(57)【要約】  化合物５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾール、前記化合物の製造のための方法、前記化合物を含む局所用組成物、および、創傷部位として病原性細菌によって引き起こされた感染の、局所的処置におけるその使用、が提供される。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾール、またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項２】
５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾール、またはその薬学的に許容可能な塩、および、皮膚科学的に許容可能な担体、を含む医薬組成物。
【請求項３】
薬物としての、請求項２に記載の組成物の使用。
【請求項４】
前記使用が糖尿病性潰瘍内の病原性細菌の根絶のために行われる、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記使用が糖尿病性足感染の処置である、請求項３に記載の使用。
【請求項６】
前記使用が蜂巣炎の処置である、請求項３に記載の使用。
【請求項７】
処置を必要とする個体における糖尿病性潰瘍内の病原性細菌を根絶させる方法であって、前記方法が、有効な量の５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾールを含む組成物を、潰瘍に適用する工程を含む、方法。
【請求項８】
前記病原性細菌が、腸球菌スパイク、バンコマイシン耐性腸球菌ＡＴＣＣ７００２１１およびＡＴＣＣ５１２９９を含むエンテロコッカス−フェカーリス、かん菌スパイク、セレウス菌、ブドウ球菌スパイク、表皮ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌株ＮＲＳ７（バンコマイシン中間体）、ＮＲＳ２（バンコマイシン中間体）、ＡＴＣＣ４３３００（耐メチシリン−ＭＲＳＡ）、ＮＲＳ１、ＮＲＳ３８２（ＵＳＡ１００伝染性株）、ＮＲＳ３８３（ＵＳＡ２００伝染性株）、ＮＲＳ３８４（ＵＳＡ３００伝染性株）、ＭＲＳＡ臨床分離株、群集獲得のＭＲＳＡ臨床分離株および多剤耐性（ＭＤＲ）のシプロフロキサシン、ペニシリン、エリスロマイシンおよび／または耐ムピロシン臨床分離株を含む臨床分離株、連鎖球菌スパイク、ストレプトコッカスアガラクティエ、肺炎球菌およびクロストリジウム種、から成る群から選ばれる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
化合物が、７日−１４日の間、または、創傷閉鎖まで、毎日一回または二回適用される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
個体における糖尿病性足感染の処置の方法であって、前記個体が感染の部位を有し、前記方法が、有効な量の５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾールを含む組成物を、前記部位に適用する工程を含む、方法。
【請求項１１】
前記病原性細菌が、腸球菌スパイク、バンコマイシン耐性腸球菌ＡＴＣＣ７００２１１およびＡＴＣＣ５１２９９を含むエンテロコッカス−フェカーリス、かん菌スパイク、セレウス菌、ブドウ球菌スパイク、表皮ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌株、ＮＲＳ７（バンコマイシン中間体）、ＮＲＳ２（バンコマイシン中間体）、ＡＴＣＣ４３３００（耐メチシリン−ＭＲＳＡ）、ＮＲＳ１、ＮＲＳ３８２（ＵＳＡ１００伝染性株）、ＮＲＳ３８３（ＵＳＡ２００伝染性株）、ＮＲＳ３８４（ＵＳＡ３００伝染性株）、ＭＲＳＡ臨床分離株、群集獲得のＭＲＳＡ臨床分離株および多剤耐性（ＭＤＲ）のシプロフロキサシン、ペニシリン、エリスロマイシンおよび／または耐ムピロシン臨床分離株を含む臨床分離株、連鎖球菌スパイク、ストレプトコッカスアガラクティエ、肺炎球菌およびクロストリジウム種、から成る群から選ばれる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
化合物が、７日−１４日の間、または、創傷閉鎖まで、毎日一回または二回適用される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
個体における蜂巣炎の処置の方法であって、前記個体が感染の部位を有し、前記方法が、有効な量の５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾールを含む組成物を、前記部位に適用する工程を含む、方法。
【請求項１４】
前記病原性細菌が、腸球菌スパイク、バンコマイシン耐性腸球菌ＡＴＣＣ７００２１１およびＡＴＣＣ５１２９９を含むエンテロコッカス−フェカーリス、かん菌スパイク、セレウス菌、ブドウ球菌スパイク、表皮ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌株、ＮＲＳ７（バンコマイシン中間体）、ＮＲＳ２（バンコマイシン中間体）、ＡＴＣＣ４３３００（耐メチシリン−ＭＲＳＡ）、ＮＲＳ１、ＮＲＳ３８２（ＵＳＡ１００伝染性株）、ＮＲＳ３８３（ＵＳＡ２００伝染性株）、ＮＲＳ３８４（ＵＳＡ３００伝染性株）、ＭＲＳＡ臨床分離株、群集獲得のＭＲＳＡ臨床分離株および多剤耐性（ＭＤＲ）のシプロフロキサシン、ペニシリン、エリスロマイシンおよび／または耐ムピロシン臨床分離株を含む臨床分離株、連鎖球菌スパイク、ストレプトコッカスアガラクティエ、肺炎球菌およびクロストリジウム種、から成る群から選ばれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
化合物が、７日−１４日の間、または、創傷閉鎖まで、毎日一回または二回適用される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾール、またはその薬学的に許容可能な塩、の製造の方法であって、前記方法が、パラジウムクロスカップリング条件下で、Ｎ−保護５−ブロモテトラゾールの混合物を、チオフェン−３−イルボロン酸と反応させる工程を含む、方法。求項１５に記載のセンサシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１７年１２月１１日に出願され、「感染の局所処置」と題する、米国仮特許出願第６２／５９７，１５９の利益を主張し、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、世界的に４億１５００万人以上の人に影響を与える重大な疾患であり、その発生は、２０３５年までに６億４２００万以上に上昇すると予想されている（国際糖尿病連合、２０１６年）。糖尿病患者は、末梢血流量の低下を含む、多数の深刻な合併症を示し得る。四肢への血流量の低下は、末梢神経障害、つまり、末梢神経の変性をもたらし得る。末梢神経障害は、糖尿病患者の最大５０％に影響し、ピリピリ感、しびれ感、および、四肢の疼痛を検知する能力の喪失という特徴を示し、その結果、糖尿病性潰瘍（いわゆる「糖尿病潰瘍感染」または「ＤＵＩ」）に進行する感染をもたらし、それは、しばしば足に現れる（「ＤＦＩ」）。毎年、糖尿病患者のおよそ３％が糖尿病性潰瘍を発症し、その数は１１５０万人以上になる。糖尿病性潰瘍患者のうちの有意な割合が、皮膚の深層および最終的には骨の中へと到達する深刻な感染症を発症し、しばしば、四肢の一部または全部を切断する結果となる。現在利用可能な処置の選択肢が不十分である結果として、多くのそのような感染は重症化する。
