(57)【要約】改善された架橋レシリン組成物及びこれらの改善された組成物を作製する方法を、本明細書において開示する。これらは、レシリン組成物を架橋する新しい方法、架橋レシリン固体組成物の材料特性を調整するための極性非水溶媒の使用、ならびにレシリン発泡体組成物及びそれを作製する方法を含む。2021530522.tif 000029
2021530522.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製組み換えレシリンを含む組成物を提供する工程、
過硫酸アンモニウムを含む架橋溶液に前記組み換えレシリンを入れる工程、及び
前記架橋溶液中の前記組み換えレシリンを、少なくとも６０℃の温度でインキュベートし、それにより、架橋組み換えレシリン固体組成物を生成する工程
を含む、組み換えレシリンを架橋する方法。
【請求項２】
前記インキュベーションが、少なくとも１５分、少なくとも３０分、少なくとも４５分、少なくとも６０分、少なくとも９０分、または少なくとも２時間実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記架橋溶液中の前記組み換えレシリンが、６０℃〜８５℃、７０℃〜８５℃、または７５℃〜８５℃の温度でインキュベートされる、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記インキュベーションが、少なくとも２時間実施される、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記架橋溶液が、光触媒や架橋酵素を含まない、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記架橋された組み換えレシリン固体組成物が、室温で５日間超、１０日間超、２０日間超、または４０日間超で安定である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記精製組み換えレシリンが、培養物中の改変生物において前記組み換えレシリンをコードする遺伝子を組み換え発現すること、及び前記培養物から発現組み換えレシリンを精製することにより調製される、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
架橋組み換えレシリンを含む組成物であって、前記組み換えレシリンが、前記レシリンを過硫酸アンモニウム及び熱に曝露することにより架橋されている、前記組成物。
【請求項９】
架橋酵素を含まない、架橋組み換えレシリンを含む組成物。
【請求項１０】
光触媒を含まない、架橋組み換えレシリンを含む組成物。
【請求項１１】
極性非水溶媒中に架橋組み換えレシリンを含む、組み換えレシリン組成物。
【請求項１２】
前記極性非水溶媒が、プロトン性溶媒である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記プロトン性溶媒が、グリセロール、プロピレングリコール、及びエチレングリコールからなる群より選択される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記極性非水溶媒が、非プロトン性溶媒である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記非プロトン性溶媒が、ＤＭＳＯである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
２０〜４０重量％のレシリンを含む、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
サイズ排除クロマトグラフィーで測定した場合、前記レシリンが、全レシリンの一部として少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％の全長レシリンである、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記極性非水溶媒が、前記溶媒の少なくとも６０体積％、少なくとも７０体積％、少なくとも８０体積％、少なくとも９０体積％、少なくとも９５体積％、少なくとも９８体積％、または少なくとも９９体積％である、請求項１１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記組み換えレシリン組成物が、水性溶媒中の同様の架橋組み換えレシリンよりも大きい弾性率を有する、請求項１１〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
ＡＳＴＭ  Ｄ２２４０によりＳｈｏｒｅ  ＯＯデュロメーターを使用して測定した場合、前記組み換えレシリン組成物が、少なくとも１０の硬度を含む、請求項１１〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
ＡＳＴＭ  Ｄ２２４０によりＳｈｏｒｅ  ＯＯデュロメーターを使用して測定した場合、前記組み換えレシリン組成物が、約１０〜約５０の硬度を含む、請求項１１〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
ＡＳＴＭ  Ｄ７１２１で測定した場合、前記組み換えレシリン組成物が、約４０％〜約６０％の反発弾性を含む、請求項１１〜２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
ＡＳＴＭ  Ｄ５７５で測定した場合、前記組み換えレシリン組成物が、約６〜約８ｐｓｉの２５％での圧縮応力を含む、請求項１１〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
Ｚｗｉｃｋ圧縮試験で測定した場合、前記組み換えレシリン組成物が、２ｋＮ未満の圧縮力で弾性から塑性へ遷移しない、請求項１１〜２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記組み換えレシリン組成物が、発泡材料である、請求項１１〜２４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
水性溶媒中で架橋組み換えレシリン固体組成物を提供する工程、及び
前記水性溶媒を極性非水溶媒と交換する工程
を含む、組み換えレシリン固体を調製する方法。
【請求項２７】
前記極性非水溶媒が、プロトン性溶媒である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記プロトン性溶媒が、グリセロール、プロピレングリコール、及びエチレングリコールからなる群より選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記極性非水溶媒が、非プロトン性溶媒である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記非プロトン性溶媒が、ＤＭＳＯである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記溶媒交換が、少なくとも８時間、少なくとも１６時間、少なくとも２４時間、または少なくとも４８時間実施される、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記溶媒交換が、約６０℃で実施される、請求項２６〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
サイズ排除クロマトグラフィーで測定した場合、前記架橋組み換えレシリン固体組成物が、全レシリンの一部として少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％の全長レシリンを含む、請求項２６〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記架橋組み換え固体組成物が請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法で調製される、請求項２６〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
水性溶媒を含む架橋組み換えレシリン固体組成物を提供する工程、及び
前記水性溶媒を極性非水溶媒で置き換えるために溶媒交換を実施する工程
を含む、架橋組み換えレシリン固体を含む固体組成物の材料特性を調整する方法。
【請求項３６】
前記溶媒を置き換えると、前記架橋組み換えレシリン固体組成物の弾性率、弾性、硬度、最大弾性圧縮荷重、または材料寿命が変化する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
精製組み換えレシリンを含む組成物を提供する工程、
過硫酸アンモニウムを含む水性溶媒に前記組み換えレシリンを入れる工程、
前記水性溶媒中の前記組み換えレシリンを、少なくとも６０℃の温度でインキュベートし、それにより、架橋組み換えレシリン固体組成物を生成する工程、ならびに
グリセロール、プロピレングリコール、エチレングリコール、及びＤＭＳＯからなる群より選択される極性非水溶媒と、前記水性溶媒を交換する工程
を含む、組み換え架橋レシリン固体を調製する方法。
【請求項３８】
水性溶媒中で架橋組み換えレシリン固体組成物を提供する工程、
前記水性溶媒を極性非水溶媒と交換する工程、及び
前記架橋組み換えレシリン固体組成物に１つ以上の気泡を導入する工程
を含む、組み換えレシリン発泡体を調製する方法。
【請求項３９】
前記極性非水溶媒が、プロトン性溶媒である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記プロトン性溶媒が、グリセロール、プロピレングリコール、及びエチレングリコールからなる群より選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記極性非水溶媒が、非プロトン性溶媒である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記非プロトン性溶媒が、ＤＭＳＯである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記溶媒交換が、少なくとも８時間、少なくとも１６時間、少なくとも２４時間、または少なくとも４８時間実施される、請求項３８〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記溶媒交換が、約６０℃で実施される、請求項３８〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
サイズ排除クロマトグラフィーで測定した場合、前記架橋組み換えレシリン固体組成物が、全レシリンの一部として少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％の全長レシリンを含む、請求項３８〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記架橋組み換え固体組成物が請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法で調製される、請求項３８〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記導入が、前記架橋組み換えレシリン固体組成物に発泡剤を添加することを含む、請求項３８〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記発泡剤が、化学発泡剤を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記化学発泡剤が、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、アンモニウム、アゾジカルボンアミド、イソシアナート、ヒドラジン、イソプロパノール、５−フェニルテトラゾール、トリアゾール、４，４’オキシビス（ベンゼンスルホニルヒドラジド）（ＯＢＳＨ）、トリヒドラジントリアジン（ＴＨＴ）、リン酸水素、酒石酸、クエン酸、及びトルエンスルホニルセミカルバジド（ＴＳＳ）を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記化学発泡剤が、重炭酸ナトリウムを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記発泡剤が、物理発泡剤を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
前記物理発泡剤が、クロロフルオロカーボン（ＣＦＣ）、溶存窒素、Ｎ２、ＣＨ４、Ｈ２、ＣＯ２、Ａｒ、ペンタン、イソペンタン、ヘキサン、二塩化メチレン、及びジクロロテトラフルオロエタンを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記物理発泡剤が、溶存窒素を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
請求項１〜７、２５〜３６、及び３８〜５３のいずれか１項に記載の方法で調製された組成物を含む、靴のインソール。
【請求項５５】
極性非水溶媒中の架橋レシリン組成物を含む組成物であって、前記架橋レシリンが発泡されている、前記組成物。
【請求項５６】
前記発泡架橋レシリンが、少なくとも５０％の多孔性を含む、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５７】
前記発泡架橋レシリンが、約０．０１ｍｍ〜約３ｍｍの平均気泡直径を有する、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５８】
請求項８〜２５及び請求項５５〜５７のいずれか１項に記載の組成物を含む、靴のインソール。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本出願は、内容の全体が参照により組み込まれる２０１８年７月１８日に出願された米国仮出願第６２／７００，１９７号の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
背景
エラストマータンパク質は、粘弾性の機械的特性を示すポリペプチドであり、エラスチン、レシリン、アブダクチン、及びタコの動脈のエラストマーを含む。レシリンは、負荷及び除荷中にエネルギーをほとんど消費しないので、特に興味深いエラストマータンパク質である。レシリンは、多数の昆虫にみられ、低エネルギー消費により、多数の昆虫種が跳ぶまたは羽を非常に効率的に回転させる特別な能力が可能になる。レシリンは、その特有の特性により、多くの産業用途を有し得る興味深いエラストマー材料である。それ故、必要とされるものは、望ましい機械的特性を有し且つ大規模で効率的な製造に適する新しいレシリン組成物及びそれを作製する方法である。
【０００３】
天然のレシリン及びレシリン様タンパク質（レシリン配列に基づく）の様々な変形が、Ｅ．  ｃｏｌｉ培養物中の多数の群により組み換え産生されており、組み換え発現されたタンパク質を抽出するために細胞を溶解させ、精製するためにアフィニティークロマトグラフィー手法を使用することにより単離されている（Ｅｌｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５、Ｃｈａｒａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９、ＭｃＧａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。天然のレシリンにおいても架橋を形成するチロシン残基を標的とする、組み換え産生されたレシリン及びレシリン様タンパク質が架橋されている（例えば、Ｅｌｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５、Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１を参照のこと）。リジン残基（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）またはシステイン残基（ＭｃＧａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）を標的とする組み換え産生されたレシリンも架橋されている。架橋方法は、酵素的に触媒された架橋及び光活性化された架橋を含んでいる。架橋の酵素触媒のための酵素は、最終組成物から除去するのが難しい可能性がある一方、光活性化架橋は、不純物も残しながら、表面のみが光に曝露されるために非効率になり得る。酵素不純物は、レシリンを分解し得る一方、最終的な固体架橋組成物に残った酵素または光触媒のいずれかからの不純物は、望ましくない機械的特性をもたらし得る。それ故、必要とされるものは、分解を生じる不純物を残さず、且つ大規模で効率的に実施することができる組み換えレシリンタンパク質を架橋する新しい方法である。
【発明の概要】
【０００４】
改善された架橋レシリン組成物及びこれらの改善された組成物を作製する方法が本明細書で開示される。これらは、レシリン組成物を架橋する新しい方法、及び架橋レシリン固体組成物の材料特性を調整するための極性非水溶媒の使用を含む。
【０００５】
一部の実施形態では、組み換えレシリンを架橋する方法が本明細書で提供され、方法は、精製組み換えレシリンを含む組成物を提供する工程、過硫酸アンモニウムを含む架橋溶液に該組み換えレシリンを入れる工程、及び少なくとも６０℃の温度で、該架橋溶液中で該組み換えレシリンをインキュベートし、それにより、架橋組み換えレシリン固体組成物を生成する工程を含む。
【０００６】
一部の実施形態では、インキュベーションは、少なくとも１５分、少なくとも３０分、少なくとも４５分、少なくとも６０分、少なくとも９０分、または少なくとも２時間実施される。
【０００７】
一部の実施形態では、該架橋溶液中の組み換えレシリンは、６０℃〜８５℃、７０℃〜８５℃、または７５℃〜８５℃の温度でインキュベートされる。
【０００８】
一部の実施形態では、インキュベーションは、少なくとも２時間実施される。
【０００９】
一部の実施形態では、架橋溶液は、光触媒や架橋酵素を含まない。
【００１０】
一部の実施形態では、架橋組み換えレシリン固体組成物は、室温で、５日超、１０日超、２０日超、または４０日超にわたって安定である。
【００１１】
一部の実施形態では、精製組み換えレシリンは、培養物中の改変生物において該組み換えレシリンをコードする遺伝子を組み換え発現すること、及び該培養物から発現された組み換えレシリンを精製すること、により調製される。
【００１２】
一部の実施形態によると、架橋組み換えレシリンを含む組成物も本明細書で提供され、該組み換えレシリンは、該レシリンを過硫酸アンモニウム及び熱に曝露することにより架橋されている。一部の実施形態では、組成物は、架橋酵素を含まない。一部の実施形態では、組成物は、光触媒を含まない。
【００１３】
一部の実施形態では、極性非水溶媒中に架橋組み換えレシリンを含む組み換えレシリン組成物が本明細書に提供される。
【００１４】
一部の実施形態では、極性非水溶媒は、プロトン性溶媒である。一部の実施形態では、プロトン性溶媒は、グリセロール、プロピレングリコール、及びエチレングリコールからなる群より選択される。一部の実施形態では、極性非水溶媒は、非プロトン性溶媒である。一部の実施形態では、非プロトン性溶媒は、ＤＭＳＯである。
【００１５】
一部の実施形態では、組成物は、２０〜４０重量％のレシリンを含む。
【００１６】
一部の実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーで測定した場合、レシリンは、全レシリンの一部として少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％の全長レシリンである。
【００１７】
一部の実施形態では、極性非水溶媒は、該溶媒の、少なくとも６０体積％、少なくとも７０体積％、少なくとも８０体積％、少なくとも９０体積％、少なくとも９５体積％、少なくとも９８体積％、または少なくとも９９体積％である。
【００１８】
一部の実施形態では、組み換えレシリン組成物は、水性溶媒中の類似の架橋組み換えレシリンよりも大きい弾性率を有する。
【００１９】
一部の実施形態では、ＡＳＴＭ  Ｄ２２４０によりＳｈｏｒｅ  ＯＯデュロメーターを使用して測定した場合、組み換えレシリン組成物は、少なくとも１０の硬度を含む。
【００２０】
一部の実施形態では、ＡＳＴＭ  Ｄ２２４０によりＳｈｏｒｅ  ＯＯデュロメーターを使用して測定した場合、組み換えレシリン組成物は、約１０〜約５０の硬度を含む。
【００２１】
一部の実施形態では、ＡＳＴＭ  Ｄ７１２１で測定した場合、組み換えレシリン組成物は、約４０％〜約６０％の反発弾性を含む。
【００２２】
一部の実施形態では、ＡＳＴＭ  Ｄ５７５で測定した場合、組み換えレシリン組成物は、約６〜約８ｐｓｉの２５％での圧縮応力を含む。
【００２３】
一部の実施形態では、Ｚｗｉｃｋ圧縮試験により測定した場合、組み換えレシリン組成物は、２ｋＮ未満の圧縮力で弾性から塑性へ遷移しない。一部の実施形態では、組み換えレシリン組成物は、発泡材料である。
【００２４】
一部の実施形態によると、組み換えレシリン固体を調製する方法も本明細書に提供され、方法は、水性溶媒中で架橋組み換えレシリン固体組成物を提供する工程、及び該水性溶媒を極性非水溶媒と交換する工程を含む。
【００２５】
一部の実施形態では、極性非水溶媒は、プロトン性溶媒である。一部の実施形態では、プロトン性溶媒は、グリセロール、プロピレングリコール、及びエチレングリコールからなる群より選択される。一部の実施形態では、極性非水溶媒は、非プロトン性溶媒である。一部の実施形態では、非プロトン性溶媒は、ＤＭＳＯである。
【００２６】
一部の実施形態では、溶媒交換は、少なくとも８時間、少なくとも１６時間、少なくとも２４時間、または少なくとも４８時間実施される。
【００２７】
一部の実施形態では、溶媒交換は、約６０℃で実施される。
【００２８】
一部の実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーにより測定した場合、架橋組み換えレシリン固体組成物は、全レシリンの一部として少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％の全長レシリンを含む。
【００２９】
一部の実施形態では、架橋組み換え固体組成物は、本明細書に記載の過硫酸アンモニウム及び加熱方法により調製される。
【００３０】
一部の実施形態によると、架橋組み換えレシリン固体を含む固体組成物の材料特性を調整する方法も本明細書に提供され、方法は、水性溶媒を含む架橋組み換えレシリン固体組成物を提供する工程、及び該水性溶媒を極性非水溶媒で置き換える溶媒交換を実施する工程を含む。一部の実施形態では、該溶媒を置き換えると、架橋された組み換えレシリン固体組成物の弾性率、弾性、硬度、最大弾性圧縮荷重、または材料寿命が変化する。
【００３１】
一部の実施形態によると、組み換え架橋レシリン固体を調製する方法も本明細書に提供され、方法は、精製組み換えレシリンを含む組成物を提供する工程、過硫酸アンモニウムを含む水性溶媒に該組み換えレシリンを入れる工程、該水性溶媒中の該組み換えレシリンを少なくとも６０℃の温度でインキュベートし、それにより、架橋組み換えレシリン固体組成物を生成する工程、ならびに、グリセロール、プロピレングリコール、エチレングリコール、及びＤＭＳＯからなる群より選択される極性非水溶媒と、該水性溶媒を交換する工程を含む。
【００３２】
一部の実施形態によると、組み換えレシリン発泡体を調製する方法も本明細書で提供され、方法は、水性溶媒中で架橋組み換えレシリン固体組成物を提供する工程、該水性溶媒を極性非水溶媒と交換する工程、及び、架橋組み換えレシリン固体組成物に１つ以上の気泡を導入する工程を含む。
【００３３】
一部の実施形態では、極性非水溶媒は、プロトン性溶媒である。一部の実施形態では、プロトン性溶媒は、グリセロール、プロピレングリコール、及びエチレングリコールからなる群より選択される。一部の実施形態では、極性非水溶媒は、非プロトン性溶媒である。一部の実施形態では、非プロトン性溶媒は、ＤＭＳＯである。
【００３４】
一部の実施形態では、溶媒交換は、少なくとも８時間、少なくとも１６時間、少なくとも２４時間、または少なくとも４８時間実施される。
【００３５】
一部の実施形態では、溶媒交換は、約６０℃で実施される。
【００３６】
一部の実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーにより測定した場合、架橋組み換えレシリン固体組成物は、全レシリンの一部として少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％の全長レシリンを含む。
【００３７】
一部の実施形態では、架橋組み換え固体組成物は、本明細書に記載の過硫酸アンモニウム及び加熱方法により調製される。
【００３８】
一部の実施形態では、導入は、架橋組み換えレシリン固体組成物に発泡剤を添加することを含む。
【００３９】
一部の実施形態では、発泡剤は、化学発泡剤を含む。一部の実施形態では、化学発泡剤は、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、アンモニウム、アゾジカルボンアミド、イソシアナート、ヒドラジン、イソプロパノール、５−フェニルテトラゾール、トリアゾール、４，４’オキシビス（ベンゼンスルホニルヒドラジド）（ＯＢＳＨ）、トリヒドラジントリアジン（ＴＨＴ）、リン酸水素、酒石酸、クエン酸、及びトルエンスルホニルセミカルバジド（ＴＳＳ）を含む。一部の実施形態では、化学発泡剤は、重炭酸ナトリウムを含む。
【００４０】
一部の実施形態では、発泡剤は、物理的な発泡剤を含む。一部の実施形態では、物理発泡剤は、クロロフルオロカーボン（ＣＦＣ）、溶存窒素、Ｎ２、ＣＨ４、Ｈ２、ＣＯ２、Ａｒ、ペンタン、イソペンタン、ヘキサン、二塩化メチレン、及びジクロロテトラフルオロエタンを含む。一部の実施形態では、物理発泡剤は、溶存窒素を含む。
【００４１】
一部の実施形態によれば、組み換えレシリンタンパク質を含む組成物を生成するための方法が本明細書で提供され、方法は、発酵物において組み換え宿主細胞の集団を培養すること（該組み換え宿主細胞は、分泌レシリンコード配列を含むベクターを含み、該組み換え宿主細胞は、該分泌レシリンコード配列によりコードされる組み換えレシリンタンパク質を分泌する）、及び該発酵物から該組み換えレシリンタンパク質を精製することを含む。
【００４２】
