(57)【要約】  療法抵抗性ＥＲα陽性の乳がん、卵巣がん、及び子宮内膜がん細胞を殺す一連の小分子ＥＲαバイオモジュレータ。これらの小分子は、ＢＨＰＩ及び他の従来の療法（内分泌療法、タモキシフェン及びフルベストラント／ＩＣＩ）と比較して、療法抵抗性乳がん細胞を殺す能力が高いことから、高い治療能力を有する。それらの新規化合物は、がん細胞の増殖を阻害するだけでなく、実際にそれを殺すことで、後年の腫瘍再活性化を防止するものである。【選択図】図４−２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式Ｉの化合物又は該化合物の塩若しくは溶媒和物。
【化１】
2021529757.tif 000032
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロ、−ＯＲＡ、−ＳＲＡ、−Ｎ（ＲＡ）２、アルキル、シクロアルキル、複素環、アリール、又はヘテロアリールであり；
Ａ１、Ａ２、Ａ３及びＡ４はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロ、又はアルキルであり；
Ｇ１は、ハロ、−ＯＲＢ、−ＳＲＢ、−Ｓ（＝Ｏ）２ＲＢ、又はアルキルであり；
Ｇ２は、ハロ、−ＯＲＣ、−ＳＲＣ、−Ｓ（＝Ｏ）２ＲＣ、又はアルキルであり；
Ｘ及びＺはそれぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、又は−ＮＲＤであり；
ＲＡ、ＲＢ、ＲＣ及びＲＤはそれぞれ独立に、Ｈ又はアルキルであり、存在する場合に、−ＯＲＢ及び−ＯＲＣが両方とも−ＯＨであることはなく；
各アルキル、シクロアルキル、複素環、アリール、及びヘテロアリールは、１以上の置換基で置換されていても良い。］
【請求項２】
前記化合物が（Ｓ）−エナンチオマーである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記化合物が（Ｒ）−エナンチオマーである、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
ＲＡ、ＲＢ、ＲＣ及びＲＤがそれぞれ独立に、Ｈ又は−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４がそれぞれ独立に、Ｈ、ハロ、又は−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ａ１、Ａ２、Ａ３及びＡ４がそれぞれ独立に、Ｈ又はハロであり、Ｇ１が−ＯＲＢである、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｘが−ＮＲＤであり、ＺがＯである、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ１がＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨ２ＣＦ３、ＣＦ２ＣＨ３、又はＣＦ２ＣＦ３である、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
Ｇ１が−ＯＲＢであり、ＲＢがＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨ２ＣＦ３、ＣＦ２ＣＨ３、又はＣＦ２ＣＦ３である、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
前記化合物が下記式ＩＩ又は式ＩＩＩの化合物である、請求項１に記載の化合物。
【化２】
2021529757.tif 000033
【請求項１０】
前記化合物が下記式ＩＶの化合物である、請求項１に記載の化合物。
【化３】
2021529757.tif 000034
［式中、Ｇ１は−ＯＲＢであり、ＲＢ及びＲ１はそれぞれ独立に、アルキル又はシクロアルキルであり、前記アルキル及びシクロアルキルは、１以上のハロ基によって置換されていても良い。］
【請求項１１】
１以上の水素原子が重水素若しくは三重水素であり、１以上の炭素原子が炭素同位体又はそれの組みあわせである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
前記化合物が化合物（Ｓ）−又は（Ｒ）−２、４、６、８又は１０５のいずれか一つである、請求項１に記載の化合物。
【化４】
2021529757.tif 000035
【請求項１３】
前記化合物が左旋性である、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
前記化合物が右旋性である、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１５】
前記化合物が（Ｒ）−１０５又は（Ｓ）−１０５である、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１６】
前記化合物が（Ｒ）−１０５である、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
前記化合物がアルファエストロゲン受容体（ＥＲα）への結合アフィニティを有し、その結合アフィニティのＩＣ５０が約５００ｎＭ未満である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の化合物及び第２の薬剤を含む組成物。
【請求項１９】
薬学的に許容される希釈剤、担体、賦形剤又は緩衝剤と組み合わせて請求項１〜１７のいずれか１項に記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項２０】
前記化合物が（Ｒ）−１０５及び（Ｓ）−１０５のラセミ混合物である、請求項１９に記載の医薬組成物。
【化５】
2021529757.tif 000036
【請求項２１】
処置を必要とするＥＲα陽性がん対象者に対して、治療上有効量の請求項１〜１７のいずれか１項に記載の化合物を投与することで当該対象者におけるがんを治療することを含む、がんの治療方法。
【請求項２２】
前記化合物が、小胞体における小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）の過反応によって、ＥＲα陽性がんを殺すかそれの成長を阻害する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記化合物が（Ｒ）−１０５及び（Ｓ）−１０５のラセミ混合物である、請求項２１に記載の方法。
【化６】
2021529757.tif 000037
【請求項２４】
前記ＥＲα陽性がんが乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸癌、又は子宮内膜がんである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記化合物を経口投与又は注射により投与する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
処置を必要とする対象者におけるＥＲα陽性疾患の治療のための請求項１〜１７のいずれか１項に記載の化合物の使用であって、治療上有効量の前記化合物を当該対象者に投与することで、当該対象者におけるがんを治療する使用。
【請求項２７】
前記ＥＲα陽性疾患が乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸癌、又は子宮内膜がんである、請求項２６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１８年７月３日出願の米国暫定特許出願番号６２／６９３，６４１（参照によって本明細書に組み込まれる）に対する３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）下での優先権を主張するものである。
【０００２】
政府支援
本発明は、国立衛生研究所によって提供された助成番号ＲＯ１ＤＫ０７１９０９下の政府支援を得て行った。政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
乳がんの約７０％がＥＲα陽性である。これらの腫瘍の内分泌（ホルモン）療法には、エストロゲン産生を阻害するアロマターゼ阻害薬、ＥＲαへの結合に関してエストロゲンと競争するタモキシフェン及びいずれもエストロゲンと競争し、ＥＲα分解を促進するフルベストラント／フェソロデックス／ＩＣＩ  １８２，７８０などがある。初期は有効であるが、原発性腫瘍において抵抗性が生じる場合があり、それは転移の場合にはほぼ一般的である。抵抗性の機序は多様であるが、最近の研究により、これらの転移性腫瘍の約３０％がＥＲα変異、最も一般的にはＥＲαＤ５３８Ｇ及びＥＲαＹ５３７Ｓを有することが明らかになっている。これらの腫瘍がエストロゲン非依存性増殖を示すことから、エストロゲン産生を遮断するアロマターゼ阻害薬に対して抵抗性であることを示す十分な証拠がある。それらは、タモキシフェンに対してもかなり抵抗性であり、フルベストラントに対して部分的に抵抗性である。特に、転移性腫瘍が変異のない野生型ＥＲαを含む患者と比べて、転移性腫瘍がＥＲαＤ５３８Ｇ変異を含む変異を含む患者では生存期間が６ヶ月短くなり、ＥＲαＹ５３７Ｓ変異を有する患者では生存期間が１２ヶ月短くなる。従って、これらの変異を含む乳がん細胞を標的とする化学療法剤を開発する努力が大規模かつ広範囲に行われている。
【０００４】
ＥＲα陽性乳がんの病理は異常である。５年生存率は印象的であるが、その腫瘍は、最初の診断から１０〜２０年後に再発する場合が多い。それは、休眠乳がん細胞の増殖再活性化のためであると考えられる。従って、腫瘍細胞を実際に殺すこと、そしてその細胞を休眠状態に維持させて、再活性化しやすいようにさせないことが特に重要である。現行の内分泌療法は細胞増殖抑制性であって、細胞傷害性ではないことから、残った乳がん細胞を殺すものではない。そのため、その細胞は休眠状態となり、後日再活性化され得る。これらの再発性腫瘍についての治療選択肢はあまりなく、ほとんどの乳がん死はＥＲα陽性腫瘍患者でのものである。
【０００５】
卵巣がんは通常、進行段階で見つかる。腫瘍は多くの場合、手術後に再発する。卵巣腫瘍の３０〜７０％がＥＲα陽性であり、ＥＲα発現が良くない転帰に関連するが、内分泌療法は有効ではなく、再発性腫瘍は通常、白金に基づく化学療法及びパクリタキセルで治療される。最初は応答性であっても、数サイクルの治療後に、腫瘍は抵抗性卵巣がんとして再発して、治療選択肢は良くない。卵巣がん患者の半数より多くが５年以内に死亡する。卵巣がんでは、パクリタキセル及び他の化学療法薬に対する抵抗性の非常に一般的な抵抗性は、多剤抵抗性；ＡＴＰ依存性排出ポンプの過剰発現によって生じるエネルギー依存性薬剤排出、特には多剤抵抗性タンパク質１（ＭＤＲ１）／Ｐ−糖タンパク質／ＡＢＣＢ１である。かなりの努力が為されてきたが、有効な無毒性のＭＤＲ１阻害薬は、まだ見つかっていない。
【０００６】
多くの子宮内膜のがんがＥＲα陽性であるが、内分泌療法があまり有効ではない。
【０００７】
従って、重要な治療上の目標は、単に細胞増殖抑制性であるだけでなく細胞傷害性である新たな小分子を確認し、相当する治療法を開発することにある。
【発明の概要】
【０００８】
本開示は、治療可能性を大きく高めた、療法抵抗性乳がん細胞を実際に死滅させる改善された能力を有する小分子の恩恵を提供するものである。具体的には、再発を予防するため、増殖性かつ休眠中の療法抵抗性乳がん細胞の全集団を破壊することが必須である。ＢＨＰＩと比較して、そして内分泌療法タモキシフェン及びフルベストラント／ＩＣＩと比較して、活性エナンチオマー（−）Ｃ−１０５は、乳がん細胞を死滅させる非常に高い能力を有する。従って、化合物（−）Ｃ−１０５は、飛躍的に高い治療能力を示す（図４Ａ−４Ｃ）。
【０００９】
本開示は、下記式Ｉの化合物：
【化１】
2021529757.tif 000003
【００１０】
又はそれの塩若しくは溶媒和物を提供する。
【００１１】
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロ、−ＯＲＡ、−ＳＲＡ、−Ｎ（ＲＡ）２、アルキル、シクロアルキル、複素環、アリール、又はヘテロアリールであり；
Ａ１、Ａ２、Ａ３及びＡ４はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロ、又はアルキルであり；
Ｇ１は、ハロ、−ＯＲＢ、−ＳＲＢ、−Ｓ（＝Ｏ）２ＲＢ、又はアルキルであり；
Ｇ２は、ハロ、−ＯＲＣ、−ＳＲＣ、−Ｓ（＝Ｏ）２ＲＣ、又はアルキルであり；
Ｘ及びＺはそれぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、又は−ＮＲＤであり；
ＲＡ、ＲＢ、ＲＣ及びＲＤはそれぞれ独立に、Ｈ又はアルキルであり、存在する場合に、−ＯＲＢ及び−ＯＲＣが両方とも−ＯＨであることはなく；
各アルキル、シクロアルキル、複素環、アリール、及びヘテロアリールは、１以上の置換基で置換されていても良い。
【００１２】
上記化合物は、αエストロゲン受容体（ＥＲα）に結合し、小胞体における小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）の過反応によってがん細胞を死滅又は増殖阻害することができる。
【００１３】
さらに、本開示は、がんの治療方法であって、処置を必要とするＥＲα陽性がん対象者に対して、治療上有効量の上記化合物を投与することで、その対象者におけるがんを治療することを含む方法を提供する。
【００１４】
本発明は、式Ｉ〜ＩＶの新規化合物、式Ｉ〜ＩＶの化合物の合成のための中間体、並びに式Ｉ〜ＩＶの化合物の製造方法を提供する。本発明は、他の有用な化合物の合成のための中間体として有用である式Ｉ〜ＩＶの化合物も提供する。本発明は、哺乳動物、例えばヒトにおけるがんの治療に有用な医薬の製造のための式Ｉ〜ＩＶの化合物の使用を提供する。
【００１５】
本発明は、薬物療法で使用される本明細書に記載の組成物の使用を提供する。薬物療法は、がん、例えば、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸癌、子宮内膜がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、又は結腸がんを治療することができる。本発明は、哺乳動物における疾患、例えばヒトにおけるがんを治療するための医薬の製造のための本明細書に記載の組成物の使用も提供する。その医薬は、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、又は担体を含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
下記の図面は本明細書の一部を形成するものであり、本発明のある種の実施形態又は各種態様をさらに示すことを目的として含まれているものである。いくつかの例で、本発明の実施形態は、本明細書で提供される詳細な説明と組み合わせて添付の図面を参照することで最も良く理解することができる。その説明及び添付の図面によって、本発明のある種の具体的な実施例又はある種の態様を明らかにすることができる。しかしながら、その実施例又は態様を本発明の他の実施例又は態様と組み合わせて使用可能であることは、当業者には理解されよう。
【図１】ＥＲα陽性及びＥＲα陰性ヒトがん細胞に対する（±）−１０５の効果の用量応答試験。化合物１０５のＩＣ５０を決定するためのアラマーブルー２４時間死滅アッセイ。
【図２】ＢＨＰＩ及び（±）−１０５がＥＲα陽性Ｔ４７Ｄ細胞を死滅させる能力を比較する用量応答試験。化合物（±）−１０５は、乳がん細胞死を強力に誘発する。
【図３】（±）−１０５がＥＲα陽性細胞を死滅させる能力及びそれがＥＲα陰性細胞を死滅させる能力がないことの比較。
【図４】（−）１０５は、がん細胞を強力かつ定量的に死滅させる。ＭＣＦ７（ＥＲ＋）細胞、２４時間インキュベーション、アラマーブルー蛍光を介した読み取り、死滅対照：ラプチナール、ｎ＝３（Ａ、Ｂ）。（−）−１０５は、経口投与した場合に有効である（Ｃ）。ＴＹＳ細胞の同所性（Ｏｒｔｈｏｐｔｉｃ）マウス異種移植乳がん、生物発光撮像による視覚化。処理：経口強制投与又は腹腔内注射による３日間にわたる１日１回４０ｍｇ／ｋｇ（−）−１０５投与。
【図５】個々のエナンチオマーの分解能を示す（±）−１０５のキラル分離。
【図６】分離されたピークを示す（±）−１０５キラルＨＰＬＣトレース。
【図７】単離されたエナンチオマーの（−）−１０５キラルＨＰＬＣ。
【図８】他の単離エナンチオマーの（＋）−１０５キラルＨＰＬＣトレース。
【図９】１０５の（−）エナンチオマーは活性であり、（＋）エナンチオマーはＴ４７Ｄ細胞系において不活性である。
【図１０】（−）−１０５はＭＣＦ−７細胞の用量依存性死を誘発し；（＋）−１０５は不活性である。
【図１１】用量応答試験が、（−）−１０５がＴ４７Ｄ細胞死滅に関してＢＨＰＩより優れることを示している。
【図１２】用量応答試験が、（−）−１０５がＭＣＦ−７及びＴＹＳ細胞試験においてＢＨＰＩより優れていることを示している。
【図１３】用量応答試験が、（−）−１０５がＴＤＧ−Ｌｕｃ細胞死滅においてＢＨＰＩ及び現行の内分泌療法より優れていることを示している。
【図１４】（−）−１０５によるがん細胞死滅に関してＩＣ５０を決定するための用量応答試験。
【図１５】長期実験で、（−）−１０５は、ＴＹＳ−Ｌｕｃ細胞の１００％を殺し、ＢＨＰＩは殺さない。
【図１６】療法を模倣する長期実験で、（−）−１０５は、致死性の療法抵抗性乳がん細胞を根絶するが、ＢＨＰＩは根絶しない。
【図１７】ルシフェラーゼを用いる生物発光撮像（ＢＬＩ）は、マウスにおける療法抵抗性ＴＹＳ−ｌｕｃ乳房腫瘍のほぼ根絶を示している。
【図１８】（−）−１０５は、ＢＨＰＩによる殺滅に対して抵抗性である乳がん細胞を殺す。
【図１９】（−）−１０５は、スプライスＸＢＰ−１  ｍＲＮＡの誘発によって示されるＵＰＲを強力に活性化する。
【図２０】（−）−１０５は、療法抵抗性Ｃａｏｖ−３ＥＲα陽性卵巣がん細胞でのタンパク質合成の阻害において、ＢＨＰＩより優れている。
【図２１】２−ＡＰＢによる小胞体からのカルシウム流出の遮断が（−）−１０５誘発がん細胞死を阻害する。
【図２２】１０５は細胞内ＡＴＰレベルを低下させる；ＡＴＰレベルにおけるこの低下は、小胞体ＳＥＲＣＡポンプをタプシガルギンで不活性化することで遮断される。
【図２３】タプシガルギンによるＡＴＰレベル低下の遮断が、−１０５誘発細胞死を阻害する。
【図２４】被験化合物及びＢＨＰＩがＴＤＧ細胞を死滅させる能力の比較。
【図２５】被験化合物及びＢＨＰＩがＴＹＳ細胞を死滅させる能力の比較。
【図２６】被験化合物４、６、１０５及びＢＨＰＩがＴＹＳ細胞を死滅させる能力の比較。
【図２７】被験化合物及びＢＨＰＩがＴ４７Ｄ細胞を死滅させる能力の比較。
【図２８】被験化合物とＢＨＰＩのいずれも、ＥＲα陰性非非腫瘍形成姓ＭＣＦ−１０Ａ乳腺細胞を死滅させない。
【図２９】被験化合物及びＢＨＰＩがＴ４７Ｄ細胞を死滅させる能力の評価。
【図３０】ＢＨＰＩ及び被験化合物がＴ４７Ｄ、ＴＹＳ及びＴＤＧ細胞の増殖を阻害する能力を比較する用量応答試験。
【図３１】（−）１０５は、例えば致死性ＥＲ＋変異体に対してなど、ＥＲ＋がん細胞について非常に選択的である。
【図３２】（−）１０５は、ＢＨＰＩと同じ作用機序（ＭＯＡ）を有する。
【図３３】１０５は、療法抵抗性卵巣ＣａＯＶ−３卵巣がん細胞を殺すが、ＢＨＰＩは殺さない。（±）−１０５；細胞死アッセイ：自動トリパンブルー排除。（（±）−１０５後２４時間）。
【図３４】（−）１０５は、ＥＲ＋薬剤抵抗性腫瘍をほぼ根絶する。同所性乳がんモデル、ＴＹＳ−Ｌｕｃ細胞、４０ｍｇ／ｋｇ（−）−１０５腹腔内、１日１回。注射後７日画像は、注射前画像と比べて高効率でのかなり長い曝露である。
【図３５】追加のＰＰＴスライド（−）−１０５は、長期実験がん刺激療法においてＢＨＰＩより優れている。細胞：Ｔ４７Ｄ−ルシフェラーゼ。
【図３６】ＥＲα−陽性がん細胞を死滅させる化合物であるＳＥＲＫ−Ｆ６（Ｃ（−）−１０５、（−）−１０５、（Ｒ）−１０５、（−）−１、又は（Ｒ）−１とも称される）の発見。［ａ］ＢＨＰＩ及びラセミ体化合物１（即ち（±）−１）の化学構造、及びｎＭ単位で示した濃度での２４時間インキュベーション後のＴ４７Ｄ乳がん細胞に対するそれらの細胞傷害活性。細胞をアネキシンＶ−ＦＩＴＣ及びＰＩ色素で染色してから、フローサイトメトリーによって分析した。エラーバーは、３つの独立の反復実験のＳ．Ｅ．Ｍを表す。［ｂ］ＳＥＲＫ−Ｆ６は、ＥＲα−陽性細胞系、ＭＣＦ−７に対して細胞傷害性であるが、ＥＲα−陰性細胞系、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に対してはわずかな効果しか持たない。細胞をＳＥＲＫ−Ｆ６又は陽性対照、ラプチナールとともに２４時間インキュベートし、次にアネキシンＶ−ＦＩＴＣ及びＰＩ色素で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。エラーバーは、３つの独立の反復実験のＳ．Ｅ．Ｍを表す。［ｃ］報告されたＥＲαステータスによって分類されたがん細胞系のパネルに対する、２４時間インキュベーション後のＳＥＲＫ−Ｆ６のＩＣ５０値。細胞生存性をアラマーブルー蛍光によって測定し、媒体対照及びラプチナール処理された定量的死滅対照に対して設定した。エラーバーは、３つの独立の実験のＳ．Ｅ．Ｍを表す。［ｄ］示した濃度での化合物と２４時間インキュベーションした後のＴ４７Ｄ細胞のクリスタルバイオレット染色。画像は、二つの独立の実験を代表するものである。［ｅ、ｆ］Ｔ４７Ｄ、ＴＤＧ、及びＴＹＳ細胞を用いた長期細胞培養実験。細胞を化合物（１μＭ）とともに２週間インキュベートしてから、化合物を洗い出し、細胞を２ヶ月間培養した。細胞数をＭＴＳによって求めた。
【図３７】ＳＥＲＫ−Ｆ６は、ＥＲα−陽性細胞を根絶させる活性種である。［ａ］ＥＲα−陽性細胞系のパネルでの化合物インキュベーションの２４時間後のトリパンブルー排除アッセイ。［ｂ］１μＭのＢＨＰＩ又はＳＥＲＫ−Ｆ６とともにインキュベートしたＭＣＦ−７、ＭＤＧ、及びＭＹＳ細胞による長期細胞培養実験。
