(57)【要約】本発明は、調節Ｔ細胞の表面に存在する抗原であるＬｒｉｇ−１（ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎｓ１）タンパク質のエピトープとこれに特異的に結合する抗体または抗原結合断片に関する。【選択図】図１５
2021523703.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むエピトープに特異的に結合する抗体または抗原結合断片：
［式１］
Ｌｘ１Ｌｘ２ｘ３Ｎ
前記式１中、
ｘ１〜ｘ３は、それぞれ独立して、中性アミノ酸、酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸または芳香族アミノ酸である。
【請求項２】
前記ｘ１〜ｘ３は、それぞれ独立して、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ；Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ；Ｄ）、セリン（ｓｅｒｉｎｅ；Ｓ）、チロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ；Ｙ）、アルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ；Ｒ）、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ；Ｆ）、リシン（ｌｙｓｉｎｅ、Ｋ）、ヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｈ）、ロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ、Ｌ）、バリン（ｖａｌｉｎｅ、Ｖ）、トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ、Ｔ）、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ；Ａ）、グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ；Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ；Ｅ）およびグリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ；Ｇ）からなる群より選択されるアミノ酸である、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項３】
前記ｘ１は、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ；Ｎ）、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ；Ｆ）、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ；Ｄ）、リシン（ｌｙｓｉｎｅ、Ｋ）、ヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｈ）、バリン（ｖａｌｉｎｅ、Ｖ）、アルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ；Ｒ）およびトレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ、Ｔ）からなる群より選択されるアミノ酸であり、
前記ｘ２は、セリン（ｓｅｒｉｎｅ；Ｓ）、グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ；Ｑ）、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ；Ａ）、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ；Ｎ）、グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ；Ｅ）、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ；Ｄ）、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ；Ｆ）およびグリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ；Ｇ）からなる群より選択されるアミノ酸であり、
前記ｘ３は、チロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ；Ｙ）、ヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｈ）、グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ；Ｇ）、アルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ；Ｒ）、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ；Ｎ）、ロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ、Ｌ）、リシン（ｌｙｓｉｎｅ、Ｋ）およびフェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ；Ｆ）からなる群より選択されるアミノ酸である、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項４】
前記エピトープは、１０〜２０ｍｅｒからなる、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項５】
前記式１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、前記エピトープのＮ−ターミナルから３〜６番目に位置する、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項６】
前記ポリペプチドは、配列番号４〜１７のいずれか１つのアミノ酸配列で表される、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項７】
配列番号１８〜２９のいずれか１つのアミノ酸配列で表されるＬｒｉｇ−１タンパク質のエピトープに特異的に結合する抗体または抗原結合断片。
【請求項８】
Ｌｒｉｇ−１（ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎｓ１）タンパク質のエピトープであって、
下記式１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むエピトープ：
［式１］
Ｌｘ１Ｌｘ２ｘ３Ｎ
前記式１中、
ｘ１〜ｘ３は、それぞれ独立して、中性アミノ酸、酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸または芳香族アミノ酸である。
【請求項９】
Ｌｒｉｇ−１（ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎｓ１）タンパク質のエピトープであって、
配列番号１８〜２９のいずれか１つのアミノ酸配列で表されるポリペプチドを含む、エピトープ。
【請求項１０】
請求項９に記載のエピトープをコーディングする核酸分子。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸分子が挿入された発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載の発現ベクターが形質感染した宿主細胞株。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片を有効成分として含む癌の予防または治療用薬学組成物。
【請求項１４】
前記癌は、胃癌、肝臓癌、膠細胞腫、卵巣癌、大膓癌、頭頸部癌、膀胱癌、腎細胞癌、乳癌、転移癌、前立腺癌、膵臓癌、黒色腫または肺癌である、請求項１３に記載の薬学組成物。
【請求項１５】
請求項７に記載の抗体または抗原結合断片を有効成分として含む癌の予防または治療用薬学組成物。
【請求項１６】
前記癌は、胃癌、肝臓癌、膠細胞腫、卵巣癌、大膓癌、頭頸部癌、膀胱癌、腎細胞癌、乳癌、転移癌、前立腺癌、膵臓癌、黒色腫または肺癌である、請求項１５に記載の薬学組成物。
【請求項１７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片；および薬物を含む抗体−薬物結合体。
【請求項１８】
請求項７に記載の抗体または抗原結合断片；および薬物を含む抗体−薬物結合体。
【請求項１９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片を個体に投与するステップを含む癌の予防または治療方法。
【請求項２０】
請求項７に記載の抗体または抗原結合断片を個体に投与するステップを含む癌の予防または治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、調節Ｔ細胞の表面に存在する抗原であるＬｒｉｇ−１（ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎｓ１）タンパク質のエピトープとこれに特異的に結合する抗体または抗原結合断片に関する。
【背景技術】
【０００２】
すべての正常個体において最も重要な特性の一つは、自己（ｓｅｌｆ）を構成している抗原物質に対しては有害と反応しないのに対し、非自己（ｎｏｎ−ｓｅｌｆ）抗原に対してはこれを認識し除去できる能力を有することである。このように自己抗原に対する生体の無反応を免疫学的無反応性（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｕｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ）または寛容（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）という。自己寛容は、自己抗原の特異的な受容体を持っているかもしれないリンパ球を除去することにより、または自己抗原に接した後、自ら反応する機能が不活性化することから発生する。自己寛容を誘導したり維持し続ける上で問題が生じると、自己抗原に対して免疫反応が起こり、これによってもたらされる疾患を自己免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）という。
【０００３】
前記自己免疫疾患の治療のために、１９７０年代初めにＧｅｒｓｈｏｎによって従来のＴ細胞（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）の効果機能（ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を制御および抑制できるＴ細胞の存在の可能性がある抑制Ｔ細胞という概念を導入して、最初に提示されて以来（Ｒ．Ｋ．Ｇｅｒｓｈｏｎ  ａｎｄ  Ｋ．Ｋｏｎｄｏ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９７０，１８：７２３−３７）、免疫学の多くの分野で調節Ｔ細胞の生物学的特性および機能を究明するための研究が行われてきている。
【０００４】
これによって、前記調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、過剰な炎症と免疫反応の発生を自然的に防止する重要な役割を果たすが、自己免疫疾患と慢性炎症疾患が発生する場合、調節Ｔ細胞の機能と数字が著しく減少することが報告された。したがって、免疫疾患と炎症疾患がある患者の場合、調節Ｔ細胞が正常な水準に生成されることが重要であり、これは前記疾患の治療法の一つになり得る。
【０００５】
現在まで調節Ｔ細胞に特異的に存在する遺伝子およびタンパク質に関する研究が行われ、ＣＤ２５、ＣＴＬＡ４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ３８、ＣＤ１０３、ＧＩＴＲおよびＣＤ４５ＲＢなどの物質が標識物質に相当できるとされているものの、まだ調節Ｔ細胞のみを単独で標的化できる遺伝子およびタンパク質は存在しない。
【０００６】
