(57)【要約】  本発明は、非凝集ＢＬＧの選択的結晶化による乳清タンパク質含有フィードからのベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）の除去に基づいて、食用アルファ−ラクトアルブミン強化タンパク質組成物を製造する新しい方法に関する。本発明はさらに、新しい食用アルファ−ラクトアルブミン強化タンパク質組成物、これらの組成物の使用及びこれらの組成物を含む食品に関する。
2021529769.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む食用のアルファ−ラクトアルブミン強化乳清タンパク質組成物を調製する方法
ａ）非凝集ベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）、アルファ−ラクトアルブミン（ＡＬＡ）及び任意の追加の乳清タンパク質を含む乳清タンパク質溶液を提供する工程、前記乳清タンパク質溶液は、ＢＬＧに関して過飽和であり、ｐＨは５〜６の範囲である、
ｂ）過飽和乳清タンパク質溶液中で、好ましくは塩溶モードで、非凝集ＢＬＧを結晶化する工程、及び
ｃ）残りの母液からＢＬＧ結晶を分離し、母液の少なくとも一部を回収する工程、
ｄ）回収された母液から誘導された第１の組成物を提供する工程、
ｅ）任意に、第１の組成物のｐＨを、
ｉ）２．５〜４．９の範囲のｐＨ、又は
ｉｉ）６．１〜８．５の範囲のｐＨ
に調整する工程、
ｆ）
工程ｄ）から得られた第１の組成物もしくはそのタンパク質濃縮物、又は
工程ｅ）から得られたｐＨ調整された第１の組成物もしくはそのタンパク質濃縮物
を乾燥する工程
を含む方法。
【請求項２】
好ましくはｅ）のｐＨ調整後かつ工程ｆ）の乾燥前に実施される、物理的微生物低減をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ａ）の乳清タンパク質溶液が、タンパク質の総量に対して最大で９０重量％ＢＬＧを含む、請求項１〜２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
乳清タンパク質溶液が、乳血清タンパク質濃縮物、乳清タンパク質濃縮物、乳血清タンパク質分離物、及び／又は乳清タンパク質分離物を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
乳清タンパク質溶液の導電率とタンパク質の総量との間の比が最大で０．３である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
乳清タンパク質溶液のＵＦ透過液導電率が最大で７ｍＳ／ｃｍである、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
過飽和乳清タンパク質溶液が、乳清タンパク質フィードに対し、以下の調整：
ｐＨを調整すること、
導電率を低減すること、
温度を下げること、
タンパク質濃度を増加させること、及び
水活性を低下させる薬剤を添加すること、
のうちの１つ又は２つ以上を行うことによって調製される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
工程ｃ）が、ＢＬＧ結晶を、少なくとも３０重量％、好ましくは少なくとも４０重量％、さらにより好ましくは少なくとも５０重量％の固形分に分離することを含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
第１の組成物が、回収された母液を含むか、又はそれからなる、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
第１の組成物が、回収された母液のタンパク質濃縮物を含むか、又はそれからなる、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
第１の組成物の供給が、好ましくは総タンパク質に対するＡＬＡの重量パーセンテージが回収された母液の場合より少なくとも５％高くなっている第１の組成物を包含する、さらなるＡＬＡ強化を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
第１の組成物のｐＨが、２．５〜４．９、好ましくは２．８〜４．５、より好ましくは２．８〜３．２の範囲のｐＨに調整される、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
第１の組成物のｐＨが、６．１〜８．５、好ましくは６．３〜８．０、さらにより好ましくは６．５〜７．５の範囲のｐＨに調整される、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
物理的微生物低減が、
熱処理、好ましくは少なくとも低温殺菌、
紫外線照射処理、
パルス光処理、
精密ろ過、
高圧処理、及び
超音波処理
のうちの１つ又は２つ以上を含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
食用の、ＡＬＡ強化乳清タンパク質組成物であって、請求項１〜１４のいずれかに記載の１つ又は２つ以上の方法によって得ることができる組成物。
【請求項１６】
食品を製造する方法であって、
ａ）非凝集ベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）、アルファ−ラクトアルブミン（ＡＬＡ）及び任意の追加の乳清タンパク質を含む乳清タンパク質溶液を提供する工程、前記乳清タンパク質溶液は、ＢＬＧに関して過飽和であり、ｐＨは５〜６の範囲である、
ｂ）過飽和乳清タンパク質溶液中で、好ましくは塩溶モードで、非凝集ＢＬＧを結晶化する工程、及び
ｃ）残りの母液からＢＬＧ結晶を分離し、母液の少なくとも一部を回収する工程、
ｄ）回収された母液から誘導される第１の組成物を供給する工程、
ｅ）任意に、第１の組成物のｐＨを、
ｉ）２．５〜４．９の範囲のｐＨ、又は
ｉｉ）６．１〜８．５の範囲のｐＨ
に調整する工程、
ｆ）任意に、工程ｄ）から得られた第１の組成物もしくはそのタンパク質濃縮物を乾燥するか、又は工程ｅ）から得られたｐＨ調整された第１の組成物もしくはそのタンパク質濃縮物を乾燥する工程、
ｇ）
ｇ１）工程ｄ）から得られた第１の組成物もしくはそのタンパク質濃縮物、
ｇ２）工程ｅ）から得られたｐＨ調整された第１の組成物もしくはそのタンパク質濃縮物、及び／又は
ｇ３）工程ｆ）で得られた乾燥組成物
を１つ又は２つ以上の成分と組み合わせ、そして組合せを食品に変換する工程
を含む方法。
【請求項１７】
例えば請求項１６に記載の方法により得ることができる、ＡＬＡ強化乳清タンパク質組成物を含む食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非凝集ＢＬＧの選択的結晶化による乳清タンパク質含有フィードからのベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）の除去に基づいて、食用アルファ−ラクトアルブミン強化タンパク質組成物を製造する新しい方法に関する。本発明はさらに、新しい食用アルファ−ラクトアルブミン強化タンパク質組成物、これらの組成物の使用及びこれらの組成物を含む食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳タンパク質分画の概念は当技術分野でよく知られており、過去数十年の間に、それぞれが特定の特性及び特徴を有する様々な乳タンパク質種で強化された組成物を調製するための一連の技術に発展した。
【０００３】
乳血清又は乳清からのアルファ−ラクトアルブミン（ＡＬＡ）の分離は、多くの出版物の主題であり、典型的には複数の分離工程が含まれ、多くの場合精製されたＡＬＡに到達するためのろ過及び／又はクロマトグラフィー技術が含まれる。
【０００４】
米国特許第５，００８，３７６号は、限外ろ過を使用するＡＬＡ分離技術を記載している。熱沈殿法は、ＡＬＡの凝集を促進するのに十分な時間、所定のｐＨ範囲で乳清に熱を加えることを含む。そのような熱沈殿法は、米国特許第５，４５５，３３１号に記載されている。イオン交換法は、タンパク質画分を選択的に保持するために、乳清をアニオン又はカチオン交換体と接触させることを含む。このような方法は、米国特許第５，０７７，０６７号に記載されている。
【０００５】
Ｍｕｌｌｅｒら（レ（Ｌａｉｔ）８３、４３９−４５１頁、２００３）は、特定の限外ろ過処理によって、また場合によってはＡＬＡの可逆的沈殿によって、酸性乳清からＡＬＡを強化する方法を報告している。ＡＬＡ沈殿物は、例えば遠心分離及び再溶解により他の乳清タンパク質から分離される。良好な沈殿収率は、５５℃で５〜１０分間維持し、ｐＨ３．９で得られた。
【発明の概要】
【０００６】
偶然にも、本発明者らは、ＢＬＧの選択的結晶化及びＢＬＧ結晶の除去によって、ＡＬＡが粗乳清タンパク質溶液から強化され得るという驚くべき発見をした。これは、トルエンなの有機溶媒を使用せずに行うことができる。この発見は、タンパク質の結晶化を望む前に高度に精製する必要があり、すべてのタンパク質を結晶化できるわけではないという当技術分野の共通した一般的知識に反している。
【０００７】
この発見は、乳製品業界での乳清タンパク質の取り扱いと分別の方法を変える可能性があり、食品成分として安全に使用できるＡＬＡ強化タンパク質組成物の効率的かつ低刺激での製造、例えば乳児用調製粉乳製品の製造のきっかけをもたらす。
【０００８】
したがって、本発明の一実施態様は、食用のアルファ−ラクトアルブミン強化乳清タンパク質組成物を調製する方法に関するものであり、この方法は、
ａ）非凝集ベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）、アルファ−ラクトアルブミン（ＡＬＡ）及び任意の追加の乳清タンパク質を含む乳清タンパク質溶液を提供する工程であって、前記乳清タンパク質溶液が、ＢＬＧに関して過飽和であり、ｐＨが５〜６の範囲であるものとする工程、
ｂ）過飽和乳清タンパク質溶液中で、好ましくは塩溶モードで、非凝集ＢＬＧを結晶化する工程、及び
ｃ）残りの母液からＢＬＧ結晶を分離し、母液の少なくとも一部を回収する工程、
ｄ）回収された母液から誘導された第１の組成物を供給する工程、
ｅ）任意に、第１の組成物のｐＨを、
ｉ）２．５〜４．９の範囲のｐＨ、又は
ｉｉ）６．１〜８．５の範囲のｐＨ
に調整することもある工程、
ｆ）
−工程ｄ）から得られた第１の組成物もしくはそのタンパク質濃縮物、又は
−工程ｅ）から得られたｐＨ調整された第１の組成物もしくはそのタンパク質濃縮物
を乾燥する工程
を含む。
【０００９】
本発明の別の実施態様は、食用の、ＡＬＡ強化乳清タンパク質組成物に関するもので、前記組成物は、例えば本明細書に記載された１つ又は２つ以上の方法によって入手可能である。
【００１０】
さらに本発明の一実施態様は、食品を製造する方法に関するもので、この方法は、
ａ）非凝集ベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）、アルファ−ラクトアルブミン（ＡＬＡ）及び任意の追加の乳清タンパク質を含む乳清タンパク質溶液を提供する工程であって、前記乳清タンパク質溶液が、ＢＬＧに関して過飽和であり、ｐＨが５〜６の範囲であるものとする工程、
ｂ）過飽和乳清タンパク質溶液中で、好ましくは塩溶モードで、非凝集ＢＬＧを結晶化する工程、及び
ｃ）残りの母液からＢＬＧ結晶を分離し、母液の少なくとも一部を回収する工程、
ｄ）回収された母液から誘導された第１の組成物を供給する工程、
ｅ）任意に、第１の組成物のｐＨを、
ｉ）２．５〜４．９の範囲のｐＨ、又は
ｉｉ）６．１〜８．５の範囲のｐＨ
に調整することもある工程、
ｆ）任意に、工程ｄ）から得られた第１の組成物もしくはそのタンパク質濃縮物を乾燥するか、又は工程ｅ）から得られたｐＨ調整された第１の組成物もしくはそのタンパク質濃縮物を乾燥することもある工程、
ｇ）
ｇ１）工程ｄ）から得られた第１の組成物もしくはそのタンパク質濃縮物、
ｇ２）工程ｅ）から得られたｐＨ調整された第１の組成物もしくはそのタンパク質濃縮物、及び／又は
ｇ３）工程ｆ）で得られた乾燥組成物
を１つ又は２つ以上の成分と組み合わせ、そして組合せを食品に変換する工程
を含む。
【００１１】
本発明のさらなる実施態様は、ＡＬＡ強化乳清タンパク質組成物を含む食品に関するもので、前記食品は例えば本明細書で定義された食品の製造方法によって得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、甘性乳清に基づく粗乳清タンパク質溶液（実線）と結晶化後に得られた母液（破線）の２つの重ね合わせたクロマトグラムを示している。実線と破線の違いは、ＢＬＧ結晶が除去されているためである。
【図２】図２は、例２から回収されたＢＬＧ結晶の顕微鏡写真である。
【図３】図３は、例２から回収されたＢＬＧ結晶のクロマトグラムである。
【図４】図４は、例３のフィード（実線）及びＢＬＧ結晶の結晶化及び除去後に得られた母液（破線）のクロマトグラムを示している。
【図５】図５は、結晶化の前（左側の写真）及び後（右側の写真）の例５のフィード３の写真を示している。
【図６】図６は、母液からＢＬＧ結晶を分離するためにＤＣＦを使用する、例６の結晶化方法の変形の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
定義
本発明の文脈において、「ベータ−ラクトグロブリン」又は「ＢＬＧ」という用語は、例えば天然の、折りたたまれていない、及び／又はグリコシル化された形態での、哺乳動物種からのベータ−ラクトグロブリンに関するものであり、天然に存在する遺伝的バリアントを含む。この用語はさらに、凝集ＢＬＧ、沈殿ＢＬＧ及び結晶性ＢＬＧを含む。ＢＬＧの量に言及する場合、凝集ＢＬＧを含むＢＬＧの総量を指すものとする。ＢＬＧの総量は、例１．２１に従って決定される。「凝集ＢＬＧ」という用語は、少なくとも部分的に折りたたまれておらず、さらに、典型的には疎水性相互作用及び／又は共有結合によって、他の変性ＢＬＧ分子及び／又は他の変性乳清タンパク質と凝集しているＢＬＧを指す。
【００１４】
ＢＬＧは、ウシ乳清及び乳血清で最も優勢なタンパク質であり、いくつかの遺伝的バリアントで存在し、牛乳での主なものはＡ及びＢと標識されている。ＢＬＧはリポカリンタンパク質であり、多くの疎水性分子に結合できることから、それらの輸送におけるある役割が示唆され得る。ＢＬＧは、シデロホアを介して鉄に結合できることも示されており、病原体と闘う際にある役割を果たしている可能性がある。ＢＬＧのホモログはヒト母乳には欠けている。
【００１５】
ウシＢＬＧは、分子量が約１８．３〜１８．４ｋＤａである、約１６２アミノ酸残基の比較的小さいタンパク質である。生理学的条件下では、ウシＢＬＧは主に二量体であるが、核磁気共鳴分光法を使用して測定したところによると、その天然状態を維持しながら、約ｐＨ３未満の単量体に解離する。逆に、ＢＬＧはまた、様々な自然条件下で、四量体、八量体及びその他の多量体の凝集形態でも存在する。
【００１６】
本発明の文脈において、「非凝集ベータ−ラクトグロブリン」又は「非凝集ＢＬＧ」という用語はまた、天然の、折りたたまれていない、及び／又はグリコシル化された形態での、哺乳動物種からのベータ−ラクトグロブリンを指し、天然に存在する遺伝的バリアントを含む。しかしながら、この用語には、凝集ＢＬＧ、沈殿ＢＬＧ又は結晶化ＢＬＧは含まれない。非凝集ＢＬＧの量又は濃度は、例１．２に従って決定される。
【００１７】
総ＢＬＧに対する非凝集ＢＬＧの割合は、計算（ｍ総ＢＬＧ−ｍ非凝集ＢＬＧ）／ｍ総ＢＬＧ＊１００％によって決定される。ｍ総ＢＬＧは、例１．２１に従って決定されたＢＬＧの濃度又は量であり、ｍ非凝集ＢＬＧは、例１．２に従って決定された非凝集ＢＬＧの濃度又は量である。
【００１８】
本発明の文脈において、「結晶」という用語は、その構成要素（原子、分子又はイオンなど）が規則性の高い微視的構造で配置され、すべての方向に延びる結晶格子を形成する固体材料を指す。
【００１９】
本発明の文脈において、「ＢＬＧ結晶」という用語は、規則性の高い微視的構造で配置され、すべての方向に延びる結晶格子を形成する、非凝集で、好ましくは天然のＢＬＧを主に含むタンパク質結晶を指す。ＢＬＧ結晶は、例えば、モノリシック又は多結晶であり得、例えば無傷の結晶、結晶片、又はそれらの組合せであり得る。結晶片は、例えば、無傷の結晶が処理中に機械的せん断を受けると形成される。結晶片はまた、規則性の高い微視的結晶構造を有するが、無傷の結晶の均一な表面及び／又は均一なエッジもしくは角を欠く可能性がある。例えば、多くの無傷のＢＬＧ結晶の例についてはＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０８４５５３の図１８及びＢＬＧ結晶片の例についてはＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０８４５５３の図１３を参照。どちらの場合も、ＢＬＧ結晶又は結晶片は、光学顕微鏡を使用して、明確に定義された緻密でコヒーレントな構造として視覚的に識別することができる。ＢＬＧ結晶又は結晶片は、多くの場合、少なくとも部分的に透明である。タンパク質結晶はさらに複屈折性であることが知られており、この光学特性を使用して、結晶構造を有する未知の粒子を識別することができる。一方、非結晶性ＢＬＧ凝集体は、定義が不十分で不透明であり、不規則なサイズの詰まっていないか又は多孔性の塊として出現することが多い。
【００２０】
本発明の文脈において、「結晶化」という用語は、タンパク質結晶の形成を指す。結晶化は、例えば、自発的に発生するか、又は結晶化シードの添加によって開始され得る。
【００２１】
「母液」
本発明の文脈において、「母液」という用語は、ＢＬＧが結晶化され、ＢＬＧ結晶が少なくとも部分的に除去された後に残る乳清タンパク質溶液に関する。母液にはまだいくつかのＢＬＧ結晶が含まれ得るが、通常は分離を免れた小さなＢＬＧ結晶のみが含まれ得る。
【００２２】
本発明の文脈において、「食用組成物」という用語は、ヒトの消費及び食品成分としての使用に安全であり、トルエン又は他の望ましくない有機溶媒などの問題のある量の有毒成分を含まない組成物を指す。
【００２３】
本発明の文脈において、「ＡＬＡ」又は「アルファ−ラクトアルブミン」という用語は、例えば天然及び／又はグリコシル化された形態での哺乳動物種からのアルファ−ラクトアルブミンを指し、天然に存在する遺伝的バリアントを含む。この用語はさらに、凝集ＡＬＡ及び沈殿ＢＬＧを含む。ＡＬＡの量に言及する場合、例えば凝集ＡＬＡを含むＡＬＡの総量を指すものとする。ＡＬＡの総量は、例１．２１に従って決定される。「凝集ＡＬＡ」という用語は、典型的には少なくとも部分的に折りたたまれておらず、さらに、典型的には疎水性相互作用及び／又は共有結合によって、他の変性ＡＬＡ分子及び／又は他の変性乳清タンパク質と凝集しているＡＬＡに関するものである。
【００２４】
アルファ−ラクトアルブミン（ＡＬＡ）は、ほとんどすべての哺乳動物種の乳汁に存在するタンパク質である。ＡＬＡはラクトースシンターゼ（ＬＳ）ヘテロ二量体の調節サブユニットを形成し、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ベータ４Ｇａｌ−Ｔ１）は触媒成分を形成する。まとめると、これらのタンパク質は、ＬＳがガラクトース部分をグルコースに移すことによってラクトースを生成することを可能にする。ベータ−ラクトグロブリンとの主な構造上の違いの１つは、ＡＬＡには共有結合凝集反応の開始点としての役割を果たし得る遊離チオール基がないことである。
【００２５】
本発明の文脈において、「非凝集ＡＬＡ」という用語はまた、例えば天然の、折りたたまれていない、及び／又はグリコシル化された形態での、哺乳動物種からのＡＬＡを指し、天然に存在する遺伝的バリアントを含む。しかしながら、この用語には、凝集ＡＬＡ又は沈殿ＡＬＡは含まれない。非凝集ＢＬＧの量又は濃度は、例１．２に従って決定される。
【００２６】
総ＡＬＡに対する非凝集ＡＬＡの割合は、計算（ｍ総ＡＬＡ−ｍ非凝集ＡＬＡ）／ｍ総ＡＬＡ＊１００％によって決定される。ｍ総ＡＬＡは、例１．２１に従って決定されたＡＬＡの濃度又は量であり、ｍ非凝集ＡＬＡは、例１．２に従って決定された非凝集ＡＬＡの濃度又は量である。
【００２７】
本発明の文脈において、「ＡＬＡ強化」又は「ＡＬＡに関して強化された」組成物は、由来するフィードよりも総タンパク質に対しＡＬＡの重量パーセンテージが高い。
【００２８】
本発明の文脈において、「カゼイノマクロペプチド」又は「ＣＭＰ」という用語は、例えば天然及び／又はグリコシル化された形態での、哺乳動物種からの「κ−ＣＮ」又は「カッパ−カゼイン」の加水分解に由来する親水性ペプチド、残基１０６〜１６９を指し、アスパラギン酸プロテイナーゼ、例えばキモシンによる天然に存在する遺伝的バリアントを含む。
【００２９】
「乳清」という用語は、乳のカゼインを沈殿させて除去した後に残る液相を指す。カゼインの沈殿は、例えば乳の酸性化及び／又はレンネット酵素の使用によって達成され得る。カゼインのレンネットに基づく沈殿によって生成される乳清製品である「甘性乳清」と、カゼインの酸に基づく沈殿によって生成される乳清製品である「酸性乳清」又は「サワー乳清」など、いくつかのタイプの乳清が存在する。カゼインの酸に基づく沈殿は、例えば、食用酸の添加又は細菌培養によって達成され得る。
【００３０】
「乳血清」という用語は、カゼイン及び乳脂肪球が、例えば精密ろ過又は大孔径限外ろ過により乳から除去されたときに残る液体を指す。乳血清は「理想的な乳清」と呼ばれることもあり得る。
【００３１】
「乳血清タンパク質」又は「血清タンパク質」という用語は、乳血清中に存在するタンパク質を指す。
【００３２】
本発明の文脈において、「乳清タンパク質」という用語は、乳清又は乳血清中に見出されるタンパク質を指す。乳清タンパク質は、乳清又は乳血清に見られるタンパク質種のサブセットであり得、また単一の乳清タンパク質種の場合さえあり得、乳清又は／及び乳血清に見られるタンパク質種の完全なセットである可能性もある。
【００３３】
カゼインという用語は、乳に含まれるカゼインタンパク質を指し、生乳に含まれる天然ミセルカゼイン、個々のカゼイン種、及びカゼイナートの両方を包含する。
【００３４】
本発明の文脈において、「過飽和」又は「ＢＬＧに関して過飽和」である液体は、所与の物理的及び化学的条件でその液体中の非凝集ＢＬＧの飽和点を超えている濃度の溶解した非凝集ＢＬＧを含む。「過飽和（である）」という用語は、結晶化の分野では周知であり（例えば、Ｇｅｒａｒｄ  Ｃｏｑｕｅｒｅｌａ、「溶液からの分子系の結晶化：状態図、過飽和及び他の基本概念」（Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｒｏｍ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ｐｈａｓｅ  ｄｉａｇｒａｍｓ，ｓｕｐｅｒｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｂａｓｉｃ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ）、化学会レビュー（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ）、２２８６〜２３００頁、７号、２０１４を参照）、また過飽和は、（例、分光法又は粒子サイズ分析による）様々な測定技術によって決定され得る。本発明の文脈において、ＢＬＧに関する過飽和は、以下の手順によって決定される。
【００３５】
特定の条件セットの液体がＢＬＧに関して過飽和であるかどうかを試験する手順：
ａ）試験する液体の５０ｍｌ試料を、高さ１１５ｍｍ、内径２５ｍｍ及び容量５０ｍＬの遠心分離管（ＶＷＲカタログ番号５２５−０４０２）に移す。工程ａ）〜工程ｈ）の間、試料とその後続の画分を液体の元の物理的及び化学的条件に保つように注意するべきである。
ｂ）試料を直ちに３０００ｇで３．０分間、最大３０秒の加速と最大３０秒の減速で遠心分離する。
ｃ）遠心分離の直後に、（ペレットが形成された場合にはペレットを乱すことなく）可能な限り多くの上清を第２の遠心分離管（工程ａと同じタイプ）に移す。
ｄ）上清の０．０５ｍＬ二次試料を採取する（二次試料Ａ）
ｅ）粒子サイズが最大２００ミクロンのＢＬＧ結晶１０ｍｇ（全固形分に対して少なくとも９８％純粋の、非凝集ＢＬＧ）を第２の遠心分離管に加え、混合物を攪拌する。
ｆ）第２の遠心分離管を元の温度で６０分間放置する。
ｇ）工程ｆ）の直後に、第２の遠心分離管を５００ｇで１０分間遠心分離し、次いで上清の別の０．０５ｍＬ二次試料（二次試料Ｂ）を採取する。
ｈ）工程ｇ）の遠心分離ペレットを、存在する場合は回収し、ｍｉｌｌｉＱ水に再懸濁し、顕微鏡で見ることができる結晶の存在について懸濁液を直ちに検査する。
ｉ）例１．２に概説されている方法を使用して、二次試料Ａ及びＢの非凝集ＢＬＧの濃度を測定し、結果を、二次試料の総重量に対するＢＬＧの重量％として表す。二次試料Ａの非凝集ＢＬＧの濃度をＣＢＬＧ、Ａと称し、二次試料Ｂの非凝集ＢＬＧの濃度をＣＢＬＧ、Ｂと称す。
