(57)【要約】  本発明は、成分：ａ）少なくとも１種の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）除去剤、ｂ）少なくとも１種のトール様受容体９（ＴＬＲ９）アゴニスト、ｃ）１種または複数の免疫チェックポイント阻害剤を含み、ヒトまたは非ヒト哺乳動物の癌の治療に使用するための医薬併用剤に関する。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬併用剤であって、成分：
ａ）少なくとも１種の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）除去剤、
ｂ）少なくとも１種のトール様受容体９（ＴＬＲ９）アゴニスト、
ｃ）１種または複数の免疫チェックポイント阻害剤、を含み、ヒトまたは非ヒト哺乳動物の癌の治療に使用するための、医薬併用剤。
【請求項２】
前記成分ａ）のＴｒｅｇ除去剤が、表面抗原除去抗体または抗体フラグメントである、請求項１に記載の医薬併用剤。
【請求項３】
前記成分ａ）のＴｒｅｇ除去剤が、ＣＤ２５、ＣＤ１５ｓ、ＧＩＴＲ、ＣＣＲ４、ＣＴＬＡ−４、ＯＸ−４０、ＬＡＧ３、ＧＡＲＰ、ＺＡＰ−７０またはＰＤ−１表面抗原に対する抗体または抗体フラグメントである、請求項２に記載の医薬併用剤。
【請求項４】
前記成分ａ）のＴｒｅｇ除去剤が、ホスファチジルイノシトール−４，５−ビスホスフェート  ３−キナーゼデルタ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤である、請求項１に記載の医薬併用剤。
【請求項５】
前記成分ｂ）のＴＬＲ９アゴニストが、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含むＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）で構成される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬併用剤。
【請求項６】
前記ＣｐＧ  ＯＤＮが、式ＣＣｘ（Ｃ以外）（Ｃ以外）ｘｘＧＧＧで構成され、式中、ｘは、修飾または非修飾Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇまたはその誘導体からなる群より選択される任意の塩基である、請求項５に記載の医薬併用剤。
【請求項７】
前記ＣｐＧ  ＯＤＮが、１種または複数のヌクレアーゼ耐性ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドを含む、請求項５または６に記載の医薬併用剤。
【請求項８】
前記ＣｐＧ  ＯＤＮが、核酸配列：
５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ−３’（配列番号１）、
５’−ＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ−３’（配列番号２）、
５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ−３’（配列番号３）、
５’−ＧＧＧＧＴＣＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＧＧ−３’（配列番号４）
５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ−３’（配列番号５）、
５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ−３’（配列番号６）、
５’−ＴＣＧＡＣＧＴＴＣＧＴＣＧＴＴＣＧＴＣＧＴＴＣ−３’（配列番号７）、
５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ−３’（配列番号８）、
５’−ＴＣＧＣＧＡＣＧＴＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＴＴＣＧＧＴＡ−３（配列番号９）、
５’−ＧＧＧＧＡＣＧＡＣＧＴＣＧＴＧＧＧＧＧＧＧ−３’（配列番号１０）、
５’−ＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＡＣＧＴＴＧＡＴ−３’（配列番号１１）、
５’−ＴＣＧＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＣＣＧＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＣＧＧ−３’（配列番号１２）、の内の１個または複数を含む、請求項５に記載の医薬併用剤。
【請求項９】
前記成分ｂ）のＴＬＲ９アゴニストが、大腸菌、他の原核生物およびウィルスに由来し、ＴＬＲ９、または細菌性またはウィルスＤＮＡ  ＴＬＲ９アゴニスト中のリン酸ジエステル骨格などの非メチル化ＣｐＧ配列を模倣し、ダブルステムループ免疫調節剤（ｄＳＬＩＭ）として知られるＴＬＲ９を活性化する能力を有するダンベル様構造体に折り畳まれるものに結合する能力を有する一本鎖または二本鎖ゲノムＤＮＡである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬併用剤。
【請求項１０】
前記成分ｃ）の１種または複数のチェックポイント阻害剤が、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＫＩＲ、ＯＸ４０、ＩｇＧ、ＩＤＯ−１、ＩＤＯ−２、ＣＥＡＣＡＭ１、ＴＮＦＲＳＦ４、ＯＸ４０Ｌ、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＣＧＥＮ−１５０４９、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ａ２ａＲ、およびＢ−７またはこれらの組み合わせからなる群より選択されるチェックポイントタンパク質を阻害する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬併用剤。
【請求項１１】
ａ）前記制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）除去剤が、ＣＤ２５に対する抗体または抗体フラグメントである、
ｂ）前記トール様受容体９（ＴＬＲ９）アゴニストがＣｐＧ  ＯＤＮである、
ｃ）１種または複数の前記免疫チェックポイント阻害剤が、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１抗体である、請求項１に記載の医薬併用剤。
【請求項１２】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、単一注射溶液で希釈されたＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１抗体の組み合わせである、請求項１０に記載の医薬併用剤。
【請求項１３】
前記組み合わせが、成分ａ）が、成分ｂ）および成分ｃ）の前に、１回または繰り返して投与され、任意選択で、成分ｂ）が、成分ｃ）を癌患者へ投与する前に、１回または繰り返して投与されることを規定する投与計画をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬併用剤。
【請求項１４】
前記投与計画が、
ａ．成分ａ）が、＋１日目の前に５〜９日間注射される、
ｂ．成分ｂ）が、＋１日目に開始して、１回または複数の注射により、３または４日目毎に注射される、
ｃ．成分ｃ）が、＋１日目に開始して、１回または複数の注射により、３または４日目毎に注射される、ことを規定する、請求項１３に記載の医薬併用剤。
【請求項１５】
３種の成分ａ）〜ｃ）の全てが、その後の癌患者への注射のための、別々の注射溶液として封入される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の医薬併用剤。
【請求項１６】
前記組み合わせがキットオブパーツである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の医薬併用剤。
【請求項１７】
組織中の腫瘍細胞の増殖を漸減させるエクスビボ法であって、
ａ．少なくとも１種の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）除去剤の適用ステップ、
ｂ．少なくとも１種のトール様受容体９（ＴＬＲ９）アゴニストの適用ステップ、
ｃ．１種または複数の免疫チェックポイント阻害剤の適用ステップであって、少なくとも前記ＴＬＲ９アゴニストが、Ｔｒｅｇ細胞除去後に続けて適用され、１種または複数の前記免疫チェックポイント阻害剤が、少なくとも１種の前記ＴＬＲ９アゴニストの後に、またはそれと同時に適用される、適用ステップ、を含む方法。
【請求項１８】
前記Ｔｒｅｇ除去剤、前記ＴＬＲ９アゴニストおよび／またはチェックポイント阻害剤が、請求項１〜１５で定められるいずれか１種である、請求項１７に記載のエクスビボ法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物の癌の治療に使用するための医薬併用剤およびキットオブパーツに関する。
【背景技術】
【０００２】
ほとんどの癌は、全体的にみて予後不良であり、早期に診断された場合にのみ、手術およびアブレーション療法により治癒を提供し得る（Ｓｉｅｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７年）。しかし、多くの場合、および特に肺癌に関しては、悪性疾患は進行期にのみ診断され、化学療法剤の場合には、放射線および、いくつかの事例では、チロシンキナーゼ阻害剤が寛解をもたらし、生存期間を延長する（非特許文献１２；非特許文献２７）。免疫チェックポイント阻害剤と免疫ワクチン接種との組み合わせは、唯一の利用可能な代替治療選択肢として残されている（非特許文献３；非特許文献６；非特許文献８；非特許文献１４；非特許文献１７；非特許文献２１）。
【０００３】
生理的状態下では、刺激および阻害経路の両方は、病原体に対する炎症性免疫応答を調節し、自己抗原に対する耐性を維持する。これらは、一連の多様な免疫チェックポイントにより調節され、それにより、健康な組織を損傷から保護する。悪性腫瘍はこれらのチェックポイントを利用して、免疫応答を抑制し、免疫系による破壊を回避できる。臨床的進展が認められる典型的な免疫チェックポイント阻害剤は、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）およびプログラム細胞死１（ＰＤ−１）であり、これらは、抗癌剤開発担当者の初期標的となってきた。ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４、ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ；ＣＤ２７２）、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン−３（ＴＩＭ−３）、リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３；ＣＤ２２３）、などの共抑制受容体は、多くの場合、チェックポイント制御因子と呼ばれる。
【０００４】
ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１経路は、免疫応答の異なる段階で機能する。ＣＴＬＡ−４の早期Ｔ細胞活性化に対する影響と対照的に、ＰＤ−１経路は、（後期）エフェクター段階でＴ細胞応答に影響を与えるように見える。ＰＤ−１は、持続的抗原暴露後、通常は慢性感染症または腫瘍に応答してＴ細胞上で発現上昇している。ＰＤ−１にリガンドであるＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２は、腫瘍細胞、ならびにいくつか他の造血および非造血細胞型により発現され得る。
