(57)【要約】本発明は、無傷ミトコンドリアおよび／または破裂ミトコンドリアを含む組成物を使用して、細胞内の脂質代謝を上昇させる方法に関する。本発明は、脂質およびコレステロール代謝の上昇から恩恵を受ける疾患を治療するための方法、ならびに体重減少を誘発するための方法または体重増加を低減するための方法であって、無傷ミトコンドリアおよび／または破裂ミトコンドリアを含む組成物を、組成物を必要とする対象に投与することを含む、方法をさらに提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質およびコレステロール代謝の上昇を必要とする対象における脂質およびコレステロール代謝の上昇に使用するための、無傷ミトコンドリアおよび／または破裂ミトコンドリアを含む、組成物。
【請求項２】
前記破裂ミトコンドリアを含む前記組成物が、前記破裂ミトコンドリアから放出される少なくとも１つのミトコンドリア構成物をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記構成物が、ミトコンドリアタンパク質、ミトコンドリア核酸、ミトコンドリア脂質、ミトコンドリアペプチド、ミトコンドリア糖、ミトコンドリア構造、ミトコンドリアマトリックスの少なくとも一部、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記無傷ミトコンドリアを含む前記組成物が、高張液をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ミトコンドリアが、単離されたミトコンドリアであり、前記単離されたミトコンドリア中の前記ミトコンドリアタンパク質の重量が、前記ミトコンドリアおよび他の細胞内細胞タンパク質の合計重量の８０％超を構成する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記ミトコンドリアが、部分的に精製されたミトコンドリアであり、前記部分的に精製されたミトコンドリア中の前記ミトコンドリアタンパク質の重量が、前記ミトコンドリアおよび他の細胞内タンパク質の合計重量の１０％〜８０％を構成する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記部分的に精製されたミトコンドリア中の前記ミトコンドリアタンパク質の重量が、前記ミトコンドリアおよび他の細胞内タンパク質の合計重量の２０％〜４０％を構成する、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記ミトコンドリアが、凍結融解サイクルを受けている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記ミトコンドリアが、胎盤、培養物中で成長した胎盤細胞、血液細胞、植物組織、植物細胞、または培養物中で成長した植物細胞からなる群から選択される細胞または組織に由来する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ミトコンドリアが、リョクトウもやしに由来する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
脂質およびコレステロール代謝を上昇させることが、総コレステロールの血中濃度、ＬＤＬコレステロールの血中濃度、トリグリセリドの血中濃度、脂肪細胞中の脂肪酸および／もしくはトリグリセリドの濃度、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのパラメータを低下させることを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、経腸、非経口、静脈内、動脈内、皮下、経口、および組織または器官への直接注射からなる群から選択される経路によって、前記組成物を必要とする前記対象に投与される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
脂質およびコレステロール代謝の上昇から恩恵を受ける疾患の治療または予防に使用するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
脂質およびコレステロール代謝の上昇から恩恵を受ける前記疾患が、肥満、腹腔内脂肪組織の増加に関連する疾患、内臓肥満、内臓脂肪組織症候群、脂肪肝疾患、およびセルライトからなる群から選択される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
脂質およびコレステロール代謝の上昇から恩恵を受ける前記疾患が、肥満である、請求項１３または１４に記載の組成物。
【請求項１６】
体重減少の誘発または体重増加の減弱もしくは低減を必要とする対象における、体重減少の誘発または体重増加の減弱もしくは低減に使用するための、無傷ミトコンドリアおよび／または破裂ミトコンドリアを含む、組成物。
【請求項１７】
前記破裂ミトコンドリアを含む前記組成物が、前記破裂ミトコンドリアから放出される少なくとも１つのミトコンドリア構成物をさらに含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記構成物が、ミトコンドリアタンパク質、ミトコンドリア核酸、ミトコンドリア脂質、ミトコンドリアペプチド、ミトコンドリア糖、ミトコンドリア構造、ミトコンドリアマトリックスの少なくとも一部、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記無傷ミトコンドリアを含む前記組成物が、高張液をさらに含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ミトコンドリアが、単離されたミトコンドリアであり、前記単離されたミトコンドリア中の前記ミトコンドリアタンパク質の重量が、前記ミトコンドリアおよび他の細胞内細胞タンパク質の合計重量の８０％超を構成する、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ミトコンドリアが、部分的に精製されたミトコンドリアであり、前記部分的に精製されたミトコンドリア中の前記ミトコンドリアタンパク質の重量が、前記ミトコンドリアおよび他の細胞内タンパク質の合計重量の１０％〜８０％を構成する、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記部分的に精製されたミトコンドリア中の前記ミトコンドリアタンパク質の重量が、前記ミトコンドリアおよび他の細胞内タンパク質の合計重量の２０％〜４０％を構成する、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ミトコンドリアが、凍結融解サイクルを受けている、請求項１６〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記ミトコンドリアが、胎盤、培養物中で成長した胎盤細胞、血液細胞、植物組織、植物細胞、または培養物中で成長した植物細胞からなる群から選択される細胞または組織に由来する、請求項１６〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ミトコンドリアが、リョクトウもやしに由来する、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記組成物が、経腸、非経口、静脈内、動脈内、皮下、経口、および組織または器官への直接注射からなる群から選択される経路によって、前記組成物を必要とする前記対象に投与される、請求項１６〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
脂質およびコレステロール代謝の上昇を必要とする対象における脂質およびコレステロール代謝を上昇させるための方法であって、
（ａ）無傷ミトコンドリアおよび／または破裂ミトコンドリアを含む組成物を提供することと、
（ｂ）前記対象に治療有効量の前記組成物を投与し、それにより脂質またはコレステロール代謝を上昇させることと、を含む、方法。
【請求項２８】
前記破裂ミトコンドリアを含む前記組成物が、前記破裂ミトコンドリアから放出される少なくとも１つのミトコンドリア構成物をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記無傷ミトコンドリアを含む前記組成物が、高張液をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記ミトコンドリアが、単離されたミトコンドリアであり、前記単離されたミトコンドリア中の前記ミトコンドリアタンパク質の重量が、前記ミトコンドリアおよび他の細胞内細胞タンパク質の合計重量の８０％超を構成する、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ミトコンドリアが、部分的に精製されたミトコンドリアであり、前記部分的に精製されたミトコンドリア中の前記ミトコンドリアタンパク質の重量が、前記ミトコンドリアおよび他の細胞内タンパク質の合計重量の１０％〜８０％を構成する、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ミトコンドリアが、凍結融解サイクルを受けている、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ミトコンドリアが、胎盤、培養物中で成長した胎盤細胞、血液細胞、植物組織、植物細胞、または培養物中で成長した植物細胞からなる群から選択される細胞または組織に由来する、請求項２７〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記組成物が、経腸、非経口、静脈内、動脈内、皮下、経口、および組織または器官への直接注射からなる群から選択される経路によって、前記組成物を必要とする前記対象に投与される、請求項２７〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記組成物が、経口投与によって投与される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記組成物が、前記対象の脂肪組織に投与される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
脂質およびコレステロール代謝を上昇させることが、総コレステロールの血中濃度、ＬＤＬコレステロールの血中濃度、トリグリセリドの血中濃度、脂肪細胞中の脂肪酸および／もしくはトリグリセリドの濃度、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのパラメータを低下させることを含む、請求項２７〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
脂質およびコレステロール代謝の上昇から恩恵を受ける疾患を治療または予防するための、請求項２７〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
脂質およびコレステロール代謝の上昇から恩恵を受ける前記疾患が、肥満、腹腔内脂肪組織の増加に関連する疾患、内臓肥満、内臓脂肪組織症候群、脂肪肝疾患、およびセルライトからなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
脂質およびコレステロール代謝の上昇から恩恵を受ける前記疾患が、肥満である、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記方法が、薬物療法を投与することをさらに含み、前記薬物療法が、脂肪吸収を低減する薬物、満腹を制御する薬物、総コレステロールおよびＬＤＬコレステロールのレベルを低減するための薬物、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
体重減少の誘発または体重増加の減弱もしくは低減を必要とする対象における、体重減少を誘発するための方法または体重増加を減弱もしくは低減するための方法であって、
（ａ）無傷ミトコンドリアおよび／または破裂ミトコンドリアを含む組成物を提供することと、
（ｂ）前記対象に治療有効量の前記組成物を投与することと、を含む、方法。
【請求項４３】
前記破裂ミトコンドリアを含む前記組成物が、前記破裂ミトコンドリアから放出される少なくとも１つのミトコンドリア構成物をさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記無傷ミトコンドリアを含む前記組成物が、高張液をさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記ミトコンドリアが、単離されたミトコンドリアであり、前記単離されたミトコンドリア中の前記ミトコンドリアタンパク質の重量が、前記ミトコンドリアおよび他の細胞内細胞タンパク質の合計重量の８０％超を構成する、請求項４２〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記ミトコンドリアが、部分的に精製されたミトコンドリアであり、前記部分的に精製されたミトコンドリア中の前記ミトコンドリアタンパク質の重量が、前記ミトコンドリアおよび他の細胞内タンパク質の合計重量の１０％〜８０％を構成する、請求項４２〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記ミトコンドリアが、凍結融解サイクルを受けている、請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記ミトコンドリアが、胎盤、培養物中で成長した胎盤細胞、血液細胞、植物組織、植物細胞、または培養物中で成長した植物細胞からなる群から選択される細胞または組織に由来する、請求項４２〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記組成物が、経腸、非経口、静脈内、動脈内、皮下、経口、および組織または器官への直接注射からなる群から選択される経路によって、前記組成物を必要とする前記対象に投与される、請求項４２〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記組成物が、経口投与によって投与される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記組成物が、前記対象の前記脂肪組織に投与される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記方法が、薬物療法を投与することをさらに含み、前記薬物療法が、脂肪吸収を低減する薬物、満腹を制御する薬物、総コレステロールおよびＬＤＬコレステロールのレベルを低減するための薬物、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項４２〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無傷ミトコンドリアおよび／または破裂ミトコンドリアを含む組成物を使用して、細胞内の脂質代謝を上昇させる方法に関する。本発明は、脂質およびコレステロール代謝の上昇から恩恵を受ける疾患を治療するための方法、ならびに体重減少を誘発するための方法または体重増加を低減するための方法であって、無傷ミトコンドリアおよび／または破裂ミトコンドリアを含む組成物を、組成物を必要とする対象に投与することを含む、方法をさらに提供する。
【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリアは、ピルビン酸酸化、クレブス回路、ならびにアミノ酸、脂肪酸、およびステロイドの代謝などの、真核細胞内の多数の重要な課題を実行する。ミトコンドリアの主な機能は、電子伝達鎖および酸化的リン酸化系（「呼吸鎖」）によるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）としてのエネルギーの生成である。ミトコンドリアが関与する追加のプロセスには、熱産生、カルシウムイオンの貯蔵、カルシウムシグナリング、プログラム細胞死（アポトーシス）、および細胞増殖が含まれる。
【０００３】
ミトコンドリアは、ほぼ全ての真核生物に見出され、細胞型に応じて数および位置が異なる。ミトコンドリアは、それら独自のＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）、ならびにＲＮＡおよびタンパク質を合成するためのそれら独自の機構を含有する。ｍｔＤＮＡは、３７個しか遺伝子を有しないため、哺乳動物の体内の遺伝子産物のほとんどは、核ＤＮＡによってコードされている。
【０００４】
本発明者らに対するＷＯ２０１３／０３５１０１は、ミトコンドリア組成物およびそれを使用する治療方法に関し、部分的に精製された機能的なミトコンドリアの組成物、および組成物を使用して、組成物を必要とする対象に組成物を投与することによってミトコンドリア機能の増加から恩恵を受ける病態を治療する方法を開示する。
【０００５】
脂質の貯蔵、分解、および腸管吸収に影響を与える病態は、いわゆる「脂質代謝障害」の幅広いカテゴリに含まれる。脂質代謝障害には、食事性および定型的高コレステロール血症、無ベータリポタンパク血症、ならびに低ベータリポタンパク血症が含まれる。アンダーソン病およびアテローム動脈硬化症を含む、いくつかの他の原因不明の脂質代謝障害もまた、確認されている。脂質代謝障害の一般的な症状には、慢性下痢、不十分な体重増加または体重減少、肥満、および過剰体重の減少不能が含まれるが、これらに限定されない。
【０００６】
米国特許第６，６１６，９２６号は、脂質代謝および貯蔵を調節する方法を対象とする。
【０００７】
米国特許第６，９２９，８０６号は、脂質代謝を改善し、高血圧を低減するための薬剤を対象とする。牛乳由来の塩基性タンパク質画分および塩基性ペプチド画分が、脂質代謝を改善し、高血圧を低減するための薬剤の有効構成成分として使用するために提供されている。
