(57)【要約】  ヒト及び動物の食品用サプリメント成分としてのリグニン画分の使用、並びにそれを含む食品用サプリメントを開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
食品病原体に起因する感染症の予防及び治療における、ヒト及び動物の食品用サプリメント中の抗病原性物質として使用するためのリグニン画分であって、
サイズ排除クロマトグラフィーによって測定された重量平均分子量が最大２，５００ダルトンのフラグメントを含み、
前記フラグメントが重量平均で最大１３個のフェニルプロパン単位を含む、リグニン画分。
【請求項２】
大腸菌、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｄｉｔｉｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）を含む食品病原体に対する抗病原性物質であって、プロバイオティクス微生物に悪影響を及ぼさない、請求項１に記載のリグニン画分。
【請求項３】
１５０ダルトン〜２，５００ダルトンの重量平均分子量を有するフラグメントを含み、前記フラグメントが、重量平均で最大１２個のフェニルプロパン単位を含む、請求項１又は２に記載のリグニン画分。
【請求項４】
サイズ排除クロマトグラフィーによって測定された数平均分子量が最大２，０００ダルトンのフラグメントを含み、
該フラグメントが、数平均で最大１１個のフェニルプロパン単位を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のリグニン画分。
【請求項５】
１５０ダルトン〜１，０００ダルトンの数平均分子量を有するフラグメントを含む、請求項４に記載のリグニン画分。
【請求項６】
動物飼料１トン当たり最大１０ｋｇ、より好ましくは動物飼料１トン当たり１〜５ｋｇの量で使用される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のリグニン画分。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のリグニン画分、及び好適な食品担体を含む食品用サプリメント。
【請求項８】
さらに、サイズ排除クロマトグラフィーによって測定された重量平均分子量が、３，５００〜５，５００ダルトンであるフラグメントを含むリグニン画分を含み、
前記フラグメントが、重量平均で最大４０個のフェニルプロパン単位を含む、請求項７に記載の食品用サプリメント。
【請求項９】
さらに、少なくとも１つの樹脂酸を含み、
前記樹脂酸が、アビエチン酸、デヒドロアビエチン酸、パルストリン酸、ネオアビエチン酸、ピマル酸、イソピマル酸、サンダロピマル酸、又はそれらのエステル、又はそれらのエーテル、又はそれらのアルカリもしくはアルカリ土類塩、又はそれらの混合物である、請求項７又は８に記載の食品用サプリメント。
【請求項１０】
さらに、Ｃ１２〜Ｃ２４脂肪酸の少なくとも１つのアルカリもしくはアルカリ土類塩、少なくとも１つの脂肪油、又はそれらの混合物を含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載の食品用サプリメント。
【請求項１１】
家畜の給餌に使用するための食品用サプリメントであって、
家畜から得られる食肉の品質及び品質保持期間の改善に有効な量で投与される、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の食品用サプリメント。
【請求項１２】
雌家畜の給餌に使用するための食品用サプリメントであって、
雌家畜から得られる乳生産量及び品質の改善に有効な量で投与される、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の食品用サプリメント。
【請求項１３】
家畜の給餌に使用するための食品用サプリメントであって、
家畜の繁殖力の向上に有効な量で投与される、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の食品用サプリメント。
【請求項１４】
家畜の給餌に使用するための食品用サプリメントであって、
消化効率又は反芻を損なうことなく、メタン排出量の低減に有効な量で投与される、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の食品用サプリメント。
【請求項１５】
リグニン画分を最大１００ｇ、好ましくはリグニン画分を２０〜８０ｇ含む１日投与量で反芻動物に投与される、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の食品用サプリメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト及び動物の食品用サプリメント成分としてのリグニン画分の使用、並びにそれを含む食品用サプリメントに関する。
【背景技術】
【０００２】
いくつかの産業では、例えば食品業界では、業界で処理する製品、例えば食品の衛生状態を維持するために、細菌の増殖を避けることが必要である。農場では、そして食肉処理場では、細菌の増殖は、一方では非常に一般的であり、他方ではその増殖を制限し、回避することが非常に重要である。
【０００３】
既知の製品は多くの微生物に対して効果がないことが多く、そのため多くの異なる製品を使用しなければならない。また、既知の製品は多くの場合、環境とそれらが使用される製品の両方を汚染する。
【０００４】
このような場合、通常使用される製品は抗生物質である。しかし、これらの薬剤の乱用及び誤用と、経済的インセンティブの低下及び厳しい規制要件に起因する製薬業界による新薬開発の不足は、抗生物質耐性の危機の根底にあると考えられている。
【０００５】
抗微生物薬耐性（ＡＭＲ）とは、以前の治療に使用した薬剤の効果に抵抗する微生物の能力である。この用語には、より具体的な「抗生物質耐性」も含まれる。これは抗生物質に対して耐性を持つようになった細菌にのみ適用される。耐性微生物は治療がより難しく、代替薬又は高投与量が必要となり、両者ともに、より高価であるか、より毒性が強い場合がある。
【０００６】
世界保健機関（ＷＨＯ）は、畜産における抗生物質の不適切な使用は、抗生物質耐性菌の出現と蔓延の根本的な原因であり、動物飼料における成長促進剤としての抗生物質の使用は制限されるべきであると断言した。世界動物衛生機関は、陸生動物衛生規約に、各国の抗微生物薬耐性監視とモニタリングプログラムの作成と調和、畜産における抗生物質使用量のモニタリング、抗生物質の適正かつ慎重な使用を確保するための推奨事項について、加盟国に推奨する一連のガイドラインを追加した。別のガイドラインは、関連する危険因子を確立し、抗生物質耐性のリスクを評価するのに役立つ方法論を実行するためのものである。
【０００７】
このように、抗生物質の使用を回避しながら、これらの悪い微生物を効果的に撃退し、同時にヒトや動物の健康を維持する必要性が感じられている。
【発明の概要】
【０００８】
上記目的は、請求項１に記載の通り、リグニン画分を抗病原性物質としてヒト及び動物の食品用サプリメントに使用することにより達成された。
【０００９】
この点において、また本発明は、前記リグニン画分と好適な食品担体を含む食品用サプリメントに関する。
【００１０】
別の態様において、本発明は、家畜の給餌に使用するための食品用サプリメントに関し、前記食品用サプリメントは、家畜から得られる食肉の品質及び品質保持期間の改善に有効な量で投与される。
【００１１】
さらなる態様において、本発明は、雌家畜の給餌に使用するための食品用サプリメントに関し、前記食品用サプリメントは、雌家畜から得られる乳生産量及び品質の改善に有効な量で投与される。
【００１２】
さらなる態様において、本発明は、家畜の給餌に使用するための食品用サプリメントに関し、前記食品用サプリメントは、家畜の繁殖力の向上に有効な量で投与される。
【００１３】
さらなる態様において、本発明は、家畜の給餌に使用するための食品用サプリメントに関し、前記食品用サプリメントは、消化効率又は反芻を損なうことなく、メタン排出量の低減に有効な量で投与される。
【００１４】
本発明の特徴及び利点は、以下の詳細な説明、例示目的で提供される実施例、及び添付の図面から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、実施例６による対照群及び実験群の１４日間の熟成中の食肉の赤色度プロファイルを示す。