一部の実施形態では、組み換えレシリンタンパク質は、全長または短縮型天然レシリンである。一部の実施形態では、天然レシリンは、セイシェルショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｓｅｃｈｅｌｌｉａ）、パナマハキリアリ（Ａｃｒｏｍｙｒｍｅｘ  ｅｃｈｉｎａｔｉｏｒ）、ルリボシヤンマ属（Ａｅｓｈｎａ）、ノサシバエ（Ｈａｅｍａｔｏｂｉａ  ｉｒｒｉｔａｎｓ）、ネコノミ（Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ  ｆｅｌｉｓ）、セイヨウオオマルハナバチ（Ｂｏｍｂｕｓ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、コクヌストモドキ（Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ  ｃａｓｔａｎｅｕｍ）、ミツバチ（Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）、キョウソヤドリコバチ（Ｎａｓｏｎｉａ  ｖｉｔｒｉｐｅｎｎｉｓ）、コロモジラミ（Ｐｅｄｉｃｕｌｕｓ  ｈｕｍａｎｕｓ  ｃｏｒｐｏｒｉｓ）、ガンビアハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｇａｍｂｉａｅ）、ツェツェバエ（Ｇｌｏｓｓｉｎａ  ｍｏｒｓｉｔａｎｓ）、アタ・セファロテス（Ａｔｔａ  ｃｅｐｈａｌｏｔｅｓ）、アノフェレス・ダーリンギ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｄａｒｌｉｎｇｉ）、エンドウヒゲナガアブラムシ（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ  ｐｉｓｕｍ）、クロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｖｉｒｉｌｉｓ）、ドロソフィラ・エレクタ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｅｒｅｃｔａ）、スナバエ（Ｌｕｔｚｏｍｙｉａ  ｌｏｎｇｉｐａｌｐｉｓ）、ベネズエラサシガメ（Ｒｈｏｄｎｉｕｓ  ｐｒｏｌｉｘｕｓ）、ヒアリ（Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａ）、クレクス・クインクエファシアタス（Ｃｕｌｅｘ  ｑｕｉｎｑｕｅｆａｓｃｉａｔｕｓ）、ウリミバエ（Ｂａｃｔｒｏｃｅｒａ  ｃｕｃｕｒｂｉｔａｅ）、及びトリコグラマ・プレチオサム（Ｔｒｉｃｈｏｇｒａｍｍａ  ｐｒｅｔｉｏｓｕｍ）からなる群より選択される生物由来のものである。一部の実施形態では、組み換えレシリンタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含む。一部の実施形態では、組み換えレシリンタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４を含む。
【００４３】
一部の実施形態では、組み換えレシリンタンパク質は、アルファ接合因子分泌シグナルを含む。一部の実施形態では、組み換えレシリンタンパク質は、ＦＬＡＧタグを含む。一部の実施形態では、ベクターは、複数の分泌レシリンコード配列を含む。
【００４４】
一部の実施形態では、組み換え宿主細胞は、酵母細胞である。一部の実施形態では、酵母細胞は、メチロトローフ酵母細胞である。一部の実施形態では、組み換え宿主細胞は、ピキア（コマガタエラ）・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、アルクスラ・アデニニボランス（Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、ピキア（シェフェルソミセス）・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ（Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ）ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、及びクルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）からなる群より選択される種である。
【００４５】
一部の実施形態では、組み換え宿主細胞は、２ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間を超える速度で組み換えレシリンを産生する。一部の実施形態では、組み換え宿主細胞は、組み換え宿主細胞により発現される総組み換えレシリンタンパク質と比較して５０％を超える組み換えレシリンの分泌画分を産生する。一部の実施形態では、組み換え宿主細胞は、２ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間を超える速度で組み換えレシリンを分泌する。一部の実施形態では、組み換えレシリンの８０％超が、該発酵物において組み換え宿主細胞の外側にある。一部の実施形態では、発酵物は、少なくとも２ｇ組み換えレシリン／Ｌを含む。
【００４６】
一部の実施形態では、該組み換えレシリンタンパク質を精製することは、発酵物を遠心分離することにより、第１のペレット画分及び第１の上清画分を生成すること、ならびに、第１のペレット画分から組み換えレシリンタンパク質を単離することを含む。一部の実施形態では、該組み換えレシリンタンパク質を精製することはさらに、第１のペレット画分にカオトロープを添加して、組み換えレシリンタンパク質が可溶性である溶液を生成すること、該カオトロープを含む第１のペレット画分を遠心分離することにより、第２の上清画分及び第２のペレット画分を生成すること、ならびに、第２の上清画分から可溶性の全長レシリンを単離することを含む。
【００４７】
一部の実施形態では、分泌レシリンコード配列を含むベクターが本明細書に提供される。一部の実施形態では、分泌レシリンコード配列は、全長または短縮型天然レシリンをコードする。一部の実施形態では、分泌レシリンコード配列は、改変全長または短縮型天然レシリンをコードする。一部の実施形態では、改変レシリンは、別のレシリンに架橋することが可能なアミノ酸残基の位置での付加、削減、置換、または変化を含む。
【００４８】
一部の実施形態では、全長または短縮型天然レシリンは、セイシェルショウジョウバエ、パナマハキリアリ、ルリボシヤンマ属、ノサシバエ、ネコノミ、セイヨウオオマルハナバチ、コクヌストモドキ、ミツバチ、キョウソヤドリコバチ、コロモジラミ、ガンビアハマダラカ、ツェツェバエ、アタ・セファロテス、アノフェレス・ダーリンギ、エンドウヒゲナガアブラムシ、クロショウジョウバエ、ドロソフィラ・エレクタ、スナバエ、ベネズエラサシガメ、ヒアリ、クレクス・クインクエファシアタス、ウリミバエ、及びトリコグラマ・プレチオサムからなる群より選択される生物由来のものである。
【００４９】
一部の実施形態では、分泌レシリンコード配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含むポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、分泌レシリンコード配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４を含むポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、分泌レシリンコード配列は、１つ以上のＡリピートまたは準Ａリピートを含む組み換えレシリンをコードする。一部の実施形態では、分泌レシリンコード配列は、１つ以上のＢリピートまたは準Ｂリピートを含む組み換えレシリンをコードする。一部の実施形態では、分泌レシリンコード配列は、１つ以上のＡリピートもしくは準Ａリピート、または１つ以上のＢリピートもしくは準Ｂリピートのいずれかを含むが、両方ではない組み換えレシリンをコードする。一部の実施形態では、分泌レシリンコード配列は、１つ以上のＡリピートまたは準Ａリピート及び１つ以上のＢリピートまたは準Ｂリピートを含む組み換えレシリンをコードする。
【００５０】
一部の実施形態では、組み換えレシリンはさらに、キチン結合ドメインを含む。一部の実施形態では、分泌レシリンコード配列は、アルファ接合因子分泌シグナルを含むポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、分泌レシリンコード配列は、ＦＬＡＧタグを含む。
【００５１】
一部の実施形態では、ベクターは、複数の分泌レシリンコード配列を含む。一部の実施形態では、ベクターは、３つの分泌レシリンコード配列を含む。一部の実施形態では、分泌レシリンコード配列は、構成的または誘導性プロモーターに作動可能に連結される。
【００５２】
一部の実施形態によると、分泌レシリンコード配列を含む１つ以上のベクターを含む組み換え宿主細胞も本明細書で提供される。一部の実施形態では、組み換え宿主細胞は、酵母細胞である。一部の実施形態では、酵母細胞は、メチロトローフ酵母細胞である。一部の実施形態では、組み換え宿主細胞は、ピキア（コマガタエラ）・パストリス、ハンゼヌラ・ポリモルファ、アルクスラ・アデニニボランス、ヤロウイア・リポリティカ、ピキア（シェフェルソミセス）・スティピティス、ピキア・メタノリカ、出芽酵母、及びクルイベロミセス・ラクチスからなる群より選択される種である。
【００５３】
一部の実施形態では、組み換え宿主細胞は、分泌レシリンコード配列を含む３つのベクターを含む。
【００５４】
一部の実施形態では、組み換え宿主細胞は、２ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間を超える速度で組み換えレシリンを産生する。一部の実施形態では、組み換え宿主細胞は、５０％を超える組み換えレシリンの分泌画分を有する。一部の実施形態では、組み換え宿主細胞は、２ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間を超える速度でレシリンを分泌する。
【００５５】
一部の実施形態によると、分泌レシリンコード配列を含む１つ以上のベクターを含む組み換え宿主細胞と組み換え宿主細胞を成長させるのに適する培地を含む発酵物も本明細書で提供される。
【００５６】
一部の実施形態では、発酵物は、少なくとも２ｇ組み換えレシリン／Ｌを含む。
【００５７】
発酵物の一部の実施形態では、組み換えレシリンの８０％超は、組み換え宿主細胞の外側にある。
【００５８】
発酵物の一部の実施形態では、組み換えレシリンは、全長組み換えレシリンである。
【００５９】
一部の実施形態によると、分泌レシリンコード配列を含む１つ以上のベクターを含む組み換え宿主細胞と組み換え宿主細胞を成長させるのに適する培地を含む発酵物に由来する組み換えレシリンを含む組成物も本明細書で提供される。一部の実施形態では、組成物は、少なくとも６０重量％の組み換えレシリンを含む。
【００６０】
一部の実施形態では、組成物は、類似量の天然レシリンを含む組成物と比較して、類似の特性を有する。一部の実施形態では、組成物は、類似量の天然レシリンを含む組成物と比較して、異なる特性を有する。
【００６１】
一部の実施形態では、組成物は、５０％を超える弾性を含む。一部の実施形態では、組成物は、１０ＭＰａ未満の圧縮弾性率を有する。一部の実施形態では、組成物は、１０ＭＰａ未満の引張弾性率を有する。一部の実施形態では、組成物は、１ＭＰａ未満の剪断弾性率を有する。一部の実施形態では、組成物は、１％を超える破壊伸びを有する。一部の実施形態では、組成物は、０．１ｋＰａを超える最大引張強さを有する。一部の実施形態では、組成物は、９０未満のＳｈｏｒｅ  ＯＯ硬度を有する。一部の実施形態では、組成物は、全長レシリンを含む。
【００６２】
一部の実施形態によると、組み換えレシリンを含む組成物を生成するための方法も本明細書で提供され、方法は、分泌レシリンコード配列を含む１つ以上のベクターを含む組み換え宿主細胞を培養して、組み換え宿主細胞からの組み換えレシリンの分泌を促進する条件下で発酵物を生成するステップを含む。
【００６３】
一部の実施形態では、組み換えレシリンを含む組成物を生成するための方法はさらに、該組み換えレシリンを精製して、全長の天然レシリンを生成するステップを含む。一部の実施形態では、全長の天然レシリンを生成するために該組み換えレシリンを精製することは、発酵物を遠心分離することにより、第１のペレット画分及び第１の上清画分を生成すること、ならびに、第１のペレット画分から組み換えレシリンタンパク質を単離することを含む。一部の実施形態では、第１のペレット画分から組み換えレシリンタンパク質を単離することは、第１のペレット画分にカオトロープを添加して、組み換えレシリンタンパク質が可溶性である溶液を生成すること、該カオトロープを含む第１のペレット画分を遠心分離することにより、第２の上清画分及び第２のペレット画分を生成すること、ならびに、第２の上清画分から組み換えレシリンタンパク質を単離することを含む。
【００６４】
一部の実施形態では、組み換えレシリンを含む組成物を生成するための方法はさらに、複数の該組み換えレシリンを架橋するステップを含む。一部の実施形態では、該架橋は、酵素的架橋である。一部の実施形態では、該架橋は、光化学的架橋である。一部の実施形態では、組み換えレシリンタンパク質は、全長レシリンタンパク質を含む。
【００６５】
一部の実施形態によると、培地及び組み換え宿主細胞を含む発酵物も本明細書で提供され、組み換え宿主細胞は、ベクターを含み、ベクターは、分泌レシリンコード配列を含み、組み換え宿主細胞は、組み換えレシリンを少なくとも２ｍｇ／ｇ乾燥細胞重量／時間の速度で分泌する。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
上述及び他の目的、特徴、及び利点は、添付の図面に示される、本発明の特定の実施形態の以下の説明から明らかとなり、同様の参照文字は、異なる図にわたって同じ部分を指す。図面は、必ずしも縮尺通りでなく、代わりに、本発明の種々の実施形態の原理を説明することに重点を置く。
【００６７】
【図１】例示的なレシリンの構造を概略的に示す。
【図２】組み換えレシリンを含む組成物を生成するための方法の流れ図である。
【図３】３つの分泌レシリンコード配列を含むベクターの例示的なマップである。
【図４】種々の形状及び形態の架橋精製組み換えレシリンを含むタンパク質性ブロックコポリマーの写真を示す。
【図５】架橋組み換えレシリンを含むタンパク質性ブロックコポリマーの圧縮の写真を示す。
【図６】過硫酸アンモニウム及び熱（ＡＰ）により架橋されたレシリン固体組成物、過硫酸アンモニウム及び熱で架橋され且つ過剰な架橋溶液を除去するために３回洗浄されたレシリン固体組成物（ＡＰ  ３ｘ洗浄）、及び西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）による酵素的架橋されたレシリン固体組成物の、レシリン上のＦＬＡＧタグに特異的な抗体を使用してＥＬＩＳＡで測定された総分解レシリンを示す。
【図７】１０重量％のヒュームドシリカ（左）及び５重量％のヒュームドシリカ（右）を含むレシリン発泡体の写真を示す。
【図８】５重量％のヒュームドシリカを含むレシリン発泡体の写真を示す。比較のために、２５セント硬貨を含める。
【図９】架橋後（上）及び密閉せずに１週間保管した７日後（下）のグリセロール系及び水系架橋レシリン組成物の画像を示す。
【図１０Ａ】以下の架橋レシリン組成物についてレオメーターで測定された応力ひずみ曲線を示す：６０％のグリセロール溶媒交換、続いて、１００％のグリセロール溶媒交換で調製されたグリセロール溶媒中の２７重量％のレシリン。
【図１０Ｂ】以下の架橋レシリン組成物についてレオメーターで測定された応力ひずみ曲線を示す：プロピレングリコール溶媒中の２７重量％の全長レシリン。
【図１０Ｃ】以下の架橋レシリン組成物についてレオメーターで測定された応力ひずみ曲線を示す：プロピレングリコール溶媒中の２７％の全長レシリン（すなわち、全レシリンの割合として約８０％の全長レシリン）。
【図１１】５重量％のヒュームドシリカを含むレシリン発泡体の応力−ひずみ曲線を示す。
【図１２】以下の架橋レシリン固体組成物のそれぞれについてレオメーターにより測定された弾性及び弾性率の相対値のプロットを示す：２０重量％のレシリン、プロピレングリコール（「Ａ」）；２７重量％レシリン、プロピレングリコール（「Ｂ」）；４０重量％レシリン、プロピレングリコール（「Ｃ」）；レシリンコアセルベート、プロピレングリコール（「Ｄ」）；２７重量％の全長レシリン、プロピレングリコール（「Ｅ」）；２７重量％レシリン、６０〜１００％グリセロール（「Ｆ」）；２７重量％レシリン、１００％グリセロール（「Ｈ」）；及び２７重量％のレシリン、エチレングリコール（「Ｉ」）。
【図１３】以下の架橋レシリン固体のそれぞれについてＺｗｉｃｋ引張試験機により測定した場合、加えられた力対ひずみ曲線のプロットを示す：２７重量％のレシリンエチレングリコール固体（「Ａ」）、２７重量％のレシリンプロピレングリコール固体（「Ｃ」）、コアセルベートレシリンプロピレングリコール固体（「Ｄ」）、２７重量％のレシリン６０〜１００％グリセロール固体（「Ｇ」）、及び２７重量％のレシリン１００％のグリセロール固体（「Ｈ」）。
【００６８】
図は、例示のためのみに、本開示の種々の実施形態を示す。当業者は、以下の考察から、本明細書で例示される構造及び方法の代替の実施形態が、本明細書に記載の原理から逸脱することなく用いられ得ることを容易に認識するであろう。
【発明を実施するための形態】
【００６９】
詳細な説明
本発明の種々の実施形態の詳細が以下の説明に記載される。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、説明及び図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００７０】
定義
別途定義のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示に関わる技術分野における当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【００７１】
本明細書で使用される「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という用語ならびに同様の指示対象は、本明細書で別途指示のない限り、または文脈により明確に矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方を指す。
【００７２】
「約」、「ほぼ」、または「類似」という用語は、当業者により決定される特定の値の許容誤差範囲内を意味し、これは、部分的に、値が測定もしくは決定される方法、または測定システムの制限に依存し得る。以下に記載される全ての範囲及び量は、概数であり、本発明を限定することを意図するものではないことを理解すべきである。範囲及び数値が使用される場合、これらは、統計的範囲または測定誤差または変動を含むように概数とすることができる。一部の実施形態では、例えば、測定値は、プラスまたはマイナス１０％とすることができる。
【００７３】
アミノ酸は、１文字コードまたは３文字コードで言及することができる。１文字コード、アミノ酸名、及び３文字コードは、以下の通りである：Ｇ−グリシン（Ｇｌｙ）、Ｐ−プロリン（Ｐｒｏ）、Ａ−アラニン（Ａｌａ）、Ｖ−バリン（Ｖａｌ）、Ｌ−ロイシン（Ｌｅｕ）、Ｉ−イソロイシン（Ｉｌｅ）、Ｍ−メチオニン（Ｍｅｔ）、Ｃ−システイン（Ｃｙｓ）、Ｆ−フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、Ｙ−チロシン（Ｔｙｒ）、Ｗ−トリプトファン（Ｔｒｐ）、Ｈ−ヒスチジン（Ｈｉｓ）、Ｋ−リジン（Ｌｙｓ）、Ｒ−アルギニン（Ａｒｇ）、Ｑ−グルタミン（Ｇｌｎ）、Ｎ−アスパラギン（Ａｓｎ）、Ｅ−グルタミン酸（Ｇｌｕ）、Ｄ−アスパラギン酸（Ａｓｐ）、Ｓ−セリン（Ｓｅｒ）、Ｔ−スレオニン（Ｔｈｒ）。
【００７４】
「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｗｉｔｈ）」という用語、またはそれらの変形は、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と同様の方法で包括的であることが意図される。
【００７５】
本明細書で使用される「微生物」という用語は、微生物を指し、単細胞生物を指す。本明細書で使用される場合、この用語は、全ての細菌、全ての古細菌、単細胞原生生物、単細胞動物、単細胞植物、単細胞真菌、単細胞藻類、全ての原生動物、及び全てのクロミスタを含む。
【００７６】
本明細書で使用される「天然」という用語は、天然の未改変状態で自然界に見出される組成物を指す。
【００７７】
「任意の」または「任意に」という用語は、特徴もしくは構造が存在してもしなくてもよいか、または、事象もしくは状況が起こっても起こらなくてもよいこと、ならびに、記述が、特定の特徴もしくは構造が存在する場合及び特徴もしくは構造が存在しない場合、または事象もしくは状況が起こる場合及び事象もしくは状況が起こらない場合を含むことを意味する。
【００７８】
本明細書で使用される「分泌画分」という用語は、細胞により産生される総レシリンと比較した、細胞から分泌される組み換えレシリンの画分を指す。
【００７９】
本明細書で使用される「分泌シグナル」という用語は、ポリペプチドに融合されると、細胞からのそのポリペプチドの分泌を媒介する短いペプチドを指す。
【００８０】
本明細書で使用される「分泌レシリンコード配列」という用語は、Ｎ末端で分泌シグナルに融合され、任意に、タグペプチドまたはＣ末端でポリペプチドに融合される本明細書に提供されるレシリンをコードするヌクレオチド配列を指す。
【００８１】
ポリペプチド（例えば、レシリン）に関して本明細書で使用される「組み換え」という用語は、組み換え宿主細胞内で産生されるポリペプチド、または組み換え核酸から合成されるポリペプチドを指す。
【００８２】
本明細書で使用される「組み換え宿主細胞」という用語は、組み換え核酸を含む宿主細胞を指す。
【００８３】
本明細書で使用される「組み換え核酸」という用語は、天然に存在する環境から取り出された核酸、または自然界にみられる場合に、その核酸に隣接もしくは近接する核酸の全部もしくは一部が付随しない核酸、または自然界では連結されない核酸に作動可能に連結される核酸、または自然界では生じない核酸、または自然界の核酸にみられない改変を含有する核酸（例えば、人間の介入により、例えば、人工的に導入される挿入、欠失、もしくは点変異）、または異種部位で染色体に組み込まれる核酸を指す。この用語は、化学的に合成されたヌクレオチド類似体を含むクローン化ＤＮＡ分離株及び核酸を含む。
【００８４】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、一般に、追加のＤＮＡセグメントをライゲーションすることができる環状二本鎖ＤＮＡループを指すが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅からまたは制限酵素による環状プラスミドの処理から生じるような線状二本鎖分子も含む。他のベクターとしては、バクテリオファージ、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、及び酵母人工染色体（ＹＡＣ）が挙げられる。別のタイプのベクターは、ウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに連結することができる。ある特定のベクターは、それらが導入された細胞内で自律複製することができる（例えば、細胞内で機能する複製起点を有するベクター）。他のベクターは、細胞への導入時に細胞のゲノムに組み込むことができ、それにより、細胞ゲノムと一緒に複製される。
【００８５】
アミノ酸または核酸配列に関して本明細書で使用される「リピート」という用語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド内に複数回存在する部分配列（例えば、連結される配列）を指す。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、いかなる介在配列も有しないリピート配列の直接の繰り返しを有し得るか、または介在配列を有するリピート配列の非連続繰り返しを有し得る。アミノ酸または核酸配列に関して本明細書で使用される「準リピート」という用語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドにわたって不正確に繰り返される（すなわち、準リピート部分配列の一部が、準リピート間で可変である）部分配列である。リピートポリペプチド及びＤＮＡ分子（またはポリペプチドもしくはＤＮＡ分子の一部）は、リピート部分配列（すなわち、正確なリピート）または準リピート部分配列（すなわち、不正確なリピート）のいずれかで構成することができる。
【００８６】
本明細書で使用される「天然レシリン」という用語は、昆虫により産生されるエラストマーポリペプチドまたはタンパク質を指す。天然レシリンの非限定例のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号としては、以下のＮＣＢＩ配列番号が挙げられる：ＮＰ９９５８６０（キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ））、ＮＰ６１１１５７（キイロショウジョウバエ）、Ｑ９Ｖ７Ｕ０（キイロショウジョウバエ）、ＡＡＳ６４８２９、ＡＡＦ５７９５３（キイロショウジョウバエ）、ＸＰ００１８１７０２８（コクヌストモドキ）、及びＸＰ００１９４７４０８（エンドウヒゲナガアブラムシ）。
【００８７】
本明細書で使用される「改変された」という用語は、天然タンパク質またはポリペプチド配列とは組成が異なるタンパク質またはポリペプチド配列を指し、機能特性が天然タンパク質またはポリペプチド特性の１０％以内に保存される。一部の実施形態では、改変タンパク質またはポリペプチドと天然のタンパク質またはポリペプチドの差異は、１次配列内に存在する（例えば、１つ以上のアミノ酸が、除去、挿入、もしくは置換される）か、または翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化）であり得る。アミノ酸欠失は、タンパク質から１つ以上のアミノ酸を除去することを指す。アミノ酸挿入は、タンパク質またはポリペプチドに導入される１つ以上のアミノ酸残基を指す。アミノ酸挿入は、Ｎ末端及び／またはＣ末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸の配列内挿入を含んでもよい。アミノ酸置換は、非保存的または保存的置換を含み、保存的アミノ酸置換表が、当該技術分野で周知である（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｅｄｓ）を参照のこと）。一部の実施形態では、改変タンパク質またはポリペプチドと天然のタンパク質またはポリペプチドアミノ酸またはヌクレオチドとの配列同一性は、アミノ酸またはヌクレオチド塩基の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％である。
【００８８】
本明細書で使用される「短縮型」という用語は、天然のタンパク質またはポリペプチドよりも長さが短いタンパク質またはポリペプチド配列を指す。一部の実施形態では、短縮型タンパク質またはポリペプチドは、天然タンパク質またはポリペプチドの長さの１０％超、または２０％超、または３０％超、または４０％超、または５０％超、または６０％超、または７０％超、または８０％超、または９０％超であり得る。
【００８９】
ポリペプチド、核酸、またはそのフラグメントを指す場合、本明細書で使用される「ホモログ」または「実質的な類似性」という用語は、別のアミノ酸または核酸（またはその相補鎖）と、適切なアミノ酸またはヌクレオチド挿入または欠失とともに最適にアラインされる場合、上述のように、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧａｐなどの周知の任意の配列同一性アルゴリズムで測定した場合、アミノ酸またはヌクレオチド塩基の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％のアミノ酸またはヌクレオチド配列同一性があることを示す。
【００９０】
