(57)【要約】  本発明は、野生型ＣＴＣＦのアミノ酸配列と配列が異なる、少なくとも１つのジンクフィンガーにおける少なくとも１つのアミノ酸残基を含む操作されたＣＣＣＴＣ結合因子（ＣＴＣＦ）バリアントであって、操作されたＣＴＣＦバリアントは、野生型ＣＴＣＦよりも高いアフィニティーで変異体ＣＴＣＦ結合配列（ＣＢＳ）に結合し、変異体ＣＢＳは、コンセンサスＣＢＳのヌクレオチド配列と配列が異なる少なくとも１つのヌクレオチド塩基を含み、野生型ＣＴＣＦのアミノ酸配列と配列が異なる少なくとも１つのアミノ酸残基は、操作されたＣＴＣＦバリアントのＺＦ７、ＺＦ６、ＺＦ５、ＺＦ４、およびＺＦ３のいずれかの位置−１、＋１、＋２、＋３、＋５、および＋６におけるアミノ酸残基からなる群から選択される、操作されたＣＴＣＦバリアントに関する。
2021523719.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型ＣＴＣＦのアミノ酸配列と配列が異なる、少なくとも１つのジンクフィンガーにおける少なくとも１つのアミノ酸残基を含む操作されたＣＣＣＴＣ結合因子（ＣＴＣＦ）バリアントであって、前記操作されたＣＴＣＦバリアントは、野生型ＣＴＣＦよりも高いアフィニティーで変異体ＣＴＣＦ結合配列（ＣＢＳ）に結合し、前記変異体ＣＢＳは、コンセンサスＣＢＳのヌクレオチド配列と配列が異なる少なくとも１つのヌクレオチド塩基を含み、前記野生型ＣＴＣＦのアミノ酸配列と配列が異なる前記少なくとも１つのアミノ酸残基は、前記操作されたＣＴＣＦバリアントのＺＦ７、ＺＦ６、ＺＦ５、ＺＦ４、およびＺＦ３のいずれかの位置−１、＋１、＋２、＋３、＋５、および＋６におけるアミノ酸残基からなる群から選択される、操作されたＣＴＣＦバリアント。
【請求項２】
前記変異体ＣＢＳは、前記コンセンサスＣＢＳモチーフの位置２にチミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）、またはグアニン（Ｇ）残基を有し、前記操作されたＣＴＣＦは、ＺＦ７の位置＋３にアミノ酸残基トレオニン、アスパラギン、またはヒスチジンを含む、請求項１に記載の操作されたＣＴＣＦバリアント。
【請求項３】
前記変異体ＣＢＳは、前記コンセンサスＣＢＳモチーフの位置２にＧ残基を有し、前記操作されたＣＴＣＦは、ＺＦ７の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＤＨＬＱＴ、ＥＨＬＮＶ、ＡＨＬＱＶ、ＥＨＬＲＥ、ＤＨＬＱＶ、ＥＨＬＫＶ、ＥＨＬＶＶ、ＤＨＬＲＴ、またはＤＨＬＡＴを含む、請求項１に記載の操作されたＣＴＣＦバリアント。
【請求項４】
前記変異体ＣＢＳは、前記コンセンサスＣＢＳモチーフの位置３にＴ、Ｇ、またはＣ残基を有し、前記操作されたＣＴＣＦは、ＺＦ７の位置−１〜＋３に：
アミノ酸配列ＲＫＨＤもしくはＲＲＳＤを含み、前記変異体ＣＢＳは前記コンセンサスＣＢＳモチーフの位置３にＴ残基を有する；
アミノ酸配列ＲＫＡＤ、ＩＰＲＩ、ＲＫＨＤ、もしくはＲＫＤＤを含み、前記変異体ＣＢＳは前記コンセンサスＣＢＳモチーフの位置３にＧ残基を有する；または、
アミノ酸配列ＧＩＶＮ、ＥＬＬＮ、ＱＡＬＬ、もしくはＰＨＲＭを含み、前記変異体ＣＢＳは前記コンセンサスＣＢＳモチーフの位置３にＣ残基を有する、
請求項１に記載の操作されたＣＴＣＦバリアント。
【請求項５】
前記変異体ＣＢＳは、前記コンセンサスＣＢＳモチーフの位置５にＴ、Ｇ、またはＡ残基を有し、前記操作されたＣＴＣＦは、ＺＦ６の位置＋２〜＋６に：
アミノ酸配列ＮＡＭＫＲ、ＧＮＭＡＲ、ＥＧＭＴＲ、ＳＮＭＶＲ、もしくはＮＡＭＲＧを含み、前記変異体ＣＢＳは前記コンセンサスＣＢＳモチーフの位置５にＴ残基を有する；または、
アミノ酸配列ＥＨＭＧＲ、ＤＨＭＮＲ、ＴＨＭＫＲ、ＥＨＭＲＲ、もしくはＴＨＭＮＲを含み、前記変異体ＣＢＳは前記コンセンサスＣＢＳモチーフの位置５にＧ残基を有する、
請求項１に記載の操作されたＣＴＣＦバリアント。
【請求項６】
前記変異体ＣＢＳは、前記コンセンサスＣＢＳモチーフの位置６にＴ、Ｇ、またはＣ残基を有し、前記操作されたＣＴＣＦは、ＺＦ６の位置−１〜＋３に：
アミノ酸配列ＭＮＥＳもしくはＨＲＥＳを含み、前記変異体ＣＢＳは前記コンセンサスＣＢＳモチーフの位置６にＴ残基を有する；または、
アミノ酸配列ＲＰＤＴ、ＲＴＤＩ、もしくはＲＨＤＴを含み、前記変異体ＣＢＳは前記コンセンサスＣＢＳモチーフの位置６にＧ残基を有する、
請求項１に記載の操作されたＣＴＣＦバリアント。
【請求項７】
前記変異体ＣＢＳは、前記コンセンサスＣＢＳモチーフの位置７にＣ、Ａ、またはＴ残基を有し、前記操作されたＣＴＣＦは、ＺＦ５の位置＋２〜＋６に：
アミノ酸配列ＨＧＬＫＶ、ＨＲＬＫＥ、ＨＡＬＫＶ、ＳＲＬＫＥ、もしくはＤＧＬＲＶを含み、前記変異体ＣＢＳは前記コンセンサスＣＢＳモチーフの位置７にＴ残基を有する；
アミノ酸配列ＨＴＬＫＶもしくはＨＧＬＫＶを含み、前記変異体ＣＢＳは前記コンセンサスＣＢＳモチーフの位置７にＡ残基を有する；または、
アミノ酸配列ＳＲＬＫＥ、ＨＲＬＫＥ、もしくはＮＲＬＫＥを含み、前記変異体ＣＢＳは前記コンセンサスＣＢＳモチーフの位置７にＣ残基を有する、
請求項１に記載の操作されたＣＴＣＦバリアント。
【請求項８】
前記変異体ＣＢＳは、前記コンセンサスＣＢＳモチーフの位置８にＣ、Ａ、またはＴ残基を有し、前記操作されたＣＴＣＦは、ＺＦ５の位置＋２〜＋６に：
アミノ酸配列ＡＴＬＫＲ、ＱＡＬＲＲ、ＧＧＬＶＲ、またはＨＧＬＩＲを含み、前記変異体ＣＢＳは前記コンセンサスＣＢＳモチーフの位置８にＴ残基を有する；
アミノ酸配列ＡＮＬＳＲ、ＴＧＬＴＲ、ＨＧＬＶＲ、またはＧＧＬＴＲを含み、前記変異体ＣＢＳは前記コンセンサスＣＢＳモチーフの位置８にＡ残基を有する；
アミノ酸配列ＨＴＬＲＲ、ＴＶＬＫＲ、ＡＤＬＫＲ、またはＨＧＬＲＲを含み、前記変異体ＣＢＳは前記コンセンサスＣＢＳモチーフの位置８にＣ残基を有する、
請求項１に記載の操作されたＣＴＣＦバリアント。
【請求項９】
前記変異体ＣＢＳは、前記コンセンサスＣＢＳモチーフの位置１０にＴ、Ａ、またはＣ残基を有し、前記操作されたＣＴＣＦは、ＺＦ４の位置＋２〜＋６に：
アミノ酸配列ＡＨＬＲＫを含み、前記変異体ＣＢＳは前記コンセンサスＣＢＳモチーフの位置１０にＴ残基を有する；
アミノ酸配列ＡＫＬＲＶ、ＥＫＬＲＩ、もしくはＡＫＬＲＩを含み、前記変異体ＣＢＳは前記コンセンサスＣＢＳモチーフの位置１０にＡ残基を有する；または、
アミノ酸配列ＴＫＬＫＶを含み、前記変異体ＣＢＳは前記コンセンサスＣＢＳモチーフの位置１０にＣ残基を有する、
請求項１に記載の操作されたＣＴＣＦバリアント。
【請求項１０】
前記変異体ＣＢＳは、前記コンセンサスＣＢＳモチーフの位置１１にＴ、Ａ、またはＣ残基を有し、前記操作されたＣＴＣＦは、ＺＦ４の位置＋２〜＋６に：
アミノ酸配列ＡＴＬＲＲもしくはＲＲＬＤＲを含み、前記変異体ＣＢＳは前記コンセンサスＣＢＳモチーフの位置１１にＴ残基を有する；
アミノ酸配列ＴＮＬＲＲ、ＡＮＬＲＲ、もしくはＧＮＬＴＲを含み、前記変異体ＣＢＳは前記コンセンサスＣＢＳモチーフの位置１１にＡ残基を有する；または、
アミノ酸配列ＡＭＬＫＲ、ＨＭＬＴＲ、ＡＭＬＲＲ、もしくはＴＭＬＲＲを含み、前記変異体ＣＢＳは前記コンセンサスＣＢＳモチーフの位置１１にＣ残基を有する、
請求項１に記載の操作されたＣＴＣＦバリアント。
【請求項１１】
前記変異体ＣＢＳは、前記コンセンサスＣＢＳモチーフの位置１３にＴ、Ａ、またはＣ残基を有し、前記操作されたＣＴＣＦは、ＺＦ３の位置＋２〜＋６に：
アミノ酸配列ＱＱＬＩＶ、ＳＱＬＩＶ、ＱＱＬＬＶ、ＧＥＬＶＶ、もしくはＱＱＬＬＩを含み、前記変異体ＣＢＳは前記コンセンサスＣＢＳモチーフの位置１３にＴ残基を有する；
アミノ酸配列ＧＱＬＩＶ、ＧＱＬＴＶ、ＧＫＬＶＴ、ＴＥＬＩＩ、もしくはＱＧＬＬＶを含み、前記変異体ＣＢＳは前記コンセンサスＣＢＳモチーフの位置１３にＡ残基を有する；または、
アミノ酸配列ＱＱＬＬＴ、ＧＱＬＬＴ、ＧＥＬＬＴ、もしくはＱＱＬＬＩを含み、前記変異体ＣＢＳは前記コンセンサスＣＢＳモチーフの位置１３にＣ残基を有する、
請求項１に記載の操作されたＣＴＣＦバリアント。
【請求項１２】
前記変異体ＣＢＳは、前記コンセンサスＣＢＳモチーフの位置２、６、７、および１０にそれぞれＡ、Ｇ、Ｔ、およびＴ残基を有し、前記操作されたＣＴＣＦは、
（ｉ）前記操作されたＣＴＣＦのＺＦ４の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＡＫＬＫＫ、ＡＫＬＲＫ、ＡＨＬＲＶ、ＡＫＬＲＶ、またはＳＫＬＲＬ；
（ｉｉ）前記操作されたＣＴＣＦのＺＦ５の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＥＲＬＲＶ、ＮＲＬＫＶ、ＳＲＬＫＥ、またはＮＲＬＫＶ；
（ｉｉｉ）前記操作されたＣＴＣＦのＺＦ６の位置−１〜＋３にアミノ酸配列ＲＰＤＴ、ＲＴＥＴ、またはＲＡＤＶ；および
（ｉｖ）前記操作されたＣＴＣＦのＺＦ７の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＤＮＬＬＡ、ＳＮＬＬＶ、ＤＮＬＭＡ、またはＤＮＬＲＶ
を含む、請求項１に記載の操作されたＣＴＣＦバリアント。
【請求項１３】
前記変異体ＣＢＳは、前記コンセンサスＣＢＳモチーフの位置２、６、７、および１０にそれぞれＧ、Ｇ、Ｔ、およびＴ残基を有し、前記操作されたＣＴＣＦは、
（ｉ）前記操作されたＣＴＣＦのＺＦ４の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＧＨＬＫＫ、ＡＨＬＲＫ、またはＧＫＬＲＩ；
（ｉｉ）前記操作されたＣＴＣＦのＺＦ５の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＳＲＬＫＥ、ＤＡＬＲＲ、ＤＧＬＫＲ、またはＴＲＬＲＥ；
（ｉｉｉ）前記操作されたＣＴＣＦのＺＦ６の位置−１〜＋６にアミノ酸配列ＲＰＤＴＭＫＲまたはＲＴＥＮＭＫＭ；および
（ｉｖ）前記操作されたＣＴＣＦのＺＦ７の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＥＨＬＫＶ、ＤＨＬＬＡ、またはＨＨＬＤＶ
を含む、請求項１に記載の操作されたＣＴＣＦバリアント。
【請求項１４】
前記変異体ＣＢＳは、前記コンセンサスＣＢＳモチーフの位置２、５、および１１にそれぞれＡ、Ｇ、およびＡ残基を有し、前記操作されたＣＴＣＦは、
（ｉ）前記操作されたＣＴＣＦのＺＦ４の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＳＮＬＲＲ、ＧＮＬＶＲ、ＧＮＬＲＲ、ＧＮＬＫＲ、ＡＮＬＲＲ、ＮＮＬＲＲ、またはＴＮＬＲＲ；
（ｉｉ）前記操作されたＣＴＣＦのＺＦ６の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＥＨＭＫＲ、ＥＨＭＲＲ、ＴＨＭＫＲ、ＥＨＭＮＲ、またはＥＨＭＡＲ；および
（ｉｉｉ）前記操作されたＣＴＣＦのＺＦ７の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＤＮＬＬＴ、ＤＮＬＬＶ、ＤＮＬＱＴ、ＤＮＬＬＡ、ＤＮＬＡＴ、ＤＮＬＱＡ、ＤＮＬＭＡ、またはＤＮＬＭＴ
を含む、請求項１に記載の操作されたＣＴＣＦバリアント。
【請求項１５】
前記変異体ＣＢＳは、前記コンセンサスＣＢＳモチーフの位置２、５、および１１にそれぞれＧ、Ｇ、およびＡ残基を有し、前記操作されたＣＴＣＦは、
（ｉ）前記操作されたＣＴＣＦのＺＦ４の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＧＮＬＶＲ、ＧＮＬＲＲ、ＧＮＬＡＲ、ＧＮＬＭＲ、ＡＮＬＲＲ、ＳＮＬＲＲ、またはＮＮＬＲＲ；
（ｉｉ）前記操作されたＣＴＣＦのＺＦ６の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＥＨＭＮＲ、ＥＨＭＫＲ、ＥＨＭＲＲ、ＳＨＭＮＲ、ＳＨＭＲＲ、ＴＨＭＫＲ、またはＤＨＭＮＲ；および
（ｉｉｉ）前記操作されたＣＴＣＦのＺＦ７の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＥＨＬＫＶ、ＥＨＬＡＥ、ＳＴＬＮＥ、ＤＨＬＱＶ、ＥＨＬＮＶ、ＤＨＬＮＴ、ＥＨＬＱＡ、またはＨＨＬＭＨ
を含む、請求項１に記載の操作されたＣＴＣＦバリアント。
【請求項１６】
前記変異体ＣＢＳは、前記コンセンサスＣＢＳモチーフの位置６、７、および１０にそれぞれＧ、Ｔ、およびＴ残基を有し、前記操作されたＣＴＣＦは、
（ｉ）前記操作されたＣＴＣＦのＺＦ４の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＧＨＬＫＫ、ＡＨＬＫＫ、ＴＫＬＲＬ、ＴＫＬＫＬ、ＧＨＬＲＫ、ＴＨＬＫＫ、またはＡＨＬＲＫ；
（ｉｉ）前記操作されたＣＴＣＦのＺＦ５の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＴＲＬＫＥまたはＳＲＬＫＥ；および
（ｉｉｉ）前記操作されたＣＴＣＦのＺＦ６の位置−１〜＋３にアミノ酸配列ＲＡＤＮ、ＲＨＤＴ、ＲＲＤＴ、ＲＰＤＴ、ＲＴＳＳ、またはＲＮＤＴ
を含む、請求項１に記載の操作されたＣＴＣＦバリアント。
【請求項１７】
コヒーシン（cohesion）と相互作用してエンハンサー−プロモーターループの形成を媒介して遺伝子発現をモジュレートする、請求項１から１６のいずれか一項に記載の操作されたＣＴＣＦバリアント。
【請求項１８】
請求項１から１７のいずれか一項に記載の操作されたＣＴＣＦバリアントの治療上有効量を対象に投与するステップを含む、それを必要とする対象を治療する方法。
【請求項１９】
前記対象は癌を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１から１７のいずれか一項に規定の変異体ＣＢＳの制御下にある遺伝子の発現を活性化するまたは抑制する方法であって、前記遺伝子は、前記変異体ＣＢＳの制御下で異常に発現しており、前記変異体ＣＢＳと請求項１から１７のいずれか一項に記載の操作されたＣＴＣＦとを接触させ、それによって前記遺伝子の発現を調節するステップを含む、方法。
【請求項２１】
前記操作されたＣＴＣＦは、コヒーシンと相互作用してエンハンサー−プロモーターループの形成を媒介することによって前記遺伝子の発現を活性化するまたは抑制する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１から１７のいずれか一項に記載の操作されたＣＴＣＦバリアントを含む、薬学的組成物。
【請求項２３】
請求項１から１７のいずれか一項に記載の操作されたＣＴＣＦバリアントをコードする核酸を含む、遺伝子の調節のための遺伝子発現システム。
【請求項２４】
請求項１から１７のいずれか一項に記載の操作されたＣＴＣＦバリアントと変異体ＣＢＳとを接触させて結合複合体を形成し、それによりクロマチンの構造が変更されるステップを含む、クロマチンの構造を変更する方法。
【請求項２５】
１つまたは複数の変異を持つＣＢＳと請求項１から１７のいずれか一項に記載の操作されたＣＴＣＦバリアントとを接触させるステップを含む、１つまたは複数の変異を持つＣＢＳの制御下にある遺伝子の発現をモジュレートする方法。
【請求項２６】
請求項１から１７のいずれか一項に記載の操作されたＣＴＣＦバリアントおよび本明細書において記載される方法における使用のための取扱説明書を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、２０１８年５月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／６７２，６８２号明細書、および２０１９年４月２日に出願された米国仮特許出願第６２／８２８，２７７号明細書の利益を主張する。前述の米国仮特許出願の全内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
連邦支援による研究または開発
本発明は、アメリカ国立衛生研究所によって授与された助成金第ＧＭ１１８１５８号の下で政府援助により行われた。政府は、本発明におけるある一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、少なくとも一部には、変更したＤＮＡ結合特異性を有する操作されたＣＣＣＴＣ結合因子バリアントに関する。
【背景技術】
【０００４】
ＣＣＣＴＣ結合因子（ＣＴＣＦ）は、高次クロマチン構造を維持することによって必須のゲノムオーガナイザーとして作用し、一方で細胞分化におけるおよび遺伝子発現の促進または抑制における役割も有するマルチドメインタンパク質である（Ong and Corces, Nature Reviews Genetics (2014)；Phillips and Corces, Cell (2009)）。ＣＴＣＦは、ゲノムのメガベースにまたがるトポロジカル関連ドメイン（ＴＡＤ）、ならびに遺伝子クラスター内の微調整された遺伝子断絶または遺伝子活性化につながるより小型のサブＴＡＤを維持する（Ali et al., Current Opinion in Genetics & Development (2016)；Nora et al., Nature (2012)；Rao et al., Cell (2014)）。加えて、ＣＴＣＦは、転写の速度に影響を与えることによってｍＲＮＡスプライシングを調節することが見出されており、より最近では、二本鎖断裂における相同組み換え修復を促進することに関わっている（Shukla et al., Nature (2011)；Hilmi et al., Science Advances (2017)；Han et al., Scientific Reports (2016)）。ＣＴＣＦは、ＣＴＣＦ結合部位（ＣＢＳ）を認識する１１フィンガージンクフィンガー（ＺＦ）アレイを介してゲノムのあらゆる場所で結合する。ＣＢＳは、典型的に、高度に保存された１５ｂｐのコア配列を有して、長さが４０ｂｐである。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、少なくとも一部には、野生型ＣＴＣＦよりも高いアフィニティーで変異体ＣＢＳに結合し得る操作されたＣＴＣＦバリアントの開発に基づく。
【０００６】
本発明は、野生型ＣＴＣＦのアミノ酸配列と配列が異なる、少なくとも１つのジンクフィンガーにおける少なくとも１つのアミノ酸残基を含む操作されたＣＣＣＴＣ結合因子（ＣＴＣＦ）バリアントであって、操作されたＣＴＣＦバリアントは、野生型ＣＴＣＦよりも高いアフィニティーで変異体ＣＴＣＦ結合配列（ＣＢＳ）に結合し、変異体ＣＢＳは、コンセンサスＣＢＳのヌクレオチド配列と配列が異なる少なくとも１つのヌクレオチド塩基を含み、野生型ＣＴＣＦのアミノ酸配列と配列が異なる少なくとも１つのアミノ酸残基は、操作されたＣＴＣＦバリアントのＺＦ７、ＺＦ６、ＺＦ５、ＺＦ４、およびＺＦ３のいずれかの位置−１、＋１、＋２、＋３、＋５、および＋６におけるアミノ酸残基からなる群から選択される、操作されたＣＴＣＦバリアントに関する。
【０００７】
一部の実施形態において、操作されたＣＴＣＦバリアントは、野生型ＣＴＣＦよりも高いアフィニティーで、コンセンサスＣＢＳモチーフの位置２にチミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）、またはグアニン（Ｇ）残基を有する変異体ＣＴＣＦ結合配列（ＣＢＳ）に結合し、操作されたＣＴＣＦは、ＺＦ７の位置＋３にアミノ酸残基トレオニン、アスパラギン、またはヒスチジンを含む。
【０００８】
