしくは１つ以上のアミノ基に加えて、Ｎアセチル化されている少なくとも１つのアミノ基を有していてもよい。基質は、限定はされないが、例えば、２００４年のＣｈａｐｍａｎ  Ｅ．らの著書に記載のものでもよく、その例として、４−ニトロフェノール（ｐ−ニトロフェノール、略して「ｐＮＰ」としても知られている）などのフェノール、カテコールアミン、アリールヒドロキシルアミン、ヒドロキシステロイド、ドーパミン、チラミン、ミノキシディル、プレグネノロン、デヒドロエピアンドロステロン（略して「ＤＨＥＡ」）、ヘパロサンなどの少糖類、ならびに、Ｎ−アセチル化グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を有するヘパラン硫酸、ヘパラン硫酸グリコサミノグリカン（略して「ＨＳＧＡＧ」）、Ｎ−硫酸化ヘパロサン（略して「ＮＳ−ヘパロサン」）、および硫酸ケラタンなどのヘパロサンの硫酸化誘導体などが挙げられる。ヘパロサンは、基質の特定の例であり、その製造方法が知られている（例えば、米国特許出願公開第２０１６２０１１０３号参照）。
【００４９】
スルホトランスフェラーゼのスルホトランスフェラーゼ活性を決定することができるようにスルホ基をスルホトランスフェラーゼに供与できる分子であれば、いずれの分子も、本明細書に記載の方法において用いることができるスルホ基ドナーとして使用することができる。実際には、Ｏ−スルホトランスフェラーゼ、Ｎ−スルホトランスフェラーゼ、および／またはＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼにスルホ基を供与することができ、その結果、上記スルホトランスフェラーゼがスルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質となりうるような、任意の分子を用いることができる。例えば、３’−ホスホ−５’−アデニリル硫酸としても知られる、３’−ホスホアデノシン５’−ホスホ硫酸（ＰＡＰＳ、ＰｕｂＣｈｅｍ  ＣＩＤ：１０２１４）、または、その塩、例えば、ナトリウム塩もしくはリチウム塩などがスルホ基のドナーとして機能しうる（例えば、Ｓｃｈｅｍｅ  １  ｉｎ  Ｃｈａｐｍａｎ  Ｅ．ら，２００４参照）。ＰＡＰＳは、外因的に使用してもよい、つまり、本明細書に記載の方法において使用できる細菌を含む培地に、ＰＡＰＳを添加してもよく、かつ／または、ＰＡＰＳを、スルホトランスフェラーゼに固有に結合している内因性の形態で使用してもよい。その理由は、生物において、後に、スルホトランスフェラーゼによって補充され、かつ、補因子としてスルホトランスフェラーゼに結合するＰＡＰＳの形成を触媒する酵素（ＡＴＰスルフリラーゼおよびアデノシン５’−ホスホ硫酸キナーゼ）が存在することが知られているからである。ＰＡＰＳは、高価かつ不安定な化学化合物であるため、生物によって内因的に合成されてスルホトランスフェラーゼに固有に結合するＰＡＰＳを使用することが好ましい。この場合、スルフリル化が生じる培地においてＰＡＰＳを再生または再生利用するためのシステムが開発された（例えば、Ｆｉｇ．１  ｉｎ  Ｓｔｅｒｎｅｒ  Ｅ．ら，２０１４；Ｇｒｅｇｏｒｙ  Ｊ．Ｄ．ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎｎ  Ｆ．，Ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｓｕｌｆａｔｅ  ａｍｏｎｇ  ｐｈｅｎｏｌｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｗｉｔｈ  ３’，５’−ｄｉｐｈｏｓｐｈｏａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ａｓ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９５７，２２９（２）：１０８１−１０９０参照）。上記システムにおいて、スルホトランスフェラーゼは、ＰＡＰＳを３’−ホスホアデノシン−５’−リン酸（略して「ＰＡＰ」）に変換し、基質をスルフリル化する。その後、ＰＡＰ用のスルホ基ドナーとしてｐ−ニトロフェニル硫酸（ｐＮＰＳ）を利用することができる、３’−ホスホアデノシン５’−ホスホ硫酸−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を用いて、ＰＡＰをＰＡＰＳへと再生利用する。
【００５０】
「ヘパロサン−Ｎ−硫酸−グルクロン酸−５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質」とは、Ｎ−硫酸化ヘパロサンにおいてＮ−硫酸糖残基に隣接するＤ−グルクロン酸（ＧｌｃＡ）残基をイズロン酸（ＩｄｏＡ）残基へ変換する反応を触媒するタンパク質を意味しうる（ＥＣ５．１．３．１７；Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ  Ｈ．ら，Ｈｅｐａｒｏｓａｎ−ｇｌｕｃｕｒｏｎａｔｅ  ５−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｅｎｚｙｍｅ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１５，２５（７）：７３５−７４４）。ヘパロサン−Ｎ−硫酸−グルクロン酸−５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質の活性は、基質として［５−３Ｈ］ヘパロサンを用いる放射性同位体技術によって決定することができる（Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ  Ｈ．ら。２０１５年）。
【００５１】
ヘパロサン−Ｎ−硫酸−グルクロン酸−５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質は、ヘパロサン−Ｎ−硫酸−グルクロン酸−５−エピメラーゼ（ＨＮＳＧ−５ｅｐｉ）と称することができる。ＨＮＳＧ−５ｅｐｉの具体例として、限定はされないが、例えば、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベース、エントリ番号Ｏ９４９２３）、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、エントリ番号Ｑ９ＥＰＳ３）、ウシ（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ、エントリ番号Ｏ１８７５６）、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ、エントリ番号Ｑ６ＴＳ３３）、ハムスター（例えばＣｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ、エントリ番号Ａ０Ａ０６１Ｉ８Ｒ４）、ヒツジ（Ｏｖｉｓ  ａｒｉｅｓ、エントリ番号Ｗ５ＱＢ７９）、および、ゾウ（例えばＬｏｘｏｄｏｎｔａ  ａｆｒｉｃａｎａ、エントリ番号Ｇ３Ｔ４Ｘ０）などに固有のＨＮＳＧ−５ｅｐｉが挙げられ、これらのタンパク質を、本明細書に記載の方法において使用できる。
【００５２】
再生ＰＡＰＳ用システムにおいてスルホ基のドナーとしてｐＮＰＳを使用することができるため、本明細書に記載の方法において使用することができるような活性を有するタンパク質に関連して、「３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質」とは、広義において、Ｏ−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質（ＥＣ２．８．２．−）の一例である、アリールスルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質（ＥＣ２．８．２．１）を意味する。したがって、Ｏ−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質についての本明細書の説明は、アリールスルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質に準用でき、ひいては、３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質に準用できることは、当業者には明らかであろう。次に、スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質の活性を判定するために用いることができる方法を用いて、３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質の活性を判定できることは明らかであり、これらの方法として、例えば、基質としてのＰＡＰとスルホ基のドナーとしてのｐＮＰＳを使用する方法（Ｓｔｅｒｎｅｒ  Ｅ．ら。２０１４年）が挙げられる。
【００５３】
３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質は、３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸−スルホトランスフェラーゼ（略して「ＰＡＰＳ  ＳＴ」）と称することができ、広義において、アリールスルホトランスフェラーゼを意味しうる。再生ＰＡＰＳに使用することができるアリールスルホトランスフェラーゼの具体例として、限定はされないが、例えば、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、ＳＴ１Ａ３、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベース、エントリ番号Ｐ０ＤＭＭ９、ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、ＳＴ１Ａ１、エントリ番号Ｐ１７９８８、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）遺伝子エントリ番号ＮＰ＿１１４０２２．１）、および、マウス（ｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、ＳＴ１Ａ１、エントリ番号Ｐ５２８４０）などに固有のアリールスルホトランスフェラーゼが挙げられる。
【００５４】
ＯＳＴ、ＮＳＴ、ＮＤＳＴ、ＨＮＳＧ−５ｅｐｉ、およびＰＡＰＳ  ＳＴはそれぞれ、異なるタンパク質アイソフォームに存在し、これは、ＯＳＴ、ＮＳＴ、ＮＤＳＴ、ＨＮＳＧ−５ｅｐｉ、およびＰＡＰＳ  ＳＴをコードする遺伝子の選択的スプライシングの結果であることが知られている。本明細書に記載の方法により所望の活性を有するタンパク質である限り、これらのタンパク質アイソフォームも、本明細書に記載の方法において使用してもよい。
【００５５】
細菌もしくは哺乳類など特定の種に固有のタンパク質または核酸に関する「〜に固有の」という表現は、その種に固有のタンパク質または核酸を意味しうる。つまり、特定の種に固有のタンパク質または核酸は、それぞれ、その種に天然に存在し、当業者に既知の手段を用いて、その種から分離し、配列することができるタンパク質または核酸を意味しうる。さらに、タンパク質または核酸が存在する種から分離されたタンパク質または核酸のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を、容易に決定することができるので、例えば組換えＤＮＡ技術などの遺伝子工学技術や化学合成法などを用いて得ることができるタンパク質または核酸であっても、そのようにして得られたタンパク質のアミノ酸配列または核酸のヌクレオチド配列が、その種に天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列または核酸のヌクレオチド配列と同一であるという限り、タンパク質または核酸に関する「〜に固有の」という表現は、上記タンパク質または核酸を意味しうる。特定の種に固有のアミノ酸配列の例として、限定はされないが、タンパク質、具体的には酵素を含む、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドなどが挙げられる。特定の種に固有のヌクレオチド配列の例として、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）が挙げられ、これらは、プロモーター、アテニュエーター、ターミネーターなどを含む制御配列、遺伝子、遺伝子間配列、配列コード化シグナルペプチド、タンパク質のプロ部分、人工アミノ酸配列などに限定されない。様々な種に固有の、アミノ酸配列およびヌクレオチド配列ならびにそれらのホモログの例を本明細書に記載する。これらの例として、限定はされないが、尾長の小型ハムスター（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｌｏｎｇｉｃａｕｄａｔｕｓ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ、アクセッション番号Ｏ０８８９．１）に固有であり、対応するｍＲＮＡ（ＧｅｎｅＢａｎｋ、アクセッション番号Ｄ８８８１１．１）によってコードされるヘパラン硫酸２−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ（ＨＳ  ２−ＯＳＴ）、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ、ＮＣＢＩ参照配列、アクセッション番号ＮＰ＿９９８０１４．１）に固有であり、対応するｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ参照配列、アクセッション番号ＮＭ＿２１２８４９．１）によってコードされるヘパロサンＮ−硫酸−グルクロン酸−５−エピメラーゼ（ＨＮＳＧ−５ｅｐｉ）、およびラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、ＮＣＢＩ参照配列、アクセッション番号ＮＰ＿１１４０２２．１）に固有であり、対応するｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ参照配列、アクセッション番号ＮＭ＿０３１８３４．１）によってコードされるアミノ酸を有するアリールスルホトランスフェラーゼ１Ａ１が挙げられる。
【００５６】
スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質で細菌を改変する方法であって、細菌が本明細書に記載の方法で使用することができる方法と関連して、そのタンパク質に対して以下に示す説明は、所望の活性を有し、かつ、上記方法において使用できるいずれのタンパク質にも準用できる。所望の活性を有するタンパク質の例として、限定はしないが、ヘパロサン−Ｎ−硫酸−グルクロン酸−５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質、および３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質などが挙げられ、これは、上記細菌が、本明細書に記載の特性以外の他の特性を有しうるからである。
【００５７】
本明細書に記載の方法において使用できる細菌は、スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を産生するように改変されている。タンパク質は遺伝子によってコードされるので、スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を発現するように細菌を改変できることは、当業者にとって明らかである。
【００５８】
「スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を発現するように改変された細菌」とは、細菌（宿主菌と称する）が、スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含むように、スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を固有または天然には有していない細菌が改変されていることを意味しうる。なお、上記遺伝子は、宿主菌（ドナー生物と称する）とは異なる生物に固有に、または天然に存在している、またはその生物に固有である。ドナー生物に固有で、かつ、宿主菌へ導入される遺伝子を、宿主菌に照らして異種遺伝子と称することができ、その宿主菌に対しては、上記遺伝子は固有でもなく、天然のものでもない。
