(57)【要約】  本発明は、ヒトインターロイキン−１受容体アクセサリータンパク質（ｈｕ−ＩＬ１ＲＡＰ）に特異的に結合し、ＩＬ−１、ＩＬ−３３、およびＩＬ−３６の細胞内シグナル伝達経路を完全ブロッキングする抗体および抗原結合断片などの結合タンパク質を提供する。このような結合タンパク質を含む組成物、ならびにこのような結合タンパク質を作製および使用する方法も提供される。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）第１の軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１）、第２の軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ２）、および第３の軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ３）、ならびに／または（ｉｉ）第１の重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１）、第２の重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ２）、および第３の重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ３）を含む抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体であって、
（ａ）ＨＶＲ−Ｌ１が、アミノ酸配列ＲＡＳＥＮＩＸＸＮＸＸ（配列番号１０）を含み、式中、７番目のＸが、ＹまたはＷであり、８番目のＸが、Ｓ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、またはＹであり、１０番目のＸが、Ｌ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、１１番目のＸが、Ａ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、またはＴであり、
（ｂ）ＨＶＲ−Ｌ２が、アミノ酸配列ＧＸＸＮＸＡＤ（配列番号３６）を含み、式中、２番目のＸが、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり、３番目のＸが、Ｋ、Ｇ、またはＮであり、５番目のＸが、Ｌ、Ｆ、Ｈ、Ｗ、またはＹであり、
（ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３が、アミノ酸配列ＸＸＦＸＴＸＰＲＴ（配列番号６２）を含み、式中、１番目のＸが、ＱまたはＳであり、２番目のＸが、ＨまたはＳであり、４番目のＸが、Ｗ、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、またはＹであり、６番目のＸが、Ｔ、Ｉ、またはＶであり、
（ｄ）ＨＶＲ−Ｈ１が、アミノ酸配列ＸＸＸＸＸＸＸ（配列番号７７）を含み、式中、１番目のＸが、Ｆ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、またはＹであり、２番目のＸが、Ｓ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、またはＴであり、３番目のＸが、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｑ、またはＲであり、４番目のＸが、Ｙ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｓ、またはＶであり、５番目のＸが、Ａ、Ｎ、またはＳであり、６番目のＸが、Ｍ、Ｖ、またはＷであり、７番目のＸが、ＳまたはＧであり、
（ｅ）ＨＶＲ−Ｈ２が、アミノ酸配列ＴＸＸＸＸＸＸＸＸＹＸＬＸＤＶＫＧ（配列番号１４０）を含み、式中、２番目のＸが、Ｖ、Ａ、Ｎ、またはＳであり、３番目のＸが、ＴまたはＳであり、４番目のＸが、Ｅ、Ｄ、Ｎ、Ｔ、またはＶであり、５番目のＸが、Ｇ、Ｉ、Ｐ、Ｔ、またはＶであり、６番目のＸが、Ｇ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり、７番目のＸが、Ｄ、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、またはＳであり、８番目のＸが、ＹまたはＷであり、９番目のＸが、Ｎ、Ａ、Ｇ、Ｐ、またはＲであり、１１番目のＸが、Ｃ、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、１３番目のＸが、Ｄ、Ｓ、またはＷであり、
（ｆ）ＨＶＲ−Ｈ３が、アミノ酸配列ＸＸＤＸＸＰＹＦＸＤＹ（配列番号２０２）を含み、式中、１番目のＸが、Ａ、Ｇ、Ｓ、またはＴであり、２番目のＸが、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、またはＶであり、４番目のＸが、Ｒ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、またはＳであり、５番目のＸが、Ｗ、またはＦであり、９番目のＸが、Ｆ、Ｌ、Ｍ、またはＷである、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体。
【請求項２】
（ａ）ＨＶＲ−Ｌ１が、配列番号１１〜３５から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ＨＶＲ−Ｌ２が、配列番号３７〜６１から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３が、配列番号６３〜７６から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｄ）ＨＶＲ−Ｈ１が、配列番号７８〜１２０から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｅ）ＨＶＲ−Ｈ２が、配列番号１４１〜２０１から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｆ）ＨＶＲ−Ｈ３が、配列番号２０３〜２２５から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
（ａ）ＨＶＲ−Ｌ１が、配列番号１１のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ＨＶＲ−Ｌ２が、配列番号３７のアミノ酸配列を含み、
（ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３が、配列番号６３のアミノ酸配列を含み、
（ｄ）ＨＶＲ−Ｈ１が、配列番号７８のアミノ酸配列を含み、
（ｅ）ＨＶＲ−Ｈ２が、配列番号１４１、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、および１９１から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｆ）ＨＶＲ−Ｈ３が、配列番号２０３のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
（ａ）ＨＶＲ−Ｌ１が、配列番号１１、１３、および２３から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ＨＶＲ−Ｌ２が、配列番号３７、３８、４５、４９、５４、および６１から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３が、配列番号６３、６７、６９、７０、７１、７５、および７６から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｄ）ＨＶＲ−Ｈ１が、配列番号７８、８１、９０、９２、および１１８から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｅ）ＨＶＲ−Ｈ２が、配列番号１４１、１４４、１４９、１５３、１７２、１８１、１９１、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、および２０１から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｆ）ＨＶＲ−Ｈ３が、配列番号２０３、２１４、２１５、２２０、および２２２から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体が、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、
（ａ）ＣＤＲ−Ｌ１が、アミノ酸配列ＲＡＳＥＮＩＸＸＮＸＸ（配列番号１０）を含み、式中、７番目のＸが、ＹまたはＷであり、８番目のＸが、Ｓ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、またはＹであり、１０番目のＸが、Ｌ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、１１番目のＸが、Ａ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、またはＴであり、
（ｂ）ＣＤＲ−Ｌ２が、アミノ酸配列ＧＸＸＮＸＡＤ（配列番号３６）を含み、式中、２番目のＸが、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり、３番目のＸが、Ｋ、Ｇ、またはＮであり、５番目のＸが、Ｌ、Ｆ、Ｈ、Ｗ、またはＹであり、
（ｃ）ＣＤＲ−Ｌ３が、アミノ酸配列ＸＸＦＸＴＸＰＲＴ（配列番号６２）を含み、式中、１番目のＸが、ＱまたはＳであり、２番目のＸが、ＨまたはＳであり、４番目のＸが、Ｗ、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、またはＹであり、６番目のＸが、Ｔ、Ｉ、またはＶであり、
（ｄ）ＣＤＲ−Ｈ１が、アミノ酸配列ＸＸＸＸＸ（配列番号１２１）を含み、式中、１番目のＸが、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｑ、またはＲであり、２番目のＸが、Ｙ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｓ、またはＶであり、３番目のＸが、Ａ、Ｎ、またはＳであり、４番目のＸが、Ｍ、Ｖ、またはＷであり、５番目のＸが、ＳまたはＧであり、
（ｅ）ＣＤＲ−Ｈ２が、アミノ酸配列ＴＸＸＸＸＸＸＸＸＹＸＬＸＤＶＫＧ（配列番号１４０）を含み、式中、２番目のＸが、Ｖ、Ａ、Ｎ、またはＳであり、３番目のＸが、ＴまたはＳであり、４番目のＸが、Ｅ、Ｄ、Ｎ、Ｔ、またはＶであり、５番目のＸが、Ｇ、Ｉ、Ｐ、Ｔ、またはＶであり、６番目のＸが、Ｇ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり、７番目のＸが、Ｄ、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、またはＳであり、８番目のＸが、ＹまたはＷであり、９番目のＸが、Ｎ、Ａ、Ｇ、Ｐ、またはＲであり、１１番目のＸが、Ｃ、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、１３番目のＸが、Ｄ、Ｓ、またはＷであり、
（ｆ）ＣＤＲ−Ｈ３が、アミノ酸配列ＤＸＸＰＹＦＸＤＹ（配列番号２２６）を含み、式中、２番目のＸが、Ｒ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、またはＳであり、３番目のＸが、Ｗ、またはＦであり、７番目のＸが、Ｆ、Ｌ、Ｍ、またはＷである、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
（ａ）ＣＤＲ−Ｌ１が、配列番号１１〜３５から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ＣＤＲ−Ｌ２が、配列番号３７〜６１から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｃ）ＣＤＲ−Ｌ３が、配列番号６３〜７６から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｄ）ＣＤＲ−Ｈ１が、配列番号１２２〜１３９から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｅ）ＣＤＲ−Ｈ２が、配列番号１４１〜２０１から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｆ）ＣＤＲ−Ｈ３が、配列番号２２７〜２３９から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
（ａ）ＣＤＲ−Ｌ１が、配列番号１１のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ＣＤＲ−Ｌ２が、配列番号３７のアミノ酸配列を含み、
（ｃ）ＣＤＲ−Ｌ３が、配列番号６３のアミノ酸配列を含み、
（ｄ）ＣＤＲ−Ｈ１が、配列番号１２２のアミノ酸配列を含み、
（ｅ）ＣＤＲ−Ｈ２が、配列番号１４１、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、および１９１から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｆ）ＣＤＲ−Ｈ３が、配列番号２２７のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体が、
配列番号２４０のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ−Ｌ１）、
配列番号２４１のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ−Ｌ２）、
配列番号２４２のアミノ酸配列を含む第３の軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ−Ｌ３）、
配列番号２４３のアミノ酸配列を含む第４の軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ−Ｌ４）、
配列番号２４９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖フレームワーク領域（ＦＲ−Ｈ１）、
配列番号２５０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖フレームワーク領域（ＦＲ−Ｈ２）、
配列番号２５１のアミノ酸配列を含む第３の重鎖フレームワーク領域（ＦＲ−Ｈ３）、
配列番号２５２のアミノ酸配列を含む第４の重鎖フレームワーク領域（ＦＲ−Ｈ４）を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体が、
配列番号２４４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ−Ｌ１）、
配列番号２４５または２４６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ−Ｌ２）、
配列番号２４７のアミノ酸配列を含む第３の軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ−Ｌ３）、
配列番号２４８のアミノ酸配列を含む第４の軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ−Ｌ４）、
配列番号２５３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖フレームワーク領域（ＦＲ−Ｈ１）、
配列番号２５４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖フレームワーク領域（ＦＲ−Ｈ２）、
配列番号２５５のアミノ酸配列を含む第３の重鎖フレームワーク領域（ＦＲ−Ｈ３）、
配列番号２５６のアミノ酸を含む第４の重鎖フレームワーク領域（ＦＲ−Ｈ４）を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体が、配列番号２５７、２５８、もしくは２５９から選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、および／または配列番号２７９、２８５、もしくは２９０から選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体が、配列番号２５７に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、および／または配列番号２７９に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１２】
前記抗体が、配列番号２５８もしくは２５９に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、および／または配列番号２８５もしくは２９０に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１３】
前記抗体が、配列番号２５７〜２７８から選択される軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１４】
前記抗体が、配列番号２７９〜３１０から選択される重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１５】
前記抗体が、
配列番号２５９の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、および配列番号２９０の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列、
配列番号２６８の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、および配列番号３０７の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列、
配列番号２６８の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、および配列番号２９８の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列、
配列番号２６９の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、および配列番号３０７の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列、
配列番号２６９の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、および配列番号２９８の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列、
配列番号２６９の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、および配列番号２９７の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列、
配列番号２７０の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、および配列番号３０７の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列、または
配列番号２７０の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、および配列番号２９８の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１６】
前記抗体が、配列番号３２８、３２９、３３０、もしくは３３１から選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、および／または配列番号３３２、３３３、３３４、３３５、もしくは３３６から選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１７】
前記抗体が、配列番号３２８〜３３１から選択される軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１８】
前記抗体が、配列番号３３２〜３３６から選択される重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１９】
前記抗体が、
配列番号３２８の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、および配列番号３３２の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
配列番号３２９の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、および配列番号３３５の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
配列番号３２９の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、および配列番号３３６の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
配列番号３２９の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、および配列番号３３３の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
配列番号３２９の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、および配列番号３３４の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
配列番号３３０の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、および配列番号３３５の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
配列番号３３０の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、および配列番号３３６の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
配列番号３３０の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、および配列番号３３３の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
配列番号３３０の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、および配列番号３３４の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
配列番号３３１の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、および配列番号３３５の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
配列番号３３１の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、および配列番号３３６の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
配列番号３３１の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、および配列番号３３３の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、または
配列番号３３１の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、および配列番号３３４の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の抗体。
【請求項２０】
抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体であって、
配列番号１１の第１の軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１）、配列番号３７の第２の軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ２）、配列番号６３の第３の軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ３）、ならびに／もしくは配列番号７８の第１の重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１）、配列番号１９１の第２の重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ２）、および配列番号２０３の第３の重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ３）、
配列番号１１の第１の軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１）、配列番号５４の第２の軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ２）、配列番号６３の第３の軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ３）、ならびに／もしくは配列番号７８の第１の重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１）、配列番号１９１の第２の重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ２）、および配列番号２１５の第３の重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ３）、
配列番号１１の第１の軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１）、配列番号５４の第２の軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ２）、配列番号６３の第３の軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ３）、ならびに／もしくは配列番号７８の第１の重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１）、配列番号１９５の第２の重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ２）、および配列番号２０３の第３の重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ３）、
配列番号１１の第１の軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１）、配列番号５４の第２の軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ２）、配列番号６３の第３の軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ３）、ならびに／もしくは配列番号７８の第１の重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１）、配列番号１９１の第２の重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ２）、および配列番号２１５の第３の重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ３）、
配列番号１１の第１の軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１）、配列番号５４の第２の軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ２）、配列番号６９の第３の軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ３）、ならびに／もしくは配列番号７８の第１の重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１）、配列番号１９５の第２の重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ２）、および配列番号２０３の第３の重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ３）、
配列番号１１の第１の軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１）、配列番号５４の第２の軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ２）、配列番号７０の第３の軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ３）、ならびに／もしくは配列番号７８の第１の重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１）、配列番号１９１の第２の重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ２）、および配列番号２１５の第３の重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ３）、または
配列番号１１の第１の軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１）、配列番号５４の第２の軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ２）、配列番号７０の第３の軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ３）、ならびに／もしくは配列番号７８の第１の重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１）、配列番号１９５の第２の重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ２）、および配列番号２０３の第３の重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ３）を含む、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体。
【請求項２１】
抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体であって、
配列番号１１の第１の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号３７の第２の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｌ２）、配列番号６３の第３の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｌ３）、ならびに／もしくは配列番号１２２の第１の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号１９１の第２の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｈ２）、および配列番号２２７の第３の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｈ３）、
配列番号１１の第１の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号５４の第２の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｌ２）、配列番号６３の第３の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｌ３）、ならびに／もしくは配列番号１２２の第１の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号１９１の第２の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｈ２）、および配列番号２２９の第３の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｈ３）、
配列番号１１の第１の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号５４の第２の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｌ２）、配列番号６３の第３の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｌ３）、ならびに／もしくは配列番号１２２の第１の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号１９５の第２の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｈ２）、および配列番号２２７の第３の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｈ３）、
配列番号１１の第１の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号５４の第２の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｌ２）、配列番号６３の第３の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｌ３）、ならびに／もしくは配列番号１２２の第１の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号１９１の第２の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｈ２）、および配列番号２２９の第３の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｈ３）、
配列番号１１の第１の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号５４の第２の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｌ２）、配列番号６９の第３の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｌ３）、ならびに／もしくは配列番号１２２の第１の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号１９５の第２の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｈ２）、および配列番号２２７の第３の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｈ３）、
配列番号１１の第１の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号５４の第２の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｌ２）、配列番号７０の第３の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｌ３）、ならびに／もしくは配列番号１２２の第１の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号１９１の第２の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｈ２）、および配列番号２２９の第３の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｈ３）、または
配列番号１１の第１の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号５４の第２の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｌ２）、配列番号７０の第３の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｌ３）、ならびに／もしくは配列番号１２２の第１の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号１９５の第２の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｈ２）、および配列番号２２７の第３の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｈ３）を含む、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体。
【請求項２２】
抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体であって、
配列番号２５９の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、および配列番号２９０の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列、
配列番号２６８の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、および配列番号３０７の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列、
配列番号２６８の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、および配列番号２９８の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列、
配列番号２６９の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、および配列番号３０７の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列、
配列番号２６９の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、および配列番号２９８の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列、
配列番号２６９の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、および配列番号２９７の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列、
配列番号２７０の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、および配列番号３０７の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列、または
配列番号２７０の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、および配列番号２９８の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列を含む、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体。
【請求項２３】
抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体であって、
配列番号３２８の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、および配列番号３３２の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
配列番号３２９の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、および配列番号３３５の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
配列番号３２９の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、および配列番号３３６の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
配列番号３２９の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、および配列番号３３３の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
配列番号３２９の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、および配列番号３３４の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
配列番号３３０の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、および配列番号３３５の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
配列番号３３０の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、および配列番号３３６の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
配列番号３３０の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、および配列番号３３３の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
配列番号３３０の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、および配列番号３３４の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
配列番号３３１の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、および配列番号３３５の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
配列番号３３１の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、および配列番号３３６の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
配列番号３３１の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、および配列番号３３３の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、または
配列番号３３１の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、および配列番号３３４の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列を含む、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体。
【請求項２４】
前記抗体が、１×１０−８Ｍ以下、１×１０−９Ｍ以下、１×１０−１０Ｍ以下、または１×１０−１１Ｍ以下の結合親和性でヒトＩＬ１ＲＡＰに結合し、必要に応じて、前記結合親和性が、配列番号３のｈｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰポリペプチドに対する平衡解離定数（ＫＤ）によって測定される、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２５】
前記抗体が、ＩＬ−１刺激性シグナル、ＩＬ−３３刺激性シグナル、および／またはＩＬ−３６刺激性シグナルを、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％減少させ、必要に応じて、前記シグナルの減少が、細胞ブロッキングアッセイによって測定される、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２６】
前記抗体が、ＩＬ−１刺激性シグナル、ＩＬ−３３刺激性シグナル、およびＩＬ−３６刺激性シグナルを少なくとも９５％、または少なくとも９９％減少させる、請求項２５に記載の抗体。
【請求項２７】
前記ＩＬ−１、ＩＬ−３３、および／またはＩＬ−３６刺激性シグナルが、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３、ＩＬ−３６α、ＩＬ−３６β、およびＩＬ−３６γから選択されるアゴニストによって刺激される、請求項２５に記載の抗体。
【請求項２８】
約ＥＣ５０のアゴニスト濃度で、前記抗体が、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、または１ｎＭ以下のＩＣ５０を有する、請求項２５に記載の抗体。
【請求項２９】
前記抗体が、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３、ＩＬ−３６α、ＩＬ−３６β、およびＩＬ−３６γアゴニストのうちの１つ以上がその同族受容体に結合することによって開始される細胞内シグナルを少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％減少させ、必要に応じて、前記細胞内シグナルの減少が、細胞ブロッキングアッセイによって測定される、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３０】
前記抗体が、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３、ＩＬ−３６α、ＩＬ−３６β、およびＩＬ−３６γアゴニストが結合することによって開始される前記細胞内シグナルを少なくとも９５％、または少なくとも９９％減少させる、請求項２９に記載の抗体。
【請求項３１】
約ＥＣ５０のＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３、ＩＬ−３６α、ＩＬ−３６β、および／またはＩＬ−３６γの濃度で、前記抗体が、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、または１ｎＭ以下のＩＣ５０を有する、請求項２９に記載の抗体。
【請求項３２】
約ＥＣ５０のＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３、ＩＬ−３６α、ＩＬ−３６β、および／またはＩＬ−３６γの濃度で、前記抗体が、５ｎＭ以下のＩＣ５０を有する、請求項３１に記載の抗体。
【請求項３３】
前記抗体が、初代ヒト肺線維芽細胞（ＰＨＬＦ）からのＩＬ８のＩＬ−１α、ＩＬ−１β、および／またはＩＬ−３６β刺激性放出を阻害し、必要に応じて、約ＥＣ５０のＩＬ−１α、ＩＬ−１β、および／またはＩＬ−３６βの濃度で、前記抗体が、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、または１ｎＭ以下のＩＣ５０を有する、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３４】
前記抗体が、初代ヒト単球からのＩＬ６のＩＬ−１β刺激性放出を阻害し、必要に応じて、約ＥＣ５０のＩＬ−１β濃度で、前記抗体が、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、または１ｎＭ以下のＩＣ５０を有する、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３５】
前記抗体が、ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞からのＩＮＦ−γのＩＬ−３３刺激性放出を阻害し、必要に応じて、約ＥＣ５０のＩＬ−３３濃度で、前記抗体が、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、または１ｎＭ以下のＩＣ５０を有する、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３６】
前記抗体が、ヒト表皮ケラチノサイト（ＨＥＫｎ）からのＩＬ８のＩＬ−３６β刺激性放出を阻害し、必要に応じて、約ＥＣ６０のＩＬ−３６β濃度で、前記抗体が、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、または２ｎＭ以下のＩＣ５０を有する、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３７】
前記抗体が、好塩基球でＩＬ−３３刺激性リン酸化を阻害し、必要に応じて、約ＥＣ５６のＩＬ−３３濃度で、前記抗体が、７５ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、または４５ｎＭ以下のＩＣ５０を有する、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３８】
前記抗体が、ＣＤ４＋Ｔ細胞からＩＮＦ−γのＩＬ−３３刺激性放出を阻害し、必要に応じて、約ＥＣ３４のＩＬ−３３濃度で、前記抗体が、７５ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、または４５ｎＭ以下のＩＣ５０を有する、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３９】
前記抗体が、ヒトＩＬ１ＲＡＰのドメイン３内の１つ以上のアミノ酸残基に特異的に結合し、ドメイン３が、配列番号１または３のアミノ酸配列の２３８〜３６７番目を含む、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４０】
前記抗体が、配列番号１または３のアミノ酸配列の２４３〜２５５番目、２５７〜２６８番目、および／または３３３〜３３６番目に特異的に結合する、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４１】
前記抗体が、ヒトＩＬ１ＲＡＰのドメイン１またはドメイン２内のアミノ酸残基に結合せず、必要に応じて、ドメイン１およびドメイン２が、配列番号１または３のアミノ酸配列の２１〜２３７番目を含む、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４２】
前記抗体が、配列番号８のカニクイザルＩＬ１ＲＡＰポリペプチドと交差反応する、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４３】
前記抗体が、配列番号９のマウスＩＬ１ＲＡＰポリペプチドと交差反応する、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４４】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４５】
前記抗体が、組換え抗体である、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４６】
前記抗体が、キメラ抗体である、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４７】
前記抗体が、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４８】
前記抗体が、抗体断片であり、必要に応じて、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）、単一アーム抗体、およびｓｃＦｖからなる群から選択される、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４９】
前記抗体が、クラスＩｇＧの完全長抗体であり、必要に応じて、前記クラスＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４から選択されるアイソタイプを有する、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５０】
前記抗体が、Ｆｃ領域変異体であり、必要に応じて、前記Ｆｃ領域変異体が、エフェクター機能を変えるか、または半減期を変え、必要に応じて、前記半減期が、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日以上に増加する、請求項４９に記載の抗体。
【請求項５１】
前記Ｆｃ領域変異体が、ＹＴＥ変異のセットを含み、必要に応じて、前記ＹＴＥ変異が、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、およびＴ２５６Ｅのアミノ酸置換を含む、請求項５０に記載の抗体。
【請求項５２】
前記Ｆｃ領域変異体が、エフェクター機能を低下させる、かつ／またはエフェクターレス抗体をもたらす、請求項５０に記載の抗体。
【請求項５３】
前記Ｆｃ領域変異体が、２９７番目にアミノ酸置換を含み、必要に応じて、前記２９７番目のアミノ酸置換が、Ｎ２９７Ｇである、請求項５２に記載の抗体。
【請求項５４】
前記抗体が、免疫複合体であり、必要に応じて、前記免疫複合体が、ＩＬ１ＲＡＰ媒介性の状態または疾患を治療するための治療剤を含み、必要に応じて、前記治療剤が、がん治療のための化学療法剤または細胞毒性剤である、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５５】
前記抗体が、多重特異性抗体、必要に応じて二重特異性抗体である、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５６】
前記抗体が、免疫グロブリン足場または免疫グロブリンフレームワーク以外の足場、必要に応じて代替タンパク質足場および人工ポリマー足場から選択される足場にグラフティングされたＣＤＲを含む合成抗体である、請求項１〜５５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５７】
請求項１〜５６のいずれか１項に記載の抗体と同じエピトープに特異的に結合する抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体。
【請求項５８】
前記抗体が、ＩＬ１ＲＡＰのドメイン３内の１つ以上のアミノ酸残基に特異的に結合し、ドメイン３が、配列番号１または３のアミノ酸配列の２３８〜３６７番目を含む、抗ＩＬ１ＲＡＰ。
【請求項５９】
前記抗体が、配列番号１または３のアミノ酸配列の２４３〜２５５番目、２５７〜２６８番目、および／または３３３〜３３６番目に特異的に結合する、請求項５８に記載の抗体。
【請求項６０】
請求項１〜５９のいずれか１項に記載の抗体をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６１】
シグナルペプチド（ＳＰ）をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項６０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６２】
前記ポリヌクレオチドが、軽鎖および重鎖をコードする、請求項６０に記載のポリヌクレオチド。７
【請求項６３】
前記ポリヌクレオチドが、哺乳動物細胞における前記抗体の至適発現のために選択された１つ以上のコドンを含むポリヌクレオチド配列を含む、請求項６０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６４】
前記ポリヌクレオチド配列が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における前記抗体の至適発現のために選択された１つ以上のコドンを含む、請求項６０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６５】
請求項６０〜６４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項６６】
請求項６５に記載のベクターを含む単離された宿主細胞。
【請求項６７】
請求項６０〜６４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項６８】
請求項１〜５９のいずれか１項に記載の抗体を発現する単離された宿主細胞。
【請求項６９】