【０００３】
ＤＵＩのための現在の抗生物質処置は、ＤＦＩ段階２からＤＦＩ段階３への移行は最大５０％であり、その成功は限定的である。（すべての糖尿病足感染症の最大５０％に相当する）最も重篤な症例は、足の一または全部の切断を必要とし、実際、ＤＦＩは、すべての糖尿病患者入院の２５％を占める。既存の経口または注射可能な抗生物質は、糖尿病性潰瘍の中およびその周辺の血管系が貧弱であり、そのような抗生物質が感染の部位に到達する能力を低下させることから、ＤＦＩを処置するには有効ではなかった。
【０００４】
局所用抗生物質は、それらが感染の部位に直接に適用され、通常の血管系が無い場合ですら細菌を根絶することができるので、より有効な処置を提供する見込みがある。残念ながら、現在利用可能な局所用抗生物質は、それらが皮膚の深層へと入り込むことを阻むそれらに特有の物理化学的特性により、一般に有効ではない。さらに、適切な治療を計画するという課題に加え、多剤耐性（ＭＤＲ）がＤＦＩにおいて現れて来ている。
【０００５】
ＭＤＲ細菌を標的とする、新しい抗生物質を開発するための最近の戦略は、主に、既知のターゲットに対する既存の抗生物質の、新しい世代を作り出すことに集中している。しかしながら、根本的なメカニズムは既に整っているので、しばしば耐性が急速に生じる。新しいターゲットに対して考案される、現在使用されていないクラスの抗生物質は、ＭＤＲ細菌感染症に有効であるとのより大きな見込みを有するため、必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
局所投与のために調整された生理化学的な特性を有し、かつ、抗菌性治療に現在使用されていない、細菌ターゲットを阻害する化合物が提供される。これらの化合物は、類似のクラスの抗菌化合物と比較しても、予想外に良い、局所投与における細菌のスペクトルおよび有効性を実証する。
【０００７】
一般的に、ある態様において、５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾール、または、その薬学的に許容可能な塩、が提供される。
【０００８】
一般的に、ある態様において、５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾール、または、その薬学的に許容可能な塩、および、皮膚科学的に許容可能な担体、が提供される。
【０００９】
一般的に、ある態様において、特に糖尿病性潰瘍内の病原性細菌を根絶するための、または、糖尿病性足感染の処置のための、または蜂巣炎のための薬物として、薬物としての上記の組成物の使用が提供される。
【００１０】
一般的に、ある態様において、糖尿病性潰瘍内の病原性細菌を根絶する方法が提供され、その方法は、上記の組成物の１つの有効な量を、そのような処置を必要とする個体の潰瘍に適用する工程を含む。
【００１１】
一般的に、ある態様において、感染の部位にそのような処置を必要とする個体の糖尿病性足感染の処置の方法が提供され、その方法は、上記の組成物の１つの有効な量を、感染の部位に適用する工程を含む。
【００１２】
一般的に、ある態様において、そのような処置を必要とする個体の感染の部位における蜂巣炎の措置の方法が提供され、その方法は、その部位に上記の組成物の１つの有効な量を適用する工程を含む。
【００１３】
一般的に、ある態様において、５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾール、またはその薬学的に許容可能な塩、の製造の方法が提供され、その方法は、パラジウムクロスカップリング条件下で、Ｎ−保護５−ブロモテトラゾールを、チオフェン−３−イルボロン酸と反応させる工程を含む。
【００１４】
この後に明らかになる本発明の既述のおよびその他の利点と特徴と共に、本発明の性質は、本発明について以下の詳述および添付の特許範囲の請求を参照することにより、より明確に理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ウサギの、虚血耳モデルにおける、経時的な百分率創傷縮小を示す。黒い線（一番下）は１％のＤＭＳＯ対照群を示す；赤い線（中間）は２％のムピロシン軟膏群を示す；紫の点線（一番上）は、１％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）群の、２％の５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾール（ｗ／ｖ）群を示す。
【図２Ａ】ＭＲＳＡを皮内注射され、７日間処置された、ＳＫＨ１マウス（Ｎ＝５／群）の、対数（組織の重量あたりのコロニー形成単位）を示す。赤い棒（左）は対照群である；青い棒（中間）は比較ムピロシン処置群である；緑の棒（右）は、５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾール処置群である。
【図２Ｂ】ＭＲＳＡを皮内注射され、７日間処置された、ＳＫＨ１マウス（Ｎ＝５／群）の、平方ミリメートルで表される病変面積を示す。濃い青色の線（一番上）は対照群である；薄い青色（一番下）は、５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾール処置群である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
脂質合成は、多くの工程が細菌に特有であり、細菌のあらゆる属にわたって高度に保存されるので、抗菌薬発見のための魅力的なターゲットである。後に脂質および他の重要な高分子の合成に使用するために、アシル担体蛋白質の活性化を促進する、ＡｃｐＳは、１つのそのようなターゲットである。本明細書では、広範囲の、臨床的に関連するグラム陽性菌に対して有効であるＡｃｐＳ阻害剤、つまり、５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾール、が開示される。その特有の作用機序により、５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾールは、ＭＲＳＡおよびＶＲＥの、重要なＭＤＲ臨床分離株に対する、高レベルの効能を示す。５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾールを用いる、動物の局所的処置は、ＭＲＳＡ感染症を根絶し、治癒を改善する。したがって、５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾールは、局所的感染症のための薬物としての価値を有する。