ｊ）工程ａ）の試料を採取した液体は、ｃＢＬＧ、ＢがｃＢＬＧ、Ａよりも低く、工程ｉ）で結晶が観察される場合、（特定の条件で）過飽和であった。
【００３６】
本発明の文脈において、「液体」及び「溶液」という用語は、粒子状物質を含まない組成物と、例えばタンパク質結晶又は他のタンパク質粒子など、液体及び固体及び／又は半固体粒子の組合せを含む組成物の両方を包含する。したがって、「液体」又は「溶液」は、懸濁液であり得、さらにはスラリーの場合もあり得る。しかしながら、「液体」及び「溶液」は、好ましくはポンプ操作可能である。
【００３７】
本発明の文脈において、「乳清タンパク質濃縮物」（ＷＰＣ）及び「血清タンパク質濃縮物」（ＳＰＣ）という用語は、総固形分に対しタンパク質の総含有量が２０〜８９重量％である乾燥又は水性組成物を指す。
【００３８】
ＷＰＣ又はＳＰＣは、好ましくは、
総固形分に対して２０〜８９重量％のタンパク質、
総タンパク質に対して１５〜７０重量％の非凝集ＢＬＧ、
総タンパク質に対して８〜５０重量％のＡＬＡ、及び
タンパク質に対して０〜４０重量％のＣＭＰ
を含む。
【００３９】
あるいは、しかしまた好ましいことに、ＷＰＣ又はＳＰＣは、
総固形分に対して２０〜８９重量％のタンパク質、
総タンパク質に対して１５〜９０重量％の非凝集ＢＬＧ、
総タンパク質に対して４〜５０重量％のＡＬＡ、及び
タンパク質に対して０〜４０重量％のＣＭＰ
を含み得る。
【００４０】
好ましくは、ＷＰＣ又はＳＰＣは、
総固形分に対して２０〜８９重量％のタンパク質、
総タンパク質に対して１５〜８０重量％の非凝集ＢＬＧ、
総タンパク質に対して４〜５０重量％のＡＬＡ、及び
タンパク質に対して０〜４０重量％のＣＭＰ
を含む。
【００４１】
より好ましくは、ＷＰＣ又はＳＰＣは、
総固形分に対して７０〜８９重量％のタンパク質、
総タンパク質に対して３０〜９０重量％の非凝集ＢＬＧ、
総タンパク質に対して４〜３５重量％のＡＬＡ、及び
タンパク質に対して０〜２５重量％のＣＭＰ
を含む。
【００４２】
ＳＰＣには、典型的にはＣＭＰが含まれていないか、又は痕跡量のＣＭＰしか含まれていない。
【００４３】
「乳清タンパク質分離物」（ＷＰＩ）及び「血清タンパク質分離物」（ＳＰＩ）という用語は、総固形分に対して９０〜１００重量％のタンパク質総量を含む乾燥又は水性組成物を指す。
【００４４】
ＷＰＩ又はＳＰＩは、好ましくは、
総固形分に対して９０〜１００重量％のタンパク質、
総タンパク質に対して１５〜７０重量％の非凝集ＢＬＧ、
総タンパク質に対して８〜５０重量％のＡＬＡ、及び
総タンパク質に対して０〜４０重量％のＣＭＰ
を含む。
【００４５】
あるいは、しかしまた好ましいことに、ＷＰＩ又はＳＰＩは、
総固形分に対して９０〜１００重量％のタンパク質、
総タンパク質に対して３０〜９５重量％の非凝集ＢＬＧ、
総タンパク質に対して４〜３５重量％のＡＬＡ、及び
総タンパク質に対して０〜２５重量％のＣＭＰ
を含み得る。
【００４６】
より好ましくは、ＷＰＩ又はＳＰＩは、
総固形分に対して９０〜１００重量％のタンパク質、
総タンパク質に対して３０〜９０重量％の非凝集ＢＬＧ、
総タンパク質に対して４〜３５重量％のＡＬＡ、及び
総タンパク質に対して０〜２５重量％のＣＭＰ
を含み得る。
【００４７】
ＳＰＩには、典型的にはＣＭＰが含まれていないか、又は痕跡量のＣＭＰしか含まれていない。
【００４８】
「〜から本質的になる」及び「〜から本質的になっている」という用語は、問題の特許請求の範囲又は特徴が、特定の材料又は工程、及び特許請求の範囲に示された発明の基本的かつ新規である特徴に実質的に影響を与えないものを包含することを意味する。
【００４９】
本発明の文脈において、「Ｙ及び／又はＸ」という句は、「Ｙ」又は「Ｘ」又は「Ｙ及びＸ」を意味する。同じ論理に沿って、「ｎ１、ｎ２、．．．、ｎｉ−１、及び／又はｎｉ」という句は、「ｎ１」又は「ｎ２」又は．．．又は「ｎｉ−１」又は「ｎｉ」又は成分：ｎ１、ｎ２、．．．、ｎｉ−１、及びｎｉの任意の組合せを意味する。
【００５０】
本発明の文脈において、「乾燥（する）」又は「乾燥した」という用語は、問題の組成物又は製品に含まれる水が、最大で１０重量％、好ましくは最大で６重量％であり、より好ましくはさらに少ないことを意味する。
【００５１】
本発明の文脈において、「物理的微生物低減」という用語は、組成物の生存可能な微生物の総量の低減をもたらす組成物との物理的相互作用を指す。この用語は、微生物を殺す結果となる化学物質の添加を含まない。この用語はさらに、噴霧乾燥中に噴霧された液滴がさらされる熱曝露を含まないが、噴霧乾燥前の可能な予熱を含む。
【００５２】
本発明の文脈において、粉末のｐＨは、９０ｇの脱塩水に混合された１０ｇの粉末のｐＨを指し、例１．８に従って測定される。
【００５３】
本発明の文脈において、ある特定の組成物、製品、又は材料の成分の重量の割合（重量％（％ｗ／ｗ））は、別の参照基準（例、総固形分又は総タンパク質）が具体的に挙げられていなければ、特定の組成物、製品、又は材料の重量に対するその成分の重量の割合を意味する。
【００５４】
本発明の文脈において、成分Ｘと成分Ｙとの間の「重量比」という用語は、計算ｍＸ／ｍＹによって得られる値を意味し、式中、ｍＸは、成分Ｘの量（重量）であり、ｍＹは、成分Ｙの量（重量）である。
【００５５】
本発明の文脈において、「少なくとも低温殺菌」という用語は、７０℃で１０秒間の熱処理と同等又はそれ以上の微生物殺傷効果を有する熱処理を指す。殺菌効果を決定するための参照基準は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７である。
【００５６】
本発明の文脈において、「乳清タンパク質溶液」という用語は、塩溶モードでのＢＬＧに関して過飽和であり、ＢＬＧ結晶を調製するのに有用である特別な水性乳清タンパク質組成物を説明するために使用される。
【００５７】
本発明の文脈において、「乳清タンパク質フィード」という用語は、乳清タンパク質溶液が誘導されるものを指す。乳清タンパク質フィードは、典型的にはＷＰＣ、ＷＰＩ、ＳＰＣ又はＳＰＩである。
【００５８】
本発明の文脈において、「無菌」という用語は、問題の無菌組成物又は製品が生存可能な微生物を一切含まず、したがって、室温での貯蔵中に微生物の増殖がないことを意味する。滅菌された組成物は無菌状態である。
【００５９】
飲料調製物などの液体を滅菌し、無菌容器に無菌的に包装する場合、典型的には、室温で少なくとも６か月の貯蔵寿命が得られる。滅菌処理は、液体の腐敗を引き起こす可能性のある胞子や微生物を殺す。
【００６０】
本発明の文脈において、「タンパク質画分」という用語は、問題の組成物のタンパク質、例えば、粉末又は飲料調製物のタンパク質に関するものである。
【００６１】
本発明の文脈において、本明細書で使用される「ミネラル」という用語は、特に指定がない限り、主要なミネラル、微量又はマイナーなミネラル、他のミネラル、及びそれらの組合せのいずれか１つを指す。主要なミネラルには、カルシウム、リン、カリウム、硫黄、ナトリウム、塩素、マグネシウムがある。微量又はマイナーなミネラルには、鉄、コバルト、銅、亜鉛、モリブデン、ヨウ素、セレン、マンガンが含まれ、他のミネラルには、クロム、フッ素、ホウ素、リチウム、及びストロンチウムが含まれる。
【００６２】
本発明の文脈において、本明細書で使用される「脂質」、「脂肪」、及び「油」という用語は、特に指定がない限り、植物又は動物から誘導又は加工処理される脂質材料を指すために互換的に使用される。これらの用語にはまた、合成脂質材料がヒトの消費に適している限り、そのような合成脂質材料も含まれる。
【００６３】
本発明の文脈において、「透明な」という用語は、視覚的に透明な外観を有し、光が通過することを可能にし、それを通して別個の画像が見られる飲料調製物を包含する。透明な飲料の濁度は最大２００ＮＴＵである。
【００６４】
本発明の文脈において、「不透明な」という用語は、目に見えて不明瞭な外観を有する飲料調製物を包含し、そしてそれは、２００ＮＴＵを超える濁度を有する。
【００６５】
本発明の文脈において、第１の溶液の「タンパク質濃縮物」又は「そのタンパク質濃縮物」は、第１の溶液よりも、ｉ）総固形分ベースで、より高い重量パーセンテージの総タンパク質及び／又はｉｉ）総重量ベースで、より高い重量パーセンテージの総タンパク質を有する第２の溶液に関する。タンパク質濃縮物は、例えば、第１の溶液から水のみを除去することによって、並びに／又は例えば炭水化物及び塩などの非タンパク質固形分を除去することによって得られることがある。タンパク質濃縮物は、好ましくは、第１の溶液と実質的に同じｐＨ、すなわち、好ましくは、第１の溶液のｐＨより最大で０．３高いか低いｐＨ値、より好ましくは、第１の溶液のｐＨより最大で０．２高いか低いｐＨ値、さらにより好ましくは、第１の溶液のｐＨより最大で０．１高いか低いｐＨ値を有する。
【００６６】
本発明の文脈において、「追加のタンパク質」という用語は、ＢＬＧでもＡＬＡでもないタンパク質を意味する。乳清タンパク質溶液に存在する追加のタンパク質は、典型的には、乳血清又は乳清に見られる非ＢＬＧ／ＡＬＡタンパク質のうちの１つ又は２つ以上を含む。前述のタンパク質の非限定的な例は、ウシ血清アルブミン、免疫グロブリン、カゼイノマクロペプチド（ＣＭＰ）、オステオポンチン、ラクトフェリン、及び乳脂肪球膜タンパク質である。
【００６７】
したがって、乳清タンパク質溶液は、好ましくは、ウシ血清アルブミン、免疫グロブリン、カゼイノマクロペプチド（ＣＭＰ）、オステオポンチン、ラクトフェリン、乳脂肪球膜タンパク質、及びそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの追加の乳清タンパク質を含み得る。
【００６８】
本発明の文脈において、「母液」という用語は、非凝集ＢＬＧが結晶化され、ＢＬＧ結晶が少なくとも部分的に除去された後に残る乳清タンパク質溶液を指す。母液にはまだいくつかのＢＬＧ結晶が含まれ得るが、通常は分離を免れた小さなＢＬＧ結晶のみが含まれ得る。
【００６９】
前述のように、本発明の一実施態様は、食用のアルファ−ラクトアルブミン強化乳清タンパク質組成物を調製する方法に関するものであり、この方法は、
ａ）非凝集ＢＬＧ、ＡＬＡ及び任意の追加の乳清タンパク質を含む乳清タンパク質溶液を供給する工程であって、前記乳清タンパク質溶液が、ＢＬＧに関して過飽和であり、ｐＨが５〜６の範囲であるものとする工程、
ｂ）過飽和乳清タンパク質溶液中で、好ましくは塩溶モードで、非凝集ＢＬＧを結晶化する工程、及び
ｃ）残りの母液からＢＬＧ結晶を分離し、母液の少なくとも一部を回収する工程、
ｄ）回収された母液及び任意に使用された洗浄液から誘導された第１の組成物を供給する工程、
ｅ）任意に、第１の組成物のｐＨを、
ｉ）２．５〜４．９の範囲のｐＨ、又は
ｉｉ）６．１〜８．５の範囲のｐＨ
に調整することもある工程、
ｆ）
−工程ｄ）から得られた第１の組成物もしくはそのタンパク質濃縮物、又は
−工程ｅ）から得られたｐＨ調整された第１の組成物もしくはそのタンパク質濃縮物
を乾燥する工程
を含む。
【００７０】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、本方法は、物理的微生物低減をさらに含み、好ましくは、工程ｅ）のｐＨ調整後かつ工程ｆ）の乾燥前に実施される。
【００７１】
前述のように、本発明の工程ａ）は、非凝集ＢＬＧ、ＡＬＡ、及び少なくとも追加の乳清タンパク質を含む乳清タンパク質溶液を提供することを含む。
【００７２】
本発明のいくつかの実施形態において、乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して最大で１０重量％のカゼイン、好ましくは最大で５重量％、より好ましくは最大で１重量％、さらに好ましくはタンパク質の総量に対して最大で０．５％のカゼインを含む。本発明のいくつかの好ましい実施形態において、乳清タンパク質溶液は、検出可能な量のカゼインを含まない。
【００７３】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも５重量％の追加の乳清タンパク質を含む。好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも１０重量％の追加の乳清タンパク質を含む。より好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも１５重量％の追加の乳清タンパク質を含む。
【００７４】
さらにより好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも２０重量％の追加の乳清タンパク質を含む。最も好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも３０重量％の追加の乳清タンパク質を含み得る。
【００７５】
本発明の他の好ましい実施形態において、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも１重量％の追加の乳清タンパク質を含む。好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも２重量％の追加の乳清タンパク質を含む。さらにより好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも３重量％の追加の乳清タンパク質を含む。最も好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも４重量％の追加の乳清タンパク質を含み得る。
【００７６】
本発明のさらに他の好ましい実施形態において、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも３５重量％の追加の乳清タンパク質を含む。好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも４０重量％の追加の乳清タンパク質を含み得る。さらに好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、例えばタンパク質の総量に対して少なくとも４５重量％の追加の乳清タンパク質を含み得る。さらになお好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも５０重量％の追加の乳清タンパク質を含み得る。
【００７７】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して５〜９０重量％の範囲で追加の乳清タンパク質を含む。好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して１０〜８０重量％の範囲で追加の乳清タンパク質を含み得る。工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、例えばタンパク質の総量に対して２０〜７０重量％の範囲で追加の乳清タンパク質を含み得る。好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して３０〜７０重量％の範囲で追加の乳清タンパク質を含む。
【００７８】
前述のように、本発明者らは、有機溶媒を使用せずに非凝集ＢＬＧを結晶化することが可能であることを見出した。この精製アプローチはまた、乳清タンパク質を含む調製物を精製するためにも使用され得、この調製物に対してはすでに何らかのＢＬＧ精製が行われており、非凝集ＢＬＧの純度をさらに高める簡単な方法を提供する。したがって、本発明のいくつかの好ましい実施形態において、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して１〜２０重量％の範囲で追加の乳清タンパク質を含む。好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して２〜１５重量％の範囲で追加の乳清タンパク質を含み得る。さらにより好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、例えばタンパク質の総量に対して３〜１０重量％の範囲で追加の乳清タンパク質を含み得る。
【００７９】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも５重量％のＡＬＡを含む。好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも１０重量％のＡＬＡを含む。さらにより好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも１５重量％のＡＬＡを含む。あるいは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも２０重量％のＡＬＡを含む。
【００８０】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも２５重量％のＡＬＡを含む。好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも３０重量％のＡＬＡを含む。好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも３５重量％のＡＬＡを含む。さらにより好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも４０重量％のＡＬＡを含み得る。
【００８１】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して５〜９５重量％の範囲でＡＬＡを含む。好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して５〜７０重量％の範囲でＡＬＡを含む。さらにより好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して１０〜６０重量％の範囲でＡＬＡを含み得る。好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して１２〜５０重量％の範囲でＡＬＡを含む。さらにより好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して２０〜４５重量％の範囲でＡＬＡを含み得る。
【００８２】
本明細書に記載の組成物及び製品のＡＬＡの少なくとも一部は、多くの場合少なくともある程度の非凝集ＡＬＡを含むことが好ましい。好ましくは、ＡＬＡの少なくとも２５％は非凝集ＡＬＡである。より好ましくは、ＡＬＡの少なくとも少なくとも５０％は、非凝集ＡＬＡである。さらにより好ましくは、ＡＬＡの少なくとも７０％が非凝集ＡＬＡである。最も好ましくは、ＡＬＡの少なくとも９０％が非凝集ＡＬＡである。さらになお好ましいのは、ＡＬＡのほぼ１００％が非凝集ＡＬＡであり得ることである。
【００８３】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、工程ａ）の乳清タンパク質溶液では、非凝集ＢＬＧとＡＬＡとの間の重量比が少なくとも０．０１である。好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液では、非凝集ＢＬＧとＡＬＡとの間の重量比が少なくとも０．５である。さらにより好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液では、非凝集ＢＬＧとＡＬＡとの間の重量比が少なくとも１、例えば少なくとも２などである。例えば、工程ａ）の乳清タンパク質溶液では、非凝集ＢＬＧとＡＬＡとの間の重量比が少なくとも３であり得る。
乳清タンパク質溶液及び乳清タンパク質フィード中の非凝集ＢＬＧ及び他のタンパク質の量と濃度はすべて、溶解したタンパク質を指しており、沈殿又は結晶化したタンパク質は含まれない。
【００８４】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、工程ａ）の乳清タンパク質溶液では、非凝集ＢＬＧとＡＬＡとの間の重量比が０．０１〜２０の範囲である。好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液では、非凝集ＢＬＧとＡＬＡとの間の重量比が０．２〜１０の範囲である。さらにより好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液では、非凝集ＢＬＧとＡＬＡとの間の重量比が０．５〜４の範囲である。例えば、工程ａ）の乳清タンパク質溶液では、非凝集ＢＬＧとＡＬＡとの間の重量比が１〜３の範囲であり得る。
【００８５】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも１重量％の非凝集ＢＬＧを含む。好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも２重量％の非凝集ＢＬＧを含む。さらにより好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも５重量％の非凝集ＢＬＧを含む。好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも１０重量％の非凝集ＢＬＧを含み得る。
【００８６】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも１２重量％の非凝集ＢＬＧを含む。例えば、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも１５重量％の非凝集ＢＬＧを含み得る。工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、例えばタンパク質の総量に対して少なくとも２０重量％の非凝集ＢＬＧを含み得る。あるいは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して少なくとも３０重量％の非凝集ＢＬＧを含み得る。
【００８７】
本発明のいくつかの特に好ましい実施形態において、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して最大で９５重量％の非凝集ＢＬＧを含む。好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して最大で９０重量％の非凝集ＢＬＧを含み得る。さらに好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、例えばタンパク質の総量に対して最大で８５重量％の非凝集ＢＬＧを含み得る。さらにより好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、例えばタンパク質の総量に対して最大で８０重量％の非凝集ＢＬＧを含み得る。好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して最大で７８重量％の非凝集ＢＬＧを含み得る。好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して最大で７５重量％の非凝集ＢＬＧを含み得る。
【００８８】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して１〜９５重量％の範囲で非凝集ＢＬＧを含む。好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して５〜９０重量％の範囲で非凝集ＢＬＧを含み得る。より好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して１０〜８５重量％の範囲で非凝集ＢＬＧを含む。さらにより好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して１０〜８０重量％の範囲で非凝集ＢＬＧを含む。最も好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して２０〜７０重量％の範囲で非凝集ＢＬＧを含み得る。
【００８９】
本発明の他の好ましい実施形態において、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して１０〜９５重量％の範囲で非凝集ＢＬＧを含む。好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して１２〜９０重量％の範囲で非凝集ＢＬＧを含み得る。より好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して１５〜８５重量％の範囲で非凝集ＢＬＧを含む。さらにより好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して１５〜８０重量％の範囲で非凝集ＢＬＧを含む。最も好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、タンパク質の総量に対して３０〜７０重量％の範囲で非凝集ＢＬＧを含み得る。