【図２】図２は、実施例６による対照群及び実験群の１４日間の熟成中の食肉の黄色度プロファイルを示す。
【図３】図３は、実施例６による第一胃液のｉｎ  ｖｉｔｒｏ消化の２４時間の間の総ガス生成量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
従って、本発明の対象は、食品病原体に起因する感染症の予防及び治療におけるヒト及び動物の食品用サプリメント中の抗病原性物質としてのリグニン画分の使用であり、前記リグニン画分は、サイズ排除クロマトグラフィーによって測定された重量平均分子量が最大２，５００ダルトンのフラグメントを含み、前記フラグメントは重量平均で最大１３個のフェニルプロパン単位を含む。
【００１７】
リグニンは、いくつかの藻類、維管束植物（その樹皮を含む）及び草本植物、例えば、樹（すなわち、針葉樹と広葉樹）、すべての穀物の藁、サトウキビバガス、草、麻、黄麻、大麻又は綿の支持組織の重要な構造材料を形成する複雑な有機ポリマー類である。またリグニンは、泥炭、レオナルダイト、石炭等の鉱物源を有する場合もある。化学的には、リグニンは、重量平均分子量が２０，０００ダルトン以上のフェニルプロパン単位が多くの異なる結合によって結びついた、非常に不規則な、ランダムに架橋したポリマーである。最も重要な結合パターンを含む代表的で例示的なリグニンフラグメント（Ｉ）を以下に示す：
【００１８】
【化１】
2021507885.tif 000002
【００１９】
前記ポリマーは、３つのフェニルプロパノイドモノマー前駆体の酵素が介在する脱水素重合の結果である：
【００２０】
【化２】
2021507885.tif 000003
【００２１】
それぞれ以下の部分が得られる:
【００２２】
【化３】
2021507885.tif 000004
【００２３】
コニフェリルアルコールはすべての種に存在し、球果植物（針葉樹）では主要なモノマーである。落葉樹（広葉樹）の種は最大４０％のシナピルアルコール単位を含む一方で、また草や農作物は、クマリールアルコール単位を含む場合がある。
【００２４】
リグニンは、その原料となるバイオマス源によって針葉樹リグニンと広葉樹リグニンに分類される。適切なリグニン画分を得るための適切な出発原料となり得る原料のバイオマス源は、実質的に純粋なリグニン、クラフトリグニン、バイオマス由来リグニン、アルカリパルプ化プロセスからのリグニン、ソーダプロセスからのリグニン、オルガノソルブパルプ化からのリグニン及びそれらの任意の組み合わせを含む任意のリグニンである。
【００２５】
「実質的に純粋なリグニン」なる表現は、乾燥原料のバイオマスを基準に少なくとも９０％の純粋なリグニン、好ましくは少なくとも９５％の純粋なリグニンと理解されるべきである。残部は、抽出物、ヘミセルロース等の炭水化物及び無機物である。
【００２６】
「クラフトリグニン」なる表現は、クラフト黒液に由来するリグニンと理解される。黒液は、リグニン残渣、ヘミセルロース、及びクラフトパルプ化プロセスで使用される無機化学物質のアルカリ性水溶液である。パルプ化プロセスからの黒液は、様々な割合で様々な針葉樹種と広葉樹種に由来する成分を含む。リグニンは、沈殿や濾過等を含む様々な方法で黒液から分離することができる。リグニンは通常、１１〜１２未満のｐＨ値で沈殿を開始する。様々な特性を有するリグニン画分を沈殿させるために、様々なｐＨ値を使用することができる。これらのリグニン画分は、分子量分布（例えば、Ｍｗ及びＭｎ）、多分散性、ヘミセルロース及び抽出物の含有量、無機物の含有量によって互いに相違していてもよい。沈殿したリグニンは、酸洗浄工程を用いて、無機不純物、ヘミセルロース及び木材抽出物から精製することができる。さらなる精製は、濾過によって達成することができる。
【００２７】
あるいは、リグニンは純粋なバイオマスから分離される。分離プロセスは、バイオマスを強アルカリで液化することから始めることができ、次いで中和プロセスを行う。アルカリ処理の後、リグニンは、上記で提示した方法と同様の方法で沈殿させることができる。
【００２８】
あるいは、バイオマスからのリグニンの分離は、酵素処理工程を含む。酵素処理は、バイオマスから抽出されるリグニンを変化させる。純粋なバイオマスから分離されたリグニンは、実質的に硫黄を含まず（硫黄含有量は３％未満）、したがって、さらなる処理に役立つ。
【００２９】
好ましくは、そうして分離されたリグニンはまた、フラグメントの重量平均分子量をさらに減少させるために、解重合工程に供される。
【００３０】
好ましくは、そうして分離されたリグニンはまた、フラグメントの重量及び数平均分子量をさらに減少させるために、解重合工程に供される。
【００３１】
好適な解重合プロセスとしては、塩基触媒解重合、酸触媒解重合、金属触媒解重合、イオン液体支援解重合（ｉｏｎｉｃ  ｌｉｑｕｉｄｓ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）及び超臨界流体支援リグニン解重合等（ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｌｕｉｄｓ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌｉｇｎｉｎ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）が挙げられる。
【００３２】
好ましい実施形態では、前記リグニン画分は、塩基触媒解重合によって得られる。
【００３３】
好ましくは、前記リグニン画分は、分離されたリグニンを、３００℃未満の温度、３０ＭＰａ未満の圧力で、塩基触媒解重合に供することにより得られる。
【００３４】
ｐＨは、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）２、ＬｉＯＨ、Ｋ２ＣＯ３、又はそれらの混合物等の塩基を添加することにより、１１〜１４の間に設定される。
【００３５】
本発明の目的のために、リグニン画分中のフラグメントの重量平均分子量（Ｍｗ）は、サイズ排除クロマトグラフィー（又は「ＳＥＣ」）によって測定される。ＳＥＣは、ビーズの細孔内に存在する滞留液体を固定相として用い、流動性のある液体を移動相として用いる。そのため、移動相はビーズ間を流れ、またビーズの細孔に出入りすることができる。分離メカニズムは、溶液中のポリマー分子の大きさに基づいている。より大きな分子は最初に溶出する。ビーズ内の多くの細孔に入ることができる小さな分子は、カラムを通過するのに時間がかかるため、ゆっくりとカラムから出る。ポリマーサンプルの成分の分子量を測定するために、既知の重量の標準ポリマーを用いた校正を行う必要がある。その後、未知のサンプルからの値を校正グラフと比較する。保持時間は、使用されるカラム材料、溶離液、及び使用される標準がサンプルと比較してどの程度類似するかに依存する。本発明において、溶離液は、好ましくは０．１Ｍ  ＮａＯＨである。
【００３６】
本発明のリグニン画分は、以下に提供する実施例に示す通り、プロバイオティクス微生物に悪影響を及ぼすことなく、同時に、食品病原体に対して非常に選択的で効果的であることが、予想外かつ驚くべきことに証明された。
【００３７】
食品病原体とは、大腸菌、カンジダ・アルビカンス、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、サルモネラ・エンテリティディス、カンピロバクター・ジェジュニ、リステリア・モノサイトゲネス等のグラム陽性及びグラム陰性の細菌及び真菌である。
【００３８】
プロバイオティクス微生物の例としては、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、サッカロマイセス・ブラウディ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ブレベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・パラカセイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）等が挙げられる。
【００３９】