【００５９】
「スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を発現するように改変された細菌」もまた、スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が導入された宿主菌であって、そのような改変の結果として、スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を産生することができるようになった宿主菌を意味しうる。
【００６０】
スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を産生するように改変されている細菌は、スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を導入することによって得ることができる。受容菌に組換えＤＮＡを導入する方法は、すでに報告されて、当業者に周知の従来の方法であってもよい。そのような方法として、例えば、形質転換、形質移入、感染、接合、および動員が挙げられる。スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含有する組換えＤＮＡを用いて、細菌を形質転換、形質移入、感染、接合、または動員することによって、遺伝子を発現し、遺伝子によってコードされたタンパク質を合成する能力を細菌に付与することができる。例えば、ＤＮＡへの大腸菌Ｋ１２の細胞の浸透性が増加するように塩化カルシウムで受容細胞を処理する方法が、効率的なＤＮＡ形質転換および形質移入のために報告されている（Ｍａｎｄｅｌ  Ｍ．およびＨｉｇａ  Ａ．，Ｃａｌｃｉｕｍ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ＤＮＡ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９７０，５３：１５９−１６２）。特殊化および／または一般化された形質導入の方法について記載されている（Ｍｏｒｓｅ  Ｍ．Ｌ．ら，Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９５６，４１（１）：１４２−１５６；Ｍｉｌｌｅｒ  Ｊ．Ｈ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９７２）。受容生物のゲノムへＤＮＡをランダムおよび／またはターゲット組み込みする他の方法、例えば、「Ｍｕ駆動組込み／増幅」（例えば、Ａｋｈｖｅｒｄｙａｎ  Ｖ．Ｚ．ら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１１，９１：８５７−８７１参照）、「Ｒｅｄ／ＥＴ駆動組込み」または「Ｒｅｄ／ＥＴ媒介組込み」（Ｄａｔｓｅｎｋｏ  Ｋ．Ａ．およびＷａｎｎｅｒ  Ｂ．Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０００，９７（１２）：６６４０−６６４５；Ｚｈａｎｇ  Ｙ．，ら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，１９９８，２０：１２３−１２８）を適用することもでき、さらに、Ｍｕ駆動複製性転移に加えて所望の遺伝子を多重挿入するため（Ａｋｈｖｅｒｄｙａｎ  Ｖ．Ｚ．ら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１１，９１：８５７−８７１）、また、結果として所望の遺伝子を増幅させるｒｅｃＡ−依存の相同組換えに基づいて化学誘発して染色体を進化させるため（Ｔｙｏ  Ｋ．Ｅ．Ｊ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００９，２７：７６０−７６５）、転移、部位特異的および／または相同Ｒｅｄ／ＥＴ媒介組換え、ならびに／またはＰ１媒介一般化形質導入の様々な組み合わせを使用する他の方法（例えば、Ｍｉｎａｅｖａ  Ｎ．Ｉ．ら，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００８，８：６３；Ｋｏｍａ  Ｄ．ら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１２，９３（２）：８１５−８２９参照）を用いることができる。
【００６１】
宿主菌における遺伝子の発現は、使用頻度が中程度または高い同義コドンをレアコドン（宿主菌に関して、いわゆる使用頻度が低いコドン）で置換することによって向上することができる。このとき、コドンの使用頻度は、宿主菌の１つの細胞における単位時間当たりのコドンの翻訳頻度、または、宿主菌の、配列されたタンパク質をコードするリーディングフレームの平均コドン頻度として定義される（Ｚｈａｎｇ  Ｓ．Ｐ．ら，Ｌｏｗ−ｕｓａｇｅ  ｃｏｄｏｎｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，ｙｅａｓｔ，ｆｒｕｉｔ  ｆｌｙ  ａｎｄ  ｐｒｉｍａｔｅｓ，Ｇｅｎｅ，１９９１，１０５（１）：６１−７２）。生物当たりのコドン使用頻度は、コドン利用データベースで見つけることができる。なお、コドン利用データベースは、ＣＵＴＧの拡張ウェブ版である（Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｔａｂｕｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ＧｅｎＢａｎｋ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／；  Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｙ．ら，Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｔａｂｕｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｙｅａｒ  ２０００，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０００，２８（１）：２９２）。大腸菌における、そのような変異として、限定はされないが、例えば、ＣＧＴまたはＣＧＣを、レアＡｒｇコドンであるＡＧＡ、ＡＧＧ，ＣＧＧ、ＣＧＡで置換すること、ＡＴＣまたはＡＴＴを、レアＩｌｅコドンであるＡＴＡで置換すること、ＣＴＧ、ＣＴＣ、ＣＴＴ、ＴＴＡ、またはＴＴＧを、レアＬｅｕコドンであるＣＴＡで置換すること、ＣＣＧまたはＣＣＡを、レアＰｒｏコドンであるＣＣＣで置換すること、ＴＣＴ、ＴＣＡ、ＴＣＣ、ＡＧＣ、またはＡＧＴを、レアＳｅｒコドンであるＴＣＧで置換すること、および、ＧＧＴまたはＧＧＣを、レアＧｌｙコドンであるＧＧＡ、ＧＧＧで置換することなどが挙げられる。使用頻度の高い同義コドンを使用頻度の低いコドンで置換することが好ましい。中程度または高い使用頻度の同義コドンを、レアコドンおよび／または低使用頻度コドンで置換することを、レアコドンを認識する転移ＲＮＡをコードする遺伝子の共発現と組み合わせて行ってもよい。例えば、目的の変異をＤＮＡの目的位置へ導入する部位特異的変異法を用いて、コドンを置換することができる。部位特異的変異法の例として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用する方法（Ｈｉｇｕｃｈｉ  Ｒ．，Ｕｓｉｎｇ  ＰＣＲ  ｔｏ  ｅｎｇｉｎｅｅｒ  ＤＮＡ，６１−７０．Ｉｎ：ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｅｒｌｉｃｈ  Ｈ．Ａ．（編），Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９８７，１５４：３８２−４０３）、およびファージを利用する方法（Ｋｒａｍｅｒ  Ｗ．およびＦｒｉｔｓ  Ｈ．Ｊ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９８７，１５４：３５０−３６７；Ｋｕｎｋｅｌ  Ｔ．Ａ．ら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９８７，１５４：３６７−３８２）が挙げられる。
【００６２】
遺伝子を宿主菌に導入する場合、改変された細菌において遺伝子が発現するように、遺伝子がその細菌によって保持されればよい。具体的には、宿主菌において機能するプロモーター配列（プロモーターとも称する）の制御下で遺伝子が発現するように遺伝子導入すれよい。プロモーターは、宿主菌に固有のプロモーターであっても、ドナー生物またはさらには別の生物に固有の異種プロモーターであってもよい。プロモーターは、導入される遺伝子に固有のプロモーターであってもよく、または、別の遺伝子のプロモーターであってもよい。プロモーターとして、例えば、本明細書に記載の強力なプロモーターを使用してもよい。
【００６３】
遺伝子転写終止用ターミネーター配列（ターミネーターとも称する）を、遺伝子の下流に配置してもよい。ターミネーターが宿主菌において機能する限り、ターミネーターは特に限定されない。ターミネーターは、宿主菌に固有のターミネーターであっても、ドナー生物またはさらには別の生物に固有の異種ターミネーターであってもよい。ターミネーターは、導入される遺伝子に固有のターミネーターであっても、または、別の遺伝子のターミネーターであってもよい。
【００６４】
さらに、２つ以上の遺伝子のコピーを導入する場合、改変された細菌において各遺伝子が発現することができるように、遺伝子がその細菌によって保持されればよい。例えば、導入されるすべての遺伝子が、単一の発現ベクターに存在してもよく、染色体に存在してもよい。または、遺伝子は、２つ以上の発現ベクターに存在してもよく、または、１つ以上の発現ベクターと染色体とに別個に存在してもよい。遺伝子が、異なる核酸分子に存在するか、または単独核酸分子に存在する場合、導入されるすべての遺伝子が発現できるように上記遺伝子が核酸分子に存在してもよい。実際、細菌において遺伝子が発現できる限り、宿主菌へ遺伝子を導入するいずれの方法をも選択することができる。「発現できる」とは、鋳型としてのＤＮＡに相補的なＲＮＡを合成できるようにＤＮＡからの転写が生じる場合のことを意味しうる。また、「発現できる」とは、鋳型としてのＤＮＡに相補的なＲＮＡを合成できるようにＤＮＡからの転写が生じる場合や、ＲＮＡからの翻訳が生じ、その結果、タンパク質の活性を決定することができるように、例えば、所望の活性を有するタンパク質などのペプチドを産生することができる場合をも意味しうる。
【００６５】
様々な微生物に固有のベクター、プロモーター、およびターミネーターは、「微生物学基礎講座第８巻遺伝子工学」（共立出版、１９８７年）に詳細に開示されており、これらを用いることができる。
【００６６】
細菌において機能する強力なプロモーターの制御下で遺伝子が発現するように、遺伝子を宿主菌に導入することが好ましく、上記プロモーターは、遺伝子に固有のプロモーターまたは宿主菌に固有のプロモーターよりも強力である。腸内細菌科に属する細菌において高レベルで遺伝子を発現させる強力なプロモーターを使用できる。腸内細菌科の細菌において使用できる強力なプロモーターとしては、例えば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ならびにλファージのＰＲおよびＰＬプロモーターが挙げられる。また、強力なプロモーターとして、各種レポーター遺伝子を用いることで高活性型の在来のプロモーターを得てもよい。例えば、プロモーター領域内の−３５、−１０領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開第００／１８９３５号）。高活性型プロモーターとしては、例えば、各種のｔａｃ様プロモーター（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ  Ｊ．Ｉ．ら。ロシア特許出願番号２００６１３４５７４Ａ）が挙げられる。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  Ｍ．Ａ．およびＤｏｉ  Ｒ．Ｈ．の論文（Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ｉｎ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．，１９９５，１：１０５−１２８）などに記載されている。
【００６７】
遺伝子の転写効率をさらに向上してもよい。これは、例えば、遺伝子のプロモーター領域に変異を導入して、より強力なプロモーター機能を獲得し、その結果、プロモーターの下流に配置される遺伝子の転写レベルが向上することによって達成できる。さらに、シャインダルガノ（ＳＤ）配列、ならびに／またはＳＤ配列と開始コドンの間のスペーサー領域、ならびに／または、リボソーム結合部位における開始コドンからすぐ上流および／もしくは下流の配列における数個のヌクレオチドの置換によって、ｍＲＮＡの翻訳効率に大きな影響が及ぼされることが知られている。例えば、開始コドンに先行する３つのヌクレオチドの特性に依存して、発現レベルの２０倍の範囲が見出された（Ｇｏｌｄ  Ｌ．ら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９８１，３５：３６５−４０３；Ｈｕｉ  Ａ．ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９８４，３：６２３−６２９）。
【００６８】
さらに、遺伝子の翻訳効率をさらに向上してもよい。これは、例えば、染色体上の遺伝子のためのリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を、より強力なＲＢＳで置換することによって、達成されうる。「より強力なＲＢＳ」とは、遺伝子の固有または野生型のＲＢＳと比較して、ｍＲＮＡの翻訳を改良するＲＢＳを意味する。より強力なＲＢＳの例として、ファージＴ７の遺伝子１０のＲＢＳを用いることができる（Ｏｌｉｎｓ  Ｐ．Ｏ．ら，Ｇｅｎｅ，１９８８，７３：２２７−２３５）。
【００６９】
ベクターとしては、宿主菌の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであるのが好ましく、また、ベクターは、所望の形質転換体を選択するために、抗生物質耐性遺伝子などのマーカー遺伝子を有することが好ましい。さらに、ベクターは、導入された遺伝子を発現するためのプロモーターおよび／またはターミネーターを有していてもよい。ベクターは、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミド、またはファージミドなどであってよい。腸内細菌科に属する細菌を形質転換するのに好適なベクターの例として、限定はされないが、例えば、ｐＭＷ１１８／１１９、ｐＢＲ３２２、およびｐＵＣ１９などの広宿主域プラスミドが挙げられる。例えば、相同組換えまたはＭｕドリブンインテグレーションなどを行うことで、細菌の染色体ＤＮＡへ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。相同組換えは、染色体ＤＮＡにおいて多数のコピーを有する配列を用いて行うことができる。染色体ＤＮＡにおいて多数のコピーを有する配列の例として、限定はされないが、例えば、反復ＤＮＡ配列、または転移因子の端部に存在する逆方向反復配列が挙げられる。さらに、遺伝子をトランスポゾンへ導入し、そして転写して染色体ＤＮＡへ遺伝子の多数のコピーを導入することが可能である。Ｍｕドリブンインテグレーションを用いることによって、遺伝子の３つ以上のコピーを、１つの作用中に、染色体ＤＮＡへ導入することができる（Ａｋｈｖｅｒｄｙａｎ  Ｖ．Ｚ．ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（Ｒｕｓｓｉａｎ），２００７，３：３−２０）。
【００７０】