【０００８】
米国特許第７，２３８，７２７号は、脂質代謝を改善するための組成物、高脂血症を予防または治療するための組成物、肥満を予防または治療するための組成物、ならびに高脂血症および肥満を予防または緩和するための食品を提供し、これらは、有効成分としてバリンを含有する。
【０００９】
中村ら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｆｏｏｄ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５３（１），５８１−５９０；２０１６）は、５種類の市販のもやしにおける生理活性薬剤の特性評価、ならびにフルクトースを負荷した自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）におけるそれらの降圧、抗高脂血症、および抗糖尿病効果の比較を提供する。
【００１０】
脂質およびコレステロールのレベルの低減を必要とする対象における脂質およびコレステロールのレベルを低減するための新たな治療方法、ならびに肥満の効果的な治療方法であって、安全で費用効果が高く、副作用が最小で、かつ侵襲性が低〜中程度である、治療方法に対する満たされていない医学的必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、その実施形態において、無傷ミトコンドリアおよび／または破裂ミトコンドリアを含む組成物を、組成物を必要とする対象に投与することによる、脂質およびコレステロール代謝を上昇させるための方法を初めて開示する。具体的には、本発明は、細胞内の脂質含有量を減少させ、それにより体脂肪の低減を必要とする対象における体脂肪の低減を誘発する方法を開示する。いくつかの実施形態によれば、本発明は、総コレステロールおよび／または低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールのレベルの低減を必要とする対象における総コレステロールおよび／または低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールのレベルを低減する方法を開示する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００１２】
本発明は、脂肪細胞をミトコンドリアとともにインキュベートすると、本明細書で以下に例示されるように、細胞脂質蓄積中に有意な減少がもたらされるという予想外の発見に一部基づいている。
【００１３】
一態様によれば、本発明は、脂質およびコレステロール代謝の上昇を必要とする対象における脂質およびコレステロール代謝の上昇に使用するための、無傷ミトコンドリアおよび／または破裂ミトコンドリアを含む組成物を提供する。
【００１４】
別の態様によれば、本発明は、体重減少の誘発または体重増加の減弱もしくは低減を必要とする対象における、体重減少の誘発または体重増加の減弱もしくは低減に使用するための、無傷ミトコンドリアおよび／または破裂ミトコンドリアを含む組成物を提供する。
【００１５】
別の態様によれば、本発明は、脂質およびコレステロール代謝の上昇を必要とする対象における脂質およびコレステロール代謝を上昇させるための方法であって、
（ａ）無傷ミトコンドリアおよび／または破裂ミトコンドリアを含む組成物を提供することと、
（ｂ）対象に治療上有効量の組成物を投与し、それにより脂質またはコレステロール代謝を上昇させることと、を含む、方法を提供する。
【００１６】
さらに別の態様によれば、本発明は、体重減少の誘発または体重増加の減弱もしくは低減を必要とする対象における、体重減少を誘発するための方法または体重増加を減弱もしくは低減するための方法であって、
（ａ）無傷ミトコンドリアおよび／または破裂ミトコンドリアを含む組成物を提供することと、
（ｂ）該対象に治療有効量の組成物を投与することと、を含む、方法を提供する。
【００１７】
いくつかの実施形態によれば、破裂ミトコンドリアを含む組成物は、破裂ミトコンドリアから放出された少なくとも１つのミトコンドリア構成物をさらに含む。いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つのミトコンドリア構成物は、ミトコンドリアタンパク質、ミトコンドリア核酸、ミトコンドリア脂質、ミトコンドリアペプチド、ミトコンドリア糖、ミトコンドリア構造、ミトコンドリアマトリックスの少なくとも一部、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００１８】
いくつかの実施形態によれば、無傷ミトコンドリアを含む組成物は、高張液をさらに含む。さらなる実施形態によれば、高張液は、糖を含む。またさらなる実施形態によれば、高張液は、スクロースを含む。
【００１９】
いくつかの実施形態によれば、ミトコンドリアは、単離されたミトコンドリアであり、単離されたミトコンドリア中のミトコンドリアタンパク質の重量は、ミトコンドリアおよび他の細胞内細胞タンパク質の合計重量の８０％超を構成する。
【００２０】
他の実施形態によれば、ミトコンドリアは、部分的に精製されたミトコンドリアであり、部分的に精製されたミトコンドリア中のミトコンドリアタンパク質の重量は、ミトコンドリアおよび他の細胞内タンパク質の合計重量の１０％〜８０％を構成する。特定の実施形態によれば、部分的に精製されたミトコンドリア中のミトコンドリアタンパク質の重量は、ミトコンドリアおよび他の細胞内タンパク質の合計重量の２０％〜４０％を構成する。
【００２１】
いくつかの実施形態によれば、ミトコンドリアは、凍結融解サイクルを受けている。
【００２２】
いくつかの実施形態によれば、ミトコンドリアは、胎盤、培養物中で成長した胎盤細胞、血液細胞、植物組織、植物細胞、または培養物中で成長した植物細胞からなる群から選択される細胞または組織に由来する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。特定の実施形態によれば、ミトコンドリアは、リョクトウもやしに由来する。
【００２３】
いくつかの実施形態によれば、脂質およびコレステロール代謝を上昇させることは、総コレステロールの血中濃度、ＬＤＬコレステロールの血中濃度、トリグリセリドの血中濃度、脂肪細胞中の脂肪酸および／もしくはトリグリセリドの濃度、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのパラメータを低下させることを含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００２４】
いくつかの実施形態によれば、組成物は、経腸、非経口、静脈内、動脈内、皮下、経口、および組織または器官への直接注射からなる群から選択される経路によって、組成物を必要とする対象に投与される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。特定の実施形態によれば、組成物は、経口投与によって投与される。他の実施形態によれば、組成物は、対象の脂肪組織に投与される。
【００２５】
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物および方法は、脂質およびコレステロール代謝の上昇から恩恵を受ける疾患の治療または予防に使用することができる。
【００２６】
いくつかの実施形態によれば、脂質およびコレステロール代謝の上昇から恩恵を受ける疾患は、肥満、腹腔内脂肪組織の増加に関連する疾患、内臓肥満、内臓脂肪組織症候群、脂肪肝疾患、およびセルライトからなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。特定の実施形態によれば、脂質およびコレステロール代謝の上昇から恩恵を受ける該疾患は、肥満である。
【００２７】
いくつかの実施形態によれば、本発明の方法は、薬物療法を投与することをさらに含み、該薬物療法は、脂肪吸収を低減する薬物、満腹を制御する薬物、総コレステロールおよびＬＤＬコレステロールのレベルを低減するための薬物、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００２８】
本発明のさらなる実施形態、特徴、利点、および適用可能性の全範囲は、本明細書で以下に与えられる発明を実施するための形態および図面から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の趣旨および範囲内の様々な変更および修正は、この発明を実施するための形態から当業者に明らかになるため、発明を実施するための形態は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、単に例示として与えられているにすぎないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】オイルレッド染色を使用して評価した、脂肪細胞に分化し、増加する量のミトコンドリア（「ミト」）とともにインキュベートした３Ｔ３−Ｌ１細胞の脂質含有量を示す棒グラフである。対照＝未分化３Ｔ３−Ｌ１細胞、Ｃ＋５０μｌのＭ＝５０μｌのミトコンドリアとともにインキュベートした未分化３Ｔ３−Ｌ１細胞。
【図２】ミトコンドリアとともに（ＢＳ＋ミト）またはミトコンドリアなしで（ＢＳ）インキュベートしたウシ血清中のコレステロール含有量を比較する棒グラフである。
【図３】新鮮なミトコンドリア（「新鮮」）対凍結したミトコンドリア（「Ｎ２／−７０」、液体窒素中で瞬間凍結し、−７０℃で３０分間保持）中の経時的なＯ２消費を示すドットプロットである。Ｓ＝２５ｍＭのコハク酸塩の存在、Ｓ＋ＡＤＰ＝２５ｍＭのコハク酸塩および１．６５ｍＭのＡＤＰの存在。
【図４Ａ】単離緩衝液（４Ａ）またはＰＢＳ（４Ｂ）中でインキュベートしたミトコンドリアの酸素消費を比較するドットプロットを示す。
【図４Ｂ】単離緩衝液（４Ａ）またはＰＢＳ（４Ｂ）中でインキュベートしたミトコンドリアの酸素消費を比較するドットプロットを示す。
【図４Ｃ】単離緩衝液またはＰＢＳ中でインキュベートしたミトコンドリアからのクエン酸合成酵素放出（％）を比較する棒グラフである。
【図５Ａ】単離緩衝液またはＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）中でインキュベートしたミトコンドリアの酸素消費を比較するドットプロットを示す。
【図５Ｂ】単離緩衝液またはＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）中でインキュベートしたミトコンドリアからのクエン酸合成酵素放出を比較する棒グラフである。
【図６】２０ｍＭのスクロース（ＭＰ）または２００ｍＭのスクロース（Ｍ）を含むミトコンドリア組成物中の経時的なＯ２消費を示すドットプロットである。
【図７】単離緩衝液（ＩＢ）またはＰＢＳ（ＰＢＳ）中に懸濁したミトコンドリアで処理したマウス３Ｔ３細胞内の経時的なＯ２消費を示すドットプロットである。
【図８】ＰＢＳ中に懸濁したミトコンドリア（ＰＢＳ）、または処理前に凍結および解凍したＰＢＳ中に懸濁したミトコンドリア（ＰＢＳ凍結）で処理したヒト１４３Ｂ細胞のクエン酸合成酵素活性を比較する棒グラフである。
【図９Ａ】コハク酸塩（Ｓ）またはコハク酸塩＋ＡＤＰ（Ｓ＋Ａ）の存在下で、単離緩衝液（「ＩＢ」）中またはＰＢＳ中のいずれかに懸濁したマウス胎盤ミトコンドリアの経時的なミトコンドリアＯ２消費を比較するドットプロットである。
【図９Ｂ】ＰＢＳ中または単離緩衝液（ＩＢ）中に懸濁したミトコンドリアのクエン酸合成酵素放出を比較する棒グラフである。
【図１０】単離緩衝液（ＩＢ）中またはＰＢＳ中に懸濁したミトコンドリアとともにインキュベートしたヒト１４３Ｂ細胞内のクエン酸合成酵素活性を比較した棒グラフである。ＮＴ＝対照、未処理細胞。
【図１１Ａ】低用量または高用量のミトコンドリアで治療した後の、高脂肪食（ＨＦＤ）または通常食（通常）のいずれかを給餌したＣ５７ＢＬマウスの体重の変化を示すドットプロットである。
【図１１Ｂ】ＨＦＤ群対高用量ミトコンドリアＨＦＤ群におけるコレステロールレベルを比較する棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明は、無傷ミトコンドリアおよび／または破裂ミトコンドリアを含む組成物の投与を通した、脂質およびコレステロールの代謝の上昇を必要とする対象における脂質およびコレステロールの代謝を上昇させるための組成物および方法に関する。本発明は、体重減少を誘発または体重増加を減弱／低減するための組成物および方法、ならびに脂質およびコレステロール代謝の上昇から利益を得る可能性がある疾患の治療または予防のための組成物および方法をさらに提供する。
【００３１】
一態様によれば、本発明は、脂質およびコレステロール代謝の上昇を必要とする対象における脂質およびコレステロール代謝を上昇させるための方法であって、
（ａ）無傷ミトコンドリアおよび／または破裂ミトコンドリアを含む組成物を提供することと、
（ｂ）組成物を必要とする対象に治療有効量の組成物を投与し、それにより脂質またはコレステロール代謝を上昇させることと、を含む、方法を提供する。
【００３２】
別の態様によれば、本発明は、脂質およびコレステロール代謝の上昇から恩恵を受ける疾患を治療または予防するための方法であって、
（ａ）無傷ミトコンドリアおよび／または破裂ミトコンドリアを含む組成物を提供することと、
（ｂ）対象に治療有効量の組成物を投与することと、を含む、方法を提供する。
【００３３】
さらに別の態様によれば、本発明は、体重減少の誘発または体重増加の減弱もしくは低減を必要とする対象における体重減少を誘発するための方法または体重増加を減弱もしくは低減するための方法であって、
（ａ）無傷ミトコンドリアおよび／または破裂ミトコンドリアを含む組成物を提供することと、
（ｂ）組成物を必要とする対象に治療有効量の組成物を投与し、それにより対象における体重減少を誘発または体重増加を減弱／低減することと、を含む、方法を提供する。
【００３４】
別の態様によれば、本発明は、体重減少の誘発を必要とする対象における体重減少を誘発するための方法であって、
（ａ）無傷ミトコンドリアおよび／または破裂ミトコンドリアを含む組成物を提供することと、
（ｂ）組成物を必要とする対象に治療有効量の組成物を投与し、それにより対象における体重減少を誘発することと、を含む、方法を提供する。
【００３５】
別の態様によれば、本発明は、体重増加の減弱または低減を必要とする対象における体重増加を減弱または低減するための方法であって、
（ａ）無傷ミトコンドリアおよび／または破裂ミトコンドリアを含む組成物を提供することと、
（ｂ）組成物を必要とする対象に治療有効量の組成物を投与し、それにより対象における体重増加を減弱／低減することと、を含む、方法を提供する。
【００３６】
一態様によれば、本発明は、脂質およびコレステロール代謝の上昇を必要とする対象における脂質およびコレステロール代謝の上昇に使用するための、無傷ミトコンドリアおよび／または破裂ミトコンドリアを含む組成物を提供する。
【００３７】
別の態様によれば、本発明は、脂質およびコレステロール代謝の上昇から恩恵を受ける疾患の治療または予防に使用するための、無傷ミトコンドリアおよび／または破裂ミトコンドリアを含む組成物を提供する。
【００３８】
さらに別の態様によれば、本発明は、体重減少の誘発または体重増加の減弱もしくは減少を必要とする対象における体重減少の誘発または体重増加の減弱もしくは減少に使用するための、無傷ミトコンドリアおよび／または破裂ミトコンドリアを含む組成物を提供する。
【００３９】
別の態様によれば、本発明は、体重減少の誘発を必要とする対象における体重減少の誘発に使用するための、無傷ミトコンドリアおよび／または破裂ミトコンドリアを含む組成物を提供する。
【００４０】
さらに別の態様によれば、本発明は、体重増加の減弱または減少を必要とする対象における体重増加の減弱または減少に使用するための、無傷ミトコンドリアおよび／または破裂ミトコンドリアを含む組成物を提供する。いくつかの態様によれば、本発明は、体重増加の減弱を必要とする対象における体重増加の減弱に使用するための、無傷ミトコンドリアおよび／または破裂ミトコンドリアを含む組成物を提供する。他の態様によれば、本発明は、体重増加の低減を必要とする対象における体重増加の低減に使用するための、無傷ミトコンドリアおよび／または破裂ミトコンドリアを含む組成物を提供する。
【００４１】
いくつかの実施形態によれば、破裂ミトコンドリアを含む組成物は、破裂ミトコンドリアから放出される少なくとも１つのミトコンドリア構成物をさらに含む。いくつかの実施形態によれば、ミトコンドリア構成物は、ミトコンドリアタンパク質、ミトコンドリア核酸、ミトコンドリア脂質、ミトコンドリア糖、ミトコンドリア構造、ミトコンドリアマトリックスの少なくとも一部、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００４２】
いくつかの実施形態によれば、無傷ミトコンドリアを含む組成物は、高張液をさらに含む。いくつかの実施形態によれば、高張液は、糖を含む。いくつかの実施形態によれば、高張液は、スクロースを含む。
【００４３】
別の実施形態によれば、ミトコンドリアは、凍結融解サイクルを受けている。
【００４４】
別の実施形態によれば、組成物は、経腸、非経口、静脈内、動脈内、皮下、経口、および組織または器官への直接注射からなる群から選択される経路によって、組成物を必要とする対象に投与される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００４５】
別の実施形態によれば、組成物は、対象の脂肪組織に投与される。
【００４６】
さらに別の実施形態によれば、組成物は、経口投与によって投与されてもよい。別の実施形態によれば、組成物は、食品添加物として経口投与されてもよい。別の実施形態によれば、組成物は、栄養補助食品として経口投与されてもよい。さらなる実施形態によれば、組成物は、飲み物または飲料への添加物として投与されてもよい。