本明細書で使用される「レシリン」という用語は、架橋してエラストマーを形成することができるタンパク質またはポリペプチドを指し、タンパク質またはポリペプチドは、天然レシリン、または改変される天然レシリン、または短縮される天然レシリンである。本発明のレシリンは、好ましくは、組み換えレシリンである。一部の実施形態では、組み換えレシリンは、異種発現された及び宿主細胞から分泌される（例えば、昆虫から単離された）レシリンまたはレシリンフラグメントをコードする（例えば、短縮または連結される）天然または改変ヌクレオチド配列を含む。好ましい実施形態では、分泌組み換えレシリンタンパク質は、宿主細胞の細胞外の溶液から収集される。一部の実施形態では、レシリンは、発泡材料、例えば、固体発泡体の形態である。
【００９１】
本明細書で使用される場合、「エラストマー」という用語は、粘弾性及び通常は（分子間に共有結合架橋が存在する場合は、それを除く）弱い分子間力を有するポリマーを指す。粘弾性は、変形を受ける場合、粘性特性及び弾性特性の両方を示し、従って、時間依存のひずみを示す材料の特性である。弾性は、規則正しい固体の結晶面に沿った結合の伸長に関連し、粘度は、アモルファス材料内の原子または分子の拡散の結果である。従って、粘弾性のエラストマーは一般に、他の材料と比較して、ヤング率が低く、破壊ひずみが高い。材料の粘性構成成分により、粘弾性材料は、荷重が加えられ、次に、除かれる場合にエネルギーが放散する。この現象は、粘弾性材料の応力−ひずみ曲線のヒステリシスとして観察される。荷重が加えられる時、特定の応力−ひずみ曲線があり、荷重が除かれる時、除荷時の応力−ひずみ曲線は、荷重時の曲線とは異なる。消費されるエネルギーは、負荷及び除荷曲線の間の面積である。
【００９２】
本明細書で使用される場合、「非水性」という用語は、主に、水ではない１つ以上の化合物を含む溶媒を指す。これは、溶媒として存在する水の割合が全体的に減少する溶媒との溶媒交換プロセスを経ており、すなわち、溶媒としての水が非水分子で置き換えられている組成物を含む。一部の実施形態では、非水溶媒は、５０％未満の水を含むものである。架橋レシリン組成物の溶媒に関して本明細書で使用される極性非水溶媒は、レシリンを溶解させることができる任意の非水溶媒を指す。
【００９３】
本明細書の値の範囲の列挙は、単に、本明細書に別途指示のない限り、範囲内に包括的に入る別々の各値を個別に指す簡単な方法として使用されることが意図され、別々の各値は、本明細書に個別に記載されるかのように本明細書に組み込まれる。
【００９４】
レシリン組成物
組み換えレシリンを含む組成物、及びそれらを生成するための方法が本明細書で提供される。
【００９５】
レシリンは、石油系エラストマーと比較して多くの固有の特性を有する。最も注目すべきことに、レシリンは、非常に高い弾性効率（すなわち、弾性）を有し、変形に入力されたエネルギーのほとんどが熱として失われない。レシリンの他の望ましい特性としては、例えば、圧縮弾性率、引張弾性率、剪断弾性率、硬度、反発、及び圧縮永久ひずみが挙げられる。さらに、レシリンは、タンパク質であり、従って、生分解することができ、これにより、石油系ポリマーよりも環境適合性になる。また、レシリンは、生体適合性であり、それ故、ヒトまたは動物との接触を伴う用途で使用することができる。最後に、組み換えレシリンの機械的特性は、特定の用途の分野に設計されたエラストマーを生成するように、タンパク質配列、タンパク質構造、分子間架橋の量、及び処理の可変要素を変化させることにより調整することができる。
【００９６】
一部の実施形態では、望ましい機械的特性を有する架橋レシリン組成物及びそれらを生成する方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、大きなバッチで効率的に実施することができ、架橋反応で残った不純物による分解を受けにくい架橋レシリン固体を形成するレシリン組成物を架橋する方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、架橋反応は、過硫酸アンモニウムなどの過硫酸塩へのレシリンの曝露を含む。過硫酸塩により触媒される架橋反応を開始するために、熱を加えることができる。このタイプの架橋反応は、組成物中にいかなる光活性または酵素化合物も残さない。さらに、この架橋反応は、光活性化を必要としないので、光が架橋溶液の全ての部分に到達する必要なしに、大きなバッチを効率的に生成することができる。一部の実施形態では、架橋は、得られた組み換えレシリン組成物が特定の形状または形態を有するように、容器または型内で生じる。
【００９７】
本明細書で提供される架橋レシリン固体組成物はまた、ある特定の用途に好ましい弾性率、硬度、最大弾性圧縮荷重、弾性、及び材料の寿命／疲労などの所望の機械的特性を提供するために、極性非水溶媒を含む架橋レシリン組成物を含む。一部の実施形態では、組成物は、レシリン組成物との溶媒交換を実施して、水性溶媒を非水溶媒で置き換えることにより作製される。架橋レシリンと溶媒交換を行うことができる溶媒には、非架橋形態でレシリンを溶解させる溶媒を含む。
【００９８】
好ましい実施形態では、非水溶媒は、不揮発性で水溶性または極性である。一部の実施形態では、溶媒の分子量は、約１００以下である。一部の実施形態では、極性非水溶媒は、グリセロール、プロピレングリコール、エチレングリコール、またはＤＭＳＯを含む。一部の実施形態では、溶媒交換は、極性非水溶媒勾配（例えば、６０％から１００％へのグリセロール）を使用して行われる。
【００９９】
一部の実施形態では、例えば、要望通りに、加えられた力からのエネルギーの吸収を含む物理的特性が改善された組成物を提供するために、本明細書に記載の架橋レシリン組成物を使用することができる。一部の実施形態では、ゴムを含有する既存の生成物を改善するために、本明細書に記載の架橋レシリン組成物を使用することができる。特に、本明細書で提供される架橋レシリン組成物の一部は、非弾性材料に遷移することなく、大量の力を吸収することができる。
【０１００】
一部の実施形態では、本明細書で提供される架橋レシリン組成物は、ミッドソールとして使用することができる。一部の実施形態では、本明細書で提供される架橋レシリン組成物は、ゴルフボールのコアの一部として使用することができる。他の実施形態では、本明細書で提供される架橋レシリン組成物は、例えば、ゴルフクラブもしくはテニスラケットなどのスポーツ用品用のハンドルもしくはグリップに、自転車グリップもしくはオートバイグリップとして、またはハンマー、ネイルガン、削岩機、及びエネルギーを吸収して戻すことが好ましい他の任意の道具などの道具及び工業用途用のグリップとして、使用することができる。一部の実施形態では、本明細書で提供される架橋レシリン組成物は、ブッシングまたは制振、例えば、スケートボードトラックまたはハードドライブプラッター振動緩衝装置に使用することができる。一部の実施形態では、架橋レシリン組成物は、スケートボード、ローラーブレード、またはスクーターなどのホイールの優れた材料として使用することができる。一部の実施形態では、本明細書で提供される架橋レシリン組成物は、ヘルメット、肘もしくは膝パッド、または安全帽などの保護装置のための、あるいは擦傷から皮膚を保護するために保護外層としての、パディングなどの安全及び保護具に使用することができる。
【０１０１】
一部の実施形態では、本明細書で提供される架橋レシリン組成物は、自動車部品、例えば、ブッシングもしくは緩衝装置などのサスペンションコンポーネント、またはシートボルスター及びランバーサポートなどの内部クッションに使用することができる。一部の実施形態では、本明細書で提供される架橋レシリン組成物は、タイヤ及びインナーチューブに使用することができる。一部の実施形態では、本明細書で提供される架橋レシリン組成物は、スーパーボールに使用することができる。一部の実施形態では、本明細書で提供される架橋レシリン組成物は、靴のインソール、ミッドソール、及びアウトソールに使用することができる。一部の実施形態では、本明細書で提供される架橋レシリン組成物は、パッド入りマットに使用することができる。一部の実施形態では、本明細書で提供される架橋レシリン組成物は、いくつかのタイプのガスケットまたはＯリングに使用することができる。一部の実施形態では、本明細書で提供される架橋レシリン組成物は、耐衝撃性を高めるために、プラスチック製品に添加することができる。一部の実施形態では、本明細書で提供される架橋レシリン組成物は、電話またはタブレットケースなどの保護ケースに使用することができる。一部の実施形態では、本明細書で提供される架橋レシリン組成物は、ゴム印に使用することができる。一部の実施形態では、本明細書で提供される架橋レシリン組成物は、ローラーに使用することができる。一部の実施形態では、本明細書で提供される架橋レシリン組成物は、ゴムバンドに使用することができる。
【０１０２】
一部の実施形態では、本明細書で提供される架橋されたレシリン組成物は、靴のソール、地下室の床、音楽スタジオのためのノイズ保護、自動車バンパー、クッションパッド、ドアマット、ヨガマット、ドラムパッド、ウィンドウワイパー、自動車タイヤ、消火ホース、電気配線絶縁材、ゴムバンド、ゴム製アヒル、弾性手袋、調理器具、レインブーツ、歯がため、自転車タイヤ、時計、瓶、ガスケット、ヘアタイ、フリップフロップ、電話ケース、メディシンボール、スーパーボール、水または埃からの汚染を防ぐ電子デバイス用のシール、冷蔵庫または冷凍庫のドアシール、チャンバーの中または外への空気の流れを防止するシール、トランポリン、おしゃぶり、窓シール、ハロウィーンマスク、ガーデンホース、卓球ラケット、コンベアベルト、ダクト、スタンプ、バルーン、皮膚及び髪のケア及び保護のための化粧品組成物、ネイル組成物、または装飾化粧品の調製に使用することができる。
【０１０３】
好適な皮膚化粧品組成物は、例えば、フェイストニック、フェイシャルマスク、例えばシートマスク、デオドラント、及び他の化粧品ローションである。装飾化粧品に使用される組成物は、例えば、コンシーラースティック、ステージメイクアップ、マスカラ及びアイシャドウ、口紅、コールペンシル、アイライナー、ほお紅、パウダー、及び眉ペンシルを含む。
【０１０４】
使用分野に応じて、本明細書に記載の組成物は、例えば、クリーム、フォーム、ゲル、スティック、ムース、ミルク、スプレー（ポンプスプレーもしくは噴射剤含有スプレー）またはローションなどのスキンケアに適する形態で適用することができる。
【０１０５】
図１は、天然レシリンの例を示し、これは、コンセンサスアミノ酸配列ＹＧＸＰ（「Ａリピート」）（Ｘは任意のアミノ酸である）を含む複数のリピート単位を含むＮ末端Ａドメイン、キチン結合型ＲＲ−２（Ｃ）ドメイン（Ｐｆａｍ参照番号ＰＦ００３７９、Ｒｅｂｅｒｓ  ＪＥ  ＆  Ｗｉｌｌｉｓ，ＪＨ．Ａ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｎ  ａｎｔｈｒｏｐｏｄ  ｃｕｔｉｃｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｉｎｄｓ  ｃｈｉｔｉｎ．Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３１：１０８３−１０９３）、及びコンセンサスアミノ酸配列ＵＹＺＸＺ（「Ｂリピート」）（式中、Ｕはグリシンまたはセリンであり、Ｚはセリン、グリシン、アルギニン、またはプロリンであり、Ｘは任意のアミノ酸である）を含む複数のリピート単位を含むＣ末端Ｂドメインを含有する。全ての天然に存在するレシリンが、Ａドメイン、Ｃドメイン、及びＢドメインを有するわけではない。種々の昆虫により産生される天然レシリンは通常、不正確なリピート（すなわち、準リピート）を、Ａドメイン及び／またはＢドメイン内に、準リピート間にいくらかのアミノ酸変動を伴って有する。
【０１０６】
一部の実施形態では、本明細書で提供される組み換えレシリンは、１つ以上のＡリピートを含む。一部の実施形態では、組み換えレシリンは、それぞれコンセンサス配列ＳＸＸＹＧＸＰ（式中、Ｓはセリンであり、Ｘはアミノ酸であり、Ｙはチロシンであり、Ｇはグリシンであり、Ｐはプロリンである）を有するＡリピート及び／または準Ａリピートアミノ酸部分配列の複数のブロックを含むＮ末端Ａドメインを含む。
【０１０７】
一部の実施形態では、本明細書で提供される組み換えレシリンは、１つ以上のＢリピートを含む。一部の実施形態では、組み換えレシリンは、それぞれコンセンサス配列ＧＹＺＸＺＺＸ及び／またはＳＹＺＸＺＺＸ（式中、Ｇはグリシンであり、Ｙはチロシンであり、Ｚはセリン、グリシン、プロリン、またはアルギニンであり、Ｓはセリンであり、Ｘは任意のアミノ酸である）を有するＢリピート及び／または準Ｂリピートアミノ酸部分配列の複数のブロックを含むＣ末端Ｂドメインを含む。
【０１０８】
一部の実施形態では、本明細書で提供される組み換えレシリンは、１つ以上のＡリピートを含む。そのような一部の実施形態では、組み換えレシリンは、１〜１００のＡリピート、または２〜５０のＡリピート、または５〜５０のＡリピート、または５〜２０のＡリピートを含む。
【０１０９】
一部の実施形態では、組み換えレシリンは、式
（Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４）ｎ（１）
により記載される１つ以上のコンセンサス配列を含み、
式中、括弧はコンセンサス配列のリピートまたは準リピートを示し、
ｎはＡリピートまたは準Ａリピートの数を記載し、１〜１００、または２〜５０、または５〜５０、または５〜２０であり、
Ｘ１は４アミノ酸長のモチーフであって、Ｘ１の第１のアミノ酸はＹであり、Ｘ１の残りのアミノ酸はＧＡＰ、ＧＬＰ、ＧＰＰ、ＧＴＰ、またはＧＶＰであり、
Ｘ２は３〜２０アミノ酸長のモチーフであり、
Ｘ２はＧＧＧ、ＧＧＧＧ、Ｎ、ＮＧ、ＮＮ、ＮＧＮ、ＮＧＮＧ、ＧＱＧＧ、ＧＱＧＮ、ＧＱＧＱ、ＧＱＧＱＧ、もしくは３つ以上のグリシン残基を含むか、または、Ｘ２の残基の５０％以上が、グリシンもしくはアスパラギンのいずれかであるか、または、Ｘ２の残基の６０％以上が、グリシンもしくはアスパラギンのいずれかであるか、またはＸ２の残基の７０％以上が、グリシンもしくはアスパラギンのいずれかであるか、またはＸ２の残基の８０％以上が、グリシンもしくはアスパラギンのいずれかであり、
Ｘ３は２〜６アミノ酸長のモチーフであり、Ｘ３はＧＧ、ＬＳ、ＡＰＳ、ＧＡＧ、ＧＧＧ、ＫＰＳ、ＲＰＳ、またはＧＧＧＧであり、
Ｘ４は１〜２アミノ酸長のモチーフであり、Ｘ４はＳ、Ｄ、Ｔ、Ｎ、Ｌ、ＤＳ、ＤＴ、ＬＳ、ＳＳ、ＳＴ、ＴＮ、またはＴＳである。
【０１１０】
そのような一部の実施形態では、組み換えレシリンは、モチーフＸ１、Ｘ２、Ｘ３、及びＸ４を含むが、他の実施形態では、組み換えレシリンは、モチーフＸ１、Ｘ２、Ｘ３、もしくはＸ４、またはそれらの組み合わせを含む。
【０１１１】
一部の実施形態では、本明細書で提供される組み換えレシリンは、１つ以上のＢリピートを含む。そのような一部の実施形態では、組み換えレシリンは、１〜１００のＢリピート、または２〜５０のＡリピート、または５〜５０のＡリピート、または５〜２０のＡリピートを含む。
【０１１２】
一部の実施形態では、組み換えレシリンは、式
（Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３）ｍ（２）
により記載される１つ以上のコンセンサス配列を含み、
式中、括弧はコンセンサス配列のリピートまたは準リピートを示し、
ｍはＢ−リピートまたは準Ｂ−リピートの数を記載し、１〜１００であり、
Ｘ１１は１〜５アミノ酸長のモチーフであり、第１のアミノ酸はＹであり、残りのアミノ酸はＧＡＰ、ＧＰＰ、ＳＳＧ、またはＳＧＧを含み得、
Ｘ１２は２〜５アミノ酸長のモチーフであり、ＧＱ、ＧＮ、ＲＰＧ、ＲＰＧＧＱ、ＲＰＧＧＮ、ＳＳＳ、ＳＫＧ、またはＳＮを含み、
Ｘ１３は４〜３０アミノ酸長のモチーフであり、ＧＧ、ＤＬＧ、ＧＦＧ、ＧＧＧ、ＲＤＧ、ＳＧＧ、ＳＳＳ、ＧＧＳＦ、ＧＮＧＧ、ＧＧＡＧＧ、もしくは３以上のグリシン残基を含むか、または３０％以上の残基がグリシンであるか、もしくは４０％以上の残基がグリシンであるか、もしくは５０％以上の残基がグリシンであるか、もしくは６０％以上の残基がグリシンである。
【０１１３】
そのような一部の実施形態では、組み換えレシリンは、モチーフＸ１１、Ｘ１２、及びＸ１３を含むが、そのような他の実施形態では、組み換えレシリンは、モチーフＸ１１、Ｘ１２、もしくはＸ１３、またはそれらの組み合わせを含む。
【０１１４】
一部の実施形態では、本明細書で提供される組み換えレシリンは、１つ以上のＡリピート、１つ以上のＢリピート、及び／または１つ以上のＣドメインを含む。一部の実施形態では、組み換えレシリンは、１つ以上のＡリピートまたは１つ以上のＢリピートを含むが、両方は含まない。一部の実施形態では、組み換えレシリンは、１つ以上のＡリピートを含むが、ＢリピートとＣドメインのどちらも含まない。一部の実施形態では、組み換えレシリンは、１つ以上のＢリピートを含むが、ＡリピートとＣドメインのどちらも含まない。組み換えレシリンがＣドメインを含む実施形態では、Ｃドメインは、ＡリピートまたはＢリピートのＮ末端側またはＣ末端側のいずれかに、またはＡリピート及びＢリピート間に、配置することができる。
【０１１５】
一部の実施形態では、組み換えレシリンはさらに、配列ＸＸＥＰＰＶＳＹＬＰＰＳ（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）を含む。そのような一部の実施形態では、配列は、ＡリピートまたはＢリピートのＮ末端側に位置する。
【０１１６】
一部の実施形態では、組み換えレシリンは、非天然環境で発現される全長天然レシリンである。一部の実施形態では、組み換えレシリンは、天然レシリンの短縮バージョンを含む。一部の実施形態では、短縮型天然レシリンは、少なくとも１つのＡリピートを含む。一部の実施形態では、短縮型天然レシリンは、少なくとも１つのＢリピートを含む。全長及び短縮型天然レシリンの非限定例は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜４４として提供される。一部の実施形態では、組み換えレシリンは、全長のセイシェルショウジョウバエレシリン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）である。一部の実施形態では、組み換えレシリンは、短縮型パナマハキリアリレシリン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）である。一部の実施形態では、組み換えレシリンは、非天然の方法で架橋（例えば、より少ないかより多い架橋、異なるアミノ酸残基を介した架橋）される全長または短縮型天然レシリンである。
【０１１７】
一部の実施形態では、組み換えレシリンは、改変全長または短縮型天然レシリンである。一部の実施形態では、組み換えレシリンは、全長または短縮型天然レシリンと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一である。一部の実施形態では、組み換えレシリンは、全長セイシェルショウジョウバエレシリン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一である。一部の実施形態では、組み換えレシリンは、短縮型パナマハキリアリレシリン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一である。
【０１１８】
ヌクレオチド配列またはタンパク質配列同一性を測定するために使用することができる当該技術分野で既知のいくつかの異なるアルゴリズムが存在する。例えば、ポリヌクレオチド配列は、ウィスコンシンパッケージバージョン１０．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、ウィスコンシン州マディソンのプログラムであるＦＡＳＴＡ、Ｇａｐ、またはＢｅｓｔｆｉｔを使用して比較することができる。ＦＡＳＴＡは、クエリー及び検索配列の間で最も重複する領域のアラインメント及びパーセント配列同一性を提供する。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３−９８，１９９０（全体が本明細書で参照により組み込まれる）を参照のこと。例えば、核酸配列間のパーセント配列同一性は、デフォルトのパラメーター（ワードサイズ６及びスコアリングマトリックスのＮＯＰＡＭファクター）で、ＦＡＳＴＡを使用して、または参照により本明細書に組み込まれるＧＣＧバージョン６．１で提供されるデフォルトのパラメーターで、Ｇａｐを使用して決定することができる。あるいは、配列は、コンピュータープログラムのＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０、Ｇｉｓｈ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２，１９９３、Ｍａｄｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１，１９９６；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７、Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６４９−６５６，１９９７）、特に、ｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）を使用して比較することができる。
【０１１９】
一部の実施形態では、改変レシリンは、改変レシリンが全長または短縮型天然レシリンと異なる位置及び／または異なる量及び／または異なるタイプの翻訳後修飾を１つ以上有するように、全長または短縮型天然レシリンと、翻訳後修飾される（例えば、グリコシル化、リン酸化）アミノ酸残基が異なる。一部の実施形態では、改変レシリンは、改変レシリンが全長または短縮型の天然レシリンとは異なる、架橋に関与する１つ以上の位置及び／または異なる量及び／または異なるタイプのアミノ酸を有するように、架橋に関与するアミノ酸残基が全長または短縮型天然レシリンとは異なる。そのような一部の実施形態では、改変レシリンは、１つ以上の追加またはより少ないチロシン残基、１つ以上の追加またはより少ないリジン残基、及び／または１つ以上の追加またはより少ないシステイン残基を含む点で、全長または短縮型天然レシリンとは異なる。
【０１２０】
一部の実施形態では、組み換えレシリンは、連結される天然もしくは短縮型天然レシリンまたは連結される改変レシリンを含む。一部の実施形態では、連結される天然もしくは短縮型天然レシリンまたは連結される改変レシリンは、少なくとも２つのＡリピート（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）を含む。一部の実施形態では、連結される短縮型天然レシリンもしくは連結される改変レシリンは、少なくとも２つのＢリピート（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）を含む。
【０１２１】
タンパク質の定量及び純度分析
一部の実施形態では、組成物中の全長レシリンの総量は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、逆相高速液体クロマトグラフィー、または当該技術分野で既知の他の方法（例えば、定量的ウェスタンブロット）で決定される。種々の実施形態では、同じまたは類似のアッセイが、単量体及び凝集体形態の全長レシリンの相対量を評価するために使用されてもよい。
【０１２２】
本明細書に記載されるように、特定の実施形態では、レシリン組成物中のレシリンの優勢な種（すなわち、単量体全長レシリン）の相対量を特徴付けるデータは、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）から、以下のように決定される。レシリン粉末を５Ｍのグアニジンチオシアナートに溶解させ、Ｙａｒｒａ  ＳＥＣ−３０００  ＳＥＣ−ＨＰＬＣカラム上に注入して、分子量に基づいて成分を分離する。屈折率が、検出モダリティとして使用される。ＢＳＡが、全てのタンパク質の９０％超が互いに約７％以内のｄｎ／ｄｃ値（屈折率の応答係数）を示すという仮定の下で、一般的なタンパク質標準として使用される。ポリ（エチレンオキシド）が、保持時間標準として使用され、ＢＳＡ較正物質が、方法の一貫した性能を保証するためにチェック標準として使用される。単量体全長レシリンに対応する範囲は、６０〜４０ｋＤａから評価され、凝集または重合した全長レシリンに対応し得る観察されたより高いピークは、この定量化には含まれない。このレシリンピークの相対的なパーセンテージは、総レシリンの一部としての組成物中の全長レシリンの量を決定するために、質量％及び面積％として報告される。
【０１２３】
架橋
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法はさらに、組み換えレシリンを架橋して、本明細書で提供される組み換えレシリン組成物を得るステップ（図２のステップ１００５）を含む。架橋剤を含む所望の溶媒中の組み換えレシリンを小さな成形型に充填して、架橋後に得られる固体の形状を制御することができる。得られた組み換えレシリン固体の例が図４に示される。
【０１２４】
一部の実施形態では、架橋は、チロシン残基を介して達成される。レシリンは、長さの大部分にわたって１５〜２４アミノ酸毎にチロシン残基を有する。一部の実施形態では、レシリンの架橋は、レシリン中でジチロシン及びトリチロシン架橋を生成して、レシリン固体を形成する。
【０１２５】
他の実施形態では、架橋は、リジン残基を介して達成される。一部の実施形態では、架橋は、システイン残基を介して達成される。一部の実施形態では、架橋は、トランスグルタミナーゼを用いる（例えば、Ｋｉｍ  Ｙ，Ｇｉｌｌ  ＥＥ，Ｌｉｕ  ＪＣ．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｒｅｓｉｌｉｎ−Ｂａｓｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．１７（８）：２５３０−９を参照のこと）。一部の実施形態では、架橋は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を用いる（ＭｃＧａｎｎ  ＣＬ，Ｌｅｖｅｎｓｏｎ  ＥＡ，Ｋｉｉｃｋ  ＫＬ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．２０１３，２１４，２０３−１３；ＭｃＧａｎｎ  ＣＬ，Ａｋｉｎｓ  ＲＥ，Ｋｉｉｃｋ  ＫＬ．Ｒｅｓｉｌｉｎ−ＰＥＧ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  Ｙｉｅｌｄ  Ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｅｌａｓｔｏｍｅｒｉｃ  Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ｗｉｔｈ  Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１６；１７（１）：１２８−４０）。
【０１２６】
一部の実施形態では、組み換えレシリンは、酵素的架橋を介して（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼを使用して）架橋される。この方法はレシリンの大きな溶液を効率的に架橋し得るが、得られる架橋生成物は、架橋されたレシリン固体に共有結合で組み込まれた活性酵素を含む。これにより、レシリンのタンパク質骨格を分解するラジカル連鎖反応が生じる。