一方、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、以下、「ＣＤＲ」という）と呼ばれる３個の多変可能な領域および４個の構造領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ）を含む。前記ＣＤＲは、主に抗原の抗原決定基（ｅｐｉｔｏｐｅ）に結合する役割を果たす。それぞれの鎖のＣＤＲは、典型的にＮ−末端からはじまって、順次に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と称し、また、特定のＣＤＲが位置している鎖によって識別される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の一つの目的は、調節Ｔ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ、Ｔｒｅｇ  ｃｅｌｌ）の表面に存在するＬｒｉｇ−１（ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎｓ１）タンパク質のエピトープを提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的は、前記エピトープに特異的に結合できる抗体または抗原結合断片を提供することである。
【０００９】
本発明のさらに他の目的は、前記エピトープに特異的に結合できる抗体または抗原結合断片を含む癌の予防または治療用薬学組成物を提供することである。
【００１０】
本発明のさらに他の目的は、前記エピトープに特異的に結合できる抗体または抗原結合断片を用いて癌を予防または治療する方法を提供することである。
【００１１】
しかし、本発明がなそうとする技術的課題は、以上に述べた課題に制限されず、述べていないさらに他の課題は、以下の記載から当業界における通常の知識を有する者に明確に理解されるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、Ｌｒｉｇ−１（ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎｓ１）タンパク質のエピトープまたは前記エピトープに特異的に結合する抗体または抗原結合断片に関する。
【００１３】
本発明において、前記「Ｌｒｉｇ−１タンパク質」は、調節Ｔ細胞の表面に存在する膜貫通タンパク質であって、細胞外あるいはルーメン側のロイシン反復配列（ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｒｅｐｅａｔ（ＬＲＲ））と３つの免疫グロブリン類似ドメイン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎｓ）、細胞膜貫通配列および細胞質尾部から構成されている。ＬＲＩＧ遺伝子ファミリーはＬＲＩＧ１、ＬＲＩＧ２とＬＲＩＧ３が存在し、これらの間のアミノ酸は非常に保全的に構成されている。前記ＬＲＩＧ１遺伝子は正常皮膚で高く発現しており、基底と毛嚢細胞に発現して上皮幹細胞の増殖を調節することができる。したがって、表皮の恒常性の維持に重要な役割をし、不存在の場合、乾癬や皮膚癌に発展しうる。ＬＲＩＧ１が位置した染色体３ｐ１４．３部分が切断される場合には癌細胞に発展する可能性があると報告されており、実際に腎臓癌（ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）と扁平上皮癌（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）ではＬＲＩＧ１の発現が非常に減少していることが確認された。ところが、最近は、前記Ｌｒｉｇ−１を発現する癌は２０〜３０％程度に過ぎないことが究明されている。一方、本発明の目的上、前記Ｌｒｉｇ−１タンパク質は、ヒトまたはマウスに存在するタンパク質であってもよいが、これに限定されるものではない。
【００１４】
本発明の一例において、前記Ｌｒｉｇ−１タンパク質は、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類などを含む哺乳類に由来するＬｒｉｇ−１タンパク質であってもよい。
【００１５】
本発明の一例において、前記Ｌｒｉｇ−１タンパク質は、配列番号１で表されるヒト由来Ｌｒｉｇ−１タンパク質であってもよく、これは配列番号２で表される核酸配列によってコーディングされてもよいが、これに限定されるものではない（表１参照）。
【００１６】
【表１】
2021523703.tif 000003
2021523703.tif 000004
【００１７】
本発明の他の例において、前記Ｌｒｉｇ−１タンパク質は、配列番号３で表されるマウス由来Ｌｒｉｇ−１タンパク質であってもよいが、これに限定されるものではない（表２参照）。
【００１８】
【表２】
2021523703.tif 000005
【００１９】
本発明の一実施形態によれば、前記Ｌｒｉｇ−１タンパク質のエピトープであって、下記式１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むエピトープを提供する：
【００２０】
［式１］
Ｌｘ１Ｌｘ２ｘ３Ｎ
前記式１中、
ｘ１〜ｘ３は、それぞれ独立して、中性アミノ酸、酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸または芳香族アミノ酸であってもよい。ここで、前記中性アミノ酸は、グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ；Ｇ）、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ；Ａ）、バリン（ｖａｌｉｎｅ、Ｖ）、ロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ、Ｌ）、イソロイシン（ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ、Ｉ）、セリン（ｓｅｒｉｎｅ、Ｓ）またはトレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ、Ｔ）であってもよく、前記酸性アミノ酸は、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ；Ｄ）、グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ；Ｅ）、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ；Ｎ）またはグルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ；Ｑ）であってもよいし、前記塩基性アミノ酸は、リシン（ｌｙｓｉｎｅ、Ｋ）、アルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ；Ｒ）またはヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｈ）であってもよく、前記芳香族アミノ酸は、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ；Ｆ）またはチロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ；Ｙ）であってもよい。
【００２１】
本発明の一例として、前記ｘ１〜ｘ３は、それぞれ独立して、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ；Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ；Ｄ）、セリン（ｓｅｒｉｎｅ；Ｓ）、チロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ；Ｙ）、アルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ；Ｒ）、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ；Ｆ）、リシン（ｌｙｓｉｎｅ、Ｋ）、ヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｈ）、ロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ、Ｌ）、バリン（ｖａｌｉｎｅ、Ｖ）、トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ、Ｔ）、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ；Ａ）、グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ；Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ；Ｅ）およびグリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ；Ｇ）からなる群より選択されるアミノ酸であってもよい。
【００２２】
本発明の他の例として、前記ｘ１は、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ；Ｎ）、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ；Ｆ）、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ；Ｄ）、リシン（ｌｙｓｉｎｅ、Ｋ）、ヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｈ）、バリン（ｖａｌｉｎｅ、Ｖ）、アルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ；Ｒ）およびトレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ、Ｔ）からなる群より選択されるアミノ酸であり、前記ｘ２は、セリン（ｓｅｒｉｎｅ；Ｓ）、グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ；Ｑ）、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ；Ａ）、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ；Ｎ）、グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ；Ｅ）、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ；Ｄ）、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ；Ｆ）およびグリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ；Ｇ）からなる群より選択されるアミノ酸であり、前記ｘ３は、チロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ；Ｙ）、ヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｈ）、グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ；Ｇ）、アルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ；Ｒ）、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ；Ｎ）、ロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ、Ｌ）、リシン（ｌｙｓｉｎｅ、Ｋ）およびフェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ；Ｆ）からなる群より選択されるアミノ酸であってもよい。
【００２３】
本発明のさらに他の例として、前記ｘ１〜ｘ３は、それぞれ独立して、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ；Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ；Ｄ）、セリン（ｓｅｒｉｎｅ；Ｓ）、チロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ；Ｙ）およびアルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ；Ｒ）からなる群より選択されるアミノ酸であってもよい。
【００２４】