【図３８】ＳＥＲＫ−Ｆ６は、予想される（ａｎｔｉｃｉｐａｔｏｒｙ）ＵＰＲを活性化する。［ａ］指定時間後の化合物処理の結果としてのＴ４７Ｄ細胞でのｓｐ−ＸＢＰ１  ｍＲＮＡの誘発。ＢＨＰＩ及びＳＥＲＫ−Ｆ６を１μＭで投与した。ｍＲＮＡレベルをＲＴ−ＰＣＲによって定量した。エラーバーは、６つの生物学的反復実験のＳ．Ｅ．Ｍを表す。［ｂ］細胞内ＡＴＰ枯渇（ここでは詳細を必要とする）も、ここでＴ４７Ｄデータを必要とする。［ｃ］ＳＥＲＫ−Ｆ６処理（１μＭ）によって、Ｔ４７Ｄ細胞での急速なタンパク質合成阻害が生じる。
【図３９】ＳＥＲＫ−Ｆ６は、ＵＰＲの過反応によって野生型ＥＲα腫瘍を根絶する。［ａ］ＭＣＦ−７同所性腫瘍を６０日間Ｅ２ペレット（０．３６ｍｇ）を補給したＮｕ／Ｊ卵巣切除マウスで確立し、約４００ｍｍ３まで増殖させ（確立するのに２８日）、無作為化し、次に１日１回媒体（ｎ＝３）、１週間に１回媒体（ｎ＝３）、１週間に１回フルベストラント（５ｍｇ／マウス、皮下、ｎ＝６）、１日１回ＳＥＲＫ−Ｆ６（１０又は４０ｍｇ／ｋｇ経口）で処理した。媒体アームは平均を求めた。ｐ値：＊：ｐ≦０．０５、＊＊：ｐ≦０．０１、＊＊＊：ｐ≦０．００１、＊＊＊＊：ｐ≦０．０００１。腫瘍画像を試験終了後に撮り（第２１日）、それらは全ての腫瘍（ｎ＝６）を代表するものである。［ｂ〜ｅ］ＭＣＦ−７細胞を同所的に両側移植し、総腫瘍組織量が約４００ｍｍ３となるまで腫瘍を増殖させてから、媒体又はＳＥＲＫ−Ｆ６（４０ｍｇ／ｋｇ経口）で１日１回処理した。３日後（ｂ，ｃ）及び７日後（ｄ，ｅ）にマウス（ｎ＝５匹／アーム）を屠殺し、腫瘍を回収した。腫瘍組織量を、両方の腫瘍の合計として示している（ｂ，ｄ）。［ｃ、ｅ］ＵＰＲマーカーＰ−ＰＥＲＫ及びＰ−ＥＩＦ２α、並びにＥＲαのウェスタンブロット分析。ビンキュリン（Ｖｉｎ）を負荷対照として用いた。表示されたウェスタンブロットは、４つの技術的反復実験を代表するものである。表示された全ての実験の進行中、Ｅ２ペレットが存在した。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍを表す。
【図４０】ＳＥＲＫ−Ｆ６は耐容され、生物学的に意味のある濃度に達し、イン・ビボで血液−脳関門を通過する。［ａ］指定の用量、投与経路及び時間後のＳＥＲＫ−Ｆ６の血清濃度。濃度はＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析によって求めた。ＳＥＲＫ−Ｆ６の平均２４時間ＩＣ５０は４２ｎＭである。［ｂ］ＳＥＲＫ−Ｆ６についての薬物動態パラメータ計算値。ＡＵＣ：曲線下面積、Ｃｍａｘ：最大濃度、ｔ１／２：半減期。［ｃ、ｄ］マウス（ＣＤ−１）を指定の用量及び時間で処理し、屠殺し、血清及び脳を回収した。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析によって濃度を求めた。平均血液／マウスは、５８．５ｍＬ／ｋｇと見積もられた。［ｆ〜ｊ］同所性ＭＣＦ−７腫瘍を有するマウスのＳＥＲＫ−Ｆ６処理。［ｆ］第０日及び第２１日腫瘍測定の比較を行う腫瘍変化パーセント。治療アーム：１日１回媒体（ｎ＝３）、１週間に１回媒体（ｎ＝３）、１週間に１回フルベストラント（５ｍｇ／マウス、皮下、ｎ＝６）、１日１回ＳＥＲＫ−Ｆ６（１０又は４０ｍｇ／ｋｇ経口）。媒体アームを合わせた。［ｇ］マウスから回収した腫瘍の質量。［ｉ］このＭＣＦ−７試験時に観察されたマウス体重（ｎ＝６）。［ｉ、ｊ］ＭＣＦ−７両側同所性モデルについての腫瘍測定値（ｎ＝４〜５）。
【図４１】ＳＥＲＫ−Ｆ６は、変異体ＥＲα原発性及び転移乳がんを根絶する。［ａ〜ｃ］ＴＹＳ−ｌｕｃ。同所性腫瘍をＮＳＧ卵巣切除マウスで確立し（Ｅ２ペレットなし、確立するのに６０日）、示されたように１日１回投与した（ｎ＝５〜６）。［ｂ］ＳＥＲＫ−Ｆ６処理マウスの生物発光画像の代表例（７日）。［ｄ、ｅ］ＴＤＧ−ｌｕｃ。同所性腫瘍をＮＳＧ卵巣切除マウスで確立し（Ｅ２ペレットなし、確立するのに１２０日）、示されたように１日１回投与した（ｎ＝４〜５）。［ｅ］ＴＤＧ−ｌｕｃを有するＳＥＲＫ−Ｆ６処理マウスの生物発光画像。７日後の腫瘍組織量。［ｆ］ＭＹＳ−ｌｕｃ。ＮＳＧ卵巣切除マウスでの同所性腫瘍（Ｅ２ペレットなし、確立するのに４５日）に、示されたように１日１回投与した（ｎ＝４〜５）。［ｇ］ＭＤＧ−ｌｕｃ。ＮＳＧ卵巣切除マウスでの同所性腫瘍（Ｅ２ペレットなし、確立するのに４５日）に、示されたように１日１回投与した（ｎ＝４〜５）。［ｈ］ＭＤＧ−ｌｕｃを有する転移モデル。ＮＳＧ卵巣切除マウスの尾静脈に細胞を注射し（Ｅ２ペレットなし、確立するのに１．５ヶ月）、マウスに、示されたように１日１回投与した（ｎ＝４〜５）。
【図４２】結果は、変異体ＥＲαのＳＥＲＫ−Ｆ６介在根絶が定量的細胞死滅に依存することを示している。［ａ］２１日間の１日１回ＳＥＲＫ−Ｆ６投与（４０ｍｇ／ｋｇ腹腔内）後に処置を停止し、マウス腫瘍組織量を、生物発光を介して追跡した。［ｂ、ｃ］ＳＥＲＫ−Ｆ６処理時のＴＹＳ腫瘍を有するマウスの体重。［ｄ］相対的に低用量のＳＥＲＫ−Ｆ６（１０ｍｇ／ｋｇ経口）で処理したＴＹＳ腫瘍を有するマウスは腫瘍を再成長させるが、より高用量（４０ｍｇ／ｋｇ経口）でのＳＥＲＫ−Ｆ６の再処理により、完全な退行が生じる。［ｅ］ＴＤＧモデル中に観察されたマウス体重。［ｆ］ＴＤＧを有するマウスを、１４連続日にわたり処理し、処理を中断して、生物発光撮像による腫瘍再成長の観察ができるようにした。［ｇ］ＴＤＧ−ｌｕｃ。同所性腫瘍をＮＳＧ卵巣切除マウスで確立し（Ｅ２ペレットなし、確立するのに約１２０日）、示されたように１日１回投与した（ｎ＝５〜６）。［ｈ］ＴＤＧ−ｌｕｃを有するマウス。より低用量のＳＥＲＫ−Ｆ６（１０ｍｇ／ｋｇ経口）で処理した腫瘍は、処理なく２ヶ月後に腫瘍を再成長させるが、より高用量（４０ｍｇ／ｋｇ腹腔内）でのＳＥＲＫ−Ｆ６の再処理によって完全な退行が生じる。示されたエラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ．である。
【図４３】ＭＹＳ／ＭＤＧ腫瘍のＳＥＲＫ−Ｆ６介在根絶は、細胞殺滅量に依存する。［ａ〜ｂ］ＭＹＳ−ｌｕｃ。同所性腫瘍をＮＳＧ卵巣切除マウスで確立し（Ｅ２ペレットなし、確立するのに約４５日）、示されたように１日１回投与した（ｎ＝５〜６）。［ｂ］ＭＹＳ−ｌｕｃの処理。ＳＥＲＫ−Ｆ６の２１日間１日１回投与後に腫瘍処理を停止し、マウス腫瘍組織量を生物発光によって追跡した。第６０日に、再成長した腫瘍にＳＥＲＫ−Ｆ６（４０ｍｇ／ｋｇ１日１回腹腔内）を投与した。［ｃ］代表的な生物発光画像。［ｃ〜ｄ］ＭＤＧ−ｌｕｃ。同所性腫瘍をＮＳＧ卵巣切除マウスで確立し（Ｅ２ペレットなし、確立するのに約４５日）、示されたように１日１回投与した（ｎ＝５〜６）。総光量子束を介して、腫瘍体積を追跡した。［ｄ］ＭＤＧ−ｌｕｃ。１日１回経口で４０ｍｇ／ｋｇＳＥＲＫ−Ｆ６による処理を受けた腫瘍は、処理を停止した後に再成長した。再成長した腫瘍を、４０ｍｇ／ｋｇ  ＳＥＲＫ−Ｆ６腹腔内で再処理し、腫瘍の退行を観察した。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
がん細胞は、長期間にわたって休眠状態に留まり、そして再活動化し得る。従って、単に腫瘍細胞が増殖するのを防ぐだけでなく、その腫瘍細胞を殺すことが望ましい。本開示は、がん細胞、例えば乳がん細胞を殺す能力について化合物の試験を行うための各種アッセイの説明を提供するものでもある。
【００１８】
本開示はまた、野生型エストロゲン受容体α（ＥＲα）及び転移乳がんで一般的であるＥＲα変異の両方を発現する乳がん細胞の殺滅においてＢＨＰより有効な新規化合物を確認するものである。これらの変異は、現行の両方に対する抵抗性に関連する。さらに、本開示は、ＥＲαを含む卵巣がん細胞、子宮がん細胞及び他のがん細胞に対して活性な化合物を確認するものである。
【化２】
2021529757.tif 000004
【００１９】
化合物Ｃ（−）−１０５の発見は、ＢＨＰＩに対する構造に関係している。発見された化合物１０５の左旋性エナンチオマーの絶対配置は、（Ｒ）−配置を有することが確認された（即ち、（Ｒ）−１０５）。それは、単にがん細胞の増殖を阻害するだけではなく、がん細胞に対して細胞傷害性であることが確認された。（Ｒ）−１０５のその表現型は、がん細胞として次に腫瘍を殺す。化合物ＢＨＰＩ、フルベストラント、タモキシフェン及び０１−１５ががん細胞を殺さないことから、それらのことを考慮すると、この知見は驚くべきものである。これらの化合物は単にがん細胞増殖を遅らせるだけである、即ち、それらは細胞増殖抑制性である。従って、（Ｒ）−１０５は、それの独特な細胞傷害性プロファイル及びイン・ビトロでがん細胞を定量的に殺す能力によって識別された。さらに別のイン・ビボ試験から得られたデータは、腫瘍の退行におけるその化合物の有効性を証明している。
【００２０】
定義
下記の定義は、本明細書及び特許請求の範囲についての明瞭かつ一貫性のある理解を提供することを目的として含まれているものである。本明細書で使用される場合、列挙される用語は、下記の意味を有する。本明細書で使用される他の全ての用語及び表現は、当業者であれば理解するであろうそれらの通常の意味を有する。そのような通常の意味は、Ｈａｗｌｅｙ′ｓ  Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  １４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，    Ｒ．  Ｊ．  Ｌｅｗｉｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．，  ２００１のような技術辞書を参照することで得ることができる。
【００２１】
明細書における「１実施形態」、「実施形態」などへの言及は、記載されている実施形態が、特定の態様、特徴、構造、部分又は特性を含み得るものであるが、全ての実施形態が必ずしも、その態様、特徴、構造、部分又は特性を含む必要があるわけではない。さらに、そのような表現は、明細書の他の箇所で言及される同じ実施形態を指し得るが、必ずしもそうである必要はない。さらに、ある特定の態様、特徴、構造、部分又は特性が、ある実施形態との関連で記載されている場合、明瞭に記載されているか否かに拘わらず、そのような態様、特徴、構造、部分若しくは特性に他の実施形態が影響を与えるか、関係することは、当業者の知識の範囲内である。
【００２２】
単数形「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が他の形を明瞭に指定していない限り、複数形を含むものである。従って、例えば、「化合物」と言う場合、それは、複数のそのような化合物を含むことから、化合物Ｘは複数の化合物Ｘを含む。さらに留意すべき点として、特許請求の範囲は、任意の要素を排除するよう作ることができる。従って、この記述は、本明細書に記載の要素、及び／又は特許請求の要素の記述又は「消極的」限定の使用との関連で、「専ら」、「ただ〜だけ」などの排他的用語を使用するための先行語となるものである。
【００２３】
「及び／又は」という用語は、この用語が関連する事項、事項の組みあわせ、又は全ての事項を意味する。「１以上」及び「少なくとも一つ」という表現は、特にそれの使用の文脈で読む場合に、当業者によって容易に理解されるものである。例えば、その表現は、１、２、３、４、５、６、１０、１００、又は記載の下限より約１０、１００若しくは１０００倍高い上限を意味することができる。例えば、フェニル環上の１以上の置換基は、その環上の１〜５個の置換基を指す。
【００２４】
当業者には理解されるように、全ての数値、例えば成分、特性、例えば分子量、反応条件などの量を表す数値は近似値であり、「約」という用語によって全ての場合で変更しても良いものと理解される。これらの値は、本明細書における記述の内容を用いる当業者が得ようとする所望の特性に応じて変わり得る。そのような値が本質的に、それらの個々の試験測定値で認められる標準偏差から必然的に生じる可変性を含むことも明らかである。値が近似値として表される場合、先行詞「約」を用いることで、修飾語「約」がない特定の値もさらなる態様を形成することは明らかであろう。
【００２５】
「約」及び「ほぼ」という用語は互換的に用いられる。その用語の両方とも、特定された値の±５％、±１０％、±２０％又は±２５％の変動を指し得る。例えば、「約５０」パーセントは、一部の実施形態において、４５〜５５パーセントの変動、又は特定の請求項によって他の形態で定義される変動を含み得るものである。整数範囲の場合、「約」という用語は、範囲の各末端で記載の整数より大きい及び／又は小さい１個若しくは２個の整数を含むことができる。本明細書において別段の断りがない限り、「約」及び「ほぼ」という用語は、個々の成分、組成物若しくは実施形態の機能性に関して等価である記載範囲に近い値、例えば重量パーセントを含むものである。「約」及び「ほぼ」という用語は、この段落で上記で論じた記載範囲のエンドポイントを変えることもできる。
【００２６】
当業者には明らかなように、あらゆる点に関して、特には記述を提供することに関して、本明細書で記述の全ての範囲は、あらゆる可能な下位範囲及びそれの下位範囲の組みあわせ、並びにその範囲を構成する個々の値、特には整数値も包含する。従って、二つの特定の単一値の間の各単一値も開示されているものと理解される。例えば、１０〜１５が開示されている場合、１１、１２、１３、及び１４も、個別に及びその範囲の一部として開示される。記載の範囲（例えば、重量パーセント又は炭素基）は、その範囲内の各具体的な値、整数、小数又は単位元を含む。列記の範囲は、少なくとも等しい１／２、１／３、１／４、１／５又は１／１０ずつに分けられる同じ範囲を十分に説明及び可能とするものと容易に認識することができる。非限定的例として、本明細書に記載の各範囲は、下側１／３、中央１／３及び上側１／３などに容易に分けることができる。当業者であればやはり理解するように、「〜まで」、「少なくとも」、「より大きい」、「未満」、「より多い」、又は「以上」などの言語は全て、記載の数字を含むものであり、そのような用語は、後に、上記で述べたような下位範囲に分けることができる範囲を指す。同様にして、本明細書で記載の全ての比も、より広い比内に含まれる全ての下位比を含む。従って、基、置換基及び範囲について挙げられた具体的な値は例示のみを目的とするものであり；それらは、他の定義された値又は基及び置換基についての定義された範囲内の他の値を排除するものではない。さらに明らかな点として、各範囲のエンドポイントは、他のエンドポイントとの関係でも、他のエンドポイントから独立にでも有意である。
【００２７】
構成員を一般的な方法で、例えばマルクーシュ群で群分けすることができ、本発明が列記された全群を全体としてだけでなく、その群の各構成員を個別に、そして主要群の全ての可能な下位群も包含することも、当業者は容易に理解するものである。さらに、あらゆる点に関して、本発明は、主要群だけでなく、群構成員の１以上がない主要群も包含する。従って、本発明は、記載の群の構成員のいずれか１以上の明瞭な除外を想到するものである。従って、但し書きは開示のカテゴリー又は実施形態のいずれかに適用することができ、それによって記載の要素、種又は実施形態のいずれか１以上を、例えば明瞭な消極的制限での使用のために、そのようなカテゴリー又は実施形態から除外することができる。
【００２８】
「接触する」という用語は、例えば細胞レベル又は分子レベルで触れ、接触を行い、又は直接又は近接させることで、例えば、溶液、反応混合物中、イン・ビトロ若しくはイン・ビボなどでの生理的反応、化学反応又は物理的変化を生じさせる行為を指す。
【００２９】
「有効量」は、疾患、障害、及び／又は状態を治療し、又は記載の効果をもたらす上で有効な量を指す。例えば、有効量は、治療される状態又は症状の進行若しくは重度を低下させる上で有効な量であることができる。治療上有効量の決定は、当業者の能力の範囲内である。「有効量」という用語は、宿主において、疾患若しくは障害を治療若しくは予防する上で、又は疾患若しくは障害の症状を治療する上で有効な、本明細書に記載の化合物の量、又は本明細書に記載の化合物の組みあわせの量を含むものである。従って、「有効量」は通常、所望の効果を提供する量を意味する。
【００３０】
或いは、本明細書で使用される場合、「有効量」又は「治療上有効量」という用語は、治療される疾患又は状態の症状の１以上をある程度軽減する、十分な量の投与される薬剤若しくは組成物若しくは組成物の組みあわせを指す。結果は、疾患の徴候、症状若しくは原因の低減及び／又は緩和、又は生体系の他の所望の修正であることができる。例えば、治療用途に関しての「有効量」は、疾患症状における臨床的に有意な低下を提供するのに必要な本明細書で開示の化合物を含む組成物の量である。個々の場合で適切な「有効量」は、用量増加試験などの技術を用いて求めることができる。その用量は、１回以上の投与で投与することができた。しかしながら、有効用量と考えられるものの正確な決定は、各患者に固有の要素、例えば患者の年齢、大きさ、疾患の種類若しくは程度、疾患の段階、組成物の投与経路、使用される補助療法の種類若しくは程度、進行している疾患プロセス、及び所望の治療の種類（例えば、積極的治療と従来治療）など（これらに限定されるものではない）に基づくことができる。
【００３１】
「治療すること」、「治療する」及び「治療」という用語は、（ｉ）疾患、病的状態若しくは医学的状態が起こるのを防止すること（例えば予防）；（ｉｉ）疾患、病的状態若しくは医学的状態を阻害すること又はそれの進行を停止すること；（ｉｉｉ）疾患、病的状態若しくは医学的状態を緩和すること；及び／又は（ｉｖ）疾患、病的状態若しくは医学的状態関連の症状を軽減することを含む。従って、「治療する」、「治療」及び「治療すること」という用語は、予防に適用拡大することができ、治療される状態若しくは症状を予防する、それの予防、それを予防すること、軽減すること、停止すること、又は進行若しくは重度を逆転させることを含み得る。従って、「治療」という用語は、適宜に、医学的、治療的及び／又は予防的投与を含むことができる。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「対象者」又は「患者」は、疾患又は他の悪性腫瘍の症状を有する、又はそのリスクを有する個体を意味する。患者はヒト若しくは非ヒトであることができ、例えば、研究目的の「モデル系」として使用される動物系統又は種、例えば本明細書に記載のマウスモデルなどがあり得る。同様に、患者には、成人又は未成年（例えば、小児）などがあり得る。さらに、患者は、本明細書で予想される組成物の投与から恩恵を受け得る生物、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒト又は非ヒト）を意味し得る。哺乳動物の例には、哺乳類の構成員：ヒト、非ヒト霊長類、例えばチンパンジー、及び他の類人猿及びサル種；家畜、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ；ペット動物、例えばウサギ、イヌ及びネコ；齧歯類などの実験動物、例えばラット、マウス及びモルモットなどがあるが、これらに限定されるものではない。非哺乳動物の例には、鳥、魚などがあるが、これらに限定されるものではない。本明細書で提供される方法の１実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「提供する」、「投与する」、「導入する」という用語は本明細書においては互換的に使用され、所望の部位への組成物の少なくとも部分的局在化をもたらす方法又は経路に、本開示の組成物を置くことを指す。その組成物は、対象者における所望の位置への送達をもたらすいずれか適切な経路によって投与することができる。
【００３４】
本明細書に記載の組成物は、組成物の安定性及び活性を延長する別の組成物とともに、又は他の治療剤と組み合わせて投与することができる。
【００３５】
「阻害する」、「阻害すること」及び「阻害」という用語は、疾患、感染、状態、又は細胞群の増殖及び進行の遅延、停止若しくは逆転を指す。阻害は、例えば、治療や接触がない場合に生じる増殖又は進行と比較して、約２０％、４０％、６０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％高いものであることができる。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、広義の用語であり、それの通常の意味で使用され、例えば、特定されたものの必ずしも全体である必要はなくかなりの部分などがあるが、それに限定されるものではない。例えば、その用語は、１００％全数値でなくても良い数値を指すことができると考えられる。その全数値は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１５％、又は約２０％だけ小さいものであることができる。
【００３７】
本開示は、本発明の化合物及び組成物の製造方法を提供する。その化合物及び組成物は、任意に有機合成の標準的な技術と組み合わせて、本明細書に記載の利用可能な技術のいずれかによって製造することができる。エーテル化及びエステル化などの多くの技術が当業界では公知である。しかしながら、これらの技術の多くが、Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），  Ｖｏｌ．  １，  Ｉａｎ  Ｔ．  Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｈｕｙｅｎ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ，  １９７１；  Ｖｏｌ．  ２，  Ｉａｎ  Ｔ．  Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｈｕｙｅｎ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ，  １９７４；  Ｖｏｌ．  ３，  Ｌｏｕｉｓ  Ｓ．  Ｈｅｇｅｄｕｓ  ａｎｄ  Ｌｅｒｏｙ  Ｗａｄｅ，  １９７７；  Ｖｏｌ．  ４，  Ｌｅｒｏｙ  Ｇ．  Ｗａｄｅ，  Ｊｒ．，  １９８０；  Ｖｏｌ．  ５，  Ｌｅｒｏｙ  Ｇ．  Ｗａｄｅ，  Ｊｒ．，  １９８４；  ａｎｄ  Ｖｏｌ．  ６；  ａｓ  ｗｅｌｌ  ａｓ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｔｅｘｔｓ  ｓｕｃｈ  ａｓ  Ｍａｒｃｈ′ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．，  ｂｙ  Ｍ．  Ｂ．  Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｍａｒｃｈ  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ２００１）；  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ，  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ＆  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  Ｉｎ  ９  Ｖｏｌｕｍｅｓ，  Ｂａｒｒｙ  Ｍ．  Ｔｒｏｓｔ，  Ｅｄｉｔｏｒ−ｉｎ−Ｃｈｉｅｆ  （Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９３  ｐｒｉｎｔｉｎｇ）；  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｐａｒｔ  Ｂ：  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃａｒｙ  ａｎｄ  Ｓｕｎｄｂｅｒｇ  （１９８３）で説明されている。