【００４７】
別の実施形態によれば、本発明のミトコンドリアは、胎盤、培養物中で成長した胎盤細胞、および血液細胞からなる群から選択される細胞または組織に由来する。別の実施形態によれば、本発明のミトコンドリアは、ヒト胎盤、培養物中で成長したヒト胎盤細胞、およびヒト血液細胞からなる群から選択される細胞または組織に由来する。さらに別の実施形態によれば、本発明のミトコンドリアは、植物に由来する。いくつかの実施形態によれば、本発明のミトコンドリアは、植物組織、植物細胞、または培養物中で成長した植物細胞に由来する。いくつかの実施形態によれば、本発明のミトコンドリアは、マメに由来する。特定の実施形態によれば、本発明のミトコンドリアは、リョクトウに由来する。さらなる特定の実施形態によれば、本発明のミトコンドリアは、リョクトウもやしに由来する。
【００４８】
別の実施形態によれば、脂質およびコレステロール代謝の上昇から恩恵を受ける疾患は、肥満、腹腔内脂肪組織の増加に関連する疾患、内臓肥満、内臓脂肪組織症候群、脂肪肝疾患、およびセルライトからなる群から選択される。別の実施形態によれば、脂質およびコレステロール代謝の上昇から恩恵を受ける疾患は、肥満である。
【００４９】
別の実施形態によれば、本発明の方法は、追加の療法を施すことをさらに含む。別の実施形態によれば、追加の療法は、食事療法、身体活動、行動療法、薬物療法、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００５０】
別の実施形態によれば、薬物療法は、脂肪吸収を低減する薬物、満腹を制御する薬物、総コレステロールおよびＬＤＬコレステロールのレベルを低減するための薬物、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００５１】
別の実施形態によれば、総コレステロールおよびＬＤＬコレステロールのレベルを低減するための薬物は、ＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素阻害剤、ニコチン酸、フィブリン酸誘導体、胆汁酸捕捉剤、コレステロール吸収阻害剤、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００５２】
「脂質およびコレステロール代謝を上昇させること」という用語は、以下の選択肢、脂質代謝を上昇させること、コレステロール代謝を上昇させること、およびそれらの組み合わせのいずれかを指すことを理解されたい。
【００５３】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、脂質およびコレステロール代謝を上昇させるための方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、本発明は、脂質代謝を上昇させるための方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、本発明は、コレステロール代謝を上昇させるための方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、本発明は、脂質代謝およびコレステロール代謝のうちの少なくとも１つを上昇させるための方法を提供する。
【００５４】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、脂質代謝の上昇を必要とする対象における脂質代謝を上昇させるための方法であって、無傷ミトコンドリアおよび／または破裂ミトコンドリアを含む組成物を提供することと、組成物を必要とする対象に治療有効量の組成物を投与することと、を含む、方法を提供する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００５５】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、脂質代謝の上昇から恩恵を受ける疾患を治療するための方法であって、無傷ミトコンドリアおよび／または破裂ミトコンドリアを含む組成物を提供することと、組成物を必要とする対象に治療有効量の組成物を投与することと、を含む、方法を提供する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「脂質代謝を上昇させること」という用語は、脂質代謝の増加を指す。いくつかの実施形態によれば、脂質代謝は、細胞内の脂質代謝を指す。いくつかの実施形態によれば、脂質代謝を上昇させることには、脂質含有量の低減が含まれるが、これに限定されない。いくつかの実施形態によれば、脂質代謝を上昇させることは、脂質酸化の増加である。
【００５７】
いくつかの実施形態によれば、「脂質」という用語は、脂肪細胞内に存在する任意の種類の脂質を指す。いくつかの実施形態によれば、「脂質」という用語は、脂肪酸、トリグリセリド、およびそれらの組み合わせを指す。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。本明細書で使用される場合、「脂質含有量の低減」という用語は、脂肪細胞（ａｄｉｐｏｓｅ  ｃｅｌｌ）（本明細書では脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ）とも称される）内に位置する脂肪酸および／またはトリグリセリドの量／濃度の減少、故に脂肪細胞内の脂質レベル（本明細書では脂質貯蔵とも称される）の低減を指す。
【００５８】
いくつかの実施形態によれば、「脂質代謝を上昇させること」という用語は、脂肪細胞内および／または血中に位置する脂肪酸および／またはトリグリセリドの量／濃度を、治療前の量／濃度と比較して、少なくとも２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、または１００％の割合だけ低減することを指す。脂肪酸および／またはトリグリセリドの量は、当該技術分野で既知の方法、例えば、オイルレッドＯ染色、全脂質の滴定手順、および酵素分光光度手順によって測定することができる。
【００５９】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、脂質含有量の低減を必要とする対象における脂質含有量を低減するための方法であって、無傷ミトコンドリアおよび／または破裂ミトコンドリアを含む組成物を提供することと、組成物を必要とする対象に治療有効量の組成物を投与することと、を含む、方法を提供する。
【００６０】
いくつかの実施形態によれば、本明細書で使用される場合、「コレステロール代謝を上昇させること」という用語には、総コレステロールおよび／または低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールの血中濃度を低下させることが含まれるが、これらに限定されない。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。特定の実施形態によれば、「コレステロール代謝を上昇させること」という用語は、総コレステロールおよび／もしくは低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールの血中濃度、または総コレステロールを、治療前の濃度と比較して、少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、または１００％の割合だけ低下させることを指す。いくつかの実施形態によれば、「コレステロール」という用語は、総コレステロールを指す。いくつかの実施形態によれば、「コレステロール」という用語は、ＬＤＬコレステロールを指す。いくつかの実施形態によれば、「コレステロール」という用語は、総コレステロールおよび／またはＬＤＬコレステロールを指す。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態によれば、本発明の方法に従ってコレステロール代謝を上昇させることは、高血清コレステロールを治療および／または緩和する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００６１】
「高血清コレステロール」または「高総コレステロールおよびＬＤＬコレステロール」という用語は、本明細書では互換的に使用され、健康な対象に存在する正常なレベルを超える、対象におけるコレステロール血清レベルを指す。高血清コレステロールは、血清中の高コレステロールに関連する疾患の発症につながる可能性がある。コレステロールの正常なレベルは、人種および年齢群によって異なる。典型的には、コレステロールは、対象において、総血漿コレステロール、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロール、およびそれらの組み合わせのいずれかとして測定される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００６２】
コレステロールレベルに関して「正常を超える」および「正常よりも高い」という用語は、本明細書では互換的に使用される。正常なコレステロール値は、様々な要因に依存し、医療提供者の基準に従って決定することができる。典型的には、成人では、高血清コレステロール濃度は一般に、総血漿コレステロールでは約５．２〜約６．１８ｍｍｏｌ／Ｌ（２００〜２３９ｍｇ／ｄＬ）を超えるもの、および／またはＬＤＬコレステロールでは約３．３６〜約４．１１ｍｍｏｌ／Ｌ（１３０〜１５９ｍｇ／ｄＬ）を超えるものと見なされる。コレステロールレベルの下限は、年齢および性別などの様々な要因に応じて、対象にとって健康なものと見なされる。子供または青年の場合、健康なコレステロールレベルは、総血漿コレステロールでは約１２０ｍｇ／ｄＬ〜約１７０ｍｇ／ｄＬである。いくつかの実施形態では、ヒト対象における正常よりも高いコレステロールレベルは、総血漿コレステロールでは約２４０ｍｇ／ｄＬ超、約２２０ｍｇ／ｄＬ超、約２００ｍｇ／ｄＬ超、約１９０ｍｇ／ｄＬ超、約１８０ｍｇ／ｄＬ超、または約１７０ｍｇ／ｄＬ超である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００６３】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、総コレステロールおよび／またはＬＤＬコレステロールの代謝の上昇を必要とする対象における総コレステロールおよび／またはＬＤＬコレステロールの代謝を上昇させるための方法であって、無傷ミトコンドリアおよび／または破裂ミトコンドリアを含む組成物を提供することと、組成物を必要とする対象に治療有効量の組成物を投与することと、を含む、方法を提供する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態によれば、本発明は、高総コレステロールおよび高ＬＤＬコレステロールを患っている対象における総コレステロールおよび／またはＬＤＬコレステロールの代謝を上昇させるための方法を提供する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態によれば、本発明は、健康な対象における総コレステロールおよび／またはＬＤＬコレステロールの代謝を上昇させるための方法を提供する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００６４】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、総コレステロールおよび／またはＬＤＬコレステロールの血清レベルの低減を必要とする対象における総コレステロールおよび／またはＬＤＬコレステロールの血清レベルを低減するための方法であって、無傷ミトコンドリアおよび／または破裂ミトコンドリアを含む組成物を提供することと、組成物を必要とする対象に治療有効量の組成物を投与することと、を含む、方法を提供する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態によれば、本発明は、高総コレステロールおよび高ＬＤＬコレステロールを患っている対象における総コレステロールおよび／またはＬＤＬコレステロールの血清レベルを低下させるための方法を提供する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態によれば、本発明は、健康な対象における総コレステロールおよび／またはＬＤＬコレステロールの血清レベルを低減するための方法を提供する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００６５】
いくつかの実施形態によれば、本発明の方法は、脂質および／またはコレステロール代謝の上昇から恩恵を受ける疾患の治療または予防に使用される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。本明細書で使用される場合、「脂質および／またはコレステロール代謝の上昇から恩恵を受ける疾患」は、正常よりも高い脂質および／もしくはコレステロールのレベルをもたらす疾患、または正常よりも高い脂質および／もしくはコレステロールのレベルによって悪化する可能性がある疾患を指す。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。別の実施形態によれば、脂質および／またはコレステロール代謝の上昇から恩恵を受ける疾患は、過剰な脂質貯蔵に関連する疾患である。脂質および／またはコレステロールの正常なレベルは、性別および年齢などであるがこれらに限定されない、患者のパラメータに関連していることに留意されたい。いくつかの実施形態によれば、脂質および／またはコレステロール代謝の上昇から恩恵を受ける疾患は、セルライトである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。本明細書で使用される場合、「セルライト」という用語は、線維性結合組織内からの皮下脂質のヘルニア形成を指す。
【００６６】
別の実施形態によれば、脂質および／またはコレステロール代謝の上昇から恩恵を受ける疾患は、肥満、腹腔内脂肪組織の増加に関連する疾患、内臓肥満、内臓脂肪組織症候群、脂肪肝疾患、およびセルライトからなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。別の実施形態によれば、脂質および／またはコレステロール代謝の上昇から恩恵を受ける疾患は、肥満である。いかなる理論または機構によっても拘束されることを望むものではないが、脂質および／またはコレステロール代謝の上昇から恩恵を受ける疾患に苦しむ対象への本発明の組成物の投与は、脂質および／またはコレステロールレベルの低減、ならびに故に疾患の治療または緩和をもたらす。本発明の方法は、脂質および／もしくはコレステロール代謝の上昇から恩恵を受ける疾患を患っている対象、または脂質および／もしくはコレステロール代謝の上昇から恩恵を受ける疾患に罹患しやすいか、もしくはそれを有する疑いのある対象を治療することができることを理解されたい。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００６７】
本明細書で使用される場合、別段明記しない限り、「疾患を予防すること」という用語には、特定の疾患または障害に関連する症状の阻害または防止が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、別段明記しない限り、「治療すること」という用語は、疾患または障害の症状の発症後の組成物の投与を指す一方で、「予防すること」は、特に疾患または障害のリスクがある患者への、症状の発症前の投与を指す。
【００６８】
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物および方法を使用して、対象における体重減少を誘発する。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物および方法を使用して、対象における体脂肪の低減を誘発する。いかなる理論または機構によっても拘束されることを望むものではないが、本発明の組成物の投与は、脂質および／またはコレステロール代謝の上昇をもたらし、故に対象における体脂肪を低減し、体重減少を誘発する。
【００６９】
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物および方法は、同様の条件（すなわち、同じ生活習慣、食事、または身体活動）下で他の方法では体重の減少または体重増加の減弱もしくは低減がないであろう対象における体重減少を誘発すること、または体重増加を減弱もしくは低減することができる。
【００７０】
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物および方法を使用して、対象における体重増加を減弱または低減する。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物および方法を使用して、対象における体重増加を予防する。他の実施形態によれば、本発明の組成物および方法を使用して、対象における体重再増加を予防、減弱、または低減する。さらなる実施形態によれば、本発明の組成物および方法を使用して、過体重／肥満になりやすい対象における体重増加を予防、減弱、または低減する。特定の実施形態によれば、本発明の組成物および方法を使用して、２型糖尿病、薬物治療、禁煙などに関連する体重増加を予防、減弱、または低減する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「体重増加を減弱または低減する」および「体重増加を減弱または低減すること」という用語は、患者の体重増加を減少させることを指す。「体重再増加を減弱または減少させる」および「体重再増加を減弱または減少させること」という用語は、減量後に体重の回復を経験している患者の体重増加を減少させることを指す。体重再増加は、食事、運動、行動修正、または承認された療法を介して達成された体重減少の中止後のリバウンド効果によるものであり得る。