【００１７】
特に、本明細書に議論されるように、特有の作用機序とは、化合物が実施例で議論されるようなＡＣＰシンターゼ阻害剤であるという機序である。加えて、化合物は、皮膚を通り抜けて全身の隙間に顕著に侵入することなく、皮膚層に特に良く浸透することが示されている。当業者に理解されるであろう通り、このことは有意な利点である、というのは、以下に説明されるように、この薬剤は（皮膚中で）細菌が存在している場所へ提供されるが、身体の中に入ることは期待されていないためである。
【００１８】
本明細書で言及される、すべての特許、特許出願、および他の公報は、それらの全体が引用によって本明細書に組み込まれる。
【００１９】
ある実施形態では、５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾール、またはその薬学的に許容可能な塩、が提供される。
【００２０】
ある実施形態では、５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾール、またはその薬学的に許容可能な塩、および、皮膚科学的に許容可能な担体を含む医薬組成物、が提供される。いくつかの実施形態では、皮膚科学的に容認可能な担体はクリームであり、５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾール、またはその薬学的に許容可能な塩、は、例えば２％または１％といった、約０．５−５％の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、皮膚科学的に容認可能な担体は、Ｇｌａｘａｌ ｂａｓｅである。
【００２１】
ある実施形態では、上に提供される組成物の１つの、薬物としての使用が提供される。いくつかの実施例では、薬物は、糖尿病性潰瘍内の病原性細菌を根絶させるためのものである。いくつかの実施例では、薬物は、糖尿病性足感染の処置のためのものである。いくつかの実施例では、薬物は、蜂巣炎の処置のためのものである。
【００２２】
病原性細菌の例は腸球菌スパイク、バンコマイシン耐性腸球菌ＡＴＣＣ７００２１１およびＡＴＣＣ５１２９９を含むエンテロコッカス−フェカーリス、バチルス菌スパイク、セレウス菌、ブドウ球菌スパイク、表皮ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌株ＮＲＳ７（バンコマイシン中間体）、ＮＲＳ２（バンコマイシン中間体）、ＡＴＣＣ４３３００（耐メチシリン−ＭＲＳＡ）、ＮＲＳ１、ＮＲＳ３８２（ＵＳＡ１００伝染性株）、ＮＲＳ３８３（ＵＳＡ２００伝染性株）、ＮＲＳ３８４（ＵＳＡ３００伝染性株）、ＭＲＳＡ臨床分離株群集を獲得したＭＲＳＡ臨床分離株、そして多剤耐性の（ＭＤＲ）シプロフロキサシン、ペニシリン、エリスロマイシンおよび／またはムピロシンの抵抗性の臨床分離株を含む臨床分離株、連鎖球菌スパイク、ストレプトコッカスアガラクティエ、肺炎球菌およびクロストリジウム種を含むが、それらには限定されない。
【００２３】
ある実施形態では、糖尿病性潰瘍内の病原性細菌を根絶するための方法が提供され、その方法は、有効な量の上記に提供される組成物の１つを、そのような処置を必要とする個体の潰瘍に適用する工程を含む。
【００２４】
ある実施形態では、感染の部位における糖尿病性足感染の処置の方法が提供され、その方法は、有効な量の上記に提供される組成物の１つを、そのような処置を必要とする個体の感染の部位に適用する工程を含む。
【００２５】
ある実施形態では、感染の部位における蜂巣炎の処置の方法が提供され、その方法は、有効な量の上記に提供される組成物の１つを、そのような処置を必要とする個体の感染の部位に適用する工程を含む。
【００２６】
当業者によって理解されるであろうとおり、「そのような処置を必要とする個体」は、病原性細菌を含む糖尿病性潰瘍、糖尿病性足感染および／または蜂巣炎に罹患しているか、それらの疾病であると診断されているか、または、それらの疾病を有すると疑いのある個体を指す。
【００２７】
当業者によって理解されるであろうとおり、「有効な量」は、病原性細菌を含む糖尿病性潰瘍、糖尿病性足感染および／または蜂巣炎に関連する、少なくとも１つの症状の重症度を低下させるのに十分な量を指す。これらの疾患の症状の例は、当業者には周知である、および／または、様々な参照元を参照することにより、容易に特定できる。例えば、症状の一部として、炎症および化膿、潰瘍性疾病の継続（治癒しない、または治癒が遅い）、潰瘍の面積または深度の拡大、が挙げられる。
【００２８】
いくつかの実施形態において、「有効な量」は、感染症を除去するのに有効な量、または、骨髄炎あるいは下肢切断などの合併症の危険を低下させるのに有効な量である。
【００２９】
使用に際し、化合物は定期的に、例えば毎日一回または二回、適用されるべきである。一般的な適用は７日間から１４日間で、例えば、７日間、１０日間または１４日間、または創傷が閉鎖するまでである。
【００３０】
ある実施形態では、５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾール、またはその薬学的に許容可能な塩、の製造の方法が提供され、その方法は、パラジウムクロスカップリング条件下で、Ｎ−保護５−ブロモテトラゾールの混合物を、チオフェン−３−イルボロン酸と反応させる工程を含む。いくつかの実施形態では、窒素保護基はベンジルである。いくつかの実施形態では、パラジウムクロスカップリグ条件は、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４および炭酸ナトリウムを含む。
【００３１】
上に提供されるような処置の方法または使用は、好ましくは、それを必要とする哺乳動物、より好ましくはヒトに、適用される。処置の方法または使用は、好ましくは、適用可能な潰瘍または感染の箇所の中、その上、またはその周りに、局所的に投与される。
【００３２】
定義
【００３３】
特に定めの無い限り、本明細書に使用されるような用語は、下に詳述されるように、次の定義を指す。
【００３４】
化合物の「投与」または化合物を「投与すること」の用語は、適用可能なものとして、予防、処置、または診断に有効な量で、その個体の身体の中または上に、導入され得る形態で、５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾール、またはその薬学的に許容可能な塩を個体に提供する；および、具体的には薬学的に許容可能な担体、より具体的には皮膚科学的に容認可能な担体を含む局所的な投与形態、で提供することを、意味するものと理解されるべきである。
【００３５】