【００９０】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、乳清タンパク質溶液の重量に対して少なくとも０．４重量％の非凝集ＢＬＧを含む。好ましくは、乳清タンパク質溶液は、少なくとも１．０重量％の非凝集ＢＬＧを含む。より好ましくは、乳清タンパク質溶液は、少なくとも２．０重量％の非凝集ＢＬＧを含む。乳清タンパク質溶液が少なくとも４重量％の非凝集ＢＬＧを含むことがさらにより好ましい。
【００９１】
より高濃度の非凝集ＢＬＧがさらにより好ましく、好ましくは、乳清タンパク質溶液は、少なくとも６重量％の非凝集ＢＬＧを含む。より好ましくは、乳清タンパク質溶液は、少なくとも１０重量％の非凝集ＢＬＧを含む。乳清タンパク質溶液が少なくとも１５重量％の非凝集ＢＬＧを含むことがさらにより好ましい。
【００９２】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、工程ａ）の乳清タンパク質溶液は、乳清タンパク質溶液の重量に対して０．４〜４０重量％の範囲で非凝集ＢＬＧを含む。好ましくは、乳清タンパク質溶液は、１〜３５重量％の範囲で非凝集ＢＬＧを含む。より好ましくは、乳清タンパク質溶液は、４〜３０重量％の範囲で非凝集ＢＬＧを含む。乳清タンパク質溶液が１０〜２５重量％の範囲で非凝集ＢＬＧを含むことがさらにより好ましい。
【００９３】
任意の適切な乳清タンパク質供給源を使用して、乳清タンパク質溶液を調製することができる。本発明のいくつかの好ましい実施形態において、乳清タンパク質溶液は、乳血清タンパク質濃縮物、乳清タンパク質濃縮物、乳血清タンパク質分離物、乳清タンパク質分離物、又はそれらの組合せを含むか、又はそれらからなる。
【００９４】
乳清タンパク質溶液は、脱塩乳清タンパク質溶液であることが好ましい。
【００９５】
この文脈において、脱塩（された）という用語は、乳清タンパク質溶液の導電率が最大で１５ｍＳ／ｃｍ、好ましくは最大で１０ｍＳ／ｃｍ、さらにより好ましくは最大で８ｍＳ／ｃｍであることを意味する。脱塩乳清タンパク質溶液のＵＦ透過液導電率は、好ましくは最大で７ｍＳ／ｃｍ、より好ましくは最大で４ｍＳ／ｃｍ、さらにより好ましくは最大で１ｍＳ／ｃｍである。
【００９６】
乳清タンパク質溶液は、脱塩乳血清タンパク質濃縮物、脱塩乳血清タンパク質分離物、脱塩乳清タンパク質濃縮物、又は脱塩乳清タンパク質分離物であることが特に好ましい。
【００９７】
本発明のいくつかの特に好ましい実施形態において、乳清タンパク質溶液は、脱塩及びｐＨ調整された乳血清タンパク質濃縮物、乳清タンパク質濃縮物、乳血清タンパク質分離物、乳清タンパク質分離物、又はそれらの組合せを含むか、又はそれらから成ることさえある。
【００９８】
乳清タンパク質溶液は、例えば、脱塩乳血清タンパク質濃縮物を含み得るか、又はそれからなることさえあり得る。あるいは、乳清タンパク質溶液は、脱塩乳清タンパク質濃縮物を含み得るか、又はそれからなることさえあり得る。あるいは、乳清タンパク質溶液は、脱塩乳血清タンパク質分離物を含み得るか、又はそれからなることさえあり得る。あるいは、乳清タンパク質溶液は、脱塩乳清タンパク質分離物を含み得るか、又はそれからなることさえあり得る。
【００９９】
乳清タンパク質溶液のタンパク質は、好ましくは哺乳動物の乳に由来し、好ましくは例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、スイギュウ、ラクダ、ラマ、雌ウマ及び／又はシカなどの反芻動物の乳に由来する。ウシの乳（牛乳）に由来するタンパク質が特に好ましい。したがって、ＢＬＧ及び追加の乳清タンパク質は、好ましくは、ウシＢＬＧ及びウシ乳清タンパク質である。
【０１００】
乳清タンパク質溶液のタンパク質は、好ましくはその天然状態に可能な限り近く、好ましくは、あるとすれば、これに対し穏やかな熱処理のみが行われる。
【０１０１】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、乳清タンパク質溶液の非凝集ＢＬＧが有するラクトシル化度は、最大で１である。好ましくは、乳清タンパク質溶液の非凝集ＢＬＧが有するラクトシル化度は、最大で０．６である。より好ましくは、乳清タンパク質溶液の非凝集ＢＬＧが有するラクトシル化度は、最大で０．４である。さらにより好ましくは、乳清タンパク質溶液の非凝集ＢＬＧが有するラクトシル化度は、最大で０．２である。最も好ましくは、乳清タンパク質溶液の非凝集ＢＬＧが有するラクトシル化度は、例えば好ましくは最大で０．０１など、最大でも０．１である。
【０１０２】
ＢＬＧのラクトシル化度は、Ｃｚｅｒｗｅｎｋａら（農業・食品化学誌（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．）、第５４巻、２３号、２００６、８８７４−８８８２頁）に従って決定される。
【０１０３】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、乳清タンパク質溶液は、タンパク質１００ｇあたり最大で８０ｍｇのフロシン値を有する。好ましくは、乳清タンパク質溶液は、タンパク質１００ｇあたり最大で４０ｍｇのフロシン値を有する。より好ましくは、乳清タンパク質溶液は、タンパク質１００ｇあたり最大で２０ｍｇのフロシン値を有する。さらにより好ましくは、乳清タンパク質溶液は、タンパク質１００ｇあたり最大で１０ｍｇのフロシン値を有する。最も好ましくは、乳清タンパク質溶液は、例えば好ましくはタンパク質１００ｇあたり０ｍｇのフロシン値など、タンパク質１００ｇあたり最大で５ｍｇのフロシン値を有する。
【０１０４】
乳清タンパク質溶液には、典型的には、タンパク質に加えて他の成分が含まれている。乳清タンパク質溶液は、例えばミネラル、炭水化物、及び／又は脂質など、乳清又は乳血清に通常見られる他の成分を含む場合がある。別法として、又は追加的に、乳清タンパク質溶液は、乳清又は乳血清に天然では含まれない成分を含み得る。しかしながら、そのような非天然成分は、好ましくは食品生産での使用に対して、そして好ましくはヒトの消費にとっても安全でなければならない。
【０１０５】
本方法は、非凝集ＢＬＧ以外の固形分を含む粗乳清タンパク質溶液から非凝集ＢＬＧを分離するために特に有利である。
【０１０６】
例えば乳清タンパク質溶液は、例えばラクトース、オリゴ糖、及び／又はラクトースの加水分解生成物（すなわち、グルコース及びガラクトース）など、炭水化物を含み得る。乳清タンパク質溶液は、例えば、１〜３０重量％の範囲、又は２〜２０重量％の範囲など、０〜４０重量％の範囲の炭水化物を含み得る。
【０１０７】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、乳清タンパク質溶液は、最大で２０重量％の炭水化物、好ましくは最大で１０重量％の炭水化物、より好ましくは最大で５重量％の炭水化物、さらにより好ましくは最大で２重量％の炭水化物を含む。
【０１０８】
乳清タンパク質溶液はまた、脂質を、例えば、トリグリセリド及び／又はリン脂質などの他の脂質タイプの形で含み得る。
【０１０９】
本発明のいくつかの実施形態において、工程ａ）の乳清タンパク質溶液が含む脂質総量は、総固形分に対して最大で１５重量％である。好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液が含む脂質総量は、総固形分に対して最大で１０重量％である。より好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液が含む脂質総量は、総固形分に対して最大で６重量％である。さらにより好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液が含む脂質総量は、総固形分に対して最大で１．０重量％である。最も好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液が含む脂質総量は、総固形分に対して最大でも０．５重量％である。
【０１１０】
乳清タンパク質溶液のタンパク質の総量は、典型的には、乳清タンパク質溶液の重量に対して少なくとも１重量％である。好ましくは、乳清タンパク質溶液のタンパク質の総量は、少なくとも５重量％である。より好ましくは、乳清タンパク質溶液のタンパク質の総量は、少なくとも１０重量％である。さらにより好ましくは、乳清タンパク質溶液のタンパク質の総量は、少なくとも１５重量％である。
【０１１１】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、乳清タンパク質溶液のタンパク質の総量は、１〜５０重量％の範囲である。好ましくは、乳清タンパク質溶液のタンパク質の総量は、５〜４０重量％の範囲である。より好ましくは、乳清タンパク質溶液のタンパク質の総量は、１０〜３０重量％の範囲である。さらにより好ましいのは、乳清タンパク質溶液のタンパク質の総量は、１５〜２５重量％の範囲である。
【０１１２】
乳清タンパク質溶液のタンパク質の総量は、例１．１に従って決定される。
【０１１３】
乳清タンパク質溶液は、典型的には、乳清タンパク質フィードを、ＢＬＧに関して過飽和である乳清タンパク質溶液を形成する１つ又は２つ以上の調整にかけることによって調製される。
【０１１４】
フィードは、好ましくは、ＷＰＣ、ＷＰＩ、ＳＰＣ、ＳＰＩ、又はそれらの組合せである。
【０１１５】
本発明の文脈において、「乳清タンパク質フィード」という用語は、ＢＬＧに関して過飽和状態にされた乳清タンパク質溶液に変換される組成物を指す。乳清タンパク質フィードは、典型的には、非凝集ＢＬＧ、ＡＬＡ、及び少なくとも１つの追加の乳清タンパク質を含む水性液体であるが、通常、ＢＬＧに関して過飽和ではない。
【０１１６】
乳清タンパク質溶液の化学組成に関する実施形態は、乳清タンパク質フィードにも同様に適用される。しかしながら、典型的には、乳清タンパク質フィードの少なくとも１つのパラメータは、過飽和又は少なくとも自発的な結晶化を回避するように設定されている。
【０１１７】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、過飽和乳清タンパク質溶液は、乳清タンパク質フィードを、以下の調整：
−ｐＨを調整すること、
−導電率を低減すること、
−温度を下げること、
−タンパク質濃度を増加させること、
−水活性を低下させる薬剤を添加すること、
−イオン組成を改変すること
のうちの１つ又は２つ以上にかけることによって調製される。
【０１１８】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、乳清タンパク質溶液の調製は、乳清タンパク質フィードのｐＨを５〜６の範囲のｐＨに調整することを含む。
【０１１９】
すべてのｐＨ値は、ｐＨガラス電極を使用して測定され、２５℃に正規化されている。
【０１２０】
乳清タンパク質溶液は、例えば、４．９〜６．１の範囲のｐＨを有し得る。乳清タンパク質溶液のｐＨは、例えば、５．０〜６．１の範囲内であり得る。あるいは、乳清タンパク質溶液のｐＨは５．１〜６．１の範囲であり得る。好ましくは、乳清タンパク質溶液のｐＨは５．１〜６．０の範囲である。
【０１２１】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、乳清タンパク質溶液のｐＨは、５．０〜６．０の範囲である。好ましくは、乳清タンパク質溶液のｐＨは５．１〜６．０の範囲である。より好ましくは、乳清タンパク質溶液のｐＨは５．１〜５．９の範囲である。さらにより好ましくは、乳清タンパク質溶液のｐＨは５．２〜５．９の範囲であり得る。最も好ましくは、乳清タンパク質溶液のｐＨは５．２〜５．８の範囲である。
【０１２２】
ｐＨについては、食品に許容され得る酸及び／又は塩基を使用して調整することが好ましい。食品に許容され得る酸、例えばカルボン酸などが特に好ましい。前述の酸の有用な例は、例えば、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、マレイン酸、酒石酸、乳酸、クエン酸、又はグルコン酸、及び／又はそれらの混合物である。
【０１２３】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、ｐＨは、例えばＤ−グルコノ−デルタ−ラクトンなどのラクトンを使用して調整され、このラクトンは、ゆっくりと加水分解すると同時に、それを含む水性液体のｐＨを低下させる。ラクトンの加水分解終了後の目標ｐＨを、正確に計算することができる。
【０１２４】
食品に許容され得る塩基の有用な例は、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウムなどの例えば水酸化物供給源、例えばクエン酸三ナトリウムなどの食用酸の塩、及び／又はそれらの組合せである。
【０１２５】
本発明の他の好ましい実施形態において、ｐＨは、そのＨ＋形態にカチオン交換材料を添加することによって調整される。ビーズタイプ／大粒子タイプのカチオン交換材料は、結晶化前又は結晶化後でも乳清タンパク質溶液から簡単に除去される。そのＨ＋形態にカチオン交換材料を添加することによるｐＨの調整は、乳清タンパク質フィードの導電率に著しく影響する負の対イオンを加えることなくｐＨを低下させるので、本発明において特に有利である。
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、乳清タンパク質溶液の調製は、乳清タンパク質フィードの導電率を低下させることを含む。
【０１２６】
本明細書に記載されている導電率の値は、特に明記されていない限り、２５℃に正規化されている。
【０１２７】
本発明者らは、乳清タンパク質溶液の導電率を低下させると、ＢＬＧ結晶の収率が高くなることを発見した。乳清タンパク質溶液の得られる最小導電率は、タンパク質画分と脂質画分（もしあれば）の組成に左右される。いくつかのタンパク質種、例えばカゼイノマクロペプチド（ＣＭＰ）などは、他のタンパク質種よりも導電率に寄与する。したがって、乳清タンパク質フィードの導電率は、タンパク質及びタンパク質の対イオンが導電率の主因であるレベルに近づけることが好ましい。多くの場合、導電率の低下には、液相に存在し、タンパク質に堅固には結合していない小さな遊離イオンの少なくとも一部の除去が含まれる。
【０１２８】
多くの場合、乳清タンパク質溶液の導電率は、最大でも１０ｍＳ／ｃｍであることが好ましい。本発明のいくつかの好ましい実施形態において、乳清タンパク質溶液の導電率は、最大で５ｍＳ／ｃｍである。好ましくは、乳清タンパク質溶液の導電率は、最大で４ｍＳ／ｃｍである。
【０１２９】
より低い導電率がさらに好ましく、より高い収率のＢＬＧ結晶を生じさせる。したがって、乳清タンパク質溶液の導電率は、好ましくは最大で３ｍＳ／ｃｍである。本発明のいくつかの好ましい実施形態において、乳清タンパク質溶液の導電率は、最大で１ｍＳ／ｃｍである。好ましくは、乳清タンパク質溶液の導電率は、最大で０．５ｍＳ／ｃｍである。
【０１３０】
乳清タンパク質フィードの導電率は、好ましくは、透析又はダイアフィルトレーションによって低下する。限外ろ過によるダイアフィルトレーションは、タンパク質を保持しながら塩や小さな荷電分子を洗い流すことができるため、特に好ましい。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、同じＵＦユニットが、乳清タンパク質フィードのＵＦ／ダイアフィルトレーション及びその後の濃縮に使用される。
【０１３１】
本発明者らは、乳清タンパク質溶液の導電率（ｍＳ／ｃｍで表される）とタンパク質の総量（乳清タンパク質溶液の総重量に対する総タンパク質の重量％で表される）との間の比が、有利にはある特定のしきい値又はそれ以下に保たれることで非凝集ＢＬＧの結晶化を促進できることを示す状況を目の当たりにしてきた。
【０１３２】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、乳清タンパク質溶液の導電率とタンパク質の総量との間の比は、最大で０．３である。好ましくは、乳清タンパク質溶液の導電率とタンパク質の総量との間の比は、最大で０．２５である。好ましくは、乳清タンパク質溶液の導電率とタンパク質の総量との間の比は、最大で０．２０である。より好ましくは、乳清タンパク質溶液の導電率とタンパク質の総量との間の比は、最大で０．１８である。さらにより好ましくは、乳清タンパク質溶液の導電率とタンパク質の総量との間の比は、最大で０．１２である。最も好ましくは、乳清タンパク質溶液の導電率とタンパク質の総量との間の比は、最大で０．１０である。
【０１３３】
例えば、乳清タンパク質溶液の導電率とタンパク質の総量との間の比は、およそ０．０７、又はそれ以下であることが好ましい。
【０１３４】
本発明者らはさらに、乳清タンパク質フィードを有利に調整して、最大で１０ｍＳ／ｃｍのＵＦ透過液導電率を有する乳清タンパク質溶液を提供し得ることを見出した。ＵＦ透過液導電率は、液体の小分子画分の導電率の尺度である。「導電率」という用語が本明細書でそのように使用される場合、それは問題の液体の導電率を指す。「ＵＦ透過液導電率」という用語が使用される場合、それは液体の小分子画分の導電率を指し、例１．１４に従って測定される。
【０１３５】
好ましくは、乳清タンパク質溶液のＵＦ透過液導電率は、最大で７ｍＳ／ｃｍである。より好ましくは、乳清タンパク質溶液のＵＦ透過液導電率は、最大で５ｍＳ／ｃｍであり得る。さらにより好ましくは、乳清タンパク質溶液のＵＦ透過液導電率は、最大で３ｍＳ／ｃｍであり得る。
【０１３６】
さらに低いＵＦ透過液導電率を使用することもでき、非凝集ＢＬＧを高収率で得るべきである場合は特に好ましい。したがって、好ましくは、乳清タンパク質溶液のＵＦ透過液導電率は、最大で１．０ｍＳ／ｃｍである。より好ましくは、乳清タンパク質溶液のＵＦ透過液導電率は、最大で０．４ｍＳ／ｃｍであり得る。さらにより好ましくは、乳清タンパク質溶液のＵＦ透過液導電率は、最大で０．１ｍＳ／ｃｍであり得る。最も好ましくは、乳清タンパク質溶液のＵＦ透過液導電率は、最大で０．０４ｍＳ／ｃｍであり得る。
【０１３７】
例えばダイアフィルトレーション中にＭｉｌｌｉＱ水を希釈剤として使用する場合（ＭｉｌｌｉＱ水は約０．０６μＳ／ｃｍの導電率を有する）、さらに低いＵＦ透過液導電率に達する可能性がある。したがって、乳清タンパク質溶液のＵＦ透過液導電率は、最大０．０１ｍＳ／ｃｍであり得る。あるいは、乳清タンパク質溶液のＵＦ透過液導電率は、最大で０．００１ｍＳ／ｃｍであり得る。あるいは、乳清タンパク質溶液のＵＦ透過液導電率は、最大で０．０００１ｍＳ／ｃｍであり得る。
【０１３８】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、乳清タンパク質溶液の調製は、乳清タンパク質フィードの温度を下げることを含む。
【０１３９】
例えば、乳清タンパク質溶液の調製は、乳清タンパク質フィードの温度を少なくとも５℃、好ましくは少なくとも１０℃、さらにより好ましくは少なくとも１５℃に下げることを含み得る。例えば、乳清タンパク質溶液の調製は、乳清タンパク質フィードの温度を少なくとも２０℃に下げることを含み得る。
【０１４０】
乳清タンパク質フィードの温度は、例えば、最大で３０℃、好ましくは最大で２０℃、さらにより好ましくは最大で１０℃に低減され得る。本発明者らは、さらに低い温度でも、より高い過飽和度をもたらすことを見出しており、したがって、乳清タンパク質フィードの温度は、例えば最大で５℃、好ましくは最大で２℃、さらにより好ましくは最大で０℃に低減され得る。温度は０℃よりも低いことさえあり得る。しかしながら、好ましくは、乳清タンパク質溶液は、例えば氷のスラリーの形態で、ポンプ操作可能であり続けるべきである。
【０１４１】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、乳清タンパク質溶液は、ＢＬＧ結晶化の初期化（ｉｎｉｔｉａｌｉｓａｔｉｏｎ）前の氷スラリーである。あるいは、又はさらに、結晶化している乳清タンパク質溶液は、工程ｂ）のＢＬＧ結晶化中に氷スラリーに変換されるか、又は氷スラリーとして維持され得る。
【０１４２】
本発明のいくつかの特に好ましい実施形態において、乳清タンパク質溶液の調製は、乳清タンパク質フィードの総タンパク質濃度を増加させることを含む。乳清タンパク質フィードを、例えば、限外ろ過、ナノろ過、逆浸透、及び／又は蒸発などの１つ又は２つ以上のタンパク質濃縮工程にかけ、それによって濃縮して、乳清タンパク質溶液を得ることが可能である。
【０１４３】
限外ろ過は、塩及び炭水化物の濃度がほとんど影響を受けない一方で、タンパク質の選択的濃縮を可能にするため、特に好ましい。上記のように、限外ろ過は、好ましくは、乳清タンパク質フィードのダイアフィルトレーション及び濃縮の両方に使用される。
【０１４４】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、乳清タンパク質溶液中の非凝集ＢＬＧの濃度は、非凝集ＢＬＧの自発的結晶化が起こるレベルよりも低い。したがって、乳清タンパク質溶液が準安定領域にあるとき、すなわち、播種の使用時にＢＬＧ結晶が成長はできるが結晶化が自発的には始まらない過飽和領域にあるとき、多くの場合、乳清タンパク質フィードの改変を停止することが好ましい。
【０１４５】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、乳清タンパク質溶液の調製は、１つ又は２つ以上の水分活性低減剤を乳清タンパク質フィードに添加することを含む。
【０１４６】
前述の水分活性低減剤の有用であるが非限定的な例は、多糖類及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
【０１４７】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、乳清タンパク質溶液の調製は、例えばイオン交換、新しいイオン種の追加、透析、又はダイアフィルトレーションにより、乳清タンパク質フィードのイオン組成を改変することを含む。
【０１４８】
典型的には、乳清タンパク質溶液は、過飽和状態を作り出すための上記方法の工程の２つ以上を組み合わせることによって調製される。
【０１４９】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、乳清タンパク質溶液の調製は、乳清タンパク質フィードに対し、少なくとも：
−例えば、１０℃を超える温度での、限外ろ過、ナノろ過又は逆浸透の使用による濃縮、及び
−それに続く、１０℃未満の温度への冷却
を実施することを含む。
【０１５０】
本発明の他の好ましい実施形態において、乳清タンパク質溶液の調製は、乳清タンパク質フィードに対し、少なくとも
−６．０を超えるｐＨでの濃縮、及び
−それに続く、酸（ＧＤＬ又はＨ＋型のカチオン交換物質など）の添加によるｐＨの低減
を行うことを含む。
【０１５１】
本発明のさらに他の好ましい実施形態において、乳清タンパク質溶液の調製は、乳清タンパク質フィードに対し、少なくとも：
−例えば少なくとも非凝集ＢＬＧを保持する膜を使用したダイアフィルトレーションによる、導電率の低減
を行うことを含む。
【０１５２】
本発明のさらに好ましい実施形態において、乳清タンパク質溶液の調製は、乳清タンパク質フィードに対し、少なくとも：
−５〜６へのｐＨの調整、
−少なくとも非凝集ＢＬＧを保持する膜を使用したダイアフィルトレーションによる導電率の低減、
−例えば１０℃を超える温度での、限外ろ過、ナノろ過又は逆浸透を使用した、タンパク質の濃縮、及び
−最終的な、１０℃未満の温度への冷却
の組合せを実施することを含む。
【０１５３】
本発明者らはさらに、ナトリウム＋カリウムの合計とカルシウム＋マグネシウムの合計との間のモル比を制御することにより、本方法の非凝集ＢＬＧ収率が改善され得ることを見出した。カルシウムとマグネシウムの相対量が多いと、驚くべきことに、非凝集ＢＬＧの収率が増加すると思われ、したがって、本方法の非凝集ＢＬＧ回収の効率が高められる。
【０１５４】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、工程ａ）の乳清タンパク質溶液では、Ｎａ＋ＫとＣａ＋Ｍｇとの間のモル比が最大で４である。より好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液では、Ｎａ＋ＫとＣａ＋Ｍｇとの間のモル比が最大で２である。さらにより好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液では、Ｎａ＋ＫとＣａ＋Ｍｇとの間のモル比が最大で１．５、さらにより好ましくは最大で１．０である。最も好ましくは、工程ａ）の乳清タンパク質溶液では、Ｎａ＋ＫとＣａ＋Ｍｇとの間のモル比が、最大で０．５、例えば最大で０．２である。