本発明のさらに他の例として、前記ｘ１は、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ；Ｎ）またはアスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ；Ｄ）であり、前記ｘ２は、セリン（ｓｅｒｉｎｅ；Ｓ）またはアスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ；Ｎ）であり、前記ｘ３は、チロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ；Ｙ）またはアルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ；Ｒ）であってもよい。
【００２５】
本発明において、前記エピトープは、前記式１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むもので、１０〜２０ｍｅｒ、好ましくは１０〜１５ｍｅｒ、より好ましくは１１〜１４ｍｅｒからなってもよい。
【００２６】
また、本発明において、前記エピトープにおける前記式１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、前記エピトープのＮ−ターミナルから３〜６番目、好ましくは４〜６番目、より好ましくは５番目に位置してもよい。
【００２７】
本発明の一例として、前記式１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、下記表３の配列番号４〜１７のいずれか１つのアミノ酸配列で表されてもよいが、これに限定されるものではない：
【００２８】
【表３】
2021523703.tif 000006
【００２９】
本発明の他の例として、前記エピトープは、配列番号１８または２０のアミノ酸配列で表されてもよいが、これに限定されるものではない。
【００３０】
本発明の他の実施形態によれば、前記Ｌｒｉｇ−１タンパク質のエピトープであって、下記表４の配列番号１８〜２９のいずれか１つのアミノ酸配列で表されるポリペプチドを含むエピトープを提供する：
【００３１】
【表４】
2021523703.tif 000007
【００３２】
本発明の他の実施形態によれば、本発明で提供する前記エピトープをコーディングする核酸分子を提供する。
【００３３】
本発明の核酸分子は、本発明で提供するポリペプチドのアミノ酸配列を、当業者に知られているように、ポリヌクレオチド配列に翻訳された核酸分子のすべてを含む。そのため、ＯＲＦ（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）による多様なポリヌクレオチド配列が製造可能であり、これもすべて本発明の核酸分子に含まれる。
【００３４】
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明で提供する前記単離された核酸分子が挿入された発現ベクターを提供する。
【００３５】
本発明において、前記「ベクター」は、ある核酸分子が連結された他の核酸を輸送できる前記核酸分子である。ベクターの一類型は、追加的なＤＮＡセグメントが結紮できる円形二重鎖ＤＮＡを指す「プラスミド」である。また、他の類型のベクターはファージベクターである。さらに他の類型のベクターはウイルス性ベクターで、追加的なＤＮＡセグメントがウイルスゲノムに結紮できる。あるベクターは、それらが流入した宿主細胞で自律的な複製が可能である（例えば、バクテリア性ベクターはバクテリア性複製起源を有するエピソーム哺乳類ベクター）。その他のベクター（例えば、非−エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞に流入しながら宿主細胞のゲノムに統合され、それによって、宿主ゲノムとともに複製される。それだけでなく、あるベクターは、これらが作動レベルで連結された遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターは、本願において、「組換え発現ベクター」または単に「発現ベクター」と名付けられる。一般的に、組換えＤＮＡ手法で有用な発現ベクターは、たびたびプラスミドの形態で存在する。本明細書において、「プラスミド」と「ベクター」は、プラスミドがベクターのうち最も通常使用される形態であるため、相互交換して使用可能である。
【００３６】
本発明において、前記発現ベクターの具体例としては、商業的に広く使用されるｐＣＤＮＡベクター、Ｆ、Ｒ１、ＲＰ１、Ｃｏｌ、ｐＢＲ３２２、ＴｏＬ、Ｔｉベクター；コスミド；ラムダ、ラムダ状（ｌａｍｂｄｏｉｄ）、Ｍ１３、Ｍｕ、ｐ１  Ｐ２２、Ｑμμ、Ｔ−ｅｖｅｎ、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ７などのファージ；植物ウイルスからなる群より選択できるが、これに限定されるものではなく、当業者に発現ベクターとして知られたすべての発現ベクターは本発明に使用可能であり、発現ベクターを選択する時には目的とする宿主細胞の性質による。宿主細胞へのベクターの導入時、リン酸カルシウムトランスフェクション、ウイルス感染、ＤＥＡＥ−デキストラン調節トランスフェクション、リポフェクタミントランスフェクションまたは電気穿孔法によって行われるが、これに限定されるものではなく、当業者は使用する発現ベクターおよび宿主細胞に適した導入方法を選択して用いることができる。好ましくは、ベクターは、１つ以上の選別マーカーを含むが、これに限定されず、選別マーカーを含まないベクターを用いて生産物の生産の有無によって選別可能である。選別マーカーの選択は、目的とする宿主細胞によって選別され、これはすでに当業者に知られた方法を利用するので、本発明はこれに制限を設けない。
【００３７】
本発明の核酸分子を、精製を容易にするために、タグ配列を発現ベクター上に挿入して融合させることができる。前記タグとしては、ヘキサ−ヒスチジンタグ、ヘマグルチニンタグ、ｍｙｃタグまたはｆｌａｇタグを含むが、これに限定されるものではなく、当業者に知られた精製を容易にするタグはすべて本発明で利用可能である。
【００３８】
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明で提供する前記発現ベクターが形質感染した宿主細胞株を提供する。
【００３９】
本発明において、前記「宿主細胞」には、ポリペプチド挿入物の組込みのためのベクターのレシピエント（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）であり得るか、またはレシピエントであった個別的な細胞または細胞培養物が含まれる。宿主細胞には単一宿主細胞の子孫が含まれ、前記子孫は自然的な、偶発的なまたは故意の突然変異のために必ずしも元の親細胞と完全に同一（形態学上またはゲノムＤＮＡ補完体において）でなくてもよい。宿主細胞には、本願のポリペプチドで体内で形質注入された細胞が含まれる。
【００４０】
本発明において、前記宿主細胞としては、哺乳動物、植物、昆虫、菌類または細胞性起源の細胞を含むことができ、例えば、大膓菌、ストレプトミセス、サルモネラティフィムリウムなどのバクテリア細胞；酵母細胞、ピキアパストリスなどの菌類細胞；ドロソフィラ、スポドプテラＳｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞、Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌｓ）、ＳＰ２／０（マウス骨髄腫）、ヒトリンパ芽球（Ｈｕｍａｎ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ）、ＣＯＳ、ＮＳＯ（マウス骨髄腫）、２９３Ｔ、ボウズメラノーマ細胞、ＨＴ−１０８０、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓細胞、Ｂａｂｙ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌｓ）、ＨＥＫ（ヒト胚腎臓細胞、Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌｓ）またはＰＥＲＣ．６（ヒト網膜細胞）の動物細胞；または植物細胞であってもよいが、これに限定されるものではなく、当業者に知られた宿主細胞株として使用可能な細胞はすべて利用可能である。
【００４１】
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明のエピトープに特異的に結合する抗体または抗原結合断片を提供する。
【００４２】
また、本発明による抗体は、調節Ｔ細胞上に存在するＬｒｉｇ−１タンパク質のうち、前記式１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むエピトープ；または配列番号１８〜２９のいずれか１つのアミノ酸配列で表されるポリペプチドを含むエピトープに特異的に結合して前記調節Ｔ細胞の機能を抑制し、エフェクターＴ細胞の活性は維持あるいは上昇させて、癌細胞の中でも特に固形癌細胞の成長を効果的に抑制することができる。
【００４３】
本発明において、前記「癌」は、哺乳類において典型的に調節されない細胞成長で特徴づけられた生理的状態を示すか、指す。本発明において、予防、改善または治療の対象になる癌は、固形臓器（ｓｏｌｉｄ  ｏｒｇａｎ）で異常に細胞が成長して発生した塊からなる固形癌（ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒ）であってもよく、固形臓器の部位によって、胃癌、肝臓癌、膠細胞腫、卵巣癌、大膓癌、頭頸部癌、膀胱癌、腎細胞癌、乳癌、転移癌、前立腺癌、膵臓癌、黒色腫または肺癌などであってもよいが、これに限定されるものではない。
【００４４】
本発明において、前記抗体は、全長抗体（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）または抗体の一部分であって、Ｌｒｉｇ−１タンパク質に結合する能力を有し、本発明の結合分子と競争的にＬｒｉｇ−１抗原決定部位に結合する抗体断片のすべてを含む。
【００４５】
本発明において、前記「抗体」は、免疫学的に特定抗原と反応性を有する免疫グロブリン分子を含む、抗原を特異的に認識する受容体の役割を果たすタンパク質分子を意味する。本発明の目的上、前記抗原は、調節Ｔ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ）の表面に存在するＬｒｉｇ−１タンパク質であってもよい。好ましくは、前記Ｌｒｉｇ−１タンパク質のロイシンリッチ部位（Ｌｅｕｃｉｎｅ  Ｒｉｃｈ  Ｒｅｇｉｏｎ）または免疫グロブリン類似ドメインを特異的に認識するものであってもよいが、これに限定されない。
【００４６】
本発明において、前記「免疫グロブリン」は、重鎖および軽鎖を有し、それぞれの重鎖および軽鎖は、不変領域および可変領域を含む。軽鎖および重鎖の可変領域は、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、以下、「ＣＤＲ」という）と呼ばれる３個の多変可能な領域および４個の構造領域（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ）を含む。前記ＣＤＲは、主に抗原の抗原決定基（Ｅｐｉｔｏｐｅ）に結合する役割を果たす。それぞれの鎖のＣＤＲは、典型的にＮ−末端からはじまって、順次に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と称し、また、特定のＣＤＲが位置している鎖によって識別される。
【００４７】
本発明において、前記「全長抗体」は、２個の全長の軽鎖および２個の全長の重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は、重鎖とジスルフィド（Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）結合で連結されており、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、およびＩｇＧを含む。前記ＩｇＧはその亜型（ｓｕｂｔｙｐｅ）で、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む。
【００４８】
