(57)【要約】  本発明は、微小管結合タンパク質タウに特異的に結合する結合分子及び抗原結合断片に関する。本発明はまた、結合分子又は抗原結合断片を使用する診断方法、予防方法及び治療方法に関する。
2021505142.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む結合分子；
配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む結合分子；
配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む結合分子；
配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む結合分子；並びに
配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む結合分子；
からなる群から選択されるタウに特異的に結合することができる結合分子。
【請求項２】
前記結合分子は、配列番号１３、１６及び１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びに配列番号１５及び１８からなる群から選択される軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の結合分子。
【請求項３】
前記結合分子は、
配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む結合分子；
配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む結合分子；
配列番号１７アミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む結合分子；
配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む結合分子；並びに
配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む結合分子
からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の結合分子。
【請求項４】
請求項１、２又は３に記載の結合分子と、タウへの結合を免疫特異的に争う結合分子。
【請求項５】
ヒトモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項６】
タウタンパク質凝集体の広がりの阻害、及び／又はミクログリアによるタウ凝集体の取り込み及び分解の媒介に使用するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項７】
医薬として使用するための、好ましくは、タウの病的凝集が関わる神経変性疾患の診断、予防及び／又は治療に使用するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項８】
前記神経変性疾患はアルツハイマー病である、請求項６又は７に記載の使用のための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項のいずれか一項に記載の少なくとも１つの結合分子を含み、少なくとも１つのタグをさらに含む免疫コンジュゲート。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の結合分子をコードする核酸分子。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の結合分子、及び／又は請求項９に記載の免疫コンジュゲート、並びに薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬に関する。本発明は特に、タウに特異的に結合し、タウシードの広がりを阻害することができる結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合断片に関する。本発明はまた、抗タウ結合分子を使用する診断方法、予防方法及び治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
認知症は、記憶、思考、行動及び日常活動を行う能力に支障を来たす多くの進行性障害によって引き起こされ得る症候群である。現在、全世界で約３６００万人が認知症に罹患している。認知症者数は２０３０年までに倍増し、２０５０年までには３倍を超えて１億１５４０万人に上ることが予想されている。アルツハイマー病（ＡＤ）は最も一般的なタイプの認知症である。現在、６５歳以上の９人に１人（１１パーセント）及び８５歳を超える人のほぼ半数がアルツハイマー病を患っている。国際アルツハイマー病協会（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）によれば、これらの患者にかかる医療コストは、現在では世界全体で年間６０００億ドルを超える。こうしたコストは、特に発展途上国世界において、さらなる公的な社会医療制度の出現、及び所得の向上による機会費用の高まりに伴い、疾患の罹患率を上回ってさらに急速に上昇する可能性が高い。
【０００３】
ＡＤ患者の脳には２つの異常構造、アミロイド斑及び細胞内の神経原線維変化（ＮＦＴ）が豊富にある。これは、特に脳のうちの記憶に重要な特定の領域について当てはまる。また、大脳皮質及び特定の皮質下領域におけるニューロン及びシナプスの実質的な脱落もある。神経原線維変化及びニューロン脱落はともに疾患の持続期間及び重症度と並行して増加し、そして神経原線維負荷は、認知低下と相関することが示されている。
【０００４】
神経原線維変化は、微小管結合タンパク質タウの過剰リン酸化した不溶性の蓄積物で構成される神経細胞内病変である。これらの蓄積物は、ＡＤだけでなくまとめてタウオパチーとして知られる他の多くの神経変性疾患の病理組織学的特徴である。タウオパチーには、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、ピック病（ＰｉＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、及び前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）が含まれる。ヒトタウオパチーでは、病変が疾患に特異的なパターンで、１つの脳領域から別の脳領域へと進行するが、その基本的なメカニズムは未だ明らかになっていない。
【０００５】
このようにタウ病変は多くのタウオパチーに関与し、その原因であり得る。その正常な形態では、タウは主にニューロン軸索に発現する高可溶性の微小管結合タンパク質であり、微小管に結合してその集合及び安定性を促進する。タウ蛋白質は多くの潜在的リン酸化部位を含み、これらの部位のいくつかの調節されたリン酸化及び脱リン酸化が、チューブリン及び細胞骨格機能との相互作用に影響することが示されている。タウの過剰リン酸化は微小管を解離させ、正常では無秩序の高可溶性タンパク質をβシートリッチフィブリル、又は、対らせんフイラメント（ＰＨＦ）とも呼ばれ、ＮＦＴを構成し、異栄養性軸索及び細胞体で可視化され得るタウ凝集体に集合させると考えられている。タウ線維化の初期段階はエネルギー的に好ましくないが、核が形成されると、それらはタウモノマーを急速に補充し、熱力学的に安定な凝集体に変わる。その後、これらの凝集体は、タウモノマーを補充し、それらをデノボフィブリルに変換することができる、より多くのフィブリル末端を生成する断片化を受け得る。このプロセスは、最も一般的な用語では「シーディング」と呼ばれる。タウ病変の量は、ヒト及びトランスジェニックマウスモデルにおける進行性ニューロン機能不全、シナプス消失、及び機能低下と相関する。能動免疫化のための種々のホスホタウペプチド及び受動免疫化のための種々の抗タウ抗体を含む、タウに対する受動免疫化及び能動免疫化が、いくつかの異なるマウスモデルを用いてマウスにおいて分析されている。タウ上の初期病的立体エピトープにおける過剰リン酸化タウタンパク質のリン酸化Ｓｅｒ３９６及びＳｅｒ４０４と反応する十分に特徴付けられた抗タウ抗体による受動免疫化により、能動免疫化研究で見られた結果が確認された。これらの抗体で処置されたマウスは、タウ病変の顕著な減少（これは生化学的方法及び組織学によって測定された）、及び運動機能低下の損失の有意な遅延（これは行動試験において評価された）を示した（Ｂｏｕｔａｊａｎｇｏｕｔ  Ａ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２０１１；１１８（４）：６５８−６６７．，Ｃｈａｉ  Ｘ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１１；２８６（３９）：３４４５７−３４４６７）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在、ＡＤに対する最も一般的な医学的アプローチは対症療法の提供であり、これは、数年の治療後でさえ有効ではない。ＡＤのための新しい治療方法及び戦略は、症状の治療を超えて、認知低下を予防し、疾患の基本的な病的プロセスを妨げる必要がある。特に、単独で、又は他のＡＤ標的薬物と組み合わせて、疾患の最も初期の段階の少なくともいくつかを妨害する分子を開発する必要がある。このような分子は、ＡＤ及び他のタウオパチーの早期診断（それ自体が治療結果を改善し得る）、予防及び治療において、新規の有利な選択肢を提供するであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、タウモノマー及び対らせんフイラメント（ＰＨＦ）に特異的に結合することができ、タウ凝集の広がりを阻害することができ、且つ／又はミクログリアによるタウ凝集体の取り込み及び分解を媒介することができる新規な結合分子、特にヒト結合分子、例えばヒト抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０００８】
好ましい実施形態では、本発明による結合分子は、
配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む結合分子；
配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む結合分子；
配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む結合分子；
配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む結合分子；並びに
配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む結合分子
からなる群から選択される。
【０００９】
特定の実施形態では、結合分子は、インビトロでタウモノマーに結合することができる。
【００１０】
特定の実施形態では、結合分子は、インビトロでタウ凝集の広がりを阻害することができる。
【００１１】
特定の実施形態では、結合分子は、インビトロでタウ対らせんフイラメント（ＰＨＦ）に結合することができ、ミクログリアによるそれらの取り込みを媒介する。
【００１２】
特定の実施形態では、結合分子は、配列番号１３、１６及び１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びに配列番号１５及び１８からなる群から選択される軽鎖可変領域を含む。