導入される遺伝子の一部または全体のヌクレオチド配列の有無を確認することによって、遺伝子の導入を確認することができる。ヌクレオチド配列の存在は、例えば、ＰＣＲによって、判定することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．，ら：＜＜Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ＞＞，第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＵＳＡ（２００１））。導入される遺伝子の発現の有無を確認することによっても、遺伝子の導入を確認することができる。遺伝子の転写量の有無を確認するか、または遺伝子によってコードされたタンパク質の存在を確認することによって、遺伝子の発現の有無を確認することができる。遺伝子の転写量の有無は、遺伝子から転写されたｍＲＮＡの存在を確認することによって、確認することができる。ｍＲＮＡの存在を確認する方法として、例えば、ノーザンハイブリダイゼーションおよびＲＴ−ＰＣＲなどが挙げられる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．，ら：＜＜Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ＞＞，第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＵＳＡ（２００１））。タンパク質の存在は、例えば、抗体を用いてウェスタンブロットによって判定することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ら：＜＜Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ＞＞，第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＵＳＡ（２００１））。
【００７１】
遺伝子のコピー数やその有無は、例えば、染色体ＤＮＡを制限し、その後、遺伝子配列および蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）などに基づいてプローブを用いてサザンブロットすることで、測定することができる。遺伝子発現のレベルは、ノーザンブロットおよび定量ＲＴ−ＰＣＲなどの様々な周知の方法を使用して遺伝子から転写されたｍＲＮＡの量を測定することによって、判定することができる。遺伝子によってコードされたタンパク質の量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびそれに続く免疫ブロット分析（ウェスタンブロット分析）、またはタンパク質試料の質量分析などの既知の方法によって、測定することができる。
【００７２】
プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの消化、連結、および形質転換、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドの選択、ならびに変異の組み込みなど、ＤＮＡの組換え分子を用いた操作および分子クローニングの方法は、当業者に周知の通常の方法であってもよい。これらの方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ  Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、またはＧｒｅｅｎ  Ｍ．Ｒ．およびＳａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．Ｒ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，第４版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２０１２）；Ｂｅｒｎａｒｄ  Ｒ．Ｇｌｉｃｋ，Ｊａｃｋ  Ｊ．ＰａｓｔｅｒｎａｋおよびＣｈｅｒｙｌ  Ｌ．Ｐａｔｔｅｎ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ”，第４版，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ（２００９）に記載されている。
【００７３】
また、本明細書に記載の方法において使用することができる細菌を、ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．−）をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を減弱させるように改変することができる。なお、ホスファターゼの例は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｅｎｚｙｍｅ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ＥＣ／３．１．３．−）に列挙されている。上記方法によれば、ａｐｈＡ遺伝子、ｃｙｓＱ遺伝子、およびｃｐｄＢ遺伝子のうち１つ以上の発現を減弱させるように、細菌を改変することができる。一実施例では、ａｐｈＡ遺伝子の発現を減弱させるように細菌を改変することができる。ｃｙｓＱ遺伝子および／またはｃｐｄＢ遺伝子の発現を減弱させることができるように、ａｐｈＡ遺伝子を有する細菌であって、ａｐｈＡ遺伝子の発現が減弱している細菌を、さらに改変できる。別の実施例では、ｃｙｓＱ遺伝子の発現を減弱させるように細菌を改変することができる。ｃｙｓＱ遺伝子を有する細菌であって、ｃｙｓＱ遺伝子の発現が減弱している細菌を、ａｐｈＡ遺伝子および／またはｃｐｄＢ遺伝子の発現を減弱させるようにさらに改変できる。
【００７４】
ａｐｈＡ遺伝子の発現の減弱に関する下記の説明は、本明細書に記載の方法において使用できる細菌において発現が減弱しているいずれの遺伝子にも準用できる。そのような遺伝子して、限定はされないが、例えば、ｃｙｓＱ遺伝子およびｃｐｄＢ遺伝子が挙げられる。
【００７５】
「ａｐｈＡ遺伝子の発現を減弱させるように細菌が改変されている」とは、改変された細菌においてａｐｈＡ遺伝子の発現を減弱させるように細菌が改変されていることを意味しうる。例えば、ａｐｈＡ遺伝子の不活性化によって、ａｐｈＡ遺伝子の発現を減弱させることができる。
【００７６】
「ａｐｈＡ遺伝子が不活性化される」とは、野生型または未改変のａｐｈＡ遺伝子を保持する細菌と比較すると、改変された遺伝子が完全に不活性または無機能のタンパク質ＡｐｈＡをコードすることを意味しうる。また、遺伝子の一部欠失または遺伝子全体の欠失、遺伝子のヌクレオチド配列における１つ以上の塩基の置換による、遺伝子によりコードされたタンパク質中のアミノ酸置換（ミスセンス変異）の発生、終止コドンの導入（ナンセンス変異）、１〜２塩基の欠失による、遺伝子のリーディングフレームシフトの発生、薬剤耐性遺伝子および／または転写終止シグナルの挿入、または、プロモーター、エンハンサー、アテニュエーター、リボソーム結合部位などの配列制御遺伝子の発現を含む、遺伝子の隣接領域の改変などによって、改変ＤＮＡ領域がａｐｈＡ遺伝子を天然に発現することができないことは許容される。また、「Ｒｅｄ／ＥＴ駆動組込み」または「λＲｅｄ／ＥＴ媒介組込み」に基づいて、例えば、ＵＶ照射またはニトロソグアニジン（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）を用いる変異処理、部位特異的変異、相同組換えを用いる遺伝子破壊、および／または挿入−欠失突然変異など、従来の方法によって、遺伝子の不活性化を行うこともできる（Ｙｕ  Ｄ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０００，９７（１１）：５９７８−５９８３；Ｄａｔｓｅｎｋｏ  Ｋ．Ａ．およびＷａｎｎｅｒ  Ｂ．Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０００，９７（１２）：６６４０−６６４５；Ｚｈａｎｇ  Ｙ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，１９９８，２０：１２３−１２８）。
【００７７】
「ａｐｈＡ遺伝子の発現が減弱している」とは、プロモーター、エンハンサー、アテニュエーター、および転写終止シグナルなど、遺伝子の発現を制御する配列、リボソーム結合部位、ならびに他の発現制御要素を含む遺伝子であって、改変された結果、ａｐｈＡ遺伝子の発現レベルの低下を生じる遺伝子に、操作可能に結合している領域を、改変細菌が含むこと、ならびに他の例を意味する（例えば、国際公開第９５／３４６７２号、Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｔ．Ａ．およびＫｅａｓｌｉｎｇ  Ｊ．Ｄ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，１９９９，１５：５８−６４参照）。遺伝子に関して「操作可能に結合している」とは、ヌクレオチド配列の発現（例えば、向上した、増加した、構成性の、基礎の、抗ターミネーションの、減弱した、調節解除された、減少した、または抑制された発現）、具体的にはヌクレオチド配列によってコードされた遺伝子産物の発現が生じうるように、制御領域が核酸分子または遺伝子のヌクレオチド配列に結合していることを意味する。
【００７８】
また、「ａｐｈＡ遺伝子の発現が減弱している」とは、ａｐｈＡ遺伝子の発現が減弱している改変細菌において、遺伝子のｍＲＮＡの量または遺伝子によってコードされるＡｐｈＡタンパク質の量など、ａｐｈＡ遺伝子の発現産物の量が、例えば、未改変の細菌におけるａｐｈＡ遺伝子の発現産物の量の５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％にまで減少していることを意味する。
【００７９】
また、「ａｐｈＡ遺伝子の発現を減弱させるように細菌が改変されている」とは、改変された細菌において、ＡｐｈＡタンパク質などの遺伝子タンパク質産物の総酵素活性が、未改変の細菌における酵素活性と比較して、減少するように、細菌が改変されていることを意味する。一細胞当たりのＡｐｈＡタンパク質の活性が、未改変の細菌における活性の５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％にまで減少するよう、細菌を改変することができる。
【００８０】
上記比較のための基準としての役割を果たす未改変の細菌の例として、例えば、大腸菌Ｋ−１２株ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ４７０７６）や大腸菌Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ２７３２５）などのエシェリヒア属に属する細菌の野生型菌株、または、Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ  ＡＪ１３３５５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６１４）などパントエア属に属する細菌の野生型菌株などが挙げられる。
【００８１】
染色体ＤＮＡにおけるプロモーターなどの遺伝子の発現制御配列を、より弱い配列に置換することによって、ａｐｈＡ遺伝子の発現を減弱させることができる。例えば、遺伝子のプロモーター領域において１つ以上のヌクレオチド置換を導入し、それによって、国際公開第００／１８９３５号に開示されているように、プロモーターを弱めるように改変することが可能である。さらに、シャインダルガノ（ＳＤ）配列、ＳＤ配列と開始コドンの間のスペーサー領域、ならびに／または、リボソーム結合部位における開始コドンからすぐ上流および／もしくは下流の配列における数個のヌクレオチドの置換が、ｍＲＮＡの翻訳効率に大きな影響を及ぼすことが知られている。このＲＢＳの改変を、ａｐｈＡ遺伝子の転写の低減と組み合わせてもよい。
【００８２】
また、遺伝子のコード領域にトランスポゾンもしくは挿入配列（ＩＳ）を挿入する（米国特許第５１７５１０７号）または遺伝子発現を制御する領域に挿入することによって、または、紫外線（ＵＶ）照射もしくはニトロソグアニジン（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンＮＴＧ）を用いた変異などの従来の方法によって、ａｐｈＡ遺伝子の発現を減弱させることもできる。さらに、例えばλＲｅｄ／ＥＴ媒介組換えに基づく既知の染色体編集法によって、部位特異的変異を組み込むことができる（Ｄａｔｓｅｎｋｏ  Ｋ．Ａ．およびＷａｎｎｅｒ  Ｂ．Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０００，９７（１２）：６６４０−６６４５）。
【００８３】
大腸菌のａｐｈＡ遺伝子（同義語：ＥＣＫ４０４７、ｈｏｂＨ、ＪＷ４０１５、ｎａｐＡ、ｙｊｂＰ）は、クラスＢ酸性ホスファターゼ、ＡｐｈＡ（ＥＣ３．１．３．２、ＮＣＢＩ、ＧｅｎＢａｎｋ、アクセッション番号ＮＣ＿０００９１３．３、ヌクレオチド位置：４２６９４１４〜４２７０１２７、遺伝子ＩＤ：９４８５６２）をコードし、大腸菌Ｋ−１２株の染色体の反対株にあるｙｊｂＳ遺伝子と大腸菌Ｋ−１２株の染色体の同鎖にあるｙｊｂＱ遺伝子の間に配置されている。ａｐｈＡ遺伝子（配列番号１）のヌクレオチド配列、および大腸菌Ｋ−１２株ＭＧ１６５５に固有のａｐｈＡ遺伝子によってコードされたＡｐｈＡタンパク質（配列番号２）のアミノ酸配列が知られている。さらに、腸内細菌科に属する他の細菌種に固有のＡｐｈＡのアミノ酸ホモログも知られており、例えば、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）（大腸菌Ｋ−１２株ＭＧ１６５５に固有のＡｐｈＡ（配列番号２）との同一性：１００％）、ソンネイ赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ）（同一性：９９％）、シトロバクター・フロインデイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）（同一性：９１％）、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）（同一性：８９％）、クライベラ・クリオクレッセンス（Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｃｒｙｏｃｒｅｓｃｅｎｓ）およびエンテロバクター・クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）（同一性：８４％）、クレブシエラ・ミシガネンシス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ）およびラオウルテラ・プランティコーラ（Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ  ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）（同一性：８３％）、およびパントエア菌種１．１９（Ｐａｎｔｏｅａ  ｓｐ．１．１９）（同一性：７５％）などの種に固有のホモログがある（例えば、ＮＣＢＩデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／参照）。したがって、大腸菌Ｋ−１２株ＭＧ１６５５に固有のＡｐｈＡタンパク質、およびそれをコードするａｐｈＡ遺伝子はそれぞれ、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質のホモログ、および配列番号１のヌクレオチド配列のホモログであるタンパク質および遺伝子も有しうる。
【００８４】