一部の実施形態において、操作されたＣＴＣＦバリアントは、野生型ＣＴＣＦよりも高いアフィニティーで、コンセンサスＣＢＳモチーフの位置２にＧ残基を有する変異体ＣＢＳに結合し、操作されたＣＴＣＦは、ＺＦ７の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＤＨＬＱＴ、ＥＨＬＮＶ、ＡＨＬＱＶ、ＥＨＬＲＥ、ＤＨＬＱＶ、ＥＨＬＫＶ、ＥＨＬＶＶ、ＤＨＬＲＴ、またはＤＨＬＡＴを含む。
【０００９】
一部の実施形態において、操作されたＣＴＣＦバリアントは、野生型ＣＴＣＦよりも高いアフィニティーで、コンセンサスＣＢＳモチーフの位置３にＴ、Ｇ、またはＣ残基を有する変異体ＣＢＳに結合し、操作されたＣＴＣＦは、ＺＦ７の位置−１〜＋３に：アミノ酸配列ＲＫＨＤもしくはＲＲＳＤを含み、変異体ＣＢＳはコンセンサスＣＢＳモチーフの位置３にＴ残基を有する；アミノ酸配列ＲＫＡＤ、ＩＰＲＩ、ＲＫＨＤ、もしくはＲＫＤＤを含み、変異体ＣＢＳはコンセンサスＣＢＳモチーフの位置３にＧ残基を有する；または、アミノ酸配列ＧＩＶＮ、ＥＬＬＮ、ＱＡＬＬ、もしくはＰＨＲＭを含み、変異体ＣＢＳはコンセンサスＣＢＳモチーフの位置３にＣ残基を有する。
【００１０】
一部の実施形態において、操作されたＣＴＣＦバリアントは、野生型ＣＴＣＦよりも高いアフィニティーで、コンセンサスＣＢＳモチーフの位置５にＴ、Ｇ、またはＡ残基を有する変異体ＣＢＳに結合し、操作されたＣＴＣＦは、ＺＦ６の位置＋２〜＋６に：アミノ酸配列ＮＡＭＫＲ、ＧＮＭＡＲ、ＥＧＭＴＲ、ＳＮＭＶＲ、もしくはＮＡＭＲＧを含み、変異体ＣＢＳはコンセンサスＣＢＳモチーフの位置５にＴ残基を有する；または、アミノ酸配列ＥＨＭＧＲ、ＤＨＭＮＲ、ＴＨＭＫＲ、ＥＨＭＲＲ、もしくはＴＨＭＮＲを含み、変異体ＣＢＳはコンセンサスＣＢＳモチーフの位置５にＧ残基を有する。
【００１１】
一部の実施形態において、操作されたＣＴＣＦバリアントは、野生型ＣＴＣＦよりも高いアフィニティーで、コンセンサスＣＢＳモチーフの位置６にＴ、Ｇ、またはＣ残基を有する変異体ＣＢＳに結合し、操作されたＣＴＣＦは、ＺＦ６の位置−１〜＋３に：アミノ酸配列ＭＮＥＳもしくはＨＲＥＳを含み、変異体ＣＢＳはコンセンサスＣＢＳモチーフの位置６にＴ残基を有する；または、アミノ酸配列ＲＰＤＴ、ＲＴＤＩ、もしくはＲＨＤＴを含み、変異体ＣＢＳはコンセンサスＣＢＳモチーフの位置６にＧ残基を有する。
【００１２】
一部の実施形態において、操作されたＣＴＣＦバリアントは、野生型ＣＴＣＦよりも高いアフィニティーで、コンセンサスＣＢＳモチーフの位置７にＣ、Ａ、またはＴ残基を有する変異体ＣＢＳに結合し、操作されたＣＴＣＦは、ＺＦ５の位置＋２〜＋６に：アミノ酸配列ＨＧＬＫＶ、ＨＲＬＫＥ、ＨＡＬＫＶ、ＳＲＬＫＥ、もしくはＤＧＬＲＶを含み、変異体ＣＢＳはコンセンサスＣＢＳモチーフの位置７にＴ残基を有する；アミノ酸配列ＨＴＬＫＶもしくはＨＧＬＫＶを含み、変異体ＣＢＳはコンセンサスＣＢＳモチーフの位置７にＡ残基を有する；または、アミノ酸配列ＳＲＬＫＥ、ＨＲＬＫＥ、もしくはＮＲＬＫＥを含み、変異体ＣＢＳはコンセンサスＣＢＳモチーフの位置７にＣ残基を有する。
【００１３】
一部の実施形態において、操作されたＣＴＣＦバリアントは、野生型ＣＴＣＦよりも高いアフィニティーで、コンセンサスＣＢＳモチーフの位置８にＣ、Ａ、またはＴ残基を有する変異体ＣＢＳに結合し、操作されたＣＴＣＦは、ＺＦ５の位置＋２〜＋６に：アミノ酸配列ＡＴＬＫＲ、ＱＡＬＲＲ、ＧＧＬＶＲ、またはＨＧＬＩＲを含み、変異体ＣＢＳはコンセンサスＣＢＳモチーフの位置８にＴ残基を有する；アミノ酸配列ＡＮＬＳＲ、ＴＧＬＴＲ、ＨＧＬＶＲ、またはＧＧＬＴＲを含み、変異体ＣＢＳはコンセンサスＣＢＳモチーフの位置８にＡ残基を有する；アミノ酸配列ＨＴＬＲＲ、ＴＶＬＫＲ、ＡＤＬＫＲ、またはＨＧＬＲＲを含み、変異体ＣＢＳはコンセンサスＣＢＳモチーフの位置８にＣ残基を有する。
【００１４】
一部の実施形態において、操作されたＣＴＣＦバリアントは、野生型ＣＴＣＦよりも高いアフィニティーで、コンセンサスＣＢＳモチーフの位置１０にＴ、Ａ、またはＣ残基を有する変異体ＣＢＳに結合し、操作されたＣＴＣＦは、ＺＦ４の位置＋２〜＋６に：アミノ酸配列ＡＨＬＲＫを含み、変異体ＣＢＳはコンセンサスＣＢＳモチーフの位置１０にＴ残基を有する；アミノ酸配列ＡＫＬＲＶ、ＥＫＬＲＩ、もしくはＡＫＬＲＩを含み、変異体ＣＢＳはコンセンサスＣＢＳモチーフの位置１０にＡ残基を有する；または、アミノ酸配列ＴＫＬＫＶを含み、変異体ＣＢＳはコンセンサスＣＢＳモチーフの位置１０にＣ残基を有する。
【００１５】
一部の実施形態において、操作されたＣＴＣＦバリアントは、野生型ＣＴＣＦよりも高いアフィニティーで、コンセンサスＣＢＳモチーフの位置１１にＴ、Ａ、またはＣ残基を有する変異体ＣＢＳに結合し、操作されたＣＴＣＦは、ＺＦ４の位置＋２〜＋６に：アミノ酸配列ＡＴＬＲＲもしくはＲＲＬＤＲを含み、変異体ＣＢＳはコンセンサスＣＢＳモチーフの位置１１にＴ残基を有する；アミノ酸配列ＴＮＬＲＲ、ＡＮＬＲＲ、もしくはＧＮＬＴＲを含み、変異体ＣＢＳはコンセンサスＣＢＳモチーフの位置１１にＡ残基を有する；または、アミノ酸配列ＡＭＬＫＲ、ＨＭＬＴＲ、ＡＭＬＲＲ、もしくはＴＭＬＲＲを含み、変異体ＣＢＳはコンセンサスＣＢＳモチーフの位置１１にＣ残基を有する。
【００１６】
一部の実施形態において、操作されたＣＴＣＦバリアントは、野生型ＣＴＣＦよりも高いアフィニティーで、コンセンサスＣＢＳモチーフの位置１３にＴ、Ａ、またはＣ残基を有する変異体ＣＢＳに結合し、操作されたＣＴＣＦは、ＺＦ３の位置＋２〜＋６に：アミノ酸配列ＱＱＬＩＶ、ＳＱＬＩＶ、ＱＱＬＬＶ、ＧＥＬＶＶ、もしくはＱＱＬＬＩを含み、変異体ＣＢＳはコンセンサスＣＢＳモチーフの位置１３にＴ残基を有する；アミノ酸配列ＧＱＬＩＶ、ＧＱＬＴＶ、ＧＫＬＶＴ、ＴＥＬＩＩ、もしくはＱＧＬＬＶを含み、変異体ＣＢＳはコンセンサスＣＢＳモチーフの位置１３にＡ残基を有する；または、アミノ酸配列ＱＱＬＬＴ、ＧＱＬＬＴ、ＧＥＬＬＴ、もしくはＱＱＬＬＩを含み、変異体ＣＢＳはコンセンサスＣＢＳモチーフの位置１３にＣ残基を有する。
【００１７】
一部の実施形態において、操作されたＣＴＣＦバリアントは、野生型ＣＴＣＦよりも高いアフィニティーで、コンセンサスＣＢＳモチーフの位置２、６、７、および１０にそれぞれＡ、Ｇ、Ｔ、およびＴ残基を有する変異体ＣＢＳに結合し、操作されたＣＴＣＦは、（ｉ）操作されたＣＴＣＦのＺＦ４の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＡＫＬＫＫ、ＡＫＬＲＫ、ＡＨＬＲＶ、ＡＫＬＲＶ、またはＳＫＬＲＬ；（ｉｉ）操作されたＣＴＣＦのＺＦ５の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＥＲＬＲＶ、ＮＲＬＫＶ、ＳＲＬＫＥ、またはＮＲＬＫＶ；（ｉｉｉ）操作されたＣＴＣＦのＺＦ６の位置−１〜＋３にアミノ酸配列ＲＰＤＴ、ＲＴＥＴ、またはＲＡＤＶ；および（ｉｖ）操作されたＣＴＣＦのＺＦ７の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＤＮＬＬＡ、ＳＮＬＬＶ、ＤＮＬＭＡ、またはＤＮＬＲＶ、を含む。
【００１８】
一部の実施形態において、操作されたＣＴＣＦバリアントは、野生型ＣＴＣＦよりも高いアフィニティーで、コンセンサスＣＢＳモチーフの位置２、６、７、および１０にそれぞれＧ、Ｇ、Ｔ、およびＴ残基を有する変異体ＣＢＳに結合し、操作されたＣＴＣＦは、（ｉ）操作されたＣＴＣＦのＺＦ４の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＧＨＬＫＫ、ＡＨＬＲＫ、またはＧＫＬＲＩ；（ｉｉ）操作されたＣＴＣＦのＺＦ５の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＳＲＬＫＥ、ＤＡＬＲＲ、ＤＧＬＫＲ、またはＴＲＬＲＥ；（ｉｉｉ）操作されたＣＴＣＦのＺＦ６の位置−１〜＋６にアミノ酸配列ＲＰＤＴＭＫＲまたはＲＴＥＮＭＫＭ；および（ｉｖ）操作されたＣＴＣＦのＺＦ７の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＥＨＬＫＶ、ＤＨＬＬＡ、またはＨＨＬＤＶ、を含む。
【００１９】
一部の実施形態において、操作されたＣＴＣＦバリアントは、野生型ＣＴＣＦよりも高いアフィニティーで、コンセンサスＣＢＳモチーフの位置２、５、および１１にそれぞれＡ、Ｇ、およびＡ残基を有する変異体ＣＢＳに結合し、操作されたＣＴＣＦは、（ｉ）操作されたＣＴＣＦのＺＦ４の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＳＮＬＲＲ、ＧＮＬＶＲ、ＧＮＬＲＲ、ＧＮＬＫＲ、ＡＮＬＲＲ、ＮＮＬＲＲ、またはＴＮＬＲＲ；（ｉｉ）操作されたＣＴＣＦのＺＦ６の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＥＨＭＫＲ、ＥＨＭＲＲ、ＴＨＭＫＲ、ＥＨＭＮＲ、またはＥＨＭＡＲ；および（ｉｉｉ）操作されたＣＴＣＦのＺＦ７の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＤＮＬＬＴ、ＤＮＬＬＶ、ＤＮＬＱＴ、ＤＮＬＬＡ、ＤＮＬＡＴ、ＤＮＬＱＡ、ＤＮＬＭＡ、またはＤＮＬＭＴ、を含む。
【００２０】
一部の実施形態において、操作されたＣＴＣＦバリアントは、野生型ＣＴＣＦよりも高いアフィニティーで、コンセンサスＣＢＳモチーフの位置２、５、および１１にそれぞれＧ、Ｇ、およびＡ残基を有する変異体ＣＢＳに結合し、操作されたＣＴＣＦは、（ｉ）操作されたＣＴＣＦのＺＦ４の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＧＮＬＶＲ、ＧＮＬＲＲ、ＧＮＬＡＲ、ＧＮＬＭＲ、ＡＮＬＲＲ、ＳＮＬＲＲ、またはＮＮＬＲＲ；（ｉｉ）操作されたＣＴＣＦのＺＦ６の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＥＨＭＮＲ、ＥＨＭＫＲ、ＥＨＭＲＲ、ＳＨＭＮＲ、ＳＨＭＲＲ、ＴＨＭＫＲ、またはＤＨＭＮＲ；および（ｉｉｉ）操作されたＣＴＣＦのＺＦ７の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＥＨＬＫＶ、ＥＨＬＡＥ、ＳＴＬＮＥ、ＤＨＬＱＶ、ＥＨＬＮＶ、ＤＨＬＮＴ、ＥＨＬＱＡ、またはＨＨＬＭＨ、を含む。
【００２１】
一部の実施形態において、操作されたＣＴＣＦバリアントは、野生型ＣＴＣＦよりも高いアフィニティーで、コンセンサスＣＢＳモチーフの位置６、７、および１０にそれぞれＧ、Ｔ、およびＴ残基を有する変異体ＣＢＳに結合し、操作されたＣＴＣＦは、（ｉ）操作されたＣＴＣＦのＺＦ４の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＧＨＬＫＫ、ＡＨＬＫＫ、ＴＫＬＲＬ、ＴＫＬＫＬ、ＧＨＬＲＫ、ＴＨＬＫＫ、またはＡＨＬＲＫ；（ｉｉ）操作されたＣＴＣＦのＺＦ５の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＴＲＬＫＥまたはＳＲＬＫＥ；および（ｉｉｉ）操作されたＣＴＣＦのＺＦ６の位置−１〜＋３にアミノ酸配列ＲＡＤＮ、ＲＨＤＴ、ＲＲＤＴ、ＲＰＤＴ、ＲＴＳＳ、またはＲＮＤＴ、を含む。
【００２２】
一部の実施形態において、操作されたＣＴＣＦバリアントは、野生型ＣＴＣＦのアミノ酸配列と配列が異なる、少なくとも１つのジンクフィンガーにおける少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、操作されたＣＴＣＦバリアントは、野生型ＣＴＣＦよりも高いアフィニティーで変異体ＣＴＣＦ結合配列（ＣＢＳ）に結合し、変異体ＣＢＳは、コンセンサスＣＢＳのヌクレオチド配列と配列が異なる少なくとも１つのヌクレオチド塩基を含み、野生型ＣＴＣＦのアミノ酸配列と配列が異なる少なくとも１つのアミノ酸残基は、操作されたＣＴＣＦバリアントのＺＦ７、ＺＦ６、ＺＦ５、ＺＦ４、およびＺＦ３のいずれかの位置−１、＋１、＋２、＋３、＋５、および＋６におけるアミノ酸残基からなる群から選択される。
【００２３】
一部の実施形態において、野生型ＣＴＣＦよりも高いアフィニティーで、コンセンサスＣＢＳモチーフの位置２においてコンセンサスＣＢＳと異なる変異体ＣＴＣＦ結合配列（ＣＢＳ）に結合する操作されたＣＣＣＴＣ結合因子（ＣＴＣＦ）バリアントであって、操作されたＣＴＣＦは、ＺＦ７の位置＋３にアミノ酸残基トレオニン、アスパラギン、またはヒスチジンを含む。
【００２４】
一部の実施形態において、操作されたＣＴＣＦバリアントは、野生型ＣＴＣＦよりも高いアフィニティーで、コンセンサスＣＢＳモチーフの位置２にＣからＧへの変異を有する変異体ＣＢＳに結合し、操作されたＣＴＣＦは、ＺＦ７の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＤＨＬＱＴ、ＥＨＬＮＶ、ＡＨＬＱＶ、ＥＨＬＲＥ、ＤＨＬＱＶ、ＥＨＬＫＶ、ＤＨＬＱＶ、ＥＨＬＶＶ、ＤＨＬＲＴ、ＤＨＬＡＴ、またはＤＨＬＱＴを含む。
【００２５】
一部の実施形態において、操作されたＣＴＣＦバリアントは、野生型ＣＴＣＦよりも高いアフィニティーで、コンセンサスＣＢＳモチーフの位置３においてコンセンサスＣＢＳと異なる変異体ＣＢＳに結合し、操作されたＣＴＣＦは、ＺＦ７の位置−１〜＋３にアミノ酸配列ＲＫＨＤ、ＲＲＳＤ、ＧＩＶＮ、ＥＬＬＮ、またはＰＨＲＭを含む。
【００２６】
一部の実施形態において、操作されたＣＴＣＦバリアントは、野生型ＣＴＣＦよりも高いアフィニティーで、コンセンサスＣＢＳモチーフの位置５においてコンセンサスＣＢＳと異なる変異体ＣＢＳに結合し、操作されたＣＴＣＦは、ＺＦ６の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＮＡＭＫＲ、ＥＨＭＧＲ、ＤＨＭＮＲ、ＴＨＭＫＲ、ＥＨＭＲＲ、またはＴＨＭＮＲを含む。
【００２７】
一部の実施形態において、操作されたＣＴＣＦバリアントは、野生型ＣＴＣＦよりも高いアフィニティーで、コンセンサスＣＢＳモチーフの位置６においてコンセンサスＣＢＳと異なる変異体ＣＢＳに結合し、操作されたＣＴＣＦは、ＺＦ６の位置−１〜＋３にアミノ酸配列ＭＮＥＳ、ＨＲＥＳ、ＲＰＤＴ、ＲＴＤＩ、またはＲＨＤＴを含む。
【００２８】
一部の実施形態において、操作されたＣＴＣＦバリアントは、野生型ＣＴＣＦよりも高いアフィニティーで、コンセンサスＣＢＳモチーフの位置７においてコンセンサスＣＢＳと異なる変異体ＣＢＳに結合し、操作されたＣＴＣＦは、ＺＦ５の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＨＧＬＫＶ、ＨＲＬＫＥ、ＨＡＬＫＶ、ＳＲＬＫＥ、ＤＧＬＲＶ、ＨＴＬＫＶ、またはＮＲＬＫＥを含む。
【００２９】
一部の実施形態において、操作されたＣＴＣＦバリアントは、野生型ＣＴＣＦよりも高いアフィニティーで、コンセンサスＣＢＳモチーフの位置８においてコンセンサスＣＢＳと異なる変異体ＣＢＳに結合し、操作されたＣＴＣＦは、ＺＦ５の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＡＴＬＫＲ、ＱＡＬＲＲ、ＧＧＬＶＲ、ＨＧＬＩＲ、ＡＮＬＳＲ、ＴＧＬＴＲ、ＨＧＬＶＲ、ＧＧＬＴＲ、ＨＴＬＲＲ、ＴＶＬＫＲ、ＡＤＬＫＲ、またはＨＧＬＲＲを含む。
【００３０】
一部の実施形態において、操作されたＣＴＣＦバリアントは、野生型ＣＴＣＦよりも高いアフィニティーで、コンセンサスＣＢＳモチーフの位置１０においてコンセンサスＣＢＳと異なる変異体ＣＢＳに結合し、操作されたＣＴＣＦは、ＺＦ４の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＡＨＬＲＫ、ＡＫＬＲＶ、ＧＧＬＧＬ、ＡＫＬＲＩ、ＴＫＬＫＶ、またはＳＫＬＲＶを含む。
【００３１】
一部の実施形態において、操作されたＣＴＣＦバリアントは、野生型ＣＴＣＦよりも高いアフィニティーで、コンセンサスＣＢＳモチーフの位置１１においてコンセンサスＣＢＳと異なる変異体ＣＢＳに結合し、操作されたＣＴＣＦは、ＺＦ４の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＡＴＬＲＲ、ＲＲＬＤＲ、ＴＮＬＲＲ、ＡＮＬＲＲ、ＧＮＬＴＲ、ＡＭＬＫＲ、ＨＭＬＴＲ、ＡＭＬＲＲ、またはＴＭＬＲＲを含む。
【００３２】
一部の実施形態において、操作されたＣＴＣＦバリアントは、野生型ＣＴＣＦよりも高いアフィニティーで、コンセンサスＣＢＳモチーフの位置１３においてコンセンサスＣＢＳと異なる変異体ＣＢＳに結合し、操作されたＣＴＣＦは、ＺＦ３の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＱＱＬＩＶ、ＳＱＬＩＶ、ＱＱＬＬＶ、ＧＥＬＶＶ、ＱＱＬＬＩ、ＧＱＬＩＶ、ＧＱＬＴＶ、ＴＥＬＩＩ、ＱＧＬＬＶ、ＱＱＬＬＴ、ＧＱＬＬＴ、ＧＥＬＬＴ、またはＱＱＬＬＩを含む。
【００３３】
一部の実施形態において、操作されたＣＴＣＦバリアントは、野生型ＣＴＣＦよりも高いアフィニティーで、コンセンサスＣＢＳモチーフの位置２、６、７、および１０においてコンセンサスＣＢＳと異なる変異体ＣＢＳに結合し、操作されたＣＴＣＦは、
（ｉ）ＺＦ４の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＡＫＬＫＫ、ＡＫＬＲＫ、ＡＨＬＲＶ、ＡＫＬＲＶ、またはＳＫＬＲＬ；
（ｉｉ）ＺＦ５の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＥＲＬＲＶ、ＮＲＬＫＶ、ＳＲＬＫＥ、またはＮＲＬＫＶ；
（ｉｉｉ）ＺＦ６の位置−１〜＋３にアミノ酸配列ＲＰＤＴ、ＲＴＥＴ、またはＲＡＤＶ；および
（ｉｖ）ＺＦ７の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＤＮＬＬＡ、ＳＮＬＬＶ、ＤＮＬＭＡ、またはＤＮＬＲＶ
を含む。
【００３４】
一部の実施形態において、操作されたＣＴＣＦバリアントは、野生型ＣＴＣＦよりも高いアフィニティーで、コンセンサスＣＢＳモチーフの位置２、６、７、および１０においてコンセンサスＣＢＳと異なる変異体ＣＢＳに結合し、操作されたＣＴＣＦは、
（ｉ）ＺＦ４の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＧＨＬＫＫ、ＡＨＬＲＫ、またはＧＫＬＲＩ；
（ｉｉ）ＺＦ５の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＳＲＬＫＥ、ＤＡＬＲＲ、ＤＧＬＫＲ、またはＴＲＬＲＥ；
（ｉｉｉ）ＺＦ６の位置−１〜＋３６にアミノ酸配列ＲＰＤＴＭＫＲまたはＲＴＥＮＭＫＭ；および
（ｉｖ）ＺＦ７の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＥＨＬＫＶ、ＤＨＬＬＡ、またはＨＨＬＤＶ
を含む。
【００３５】
一部の実施形態において、操作されたＣＴＣＦバリアントは、野生型ＣＴＣＦよりも高いアフィニティーで、コンセンサスＣＢＳモチーフの位置２、５、および１１においてコンセンサスＣＢＳと異なる変異体ＣＢＳに結合し、操作されたＣＴＣＦは、
（ｉ）ＺＦ４の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＳＮＬＲＲ、ＧＮＬＶＲ、ＧＮＬＲＲ、ＧＮＬＫＲ、ＡＮＬＲＲ、ＮＮＬＲＲ、またはＴＮＬＲＲ；
（ｉｉ）ＺＦ６の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＥＨＭＫＲ、ＥＨＭＲＲ、ＴＨＭＫＲ、ＥＨＭＮＲ、またはＥＨＭＡＲ；および