【００１３】
特定の実施形態では、本発明の結合分子は、
配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む結合分子；
配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む結合分子；
配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む結合分子；
配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む結合分子；並びに
配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む結合分子
からなる群から選択される。
【００１４】
好ましくは、本発明による結合分子は、ヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。
【００１５】
特定の実施形態では、結合分子は、ヒトモノクローナルＩｇＧ抗体、好ましくはＩｇＧ１抗体である。
【００１６】
本発明はまた、本発明による少なくとも１つの結合分子を含み、少なくとも１つのタグをさらに含む免疫コンジュゲートに関する。
【００１７】
本発明の他の態様は、本発明による結合分子をコードする核酸分子に関する。
【００１８】
本発明の結合分子、免疫コンジュゲート及び／又は核酸分子は、医薬としての使用、好ましくはアルツハイマー病（ＡＤ）を含むがこれに限定されないタウオパチーの診断、予防及び／又は治療における使用に適している。
【００１９】
本発明はまた、本発明による結合分子の機能的変異体に関する。
【００２０】
本発明はまた、本発明による結合分子及び／又は免疫コンジュゲート、並びに薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】バイオレイヤー干渉法（Ｏｃｔｅｔ）による親和性の評価。
【図２】等温滴定カロリメトリーによる親和性の測定。
【図３】ＣＢＴＡＵ−２８．１はＢＶ２細胞におけるタウ凝集体の取り込みを増強するが、ＣＢＴＡＵ−２７．１は増強しない。
【図４】ＡＤ脳ホモジネートからシードを減少させるＣＢＴＡＵ−２８．１抗体の能力。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
定義
本明細書中で使用される用語「結合分子」は、当該技術分野で知られる全ての免疫グロブリンクラス及びサブクラスを含む。それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列によって、結合分子は完全な抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭに分けることができ、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４にさらに分けることができる。
【００２３】
本発明を通して使用される場合、用語「抗原結合断片」は、抗体などの完全な結合分子の一部を意味する。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片、ＣＤＲ、抗原結合部位、重鎖又は軽鎖可変領域、ダイアボディ、トリアボディ、一本鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、及び少なくとも２つの完全な抗体又はその断片から形成される多重特異性抗体、又は（ポリ）ペプチドに結合する抗原を付与するのに十分な免疫グロブリンの断片を少なくとも含む（ポリ）ペプチドなどが含まれる。抗原結合断片は、抗体のアミノ酸配列の少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、又は２５０の連続するアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むペプチド又はポリペプチドを含み得る。抗原結合断片は、合成的に、又は完全な免疫グロブリンの酵素的若しくは化学的開裂によって作製されてもよく、或いは組換えＤＮＡ手法によって遺伝子操作されてもよい。産生の方法は当該技術分野でよく知られており、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ：Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ，Ｌａｎｅ（１９８８），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されており、この文献は参照により本明細書に組み込まれる。抗体又はその抗原結合断片は１つ以上の結合部位を有し得る。２つ以上の結合部位がある場合、それらの結合部位は互いに同一であってもよく、又はそれらは異なってもよい。
【００２４】
免疫グロブリン軽鎖又は重鎖可変領域は、「抗原結合部位」によって分断された「フレームワーク」領域からなる。抗原結合部位は、以下のように、種々の用語を用いて定義される：（ｉ）相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列可変性に基づく（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｋａｂａｔ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １３２：２１１−５０，１９７０）。一般に、抗原結合部位は各可変領域に３つのＣＤＲを有する（重鎖可変領域（ＶＨ）におけるＨＣＤＲｌ、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３と、軽鎖可変領域（ＶＬ）におけるＬＣＤＲｌ、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｌｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）。（ｉｉ）用語「超可変領域」、「ＨＶＲ」、又は「ＨＶ」は、Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ９６：９０１−１７，１９８７）により定義されるように、抗体可変ドメインの中で構造が超可変的な領域を指す。一般に、抗原結合部位は各ＶＨ（Ｈｌ、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬ（Ｌｌ、Ｌ２、Ｌ３）に３つの超可変領域を有する。Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋは、構造的に保存されたＨＶを「カノニカルな構造」と呼んでいる。ＣＤＲ及びＨＶの付番方式及びアノテーションは、近年、Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ（Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ４５：３８３２−９，２００８）によって改訂されている。（ｉｉｉ）抗原結合部位を形成する領域の別の定義は、免疫グロブリンとＴ細胞受容体のＶドメインの比較に基づき、Ｌｅｆｒａｎｃ（Ｌｅｆｒａｎｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｖ  Ｃａｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ２７：５５−７７，２００３）によって提唱されている。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ  ｉｍｇｔ＿ｏｒｇ）が、これらの領域の標準化された付番及び定義を提供している。ＣＤＲ、ＨＶ及びＩＭＧＴ記述の間の対応は、Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．に記載されている。抗原結合部位はまた、特異性決定残基使用法（ＳＤＲＵ）に基づき記述することもできる（Ａｌｍａｇｒｏ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ  １７：１３２−４３，２００４）。ここで特異性決定残基（ＳＤＲ）は、抗原接触に直接関与する免疫グロブリンのアミノ酸残基を指す。
【００２５】
Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．はまた、任意の抗体に適用可能な可変ドメイン配列の付番方式を定義した。当業者は、配列それ自体を超えるいかなる実験データにも頼ることなく、この「Ｋａｂａｔ付番」方式を任意の可変ドメイン配列に明確に割り当てることができる。本明細書で使用されるとき、「Ｋａｂａｔ付番」は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）によって規定される付番方式を指す。特記されない限り、本発明の抗体、又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体における具体的なアミノ酸残基位置の付番に対する言及はＫａｂａｔ付番方式に従うが、しかしながら、この方式は理論上のものであり、本発明のあらゆる抗体に等しく適用されないこともある。例えば、最初のＣＤＲの位置によって、続くＣＤＲがいずれかの方向にシフトし得る。
【００２６】
「フレームワーク」又は「フレームワーク配列」は、抗原結合部位配列と定義されるものを除いた抗体の可変領域内の残りの配列である。抗原結合部位の正確な定義は上記に記載したとおり様々な記述によって決定し得るため、正確なフレームワーク配列は抗原結合部位の定義に依存する。
【００２７】
用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は、本明細書で使用されるとき、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体（又は抗体断片）を意味する。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一般的には単一の抗原決定基を対象とする。
【００２８】
用語「特異的に結合する」、又は「特異的に認識する」は、抗体とその結合パートナー、例えば抗原との相互作用に関連して本明細書で使用されるとき、その相互作用が結合パートナー上の特定のアミノ酸配列又は構造、例えば抗原決定基又はエピトープの存在に依存することを意味する。換言すれば、結合パートナーが他の分子又は生物の混合物中に存在する場合であっても、抗体はその結合パートナーに優先的に結合し、又は認識する。結合は共有結合性又は非共有結合性相互作用又はその両方の組み合わせによって媒介され得る。さらに言い換えれば、用語「特異的に結合する」又は「特異的に認識する」は、抗体が、ある抗原決定基又はエピトープとの特異的な免疫反応性を有し、他の抗原決定基又はエピトープとの免疫反応性を有しないことを意味する。抗原に（免疫）特異的に結合する抗体は、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ＢＩＡＣＯＲＥ、又は当該技術分野において知られている他のアッセイによって決定されるように、他のペプチド又はポリペプチドにより低い親和性で結合してもよい。抗原に特異的に結合する抗体又はその断片は、同じエピトープを有する関連抗原との交差反応性を有し得る。好ましくは、抗原に特異的に結合する抗体又はその断片は、他の抗原との交差反応性を有しない。
【００２９】