これは、本発明のリグニン画分が、有利には抗生物質治療の代替を可能にすることを意味する。抗生物質耐性は抗生物質に対する細菌耐性の因子の出現（及び伝播）と定義され、抗生物質の過剰及び／又は不適切な使用によって微生物集団に及ぼされる選択圧によって引き起こされる。本明細書に記載のリグニン画分は、抗生物質耐性感染症の予防及び治療のための抗生物質の有効な代替手段であることが証明されている。
【００４０】
以下に示す実施例から分かるように、本発明のリグニン画分は、有利かつ驚くべきことに、ヒト及び動物、特に家畜の全体的な健康及びウェルネスを向上させることができ、一方で、後者の経済的パフォーマンス、そこから得られる乳及び食肉の品質を向上させることができる。
【００４１】
好ましくは、前記リグニン画分は、最大２，０００ダルトンの重量平均分子量を有するフラグメントを含む。
【００４２】
好ましい実施形態では、前記リグニン画分は、最大１，５００ダルトンの重量平均分子量を有するフラグメントを含む。
【００４３】
いくつかの実施形態では、前記リグニン画分は、最小１５０ダルトン（ｄｏｗｎ  ｔｏ  １５０  Ｄａｌｔｏｎｓ）の重量平均分子量を有するフラグメントを含む。
【００４４】
好ましい実施形態では、前記リグニン画分は、１５０ダルトン〜２，５００ダルトンの重量平均分子量を有するフラグメント、好ましくは２５０ダルトン〜２，０００ダルトンの重量平均分子量を有するフラグメント、より好ましくは５００ダルトン〜１，８００ダルトンの重量平均分子量を有するフラグメントを含む。
【００４５】
好ましくは、これらの実施形態において、前記フラグメントは、重量平均で最大１２個のフェニルプロパン単位を含み、より好ましくは、重量平均で最大１１個のフェニルプロパン単位を含む。
【００４６】
３つのフェニルプロパノイドモノマー前駆体の分子量は、クマリルアルコールの１５０Ｄａ、コニフェリルアルコールの１８０Ｄａ、及びシナピルアルコールの２１０Ｄａの間で変化する。したがって、平均重量は１８０Ｄａであり、この値は「フェニルプロパン単位」として使用した。Ｍｗ値を１８０Ｄａで除算し、その結果、重量平均でのフェニルプロパン単位数を得た。
【００４７】
特に好ましい実施形態は、前記リグニン画分が、重量平均分子量が２５０ダルトン〜２，０００ダルトンであり、重量平均で２〜１１個のフェニルプロパン単位を有するフラグメントを含む。
【００４８】
別の実施形態では、リグニン画分は、最大２，０００ダルトンの数平均分子量（Ｍｎ）を有するフラグメントを含む。
【００４９】
本発明の目的のために、リグニン画分中のフラグメントの数平均分子量（Ｍｎ）は、サイズ排除クロマトグラフィーによって測定される。好ましくは、リグニン画分は、最大１，５００ダルトンの数平均分子量（Ｍｎ）を有するフラグメントを含む。
【００５０】
好ましい実施形態では、前記リグニン画分は、１５０ダルトン〜１，０００ダルトンの数平均分子量を有するフラグメントを含む。
【００５１】
いかなる理論にも縛られることを望まず、数平均分子量が低いほど活性分子が多いと考えられる。これは、分子量が低いほどフラグメントが小さいことを意味し、フラグメントが小さいほど架橋／短鎖フラグメントが少ないことを意味し、そして、架橋／短鎖フラグメントが少ないほどその上にある遊離官能基の数が多いことを意味し、より反応性の高いフラグメントが多いことを考慮して提唱される。
【００５２】
さらに、より小さな分子は病原体の細胞膜を通過しやすく、そこに拡散しやすいため、リグニン画分の全体的な効果を顕著に向上できると考えらる。
【００５３】
好ましくは、これらの実施形態において、前記フラグメントは、数平均で最大１１個のフェニルプロパン単位を含み、より好ましくは、数平均で最大８個のフェニルプロパン単位を含む。
【００５４】
３つのフェニルプロパノイドモノマー前駆体の分子量は、クマリルアルコールの１５０Ｄａ、コニフェリルアルコールの１８０Ｄａ、及びシナピルアルコールの２１０Ｄａの間で変化する。したがって、平均重量は１８０Ｄａであり、この値は「フェニルプロパン単位」として使用した。Ｍｎ値を１８０Ｄａで除算し、その結果、数平均でのフェニルプロパン単位数を得た。
【００５５】
好ましい実施形態では、前記リグニン画分は、１５０ダルトン〜２，５００ダルトンの重量平均分子量（Ｍｗ）を有するフラグメントと、最大２，０００ダルトンの数平均分子量（Ｍｎ）を有するフラグメントを含む。
【００５６】
より好ましくは、前記リグニン画分は、重量平均分子量（Ｍｗ）が１５０ダルトン〜２，５００ダルトン、重量平均で２〜１３個のフェニルプロパン単位を有するフラグメントと、数平均分子量（Ｍｎ）が最大２，０００ダルトン、数平均で最大１１個のフェニルプロパン単位を有するフラグメントを含む。
【００５７】
さらなる実施形態では、リグニン画分は、１．２５〜６の多分散指数（ＰＤＩ）を有する。
【００５８】
多分散指数（ＰＤＩ）もしくは不均一指数、又は単に分散性は、特定のポリマーサンプル中の分子量の分布の程度である。ＰＤＩは、重量平均分子量（Ｍｗ）を数平均分子量（Ｍｎ）で割った値である。これは、ポリマーのバッチ内の個々の分子量の分布を示す。
【００５９】
特に好ましい実施形態では、前記リグニン画分が、１５０ダルトン〜２，５００ダルトンの重量平均分子量（Ｍｗ）と、重量平均で２〜１３個のフェニルプロパン単位を有するフラグメントを含み、前記リグニン画分は、１．２５〜６の多分散指数を有する。
【００６０】
また特に好ましい実施形態では、前記リグニン画分が、最大２，０００ダルトンの数平均分子量（Ｍｎ）と、数平均で最大１１個のフェニルプロパン単位を有するフラグメントを含み、前記リグニン画分は、１．２５〜６の多分散指数を有する。
【００６１】
最も好ましい実施形態では、前記リグニン画分が、１５０ダルトン〜２，５００ダルトンの重量平均分子量（Ｍｗ）及び重量平均で２〜１３個のフェニルプロパン単位、最大２，０００ダルトンの数平均分子量（Ｍｎ）及び数平均で最大１１個のフェニルプロパン単位を有するフラグメントを含み、前記リグニン画分が１．２５〜６の多分散指数を有する。
【００６２】
本発明の特に好ましい実施形態において、前記リグニン画分は、８００ダルトン〜１，５００ダルトンの重量平均分子量（Ｍｗ）、重量平均で４〜８個のフェニルプロパン単位、３００ダルトン〜７００ダルトンの数平均分子量（Ｍｎ）、数平均で２〜４個のフェニルプロパン単位を有するフラグメントを含む。これらの特に好ましい実施形態では、前記リグニン画分において、最も豊富なフェニルプロパン単位はコニフェリルアルコール由来のものであり、一方、より少ないフェニルプロパン単位はシナピルアルコール由来のものである。
【００６３】
前記リグニン画分は、固体形態又は液体形態であってもよい。
【００６４】
リグニン画分が固体形態である場合、前記固体形態は、錠剤、ミニ錠剤、マイクロ錠剤、顆粒剤、微粒剤、ペレット、多粒子剤、微粒化粒子又は粉末とすることができる。
【００６５】
リグニン画分が液体形態である場合、前記液体形態は溶媒溶液である。
【００６６】
適切な溶媒は、水、グリコール、アルコール、多価アルコール、有機酸、及びそれらの組み合わせである。
【００６７】
好ましい溶媒は、水、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、アリルアルコール、１，２−プロピレングリコール、１，３−プロピレングリコール、１，２−エチレングリコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、グリセロール、乳酸、ポリ乳酸、及びそれらの混合物である。
【００６８】
より好ましい溶媒は、水、１，２−プロピレングリコール、１，３−プロピレングリコール、１，２−エチレングリコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びそれらの混合物である。
【００６９】
最も好ましい実施形態では、溶媒は水である。
【００７０】
好ましくは、前記リグニン画分が液体形態である場合、前記液体形態は、ｐＨが８〜１１であり、より好ましくは９．５〜１０．５である。
【００７１】
好ましい実施形態では、リグニン画分は、動物飼料１トン当たり最大１０ｋｇ、より好ましくは動物飼料１トン当たり１〜５ｋｇの量で使用される。
【００７２】
さらなる態様において、また本発明は、上述の通り使用するためのリグニン画分を含む食品用サプリメント、及び好適な食品担体に関する。