【００７２】
本発明の組成物および方法を用いて、過体重／肥満の個体を治療すること、および／または過体重／肥満になりやすい対象を治療することができることを理解されたい。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物および方法は、肥満または過体重の定義に該当しない局所脂質貯蔵障害（リピドーシスとしても知られる）を有する対象を治療することをさらに対象とする。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物および方法は、医学的体重減少および非医学的体重減少に使用することができる。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「それを必要とする対象」という用語は、脂質および／またはコレステロール代謝の上昇から恩恵を受ける疾患に罹患しているか、またはそれに罹患するリスクがある対象を指す。いくつかの実施形態によれば、それを必要とする対象は、体重減少を必要とするかもしくは望む対象、またはより低い脂質および／またはコレステロールレベルを必要とする対象である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態によれば、「それを必要とする対象」という用語は、肥満、過体重、内臓肥満、過剰な脂質貯蔵に関連する疾患または障害、腹腔内脂肪組織の増加に関連する疾患、内臓脂肪組織症候群、脂肪肝疾患、セルライト、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される病態のうちの少なくとも１つを患っている対象を指す。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、任意のヒトまたは非ヒト対象を指し得る。一実施形態では、対象は、哺乳動物対象である。特定の実施形態では、哺乳動物対象は、ヒト対象である。
【００７４】
いくつかの実施形態では、対象は、脂質および／もしくはコレステロール代謝の上昇から恩恵を受ける疾患に罹患しているか、またはそれに罹患するリスクがあるヒト対象、あるいは体重減少を必要とするか、もしくは望んでいるヒト対象、またはより低い脂質および／またはコレステロールレベルを必要とするヒト対象であり得る。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。他の実施形態では、対象は、肥満、過体重、内臓肥満、過剰な脂質貯蔵に関連する疾患または障害、腹腔内脂肪組織の増加に関連する疾患、内臓脂肪組織症候群、脂肪肝疾患、セルライト、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される病態のうちの少なくとも１つを患っているヒト対象である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「過体重」という用語は、２５〜２９．９ｋｇ／ｍ２の肥満度指数（ＢＭＩ）を指す。本明細書で使用される場合、「肥満」という用語は、３０ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩを指す。「過体重」および「肥満」という用語の範囲は、当該技術分野で既知の任意の体重評価方法によって評価することができ、肥満度指数に基づく評価に限定されないことに留意されたい。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「内臓肥満」という用語は、皮下ではなく、腹部内臓および網に脂肪が過剰に沈着することによる肥満の形態を指す。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、脂質および／またはコレステロール代謝を上昇させるのに有効な本発明の組成物の量を指す。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態によれば、本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、脂質および／またはコレステロール代謝を、脂質および／またはコレステロール代謝の上昇から恩恵を受ける疾患の治療または予防を可能にするレベルまで上昇させるのに有効な本発明の組成物の量を指す。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。他の実施形態によれば、本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、脂質および／またはコレステロール代謝を、対象における体重減少の達成または体重増加の低減／予防／減弱を可能にするレベルまで上昇させるのに有効な本発明の組成物の量を指す。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００７８】
コレステロール代謝に特に言及する「治療有効量」という用語は、総コレステロールおよび／またはＬＤＬコレステロールの低減を必要とする対象の血中の総コレステロールおよび／またはＬＤＬコレステロールを、高レベルとは見なされないレベルまで低減するのに有効な組成物の量を指す。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００７９】
別の実施形態によれば、本発明の方法は、追加の療法を施すことをさらに含む。別の実施形態によれば、追加の療法は、食事療法、身体活動、行動療法、薬物療法、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。別の実施形態によれば、薬物療法は、脂肪吸収を低減する薬物、満腹を制御する薬物、総コレステロールおよびＬＤＬコレステロールのレベルを低減する薬物、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「総コレステロールおよびＬＤＬコレステロールを低減するための薬物療法」ならびに「総コレステロールおよびＬＤＬコレステロールのレベルを低減するための薬物」という用語は、互換的に使用される。別の実施形態によれば、総コレステロールおよびＬＤＬコレステロールを低減するための薬物療法は、３−ヒドロキシ−３−メチル−グルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素）阻害剤、ニコチン酸、フィブリン酸誘導体、胆汁酸捕捉剤、コレステロール吸収阻害剤、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００８１】
本明細書で使用される場合、「組成物」および「本発明の組成物」という用語は、互換的に使用される。いくつかの実施形態によれば、本明細書で使用される場合、「本発明の組成物」という用語は、無傷ミトコンドリアおよび／または破裂ミトコンドリアを含む組成物を指す。いくつかの実施形態によれば、本明細書で使用される場合、「本発明の組成物」という用語は、無傷ミトコンドリアおよび破裂ミトコンドリアからなる群から選択されるミトコンドリアを指す。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、破裂ミトコンドリアを含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、無傷ミトコンドリアを含む。他の実施形態によれば、本発明の組成物は、無傷ミトコンドリアおよび破裂ミトコンドリアを含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、少なくとも１つのミトコンドリア構成物を含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、破裂ミトコンドリアおよび少なくとも１つのミトコンドリア構成物を含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、破裂ミトコンドリア、ならびに破裂ミトコンドリアから放出および／または分泌される少なくとも１つのミトコンドリア構成物を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、部分的に精製されたミトコンドリアを含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、単離されたミトコンドリアを含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、ミトコンドリアによって馴化された培地を含む。他の実施形態によれば、本発明の組成物は、破裂ミトコンドリア、少なくとも１つのミトコンドリア構成物、単離されたミトコンドリア、部分的に精製されたミトコンドリア、無傷ミトコンドリア、ミトコンドリアによって馴化された培地、およびそれらの組み合わせからなる群の少なくとも１つを含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。本明細書で使用される場合、「ミトコンドリアによって馴化された培地」という用語は、ミトコンドリアがインキュベートされ、ミトコンドリア構成物および／またはミトコンドリアから分泌される要素を含む培地を指す。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「無傷ミトコンドリアおよび／または破裂ミトコンドリアを含む組成物」、「無傷ミトコンドリアおよび破裂ミトコンドリアからなる群から選択されるミトコンドリアを含む組成物」、ならびに「ミトコンドリアを含む組成物」という用語は、互換的に使用され得る。これらの用語は、無傷ミトコンドリア、破裂ミトコンドリア、または無傷ミトコンドリアおよび破裂ミトコンドリアの両方を含む組成物を対象とする。
【００８３】
ミトコンドリアには、１６，５６９塩基対からなる環状二本鎖分子であるミトコンドリアゲノムが含まれる。それは、１３個のタンパク質をコードする遺伝子、２２個の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）遺伝子、および２つのリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子を含む、３７個の遺伝子を含有する。１３個のタンパク質をコードする遺伝子は、ミトコンドリア呼吸鎖の構成要素である。野生型（ｗｔ）−ｍｔＤＮＡ分子には、配列多型も含まれ得るが、それは、依然として完全に機能的である。構造的に、ミトコンドリアのオルガネラは、直径または幅が０．５μｍ〜１μｍの範囲であり、４つの区画、外膜、内膜、膜間腔、およびマトリックスを有する。
【００８４】
本明細書で使用される場合、「ミトコンドリア」または「本発明のミトコンドリア」という用語は、互換的であり、無傷ミトコンドリアおよび／または破裂ミトコンドリアを指す。いくつかの実施形態によれば、本発明のミトコンドリアは、無傷ミトコンドリアを指す。いくつかの実施形態によれば、本発明のミトコンドリアは、破裂ミトコンドリアを指す。いくつかの実施形態によれば、本発明のミトコンドリアは、破裂ミトコンドリア、およびミトコンドリアから分泌または放出される少なくとも１つのミトコンドリア構成物を指す。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態によれば、本発明のミトコンドリアは、本発明に従って少なくとも１つのミトコンドリア構成物が放出されるミトコンドリアを指す。
【００８５】
本発明によるミトコンドリアは、本明細書に開示される方法によって、または当該技術分野で既知の任意の他の方法によって得ることができる。市販のミトコンドリア単離キットには、例えば、ミトコンドリア分離キット、ＭＩＴＯＩＳＯ１（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）などが含まれる。
【００８６】
いくつかの実施形態によれば、本発明のミトコンドリアは、機能的なミトコンドリアである。別の実施形態によれば、部分的に精製されたミトコンドリアは、機能的なミトコンドリアである。別の実施形態によれば、本発明のミトコンドリアは、機能的ではない。別の実施形態によれば、本発明のミトコンドリアは、単離されたミトコンドリアである。別の実施形態によれば、本発明のミトコンドリアは、無傷ミトコンドリアである。別の実施形態によれば、本発明のミトコンドリアは、部分的に機能的である。本明細書で使用される場合、部分的に機能的なミトコンドリアは、酸素消費などであるがこれに限定されない、ミトコンドリアの少なくとも１つの機能的特性を欠くミトコンドリアを指す。いくつかの実施形態によれば、破裂ミトコンドリアは、非機能的なミトコンドリアである。いくつかの実施形態によれば、破裂ミトコンドリアは、部分的に機能的なミトコンドリアである。
【００８７】
いくつかの実施形態によれば、「機能的なミトコンドリア」という用語は、酸素を消費するミトコンドリアを指す。別の実施形態によれば、機能的なミトコンドリアは、無傷の外膜を有する。いくつかの実施形態によれば、機能的なミトコンドリアは、無傷ミトコンドリアである。いくつかの実施形態によれば、機能的なミトコンドリアは、経時的に増加する速度で酸素を消費する。いくつかの実施形態によれば、ミトコンドリアの機能性は、酸素消費によって測定される。いくつかの実施形態によれば、ミトコンドリアの酸素消費は、ＭｉｔｏＸｐｒｅｓｓ蛍光プローブ（Ｌｕｘｃｅｌ）などであるがこれらに限定されない、当該技術分野で既知の任意の方法によって測定することができる。いくつかの実施形態によれば、機能的なミトコンドリアは、ＡＤＰ、およびグルタミン酸、リンゴ酸、またはコハク酸などであるがこれらに限定されない基質の存在下で、酸素消費速度の増加を示すミトコンドリアである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態によれば、機能的なミトコンドリアは、ＡＴＰを産生するミトコンドリアである。いくつかの実施形態によれば、機能的なミトコンドリアは、それら自体のＲＮＡおよびタンパク質を製造することができるミトコンドリアであり、自己複製構造である。いくつかの実施形態によれば、機能的なミトコンドリアは、ミトコンドリアリボソーム分子およびミトコンドリアｔＲＮＡ分子を産生する。
【００８８】
当該技術分野で既知であるように、機能的な胎盤ミトコンドリアは、プロゲステロンの産生に関与する（例えば、Ｔｕｃｋｅｙ  ＲＣ，Ｐｌａｃｅｎｔａ，２００５，２６（４）：２７３−８１を参照されたい）。いくつかの実施形態によれば、機能的なミトコンドリアは、プロゲステロンまたはプレグネノロンを産生するミトコンドリアである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態によれば、機能的なミトコンドリアは、プロゲステロンを分泌するミトコンドリアである。非限定的な例では、培養物中で成長した胎盤または胎盤細胞に由来するミトコンドリアは、プロゲステロンまたはプレグネノロンを産生する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態によれば、本発明のミトコンドリアは、培養物中で成長した胎盤または胎盤細胞に由来し、ミトコンドリアは、プロゲステロンまたはプレグネノロンを産生する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態によれば、本発明の無傷ミトコンドリアにおけるプロゲステロンまたはプレグネノロンの産生は、凍結融解サイクル後に損なわれない。いくつかの実施形態によれば、ミトコンドリアの機能性は、ミトコンドリアプロゲステロン産生、またはプレゲネノロンなどであるがこれに限定されない、プロゲステロン前駆体のミトコンドリア産生を測定することによって測定される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。プロゲステロン産生は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などであるがこれに限定されない、当該技術分野で既知の任意のアッセイによって測定することができる。
【００８９】
本明細書で使用される場合、ミトコンドリアに関して「由来する」という用語は、ミトコンドリアが得られた源に関する。例えば、源は、胎盤、培養物中で成長した胎盤細胞、血液細胞、植物組織、植物細胞、および培養物中で成長した植物細胞からなる群から選択される細胞または組織であり得る。
【００９０】
本明細書で使用される場合、「部分的に精製されたミトコンドリア」という用語は、他の細胞構成成分から分離されたミトコンドリアを指し、ミトコンドリアの重量は、（Ｈａｒｔｗｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２００９，（９）：３２０９−３２１４に例示されるように）ミトコンドリアおよび他の細胞内画分の合計重量の１０〜８０％、２０〜８０％、２０〜７０％、４０〜７０％、２０〜４０％、または２０〜３０％を構成する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。別の実施形態によれば、部分的に精製されたミトコンドリアは、無傷細胞を含有しない。
【００９１】