用語「エピトープ」は、本明細書で使用されるとき、抗体のＣＤＲループが接触する抗原の一部分を意味する。「構造的エピトープ」は抗原表面上の約１５〜２２個の接触残基を含み、まとめて抗体のパラトープと称されるＣＤＲ上の残基の大きい群と接触する多くのアミノ酸残基が関わる。エピトープ残基とパラトープ残基との間の直接接触は水素結合、塩橋、疎水性表面のファンデルワールス力、及び形状相補性などの静電力によって確立される。界面にはまた、抗原−抗体相互作用の特異性及び親和性に寄与する結合水分子又は他の補助因子がある。抗原−抗体複合体の結合エネルギーはエピトープ−パラトープ界面におけるごく一部の接触残基によって主に媒介される。これらの「エネルギー残基」は、多くの場合、エピトープ−パラトープ界面の中心に位置して機能的エピトープを作り上げる。界面の周辺の接触残基は、概して結合エネルギーへの寄与は小さく、それらを置き換えても、往々にして抗原との結合にはほとんど影響がない。したがって、エピトープの結合又は機能活性には、構造的エピトープの中心に位置し、且つ特異性決定ＣＤＲが接触するごく一部のエネルギー残基が関わる。抗原タンパク質上の機能的エピトープの割り当ては、アラニンスキャン変異誘発を含むいくつかの方法を用いるか、又は抗体で抗原の結晶構造を解くことによって行い得る。エピトープは本質的に線状であってもよく、又は不連続エピトープ、例えば立体エピトープ（これは線状の一続きのアミノ酸よりむしろ、抗原の非連続アミノ酸の間の空間的関係によって形成される）であってもよい。立体エピトープは、抗原の折り畳みによって生じるエピトープ（ここでは抗原の線状配列の異なる部分のアミノ酸が三次元空間で近接するようになる）を含む。不連続エピトープでは、１つ以上の線状ペプチドが、例えばタンパク質配列の異なる領域に分散したいわゆる部分エピトープと低い親和性で結合することが可能であり得る（Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．（２０１１）Ｂｌｏｏｄ  １１８（２）：２１９−２０．）。
【００３０】
本明細書で使用されるとき、用語「親和性」は結合分子（例えば、免疫グロブリン分子）のＣＤＲとの個々のエピトープ又は部分エピトープの結合の強度の尺度を指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．（１９８８），ｐａｇｅｓ  ２７−２８を参照されたい。本明細書で使用されるとき、用語「アビディティ」は、免疫グロブリンの集団と抗原との間の複合体の全体的な安定性、すなわち、抗原との免疫グロブリン混合物の機能上の組み合わせ強度を指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗ，ｐａｇｅｓ  ２９−３４を参照されたい。アビディティは、特異的エピトープに対する集団中の個々の免疫グロブリン分子の親和性と、また免疫グロブリン及び抗原の結合価との両方に関係する。例えば、二価モノクローナル抗体と、ポリマーなどの繰り返しの非常に多いエピトープ構造を有する抗原との間の相互作用は、高アビディティの１つであろう。抗原に対する抗体の親和性又はアビディティは任意の適切な方法を使用して実験的に決定することができる。例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”，Ｉｎ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８４），Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９９２）、及び本明細書中に記載の方法を参照されたい。抗原に対する抗体の親和性を測定する一般的な方法には、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、及び表面プラズモン共鳴が含まれる。特定の抗体抗原相互作用の親和性測定値は、例えば、塩濃度、ｐＨなどの条件が異なる中で測定した場合には変わり得る。したがって、親和性及び他の抗原結合パラメータ、例えば、ＫＤ、ＩＣ５０の測定は、好ましくは抗体及び抗原の標準溶液、並びに標準緩衝液で行われる。
【００３１】
用語「ポリヌクレオチド」は、単数の核酸及び複数の核酸を包含するものとし、単離された核酸分子又は核酸コンストラクト、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、従来のリン酸ジエステル結合又は非従来的な結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含み得る。用語「核酸分子」は、ポリヌクレオチドに存在する任意の１つ以上の核酸セグメント、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。「単離された」核酸又はポリヌクレオチドとは、その天然環境から取り出されている核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。例えば、ベクター中に含まれる抗体をコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的上、単離されていると見なされる。
【００３２】
特定の実施形態では、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。ＤＮＡの場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、通常、１つ以上のコード領域に作動可能に会合したプロモーター及び／又は他の転写若しくは翻訳制御エレメントを含み得る。作動可能な会合は、遺伝子産物、例えばポリペプチドのコード領域が、その遺伝子産物の発現を調節配列の影響下又は制御下に置くようにして１つ以上の調節配列と会合している場合である。したがって、プロモーター領域は、プロモーターにその核酸の転写を生じさせる能力があれば、ポリペプチドをコードする核酸と作動可能に会合しているとし得る。プロモーターは、所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を指図する細胞特異的プロモーターであり得る。プロモーターに加えて、他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルがポリヌクレオチドと作動可能に会合して細胞特異的転写を指図し得る。好適なプロモーター及び他の転写制御領域は本明細書に開示される。
【００３３】
本明細書で使用されるとき、用語「治療する」又は「治療」は、療法的治療及び予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）又は予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）処置（その目的は、パーキンソニズム又はアルツハイマー病の発症などの望ましくない生理学的変化又は障害を予防又は減速（減少）させることである）の両方を指す。有益な又は所望の臨床結果としては、以下に限定されないが、検出が可能であるか不可能であるかに関わらず、症状の軽減、疾患の程度の縮小、疾患が安定している（すなわち、悪化していない）状態、疾患の進行の遅延又は減速、病状の改善又は緩和、及び寛解（部分的であるか全体的であるかに関わらず）が挙げられる。「治療」はまた、治療を受けなかった場合の予想と比較して生存が延びることも意味し得る。治療を必要とする者には、既に病態若しくは障害を有する者、及び病態若しくは障害に罹り易い者又は病態若しくは障害の発現を予防すべき者が含まれる。「医薬」は、本明細書で使用されるとき、望ましくない生理学的変化又は障害の治療に用いられる薬剤である。
【００３４】
「対象」又は「個体」又は「動物」又は「患者」又は「哺乳動物」は、診断、予後判定、予防、又は治療が所望される任意の対象、特に哺乳類対象、例えばヒト患者を意味する。
【００３５】
発明の詳細な説明
第１の態様では、本発明は、タウに特異的に結合することができ、タウ凝集の広がりを阻害することができ、且つ／又はミクログリアによるタウ凝集体の取り込みを媒介することができる結合分子、例えば、抗体及び／又はその抗原結合断片を提供し、その結合分子は、
配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む結合分子；
配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む結合分子；
配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む結合分子；
配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む結合分子；並びに
配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む結合分子
からなる群から選択される。
【００３６】
特定の実施形態では、結合分子は、インビトロでタウモノマーに結合することができる。
【００３７】
特定の実施形態では、結合分子は、インビトロでタウ凝集の広がりを阻害することができる。
【００３８】
特定の実施形態では、結合分子は、タウ対らせんフイラメント（ＰＨＦ）に結合することができ、インビトロでミクログリアによるそれらの取り込みを媒介する。
【００３９】
特定の実施形態では、結合分子は、配列番号１３、１６及び１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びに配列番号１５及び１８からなる群から選択される軽鎖可変領域を含む。
【００４０】
特定の実施形態では、本発明の結合分子は、
配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む結合分子；
配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む結合分子；
配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む結合分子；
配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む結合分子；並びに
配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む結合分子
からなる群から選択される。
【００４１】
特定の実施形態では、結合分子は、ヒトモノクローナルＩｇＧ抗体、好ましくはＩｇＧ１抗体である。
【００４２】
本発明によれば、極めて高い親和性でタウに特異的に結合し、ＰＨＦ様凝集体の伝播を阻害することができる新規な結合分子が提供される。特定の実施形態では、結合分子は、タウＰＨＦに結合することができ、Ｆｃ介在機構によってミクログリアによるそれらの取り込みを促進する。
【００４３】
特定の実施形態では、結合分子は２５０ｎｍ以下、好ましくは１００ｎｍ以下の親和性でタウに特異的に結合する。
【００４４】