【０１２７】
他の実施形態では、組み換えレシリンは、光化学的架橋を介して架橋される（例えば、Ｅｌｖｉｎ  ＣＭ，Ｃａｒｒ  ＡＧ，Ｈｕｓｏｎ  ＭＧ，Ｍａｘｗｅｌｌ  ＪＭ，Ｐｅａｒｓｏｎ  ＲＤ，Ｖｕｏｃｏｌｏ  Ｔ，Ｌｉｙｏｕ  ＮＥ，Ｗｏｎｇ  ＤＣＣ，Ｍｅｒｒｉｔｔ  ＤＪ，Ｄｉｘｏｎ  ＮＥ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００５，４３７，９９９−１００２、Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  ＪＬ，Ｄｕｔｔａ  ＮＫ，Ｅｌｖｉｎ  ＣＭ，Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ  ＮＲ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂ  ２０１５，３，６５７６−７９、Ｄｅｇｔｙａｒ  Ｅ，Ｍｌｙｎａｒｃｚｙｋ  Ｂ，Ｆｒａｔｚｌ  Ｐ，Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ＭＪ．Ｐｏｌｙｍｅｒ  ２０１５，６９，２５５−６３を参照のこと）。
【０１２８】
この架橋反応はまた、材料から完全に透析することが困難である活性な触媒のレシリン固体への組み込みをもたらし、比較的高い触媒負荷を使用し、型を通して光活性化が困難であり得る反応には効率的ではない。
【０１２９】
分解を防ぎ、エネルギー吸収の量及び形態が重要である、ある特定の用途のために好ましい一部の機械的特性を有する固体物質を作る新しい組み換えレシリンの架橋化学作用が本明細書で提供される。
【０１３０】
好ましい実施形態では、組み換えレシリンは、過硫酸アンモニウムを含む溶媒及び熱の適用（例えば、約８０℃の温度で約２．５時間のインキュベーション）を介して架橋される。この架橋反応は、効率的であり、レシリン固体中に活性触媒を残さず、タンパク質の分解が少ない組成物が得られる。
【０１３１】
一部の実施形態では、レシリン架橋反応のための過硫酸アンモニウムの最終濃度は、約３０〜４０ｍＭである。一部の実施形態では、過硫酸アンモニウム及びレシリンを含む架橋溶液は、望ましい機械的特性を備えた固体を形成するのに十分な架橋を促進するために、少なくとも１５分、少なくとも３０分、少なくとも６０分、少なくとも９０分、または少なくとも２時間インキュベートされる（すなわち、熱に曝露される）。一部の実施形態では、他の過硫酸塩が使用される。
【０１３２】
一部の実施形態では、過硫酸アンモニウム及びレシリン組成物溶液に加えられる熱は、少なくとも４０℃、少なくとも４５℃、少なくとも５０℃、少なくとも５５℃、少なくとも６０℃、少なくとも６５℃、少なくとも７０℃、少なくとも７５℃、または少なくとも８０℃である。一部の実施形態では、過硫酸アンモニウム及びレシリンの架橋溶液に加えられる熱は、５０℃〜９０℃または６０℃〜９０℃または７０℃〜９０℃または７５℃〜８５℃または７０℃〜８０℃である。一部の実施形態では、架橋溶液は、酵素触媒を含まない。一部の実施形態では、架橋溶液は、光活性触媒を含まない。
【０１３３】
一部の実施形態では、架橋溶液は、総架橋溶液の少なくとも１重量％、５重量％、１０重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、４５重量％、もしくは５０重量％のレシリン、総架橋溶液の１重量％から１００重量％、９０重量％、８０重量％、７０重量％、６０重量％、５０重量％、４０重量％、３０重量％、２０重量％、もしくは１０重量％、１０重量％から１００重量％、９０重量％、８０重量％、７０重量％、６０重量％、５０重量％、４０重量％、３０重量％、もしくは２０重量％、２０重量％から１００重量％、９０重量％、８０重量％、７０重量％、６０重量％、５０重量％、４０重量％、もしくは３０重量％、３０重量％から１００重量％、９０重量％、８０重量％、７０重量％、６０重量％、５０重量％、もしくは４０重量％、４０重量％から１００重量％、９０重量％、８０重量％、７０重量％、６０重量％、もしくは５０重量％、５０重量％から１００重量％、９０重量％、８０重量％、７０重量％、もしくは６０重量％、６０重量％から１００重量％、９０重量％、８０重量％、もしくは７０重量％、７０重量％から１００重量％、９０重量％、もしくは８０重量％、８０重量％から１００重量％もしくは９０重量％、または９０重量％から１００重量％を占める。好ましい実施形態では、レシリンは、２０重量％〜３０重量％のレシリンの濃度まで架橋溶液に溶解される。一部の実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で測定した場合、総レシリンは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の全長レシリンを含む。
【０１３４】
溶媒交換レシリン固体
架橋レシリンは水性溶媒中で形成することができ、エネルギー吸収及び剛性が望まれるある特定の用途にはあまり適さない低硬度及び弾性率を有する組成物をもたらす。一部の実施形態では、溶媒交換が、水性溶媒を極性非水溶媒と置き換えて、所望の材料特性を提供するために、架橋レシリン組成物に対して実施される。一部の実施形態では、極性非水溶媒は、グリセロール、プロピレングリコール、エチレングリコール、またはＤＭＳＯを含む。一部の実施形態では、非水溶媒は、水混和性である。一部の実施形態では、非水溶媒は、非揮発性溶媒である。一部の実施形態では、非水溶媒は、複数のアルコール官能基を有する分子を含む。一部の実施形態では、非水溶媒は、分子量が約１００ｇ／ｍｏｌ未満の分子（複数可）を少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％含む。本明細書に記載されるように、弾性率、硬度、最大弾性圧縮荷重、弾性、及び材料寿命／疲労を含む架橋レシリン組成物の材料特性を、溶媒交換を使用して調整することができる。架橋レシリンと溶媒交換を行うことができる溶媒には、非架橋形態でレシリンを溶解させる溶媒を含む。
【０１３５】
一部の実施形態では、レシリンの水性溶媒を極性非水溶媒と置き換える溶媒交換は、熱の存在下で、例えば、約６０℃の温度で実施される。一部の実施形態では、溶媒交換プロセスは、レシリン固体に対して少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍の体積の交換溶媒を含有する溶液中で実施される。一部の実施形態では、溶媒交換は、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも８時間、少なくとも１６時間、少なくとも２４時間、または少なくとも４８時間実施される。一部の実施形態では、グリセロール、プロピレングリコール、エチレングリコール、またはＤＭＳＯが、架橋レシリン固体組成物の交換溶媒として使用される。
【０１３６】
一部の実施形態では、交換溶媒の選択及び使用される濃度は、溶媒設計から、剛性などの所望の調整可能な機械的特性を達成するように選択される。これは、所望の用途（例えば、靴のソール、ゴルフボールなど）に応じて選択することができる。
【０１３７】
一部の実施形態では、上記の溶媒交換プロセスにより、非水溶媒中で形成された架橋レシリン組成物は、少なくとも１０日間、少なくとも２０日間、少なくとも３０日間、少なくとも４０日間、または少なくとも５０日室温で安定である。一部の実施形態では、上記の溶媒交換プロセスにより、非水溶媒中で形成された架橋レシリン組成物は、少なくとも１０日間、少なくとも２０日間、少なくとも３０日間、少なくとも４０日間、または少なくとも５０日間、カビの成長に対して耐性を示す。一部の実施形態では、上記の溶媒交換プロセスにより、非水溶媒中で形成された架橋レシリン組成物は、少なくとも７日間または少なくとも１４日間、脱水に対して耐性を示す。対照的に、水系架橋レシリン固体は、周囲条件下で開放環境に保存した場合、２週間以内に完全に脱水し、５〜１４日以内にカビを成長させることが観察された。さらに、水系レシリン固体の１０ｍｍ×５ｍｍディスクは、２２０ｌｂの力が加えられる場合に壊れるが、グリセロール系レシリン固体の１０ｍｍ×５ｍｍディスクは、２２０ｌｂの力の下では壊れない。
【０１３８】
一部の実施形態では、連続的に試験される材料間の相対的な材料特性は、レオメーターを使用して試験することができる。例えば、架橋レシリン組成物は、シリンダー型内で形成されていてもよく、得られたレシリンシリンダーは、レオメーターを使用して圧縮試験にかけられる。組み換えレシリンシリンダーは、破損することなく、開始の高さ７．３ｍｍ（平均幅５．４ｍｍ）から０．６６ｍｍ未満に圧縮することができる。図５に示されるように、圧縮荷重の解放時に、シリンダーは、６．７ｍｍの高さ（平均幅５．６ｍｍ）に戻った。
【０１３９】
一部の実施形態では、極性非水溶媒は、該溶媒の極性非水性組成物の、少なくとも５０体積％、少なくとも６０体積％、少なくとも７０体積％、少なくとも８０体積％、少なくとも９０体積％、少なくとも９５体積％、少なくとも９８体積％、または少なくとも９９体積％を構成する。一部の実施形態では、溶媒は、該溶媒の、少なくとも５０体積％、少なくとも６０体積％、少なくとも７０体積％、少なくとも８０体積％、少なくとも９０体積％、少なくとも９５体積％、少なくとも９８体積％、または少なくとも９９体積％のグリセロール、プロピレングリコール、エチレングリコール、またはＤＭＳＯを含む。
【０１４０】
一部の実施形態では、本明細書で提供される組み換えレシリン組成物は、水性溶媒中の架橋組み換えレシリンよりも大きい弾性率を有する。
【０１４１】
一部の実施形態では、本明細書で提供される架橋レシリン組成物は、５０以上、４０以上、３０以上、２０以上、１０以上、１０から５０、４０、３０、もしくは２０、２０から５０、４０、もしくは３０、３０から５０もしくは４０、または４０から５０のＳｈｏｒｅ  ＯＯ硬度を有する。一部の実施形態では、レシリンの硬度測定は、ＡＳＴＭ  Ｄ２２４０に従って実施される。一部の実施形態では、ＡＳＴＭ  Ｄ２２４０によりＳｈｏｒｅ  ＯＯデュロメーターを使用して測定した場合、組み換えレシリン組成物は、少なくとも１０の硬度を含む。一部の実施形態では、ＡＳＴＭ  Ｄ２２４０によりＳｈｏｒｅ  ＯＯデュロメーターを使用して測定した場合、組み換えレシリン組成物は、少なくとも３０の硬度を含む。一部の実施形態では、ＡＳＴＭ  Ｄ２２４０によりＳｈｏｒｅ  ＯＯデュロメーターを使用して測定した場合、組み換えレシリン組成物は、約１０〜約５０の硬度を含む。一部の実施形態では、架橋レシリン組成物の硬度は、整形外科用ソールに匹敵する。
【０１４２】
一部の実施形態では、ＡＳＴＭ  Ｄ７１２１で測定した場合、組み換えレシリン組成物は、約４０％〜約６０％の反発弾性を含む。
【０１４３】
一部の実施形態では、ＡＳＴＭ  Ｄ５７５により測定した場合、組み換えレシリン組成物は、約６ｐｓｉ〜約８ｐｓｉの２５％での圧縮応力を含む。
【０１４４】
一部の実施形態では、Ｚｗｉｃｋ圧縮試験により測定した場合、組み換えレシリン組成物は、２ｋＮ未満の圧縮力で弾性から塑性へ遷移しない。
【０１４５】
一部の実施形態では、弾性、圧縮弾性率、引張弾性率、剪断弾性率、破断伸び、最大引張強さ、硬度、剛性、及び反発などのレシリン固体材料特性は、使用される溶媒及び溶媒交換の実施される方法に基づいて調整することができる。例えば、グリセロールは、勾配を用いるか、または用いずに、レシリン固体へ交換でき、異なる材料特性をもたらす。レシリン固体中のレシリンの濃度及び全レシリンの一部としての全長レシリンの量もまた、架橋レシリン固体組成物の材料特性に影響を与えるように調整することができる。
【０１４６】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるように、水系レシリン組成物（すなわち、水性溶媒中の架橋レシリン組成物）を極性非水系レシリン組成物（すなわち、極性非水溶媒中の架橋レシリン組成物）と置き換える溶媒交換は、同様の弾性及び同様の伸縮性を有するより堅い材料をもたらす。
【０１４７】
一部の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、少なくとも５重量％、少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも３５重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも４５重量％、少なくとも５０重量％、少なくとも５５重量％、少なくとも６０重量％、少なくとも６５重量％、少なくとも７０重量％、少なくとも７５重量％、少なくとも８０重量％、少なくとも８５重量％、少なくとも９０重量％、少なくとも９５重量％、１０重量％と１００重量％、９０重量％、８０重量％、７０重量％、６０重量％、５０重量％、４０重量％、３０重量％、もしくは２０重量％の間、２０重量％と１００重量％、９０重量％、８０重量％、７０重量％、６０重量％、５０重量％、４０重量％、もしくは３０重量％の間、３０重量％と１００重量％、９０重量％、８０重量％、７０重量％、６０重量％、５０重量％、もしくは４０重量％の間、４０重量％と１００重量％、９０重量％、８０重量％、７０重量％、６０重量％、もしくは５０重量％の間、５０重量％と１００重量％、９０重量％、８０重量％、７０重量％、もしくは６０重量％の間、６０重量％と１００重量％、９０重量％、８０重量％、もしくは７０重量％の間、７０重量％と１００重量％、９０重量％、もしくは８０重量％の間、８０重量％と１００重量％もしくは９０重量％の間、または９０重量％と１００重量％の間の組み換えレシリンを含む。組み換えレシリンは、同一の組み換えレシリン、または少なくとも２つの異なるアミノ酸配列を有する組み換えレシリンの混合物であり得る。
【０１４８】
一部の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、各組成物中に総レシリンの一部として、少なくとも５重量％、少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも３５重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも４５重量％、少なくとも５０重量％、少なくとも５５重量％、少なくとも６０重量％、少なくとも６５重量％、少なくとも７０重量％、少なくとも７５重量％、少なくとも８０重量％、少なくとも８５重量％、少なくとも９０重量％、少なくとも９５重量％、１０重量％と１００重量％、９０重量％、８０重量％、７０重量％、６０重量％、５０重量％、４０重量％、３０重量％、もしくは２０重量％の間、２０重量％と１００重量％、９０重量％、８０重量％、７０重量％、６０重量％、５０重量％、４０重量％、もしくは３０重量％の間、３０重量％と１００重量％、９０重量％、８０重量％、７０重量％、６０重量％、５０重量％、もしくは４０重量％の間、４０重量％と１００重量％、９０重量％、８０重量％、７０重量％、６０重量％、もしくは５０重量％の間、５０重量％と１００重量％、９０重量％、８０重量％、７０重量％、もしくは６０重量％の間、６０重量％と１００重量％、９０重量％、８０重量％、もしくは７０重量％の間、７０重量％と１００重量％、９０重量％、もしくは８０重量％の間、８０重量％と１００重量％もしくは９０重量％の間、または９０重量％と１００重量％の間の全長組み換えレシリンを含む。
【０１４９】
一部の実施形態では、組み換えレシリン組成物は、発泡材料である。一部の実施形態では、架橋レシリン組成物は、発泡材料、例えば、発泡固体である。一部の実施形態では、発泡材料は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の多孔度を含む。本明細書に記載されるように、多孔度は、その質量の体積に対する材料の隙間の体積のパーセンテージを指す。一部の実施形態では、本明細書に記載の発泡材料の密度は、非発泡材料の密度の少なくとも１／３、例えば、非発泡架橋レシリン組成物の密度の少なくとも１／２、少なくとも３／４、または少なくとも２倍である。一部の実施形態では、本明細書に記載の発泡材料中の気泡の平均直径は、約０．０１ｍｍ〜約３ｍｍ、例えば、約０．０２ｍｍ〜約１ｍｍ、約０．０５ｍｍ〜約２ｍｍ、約０．１ｍｍ〜約３ｍｍ、約０．２ｍｍ〜約４ｍｍ、約０．５ｍｍ〜約５ｍｍ、約１ｍｍ〜約１．５ｍｍ、または約１．５ｍｍ〜約２ｍｍである。
【０１５０】
一部の実施形態では、組み換えレシリン組成物は、発泡材料の１つ以上の層を含む。一部の実施形態では、発泡材料の１つ以上の層は、所望の順序で、例えば、支持層が発泡材料の２層間に配置される、連続的または交互の構成で構成される。発泡材料の１つ以上の層は、当該技術分野で既知の任意の方法、例えば、噴霧乾燥、射出成形、で配置されてもよい。一部の実施形態では、発泡材料の１つ以上の層は、１つ以上の空隙を含む。各層のトポグラフィー及び一緒に重なる発泡材料の１つ以上の層の傾向は、異なってもよい。一部の実施形態では、空隙は、空気の流れを導き、追加の吸収能力を提供するのを助けるように、１つ以上の側に流路を提供してもよい。
【０１５１】
機械的特性
他の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、架橋レシリンを含む組成物と比較して異なる特性を有する。一部の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、合成弾性材料と比較して同様の特性を有する。そのような特性の非限定例としては、弾性、圧縮弾性率、引張弾性率、剪断弾性率、硬度、反発、及び圧縮永久ひずみが挙げられる。特定の機械的特性を有する組成物を得るように改変することができるパラメーターは、例えば、組み換えレシリンの長さ及び／または配列、組み換えレシリンの翻訳後修飾の程度及び／またはタイプ、組み換えレシリンの架橋の程度及び／またはタイプ、ならびに架橋レシリン組成物の溶媒の性質を含む。
【０１５２】
一部の実施形態では、エラストマー試料の応力−ひずみ測定を行う多くの異なるタイプの引張及び圧縮システムを使用して、最大引張強度、圧縮弾性率、引張弾性率、剪断弾性率、破断伸び、及び弾性などの機械的特性を測定することができる。ヒステリシスとの曲線を含む、得られる応力−ひずみ曲線は、引張りまたは圧縮で測定することができる。一部の実施形態では、張力及び圧縮試験システムは、試料にひずみを適用し、ロードセルを使用して得られる力を測定することができる。一部の実施形態では、機械的特性は、巨視的スケール（例えば、巨視的圧縮試験機を使用する）、微視的、またはナノスケール（例えば、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）またはナノ圧痕測定を使用する）で測定することができる。一部の実施形態では、エラストマーの圧縮機械的特性は、標準ＡＳＴＭ  Ｄ５７５−９１（２０１２）圧縮におけるゴム特性の標準試験法に従って測定することができる。引張りのエラストマーの機械的測定は、ＡＳＴＭ  Ｄ４１２−１５ａ加硫ゴム及び熱可塑性エラストマーの標準試験法−引張りを使用して実施することができる。一部の実施形態では、エラストマーの引き裂き強さは、ＡＳＴＭ  Ｄ６２４−００従来の加硫ゴム及び熱可塑性エラストマーの引き裂き強さに関する標準試験法を使用して実施することができる。一部の実施形態では、スラブ、結合、及び成形エラストマーの機械的特性は、ＡＳＴＭ  Ｄ３５７４−１１柔軟な細胞物質−スラブ、結合、及び成形ウレタン発泡体に関する標準試験法を使用して実施することができる。一部の実施形態では、エラストマーの機械的特性は、振動法を使用する加硫ゴム及びゴム様材料の動的試験のためのＡＳＴＭ  Ｄ５９９２−９６（２０１１）標準ガイドを使用して測定することができる。
【０１５３】
一部の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、または９５％超、５０％から１００％、９０％、８０％、７０％、もしくは６０％、６０％から１００％、９０％、８０％、もしくは７０％、７０％から１００％、９０％、もしくは８０％、８０％から１００％もしくは９０％、９０％から１００％、９５％から１００％、９０％から９９％、または９５％から９９％の弾性を有する。
【０１５４】
一部の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、１０ＭＰａ未満、７ＭＰａ未満、５ＭＰａ未満、２ＭＰａ未満、１ＭＰａ未満、０．５ＭＰａ未満、もしくは０．１ＭＰａ未満、０．０１ＭＰａから１０ＭＰａ、７ＭＰａ、５ＭＰａ、２ＭＰａ、１ＭＰａ、０．５ＭＰａ、もしくは０．１ＭＰａ、０．１ＭＰａから１０ＭＰａ、７ＭＰａ、５ＭＰａ、２ＭＰａ、１ＭＰａ、もしくは０．５ＭＰａ、０．５ＭＰａから１０ＭＰａ、７ＭＰａ、５ＭＰａ、２ＭＰａ、もしくは１ＭＰａ、１ＭＰａから１０ＭＰａ、７ＭＰａ、５ＭＰａ、もしくは２ＭＰａ、２ＭＰａから１０ＭＰａ、７ＭＰａ、もしくは５ＭＰａ、５ＭＰａから１０ＭＰａもしくは７ＭＰａ、または７ＭＰａから１０ＭＰａの圧縮弾性率を有する。一部の実施形態では、組成物の圧縮弾性率は、ＡＳＴＭ  Ｄ５７５−９１（２０１２）圧縮におけるゴム特性の標準試験法により定義されるように測定することができる。
【０１５５】
一部の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、１０ＭＰａ未満、７ＭＰａ未満、５ＭＰａ未満、２ＭＰａ未満、１ＭＰａ未満、０．５ＭＰａ未満、もしくは０．１ＭＰａ未満、０．０１ＭＰａから１０ＭＰａ、７ＭＰａ、５ＭＰａ、２ＭＰａ、１ＭＰａ、もしくは０．５ＭＰａ、０．５ＭＰａから１０ＭＰａ、７ＭＰａ、５ＭＰａ、２ＭＰａ、もしくは１ＭＰａ、１ＭＰａから１０ＭＰａ、７ＭＰａ、５ＭＰａ、もしくは２ＭＰａ、２ＭＰａから１０ＭＰａ、７ＭＰａ、もしくは５ＭＰａ、５ＭＰａから１０ＭＰａもしくは７ＭＰａ、または７ＭＰａから１０ＭＰａの引張弾性率を有する。
【０１５６】
一部の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、１ＭＰａ未満、１００ｋＰａ未満、５０ｋＰａ未満、２０ｋＰａ未満、１０ｋＰａ未満、もしくは１ｋＰａ未満、０．１ｋＰａから１ＭＰａ、１００ｋＰａ、５０ｋＰａ、２０ｋＰａ、１０ｋＰａ、もしくは１ｋＰａ、１ｋＰａから１ＭＰａ、１００ｋＰａ、５０ｋＰａ、２０ｋＰａ、もしくは１０ｋＰａ、１０ｋＰａから１ＭＰａ、１００ｋＰａ、５０ｋＰａ、もしくは２０ｋＰａ、２０ｋＰａから１ＭＰａ、１００ｋＰａ、もしくは５０ｋＰａ、５０ｋＰａから１ＭＰａもしくは１００ｋＰａ、または１００ｋＰａから１ＭＰａの剪断弾性率を有する。
【０１５７】
一部の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、１％超、１０％超、５０％超、１００％超、３００％超、もしくは５００％超、１％から５００％、３００％、１００％、５０％、もしくは１０％、１０％から５００％、３００％、１００％、もしくは５０％、５０％から５００％、３００％、もしくは１００％、１００％から５００％もしくは３００％、または３００％から５００％の破断伸びを有する。
【０１５８】
一部の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、０．１ｋＰａ超、１ｋＰａ超、２ｋＰａ超、５ｋＰａ超、もしくは１０ｋＰａ超、０．１ｋＰａから１００ｋＰａ、１０ｋＰａ、５ｋＰａ、２ｋＰａ、もしくは１ｋＰａ、１ｋＰａから１００ｋＰａ、１０ｋＰａ、５ｋＰａ、もしくは２ｋＰａ、２ｋＰａから１００ｋＰａ、１０ｋＰａ、もしくは５ｋＰａ、５ｋＰａから１００ｋＰａもしくは１０ｋＰａ、または１０ｋＰａから１００ｋＰａの最大引張強度を有する。
【０１５９】
一部の実施形態では、硬度及び圧縮弾性率などの機械的特性は、圧痕及びナノ圧痕測定システムを使用して測定することができる。一部の実施形態では、所与の量のひずみまで試料に食い込む先端を利用する圧痕測定は、硬度及びレシリンの圧縮弾性率を測定するために使用され、得られる力は、ロードセルを使用して測定される。一部の実施形態では、Ｖｉｃｋｅｒｓ及びＢｅｒｋｏｖｉｃｈ形状の先端を含む、様々な先端形状を使用することができる。一部の実施形態では、圧痕手法により測定された硬度は、硬度＝（ピーク力）／（接触面積）の関係により特徴付けられる。
【０１６０】
一部の実施形態では、ポリマー、エラストマー、及びゴムの硬度は、硬度計を使用して測定することができる。一部の実施形態では、エラストマーの硬度は、標準ＡＳＴＭ  Ｄ２２４０を使用して測定することができ、これは、特定のばね力及び圧子構成の組み合わせを使用する１２の異なるデュロメータースケールを承認する。最も一般的なスケールは、Ｓｈｏｒｅ  ＯＯ、Ａ、及びＤ硬度スケールである。硬度スケールは、０〜１００の範囲であり、０は、より柔らかい材料であり、１００は、より硬い材料である。
【０１６１】
一部の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、９０未満、８０未満、７０未満、６０未満、５０未満、４０未満、３０未満、もしくは２０未満、１０から９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、もしくは２０、２０から９０、８０、７０、６０、５０、４０、もしくは３０、３０から９０、８０、７０、６０、５０、もしくは４０、４０から９０、８０、７０、６０、もしくは５０、５０から９０、８０、７０、もしくは６０、６０から９０、８０、もしくは７０、７０から９０もしくは８０、または８０から９０のＳｈｏｒｅ  ＯＯ硬度を有する。一部の実施形態では、レシリンの硬度測定は、ＡＳＴＭ  Ｄ２２４０に従って実施される。
【０１６２】
本明細書で使用される場合、「反発」という用語は、特定の弾性の尺度を指す。一部の実施形態では、反発は、振り子ツール及びドロップボールを含むいくつかの様々なツールを用いて測定することができる。振り子タイプの測定では、一般に反発率と呼ばれるＲＢは、以下の式から決定される。
2021530522.tif 000003
【０１６３】
反発弾性は、以下の通り計算することができる：
2021530522.tif 000004
（式中、ｈ＝反発の頂点の高さ、Ｈ＝初期の高さ）。反発弾性は、リバウンドの角度を測定することによっても決定することができる。エラストマーの反発を決定するための試験法の一部の例は、ＡＳＴＭ  Ｄ２６３２−１５及びＡＳＴＭ  Ｄ７１２１−０５（２０１２）である。
【０１６４】
一部の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、もしくは９５％超、５０％から１００％、９０％、８０％、７０％、または６０％、６０％から１００％、９０％、８０％、または７０％、７０％から１００％、９０％、または８０％、８０％から１００％もしくは９０％、９０％から１００％、９５％から１００％、９０％から９９％、または９５％から９９％の反発を有する。一部の実施形態では、レシリンの反発測定は、ＡＳＴＭ  Ｄ２６３２−１５、またはＡＳＴＭ  Ｄ７１２１−０５（２０１２）に従って実施される。
【０１６５】