（ｉｉｉ）ＺＦ７の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＤＮＬＬＴ、ＤＮＬＬＶ、ＤＮＬＱＴ、ＤＮＬＬＡ、ＤＮＬＡＴ、ＤＮＬＱＡ、ＤＮＬＭＡ、またはＤＮＬＭＴ
を含む。
【００３６】
一部の実施形態において、操作されたＣＴＣＦバリアントは、野生型ＣＴＣＦよりも高いアフィニティーで、コンセンサスＣＢＳモチーフの位置２、５、および１１においてコンセンサスＣＢＳと異なる変異体ＣＢＳに結合し、操作されたＣＴＣＦは、
（ｉ）ＺＦ４の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＧＮＬＶＲ、ＧＮＬＲＲ、ＧＮＬＡＲ、ＧＮＬＭＲ、ＡＮＬＲＲ、ＳＮＬＲＲ、またはＮＮＬＲＲ；
（ｉｉ）ＺＦ６の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＥＨＭＮＲ、ＥＨＭＫＲ、ＥＨＭＲＲ、ＳＨＭＮＲ、ＳＨＭＲＲ、ＴＨＭＫＲ、またはＤＨＭＮＲ；および
（ｉｉｉ）ＺＦ７の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＥＨＬＫＶ、ＥＨＬＡＥ、ＳＴＬＮＥ、ＤＨＬＱＶ、ＥＨＬＮＶ、ＤＨＬＮＴ、ＥＨＬＱＡ、またはＨＨＬＭＨ
を含む。
【００３７】
一実施形態において、操作されたＣＴＣＦバリアントは、野生型ＣＴＣＦよりも高いアフィニティーで、コンセンサスＣＢＳモチーフの位置６、７、および１０においてコンセンサスＣＢＳと異なる変異体ＣＢＳに結合し、操作されたＣＴＣＦは、
（ｉ）ＺＦ４の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＧＨＬＫＫ、ＡＨＬＫＫ、ＴＫＬＲＬ、ＴＫＬＫＬ、ＧＨＬＲＫ、ＴＨＬＫＫ、またはＡＨＬＲＫ；
（ｉｉ）ＺＦ５の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＴＲＬＫＥまたはＳＲＬＫＥ；および
（ｉｉｉ）ＺＦ６の位置−１〜＋３にアミノ酸配列ＲＡＤＮ、ＲＨＤＴ、ＲＲＤＴ、ＲＰＤＴ、ＲＴＳＳ、またはＲＮＤＴ
を含む。
【００３８】
一部の実施形態において、操作されたＣＴＣＦバリアントは、コヒーシン（cohesion）と相互作用してエンハンサー−プロモーターループの形成を媒介して遺伝子発現をモジュレートする。
【００３９】
別の態様において、本発明は、それを必要とする対象を治療する方法を特質とし、方法は、本明細書において記載される操作されたＣＴＣＦバリアントの治療上有効量を対象に投与するステップを含む。
【００４０】
一部の実施形態において、対象は癌を有し得る。
【００４１】
別の態様において、本発明は、１つまたは複数の変異を持つＣＢＳの制御下にある遺伝子の発現を活性化するまたは抑制する方法を特質とし、方法は、請求項１から１５のいずれか一項に記載の操作されたＣＴＣＦと遺伝子における関心対象の配列とを接触させ、それにより遺伝子の発現が調節されるステップを含む。
【００４２】
別の態様において、本発明は、本明細書において記載される操作されたＣＴＣＦバリアントを含む薬学的組成物を特質とする。
【００４３】
別の態様において、本発明は、遺伝子の調節のための遺伝子発現システムを特質とし、システムは、本明細書において記載される操作されたＣＴＣＦバリアントをコードする核酸を含む。
【００４４】
別の態様において、本発明は、請求項１から１５のいずれか一項に記載の操作されたＣＴＣＦバリアントと関心対象の配列とを接触させて結合複合体を形成し、それによりクロマチンの構造が変更されるステップを含む、クロマチンの構造を変更する方法を特質とする。
【００４５】
別の態様において、本発明は、１つまたは複数の変異を持つＣＢＳの制御下にある遺伝子の発現を活性化するまたは抑制する方法を特質とし、方法は、１つまたは複数の変異を持つＣＢＳと本明細書において記載される操作されたＣＴＣＦバリアントとを接触させるステップを含む。
【００４６】
別の態様において、本発明は、本明細書において記載される操作されたＣＴＣＦバリアントを含むキットを特質とする。
【００４７】
本開示において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」等は、米国特許法においてそれらに帰する意味を有し、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」等を意味し得；「から本質的になる」または「本質的に構成する」は、同様に米国特許法において帰される意味を有し、当該用語は制約がなく、列挙されるものの基本的なまたは新規な特徴が、列挙されるもの以外のものの存在によって変化しない限りにおいて、列挙されるもの以外のものの存在を可能にするが、先行技術実施形態を除外する。
【００４８】
別様に定義されていない限り、本明細書において使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。方法および材料は、本発明における使用のために本明細書において記載され、当技術分野において公知の他の適切な方法および材料も使用され得る。材料、方法、および例は単なる例示であり、限定的であることを意図されない。本明細書において言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、および他の参考文献は、それらの全体を参照により組み入れられる。矛盾する場合、定義を含めた本明細書が制御するであろう。
【００４９】
本発明の他の特質および利点は、以下の詳細な説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から明白であろう。
【００５０】
例として与えられるが、記載される具体的な実施形態に本発明を限定することを意図されない以下の詳細な説明は、参照により本明細書に組み入れられる添付の図面と併せて理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】ＣＴＣＦ結合部位における例示的な１１フィンガーＣＴＣＦジンクフィンガーアレイタンパク質−ＤＮＡ相互作用の略図。１１フィンガーアレイの各ジンクフィンガーは、タンパク質−ＤＮＡ塩基接触が、各アルファ−ヘリックスの位置−１、２、３、および６におけるアミノ酸によってなされる認識アルファ−ヘリックスを含有した。位置２はここに示されていない結合部位の反対側の鎖と交差鎖接触することから、ここでは位置−１、３、および６のみを描写した。結合部位に対する配列は、ＣｈＩＰ−ｓｅｑデータ（Nakahashi et al., 2013）に由来した。結合部位を、３つのセグメント：５’隣接（灰色の線）、コア（黒色の線）、および３’隣接（薄い灰色の線）に分割した。各セグメント内の各ヌクレオチドの位置に番号が付されている。ダッシュは、ジンクフィンガーアレイと結合部位との間の公知のＤＮＡ−タンパク質接触（黒色）、および理論的ＤＮＡ−タンパク質接触（灰色）を示す。アレイのジンクフィンガー３〜７（白色）は、コア配列とタンパク質−ＤＮＡ接触する（黒色の太線を引かれた）。ＣＴＣＦ結合ＤＮＡフラグメントのＣｈＩＰ−ｅｘｏおよびＤＮＡｓｅＩフットプリンティングによって示唆されるように（Hashimoto, H. et al., 2017）、ジンクフィンガー８とジンクフィンガー９〜１１との間に考え得る５〜６個の塩基対ギャップ（水平の破線によって表される）があった。ＣＴＣＦは、結合部位の３’末端に結合するタンパク質のＮ末端側を有して、３’−５’方向でその標的部位に結合することに留意されたい。
【図２】Ｂ２Ｈベータ−ガラクトシダーゼレポーターアッセイの略図。Ｂ２Ｈレポーターアッセイは、Ｇａｌ４のＧａｌ１１Ｐ媒介性の導きを使用して、結合を示した。大腸菌（E.coli）は、２つのプラスミドで形質転換される：一方のプラスミドは、ジンクフィンガー−Ｇａｌ１１Ｐ融合体およびＲＮＡポリメラーゼのアルファＮ末端ドメイン（α−ＮＴＤ）−Ｇａｌ４融合体の両方をコードし；第２のプラスミドは、β−ガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺ遺伝子の発現を推進する弱いプロモーターの上流に改変可能な結合配列を含有した。標的配列に結合し得るジンクフィンガー−Ｇａｌ１１Ｐ融合体は、プロモーターにα−ＮＴＤ−Ｇａｌ４融合体を導き、それによってｌａｃＺの発現を誘導した。β−ガラクトシダーゼレベルのこの増加を、単純な比色分析ＯＮＰＧに基づくアッセイによって検出した。ＣＴＣＦジンクフィンガーアレイ−ｇａｌ１１Ｐ融合体は、この略図においてＣＴＣＦ結合部位に結合しており、ｌａｃＺの上流にあるプロモーター領域にα−ＮＴＤ−Ｇａｌ４融合体を導き、発現につながった。
【図３】Ｂ２Ｈ  Ｂ−ｇａｌアッセイにおける倍活性化は、１１フィンガーアレイのＣＴＣＦジンクフィンガー１〜１１が全長標的部位と相互作用する場合に最大であった。５つの標的部位（凡例に示された配列）を、全ＣＴＣＦジンクフィンガーアレイおよび４つの異なる部分集合（ｘ軸に示される）とともに試験した。ＣＴＣＦ結合部位の最も高度に保存された配列であるコア配列（黒色かつ太字）を、独立して、およびHashimoto, H. et al. Mol. Cell. 2017（黒色および薄い灰色）；Persikov, A and Singh, M. NAR. 2014（中間の灰色）；およびNakahashi, H. et al., Cell Rep. 2013（非常に薄い灰色および濃い灰色）に由来する異なる分量の隣接配列を用いて試験した。陽性対照は、細菌およびヒト背景において公知の配列に強く結合する公知の３フィンガージンクフィンガーの結合活性を反映する。陰性対照は、ＲＮＡポリメラーゼのアルファＮ末端ドメイン（α−ＮＴＤ）−Ｇａｌ４融合体がｌａｃＺのプロモーターに直接導かれない場合のベースラインのベータ−ガラクトシダーゼレベルを反映する。このベースラインを使用して、ＣＴＣＦジンクフィンガーアレイがｇａｌ１１Ｐに融合する場合の倍活性化を算出した。
【図４】ＣＴＣＦジンクフィンガーアレイは、ＣＴＣＦ結合部位内のコア領域のある特定の位置における配列変化に敏感である。４０ｂｐの参照ＣＢＳの各位置における４つの考え得るヌクレオチドのそれぞれを、Ｂ２ＨｙにおいてＣＴＣＦジンクフィンガーアレイを結合する能力について試験した。倍活性化は、バックグラウンドβ−ガラクトシダーゼレベルを上回る結合活性を反映する（バックグラウンドβ−ｇａｌレベルは、ｇａｌ１１Ｐに融合したジンクフィンガーアレイを有しないｇａｌ４−ＲＮＡポリメラーゼ融合体の存在下における、各結合部位を有するサンプルからのβ−ｇａｌのレベルから獲得される）。上の参照配列は、３つのセグメント：５’隣接（濃い灰色で線を引かれた）、コア（黒色で線を引かれた）、および３’隣接（灰色で線を引かれた）に分割されている。各セグメント内の各ヌクレオチドの位置に番号が付されている。ダッシュは、ジンクフィンガーアレイと結合部位との間の公知のＤＮＡ−タンパク質接触（黒色）、および理論的ＤＮＡ−タンパク質接触（灰色）を示す。結合部位のコア配列１〜１５（黒色、太字）は、アレイのジンクフィンガー３〜７（白色、黒色の輪郭）と相互作用し、結合配列の変化に最も敏感であるように見える。５’隣接配列ならびに３’隣接配列への変更は、結合に負の影響を与えなかった。
【図５】ＣＴＣＦ結合部位の最大結合能。参照結合部位（下部）に改変を行って、ヌクレオチド変化を組み合わせ、それは個々にＣＴＣＦジンクフィンガーアレイの結合活性の増加を示した。コア配列モチーフは太字であり、一方で加えられた変化には下線が引かれている。１１フィンガーＣＴＣＦジンクフィンガーアレイの結合活性を、Ｂ２Ｈベータ−ガラクトシダーゼレポーターアッセイにおいて三つ組で定量した。倍活性化は、ＤＮＡ結合タンパク質が存在しない場合のバックグラウンドレベルを上回る結合活性を反映する。
【図６】Ｂ２Ｈベータ−ラクタマーゼ阻害剤選択の略図。選択システムは、ＣＢＳへのジンクフィンガーアレイの結合の成功が、ｌａｃＺの代わりに、抗生物質のベータ−ラクタマーゼクラスの阻害剤であるＢｌａＣ発現を推進する点を除いて、レポーターシステムと同じ構成要素を含有した。ＢｌａＣの発現は、カルベニシリンプレート上での成長を可能にした。選択は、ベータラクタマーゼの阻害剤であるクラブラン酸の添加によって推進された。ＢｌａＣの低レベルの発現は、カルベニシリンプレート上での成長をもたらし得るが、クラブラン酸の添加は、ＢｌａＣ活性を阻害し、偽陽性の枯渇および結合部位に加えられた任意の改変に対する強い結合因子のさらなる富化をもたらす。ｇａｌ１１Ｐに融合したジンクフィンガーアレイにおける変異のライブラリーを、低ストリンジェンシーな条件、それに続くクラブラン酸の勾配での選択により、変更した結合配列への結合因子に対して選択した。勾配の最も高いストリンジェンシーな末端での成長は、新たな結合配列への強い結合因子である、ジンクフィンガーアレイにおけるバリアントを示した。
【図７−１】図７Ａ〜Ｃ  変更したＣＴＣＦ結合部位に対するバリアントの結合活性。選択プレートの高ストリンジェンシーな勾配から採取されたバリアントを、コア配列の位置２（灰色の星）における４つすべての考え得るヌクレオチドを表す配列に対する結合活性について試験した。選択から取り出されたバリアントのアミノ酸配列がヒートマップの上に挙げられており、コア配列の位置２に存在するヌクレオチドをｙ軸に示した。図７Ａ：位置２におけるヌクレオチドがＴである。図７Ｂ：位置２におけるヌクレオチドがＡである。図７Ｃ：結合におけるヌクレオチドを、ベータ−ガラクトシダーゼレポーターシステムおよび比色分析ＯＮＰＧアッセイによって定量した。野生型結合部位配列に対する野生型ＣＴＣＦジンクフィンガーアレイの結合活性を白色の点によって示した。各ヌクレオチド変化に対するＺＦ７アルファ認識ヘリックスの略図が左側にある。それは、結合配列におけるトリプレットと相互作用するアミノ酸残基を含んだ。アルファヘリックスの位置３におけるアミノ酸は、ライブラリーにおいて様々に異なり、「Ｘ」によって示される。
【図７−２】図７−１と同様である。
【図８】認識ヘリックス内の変動の増加は、より強い結合因子をもたらした。ライブラリーにおける差異のために４つのアミノ酸を標的にして、選択におけるより高い柔軟性を可能にし、選定される改変された結合部位へのより強い結合因子を生んだ。コア配列の位置２（灰色の星）におけるＣ：Ｇ変化を標的にするＺＦ７を、拡大手法を使用してバリアントに対して選択した。各アミノ酸コドンを、示される部位（「Ｘ」）で「ＶＮＳ」コドンと置き換えた。１２個のコロニーを選択の高ストリンジェンシーな末端から採取し、示されるヌクレオチドがコア配列の位置２にある場合にＣＴＣＦ結合部位に結合するそれらの能力について試験した。選択されたバリアントのアミノ酸配列はｘ軸に挙げられており、コア配列の位置２におけるヌクレオチドはｙ軸にある。野生型結合配列に対する野生型ジンクフィンガーアレイ結合活性が白色の点によって示されている。
【図９−１】図９Ａ〜Ｃ  ＣＢＳにおけるコアモチーフの位置３での変更した結合部位配列を結合する選択されたバリアント。バリアントのライブラリーに対して実施された選択は、１１フィンガーＣＴＣＦジンクフィンガーアレイのＺＦ７における認識ヘリックスの位置−１〜３における変更に集中した。「ＶＮＳ」コドンを、「Ｘ」によって示される位置に導入し、ＣＢＳにおけるコアモチーフの位置３（灰色の星）での３つの異なるヌクレオチド変化に対して選択した。直接的なタンパク質−ＤＮＡ接触は破線によって示されている。（Ａ）結合部位におけるＡ：Ｔ変化に対して実施された選択、（Ｂ）Ａ：Ｇ変化、（Ｃ）Ａ：Ｃ変化。取り出されたほとんどのバリアントは、変更した特異性の代わりに、緩和した結合特異性を有した。
【図９−２】図９−１と同様である。
【図９−３】図９−１と同様である。
【図１０−１】図１０Ａ〜Ｂ  ＣＢＳにおけるコアモチーフの位置５での配列変化を標的にして実施された選択。バリアントのライブラリーに対して実施された選択は、ＺＦ６認識ヘリックスの位置２〜６における変更に集中し、４番目の位置は変化しないままであった。「ＶＮＳ」コドンを、「Ｘ」によって示される位置に導入し、ＣＢＳのコアモチーフにおけるコアモチーフの位置５（灰色の星）での３つの異なるヌクレオチド変化に対して選択した。直接的なタンパク質−ＤＮＡ接触を破線によって示した。（Ａ）結合部位におけるＣ：Ｔ変化に対して実施された選択、（Ｂ）Ｃ：Ｇ変化。Ｃ：Ａ変化に対する選択プレート上での勾配の低ストリンジェンシーな末端を越えて成長したバリアントはなく、弱い／不十分な結合因子と見なされたバリアントはなかった。結合配列におけるＣ：Ｇ変化を標的にする「ＴＨＭＫＲ」を除いて、取り出されたほとんどのバリアントは、変更した特異性の代わりに、緩和した結合特異性を有した。
【図１０−２】図１０−１と同様である。
【図１１−１】図１１Ａ〜Ｃ  ＣＢＳにおけるコアモチーフの位置６での配列変化を標的にして実施された選択。バリアントのライブラリーに対して実施された選択は、ＺＦ６認識ヘリックスの位置−１〜３における変更に集中した。「ＶＮＳ」コドンを、「Ｘ」によって示される位置に導入し、ＣＢＳにおけるコアモチーフの位置６（灰色の星）での３つの異なるヌクレオチド変化に対して選択した。直接的なタンパク質−ＤＮＡ接触は破線によって示されている。（Ａ）結合部位におけるＡ：Ｔ変化に対して実施された選択、（Ｂ）Ａ：Ｇ変化、（Ｃ）Ａ：Ｃ変化。Ａ：Ｔ選択から分析されたバリアントは、緩和した結合プロファイルを有し、一方でＡ：Ｇ選択からのバリアントは、変化したヌクレオチドのみに対して強い結合を示した。Ａ：Ｃ選択において、優れた結合因子は同定されなかった。
【図１１−２】図１１−１と同様である。
【図１１−３】図１１−１と同様である。
【図１２−１】図１２Ａ〜Ｃ  ＣＢＳにおけるコアモチーフの位置７での配列変化を標的にして実施された選択。バリアントのライブラリーに対して実施された選択は、ＺＦ５認識ヘリックスの位置４〜６における変更に集中し、４番目の位置は変化しないままであった。「ＶＮＳ」コドンを、「Ｘ」によって示される位置に導入し、ＣＢＳにおけるコアモチーフの位置７（灰色の星）での３つの異なるヌクレオチド変化に対して選択した。直接的なタンパク質−ＤＮＡ接触は線によって示されている。（Ａ）結合部位におけるＧ：Ｔ変化に対して実施された選択、（Ｂ）Ｇ：Ａ変化、（Ｃ）Ｇ：Ｃ変化。
【図１２−２】図１２−１と同様である。
【図１２−３】図１２−１と同様である。
【図１３−１】図１３Ａ〜Ｃ  ＣＢＳにおけるコアモチーフの位置８での配列変化を標的にして実施された選択。バリアントのライブラリーに対して実施された選択は、ＺＦ５認識ヘリックスの位置２〜６における変更に集中し、４番目の位置は変化しないままであった。「ＶＮＳ」コドンを、「Ｘ」によって示される位置に導入し、ＣＢＳにおけるコアモチーフの位置８（灰色の星）での３つの異なるヌクレオチド変化に対して選択した。直接的なタンパク質−ＤＮＡ接触は線によって示されている。（Ａ）結合部位におけるＧ：Ｔ変化に対して実施された選択、（Ｂ）Ｇ：Ａ変化、（Ｃ）Ｇ：Ｃ変化。同じライブラリーを用いて出現する異なるバリアントは、配列における、しかし結合部位での異なる位置における、同じ変化に結合するために使用されていることに留意されたい。
【図１３−２】図１３−１と同様である。
【図１３−３】図１３−１と同様である。