大腸菌のｃｙｓＱ遺伝子（同義語：ａｍｔ、ａｍｔＡ、ＥＣＫ４２１０、ＪＷ４１７２）は、３’（２’），５’−ビスリン酸ヌクレオチダーゼ、ＣｙｓＱ（ＥＣ３．１．３．７、ＮＣＢＩ、ＧｅｎＢａｎｋ、アクセッション番号ＮＣ＿０００９１３．３、ヌクレオチド位置：４４３６７５５〜４４３７４９５、Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９４８７２８）をコードし、また、大腸菌Ｋ−１２株の染色体の反対の株にあるｃｐｄＢ遺伝子と大腸菌Ｋ−１２株の染色体の同鎖にあるｙｔｆＩ遺伝子との間に配置されている。ｃｙｓＱ遺伝子（配列番号３）のヌクレオチド配列、および大腸菌Ｋ−１２株ＭＧ１６５５に固有のｃｙｓＱ遺伝子によってコードされたＣｙｓＱタンパク質（配列番号４）のアミノ酸配列が知られている。さらに、腸内細菌科に属する他の細菌の種に固有のＣｙｓＱのアミノ酸ホモログも知られており、例えば、ソンネイ赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ）（大腸菌Ｋ−１２株ＭＧ１６５５に固有のＣｙｓＱ（配列番号４）との同一性：９９％）、シトロバクター・アマロナティカス（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｍａｌｏｎａｔｉｃｕｓ）（同一性：９１％）、エンテロバクター・クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）（同一性：９０％）、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）およびクレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）（同一性：８８％）、Ｐｌｕｒａｌｉｂａｃｔｅｒ  ｇｅｒｇｏｖｉａｅ（同一性：８７％），およびパントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｎａｎａｔｉｓ）（同一性：８１％）などの種に固有のホモログである（例えば、ＮＣＢＩデータベース参照）。したがって、大腸菌Ｋ−１２株ＭＧ１６５５に固有のＣｙｓＱタンパク質、およびそれをコードするｃｙｓＱ遺伝子はそれぞれ、配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質および配列番号３のヌクレオチド配列のホモログである、タンパク質および遺伝子も有しうる。
【００８５】
大腸菌のｃｐｄＢ遺伝子（同義語：ＥＣＫ４２０９、ＪＷ４１７１）は、２’，３’−環状ヌクレオチド２’−ホスホジエステラーゼ／３’−ヌクレオチダーゼ、ＣｐｄＢ（ＥＣ３．１．４．１６，３．１．３．６、ＮＣＢＩ、ＧｅｎＢａｎｋ、アクセッション番号ＮＣ＿０００９１３．３、ヌクレオチド位置：４４３４６２２〜４４３６５６５、補体、Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９４８７２９）をコードし、大腸菌Ｋ−１２株の染色体の反対株にあるｃｙｓＱ遺伝子とｙｔｆＨ遺伝子との間に配置されている。ｃｐｄＢ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号５）、および大腸菌Ｋ−１２株ＭＧ１６５５に固有のｃｐｄＢ遺伝子によってコードされたＣｐｄＢタンパク質のアミノ酸配列（配列番号６）が知られている。さらに、腸内細菌科に属する他の細菌種に固有のＣｐｄＢのアミノ酸ホモログも知られており、例えば、ソンネイ赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ）およびフレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）（大腸菌Ｋ−１２株ＭＧ１６５５（配列番号６）に固有のＣｐｄＢとの同一性：９９％）、シトロバクター・フロインデイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）およびサルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）（同一性：９１％）、クライベラ・アスコルバータ（Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ａｓｃｏｒｂａｔａ））（同一性８９％）、エンテロバクター・クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）（同一性：８８％）、クレブシエラ・ニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）（同一性：８７％）、およびパントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｎａｎａｔｉｓ）（同一性：７５％）などの種に固有のホモログである（例えば、ＮＣＢＩデータベース参照）。したがって、大腸菌Ｋ−１２株ＭＧ１６５５に固有のＣｐｄＢタンパク質、およびそれをコードするｃｐｄＢ遺伝子はそれぞれ、配列番号６のアミノ酸配列を有するタンパク質および配列番号５のヌクレオチド配列のホモログであるタンパク質および遺伝子も有しうる。
【００８６】
大腸菌Ｋ−１２株ＭＧ１６５５に固有であり、ＡｐｈＡタンパク質をコードするａｐｈＡ遺伝子のバリアントに関する下記の説明を、本明細書に記載の方法において使用できる、いずれの遺伝子およびその遺伝子によってコードされたいずれのタンパク質にも準用できる。なお、上記遺伝子および上記タンパク質には、腸内細菌科に属する他の細菌種に固有の遺伝子およびタンパク質も含まれる。
【００８７】
細菌の科、属、種、または株間でＤＮＡ配列に相違があってもよい。したがって、ａｐｈＡ遺伝子は、配列番号１の遺伝子に限定されないが、配列番号１のバリアントヌクレオチド配列またはホモログであり、ＡｐｈＡタンパク質のバリアントをコードする遺伝子を含んでもよい。
【００８８】
「バリアントタンパク質」とは、配列番号２のアミノ酸配列と比較して、配列に１つ以上の変異を有するタンパク質を意味し、上記タンパク質は、１個または数個のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入、および／または付加したものであるが、タンパク質の活性または機能をまだ維持しているか、または、バリアントタンパク質の３次元構造は、未改変のタンパク質、例えば配列番号２のアミノ酸配列を有する野生型タンパク質ＡｐｈＡなどに対してさほど変化していない。バリアントタンパク質の変化の数は、タンパク質の三次元構造におけるアミノ酸残基の位置、またはアミノ酸残基の種類に依存する。その数は、厳密に限定されないが、配列番号２において、１〜５０、別の例においては１〜４０、別の例においては１〜３０、別の例においては１〜２０、別の例においては１〜１５、別の例においては１〜１０、別の例においては１〜５である。これは、アミノ酸が互いに対して高い相同性を有し、その結果、タンパク質の活性または機能がそのような変化に影響されない、またはタンパク質の三次元構造は、例えば野生型タンパク質などの未改変のタンパク質に対して、あまり変化していないため、可能となる。したがって、ａｐｈＡ遺伝子のバリアントヌクレオチド配列によってコードされたバリアントタンパク質は、相同性を有していてもよい。この相同性は、コンピュータプログラムｂｌａｓｔｐを使用した際に、タンパク質の活性もしくは機能が維持される限り、またはバリアントタンパク質の三次元構造が、配列番号２のアミノ酸配列を有する野生型タンパク質ＡｐｈＡなどの未改変のタンパク質に対してあまり変化していない限り、配列番号２のアミノ酸配列全体に対して、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の、パラメータ「同一性」として定義される。
【００８９】
本明細書では、「相同性」は、「同一性」、つまり、アミノ酸残基またはヌクレオチドの同一性を意味しうる。２つの配列間の配列同一性は、２つの配列を最大限一致させるように整列したときに２つの配列間で一致する残基の比率として算出される。
【００９０】
１個または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加の例は、保存的変異でありうる。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換は、限定はされないが、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒ間の相互置換であり、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、およびＶａｌ間での相互置換であり、置換部位が親水性アミノ酸である場合には、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、およびＴｈｒ間での相互置換であり、置換部位が極性アミノ酸である場合には、ＧｌｎおよびＡｓｎ間での相互置換であり、置換部位が塩基性アミノ酸である場合には、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓ間での相互置換であり、置換部位が酸性アミノ酸である場合には、ＡｓｐおよびＧｌｕ間での相互置換であり、置換部位がヒドロキシ基を有するアミノ酸である場合には、ＳｅｒおよびＴｈｒ間での相互置換でありうる。保存的置換として、例えば、Ａｌａから、ＳｅｒまたはＴｈｒへの置換、Ａｒｇから、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓへの置換、Ａｓｎから、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、またはＡｓｐへの置換、Ａｓｐから、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、またはＧｌｎへの置換、Ｃｙｓから、ＳｅｒまたはＡｌａへの置換、ＧｌｎからＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、またはＡｒｇへの置換、Ｇｌｕから、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、またはＡｓｐへの置換、ＧｌｙからＰｒｏへの置換、Ｈｉｓから、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、またはＴｙｒへの置換、Ｉｌｅから、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、またはＰｈｅへの置換、Ｌｅｕから、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、またはＰｈｅへの置換、Ｌｙｓから、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、またはＡｒｇへの置換、Ｍｅｔから、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、またはＰｈｅへの置換、Ｐｈｅから、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、またはＬｅｕへの置換、Ｓｅｒから、ＴｈｒまたはＡｌａへの置換、Ｔｈｒから、ＳｅｒまたはＡｌａへの置換、Ｔｒｐから、ＰｈｅまたはＴｙｒへの置換、Ｔｙｒから、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、またはＴｒｐへの置換、および、Ｖａｌから、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、またはＬｅｕへの置換が挙げられる。
【００９１】
１個または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加の例は、非保存的変異でありうるが、これは、その変異が、アミノ酸配列の異なる位置で１つ以上の第２次変異によって補償され、その結果、タンパク質の活性または機能が維持されるか、または、バリアントタンパク質の三次元構造が、例えば野生型タンパク質など未改変のタンパク質に対してあまり変化していないことが条件である。
【００９２】
ポリペプチドの同一性率は、アルゴリズムｂｌａｓｔｐを用いて算出することができる。より具体的には、ポリペプチドの同一性率は、ＮＣＢＩが提供するデフォルト設定のＳｃｏｒｉｎｇ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ（Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ：Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ＝１１，  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ＝１；Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  Ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ：Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｓｃｏｒｅ  ｍａｔｒｉｘ  ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）でのアルゴリズムｂｌａｓｔｐを用いて算出できる。ポリヌクレオチドの同一性率は、アルゴリズムｂｌａｓｔｎを用いて算出できる。より具体的には、ポリヌクレオチドの同一性率は、ＮＣＢＩが提供するデフォルト設定のＳｃｏｒｉｎｇ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ（Ｍａｔｃｈ／Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｓｃｏｒｅｓ＝１，−２；  Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ＝Ｌｉｎｅａｒ）でのアルゴリズムｂｌａｓｔｎを用いて算出できる。
【００９３】
ＡｐｈＡタンパク質をコードするａｐｈＡ遺伝子は、バリアントヌクレオチド配列でありうる。「バリアントヌクレオチド配列」とは、標準遺伝子コード表（例えば、Ｌｅｗｉｎ  Ｂ．，“Ｇｅｎｅｓ  ＶＩＩＩ”，２００４，Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｕｐｐｅｒ  Ｓａｄｄｌｅ  Ｒｉｖｅｒ，ＮＪ  ０７４５８参照）による任意の同義アミノ酸コドンを用いてバリアントタンパク質をコードするヌクレオチド配列を意味しうる。したがって、ＡｐｈＡタンパク質をコードするａｐｈＡ遺伝子は、遺伝子コードの縮重によるバリアントヌクレオチド配列でありうる。
【００９４】
また、「バリアントヌクレオチド配列」とは、限定はされないが、配列番号１の配列と相補的なヌクレオチド配列、または配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列から調製できるプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成することができるヌクレオチド配列を意味しうる。ストリンジェントな条件として、特異的なハイブリッド、例えば、コンピュータプログラムｂｌａｓｔｎを使用した際、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の、パラメータ「同一性」として定義される相同性を有するハイブリッドを形成し、かつ、非特異的なハイブリッド、例えば、上記より相同性が低いハイブリッドは形成されないという条件が挙げられる。例えば、ストリンジェントな条件の例として、６０℃で１×標準クエン酸ナトリウムまたは標準塩化ナトリウム（ＳＳＣ）かつ０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、６０℃で０．１×ＳＳＣかつ０．１％ＳＤＳ、または６５℃で０．１×ＳＳＣかつ０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で、１回以上、または別の例では２〜３回洗浄する条件が挙げられる。洗浄時間は、ブロットに用いる膜の種類に依存しうるが、概して、メーカーが推奨する時間である。例えば、ストリンジェントな条件下で正に帯電するナイロン膜（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）であるＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｈｙｂｏｎｄ（登録商標）−Ｎ＋の推奨洗浄時間は、１５分間である。洗浄工程は、２〜３回、実施することができる。プローブとして、配列番号１の配列と相補的な配列の一部を用いてもよい。そのようなプローブは、配列番号１の配列に基づいて調製したプライマーとしてのオリゴヌクレオチドと、テンプレートとしてのヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片とを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、Ｗｈｉｔｅ  Ｔ．Ｊ．ら，Ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．，１９８９，５：１８５−１８９参照）によって、生成することができる。プローブ長は、＞５０ｂｐであることが推奨される。プローブ長は、ハイブリッド形成条件によって好適に選択することができ、通常、１００ｂｐ〜１ｋｂｐである。例えば、約３００ｂｐ長のＤＮＡ断片をプローブとして使用する場合、ハイブリッド形成後の洗浄条件は、例えば、５０℃，６０℃、または６５℃で、２×ＳＳＣかつ０．１％ＳＤＳである。