本明細書で使用される場合、「圧縮永久ひずみ」という用語は、加えられた力が除去された後に残存する永久変形の尺度を指す。一部の実施形態では、圧縮永久ひずみは、空気中で一定の力の下での圧縮永久ひずみ（圧縮永久ひずみＡと呼ばれる）、空気中で一定のたわみの下での圧縮永久ひずみ（圧縮永久ひずみＢと呼ばれる）、及び材料の硬度を考慮する空気中の一定のたわみの下での圧縮永久ひずみ（圧縮永久ひずみＣと呼ばれる）を含む、様々な方法で測定することができる。圧縮永久ひずみＡ（ＣＡ）は、以下の数式、ＣＡ＝［（ｔｏ−ｔｉ）／ｔｏ］×１００により計算される（式中、ｔｏは元の標本の厚さであり、ｔｉは試験中の標本の厚さである）。圧縮永久ひずみＢ（ＣＢ）は、ＣＢ＝［（ｔｏ−ｔｉ）／（ｔｏ−ｔｎ）］×１００で与えられる（式中、ｔｏは元の標本の厚さであり、ｔｉは試験後の標本の厚さであり、ｔｎは試験中のスペーサーの厚さまたは標本の厚さである）。エラストマーの圧縮永久ひずみを決定するための試験法の一部の例は、ＡＳＴＭ  Ｄ３５７４−１１及びＡＳＴＭ  Ｄ３９５−１６である。
【０１６６】
一部の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、もしくは９５％超、５０％から１００％、９０％、８０％、７０％、もしくは６０％、６０％から１００％、９０％、８０％、もしくは７０％、７０％から１００％、９０％、もしくは８０％、８０％から１００％もしくは９０％、９０％から１００％、９５％から１００％、９０％から９９％、または９５％から９９％の圧縮永久ひずみＡまたは圧縮永久ひずみＢを有する。一部の実施形態では、レシリンの圧縮永久ひずみ測定は、ＡＳＴＭ  Ｄ３５７４−１１及びＡＳＴＭ  Ｄ３９５−１６に従って実施される。
【０１６７】
レシリンの生成物への加工及び成形は、様々な用途に応じて多くの形態をとることができる。従って、本明細書で提供される組成物は、限定されないが、ゲル、多孔質スポンジ、フィルム、機械加工可能な固体、鋳造形態、成形形態、及び複合材料を含む任意の形状及び形態を有し得る。
【０１６８】
本明細書で使用される場合、「密度」という用語は、体積で除した試料の質量を指す。一部の実施形態では、エラストマーの密度は、気泡を除去するために水の代わりにアルコールを使用したピクノメーターを使用して決定することができる。一部の実施形態では、エラストマーの密度は、静水圧法を使用して決定することができる。本明細書で使用される場合、「圧縮体積密度」という用語は、試料質量対試料の圧縮体積の比を指し、「圧縮体積」は、ピストン−シリンダー試験チャンバーエンクロージャーの周囲の形状に完全に一致するまで自由に動かすのに十分な圧縮力にかけられる際に、エラストマー試料で達成される最終平衡体積として定義される。一部の実施形態では、エラストマーの圧縮体積密度は、圧縮体積密度計を使用して決定することができる。
【０１６９】
一部の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、０．５ｍｇ／ｃｍ３〜２．０ｍｇ／ｃｍ３、または１．０ｍｇ／ｃｍ３〜１．５ｍｇ／ｃｍ３、または１．１ｍｇ／ｃｍ３〜１．４ｍｇ／ｃｍ３、または１．２ｍｇ／ｃｍ３〜１．３５ｍｇ／ｃｍ３の密度または圧縮体積密度を有する。一部の実施形態では、エラストマーの密度または圧縮体積密度の決定は、ＡＳＴＭ  Ｄ２９７−１５ゴム生成物の標準試験法−化学分析を使用して実施することができる。
【０１７０】
本明細書で提供される組成物は、とりわけ、限定されないが、航空宇宙、自動車、スポーツ用品、防振、履物、及び衣類における用途を含む、いくつかの用途を有する。これらのカテゴリーの一部の用途を、非限定例として列挙する。望ましい弾性効率のために、レシリンは、機械的エネルギーを貯蔵及び回収するためのエネルギー貯蔵装置（例えば、ゴムバンド）として使用することができる。自動車のサスペンションシステムは、レシリンブッシングを適用することにより改善でき、高速で隆起を越え、窪みを通過する時に、路上でのタイヤのより多くの接触を維持する。さらに、ゴルフボールのコア、テニスラケットグリップ、ゴルフクラブグリップ、及び卓球パドルを含む、様々に調整された機械的特性を有するレシリンのいくつかのスポーツ用品用途がある。
【０１７１】
特に興味深い用途は、本明細書で提供されるレシリン組成物の独特の特性による履物である。インソールまたはミッドソールとして、レシリンは、フットストライクを緩衝すること、及び前方への運動量としてフットストライクするものからの多くのエネルギーを復元することにより、靴の快適さ及び生体効率を向上させ得る。ミッドソールとして、レシリンは、ミッドソール全体とするか、または特性を補完するために別の材料内にカプセル化することができる（例えば、耐摩耗性または耐摩耗性材料、または牽引力に調整された材料）。レシリンミッドソールはまた、強化された性能（例えば、より柔らかいヒールストライク領域及びより強固なアーチサポート）を提供するために合わせて機能する、異なって調整された機械的特性を有する複数のレシリン材料を含有し得る。
【０１７２】
ベクター、宿主細胞、及び発酵物
さらに、組み換えレシリンをコードするベクター、そのようなベクターを含む組み換え宿主細胞、ならびにそのような組み換え宿主細胞及び組み換えレシリンを含む発酵物が本明細書に提供される。
【０１７３】
一部の実施形態では、本明細書で提供されるベクターは、分泌レシリンコード配列を含み、これは、Ｎ末端で分泌シグナルに、任意に、Ｃ末端でタグペプチドまたはポリペプチドに融合されるレシリンポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ベクターは、特定の宿主細胞における発現のためにコドン最適化される分泌レシリンコード配列を含む。
【０１７４】
好適な分泌シグナルは、本明細書で提供される組み換え宿主細胞におけるポリペプチドの分泌を媒介する分泌シグナルである。好適な分泌シグナルの非限定例は、出芽酵母のアルファ接合因子（α−ＭＦ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）の酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ１）、及びインゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）からのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ−Ｅ）の分泌シグナルである。さらなる分泌シグナルは、当該技術分野で知られているか、または宿主細胞により分泌されたタンパク質の同定、続いて、分泌タンパク質のゲノム分析及び非翻訳Ｎ末端配列の同定により同定することができる（例えば、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ  ｉｎ  ｍｅｔｈａｎｏｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１  Ａｐｒ；９０（１）：２３５−４７を参照のこと）。
【０１７５】
分泌レシリンコード配列によりコードされるレシリンは、さらにタグペプチドまたはポリペプチドに融合することができる。タグペプチドまたはポリペプチドの非限定例としては、親和性タグ（すなわち、特定の薬剤もしくはマトリックスに結合するペプチドもしくはポリペプチド）、可溶化タグ（すなわち、タンパク質の好適な折り畳みを助け、沈殿を防ぐペプチドもしくはポリペプチド）、クロマトグラフィータグ（すなわち、特定の分離手法に対し異なる解像度を得るために、タンパク質のクロマトグラフィー特性を変化させるペプチドもしくはポリペプチド）、エピトープタグ（すなわち、抗体により結合されるペプチドもしくはポリペプチド）、蛍光タグ（すなわち、短波長光で励起すると、高波長光を発するペプチドもしくはポリペプチド）、発色タグ（すなわち、可視光スペクトルの特定のセグメントを吸収するペプチドもしくはポリペプチド）、酵素基質タグ（すなわち、特定の酵素反応の基質であるペプチドもしくはポリペプチド）、化学基質タグ（すなわち、特定の化学改変の基質であるペプチドもしくはポリペプチド）、またはその組み合わせが挙げられる。好適な親和性タグの非限定例としては、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリ（Ｈｉｓ）タグ、ＳＢＰタグ、ストレップタグ、及びカルモジュリンタグが挙げられる。好適な溶解度タグの非限定例としては、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、ＭＢＰ、及びＧＳＴが挙げられる。クロマトグラフィータグの非限定例としては、ポリアニオン性アミノ酸（例えば、ＦＬＡＧタグ
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）及びポリグルタミン酸タグが挙げられる。エピトープタグの非限定例としては、Ｖ５タグ、ＶＳＶタグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、Ｅタグ、ＮＥタグ、及びＦＬＡＧタグが挙げられる。蛍光タグの非限定例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、橙色蛍光タンパク質（ＯＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、及びその誘導体が挙げられる。発色タグの非限定例としては、タンパク質のＧＦＰ様ファミリーの非蛍光メンバー（例えば、ＢｌｉｔｚｅｎＢｌｕｅ、ＤｏｎｎｅｒＭａｇｅｎｔａ；ＤＮＡ２．０、カリフォルニア州ニューアーク）が挙げられる。酵素基質タグの非限定例としては、ビオチン化に適する配列内にリジンを含むペプチドまたはポリペプチド（例えば、ＡｖｉＴａｇ、ビオチンカルボキシキャリアタンパク質［ＢＣＣＰ］）が挙げられる。化学基質タグの非限定例としては、ＦＩＡＳＨ−ＥＤＴ２との反応に適する基質が挙げられる。レシリンへのＣ末端ペプチドまたはポリペプチドの融合は、切断可能（例えば、ＴＥＶプロテアーゼ、トロンビン、第Ｘａ因子、またはエンテロペプチダーゼにより）、または切断不可能であり得る。
【０１７６】
一部の実施形態では、ベクターは、単一の分泌レシリンコード配列を含む。他の実施形態では、ベクターは、２つ以上（例えば、３、４、または５）の分泌レシリンコード配列を含む。そのような一部の実施形態では、分泌レシリンコード配列は、同一である。そのような他の実施形態では、分泌レシリンコード配列のうちの少なくとも２つは、同一ではない。分泌レシリンコード配列の少なくとも２つが同一ではない実施形態では、少なくとも２つの分泌レシリンコード配列は、レシリン及び／もしくは分泌シグナルならびに／またはそれらをコードする任意のタグペプチドもしくはポリペプチドにおいて互いに異なり得る。
【０１７７】
一部の実施形態では、ベクターは、分泌レシリンコード配列の発現を駆動するように、分泌レシリンコード配列に作動可能に連結されるプロモーターを含む。プロモーターは、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターであり得る。一部の実施形態では、誘導性プロモーターの誘導は、グルコース抑制、ガラクトース誘導、スクロース誘導、リン酸抑制、チアミン抑制、またはメタノール誘導を介して起こる。好適なプロモーターとしては、本明細書で提供される組み換え宿主細胞におけるタンパク質の発現を媒介するプロモーターが挙げられる。好適なプロモーターの非限定例としては、ＡＯＸ１プロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＬＡＣ４−ＰＢＩプロモーター、Ｔ７プロモーター、ＴＡＣプロモーター、ＧＣＷ１４プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、λＰＬプロモーター、λＰＲプロモーター、ベータラクタマーゼプロモーター、ｓｐａプロモーター、ＣＹＣ１プロモーター、ＴＤＨ３プロモーター、ＧＰＤプロモーター、ＴＥＦ１プロモーター、ＥＮＯ２プロモーター、ＰＧＬ１プロモーター、ＳＵＣ２プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＡＤＨ２プロモーター、ＨＸＴ７プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、及びＣＬＢ１プロモーターが挙げられる。分泌レシリンコード配列の発現を促進するために使用することができる追加のプロモーターは、当該技術分野で知られている。
【０１７８】
一部の実施形態では、ベクターは、分泌レシリンコード配列の転写の終結をもたらすように、分泌レシリンコード配列に作動可能に連結されるターミネーターを含む。好適なターミネーターとしては、本明細書で提供される組み換え宿主細胞における転写を終結させるターミネーターが挙げられる。好適なターミネーターの非限定例としては、ＡＯＸ１ターミネーター、ＰＧＫ１ターミネーター、及びＴＰＳ１ターミネーターが挙げられる。分泌レシリンコード配列の転写の終結をもたらす追加のターミネーターは、当該技術分野で知られている。
【０１７９】
ベクターが２つ以上のレシリンコード配列を含む実施形態では、２つ以上のレシリンコード配列は、同じプロモーター及び／もしくはターミネーター、または２つ以上の異なるプロモーター及び／もしくはターミネーターに作動可能に連結することができる。
【０１８０】
本明細書で提供されるベクターはさらに、組み換え宿主細胞におけるベクターの増殖に適する要素を含み得る。そのような要素の非限定例としては、細菌の複製起点及び選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子、栄養要求性マーカー）が挙げられる。細菌の複製起点及び選択マーカーは、当該技術分野で知られている。一部の実施形態では、選択マーカーは、薬剤耐性マーカーである。薬剤耐性マーカーは、それが無ければ細胞を別途死滅させるであろう、外因的に加えられた薬剤を、細胞が解毒することを可能にする。薬剤耐性マーカーの実例としては、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、ブレオマイシン、ストレプトマイシン、ハイグロマイシン、ネオマイシン、ゼオシン（商標）などの抗生物質に対して耐性があるものが含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、選択マーカーは、栄養要求性マーカーである。栄養要求性マーカーは、必須成分を欠く培地で成長する間に、細胞が必須成分（通常は、アミノ酸）を合成することを可能にする。選択可能な栄養要求性遺伝子配列としては、例えば、ヒスチジノールの存在下でヒスチジン不含培地での成長を可能にするｈｉｓＤが挙げられる。本発明のベクターに適する他の選択マーカーとしては、ブレオマイシン耐性遺伝子、メタロチオネイン遺伝子、ハイグロマイシンＢ−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ＡＵＲＩ遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、及びキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が挙げられる。
【０１８１】
本発明のベクターはさらに、宿主細胞のゲノム内の特定の場所への分泌レシリンコード配列の直接取り組みを誘導する標的化配列を含み得る。そのような標的化配列の非限定例としては、宿主細胞のゲノムに存在するヌクレオチド配列と同一であるヌクレオチド配列が挙げられる。一部の実施形態では、標的化配列は、宿主細胞のゲノムにおける繰り返し要素と同一である。一部の実施形態では、標的化配列は、宿主細胞のゲノムにおける転位因子と同一である。
【０１８２】
一部の実施形態では、本明細書に記載のベクターを含む組み換え宿主細胞が本明細書に提供される。一部の実施形態では、ベクターは、例えば、相同組み換えまたは標的化組み込みにより、組み換え宿主細胞のゲノム（例えば、染色体）内に安定して組み込まれる。ゲノム組み込みに適する部位の非限定例としては、出芽酵母ゲノムのＴｙ１遺伝子座、ピキア・パストリスゲノムのｒＤＮＡ及びＨＳＰ８２遺伝子座、ならびに組み換え宿主細胞のゲノム全体にコピーが散在している転位因子が挙げられる。他の実施形態では、ベクターは、組み換え宿主細胞のゲノム内に安定して組み込まれておらず、むしろ染色体外である。
【０１８３】
組み換え宿主細胞は、哺乳動物、植物、藻類、真菌、または微生物起源のものであり得る。好適な真菌の非限定例としては、以下が挙げられる：メチロトローフ酵母、糸状酵母、アルクスラ・アデニニボランス、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、クロコウジカビ変種アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ｖａｒ．ａｗａｍｏｒｉ）、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、カンジダ・エチェルシイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｅｔｃｈｅｌｌｓｉｉ）、カンジダ・ギリエルモンディ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、カンジダ・フミリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｈｕｍｉｌｉｓ）、カンジダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、カンジダ・プソイドトロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、トルラ酵母（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、カンジダ・ベルサチリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）、デバリオミセス・ハンセニイ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ）、クリ胴枯病菌（Ｅｎｄｏｔｈｉａ  ｐａｒａｓｉｔｉｃａ）、エレモテシウム・アシュビイ（Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ  ａｓｈｂｙｉｉ）、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ、クルイベロミセス・ラクチス、クルイベロミセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、クルイベロミセス・サーモトレランス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、モルティエレラ・ヴィナセア変種ラフィノースユーティライザ（Ｍｏｒｔｅｉｒｅｌｌａ  ｖｉｎａｃｅａｅ  ｖａｒ．ｒａｆｆｉｎｏｓｅｕｔｉｌｉｚｅｒ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、ムコール・ミエヘイ変種クーニー・エト・エマーソン（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ  ｖａｒ．Ｃｏｏｎｅｙ  ｅｔ  Ｅｍｅｒｓｏｎ）、ムコール・プシルス・リント（Ｍｕｃｏｒ  ｐｕｓｉｌｌｕｓ  Ｌｉｎｄｔ）、ペニシリウム・ロックフォルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｉ）、ピキア・メタノリカ、ピキア・パストリス（コマガタエラ・ファフィイ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｈａｆｆｉｉ））、ピキア（シェフェルソミセス）・スティピティス、リゾプス・ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｎｉｖｅｕｓ）、ロドトルラ属種（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｓｐ．）、サッカロミセス・バヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）、サッカロミセス・ベチクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｅｔｉｃｕｓ）、出芽酵母、サッカロミセス・チェバリエリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｈｅｖａｌｉｅｒｉ）、サッカロミセス・ジアスタチクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロミセス・エリプソイデウス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｕｓ）、サッカロミセス・エキシグウス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｘｉｇｕｕｓ）、サッカロミセス・フロレンチヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｓ）、サッカロミセス・フラギリス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、サッカロミセス・パストリアヌ��（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）、サッカロミセス・ポンベ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、サッカロミセス・サケ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓａｋｅ）、サッカロミセス・ウバルム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｒｕｍ）、スポリディオボルス・ジョンソニイ（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、スポリディオボルス・サルモニコロル（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ）、スポロボロミセス・ロセウス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｕｓ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉ）、キサントフィロミセス・デンドロロウス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ）、ヤロウイア・リポリティカ、ザイゴサッカロミセス・ロウキシイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）、ならびにそれらの派生物及び交配種。
【０１８４】
好適な微生物の非限定例としては、以下が挙げられる：アセトバクター・スボキシダンス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ）、アセトバクター・キシリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｍ）、アクチノプラネス・ミズーリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅ  ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）、アルスロスピラ・プラテンシス（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）、アルスロスピラ・マキシマ（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｍａｘｉｍａ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ＿ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ラクチス  ランスフィールドＮ群、ロイコノストック・シトロボルム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｏｖｏｒｕｍ）、ロイコノストック・デキストラニクム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｄｅｘｔｒａｎｉｃｕｍ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）株ＮＲＲＬ  Ｂ−５１２（Ｆ）、ミクロコッカス・リゾデイクティカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）、スピルリナ属（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）、ストレプトコッカス・クレモリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、ストレプトコッカス・ラクチス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ストレプトコッカス・ラクチス亜種ジアセチラクチス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ  ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトミセス・チャッタノオゲンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｈａｔｔａｎｏｏｇｅｎｓｉｓ）、ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトミセス・ナタレンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｎａｔａｌｅｎｓｉｓ）、ストレプトミセス・オリバセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｏｌｉｖａｃｅｕｓ）、ストレプトミセス・オリボクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトミセス・ルビジノサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓ）、キサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、及びそれらの派生物及び交配種。組み換え宿主細胞として使用することができるさらなる株は、当該技術分野で既知である。「組み換え宿主細胞」という用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫を指すことが意図されると理解すべきである。変異または環境の影響のいずれかにより、特定の改変が、後の世代で起こり得るので、そのような子孫は、実際には、親細胞と同一でないことがあるが、依然として、本明細書で使用される「組み換え宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。
【０１８５】
一部の実施形態では、組み換え宿主細胞は、本明細書で提供される組み換えレシリンの産生を改善する遺伝子改変を含む。そのような遺伝子改変の非限定例として、プロモーターの変化、キナーゼ活性の変化、タンパク質フォールディング活性の変化、タンパク質分泌活性の変化、遺伝子発現誘導経路の変化、及びプロテアーゼ活性の変化が挙げられる。
【０１８６】