【図１４−１】図１４Ａ〜Ｃ  ＣＢＳにおけるコアモチーフの位置１０での配列変化を標的にして実施された選択。バリアントのライブラリーに対して実施された選択は、ＺＦ４認識ヘリックスの位置２〜６における変更に集中し、４番目の位置は変化しないままであった。「ＶＮＳ」コドンを、「Ｘ」によって示される位置に導入し、ＣＢＳにおけるコアモチーフの位置１０（灰色の星）での３つの異なるヌクレオチド変化に対して選択した。直接的なタンパク質−ＤＮＡ接触は線によって示されている。（Ａ）結合部位におけるＧ：Ｔ変化に対して実施された選択、（Ｂ）Ｇ：Ａ変化、（Ｃ）Ｇ：Ｃ変化。Ｇ：Ｃ選択は、勾配選択プレートの高ストリンジェンシーな末端でいかなる成長ももたらさなかった。結合データは、中間層領域から採取されたコロニーを反映し、それは、それらが結合因子として十分に働かなかったためである。白色の点は、野生型結合配列に対する野生型ＣＴＣＦジンクフィンガーアレイ結合活性を示す。
【図１４−２】図１４−１と同様である。
【図１４−３】図１４−１と同様である。
【図１５−１】図１５Ａ〜Ｃ  ＣＢＳにおけるコアモチーフの位置１１での配列変化を標的にして実施された選択。バリアントのライブラリーに対して実施された選択は、ＺＦ４認識ヘリックスの位置２〜６における変更に集中し、４番目の位置は変化しないままであった。「ＶＮＳ」コドンを、「Ｘ」によって示される位置に導入し、ＣＢＳにおけるコアモチーフの位置１１（灰色の星）での３つの異なるヌクレオチド変化に対して選択した。直接的なタンパク質−ＤＮＡ接触は線によって示されている。（Ａ）結合部位におけるＧ：Ｔ変化に対して実施された選択、（Ｂ）Ｇ：Ａ変化、（Ｃ）Ｇ：Ｃ変化。
【図１５−２】図１５−１と同様である。
【図１５−３】図１５−１と同様である。
【図１６−１】図１６Ａ〜Ｃ  ＣＢＳにおけるコアモチーフの位置１３での配列変化を標的にして実施された選択。バリアントのライブラリーに対して実施された選択は、ＺＦ３認識ヘリックスの位置２〜６における変更に集中し、４番目の位置は変化しないままであった。「ＶＮＳ」コドンを、「Ｘ」によって示される位置に導入し、ＣＢＳにおけるコアモチーフの位置１３（灰色の星）での３つの異なるヌクレオチド変化に対して選択した。直接的なタンパク質−ＤＮＡ接触は線によって示されている。（Ａ）結合部位におけるＧ：Ｔ変化に対して実施された選択、（Ｂ）Ｇ：Ａ変化、（Ｃ）Ｇ：Ｃ変化。
【図１６−２】図１６−１と同様である。
【図１６−３】図１６−１と同様である。
【図１７】ＣＢＳへの複数の配列変化に対するマルチフィンガーバリアントの結合活性。ＣＢＳのコアモチーフにおけるそれらそれぞれのトリプレットに結合する、１１フィンガーアレイのうちのジンクフィンガー４〜７の認識ヘリックスの略図。変更したアミノ酸は「Ｘ」によって示されており、野生型ＣＢＳに対するヌクレオチド変化は、略図における灰色の星によっておよび太文字によって示されている。このライブラリーにおいて、ＺＦ１〜３およびＺＦ８〜１１を改変した。タンパク質−ＤＮＡ接触は、ＺＦ認識ヘリックスとＣＢＳ配列との間の線によって示されている。野生型ＣＢＳへの野生型ＣＴＣＦ１１フィンガージンクフィンガーアレイ結合強度が白い点によって示されている。ＺＦ４〜７における各バリアント認識ヘリックスのアミノ酸配列はｙ軸に挙げられており、改変されたＣＢＳ（赤色の変化）または野生型ＣＢＳに対する結合活性は、Ｂ２Ｈ  β−ｇａｌレポーターアッセイによって反映されている。
【図１８】ＣＢＳへの複数の配列変化に対するマルチフィンガーバリアントの結合活性。以前はＣ：Ａ変化があったＣＢＳの位置２に今はＣ：Ｇ変化があることを除いて、以前と同じ選択。この選択から取り出されたバリアントは、野生型ＣＢＳに結合することなく、改変されたＣＢＳに対する結合活性を有した。野生型１１フィンガーＺＦアレイのみが、野生型ＣＢＳに対する結合活性を示し（白い点）、改変されたＣＢＳに結合する能力を示さなかった。興味深いことには、ライブラリーにおいて選択された支配的バリアントは、認識ヘリックスの位置９で生じる変異を含有し、それは、オリゴ合成の間に（各位置における誤ったヌクレオチドの０．０５％の可能性）またはこれらのライブラリーを構築する間のＰＣＲを通じて導入された。
【図１９】ＣＢＳへの複数の配列変化に対するマルチフィンガーバリアントの結合活性。個々のプールされた高ストリンジェンシーな選択からのバリアントを一緒にまとめ、野生型ＣＢＳに対する３つの変化（灰色の星または太字によって示される）に対して選択した。バリアントを、野生型ＣＴＣＦジンクフィンガーアレイと並行して、改変されたＣＢＳおよび野生型ＣＢＳに対する結合についてアッセイした。選択から取り出されたバリアントは、改変されたＣＢＳに結合することができたが、野生型配列には結合することができなかった。逆に、野生型ジンクフィンガーアレイは、野生型ＣＢＳに結合することができたが、改変されたものには結合することができなかった。
【図２０】ＣＢＳへの複数の配列変化に対するマルチフィンガーバリアントの結合活性。個々のプールされた高ストリンジェンシーな選択からのバリアントを一緒にまとめ、野生型ＣＢＳに対する３つの変化（灰色の星または太字によって示される）に対して選択した。バリアントを、野生型ＣＴＣＦジンクフィンガーアレイと並行して、改変されたＣＢＳおよび野生型ＣＢＳに対する結合についてアッセイした。選択から取り出されたバリアントは、改変されたＣＢＳに結合することができたが、野生型配列には結合することができなかった。逆に、野生型ジンクフィンガーアレイは、野生型ＣＢＳに結合することができたが、改変されたものには結合することができなかった。
【図２１】ＣＢＳへの複数の配列変化に対するマルチフィンガーバリアントの結合活性。個々のプールされた高ストリンジェンシーな選択からのバリアントを一緒にまとめ、野生型ＣＢＳに対する３つの変化（灰色の星または太字によって示される）に対して選択した。バリアントを、野生型ＣＴＣＦジンクフィンガーアレイと並行して、改変されたＣＢＳおよび野生型ＣＢＳに対する結合についてアッセイした。選択から取り出されたバリアントは、改変されたＣＢＳに結合することができたが、野生型配列には結合することができなかった。逆に、野生型ジンクフィンガーアレイは、野生型ＣＢＳに結合することができたが（白い点）、改変されたものには結合することができなかった。
【図２２】野生型ＣＴＣＦは、野生型ＣＴＣＦ標的部位への結合活性を有し、２つのバリアント標的部位への結合活性を有しない。Ｂ２Ｈアッセイに見られるように、ヒト細胞背景において、内因性ＣＴＣＦが野生型ＣＢＳに結合し、バリアント結合部位に結合しないことを確認するために、本発明者らは、ヒト赤白血病細胞株であるＫ５６２細胞を回収し、ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲによりＣＴＣＦ結合を検討した。ＣＴＣＦに架橋されたゲノムＤＮＡを富化するＣＴＣＦ特異的抗体を使用して、ＣＴＣＦを、公知のＣＴＣＦ標的部位へのおよび２つの内因性バリアント結合部位配列への結合についてアッセイした。２セットのｑＰＣＲプライマーを各結合部位（１．１、１．２等によって示される）に対して設計した。結合を、抗体で処理されていない架橋されかつ超音波処理されたサンプルの１％インプットを上回る標的部位の富化によって判定し、それは、関心対象の部位のレベルを、抗体で富化されていないサンプルにおける関心対象の部位の頻度と比べた倍増加として表すためのものである。各サンプルの抗体に基づく富化は、未処理の、それゆえ富化されていないインプットを上回る倍富化によって定量される。陰性対照は、ＣＴＣＦが結合しない標的部位のバックグラウンドｑＰＣＲ増幅レベルを反映する。この陰性レベルを上回るものはどんなものでも、富化されており、ＣＴＣＦ結合を示すと見なされ、一方で下回るものはどんなものでも、未富化でなく、それゆえＣＴＣＦによる結合がないと見なされる。野生型ＣＴＣＦは、細菌Ｂ２Ｈレポーターアッセイによって予測されるように、バリアント結合部位への検出可能な結合なしで、野生型標的部位に結合する。
【図２３−１】図２３Ａ〜Ｂ  ヒト細胞における、外因性野生型およびバリアントＣＴＣＦ結合活性。ＣＴＣＦバリアントが選択された５つのバリアント結合部位のうちの１つに合致する２つの内因性バリアント結合部位配列を、ヒトゲノムにおいて同定した（バリアント部位１およびバリアント部位２）。バリアント部位１およびバリアント部位２のバリアント結合部位配列に結合するように選択された、３×ＨＡタグを有する野生型ＣＴＣＦおよび３×ＨＡタグ付けされた操作されたＣＴＣＦバリアントのうちの１つの両方を、ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲによりヒト細胞における結合についてアッセイした。図２３Ａ：３×ＨＡタグ付けされた野生型ＣＴＣＦは、野生型ＣＴＣＦ結合部位に結合し、いずれのバリアント結合部位にも結合しない。ヒトＫ５６２細胞に、３×ＨＡタグ付けされたＣＴＣＦを発現するプラスミドをトランスフェクトし、外因性ＣＴＣＦ（３×ＨＡタグ付けされた）を特異的に富化しかつ内因性ＣＴＣＴ（タグなし）結合を富化しないＨＡ抗体で処理した。陰性対照は、ＣＴＣＦによって占有されない領域の富化を有しないＣｈＩＰ−ｑＰＣＲレベルを示すために提供されている。これらの結果は、外因性野生型ＣＴＣＦが、内因性ＣＴＣＦと同じ結合活性を有することを実証する。図２３Ｂ：３×ＨＡタグ付けされたバリアントＣＴＣＦは、バリアント結合部位に結合し、野生型ＣＴＣＦ結合部位に結合しない。３×ＨＡをタグ付けされたバリアントＣＴＣＦを発現するＫ５６２細胞をＣｈＩＰ−ｑＰＣＲによって分析し、ＨＡ特異的抗体で処理した。図２２および２３Ａにあるのと同じ部位を、バリアントＣＴＣＦ結合について調べた。バリアントＣＴＣＦは、バリアント特異的ＨＡ抗体での富化によって示されるようにバリアント部位に結合し得、ＨＡ抗体に基づく富化の欠如によって示されるように野生型結合部位において検出可能な結合は見られなかった。
【図２３−２】図２３−１と同様である。
【図２４−１】図２４Ａ〜Ｂ  バリアント結合部位周辺に位置する遺伝子の野生型対照と比べた遺伝子発現の変化。Ｇ３結合部位配列に対して選択されたバリアントＣＴＣＦ、および他の結合部位配列に対して選択されたバリアントＣＴＣＦを、野生型Ｋ５６２において発現させた。バリアントＣＴＣＦをＧＦＰに融合させ、ヌクレオフェクションの７２時間後にＧＦＰ＋細胞からＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡをＲＮＡから作出し、ＲＴ−ｑＰＣＲによって定量した。サンプルにわたる遺伝子発現レベルを、ハウスキーピング遺伝子（ＨＰＲＴ）に対して正規化した。遺伝子発現の変化は、ＧＦＰをタグ付けされた野生型ＣＴＣＦを発現する野生型Ｋ５６２における遺伝子発現レベルと比べたものである。図２４Ａ．野生型ＣＴＣＦ対照と比べた、バリアントＣＴＣＦの存在下におけるＧ３バリアント結合部位周辺の遺伝子の遺伝子発現の変化。図２４Ｂ．野生型対照と比べた、他のバリアント結合部位周辺の遺伝子の遺伝子発現の変化。
【図２４−２】図２４−１と同様である。
【図２５】ＭＹＣの上流にあるバリアント結合部位の導入は、内因性ＭＹＣ発現の低下につながる。ＭＹＣ  ＴＳＳの約２ｋｂ上流にあるＣＴＣＦ結合部位を、ＣＴＣＦバリアント選択に使用された６つの異なる配列のうちの１つと置き換えた（表に挙げられる）。野生型ＣＴＣＦ結合部位配列からの４〜６ヌクレオチド変化を有するこれらの配列の導入は、ＣＴＣＦ結合部位が欠失しかつループ形成が分断された場合と同じレベルまで、内因性ＭＹＣ発現の低下をもたらす。ＷＴ＿６配列は、天然ＣＴＣＦ結合部位からの４つの点変異を有するが、これらの変化は、Ｂ２Ｈレポーターアッセイからの結果によって示されるように、野生型ＣＴＣＦ結合に影響を有しないはずである。ＷＴ＿６細胞株におけるＭＹＣ発現レベルは野生型Ｋ５６２のＭＹＣ発現レベルと同等であることから、これは事実であるように見える。Ｋ５６２活力はＭＹＣ発現に結び付くため、すべてのバリアント細胞株を、別個のＰＧＫプロモーターから発現される外因性ＭＹＣを有するＫ５６２細胞株（ｅｘｏＭＹＣ．Ｋ５６２）において作出した。
【図２６−１】図２６Ａ〜Ｂ  バリアントＣＴＣＦは、操作されたＧ３バリアント結合部位に結合することができ、ＭＹＣ発現を回復させることができる。Ｇ３バリアント結合部位配列に結合するように選択されたＣＴＣＦバリアントを、Ｇ３＿３．Ｋ５６２細胞株において発現させた。ヌクレオフェクションの７２時間後に、細胞をＭＹＣ発現およびＤＮＡでのＣＴＣＦ占有率について分析した。バリアントおよび野生型（（ｗｔ）によって示される）のＺＦヘリックスの残基は凡例に挙げられている。Ｇ３結合部位配列およびＣＴＣＦジンクフィンガーアレイの相互作用する認識ヘリックスも図示されている。図２６Ａ．内因性ＭＹＣレベルは、ＣＴＣＦバリアントが発現した場合に、Ｇ３＿３細胞株において野生型レベルに回復する。内因性ＭＹＣ発現レベルは、ＲＴ−ｑＰＣＲによって定量され、Ｇ３＿３細胞株の低下した内因性ＭＹＣレベルと比べたものである。ＣＴＣＦ結合部位へのいかなる変更もないｅｘｏＭＹＣ．Ｋ５６２細胞株からの内因性ＭＹＣレベルが陽性対照として示されている（破線によって分離されている）。図２６Ｂ．ＣＴＣＦバリアントは、Ｇ３＿３細胞株において導入されたバリアント結合部位に結合することができ、一方で野生型ＣＴＣＦは結合しない。ＣＴＣＦ  Ａｂ特異的富化は、野生型およびバリアントＣＴＣＦの両方を捕捉し、一方でＨＡ  Ａｂは、ＨＡタグ付けされたＣＴＣＦ（一過性に発現する）のみを検出するであろう。ｅｘｏＭＹＣ．Ｋ５６２は、ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲに対する対照として含まれ、破線によって分離されている。ｅｘｏＭＹＣ．Ｋ５２は、ＭＹＣの上流にあるＣＴＣＦ結合部位に天然配列を有し、野生型ＣＴＣＦ結合を示すはずである。外因性に発現されるＣＴＣＦ（バリアントおよび野生型）にＨＡをタグ付けし、Ｇ３＿３細胞株において発現させる。ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲを実施して、ＭＹＣの約２ｋｂ上流にある野生型部位を置き換えたバリアントＣＴＣＦ部位へのＣＴＣＦ結合を調べた（ＭＹＣ部位）。ゲノムにおける他の場所での内因性Ｇ３部位および公知のＣＴＣＦ結合を有しない領域が、それぞれ陽性および陰性対照として働いた。バリアントＣＴＣＦは、ＣＴＣＦおよびＨＡ抗体の両方での富化によって示されるように、バリアント部位に結合することができ、一方で野生型ＣＴＣＦは結合しない。
【図２６−２】図２６−１と同様である。
【図２７−１】図２７Ａ〜Ｂ  バリアントＣＴＣＦは、操作されたＡ３バリアント結合部位に結合することができ、ＭＹＣ発現を回復させることができる。Ａ３バリアント結合部位配列に結合するように選択されたＣＴＣＦバリアントを、Ａ３＿４．Ｋ５６２細胞株において発現させた。ヌクレオフェクションの７２時間後に、細胞をＭＹＣ発現およびＤＮＡでのＣＴＣＦ占有率について分析した。バリアントおよび野生型（（ｗｔ）によって示される）のＺＦヘリックスの残基は凡例に挙げられている。Ａ３結合部位配列およびＣＴＣＦジンクフィンガーアレイの相互作用する認識ヘリックスも図示されている。図２７Ａ．内因性ＭＹＣレベルは、ＣＴＣＦバリアントが発現した場合に、Ａ３＿４細胞株において野生型レベルに回復する。内因性ＭＹＣ発現レベルは、ＲＴ−ｑＰＣＲによって定量され、Ａ３＿４細胞株の低下した内因性ＭＹＣレベルと比べたものである。ＣＴＣＦ結合部位へのいかなる変更もないｅｘｏＭＹＣ．Ｋ５６２細胞株からの内因性ＭＹＣレベルが陽性対照として示されている（破線によって分離されている）。図２７Ｂ．ＣＴＣＦバリアントは、Ａ３＿４細胞株において導入されたバリアント結合部位に結合することができ、一方で野生型ＣＴＣＦは結合しない。ＣＴＣＦ  Ａｂ特異的富化は、野生型およびバリアントＣＴＣＦの両方を捕捉し、一方でＨＡ  Ａｂは、ＨＡタグ付けされたＣＴＣＦ（一過性に発現する）のみを検出するであろう。ｅｘｏＭＹＣ．Ｋ５６２は、ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲに対する対照として含まれ、破線によって分離されている。ｅｘｏＭＹＣ．Ｋ５２は、ＭＹＣの上流にあるＣＴＣＦ結合部位に天然配列を有し、野生型ＣＴＣＦ結合を示すはずである。外因性に発現されるＣＴＣＦ（バリアントおよび野生型）にＨＡをタグ付けし、Ａ３＿４細胞株において発現させる。ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲを実施して、ＭＹＣの約２ｋｂ上流にある野生型部位に置き換えたバリアントＣＴＣＦ部位へのＣＴＣＦ結合を調べた（ＭＹＣ部位）。ゲノムにおける他の場所での内因性Ａ３部位および公知のＣＴＣＦ結合を有しない領域が、それぞれ陽性および陰性対照として働いた。バリアントＣＴＣＦは、陰性対照を上回るＣＴＣＦおよびＨＡ抗体の両方での富化によって示されるように、バリアント部位に結合することができ、一方で野生型ＣＴＣＦは結合しない。
【図２７−２】図２７−１と同様である。
【図２８】バリアントＣＴＣＦは、他＿１０バリアント結合部位細胞株のＭＹＣ発現を回復させる。他バリアント結合部位配列に結合するように選択されたＣＴＣＦバリアントを、他１０．Ｋ５６２細胞株において発現させた。ヌクレオフェクションの７２時間後に、細胞をＭＹＣ発現について分析した。バリアントおよび野生型ＣＴＣＦ（（ｗｔ）によって示される）のＺＦヘリックスの残基は凡例に挙げられている。他結合部位配列およびＣＴＣＦジンクフィンガーアレイの相互作用する認識ヘリックスも図示されている。Ａ．内因性ＭＹＣレベルは、ＣＴＣＦバリアントが発現した場合に、他＿１０細胞株において野生型レベルに回復する。内因性ＭＹＣ発現レベルは、ＲＴ−ｑＰＣＲによって定量され、他＿１０細胞株の低下した内因性ＭＹＣレベルと比べたものである。ＣＴＣＦ結合部位へのいかなる変更もないｅｘｏＭＹＣ．Ｋ５６２細胞株からの内因性ＭＹＣレベルが陽性対照として示されている（破線によって分離されている）。
【図２９】バリアントＣＴＣＦは、Ａ他＿２バリアント結合部位細胞株のＭＹＣ発現を回復させる。Ａ他バリアント結合部位配列に結合するように選択されたＣＴＣＦバリアントを、Ａ他＿２．Ｋ５６２細胞株において発現させた。ヌクレオフェクションの７２時間後に、細胞をＭＹＣ発現について分析した。バリアントおよび野生型ＣＴＣＦ（（ｗｔ）によって示される）のＺＦヘリックスの残基は凡例に挙げられている。Ａ他結合部位配列およびＣＴＣＦジンクフィンガーアレイの相互作用する認識ヘリックスも図示されている。Ａ．内因性ＭＹＣレベルは、ＣＴＣＦバリアントが発現した場合に、Ａ他＿２細胞株において野生型レベルに回復する。内因性ＭＹＣ発現レベルは、ＲＴ−ｑＰＣＲによって定量され、Ａ他＿２細胞株の低下した内因性ＭＹＣレベルと比べたものである。ＣＴＣＦ結合部位へのいかなる変更もないｅｘｏＭＹＣ．Ｋ５６２細胞株からの内因性ＭＹＣレベルが陽性対照として示されている（破線によって分離されている）。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
詳細な説明
これまで、野生型ＣＴＣＦよりも高いアフィニティーで変異体ＣＢＳに結合するように設計される利用可能な操作されたＣＴＣＦバリアントはない。それゆえ、野生型ＣＴＣＦよりも高いアフィニティーで変異体ＣＢＳに結合し得る操作されたＣＴＣＦバリアントの必要性がある。
【００５３】
本開示は、少なくとも一部には、ジンクフィンガーアレイに変更を有するＣＴＣＦバリアントを、１つまたは複数の点変異を持するＣＢＳ、すなわち変異体ＣＢＳを認識するように操作し得るという発見に基づく。
【００５４】