前記宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、骨髄腫細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２／０）、サル腎細胞（ＣＯＳ−７）、ヒト胚性腎臓系統（２９３）、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、ＴＭ４）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎細胞、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）、マウス乳腺腫瘍細胞、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、およびＦＳ４細胞から選択される、請求項６８に記載の宿主細胞。
【請求項７０】
抗体を産生する方法であって、抗体が産生されるように、請求項６６〜６９のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
【請求項７１】
請求項１〜５９のいずれか１項に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項７２】
請求項１〜５９のいずれか１項に記載の抗体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項７３】
前記組成物が、ＩＬ−１、ＩＬ−３３、ＩＬ−３６、および／またはＩＬ１ＲＡＰ媒介性の疾患または状態を治療するための治療剤をさらに含み、必要に応じて、前記治療剤が、化学療法剤である、請求項７２に記載の医薬組成物。
【請求項７４】
対象のＩＬ１ＲＡＰ媒介性疾患を治療する方法であって、治療有効量の請求項１〜５９のいずれか１項に記載の抗体、または治療有効量の請求項７２に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項７５】
対象におけるＩＬ−１、ＩＬ−３３、および／またはＩＬ−３６のシグナル伝達によって媒介される疾患を治療する方法であって、治療有効量の請求項１〜５９のいずれか１項に記載の抗体または治療有効量の請求項７２に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項７６】
対象におけるＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３、ＩＬ−３６α、ＩＬ−３６βおよび／またはＩＬ−３６γ刺激性シグナル伝達によって媒介される疾患を治療する方法であって、治療有効量の請求項１〜５９のいずれか１項に記載の抗体または治療有効量の請求項７２に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項７７】
前記疾患が、にきび、急性膵炎、急性重症潰瘍性大腸炎、成人発症型スティル病、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、気道過敏性、気道炎症、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アナフィラキシー、関節炎痛、喘息、アテローム性動脈硬化症、アトピー性皮膚炎、アトピー性湿疹、自己免疫性血管炎、ベーチェット病、骨がん、脳がん、乳がん、悪液質／食欲不振、軟骨損傷、脳虚血、慢性疲労症候群、慢性閉塞性肺疾患、クロストリジウム関連疾患、結腸がん、うっ血性心不全、結膜炎、冠動脈バイパス移植、冠動脈再狭窄、クローン病、糖尿病、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、ドライアイ疾患、子宮内膜症、好酸球関連胃腸障害、好酸球性食道炎、家族性寒冷自己炎症性症候群、家族性地中海熱、発熱、線維筋痛症、線維性障害、食物アレルギー、汎発性膿疱性乾癬、緑内障、糸球体腎炎、痛風性関節炎、移植片対宿主疾患、蠕虫感染、出血性ショック、化膿性汗腺炎、痛覚過敏、高ＩｇＤ症候群、高尿酸血症、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、がん関連痛、感染症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、緊張に起因する炎症状態、角膜移植に関連する炎症性眼疾患、炎症性疼痛、インフルエンザ、腸がん、虚血、若年性関節炎、川崎病、腎臓がん、レーバー先天性黒内障、肝臓がん、肝疾患、肺がん、マックル−ウェルズ症候群、多発性骨髄腫、多発性硬化症、筋骨格痛、骨髄性および他の白血病、心筋機能不全、筋障害、鼻ポリープ、新生児発症多系統炎症性疾患、神経毒性、非感染性結膜炎、非小細胞肺がん、整形外科手術、骨関節炎、骨粗鬆症、疼痛、掌蹠膿疱症、膵臓がん、パーキンソン病、歯周病、末梢血管疾患、リウマチ性多発筋痛症、ポリープ状脈絡膜血管症（ＰＣＶ）、早産、前立腺がん、原虫感染症、乾癬、乾癬性関節炎、壊疽性膿皮症、再灌流傷害、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、再狭窄、網膜剥離、網膜色素変性症、未熟網膜症（ＲＯＰ）、関節リウマチ、敗血症性ショック、鎌状赤血球貧血、放射線療法による副作用、副鼻腔炎、皮膚がん、睡眠障害、捻挫、シュタルガルト病、胃がん、側頭下顎関節疾患、ＴＮＦ受容体関連周期性症候群、移植拒絶、外傷、外傷性眼損傷、２型糖尿病、潰瘍性大腸炎、およびブドウ膜炎から選択される、請求項７４〜７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
対象の喘息を治療する方法であって、治療有効量の請求項１〜５９のいずれか１項に記載の抗体、または治療有効量の請求項７３に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項７９】
対象のがんを治療する方法であって、治療有効量の請求項１〜５９のいずれか１項に記載の抗体、または治療有効量の請求項７３に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含み、必要に応じて、前記がんが、乳がん、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、膵臓がんから選択される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１８年８月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／７１９，３９７号の優先権を主張するものであり、これはあらゆる目的で参照として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、一般に、インターロイキン−１受容体アクセサリータンパク質に結合する抗体および抗原結合断片などの結合タンパク質、およびこのような結合タンパク質を使用する方法に関する。
【０００３】
配列表への言及
配列表の公式写しは、ＡＳＣＩＩ方式のテキストファイルとして、特許明細書と同時に、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で提出され、ファイル名は「０９４０２−００２ＵＳ１＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」、作成日は２０１９年８月１５日、サイズは１８０，８８９バイトである。ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で出願された配列表は、特許明細書の一部であり、配列表全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
サイトカインリガンドのインターロイキン−１（ＩＬ−１）ファミリーおよび受容体は、炎症、自己免疫、免疫調節、細胞増殖（ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、および宿主防御に関連しており、炎症、自己免疫、免疫調節、変性、および細胞増殖（例えば、がん）の疾患および障害の病態の一因となり、そのサイトカインおよび受容体は、このような疾患および障害の病原性メディエーターとして機能する。例えば、Ｇａｒｌａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３９：１００３−１０１８（２０１３）を参照。
【０００５】
サイトカインのＩＬ−１ファミリーには、インターロイキン−１アルファ（ＩＬ−１アルファまたはＩＬ−１ａまたはＩＬ−１α）、インターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１βまたはＩＬ−１ｂ）、インターロイキン−３３（ＩＬ−３３）、インターロイキン−３６アルファ（ＩＬ−３６アルファまたはＩＬ−３６α）、インターロイキン−３６ベータ（ＩＬ−３６βまたはＩＬ−３６ｂ）、およびインターロイキン−３６ガンマ（ＩＬ−３６ガンマまたはＩＬ−３６γ）が含まれる。これらのサイトカインはそれぞれ、特定の細胞表面に発現する特異的なＩＬ−１ファミリー細胞膜受容体に結合できるリガンドとして機能する。ＩＬ−１ファミリーサイトカインがその同族受容体に結合すると、共受容体が動員されて、サイトカイン、その同族膜受容体、およびその共受容体を含む三元複合体を形成する。得られた三元複合体は、ＮＦ−κＢおよびＡＰ−１を含む一連の転写因子ならびにマイトジェン活性化プロテインキナーゼの細胞内シグナル伝達（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）および活性化を促進し、三元複合体は、多数のサイトカイン、ケモカイン、酵素、および接着分子の産生を含む炎症および免疫応答のカスケードを誘発する。
【０００６】
インターロイキン−１受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ１ＲＡＰ）は、インターロイキン−１受容体１（ＩＬ１Ｒ１）、ＳＴ２（インターロイキン−１受容体様１またはＩＬ１ＲＬ１としても知られる）およびインターロイキン−１受容体様２（ＩＬ１ＲＬ２）を含むＩＬ−１ファミリーのいくつかの受容体の共通の細胞膜共受容体として機能する。ＩＬ１ＲＡＰは、上記のＩＬ−１ファミリーサイトカインの１つであるサイトカインの特異的同族受容体、およびＩＬ１ＲＡＰ共受容体によって形成される三元シグナル伝達複合体（ｔｅｒｎａｒｙ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）の必要な構成要素である。したがって、ＩＬ１ＲＡＰは、ＩＬ−１ファミリーサイトカインであるＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３、ＩＬ−３６α、ＩＬ−３６β、およびＩＬ−３６γによって刺激される特定の下流シグナル伝達経路を促進する必要があるため、ＩＬ−１ファミリーシグナル伝達経路において重要な機能を果たす。
【０００７】
ＷＯ２０１２／０９８４０７Ａ１は、ＩＬ１ＲＡＰを発現する固形腫瘍に関連する細胞死の誘導ならびに／または細胞の成長および／もしくは増殖の阻害に使用するためのＩＬ１ＲＡＰに対する特異性を有する抗体などの結合部分を含む薬剤（ａｇｅｎｔ）を対象とする。ＷＯ２０１２／０９８４０７Ａ１では、ヒトＩＬ１ＲＡＰに対するマウスＩｇＧ２ａモノクローナル抗体である「ｍＡｂ８１．２」が開示され、これは、インビボで投与された場合、黒色腫マウスモデルにおいて統計的に有意な腫瘍成長の遅延をもたらした。
【０００８】
ＷＯ２０１５／１３２６０２Ａ１は、ヒトＩＬ１ＲＡＰに特異的な抗体および固形腫瘍の治療へのそれらの使用を対象とする。ＷＯ２０１５／１３２６０２Ａ１では、２００ｐＭのＫＤでヒトＩＬ１ＲＡＰのドメイン２に特異的に結合し、カニクイザルＩＬ１ＲＡＰと交差反応し、１つ以上のがん細胞株（ＣＭＬなど）においてＡＤＣＣを誘導することができ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、およびＩＬ−３３刺激性シグナル伝達にいくらかの阻害効果を有する、特定のマウス由来抗体「ＣＡＮ０４」が開示されている。
【０００９】
ＷＯ２０１６／０２０５０２Ａ１では、それぞれ１．４および０．９ｎＭのＫＤでヒトＩＬ１ＲＡＰのドメイン３に特異的に結合し、カニクイザルＩＬ１ＲＡＰと交差反応し、１つ以上のがん細胞株（ＣＭＬなど）でＡＤＣＣを誘導することができる、２つの特定のマウス由来抗体「ＣＡＮ０１」および「ＣＡＮ０３」が開示されている。ＣＡＮ０３は、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、およびＩＬ−３３刺激性シグナル伝達にある程度の阻害効果があると決定された一方、ＣＡＮ０１は、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、およびＩＬ−３３シグナル伝達に明らかな阻害作用はないことが見出された。
【００１０】
ＷＯ２０１６／２０７３０４Ａ１は、ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰに特異的に結合し、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３、および／またはＩＬ−３６βによって刺激されるＮＦｋＢ活性にいくらかの阻害効果を有するウサギ由来抗体を対象とする。
【００１１】
ＷＯ２０１７／１９１３２５Ａ９は、ヒトＩＬ−１Ｒ３に特異的に結合し、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３、および／またはＩＬ−３６βによって刺激されるＮＦｋＢ活性にいくらかの阻害効果を有するヒト化ＩｇＧ１抗体を対象とする。
【００１２】
サイトカインリガンドのＩＬ−１ファミリーおよび受容体に関連する炎症性、自己免疫性、免疫調節性、変性性、および細胞増殖性の疾患または障害を治療、改善、または予防する療法の必要性が依然としてある。本開示は、これらおよび他のニーズを満たすものである。
【発明の概要】
【００１３】
本開示は、高い親和性でヒトＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する抗体を提供する。抗体は、ＩＬ−１、ＩＬ−３３、および／またはＩＬ−３６シグナル伝達経路を減少、阻害、および／または完全ブロッキングすることができ、この経路には、次のアゴニストのうちの１つ以上の結合によって刺激されるシグナル伝達が含まれる。ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３、ＩＬ−３６α、ＩＬ−３６β、およびＩＬ−３６γ。本開示は、ＩＬ−１、ＩＬ−３３、および／またはＩＬ−３６シグナル伝達の阻害に応答する疾患および状態を治療する方法も提供する。
【００１４】
いくつかの実施形態において、本開示は、（ｉ）第１の軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１）、第２の軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ２）、および第３の軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ３）、ならびに／または（ｉｉ）第１の重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１）、第２の重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ２）、および第３の重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ３）を含む抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体であって、
（ａ）ＨＶＲ−Ｌ１が、アミノ酸配列ＲＡＳＥＮＩＸＸＮＸＸ（配列番号１０）を含み、式中、７番目のＸが、ＹまたはＷであり、８番目のＸが、Ｓ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、またはＹであり、１０番目のＸが、Ｌ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、１１番目のＸが、Ａ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、またはＴであり、
（ｂ）ＨＶＲ−Ｌ２が、アミノ酸配列ＧＸＸＮＸＡＤ（配列番号３６）を含み、式中、２番目のＸが、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり、３番目のＸが、Ｋ、Ｇ、またはＮであり、５番目のＸが、Ｌ、Ｆ、Ｈ、Ｗ、またはＹであり、
（ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３が、アミノ酸配列ＸＸＦＸＴＸＰＲＴ（配列番号６２）を含み、式中、１番目のＸが、ＱまたはＳであり、２番目のＸが、ＨまたはＳであり、４番目のＸが、Ｗ、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、またはＹであり、６番目のＸが、Ｔ、Ｉ、またはＶであり、
（ｄ）ＨＶＲ−Ｈ１が、アミノ酸配列ＸＸＸＸＸＸＸ（配列番号７７）を含み、式中、１番目のＸが、Ｆ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、またはＹであり、２番目のＸが、Ｓ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、またはＴであり、３番目のＸが、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｑ、またはＲであり、４番目のＸが、Ｙ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｓ、またはＶであり、５番目のＸが、Ａ、Ｎ、またはＳであり、６番目のＸが、Ｍ、Ｖ、またはＷであり、７番目のＸが、ＳまたはＧであり、
（ｅ）ＨＶＲ−Ｈ２が、アミノ酸配列ＴＸＸＸＸＸＸＸＸＹＸＬＸＤＶＫＧ（配列番号１４０）を含み、式中、２番目のＸが、Ｖ、Ａ、Ｎ、またはＳであり、３番目のＸが、ＴまたはＳであり、４番目のＸが、Ｅ、Ｄ、Ｎ、Ｔ、またはＶであり、５番目のＸが、Ｇ、Ｉ、Ｐ、Ｔ、またはＶであり、６番目のＸが、Ｇ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり、７番目のＸが、Ｄ、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、またはＳであり、８番目のＸが、ＹまたはＷであり、９番目のＸが、Ｎ、Ａ、Ｇ、Ｐ、またはＲであり、１１番目のＸが、Ｃ、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、１３番目のＸが、Ｄ、Ｓ、またはＷであり、
（ｆ）ＨＶＲ−Ｈ３が、アミノ酸配列ＸＸＤＸＸＰＹＦＸＤＹ（配列番号２０２）を含み、式中、１番目のＸが、Ａ、Ｇ、Ｓ、またはＴであり、２番目のＸが、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、またはＶであり、４番目のＸが、Ｒ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、またはＳであり、５番目のＸが、Ｗ、またはＦであり、９番目のＸが、Ｆ、Ｌ、Ｍ、またはＷである、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を提供する。
【００１５】
いくつかの実施形態において、本開示は、（ｉ）第１の軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１）、第２の軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ２）、および第３の軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ３）、ならびに／または（ｉｉ）第１の重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１）、第２の重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ２）、および第３の重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ３）を含む抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を提供し、（ａ）ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号１１〜３５から選択されるアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号３７〜６１から選択されるアミノ酸配列を含み、（ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３は、配列番号６３〜７６から選択されるアミノ酸配列を含み、（ｄ）ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号７８〜１２０から選択されるアミノ酸配列を含み、（ｅ）ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号１４１〜２０１から選択されるアミノ酸配列を含み、（ｆ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号２０３〜２２５から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態において、本開示は、（ｉ）第１の軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１）、第２の軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ２）、および第３の軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ３）、ならびに／または（ｉｉ）第１の重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１）、第２の重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ２）、および第３の重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ３）を含む抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を提供し、（ａ）ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号１１のアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号３７のアミノ酸配列を含み、（ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３は、配列番号６３のアミノ酸配列を含み、（ｄ）ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号７８のアミノ酸配列を含み、（ｅ）ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号１４１、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、および１９１から選択されるアミノ酸配列を含み、（ｆ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号２０３のアミノ酸配列を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、本開示は、（ｉ）第１の軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１）、第２の軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ２）、および第３の軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ３）、ならびに／または（ｉｉ）第１の重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１）、第２の重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ２）、および第３の重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ３）を含む抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を提供し、（ａ）ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号１１、１３、および２３から選択されるアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号３７、３８、４５、４９、５４、および６１から選択されるアミノ酸配列を含み、（ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３は、配列番号６３、６７、６９、７０、７１、７５、および７６から選択されるアミノ酸配列を含み、（ｄ）ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号７８、８１、９０、９２、および１１８から選択されるアミノ酸配列を含み、（ｅ）ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号１４１、１４４、１４９、１５３、１７２、１８１、１９１、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、および２０１から選択されるアミノ酸配列を含み、（ｆ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号２０３、２１４、２１５、２２０、および２２２から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態において、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、
（ａ）ＣＤＲ−Ｌ１が、アミノ酸配列ＲＡＳＥＮＩＸＸＮＸＸ（配列番号１０）を含み、式中、７番目のＸが、ＹまたはＷであり、８番目のＸが、Ｓ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、またはＹであり、１０番目のＸが、Ｌ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、１１番目のＸが、Ａ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、またはＴであり、
（ｂ）ＣＤＲ−Ｌ２が、アミノ酸配列ＧＸＸＮＸＡＤ（配列番号３６）を含み、式中、２番目のＸが、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり、３番目のＸが、Ｋ、Ｇ、またはＮであり、５番目のＸが、Ｌ、Ｆ、Ｈ、Ｗ、またはＹであり、
（ｃ）ＣＤＲ−Ｌ３が、アミノ酸配列ＸＸＦＸＴＸＰＲＴ（配列番号６２）を含み、式中、１番目のＸが、ＱまたはＳであり、２番目のＸが、ＨまたはＳであり、４番目のＸが、Ｗ、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、またはＹであり、６番目のＸが、Ｔ、Ｉ、またはＶであり、
（ｄ）ＣＤＲ−Ｈ１が、アミノ酸配列ＸＸＸＸＸ（配列番号１２１）を含み、式中、１番目のＸが、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｑ、またはＲであり、２番目のＸが、Ｙ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｓ、またはＶであり、３番目のＸが、Ａ、Ｎ、またはＳであり、４番目のＸが、Ｍ、Ｖ、またはＷであり、５番目のＸが、ＳまたはＧであり、
（ｅ）ＣＤＲ−Ｈ２が、アミノ酸配列ＴＸＸＸＸＸＸＸＸＹＸＬＸＤＶＫＧ（配列番号１４０）を含み、式中、２番目のＸが、Ｖ、Ａ、Ｎ、またはＳであり、３番目のＸが、ＴまたはＳであり、４番目のＸが、Ｅ、Ｄ、Ｎ、Ｔ、またはＶであり、５番目のＸが、Ｇ、Ｉ、Ｐ、Ｔ、またはＶであり、６番目のＸが、Ｇ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり、７番目のＸが、Ｄ、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、またはＳであり、８番目のＸが、ＹまたはＷであり、９番目のＸが、Ｎ、Ａ、Ｇ、Ｐ、またはＲであり、１１番目のＸが、Ｃ、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、１３番目のＸが、Ｄ、Ｓ、またはＷであり、
（ｆ）ＣＤＲ−Ｈ３が、アミノ酸配列ＤＸＸＰＹＦＸＤＹ（配列番号２２６）を含み、式中、２番目のＸが、Ｒ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、またはＳであり、３番目のＸが、Ｗ、またはＦであり、７番目のＸが、Ｆ、Ｌ、Ｍ、またはＷである。
【００１９】
いくつかの実施形態において、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、相補性決定領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、（ａ）ＣＤＲ−Ｌ１は、配列番号１１〜３５から選択されるアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＣＤＲ−Ｌ２は、配列番号３７〜６１から選択されるアミノ酸配列を含み、（ｃ）ＣＤＲ−Ｌ３は、配列番号６３〜７６から選択されるアミノ酸配列を含み、（ｄ）ＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号１２２〜１３９から選択されるアミノ酸配列を含み、（ｅ）ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号１４１〜２０１から選択されるアミノ酸配列を含み、（ｆ）ＣＤＲ−Ｈ３は、配列番号２２７〜２３９から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態において、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、配列番号２５７、２５８、もしくは２５９から選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、および／または配列番号２７９、２８５、もしくは２９０から選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号２５７〜２７８から選択される軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号２７９〜３１０から選択される重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態において、本開示は、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を提供し、この抗体は、
配列番号２５９の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、および配列番号２９０の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列、
配列番号２６８の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、および配列番号３０７の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列、
配列番号２６８の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、および配列番号２９８の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列、
配列番号２６９の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、および配列番号３０７の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列、
配列番号２６９の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、および配列番号２９８の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列、
配列番号２６９の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、および配列番号２９７の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列、
配列番号２７０の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、および配列番号３０７の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列、または
配列番号２７０の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、および配列番号２９８の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態において、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、配列番号３２８、３２９、３３０、もしくは３３１から選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、および／または配列番号３３２、３３３、３３４、３３５、もしくは３３６から選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号３２８〜３３１から選択される軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号３３２〜３３６から選択される重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列を含む。
【００２３】
いくつかの実施形態において、本開示は、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を提供し、この抗体は、
配列番号３２８の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、および配列番号３３２の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
配列番号３２９の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、および配列番号３３５の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
配列番号３２９の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、および配列番号３３６の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
配列番号３２９の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、および配列番号３３３の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
配列番号３２９の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、および配列番号３３４の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
配列番号３３０の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、および配列番号３３５の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
配列番号３３０の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、および配列番号３３６の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
配列番号３３０の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、および配列番号３３３の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
配列番号３３０の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、および配列番号３３４の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
配列番号３３１の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、および配列番号３３５の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
配列番号３３１の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、および配列番号３３６の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
配列番号３３１の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、および配列番号３３３の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、または
配列番号３３１の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、および配列番号３３４の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列を含む。
【００２４】
本開示によって提供される抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の様々な実施形態において、抗体は、以下の特性
（ａ）抗体は、１×１０−８Ｍ以下、１×１０−９Ｍ以下、１×１０−１０Ｍ以下、または１×１０−１１Ｍ以下の結合親和性でヒトＩＬ１ＲＡＰに結合し、必要に応じて、結合親和性は、配列番号３のｈｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰポリペプチドに対する平衡解離定数（ＫＤ）によって測定される、
（ｂ）抗体は、ＩＬ−１刺激性シグナル、ＩＬ−３３刺激性シグナル、および／またはＩＬ−３６刺激性シグナルを、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％減少させ、必要に応じて、シグナルの減少は、細胞ブロッキングアッセイによって測定され、必要に応じて、ＩＬ−１、ＩＬ−３３、および／またはＩＬ−３６刺激性シグナルは、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３、ＩＬ−３６α、ＩＬ−３６β、およびＩＬ−３６γから選択されるアゴニストにより刺激され、必要に応じて、約ＥＣ５０のアゴニストの濃度で、抗体は、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、または１ｎＭ以下のＩＣ５０を有する、
（ｃ）抗体は、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３、ＩＬ−３６α、ＩＬ−３６β、およびＩＬ−３６γアゴニストのうちの１つ以上がその同族受容体に結合することによって開始される細胞内シグナルを少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％減少させ、必要に応じて、細胞内シグナルの減少は、細胞ブロッキングアッセイによって測定され、必要に応じて、約ＥＣ５０のＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３、ＩＬ−３６α、ＩＬ−３６β、および／またはＩＬ−３６γの濃度で、抗体は、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、または１ｎＭのＩＣ５０を有するアゴニストによって開始される細胞内シグナルを減少させる、
（ｄ）抗体は、初代ヒト肺線維芽細胞（ＰＨＬＦ）からのＩＬ８のＩＬ−１α、ＩＬ−１β、および／またはＩＬ−３６β刺激性放出を阻害し、必要に応じて、約ＥＣ５０のＩＬ−１α、ＩＬ−１β、および／またはＩＬ−３６βの濃度で、抗体は、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、または１ｎＭ以下のＩＣ５０を有する、
（ｅ）抗体は、初代ヒト単球からのＩＬ６のＩＬ−１β刺激性放出を阻害し、必要に応じて、約ＥＣ５０のＩＬ−１β濃度で、抗体は、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、または１ｎＭ以下のＩＣ５０を有する、
（ｆ）抗体は、ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞からのＩＮＦ−γのＩＬ−３３刺激性放出を阻害し、必要に応じて、約ＥＣ５０のＩＬ−３３濃度で、抗体は、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、または１ｎＭ以下のＩＣ５０を有する、
（ｇ）抗体は、ヒト表皮ケラチノサイト（ＨＥＫｎ）からのＩＬ８のＩＬ−３６β刺激性放出を阻害し、必要に応じて、約ＥＣ６０のＩＬ−３６β濃度で、抗体は、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、または２ｎＭ以下のＩＣ５０を有する、
（ｈ）抗体は、好塩基球でＩＬ−３３刺激性リン酸化を阻害し、必要に応じて、約ＥＣ５６のＩＬ−３３濃度で、抗体は、７５ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、または４５ｎＭ以下のＩＣ５０を有する、
（ｉ）抗体は、ＣＤ４＋Ｔ細胞からＩＮＦ−γのＩＬ−３３刺激性放出を阻害し、必要に応じて、約ＥＣ３４のＩＬ−３３濃度で、抗体は、７５ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、または４５ｎＭ以下のＩＣ５０を有する、
（ｊ）抗体は、ヒトＩＬ１ＲＡＰのドメイン３内の１つ以上のアミノ酸残基に特異的に結合し、ドメイン３は、配列番号１または３のアミノ酸配列の２３８〜３６７番目を含む、
（ｋ）抗体は、配列番号１または３のアミノ酸配列の２４３〜２５５番目、２５７〜２６８番目、および／または３３３〜３３６番目に特異的に結合する、
（ｌ）抗体は、ヒトＩＬ１ＲＡＰのドメイン１またはドメイン２内のアミノ酸残基に結合せず、必要に応じて、ドメイン１およびドメイン２は、配列番号１または３のアミノ酸配列の２１〜２３７番目を含む、
（ｍ）抗体は、配列番号８のカニクイザルＩＬ１ＲＡＰポリペプチドと交差反応する、ならびに／あるいは、
（ｎ）抗体は、配列番号９のマウスＩＬ１ＲＡＰポリペプチドと交差反応する、のうちの１つ以上によって特徴付けられる。
【００２５】
本開示は、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の実施形態も提供する。ここで、（ｉ）抗体は、モノクローナル抗体である；（ｉｉ）抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である；（ｉｉｉ）抗体は、クラスＩｇＧの完全長抗体であり、必要に応じて、クラスＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４から選択されるアイソタイプを有する；（ｉｖ）抗体は、Ｆｃ領域変異体、必要に応じて、エフェクター機能を改変するＦｃ領域変異体（例えば、エフェクターレス抗体をもたらす変異体）、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性、および／またはＡＤＣＰ活性の低下を示すＦｃ領域変異体、ヒト単球、好中球、および／またはジャーカット細胞に細胞傷害活性の低下を示すＦｃ領域変異体、または抗体半減期を改変するＦｃ領域変異体である；（ｖ）抗体は抗体断片であり、必要に応じて、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）、およびｓｃＦｖからなる群から選択される；（ｖｉ）抗体は、免疫複合体であり、必要に応じて、免疫複合体は、ＩＬ１ＲＡＰ媒介性の疾患または状態を治療するための治療剤を含む；（ｖｉｉ）抗体は、多重特異性抗体であり、必要に応じて、二重特異性抗体である；および（ｖｉｉｉ）抗体は、合成抗体であり、ＣＤＲは免疫グロブリン足場またはフレームワーク以外の足場またはフレームワーク、必要に応じて、代替タンパク質足場および人工ポリマー足場から選択される足場にグラフティングされる。
【００２６】
他の実施形態において、本開示は、本明細書に開示される抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体をコードする単離された核酸を提供する。
【００２７】
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に開示されるような抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体をコードする核酸を含む宿主細胞も提供する。
【００２８】
本開示は、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を産生する方法を提供し、本方法は、抗体が産生されるように、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体をコードする核酸（またはベクター）を含む宿主細胞を培養することを含む。
【００２９】
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に開示されるような抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ＩＬ−１、ＩＬ−３３、ＩＬ−３６、および／またはＩＬ１ＲＡＰ媒介性の疾患または状態を治療するための治療薬をさらに含み、必要に応じて、治療剤は化学療法剤である。
【００３０】
本開示は、対象のＩＬ１ＲＡＰ媒介性疾患を治療する方法も提供し、本方法は、本明細書に開示されるような治療有効量の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体、または本明細書に開示されるような抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の治療有効量の医薬製剤を対象に投与することを含む。
【００３１】
本開示は、対象のＩＬ−１、ＩＬ−３３、および／またはＩＬ−３６シグナル伝達によって媒介される疾患を治療する方法も提供し、本方法は、本明細書に開示されるような治療有効量の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体、または本明細書に開示されるような抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の治療有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む。
【００３２】
本開示は、対象のＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３、ＩＬ−３６α、ＩＬ−３６β、および／またはＩＬ−３６γ刺激性シグナル伝達によって媒介される疾患を治療する方法も提供し、本方法は、本明細書に開示されるような治療有効量の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体、または本明細書に開示されるような抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の治療有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む。
【００３３】
本明細書に開示される治療方法の様々な実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰ媒介性の疾患および状態、またはＩＬ−１、ＩＬ−３３、および／もしくはＩＬ−３６シグナル伝達によって媒介される疾患には、炎症性疾患、自己免疫疾患、呼吸器疾患、代謝性疾患、感染症、およびがんが含まれる。いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰ媒介性の疾患および状態は、にきび、急性膵炎、急性重症潰瘍性大腸炎、成人発症型スティル病、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、気道過敏性、気道炎症、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アナフィラキシー、関節炎痛、喘息、アテローム性動脈硬化症、アトピー性皮膚炎、アトピー性湿疹、自己免疫性血管炎、ベーチェット病、骨がん、脳がん、乳がん、悪液質／食欲不振、軟骨損傷、脳虚血、慢性疲労症候群、慢性閉塞性肺疾患、クロストリジウム関連疾患、結腸がん、うっ血性心不全、結膜炎、冠動脈バイパス移植、冠動脈再狭窄、クローン病、糖尿病、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、ドライアイ疾患、子宮内膜症、好酸球関連胃腸障害、好酸球性食道炎、家族性寒冷自己炎症性症候群、家族性地中海熱、発熱、線維筋痛症、線維性障害、食物アレルギー、汎発性膿疱性乾癬、緑内障、糸球体腎炎、痛風性関節炎、移植片対宿主疾患、蠕虫感染、出血性ショック、化膿性汗腺炎、痛覚過敏、高ＩｇＤ症候群、高尿酸血症、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、がん関連痛、感染症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、緊張に起因する炎症状態、角膜移植に関連する炎症性眼疾患、炎症性疼痛、インフルエンザ、腸がん、虚血、若年性関節炎、川崎病、腎臓がん、レーバー先天性黒内障、肝臓がん、肝疾患、肺がん、マックル−ウェルズ症候群、多発性骨髄腫、多発性硬化症、筋骨格痛、骨髄性および他の白血病、心筋機能不全、筋障害、鼻ポリープ、新生児発症多系統炎症性疾患、神経毒性、非感染性結膜炎、非小細胞肺がん、整形外科手術、骨関節炎、骨粗鬆症、疼痛、掌蹠膿疱症、膵臓がん、パーキンソン病、歯周病、末梢血管疾患、リウマチ性多発筋痛症、ポリープ状脈絡膜血管症（ＰＣＶ）、早産、前立腺がん、原虫感染症、乾癬、乾癬性関節炎、壊疽性膿皮症、再灌流傷害、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、再狭窄、網膜剥離、網膜色素変性症、未熟網膜症（ＲＯＰ）、関節リウマチ、敗血症性ショック、鎌状赤血球貧血、放射線療法による副作用、副鼻腔炎、皮膚がん、睡眠障害、捻挫、シュタルガルト病、胃がん、側頭下顎関節疾患、ＴＮＦ受容体関連周期性症候群、移植拒絶、外傷、外傷性眼損傷、２型糖尿病、潰瘍性大腸炎、およびブドウ膜炎から選択され得る。
【００３４】
いくつかの実施形態において、本開示は、対象のがんを治療する方法も提供し、本方法は、本明細書に開示されるような治療有効量の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の抗体、または本明細書に開示されるような抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の治療有効量の医薬製剤を対象に投与することを含む。実施形態において、がんは、乳がん、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、膵臓がんから選択される。
【００３５】
いくつかの実施形態において、本開示は、対象の喘息を治療する方法も提供し、本方法は、本明細書に開示されるような治療有効量の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の抗体、または本明細書に開示されるような抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の治療有効量の医薬製剤を対象に投与することを含む。
【００３６】
いくつかの実施形態において、本開示は、生体試料のＩＬ１ＲＡＰのレベルを検出するための方法も提供し、本方法は、本明細書に開示されるような抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体と試料とを接触させる段階を含む。本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、ＩＬ１ＲＡＰの検出および定量化のために、競合結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、免疫沈降アッセイ、ならびに酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）など、いずれかの既知のアッセイ方法で使用することができる（Ｓｏｌａ，１９８７，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．を参照）。抗体は、幅広いアッセイに適した高い親和性でｈｕ−ＩＬ１ＲＡＰに結合する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１Ａ】ＨＥＫ−ＢＬＵＥ（商標）ＩＬ−１／ＩＬ−３３応答性センサー細胞、またはＨＥＫ−ＢＬＵＥ（商標）ＩＬ−３６応答性センサー細胞（すなわち、ＩＬ−３６受容体を一過性発現するＩＬ−３３細胞）で評価され、示された種々のアゴニストで刺激されたＩＬ−１、ＩＬ−３３、およびＩＬ−３６刺激性細胞内シグナル伝達の阻害アッセイにおけるマウスハイブリドーマ由来抗ｈｕ−ＩＬ１ＲＡＰ抗体である１１Ｃ５（Ｈｙ）の結果プロットを示す。図１Ａ：ＨＥＫ−ＢＬＵＥ（商標）ＩＬ−１／ＩＬ−３３応答性細胞のＩＬ−１α刺激（［ＩＬ−１α］＝３５ｐＭ）の１１Ｃ５（Ｈｙ）阻害、ＩＣ５０＝４．７０ｎＭ。図１Ｂ：ＨＥＫ−ＢＬＵＥ（商標）ＩＬ−１／ＩＬ−３３応答性細胞のＩＬ−１β刺激（［ＩＬ−１β］＝７ｐＭ）の１１Ｃ５（Ｈｙ）阻害、ＩＣ５０＝１．００ｎＭ。図１Ｃ：ＨＥＫ−ＢＬＵＥ（商標）ＩＬ−１／ＩＬ−３３応答性細胞のＩＬ−３３刺激（［ＩＬ−３３］＝６０ｐＭ）の１１Ｃ５（Ｈｙ）阻害、ＩＣ５０＝３．７１ｎＭ。図１Ｄ：ＨＥＫ−ＢＬＵＥ（商標）ＩＬ−３６応答性細胞のＩＬ−３６α刺激（［ＩＬ−３６α］＝１０ｐＭ）の１１Ｃ５（Ｈｙ）阻害、ＩＣ５０＝２．５２ｎＭ。図１Ｅ：ＨＥＫ−ＢＬＵＥ（商標）ＩＬ−３６応答性細胞のＩＬ−３６β刺激（［ＩＬ−３６β］＝５ｐＭ）の１１Ｃ５（Ｈｙ）阻害、ＩＣ５０＝０．９８ｎＭ。図１Ｆ：ＨＥＫ−ＢＬＵＥ（商標）ＩＬ−３６応答性細胞のＩＬ−３６γ刺激（［ＩＬ−３６γ］＝７ｐＭ）の１１Ｃ５（Ｈｙ）阻害、ＩＣ５０＝０．６７ｎＭ。全てのアッセイは、約ＥＣ５０〜ＥＣ７０のアゴニスト濃度で実施され、示されているエラーバーは、二重試料からの標準偏差を表しており、陽性対照（ＰＣ）は黒い破線で表される一方、陰性対照（ＮＣ）は灰色の破線で表される。
【図１Ｂ】同上。
【図１Ｃ】同上。
【図１Ｄ】同上。
【図１Ｅ】同上。
【図１Ｆ】同上。
【図２】ハイブリドーマ由来のマウス抗ｈｕ−ＩＬ１ＲＡＰ抗体１１Ｃ５（Ｈｙ）およびこの抗体のヒト化型ｈ１１Ｃ５のＶＬおよびＶＨ領域に対して最も近縁のヒト生殖系列カッパ軽鎖ＶＬ領域（遺伝子ＩＤ−Ｖ遺伝子：ＩＧＫＶ１−ＮＬ１＊０１、Ｊ遺伝子：ＩＧＫＪ４＊０２）および重鎖ＶＨ領域（遺伝子ＩＤ−Ｖ遺伝子：ＩＧＨＶ３−７＊０３、Ｊ遺伝子：ＩＧＨＪ４＊０３）のアミノ酸配列の整列を示す。
【図３】４５０ｎｍでのバキュロウイルス（ＢＶ）粒子のＥＬＩＳＡシグナルに対する、ヒト化抗ｈｕ−ＩＬ１ＲＡＰ抗体ｈ１１Ｃ５ならびに陽性および陰性対照参照抗体の濃度のプロットを示し、ｈ１１Ｃ５によるＢＶ粒子への非特異的結合がないことを示している。