本明細書で提供される組み換え宿主細胞は、好適な起源の細胞を本明細書で提供されるベクターで形質転換することにより生成される。そのような変換の場合、ベクターは、円形または線形であり得る。ベクターを含む組み換え宿主細胞の形質転換は、例えば、細胞の成長についてのもしくはこれに対する選択を可能にするベクターによりコードされる薬物耐性もしくは栄養要求性マーカーを発現させることにより、または他の手段（例えば、ベクターに含まれる発光ペプチドの検出、個々の組み換え宿主細胞コロニーの分子分析、例えば、制限酵素マッピング、ＰＣＲ増幅、または単離染色体外ベクターもしくは染色体組み込み部位の配列分析によるもの）により、容易に同定することができる。
【０１８７】
一部の実施形態では、本明細書で提供される組み換え宿主細胞は、本明細書で提供される高力価の組み換えレシリンを産生し得る。そのような一部の実施形態では、組み換え宿主細胞は、２ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間超、４ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間超、６ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間超、８ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間超、１０ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間超、１２ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間超、１４ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間超、１６ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間超、１８ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間超、２０ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間超、２５ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間超、もしくは３０ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間超、２から４０、３０、２０、１０、もしくは５ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間、５から４０、３０、２０、もしくは１０ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間、１０から４０、３０、もしくは２０ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間、２０から４０もしくは３０ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間、または３０から４０ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間の速度で組み換えレシリンを産生する。そのような他の実施形態では、組み換え宿主細胞は、２ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間超、４ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間超、６ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間超、８ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間超、１０ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間超、１２ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間超、１４ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間超、１６ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間超、１８ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間超、２０ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間超、２５ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間超、もしくは３０ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間超、２から４０、３０、２０、１０、もしくは５ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間、５から４０、３０、２０、もしくは１０ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間、１０から４０、３０、もしくは２０ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間、２０から４０もしくは３０ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間、または３０から４０ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間の速度で組み換えレシリンを分泌する。産生された組み換えレシリンの識別は、ＨＰＬＣ定量、ウェスタンブロット分析、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、及び２次元質量分析（２Ｄ−ＭＳ／ＭＳ）配列同定により確認することができる。
【０１８８】
一部の実施形態では、本明細書で提供される組み換え宿主細胞は、本明細書で提供される組み換えレシリンの高分泌画分を有する。そのような一部の実施形態では、組み換え宿主細胞は、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、もしくは９０％超、５０％から１００％、９０％、８０％、７０％、もしくは６０％、６０％から１００％、９０％、８０％、もしくは７０％、７０％から１００％、９０％、もしくは８０％、９０％から１００％もしくは９０％、または９０％から１００％の組み換えレシリンの画分を分泌している。
【０１８９】
組み換えレシリンの産生及び分泌は、組み換え宿主細胞に含まれる分泌レシリンコード配列のコピー数及び／または組み換え宿主細胞に含まれる分泌レシリンコード配列の転写速度により影響を受け得る。一部の実施形態では、組み換え宿主細胞は、単一の分泌レシリンコード配列を含む。他の実施形態では、組み換え宿主細胞は、２つ以上（例えば、３、４、５、またはそれ以上）の分泌レシリンコード配列を含む。一部の実施形態では、組み換え宿主細胞は、強力なプロモーターに作動可能に連結される分泌レシリンコード配列を含む。強力なプロモーターの非限定例としては、ピキア・パストリスのｐＧＣＷ１４プロモーターを含む。一部の実施形態では、組み換え宿主細胞は、中程度のプロモーターに作動可能に連結される分泌レシリンコード配列を含む。そのような中程度のプロモーターの非限定例としては、ピキア・パストリスのｐＧＡＰプロモーターが挙げられる。一部の実施形態では、組み換え宿主細胞は、弱いプロモーターの制御下でレシリンをコードするコード配列を含む。
【０１９０】
本明細書で提供される発酵物は、本明細書に記載の組み換え宿主細胞、及び組み換え宿主細胞を成長させるのに適する培地を含む。
【０１９１】
発酵物は、細胞生存及び／または成長、ならびに組み換えレシリンの分泌のために組み換え宿主細胞により必要とされる栄養素を提供する培地中で組み換え宿主細胞を培養することにより得られる。そのような培地は通常、過剰な炭素源を含有する。好適な炭素源の非限定例としては、単糖、二糖、多糖、及びそれらの組み合わせが挙げられる。好適な単糖の非限定例としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、リボース、キシロース、アラビノース、リボース、及びそれらの組み合わせが挙げられる。好適な二糖の非限定例としては、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、及びそれらの組み合わせが挙げられる。好適な多糖の非限定例としては、ラフィノース、デンプン、グリコーゲン、グリカン、セルロース、キチン、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１９２】
一部の実施形態では、発酵物は、全発酵物の少なくとも１重量％、少なくとも５重量％、少なくとも１０重量％、少なくとも２０重量％、もしくは少なくとも３０重量％、１重量％から１００重量％、９０重量％、８０重量％、７０重量％、６０重量％、５０重量％、４０重量％、３０重量％、２０重量％、もしくは１０重量％、１０重量％から１００重量％、９０重量％、８０重量％、７０重量％、６０重量％、５０重量％、４０重量％、３０重量％、もしくは２０重量％、２０重量％から１００重量％、９０重量％、８０重量％、７０重量％、６０重量％、５０重量％、４０重量％、もしくは３０重量％、３０重量％から１００重量％、９０重量％、８０重量％、７０重量％、６０重量％、５０重量％、もしくは４０重量％、４０重量％から１００重量％、９０重量％、８０重量％、７０重量％、６０重量％、もしくは５０重量％、５０重量％から１００重量％、９０重量％、８０重量％、７０重量％、もしくは６０重量％、６０重量％から１００重量％、９０重量％、８０重量％、もしくは７０重量％、７０重量％から１００重量％、９０重量％、もしくは８０重量％、８０重量％から１００重量％もしくは９０重量％、または９０重量％から１００重量％の量の組み換えレシリンを含む。
【０１９３】
一部の実施形態では、発酵物は、少なくとも２ｇ／Ｌ、少なくとも５ｇ／Ｌ、少なくとも１０ｇ／Ｌ、少なくとも１５ｇ／Ｌ、少なくとも２０ｇ／Ｌ、少なくとも２５ｇ／Ｌ、もしくは少なくとも３０ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌから３００ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、もしくは１０ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌから３００ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、もしくは２０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌから３００ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、もしくは３０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌから３００ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、もしくは４０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌから３００ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、もしくは５０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌから３００ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、もしくは６０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌから３００ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、もしくは７０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌから３００ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、もしくは８０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌから３００ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、もしくは９０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌから３００ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、もしくは１００ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌから３００ｇ／Ｌもしくは２００ｇ／Ｌ、または２００ｇ／Ｌから３００ｇ／Ｌの量の組み換えレシリンを含む。
【０１９４】
組み換えレシリンの生成方法
さらに、本明細書に記載の組み換えレシリンの生成のための方法が本明細書で提供される。
【０１９５】
方法は一般に、当該技術分野で周知のならびに別途指示のない限り、本明細書を通して引用及び考察される種々の一般的及びより具体的な参考文献に記載される従来の方法に従って実施される。例えば、以下を参照のこと：Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，１９９２，ａｎｄ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  ｔｏ  ２００２）、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９０、Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，２００３、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，Ｎ．Ｊ．、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ  Ｉ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９７６、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ  ＩＩ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９７６、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９。
【０１９６】
一部の実施形態では、新規の方法が、宿主細胞から細胞外にレシリンを分泌するために利用される。一部の実施形態では、方法は、分泌レシリンコード配列を含むベクターを構築すること（図２のステップ１００１）、ベクターを宿主細胞に形質転換すること（図２のステップ１００２）、その後に、細胞外にレシリンを分泌する組み換え宿主細胞を培養すること（図２のステップ１００３）を含む。一部の実施形態では、方法は、２ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間超、４ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間超、６ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間超、８ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間超、１０ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間超、１２ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間超、１４ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間超、１６ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間超、１８ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間超、２０ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間超、２５ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間超、または３０ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間超、２から４０、３０、２０、１０、もしくは５ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間、５から４０、３０、２０、もしくは１０ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間、１０から４０、３０、もしくは２０ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間、２０から４０もしくは３０ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間、または３０から４０ｍｇレシリン／ｇ乾燥細胞重量／時間の速度で細胞外にレシリンを分泌することを含む。一部の実施形態では、分泌レシリンは、次に精製され（図２のステップ１００４）、精製レシリンは、エラストマーを形成するように架橋される（図２のステップ１００５）。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、本明細書で提供される組み換え宿主細胞を得るために、本明細書で提供されるベクターで細胞を形質転換するステップを含む（図２のステップ１００２）。ベクターで細胞を形質転換するための方法は、当該技術分野で周知である。そのような方法の非限定例としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、リポソームトランスフェクション（例えば、カチオン性リポソームトランスフェクション）、カチオン性ポリマートランスフェクション、エレクトロポレーション、細胞圧搾、ソノポレーション、光学的トランスフェクション、原形質融合、インペイルフェクション、流体力学的送達、遺伝子銃、マグネトフェクション、及びウイルストランスフェクションが挙げられる。当業者は、ベクターを導入するためのある特定の手法がある特定のタイプの細胞に対してより良好に機能するという、当該技術分野の知識に基づいて本明細書で提供されるベクターで細胞を形質転換するための１つ以上の好適な方法を選択することができる。
【０１９７】
一部の実施形態では、方法はさらに、本明細書で提供される発酵物を得るのに適する条件下、培地中で、本明細書で提供される組み換え宿主細胞を培養するステップを含む（図２のステップ１００３）。一部の実施形態では、条件及び培地は、組み換え宿主細胞から培地への組み換えタンパク質の分泌を促進するのに適する。これらの方法で使用される好適な培地は、好適な培養条件と同様に、当該技術分野で既知である。酵母宿主細胞の培養の例示的な詳細は、Ｉｄｉｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８６：４０３−４１７，２０１０、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ．Ｅｎｇ．５：２７５−２８７，２０００、Ｚｈｕ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．３０：１１５８−１１７０，２０１２；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＡｂｓ  ２：４６６−４７７，２０１０に記載される。
【０１９８】
一部の実施形態では、方法はさらに、本明細書に提供される組み換えレシリンを得るために、本明細書に提供される発酵物から分泌組み換えレシリンを精製するステップを含む（図２のステップ１００４）。精製は、発酵物から分泌タンパク質を精製するための当該技術分野で既知の様々な方法で生じ得る。そのような方法の一般的なステップは、遠心分離（細胞を除去するための）、それに続く、沈殿剤または他の好適なコスモトロープ（例えば、硫酸アンモニウム）を使用するタンパク質の沈殿を含む。次に、沈殿タンパク質は、遠心分離により上清から分離し、溶媒中に再懸濁させることができる（例えば、リン酸緩衝食塩水［ＰＢＳ］）。懸濁タンパク質は、溶解塩を除去するために透析することができる。さらに、透析タンパク質は、他のタンパク質を変性するために加熱することができ、変性タンパク質は、遠心分離により除去することができる。任意に、精製組み換えレシリンをコアセルベート形成させることができる。
【０１９９】
種々の実施形態では、発酵物から分泌組み換えタンパク質を精製する方法は、尿素またはグアニジンチオシアナートなどの既知のカオトロープを有する全細胞ブロスまたは細胞ペレット中のタンパク質の可溶化と組み合わせた種々の遠心分離ステップを含み得る。
【０２００】
一部の実施形態では、組み換えレシリンタンパク質は、全細胞ブロスを遠心分離して、細胞の第１のペレット及び第１の上清を生じさせること、ならびに第１の上清を抽出して、透明な細胞ブロスを生じさせることにより精製することができる。次に、硫酸アンモニウムを使用して、第１の上清を沈殿させ、遠心分離して、第２のペレット及び第２の上清（廃棄した）を生じさせる。次に、第２のペレットを透析のためにＰＢＳ中に再懸濁させる。次に、一部の実施形態では、透析された溶液を高温にかけ、標的組み換えタンパク質よりも安定性が低いタンパク質を変性させる。次に、透析及び変性溶液を遠心分離することにより、変性タンパク質を除去して、第３のペレット及び第３の上清を生じさせる。第３の上清を変性溶液から保持し、次に、第３の上清を冷却することによりコアセルベート形成させて、標的組み換えレシリンタンパク質を含有する密な下層と上層への相分離を誘導する。この方法により精製された試料は、「ＣＣＢ」試料と呼ぶことができる。一部の実施形態では、下層を保持すること、及び低温で下層をインキュベートして、さらなる相分離を誘導することにより、複数のコアセルベート形成を実施する。
【０２０１】
一部の実施形態では、組み換えレシリンタンパク質は、全細胞ブロスを遠心分離して、細胞の第１のペレット及び細胞に近接する（例えば、細胞に付着している、細胞の表面上の）タンパク質及び／または不溶性タンパク質（例えば、タンパク質凝集体）及び第１の上清を生じさせること、次に、第１の上清を廃棄して、第１のペレットを得ることにより精製することができる。次に、第１のペレットは、組み換えレシリンタンパク質を可溶化するために、グアニジンチオシアナートに再懸濁させることができる。次に、再懸濁液を再度遠心分離して、第２のペレット及び第２の上清を生じさせる。次に、第２の上清をＰＢＳに対して透析し、組み換えレシリン以外のタンパク質を変性させるために高温にかけ、遠心分離して第３のペレット及び第３の上清を生じさせる。次に、一部の実施形態では、次に、第３の上清を冷却によりコアセルベート形成にかけ、組み換えレシリンを含有する密な下層と上層への相分離を生じさせる。本方法により精製された試料は、「ゲル層」試料と呼ぶことができる。一部の実施形態では、下層を保持すること、及び低温で下層をインキュベートして、さらなる相分離を誘導することにより、複数のコアセルベート形成を実施する。
【０２０２】
一部の実施形態では、組み換えレシリンタンパク質は、全細胞ブロスを遠心分離して、ペレット及び上清を生じさせること、次に、上清を廃棄して、細胞のペレット及び細胞に近接する（例えば、細胞への付着する、細胞の表面上の）タンパク質及び／または不溶性タンパク質（例えば、タンパク質凝集体）を得ることにより精製することができる。次に、細胞のペレットをグアニジンチオシアナートに再懸濁させて、細胞に近接するタンパク質を可溶化する。再懸濁液を再度遠心分離して、細胞の第２のペレット及び第２の上清を生じさせる。次に、第２の上清を硫酸アンモニウムで沈殿させ、遠心分離させて、第３のペレット及び第３の上清を生じさせる。次に、第３のペレットをグアニジンチオシアナート中に懸濁させ、次に、ＰＢＳに対して透析し、高温にかけて組み換えレシリン以外のタンパク質を変性させ、遠心分離して第４の上清及び第４のペレットを生じさせる。次に、第４の上清を冷却によるコアセルベート形成にかけて、相分離を生じさる。本方法により精製された試料は、「沈殿したゲル層」試料と呼ぶことができる。
【０２０３】
一部の実施形態では、組み換えレシリンタンパク質は、全細胞ブロスに尿素を添加して、タンパク質を可溶化すること、次に、全細胞ブロスを遠心分離して、第１のペレット及び第１の上清を生じさせることにより精製することができる。次に、硫酸アンモニウムを使用して、第１の上清を沈殿させ、遠心分離して、第２のペレット及び第２の上清を生じさせる。第２の上清を廃棄し、次に、第２のペレットをグアニジンチオシアナート中に再懸濁させ、ＰＢＳに対して透析し、次に、組み換えレシリン以外のタンパク質を変性するために高温にかけ、再度遠心分離して、第３のペレット及び第３の上清を生じさせる。次に、第３の上清を冷却することにより、第３の上清をコアセルベート形成して、組み換えレシリンを含有する密な下層と上層への相分離を誘導する。本方法により精製された試料は、「尿素ＷＣＢＥ」試料と呼ぶことができる。
【０２０４】
一部の実施形態では、組み換えレシリンタンパク質は、全細胞ブロスを遠心分離して、第１のペレット及び第１の上清を生じさせること、次に、第１の上清を廃棄して、細胞の第１のペレット及び細胞に近接する（例えば、細胞への付着する、細胞の表面上の）タンパク質及び／または不溶性タンパク質（例えば、タンパク質凝集体）を得ることにより精製することができる。次に、細胞の第１のペレットをグアニジンチオシアナートに再懸濁させて、タンパク質を可溶化する。再懸濁液を再度遠心分離して、細胞の第２のペレット及び第２の上清を生じさせる。第２の上清を、ＰＢＳに対して透析し、次に、遠心分離して、タンパク質の重い相、上清の軽い相、及び軽い相から重い相を分離する薄膜を生じさせる。次に、軽い相及び薄膜を廃棄することにより、タンパク質の重い相を分離させる。本方法により精製された試料は、「密な層」試料と呼ぶことができる。
【０２０５】
一部の実施形態では、組み換えレシリン組成物は、発泡材料である。一部の実施形態では、組み換えレシリン発泡体を調製する方法は、水性溶媒中に架橋組み換えレシリン固体組成物を提供する工程、該水性溶媒を極性非水溶媒と交換する工程、及び架橋組み換えレシリン固体組成物に１つ以上の気泡を導入する工程を含む。当該技術分野で既知の気泡を導入する任意の方法が本明細書で使用されてもよい。例えば、気泡を導入する方法は、ボルテックス、混合、酵母の添加、及び化学反応を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、１つ以上の気泡の導入は、架橋組み換えレシリン固体組成物が提供されると同時に生じ得る。一部の実施形態では、１つ以上の気泡を導入することは、架橋組み換えレシリン固体組成物が提供された後に生じ得る。
【０２０６】
発泡剤が通常、ポリマー発泡体を作製するためにポリマー材料に導入される。一実施形態によれば、化学発泡剤がポリマーと混合される。化学発泡剤は、通常ポリマーが溶融する条件下で、ポリマー材料中で化学反応を受けて、気体の形成を引き起こす。化学発泡剤は一般に、特定の温度で分解し、窒素、二酸化炭素、または一酸化炭素などの気体を放出する低分子量有機化合物である。