【０１５５】
Ｎａ＋ＫとＣａ＋Ｍｇとの間のモル比は、（ｍＮａ＋ｍＫ）／（ｍＣａ＋ｍＭｇ）として計算され、式中、ｍＮａは元素Ｎａのモル単位での含有量、ｍＫは元素Ｋのモル単位での含有量、ｍＣａは元素Ｃａのモル単位での含有量、及びｍＭｇは元素Ｍｇのモル単位での含有量である。
【０１５６】
乳清タンパク質溶液は、塩溶によってＢＬＧに関して過飽和であり、したがって、非凝集ＢＬＧは、塩溶モードで乳清タンパク質溶液から結晶化され得ることが特に好ましい。
【０１５７】
本発明のいくつかの実施形態において、乳清タンパク質溶液は、低含有量の変性タンパク質を有する。これは、凝集ＢＬＧがＡＬＡ強化乳清タンパク質組成物になることを避けるために特に好ましい。好ましくは、乳清タンパク質溶液は、最大で２％、好ましくは最大で１．５％、より好ましくは最大で１．０％、最も好ましくは最大で０．８％のタンパク質変性度を有する。
【０１５８】
本方法の工程ｂ）は、過飽和乳清タンパク質溶液の非凝集ＢＬＧの少なくとも一部を結晶化することを含む。
【０１５９】
工程ｂ）の結晶化は、塩溶モードで、すなわち、低いイオン強度及び導電率を有する液体中で行われることが特に好ましい。これは、結晶化を引き起こすためにかなりの量の塩が溶液に加えられる塩析モードとは対照的である。
【０１６０】
工程ｂ）の非凝集ＢＬＧの結晶化には、例えば、以下のこと：
−結晶化が起こるのを待つこと、
−結晶化シードの添加、
−非凝集ＢＬＧの過飽和度をさらに高めること、及び／又は
−機械的刺激
のうちの１つ又は２つ以上が含まれ得る。
【０１６１】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、工程ｂ）は、結晶化シードを乳清タンパク質溶液に加えることを含む。本発明者らは、結晶化シードの添加により、ＢＬＧ結晶化がいつどこで行われるかを制御して、方法用機器の突然の目詰まり及び製造中の意図しない停止を回避できることを見出した。例えば、多くの場合、乳清タンパク質フィードを濃縮している間は結晶化の開始を回避することが望ましい。
【０１６２】
ＤＣＦなど、セラミック膜又は高剪断システムが使用されない限り、乳清タンパク質溶液は、工程ｂ）の操作中にＵＦ膜又はＭＦ膜に接触しないことが特に好ましい。
【０１６３】
原則として、非凝集ＢＬＧの結晶化を開始させるシード材料であればいずれも使用することができる。しかしながら、乳清タンパク質溶液にさらなる不純物が追加されるのを避けるために、水和ＢＬＧ結晶又は乾燥ＢＬＧ結晶を播種に使用することが好ましい。
【０１６４】
結晶化シードは、乾燥形態であっても、乳清タンパク質溶液に添加されたときに懸濁液の一部を形成していてもよい。結晶化シード、例えばＢＬＧ結晶を含む懸濁液を添加することは、結晶化のより迅速な開始をもたらすと思われるため、現時点では好ましい。前述の懸濁液は、ｐＨが５〜６の範囲であり、導電率が最大で１０ｍＳ／ｃｍである結晶化シードを含むことが好ましい。
【０１６５】
結晶化シードは、ＢＬＧ結晶化後に乾燥されていないＢＬＧ結晶の懸濁液を介して添加されることが特に好ましい。前述の懸濁液は、例えば、前のバッチの工程２）から得られたＢＬＧ結晶及び母液の一部、又は前のバッチの工程３）、４）もしくは５）から得られた湿ったＢＬＧ結晶の一部であり得る。
【０１６６】
本発明者らは、結晶化シードに湿潤ＢＬＧ結晶を使用すると、乾燥又は水和が不十分なＢＬＧ結晶が使用される場合よりもはるかに大きなＢＬＧ結晶が工程２）中にもたらされ、これもまた母液からのＢＬＧの分離をより効率的にすることを観察した。乳清タンパク質フィード、結晶化条件、播種材料の質量と粒子サイズ、冷却プロファイル、及び分離方法が同じである実験において、本発明者らは、未乾燥のＢＬＧ結晶を播種すると、再水和され、乾燥されたＢＬＧ結晶（得られた粒子サイズ：４０〜６０ミクロン）を播種することによって得られたＢＬＧ結晶と比べて、得られた結晶（得られた粒子サイズ：１００〜１３０ミクロン）の粒子サイズが１００％増加していることを発見した。
【０１６７】
あるいは、結晶化シードが乾燥ＢＬＧ結晶に基づいている場合、結晶を水性液体、例えば水に再懸濁し、生成したＢＬＧ結晶懸濁液を結晶化の開始に使用する前に、乾燥したＢＬＧ結晶を少なくとも３０分間、好ましくは少なくとも１．０時間、さらにより好ましくは少なくとも１．５時間再水和させることが好ましい。
【０１６８】
本発明のいくつかの実施形態において、結晶化シードの少なくともいくつかは、乳清タンパク質溶液と接触した状態になる固相上に配置される。
【０１６９】
結晶化シードは、好ましくは、ＢＬＧ結晶の所望のサイズよりも小さい粒子サイズを有する。結晶化シードのサイズは、ふるい分け又は他のサイズ分画方法によって最大のシードを除去することによって改変され得る。例えば粉砕による粒子サイズの縮小はまた、粒子サイズ分画の前に使用され得る。
【０１７０】
本発明のいくつかの実施形態において、結晶化シードの少なくとも９０重量％は、０．１〜６００ミクロンの範囲の粒子サイズ（ふるい分け分析によって測定される）を有する。例えば、結晶化シードの少なくとも９０重量％は、１〜４００ミクロンの範囲の粒子サイズを有し得る。好ましくは、結晶化シードの少なくとも９０重量％は、５〜２００ミクロンの範囲の粒子サイズを有し得る。より好ましくは、結晶化シードの少なくとも９０重量％は、５〜１００ミクロンの範囲の粒子サイズを有し得る。
【０１７１】
結晶化シードの粒子サイズと投与量は、非凝集ＢＬＧの最適な結晶化をもたらすように調整され得る。
【０１７２】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、結晶化シードは、ＢＬＧに関して過飽和を達成する前ではあるが、好ましくは過飽和に達したときに少なくともいくつかの結晶化シードが依然として存在する方法で乳清タンパク質フィードに添加される。これは、例えば、乳清タンパク質フィードが過飽和に近いとき、例えば冷却、濃縮、及び／又はｐＨ調整中に結晶化シードを添加することにより達成され得、結晶化シードが完全に溶解する前に過飽和に到達させるためであり得る。
【０１７３】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、工程ｂ）は、非凝集ＢＬＧの過飽和度をさらに、好ましくはＢＬＧの結晶化が即座に、すなわち最大２０分で、好ましくは最大５分で開始する程度まで増加させることを含む。
【０１７４】
これはまた、結晶子が自発的に形成され、結晶化方法を開始する核形成ゾーンとも称される。
【０１７５】
過飽和度は、例えば、以下のこと：
−乳清タンパク質溶液のタンパク質濃度をさらに上げること、
−乳清タンパク質溶液をさらに冷却すること、
−乳清タンパク質溶液をＢＬＧ結晶化に最適なｐＨに近づけること、
−導電率をさらに低減すること
のうちの１つ又は２つ以上により高められ得る。
【０１７６】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、工程ｂ）は、ＢＬＧ結晶が形成されるのを待つことを含む。これには数時間かかる場合があり、典型的には、ＢＬＧに対してわずかに過飽和であり、結晶化シードが追加されていない乳清タンパク質溶液の場合である。
【０１７７】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、乳清タンパク質溶液の供給（工程ａ）及び非凝集ＢＬＧの結晶化（工程ｂ）は、２つの別個の工程として行われる。
【０１７８】
しかしながら、本発明の他の好ましい実施形態において、工程ｂ）は、結晶化している乳清タンパク質溶液のさらなる調整を含むことで、非凝集ＢＬＧの過飽和度を高めるか、又は少なくとも過飽和を維持する。追加の調整により、ＢＬＧ結晶の収率が向上する。
【０１７９】
前述のさらなる調整には、
−結晶化している乳清タンパク質溶液のタンパク質濃度をさらに上げること、
−結晶化している乳清タンパク質溶液をさらに低温まで冷却すること、
−結晶化している乳清タンパク質溶液をＢＬＧ結晶化に最適なｐＨに近づけること、
−結晶化している乳清タンパク質溶液の導電率をさらに低減すること
のうちの１つ又は２つ以上が含まれ得る。
【０１８０】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、結晶化している乳清タンパク質溶液は、新しい微結晶の自発的形成を回避するために、工程ｂ）の間、準安定ゾーンに維持される。
【０１８１】
本発明者らは、Ｘ線結晶学によって単離されたＢＬＧ結晶の結晶格子構造を決定しており、先行技術においては同様の結晶を発見していない。
【０１８２】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、工程ｂ）の間に得られたＢＬＧ結晶の少なくともいくつかは、直方晶系空間群Ｐ  ２１  ２１  ２１を有する。
【０１８３】
好ましくは、得られたＢＬＧ結晶の少なくともいくつかは、直方晶系空間群Ｐ  ２１  ２１  ２１を有し、単位格子寸法ａ＝６８．６８（±５％）オングストローム、ｂ＝６８．６８（±５％）オングストローム、及びｃ＝１５６．６５（±５％）オングストローム；並びに単位格子インテグラル角度α＝９０°、β＝９０°、及びγ＝９０°である。
【０１８４】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、得られたＢＬＧ結晶の少なくともいくつかは、直方晶系空間群Ｐ  ２１  ２１  ２１を有し、単位格子寸法ａ＝６８．６８（±２％）オングストローム、ｂ＝６８．６８（±２％）オングストローム、及びｃ＝１５６．６５（±２％）オングストローム；単位格子インテグラル角度α＝９０°、β＝９０°、及びγ＝９０°である。
【０１８５】
さらにより好ましいことに、得られたＢＬＧ結晶の少なくともいくつかは、直方晶系空間群Ｐ  ２１  ２１  ２１を有し得、単位格子寸法ａ＝６８．６８（±１％）オングストローム、ｂ＝６８．６８（±１％）オングストローム、及びｃ＝１５６．６５（±１％）オングストローム；単位格子インテグラル角度α＝９０°、β＝９０°、及びγ＝９０°であり得る。
【０１８６】
最も好ましくは、得られたＢＬＧ結晶の少なくともいくつかは、直方晶系空間群Ｐ  ２１  ２１  ２１を有し、単位格子寸法ａ＝６８．６８オングストローム、ｂ＝６８．６８オングストローム、及びｃ＝１５６．６５オングストローム；並びに単位格子インテグラル角度α＝９０°、β＝９０°、及びγ＝９０°である。
【０１８７】
本発明のいくつかの特に好ましい実施形態において、本方法は、残りの乳清タンパク質溶液から少なくともいくつかのＢＬＧ結晶を分離する工程ｃ）を含む。これは、非凝集ＢＬＧの精製が望まれる場合に特に好ましい。
【０１８８】
工程ｃ）は、例えば、ＢＬＧ結晶を少なくとも３０重量％の固形分量に分離することを含み得る。好ましくは、工程ｃ）は、ＢＬＧ結晶を少なくとも４０重量％の固形分量に分離することを含む。さらにより好ましくは、工程ｃ）は、ＢＬＧ結晶を少なくとも５０重量％の固形分量に分離することを含む。
【０１８９】
本発明者らは、分離されたＢＬＧ結晶に付着する水性部分は典型的には、避けられるべき不純物を含むので、高い固形分量が非凝集ＢＬＧの精製に有利であることを見出した。さらに、高い固形分量であれば、分離されたＢＬＧ結晶を例えば粉末などの乾燥製品に変換するためのエネルギー消費が削減され、所定の容量の乾燥ユニットから得られる非凝集ＢＬＧ収量が増加する。
【０１９０】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、工程ｃ）は、ＢＬＧ結晶を少なくとも６０％の固形分量に分離することを含む。好ましくは、工程ｃ）は、ＢＬＧ結晶を少なくとも７０％の固形分量に分離することを含む。さらにより好ましくは、工程ｃ）は、ＢＬＧ結晶を少なくとも８０％の固形分量に分離することを含む。
【０１９１】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、工程ｃ）の分離は、以下の操作：
−遠心分離、
−デカンテーション、
−ろ過、
−沈降、
−上記の組合せ
のうちの１つ又は複数を含む。
【０１９２】
これらの単位操作は当業者に周知であり、容易に実施される。ろ過による分離は、例えば、真空ろ過、ダイナミッククロスフローろ過（ＤＣＦ）、ろ液プレス又はフィルタ遠心分離機の使用を含み得る。
【０１９３】
ろ過には、所望の結果に基づいて異なる細孔径を使用することができる。好ましくは、フィルタは、天然の乳清タンパク質及び小さな凝集体を通過させるが、ＢＬＧ結晶を保持する。フィルタは、好ましくは、少なくとも０．１ミクロンの公称細孔径を有する。フィルタは、例えば、少なくとも０．５ミクロンの公称細孔径を有し得る。さらにより好ましくは、フィルタは、少なくとも２ミクロンの公称細孔径を有し得る。
【０１９４】
より大きな細孔径を有するフィルタも使用することができ、実際、主に大きな結晶を、ＢＬＧ結晶を含む液体から分離するべきである場合には好ましい。本発明のいくつかの実施形態において、フィルタは、少なくとも５ミクロンの公称細孔径を有する。好ましくは、フィルタは、少なくとも２０ミクロンの公称細孔径を有する。さらにより好ましくは、フィルタは、少なくとも４０ミクロンの細孔径を有し得る。
【０１９５】
フィルタは、例えば０．０３〜５０００ミクロン、例えば０．１〜５０００ミクロンなどの範囲の細孔径を有し得る。好ましくは、フィルタは、０．５〜１０００ミクロンの範囲の細孔径を有し得る。さらにより好ましくは、フィルタは、例えば、５〜８００ミクロンの範囲、例えば１０〜５００ミクロンの範囲又は５０〜５００ミクロンの範囲などの細孔径を有し得る。
【０１９６】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、フィルタは、０．０３〜１００ミクロンの範囲の細孔径を有する。好ましくは、フィルタは、０．１〜５０ミクロンの範囲の細孔径を有し得る。より好ましくは、フィルタは、４〜４０ミクロンの範囲の細孔径を有し得る。さらにより好ましくは、フィルタは、１０〜２０ミクロンの範囲など、５〜３０ミクロンの範囲の細孔径を有し得る。
【０１９７】
１ミクロンより大きい細孔径を有するフィルタを使用することの利点は、細菌及び他の微生物もまた、分離中に、並びに任意に洗浄及び／又は再結晶化中にも少なくとも部分的に除去されることである。
【０１９８】
細孔径が１ミクロンを超えるフィルタを使用する別の利点は、水の除去とその後の乾燥が容易になり、エネルギー消費が少なくなることである。
【０１９９】
ＢＬＧ結晶から分離された残りの乳清タンパク質溶液は、乳清タンパク質溶液の調製中に乳清タンパク質フィードにリサイクルされ得る。
【０２００】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、工程ｃ）は、フィルタ遠心分離機を使用する。本発明の他の好ましい実施形態において、工程ｃ）は、デカンタ遠心分離機を使用する。初期の結果は、母液からＢＬＧ結晶を分離するためのフィルタ遠心分離機及び／又はデカンタ遠心分離機の使用により、例えば真空ろ過よりも本方法の操作がより確実に実現されることを示している。
【０２０１】
多くの場合、形成されたフィルタケーキを乾燥ガスで乾燥させて、フィルタケーキの水分含有量を減らし、好ましくはフィルタケーキをフィルタから剥がすことができるようにすることが好ましい。乾燥ガスの使用は、フィルタケーキが直接乾燥食用ＢＬＧ組成物に変換される場合、分離工程の一部、あるいは最終乾燥工程を形成することもあり得る。
【０２０２】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、工程ｃ）は、ＤＣＦユニットを使用する。
【０２０３】
初期試験（例６を参照）は、膜孔径が０．０３〜５ミクロンの範囲、好ましくは０．３〜１．０ミクロンの範囲であるＤＣＦユニットを使用すると、ＢＬＧ結晶を効率的に分離できることを示しており、本発明者らは、ＤＣＦユニットが、ＢＬＧ結晶を含む乳清タンパク質溶液の大きなバッチからでも結晶を分離するのに十分な時間稼働できることを観察している。
【０２０４】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、工程ｃ）は、ＢＬＧ結晶を保持することができる膜を備えたＤＣＦユニットを使用して実施され、ＤＣＦ透過液は、リサイクルされて乳清タンパク質溶液又は乳清タンパク質フィードの一部を形成することになり、ＤＣＦ保持液は回収されるか又は結晶化タンクに戻され得る。好ましくは、ＤＣＦ透過液は、例えば、乳清タンパク質溶液又は乳清タンパク質フィードと混合する前に、ＢＬＧに関して過飽和にするための限外ろ過／ダイアフィルトレーションにより処理される。
【０２０５】
有利なことに、これらの実施形態は、液体流の温度を１５℃より高温にすることを必要とせず、したがって、より高い温度を必要とする方法の変形よりも微生物汚染を受けにくい。これらの実施形態の別の産業上の利点は、過飽和のレベルが容易に制御され、望ましくない自発的な結晶化が起こらないレベルに維持できることである。したがって、方法のこれらの実施形態中の液体流の温度は、好ましくは最高で１５℃、より好ましくは最高で１２℃、さらにより好ましくは最高で１０℃、最も好ましくは最高で５℃である。
【０２０６】
これらの実施形態は、例６に具体例として示され、図６に示されている。これらの実施形態は、バッチ法又は連続法として実施され得る。
【０２０７】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、本方法は、ＢＬＧ結晶、例えばｃ）の分離されたＢＬＧ結晶を洗浄する工程を含む。洗浄は、単一の洗浄又は複数の洗浄工程からなり得る。
【０２０８】
洗浄は、好ましくは、ＢＬＧ結晶を完全に溶解することなく、ＢＬＧ結晶を洗浄液と接触させ、続いて残りのＢＬＧ結晶を洗浄液から分離することを含む。
【０２０９】
洗浄液は、好ましくは、ＢＬＧ結晶の完全な溶解を回避するように選択され、例えば、脱塩水、水道水、又は逆浸透透過液を含むか、又はそれらから本質的になるものであり得る。
【０２１０】
洗浄液は、例えば、冷たい脱塩水、冷たい水道水、又は冷たい逆浸透透過液を含むか、又は本質的にそれらからなるものであり得る。
【０２１１】
洗浄液は、５〜６の範囲、好ましくは５．０〜６．０の範囲、さらにより好ましくは５．１〜６．０の範囲、例えば、５．１〜５．９などの範囲のｐＨを有し得る。
【０２１２】
あるいは、洗浄液は、６．１〜８の範囲、好ましくは６．４〜７．６の範囲、さらにより好ましくは６．６〜７．４の範囲、例えば、６．８〜７．２などの範囲のｐＨを有し得る。これは典型的には、脱塩水、水道水、又は逆浸透透過液が含まれるときの洗浄液のｐＨである。一般に、洗浄液はミネラルが少なく、緩衝能力が低いことが好ましい。
【０２１３】
洗浄液は、最大で０．１ｍＳ／ｃｍ、好ましくは最大で０．０２ｍＳ／ｃｍ、さらにより好ましくは最大で０．００５ｍＳ／ｃｍの導電率を有し得る。
【０２１４】
さらに低い導電率を有する洗浄液を使用することができる。例えば、洗浄液は、最大で１マイクロＳ／ｃｍの導電率を有し得る。あるいは、洗浄液は、最大で０．１マイクロＳ／ｃｍ、例えば約０．０５マイクロＳ／ｃｍの導電率を有し得る。
【０２１５】
結晶化したＢＬＧの溶解を制限するために、洗浄工程を低温で実施することが好ましい。洗浄液の温度は、好ましくは最高で３０℃、より好ましくは最高で２０℃、さらにより好ましくは最高で１０℃である。
【０２１６】
洗浄工程は、例えば、最高で５℃で、より好ましくは最高で２℃で、例えば、約０℃で実施され得る。例えば１つ又は２つ以上の凝固点抑制剤が存在するため、洗浄液がその温度で凍結しない限り、０℃より低い温度を使用することができる。
【０２１７】
本発明のいくつかの実施形態において、洗浄液は、例えば少なくとも１重量％の量で、好ましくは少なくとも３重量％の量で、例えば、４重量％の量などで、非凝集ＢＬＧを含む。
【０２１８】
工程ｄ）の洗浄は、典型的には、初期量のＢＬＧ結晶の最大で８０重量％、好ましくは最大で５０重量％、さらにより好ましくは初期量のＢＬＧ結晶の最大で２０重量％を溶解する。好ましくは、工程ｄ）の洗浄は、初期量のＢＬＧ結晶の最大で１５重量％、より好ましくは最大で１０重量％、さらにより好ましくは初期量のＢＬＧ結晶の最大で５重量％を溶解する。
【０２１９】
洗浄液の総量と分離されたＢＬＧ結晶の初期量との間の重量比は、多くの場合少なくとも１、好ましくは少なくとも２、より好ましくは少なくとも５である。例えば、洗浄液の量と分離されたＢＬＧ結晶の初期量との間の重量比は、少なくとも１０であり得る。あるいは、洗浄液の総量と分離されたＢＬＧ結晶の初期量との間の重量比は、少なくとも２０、例えば少なくとも５０又は少なくとも１００などであり得る。
【０２２０】
「洗浄液の総量」という用語は、方法全体において使用される洗浄液の総量を指す。
【０２２１】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、１つ又は２つ以上の洗浄手順が、ＢＬＧ結晶分離と同じフィルタ配置又は同様のフィルタ配置で行われる。主にＢＬＧ結晶を含むフィルタケーキに、ＢＬＧ結晶の残りの部分がフィルタケーキに残っている間にフィルタを通して除去される洗浄液の１つ又は２つ以上の手順を追加する。
【０２２２】
本発明の特に好ましい実施形態では、工程ｃ）の分離は、ＢＬＧ結晶を保持するフィルタを使用して実行される。それに続いて、フィルタケーキを、フィルタケーキ及びフィルタを通って移動する１つ又は２つ以上の量の洗浄液と接触させる。多くの場合、洗浄液の各量は、フィルタケーキの体積の最大でも１０倍、好ましくはフィルタケーキの体積の最大でも５倍、より好ましくはフィルタケーキの体積の最大でも１倍、さらにより好ましくはフィルタケーキの体積の最大でも０．５倍、例えばフィルタケーキの体積の最大でも０．２倍などであることが好ましい。フィルタケーキの体積には、フィルタケーキの固体と流体（液体と気体）の両方が含まれる。フィルタケーキは、この方法で少なくとも２回、好ましくは少なくとも４回、さらにより好ましくは少なくとも６回洗浄されることが好ましい。
【０２２３】
洗浄工程からの使用済み洗浄液を、例えば、乳清タンパク質フィード又は乳清タンパク質溶液にリサイクルしてもよく、洗い流された非凝集ＢＬＧを再度分離することができる。
本方法はさらに、
−分離したＢＬＧ結晶を再結晶液に溶解すること、
−ＢＬＧに関して過飽和になるように再結晶液を調整すること、
−過飽和で調整された再結晶液中で非凝集ＢＬＧを結晶化すること、及び
−残りの調整された再結晶液からＢＬＧ結晶を分離すること
を含む再結晶化工程を含む工程を含み得る。
【０２２４】
再結晶化は、単一の再結晶化手順又は複数の再結晶化手順のいずれかを含み得る。
【０２２５】
本発明のいくつかの実施形態において、工程もしくはｃ）のＢＬＧ結晶又はその後に洗浄されたＢＬＧ結晶は、少なくとも２回再結晶化される。例えば、ＢＬＧ結晶は、例えば少なくとも４回など、少なくとも３回再結晶化され得る。
【０２２６】
洗浄及び再結晶化工程は、任意の手順で組み合わせることができ、任意に複数回実行することができる。
【０２２７】
工程ｃ）の分離されたＢＬＧ結晶は、例えば、本方法の手順：
−１つ又は２つ以上の洗浄工程と、それに続く
−１つ又は２つ以上の再結晶化工程
に供され得る。
【０２２８】
あるいは、工程ｃ）の分離されたＢＬＧ結晶は、本方法の手順：
−１つ又は２つ以上の再結晶化工程と、それに続く
−１つ又は２つ以上の洗浄工程
に供され得る。
【０２２９】
例えば、
−１つ又は２つ以上の洗浄工程、
−１つ又は２つ以上の再結晶化工程、
−１つ又は２つ以上の洗浄工程、及び
−１つ又は２つ以上の再結晶化工程
という手順で、
又は、例えば、
−１つ又は２つ以上の再結晶化工程、
−１つ又は２つ以上の洗浄工程、
−１つ又は２つ以上の再結晶化工程、
−１つ又は２つ以上の洗浄工程
という手順で、
洗浄と再結晶化の複数の工程を組み合わせることも可能である。
【０２３０】
工程ｄ）は、回収された母液に由来する第１の組成物を提供する。
【０２３１】
本発明の文脈において、「回収された母液に由来する第１の組成物」及び「第１の組成物」という用語は、回収された母液の少なくともかなりの量のＡＬＡを、好ましくは回収された母液の実質的にすべてのＡＬＡ含む水性の液体組成物に関するものである。
【０２３２】
本発明のいくつかの実施形態において、第１の組成物は、回収された母液のＡＬＡの少なくとも２０％、回収された母液のＡＬＡの、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％を含む。好ましくは、第１の組成物は、回収された母液の実質的にすべてのＡＬＡを含む。
【０２３３】
本発明の他の好ましい実施形態において、第１の組成物は、回収された母液を含むか、又はそれからなる。したがって、第１の組成物は、回収された母液それ自体であることが好ましい場合がある。
【０２３４】
本発明の他の好ましい実施形態において、第１の組成物は、回収された母液のタンパク質濃縮物である。
【０２３５】