ＣＴＣＦ
ＣＣＣＴＣ結合因子（ＣＴＣＦ）は、高次クロマチン構造を維持することによって必須のゲノムオーガナイザーとして作用し、一方で細胞分化におけるおよび遺伝子発現の促進または抑制における役割も有するマルチドメインタンパク質である。ＣＴＣＦは、ゲノムのメガベースにまたがるトポロジカル関連ドメイン（ＴＡＤ）、ならびに遺伝子クラスター内の微調整された遺伝子断絶または遺伝子活性化につながるより小型のサブＴＡＤを維持する。加えて、ＣＴＣＦは、転写の速度に影響を与えることによってｍＲＮＡスプライシングを調節することが見出されており、より最近では、二本鎖断裂における相同組み換え修復を促進することに関わっている。野生型ＣＴＣＦは、標準的ＣＴＣＦ結合部位（ＣＢＳ）を認識する１１フィンガージンクフィンガーアレイを介してゲノムのあらゆる場所で結合する。
【００５５】
野生型ＣＴＣＦ  ＺＦアレイは、ＺＦ３〜６の位置−１〜＋６に以下の配列：
ＺＦ３の位置−１〜＋６：ＴＳＧＥＬＶＲ（配列番号１）
ＺＦ４の位置−１〜＋６：ＥＶＳＫＬＫＲ（配列番号２）
ＺＦ５の位置−１〜＋６：ＤＴＹＫＬＫＲ（配列番号３）
ＺＦ６の位置−１〜＋６：ＱＳＧＴＭＫＭ（配列番号４）
ＺＦ７の位置−１〜＋６：ＲＫＳＤＬＧＶ（配列番号５）
を含む。
【００５６】
野生型ＣＴＣＦは、下記で示されるアミノ酸配列：
【００５７】
【化１】
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と比較して、８０％を上回る、８５％を上回る、９０％を上回る、９５％を上回る、９６％を上回る、９７％を上回る、９８％を上回る、または９９％を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００５８】
２つの異なる核酸またはポリペプチド配列を比較する目的のために、一方の配列（試験配列）は、もう一方（比較配列）と特異的パーセンテージ同一であると記載され得る。パーセンテージ同一性は、様々なＢＬＡＳＴプログラムに組み入れられる、Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877 (1993)のアルゴリズムによって判定され得る。パーセンテージ同一性は、アメリカ国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）ウェブサイトで利用可能である「ＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールによって判定され得る。Tatusova and Madden, FEMS Microbiol. Lett., 174(2):247-250 (1999)を参照されたい。ＤＮＡ−ＤＮＡ一対比較に関しては、ＢＬＡＳＴＮプログラムが、初期設定パラメーター（例えば、マッチ：１；ミスマッチ：−２；オープンギャップ：５ペナルティー；伸長ギャップ：２ペナルティー；ギャップｘ＿ドロップオフ：５０；期待値：１０；およびワードサイズ：１１、フィルターあり）を用いて使用される。タンパク質−タンパク質一対比較に関しては、ＢＬＡＳＴＰプログラムが、初期設定パラメーター（例えば、行列：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップオープン：１１；ギャップ伸長：１；ｘ＿ドロップオフ：１５；期待値：１０．０；およびワードサイズ：３、フィルターあり）を使用して採用され得る。２つの配列のパーセント同一性は、ＢＬＡＳＴを使用して、試験配列と比較配列とをアラインし、比較配列の同じ位置におけるアミノ酸またはヌクレオチドと同一であるアラインされた試験配列におけるアミノ酸またはヌクレオチドの数を判定し、かつ同一のアミノ酸またはヌクレオチドの数を比較配列におけるアミノ酸またはヌクレオチドの数で割ることによって算出される。ＢＬＡＳＴを使用して２つの配列を比較する場合、それは配列をアラインし、規定のアラインされた領域にわたるパーセント同一性を生み出す。２つの配列がそれらの長さ全体にわたってアラインされる場合、ＢＬＡＳＴによって生み出されるパーセント同一性は、２つの配列のパーセント同一性である。ＢＬＡＳＴが２つの配列をそれらの長さ全体にわたってアラインしない場合には、試験配列および比較配列のアラインされていない領域における同一のアミノ酸またはヌクレオチドの数はゼロであると見なされ、パーセント同一性は、アラインされた領域における同一のアミノ酸またはヌクレオチドの数を足し、かつその数を比較配列の長さで割ることによって算出される。ＢＬＡＳＴプログラムの様々なバージョン、例えばＢＬＡＳＴ２．１．２またはＢＬＡＳＴ＋２．２．２２を使用して、配列を比較し得る。
【００５９】
ＣＴＣＦ結合部位（ＣＢＳ）
ＣＢＳは、典型的に、高度に保存された１５ｂｐのコア配列（またはコアモチーフ）を有して、長さが４０ｂｐである。コア配列に隣接する配列は著しくあまり保存されていないが、それでもやはりゲノムのあらゆる部位におけるＣＴＣＦ結合に重要である（図１）。
【００６０】
野生型ＣＴＣＦは、以下のコア配列：５’−ＮＣＤＮＨＮＧＲＮＧＤＮＮＮＮ−３’を含有する「コンセンサスＣＢＳモチーフ」に結合する。
【００６１】
一実施形態において、コンセンサスＣＢＳモチーフは、以下のコア配列：５’−ＣＣＡＧＣＡＧＧＧＧＧＣＧＣＴ−３’（配列番号６）を含有する。他のコア配列は当技術分野において公知である。
【００６２】
コア配列に隣接するヌクレオチドが、ＣＴＣＦ内に存在する１１フィンガーＺＦアレイによって結合されるかどうかは未知である。コンセンサスＣＴＣＦ結合配列（ＣＢＳ）に結合した１１フィンガージンクフィンガー（ＺＦ）アレイの共結晶構造は、１１フィンガーＺＦアレイのＺＦ３〜７のみが、高度に保存されたコア配列に直接結合するように見え、一方でＺＦ８〜１１および１〜２は、配列特異的接触を媒介しないように見えることを示唆する。ＺＦアレイの漸進的切り取りは、ＺＦ８〜１１およびＺＦ１〜２が、ＣＢＳへのＣＴＣＦのＤＮＡ結合およびＤＮａｓｅＩフットプリンティングを向上させ得ることを示唆し、ならびにＣｈＩＰ−ＳｅｑおよびＣｈＩＰ−Ｅｘｏデータは、ＺＦ９〜１１が重要なタンパク質−ＤＮＡ接触を作り出し得ることを示唆する（Rhee and Pugh, Cell (2011)；Nakahashi et al., Cell Reports (2013)）。興味深いことには、ＣＢＳに結合したＣＴＣＦ  Ｚアレイの共結晶構造は、ジンクフィンガー２〜９のみを含有し、他のフィンガーは構造において目に見えず、モチーフの隣接領域と相互作用するジンクフィンガーはＤＮＡとの安定な接触を作り出し得ないという意見と一致する（Hashimoto, et al., Molecular Cell (2017)）。ゆえに、アレイの１１フィンガーすべてがＣＴＣＦのＤＮＡ結合活性に対してどんな影響を有するのか、およびすべてのジンクフィンガーまたは部分集合がＤＮＡと接触するかどうかは不明なままである。
【００６３】
ＣＴＣＦ結合は、ＣＢＳの保存された１５ｂｐコアモチーフの変化に敏感であり、マウスでは、ある特定の位置における単一ヌクレオチド変化はＣＴＣＦ結合の喪失につながり得る（Nakahashi et al., Cell Reports (2013)）。ＣＴＣＦ結合部位は、消化管癌患者由来の一次サンプルにおいてＣＴＣＦ結合部位のコア配列に局在する癌関連変異を有して、ならびに発がん遺伝子および腫瘍抑制遺伝子の付随する非定型遺伝子発現プロファイルを有して、癌における変異ホットスポットであると報告されている（Guo et al., Nature Communications (2018)）。ＣＴＣＦ結合部位の小さな欠失は、両方とも癌発生における役割を担うＭＹＣおよびＰＴＧＳ２等の遺伝子の発現の喪失につながることも示されている（Schuijers et al., Cell Reports (2018)；Kang et al., Oncogene (2015)）。
【００６４】
本明細書において記載される方法を使用して、複数のジンクフィンガーを含む操作されたＣＴＣＦバリアントを選択し得および作出し得、選択されたポリペプチドは、野生型ＣＴＣＦと配列が異なる、少なくとも１つのジンクフィンガーにおける少なくとも１つのアミノ酸残基を有し、操作されたＣＴＣＦバリアントは、関心対象のＤＮＡ配列（例えば、コンセンサスＣＢＳ配列に少なくとも１つの変異を持するＣＢＳ）に結合するが、コンセンサスＣＢＳには結合しない。本発明の方法を使用すると、足場ポリペプチドは、異なる構造的および機能的特質を有する、足場に基づく新たなジンクフィンガーポリペプチド内に再操作され、それにより新たなポリペプチドは関心対象の配列に結合するが、足場タンパク質の天然に存在するＤＮＡ結合部位には結合しない。
【００６５】
「ジンクフィンガー」または「Ｚｆ」という用語は、亜鉛によって安定化されるＤＮＡ結合ドメインを有するポリペプチドを指す。個々のＤＮＡ結合ドメインは、典型的に「フィンガー」と称される。Ｚｆタンパク質は、少なくとも１つのフィンガー、好ましくは２つのフィンガー、３つのフィンガー、または６つのフィンガーを有する。２つ以上のＺｆを有するＺｆタンパク質は、「マルチフィンガー」または「マルチＺｆ」タンパク質と称される。各フィンガーは、典型的に、およそ３０アミノ酸の、亜鉛をキレートするＤＮＡ結合ドメインを含む。これらのタンパク質の１つのクラスを特徴付けする例示的なモチーフは、「Ｃ（２）Ｈ（２）クラス」として知られる−Ｃｙｓ−（Ｘ）（２〜４）−Ｃｙｓ−（Ｘ）（１２）−Ｈｉｓ−（Ｘ）（３〜５）−Ｈｉｓ（配列番号７）であり、式中、Ｘは任意のアミノ酸である。このクラスの単一のＺｆは、典型的に、２つのシステイン残基と一緒に亜鉛と連動する２つの不変ヒスチジン残基を含有するアルファヘリックスからなる。
【００６６】
核酸結合因子およびその標的核酸、例えばＣＴＣＦ（バリアントまたは野生型）およびＣＢＳに関する「に結合する」または「結合すること」という用語は、結合により、核酸結合因子が生物学的に重大な機能、例えば転写活性化、結合部位への他のタンパク質の導き、および／またはクロマチン構造の変更を媒介することが可能となるような、分子間相互作用、例えばイオン性、共有結合性、ロンドン分散力、双極子−双極子、または水素結合による、核酸の標的核酸配列への核酸結合因子の配列依存的結合を指す。そのような結合は、遺伝子発現の活性化、過剰発現、抑制、または不活性化等、遺伝子の発現のモジュレーションをもたらし得る。
【００６７】
核酸結合因子およびその標的核酸、例えばＣＴＣＦ（バリアントまたは野生型）およびＣＢＳに関する「には結合しない」という用語は、核酸における標的配列の存在の欠如（例えば、ＣＢＳにおける１つまたは複数の点変異に起因した）の結果としての、分子間相互作用、例えばイオン性、共有結合性、ロンドン分散力、双極子−双極子、または水素結合による、核酸への核酸結合因子の配列特異的結合の欠如を指す。そのような非結合により、核酸結合因子は生物学的に重大な機能、例えば転写活性化、ＤＮＡ修飾、ＤＮＡ切断、結合部位への他のタンパク質の導き、および／またはクロマチン構造の変更、を媒介することが可能とならない。
【００６８】
Ｚｆタンパク質内の各フィンガーは、ＤＮＡ配列内の約２〜約５塩基対に結合する。典型的に、Ｚｆタンパク質内の単一のＺｆは、ＤＮＡ配列内の３または４塩基対「サブサイト」に結合する。したがって、「サブサイト」とは、単一のジンクフィンガーによって結合されるＤＮＡ配列である。「マルチサブサイト」とは、１つを上回る数のジンクフィンガーによって結合されるＤＮＡ配列であり、少なくとも４ｂｐ、好ましくは６ｂｐ、またはそれを上回る数を含む。マルチＺｆタンパク質は、少なくとも２つ、典型的には３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれを上回る数のサブサイト、すなわち当該タンパク質の各フィンガーに対して１つを結合する。
【００６９】
組成物および方法
野生型ＣＴＣＦよりも高いアフィニティーで変異体ＣＢＳに結合し得る操作されたＣＴＣＦバリアントが本明細書において記載される。操作されたＣＴＣＦバリアントは、変異体ＣＢＳ（コンセンサスＣＢＳの核酸配列と配列が異なる少なくとも１つの核酸を有するＣＢＳ）の制御下にある遺伝子を調節することにおいて使用され得る。ＣＴＣＦバリアントは、野生型ＣＴＣＦのアミノ酸配列と配列が異なる、少なくとも１つのジンクフィンガーにおける少なくとも１つのアミノ酸残基を有する。
【００７０】
例示的な操作されたＣＴＣＦバリアントには、
（１）ＺＦ７の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＤＨＬＱＴ（配列番号８）、ＥＨＬＮＶ（配列番号９）、ＡＨＬＱＶ（配列番号１０）、ＥＨＬＲＥ（配列番号１１）、ＤＨＬＱＶ（配列番号１２）、ＥＨＬＫＶ（配列番号１３）、ＤＨＬＱＶ（配列番号１４）、ＥＨＬＶＶ（配列番号１５）、ＤＨＬＲＴ（配列番号１６）、ＤＨＬＡＴ（配列番号１７）、もしくはＤＨＬＱＴ（配列番号１８）；
（２）ＺＦ７の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＤＨＬＱＴ（配列番号１９）、ＥＨＬＮＶ（配列番号２０）、ＡＨＬＱＶ（配列番号２１）、ＥＨＬＲＥ（配列番号２２）、ＤＨＬＱＶ（配列番号２３）、ＥＨＬＫＶ（配列番号２４）、ＤＨＬＱＶ（配列番号２５）、ＥＨＬＶＶ（配列番号２６）、ＤＨＬＲＴ（配列番号２７）、ＤＨＬＡＴ（配列番号２８）、もしくはＤＨＬＱＴ（配列番号２９）；
（３）ＺＦ６の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＮＡＭＫＲ（配列番号３０）、ＥＨＭＧＲ（配列番号３１）、ＤＨＭＮＲ（配列番号３２）、ＴＨＭＫＲ（配列番号３３）、ＥＨＭＲＲ（配列番号３４）、もしくはＴＨＭＮＲ（配列番号３５）；
（４）ＺＦ６の位置−１〜＋３にアミノ酸配列ＭＮＥＳ（配列番号３６）、ＨＲＥＳ（配列番号３７）、ＲＰＤＴ（配列番号３８）、ＲＴＤＩ（配列番号３９）、もしくはＲＨＤＴ（配列番号４０）；
（５）ＺＦ５の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＨＧＬＫＶ（配列番号４１）、ＨＲＬＫＥ（配列番号４２）、ＨＡＬＫＶ（配列番号４３）、ＳＲＬＫＥ（配列番号４４）、ＤＧＬＲＶ（配列番号４５）、ＨＴＬＫＶ（配列番号４６）、もしくはＮＲＬＫＥ（配列番号４７）；
（６）ＺＦ５の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＡＴＬＫＲ（配列番号４８）、ＱＡＬＲＲ（配列番号４９）、ＧＧＬＶＲ（配列番号５０）、ＨＧＬＩＲ（配列番号５１）、ＡＮＬＳＲ（配列番号５２）、ＴＧＬＴＲ（配列番号５３）、ＨＧＬＶＲ（配列番号５４）、ＧＧＬＴＲ（配列番号５５）、ＨＴＬＲＲ（配列番号５６）、ＴＶＬＫＲ（配列番号５７）、ＡＤＬＫＲ（配列番号５８）、もしくはＨＧＬＲＲ（配列番号５９）；
（７）ＺＦ４の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＡＨＬＲＫ（配列番号６０）、ＡＫＬＲＶ（配列番号６１）、ＧＧＬＧＬ（配列番号６２）、ＡＫＬＲＩ（配列番号６３）、ＴＫＬＫＶ（配列番号６４）、もしくはＳＫＬＲＶ（配列番号６５）；
（８）ＺＦ４の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＡＴＬＲＲ（配列番号６６）、ＲＲＬＤＲ（配列番号６７）、ＴＮＬＲＲ（配列番号６８）、ＡＮＬＲＲ（配列番号６９）、ＧＮＬＴＲ（配列番号７０）、ＡＭＬＫＲ（配列番号７１）、ＨＭＬＴＲ（配列番号７２）、ＡＭＬＲＲ（配列番号７３）、もしくはＴＭＬＲＲ（配列番号７４）；
（９）ＺＦ３の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＱＱＬＩＶ（配列番号７５）、ＳＱＬＩＶ（配列番号７６）、ＱＱＬＬＶ（配列番号７７）、ＧＥＬＶＶ（配列番号７８）、ＱＱＬＬＩ（配列番号７９）、ＧＱＬＩＶ（配列番号８０）、ＧＱＬＴＶ（配列番号８１）、ＴＥＬＩＩ（配列番号８２）、ＱＧＬＬＶ（配列番号８３）、ＱＱＬＬＴ（配列番号８４）、ＧＱＬＬＴ（配列番号８５）、ＧＥＬＬＴ（配列番号８６）、もしくはＱＱＬＬＩ（配列番号８７）；
（１０）ＺＦ４の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＡＫＬＫＫ（配列番号８８）、ＡＫＬＲＫ（配列番号８９）、ＡＨＬＲＶ（配列番号９０）、ＡＫＬＲＶ（配列番号９１）、もしくはＳＫＬＲＬ（配列番号９２）；ＺＦ５の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＥＲＬＲＶ（配列番号９３）、ＮＲＬＫＶ（配列番号９４）、ＳＲＬＫＥ（配列番号９５）、もしくはＮＲＬＫＶ（配列番号９６）；ＺＦ６の位置−１〜＋３にアミノ酸配列ＲＰＤＴ（配列番号９７）、ＲＴＥＴ（配列番号９８）、もしくはＲＡＤＶ（配列番号９９）；およびＺＦ７の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＤＮＬＬＡ（配列番号１００）、ＳＮＬＬＶ（配列番号１０１）、ＤＮＬＭＡ（配列番号１０２）、もしくはＤＮＬＲＶ（配列番号１０３）；
（１１）ＺＦ４の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＧＨＬＫＫ（配列番号１０４）、ＡＨＬＲＫ（配列番号１０５）、もしくはＧＫＬＲＩ（配列番号１０６）；ＺＦ５の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＳＲＬＫＥ（配列番号１０７）、ＤＡＬＲＲ（配列番号１０８）、ＤＧＬＫＲ（配列番号１０９）、もしくはＴＲＬＲＥ（配列番号１１０）；ＺＦ６の位置−１〜＋３にアミノ酸配列ＲＰＤＴ（配列番号１１１）もしくはＲＴＥＮ（配列番号１１２）；およびＺＦ７の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＥＨＬＫＶ（配列番号１１３）、ＤＨＬＬＡ（配列番号１１４）、もしくはＨＨＬＤＶ（配列番号１１５）；
（１２）ＺＦ４の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＳＮＬＲＲ（配列番号１１６）、ＧＮＬＶＲ（配列番号１１７）、ＧＮＬＲＲ（配列番号１１８）、ＧＮＬＫＲ（配列番号１１９）、ＡＮＬＲＲ（配列番号１２０）、ＮＮＬＲＲ（配列番号１２１）、もしくはＴＮＬＲＲ（配列番号１２２）；ＺＦ６の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＥＨＭＫＲ（配列番号１２３）、ＥＨＭＲＲ（配列番号１２４）、ＴＨＭＫＲ（配列番号１２５）、ＥＨＭＮＲ（配列番号１２６）、もしくはＥＨＭＡＲ（配列番号１２７）；およびＺＦ７の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＤＮＬＬＴ（配列番号１２８）、ＤＮＬＬＶ（配列番号１２９）、ＤＮＬＱＴ（配列番号１３０）、ＤＮＬＬＡ（配列番号１３１）、ＤＮＬＡＴ（配列番号１３２）、ＤＮＬＱＡ（配列番号１３３）、ＤＮＬＭＡ（配列番号１３４）、もしくはＤＮＬＭＴ（配列番号１３５）；