前記食品用サプリメントは、固体形態又は液体形態であってもよい。
【００７３】
食品用サプリメントが固体形態である場合、前記固体形態は、錠剤、ミニ錠剤、マイクロ錠剤、顆粒剤、微粒剤、ペレット、多粒子剤、微粒化粒子又は粉末とすることができる。
【００７４】
食品用サプリメントが固体形態である場合、前記固体形態は、最大９９ｗｔ％のリグニン画分を含み、好ましくは、５〜９０ｗｔ％のリグニン画分を含む。
【００７５】
食品用サプリメントが液体形態である場合、前記液体形態は、溶液、乳剤、分散液、懸濁液、ゲル、滴下液又はスプレーとすることができる。
【００７６】
食品用サプリメントが液体形態である場合、前記液体形態は、最大５０ｗｔ％のリグニン画分を含み、好ましくは０．１〜２５ｗｔ％のリグニン画分を含む。これは、組成物は、使用前に必要に応じて水で適切に希釈するか、又は動物飼料と直接混合できる濃縮物であることを意味する。
【００７７】
好適な担体としては、酸性化剤、酸性中和剤、凝集防止剤、酸化防止剤、充填剤、抵抗剤、ゲル化剤、コーティング剤、変性澱粉、封鎖剤、増粘剤、甘味料、シンナー、溶剤、解離剤、滑剤、染料、結合剤、潤滑剤、安定化剤、吸着剤、防腐剤、湿潤剤、香料、被膜形成物質、乳化剤、湿潤剤、離型剤及びそれらの混合物が挙げられる。
【００７８】
好ましい実施形態では、さらに食品用サプリメントは、サイズ排除クロマトグラフィーによって測定された重量平均分子量が、３，５００〜５，５００ダルトンであるフラグメントを含むリグニン画分を含み、前記フラグメントは重量平均で最大４０個のフェニルプロパン単位を含む。好ましくは、さらに食品用サプリメントは、サイズ排除クロマトグラフィーによって測定された重量平均分子量が４，０００〜５，０００ダルトンであるフラグメントを含むリグニン画分を含み、前記フラグメントは重量平均で最大３５個のフェニルプロパン単位を含む。
【００７９】
別の好ましい実施形態では、さらに食品用サプリメントは、少なくとも１つの樹脂酸を含む。好ましくは、前記樹脂酸は、アビエチン酸、デヒドロアビエチン酸、パルストリン酸、ネオアビエチン酸、ピマル酸、イソピマル酸、サンダロピマル酸、又はそれらのエステル、又はそれらのエーテル、又はそれらのアルカリもしくはアルカリ土類塩、又はそれらの混合物である。
【００８０】
好ましくは、食品用サプリメントは、前記少なくとも１つの樹脂酸を、食品用サプリメントの重量に対して最大１０重量％、より好ましくは最大７重量％含有する。
【００８１】
樹脂酸は針葉樹に存在し、樹脂酸製品には３つの主な種類がある。すなわち、トール油ロジン（Ｔａｌｌ  Ｏｉｌ  Ｒｏｓｉｎ）（ＴＯＲ）、ウッドロジン（Ｗｏｏｄ  Ｒｏｓｉｎ）、ガムロジン（ＧＵＭ  Ｒｏｓｉｎ）である。ＴＯＲは、パルプの製造によって生成される粗トール油（ＣＴＯ）から真空蒸留によって分離された樹脂酸画分である。ＣＴＯは、粗トール油石鹸（Ｃｒｕｄｅ  Ｔａｌｌ  Ｏｉｌ  Ｓｏａｐ）又は粗硫酸石鹸（Ｃｒｕｄｅ  Ｓｕｌｐｈａｔｅ  Ｓｏａｐ）（ＴＯＳ）の酸性化によって得られる。ＴＯＳは、パルプ製造プロセスで、ブラックリキュールと呼ばれることが多いパルプミル中の調理液（ｃｏｏｋｉｎｇ  ｌｉｑｕｉｄ）から分離される。ウッドロジンは枯れ木、木の切り株、枝等から水蒸気蒸留又は他の手段で分離された画分であり、ガムロジンは、タップと呼ばれることが多い生きた木からの採取による樹脂から、水蒸気蒸留された、又は他の手段で分離された樹脂画分である。
【００８２】
樹脂酸を含有し、粗トール油から真空蒸留により得られる物質としては、蒸留トール油（ＤＴＯ）、トール油脂肪酸（ＴＯＦＡ）、トール油ピッチ（ＴＯＰ）が挙げられる。ＤＴＯは、樹脂酸を１０〜４０％含有する。ＣＴＯは通常１５〜７０％の樹脂酸を含み、樹脂酸の含有量が最も少ないものは、一般に混合木材パルプの調理（ｃｏｏｋｉｎｇ）によって提供される。
【００８３】
用語「トール油ロジン」又は「ＴＯＲ」は、粗トール油の蒸留及び蒸留したトール油のさらなる精製によって得られる組成物を指すと理解されるべきである。ＴＯＲは通常、６０〜９９％（ｗ／ｗ）の樹脂酸を含む。
【００８４】
用語「ウッドロジン」は、枯れ木、木の切り株、枝等から蒸留又は他の手段で得られる組成物を指すと理解されるべきである。ウッドロジンは通常、５０〜９９％（ｗ／ｗ）の樹脂酸を含む。
【００８５】
用語「ガムロジン」は、生きた木から採取された樹脂から、蒸留又は他の手段による分離で得られる組成物を指すと理解されるべきである。ガムロジンは通常、５０〜９９％（ｗ／ｗ）の樹脂酸を含む。
【００８６】
用語「蒸留トール油」又は「ＤＴＯ」は、粗トール油の蒸留及び蒸留されたトール油のさらなる精製によって得られる組成物を指すと理解されるべきである。ＤＴＯは通常、１０〜６０％（ｗ／ｗ）の樹脂酸を含む。
【００８７】
また樹脂酸ベースの組成物ＴＯＲ、ウッドロジン、ガムロジン、ＣＴＯ、ＴＯＳ及びＤＴＯは、１つ以上の樹脂酸組成物と１つ以上の脂肪酸組成物を油又は脂肪の形態で混合することによって製造することができる。製造される樹脂酸誘導体は、例えば、エステル、エーテル又はアルカリ金属塩である。
【００８８】
樹脂酸は、抗菌性、抗炎症性、抗酸化性、抗菌バイオフィルム性等の多くの特性を示すことが知られている。しかし、樹脂酸は、酸化、自然発火及びパッキングに曝されるため、特に固体形態では、経時安定性に劣る。
【００８９】
驚くべきことに、前記少なくとも１つの樹脂酸を本発明のリグニン画分と混合すると、固体又は液体のいずれかで得られた混合物は、経時的に非常に安定であり、酸化されないため、樹脂酸の特性の利益を十分に得ることが可能であることが判明した。これは、本発明のリグニン画分を含む得られた食品用サプリメントにおいて、樹脂酸が分解から保護されるだけでなく、リグニン画分と樹脂酸の間の相乗的な抗炎症効果が認められることを意味する。
【００９０】
また食品用サプリメントは、Ｃ１２〜Ｃ２４脂肪酸の少なくとも１つのアルカリもしくはアルカリ土類塩、少なくとも１つの脂肪油、又はそれらの混合物をさらに含むことができる。これらの脂肪油又は塩は、液体形態の食品用サプリメントが好ましい場合には、樹脂酸のより良好な可溶化を可能にする。
【００９１】
好ましくは、前記アルカリもしくはアルカリ土類の塩は、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムの塩又はそれらの混合物である。
【００９２】
好ましくは、前記Ｃ１２〜Ｃ２４脂肪酸は、ラウリン酸（Ｃ１２）、トリデシル酸（Ｃ１３）、ミリスチン酸（Ｃ１４）、ペンタデシル酸（Ｃ１５）、パルミチン酸（Ｃ１６）、マルガリン酸（Ｃ１７）、ステアリン酸（Ｃ１８）、オレイン酸（Ｃ１８：１）、リノール酸（Ｃ１８：２）、α−リノレン酸（Ｃ１８：３）、γ−リノレン酸（Ｃ１８：３）、ノナデシル酸（Ｃ１９）、アラキジン酸（Ｃ２０）、ヘンエイコサン酸（Ｃ２１）、ベヘン酸（Ｃ２２）、トリコシル酸（Ｃ２３）、リグノセリン酸（Ｃ２４）、ステアリドン酸（Ｃ１８：４）、エイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５）、ドコサヘキサエン酸（Ｃ２２：６）、ジホモ−γ−リノレン酸（Ｃ２０：３）、アラキドン酸（Ｃ２０：４）、アドレン酸（Ｃ２２：４）、パルミトレイン酸（Ｃ（Ｃ１６：１）、バクセン酸（Ｃ１８：１）、パウリン酸（Ｃ２０：１）、エライジン酸（Ｃトランス−１８：１）、ゴンド酸（Ｃ２０：１）、エルカ酸（Ｃ２２：１）、ネルボン酸（Ｃ２４：１）、ミード酸（２０：３）、又はそれらの混合物である。
【００９３】
好ましい実施形態では、前記Ｃ１２〜Ｃ２４脂肪酸の少なくとも１つのアルカリもしくはアルカリ土類塩は、パルミチン酸カルシウム、ラウリン酸カルシウム、オレイン酸カルシウム、パーム油のカルシウム石鹸、又はそれらの混合物である。
【００９４】
好ましくは、前記少なくとも１つの脂肪油は、ヘンプ油、キャノーラ油、ヒマワリ油、オリーブ油、コーン油、パーム油、ヤシ油、パイン油、綿実油、小麦胚芽油、大豆油（ｓｏｙａ  ｏｉｌ）、サフラワー油、亜麻仁油、キリ油、ヒマシ油、大豆油（ｓｏｙｂｅａｎ  ｏｉｌ）、落花生油、菜種油、ゴマ種子油、米胚芽油、魚油、鯨油、マリン油（ｍａｒｉｎｅ  ｏｉｌ）又はそれらの混合物である。
【００９５】
好ましくは、食品用サプリメントは、前記Ｃ１２〜Ｃ２４脂肪酸の前記少なくとも１つのアルカリもしくはアルカリ土類塩、少なくとも１つの脂肪油、又はその混合物を、前記食品用サプリメント１トン当たり１〜１００ｋｇの濃度で含有する。