【００３８】
本明細書に記載の式及び化合物は、保護基を用いて修飾することができる。好適なアミノ及びカルボキシ保護基は、当業者には公知である（例えば、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｇｒｅｅｎｅ，  Ｔ．  Ｗ．，  ａｎｄ  Ｗｕｔｚ，  Ｐ．  Ｇ．  Ｍ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ及びそこで引用の参考文献；Ｐｈｉｌｉｐ  Ｊ．  Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ；  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  （Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ  Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９４）及びそこで引用の参考文献；及びＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，  Ｌａｒｏｃｋ，  Ｒ．  Ｃ．，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９９）及びそこで引用の参考文献を参照する。）。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「置換されている」又は「置換基」という用語は、「置換されている」（又は「置換基」）を用いる表現で示されている基上の１以上の（例えば、各種実施形態で１〜２０、他の実施形態で１〜１０、１、２、３、４又は５；一部の実施形態で１、２、又は３；他の実施形態１又は２）水素が、指定された基から選択されたもので、又は当業者に公知の好適な基で置き換わっていることを示すものであるが、ただし、指定された原子の通常の価数を超えるものではなく、その置換によって安定な化合物が得られるものである。好適な指定基には、例えばアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリフルオロメチルチオ、ジフルオロメチル、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、及びシアノなどがある。さらに、置換された炭素（又は他の）原子に結合することができる置換基の非限定的な例には、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ′、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ′）２、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、Ｒ′、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）、メチレンジオキシ、エチレンジオキシ、Ｎ（Ｒ′）２、ＳＲ′、ＳＯＲ′、ＳＯ２Ｒ′、ＳＯ２Ｎ（Ｒ′）２、ＳＯ３Ｒ′、Ｃ（Ｏ）Ｒ′、Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ′、Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ′、Ｃ（Ｓ）Ｒ′、Ｃ（Ｏ）ＯＲ′、ＯＣ（Ｏ）Ｒ′、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ′）２、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ′）２、Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ′）２、（ＣＨ２）０−２ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ′、Ｎ（Ｒ′）Ｎ（Ｒ′）Ｃ（Ｏ）Ｒ′、Ｎ（Ｒ′）Ｎ（Ｒ′）Ｃ（Ｏ）ＯＲ′、Ｎ（Ｒ′）Ｎ（Ｒ′）ＣＯＮ（Ｒ′）２、Ｎ（Ｒ′）ＳＯ２Ｒ′、Ｎ（Ｒ′）ＳＯ２Ｎ（Ｒ′）２、Ｎ（Ｒ′）Ｃ（Ｏ）ＯＲ′、Ｎ（Ｒ′）Ｃ（Ｏ）Ｒ′、Ｎ（Ｒ′）Ｃ（Ｓ）Ｒ′、Ｎ（Ｒ′）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ′）２、Ｎ（Ｒ′）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ′）２、Ｎ（ＣＯＲ′）ＣＯＲ′、Ｎ（ＯＲ′）Ｒ′、Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｒ′）２、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＯＲ′）Ｒ′、又はＣ（＝ＮＯＲ′）Ｒ′などがあり、Ｒ′は水素又は炭素系部分であることができ、前記炭素系部分自体がさらに置換されていることができる。置換基が一価である場合、例えばＦ又はＣｌである場合、それは、それが単結合によって置換している原子に結合している。置換基が複数価である場合、例えば２価であるＯである場合、それは、それが複数結合によって置換している原子に結合することができる、即ち２価置換基は二重結合によって結合しており；例えば、Ｏで置換されたＣはカルボニル基、Ｃ＝Ｏを形成しており、そのＣ及びＯは二重結合している。或いは、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）又はＳ（Ｏ）２などの２価置換基は２個の異なる炭素原子への二つの単結合によって連結されていることができる。例えば、２価置換基であるＯは、２個の隣接する炭素原子のそれぞれに結合してエポキシド基を提供することができるか、そのＯは、隣接する炭素原子若しくは隣接しない炭素原子間で架橋エーテル基を形成することができ、例えばシクロヘキシル基の１，４−炭素を架橋して、［２．２．１］−オキサビシクロ系を形成する。さらに、いずれの置換基も、連結基、例えば（ＣＨ２）ｎ又は（ＣＲ′２）ｎによって炭素又は他の原子に結合していることができ、この場合、ｎは１、２、３又はそれ以上であり、各Ｒ′は独立に選択される。
【００４０】
「ハロ」又は「ハライド」という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモ、又はヨードを指す。同様に、「ハロゲン」とう用語は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素を指す。
【００４１】
「アルキル」という用語は、例えば１〜２０個の炭素原子、及び多くの場合１〜１２、１〜１０、１〜８、１〜６又は１〜４個の炭素原子を有する分岐若しくは未分岐の炭化水素を指す。本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、下記で定義の「シクロアルキル」も包含する。例としては、メチル、エチル、１−プロピル、２−プロピル（イソ−プロピル）、１−ブチル、２−メチル−１−プロピル（イソブチル）、２−ブチル（ｓｅｃ−ブチル）、２−メチル−２−プロピル（ｔ−ブチル）、１−ペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、２−メチル−２−ブチル、３−メチル−２−ブチル、３−メチル−１−ブチル、２−メチル−１−ブチル、１−ヘキシル、２−ヘキシル、３−ヘキシル、２−メチル−２−ペンチル、３−メチル−２−ペンチル、４−メチル−２−ペンチル、３−メチル−３−ペンチル、２−メチル−３−ペンチル、２，３−ジメチル−２−ブチル、３，３−ジメチル−２−ブチル、ヘキシル、オクチル、デシル、ドデシルなどがあるが、これらに限定されるものではない。そのアルキルは、置換されていないか、例えば下記に記載の置換基で置換されていることができる。アルキルは、任意に、部分不飽和又は完全不飽和であることもできる。従って、アルキル基という場合、それはアルケニル基及びアルキニル基の両方を含むことができる。アルキルは、上記で記載及び例示のように一価炭化水素基であることができるか、それは２価炭化水素基であることができる（即ち、アルキレン）。
【００４２】
「シクロアルキル」という用語は、例えば単一のシクロ環又は複数縮合環を有する３〜１０個の炭素原子の環状アルキル基を指す。シクロアルキル基には、例を挙げると、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロオクチルんどの環構造、又はアダマンチルなどの複数環構造などがある。シクロアルキルは置換されていないか置換されていることができる。シクロアルキル基は、一価若しくは二価であることができ、任意に、アルキル基について記載のように置換されていることができる。シクロアルキル基は、不飽和の１以上の部位含んでいても良く、例えば、シクロアルキル基は、１以上の炭素−炭素二重結合を含むことができ、例えば１−シクロペンタ−１−エンイル、１−シクロペンタ−２−エンイル、１−シクロペンタ−３−エンイル、シクロヘキシル、１−シクロヘキサ−１−エンイル、１−シクロヘキサ−２−エンイル、１−シクロヘキサ−３−エンイルなどであることができる。
【００４３】
「複素環アルキル」又は「複素環」という用語は、少なくとも１個の環にチオ、硫黄、酸素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子、好ましくは１〜３個のヘテロ原子を含む飽和若しくは部分飽和の単環式、二環式若しくは多環式環を指す。各環は、好ましくは３〜１０員、より好ましくは４〜７員である。好適な複素環アルキル置換基の例には、ピロリジル、テトラヒドロフリル、テトラヒドロチオフラニル、ピペリジル、ピペラジル、テトラヒドロピラニル、モルホリノ、１，３−ジアザパン、１，４−ジアザパン、１，４−オキサゼパン及び１，４−オキサチアパンなどがある。その基は、末端基又は架橋基であることができる。
【００４４】
「芳香族」という用語は、アリール若しくはヘテロアリール基又は本明細書に記載の置換基を指す。さらに、芳香族部分は、二芳香族部分、三芳香族部分などであることができる。二芳香族部分は、ビフェニル又はビピリジンなど（これらに限定されるものではない）の二つの芳香族部分間の単結合を有する。同様に、三芳香族部分は、各芳香族部分間の単結合を有する。
【００４５】
「アリール」という用語は、親芳香環系の１個の炭素原子からの少なくとも１個の水素原子の除去から誘導される芳香族炭化水素基を指す。その基の結合部位は、親環系の飽和若しくは不飽和炭素原子であることができる。アリール基は、６〜３０個の炭素原子、例えば約６〜１０個の炭素原子を有することができる。他の実施形態において、アリール基は、６〜６０個の炭素原子、６〜１２０個の炭素原子、又は６〜２４０個の炭素原子を有することができる。アリール基は、単一の環（例えば、フェニル）又は複数の縮合（融合）環を有することができ、少なくとも一つの環が芳香族である（例えば、ナフチル、ジヒドロフェナントレニル、フルオレニル又はアントリル）。代表的なアリール基には、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニルなどから誘導される基などがあるが、それらに限定されるものではない。アリールは、置換されていないか置換されていても良い。
【００４６】
「ヘテロアリール」という用語は、１個、２個若しくは３個の芳香環を含み、芳香環に少なくとも１個のチオ、酸素若しくは硫黄原子を含む単環式、二環式若しくは三環式環系を指す。ヘテロアリールは、置換されていないか、「置換されている」の定義で記載のように１以上、特には１〜３個の置換基によって置換されていることができる。代表的なヘテロアリール基は、１以上のヘテロ原子に加えて、環骨格に２〜２０個の炭素原子を含む。ヘテロアリール基の例には、２Ｈ−ピロリル、３Ｈ−インドリル、４Ｈ−キノリジニル、アクリジニル、ベンゾ［ｂ］チエニル、ベンゾチアゾリル、β−カルボリニル、カルバゾリル、クロメニル、シンノリニル、ジベンゾ［ｂ，ｄ］フラニル、フラザニル、フリル、イミダゾリル、イミジゾリル、インダゾリル、インドリシニル、インドリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、ナフチリジニル、オキサゾリル、ペリミジニル（ｐｅｒｉｍｉｄｉｎｙｌ）、フェナントリジニル、フェナントロリニル、フェナルサジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサチイニル、フェノキサジニル、フタラジニル、プテリジニル、プリニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、キノキサリニル、チアジアゾリル、チアントレニル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、テトラゾリル及びキサンテニルなどがあるが、これらに限定されるものではない。１実施形態において、「ヘテロアリール」という用語は、炭素及び非過酸化物酸素、硫黄及びＮ（Ｚ）から独立に選択される１、２、３若しくは４個のヘテロ原子を含む５個若しくは６個の環原子を含む単環式芳香環を指し、Ｚは非存在であるか、Ｈ、Ｏ、アルキル、アリール、又は（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアリールである。一部の実施形態において、ヘテロアリールは、それから誘導される約８〜１０個の環原子のオルト縮合二環式複素環を指し、特にはベンゾ誘導体又はプロピレン、トリメチレン若しくはテトラメチレンジラジカルをそれに縮合させることで誘導されるものを指す。
【００４７】
本明細書で使用される「エナンチオマー豊富」（「ｅｅ」）という用語は、別のエナンチオマーより大きい程度で存在する一つのエナンチオマーを有する混合物を指す。従って、別のエナンチオマーより大きい程度で存在する一つのエナンチオマーを提供する反応は、「エナンチオマー選択的」であると考えられる（又は「エナンチオマー選択性」を示す）。本発明の１実施形態において、「エナンチオマー豊富」という用語は、少なくとも約２％ｅｅを有する混合物を指し；本発明の別の実施形態において、「エナンチオマー豊富」という用語は、少なくとも約５％ｅｅを有する混合物を指し；本発明の別の実施形態において、「エナンチオマー豊富」という用語は、少なくとも約２０％を有する混合物を指し；本発明の別の実施形態において、「エナンチオマー豊富」という用語は、少なくとも約５０％を有する混合物を指し；本発明の別の実施形態において、「エナンチオマー豊富」という用語は、少なくとも約８０％を有する混合物を指し；本発明の別の実施形態において、「エナンチオマー豊富」という用語は、少なくとも約９０％を有する混合物を指し；本発明の別の実施形態において、「エナンチオマー豊富」という用語は、少なくとも約９５％を有する混合物を指し；本発明の別の実施形態において、「エナンチオマー豊富」という用語は、少なくとも約９８％を有する混合物を指し；本発明の別の実施形態において、「エナンチオマー豊富」という用語は、少なくとも約９９％を有する混合物を指す。「エナンチオマー豊富」という用語は、エナンチオマー的に純粋な混合物を含み、それは、反対の光学活性の化学種を実質的に含まないか、一方のエナンチオマーが例えば０．０１％、０．００１％又は０．０００１％という非常に低量で存在する混合物である。
【００４８】
「ＩＣ５０」という用語は通常、２４時間以内で細胞の５０％を殺すのに必要な濃度と定義される。
【００４９】
本開示全体を通じて、化合物１０５の左旋性エナンチオマーを指す「（−）−１０５」という用語は、Ｃ（−）−１０５、（−）−１、（Ｒ）−１０５、（Ｒ）−１、又はＳＥＲＫ−Ｆ６という用語と互換的に使用することができる。同様に、（＋）−１０５は、右旋性エナンチオマーであり、（Ｓ）−１０５、（Ｓ）−１又は（＋）−１とも称される。やはり、化合物１０５のラセミ体を指す「（±）−１０５」という用語は、（±）−１という用語と互換的に使用することができる。
【００５０】
本発明の実施形態
本開示は、下記式Ｉの化合物又はそれの塩若しくは溶媒和物の多様な実施形態を提供する。
【化３】
2021529757.tif 000005
【００５１】
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロ、−ＯＲＡ、−ＳＲＡ、−Ｎ（ＲＡ）２、アルキル、シクロアルキル、複素環、アリール、又はヘテロアリールであり；
Ａ１、Ａ２、Ａ３及びＡ４はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロ、又はアルキルであり；
Ｇ１はハロ、−ＯＲＢ、−ＳＲＢ、−Ｓ（＝Ｏ）２ＲＢ、又はアルキルであり；
Ｇ２はハロ、−ＯＲＣ、−ＳＲＣ、−Ｓ（＝Ｏ）２ＲＣ、又はアルキルであり；
Ｘ及びＺはそれぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、又は−ＮＲＤであり；
ＲＡ、ＲＢ、ＲＣ及びＲＤはそれぞれ独立に、Ｈ又はアルキルであり、存在する場合、−ＯＲＢ及び−ＯＲＣが両方とも−ＯＨであることはなく；
各アルキル、シクロアルキル、複素環、アリール、及びヘテロアリールは、１以上の置換基で置換されていても良い。
【００５２】
本明細書に記載の式Ｉ〜ＩＶの各種実施形態において、Ｒ５は、Ａ１に対してオルトの位置での置換基である。各種実施形態において、Ｒ６は、Ａ２に対してオルトの位置での置換基である。各種実施形態において、Ｒ７は、Ａ３に対してオルトの位置での置換基である。各種実施形態において、Ｒ８は、Ａ４に対してオルトの位置での置換基である。各種実施形態において、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロ、−ＯＲＡ、−ＳＲＡ、−Ｎ（ＲＡ）２、アルキル、シクロアルキル、複素環、アリール、又はヘテロアリールである。
【００５３】
一部の実施形態において、当該化合物は（Ｓ）−エナンチオマーである。他の実施形態において、当該化合物は（Ｒ）−エナンチオマーである。別の実施形態において、ＲＡ、ＲＢ、ＲＣ及びＲＤはそれぞれ独立に、Ｈ又は−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロ、又は−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルである。一部の他の実施形態において、Ａ１、Ａ２、Ａ３及びＡ４はそれぞれ独立に、Ｈ又はハロであり、Ｇ１は−ＯＲＢである。さらなる実施形態において、Ｘは−ＮＲＤであり、ＺはＯである。さらなる実施形態において、ＲＡ、ＲＢ、ＲＣ、ＲＤ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に、−（Ｃ２−Ｃ６）アルキル、−（Ｃ３−Ｃ６）アルキル、又は−（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキルである。
【００５４】
各種の別の実施形態において、Ｒ１はＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨ２ＣＦ３、ＣＦ２ＣＨ３、又はＣＦ２ＣＦ３である。さらに他の別の実施形態において、Ｇ１は−ＯＲＢであり、ＲＢはＨ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨ２ＣＦ３、ＣＦ２ＣＨ３、又はＣＦ２ＣＦ３である。
【００５５】
さらなる実施形態において、当該化合物は、下記式ＩＩ又は式（ＩＩＩ）の化合物である。
【化４】
2021529757.tif 000006
【００５６】
一部の他の実施形態において、当該化合物は、下記式ＩＶの化合物である。
【化５】
2021529757.tif 000007
【００５７】
式中、Ｇ１は−ＯＲＢであり、ＲＢ及びＲ１はそれぞれ独立にアルキル又はシクロアルキルであり、前記アルキル及びシクロアルキルは１以上のハロ基によって置換されていても良い。
【００５８】
各種の他の実施形態において、１以上の水素原子が重水素又は三重水素であり、１以上の炭素原子が炭素同位体又はそれらの組みあわせである。
【００５９】
さらに他の実施形態において、当該化合物は化合物（Ｓ）−又は（Ｒ）−２、４、６、８又は１０５のいずれか一つである。
【化６】
2021529757.tif 000008
【００６０】
さらなる実施形態において、当該化合物は、下記で示された化合物のいずれか一つ又はそれのエナンチオマーである。
【化７】
2021529757.tif 000009
【００６１】
一部の別の実施形態において、当該化合物は左旋性である。他の実施形態において、当該化合物は右旋性である。他の実施形態においては、当該化合物は（Ｒ）−１０５又は（Ｓ）−１０５である。さらに他の実施形態では、当該化合物は（Ｒ）−１０５である。
【００６２】