別の実施形態によれば、部分的に精製されたミトコンドリア中のミトコンドリアタンパク質の重量は、ミトコンドリアおよび他の細胞内タンパク質の合計重量の少なくとも１０％を構成する。別の実施形態によれば、部分的に精製されたミトコンドリア中のミトコンドリアタンパク質の重量は、ミトコンドリアおよび他の細胞内タンパク質の合計重量の少なくとも２０％を構成する。別の実施形態によれば、部分的に精製されたミトコンドリア中のミトコンドリアタンパク質の重量は、ミトコンドリアおよび他の細胞内タンパク質の合計重量の１０％〜８０％を構成する。別の実施形態によれば、部分的に精製されたミトコンドリア中のミトコンドリアタンパク質の重量は、ミトコンドリアおよび他の細胞内タンパク質の合計重量の２０％〜８０％を構成する。別の実施形態によれば、部分的に精製されたミトコンドリア中のミトコンドリアタンパク質の重量は、ミトコンドリアおよび他の細胞内タンパク質の合計重量の２０％〜４０％を構成する。さらに別の実施形態によれば、部分的に精製されたミトコンドリア中のミトコンドリアタンパク質の重量は、ミトコンドリアおよび他の細胞内タンパク質の合計重量の２０％〜３０％を構成する。別の実施形態によれば、部分的に精製されたミトコンドリア中のミトコンドリアタンパク質の重量は、ミトコンドリアおよび他の細胞内タンパク質の合計重量の４０％〜８０％を構成する。別の実施形態によれば、部分的に精製されたミトコンドリア中のミトコンドリアタンパク質の重量は、ミトコンドリアおよび他の細胞内タンパク質の合計重量の３０％〜７０％を構成する。別の実施形態によれば、部分的に精製されたミトコンドリア中のミトコンドリアタンパク質の重量は、ミトコンドリアおよび他の細胞内タンパク質の合計重量の５０％〜７０％を構成する。別の実施形態によれば、部分的に精製されたミトコンドリア中のミトコンドリアタンパク質の重量は、ミトコンドリアおよび他の細胞内タンパク質の合計重量の６０％〜７０％を構成する。別の実施形態によれば、部分的に精製されたミトコンドリア中のミトコンドリアタンパク質の重量は、ミトコンドリアおよび他の細胞内タンパク質の合計重量の８０％未満を構成する。
【００９２】
本明細書で使用される場合、「ミトコンドリアタンパク質」という用語は、ゲノムＤＮＡまたはｍｔＤＮＡによってコードされるミトコンドリアタンパク質を含む、ミトコンドリアに起源を持つタンパク質を指す。本明細書で使用される場合、「細胞内タンパク質」という用語は、ミトコンドリアが産生される細胞または組織に起源を持つ全てのタンパク質を指す。
【００９３】
本明細書で使用される場合、「単離されたミトコンドリア」という用語は、他の細胞構成成分から分離されたミトコンドリアを指し、ミトコンドリアタンパク質の重量は、ミトコンドリアおよび他の細胞内細胞タンパク質の合計重量の８０％超を構成する。単離されたミトコンドリアの調製は、緩衝液組成の変更、または部分的に精製されたミトコンドリアの調製には不要な追加の洗浄ステップ、浄化サイクル、遠心分離サイクル、および超音波処理サイクルを必要とする場合がある。いかなる理論または機構によっても拘束されることを望むものではないが、そのような追加のステップおよびサイクルは、単離されたミトコンドリアの機能性を損なう場合がある。
【００９４】
一実施形態によれば、単離されたミトコンドリア中のミトコンドリアタンパク質の重量は、ミトコンドリアおよび他の細胞内細胞タンパク質の合計重量の８０％超を構成する。別の実施形態によれば、単離されたミトコンドリア中のミトコンドリアタンパク質の重量は、ミトコンドリアおよび他の細胞内タンパク質の合計重量の９０％超を構成する。単離されたミトコンドリアを得るための方法の非限定的な例は、ＭＡＣＳ（登録商標）技術（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）である。いかなる理論または機構によっても拘束されることを望むものではないが、ミトコンドリアの重量がミトコンドリアおよび他の細胞内画分の合計重量の９５％超を構成する単離されたミトコンドリアは、機能的なミトコンドリアではない。別の実施形態によれば、単離されたミトコンドリアは、無傷細胞を含有しない。いくつかの実施形態によれば、本発明のミトコンドリアは、単離されたミトコンドリアである。
【００９５】
本明細書で使用される場合、「無傷ミトコンドリア」という用語は、外膜、内膜、（内膜によって形成される）クリステ、およびマトリックスを含むミトコンドリアを指す。いくつかの実施形態によれば、無傷ミトコンドリアは、ミトコンドリアＤＮＡを含む。本明細書で使用される場合、「マイトプラスト」という用語は、外膜を欠くミトコンドリアを指す。別の実施形態によれば、ミトコンドリア膜の無傷性は、当該技術分野で既知の任意の方法によって決定することができる。非限定的な例では、ミトコンドリア膜の無傷性は、テトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ）またはテトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）蛍光プローブを使用して測定される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。顕微鏡下で観察され、ＴＭＲＭまたはＴＭＲＥ染色を示すミトコンドリアには、無傷ミトコンドリア外膜を有する。いくつかの実施形態によれば、ミトコンドリア膜の無傷性は、ミトコンドリア外のクエン酸合成酵素の存在をアッセイすることによって測定される。いくつかの実施形態によれば、クエン酸合成酵素を放出するミトコンドリアは、ミトコンドリアの無傷性が損なわれている。いくつかの実施形態によれば、ミトコンドリア膜の無傷性は、ＡＤＰの存在に結合した酸素消費のミトコンドリア速度を測定することによって決定される。いくつかの実施形態によれば、ＡＤＰの存在下でのミトコンドリアの酸素消費の増加は、無傷ミトコンドリア膜を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明による無傷ミトコンドリアは、部分的に精製されたミトコンドリアである。いくつかの実施形態によれば、本発明による無傷ミトコンドリアは、単離されたミトコンドリアである。いくつかの実施形態によれば、機能的なミトコンドリアは、無傷ミトコンドリアである。
【００９６】
本明細書で使用される場合、「ミトコンドリア膜」という用語は、ミトコンドリア内膜、ミトコンドリア外膜、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるミトコンドリア膜を指す。
【００９７】
本明細書で使用される場合、「破裂ミトコンドリア」という用語は、内ミトコンドリア膜および外ミトコンドリア膜が剪断された（引き裂かれた）もの、穿孔されたもの、穿刺されたものなどのミトコンドリアを指す。いくつかの実施形態によれば、破裂ミトコンドリアは、２つ以上の部分／部分に剪断されたミトコンドリアである。破裂ミトコンドリアは、本明細書に記載の方法または当該技術分野で既知の任意の他の方法によって破裂させた無傷ミトコンドリアであることを理解されたい。
【００９８】
いくつかの実施形態によれば、破裂ミトコンドリアは、ミトコンドリアから少なくとも１つのミトコンドリア構成物を放出したミトコンドリアである。いくつかの実施形態によれば、破裂ミトコンドリアは、内ミトコンドリア膜および外ミトコンドリア膜が引き裂かれる、穿孔される、穿刺されるなどし、少なくとも１つのミトコンドリア構成物を放出したミトコンドリアを対象とする。いくつかの実施形態によれば、無傷ミトコンドリアの破裂は、少なくとも１つのミトコンドリア構成物の放出をもたらす。いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つのミトコンドリア構成物を放出した破裂ミトコンドリアが、放出された構成物とともに投与されることが理解されるべきである。
【００９９】
本明細書で使用される場合、「ミトコンドリア構成物」という用語は、ミトコンドリアに含まれる任意の要素を指す。いくつかの実施形態によれば、ミトコンドリア構成物は、ミトコンドリアタンパク質、ミトコンドリアペプチド、ミトコンドリア核酸、ミトコンドリア脂質、ミトコンドリア糖、ミトコンドリア構造、ミトコンドリアマトリックスの少なくとも一部、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの要素である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１００】
本明細書で使用される場合、「ミトコンドリア構造」という用語は、マトリックス顆粒、ＡＴＰ−合成酵素粒子、ミトコンドリアリボソーム、およびクリステなどであるがこれらに限定されない、ミトコンドリアに存在する構造および／またはオルガネラを指す。いくつかの実施形態によれば、ミトコンドリア構成物は、無傷の機能的なミトコンドリアの少なくとも１つの機能を維持する。いくつかの実施形態によれば、ミトコンドリア構成物は、単一の種類のミトコンドリアタンパク質、ミトコンドリアペプチド（例えば、ヒューマニン）、ミトコンドリア核酸、ミトコンドリア脂質、ミトコンドリア構造、またはミトコンドリア糖を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態によれば、ミトコンドリア構成物は、少なくとも１つの機能タンパク質を含む。いくつかの実施形態によれば、ミトコンドリア構成物は、ミトコンドリアマトリックスの少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態によれば、ミトコンドリア構成物は、ミトコンドリアマトリックス全体を含む。いくつかの実施形態によれば、ミトコンドリア構成物は、ミトコンドリアマトリックスの少なくとも一部、およびタンパク質、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、またはイオンなどであるがこれらに限定されない、その中に含まれる要素の少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態によれば、ミトコンドリア構成物は、ミトコンドリアマトリックスの少なくとも一部、ならびにその中に含まれる以下の要素、ミトコンドリアタンパク質、ミトコンドリア核酸、ミトコンドリア脂質、ミトコンドリア糖、およびミトコンドリア構造のうちの少なくとも１つを含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。本明細書で使用される場合、「ミトコンドリアマトリックス」という用語は、ミトコンドリア内膜内の粘性材料を指す。
【０１０１】
本発明のいくつかの実施形態によるミトコンドリア構成物は、ミトコンドリアタンパク質などであるがこれに限定されない、ミトコンドリアから分泌または放出される要素であることを理解されたい。いくつかの実施形態によれば、ミトコンドリアから分泌または放出されるミトコンドリア構成物は、ミトコンドリアがインキュベートされた馴化培地からミトコンドリア構成物を回収することなどであるがこれらに限定されない、当該技術分野で既知の任意の方法によって回収することができる。
【０１０２】
いくつかの実施形態によれば、ミトコンドリア構成物は、細胞からミトコンドリア画分を単離するための当該技術分野で既知の任意の方法、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）の培養細胞用ミトコンドリア単離キットを使用することによって実行される方法によって得ることができる。いくつかの実施形態によれば、ミトコンドリア画分または構成物は、ミトコンドリアの単離または部分精製の副産物として産生される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１０３】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、脂質およびコレステロール代謝の上昇を必要とする対象における脂質およびコレステロール代謝を上昇させるための方法であって、少なくとも１つのミトコンドリア構成物を含む組成物を提供することと、組成物を必要とする対象に治療有効量の組成物を投与することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、本発明は、脂質およびコレステロール代謝の上昇から恩恵を受ける疾患を治療または予防するための方法であって、少なくとも１つのミトコンドリア構成物を含む組成物を提供することと、対象に治療有効量の組成物を投与することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、本発明は、体重減少の誘発を必要とする対象における体重減少を誘発するための方法であって、少なくとも１つのミトコンドリア構成物を含む組成物を提供することと、組成物を必要とする対象に治療有効量の組成物を投与することと、を含む、方法を提供する。他の実施形態によれば、本発明は、体重増加の予防、減弱、または低減を必要とする対象における体重増加を予防、減弱、または低減するための方法であって、少なくとも１つのミトコンドリア構成物を含む組成物を提供することと、組成物を必要とする対象に治療有効量の組成物を投与することと、を含む、方法を提供する。さらなる実施形態によれば、本発明は、体重再増加の防止、減弱、または低減を必要とする対象における体重再増加を防止、減弱、または低減する方法であって、少なくとも１つのミトコンドリア構成物を含む組成物を提供することと、組成物を必要とする対象に治療有効量の組成物を投与することと、を含む、方法を提供する。
【０１０４】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、脂質およびコレステロール代謝の上昇を必要とする対象における脂質およびコレステロール代謝の上昇に使用するための、少なくとも１つのミトコンドリア構成物を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態によれば、本発明は、脂質およびコレステロール代謝の上昇から恩恵を受ける疾患の治療または予防に使用するための、少なくとも１つのミトコンドリア構成物を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態によれば、本発明は、体重減少の誘発を必要とする対象における体重減少の誘発に使用するための、少なくとも１つのミトコンドリア構成物を含む組成物を提供する。他の実施形態によれば、本発明は、体重増加の減弱または低減を必要とする対象における体重増加の減弱または低減に使用するための、少なくとも１つのミトコンドリア構成物を含む組成物を提供する。他の実施形態によれば、本発明は、体重再増加の減弱または低減を必要とする対象における体重再増加の減弱または低減に使用するための、少なくとも１つのミトコンドリア構成物を含む組成物を提供する。
【０１０５】
本発明のいくつかの実施形態による破裂ミトコンドリアおよび／またはミトコンドリア構成物は、無傷ミトコンドリアおよび／または単離されたミトコンドリアおよび／または部分的に精製されたミトコンドリアから得られることを理解されたい。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。本発明の好ましい実施形態によるミトコンドリア構成物は、当該技術分野で既知の任意の方法によって無傷ミトコンドリアから得られることをさらに理解されたい。いくつかの実施形態によれば、本発明のミトコンドリア構成物は、無傷ミトコンドリアを高張液から低張液に移動させることによって得られる。いくつかの実施形態によれば、無傷ミトコンドリアを高張液から低張液に移動させることは、少なくとも１つのミトコンドリア構成物の放出をもたらす。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１０６】
本明細書で使用される場合、「低張」、「等張」、および「高張」という用語は、無傷ミトコンドリア内の溶質濃度に対する濃度に関する。
【０１０７】
他の実施形態によれば、破裂ミトコンドリアは、無傷ミトコンドリアを、低張リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液などであるがこれに限定されない、低張液に曝露することによって得られる。いかなる理論または機構によっても拘束されることを望むものではないが、無傷ミトコンドリアを低張液に曝露することは、ミトコンドリアの爆発または穿孔をもたらし、ミトコンドリアマトリックスの少なくとも一部などであるがこれに限定されない、ミトコンドリア構成物を放出する可能性がある、破裂ミトコンドリアが得られる。
【０１０８】
いくつかの実施形態によれば、破裂ミトコンドリアは、ミトコンドリアを高張液から低張液に移動させることによって得られる。いかなる理論または機構によっても拘束されることを望むものではないが、無傷ミトコンドリアを高張液に移動させることは、ミトコンドリアの爆発、破裂、または穿孔をもたらし、故にミトコンドリアマトリックスの少なくとも一部などであるがこれに限定されない、ミトコンドリア構成物を放出する可能性がある、破裂ミトコンドリアが得られる。非限定的な例では、無傷ミトコンドリアの爆発、破裂、または穿孔は、クエン酸合成酵素などのミトコンドリアタンパク質の放出をもたらす場合がある。いくつかの実施形態によれば、クエン酸合成酵素の放出は、破裂ミトコンドリアの指標として使用される。いくつかの実施形態によれば、本発明によるミトコンドリア構成物は、無傷ミトコンドリア内の浸透圧を増加させることによって無傷ミトコンドリアから放出される。いかなる理論または機構によっても拘束されることを望むものではないが、ミトコンドリア膜が穿孔される、かつ／または引き裂かれるように無傷ミトコンドリア内の浸透圧を増加させることは、破裂ミトコンドリアをもたらし、本発明によるミトコンドリア構成物の放出をもたらす可能性がある。
【０１０９】
いくつかの実施形態によれば、本発明による無傷ミトコンドリアを含む組成物は、高張液として製剤化される。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、高張液を含む。いくつかの実施形態によれば、本発明による高張液は、糖を含む。本明細書で使用される場合、「糖」という用語は、糖、オリゴ糖、または多糖を指し得る。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態によれば、糖は、スクロースである。いくつかの実施形態によれば、本発明による高張液中の糖の濃度は、単離緩衝液中の糖の濃度と同様である。いくつかの実施形態によれば、ミトコンドリア機能を保存するように作用する十分な糖濃度は、ミトコンドリアを無傷で保存するのに十分である。いくつかの実施形態によれば、単離緩衝液は、高張である。他の実施形態によれば、本発明による高張液中の糖濃度は、ミトコンドリアを無傷で保存するのに十分な糖濃度である。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、ミトコンドリアを無傷で保存するのに十分な糖濃度をさらに含む。