【図４Ａ】ハイブリドーマ由来の抗ｈｕ−ＩＬ１ＲＡＰ抗体１１Ｃ５（Ｈｙ）に基づいて組換え調製した下記抗体の細胞内シグナル伝達阻害アッセイ結果のプロットを示す。マウス１１Ｃ５（「ｍ１１Ｃ５」）、キメラ１１Ｃ５（「ｃ１１Ｃ５」）、ヒト化１１Ｃ５ｍＡｂ（「ｈ１１Ｃ５」）、ｃ１１Ｃ５のＣ５９Ｙ変異体（「ｃ１１Ｃ５＿Ｃ５９Ｙ」）、およびｈ１１Ｃ５のＣ５９Ｙ変異体（「ｈ１１Ｃ５＿Ｃ５９Ｙ」）。比較のために、１１Ｃ５（Ｈｙ）およびヒトアイソタイプ対照抗体（「Ｈｕ  ＩｇＧ１対照」）のアッセイ結果のプロットも含まれた。図４Ａ：ＨＥＫ−ＢＬＵＥ（商標）ＩＬ−１／ＩＬ−３３応答性細胞のＩＬ−１β刺激（［ＩＬ−１β］＝７ｐＭ）の１１Ｃ５（Ｈｙ）、ｍ１１Ｃ５およびｈ１１Ｃ５の阻害。図４Ｂ：ＨＥＫ−ＢＬＵＥ（商標）ＩＬ−１／ＩＬ−３３応答性細胞のＩＬ−３３刺激（［ＩＬ−３３］＝６０ｐＭ）の１１Ｃ５（Ｈｙ）、ｍ１１Ｃ５およびｈ１１Ｃ５の阻害。図４Ｃ：ＨＥＫ−ＢＬＵＥ（商標）ＩＬ−１／ＩＬ−３３応答性細胞のＩＬ−１β刺激（［ＩＬ−１β］＝７ｐＭ）のｈ１１Ｃ５およびｈ１１Ｃ５＿Ｃ５９Ｙの阻害。図４Ｄ：ＨＥＫ−ＢＬＵＥ（商標）ＩＬ−１／ＩＬ−３３応答性細胞のＩＬ−３３刺激（［ＩＬ−３３］＝６０ｐＭ）のｈ１１Ｃ５およびｈ１１Ｃ５＿Ｃ５９Ｙの阻害。図４Ｅ：初代ヒト肺線維芽細胞（ＰＨＬＦ）のＩＬ−１α刺激（［ＩＬ−１α］＝１０ｐＭ）のｃ１１Ｃ５＿Ｃ５９Ｙ阻害、ＩＣ５０＝３．９６ｎＭ。図４Ｆ：初代ヒト単球（ＰＨＭ）のＩＬ−１β刺激（［ＩＬ−１β］＝０．９２５ｎＭ）のｃ１１Ｃ５＿Ｃ５９Ｙ阻害、ＩＣ５０＝０．７４ｎＭ。図４Ｇ：初代ヒトＮＫ（ＰＨＮＫ）細胞のＩＬ−３３刺激（［ＩＬ−３３］＝１ｎＭ、［ＩＬ−１２］＝０．１ｎｇ／ｍＬ）のｃ１１Ｃ５＿Ｃ５９Ｙ阻害、ＩＣ５０＝２．９０ｎＭ。図４Ｈ：ＰＨＬＦのＩＬ−３６β刺激（［ＩＬ−３６β］＝２ｎＭ）のｃ１１Ｃ５＿Ｃ５９Ｙ阻害、ＩＣ５０＝０．２８ｎＭ。全ての組換え抗体には、エフェクターレス機能を付与するＮ２９７Ｇ変異も含まれている。アゴニストは約ＥＣ５０〜ＥＣ７０の有効濃度で使用した。エラーバーは、二重試料からの標準偏差を表している。陽性対照（ＰＣ）は黒い破線で表される一方、陰性対照（ＮＣ）は灰色の破線で表される。
【図４Ｂ】同上。
【図４Ｃ】同上。
【図４Ｄ】同上。
【図４Ｅ】同上。
【図４Ｆ】同上。
【図４Ｇ】同上。
【図４Ｈ】同上。
【図５Ａ】実施例９および１０に記載されているように、ＶＬまたはＶＨ領域のいずれかまたは両方に単一、二重、または三重の変異を含む、ＦａｂまたはＩｇＧタンパク質のいずれかのｈ１１Ｃ５＿Ｃ５９Ｙ／Ａ４３Ｓの親和性成熟変異体のＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞内シグナル伝達阻害アッセイ結果のプロットを示す。図５Ａ：ＨＥＫ−ＢＬＵＥ（商標）ＩＬ−１／ＩＬ−３３応答性細胞のＩＬ−１β刺激（［ＩＬ−１β］＝７ｐＭ）の阻害。図５Ｂ：ＨＥＫ−ＢＬＵＥ（商標）ＩＬ−１／ＩＬ−３３応答性細胞のＩＬ−３３刺激（［ＩＬ−３３］＝４０ｐＭ）の阻害。図５Ｃ：ＨＥＫ−ＢＬＵＥ（商標）ＩＬ−３６応答性細胞のＩＬ−３６α刺激（［ＩＬ−３６α］＝６０ｐＭ）の阻害。図１Ｄ：ＨＥＫ−ＢＬＵＥ（商標）ＩＬ−１／ＩＬ−３３応答性細胞のＩＬ−１β刺激（［ＩＬ−１β］＝９ｐＭ）の阻害。図５Ｅ：ＨＥＫ−ＢＬＵＥ（商標）ＩＬ−１／ＩＬ−３３応答性細胞のＩＬ−３３刺激（［ＩＬ−３３］＝６０ｐＭ）の阻害。図５Ｆ：ＨＥＫ−ＢＬＵＥ（商標）ＩＬ−３６応答性細胞のＩＬ−３６α刺激（［ＩＬ−３６α］＝５０ｐＭ）の阻害。図で使用される変異体の識別子に対応するＶＬおよびＶＨ領域の変異は、実施例９で説明される。図５Ａ〜Ｃは、非親和性成熟親抗体のＦａｂ型「ｈ１１Ｃ５＿ＡＣ５９Ｙ／Ａ４３Ｓ」およびＩｇＧ対照「Ｆａｂ対照」を含む、親和性成熟変異体のＦａｂ型の結果を示す。図５Ｄ〜Ｆは、親和性成熟変異体の完全長ＩｇＧ抗体型の結果を示し、非親和性成熟親抗体「ｈ１１Ｃ５＿ＡＣ５９Ｙ／Ａ４３Ｓ」の完全長ＩｇＧ抗体型およびＩｇＧ対照を含む。アイソタイプＩｇＧ対照抗体を含む、試験された全ての完全長ＩｇＧ抗体には、エフェクターレス機能を付与するＮ２９７Ｇ変異が含まれていた。ＩＬ−１βまたはＩＬ−３６α刺激のアッセイは、約ＥＣ５０〜ＥＣ６０のアゴニスト濃度で実施された。ＩＬ−３３刺激のアッセイは、約ＥＣ３５〜ＥＣ４５のアゴニスト濃度で実施された。示されるエラーバーは、二重試料からの標準偏差を表す。陽性対照（ＰＣ）は黒い破線で表される一方、陰性対照（ＮＣ）は灰色の破線で表される。
【図５Ｂ】同上。
【図５Ｃ】同上。
【図５Ｄ】同上。
【図５Ｅ】同上。
【図５Ｆ】同上。
【図６Ａ】実施例１２に記載されているように、ｈ１１Ｃ５変異体ＹＫＤ（または「１１Ｃ５−ＹＫＤ」）と比較したｈ１１Ｃ５変異体ＹＫＤ／ＹＴＥ（または「１１Ｃ５−ＹＫＤ／ＹＴＥ」）のＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞内シグナル伝達阻害アッセイ結果のプロットを示す。図６Ａは、ＩＬ−１βで刺激されたＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞のアッセイ結果を示し、図６Ｂは、ＩＬ−３３で刺激されたＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞のアッセイ結果を示し、図６Ｃは、ＩＬ−３６βで刺激されたＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞のアッセイ結果を示す。各アッセイにおいて、アゴニスト濃度はＥＣ５５に近いか、またはＥＣ５５より高い。示されるエラーバーは、二重試料からの平均の標準誤差を表す。陽性対照（ＰＣ）は黒い破線で表される一方、陰性対照（ＮＣ）は灰色の破線で表される。
【図６Ｂ】同上。
【図６Ｃ】同上。
【図７】ＩＬ−１βで刺激された単球において、ＥＣ５５より高いアゴニスト濃度で、ＹＫＤ（もしくは「１１Ｃ５−ＹＫＤ」）またはアイソタイプ対照（ＩｇＧ対照）と比較したｈ１１Ｃ５変異体抗体のＹＫＤ／ＹＴＥ（または「１１Ｃ５−ＹＫＤ／ＹＴＥ」）のブロッキング効果のアッセイのプロットを示す（実施例１２に記載の通り）。示されるエラーバーは、二重試料からの標準偏差を表す。陽性対照（ＰＣ）は黒い破線で表される一方、陰性対照（ＮＣ）は灰色の破線で表される。
【図８】ＩＬ−１αで刺激されたＰＨＬＦ細胞において、ＥＣ５５に近いか、またはＥＣ５５より高いアゴニスト濃度で、変異体ＹＫＤ（もしくは「１１Ｃ５−ＹＫＤ」）またはアイソタイプ対照（ＩｇＧ対照）と比較したｈ１１Ｃ５変異体ＹＫＤ／ＹＴＥ（または「１１Ｃ５−ＹＫＤ／ＹＴＥ」）のブロッキング効果のアッセイのプロットを示す（実施例１２に記載の通り）。示されるエラーバーは、二重試料からの標準偏差を表す。陽性対照（ＰＣ）は黒い破線で表される一方、陰性対照（ＮＣ）は灰色の破線で表される。
【図９】ＩＬ−３６βで刺激されたＨＥＫｎ細胞において、ＥＣ５５より高いアゴニスト濃度で、ＹＫＤ（もしくは「１１Ｃ５−ＹＫＤ」）またはアイソタイプ対照（ＩｇＧ対照）と比較したｈ１１Ｃ５変異体抗体のＹＫＤ／ＹＴＥ（または「１１Ｃ５−ＹＫＤ／ＹＴＥ」）のブロッキング効果のアッセイのプロットを示す（実施例１２に記載の通り）。示されるエラーバーは、二重試料からの標準偏差を表す。陽性対照（ＰＣ）は黒い破線で表される。
【図１０】ＩＬ−３６βで刺激されたＰＨＬＦ細胞において、ＥＣ５５に近いか、またはＥＣ５５より高いアゴニスト濃度で、ＹＫＤ（もしくは「１１Ｃ５−ＹＫＤ」）またはアイソタイプ対照（ＩｇＧ対照）と比較したｈ１１Ｃ５変異体抗体のＹＫＤ／ＹＴＥ（または「１１Ｃ５−ＹＫＤ／ＹＴＥ」）のブロッキング効果のアッセイのプロットを示す（実施例１２に記載の通り）。示されるエラーバーは、二重試料からの標準偏差を表す。陽性対照（ＰＣ）は黒い破線で表される一方、陰性対照（ＮＣ）は灰色の破線で表される。
【図１１】ＩＬ−１２の存在下ＩＬ−３３で刺激された初代ヒトＮＫ細胞において、ＹＫＤ（もしくは「１１Ｃ５−ＹＫＤ」）またはアイソタイプ対照（ＩｇＧ対照）と比較したｈ１１Ｃ５変異体抗体のＹＫＤ／ＹＴＥ（または「１１Ｃ５−ＹＫＤ／ＹＴＥ」）のブロッキング効果のアッセイのプロットを示す（実施例１２に記載の通り）。ＩＬ−３３は、ＥＣ５０に相当する有効濃度にある。示されるエラーバーは、二重試料からの標準偏差を表す。陽性対照（ＰＣ）は黒い破線で表される一方、陰性対照（ＮＣ）は灰色の破線で表される。
【図１２】ＥＣ５６のアゴニスト濃度で、ＩＬ−３３で刺激された好塩基球におけるｈ１１Ｃ５変異体抗体のＹＫＤ／ＹＴＥ（または「１１Ｃ５−ＹＫＤ／ＹＴＥ」）またはアイソタイプ対照（ＩｇＧ対照）のブロッキング効果のアッセイのプロットを示す（実施例１２に記載の通り）。示されるエラーバーは、二重試料からの標準偏差を表す。陽性対照（ＰＣ）は黒い破線で表される一方、陰性対照（ＮＣ）は灰色の破線で表される。
【図１３】ＥＣ３４のアゴニスト濃度で、ＩＬ−３３で刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞におけるｈ１１Ｃ５変異体抗体のＹＫＤ／ＹＴＥ（もしくは「１１Ｃ５−ＹＫＤ／ＹＴＥ」）またはアイソタイプ対照（ＩｇＧ対照）のブロッキング効果のアッセイのプロットを示す（実施例１２に記載の通り）。示されるエラーバーは、三重試料からの平均の標準誤差を表す。陽性対照（ＰＣ）は黒い破線で表される一方、陰性対照（ＮＣ）は灰色の破線で表される。
【図１４Ａ】実施例１４に記載されているように、カニクイザルで実施された薬物動態研究１、２および３から得られたデータを最もよく記載する非線形２コンパートメントモデルを示す。モデルパラメータ、変数、および初期条件は次のように定義された。「Ｖｃ」は、ｍＬ／ｋｇ単位で、体重当たりの中心コンパートメントの体積であり、「ｖｐ」は、ｍＬ／ｋｇ単位で、体重当たりの末梢コンパートメントの体積であり、「ＣＬｔ」は、ｍＬ／日／ｋｇの単位で、ＦｃＲｎ媒介性ＩｇＧ異化および再循環により生じると想定される体重当たりの線形クリアランスであり、「ＣＬｄ」は、ｍＬ／日／ｋｇの単位で、体重当たりの中心コンパートメントと末梢コンパートメントとの分布クリアランスであり、「Ａ（１）（ｔ）」は、体重当たりの時間ｔにおける中心コンパートメントの薬物量であり、したがって、血漿濃度時間プロファイルのモデル予測は、μｇ／ｋｇの単位、Ａ（１）（０）＝０で、「Ａ（１）（ｔ）／Ｖｃ」であった。また「Ａ（２）（ｔ）」は、μｇ／ｋｇの単位、Ａ（２）（０）＝０で、体重当たりの時間ｔにおける末梢コンパートメントの薬物量である。
【図１４Ｂ】実施例１４に記載されるように、カニクイザルにおける抗体の単回静注用量の投与後のＹＫＤ（図１４Ｂ）およびＹＫＤ／ＹＴＥ（図１４Ｃ）の薬物動態を示す。図１４Ｂ：４０ｍｇ／ｋｇ（黒丸で示す）、２０ｍｇ／ｋｇ（白丸）、１０ｍｇ／ｋｇ（黒四角）、３ｍｇ／ｋｇ（白四角）および１ｍｇ／ｋｇ（黒三角）のＹＫＤ用量。図１４Ｃ：４０ｍｇ／ｋｇ（黒丸で示す）、１０ｍｇ／ｋｇ（白四角）および３ｍｇ／ｋｇ（黒三角）のＹＫＤ／ＹＴＥ用量。エラーバーは標準偏差を表す。
【図１４Ｃ】同上。
【図１５】ヒトＩＬ１ＲＡＰ（分子表面）、ＩＬ−１β（濃灰色リボン）、およびＩＬ−１Ｒ１（薄灰色リボン）の三元複合体の結晶構造（ＰＤＢコード：３Ｏ４Ｏ）の分子表面およびリボン表現を示す。この表現は、実施例１５に記載されるように、抗ｈｕ−ＩＬ１ＲＡＰ抗体、ＹＩＳおよびＹＫＳの結合に有害であるが、変異した場合の参照抗体の結合には有害ではないと同定されたＩＬ１ＲＡＰアミノ酸残基の空間分布を示す。９個以上のフラグ付き置換で観察されたＩＬ１ＲＡＰ残基のＩ２４５、Ｅ２６１、およびＴ２６７は黒で彩色され、６〜８個のフラグ付き置換を有するエピトープの他の残基は濃灰色で彩色されている。
【図１６Ａ】実施例１８に記載されるように、単回ＩＬ−１β接種モデル（図１６Ａ）または単回ＩＬ−３６α接種モデル（図１６Ｂ）で決定された１４Ｆ４またはアイソタイプ対照（ＩｇＧ対照）のブロッキング効果プロットを示す。図１６Ａ：マウスに１４Ｆ４またはＩｇＧ対照を投与し、１日後にＤ−ＰＢＳまたは５０ｎｇのＩＬ−１βを腹腔内接種し、接種の２時間後、採血し、血清ＩＬ−６レベルを決定し、データは、群当たり５匹のマウスからのものであり、２つの独立実験を表し、棒グラフは平均＋／−ＳＥＭを示し、個々の円は１個体マウスからのデータを示し、１４Ｆ４またはＩｇＧ対照を投与されたマウスは白円または黒円でそれぞれ示され、アイソタイプ／ＰＢＳとアイソタイプ／ＩＬ−１β接種マウスとを比較する、またはアイソタイプ／ＩＬ−１β接種マウスと１４Ｆ４／ＩＬ−１β接種マウスとを比較するマン−ホイットニー検定を使用する＊＊ｐ≦０．０１。図１６Ｂ：マウスに１４Ｆ４またはＩｇＧ対照を投与し、１日後にＤ−ＰＢＳまたは１０ｎｇのＩＬ−３６αを経鼻接種し、接種の１日後、肺気腔の細胞炎症を決定し、データは、群当たり５匹のマウスからのものであり、２つの独立実験を表し、棒グラフは平均＋／−ＳＥＭを示し、各円は１個体マウスからのデータを示し、１４Ｆ４またはＩｇＧ対照を投与されたマウスは白円または黒円でそれぞれ示され、アイソタイプ／ＰＢＳとアイソタイプ／ＩＬ−３６α接種マウスとを比較する、またはアイソタイプ／ＩＬ−３６α接種マウスと１４Ｆ４／ＩＬ−３６α接種マウスとを比較するマン−ホイットニー検定を使用する＊＊ｐ≦０．０１。
【図１６Ｂ】同上。
【図１７Ａ】実施例１８に記載されるように、肺気腔における免疫細胞浸潤をアッセイする複数のＩＬ−１β接種モデルで決定された１４Ｆ４またはアイソタイプ対照（ＩｇＧ対照）のブロッキング効果のプロットを示す。肺気腔における５つの異なる細胞型の浸潤について、ブロッキング効果を測定した。好中球（図１７Ａ）、ＣＤ４  Ｔ細胞（図１７Ｂ）、Ｔ１−ＳＴ２＋ＣＤ４  Ｔ細胞（図１７Ｃ）、単球（図１７Ｄ）、および樹状細胞（図１７Ｅ）。−１日目および２日目に、マウスに１４Ｆ４、またはＩｇＧ対照を投与し、０、１、および２日目にＤ−ＰＢＳまたは３０ｎｇのＩＬ−１βを経鼻接種し、３日目に、肺気腔の細胞炎症が決定され、データは、群当たり５匹のマウスからのものであり、２つの独立実験を表し、棒グラフは平均＋／−ＳＥＭを示す。個々の円は１個体マウスからのデータを示し、１４Ｆ４またはＩｇＧ対照を投与されたマウスは白円または黒円でそれぞれ示され、アイソタイプ／ＰＢＳとアイソタイプ／ＩＬ−１β接種マウスとを比較する、またはアイソタイプ／ＩＬ−１β接種マウスと１４Ｆ４／ＩＬ−１β接種マウスとを比較するマン−ホイットニー検定を使用する＊ｐ≦０．０５および＊＊ｐ≦０．０１。
【図１７Ｂ】同上。
【図１７Ｃ】同上。
【図１７Ｄ】同上。
【図１７Ｅ】同上。
【図１８Ａ】実施例１８に記載されるように、肺組織におけるケモカインおよびサイトカインのレベルをアッセイする複数のＩＬ−１β接種モデルで決定された１４Ｆ４またはアイソタイプ対照（ＩｇＧ対照）のブロッキング効果のプロットを示す。ブロッキング効果は、肺組織試料から測定された３つの異なるケモカインおよびサイトカインのレベルに基づいて決定された。ＩＬ−１β（図１８Ａ）、ＩＬ−１７Ａ（図１８Ｂ）、およびＣＸＣＬ１（図１８Ｃ）。−１日目および２日目に、マウスに１４Ｆ４またはＩｇＧ対照を投与し、０、１、および２日目に、Ｄ−ＰＢＳまたは３０ｎｇのＩＬ−１βを経鼻接種し、３日目に、タンパク質ケモカインおよびサイトカイン分析用に肺組織を収集し、データは、群当たり５匹のマウスからのものであり、２つの独立実験を表し、棒グラフは平均＋／−ＳＥＭを示し、各円は１個体マウスからのデータを示し、１４Ｆ４またはＩｇＧ対照を投与されたマウスは白円または黒円でそれぞれ示され、アイソタイプ／ＰＢＳとアイソタイプ／ＩＬ−１β接種マウスとを比較する、またはアイソタイプ／ＩＬ−１β接種マウスと１４Ｆ４／ＩＬ−１β接種マウスとを比較するマン−ホイットニー検定を使用する＊ｐ≦０．０５および＊＊ｐ≦０．０１。
【図１８Ｂ】同上。
【図１８Ｃ】同上。
【図１９Ａ】実施例１８に記載されるように、血清抗体レベルをアッセイする急性ＨＤＭ喘息モデルで決定された１４Ｆ４またはアイソタイプ対照（ＩｇＧ対照）のブロッキング効果のプロットを示す。図１９Ａ：ＨＤＭ特異的ＩｇＥのアッセイ、図１９Ｂ：ＨＤＭ特異的ＩｇＧ１のアッセイ。−１、２、６、９、および１３日目に、マウスに１４Ｆ４またはＩｇＧ対照を腹腔内投与し、０〜３、６〜１０、１３および１４日目に、生理食塩水または２５μｇのＨＤＭを経鼻接種し、最終接種１日後に、採血し、血清ＨＤＭに特異的なＩｇＥおよびＩｇＧ１のレベルを決定し、データは、群当たり６〜１０匹のマウスからのものであり、２つの独立実験を表し、棒グラフは平均＋／−ＳＥＭを示し、各円は１個体マウスからのデータを示し、１４Ｆ４またはＩｇＧ対照を投与されたマウスは白円または黒円でそれぞれ示され、アイソタイプ／生理食塩水とアイソタイプ／ＨＤＭ接種マウスとを比較する、またはアイソタイプ／ＨＤＭ接種マウスと１４Ｆ４／ＨＤＭ接種マウスとを比較するマン−ホイットニー検定を使用する＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１および＊＊＊ｐ≦０．００１。
【図１９Ｂ】同上。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本開示は抗体を提供し、抗体には、高い親和性でヒトＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合するヒト化抗体が含まれる。開示された抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、ＩＬ−１、ＩＬ−３３、および／またはＩＬ−３６シグナル伝達経路を含むＩＬ１ＲＡＰ媒介性経路による細胞内シグナル伝達を減少、阻害、および／または完全ブロッキングすることができる。より具体的には、本明細書に開示される抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、以下のアゴニストのうちの１つ以上の結合によって刺激されるシグナル伝達を減少、阻害、および／または完全ブロッキングすることができる。ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３、ＩＬ−３６α、ＩＬ−３６β、およびＩＬ−３６γ。本開示は、ＩＬ１ＲＡＰ媒介性疾患を治療する方法における抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の使用も提供し、該疾患には、ＩＬ−１、ＩＬ−３３、および／またはＩＬ−３６シグナル伝達の阻害に応答する疾患および状態が含まれ、種々のがん（例えば、乳房、結腸直腸、非小細胞肺、膵臓）、ならびに関節炎、喘息、および潰瘍性大腸炎を含む炎症性、感染性、および自己免疫性の疾患が含まれるが、これらに限定されない。
【００３９】
用語および技法の概要
本明細書の記載および添付の特許請求の範囲について、単数形「ａ」および「ａｎ」は、明らかに別段の指示がない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「タンパク質（ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」への言及には複数のタンパク質が含まれ、「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」への言及は複数の化合物を指す。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、互いに交換可能であり、限定することを意図するものではない。様々な実施形態の記載が「含む」という用語を使用する場合、当業者は、いくつかの特定の例において、実施形態が「本質的にからなる」または「からなる」という言語を使用して代替的に説明できることを理解するであろうことをさらに理解されたい。
【００４０】
値の範囲が提供される場合、文脈上明らかに別段の指示がない限り、その範囲の上限と下限の間にある値の各介在整数、および値の各介在整数の各１０分の１、明らかに別段の指示がない限り、およびその記載範囲における任意の他の記載値または介在値は、本発明に包含されると理解される。これらのより小さな範囲の上限および下限は、独立してより小さな範囲に含まれ、本発明内にも包含され、記載範囲における明確に除外される制限を受ける。記載範囲がこれらの制限の一方または両方を含む場合、これらの含まれる制限の（ｉ）いずれかまたは（ｉｉ）両方を除く範囲も本発明に含まれる。例えば、「１〜５０」には、「２〜２５」、「５〜２０」、「２５〜５０」、「１〜１０」などが含まれる。
【００４１】
一般に、本明細書で使用される命名法ならびに本明細書に記載される技法および手順は、当業者によって十分に理解されかつ一般的に使用されるものを含み、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄ．），Ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９（ｈｅｒｅｉｎａｆｔｅｒ  “Ｓａｍｂｒｏｏｋ”）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ２０１１）（ｈｅｒｅｉｎａｆｔｅｒ  “Ａｕｓｕｂｅｌ”）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌｓ．１  ａｎｄ  ２，Ｒ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｓ．Ｄｕｂｅｌ，ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ（２０１０）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｖ．Ｏｓｓｉｐｏｗ  ａｎｄ  Ｎ．Ｆｉｓｃｈｅｒ，ｅｄｓ．，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２０１４）、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｆｒｏｍ  Ｂｅｎｃｈ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃ，Ｚ．Ａｎ，ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．（２００９）、およびＰｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ，Ｔｉｍ  Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ｈｅｎｒｙ  Ｂ．Ｌｏｗｍａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ（２００４）に記載される一般的な技法および方法論などである。
【００４２】
本開示で参照される全ての出版物、特許、特許出願、および他の文書は、個々の出版物、特許、特許出願、または他の文書が、あらゆる目的で参照として本明細書に組み込まれることを個別に示すような場合と同程度に、あらゆる目的で全体を参照として本明細書に組み込まれる。
【００４３】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、限定することを意図するものではないことを理解されたい。本開示を解釈する目的で、以下の用語の説明が適用され、適切な場合、単数形で使用される用語は複数形も含み、逆もまた同様である。
【００４４】
本明細書で使用される「ＩＬ１ＲＡＰ」とは、ＩＬ−１ファミリーにおけるいくつかの受容体の細胞膜共受容体であるインターロイキン−１受容体アクセサリータンパク質を指し、インターロイキン−１受容体１（ＩＬ１Ｒ１）、ＳＴ２（インターロイキン−１受容体様１またはＩＬ１ＲＬ１としても知られる）、およびインターロイキン−１受容体様タンパク質２（ＩＬ１ＲＬ２）を含む。インターロイキン−１受容体アクセサリータンパク質、またはＩＬ１ＲＡＰは、当技術分野では、「ＩＬ−１ＲＡＰ」、「ＩＬ−１ＲＡｃＰ」、「ＩＬ１ＲＡｃＰ」または「ＩＬ−１Ｒ３」と呼ばれることがあることに留意されたい。「ＩＬ１ＲＡＰ」、「ＩＬ１ＲＡＰポリペプチド」、および「ＩＬ１ＲＡＰタンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
【００４５】
本明細書で使用される「ＩＬ１ＲＡＰ媒介性状態」または「ＩＬ１ＲＡＰ媒介性疾患」は、共受容体として作用するＩＬ１ＲＡＰと共にサイトカインのＩＬ−１ファミリーによって媒介されるシグナル伝達経路の異常な機能に関連する任意の病状を包含し、該経路は、ＩＬ−１ファミリーサイトカインのＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３、ＩＬ−３６α、ＩＬ−３６β、およびＩＬ−３６γによって刺激される下流のシグナル伝達経路を含むが、これらに限定されない。例えば、ＩＬ１ＲＡＰ媒介性疾患には、がん、炎症性、感染性および自己免疫性の疾患を含む、ＩＬ−１、ＩＬ−３３、および／またはＩＬ−３６シグナル伝達経路のアンタゴニストまたは阻害剤によって媒介および／または応答する疾患が含まれ得るが、これらに限定されない。より具体的には、ＩＬ１ＲＡＰ媒介性疾患には、にきび、急性重症潰瘍性大腸炎、成人発症スティル病、アレルギー性鼻炎、痛風関節炎、若年性関節炎、骨関節炎、関節リウマチ、関節炎痛、喘息、アテローム性動脈硬化症、アトピー性湿疹、ベーチェット病、悪液質、乳がん、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、膵臓がん、慢性閉塞性肺疾患、ドライアイ症候群、家族性寒冷自己炎症性症候群、家族性地中海熱、食物アレルギー、汎発性膿疱性乾癬、化膿性汗腺炎、高ＩｇＤ症候群、高尿酸血症、マックル−ウェルズ症候群、新生児発症多系統炎症性疾患、筋骨格痛、掌蹠膿疱症、末梢血管疾患、リウマチ性多発筋痛症、鼻ポリープ、乾癬、壊疽性膿皮症、再狭窄、鎌状赤血球貧血、副鼻腔炎、ＴＮＦ受容体関連周期性症候群、２型糖尿病、および潰瘍性大腸炎が含まれ得るが、これらに限定されない。
【００４６】
本明細書で使用される「ＩＬ−１刺激性シグナル」とは、ＩＬ−１αまたはＩＬ−１βなどのＩＬ−１サイトカインがその同族細胞表面受容体であるＩＬ１Ｒ１に結合することによって開始される細胞内シグナルを指す。例示的なＩＬ−１刺激性シグナルには、本明細書の実施例に開示されるようなＨＥＫ−ＢＬＵＥ（商標）ＩＬ−１応答性細胞アッセイなど、細胞ブロッキングアッセイを使用して測定可能なものが含まれる。
【００４７】
本明細書で使用される「ＩＬ−３３刺激性シグナル」とは、ＩＬ−３３などのＩＬ−３３サイトカインがその同族細胞表面受容体であるＩＬ１ＲＬ１（ＳＴ２としても知られる）に結合することによって開始される細胞内シグナルを指す。例示的なＩＬ−３３刺激性シグナルには、本明細書の実施例に開示されるようなＨＥＫ−ＢＬＵＥ（商標）ＩＬ−３３応答性細胞アッセイなど、細胞ブロッキングアッセイを使用して測定可能なものが含まれる。
【００４８】
本明細書で使用される「ＩＬ−３６刺激性シグナル」は、ＩＬ−３６α、ＩＬ−３６β、またはＩＬ−３６γなどのＩＬ−３６サイトカインがその同族細胞表面受容体であるＩＬ１ＲＬ２に結合することによって開始される細胞内シグナルを指す。例示的なＩＬ−３６刺激性シグナルには、本明細書の実施例に開示されるようなＨＥＫ−ＢＬＵＥ（商標）ＩＬ−３６応答性細胞アッセイなど、代替細胞ブロッキングアッセイによって測定されるものが含まれる。
【００４９】
「細胞ブロッキングアッセイ」とは、抗体が結合する抗原の生物活性を阻害または低減する抗体の能力を測定することができるアッセイを指す。例えば、細胞ブロッキングアッセイを使用して、ＩＬ−１、ＩＬ−３３、およびＩＬ−３６のシグナル伝達経路を介したＩＬ１ＲＡＰ媒介性細胞内シグナル伝達など、特定の生物学的機能または生化学的機能を阻害するために必要な抗体の濃度を測定することができる。いくつかの実施形態において、抗体（例えば、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体）の半数阻害濃度（ＩＣ５０）および／または９０％阻害濃度（ＩＣ９０）は、細胞ブロッキングアッセイを使用して測定される。いくつかの実施形態において、細胞ブロッキングアッセイを使用して、抗体がアゴニスト（例えば、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３、ＩＬ−３６α、ＩＬ−３６β、ＩＬ−３６γ）とその同族受容体との相互作用をブロッキングするか否かを決定する。本開示の抗体を用いる有用な細胞ブロッキングアッセイは、初代細胞アッセイ（例えば、ＰＨＬＦ細胞）、ならびにレポーターまたはセンサー細胞アッセイ（例えば、ＨＥＫ−ＢＬＵＥ（商標）レポーター細胞アッセイ）を含み得る。好適なＨＥＫ−ＢＬＵＥ（商標）特異的サイトカイン応答性レポーター細胞アッセイなど、ＩＬ−１、ＩＬ−３３、およびＩＬ−３６シグナル伝達経路の例示的な細胞ブロッキングアッセイは、本明細書で提供される実施例に記載されている。
【００５０】
本明細書で使用される「抗体」とは、特定の抗原に特異的に結合するか、または免疫学的に反応する１つ以上のポリペプチド鎖を含む分子を指す。本開示の例示的な抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、多重特異性（またはヘテロコンジュゲート）抗体（例えば、二重特異性抗体）、一価抗体（例えば、単一アーム抗体）、多価抗体、抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｒＩｇＧ、およびｓｃＦｖ断片）、抗体融合物、および合成抗体（または抗体模倣物）が含まれる。
【００５１】
「抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体」または「ＩＬ１ＲＡＰに結合する抗体」とは、抗体がＩＬ１ＲＡＰを標的とする際の診断剤および／または治療剤として有用であるように十分な親和性でＩＬ１ＲＡＰに結合する抗体を指す。いくつかの実施形態において、無関係の非ＩＬ１ＲＡＰ抗原への抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される場合、ＩＬ１ＲＡＰへの抗体結合の約１０％未満である。いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに結合する抗体は、＜１μＭ、＜１００ｎＭ、＜１０ｎＭ、＜１ｎＭ、＜０．１ｎＭ、＜０．０１ｎＭ、または＜１ｐＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。
【００５２】
「完全長抗体」、「インタクト抗体」、または「全抗体」とは、本明細書で互換的に使用され、天然の抗体構造に実質的に類似する構造を有する抗体、または本明細書で定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
【００５３】
「抗体断片」とは、完全長抗体と同じ抗原に結合することができる完全長抗体の一部を指す。抗体断片の例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、線形抗体、一価または単一アーム抗体、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）および抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【００５４】
抗体の「クラス」とは、その重鎖が保有する定常ドメインまたは定常領域の種類を指す。抗体には、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの５つの主要なクラスがあり、これらのいくつかは、さらに、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２に分類される。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。
【００５５】
「可変領域」または「可変ドメイン」とは、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨおよびＶＬ）は一般に類似の構造を有し、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）および３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む（例えば、Ｋｉｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，ｐａｇｅ  ９１を参照）。単一のＶＨまたはＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、ＶＨまたはＶＬドメインを使用して、該抗原に結合する抗体から単離し、それぞれ相補的なＶＬまたはＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングすることができる（例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５０：８８０−８８７（１９９３）；Ｃｌａｒｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）を参照）。
【００５６】
本明細書で使用される「超可変領域」または「ＨＶＲ」とは、配列が超可変性であり、かつ／または構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般に、天然抗体は、６つのＨＶＲを有する４つの鎖を含み、重鎖可変ドメインＶＨ（ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３）に３つ、軽鎖可変ドメインＶＬ（ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３）に３つである。ＨＶＲは一般に、超可変ループおよび／または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を含む。別段に明記しない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基および他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に従って本明細書で付番される。
【００５７】
本明細書で使用される「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とは、最も高い配列多様性を有するおよび／または抗原認識に関与する、可変ドメインのＨＶＲ内の領域を指す。一般に、天然抗体は、６つのＣＤＲを有する４つの鎖を含み、重鎖可変ドメインＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に３つ、軽鎖可変ドメインＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つである。例示的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基２４〜３４、Ｌ２の５０〜５６、Ｌ３の８９〜９７、Ｈ１の３１〜３５Ｂ、Ｈ２の５０〜６５、およびＨ３の９５〜１０２で出現する。（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．、前出）。
【００５８】
「フレームワーク」または「ＦＲ」とは、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４の４つのＦＲドメインで構成される。したがって、ＨＶＲおよびＦＲ配列は、一般に、ＶＨ（またはＶＬ）において次の配列で出現する。ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００５９】
「天然抗体」とは、天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、ジスルフィド結合した２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖で構成されている。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖は可変領域（ＶＨ）を有し、可変重ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれ、その後に３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）が続く。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は可変領域（ＶＬ）を有し、可変軽ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれ、その後に定常軽（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つのタイプのうちの１つに割り当てられ得る。
【００６０】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」とは、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体を指し、すなわち、該集団を含む個々の抗体は、可能な変異体抗体（例えば、変異体抗体は、天然に存在する変異またはモノクローナル抗体の産生中に生じる変異、および一般に少量存在する変異を含む）を除いて、同一であり、かつ／または同じエピトープに結合する。典型的には、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、「モノクローナル」という用語は、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない様々な技法によって作製され得、このような方法および他の例示的なモノクローナル抗体作製法は、本明細書に記載されている。
【００６１】
「キメラ抗体」とは、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の供給源または種に由来し、一方、重鎖および／または軽鎖の残りが異なる供給源または種に由来する抗体を指す。
【００６２】
「ヒト化抗体」とは、非ヒトＨＶＲからのアミノ酸配列およびヒトＦＲからのアミノ酸配列を含むキメラ抗体を指す。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含み、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のＨＶＲに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト抗体のＦＲに対応する。ヒト化抗体は、必要に応じて、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含み得る。抗体の「ヒト化形態」、例えば、非ヒト抗体とは、ヒト化を受けた抗体を指す。
【００６３】
「ヒト抗体」とは、ヒトもしくはヒト細胞によって産生される抗体またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体をコードする配列を利用する非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有する抗体を指す。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。
【００６４】
「ヒト共通フレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨ配列は、可変ドメイン配列のサブグループから選択される。一般に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ（１９９１），ｖｏｌｓ．１−３のようなサブグループである。一実施形態において、ＶＬの場合、サブグループは、前出のＫａｂａｔらのように、サブグループカッパＩである。一実施形態において、ＶＨの場合、サブグループは、前出のＫａｂａｔらのようにサブグループＩＩＩである。
【００６５】
本明細書で使用される「アクセプターヒトフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒト共通フレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワークまたは重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒト共通フレームワークに「由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含み得るか、またはアミノ酸配列の変化を含み得る。いくつかの実施形態において、アミノ酸の変化数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、または２以下である。いくつかの実施形態において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒト共通フレームワーク配列と配列が同一である。
【００６６】
「Ｆｃ領域」とは、免疫グロブリン重鎖のＣ末端ポリペプチド配列を含む二量体複合体を指し、Ｃ末端ポリペプチド配列は、インタクト抗体のパパイン消化によって得られるものである。Ｆｃ領域は、天然または変異体のＦｃ配列を含み得る。免疫グロブリン重鎖のＦｃ配列の境界は変化する場合があるが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ配列は通常、約Ｃｙｓ２２６番目でのアミノ酸残基から、または約Ｐｒｏ２３０番目からＬｙｓ４４７でのＦｃ配列のカルボキシル末端まで伸長すると定義される。しかしながら、Ｆｃ配列のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、組換え生産に使用される細胞培養システム（例えば、ＣＨＯ細胞での生産）で生じ得る酵素切断により組換え抗体のＦｃ領域に存在する場合と存在しない場合がある。免疫グロブリンのＦｃ配列は、一般に、２つの定常ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含み、必要に応じて、ＣＨ４ドメインを含む。
【００６７】
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」とは、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を指す。いくつかの実施形態において、ＦｃＲは、天然のヒトＦｃＲである。いくつかの実施形態において、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合するものであり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含み、これらの受容体の対立遺伝子変異体および選択的スプライシング形態を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）が含まれ、これらは主にその細胞質ドメインが異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（例えば、Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５：２０３−２３４（１９９７）を参照）。本明細書で使用されるＦｃＲは、新生児受容体であるＦｃＲｎも含み、ＦｃＲｎは、胎児への母体ＩｇＧの移動（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１  １７：５８７（１９７６）およびＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４：２４２９−２４３４（１９９４））および免疫グロブリンの恒常性の調節に関与する。ＦｃＲは、例えば、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，９：４５７−９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４（１９９４）；ａｎｄ  ｄｅ  Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１２６：３３０−４１（１９９５）で概説されている。
【００６８】
本明細書で使用される「多価抗体」は、３つ以上の抗原結合部位を含む抗体である。多価抗体は、好ましくは、３つ以上の抗原結合部位を有するように操作され、一般に、天然配列のＩｇＭまたはＩｇＡ抗体ではない。
【００６９】
「多重特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる結合部位を有し、各部位が異なる結合特異性を有する抗体である。多重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片であることができ、異なる結合部位は、それぞれ異なる抗原に結合し得るか、または異なる結合部位は、同じ抗原の２つの異なるエピトープに結合し得る。
【００７０】
「Ｆｖ断片」とは、完全な抗原認識および結合部位を含む抗体断片を指す。この領域は、緊密に結合した１つの重鎖および１つの軽鎖の可変ドメインの二量体で構成されており、例えば、ｓｃＦｖでは天然で共有結合性であり得る。各可変ドメインの３つのＨＶＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を規定するのは、この構成においてである。まとめると、６つのＨＶＲまたはそのサブセットは、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、通常は結合部位全体よりも低い親和性であるが、抗原を認識して結合する能力を有する。
【００７１】
「Ｆａｂ断片」とは、軽鎖の可変および定常ドメイン、ならびに重鎖の可変ドメインおよび第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む抗体断片を指す。「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、一対のＦａｂ断片を含み、これらは一般に該Ｆａｂ断片間のヒンジシステインによってそれらのカルボキシ末端近くで共有結合している。抗体断片の他の化学カップリングも当技術分野で知られている。
【００７２】
本明細書で使用される「抗原結合アーム」とは、目的の標的分子に特異的に結合する能力を有する抗体の構成要素を指す。典型的には、抗原結合アームは、免疫グロブリンポリペプチド配列、例えば、免疫グロブリン軽鎖および重鎖のＨＶＲおよび／または可変ドメイン配列の複合体である。
【００７３】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」とは、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体断片を指し、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドには、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に、ＳｃＦｖが所望の抗原結合構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーがさらに含まれる。
【００７４】
「ダイアボディ」とは、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、この断片は、同じポリペプチド鎖（ＶＨおよびＶＬ）に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは別の鎖の相補的ドメインと対合するしかなく、２つの抗原結合部位を作成する。
【００７５】
「線形抗体」とは、Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５）に記載されている抗体を指す。簡潔に述べると、これらの抗体は、相補的な軽鎖ポリペプチドと共に、一対の抗原結合領域を形成する重鎖断片（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）のタンデム反復を含む。線形抗体は二重特異性または単一特異性であり得る。
【００７６】
「裸の抗体」とは、異種部分（例えば、細胞傷害部分）または放射性標識に結合していない抗体を指す。
【００７７】
「親和性」とは、分子の単一結合部位（例えば、抗体）とその結合相手（例えば、抗原）との非共有相互作用全体の強さを指す。「結合親和性」とは、結合対のメンバー（例えば、抗体および抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘのその相手Ｙに対する親和性は、一般に平衡解離定数（ＫＤ）で表すことができる。親和性は、当技術分野で知られている一般的方法によって測定することができ、本明細書に記載されているものを含む。結合親和性を測定するための具体的な事例的および例示的な実施形態を以下に記載する。
【００７８】
「特異的に結合する」または「特異的結合」とは、わずか約１×１０−７Ｍの親和性値を有する抗原への抗体の結合を指す。
【００７９】
「親和性成熟」抗体とは、このような変化を保有しない親抗体と比較して、１つ以上のＨＶＲに１つ以上の変化を有する抗体を指し、このような変化は、抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす。
【００８０】
抗体の「機能的抗原結合部位」は、標的抗原に結合できる部位である。抗原結合部位の抗原結合親和性は、必ずしも抗原結合部位が由来する親抗体ほど強力ではないが、抗原に結合する能力は、抗原への抗体の結合を評価するために知られている様々な方法のいずれか１つを使用して測定可能でなければならない。
【００８１】
「単離された抗体」とは、その自然環境の構成要素から分離された抗体を指す。いくつかの実施形態において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー法（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）により決定されるように９５％超または９９％の純度に精製される。抗体純度の評価方法の概説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ  Ａｎａｌｙｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ，８４８：７９−８７を参照。
【００８２】
本明細書で使用される「実質的に類似する」または「実質的に同じ」とは、２つの数値（例えば、一方は試験抗体に関連し、他方は参照抗体に関連する）間の十分に高度な類似性を指し、当業者は、２つの値の差が、該値（例えば、ＫＤ値）によって測定される生物学的特徴に照らして、生物学的および／または統計的な有意性がほとんどまたは全くないとみなすであろう。
【００８３】
本明細書で使用される「実質的に異なる」とは、２つの数値（一般に、一方は分子に関連し、他方は参照分子に関連する）間の十分に高度な差異を指し、当業者は、２つの値の差が、該値（例えば、ＫＤ値）によって測定される生物学的特徴に照らして、統計的に有意であると見なすであろう。
【００８４】
「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域に起因する生物活性を指し、抗体のアイソタイプによって異なる。抗体エフェクター機能の例には、Ｃｌｑ結合および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方調節およびＢ細胞の活性化が含まれる。
【００８５】
「免疫複合体」とは、細胞毒性剤を含むがこれに限定されない、１つ以上の異種分子に結合した抗体を指す。
【００８６】
「治療」、「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」とは、治療されている個体の障害の自然経過を変えようとする試みにおける臨床的介入を指し、予防のために、または臨床病理学の過程のいずれかで実施することができる。治療の望ましい結果には、障害の発生または再発の予防、症状の緩和（ａｌｌｅｖｉａｔｉｏｎ）、障害の任意の直接的または間接的な病理学的結果の減少、転移の予防、進行速度の低下、病態の改善または緩和（ｐａｌｌｉａｔｉｏｎ）、および寛解または予後の改善が含まれ得るが、これらに限定されない。例えば、治療は、ＩＬ１ＲＡＰによって媒介される疾患または状態の発症を遅延させるか、または進行を遅らせるために、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を含む治療有効量の医薬製剤を対象に投与することを含み得る。
【００８７】
「医薬製剤」とは、有効成分（複数可）の生物活性が有効であり、製剤が投与される対象に毒性のある追加成分を含まない形態の調製物を指す。
【００８８】
「薬学的に許容される担体」とは、それが投与される対象に対して無毒である、有効成分以外の医薬製剤の成分を指す。薬学的に許容される担体には、緩衝剤、賦形剤、安定剤、または防腐剤が含まれるが、これらに限定されない。
【００８９】
「治療有効量」とは、例えば、対象の疾患、障害、または状態を治療または予防するために所望する治療結果または予防結果を達成するための有効成分または薬剤（例えば、医薬製剤）の量を指す。ＩＬ１ＲＡＰ媒介性の疾患または状態の場合、治療剤の治療有効量は、該疾患、障害、または状態に関連する１つ以上の症状をある程度低減、予防、阻害、および／または軽減する量である。喘息療法の場合、インビボでの有効性は、例えば、症状の持続時間、重症度、および／もしくは再発、応答率（ＲＲ）、応答の持続時間、ならびに／または生活の質を評価することによって測定することができる。
【００９０】
本明細書で使用される「同時に」とは、２つ以上の治療剤の投与を指し、投与の少なくとも一部が時間的に重複する。したがって、同時投与は、１つ以上の他の薬剤の投与を中止した後、１つ以上の薬剤の投与が継続する場合の投薬計画を含む。
【００９１】
「個体」または「対象」とは、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）を含むがこれらに限定されない哺乳動物を指す。
【００９２】
様々な実施形態の詳細な説明
Ｉ．サイトカインのＩＬ−１ファミリー
ＩＬ−１ファミリーは、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３、ＩＬ−３６α、ＩＬ−３６β、およびＩＬ−３６γを含む、多くのアゴニストサイトカインを含み、免疫、細胞増殖、および炎症の病原性メディエーターおよびレギュレーターとして機能する。このような各サイトカインのそれぞれの同族細胞膜受容体への結合は、ＩＬ１ＲＡＰ共受容体の動員および細胞内シグナル伝達を誘発するシグナル伝達複合体の形成をもたらす。
【００９３】
例えば、ＩＬ−１αはアゴニストサイトカインとして作用し、その同族受容体であるＩＬ１Ｒ１への結合を介して細胞内シグナル伝達を開始する。ＩＬ−１αがＩＬ１Ｒ１に結合すると、共受容体アクセサリータンパク質ＩＬ１ＲＡＰが動員され、結合して、ＩＬ−１α、ＩＬ１Ｒ１、およびＩＬ１ＲＡＰを含む三元シグナル伝達複合体を形成する。ＩＬ−１アルファによって刺激されたシグナル伝達は、標的細胞で核因子カッパＢ（ＮＦ−κＢ）転写因子経路およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路の活性化を引き起こし、病原性炎症、細胞増殖、および免疫応答のカスケードを誘発する。その後のシグナル伝達カスケードは、病原性炎症、細胞増殖、および免疫応答に関連するいくつかのタンパク質の発現をもたらす。例えば、Ｇａｒｌａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３９：１００３−１０１８（２０１３）を参照。
【００９４】
同様に、ＩＬ−１βはアゴニストサイトカインとして作用し、その同族受容体であるＩＬ１Ｒ１に結合することによって細胞内シグナル伝達を開始する。ＩＬ−１βがＩＬ１Ｒ１に結合すると、共受容体ＩＬ１ＲＡＰが動員され、結合して、ＩＬ−１β、ＩＬ１Ｒ１、およびＩＬ１ＲＡＰを含む三元シグナル伝達複合体が形成される。ＩＬ−１βによって媒介されるシグナル伝達は、標的細胞におけるＮＦ−κＢ転写因子経路およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼ経路の活性化をもたらし、これは、シグナル伝達カスケードを誘発し、病原性炎症、細胞増殖、免疫応答に関連する多くのタンパク質の発現をもたらす。例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１（１）：９０５−９１２（２０１０）、Ｓａｌｕｊａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓｌ．Ａｌｌｅｒｇｙ，５：３３（２０１５）を参照。
【００９５】
アゴニストサイトカインＩＬ−３３は、その同族受容体ＳＴ２（ＩＬ１ＲＬ１としても知られる）に結合することによって、その機能的細胞内シグナル伝達効果を媒介し、続いて共受容体ＩＬ１ＲＡＰの動員および結合により、ＩＬ−３３、ＳＴ２、およびＩＬ１ＲＡＰを含む三元シグナル伝達複合体を形成する。ＩＬ−３３によって媒介されるシグナル伝達は、ＮＦ−κＢ転写因子経路およびＡＰ−１経路の活性化をもたらし、幅広い免疫応答および炎症反応を引き起こす。例えば、Ｓｅｂａｓｔｉａｎ  Ｇｕｎｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，４７：５１０−５２３（２０１７）を参照。シグナル伝達カスケードは、病原性の炎症性、細胞増殖性、および免疫性の応答に関連する多くのタンパク質の発現をもたらす。Ｓｈａｆａｑａｔ  Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１０４（４７）：１８６６０−１８６６５（２００７）。
【００９６】
アゴニストサイトカインＩＬ−３６α、ＩＬ−３６β、およびＩＬ−３６γのそれぞれは、同族受容体であるＩＬ１ＲＬ２に結合することによって細胞内シグナル伝達を誘導する。これらのＩＬ−３６サイトカインのいずれかによるＩＬ１ＲＬ２への結合は、共受容体ＩＬ１ＲＡＰの動員および結合を引き起こし、ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬ１ＲＡＰ、およびシグナル伝達事象を開始した各ＩＬ−３６サイトカインを含む三元シグナル伝達複合体の形成をもたらす。ＩＬ−３６α、ＩＬ−３６β、またはＩＬ−３６γによって刺激されたシグナル伝達は、標的細胞のＮＫ−κＢ転写因子およびＡＰ−１経路の活性化をもたらし、様々な炎症性、増殖性、および病原性の免疫応答を誘導する。例えば、Ｊｅｎｎｉｆｅｒ  Ｔｏｗｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９（１４）：１３６７７−１３６８８（２００４）、Ｓｅｂａｓｔｉａｎ  Ｇｕｎｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９３（２）：９２１−９３０（２０１４）を参照。