本発明のいくつかの実施形態において、第１の組成物が１つ又は２つ以上の追加の乳清タンパク質供給源を含むことがさらに可能であり、多くの場合、第１の組成物の総タンパク質に対するＡＬＡの重量パーセンテージが回収された母液における場合と少なくとも同じであることが好ましい。
【０２３６】
回収された母液がまだ要求される特徴を有していない場合、第１の組成物の供給は、例えば、回収された母液を、
−脱塩、
−ミネラルの追加
−希釈、
−濃縮、
−物理的微生物低減、及び
−ｐＨ調整
の群から選択される１つ又は２つ以上の工程にかけることを含み得る。
【０２３７】
脱塩の非限定的な例には、例えば、透析、ゲルろ過、限外ろ過／ダイアフィルトレーション、ナノろ過／ダイアフィルトレーション、及びイオン交換クロマトグラフィーが含まれる。
【０２３８】
ミネラルの添加の非限定的な例には、例えばＮａ、Ｋ、Ｃａ、及び／又はＭｇの塩など、可溶性の食品に許容され得る塩の添加が含まれる。前述の塩は、例えば、リン酸塩、塩化物塩、又は食用酸の塩、例えば、クエン酸塩、ラクトビオン酸塩又は乳酸塩などであり得る。ミネラルは、固体形態、懸濁形態、又は溶解形態で添加され得る。
【０２３９】
希釈の非限定的な例には、例えば、水、脱塩水、又はミネラル、酸、塩基の水溶液などの液体希釈剤の添加が含まれる。
【０２４０】
濃縮の非限定的な例には、例えば、蒸発、逆浸透、ナノろ過、限外ろ過及びそれらの組合せが含まれる。
【０２４１】
濃縮により、総固形分に対してタンパク質の濃度を増加させなければならない場合は、限外ろ過又は代替的に透析などの濃縮工程を使用することが好ましい。濃縮により、総固形分に対してタンパク質の濃度を増加させる必要がない場合、例えば、蒸発、ナノろ過及び／又は逆浸透などの方法が有用であり得る。
【０２４２】
物理的微生物低減の非限定的な例には、例えば、熱処理、細菌ろ過、紫外線照射、高圧処理、パルス光処理、パルス電場処理、及び超音波が含まれる。これらの方法は、当業者によく知られている。
【０２４３】
細菌ろ過は、典型的には精密ろ過又は大孔径限外ろ過を含み、微生物を保持できるが、興味の対象であるタンパク質や他の成分を通過させることができる細孔径を必要とする。有用な細孔径は、典型的には最大で１．５ミクロン、好ましくは最大で１．０ミクロン、より好ましくは最大で０．８ミクロン、さらにより好ましくは最大で０．５ミクロン、そして最も好ましくは最大で０．２ミクロンである。細菌ろ過の細孔径は、典型的には少なくとも０．１ミクロンである。
【０２４４】
細菌ろ過は、例えば、０．０２〜１ミクロン、好ましくは０．０３〜０．８ミクロン、より好ましくは０．０４〜０．６ミクロン、さらにより好ましくは０．０５〜０．４ミクロン、最も好ましくは０．１〜０．２ミクロンの細孔径を有する膜を含み得る。
【０２４５】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、処理される液体、好ましくは母液は、細菌ろ過にかけられ、続いて、最高８０℃、好ましくは最高７５℃の温度を使用する熱処理にかけられる。この熱処理の温度及び持続時間の組合せは、好ましくは無菌の液体を提供するように選択される。
【０２４６】
本発明の他の好ましい実施形態において、処理される液体、好ましくは母液は、細菌ろ過にかけられ、続いて、少なくとも１５０℃の温度を使用する、最大で０．２秒の持続時間、好ましくは最大で０．１秒の持続時間の熱処理にかけられる。この熱処理の温度及び持続時間の組合せは、好ましくは無菌の液体を提供するように選択される。
【０２４７】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、物理的微生物低減は、熱処理を含むか、又は熱処理からなることさえある。
【０２４８】
好ましくは、熱処理は少なくとも低温殺菌を含む。
【０２４９】
特に好ましい実施形態において、熱処理は、７０〜８０℃の範囲の温度に加熱することを含む。
【０２５０】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、熱処理の温度は、７０〜８０℃の範囲、好ましくは７０〜７９℃の範囲、より好ましくは７１〜７８℃の範囲、さらにより好ましくは７２〜７７℃の範囲、最も好ましくは約７５℃など、７３〜７６℃の範囲である。
【０２５１】
好ましくは、熱処理の持続時間は、７０〜８０の温度範囲で実施される場合、１秒〜３０分である。最高の曝露時間は、温度範囲の最低温度に最適なものであり、その逆も同様である。
【０２５２】
本発明の特に好ましい実施形態において、熱処理は、７０〜７８℃で１秒〜３０分、より好ましくは７１〜７７℃で１分〜２５分、さらにより好ましい７２〜７６℃で２分〜２０分を条件とする。
【０２５３】
いくつかの実施形態では、特に乾燥前に非凝集ＢＬＧの展開及び場合により凝集も必要とされる場合、より高い温度も好ましい場合がある。例えば、熱処理の温度は、少なくとも８１℃、好ましくは少なくとも９１℃、より好ましくは少なくとも１００℃、さらにより好ましくは少なくとも１２０℃、最も好ましくは少なくとも１４０℃であり得る。
【０２５４】
熱処理は、例えば、９０〜１３０℃の範囲の温度及び４秒〜３０分の範囲の持続時間を含み得る。熱処理は、例えば、９０〜９５℃の範囲の温度へ１〜１０分の持続時間、例えば約１２０℃で約２０秒間加熱することを含み得る。あるいは、熱処理は、１１５〜１２５℃の範囲の温度へ５〜３０秒の持続時間、例えば約１２０℃で約２０秒間加熱することを含み得る。
【０２５５】
あるいは、熱処理は、例えば、典型的には１３５〜１４４℃の範囲の温度及び２〜１０秒の範囲の持続時間を含むＵＨＴタイプの処理であり得る。
【０２５６】
代替的ではあるがまた好ましいことに、熱処理は、１４５〜１８０℃の範囲の温度及び０．０１〜２秒の範囲の持続時間、より好ましくは１５０〜１８０℃の範囲の温度及び０．０１〜０．３秒の範囲の持続時間を含み得る。
【０２５７】
熱処理の実施は、プレート式もしくは管型熱交換器、掻面式熱交換器又はレトルトシステムなどの慣用的装置の使用を含み得る。あるいは、そして９５℃を超える熱処理に特に好ましいのは、例えば直接蒸気圧入、直接蒸気注入、又は噴霧調理を用いて、直接蒸気ベースの加熱が使用され得る。さらに、前述の直接蒸気ベースの加熱は、好ましくは、瞬間冷却と組み合わせて使用される。噴霧調理の実施の適切な例は、国際公開第２００９１１３８５８Ａ１号に見出され、これらはすべての目的のために本明細書に組み込まれる。直接蒸気注圧入及び直接蒸気注入の実施の適切な例は、国際公開第２００９１１３８５８Ａ１号及び国際公開第２０１０／０８５９５７Ａ３号に見出され、これらはすべての目的のために本明細書に組み込まれる。高温処理の全般的態様は、例えば「食品加工における熱技術」（Ｔｈｅｒｍａｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｉｎ  ｆｏｏｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）ＩＳＢＮ１８５５７３５５８  Ｘに記載されており、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【０２５８】
ｐＨ調整の非限定的な例には、例えば、塩基及び／又は酸、好ましくは食品に許容され得る塩基及び／又は酸の添加が含まれる。二価金属カチオンをキレート化することができる酸及び／又は塩基を使用することが特に好ましい。前述の酸塩基の例は、ＥＤＴＡ、クエン酸、クエン酸塩、ラクトビオン酸、ラクトビオン酸塩、グルコン酸、グルコン酸塩、乳酸、乳酸塩、リン酸、リン酸塩及びそれらの組合せである。
【０２５９】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、第１の組成物のｐＨは、母液と実質的に同じｐＨであり、したがって、好ましくは、ｐＨ５〜６の範囲である。あるいは、第１の組成物は、５〜６のｐＨ範囲外のｐＨを有し得る。
【０２６０】
本発明者らが実施した最初の実験により、回収された母液は、それが、例えばより濃縮されているか、又はより低い温度に冷却されているならば、多くの場合、ＢＬＧ結晶化を継続することができることが明らかになった。本発明者らは、回収された母液が、工程ｃ）の分離を免れた小さな結晶片を依然として含み、したがって、結晶化のためにすでに播種されていると考えている。液体は、典型的には乾燥に必要なエネルギー量を減らすために乾燥前に濃縮されるが、回収された母液がそのまま使用される場合、この濃縮によって不要なＢＬＧ結晶が形成される可能性がある。本発明者らは、生成物を乾燥する前又はそれを濃縮する前に、回収された母液の非凝集ＢＬＧレベルを過飽和レベルより低くして、製造における望ましくない結晶化及びファウリングを回避することが有利であることを見出した。
【０２６１】
したがって、本発明のいくつかの好ましい実施形態において、第１の組成物又は第１の組成物のタンパク質濃縮物は、ＢＬＧに関して過飽和ではない。あるいは、第１の組成物又は第１の組成物のタンパク質濃縮物は、それがＢＬＧ結晶を含まない限り、ＢＬＧに関して過飽和であり得る。
【０２６２】
工程ｅ）のｐＨ調整は、第１の組成物又は第１の組成物のタンパク質濃縮物が過飽和にならないことを確実にする。第１の組成物又はそのタンパク質濃縮物のｐＨが５．０〜６．０の範囲のｐＨを有する場合、過飽和を回避するために、非凝集ＢＬＧ濃度、導電率、及び／又は温度を選択することが好ましい。
【０２６３】
本発明のさらに他の好ましい実施形態において、第１の組成物は、回収された母液のＡＬＡ分離物である。そうである場合、第１の組成物の供給には、回収された母液のさらなるＡＬＡ強化が含まれる。
【０２６４】
本発明の文脈において、「さらなるＡＬＡ強化」という用語は、第１の組成物の供給が１つ又は２つ以上の方法工程、すなわち、さらなるＡＬＡ強化を含むことを意味し、その結果、総タンパク質に対するＡＬＡの重量パーセンテージが、回収された母液の場合よりも少なくとも５％高い第１の組成物が提供された。
【０２６５】
したがって、第１の組成物は、例えば、総タンパク質に対するＡＬＡの重量パーセンテージが、回収された母液の場合よりも少なくとも５％高いものであり得る。好ましくは、第１の組成物においては、総タンパク質に対するＡＬＡの重量パーセンテージが、回収された母液のそれよりも少なくとも１０％高く、より好ましくは少なくとも２０％高く、さらにより好ましくは少なくとも３０％高く、最も好ましくは少なくとも５０％高い。
【０２６６】
さらに高いレベルのＡＬＡ強化が望まれる場合もあり、本発明のいくつかの好ましい実施形態では、第１の組成物において、総タンパク質に対するＡＬＡの重量パーセンテージが、回収された母液のそれよりも少なくとも７５％高い。好ましくは、第１の組成物においては、総タンパク質に対するＡＬＡの重量パーセンテージが、回収された母液のそれよりも少なくとも１００％高く、より好ましくは少なくとも１５０％高く、さらにより好ましくは少なくとも２００％高く、最も好ましくは少なくとも４００％高い。
【０２６７】
第１の組成物のＡＬＡの重量パーセンテージは、母液が第１の組成物を得るためにどのように処理されたかによって異なるが、典型的には総タンパク質に対して少なくとも２０重量％である。好ましくは、第１の組成物は、総タンパク質に対して少なくとも２５重量％のＡＬＡの重量パーセンテージを有する。より好ましくは、第１の組成物は、総タンパク質に対して少なくとも３０重量％のＡＬＡの重量パーセンテージを有する。さらにより好ましくは、第１の組成物は、総タンパク質に対して少なくとも４０重量％のＡＬＡの重量パーセンテージを有する。最も好ましくは、第１の組成物は、総タンパク質に対して少なくとも５０重量％のＡＬＡの重量パーセンテージを有する。
【０２６８】
本発明者らは、乳清タンパク質フィードが、酸性乳清からの乳清タンパク質分離物又は乳血清タンパク質分離物などのＣＭＰ不含有の乳清タンパク質源である場合、及び例５に概説されているようにＤＣＦが使用されている場合、総タンパク質に対して６０％を超えるＡＬＡの重量パーセンテージが得られると推定している。
【０２６９】
したがって、本発明のいくつかの好ましい実施形態において、第１の組成物は、総タンパク質に対して少なくとも６０重量％のＡＬＡの重量パーセンテージを有する。より好ましくは、第１の組成物は、少なくとも７０重量％のＡＬＡの重量パーセンテージを有する。さらにより好ましくは、第１の組成物は、総タンパク質に対して少なくとも８０重量％のＡＬＡの重量パーセンテージを有する。最も好ましくは、第１の組成物は、総タンパク質に対して少なくとも９０重量％のＡＬＡの重量パーセンテージを有する。
【０２７０】
ＡＬＡのさらなる強化は、任意の適切な方法によって達成することができる。
【０２７１】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、ＡＬＡのさらなる強化は、ＡＬＡの可逆的凝集を形成し、続いて凝集したＡＬＡを回収するために、ｐＨを３．５〜５．５に調整し、５０〜７０℃に加熱することを含むＡタイプ強化を含む。次いで、この方法で回収されたＡＬＡは、第１の組成物の一部を形成することになる。さらなるＡＬＡ強化のための前述の方法の有用な例は、米国特許第５，４５５，３３１号（Ｐｅａｒｃｅらによる）、米国特許第６，６１３，３７７号及びＭｕｌｌｅｒら（レ（Ｌａｉｔ）８３、４３９〜４５１頁、２００３）に記載されており、これらはすべての目的のため参照により本明細書に組み込まれる。
【０２７２】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、ＡＬＡのさらなる強化は、回収された母液をイオン交換クロマトグラフィーにかけることを含む、Ｂタイプ強化を含む。さらなるＡＬＡ強化のための前述の方法の有用な例は、ｄｅ  Ｊｏｎｇｈら（「緩やかな単離手順によりβ−ラクトグロブリンの新しいタンパク質構造が明らかにされる」（Ｍｉｌｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｅｓ  Ｎｅｗ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  β−Ｌａｃｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）、酪農科学誌（Ｊ  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．）、第８４（３）巻、２００１、５６２−５７１頁）及びＶｙａｓら（「天然β−ラクトグロブリン親和性分離方法のスケールアップ」（Ｓｃａｌｅ−Ｕｐ  ｏｆ  Ｎａｔｉｖｅ  β−Ｌａｃｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ）、酪農科学誌（Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．）８５：１６３９−１６４５、２００２）に記載されており、これらはすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【０２７３】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、ＡＬＡのさらなる強化は、膜分離を使用してＡＬＡを他の乳清タンパク質から分離するＣタイプ強化を含む。さらなるＡＬＡ強化のための前述の方法の有用な例は、米国特許第５，００８，３７６号に記載されており、これらは、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【０２７４】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、ＡＬＡのさらなる強化は、ＡＬＡ及び他の乳清タンパク質からＣＭＰを除去するために、最大ｐＨ４のｐＨで限外ろ過を使用するＤタイプ強化を含む。酸性限外ろ過工程の有用な実施形態及び例は、国際公開第２０１４０７６２５２Ａ１号、国際公開第９９２９１８３Ａ１号、及び米国特許第５２７８２８８号に記載されており、これらはすべて、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【０２７５】
ＡＬＡのさらなる強化は、例えば、Ａタイプ、Ｂタイプ、Ｃタイプ、及びＤタイプからなる群から選択される２つ以上の強化方法の組合せを含み得る。
【０２７６】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、第１の組成物は、総タンパク質に対して少なくとも９２重量％、好ましくは少なくとも９５重量％、より好ましくは少なくとも９７重量％、さらにより好ましくは少なくとも９８％の量でＡＬＡを含み、最も好ましくは総タンパク質に対して少なくとも９９．５重量％の量で非凝集ＢＬＧを含む。
【０２７７】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、第１の組成物は、少なくとも５重量％、好ましくは少なくとも１０重量％、より好ましくは少なくとも１５重量％、さらにより好ましくは少なくとも２０重量％の量で総タンパク質を含み、最も好ましくは少なくとも３０重量％の量で総タンパク質を含む。
【０２７８】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、第１の組成物は、５〜４０重量％の範囲、好ましくは１０〜３５重量％の範囲、より好ましくは１５〜３０重量％の範囲、さらにより好ましくは２０〜２５重量％の範囲の量で総タンパク質を含む。
【０２７９】
本発明者らは、第１の組成物中のタンパク質濃度の増加により、より高いかさ密度を有する噴霧乾燥粉末が生じることを観察しており、したがって、第１の組成物中に比較的高濃度のタンパク質を有することが好ましい。
【０２８０】
したがって、本発明の他の好ましい実施形態において、第１の組成物は、１０〜４０重量％の範囲、好ましくは２０〜３８重量％の範囲、より好ましくは２４〜３６重量％の範囲、さらにより好ましくは２８〜３４重量％の範囲の量で総タンパク質を含む。
【０２８１】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、第１の組成物は、５〜５０重量％の範囲、好ましくは１０〜４０重量％の範囲、より好ましくは１５〜３５重量％の範囲、さらにより好ましくは２０〜３０重量％の範囲の含有量で総固形分を含む。
【０２８２】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、第１の組成物は、５０〜９５重量％の範囲、好ましくは６０〜９０重量％の範囲、より好ましくは６５〜８５重量％の範囲、さらにより好ましくは７０〜８０重量％の範囲の量での含水量を含む。
【０２８３】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、第１の組成物は、最大で６０重量％、好ましくは最大で５０重量％、より好ましくは最大で２０重量％、さらにより好ましくは最大で１０重量％、さらにより好ましくは最大で１重量％、最も好ましくは最大で０．１％の量で炭水化物を含む。例えば、第１の組成物は、例えば、ラクトース、オリゴ糖及び／又はラクトースの加水分解生成物（すなわち、グルコース及びガラクトース）、スクロース、及び／又はマルトデキストリンなどの炭水化物を含み得る。
【０２８４】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、第１の組成物は、最大で１０重量％、好ましくは最大で５重量％、より好ましくは最大で２重量％、さらにより好ましくは最大で０．１重量％の量で脂質を含む。
【０２８５】
本発明者らは、ミネラル含有量を制御して、第１の組成物の所望の特性のいくつかに到達させることが有利であり得ることを見出した。
【０２８６】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、第１の組成物のＮａ、Ｋ、Ｍｇ、及びＣａの量の合計は、最大で１０ｍｍｏｌ／ｇ（タンパク質）である。好ましくは、第１の組成物のＮａ、Ｋ、Ｍｇ、及びＣａの量の合計は、最大で６ｍｍｏｌ／ｇ（タンパク質）、より好ましくは最大で４ｍｍｏｌ／ｇ（タンパク質）、さらにより好ましくは最大で２ｍｍｏｌ／ｇ（タンパク質）である。
【０２８７】
本発明の他の好ましい実施形態では、第１の組成物のＮａ、Ｋ、Ｍｇ、及びＣａの量の合計は、最大で１．０ｍｍｏｌ／ｇ（タンパク質）である。好ましくは、第１の組成物のＮａ、Ｋ、Ｍｇ、及びＣａの量の合計は、最大で０．６ｍｍｏｌ／ｇ（タンパク質）、より好ましくは最大で０．４ｍｍｏｌ／ｇ（タンパク質）、さらにより好ましくは最大で０．２ｍｍｏｌ／ｇ（タンパク質）、最も好ましくは最大で０．１ｍｍｏｌ／ｇ（タンパク質）である。
【０２８８】
本発明の他の好ましい実施形態では、第１の組成物のＭｇ及びＣａの量の合計は、最大で５ｍｍｏｌ／ｇ（タンパク質）である。好ましくは、第１の組成物のＭｇ及びＣａの量の合計は、最大で３ｍｍｏｌ／ｇ（タンパク質）、より好ましくは最大で１．０ｍｍｏｌ／ｇ（タンパク質）、さらにより好ましくは最大で０．５ｍｍｏｌ／ｇ（タンパク質）である。
【０２８９】
本発明の他の好ましい実施形態において、第１の組成物のＭｇ及びＣａの量の合計は、最大で０．３ｍｍｏｌ／ｇ（タンパク質）である。好ましくは、第１の組成物のＭｇ及びＣａの量の合計は、最大で０．２ｍｍｏｌ／ｇ（タンパク質）、より好ましくは最大で０．１ｍｍｏｌ／ｇ（タンパク質）、さらにより好ましくは最大で０．０３ｍｍｏｌ／ｇ（タンパク質）、そして最も好ましくは最大で０．０１ｍｍｏｌ／ｇ（タンパク質）である。
【０２９０】
いくつかの用途では、適切な特徴を備えた製品を得るために、第１の組成物のｐＨを変更する必要がある。前述の実施形態では、本発明の方法は、工程ｅ）を含む。
【０２９１】
したがって、本発明のいくつかの好ましい実施形態において、本方法は工程ｅ）を含み、この場合、
−第１の組成物のｐＨを、２．５〜４．９、好ましくは２．８〜４．５、より好ましくは２．８〜３．２の範囲のｐＨに調整するか、又は
−第１の組成物のｐＨを、６．１〜８．５、好ましくは６．３〜８．０、さらにより好ましくは６．５〜７．５の範囲のｐＨに調整する。
【０２９２】
例えば、第１の組成物のｐＨを、２．５〜４．９、好ましくは２．８〜４．５、より好ましくは２．８〜３．２の範囲のｐＨに調整することがあり得る。
【０２９３】
あるいは、第１の組成物のｐＨを、６．１〜８．５、好ましくは６．３〜８．０、さらにより好ましくは６．５〜７．５の範囲のｐＨに調整し得る。
【０２９４】
ｐＨ調整は、好ましくは、本明細書に記載の食品グレードの酸及び塩基のうちの１つ又は２つ以上を用いて、そして好ましくは、強酸又は強塩基が使用される場合は希酸又は希塩基を用いて行われる。
【０２９５】
工程ｆ）は、
−工程ｄ）から得られた第１の組成物又はそのタンパク質濃縮物、又は
−工程ｅ）から得られたｐＨ調整された第１の組成物又はそのタンパク質濃縮物
を乾燥することを含む。
【０２９６】
工程ｆ）の乾燥は、典型的には、噴霧乾燥又は凍結乾燥を伴う。
【０２９７】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、乾燥に供される液体流は、ｐＨ調整された第１の組成物のタンパク質濃縮物である。
【０２９８】
「乾燥に供される液体流」という用語は、以下の液体：
−工程ｄ）から得られた第１の組成物、
−工程ｄ）から得られた第１の組成物のタンパク質濃縮物、
−工程ｅ）から得られたｐＨ調整された第１の組成物、又は
−工程ｅ）から得られたｐＨ調整された第１の組成物のタンパク質濃縮物
のうちの１つを指す。
−
【０２９９】
本発明の他の好ましい実施形態において、乾燥に供される液体流は、第１の組成物のタンパク質濃縮物である。
【０３００】
噴霧乾燥は、現時点で好ましい乾燥方法である。
【０３０１】
本発明のいくつかの実施形態において、乾燥に供される液体流は、噴霧装置（例えば、ノズル又は噴霧器）の出口に到達するとき、最高で７０℃、好ましくは最高で６０℃、より好ましくは最高で５０℃の温度を有する。本発明のいくつかの好ましい実施形態において、乾燥に供される液体流は、噴霧装置の出口に到達するとき、最高で４０℃、好ましくは最高で３０℃、より好ましくは最高で２０℃、さらにより好ましくは最高で１０℃、最も好ましくは最高で５℃の温度を有する。
【０３０２】
噴霧乾燥機の噴霧装置は、乾燥される溶液又は懸濁液を、噴霧乾燥機の乾燥チャンバに入る液滴に変換する装置、例えば、ノズル又は噴霧器である。
【０３０３】
乾燥に供される液体流は、噴霧装置の出口に到達するとき０〜５０℃の範囲、噴霧装置の出口に到達するとき、好ましくは２〜４０℃の範囲、より好ましくは４〜３５℃の範囲、最も好ましくは５〜１０℃の範囲の温度を有することが特に好ましい。
【０３０４】
噴霧乾燥機のガスの入口温度は、好ましくは１４０〜２２０℃の範囲、より好ましくは１６０〜２００℃の範囲、さらにより好ましくは１７０〜１９０℃の範囲であり、例えば、好ましくは約１８０℃などである。噴霧乾燥機からのガスの出口温度は、好ましくは５０〜９５℃の範囲、より好ましくは７０〜９０℃の範囲、さらにより好ましくは８０〜８８℃の範囲であり、例えば好ましくは約８５℃などである。経験則として、噴霧乾燥に供される固体は、ガス出口温度よりも１０〜１５℃低い温度に加熱されると言われている。