また、本発明において、前記「抗原結合断片」は、抗原結合機能を保有している断片を意味し、抗原結合断片の例は、（ｉ）軽鎖の可変領域（ＶＬ）および重鎖の可変領域（ＶＨ）と軽鎖の不変領域（ＣＬ）および重鎖の１番目の不変領域（ＣＨ１）からなるＦａｂ断片；（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｉｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４−５４６（１９８９）］；（ｖ）分離されたＣＤＲ領域；（ｖｉ）２個の連結されたＦａｂ断片を含む２価の断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｖｉｉ）ＶＨドメインおよびＶＬドメインが抗原結合部位を形成するように結合させるペプチドリンカーによって結合した単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）；（ｖｉｉｉ）二特異的な単鎖Ｆｖ二量体および（ｉｘ）遺伝子の融合によって作製された多価または多特異的な断片であるダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）などを含む。前記抗原結合断片は、タンパク質加水分解酵素、例えば、パパインまたはペプシンを用いる場合、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２の断片を得ることができ、遺伝子組換え技術により作製することができる。
【００４９】
また、本発明において、前記抗体は、単クローン抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、多クローン抗体（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、キメラ抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）、両特異性分子、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ドメイン抗体、二重特異的抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、抗体模倣体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）またはその断片であってもよいが、これに限定されるものではない。
【００５０】
また、本発明において、前記「単クローン抗体」は、実質的に同一の抗体集団で得た単一分子組成の抗体分子を称するもので、特定の抗原決定基（Ｅｐｉｔｏｐｅ）に対して単一結合特異性および親和度を示す。
【００５１】
本発明において、前記「キメラ抗体」は、マウス抗体の可変領域およびヒト抗体の不変領域を組換えた抗体であって、マウス抗体に比べて免疫反応が大きく改善された抗体である。
【００５２】
また、本発明において、前記「ヒト化抗体」は、ヒトでない種に由来する抗体のタンパク質配列をヒトで自然的に生産された抗体変異体と類似するように変形させた抗体を意味する。その例として、前記ヒト化抗体は、マウス由来のＣＤＲをヒト抗体由来のＦＲと組換えてヒト化可変領域を製造し、これを好ましいヒト抗体の不変領域と組換えてヒト化抗体を製造することができる。
【００５３】
本発明において、前記「結合」または「特異的結合」は、本願の抗体または抗体組成物の抗原に対する親和度を示すものである。抗原抗体結合における「特異的結合」は、典型的に解離定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ、Ｋｄ）が１×１０−５Ｍ未満または１×１０−６Ｍ未満または１×１０−７Ｍ未満の場合、非特異的な背景結合と区分される。特異的結合は、当業界における公知の方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）、免疫沈殿（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、共沈殿（ｃｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）などの方法で検出可能であり、非特異的結合と特異的結合を区分できる適切な対照群を含む。
【００５４】
本発明の抗体または抗原結合断片は、単量体の抗原結合能の少なくとも一部を含む二量体、三量体、四量体、五量体などの多量体で存在できる。このような多量体はまた、同種多量体、または異種多量体を含むものである。抗体多量体は、多数の抗原結合部位を含むため、単量体と比較して抗原に対する結合能に優れている。抗体の多量体はさらに、多機能性（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ、ｔｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ、ｔｅｔｒａｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）抗体の作製にも容易である。
【００５５】
本発明において、前記「多機能性」とは、２種以上の活性または機能（例えば、抗原結合能、酵素活性、リガンドまたは受容体結合能）を有する抗体または抗原結合断片を称するもので、例えば、本発明の抗体は、酵素活性を有するポリペプチド、例えば、ルシフェラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、ガラクトシダーゼなどと結合できる。多機能性抗体はさらに、多価性（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）または多特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ、ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃなど）形態の抗体を含む。
【００５６】
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明で提供する抗体または抗原結合断片；および薬物を含む抗体−薬物結合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）を提供する。
【００５７】
本発明において、前記「抗体−薬物結合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）」とは、抗体と薬物の生物学的活性を低下させることなく薬物と抗体を化学的に連結した形態を指す。本発明において、前記抗体−薬物結合体は、抗体の重鎖および／または軽鎖のＮ−末端のアミノ酸残基に薬物が結合した形態、具体的には、抗体の重鎖および／または軽鎖のＮ−末端、α−アミン基に薬物が結合した形態をいう。
【００５８】
本発明において、前記「薬物」は、細胞に特定の生物学的活性を有する任意の物質を意味することができ、これはＤＮＡ、ＲＮＡまたはペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ）を含む概念である。前記薬物は、α−アミン基と反応して架橋できる反応基を含む形態であってもよいし、α−アミン基と反応して架橋できる反応基を含むリンカーが連結されている形態も含む。
【００５９】
本発明において、前記α−アミン基と反応して架橋できる反応基の例としては、抗体の重鎖または軽鎖のＮ−末端のα−アミン基と反応して架橋できれば、その種類は特に限定されず、当業界で公知のアミン基と反応する種類をすべて含む。その例として、イソチオシアネート（Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、イソシアネート（Ｉｓｏｃｙａｎａｔｅｓ）、アシルアジド（Ａｃｙｌ  ａｚｉｄｅ）、ＮＨＳエステル（ＮＨＳ  ｅｓｔｅｒ）、スルホニルクロライド（Ｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、アルデヒド（Ａｌｄｅｈｙｄｅ）、グリオキサール（Ｇｌｙｏｘａｌ）、エポキシド（Ｅｐｏｘｉｄｅ）、オキシラン（Ｏｘｉｒａｎｅ）、カーボネート（Ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、アリールハライド（Ａｒｙｌ  ｈａｌｉｄｅ）、イミドエステル（Ｉｍｉｄｏｅｓｔｅｒ）、カルボイミド（Ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）、アンハイドライド（Ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）およびフルオロフェニルエステル（Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｅｓｔｅｒ）のいずれか１つであってもよいが、これに限定されるものではない。
【００６０】
本発明において、抗体−薬物結合体は、前記抗体または抗原結合断片として、本発明のエピトープ、すなわち、Ｌｒｉｇ−１タンパク質のうち、前記式１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むエピトープ；または配列番号１８〜２９のいずれか１つのアミノ酸配列で表されるエピトープに特異的に結合する抗体または抗原結合断片を含み、この時、前記薬物は、Ｌｒｉｇ−１抗体が標的とする疾患である、癌を治療できる薬物で抗癌剤であってもよい。
【００６１】
本発明において、前記抗癌剤は、癌の予防、改善または治療のために使用される薬物であれば制限なく含まれるが、例えば、ナイトロジェンマスタード、イマチニブ、オキサリプラチン、リツキシマブ、エルロチニブ、ネラチニブ、ラパチニブ、ゲフィチニブ、バンデタニブ、ニロチニブ、セマサニブ、ボスチニブ、アキシチニブ、セジラニブ、レスタウルチニブ、トラスツズマブ、ゲフィチニブ、ボルテゾミブ、スニチニブ、カルボプラチン、ソラフェニブ、ベバシズマブ、シスプラチン、セツキシマブ、ヴィスクム・アルブム、アスパラギナーゼ、トレチノイン、ヒドロキシカルバミド、ダサチニブ、エストラムスチン、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、イブリツモマブ・チウキセタン、ヘプタプラチン、メチルアミノレブリン酸、アムサクリン、アレムツズマブ、プロカルバジン、アルプロスタジル、硝酸ホルミウムキトサン、ゲムシタビン、ドキシフルリジン、ペメトレキセド、テガフール、カペシタビン、ギメラシン、オテラシル、アザシチジン、メトトレキサート、ウラシル、シタラビン、フルオロウラシル、フルダラビン、エノシタビン、フルタミド、カペシタビン、デシタビン、メルカプトプリン、チオグアニン、クラドリビン、カルモフール、ラルチトレキセド、ドセタキセル、パクリタキセル、イリノテカン、ベロテカン、トポテカン、ビノレルビン、エトポシド、ビンブラスチン、イダルビシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ピラルビシン、アクラルビシン、ペプロマイシン、テムシロリムス、テモゾロミド、ブスルファン、イホスファミド、シクロホスファミド、メルファラン、アルトレタミン、ダカルバジン、チオテパ、ニムスチン、クロラムブシル、ミトラクトール、レウコボリン、トレトニン、エキセメスタン、アミノグルテチミド、アナグレリド、オラパリブ、ナベルビン、ファドロゾール、タモキシフェン、トレミフェン、テストラクトン、アナストロゾール、レトロゾール、ボロゾール、ビカルタミド、ロムスチン、５ＦＵ、ボリノスタット、エンチノスタットおよびカルムスチンからなる群より選択可能であり、これに限定されるものではない。
【００６２】
本発明において、前記癌は、固形臓器（ｓｏｌｉｄ  ｏｒｇａｎ）で異常に細胞が成長して発生した塊からなる固形癌（ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒ）であってもよく、具体例として、固形臓器の部位によって、胃癌、肝臓癌、膠細胞腫、卵巣癌、大膓癌、頭頸部癌、膀胱癌、腎細胞癌、乳癌、転移癌、前立腺癌、膵臓癌、黒色腫または肺癌などであってもよいが、これに限定されるものではない。
【００６３】
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明で提供する抗体または抗原結合断片；または抗体−薬物結合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）を有効成分として含む癌の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【００６４】
本発明において、前記薬学組成物から有効成分として含む抗体または抗原結合断片；またはこれに薬物が結合した抗体−薬物結合体は、調節Ｔ細胞上に存在するＬｒｉｇ−１タンパク質のうち、前記式１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むエピトープ；または配列番号１８〜２９のいずれか１つのアミノ酸配列で表されるポリペプチドを含むエピトープに特異的に結合して前記調節Ｔ細胞の機能を抑制し、エフェクターＴ細胞の活性は維持あるいは上昇させて、癌細胞の中でも特に固形癌細胞の成長を効果的に抑制することができる。
【００６５】