タウは、複数のよく知られたアイソフォームを有する、豊富にある中枢及び末梢神経系タンパク質である。ヒト中枢神経系（ＣＮＳ）においては、３５２〜４４１のサイズ範囲の６つの主要なタウアイソフォームが、選択的スプライシングのために存在する（Ｈａｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １５：１１２−９，２００９）。これらのアイソフォームは、０、１又は２のＮ酸性末端インサート（０Ｎ、１Ｎ又は２Ｎ）と、３又は４の直列に配列した微小管結合リピート（３Ｒ又は４Ｒ）の調節的包含によって互いに異なり、ＯＮ３Ｒ、１Ｎ３Ｒ、２Ｎ３Ｒ、ＯＮ４Ｒ、１Ｎ４Ｒ及び２Ｎ４Ｒと呼ばれる。本明細書で使用されるとき、組換えタウは、配列番号９のタウアイソフォームを指す。９で示される配列を有する。タウタンパク質は、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バキュロウイルス、哺乳類又は無細胞系において多量に組換え発現させることができる。組換えタウは、標準的な方法（例えば、Ｂａｒｇｈｏｒｎ，ｅｔ  ａｌ  ２００５，Ｍｅｔｈ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３５−５１）を用いて、又は実施例１に記載されるように、組換え発現及び精製し得る。
【００４５】
一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片などの本発明の結合分子は、配列番号２０又は２１の非リン酸化タウペプチドに特異的に結合する。
【００４６】
特定の実施形態では、本発明の結合分子又はその抗原結合断片は、タウのＮ末端インサート領域に特異的に結合する。
【００４７】
特定の実施形態では、結合分子又はその抗原結合断片は、タウタンパク質のアミノ酸残基４２〜１０３を含むエピトープに特異的に結合する。
【００４８】
特定の実施形態では、結合分子又はその抗原結合断片は、タウタンパク質のアミノ酸残基５２〜７１を含むエピトープに特異的に結合する。
【００４９】
特定の実施形態では、タウタンパク質は配列番号１９のアミノ酸配列を含む。
【００５０】
タウは微小管に結合して細胞を通じたカーゴの輸送を調節し、これは、７９個の潜在的なセリン（Ｓｅｒ）及びスレオニン（Ｔｈｒ）リン酸化部位の多くで起こるタウリン酸化によって調節され得るプロセスである。タウは、脳の発達中に高度にリン酸化される。リン酸化の程度は成人期に減少する。リン酸化部位の一部はタウの微小管結合ドメイン内に位置し、タウリン酸化の増加が微小管の結合を負に調節することが示されている。例えば、微小管結合モチーフ内又はそれに隣接して位置するＳｅｒ２６２及びＳｅｒ３９６が、ＡＤ患者の脳における神経原線維変化（ＮＦＴ）の主要な成分である異常な対らせんフィラメント（ＰＨＦ）のタウタンパク質において過リン酸化される。
【００５１】
用語「対らせんフィラメントタウ」又は「ＰＨＦタウ」は、本明細書で使用されるとき、最初に認知症患者の脳においてアルツハイマーにより記載された、神経原線維変化（ＮＦＴ）と呼ばれる病理学的構造を作り上げる、よく知られたタウ凝集体を指す。その存在はまた、タウオパチーとして知られる数々の他の疾患にも見られる。したがって、タウの凝集体は、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭型認知症、核上性麻痺、ピック病、嗜銀顆粒性疾患（ＡＧＤ）、皮質基底核変性症、ＦＴＤＰ−１７、パーキンソン病、ボクサー痴呆における神経原線維変化（ＮＦＴ）の主要な構成成分として観察することができる（Ｇｅｎｄｒｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｔｒｕｃｅｌｌｉ，Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒ．４：１３（２００９）に概説されている）。
【００５２】
用語「神経原線維変化」（ＮＦＴ）は、最初に認知症患者の脳においてアルツハイマーにより記載された病理学的構造を指す。ＮＦＴは、順序正しく並んだ過リン酸化タウタンパク質の対らせんフィラメントで構成され、アルツハイマー病の主要なマーカーとして最も一般的に知られている。
【００５３】
生理学上のタウタンパク質はニューロンの微小管を安定化させる。病的リン酸化が異常なタウ局在化及び凝集をもたらし、それによって微小管の不安定化及び細胞輸送障害が起こる。凝集タウはインビトロで神経毒性がある（Ｋｈｌｉｓｔｕｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（２００６），１２０５−１２１４）。しかしながら、正確な神経毒種は未だ明らかになっておらず、それらがニューロン死をもたらす機構も不明である。
【００５４】
本発明によれば、タウに特異的に結合し、タウ凝集体の広がりを阻害し、且つ／又はミクログリアによるそれらの取り込み及び生じ得る分解を媒介することができる新規な結合分子が提供される。したがって、本発明の結合分子は、タウ病変の形成を妨げる可能な治療試薬として、ＡＤを発症するリスクを評価するバイオマーカーとして、及び／又はＡＤを発症するリスクを評価するバイオマーカーを捕捉するために使用される試薬として役立ち得る。
【００５５】
本発明の結合分子は、モノクローナル抗体などの完全な免疫グロブリン分子であってもよいし、その抗原結合断片であってもよく、このような抗原結合断片としては、以下に限定されないが、タウに対する特異的な抗原結合性を付与するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも断片を含む重鎖及び軽鎖可変領域、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二価一本鎖抗体、一本鎖ファージ抗体、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ、及び（ポリ）ペプチドが挙げられる。
【００５６】
好ましい一実施形態では、本発明の結合分子は、ヒトモノクローナル抗体及び／又はその抗原結合断片である。結合分子はまた、ナノボディ、アルファボディ、アフィボディ、ＦＮ３ドメイン足場、及びＡｄｎｅｃｔｉｎ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎ、Ｄａｒｐｉｎ、Ｃｅｎｔｙｒｉｎなどのような（ヒト）リピートタンパク質におけるドメインに基づく他の足場、又はエピトープ結合配列を含む他の足場であってもよい。
【００５７】
本発明はまた、本発明による少なくとも１つの結合分子及び少なくとも１つの薬学的に許容され得る賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【００５８】
なおさらなる態様では、本発明は免疫コンジュゲート、すなわち、本明細書中に定義されるような少なくとも１つの結合分子を含み、そしてさらに少なくとも１つのタグを含む分子を提供する。タグは、共有結合によってヒト結合分子に直接連結／コンジュゲートすることができる。或いは、タグは、１つ以上の連結化合物によって結合分子に連結／コンジュゲートすることができる。タグを結合分子にコンジュゲートする手法は当業者によく知られている。本発明の免疫コンジュゲートのタグは、治療薬とすることができるが、検出可能な部分／作用物質とすることもできる。治療及び／又は予防に適したタグは、毒素若しくはその機能的部分、抗生物質、酵素、食作用を強める他の結合分子、又は免疫刺激物とすることができる。検出可能な作用物質を含む免疫コンジュゲートは、例えば、対象がＡＤを発症するプロセスにあるかどうかを評価するために診断的に使用され得る。検出可能な成分／作用物質としては、酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、ポジトロン放出金属、及び非放射性常磁性金属イオンが挙げられるが、これらに限定されない。検出及び／又は分析及び／又は診断目的のために結合分子を標識するのに使用されるタグは、とりわけ（組織）試料の免疫組織化学的染色、フローサイトメトリー検出、走査型レーザーサイトメトリー検出、蛍光イムノアッセイ、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、バイオアッセイ（例えば、食作用アッセイ）、ウェスタンブロッティングアプリケーションなどの、使用する具体的な検出／分析／診断の手法及び／又は方法に依存する。当該技術分野で知られている検出／分析／診断の手法及び／又は方法のための好適な標識は、当業者の理解の範囲内である。
【００５９】
本発明の別の態様では、本発明による少なくとも１つの結合分子、機能的変異体、又は免疫コンジュゲートをコードする核酸分子を提供する。そのような核酸分子は、上記のように、例えば、親和性成熟のプロセスにおいて、クローニングの目的のための中間体として使用することができる。好ましい実施形態では、核酸分子は単離又は精製される。当業者は、これらの核酸分子の機能的変異体もまた本発明の一部であると意図されることを理解するであろう。機能的変異体は、標準的な遺伝子コードを用いて直接翻訳されて、親核酸分子から翻訳されたものと同一のアミノ酸配列を提供し得る核酸配列である。
【００６０】
本発明による１つ以上の核酸分子を含むポリヌクレオチド、例えば、ベクターを提供することは、本発明の他の態様である。ベクターは、とりわけＦ、Ｒ１、ＲＰ１、Ｃｏｌ、ｐＢＲ３２２、ＴＯＬ、Ｔｉなどのプラスミド；コスミド；ラムダ、ラムドイド、Ｍ１３、Ｍｕ、Ｐ１、Ｐ２２、Ｑβ、Ｔ−ｅｖｅｎ、Ｔ−ｏｄｄ、Ｔ２、Ｔ４、Ｔ７などのファージ；植物ウイルスに由来することができる。ベクターは、本発明の結合分子のクローニングのために、及び／又は発現のために使用することができ、遺伝子治療目的のためにさらに使用されてもよい。１つ以上の発現調節核酸分子に作動可能に連結された本発明による１つ以上の核酸分子を含むベクターもまた本発明に包含される。ベクターの選択は、従う組換え手順及び使用する宿主に依存する。宿主細胞におけるベクターの導入は、とりわけリン酸カルシウムトランスフェクション、ウイルス感染、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性のトランスフェクション、リポフェクタミントランスフェクション、又はエレクトロポレーションによって実行することができる。ベクターは、自己複製性であってもよく、又はそれらが統合される染色体と一緒に複製してもよい。好ましくは、ベクターは、１つ以上の選択マーカーを含む。マーカーの選択は、当業者によく知られているように、本発明にとって重大ではないが、選択した宿主細胞に依存し得る。それらには、カナマイシン、ネオマイシン、プロマイシン、ハイグロマイシン、ゼオシン、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ＴＫ）、マウス由来のジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ｄｈｆｒ）が含まれるが、これらに限定されない。ヒト結合分子の単離に使用することができるタンパク質又はペプチドをコードする１つ以上の核酸分子に作動可能に連結された上記のヒト結合分子をコードする１つ以上の核酸分子を含むベクターもまた本発明に包含される。このようなタンパク質又はペプチドとしては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、金属結合ポリヒスチジン、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、及びβ−ガラクトシダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