【０００５】
ＣＴＬＡ４の臨床的抑制は、イピリムマブおよびトレメリムマブを用いて行われてきた。しかし、イピリムマブで治療した患者の集積データでは、これは、約３年で生存のプラトーに達し得るように見える。その後、３年間生存のまま残った患者は、持続性長期生存の恩恵を経験する可能性があり、これには、最大１０年間にわたり続く一部の患者が含まれる。このような抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂ療法の１つの主要な欠点は、それ自体を低減させる能力をなくした過剰免疫系に起因する自己免疫毒性の可能性があることである。イピリムマブで治療された患者の最大２５％が、皮膚炎、小腸結腸炎、肝炎、内分泌疾患（下垂体炎、甲状腺炎、および副腎炎を含む）、関節炎、ぶどう膜炎、腎炎、および無菌性髄膜炎などの重篤なグレード３〜４の有害事象／自己免疫型副作用を発症したことが報告されている。従って、チェックポイント阻害剤は、応答対象集団での癌治療に極めて効果的であるが、癌対象の約７５％は、この療法に応答しない。加えて、応答集団であっても、応答は必ずしも完全または最適ではない。
【０００６】
Ｈｅｒｂｓｔら（非特許文献１９）により報告された臨床試験は、ヒト化モノクローナル抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いて単一薬剤安全性、活性およびＰＤ−Ｌ１抑制の関連バイオマーカーを評価するように設計された。抗ＣＴＬＡ−４の経験とは対照的に、抗ＰＤ−１療法は、耐容性がより良好であるように見え、比較的低比率の自己免疫型副作用を誘導する。
【０００７】
従って、これらの第一世代抗癌免疫治療薬の臨床適用は、一部の患者（例えば、肺癌の約２０％）のみが、免疫チェックポイント遮断療法に応答することを示した（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献３５）。
【０００８】
古典的な治療戦略の失敗および第一世代チェックポイント遮断免疫療法に対する限定的な応答性は、新規の、より良好な治療選択肢が癌療法に必要であることを明確に示している。免疫チェックポイント制御因子単独の応答性および臨床的成功が限られているという事実を考慮すれば、相乗的治療法、すなわち、免疫チェックポイント制御因子と追加の免疫調節経路との組み合わせは、抗癌免疫療法の有効性を高める合理的方法といえる。自然免疫応答は、獲得および自然免疫の両方に基づいているので、抗癌免疫ワクチンは、獲得（ＴおよびＢ細胞）ならびに自然（樹状細胞、自然リンパ系細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞および顆粒球）免疫応答の両方を刺激する治療薬の組み合わせ作用から恩恵を受ける。
【０００９】
腫瘍微小環境の再形成ならびに成熟、抗原提示および腫瘍特異的細胞傷害性リンパ球のプライミングの強化が可能な相乗的共治療薬の１つのグループは、トール様受容体（ＴＬＲ）である。ＴＬＲは、免疫系の多くの細胞上に存在し、自然免疫応答に関与することが示された（非特許文献２０）。ＴＬＲは、脊椎動物が外来性分子を認識し、免疫応答を開始する重要な手段であり、また、自然および獲得免疫応答を結び付けることができる（非特許文献２；非特許文献２５）。一部のＴＬＲは、細胞表面に配置され、細胞外病原体を検出し、これに対する応答を開始し、および、細胞内に位置する他のＴＬＲは、細胞内病原体を検出し，これに対する応答を開始する。加えて、ＴＬＲは、危険シグナルを検知し、免疫刺激抗癌応答を促進できる（非特許文献２４）。
【００１０】
ＴＬＲアゴニストは、自然および獲得抗癌免疫応答の橋渡しをする能力を有する。しかし、増えつつある証拠は、種々のＴＬＲは、癌発生に対し、異なる副作用、いくつかの事例では、望ましくない副作用を有し得ることを示唆する。（非特許文献３２）この理由のために、併用療法での免疫増強剤としてのＴＬＲの適用については、この問題を明確にしなければならない。
【００１１】
ＴＬＲの中で、ＴＬＲ９は、免疫療法の強化のための良好な候補であるように見える。理由は、ＴＬＲ９刺激は、Ｔｈ１および炎症促進性サイトカインの産生を特徴とする自然免疫応答を促進するためである（非特許文献３０）。ＴＬＲ９は、細菌およびウィルスＤＮＡ、合成ＩＭＯ−２０５５（ＥＭＤ１２０１０８１）および免疫調節オリゴヌクレオチド（例えば、ＩＭＯ−２１２５またはＩＭＯ−２０１５５）ならびに細菌またはウィルスＤＮＡ中の非メチル化デオキシシチジレート−ホスフェート−デオキシグアニレート（ＣｐＧ）配列を模倣する他の合成オリゴヌクレオチド中でよく認められる非メチル化ＣｐＧモチーフを認識することが知られている（非特許文献１３；非特許文献１８）。加えて、リン酸ジエステル骨格を含み、ＭＧＮ−１７０３およびＭＧＮ−１７０６などのダブルステムループ免疫調節剤（ｄＳＬＩＭ）として知られるダンベル様構造中に折り畳まれるＴＬＲ９アゴニストは、ＴＬＲ９アゴニストとして機能する（非特許文献１３；非特許文献２６）。さらに、ＴＬＲ９の天然起源アゴニストは、抗腫瘍活性（例えば、抗腫瘍増殖および抗血管新生）を生じ、有効な抗癌応答、例えば、抗白血病応答を生じることが示された（非特許文献３３）。ＴＬＲ９標的化は、肺治療適用に特に好都合である。理由は、ＴＬＲ９は，マウスおよび人の気管支上皮、血管内皮、肺胞中隔細胞、肺胞マクロファージ、樹状細胞およびＢ細胞で発現しているためである（非特許文献３０；非特許文献３１）。加えて、ＴＬＲ９アゴニストは、臨床試験で使用されてきた。発表データは、有害毒作用を示さず、いくつかの事例では、小さい臨床的有用性も示されている（非特許文献９；非特許文献２３；非特許文献３６）。
【００１２】
ＴＬＲ９およびチェックポイント阻害剤の個々の欠点を考慮して、免疫チェックポイント調節物質またはチェックポイント阻害剤が、１種または複数のＴＬＲ９アゴニストと一緒に癌患者に同時投与される併用療法が開発された。
【００１３】
特許文献１は、医薬、特に、癌の予防および／または治療で使用するための、免疫チェックポイント調節物質および細胞透過性ペプチド、少なくとも１種の抗原または抗原エピトープ、およびＴＬＲペプチドアゴニストを含む複合体の組み合わせについて記載している。さらに、この発明はまた、医薬，例えば、癌の予防および／または治療に有用な、医薬組成物およびワクチン剤などの組成物も提供する。
【００１４】
特許文献２は、癌に対する免疫応答を誘導する方法を記載し、該方法は、癌患者に１種または複数のＴＬＲ９アゴニストおよび１種または複数のチェックポイント阻害剤を同時投与することを含む。
【００１５】
特許文献３は、癌の治療または抗腫瘍応答を必要としている対象の癌の治療または抗腫瘍応答を開始、強化、または持続させる方法を記載し、該方法は、チェックポイント阻害剤と組み合わせて、治療薬を対象に投与することを含む。
【００１６】
特許文献４は、ＴＬＲ９アゴニストを、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＬＡＧ３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＫＩＲ、ＯＸ４０、ＩｇＧ、ＩＤＯ−１、ＩＤＯ−２、ＩＣＯＳ、ＣＥＣＡＭ１、ＴＮＦＲＳＦ４、ＢＴＬＡ、ＯＸ４０ＬまたはＴＩＭ３の阻害剤などの１種または複数のチェックポイント阻害剤と組み合わせて使用する癌の治療方法を記載している。該方法は、特定のＣＰＧオリゴヌクレオチドの局所投与および抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または抗ＣＴＬＡ４抗体などのチェックポイント阻害剤の全身投与を含む。
【００１７】
特許文献５は、有効量のＴＬＲ９アゴニストおよびチェックポイント阻害剤を対象に投与することにより癌の治療のための方法を記載し、ＴＬＲ９アゴニストは、腫瘍中に、または腫瘍にほぼ隣接して投与される。ＴＬＲ９アゴニストは好ましくは、ＣｐＧ  ＤＮＡであり、チェックポイント阻害剤は好ましくは、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１および／またはＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである。
【００１８】
チェックポイント阻害剤および／またはＴＬＲを用いた癌免疫療法の成功を妨害するさらなる障害は、免疫抑制性制御性Ｔ細胞（ＴｒｅｇまたはＴｒｅｇ細胞）である（非特許文献３４）。Ｔｒｅｇの固有の機能は、病理学的自己免疫を抑制することである。癌では、免疫系は、免疫学的な攻撃に対して腫瘍を保護するように働くＴｒｅｇ細胞を生成するために再プログラムされる。免疫応答は、免疫応答を抑制するために、共抑制受容体の発現上昇をもたらす。Ｔ細胞上の発現上昇共抑制分子の典型例は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３およびＬＡＧ−３である。共抑制受容体の発見は、Ｔ細胞活性化を継続させ、Ｔｒｅｇ細胞により阻害させないために、これらの受容体に対する抗体の開発に繋がった。この機序により、Ｔ細胞は、種々の標的の攻撃を開始する。
【００１９】
現在まで、ＴＬＲまたはチェックポイント阻害剤を用いて、癌の効果的治療をもたらし、前述の欠点を回避し得る信頼性の高い療法または活性薬剤の組み合わせは存在していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】国際公開第２０１６／１４６２６１号
【特許文献２】欧州特許出願公開第３２０４０４０号明細書
【特許文献３】国際公開第２０１５／０６９７７０号
【特許文献４】国際公開第２０１６／０５７８９８号
【特許文献５】国際公開第２０１６／１０９３１０号
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Ａｈｍａｄ，Ｓ．，Ａｂｕ−Ｅｉｄ，Ｒ．，Ｓｈｒｉｍａｌｉ，Ｒ．，Ｗｅｂｂ，Ｍ．，Ｖｅｒｍａ，Ｖ．，Ｄｏｒｏｏｄｃｈｉ，Ａ．，Ｂｅｒｒｏｎｇ，Ｚ．，Ｓａｍａｒａ，Ｒ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｐ．Ｃ．，Ｍｋｒｔｉｃｈｙａｎ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｋｈｌｅｉｆ，Ｓ．Ｎ．，“Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ＰＩ３Ｋ５  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ＣＤ４”，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２０１７，７７（８），１８９２−１９０４
【非特許文献２】Ａｋｉｒａ，Ｓ．，Ｔａｋｅｄａ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｋａｉｓｈｏ，Ｔ．，“Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｌｉｎｋｉｎｇ  ｉｎｎａｔｅ  ａｎｄ  ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ”，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００１，２，６７５−６８０
【非特許文献３】Ａｎｔｏｎｉａ，Ｓ．Ｊ．，Ｖｉｌｌｅｇａｓ，Ａ．，Ｄａｎｉｅｌ，Ｄ．，Ｖｉｃｅｎｔｅ，Ｄ．，Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｓ．，Ｈｕｉ，Ｒ．，Ｙｏｋｏｉ，Ｔ．，Ｃｈｉａｐｐｏｒｉ，Ａ．，Ｌｅｅ，Ｋ．Ｈ．，ｄｅ  Ｗｉｔ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ  ａｆｔｅｒ  Ｃｈｅｍｏｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｓｔａｇｅ  ＩＩＩ  Ｎｏｎ−Ｓｍａｌｌ−Ｃｅｌｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ”，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，２０１７，３７７，１９１９−１９２９．