【００９５】
大腸菌種に固有であり、かつＡｐｈＡタンパク質をコードするａｐｈＡ遺伝子については、すでに明らかにされているので（上記参照）、腸内細菌科の他の細菌種に固有であり、かつＡｐｈＡタンパク質をコードする遺伝子、およびＡｐｈＡタンパク質のバリアントタンパク質をコードするａｐｈＡ遺伝子のバリアントヌクレオチド配列は、腸内細菌科の細菌と、上記細菌に固有のａｐｈＡ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて調製したオリゴヌクレオチドプライマーとを用いるＰＣＲによって、または、試験管内で野生型ａｐｈＡ遺伝子を含むＤＮＡを、例えばヒドロキシルアミンで処理することによる部位特異的変異誘発法によって、または、微生物、例えば、野生型のａｐｈＡ遺伝子を保持する腸内細菌科に属する細菌を、紫外線（ＵＶ）照射もしくはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）や亜硝酸などのこの類の処理に通常使用される変異導入剤で処理する方法によって、または、完全長遺伝子構造として化学合成されることによって、得ることができる。
【００９６】
遺伝子（例えば「野生型遺伝子」）およびタンパク質（例えば「野生型タンパク質」）に関して本明細書で用いられる、「固有の」および「天然の」と等価でありうる「野生型」とは、それぞれ、野生型細菌、例えば腸内細菌科に属する細菌の野生型菌株、例えば、大腸菌ＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ４７０７６）、大腸菌Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ２７３２５）、およびＰ．アナナティス  ＡＪ１３３５５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６１４）などに天然に存在かつ／もしくは発現し、かつ／または、それらによって産生される、固有の遺伝子および固有のタンパク質を意味しうる。タンパク質は遺伝子によってコードされるため、「野生型タンパク質」は、野生型細菌のゲノムに固有または天然に発生する「野生型遺伝子」によってコードされうる。
【００９７】
本明細書に記載の方法において使用できる細菌は、所望の活性を有するタンパク質をコードする前述のＤＮＡを、ホスファターゼをコードする１つ以上の前述のＤＮＡの発現を減弱させるようにすでに改変されている細菌へ導入することによって、得ることができる。または、所望の活性を有するタンパク質を産生するようにすでに改変されている細菌において、ホスファターゼをコードする１つ以上の前述のＤＮＡの発現を減弱させることによっても、上記細菌を得ることができる。
【００９８】
上述した特性に加えて、上記細菌は、本発明から逸脱しない範囲で、様々な栄養素要求性、薬剤耐性、薬剤感度、および薬剤依存性などの他の特異な特性を有しうる。
【００９９】
２．方法
本明細書に記載するように基質を酵素によりスルフリル化する方法は、腸内細菌科に属する細菌を含む培地中で基質をＰＡＰＳと反応させて、基質の硫酸化誘導体（標的化合物と称することもできる）を生成し、培地から硫酸化誘導体を回収するステップを含む。上記方法は、標的化合物を所望の純度で得ることができるように培地から硫酸化誘導体を精製するステップと、および／または他の必要なステップとを、任意で含んでもよい。
【０１００】
本明細書に記載の方法を用いて基質を反応させるステップは、基質の硫酸化誘導体または標的化合物を生成することができるように、所望の活性を有するタンパク質を機能させるのに好適な条件下で実施することができる。上記方法によって、基質を培地においてスルフリル化して、その硫酸化誘導体を生成することができる限り、上記方法において使用できる培地は、任意の培地中であってよい。培地は、本明細書に記載の方法を用いて基質をスルフリル化するのに必要な成分を含みうる。上記成分として、少なくとも、溶剤、腸内細菌科に属する細菌、ＰＡＰＳ、および基質が含まれる。これらの成分に加えて、培地は、１つ以上の他の成分、例えば、有機塩および／または無機塩、酸性またはアルカリ性物質、界面活性剤、ｐＮＰＳ、ならびに酵素を含むタンパク質などを含みうる。溶剤に関しては、少なくとも、スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質が機能でき、その結果、タンパク質の活性を決定することができるような水性培地を用いることができる。例えば、上記方法で使用できる細菌が培養されている培地は、培地が基質のスルフリル化に必要な成分で補われるという条件下で、基質の酵素によるスルフリル化に使用してもよい。さらに、他のタンパク質、例えば、ヘパロサン−Ｎ−硫酸−グルクロン酸−５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質、および／または３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質なども機能することができるように、培地の組成物を適切に選択することができる。
【０１０１】
本明細書に記載の方法において使用できる細菌は、少なくとも、スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を産生するように改変されており、ヘパロサン−Ｎ−硫酸−グルクロン酸−５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質、および／または３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸−スルホトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を産生するように、さらに改変されている場合もあるので、細菌細胞および／または細菌が培養されている培地から分離かつ／または精製されることなく、上記活性を有するタンパク質を用いることができる。つまり、所望の活性を有するタンパク質の活性を培地中で決定することができる限り、または基質の硫酸化誘導体を、上記方法を用いて生成することができる限り、本明細書に記載するように改変されている細菌を含む培地を使用できる。使用できる培地は、所望の活性を有するタンパク質をより有効に用いることができるように、細菌の破砕細胞（いわゆる粗細胞ライセート）を含みうる。細胞破砕の方法は、当業界においては周知であり、例えば、機械破砕、液体均質化（フレンチプレス破砕を含む）、高周波音波法（いわゆる超音波リーシス）、凍結融解サイクル、および手動破砕などが挙げられる。
【０１０２】
本明細書に記載の方法を用いて基質を酵素によりスルフリル化するための条件は、上記方法で使用できるタンパク質の特性を参照して、適切に選択かつ調整することができる。上記特性は、当業者に周知であり、例えば、Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｂｒｅｎｄａ，  ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｒｅｎｄａ−ｅｎｚｙｍｅｓ．ｏｒｇ）、およびＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｅｎｚｙｍｅ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）で見つけることができる。例えば、哺乳類種に固有のタンパク質を用いる場合、上記スルフリル化は、２５℃〜３５℃の温度で２４〜７２時間実施してもよく、ｐＨは、６．５〜７．５に維持してもよい。
【０１０３】
本明細書に記載の方法において使用できる腸内細菌科に属する細菌は、上記方法において使用するように選択された細菌を培養するのに好適な条件下で培養することができる。例えば、エシェリヒア属に属する細菌を培養する場合、１６〜７２時間、１６〜２４時間、または３２〜４８時間、好気条件下で培養を実施してもよく、培養中の培養温度を３０℃〜４５℃または３０℃〜３７℃の範囲内に制御してもよく、かつ、ｐＨは、５〜８または６〜７．５の間に調節してもよい。ｐＨは、尿素、炭酸カルシウム、またはアンモニアガスなど、無機または有機、酸性またはアルカリ性の物質を用いて調節することができる。
【０１０４】
培地は、炭素源、窒素源、硫黄源、リン源、無機イオン、ならびに、必要に応じて、その他の有機成分および無機成分を含む通常の培地など、合成または天然培地のいずれでもよい。炭素源として、グルコース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、フルクトース、アラビノース、マルトース、キシロース、トレハロース、リボース、およびデンプンの加水分解物などの糖類、エタノール、グリセロール、マンニトール、およびソルビトールなどのアルコール類、グルコン酸、フマル酸、クエン酸、リンゴ酸、およびコハク酸等の有機酸類、ならびに脂肪酸類などを用いる事ができる。窒素源として、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、およびリン酸アンモニウムなどの無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、ならびにアンモニア水などを用いる事ができる。さらに、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、およびコーンスティープリカーなどが使用できる。培地は、これらの窒素源のうち、１種類以上を含んでもよい。硫黄源として、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、および硫酸マンガンなどが挙げられる。炭素源、窒素源、および硫黄源に加えて、培地は、リン源を含んでもよい。リン源として、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、およびピロリン酸などのリン酸ポリマーなどを使用することができる。ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、およびビタミンＢ１２などのビタミン類、ならびに必要な物質、例えば、アデニンやＲＮＡなどの核酸、アミノ酸、ペプトン、カザミノ酸、酵母抽出物などの有機栄養素類などが、微量であったとしても、適量含まれていてもよい。上記以外に、必要に応じて、少量のリン酸カルシウム、鉄イオン、およびマンガンイオンなどを添加してもよい。
【０１０５】
基質の硫酸化誘導体は、遊離状態で、もしくはその塩として、またはこれらの混合物として生成できる。例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、および標的化合物の塩を、上記方法によって生成することができる。これは、スルホ基（−ＳＯ３Ｈ）は、スルフリル化の条件下で、例えばアルカリ性物質などの中和剤と、典型的な酸塩基中和反応で反応して、当業者には明らかな、スルホ基含有分子の化学的特徴である塩を形成することができるため、可能となる。
【０１０６】
基質を反応させるステップの後、濃縮、沈殿、結晶化、イオン交換クロマトグラフィ、中圧または高圧液体クロマトグラフィ、またはこれらの組み合わせなど、当業者には周知の従来技術を用いて、基質の硫酸化誘導体を培地から回収することができる。さらに、標的化合物を、所望の純度、例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または９９．９％以上などで得ることができるように、培地から回収された硫酸化誘導体を精製することができる。純度は、例えば、重量比（ｗ／ｗ）で表してもよい。
【０１０７】
例えば、本明細書に記載の酵素によるスルフリル化の方法を用いて、ヘパリンを標的化合物として得る場合、例えば、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｅｒ  Ｊ．−Ｙ．らの著書（２０１７年）に記載され、そこに引用されている参考文献に記載の手順を用いて、ヘパリンを培地から回収することができる。特に、まず、ヘパリンを、例えばＨｙａｍｉｎｅ（登録商標）１６２２などの第４級アンモニウム塩を用いて培地から析出させてもよい。その後、析出したＨｙａｍｉｎｅ（登録商標）−ヘパリン錯体を、濃縮ＮａＣｌ溶液を用いて抽出し、ヘパリンナトリウム塩を得ることができる。その後、温度、ｐＨ、および塩濃度の制御下で、ヘパリンナトリウム塩に対して、陰イオン交換クロマトグラフィを行い、帯電および特定の活性により分画されたヘパリンを回収することができる。この段階で、十分な純度のヘパリンを、通常、得ることができる。例えば、低分子量ヘパリン（Ｌｏｗ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｈｅｐａｒｉｎ：略して「ＬＭＷＨ」）として、ヘパリンを得ることができる。低分子量ヘパリンは、例えば、１０００〜１００００Ｄａの分子量（平均分子量４０００〜６０００Ｄａ）の画分を意味しうる。未分画のヘパリンと比較して、ＬＭＷＨは出血の副作用がより少ないという長所を有する。
【０１０８】
例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、またはアセトンなどの有機溶媒を使用する析出、および、例えば、過マンガン酸カリウム（ＫＭｎＯ４）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、過酢酸（ＣＨ３ＣＯ３Ｈ）、次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ）、またはオゾン（Ｏ３）を使用する漂白を行うことによって、任意に、ヘパリンをさらに精製することができる。最後に、高濃度のメタノールまたはエタノールから析出させることによって、ヘパリンを精製することができる。必要に応じて、析出したヘパリンを、４０℃〜７５℃の温度で真空状態で乾燥させることもできる。
【０１０９】
本明細書に記載の酵素によるスルフリル化の方法を用いて、ヘパリンを標的化合物として得るときに、ヘパリンに対して、脱重合ステップを行ってもよい。脱重合は、例えば、亜硝酸の使用によって、光分解法によって、またはヘパリナーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、もしくはこれらの組み合わせを酵素的に適用することによって、行うことができる。脱重合の程度は特に限定されない。例えば、１０００〜３５０００Ｄａの分子量を有するヘパリンが得られるように脱重合を行ってもよい。
【実施例】
【０１１０】
本発明を、以下の実施例を参照してより具体的に説明するが、これらの実施例に限定されない。
【０１１１】
実施例１  ホスファターゼをコードする遺伝子を欠失している大腸菌株Ｏｒｉｇａｍｉ（登録商標）２（ΔｐｔｒＡ  ΔｈｓｌＵ）の細胞ライセートにおけるＰＡＰおよびＰＡＰＳの安定性の検討
【０１１２】
１．１．大腸菌Ｋ−１２株Ｏｒｉｇａｍｉ（登録商標）２（ΔｐｔｒＡ  ΔｈｓｌＵ）