他の別の実施形態において、当該化合物（エナンチオマー又はラセミ体）は、エストロゲン受容体（ＥＲα）に対する結合アフィニティを有し、その結合アフィニティのＩＣ５０は約５００ｎＭ未満である。他の実施形態において、ＥＲαに対するＩＣ５０は、約１ｐＭ〜約１０００ｎＭ、約０．１ｎＭ〜約７５０ｎＭ、約１ｎＭ〜約２５０ｎＭ、約５ｎＭ〜約５００ｎＭ、又は約１０ｎＭ〜約５０００ｎＭである。各種の他の実施形態において、当該化合物は、小胞体での小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）の過反応によって、がん細胞を死滅させるか、それの増殖を阻害する。さらなる実施形態において、がん細胞はＥＲα陽性がん細胞である。一部の他の実施形態において、がん細胞は、乳がん細胞、卵巣がん細胞、又は子宮内膜がん細胞である。
【００６３】
本開示は、本明細書で開示の化合物及び第２の薬剤を含む組成物も提供する。本開示はさらに、薬学的に許容される希釈剤、担体、賦形剤、又は緩衝剤と組み合わせて当該化合物を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物の一部の実施形態において、当該化合物は、（Ｒ）−１０５及び（Ｓ）−１０５のラセミ混合物である。各種実施形態において、化合物のラセミ混合物は、エナンチオマーの混合物であり、そのエナンチオマーの混合物は、約５０：５０、約４５：５５、約４０：６０、約３０：７０、約２０：８０、約１０：９０、又は約５：９５の比を有する。
【００６４】
本開示はさらに、処置を必要とするＥＲα陽性がん対象者に対して、治療上有効量の当該化合物を投与することで、その対象者におけるがんを治療することを含む、がんの治療方法を提供する。さらなる実施形態において、当該化合物は、小胞体での小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）の過反応によって、ＥＲα陽性がんを死滅させるか、それの成長を阻害する。他の実施形態において、当該化合物は、（Ｒ）−１０５及び（Ｓ）−１０５のラセミ混合物である。他の実施形態において、ＥＲα陽性がんは、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸癌、又は子宮内膜がんである。
【００６５】
本開示はさらに、処置を必要とする対象者でのＥＲα陽性疾患の治療のための化合物の使用であって、治療上有効量の当該化合物をその対象者に投与することで、その対象者におけるがんを治療する使用を提供する。各種実施形態において、ＥＲα陽性疾患はＥＲα陽性がんである。他の実施形態において、ＥＲα陽性がんは、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸癌、又は子宮内膜がんである。別の実施形態において、当該化合物は、経口、注射、皮下、舌下、直腸、注入、静脈、皮膚吸収で、又は体腔若しくは開口部から投与される。
【００６６】
本開示は、体積、質量、パーセント、比率などの変数の範囲、限度及び逸脱を提供する。「数１」〜「数２」などの範囲が、整数及び分数を含む数の連続範囲を示唆していることは、当業者には理解される。例えば、１〜１０は、１、２、３、４、５、・・・９、１０を意味する。それはまた、１．０、１．１、１．２．１．３、・・・、９．８、９．９、１０．０も意味し、１．０１、１．０２、１．０３なども意味する。開示の変数が「数１０」より小さい数である場合、それは、上記で記載の数１０より小さい整数及び分数を含む連続範囲を示唆している。同様に、開示の変数が「数１０」より大きい数である場合、それは、上記で記載の数１０より大きい整数及び分数を含む連続範囲を示唆している。これらの範囲は、意味について上記で説明している「約」という用語によって変えることができる。
【００６７】
結果及び考察
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集システムを用いて、Ｔ４７Ｄヒト乳がん細胞における野生型ＥＲαを、転移乳がんで認められる二つの最も一般的なＥＲα変異ＥＲαＹ５３７Ｓ及びＥＲαＤ５３８Ｇで置き換えた。得られた細胞系ＴＹＳ−４（ＴＹＳとも称される）及びＴＤＧ−１（ＴＤＧとも称される）（Ｔ４７ＤＥＲαＹ５３７Ｓクローン４及びＴ４７ＤＥＲαＤ５３８Ｇクローン１）は、タモキシフェン（タモキシフェンの活性型はｚ−４−ヒドロキシタモキシフェン；ｚ−ＯＨＴである。）及びフルベストラント／ＩＣＩに対してかなりの抵抗性を示す（Ｍａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６）。
【００６８】
生存動物中のこれらの変異を有する腫瘍を視覚化するため、蛍ルシフェラーゼを安定に発現するＴＹＳ及びＴＤＧ細胞のクローン系を単離した。これらのＴＹＳ−Ｌｕｃ及びＴＹＤＧ−Ｌｕｃ細胞を含む同所性マウス腫瘍を、生物発光撮像（ＢＬＩ）によって生存動物において視覚化する。イン・ビボ撮像システム（ＩＶＩＳ）は１０，０００倍を超える検出範囲を有し、原発性腫瘍及び及び転移性腫瘍の両方の進行を視覚化するのに用いることができることから、ＩＶＩＳを用いるＢＬＩが、動物モデルでの新たな抗がん薬の効力を評価する最も先進の手法であると考えられる。他のどの大学、製薬会社及びバイオテクノロジー会社の研究チームも、ＢＬＩのための乳がんＥＲα変異及びルシフェラーゼの発現を組み合わせる細胞系を開発していない。
【００６９】
無作為高スループットスクリーニングを、ＥＲα作用を遮断する小分子について用いて、新規なＥＲαバイオモジュレータを確認した。ＢＨＰＩは、その調査から現れた第１世代の主要な小分子であった。ＢＨＰＩは、療法抵抗性ＥＲα陽性乳がん及び子宮内膜がん細胞を殺し、卵巣がん細胞の増殖を遮断する、強力なファースト・イン・クラスの非競合小分子ＥＲαバイオモジュレータである。ＢＨＰＩは、タモキシフェン及びフルベストラントと異なるＥＲα上の部位で結合し、異なる作用機序を有する。ＢＨＰＩがＥＲαを介して作用して、小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）の活性化の予想される経路の持続的な致死性過反応を誘発することが示された。細胞培養モデルにおいて、ＢＨＰＩは増殖を選択的に遮断し、療法抵抗性の乳がん、卵巣がん及び子宮内膜がん細胞を死滅させる。特に、ＢＨＰＩは、転移乳がんで確認されるＥＲα変異を発現するＴＹＳ及びＴＤＧ細胞の増殖を遮断した。
【００７０】
ＥＲα陽性乳がんのマウス異種移植モデルにおいて、妥当な用量で、ＢＨＰＩは、腫瘍増殖を停止し、急速且つかなりの腫瘍退行を誘発した。
【００７１】
４週間後のＴＹＳ−Ｌｕｃ及びＴＤＧ−Ｌｕｃ細胞を用いる異種移植試験では、媒体対照乳房腫瘍は、細胞がほぼ４倍化した。対照的に、ＢＨＰＩで処理したマウスにおける腫瘍は、９７％〜９９．５％退行を示した。
【００７２】
多様な抗がん薬に対して非常に抵抗性であるＯＶＣＡＲ−３細胞を用いる同所性卵巣がん異種移植モデルにおいて、タキサンパクリタキセルは有効ではなかった。ＢＨＰＩ単独で、腫瘍成長を強力に低減させた。特に、ＢＨＰＩ＋パクリタキセルで処理したマウスでは腫瘍な検出不能であり、循環がんバイオマーカーＣＡ１２５のレベルは次第に低下して検出できなくなった。両方の試験において、ＢＨＰＩはマウスによって良好に耐容された。
【００７３】
療法抵抗性乳がん細胞を殺す優れた能力を有する新たな化合物
合成及び評価により、療法抵抗性乳がん細胞を殺す能力においてＢＨＰＩより優れている新規化合物を確認した。ＢＨＰＩと比較して、この群における主要な化合物であるＣ−１０５は、優れた有効性及び効力を示す。
【００７４】
がん細胞を殺す改善された能力を有する化合物に関してアッセイを開発した。そのアッセイの一つは、細胞死に関する旧来の基準、色素であるトリパンブルーの取り込みによって測定される膜完全性の喪失に基づくものである。これは、トリパンブルーを取り込んだ群中の細胞のパーセントを求める装置に基づくアッセイである。トリパンブルーを取り込んだ全ての細胞は死滅する。この新規なアッセイは、開示のスクリーニング作業の流れに特有のものである。トリパンブルー取り込みが細胞死の尺度として一般に受け入れられているが、抗がん薬候補剤を調べるのに他者は使ってこなかった。細胞死を評価するのに用いたさらなるアッセイには、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）及び増殖阻害に基づくアッセイ及び場合により１００％細胞死を誘発することが知られている化合物であるラプチナールと併用した細胞数の測定などがある。
【００７５】
合成により、驚くべき結果を与える新規な構造的特徴を含む小分子が得られた。ＢＨＰＩと比較して、主要小分子であるＣ−１０５は、かなり優れた有効性及び効力を示す。特に、ＢＨＰＩとは異なり、Ｃ−１０５の活性（−）エナンチオマーは、長期細胞培養実験で１００％のＴＹＳ−Ｌｕｃ細胞を殺した。
【００７６】
さらに、現行の内分泌療法薬タモキシフェン及びフルベストラントは細胞増殖抑制性であり、ＴＹＳ及びＴＤＧ乳がん細胞を殺す能力を全く示さなかった。ＥＲα陽性乳がん細胞を効果的に殺す濃度の１０倍強高い濃度であっても標的特異性を示して、Ｃ−１０５は、いくつかのＥＲα陰性細胞系では全く効果を示さなかった。さらに、不活性（＋）エナンチオマーは、ＥＲα陽性及びＥＲα陰性細胞系において効果がなく、毒性がなかった。
【００７７】
特に、マウス異種移植片において、ちょうど３日間にわたる活性（−）Ｃ−１０５の投与後、腫瘍を破壊した。腫瘍を視覚化するためにＢＬＩを用いて、５個の腫瘍のうち４個が９９．９％超縮小（退行）し、５個全てが９９％超縮小した。７日以内に、キャリパーを用いて、５個の腫瘍全てが検出できない大きさまで縮小していた。３週間後、１匹のマウスにおける腫瘍が完全に消失し（完全退行−１００％）、残りの４匹のマウスのうち３匹における腫瘍が９９．９％超縮小した。処理を停止し、４週間待機した後の、残りのシグナルが死亡腫瘍細胞によるものか休眠腫瘍細胞によるものであるか、又は腫瘍細胞が再増殖するか否かについての長期試験で、完全に消失した（完全退行−１００％）一つの腫瘍は−１００％に留まり、他のマウスでは「微小腫瘍」再増殖は全くなかった。これは未だかつてなかった応答である。
【００７８】
−１０５の作用機序：−１０５の作用には、小胞体ストレスセンサー、小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）の致死的過反応などがあるが、それらに限定されるものではない。小胞体（ＥｎＲ）ストレスセンサー、小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）は、新たなタンパク質の合成と、細胞内でタンパク質の折り畳み及び輸送を助けるシャペロン及び他のタンパク質の利用可能性とのバランスを取るものである。予想されるＵＰＲ経路が、変性タンパク質の非存在下に活性化され、新たなタンパク質折り畳み能力の将来的必要性を予想させるものである（図３２）。
【００７９】
小胞体ストレス応答の致死性過反応を誘導するため、−１０５はがん細胞中のＥＲαに結合する。これによって、ホスホリパーゼＣγ（ＰＬＣγ）が活性化され、活性化ＰＬＣγがイノシトール三リン酸を酵素的に産生する（ＩＰ３）。ＩＰ３は、ＥｎＲ中の小胞体ＩＰ３受容体カルシウムチャンネルに結合し、それを開く。ＩＰ３Ｒカルシウムチャンネルを開くことで、小胞体の内腔（内部）に貯蔵されたカルシウムが細胞体に非常に急速に流出する。これは、ＵＰＲを過剰活性化する。活性化されると、ＵＰＲの一つのアーム、ＰＥＲＫアームが、タンパク質合成を阻害する。ＵＰＲの別のアーム、ＩＲＥ１αの活性化が、転写因子ＸＢＰ−１（ｓｐＸＢＰ−１）をコードするｍＲＮＡの活性スプライス型の形成を誘発する。カルシウム恒常性を回復するため、小胞体の膜における強力なＳＥＲＣＡポンプが、細胞体からＥｎＲ内部へのカルシウムのＡＴＰ依存性ポンピングを行う。ＩＰ３Ｒカルシウムチャンネルは開放されたままであることから、ＥｎＲの内腔にポンピングされたカルシウムは漏出する。これによって、細胞内ＡＴＰを消耗させる無益回路が作られる。
【００８０】
ＵＰＲマーカー及び阻害剤：ｓｐＸＢＰ−１  ｍＲＮＡの形成をＵＰＲ活性化に関するマーカーとして用いる。広く使用されている小分子２−ＡＰＢはＩＰ３Ｒを閉じた状態にロックし、カルシウム流出及びＵＰＲ過反応を防止する。小分子タプシガルギン（ＴＨＧ）は、ＳＥＲＣＡポンプを強力に阻害し、細胞がそれのＡＴＰ蓄えを使い切るのを防止する。
【００８１】
処理及び媒体対照マウス腫瘍試験で、ヒト乳がん細胞を操作して、転移性乳がんで認められる致死性ＥＲαＹ５３７Ｓ変異、及び蛍ルシフェラーゼの遺伝子の両方を含むようにした。適切な化学薬剤を加えると、蛍ルシフェラーゼがその化学薬剤を壊して、光が生じる。撮像システムと称される高感度検出器を用い、生存マウス体内での腫瘍を画像化することができる。これは生物発光撮像又はＢＬＩと称される。大きい腫瘍が形成された。次に、（−）−１０５を、１日１回３週間にわたり皮下に注射した。撮像システムを用い、腫瘍に対する（−）−１０５の効果をモニタリングした。同時に、（−）−１０５が溶解した媒体の腫瘍に対する効果もモニタリングした。これらの腫瘍を、試験薬剤（−）−１０５投与をしなかった以外は同じように処理した。
【００８２】
図１７の画像は、（−）−１０５で処理したマウス５匹（撮像装置は１回でマウス５匹しか撮影できない。）のうちの４匹との対照比較した、試験終了後の媒体注射対照腫瘍の一つを示すものである。表１は、腫瘍から放出された光を示す。マウス異種移植片において、（−）１０５は、大きい療法抵抗性乳房腫瘍の急速かつ広範囲の退行を誘発する。図１７における腫瘍は肉眼で見ることはできないが、露光時間及び感度をかなり上げることで、処理マウスでのわずかな数の発光細胞を撮像することができる（図３４）。
【００８３】
（−）−１０５による処理停止後に起こることを確認するため、試験を行った（表２）。その試験は、微小腫瘍が休眠状態に留まるか否か、又それらが再成長するか否かを示すように設計した。３週間の処理終了後、「微小腫瘍」と称される、ごくわずかな量の光を発する残留物がある。その撮像システムの感度に基づくと、これらの微小腫瘍がどこかで０〜約１，０００個のがん細胞を含むものと考えられ；その微小腫瘍は肉眼では見ることができないであろう。それを見るには、強力な撮像システム又は顕微鏡が必要である。これらの細胞が死んでいるか、最早分裂せずに休眠状態であるかを調べるため、処理を受けるのを停止してから２週間後及び４週間後に、その細胞を撮像した。この試験によって、増殖性がん細胞が根絶されているか否かを調べた。この試験は継続している。
【００８４】
ルシフェラーゼを用いる生物発光撮像（ＢＬＩ）は、１匹の媒体注射対照マウス及び５匹の（−）−１０５処理マウスのうちの４匹の比較撮像で、マウスにおける療法抵抗性乳房腫瘍のほぼ根絶を示している（図１７）。図１７の画像で示されているように、３週間の試験で、大きい乳房腫瘍が処理開始時に存在し、退行した。その試験は、同所性ＴＹＳ−Ｌｕｃ（注射細胞：Ｔ４７ＤＥＲαＹ５３７−Ｌｕｃヒト乳がん細胞）、例えば、転移性乳がんにおけるヒトでの最も致死性のＥＲα変異を用いて行った。腫瘍がＮＳＧマウスで成長した。さらなる詳細についてが、実施例に提供されている。
【００８５】
表１．転移性乳がんで見られる致死性ＥＲαＹ５３７Ｓ変異を発現する乳房腫瘍の生物発光撮像（ＢＬＩ）を用いる、同所性マウス異種移植腫瘍における（−）−１０５の評価
【表１】
2021529757.tif 000010
【００８６】
表２．（−）−１０５処理停止から４週間後に、微小腫瘍の再成長なし
【表２】
2021529757.tif 000011
【００８７】
試験における重要な知見により、下記のことが明らかになった。
【００８８】
（ａ）（−）−１０５は、急速且つ劇的に腫瘍を破壊した。わずか３日後、５匹全てのマウスの腫瘍が、９９％超縮小又は退行した。５個の腫瘍のうちの４個が９９．９％超縮小した。
【００８９】
（ｂ）３週間の試験終了後、１匹のマウスでは検出可能な腫瘍が全くなく（腫瘍が根絶された；約１００％）、他の４匹のマウスにおける腫瘍はほぼ根絶され、そのうちの２匹では、撮像システムが検出可能な限度に非常に近かった。
【００９０】
（ｃ）処理を停止してから２週間後、微小腫瘍が再度成長を開始していなかった。５匹のマウスのうちの２匹が検出可能な腫瘍を持たず（腫瘍が根絶された；約１００％）、２匹がごくわずかに悪化し、１匹がごくわずかに改善した。
【００９１】
（ｄ）全体的に、対照媒体処理腫瘍は成長を続けた。従って、試験薬（−）−１０５の投与のために劇的な腫瘍退行が認められた。
【００９２】
（ｅ）キャリパーを用いて腫瘍の大きさを測定したところ、５匹全てのマウスでの腫瘍が、（−）−１０５による処理のちょうど３日後に、検出できないほどに縮小した（退行）。
【００９３】
（ｆ）全体的に、（−）−１０５で処理したマウスの健康状態は良好であった。毒性なし。
【００９４】
一般的合成方法
本発明は、本発明の化合物及び組成物の製造方法に関するものでもある。その化合物及び組成物は、有機合成の適用可能な技術のいずれか、例えば本明細書に記載の技術によって製造することができる。多くのそのような技術が当業界では公知である。しかしながら、公知の技術の多くが、Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），  Ｖｏｌ．  １，  Ｉａｎ  Ｔ．  Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｈｕｙｅｎ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ，  １９７１；  Ｖｏｌ．  ２，  Ｉａｎ  Ｔ．  Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｈｕｙｅｎ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ，  １９７４；  Ｖｏｌ．  ３，  Ｌｏｕｉｓ  Ｓ．  Ｈｅｇｅｄｕｓ  ａｎｄ  Ｌｅｒｏｙ  Ｗａｄｅ，  １９７７；  Ｖｏｌ．  ４，  Ｌｅｒｏｙ  Ｇ．  Ｗａｄｅ，  Ｊｒ．，  １９８０；  Ｖｏｌ．  ５，  Ｌｅｒｏｙ  Ｇ．  Ｗａｄｅ，  Ｊｒ．，  １９８４；  ａｎｄ  Ｖｏｌ．  ６，  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｂ．  Ｓｍｉｔｈ；  ａｓ  ｗｅｌｌ  ａｓ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｔｅｘｔｓ  ｓｕｃｈ  ａｓ  Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．  ｂｙ  Ｍ．Ｂ．  Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｍａｒｃｈ  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ２００１），  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ，  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ＆  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ｉｎ  ９  Ｖｏｌｕｍｅｓ，  Ｂａｒｒｙ  Ｍ．  Ｔｒｏｓｔ，  Ｅｄ．−ｉｎ−Ｃｈｉｅｆ  （Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９３  ｐｒｉｎｔｉｎｇ）  ）；  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｐａｒｔ  Ｂ：  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃａｒｙ  ａｎｄ  Ｓｕｎｄｂｅｒｇ  （１９８３）；  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｇｒｅｅｎｅ，  Ｔ．Ｗ．，  ａｎｄ  Ｗｕｔｚ，  Ｐ．Ｇ．Ｍ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，  Ｌａｒｏｃｋ，  Ｒ．Ｃ．，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９９）で詳細に説明されている。
【００９５】
本発明の化合物の多くの例示的製造方法を下記に提供されている。これらの方法は、そのような製造の性質を説明するためのものであり、そのような製造は適用可能な範囲を限定するものではない。
【００９６】
概して、温度、反応時間、溶媒、後処理手順などの反応条件は、行われる特定の反応について当業界で一般的なものである。引用文献材料は、そこで引用されている材料とともに、そのような条件の詳細な説明を含む。代表的には、温度は−１００℃〜２００℃であり、溶媒は、要求される条件に応じて非プロトン性又はプロトン性であり、反応時間は１分〜１０日間である。後処理は代表的には、未反応試薬の失活とそれに続く水／有機層系（抽出）、そして生成物を含む層の分離からなる。
【００９７】
酸化及び還元反応は代表的には、室温（約２０℃）近くの温度で行われるが、金属水素化物還元の場合は非常に多くの場合、温度は０℃〜−１００℃まで下げる。適切な場合は、加熱を用いることもできる。溶媒は代表的には、還元の場合は非プロトン性であり、酸化の場合はプロトン性又は非プロトン性であることができる。反応時間を調節して、所望の変換を行う。
【００９８】
縮合反応は代表的には、室温付近の温度で行われるが、非平衡の速度論的に制御された縮合の場合は、低温（０℃〜−１００℃）も一般的である。溶媒は、プロトン性（平衡反応では一般的）又は非プロトン性（速度論的に制御された反応では一般的）であることができる。反応副生成物の共沸除去及び無水反応条件（例えば、不活性ガス環境）の使用などの標準的な合成技術は当業界で一般的であり、適用可能な場合に用いられる。
【００９９】