【０１１０】
別の実施形態によれば、ミトコンドリアを無傷で保存するのに十分な糖濃度は、１００ｍＭ〜４００ｍＭ、好ましくは１００ｍＭ〜２５０ｍＭ、最も好ましくは２００ｍＭ〜２５０ｍＭの濃度である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。別の実施形態によれば、ミトコンドリアを無傷で保存するのに十分な糖濃度は、１００ｍＭ〜１５０ｍＭである。別の実施形態によれば、ミトコンドリアを無傷で保存するのに十分な糖濃度は、１５０ｍＭ〜２００ｍＭである。別の実施形態によれば、ミトコンドリアを無傷で保存するのに十分な糖濃度は、１００ｍＭ〜２００ｍＭである。別の実施形態によれば、ミトコンドリアを無傷で保存するのに十分な糖濃度は、１００ｍＭ〜４００ｍＭである。別の実施形態によれば、ミトコンドリアを無傷で保存するのに十分な糖濃度は、１５０ｍＭ〜４００ｍＭである。別の実施形態によれば、ミトコンドリアを無傷で保存するのに十分な糖濃度は、２００ｍＭ〜４００ｍＭである。別の実施形態によれば、ミトコンドリアを無傷で保存するのに十分な糖濃度は、少なくとも１００ｍＭである。いかなる理論または作用機構によっても拘束されることを望むものではないが、１００ｍＭ未満の糖濃度は、ミトコンドリアを無傷で保存するのに十分ではない場合がある。いくつかの実施形態によれば、１００ｍＭ超の糖濃度は、高張である。
【０１１１】
いくつかの実施形態によれば、本発明による破裂ミトコンドリアを含む組成物は、低張液として製剤化される。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、低張液を含む。低張溶液の非限定的な例は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。いくつかの実施形態によれば、ＰＢＳ中のミトコンドリアは、破裂ミトコンドリアである。他の実施形態によれば、単離緩衝液中のミトコンドリアは、無傷ミトコンドリアである。いくつかの実施形態によれば、ミトコンドリアを無傷で保存するのに十分な糖濃度を含む単離緩衝液中のミトコンドリアは、無傷ミトコンドリアである。
【０１１２】
いくつかの実施形態によれば、本発明の無傷ミトコンドリアは、イオン交換阻害剤に曝露される。いくつかの実施形態によれば、本発明の無傷ミトコンドリアは、イオン交換阻害剤への曝露によってサイズが低減する。別の実施形態によれば、本発明の無傷ミトコンドリアは、イオン交換阻害剤への曝露によってサイズが低減した。いくつかの実施形態によれば、本発明の無傷ミトコンドリアは、部分精製または単離後に、イオン交換阻害剤に曝露される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態によれば、本発明の無傷ミトコンドリアは、部分精製または単離中にイオン交換体阻害剤に曝露される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。他の実施形態によれば、本発明の無傷ミトコンドリアが由来する細胞または組織は、ミトコンドリアの部分精製または単離前に、イオン交換阻害剤に曝露される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。別の実施形態によれば、イオン交換阻害剤は、ＣＧＰ３７１５７である。本明細書で使用される場合、「ＣＧＰ」および「ＣＧＰ３７１５７」という用語は、互換的に使用される。いかなる理論または機構によっても拘束されることを望むものではないが、ミトコンドリアＮａ＋／Ｃａ２＋交換体を遮断する薬剤（ＣＧＰ３７１５７など）は、ミトコンドリア分裂を誘発し、ミトコンドリアＡＴＰ産生を増加させ、ミトコンドリアサイズを低減する。ミトコンドリア分裂は、自然発生的な分裂またはＣＧＰ３７１５７などの適切な薬剤によって誘発される分裂を指す。別の実施形態によれば、本発明の最終組成物は、遊離イオン交換阻害剤を欠く。本明細書で使用される場合、イオン交換阻害剤を欠く組成物は、本発明のミトコンドリアに結合していないイオン交換阻害剤を欠く組成物を指す。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、本発明のミトコンドリアに結合したイオン交換阻害剤を含む。いくつかの実施形態によれば、イオン交換阻害剤を欠く組成物は、１μＭ未満、好ましくは０．５μＭ未満、最も好ましくは０．１μＭ未満の濃度のイオン交換阻害剤を含む。
【０１１３】
いくつかの実施形態によれば、本発明のミトコンドリアは、それらが投与される対象とは異なる対象に由来する。いくつかの実施形態によれば、本発明のミトコンドリアは、それらが投与されるのと同じ対象に由来する。別の実施形態によれば、本発明のミトコンドリアは、同種および異種から選択される源に由来する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。別の実施形態によれば、本発明のミトコンドリアは、同系、同種、および異種から選択される源に由来する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。別の実施形態によれば、本発明のミトコンドリアは、同種および異種から選択される源に由来する細胞または組織に由来する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。別の実施形態によれば、本発明のミトコンドリアは、同系、同種、および異種から選択される源に由来する細胞または組織に由来する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１１４】
本明細書で使用される場合、同種源のミトコンドリアは、同じ種に由来する、治療される対象とは異なる対象に由来するミトコンドリアを指す。本明細書で使用される場合、異種源のミトコンドリアは、異なる種に由来する、治療される対象とは異なる対象に由来するミトコンドリアを指す。本明細書で使用される場合、「同系」という用語は、遺伝的に同一であることを指す。いくつかの実施形態によれば、自己細胞は、同系細胞である。
【０１１５】
いくつかの実施形態によれば、本発明のミトコンドリアは、哺乳動物対象に由来する。別の実施形態によれば、哺乳動物対象は、ヒト対象である。別の実施形態によれば、本発明のミトコンドリアは、哺乳動物細胞に由来する。別の実施形態によれば、哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。別の実施形態によれば、本発明のミトコンドリアは、培養物中の細胞に由来する。別の実施形態によれば、本発明のミトコンドリアは、培養物中のヒト細胞に由来する。別の実施形態によれば、本発明のミトコンドリアは、組織に由来する。
【０１１６】
いくつかの実施形態によれば、本発明のミトコンドリアは、ヒト胎盤、培養物中で成長したヒト胎盤細胞、およびヒト血液細胞からなる群から選択される細胞または組織に由来する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。別の実施形態によれば、本発明のミトコンドリアは、胎盤、培養物中で成長した胎盤細胞、および血液細胞からなる群から選択される細胞または組織に由来する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１１７】
いくつかの実施形態によれば、本発明のミトコンドリアは、植物に由来する。いくつかの実施形態によれば、本発明のミトコンドリアは、植物組織、植物細胞、または培養物中で成長した植物細胞に由来する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態によれば、本発明に従って、植物組織、植物細胞、または培養物中で成長した植物細胞からミトコンドリアを導出することは、植物プロトプラストからミトコンドリアを導出することを指す。本発明による植物ミトコンドリアは、ミトコンドリアを構成することが当該技術分野で既知である、任意の植物種、植物器官、植物細胞、または培養物中で成長した植物細胞に由来し得る。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。非限定的な例では、本発明による植物ミトコンドリアは、貯蔵器官（ジャガイモ、糖質、もしくはテンサイなど）、緑色の葉（タバコ、エンドウマメ、もしくはペチュニアなど）、または黄化した実生（コムギ、トウモロコシ、またはリョクトウなど）に由来し得る。特定の実施形態によれば、本発明のミトコンドリアは、リョクトウに由来する。いくつかの実施形態によれば、本発明のミトコンドリアは、リョクトウもやしに由来する。いくつかの実施形態によれば、本発明のミトコンドリアは、ジャガイモに由来する。いくつかの実施形態によれば、本発明のミトコンドリアは、ドナリエラなどであるがこれに限定されない、藻類に由来する。他の実施形態によれば、本発明のミトコンドリアは、動物対象、好ましくは哺乳動物対象、最も好ましくはヒト対象または培養物中で成長したヒト細胞から得られる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態によれば、本発明のミトコンドリアは、細胞壁を欠く細胞、好ましくは哺乳動物細胞、最も好ましくはヒト細胞から得られる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１１８】
いくつかの実施形態によれば、本発明による破裂ミトコンドリアは、無傷ミトコンドリアに由来する。いくつかの実施形態によれば、本発明による破裂ミトコンドリアは、無傷の部分的に精製されたミトコンドリアに由来する。いくつかの実施形態によれば、本発明による破裂ミトコンドリアは、無傷の単離されたミトコンドリアに由来する。
【０１１９】
いくつかの実施形態によれば、本発明の無傷および／または破裂ミトコンドリアは、ヒト胎盤、培養物中で成長したヒト胎盤細胞、およびヒト血液細胞からなる群から選択される細胞または組織に由来する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。別の実施形態によれば、本発明の無傷および／または破裂ミトコンドリアは、胎盤、培養物中で成長した胎盤細胞、および血液細胞からなる群から選択される細胞または組織に由来する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１２０】
いくつかの実施形態によれば、本発明によるミトコンドリア構成物は、胎盤、培養物中で成長した胎盤細胞、および血液細胞からなる群から選択される細胞または組織に由来するミトコンドリアから産生される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態によれば、本発明によるミトコンドリア構成物は、ヒト胎盤、培養物中で成長したヒト胎盤細胞、およびヒト血液細胞からなる群から選択される細胞または組織に由来するミトコンドリアから産生される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１２１】
本明細書で使用される場合、「培養物中で成長した細胞」または「培養物中で成長した組織」という語句はそれぞれ、細胞または組織が由来する生物外にある、液体、半固体、または固体の培地中で成長した多数の細胞または組織を指す。いくつかの実施形態によれば、培養物中で成長した細胞は、バイオリアクター内で成長した細胞である。非限定的な例によれば、細胞は、（ＷＯ２００８／１５２６４０に開示されるバイオリアクターなどであるがこれに限定されない）バイオリアクター内で成長させ、その後細胞から部分的に精製された機能的なミトコンドリアを単離することができる。
【０１２２】
別の実施形態によれば、本発明のミトコンドリアは、凍結融解サイクルを受けている。いくつかの実施形態によれば、本発明の無傷ミトコンドリアは、凍結融解サイクルを受けている。いかなる理論または機構によっても拘束されることを望むものではないが、凍結融解サイクルを受けた無傷ミトコンドリアは、凍結融解サイクルを受けていない対照無傷ミトコンドリアと比較して、解凍後に少なくとも同等の酸素消費速度を示す。したがって、凍結融解サイクルを受けた無傷ミトコンドリアは、凍結融解サイクルを受けていない対照ミトコンドリアと少なくとも同程度に機能的である。
【０１２３】
本明細書で使用される場合、「凍結融解サイクル」という用語は、本発明のミトコンドリアを０℃未満の温度に凍結し、ミトコンドリアを０℃未満の温度で所定の期間維持し、ミトコンドリアを室温または体温または本発明の方法による投与を可能にする０℃超の任意の温度まで解凍することを指す。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。本明細書で使用される場合、「室温」という用語は、１８℃〜２５℃の温度を指す。本明細書で使用される場合、「体温」という用語は、３５．５℃〜３７．５℃、好ましくは３７℃の温度を指す。
【０１２４】
特定の実施形態によれば、本発明のミトコンドリアは、凍結乾燥を受けている。さらなる実施形態によれば、本発明の無傷ミトコンドリアは、凍結乾燥を受けている。
【０１２５】
本明細書で使用される場合、「凍結乾燥」という用語は、本発明のミトコンドリアを凍結し、その後溶媒、好ましくは水混和性溶媒のうちの１つの濃度を、昇華および脱着によって生物学的反応または化学反応を支持しなくなるレベルまで低減することを伴う凍結乾燥または脱水技術として定義される。これは通常、高真空での乾燥ステップによって行われる。
【０１２６】
いくつかの実施形態によれば、凍結融解サイクルを受けたミトコンドリアは、少なくとも−１９６℃の温度で凍結された。いくつかの実施形態によれば、凍結融解サイクルを受けたミトコンドリアは、少なくとも−７０℃の温度で凍結された。いくつかの実施形態によれば、凍結融解サイクルを受けたミトコンドリアは、少なくとも−２０℃の温度で凍結された。いくつかの実施形態によれば、凍結融解サイクルを受けたミトコンドリアは、少なくとも−４℃の温度で凍結された。いくつかの実施形態によれば、凍結融解サイクルを受けたミトコンドリアは、少なくとも０℃の温度で凍結された。別の実施形態によれば、ミトコンドリアの凍結は、漸進的である。いくつかの実施形態によれば、ミトコンドリアの凍結は、瞬間凍結による。本明細書で使用される場合、「瞬間凍結」という用語は、ミトコンドリアを低温貯蔵温度に供することによって急速に凍結することを指す。非限定的な例では、瞬間凍結には、液体窒素を使用して凍結することが含まれ得る。
【０１２７】
いくつかの実施形態によれば、凍結融解サイクルを受けたミトコンドリアは、解凍前に少なくとも３０分間凍結された。別の実施形態によれば、凍結融解サイクルは、ミトコンドリアを解凍前に少なくとも３０、６０、９０、１２０、１８０、２１０分間凍結することを含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態によれば、凍結融解サイクルを受けたミトコンドリアは、解凍前に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２４、４８、７２、９６、１２０時間凍結された。各凍結時間は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態によれば、凍結融解サイクルを受けたミトコンドリアは、解凍前に少なくとも４、５、６、７、３０、６０、１２０、３６５日間凍結された。各凍結時間は、本発明の別個の実施形態を表す。別の実施形態によれば、凍結融解サイクルは、ミトコンドリアを解凍前に少なくとも１、２、３週間凍結することを含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。別の実施形態によれば、凍結融解サイクルは、ミトコンドリアを解凍前に少なくとも１、２、３、４、５、６ヶ月間凍結することを含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１２８】
いくつかの実施形態によれば、凍結融解サイクルを受けたミトコンドリアは、−７０℃で解凍前に少なくとも３０分間凍結された。いかなる理論または機構によっても拘束されることを望むものではないが、ミトコンドリアを凍結し、それらを長期間後に解凍する可能性は、長期間の貯蔵後でも再現性のある結果をもって、ミトコンドリアの容易な貯蔵および使用を可能にする。いくつかの実施形態によれば、本発明による破裂ミトコンドリアは、凍結融解サイクルを受けた無傷ミトコンドリアから調製／産生される。
【０１２９】
別の実施形態によれば、解凍は、室温である。いくつかの実施形態によれば、解凍は、体温である。別の実施形態によれば、解凍は、本発明の方法による投与を可能にする温度である。別の実施形態によれば、解凍は、漸進的に実行される。
【０１３０】