いくつかの実施形態では、局所的な剤形は、液体、固体または半固体である。いくつかの実施形態では、局所的な剤形は、クリーム、エマルジョン、軟膏、ペーストまたはゲルとして製剤される。いくつかの実施形態では、局所的な剤形は、個体の肌に、創傷が開いているか閉じているかにかかわらず、適用される。いくつかの実施形態では、局所的な製剤は、５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾール、またはその薬学的に許容可能な塩、と無菌条件下で混合され、局所的な製剤は、薬学的に許容可能な担体、および、防腐剤、抗酸化剤、緩衝液、保湿剤、浸透促進剤または増粘剤などの、あらゆる望ましい賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、製剤は、脂肪性基剤または炭化水素基剤を含む。いくつかの実施形態では、製剤は、無水基剤または吸収基剤を含む。いくつかの実施形態では、製剤は、エマルジョン基剤（油中水型、水中油型）を含む。いくつかの実施形態では、製剤は、水溶性基剤を含む。
【００３６】
本明細書に使用されるような用語「アミノ」は、−ＮＨ２基を意味する。
【００３７】
本明細書に使用されるような用語「ブロモ」は、−Ｂｒを意味する。
【００３８】
本明細書に使用されるような用語「カルボニル」は、−Ｃ（＝Ｏ）−基を意味する。
【００３９】
本明細書で使用されるような用語「カルボキシ」は、−ＣＯＯＨ基を意味し、エステル基−ＣＯＯ−アルキルとして保護され得る。
【００４０】
本明細書に使用されるような用語「シアノ」は、−ＣＮ基を意味する。
【００４１】
本明細書で使用されるような用語「フルオロ」は、−Ｆを意味する。
【００４２】
本明細書に使用されるような用語「ハロ」または「ハロゲン」は、Ｃｌ、Ｂｒ、ＩまたはＦを意味する。
【００４３】
本明細書に使用されるような用語「ヒドロキシ」は、−ＯＨ基を意味する。
【００４４】
用語「ヒドロキシ保護基」は、合成手順の間に、望ましくない反応からヒドロキシル基を保護する置換基を意味する。ヒドロキシ保護基の例は、メトキシメチル、ベンジルオキシメチル、２−メトキシエトキシメチル、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル、ベンジル、トリフェニルメチル、２，２，２−トリクロロエチル、ｔ−ブチル、トリメチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、メチレンアセタール、アセトニドベンジリデンアセタール、環状オルトエステル、メトキシメチレン、環状カーボネートおよび環状ボロネート、を含むがこれらに限定されない。ヒドロキシ保護基は、トリエチルアミンなどの、塩基を有するヒドロキシ基を含む化合物と、ハロゲン化アルキル、アルキルトリフラート、ハロゲン化トリアルキルシリル、トリアルキルシリルトリフラート、アリールジアルキルシリルトリフラート、または、クロロギ酸アルキルから選ばれる試薬、ＣＨ２ｌ２、あるいは、ジハロボロン酸エステルを、例えばヨウ化メチル、ヨウ化ベンジル、トリエチルシリルトリフラート、塩化アセチル、塩化ベンジル、または、炭酸ジメチルと反応させることによって、ヒドロキシ基に付加される。保護基はさらに、ヒドロキシ基を含む化合物をと、酸およびアルキルアセタールと反応させることによって、ヒドロキシ基に付加される。
【００４５】
本明細書で使用されるような用語「窒素保護基」は、合成手順の間に、望ましくない反応から窒素原子を保護することを意図されている基を意味する。窒素保護基は、カルバマート、アミド、Ｎ−ベンジル誘導体およびイミン誘導体を含む。好ましい窒素保護基は、アセチル、ベンゾイル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、ホルミル、フェニルスルホニル、ピバロイル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ｔｅｒｔ−ブチルアセチル、トリフルオロアセチルおよびトリフェニルメチル（トリチル）である。窒素保護基は、アミノ基を含む化合物を、トリエチルアミンのような塩基および、ハロゲン化アルキル、アルキルトリフラート、例えば（アリキル−Ｏ）２Ｃ＝Ｏで表わされるジアルキル無水物、例えば（アリール−Ｏ）２Ｃ＝Ｏで表わされるジアリール無水物、ハロゲン化アシル、クロロギ酸アルキルまたはハロゲン化アルキルスルホニル、ハロゲン化アリールスルホニルまたはハロ−ＣＯＮ（アルキル）２、例えば、塩化アセチル、塩化アセチル、塩化ベンゾイル、臭化ベンジル、塩化ベンジルオキシカルボニル、フッ化ホルミル、塩化フェニルスルホニル、塩化ピバロイル、（ｔｅｒｔ−ブチル−Ｏ−Ｃ＝Ｏ）２Ｏ、トリフルオロ酢酸無水物およびトリフェニルメチルクロリド、から選択される試薬に、反応させることによって、第１または第２のアミノ基に付加される。
【００４６】
特に指示の無い限り、用語「保護基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｇ  ｇｒｏｕｐ）」または「保護基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｇｒｏｕｐ）」は、化学反応にさらされる分子の一部を指すために使用される場合は、その化学反応の条件下では反応的では無いが、その条件下で反応的な部分を提供するために取り除かれ得る、化学的部分を意味する。保護基は、当技術分野で周知である。例えば、Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．ａｎｄ  Ｗｕｔｓ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（３ｒｄ  ｅｄ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：  １９９９）；Ｌａｒｏｃｋ．Ｒ．Ｃ．，  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  （２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：  １９９９）を参照のこと。いくつかの例は、ベンジル、ジフェニルメチル、トリチル、Ｃｂｚ、Ｂｏｃ、Ｆｍｏｃ、メトキシカルボニル、エトキシカルボニルおよびフタルイミドを含む。保護基は例えば、窒素保護基およびヒドロキシ保護基を含む。窒素で保護される化合物は、「Ｎ−保護である」と呼ばれ場合がある。
【００４７】