本発明において、前記癌は、固形臓器（ｓｏｌｉｄ  ｏｒｇａｎ）で異常に細胞が成長して発生した塊からなる固形癌（ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒ）であってもよく、具体例として、固形臓器の部位によって、胃癌、肝臓癌、膠細胞腫、卵巣癌、大膓癌、頭頸部癌、膀胱癌、腎細胞癌、乳癌、転移癌、前立腺癌、膵臓癌、黒色腫または肺癌などであってもよいが、これに限定されるものではない。
【００６６】
一方、本発明において、「予防」は、本発明の薬学組成物を用いて疾患の症状を遮断するか、その症状を抑制または遅延させるすべての行為であれば制限なく含むことができる。
【００６７】
また、本発明において、「治療」は、本発明の薬学組成物を用いて疾患の症状が好転するか、有利になるすべての行為であれば制限なく含むことができる。
【００６８】
本発明において、前記薬学組成物は、カプセル、錠剤、顆粒、注射剤、軟膏剤、粉末または飲料形態であることを特徴とし、前記薬学組成物は、ヒトを対象にすることを特徴とすることができる。
【００６９】
本発明において、前記薬学組成物はこれらに限定されるものではないが、それぞれ通常の方法によって、散剤、顆粒剤、カプセル、錠剤、水性懸濁液などの経口型剤形、外用剤、坐剤および滅菌注射溶液の形態に剤形化して使用できる。本発明の薬学組成物は、薬学的に許容可能な担体を含むことができる。薬学的に許容される担体は、経口投与時には、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを使用することができ、注射剤の場合には、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤などを混合して使用することができ、局所投与用の場合には、基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを使用することができる。本発明の薬学組成物の剤形は、上述のような薬剤学的に許容される担体と混合して多様に製造可能である。例えば、経口投与時には、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル（ｅｌｉｘｉｒ）、サスペンション、シロップ、ウエハなどの形態に製造することができ、注射剤の場合には、単位投薬アンプルまたは複数回投薬形態に製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、カプセル、徐放型製剤などに剤形化することができる。
【００７０】
一方、製剤化に適した担体、賦形剤および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレートまたは鉱物油などが使用できる。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などを追加的に含んでもよい。
【００７１】
本発明において、前記薬学組成物の投与経路はこれらに限定されるものではないが、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髓内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下または直腸が含まれる。経口または非経口投下が好ましい。
【００７２】
本発明において、前記「非経口」とは、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、硬膜内、病巣内および頭蓋骨内注射または注入技術を含む。本発明の薬学組成物はさらに、直腸投与のための坐剤の形態で投与可能である。
【００７３】
本発明の前記薬学組成物は、使用された特定化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康、性別、定式、投与時間、投与経路、排出率、薬物配合および予防または治療される特定疾患の重症を含んだ様々な要因によって多様に変化可能であり、前記薬学組成物の投与量は、患者の状態、体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路および期間によって異なるが、当業者によって適宜選択可能であり、１日０．０００１〜５０ｍｇ／ｋｇまたは０．００１〜５０ｍｇ／ｋｇ投与することができる。投与は、１日に１回投与してもよく、数回分けて投与してもよい。前記投与量は、いかなる面でも本発明の範囲を限定するものではない。本発明による医薬組成物は、丸剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤に剤形化可能である。
【００７４】
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明による抗体または抗原結合断片；または抗体−薬物結合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）を個体に投与するステップを含む癌の予防または治療方法に関する。
【００７５】
本発明の抗体または抗原結合断片；および抗体−薬物結合体は、調節Ｔ細胞上に存在するＬｒｉｇ−１タンパク質のうち、前記式１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むエピトープ；または配列番号１８〜２９のいずれか１つのアミノ酸配列で表されるポリペプチドを含むエピトープに特異的に結合して前記調節Ｔ細胞の機能を抑制し、エフェクターＴ細胞の活性は維持あるいは上昇させて、癌細胞の中でも特に固形癌細胞の成長を効果的に抑制することができる。
【００７６】
本発明において、前記「個体」は、癌の発病が疑われる個体であって、前記癌発病の疑われる個体は、当該疾患が発病したか発病しうるヒトを含むネズミ、家畜などを含む哺乳動物を意味するが、本発明の抗体または抗体−薬物結合体で治療可能な個体は制限なく含まれる。
【００７７】
本発明の方法は、抗体または抗体−薬物結合体を薬学的有効量で投与することを含むことができる。好適な１日の総使用量は正しい医学的判断範囲内で処置医師によって決定可能であり、１回または数回に分けて投与することができる。しかし、本発明の目的上、特定患者に対する具体的な治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、場合によっては、他の製剤が使用されるか否かをはじめとする具体的組成物、患者の年齢、体重、一般健康状態、性別および食事、投与時間、投与経路および組成物の分泌率、治療期間、具体的組成物とともに使用されるか同時使用される薬物をはじめとする多様な因子と医薬分野でよく知られた類似因子によって異なって適用することが好ましい。
【００７８】
一方、これに限定されないが、前記癌の予防または治療方法は、１つ以上の癌疾患に対する治療的活性を有する化合物または物質を投与することをさらに含む併用療法であってもよい。
【００７９】
本発明において、前記「併用」は、同時、個別または順次投与を示すと理解されなければならない。前記投与が順次または個別的な場合、２次成分投与の間隔は、前記併用の有利な効果を失わないようにするものでなければならない。
【００８０】
本発明において、前記抗体または抗体−薬物結合体の投与用量は、患者の体重１ｋｇあたり約０．０００１μｇ〜５００ｍｇであってもよいが、これに限定されるものではない。
【００８１】
本発明において、前記癌は、固形臓器（ｓｏｌｉｄ  ｏｒｇａｎ）で異常に細胞が成長して発生した塊からなる固形癌（ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒ）であってもよく、具体例として、固形臓器の部位によって、胃癌、肝臓癌、膠細胞腫、卵巣癌、大膓癌、頭頸部癌、膀胱癌、腎細胞癌、乳癌、転移癌、前立腺癌、膵臓癌、黒色腫または肺癌などであってもよいが、これに限定されるものではない。
【発明の効果】
【００８２】
本発明によるＬｒｉｇ−１タンパク質のエピトープに特異的に結合する抗体または抗原結合断片は、調節Ｔ細胞上に存在する本発明のエピトープに特異的に結合して前記調節Ｔ細胞の機能を抑制し、エフェクターＴ細胞の活性は維持あるいは上昇させて、癌細胞の中でも特に固形癌細胞の成長を効果的に抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】本発明の一実施例によるＬｒｉｇ−１タンパク質の構造を示す図である。
【図２】本発明の一実施例によるＬｒｉｇ−１タンパク質の構造を示す図である。
【図３】本発明の一実施例によるＬｒｉｇ−１  ｍＲＮＡの発現程度を示す図である。
【図４】本発明の一実施例によるＬｒｉｇ−１  ｍＲＮＡの発現程度を示す図である。
【図５】本発明の一実施例によるＬｒｉｇ−１  ｍＲＮＡの発現程度を示す図である。
【図６】本発明の一実施例によるＬｒｉｇ−１、Ｌｒｉｇ−２およびＬｒｉｇ−３  ｍＲＮＡの発現程度を示す図である。
【図７】本発明の一実施例による調節Ｔ細胞と非調節Ｔ細胞内のＬｒｉｇ−１タンパク質の発現量の比較結果を示す図である。
【図８】本発明の一実施例による調節Ｔ細胞の表面にＬｒｉｇ−１タンパク質の発現を示す図である。
【図９】本発明の一実施例において抗体（Ａ７、Ｃ８、Ｅ７、Ｇ３、Ａ８、Ｂ８、Ｄ９およびＨ６）とＬｒｉｇ−１タンパク質に対する結合力を分析した結果を示す図である。
【図１０】本発明の一実施例においてＬｒｉｇ−１タンパク質に特異的な単クローン抗体（Ａ７、Ｃ８、Ｅ７、Ｇ３、Ａ８、Ｂ８、Ｄ９およびＨ６）と調節Ｔ細胞内におけるＬｒｉｇ−１タンパク質誘導Ｓｔａｔ３リン酸化調節機序を分析した結果を示す図である。
【図１１】本発明の一実施例においてＬｒｉｇ−１タンパク質に特異的な単クローン抗体（Ａ８、Ｂ８、Ｄ９およびＨ６）を用いた癌治療の実験設計図を示す図である。
【図１２】本発明の一実施例においてＬｒｉｇ−１タンパク質に特異的な単クローン抗体（Ａ８、Ｂ８、Ｄ９およびＨ６）を用いた癌治療効果を示す図である。
【図１３】本発明の一実施例においてマイクロアレイを用いてＬｒｉｇ−１タンパク質に対する単クローン抗体（Ｈ６）１０μｇ／ｍｌのエピトープマッピング結果を示す図である。
【図１４】本発明の一実施例においてマイクロアレイを用いてＬｒｉｇ−１タンパク質に対する単クローン抗体（Ｈ６）１００μｇ／ｍｌのエピトープマッピング結果を示す図である。
【図１５】本発明の一実施例においてマイクロアレイを用いてＬｒｉｇ−１タンパク質に対する単クローン抗体（Ｈ６）のエピトープマッピング結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００８４】
本発明は、Ｌｒｉｇ−１（ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎｓ１）タンパク質のエピトープまたは前記エピトープに特異的に結合する抗体または抗原結合断片に関する。
【００８５】
本発明の一実施形態によれば、前記Ｌｒｉｇ−１タンパク質のエピトープであって、下記式１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むエピトープを提供する：
【００８６】
［式１］
Ｌｘ１Ｌｘ２ｘ３Ｎ
前記式１中、
ｘ１〜ｘ３は、それぞれ独立して、中性アミノ酸、酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸または芳香族アミノ酸であってもよい。ここで、前記中性アミノ酸は、グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ；Ｇ）、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ；Ａ）、バリン（ｖａｌｉｎｅ、Ｖ）、ロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ、Ｌ）、イソロイシン（ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ、Ｉ）、セリン（ｓｅｒｉｎｅ、Ｓ）またはトレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ、Ｔ）であってもよく、前記酸性アミノ酸は、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ；Ｄ）、グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ；Ｅ）、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ；Ｎ）またはグルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ；Ｑ）であってもよいし、前記塩基性アミノ酸は、リシン（ｌｙｓｉｎｅ、Ｋ）、アルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ；Ｒ）またはヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｈ）であってもよく、前記芳香族アミノ酸は、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ；Ｆ）またはチロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ；Ｙ）であってもよい。