【００９７】
ＩＩ．ＩＬ１ＲＡＰ
ＩＬ１ＲＡＰは、特定の細胞表面に発現する膜タンパク質である。ヒトＩＬ１ＲＡＰ（本明細書では「ｈｕ−ＩＬ１ＲＡＰ」とも呼ばれる）の配列および注釈は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＢ８４０５９．１またはＵｎｉＰｒｏｔエントリーＱ９ＮＰＨ３で見出すことができる。完全長ｈｕ−ＩＬ１ＲＡＰ前駆体タンパク質のアミノ酸配列は、本明細書に配列番号１として記載されている。完全長ｈｕ−ＩＬ１ＲＡＰをコードする例示的な１７４０ヌクレオチド配列は、本明細書に配列番号２として記載されている。
【００９８】
完全長ｈｕ−ＩＬ１ＲＡＰのアミノ酸配列は、シグナルペプチド、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを順序通りに含む。シグナル配列は、配列番号１のアミノ酸１〜２０を含む。ｈｕ−ＩＬ１ＲＡＰの成熟型は、配列番号１のアミノ酸２１〜５７０を含む。ｈｕ−ＩＬ１ＲＡＰの細胞外ドメインは、配列番号１のアミノ酸２１〜３６７を含む。ｈｕ−ＩＬ１ＲＡＰの細胞外ドメインはさらに３つの異なるドメインを含む。ドメイン１（「Ｄ１」）は、配列番号１のアミノ酸２１〜１３３を含む。ドメイン２（「Ｄ２」）は、配列番号１のアミノ酸１３４〜２３７を含む。ドメイン３（「Ｄ３」）は、配列番号１のアミノ酸２３８〜３６７を含む。ｈｕ−ＩＬ１ＲＡＰの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインは、配列番号１のアミノ酸３６８〜３８８、およびアミノ酸３８９〜５７０をそれぞれ含む。
【００９９】
完全長ｈｕ−ＩＬ１ＲＡＰタンパク質の一部に対応するポリペプチド構築物は、高い結合親和性で抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を誘発するための抗原として使用することができる。本明細書の他の箇所で開示されるように、これらの抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３、ＩＬ−３６α、ＩＬ−３６β、およびＩＬ−３６γのうちの１つ以上がその同族受容体に結合することによって開始される細胞内シグナルを減少させることができる。抗原として有用なｈｕ−ＩＬ１ＲＡＰタンパク質の部分に対応するポリペプチド構築物には、ｈｕ−ＩＬ１ＲＡＰの細胞外ドメイン、ならびにドメインＤ１、Ｄ２、Ｄ１＋Ｄ２、およびＤ３に対応するポリペプチドが含まれる。
【０１００】
以下の表１は、本開示のｈｕ−ＩＬ１ＲＡＰポリペプチド構築物配列の要約説明、およびそれらの配列識別子を提供する。さらに、マウスおよびカニクイザルのＩＬ１ＲＡＰタンパク質に対応する簡易ポリペプチド構築物は、抗ｈｕ−ＩＬ１ＲＡＰ抗体の交差反応性を決定するのに有用であるため、提供される。配列は、添付の配列表にも含まれる。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【０１０１】
ＩＩＩ．抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体
いくつかの実施形態において、本開示は、様々な周知の免疫グロブリン特徴（例えば、ＣＤＲ、ＨＶＲ、ＦＲ、ＶＨ、およびＶＬドメイン）のアミノ酸配列およびコードヌクレオチド配列に関して抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の構造を提供する。以下の表２は、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体配列、およびこれらの配列識別子の要約説明を提供する。配列は、添付の配列表に含まれる。
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【表２−７】
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【表２−８】
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【表２−９】
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【表２−１０】
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【表２−１１】
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【表２−１２】
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【０１０２】
１．抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の結合親和性および細胞シグナル伝達阻害
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、ヒトＩＬ１ＲＡＰに結合するための平衡解離定数（ＫＤ）が、＜１００ｎＭ、＜１０ｎＭ、＜１ｎＭ、＜０．１ｎＭ、＜０．０１ｎＭ、または＜０．００１ｎＭである（例えば、１０−８Ｍ以下、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）。より具体的には、いくつかの実施形態において、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、１×１０−８Ｍ以下、１×１０−９Ｍ以下、１×１０−１０Ｍ以下または１×１０−１１Ｍ以下の結合親和性でヒトＩＬ１ＲＡＰに結合する。いくつかの実施形態において、結合親和性は、配列番号３のｈｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰポリペプチドに結合するための平衡解離定数（ＫＤ）として測定される。一般に、リガンドのその受容体への結合親和性は、様々なアッセイのいずれかを使用して決定することができ、様々な定量値で表すことができる。抗体の親和性を決定するのに有用である具体的なＩＬ１ＲＡＰ結合アッセイは、本明細書の実施例に開示されている。さらに、抗原結合アッセイが、当技術分野で知られており、本明細書で使用することができ、ウエスタンブロット、放射性免疫アッセイ、酵素結合免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、表面プラズモン共鳴に基づくアッセイ（ＷＯ２００５／０１２３５９に記載されているＢＩＡｃｏｒｅアッセイなど）、免疫沈降アッセイ、蛍光免疫アッセイ、およびプロテインＡ免疫アッセイなどの技法を使用する任意の直接または競合結合アッセイを含むが、これらに限定されない。
【０１０３】
したがって、いくつかの実施形態において、結合親和性は、ＫＤ値として表され、固有の結合親和性を反映する（例えば、最小化された結合活性効果を有する）。本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、ｈｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰポリペプチド（配列番号３）に対して強い結合親和性を示し、例えば、１０ｎＭ〜１ｐＭのＫＤ値を示す。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、ＩＬ−１、ＩＬ−３３、および／またはＩＬ−３６シグナル伝達経路を含むＩＬ１ＲＡＰ媒介性経路による細胞内シグナル伝達、より具体的には、下記アゴニスト、すなわち、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３、ＩＬ−３６α、ＩＬ−３６β、およびＩＬ−３６γのうちの１つ以上の結合によって刺激されるシグナル伝達経路を減少、阻害、および／または完全ブロッキングする。これらのＩＬ１ＲＡＰ媒介性シグナル伝達経路を阻害する抗体の能力は、本開示の実施例に記載されるＨＥＫ−ＢＬＵＥ（商標）レポーター細胞アッセイおよび初代細胞ブロッキングアッセイを含む既知の細胞ブロッキングアッセイを使用してインビトロでアッセイすることができる。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達を減少、阻害、および／または完全ブロッキングする抗体の能力は、アゴニスト（複数可）のＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３、ＩＬ−３６α、ＩＬ−３６β、および／またはＩＬ−３６γを約ＥＣ５０の濃度で用いたレポーター細胞ブロッキングアッセイを使用して、抗体のＩＣ５０として決定される。アゴニストのＥＣ５０は、アッセイ前に推定しかできないことが多く、データの非線形回帰分析を使用してアッセイが完了した後に決定される。このようなアッセイにおいて、約ＥＣ５０値は、典型的には、ＥＣ４０−４５〜ＥＣ５５−６０の範囲であろう。
【０１０５】
したがって、いくつかの実施形態において、本開示のＩＬ１ＲＡＰ抗体は、ＩＬ１ＲＡＰ媒介性経路による細胞内シグナル伝達を減少、阻害、および／または完全ブロッキングする能力に基づく以下の機能特性のうちの１つ以上によって特徴付けられる。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、ＩＬ−１刺激性シグナル、ＩＬ−３３刺激性シグナル、および／またはＩＬ−３６刺激性シグナルを、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％減少させる。いくつかの実施形態において、シグナルの減少は、レポーター細胞ブロッキングアッセイ（例えば、ＨＥＫ−ＢＬＵＥ（商標）レポーター細胞アッセイ）を使用して測定することができる。当業者は、ＩＬ−１刺激性、ＩＬ−３３刺激性、および／またはＩＬ−３６刺激性経路における細胞シグナル伝達の阻害を決定する際に使用することが知られている既知のレポーター細胞アッセイのいずれかを選択することができる。一般に、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、約ＥＣ５０濃度（例えば、ＥＣ４０〜ＥＣ６０）のアゴニストの結合によって開始されるＩＬ１ＲＡＰ媒介性細胞内シグナルを減少させ、抗体のＩＣ５０値は１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、または１ｎＭである。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、ＩＬ−１刺激性シグナル、ＩＬ−３３刺激性シグナル、およびＩＬ−３６刺激性シグナルを少なくとも９５％、または少なくとも９９％減少させ、必要に応じて、ＩＬ−１、ＩＬ−３３、および／またはＩＬ−３６刺激性シグナルは、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３、ＩＬ−３６α、ＩＬ−３６β、およびＩＬ−３６γから選択されるアゴニストによって刺激され、必要に応じて、約ＥＣ５０のアゴニスト濃度の抗体は、１０ｎＭ以下、５ｎｍ以下、または１ｎＭ以下のＩＣ５０を有する。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３、ＩＬ−３６α、ＩＬ−３６β、およびＩＬ−３６γアゴニストのうちの１つ以上がその同族受容体に結合することによって開始される細胞内シグナルを少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％減少させる。いくつかの実施形態において、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、初代ヒト肺線維芽細胞（ＰＨＬＦ）からのＩＬ８のＩＬ−１α、ＩＬ−１β、および／またはＩＬ−３６β刺激性放出を阻害し、必要に応じて、約ＥＣ５０のＩＬ−１α、ＩＬ−１βで、および／またはＩＬ−３６β濃度で、抗体は、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、または１ｎＭ以下のＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態において、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、初代ヒト単球からのＩＬ６のＩＬ−１β刺激性放出を阻害し、必要に応じて、約ＥＣ５０のＩＬ−１β濃度で、抗体は、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、または１ｎＭ以下のＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態において、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞からのＩＮＦ−γのＩＬ−３３刺激性放出を阻害し、必要に応じて、約ＥＣ５０のＩＬ−３３濃度で、抗体は、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、または１ｎＭ以下のＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態において、抗体は、ヒト表皮ケラチノサイト（ＨＥＫｎ）からのＩＬ８のＩＬ−３６β刺激性放出を阻害し、必要に応じて、約ＥＣ６０のＩＬ−３６β濃度で、抗体は、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、または２ｎＭ以下のＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態において、抗体は、好塩基球でＩＬ−３３刺激性リン酸化を阻害し、必要に応じて、約ＥＣ５６のＩＬ−３３濃度で、抗体は、７５ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、または４５ｎＭ以下のＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態において、抗体は、ＣＤ４＋Ｔ細胞からＩＮＦ−γのＩＬ−３３刺激性放出を阻害し、必要に応じて、約ＥＣ３４のＩＬ−３３濃度で、抗体は、７５ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、または４５ｎＭ以下のＩＣ５０を有する。
【０１０９】
２．抗体断片
いくつかの実施形態において、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、抗体断片であり得る。本開示の結合決定基と共に有用な抗体断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一価、１アーム（または単一アーム）抗体、ｓｃＦｖ断片、および本明細書に記載され、当技術分野で知られている他の断片が含まれるが、これらに限定されない。様々な抗体断片の概説については、例えば、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，９：１２９−１３４（２００３）を参照。ｓｃＦｖ断片の概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照。ＷＯ９３／１６１８５、ならびに米国特許第５，５７１，８９４号および第５，５８７，４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、インビボ半減期が増加したＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片の説明については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照。他の一価抗体形態は、例えば、ＷＯ２００７／０４８０３７、ＷＯ２００８／１４５１３７、ＷＯ２００８／１４５１３８、およびＷＯ２００７／０５９７８２に記載されている。一価の単一アーム抗体は、例えば、ＷＯ２００５／０６３８１６に記載されている。ダイアボディは、二価または二重特異性でありうる２つの抗原結合部位を有する抗体断片である（例えば、ＥＰ０４０４０９７、ＷＯ９３／０１１６１、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，９：１２９−１３４（２００３）およびＨｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照）。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、抗体断片は、抗体の重鎖可変ドメインの全部または一部、または軽鎖可変ドメインの全部または一部を含む単一ドメイン抗体である。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ウォルサム；例えば、米国特許第６，２４８，５１６号を参照）である。
【０１１１】
抗体断片は、本明細書に記載されるように、インタクト抗体のタンパク質分解消化、ならびに組換え宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはファージ）による産生を含むが、これらに限定されない様々な技法によって作製され得る。
【０１１２】
本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体のいずれも、当技術分野で知られているおよび／または本明細書に記載されている方法および技法を使用して抗体断片として調製され得ることが企図される。例えば、本開示の様々な抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体のＦａｂ型の調製および分析は、実施例８に記載されている。
【０１１３】
３．キメラおよびヒト化抗体
いくつかの実施形態において、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、キメラ抗体であり得る。（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）に記載のキメラ抗体を参照）。一実施形態において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルなどの非ヒト霊長類に由来する可変領域）およびヒト定常領域を含む。いくつかの実施形態において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のものから変換された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含むことができると企図される。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、親の非ヒト抗体の特異性および親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低減させるためにヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（またはその一部）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（またはその一部）がヒト抗体配列に由来する１つ以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、必要に応じて、ヒト定常領域の少なくとも一部も含むであろう。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体中のいくつかのＦＲ残基は、抗体の特異性または親和性を回復または改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ残基が由来する抗体）からの対応残基で置換される。
【０１１５】
ヒト化抗体およびそれらを作製する方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ，．１３：１６１９−１６３３（２００８）で概説されており、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ´Ｉ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１００２９−１００３３（１９８９）、米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号および同第７，０８７，４０９号、Ｋａｓｈｍｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６：２５−３４（２００５）（ＳＤＲ（ａ−ＨＶＲ）グラフティングの記載）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８：４８９−４９８（１９９１）（「リサーフェイシング」の記載）、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６：４３−６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」の記載）、ならびにＯｓｂｏｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６：６１−６８（２００５）およびＫｌｉｍｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２−２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングへの「ガイド下選択」アプローチの記載）でさらに記載されている。
【０１１６】
ヒト化に有用なヒトフレームワーク領域には、「ベスト−フィット」法を使用して選択されたフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６（１９９３）を参照）、軽鎖または重鎖の可変領域の特定サブグループのヒト抗体共通配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）およびＰｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５１：２６２３（１９９３）を参照）、ヒト成熟（体細胞変異した）フレームワーク領域またはヒト生殖系列フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）を参照）、およびＦＲライブラリーのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８−１０６８４（１９９７）およびＲｏｓｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：２２６１１−２２６１８（１９９６）を参照）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１７】
本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体のいずれも、当技術分野で知られているおよび／または本明細書に記載されている方法および技法を使用して、ヒト化抗体として調製され得ることが企図される。例えば、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体のヒト化型の調製および分析は、実施例５〜７に記載されている。
【０１１８】
４．ヒト抗体
いくつかの実施形態において、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、ヒト抗体であり得る。ヒト抗体は、当技術分野で知られている様々な技法を使用して産生することができる。ヒト抗体は、一般に、ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，５：３６８−７４（２００１）およびＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０：４５０−４５９（２００８）に記載されている。ヒト抗体は、インタクトヒト抗体または抗原接種に応答してヒト可変領域を有するインタクト抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製することができる。このような動物は典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座に置き換わる、または染色体外に存在するか、もしくは動物の染色体にランダムに組み込まれる、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含む。このようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は一般に不活化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得る方法の概説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７−１１２５（２００５）を参照。例えば、米国特許第６，０７５，１８１号および同第６，１５０，５８４号のＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）、米国特許第５，７７０，４２９号のＨＵＭＡＢ（登録商標）技術、米国特許第７，０４１，８７０号のＫ−Ｍ  ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術および米国特許出願公開第ＵＳ２００７／００６１９００号のＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術も参照）。このような動物によって生成されたインタクト抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによって、さらに改変され得る。
【０１１９】
ヒト抗体は、ハイブリドーマに基づく方法で作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が記載されている。例えば、Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）、およびＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）を参照。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により生成されたヒト抗体は、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７−３５６２（２００６）にも記載されている。ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を説明する追加方法には、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号に記載されている方法が含まれる。ヒトハイブリドーマ技術（すなわち、トリオーマ技法）は、例えば、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７−９３７（２００５）およびＶｏｌｌｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５−９１（２００５）に記載されている。
【０１２０】
ヒト抗体は、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによっても生成され得る。このような可変ドメイン配列を、次いで、所望のヒト定常ドメインと組み合わせることができる。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技法を以下に記載する。
【０１２１】
本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体のいずれも、当技術分野で知られているおよび／または本明細書に記載されている方法および技法を使用して、ヒト抗体として調製され得ることが企図される。
【０１２２】
５．ライブラリー由来の抗体
いくつかの実施形態において、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、所望する活性または複数の活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離され得る。例えば、ファージディスプレイライブラリーを生成し、そのようなライブラリーを所望の結合特徴を保有する抗体についてスクリーニングするための様々な方法が当技術分野で知られている。本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体ヒト化型の親和性成熟変異体を調製するためのファージディスプレイの使用は、本明細書に開示される実施例に記載されている。このようなライブラリー由来の抗体を産生するための他の方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９２）、Ｍａｒｋｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｄｂｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２４８：１６１−１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）、Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３３８（２）：２９９−３１０（２００４）、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）、Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）およびＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）に見出すことができる。
【０１２３】
コンビナトリアルライブラリースクリーニングを使用し、当技術分野で知られているおよび／または本明細書に記載されている方法および技法を使用して、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の変異体を生成し得ることが企図される。例えば、本開示のヒト化抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の広範囲な親和性成熟変異体を調製するためのファージディスプレイライブラリーの生成およびスクリーニングの使用は、実施例８に記載されている。
【０１２４】
６．多重特異性抗体
いくつかの実施形態において、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。いくつかの実施形態において、多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる結合部位を有し、それぞれが異なる抗原に対する結合特異性を有し、そのうちの少なくとも１つがＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合するモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、結合部位のうちの少なくとも１つは、細胞毒性剤に特異的に結合する。例示的な実施形態において、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、二重特異性抗体であり、ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞に細胞毒性剤を局在化するために使用することができる。
【０１２５】
多重特異性抗体を作製するための技法には、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現が含まれるが、これに限定されない（例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７（１９８３）、ＷＯ９３／０８８２９、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：３６５５（１９９１）を参照）。「ノブインホール」エンジニアリングも使用できる（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照）。
【０１２６】
多重特異性抗体は、ホモ二量体ではなくＦｃヘテロ二量体抗体分子の形成に有利な「静電ステアリング」効果の操作（ＷＯ２００９／０８９００４Ａ１）、２つ以上の抗体または断片の架橋（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、およびＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照）、二重特異性抗体を産生するためのロイシンジッパーの使用（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）を参照）、二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術の使用（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）二量体の使用（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５２：５３６８（１９９４）を参照）または三重特異性抗体（例えば、Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：６０（１９９１）を参照）によっても作製することができる。
【０１２７】
本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体のいずれも、当技術分野で知られているおよび／または本明細書に記載されている方法および技法を使用して、多重特異性抗体として調製され得ることが企図される。
【０１２８】
７．抗体変異体
いくつかの実施形態において、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の変異体も企図される。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性が改善された抗体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することによって、またはペプチド合成によって調製することができる。そのような修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／または挿入、および／または置換が含まれる。最終構築物がＩＬ１ＲＡＰ抗原結合の所望の特徴を保有するという条件で、欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせを行って、最終構築物に到達することができる。本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の広範囲な変異体は、当技術分野で知られているおよび／または本明細書に記載されている方法および技法を使用して調製され得ることが企図され、（ｉ）アミノ酸の置換、挿入および／または欠失変異体、（ｉｉ）グリコシル化変異体、（ｉｉｉ）Ｆｃ領域変異体、（ｉｖ）システイン操作変異体、および（ｖ）誘導体化変異体を含むがこれらに限定されない。本開示の実施例５〜９、表２、および配列表は、ハイブリドーマ由来の１１Ｃ５（Ｈｙ）抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の多数の例示的変異体、ならびにそのヒト化型ｈ１１Ｃ５を提供する。例示された変異体は、以下のうちの１つ以上を含む。システイン易罹病性を排除するためのＣＤＲ−Ｈ２におけるアミノ酸置換（例えば、Ｃ５９Ｙ）、エフェクターレス機能を付与するＦｃ領域変異体（例えば、Ｎ２９７Ｇ）、ならびに抗原親和性および／または細胞ブロッキング活性を増加させるＣＤＲおよび可変ドメイン領域における広範な単一、二重、三重アミノ酸置換（例えば、配列番号１２〜３５、３８〜６１、６４〜７６、７９〜１２０、１２３〜１３９、１４２〜２０１、２０４〜２２５、２２８〜２３９、２５９〜２７８、および２８０〜３１０）。
【０１２９】
Ａ．置換、挿入、および欠失の変異体
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるものに加えて、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体変異体が提供される。変異誘発の部位には、ＨＶＲおよびＦＲを含めることができる。典型的な「保存的」アミノ酸置換および／または共通側鎖のクラスまたは特性に基づく置換は、当技術分野で周知であり、本開示の実施形態で使用することができる。本開示は、アミノ酸側鎖クラスの１つのメンバーが別のクラスからのアミノ酸と交換される非保存的アミノ酸置換に基づく変異体も企図する。
【０１３０】
アミノ酸側鎖は典型的には、次のクラスまたは共通の特性に従ってグループ化される。（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ノルロイシン、（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、（５）鎖配向の影響：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、および（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１３１】
抗体へのアミノ酸置換、および所望する機能、例えば、保持／改善された抗原結合、減少した免疫原性、または改善されたＡＤＣＣもしくはＣＤＣについての後続のスクリーニングのための技法は当技術分野で周知である。
【０１３２】
アミノ酸置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することを含み得る。一般に、さらなる研究用に選択された結果として生じる変異体（複数可）は、親抗体と比べて特定の生物学的特性が改変され（例えば、親和性の増加、免疫原性の低減）、かつ／または親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持するであろう。例示的な置換変異体は、親和性成熟抗体であり、これは、便宜上、例えば、本明細書の実施例に記載されるものなどのファージディスプレイに基づく親和性成熟技法を使用して生成され得る。簡潔に述べると、１つ以上のＨＶＲ残基が変異し、変異体抗体がファージに提示され、特定の生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
【０１３３】
変異誘発の標的となり得る抗体の残基または領域を同定するための有用な方法は、「アラニンスキャニング変異誘発」である（例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５を参照）。この方法では、標的残基の残基またはグループ（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、およびＧｌｕなどの荷電残基）が同定され、中性または負電荷のアミノ酸（例えば、Ａｌａまたはポリアラニン）で置き換えられ、抗体と抗原との相互作用が影響するか否かを決定する。アミノ酸位置にさらなる置換を導入し、最初の置換に対する機能感受性を実証することができる。あるいは、またはさらに、抗体と抗原との接触点を同定するための抗原−抗体複合体の結晶構造を決定することができる。このような接触残基および隣接残基は、置換の候補として標的化または排除され得る。変異体をスクリーニングして、所望の特性が含まれているか否かを決定できる。
【０１３４】
アミノ酸配列の挿入には、１つの残基から１００以上の残基を含むポリペプチドまでの長さにわたるアミノ酸および／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体には、抗体の血清半減期を増加させる酵素またはポリペプチドに対する抗体のＮ末端またはＣ末端への融合が含まれる。
【０１３５】
抗体親和性を改善するために、ＨＶＲで置換され得る。このような変更は、「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセス中に高頻度で変異を受けるコドンによってコードされる残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．，Ｂｉｏｌ．２０７：１７９−１９６（２００８）を参照）で行うことができ、得られた変異体ＶＨまたはＶＬは、結合親和性について試験される。一実施形態において、親和性成熟は、二次ライブラリーから構築および再選択することによって実行することができる（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，（２００１）を参照）多様性を導入する別の方法には、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一回に４〜６残基）がランダム化されるＨＶＲ指向アプローチが含まれる。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発またはモデリングを使用して、特異的に同定することができる。特に、ＣＤＲ−Ｈ３およびＣＤＲ−Ｌ３が標的化されることが多い。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、置換、挿入、または欠失は、そのような変更が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低減させない限り、１つ以上のＨＶＲ内で起こり得る。例えば、結合親和性を実質的に低減させない保存的変更（例えば、本明細書で提供されるような保存的置換）がＨＶＲにおいてなされ得る。このような変更は、ＨＶＲの「ホットスポット」の外部にあり得る。上記で提供された変異体ＶＨおよびＶＬ配列のいくつかの実施形態において、各ＨＶＲは、変更されていないか、またはわずか１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換を含む。
【０１３７】
Ｂ．グリコシル化変異体
いくつかの実施形態において、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増減するように変更される。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が作成または除去されるように、アミノ酸配列を変更することによって実行することができる。
【０１３８】
抗体がＦｃ領域を含む実施形態において、Ｆｃ領域に付着した炭水化物を変更することができる。典型的には、哺乳動物細胞によって産生される天然抗体は、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７へのＮ−結合によって結合された分岐、二分岐オリゴ糖を含む（例えば、Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ，１５：２６−３２（１９９７）を参照）。オリゴ糖には、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、およびシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造の「ステム」内のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースなどの様々な炭水化物が含まれ得る。いくつかの実施形態において、抗体のＦｃ領域のオリゴ糖の修飾は、特定の改善された特性を有する変異体を作成することができる。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、親抗体の変異体であり得、変異体は、Ｆｃ領域に（直接的または間接的に）結合したフコースを欠く炭水化物構造を含む。例えば、そのような抗体中のフコース量は、約１％〜約８０％、約１％〜約６５％、約５％〜約６５％、または約２０％〜約４０％であり得る。フコース量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（例えば、ＷＯ２００８／０７７５４６を参照）によって測定されるように、Ａｓｎ２９７に結合した全ての糖構造（例えば、複合体、ハイブリッド、および高マンノース構造）の総量と比べて、Ａｓｎ２９７で糖鎖内のフコース平均量を算出することにより決定できる。Ａｓｎ２９７とは、Ｆｃ領域の約２９７番目に位置するアスパラギン残基を指すが（Ｆｃ領域残基のＥｕ付番）、Ａｓｎ２９７は、抗体のわずかな配列変異のため、２９７番目の上流または下流±約３アミノ酸、すなわち、２９４〜３００番目の間にも位置し得る。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、フコシル化変異体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許公開第ＵＳ２００３／０１５７１０８号または同第ＵＳ２００４／００９３６２１号を参照。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体の例およびそれらを調製するための関連方法は、例えば、ＵＳ２００３／０１５７１０８、ＵＳ２００３／０１１５６１４、ＵＳ２００２／０１６４３２８、ＵＳ２００４／００９３６２１、ＵＳ２００４／０１３２１４０、ＵＳ２００４／０１１０７０４、ＵＳ２００４／０１１０２８２、ＵＳ２００４／０１０９８６５、ＷＯ２０００／６１７３９、ＷＯ２００１／２９２４６、ＷＯ２００３／０８５１１９、ＷＯ２００３／０８４５７０、ＷＯ２００５／０３５５８６、ＷＯ２００５／０３５７７８、ＷＯ２００５／０５３７４２、ＷＯ２００２／０３１１４０、Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３３６：１２３９−１２４９（２００４）、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）に開示されている。
【０１４１】
脱フコシル化抗体を産生するのに有用な細胞株には、タンパク質フコシル化が欠損しているＬｅｄ３ＣＨＯ細胞（例えば、Ｒｉｐｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，．２４９：５３３−５４５（１９８６）、ＵＳ２００３／０１５７１０８、およびＷＯ２００４／０５６３１２を参照）、およびアルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８などのノックアウト細胞株、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）、Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０−６８８（２００６）、およびＷＯ２００３／０８５１０７）が含まれる。
【０１４２】
Ｃ．Ｆｃ領域変異体
いくつかの実施形態において、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、Ｆｃ領域（すなわち、Ｆｃ領域変異体）に１つ以上のアミノ酸修飾を含み得る。Ｆｃ領域変異体は、１つ以上のアミノ酸残基の位置にアミノ酸置換を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＦｃ領域）を含み得る。本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体と共に有用であり、当技術分野で知られている広範囲のＦｃ領域変異体を以下に記載する。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、エフェクター機能が変更されたＦｃ領域変異体である。いくつかの実施形態において、エフェクター機能が変更された抗体は、親抗体のエフェクター機能の一部（全てではない）、低下したエフェクター機能を保有するか、またはエフェクター機能のいずれも（例えば、エフェクターレス）保有しない。エフェクターレスＦｃ領域変異体は、エフェクター機能（ＡＤＣＣなど）が不要または有害である、および／または抗体のインビボ半減期が重要である特定の適用にとってより望ましい。
【０１４４】
エフェクター機能が低減した、またはエフェクターレスであるＦｃ領域変異体抗体は、次のＦｃ領域、すなわち２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７および３２９番目の１つ以上にアミノ酸置換を含み得る（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号を参照）。このようなＦｃ領域変異体は、２６５、２６９、２７０、２９７および３２７番目のうちの２つ以上でのアミノ酸置換を含み得る。このようなＦｃ領域変異体は、２６５および２９７の両残基のアラニンへの置換も含み得る（例えば、米国特許第７，３３２，５８１号を参照）。実施例および本明細書の他の箇所で開示されるように、いくつかの実施形態において、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、エフェクターレスのＦｃ領域変異体である。いくつかの実施形態において、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体のエフェクターレスＦｃ領域変異体は、アミノ酸置換Ｎ２９７Ｇを含む。
【０１４５】
ＦｃＲへの結合が改善または減少したＦｃ領域変異体は、例えば、米国特許第６，７３７，０５６号、ＷＯ２００４／０５６３１２およびＳｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（９）：６５９１−６６０４（２００１）に開示されている。ＡＤＣＣが改善されたＦｃ領域変異体は、例えば、Ｆｃ領域の２９８、３３３、および／または３３４番目（ＥＵ付番に基づく）に１つ以上のアミノ酸置換を含むことができる。例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ９９／５１６４２、およびＩｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６４：４１７８−４１８４（２０００）に記載されているように、Ｃｌｑ結合および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）が変更された（すなわち、改善あるいは減少した）Ｆｃ領域変異体。半減期が増加し、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善されたＦｃ領域変異体は、例えば、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）に開示されている。このようなＦｃ領域変異体は、２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、および４３４番目のうちの１つ以上でアミノ酸置換を含む。半減期が増加した他のＦｃ領域変異体には、例えば、ＵＳ７６５８９２１Ｂ２（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されている２５２、２５４、および２５６番目のＹＴＥ変異のセット（すなわち、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ）が含まれる。実施例および本明細書の他の箇所で開示されるように、いくつかの実施形態において、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、ＹＴＥ変異のセットを含むＦｃ領域変異体である。Ｆｃ領域変異体の他の例は、例えば、米国特許第５，６４８，２６０号および同第５，６２４，８２１号およびＷＯ９４／２９３５１に見出すことができる。
【０１４６】
本明細書の他の箇所に記載されているように、天然に存在する抗体のＦｃ領域は、典型的には、４４７番目（Ｌｙｓ４４７）にＣ末端リジンを含む。しかしながら、このＣ末端リジンは、細胞培養における組換え抗体の産生中（例えば、ＣＨＯ細胞での産生）、酵素切断によりＦｃ領域から切断されることが多い。したがって、Ｃ末端リジンがあるＦｃ領域を含むとして本明細書に記載される抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体のいずれも、Ｃ末端リジンがないことを除いて、Ｆｃ領域を含む同一の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体も含むことが意図される。同様に、Ｃ末端リジンがないＦｃ領域を含むとして本明細書に記載される抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体のいずれも、Ｃ末端リジンがあることを除いて、Ｆｃ領域を含む同一の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体も含むことが意図される。
【０１４７】
一般に、インビトロおよび／またはインビボの細胞傷害アッセイを実行して、Ｆｃ領域変異体におけるＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性の低減／喪失を確認する（ｃｏｎｆｉｒｍ）ことができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実施して、抗体がＦｃγＲ結合を欠いている（したがって、ＡＤＣＣ活性を欠いている可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持することを確実にすることができる。ＡＤＣＣを媒介する初代細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを発現する。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：７０５９−７０６３（１９８６）を参照）およびＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：１４９９−１５０２（１９８５）、第５，８２１，３３７号（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６６：１３５１−１３６１（１９８７）を参照）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を使用することができる（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州マウンティンビューおよびＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）を参照）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、またはさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されているような動物モデルにおいて評価され得る。抗体がＣｌｑに結合できないため、ＣＤＣ活性を欠くことを確認するために、Ｃｌｑ結合アッセイを実行することもできる。例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９およびＷＯ２００５／１００４０２のＣｌｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施することができる（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０２：１６３（１９９７）、Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０１，１０４５−１０５２（２００３）、およびＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ，１０３：２７３８−２７４３（２００４）を参照）。ＦｃＲｎ結合およびインビボクリアランス／半減期の決定は、当技術分野で知られている方法を使用して実施することができる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８（１２）：１７５９−１７６９（２００６）を参照）。
【０１４８】
本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の広範囲なＦｃ領域変異体は、当技術分野で知られているおよび／または本明細書に記載されている方法および技法を使用して調製され得ることが企図される。例えば、Ｎ２９７Ｇアミノ酸置換で調製されたＦｃ領域変異体は、実施例９に記載されるように、細胞ブロッキング活性を保持しながら、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体にエフェクターレス機能を付与する。
【０１４９】
Ｄ．システイン操作変異体