【００９６】
別の態様において、本発明は、家畜から得られる食肉の品質及び品質保持期間を改善するための、家畜の給餌に使用するための食品用サプリメントに関する。特に、本発明は、家畜から得られる食肉の品質及び品質保持期間の改善に有効な量で前記食品用サプリメントが投与される、家畜の給餌に使用するための食品用サプリメントに関する。
【００９７】
本発明における「家畜」なる用語は、反芻動物及び非反芻動物の両方を含むことを意味する。反芻動物は４室の胃を持つ草食性哺乳動物であり、この複雑な胃の中で、そうしなければ消化されない植物性物質を発酵させて消化し、反芻する。（半消化された植物性物質のボールを咳をして戻し、それを再度噛み砕いて、再び飲み込む）。反芻動物には、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカ、カモシカ、キリン及びラクダ、並びに、バイソン、ジャコウウシ、オカピ、ラマ等の近縁の動物が含まれる。偽反芻動物を含む非反芻動物としては、ブタ、ウマ、ニワトリ、ウサギ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジ、ヤマウズラ、及び、魚貝を挙げることができる。これは、有利には、本発明の食品用サプリメントは魚貝の給餌、すなわち水産養殖においても使用できることを意味する。
【００９８】
驚くべきことに、本発明の食品用サプリメントを与えられた家畜は、時間の経過とともに赤味や黄色味を失うという食肉の自然な傾向が予想外に顕著に減少し、同時に食肉の品質保持期間と鮮度が劇的に向上する（すなわち、最長7日以上）ため、優れた品質の食肉を提供することが観察された。いかなる理論にも縛られることを望まず、上記の報告された抗病原性特性に加えて、本発明のリグニン画分の非常に効果的な抗酸化特性は、食肉の表面の酸化プロセスを阻害し、それによって色の変化を打ち消し、食肉の鮮度と可食性をより長い期間保存することを可能にしていると考えられる。
【００９９】
色は、食肉業界や食肉科学研究の品質指標として一般的に使用されている重要な要素である。消費者は変色を鮮度と食料の保健上の健全性（ｗｈｏｌｅｓｏｍｅｎｅｓｓ）の欠如を示すものとして利用するため、色は食肉の品質特性の中で最も重要なものの一つであり、購買決定に大きく影響すると報告されている。消費者が知覚する品質は必ずしも客観的な品質と一致するとは限らないが、いずれにしても生鮮食肉市場に大きな経済的損失をもたらす可能性がある。また色は、褐色ではなく赤色である食肉を購入することを好む消費者に品質を示すものであり、業界は望ましくない色のために損失を出すため、経済的な観点からも重要である。以下の実施例で示される通り、本発明の食品用サプリメントは、新鮮な食肉の赤味と黄色味の非常に満足度の高いレベルを長期間維持することを可能にする。
【０１００】
さらなる態様において、本発明は、雌家畜から得られる乳の生産及び品質を改善するための、雌家畜の給餌における使用のための食品用サプリメントに関する。特に、本発明は、前記食品用サプリメントが雌家畜から得られる乳生産量及び品質を改善するために有効な量で投与される、雌家畜の給餌における使用のための食品用サプリメントに関する。
【０１０１】
驚くべきことに、本発明の食品用サプリメントを与えられた雌家畜は、以下の実施例に示す通り、より優れた品質の乳を、１日当たりより多くの量で提供することが観察された。実際、泌乳牛への食品用サプリメントの投与の効果は、生産された乳量と品質に関する以下の観察結果に基づいて、いくつかの事象と時系列で明らかである：
−  乳中の総ポリフェノール濃度の増加；
−  動物当たりの毎日の乳生産量の増加；
−  急性期における体細胞数の減少；
−  フリーラジカル（ＴＥＡＣ）の吸収能力の増加。
【０１０２】
上記の結果は、総ポリフェノール濃度のピークが約２５０％、乳生産量全体の増加が＋２０．８％、体細胞数の減少が−３１％、ＴＥＡＣの増加が＋３３％と非常に有意である。
【０１０３】
また、これらの成果は、処理の１５〜１７日目近辺に最大値が集中し、特定の同調を示すことに留意すべきである。
【０１０４】
また、本発明に従った補給は、中止後少なくとも２週間、その有益性を引き伸ばす状態を作り出したことも分かった。有益な効果は、約２０日後に薄れ始め、それは乳中の体細胞の再増加によって証明される。
【０１０５】
通常牛乳は微量のポリフェノールしか含まないので、本発明の食品用サプリメントを与えられた乳牛から得られた乳が、予想外に最大４６０ｍｇ／ｌのポリフェノールを含むことを非常に高く評価すべきである。ポリフェノールのヒトの必要量が８２０ｍｇ／ｄｉｅであり、ヒトの牛乳の摂取量が平均で２５０ｍｌ／ｄｉｅであることを考慮すると、本発明の乳によって与えられるポリフェノールの寄与は、言われているように通常これがゼロに近い場合、１１４ｍｇである。
【０１０６】
さらなる態様において、本発明は、家畜の繁殖力を改善するための、家畜の給餌に使用するための食品用サプリメントに関する。特に、本発明は、前記食品用サプリメントが、家畜の繁殖力を改善するのに有効な量で投与される、家畜の給餌に使用するための食品用サプリメントに関する。
【０１０７】
驚くべきことに、本発明の食品用サプリメントを与えられた家畜は、雄家畜及び雌家畜の両方について出産率の有意な上昇が認められた。
【０１０８】
特に、乳牛等の雌家畜では、受精後の受胎率（少なくとも＋１５％）と生殖寿命の点で繁殖力が向上するのに対し、雄牛や水牛等の雄家畜では、精液の質、生殖パラメータ、生殖寿命の点で繁殖力が向上する。
【０１０９】
さらなる態様では、本発明は、消化効率又は反芻を損なうことなく、メタン排出量を低減するための、家畜の給餌における使用のための食品用サプリメントに関する。特に、本発明は、前記食品用サプリメントが、消化効率又は反芻を損なうことなく、メタン排出量の低減に有効な量で投与される、家畜の給餌に使用するための食品用サプリメントに関する。
【０１１０】
家畜からの温室効果ガスであるメタンの排出量は、これまで考えられていたよりも多く、地球温暖化を抑制するための戦いにおいて、さらなる課題をもたらしている。畜牛１頭当たりが生成するメタンの修正された計算値は、２０１１年の世界の家畜の排出量が国連の気候変動に関する政府間パネル（ＩＰＣＣ）のデータに基づく推定値よりも１１％多いことを示す。泥炭地、湿地、シロアリ等の自然発生源に加えて、ヒトの活動によるメタン（全体の約３分の２を占めている）は、２つの方法で生成される：石炭、石油、特に天然ガスの生産と輸送中に無臭で無色のガスが漏れる；及び、ほぼ同じ程度で、畜牛やヒツジ等の反芻動物のげっぷや曖気、及び、特に埋め立て地の有機廃棄物の腐敗から生成される。ＩＰＣＣによると、２０１５年の世界の温室効果ガス排出量の約１６％をメタンが占めている。メタンは温室効果ガスとしてはＣＯ２よりもはるかに強力であり、太陽の放射力をより多く取り込むが、大気中での持続時間は短い。それを考慮に入れて、科学者は、ガスの「地球温暖化係数」が、１００年の期間にわたって二酸化炭素の２８倍大きいと計算する。家畜からのメタン排出量は、急速に発展しているアジア、ラテンアメリカ、アフリカの地域で最も急激に増加していることが指摘された。対照的に、米国とカナダでは増加が急激に鈍化している。
【０１１１】
したがって、反芻家畜からのメタンの全体的な生産量を減少させる可能性が非常に高く評価され、同時に、以下の実施例で示される通り、本発明のリグニン画分が、消化効率又は反芻を損なうことなくこの目的を達成できるという事実は、非常に予想外であった。
【０１１２】
好ましくは、食品用サプリメントは、本発明のリグニン画分を最大１００ｇ、より好ましくは本発明のリグニン画分を２０〜８０ｇ含む１日投与量で反芻動物に投与される。
【０１１３】
また、本発明のリグニン画分の使用と食品用サプリメントの使用の好ましい態様のすべての組み合わせ、及び上記で報告されたその使用は、本明細書中に開示されたものとみなされると理解されるべきである。
【０１１４】
本発明のリグニン画分の使用、食品用サプリメント、及び上記に開示されたそれぞれの使用の好ましい態様のすべての組み合わせは、本明細書に記載されていると理解されるべきである。
【０１１５】
以下は、例示の目的で提供される本発明の実施例である。
【実施例】
【０１１６】