【０２０７】
例示的な化学発泡剤としては、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、アンモニウム、アゾジカルボンアミド、イソシアナート、ヒドラジン、イソプロパノール、５−フェニルテトラゾール、トリアゾール、４，４’オキシビス（ベンゼンスルホニルヒドラジド）（ＯＢＳＨ）、トリヒドラジントリアジン（ＴＨＴ）、リン酸水素、酒石酸、クエン酸、及びトルエンスルホニルセミカルバジド（ＴＳＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０８】
一部の実施形態では、発泡剤、増粘剤、及び／または硬化剤が、組み換えレシリン固体に添加される。例示的な発泡剤としては、キサンタンガム、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム、ウシ血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な増粘剤としては、ヒュームドシリカ及びキサンタンガムが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な硬化剤としては、脂肪族ポリアミン、脂肪ポリアミド、芳香族ポリアミン硬化剤、無水物硬化剤、三フッ化ホウ素硬化剤、及び硬化剤（ジシアンジアミド）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０９】
別の実施形態によれば、物理発泡剤、すなわち、周囲条件下で気体である流体が、溶融ポリマー流に注入されて、混合物を形成する。混合物を圧力低下にかけて、発泡剤が膨張してポリマー内に気泡（セル）を形成させる。一部の実施形態では、必要とされる圧力は、約５００ｐｓｉ〜約２０００ｐｓｉ、例えば、約６００ｐｓｉ〜約１０００ｐｓｉ、約７００ｐｓｉ〜約１５００ｐｓｉ、及び約８００ｐｓｉ〜約２０００ｐｓｉである。一部の実施形態では、必要とされる圧力は、約５００ｐｓｉである。
【０２１０】
例示的な物理発泡剤としては、クロロフルオロカーボン（ＣＦＣ）、溶存窒素、Ｎ２、ＣＨ４、Ｈ２、ＣＯ２、Ａｒ、ペンタン、イソペンタン、ヘキサン、二塩化メチレン、及びジクロロテトラフルオロエタンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１１】
均等物及び範囲
当業者は、本明細書に記載の本発明による特定の実施形態と同等の多くのものを認識する、または、通常の実験のみを使用して、それらを確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記説明に限定されることを意図するものではなく、添付の特許請求の範囲に記載される通りである。
【０２１２】
特許請求の範囲では、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」などの冠詞は、反対の指示がない限り、または別途文脈から明らかでない限り、１つまたは複数を意味し得る。グループの１つ以上のメンバー間に「または」を含む特許請求の範囲または説明は、反対の指示がない限り、または別途文脈から明らかでない限り、グループメンバーの１つ、複数、または全てが、所与の生成物またはプロセスに存在するか、用いられるか、または別途関連する場合に満たされていると見なされる。本発明は、正確に、グループの１つのメンバーが、所与の生成物またはプロセスに存在するか、用いられるか、または別途関連する実施形態を含む。本発明は、グループメンバーのうちの複数または全てが、所与の生成物またはプロセスに存在する、用いられるか、または別途関連する実施形態を含む。
【０２１３】
「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、オープンであることが意図され、追加の要素またはステップを含むことを許容するが、必要とはしないことにも留意される。「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語が本明細書で使用される場合、「からなること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語も包含及び開示される。
【０２１４】
範囲が与えられる場合、端点が含まれる。さらに、別途指示のない限り、または別途文脈及び当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表現される値は、文脈に別途明示のない限り、範囲の下限の単位の１０分の１まで、本発明の異なる実施形態の記載範囲の任意の具体的な値または部分範囲を想定し得ると理解すべきである。
【０２１５】
引用される全ての出典、例えば、本明細書で引用される参考文献、出版物、データベース、データベースエントリー、及び技術は、引用で明示的に記載されていない場合でも、参照により本出願に組み込まれる。引用された出典及び本出願の記述が矛盾する場合、本出願の記述が優先されるものとする。
【０２１６】
セクション及び表の見出しは、限定することが意図されない。
【実施例】
【０２１７】
以下は、本発明を実施するための特定の実施形態の例である。実施例は、例証の目的のためのみに提供され、決して、本発明の範囲を限定することは意図されない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確さを確保するための取り組みがなされているが、もちろん、ある程度の実験誤差及び偏差は許容されるべきである。
【０２１８】
本発明の実施は、別途指示のない限り、当業者の範囲内で、タンパク質化学、生化学、組み換えＤＮＡ手法、及び薬理学の従来の方法を用いるであろう。そのような手法は、文献で完全に説明される。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）、Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｄｄｉｔｉｏｎ）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｎ．Ｋａｐｌａｎ  ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）、Ｃａｒｅｙ  ａｎｄ  Ｓｕｎｄｂｅｒｇ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）Ｖｏｌｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ（１９９２）を参照のこと。
【０２１９】
実施例１：組み換えレシリンの産生
ＧＳ１１５（ＮＲＲＬ  Ｙ１５８５１）ピキア・パストリス（コマガタエラ・ファフィイ）のＨＩＳ＋誘導体を、分泌レシリンコード配列を含むベクターで形質転換することにより、組み換えレシリンを分泌するピキア・パストリス組み換え宿主細胞を生成した。
【０２２０】
ベクターはそれぞれ、Ｎ末端分泌シグナル（アルファ接合因子リーダー及びプロ配列）にインフレームで融合される３つのレシリンコード配列、一部の場合では、Ｃ末端３ｘＦＬＡＧタグ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）を含んでいた（図３を参照のこと）。分泌レシリンコード配列のそれぞれは、プロモーター（ｐＧＣＷ１４）及びターミネーター（ｔＡＯＸ１  ｐＡシグナル）が隣接していた。ベクターはさらに、３つの分泌レシリンコード配列のピキア・パストリスゲノムのＨＳＰ８２遺伝子座への組み込みを誘導し得る標的領域、細菌及び酵母形質転換体の選択のための優勢な耐性マーカー、ならびに細菌の複製起点を含んでいた。
【０２２１】
レシリンコード配列を、科学文献及び公開配列データベースの検索から取得した。ヌクレオチド配列をアミノ酸配列に翻訳し、次に、コドン最適化した。全長及び短縮レシリン配列の両方を選択した。選択分泌レシリンコード配列が表１に示される。
【０２２２】
（表１）例示的な全長及び短縮型レシリンアミノ酸配列及び組み換え宿主株
2021530522.tif 000006
【０２２３】
エレクトロポレーションを使用して、ベクターをピキア・パストリスに形質転換して、分泌された各レシリンコード配列の３つの組み込まれたコピーを含む宿主株を生成する。形質転換体を抗生物質が補充されたＹＰＤアガープレート上にプレーティングし、そして３０℃で４８時間インキュベートした。
【０２２４】
各最終の形質転換からクローンを９６ウェルブロックで緩衝化グリセロール複合培地（ＢＭＧＹ）４００μＬに接種し、１，０００ｒｐｍで撹拌しながら３０℃で２４時間インキュベートした。試料を取り出し、組み換え宿主細胞を遠心分離によりペレット状にし、上清を回収し、（３ｘＦＬＡＧタグを含むポリペプチドのための）クマシーゲル及びウェスタンブロット分析を介してレシリン含量の分析のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動させた。ＦＬＡＧタグ付きタンパク質の場合、残りの培養物を使用して、ＥＬＩＳＡ測定用に最小限の培地培養物を２回接種した。１つの複製をペレット状にし、上清を直接測定した。第２の複製をグアニジンチオシアナートで抽出し、細胞内画分及び細胞外画分の両方を測定した。
【０２２５】
多数の種からの組み換えレシリンは、ピキア・パストリス組み換え宿主細胞でうまく発現された。組み換え宿主細胞は、産生された組み換えレシリンの最大９０％を分泌した。
【０２２６】
配列表のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９は、後で切断されるシグナル配列とともに発現される全長セイシェルショウジョウバエレシリン配列（Ｄｓ＿ＡＣＢ）を提供する。第１の配列（斜体）は、シグナルペプチダーゼによる転写、続く、Ｋｅｘ２による切断の後に２回切断されるアルファ接合因子前駆体タンパク質シグナル配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）である。第２の配列（太字）は、Ｓｔｅ１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）により切断されるＥＡＥＡリピートである。第３の配列（小文字）は、セイシェルショウジョウバエの全長レシリン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）に対応する。第４の配列（太字及び斜体）は、リンカー配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）に対応する。第５の配列（下線付き）は、３Ｘ  ＦＬＡＧタグ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）に対応する。
【０２２７】
エドマン配列決定により、約１１０ｋＤａバンドのタンパク質配列のＮ末端が、全長セイシェルショウジョウバエのレシリン配列に対応していたことが確認された。具体的には、Ｎ末端配列決定は、Ｎ末端は、「ＥＡＥＡ」または「ＧＲＰＥ」に対応した（それぞれ、ＥＡＥＡリピートを有するまたは有しない全長セイシェルショウジョウバエレシリン配列）ことを示した。
【０２２８】
実施例２：組み換えレシリンの精製
非ＦＬＡＧタグ付きＤｓ＿ＡＣＢ及びＡｅ＿Ａ組み換えレシリンポリペプチドを以下の通り精製した。３００ｒｐｍで撹拌しながら、ＲＭｓ１２２１株（Ｄｓ＿ＡＣＢを発現する）及びＲＭｓ１２２４株（Ａｅ＿Ａを発現する）を、フラスコ内の５００ｍＬのＢＭＧＹ中で、３０℃で４８時間成長させた。
【０２２９】
Ｌｙｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）の精製のプロトコールを応用した。遠心分離により細胞をペレット状にし、上清を収集した。硫酸アンモニウムの添加により、タンパク質を沈殿させた。沈殿したタンパク質を、少量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁させ、再懸濁試料を、塩を除去するためにＰＢＳに対して透析した。次に、透析された試料を加熱して、天然タンパク質を変性させ、変性タンパク質を遠心分離により除去した。保持された上清は、精製レシリンポリペプチドを含有していた。任意に、保持された上清を冷却させ、これによりコアセルベート形成が生じ、下相の濃縮をもたらし、上相を希釈した。
【０２３０】
全細胞ブロスを遠心分離して、細胞の第１のペレット及び細胞に近接する（例えば、細胞に付着している、細胞の表面上の）タンパク質及び／または不溶性タンパク質（例えば、タンパク質凝集体）及び第１の上清を生成すること、次に、第１の上清を廃棄して、第１のペレットを得ることにより、試料の第２のセットを調製した。最初のペレットをグアニジンチオシアナートに再懸濁させて、Ｄｓ＿ＡＣＢを可溶化した。再懸濁液を再度遠心分離して、第２のペレット及び第２の上清を生じさせた。次に、第２の上清をＰＢＳに対し透析し、Ｄｓ＿ＡＣＢ以外のタンパク質を変性させるために高温にかけ、遠心分離して、第３のペレット及び第３の上清を生じさせた。第３の上清を冷却によるコアセルベート形成にかけて、Ｄｓ＿ＡＣＢを含有する密な下層と上層への相分離を生じさせた。これは、本明細書では、ゲル層分離、またはコアセルベート形成試料とも呼ばれる。一部のゲル層試料では、下層を保持すること、及び低温で下層をインキュベートして、さらに相分離を誘導することにより、複数のコアセルベート形成を実施した。
【０２３１】
（表２）架橋レシリンの安定性
2021530522.tif 000007
【０２３２】
実施例３：精製、分泌、組み換えレシリンの架橋
精製レシリンは、光架橋（Ｅｌｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２００５から応用）、酵素架橋（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２００９から応用）、または本明細書に記載の方法（すなわち、過硫酸アンモニウム及び熱）という３つの方法のうちの１つを介して架橋された。
【０２３３】
光架橋
光架橋のために、レシリンタンパク質を過硫酸アンモニウム及びトリス（ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）（［Ｒｕ（ｂｐｙ）３］２＋）と混合した。混合物を明るい白色光に曝露した後、混合物がゴム状の固体を形成した。
【０２３４】
具体的には、１０ｍＭのＲｕ（ＩＩ）光触媒（ＣＡＳ  ５０５２５−２７−４）ストック水溶液及び１００ｍＭの過硫酸アンモニウムストック水溶液を調製した。精製レシリン粉末をリン酸緩衝生理食塩水に２０〜３０重量％のレシリン濃度で溶解させて、レシリンストック液を調製した。
【０２３５】
１０ｍＭのＲｕ（ＩＩ）光触媒溶液２μＬ及び１００ｍＭの過硫酸アンモニウム２μＬを、１０μＬのレシリンストック液に添加し、混合して、光架橋溶液を形成した。気泡を遠心分離により光架橋溶液から除去し、光架橋溶液を型に注いだ。
【０２３６】
次に、光架橋溶液を白色光（白色ＬＥＤフラッドライト、Ｚｏｃｈｌｏｎ  ＵＳＰＴ１００Ｗ  １１０Ｖ）に３０秒〜１分間曝露した。
【０２３７】
酵素的架橋
酵素的架橋のために、レシリンタンパク質を西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）及び過酸化水素と混合した。混合物を３７℃でインキュベートした後、混合物がゴム状の固体を形成した。
【０２３８】
具体的には、水中の西洋ワサビペルオキシダーゼの１０ｍｇ／ｍＬのストック（１型、Ｐ８１２５  Ｓｉｇｍａ）（ＨＲＰストック）及び水中の１００ｍＭのＨ２Ｏ２ストックである。精製レシリン粉末をリン酸緩衝生理食塩水に２０〜３０重量％のレシリン濃度で溶解させて、レシリンストック液を調製した。
【０２３９】
ＨＲＰストック６μＬをレシリンストック液２１μＬに添加し、混合した。次に、Ｈ２Ｏ２ストック３μＬを添加し、ボルテックスにより混合して、酵素的架橋溶液を形成した。気泡を遠心分離により酵素的架橋溶液から除去し、４℃で溶液を維持しながら、酵素的架橋溶液を型に注いだ。架橋を実施するために、酵素的架橋溶液を３７℃で１５分間インキュベートした。得られる架橋レシリン組成物は、レシリン固体に共有結合している活性酵素を含む。
【０２４０】
過硫酸塩及び熱架橋
過硫酸アンモニウム及び熱を使用して、精製レシリンを架橋した。
【０２４１】
具体的には、精製レシリン粉末をリン酸緩衝生理食塩水に２０〜３０重量％のレシリン濃度で溶解させて、レシリンストック液を調製した。水中の２００ｍＭの過硫酸アンモニウム４μＬを、レシリンストック液１８μＬと混合して、最終濃度を３６ｍＭの過硫酸アンモニウムにした。気泡を遠心分離で過硫酸塩架橋溶液から除去し、過硫酸塩架橋溶液を型に注いだ。
【０２４２】
架橋を実施するために、過硫酸塩架橋溶液を、密閉された湿った環境中、８０℃で２．５時間インキュベートした。得られる架橋レシリン組成物は、レシリン固体中に活性な触媒が残存せず、分解が少ないタンパク質を有する組成物をもたらす。
【０２４３】
ＨＲＰ架橋組成物の分解
各架橋試料が毎日の観察を通して固体のままであった期間を決定することにより、架橋試料の安定性を経時的に評価した。表３は、光架橋（Ｒｕ＋ｈｖ）、酵素架橋（ＨＲＰ）、及び過硫酸アンモニウム及び熱（ＡＰ＋熱）による架橋により調製された各架橋試料の固体としての時間を示す。表３に示されるように、室温で、光架橋または過硫酸アンモニウムで架橋されたレシリン組成物は、酵素架橋により架橋されるレシリン組成物よりもはるかに長い安定期間を有していた。
【０２４４】
（表３）様々な架橋手順により架橋されたレシリン組成物の分解
2021530522.tif 000008
【０２４５】
ＥＬＩＳＡで測定された過硫酸アンモニウム架橋レシリン組成物（ＡＰ）及び酵素的に架橋されたレシリン組成物（ＨＲＰ）の全分解レシリンが図６に示される。架橋レシリン組成物からのレシリンフラグメントの分解及び分泌の増加が、ＡＰ試料と比較してＨＲＰ試料で観察される。
【０２４６】
このデータは、安定したレシリン組成物の調製には、過硫酸アンモニウム架橋が酵素的架橋よりも好ましいことを示す。酵素的に架橋されたレシリン組成物では、架橋酵素は組成物に残り、組成物の分解をもたらす。
【０２４７】
実施例４：架橋全長レシリンとレシリン混合物の安定性
様々なレベルの分解生成物で生成されたレシリン試料及び全長のレシリンを、上記のように酵素的架橋に供した。各架橋試料が毎日の観察を通して固体のままであった期間を決定することにより、架橋試料の安定性を経時的に評価した。表４は、各架橋試料の固体としての時間を示す。表４に示されるように、全長レシリンを含む試料は、全長レシリンを含まない試料よりも安定期間が長かった。
【０２４８】
（表４）架橋レシリンの安定性
2021530522.tif 000009
【０２４９】
実施例５：レシリン発泡体
増粘添加剤、例えば、ヒュームドシリカ、及び重炭酸ナトリウムの存在下でレシリンを架橋すると、比較的均一な気泡分布を有する発泡レシリンがもたらされた。ヒュームドシリカの量を変更すると、平均気泡サイズに影響を与え、発泡レシリン固体を調整する手段が与えられる。結果が表５に示される。
【０２５０】
（表５）レシリン発泡体のデータ
2021530522.tif 000010
【０２５１】
レシリンの溶液を調製した。０．８１ｇのレシリンをｐＨ７．４の２．１９ｍＬのＰＢＳに溶解させた。発泡剤を添加し、気泡を導入するために溶液をボルテックスし、熱または光により架橋した。５０ｍｇのキサンタンガムを溶液に添加し、続いて、２２５ｍＭの過硫酸アンモニウム０．６５ｍＬを添加した。キサンタンガムは、溶液中の気泡を取り出すのに役立つ粘度も増加させたので、発泡剤として使用した。次に、溶液をボルテックスし、８０℃で３．５時間加熱した。
【０２５２】
一部の試料では、ルテニウム（ＩＩ）及び白色光を使用してレシリンを架橋した。そのような実験では、０．４０５ｇのレシリンロット３を１．１０ｍＬのＰＢＳに溶解させた。次に、１００ｍＭの過硫酸アンモニウム０．３ｍＬ及び１０ｍＭのＲｕ（ＩＩ）触媒０．３ｍＬを添加した。他の試料では、０．４０５ｇのレシリンロット３を１．１０ｍＬのＰＢＳに溶解させた。次に、２５ｍｇのキサンタンガムを添加し、続いて、１００ｍＭの過硫酸アンモニウム０．３ｍＬ及び１０ｍＭのＲｕ（ＩＩ）触媒０．３ｍＬを添加した。
【０２５３】
一部の試料では、重炭酸ナトリウムを化学発泡剤として使用した。重炭酸ナトリウムをレシリン溶液に添加して、架橋させた。一部の試料では、増粘剤であるヒュームドシリカを添加した。重炭酸ナトリウムが多すぎると（３３ｍｇ／ｍＬ以上）、ゲル化が抑制された。６〜２０ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウムをレシリン溶液に使用すると、８０℃で３．５時間後に大きな気泡のあるレシリン固体が得られた。増粘剤であるヒュームドシリカを４〜１０重量％添加すると、気泡が均一に分布したレシリン発泡体が得られた（図７及び８）。ヒュームドシリカが少なすぎると、半発泡レシリン固体が生成され、５重量％よりも多くのヒュームドシリカを添加すると、より小さい気泡を有する発泡レシリンがもたらされた（図７）。５重量％のヒュームドシリカを含むレシリン発泡体の気泡の直径は、０．２〜２ｍｍであった。１０重量％のヒュームドシリカを含むレシリン発泡体の気泡の直径は、０．０５〜０．２ｍｍであった。
【０２５４】
具体的には、０．２７ｇのレシリンロット３をｐＨ７．４の０．７３ｍＬのＰＢＳに溶解させた。次に、３７、１８、１０、または６ｍｇの重炭酸ナトリウムを溶液に添加し、続いて、２２５ｍＭの過硫酸アンモニウム０．２２ｍＬ及び０〜１０重量％のヒュームドシリカを添加した。溶液をボルテックスし、８０℃で３．５時間加熱した。実験をキャップ付きの２ｍＬのチューブ中で実施した。
【０２５５】
一部の試料では、ＩＳＣＯポンプを使用して、８３℃でレシリンを架橋しながら、１６００ｐｓｉまたは５００ｐｓｉのいずれかで溶存窒素を導入した。これらの圧力での架橋は、おそらく溶存酸素の量の増加のために、大気圧での架橋よりも遅い速度で進行した。
【０２５６】
具体的には、２２５または５５０ｍＭの過硫酸アンモニウムの水溶液１．１ｍＬを、２７重量％のレシリンのＰＢＳ溶液５ｍＬに添加した。次に、この溶液を７１９７ｒｃｆで５分間遠心分離し、ＩＳＣＯポンプに加えた。次に、ポンプをハウス窒素に接続し、ＩＳＣＯポンプは、最大容量２６６ｍＬに設定し、３分間窒素でパージし、次に、密封した。次に、ポンプを５００ｐｓｉまたは１６００ｐｓｉのいずれかに設定し、８３℃で２〜６時間加熱した。圧力を解放した後、レシリンを８３℃でさらに１〜２時間加熱した。
【０２５７】
実施例６：溶媒交換、及び水性溶媒と極性非水溶媒中の架橋レシリンの比較
以下に詳細に記載するように、水性溶媒中の組み換えレシリンの架橋混合物を溶媒交換で処理して、溶媒を極性非水溶媒で置き換えて、特定の用途により適する材料特性を有する組成物を形成した。
【０２５８】
残りの粉末が部分的に分解されたレシリンを含む、ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）で測定した、１９質量％の全長レシリンを含むレシリン粉末を調製した。
【０２５９】
次に、レシリン粉末を１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解させ、報告されたレシリンの重量パーセントは、重量／重量（ｗ／ｗ）である。０．２７ｇのレシリンを０．７３ｇのＰＢＳ溶液に添加することにより、２７重量％のレシリンの溶液１ｇを調製する。次に、レシリン溶液を型内で架橋して、水系レシリン固体組成物を形成した。形成されたレシリン固体は、直径１５ｍｍ×高さ５ｍｍのディスクであった。
【０２６０】
グリセロール系レシリン固体を生成するために、水系固体を、密閉容器中、６０℃で１６時間、２０×体積の６０％のグリセロール（６０：４０グリセロール：水（ｖ：ｖ））に交換される。次に、固体を、密封されていない容器内で、６０℃で１６時間、２０×体積のグリセロールに交換する。
【０２６１】
水系及びグリセロール系レシリン固体の試料を、室温で１週間密封せずに保管した。図９に示されるように、水系レシリン固体をわずか１週間後に脱水したが、グリセロール系レシリン固体は目に見える分解や脱水なしに元の形状を維持した。
【０２６２】
実施例７：溶媒交換、及び複数の極性非水性レシリン溶媒の特性の比較
以下のように、極性非水溶媒中のレシリン固体を、１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の架橋レシリンから調製した。
【０２６３】
密封されていない容器内で、６０℃で１６時間または２日間（すなわち、２日間のインキュベーション）、２０×体積のプロピレングリコール中でレシリン固体を交換することにより、プロピレングリコール溶媒中のレシリン固体を調製した。
【０２６４】
密閉容器内で、６０℃で１６時間、２０×体積の６０％のグリセロール（６０：４０グリセロール：水（ｖ：ｖ））中でレシリン固体を交換することにより、６０〜１００％グリセロール溶媒中のレシリン固体を調製した。次に、固体を、密封されていない容器内で、６０℃で１６時間、２０×体積のグリセロールに交換する。
【０２６５】
密封されていない容器内で、６０℃で１６時間または２日間（すなわち、２日間のインキュベーション）、２０×体積のグリセロール中でレシリン固体を交換することにより、１００％のグリセロール溶媒中のレシリン固体を調製した。
【０２６６】
密封されていない容器内で、６０℃で１６時間、２０×体積のエチレングリコール中でレシリン固体を交換することにより、エチレングリコール溶媒中のレシリン固体を調製した。
【０２６７】
密封されていない容器内で、６０℃で１６時間、２０×体積のプロピレングリコール中のレシリン固体を交換することにより、プロピレングリコール溶媒中のレシリン固体を調製した。
【０２６８】
コアセルベート形成による精製に基づいてレシリン固体を形成するために、２７重量％（ｗ／ｗ）のレシリン溶液を−５℃でインキュベートし、液−液相分離が生じた。下部コアセルベート層を分離し、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）粉末をコアセルベートに混合して、最終濃度を３６ｍＭのＡＰＳにした。次に、この溶液を８０℃で２．５時間架橋した。次に、代表的な溶媒交換手順に従って、固体を交換した。
【０２６９】
別途記載のない限り、使用されるレシリン粉末は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で測定して１９質量％の全長であり、粉末の残りは部分的に分解されたレシリンで構成される。ＳＥＣで測定して８７質量％の全長単量体レシリンであるレシリン粉末から、２７重量％の「全長レシリン」試料を調製した。
【０２７０】
ＳＥＣを使用してレシリン組成物中にレシリンの優勢種の相対量の特性を示すために、レシリン粉末を、５Ｍのグアニジンチオシアナートに溶解させ、分子量に基づいて成分に分離するために、Ｙａｒｒａ  ＳＥＣ−３０００  ＳＥＣ−ＨＰＬＣカラムに注入した。検出モダリティとして屈折率を使用した。全てのタンパク質の９０％超が互いに約７％以内のｄｎ／ｄｃ値（屈折率の応答係数）を示すという仮定の下で、一般的なタンパク質標準としてＢＳＡを使用した。保持時間の標準としてポリ（エチレンオキシド）を使用し、方法の一貫した性能を保証するチェック標準としてＢＳＡ較正物質を使用した。６０〜４０ｋＤａのレシリンに対応する範囲を評価し、凝集または重合したレシリンに対応し得る観察されたより高いピークは、この定量化には含めなかった。総レシリンの一部としての組成物中の全長レシリンの量を決定するために、このレシリンピークの相対パーセンテージを質量％及び面積％として報告した。