【非特許文献４】Ａｌｉ，Ｋ．，Ｓｏｏｎｄ，Ｄ．Ｒ．，Ｐｉｎｅｉｒｏ，Ｒ．，Ｈａｇｅｍａｎｎ，Ｔ．，Ｐｅａｒｃｅ，Ｗ．，Ｌｉｍ，Ｅ．Ｌ．，．．．Ｖａｎｈａｅｓｅｂｒｏｅｃｋ，Ｂ．，“Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＩ（３）Ｋ  ｐ１１０δ  ｂｒｅａｋｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ−ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  ｃａｎｃｅｒ”，Ｎａｔｕｒｅ，２０１４，５１０（７５０５），４０７−４１１
【非特許文献５】Ｂｏｗｅｒｓ，Ｊ．Ｓ．，Ｍａｊｃｈｒｚａｋ，Ｋ．，Ｎｅｌｓｏｎ，Ｍ．Ｈ．，Ａｋｓｏｙ，Ｂ．Ａ．，Ｗｙａｔｔ，Ｍ．Ｍ．，Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｓ．，Ｂａｉｌｅｙ，Ｓ．Ｒ．，Ｎｅａｌ，Ｌ．Ｒ．，Ｈａｍｍｅｒｂａｃｈｅｒ，Ｊ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｐａｕｌｏｓ，Ｃ．Ｍ．，“ＰＩ３Ｋ６  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ｆｉｔｎｅｓｓ  ｏｆ  Ａｄｏｐｔｉｖｅｌｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ  ＣＤ８”，Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１７，８，１２２１
【非特許文献６】Ｂｒａｈｍｅｒ，Ｊ．，Ｒｅｃｋａｍｐ，Ｋ．Ｌ．，Ｂａａｓ，Ｐ．，Ｇｒｉｎｄ，Ｌ．，Ｅｂｅｒｈａｒｄｔ，Ｗ．Ｅ．，Ｐｏｄｄｕｂｓｋａｙａ，Ｅ．，Ａｎｔｏｎｉａ，Ｓ．，Ｐｌｕｚａｎｓｋｉ，Ａ．，Ｖｏｋｅｓ，Ｅ．Ｅ．，Ｈｏｌｇａｄｏ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ  ｖｅｒｓｕｓ  Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ  ｉｎ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｓｑｕａｍｏｕｓ−Ｃｅｌｌ  Ｎｏｎ−Ｓｍａｌｌ−Ｃｅｌｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ”，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，２０１５，３７３，１２３−１３５
【非特許文献７】Ｂｒａｈｍｅｒ，Ｊ．Ｒ．，Ｔｙｋｏｄｉ，Ｓ．Ｓ．，Ｃｈｏｗ，Ｌ．Ｑ．，Ｈｗｕ，Ｗ．Ｊ．，Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｈｗｕ，Ｐ．，Ｄｒａｋｅ，Ｃ．Ｇ．，Ｃａｍａｃｈｏ，Ｌ．Ｈ．，Ｋａｕｈ，Ｊ．，Ｏｄｕｎｓｉ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＰＤ−  Ｌ１  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｃａｎｃｅｒ”，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，２０１２，３６６，２４５５−２４６５
【非特許文献８】Ｃａｒｂｏｎｅ，Ｄ．Ｐ．，Ｒｅｃｋ，Ｍ．，Ｐａｚ−Ａｒｅｓ，Ｌ．，Ｃｒｅｅｌａｎ，Ｂ．，Ｈｏｒｎ，Ｌ．，Ｓｔｅｉｎｓ，Ｍ．，Ｆｅｌｉｐ，Ｅ．，ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｅｕｖｅｌ，Ｍ．Ｍ．，Ｃｉｕｌｅａｎｕ，Ｔ．Ｅ．，Ｂａｄｉｎ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｆｉｒｓｔ−Ｌｉｎｅ  Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ  ｉｎ  Ｓｔａｇｅ  ＩＶ  ｏｒ  Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  Ｎｏｎ−Ｓｍａｌｌ−Ｃｅｌｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ”，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，２０１７，３７６，２４１５−２４２６
【非特許文献９】Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ，Ａ．，Ｍｅｔｅｌｌｕｓ，Ｐ．，Ｕｒｓｕ，Ｒ．，Ｚｏｈａｒ，Ｓ．，Ｌａｆｉｔｔｅ，Ｆ．，Ｂａｒｒｉｅ，Ｍ．，Ｍｅｎｇ，Ｙ．，Ｒｉｃｈａｒｄ，Ｍ．，Ｐａｒｉｚｏｔ，Ｃ．，Ｌａｉｇｌｅ−Ｄｏｎａｄｅｙ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣｐＧ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｆｏｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ：ａ  ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｓｔｕｄｙ”，Ｎｅｕｒｏ  Ｏｎｃｏｌ，２０１０，１２，４０１−４０８
【非特許文献１０】Ｃｈｅｌｌａｐｐａ，Ｓ．，Ｋｕｓｈｅｋｈａｒ，Ｋ．，Ｍｕｎｔｈｅ，Ｌ．Ａ．，ＴｊΦｎｎｆｊｏｒｄ，Ｇ．Ｅ．，Ａａｎｄａｈｌ，Ｅ．Ｍ．，Ｏｋｋｅｎｈａｕｇ，Ｋ．，＆Ｔａｓｋｅｎ，Ｋ．，“Ｔｈｅ  ＰＩ３Ｋ  ｐ１１０δ  Ｉｓｏｆｏｒｍ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｉｄｅｌａｌｉｓｉｂ  Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ”，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１９，２０２（５），１３９７−１４０５
【非特許文献１１】Ｅｒｒａ，Ｍ．，Ｔａｌｔａｖｕｌｌ，Ｊ．，Ｂｅｒｎａｌ，Ｆ．Ｊ．，Ｃａｔｕｒｌａ，Ｊ．Ｆ．，Ｃａｒｒａｓｃａｌ，Ｍ．，Ｐａｇｅｓ，Ｌ．，．．．Ｃａｌｂｅｔ，Ｍ．，“Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｉｎｈａｌｅｄ  ＰＩ３Ｋ５  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ”，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ，２０１８，６１（２１），９５５１−９５６７
【非特許文献１２】Ｅｔｔｉｎｇｅｒ，Ｄ．Ｓ．，Ｗｏｏｄ，Ｄ．Ｅ．，Ａｋｅｒｌｅｙ，Ｗ．，Ｂａｚｈｅｎｏｖａ，Ｌ．Ａ．，Ｂｏｒｇｈａｅｉ，Ｈ．，Ｃａｍｉｄｇｅ，Ｄ．Ｒ．，Ｃｈｅｎｅｙ，Ｒ．Ｔ．，Ｃｈｉｒｉｅａｃ，Ｌ．Ｒ．，Ｄ’Ａｍｉｃｏ，Ｔ．Ａ．，Ｄｉｌｌｉｎｇ，Ｔ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，“ＮＣＣＮ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ：Ｎｏｎ−Ｓｍａｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．２０１６”，Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃｏｍｐｒ  Ｃａｎｅ  Ｎｅｔｗ，２０１６，１４，２５５−２６４
【非特許文献１３】Ｇｏｓｕ，Ｖ．，Ｂａｓｉｔｈ，Ｓ．，Ｋｗｏｎ，Ｏ．Ｐ．，ａｎｄ  Ｃｈｏｉ，Ｓ．，“Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｉｎ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ”，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１２，１７，１３５０３−１３５２９
【非特許文献１４】Ｇｏｖｉｎｄａｎ，Ｒ．，Ｓｚｃｚｅｓｎａ，Ａ．，Ａｈｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｃ．Ｐ．，Ｇｏｎｚａｌｅｚ  Ｍｅｌｉａ，Ｐ．Ｆ．，Ｂａｒｌｅｓｉ，Ｆ．，Ｈａｎ，Ｂ．，Ｇａｎｅａ，Ｄ．Ｅ．，Ｖｏｎ  Ｐａｗｅｌ，Ｊ．，Ｖｌａｄｉｍｉｒｏｖ，Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｈａｓｅ  ＩＩＩ  Ｔｒｉａｌ  ｏｆ  Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｗｉｔｈ  Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ａｎｄ  Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ  ｉｎ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｓｑｕａｍｏｕｓ  Ｎｏｎ−Ｓｍａｌｌ−Ｃｅｌｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ”，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，２０１７，３５，３４４９−３４５７
【非特許文献１５】Ｇｕｅｒｒａ，Ｃ．，Ｍｉｊｉｍｏｌｌｅ，Ｎ．，Ｄｈａｗａｈｉｒ，Ａ．，Ｄｕｂｕｓ，Ｐ．，Ｂａｒｒａｄａｓ，Ｍ．，Ｓｅｒｒａｎｏ，Ｍ．，Ｃａｍｐｕｚａｎｏ，Ｖ．，ａｎｄ  Ｂａｒｂａｃｉｄ，Ｍ．，“Ｔｕｍｏｒ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  Ｋ−ｒａｓ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｉｓ  ｈｉｇｈｌｙ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｎ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｏｎｔｅｘｔ”，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，２００３，４，１１１−１２０
【非特許文献１６】Ｈａｍｅｙｅｒ，Ｄ．，Ｌｏｏｎｓｔｒａ，Ａ．，Ｅｓｈｋｉｎｄ，Ｌ．，Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｓ．，Ａｎｔｕｎｅｓ，Ｃ．，Ｇｒｏｅｎ，Ａ．，Ｂｉｎｄｅｌｓ，Ｅ．，Ｊｏｎｋｅｒｓ，Ｊ．，Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔ，Ｐ．，Ｍｅｕｗｉｓｓｅｎ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  Ｃｒｅ  ｄｅｌｅｔｅｒ  ｍｏｕｓｅ  ａｌｌｏｗｉｎｇ  ｍｏｓａｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｔｉｓｓｕｅｓ”，Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００７，３１，３２−４１