保護基。「保護基」という用語は、ヒドロキシ又は他のヘテロ原子に結合している時には、望ましくない反応がこの基で起こるのを防止し、従来の化学的若しくは酵素的段階によって除去してヒドロキシル基を再生することができる基を指す。使用される特定の除去可能な保護基は常に必須とは限らず、好ましい脱離可能なヒドロキシル保護基には、従来の置換基、例えばアリル、ベンジル、アセチル、クロロアセチル、チオベンジル、ベンジリデン、フェナシル、メチルメトキシ、シリルエーテル（例えば、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、ｔ−ブチル−ジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）、又はｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＳ））及びヒドロキシル官能基に化学的に導入可能であり、後で生成物の性質と適合する温和な条件で化学的若しくは酵素的方法によって選択的に除去される他の基などがある。
【０１００】
好適なヒドロキシル保護基は当業者には公知であり、Ｔ．Ｗ．  Ｇｒｅｅｎｅ，  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  Ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；  Ｗｉｌｅｙ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８１  （″Ｇｒｅｅｎｅ″）及びそこで引用の参考文献、並びにＫｏｃｉｅｎｓｋｉ，  Ｐｈｉｌｉｐ  Ｊ．；  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  （Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ  Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９４）［これらはいずれも、参照によって本明細書に組み込まれる。］でより詳細に開示されている。
【０１０１】
保護基は、利用可能であり、一般に公知で使用されており、合成手順中、即ち本発明の方法によって当該化合物を製造する経路若しくは方法中の保護基との副反応を防止するのに任意に使用される。ほとんどの場合、保護を行う場合に、どの基を保護するかに関する決定、及び化学保護基「ＰＧ」の性質は、（例えば、酸性条件、塩基性条件、酸化条件、還元条件その他の条件）に対して保護される反応の化学及び所期の合成の方向性によって決まる。
【０１０２】
図式１：（＋）１０５及び（−）１０５の合成
【化８】
2021529757.tif 000012
【０１０３】
図式２：化合物１〜６の合成のための一般的合成経路
【化９】
2021529757.tif 000013
【０１０４】
図式３：化合物７及び８の合成
【化１０】
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【０１０５】
図式１〜３は、図式４における化合物などの本明細書で開示の化合物の一般的合成を示している。詳細な実験条件は実施例で提供されている。
【０１０６】
図式４：図式１〜３によって製造される合成化合物の構造
【化１１】
2021529757.tif 000015
【０１０７】
がん細胞死滅アッセイの基礎
トリパンブルー：数十年間、色素トリパンブルーを排除する能力によって、生存細胞が測定されてきた。無傷の膜を有する細胞は、トリパンブルーを取り込まない。膜の完全性を失っている死んだ細胞は、色素を取り込んで青色である。従って、死んだ細胞のパーセントは、総細胞集団からのトリパンブルー陽性である細胞のパーセントである。トリパンブルー取り込みの定量的評価は、Ｆｉｓｈｅｒからの細胞カウンターを用いる。そのアッセイは機器に基づくものであることから、トリパンブルー陽性細胞のパーセント測定において観察者バイアスがない。
【０１０８】
アラマーブルー／ラプチナールアッセイ：生存細胞は、還元環境を維持する。アラマーブルー（登録商標）（レザズリン）の非蛍光性細胞透過性成分が細胞によって取り込まれる。生存細胞では、それは還元されて蛍光性化合物レゾルフィンとなる。細胞数対蛍光の標準曲線を用いて、試験サンプル中の生存細胞数を求めることができる。高濃度では、ラプチナールは１００％の細胞を殺す。試験化合物を溶解させた媒体には毒性はない。従って、培地のみについてのブランクを引いた後、媒体についての蛍光読み取り値は、１００％生存細胞に相当し、ラプチナールについてのシグナルは０％生存細胞に相当する。このアッセイはトリパンブルーアッセイと比較して細胞死の直接測定を提供するものではないが、かなり多数のサンプルまで規模拡大することがより容易である。
【０１０９】
フローサイトメトリー（ＦＩＴＣ）：死にかけている細胞は、蛍光活性化細胞分別機（ＦＡＣＳ）を用いてモニタリングすることができる固有の変化を示す。一つのそのような変化は、細胞膜極性の喪失である。これは、アネキシンＶを用いてモニタリングされる。死にかけている細胞も、色素ヨウ化プロピジウムを取り込む。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）は、ＤＮＡ中に挿入されると蛍光を発する。これらのアッセイは、細胞死の特定の段階の細胞をモニタリングする。例えば、死んでいてＤＮＡが破壊されており、最早ＰＩを取り込まないほどの小片状態である細胞は死んでいるが、最早ＰＩ陽性とは見られない。
【０１１０】
アッセイの実施及び条件
トリパンブルーアッセイ：アッセイは、６ウェルプレートでの細胞について行う：３００，０００細胞を、６ウェルプレートの各ウェルで、培地３ｍＬ中に蒔く。２４時間後、ＤＭＳＯ媒体又は指定の化合物を加える（体積の１／１０００）。細胞をさらに２４時間インキュベートし、次にトリプシン０．２５ｍＬ中に回収し、培地０．７５ｍＬによって回収する。細胞を遠心下降させ、細胞ペレットの上にある残った培地１００〜２００μＬに再懸濁させる（ピペットで数回上下させることで細胞を再懸濁させる）。トリパンブルー１０μＬに１０μＬを加える。次に、１０μＬをカウントスライドに挿入する。スライドをＦｉｓｈｅｒ  ＴＣ２０に挿入した後は、カウントは自動的である（トリパンブルー陽性：トリパンブルー陰性細胞の正確な比率には、機器カウントの視野に細胞約２００個が必要であることから、これらの多くの細胞が必要である。）。
【０１１１】
アラマーブルーラプチナールアッセイ：細胞を、通常は培地５０μＬ中、４，０００〜１０，０００細胞／ウェル（９６ウェルプレート）で蒔く。約１８時間後、所望の最終濃度の２倍濃度の試験化合物（Ｃ−１０５）を含む追加の培地５０μＬを各ウェルに加えた。２４時間後、アラマーブルー試薬を加え、ウェルにおける蛍光を読み取った（ＢＭＧ  ＰｈｅｒａＳｔａｒ又は  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  Ｍ３  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ）。相対死滅％を、ラプチナール処理細胞についての読み取り値を１００％死亡細胞に設定し、媒体処理細胞についての読み取り値を０％死亡細胞に設定することで求めた。
【０１１２】
フローサイトメトリー（ＦＩＴＣ）アッセイ：細胞を、１２ウェルプレートに、７５，０００細胞／ウェルで接種し、終夜付着させた。翌日、指定濃度のラプチナール（陽性対照）、（−）−１０５、（±）−１０５、及び（＋）−１０５を加え、３７℃で２４時間インキュベートした（最終体積：１ｍＬ、０．１％ＤＭＳＯ）。インキュベーション後、細胞を回収し、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ及びＰＩ色素と前混合した冷アネキシン結合緩衝剤（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）３５０μＬに再懸濁させた。サンプルをＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで分析し、データ解析を、ＦＳＣ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ５−６を用いて行った。細胞死を、ＤＭＳＯ処理対照との比較で評価した。
【０１１３】
治療標的に使用される細胞系：ＥＲα陽性乳がん細胞
ＴＤＧ及びＴＤＧ−ＬＵＣ（Ｔ４７ＤＥＲαＤ５３８Ｇクローン１）：転移性乳がんで見られるＥＲαＤ５３８Ｇ変異で置き換わった野生型ＥＲα遺伝子の両コピー。これらの細胞はエストロゲンなしで増殖し、エストロゲンを加えても増殖速度はかなりわずかしか上昇しない。ｚ−ＯＨＴ（タモキシフェンの活性型）及びフルベストラント／／フェソロデックス／ＩＣＩ１８２，７８０に対する実質的な抵抗性。ＥＲαＹ５３７Ｓ細胞より、ｚ−ＯＨＴ及びフルベストラント／ＩＣＩに対する抵抗性が若干低い。ＥＲαＤ５３８Ｇは、転移性乳がんで単一の最も一般的な変異である。従って、これらの細胞は試験には必須である。（ＴＤＧ−ＬＵＣ）蛍ルシフェラーゼを発現するように安定にトランスフェクションされたＴＤＧ細胞。ルシフェラーゼ遺伝子の転写は、構成的に活性なＣＭＶプロモーターによって駆動される。
【０１１４】
ＴＹＳ及びＴＹＳ−ＬＵＣ（Ｔ４７ＤＥＲαＹ５３７ＳＣＬＯＮＥ４）：転移性乳がんで見られるＥＲαＹ５３７Ｓ変異で置き換わった野生型ＥＲα遺伝子の両コピー。エストロゲンなしでの急速な増殖。エストロゲンによる追加的な増殖刺激なし。ｚ−ＯＨＴ及びフルベストラント／ＩＣＩに対する実質的な抵抗性。ＥＲαＤ５３８Ｇ細胞より、現行薬剤に対して若干抵抗性が高い。これは、転移性乳がんにおける最も致死性の変異である。（ＴＹＳ−Ｌｕｃ）蛍ルシフェラーゼを発現するように安定にトランスフェクションされたＴＹＳ細胞。ルシフェラーゼ遺伝子の転写は、構成的に活性なＣＭＶプロモーターによって駆動される。
【０１１５】
Ｔ４７Ｄ：ＥＲα陽性、増殖するのにエストロゲンを必要とし、ｚ−ＯＨＴ及びフルベストラント／ＩＣＩに対して感受性；親細胞系、広く使用されるが、ＭＣＦ−７細胞ほど一般的ではない。ＭＣＦ−７細胞と比較して低いＴ４７Ｄ細胞でのＥＲαレベルが、実際の乳がんにおけるＥＲαレベルとの一致性が高い。一つには、Ｔ４７Ｄ細胞が、変異ＥＲαを発現する二つの細胞系より、増殖阻害及び殺滅を行うのにより高いＢＨＰＩ濃度を必要とすることから、Ｔ４７Ｄ細胞を調べた。
【０１１６】
ＭＣＦ−７（Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ−７）：ＥＲα陽性、最も広く使用されるＥＲα陽性乳がん細胞系。エストロゲンはそれの増殖を非常に刺激する；ｚ−ＯＨＴ及びフルベストラント／ＩＣＩに対して感受性。
【０１１７】
ＥＣＣ−１：ＥＲα陽性子宮がん細胞。
【０１１８】
Ｃａｏｖ３：薬剤抵抗性ＥＲα陽性卵巣がん細胞。ＢＨＰＩはＣａｏｖ−３細胞の増殖を遮断するが、それを殺すわけではない。これらの細胞は、タモキシフェン及びフルベストラントに対して完全に抵抗性であり、シスプラチン及びパクリタキセルに対して部分的に抵抗性である。
【０１１９】
毒性及びオフターゲット効果を調べるのに用いられるＥＲα陰性細胞
ＨｅＬａ：これは、子宮頸起源のＥＲα陰性細胞である。最も広く使用されるヒト細胞系。
【０１２０】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞：これは、ＥＲα陰性細胞であり、トリプルネガティブ乳がんの最も一般的なモデルである。非常に転移性が高い。この細胞は、この試験では、ほとんどの他の細胞系と比較して、非特異的増殖阻害に対して感受性が高いことから使用される。従って、それは、非特異的毒性についての厳しい試験である。
【０１２１】
ＭＣＦ−１０Ａ（Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ−１０Ａ）：不死性であるが腫瘍形成性ではないＥＲα陰性乳腺細胞系。
【０１２２】
統計学
別段の断りがない限り、各サンプル少なくとも３回の生物反復実験がある（ｎ＝３）。データは、反復実験±Ｓ．Ｅ．Ｍの平均として表される。同じ濃度の１０５、ＢＨＰＩ、又は他の化合物で処理した細胞との比較で、媒体で処理した細胞について比較を行い、その場合に、いずれもスチューデントｔ検定を用いてＰ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【０１２３】
医薬製剤
本明細書に記載の化合物を用いて、例えば、その化合物を薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、又は担体と組み合わせることで、治療用医薬組成物を調製することができる。その化合物は、塩又は溶媒和物の形態で担体に加えることができる。例えば、化合物が十分に塩基性若しくは酸性であって安定な無毒性の酸塩若しくは塩基塩を形成する場合に、塩としての化合物の投与が適切である場合がある。薬学的に許容される塩の例には、生理的に許容されるアニオンを形成する酸と形成される有機酸付加塩、例えば、トシル酸塩、メタンスルホン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、マロン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、α−ケトグルタル酸塩及びβ−グリセロリン酸塩がある。好適な無機塩を形成することもでき、例えば塩酸塩、ハライド、硫酸塩、硝酸塩、重炭酸塩、及び炭酸塩などがある。
【０１２４】
薬学的に許容される塩は、当業界で公知の標準的な手順を用いて、例えばアミンなどの十分に塩基性の化合物を好適な酸と反応させて生理的に許容されるイオン性化合物を提供することで得ることができる。カルボン酸のアルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウム又はリチウム）又はアルカリ土類金属（例えば、カルシウム）塩も、類似の方法によって製造することができる。
【０１２５】
本明細書に記載の式の化合物は、医薬組成物として製剤し、各種形態でヒト患者などの哺乳動物宿主に投与することができる。それらの形態は、選択される投与経路、例えば、経口若しくは非経口糖投与、静脈、筋肉、局所若しくは皮下経路によって個別に調整することができる。
【０１２６】
本明細書に記載の化合物は、薬学的に許容される媒体、例えば不活性希釈剤又は吸収可能な食用担体と組み合わせて全身投与することができる。経口投与のため、化合物を、硬若しくは軟シェルゼラチンカプセルに封入、錠剤に圧縮、又は患者の食事に直接組み込みすることができる。化合物は、１以上の賦形剤と組みあわせ、摂取可能な錠剤、口腔錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウェハなどの形態で使用することもできる。そのような組成物及び製剤は代表的には、少なくとも０．１％の活性化合物を含む。その組成物及び製剤のパーセントは変動可能であり、簡便には所与の単位製剤の重量の約０．５％〜約６０％、約１％〜約２５％、又は約２％〜約１０％であることができる。そのような治療的に有用な組成物中の活性化合物の量は、有効用量レベルを得ることができるようなものであることができる。
【０１２７】
錠剤、トローチ、丸薬、カプセルなども、次のもの：トラガカントガム、アカシア、コーンスターチ又はゼラチンなどの結合剤；リン酸二カルシウムなどの賦形剤；コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸などの崩壊剤；及びステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤のうちの１以上を含むこともできる。ショ糖、果糖、乳糖又はアスパルテームなどの甘味剤；又はペパーミント、冬緑油又はチェリー香料などの香味剤を加えることができる。単位製剤がカプセルである場合、それは、上記の種類の材料に加えて、液体担体、例えば植物油又はポリエチレングリコールを含むことができる。各種他の材料が、コーティングとして、又は固体単位製剤の物理形態を他の形で改変するために存在することができる。例えば、錠剤、丸薬又はカプセルを、ゼラチン、ロウ、セラック又は糖などでコーティングすることができる。シロップ又はエリキシル剤は、活性化合物、甘味剤としてのショ糖若しくは果糖、保存剤としてのメチル及びプロピルパラベン、色素並びにチェリー若しくはオレンジフレーバーなどの香味剤を含むことができる。単位製剤を調製するのに用いられる材料は、医薬として許容され、使用される量で実質的に無毒性でなければならない。さらに、活性化合物を徐放製剤及び機器に組み込むことができる。
【０１２８】
活性化合物は、注入若しくは注射によって静脈投与又は腹腔内投与することができる。活性化合物又はそれの塩の溶液は、任意に無毒性界面活性剤と混合して水中で調製することができる。分散液は、グリセリン、液体ポリエチレングリコール類、トリアセチン若しくはそれらの混合物中、又は薬学的に許容されるオイル中で調製することができる。貯蔵及び使用の通常の条件下で、製剤には保存剤を含有させて、微生物の増殖を防止することができる。
【０１２９】
注射又は注入に好適な医薬製剤は、任意にリポソームにカプセル封入して、無菌注射用若しくは注入用溶液若しくは分散液の即時調製製剤用に調整した有効成分を含む、無菌の水溶液、分散液又は無菌粉剤などがあり得る。最終的な製剤は、製造及び貯蔵の条件下で無菌、流体及び安定でなければならない。液体の担体又は媒体は、例えば、水、エタノール、多価アルコール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール類など）、植物油、無毒性グリセリルエステル、及びこれらの好適な混合物を含む溶媒若しくは液体分散媒であることができる。例えば、リポソームの形成により、分散液の場合の必要な粒径の維持によって、又は界面活性剤を用いることで適切な流動性を維持することができる。微生物の作用の防止は、各種抗細菌剤及び／又は抗真菌剤、例えばパラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって行うことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖類、緩衝剤、又は塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射組成物の長期吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及び／又はゼラチンによって行うことができる。
【０１３０】
無菌注射溶液は、必要に応じて上記で挙げた各種他の成分とともに、必要な量の活性化合物を適切な溶媒中に組み込み、任意に、その後にフィルター滅菌することで調製することができる。無菌注射溶液を調製するための無菌粉末の場合、調製方法は、溶液中に存在する有効成分＋いずれか別の所望の成分の粉末を与える真空乾燥及び凍結乾燥技術を含むことができる。
【０１３１】
局所投与の場合、化合物は、例えばそれが液体である場合、純粋な形態で用いることができる。しかしながら、例えば、固体、液体、ゲル等であることができる皮膚科学的に許容される担体と組み合わせて、組成物若しくは製剤として皮膚に活性薬剤を投与することが望ましい。
【０１３２】
有用な固体担体には、タルク、クレー、微結晶セルロース、シリカ、アルミナなどの微粉砕固体などがある。有用な液体担体には、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アルコール類、グリコール類、又は水−アルコール／グリコール混合物などがあり、それには、任意に無毒性界面活性剤を用いて化合物を有効なレベルで溶解若しくは分散させることができる。芳香剤及び別の抗微生物剤などの補助剤を加えて、所与の用途のための特性を至適化することができる。得られた液体組成物を、吸収パッドから使用するか、救急絆及び包帯に含浸させるのに使用するか、ポンプ型又はエアロゾル噴霧器を用いて患部に噴霧することができる。
【０１３３】
合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸の塩及びエステル、脂肪アルコール、変性セルロース、又は変性無機材料などの増粘剤も液体担体とともに用いて、ユーザーの皮膚への直接塗布のための塗りペースト、ゲル、軟膏、ソープなどを形成することもできる。
【０１３４】
活性剤を皮膚の送達するための皮膚科組成物の例は当業界で公知であり；例えば、米国特許第４，９９２，４７８号（Ｇｅｒｉａ）、同４，８２０，５０８号（Ｗｏｒｔｚｍａｎ）、同４，６０８，３９２号（Ｊａｃｑｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．）、及び同４，５５９，１５７号（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．）を参照する。そのような皮膚科組成物は、本明細書に記載の化合物と組み合わせて用いることができ、その場合、そのような組成物の成分は、本明細書に記載の化合物によって置き換えても良く、又は本明細書に記載の化合物を組成物に加えることができる。
【０１３５】
本明細書に記載の化合物の有用な用量は、それらのイン・ビトロ活性及び動物モデルでのイン・ビボ活性を比較することで決定することができる。マウス及び他の動物における有効用量のヒトへの外挿方法は当業界で公知であり；例えば、米国特許第４，９３８，９４９号（Ｂｏｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）を参照する。治療に使用するのに必要な化合物、又はそれの活性塩若しくは誘導体の量は、選択される特定の化合物若しくは塩に応じてだけでなく、投与経路、治療される状態の性質、及び患者の年齢及び状態に応じても変動するものであり、最終的には担当の医師若しくは臨床関係者の裁量によるものである。
【０１３６】
しかしながら、通常、好適な用量は、約０．５〜約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約１０〜約７５ｍｇ／ｋｇ／日、例えば３〜約５０ｍｇ／被投与者体重ｋｇ／日の範囲、好ましくは６〜９０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲、最も好ましくは１５〜６０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。
【０１３７】
当該化合物は簡便には、単位製剤で製剤され；例えば、５〜１０００ｍｇ、簡便には１０〜７５０ｍｇ、最も簡便には５０〜５００ｍｇの有効成分／単位製剤を含む。１実施形態において、本発明は、そのような単位製剤で製剤された本発明の化合物を含む組成物を提供する。