【０３０５】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、噴霧乾燥機は、好ましくは５０〜８５℃の範囲、より好ましくは６０〜８０℃の範囲、さらにより好ましくは６５〜７５℃の範囲であり、例えば好ましくは約７０℃などである。
【０３０６】
乾燥工程はさらに、例えば噴霧乾燥装置に統合されているか、又は噴霧乾燥後に実行される別個のユニット操作として流動床乾燥を含み得る。
【０３０７】
噴霧乾燥と流動床乾燥の組合せにより、乾燥する液滴が噴霧乾燥チャンバを移動する間に除去される水の量を減らすことが可能になり、代わりに流動床乾燥によって湿った粉末から残留水が除去される。この溶液は、噴霧乾燥のみによる乾燥よりも乾燥に必要なエネルギーが少なく、さらに、例えばインスタント化及び／又は凝集により、粉末を改変することを可能にする。インスタント化は、好ましくは、レシチン又は別の有用な湿潤剤を粉末の表面に適用することによって実行される。インスタント化を適用する場合、インスタント化（ｉｎｓｔａｎｔｉｓａｔｉｏｎ）剤、例えば食用油に溶解したレシチンを、典型的には、最終粉末の総重量に対して０．５〜２重量％の範囲、好ましくは最終粉末の総重量に対して１．０〜１．５重量％の範囲の量で添加する。
【０３０８】
本発明者らは、乳清タンパク質溶液の調製を含む結晶化方法が微生物増殖を起こしやすいことに気づき、この問題に対処するために方法を改変することが有利であることを見出した。
【０３０９】
乳清タンパク質フィードの供給から工程ｆ）の乾燥又は後続の食品製造のためのＡＬＡの使用までの、ＡＬＡ分子が１２℃を超える温度にある合計時間は、最大で２４時間、好ましくは２０時間、より好ましくは最大で１２時間、さらにより好ましくは最大で６時間、そして最も好ましくは最大で３時間であることが特に好ましい。
【０３１０】
持続時間をさらに短縮することが可能であり、好ましいことが多いため、本発明のいくつかの好ましい実施形態において、乳清タンパク質フィードの供給から工程ｆ）の乾燥又は後続の食品製造のための第１の組成物の使用までの、ＡＬＡ分子が１２℃を超える温度にある合計時間は、最大で２時間、好ましくは１時間、より好ましくは最大で０．５時間、さらにより好ましくは最大で０．３時間、最も好ましくは最大で０．１時間である。
【０３１１】
さらに、本方法は、少なくとも１つの物理的微生物低減を含み、好ましくは、ＢＬＧ結晶の除去後に母液に適用され、及び／又は工程ｃ）に続いてＡＬＡ含有液体流に適用されることが好ましい。
【０３１２】
物理的微生物低減は、好ましくは、
−熱処理、好ましくは少なくとも低温殺菌、
−紫外線照射処理、
−パルス光処理、
−パルス電界処理、
−精密ろ過、
−高圧処理、及び
−超音波処理
のうちの１つ又は２つ以上を含む。
【０３１３】
これらの方法は当業者に周知であり、熱処理に関するさらなる詳細が本明細書に提供されている。
【０３１４】
精密ろ過を伴う物理的微生物低減には、微生物を保持できるが、興味の対象であるタンパク質や他の成分を通過させることができる細孔径が必要である。有用な細孔径は、典型的には最大で１．５ミクロン、好ましくは最大で１．０ミクロン、より好ましくは最大で０．８ミクロン、さらにより好ましくは最大で０．５ミクロン、そして最も好ましくは最大で０．２ミクロンである。細菌ろ過の細孔径は、典型的には少なくとも０．１ミクロンである。
【０３１５】
乾燥に供される液体流は、好ましくは、微生物の含有量が少ない。
【０３１６】
本発明のいくつかの実施形態において、乾燥に供される液体流は、最大で５００．０００ＣＦＵ／ｇ、好ましくは最大で１００．０００ＣＦＵ／ｇ、より好ましくは最大で５０．０００ＣＦＵ／ｇ、さらにより好ましくは最大で１０．０００ＣＦＵ／ｇを含む。
【０３１７】
好ましくは、乾燥に供される液体流に含まれ得るのは、最大で１０００コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｇに過ぎない。さらにより好ましくは、乾燥に供される液体流に含まれるのは、最大で６００ＣＦＵ／ｇに過ぎない。より好ましくは、乾燥に供される液体流に含まれるのは、最大で３００ＣＦＵ／ｇに過ぎない。さらにより好ましくは、乾燥に供される液体流に含まれるのは、最大で１００ＣＦＵ／ｇに過ぎない。さらにより好ましくは、乾燥に供される液体流に含まれるのは、最大で５０ＣＦＵ／ｇに過ぎない。最も好ましくは、乾燥に供される液体流に含まれるのは、最大で２０ＣＦＵ／ｇｍ、例えば最大で１０ＣＦＵ／ｇなどに過ぎない。特に好ましい実施形態では、乾燥に供される液体流は無菌である。乾燥に供される液体流は、例えば、液体流を乾燥に供している間にいくつかの物理的微生物低減方法を組み合わせることによって調製され得る。
【０３１８】
この方法は、多くの場合、食用のＡＬＡ強化乳清タンパク質組成物を包装する工程を含む。食用乳清タンパク質組成物は、典型的には、適切な容器に包装され、その後、密閉及び／又は密封される。包装は、例えば、無菌又は滅菌条件下で実施され得、例えば、食用乳清タンパク質組成物を滅菌容器に充填して密封することを含み得る。
【０３１９】
本発明の別の実施態様は、例えば本明細書に記載された方法によって得られる、食用のＡＬＡ強化乳清タンパク質組成物に関する。
【０３２０】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、食用のＡＬＡ強化乳清タンパク質組成物は、
−総タンパク質に対して２４〜８０重量％、好ましくは２４〜７０重量％の範囲の量のＡＬＡ、
−総タンパク質に対して３〜１４重量％の範囲の量の免疫グロブリン、及び
−任意に、総タンパク質に対して１〜６重量％の範囲、好ましくは総タンパク質に対して２〜５重量％の範囲の量のリン脂質
を含む。
【０３２１】
リン脂質の量は、Ｖａｇｈｅｌａら（Ｖａｇｈｅｌａら、「狭口径カラムと蒸発光散乱検出器を備えた高速液体クロマトグラフィーによる乳清タンパク質濃縮物からのリン脂質の定量分析」（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ  ｆｒｏｍ  ｗｈｅｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ  ｂｙ  ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎａｒｒｏｗ−ｂｏｒｅ  ｃｏｌｕｍｎ  ａｎｄ  ａｎ  ｅｖａｐｏｒａｔｉｖｅ  ｌｉｇｈｔ−ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ）、米国油脂化学協会誌（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’  Ｓｏｃｉｅｔｙ）、１９９５年６月、７２巻、６号、７２９〜７３３頁）に従って測定される。
【０３２２】
前述の食用のＡＬＡ強化乳清タンパク質組成物は、例えば、乳清タンパク質フィードが、タンパク質変性熱処理を受けていない血清タンパク質濃縮物である場合に得られる。
【０３２３】
本発明者らは、これらの成分が小児の栄養に有用であるため、ＡＬＡに加えて免疫グロブリン及び任意にリン脂質も含む食用のＡＬＡ強化乳清タンパク質組成物を提供できることが特に有利であることを見出した。
【０３２４】
本発明のいくつかの実施形態において、食用のＡＬＡ強化乳清タンパク質組成物が含むカゼイン種は、総タンパク質に対して最大で１５重量％である。
【０３２５】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、ＡＬＡ強化乳清タンパク質組成物は、
−総タンパク質に対して４０〜７０重量％の範囲のＡＬＡ、
−総タンパク質に対して最大１５重量％のカゼイン種、及び
−総タンパク質に対して少なくとも３重量％の免疫グロブリン
を含み得る。
【０３２６】
本発明の利点は、得られたＡＬＡ強化乳清タンパク質組成物が、典型的には非常に穏やかに処理され、過度の熱ストレスにさらされていないことである。本発明のいくつかの好ましい実施形態において、ＡＬＡ強化乳清タンパク質組成物は、フロシン値が最大で５０ｍｇ／１００ｇ（タンパク質）である。好ましくは、ＡＬＡ強化乳清タンパク質組成物は、フロシン値が最大で３０ｍｇ／１００ｇ（タンパク質）である。より好ましくは、ＡＬＡ強化乳清タンパク質組成物は、フロシン値が最大で２０ｍｇ／１００ｇ（タンパク質）である。さらにより好ましくは、ＡＬＡ強化乳清タンパク質組成物は、フロシン値が最大１０ｍｇ／１００ｇ（タンパク質）である。最も好ましくは、ＡＬＡ強化乳清タンパク質組成物は、フロシン値が最大で２ｍｇ／１００ｇ（タンパク質）であり、好ましくは、検出可能なフロシン値を全く有しない。
【０３２７】
ＡＬＡ強化乳清タンパク質組成物中のＢＬＧの含有量は、比較的低いことが多い。本発明のいくつかの好ましい実施形態において、ＡＬＡ強化乳清タンパク質組成物が含むＢＬＧは、総タンパク質に対して最大で４０重量％である。好ましくは、ＡＬＡ強化乳清タンパク質組成物が含むＢＬＧは、総タンパク質に対して最大で３０重量％である。より好ましくは、ＡＬＡ強化乳清タンパク質組成物が含むＢＬＧは、総タンパク質に対して最大で２０重量％である。さらにより好ましくは、ＡＬＡ強化乳清タンパク質組成物が含むＢＬＧは、総タンパク質に対して最大で１０重量％である。最も好ましくは、ＡＬＡ強化乳清タンパク質組成物が含むＢＬＧは、総タンパク質に対して最大で２重量％である。例えば、ＡＬＡ強化乳清タンパク質組成物が含むＢＬＧは、総タンパク質に対して最大で０．５重量％であることが好ましい。
【０３２８】
本発明の別の実施態様は、食品を製造する方法に関するもので、この方法は、
ａ）非凝集ＢＬＧ、ＡＬＡ及び任意の追加の乳清タンパク質を含む乳清タンパク質溶液を提供する工程であって、前記乳清タンパク質溶液が、ＢＬＧに関して過飽和であり、ｐＨが５〜６の範囲であるものとする工程、
ｂ）過飽和乳清タンパク質溶液中で、好ましくは塩溶モードで、非凝集ＢＬＧを結晶化する工程、及び
ｃ）残りの母液からＢＬＧ結晶を分離し、母液の少なくとも一部を回収する工程、
ｄ）回収された母液及び任意に使用済み洗浄液から誘導された第１の組成物を供給する工程、
ｅ）任意に、第１の組成物のｐＨを、
ｉ）２．５〜４．９の範囲のｐＨ、又は
ｉｉ）６．１〜８．５の範囲のｐＨ
に調整することもある工程、
ｆ）任意に、工程ｄ）から得られた第１の組成物もしくはそのタンパク質濃縮物を乾燥するか、又は工程ｅ）から得られたｐＨ調整された第１の組成物もしくはそのタンパク質濃縮物を乾燥する工程、
ｇ）
ｇ１）工程ｄ）から得られた第１の組成物もしくはそのタンパク質濃縮物、
ｇ２）工程ｅ）から得られたｐＨ調整された第１の組成物もしくはそのタンパク質濃縮物、及び／又は
ｇ３）工程ｆ）で得られた乾燥組成物
を１つ又は２つ以上の成分と組み合わせ、そして組合せを食品に変換する工程
を含む。
【０３２９】
食品は、乳児用調製粉乳、飲料、インスタント飲料粉末、プロテインバー、お粥、又はスムージーである。
【０３３０】
食品を調製するための１つ又は２つ以上の成分は、１つ又は２つ以上の乳成分不含有の炭水化物、乳成分不含有の脂質、及び／又は乳成分不含有のタンパク質を含むことが多い。「乳成分不含有の炭水化物」という用語は、牛乳に存在しない炭水化物を意味する。「乳成分不含有の脂質」という用語は、牛乳に存在しない脂質を意味する。「乳成分不含有の炭水化物」という用語は、牛乳には存在しないタンパク質を意味する。
【０３３１】
ＡＬＡ強化乳清タンパク質組成物のアミノ酸プロファイルは、乳児用調製粉乳や他の小児用食品に特に適している。
【０３３２】
さらに本発明の一実施態様は、例えば上記の方法で得られる、ＡＬＡ強化乳清タンパク質組成物を含む食品、好ましくは栄養製品に関する。
【０３３３】
本発明のさらなる実施態様は、本明細書に記載のＡＬＡ強化乳清タンパク質組成物を含む栄養製品に関する。
【０３３４】
本発明の文脈において、「栄養製品」という用語は、食用製品、すなわち、少なくともタンパク質並びに脂質、炭水化物、ミネラル、及びビタミンのうちの１つ又は２つ以上を含む、ヒトの消費に対して安全な製品に関する。栄養製品は、好ましくはタンパク質、炭水化物及び脂質を含み、さらにより好ましくは、それはタンパク質、炭水化物、脂質、ミネラル及びビタミンを含む。
【０３３５】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、栄養製品は、臨床栄養に適した栄養製品、スポーツ栄養に適した栄養製品、又は小児栄養に適した栄養製品である。
【０３３６】
栄養製品が小児用栄養製品であることが特に好ましい。好ましくは、栄養製品は、栄養的に完全な乳児用調製粉乳、又は少なくとも乳児用調製粉乳に必要なタンパク質を含む乳児用調製粉乳ベースである。代替的ではあるが、また好ましくは、小児用栄養製品は、追加の調合乳又は成長期用乳であり得る。
【０３３７】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、例えば乳児用調製粉乳の形態の栄養製品は、
−タンパク質の総量に対して少なくとも４０重量％、好ましくは少なくとも４５重量％のＡＬＡ、及び
−タンパク質の総量に対して少なくとも５重量％の免疫グロブリン
を含む。
【０３３８】
本発明の他の実施形態において、例えば乳児用調製粉乳の形態の栄養製品は、
−総タンパク質に対して４０〜７０重量％の範囲のＡＬＡ、
−総タンパク質に対して最大で１５重量％のカゼイン種
−及び少なくとも５重量％の免疫グロブリン
を含む。
【０３３９】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、例えば乳児用調製粉乳の形態の栄養製品は、
−総タンパク質に対して２４〜８０重量％、好ましくは総タンパク質に対して４０〜７０重量％、及びさらに好ましくは総タンパク質に対して４５〜６５重量％の範囲の量のＡＬＡ、
−総タンパク質に対して５〜１４重量％の範囲の量の免疫グロブリン、及び
−任意に、総タンパク質に対して１〜６重量％の範囲、好ましくは総タンパク質に対して２〜５重量％の範囲の量のリン脂質
を含む。
【０３４０】
本発明の他の実施形態において、例えば乳児用調製粉乳の形態の栄養製品には、総タンパク質に対して最大で５０重量％のカゼイン種、好ましくは総タンパク質に対して最大で４０重量％のカゼイン種、総タンパク質に対して最大で３０重量％のカゼイン種が含まれる。
【０３４１】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、例えば乳児用調製粉乳の形態の栄養製品は、
−総タンパク質に対して２４〜５０重量％の範囲のＡＬＡ、
−総タンパク質に対して２０〜４０重量％のカゼイン種、及び
−総タンパク質に対して少なくとも３〜１５重量％の免疫グロブリン
を含む。
【０３４２】
例えば乳児用調製粉乳の形態の栄養製品のＢＬＧの含有量は、比較的低いことが多い。本発明のいくつかの好ましい実施形態において、例えば乳児用調製粉乳の形態の栄養製品が含むＢＬＧは、総タンパク質に対して最大で４０重量％である。好ましくは、ＡＬＡ強化乳清タンパク質組成物が含むＢＬＧは、総タンパク質に対して最大で３０重量％である。さらに好ましくは、例えば乳児用調製粉乳の形態の栄養製品が含むＢＬＧは、総タンパク質に対して最大で２０重量％である。さらにより好ましくは、例えば乳児用調製粉乳の形態の栄養製品が含むＢＬＧは、総タンパク質に対して最大で１０重量％である。最も好ましくは、例えば乳児用調製粉乳の形態の栄養製品が含むＢＬＧは、総タンパク質に対して最大で２重量％である。例えば乳児用調製粉乳の形態の栄養製品が含むＢＬＧは、例えば総タンパク質に対して最大で０．５重量％であることが好ましい。
【０３４３】
栄養製品に含まれ得る１つ又は２つ以上の追加の成分は、有利には小児製品に通常使用される成分の中から選択され得る。
【０３４４】
例えば、栄養製品、例えば、乳児用調製粉乳の形態の場合、例えば２’−ＦＬ及びＬＮｎＴなど、ヒト母乳オリゴ糖（ＨＭＯ）の少なくとも１つを含み得る。研究では、中枢神経系（ＣＮＳ）機能の改善におけるＨＭＯの複数の役割が示されている。上記の２’−ＦＬ及びＬＮｎＴのうちの少なくとも１つを含むことに加えて、ある特定の実施態様では、栄養製品は、追加のシアル化又はフコシル化されたヒト母乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を含む。
【０３４５】
栄養製品に使用されるＨＭＯのいずれか又はすべては、限定はされないが、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、又はヤギの種を含む哺乳動物によって分泌される乳から単離又は強化され得る。ＨＭＯはまた、微生物発酵、酵素方法、化学合成、又はそれらの組合せによっても製造され得る。
【０３４６】
乳児用調製粉乳に含めるのに適したシアル化ＨＭＯは、例えば、オリゴ糖バックボーンに少なくとも１つのシアル酸残基を含み得る。ある特定の実施態様では、シアル化ＨＭＯは、２つ以上のシアル酸残基を含む。
【０３４７】
代替的又は追加的に、栄養製品はまた、例えばトランスガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、フルクトースオリゴ糖（ＦＯＳ）、及び／又はポリデキストロースなどの他のタイプのオリゴ糖を含み得る。
【０３４８】
例えば乳児用調製粉乳の形態の栄養製品は、さらに、例えば、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、アラキドン酸（ＡＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、リノール酸、リノレン酸（アルファリノレン酸）及びガンマリノレン酸などの１つ又は２つ以上の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を含み得る。
【０３４９】
研究により、乳児の脳と視力の発達をサポートするＰＵＦＡの複数の役割が示されている。乳児用調製粉乳にＤＨＡとＡＡを含めることで、中枢神経系に関連する認知、学習、及び記憶などの神経機能を改善することができるというのが本出願人の信じるところである。
【０３５０】
ある特定の実施態様において、ＰＵＦＡは、遊離脂肪酸として、トリグリセリド形態で、ジグリセリド形態で、モノグリセリド形態で、リン脂質形態で、又は上記のうちの１つ又は２つ以上の混合物として、好ましくはトリグリセリド形態で提供される。ＰＵＦＡは、植物油、海洋プランクトン、真菌油、及び魚油などの油供給源に由来する場合がある。ある特定の実施態様において、ＰＵＦＡは、メンハーデン、サーモン、アンチョビ、タラ、オヒョウ、マグロ又はニシン油などの魚油に由来する。
【０３５１】
例えば乳児用調製粉乳の形態の栄養製品は、さらに、例えば、ヌクレオチドイノシンモノホスファート、シチジン５’−モノホスファート、ウリジン５’−モノホスファート、アデノシン５’−モノホスファート、グアノシン５’−１−モノホスファート、より好ましくはシチジン５’−モノホスファート、ウリジン５’−モノホスファート、アデノシン５’−モノホスファート及びグアノシン５’−モノホスファートを含む１つ又は２つ以上のヌクレオチドを含み得る。
【０３５２】
例えば乳児用調製粉乳の形態での栄養製品の炭水化物濃度は、例えば栄養製品の約５重量％〜約４０重量％、例えば約７重量％〜約３０重量％、例えば約１０重量％〜約２５重量％の範囲であり得る。存在する場合、脂肪濃度は、最も典型的には、乳児用調製粉乳の約１重量％〜約３０重量％、例えば約２重量％〜約１５重量％、例えば約３重量％〜約１０重量％の範囲である。存在する場合、タンパク質濃度は、最も典型的には、栄養製品の約０．５重量％〜約３０重量％、例えば約１重量％〜約１５重量％、例えば約２重量％〜約１０重量％の範囲である。
【０３５３】
本発明のいくつかの実施形態において、例えば乳児用調製粉乳の形態での栄養製品は、上記のＰＵＦＡに加えて１つ又は２つ以上の脂肪源を含む。本明細書で使用するのに適した脂肪源には、経口乳児用調製粉乳での使用に適しており、前述の調製粉乳の本質的な要素及び特徴と適合性があるあらゆる脂肪又は脂肪源が含まれる。
【０３５４】
本明細書に記載の栄養製品で使用するのに適した脂肪又はその供給源のさらなる非限定的な例には、ココナッツ油、分留ココナッツ油、大豆油、トウモロコシ油、オリーブ油、サフラワー油、高オレイン酸サフラワー油、オレイン酸（ＥＭＥＲＳＯＬ  ６３１３  ＯＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ、Ｃｏｇｎｉｓ  Ｏｌｅｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、マレーシア）、ＭＣＴ油（中鎖トリグリセリド）、ヒマワリ油、高オレイン酸ヒマワリ油、パーム油及びパーム核油、パームオレイン、キャノーラ油、海洋油、魚油、真菌油、藻油、綿実油並びにそれらの組合せが含まれる。
【０３５５】
栄養製品には、乳血清タンパク質とカゼインに加えて、他の種類のタンパク質も含まれている場合がある。例えば乳児用調製粉乳の形態での栄養製品で使用するのに適したタンパク質又はその供給源の非限定的な例には、加水分解された、部分的に加水分解された、又は加水分解されていないタンパク質又はタンパク質供給源が含まれ、これらは、動物（例、肉、魚）、穀物（例、イネ、トウモロコシ）、野菜（例、大豆）又はそれらの組合せなど、既知であるか又は他の点で適切なあらゆる供給源に由来し得る。前述のタンパク質の非限定的な例には、広範囲に加水分解されたカゼイン、大豆タンパク質分離物、及び大豆タンパク質濃縮物が含まれる。
【０３５６】
栄養製品は、例えば、加水分解されたタンパク質、すなわちタンパク質加水分解物を含み得る。この文脈において、「加水分解（された）タンパク質」又は「タンパク質加水分解物」という用語は互換的に使用され、広範囲に加水分解されたタンパク質を含み、加水分解度は、ほとんどの場合、少なくとも約２０％、例えば約２０％〜約８０％、例えば約３０％）〜約８０％、さらにより好ましくは約４０％＞〜約６０％＞である。加水分解度は、加水分解法によってペプチド結合が切断される程度である。これらの実施形態の広範囲に加水分解されたタンパク質成分について特性検定する目的でのタンパク質加水分解度は、選択され液体製剤のタンパク質成分のアミノ窒素対総窒素比（ＡＮ／ＴＮ）を定量化することにより、製剤技術における一般的技量の者によって容易に決定される。アミノ窒素成分は、アミノ窒素含有量を決定するためのＵＳＰ滴定法によって定量化され、総窒素成分は、Ｔｅｃａｔｏｒ  Ｋｊｅｌｄａｈｌ法によって測定されるが、これらはすべて分析化学技術における一般的技量の者に周知の方法である。
【０３５７】
適切な加水分解タンパク質には、大豆タンパク質加水分解物、カゼインタンパク質加水分解物、乳清タンパク質加水分解物、イネタンパク質加水分解物、ジャガイモタンパク質加水分解物、魚タンパク質加水分解物、卵アルブミン加水分解物、ゼラチンタンパク質加水分解物、動物及び植物タンパク質加水分解物の組合せ、並びにそれらの組合せが含まれる。特に好ましいタンパク質加水分解物には、乳清タンパク質加水分解物及び加水分解されたカゼイン塩ナトリウムが含まれる。
【０３５８】
栄養製品は、乳糖に加えて、さらなる炭水化物を含む場合がある。適切な炭水化物又はその供給源の非限定的な例には、マルトデキストリン、加水分解又は修飾デンプン又はコーンスターチ、グルコースポリマー、コーンシロップ、コーンシロップ固形物、イネ由来炭水化物、エンドウ豆由来炭水化物、ジャガイモ由来炭水化物、タピオカ、スクロース、フルクトース、ラクトース、高フルクトースコーンシロップ、蜂蜜、糖アルコール（例、マルチトール、エリスリトール、ソルビトール）、人工甘味料（例、スクラロース、アセスルファムカリウム、ステビア）及びそれらの組合せが含まれる。特に望ましい炭水化物は、低デキストロース当量（ＤＥ）マルトデキストリンである。
【０３５９】
カゼイン供給源は、典型的には、栄養製品中のカゼインと乳血清タンパク質との間の所望の重量比を得るのに十分な量で、ＡＬＡ強化乳清タンパク質組成物に添加される。本発明のいくつかの好ましい実施形態において、ＡＬＡ強化乳清タンパク質組成物及びカゼイン供給源は、乳血清タンパク質とカゼインとの間の重量比が１〜９、好ましくは１〜３、さらにより好ましくは１．２〜１．９、例えば約１．５などになるように混合される。
【０３６０】
本発明の文脈において、２つの成分ＡとＢとの間の重量比は、成分Ａの重量を成分Ｂの重量で割ったものとして決定される。したがって、組成物が９重量％のＡ及び６重量％のＢを含む場合、重量比は９％／６％＝１．５になる。
【０３６１】
本発明の方法の利点は、先行技術の非凝集ＢＬＧ結晶化のための同等の方法よりもはるかに迅速であることである。乳清タンパク質フィードの最初の調整から工程ｃの分離の完了までの期間は、最大で１０時間、好ましくは最大で４時間、より好ましくは最大で２時間、さらにより好ましくは最大で１時間であり得る。