（１３）ＺＦ４の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＧＮＬＶＲ（配列番号１３６）、ＧＮＬＲＲ（配列番号１３７）、ＧＮＬＡＲ（配列番号１３８）、ＧＮＬＭＲ（配列番号１３９）、ＡＮＬＲＲ（配列番号１４０）、ＳＮＬＲＲ（配列番号１４１）、もしくはＮＮＬＲＲ（配列番号１４２）；ＺＦ６の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＥＨＭＮＲ（配列番号１４３）、ＥＨＭＫＲ（配列番号１４４）、ＥＨＭＲＲ（配列番号１４５）、ＳＨＭＮＲ（配列番号１４６）、ＳＨＭＲＲ（配列番号１４７）、ＴＨＭＫＲ（配列番号１４８）、もしくはＤＨＭＮＲ（配列番号１４９）；およびＺＦ７の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＥＨＬＫＶ（配列番号１５０）、ＥＨＬＡＥ（配列番号１５１）、ＳＴＬＮＥ（配列番号１５２）、ＤＨＬＱＶ（配列番号１５３）、ＥＨＬＮＶ（配列番号１５４）、ＤＨＬＮＴ（配列番号１５５）、ＥＨＬＱＡ（配列番号１５６）、もしくはＨＨＬＭＨ（配列番号１５７）；または
（１４）ＺＦ４の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＧＨＬＫＫ（配列番号１５８）、ＡＨＬＫＫ（配列番号１５９）、ＴＫＬＲＬ（配列番号１６０）、ＴＫＬＫＬ（配列番号１６１）、ＧＨＬＲＫ（配列番号１６２）、ＴＨＬＫＫ（配列番号１６３）、もしくはＡＨＬＲＫ（配列番号１６４）；ＺＦ５の位置＋２〜＋６にアミノ酸配列ＴＲＬＫＥ（配列番号１６５）もしくはＳＲＬＫＥ（配列番号１６６）；およびＺＦ６の位置−１〜＋３にアミノ酸配列ＲＡＤＮ（配列番号１６７）、ＲＨＤＴ（配列番号１６８）、ＲＲＤＴ（配列番号１６９）、ＲＰＤＴ（配列番号１７０）、ＲＴＳＳ（配列番号１７１）、もしくはＲＮＤＴ（配列番号１７２）
を含有するものが含まれる。
【００７１】
一部の実施形態において、操作されたＣＴＣＦバリアントは、上記で挙げられたアミノ酸配列の２つ以上の組み合わせを含有する。
【００７２】
本開示の一実施形態において、コンセンサスＣＢＳ内のある特定の位置における変異は、ランダム化ライブラリーから、変異したＣＢＳ配列を認識し得るバリアントを選択するために使用された細菌ツーハイブリッドシステムにおいて、野生型ＣＴＣＦジンクフィンガーアレイによる結合を実質的に低下させた。フィンガーを一緒に組み合わせることを使用して、複数の点変異を持するＣＢＳを認識し得るバリアントＣＴＣＦジンクフィンガーアレイを作出し得る。本開示の一部の実施形態において、これらのジンクフィンガーアレイバリアントを持するＣＴＣＦタンパク質を使用して、ＣＢＳ（すなわち、非標準的ＣＢＳ）内に１つまたは複数の変異を持つ部位におけるＣＴＣＦ結合活性を回復させる。本開示の一部の実施形態において、ＣＴＣＦバリアントは、ゲノムにおける代替的な非ＣＢＳ部位を認識し得る。一部の実施形態において、そのようなＣＴＣＦバリアントを使用して、遺伝子を故意に断絶し得および／またはゲノムの高次構造をかき乱し得、それによって関心対象のある特定の標的遺伝子の発現を変更する人工ＴＡＤおよび／またはエンハンサー−プロモーターループを創出し得る。
【００７３】
疾患の診断および治療
本明細書において記載される操作されたＣＴＣＦバリアントは、変異体ＣＢＳに起因した異常な遺伝子調節が根本的要因である疾患を治療するために使用され得る。本明細書において記載される操作されたＣＴＣＦバリアントは、例えば、野生型ＣＴＣＦには結合しない変異体ＣＢＳに結合し得、それによって遺伝子調節を変更しまたは回復させ、それが疾患の進行を逆転させ得るまたは減速させ得る。ＣＴＣＦ結合は、ＭＹＣ等のがん遺伝子の発現を調節することが示されている。ＣＴＦＣ結合部位に蓄積した変異および野生型ＣＴＣＦ結合の喪失は、がん遺伝子の調節異常および発がんの危険性の増加に関連している。ＭＹＣの転写調節異常は、侵襲性の強い腫瘍細胞における最も頻度が高い事象の１つであり、調節異常は、エンハンサー−プロモーターループを分断するＣＴＣＦ結合部位における変異の結果である。操作されたＣＴＣＦバリアントは、変異した部位に結合し得、正常な遺伝子発現レベルを回復させ得、癌発生の危険性を低下させる。別の場合には、脆弱Ｘ症候群は、繰り返し領域における重複およびＦＭＲ１発現の喪失の結果である。Ｘ染色体における反復領域の重複は、ＣＴＣＦ結合部位を分断し、ＦＭＲ１の発現を推進するエンハンサー−プロモーターループの喪失につながる。操作されたＣＴＣＦバリアントは、エンハンサー−プロモーターループを回復させ得、ＦＭＲ１発現の回復につながる。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）および他の組み込み型ウイルス（ＨＩＶ等）は、近隣エンハンサーからのウイルスゲノムのＣＴＣＦ媒介性断絶によってしばしばサイレンシングされる。ＨＰＶ１８の場合、ウイルスゲノムのプロモーター領域にＣＴＣＦ結合部位がある。ＣＴＣＦ結合部位に変異を有するＨＰＶ１８は、結合部位におけるこれらの配列変異がＣＴＣＦによってもはや認識され得ないためサイレンシングされない。操作されたＣＴＣＦバリアントは、変異したＨＰＶが組み込まれたゲノムに結合し得、断絶しているループを回復させ得るであろう。
【００７４】
キット
操作されたＣＴＣＦバリアントおよび／または本明細書において記載される操作されたＣＴＣＦをコードする核酸、ならびに使用のための取扱説明書を含むキットも本明細書において提供される。
【００７５】
操作されたＣＴＣＦバリアントの他の適用
本明細書において記載される操作されたＣＴＣＦは、いくつかの他の適用において使用され得、その一部は本明細書において開示される。
【００７６】
一部の実施形態において、操作されたＣＴＣＦバリアントまたはそのような操作されたＣＴＣＦバリアントをコードする核酸を使用して、ＣＴＣＦと他のクロマチン組織化タンパク質との複雑な相互作用をさらに解明し得る。クロマチンの構造維持は、細胞内で厳密に調節され、ＣＴＣＦは主要な役割を担う。どのようにして高次構造が細胞分裂を越えて引き継がれ、細胞分化を通じて維持されるかは依然として不明なままであり、ＣＴＣＦバリアントの使用は、その役割を明らかにするのに役立ち得る。ＣＴＣＦバリアントを使用して、どのようにしてループがゲノムにわたって形成されるかを調査し得、ならびに研究および治療的適用のために内因性遺伝子発現に影響を与える様式で正常なゲノムアーキテクチャーを改変し得または回復させ得るであろう。それらを使用して、また、本発明者らがＴＡＤに基づくゲノム組織化の進化的意味合いおよび遺伝子発現のエピジェネティック調節をよりよく理解し得るように先祖代々のＣＴＣＦ結合部位を再建し得るであろう、または研究および治療的適用のために内因性遺伝子発現に影響を与える代替的なゲノムアーキテクチャーを創出し得るであろう。
【実施例】
【００７７】
材料および方法
以下の材料および方法を、下記で示される実施例において使用した。
【００７８】
Ｂ２Ｈレポーターアッセイ構成要素の構築
ジンクフィンガー細菌発現プラスミドは、ｇａｌ１１Ｐに融合したＣＴＣＦジンクフィンガーアレイ（またはバリアント）を含有した。ＣＴＣＦ１１フィンガージンクフィンガーアレイのすべてまたは一部のアミノ末端をｇａｌ１１Ｐのカルボキシ末端に、それらの間にＦｌａｇタグリンカーを用いて融合させた。ジンクフィンガー発現プラスミドは、カナマイシン耐性遺伝子を含有する。細菌レポータープラスミドとして知られる第２のプラスミドは、ＢｓａＩ制限消化、それに続くＣＴＣＦ結合部位を含有するアニールされたオリゴのＴ４媒介性ライゲーションを介して導入されたＣＴＣＦ結合部位配列を含有した。レポータープラスミドは、ＣＴＣＦ結合部位が結合された場合にｌａｃＺの発現を促進する細菌ｌａｃプロモーターを含有した。レポータープラスミドは、クロラムフェニコール耐性遺伝子も有する。
【００７９】
細菌ツーハイブリッド（Ｂ２Ｈ）ランダム化ライブラリー構築
相補的オリゴは、意図的に配列に導入される「ＶＮＳ」または「ＮＮＳ」変動を用いて、ＩＤＴによって合成された。オリゴをアニールし、Ｔ４リガーゼを使用してジンクフィンガー発現プラスミド（ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで事前に消化された）にライゲーションした。ライゲーション反応物をＱｉａｇｅｎ  Ｍｉｎｅｌｕｔｅカラムを使用して精製し、精製された基質をエレクトロコンピテントＸＬ１ｂｌｕｅ大腸菌（E.coli）系統に電気形質転換した。ＳＯＣ中にて３７℃で１時間の回復後、５０ｕｇ／ｍＬのカナマイシンを有する１５０ｍＬのＬｕｒｉａブロス（ＬＢ）に形質転換物を植菌した。培養物が０．４００〜０．６００のＯＤ６００に到達した（３７℃で約１０時間の成長）後、培養物をスピンダウンし、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍａｘｉｐｒｅｐキットを使用してライブラリーを回収した。
【００８０】
細菌ツーハイブリッド（Ｂ２Ｈ）レポーターアッセイ
６００ｎｇのｇａｌ１１Ｐ−ジンクフィンガー発現プラスミド、および関心対象のＣＴＣＦ結合部位を有する６００ｎｇのレポータープラスミドを、ＲＮＡポリメラーゼのアルファＮ末端ドメイン（α−ＮＴＤ）−Ｇａｌ４融合体とともに、１５０ｕＬのΔλ大腸菌（E.coli）系統に化学的に形質転換した。プラスミドおよび細胞混合物を氷上で３０分間インキュベートし、４２℃で１分間熱ショックを与え、氷上で２分間回復させ、その後に５００ｕＬのＬｕｒｉａブロス中での１時間の回復が続いた。回復後、形質転換物を、カナマイシン（５０ｕｇ／ｍＬ）、クロラムフェニコール（１２．５ｕｇ／ｕＬ）選択ＬＢ寒天プレートにプレーティングした。３７℃での１４〜１６時間の成長後、コロニーを採取し、１ｍＬの誘導培地（５０ｕｇ／ｕＬのカナマイシン、１２．５ｕｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、１０ｕｇ／ｍＬのＺｎＣｌ、および５００ｕｇ／ｍＬのＩＰＴＧを有するＬｕｒｉａブロス）中で一晩成長させた。１５〜１７時間の成長後、２５ｕＬの一晩の培養物を１ｍＬの新鮮な誘導培地に継代培養し、３７℃で２時間または培養物が分光光度計によって測定されるＤ５９５  ０．１５７〜０．２６８の間になるまで成長させた。次いで、１００ｕＬの継代培養物を、リゾチームとＰｏｐＣｕｌｔｕｒｅソープとの１１ｕＬの１：１０混合物を使用して最低１５分間溶解した。次いで、１５ｕＬの溶解混合物を、以前に記載された比色分析ＯＮＰＧアッセイによってＬａｃＺの倍活性化について分析した。結合を、ＬａｃＺの倍活性化によって定量した。陰性対照（ｇａｌ１１Ｐに融合したジンクフィンガータンパク質なし）のβ−ｇａｌレベルを上回るサンプルのβ−ｇａｌレベルの倍増加を算出することによって、倍活性化を判定した。
【００８１】
細菌ツーハイブリッド（Ｂ２Ｈ）選択アッセイ
選択アッセイに関与したプラスミドは、１つの違いのみを有して、以前と同じである。レポータープラスミドは、ＬａｃＺを、カルベニシリン等のβ−ラクタム環クラスの抗生物質に対する抗生物質耐性遺伝子であるＢｌａＣと入れ替えることによって選択プラスミドであるように作製される。ジンクフィンガー−ｇａｌ１１Ｐ発現プラスミドにライゲーションされたオリゴのプールからバリアントのライブラリーを構築することによって、選択を行う。これらを、関心対象のＣＴＣＦ結合部位を有する選択プラスミドを含有するエレクトロコンピテントΔλ大腸菌（E.coli）系統に電気形質転換する。細胞を１ｍＬのＳＯＣ中にて３７℃で１時間回復させ、その後に、４ｍＬの誘導培地（以前に記載された）中にて３７℃で付加的な３時間の選択プラスミドの誘導が続く。合計４時間後、形質転換物を低ストリンジェンシーなプレート（５０ｕｇ／ｍＬのカナマイシン、１２．５ｕｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、１００ｕｇ／ｍＬのカルベニシリン、１０ｕｇ／ｍＬの塩化亜鉛、および２００ｕｇ／ｍＬのＩＰＴＧ、および０．４５ｕｇ／ｍＬのクラブラン酸を有するＬＢ寒天）にプレーティングする。プレートを、２０〜２４時間３７℃で一晩成長させ、次いで、コロニーを２ｍＬのＬＢを有する表面から回収する。５０ｕＬの削り取られたコロニーを、５０ｕｇ／ｍＬのカナマイシンおよび１２．５ｕｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを有する１ｍＬのテリフィックブロス（ＴＢ）に継代培養し、３７℃で１４〜１６時間成長させた。翌日、プラスミドを一晩の培養物から回収し、関心対象のＣＴＣＦ結合部位を有する以前と同じ選択プラスミドを含有する化学的コンピテントΔλ大腸菌（E.coli）系統に化学的に形質転換する。化学的形質転換は、３７℃で１時間の回復後に誘導培地中で２時間の成長を加えて、以前に記載されるように実施される。合計３時間の成長後、細胞を高ストリンジェンシーな選択勾配プレートにプレーティングする。高ストリンジェンシーな勾配プレートは、濃度が約１から開始して最高４０ｕｇ／ｍＬまでのクラブラン酸の勾配を有して、５０ｕｇ／ｍＬのカナマイシン、１２．５ｕｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、１００ｕｇ／ｍＬのカルベニシリン、１０ｕｇ／ｍＬのＺｎＣｌ、２００ｕｇ／ｍＬのＩＰＴＧを含有する。プレートを３７℃で２０〜２４時間インキュベートした。最も高いレベルのクラブラン酸を有する勾配で成長したコロニーを採取し、５０ｕｇ／ｍＬのカナマイシンを有する１ｍＬのＴＢ中で成長させ、一晩成長させてプラスミドを回収した。次いで、バリアントプラスミドをサンガーシーケンシングし、ならびにＢ２Ｈ  β−ｇａｌレポーターアッセイにおいて結合活性について分析した。
【００８２】
高ストリンジェンシーな勾配プレート
高ストリンジェンシーな選択勾配プレートは、濃度が約１から開始して４０ｕｇ／ｍＬまでのクラブラン酸の勾配を有して、５０ｕｇ／ｍＬのカナマイシン、１２．５ｕｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、１００ｕｇ／ｍＬのカルベニシリン、１０ｕｇ／ｍＬのＺｎＣｌ、２００ｕｇ／ｍＬのＩＰＴＧを含有する。クラブラン酸の勾配を得るために、約２５℃の傾斜（くさびの細い先がＬＢ寒天でどうにか覆われるだけのような十分な角度）を有するように、ピペットチップを使用して長方形プレートを持ち上げる。５０ｕｇ／ｍＬのカナマイシン、１２．５ｕｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、１００ｕｇ／ｍＬのカルベニシリン、１０ｕｇ／ｍＬのＺｎＣｌ、２００ｕｇ／ｍＬのＩＰＴＧ、および４ｕｇ／ｍＬのクラブラン酸を有する２０〜２５ｍＬのＬＢ寒天を傾けたプレートに添加し、底のくさびを形成する。固まり次第、プレートを平らに置き、５０ｕｇ／ｍＬのカナマイシン、１２．５ｕｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、１００ｕｇ／ｍＬのカルベニシリン、１０ｕｇ／ｍＬのＺｎＣｌ、２００ｕｇ／ｍＬのＩＰＴＧ（クラブラン酸を有しない）を有する２０〜２５ｍＬのＬＢ寒天を上部に注ぐ。これにより、約１ｕｇ／ｍＬから最高４．０ｕｇ／ｍＬに及ぶ範囲のクラブラン酸の勾配を有するプレートが創出される。
【００８３】
ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲを使用したＣＴＣＦ結合アッセイ
３×１０５個細胞／ｍＬの密度でのトランスフェクションの１８〜２４時間前に、Ｋ５６２細胞を播種した。バリアントごとに３００万個のＫ５６２を、提供される最適化プロトコールを使用したＬｏｎｚａキットＶを使用してトランスフェクトし、１０ｃｍディッシュにプールした。ｐＣＡＧプロモーターによって発現されるＨＡエピトープタグ付けされたＣＴＣＦ（野生型またはバリアント）を発現する５ｕｇのプラスミドを、各１００万個の細胞反応物に対して使用した。トランスフェクションの７２時間後、およそ１０００万個の細胞を１％ホルムアルデヒドを用いて３７℃で１０分間架橋した。反応を、１．２ｍＬの２．５Ｍグリシンを用いて３７℃で５分間消光した。細胞を４３０ｇで１０分間ペレットにし、ＳＦＸ２５０  Ｂｒａｎｓｏｎ超音波処理器で５．５分間、３２％の振幅で、１．３秒間オフ、０．７秒間オンで超音波処理した。次いで、サンプルを半分に分け、一方をＣＴＣＦに特異的な抗体とともに４℃で回転させながら一晩沈殿させ、他方をＨＡ特異的抗体とともに一晩沈殿させた。翌日、抗体が結合したクロマチン複合体を、回転させながらＧ−ｄｙｎａｂｅａｄｓとともに４℃で２時間インキュベートした。ビーズを、１ｍＬの氷冷ＲＩＰＡ１５０洗浄バッファー（０．１％ＳＤＳ、０．１％ＤＯＣ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中で３回、１ｍＬの氷冷ＲＩＰＡ５００洗浄バッファー（０．１％ＳＤＳ、０．１％ＤＯＣ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８、５００ｍＭ  ＮａＣｌ）中で３回、１ｍＬの氷冷ＬｉＣｌ洗浄バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８、２５０ｍＭ  ＬｉＣｌ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．５％ＤＯＣ）で３回、および１ｍＬの氷冷１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５中で１回洗浄した。抗体クロマチン複合体を、新しく添加された５ｍＭ  ＤＴＴを有する１００ｕＬの溶出バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８、０．１％ＳＤＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中にビーズから溶出した。ビーズを、９００ｒｐｍで振とうしながら、溶出バッファーとともに６５℃で１時間インキュベートした。ビーズを磁石によってペレットにし、上清をきれいなチューブに移し、そこで室温に冷ました後、１ｕＬのＲＮＡｓｅ（Ｒｏｃｈｅ  １１１１９９１５００１）をサンプルに添加し、６００ｒｐｍにて３７℃で３０分間インキュベートした。３ｕＬのプロテイナーゼＫ［２０ｍｇ／ｍＬ］をサンプルに添加し、６５℃で一晩インキュベートした（Ｌｉｆｅｔｅｃｈ  ＃１００００５３９３）。翌日、１６０ｕＬのＰＥＧ／ＮａＣｌ（２０％ＰＥＧ、２．５Ｍ  ＮａＣｌ）を有する１００ｕＬのＳＰＲＩビーズをサンプルに添加し、ボルテックスし、磁石上にビーズをペレットにする前に室温で５分間インキュベートした。ペレットを８０％エタノールで２回洗浄し、１５０ｕＬの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８中での最終溶出の前に５分間空気乾燥させた。リアルタイムｑＰＣＲによる、抗体によって処理されていない１％インプットを上回るフラグメント富化の定量のために、３ｕＬの回収された上清を、５ｕＬのＳＹＢＲ  ｑＰＣＲマスターミックスおよび２ｕＬのプライマーミックスと混合した。
【００８４】
バリアント結合部位細胞株の作出