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、反応性チオール基を作成するために、特定の非ＣＤＲ位置でシステイン残基で置換され得ることが企図される。このような操作された「チオＭＡｂ」は、本明細書の他の箇所に記載されるように、例えば、薬物部分またはリンカー−薬物部分に抗体を結合することによって免疫複合体を作成するために使用され得る。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されているように生成することができる。いくつかの実施形態において、以下の抗体残基のうちのいずれか１つ以上は、システインで置換され得る。軽鎖のＶ２０５（カバット付番）、重鎖のＡ１１８（ＥＵ付番）、重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ付番）。
【０１５０】
Ｅ．誘導体化変異体
いくつかの実施形態において、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、非タンパク質性部分でさらに修飾（すなわち、誘導体化）され得る。抗体の誘導体化に適した非タンパク質性部分には、水溶性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコールおよびプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸のホモポリマーまたはランダムコポリマー、およびデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、抗体の修飾は、メトキシ−ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドを使用して実行することができる。ポリマーは、任意の分子量のものであり、分岐または非分岐であり得る。抗体に結合するポリマーの数は様々であり、複数のポリマーが結合する場合、それらは同じ分子または異なる分子であり得る。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数および／または種類は、抗体の特定の特性または機能を含むがこれらに限定されない考慮事項、例えば、抗体誘導体が定義する条件下で療法に使用されるか否か、に基づいて決定することができる。
【０１５１】
８．免疫複合体
いくつかの実施形態において、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、免疫複合体でもあり得、免疫複合体は、１つ以上の細胞毒性剤に結合した抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を含む。本開示によって企図される好適な細胞毒性剤には、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素活性毒素、またはそれらの断片）、または放射性同位体が含まれる。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、免疫複合体は、本明細書に記載されるような抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体が１つ以上の薬物と結合する抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）である。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、本開示の免疫複合体は、ＩＬ−１、ＩＬ−３３、ＩＬ−３６、および／またはＩＬ１ＲＡＰ媒介性の疾患または状態を治療するための薬物または治療薬と結合した本明細書に記載の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を含む。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、Ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセンを含むがこれらに限定されない、酵素活性毒素またはその断片に結合することができる。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、本開示の免疫複合体は、放射性同位体と結合した本明細書に記載の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体（すなわち、放射性複合体（ｒａｄｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ））を含む。このような放射性複合体の産生には、様々な放射性同位体が利用できる。例としては、２１１Ａｔ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉ、３２Ｐ、２１２Ｐｂ、およびＬｕの放射性同位体が含まれる。いくつかの実施形態において、免疫複合体は、シンチグラフィー検出用の放射性同位体、またはＮＭＲ検出またはＭＲＩ用のスピン標識を含み得る。好適な放射性同位体またはスピン標識には、１２３Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１３Ｃ、１９Ｆ、１５Ｎ、１７Ｏ、Ｇｄ、Ｍｎ、およびＦｅの様々な同位体が含まれ得る。
【０１５６】
抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体と細胞毒性剤との免疫複合体は、タンパク質との結合に適した幅広い周知の二機能性試薬および化学物質を使用して作製することができる。このような試薬には、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチルＨＱ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス−（ｐ−アジドベンゾイル）−ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン−２，６−ジイソシアネート）、およびビス活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５７】
本開示の免疫複合体を調製するための試薬は、市販の「架橋」試薬、例えば、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、およびスルホ−ＳＭＰＢ、およびＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、米国イリノイ州ロックフォードを参照）も含み得る。
【０１５８】
９．合成抗体
いくつかの実施形態において、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、免疫グロブリン足場もしくはフレームワーク以外の足場もしくはフレームワーク、例えば、代替タンパク質足場、または人工ポリマー足場にグラフティングされた抗ＩＬ１ＲＡＰ免疫グロブリン（例えば、ＣＤＲ−Ｌ１など）からのＣＤＲのセットを含む合成抗体であり得る。
【０１５９】
本開示の合成抗体を調製するために企図される例示的な代替タンパク質足場には、フィブロネクチン、ネオカルチノスタチンＣＢＭ４−２、リポカリン、Ｔ細胞受容体、プロテインＡドメイン（プロテインＺ）、Ｉｍ９、ＴＰＲタンパク質、亜鉛フィンガードメイン、ｐＶＩＩＩ、鳥類膵臓ポリペプチド、ＧＣＮ４、ＷＷドメインＳｒｃ相同性ドメイン３、ＰＤＺドメイン、ＴＥＭ−１ベータラクタマーゼ、チオレドキシン、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、ＰＨＤ−ｆｍｇｅｒドメイン、ＣＬ−２、ＢＰＴＩ、ＡＰＰＩ、ＨＰＳＴＩ、エコチン、ＬＡＣＩ−Ｄ１、ＬＤＴＩ、ＭＴＩ−ＩＩ、サソリ毒素、昆虫デフェンシン−Ａペプチド、ＥＥＴＩ−ＩＩ、Ｍｉｎ−２３、ＣＢＤ、ＰＢＰ、チトクロームｂ−５６２、Ｌｄｌ受容体ドメイン、ガンマ−クリスタリン、ユビキチン、トランスフェリン、および／またはＣ型レクチン様ドメインが含まれ得るが、これらに限定されない。
【０１６０】
合成抗体に有用な例示的人工ポリマー（非タンパク質）の足場は、例えば、Ｆｉｅｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）“Ｎｏｎ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ａｓ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ，”ｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ｅｄｓ．Ｓ．Ｄｕｂｅｌ  ａｎｄ  Ｊ．Ｍ．Ｒｅｉｃｈｅｒｔ），Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．；Ｇｅｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，１３：２４５−２５５（２００９）、Ｂｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２３（１０）：１２５７−１２６８（２００５）に記載されている。
【０１６１】
ＩＶ．組換え法および組成物
本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、抗体産生の分野で周知の組換え方法および材料を使用して産生することができる。いくつかの実施形態において、本開示は、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体をコードする単離された核酸を提供する。核酸は、ＶＬを含むアミノ酸配列および／または抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖および／または重鎖）をコードすることができる。いくつかの実施形態において、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体をコードする核酸配列を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。いくつかの実施形態において、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体をコードする核酸配列を含む宿主細胞が提供される。一実施形態において、宿主細胞は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列および抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクターで形質転換されている。別の実施形態において、宿主細胞は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター、および抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクターで形質転換されている。
【０１６２】
組換え法のいくつかの実施形態において、使用される宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの真核細胞、またはリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０）である。一実施形態において、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の作製方法が提供され、この方法は、上で提供されるように、抗体の発現に適した条件下で、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することと、必要に応じて、宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から抗体を回収することとを含む。
【０１６３】
簡潔に述べると、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の組換え産生は、抗体をコードする核酸を単離し（例えば、本明細書に記載されるように）、宿主細胞におけるさらなるクローニングおよび／または発現のためにこの核酸を１つ以上のベクターに挿入することによって実行される。このような核酸は、当技術分野で周知の従来手順を使用して（例えば、所望の抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離および配列決定される。抗体をコードするベクターをクローニングまたは発現するための好適な宿主細胞および培養方法は、当技術分野で周知であり、原核細胞または真核細胞が含まれる。典型的には、発現後、抗体は、可溶性画分で細胞ペーストから単離され、さらに精製され得る。原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物は、グリコシル化経路が「ヒト化」された真菌または酵母株を含む、抗体をコードするベクターの好適なクローニングまたは発現宿主であり、部分的または完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす（例えば、Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２２：１４０９−１４１４（２００４）、およびＬｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２４：２１０−２１５（２００６）を参照）。
【０１６４】
本開示のグリコシル化抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の発現に好適な宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物および脊椎動物）にも由来し得る。無脊椎動物細胞の例には、植物および昆虫の細胞が含まれる。特に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクション用に、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる多数のバキュロウイルス株が同定されている。植物細胞培養物を宿主として利用することもできる（例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、および同第７，１２５，９７８号を参照）。
【０１６５】
本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の産生に有用な哺乳動物宿主細胞株の例には、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０）を参照）、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２／０などの骨髄腫細胞株、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚性腎臓系統（例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９（１９７７）に記載されている２９３または２９３細胞）、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３−２５１（１９８０）に記載されているＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；ＴＲＩ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  ＮＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３：４４−６８（１９８２）を参照）、ＭＲＣ５細胞、およびＦＳ４細胞が含まれる。抗体産生に適した有用な哺乳動物宿主細胞株の一般的概説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐｐ．２５５−２６８（２００３）を参照。
【０１６６】
Ｖ．抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の医薬組成物および製剤
本開示は、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を含む医薬組成物および医薬製剤も提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載される抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体および薬学的に許容される担体を含む医薬製剤を提供する。このような医薬製剤は、所望の純度を有する抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を、１つ以上の薬学的に許容される担体と混合することによって調製することができる。典型的には、このような抗体製剤は、水溶液（例えば、米国特許第６，１７１，５８６号、およびＷＯ２００６／０４４９０８を参照）として、または凍結乾燥製剤（例えば、米国特許第６，２６７，９５８号を参照）として調製することができる。
【０１６７】
本明細書に開示されるような抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を含む組成物および製剤は、抗ＩＬ１ＲＡＰに加えて、製剤が投与される対象において治療される特定の兆候に有用な他の有効成分（すなわち、治療剤）をさらに含み得ることも企図される。好ましくは、任意の追加治療剤は、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体活性の活性と相補的な活性を有し、その活性は互いに悪影響を及ぼさない。したがって、いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に開示される抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供し、さらに、ＩＬ−１、ＩＬ−３３、ＩＬ−３６および／またはＩＬ１ＲＡＰ媒介性の疾患または状態の治療に有用な治療剤を含む。いくつかの実施形態において、例えば、疾患兆候ががんである場合、治療剤は、特定のがんに適切な化学療法剤である。いくつかの実施形態において、組成物中のさらなる治療剤は、ＩＬ−１、ＩＬ−３３、ＩＬ−３６シグナル伝達経路のアンタゴニストである。
【０１６８】
薬学的に許容される担体は、一般に、使用される投与量および濃度でレシピエントに対して無毒である。このような薬学的に許容される広範囲の担体が当技術分野で周知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）を参照）。本開示の製剤に有用で薬学的に許容される例示的な担体には、ホスフェート、シトレート、および他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤、保存剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール、メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、およびｍ−クレゾール）、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸、単糖、二糖、およびグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなどの糖、ナトリウムなどの塩形成対イオン、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）、および／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれ得るが、これらに限定されない。
【０１６９】
本開示の製剤に有用な薬学的に許容される担体は、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）など、ヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（例えば、ｒＨｕＰＨ２０またはＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）などの間質性薬分散剤も含み得る（例えば、米国特許公開第２００５／０２６０１８６号および第２００６／０１０４９６８号を参照）。
【０１７０】
追加の治療剤および有効成分は、例えば、コアセルベーション技法によって、または界面重合によって、例えば、コロイド薬送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルジョンで、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタシレート）マイクロカプセルによって、調製されたマイクロカプセルに封入され得る。このような技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、製剤は、抗体および／または他の有効成分の徐放性調製物であり得る。徐放性調製物の好適な例には、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、このマトリックスは、成形品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態である。
【０１７２】
典型的には、対象に投与される本開示の製剤は滅菌性である。滅菌製剤は、よく知られた技法を使用して、例えば、滅菌濾過膜による濾過によって容易に調製することができる。
【０１７３】
ＩＶ．治療の用途および方法
本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を含む組成物または製剤のいずれも、ＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合するおよび／またはＩＬ１ＲＡＰの活性をブロッキングするそれらの能力を利用する、特に、ＩＬ−１ファミリーサイトカインのＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３、ＩＬ−３６α、ＩＬ−３６β、および／またはＩＬ−３６γによる細胞内シグナル伝達を媒介するＩＬ１ＲＡＰの能力をブロッキングする、治療法などの任意の方法または用途に使用できることが企図される。ＩＬ１ＲＡＰによって媒介される細胞内シグナル伝達経路には、ＩＬ−１、ＩＬ−３３、およびＩＬ−３６経路が含まれ、より具体的には、少なくともサイトカインアゴニストのＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３、ＩＬ−３６α、ＩＬ−３６β、および／またはＩＬ−３６γによって刺激されるシグナル伝達経路が含まれる。ＩＬ１ＲＡＰ媒介性シグナル伝達経路の阻害は、本開示の実施例に記載されるＨＥＫ−ＢＬＵＥ（商標）レポーター細胞アッセイおよび初代細胞ブロッキングアッセイを含む既知の細胞ブロッキングアッセイを使用して、インビトロで検定することができる。
【０１７４】
ＩＬ１ＲＡＰ媒介性疾患は、ＩＬ１ＲＡＰがシグナル伝達を媒介する際の共受容体として作用するサイトカインのＩＬ−１ファミリー、すなわちＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３、ＩＬ−３６α、ＩＬ−３６β、および／またはＩＬ−３６γの体液または組織における値上昇に伴う任意の疾患または状態を含み得る。ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３、ＩＬ−３６α、ＩＬ−３６β、および／またはＩＬ−３６γの上昇値には、例えば、特定の細胞または組織で通常見られる値を超える値を含み得るか、または通常これらのサイトカインを発現しない細胞または組織における検出可能な値である。通常、ＩＬ１ＲＡＰ媒介性の状態または疾患は、次の特徴を示す。（１）該状態または疾患に伴う病態が、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３、ＩＬ−３６α、ＩＬ−３６β、および／もしくはＩＬ−３６γの投与によって、ならびに／またはＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３、ＩＬ−３６α、ＩＬ−３６β、および／またはＩＬ−３６γの発現の上方調節によって、動物に実験的に誘発され得る。ならびに、（２）実験動物モデルで生成される状態または疾患に伴う病態が、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３、ＩＬ−３６α、ＩＬ−３６βおよび／またはＩＬ−３６γの作用を阻害することが知られている薬剤によって阻害することができる。
【０１７５】
ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３、ＩＬ−３６α、ＩＬ−３６β、および／またはＩＬ−３６γは、炎症促進性サイトカインであることが知られているが、共受容体としてのＩＬ１ＲＡＰによって媒介されるこれらのサイトカインによって刺激されるＩＬ−１、ＩＬ−３３、および／またはＩＬ−３６シグナル伝達経路の異常機能は、炎症疾患、自己免疫疾患、呼吸器疾患、代謝疾患、感染症、およびがんを含むが、これらに限定されない広範囲の疾患および状態に関連することが知られている。
【０１７６】
例えば、ＩＬ−３３シグナル伝達の異常な機能に関連し、その結果、ＩＬ１ＲＡＰの共受容体活性によっても媒介される広範囲の状態および疾患には、以下が含まれるが、これらに限定されない：媒介性障害は、炎症状態（例えば、喘息、気道過敏性、気道炎症、敗血症、敗血症性ショック、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、関節リウマチ、または慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））；免疫障害（例えば、喘息、関節リウマチ、アレルギー、アトピー性アレルギー、アナフィラキシー、アナフィラキシーショック、アレルギー性鼻炎、乾癬、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、糖尿病、または肝疾患）；線維性障害（例えば、特発性肺線維症（ＩＰＦ））；好酸球性障害（例えば、好酸球性食道炎などの好酸球関連胃腸障害）；感染症（例えば、蠕虫、リーシュマニアメジャーなどの原生動物、またはＲＳＶやインフルエンザなどのウイルス感染症）；痛み（例えば、炎症性の痛み）；中枢神経系障害（例えば、アルツハイマー病）；固形腫瘍（例えば、乳房腫瘍、結腸腫瘍、前立腺腫瘍、肺腫瘍、腎臓腫瘍、肝腫瘍、膵臓腫瘍、胃腫瘍、腸腫瘍、脳腫瘍、骨腫瘍、または皮膚腫瘍）；または眼科疾患であり得る。ＩＬ−３３によって媒介される特定の眼科的障害には、滲出型ＡＭＤ、萎縮型ＡＭＤ、中等度ＡＭＤ、進行したＡＭＤ、および地図状萎縮（ＧＡ））を含む加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、網膜症（例えば、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、および高高度ＤＲ）、ポリープ状脈絡膜血管障害（ＰＣＶ）、糖尿病性黄斑浮腫、ドライアイ疾患、ベーチェット病、網膜剥離、緑内障、ブドウ膜炎（例えば、感染性および非感染性ブドウ膜炎）、網膜色素変性症、レーバー先天性黒内障、シュタルガルト病、外傷性眼損傷、および結膜炎（例えば、感染性結膜炎、非感染性結膜炎、およびアレルギー性結膜炎）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７７】
同様に、ＩＬ−１の異常な機能に関連し、その結果、ＩＬ１ＲＡＰの共受容体活性によっても媒介される広範囲の状態および疾患には、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；アルツハイマー病；エイズ誘発性悪液質を含む悪液質／食欲不振；喘息およびその他の肺疾患；アテローム性動脈硬化症；自己免疫性血管炎；慢性疲労症候群；クロストリジウム関連下痢を含む、クロストリジウム関連疾患；うっ血性心不全、冠状動脈再狭窄、心筋梗塞、心筋機能障害（例えば、敗血症に関連する）、および冠状動脈バイパス移植片を含む冠状動脈の状態および徴候；多発性骨髄腫および骨髄性（例えば、ＡＭＬまたはＣＭＬ）および他の白血病などのがん、ならびに腫瘍転移；糖尿病（例えば、インスリン依存性糖尿病）；子宮内膜症；発熱、線維筋痛症；糸球体腎炎；移植片対宿主病／移植片拒絶；出血性ショック；痛覚過敏；炎症性腸疾患；変形性関節症、乾癬性関節炎および関節リウマチを含む関節の炎症状態；例えば、角膜移植に関連する可能性がある炎症性眼疾患；脳虚血を含む虚血（例えば、外傷、てんかん、出血または脳卒中の結果としての脳損傷、それぞれが神経変性につながる可能性がある）；川崎病；学習障害；肺疾患（例えば、ＡＲＤＳ）；多発性硬化症；ミオパチー（例えば、特に敗血症における筋肉タンパク質代謝）；神経毒性（例えば、ＨＩＶによって誘発されるもの）；骨粗鬆症；がん関連の痛みを含む痛み；パーキンソン病；歯周病；早産；乾癬；再灌流傷害；敗血症性ショック；放射線療法による副作用；側頭下顎関節疾患；睡眠障害；ブドウ膜炎；または、緊張、捻挫、軟骨損傷、外傷、整形外科手術、感染症、またはその他の疾患プロセスに起因する炎症状態が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７８】
ＩＬ−１、ＩＬ−３３、および／またはＩＬ−３６シグナル伝達経路のアンタゴニストまたは阻害剤として作用する薬剤は、下記を含むが、これらに限定されない広範囲の疾患および状態を治療するために臨床開発中である。にきび、急性重症潰瘍性大腸炎、成人発症型スティル病、アレルギー性鼻炎、関節炎（痛風、若年性、骨、およびリウマチを含む）、関節炎痛、喘息、アテローム性動脈硬化症、アトピー性湿疹、ベーチェット病、悪液質、がん（乳房、結腸直腸、非小細胞肺、および膵臓を含む）、慢性閉塞性肺疾患、ドライアイ症候群、家族性寒冷自己炎症性症候群、家族性地中海熱、食物アレルギー、汎発性膿疱性乾癬、化膿性汗腺炎、高ＩｇＤ症候群、高尿酸血症、マックル−ウェルズ症候群、新生児発症多系統炎症性疾患、筋骨格痛、掌蹠膿疱症、末梢血管疾患、リウマチ性多発筋痛症、鼻ポリープ、乾癬、壊疽性膿皮症、再狭窄、鎌状赤血球貧血、副鼻腔炎、ＴＮＦ受容体関連周期性症候群、２型糖尿病、および潰瘍性大腸炎。
【０１７９】
本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を含む組成物または製剤のいずれかは、ＩＬ−１、ＩＬ−３３、および／またはＩＬ−３６シグナル伝達経路の異常機能に関連する先に挙げた疾患または状態のいずれかを治療するための方法または用途において使用できるため、ＩＬ１ＲＡＰの共受容体活性によって媒介され得ることが企図される。一般に、これらの状態および疾患には、炎症性疾患、自己免疫疾患、呼吸器疾患、代謝障害、感染症、およびがんが含まれるが、これらに限定されない。
【０１８０】
したがって、いくつかの実施形態において、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を含む組成物または製剤は、にきび、急性膵炎、急性重症潰瘍性大腸炎、成人発症型スティル病、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、気道過敏性、気道炎症、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アナフィラキシー、関節炎痛、喘息、アテローム性動脈硬化症、アトピー性皮膚炎、アトピー性湿疹、自己免疫性血管炎、ベーチェット病、骨がん、脳がん、乳がん、悪液質／食欲不振、軟骨損傷、脳虚血、慢性疲労症候群、慢性閉塞性肺疾患、クロストリジウム関連疾患、結腸がん、うっ血性心不全、結膜炎、冠動脈バイパス移植、冠動脈再狭窄、クローン病、糖尿病、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、ドライアイ疾患、子宮内膜症、好酸球関連胃腸障害、好酸球性食道炎、家族性寒冷自己炎症性症候群、家族性地中海熱、発熱、線維筋痛症、線維性障害、食物アレルギー、汎発性膿疱性乾癬、緑内障、糸球体腎炎、痛風性関節炎、移植片対宿主疾患、蠕虫感染、出血性ショック、化膿性汗腺炎、痛覚過敏、高ＩｇＤ症候群、高尿酸血症、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、がん関連痛、感染症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、緊張に起因する炎症状態、角膜移植に関連する炎症性眼疾患、炎症性疼痛、インフルエンザ、腸がん、虚血、若年性関節炎、川崎病、腎臓がん、レーバー先天性黒内障、肝臓がん、肝疾患、肺がん、マックル−ウェルズ症候群、多発性骨髄腫、多発性硬化症、筋骨格痛、骨髄性および他の白血病、心筋機能不全、筋障害、鼻ポリープ、新生児発症多系統炎症性疾患、神経毒性、非感染性結膜炎、非小細胞肺がん、整形外科手術、骨関節炎、骨粗鬆症、疼痛、掌蹠膿疱症、膵臓がん、パーキンソン病、歯周病、末梢血管疾患、リウマチ性多発筋痛症、ポリープ状脈絡膜血管症（ＰＣＶ）、早産、前立腺がん、原虫感染症、乾癬、乾癬性関節炎、壊疽性膿皮症、再灌流傷害、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、再狭窄、網膜剥離、網膜色素変性症、未熟網膜症（ＲＯＰ）、関節リウマチ、敗血症性ショック、鎌状赤血球貧血、放射線療法による副作用、副鼻腔炎、皮膚がん、睡眠障害、捻挫、シュタルガルト病、胃がん、側頭下顎関節疾患、ＴＮＦ受容体関連周期性症候群、移植拒絶、外傷、外傷性眼損傷、２型糖尿病、潰瘍性大腸炎、およびブドウ膜炎から選択される状態または疾患の治療に使用するための方法、療法、薬剤（ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ）、診断、または用途で使用することができる。
【０１８１】
以下の実施例を含む本明細書に開示されるように、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、ＩＬ−１、ＩＬ−３３、およびＩＬ−３６のシグナル伝達経路を含むＩＬ１ＲＡＰによって媒介される細胞内シグナル伝達を減少、阻害、および／またはブロッキングする能力を有する。したがって、いくつかの実施形態において、本開示は、対象におけるＩＬ１ＲＡＰ媒介性の疾患または状態を治療する方法を提供し、本方法は、治療有効量の本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を対象に投与すること、または、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体および薬学的に許容される担体を含む治療有効量の医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む。
【０１８２】
本明細書の他の箇所に開示されるように、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、ＩＬ−１、ＩＬ−３３、およびＩＬ−３６シグナル伝達経路を減少、阻害、および／またはブロッキングする能力を有する。したがって、本開示は、ＩＬ−１、ＩＬ−３３、および／またはＩＬ−３６シグナル伝達経路の減少、阻害、および／またはブロッキングに応答する疾患および状態を治療する方法も提供する。
【０１８３】
さらに、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、アゴニストのＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３、ＩＬ−３６α、ＩＬ−３６βおよび／またはＩＬ−３６γによって刺激される細胞内シグナル伝達を減少、阻害、および／またはブロッキングする能力を有する。したがって、本開示は、アゴニストＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３、ＩＬ−３６α、ＩＬ−３６β、および／またはＩＬ−３６γによって刺激される細胞内シグナル伝達の減少、阻害、および／またはブロッキングに応答する疾患および状態を治療する方法も提供する。
【０１８４】
ＩＬ１ＲＡＰ媒介性経路でもあるＩＬ−１シグナル伝達経路は、多くの種類のがんに関連している。したがって、いくつかの実施形態において、本開示は、対象のがんを治療する方法を提供し、本方法は、治療有効量の本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体をそれを必要とする対象に投与すること、または、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体および薬学的に許容される担体を含む治療有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む。
【０１８５】
ＩＬ−１、ＩＬ−３３、および／またはＩＬ−３６シグナル伝達経路の３つ全ては、ＩＬ１ＲＡＰ媒介性経路でもあり、喘息に関連している。したがって、いくつかの実施形態において、本開示は、対象の喘息を治療する方法を提供し、本方法は、治療有効量の本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体をそれを必要とする対象に投与すること、または、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体および薬学的に許容される担体を含む治療有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む。
【０１８６】
いくつかの実施形態において、本開示は、ＩＬ１ＲＡＰ媒介性疾患、ＩＬ−１、ＩＬ−３３、およびＩＬ−３６シグナル伝達経路媒介性疾患、ならびに／またはアゴニストのＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３、ＩＬ−３６α、ＩＬ−３６β、および／もしくはＩＬ−３６γによって刺激される細胞内シグナル伝達によって媒介される疾患を治療および／または予防する方法を提供する。このような治療実施形態の方法において、本方法は、治療有効量の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体、または本明細書に記載の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を含む組成物もしくは医薬製剤をそれを必要とする対象に投与することを含む。
【０１８７】
本治療方法に従う抗体、組成物、または医薬製剤の投与は、対象のＩＬ１ＲＡＰ媒介性疾患の進行から対象を保護および／または治療する抗体誘導性治療効果を提供する。いくつかの実施形態において、本治療方法は、ＩＬ１ＲＡＰ媒介性の疾患または状態を予防および／または治療するために、当業者に知られている１つ以上の追加治療剤の投与または治療をさらに含むことができる。１つ以上の追加薬剤の投与を含むこのような方法は、併用投与（２つ以上の治療剤が同じまたは個別の製剤に含まれる場合）、および個別投与を包含し、その場合、抗体組成物または製剤は、追加治療剤投与の前、同時、および／または後に投与され得る。
【０１８８】
本開示の治療方法のいくつかの実施形態において、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体または抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を含む医薬製剤は、薬剤を全身的にまたは所望の標的組織に送達する任意の投与様式（ｍｏｄｅ  ｏｆ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって対象に投与される。全身投与は、一般に、所望の標的部位、組織、または器官への直接ではない部位で対象に抗体を投与する任意の様式を指し、抗体またはその製剤は、対象の循環系に入るため、代謝および他の同様なプロセスを受ける。
【０１８９】
したがって、本開示の治療方法において有用な投与様式には、注射、注入、点滴、および吸入が含まれ得るが、これらに限定されない。注射による投与には、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、脳内脊髄、および胸骨内の注射および注入が含まれ得る。
【０１９０】
いくつかの実施形態において、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の医薬製剤は、抗体が腸内の不活性化から保護されるように製剤化される。したがって、本治療方法は、製剤の経口投与を含み得る。
【０１９１】
いくつかの実施形態において、薬剤としての本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を含む組成物または製剤の使用も提供される。さらに、いくつかの実施形態において、本開示は、薬剤、特にＩＬ１ＲＡＰ媒介性疾患を治療、予防または阻害するための薬剤の製造または調製における抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を含む組成物または製剤の使用を提供する。さらなる実施形態において、本薬剤は、ＩＬ１ＲＡＰ媒介性疾患の個体に有効量の薬剤を投与することを含む、ＩＬ１ＲＡＰ媒介性疾患を治療、予防または阻害するための方法で使用する。特定の実施形態において、薬剤は、有効量の少なくとも１つの追加治療剤、または治療をさらに含む。
【０１９２】
さらなる実施形態において、薬剤は、ＩＬ１ＲＡＰ媒介性疾患を治療、阻害または予防するために薬剤の有効な量を対象に投与することを含む、対象のＩＬ１ＲＡＰ媒介性疾患を治療、阻害または予防する際に使用する。
【０１９３】
ＩＬ１ＲＡＰ媒介性の疾患または状態の予防または治療のため、本開示の組成物および製剤に含まれる抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の適切な投与量（単独でまたは１つ以上の他の追加治療剤と併用して使用される場合）は、治療される特定の疾患または状態、疾患の重症度および経過、抗体が予防目的または治療目的で投与されるか否か、患者に投与された薬歴、患者の病歴および抗体に対する応答、および主治医の裁量に依存するだろう。本明細書に記載の組成物および製剤に含まれる抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、一度に、または一連の治療にわたって患者に適切に投与することができる。本明細書では、様々な時点にわたる単回投与または複数回投与、ボーラス投与、およびパルス注入を含むが、これらに限定されない様々な投薬スケジュールが企図される。
【０１９４】
疾患の種類および重症度に応じて、本開示の製剤中約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇの抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、例えば、１回以上の個別投与によるかまたは持続注入によるかを問わず、ヒト対象に投与するための初回の候補投与量である。一般に、抗体の投与量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。いくつかの実施形態において、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ（またはこれらの任意の組み合わせ）の１つ以上の用量を患者に投与することができる。
【０１９５】
投与量の投与は、対象の状態に応じて、数日以上にわたって維持することができ、例えば、当技術分野で知られている方法によって決定されるように、ＩＬ１ＲＡＰ媒介性疾患が十分に治療されるまで投与を続けることができる。いくつかの実施形態において、高い初回負荷量が投与され、その後、１回以上の低用量が投与され得る。しかしながら、他の投与計画が有用な場合がある。投与量投与の治療効果の進行は、従来の技法およびアッセイによって監視することができる。
【０１９６】
したがって、本開示方法のいくつかの実施形態において、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の投与は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの１日投与量を含む。いくつかの実施形態において、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の投与量は、少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２０ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約３０ｍｇ／ｋｇでの１日投与量を含む。
【０１９７】
さらに、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、ＩＬ１ＲＡＰを検出するためのアッセイ法において使用され得る。ヒトＩＬ１ＲＡＰに高い親和性で結合するそれらの能力により、本明細書に開示される抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、広範囲のアッセイ方法および方式に適切である。抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、ＩＬ１ＲＡＰの検出および定量化のために、競合結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、免疫沈降アッセイ、ならびに酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）など、いずれかの既知のアッセイ方法で使用できることが企図される（Ｓｏｌａ，１９８７，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．を参照）。したがって、いくつかの実施形態において、本開示は、生体試料のＩＬ１ＲＡＰのレベルを検出するための方法を提供し、本方法は、本明細書に開示されるような抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体と試料とを接触させる段階を含む。さらに、いくつかの実施形態において、生体試料中のＩＬ１ＲＡＰのレベルを検出する方法を使用して、例えばヒト対象からの生体試料におけるＩＬ１ＲＡＰ媒介性の状態または疾患を検出および／または診断することができることが企図される。
【実施例】
【０１９８】
本開示の様々な特徴および実施形態は、下記の代表的な実施例で示され、これらは、例示を意図するものであり、限定するものではない。当業者は、特定の実施例が、その後に続く特許請求の範囲でより完全に説明されるように、本発明の例示にすぎないことを容易に理解するであろう。本出願に記載されている全ての実施形態および特徴は、その中に含まれる全ての実施形態と互換性があり、組み合わせ可能であると理解されるべきである。
【０１９９】
実施例１：ＩＬ１ＲＡＰポリペプチドの生成
本実施例は、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を誘発およびスクリーニングする際に抗原として使用される様々なＩＬ１ＲＡＰポリペプチド構築物の調製を例示する。
【０２００】
ｈｕ−ＩＬ１ＲＡＰの細胞外ドメインは、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１：９０５−９１２（２０１０）の構造情報に基づいて、完全長の個々のドメイン（すなわち、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３）として組換え精製された。発現構築物のアミノ酸配列境界は、上記の表１および添付の配列表で提供される。全ての組換えＩＬ１ＲＡＰポリペプチド構築物は、精製および検出の目的で、下記の「ＧＧＧＳ−Ｖ５−６ＸＨｉｓ」Ｃ末端タグを有した。ＧＧＧＳＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴＨＨＨＨＨＨ（配列番号３１９）。個々のドメイン（例えば、Ｄ１、Ｄ１Ｄ２、Ｄ３）の構築物は、精製および検出の目的で、下記の「ＧＧＧＳ−Ｖ５−Ａｖｉ−６ＸＨｉｓ」Ｃ末端タグ（「Ａｖｉ」タグも含む）を有した。ＧＧＧＳＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号３２０）。
【０２０１】
ＩＬ１ＲＡＰ構築物タンパク質は、製造業者のプロトコルに従って、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）で発現させた。５日後に細胞を採取し、清澄化した上清に２０ｍＭイミダゾールｐＨ７．５を補充し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ＴＢＳ）、２０ｍＭイミダゾールｐＨ７．５で平衡化したＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦ粗カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国イリノイ州シカゴ）に適用した。タンパク質は、２０ＣＶ勾配で１００％ＴＢＳ、５００ｍＭイミダゾールｐＨ７．５に溶出した。タンパク質を含む溶出画分をプールし、タンパク質の分子量に応じて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５またはＳｕｐｅｒｄｅｘ２００増加カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国イリノイ州シカゴ）に充填した。単量体タンパク質を含むピーク画分をプールし、１ＸＰＢＳ、ｐＨ７．５または２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ＨＢＳ）、ｐＨ８．０に保存した。
【０２０２】
実施例２：ハイブリドーマ法を使用した抗ヒトＩＬ１ＲＡＰ抗体の生成、さらなる特性評価のためのスクリーニングおよび選択
この実施例は、マウスハイブリドーマ技術を使用して抗ｈｕ−ＩＬ１ＲＡＰ抗体を生成する方法、ならびにさらなる特性評価のために抗体をスクリーニングおよび選択する方法を例示する。
【０２０３】
免疫および融合：Ｂａｌｂ／ｃ、Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ、およびＳＪ／Ｌマウスを、５０μｇ／マウスの使用で、ｈｕ−ＩＬ１ＲＡＰの膜型細胞外ドメインを含む配列番号３のｈｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰポリペプチド構築物（表１を参照）で免疫した。初回免疫に続いて、下記の３つの異なるＩＬ１ＲＡＰ免疫原のその後の追加免疫が、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の好適な力価を誘導するのに必要なスケジュールおよび期間で、マウスに投与された。２５μｇ／マウスの配列番号３ポリペプチド（ｈｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰ）、２５μｇ／マウスの配列番号９ポリペプチド（ｍｏ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰ）、または２５μｇ／マウスの配列番号６ポリペプチド（ｈｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰ−Ｄ３）。アジュバントＭａｇｉｃ  Ｍｏｕｓｅ（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ニューヨーク州シャーリー）を全ての免疫に使用した。力価は、以下に記載されるようにＥＬＩＳＡによって決定された。力価に基づいて選択されたマウスには、融合前にアジュバントなしで最終の追加免疫を与えた。１日後、脾臓を採取し、標準プロトコルに従って処理した。標準プロトコルに従って、ＰＥＧを使用して、脾細胞を骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクションＣＲＬ  １５８０）と融合させ、標準的な技法を使用して９６ウェルプレートに約５０，０００骨髄腫細胞／ウェルで播種し、得られたコロニーのクローン性を最大化した。親ハイブリドーマは、ＡＨ（アザセリン＋ヒポキサンチン）を補充した選択培地を使用して選択された。
【０２０４】
ＥＬＩＳＡアッセイ：培養の１２〜１４日後、ハイブリドーマ上清を収集し、配列番号３のｈｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰ細胞外ドメインでコーティングされた９６ウェルプレートを用いたＥＬＩＳＡによる一次スクリーニングに供した。ＥＬＩＳＡアッセイは、一般に、Ｂａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０：１４９−１５６（２００２）に記載されているように実施した。簡潔に述べると、９６ウェルＭＡＸＩＳＯＲＰ（登録商標）平底プレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム、カタログ番号４３９４５４）を、５０μＬ／ウェルのタンパク質を用いて、コーティング緩衝液（０．０５Ｍカーボネート緩衝液、ｐＨ９．６またはホスフェート緩衝生理食塩水、ＰＢＳ）中１μｇ／ｍＬの濃度で、４℃で一晩コーティングした。コーティング溶液を除去した後、ホスフェート緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４（ＥＬＩＳＡ希釈液）に１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む２００μＬのアッセイ／ブロッキング溶液を添加し、室温で攪拌しながら１時間または４℃で攪拌せずに一晩、インキュベーションすることにより、非特異的結合をブロッキングした。次にプレートを３００μＬのＰＢＳ、０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０（洗浄緩衝液）で３回洗浄した。個々のハイブリドーマクローン（または指示濃度の精製抗体）からの１００μＬの培養上清を各ウェルに添加し、続いて撹拌しながら室温で１時間インキュベーションした。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した５０μＬ／ウェルのヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国テキサス州モントゴメリー、カタログ番号Ａ９０−１３１Ｐ）を１：３，０００希釈で、または西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、米国ペンシルベニア州ウェストグローブ、カタログ番号１０９−０３５−０８８）をＥＬＩＳＡ希釈液の１：１０，０００希釈で、添加した。プレートを室温で１時間撹拌しながらインキュベーションし、洗浄緩衝液で６回洗浄し、５０μＬ／ウェルのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）マイクロウェルペルオキシダーゼ基質（Ｓｃｙｔｅｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、米国ユタ州ローガン、カタログ番号ＴＭ１９９９）を添加して３〜１０分間発色させた。５０μＬ／ウェルの２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国ミズーリ州セントルイス、カタログ番号２５８１０５）で酸性化することにより、酵素による発色を停止させた。プレートは、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉ３Ｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＬＬＣ、米国カリフォルニア州サンノゼ）を使用して４５０ｎｍの波長で分析した。
【０２０５】
この一次ＥＬＩＳＡアッセイスクリーニングは、配列番号３のｈｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰポリペプチドおよび配列番号６のｈｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰ−Ｄ３ポリペプチドで免疫された３匹のＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウスによって生成されたハイブリドーマから合計４７０の抗ヒトＩＬ１ＲＡＰバインダーを同定した。これらの４７０個の親ハイブリドーマを２４ウェルプレートに増殖させ（ｅｘｐａｎｄ）、上記の通りに確認のＥＬＩＳＡスクリーニングを実行した結果、３１５個のｈｕ−ＩＬ１ＲＡＰバインダーを確認した。
【０２０６】
ハイブリドーマのＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞ブロッキングアッセイ、サブクローニングおよび精製のためのスクリーニング
ｈｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰ結合が陽性であることが確認された３１５個のハイブリドーマは、以下に記載されるＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞ブロッキングアッセイを使用して、ＩＬ−１媒介性ＩＬ１Ｒ１／ＩＬ１ＲＡＰおよびＩＬ−３３媒介性ＳＴ２／ＩＬ１ＲＡＰのシグナル伝達経路を阻害する能力についてさらに特性評価された。
【０２０７】