上述のベクターの１つ以上のコピーを含む宿主は、本発明のさらなる態様である。好ましくは、宿主は、宿主細胞である。宿主細胞としては、哺乳動物、植物、昆虫、真菌、又は細菌を起源とする細胞が挙げられるが、これらに限定されない。細菌細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などのエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属のいくつかの種などのグラム陽性菌又はグラム陰性菌由来の細胞を含むが、これらに限定されない。真菌細胞の群では、好ましくは、酵母細胞が使用される。酵母における発現は、とりわけピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、及びハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）などの酵母株を使用することにより実現することができる。さらに、ショウジョウバエ及びＳｆ９由来の細胞などの昆虫細胞を、宿主細胞として使用することができる。それに加えて、宿主細胞は、とりわけ、森林植物などの作物植物由来の細胞、又は穀物植物若しくは薬用植物などの食物及び原材料を提供する植物由来の細胞、又は鑑賞植物由来の細胞、又は球根作物由来の細胞などの植物細胞とすることができる。形質転換（トランスジェニック）植物又は植物細胞は、知られた方法、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介遺伝子導入、葉片の形質転換、ポリエチレングリコール誘導ＤＮＡ導入によるプロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション、超音波処理、マイクロインジェクション、又はパーティクルガン遺伝子導入法によって作製することができる。加えて、好適な発現系は、バキュロウイルス系とすることができる。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳＯ細胞、又はＢｏｗｅｓメラノーマ細胞などの哺乳類細胞を使用する発現系は、本発明において好ましい。哺乳動物細胞は、哺乳動物起源の天然分子に極めて類似した翻訳後修飾を有する発現タンパク質を提供する。本発明はヒトに投与しなければならないことがあり得る分子を扱うため、完全にヒトの発現系が特に好ましいであろう。したがって、より一層好ましくは、宿主細胞はヒト細胞である。ヒト細胞の例は、とりわけＨｅＬａ、９１１、ＡＴ１０８０、Ａ５４９、２９３、及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。好ましい実施形態では、ヒトプロデューサー細胞は、発現可能な構成をしたアデノウイルスＥ１領域をコードする核酸配列の少なくとも機能的部分を含む。より一層好ましい実施形態では、前記宿主細胞は、ヒト網膜に由来し、９１１細胞、又は番号９６０２２９４０で１９９６年２月２９日にＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）、ＣＡＭＲ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ  ＳＰ４  ＯＪＧ、Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎに委託され、商標ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）（ＰＥＲ．Ｃ６はＣｒｕｃｅｌｌ  Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｂ．Ｖ．の登録商標である）で販売されている細胞株などのように、アデノウイルスＥ１配列を含む核酸により不死化される。本出願の目的のために、「ＰＥＲ．Ｃ６細胞」は、番号９６０２２９４０で委託された細胞又は祖先、上流若しくは下流の継代、及び委託された細胞の祖先由来の子孫、並びに前述のもののいずれかの誘導体を指す。宿主細胞における組換えタンパク質の産生は、当該技術分野においてよく知られている方法によって実行することができる。目的タンパク質のための産生プラットフォームとしてＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）という商標で販売されている細胞の使用は、国際公開第００／６３４０３号パンフレットに記載されており、この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００６２】
本発明による結合分子を生産する方法は、本発明のさらなる態様である。特定の実施形態では、この方法は、（ａ）本発明による宿主を、結合分子が発現しやすい条件下で培養する工程と、（ｂ）任意選択で、発現した結合分子を回収する工程と、を含む。発現した結合分子は、無細胞抽出物から回収することができるが、好ましくは、培地から回収される。上記の生産方法はまた、本発明の結合分子及び／又は免疫コンジュゲートの機能的変異体を生産するために使用することができる。結合分子などのタンパク質を無細胞抽出物又は培地から回収する方法は当業者にはよく知られている。上記の方法によって得られる結合分子、機能的変異体、及び／又は免疫コンジュゲートもまた本発明の一部である。
【００６３】
或いは、宿主細胞などの宿主での発現の次に、本発明の結合分子及び免疫コンジュゲートを、従来のペプチドシンセサイザーによる合成によって、又は本発明によるＤＮＡ分子に由来するＲＮＡ核酸を用いる無細胞翻訳系で生産することができる。上記の合成による生産方法又は無細胞翻訳系によって得られる結合分子及び免疫コンジュゲートも本発明の一部である。
【００６４】
なおさらなる態様では、本発明は、本発明による少なくとも１つの結合分子、好ましくはヒトモノクローナル抗体、少なくとも１つのその機能的変異体、本発明による少なくとも１つの免疫コンジュゲート、及び／又はこれらの組み合わせを提供する。それに加えて、組成物は、とりわけ、アルブミン若しくはポリエチレングリコールなどの安定化分子又は塩を含んでもよい。使用される塩は、好ましくは、結合分子の望ましい生物学的活性を保持し、且つ望ましくない毒性効果を一切付与しない塩である。必要に応じて、本発明のヒト結合分子を、物質の内若しくは外にコーティングして、酸の作用、又は結合分子を不活化し得る他の天然若しくは非天然の条件から結合分子を保護することができる。
【００６５】
なおさらなる態様では、本発明は、本発明において定義される少なくとも１つの核酸分子を含む組成物を提供する。組成物は、塩（例えば、ＮａＣｌ若しくは上記の塩）、洗浄剤（例えば、ＳＤＳ）、及び／又は他の好適な成分を含有する水溶液などの水溶液を含んでもよい。
【００６６】
さらに、本発明は、本発明の少なくとも１つの結合分子、例えば、ヒトモノクローナル抗体（又はその機能的断片若しくは変異体）、本発明による少なくとも１つの免疫コンジュゲート、本発明による少なくとも１つの組成物、又はこれらの組み合わせを含む医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容され得る賦形剤又は担体をさらに含む。薬学的に許容される賦形剤又は担体は当業者によく知られている。
【００６７】
特定の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１つの他の予防薬及び／又は治療薬を含む。このような薬剤は、結合分子、小分子、有機又は無機化合物、酵素、ポリヌクレオチド配列などであり得る。これらは、本発明の結合分子と組み合わせて使用することができる。本明細書における「組み合わせて」は、別個の製剤として、若しくは１つの単一の組み合わされた製剤として、同時に、又は別個の製剤として、逐次的な投与レジメンに従い、任意の順序で、であることを意味する。
【００６８】
特定の実施形態では、結合分子は、タンパク質の凝集を阻害及び／又は防止するために使用されるものである。
【００６９】
特定の実施形態では、結合分子は、薬剤として使用するためのものであり、好ましくはＡＤなどの神経変性疾患の診断、治療、及び／又は予防処置に使用するためのものである。したがって、本発明の結合分子又はその断片は、脳内のタウ若しくは病的タウの蓄積、又はタウ凝集を含む神経変性疾患を有する患者、例えば、ＡＤ、及びタウが過剰発現し得る任意の他のタウオパチー又は他のタウ関連病変を患う患者の症状を治療、減少又は予防するために使用され得る。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、本発明の結合分子は、病的タウ又はタウ凝集、したがって脳内のＰＨＦタウの量を低減又は消失させることにより、その有益な効果を発揮し得る。本発明の抗体を使用して、任意の分類に属する動物患者を治療し得る。かかる動物の例としては、哺乳動物、例えば、ヒト、げっ歯類、イヌ、ネコ及び家畜が挙げられる。
【００７０】
本発明の別の実施形態は、タウタンパク質凝集の広がりを阻害及び／又は防止する方法である。
【００７１】
本発明の別の実施形態は、患者におけるタウの凝集が関わる神経変性疾患の症状を治療又は低減する方法であり、この方法は、神経変性疾患の症状を治療又は低減するのに十分な時間にわたって本発明の結合分子の治療有効量を患者に投与することを含む。上記の実施形態のいずれにおいても、タウの凝集が関わる神経変性疾患はタウオパチーである。本明細書で使用されるとき、「タウオパチー」は、脳内におけるタウの病的凝集が関わる任意の神経変性疾患を包含する。家族性及び孤発性ＡＤに加えて、他の例示的なタウオパチーは、１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）、進行性核上性麻痺、皮質基底核変性症、ピック病、進行性皮質下神経膠症、神経原線維変化型老年期認知症（ｔａｎｇｌｅ  ｏｎｌｙ  ｄｅｍｅｎｔｉａ）、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、嗜銀顆粒性認知症、筋萎縮性側索硬化症・パーキンソニズム認知症複合、ダウン症候群、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、ハレルフォルデン・スパッツ病、封入体筋炎、クロイツフェルトヤコブ病、多系統萎縮症、ニーマン・ピック病Ｃ型、プリオンタンパク質脳アミロイドアンギオパチー、亜急性硬化性全脳炎、筋強直性ジストロフィー、神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン疾患、脳炎後パーキンソニズム、及び慢性外傷性脳症、例えば、拳闘家認知症（ボクサー病）である。（Ｍｏｒｒｉｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｕｒｏｎ  ７０：４１０−２６，２０１１）。
【００７２】
タウオパチー関連行動表現型としては、認知障害、初期人格変化及び脱抑制、無関心、無為症、無言症、失行症、保続症、常同運動／行動、口愛過度、無秩序、逐次的な課題を計画したり又は取りまとめたりできないこと、利己的／冷淡、反社会的特性、共感の欠如、もたつき、高頻度の錯語的誤りを伴うが理解力は比較的保たれている失文法発話、理解力低下及び喚語困難、緩徐進行性歩行不安定性、後方突進、すくみ、頻繁な転倒、レボドパ不応性軸性硬直、核上性注視麻痺、矩形波眼球運動、緩徐な垂直性サッケード、仮性球麻痺、四肢の失行、ジストニー、皮質性感覚消失、及び振戦が挙げられる。
【００７３】