【０３６２】
例
例１−分析方法
例１．１：総タンパク質の測定
試料の総タンパク質含有量（真のタンパク質）を、以下の要領で測定する：
１）ＩＳＯ  ８９６８−１／２｜ＩＤＦ  ０２０−１／２−乳−窒素含有量の測定−パート１／２：ケルダール法を使用した窒素含有量の測定に準拠して試料の総窒素を測定する。
２）ＩＳＯ  ８９６８−４｜ＩＤＦ  ０２０−４−乳−窒素含有量の測定−パート４：非タンパク質窒素含有量の測定に準拠して試料の非タンパク質窒素を測定する。
３）タンパク質の総量を（ｍ総窒素−ｍ非タンパク質窒素）＊６．３８として計算する。
【０３６３】
例１．２：非凝集ＢＬＧ、ＡＬＡ、及びＣＭＰの決定
非凝集アルファ−ラクトアルブミン（ＡＬＡ）、ベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）及びカゼイノマクロペプチド（ＣＭＰ）の含有量を、それぞれ０．４ｍＬ／分でＨＰＬＣ分析により分析した。２５マイクロリットルのろ過試料を、２１０ｎｍのＵＶ検出器を用い、溶離液（４６５ｇのＭｉｌｌｉ−Ｑ水、４１７．３ｇのアセトニトリル及び１ｍＬのトリフルオロ酢酸からなる）で平衡化して取り付けたプレカラムＰＷｘｌ（６ｍｍ×４ｃｍ、Ｔｏｓｏｈａｓｓ、日本）と直列に接続した２つのＴＳＫｇｅｌ３０００ＰＷｘｌ（７．８ｍｍ×３０ｃｍ、Ｔｏｓｏｈａｓｓ、日本）カラムに注入する。
【０３６４】
天然アルファ−ラクトアルブミン（Ｃアルファ）、ベータ−ラクトグロブリン（Ｃベータ）、及びカゼイノマクロペプチド（ＣＣＭＰ）の含有量の定量分析は、対応する標準タンパク質で得られたピーク面積を試料のピーク面積と比較することによって実行された。
【０３６５】
追加のタンパク質（非ＢＬＧタンパク質）の総量は、総タンパク質の量からＢＬＧの量を差し引くことによって決定された（例１．１に従って測定された）。
【０３６６】
例１．３：濁度の測定
濁度は、空気中の煙と同様に、一般に肉眼では見えない多数の粒子によって引き起こされる流体の曇り又はかすみである。
【０３６７】
濁度は比濁法濁度単位（ＮＴＵ）で測定される。
【０３６８】
２０ｍＬの飲料／試料を、ＮＴＵガラスに添加し、Ｔｕｒｂｉｑｕａｎｔ（登録商標）３０００ＩＲ濁度計に配置した。ＮＴＵ値は安定化後に測定され、２回繰り返された。
【０３６９】
例１．４：粘度の測定
飲料調製物の粘度は、レオメータ（Ａｎｔｏｎ  Ｐａａｒ、Ｐｈｙｓｉｃａ  ＭＣＲ３０１）を使用して測定した。
【０３７０】
３．８ｍＬの試料をカップＤＧ２６．７に添加した。試料を２２℃に平衡化し、次いで５０ｓ−１で３０秒間事前にせん断し、その後３０秒の平衡時間をおき、１ｓ−１及び２００ｓ−１及び１ｓ−１の間のせん断速度掃引を実行した。
【０３７１】
特に明記しない限り、粘度は１００ｓ−１のせん断速度にて単位センチポアズ（ｃＰ）で表される。測定されたｃＰ値が高いほど、粘度が高くなる。
【０３７２】
あるいは、ＧｉｌｓｏｎによるＶｉｓｃｏｍａｎを使用して粘度を推定し、約３００ｓ−１のせん断速度で記録した。
【０３７３】
例１．５：灰分含有量の測定
食品の灰分含有量は、ＮＭＫＬ  １７３：２００５「食品中の灰分重量測定」に従って測定される。
【０３７４】
例１．６：導電率の測定
水溶液の「導電率」（「比導電率」と呼ばれることもある）は、溶液が電気を伝導する能力の尺度である。導電率は、例えば、２つの電極間の溶液のＡＣ抵抗を測定することによって決定され得、結果は、典型的にはミリジーメンス／ｃｍ（ｍＳ／ｃｍ）の単位で示される。導電率は、例えば、ＥＰＡ（米国環境保護庁）の方法番号１２０．１に従って測定され得る。
【０３７５】
本明細書に記載されている導電率の値は、特に明記されていない限り、２５℃に正規化されている。
【０３７６】
導電率は、導電率計（テトラコン３２５電極を備えたＷＴＷ  Ｃｏｎｄ  ３２１０）で測定される。
【０３７７】
システムは、使用前にマニュアルに記載されているように較正されている。電極を、局所的な希釈を避けるために、測定が行われるのと同じタイプの媒質で完全にすすぐ。測定が行われる領域が完全に水没するように、電極を媒質中に下げる。次に、電極を攪拌して、電極に閉じ込められた空気をすべて除去する。次に、電極を、安定した値がディスプレイから取得及び記録され得るまで静止状態に保つ。
【０３７８】
例１．７：溶液の総固形分の測定
溶液の総固形分は、ＮＭＫＬ  １１０第２版、２００５（総固形分（水）−乳及び乳製品の重量分析）に従って測定され得る。ＮＭＫＬは、「北欧食品分析委員会（Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ｍｅｔｏｄｉｋｋｏｍｉｔｅ  Ｎａｅｒｉｎｇｓｍｉｄｌｅｒ）」の略語である。
【０３７９】
溶液の含水量は、１００％から総固形分の相対量（重量％）を引いたものとして計算され得る。
【０３８０】
例１．８：ｐＨの測定
すべてのｐＨ値は、ｐＨガラス電極を使用して測定され、２５℃に正規化されている。
ｐＨガラス電極（温度補償付き）を、前もって注意深くすすぎ、使用前に較正する。試料が液体形態の場合、２５℃の液状溶液中で直接ｐＨを測定する。試料が粉末の場合、１０グラムの粉末を９０ｍｌの脱塩水に室温で激しく攪拌しながら溶かす。次に、溶液のｐＨを２５℃で測定する。
【０３８１】
例１．９：粉末の含水量の測定
食品の含水量は、ＩＳＯ  ５５３７：２００４（粉乳−水分含有量の測定（参照方法））に従って測定される。
【０３８２】
例１．１０：カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、カリウム、リンの量の測定（ＩＣＰ−ＭＳ法）
カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、カリウム、及びリンの総量は、試料を、最初にマイクロ波分解を使用して分解し、次に複数の場合もあるミネラルの総量を、ＩＣＰ装置を使用して測定するという手順を使用して決定される。
【０３８３】
装置：
マイクロ波装置はＡｎｔｏｎＰａａｒ製で、ＩＣＰはＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｉｎｃ製のＯｐｔｉｍａ２０００ＤＶである。
【０３８４】
材料：
１ＭのＨＮＯ３
２％ＨＮＯ３中のイットリウム
５％ＨＮＯ３中のカルシウム、マグネシウム、ナトリウム、カリウム、及びリンについての適切な標準物質
【０３８５】
前処理：
一定量の粉末を量り取り、その粉末をマイクロ波分解チューブに移す。５ｍＬの１Ｍ  ＨＮＯ３を添加する。マイクロ波装置の使用説明書に従って、マイクロ波装置中で試料を分解する。分解にかけたチューブを、ドラフトチャンバに入れ、蓋を外して揮発性のヒュームを蒸発させる。
【０３８６】
測定手順：
既知量のＭｉｌｌｉ−Ｑ水を使用して、前処理した試料をＤｉｇｉＴＵＢＥに移す。２％ＨＮＯ３中のイットリウムの溶液を、分解チューブに添加し（５０ｍＬの希釈試料あたり約０．２５ｍＬ）、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を使用して既知の体積に希釈する。製造元が説明する手順を使用して、ＩＣＰで試料を分析する。
【０３８７】
ブラインド試料は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を使用して、１０ｍＬの１Ｍ  ＨＮＯ３と０．５ｍＬのイットリウムの２％ＨＮＯ３溶液の混合物を最終体積１００ｍＬに希釈することによって調製する。
【０３８８】
予想される試料濃度を挟む濃度を有する少なくとも３つの標準試料を調製する。
【０３８９】
例１．１１：フロシン値の測定：
フロシン値は、「乳児用穀物加工中のフロシン測定によるメイラード反応評価」（Ｍａｉｌｌａｒｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｆｕｒｏｓｉｎｅ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｄｕｒｉｎｇ  Ｉｎｆａｎｔ  Ｃｅｒｅａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）、Ｇｕｅｒｒａ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚら、穀物科学誌（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｒｅａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２９（１９９９）１７１−１７６に記載されているように測定され、タンパク質の総量は例１．１に従って決定される。フロシン値は、タンパク質１００ｇあたりのｍｇ単位のフロシンで記録される。
【０３９０】
例１．１２：液体中のＢＬＧの結晶化度の測定
次の方法を使用して、ｐＨが５〜６の範囲の液体中のＢＬＧの結晶化度を測定する。
ａ）問題の液体の１０ｍＬ試料を、細孔径０．４５ミクロンのＣＡ膜を備えたＭａｘｉ−Ｓｐｉｎフィルタに移す。
ｂ）遠心分離機を２℃に保ちながら、直ちにフィルタを１５００ｇで５分間回転させる。
ｃ）スピンフィルタの保持側に２ｍＬの冷Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水（２℃）を加え、すぐに、遠心分離機を２℃に冷却したまま、フィルタを１５００ｇで５分間回転させ、透過液（透過液Ａ）を集め、体積を測定し、例１．２に概説されている方法を使用して、ＨＰＬＣにより非凝集ＢＬＧ濃度を測定する。
ｄ）フィルタの保持側に４ｍＬの２Ｍ  ＮａＣｌを加え、すばやく攪拌し、混合物を２５℃で１５分間放置する。
ｅ）直ちにフィルタを１５００ｇで５分間回転させ、透過液（透過液Ｂ）を集める。
ｆ）例１．２に概説されている方法を使用して、透過液Ａ及び透過液Ｂ中の非凝集ＢＬＧの総重量を測定し、その結果を重量パーセントではなく非凝集ＢＬＧの総重量に変換する。透過液Ａ中の非凝集ＢＬＧの重量をｍ透過液Ａと称し、透過液Ｂ中の非凝集ＢＬＧの重量をｍ透過液Ｂと称す。
ｇ）ＢＬＧに関する液体の結晶化度は、次のように決定される：
結晶化度＝ｍ透過液Ｂ／（ｍ透過液Ａ＋ｍ透過液Ｂ）＊１００％
【０３９１】
例１．１３：乾燥粉末中のＢＬＧの結晶化度の測定
この方法を使用して、乾燥粉末中のＢＬＧの結晶化度を測定する。
ａ）５．０グラムの粉末試料を２０．０グラムの冷Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水（２℃）と混合し、２℃で５分間放置する。
ｂ）問題の液体の試料を、０．４５ミクロンのＣＡ膜を備えたＭａｘｉ−Ｓｐｉｎフィルタに移す。
ｃ）遠心分離機を２℃に保ちながら、直ちにフィルタを１５００ｇで５分間回転させる。
ｄ）スピンフィルタの保持側に２ｍＬの冷Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水（２℃）を加え、直ちに、フィルタを１５００ｇで５分間回転させ、透過液（透過液Ａ）を集め、体積を測定し、例１．２に概説されている方法を使用して、ＨＰＬＣにより非凝集ＢＬＧ濃度を測定し、その結果を重量パーセントではなく非凝集ＢＬＧの総重量に変換する。透過液Ａ中の非凝集ＢＬＧの重量を、ｍ透過液Ａと称す。
ｆ）次に、粉末中のＢＬＧの結晶化度は、次の式を使用して計算される：
【数１】
2021529769.tif 000003
式中、ｍＢＬＧ総量は、工程ａ）の粉末試料中の非凝集ＢＬＧの総量である。
【０３９２】
粉末試料の非凝集ＢＬＧの総量が不明な場合、これは、別の５ｇの粉末試料（同じ粉末供給源から）を２０．０グラムのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に懸濁し、ＮａＯＨ水溶液の添加によりｐＨを７．０に調整し、混合物を攪拌しながら２５℃で１時間放置し、最後に例１．２を使用して粉末試料の非凝集ＢＬＧの総量を測定することで決定され得る。
【０３９３】
例１．１４：ＵＦ透過液の導電率の測定
１５ｍＬの試料を３ｋＤａカットオフ（３０００ＮＭＷＬ）のＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルタユニットに移し、４０００ｇで２０〜３０分間、又は導電率を測定するのに十分な体積のＵＦ透過液がフィルタユニットの下部に蓄積するまで遠心分離する。遠心分離直後に導電率を測定する。試料の取り扱いと遠心分離は、試料の供給源の温度で実行される。
【０３９４】
例１．１５：粉末中の乾燥ＢＬＧ結晶の検出
粉末中の乾燥ＢＬＧ結晶の存在は、次の方法で識別され得る：
【０３９５】
分析する粉末の試料を再懸濁し、４℃の温度の脱塩水に２部の水と１部の粉末という重量比で穏やかに混合し、４℃で１時間再水和させる。
【０３９６】
再水和された試料を、好ましくは複屈折を検出するために平面偏光を使用して、結晶の存在を識別するために顕微鏡検査によって検査する。
【０３９７】
結晶様物質を分離し、Ｘ線結晶構造解析を行って、結晶構造の存在を確認し、好ましくはまた、結晶格子（空間群と単位格子の寸法）がＢＬＧ結晶の結晶格子の場合に対応していることも確認する。
【０３９８】
分離された結晶様物質の化学組成を分析して、その固体が主に非凝集ＢＬＧで構成されていることを確認する。
【０３９９】
例１．１６：ラクトースの総量の測定
ラクトースの総量は、ＩＳＯ  ５７６５−２：２００２（ＩＤＦ  ７９−２：２００２）「粉乳、ドライアイス−ミックス及び方法チーズ−ラクトース含有量の測定−パート２：ラクトースのガラクトース部分を利用した酵素法」に従って測定される。
【０４００】
例１．１７：炭水化物の総量の測定：
炭水化物の量は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ総炭水化物アッセイキット（Ｃａｔ  ＭＡＫ１０４−１ＫＴ）を使用して決定され、このキットでは、炭水化物が加水分解され、フルフラールとヒドロキシフルフラールに変換され、４９０ｎｍで分光光度的にモニターされるクロマゲン（ｃｈｒｏｍａｇｅｎ）に変換される。
【０４０１】
例１．１８：脂質の総量の測定
脂質の量は、ＩＳＯ  １２１１：２０１０（脂肪含有量の測定−Ｒｏｓｅ−Ｇｏｔｔｌｉｅｂ重量分析法）に従って測定される。
【０４０２】
例１．１９：ブリックスの測定
ブリックス測定は、研磨水（逆浸透によってろ過された水で最大０．０５ｍＳ／ｃｍの導電率が得られる）に対して較正されたＰＡＬ−αデジタルハンドヘルド屈折計（Ａｔａｇｏ）を使用して実施された。
【０４０３】
約５００μｌの試料を装置のプリズム面に移し、測定を開始した。測定値を読み取り、記録した。
【０４０４】
乳清タンパク質溶液のブリックスは、総固形分（ＴＳ）の含有量に比例し、ＴＳ（重量％）はおおよそブリックス＊０．８５である。
【０４０５】
例１．２０：コロニー形成単位の数の測定
試料１グラムあたりのコロニー形成単位の数の測定は、ＩＳＯ  ４８３３−１：２０１３（Ｅ）：食品及び動物の摂食物の微生物学−微生物の列挙のための水平方法−３０℃でのコロニーカウント技術に従って実行される。
【０４０６】
例１．２１：ＢＬＧ、ＡＬＡ、及びＣＭＰの総量の測定
この手順は、ＡＬＡ、ＢＬＧ及びＣＭＰなどのタンパク質、並びに任意に組成物中の他のタンパク質種をも定量分析するための液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）方法である。例１．２の方法とは対照的に、本方法はまた、凝集体中に存在するタンパク質を測定し、したがって、問題の組成物中のタンパク質種の総量の測定値を提供する。
【０４０７】
分離モードはサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）であり、この方法では試料溶媒とＨＰＬＣ移動相の両方として６ＭグアニジンＨＣＩ緩衝液を使用する。メルカプトエタノールは、タンパク質又はタンパク質凝集体におけるジスルフィド（Ｓ−Ｓ）を還元して、折りたたまれていない単量体構造を作成する還元剤として使用される。
【０４０８】
試料調製は、移動相に１０ｍｇタンパク質相当量を溶解することで容易に行われる。
【０４０９】
２つのＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ（７．７ｍｍｘ３０．０ｃｍ）カラム（ＧＰＣカラム）とガードカラムを直列に配置して、原材料中の主要なタンパク質を適切に分離する。
【０４１０】
溶出された被分析試料を、ＵＶ検出（２８０ｎｍ）によって検出及び定量化する。
【０４１１】
装置／材料：
１．手動シール洗浄付きＨＰＬＣポンプ５１５（Ｗａｔｅｒｓ）
２．ＨＰＬＣポンプコントローラモジュールＩＩ（Ｗａｔｅｒｓ）
３．オートサンプラ７１７（Ｗａｔｅｒｓ）
４．デュアル吸光度検出器２４８７（Ｗａｔｅｒｓ）
５．定量記録を作成することができるコンピュータソフトウェア（Ｅｍｐｏｗｅｒ  ３、Ｗａｔｅｒｓ）
６．分析カラム：２つのＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ（７．８×３００ｍｍ、Ｐ／Ｎ：０８５４１）。
ガードカラム：ＴＳＫ−ガードカラムＳＷｘＬ（６．０ｘ４０ｍｍ、Ｐ／Ｎ：０８５４３）。
７．超音波浴（Ｂｒａｎｓｏｎ  ５２００）
０．２μｍの酢酸セルロース膜を備えた８．２５ｍｍシリンジフィルタ（５１４−００６０、ＶＷＲ）
【０４１２】
手順：
移動相：
Ａ．ストック緩衝液。
１．１０００ｍＬビーカに５６．６ｇのＮａ２ＨＰＯ４、３．５ｇのＮａＨ２ＰＯ４、及び２．９ｇのＥＤＴＡを量り入れる。
８００ｍＬの水に溶かす。
２．ｐＨを測定し、任意にＨＣｌ（ｐＨを下げる）又はＮａＯＨ（ｐＨを上げる）で７．５±０．１に調整する。
３．１０００ｍＬメスフラスコに移し、水で希釈して容量を調整する。
【０４１３】
Ｂ．６ＭグアニジンＨＣｌ移動相。
１．２０００ｍＬビーカに１１４６ｇのグアニジンＨＣｌを量り取り、２００ｍＬのストック緩衝液（Ａ）を加える。
２．マグネチックスターラ（５０℃）で混合しながら、この溶液を水で約１６００ｍＬに希釈する。
３．ＮａＯＨでｐＨを７．５±０．１に調整する。
４．２０００ｍＬメスフラスコに移し、水で希釈して容量を調整する。
５．０．２２μｍの膜フィルタを備えた溶媒ろ過装置を使用してろ過する。
【０４１４】
較正標準。
定量する各タンパク質の較正標準を、次の方法で調製する：
１．約２５ｍｇのタンパク質参照標準を、１０ｍＬのメスフラスコに正確に（０．０１ｍｇまで）秤量して入れ、１０ｍＬの水に溶かす。
これが、前記タンパク質のタンパク質ストック標準溶液（Ｓ１）である。
２．２００μｌのＳ１を２０ｍｌメスフラスコにピペットで入れ、移動相で希釈して容量を調整する。
これが、低希釈標準溶液ＷＳ１である。
３．５００μＬのＳ１を１０ｍＬのメスフラスコにピペットで入れ、移動相で希釈して容量を調整する。
これが、標準溶液ＷＳ２である。
４．５００μＬのＳ１を５ｍＬのメスフラスコにピペットで入れ、移動相で希釈して容量を調整する。
これが、標準溶液ＷＳ３である。
５．７５０μＬのＳ１を５ｍＬのメスフラスコにピペットで入れ、移動相で希釈して容量を調整する。
これが、標準溶液ＷＳ４である。
６．１．０ｍＬのＳ１を５ｍＬのメスフラスコにピペットで入れ、移動相で希釈して容量を調整する。
これが、高希釈標準溶液ＷＳ５である。
７．目盛り付き使い捨てピペットを使用して、１．５ｍＬのＷＳ１〜５を別々のバイアルに移す。
各バイアルに１０μＬの２−メルカプトエタノールを添加し、キャップをする。溶液を１０秒間ボルテックスする。
標準液を周囲温度で約１時間放置する。
８．０．２２μｍの酢酸セルロースシリンジフィルタを使用して標準液をろ過する。
【０４１５】
タンパク質の純度は、ケルダール（Ｎｘ６．３８）及びＨＰＬＣを使用した標準溶液ＷＳ５からの面積％を使用して測定される。
タンパク質（ｍｇ）＝「タンパク質標準重量」（ｍｇ）ｘＰ１ｘＰ２
Ｐ１＝Ｐ％（ケルダール）
Ｐ２＝タンパク質面積％（ＨＰＬＣ）
【０４１６】
試料調製
１．元の試料のタンパク質２５ｍｇに相当する量を秤量し、２５ｍＬのメスフラスコに入れる。
２．約２０ｍＬの移動相を加え、試料を約３０分間溶解させる。
３．移動相を容量に加え、１６７μＬの２−メルカプトエタノールを２５ｍｌの試料溶液に加える。
４．約３０分間超音波処理し、その後、試料を周囲温度で約１時間半放置する。
５．溶液を混合し、０．２２μｌの酢酸セルロースシリンジフィルタを使用してろ過する。
【０４１７】
ＨＰＬＣシステム／カラム
カラムの平衡化
１．ＧＰＣガードカラムと２つのＧＰＣ分析カラムを直列に接続する。
新しいカラムは通常、リン酸塩緩衝液中で出荷される。
２．新しいカラムに水を３０〜６０分で０．１ｍＬ／分から０．５ｍＬ／分へと徐々に流す。
約１時間フラッシングを続ける。
３．流量を０．５ｍＬ／分から０．１ｍＬ／分へと徐々に下げ、貯蔵器中で移動相と交換する。
４．圧力ショックを回避するために、ポンプの流量を３０〜６０分で０．１ｍＬ／分から０．５ｍＬ／分に徐々に増やし、０．５ｍＬ／分のままにする。
５．１０個の試料を注入してカラムを飽和させ、ピークが溶出するのを待つ。
これは、カラムの調整に役立つ。
この工程は、次の注入の前に各注入が完了するのを待つ必要なしに実行される。
６．移動相と少なくとも１時間平衡を保つ。
【０４１８】
結果の計算
定量化されるタンパク質、例えば、アルファ−ラクトアルブミン、ベータ−ラクトグロブリン、及びカゼイノマクロペプチドの含有量の定量的測定は、対応する標準タンパク質で得られたピーク面積を試料のピーク面積と比較することによって実行される。結果については、元の試料１００ｇあたりの特定タンパク質のｇ数、又は元の試料の重量に対する特定タンパク質の重量パーセンテージとして記録する。
【０４１９】
例２：結晶化によるベータ−ラクトグロブリンの除去による乳清中のアルファ−ラクトアルブミンの強化
プロトコル：
標準的なチーズ製造方法からの甘性乳清に由来するラクトース枯渇ＵＦ保持液を、１．２ミクロンの膜を使用する精密ろ過にかけ、その後ＢＬＧ結晶化方法のためのフィードとして使用した。甘性乳清フィードについては、４６ミルスペーサを備えたＫｏｃｈ  ＨＦＫ−３２８タイプの膜を使用した限外ろ過セットアップを使用し、１．５〜３．０ｂａｒのフィード圧力、２１％ＴＳ（総固形分）±５のフィード濃度、及びダイアフィルトレーション媒質としての研磨水（逆浸透によってろ過された水）を使用して調整した。次に、ＨＣｌを加えることによってｐＨを調整して、約５．４０のｐＨを得た。保持液の導電率の低下が２０分間で０．０３ｍＳ／ｃｍを下回るまで、ダイアフィルトレーションを続けた。次に、保持液を約３０％ＴＳ（濃縮保持液の総重量に対して約２３．１％の総タンパク質）に濃縮した。濃縮保持液の調製は、１０〜１２℃の温度で実施した。濃縮保持液の試料を３０００ｇで５分間遠心分離したが、目に見えるペレットは形成されなかった。上清をＨＰＬＣ分析にかけた。フィードの組成を表１に示す。
【０４２０】
この例におけるＢＬＧ及びＡＬＡなどの特定のタンパク質のすべての濃度は、非凝集タンパク質の濃度に関するもので、例１．２に従って測定されることに留意するべきである。
【０４２１】
濃縮保持液に、自発的なＢＬＧ結晶化から得られた０．５ｇ／Ｌの純粋なＢＬＧ結晶材料を播種した（ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０８４５５３号、例３に記載されている）。ＢＬＧ結晶スラリーをＭｉｌｌｉＱ水で５回洗浄し、各洗浄後にＢＬＧ結晶を収集することによって、播種材料を調製した。洗浄後、ＢＬＧ結晶を凍結乾燥し、乳棒と乳鉢を使用して粉砕し、次いで２００ミクロンのふるいに通した。したがって、結晶化シードの粒子サイズは２００ミクロン未満であった。
【０４２２】
濃縮保持液を３００Ｌの結晶化タンクに移し、そこで約２℃に冷却し、穏やかに攪拌しながらこの温度で一晩保持した。翌朝、冷却された濃縮保持液の試料を試験管に移し、視覚的及び顕微鏡検査の両方で検査した。急速に沈降する結晶が一晩で明らかに形成された。結晶と母液の両方を含む混合物の実験室試料を、氷水浴中でさらに０℃に冷却した。母液と結晶を３０００ｇで５分間遠心分離することによって分離し、ＨＰＬＣ分析のために上清とペレットの試料を採取した。結晶を冷研磨水で１回洗浄し、次に再度遠心分離した後凍結乾燥させた。
【表１】
2021529769.tif 000004
【０４２３】
タンパク質分析：
タンパク質の定量には、標準物質でのＴＳＫ−ＨＰＬＣを使用し、６．３８の係数でケルダール法を使用して、タンパク質濃度を測定した。
【０４２４】
ＨＰＬＣによるＢＬＧ相対収量の定量化：
すべての試料に対し、研磨水を加えることによって同じ程度の希釈を行い、試料を０．２２μｍフィルタでろ過した。各試料について、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ（登録商標）５μｍＣ４  ３００オングストローム、ＬＣカラム２５０ｘ４．６ｍｍ、Ｅａを備えたＨＰＬＣシステムに同じ容量をロードした。そして２１４ｎｍで検出した。
試料については、次の条件を使用して処理した。