本発明の化合物は、無機酸または有機酸に由来する、薬学的に許容可能な塩の形態で使用され得る。薬学的に許容可能な塩は、当該技術分野で周知である。明確性のために、本明細書で使用されるような用語「薬学的に許容可能な塩」は、または、無機酸と無機塩基および有機酸と有機塩基を含む、通常薬学的に許容可能な無毒な酸または塩基、から調製される塩、を指す。適切な、薬学的に許容可能な塩基付加塩は、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムおよび亜鉛から作られる金属塩、あるいは、リジン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（Ｎ−メチルグルカミン）およびプロカインから作られる有機塩を含む。適切な、無毒な酸は、酢酸、アルギン酸、アントラニル酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、１０−カンファースルホン酸、クエン酸、エテンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、フロン酸、ガラクツロン酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタミン酸、グリコール酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムチン酸、硝酸、パモン酸、パントテン酸、フェニル酢酸、リン酸、プロピオン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、スルファニル酸で、硫酸、酒石酸、および、ｐ−トルエンスルホン酸、などの無機酸および有機酸を含む。特定の無毒な酸は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸およびメタンスルホン酸を含む。特定の塩の例は、したがって、塩酸塩とメシル酸塩を含む。その他も、当該技術分野で周知である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １８ｔｈ  ｅｄ．  （Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  Ｅａｓｔｏｎ  Ｐａ．：  １９９０）、および、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  １９ｔｈ  ｅｄ．  （Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  Ｅａｓｔｏｎ  Ｐａ．：  １９９５）を参照のこと。本発明の化合物の、酸付加塩、カルボン酸塩、アミノ酸付加塩、および双性イオン塩の調製および使用はさらに、それらが、適切な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などを起こさずに、ヒトおよび下等動物の組織と接触状態で使用するのに適しており、合理的な利益／リスク比率に見合っており、そして、意図される用途に効果的であれば、薬学的に許容可能であると考えられる。そのような塩はさらに、本発明の化合物の様々な溶媒和物および水和物を含み得る。
【００４８】
本発明のある化合物は、例えば、炭素、フッ素またはヨウ素といった様々な同位体により、同位体標識されることが可能であり、問題の化合物が少なくとも１つのそのような原子を含む場合に適用可能である。
【００４９】
より大きな化合物の一部を形成する化学的部分は、本明細書では、それが単一の分子として存在する時に一般に認められる名称を、またはそのラジカルが一般に認められる名称、を使用して説明され得る。例えば、用語「ピリジン」および「ピリジル」は、他の化学的部分に添付される部分を説明するために使用される時と同じ意味が認められる。したがって、例えば、「ＸがピリジルであるＸＯＨ」および「ＸがピリジンであるＸＯＨ」の２つの句は、同じ意味が認められ、化合物のピリジン−２−オール、ピリジン−３−オール、およびピリジン−４−オールを包含する。
【００５０】
特に指示の無い限り、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」、および「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」は、患者が特定の疾患または障害に罹患し始める前に生じる行為を意味し、その疾患または障害の重症度、または、その症状の１つ以上の重症度を、抑制または低下させる。その用語は、予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）を包含する。
【００５１】
特に指示の無い限り、化合物の「予防上有効な量」は、疾患または疾病、あるいは、疾患または疾病に関連する１つ以上の症状を予防するか、その再発を防ぐのに、十分な量である。化合物の予防的に有効な量は、単独で、または他の薬剤と組み合わされた、治療剤のある量であり、それは、その疾患の予防における予防的な利点を提供する。用語「予防的に有効な量」は、全面的な予防を向上させる、または、他の予防薬の予防的な有効性を増強する、量を包含し得る。
【００５２】
特に指示の無い限り、化合物の「診断上有効な量」は、疾患または疾病を診断するのに十分な量である。一般的に、診断目的のための化合物の投与は、化合物の治療用の使用ほどは長く継続せず、診断するのに１度の投与で十分な場合は、一度のみ投与され得る。
【００５３】
特に指示の無い限り、化合物の「治療上有効な量」は、疾患または疾病、あるいは、疾患または疾病に関連する１つ以上の症状を、処置するのに十分な量である。
【００５４】
用語「被験体」は、疾患が生じ得る生体を含むことが意図される。被験体の例は、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびその遺伝子導入種を含む。
【００５５】
用語、「実質的に純粋な」は、単離された物質が、当技術分野で知られる分析技術によって分析されるとおりに、少なくとも９０％純粋であること、好ましくは９５％純粋であること、さらに好ましくは９９％の純粋であること、を意味する。
【００５６】
医薬組成物における有効成分の実際の投与量レベルは、特定の患者、組成物および投与モードに対して、望ましい治療反応を達成するのに有効な活性化合物の量を得るように、変えられ得る。選択された投与量レベルは、特定の化合物の活性、投与経路、処置されている疾病の重症度、および、処置されている患者の状態と既往歴、に依存する。しかし、望まれる治療効果を達成するために必要とされるより低いレベルで化合物の投与を開始し、望まれる効果が達成されるまで、徐々に投与量を増大させることは、当該技術分野の技能の範囲である。
【００５７】
５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾールの有効な量は、純粋な形態で、または、薬学的に許容可能な塩という形態が存在するところではその形態で、使用され得る。１日のトータルの使用は、正当な医療判断の範囲内で、主治医によって決定されるであろう。任意の特定の患者のための、特に有効な投与量レベルおよび投与の頻度は、処置されている障害および障害の重症度；利用される具体的な組成物；患者の年齢、体重、健康状態、性別および食事；投与に必要な時間；各投与の効果の期間；処置全体の期間；リスク／効果比率；利用される具体的な化合物と組み合わせて、または、同時に使用される薬物；および医療分野でよく知られる同様の因子、を含む、様々な因子に依存するであろう。例えば、望まれる治療効果を達成するために必要とされるより低いレベルで化合物の投与を開始し、望まれる効果が達成されるまで、徐々に投与量を増大させることは、当該技術分野の技能の範囲である。
【００５８】
本明細書に説明される化合物、組成物、方法および使用に関するさらなる情報は、以下の実施例に見つけることができる。
【００５９】
実施例
【００６０】