ＰＡＰとＰＡＰＳの安定性について、大腸菌Ｋ−１２株Ｏｒｉｇａｍｉ（登録商標）２（ΔｐｔｒＡ  ΔｈｓｌＵ）の粗細胞ライセートにおいて検討した。大腸菌Ｋ−１２株Ｏｒｉｇａｍｉ（登録商標）２は、ａｐｈＡ、ｃｙｓＱ、およびｃｐｄＢ遺伝子から選択された、ホスファターゼをコードする１つ以上の遺伝子を欠失するようにさらに改変されている。細胞内で合成または産生されるタンパク質の酵素活性は、タンパク質のジスルフィド結合の適切な形成に影響されうることが知られている（例えば、Ｋｅ  Ｎ．およびＢｅｒｋｍｅｎ  Ｍ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｂｏｎｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０１４，１０８：１６．１Ｂ．１−２１参照）。したがって、遺伝子型Δ（ａｒａ−ｌｅｕ）７６９７  ΔｌａｃＸ７４  ΔｐｈｏＡ  ＰｖｕＩＩ  ｐｈｏＲ  ａｒａＤ１３９  ａｈｐＣ  ｇａｌＥ  ｇａｌＫ  ｒｐｓＬ  Ｆ’［ｌａｃ＋  ｌａｃＩｑ  ｐｒｏ］  ｇｏｒ５２２：：Ｔｎ１０  ｔｒｘＢ（ＳｔｒＲ，ＴｅｔＲ）を有する大腸菌Ｋ−１２株Ｏｒｉｇａｍｉ（登録商標）２（Ｍｅｒｃｋ社、カタログ番号７１３４４−３）を、スルホトランスフェラーゼおよびヘパロサン−Ｎ−硫酸−グルクロン酸−５−エピメラーゼを生成するために選択した。上記株は、チオレドキシンレダクターゼ（ｔｒｘＢ）およびグルタチオンレダクターゼ（ｇｏｒ）をコードする遺伝子に変異を有しており、これによって、大腸菌細胞質におけるジスルフィド結合の形成がかなり向上する。
【０１１３】
スルホトランスフェラーゼおよびヘパロサン−Ｎ−硫酸−グルクロン酸−５−エピメラーゼを、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ付きタンパク質として、大腸菌で有効に生成することができる（例えば、Ｂｅｔｈｅａ  Ｈ．Ｎ．ら，Ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ２−Ｏ−ｓｕｌｆｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｂｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ  ｇｕｉｄｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００８，１０５（４８）：１８７２４−１８７２９；Ｌｉ  Ｋ．ら，Ｕｓｉｎｇ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ２−Ｏ−ｓｕｌｆｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｔｏ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  Ｃ５−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｍｕｔａｎｔｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１０，２８５（１５）：１１１０６−１１１１３参照）。しかし、粗細胞ライセートにおける標的タンパク質の生成の有効性をさらに向上することが望ましい。これは、例えばＭＢＰタグ付きタンパク質のタンパク質分解を低減することによって達成できる。特に、プロテアーゼをコードする１つ以上の遺伝子は、タンパク質を発現する細菌において欠失させることができる。大腸菌菌体の粗ライセート中のＭＢＰタグ付きタンパク質の安定性は、ペリプラズムプロテアーゼＩＩＩおよびＨｓｌＶＵプロテアーゼのＡＴＰアーゼ成分をそれぞれコードするｐｔｒＡ遺伝子およびｈｓｌＵ遺伝子を欠失することによって有意に向上できることを我々は見出した。
【０１１４】
したがって、ＭＢＰタグ付きタンパク質を生成し、粗細胞ライセートにおけるＰＡＰおよびＰＡＰＳの安定性を検討するための最適な宿主株として、大腸菌Ｋ−１２株Ｏｒｉｇａｍｉ（登録商標）２（ΔｐｔｒＡ  ΔｈｓｌＵ）を選択した。
【０１１５】
１．２．大腸菌Δ２−５株の構築
大腸菌Ｋ−１２株Ｏｒｉｇａｍｉ（登録商標）２の染色体において、ｐｔｒＡ、ｈｓｌＵ、ｃｙｓＱ、ｃｐｄＢ、およびａｐｈＡ遺伝子を、一つずつ欠失した。インフレーム遺伝子欠失法（Ｄｕａｌ−Ｉｎ／Ｏｕｔ法としても知られている）を用いた（Ｍｉｎａｅｖａ  Ｎ．Ｉ．ら，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００８，８：６３）。表１に、構築したΔ２−５株を示す。
【０１１６】
１．３．粗細胞ライセートの調製
各Δ２−５株を、５０ｍＬ試験管内で、３７℃で一晩（約１６時間）、１０ｍＬのＬＢ培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．およびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２００１年）において増殖させた。その後、細胞を、遠心分離（５０００ｒｐｍ）によって収集し、０．３ｍＬの緩衝液Ａ（１００ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール）に再懸濁し、超音波処理によって破砕した。不溶性細胞成分の画分を遠心分離（１３０００ｒｐｍ）によって沈殿させた。粗細胞ライセート（いわゆる上清）の可溶性画分を新しいバイアルに移し、ＰＡＰおよびＰＡＰＳの安定性をＰＡＰ（Ｓ）の安定性アッセイで検討するのに使用した。
【０１１７】
１．４．ＰＡＰ（Ｓ）安定性アッセイ
各反応混合物（１００μＬ）は、ｐＨ７．０の５０ｍＭのＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）と、１ｍｍのＭｇＣｌ２と、１％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と、０．４ｍｇ／ｍＬのＰＡＰまたはＰＡＰＳとを含んでいた。粗細胞ライセートの可溶性画分（実施例１．３）を、反応混合物中のタンパク質終濃度が２．５ｍｇ／ｍＬになるまで添加した。対照として、ライセートの代わりに水を使用した。各反応混合物を、３０℃で、表２および表３に示す時間、培養し、その後、ＨＰＬＣ法を用いて分析した。ＨＰＬＣ解析の条件は以下のとおりとした。
装置：Ａｌｌｉａｎｃｅ  Ｗａｔｅｒｓ
カラム：ＴＳＫ  ＧＥＬ  ＤＥＡＥ−５ＰＷ  ２×７５ｍｍ、１０μｍ
検出：ＵＶ検出器（デュアル吸光検出器）を用いて、ＮＳおよびＮＳ２Ｓに対しては２３５ｎｍで、ＰＡＰおよびＰＡＰＳに対しては２５４ｎｍで検出。ＮＳは、α−ΔＵＡ−［１→４］−ＧｌｃＮＳを意味し、ＮＳ２Ｓは、α−ΔＵＡ−２Ｓ−［１→４］−ＧｌｃＮＳを意味する。ΔＵＡは、４−デオキシ−Ｌ−スレオ−ヘキシ−４−エノピラノシルウロン酸（４−ｄｅｏｘｙ−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−ｅｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）を意味し、ＧｌｃＮＳは、Ｎ−スルホ−Ｄ−グルコサミンを意味する。
溶出液のグラジエント：３０分−０％Ｂに対して、０分−０％Ｂ、１５分−５％Ｂ、２０分−３０％Ｂ、３０分−１００％Ｂ。このとき、溶出緩衝液Ａは、２．５６ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ３．０、Ｈ３ＰＯ４で調節）、５％アセトニトリルであり、溶出緩衝液Ｂは、２．５６ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ３．０、Ｈ３ＰＯ４で調節）、０．５ＭのＬｉＣｌ２である。
温度：４０℃
溶出速度：０．２ｍＬ／分
注入量：１０μＬ
注入時間：５０分
圧力：１４０〜１６０ｐｓｉ
較正試料：１〜２００ｍｇ／Ｌ
検出限界：０．００５ｍｇ／Ｌ
溶出時間：ＰＡＰ（１９．４２分）、ＮＳ（２１．９４分）、ＰＡＰＳ（２６．０２分）、ＮＳ２Ｓ（２８．９１分）
【０１１８】
表２および表３に、ＰＡＰ（Ｓ）安定性アッセイの結果を示す。表２から分かるように、ＰＡＰは、Δ２株の粗細胞ライセートにおいてかなり不安定であり、２２時間以内に完全に分解した。Δ２株中のｃｙｓＱ遺伝子を欠失してΔ３株を得た結果、ＰＡＰ安定性は向上したが、ＰＡＰはすべて２２時間以内に分解した。Δ３株中のｃｐｄＢ遺伝子を欠失してΔ４株を得た結果、ＰＡＰ安定性はかなり向上し、ＰＡＰの約２５％は、２２時間の培養後も反応混合物中に保持されていた。Δ４株中のａｐｈＡ遺伝子を欠失してΔ５株を得た結果、ＰＡＰ安定性は２倍以上向上し、ＰＡＰの約５０％は、２２時間の培養後も反応混合物中に保持されていた。このように、ＡｐｈＡ、ＣｙｓＱ、およびＣｐｄＢをコードする１つ以上の遺伝子を欠失することによって、ＰＡＰの安定性を高めることができる。
【０１１９】
表３から分かるように、ＰＡＰＳは、Δ２株の粗細胞ライセートにおいてかなり不安定であり、２２時間以内に完全に分解した。Δ２株中のｃｙｓＱ遺伝子を欠失してΔ３株を得た結果、ＰＡＰ安定性は、２２時間以内に１０倍以上向上した。Δ３株中のｃｐｄＢ遺伝子を欠失してΔ４株を得た結果、ＰＡＰＳ安定性は向上しなかった。Δ４株中のａｐｈＡ遺伝子を欠失してΔ５株を得た結果、ＰＡＰＳ安定性は２倍以上向上した。このように、ＡｐｈＡおよびＣｙｓＱをコードする１つまたは２つの遺伝子を欠失することによって、ＰＡＰＳの安定性を高めることができる。
【０１２０】
実施例２  スルホ基のドナーとしてＰＡＰＳを用いた、低分子量ヘパロサンＮ−硫酸塩の酵素によるスルフリル化
スルホ基のドナーとしてのＰＡＰＳと、ヘパロサン硫酸２−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ（ＨＳ  ２−ＯＳＴ）およびヘパロサン−Ｎ−硫酸−グルクロン酸−５−エピメラーゼ（ＨＮＳＧ−５ｅｐｉ）を産生することができるΔ２−５株の粗細胞ライセートとを用いて、低分子量ヘパロサンＮ−硫酸塩（「ＬＭＷＨＳ」と略称する）の酵素によるスルフリル化を行った。
【０１２１】
２．１．ｐＡＣＹＣ１８４−ＭＢＰ＊−２ＯＳＴＹ９４Ａ（Ｄ６９−Ｎ３５６）プラスミドの構築
２．１．１．ｐＭＡＬ＊ベクターの構築
ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘベクター（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社、カタログ番号Ｅ８０００Ｓ）を改変して、ペプチドリンカーＳ３Ｎ１０ＬＧＩＥＧＲＩＳＥＦＧＳをコードするＤＮＡ断片を、ＭＢＰタンパク質のＣ末端をコードするＤＮＡ断片で置換した。このとき、３５９位にあるグルタミン酸残基をアラニン残基で置換（Ｅ３５９Ａ）し、３６２位にあるリジン残基をアラニン残基で置換（Ｋ３６２Ａ）し、３６３位にあるアスパラギン酸残基をアラニン残基で置換（Ｄ３６３Ａ）する（Ｒｏｂ  Ｊ．  Ｃ．ら，Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔｒｉｍｅｒｉｃ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｇｐ２１  ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ａｓ  ａ  ｃｈｉｍｅｒａ  ｗｉｔｈ  ｍａｌｔｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，７：１６１２−１６１９）。さらに、制限酵素部位ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ−ＸｈｏＩ−ＮｏｔＩをベクターに導入した。
【０１２２】
５’−ＢｇｌＩＩ制限酵素部位と３’−ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位とに隣接しているＭＢＰのＣ末端の一部を含むＰＣＲ断片を、プライマーＰ１（配列番号７）およびＰ２（配列番号８）、ならびに鋳型としてｐＭＡＬ−ｃ２Ｘプラスミドを用いて増幅した。ＰＣＲ産物を、ｐＭＡＬ−ｃ２ＸプラスミドのＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位に連結した。このようにして、ｐＭＡＬ＊ベクターを構築した。
【０１２３】
２．１．２．ｐＭＡＬ＊−２ＯＳＴＹ９４Ａ（Ｄ６９−Ｎ３５６）プラスミドの構築
配列番号１０のアミノ酸配列を有する変異ＨＳ  ２−ＯＳＴをコードするコード配列（ＣＤＳ）を保持するＤＮＡ断片（配列番号９）を、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）カスタムＤＮＡ合成（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）によって化学的に合成した。ここにおいて、上記アミノ酸配列は、オナガキヌゲネズミ（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｌｏｎｇｉｃａｕｄａｔｕｓ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ、アクセッション番号Ｏ０８８９．１）に固有のＨＳ  ２−ＯＳＴにおいて、６９位にあるアスパラギン酸残基（Ｄ６９）から３５６位にあるアスパラギン残基（Ｎ３５６）までのポリペプチドに対応する。また、９４位にあるチロシン残基は、アラニン残基で置換（Ｙ９４Ａ）されている。このＤＮＡ断片を、制限酵素ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩを用いて消化し、ｐＭＡＬ＊／ＮｏｔＩ−ＸｈｏＩベクター（実施例２．１．１）にクローニングした。このようにして、ｐＭＡＬ＊−２ＯＳＴＹ９４Ａ（Ｄ６９−Ｎ３５６）プラスミドを構築した。
【０１２４】
２．１．３．ｐＡＣＹＣ１８４−ＭＢＰ＊−２ＯＳＴＹ９４Ａ（Ｄ６９−Ｎ３５６）プラスミドの構築
ｐＭＡＬ＊−２ＯＳＴ（Ｄ６９−Ｎ３５６）プラスミドの３．６−ｋｂｐ  ＦｓｐＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ＤＮＡ断片を、ｐＡＣＹＣ１８４クローニングベクター（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ、アクセッション番号Ｘ０６４０３）のＥｃｏＲＶ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位にサブクローニングした。このようにして、ｐＡＣＹＣ１８４−ＭＢＰ＊−２ＯＳＴＹ９４Ａ（Ｄ６９−Ｎ３５６）プラスミドを構築した。
【０１２５】
２．２．ｐＳＵＭＯ−ｄｒｅＧｌｃｅ（Ｇ７０−Ｎ５８５）プラスミドの構築
ｐＥＴｉｔｅ（商標）Ｎ−Ｈｉｓ  ＳＵＭＯ  Ｋａｎ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｌｕｃｉｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、２９０５  Ｐａｒｍｅｎｔｅｒ  Ｓｔ，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＩ５３５６２  ＵＳＡ）由来のＮ末端タグ６ｘＨｉｓ−ＳＵＭＯペプチド（配列番号１２）をコードするＤＮＡ断片（配列番号１１）を、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）カスタムＤＮＡ合成（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）によって化学的に合成した。ここにおいて、上記ペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＨＮＳＧ−５ｅｐｉの（Ｇ７０−Ｎ５８５）断片と融合しており、上記アミノ酸配列は、ダニオレリオ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿９９８０１４．１）に固有のＨＮＳＧ−５ｅｐｉにおいて、７０位にあるグリシン残基（Ｇ７０）から５８５位にあるアスパラギン残基（Ｎ５８５）までのポリペプチドに対応する。このＤＮＡ断片を、制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩを用いて消化し、ｐＭＡＬ＊／ＮｄｅＩ−ＸｈｏＩベクター（実施例２．１．１）にクローニングした。このようにして、ｐＳＵＭＯ−ｄｒｅＧｌｃｅ（Ｇ７０−Ｎ５８５）プラスミドを構築した。