ＭＹＣ  ＴＳＳの約２ｋｂ上流にあるＣＴＣＦ結合部位に導入されたバリアント結合部位を有する細胞株を、ｅｘｏＭＹＣ．Ｋ５６２に、ＳｐＣａｓ９−Ｐ２Ａ−ＧＦＰ、ＣＴＣＦ結合部位を標的にするｇＲＮＡ、および６つの異なるバリアント結合部位を導入するＨＤＲ鋳型としての６つの個別のｓｓＯＤＮのうちの１つをヌクレオフェクトすることによって作出した。ｅｘｏＭＹＣ．Ｋ５６２は、ＰＧＫプロモーターから発現される外因性ＭＹＣ構築物を形質導入されたＫ５６２細胞株である。内因性ＭＹＣ発現の任意の低下はＫ５６２細胞の生存に影響を与え得ることから、これが必要であった。単一細胞クローン増殖のために、ＧＦＰ＋細胞を９６ウェルプレートに高希釈で選別した。増殖され次第、ｇＤＮＡおよびＲＮＡを抽出して、クローン細胞集団を遺伝子型判定および表現型判定した。内因性ＭＹＣの低下を有し、また所望のＨＤＲ事象のための標的部位でホモ接合性に見えるクローン株を調査において使用した。
【００８５】
ＲＴ−ｑＰＣＲによってＭＹＣ発現を定量する
ＭＹＣの上流にバリアント結合部位を持するように編集された３００万個のＫ５６２細胞のゲノムに、ＬｏｎｚａキットＶプロトコールに従って、バリアントＣＴＣＦを発現する５ｕｇのプラスミドをヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクションの７２時間後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡ  Ｐｌｕｓ  ＲＮＡ単離プロトコールに従って、１００万個の細胞をＲＮＡ抽出のために単離した。Ｔｈｅｒｍｏ  Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡキットにより、ＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。３ｕＬの１：２０希釈のｃＤＮＡを５ｕＬのＴｈｅｒｍｏ  Ｆａｓｔ  ＳＹＢＲｇｒｅｅｎマスターミックスと混合し、標準ＰＣＲ増幅プロトコールに従って、ＲＴ−ｑＰＣＲ機器でランした。
【００８６】
結果
ＣＴＣＦ結合効率に影響を及ぼす、ＣＢＳにおける単一ヌクレオチド置換
本発明者らは、細菌ツーハイブリッド（Ｂ２Ｈ）システムを使用して、野生型ＣＴＣＦ結合を分断する単一のまたは複数の配列変化を持つ変異したＣＢＳに結合するＣＴＣＦのジンクフィンガーアレイを考案し得るであろうと本発明者らは推論した（Wright et al. Nature Protocols (2006)；Sander et al., Nature Methods (2010)；Maeder et al. Molecular Cell. (2008)）。本発明者らは、以前に記載された細菌ツーハイブリッド（Ｂ２Ｈ）システムを使用して、以前に規定されたコンセンサスＣＢＳ部位内の単一ヌクレオチド置換の影響を体系的に規定した（Joung et al., PNAS (2000)）。Ｂ２Ｈシステムにおいて、関心対象の標的部位へのＤＮＡ結合ジンクフィンガーアレイの結合を、レポーター遺伝子（例えば、ベータ−ガラクトシダーゼまたは抗生物質耐性遺伝子）の転写の増加をもたらすように構成し得る（図２）。これを行うために、２つの融合体を、レポーター構築物を持つ大腸菌（E.coli）細胞において発現させる。第１の融合体は、酵母Ｇａｌ４融合体のフラグメントと相互作用する酵母Ｇａｌ１１Ｐタンパク質のフラグメントに融合したジンクフィンガーアレイからなる。第２の融合体は、酵母Ｇａｌ４フラグメントとの大腸菌（E.coli）ＲＮＡポリメラーゼアルファサブユニットのＮ末端ドメインの融合体（α−Ｇａｌ４融合体）からなる。レポーター構築物は、プロモーターの上流に位置する、ジンクフィンガーアレイに対する結合部位を有して、関心対象のレポーター遺伝子の発現を推進する弱い大腸菌（E.coli）プロモーターからなる。ジンクフィンガー結合部位へのジンクフィンガー−Ｇａｌ１１Ｐ融合体の結合は、アルファ−Ｇａｌ４融合体を持するＲＮＡポリメラーゼ複合体の導きをもたらし、レポーター遺伝子の転写の増加がもたらされる。レポーター遺伝子が、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）をコードするｌａｃＺである場合、ベータ−ｇａｌ発現のレベルは、十分に確立された比色分析ＯＮＰＧに基づくアッセイを使用して容易に定量され得る（図２）。
【００８７】
このＢ２Ｈレポーターアッセイにおいて、本発明者らは、１５ｂｐコンセンサスＣＢＳ配列だけでなく、ジンクフィンガーアレイ全体（ＺＦ１〜１１）および全ＣＴＣＦ結合部位（ＣＢＳ）が、ｌａｃＺ遺伝子の最適な発現に要求されることを判定し（図３）、それはヒト細胞１０、１１における観察されたＣＴＣＦ結合要件を模倣する。転写開始部位に対するＣＢＳ部位の位置決めを最適化した後、本発明者らは、次いで、ＣＢＳに点変異を体系的に導入し、ｌａｃＺ発現に対するそれらの影響を試験した。これらの結果は、１５ｂｐコア配列の外側にあるヌクレオチドの変異が、ｌａｃＺ発現にほとんど影響を有しないことを実証した。しかしながら、それに反して、コア配列内のある特定の位置におけるある特定の配列は、結合なしまたは結合の低下をもたらした（図４）。本発明らの結果は、ヒト細胞におけるＣＴＣＦ結合部位に関するＣｈＩＰ−Ｓｅｑデータと密接に合致し、ＣＴＣＦコアにおける点変異がＣＴＣＦ結合の喪失につながる、文献における他の調査を反映する。まとめると、これらの結果は、Ｂ２ＨシステムにおけるＣＴＣＦジンクフィンガーアレイの結合活性が、ヒト細胞における無傷ＣＴＣＦタンパク質の結合活性を模倣することを強く示唆する。
【００８８】
結合部位の隣接領域のほとんどの配列変化は、結合効率にほとんど影響を有しなかったものの、ある特定の変更は、ｌａｃＺ発現の倍活性化をわずかに向上させるように見えた。それゆえ、本発明者らは、Ｂ２Ｈアッセイにおいて規定される「最善の」ヌクレオチドを持つより「最適化された」ＣＢＳが、ｌａｃＺ発現のより高い倍活性化につながり得るかどうかを試験したが、本発明者らは、元のコンセンサス配列（ＮａｋａｈａｓｈｉらのＣｈＩＰ−ｓｅｑデータに由来する）と比較していかなる高い活性も観察しなかった（図５）。
【００８９】
単一の変更したヌクレオチドを有する変異したＣＢＳに結合する操作されたＣＴＣＦバリアントの作出
次に、本発明者らは、本発明者らがＢ２Ｈシステムを使用して、野生型ＣＴＣＦジンクフィンガーアレイによって認識されない変異したＣＢＳを認識し得るＣＴＣＦジンクフィンガーアレイバリアントを選択し得るかどうかを判定しようと努めた。これを行うために、本発明者らはＢ２Ｈレポーター構築物を改変し、ｌａｃＺ遺伝子を、ベータ−ラクタマーゼをコードし、それゆえベータ−ラクタム抗生物質（例えば、カルベニシリン）に対する耐性を付与するｂｌａＣ遺伝子で置き換えた（図６）。この改変により、本発明者らは、ｂｌａＣ発現を推進する弱いプロモーターの上流に位置する変異体ＣＢＳに効率的に結合し得るＣＴＣＦジンクフィンガーアレイバリアントを発現する細胞を選択することが可能となる。次第により高くなるレベルのｂｌａＣ発現は、カルベニシリンを含有する培地および次第により高くなる濃度のベータ−ラクタマーゼ阻害剤クラブラン酸を使用することによって選択され得る。クラブラン酸の勾配は、単一の寒天プレート内で創出され得（図６；材料および方法を参照されたい）、それによって、阻害剤の様々な濃度における細胞のサンプリングが可能となる。
【００９０】
この改変されたＢ２Ｈ選択システムを用いて、本発明者らは、まず、このシステムにおいて、野生型ＣＴＣＦジンクフィンガーアレイによる結合を無効にする単一点変異を持つＣＢＳに結合し得るＣＴＣＦジンクフィンガーアレイバリアントを同定しようと努めた。初回の一連の選択実験において、本発明者らは、（上記で引用される以前に公開された共結晶構造によって示される）ＺＦ７のアルファ−ヘリックス認識ヘリックスの３番目の位置（＋３）に存在するアスパラギン酸（Ｄ）によって接触されるＣの変異を持つ変異体ＣＢＳに結合し得るＣＴＣＦジンクフィンガーアレイバリアントを同定しようと努めた。本発明者らは、ＺＦ７の＋３位置をコードするコドンが、縮重ＮＮＳコドン（式中、Ｎ＝Ｇ、Ａ、Ｃ、またはＴ、およびＳ＝ＧまたはＣ）を使用してランダム化された、ＣＴＣＦジンクフィンガーアレイバリアントのランダム化ライブラリーを創出した。本発明者らは、次いで、Ｂ２Ｈ選択システムを使用して、このライブラリーを調べて、ＺＦ  ＋３によって接触される位置にＣからＴ、ＣからＧ、およびＣからＡへの置換を持つＣＢＳを認識し得るバリアントを同定した。最初に、０〜０．４５ｕｇ／ｍｌに及ぶクラブラン酸勾配を有する低ストリンジェンシーなプレートに対して選択を実施し、生存コロニーを回収し、バリアントジンクフィンガーアレイをコードするプラスミドを精製した。バリアントのこの選択された部分集合を、次いで、カルベニシリンおよび０〜４ｕｇ／ｍｌに及ぶクラブラン酸の勾配を有するプレートでのＢ２Ｈシステムにおける高ストリンジェンシーな選択に供した。バリアントジンクフィンガーアレイをコードするプラスミドを、最も高い濃度のクラブラン酸を有する勾配プレートの末端で成長したコロニーから精製し、シーケンシングし、次いでベータ−ガラクトシダーゼアッセイによってＢ２Ｈレポーターアッセイにおいて試験した。
【００９１】
図７Ａ〜Ｃに見られ得るように、本発明者らは、元のコンセンサスＣＢＳと比較して、変異したＣＢＳに対する優先的な結合活性（Ｂ２Ｈレポーターアッセイによって判断される）を示すＣＴＣＦジンクフィンガーアレイバリアントを獲得した。これらのクローンは、ＺＦ７の＋３位置における特定のアミノ酸の選択も示し、Ｔ部位に対するＣに関してはトレオニン（Ｔ）が選択され、Ａ部位に対するＣに関してはアスパラギン（Ｎ）が選択され、Ｇ部位に対するＣに関してはヒスチジン（Ｈ）が選択された。これらのアミノ酸の正体は、Ｚｉｆ２６８ジンクフィンガーアレイを使用した以前のジンクフィンガー選択に基づき、変異体ヌクレオチドを認識することが予想され得るものと一致する。しかしながら、本発明者らは、変更した結合活性を有する変異体の選択に成功したものの、ほとんどの場合において、変異したＣＢＳに対するバリアントの結合活性は、コンセンサスＣＢＳに対する野生型ＣＴＣＦジンクフィンガーアレイのものほど強くなかった（Ｂ２Ｈレポーターアッセイによって判断される）（図７Ａ〜Ｃ）。
【００９２】
Ｚｉｆ２６８ジンクフィンガーアレイのＤＮＡ結合特異性を再操作することと合わせた本発明者らの以前の経験に基づき、本発明者らは、より強い結合バリアントを獲得することは、ＺＦ７における＋３位置に隣接するアミノ酸の変更を要求し得ると仮説を立てた。この考えを試験するために、本発明者らは、本発明者らが縮重ＶＮＳコドン（式中、Ｖ＝Ｇ、Ａ、またはＣ）を使用してＺＦ７の位置＋２、＋３、＋５、および＋６をランダム化した、バリアントのより大きなライブラリーを創出した。ＺＦ７の位置＋４は、それがＺＦドメインの内部コアに面し、ＤＮＡと接触しないと予想されるため変更されなかった。本発明者らは、次いで、このライブラリーを使用して上で記載されるＢ２Ｈ選択を実施して、野生型ＣＴＣＦジンクフィンガーアレイにおけるＺＦ７  ＋３によって接触される位置にＣからＧへの変異を有する変異体ＣＢＳを同定し得るバリアントを同定した。これらの選択により、変異体ＣＢＳに対するより強い結合活性を示しかつ選択されたアミノ酸の同一性においてある程度のコンセンサスを示すバリアントが同定された（図８）。
【００９３】
この成功に基づき、本発明者らは、ＺＦ７、ＺＦ６、ＺＦ５、ＺＦ４、およびＺＦ３に対する位置−１、＋１、＋２、および＋３または＋２、＋３、＋５、および＋６をランダム化した付加的なランダム化ライブラリーを作出した。本発明者らは、次いで、ライブラリーにおけるランダム化された残基によって接触されると予想される位置にヌクレオチド置換を持する様々な合致した変異体ＣＢＳに対して、これらのライブラリーを使用して上で記載される選択を実施した（図９〜１６）。高ストリンジェンシーな選択プレートの最も選択的な末端における個々の生存コロニーからのバリアントの分析は、これらの選択の多くが、関心対象の変異体ＣＢＳに対する高い活性を有するバリアントを生み出すことを示し、およびこれらのクローンのシーケンシングは、アミノ酸配列において概してある程度のコンセンサスがあることを示し、選択が上手く生じていることを示唆した（図９〜１６）。
【００９４】
複数の変更したヌクレオチドを有する変異したＣＢＳに結合する操作されたＣＴＣＦバリアントの作出
単一の変更したヌクレオチド位置を有するＣＢＳを認識し得るＣＴＣＦジンクフィンガーバリアントを同定することに成功したため、本発明者らは、次に、複数の変異したヌクレオチドを持つＣＢＳを認識し得るバリアントを同定しようと努めた。これを行うために、本発明者らは、個々の変異を持つ、ＣＢＳ内の異なる「サブサイト」に結合するようにそれぞれが選択されたＺＦバリアントを組み換えようと努めた。しかしながら、マルチフィンガーアレイにおけるＺＦの間に存在する周知の前後関係依存的効果が理由で、本発明者らは、本発明者らが、任意の所与の変更したサブサイトに対して、選択されたＺＦバリアントのプール（単一のバリアントではなく）を一緒に組み換えて、複数の変異を持つＣＢＳを認識するように一緒になって最善に働く変異したＺＦの組み合わせを同定するストラテジーに取り組んだ。様々な変異したＣＢＳサブサイトに対するＺＦバリアントのプールを単離するために、本発明者らは、単一変異を持つＣＢＳ部位に関して本発明者らが実施した高ストリンジェンシーな選択プレートから残りすべてのクローンを回収した（図９〜１６に描写される）。これらのプールにおける様々な選択されたクローンのディープシーケンシングは、予想どおりに各選択内にある程度のコンセンサスを有する多様な配列を生み出した（表１）。
【００９５】
本発明者らは、次いで、ＺＦ４、５、６、および７に対するバリアントのプールを組み換えて、これらの位置に対する様々な変更した認識ヘリックスを持するＣＴＣＦジンクフィンガーアレイを創出し、次いで、ＺＦ４、５、６、および７に対するサブサイトに様々なヌクレオチド置換の組み合わせを持つ５つの異なる変異したＣＢＳに対してＢ２Ｈ選択（材料および方法を参照されたい）を実施した（図１７〜２１）。これらの選択からのクローンのシーケンシングは、各フィンガーに対するある特定の認識ヘリックス配列が複数回選択されることを示し、選択により、一緒に上手く働く組み合わせが同定されていることを示唆した。重要なことには、多重に変異したＣＢＳの５つすべてに関して、同定されたＣＴＣＦジンクフィンガーアレイバリアントのいくつかは、Ｂ２Ｈアッセイによって判断されるように、それらが選択された部位に対して良好な結合活性を示した（図１７〜２１）。加えて、５つの変異体ＣＢＳ部位のうちの４つに関して、本発明者らは、変異体ＣＢＳに結合するだけでなく、元の変異していない（コンセンサス）ＣＢＳに結合することもできないバリアントを同定することができた。ゆえに、本明細書で記載される本発明者らの手法を使用して、本発明者らは、元の野生型ＣＴＣＦジンクフィンガーアレイによって効率的に結合されない多重に変異したＣＢＳを認識し得るＣＴＣＦ  ＺＦアレイバリアントを同定することができると本発明者らは結論付けた。
【００９６】
ヒト細胞における変異体および野生型ＣＢＳへの操作されたＣＴＣＦバリアントの結合特異性
モチーフにわたる複数の配列変化を有するＣＢＳを認識し得る操作されたバリアントに成功したため、本発明者らは、次に、バリアントが、ヒト細胞背景においてこれらの同じ変異体結合部位に結合し得、一方で野生型ＣＢＳに結合しないかどうかを調べることを望んだ。まず、本発明者らが、結合するようにＣＴＣＦバリアントを選択していた５つの変異した結合部位のそれぞれに対する１５ｂｐコア配列と合致する、ヒトゲノムにおける部位の集合体を本発明者らは見出した（図１７〜２１に記載される）。本発明者らは、次いで、５つの変異した結合部位のうちの１つ（図２０に描写される配列）と合致する配列を有する２つのバリアント結合部位ならびに公知のＣＢＳに注目して、Ｂ２Ｈレポーターアッセイが示唆するであろうように、内因性ＣＴＣＦが野生型ＣＢＳに結合し得、バリアント結合部位には結合しないかどうかを判定した（図２０）。赤白血病細胞株であるヒトＫ５６２を回収し、ＣＴＣＦ特異的抗体を使用したＣｈＩＰ−ｑＰＣＲによって分析してＣＴＣＦ−ＤＮＡ結合を検出した。野生型ＣＴＣＦは、変異したＣＢＳと合致する２つの異なる標的部位への検出可能な結合を示さなかったが、野生型ＣＴＣＦ結合部位の大幅な富化を示し、Ｂ２Ｈレポーターアッセイの結果を支持した（図２２）。次に、本発明者らは、Ｋ５６２におけるプラスミドトランスフェクションによって送達された、過剰発現した外因性の３×ＨＡタグ付けされた野生型ＣＴＣＦが、内因性ＣＴＣＦに関して観察されたものと同じ結合プロファイルを有するかどうかを確かめることを望んだ。野生型Ｋ５６２に３×ＨＡ−ＣＴＣＦをトランスフェクトし、７２時間後に回収し、ＨＡ特異的抗体を用いたＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ分析のために処理した。外因性の野生型３×ＨＡ−ＣＴＣＦは、内因性の野生型ＣＴＣＦと同じく、野生型ＣＢＳに結合し得、バリアント結合部位には結合し得ず、プラスミド送達によるＣＴＣＦの過剰発現が、生物学的に関連した挙動を反映することを示唆した（図２３Ａ）。これらの結果に基づき、本発明者らは、次に、バリアントＣＴＣＦが、ヒトゲノム原産のバリアント結合部位に結合する能力を検討した。選定されたバリアントは、Ｂ２Ｈアッセイにおける選択から取り出されたものであり、Ｂ２Ｈレポーターアッセイによって、図２２〜２３Ｂにおいて使用されたバリアント部位１および２と同じ配列を有するバリアント部位に結合することが示された。Ｋ５６２に３×ＨＡタグ付けされたＣＴＣＦバリアントをトランスフェクトし、以前と同じ部位をＣｈＩＰ−ｑＰＣＲによって結合活性について検討した。バリアント特異的ＨＡ富化は、バリアント結合部位に存在しかつ野生型部位に欠如しており、本発明者らが、天然ＣＢＳに結合することなく、たった３つのヌクレオチド変化を有する変異体ＣＢＳに特異的に結合し得るバリアントを考案することに成功したことを示唆した（図２３Ｂ）。
【００９７】
ループ形成を介した操作されたＣＴＣＦバリアントによる遺伝子発現調節
ＣＴＣＦは、ゲノムのＣＴＣＦ−コヒーシン媒介性ループ形成により遺伝子発現を変更する能力を有する。本発明者らは、バリアントＣＴＣＦが、内因性バリアント結合部位に結合した場合に、野生型ＣＴＣＦの遺伝子調節能を再生し得るかどうかを確かめることに好奇心を持った。遺伝子発現変化を調べるために、本発明者らは、バリアント結合部位の１Ｍｂ領域内の遺伝子に重点を置いた。バリアント部位１．１および１．２に対して１Ｍｂ領域内に１１個の遺伝子が同定され、バリアント部位２．１および２．２に対して別の１０個の遺伝子が同定された。バリアント部位１およびバリアント部位２に結合する能力を有する、ＧＦＰに融合したバリアントＣＴＣＦをＫ５６２にヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクションの７２時間後、ＲＮＡをＧＦＰ＋細胞から単離し、遺伝子発現レベルを、野生型ＣＴＣＦ対照をヌクレオフェクトされたＫ５６２から抽出されたＲＮＡと比較した。バリアント部位１．１および１．２に対する１１個の遺伝子のうち、６個の遺伝子が、野生型ＣＴＣＦ対照をヌクレオフェクトされた細胞（ＪＪ３８８）と比べて遺伝子発現の変化を示した（図２４Ａ）。バリアント部位２．１および２．２に対して同定された１０個の遺伝子のうちの２個が、野生型対照と比べて変更した遺伝子発現レベルを有した（図２４Ｂ）。このデータは、バリアントＣＴＣＦタンパク質がヒト細胞においてそれらの標的配列に結合するだけでなく、それが、おそらくループまたはサブＴＡＤの形成により遺伝子発現を調節する天然ＣＴＣＦの生物学的役割を再生もすることを示唆する。
【００９８】