【００８７】
本発明の一例として、前記ｘ１〜ｘ３は、それぞれ独立して、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ；Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ；Ｄ）、セリン（ｓｅｒｉｎｅ；Ｓ）、チロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ；Ｙ）、アルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ；Ｒ）、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ；Ｆ）、リシン（ｌｙｓｉｎｅ、Ｋ）、ヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｈ）、ロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ、Ｌ）、バリン（ｖａｌｉｎｅ、Ｖ）、トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ、Ｔ）、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ；Ａ）、グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ；Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ；Ｅ）およびグリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ；Ｇ）からなる群より選択されるアミノ酸であってもよい。
【００８８】
本発明の他の例として、前記ｘ１は、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ；Ｎ）、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ；Ｆ）、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ；Ｄ）、リシン（ｌｙｓｉｎｅ、Ｋ）、ヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｈ）、バリン（ｖａｌｉｎｅ、Ｖ）、アルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ；Ｒ）およびトレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ、Ｔ）からなる群より選択されるアミノ酸であり、前記ｘ２は、セリン（ｓｅｒｉｎｅ；Ｓ）、グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ；Ｑ）、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ；Ａ）、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ；Ｎ）、グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ；Ｅ）、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ；Ｄ）、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ；Ｆ）およびグリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ；Ｇ）からなる群より選択されるアミノ酸であり、前記ｘ３は、チロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ；Ｙ）、ヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｈ）、グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ；Ｇ）、アルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ；Ｒ）、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ；Ｎ）、ロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ、Ｌ）、リシン（ｌｙｓｉｎｅ、Ｋ）およびフェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ；Ｆ）からなる群より選択されるアミノ酸であってもよい。
【００８９】
本発明のさらに他の例として、前記ｘ１〜ｘ３は、それぞれ独立して、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ；Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ；Ｄ）、セリン（ｓｅｒｉｎｅ；Ｓ）、チロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ；Ｙ）およびアルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ；Ｒ）からなる群より選択されるアミノ酸であってもよい。
【００９０】
本発明のさらに他の例として、前記ｘ１は、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ；Ｎ）またはアスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ；Ｄ）であり、前記ｘ２は、セリン（ｓｅｒｉｎｅ；Ｓ）またはアスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ；Ｎ）であり、前記ｘ３は、チロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ；Ｙ）またはアルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ；Ｒ）であってもよい。
【００９１】
本発明のさらに他の例として、前記式１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、配列番号４〜１７のいずれか１つのアミノ酸配列で表されてもよいが、これに限定されるものではない。
【００９２】
本発明の他の実施形態によれば、前記Ｌｒｉｇ−１タンパク質のエピトープであって、下記表４の配列番号１８〜２９のいずれか１つのアミノ酸配列で表されるポリペプチドを含むエピトープを提供する。
【００９３】
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明のエピトープに特異的に結合する抗体または抗原結合断片を提供する。
【００９４】
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明で提供する抗体または抗原結合断片を有効成分として含む癌の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【実施例】
【００９５】
以下、実施例を通じて本発明をより詳しく説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないことは当業界における通常の知識を有する者にとって自明であろう。
【００９６】
実施例
【００９７】
［準備例１］Ｔ細胞の亜型細胞の培養
【００９８】
調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）でのみＬｒｉｇ−１タンパク質が発現するかを確認するために、Ｔ細胞の亜型（ｓｕｂｓｅｔ）であるＴｈ０、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７およびｉＴｒｅｇを用意した。前記ｉＴｒｅｇは、自然的に分離したｎＴｒｅｇとは異なり、下記の組成を含む培地で分化を人工的に誘導した細胞を意味する。
【００９９】
Ｔ細胞の亜型はまず、ネズミの脾臓から得たナイーブ（ｎａｉｖｅ）Ｔ細胞を分離した後、ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ｈｙｃｌｏｎｅ、ｌｏｇａｎ、ＵＴ）１０％を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）栄養培地に下記表５の成分をそれぞれさらに含ませて、３７℃、５％ＣＯ２培養器内で７２時間培養によりそれぞれの細胞に分化誘導した。
【０１００】
【表５】
2021523703.tif 000008
【０１０１】
［実施例１］Ｌｒｉｇ−１構造の分析
【０１０２】
調節Ｔ細胞の表面タンパク質であるＬｒｉｇ−１タンパク質に特異的な抗体を作製するために、Ｌｒｉｇ−１タンパク質の細胞外ドメインの３次元立体構造を予測した。
【０１０３】
まず、抗原決定基（Ｅｐｉｔｏｐｅ）の塩基配列予測のためにＬｒｉｇ−１タンパク質の細胞外ドメイン（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ；ＥＣＤ）の構造を確認するために、Ｕｎｉｐｒｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）とＲＣＳＢ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ）ツールを用いて３次元立体構造を予測した後、その結果を図１および２に示した。
【０１０４】
図１に示すように、Ｌｒｉｇ−１タンパク質の細胞外ドメインのうち、Ｌｒｉｇ−ＬＲＲドメイン（アミノ酸配列４１〜４９４番）内にはＬＲＲ１〜ＬＲＲ１５の計１５個のロイシンリッチ部位（Ｌｅｕｃｉｎｅ  ｒｉｃｈ  ｒｅｇｉｏｎ）が存在した。前記ＬＲＲドメインそれぞれは２３〜２７個のアミノ酸から構成され、ロイシンは３〜５個存在した。
【０１０５】
また、図２に示すように、Ｌｒｉｇ−１タンパク質の細胞外ドメインのうち、Ｌｒｉｇ−１タンパク質のアミノ酸配列４９４〜７８１番は免疫グロブリン類似ドメイン（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎ）が３個存在した。
【０１０６】
［実施例２］Ｌｒｉｇ−１  ｍＲＮＡの調節Ｔ細胞での特異的発現の確認
【０１０７】
Ｌｒｉｇ−１タンパク質が調節Ｔ細胞に特異的なバイオマーカー（ｂｉｏｍａｒｋｅｒ）として作用できるかを検証した。
【０１０８】
前記検証のために、ネズミの脾臓からＣＤ４ビーズを通して磁石活性細胞分類機（ｍａｇｎｅｔ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ；ＭＡＣＳ）を用いてＣＤ４＋  Ｔ細胞を分離した。以後、ＣＤ２５抗体を用いて、蛍光活性細胞分類機（ＦＡＣＳ）を用いて調節Ｔ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋  Ｔ）細胞および非調節Ｔ（ＣＤ４＋ＣＤ２５−  Ｔ）細胞を分離した。それぞれの細胞および前記準備例１で分化された細胞はトリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）を用いてｍＲＮＡを抽出した後、ゲノミックＲＮＡは、ｇＤＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、会社で提供したプロトコルによって、ｇＤＮＡを除去した。ｇＤＮＡの除去されたｍＲＮＡは、ＢＤｓｐｒｉｎｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）によりｃＤＮＡに合成した。
【０１０９】
前記ｃＤＮＡでＬｒｉｇ−１  ｍＲＮＡの発現量を定量的に確認するためにリアルタイム重合酵素連鎖反応（ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を行った。
【０１１０】
前記リアルタイム重合酵素連鎖反応は、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて、会社で提供したプロトコルによって、９５℃で３分、６１℃で１５秒、７２℃で３０秒ずつ、４０サイクルの条件で、下記表６のプライマーを用いて行い、相対的な遺伝子発現量は△ＣＴ方法を用いて計算し、ＨＰＲＴを用いて一般化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）して、その結果を図３〜６に示した。