ＨＥＫ  Ｂｌｕｅ細胞株：この実施例および次の実施例に記載するＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞株は、元の親系統としてＨＥＫ−２９３細胞株（ヒト胎児腎臓上皮細胞）を使用する。ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、およびＩＬ−３３による刺激に応答するＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−１／ＩＬ−３３センサー細胞は、インビボＧｅｎ（インビボＧｅｎ、米国カリフォルニア州サンディエゴ、カタログ番号ｈｋｂ−ｉｌ３３）から入手した。これらのＩＬ−１／ＩＬ−３３センサー細胞は、ＩＬ−３３受容体ＳＴ２を発現するヒトＳＴ２遺伝子を用いたＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−１βセンサー細胞（インビボＧｅｎ、カタログ番号ｈｋｂ−ｉｌ１ｂ）の安定したトランスフェクションによって生成された。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−１β細胞は、ＮＦ−κＢ／ＡＰ−１  ＳＥＡＰ（分泌型胚性アルカリホスファターゼ）レポーター遺伝子を発現し、不活性化ＴＮＦ−α応答を含み、ＳＥＡＰ産生がＩＬ−１またはＩＬ−３３経路の活性化を示すことを確実にする。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−１／ＩＬ−３３応答性細胞は、製造業者のガイドラインに従って維持した。簡潔に述べると、細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、米国ジョージア州フラワリー・ブランチ）、１００ＩＵ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．、米国ニューヨーク州コーニング）からなる標準成長培地で維持した。成長培地には、ＳＥＡＰをコードするプラスミドを維持するために１００μｇ／ｍＬゼオシン、ＩＬ−１特異性を維持するために２００μｇ／ｍＬハイグロマイシンＢ、およびＳＴ２をコードするプラスミドを維持するために１００μｇ／ｍＬブラスチシジンをさらに補充した。
【０２０８】
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＳＥＡＰアッセイ：ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−１／ＩＬ−３３応答性センサー細胞は、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、またはＩＬ−３３刺激が生じた全てのＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＳＥＡＰアッセイに使用された。アッセイで使用されるアゴニストの半数効果濃度（ＥＣ５０）の推定値を提供するために、全アッセイに先立って８ポイントの段階希釈系列からなるアゴニストの用量応答曲線が生成された。実験使用の２４時間前に、使用時に最低８０％の集密度になる濃度で細胞を９６ウェル平底プレートに播種した。所望のアゴニストを最終容積２００μＬまで細胞に加え、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベーションした。ＳＥＡＰ産生は、ＳＥＡＰ検出アッセイを使用して定量化した。ＳＥＡＰ検出媒体ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（インビボＧｅｎ）を使用して、様々な指示条件で、一般製造業者のガイドラインによって、ＳＥＡＰのレベルを決定した。具体的には、２０μＬの細胞培養上清（アゴニスト添加の２４時間後に収集）を１３０μＬのＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ検出培地に添加した。反応を３７℃で１時間進行させ、その時点で、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）と共にＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）分光光度計を使用して、波長６５０ｎｍでの吸光度を測定した。生アッセイデータは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェアを用いて分析し、アッセイでアゴニストＥＣ５０値の非線形回帰決定を実施した。
【０２０９】
ハイブリドーマ細胞培養上清（ＳＮ）の未精製抗ｈｕ−ＩＬ１ＲＡＰ抗体のＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＳＥＡＰアッセイは、上記のように実施されたが、以下の改変が加えられた。抗ｈｕ−ＩＬ１ＲＡＰ抗体を含む未精製のハイブリドーマ細胞培養ＳＮを、５０μＬの最終容量の４倍でＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−１／ＩＬ−３３細胞に添加した。細胞および抗体を含有するハイブリドーマ細胞培養ＳＮは、３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベーションした。１時間の抗体インキュベーションに続いて、アゴニストを、細胞および抗体を含むウェルに、所望濃度の４倍で、２００μＬの総量内で最終的な所望濃度の１倍になるように添加した。阻害率は、試料（この場合、抗ｈｕ−ＩＬ１ＲＡＰ抗体を含むハイブリドーマ細胞培養ＳＮ）から得られた値から陰性対照から得られた吸光度値を差し引くことによって算出した。次に、陰性対照で調整した試料を使用して、陽性対照（抗体を含むハイブリドーマ細胞培養ＳＮの不在下でのみアゴニストに曝露した細胞）に対する比率を決定した。
【０２１０】
精製ハイブリドーマ由来の抗ｈｕ−ＩＬ１ＲＡＰ抗体を使用して実施されたＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＳＥＡＰアッセイは、ハイブリドーマ細胞培養ＳＮを用いた上記のアッセイと同様に実施された。簡潔に述べると、抗体は、３７℃、５％ＣＯ２で１時間、標準成長培地中、アゴニストの不在下で、細胞とインキュベーションした。１時間のインキュベーション後、推定ＥＣ５０濃度の目的のアゴニストを最終容量２００μＬまで添加し、実験をさらに２４時間進行させた。陰性対照（ＮＣ）は、成長培地のみに曝露された細胞を表す一方、陽性対照（ＰＣ）は、アゴニストのみに曝露された細胞を表す（アンタゴニストまたは対照抗体の不在下）。
【０２１１】
抗体（以下の実施例に記載されるＦａｂを含む）の半数阻害濃度（ＩＣ５０）を決定するために、７点段階希釈系列を使用した（指示濃度で開始）。前述のアゴニスト用量応答曲線と同様に、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７ソフトウェアを使用して非線形回帰分析を実施し、アッセイ結果からＩＣ５０値を決定した。
【０２１２】
下記の市販のヒトサイトカインをＨＥＫ−Ｂｌｕｅアッセイのアゴニストとして使用した。ＩＬ−１α（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＩＬ−１β（インビボＧｅｎ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）およびＩＬ−３３（インビボＧｅｎ、またはＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  ＵＳ、米国ニュージャージー州ロッキーヒル）。
【０２１３】
ＥＬＩＳＡスクリーニングおよびＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞ブロッキングアッセイの結果を使用して、サブクローニングおよび精製のために１５個の親ハイブリドーマ系統のパネルを選択した。選択したハイブリドーマおよびＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞ブロッキングアッセイの結果を以下の表３に示す。
【表３】
2021533829.tif 000018
【０２１４】
ハイブリドーマのサブクローニングおよび精製：サブクローニングは、ＥＬＩＳＡスクリーニングによって確認されたサブクローンを用いた標準限界希釈によって実施された（上記の通り）。サブクローンは、無血清培地で３０ｍＬの培養物にスケールアップされた。抗体は以下のように精製した。細胞を除去するために３００ｇで１０分間遠心分離し、孔径０．２２μｍのフィルターで濾過することにより、上清培地を清澄化した。清澄化した上清培地を、ＰＢＳ緩衝液で平衡化したＰＯＲＯＳ  ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ  Ａ樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）と混合し、穏やかに回転させながら室温で１．５時間インキュベーションした。インキュベーション後、スラリーをカラムに充填し、樹脂を、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む２０カラム容量（ＣＶ）のＰＢＳ緩衝液で洗浄した。ＩｇＧ分子は、３ＣＶの０．１Ｍ酢酸、０．１５Ｍ  ＮａＣｌで溶出した。溶離液を１Ｍ  ＭＯＰＳ、ｐＨ７．０でｐＨ５．２にすばやく中和し、ＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して緩衝液をＰＢＳ緩衝液に交換した。
【０２１５】
精製ハイブリドーマ抗体の特性評価
ＥＬＩＳＡアッセイ：ＥＬＩＳＡアッセイ（上記の通り）を使用して、１５個の親ハイブリドーマから得られた精製抗体がｈｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰポリペプチドおよび可溶性ｈｕ−Ｓ−ＩＬ１ＲＡＰポリペプチド（配列番号７）に結合できることを確認し、ならびにマウスｍｏ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰポリペプチド（配列番号９）、およびカニクイザルｃｙｎｏ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰポリペプチド（配列番号８）に対する交差反応性の程度を決定した。ハイブリドーマから精製された１５個の抗体の段階希釈を２０ｎＭから試験し、それぞれのＥＣ５０を以下の表４に示すように算出した。
【表４】
2021533829.tif 000019
【０２１６】
結合ドメインマッピング：１５個の精製抗体の結合ドメインマッピングは、アッセイプレート上に１μｇ／ｍｌでコーティングされた下記のＩＬ１ＲＡＰポリペプチド構築物を用いて、上記のＥＬＩＳＡアッセイを使用して実行された。ｈｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰ、ｈｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰ−Ｄ１、ｈｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰ−Ｄ１Ｄ２、およびｈｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰ−Ｄ３。１５ｍＡｂを１０ｎＭの濃度で試験し、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を以下の表５に示す。
【表５】
2021533829.tif 000020
【０２１７】
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅアッセイ：１５個の親ハイブリドーマに由来する精製抗ｈｕ−ＩＬ１ＲＡＰ抗体を試験して、上記のＨＥＫ−Ｂｌｕｅアッセイを使用してＩＬ１Ｒ１／ＩＬ１ＲＡＰおよびＳＴ２／ＩＬ１ＲＡＰ経路のＩＬ−１βおよびＩＬ−３３媒介性活性化をブロッキングする能力を決定した。全てのｍＡｂについて用量応答を実行し、ＩＬ−１βおよびＩＬ−３３媒介性活性化の阻害度の決定を、１００ｎＭの抗体濃度で、アゴニストのみに曝露した細胞から得られた最大シグナルのパーセンテージとして算出した。これらのＨＥＫ−Ｂｌｕｅアッセイの結果を以下の表６に示す。
【表６】
2021533829.tif 000021
【０２１８】
表６のＨＥＫ−Ｂｌｕｅアッセイ結果に示されているように、試験した全ての抗体のうち、ハイブリドーマ１１Ｃ５由来のｍＡｂのみが、１００ｎＭの濃度で、ＩＬ−１βおよびＩＬ−３３活性化経路の両方を完全ブロッキングまたはほぼ完全ブロッキングする活性を示した（それぞれ、９９％および９３％）。
【０２１９】
ＯＣＴＥＴ結合親和性：１１Ｃ５ハイブリドーマ（以下、「１１Ｃ５（Ｈｙ）」）から精製したｍＡｂのｈｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰおよびｃｙｎｏ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰポリペプチド構築物への結合親和性をＯＣＴＥＴ（登録商標）Ｂｉｏ−Ｌａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（ＢＬＩ）結合分析（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ  ＵＳＡ、米国カリフォルニア州フリーモント）を使用して測定した。ＢＬＩ実験方式は、溶液中のＩＬ１ＲＡＰ抗原を用いて抗体をバイオレイヤー表面に固定化する。配列番号３のｈｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰポリペプチド、配列番号８のｃｙｎｏ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰポリペプチド、またはハイブリドーマ１１Ｃ５から精製されたｍＡｂを、それぞれ最終容量２００μＬに、実験緩衝液（０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ緩衝液）で希釈した。全試料を黒色の９６ウェルプレートに入れ、２５℃で実験を実施した。ハイブリドーマ１１Ｃ５から精製したｍＡｂを最終濃度３５ｎＭに希釈し、抗マウスＩｇＧ  Ｆｃキャプチャー（ＡＭＣ）バイオセンサー（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ）に固定化した。分析対象を０．９〜２５ｎＭの範囲で実験緩衝液で段階希釈した。バイオセンサーは、実験を開始する前に、２５℃の実験緩衝液中で１０分間平衡化した。
【０２２０】
動態実験は、段階名、溶液、および時間が列挙されている下記の段階で実施した。ベースライン（緩衝液−６０秒）、充填（抗体−２００秒）、ベースライン２（緩衝液−最小１２０秒）、結合（分析対象−２００〜３００秒）および解離（緩衝液−１０００秒）。分析対象の会合および固定化抗体からの抗原の解離から生じるＢＬＩシグナルは、ＯＣＴＥＴ（登録商標）データ分析ソフトウェア（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して分析した。最初に、参照ウェル（実験ウェルと同じ段階を経たが、結合段階の分析対象を含まないバイオセンサー）を使用して、記録された全てのトレースに対して参照減算を実施し、次に全てのトレースを結合段階の開始に合わせた。各分析対象とのｍＡｂ  １１Ｃ５（Ｈｙ）のＫＤを算出するために、結合および解離の段階全体を１：１結合モデルでＧｌｏｂａｌ  ｆｉｔ（４個の分析対象濃度トレースの最小値）に使用した。このＯＣＴＥＴ  ＢＬＩ分析の結果を以下の表７に示す。
【表７】
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【０２２１】
要約：ハイブリドーマ１１Ｃ５、１１Ｃ５（Ｈｙ）に由来する精製抗Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、上記のアッセイにおけるその優れた特性に基づいて、さらなる特性評価と親和性成熟のために選択された。すなわち、１１Ｃ５（Ｈｙ）ｍＡｂは、ＩＬ１ＲＡＰのドメイン３（Ｄ３）に結合し、ＥＬＩＳＡで決定された場合、ｈｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰ、ｈｕ−Ｓ−ＩＬ１ＲＡＰ、およびｃｙｎｏ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰポリペプチドに等しくよく結合し、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅアッセイで決定された場合、ＩＬ−１βおよびＩＬ−３３活性化経路の両方を完全ブロッキングまたはほぼ完全ブロッキングする活性を示す。しかしながら、１１Ｃ５（Ｈｙ）ｍＡｂは、配列番号９のマウス−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰポリペプチドと交差反応しない。
【０２２２】
実施例３：選択された抗ヒトＩＬ１ＲＡＰ抗体の配列決定
本実施例は、ハイブリドーマに由来する抗ｈｕ−ＩＬ１ＲＡＰ抗体の配列の決定を例示する。
【０２２３】
下記のプロトコルを使用して、選択したハイブリドーマから抗体の重鎖断片および軽鎖断片をコードする遺伝子を同定、クローン化、および配列決定した。
【０２２４】
目的のハイブリドーマを、標準ハイブリドーマ培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１０％ＦＢＳ、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ、１％ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）において、８０％超の生存率で、７〜１０日間、Ｔ７５フラスコで１〜３ｘ１０５の密度まで成長させた。培養物から１〜３００万個の細胞を１５ｍＬ  ｆａｌｃｏｎチューブに３００ｇで５分間ペレット化した。ペレット細胞を５ｍＬの氷冷ＰＢＳに再懸濁して洗浄した。３００ｇで５分間遠心分離した後、ＰＢＳを除去し、細胞を再懸濁し、１ｍＬのＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国カリフォルニア州カールズバッド）に溶解した。細胞の完全な溶解を確実にするために、溶解物を２０Ｇ１ゲージ針（ＢＤ  ３０５１７５）を備えた１ｍＬシリンジに２０回通した。ＴＲＩＺＯＬ／細胞懸濁液を直ちにドライアイスで凍結し、処理するまで−８０℃で保存した。
【０２２５】
Ｄｉｒｅｃｔ−ｚｏｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｐｌｕｓキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、米国カリフォルニア州アービン）を使用して溶解物から全ＲＮＡを単離し、５μｇの全ＲＮＡを使用して、ＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ５’キット（タカラバイオ、日本）を使用して、５’−ＲＡＣＥ対応ハイブリドーマｃＤＮＡを生成した。下記のマウスＶＨファミリー特異的可変領域プライマーを使用して、ｃＤＮＡから重鎖および軽鎖の特異的遺伝子断片を増幅した。ＴＣＴＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＣＧＧ（配列番号３２１）、およびＴＴＴＧＴＣＣＡＣＣＧＴＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＴＧＧＴ（配列番号３２２）。下記のマウスＶカッパファミリーに特異的な可変領域プライマー、ＧＡＴＣＡＧＴＣＣＡＡＣＴＧＴＴＣＡＧＧＡＣＧＣＣ（配列番号３２３）、またはマウスＶラムダファミリーに特異的な可変領域プライマー、ＡＣＡＣＴＣＡＧＣＡＣＧＧＧＡＣＡＡＡＣＴＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＴ（配列番号３２４）、ＡＣＡＣＴＣＴＧＣＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＴＣＴＴＴＴＣＣＡＣＡＧＴ（配列番号３２５）、およびＡＣＡＣＴＣＡＧＣＡＣＧＧＧＡＣＡＡＡＣＴＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＴＧ（配列番号３２６）は、５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲ反応においてキットに含まれるユニバーサルプライマーと組み合わせて使用された。
【０２２６】
ＰＣＲ産物を精製し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングキット（タカラバイオ、日本）を使用してｐＲＡＣＥにクローニングした。両鎖は、Ｍ１３順方向およびＭ１３逆方向のプライマーを備えたＳａｎｇｅｒシーケンサーを使用して配列決定された。
【０２２７】
ハイブリドーマ１１Ｃ５に由来するｍＡｂについて決定された軽鎖および重鎖の可変ドメインアミノ酸配列のＶＬおよびＶＨは、上記の表２に列挙され、添付の配列表にそれぞれ配列番号２５７および２７９として提供される。
【０２２８】
さらに、ハイブリドーマ１０Ａ１１、９Ｄ５、８Ｈ１、および１３Ｄ８に由来するｍＡｂについて決定されたＶＬおよびＶＨの配列を表２に列挙し、添付の配列表にそれぞれ配列番号３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、および３１８として提供される。
【０２２９】
実施例４：１１Ｃ５ハイブリドーマ由来の抗Ｈｕ−ＩＬ１ＲＡＰ  ｍＡｂによるＩＬ−１、ＩＬ−３３、およびＩＬ−３６刺激性細胞内シグナル伝達の阻害
この実施例は、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞ブロッキングアッセイで決定されたように、１１Ｃ５、１１Ｃ５（Ｈｙ）に由来する精製抗ｈｕ−ＩＬ１ＲＡＰ  ｍＡｂが、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３、およびＩＬ−３６α、ＩＬ−３６β、およびＩＬ−３６γ刺激性細胞内シグナル伝達をブロッキングすることができることを例示する。簡潔に述べると、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−１／ＩＬ−３３センサー細胞、またはＩＬ−３６受容体ＩＬ１ＲＬ２で一過性トランスフェクションされたＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−３３センサー細胞を使用して、１１Ｃ５（Ｈｙ）がＩＬ−１、ＩＬ−３３、およびＩＬ−３６依存性シグナル伝達経路をブロッキングするか否かを決定した。これらのＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞株は両方ともＮＦ−κＢ／ＡＰ−１  ＳＥＡＰレポーター遺伝子を発現しており、簡単なＳＥＡＰ検出アッセイにより、ＩＬ−１、ＩＬ−３３、またはＩＬ−３６の活性化を監視することができる。
【０２３０】
材料および方法
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞：この実施例で使用されるＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−１／ＩＬ−３３センサー細胞は、上記の実施例２に記載されている。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−３３センサー細胞（インビボＧｅｎ、カタログ番号ｈｋｂ−ｈｉｌ３３）は、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−１／ＩＬ−３３細胞に類似しているが、ＩＬ−１およびＴＮＦ−αの両応答がブロッキングされた。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−３３細胞は、製造業者のガイドラインによって、前述の標準成長培地を使用し、１Ｘ  ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ抗生物質（インビボＧｅｎ、カタログ番号ｈｂ−ｓｅｌ）を補充して、ＳＥＡＰ、ＳＴ２、およびＩＬ−３３の特異性をコードするプラスミドを維持した。
【０２３１】
ＩＬ−３６受容体によるＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−３３細胞の一過性トランスフェクション。ＩＬ−３６受容体をコードするヒトＩＬ１ＲＬ２遺伝子を含むプラスミドは、ＡｖａｎｔＧｅｎ（カスタムオーダー）によって生成された。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−３３センサー細胞は、製造業者のガイドラインに従って、ＬｙｏＶｅｃ（インビボＧｅｎ）を使用して一過性トランスフェクションされた。簡潔に述べると、トランスフェクションの２４時間後に最低８０％の集密度を生じる濃度で、標準成長培地に懸濁した細胞にＬｙｏＶｅｃ−ＤＮＡ複合体を直接添加し、すぐに９６ウェル平底プレートに播種した。トランスフェクションの２４時間後、細胞を標準的なＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＳＥＡＰアッセイで使用した。
【０２３２】
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＳＥＡＰアッセイ。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−１／ＩＬ−３３細胞は、ＩＬ−１またはＩＬ−３３刺激が生じた全てのＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＳＥＡＰアッセイに使用され、上記の実施例２に記載されている。ＩＬ−３６刺激によるアッセイでは、ＩＬ−３６受容体であるＩＬ１ＲＬ２を一過性発現するＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−３３細胞を使用した。これらの一過性トランスフェクションされたＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−３３センサー細胞は、ＩＬ−３６α、ＩＬ−３６β、およびＩＬ−３６−γによる刺激に応答する。ヒトＩＬ−３６α、ＩＬ−３６β、およびＩＬ−３６γのサイトカインをＮ末端配列から切断して、完全に成熟なサイトカインを産生した。前述のように、アゴニストＥＣ５０およびアンタゴニスト抗体ＩＣ５０の値が得られた。陰性対照（ＮＣ）は成長培地のみに曝露された細胞を表す一方、陽性対照（ＰＣ）はアゴニストのみに曝露された細胞を表す（アンタゴニスト抗体または対照抗体がない場合）。
【０２３３】
結果
１１Ｃ５（Ｈｙ）ｍＡｂをＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−１／ＩＬ−３３細胞と１時間インキュベーションした後、以前にＥＣ５５〜６０とほぼ同等であると決定された濃度でＩＬ−１α（図１Ａ）またはＩＬ−１β（図１Ｂ）を添加した。１１Ｃ５（Ｈｙ）ｍＡｂは強いブロッキング活性を示し、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βのＩＣ５０は、それぞれ４．７Ｅ−０９Ｍおよび１．０Ｅ−０９Ｍに相当した。１００ｎＭの抗体濃度では、それぞれの陽性（ＰＣ）および陰性（ＮＣ）対照と比較した場合、ほぼ完全な阻害（ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βでそれぞれ９４％および９９％）が観察された。
【０２３４】
同様のアッセイを実施して、ＩＬ−３３で刺激されたＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−１／ＩＬ−３３細胞におけるブロッキング効力および有効性を決定した（図１Ｃ）。ＩＬ−１ブロッキングアッセイで観察されたように、１１Ｃ５（Ｈｙ）はＩＬ−３３刺激時に強いブロッキング活性を示し（ＩＣ５０＝３．７１Ｅ−０９Ｍ）、試験抗体の最大濃度（１００ｎＭ）でほぼ完全なブロッキング（９３％）が観察された。
【０２３５】
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−３６応答性細胞（すなわち、ＩＬ−３６受容体ＩＬ１ＲＬ２を一過性発現するＩＬ−３３細胞）を１１Ｃ５（Ｈｙ）と１時間インキュベーションした後、ＩＬ−３６α（図１Ｄ）、ＩＬ−３６β（図１Ｅ）またはＩＬ−３６γ（図１Ｆ）で刺激した。１００ｎＭの１１Ｃ５（Ｈｙ）抗体濃度で、ＩＬ−３６依存性シグナル伝達のほぼ完全な阻害、具体的には、ＩＬ−３６α、ＩＬ−３６β、およびＩＬ−３６γのそれぞれ９８％、９８％、および９９％の阻害が観察された。ＩＣ５０値は、ＩＬ−３６α、ＩＬ−３６β、ＩＬ−３６γでそれぞれ２．５２Ｅ−０９Ｍ、９．８１Ｅ−１０Ｍ、および６．６５Ｅ−１０Ｍであった。
【０２３６】
ＨＥＫ−ＢｌｕｅアッセイにおけるｍＡｂ  １１Ｃ５（Ｈｙ）のＩＣ５０値および％阻害は、以下の表８に要約する。
【表８】
2021533829.tif 000023
【０２３７】
上記の表８の結果に示されているように、精製されたハイブリドーマ由来抗体１１Ｃ５（Ｈｙ）は、ＨＥＫ  Ｂｌｕｅ細胞ブロッキングアッセイにおいて、全６つのサイトカイン（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３、ＩＬ−３６α、ＩＬ−３６βおよびＩＬ−３６γ）の刺激時に全３つの目的経路（ＩＬ−１、ＩＬ−３３、およびＩＬ−３６）を強くブロッキングすることができる。
【０２３８】
実施例５：抗ＩＬ１ＲＡＰ  ｍＡｂ  １１Ｃ５（Ｈｙ）のヒト化、キメラ、およびＣ５９変異体型の調製
この実施例は、ハイブリドーマ１１Ｃ５に由来するマウス抗ＩＬ１ＲＡＰ  ｍＡｂ  １１Ｃ５（Ｈｙ）のヒト化およびキメラ型の調製を例示する。さらに、この実施例は、５９番目の重鎖システイン残基を一連の代替アミノ酸、すなわちＣ５９Ａ、Ｃ５９Ｓ、Ｃ５９Ｔ、Ｃ５９Ｖ、およびＣ５９Ｙで置換した、１１Ｃ５（Ｈｙ）ｍＡｂのマウス、ヒト化およびキメラ変異体の調製を例示する。
【０２３９】
マウス抗ＩＬ１ＲＡＰ  １１Ｃ５可変領域配列のヒト化
配列番号２５７のマウス１１Ｃ５（Ｈｙ）抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）配列および配列番号２７９の重鎖可変領域（ＶＨ）配列を、ヒト生殖系列抗体配列に対して整列させた。ヒト生殖系列カッパ軽鎖（遺伝子ＩＤ−Ｖ遺伝子：ＩＧＫＶ１−ＮＬ１＊０１、Ｊ遺伝子：ＩＧＫＪ４＊０２）およびヒト生殖系列重鎖（遺伝子ＩＤ−Ｖ遺伝子：ＩＧＨＶ３−７＊０３、Ｊ遺伝子：ＩＧＨＪ４＊０３）は、最も近縁のヒトフレームワークとして同定された。マウス１１Ｃ５（のＨｙ）のＶＬおよびＶＨドメイン、最も近縁のヒト生殖系列配列、およびヒト化ｈ１１Ｃ５のアミノ酸配列アラインメントは、は、図２に示す。
【０２４０】
マウス１１Ｃ５（Ｈｙ）軽鎖および重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、同定された最も近縁の軽鎖および重鎖のヒトフレームワークにそれぞれグラフティングし、ヒト化抗体クローン（以下、「ｈ１１Ｃ５」と呼ぶ）を生成した。マウス１１Ｃ５（Ｈｙ）ＶＬ配列（配列番号２５７）におけるＣＤＲ−Ｌ１の２４〜３４番目、ＣＤＲ−Ｌ２の５０〜５６番目およびＣＤＲ−Ｌ３の８９〜９７番目をヒトカッパ軽鎖フレームワークアクセプターにグラフティングした。マウス１１Ｃ５（Ｈｙ）ＶＨ配列（配列番号２７９）におけるＣＤＲ−Ｈ１の３１〜３５番目、ＣＤＲ−Ｈ２の５０〜６５番目、およびＣＤＲ−Ｈ３の９５〜１０２番目をヒト重鎖フレームワークアクセプターにグラフティングした。マウス１１Ｃ５（Ｈｙ）軽鎖のフレームワーク領域２の４８番目も、この位置が、ＶＨ−ＶＬ相互作用界面の一部であるか、ＣＤＲ構造を調整し、抗原に適合するように微調整することができる「バーニア」ゾーンとして作用するフレームワーク残基であると見出されたため（例えば、Ｆｏｏｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２４：４８８７−４９９（１９９２）を参照）、ヒトカッパ軽鎖フレームワークアクセプターにグラフティングした。
【０２４１】
ＶＬについては５’隣接制限酵素部位としてＡｇｅＩ、３’隣接制限酵素部位としてＫｐｎＩ、ＶＨについては５’隣接制限酵素部位としてＡｇｅＩ、３’隣接制限酵素部位としてＢｓｔＥＩＩを用いて、ヒト化可変ドメイン配列をＤＮＡ断片として合成した。ｈ１１Ｃ５の軽鎖発現プラスミドは、完全ヒトカッパ軽鎖定常領域を含むｐＲＫプラスミドにおいて、ＡｇｅＩ−ＫｐｎＩ断片を合成ｈ１１Ｃ５  ＶＬ  ＤＮＡ断片と置換することによって得られた。ｈ１１Ｃ５の重鎖発現プラスミドは、完全ヒトＩｇＧ１重定常ドメインを含むｐＲＫプラスミドにおいて、ＡｇｅＩ−ＢｓｔＥＩＩ断片を合成ｈ１１Ｃ５  ＶＨ  ＤＮＡ断片と置換することによって得られた。
【０２４２】
ヒト化ｈ１１Ｃ５抗体との比較のために、マウス１１Ｃ５（Ｈｙ）ＶＬおよびＶＨ配列のＤＮＡ断片を上記のように合成した。マウス１１Ｃ５（Ｈｙ）の軽鎖および重鎖、または１１Ｃ５のキメラ型（マウスＶＬおよびＶＨドメイン、ならびにヒトＣＬおよびＣＨ１〜ＣＨ３ドメインを含む）を発現するプラスミドは、それぞれマウスＩｇＧ２ａまたはヒトＩｇＧ１定常ドメインを保有するｐＲＫプラスミドに合成ＤＮＡ断片をクローニングすることによって構築された。
【０２４３】
抗ＩＬ１ＲＡＰ１１Ｃ５の重鎖Ｃｙｓ５９変異体の生成
マウス１１Ｃ５（Ｈｙ）のＶＨのＣＤＲ−Ｈ２配列には、５９番目（Ｃｙｓ５９）に不対システイン残基が含まれており、これは抗体のさらなる治療開発において主な易罹病性であり得る。この易罹病性を除去するため、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）またはチロシン（Ｙ）のいずれかを用いて、５９番目のシステイン（Ｃ）がアミノ酸置換された一連のＶＨドメイン配列の変異体を合成した。置換は、システイン（アラニン、セリン、スレオニン、およびバリン）とのアミノ酸側鎖の類似性に基づいて、または５９番目（チロシン）の最も近縁の生殖系列配列に基づいて選択された。マウス１１Ｃ５（「１１Ｃ５（Ｈｙ）」）、キメラ１１Ｃ５（「ｃ１１Ｃ５」）、およびヒト化１１Ｃ５（「ｈ１１Ｃ５」）の各ＶＨ配列に即して生成された一連のＣｙｓ５９  ｍＡｂ変異体は、５’隣接制限酵素部位としてＡｇｅＩ、３’隣接制限酵素部位としてＢｓｔＥＩＩを用いてＤＮＡ断片として合成された。Ｃｙｓ５９変異体の重鎖発現プラスミドは上記のように生成された。
【０２４４】
１１Ｃ５（Ｈｙ）由来のマウス、キメラおよびヒト化抗ＩＬ１ＲＡＰ  ｍＡｂおよびそれらのＣｙｓ５９変異体の組換え型の生成
組換えＩｇＧ分子の発現は、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ発現システム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国カリフォルニア州カールズバッド）を使用して、製造業者の指示に従って実施した。トランスフェクション反応では、重鎖と軽鎖のプラスミドの比率を１対１に保ち、トランスフェクション細胞を６日間培養してから採取した。
【０２４５】
組換えＩｇＧ分子は下記のプロトコルで精製された。上清培地は、３００ｇで１０分間遠心分離して細胞を除去し、孔径０．２２μｍのフィルターで濾過することにより、清澄化した。清澄化した上清培地を、ＰＢＳ緩衝液で平衡化したＰＯＲＯＳ  ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ  Ａ樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と混合し、穏やかに回転させながら室温で１．５時間インキュベーションした。インキュベーション後、スラリーをカラムに充填し、樹脂を、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む２０カラム容量のＰＢＳ緩衝液で洗浄した。次に、組換えＩｇＧ分子を３カラム容量の０．１Ｍ酢酸、０．１５Ｍ  ＮａＣｌで溶出した。溶離液を１Ｍ  ＭＯＰＳ、ｐＨ７．０でｐＨ５．２にすばやく中和し、ＰＤ−１０カラム（ＧＥ）で緩衝液をＰＢＳ緩衝液に交換した。
【０２４６】
１１Ｃ５（Ｈｙ）由来のマウス、キメラおよびヒト化抗ＩＬ１ＲＡＰ  ｍＡｂおよびそれらのＣｙｓ５９変異体の組換え型の結合親和性
１１Ｃ５（Ｈｙ）に由来するマウス（「ｍ１１Ｃ５」）、キメラ（「ｃ１１Ｃ５」）、およびヒト化（「ｈ１１Ｃ５」）の組換え型ｍＡｂの配列番号３のｈｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰポリペプチドに対する結合親和性は、ＯＣＴＥＴ  Ｂｉｏ−Ｌａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（ＢＬＩ）結合分析（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ）によって測定した。
【０２４７】
実験方式では、抗体がバイオレイヤー表面に固定化されており、抗原ＩＬ１ＲＡＰが溶液中に存在した。組換えｈｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰおよび全ての１１Ｃ５変異体を、実験緩衝液（０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ緩衝液）で希釈した（それぞれ最終容量２００μＬ）。全試料を黒色の９６ウェルプレートに入れ、２５℃で実験を実施した。マウスおよびキメラ１１Ｃ５変異体（３５ｎＭ）は、抗マウスＩｇＧ  Ｆｃキャプチャー（ＡＭＣ）バイオセンサー（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ）に固定化された。抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃキャプチャー（ＡＨＣ）バイオセンサー（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ）は、ヒト化１１Ｃ５変異体（３５ｎＭ）に使用した。ｈｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰ分析対象溶液は、実験緩衝液で１〜８１ｎＭの範囲で段階希釈した。バイオセンサーは、実験開始前に、２５℃の実験緩衝液中で１０分間平衡化した。
【０２４８】
動態実験は、段階名、溶液、および時間が列挙されている下記の段階で実施した。ベースライン（緩衝液−６０秒）、充填（抗体−２００秒）、ベースライン２（緩衝液−最小１２０秒）、結合（分析対象−２００〜３００秒）および解離（緩衝液−１０００秒）。
【０２４９】
分析対象の結合および固定化抗体からの解離から得られたＢＬＩシグナルを、Ｏｃｔｅｔ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して分析した。最初に、参照ウェル（実験ウェルと同じ段階を経たが、結合段階の分析対象を含まないバイオセンサー）を使用して、記録された全てのトレースに対して参照減算を実施し、次に全てのトレースを結合段階の開始に合わせた。ｈｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰとの各１１Ｃ５変異体のＫＤを算出するために、結合および解離の段階全体を１：１結合モデルでＧｌｏｂａｌ  ｆｉｔ（４個の分析対象濃度トレースの最小値）に使用した。算出されたＫＤ値を以下の表９に列挙する。
【表９】
2021533829.tif 000024
【０２５０】
実施例６：ヒト化１１Ｃ５の非特異的結合評価
この実施例は、ヒト化１１Ｃ５（ｈ１１Ｃ５）が非特異的結合を示さないことを示すバキュロウイルス（ＢＶ）粒子ＥＬＩＳＡアッセイを例示する。
【０２５１】
下記のプロトコルを使用して、Ｈｏｔｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｍＡｂｓ，４（６）：７５３−７６０（２０１２）に記載されているプロトコルに従って、ｈ１１Ｃ５のバキュロウイルス（ＢＶ）粒子への非特異的結合を評価した。簡潔に述べると、ＢＶ粒子を９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに２．５％懸濁液として４℃で一晩コーティングした。次に、プレートを、１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで室温で１時間ブロッキングした。段階希釈したｈ１１Ｃ５抗ｈｕ−ＩＬ１ＲＡＰ抗体をプレートに１時間添加し、結合抗体を西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で検出した後、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および２Ｎ硫酸を添加した。４５０ｎｍでの吸光度を測定し、参照抗体と比較した。
【０２５２】
結果：図３のプロットに示されているように、ｈ１１Ｃ５抗体は４５０ｎｍで検出可能なＢＶ  ＥＬＩＳＡシグナルを示さず、ＢＶ粒子への非特異的結合がないことを示している。
【０２５３】
実施例７：１１Ｃ５に基づくマウス、キメラ、およびヒト化抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の機能アッセイ
この実施例は、ＩＬ−１、ＩＬ−３３、およびＩＬ−３６刺激性細胞内シグナル伝達を阻害するそれぞれの能力を決定するため、実施例４および５に記載の組換えマウス、キメラ、およびヒト化抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の細胞ブロッキングアッセイを例示する。
【０２５４】
材料および方法
細胞株およびＨＥＫ−Ｂｌｕｅアッセイ。この実施例７で使用される細胞株およびＨＥＫ−Ｂｌｕｅアッセイは、上記の実施例２および４に記載されている。
【０２５５】
初代ヒト肺線維芽細胞および関連アッセイ。初代ヒト肺線維芽細胞（ＰＨＬＦ）は市販されており、Ｌｏｎｚａ（カタログ番号ＣＣ−２５１２）から入手した。細胞は、正常な（無病）提供ヒト組織から単離され、製造業者によって凍結保存された。細胞は、製造業者が推奨する一般的なガイドラインを使用して解凍および維持された。ＰＨＬＦは、使用前に熱不活化（５６℃で３０分間）された２％ヒトＡＢ血清（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、７．５ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）、  １００ＩＵ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充したＦｉｂｒｏＬｉｆｅ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＬｉｆｅＬｉｎｅ）からなる成長培地で維持された。実験使用の前日、ＰＨＬＦを平底の９６ウェルプレートに、使用日に約８０〜８５％の集密度になる濃度で播種した。
【０２５６】
抗体ブロッキングアッセイで使用する前に、アゴニストＥＣ５０は、以下の改変を加えながら、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞について実施例２に記載されているのと同様の様式（ｍａｎｎｅｒ）でアゴニスト用量応答曲線を実施することによって決定された。ＰＨＬＦ成長培地のみ（最終容量２００μＬ）を含むウェルのＰＨＬＦにアゴニストを添加した後、細胞を組織培養インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）に４時間戻した。次に、組織培養上清を収集し、４℃で１〜３日間保存した。ＩＬ−８（ヒト）ＡｌｐｈａＬＩＳＡ検出キット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、収集した上清に存在するＩＬ−８のレベルを定量化した。アッセイは、製造業者のガイドラインの指示通りに実施された。ＥｎＶｉｓｉｏｎ−Ａｌｐｈａ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して取得した生データは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して分析し、非線形回帰分析（曲線適合）、Ｓｉｇｍｏｉｄａｌ、４ＰＬを使用して補間を実施し、Ｘはｌｏｇ（濃度）であり、重量は「重量×１／Ｙ２」により定義する。次に、標準的な非線形回帰分析を使用して、補間データを分析した。
【０２５７】
細胞ブロッキングアッセイは、実施例４の通りであるがＩＣ５０値を得るのに役立つ様式で、ＰＨＬＦの使用を具体的に説明するように改変を加えて、実施された。簡潔に述べると、ｃ１１Ｃ５＿Ｃ５９Ｙ、または適切な抗体対照（例えば、Ｈｕ  ＩｇＧ１対照）を３７℃で１時間ＰＨＬＦと共にインキュベーションした後、アゴニスト（ＩＬ−１αまたはＩＬ−３６β）を添加した。実験をさらに４時間（３７℃、５％ＣＯ２）進行させ、細胞培養上清を収集し、上記のようにＩＬ−８の定量を実施した。
【０２５８】
初代ヒト単球および関連アッセイ。「アンタッチド」としても知られる、負の免疫磁気選択によって単離された初代ヒト単球（ＰＨＭＯ）は市販されており、ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手した。単球は、一般的な製造業者のガイドラインに従って解凍され、実施例４に記載されるように標準成長培地で維持された。抗体ブロッキングアッセイでは、ＰＨＭＯをアッセイの前日に８０，０００／ウェルで平底の９６ウェルプレートに播種した。抗体ｃ１１Ｃ５＿Ｃ５９Ｙ、または適切な抗体アイソタイプ対照（Ｈｕ  ＩｇＧ対照）を、５％ＣＯ２、３７℃で１時間ＰＨＭＯと共にインキュベーションした後、目的のアゴニスト（例えば、ＩＬ−１β）を添加した。全ウェルの最終容量は２００μＬであり、陽性対照（ＰＣ）は成長培地およびアゴニストのみを示し、陰性対照（ＮＣ）はＰＨＭＯおよび成長培地のみを示す。
【０２５９】
アゴニスト添加の２４時間後に組織培養上清を収集し、ＥＬＩＳＡアッセイを実施して存在するＩＬ−６のレベルを決定できるまで−８０℃で保存した。ヒトＩＬ−６  ＥＬＩＳＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、上清中のＩＬ−６のレベルを定量化した。生データ分析および補間は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアおよび非線形回帰分析を使用して実施した。抗体ブロッキングアッセイの前に、アゴニスト用量応答曲線を生成して、実施例２に一般的に記載されているように、ＰＨＭＯの使用を具体的に説明するように改変して、上記のようにＥＣ５０値を決定した。抗体ＩＣ５０値も同じ様式で決定した。
【０２６０】
初代ヒトＮＫ細胞および関連アッセイ。負の免疫磁気選択によって単離された初代ヒトＮＫ細胞は、ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カナダ、バンクーバー）から購入した。実験使用日に、ＮＫ細胞は、一般的な製造業者のガイドラインに従って下記の改変を加えて解凍した。細胞は、０．０５ｍｇ／ｍＬ  ＤＮＡｓｅ  Ｉ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＲＰＭＩ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）からなる解凍培地で解凍した。解凍後、実験使用前に、細胞に最低１時間の回復時間（３７℃、５％ＣＯ２）を与え、使用前に熱不活化（５６℃で３０分間）した１０％ヒトＡＢ血清（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｅｌｌｇｒｏ）、２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）、および１Ｘ  ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）からなるＮＫ成長培地で維持した。
【０２６１】
抗体ブロッキングアッセイで実験使用前に、アゴニストＥＣ５０は、以下の改変を加えながら、実施例２にＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞について記載されているのと同様の様式でアゴニスト用量応答曲線を実施することによって決定された。ＮＫ細胞を丸底９６ウェルプレートに５０，０００／ウェルで播種した。ＮＫ成長培地のみ（最終容量２００μＬ）に懸濁したＮＫ細胞にアゴニストを添加した後、細胞を組織培養インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）に２４時間戻した。ＮＫ成長培地のみを含む標準的な陰性対照（ＮＣ）に加えて、陽性対照（ＰＣ）は、ＩＬ−３３（指定濃度）および０．１ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１２の両方を含むＮＫ成長培地で構成されていた。追加の「ＩＬ−１２のみ」の対照も含まれた。
【０２６２】
アゴニスト添加の２４時間後に組織培養上清を収集し、４℃で１〜３日間保存した。上清に存在するＩＦＮ−γのレベルは、製造業者のガイドラインに従って、ヒトＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して決定された。非線形回帰分析は、最終ＥＣ５０値を得るために、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェアを用いて実施した。
【０２６３】
抗体ブロッキングアッセイを同様に実施したが、実施例２に一般的に記載されるようにＩＣ５０値を得るのに役立つ様式で、上記に詳述したように、ＮＫ細胞の使用を具体的に説明するように改変された。簡潔に述べると、ｃ１１Ｃ５＿Ｃ５９Ｙ、または適切な抗体アイソタイプ対照（Ｈｕ  ＩｇＧ対照）をＮＫ細胞と共に３７℃で１時間インキュベーションした後、アゴニスト（ＩＬ−３３＋ＩＬ−１２、またはＩＬ−１２のみ）を添加した。実験をさらに２４時間（３７℃、５％ＣＯ２）進行させ、細胞培養上清を収集し、上記のようにＩＦＮγの定量を実施した。
【０２６４】
結果
組換えヒト化１１Ｃ５（「ｈ１１Ｃ５」）のブロッキング効力および有効性を決定するために、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−１／ＩＬ−３３ブロッキングアッセイを実施した。元のマウスハイブリドーマに由来する抗体（「１１Ｃ５（Ｈｙ）」）および組換えマウスエフェクターレス型（「ｍ１１Ｃ５」）もアッセイし、ヒト化の結果としてブロッキング活性の潜在的な損失、およびエフェクターレスヒトＩｇＧアイソタイプ対照（「Ｈｕ  ＩｇＧ１対照」）を評価した。
【０２６５】
ヒト化は、ＩＬ−１β（図４Ａ）およびＩＬ−３３（図４Ｂ）で刺激された両細胞においてブロッキング活性のわずかな損失をもたらした。ヒト化抗体ｈ１１Ｃ５は、１００ｎＭの（ＩＣ５０＝０．７０５ｎＭ）で完全な阻害を示したｍ１１Ｃ５、ハイブリドーマ由来１１Ｃ５（のＨｙ）の組み換え型と比較して、ＩＬ−１β刺激性細胞を用いて９８％阻害（ＩＣ５０＝３．１２ｎｍ）を実証した。同様に、ＩＬ−３３刺激性細胞の場合、１００ｎＭのｈ１１Ｃ５は、ｍ１１Ｃ５で観察された９６％の阻害（ＩＣ５０＝２．２５ｎＭ）と比較して、８０％の阻害（ＩＣ５０＝２４．０ｎＭ）を示した。図４Ｃおよび４Ｄに示されるように、ｈ１１Ｃ５のＩＬ−１βおよびＩＬ−３３ブロッキング活性は、Ｃ５９の易罹病性を除去する１１Ｃ５＿Ｃ５９Ｙ変異体によって部分的に回復した。ｈ１１Ｃ５＿Ｃ５９Ｙについては、ＩＬ−１βブロッキング活性のＩＣ５０は１．０３ｎＭに改善し、ＩＬ−３３ブロッキング活性のＩＣ５０は３．７５ｎＭに改善した。
【０２６６】
要約すると、ハイブリドーマ由来の抗Ｈｕ  ＩＬ１ＲＡＰ抗体である１１Ｃ５（Ｈｙ）は、ＩＬ−１およびＩＬ−３３依存性経路をブロッキングする能力がわずかに低減するだけでヒト化に成功し、ＶＨ領域のＣ５９Ｙ置換によって部分的に回復した。
【０２６７】
これまでに利用されたＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞株は、ＩＬ−１、ＩＬ−３３、またはＩＬ−３６経路の活性化を評価するための迅速かつ簡単な方法を提供したが、これらのような細胞株は、インビボで起こり得るものを表していない可能性がある。したがって、本発明者らは初代ヒト細胞を利用して１１Ｃ５のブロッキング活性を評価しようとした。ヒト肺線維芽細胞は、ＩＬ−１受容体（ＩＬ１Ｒ１）およびそれに関連する共受容体であるＩＬ１ＲＡＰを発現することが知られている。さらに、それらは自然免疫応答および炎症性免疫応答の両方に寄与すると考えられている（Ｓｕｗａｒａ，Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。１１Ｃ５抗体が初代ヒト肺線維芽細胞（ＰＨＬＦ）のＩＬ−１シグナル伝達を阻害する程度を決定するために、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞株アッセイに利用される一般的な実験アプローチを改変して、ＰＨＬＦの特定の技術的要件を説明した。さらに、エフェクターレスＮ２９７Ｇ変異（「ｃ１１Ｃ５＿Ｃ５９Ｙ」）を特徴とする１１Ｃ５抗体の組換えキメラ型をアッセイで使用した。
【０２６８】
図４Ｅに示されるように、ｃ１１Ｃ５＿Ｃ５９Ｙは、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅアッセイ（図１Ａを参照）のＩＬ−１α刺激性活性で観察されたように、ＰＨＬＦにおいてＩＬ−１α媒介性ＩＬ−８産生の著しく類似したブロッキング活性を実証し、両場合で約４ｎＭのＩＣ５０が観察された（ＰＨＬＦｓにおける１００ｎＭのｃ１１Ｃ５＿Ｃ５９ＹでＩＣ５０  ３．９６ｎＭおよび８７％阻害）。
【０２６９】
ＩＬ−１経路は気道の炎症に寄与すると考えられており、ヒト単球はＩＬ−１に応答することが知られている（Ｓｉｍｓ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ  ２０１０）。図４Ｆに示されるように、初代ヒト単球（ＰＨＭＯ）がｃ１１Ｃ５＿Ｃ５９Ｙの存在下でＩＬ−１βで刺激された場合、ＩＬ−６産生の１００％阻害が観察され、ＩＣ５０は０．７３３ｎＭであった。これは、ｃ１１Ｃ５＿Ｃ５９ＹがＰＨＭＯにおけるＩＬ−１β媒介性シグナル伝達を完全ブロッキングすることができることを実証している。
【０２７０】
喘息の症状に対するＩＬ−３３経路の役割および寄与は十分に考証されている（例えば、Ｓｉｍｓ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０（２）：８９−１０２（２０１０）、Ｇａｒｌａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３９（６）：１００３−１０１８（２０１３）、Ｓａｌｕｊａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓｌ．Ａｌｌｅｒｇｙ，５：３３（２０１５）を参照）。ｃ１１Ｃ５＿Ｃ５９Ｙが初代ヒト細胞のＩＬ−３３経路をブロッキングすることができるか否かを確認する（ａｓｃｅｒｔａｉｎ）ために、ヒトＮＫ細胞を使用してアッセイを実行した。ＩＬ−１２は、ＮＫ細胞によるＳＴ２（ＩＬ−３３受容体）の発現を刺激することが知られており、一般的なＮＫ刺激因子とみなされ、ＩＦＮ−γの産生および増殖を増加させ、ならびに細胞傷害を増強する（例えば、Ｌｉｅｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６（１１）；６７６−６８９（２０１６），Ｇｒａｎｚｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８：４５８（２０１７）を参照）。ＩＬ−１２の存在下で、ＩＬ−３３で刺激された初代ヒトＮＫ細胞は、ＩＦＮ−γを産生する一方、ＩＬ−１２のみに曝露されたＮＫ細胞は検出可能なＩＦＮ−γを産生しない。
【０２７１】
ｃ１１Ｃ５＿Ｃ５９ＹがヒトＮＫ細胞のＩＬ−３３／ＩＬ−１２シグナル伝達をブロッキングする程度を決定するために、ｃ１１Ｃ５＿Ｃ５９Ｙまたはエフェクターレスアイソタイプ対照抗体（「ＩｇＧ対照」）をヒトＮＫ細胞と共に１時間インキュベーションした後、２４時間ＩＬ−３３／ＩＬ−１２刺激をした。図４Ｇに示すように、ＩＦＮ−γ産生は、対照抗体とインキュベーションしたヒトＮＫ細胞において検出可能であったが、ｃ１１Ｃ５＿Ｃ５９Ｙと共にインキュベーションしたＮＫ細胞ではＮＣ値近くのレベルまで低減し、２．９０ｎＭのＩＣ５０および１００ｎＭでの８７％阻害であった。
【０２７２】
気道上皮、上皮細胞および免疫細胞のクロストーク、ならびに上皮細胞と線維芽細胞との相互作用は、免疫炎症および喘息におけるそれらの役割についてますます注目を集めている（例えば、Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ  ａｎｄ  Ｈａｍｍａｄ（２０１２）；Ｎｏｗａｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１６８（３）：３６２−３７５（２０１７）を参照）。気管支上皮細胞は、ウイルスまたは細菌の感染およびタバコの煙への曝露などの損傷またはストレスに続いて、ＩＬ−１およびＩＬ−３６などの炎症性サイトカインの産生に寄与することが知られている。さらに、肺線維芽細胞は、ＩＬ−１およびＩＬ−３６に応答して炎症反応を誘導することが知られている（例えば、Ｓｕｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７（３）：６８４−６９３（２０１４）；Ｂａｓｓｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，２８１（１）：１６９−１７８（２０１８）を参照）。図４Ｈに示されるように、ｃ１１Ｃ５＿Ｃ５９Ｙは、ＰＨＬＦのＩＬ−３６β刺激をブロッキングすることが示され、ＮＣ群のＰＨＬＦに匹敵するレベル（１００％阻害）にＩＬ−８産生を低減させることが見出され、０．２８ｎＭのＩＣ５０であった。