治療に適した患者には、ＡＤ又は他のタウオパチーのリスクがある無症候者、並びに現在症状を示している患者が含まれる。治療に適した患者には、ＡＤの家族歴又はゲノムにおける遺伝的リスク要因の存在など、ＡＤの既知の遺伝的リスクを有する者が含まれる。例示的リスク要因は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の、特に７１７位並びに６７０位及び６７１位における変異（それぞれ、ハーディ型変異及びスウェーデン型変異）である。他のリスク要因は、プレセニリン遺伝子ＰＳ１及びＰＳ２、並びにＡｐｏＥ４の変異、高コレステロール血症又はアテローム性動脈硬化症の家族歴である。現在ＡＤに罹患している者は、上記のリスク要因の存在による特徴的な認知症から認めることができる。加えて、ＡＤを有する者を特定するための幾つもの診断検査が利用可能である。それらには、脳脊髄液タウ及びＡβ４２レベルの測定が含まれる。タウレベルの上昇及びＡΒ４２レベルの低下はＡＤの存在を意味する。ＡＤ罹患者はまた、アルツハイマー病・関連障害協会（ＡＤ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）の基準によって診断することができる。
【００７４】
本発明の抗タウ結合分子は、タウの蓄積、及び／又はタウの病的凝集が関わる神経変性疾患、例えばＡＤ又は他のタウオパチー若しくはタウ関連の病気を治療又は予防するための治療用薬剤及び予防用薬剤のいずれとしても好適である。無症候患者では、治療は任意の年齢（例えば、約１０歳、１５歳、２０歳、２５歳、３０歳）で開始し得る。しかしながら、通常は、患者が約４０歳、５０歳、６０歳、又は７０歳に達するまで治療を開始する必要はない。治療は、一般的には、ある期間にわたる複数回の投薬を伴う。治療は、時間の経過に伴う治療用薬剤に対する抗体又は活性化Ｔ細胞若しくはＢ細胞応答をアッセイすることによってモニタし得る。応答が低下する場合、ブースター投薬が適応となる。
【００７５】
予防的適用においては、医薬組成物又は医薬は、ＡＤ又はタウが関わる他の病気に罹り易い、又はさもなければそのリスクがある患者に対し、疾患の生化学的、組織学的な及び／又は行動上の症状、その合併症、及び疾患の発症中に現れる中間的な病的表現型を含めた疾患のリスクを解消又は低減し、その重症度を軽減し、又はその発生を遅延させるのに十分な量で投与される。療法的適用においては、組成物又は医薬は、そうした疾患の疑いがあるか、又は既にそれに罹患している患者に対し、疾患の症状（生化学的、組織学的な及び／又は行動上の）のいずれかを低減し、抑え、又は遅延させるのに十分な量で投与される。療法薬の投与により、特徴的なアルツハイマーの病変を未だ発症していない患者における軽度認知障害が低減され、又は消失し得る。療法的又は予防的治療を達成するのに十分な量は、療法上又は予防上有効な用量として定義される。予防的レジーム及び療法的レジームの両方において、組成物又は医薬は、通常、十分な免疫応答が得られるまで数回の投薬で投与される。
【００７６】
本発明の抗タウ結合分子又はその断片は、関連する神経変性疾患の治療に有効な他の薬剤と併用して投与され得る。ＡＤの場合、本発明の抗体は、アミロイドβ（Ａβ）の沈着を低減又は予防する薬剤と併用して投与され得る。ＰＨＦタウ病変及びＡβ病変は相乗的である可能性がある。したがって、ＰＨＦタウ病変及びＡβ関連病変の両方の除去を同時に標的化する併用療法は、各々を個別に標的化するより有効であり得る。
【００７７】
パーキンソン病及び関連する神経変性疾患の場合、凝集形態のａ−シヌクレインタンパク質を除去するための免疫調節もまた、新たな療法である。タウ及びα−シヌクレインの両タンパク質の除去を同時に標的化する併用療法は、いずれかのタンパク質を個別に標的化するより有効であり得る。本発明の方法において、タウオパチーの治療又は症状の改善における結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合断片の「治療有効量」は、標準的な研究手法によって決定し得る。例えば、抗体の投薬量は、当該技術分野においてよく知られている関連性のある動物モデルにその薬剤を投与することによって決定し得る。
【００７８】
加えて、任意選択でインビトロアッセイを用いて最適な投薬量範囲の特定を補助し得る。特定の有効用量の選択は、当業者が（例えば臨床試験によって）幾つかの要因を考慮して決定し得る。かかる要因としては、治療又は予防しようとする疾患、関わる症状、患者の体重、患者の免疫状態及び当業者に知られている他の要因が挙げられる。製剤中に用いられる正確な用量はまた、投与経路、及び疾患の重症度にも依存することになり、医師の判断及び各患者の状況に従って決定されるべきである。有効用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から得られる用量反応曲線から推定することができる。本発明の結合分子の療法的使用に対する投与方法は、その薬剤を宿主に送達する任意の好適な経路であってよい。これらの結合分子の医薬組成物は、非経口投与、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内又は頭蓋内投与に有用であり、或いは脳又は脊椎の脳脊髄液に投与することもできる。
【００７９】
治療は、単回投与スケジュールで与えられても、又は複数回投与スケジュールとして与えられてもよく、複数回投与スケジュールでは、主要な治療コースは１〜１０回の別個の投与と、続いて応答の維持及び又は強化に必要な時間間隔後に、例えば２回目の用量について１〜４ヵ月の時点で与えられる他の投与、及び必要であれば数ヵ月後のその後の投与とを含むものであり得る。好適な治療スケジュールの例としては、以下が挙げられる：（ｉ）０、１ヵ月及び６ヵ月、（ｉｉ）０、７日及び１ヵ月、（ｉｉｉ）０及び１ヵ月、（ｉｖ）０及び６ヵ月、又は疾患症状を低減し、若しくは疾患の重症度を低減すると予想される所望の応答を誘発するのに十分な他のスケジュール。したがって、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、１ｍｌ滅菌緩衝用水と、約１ｎｇ〜約１００ｍｇ、約５０ｎｇ〜約３０ｍｇ又は約５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明の抗体とを含有するように調製し得る。同様に、静脈内注入用の本発明の医薬組成物は、約２５０ｍｌの滅菌リンゲル溶液と、約１ｍｇ〜約３０ｍｇ又は約５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明の抗体とを含有するように構成し得る。非経口的に投与可能な組成物を調製するための実際の方法はよく知られており、例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ”，１５ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡにさらに詳細に記載されている。
【００８０】
本発明の結合分子は、保存のため凍結乾燥し、使用前に好適な担体中に再構成することができる。この手法は、抗体及び他のタンパク質製剤で有効であることが示されており、当該技術分野において知られている凍結乾燥及び再構成手法を用いることができる。
【００８１】
特定の実施形態では、結合分子は、対象におけるＡＤ又は他のタウオパチーを診断する方法で使用され得る。この方法には、本発明の抗体又はその断片などの診断用試薬を使用してタウの存在を対象において検出することが関わる。タウは、対象からの生体試料（例えば、血液、尿、脳脊髄液）において、その生体試料を診断用抗体試薬と接触させて、対象からの試料中のＰＨＦタウに対する診断用抗体試薬の結合を検出することにより検出し得る。検出を実施するためのアッセイには、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、ウエスタンブロット、又は生体内イメージングなどのよく知られた方法が含まれる。
【００８２】
診断は、対象からの試料又は対象における標識されたタウの数、サイズ、及び／若しくは強度、タウの蓄積、タウの凝集、並びに／又は神経原線維変化を対応するベースライン値と比較することによって行われ得る。ベースライン値は、無疾患者の集団の平均レベルに相当し得る。ベースライン値はまた、同じ対象で測定された以前のレベルに相当してもよい。
【００８３】
上記の診断方法はまた、対象における治療前、治療中又は治療後のタウの存在を検出することにより、療法に対する対象の反応のモニタリングにも用いることができる。ベースラインと比較した値の変化が治療反応性を示す。値はまた、病的タウが脳から除去されていくにつれ、生体液中で一時的に変化することもある。
【００８４】
本発明は、さらに、上述の診断及びモニタリング方法を実施するためのキットを対象とする。通常、かかるキットは、本発明の結合分子などの診断用試薬と、任意選択で検出可能標識とを含む。診断用結合分子、例えば抗体、それ自体が、直接検出可能な、又は二次的反応（例えば、ストレプトアビジンとの反応）を介して検出可能な検出可能標識（例えば、蛍光分子、ビオチンなど）を含んでもよい。或いは、検出可能標識を含有する第２の試薬を利用してもよく、ここで、この第２の試薬は一次抗体に対して結合特異性を有する。生体試料中のタウの測定に好適な診断キットにおいて、キットの抗体は、マイクロタイターディッシュのウェルなどの固相に予め結合して供給されてもよい。
【００８５】
実施例において本発明をさらに説明するが、それらは決して本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００８６】
実施例１
タンパク質の発現及び精製
ｈｕＴａｕ４４１（配列番号１９）、すなわちＮ末端インサートと４つの全ての微小管結合モチーフの両方を含むヒトタウの最長アイソフォームを、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）細菌株において以下のように発現させた：１０Ｌの２ＹＴブロス培養物を３７℃でＯＤ６００＝１．０の濃度までインキュベートした。ＩＰＴＧを１ｍＭまで添加し、培養物をさらに３時間インキュベートした。細菌細胞を遠心分離によって回収し、ＰＢＳに再懸濁して、残りの上清を洗い流した。遠心分離後、ペレットを−８０℃で精製まで保存した。
【００８７】
ペレットを、５ｍｌ／ｇペレット溶解緩衝液［Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ  ｍａｓｔｅｒｍｉｘ、Ｍｅｒｃｋ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）＋Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｕｌｔｒａ  ＥＤＴＡ  ｆｒｅｅプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）及び追加の５００ＵのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に再懸濁した。室温で３０分後、溶解物を７０℃で６０分間の熱処理に供した。沈殿した物質を遠心分離によって除去し、可溶性タウタンパク質を、Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｅｘｃｅｌ（ＧＥ）カラム、続いてＣ−Ｔａｇ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によるアフィニティークロマトグラフィーによって単離し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（Ａｋｔａ  Ａｖａｎｔ  ２５、ＧＥ）でゲル濾過した。タンパク質を含有する各画分からのアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、汚染物質の量が最も少ない画分（モノマータウより高い又は低いバンド）を実験目的のために保持した。全ての場合において、ＳＥＣ−ＭＡＬＳによる評価で、調製物は＞９５％のモノマータウタンパク質を含有した。