本実施例におけるＭｗ及びＭｎは、以下の手順に従ってサイズ排除クロマトグラフィーにより測定した。
【０１１７】
試薬及び材料
−  溶離液：０．１Ｍ  ＮａＯＨ；流量０．５ｍｌ／ｍｉｎ
−  ＲＩ検出器の校正：プルラン標準品；Ｍｐ：１００，０００〜１，０８０（６標準）（Ｍｐはピーク最大分子量）
−  紫外線検出器（２８０ｎｍ）の校正：ＰＳＳ標準；ポリスチレンスルホン酸ナトリウム塩；Ｍｐ  ６５，４００〜８９１（６標準）；標準物質は超純水に溶解し、濃度は約５ｍｇ／ｍｌとする。注入量は２０μｌ。
−品質管理サンプル：Ｍｗ分布が既知のリグニンを使用する。
【０１１８】
設備及び機器
−  Ｄｉｏｎｅｘ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００  オートサンプラー、カラムコンパートメント及びポンプ
−  Ｄｉｏｎｅｘ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００  ダイオードアレイ検出器
−  示差屈折率検出器：Ｓｈｏｄｅｘ  ＲＩ−１０１
−  カラム：ＰＳＳ  ＭＣＸカラム：プレカラム及び２つの分析カラム：１０００Å及び１０００００Å；カラム材質はスルホン化ジビニルベンゼン共重合体マトリックス。
−  シリンジフィルター０．４５μｍ及びＳＴＤサンプル用のガラス製サンプルボトル。
サンプル濾過：Ｍｉｎｉ−Ｕｎｉｐｒｅｐシリンジレスフィルター装置ＰＴＦＥ又はナイロン；０．４５μｍ。必要に応じて、予備濾過用の５μｍシリンジフィルター
−  測定ボトル
【０１１９】
手順
−  溶離液の調製
理想的には、溶離液の調製に使用する水は、溶存二酸化炭素をできるだけ含まない低抵抗率の高品質の脱イオン水（１８ＭΩ●ｃｍ又はより良いもの）である。水には、生物学的汚染（細菌やカビ等）や粒子状物質が含まれていないことが必要である。溶離液を調製するために使用する水は、できるだけ溶存二酸化炭素を含まない低抵抗の高品質の脱イオン水（１８ＭΩｃｍ以上）が理想的である。水は、生物学的汚染（細菌及びカビ等）や粒子状物質を含んでいてはならない。
−  １０％ＭｅＯＨ／水を用いたニードル洗浄
【０１２０】
−  液体サンプル
強アルカリ溶液サンプルを１：１００に希釈し、ＰＴＦＥシリンジフィルター（０．４５μｍ）で濾過してバイアルに入れる。固体リグニンサンプルを０．１Ｍ  ＮａＯＨに希釈及び溶解し、ＰＴＦＥシリンジフィルター０．４５μｍで濾過する。準備されたサンプルをオートサンプラーに投入する。注入量は２０μｌである。サンプルの後、カラムを洗浄するために１Ｍ  ＮａＯＨをサンプルとして注入する。
【０１２１】
機器パラメーター
−  流量  ０．５  ｍｌ／ｍｉｎ
−  溶離液  ０．１Ｍ  ＮａＯＨ
−  カラムオーブン温度  ３０℃
−  イソクラティック溶離
−  実行時間  ４８分
【０１２２】
−  固体サンプル
固体試料（リグニン）は、必要に応じて６０℃のオーブンで一晩乾燥させる。約１０ｍｇを１０ｍｌの測定ボトルに秤量する。サンプルを０．１Ｍ  ＮａＯＨ溶液に溶解及び希釈し、マークに充填する。サンプルをＰＴＦＥ、０．４５μｍフィルターで濾過する。サンプルが適切に溶解しない場合は、超音波水浴に入れるか、５μｍシリンジフィルターで濾過することができる。
【０１２３】
−  キャリブレーション用標準試料
各標準品約５０ｍｇを１０ｍｌの測定ボトルに秤量し、超純水を加えてマークに充填する。標準品はＰＴＦＥ、０．４５μｍシリンジフィルターで濾過する。キャリブレーションサンプルの実行後、キャリブレーション結果は処理メソッドに統合されて処理され、保存される。キャリブレーションは線形１次キャリブレーションである。
【０１２４】
−  品質管理サンプル
リグニンサンプルは、品質管理サンプルとしてＭｗ分布が既知のリグニンを使用する。リグニンは０．１Ｍ  ＮａＯＨに溶解し、濃度は約１ｍｇ／ｍｌとする。
【０１２５】
実施例１．
ブナ材（Ｆａｇｕｓ  ｓｙｌｖａｔｉｃａ）から得られたオルガノソルブリグニンを塩基触媒解重合（「ＢＣＤ」）で処理した。ＢＣＤプロセスは、２８０℃、２５０バール、ｐＨ１２〜１４で８分間実行した。得られたリグニン生成物は、液体画分と固体画分で構成されていた。
その後、これらの画分を分離した。
【０１２６】
液体リグニン画分は油であり、以下の特性を有していた：
単一種：Ｆａｇｕｓ  ｓｙｌｖａｔｉｃａ
Ｍｗ：１００〜３００  Ｄａ  （１〜２フェニルプロパン単位）
フェノール：０％
グアヤコール：１５〜２０％
シリンゴール：５０〜６０％
カテコール及びメトキシカテコール：５〜１０％
オリゴマー／不明：１５〜３０％
【０１２７】
固形リグニン画分は、以下の特性を有していた：
単一種：Ｆａｇｕｓ  ｓｙｌｖａｔｉｃａ
Ｍｗ：８００〜１，５００Ｄａ（４〜８フェニルプロパン単位）
Ｍｎ：３００〜７００Ｄａ（２〜４フェニルプロパン単位）
ＯＨ基の構造：
脂肪族  ０．２〜０．４ｍｍｏｌ／ｇ
カルボン酸  ０．３〜０．５ｍｍｏｌ／ｇ
縮合及びシリンギル  １．０〜２．０ｍｍｏｌ／ｇ
グアヤシル  ０．４ｍｍｏｌ／ｇ
カテコール及びｐ−ＯＨ−フェニル  １．０〜１．８ｍｍｏｌ／ｇ
【０１２８】
実施例１ａ．
５０ｇの上記油状のリグニン画分（５％ｗ／ｗ）を、９５０ｇの１，３−プロピレングリコールと混合し、４０〜５０℃で加温した。
混合物を室温まで冷却し、粘性溶液（以下、「ＬＭＷ１２」と略記する）を得た。
【０１２９】
実施例１ｂ．
１００ｇの上記固体リグニン画分（１０％ｗ／ｗ）を、８００ｇの１，３−プロピレングリコール、及び１００ｇのＮＨ４ＯＨ（３０％溶液）とホットミックスした。
混合物を室温まで冷却し、次いで濾過して黒色の溶液（以下、「ＬＭＷ１１」と略記する）を得た。
【０１３０】
実施例１ｃ．
１００ｇの上記固体リグニン画分（１０％ｗ／ｗ）を、８３５ｇの１，３−プロピレングリコール、及び６５ｇのＫＯＨ（２０％溶液）とホットミックスした。
混合物を室温まで冷却し、次いで濾過して黒色の溶液（以下、「ＬＭＷ１０」と略記する）を得た。
【０１３１】
実施例２．
クラフト黒液から下記リグニン画分が抽出された。前記リグニン画分は以下の特性を有する：
＞全固形分の９５％
単一種：サザンパイン
Ｍｗ：４４００〜５０００Ｄａ（２４〜２８フェニルプロパン単位）
Ｍｎ：１２００〜１３００Ｄａ（６〜７フェニルプロパン単位）
ＯＨ基の構造：
脂肪族  ２．１ｍｍｏｌ／ｇ
カルボン酸  ０．５ｍｍｏｌ／ｇ
縮合及びシリンギル  １．７ｍｍｏｌ／ｇ
グアヤシル  ２．０ｍｍｏｌ／ｇ
カテコール及びｐ−ＯＨ−フェニル  ４．０ｍｍｏｌ／ｇ
【０１３２】
実施例２ａ．
１００ｇの上記リグニン画分（１０％ｗ／ｗ）を、８４０ｇの１，３−プロピレングリコール、及び６０ｇのＮＨ４ＯＨ（３０％溶液）とホットミックスした。
混合物を室温まで冷却し、次いで濾過して黒色の溶液（以下、「ＯＸ１１」と略記する）を得た。
【０１３３】
実施例２ｂ．
１００ｇの上記リグニン画分（１０％ｗ／ｗ）を、８４０ｇの１，３−プロピレングリコール、及び６０ｇのＮａＯＨ（３０％溶液）とホットミックスした。
混合物を室温まで冷却し、次いで濾過して黒色の溶液（以下、「ＯＸ１０」と略記する）を得た。
【０１３４】
実施例３．
実施例１の生成物の抗菌活性を、微量液体希釈法（ＣＬＳＩプロトコル−Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を用いた抗微生物薬感受性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験により評価した。４つの生成物（ブランク、ＬＭＷ１２、ＬＭＷ１１、ＬＭＷ１０）の最小阻害濃度（ＭＩＣ）を、マルチウェルプレート中で測定した。ブランクは１，３−プロピレングリコールのみである。
下記の微生物（細菌及び真菌）について、生成物の抗菌活性を試験した：
【０１３５】
特定のスクリーニング・生物制御
細菌
−  大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）
−  緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）
−  黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）