実施例１−  ５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾールの合成
【００６１】
以下に与えられる化学的スキームを参照する：
【００６２】
【化１】
2021505627.tif 000002
ブロモカルボニトリル（２）（１．０ｇ、３．７ｍｍｏｌ）、イソプロピルフェニルボロンエステル（１）（２．３１ｇ、８．２ｍｍｏｌ、２．２ｅｑ）およびＰｄ（ＰＰｈ３）４（０．２２ｇ、０．１９ｍｍｏｌ、０．０５ｅｑ）が丸底フラスコに追加され、そして３秒間真空にされ、それからアルゴンで３度流された。これに、２Ｍ水溶性炭酸ナトリウム溶液（９．４ｍｌ、１８．８ｍｍｏｌ、５ｅｑ）および２０ｍｌのジオキサンが加えられる。その反応は９５℃で夜通し攪拌され、その後に、水でクエンチされた。黒い混合物が酢酸エチル（２ｘ２０ｍｌ）と共に抽出され、無水の硫酸ナトリウム上で乾燥され、濾過され、そして、回転蒸発を介して濃縮された。チオフェニルカルボニトリル（３）（１．４ｇ、９０％）は、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中、２５％のＤＣＭ）によって得られた。
【００６３】
チオフェニルカルボニトリル（３）（１．０ｇ、２．４ｍｍｏｌ）、アジ化ナトリウム（０．３９ｇ、６．０ｍｍｏｌ、２．５ｅｑ）および臭化亜鉛（１．３６ｇ、６．０ｍｍｏｌ、２．５ｅｑ）は、丸底フラスコの中で、２０ｍｌの無水ＤＭＦと結合され、そして３秒間真空にされ、それからアルゴンで３回流された。その反応は１３５℃で夜通し攪拌され、その後に、５ｍｌの１ＮのＨＣｌ溶液でクエンチされた。混合物は濾過され、生成物がフラッシュカラムクロマトグラフィーヘキサン中、１％のＡｃＯＨおよび３５％のＥｔＯＡｃ）によって得られた。
【００６４】
ＮＭＲ評価。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）１．１３（ｓ，ｂｒ，６Ｈ）、１．３０（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，６Ｈ）、２．９２（ｍ，１Ｈ）、３．３８（ｍ，１Ｈ）、７．２６（ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．１Ｈｚ，１Ｈ）、７．４０（ｍ，４Ｈ）、７．５４（ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ，１Ｈ）、７．７６（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）２４．６（２）、２４．７、２４．８、３０．４、３１．０、１２３．０、１２６．５、１２６．９、１２７．２、１２７．８、１２８．１、１２８．７、１３０．０、１３２．５、１３２．７、１３５．９、１３７．８、１４２．５、１４３．９、１５０、１５１．５。
【００６５】
実施例２（予測）−  ５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾールのアジドを含まない（ａｚｉｄｅ−ｆｒｅｅ）合成
【００６６】
５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾールはまた、Ｎ−保護テトラゾールの混合物を作り出すための、テトラゾールの保護によって作られ得る。この工程の後には、Ｎ−保護５−ブロモテトラゾールの混合物を作り出すための臭素化が続き、その後には、チオフェン−３−イルボロン酸を使用する、パラジウムクロスカップリングが続く。その後、結果として生じる生成物は、チオフェンの、２−と５−の位置で臭素化され、その後に（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）ボロン酸を使用する、パラジウムクロスカップリングが続く。Ｎ−保護テトラゾール部分の脱保護は、混合物を、単一の生成物に分解する。脱保護は、当技術分野で周知の方法を使用して、薬学的に許容可能な塩部分の導入と組み合わされ得るか、または、脱保護後に、薬学的に許容可能な塩部分の導入が続く。１つの可能性のある合成が以下のスキームで与えられ、そこでは、窒素保護基はベンジルである：
【００６７】
【化２】
2021505627.tif 000003
【００６８】
実施例３−  ５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾールおよび皮膚科学的に容認可能な担体を含む、医薬組成物の調製
【００６９】
製剤は、５０ｍｇの化合物を５０μｌの１００％ＤＭＳＯに溶かし、その後、５ｍｌのＧｌａｘａｌ ｂａｓｅ（ＷｅｌｌＳｐｒｉｎｇ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃａｎａｄａ社、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、Ｃａｎａｄａ）に徐々に追加して混ぜ合わせ、１％（ｗ／ｖ）の化合物および１％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯの最終濃度にした。
【００７０】
生物学データ
最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）
【００７１】
臨床病理検査用標準物質研究所（ＣＳＬＩ）ガイドラインに準拠する微量希釈液体分析を使用して、我々は、広範囲のＭＤＲ細菌に対するＭＩＣと、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）および連鎖球菌種に対する顕著で本質的な活性と、を確立するために、５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾール（以下表の「被験物質」）を試験した。抗菌性感受性試験が、ＣＬＳＩガイドラインに準拠して、微量希釈液体分析によって実施された。接種材料は、水に希釈された固定相培養物から調製された。マイクロタイタープレートウェルは、ミュラー・ヒントンＩＩカチオン調製媒地で希釈された化合物の１００μＬのアリコートを受け取った。化合物の最終濃度は一般に、連続２倍希釈において、２５０から０．１２５μｇ／ｍｌの範囲だった。試験化合物に加えて、ＤＭＳＯビヒクル対照列とともに、培養および無菌状態の対照が含まれていた。マイクロタイタープレートは、５×１０５の細菌で植菌され、加湿大気の中で３５℃で一晩インキュベートされた。
【００７２】
さらに、５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾール対１２５の重要なグラム陽性菌のパネルと、ＭＲＳＡ、ＶＲＥおよび表皮ブドウ球菌のＭＤＲ臨床分離株のインビトロ試験は、バンコマイシン、ペニシリン、エリスロマイシンおよびシプロフロキサシンに耐性のある株を含む、これらのＭＤＲ株に対して、０．５−１．０μｇ／ｍｌのＭＩＣ値を示した。
【００７３】
【表１】
2021505627.tif 000004
【００７４】