【０２７３】
以下の表１０に要約されるｃ１１Ｃ５＿Ｃ５９Ｙの結果を含む本実施例７の結果によって示されるように、ハイブリドーマ由来の抗ｈｕ−ＩＬ１ＲＡＰ抗体、１１Ｃ５（Ｈｙ）に基づく組換え抗体は、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞株および初代ヒト細胞の両方において、ＩＬ−１、ＩＬ−３３およびＩＬ−３６シグナル伝達をブロッキングすることができる。さらに、初代ヒト細胞アッセイは、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞株アッセイの使用をさらに検証する。
【表１０】
2021533829.tif 000025
【０２７４】
実施例８：ファージライブラリーパニングを使用したヒト化抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の親和性成熟
この実施例は、ヒトＩＬ１ＲＡＰへの結合を改善するために、ヒト化抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体ｈ１１Ｃ５の親和性成熟に使用されるファージライブラリー構築およびパニング技法を例示する。
【０２７５】
ヒト化１１Ｃ５Ｃ５９Ｙ／Ａ４３Ｓ親和性成熟ＮＮＫライブラリーの構築
ｈｕ−ＩＬ１ＲＡＰに対するｈ１１Ｃ５＿Ｃ５９Ｙ抗体の結合親和性をさらに改善するために、親和性成熟プロセスを実行した。ライブラリーの構築を開始する前に、アラニン（Ａ）からセリン（Ｓ）への置換（Ａ４３Ｓ）がｈ１１Ｃ５＿Ｃ５９Ｙ軽鎖のフレームワーク領域２に導入された。Ａ４３Ｓ置換は、ヒト化プロセスによるＶＨ−ＶＬ相互作用界面の変更の潜在的な影響を最小限に抑えるために導入された（Ｆｏｏｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２４：４８７−４９９（１９９２））。したがって、ファージライブラリーは、ｈ１１Ｃ５＿Ｃ５９Ｙ／Ａ４３Ｓ変異体を親配列として使用することに基づいて構築された。ファージライブラリーは、全２０個のアミノ酸をコードするＮＮＫ縮重コドンを使用して軽鎖または重鎖ＣＤＲ残基のいずれかの残基ランダム化を用いて、一価Ｆａｂファージディスプレイ用のＦａｂ−ａｍｂｅｒ方式で構築された（Ｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９（１２）：５３８１−５３８３（１９９２））。変異誘発オリゴヌクレオチドは、３つの軽鎖または重鎖ＣＤＲのそれぞれのＣＤＲ残基に１つのＮＮＫ変異を適用するように設計された。したがって、ライブラリーの各メンバーは、軽鎖または重鎖の各ＣＤＲに１つずつ、３つのＮＮＫ縮重コドンを保有する。次に、合成変異誘発オリゴヌクレオチドを使用して、クンケル変異誘発を用いて軽鎖または重鎖ライブラリーを構築した（Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４：３６７−３８２（１９８７））。得られたライブラリーＤＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１細胞に電気穿孔し、約１．３×１０９の形質転換体を得た。
【０２７６】
配列番号３（２μｇ／ｍＬ）のｈｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰポリペプチド構築物を、Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート上４℃で一晩コーティングした。第１パニングラウンドでは、プレートおよびファージライブラリーを０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０および１％ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液で１時間（プレート）または３０分（ファージライブラリー）ブロッキングした。プレートをＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ（０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含むＰＢＳ緩衝液）で洗浄し、ブロッキングされたファージライブラリーと共に振とうしながら２時間インキュベーションした。非特異的に結合したファージは、Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで激しく洗浄することにより除去した。特異的に結合したファージを０．１Ｎ  ＨＣｌで溶出し、１／１０体積／体積の１．３Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基を使用して中和した。非特異的相互作用は、１／１０体積／体積の１％ＢＳＡを添加することにより阻害された。
【０２７７】
第２パニングラウンドは、ブロッキング段階にＳＵＰＥＲＢＬＯＣＫ（商標）ＰＢＳ緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）および０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を使用したことを除いて、１回目と同一であった。
【０２７８】
第３〜５のパニングラウンドでは、ファージライブラリーをブロッキング緩衝液（ラウンド３で１％ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液、ラウンド４および５でＳＵＰＥＲＢＬＯＣＫ（商標）ＰＢＳ緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）および０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０）で３０分間インキュベーションし、次に低濃度のビオチン化ｈｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰで１時間インキュベーションした。Ｈｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰに結合したファージを、ブロッキングされたニュートラアビジンでコーティングしたプレートに捕捉し、Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで十分に洗浄し、ラウンド１および２と同じ様式で溶出および中和した。最終選択ラウンドでは、１０００倍の非ビオチン化ｈｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰが競合相手として添加され、選択厳密性が増した。
【０２７９】
ＮＧＳを使用して親和性成熟ライブラリーから配列を抽出するために、ファージミド二本鎖ＤＮＡを、最初のファージライブラリー（非選別ライブラリー）ならびに第２および第３ラウンドの溶液選択（選別ライブラリー）からファージミドを保有するＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ−１細胞から単離した。精製されたＤＮＡをテンプレートとして使用し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  １６ｓライブラリー調製プロトコル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を使用してＶＬおよびＶＨ領域のアンプリコンを生成した。配列決定アダプターおよびデュアルインデックスバーコードは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｎｅｘｔｅｒａ  ＸＴ  Ｉｎｄｅｘ  Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）を使用して追加された。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑでの配列決定用の調製において、アダプターを連結したアンプリコンを、ＭｉＳｅｑ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  ｖ３（６００サイクル）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）を使用して、標準Ｉｌｌｕｍｉｎａライブラリー変性および試料充填プロトコルに供した。ペアエンド配列決定は、２００塩基対〜３００塩基対の挿入サイズでアンプリコンの全長をカバーするように実施した。
【０２８０】
ｈ１１Ｃ５＿Ｃ５９Ｙ／Ａ４３Ｓ親和性成熟ライブラリーのＮＧＳデータ分析
ペアエンド配列決定データは、最初に、ペアエンドアセンブラＰＡＮＤＡｓｅｑ（例えば、Ｍａｓｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１３：３１（２０１２）を参照）を使用してアセンブルし、完全なアンプリコンを得た。次に、同定されたアンプリコンについて品質管理（ＱＣ）を実施し、各アンプリコンが配列の挿入または欠失および終止コドンがないことを確認し（ｃｈｅｃｋ）、各ＣＤＲ配列は、最大１つのＮＮＫ変異のみを保有し、非ＮＮＫ変異はなかった。位置特異的重み行列は、ランダム化された全ての位置の全変異頻度を算出することによって生成された。各変異の濃縮比は、前述のように、選別試料の所与の位置での所与の変異頻度を、非選別試料のまったく同じ変異の頻度で割ることによって算出した（Ｋｏｅｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２９０（３６）：２１７７３−２７８９６（２０１５））。ＮＧＳデータの分析により、ｈｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰに対して高い親和性を保持する抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体をもたらす、６つのＣＤＲのそれぞれにおける広範囲のアミノ酸置換が同定され、これらを以下の表１１に列挙する。
【表１１】
2021533829.tif 000026
【０２８１】
親和性成熟ライブラリーからのＮＧＳデータをさらに分析すると、以下の表１２に示すように、最も高い親和性改善を示すと予測されるアミノ酸置換を有する変異体ｈ１１Ｃ５抗体の選択サブセットの濃縮比および予測される親和性改善が得られた。
【表１２】
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【０２８２】
親和性成熟ＶＬまたはＶＨ領域を有するＦａｂ変異体のＢｉａｃｏｒｅ分析
高い濃縮比で親和性成熟ＶＬまたはＶＨライブラリーから同定された変異は、単一、二重、または三重の変異として、８ＸＨｉｓタグを含む哺乳動物Ｆａｂ発現構築物にクローニングするために選択され、Ｆａｂタンパク質を生成した。親和性成熟ＶＬまたはＶＨ領域をコードするプラスミドを、ＨＣ：ＬＣの１：１比率を使用して、２０〜３０ｍＬ発現用にＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にトランスフェクションした。Ｆａｂタンパク質は、上清を１Ｘリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．２（ＰＢＳ）で１．５倍に希釈し、１０ｍＭイミダゾールを添加し、バッチモードで２時間樹脂に結合することにより、ＨｉｓＰｕｒ  Ｎｉ−ＮＴＡカラムで精製した。インキュベーション後、スラリーをカラムに充填し、樹脂を２０カラム容量（ＣＶ）のＰＢＳ＋２０ｍＭイミダゾールで洗浄した。組換えＦａｂ分子は、５ＣＶ  ＰＢＳ＋２５０ｍＭイミダゾールで溶出した。精製Ｆａｂは、ＰＤ１０脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＰＢＳに緩衝液交換された。
【０２８３】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析を使用して、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）８Ｋ機器を使用して、ＶＬまたはＶＨ領域のいずれかに選択された単一、二重、および三重の変異を含む精製Ｆａｂのｈｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰに対する結合親和性を決定した。簡潔に述べると、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）へのＢｉｏｔｉｎ  ＣＡＰｔｕｒｅ試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の１：４希釈液を２μＬ／分の流速でチップに適用した。動態測定では、５ｎＭのビオチン化ｈｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰを１０μＬ／分で捕捉し、第２フローセル（ＦＣ２）で約５０の応答ユニットに達した。ＦＣ１は参照として保持された。次に、Ｆａｂタンパク質を含むＨＢＳ−Ｐ緩衝液（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）の低（０．３１ｎＭ）から高（２０ｎＭ）までの２倍段階希釈液を２５℃または３７℃のいずれかで注入した（流速：１０μＬ／分）。センサーグラムは記録され、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）８Ｋ評価ソフトウェア（バージョン１．１．１．７４４２）を用いたデータ分析の前に、参照および緩衝液の減算が行われた。結合率（ｋｏｎ）および解離率（ｋｏｆｆ）は、単純な１対１のラングミュア結合モデルを使用して算出された。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比率として算出された。
【０２８４】
結果
親和性成熟Ｆａｂ変異体のＢｉａｃｏｒｅ親和性の結果を以下の表１３に要約する。変異体の多くは、改善された結合親和性を示した。親配列にＡ５１ＹおよびＷ９２Ｉ変異を導入した変異体Ｋ１３は、ｈ１１Ｃ５＿Ｃ５９Ｙ／Ａ４３Ｓの入力親Ｆａｂよりも９倍親和性を改善した。
【表１３−１】
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【表１３−２】
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【０２８５】
親和性が改善されたＶＬおよびＶＨ領域変異体の組み合わせのＦａｂタンパク質
最も改善されたＫＤ値を示すＦａｂ変異体は、ＶＬおよびＶＨ領域の両変異体を含む変異体を生成するために、ＶＬ領域（Ｋ１０、Ｋ１３、およびＫ１７）およびＶＨ領域（Ｈ２およびＨ３）変異体から選択された。得られる組み合わせ変異体のＢＩＡＣＯＲＥ（商標）ＳＰＲ分析を上記のように実施し、結果を以下の表１４に要約する。Ｆａｂ変異体Ｋ１０／Ｈ２、Ｋ１３／Ｈ２、およびＫ１３／Ｈ３の組み合わせは、ｈ１１Ｃ５＿Ｃ５９Ｙ／Ａ４３Ｓの入力親Ｆａｂよりも約１２〜１３倍改善された親和性を示した。
【表１４】
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【０２８６】
実施例９：親和性成熟抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体のアッセイ
この実施例は、Ｆａｂおよび完全長ＩｇＧ形態の両方で、実施例８に記載の親和性成熟ヒト化抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体変異体の機能活性を特性評価するために使用される細胞ブロッキングアッセイを例示する。
【０２８７】
材料および方法
細胞株およびＨＥＫ−Ｂｌｕｅアッセイ。この実施例９の細胞株およびＨＥＫ−Ｂｌｕｅ関連アッセイは、実施例２に記載されているように実行された。
【０２８８】
完全長ｈ１１Ｃ５  ＩｇＧ変異体の産生。重鎖または軽鎖をコードするプラスミドを、３０ｍＬ発現用に１：１比率のＨＣ：ＬＣを使用して、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にトランスフェクションした。ＩｇＧは、ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、上清をカラムに流し、２０カラム容量（ＣＶ）のＰＢＳ＋５００ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄し、２０ＣＶのＰＢＳで平衡化することにより精製した。ＩｇＧは、５ＣＶの０．１Ｍ酢酸＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ３．０で溶出し、すぐに０．２ＣＶの１．０Ｍ  ＭＯＰＳ、ｐＨ７で中和した。ＩｇＧは、２ＸＰＢＳ、ｐＨ６．５でＳ２００調製等級サイジングカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用したゲル濾過によってさらに精製された。
【０２８９】
結果
実施例８の親和性成熟Ｆａｂ変異体、および変異体抗体の完全長ＩｇＧ型を用いたＨＥＫ−Ｂｌｕｅアッセイ（実施例４および７で使用された通り）を実行して、観察されたｈｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰに対する結合親和性の改善が、ＩＬ−１、ＩＬ−３３、およびＩＬ−３６シグナル伝達活性のブロッキングの改善と相関したか否かを決定した。図５Ａ、５Ｂ、および５Ｃに示されるように、実施例８で最大の親和性の改善を示す９つのＦａｂ変異体（すなわち、Ｋ１０、Ｋ１３、Ｋ１７、Ｋ１０／Ｈ２、Ｋ１０／Ｈ３、Ｋ１３／Ｈ２、Ｋ１３／Ｈ３、Ｋ１７／Ｈ２、Ｋ１７／Ｈ３）は、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅアッセイにおいて、ｈ１１Ｃ５＿Ｃ５９Ｙ／Ａ４３Ｓの親Ｆａｂと比べて、ＩＬ−１、ＩＬ−３３、およびＩＬ−３６シグナル伝達活性の阻害の増加も示した。９つの親和性成熟Ｆａｂ変異体の効力（ＩＣ５０）および１００ｎＭでの％阻害を以下の表１５に要約する。
【表１５】
2021533829.tif 000031
【０２９０】
同じ親和性成熟変異体も、エフェクターレスＮ２９７Ｇ変異を有する完全長ＩｇＧ抗体としてアッセイされた。図５Ｄおよび５Ｆに示されるように、同様の結果が、ＩＬ−１βまたはＩＬ−３６αで刺激されたＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−１／ＩＬ−３３細胞またはＩＬ−３３細胞（ＩＬ−３６受容体のＩＬ１ＲＬ２を一過性発現する）をそれぞれ利用するアッセイで観察された。しかしながら、図５Ｅに示されるように、全部ではないがほとんどの変異体は、ＩＬ−３３で刺激されたＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−１／ＩＬ−３３細胞に対してブロッキング活性の増加を示した。完全長ＩｇＧ親和性成熟変異体の効力（ＩＣ５０）および１００ｎＭでの％阻害を以下の表１６に要約する。
【表１６】
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【０２９１】
実施例１０：ｈ１１Ｃ５変異体のｐＨ依存性結合
この実施例は、ｐＨ６およびｐＨ７．４でのｈｕ−ＩＬ１ＲＡＰおよびｃｙｎｏ−ＩＬ１ＲＡＰの結合における、実施例９の親和性成熟ｈ１１Ｃ５変異体のいくつかの動態を例示する。インビボでの１１Ｃ５変異体の半減期を延長するために、本発明者らは、ｐＨ６で（中性ｐＨでの親和性を変化させずに）新生児Ｆｃ受容体であるＦｃＲｎに対するｈ１１Ｃ５の親和性を高めようとした。投与されると、ＩｇＧは最初に細胞に内部移行し、その後エンドソームで処理される（例えば、Ｋｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＡｂｓ，３（５），４２２−４３０（２０１１）を参照。エンドソームの酸性化は、ＩｇＧ  Ｆｃ断片のＦｃＲｎへの結合、低ｐＨでの高親和性相互作用を促進する（例えば、Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７（９），７１５−７２５（２００７）を参照。複合体として細胞表面に輸送された後、中性ｐＨでのＦｃに対するＦｃＲｎの親和性が低いため、ＩｇＧは放出されて循環に戻る。このリサイクルプロセスは、ＩｇＧを分解から保護し、それによってインビボでの長い半減期に寄与する。
【０２９２】
低ｐＨでＦｃＲｎに対するＩｇＧの親和性を高める変異は、抗体を細胞表面に再循環させて循環に戻すことにより、インビボでの治療用抗体の半減期を延ばし得る。しかしながら、ＩＬ１ＲＡＰによる治療用分子の標的媒介性薬物動態（ＴＭＤＤ）は、ＦｃＲｎによるリサイクルを妨げる可能性がある。酸性ｐＨでＩＬ１ＲＡＰへの解離速度定数（「ｋｏｆｆ」）が比較的速いｈ１１Ｃ５変異体は、ＴＭＤＤからの干渉を制限し、ＦｃＲｎ結合を増強する変異から最も恩恵を受け得る。
【０２９３】
実施例９のどのｈ１１Ｃ５変異体が低ｐＨでＴＭＤＤを回避する確率が最も高いかを決定するために、ｐＨ７．４およびｐＨ６でＩＬ１ＲＡＰに結合するｈ１１Ｃ５変異体の動態を測定した。実施例９のｈ１１Ｃ５変異体、Ｋ１７／Ｈ２（または「ＹＫＤ」）は、試験された４つの１１Ｃ５変異体のうち、ｐＨ６で最も速いｋｏｆｆを有する。これは、ＹＫＤが標的媒介性薬物動態（ＴＭＤＤ）を回避する確率が最も高く、したがってＦｃＲｎ結合変異から最も恩恵を受け得ることを示唆している。
【０２９４】
材料および方法
ｐＨ７．４およびｐＨ６でのｈ１１Ｃ５  ＩｇＧ変異体のＢＩＡＣＯＲＥ  ＳＰＲ分析：ｐＨ７．４でｈｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰ（配列番号３）およびｃｙｎｏ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰ（配列番号８）に結合する４つのｈ１１Ｃ５  ＩｇＧ変異体のＢＩＡＣＯＲＥ（商標）ＳＰＲ分析を実施例８に記載されているように実施し、０．６ｎＭのビオチン化ｈｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰまたは１．８ｎＭのｃｙｎｏ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰのいずれかをチップ上に捕捉し、低（０．１０３ｎＭ）から高（１０ｎＭ）までの１１Ｃ５  ＩｇＧの３倍段階希釈を３７℃で分析対象として注入した。１１Ｃ５変異体をｐＨ６でｈｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰおよびｃｙｎｏ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰに結合する場合、方法は、ｐＨ６ランニング緩衝液（１０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％（重量／体積）Ｐ２０）の使用を除いて、ｐＨ７．４での結合と同一であり、該緩衝液はＢｉｏｔｉｎ  ＣＡＰｔｕｒｅ試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１：４に希釈するためにも使用された。
【０２９５】
結果
ｐＨ７．４およびｐＨ６でのＢＩＡＣＯＲＥ  ＳＰＲ分析結果は、表１７に要約され、ここで、ＫＤは測定された見かけの親和性であり（ＩｇＧがこの方式での分析対象であるとする）、ｋｏｆｆは解離速度定数である。
【表１７】
2021533829.tif 000033
【０２９６】
ｐＨ６でのｈ１１Ｃ５変異体ＹＫＤのより速い解離速度定数（すなわち、「ＹＩＳに対するｋｏｆｆ（６）比」の最大値）は、この変異体が標的媒介性薬物動態（ＴＭＤＤ）を回避する確率がおそらく最も高いことを示唆している。ｈ１１Ｃ５−ＩＬ１ＲＡＰ複合体がエンドソームに内在化され処理される場合、ＹＫＤ変異体は他のｈ１１Ｃ５変異体と比べて最も速くＩＬ１ＲＡＰから解離するであろう。次に、ＦｃＲｎは遊離のｈ１１Ｃ５に結合し、それを細胞表面に送達し、薬物を放出して循環に戻すことができる。したがって、ｈ１１Ｃ５変異体ＹＫＤは、中性ｐＨではなく酸性ｐＨでＦｃＲｎに対する親和性を高める、Ｆｃ領域の付加的変異から最も恩恵を受ける可能性がある。
【０２９７】
実施例１１：ＹＴＥ変異を有するｈ１１Ｃ５変異体の生成
この実施例は、低ｐＨでＩｇＧ  Ｆｃ断片のＦｃＲｎへの結合をより高い親和性で促進するｈ１１Ｃ５変異体を生成する方法、および変異体をさらに特性評価する方法を例示する。
【０２９８】
材料および方法
ＹＴＥ変異を有する抗体の生成：ＦｃＲｎに対するＦｃ断片の親和性を高めることが知られているＹＴＥ三重変異Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ（Ｅｕインデックスによる付番、ＹＴＥ）（例えば、Ｄａｌｌ’  Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９（９）：５１７１−５１８０（２００２）を参照）は、実施例９および１０に記載のｈ１１Ｃ５変異体のＦｃ部分にＹＫＤおよびＹＩＳを遺伝子合成によって導入され、ＹＫＤ／ＹＴＥおよびＹＩＳ／ＹＴＥを生成した。組換え抗体ＹＫＤ／ＹＴＥおよびＹＩＳ／ＹＴＥは、実施例５に記載されているように生成した。
【０２９９】
ＹＴＥ置換を有する１１Ｃ５  ＩｇＧ変異体のＢＩＡＣＯＲＥ  ＳＰＲ分析：ｐＨ７．４および３７℃でのｈｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰおよびｃｙｎｏ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰに対する変異体ｈ１１Ｃ５抗体のＹＩＳ、ＹＩＳ／ＹＴＥ、ＹＫＤ、およびＹＫＤ／ＹＴＥのＢＩＡＣＯＲＥ（商標）ＳＰＲ結合分析は、実施例１０に記載されているように実施した。
【０３００】
ｐＨ６．０および７．４でのＦｃＲｎ結合のアッセイ：ヒトＦｃＲｎおよびｃｙｎｏ  ＦｃＲｎに対するＹＫＤおよびＹＫＤ／ＹＴＥの結合親和性を決定するために、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）８Ｋ機器を用いたＳＰＲ測定を実施した。簡潔に述べると、シリーズＳセンサーチップＣＡＰを使用して、結合測定のためにビオチン化ヒトＦｃＲｎまたはｃｙｎｏ  ＦｃＲｎを捕捉した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）へのＢｉｏｔｉｎ  ＣＡＰｔｕｒｅ試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号２８−９２０２−３４）の１：４希釈液を２μＬ／分の流速でチップに適用した。１０ｎＭのビオチン化ヒトＦｃＲｎ（Ａｃｒｏ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＦＣＮ−Ｈ５２Ｗ７）またはｃｙｎｏ  ＦｃＲｎ（Ａｃｒｏ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＦＣＭ−Ｃ５２８４）を１０μＬ／分で捕捉し、第２フローセル（ＦＣ２）で約５０の応答ユニットに達した。最初のフローセル（ＦＣ１）は参照として保持された。次に、ＹＫＤまたはＹＫＤ／ＹＴＥ  ＩｇＧを含むＭＥＳ緩衝液（１０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）またはＨＢＳ−Ｐ緩衝液（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）の低（１．３７ｎＭ）から高（１０００ｎＭ）濃度までの３倍段階希釈液を２５℃で３０μＬ／分の流速で注入した。センサーグラムは記録され、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）８Ｋ評価ソフトウェア（バージョン１．１．１．７４４２）により評価する前に、参照および緩衝液の減算が行われた。
【０３０１】
ＹＴＥ変異を有するｈ１１Ｃ５変異体の非特異的結合を決定するためのバキュロウイルス（ＢＶ）ＥＬＩＳＡ：ＹＩＳ／ＹＴＥおよびＹＫＤ／ＹＴＥの非特異的結合は、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０なし）でブロッキングされたプレートを除いて、実施例６に記載されているようにＢＶ  ＥＬＩＳＡによって評価された。
【０３０２】
結果
ＹＴＥ変異を有する抗体の生成：ＹＴＥ置換を有するＦｃ断片が生成され、そのアミノ酸配列が表２に列挙され、添付の配列表に配列番号３２７として提供される。
【０３０３】
ＹＴＥ変異を有するｈ１１Ｃ５変異体のＢＩＡＣＯＲＥ  ＳＰＲ分析：ＹＫＤ／ＹＴＥおよびＹＩＳ／ＹＴＥをそれらの親分子ＹＫＤおよびＹＩＳとそれぞれ比較する結合結果を表１８に要約する。
【表１８】
2021533829.tif 000034
【０３０４】
ＫＤは測定された見かけの親和性（ＩｇＧがこの実験方式での分析対象であるとする）であり、ｋｏｆｆは解離速度定数である。ｈｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰまたはｃｙｎｏ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰのいずれかに対するＹＫＤ／ＹＴＥおよびＹＩＳ／ＹＴＥの親和性は、２倍以内であるＫＤ値比（「ＫＤＹＴＥ／ＫＤ親」）によって示されるように、それぞれの親分子の親和性よりも有意に相違しない。したがって、ＹＴＥ置換の追加はＩＬ１ＲＡＰへの結合に影響を及ぼさないと結論付けられる。
【０３０５】
ｐＨ６．０および７．４でのＦｃＲｎ結合のアッセイ：ＳＰＲ測定を使用して、ｐＨ値６．０および７．４でのｈｕ−ＦｃＲｎおよびｃｙｎｏ−ＦｃＲｎに対するＹＫＤおよびＹＫＤ／ＹＴＥの結合親和性を決定した。平衡解離定数（ＫＤ）値は、定常状態分析を使用して算出され、ｐＨ６．０およびｐＨ７．４でのＹＫＤとＹＫＤ／ＹＴＥ間のヒトＦｃＲｎおよびｃｙｎｏ  ＦｃＲｎの結合を比較した。表１９に示すように、結果は、ＹＫＤ／ＹＴＥがｐＨ６．０ではヒトＦｃＲｎおよびｃｙｎｏ  ＦｃＲｎの結合を明らかに改善するが、ｐＨ７．４では改善しないことを示している。
【表１９】
2021533829.tif 000035
【０３０６】
ｈ１１Ｃ５  ＹＴＥ変異体の非特異的結合を決定するためのバキュロウイルス（ＢＶ）ＥＬＩＳＡ：表２０に示すように、ＹＩＳ／ＹＴＥ抗体もＹＫＤ／ＹＴＥ抗体も、４５０ｎｍの上記培地対照抗体試料で検出可能なＢＶ  ＥＬＩＳＡ吸光度シグナルを示さなかった。したがって、ＹＴＥ変異の導入により、ＢＶ粒子への非特異的結合は導入されていない。
【表２０】
2021533829.tif 000036
【０３０７】
実施例１２：ＹＴＥ変異を有する抗ヒトＩＬ１ＲＡＰ抗体のブロッキング活性の細胞アッセイ
この実施例は、実施例１１に記載のＹＴＥ変異を含む変異体抗ヒトＩＬ１ＲＡＰ抗体を使用したＨＥＫ−Ｂｌｕｅレポーターおよび初代細胞アッセイにおいて、ＩＬ−１、ＩＬ−３３、およびＩＬ−３６経路の機能阻害を例示する。
【０３０８】
方法および材料
細胞株およびＨＥＫ−Ｂｌｕｅレポーター細胞アッセイ：細胞株およびＨＥＫ−Ｂｌｕｅレポーターアッセイは、実施例２および４に記載されているように実行した。
【０３０９】
初代ヒトＮＫ細胞および関連アッセイ：アゴニスト用量応答および抗体ブロッキングアッセイを含む、初代ヒトＮＫ細胞および関連アッセイは、実施例７で先に記載および考察されている。この実施例の抗体ブロッキングアッセイは、使用するブロッキング抗体、すなわちＹＫＤ／ＹＴＥおよびＹＫＤ（実施例１１に記載）を除いて、同じ様式で実施された。陰性および陽性対照は実施例７に記載されている。阻害率は、指示抗体濃度を使用して得られた値から陰性対照で得られた値を差し引くことによって算出した。次に、陰性対照調整値を使用して、陽性対照に対する比率を決定した。陰性対照値を補間できなかった場合（例えば、検出の閾値未満）、阻害率は、陽性対照単独に対する指示抗体濃度を使用して得られた値の比率を反映する。ヒトサイトカインＩＬ−３３およびＩＬ−１２は購入した（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）。
【０３１０】
初代ヒト肺線維芽細胞および関連アッセイ：使用した初代ヒト肺線維芽細胞（ＰＨＬＦ）および関連アッセイは、実施例７に記載された通りであった。陽性対照は、アゴニスト単独（ＩＬ−１αまたはＩＬ−３６β）の存在下でのＰＨＬＦを表す。抗体ブロッキングアッセイは、ＥＣ５５に近いアゴニスト濃度またはそれより高い濃度で実施した。陰性対照は、アゴニストまたは抗体に曝露されていないＰＨＬＦを表す。阻害率は、初代ヒトＮＫ細胞アッセイについて上記のように算出された。完全に成熟したサイトカインを産生するように処理されたヒトＩＬ−３６βは、社内で生成した。ヒトＩＬ−１αは購入した（Ｇｉｂｃｏ）。
【０３１１】
初代ヒト単球および関連アッセイ：下記を除いて、実施例７に記載されているように単球アッセイを実行した。単球を９６ウェルプレートに播種し、実験使用前に３時間の回復時間（３７℃、５％ＣＯ２）を与えた。
【０３１２】
ヒト表皮ケラチノサイトおよび関連アッセイ：複数の新生児包皮から単離されたヒト表皮ケラチノサイト（ＨＥＫｎプール）は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（カタログ番号１３４０１）から入手した。ＨＥＫｎ細胞は、一般的な製造業者のガイドラインに従って解凍および継代培養され、１％ヒトケラチノサイト成長サプリメント（ＨＫＧＳ）（カタログ番号Ｓ−００１−５）および１ｘペニシリン−ストレプトマイシン溶液（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３０−００２−ＣＩ）を補充したＥｐｉＬｉｆｅ（登録商標）培地（カタログ番号Ｍ−ＥＰＩ−５００−ＣＡ）で維持された。抗体ブロッキングアッセイでは、ＨＥＫｎ細胞を解凍し、８０％の集密度に達するまで培養した。次に、細胞を平底の９６ウェルプレートに１０，０００／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩（約１８時間）インキュベーションした。一晩のインキュベーション後、ＨＥＫｎ細胞を、１１Ｃ５−ＹＫＤ、１１Ｃ５−ＹＫＤ／ＹＴＥ、または適切な抗体アイソタイプ対照（ＩｇＧ対照）の溶液に曝露し、３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベーションし、続いてアゴニストを添加した（ＥＣ６０でＩＬ−３６β）。陽性対照条件（ＰＣ）には、細胞、成長培地、およびアゴニスト（ＩＬ−３６β）が含まれた。陰性対照条件（ＮＣ）には、細胞および成長培地のみが含まれた。アゴニスト添加の２４時間後に組織培養上清を収集し、ＥＬＩＳＡを実施してＩＬ−８のレベルを決定するまで−８０℃で保存した。ヒトＩＬ−８ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、製造業者の推奨によって、上清中のＩＬ−８のレベルを定量化した。抗体ブロッキングアッセイの前に、アゴニストおよびアンタゴニストの用量応答曲線を生成して、実施例５に記載されているように、ＥＣ５０およびＩＣ５０を（それぞれ）決定した。
【０３１３】
好塩基球細胞アッセイ：下記のプロトコルは、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／０７７３８１Ａ１号に記載されているアッセイ方法から改変され、該号は参照により本明細書に組み込まれる。ＰＢＭＣは、ヘパリンナトリウム（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈ）で収集された末梢全血から単離された。血液をＰＢＳで１：１に希釈した。３０ｍＬの希釈血を１５ｍＬのＦｉｃｏｌｌ  Ｐａｑｕｅ  Ｐｒｅｍｉｕｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  １７−５４４２−０３）に重層し、試料をブレーキなしで、２０℃で２０分間４００ｇで回転させた。ＰＢＭＣ含有層を５０ｍＬチューブに移し、５０ｍＬ  ＰＢＳで２回洗浄した。洗浄したＰＢＭＣをＰＢＳに再懸濁し、２，０００万細胞／ｍＬに希釈し、ｖ底９６ウェルプレートの１ウェル当たり１００万細胞（５０μＬ）で播種した。ＰＢＳで４×最終濃度で段階希釈した抗体溶液２５μＬをウェルに添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーションした。６０分後、４×最終濃度で２５μＬのＩＬ−３３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  ２００−３３）を含むＰＢＳをウェルに添加した（最終容量１００μＬ）。細胞を５％ＣＯ２、３７℃で２０分間インキュベーションした後、１００μＬの予熱したＰｈｏｓｆｌｏｗ  Ｆｉｘ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｉ（ＢＤ  ５５７８７０）を添加した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で１０分間インキュベーションした後、５００ｇで５分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋０．０５％アジ化ナトリウム）に再懸濁した。プレートを５００ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。プレートを短時間ボルテックスすることにより、細胞ペレットを残留量に再懸濁し、１００μＬの氷冷Ｐｈｏｓｆｌｏｗ  Ｐｅｒｍ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ（ＢＤ  ５５８０５２）を各ウェルにゆっくりと加えた。プレートをＰｅｒｍ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩに−２０℃で一晩保存した。翌日、プレートを５００ｇで５分間回転させ、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。下記の抗体を用いて細胞を５０μＬ  ＦＡＣＳ緩衝液で室温で１時間染色した。抗ＣＤ１２３  ＦＩＴＣ（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  １１−１２３９−４２、１：１０希釈）、抗ホスホｐ３８  ＰＥ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６９０８Ｓ、１：５０に希釈）、抗ＨＬＡ−ＤＲ  ＢＶ４２１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ３０７６３６、１：２０に希釈）、および抗ＣＤ２０３ｃ  ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ３２４６１０  １：２００）。一部のウェルでは、アイソタイプ対照（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４７５２Ｓ）を抗ホスホ−ｐ３８  ＰＥ抗体の代わりに使用して、ホスホ−ｐ３８陽性に染色された集団のゲーティングを促進した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で読み取った。Ｕｌｔｒａｃｏｍｐビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ０１−２２２２−４１）を使用して補正対照を調製し、細胞と並行して実行した。Ｆｌｏｗｊｏソフトウェア（ＢＤ）を使用して、ＣＤ１２３＋ＨＬＡＤＲ−好塩基球でホスホ−ｐ３８染色を分析した。ＣＤ２０３ｃ染色は、ＣＤ１２３＋ＨＬＡＤＲ−に基づいてゲ��ティングされた好塩基球の同一性を検証するために使用した。ＣＤ１２３＋ＨＬＡＤＲ−好塩基球からの％ホスホ−ｐ３８陽性データをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７ソフトウェアを使用して分析し、アッセイにおける抗体ＩＣ５０値を決定した。アゴニストの用量応答は、抗体の用量応答と並行して実行した。抗体用量応答でインキュベーションした細胞は、実験前に基づいて推定ＥＣ５０でアゴニストで刺激した。陽性対照は、推定ＥＣ５０でアゴニストで処理し、抗体溶液の代わりにＰＢＳで処理した。陰性対照は、抗体およびアゴニスト溶液の両方の代わりにＰＢＳで処理した。データは平均±ＳＤとしてプロットされ、濃度ごとに２回繰り返す。
【０３１４】
ＣＤ４  Ｔ細胞アッセイ：下記のプロトコルは、Ｋｏｍａｉ−Ｋｏｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，２２１（３）：４１２−４１７（２０１６）に記載されている方法に基づいている。平底９６ウェルプレートを４℃で一晩、１００μＬの３μｇ／ｍＬ抗ＣＤ３抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ１６−００３７−８５）でコーティングした。ＰＢＭＣは、上記のようにヘパリンナトリウム（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈ）で収集された末梢全血から単離された。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、製造業者の指示に従って、ネガティブセレクション（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  １３０−０９６−５３３）を使用してＰＢＭＣから単離された。単離後、細胞を５００，０００細胞／ｍＬでＴ細胞培地（ＲＰＭＩ−１６４０、５％熱不活化ヒトＡ／Ｂ血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１ｘＭＥＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム）に再懸濁した。抗ＣＤ３コーティングプレートをＰＢＳで１回洗浄し、１ウェル当たり５０，０００個のＣＤ４＋細胞（１００μＬ）を添加した。抗体をＴ細胞培地で最終濃度の４倍に段階希釈し、５０μＬの抗体溶液を各ウェルに添加した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーションした。１時間後、ＩＬ−３３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  ２００−３３）およびＩＬ−１２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  ２００−１２）を最終濃度の４倍で含む５０μＬのＴ細胞培地を各ウェルに添加し（合計２００μＬ、最終濃度１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−１２）、プレートをインキュベーターに戻した。７２時間後、Ｔ細胞上清中のＩＦＮ−γレベルを従来のＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ８８−７３１６−８８）を使用して測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７ソフトウェアを使用してデータを補間および分析し、アッセイにおける抗体ＩＣ５０値を決定した。アゴニストの用量応答は、抗体の用量応答と並行して実行した。抗体用量応答でインキュベーションした細胞は、実験前に基づいて推定ＥＣ５０でアゴニストで刺激した。陽性対照は、推定ＥＣ５０でアゴニストで処理し、抗体溶液の代わりにＴ細胞培地で処理した。陰性対照は、抗体およびＩＬ−３３の代わりにＴ細胞培地で処理した一方、ＩＬ−１２の最終濃度は１０ｎｇ／ｍＬのままであった。阻害率は、ピーク抗体濃度での応答低減を総応答の大きさで割ったものとして算出した：％阻害＝１００％＊（陽性対照−処理抗体）／（陽性対照−陰性対照）。データは平均±ＳＥＭとしてプロットされ、抗体濃度ごとに３回繰り返す。
【０３１５】
結果
ＨＥＫ−ＢｌｕｅアッセイにおけるＩＬ−１、ＩＬ−３３およびＩＬ−３６経路の機能阻害：ｈ１１Ｃ５変異体ＹＫＤのブロッキング効力および有効性がＹＴＥ変異の添加によって変化しないことを確認するために、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−１／ＩＬ−３３／ＩＬ−３６ブロッキングアッセイにおけるＹＫＤおよびＹＫＤ／ＹＴＥによる機能阻害の比較を実施例２および４に記載されているように実行した。図６Ａ、６Ｂ、および６Ｃに示されるように、ＹＫＤ（「１１Ｃ５−ＹＫＤ」）およびＹＫＤ／ＹＴＥ（「１１Ｃ５−ＹＫＤ／ＹＴＥ」）は、ＩＬ−１β、ＩＬ−３３、およびＩＬ−３６βで刺激された細胞で同様のブロッキング活性を示した。ＩＬ１βで刺激された細胞では、ＹＫＤおよびＹＫＤ／ＹＴＥは同一効力（ＩＣ５０＝０．５１ｎＭ）を有し、１００ｎＭでそれぞれ９７％および９８％のほぼ完全阻害であった。ＩＬ−３３で刺激されたＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞の場合、ＹＫＤおよびＹＫＤ／ＹＴＥの両方が約３ｎＭ（１１Ｃ５−ＹＫＤ  ＩＣ５０＝３．１５ｎＭ、１１Ｃ５−ＹＫＤ／ＹＴＥ  ＩＣ５０＝３．３ｎＭ）の効力を示し、１００ｎＭ（ＹＫＤおよびＹＫＤ／ＹＴＥに対してそれぞれ９５％および９７％の阻害）でほぼ完全に阻害された。最後に、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞をＩＬ−３６βで刺激すると、両分子は０．９ｎＭ（ＩＣ５０）の効力で阻害し、１００ｎＭで９８％以上の阻害であった。要約すると、ヒト化変異体抗ｈｕ−ＩＬ１ＲＡＰ抗体のＹＫＤおよびＹＫＤ／ＹＴＥは、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−１、ＩＬ−３３、およびＩＬ−３６のアッセイにおいて、同等の効力およびＳＥＡＰ産生のほぼ完全なブロッキングを示した。
【０３１６】
ＹＫＤ／ＹＴＥおよびＹＫＤは、初代細胞でＩＬ−１、ＩＬ−３３およびＩＬ−３６の活性化を阻害する。実施例７で考察したように、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅレポーター細胞株は、ＩＬ−１、ＩＬ−３３およびＩＬ−３６経路の活性化後、１１Ｃ５変異体のブロッキング活性を決定するために迅速なアッセイを提供することができる。ｈ１１Ｃ５変異体のブロッキング活性のさらなる特性評価は、初代ヒト細胞実験を使用して、より生理学的に関連性のあるアッセイで実行された。実施例７に記載される初代細胞アッセイに加えて、本実施例は、ヒト表皮ケラチノサイト（ＨＥＫｎ）、好塩基球およびＣＤ４  Ｔ細胞を利用する機能阻害アッセイを含む。
【０３１７】
ヒト単球（ＰＨＭＯ）およびＰＨＬＦでのアッセイを利用して、ＹＫＤおよびＹＫＤ／ＹＴＥが初代ヒト細胞のＩＬ−１経路をブロッキングするのに同等の効力および有効性を有することを確認した。図７に示されるように、初代ヒト単球（ＰＨＭＯ）がＹＫＤまたはＹＫＤ／ＹＴＥの存在下でＩＬ−１βで刺激された場合、ＩＬ−６産生の完全阻害が観察された。両抗体が同様の効力を示した（ＹＫＤおよびＹＫＤ／ＹＴＥについて、それぞれＩＣ５０＝６３ＰＭおよび１５８ｐＭ）。ＰＨＬＦは、ＹＫＤ／ＹＴＥ、ＹＫＤ、またはアイソタイプ対照の存在下でＩＬ−１α（ＥＣ５５）で刺激した。図８のプロットに示されているように、いずれかのｈ１１Ｃ５抗体変異体の存在は、ＩＬ−１αで刺激されたＰＨＬＦにおいて、ＩＬ−８産生のほぼ完全な阻害（ＹＫＤ／ＹＴＥおよびＹＫＤについて、それぞれ９８％および９９％）をもたらし、同様のＩＣ５０値が２抗体について観察された（ＹＫＤ／ＹＴＥおよびＹＫＤについて、それぞれＩＣ５０＝６．４７ｎＭおよび９．１０ｎＭ）。要するに、アッセイ結果は、ＹＫＤ／ＹＴＥおよびＹＫＤが同等の効力および有効性を示すことを実証し、ＩＬ−１βで刺激されたＰＨＭＯにおけるＩＬ−６産生の完全阻害およびＩＬ−１αで刺激されたＰＨＬＦにおけるＩＬ−８産生の完全ブロッキングを含む。
【０３１８】
ＨＥＫｎ細胞およびＰＨＬＦでのアッセイを使用して、ＹＫＤ／ＹＴＥおよびＹＫＤがＩＬ−３６経路のブロッキングにおいて同等の効力および有効性を示したことを確認した（ｖｅｒｉｆｙ）。ＩＬ−３６受容体およびその受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ１ＲＡＰ）は、ヒトケラチノサイトで発現することが知られている（例えば、Ｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，９（２）２８９５−２９０１（２０１７）を参照）。ＩＬ−３６βで刺激されたＨＥＫｎ細胞はＩＬ−８を産生し、これは標準ＥＬＩＳＡにより上清で検出することができる。ＹＫＤ／ＹＴＥおよびＹＫＤがＩＬ−３６βで刺激されたＨＥＫｎ細胞でＩＬ−８産生をブロッキングすることができるか否かを決定するために、ＨＥＫｎ細胞をＹＫＤ／ＹＴＥ、ＹＫＤ、またはアイソタイプ対照（ＩｇＧ対照）の段階希釈でインキュベーションした。図９に示されるように、ＹＫＤおよびＹＫＤ／ＹＴＥの両方は、ＩＬ−８産生の完全な阻害（１００％）を示した。両変異体は、ＹＫＤおよびＹＫＤ／ＹＴＥについて、それぞれ１．３９ｎＭおよび１．１６ｎＭのＩＣ５０値で、同様の効力を示した。図１０に示されるように、ＹＫＤ／ＹＴＥおよびＹＫＤが、ＩＬ−３６βで刺激されたＰＨＬＦにおけるＩＬ−８産生をブロッキングする能力について試験された場合、両方ともＩＬ−８産生の完全な阻害を示した。さらに、両抗体変異体は、同様の阻害効力を有した（ＹＫＤ／ＹＴＥおよびＹＫＤについて、それぞれＩＣ５０＝０．５０ｎＭおよび０．３９ｎＭ）。要約すると、ＹＫＤ／ＹＴＥおよびＹＫＤは、ＩＬ−３６βで刺激されたＨＥＫｎ細胞およびＩＬ−３６βで刺激されたＰＨＬＦにおいて、ＩＬ−８産生のブロッキングに同等の有効性および効力を有する。
【０３１９】
アッセイにより、ＹＫＤ／ＹＴＥが初代ヒトＮＫ細胞、好塩基球、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＬ−３３経路をブロッキングすることができることも確認された。実施例７に記載されるように、ＩＬ−１２の存在下でＩＬ−３３で刺激された初代ヒトＮＫ細胞は、検出可能なＩＦＮ−γを産生しないＩＬ−１２のみに曝露されたＮＫ細胞とは異なり、ＩＦＮ−γを産生する。図１１に示すように、ＩＦＮ−γはアイソタイプ対照抗体とインキュベーションしたＮＫ細胞の上清で検出可能であったが、ヒトＮＫ細胞をＹＫＤ／ＹＴＥまたはＹＫＤで処理すると、ほぼ全てのＩＦＮ−γ産生がブロッキングされた（ＹＫＤ／ＹＴＥおよびＹＫＤについて、それぞれ９６％および９７％の阻害）。２つの抗体で観察されたＩＣ５０値は、ＹＫＤ／ＹＴＥで１．３２ｎＭ、ＹＫＤで２．９３ｎＭであった。好塩基球は、喘息患者の肺において数の増加が観察されている（例えば、Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，７７８：９０−９５（２０１６）を参照）。ＹＫＤ／ＹＴＥは、好塩基球のＩＬ−３３刺激をブロッキングする能力について試験した。ＰＢＭＣのＩＬ−３３刺激は、好塩基球でｐ３８ＭＡＰＫのリン酸化をもたらした。推定ＥＣ５０でＩＬ−３３による刺激の２０分後、ＰＢＭＣはＹＫＤ／ＹＴＥと１時間インキュベーションした。図１２の結果によって示されるように、ＹＫＤ／ＹＴＥは、好塩基球でｐ３８リン酸化を本質的に完全ブロッキングし（９９％阻害）、アゴニストＥＣ５６で４１ｎＭのＩＣ５０であった。ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＹＫＤ／ＹＴＥの有効性および効力を調べるために、ＣＤ４＋Ｔ細胞をＩＬ−３３およびＩＬ−１２で共刺激し、ＩＦＮ−γ産生をアッセイした。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１２および推定ＥＣ５０のＩＬ−３３による刺激後、ＹＫＤ／ＹＴＥと１時間インキュベーションした。図１３で示されるように、ＹＫＤ／ＹＴＥは、ＩＦＮ−γ産生をほぼ完全にブロッキングし（８９％阻害）、アゴニストＥＣ３４で４４ｎＭのＩＣ５０であった。要約すると、ＹＫＤ／ＹＴＥおよびＹＫＤは、ＩＬ−３３で刺激された初代ヒトＮＫ細胞で同様のブロッキング効力および有効性を示した。さらに、ＹＫＤ／ＹＴＥは、好塩基球におけるＩＬ−３３誘導性のｐ３８ＭＡＰＫのリン酸化を完全にブロッキングし、ＩＬ−３３刺激性ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γ産生をほぼ完全にブロッキングした。
【０３２０】
したがって、この実施例１２の結果は、ＹＫＤ／ＹＴＥおよびＹＫＤが、細胞株（ＨＥＫ−Ｂｌｕｅレポーター細胞株）および記載された全ての初代ヒト細胞アッセイにおいて、ＩＬ−１、ＩＬ−３３およびＩＬ−３６活性化をブロッキングしたことを実証する。結果には、ＰＨＬＦおよびＰＨＭＯにおけるＩＬ−１活性化のほぼ完全なまたは完全なブロッキング、ＮＫ細胞、好塩基球およびＣＤ４  Ｔ細胞におけるＩＬ−３３活性化、ならびにＰＨＬＦおよびＨＥＫｎにおけるＩＬ−３６活性化が含まれる。さらに、ＹＫＤ／ＹＴＥおよびＹＫＤは、実施された全ての機能アッセイで同等の有効性および効力を示した。
【０３２１】
実施例１３：抗ヒトＩＬ１ＲＡＰ抗体変異体の細胞傷害性の欠如
この実施例は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、および抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）のアッセイを例示し、該アッセイは、抗ヒトＩＬ１ＲＡＰ抗体のＹＫＤ／ＹＴＥ、１１Ｃ５−Ｎ２９７Ｇ、およびＹＫＤの細胞傷害性の欠如を実証する。
【０３２２】
材料および方法
試薬：アッセイで使用した抗体は、下記の通りである。ＹＫＤ／ＹＴＥ（実施例１１に記載）、ＹＫＤ（実施例８に記載）、１１Ｃ５−Ｎ２９７Ｇ（実施例５および７に記載されているように、Ｎ２９７Ｇ変異を含む親１１Ｃ５分子）、１１Ｃ５野生型（親和性を高めるＮ２９７Ｇ変異およびＹＫＤ変異を欠く親１１Ｃ５分子）、アイソタイプ対照ｈＩｇＧ１（Ｎ２９７Ｇ）および細胞傷害活性を有することが知られている陽性対照抗体としての抗ＣＤ２０抗体、リツキシマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）。下記の細胞株を利用した。：ジャーカット、ダウディおよびＴＨＰ−１（ＡＴＣＣ、バージニア州マナッサス）。ＰＢＭＣ、初代ヒト好中球、および初代ヒト単球は、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手した。ジャーカット細胞株は、その有意なＩＬ１ＲＡＰ発現のため対照として使用された。ＣＤ２０を発現するダウディ細胞株は、追加の陽性対照として使用され、抗ＣＤ２０抗体であるリツキシマブの標的細胞株として機能した。
【０３２３】
ＡＤＣＣアッセイ：ＹＫＤ／ＹＴＥおよび関連分子がＡＤＣＣ活性を示すか否かを決定するために、単球、好中球、またはジャーカット細胞からなる標的細胞のエフェクター細胞としてＮＫ細胞を使用した。８：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比をアッセイに適用した。標的細胞は、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識した。標識後、標的細胞（９６ウェルプレートの１ウェル当たり１×１０４細胞）を４つの異なる濃度で指示抗体と混合した後、さらにＮＫ細胞（９６ウェルプレートの１ウェル当たり８ｘ１０４細胞）とＲＰＭＩ完全培地で混合した。反応は３７℃で５時間進行した。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、次いで、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で１５分間染色した。次に、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）およびＦｌｏｗｊｏソフトウェア（ＢＤ）を使用して細胞を分析した。細胞死は、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔで染色された生きた標的細胞集団内のＰＩ染色細胞のパーセンテージに基づいて算出された。
【０３２４】
ＣＤＣアッセイ：ＹＫＤ／ＹＴＥおよび関連分子がＣＤＣ活性を示したかどうかを決定するために、Ｑｕｉｄｅｌの正常なヒト血清（カタログ番号Ａ１１３、カリフォルニア州サンディエゴ）を細胞傷害エフェクターとして使用し、血清の２０％をアッセイ培地に適用した。標的細胞（ヒト単球、好中球およびジャーカット細胞）は、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ染色で標識した。標識後、標的細胞（１ウェル当たり５×１０４細胞、９６ウェルプレート）を４つの異なる濃度で指示抗体と混合した後、ＡＩＭ−Ｖ培地ＣＴＳ（商標）（カタログ番号０８７０１１２−ＤＫ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で通常のヒト血清（最終濃度２０％）とさらに混合した。反応物を３７℃で１時間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、次いで、ＰＩで１５分間染色した。ＡＤＣＣアッセイについて前述したように、フローサイトメトリーを使用して細胞試料を分析し、細胞死（細胞傷害）の割合を決定した。