【０１２６】
２．３．ｐＡＣＹＣ１８４−ＭＢＰ＊−２ＯＳＴＹ９４Ａ（Ｄ６９−Ｎ３５６）およびｐＳＵＭＯ−ｄｒｅＧｌｃｅ（Ｇ７０−Ｎ５８５）プラスミドを保持するΔ２−５株の構築
ｐＡＣＹＣ１８４−ＭＢＰ＊−２ＯＳＴＹ９４Ａ（Ｄ６９−Ｎ３５６）およびｐＳＵＭＯ−ｄｒｅＧｌｃｅ（Ｇ７０−Ｎ５８５）プラスミドを、標準エレクトロポレーション手順（０．１ｃｍキュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）、電圧２ｋＶ、時間５μ秒）を用いて、Δ２−５株に導入した。まず、ｐＳＵＭＯ−ｄｒｅＧｌｃｅ（Ｇ７０−Ｎ５８５）プラスミドを導入して、Δ２−５／ｐＳＵＭＯ−ｄｒｅＧｌｃｅ（Ｇ７０−Ｎ５８５）株を構築した。その後、ｐＡＣＹＣ１８４−ＭＢＰ＊−２ＯＳＴＹ９４Ａ（Ｄ６９−Ｎ３５６）プラスミドをΔ２−５／ｐＳＵＭＯ−ｄｒｅＧｌｃｅ（Ｇ７０−Ｎ５８５）株に導入して、２つのプラスミドを保持する標的Δ２−５株を構築した。ｐＡＣＹＣ１８４−ＭＢＰ＊−２ＯＳＴＹ９４Ａ（Ｄ６９−Ｎ３５６）およびｐＳＵＭＯ−ｄｒｅＧｌｃｅ（Ｇ７０−Ｎ５８５）プラスミドを保持するΔ２−５株を、Δ２−５／ｐＳＵＭＯ／ｐＡＣＹＣ１８４株と称した。
【０１２７】
２．４．Δ２−５／ｐＳＵＭＯ／ｐＡＣＹＣ１８４の粗細胞ライセートの可溶性画分の調製
アンピシリン（２００ｍｇ／Ｌ）とクロラムフェニコール（３０ｍｇ／Ｌ）とを含むＬＢブロスで一晩増殖させた、ｐＡＣＹＣ１８４−ＭＢＰ＊−２ＯＳＴＹ９４Ａ（Ｄ６９−Ｎ３５６）およびｐＳＵＭＯ−ｄｒｅＧｌｃｅ（Ｇ７０−Ｎ５８５）プラスミドを保持するΔ２−５株の細胞培養液各１．２５ｍＬを、フラスコ内で、アンピシリン（１５０ｍｇ／Ｌ）およびクロラムフェニコール（３０ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢブロス５０ｍＬに接種し、その後、３７℃で培養してＯＤ６００約０．８に到達させた。その後、終濃度０．５ｍＭに達するまでＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）を添加して、ＨＳ  ２−ＯＳＴとＨＮＳＧ−５ｅｐｉの合成を誘導した。２０℃で４８時間、培養を行った。
【０１２８】
結果として生じたバイオマスを、遠心分離（５０００ｒｐｍ）によって収集し、０．３ｍＬの５０ｍＭのＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）溶液（ｐＨ７）に再懸濁し、超音波処理を施して細胞を破砕した。その後、不溶性タンパク質を含む粗細胞ライセートの不溶性画分を、遠心分離（１３０００ｒｐｍ）によって沈殿させ、０．３ｍＬの試料緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、５０ｍＭのＤＴＴ（１，４−ジチオスレイトール）、０．１％（ｖ／ｖ）ＳＤＳ、３０％（ｖ／ｖ）グリセロール）で再懸濁し、９５℃で１０分間培養した。その後、再び、遠心分離（１３０００ｒｐｍ）によって、不溶性画分を沈殿させた。得られた上清を、不溶性タンパク質調製物として使用した。上記の手順の結果として得られ、かつ、ヘパラン硫酸２−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ活性およびヘパロサン−Ｎ−硫酸−グルクロン酸−５−エピメラーゼ活性を有するタンパク質を含む可溶性タンパク質を含有する粗細胞ライセート（いわゆる上清）の可溶性画分を新しいバイアルに移し、使用するまで最大３〜５時間４℃で保存した。このようにして調製した粗細胞ライセートの可溶性画分中のタンパク質の平均濃度は、２０ｍｇ／ｍＬであった。
【０１２９】
ｐＡＣＹＣ１８４−ＭＢＰ＊−２ＯＳＴＹ９４Ａ（Ｄ６９−Ｎ３５６）およびｐＳＵＭＯ−ｄｒｅＧｌｃｅ（Ｇ７０−Ｎ５８５）プラスミドを保持するΔ２−５株の粗細胞ライセートの可溶性および不溶性画分中のタンパク質の含有量を分析するため、１μＬの各調製物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析にかけた（図３）。図３から分かるように、上記株の、分析したすべての粗細胞ライセート中のＨＳ  ２−ＯＳＴとＨＮＳＧ−５ｅｐｉの絶対量および相対量は、同じであった。
【０１３０】
２．５．スルホ基のドナーとしてＰＡＰＳを用いた、ＬＭＷＨＳの２−Ｏ−スルフリル化
ＬＭＷＨＳの２−Ｏスルフリル化を、ｐＨ７の５０ｍＭのＭＥＳと、１ｍＭのＭｇＣｌ２と、１％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と、１ｍＭのＣａＣｌ２と、１．２ｍＭのＰＡＰＳと、１ｍｇ／ｍＬのＬＭＷＨＳ（参考例）と、８３μＬの粗細胞ライセートの可溶性画分（実施例２．４）とを含む、総量１００μＬの反応混合物において実施した。ネガティブ（コントロール）反応は、水で置換されたライセートを除いて、上記成分を含んでいた。反応混合物を３０℃で４８時間培養した。その後、反応混合物の一部をヘパリナーゼＩ、ＩＩ、およびＩＩＩで処理した（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社、カタログ番号Ｐ０７３５Ｓ、ＰＯ７３６Ｓ、Ｐ０７３７Ｓ）。総量１００μＬの反応混合物は、培養後に得られた３０μＬの反応混合物と、１０μＬのヘパリナーゼ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社）と、ヘパリナーゼＩ、ＩＩ、およびＩＩＩ（各酵素１μＬ）と、６０μＬのＨ２Ｏとを含んでいた。反応混合物を、３０℃で２４時間培養し、その後、二糖類ＮＳ  （α−ΔＵＡ−［１→４］−ＧｌｃＮＳ）およびＮＳ２Ｓ（α−ΔＵＡ−２Ｓ−［１→４］−ＧｌｃＮＳ）の有無と量を分析するためにＨＰＬＣ法を用いて分析した。ＨＰＬＣ分析の条件は、実施例１．４に記載したとおりであった。
【０１３１】
表４に、ＬＭＷＨＳの２−Ｏ−スルフリル化の結果を示す。表４から分かるとおり、スルホ基のドナーとしてＰＡＰＳを用いるＬＭＷＨＳの２−Ｏ−スルフリル化は、ｃｙｓＱ、ｃｐｄＢ、およびａｐｈＡ遺伝子を欠失しているΔ５／ｐＳＵＭＯ／ｐＡＣＹＣ１８４株の粗細胞ライセートを用いた場合、Δ２／ｐＳＵＭＯ／ｐＡＣＹＣ１８４株と比較して、約１．４倍有効であった。
【０１３２】
実施例３  ｐＮＰＳの存在下での低分子量ヘパロサンＮ−硫酸塩の酵素によるスルフリル化
スルホ基のドナーとしてＰＡＰＳを用いて、ｐＮＰＳとアリールスルホトランスフェラーゼとを含むΔ２−５／ｐＳＵＭＯ／ｐＡＣＹＣ１８４株の粗細胞ライセートにおいて、ＬＭＷＨＳの酵素によるスルフリル化を行った。
【０１３３】
３．１．ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）のアリールスルホトランスフェラーゼ１Ａ１の発現および精製
まず、ラットに固有のＳＴ１Ａ１をコードする遺伝子を保持するｐＥＴＤｕｅｔ−Ｎ−Ｔａｇ６ｘＨｉｓ−ＳＴ１Ａ１プラスミドを構築した。ラット（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿１１４０２２．１）に固有のアリールスルホトランスフェラーゼ１Ａ１（略して「ＳＴ１Ａ１」。「Ｓｕｌｔ１ａ１」としても知られる）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片（配列番号１４）を、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）カスタムＤＮＡ合成（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）によって化学的に合成した。得られたＤＮＡ断片を、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、ｐＥＴＤｕｅｔ−１／ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。このようにして、６ｘＨｉｓタグと融合したラットに固有のＳＴ１Ａ１をコードする遺伝子を得た。
【０１３４】
その後、１ｍＬ−ＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）上で固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィ（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｍｅｔａｌ  ｉｏｎ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＩＭＡＣ）を用いて、６ｘＨｉｓタグ付きＳＴ１Ａ１を発現し、精製した。メーカーが推奨する標準手順を適用した。
【０１３５】
３．２．ｐＮＰＳの存在下でのＬＭＷＨＳの２−Ｏ−スルフリル化
ＬＭＷＨＳの２−Ｏ−スルフリル化を、ｐＨ７の５０ｍＭのＭＥＳと、１ｍＭのＭｇＣｌ２と、１％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と、１ｍＭのＣａＣｌ２と、４６μＭのＰＡＰと、１０ｍＭのｐＮＰＳと、１ｍｇ／ｍＬのＬＭＷＨＳ（参考例）と、４．７５μｇのＳＴ１Ａ１（実施例３．１）と、７４μＬの粗細胞ライセートの可溶性画分（実施例２．４）とを含む、総量１００μＬの反応混合物において、実施した。ネガティブ（コントロール）反応は、水で置換されたライセートを除いて、上記成分を含んでいた。反応混合物を３０℃で４８時間培養した。ヘパリナーゼで反応混合物を処理する際の条件、および得られた混合物をＨＰＬＣを用いて分析する際の条件は、実施例２．５に記載した条件と同じであった。
【０１３６】
表５に、ｐＮＰＳの存在下でＬＭＷＨＳを２−Ｏ−スルフリル化した結果を示す。表５から分かるように、ｃｙｓＱ、ｃｐｄＢ、およびａｐｈＡ遺伝子を欠失しているΔ５／ｐＳＵＭＯ／ｐＡＣＹＣ１８４株の粗細胞ライセートを用いた場合、スルホ基のドナーとしてＰＡＰＳを用いてｐＮＰＳの存在下でＬＭＷＨＳをスルフリル化した収率は、７５％であり、一方、Δ２／ｐＳＵＭＯ／ｐＡＣＹＣ１８４株の粗細胞ライセートを使用した場合、ＬＭＷＨＳのスルフリル化産物は検出されなかった。また、スルホ基のドナーとしてＰＡＰＳを用いた、ｐＮＰＳの存在下でのＬＭＷＨＳの２−Ｏ−スルフリル化は、ｃｙｓＱ、ｃｐｄＢ、およびａｐｈＡ遺伝子を欠失しているΔ５／ｐＳＵＭＯ／ｐＡＣＹＣ１８４株の粗細胞ライセートを使用した場合、ｃｙｓＱ遺伝子を欠失しているΔ３／ｐＳＵＭＯ／ｐＡＣＹＣ１８４株ならびにｃｙｓＱおよびｃｐｄＢ遺伝子を欠失しているΔ４／ｐＳＵＭＯ／ｐＡＣＹＣ１８４を使用した場合と比較して、それぞれ約１６倍および１５倍高かった。
【０１３７】
実施例４  スルホ基のドナーとしてｐＮＰＳを用いた、ＰＡＰの酵素によるスルフリル化
４．１．ｐＰｌａｃ−Ｎ−Ｔａｇ６ｘＨｉｓ−ＳＴ１Ａ１プラスミドの構築
ｐＰｌａｃ−Ｎ−Ｔａｇ６ｘＨｉｓ−ＳＴ１Ａ１プラスミドを構築するために、プライマーＰ３（配列番号１５）およびＰ４（配列番号１６）、ならびに鋳型としてｐＥＴＤｕｅｔ−Ｎ−Ｔａｇ６ｘＨｉｓ−ＳＴ１Ａ１プラスミド（実施例３．１）を用いて、ＰＣＲによってＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片を、ｐＭＡＬ＊プラスミド（実施例２．１．１）のＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結した。
【０１３８】
４．２．ｐＰｌａｃ−Ｎ−Ｔａｇ６ｘＨｉｓ−ＳＴ１Ａ１プラスミドを保持するΔ２−５株の構築
ｐＰｌａｃ−Ｎ−Ｔａｇ６ｘＨｉｓ−ＳＴ１Ａ１プラスミドを、標準エレクトロポレーション手順（０．１ｃｍキュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）、電圧２ｋＶ、時間５μ秒）を用いて、Δ２−５株（実施例１．２、表１）に導入した。ｐＰｌａｃ−Ｎ−Ｔａｇ６ｘＨｉｓ−ＳＴ１Ａ１プラスミドを保持するΔ２−５株を、Δ２−５／ｐＳＴ１Ａ１株と称した。
【０１３９】
４．３．Δ２−５／ｐＳＴ１Ａ１株の粗細胞ライセートの可溶性画分の調製
寒天平板上で一晩増殖することによって新たに生成したΔ２−５／ｐＳＴ１Ａ１株の細胞を、初期ＯＤ５９５０．１に達するまで、２０ｍＬの試験管内でアンピシリン（２００ｍｇ／Ｌ）を含有する５ｍＬのＬＢブロスに接種し、３７℃で、最終ＯＤ５９５１．２に達するまで培養した。その後、終濃度１ｍＭになるまでイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  β−Ｄ−１−Ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ：ＩＰＴＧ）を添加して、Ｎ−Ｔａｇ６ｘＨｉｓ−ＳＴ１Ａ１の合成を誘導した。２５℃で１６時間、培養を行った。結果として生じたバイオマスを、４℃で１０分間、３．３ｒｃｆ（相対遠心力）で遠心分離により収集し、２５ｍＬの０．９％ＮａＣｌ溶液で２回洗浄し、使用するまで−２０℃で凍結した。
【０１４０】
解凍した細胞ペレットを、０．５ｍＬの緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、ｐＨ７．４）に再懸濁し、細胞を超音波処理によって破砕した。細胞デブリを、約２０分間、１３０００ｒｐｍで遠心分離によって除去した。結果として生じた粗細胞ライセートを、ＳＴ１Ａ１タンパク質調製物として使用した。
【０１４１】
４．４．スルホ基のドナーとしてｐＮＰＳを用いるＰＡＰのスルフリル化
総量１００μＬの各反応混合物は、ｐＨ７の５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌと、２３０μＭのＰＡＰと、１ｍＭのｐＮＰＳと、１０％（ｖ／ｖ）グリセロールと、Δ２−５／ｐＳＴ１Ａ１株の粗細胞ライセート０．１ｍｇ／ｍＬとを含んでいた。混合物は、標準９６ウェルプレートで調製した。ＰＡＰを添加することによって、反応を開始した。反応混合物を、ＭｕｌｔｉｓｋａｎＧｏ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で、３０℃で３時間培養した。使用したすべてのウェルに対して、５分毎にＯＤ４０５を測定し、その結果、ｐＮＰ合成の反応速度が得られた（図４）。ｐＮＰ濃度へのＯＤ４０５の依存として得られた検量線を用いて、絶対ｐＮＰ濃度を求めた。反応混合物中のＰＡＰＳの蓄積量（モル比）は、下記式から考慮して、ｐＮＰの蓄積量と等しいとみなした。
ＰＡＰ＋ｐＮＰＳ＝ＰＡＰＳ＋ｐＮＰ
【０１４２】
得られた実験データ（図４）から分かるように、ｃｙｓＱ、ｃｐｄＢ、およびａｐｈＡ遺伝子を欠失しているΔ５／ｐＳＴ１Ａ１株の粗細胞ライセートを用いた場合に、ＰＡＰのスルフリル化収率が最も高くなることが観察された。Δ５／ｐＳＴ１Ａ１株の粗細胞ライセートのＰＡＰＳの蓄積収率（μＭ）は、ｃｙｓＱ、ｃｐｄＢ、およびａｐｈＡ遺伝子を欠失していないΔ２／ｐＳＴ１Ａ１株の粗細胞ライセートの蓄積収率と比較して、約２倍以上であった。
【０１４３】
参考例  低分子量ヘパロサンＮ−硫酸塩（ＬＭＷＨＳ）の調製
（１）ヘパロサンの調製
（１．１）ヘパロサン発酵
国際公開第２０１５／０５０１８４号の実施例１に記載のヘパロサンを生成する細菌（大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＶＫ９−ｋｆｉＡＢＣＤ株）および培養条件を用いて、ヘパロサンを含む培養液を得た。
【０１４４】
（１．２）ヘパロサンの精製
遠心分離によって、培養液から培養液の上清を回収した。培地成分を除去するために、ＵＦ膜を用いてミリＱ水で培養液の上清１ｍＬを洗浄し、２５０μＬまで濃縮した。ＵＦ膜を用いて濃縮した２５０μＬの溶液に、５００μＬの１００％エタノールを添加し、ヘパロサンを遠心分離によって沈殿させた。結果として生じた沈殿物を空気中で乾燥させて、ヘパロサンを得た。残りの培養液の上清からも、同じ手順によりヘパロサンを精製した。合計１０ｇのヘパロサンを得た。
【０１４５】
（２）ヘパロサンのＮ−脱アセチル化