【０１３８】
当該化合物は、簡便には、例えば、５〜１０００ｍｇ／ｍ２、簡便には１０〜７５０ｍｇ／ｍ２、最も簡便には５０〜５００ｍｇ／ｍ２の有効成分／単位製剤を含む単位製剤で投与することができる。所望の用量は、簡便には、単一用量で、又は適切な間隔で投与される分割用量として、例えば、２、３、４若しくはそれ以上の部分用量／日として提供することができる。その部分用量自体を、さらに、例えば多くの個別の緩く間隔を設けた投与に分割することができる。
【０１３９】
所望の用量は簡便には、単一用量で、又は適切な間隔で投与される分割用量として、例えば、２、３、４若しくはそれ以上の部分用量／日として提供することができる。その部分用量自体を、さらに、例えば多くの個別の緩く間隔を設けた投与に分割することができ；例えば、吸入器からの複数回の吸入、又は眼球への複数の液滴の投与によるものとすることができる。
【０１４０】
本明細書に記載の化合物は、有効な抗腫瘍剤であり、ＢＨＰＩと比較して高い効力及び／又は低い毒性を有することができる。好ましくは、本発明の化合物は、ＢＨＰＩより強力であり、毒性が低く、及び／又はＢＨＰＩの場合に生じる可能な異化代謝部位を回避する、即ち、ｈＢＨＰＩとは異なる代謝プロファイルを有する。
【０１４１】
本発明は、哺乳動物におけるがんの治療方法であって、がんを有する哺乳動物に、有効量の本明細書に記載の化合物若しくは組成物を投与する方法を提供する。哺乳動物には、霊長類、ヒト、齧歯類、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ヤギ、ウシなどがある。がんは、各種の悪性腫瘍、例えば、結腸がん、乳がん、メラノーマ及び白血病を指し、概して、望ましくない細胞増殖、例えば制御されない増殖、分化の欠如、局所組織侵襲及び転移を特徴とする。
【０１４２】
本発明の化合物ががんを治療する能力は、当業界で公知のアッセイを用いることで確認することができる。例えば、治療プロトコールの設計、毒性評価、データ解析、腫瘍細胞死滅の定量、及び移植可能な腫瘍スクリーニング使用の生物学的意義は公知である。さらに、化合物ががんを治療する能力は、下記に記載の試験を用いて決定することができる。
【０１４３】
下記の実施例は、上記の発明を説明することを目的としたものであり、それの範囲を狭めるものと解釈されるべきではない。当業者は、その実施例が、本発明を実施することができると考えられる多くの他の方途を提言するものであることは、当業者には容易に理解されよう。理解すべき点として、本発明の範囲内に留まりながら、多くの変形及び改変を行うことが可能である。
【０１４４】
実施例
実施例１．合成手順
一般情報：別段の断りがない限り、全ての試薬が商業的入手先から購入し、それ以上の乾燥や精製をせずに用いた。本明細書において使用される溶媒は、活性化アルミナカラムを通すことで脱水した。全ての反応を、火炎乾燥したガラス容器中、陽圧の窒素ガス下に行った。１Ｈ  ＮＭＲ及び１３Ｃ  ＮＭＲ実験は、それぞれ５００ＭＨｚ及び１８８ＭＨｚでＢｒｕｋｅｒ冷凍器で行った。ＣＤ３ＯＤで得られたスペクトラムは、１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲスペクトラムそれぞれについて３．３１ｐｐｍ及び４９．００ｐｐｍを基準とした。ＮＭＲ多重度は、ｓ＝一重線、ｄ＝二重線、ｔ＝三重線、ｑ＝四重線、ｍ＝多重線と報告される。１３Ｃ多重度は、別段の注記がない限り、全て一重線である。
【化１２】
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【０１４５】
手順Ａ：丸底フラスコに所望のフェニルブロミド（３．０８ｍｍｏｌ）を入れ、ＴＨＦ（３．０ｍＬ）に溶かした。反応混合物を冷却して−７８℃とし、ｎ−ＢｕＬｉの溶液（２．７７ｍｍｏｌ、１．７ｍＬ）を１０分間かけて滴下した。反応液を１時間攪拌した。別のフラスコ中、所望のイサチン（１．５４ｍｍｏｌ）を加え、ＴＨＦ（９．４ｍＬ）に溶かした。このイサチンの溶液を、１０分間かけて反応容器に加えた。得られた混合物を−７８℃で１時間攪拌し、昇温させて室温とし、１時間攪拌した。水（１０ｍＬ）で反応停止した。溶液を酢酸エチルで抽出し（３回）、合わせた有機層を硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、減圧下に濃縮した。得られた油状物をシリカ層に通した（溶離溶媒勾配：１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンから１００％ＥｔＯＡｃ）。溶離した化学種を丸底フラスコに入れ、空気でパージし、窒素雰囲気下に置き、ＴＨＦ（１５．４ｍＬ）に溶かした。フッ化テトラ−ｎ−ブチルの溶液（５．４ｍＬ）を反応容器に加えた。１６時間攪拌後、飽和塩化アンモニウム水溶液：水の１：１溶液（３０ｍＬ）で反応停止した。溶液を酢酸エチルで抽出し（３回）、合わせた有機層を硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、減圧下に濃縮した。得られた油状物を、カラムクロマトグラフィーによって精製した。
【化１３】
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【０１４６】
手順Ｂ：丸底フラスコに所望のフェニルブロミド（３．３５ｍｍｏｌ）を入れ、ＴＨＦ（２．８ｍＬ）に溶かした。反応混合物を冷却して−７８℃とし、ｎ−ＢｕＬｉの溶液（２．７９ｍｍｏｌ、１．８ｍＬ）を１０分間かけて滴下した。反応液を１時間攪拌した。別のフラスコ中、所望のイサチン（１．８６ｍｍｏｌ）を加え、ＴＨＦ（５．６ｍＬ）に溶かした。イサチンのこの溶液を、反応容器に１０分間かけて滴下した。得られた混合物を−７８℃で１時間攪拌し、昇温させて室温とし、１時間攪拌した。水（１０ｍＬ）で反応停止した。その溶液を酢酸エチルで抽出し（３回）、合わせた有機層を硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、減圧下に濃縮した。得られた油状物をシリカ層に通した（溶離溶媒勾配：１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンから１００％ＥｔＯＡｃ）。
【化１４】
2021529757.tif 000018
【０１４７】
手順Ｃ：丸底フラスコに所望の三級アルコール（０．９３ｍｍｏｌ）及び所望のフェノール（４．２ｍｍｏｌ）を入れ、ジクロロメタン（４．７ｍＬ）に溶かした。反応混合物を氷浴に入れ、トリフ酸（ＴｆＯＨ、０．４２ｍＬ）を滴下した。反応容器を氷浴から外し、室温で１時間攪拌した。反応混合物を氷を入れた重炭酸ナトリウムに投入し、その水溶液を酢酸エチルで抽出した（３回）。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、減圧下に濃縮した。得られたオイルをカラムクロマトグラフィーによって精製した。
【化１５】
2021529757.tif 000019
【０１４８】
３−ヒドロキシ−３−（４−ヒドロキシフェニル）−７−メチルインドリン−２−オン（１）：一般手順Ａを用いて、１を２段階で収率４５％で単離した。
【０１４９】
1H NMR (CD3OD, 500 MHz): δ 7.19 (d, J = 8.86 Hz 2H), 7.10 (d, J = 7.59 Hz 1H), 7.02 (d, J = 7.46 Hz 1H), 6.96 (dd, J = 7.54 Hz, 7.49 Hz 1 H), 6.71 (d, J = 8.72 Hz 2H), 2.29 (s, 3 H).
13C NMR (CD3OD, 188MHz): δ 182.20, 158.40, 141.39, 134.47, 132.71, 131.78, 128.23, 123.86, 123.48, 121.00, 115.93, 79.17, 16.58.
【化１６】
2021529757.tif 000020
【０１５０】
３−（４−ヒドロキシフェニル）−３−（４−メトキシフェニル）−７−メチルインドリン−２−オン（２）：一般手順Ｃを用いて、２を収率８３％で単離した。
【０１５１】
1H NMR (CD3OD, 500 MHz) δ: 7.12 (d, J = 8.93 Hz, 2H), 7.02 (m, 3H), 6.94 (m, 2H), 6.82 (d, J = 6.82 Hz, 2H), 6.69 (d, J = 8.74 Hz), 3.74 (s, 3H), 2.30 (s, 3H).
13C NMR (CD3OD, 188 MHz) δ: 182.87, 160.24, 157.71, 140.70, 135.73, 135.65, 134.26, 130.58, 130.54, 130.38, 124.48, 123.51, 121.02, 116.02, 114.64, 63.36, 55.67, 16.81.
HRMS (ESI): m/z C22H20NO3 [M+H]+の計算値:346.1443, 実測値: 346.1442.
【化１７】
2021529757.tif 000021
【０１５２】
３−ヒドロキシ−３−（４−ヒドロキシフェニル）−７−（トリフルオロメチル）インドリン−２−オン（３）：一般手順Ａを用いて、３を２段階で収率３５％で単離した。
【０１５３】
1H NMR (CD3OD, 500 MHz) δ:  7.54 (m, 1H), 7.43 (d, J = 7.49Hz 1H), 7.19 (m, 3H), 6.74 (d, J  = 8.74 Hz, 2H).
13C NMR (CD3OD, 188MHz) δ: 181.60, 158.73, 140.54 (q, J = 2.25 Hz), 136.85, 131.80, 129.89, 128.89, 126.90 (q, J = 4.6 Hz), 125.16 (q, J = 270.76 Hz), 123.74, 116.16, 113.56 (q, J = 33.17 Hz), 77.66.
【化１８】
2021529757.tif 000022
【０１５４】
３−（４−ヒドロキシフェニル）−３−（４−メトキシフェニル）−７−（トリフルオロメチル）インドリン−２−オン（４）：一般手順Ｃを用いて、４を収率８２％で単離した。
【０１５５】
1H NMR (CD3OD, 500 MHz) δ: 7.50 (dd, J = 8.09 Hz, 0.62 Hz, 1H), 7.40 (dd, J = 7.76 Hz, 0.64 Hz, 1H), 7.18 (ddd, J = 8.08 Hz, 7.46 Hz, 0.87 Hz, 1H), 7.12 (d, J = 8.87 Hz, 2H), 7.01 (d, J = 8.76 Hz, 2H), 6.86 (d, J = 8.87 Hz, 2H), 6.72 (d, J = 8.75 Hz 2H), 3.77 (s, 3H).
13C NMR (CD3OD, 188 MHz) δ: 182.24, 160.55, 158.10, 139.74 (m), 137.85, 134.73, 133.30, 130.98, 130.50, 130.49, 125.72 (q, J = 4.6 Hz, 125.23 (q, J = 270.71 Hz), 123.32, 116.27, 114.89, 113.55 (q, J = 33.50Hz), 62.12, 55.72.
HRMS (ESI): m/z C22H17NO3F3 [M+H]+の計算値:400.1161, 実測値: 400.1154.
【化１９】
2021529757.tif 000023
【０１５６】
３−ヒドロキシ−７−メチル−３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）インドリン−２−オン（５）：一般手順Ｂを用いて、５を２段階で収率６８％で単離した。
【０１５７】
1H NMR (CD3OD, 500 MHz) δ: 7.46 (d, J = 8.83 Hz 2H), 7.22 (dd, J = 1.02 Hz, 8.98 Hz, 2H), 7.13 (m, 1H), 6.98 (m, 2H), 2.31 (s, 3H).
13C NMR (CD3OD, 188 MHz) δ: 181.41, 150.1 (q, J = 1.6Hz), 141.55, 141.46, 134.03, 132.19, 128.67, 124.13, 123.4, 121.90 (q, J = 255.61 Hz), 121.32, 79.04, 16.61.
【化２０】
2021529757.tif 000024
【０１５８】
３−（４−ヒドロキシフェニル）−７−メチル−３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）インドリン−２−オン（６）：一般手順Ｃを用いて、６を収率５９％で単離した。
【０１５９】
1H NMR (CD3OD, 500 MHz) δ:  7.30 (d, J = 8.86Hz 2H), 7.20 (m, 2 H), 7.08 (m, 1H), 7.03 (d, J = 8.74 Hz, 2H), 6.99 (m, 2H), 6.72 (d, J = 8.73 Hz, 2H), 2.31 (s, 3H).
13C NMR (CD3OD, 188 MHz) δ: 182.00, 158.02, 149.56 (q, J = 1.47 Hz), 143.12, 140.82, 134.85, 133.55, 131.22, 130.77, 130.56, 124.51, 123.73, 121.89 (q, J = 255.61 Hz), 121.78, 121.32, 116.23, 63.49, 16.82.
HRMS (ESI): m/z C22H17NO3F3 [M+H]+の計算値: 400.1161, 実測値: 400.1163.
【化２１】
2021529757.tif 000025
【０１６０】
３−（４−ヒドロキシフェニル）−３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−７−（トリフルオロメチル）インドリン−２−オン（（±）−１０５）の合成：丸底フラスコに１−ブロモ−４−（トリフルオロメトキシ）ベンゼン（３．０８ｍｍｏｌ）を入れ、ＴＨＦ（３．０ｍＬ）に溶かした。反応混合物を冷却して−７８℃とし、ｎ−ＢｕＬｉの溶液（２．７７ｍｍｏｌ、１．７ｍＬ）を１０分間かけて滴下した。反応液を１時間攪拌した。別のフラスコ中、所望のイサチン（１．５４ｍｍｏｌ）を加え、ＴＨＦ（９．４ｍＬ）に溶かした。このイサチンの溶液を１０分間かけて反応容器に滴下した。得られた混合物を−７８℃で１時間攪拌し、昇温させて室温とし、１時間攪拌した。水（１０ｍＬ）で反応停止した。その溶液を酢酸エチルで抽出し（３回）、合わせた有機層を硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、減圧下に濃縮した。新たな丸底フラスコに粗三級アルコール及びフェノール（６．９５ｍｍｏｌ）を入れ、ジクロロメタン（７．７ｍＬ）に溶かした。反応混合物を氷浴に入れ、トリフ酸（ＴｆＯＨ、０．７ｍＬ）を滴下した。反応容器を氷浴から外し、室温で１時間攪拌した。反応混合物を、氷を入れた重炭酸ナトリウムに投入し、その水溶液を酢酸エチルで抽出した（３回）。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、減圧下に濃縮した。得られた油状物をカラムクロマトグラフィーによって精製した。（±）−１０５を、２合成段階で収率５０％で単離した。
【０１６１】
1H NMR (CD3OD, 500 MHz) δ: 7.54 (d, J = 7.95 Hz, 1H), 7.45 (d, J = 7.48 Hz, 1H), 7.31 (d, J = 8.91 Hz 2 H), 7.22 (m, 3H), 7.03 (d, J = 8.85 Hz, 2H), 6.75 (d, J = 8.80 Hz, 2H).
13C NMR (CD3OD, 188 MHz) δ: 181.35, 158.37, 149.81 (q, J = 1.78 Hz), 142.17, 139.84 (q, J = 2.29 Hz), 136.92, 132.65, 131.22, 131.06, 130.48, 126.12 (q, J = 4.58 Hz), 125.15 (q, J = 270.89 Hz), 123.55,121.88 (q, J = 255.84 Hz),122.01, 116.48, 113.77 (q, J = 33.32Hz), 62.22.
HRMS (ESI): m/z C22H14NO3F6 [M+H]+の計算値: 454.0878, 実測値: 454.0878.
（±）−１０５のキラル分離：（±）−１０５を、分取キラルＨＰＬＣ分離（Ｌｕｘ（登録商標）  ５μＭセルロース−１、ＬＣカラム、２５０×２１．２ｍｍ、ＡＸＩＡ（登録商標）充填、定組成：７％ｉ−ＰｒＯＨ／ヘキサン）を用いて、それの個々のエナンチオマーに分離した。回収した分画から、（−）−１０５（ピークＡ）及び（＋）−１０５（ピークＢ）が得られた：図５。このキラル分離方法によって、（−）−１０５が白色固体として（エナンチオマー純度＝＞９９％、５８９［α］ＣＨＣｌ３＝−１４．６゜（±０．１゜））、そして（＋）−１０５が白色固体として（エナンチオマー純度＝約９８〜９９％、５８９［α］ＣＨＣｌ３＝−１３．８゜（±０．１゜））得られる（実施例４参照）。エナンチオマー純度測定を、分析キラルＨＰＬＣカラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ（登録商標）ＩＢ−３（粒径３μＭ、寸法：４．６ｍｍ×１００ｍｍ、分離方法、定組成７．５％ｉ−ＰｒＯＨ／ヘキサン）によって行った（図６〜８）。
【化２２】
2021529757.tif 000026
【０１６２】
６−クロロ−３−ヒドロキシ−７−メチル−３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）インドリン−２−オン（７）：反応容器に置換されたアニリン（２．８２ｍｍｏｌ）、１Ｍ  ＨＣｌ（２．８２ｍＬ）、水（１８．８ｍＬ）、無水硫酸ナトリウム（１６．９２ｍｍｏｌ）、及びヒドロキシルアミン塩酸塩（９．１７ｍｍｏｌ）を入れた。混合物を加熱して沸騰させ、抱水クロラールを１回で加えた。反応液を４０分間還流状態に維持し、冷却して還流させ、得られた水溶液を酢酸エチルで抽出した（３回）。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、減圧下に濃縮した。得られた残留物に、濃硫酸（３ｍＬ）を加えた。この溶液を加熱して８０℃として２０分間経過させ、氷に投入した。得られた水系混合物を酢酸エチルで抽出し（３回）、合わせた有機層を硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、減圧下に濃縮した。濃縮後に得られた赤褐色固体は、ほとんどの有機溶媒にほとんど溶けないことがわかった。
【０１６３】
新たな反応容器に、所望のフェニルブロミド（３．０８ｍｍｏｌ）を加え、ＴＨＦ（３．０ｍＬ）に溶かした。反応混合物を冷却して−７８℃とし、ｎ−ＢｕＬｉの溶液（２．７７ｍｍｏｌ、１．７３ｍＬ）を１０分間かけて滴下した。反応液を１時間攪拌した。別のフラスコ中、６−クロロ−７メチルイサチン（１．５４ｍｍｏｌ）を加え、ＴＨＦ（９．４ｍＬ）に溶かした。このイサチンの溶液を、１０分間かけて反応容器に滴下した。得られた混合物を−７８℃で１時間攪拌し、昇温させて室温とし、１時間攪拌した。水（１０ｍＬ）で反応停止した。得られた溶液を酢酸エチルで抽出し（３回）、合わせた有機層を硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、減圧下に濃縮した。得られた油状物をシリカ層に通した（溶離溶媒勾配：１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンから１００％ＥｔＯＡｃ）。
【０１６４】
７を、３合成段階で収率２４％で単離した。
【０１６５】
1H NMR (CD3OD, 500 MHz) δ: 7.46 (d, J = 8.85 Hz 2H), 7.23 (d, J = 7.98 Hz, 2H), 7.10 (d, J = 7.97 Hz 1H), 6.98 (d, J = 8.02 Hz, 1H), 2.35 (s, 3H).
13C NMR (CD3OD, 188 MHz) δ: 181.25, 150.17 (q, J = 1.83 Hz), 143.14, 140.98, 136.68, 132.74, 128.63, 124.53, 124.40, 121.88 (q, J = 255.75 Hz), 121.86, 119.76, 78.91, 14.11.
HRMS (ESI): m/z C16H11NO3F3ClNa [M+Na]+の計算値: 380.0277, 実測値: 380.0284.
【化２３】
2021529757.tif 000027
【０１６６】
６−クロロ−３−（４−ヒドロキシフェニル）−７−メチル−３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）インドリン−２−オン（８）：一般手順Ｃを用いて、８を収率８５％で単離した。
【０１６７】
1H NMR (CD3OD, 500 MHz) δ: 7.30 (d, J = 8.91 Hz 2H), 7.21 (m, 2H), 7.10 (d, J = 8.10 Hz, 1H), 7.02 (m, 4H), 6.73 (d, J = 8.80 Hz, 2H), 2.35 (s, 3H).
13C NMR (CD3OD, 188 MHz) δ: 181.81, 158.16, 149.67 (q, J = 2.02 Hz), 142.6, 142.38, 135.34, 133.50, 133.10, 131.18, 130.47, 125.48, 124.12, 121.89 (q, J = 255.49 Hz), 121.8, 119.66, 116.35, 63.45, 14.30.
HRMS (ESI): m/z C22H16NO3F3Cl [M+H]+の計算値: 434.0771, 実測値: 434.0764.