５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾールはさらに、表皮ブドウ球菌、エンテロコッカスファエカリス、エンテロコッカスファエカリスＶＲＥ、のムピロシン耐性菌に対する、および、ムピロシン耐性の黄色ブドウ球菌株（ＭＭＸ  １０１３、ＭＭＸ  ７７７９、ＭＭＸ  ７７８２、ＭＭＸ  ８８４５、ＭＭＸ  ９２０２：  ２μｇ／ｍｌ  ＭＩＣ  ｖｓ  ＞  ２５６μｇ／ｍｌムピロシン用）のパネル中で、活性を保持していた；このことは、ムピロシンがより一般的に使用される局所用抗生物質のうちの１つであるために、特筆すべきことである。
【００７５】
５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾールはまた、より高度／複合的なＤＵＩケースに存在する病原体である、クロストリジウム種に対する活性を保持し、一方、その構造異性体の５−（４，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−２−イル）−１Ｈ−テトラゾールは、そのような種に対して不活性だった。
【００７６】
５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾールは、ＵＳＡ１００およびＵＳＡ３００ＭＲＳＡ株に対して実証されている通り、素早い殺菌作用を持つ。
【００７７】
作用メカニズム
【００７８】
ａｃｐＳ遺伝子は、黄色ブドウ球菌と大腸菌ゲノムＤＮＡから増幅され、ＡｃｐＳ読取枠を有するフレームにおける、Ｃ末端６ｘ−Ｈｉｓタグに加え、タンパク質生成物が結果として生じるように、標準の組換えＤＮＡ技法を使用して、ｐＥＴ２３ｂベクターに挿入された。ベクターに挿入された生成物のＤＮＡ配列は、配列決定され、既知の大腸菌および黄色ブドウ球菌ａｃｐＳ読取枠と同一であることがわかった。組換えＨｉｓタグが付けられたＡｃｐＳ発現は、ＩＰＴＧ追加および一晩の培養によって誘発される。細胞溶解物は、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＤＴＴ、５％のグリセロールの緩衝液で、１６、１８および２１Ｇの針を通した連続吸引によって取得され、さらに、ＭＥＳでｐＨ８．１に調節された。Ｈｉｓ−タグ手法を介する精製の結果、２ｍｇ／ｍｌまでのストック精製酵素溶液が得られた。典型的なＡｃｐＳ酵素活性分析で、５７ｍＭの［３Ｈ］標識アシル−ＣｏＡ、２μｇのａｐｏ−ＡＣＰ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＤＴＴ、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、および、１０μＬの最終量のＡｃｐＳが、１．５ｍＬの微小遠心管の中で室温でインキュベートされた。５分、１０分、１５分および２０分で、反応の２μｌが、氷の上の７５０μｌの１０％のＴＣＡに追加された。その後、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；２５ｍｇ／ｍｌの溶液２０μｌ）が、放射標識されたタンパク質の沈澱を促進するために添加された。サンプルは、５分間１２０００ｒｃｆで遠心分離機にかけられた。上清は取り除かれ、また、ペレットは、１０％のトリクロロ酢酸７５０μｌで、２度すすがれた。ペレットは、ギ酸の５０μｌで再懸濁され、シンチレーションバイアルに移された。２ｍＬのシンチレーション液が付加され、形成された[３Ｈ]標識されたホロ-ＡＣＰの量が、液体シンチレーションカウンテイングによって定量化された。各データポイント（残りのＡｃｐＳ酵素活性）が、提示された４つの時点の中央値と共に、ベヒクル対照の割合として表わされた。
【００７９】
ＡｃｐＳは、５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾールによって阻害されると見られた。
【００８０】
ＡｃｐＳ阻害が５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾールによる殺菌をもたらす主要なインビボターゲットであるか否かを判断するために、細菌でＡｃｐＳを過剰発現させた。多孔性の外膜を有するように遺伝子操作された大腸菌株（株Ｄ２２）は、ＩＰＴＧ誘導性プロモータの制御下で、大腸菌または黄色ブドウ球菌ＡｃｐＳのいずれかを発現するプラスミドを使って、形質転換された。ＡｃｐＳの阻害を通して細菌を殺す化合物は、ＡｃｐＳ発現の増加に応じてＭＩＣをより高い濃度にシフトするはずであり、それは、実際に５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾールに見られたことである（大腸菌の３２倍、黄色ブドウ球菌の１６倍）。
【００８１】
選択性
【００８２】
上に説明されるものに相似して実施されたインビトロ酵素分析では、５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾールが、ＡＣＰを利用する２つの他の細菌酵素：ＬｐｘＡおよび脂肪酸シンターゼ、を阻害しなかったことが特定された。
【００８３】
十分な厚さのヒトの死体の皮膚上における、皮膚の薬物動態
【００８４】
全層のヒトの皮膚が、死後のヒトのドナーの胴体から採取され、摂氏−８０度で保管された。実験の日、皮膚片は室温の生理食塩水中で少なくとも数分間解凍され、その後、長さ約２ｃｍ×幅約２ｃｍの個々の小片に分けられ、そこから全層の皮膚の７つの小片が選択された。選択片をフランツセルに載せるために、皮下組織層の幅の約２／３が切り取られた。レシーバ緩衝液が調製された（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５ｍＭの重炭酸ナトリウムおよび１．２ｍＭの塩化カルシウムを含むクレブス−リンゲル重炭酸塩緩衝液；ｐＨ７．４に調節され、０．１％のアジ化ナトリウムおよび１％のウシ血清アルブミンで強化された）。各小片は、６００ｒｐｍで動作するウォータージャケット／攪拌モジュールによって、摂氏３２度で、１２ｍＬのレシーバ緩衝液で３０分間平衡化された。３０分後に各小片に対して、蒸散量測定器を使用して、経上皮水分喪失が読み取られた。小片の露出面積は１．７７平方ｃｍであった。
【００８５】
２％のｗ／ｗのＧｌａｘａｌ ｂａｓｅで製剤化された、５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾールのおよそ３００μｌが、シリンジを通して各小片の上に直接適用された。レシーバサンプルは、３時間、６時間、１２時間、１８時間および２４時間で、各Ｆｒａｎｚ細胞のレシーバコンパートメントから採取され、シンク状態を維持するために、同量の新しい、温かい緩衝液と交換された。２４時間の終わりに、各皮膚片に残っている製剤の大部分の量が綿棒で拭き取られ、分析のために乾燥バイアルに一緒に保管された。その後、摂氏６０度で２分間の短い熱処理の後、表皮と真皮はピンセットを使用して優しく分離された。その後、各層は乾燥するように拭き取られ、計量され、別々のガラスバイアルに保存された。全てのサンプルは、ＬＣ／ＭＳ−ＭＳによる分析まで、摂氏−８０度で保存された。