【００８８】
実施例２
ＣＢＴＡＵ−２８．１変異体の調製
予め、（国際公開第２０１５／１９７８２３号パンフレットに記載されるように）抗体ＣＢＴＡＵ−２８．１を同定した。
【００８９】
本発明にしたがい、合理的構造に基づくアプローチ及び／又はランダム変異誘発戦略によって、新規且つ改良された変異体を作製した。
【００９０】
ヒトＩｇＧ１抗体を、重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）可変領域を、野生型ＩｇＧ定常領域を含む単一発現ベクターにクローニングすることによって構築した。ヒト抗タウｍＡｂに対応する配列をコードするプラスミドを、ヒト胚腎臓２９３由来Ｅｘｐｉ２９３ＦＴＭ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）に一時的にトランスフェクトし、トランスフェクションの７日後、発現した抗体を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって培養培地から精製した。ＩｇＧを、セルフパックＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、直ちにＰＢＳ（ｐＨ７．４）に緩衝液を交換した１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）でカラムから溶出した。ＳＤＳ  ｐａｇｅ、及び多角光散乱と組み合わせたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）によって各抗体を品質管理し、さらにＯｃｔｅｔバイオレイヤー干渉法によって同族タウペプチドに対する各抗体の反応性を確認した。
【００９１】
実施例３
野生型（ＷＴ）及びＣＢＴＡＵ−２８．１変異体のその対応する同族ＴａｕペプチドＡ６９４０（配列番号２０）に対する、Ｏｃｔｅｔバイオレイヤー干渉法に基づく会合及び解離のプロファイル。
タウペプチドＡ６９４０のアミノ酸配列は、４２ＧＬＫＥＳＰＬＱＴＰＴＥＤＧＳＥＥＰＧＳＥＴＳＤＡＫＳＴＰＴＡＥＤＶＴＡＰＬＶＤＥＧＡＰＧＫＱＡＡＡＱＰＨＴＥＩＰＥＧＴＴＡ１０３（配列番号２０）である。ペプチドをビオチンによってストレプトアビジンバイオセンサに結合させた。ＣＢＴＡＵ−２８．１変異体（１００ｎＭ）を含有する溶液にセンサを浸漬して、会合（０〜６００ｓ）させ、タンパク質複合体を含有するセンサを動的緩衝液中に移動させて、解離（６００〜１２００ｓ）させた。これらの実験に使用した緩衝液は、１０×「Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ’ｓ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｂｕｆｆｅｒ」をＰＢＳで１０倍希釈することによって得た。親和性の向上は、波長（ｎｍ）がより大きくシフトすること、及び／又は解離速度がより遅くなることによって確認される。
【００９２】
結果を図１に示す。図からわかるように、本発明の新規の結合分子は、Ｔａｕペプチド（配列番号２０）に対する結合プロファイルの改善を示した。これは、定常状態条件下で抗体分子がより高い割合でタウに結合することを示す会合時のより大きな波長シフト、及び新しい結合分子がより長時間タウに結合したままであることを示すより遅い解離速度によって明らかにされた。
【００９３】
実施例４
等温滴定カロリメトリー（ＩＴＣ）による親和性の測定
新しい抗体の親和性を、Ｍｉｃｒｏｃａｌ  Ａｕｔｏ−ｉＴＣ２００等温滴定熱量計（Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いて決定した。Ｔａｕ及びＣＢＴＡＵ−２８．１変異体をＰＢＳ（ｐＨ７．４）に透析して、完全な緩衝液適合条件を確保した。２０μＭのタウタンパク質（ペプチド）を、ＰＢＳ中２００μＭのＣＢＴＡＵ−２８．１ストックで漸増的に滴定し、エンタルピーの変化を各注入後に評価した。データを、Ｍｉｃｒｏｃａｌ  ＰＥＡＱ−ＩＴＣ解析ソフトウエア（Ｍａｌｖｅｒｎ）を使用して、一組の部位モデルにしたがって適合させた。
【００９４】
残基４２〜１０３を包含するＴａｕペプチドＡ６９４０（配列番号２０）を、野生型（左パネル）又は親和性最適化Ｓ３２Ｒ［ＶＬ］；Ｅ３５Ｋ［ＶＬ］（右パネル）ＣＢＴＡＵ−２８．１変異体で滴定した。結果を図２に示す。各注入時のエンタルピーの変化をＩｇＧ／Ｔａｕモル比（・）の関数として示す。実線は、「一組の結合部位」モデルに対するデータの適合を表す。適合から得られた平衡解離定数（Ｋｄ）を、各パネルの右下隅に示す。ＩＴＣから推定されるように、他の親和性改善変異体（示さず）の親和性は以下の通りである：
ＣＢＴＡＵ−２８．１（Ｉ５０Ｍ［ＶＨ］；Ｙ５２Ｗ［ＶＨ］；Ｓ１０３Ｗ［ＶＨ］；Ｓ３２Ｒ［ＶＬ］；Ｅ３５Ｋ［ＶＬ］）：６７±１１ｎＭ
ＣＢＴＡＵ−２８．１（Ｉ５０Ｍ［ＶＨ］；Ｙ５２Ｗ［ＶＨ］；Ｓ１０３Ｆ［ＶＨ］；Ｓ３２Ｒ［ＶＬ］；Ｅ３５Ｋ［ＶＬ］）：６３±１２ｎＭ
ＣＢＴＡＵ−２８．１（Ｉ５０Ｍ［ＶＨ］；Ｙ５２Ｗ［ＶＨ］；Ｓ１０３Ｗ［ＶＨ］；Ｙ３１Ｗ［ＶＬ］；Ｎ９９Ｈ［ＶＬ］）：５７±７ｎＭ
ＣＢＴＡＵ−２８．１（Ｉ５０Ｍ［ＶＨ］；Ｙ５２Ｗ［ＶＨ］；Ｓ１０３Ｆ［ＶＨ］；Ｙ３１Ｗ［ＶＬ］；Ｎ９９Ｈ［ＶＬ］）：４５±５ｎＭ
【００９５】
ＩＴＣ測定は、新しい結合分子が非常に高い親和性でタウに結合することを示し、これは、所与の時点で、抗体分子のより大きな集団がタウとの複合体で見出され得ることを意味する。
【００９６】
実施例５
ミクログリアによるタウ凝集体取り込みの媒介
組換えタウ凝集体の標識
凝集した組み換え２Ｎ４Ｒタウ（ｒＴａｕ）（配列番号１９）を、製造業者の説明書にしたがってｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＳＴＰ  Ｅｓｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で共有結合的に標識した。簡潔に記すと、ｒＴａｕ凝集体を２０，８００ｒｃｆで３０分間遠心分離することによって沈澱させ、次いで、０．１Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）に最終濃度２ｍｇ／ｍｌで再懸濁した。タンパク質１モル当たり１０モルの染料を添加し、混合物を光から保護しながら室温で４５分間インキュベートした。０．１Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したＰＤ１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、コンジュゲートしなかった色素を除去した。標識されたｒｔａｕ凝集体を、ＢＣＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、製造業者の説明書にしたがって、タンパク質含量について評価した。
【００９７】
組み換えタウ取り込みアッセイ
ＢＶ−２細胞を、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したＤＭＥＭ中で培養した。培養物を、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中、３７℃で保持した。
【００９８】
免疫複合体を生成するために、ｐＨｒｏｄｏ  Ｇｒｅｅｎ色素で共有結合的に標識した２５０ｎＭの凝集ｒＴａｕを、無血清培地中のＣＢＴＡＵ−２８．１（野生型及び本発明の新しい結合分子）又はＣＢＴＡＵ−２７．１（国際公開第２０１５／１９７８２３号パンフレットに記載）及びＳ２７ｄＹ；Ｔ１００Ｉ変異体（同時係属出願第ＥＰ１７１６３４２５．６号明細書に記載）の連続希釈液（６〜１５０ｎＭ）と共にインキュベートした。また、野生型及び高親和性変異体フォーマットのＣＢＴＡＵ−２８．１及びＣＢＴＡＵ−２７．１の両方の３００ｎＭのＦａｂフラグメントを用いて、Ｔａｕ免疫複合体を生成した。各実験において、マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照を、凝集ｒＴａｕのみと共にインキュベートした細胞と共に含めた。
【００９９】
免疫複合体を４℃で一晩インキュベートし、その翌日に５％ＣＯ２を３７℃で２時間、ＢＶ２細胞に適用した。インキュベーション後、細胞を０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡで２０分かけて採集し、したがって同時に細胞外膜に結合したＴａｕを除去し、４００ｒｃｆで遠心分離して培地を除去し、ＰＢＳで２回洗浄し、フローサイトメトリー緩衝液（ＰＢＳ  １×＋０．５％ＢＳＡ及び２ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁した。細胞を、Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ）ゲーティングを用いて、前方及び側方散乱プロファイルによって同定されるように、生きた単一細胞集団について分析した。各実験は２回行った。
【０１００】
図３に示すように、ＣＢＴＡＵ−２８．１（Ａ）はＢＶ２細胞におけるｒＴａｕの取り込みを促進したが、ＣＢＴＡＵ−２７．１（Ｂ）は促進しなかった。
ＣＢＴＡＵ−２８．１  Ｆａｂ断片はＴａｕの取り込みを増加させなかったので、取り込みはＦｃ媒介性であった（データは示さず）。
【０１０１】
ＣＢＴＡＵ−２８．１野生型（ＷＴ）及び本発明の新しい結合分子の滴定曲線は、特定の抗体濃度（Ａ）のより高い蛍光レベルに反映されているように、本発明の抗体が、ＷＴ抗体よりもＢＶ２細胞へのＴａｕの取り込みをより媒介し得ることを明らかに示した。ＣＢＴＡＵ−２７．１滴定曲線で、この抗体がＴａｕ取り込みにいかなる効果もないことがさらに確認された（Ｂ）。ＭＦＩの増加倍数を、ＢＶ２細胞単独と比較する。
【０１０２】
結果は、本発明の新規な結合分子がタウ凝集体に結合することができ、複合体が用量依存的にＦｃ媒介機構を介してミクログリアにより取り込まれる得ることを示している。取り込み効率は、新しい結合分子で非常に高い。一方、ＣＢＴＡＵ−２７．１変異体はタウ凝集体に結合することができず、したがってミクログリアによるＰＨＦ取り込みを媒介することができない。
【０１０３】
実施例６
ＡＤ脳ホモジネートからシードを除去するＣＢＴＡＵ−２８．１抗体の能力
タウシードを含有するホモジネートを、凍結保存したヒトＡＤ脳組織から生成した。免疫除去アッセイにおいて、シードを試験抗体と共にインキュベートし、プロテインＧ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓで溶液から除去した。除去した上清（「免疫除去画分」と呼ぶ）の、発色団−Ｋ１８含有ＨＥＫ２９３細胞における残留シーディング能力を試験し、フローサイトメトリーによって分析した。
【０１０４】