−  サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｄｉｔｉｓ）
−  カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）
真菌
−  カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）
【０１３６】
結果
化合物はそのままで、ｐＨを７及び８に調整した後に試験した。
すべての試験を３回繰り返して実施し、非常に類似した阻害結果が得られた。
結果を以下の表にまとめる。
【０１３７】
【表１】
2021507885.tif 000005
【０１３８】
【表２】
2021507885.tif 000006
【０１３９】
実施例４．最小阻害濃度の決定
５種類のプロバイオティクス微生物に対する実施例１ｂのリグニン画分の最小阻害濃度（ＭＩＣ）を、微量液体希釈法（ＣＬＳＩプロトコル−Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を用いた抗微生物薬感受性試験（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験）により評価した。
【０１４０】
使用した微生物は、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）及びサッカロマイセス・ブラウディ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）であった。
【０１４１】
全ての試験において、セフトリアキソン（細菌用）又はフルコナゾール（酵母用）を用いた抗菌活性の陽性対照を調製した。結果を以下の表にまとめる。サンプルを希釈し、様々な希釈液での増殖（＋）と増殖阻害（−）を評価した。灰色の四角は、増殖阻害が観察される最小濃度（ＭＩＣ）を示す。
【０１４２】
【表３】
2021507885.tif 000007
【０１４３】
【表４】
2021507885.tif 000008
【０１４４】
【表５】
2021507885.tif 000009
【０１４５】
【表６】
2021507885.tif 000010
【０１４６】
【表７】
2021507885.tif 000011
【０１４７】
以上の通り、本発明のリグニン画分は、プロバイオティクス微生物に悪影響を及ぼさないことは明らかである。
【０１４８】
実施例５．プレバイオティクス活性の測定
また実施例１ｂのリグニン画分は、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍに対してプレバイオティクス活性を示した。
実施例１ｂのリグニン画分のプレバイオティクス活性は、プロバイオティクス細菌Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍに対して得られた関連するＭＩＣ未満の濃度で試験した。
【０１４９】
【表８】
2021507885.tif 000012
【０１５０】
プレバイオティクス活性は、実施例１ｂのリグニン画分の存在下で、プロバイオティクス細菌及び腸内細菌（Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｓ．ｔｈｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の増殖を比較した定量式（プレバイオティクス指数）により評価した。
プレバイオティクス指数は、以下の通り算出した：
【０１５１】
【数１】
2021507885.tif 000013
【０１５２】
式中、第１の項がプロバイオティクス細菌の増殖を表し、第２の項が腸内細菌の増殖を表す。
【０１５３】
プレバイオティクス化合物は、増殖を改善するために当該化合物を使用しない腸内細菌に対するのとは反対に、特定のプロバイオティクス細菌の増殖を選択的に増強することができる。結果として、プレバイオティクス指数＞０は、プレバイオティクス活性を示している。
【０１５４】
【表９】
2021507885.tif 000014
【０１５５】
実施例６．肉牛の給餌におけるリグニン画分の使用
実験計画、動物管理、食肉のサンプリングと分析
試験は４０頭の肉牛を対象に、対照群と実験群の２群に無作為に分割して実施した。両群とも同じ飼料比率で、市販の飼料（生体重の２％を基準に計算）と不断給餌の混合乾草を与えた。試験開始前に、すべての動物の体重を測定し、その生体重に応じて、試験開始時に同じ平均生体重を得るために、２つの群に分割した。試験は動物の屠殺前の１２０日間、１２０日間継続した。対照群とは異なり、実験群は、最初の９０日間は動物１頭当たり３５ｇ、次の３０日間は動物１頭当たり７０ｇの量の実施例１ｂのリグニン分画を毎日想定した。
【０１５６】
最終生体重、毎月の体重増加及び食物転換指数を評価するために、毎月すべての動物の体重を測定した。さらに、試験中に、血球数と生化学的プロファイルを評価するために、血液サンプルも収集も採取した。
【０１５７】
動物は、輸送中の動物福祉に関する欧州共同体法（１／２００５ＥＣ）及び商業動物の屠殺のための動物福祉に関する欧州共同体規則（１０９９／２００９ＥＣ）に準拠して、欧州共同体が承認した食肉処理場に輸送し、屠殺した。屠殺直後、屠体は４℃で２４時間保存した。その後、分析のために第１３胸椎と第１８胸椎の間の胸腰最長筋（Ｌｏｎｇｉｓｓｉｍｕｓ  ｔｈｏｒａｃｉｓ  ｅｔ  ｌｕｍｂｏｒｕｍ）（ＬＴＬ）の筋肉のサンプル（各サンプル約４ｋｇ）を採取した。
【０１５８】
各動物の食肉を４℃で保存し、熟成中、３日目、６日目、９日目及び１４日目に比色パラメータを測定した。表面肉色は、ミノルタＣＲ−３００比色計（光源Ｄ６５；ミノルタカメラ株式会社、大阪、日本）を用いて、ＣＩＥ  Ｌ＊、ａ＊、ｂ＊（ＣＩＥ、１９７６）カラーシステムに従って測定した。反射率測定は、直径８ｍｍの読取面を有するＡ−パルスキセノンアークランプを用いて、０°の視野角から収集した。食肉の各サンプルについて、異なる３ポイントで３回の測定を行った。前のものと比較して検出器システムを９０°回転させることによって行われた各ポイントにおける３回の測定値が得られ、これにより１サンプル当たり合計９つの測定値が得られた。比色計は、白のタイトル（Ｌ＊＝９９．２、ａ＊＝１．０、ｂ＊＝１．９）を使用して、Ｈｕｎｔｅｒ−ｌａｂ色空間システムで較正した。ａ＊及びｂ＊値を用いて、Ｄｅ  Ｐａｌｏら（“Ｃｏｌｏｕｒ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｍｅａｔ  ｏｆ  ｆｏａｌｓ  ａｓ  ａｆｆｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ｓｌａｕｇｈｔｅｒｉｎｇ  ａｇｅ  ａｎｄ  ｐｏｓｔ−ｔｈａｗｉｎｇ  ｔｉｍｅ”，２０１２，Ａｓｉａｎ−Ａｕｓｔｒａｌａｓｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２５，１７７５−１７７９）に従って、彩度＝（ａ２＋ｂ２）１／２及び色相（°）＝ｔａｎ−１（ｂ／ａ）を測定した。
【０１５９】
さらに、レオロジーパラメータを測定した。ｐＨは、食肉を容易に貫通する形状のガラス電極を有する携帯用ｐＨメーター（Ｃａｒｌｏ  Ｅｒｂａ  ｐＨ  ７１０；Ｃａｒｌｏ  Ｅｒｂａ  Ｒｅａｇｅｎｔｉ，ミラノ、イタリア）を用いて記録した。各測定の前に、ｐＨメーターは、４及び７のｐＨ値を有する溶液を使用して筋肉温度用に自動的に較正された（Ｃｒｉｓｏｎ，Ｌａｉｎａｔｅ、イタリア）。保水能力（ＷＨＣ）、調理損失及びＷａｒｎｅｒ−Ｂｒａｔｚｌｅｒせん断力（ＷＢＳＦ）は、Ｄｅ  Ｐａｌｏら（“Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｎｕｔｒｉｔｉｖｅ  ｌｅｖｅｌ  ｏｎ  ｃａｒｃａｓｓ  ｔｒａｉｔｓ  ａｎｄ  ｍｅａｔ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ＩＨＤＨ  ｆｏａｌｓ”，２０１４  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ，８５，７８０-７８６）に記載の通り測定した。
【０１６０】
さらに、２４時間にわたる総ガス生産量を評価するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ消化を行った。