【０１１１】
【表６】
2021523703.tif 000009
【０１１２】
図３に示すように、非調節Ｔ（ＣＤ４＋ＣＤ２５−  Ｔ）細胞に比べて、調節Ｔ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋  Ｔ）細胞でＬｒｉｇ−１の発現が１８．１倍高いことが分かる。これは、従来知られている調節Ｔ細胞のマーカーであるＬａｇ３およびＩｋｚｆ４と比較した時、約１０倍程度発現量が高い水準であった。また、図４および５に示すように、他の種類の免疫細胞に比べて、調節Ｔ細胞、特に誘導された調節Ｔ細胞（ｉＴｒｅｇ）に比べて、自然的に分離した調節Ｔ細胞（ｎＴｒｅｇ）でＬｒｉｇ−１  ｍＲＮＡの発現が著しく高かった。
【０１１３】
また、図６に示すように、Ｌｒｉｇファミリーに相当するＬｒｉｇ−１、Ｌｒｉｇ−２およびＬｒｉｇ−３の中でＬｒｉｇ−１の発現が最も高かった。
【０１１４】
前記結果を通して、本発明によるＬｒｉｇ−１タンパク質は、調節Ｔ細胞、特に自然的に存在する調節Ｔ細胞で特異的に発現することが分かる。
【０１１５】
［実施例３］Ｌｒｉｇ−１タンパク質の調節Ｔ細胞での特異的発現の確認
【０１１６】
Ｌｒｉｇ−１  ｍＲＮＡから発現したＬｒｉｇ−１タンパク質が調節Ｔ細胞でのみ特異的に発現するかを確認した。
【０１１７】
調節Ｔ細胞特異的な転写因子であるＦＯＸＰ３プロモーターにＲＦＰ（Ｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が結合したＦＯＸＰ３−ＲＦＰ注入（Ｋｎｏｃｋ−ｉｎ）ネズミを用いて、前記ネズミの脾臓から、ＣＤ４ビーズで磁石活性細胞分類機（ｍａｇｎｅｔ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ；ＭＡＣＳ）を用いてＣＤ４＋  Ｔ細胞を分離した。以後、ＲＦＰタンパク質を用いて、蛍光活性細胞分類機（ＦＡＣＳ）を通して調節Ｔ（ＣＤ４＋ＲＦＰ＋  Ｔ）細胞および非調節Ｔ（ＣＤ４＋ＲＦＰ−  Ｔ）細胞を分離して得た。それぞれの前記細胞は、購入したＬｒｉｇ−１抗体および陰性対照群はアイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）により染色して蛍光活性細胞分類機でＬｒｉｇ−１の発現量を測定して、その結果を図７に示した。
【０１１８】
図７に示すように、点線で表される非調節Ｔ細胞の場合、陰性対照群とほぼ同じＬｒｉｇ−１の発現水準を見せたが、調節Ｔ細胞の場合、Ｌｒｉｇ−１の発現水準の高い細胞が多数存在した。
【０１１９】
前記結果を通して、本発明によるＬｒｉｇ−１タンパク質は、調節Ｔ細胞で特異的に発現することが分かる。
【０１２０】
［実施例４］調節Ｔ細胞の表面でのＬｒｉｇ−１タンパク質特異的発現の確認
【０１２１】
Ｌｒｉｇ−１タンパク質が細胞治療のターゲットになるためには、調節Ｔ細胞の表面で発現してこそさらに効果的にターゲット治療が可能なため、Ｌｒｉｇ−１タンパク質が表面で発現するか否かを確認した。
【０１２２】
前記準備例１のそれぞれの分化されたＴ細胞亜型を抗−ＣＤ４−ＡＰＣおよび抗Ｌｒｉｇ−１−ＰＥ抗体で染色し、蛍光活性細胞分類機（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ；ＦＡＣＳ）を用いてそれぞれの細胞表面でＬｒｉｇ−１の発現量を測定して、その結果を図８に示した。
【０１２３】
図８に示すように、活性化されたＴ細胞（ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ）、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ１７細胞およびナイーブ（Ｎａｉｖｅ）Ｔ細胞ではＬｒｉｇ−１の発現が０．７７〜１５．３の量で発現するのに対し、分化が誘導されたＴ細胞（ｉＴｒｅｇ）では８３．９と高く発現した。
【０１２４】
前記結果を通して、本発明によるＬｒｉｇ−１タンパク質は、調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）で特異的に発現するだけでなく、特に調節Ｔ細胞の表面でさらに高く発現することが分かる。
【０１２５】
［製造例１〜８］Ｌｒｉｇ−１タンパク質に特異的な単クローン抗体の作製
【０１２６】
本発明によるＬｒｉｇ−１タンパク質に特異的な抗体を作製した。本抗体は特定の抗原決定基を決めて生産するのではなく、Ｌｒｉｇ−１タンパク質にどの部位でも結合できる抗体を生産した。
【０１２７】
前記抗体を作製するために、Ｌｒｉｇ−１タンパク質が発現する細胞を作製した。より詳しくは、配列番号２に相当するＤＮＡ断片およびｐｃＤＮＡ（ｈｙｇｒｏ）を切断酵素で切断した後、３７℃で培養してライゲーション（Ｌｉｇａｔｉｏｎ）して、Ｌｒｉｇ−１タンパク質のＤＮＡ配列が挿入（ｉｎｓｅｒｔ）されているｐｃＤＮＡを作製した。前記作製された配列番号２が挿入されたｐｃＤＮＡは、Ｌ細胞に形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）により導入されてＬ細胞の表面にＬｒｉｇ−１タンパク質が発現できるようにした。
【０１２８】
前記細胞表面に発現するＬｒｉｇ−１に結合できる軽鎖（Ｌｒｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）および重鎖（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）アミノ酸の配列をＨｕｍａｎ  ｓｃＦｖ  ｌｉｂｒａｒｙから選別して、計８個の重鎖および軽鎖を選別した。
【０１２９】
前記選別された重鎖および軽鎖アミノ酸配列をｍｌｇＧ２ａ  Ｆｃ領域と融合して単クローン抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を作製した。前記単クローン抗体の配列は下記表７の通りである。
【０１３０】
【表７】
2021523703.tif 000010
2021523703.tif 000011
2021523703.tif 000012
【０１３１】
［実施例５］本発明による抗体のＬｒｉｇ−１タンパク質に対する結合能評価
【０１３２】
前記製造例１〜８で作製された本発明による単クローン抗体がＬｒｉｇ−１をよく認識するかを確認するために、Ｌｒｉｇ−１を安定して発現するＬ細胞に前記製造例１〜８の抗体それぞれを結合させた後、マウス抗体を認識できかつ、ｅＦｌｏｕｒ６７０がコンジュゲーション（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）された二次抗体（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を入れた後、ＦＡＣＳを用いて前記単クローン抗体のＬｒｉｇ−１タンパク質に対する結合力を分析して、その結果を図９に示した。
【０１３３】
図９に示すように、本発明によるＬｒｉｇ−１タンパク質特異的な単クローン抗体（Ａ７、Ａ８、Ｂ８、Ｃ８、Ｄ９、Ｅ７、Ｇ３およびＨ６）ともＬ細胞の表面に存在するＬｒｉｇ−１タンパク質を効果的に認識して結合したことを確認することができた。
【０１３４】
［実施例６］本発明による抗体の調節Ｔ細胞内の信号伝達経路の調節
【０１３５】
前記製造例１〜８で作製された本発明による単クローン抗体がＬｒｉｇ−１タンパク質を通して調節Ｔ細胞内の信号伝達経路にどのような影響を与えるかを分析するために、前記製造例１〜８の抗体を調節Ｔ細胞に処理して前記調節Ｔ細胞の表面に存在するＬｒｉｇ−１を刺激した後、ホスホチロシン免疫ブロット（ｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ）により刺激された調節Ｔ細胞内に存在するＳｔａｔ３タンパク質のチロシンリン酸化（ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）の程度を分析し、その結果を図１０に示した。
【０１３６】
図１０に示すように、本発明によるＬｒｉｇ−１タンパク質特異的な単クローン抗体（Ａ７、Ｃ８、Ｅ７およびＧ３）は、Ｓｔａｔ３のリン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）をＴｈ１７細胞と同じ水準に増加させることを確認することができた。一方、本発明によるＬｒｉｇ−１タンパク質特異的な単クローン抗体（Ａ８、Ｂ８、Ｄ９およびＨ６）は、Ｓｔａｔ３のリン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）をｉＴｒｅｇ細胞と同じ水準に引き続き維持および減少させることを確認することができた。
【０１３７】
［実施例７］Ａ８、Ｂ８、Ｄ９およびＨ６抗体の癌治療効果
【０１３８】
前記製造例５〜８で作製された本発明による単クローン抗体（Ａ８、Ｂ８、Ｄ９およびＨ６）の固形癌に対する治療効果を確認するために、図１１に示すように、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞（ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌ）をマウスの背中に３×１０５細胞の量で皮下注射（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した後、４日、８日、１２日目に前記製造例５〜８の抗体を２００ｕｇの量で腹腔内注射した。前記メラノーマ細胞の移植後に時間の経過による腫瘍の体積変化を測定して、その結果を図１２に示した。
【０１３９】
図１２に示すように、本発明によるＬｒｉｇ−１タンパク質特異的な単クローン抗体（Ａ８、Ｂ８、Ｄ９およびＨ６）を処理した場合、抗体を処理しなかった陰性対照群に比べて腫瘍の大きさが著しく減少したことを確認することができた。
【０１４０】
これによって、本発明によるＬｒｉｇ−１タンパク質特異的な単クローン抗体は、多様な固形癌細胞の成長を抑制して、これを効果的に予防、改善または治療できることが分かる。
【０１４１】
［実施例８］本発明によるＬｒｉｇ−１タンパク質のエピトープの決定
【０１４２】
調節Ｔ細胞の表面に存在するＬｒｉｇ−１タンパク質において各ＬＲＲドメインとＩｇ−ｌｉｋｅドメインに存在する前記製造例８のＨ６抗体の結合エピトープを発掘するために下記の実験を行った。
【０１４３】
１．実験の準備
【０１４４】
（１）マイクロアレイ
Ｌｒｉｇ−１タンパク質のペプチド切断を防止するために、前記Ｌｒｉｇ−１タンパク質のＣ−およびＮ−ターミナルにＧＳＧＳＧＳＧリンカーを伸長させた。伸長した抗原配列は、１４個のアミノ酸のペプチド−ペプチド重複によって１５個のアミノ酸に翻訳された。最終ＬＲＩＧ１ペプチドのマイクロアレイの結果、１，０９１個の異なるペプチドがデュプリケート（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）で確認され、追加的なＨＡ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＧ、１０２ｓｐｏｔｓ）コントロールペプチドによってフレーム（ｆｒａｍｅｄ）された。
【０１４５】
（２）実験材料
試料：製造例８のＨ６単クローン抗体
洗浄バッファ：ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（各培養後１０秒経過した時、３回）によるｐＨ７．４
ブロッキングバッファ（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ）：ＲｏｃｋｌａｎｄブロッキングバッファＭＢ−０７０（初のアッセイ３０分前）
培養バッファ：１０％ブロッキングバッファを追加した洗浄バッファ
アッセイの条件：培養バッファ内の抗体の濃度を１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌに調節；４℃で１６時間培養し、１４０ｒｐｍで撹拌
二次抗体：ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＤｙＬｉｇｈｔ６８０（０．２μｇ／ｍｌ）；常温で培養バッファ内で４５分間染色
対照群抗体：マウス単クローン性抗−ＨＡ（１２ＣＡ５）ＤｙＬｉｇｈｔ８００（０．５μｇ／ｍｌ）；常温で培養バッファ内で４５分間染色
スキャナ：ＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ；スキャニングオフセット（ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｏｆｆｓｅｔ）０．６５ｍｍ、解像度２１μｍ、７／７（ｒｅｄ＝７００ｎｍ／ｇｒｅｅｎ＝８００ｎｍ）のスキャニング強度