ＦＲＥＴバイオセンサー細胞は、Ｋ１８／Ｐ３０１Ｓ−ＣＦＰ及びＫ１８／Ｐ３０１Ｓ−ＹＦＰを安定に発現するＨＥＫ細胞であり、９６ウェルプレートフォーマットにプレーティングした。免疫除去画分をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００と予備混合することによって、画分を細胞にトランスフェクトして、アッセイウィンドウを増加させ、レシピエントＦＲＥＴバイオセンサー細胞上で２日間インキュベートした後、細胞をトリプシンで処理し、ＦＲＥＴポジティブ細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって定量した。ＦＲＥＴシグナルはＫ１８レポータータンパク質が凝集体を形成し、したがってＣＦＰ及びＹＦＰが近接している場合にのみ測定することができる。ＣＦＰを励起すると、エネルギーがＹＦＰに移動し、ＹＦＰは蛍光を発する（Ｈｏｌｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１４，ＰＮＡＳ  １１１，Ｅ４３７６−Ｅ４３８５）。
【０１０５】
シード
凍結保存した脳組織をバイオバンク（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  Ｂｒａｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）から取得した。凍結した脳組織を、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーを用いて、ホモジナイズ用緩衝液（１０ｍＭトリス（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５５６７−０２７）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２４７４０−０１１）、ｐＨ７．４、フィルター：０．２２μｍ＋Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｍｉｎｉ  ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１１  ８３６  １７０  ００１））中、１０００ｒｐｍで１０ストローク、ホモジナイズして、１０ｗ／ｖ％ホモジネートを得た。ホモジネートを２７．０００×ｇで１０分間、４℃にて遠心分離し、上清を、免疫除去アッセイにおけるシードとして使用するまで、−８０℃でアリコートとして保存した。
【０１０６】
アッセイの手順
以下に記載する抗体−シード−ビーズ混合物中で最終３００ｎＭ濃度を得るために、６６０ｎＭ抗体希釈物をＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ８５３７）で調製した。３００ｎＭ抗体濃度で完全な枯渇を達成するために、シードをＰＢＳで１．３倍に希釈し、適切なシーディングウィンドウを維持した。抗体希釈物及びシード希釈物を９６ウェルＰＣＲプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＡＢ−０６００）中で１：１の比で混合し、ビーズを洗浄するまでインキュベートした。
【０１０７】
１ウェル当たり１２１．５μｌのプロテインＧ  ＤｙｎａＢｅａｄｓ懸濁液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１０００４Ｄ）を９６ウェルＰＣＲプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＡＢ−０６００）に加え、ビーズから緩衝液を除去されるように、磁石（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１２３．３１Ｄ）でビーズを引き落とすことによって２回洗浄し、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ１３７９）を含むＰＢＳ中にビーズを再懸濁させた。洗浄緩衝液を完全に除去し、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０μｌのＰＢＳを各ウェル中のビーズに添加し、１ウェル当たり１：１抗体−シード混合物９０μｌを添加した。抗体−シード−ビーズ混合物は、ビーズがＰＣＲプレートのプラスチックに付着するのを防ぐために、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０を含む必要がある。
【０１０８】
抗体−シード−ビーズ混合物を、５ｒｐｍで回転させながら、４℃で一晩インキュベートした。翌日、３０００ｒｐｍで約２０秒間遠心分離することにより、蓋から凝縮物を除去した。磁石でビーズを引き落とすことによって、免疫除去画分をビーズから分離し、新しい９６ウェルＰＣＲプレートに移し、残存するシーディング能力についてＦＲＥＴバイオセンサー細胞で試験するまで−８０℃で保存した。ビーズを上記のように２回洗浄し、ＰＣＲプレート中、−２０℃で乾燥保存した。各条件を２回試験した。
【０１０９】
免疫除去画分をＦＲＥＴバイオセンサー細胞にリバーストランスフェクトし、９６ウェルプレート（ポリＤリジンプレコートμｃｌｅａｒプレート；Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ、カタログ番号６５５９４６）に１ウェル当たり１０μｌの免疫除去画分を添加した。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１０５８−０２１）で４０倍に希釈したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１６６８−０２７）１０μｌを添加し、この混合物をプレート中で１０分間インキュベートした。１ウェル当たり、５５．０００のＦＲＥＴバイオセンサー細胞（１０％（ｖ／ｖ）熱不活化ウシ胎仔血清（Ｂｉｏｗｅｓｔ、カタログ番号Ｓ１８１０−５００）及び１％Ｐｅｎｓｔｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ  Ｐ４３３３）を補充した１３０μｌのＤＭＥＭ、高グルコース、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ピルビン酸（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号３１９６６−０２１）中）を添加した。３７℃で２日間インキュベートした後、細胞をＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ８５３７）で２回洗浄し、その後、５０μｌ／ウェルの０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２５３００−０５４）を用いて３７℃で５分間、分離処理した。上下に繰り返しピペッティングして細胞を再懸濁し、顕微鏡で単一細胞を視覚的にチェックした。３０μｌ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液（ハンクス平衡塩溶液（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ８２６４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１５５７５−０３８）、１％ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ、カタログ番号Ｓ１８１０−５００））をポリプロピレン丸底プレート（ＭＷ３８４；Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３６５７）に入れ、これに５０μｌの細胞懸濁液を添加した。細胞をフローサイトメトリーによりＦＲＥＴ陽性について分析した。
【０１１０】
図４に示すように、ＣＢＴＡＵ−２８．１は、この実験で使用した抗体の最高濃度で約６０％までシーディング効率が低下したことに反映されるように、用量依存的にＡＤ脳からＰＨＦを除去することができる。さらに、親和性が改善されたＣＢＴＡＵ−２８．１分子は、極めて高いＰＨＦ除去能を示す。このことは、より急峻な用量依存効果によって、また、実験で使用された最高抗体濃度において、シーディング効率が最初の効率の１０〜３０％に低下するという事実に反映されている。これらの観察は、これらの抗体は濃度の上昇によりＡＤ脳からＰＨＦシードを中和する能力が増大することを示している。
【０１１１】
【表１】
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【０１１２】
重鎖可変領域ＷＴ  ＣＢＴＡＵ  ２８．１（配列番号１３）：
【化１】
2021505142.tif 000004
【０１１３】
軽鎖可変領域ＷＴ  ＴＢＴＡＵ  ２８．１（配列番号１４）：
【化２】
2021505142.tif 000005
【０１１４】
重鎖可変領域Ｓ３２Ｒ［ＶＬ］；Ｅ３５Ｋ［ＶＬ］（配列番号１３）：
【化３】
2021505142.tif 000006
【０１１５】
重鎖可変領域Ｓ３２Ｒ［ＶＬ］；Ｅ３５Ｋ［ＶＬ］（配列番号１５）：
【化４】
2021505142.tif 000007
【０１１６】
重鎖可変領域Ｉ５０Ｍ［ＶＨ］；Ｙ５２Ｗ［ＶＨ］；Ｓ１０３Ｗ［ＶＨ］；Ｓ３２Ｒ［ＶＬ］；Ｅ３５Ｋ［ＶＬ］（配列番号１６）：
【化５】
2021505142.tif 000008
【０１１７】
軽鎖可変領域Ｉ５０Ｍ［ＶＨ］；Ｙ５２Ｗ［ＶＨ］；Ｓ１０３Ｗ［ＶＨ］；Ｓ３２Ｒ［ＶＬ］；Ｅ３５Ｋ［ＶＬ］（配列番号１５）：
【化６】
2021505142.tif 000009
【０１１８】
重鎖可変領域Ｉ５０Ｍ［ＶＨ］；Ｙ５２Ｗ［ＶＨ］；Ｓ１０３Ｆ［ＶＨ］；Ｓ３２Ｒ［ＶＬ］；Ｅ３５Ｋ［ＶＬ］（配列番号１７）：
【化７】
2021505142.tif 000010
【０１１９】
軽鎖可変領域Ｉ５０Ｍ［ＶＨ］；Ｙ５２Ｗ［ＶＨ］；Ｓ１０３Ｆ［ＶＨ］；Ｓ３２Ｒ［ＶＬ］；Ｅ３５Ｋ［ＶＬ］（配列番号１５）：
【化８】
2021505142.tif 000011
【０１２０】
重鎖可変領域Ｉ５０Ｍ［ＶＨ］；Ｙ５２Ｗ［ＶＨ］；Ｓ１０３Ｗ［ＶＨ］；Ｙ３１Ｗ［ＶＬ］；Ｎ９９Ｈ［ＶＬ］（配列番号１６）：
【化９】
2021505142.tif 000012
【０１２１】
軽鎖可変領域Ｉ５０Ｍ［ＶＨ］；Ｙ５２Ｗ［ＶＨ］；Ｓ１０３Ｗ［ＶＨ］；Ｙ３１Ｗ［ＶＬ］；Ｎ９９Ｈ［ＶＬ］（配列番号１８）：
【化１０】
2021505142.tif 000013
【０１２２】
重鎖可変領域Ｉ５０Ｍ［ＶＨ］；Ｙ５２Ｗ［ＶＨ］；Ｓ１０３Ｆ［ＶＨ］；Ｙ３１Ｗ［ＶＬ］；Ｎ９９Ｈ［ＶＬ］（配列番号１７）：
【化１１】
2021505142.tif 000014
【０１２３】
軽鎖可変領域Ｉ５０Ｍ［ＶＨ］；Ｙ５２Ｗ［ＶＨ］；Ｓ１０３Ｆ［ＶＨ］；Ｙ３１Ｗ［ＶＬ］；Ｎ９９Ｈ［ＶＬ］（配列番号１８）：
【化１２】
2021505142.tif 000015
【０１２４】
タウタンパク質２Ｎ４Ｒ（配列番号１９）：
【化１３】
2021505142.tif 000016
【０１２５】
タウタンパク質Ａ６９４０（配列番号２０）：
【化１４】
2021505142.tif 000017
【０１２６】
タウタンパク質Ａ７７３１（配列番号２１）：
５２−ＴＥＤＧＳＥＥＰＧＳＥＴＳＤＡＫＳＴＰＴ−７１
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021505142.tif 000023
2021505142.tif 000024
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