【０４２５】
緩衝液Ａ：ＭｉｌｌｉＱ水、０．１重量％ＴＦＡ
緩衝液Ｂ：ＨＰＬＣグレードのアセトニトリル、０．０８５重量％ＴＦＡ
カラム温度：４０℃
流量：１ｍｌ／分
勾配：０〜３０分８２〜５５％Ａ及び１８〜４５％Ｂ；３０〜３２分５５〜１０％Ａ及び４５〜９０％Ｂ；３２．５〜３７．５分１０％Ａ及び９０％Ｂ；３８〜４８分１０〜８２％Ａ及び９０〜１８％Ｂ。
【０４２６】
データ処理：
すべての試料を同じ方法で処理したため、ＢＬＧピークの面積を直接比較して、相対収量を得ることができる。結晶にはＢＬＧのみが含まれており、試料はすべて同じ方法で処理されたため、アルファ−ラクトアルブミン（ＡＬＡ）の濃度、それゆえＡＬＡの面積は、すべての試料で当然同じであり、したがって、結晶化の前後のＡＬＡの面積を、相対収率の計算時の補正係数（ｃｆ）として使用する。
【数２】
2021529769.tif 000005
【０４２７】
相対収率は、次の式で計算される：
【数３】
2021529769.tif 000006
【０４２８】
母液中の他のタンパク質の強化：
フィード中のタンパク質組成を測定し、質量保存の法則とＢＬＧの相対的除去に関する知識に基づいて、ＢＬＧ以外のタンパク質が除去されなかったと仮定して、母液中のタンパク質組成を計算した。したがって：
【数４】
2021529769.tif 000007
ｍタンパク質ＭＬ＝ｍタンパク質フィード−ｍ結晶中のＢＬＧ
ｍＡＬＡフィード＝ｍＡＬＡ  ＭＬ
【数５】
2021529769.tif 000008
【０４２９】
結果：
図１は、甘性乳清からのＢＬＧの結晶化の前後のクロマトグラムを重ね合わせたものである。「結晶化前」の試料は黒い実線で表され、「結晶化後」の試料は点線で表されている。ＢＬＧの濃度が大幅に低下していることは明らかであり、前述の収率計算を使用すると、ＢＬＧの６４．５％が除去されていることが判明した。ＡＬＡＭＬ％は２９．２％と決定され、５０％のＡＬＡ強化がもたらされた。ＢＬＧ結晶と共に除去されたＡＬＡはほとんどなかったため、ＡＬＡの収率はほぼ１００％であった。図２はＢＬＧ結晶の写真を示し、図３は溶解した結晶のクロマトグラフを示しており、ＢＬＧ結晶と共に除去された非ＢＬＧタンパク質はほとんどなかったことが分かる。
【０４３０】
母液の計算されたタンパク質組成を表２に示す。
【表２】
2021529769.tif 000009
【０４３１】
結論
この例は、驚くべきことに、総タンパク質に対して４８％を超える非ＢＬＧタンパク質を含む粗乳清タンパク質濃縮物中でＢＬＧを選択的に結晶化し、続いてＢＬＧ結晶を除去することにより、ＡＬＡ強化乳清タンパク質組成物を調製できることを示した。ＡＬＡの収率はほぼ１００％であった。この発見は、工業的乳タンパク質分離の新しいアプローチへの道を開くもので、そのアプローチによると、ＢＬＧがＡＬＡ及び他のタンパク質成分から、好ましくも高温や問題のある化学物質への長時間の曝露を回避する穏やかな方法で除去される。
【０４３２】
例３：結晶化によるＢＬＧの除去による、甘性乳清からの乳清タンパク質濃縮物からのＡＬＡ及び他の乳清タンパク質種の強化。
プロトコル：
標準的なチーズ製造方法からの甘性乳清に由来するラクトース枯渇ＵＦ保持液を、１．２ミクロンのフィルタでろ過し、それに続いてＳｙｎｄｅｒ  ＦＲ膜を使用して脂肪低減を行った。次に、播種を加えないことを除いて、例２に記載の要領で透過液を結晶化のために調製した。フィードの組成を表３に示す。次に、データを例２に記載の要領で処理した。
【表３】
2021529769.tif 000010
【０４３３】
この例におけるＢＬＧ及びＡＬＡなどの特定のタンパク質のすべての濃度は、非凝集タンパク質の濃度に関するもので、例１．２に従って測定されることに留意するべきである。
結果：
【０４３４】
図４では、フィードと母液のタンパク質組成が示されている。ＢＬＧの大部分が除去されたことは明らかであり、例２に記載の要領で収率を計算すると、ＢＬＧの８２％の収率が得られる。％ＡＬＡＭＬは２９．６％と決定され、１４３％の強化が得られた。母液のタンパク質組成を表４に示す。
【表４】
2021529769.tif 000011
【０４３５】
例４：結晶化によるＢＬＧの除去による酸性乳清からの乳清タンパク質濃縮物からのＡＬＡ及び他の乳清タンパク質種の強化。
プロトコル：
酸性乳清を原料として使用し、例２に記載の要領で処理した。フィードを例２に記載の要領で結晶化させ、結果を例２に記載の要領で特徴検定し、分析した。フィードの選択された成分の濃度は、表５に示されている。
【表５】
2021529769.tif 000012
【０４３６】
図５では、フィードと母液のタンパク質組成が示されている。ＢＬＧの大部分が除去されたことは明らかである。結晶分離によるＢＬＧ収率は７０．３％と決定された。結晶化前に総タンパク質の濃度が高かったとしたら、収率はさらに高くなったはずである。この例から、ＡＬＡは８１％強化され、ＡＬＡパーセントは４３．４となった。残りの乳清タンパク質溶液（母液）のタンパク質組成を表６に示す。
【表６】
2021529769.tif 000013
【０４３７】
この例におけるＢＬＧ及びＡＬＡなどの特定のタンパク質のすべての濃度は、非凝集タンパク質の濃度に関するものであることに留意するべきである。
【０４３８】
ＡＬＡのレベルの増加に加えて、回収された母液には、元の乳清タンパク質フィードのリン脂質が豊富な乳清脂肪と免疫グロブリンがさらに含まれている。これらは、例えば乳児の認知機能と免疫系の発達に関し、乳児の栄養において栄養的に貴重な成分であると認識されている。したがって、回収された母液から調製された乳清タンパク質組成物は、ヒト化乳児用栄養製品の成分として特に適している。
【０４３９】
例５：結晶化によるＢＬＧの除去による、血清タンパク質からの乳清タンパク質濃縮物からのＡＬＡ及び他の乳清タンパク質種の強化。
脱脂乳を原料として、ＳｙｎｄｅｒＦＲ膜によりカゼインを除去した。次に、透過液を例２に記載の要領で結晶化のために調製し、データも例２に記載の要領で処理した。
表７参照。
【表７】
2021529769.tif 000014
【０４４０】
この例におけるＢＬＧ及びＡＬＡなどの特定のタンパク質のすべての濃度は、非凝集タンパク質の濃度に関するものであることに留意するべきである。
【０４４１】
この場合も、ＢＬＧの大部分が除去されたことが観察された。ＢＬＧの収率は７０．０％と決定された。濃縮された保持液の総固形分が結晶化前及び／又は結晶化中に高かった場合、収率はさらに高くなったはずである。この例では、ＡＬＡは８８％強化されているため、母液中のＡＬＡ含有量は総タンパク質に対して４４．１重量％であった。母液の計算されたタンパク質組成を表８に示す。
【表８】
2021529769.tif 000015
【０４４２】
結論
本発明の方法を使用して試験したすべてのフィードからタンパク質のＡＬＡ部分を顕著に強化することが可能であり、それにより、ＡＬＡ成分自体として使用され得るか又はさらなる強化にかけることができるＡＬＡ強化乳清タンパク質製品を提供することが可能であった。
【０４４３】
例６−ＵＦ−ＤＣＦ支援結晶化
脱脂乳の精密ろ過（精密ろ過にＳｙｎｄｅｒ  ＦＲ膜を使用）によって調製された乳血清を、例２に記載の方法のためのフィードとして使用したが、ただし、ダイアフィルトレーション中のｐＨは５．４０ではなく５．９２であり、最終的な総固形分は２０重量％であるものとする。
【０４４４】
フィードが調整された後（フィードの組成は表９に示されている）、それを３００Ｌの結晶化タンクに移し、最初にｐＨをｐＨ５．８０に調整し、温度を約１０〜１２℃に保つ。ｐＨ調整後、非自発的結晶化生成に由来するが、例２に記載されたのと同じ方法で製造された播種材料を加える。フィードは、フィード１リットルあたり０．５ｇの播種材料の濃度で播種される。播種後、冷却ケープの温度を５℃に設定し、ｐＨをゆっくりと５．５０に調整し、約１時間結晶化させた後、図６に示すようにＤＣＦ（ダイナミック・クロスフロー・フィルタ（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｃｒｏｓｓｆｌｏｗ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ））を結晶化タンクに接続する。ＤＣＦからの保持液は結晶化タンクに戻され、透過液は４６ミルスペーサを備えたＫｏｃｈＨＦＫ−３２８タイプの膜を備えたＵＦユニットのフィードとして使用される。ＤＣＦユニットには、細孔径５００ｎｍのＫｅｒａｆｏｌセラミック膜が取り付けられている。膜貫通圧力（ＴＭＰ）は０．４ｂａｒに設定され、膜の回転速度は３２Ｈｚである。
【０４４５】
ＤＣＦからの保持液は結晶化タンクに戻され、透過液は４６ミルスペーサを備えたＫｏｃｈＨＦＫ−３２８タイプの膜を備えたＵＦ（限外ろ過）ユニットのフィードとして使用される。ＵＦユニットでは、温度を１２℃を超えない範囲で上昇させておく。添加されるダイアフィルトレーション水の量を、ミネラルを母液から除去しながらＵＦユニットから出て結晶化タンクに戻る保持液が約２１％ＴＳになるように調整する。母液のダイアフィルトレーションは、透過液とダイアフィルトレーション水の導電率の差が５０マイクロＳ／ｃｍ未満になるまで続けられる。この時点で、ダイアフィルトレーション水の量を、保持液が約３０％ＴＳになるように調整する。ＢＬＧが結晶として除去されると、母液の総固形分量が減少し、この過剰な水とミネラルの継続的な除去により、ＢＬＧ結晶化中の非ＢＬＧタンパク質の濃度がＢＬＧの溶解度に及ぼす影響が限定的であるため、ＢＬＧの収率を増やすことが可能となる。ＤＣＦからの母液（ＤＣＦ透過液）の推定組成を表１０に示す。最初の３００Ｌのフィードは、１００Ｌ前後の母液に低減される。質量保存の法則に基づいて、ＢＬＧの相対収率は９４％と推定され、総タンパク質に対するＡＬＡの濃度は、フィードのＡＬＡの濃度に対して２６７％増加すると推定される。
【表９】
2021529769.tif 000016
【０４４６】
この例におけるＢＬＧ及びＡＬＡなどの特定のタンパク質のすべての濃度は、非凝集タンパク質の濃度に関するもので、例１．２に従って測定されることに留意するべきである。
【表１０】
2021529769.tif 000017
【０４４７】
結論
ＢＬＧの結晶化が行われるマトリックスから過剰なミネラルと水を継続的に除去することにより、ＡＬＡの強化を大幅に改善し、この方法を低温で行うことができる。
【０４４８】
例７：酸性化による母液の処理問題の解決
本発明者らは、母液の直接濃縮及び噴霧乾燥がファウリングの問題及び膜の閉塞を引き起こし、微生物負荷を許容可能なレベルにするためにかなりの熱処理を必要とするという兆候を以前に目にしている。得られた乾燥粉末は、必要とされる比較的過酷な熱処理のためにタンパク質の溶解度が低くなる。
【０４４９】
母液のｐＨを５．５から３．２に調整
例３に概説したものと同様の結晶化から７３０ｋｇの母液を回収し、５℃で一晩保存した。回収された母液には約４．６重量％のタンパク質が含まれ、化学組成は表１１に示されている。母液については、希釈したリン酸をゆっくりと加えることにより、ｐＨを３．２に調整した。この工程は、残ったＢＬＧ結晶を溶解するために実行された。初期ｐＨ及びｐＨ調整後における母液の細菌分析を例１．２０に従って実施し、結果を表１２に示す。
【表１１】
2021529769.tif 000018
【０４５０】
興味深いことに、濁度が８６．８ＮＴＵ（母液中）から２３．７ＮＴＵ（ｐＨ調整母液中）に変化することが観察されました。
【０４５１】
精密ろ過工程中の母液の細菌除去
細菌を取り除くために、ｐＨが約３．２の母液を、０．８マイクロメートルのセラミック膜（Ｐａｌｌ  Ｍｅｍｂｒａｌｏｘ  ＧＰ）に通した。精密ろ過工程を、約１０℃の操作温度で実行し、膜貫通圧力は３．２ｂａｒであり、透過流を６０Ｌ／時／膜に固定した。透過液を、さらなる処理のために収集した。ＭＦ工程の終わりに、約１５．２ＮＴＵの濁度を有するＭＦ透過液が収集された。透過液を例１．２０に従って分析した。
【０４５２】
限外ろ過工程中の母液の工程
精密ろ過工程から収集された透過液を、４８ミルスペーサを備えた渦巻き型ＧＲ８２ＰＥ  ＵＦ膜（分子量カットオフ５ｋＤａ）を使用してろ過した。限外ろ過工程中に、母液は約１６のブリックスに濃縮された（おおよそ１２重量％の量のタンパク質）。ろ過工程中のｐＨ変化を回避するために、追加のリン酸を加えた。
【０４５３】
この工程では、３の濃縮係数が達成された（約１８５ｋｇの濃縮ＭＦ透過液が収集された）。ろ過を続けると、さらに高い濃縮係数が得られる。この例では、ブリックスとｐＨがそれぞれおおよそ１６．５と３．３のフィードが収集され、噴霧乾燥機に送られた。限外ろ過工程後の酸性ｐＨの母液を例１．２０に従って分析した。
【０４５４】
ｐＨ調整された濃縮母液の乾燥
ｐＨ調整された濃縮母液の一部を、入口温度が１８５℃、出口温度が約８５℃の噴霧乾燥機を使用して乾燥した。得られた粉末（約１５ｋｇ）の含水量は約４．０重量％であった。微生物の含有量を、例１．２０に従って分析した。
【０４５５】
結果：
表１２から分かるように、酸を添加して母液のｐＨを約５．５から３．２に調整すると、総生菌数が約１０分の１に減少した。さらに、透過液の総生菌数が１０００ＣＦＵ／ｇ未満に低減されたように、精密ろ過工程で細菌を有効に除去することができた。噴霧乾燥後、ｐＨ３．２の最終母液粉末の総生菌数は１０ＣＦＵ／ｇであった。
【表１２】
2021529769.tif 000019
【０４５６】
また、ｐＨを３．２に調整した後の母液を５℃で３日間保存した。総生菌数は４６０，０００ＣＦＵ／ｇから３５０，０００ＣＦＵ／ｇに減少した。保存前後の試料の総生菌数の低減により、母液を酸性ｐＨ３．２に保つと、細菌の増殖も抑制されることが判明した。
【０４５７】
結論
ｐＨ３．２の母液粉末を生成するための酸性化により、細菌の負荷が大幅に減少した。さらに、母液の濁度が約８７ＮＴＵから２４ＮＴＵに減少し、これは、母液におけるＢＬＧ結晶の溶解及び／又は微生物負荷の減少の結果であると考えられている。
【０４５８】
さらに、母液の精密ろ過により、細菌の除去に成功した。さらに、約３．２のｐＨで最終粉末を使用すると、外観は透明で、濁度は５０ＮＴＵ未満である。結果として、調整された母液に由来する酸性粉末は、例えば小児栄養のための飲料及びインスタント飲料の用途に使用され得る。
【０４５９】
例８：ｐＨを上げることによる母液の処理問題の解決
ｐＨ約５．５の母液４００ｍＬを、希釈したＫＯＨと混合して、約７のｐＨを得た。ｐＨ調整された母液を、ブリックス６の固形分含有量に達するまで膜貫通圧力４ｂａｒ及び約１０℃の温度でのＳｙｎｄｅｒ  ＨＦＫ３２８膜を使用するろ過工程に供した。
【０４６０】
結果：
限外ろ過工程の後、母液は総固形分に対して８９％のタンパク質を含んでいた。ｐＨ調整により、ファウリングの問題や膜の目詰まりの問題は発生しなかった。ｐＨ調整された濃縮母液は、より高い総固形分に濃縮された場合、乾燥に適しているように思われ、あるいは、例えば小児用栄養又はインスタント飲料用の成分としてさらなる改変を伴わずに直接使用することができた。
【０４６１】
例９：母液のＡＬＡのさらなる強化
この例では、母液のＡＬＡのさらなる強化について説明した。
【０４６２】
約１３．７重量％のタンパク質含有量を有する例５に従って得られた１００Ｌの母液を、塩酸（８重量／体積％）と混合し、急速に混合して最終ｐＨ４．３を達成する。次いで、ｐＨを調整した母液を、５ｋＤａのＵＦ膜を使用した４工程の連続工程式限外ろ過プラントで限外ろ過にかけることにより濃縮し、タンパク質含有量を約２２重量％にする。次いで、ｐＨ調整された濃縮母液を管状熱交換器に通し、そこで温度をゆっくりと６４℃±１℃に上昇させ、次に、６分の滞留時間に相当する長さの同温度に維持されたチューブに通す。次に、溶液を第２の管状熱交換器中で５０℃に冷却し、２０ｒ．ｐ．ｍで回転する攪拌パドルを備えた断熱バットに集める。バット内での１０分の平均滞留時間後、溶液を、２００Ｌ／時で連続自動スラッジ除去式清澄装置にポンプで送り出す。清澄装置のボウルを水で洗い流した後、沈殿したタンパク質画分を定期的に排出させる。沈殿したタンパク質画分を研磨水に懸濁し、ＮａＯＨ水溶液（１０重量／体積％）の添加でｐＨを６．７に調整することにより溶解する。
【０４６３】
溶解したタンパク質画分を、５ｋＤａ膜を使用した限外ろ過により、総固形分含有量が約２５重量％になるまで濃縮し、噴霧乾燥する。ＡＬＡ強化粉末は、総タンパク質に対して６０重量％超のＡＬＡを含み、粉末の総固形分に対して少なくとも８５％の総タンパク質含有量を有すると予想される。含水率は最大で５重量％である。
【０４６４】
例１０：ＡＬＡ強化乳清タンパク質組成物を含む乳児用調製粉乳
２つの乳児用調製粉乳製品Ａ及びＢは、
−例４（乳児用調製粉乳Ａの場合）又は例９（乳児用調製粉乳Ｂの場合）からの６．８ｋｇのＡＬＡ強化乳清タンパク質粉末、
−２０．５ｋｇの食品グレードのラクトース、
−１５２．７ｋｇの水
−７０ｋｇのＵＦ濃縮脱脂乳（９．０重量％タンパク質、４．２重量％ラクトース、０．０５重量％脂肪、０．７重量％灰、１４．７重量％総固形分）、
−脱脂乳の３７４ｋｇの脱塩ＵＦ透過液、
−３３．２ｋｇの植物性脂肪ミックス、
−７１％総固形分を含む１５．１ｋｇのＧＯＳシロップ、並びに
−ビタミン、ヌクレオチド、及び多価不飽和脂肪酸ＰＵＦＡなどの必要な微量栄養素
を混合することにより、例４又は例９のＡＬＡ強化乳清タンパク質粉末から製造される。
【０４６５】
混合物を均質化し、低温殺菌し、濃縮し、噴霧乾燥して、乳血清タンパク質／カゼインの比率が６２／３８であり、エネルギー含有量が粉末１００ｇあたり約２０００ｋＪである、１１８ｋｇの最終乳児用調製粉乳を製造する。
【０４６６】
どちらの乳児用調製粉乳も、標準的な乳清タンパク質に基づく通常の乳児用調製粉乳よりも、ヒトの母乳をよく模倣している。どちらの乳児用調製粉乳にも、標準的な乳清タンパク質に基づく通常の乳児用調製粉乳よりも大量のＡＬＡが含まれている（特に乳児用調製粉乳Ｂ）。乳児用調製粉乳Ａには、元の乳清タンパク質フィードのリン脂質が豊富な乳清脂肪と、免疫グロブリンが含まれており、これらは、例えば乳児の認知機能と免疫系の発達に関し、乳児の栄養において栄養的に価値のある成分であると認識されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年9月7日(2020.9.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む食用のアルファ−ラクトアルブミン強化乳清タンパク質組成物を調製する方法、該組成物におけるアルファ−ラクトアルブミン（ＡＬＡ）の総タンパク質に対する重量パーセントは、それの由来元であるホエイタンパク質溶液より高い、
ａ）非凝集ベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）、ＡＬＡ及び任意の追加の乳清タンパク質を含む乳清タンパク質溶液を提供する工程、前記乳清タンパク質溶液は、ＢＬＧに関して過飽和であり、ｐＨは５〜６の範囲である、
ｂ）過飽和乳清タンパク質溶液中で、好ましくは塩溶モードで、非凝集ＢＬＧを結晶化する工程、及び
ｃ）残りの母液からＢＬＧ結晶を分離し、母液の少なくとも一部を回収する工程、
ｄ）回収された母液から誘導された第１の組成物を提供する工程、
ｅ）任意に、第１の組成物のｐＨを、
ｉ）２．５〜４．９の範囲のｐＨ、又は
ｉｉ）６．１〜８．５の範囲のｐＨ
に調整する工程、
ｆ）
工程ｄ）から得られた第１の組成物もしくはそのタンパク質濃縮物、又は
工程ｅ）から得られたｐＨ調整された第１の組成物もしくはそのタンパク質濃縮物
を乾燥する工程
を含む方法。
【請求項２】
好ましくはｅ）のｐＨ調整後かつ工程ｆ）の乾燥前に実施される、物理的微生物低減をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ａ）の乳清タンパク質溶液が、タンパク質の総量に対して最大で９０重量％ＢＬＧを含む、請求項１〜２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
乳清タンパク質溶液が、乳血清タンパク質濃縮物、乳清タンパク質濃縮物、乳血清タンパク質分離物、及び／又は乳清タンパク質分離物を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
乳清タンパク質溶液の導電率とタンパク質の総量との間の比が最大で０．３である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
乳清タンパク質溶液のＵＦ透過液導電率が最大で７ｍＳ／ｃｍである、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
過飽和乳清タンパク質溶液が、乳清タンパク質フィードに対し、以下の調整：
ｐＨを調整すること、
導電率を低減すること、
温度を下げること、
タンパク質濃度を増加させること、及び
水活性を低下させる薬剤を添加すること、
のうちの１つ又は２つ以上を行うことによって調製される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
工程ｃ）が、ＢＬＧ結晶を、少なくとも３０重量％、好ましくは少なくとも４０重量％、さらにより好ましくは少なくとも５０重量％の固形分に分離することを含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
第１の組成物が、回収された母液を含むか、又はそれからなる、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
第１の組成物が、回収された母液のタンパク質濃縮物を含むか、又はそれからなる、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
第１の組成物の供給が、好ましくは総タンパク質に対するＡＬＡの重量パーセンテージが回収された母液の場合より少なくとも５％高くなっている第１の組成物を包含する、さらなるＡＬＡ強化を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
第１の組成物のｐＨが、２．５〜４．９、好ましくは２．８〜４．５、より好ましくは２．８〜３．２の範囲のｐＨに調整される、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
第１の組成物のｐＨが、６．１〜８．５、好ましくは６．３〜８．０、さらにより好ましくは６．５〜７．５の範囲のｐＨに調整される、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
物理的微生物低減が、
熱処理、好ましくは少なくとも低温殺菌、
紫外線照射処理、
パルス光処理、
精密ろ過、
高圧処理、及び
超音波処理
のうちの１つ又は２つ以上を含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
食用の、ＡＬＡ強化乳清タンパク質組成物であって、請求項１〜１４のいずれかに記載の１つ又は２つ以上の方法によって得ることができる、以下を含む組成物：
−総タンパク質に対して２４〜８０重量％、好ましくは２４〜７０重量％の範囲の量のＡＬＡ、
−総タンパク質に対して３〜１４重量％の範囲の量の免疫グロブリン、及び
−任意に、総タンパク質に対して１〜６重量％の範囲、好ましくは総タンパク質に対して２〜５重量％の範囲の量のリン脂質。
【請求項１６】
タンパク質１００ｇあたり最大で８０ｍｇのフロシン値を有する請求項１５に記載のＡＬＡ強化乳清タンパク質組成物。
【請求項１７】
食品を製造する方法であって、
ａ）非凝集ベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）、アルファ−ラクトアルブミン（ＡＬＡ）及び任意の追加の乳清タンパク質を含む乳清タンパク質溶液を提供する工程、前記乳清タンパク質溶液は、ＢＬＧに関して過飽和であり、ｐＨは５〜６の範囲である、
ｂ）過飽和乳清タンパク質溶液中で、好ましくは塩溶モードで、非凝集ＢＬＧを結晶化する工程、及び
ｃ）残りの母液からＢＬＧ結晶を分離し、母液の少なくとも一部を回収する工程、
ｄ）回収された母液から誘導される第１の組成物を供給する工程、
ｅ）任意に、第１の組成物のｐＨを、
ｉ）２．５〜４．９の範囲のｐＨ、又は
ｉｉ）６．１〜８．５の範囲のｐＨ
に調整する工程、
ｆ）任意に、工程ｄ）から得られた第１の組成物もしくはそのタンパク質濃縮物を乾燥するか、又は工程ｅ）から得られたｐＨ調整された第１の組成物もしくはそのタンパク質濃縮物を乾燥する工程、
ｇ）
ｇ１）工程ｄ）から得られた第１の組成物もしくはそのタンパク質濃縮物、
ｇ２）工程ｅ）から得られたｐＨ調整された第１の組成物もしくはそのタンパク質濃縮物、及び／又は
ｇ３）工程ｆ）で得られた乾燥組成物
を１つ又は２つ以上の成分と組み合わせ、そして組合せを食品に変換する工程
を含む方法。
【国際調査報告】
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