【０１４６】
２．実験方法
メインアッセイで干渉を起こしうる抗原−由来ペプチドと相互作用を起こしうるかを確認するために、培養バッファ内で二次抗体および対照群抗体を用いてＬＲＩＧ１ペプチドのマイクロアレイ複製の前−染色（ｐｒｅ−ｓｔａｉｎｉｎｇ）を行った。以後、培養バッファ内で製造例８のＨ６単クローン抗体（１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌ）とともに他のＬＲＩＧ１ペプチドのマイクロアレイ複製の追加的培養を行った後、二次抗体および対照群抗体を用いて染色した。ＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて７／７（ｒｅｄ／ｇｒｅｅｎ）のスキャニング強度で読み出し（ｒｅａｄ−ｏｕｔ）を行った。スポット強度の定量化およびペプチド解読（ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）は１６−ビットのグレースケールＴＩＦＦファイルで示した。ＰｅｐＳｌｉｄｅ（Ｒ）  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いてマイクロアレイイメージを分析した。その結果は図１３〜１５に示し、分析されたエピトープ配列は下記表８に示した。
【０１４７】
【表８】
2021523703.tif 000013
【０１４８】
３．実験結果
図１３〜１５に示すように、調節Ｔ細胞上に存在するＬｒｉｇ−１タンパク質に特異的に結合して癌を効果的に治療する単クローン抗体（Ｈ６）は、Ｌｒｉｇ−１タンパク質のうち、配列番号１８〜２９のアミノ酸配列で表されるエピトープに特異的に結合して上記の機能を発揮することを確認することができた。さらに、配列番号１８および２０で表されるエピトープは、ロイシン−リッチタンパク質（ｌｅｕｃｉｎｅ  ｒｉｃｈ  ｒｅｐｅａｔ）を共通にしており、具体的には、Ｎ−ターミナルから５番目のアミノ酸位置に本発明の式１のアミノ酸配列で表される共通した配列（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含んでいることが分かった。
【０１４９】
以上、本発明について詳しく説明したが、本発明の権利範囲はこれに限定されるものではなく、請求の範囲に記載の本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で多様な修正および変形が可能であることは、当技術分野における通常の知識を有する者には自明であろう。
【産業上の利用可能性】
【０１５０】
本発明は、調節Ｔ細胞の表面に存在する抗原であるＬｒｉｇ−１（ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎｓ１）タンパク質のエピトープとこれに特異的に結合する抗体または抗原結合断片に関する。
【図１】
2021523703.tif 000014
【図２】
2021523703.tif 000015
【図３】
2021523703.tif 000016
【図４】
2021523703.tif 000017
【図５】
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【図６】
2021523703.tif 000019
【図７】
2021523703.tif 000020
【図８】
2021523703.tif 000021
【図９】
2021523703.tif 000022
【図１０】
2021523703.tif 000023
【図１１】
2021523703.tif 000024
【図１２】
2021523703.tif 000025
【図１３】
2021523703.tif 000026
【図１４】
2021523703.tif 000027
【図１５】
2021523703.tif 000028
【配列表】
2021523703000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年1月12日(2021.1.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むエピトープに特異的に結合
する抗体または抗原結合断片：
［式１］
Ｌｘ１Ｌｘ２ｘ３Ｎ
前記式１中、
ｘ１〜ｘ３は、それぞれ独立して、中性アミノ酸、酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸または
芳香族アミノ酸である。
【請求項２】
前記ｘ１〜ｘ３は、それぞれ独立して、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ；Ｎ）、ア
スパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ；Ｄ）、セリン（ｓｅｒｉｎｅ；Ｓ）、チロ
シン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ；Ｙ）、アルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ；Ｒ）、フェニルアラニ
ン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ；Ｆ）、リシン（ｌｙｓｉｎｅ、Ｋ）、ヒスチジン（ｈ
ｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｈ）、ロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ、Ｌ）、バリン（ｖａｌｉｎｅ、Ｖ
）、トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ、Ｔ）、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ；Ａ）、グルタ
ミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ；Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ；Ｅ）お
よびグリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ；Ｇ）からなる群より選択されるアミノ酸である、請求項
１に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項３】
前記ｘ１は、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ；Ｎ）、フェニルアラニン（ｐｈｅｎ
ｙｌａｌａｎｉｎｅ；Ｆ）、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ；Ｄ）、リシ
ン（ｌｙｓｉｎｅ、Ｋ）、ヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｈ）、バリン（ｖａｌｉｎ
ｅ、Ｖ）、アルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ；Ｒ）およびトレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ
、Ｔ）からなる群より選択されるアミノ酸であり、
前記ｘ２は、セリン（ｓｅｒｉｎｅ；Ｓ）、グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ；Ｑ）、ア
ラニン（ａｌａｎｉｎｅ；Ａ）、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ；Ｎ）、グルタミ
ン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ；Ｅ）、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉ
ｄ；Ｄ）、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ；Ｆ）およびグリシン（ｇｌ
ｙｃｉｎｅ；Ｇ）からなる群より選択されるアミノ酸であり、
前記ｘ３は、チロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ；Ｙ）、ヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｈ
）、グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ；Ｇ）、アルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ；Ｒ）、アスパラ
ギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ；Ｎ）、ロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ、Ｌ）、リシン（ｌｙｓ
ｉｎｅ、Ｋ）およびフェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ；Ｆ）からなる群よ
り選択されるアミノ酸である、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項４】
前記エピトープは、１０〜２０ｍｅｒからなる、請求項１に記載の抗体または抗原結合断
片。
【請求項５】
前記式１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、前記エピトープのＮ−ターミ
ナルから３〜６番目に位置する、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項６】
前記ポリペプチドは、配列番号４〜１７のいずれか１つのアミノ酸配列で表される、請求
項１に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項７】
配列番号１８〜２９のいずれか１つのアミノ酸配列で表されるＬｒｉｇ−１タンパク質の
エピトープに特異的に結合する抗体または抗原結合断片。
【請求項８】
Ｌｒｉｇ−１（ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌ
ｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎｓ１）タンパク質のエピトープであって、
下記式１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むエピトープ：
［式１］
Ｌｘ１Ｌｘ２ｘ３Ｎ
前記式１中、
ｘ１〜ｘ３は、それぞれ独立して、中性アミノ酸、酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸または
芳香族アミノ酸である。
【請求項９】
Ｌｒｉｇ−１（ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌ
ｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎｓ１）タンパク質のエピトープであって、
配列番号１８〜２９のいずれか１つのアミノ酸配列で表されるポリペプチドを含む、エピ
トープ。
【請求項１０】
請求項９に記載のエピトープをコーディングする核酸分子。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸分子が挿入された発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載の発現ベクターが形質感染した宿主細胞株。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片を有効成分として含む癌の
予防または治療用薬学組成物。
【請求項１４】
前記癌は、胃癌、肝臓癌、膠細胞腫、卵巣癌、大膓癌、頭頸部癌、膀胱癌、腎細胞癌、乳
癌、転移癌、前立腺癌、膵臓癌、黒色腫または肺癌である、請求項１３に記載の薬学組成
物。
【請求項１５】
請求項７に記載の抗体または抗原結合断片を有効成分として含む癌の予防または治療用薬
学組成物。
【請求項１６】
前記癌は、胃癌、肝臓癌、膠細胞腫、卵巣癌、大膓癌、頭頸部癌、膀胱癌、腎細胞癌、乳
癌、転移癌、前立腺癌、膵臓癌、黒色腫または肺癌である、請求項１５に記載の薬学組成
物。
【請求項１７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片；および薬物を含む抗体−
薬物結合体。
【請求項１８】
請求項７に記載の抗体または抗原結合断片；および薬物を含む抗体−薬物結合体。
【国際調査報告】
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