【非特許文献１７】Ｈｅｌｌｍａｎｎ，Ｍ．Ｄ．，Ｒｉｚｖｉ，Ｎ．Ａ．，Ｇｏｌｄｍａｎ，Ｊ．Ｗ．，Ｇｅｔｔｉｎｇｅｒ，Ｓ．Ｎ．，Ｂｏｒｇｈａｅｉ，Ｈ．，Ｂｒａｈｍｅｒ，Ｊ．Ｒ．，Ｒｅａｄｙ，Ｎ．Ｅ．，Ｇｅｒｂｅｒ，Ｄ．Ｅ．，Ｃｈｏｗ，Ｌ．Ｑ．，Ｊｕｅｒｇｅｎｓ，Ｒ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ  ｐｌｕｓ  ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ  ａｓ  ｆｉｒｓｔ−ｌｉｎｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ（ＣｈｅｃｋＭａｔｅ  ０１２）：ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ａｎ  ｏｐｅｎ−ｌａｂｅｌ，ｐｈａｓｅ  １，ｍｕｌｔｉｃｏｈｏｒｔ  ｓｔｕｄｙ”，Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ，２０１７，１８，３１−４１
【非特許文献１８】Ｈｅｍｍｉ，Ｈ．，Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｏ．，Ｋａｗａｉ，Ｔ．，Ｋａｉｓｈｏ，Ｔ．，Ｓａｔｏ，Ｓ．，Ｓａｎｊｏ，Ｈ．，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｍ．，Ｈｏｓｈｉｎｏ，Ｋ．，Ｗａｇｎｅｒ，Ｈ．，Ｔａｋｅｄａ，Ｋ．，ａｎｄ  Ａｋｉｒａ，Ｓ．，“Ａ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡ”，Ｎａｔｕｒｅ，２０００，４０８，７４０−７４５
【非特許文献１９】Ｈｅｒｂｓｔ，Ｒ．Ｓ．，Ｓｏｒｉａ，Ｊ．Ｃ．，Ｋｏｗａｎｅｔｚ，Ｍ．，Ｆｉｎｅ，Ｇ．Ｄ．，Ｈａｍｉｄ，Ｏ．，Ｇｏｒｄｏｎ，Ｍ．Ｓ．，Ｓｏｓｍａｎ，Ｊ．Ａ．，ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ，Ｄ．Ｆ．，Ｐｏｗｄｅｒｌｙ，Ｊ．Ｄ．，Ｇｅｔｔｉｎｇｅｒ，Ｓ．Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｏｆ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＭＰＤＬ３２８０Ａ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ”，Ｎａｔｕｒｅ，２０１４）．５１５，５６３−５６７
【非特許文献２０】Ｈｏｒｎｕｎｇ，Ｖ．，Ｒｏｔｈｅｎｆｕｓｓｅｒ，Ｓ．，Ｂｒｉｔｓｃｈ，Ｓ．，Ｋｒｕｇ，Ａ．，Ｊａｈｒｓｄｏｒｆｅｒ，Ｂ．，Ｇｉｅｓｅ，Ｔ．，Ｅｎｄｒｅｓ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ｇ．，“Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １−１０  ｍＲＮＡ  ｉｎ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ＣｐＧ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００２，１６８，４５３１−４５３７
【非特許文献２１】Ｈｙｅ−Ｊｕｎｇ  Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｃａｎｔｏｒ  Ｈａｒｖｅｙ，“Ｔｈｅ  Ｐａｔｈ  ｔｏ  Ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ”，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ，２０１４，２（１０），９２６−９３６．
【非特許文献２２】Ｊｏｎｋｅｒｓ，Ｊ．，Ｍｅｕｗｉｓｓｅｎ，Ｒ．，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｕｌｄｅｎ，Ｈ．，Ｐｅｔｅｒｓｅ，Ｈ．，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖａｌｋ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｂｅｒｎｓ，Ａ．，“Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＢＲＣＡ２  ａｎｄ  ｐ５３  ｉｎ  ａ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ”，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ，２００１，２９，４１８−４２５
【非特許文献２３】Ｋａｒｂａｃｈ，Ｊ．，Ｎｅｕｍａｎｎ，Ａ．，Ａｔｍａｃａ，Ａ．，Ｗａｈｌｅ，Ｃ．，Ｂｒａｎｄ，Ｋ．，ｖｏｎ  Ｂｏｅｈｍｅｒ，Ｌ．，Ｋｎｕｔｈ，Ａ．，Ｂｅｎｄｅｒ，Ａ．，Ｒｉｔｔｅｒ，Ｇ．，Ｏｌｄ，Ｌ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｊａｇｅｒ，Ｅ．，“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｂｙ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＮＹ−ＥＳＯ−１  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ＣｐＧ  ｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｎａｉｖｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ”，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２０１１，１７，８６１−８７０
【非特許文献２４】Ｌｉ，Ｋ．，Ｑｕ，Ｓ．，Ｃｈｅｎ，Ｘ．，Ｗｕ，Ｑ．，ａｎｄ  Ｓｈｉ，Ｍ．，“Ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：ＴＬＲｓ，ＲＬＲｓ，ａｎｄ  ＳＴＩＮＧ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｎｎａｔｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｐａｔｈｗａｙｓ”，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｓｃｉ，２０１７，１８
【非特許文献２５】Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ，Ｒ．，“Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ”，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００１，１，１３５−１４５
【非特許文献２６】Ｍｉｋｕｌａｎｄｒａ，Ｍ．，Ｐａｖｅｌｉｃ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｇｌａｖａｎ，Ｔ．Ｍ．，“Ｒｅｃｅｎｔ  Ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ａｇｏｎｉｓｔｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｒｎ，２０１７，２４，２０１１−２０３２
【非特許文献２７】Ｎｏｖｅｌｌｏ，Ｓ．，Ｂａｒｌｅｓｉ，Ｆ．，Ｃａｌｉｆａｎｏ，Ｒ．，Ｃｕｆｅｒ，Ｔ．，Ｅｋｍａｎ，Ｓ．，Ｌｅｖｒａ，Ｍ．Ｇ．，Ｋｅｒｒ，Ｋ．，Ｐｏｐａｔ，Ｓ．，Ｒｅｃｋ，Ｍ．，Ｓｅｎａｎ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ：ＥＳＭＯ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ”，Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ，２０１６，２７，ｖ１−ｖ２７
【非特許文献２８】Ｏｎｉｚｕｋａ，Ｓ．，Ｔａｗａｒａ，Ｉ．，Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｊ．，Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ｓ．，Ｆｕｊｉｔａ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｎａｋａｙａｍａ，Ｅ．，“Ｔｕｍｏｒ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＣＤ２５（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ）ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ”，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ，１９９９，５９，３１２８−３１３３
【非特許文献２９】Ｒａｗｌｉｎｓ，Ｅ．Ｌ．，Ｏｋｕｂｏ，Ｔ．，Ｘｕｅ，Ｙ．，Ｂｒａｓｓ，Ｄ．Ｍ．，Ａｕｔｅｎ，Ｒ．Ｌ．，Ｈａｓｅｇａｗａ，Ｈ．，Ｗａｎｇ，Ｆ．，ａｎｄ  Ｈｏｇａｎ，Ｂ．Ｌ．，“Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｓｃｇｂ１ａ１＋  Ｃｌａｒａ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ａｎｄ  ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ａｉｒｗａｙ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ａｌｖｅｏｌａｒ，ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ”，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，２００９，４，５２５−５３４
【非特許文献３０】Ｓｃｈｅｉｅｒｍａｎｎ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｋｌｉｎｍａｎ，Ｄ．Ｍ．，“Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣｐＧ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ”，Ｖａｃｃｉｎｅ，２０１４，３２，６３７７−６３８９
【非特許文献３１】Ｓｃｈｎｅｂｅｒｇｅｒ，Ｄ．，Ｃａｌｄｗｅｌｌ，Ｓ．，Ｋａｎｔｈａｎ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｓｉｎｇｈ，Ｂ．，“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ９  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇｓ”，Ｊ  Ａｎａｔ，２０１３，２２２，４９５−５０３
【非特許文献３２】Ｓｈｉ，Ｍ．，Ｃｈｅｎ，Ｘ．，Ｙｅ，Ｋ．，Ｙａｏ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｌｉ，Ｙ．，“Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ”，Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ），２０１６，９５，ｅ３９５１