【化２４】
2021529757.tif 000028
【０１６８】
１０５のエナンチオマーの分離：１０５のラセミ混合物を、分取キラルＨＰＬＣ分離（Ｌｕｘ（登録商標）  ５μＭセルロース−１、ＬＣカラム、２５０×２１．２ｍｍ、ＡＸＩＡ（登録商標）充填、定組成：７％ｉ−ＰｒＯＨ／ヘキサン）を用いて、個々のエナンチオマーに分離した（図５）。回収した分画から、（−）−１０５（ピークＡ）及び（＋）−１０５（ピークＢ）が得られた。このキラル分離方法によって、（−）−１０５が白色固体として（エナンチオマー純度＝＞９９％、［α］＝−１３４）、そして（＋）−１０５が白色固体として（エナンチオマー純度＝約９８〜＞９９％、［α］＝未測定）得られる。エナンチオマー純度測定を、分析キラルＨＰＬＣカラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ（登録商標）ＩＢ−３（粒径３μＭ、寸法：４．６ｍｍ×１００ｍｍ、分離方法、定組成７．５％ｉ−ＰｒＯＨ／ヘキサン）によって行った。化合物（−）−１０５は、光を負方向（［α］値）に曲げる。図６は、ほぼ等濃度で存在する（±）−１０５の分離されたピークを示す定量的キラルＨＰＬＣトレースである。図７は、活性（−）−１０５ピークが分離後に非常に純粋であることを示している。図８は、不活性（＋）−１０５ピークも分離後に純粋であることを示している。この製造において活性（−）−１０５のトレースがあり、（−）−１０５の顕著な効力があることから、極めて高い濃度では、（＋）−１０５が若干の活性を示す可能性はある。
【０１６９】
実施例２．化合物１０５のがん細胞死試験
異種移植片の実験的詳細：ＴＹＳ−Ｌｕｃ細胞（Ｍａｔｒｉｇｅｌ中５，０００，０００細胞）を、卵巣切除雌ＮＳＧ（ＳＣＩＤ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｓ）の上部乳房脂肪体に注射した。１０週間後、第０日に、大きい腫瘍（大きさの範囲：１００〜６００ｍｍ３）が存在した。マウスを、皮下注射により４０ｍｇ／ｋｇ／日で、（−）−１０５を溶かすのに用いた媒体、又は（−）−１０５によって処理した。腫瘍の生物発光撮像（ＢＬＩ）のために、そのマウスにイソフルラン及びルセルフィンで麻酔を施し、ルシフェラーゼ基質をマウスに注射した。フラックス、１秒以内に検出器に当たる光子の総数を、ＩＶＩＳ（イン・ビトロ撮像システム）を用いて測定した。各腫瘍を含む全領域、又は腫瘍がごく小さいか検出できない場合には等価な領域についてのフラックス（１０６単位／秒）を示しており、各時点での腫瘍の大きさにおける変化パーセントを測定した（第０日、第３日、第１週、第２週、第３週）。次に、処理を停止し、２週間後に別の測定を行った。留意すべき点として、腫瘍をキャリパーを用いても測定した。一部の腫瘍はあまり突出していないことから、それは正確さにおいてＢＬＩにはるかに及ばない。３日後、全ての（−）−１０５腫瘍は退行して、キャリパーを用いて検出できないまでになった。
【０１７０】
図１は、（±）−１０５のＥＲα陽性及びＥＲα陰性ヒトがん細胞に対する用量応答効果を示すものであり、抗がん活性を示している。ＥＲα陽性ＭＣＦ−７乳がん、Ｃａｏｖ−３卵巣がん及びＥＣＣ−１子宮がん細胞及びＥＲα陰性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳がん細胞及びＨｅＬａ、ヒト子宮頸癌細胞及びＭＣＦ−１０Ａヒト乳房上皮細胞を、培地５０μＬ中、１０，０００細胞／ウェル（９６ウェルプレート）で蒔いた。約１８時間後、２×所望の最終濃度の試験化合物（Ｃ−１０５）を含む追加の培地５０μＬを各ウェルに加えた（最終体積１００μＬ／ウェル）。２４時間後、アラマーブルー試薬を加え、ウェルにおける蛍光を１時間後に読み取った（ＢＭＧ  ＰｈｅｒａＳｔａｒ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ）。１０，０００ｎＭラプチナール処理細胞についての読み取り値を１００％死亡細胞に設定し、媒体処理細胞についての読み取り値を０％死亡細胞に設定することで、相対死亡％を求めた。（データは、３つの独立の実験の平均±ＳＥＭであり、独立実験内で各サンプルについて５つの生物反復実験を実施）。
【０１７１】
図２は、ＢＨＰＩ及び（±）−１０５がＥＲα陽性Ｔ４７Ｄ細胞を殺す能力を比較する用量応答を示している。Ｔ４７Ｄ、ヒト乳がん細胞を、７５，０００細胞／ウェルで蒔いた。翌日、ＤＭＳＯ媒体、１０μｍラプチナール（１００％細胞死の対照）、又は０、５０、１００５００及び１，０００ｎＭのＢＨＰＩ又は（±）−１０５、又は１，０００ｎＭ  ＩＣＩ／フルベストラント又は１，０００ｎＭＯＨＴを加えた。２４時間後、生存細胞を、Ｖ−ＦＩＴＣ及びプロピジウムヨージド色素を用いるＦＡＣＳによって確認した。（ｎ＝３独立実験±ＳＥＭ）。このフローサイトメトリー実験（死亡細胞を検出）からの結果は、（±）−１０５が細胞傷害性であり、細胞増殖抑制性ではないことを示している。それに対して、化合物ＯＨＴ、ＩＣＩ及びＢＨＰＩは、観察された活性が低いことに基づき、全て細胞増殖抑制性である。このアッセイでの（±）−１０５の観察される活性は、陽性対照のラプチナール、即ちやはりがん細胞を定量的に殺す化合物と同様である（図３６Ａも参照する）。
【０１７２】
図３は、（±）−１０５がＥＲα陽性及びＥＲα陰性細胞を殺す能力を比較している。用量応答は、（±）−１０５がＥＲα陽性及びＥＲα陰性細胞を急速に殺す能力を調べるものである。細胞系：ＥＲα陽性乳がん：Ｔ４７Ｄ、ＭＣＦ−１ＴＹＳ（Ｙ５３７Ｓ）；子宮内膜：ＥＣＣ−１；ＥＲα陰性細胞系：乳房ＭＤＡ−ＭＢ−２３１；メラノーマ：ＯＭＭ１、Ａ３７５；肺：Ｈ３１２２；結腸：ＨＴ−２９；線維芽細胞：ＨＦＦ−１。４，０００〜８，０００細胞／ウェルを蒔いた。翌日、０〜１０，０００ｎＭの濃度の（±）−１０５を加えた。２４時間後、アラマーブルー試薬を加え、ウェルにおける蛍光を読み取った。１０，０００ｎＭラプチナール処理細胞についての読み取り値を１００％死亡細胞に設定し、媒体処理細胞についての読み取り値を０％死亡細胞に設定することで、相対死亡％を求めた。（ｎ＝３±ＳＥＭ）。これらの結果は、ラセミ化合物１０５がＥＲα陽性がん細胞系について選択的であることを示しており；図３６Ｆにおけるエナンチオマー的に純粋な（−）−１０５でも示されている。
【０１７３】
図４Ａは、細胞死についてのＩＣ５０を求めた方法を示している。４Ｂは、ＢＨＰＩ、（−）−１０５、及び０１−１５が殺す能力を調べるものである。４Ｃは、（−）−１０５が経口投与した時に有効であることを示している。ＴＹＤ−Ｌｕｃ細胞（Ｔ４７ＤＥＲαＤ５３８Ｇ−ルシフェラーゼヒト乳がん細胞）の大きい同所性乳房腫瘍を、免疫抑制ＮＳＧマウスで４ヶ月間で形成した。マウスを、媒体のみ（媒体）、４０ｍｇ／ｋｇ（−）−１０５の経口強制投与（経口）、又は４０ｍｇ／ｋｇ（−）−１０５の１日１回注射（注射）のいずれかで３日間処理した。腫瘍を、ルシフェラーゼを用いる生物発光撮像によって視覚化した。点線は−１００％を表し；検出不能まで腫瘍退行。従って、結果は、（−）−１０５がＢＨＰＩ及び０１−１５より優れていることを示している。
【０１７４】
図９は、１０５の（−）エナンチオマーが活性であり、（＋）エナンチオマーが不活性であることを示している。ウェル当たり７５，０００個のＥＲα陽性Ｔ４７Ｄ、ヒト乳がん細胞を蒔いた。翌日、ＤＭＳＯ媒体、１０μｍラプチナール（１００％細胞死の対照）、又は１００、５００及び１，０００ｎＭの（＋）−１０５、又は（−）−１０５を加えた。２４時間後、生存細胞を、Ｖ−ＦＩＴＣ及びプロピジウムヨージド色素を用いるＦＡＣＳによって確認した。（ｎ＝１）。
【０１７５】
図１０は、（−）−１０５がＭＣＦ−７細胞の用量依存性死を誘発し；（＋）−１０５が不活性であることを示している。ウェル当たり７５，０００個のＥＲα陽性Ｔ４７Ｄ、ヒト乳がん細胞を蒔いた。翌日、ＤＭＳＯ媒体、１０μｍラプチナール（１００％細胞死の対照）、又は１〜５００ｎＭの（−）−１０５又は１，０００ｎＭ（＋）−１０５又は１，０００ｎＭ（±）−１０５を加えた。２４時間後、生存細胞を、Ｖ−ＦＩＴＣ及びプロピジウムヨージド色素を用いるＦＡＣＳによって確認した。（ｎ＝３独立実験±ＳＥＭ）。
【０１７６】
図１１は、ＢＨＰＩ及びＣ−１０５の活性（−）−１０５エナンチオマーによるＴ４７Ｄ−Ｌｕｃ細胞の殺滅の用量応答を示している。トリパンブルー細胞死アッセイを用いて、Ｃ−１０５の活性（−）エナンチオマー及びＢＨＰＩがエストロゲン受容体α（ＥＲα）陽性Ｔ４７Ｄ、ルシフェラーゼを発現するヒト乳がん細胞（Ｔ４７Ｄ−Ｌｕｃ細胞）を殺す能力を比較した。１０％ＦＢＳ中の３００，０００個のＴ４７Ｄ−Ｌｕｃ細胞／ウェルを、三連で６ウェルプレートに蒔いた。蒔いてから２４時間後、示した濃度のＣ−１０５の活性（−）エナンチオマー［（−）−１０５］又はＢＨＰＩ、又は媒体［Ｖｅｈ］を細胞に加えた。２４時間後、細胞を回収し、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ  ＩＩ自動血球計を用いる自動トリパンブルー排除によって、％死亡細胞を求めた。生存細胞のパーセントを、１００−（細胞死％）によって計算した。（ｎ＝３±ＳＥＭ）。
【０１７７】
図１２は、ＭＣＦ−７及びＴＹＳ−Ｌｕｃ細胞の殺滅において、（−）−１０５の用量応答がＢＨＰＩより優れていることを示している。トリパンブルー細胞死アッセイを用いて、１０５（−）の活性エナンチオマー［（−）−１０５］がＥＲα陽性ＭＣＦ−７及びＴＹＳ−Ｌｕｃ、ヒト乳がん細胞を殺す能力を評価した。１０％ＦＢＳ中の３００，０００個のＴ４７Ｄ細胞／ウェルを、三連で６ウェルプレートに蒔いた。蒔いてから２４時間後、示した濃度のＢＨＰＩ、又はＣ−１０５［（−）−１０５］の活性エナンチオマー１０５（−）を加えた。２４時間後、細胞を回収し、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ  ＩＩ自動血球計を用いる自動トリパンブルー排除によって、％死亡細胞を求めた。生存細胞のパーセントを、１００−（細胞死％）によって計算した。（ｎ＝３±ＳＥＭ）。
【０１７８】
図１３は、ＴＤＧ−Ｌｕｃ細胞の殺滅において、（−）−１０５の用量応答試験が、ＢＨＰＩ及び現行の内分泌療法より優れていることを示している。上図において、用量応答は、（−）−１０５がＴＤＧ−Ｌｕｃ細胞の殺滅においてＢＨＰＩより優れていることを示している。左下図は、現行の内分泌療法、ＩＣＩ／フルベストラント／フェソロデックス及びｚ−４−ヒドロキシタモキシフェン（タモキシフェンの活性型）がＴＤＧ−Ｌｕｃ細胞を殺さないことを示している。右下図は、（＋）−１０５エナンチオマーが不活性であり、ＴＤＧ−ｌｕｃ細胞を殺さないことを示している。トリパンブルー細胞死アッセイを用いて、Ｃ−１０５の活性エナンチオマー［（−）−１０５］がＥＲα陽性ＴＤＧ−Ｌｕｃ細胞を殺す能力を評価した。全ての試験において、１０％ＦＢＳ中３００，０００個のＴＤＧ−Ｌｕｃ細胞／ウェルを、三連で６ウェルプレートに蒔いた。蒔いてから２４時間後、示した濃度の（−）−１０５の活性エナンチオマー、又はＢＨＰＩ（上）ＩＣＩ、又はＯＨＴ（左下）又は（＋）−１０５（右下）を加えた。２４時間後、細胞を回収し、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ  ＩＩ自動血球計を用いる自動トリパンブルー排除によって、％死亡細胞を求めた。生存細胞のパーセントを、１００−（細胞死％）によって計算した。（ｎ＝３±ＳＥＭ）。
【０１７９】
図１４は、（−）−１０５によるがん細胞殺滅についてのＩＣ５０を示している。細胞系：ＥＲα陽性乳がん：Ｔ４７Ｄ、ＭＣＦ−７ＴＹＳ（Ｔ４７ＤＹ５３７Ｓ）ＴＤＧ（Ｔ４７ＤＤ５３８Ｇ）、ＢＴ−４７４；ＥＲα陰性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞；培地１００μＬ中、６，０００個の細胞／ウェルを蒔いた（９６ウェルプレート）。各ウェルでＤＭＳＯ濃度を１％に調節した。０〜１００，０００ｎＭの濃度の（−）−１０５を加えた。２４時間後、アラマーブルー試薬（１０μＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ）を加えた。２〜４時間後、ウェルにおける蛍光を読み取った（λｅｘ：５５５ｎＭ、λｅｍ：５８５ｎＭ、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  Ｍ３プレートリーダー）。１０，０００ｎＭラプチナール処理細胞についての読み取り値を１００％死亡細胞に設定し、媒体処理細胞についての読み取り値を０％死亡細胞に設定することで、％相対死を求めた。（ｎ＝３±ＳＥＭ）。
【０１８０】
図１５は、（−）−１０５が１００％のＴＹＳ−Ｌｕｃ細胞を殺すが、ＢＨＰＩは殺さない長期実験を示している。マウス異種移植片における数週間の腫瘍処理の効果をシミュレーションするため、長期細胞培養実験を行った。ＴＹＳ−Ｌｕｃ細胞（Ｔ４７ＤＥＲαＹ５３７Ｓ−Ｌｕｃ細胞；ＥＲαＹ５３７Ｓは転移性乳がんで見られる最も致死性の高いＥＲα変異である。）を、９６ウェルプレートにおいて４，０００細胞／ウェルで蒔いた。最初に、細胞を、ＤＭＳＯ媒体、１μＭのＣ−１０５の不活性（＋）エナンチオマー、１μＭ  ＢＨＰＩ、又は１μＭのＣ−１０５の活性（−）エナンチオマー（処理）のいずれかを含む培地中に２週間にわたり維持した。２週間（２日ごとに培地交換）後、ＭＴＳ及びＴＹＳ−Ｌｕｃ細胞についての吸収対細胞数の標準曲線を用いて、細胞数を求めた。注：（ｉ）バーは、実験のＢＨＰＩ及び（−）−１０５アームを示す。再増殖中は、薬剤は存在しない。（ｉｉ）吸収値が極めて低いことから、ＭＴＳアッセイは、２００細胞／ウェルより少ないものを正確に定量することができない。（ｉｉｉ）分離後、不活性エナンチオマーはなお、約１〜２％の活性エナンチオマーを含んでいる。従って、それは、１，０００ｎＭ）の高濃度で使用すると若干の活性を保持している。別のセットの同様に処理したウェルについてはＭＴＳでのアッセイを行わず、ＰＢＳで４回洗浄した後、４週間にわたり（２日ごとに培地を交換）１０％ｃｄ−ＦＢＳを含む、エストロゲンを含まない培地に蒔いた（再増殖）。これによって、生き残った細胞を再増殖させることができる。４週間後、ＭＴＳを用いて細胞のアッセイを行った。特に、活性（−）Ｃ−１０５で処理した細胞の再増殖は全くなく、ＢＨＰＩ処理細胞の力強い再増殖があった（注：ウェルの肉眼検査により、活性（−）−１０５で２週間処理したウェルには細胞が全くないことが確認された。）。ＢＨＰＩ処理後に再増殖した細胞がＢＨＰＩに対して抵抗性であるか否かを調べるため、それらを別のサイクルで再処理し（ＢＨＰＩ再処理）、ＢＨＰＩ殺滅に対する感受性を保持していることが示された。（ｎ＝８生物反復実験±ＳＥＭ）。
【０１８１】
図１６は、療法をシミュレーションする長期実験を示すものであり、（―）−１０５は、致死性の療法抵抗性乳がん細胞を根絶するが、ＢＨＰＩは根絶しない。細胞：ＭＣＦ−７Ｙ５３７Ｓ（ＭＣＦ−７ＥＲαＹ５３７Ｓ−ルシフェラーゼ（ＭＣＦ−７ヒト乳がん細胞由来。ＭＣＦ−７細胞は、最も広いヒト乳がん細胞系である。これは最も致死性であり、転移性乳がんにおける第２に最も一般的な変異である。）。実験条件は、図１５に対する説明のある通りである。（＋）−１０５エナンチオマーは不活性であった。
【０１８２】
図１８は、（−）−１０５が、ＢＨＰＩによる殺滅に対して抵抗性である乳がん細胞を殺すことを示している。１μＭ  ＢＨＰＩ中で生き残ることができるＴ４７Ｄヒト乳がん細胞を含むＥＲαを、クローン的結果によって選択した。（ＢＨＰＩ感受性）親Ｔ４７Ｄ細胞及び部分的にＢＨＰＩ抵抗性Ｔ４７Ｄクローン１，３，８及び１１の増殖に対する１００ｎＭ及び１μＭ  ＢＨＰＩ及び（−）−１０５の効果を評価した。４，０００細胞／ウェルを蒔いた。吸光度対細胞数の標準曲線から、ＭＴＳアッセイによって細胞数を求めた。結論：ＢＨＰＩは増殖を遮断し、Ｔ４７Ｄ細胞の多くを殺し、（−）−１０５が全てのＴ４７Ｄ細胞を殺した。ＢＨＰＩは増殖を阻害したが、抵抗性クローンの増殖を停止しなかった；（−）−１０５は抵抗性クローンの増殖を完全に遮断し、細胞数を、４，０００細胞／ウェルの元の細胞数より低い数に低下させた。従って、４日以内に、（−）−１０５は抵抗性細胞の一部を殺したが、全ては殺さなかった。
【０１８３】
予想される小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）についての−１０５の作用機序に関して、図１９は、（−）−１０５がスプライスＸＢＰ−１  ｍＲＮＡの形成を強力に誘発することを示している。ＥＲα陽性Ｔ４７Ｄ−ルシフェラーゼ、ヒト乳がん細胞を、媒体（Ｃｔｌ、対照）、１００ｎｍ  ＢＨＰＩ又は１００ｎＭ（−）−１０５中に指定の時間にわたって維持した。指定の時点で、ＲＮＡを単離し、ｓｐ−ＸＢＰ１  ｍＲＮＡのレベルをｑＲＴ−ＰＣＲによって定量した。（ｎ＝３±ＳＥＭ）。ＵＰＲの（−）１０５又はＢＨＰＩ活性化は、ＵＰＲセンサーＩＲＥ１αを活性化して、それによって不活性ＸＢＰ１  ｍＲＮＡが開裂して、活性スプライス（ｓｐ）−ＸＢＰ１  ｍＲＮＡとなる。
【０１８４】
ｓｐ−ＸＢＰ１  ｍＲＮＡ上昇が、小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）活性化の広く使用されているマーカーである。従って、（−）−１０５は、ＢＨＰＩより、ｓｐ−ＸＢＰ１のはるかに強いＵＰＲ高活性剤及び誘発剤である。
【０１８５】
図２０は、（−）−１０５が、新たなタンパク質の合成のほぼ定量的な阻害を誘発するが、ＢＨＰＩは誘発しないことを示している。ＥＲα陽性Ｃａｏｖ−３、ヒト卵巣がん細胞を、指定の時間にわたり、１，０００ｎｍ  ＢＨＰＩ又は１，０００ｎＭ（−）−１０５で処理した。細胞を３５Ｓ−メチオニンで簡単に標識した。標識３５Ｓ−メチオニンのタンパク質への取り込みを、小型のＷｈａｔｍａｎ硬化無灰フィルターでのトリクロロ酢酸沈殿及び沈殿タンパク質の捕捉によって確認したが、遊離アミノ酸は捕捉しなかった。フィルターにおけるタンパク質を塩基で可溶化し、酸で中和した後に、サンプルを液体シンチレーションカウンターでカウントした。０時点サンプルと比較した、タンパク質合成の平均（ｎ≧３）阻害パーセントを示している。（−）−１０５によるタンパク質合成のほぼ定量的阻害は。ＵＰＲのＰＥＲＫアームの致死性過反応を誘発する（−）−１０５と一致している。非増殖性細胞であっても、常にタンパク質を分解しており、新たなタンパク質を作っている。ほぼ全ての（＞９０％）タンパク質合成が阻害される細胞は成長できず、最終的には死ぬ。
【０１８６】
図２１は、２−ＡＰＢによる小胞体からのカルシウムの流出の遮断が（−）−１０５誘発がん細胞死を阻害することを示している。ＥＲα陽性ＭＣＦ−７及びＴＹＳ−Ｌｕｃを、指定の時間にわたり、ＤＭＳＯ媒体（Ｖｅｈ）、又はＢＨＰＩ又は（−）−１０５＋又は−２−ＡＰＢで処理した。細胞死を、機器によるトリパンブルー排除アッセイを用いて確認した。３０分の時点で、２−ＡＰＢはほぼ完全に、（−）−１０５誘発細胞死を遮断し、４５分及び６０分の時点で、それは部分的に細胞死を遮断した。これは、予想されるＵＰＲ経路の（−）−１０５誘発の強力な致死性活性化と一致する。（ｎ＝３±ＳＥＭ）。
【０１８７】
図２２は、−１０５が細胞内ＡＴＰレベルを低下させることを示しており；このＡＴＰレベル低下は、タプシガルギンによってＳＥＲＣＡポンプを失活させることで遮断される。ＴＹＳ−Ｌｕｃ細胞を、指定の時間にわたり、１０，０００ｎＭタプシガルギン（ＴＨＧ）を含有又は含有しない、ＤＭＳＯ媒体（Ｖｅｈ）、１，０００ｎＭ  ＢＨＰＩ、１，０００ｎＭ  −１０５中に維持した。ＡＴＰレベルをキットを用いて求め、相対ＡＴＰレベルを標準曲線から求めた。留意すべき点として、１時間の時点で、ＴＨＧは、細胞内ＡＴＰレベルにおける−１０５誘発低下を完全に遮断した。（ｎ＝３±ＳＥＭ）。
【０１８８】
図２３は、−１０５誘発細胞死を阻害するタプシガルギンによるＡＴＰレベル低下の遮断を示している。ＴＹＳ−Ｌｕｃ細胞を、指定の時間にわたり、タプシガルギン（ＴＨＧ）を含有又は含有しない、ＤＭＳＯ媒体（Ｖｅｈ）若しくはＢＨＰＩ、又は（−）−１０５中に維持した。ＴＨＧによるＡＴＰレベルの低下遮断（図１９）によって、（−）−１０５誘発細胞死が阻害された。留意すべき点として、ＴＨＧが存在した場合、１時間で、細胞（−）−１０５誘発細胞死の強力な阻害があった。（ｎ＝３±ＳＥＭ）。
【０１８９】
実施例３．１０５関連の化合物についての追加データ
図２４は、試験化合物及びＢＨＰＩがＴＤＧ細胞を殺す能力の比較を示している。ＴＤＧ細胞を、７５ｎＭのＢＨＰＩ又は７５ｎＭの各指定試験化合物：４、６及び（±）−１０５（エナンチオマーは分離していない）とともに２４時間インキュベートした。機器によるトリパンブルー排除アッセイを用いて細胞死を測定した。構造は合成セクションにある。結論：ＢＨＰＩと比較して、化合物４及び１０５は、非常に高いＴＤＧ細胞殺滅能力を示す。（ｎ＝３±ＳＥＭ）。