【０１６１】
結果
ここでは、食肉の品質、特に比色プロファイル、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ消化ガス生成に関するより興味深い結果が報告されている。
【０１６２】
特に、図１に報告される通り、赤味（赤色度）は２群間で異なることが示された。リグニン分画を与えた肉牛から得られた肉は、１４日目までの全ての熟成期間中、より高い赤味を示した。最近の研究では、食餌が筋肉の色に及ぼす影響は、グリコーゲンの貯蔵、冷蔵率又は抗酸化物質の蓄積の変化のいずれかが原因であと考えられている。これら全ては、最終的には筋肉の基本的な固有の色の特徴に関係する可能性がある。通常、加齢の間、赤味は減少する傾向にあり、下降傾向を示す。これは、実験群の食肉サンプルには当てはまらない。食肉表面の赤味の減少は、ミオグロビン色素の空気への暴露に伴って発生する生化学的現象に起因する。ミオグロビンの酸化は食肉の黒ずみを引き起こす。実験群の場合、動物の飼料による抗酸化物質を仮定することにより、食肉の赤味が高くなり、消費者からの評価も高くなった。
【０１６３】
図２は黄色味（黄色度）の傾向を報告する。対照群の動物はこの指標の低下傾向を示したが、抗酸化剤を想定した動物は加齢中にその値に変化がなく、安定した黄色味を示した。黄色味は筋肉内脂肪の量と質と密接に関連している。想定した飼料が同じで、屠殺時の体重増加と生体重が似ていることを考慮し、食肉の化学組成が似ていることを考慮すると、筋肉内脂肪量の差は２つの群の間では観察されなかった。そうではなく、これらの違いは、異なる脂肪酸プロファイルを持つ異なる筋肉内脂肪の質に起因する可能性がある。実際、黄色味の安定性の違いは、おそらく細胞間隙の脂質分解酵素の放出に続く脂質酸化プロセスの進行と、繊維内の酸化還元活性に起因している可能性がある。
【０１６４】
図３は、第一胃液のｉｎ  ｖｉｔｒｏ消化の２４時間の総ガス生成量（ｍｌ）を報告する。実験群の動物はすべての時間でガス生成量が低く、対照群の３５４５ｍｌに比べて２８６４ｍｌの生成量を示した。すなわち、約２０％の驚くべきガスの減少を示した。別の研究では、乳牛の飼料に使用される一部の酸化防止剤が、微生物の複製を減少させ、消化活動を低下させることが示されている。このことから、第一胃内での消化活動が低下し、乳と食肉の両方の生産量が低下することになる。実験群の場合、屠殺時の生体重、毎月の体重増加及びドレッシング率（ｄｒｅｓｓｉｎｇ  ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ）は群間で変化していないことを考慮すると、ガス生成量の低下は意外にも食肉の生産量の低下にはつながらなかった。この理由から、揮発性脂肪酸が減少することで、食肉及び生体重の転換率が低下するはずであることを考慮すると、生成が低下したガスはメタンガスの可能性があると考えられる。
【０１６５】
実施例７．家畜の繁殖力の評価及び本発明のリグニン画分を与えられた乳牛から得られる乳の品質の評価
本試験の目的は、実施例１ｂのリグニン画分を用いて、乳牛群の健康を向上させ、経済的パフォーマンスを向上させ、乳質を向上させることであった。
試験期間：２８日間；乳牛１頭につき１日３０グラムを投与
【０１６６】
試験サンプルの説明：
ホルスタイン牛（Ｆｒｉｅｓｉａｎ）群は、平均８５頭の搾乳中の乳牛、２０頭の乾乳牛及び関連する企業復帰によって構成された。
【０１６７】
乳牛は、内側と外側が天蓋構造で覆われた藁の寝台で作られた快適な構造の中で、安定した状態にあった。
【０１６８】
乾乳牛は、休息及び分娩エリアの藁敷、歩行用の中央パドック及び飼料ゾーン用の屋根付きシェルターに隣接した常設施設で飼育された。
【０１６９】
すべてのエリアには、休息と飼い葉桶へのアクセスのための十分なスペースが用意されている。
適切な選択につながる遺伝学に配慮をしている会社は、衣類の寿命と牛乳の品質の向上を目的とする。
【０１７０】
単一群のユニフィード（ｕｎｉｆｅｅｄ）：
−  トウモロコシサイレージ；
−  ルーサン乾草（購入）；
−  コーンフラワー；
−  永久牧草地の干し草；
−  大豆、コア；
−  サプリメントとタンポン。
【０１７１】
２０１４年の生産量：１頭あたり１１４トンの牛乳（ＡＩＡデータソース）。
【０１７２】
試験開始時のウシ群の健康状態：
ウシ群は、非常に長い暖かい期間、雨が降らない約５０〜６０日、非常に高温、そして特に湿度が高いことを特徴とする非常に厳しい夏由来である。すべての可能な環境調整システムを実装しているが、結果として、乳牛は様々な嚥下低下を訴えた：
−  乳の総生産量の減少；
−  乳中のカゼイン及び脂肪の減少；
−  跛行の存在感の増大；
−  細胞数の漸進的な増加、ピーク時には５７７，０００個に達した；
−  乳牛の繁殖力：発情の顕示が難しく、受胎率が低いというマイナスの影響。
【０１７３】
備考：
試行：授乳期に平均７７頭のウシ群を全肉牛群と統合した。
授乳期間全体の平均日数は、１８０日から１８５日の間で変動した。
試験開始時、ウシ群の健康状態は最適ではなかった：
−  一部の畜牛はインフルエンザにかかったばかりで、下痢と食欲減退を特徴とした；
−  ７頭の乳牛は、中程度の重症度の跛行を有する。
【０１７４】
混合ユニフィード中へのリグニン画分の段階的な導入には問題はなく、１週目以降、摂取量は徐々に増加し、安定した。
【０１７５】
結果：足病医が認定した通り、インフルエンザによる倦怠感を訴え、跛行であったそれらの動物は迅速に回復した。
【０１７６】
摂取量が増加すると、すぐに乳生産量が増加し、動物の体調も向上した。
【０１７７】
体細胞数（ＳＣＣ）は、酪農家が品質データを課したいずれかの農家によって、常に会社でモニターした。最初の２４０，０００／２５５，０００細胞は、第２週目に１２０，０００に低下し、試験が終了するまで、安定して約１４０，０００／１５０，０００細胞に達した。
【０１７８】
迅速：乳中の脂肪とカゼインの再調整により、会社にとってより適切な値に戻った。
ウシ群の一般的な健康状態の向上。
全般的な繁殖力の向上。
【０１７９】
乳生産量の成績：
−  乳生産量は、０日目の２７．８３  ｌ／頭から始まり、３５日目には最大値の３３．４１  ｌ／頭に達した。
−  リグニン分画の投与開始から３５日目に記録された一日の一頭当たり生産量の増加率は、最初の一頭当たり生産量と比較して＋２０．０８％であった。
−  全体として、生産量の増加率は、１日当たり＋１３８ｇ／頭であった。
１日の絶対値での最大増加は、１６〜１７日目に記録された（＋２．４３  ｌ／頭）。
【０１８０】
乳品質の成績：
−  乳中の総ポリフェノール濃度の上昇；
−  １日の１頭当たりの乳生産量の増加；
−  急性期における体細胞数の減少；
−  フリーラジカル（ＴＥＡＣ）の吸収能力の増加。
【０１８１】
上記の結果は、総ポリフェノール濃度のピークが約２５０％、乳生産量全体の増加が＋２０．８％、体細胞数の減少が−３１％、及びＴＥＡＣの増加が＋３３％と非常に有意である。
【０１８２】
また、これらの成績は、処理の１５〜１７日目近辺に最大値が集中し、特定の同調を示すことに留意すべきである。
【０１８３】
また、本発明に従った補給は、中止後少なくとも２週間、その有益性を引き伸ばす状態を作り出したことも分かった。有益な効果は、約２０日後に薄れ始め、それは乳中の体細胞の再増加によって証明される。
【０１８４】
通常牛乳は微量のポリフェノールしか含まないので、本発明の食品用サプリメントを与えられた乳牛から得られた乳が、予想外に最大４５７ｍｇ／ｌのポリフェノールを含むことを非常に高く評価すべきである。ポリフェノールのヒトの必要量が８２０ｍｇ／ｄｉｅであり、ヒトの牛乳の摂取量が平均で２５０ｍｌ／ｄｉｅであることを考慮すると、本発明の乳によって与えられるポリフェノールの寄与は、言われているように通常これがゼロに近い場合、１１４ｍｇである。
【図１】
2021507885.tif 000015
【図２】
2021507885.tif 000016
【図３】
2021507885.tif 000017
【国際調査報告】
2021507885.tif 000018
2021507885.tif 000019
2021507885.tif 000020
2021507885.tif 000021