【非特許文献３３】Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｂ．，ａｎｄ  Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍ，Ｅ．，“Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｃ−ｍｙｃ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｍｏｄｅｌ”，Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ，１９９８，９０，１１４６−１１５４
【非特許文献３４】Ｔａｎａｋａ，Ａ．，ａｎｄ  Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ｓ．，“Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ”，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ，２０１７，２７，１０９−１１８
【非特許文献３５】Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｈｏｄｉ，Ｆ．Ｓ．，Ｂｒａｈｍｅｒ，Ｊ．Ｒ．，Ｇｅｔｔｉｎｇｅｒ，Ｓ．Ｎ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｃ．，ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ，Ｄ．Ｆ．，Ｐｏｗｄｅｒｌｙ，Ｊ．Ｄ．，Ｃａｒｖａｊａｌ，Ｒ．Ｄ．，Ｓｏｓｍａｎ，Ｊ．Ａ．，Ａｔｋｉｎｓ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｓａｆｅｔｙ，ａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＰＤ−１  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ”，２０１２，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，３６６，２４４３−２４５４
【非特許文献３６】Ｕｒｓｕ，Ｒ．，Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ，Ａ．，Ｍｅｔｅｌｌｕｓ，Ｐ．，Ｌｕｂｒａｎｏ，Ｖ．，Ｌａｉｇｌｅ−Ｄｏｎａｄｅｙ，Ｆ．，Ｃａｐｅｌｌｅ，Ｌ．，Ｇｕｙｏｔａｔ，Ｊ．，Ｌａｎｇｌｏｉｓ，Ｏ．，Ｂａｕｃｈｅｔ，Ｌ．，Ｄｅｓｓｅａｕｘ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣｐＧ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｆｏｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ−Ａ  ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｉｃ，ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ  ｓｔｕｄｙ”，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，２０１７，７３，３０−３７
【非特許文献３７】Ｙａｎｇ，Ｙ．，Ｈｕａｎｇ，Ｃ．Ｔ．，Ｈｕａｎｇ，Ｘ．，ａｎｄ  Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｄ．Ｍ．，“Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｓ  ａｒｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｏｆ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＣＤ８  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ”，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００４，５，５０８−５１５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
従って、本発明の目的は、抗腫瘍ワクチン接種の効率を高めるための薬学的活性成分および抗癌免疫応答を改善するための薬学的活性成分の治療薬の組み合わせを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
この目的は、請求項１で定める個別の成分を含む医薬併用剤により解決される。医薬併用剤の好ましい実施形態は、従属請求項の一部である。
本発明の医薬併用剤は、以下の３種の成分を含む：
ａ）少なくとも１種の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）除去剤、
ｂ）少なくとも１種のトール様受容体９（ＴＬＲ９）アゴニスト、
ｃ）１種または複数の免疫チェックポイント阻害剤。
【００２４】
各成分は、好ましくは、その他の成分から離され、互いに独立して、ヒトまたは非ヒト哺乳動物対象に投与される。代替的実施形態の一部として、成分ｂ）および成分ｃ）はまた、投与時に治療効果を得るために、癌を罹患している対象に対し、単一投与量として一緒に組み合わせてもよい。
【００２５】
腫瘍細胞の増殖および進行に与える抑制性治療効果を考慮して、本発明は特に、ヒトまたは非ヒト哺乳動物の癌の治療で使用するための発明に基づく医薬併用剤に関する。基本的には、医薬併用剤は、全ての脊椎動物に好適し、これは、ヒトおよびその他の哺乳動物で存在するものと類似のシグナル伝達およびチェックポイント経路を有する。本発明の医薬併用剤は、少なくとも１種のＴｒｅｇ除去剤、少なくとも１種のＴＬＲ９アゴニストおよび１種または複数の免疫チェックポイント阻害剤が、癌に罹患している対象に適用可能な異なる区画、容器または注射溶液中に含まれるキットオブパーツの形で設計されるのが好ましい。
【００２６】
成分ａ）によるＴｒｅｇ除去剤は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を除去するか、または不活化する。この手段は、腫瘍微小環境をプレコンディショニングし、抗腫瘍ワクチン接種の効率を高める。好ましくは、成分ａ）のＴｒｅｇ除去剤は、表面抗原除去抗体または抗体フラグメント、例えば、抗原認識および結合に必要な可変重鎖および軽鎖ドメイン（ＶＬおよびＶＨ）を含むＦｃフラグメントである。好ましい実施形態では、成分ａ）のＴｒｅｇ除去剤は、ＣＤ２５、ＣＤ１５ｓ、ＧＩＴＲ、ＣＣＲ４、ＣＴＬＡ−４、ＯＸ−４０、ＬＡＧ３、ＧＡＲＰ、ＺＡＰ−７０またはＰＤ−１表面抗原に対する抗体または抗体フラグメントである。表面抗原に対する除去抗体または抗体フラグメントは、Ｔｒｅｇに特異的であり、制御性Ｔ細胞を除去して抗癌免疫応答を改善する能力を有する。例えば、Ｔｒｅｇ除去抗体αＣＣＲ４は、ヒトにおいて有害毒性副作用を示すことなく、エフェクターＴｒｅｇを除去できる。
【００２７】
Ｔｒｅｇ除去標的構造の代わりに、または追加して、ホスファチジルイノシトール−４，５−ビスホスフェート  ３−キナーゼデルタ（ＰＩ３Ｋδ）の阻害も同様に、Ｔｒｅｇ細胞を特異的に標的にして、哺乳動物における高められた免疫療法効果を生じさせる。Ｔｒｅｇ除去剤の適用と、それに続く、ＴＬＲ９アゴニストおよびチェックポイント阻害剤の適用の本発明の組み合わせは、ヒトおよび非ヒト哺乳動物における癌の治療に対する有望な手法である。理由は、この手法が、療法の有効性および治療患者の生存を顕著に高めるためである。従って、本発明の相乗的療法は、ＰＤ−１および／またはＣＴＬＡ４などの免疫チェックポイント調節阻害剤の作用を追加の免疫調節経路と一緒に組み合わせる。この手法は、Ｔｒｅｇの特異的標的化および除去を行い、それより、ＴＬＲ刺激の結果として免疫応答を高めることにより、抗癌免疫ワクチン接種の治療作用を改善する潜在力を有する。本発明は、ＴｒｅｇまたはエフェクターＴｒｅｇ細胞の事前の除去が、免疫チェックポイント調節剤およびＴＬＲ９アゴニストの注射後に、腫瘍進行を停止させることを示す前臨床データにより裏付けられる。この目的のために、マウスモデルを生成し、免疫チェックポイント阻害剤およびＴＬＲ９アゴニストの組み合わせを適用した場合のＴｒｅｇの事前の除去の相乗効果を評価した。マウスにおける後続するチェックポイント阻害性抗体およびＴＬＲ９アゴニストの注射の事前のＴｒｅｇの除去は、既に１ヶ月の治療後であっても、腫瘍量を低減させる。
【００２８】
最も重要なのは、Ｔｒｅｇ除去剤単独によるＴｒｅｇ除去、または事前のＴｒｅｇ細胞除去のないＴＬＲ９アゴニストおよび／またはチェックポイント阻害剤の適用、またはチェックポイント阻害剤単独の単回注射は、本発明による医薬併用剤および投与方法で見られるような、劇的な腫瘍低減をもたらさなかったことである。１回または複数のＴＬＲ９および免疫チェックポイント阻害剤注射後のＴｒｅｇ細胞除去剤の適用の治療効果は相乗的であり、従って、明白な腫瘍低減を生じる。本発明の医薬併用剤の成分の一般的作用モードは、マウスおよび人で類似であるので、本明細書で提示したデータは、ヒト患者に適用可能なだけでなく、哺乳動物一般にも適用できる。さらに、本発明の医薬併用剤の全成分の作用モードは、抗原非依存性であり、抗原特異的ワクチン接種により特異的に標的化される特定の腫瘍新抗原の発現に依存しないので、本発明の組み合わせは、肺癌に関して機能するのみでなく、任意の種類の悪性癌の治療にも好適する。治療されるのに好ましい形態の癌は、肺癌、黒色腫、腎臓癌、肝細胞癌および多分その他の癌型である。
【００２９】
本発明の医薬併用剤の第２成分ｂ）は、いずれの既知のＴＬＲ９アゴニストでもよい。好ましい実施形態では、成分ｂ）のＴＬＲ９アゴニストは、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）、好ましくは、１種または複数の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含むＣｐＧ  ＯＤＮである。ＣｐＧ  ＯＤＮは、非メチル化ＣｐＧ  ＯＤＮ、特に、配列構成（ＣｐＧモチーフ）を含む合成オリゴヌクレオチドである。これらのＣｐＧモチーフは、哺乳動物ＤＮＡに比べて、細菌ＤＮＡ中に約２０倍大きい頻度で存在する。ＣｐＧ  ＯＤＮは、強力な免疫賦活効果に至るＴＬＲ９により認識される。
【００３０】
好ましくは、医薬併用剤で使用されるＴＬＲ９アゴニストは、式ＣＣｘ（Ｃ以外）（Ｃ以外）ｘｘＧＧＧ（式中、ｘは、修飾または非修飾Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇまたはその誘導体からなる群より選択される任意の塩基）で構成されるＣｐＧ  ＯＤＮを含む。ある実施形態では、本発明のＣｐＧ  ＯＤＮは、１種または複数のヌクレアーゼ耐性ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドを含む。
【００３１】
好ましくは、ＴＬＲ９アゴニストとして本発明の組み合わせで利用されるＣｐＧ  ＯＤＮは、下記の核酸配列の１個または複数を含む：
５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ−３’（配列番号１）、
５’−ＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ−３’（配列番号２）
５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ−３’（配列番号３）
５’−ＧＧＧＧＴＣＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＧＧ−３’（配列番号４）
５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ−３’（配列番号５）
５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ−３’（配列番号６）
５’−ＴＣＧＡＣＧＴＴＣＧＴＣＧＴＴＣＧＴＣＧＴＴＣ−３’（配列番号７）
５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ−３’（配列番号８）
５’−ＴＣＧＣＧＡＣＧＴＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＴＴＣＧＧＴＡ−３（配列番号９）
５’−ＧＧＧＧＡＣＧＡＣＧＴＣＧＴＧＧＧＧＧＧＧ−３’（配列番号１０）
５’−ＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＡＣＧＴＴＧＡＴ−３’（配列番号１１）
５’−ＴＣＧＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＣＣＧＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＣＧＧ−３’（配列番号１２）
【００３２】
既知のクラスＡ、ＢまたはＣアゴニストのいずれか１つのグループに入る、ヒトＴＬＲ９、マウスＴＬＲ９またはその他の哺乳動物ＴＬＲ９の使用が好ましい。
【００３３】
代替的実施形態では、成分ｂ）のＴＬＲ９アゴニストは、大腸菌、他の原核生物およびウィルスから単離され、ＴＬＲ９、または細菌性またはウィルスＤＮＡ  ＴＬＲ９アゴニスト中のリン酸ジエステル骨格などの非メチル化ＣｐＧ配列を模倣し、ダブルステムループ免疫調節剤（ｄＳＬＩＭ）として知られるダンベル様構造体に折り畳まれ、ＴＬＲ９アゴニストを活性化するものに結合する能力を有する一本鎖または二本鎖ゲノムＤＮＡであってもよい。
【００３４】
本発明では、ＴＬＲ９アゴニストまたは異なるＴＬＲ９アゴニストの組み合わせは、単回注射用量または反復投与注射用量で、単独でまたは１種または複数のチェックポイント阻害剤と組み合わせて投与できる。別の形態では、従って、ＴＬＲ９アゴニストは、免疫チェックポイント阻害剤の存在しない別の注射溶液で提供される。代替的実施形態では、ＴＬＲ９アゴニストおよびチェックポイント阻害剤は、本発明の医薬併用剤の一部として、単一注射溶液で一緒に提供される。この組成物では、可能な治療効果を最大化するために、２種以上のチェックポイント阻害剤が、別のチェックポイント阻害剤および／またはＴＬＲ９アゴニストと組み合わされる。しかし、医薬併用剤の正確な組成またはその投与方法は、治療される癌の種類に依存する。本明細書で示されるように、治療効果および有害副作用の抑制は、制御性Ｔ細胞の事前の除去に強く依存する。Ｔｒｅｇ細胞の除去がその最大に達する場合、ＴＬＲ９および／またはチェックポイント阻害剤の適用およびそれらの治療効果は、最も効率的になるであろう。
【００３５】
本発明の医薬併用剤で利用される好適なチェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＫＩＲ、ＯＸ４０、ＩｇＧ、ＩＤＯ−１、ＩＤＯ−２、ＣＥＡＣＡＭ１、ＴＮＦＲＳＦ４、ＯＸ４０Ｌ、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＣＧＥＮ−１５０４９、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ａ２ａＲ、およびＢ−７またはこれらの組み合わせからなる群より選択されるチェックポイントタンパク質を阻害するのが好ましい。好ましい実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、αＣＴＬＡ−４およびαＰＤ−１抗体の組み合わせであり、単一注射溶液中で希釈されるのが好ましい。好ましい投与方法では、αＣＴＬＡ−４およびαＰＤ−１抗体は、単一注射溶液中で１：１に希釈される。
【００３６】
代替的実施形態では、Ｔｒｅｇ除去剤はまた、ＴＬＲ９アゴニストおよび／または免疫チェックポイント阻害剤の適用中またはその後に注射できる。例えば、腫瘍進行の低減により測定できる治療の成功をさらに高めるために、ＰＩ３Ｋδ抑制剤を用いて特異的にＴｒｅｇを阻害できる。従って、例えば、チェックポイント阻害剤の適用時に患者が過剰な免疫反応を示す場合には、連続的なＴｒｅｇの供給も制御できる。
【００３７】
いずれかの投与方法は、キットオブパーツとして設計されるのが好ましい本発明の組み合わせの一部である本発明の投与計画の一部であり得る。キットオブパーツの各成分は、他のものと組み合わせて作用し、所望の治療効果を達成する、すなわち、罹患腫瘍組織中での腫瘍進行を遅らせる。
【００３８】
好ましい実施形態では、本発明の組み合わせまたはキットオブパーツは、成分ａ）が成分ｂ）および成分ｃ）の前に１回または繰り返して投与されることを規定する投与計画をさらに含み、任意選択で、成分ｂ）は、成分ｃ）の投与の前に、ヒト患者または動物患者などの癌患者に１回または繰り返して投与される。好ましい実施形態では、投与計画は、
ｉ．成分ａ）は、＋１日目の前に５〜９日間注射される、
ｉｉ．成分ｂ）は、＋１日目に開始して、１回または複数の注射により、３または４日目毎に注射される、
ｉｉｉ．成分ｃ）は、＋１日目に開始して、１回または複数の注射により、３または４日目毎に注射される、ことを規定する。
【００３９】
通常、Ｔｒｅｇ細胞除去は、最後の注射後の７〜１０日目に、最強の効果に到達する。チェックポイント阻害剤適用は、＋１日目に開始して、合計３回以上の注射、好ましくは、合計５回の注射が繰り返されるのが好ましい。ＴＬＲ９アゴニストの適用は、＋１日目に開始して、２日置きに、または３日置きに行われる。しかし、最も効率的な治療効力の促進および望ましくない毒性副作用の許容範囲内のレベルまでの低減の両方を行うために、治療の動力学、治療の組み合わせおよび期間は、個別の癌サブタイプ、全体の健康状態および当然ヒト癌患者あるいはその他の脊椎動物の恐怖に対して調節する必要がある。
【００４０】
キットオブパーツの形態の医薬併用剤の提供が好ましい。このようなキットオブパーツでは、各成分は、別々の区画または注射溶液として提供される。好ましくは、３種の成分ａ）〜ｃ）の全てが、その後の癌患者への注射、好ましくは反復注射のための、別々の、独立した注射溶液として封入される。
本発明はまた、組織中の腫瘍細胞の増殖を漸減させるエクスビボ法に関し、該方法は、下記のステップを含む：
ｉ．少なくとも１種の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）除去剤の適用、
ｉｉ．少なくとも１種のトール様受容体９（ＴＬＲ９）アゴニストの適用、
ｉｉｉ．１種または複数の免疫チェックポイント阻害剤の適用であって、少なくとも１種のＴＬＲ９アゴニストが、Ｔｒｅｇ細胞除去後に続けて適用され、１種または複数の免疫チェックポイント阻害剤が、少なくとも１種のＴＬＲ９アゴニストの後に、またはそれと同時に適用される、適用。
【００４１】
Ｔｒｅｇ除去剤の適用は、微小環境のプレコンディショニングの過程中に表面特異的抗体もしくは抗体フラグメントを用いて、またはホスファチジルイノシトール−４，５−ビスホスフェート  ３−キナーゼデルタ（ＰＩ３Ｋδ）抑制剤の適用により、またはＴＬＲ９および／またはチェックポイント阻害剤適用前または適用中に実施できる。
【００４２】
本発明による組成物および方法は、患者の癌の治療に好適することが明らかであり、該方法は、次のステップを含む：
ｉ．少なくとも１種の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）除去剤の適用、
ｉｉ．少なくとも１種のトール様受容体９（ＴＬＲ９）アゴニストの適用、
ｉｉｉ．１種または複数の免疫チェックポイント阻害剤の適用であって、少なくとも１種のＴＬＲ９アゴニストが、Ｔｒｅｇ細胞除去後に続けて適用され、１種または複数の免疫チェックポイント阻害剤が、少なくとも１種のＴＬＲ９アゴニストの後に、またはそれと同時に適用される、適用。
【００４３】
組み合わせおよび投与は、本明細書で記載のいずれか１つであってよい。好ましい組み合わせは、下記のものである：
ａ）制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）除去剤は、ＣＤ２５に対する抗体または抗体フラグメントである、
ｂ）トール様受容体９（ＴＬＲ９）アゴニストはＣｐＧ  ＯＤＮである、
ｃ）１種または複数の免疫チェックポイント阻害剤は、αＣＴＬＡ−４およびαＰＤ−１抗体である。
【００４４】
ａ）〜ｃ）の本発明の組み合わせの成分は、免疫細胞の挙動を特異的に調節する。従って、免疫細胞は、本発明の組み合わせの標的である。本発明の組み合わせは、一般的免疫調節治療手法であるので、その治療機序は、癌の病期（すなわち、原発性腫瘍または二次転移腫瘍を治療する場合）に依存しない。同様に、本発明の組み合わせは、特定の癌型（すなわち、肺癌、結腸癌、黒色腫など）に限定されない。従って、本発明の組み合わせの作用モードは、最適抗癌応答を誘導するための患者の免疫系の有益な調節として最も良く記述される。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明の医薬併用剤を用いて１ヶ月の治療後の腫瘍量の減少を示す。グラフは、治療開始時（白色四角）、治療なしの腫瘍進行の１ヶ月後（黒色逆三角）および本発明の組み合わせの適用１ヶ月後（黒色四角）のマウスの平均腫瘍量を示す。各記号は、個々の１匹のマウスを示す。＊＊＊、ｐ≦０．００１。
【図２】図２ＡはＫ−Ｒａｓ／ｐ５３遺伝子スイッチ誘導の１ヶ月後（黒色ドット）、治療開始時（黒色逆三角、ＴＡＭ注射の４ヶ月後）、治療なしの１５日（白色リング）および１ヶ月（黒色十字）後のマウスの平均腫瘍量を示す。図２Ｂは治療なしの５ヶ月目（非治療対対照）、ＴＬＲ９アゴニストおよびチェックポイント阻害剤（ＣＰＩ／ＣｐＧ）を用いた１ヶ月の治療を含む５ヶ月目、またはＴｒｅｇ除去抗ＣＤ２５抗体、ＴＬＲ９アゴニストおよびチェックポイント阻害剤（プレＣＤ２５＋ＣＰＩ／ＣｐＧ）を用いた５ヶ月目のマウスの平均腫瘍量を示す。
【図３】本発明の組み合わせ（ＬＣ−１＋プレＣＤ２５＋ＣＰＩ／ＣＰＧ）を用いた治療は、極めて有意な治療効果を示した。
【図４】８．５ｘ１０４個のＢ１６−Ｆ１０黒色腫細胞のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスへの皮下注射は、線形腫瘍増殖を生じ、および、この場合も、本発明の組み合わせを用いた治療は、Ｂ１６−Ｆ１０誘導皮下黒色腫のサイズを顕著に低減させた。
【図５】ＬＣ−１肺腫瘍細胞の皮下適用（図５の−９日目に開始）後の、ＣＡＬ−１０１の２日間の腹腔内注射と、−６日目のこれの第２の注射による反復、これに続く、ＣｐＧ  ＴＬＲ９アゴニスト性オリゴヌクレオチドおよび抗ＣＴＬＡ４／抗ＰＤ１抗体の１日目およびその後の２日置きの規則的注射で構成される使用した治療スキームを示す。
【図６】１ｘ１０６個のＬＣ−１細胞をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの皮下に注射後の種々の時点で測定した腫瘍サイズを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
以下の実施例によって、本発明はさらに説明されるであろう。
実施例：
概念の立証のとして、抗ＣＤ２５抗体、ＴＬＲ９アゴニストおよびチェックポイント阻害剤からなる医薬併用剤を、マウスモデルで所望の治療相乗効果を達成するための成分として使用し、この結果はヒトを含む他の哺乳動物に同様に適用できる。
【００４７】