【０１９０】
図２５は、試験化合物及びＢＨＰＩがＴＹＳ細胞を殺す能力の比較を示している。ＴＹＳ細胞を、３５ｎＭのＢＨＰＩ又は３５ｎＭの各指定試験化合物：２、４及び１０５とともに２４時間インキュベートした。機器によるトリパンブルー排除アッセイを用いて細胞死を測定した。（ｎ＝３±ＳＥＭ）。そうして、ＢＨＰＩと比較して、化合物４及び１０５は、かなり高いＴＹＳ細胞殺滅能力を示す。
【０１９１】
図２６は、試験化合物４、６、１０５及びＢＨＰＩがＴＹＳ細胞を殺す能力の比較を示している。ＴＹＳ細胞を、５０ｎＭのＢＨＰＩ又は５０ｎＭの各指定試験化合物：４、６及び１０５とともに２４時間インキュベートした。機器によるトリパンブルー排除アッセイを用いて細胞死を測定した。（ｎ＝３±ＳＥＭ）。そうして、ＢＨＰＩと比較して、化合物４及び１０５は、高いＴＹＳ細胞殺滅能力を示す。
【０１９２】
図２７は、試験化合物及びＢＨＰＩがＴ４７Ｄ細胞を殺す能力の比較を示している。Ｔ４７Ｄ細胞を、７５ｎＭのＢＨＰＩ又は７５ｎＭの各指定試験化合物：４及び６とともに２４時間インキュベートした。機器によるトリパンブルー排除アッセイを用いて細胞死を測定した。（ｎ＝３±ＳＥＭ）。そうして、化合物４は、かなり高い野生型エストロゲン受容体を含む乳がん細胞殺滅能力を示す。
【０１９３】
図２８において、試験化合物もＢＨＰＩも、非腫瘍形成姓ＥＲα陰性ＭＣＦ−１０Ａ乳腺細胞を殺さない。ＥＲα陰性ＭＣＦ−１０Ａ細胞を、ＤＭＳＯ媒体又は７５ｎＭのＢＨＰＩ又は７５ｎＭの各指定試験化合物：４、６及び１０５中に２４時間維持した。機器によるトリパンブルー排除アッセイを用いて細胞死を測定した。（ｎ＝３±ＳＥＭ）。そうして、７５ｎＭでは、ＢＨＰＩも試験化合物のいずれも、ＥＲα陰性ＭＣＦ−１０Ａ細胞の死をほとんど誘発しない。
【０１９４】
図２９は、試験化合物及びＢＨＰＩがＴ４７Ｄ細胞を殺す能力の評価を示している。Ｔ４７Ｄ細胞を、１００ｎＭ  ＢＨＰＩで、又は１００ｎＭの各試験化合物：６、８及び１０５で２４時間処理した。（ｎ．ｓ．有意差なし）。機器によるトリパンブルー排除アッセイを用いて細胞死を測定した。（ｎ＝３±ＳＥＭ）。そうして、ＢＨＰＩと比較して、化合物１０５は、高いＴ４７Ｄ細胞殺滅能力を示す。
【０１９５】
図３０は、ＢＨＰＩ及び試験化合物がＴ４７Ｄ、ＴＹＳ及びＴＤＧ細胞の増殖を阻害する能力を比較する。Ｔ４７Ｄ細胞を、１０ＦＢＳ（エストロゲン含有）、ＴＹＳ−４及びＴＤＧ−１細胞を、１０％ｃｄ−ＦＢＳ（エストロゲン欠乏）を含む培地に入れた。細胞を、９６ウェルプレート中、２，０００細胞／ウェルで蒔く。ＦＢＳ又は活性炭−デキストラン処理ＦＢＳ（内因性エストロゲン欠乏）を含む培地中で２４時間後、指定濃度の各化合物（培地体積の１／１０００でＤＭＳＯ中）を加えた。２日後、培地を交換し、化合物を再度加えた。さらに２日後（合計４日間）、ＭＴＳアッセイを用いて細胞増殖を評価する。（ｎ＝６±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）。そうして、ＢＨＰＩ及び新たな化合物は、Ｔ４７Ｄ、ＴＹＳ−４及びＴＤＧ−１細胞の増殖を有効に阻害する。そのデータは、これらのＥＲα陽性乳がん細胞の殺滅において、化合物２、４、６及び１０５がＢＨＰＩより有効であることを示唆している。
【０１９６】
追加データを、図３１及び図３３〜４３に示している。医薬品化学作戦により、（±）−１が、予想外の細胞傷害性表現型を示すことが明らかになった（図３６Ａ）。エストロゲン受容体アルファ（ＥＲα）についての全ての公知の標的療法は細胞増殖抑制性であり、それは、それらが細胞増殖を防ぐのみであって、がん細胞を殺さないことを意味している。分取キラルカラムクロマトグラフィーによって、偏光分析器によって（−）−１０５及び（＋）−１０５と確認されたエナンチオマー的に純粋な材料（実施例４）へのアクセスが提供された。化学的誘導体化及びＸ線結晶学によって、（Ｒ）−配置を有する活性エナンチオマー及び（Ｓ）−配置を有する不活性エナンチオマーがさらに特徴付けられた（図式５）。生物データ（図３６Ｂ及び実施例４）は、（Ｒ）−１がＥＲα陽性細胞（ＭＣＦ−７）に対して細胞傷害性であり、ＥＲα陰性細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）においてはごくわずかな効果しか認められないことを示している。従って、当該化合物は、選択的エストロゲン受容体キラーに関してＳＥＲＫ−Ｆ６と新たに命名され、そのバージョンは６個のフッ素を有する。ＳＥＲＫ−Ｆ６の用量依存性活性を、ＥＲαに関してがん細胞系のパネルに対して求めた（図３６Ｃ及び図３７Ａ）。
【０１９７】
細胞傷害性療法についての重要な態様は、細胞集合を定量的に殺す能力である。ＳＥＲＫ−Ｆ６は、急速２４時間結晶クリスタルバイオレットアッセイ（図３６Ｄ）で、そして長期細胞培養実験（図３６Ｅ〜Ｆ及び図３７Ｂ）でＥＲα細胞系を定量的に殺す。ＳＥＲＫ−Ｆ６は、予想される小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）活性化を介して殺す（図３８）。この機序の重要なマーカーは、高レベルのスプライスＸＢＰ１（ｓｐ−ＸＢＰ１）（図３８Ａ）、細胞ＡＴＰレベルの急速な低下（図３８Ｂ）、及びタンパク質合成の急速な阻害（図３８Ｃ）であった。
【０１９８】
ＳＥＲＫ−Ｆ６の薬物動態をマウスで測定した（図４０Ａ〜Ｂ）。追加の研究によって、ＳＥＲＫ−Ｆ６が血液−脳関門浸透剤であることが明らかになった（図４０Ｃ〜Ｄ）。さらに、ＳＥＲＫ−Ｆ６の長期処理によって、循環エストラジオールレベルによる測定でＥＲα組織が除去されるものではない（図４０Ｅ）。これらのデータは、ＳＥＲＫ−Ｆ６がイン・ビボで生理的に妥当な濃度を達成して、良好に耐容され得ることを示している。
【０１９９】
ＥＲα陽性腫瘍殺滅についてのＳＥＲＫ−Ｆ６の効力を調べるため、大きいＭＣＦ−７腫瘍を成長させ、療法による介入を行った。ＳＥＲＫ−Ｆ６処理によって、劇的な腫瘍退行が生じる（図３９Ａ及び図４０Ｆ−Ｇ）。現行の療法（即ちフルベストラント、Ｆｕｌｖ．）は細胞増殖抑制性であることから、これらの大きい確立された腫瘍に対する劇的効果は得られない。さらに、１日１回ＳＥＲＫ−Ｆ６処理により、試験中のマウス体重に変化は全くなく、イン・ビボのＳＥＲＫ−Ｆ６耐容性を示した（図４０Ｈ）。さらに、ＳＥＲＫ−Ｆ６のイン・ビボ作用機序を示すため、ＭＣＦ−７腫瘍をマウスに移植し、ＳＥＲＫ−Ｆ６で処理した。次に、マウスを屠殺してから、腫瘍根絶を完了する。このデータは、Ｐ−ＰＥＲＫ及びＰ−ｅｉＦ２アルファレベル上昇を伴うＵＰＲの活性化を示している（図３９Ｂ〜Ｅ及び図４０Ｉ〜Ｊ）。
【０２００】
構成的活性化及び療法抵抗性に至るＥＲα変異は臨床的挑戦を代表するものであることから、ＳＥＲＫ−Ｆ６がこれらの抵抗性腫瘍にも対処し得ることを示していた。従って、ＳＥＲＫ−Ｆ６は、用量依存的に、そして複数の投与で（即ち、腹腔内及び経口投与）、Ｙ５３７Ｓ腫瘍（即ち、ＴＹＳ細胞系）を根絶し、やはり耐容された（図４１Ａ〜Ｄ及び図４２Ｂ〜Ｃ）。処理停止すると、腫瘍は再成長せず、完全な腫瘍根絶を示している（図４２Ａ）。より低い部分治療用量のＳＥＲＫ−Ｆ６（即ち、１０ｍｇ／ｋｇ経口）では、腫瘍は再成長したが、より高い用量のＳＥＲＫ−Ｆ６によるこれら腫瘍の再処理は、これらの再成長腫瘍がなおもＳＥＲＫ−Ｆ６に対して感受性であり、抵抗性ではないことを示していた（図４２Ｄ）。この結果は、がん根絶のための完全な細胞殺滅の重要性を示している。ＳＥＲＫ−Ｆ６処理によって、Ｄ５３８Ｇ変異腫瘍（ＴＤＧ細胞系）の破壊も生じる（図４１Ｄ〜Ｅ）。ＳＥＲＫ−Ｆ６処理もやはり、より高用量で耐容され（図４２Ｅ）、腫瘍を根絶するのに十分であった（図４２Ｆ）。より低い用量は、腫瘍を完全には根絶させないが、これらの腫瘍のより高い用量のＳＥＲＫ−Ｆ６による再処理によって腫瘍が退行する（図４２Ｇ〜Ｈ）。
【０２０１】
腫瘍退行がＴ４７Ｄバックグラウンド細胞系（ＴＹＳ及びＴＤＧ）では認められないことを確認するため、ＭＣＦ−７細胞をＹ５３７Ｓで処理するか、ＥＲαタンパク質（それぞれＭＹＳ及びＭＤＧ細胞）におけるＤ５３８Ｇ変異体をＳＥＲＫ−Ｆ６で処理した。劇的な腫瘍退行が認められた（図４１Ｆ〜Ｇ、及び図４３Ａ〜Ｄ）。やはり、完全な腫瘍応答を得るには、より高い用量が必要であるが、より低い用量によって非抵抗性腫瘍成長が生じる（図４３Ｂ〜Ｄ）。ＳＥＲＫ−Ｆ６処理により、転移性腫瘍負荷も根絶される（図４１Ｉ）。
【０２０２】
実施例４．化合物１（１０５）のエナンチオマーの絶対配置及びＩＣ５０の確認
【化２５】
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【表３】
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【０２０３】
（±）−１の分取グラム規模キラル分離によって、反対の旋光度を有するエナンチオマー的に純粋な（Ｒ）−１及び（Ｓ）−１を得る（図式５）。ＭＣＦ−７細胞に対する（±）−１、（Ｒ）−１、及び（Ｓ）−１のＩＣ５０により、（Ｒ）−１が、ＳＥＲＫ−Ｆ６と称される活性化学種であることが明らかになる。値は、２４時間インキュベーション後に、生存及び死亡対照（媒体及びラプチナール処理）に対して正規化したアラマーブルー蛍光アッセイを用いて得たものである。（Ｓ）−１  ＩＣ５０は＞１μＭである。誤差は、Ｓ．Ｅ．Ｍ．として示されている。
【０２０４】
図式５．結晶性（Ｒ）−１及び（Ｓ）−１誘導体を得るための合成手順：（Ｒ）−２及び（Ｓ）−２の構造のＸ線測定
【化２６】
2021529757.tif 000031
【０２０５】
実施例５．医薬剤形
下記の製剤は、本明細書に記載の式の化合物、本明細書において具体的に開示されている化合物、又はそれらの薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物（「化合物Ｘ」と称される）の治療投与若しくは予防投与に使用され得る代表的な医薬剤形を説明するものである。
【０２０６】
（ｉ）錠剤１ ｍｇ／錠
「化合物Ｘ」                  １００．０
乳糖                            ７７．５
ポビドン                        １５．０
クロスカルメロースナトリウム    １２．０
微結晶セルロース                ９２．５
ステアリン酸マグネシウム          ３．０
３００．０
（ｉｉ）錠剤２ ｍｇ／錠
「化合物Ｘ」                    ２０．０
微結晶セルロース              ４１０．０
デンプン                        ５０．０
デンプングリコール酸ナトリウム  １５．０
ステアリン酸マグネシウム          ５．０
５００．０
（ｉｉｉ）カプセル ｍｇ／カプセル
「化合物Ｘ」                    １０．０
コロイド状二酸化ケイ素            １．５
乳糖                          ４６５．５
アルファ化デンプン            １２０．０
ステアリン酸マグネシウム          ３．０
６００．０
（ｉｖ）注射１（１ｍｇ／ｍＬ） ｍｇ／ｍＬ
「化合物Ｘ」（遊離酸型）                    １．０
二塩基性リン酸ナトリウム                  １２．０
一塩基性リン酸ナトリウム                    ０．７
塩化ナトリウム                              ４．５
１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液                適量
（ｐＨを７．０〜７．５に調節）
注射用水                                    適量、１ｍＬまで
（ｖ）注射２（１０ｍｇ／ｍＬ） ｍｇ／ｍＬ
「化合物Ｘ」（遊離酸型）                    １０．０
一塩基性リン酸ナトリウム                      ０．３
二塩基性リン酸ナトリウム                      １．１
ポリエチレングリコール４００              ２００．０
０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液                  適量
（ｐＨを７．０〜７．５に調節）
注射用水                                    適量、１ｍＬまで
（ｖｉ）エアロゾル ｍｇ／缶
「化合物Ｘ」                                ２０
オレイン酸                                  １０
トリクロロモノフルオロメタン            ５０００
ジクロロジフルオロメタン              １００００
ジクロロテトラフルオロエタン            ５０００
（ｖｉｉ）局所ゲル１ 重量％
「化合物Ｘ」                                ５％
カルボマー９３４                            １．２５％
トリエタノールアミン                        適量
（ｐＨを５〜７に調節）
メチルパラベン                              ０．２％
精製水                                    適量、１００ｇまで
（ｖｉｉｉ）局所ゲル２ 重量％
「組成物Ｘ」                                ５％
メチルセルロース                            ２％
メチルパラベン                              ０．２％
プロピルパラベン                            ０．０２％
精製水                                    適量、１００ｇまで
（ｉｘ）局所軟膏 重量％
「化合物Ｘ」                                ５％
プロピレングリコール                        １％
無水軟膏基剤                              ４０％
ポリソルベート８０                          ２％
メチルパラベン                              ０．２％
精製水                                    適量、１００ｇまで
（ｘ）局所クリーム１ 重量％
「化合物Ｘ」                                ５％
白ろう                                    １０％
液体パラフィン                            ３０％
ベンジルアルコール                          ５％
精製水                                    適量、１００ｇまで
（ｘｉ）局所クリーム２ 重量％
「化合物Ｘ」                                ５％
ステアリン酸                              １０％
モノステアリン酸グリセリル                  ３％
ポリオキシエチレンステアリルエーテル        ３％
ソルビトール                                ５％
パルミチン酸イソプロピル                    ２％
メチルパラベン                              ０．２％
精製水                                    適量、１００ｇまで
これらの製剤は、製薬業界で高知の従来手順によって製造できる。上記の医薬組成を、公知の製薬技術に従って変えて、異なる量及び種類の有効成分「化合物Ｘ」を使えるようにすることが可能であることは明らかであろう。エアロゾル製剤（ｖｉ）を、標準的な定量エアロゾルディスペンサーとともに使用することができる。さらに、具体的な成分及び割合は、例示を目的としたものである。成分は好適な均等物に変えることができ、割合は、対象の剤形の所望の特性に従って変動し得る。
【０２０７】
開示の実施形態及び実施例を参照しながら具体的な実施形態について上記で説明したが、そのような実施形態は例示的なものに過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。後述の特許請求の範囲で定義のより広い態様での本発明から逸脱しない限りにおいて、当業界における通常の技術に従って、変更及び改変を行うことができる。
【０２０８】
全ての刊行物、特許及び特許文書が、あたかも参照によって個別に組み込まれるかのように、参照によって本明細書に組み込まれる。本開示と矛盾する限定はいずれも、それから理解されるべきものではない。各種の具体的及び好ましい実施形態及び技術を参照して、本発明を説明した。しかしながら、理解すべき点として、本発明の精神及び範囲に留まるのであれば、多くの変更及び改変を行うことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６−１】
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【図３６−２】
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【図３７−１】
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【図３７−２】
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【図３８−１】
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【図３８−２】
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【図３９−１】
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【図３９−２】
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【図３９−３】
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【図４０−１】
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【図４０−２】
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【図４０−３】
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【図４０−４】
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【図４０−５】
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【図４１−１】
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【図４１−２】
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【図４１−３】
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【図４１−４】
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【図４２−１】
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【図４２−２】
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【図４２−３】
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【図４３−１】
2021529757.tif 000097
【図４３−２】
2021529757.tif 000098
【国際調査報告】
2021529757.tif 000099
2021529757.tif 000100
2021529757.tif 000101