本明細書で使用される場合、「単離緩衝液」という用語は、本発明のミトコンドリアが部分的に精製または単離されている緩衝液を指す。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。本発明による無傷ミトコンドリアは、単離緩衝液中で単離または部分的に精製されるが、破裂ミトコンドリアは、本明細書に記載の方法または当該技術分野で既知の任意の他の方法によって、単離／部分的に精製された無傷ミトコンドリアから産生されることを理解されたい。非限定的な例では、単離緩衝液は、２００ｍＭのスクロース、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＭＯＰＳ、および１ｍＭのＥＧＴＡを含む。いくつかの実施形態によれば、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）が、部分精製または単離中に単離緩衝液に添加される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態によれば、０．２％のＢＳＡが、部分精製または単離中に単離緩衝液に添加される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態によれば、ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）が、部分精製または単離中に単離緩衝液に添加される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態によれば、０．２％のＨＳＡが、部分精製または単離中に単離緩衝液に添加される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。他の実施形態によれば、ＨＳＡまたはＢＳＡは、部分精製または単離後に本発明のミトコンドリアから洗浄される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いかなる機構または理論によっても拘束されることを望むものではないが、単離緩衝液中でミトコンドリアを凍結すると、凍結前に単離緩衝液を凍結緩衝液に交換したり、解凍時に凍結緩衝液を交換したりする必要がないため、時間および単離ステップが省ける。
【０１３１】
別の実施形態によれば、凍結融解サイクルを受けたミトコンドリアは、凍結緩衝液中で凍結された。別の実施形態によれば、凍結融解サイクルを受けた無傷ミトコンドリアは、単離緩衝液中で凍結された。別の実施形態によれば、凍結融解サイクルを受けた無傷ミトコンドリアは、単離緩衝液と同じ構成物を含む緩衝液中で凍結された。
【０１３２】
別の実施形態によれば、凍結緩衝液は、抗凍結剤を含む。いくつかの実施形態によれば、抗凍結剤は、糖、オリゴ糖、または多糖である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。別の実施形態によれば、凍結緩衝液中の糖濃度は、ミトコンドリア機能を保存するように作用する十分な糖濃度である。別の実施形態によれば、単離緩衝液は、糖を含む。別の実施形態によれば、単離緩衝液中の糖濃度は、ミトコンドリア機能を保存するように作用する十分な糖濃度である。別の実施形態によれば、単離緩衝液中の糖濃度は、ミトコンドリアを無傷で維持するように作用する十分な糖濃度である。別の実施形態によれば、凍結緩衝液中の糖濃度は、ミトコンドリアを無傷で維持するように作用する十分な糖濃度である。別の実施形態によれば、糖は、スクロースである。いかなる理論または機構によっても拘束されることを望むものではないが、スクロースを含む凍結緩衝液または単離緩衝液中で凍結された無傷ミトコンドリアは、凍結融解サイクルを受けていない対照ミトコンドリア、またはスクロースを有しない凍結緩衝液もしくは単離緩衝液中で凍結された対照ミトコンドリアと比較して、解凍後に少なくとも同等の酸素消費速度を示す。
【０１３３】
いくつかの実施形態によれば、破裂ミトコンドリアは、凍結融解サイクルを受けた。いくつかの実施形態によれば、本発明によるミトコンドリア構成物は、凍結融解サイクルを受けた。いくつかの実施形態によれば、凍結融解サイクルを受けた破裂ミトコンドリアは、凍結緩衝液中で凍結された。いくつかの実施形態によれば、凍結融解サイクルを受けたミトコンドリア構成物は、凍結緩衝液中で凍結された。いくつかの実施形態によれば、凍結融解サイクルを受けた破裂ミトコンドリアは、ＰＢＳなどであるが限定されない、低張液中で凍結された。いくつかの実施形態によれば、凍結融解サイクルを受けたミトコンドリア構成物は、ＰＢＳなどであるが限定されない、低張液中で凍結された。
【０１３４】
いくつかの実施形態によれば、凍結融解サイクルを受けた破裂ミトコンドリアは、単離緩衝液中で凍結された。別の実施形態によれば、凍結融解サイクルを受けた破裂ミトコンドリアは、単離緩衝液と同じ構成物を含む緩衝液中で凍結された。いくつかの実施形態によれば、凍結融解サイクルを受けたミトコンドリア構成物は、単離緩衝液中で凍結された。別の実施形態によれば、凍結融解サイクルを受けたミトコンドリア構成物は、単離緩衝液と同じ構成物を含む緩衝液中で凍結された。
【０１３５】
いくつかの実施形態によれば、破裂ミトコンドリアは、凍結乾燥を受けている。他の実施形態によれば、本発明によるミトコンドリア構成物は、凍結乾燥を受けた。
【０１３６】
局所および全身経路を含むがこれらに限定されない、対象への任意の好適な投与経路が、本発明の組成物に使用され得る。いくつかの実施形態によれば、投与することは、全身投与することである。いくつかの実施形態によれば、組成物は、全身投与のために製剤化される。いくつかの実施形態によれば、投与することは、局所投与することである。いくつかの実施形態によれば、組成物は、局所投与のために製剤化される。
【０１３７】
別の実施形態によれば、全身投与は、非経口経路による。別の実施形態によれば、局所投与は、非経口経路による。いくつかの実施形態によれば、非経口投与のための本発明の組成物の調製物は、各々が本発明の別個の実施形態を表す、無菌水溶液または非水溶液、懸濁液、または乳濁液を含む。非水性溶媒またはビヒクルの非限定的な例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油およびトウモロコシ油などの植物油、ゼラチン、ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。
【０１３８】
いくつかの実施形態によれば、非経口投与は、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、皮内、経皮、または皮下投与である。上記の投与経路の各々は、本発明の別個の実施形態を表す。別の実施形態によれば、非経口投与は、ボーラス注射によって実行される。別の実施形態によれば、非経口投与は、持続注入によって実行される。好ましい投与様式は、治療される特定の適応症に依存し、当業者には明らかであろう。
【０１３９】
別の実施形態によれば、組成物の全身投与は、注射による。別の実施形態によれば、組成物の局所投与は、注射による。注射による投与では、組成物は、水溶液中、例えば、ハンクス液、リンガー液、または生理食塩緩衝液を含むがこれらに限定されない、生理学的に適合性のある緩衝液中に製剤化され得る。注射用の製剤は、単位剤形、例えば、アンプル、または任意で保存剤が添加された複数容量容器で提示することができる。別の実施形態によれば、投与は、対流促進送達（ＣＥＤ）による。
【０１４０】
水性注射用懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの、懸濁液の粘度を増加させる物質を含有してもよい。任意で、懸濁液はまた、活性成分の溶解度を増加させて、高濃度の溶液の調製を可能にする、好適な安定剤または薬剤も含有してもよい。
【０１４１】
別の実施形態によれば、注射用に製剤化された組成物は、油性または水性ビヒクル中の溶液、懸濁液、分散液、または乳濁液の形態であってもよく、懸濁剤、安定剤、および／または分散剤などの製剤化剤を含有してもよい。好適な親油性溶媒またはビヒクルの非限定的な例には、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステルが含まれる。
【０１４２】
別の実施形態によれば、組成物は、静脈内投与されるため、静脈内投与に好適な形態で製剤化される。別の実施形態によれば、組成物は、動脈内投与されるため、動脈内投与に好適な形態で製剤化される。別の実施形態によれば、組成物は、筋肉内投与されるため、筋肉内投与に好適な形態で製剤化される。
【０１４３】
別の実施形態によれば、全身投与は、経腸経路による。別の実施形態によれば、経腸経路による投与は、経口投与である。いくつかの実施形態によれば、組成物は、経口投与用に製剤化される。
【０１４４】
いくつかの実施形態によれば、組成物は、硬質または軟質ゼラチンカプセル、ピル、カプセル、粉末、コーティングされた錠剤を含む錠剤、糖衣錠、エリキシル、懸濁液、液体、ゲル、スラリー、シロップ、または吸入の形態、およびそれらの徐放形態で経口投与用に製剤化される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１４５】
経口投与に好適な担体は、当該技術分野で周知である。経口使用のための組成物は、固体賦形剤を使用して作製し、任意で得られた混合物を粉砕し、必要に応じて好適な助剤を添加した後に顆粒の混合物を加工して、錠剤または糖衣錠コアを得ることができる。好適な賦形剤の非限定的な例には、ラクトース、スクロース、マンニトール、もしくはソルビトールを含む糖などの充填剤、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、およびカルボメチルセルロースナトリウムなどのセルロース調製物、ならびに／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容されるポリマーが挙げられる。
【０１４６】
必要に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤が添加されてもよい。調剤機で使用するための、例えば、ゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、本発明の組成物と、ラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末基剤との粉末混合物を含有して製剤化することができる。
【０１４７】
経口投与用の固体剤形には、カプセル、錠剤、ピル、粉末、および顆粒が含まれる。そのような固体剤形では、本発明の組成物は、スクロース、ラクトース、またはデンプンなどの少なくとも１つの不活性な薬学的に許容される担体と混合される。そのような剤形はまた、通常の慣行として、不活性希釈剤以外の追加の物質、例えば、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤も含むことができる。カプセル、錠剤、およびピルの場合、剤形はまた、緩衝剤も含み得る。錠剤およびピルはさらに、腸溶コーティングとともに調製することができる。
【０１４８】
経口投与用の液体製剤には、溶液、乳濁液、懸濁液、シロップなどが含まれ、それらは、水および液体パラフィンなどの従来の希釈剤を含んでもよい。
【０１４９】
経口投与用の液体剤形は、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、ならびに甘味剤、香味剤および芳香剤、ならびに保存剤などのアジュバントをさらに含有してもよい。いくつかの実施形態によれば、組成物の腸溶コーティングが、経口または頬側投与のためにさらに使用される。本明細書で使用される場合、「腸溶コーティング」という用語は、消化器系内の組成物吸収の位置を制御するコーティングを指す。腸溶コーティングに使用される材料の非限定的な例は、脂肪酸、ワックス、植物繊維、またはプラスチックである。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、食品または飲料に含まれてもよい。これらは、例えば、ヨーグルト、ケフィア、味噌、納豆、テンペ、キムチ、ザワークラウト、水、牛乳、フルーツジュース、野菜ジュース、炭酸清涼飲料、非炭酸清涼飲料、コーヒー、お茶、ビール、ワイン、酒、アルコール混合飲料、パン、ケーキ、クッキー、クラッカー、押し出しスナック、スープ、冷凍デザート、揚げ物、パスタ製品、ジャガイモ製品、コメ製品、トウモロコシ製品、コムギ製品、乳製品、菓子、ハードキャンディー、栄養バー、朝食シリアル、パン生地、パン生地ミックス、ソース、加工肉、およびチーズである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１５１】
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、プロバイオティクスをさらに含み得る。特定の実施形態によれば、本発明の組成物は、プロバイオティクスと混合される。プロバイオティクスの好適な例には、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓおよびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍが含まれるが、これらに限定されない。さらなる実施形態によれば、本発明の組成物は、プロバイオティクスをさらに含み、該組成物は、ヨーグルト、ケフィア、味噌、納豆、テンペ、キムチ、ザワークラウト、水、牛乳、フルーツジュース、野菜ジュース、炭酸清涼飲料、非炭酸清涼飲料、コーヒー、お茶、ビール、ワイン、酒、アルコール混合ドリンク、パン、ケーキ、クッキー、クラッカー、押し出しスナック、スープ、冷凍デザート、揚げ物、パスタ製品、ジャガイモ製品、コメ製品、トウモロコシ製品、コムギ製品、乳製品、菓子、ハードキャンディー、栄養バー、朝食シリアル、パン生地、パン生地ミックス、ソース、加工肉、およびチーズからなる群から選択される食品または飲料に含まれる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１５２】
「プロバイオティクス」という用語は、潜在的に有益な細菌または酵母を含有する栄養補助食品を指す。ＦＡＯ／ＷＨＯによって現在採用されている定義によれば、プロバイオティクスは、「適切な量で投与した時に宿主に対して健康上の利益を付与する生きた微生物」である。
【０１５３】
別の実施形態によれば、本発明の組成物は、静脈内、動脈内、皮下、経口、および組織または器官への直接注射からなる群から選択される経路によって、組成物を必要とする対象に投与される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。胃腸障害または疾患の治療などの特定の用途では、経腸投与が実行可能であり得る。
【０１５４】
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、組成物を必要とする対象の脂肪組織に投与される。別の実施形態によれば、本発明の組成物は、組成物を必要とする対象の脂肪組織に局所投与される。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、組成物を必要とする対象の脂肪組織への注射により投与される。
【０１５５】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、量、時間的持続期間などの測定可能な値を指す場合、指定された値から＋／−１０％、または＋／−５％、＋／−１％、または＋／−０．１％の変動さえも包含することが意図される。
【０１５６】
以下の実施例は、本発明のより完全な理解を提供するために提示される。本発明の原理を例示するために記載された特定の技術、条件、材料、割合、および報告されたデータは、例示であり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１５７】
実施例１：ウシ胎盤ミトコンドリアは、３Ｔ３−Ｌ１細胞内の脂質蓄積を減少させる
ミトコンドリアを、４００ｍｇのウシ妊娠末期胎盤から以下のプロトコルに従って調製した。
１．胎盤を、氷冷ＩＢ緩衝液（単離緩衝液：２００ｍＭのスクロース、１ｍＭのＥＧＴＡ、および１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＭＯＰＳ）＋０．２％のＢＳＡを使用して、血液がなくなるまで濯いだ。
２．胎盤を、はさみを使用して、５ｍｌのＩＢ＋０．２％のＢＳＡ中で小片に細かく刻んだ。
３．懸濁液を（１０ｍｌ）ガラスポッターに移動させ、Ｄｏｕｎｃｅガラスホモジナイザーを使用して、２回の完全な上下サイクルによって均質化した。
４．ホモジネートを１５ｍｌのチューブに移動させ、４℃で、６００ｇで１０分間遠心分離した。
５．上清を清潔な遠心チューブに移動させ、ペレットをＩＢ中に再懸濁し、第２の遠心ステップに供した。
６．上清を回収し、７，０００×ｇで１５分間遠心分離した。
７．上清を捨て、ペレットを１０ｍｌの氷冷ＩＢ中に再懸濁し、その後４℃で、６００ｇで１０分間遠心分離した。
８．４℃で、７，０００×ｇで１５分間遠心分離することによって、ミトコンドリアを上清から回収した。
９．上清を捨て、ペレットを再懸濁し、２００ｕｌのＩＢ中にミトコンドリアを含んでいた。
１０．タンパク質含有量を、ブラッドフォードアッセイによって決定した。
【０１５８】
３Ｔ３−Ｌ１細胞を、脂肪生成キット（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）の指示に従って、ＤＭＥＭ＋１０％のウシ胎児血清、デキサメタゾン、インスリン、およびＩＢＭＸとともに、コンフルエントになるまで２４ウェルプレートで培養した。細胞を、２００μｌの分化培地中の増加する量のミトコンドリアとともに２４時間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、維持培地中でさらに５日間維持した。最後に、細胞をオイルレッドＯで染色し、溶解させ、各群のプレートリーダー（５２０ｎｍ）を使用して、脂質蓄積のレベルを評価した。脂肪生成キットで処理されなかった（すなわち、該細胞内で脂肪生成が誘発されなかった）３Ｔ３−Ｌ１細胞を、対照として使用した。加えて、オイルレッドＯの定量化を、未分化の３Ｔ３−Ｌ１細胞内で測定し、５０μｌのミトコンドリアとともにインキュベートし、これは、追加の対照として機能した。図１に提示される結果は、ミトコンドリア調製物の量の増加が細胞内のオイルレッドＯの定量化の減少と相関したことを示し、これは、細胞内の脂質蓄積の減少を示している。両方の対照試料は、低レベルのオイルレッドＯ染色を示した。