抗ＣＤ２５抗体を免疫抑制性Ｔｒｅｇを除去するためのプレコンディショニング手段として使用した。ＴＬＲ９アゴニストを用いて免疫系の自然群を刺激した。既知のＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１チェックポイント阻害剤の組み合わせを用いて、Ｔ細胞活性を高め、制御性Ｔ細胞の存在または活性を低減させた。Ｔｒｅｇ除去の初期段階として、αＣＤ２５注射溶液（抗マウスＣＤ２５）をＰＢＳ中で５００μｇ／２００μｌに希釈した。Ｔｒｅｇ除去後、ＴＬＲ９アゴニストと一緒に免疫チェックポイント調節剤のいくつかの注射を適用した。治療効果を前臨床マウスモデル（ＳＣＫＰマウスモデル）を用いて測定した。このモデルは、ＴＡＭ注射時に、発癌性Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｖを誘発し、肺上皮細胞中のｐ５３腫瘍抑制因子遺伝子を不活性化する（Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ系）条件付き遺伝子スイッチを含む。この設定は、ヒト肺癌で見つかる最もよくある遺伝子ドライバー変異を再現する。Ｓｃｇｂ１ａ１−ＣｒｅＥＲＴ２／Ｋ−ＲａｓＬＳＬＧ１２Ｖ／ｐ５３ｆｌ／ｆｌ（ＳＣＫＰ）マウスモデルでは、肺癌は、タモキシフェンの単回注射により誘導され、タモキシフェンは発癌性Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｖを活性化し、肺上皮のクララ細胞、いくつかの肺胞のＩＩ型細胞および気管支肺胞幹細胞（ＢＡＳＣＳ）のｐ５３腫瘍抑制機能を不活化する。治療は、タモキシフェン注射の４ヶ月後、約２０％の肺が増殖腫瘍から構成されたときに開始される。治療開始の１ヶ月後（すなわち、タモキシフェン注射の５ヶ月後）、発明者らは、この投与計画の治療効果を定量化した。
【００４８】
治療が開始されたとき、肺腫瘍量は、総肺質量の２０％超であった（非治療４ヶ月；４Ｍ）。１ヶ月後（５Ｍ）、治療を受けていないマウスは、約３０％の平均肺腫瘍量を有した（非治療５ヶ月）。治療（αＣＤ２５プレコンディショニングとこれに続くＣｐＧ／チェックポイント治療）が適用され、治療の１ヶ月後に腫瘍質量の減少が測定されたとき、腫瘍量は、総肺質量の平均約１０％にまで顕著に低減された。また、治療を受けたマウスに明らかな有害毒性および副作用は確認されなかった。
【００４９】
図１は、本発明の医薬併用剤を用いて１ヶ月の治療後の腫瘍量の減少を示す。グラフは、治療開始時（白色四角）、治療なしの腫瘍進行の１ヶ月後（黒色逆三角）および本発明の組み合わせの適用１ヶ月後（黒色四角）のマウスの平均腫瘍量を示す。各記号は、個々の１匹のマウスを示す。＊＊＊、ｐ≦０．００１。
【００５０】
対照尺度として、Ｔｒｅｇ除去単独または事前のＴｒｅｇ除去なしのＴＬＲ９アゴニストおよびチェックポイント阻害剤の適用も試験した。治療Ｘは、α−ＣＤ２５抗体（Ｔｒｅｇ除去抗体）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＴＬＲ９アゴニスト）およびα−ＰＤ１／ＣＴＬＡ−４抗体（チェックポイント阻害剤）からなる本発明の組み合わせを意味する。
【００５１】
図２は、プレコンディショニング単独（抗ＣＤ２５）、事前のプレコンディショニングのないＴＬＲ９およびチェックポイント阻害剤の作用の本発明の組み合わせ、チェックポイント阻害剤単独（ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４に対する抗体）の効果およびＴｒｅｇ除去剤の適用に続くＴＬＲ９アゴニストおよびチェックポイント阻害剤投与を含む本発明の組み合わせの結果としての腫瘍低減の治療効果を示す。本発明の組み合わせの治療効果は相乗的である。腫瘍低減は、Ｔｒｅｇ除去がＴＬＲ９アゴニストおよびチェックポイント阻害剤と組み合わされる場合のみに達成される。
【００５２】
図２Ａのグラフは、Ｋ−Ｒａｓ／ｐ５３遺伝子スイッチ誘導の１ヶ月後（黒色ドット）、治療開始時（黒色逆三角、ＴＡＭ注射の４ヶ月後）、治療なしの１５日（白色リング）および１ヶ月（黒色十字）後のマウスの平均腫瘍量を示す。治療群を表す結果は：プレコンディショニング単独（抗ＣＤ２５）の治療作用を示す黒色菱形、プレコンディショニングのないＴＬＲ９およびチェックポイント阻害剤の作用を示す黒色三角、チェックポイント阻害剤単独（ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４に対する抗体）の効果を表す白色逆三角およびα−ＣＤ２５／ＣｐＧ／ＣＰＩ（治療Ｘと表す）からなる本発明の組み合わせの結果としての腫瘍低減を示す黒色四角である。各記号は、個々の１匹のマウスを示す。
【００５３】
ＳＣＫＰ治療データを図２Ｂにまとめており、これは、治療なしの５ヶ月目（非治療対照）、ＴＬＲ９アゴニストおよびチェックポイント阻害剤（ＣＰＩ／ＣｐＧ）を用いた１ヶ月の治療を含む５ヶ月目、またはＴｒｅｇ除去抗ＣＤ２５抗体、ＴＬＲ９アゴニストおよびチェックポイント阻害剤（プレＣＤ２５＋ＣＰＩ／ＣｐＧ）を用いた５ヶ月目のマウスの平均腫瘍量を示す。各記号は、個々の１匹のマウスを示す。
【００５４】
自発性ＳＫＰ由来のインビボデータ
ＳＫＰマウスモデルからのデータは、Ｔｒｅｇ除去（抗ＣＤ２５Ｔｒｅｇ除去によるプレコンディショニング）単独でまたはＴｒｅｇ除去なしのＴＬＲ９アゴニスト（ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド）およびチェックポイント阻害剤（ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４）の適用またはチェックポイント阻害剤単独の投与は、本発明の組み合わせによる治療時で認められるのと同じ劇的な腫瘍低減をもたらさないことを明確に示している。抗ＣＤ２５抗体、ＴＬＲ９アゴニストおよびチェックポイント阻害剤の相乗的使用は、ＴＬＲ９アゴニストおよびチェックポイント阻害剤だけの組み合わせよりも、極めて良好な治療効果をもたらす。
【００５５】
本発明の組み合わせはまた、二次的転移腫瘍における強力な治療効果をもたらすことを実証するために、本発明者らは、自発性ＳＫＰマウスモデルから新規肺癌細胞株（ＬＣ−１）を樹立した。５ｘ１０５個のＬＣ−１細胞のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの側腹部への皮下注射は、触知可能な腫瘍を生成し、これは、１５ｍｍの直径に到達するまで直線的に成長し、その時点で、我々は、実験を終了した。
【００５６】
図３から分かるように、本発明の組み合わせ（ＬＣ−１＋プレＣＤ２５＋ＣＰＩ／ＣＰＧ）を用いた治療は、極めて有意な治療効果を示した。５ｘ１０５個のＬＣ−１細胞をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの皮下に注射し、本発明の組み合わせＬＣ−１＋プレＣＤ２５＋ＣＰＩ／ＣＰＧまたは何ら追加の治療法なし（ＬＣ−１非処理）、を用いて腫瘍の発生を測定した。データは、本発明の手法の治療効力は、癌の病期に依存しない、および本発明の組み合わせは、原発性内在性肺腫瘍（図１および２参照）および二次的皮下腫瘍の転移設定の両方で極めて効果的であることを示した。
【００５７】
本発明の組み合わせおよび手法を異なる癌型に効率的に適用できることを立証するために、本発明者らは、明確に定義されたＢ１６−Ｆ１０黒色腫細胞株（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−６４７５（商標））を用いて同じ実験を実施した。図４に示すように、８．５ｘ１０４個のＢ１６−Ｆ１０黒色腫細胞のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスへの皮下注射は、線形腫瘍増殖を生じ、またこの場合も、本発明の組み合わせを用いた治療は、Ｂ１６−Ｆ１０誘導皮下黒色腫のサイズを顕著に低減させた。本発明の組み合わせ（Ｂ１６−Ｆ１０＋プレＣＤ２５＋ＣＰＩ／ＣＰＧ）または任意の追加の治療法（Ｂ１６Ｆ１０非処理）を用いずに、異なる時点で腫瘍サイズを測定した。この結果は、本発明の手法の治療効力は、特定の癌型に限定されないことを明確に示している。本発明の組み合わせの免疫細胞に対する直接作用を考慮すると、異なる癌型における本発明の手法の一般的作用が予測され得る。
【００５８】
種々のＴｒｅｇ除去剤を治療−Ｘに使用できる
本発明により実証されるように、抗ＣＤ２５抗体によるＴｒｅｇ細胞の除去は、ＴＬＲ９アゴニスト性およびチェックポイント阻害治療法の組み合わせの抗癌治療効力を顕著に高めた。抗ＣＤ２５抗体注射の作用が、第２のＴｒｅｇ不活化化合物により置き換えることができるかどうかを試験するために、抗ＣＤ２５抗体注射をＣＡＬ−１０１（イデラリシブまたはＺｙｄｅｌｉｃ）で置換した。所定のＣＡＬ−１０１投与量の使用は、フォスフォイノシチド  ３−キナーゼデルタ（ＰＩ３Ｋδ）の活性をインビボおよびインビトロで妨げ、それにより、マウスおよびヒトＴｒｅｇの機能を特異的に阻害することが示された（非特許文献１；非特許文献１０）。ＣＡＬ−１０１のみでなく、ＰＩ３Ｋδに特異的に作用する他の化合物も同様に、Ｔｒｅｇ機能を阻害し、これらの化合物は異なる経路を介して適用できることに留意すべきである（Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８）。
【００５９】
非抗体ベースＴｒｅｇ不活化剤が本発明の手法における抗ＣＤ２５作用を置換できることを示すために、１ｘ１０６個のＬＣ−１細胞をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの皮下に注射し、種々の時点での腫瘍増殖を測定した。使用した治療スキームを図５に示し、これは、ＬＣ−１肺腫瘍細胞の皮下適用（図５の−９日目に開始）後の、ＣＡＬ−１０１の２日間の腹腔内注射と、これの−６日目の第２の注射による反復、続けて、ＣｐＧ  ＴＬＲ９アゴニスト性オリゴヌクレオチドおよび抗ＣＴＬＡ４／抗ＰＤ１抗体の１日目およびその後の２日置きの規則的注射で構成される。ＣＡＬ−１０１媒介ＰＩ３Ｋδ阻害単独の治療効果を試験するために、追加のＴＬＲ９アゴニストおよびＣＴＬＡ４／抗ＰＤ１抗体の非存在下で、ＬＣ−１注射Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを２日置きのＣＡＬ−１０１注射で治療した（図５）。
【００６０】
図６では、１ｘ１０６個のＬＣ−１細胞をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの皮下に注射し、種々の時点で腫瘍サイズを測定した。ＣＡＬ−１０１注射と、これに続く、ＣｐＧ  ＴＬＲ９アゴニストおよびチェックポイント阻害性抗体による治療は、腫瘍増殖を効率的に阻止し（プレＣＡＬ＋ＣＰＩ／ＣｐＧ）、ＣＡＬ−１０１単独の場合には、マウスの治療効果は認められなかった（ＣＡＬ）。ＣｐＧ  ＴＬＲ９アゴニストおよびチェックポイント阻害性抗体と組み合わせたＰＩ３Ｋδ阻害剤ＣＡＬ−１０１の投与は、極めて強力な治療効果を誘導し、皮下ＬＣ−１腫瘍のサイズを有意に低減させた。対照的に、ＣＡＬ−１０１単独の適用は、何ら治療効果を示さなかった。これらの結果は、ＣｐＧ  ＴＬＲ９アゴニストおよびチェックポイント阻害性抗体と組み合わせて使用した場合、他のＴｒｅｇ阻害剤が同様に極めて効率的な抗癌治療効果を誘導することを示す。
【００６１】
材料および方法：
マウス