Ａ）１．２２ｇのヘパロサンに、６１ｍＬのヒドラジン水和物と４．７ｍＬの１Ｎ硫酸とを添加し、気相を窒素で置換した後、得られた混合物を１００℃に加熱し、４．７５時間反応させた。
Ｂ）氷冷却によって反応を停止した後、６１ｍＬの１６％ＮａＣｌ水溶液と６１０ｍＬのＭｅＯＨとを添加し、得られた混合物を遠心分離機にかけた。上清を除去した。結果として生じた沈殿物を、５０ｍＬのＨ２Ｏに溶解し、その後、Ａｍｉｃｏｎ  ＵＦ膜（３ｋＤａ）を用いて、脱塩かつ濃縮した。
Ｃ）結果として生じた濃縮液に、２倍の量のＨ２Ｏと等量の１Ｍ−ＮａＨＣＯ３とを添加し、その後、０．２Ｍ−Ｉ２／０．４Ｍ−ＫＩ溶液を、黄色になるまで滴下した。次に、ヒドラジン水和物を滴下して過剰なヨウ素をヨウ素イオンに還元し、その後、上記溶液を、Ａｍｉｃｏｎ  ＵＦ膜（３ｋＤａ）を用いて、再度、脱塩かつ濃縮した。濃縮溶液を減圧下で乾燥してＮ−脱アセチル化ヘパロサンを得た。得られたＮ−脱アセチル化ヘパロサン中のアセチル基の残留率は、１４．９％であった（後述する）。
【０１４６】
（３）Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンの脱重合
（３．１）ヘパリナーゼＩＩＩの調製
（３．１．１）フラボバクテリウム・ヘパリナム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｅｐａｒｉｎｕｍ）に固有のｈｅｐＣ遺伝子を保持する発現プラスミドの構築
フラボバクテリウム・ヘパリナムに固有のヘパリナーゼＩＩＩをコードするｈｅｐＣ遺伝子を、ｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０ベクターにクローニングして（米国特許出願公開番号２００５０１９６８４６）、ｈｅｐＣ遺伝子発現プラスミドｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０−ｈｅｐＣを構築した。ｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０−ｔｅｒは、強力なｎｌｐ０プロモーター（Ｐｎｌｐ０）とｒｒｎＢターミネーターとを含み、プロモーターとターミネーターの間に目的遺伝子を挿入することによって、発現ユニットとして機能することができる。「Ｐｎｌｐ０」は、大腸菌Ｋ１２株に固有の野生型ｎｌｐＤ遺伝子のプロモーターを表す。
【０１４７】
発現プラスミドの構築に関する詳細を以下に示す。ｎｌｐＤ遺伝子のための約３００ｂｐのプロモーター領域（Ｐｎｌｐ０）を含むＤＮＡ断片を、プライマーＰ５（配列番号１７）およびプライマーＰ６（配列番号１８）を用いて、鋳型としての大腸菌ＭＧ１６５５からの染色体ＤＮＡとのＰＣＲによって得た。制限酵素ＳａｌＩおよびＰａｅＩのための部位を、上記プライマー各々の５’末端に設計した。ＰＣＲサイクルは、以下のとおりであった。最初に９５℃で３分。次に、９５℃で６０秒と、５０℃で３０秒と、７２℃で４０秒とを２サイクル。続いて、９４℃で２０秒と、５５℃で２０秒と、７２℃で１５秒とを２５サイクル。最後に７２℃で５分。結果として生じたＤＮＡ断片を、ＳａｌＩとＰａｅＩで処理し、ｐＭＩＶ−５ＪＳのＳａｌＩ−ＰａｅＩ部位に挿入して（特開２００８−９９６６８）、プラスミドｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０を得た。このｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０プラスミドに挿入されたＰｎｌｐ０プロモーターのＰａｅＩ−ＳａｌＩ断片のヌクレオチド配列は、配列番号１９に示すとおりである。
【０１４８】
次に、ｒｒｎＢ遺伝子のターミネーター領域約３００ｂｐを含むＤＮＡ断片（配列番号２０）を、プライマーＰ７（配列番号２１）およびプライマーＰ８（配列番号２２）を用いて、鋳型としてのＭＧ１６５５からの染色体ＤＮＡとのＰＣＲによって得た。制限酵素ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩのための部位を、上記プライマー各々の５’末端に設計した。ＰＣＲサイクルは、以下のとおりであった。最初に９５℃で３分。次に、９５℃で６０秒と、５０℃で３０秒と、７２℃で４０秒とを２サイクル。続いて、９４℃で２０秒と、５９℃で２０秒と、７２℃で１５秒とを２５サイクル。最後に７２℃で５分。結果として生じた断片を、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで処理し、ｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０のＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入して、プラスミドｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０−ｔｅｒを得た。
【０１４９】
次に、フラボバクテリウム・ヘパリナム（ＡＴＣＣ１３１２５、Ｓｕ  Ｈ．ら、Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９９６年、６２：２７２３−２７３４）に固有のｈｅｐＣ遺伝子のＯＲＦを含むＤＮＡ鎖を、人工的に合成した。ｈｅｐＣ遺伝子のＤＮＡ断片を、プライマーＰ９（配列番号２３）およびプライマーＰ１０（配列番号２４）を用いて、鋳型としてのこのＤＮＡ鎖とのＰＣＲによって増幅した。プロトコールに記載された反応組成物において、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ社）を用いて、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲサイクルは、以下のとおりであった。最初に９４℃で５分。次に、９８℃で５秒と、５５℃で１０秒と、７２℃で８分とを３０サイクル。最後に４℃で維持した。また、ｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０のＤＮＡ断片を、プライマーとしてプライマーＰ１１（配列番号２５）およびプライマーＰ１２（配列番号２６）のオリゴヌクレオチドを用いて、鋳型ＤＮＡとしてのｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０とのＰＣＲによって得た。ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ社）とプロトコールに記載された反応組成物を用いて、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲサイクルは、以下のとおりであった。最初に９４℃で５分。次に、９８℃で５秒と、５５℃で１０秒と、７２℃で６分とを３０サイクル、最後に４℃で維持した。結果として生じた両ＤＮＡ断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて連結して、ｈｅｐＣ遺伝子発現プラスミドｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０−ｈｅｐＣを構築した。クローニングしたｈｅｐＣ遺伝子のヌクレオチド配列、およびそれによってコードされたヘパリナーゼＩＩＩ（ＨｅｐＣ）のアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号２７および配列番号２８に示される。
【０１５０】
（３．１．２）ｈｅｐＣ遺伝子を発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株の構築とヘパリナーゼＩＩＩ酵素液の調製
ｈｅｐＣ遺伝子発現プラスミドｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０−ｈｅｐＣを、エレクトロポレーション（細胞８０μＬ、２００Ω、２５μＦ、１．８ｋＶ、キュベット０．１ｍＬ）により、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に導入して、ヘパリナーゼＩＩＩを産生する株としての大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０−ｈｅｐＣ株を得た。この株を、２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール付加ＬＢ培地において、３７℃で一晩、予備培養した。次に、培養液を、終濃度２％（ｖ／ｖ）で、坂口フラスコ内の３００ｍＬのＬＢ培地に接種した。３７℃で４時間、振とう培養を実施し、その後、培養を停止した。遠心分離の後、微生物細胞を、０．８５％ＮａＣｌで２回洗浄し、３０ｍＬの５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。懸濁液に超音波破砕を施し、微生物細胞を破砕した。破砕した微生物細胞液を遠心分離機にかけ、上清（無細胞抽出液）としてヘパリナーゼＩＩＩ酵素液を調製した。
【０１５１】
（３．２）ヘパリナーゼＩＩＩを用いた、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンの脱重合
（２）で得られたＮ−アセチル基残留率１４．９％のＮ−脱アセチル化ヘパロサン１ｇと、３１．３ｍＩＵ／μＬヘパリナーゼＩＩＩ溶液２ｍＬとを、１００ｍＭのＮａＣｌと１．５ｍＭのＣａＣｌ２とを含むＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）１００ｍＬに溶解し、３７℃で５．３時間反応させた。反応液に、１００ｍＬの１６％ＮａＣｌ水溶液と９００ｍＬのＥｔＯＨとを添加かつ混合し、遠心分離機にかけて上清を除去し、かつ脱重合したＮ−脱アセチル化ヘパロサンを得た。
【０１５２】
（４）脱重合したＮ−脱アセチル化ヘパロサンのＮ−硫酸化
Ａ）（３）で得られた脱重合したＮ−脱アセチル化ヘパロサン１ｇを、５０ｍＬのミリＱ水に溶解し、得られた溶液に、２０ｍｇ／ｍＬのＮａＨＣＯ３／２０ｍｇ／ｍＬのトリメチルアミンＳＯ３の水溶液５０ｍＬを添加し、得られた混合物を５５℃で一晩反応させた。
Ｂ）混合物に、１ＬのＥｔＯＨを添加し、その後、遠心分離機にかけて上清を除去してＮ−硫酸化脱重合ヘパロサンを得た。
Ｃ）得られたＮ−硫酸化脱重合ヘパロサンを、５００μＬになるまでミリＱ水に溶解し、二糖類分析を行ってＮ−脱アセチル化ヘパロサンに対する収率を算出した。また、ＧＰＣにかけて、分子量分布を算出した。その手順を以下に示す。
【０１５３】
＜二糖類分析＞
これまでに報告された条件（Ｔ．  Ｉｍａｎａｒｉら，“Ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ”，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，１９９６，７２０：２７５−２９３）にしたがって、Ｎ−硫酸化脱重合ヘパロサンの二糖類分析を実施した。つまり、ヘパリナーゼＩＩおよびＩＩＩを用いてＮ−硫酸化脱重合ヘパロサンを不飽和二糖類に分解し、各分解生成物をＨＰＬＣで分析することによって、各二糖類構成要素の量を定量化した。
【０１５４】
同様に、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンの二糖類分析を実施した。Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンをＮ−硫酸化した後、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンの二糖類分析を実施した。つまり、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンをＮ−硫酸化し、続いて、ヘパリナーゼＩＩおよびＩＩＩを用いて不飽和二糖類へと分解し、そして、各分解生成物をＨＰＬＣで分析することによって、各二糖類構成要素の量を定量化した。脱重合されたＮ−脱アセチル化ヘパロサンをＮ−硫酸化した場合と同様に、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンをＮ−硫酸化した。
【０１５５】
具体的には、下記の手順によって二糖類分析を行った。
１）０．２ＵのヘパリナーゼＩＩ（Ｓｉｇｍａ社）、０．０２〜０．０３ｍＩＵのヘパリナーゼＩＩＩ、５μｇの多糖類試料、および１０μＬの酵素消化用緩衝液（１００ｍＭのＣＨ３ＣＯＯＮａ、１０ｍＭの（ＣＨ３ＣＯＯ）２Ｃａ、ｐＨ７．０）を混合して、測定量１００μＬになるまでミリＱ水で希釈し、反応液として使用した。
２）反応液を１６時間以上３７℃で維持し、次に、２分間１００℃で沸騰させ、反応を停止した。
３）不純物を０．４５μｍフィルタにより除去して溶液を得、その後、得られた溶液を二糖類分析用試料として使用した。
４）温度５０℃、流量０．２５ｍＬ／分、および検知波長２３０ｎｍの条件下で、粒径５μｍ、１５０ｍｍ×２．１ｍｍのＩｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３のカラムを用い、また、溶液Ａとして４％アセトニトリルおよび１．２ｍＭのトリブチルアミン、ならびに溶液Ｂとして４％アセトニトリルおよび０．１ＭのＣｓＣｌからなる溶出液組成物を用い、溶液Ｂのグラジエント１％〜９０％で、分析を実施した。
【０１５６】
各多糖類試料から生成した二糖類構成要素の総量から収率を算出した。つまり、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンから生成した二糖類の総量に対する、Ｎ−硫酸化脱重合ヘパロサンから生成した二糖類の総量のパーセンテージ（モル比）として、収率を算出した。また、このとき、Ｎ−アセチル化によって生成したアミノ基の９９％以上を、得られたＮ−硫酸化脱重合ヘパロサンにおいて、Ｎ−硫酸化した。
【０１５７】
また、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンから生成した各二糖類構成要素の量に基づいて、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサン中のＮ−アセチル基の残留率を算出した。つまり、二糖類の総量に対する、アセチル基を有する二糖類の量のパーセンテージ（モル比）として、アセチル基の残留率を算出した。アセチル基の残留率は１４．９％であった。
【０１５８】
＜ＧＰＣ分析＞
（ミリＱ水に１ｍｇ／ｍＬで溶解されている）Ｎ−硫酸化脱重合ヘパロサンおよびヘパラン硫酸を、ＨＰＬＣ（ＧＰＣ分析）によってゲルろ過した。ＧＳ５２０（Ｓｈｏｄｅｘ、Ａｓａｈｉｐａｋ  ＧＳ−５２０ＨＱ、７．５ｍｍ×３００ｍｍ、粒径７μｍ）をカラムとして使用し、１００ｍＭのリン酸二水素カリウムの水溶液を溶出液として使用し、流量０．６ｍＬ／分、カラム温度４０℃、および検知波長２００ｎｍで、分析を実施した。標準としてプルランの分子量マーカーセット（Ｓｈｏｄｅｘ社、ＳＴＡＮＤＡＲＤ  Ｐ−８２、分子量５９００〜７０８０００）を用いて、平均分子量（ＭｎおよびＭｗ）を算出した。
【０１５９】
産業上の利用可能性
本発明の方法は、アルコール類およびアミン類のＯ−およびＮ−硫酸化誘導体の酵素製造に有用である。特に、上記方法は、ヘパリンおよびヘパラン硫酸の製造に好適である。
【０１６０】
【表１】
2021529511.tif 000003
【０１６１】
【表２】
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【０１６２】
【表３】
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【０１６３】
【表４】
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【０１６４】
【表５】
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【図１】
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【図２Ａ】
2021529511.tif 000009
【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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