【０２７１】
次に、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＫｉｎｅｘｕｓレオメーターＲＮＸ２１１０を使用して、上記のように作成された組成物のそれぞれの応力−ひずみ曲線を生成した。以下のプロトコールを２２℃の温度で適用した。ステップ１：初期ギャップ−６．５ｍｍ、ステップ２：最終ギャップへの降下。ステップ１及び２を５回繰り返した。レオメーターで測定された弾性率の値は、単に相対的なものであり、様々な条件下または様々な機器で試験された材料と比較することはできない。
【０２７２】
工学応力と工学ひずみをプロットして応力−ひずみ曲線を生成した。以下の式より、工学応力を計算した：工学応力＝（レオメータージオメトリと接触するレシリン固体の垂直力（Ｎ）／Ａ（ｍｍ２））×１０６。工学ひずみは、圧縮ひずみの絶対値＝ＡＢＳ（（レシリン固体の現在の圧縮高さ（ｍｍ）−非圧縮固体の高さ（ｍｍ））／非圧縮固体の高さ（ｍｍ））＊１００である。
【０２７３】
図１０Ａは、６０〜１００％のグリセロール中の２７重量％の架橋レシリンの応力−ひずみ曲線を示す。図１０Ｂは、プロピレングリコール中の２７重量％の架橋レシリンの応力−ひずみ曲線を示す。図１０Ｃは、プロピレングリコール中の２７重量％の全長架橋レシリンの応力−ひずみ曲線を示す。比較のために、Ｄｒ．Ｓｈｏｌｌのインサートのレオメトリーデータも生成した。
【０２７４】
図１１に示されるように、発泡レシリンの応力−ひずみ曲線は、ホッケースティックのような形状であった。これは、発泡レシリンのエアポケットの結果であり、エアポケットが、まず、圧縮され、続いて、レシリン材料が圧縮される。
【０２７５】
レオメトリーデータから、弾性率及び弾性の相対値を表５に示されるように決定した。負荷曲線下面積を取得し、工学応力対ひずみプロットでの無負荷曲線下面積で除し、この値に１００を乗じることにより、相対弾性（％）を計算した。１０〜２０％の絶対圧縮ひずみから荷重曲線の勾配をとることにより、相対弾性率を計算した。
【０２７６】
示されるように、水性水系溶媒から極性非水溶媒への架橋レシリン溶媒の交換により、同様の弾性及び同様の伸縮性を有するより堅い材料がもたらされた。全ての架橋レシリン組成物は、試験された条件下で弾性であった（２０Ｎ力未満）。
【０２７７】
また、レオメーターを使用して、１００％のグリセロール溶媒中の発泡剤としてヒュームドシリカを含む、実施例５に記載されるように生成された５重量％の発泡レシリンの弾性を測定した。結果は、表６にも示される。
【０２７８】
（表６）様々な溶媒中の架橋レシリンの弾性率及び弾性の相対値
2021530522.tif 000011
【０２７９】
表６の弾性及び弾性率の相対値を、図１２に示されるようにプロットした。このプロットは、溶媒交換により架橋レシリン特性を調整した場合の、弾性及び弾性率間の関係を示す。
【０２８０】
また、レオメーターを使用して、別々に調製されたプロピレングリコール中の架橋レシリン固体の相対弾性及び弾性率を測定した。結果が表７に示される。
【０２８１】
（表７）同じように調製されたプロピレングリコール固体のレオメーターデータ
2021530522.tif 000012
【０２８２】
また、レオメーターを使用して、力を繰り返し加えることにより、様々な溶媒中で架橋レシリン固体の相対弾性及び弾性率を測定して、力を繰り返し加えることがこれらのパラメーターに与える影響を決定した。結果が表８に示される。
【０２８３】
（表８）レオメーターデータ：複数の圧縮の弾性及び弾性率データ
2021530522.tif 000013
【０２８４】
実施例８：レシリン固体の剛性と代表的なミッドソールの剛性
架橋シルク固体組成物を、水、６０〜１００％のグリセロール、１００％のグリセロール、プロピレングリコール（１６時間のインキュベーション）、及びプロピレングリコール（実施例６に記載の２日間のインキュベーション）で調製した。ＡＳＴＭ：Ｄ−２２４０によりＳｈｏｒｅ  ＯＯデュロメーター（ＡＤ−１００−００）を使用して、これらの材料の剛性を試験した。比較のために、Ｄｒ．Ｓｃｈｏｌｌのインソール及び代表的なミッドソールも試験した。結果が表９に示される。
【０２８５】
（表９）様々なレシリン組成物の剛性 対 代表的なミッドソールの剛性
2021530522.tif 000014
【０２８６】
実施例９：Ｚｗｉｃｋ圧縮曲線により測定された弾性から塑性への遷移
２７重量％のレシリンエチレングリコール固体（「Ａ」）、２７重量％のレシリンプロピレングリコール固体（「Ｃ」）、コアセルベートレシリンプロピレングリコール固体（「Ｄ」）、２７重量％のレシリン６０〜１００％グリセロール固体（「Ｇ」）、及び２７重量％のレシリン１００％グリセロール固体（「Ｈ」）に対し、Ｚｗｉｃｋ圧縮データを得た。これらの試料のそれぞれを実施例５に記載されるように調製した。
【０２８７】
具体的には、５ｋＮのロードセル及び５ｋＮ圧縮プラテン（Ｚｗｉｃｋ／Ｒｏｅｌｌ  Ｚ５．０）を備えたＺｗｉｃｋ引張試験機を使用して、上記試料の圧縮データを試験した。各固体の立体寸法は、１５ｍｍ×５ｍｍのディスクであった。２２Ｃの温度（周囲温度）及び６５％の湿度（周囲）で硬質プラスチックの圧縮プログラムのＤ６９５圧縮特性を使用して、材料を試験した。
【０２８８】
各固体のＺｗｉｃｋ引張試験機で測定された力対ひずみ曲線が図１３に示される。最大２ｋＮの印加圧縮力で、レシリン固体のいずれに対しても、弾性から塑性への遷移はみられない。代わりに、レシリン固体が圧縮応力下で壊れた場合、それは、弾性変形でなく、引張りによるものであった。
【０２８９】
実施例１０：プロピレングリコールレシリン固体の弾性及び圧縮の分析
実施例５のように調製された、プロピレングリコールに交換された２７重量％のレシリン固体について、ＡＳＴＭ  Ｄ７１２１及びＡＳＴＭ  Ｄ５７５試験を使用して、２５％のひずみでの反発弾性及び圧縮応力を測定した。試験された固体の寸法は、０．８インチの高さを有する直径１．１２５インチのディスクであった。これらの寸法の、異なる３つの試料が試験に供された。結果が表１０に示される。
【０２９０】
（表１０）プロピレングリコールレシリン固体の弾性及び圧縮のデータ
2021530522.tif 000015
【０２９１】
表１０に示されるデータは、同じＡＳＴＭ試験で試験された他のゴムまたはエラストマーと比較することができる。ＡＳＴＭ試験番号は、結果を再現するのに十分である。このデータ及びデュロメーターデータは、エラストマーの他のゴムと直接比較することができる唯一のデータである。
【０２９２】
さらなる考慮
本開示の実施形態の上述の説明は、例示の目的で提示されており、網羅的であること、または特許請求の範囲を開示された正確な形態に限定することは意図されない。当業者は、多くの修正及び変形が上の開示に照らして可能であることを理解することができる。
【０２９３】
本明細書で使用される言語表現は、主に可読性及び教示のために選択されており、本発明の主題を限定または制限するように選択されていなくてもよい。それ故、本開示の範囲は、この詳述された説明ではなく、むしろ、本明細書に基づく出願で発行される任意の特許請求の範囲により制限されることが意図される。従って、実施形態の開示は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を例示するが、限定しないことが意図される。
【０２９４】
本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、定義を含み本明細書が優先される。さらに、セクションの見出し、材料、方法、及び例は、例示にすぎず、限定することは意図されない。
【０２９５】
配列表
2021530522.tif 000016
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年6月2日(2021.6.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
一部の実施形態によると、培地及び組み換え宿主細胞を含む発酵物も本明細書で提供され、組み換え宿主細胞は、ベクターを含み、ベクターは、分泌レシリンコード配列を含み、組み換え宿主細胞は、組み換えレシリンを少なくとも２ｍｇ／ｇ乾燥細胞重量／時間の速度で分泌する。
[本発明1001]
精製組み換えレシリンを含む組成物を提供する工程、
過硫酸アンモニウムを含む架橋溶液に前記組み換えレシリンを入れる工程、及び
前記架橋溶液中の前記組み換えレシリンを、少なくとも60℃の温度でインキュベートし、それにより、架橋組み換えレシリン固体組成物を生成する工程
を含む、組み換えレシリンを架橋する方法。
[本発明1002]
前記インキュベーションが、少なくとも15分、少なくとも30分、少なくとも45分、少なくとも60分、少なくとも90分、または少なくとも2時間実施される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記架橋溶液中の前記組み換えレシリンが、60℃〜85℃、70℃〜85℃、または75℃〜85℃の温度でインキュベートされる、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1004]
前記インキュベーションが、少なくとも2時間実施される、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1005]
前記架橋溶液が、光触媒や架橋酵素を含まない、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記架橋された組み換えレシリン固体組成物が、室温で5日間超、10日間超、20日間超、または40日間超で安定である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記精製組み換えレシリンが、培養物中の改変生物において前記組み換えレシリンをコードする遺伝子を組み換え発現すること、及び前記培養物から発現組み換えレシリンを精製することにより調製される、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1008]
架橋組み換えレシリンを含む組成物であって、前記組み換えレシリンが、前記レシリンを過硫酸アンモニウム及び熱に曝露することにより架橋されている、前記組成物。
[本発明1009]
架橋酵素を含まない、架橋組み換えレシリンを含む組成物。
[本発明1010]
光触媒を含まない、架橋組み換えレシリンを含む組成物。
[本発明1011]
極性非水溶媒中に架橋組み換えレシリンを含む、組み換えレシリン組成物。
[本発明1012]
前記極性非水溶媒が、プロトン性溶媒である、本発明1011の組成物。
[本発明1013]
前記プロトン性溶媒が、グリセロール、プロピレングリコール、及びエチレングリコールからなる群より選択される、本発明1012の組成物。
[本発明1014]
前記極性非水溶媒が、非プロトン性溶媒である、本発明1011の組成物。
[本発明1015]
前記非プロトン性溶媒が、ＤＭＳＯである、本発明1014の組成物。
[本発明1016]
20〜40重量％のレシリンを含む、本発明1011〜1015のいずれかの組成物。
[本発明1017]
サイズ排除クロマトグラフィーで測定した場合、前記レシリンが、全レシリンの一部として少なくとも20％、少なくとも50％、少なくとも70％、または少なくとも80％の全長レシリンである、本発明1011〜1016のいずれかの組成物。
[本発明1018]
前記極性非水溶媒が、前記溶媒の少なくとも60体積％、少なくとも70体積％、少なくとも80体積％、少なくとも90体積％、少なくとも95体積％、少なくとも98体積％、または少なくとも99体積％である、本発明1011〜1017のいずれかの組成物。
[本発明1019]
前記組み換えレシリン組成物が、水性溶媒中の同様の架橋組み換えレシリンよりも大きい弾性率を有する、本発明1011〜1018のいずれかの組成物。
[本発明1020]
ＡＳＴＭ  Ｄ2240によりＳｈｏｒｅ  ＯＯデュロメーターを使用して測定した場合、前記組み換えレシリン組成物が、少なくとも10の硬度を含む、本発明1011〜1019のいずれかの組成物。
[本発明1021]
ＡＳＴＭ  Ｄ2240によりＳｈｏｒｅ  ＯＯデュロメーターを使用して測定した場合、前記組み換えレシリン組成物が、約10〜約50の硬度を含む、本発明1011〜1020のいずれかの組成物。
[本発明1022]
ＡＳＴＭ  Ｄ7121で測定した場合、前記組み換えレシリン組成物が、約40％〜約60％の反発弾性を含む、本発明1011〜1021のいずれかの組成物。
[本発明1023]
ＡＳＴＭ  Ｄ575で測定した場合、前記組み換えレシリン組成物が、約6〜約8ｐｓｉの25％での圧縮応力を含む、本発明1011〜1022のいずれかの組成物。
[本発明1024]
Ｚｗｉｃｋ圧縮試験で測定した場合、前記組み換えレシリン組成物が、2ｋＮ未満の圧縮力で弾性から塑性へ遷移しない、本発明1011〜1023のいずれかの組成物。
[本発明1025]
前記組み換えレシリン組成物が、発泡材料である、本発明1011〜1024のいずれかの組成物。
[本発明1026]
水性溶媒中で架橋組み換えレシリン固体組成物を提供する工程、及び
前記水性溶媒を極性非水溶媒と交換する工程
を含む、組み換えレシリン固体を調製する方法。
[本発明1027]
前記極性非水溶媒が、プロトン性溶媒である、本発明1026の方法。
[本発明1028]
前記プロトン性溶媒が、グリセロール、プロピレングリコール、及びエチレングリコールからなる群より選択される、本発明1027の方法。
[本発明1029]
前記極性非水溶媒が、非プロトン性溶媒である、本発明1026の方法。
[本発明1030]
前記非プロトン性溶媒が、ＤＭＳＯである、本発明1029の方法。
[本発明1031]
前記溶媒交換が、少なくとも8時間、少なくとも16時間、少なくとも24時間、または少なくとも48時間実施される、本発明1026〜1030のいずれかの方法。
[本発明1032]
前記溶媒交換が、約60℃で実施される、本発明1026〜1031のいずれかの方法。
[本発明1033]
サイズ排除クロマトグラフィーで測定した場合、前記架橋組み換えレシリン固体組成物が、全レシリンの一部として少なくとも20％、少なくとも50％、少なくとも70％、または少なくとも80％の全長レシリンを含む、本発明1026〜1032のいずれかの方法。
[本発明1034]
前記架橋組み換え固体組成物が本発明1001〜1007のいずれかの方法で調製される、本発明1026〜1033のいずれかの方法。
[本発明1035]
水性溶媒を含む架橋組み換えレシリン固体組成物を提供する工程、及び
前記水性溶媒を極性非水溶媒で置き換えるために溶媒交換を実施する工程
を含む、架橋組み換えレシリン固体を含む固体組成物の材料特性を調整する方法。
[本発明1036]
前記溶媒を置き換えると、前記架橋組み換えレシリン固体組成物の弾性率、弾性、硬度、最大弾性圧縮荷重、または材料寿命が変化する、本発明1035の方法。
[本発明1037]
精製組み換えレシリンを含む組成物を提供する工程、
過硫酸アンモニウムを含む水性溶媒に前記組み換えレシリンを入れる工程、
前記水性溶媒中の前記組み換えレシリンを、少なくとも60℃の温度でインキュベートし、それにより、架橋組み換えレシリン固体組成物を生成する工程、ならびに
グリセロール、プロピレングリコール、エチレングリコール、及びＤＭＳＯからなる群より選択される極性非水溶媒と、前記水性溶媒を交換する工程
を含む、組み換え架橋レシリン固体を調製する方法。
[本発明1038]
水性溶媒中で架橋組み換えレシリン固体組成物を提供する工程、
前記水性溶媒を極性非水溶媒と交換する工程、及び
前記架橋組み換えレシリン固体組成物に1つ以上の気泡を導入する工程
を含む、組み換えレシリン発泡体を調製する方法。
[本発明1039]
前記極性非水溶媒が、プロトン性溶媒である、本発明1038の方法。
[本発明1040]
前記プロトン性溶媒が、グリセロール、プロピレングリコール、及びエチレングリコールからなる群より選択される、本発明1039の方法。
[本発明1041]
前記極性非水溶媒が、非プロトン性溶媒である、本発明1038の方法。
[本発明1042]
前記非プロトン性溶媒が、ＤＭＳＯである、本発明1041の方法。
[本発明1043]
前記溶媒交換が、少なくとも8時間、少なくとも16時間、少なくとも24時間、または少なくとも48時間実施される、本発明1038〜1042のいずれかの方法。
[本発明1044]
前記溶媒交換が、約60℃で実施される、本発明1038〜1043のいずれかの方法。
[本発明1045]
サイズ排除クロマトグラフィーで測定した場合、前記架橋組み換えレシリン固体組成物が、全レシリンの一部として少なくとも20％、少なくとも50％、少なくとも70％、または少なくとも80％の全長レシリンを含む、本発明1038〜1044のいずれかの方法。
[本発明1046]
前記架橋組み換え固体組成物が本発明1001〜1007のいずれかの方法で調製される、本発明1038〜1045のいずれかの方法。
[本発明1047]
前記導入が、前記架橋組み換えレシリン固体組成物に発泡剤を添加することを含む、本発明1038〜1046のいずれかの方法。
[本発明1048]
前記発泡剤が、化学発泡剤を含む、本発明1047の方法。
[本発明1049]
前記化学発泡剤が、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、アンモニウム、アゾジカルボンアミド、イソシアナート、ヒドラジン、イソプロパノール、5−フェニルテトラゾール、トリアゾール、4，4’オキシビス（ベンゼンスルホニルヒドラジド）（ＯＢＳＨ）、トリヒドラジントリアジン（ＴＨＴ）、リン酸水素、酒石酸、クエン酸、及びトルエンスルホニルセミカルバジド（ＴＳＳ）を含む、本発明1048の方法。
[本発明1050]
前記化学発泡剤が、重炭酸ナトリウムを含む、本発明1048の方法。
[本発明1051]
前記発泡剤が、物理発泡剤を含む、本発明1047の方法。
[本発明1052]
前記物理発泡剤が、クロロフルオロカーボン（ＣＦＣ）、溶存窒素、Ｎ2、ＣＨ4、Ｈ2、ＣＯ2、Ａｒ、ペンタン、イソペンタン、ヘキサン、二塩化メチレン、及びジクロロテトラフルオロエタンを含む、本発明1051の方法。
[本発明1053]
前記物理発泡剤が、溶存窒素を含む、本発明1051の方法。
[本発明1054]
本発明1001〜1007、1025〜1036、及び1038〜1053のいずれかの方法で調製された組成物を含む、靴のインソール。
[本発明1055]
極性非水溶媒中の架橋レシリン組成物を含む組成物であって、前記架橋レシリンが発泡されている、前記組成物。
[本発明1056]
前記発泡架橋レシリンが、少なくとも50％の多孔性を含む、本発明1055の組成物。
[本発明1057]
前記発泡架橋レシリンが、約0．01ｍｍ〜約3ｍｍの平均気泡直径を有する、本発明1055の組成物。
[本発明1058]
本発明1008〜1025及び本発明1055〜1057のいずれかの組成物を含む、靴のインソール。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
一部の実施形態では、本明細書で提供される組み換えレシリンは、１つ以上のＡリピートを含む。一部の実施形態では、組み換えレシリンは、それぞれコンセンサス配列ＳＸＸＹＧＸＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）（式中、Ｓはセリンであり、Ｘはアミノ酸であり、Ｙはチロシンであり、Ｇはグリシンであり、Ｐはプロリンである）を有するＡリピート及び／または準Ａリピートアミノ酸部分配列の複数のブロックを含むＮ末端Ａドメインを含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０９】
一部の実施形態では、組み換えレシリンは、式
（Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４）ｎ（１）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）
により記載される１つ以上のコンセンサス配列を含み、
式中、括弧はコンセンサス配列のリピートまたは準リピートを示し、
ｎはＡリピートまたは準Ａリピートの数を記載し、１〜１００、または２〜５０、または５〜５０、または５〜２０であり、
Ｘ１は４アミノ酸長のモチーフであって、Ｘ１の第１のアミノ酸はＹであり、Ｘ１の残りのアミノ酸はＧＡＰ、ＧＬＰ、ＧＰＰ、ＧＴＰ、またはＧＶＰであり、
Ｘ２は３〜２０アミノ酸長のモチーフであり、
Ｘ２はＧＧＧ、ＧＧＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）、Ｎ、ＮＧ、ＮＮ、ＮＧＮ、ＮＧＮＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２）、ＧＱＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）、ＧＱＧＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）、ＧＱＧＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５）、ＧＱＧＱＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６）、もしくは３つ以上のグリシン残基を含むか、または、Ｘ２の残基の５０％以上が、グリシンもしくはアスパラギンのいずれかであるか、または、Ｘ２の残基の６０％以上が、グリシンもしくはアスパラギンのいずれかであるか、またはＸ２の残基の７０％以上が、グリシンもしくはアスパラギンのいずれかであるか、またはＸ２の残基の８０％以上が、グリシンもしくはアスパラギンのいずれかであり、
Ｘ３は２〜４アミノ酸長のモチーフであり、Ｘ３はＧＧ、ＬＳ、ＡＰＳ、ＧＡＧ、ＧＧＧ、ＫＰＳ、ＲＰＳ、またはＧＧＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）であり、
Ｘ４は１〜２アミノ酸長のモチーフであり、Ｘ４はＳ、Ｄ、Ｔ、Ｎ、Ｌ、ＤＳ、ＤＴ、ＬＳ、ＳＳ、ＳＴ、ＴＮ、またはＴＳである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１２】
一部の実施形態では、組み換えレシリンは、式
（Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３）ｍ（２）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５）
により記載される１つ以上のコンセンサス配列を含み、
式中、括弧はコンセンサス配列のリピートまたは準リピートを示し、
ｍはＢ−リピートまたは準Ｂ−リピートの数を記載し、１〜１００であり、
Ｘ１１は１〜５アミノ酸長のモチーフであり、第１のアミノ酸はＹであり、残りのアミノ酸はＧＡＰ、ＧＰＰ、ＳＳＧ、またはＳＧＧを含み得、
Ｘ１２は２〜５アミノ酸長のモチーフであり、ＧＱ、ＧＮ、ＲＰＧ、ＲＰＧＧＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７）、ＲＰＧＧＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８）、ＳＳＳ、ＳＫＧ、またはＳＮを含み、
Ｘ１３は４〜３０アミノ酸長のモチーフであり、ＧＧ、ＤＬＧ、ＧＦＧ、ＧＧＧ、ＲＤＧ、ＳＧＧ、ＳＳＳ、ＧＧＳＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）、ＧＮＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０）、ＧＧＡＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１）、もしくは３以上のグリシン残基を含むか、または３０％以上の残基がグリシンであるか、もしくは４０％以上の残基がグリシンであるか、もしくは５０％以上の残基がグリシンであるか、もしくは６０％以上の残基がグリシンである。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１５】
一部の実施形態では、組み換えレシリンはさらに、配列ＸＸＥＰＰＶＳＹＬＰＰＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２）（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）を含む。そのような一部の実施形態では、配列は、ＡリピートまたはＢリピートのＮ末端側に位置する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２６】
配列表のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９は、後で切断されるシグナル配列とともに発現される全長セイシェルショウジョウバエレシリン配列（Ｄｓ＿ＡＣＢ）を提供する。第１の配列（斜体）は、シグナルペプチダーゼによる転写、続く、Ｋｅｘ２による切断の後に２回切断されるアルファ接合因子前駆体タンパク質シグナル配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）である。第２の配列（太字）は、Ｓｔｅ１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）により切断されるＥＡＥＡリピート（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）である。第３の配列（小文字）は、セイシェルショウジョウバエの全長レシリン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）に対応する。第４の配列（太字及び斜体）は、リンカー配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）に対応する。第５の配列（下線付き）は、３Ｘ  ＦＬＡＧタグ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）に対応する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２７】
エドマン配列決定により、約１１０ｋＤａバンドのタンパク質配列のＮ末端が、全長セイシェルショウジョウバエのレシリン配列に対応していたことが確認された。具体的には、Ｎ末端配列決定は、Ｎ末端は、「ＥＡＥＡ」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）または「ＧＲＰＥ」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３）に対応した（それぞれ、ＥＡＥＡリピート（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）を有するまたは有しない全長セイシェルショウジョウバエレシリン配列）ことを示した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021530522000001.app
【国際調査報告】
2021530522.tif 000058
2021530522.tif 000059
2021530522.tif 000060