【００８６】
各時点で透過した、５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾールの累積濃度は、その時点の測定濃度の合計に以前の時点の測定濃度の１／１２を加算することによって計算された（というのも、レシーバ総量１２ｍＬから１ｍＬが、毎回採取され、置き換えられるからである）。２４時間の浸透の間の流束値は、曲線の直線部分の勾配から計算された。流束は、式、
流束＝ｄ［（Ｃｒ−ＴｘＶｒ）／ｄｔ／Ａ
で表され、ここでは、Ｃｒ−Ｔは各時点での累積濃度（ｎｇ／ｍＬ）である；Ｖｒは１２ｍＬであり、ｔは時間で表す継続時間であり、Ａは１．７７平方ｃｍの表面積である。
【００８７】
結果は、２４時間の浸透時間の最後に、レシーバサンプル中に、検知可能な５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾールがなかったことを示した（検出の下限：０．５ｎｇ／ｍＬ）。この実験では、（局所投与をシミュレートする）上部から（全身空間への侵入をシミュレートする）下部への流束は、０．１４１ｎｇ／ｈｒ／ｃｍ２未満であった。むしろ、５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾールが、皮膚の層に蓄積することがわかった。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる定量化は、２４時間の浸透時間の最後に、表皮（組織１ｍｇ当たり１６３±５８．０ｎｇ）、真皮（組織１ｍｇ当たり０．８２１±０．４６９ｎｇ）、および下皮（組織１ｍｇ当たり１．８６±１．０４ｎｇ）のレベルを示した。
【００８８】
ウサギの虚血性創傷モデルにおける有効性
【００８９】
５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾールは、ヒトのＤＵＩを模倣した代表的な動物モデルである、ウサギの虚血性創傷モデルにおける感染に対して、その有効性が試験された。このモデルでは、耳は、ニュージーランドの白うさぎの、中心および吻側栄養動脈の分裂により、虚血状態にされる。この研究では、ニュージーランドの白ウサギが使用され、それらの飼育と実験操作は、実験動物の管理と使用に関する標準ガイド（２００１）に準拠する。切開は耳の付け根で露出している軟骨のレベルになるまで行われ、その後、血管を収縮させて皮膚の剥離を助けるために、エピネフリンを皮内注射した。皮膚は、下にある軟骨膜から分離され、６．０ｍｍの大動脈生検パンチを用いて取り除かれる。食物と水は自由に与えられ、動物は、１２時間の明と暗が交互に提供される光周期を伴う７日間で、環境に慣らされ、その手順の間は、鎮痛剤（Ｂｕｐｒｅｎｅｘ  ０．０２ｍｇ／ｋｇ  ｓｃ）および麻酔（（イソフルラン（酸素担体０．５−２Ｌ／ｍｉｎを用いる０．５−５％））も与えられた。
【００９０】
虚血創傷治癒モデルは、外科的に実施された。それぞれの創傷は、２×１０７  ＣＦＵ／ｍｌ  ＭＲＳＡ（ＡＴＣＣ  ＃３３５９１）の５０μｌが接種され、包帯が巻かれた。１日後、創傷は、ベヒクルを含む５０μｌ対照クリーム（Ｎ＝４）、ムピロシンを含む５０μｌ（Ｎ＝４）、５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾールを含む５０μｌクリームのいずれかで、毎日処置された。臨床的観察は、１日目、３日目、５日目、７日目、１０日目および１４日目に実施された。創傷が評価され、観察はドレイズスコアリングシステムを使用して記録された。それぞれの創傷のデジタル写真が取得され、文書化された。
【００９１】
創傷後１４日目、麻酔下で、動物は、体重の１５０ｍｇ／ｋｇの投与量でのＢｅｕｔｈａｎａｓｉａ−Ｄの静脈内注射で、安楽死させられた。およそ２−３ｍｍの正常な、創傷の無い皮膚の縁と創傷全体を含む、検体が得られた。それぞれの耳の創傷検体は、半分に分割された。創傷の２分の１については、創傷は１０％の中性緩衝ホルマリンの入った容器に入れられ、決められた組織学的評価のために処理された。創傷構成は、炎症、肉芽種、血管新生、および上皮化の創傷部位で、４つのパラメータに対して０−４のスケールでスコア付けされた。創傷は、カレッジオブアメリカンパソロジストの委員会有資格メンバーによって、盲検法で特性化された。創傷の他方の２分の１は、無菌のペトリ皿の中で計量（ｍｇ）され、その後、無菌の使い捨ての組織粉砕機に置かれ、定量的微生物学のために均質化された。基本組織サンプルを含むチューブは、５ｍｌの０．８５％の無菌生理食塩水を充填された。その後、１：１０の階段希釈液が５つ、０．５ｍｌのアリコートと、アリコートあたり４．５ｍｌの無菌生理食塩水で調製された。その後、０．１ｍｌのホモジネートおよび各希釈液は、トリプチカーゼ大豆寒天培地に滴下され、３７°Ｃのインキュベータに置かれた。１つの創傷当たりの可視有機体の数は、組織のｃｆｕ／グラムとして記録された。
【００９２】
５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾールは、対照と比較して、細菌の生存の９９％の減少（４−対数ＣＦＵ減少）を実証した。５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾール群は、ムピロシン群より、創傷治癒と上皮化において、顕著に優れていた。５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾール群は、紅斑および浮腫に対する良い効果を示す群では、唯一のものであった。３つの群についての、経時的な、創傷減少パーセントのグラフは、図１を参照のこと：対照群は、（ｐ＜０．００１）の処置群のいずれと比較しても、創傷縮小が少なく、そして、５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾールの処置群は、ムピロシン処置群よりも優れていた（ｐ＜０．０３）。
【００９３】
蜂巣炎における有効性
【００９４】
ＳＫＨ１マウスは、ＭＲＳＡを皮内注射された（Ｎ＝１５）。５匹のマウスが、中性対照の局所的処方を、７日間受けた。５匹のマウスが、ムピロシンを含む局所的処方を、７日間受けた。５匹のマウスが、５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾールを含む局所的処方を、７日間受けた。病変面積は毎日測定された。７日の後、末端コロニー形成単位（ＣＦＵ）が、微生物学的有効性を決定するために測定された。５−（２，５−ビス（４−クロロ−２−イソプロピルフェニル）チオフェン−３−イル）−１Ｈ−テトラゾールを用いる処置は、病変面積および末端ＣＦＵ数を大幅に減少させることが分かった（図２Ｂ、２Ａを参照）。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【国際調査報告】
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