次に、本発明者らは、ＣＴＣＦバリアントが、エンハンサー−プロモーターループを創出する公知のＣＴＣＦ結合部位で野生型ＣＴＣＦの生物学的機能を再現し得ることを実証することを望んだ。ＭＹＣ発現は、ＭＹＣの転写開始部位（ＴＳＳ）の約２ｋｂ上流にあるＣＴＣＦ結合部位と、ＭＹＣ  ＴＳＳ１４の約１ｋｂ下流にあるＣＴＣＦ結合部位との間で形成されるループによって維持される。ＣＴＣＦが両方の部位に結合した場合、コヒーシンが、ＣＴＣＦのコヒーシン相互作用ドメインを介して両方のＣＴＣＦを連結し、ＭＹＣの発現を維持するループが創出される。ＣＴＣＦ結合部位の一方または両方が分断された場合、ＣＴＣＦ媒介性ループは失われ、ＭＹＣ発現１４の低下がある。ＭＹＣ  ＴＳＳの約２ｋｂ上流にあるＣＴＣＦ結合部位に５つの異なるバリアント結合部位配列（図２５に規定される）を含有する５つの細胞株を作出した。これを、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターを介して外因性ＭＹＣを発現するレンチウイルス構築物を形質導入されたＫ５６２バックグラウンド（ｅｘｏＭＹＣ．Ｋ５６２）において行って、内因性ＭＹＣ発現の低下が引き起こし得る任意の低下した細胞適応を補完した。ＣＴＣＦ結合部位への点変異がなされた付加的な６つの細胞株を作出し、それは、Ｂ２Ｈレポーターアッセイからの結果によって示されるように野生型ＣＴＣＦ結合に影響を有しないはずである。バリアント結合部位に対してホモ接合性のクローン細胞株からＲＮＡを単離し、内因性ＭＹＣ遺伝子発現レベルを逆転写酵素リアルタイムｑＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）によってアッセイした。バリアントＣＴＣＦ結合部位を有する単離された細胞株のそれぞれは、低下したレベルのＭＹＣ発現を示し、ＣＴＣＦ媒介性ループが分断されることを示唆した（図２５）。
【００９９】
この結果に基づき、本発明者らは、これらの改変された細胞株におけるバリアントＣＴＣＦの発現が、操作された部位に結合し得およびＭＹＣ発現を回復させ得るかどうかを確かめることを望んだ。ＨＡタグ付けされた野生型ＣＴＣＦおよびＨＡタグ付けされたＣＴＣＦバリアントを、それらの合致するバリアント結合部位を含有する細胞株において発現させた。Ｇ３バリアント結合部位に結合するように選択されたバリアントをＧ３＿３細胞株において、Ａ３バリアントをＡ３＿４細胞株において発現させた、等。ＨＡタグ付けされた野生型ＣＴＣＦも、結合についておよび内因性ＭＹＣ発現の回復について、バリアント細胞株のそれぞれにおいて試験した。ｅｘｏＭＹＣ．Ｋ５６２における内因性ＭＹＣ発現のレベルは、ＭＹＣ  ＴＳＳの上流にあるＣＴＣＦ結合部位に変更がないことから野生型対照として働いた。操作された細胞株において発現したＣＴＣＦバリアントは、内因性ＭＹＣ発現を回復させ、一方でこれらの細胞株における野生型ＣＴＣＦの発現は、ＭＹＣ発現を回復させ得なかった（図２６Ａ〜２９）。同じサンプルを、野生型ＣＴＣＦまたはバリアントＣＴＣＦによるバリアント結合部位の占有率について、ＣＴＣＦまたはＨＡ抗体を用いてＣＴＣＦ結合ＤＮＡフラグメントを富化するＣｈＩＰ−ｑＰＣＲによって分析した。野生型ＣＴＣＦは、バリアント結合部位の低下した占有率を有し、ＭＹＣ発現の継続的低下と一致し、一方でバリアントＣＴＣＦタンパク質は、それらが選択されたバリアント部位に結合し得、ならびにＭＹＣ発現をレスキューし得た（図２６〜２９）。まとめると、これらのデータは、本発明者らが、新規な配列に結合し得、かつ依然としてコヒーシンと相互作用して、遺伝子発現プロファイルを維持するループを形成するＣＴＣＦバリアントを考案したことを示唆する。
【０１００】
表
種々のＣＴＣＦ結合部位に関して選択されたバリアントのアミノ酸配列。すべてのアミノ酸配列は、ＮからＣ末に挙げられている。選択の最も高いストリンジェンシーで成長するコロニーを削り取り、プールし、ジンクフィンガーをコードするプラスミドを単離し、ディープシーケンシングした。読み取りの数は、三つ組で実施された選択からプールされた集団において、バリアントがどのくらい顕著であったかを反映する。
【０１０１】
【表１−１】
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【０１０２】
【表１−２】
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【０１０３】
【表１−３】
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【０１０４】
【表２−１】
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【０１０５】
【表２−２】
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【０１０６】
【表３】
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【０１０７】
【表４】
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【０１０８】
【表５】
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【０１０９】
【表６−１】
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【０１１０】
【表６−２】
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【０１１１】
【表７−１】
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【０１１２】
【表７−２】
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【０１１３】
【表８】
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【０１１４】
【表９−１】
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【０１１５】
【表９−２】
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【０１１６】
【表９−３】
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【０１１７】
【表９−４】
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【０１１８】
【表９−５】
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【０１１９】
【表１０−１】
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【０１２０】
【表１０−２】
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【０１２１】
【表１１−１】
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【０１２２】
【表１１−２】
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【０１２３】
【表１２−１】
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【０１２４】
【表１２−２】
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【０１２５】
【表１３−１】
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【０１２６】
【表１３−２】
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【０１２７】
【表１３−３】
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【０１２８】
【表１３−４】
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【０１２９】
【表１４−１】
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【０１３０】
【表１４−２】
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【０１３１】
【表１４−３】
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【０１３２】
【表１５−１】
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【０１３３】
【表１５−２】
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【０１３４】
【表１５−３】
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【０１３５】
【表１５−４】
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【０１３６】
【表１６−１】
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【０１３７】
【表１６−２】
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【０１３８】
【表１６−３】
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【０１３９】
【表１６−４】
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【０１４０】
【表１６−５】
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【０１４１】
【表１７−１】
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【０１４２】
【表１７−２】
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【０１４３】
【表１７−３】
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【０１４４】
【表１７−４】
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【０１４５】
【表１７−５】
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【０１４６】
【表１７−６】
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【０１４７】
【表１８−１】
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【０１４８】
【表１８−２】
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【０１４９】
【表１８−３】
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【０１５０】
【表１８−４】
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【０１５１】
【表１９−１】
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【０１５２】
【表１９−２】
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【０１５３】
【表１９−３】
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【０１５４】
【表１９−４】
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【０１５５】
【表１９−５】
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【０１５６】
【表２０−１】
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【０１５７】
【表２０−２】
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【０１５８】
【表２０−３】
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【０１５９】
【表２０−４】
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【０１６０】
【表２１−１】
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【０１６１】
【表２１−２】
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【０１６２】
【表２１−３】
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【０１６３】
【表２１−４】
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【０１６４】
【表２１−５】
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【０１６５】
【表２１−６】
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【０１６６】
【表２１−７】
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【０１６７】
【表２１−８】
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【０１６８】
【表２１−９】
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【０１６９】
【表２１−１０】
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【０１７０】
【表２１−１１】
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【０１７１】
【表２１−１２】
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【０１７２】
【表２２−１】
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【０１７３】
【表２２−２】
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【０１７４】
【表２２−３】
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【０１７５】
【表２３−１】
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【０１７６】
【表２３−２】
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【０１７７】
【表２３−３】
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【０１７８】
【表２４−１】
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【０１７９】
【表２４−２】
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【０１８０】
【表２４−３】
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【０１８１】
【表２４−４】
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【０１８２】
【表２５】
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【０１８３】
【表２６】
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【０１８４】
【表２７】
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【０１８５】
参考文献
【０１８６】
【表２８】
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【０１８７】
他の実施形態
本発明は、その詳細な説明と併せて記載されているが、前述の説明は例示することを意図されるものであり、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を限定するものではない。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲内にある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
2021523719.tif 000095
【図７−２】
2021523719.tif 000096
【図８】
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【図９−１】
2021523719.tif 000098
【図９−２】
2021523719.tif 000099
【図９−３】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
2021523719.tif 000110
【図１３−３】
2021523719.tif 000111
【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１７】
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【図１８】
2021523719.tif 000122
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２５】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２８】
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【図２９】
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【国際調査報告】
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2021523719.tif 000139
2021523719.tif 000140
2021523719.tif 000141
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