【０１５９】
実施例２：ウシ胎盤ミトコンドリアは、ウシ血清中のコレステロールを減少させる
ウシ胎盤ミトコンドリアを、実施例１に記載のように調製した。３０μｇのミトコンドリアを、２００μｌのウシ血清（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｓｒａｅｌ）とともに３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、血清中の総コレステロールのレベルを決定した。図２に示されるように、胎盤ミトコンドリアとともにインキュベートすることにより、血清コレステロールレベルの約１０％の減少が誘発された。
【０１６０】
実施例３：凍結および解凍したミトコンドリアは、凍結されていないミトコンドリアの酸素消費と同等の酸素消費を示す
ミトコンドリアを、以下のプロトコルに従ってマウス妊娠末期胎盤から単離した。
１．胎盤を、氷冷ＩＢ緩衝液（単離緩衝液：２００ｍＭのスクロース、１ｍＭのＥＧＴＡ、および１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＭＯＰＳ）＋０．２％のＢＳＡを使用して、血液がなくなるまで濯いだ。
２．胎盤を、はさみを使用して、５ｍｌのＩＢ＋０．２％のＢＳＡ中で小片に細かく刻んだ。
３．懸濁液を１０ｍｌのガラスポッターに移動させ、Ｄｏｕｎｃｅガラスホモジナイザーを使用して、５回の完全な上下サイクルによって均質化した。
４．ホモジネートを１５ｍｌチューブに移動させ、４℃で、６００ｇで１０分間遠心した。
５．上清を清潔な遠心チューブに移動させ、ペレットをＩＢ緩衝液中に再懸濁し、第２の遠心ステップに供した。
６．ステップ４および５の上清を５μｍのフィルターで濾過して、いかなる細胞または大きな細胞片も除去した。
７．上清を回収し、７，０００×ｇで１５分間遠心分離した。
８．ミトコンドリアペレットを１０ｍｌの氷冷ＩＢ緩衝液中で洗浄し、４℃で、７，０００×ｇで１５分間の遠心分離によって、ミトコンドリアを回収した。
９．上清を捨て、ペレットを再懸濁し、２００μｌのＩＢ緩衝液中にミトコンドリアを含有していた。
１０．タンパク質含有量を、ブラッドフォードアッセイによって決定した。
【０１６１】
凍結ミトコンドリアおよび非凍結ミトコンドリアの活性を比較するために、ミトコンドリアを、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ内でＩＢ中の液体窒素（２００ｍＭのスクロース、１ｍＭのＥＧＴＡ、および１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＭＯＰＳ）を使用して瞬間凍結し、−７０℃で３０分間保持した。ミトコンドリアを手で急速に解凍し、ＭｉｔｏＸｐｒｅｓｓ蛍光プローブ（Ｌｕｘｃｅｌ）およびＴｅｃａｎプレートリーダーを使用して、１００μｇのミトコンドリアによるＯ２消費を測定した。酸素消費を、２５ｍＭのコハク酸塩（Ｓ）の存在下、または２５ｍＭのコハク酸塩および１．６５ｍＭのＡＤＰ（Ｓ＋ＡＤＰ）の存在下で測定した。蛍光の変化を、時間０における蛍光のレベルに対して計算した。図３は、Ｏ２消費およびＯ２消費の速度が、凍結されていないミトコンドリア（「新鮮」と印付け）と比較して、凍結および解凍したミトコンドリア（「凍結」と印付け）について同等であったことを示した。
【０１６２】
凍結したミトコンドリアとは対照的に、冷却（４℃で４日間保持）したマウス胎盤ミトコンドリアは、新鮮なミトコンドリアよりもＡＴＰの産生が少なかった（表１）。
【表１】
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【０１６３】
実施例４：単離緩衝液中でインキュベートしたミトコンドリアおよびＰＢＳ中でインキュベートしたミトコンドリアの酸素消費および膜完全性の比較
ミトコンドリアを、単離緩衝液（ＩＢ）（２００ｍＭのスクロース、１ｍＭのＥＧＴＡ／Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、０．２％の脂肪酸を含まないＢＳＡで補助した１０ｍＭのＴｒｉｓ／Ｍｏｐｓ  ｐＨ７．４）を使用して、マウス妊娠末期胎盤から単離した。ミトコンドリアペレットを、ＩＢ中に懸濁し、氷上でインキュベートするか、またはＰＢＳ中に懸濁し、３７℃で１０分間インキュベートするかのいずれかにした。ＭｉｔｏＸｐｒｅｓｓ蛍光プローブ（Ｌｕｘｃｅｌ）を使用して、コハク酸塩（Ｓ）またはコハク酸塩＋ＡＤＰ（Ｓ＋Ａ）の存在下でインキュベートした５０μｇのミトコンドリアについて、酸素消費を測定した。図４Ａおよび４Ｂに見ることができるように、ＰＢＳとともにインキュベートしたミトコンドリア（４Ｂ）は、非結合ミトコンドリアに対応する酸素消費を示す一方で、ＩＢとともにインキュベートしたミトコンドリア（４Ａ）は、結合ミトコンドリアに対応する酸素消費を示す。
【０１６４】
ＣＳ０７２０キット（Ｓｉｇｍａ）を使用してクエン酸合成酵素放出を測定することによって、ＩＢ中でインキュベートしたミトコンドリアのミトコンドリア内膜完全性を、ＰＢＳ中でインキュベートしたミトコンドリアのミトコンドリア内膜完全性と比較した。図４Ｃは、ＰＢＳ中でインキュベートしたミトコンドリアでは、クエン酸合成酵素放出が証拠となっているように、膜完全性が減少していることを示す。
【０１６５】
実施例５：単離緩衝液中でインキュベートしたミトコンドリア対細胞培養培地中でインキュベートしたミトコンドリアの酸素消費および膜完全性の比較
ミトコンドリアを、単離緩衝液（ＩＢ）（２００ｍＭのスクロース、１ｍＭのＥＧＴＡ／Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、０．２％の脂肪酸を含まないＢＳＡで補助した１０ｍＭのＴｒｉｓ／Ｍｏｐｓ  ｐＨ７．４）を使用して、マウス妊娠末期胎盤から単離した。ミトコンドリアペレットを、ＩＢ中またはＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）中のいずれかで３７℃で１時間懸濁した。
【０１６６】
ＭｉｔｏＸｐｒｅｓｓ蛍光プローブ（Ｌｕｘｃｅｌ）を使用して、コハク酸＋ＡＤＰ（Ｓ＋ＡＤＰ）の存在下でインキュベートした５０μｇのミトコンドリアについて、酸素消費を測定した。図５Ａは、ＯｐｔｉＭＥＭ培地中でインキュベートしたミトコンドリアが、ＩＢ中でインキュベートしたミトコンドリアと比較して、酸素消費速度の低減を示すことを示す。
【０１６７】
ＣＳ０７２０キット（Ｓｉｇｍａ）を使用してクエン酸合成酵素放出を測定することによって、ＩＢ中でインキュベートしたミトコンドリアのミトコンドリア内膜完全性を、ＯｐｔｉＭＥＭ培地中でインキュベートしたミトコンドリアのミトコンドリア内膜完全性と比較した。図５Ｂは、ＯｐｔｉＭＥＭ培地中でインキュベートしたミトコンドリアでは、クエン酸合成酵素放出が証拠となっているように、膜完全性が減少していることを示す。
【０１６８】
実施例６：高スクロース濃度を含有する緩衝液中に懸濁したミトコンドリアは、より高い酸素消費を示す
ミトコンドリアを、以下のプロトコルに従って、ヒト妊娠末期胎盤から単離した。
１．胎盤を、氷冷ＩＢ緩衝液（単離緩衝液：２００ｍＭのスクロース、１ｍＭのＥＧＴＡ、および１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＭＯＰＳ）＋０．２％のＢＳＡを使用することによって、血液がなくなるまで濯いだ。
２．胎盤を、はさみを使用して、５ｍｌのＩＢ＋０．２％のＢＳＡ中で小片に細かく刻んだ。
３．懸濁液を１０ｍｌのガラスポッターに移動させ、Ｄｏｕｎｃｅガラスホモジナイザーを使用して、５回の完全な上下サイクルによって均質化した。
４．ホモジネートを１５ｍｌチューブに移動させ、４℃で、６００ｇで１０分間遠心した。
５．上清を清潔な遠心チューブに移動させ、ペレットをＩＢ緩衝液中に再懸濁し、第２の遠心ステップに供した。
６．ステップ４および５の上清を５μｍのフィルターで濾過して、いかなる細胞または大きな細胞片も除去した。
７．上清を回収し、７，０００×ｇで１５分間遠心分離した。
８．ミトコンドリアペレットを１０ｍｌの氷冷ＩＢ緩衝液中で洗浄し、４℃で、７，０００×ｇで１５分間の遠心分離によって、ミトコンドリアを回収した。
９．上清を捨て、ペレットを再懸濁し、２００μｌのＩＢ緩衝液中にミトコンドリアを含有していた。
１０．タンパク質含有量を、ブラッドフォードアッセイによって決定した。
【０１６９】
最終単離ステップ（ＭＰ）で１０倍に希釈したＩＢ（２０ｍＭのスクロース、０．１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＴｒｉｓ−ＭＯＰＳ）を使用することによって、マイトプラスト（外膜を欠くミトコンドリア、Ｍｕｒｔｈｙ  ａｎｄ  Ｐａｎｄｅ，１９８７による）を調製した。ＭｉｔｏＸｐｒｅｓｓ蛍光プローブ（Ｌｕｘｃｅｌ）およびＴｅｃａｎプレートリーダーを使用して、２５μｇのミトコンドリアまたはマイトプラストの経時的な酸素消費を測定した。蛍光の変化のパーセンテージを、時間０での蛍光のレベルに対して計算した。近似曲線をプロットして、Ｏ２消費速度（線の勾配）を表す経時的な蛍光の平均変化を決定した。
【０１７０】
図６に見ることができるように、２００ｍＭのスクロースを含有する緩衝液中に懸濁したミトコンドリアでは、酸素消費速度がより高かった。
【０１７１】
実施例７：マウス３Ｔ３細胞は、ミトコンドリアまたはミトコンドリア構成物での処理後に酸素消費の増加を示す
約４５０，０００個のマウス３Ｔ３細胞を、５．５ｍＭのＤ−ガラクトースを含有する無グルコース培地で２４時間飢餓させた。次に、細胞を、未処理のままにするか（ＮＴ）、または単離緩衝液中に懸濁し、氷上でインキュベートした１２．５μｇ／ｍｌのミトコンドリア（ＩＢ）、もしくはＰＢＳ中に懸濁し、３７℃で１０分間インキュベートし、２回凍結および解凍し、２５ゲージの針を通過させて、ミトコンドリア膜を完全に破壊した１２．５μｇ／ｍｌのミトコンドリア（ＰＢＳ）のいずれかとともに３時間インキュベートした。
【０１７２】
マウス３Ｔ３細胞の酸素消費を、ＭｉｔｏＸｐｒｅｓｓ蛍光プローブ（Ｌｕｘｃｅｌ）を使用して測定した。図７に見ることができるように、単離緩衝液中でインキュベートしたミトコンドリアおよびミトコンドリア構成物のいずれかでの処理は、マウス３Ｔ３細胞の酸素消費の増加をもたらした。
【０１７３】
実施例８：ヒト１４３Ｂ細胞は、新鮮なミトコンドリアまたは凍結したミトコンドリアに由来するミトコンドリア構成物での処理後に、クエン酸合成酵素活性のレベルの増加を示す
約６０，０００のヒト１４３Ｂ細胞を、５．５ｍＭのＤ−ガラクトースを含有する無グルコース培地中で７２時間飢餓させ、２４ウェルプレートに播種した。次に、細胞を、ＰＢＳ（ＮＴ）、ＰＢＳ中に懸濁した１２．５μｇ／ｍｌのミトコンドリア（ＰＢＳ）、または−８０℃で３０分間凍結し、インキュベーション前に解凍した、ＰＢＳ中に懸濁した１２．５μｇ／ｍｌのミトコンドリア（ＰＢＳ凍結）のいずれかとともに３時間インキュベートした。ヒト１４３Ｂ細胞のクエン酸合成酵素活性を、クエン酸合成酵素アッセイキット（Ｓｉｇｍａ）を使用して測定した。
【０１７４】
図８に見ることができるように、ヒト１４３Ｂのクエン酸合成酵素活性は、ミトコンドリア構成物（ＰＢＳ）または凍結および解凍を受けたミトコンドリア構成物（ＰＢＳ凍結）で処理した後に増加した。
【０１７５】
実施例９：ＰＢＳ対単離緩衝液中に懸濁したマウス胎盤ミトコンドリアは、酸素消費の減少およびクエン酸合成酵素放出の増加を示す
ミトコンドリアを、単離緩衝液（ＩＢ）（２００ｍＭのスクロース、１ｍＭのＥＧＴＡ／Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、０．２％の脂肪酸を含まないＢＳＡで補助した１０ｍＭのＴｒｉｓ／Ｍｏｐｓ  ｐＨ７．４）を使用して、マウス妊娠末期胎盤から単離した。ミトコンドリアペレットを、ＩＢ中に懸濁し、氷上でインキュベートするか、ＰＢＳ中に懸濁し、３７℃で１０分間インキュベートするかのいずれかにした。ＰＢＳに懸濁したミトコンドリアは、２サイクルの凍結／解凍を受け、そして２５ゲージの針を通過して、ミトコンドリア膜を完全に破壊した。ＭｉｔｏＸｐｒｅｓｓ蛍光プローブ（Ｌｕｘｃｅｌ）を使用して、コハク酸塩（Ｓ）またはコハク酸＋ＡＤＰ（Ｓ＋Ａ）の存在下で、ミトコンドリアの酸素消費のレベルを、５０μｇミトコンドリア中で測定した。ＣＳ０７２０キット（Ｓｉｇｍａ）を使用してミトコンドリアからのクエン酸合成酵素放出のレベルを測定することによって、ミトコンドリア内膜完全性を評価した。
【０１７６】
図９Ａに見ることができるように、ＰＢＳ中に懸濁したミトコンドリアは、酸素消費速度のより少ない変化を示す。図９Ｂに見ることができるように、ＰＢＳ中に懸濁したミトコンドリアは、ＩＢ中に懸濁したミトコンドリアと比較して、クエン酸合成酵素のより高い放出を示す。
【０１７７】
実施例１０：ヒト１４３Ｂ細胞は、単離緩衝液中またはＰＢＳ中のいずれかに懸濁したミトコンドリアとともにインキュベートした後に、クエン酸合成酵素活性のレベルの増加を示す
約６０，０００のヒト１４３Ｂ細胞を、５．５ｍＭのＤ−ガラクトースを含有する無グルコース培地で７２時間飢餓させ、２４ウェルプレートに播種した。次に、細胞を、未処理のままにするか、または単離緩衝液中に懸濁し、氷上でインキュベートした１２．５μｇ／ｍｌのミトコンドリア（ＩＢ）、もしくはＰＢＳ中に懸濁し、３７℃で１０分間インキュベートし、２回凍結および解凍し、２５ゲージの針を通過させて、ミトコンドリア膜を完全に破壊した１２．５μｇ／ｍｌのミトコンドリア（ＰＢＳ）のいずれかとともに３時間インキュベートした。ヒト１４３Ｂ細胞のクエン酸合成酵素活性を、クエン酸合成酵素アッセイキット（Ｓｉｇｍａ）を使用して測定した。
【０１７８】
図１０に見ることができるように、単離緩衝液中またはＰＢＳ中のいずれかに懸濁したミトコンドリアで処理した細胞は、細胞のクエン酸合成酵素活性の増加を誘発した。
【０１７９】
実施例１１：Ｃ５７ＢＬマウスは、リョクトウもやしから単離したミトコンドリアの経口投与後に、より少ない体重およびコレステロールレベルの減少を示す
ミトコンドリアを、以下のプロトコルに従って、リョクトウもやしから単離した。
１．４００グラムのＶｉｇｎａ  Ｒａｄｉａｔａのもやしを洗浄し、細かく刻んだ。
２．２Ｌのスクロース緩衝液（２５０ｍＭのスクロース、１０ＭｍのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）中での均質化。
３．４℃で６００ｇでの遠心分離。
４．５μｍのカットオフによって濾過する。
５．４℃で８０００ｇでの遠心分離。
６．ペレット洗浄、および４℃で８０００ｇでの遠心分離。
【０１８０】
４週齢のオスのＣ５７ＢＬマウスに、高脂肪食（ＨＦＤ、６０％の脂肪）または通常食を２ヶ月間給餌した。その後、マウスを、経口強制飼養により、リョクトウもやしから単離した低用量（３５０μｌ、０．１３μｇ／μｌ／日）または高用量（３５０μｌ、１．３μｇ／μｌ／日）のミトコンドリアで毎日治療した（１群あたりｎ＝１０匹）。対照マウス（ｎ＝１０）を、プラセボとしてスクロース緩衝液で治療した。マウスの体重を、治療後２７日間、異なる時点で記録した。実験の終了時にミトコンドリアで処理（高用量）したかまたは未処理のＨＦＤグループのマウスから血液を採取して、コレステロールレベルを評価した。
【０１８１】
図１１Ａに見ることができるように、高脂肪食を給餌したマウスでは、低用量および高用量の両方のミトコンドリア治療（「低」および「高」と印付け）が、対照群（非）と比較して、体重増加の低減をもたらした。通常食を給餌したマウスでは、体重への有意な影響は観察されず、対照マウス（通常）と比較して、高用量のミトコンドリアで治療したマウス（通常＋ミト）は、同様の体重増加を有した。加えて、図１１Ｂに見ることができるように、ＨＦＤ群のマウスは、高用量のミトコンドリア（ＨＦＤ＋ミト）での治療後に、より低いコレステロールレベルを示した。
【０１８２】
特定の実施形態の前述の説明は、本発明の一般的な性質を完全に明らかにするので、他の人は、現在の知識を適用することによって、過度の実験なしに、および一般的な概念から逸脱することなく、そのような特定の実施形態の様々な用途に容易に修正および／または適合することができ、したがって、そのような適合および変更は、本開示の実施形態の均等物の意味および範囲内で理解されるべきであり、そのように意図されている。本明細書で用いられる表現または用語は、説明を目的としたものであり、限定を目的としたものではないことを理解されたい。様々な本開示の機能を実施するための手段、材料、およびステップは、本発明から逸脱することなく、様々な代替形態をとることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2021519273.tif 000007
【図４Ｃ】
2021519273.tif 000008
【図５Ａ】
2021519273.tif 000009
【図５Ｂ】
2021519273.tif 000010
【図６】
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【図７】
2021519273.tif 000012
【図８】
2021519273.tif 000013
【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
2021519273.tif 000015
【図１０】
2021519273.tif 000016
【図１１Ａ】
2021519273.tif 000017
【図１１Ｂ】
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【国際調査報告】
2021519273.tif 000019
2021519273.tif 000020
2021519273.tif 000021