発癌性Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｖの条件付き発現および肺上皮細胞のＰ５３遺伝子機能の条件付き不活化のために、本発明者らは、ＬＳＬ−Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｖノックインマウスモデル（非特許文献１５）、条件付きｐ５３ノックインマウスモデル（非特許文献２２）およびＣｒｅＥＲＴ２  Ｃｒｅリコンビナーゼ融合遺伝子を含むＳｃｇｂ１ａ１−ＣｒｅＥＲＴ２ドライバーノックインマウスモデル（非特許文献１６）を、セクレトグロビン１ａ１遺伝子座位転写制御下（非特許文献２９）で交雑させた。本発明の医薬併用剤および投与計画を試験するために使用した条件付きＬＳＬ−Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｖマウス遺伝子型は、Ｇｕｅｒｒａおよび共同研究者により記載されたものと同じであるが、ＲＯＳＡ２６遺伝子座位に追加のノックインを含み、ＴＡＭ注射時に、ＥＹＦＰレポーターの条件付き活性化を可能とする。全ての条件付き遺伝子（発癌性Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｖ、ｐ５３機能の欠損および２個の共レポーター遺伝子ＥＹＦＰおよびｌａｃＺ）は、タモキシフェン（ＴＡＭ）の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射時に活性化される。３つ全ての遺伝子型を組み合わせたマウス（Ｓｃｇｂ１ａ１−ＣｒｅＥＲＴ２／ＬＳＬ−Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｖ／ｐ５３ｆｌ／ｆｌモデル）は、Ｃ５７ＢＬ／６  Ｊａｃｋｓｏｎの遺伝的背景を有した。
【００６２】
追加の情報：Ｓｃｇｂ１ａ１−ＣｒｅＥＲＴ２／ＬＳＬ−Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｖ／ｐ５３ｆｌ／ｆｌマウスのＴＡＭ注射は、肺癌の発症および肺腫瘍形成の進行性発症を促進する。所定量のＴＡＭの使用は、全てのマウスで肺癌表現型の完全浸透をもたらす。動力学および誘導表現型の両方は、個別マウス間で高度に再現可能であり、注射したＴＡＭの量に依存する。
【００６３】
タモキシフェン（ＴＡＭ）を用いたマウスのＣｒｅリコンビナーゼ活性の誘導
ＴＡＭストック溶液の作製のために、１００ｍｌのひまわり油をオートクレーブで処理した。最初に、１ｇのＴＡＭ粉末を３７℃の１０ｍｌのエタノール中で希釈した。この希釈液を９０ｍｌのオートクレーブ処理したひまわり油と室温で混合し、混合物を一晩震盪した。均質溶液をエッペンドルフチューブに分注し、−２０℃で貯蔵した。成体マウス（８〜１２週齢）の治療のために、１００μｌのＴＡＭ溶液をマウス当たりの単回ｉ．ｐ．注射として投与した。短期の使用のために、ＴＡＭを４℃で最大５日間貯蔵した。ＴＡＭを光曝露から常に保護した。
【００６４】
腫瘍量の可視化のための透明肺のホールマウントＬａｃＺ染色および腫瘍量の定量化
単回ＴＡＭ注射の５ヶ月後にマウス由来の肺を切開し、治療開始の１ヶ月後に分析し、氷冷ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で洗浄し、アセトン中、４℃で８時間固定した。次に、肺をＰＢＳ中で５分間の洗浄を２回行い、Ｘ−ｇａｌ緩衝液（ｐＨ７．４、Ｘ−ｇａｌ不含）中、振動台上で、４℃で８〜１２時間放置した。これは、組織への完全な浸潤および７．４のｐＨの確立に必要であった。肺を２０ｍｌのＸ−ｇａｌ染色溶液中に移し、１００ｒｐｍで震盪し、暗所で３７℃下、６〜１２時間インキュベートした。次のステップでは、肺をＰＢＳ中で５分間の洗浄を一回行った後、４℃で１週間、４％のホルムアルデヒドおよび１％のグルタルアルデヒドを含む固定緩衝液中で終夜固定した。脱水肺に対しては、最初、振動台を用いて室温で５分間のＰＢＳ中洗浄を３回行い、各肺当たり５０ｍｌの体積を使って別のメタノール／ＰＢＳ緩衝液中に移した（室温で）。その後、肺をＰＢＳ中の２５％メタノール中に１時間または臓器がガラスびんの底に沈降するまで置いた。このステップを、ＰＢＳ中の５０％および７５％のメタノールを用いて反復し、および１００％の濃度のメタノールを用いて３回繰り返した。最終的に、肺を１００％のメタノール中、４℃で少なくとも１２時間インキュベートして、水不含組織を確保した。前処理肺を透明にするために、肺を２０ｍｌの安息香酸ベンジル：ベンジルアルコールの２：１の混合物中で２〜３分間インキュベートした。強力な光源（３２００Ｋの光および６０ｍｓの露光時間）を備えた双眼鏡を用いて、透明肺の画像を直ちに取得し、倍率１．６ｘ１０で記録した。透明肺の画像を使って、ＮＩＨの撮像ソフトウェアパッケージを用いて腫瘍量を定量化した（ｈｔｔｐｓ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｅｔ／Ｗｅｌｃｏｍｅ）。いずれの場合も、Ｓｃｇｂ１ａ１−ＣｒｅＥＲＴ２／ＬＳＬ−Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｖ／ｐ５３ｆｌ／ｆｌマウスを１００μｌのＴＡＭの単回腹腔内注射により誘導して肺腫瘍形成を開始し、４ヶ月後に本発明の医薬併用剤および投与計画を用いて治療した。いずれの場合も、分析は、ＴＡＭ注射の５ヶ月後に実施した。
【００６５】
医薬併用剤の組成物
治療相乗効果を得るために、本発明の組み合わせを、抗ＣＤ２５抗体（免疫抑制性制御性Ｔ細胞を除去するために）、ＴＬＲ９アゴニスト（免疫系の自然群を刺激するために）およびチェックポイント阻害剤（Ｔ細胞活性を高め、制御性Ｔ細胞を低減させるために）から構成した。
【００６６】
制御性Ｔ細胞の除去
マウスの制御性Ｔ細胞の除去のために、５００μｇのＩｎＶｉｖｏＭＡｂ抗マウスＣＤ２５（ＢｉｏＸＣｅｌｌ）を、−９日目および−８日目の２連続日に腹腔内注射した（＋１日目に、ＴＬＲ９アゴニストおよびＰＣ−１／ＣＴＬＡ−４抗体を初めて注射する）。除去は、記載のように、最後の注射後の９日目に、その最強の効果に到達する（非特許文献２８）。あるいは（我々の初期の実験構成では用いなかったが）、ホスファチジルイノシトール−４，５−ビスホスフェート  ３−キナーゼデルタ（ＰＩ３Ｋδ）阻害剤を用いて、制御性Ｔ細胞を枯渇させることができ、免疫機能を強化できる（非特許文献１；非特許文献５）。
【００６７】
ＴＬＲ９アゴニスト適用
マウスのＴＬＲ９の全身刺激のために、Ｍｅｔａｂｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＧでＣｐＧアイランドを産生し、ホスホロチオエートを安定化した。配列５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ−３’を用いた。理由は、この配列は、マウスの制御性Ｔ細胞媒介ＣＤ８耐性を効率的に回復することが示されたためである（非特許文献３７）。免疫療法治療中、＋１日目に開始して、３日目または４日目毎に５０μｇのＣｐＧを実験動物に注射した。
【００６８】
チェックポイントメディエーター適用
効果的Ｔ細胞応答を高めるために、１００μｇのαＰＤ１（クローンＲＭＰ１−１４、カタログ：ＢＥ０１４６）と組み合わせた１００μｇのαＣＴＬＡ−４（クローン：９Ｄ９、カタログ：ＢＥ０１６４）を、免疫療法治療中に＋１日目に開始して３日目または４日目毎に実験動物に合計５回の注射を実施した。
【００６９】
ストック溶液
αＣＤ２５注射溶液：ＩｎＶｉｖｏＭＡｂ抗マウスＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒα）（クローン：ＰＣ−６１．５．３、カタログ：ＢＥ００１２）をＢｉｏＸＣｅｌｌから購入し、ＰＢＳで５００μｇ／２００μｌの濃度に希釈した。
ＣｐＧ注射溶液：Ｍｅｔａｂｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＧでＣｐＧを産生して、凍結乾燥し、オートクレーブ処理したＨ２Ｏｄｄで５０μｇ／２００μｌに希釈した。
αＣＴＬＡ−４ストック溶液：ＩｎＶｉｖｏＭＡｂ抗マウスＣＴＬＡ−４（クローン：９Ｄ９、カタログ：ＢＥ０１６４）をＢｉｏＸＣｅｌｌから購入し、ＰＢＳで１００μｇ／５０μｌの濃度に希釈した。
αＰＤ１ストック溶液：ＩｎＶｉｖｏＭＡｂ抗マウスＰＤ−１（クローン：ＲＭＰ１−１４、カタログ：ＢＥ０１４６）をＢｉｏＸＣｅｌｌから購入し、ＰＢＳで１００μｇ／５０μｌの濃度に希釈した。
チェックポイントメディエーター注射溶液：実験動物に注射する前に、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ１ストック溶液を１：１に希釈した（１００μｌの合計注射体積）。
【００７０】
ＬＣ−１細胞株の生成
安定なヒト肺癌細胞株を樹立するために、ＳＫＰマウス（ＴＡＭ注射の５ヶ月後；ＳＫＰ肺癌モデルに関するさらに多くの情報については、我々の元の出願を参照されたい）由来の肺腫瘍を外科的に取り除き、細かく切り刻み、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの皮下に注射した。４週後、皮下腫瘍を無菌下で切除し、細かく切り刻み、消化緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのヘペス、１０ｍＭのＣａＣｌ２・２水和物、２，４Ｕ／ｍｌのディスパーゼおよび０，３Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼ（両法ともＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，マンハイム、ドイツ））中、５６℃で９０分間インキュベートした。脱凝集細胞を７０μｍセルストレーナーを通過させて、１５％のＦＣＳ、１％の非必須アミノ酸、グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地中で培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。これらの初代培養物から、限界希釈により、ＬＣ−１細胞株を含むいくつかのクローン細胞株を樹立した。
【００７１】
ＬＣ−１およびＢ１６−Ｆ１０細胞株の注射
注射の前に、ＬＣ−１細胞またはＢ１６−Ｆ１０黒色腫細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−６４７５（商標））を、１０％のＦＣＳ、１％の非必須アミノ酸、グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地中で４０〜６０％集密度まで増殖させ、トリプシンで脱凝集させ、ＰＢＳ中で２回洗浄して、計数した。皮下注射に関しては、示した細胞数を１００ｌのＰＢＳ中に再懸濁し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに皮下注射した。
【００７２】
ＣＡＬ−１０１作製および注射
ＣＡＬ−１０１（Ｃ２２Ｈ１８ＦＮ７Ｏ）を最初にＤＭＳＯ中に５０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、分取量を後日の使用のために−８０℃で貯蔵した。各適用に対し、４μｌのこのＣＡＬ−１０１／ＤＭＳＯストックを１００μｌのＨ２Ｏに加え、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの腹腔内に注射した。抗ＣＤ２５置換実験では、２種のＣＡＬ−１０１注射を使用し、１ｘ１０６個のＬＣ−１細胞の皮下適用の２日後に開始した（図３の−９日目および−６日目）。ＣＡＬ−１０１をＴＬＲアゴニストおよびチェックポイント阻害性抗体と組み合わせて使用する場合、１００μｇのα−ＣＴＬＡ−４（クローン：９Ｄ９、ＢＥ０１６４）と一緒に５０μｇのＣｐＧ  ５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ−３’  ＴＲＬ９アゴニスト性オリゴヌクレオチドを、１００μｇのα−ＰＤ１（クローン：ＲＭＰ１−１４、ＢＥ０１４６）と組み合わせて、実験動物に、我々の元の適用で以前に記載したように、＋１日目に開始して、３日置きに注射した。ノギス測定により腫瘍発生を記録した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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