【０３２５】
ＡＤＣＰアッセイ：ＡＤＣＰ活性がＹＫＤ／ＹＴＥおよび関連分子に存在するか否かを確認するために、ヒトＴＨＰ−１由来マクロファージ細胞をエフェクター細胞として使用し、標的細胞はヒト単球、好中球、ジャーカット細胞またはダウディ細胞で構成された。ＴＨＰ−１細胞をホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で２日間処理した後、ＩＦＮ−γ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびリポ多糖（ＬＰＳ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）でさらに刺激した。ＡＤＣＰ反応のＥ：Ｔ比は２：１であった。標的細胞（ヒト単球、好中球、ジャーカット細胞またはダウディ細胞）をＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ染色で標識し、ＴＨＰ−１細胞をＰＫＨ２６標識キット（カタログ番号ＰＫＨ２６ＰＣＬ−１ＫＴ、Ｓｉｇｍａ）で標識した。標識後、標的細胞（９６ウェルプレートの１ウェル当たり５×１０４細胞）を４つの異なる濃度で指示抗体と組み合わせた後、さらにＴＨＰ−１由来マクロファージ細胞（９６ウェルプレートの１ウェル当たり１×１０５細胞）とＲＰＭＩ完全培地で混合した。反応物を３７℃で５時間インキュベーションした。インキュベーション後、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔの蛍光（標的細胞を同定するためのＰＢ４５０チャネル）およびＰＫＨ２６蛍光（ＴＨＰ−１由来マクロファージエフェクター細胞を同定するためのＰＥチャネル）について、フローサイトメトリーによって細胞を分析した。細胞の食作用は、二重蛍光性の細胞、すなわち、ＰＢ４５０チャネルおよびＰＥチャネルの両方で観察される蛍光によって示される。食作用率は、標識された標的細胞上で二重蛍光を発する細胞の数として算出される。
【０３２６】
結果
ＩＬ１ＲＡＰは、好中球および単球などのヒト血液細胞で発現するため、ＹＫＤ／ＹＴＥなどの抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体がＡＤＣＣ、ＣＤＣ、またはＡＤＣＰ活性を示す程度を決定することは、さらなる臨床開発にとって重要であり、これらのそれぞれが、インビボで細胞傷害を引き起こし得る。ＹＫＤ／ＹＴＥのＡＤＣＣ、ＣＤＣ、またはＡＤＣＰ活性の程度を決定するためのアッセイは、上記のように実施された。表２１（下記）に要約されているように、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体、１１Ｃ５−Ｎ２９７Ｇ、ＹＫＤ、ＹＫＤ／ＹＴＥは、アッセイで細胞傷害活性を示さなかった。（「＋」は陽性の細胞傷害性を示し、「−」は細胞傷害性がないことを示す）。
【表２１】
2021533829.tif 000037
【０３２７】
表２１の結果に示されているように、ＹＫＤ／ＹＴＥ、１１Ｃ５−Ｎ２９７Ｇ、およびＹＫＤは、ヒト単球および好中球、またはジャーカット細胞に及ぼす細胞傷害効果を示さなかった。エフェクター機能を無効にするＮ２９７Ｇ変異を欠く親分子１１Ｃ５野生型は、ＣＤＣまたはＡＤＣＰアッセイで測定した場合、細胞傷害性を示さなかったが、ＡＤＣＣアッセイではいくらか弱い活性を示した。３つのアッセイにおいて、陽性対照抗体のリツキシマブは予想レベルの細胞傷害活性を示した（データは示していない）。要約すると、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体のＹＫＤ／ＹＴＥ、１１Ｃ５−Ｎ２９７Ｇ、およびＹＫＤは、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、およびＡＤＣＰ活性を評価するアッセイによって決定された細胞傷害活性を示さなかった。
【０３２８】
実施例１４：変異体抗ヒトＩＬ１ＲＡＰ抗体の薬物動態
この実施例は、カニクイザルで実施されたＹＫＤおよびＹＫＤ／ＹＴＥの薬物動態（ＰＫ）を特性評価する研究を例示し、ＹＫＤ／ＹＴＥは、ＦｃＲｎへの結合親和性を改善するＦｃ領域の変更を伴うＹＫＤの変異体である。研究１および２は、広い用量範囲にわたる抗体のＰＫを特性評価し、潜在的な標的媒介性クリアランス機構を定量化するために、１〜４０ｍｇ／ｋｇ範囲の単回静脈内（ＩＶ）用量でのＹＫＤのＰＫを調べた。研究３は、ＹＫＤの薬物動態に及ぼすＹＴＥ変異の影響を決定するために、カニクイザルで３〜４０ｍｇ／ｋｇ範囲の単回静脈内ＩＶ投与で変異体ＹＫＤ／ＹＴＥのＰＫを調べた。
【０３２９】
材料および方法
研究デザインおよび薬物動態サンプリング計画：カニクイザルでのＹＫＤのＰＫを調べるために、２つの研究（１および２）を実行した。ＹＫＤ／ＹＴＥのＰＫを調べるために、追加研究３を実行した。全ての研究はＩＶ投与を利用した。試験品は、ｐＨ５．５の２００ｍＭアルギニンスクシネートで製剤化された。各動物の橈側皮静脈を介して下記の時点で採血した。投与前、１０分、２時間、８時間、および第１、２、４、７、１０、１４、１７、２１、２４、２８日目。ＰＫ試料を血清に処理した。研究デザインの要約を表２２（下記）に示す。
【表２２】
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【０３３０】
薬物濃度を測定するための生物分析アッセイ：サル血清中のＩＬ１ＲＡＰ特異的抗体の濃度は、５０〜０．７８ｎｇ／ｍＬの作業範囲で７つの標準から生成された検量線、さらに０．２％サル血清マトリックスのゼロ標準を使用して較正されたＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定された。ＱＣ試料は、０．２％サル血清で４０ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、および２ｎｇ／ｍＬの濃度で調製した。ヒトＩＬ１ＲＡＰタンパク質の細胞外ドメイン（配列番号３）をマイクロタイタープレート上にコーティングした後、投与試料、較正標準、および品質管理試料から抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を捕捉するために使用した。捕捉された抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合したヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体によって検出された。発色基質のテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加してＨＲＰと反応させた。次に、酸性溶液で反応を停止し、各ウェルに捕捉された抗ＩＬ１ＲＡＰ量に比例する吸光度シグナルを得た。重み４パラメーターロジスティック（４ＰＬ）モデルを使用して、較正標準のシグナル強度およびそれぞれの名目濃度を適合し、較正方程式を生成した。方程式を使用して、各試料の抗ＩＬ１ＲＡＰ濃度を、重複測定の平均から算出した。
【０３３１】
薬物動態分析の方法：研究１と２のデータを組み合わせて、ＹＫＤのＰＫパラメーターを推定した。研究３からのデータを使用して、ＹＫＤ−ＹＴＥのＰＫパラメーターを推定した。コンパートメントモデリングおよびパラメーター推定は、ＰＫ／ＰＤモデリングソフトウェアＡＤＡＰＴ  Ｖを使用して行った（Ｄ’Ａｒｇｅｎｉｏ，Ｄ．Ｚ．ｅｔ  ａｌ．，ＡＤＡＰＴ  ５  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ：Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ／Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ，Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ．（２００９））。各用量群について、群平均濃度−時間プロファイルが最初に生成され、次に、複数の用量群からの群平均濃度−時間プロファイルを様々な候補モデル構造に同時に適合させた。両性別のデータを組み合わせて、目視検査での有意な性差の欠如に基づいて、群平均濃度−時間プロファイルを算出した。分析的に報告可能な全てのＰＫデータは、コンパートメントデータ分析に含まれていた。
【０３３２】
モデルの選択は、アキアケ情報量基準（Ａｋｉａｋｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ）（ＡＩＣ）を使用して進められた。パラメーターは、最尤推定法（Ｄ’Ａｒｇｅｎｉｏ，Ｄ．Ｚ．，ｅｔ  ａｌ．，ＡＤＡＰＴ  ５  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ：Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ／Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ，Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ．（２００９））を使用して推定された。図１４Ａに示される非線形２コンパートメントモデルは、群平均データを最もよく説明することが見出された。
【０３３３】
結果
ＹＫＤおよびＹＫＤ／ＹＴＥの群平均血清濃度の時間プロファイルをそれぞれ図１４Ｂおよび図１４Ｃに示す。両抗体について、濃度は高用量に対して低用量でより急速に低下し、おそらく標的ＩＬ１ＲＡＰへの結合により、１〜４０ｍｇ／ｋｇの用量範囲にわたって非線形ＰＫが示唆された。群平均データは、上記で説明され、図１４Ａに示されるように、非線形２コンパートメントモデルに適合された。抗ヒトＩＬ１ＲＡＰ抗体のＹＫＤおよびＹＫＤ−ＹＴＥについて得られたＰＫパラメーターの推定値を表２３（下記）に要約する。
【表２３】
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【０３３４】
変異体抗ｈｕ−ＩＬ１ＲＡＰ抗体ＹＫＤの線形クリアランス（ＣＬｔ）およびｔ１／２は、それぞれ６．３ｍＬ／日／ｋｇおよび７．４日であった。これらの値は、カニクイザルのＩｇＧ１について予想範囲内であった。抗ｈｕ−ＩＬ１ＲＡＰ抗体変異体ＹＫＤ／ＹＴＥは、ＹＫＤと比較して、ＣＬｔ（４．９ｍＬ／日／ｋｇ）の減少およびｔ１／２（１１．９日）の増加を示し、ＹＫＤ／ＹＴＥ変異体がカニクイザルのＹＫＤと比べてＰＫ特性を改善したことを実証している。
【０３３５】
実施例１５：抗ヒトＩＬ１ＲＡＰ抗体のエピトープ残基マッピング
この実施例は、ｈ１１Ｃ５変異体Ｋ１３／Ｈ３（または「ＹＩＳ」）およびＫ１７／Ｈ３（または「ＹＫＳ」）の結合に重要なヒトＩＬ１ＲＡＰ残基を同定するために、ファージディスプレイ技術を次世代シーケンシング（ＮＧＳ）と組み合わせて使用する方法を例示する。ヒトＩＬ１ＲＡＰ変異体のライブラリーがファージ上に提示され、ライブラリーはＹＩＳ、ＹＫＳ、または参照抗体に対するファージパニングに供された。抗体への結合を保持するヒトＩＬ１ＲＡＰ変異体を保有するファージを精製し、ヒトＩＬ１ＲＡＰ配列をＮＧＳによって得た。ＹＩＳまたはＹＫＳ結合には有害であるが、参照抗体結合には有害ではないヒトＩＬ１ＲＡＰの変異が同定され、エピトープ残基として定義された。
【０３３６】
材料および方法
Ｓｅｒ２１からＬｙｓ３５０までのヒトＩＬ１ＲＡＰのアミノ酸配列（配列番号１）を選択して、ファージに提示させた。実施例２（上記）の表５に記載されているように、１１Ｃ５は、ヒトＩＬ１ＲＡＰのドメイン３に結合する。したがって、ヒトＩＬ１ＲＡＰの変異体を提示するファージライブラリーは、ＩＬ１ＲＡＰのドメイン３（配列番号１のＬｙｓ２３８〜Ｌｙｓ３５０）のみで全２０個のアミノ酸をコードするＮＮＫ縮重コドンを使用した残基ランダム化によって構築された。変異誘発オリゴヌクレオチドが、ライブラリーの各メンバーのヒトＩＬ１ＲＡＰドメイン３残基で１つのＮＮＫ変異のみが起こることを可能にするように設計されたことを除いて、変異誘発は実施例８に記載されているように実行された。得られたライブラリーＤＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１細胞に電気穿孔し、約４．６×１０９個の形質転換体を得た。
【０３３７】
１μｇ／ｍＬの変異体抗体のＹＩＳ、ＹＫＳ、またはヒトＩＬ１ＲＡＰドメイン１（配列番号４）に結合する参照抗体がＭａｘｉｓｏｒｐプレート上にコーティングされたことを除いて、ファージパニングの第１ラウンドは実施例８に記載されているように実施した。ヒトＩＬ１ＲＡＰドメイン１に結合する参照抗体は、ヒトＩＬ１ＲＡＰの一般的な折り畳みに有害であるが、ヒトＩＬ１ＲＡＰドメイン３への１１Ｃ５抗体の結合に必ずしも有害ではない変異を同定するプロセスにおいて対照として役立つ。
【０３３８】
ブロッキングされたファージライブラリーを、減少濃度のビオチン化ＹＩＳ、ＹＫＳ、または参照抗体と１時間インキュベーションしたことを除いて、ファージパニングの第２〜第４ラウンドは実施例８に記載されているように実施した。抗体に結合したファージをブロッキングされたニュートラアビジンでコーティングしたプレートに捕捉し、Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで十分に洗浄し、ラウンド１と同じ様式で溶出および中和した。
【０３３９】
初期ファージライブラリー（非選別試料）の配列およびパニングのラウンド２〜４（選別試料）は、ＮＧＳに対してヒトＩＬ１ＲＡＰドメイン３アンプリコンが生成されたことを除いて、実施例８に記載のＮＧＳを使用して抽出された。
【０３４０】
ＮＧＳの後、ペアエンド配列決定データアセンブリおよび配列読み取りデータの品質管理が、実施例８に記載されているように実行された。ファージパニングのラウンド２〜４の読み取りデータは、データ分析用に共にプールされた。位置重み行列は、ランダム化された全ての位置の全変異頻度を算出することによって生成された。各変異の濃縮比は、実施例８に記載されるように、選別試料の所与の位置での所与の変異の頻度を、非選別試料のまったく同じ変異の頻度で割ることによって算出した。
【０３４１】
結果
ＮＧＳデータを使用して、ＹＩＳまたはＹＫＳの結合に関してヒトＩＬ１ＲＡＰドメイン３の各アミノ酸位置での置換の影響を分析した。ゼロ未満の濃縮比は、ＹＩＳ、ＹＫＳ、または参照抗体の結合に有害なアミノ酸置換を示した。ＮＧＳデータはさらに、参照抗体結合に有害ではないがＹＩＳまたはＹＫＳの結合に有害であるヒトＩＬ１ＲＡＰドメイン３残基の置換にフラグを立てるために使用された。多数のフラグ付き置換が観察されたヒトＩＬ１ＲＡＰドメイン３残基位置は、残基ランダム化がドメイン３に適用され、ヒトＩＬ１ＲＡＰドメイン１に結合する参照抗体に影響を及ぼさないため、ＹＩＳまたはＹＫＳ結合エピトープの一部である可能性があった。
【０３４２】
図１５に示すように、同定されたＩＬ１ＲＡＰエピトープ残基がヒトＩＬ−１β、ＩＬ−１Ｒ１およびＩＬ１ＲＡＰ三元複合体（ＰＤＢ：３Ｏ４Ｏ）の結晶構造にマッピングされると、それらの分布はクラスター化され、ＩＬ１ＲＡＰと、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１Ｒ１の二元複合体との結合界面に位置付けされる。したがって、本実施例のエピトープデータは、ＹＩＳまたはＹＫＳなどの本開示の抗ｈｕ−ＩＬ１ＲＡＰ抗体の結合が、どのように三元複合体の形成をブロッキングし、それによって下流の細胞内シグナル伝達事象を阻害できるかについての構造的説明を提供する。さらに、ＩＬ１ＲＡＰとＩＬ−３３／ＳＴ２（Ｇｕｎｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，４７：５１０−５２３（２０１７））またはＩＬ−３６／ＩＬ１ＲＬ２（Ｙｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９１（３２）：１６５９７−１６６０９（２０１６））との間の構造的相互作用の全般的類似性を考慮して、本実施例のエピトープデータは、ＹＩＳおよびＹＫＳなどの本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体がこれらの２つの経路もブロッキングする能力についての構造的説明の可能性も裏付けている。
【０３４３】
表２４は、ヒトＩＬ１ＲＡＰドメインの３つの位置で観察されたフラグ付き置換の相対数を示す（＋＋＋：９個以上のフラグ付き置換、＋＋：６〜８個のフラグ付き置換、＋：３〜５個のフラグ付き置換、−：３個未満のフラグ付き置換）。フラグ付き置換の数が多い残基は、エピトープの一部である可能性が高いとみなされた。
【表２４−１】
2021533829.tif 000040
【表２４−２】
2021533829.tif 000041
【０３４４】
表２４に列挙された結果によって実証されるように、主にＤ３ドメイン内の２４３〜２５５番目、２５７〜２６８番目および３３３〜３３６番目でヒトＩＬ１ＲＡＰ残基に結合する高親和性抗体１１Ｃ５のエピトープ。これらの部位のほとんどが、ＩＬ１ＲＡＰドメイン３の表面に群がっている（図１５を参照）。これらの不連続残基は、本明細書に開示されるように、抗体、１１Ｃ５、およびその変異体のエピトープであると結論付けられる主要なパッチにマッピングされる。
【０３４５】
実施例１６：代理抗マウスＩＬ１ＲＡＰ抗体の生成
この実施例は、抗ｍｕ−ＩＬ１ＲＡＰ抗体を生成するためのマウスハイブリドーマ技術の使用、抗ｍｕ−ＩＬ１ＲＡＰ抗体１４Ｆ４の特性評価、およびインビボマウス研究のためのこの代理抗体の使用方法を例示する。
【０３４６】
材料および方法
免疫化および融合：ＩＬ１ＲＡＰノックアウトマウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、品番００３２８４）を２５μｇ／免疫／マウスのｍｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰ−Ｄ３（残基境界がＫ２３９〜Ｔ３６８であるｍｕ−ＩＬ１ＲＡＰドメイン３）で３回免疫した（配列番号３３７）。ｍｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰ（Ｃ末端６ｘヒスチジンタグと融合した細胞外部分）（配列番号９）とｍｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰ−Ｄ３（配列番号３３７）の１：１混合物を用いて、各マウスに合計２５μｇ／免疫／マウスで５回以降の免疫を与えた。Ｓｉｇｍａ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を全ての免疫に使用した。次に、マウスに、アジュバントを含まないｍｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰおよびｍｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰ−Ｄ３の１：１混合物を２５μｇ／マウスで最終追加免疫を与えた。３日後、脾臓を採取し、標準プロトコルに従って処理した。標準プロトコルに従って、ＰＥＧを使用して脾細胞を骨髄腫Ｓｐ２／０細胞（ＡＴＣＣ）と融合し、９６ウェルプレートに播種した。親ハイブリドーマは、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジンを補充した選択培地を使用して選択された。
【０３４７】
ＥＬＩＳＡアッセイ：培養の１２〜１４日後、ハイブリドーマ上清を収集し、１μｇ／ｍＬ  ｍｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰを含むＰＢＳでコーティングされた９６ウェルプレートを用いたＥＬＩＳＡによる一次スクリーニングに供した。ハイブリドーマ上清（６５μＬ／ウェル）をコーティングプレートで少なくとも１時間室温でインキュベーションし、プレートを洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。ヤギ抗マウス−Ｆｃ−ＨＲＰ二次（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、ＰＢＳで１：５０００に希釈）を添加し（６５μＬ／ウェル）、室温で１時間インキュベーションした。洗浄緩衝液で３回洗浄した後、１−Ｓｔｅｐ  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ  ＥＬＩＳＡ基質展開液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、６５μＬ／ウェル）を添加し、室温で２０分間インキュベーションした。展開剤を消光せずに６５０ｎｍでの吸光度を読み取った。
【０３４８】
一次ＥＬＩＳＡスクリーンで陽性であった親ハイブリドーマを、ヒポキサンチン−チミジンを含む培地で２４ウェルプレートに増殖させ、１μｇ／ｍＬでコーティングされたｍｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰを使用して実施例２に記載されているように確認のＥＬＩＳＡスクリーンを実行した。目的のハイブリドーマクローンを、０．５細胞／ウェルの密度で限定希釈を使用してサブクローン化し、細胞ペレットを使用して、各抗体クローンの重鎖および軽鎖配列を決定した（以下に記載）。
【０３４９】
１４Ｆ４の配列決定および組換え産生：ハイブリドーマ由来の抗ｍｕ−ＩＬ１ＲＡＰ抗体の配列決定は、実施例３に記載されているように実施した。組換え抗ｍｕ−ＩＬ１ＲＡＰ抗体１４Ｆ４は、実施例５に記載されているように生成された。
【０３５０】
組換え１４Ｆ４結合ｍｕ−ＩＬ１ＲＡＰのＢＩＡＣＯＲＥ  ＳＰＲ分析：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析を使用し、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）８Ｋ機器を使用してｍｕ−ＩＬ１ＲＡＰに対する１４Ｆ４の結合親和性を決定した。動態測定では、組換え１４Ｆ４をＨＢＳ−Ｐ緩衝液（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）で１０μｇ／ｍＬに希釈し、第２フローセル（ＦＣ２）に１０μＬ／分で抗マウスチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に捕捉した。ＦＣ１は参照として保持された。次に、低（０．１４ｎＭ）から高（１００ｎＭ）までｍｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰを含むＨＢＳ−Ｐの３倍段階希釈液を３７℃で注入した（流速：３０μＬ／分）。６０ｍＭ塩酸（流速：９０μＬ／分）を使用して各分析対象を注入する前に、チップを２回再生した。センサーグラムは記録され、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）８Ｋ評価ソフトウェア（バージョン１．１．１．７４４２）によるデータ分析前に、参照および緩衝液の減算が行われた。結合率（ｋｏｎ）および解離率（ｋｏｆｆ）は、単純な１対１のラングミュア結合モデルを使用して算出された。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比率として算出された。
【０３５１】
組換え１４Ｆ４の非特異的結合を決定するためのＢＶ  ＥＬＩＳＡ：非特異的結合の程度を決定するために１４Ｆ４を使用して、実施例１１に詳述されるようにＢＶ  ＥＬＩＳＡを実施した。
【０３５２】
ＩＬ１ＲＡＰの特異的結合活性のアッセイ：ｈｕ−ＩＬ１ＲＡＰおよびｍｕ−ＩＬ１ＲＡＰの異なるドメインに対する１４Ｆ４の特異性を決定するために、ＥＬＩＳＡを実施例２で前述したように使用し、個別に下記のタンパク質を用いて１μｇ／ｍＬでコーティングした。ｍｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰ（配列番号３３７）、ｍｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰ−Ｄ１Ｄ２（ドメイン１〜２、Ｓ２１〜Ｐ２３７）（配列番号３３８）、ｈｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰ（配列番号３）、ｈｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰ−Ｄ１（ドメイン１、Ｓ２１〜Ｑ１３３）（配列番号４）、およびｈｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰ−Ｄ３（ドメイン３、Ｋ２３８〜Ｔ３６７）（配列番号６）。組換え１４Ｆ４を１０ｎＭの濃度でアッセイした。
【０３５３】
結果
抗ｍｕ−ＩＬ１ＲＡＰ抗体の生成：ＩＬ１ＲＡＰノックアウトマウスの免疫およびその後の脾細胞の採取に続いて、ｍｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰ（配列番号９）への結合について、（ＰＥＧ融合を介して生成された）親ハイブリドーマをＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。一次ＥＬＩＳＡアッセイスクリーニングにより、ハイブリドーマから合計１７の抗マウスＩＬ１ＲＡＰバインダーが同定され、２４ウェルプレートに増殖させた後、ＥＬＩＳＡによってｍｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰに結合することがさらに確認された。実施例２に記載されるように（データは示さず）ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＳＥＡＰアッセイで全１７個の上清をスクリーニングした後、全３つの経路（ＩＬ−１、ＩＬ−３３、およびＩＬ−３６）をブロッキングする能力に基づいて１４Ｆ４を選択した。クローン１４Ｆ４は、ハイブリドーマ細胞からＶＬおよびＶＨ領域の配列決定、組換え発現および精製のために選択された。
【０３５４】
ｍｕ−ＩＬ１ＲＡＰへの組換え１４Ｆ４の結合の動態：表２５に示すように、組換え１４Ｆ４は、ＫＤ＝０．２１９ｎＭでｍｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰ（配列番号９）に結合する。
【表２５】
2021533829.tif 000042
【０３５５】
非特異的結合のＢＶ  ＥＬＩＳＡの結果：表２６に示すように、組換え１４Ｆ４は、培地対照よりも大きなＢＶ  ＥＬＩＳＡシグナルを示さず、１４Ｆ４がＢＶ粒子に非特異的結合しないことを示唆している。
【表２６】
2021533829.tif 000043
【０３５６】
ＩＬ１ＲＡＰの特異的結合活性のアッセイ：表２７に示すように、組換え抗ｍｕ−ＩＬ１ＲＡＰ抗体である１４Ｆ４は、ヒトＩＬ１ＲＡＰへの結合を示さないが、ｍｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰ（配列番号９）とｍｕ−Ｍ−ＩＬ１ＲＡＰ−Ｄ１Ｄ２（配列番号３３８）間で同等の結合を示し、１４Ｆ４がマウスＩＬ１ＲＡＰのドメイン１またはドメイン２のいずれかに特異的に結合することを示唆している。
【表２７】
2021533829.tif 000044
【０３５７】
実施例１７：代理抗マウスＩＬ１ＲＡＰ抗体１４Ｆ４のＩＬ１ＲＡＰブロッキング活性の細胞アッセイ
この実施例は、抗ｍｕ−ＩＬ１ＲＡＰ代理抗体の１４Ｆ４が、マウス細胞株または初代マウス細胞の全３つの経路（ＩＬ−１媒介性、ＩＬ−３３媒介性、およびＩＬ−３６媒介性）をブロッキングする能力を例示する。
【０３５８】
材料および方法
ＮＩＨ−３Ｔ３細胞および関連アッセイ：マウス線維芽細胞株ＮＩＨ−３Ｔ３は購入した（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５８）。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１Ｘ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ  １１１４０−０５０、１００Ｘ溶液）および１Ｘ  Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ  ３５０５０−６１、１００Ｘ溶液）を補充したＤＭＥＭ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  １０−０１３−ＣＶ）からなる標準成長培地を利用して、製造業者のガイドラインに従って培養で維持した。マウスＩＬ−１β（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）およびＩＬ−３６α（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）は購入した。
【０３５９】
抗体ブロッキングアッセイおよびアゴニスト用量応答曲線は、本実施例の条件を説明するためにいくつかの改変を加えて、実施例７に記載されたのと同様の様式で実施された。要するに、実験使用の前日、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を平底の９６ウェルプレートに、使用日に約８０〜８５％の集密度になる濃度で播種した。アッセイの日に、代理抗体１４Ｆ４またはアイソタイプ対照をＮＩＨ−３Ｔ３細胞と１時間インキュベーションし（３７℃、５％ＣＯ２）、続いてアゴニスト（ＩＬ−１βまたはＩＬ−３６α）を添加した。実験をさらに２４時間進行させた（３７℃、５％ＣＯ２）。細胞培養上清を収集し、ＩＬ−６産生のレベルをＥＬＩＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって製造業者のガイドラインに従って決定した。記載された全ての抗体ブロッキングアッセイでは、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、ＥＣ８５以上のアゴニスト濃度で刺激した。陽性対照は、成長培地およびアゴニスト単独（抗体が存在しない）とＮＩＨ−３Ｔ３細胞で構成される一方、陰性対照試料は、成長培地単独（アゴニスト刺激および抗体の不在下）とＮＩＨ−３Ｔ３細胞で構成された。
【０３６０】
Ｊ７７４−Ｄｕａｌ細胞および関連アッセイ：Ｊ７７４−Ｄｕａｌ細胞は、マウスＪ７７４．１マクロファージ様細胞株に由来した。これらの細胞は、ＮＦ−κＢレポーター遺伝子である分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を発現するように操作されている。Ｊ７７４−Ｄｕａｌ細胞は市販されており、インビボＧｅｎ（カタログ番号ｊ７７４ｄ−ｎｆｉｓ）から入手した。Ｊ７７４−Ｄｕａｌ細胞を一般的な製造業者のガイドラインに従って解凍し、１０％熱不活化ウシ胎児血清（５６℃で３０分）、１００μｇ／ｍｌ  Ｎｏｒｍｏｃｉｎ（インビボＧｅｎ（カタログ番号ａｎｔ−ｎｒ−１）、１ｘペニシリン−ストレプトマイシン溶液を含み、選択抗生物質ブラストサイジン（インビボＧｅｎカタログ番号ａｎｔ−ｂｌ−１））およびゼオシン（インビボＧｅｎカタログ番号ａｎｔ−ｚｎ−１）を補充したＤＭＥＭ（２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、３．７ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウム、４．５ｇ／Ｌグルコース、および１．０ｍＭピルビン酸ナトリウム）を含む細胞培養培地で維持した。抗体ブロッキングアッセイでは、Ｊ７７４−Ｄｕａｌ細胞を、選択抗生物質（ブラストサイジンおよびゼオシン）を含まない細胞培養培地で、細胞が８０％の集密度に達するまで培養した。次に、細胞を平底の９６ウェルプレートに５０，０００／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩（約１８時間）インキュベーションした。アゴニスト（ＥＣ５５のマウスＩＬ−３３、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、カタログ番号１２０９４３４）を添加する前に、１４Ｆ４をＪ７７４−Ｄｕａｌ細胞と１時間インキュベーションした。細胞をさらに３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベーションした。上清中のＳＥＡＰ産生は、実施例２に記載のＳＥＡＰ検出アッセイを使用して定量化した。陽性対照条件（ＰＣ）には細胞、成長培地、およびアゴニスト（ＩＬ−３３）が含まれ、陰性対照条件（ＮＣ）には細胞および成長培地のみが含まれた。データはＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェアを使用して分析し、非線形回帰分析を実施してアゴニストＥＣ５０値を決定した。抗体ブロッキングアッセイの前に、アゴニストおよびアンタゴニストの用量応答曲線を生成して、実施例５に記載されているように、ＥＣ５０およびＩＣ５０を（それぞれ）決定した。
【０３６１】
初代マウス胚性線維芽細胞および関連アッセイ：初代マウス胚性線維芽細胞（初代ＭＥＦ）はＬｏｎｚａ（カタログ番号Ｍ−ＦＢ−４８１）から入手した。これらの初代細胞は、交尾後１４日目および１５日目のＣＤ−１マウス胚から分離され、培養で増殖させた後、製造業者によって凍結保存される。細胞を解凍し、製造業者が提供するガイドラインに従って、１０％の熱不活化ウシ胎児血清（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、カタログ番号Ｓ１１１５０Ｈ）、１０ＩＵペニシリン、および１０μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３０−００２−ＣＩ）を補充した４．５ｇ／Ｌのグルコース、Ｌ−グルタミン、およびピルビン酸ナトリウム（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号１０−０１３−ＣＶ）とＤＭＥＭを使用して培養を維持した。マウスＩＬ−３６βはＢｉｏｌｅｇｅｎｄ（カタログ番号５５４５０６）から入手した。
【０３６２】
アゴニスト用量応答曲線および抗体ブロッキングアッセイは、以下に言及する改変を加えて、実施例７に記載されているように実施した。簡潔に述べると、初代ＭＥＦを平底の９６ウェルプレートに１５，０００細胞／ウェルの密度で前述の成長培地に播種した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベーションした。一晩のインキュベーション後、１４Ｆ４またはアイソタイプ対照を、３７℃、５％ＣＯ２で１時間、初代ＭＥＦとインキュベーションした。これに続いて、所定濃度のアゴニスト（マウスＩＬ−１βまたはＩＬ−３６β）を添加した。各ウェルの最終容量は２００μＬであり、抗体ブロッキングアッセイはアゴニストＥＣ７０以上で実施された。
【０３６３】
アゴニスト刺激後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２１時間インキュベーションした。続いて、プレートを遠沈し、上清を収集し、製造業者のガイドラインに従って、市販のマウスＩＬ−６  ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号８８−７０６４−８８）を使用して、分泌されたマウスＩＬ−６のレベルを決定した。陽性対照ウェルは、成長培地にアゴニストを含む細胞から構成され、陰性対照ウェルは、成長培地のみを含む細胞から構成された。データ解析は、アゴニストＥＣ５０およびアンタゴニストＩＣ５０値を決定するために、非線形回帰（曲線適合）を用いて、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェアを使用して実施した。
【０３６４】
結果
代理抗マウスＩＬ１ＲＡＰ抗体の１４Ｆ４（実施例１６に記載されるように調製された）は、マウスモデルにおけるインビボ有効性を実証するために選択された。インビボ研究の前に、１４Ｆ４は、マウス細胞株および初代細胞アッセイを使用して、全３つのＩＬ１ＲＡＰ媒介性経路（ＩＬ−１、ＩＬ−３６およびＩＬ−３３）をブロッキングする有効性についてインビトロでアッセイされた。
【０３６５】
ＮＩＨ−３Ｔ３細胞株を使用して、１４Ｆ４がインビトロでマウスＩＬ−１およびＩＬ−３６経路をブロッキングすることができるか否かを決定した。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞は、ＩＬ−１刺激に応答することが知られており、したがってＩＬ１ＲＡＰを発現する（例えば、Ｓｍｅｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，５２（７）：２２０２−２２１１（２００５）を参照）。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞は、上記のようにＩＬ−１βで刺激され、１４Ｆ４に曝露されてＩＬ１−β刺激をブロッキングするか、アイソタイプ対照抗体に曝露された。ＩＬ−６産生は、アイソタイプ対照抗体に曝露された細胞、および陽性対照細胞の上清で測定された。表２８（下記）に示すように、抗マウスＩＬ１ＲＡＰ抗体１４Ｆ４を投与されたＮＩＨ−３Ｔ３細胞は、陽性対照と比較して、ＩＬ−６の検出レベルでほぼ完全な低減（９８％阻害）を示した。１４Ｆ４は、ＩＣ５０＝１．３６ｎＭでＩＬ−１β誘導性ＩＬ−６産生を阻害し、これは、実施例１２で記載したＨＥＫ−ＢｌｕｅアッセイでＹＫＤ／ＹＴＥ（ＩＣ５０＝０．５１ｎＭ）で観察された効力に近い。
【０３６６】
ＮＩＨ−３Ｔ３細胞は、ＩＬ−３６に応答し、ＩＬ−３６αによる刺激時に用量依存的にＩＬ−６を分泌することも見出された（データは示していない）。観察された最大のＩＬ−６産生は、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞がＩＬ−１βまたはＩＬ−３６αで刺激されたかどうかにかかわらず同様であった。表２８に示すように、ＩＬ−３６αで刺激されたＮＩＨ−３Ｔ３細胞を使用して実行された１４Ｆ４ブロッキングアッセイは、ＩＬ−６産生の１００％阻害をもたらした。さらに、１４Ｆ４はＩＬ−１β刺激後に観察された効力よりも大きな効力でＩＬ−３６α誘導性ＩＬ−６産生を阻害することができ（ＩＣ５０＝０．１８ｎＭ）、１６．７ｎＭで１４Ｆ４による完全な阻害が観察された。実施例１２に記載されるように、１４Ｆ４のナノモル以下の阻害効力は、ＩＬ−３６ＨＥＫ−Ｂｌｕｅアッセイにおいて抗ヒトＩＬ１ＲＡＰ抗体ＹＫＤ／ＹＴＥについて観察された効力に匹敵する。要約すると、代理抗ｍｕ−ＩＬ１ＲＡＰマウス抗体１４Ｆ４は、マウス細胞株ＮＩＨ−３Ｔ３でＩＬ−１およびＩＬ−３６誘導性ＩＬ−６産生を効果的に阻害し、抗ｈｕ−ＩＬ１ＲＡＰ抗体のＹＫＤ／ＹＴＥで観察されたのと同等の効力をインビトロで実証した。
【０３６７】
マクロファージ様Ｊ７７４−Ｄｕａｌ細胞株を使用して、１４Ｆ４がインビトロでマウスＩＬ−３３刺激性経路をブロッキングすることができるか否かを決定した。ＩＬ−３３およびその受容体ＩＬ１Ｒ１は、マクロファージを含む多くの免疫細胞で広く発現している。ＩＬ−３３による活性化ＳＴ２シグナル伝達は、マクロファージにおけるＮＦ−κＢの活性化をもたらす（例えば、Ｋａｋｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，７（１０），８２７−８４０（２００８）を参照）。表２８に示すように、１４Ｆ４はＩＬ−３３で刺激されたＪ７７４細胞でブロッキング活性を示し、２μＭで９７％阻害（ＩＣ５０＝６．６ｎＭ）であった。ＩＬ−３３刺激によるこの阻害効力は、実施例１２のＨＥＫ−Ｂｌｕｅアッセイ（ＩＣ５０＝３．３０ｎＭ）に記載されている抗ヒトＩＬ１ＲＡＰ抗体ＹＫＤ／ＹＴＥで観察された効力と同様である。
【０３６８】
代理抗体である１４Ｆ４がＩＬ−１およびＩＬ−３６刺激性経路をブロッキングする能力は、初代ＭＥＦで決定された。初代ＭＥＦは、ＩＬ−１刺激に応答してＩＬ−６を産生する能力を有し、ＩＬ１ＲＡＰの発現を示唆する（例えば、Ｎｏｌｄ−Ｐｅｔｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８４（３８）：２５９００−２５９１１（２００９）を参照）。これらの初代マウス線維芽細胞はＩＬ１ＲＡＰを発現し、マウス胚性線維芽細胞株ＮＩＨ−３Ｔ３はＩＬ−３６刺激に応答するため、初代ＭＥＦもＩＬ−３６刺激に応答するはずであると考えられた。実際、ＩＬ−３６βで刺激すると、初代ＭＥＦは用量依存的にＩＬ−６を分泌した（データは示していない）。表２８に示されるように、１４Ｆ４は、ＩＣ５０が６．１ｎＭの陽性対照と比較して、ＩＬ−１β刺激性ＩＬ−６産生の本質的に完全な阻害を示す。同様に、ＩＬ−３６β刺激性ＩＬ−６産生を０．０９４ｎＭのＩＣ５０値で完全に阻害した。結論として、１４Ｆ４は、ＩＬ−１経路と比較してＩＬ−３６の効力がはるかに高いにもかかわらず、初代ＭＥＦのＩＬ−１経路およびＩＬ−３６経路の両方を完全にブロッキングする能力を有する。
【表２８】
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【０３６９】
要約すると、１４Ｆ４を使用した上記結果は、ＩＬ１ＲＡＰ阻害を通してＩＬ−１、ＩＬ−３３、およびＩＬ−３６経路を同時にブロッキングすることの有効性および効果を決定するため、マウスインビボ研究用の代理抗体として使用することを裏付けている。
【０３７０】
実施例１８：代理抗マウスＩＬ１ＲＡＰ抗体のインビボ有効性
この実施例は、マウス代理抗体１４Ｆ４が、少なくとも２つのＩＬ−１ファミリー経路の機能的インビボブロッキング剤であり、喘息のマウスモデルで誘導されるより複雑な表現型の機能的ブロッキング剤でもあることを例示する。
【０３７１】
材料および方法
インビボマウスモデル研究における研究用プロトコルは、表２９に要約されている。
【表２９】
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【０３７２】
動物および畜産：雌のＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＨｓｄマウスをＥｎｖｉｇｏから購入し、６〜１３週齢で使用した。マウスには、照射Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ  ｇｌｏｂａｌ１８％タンパク質のげっ歯類用食餌を与え、自由に摂水させた。動物は、１時間当たり６０回の完全換気でトウモロコシ穂軸の寝床を備えたＩｎｎｏｖｉｖｅ使い捨て換気ケージで飼育された。環境は７０°±２°Ｆの温度範囲および３０〜７０％の湿度範囲に制御された。全ての動物実験は、Ｅｘｐｌｏｒａ’ｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（カリフォルニア州サンディエゴ）によって承認された動物管理使用プロトコルに従って実施された。
【０３７３】
インビボ治療：経鼻投与（ｉ．ｎ．）治療のため、マウスを３〜４％イソフルラン（ＶｅｔＯｎｅ、アイダホ州ボイシ）で麻酔し、マイクロピペットで投与された溶液３５μｌを鼻孔から吸入させた。２．５％の２，２，２−トリブロモエチルアルコール溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）の麻酔用量を投与した後、両側開胸術または頸椎脱臼（単回ＩＬ−１β接種のみ）により、マウスを安楽死させた。
【０３７４】
データ分析：全てのインビボ研究では、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ８ソフトウェアをデータおよび統計分析に使用した。マン−ホイットニー検定は、サイトカインまたはＨＤＭの接種が生物学的応答に統計的に有意な増加を引き起こしたか否かを決定するために、ＩｇＧ対照投与され接種されていないマウスとＩｇＧ対照投与され接種されたマウスで実施された。有意性を決定した後、ＩｇＧ対照投与され接種されたマウスと１４Ｆ４投与され接種されたマウスで、マン−ホイットニー検定を実施した。
【０３７５】
Ａ．単回サイトカイン接種モデルおよび関連アッセイ：単回ＩＬ−１β接種の研究プロトコルは、Ｇａｂｒｉｅｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ：Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，６７：１４４−１５９（２０１５）に基づいて改変した。−１日目に、１ｋｇの平均群体重当たり３０ｍｇのＩｇＧ対照または１４Ｆ４を総量１００〜２００μｌでマウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。０日目に、マウスにＤ−ＰＢＳまたは５０ｎｇ  ＩＬ−１βを総量１００μｌで腹腔内接種した。接種の２時間後、マウスを安楽死させ、心臓穿刺により採血し、ＢＤ  Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ血清分離チューブ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に入れた。少なくとも３０分後、チューブを９，３００×ｇで５分間遠心分離し、血清を収集し、−８０℃で保管した。マウス血清ＩＬ−６濃度は、市販のＩＬ−６  ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号８８−７０６４−８８）により、製造業者の指示に従って測定した。血清試料は、アッセイ用に１：５に希釈した。
【０３７６】
単回ＩＬ−３６α接種の研究プロトコルは、Ｒａｍａｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ，７（９）：ｅ４５７８４（２０１２）に基づいて改変した。−１日目に、単回ＩＬ−１β接種研究と同様に、マウスに抗体を腹腔内投与した。０日目に、マウスにＤ−ＰＢＳまたは１０ｎｇのＩＬ−３６αを総量３５μｌで経鼻接種した。１日目に、マウスを安楽死させた。気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）は、気管を切開し、２０Ｇの平滑末端針または１８Ｇのカテーテルシースを挿入し、１ｍＬのシリンジを使用して０．８ｍＬのＨＢＳＳ／２ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液を注入および回収することによって実施した。この手順を３回実施した。ＢＡＬ液の細胞型数を決定するために、ＢＡＬ液を３６５×ｇで１０分間遠心分離した。上清を除去した後、２ｍＬの１Ｘ  Ｌｙｓｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５５８９９）を細胞に添加して、任意の赤血球細胞を溶解した。２分後、５ｍＬのＤ−ＰＢＳ／２％ＦＢＳ緩衝液を添加して反応を停止した。細胞を３６５×ｇで５分間遠心分離した。上清を除去した後、細胞をＨＢＳＳ／２ｍＭ  ＥＤＴＡに再懸濁し、９６ウェル丸底プレートに移し、５７０×ｇで２分間遠心分離し、上清を除去した。全ての染色段階は、氷上および暗所で実施した。死細胞を染色するために、２５μｌのＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｆａｒ  Ｒｅｄ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ（１：１０００希釈、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を追加した。１５〜２０分後、２５μｌの抗ＣＤ１６／３２（２．４Ｇ２、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むＦＡＣＳ染色緩衝液を細胞に添加し、Ｆｃ受容体結合をブロッキングした。１５分後、次いで、抗体を含む５０μｌのＢｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｓｔａｉｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をウェルに添加することにより細胞を染色した。抗体は全て１：２００希釈で使用した。下記の抗体は、Ｔｏｎｂｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。Ｌｙ６Ｇ−ＦＩＴＣ（１Ａ８）およびＣＤ１１ｂ−ＡＰＣ（Ｍ１／７０）。下記の抗体はＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。ＳｉｇｌｅｃＦ−ＰＥ（Ｅ５０−２４４０）およびＣＤ１１ｃ−ＢＶ７８５（Ｎ４１８）。Ｌｙ６Ｃ−ＰｅｒＣｐ−Ｃｙａｎｉｎｅ５．５（ＨＫ１．４）はＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから購入した。３０分後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２〜３回洗浄した。洗浄後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した後、ＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーターで分析した。ＦｌｏｗＪｏ１０ソフトウェアを使用してデータを分析した。細胞をゲーティングし、死細胞および肺胞マクロファージ（ＳｉｇｌｅｃＦ＋ＣＤ１１ｃ＋）を除外した後、マーカーの発現に基づいて細胞型を定義した。好酸球（ＳｉｇｌｅｃＦ＋ＣＤ１１ｃ−Ｌｙ６Ｇ−）、好中球（Ｌｙ６Ｇ＋ＬＹ６Ｃ＋ＣＤ１１ｂ＋ＳｉｇｌｅｃＦ−ＣＤ１１ｃ−）、および単球（ＬＹ６Ｃ＋Ｌｙ６Ｇ−ＣＤ１１ｂ＋ＳｉｇｌｅｃＦ−ＣＤ１１ｃ−）。ＢＡＬ液の細胞型数を算出するため、得られた全細胞のうちの各細胞型のパーセンテージに全細胞数を乗じた。全細胞数は、Ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅ  ５ＨＴシステムフローサイトメーター（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州ビレリカ）を使用し、製造業者の指示に従ってＶｉａＣｏｕｎｔアッセイを使用して得られた。
【０３７７】
Ｂ．複数回ＩＬ−１βサイトカイン接種モデルおよび関連アッセイ：複数回ＩＬ−１β接種の研究プロトコルは、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９６（３）：２８３−２９７（２０１７）に基づいた。−１日目および２日目に、単回ＩＬ−１β接種研究と同様に、マウスに抗体を腹腔内投与した。０、１、および２日目に、マウスにＤ−ＰＢＳまたは３０ｎｇのＩＬ−１βを総量３５μｌのＤ−ＰＢＳで経鼻接種した。３日目に、マウスを安楽死させた。ＢＡＬは前述のように実施した。左、中、下、および後ろの大静脈肺葉を２．０ｍＬチューブに収集し、瞬間凍結し、その後のタンパク質ケモカイン／サイトカイン分析用に−８０℃で保管した。ＢＡＬの細胞分析は、細胞をＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ａｑｕａ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ（１：２５０希釈、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で染色したこと、および下記の抗体を除いて、全て１：２００希釈で、前述のように実施した。Ｌｙ６Ｇ−ＦＩＴＣ（Ｔｏｎｂｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、１Ａ８）、ＳｉｇｌｅｃＦ−ＰＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅ５０−２４４０）、Ｌｙ６Ｃ−ＰｅｒＣｐ−Ｃｙａｎｉｎｅ５．５（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＨＫ１．４）、ＣＤ１１ｂ−ＡＰＣ−Ｃｙ７（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍ１／７０）、ＣＤ１１ｃ−ＢＶ７８５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｎ４１８）、ＣＤ３−ＰＥ−Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１７Ａ２）、ＣＤ４−ＢＶ６０５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＲＭ４−５）、ＣＤ１９−ＢＶ６５０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、１Ｄ３）、Ｔ１／ＳＴ２−ＢＶ４２１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕ２９−９３）およびＭＨＣクラスＩＩ−ＡＰＣ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｍ５／１１４．１５．２）。ＦｌｏｗＪｏ１０ソフトウェアを使用してデータを分析した。細胞をゲーティングし、死細胞および肺胞マクロファージ（ＣＤ１１ｃ＋ＳｉｇｌｅｃＦ＋）を除外した後、次のマーカーの発現に基づいて、ＢＡＬの下記細胞型を定義した。好中球（Ｌｙ６Ｇ＋Ｌｙ６Ｃ＋ＣＤ１１ｂ＋）、好酸球（ＳｉｇｌｅｃＦ＋ＣＤ１１ｃ−Ｌｙ６Ｇ−）、樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣＩＩ＋Ｌｙ６Ｇ−ＳｉｇｌｅｃＦ−）、単球（ＬＹ６Ｃ＋Ｌｙ６Ｇ−ＣＤ１１ｂ＋ＳｉｇｌｅｃＦ−）、ＣＤ４  Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１９−ＣＤ１１ｂ−Ｌｙ６Ｇ−ＳｉｇｌｅｃＦ−）、Ｔ１−ＳＴ２＋ＣＤ４  Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ１／ＳＴ２＋ＣＤ１９−ＣＤ１１ｂ−Ｌｙ６Ｇ−ＳｉｇｌｅｃＦ−）、ＣＤ８  Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ１９−ＣＤ１１ｂ−Ｌｙ６Ｇ−ＳｉｇｌｅｃＦ−）、およびＢ細胞（ＣＤ１９＋ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ３−ＣＤ１１ｂ−Ｌｙ６Ｇ−ＳｉｇｌｅｃＦ−）。ＢＡＬの細胞数は上記のように算出した。肺ケモカイン／サイトカインタンパク質分析では、Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号７８４４３）を含むＴｉｓｓｕｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｉ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃ��ｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＦＮＮ００７１）で、ＴｉｓｓｕｅｌｙｓｅｒＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、２５Ｈｚで２分間を３サイクルで肺試料をホモジナイズした。ホモジネートを９，３００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。組織溶解物（上清）のタンパク質量は、Ｐｉｅｒｃｅビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号２３２２７）で定量化した。溶解物は、サイトカインアッセイ用に−８０℃で保存した。サイトカイン測定に上清を使用した。２００μｇの総タンパク質肺溶解物におけるマウスサイトカインおよびケモカインのレベル（ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＩＦＮγ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−２５、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−３３、ＴＮＦα、およびＴＳＬＰ）を、マウスカスタムＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘ１７−ｐｌｅｘキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＰＰＸ−１７−ＭＸＣＥ４ＡＴ）を使用して、製造業者の指示に従って測定した。
【０３７８】
Ｃ．急性ハウスダストダニ（ＨＤＭ）喘息モデルおよび関連アッセイ：急性ハウスダストダニ（ＨＤＭ）喘息モデルは、Ｐｉｙａｄａｓａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ，５（２）：１１２−１２１（２０１６）に基づいた。−１、２、６、９、および１３日目に、マウスにＩｇＧ対照または１４Ｆ４を３０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した。０〜３、６〜１０、１３、および１４日目に、マウスに生理食塩水または２５μｇ  ＨＤＭ（Ｓｔａｌｌｅｒｇｅｎｅｓ  Ｇｒｅｅｒ、ノースカロライナ州レノア、カタログ番号ＸＰＢ８２Ｄ３Ａ．５）を経鼻接種した。１５日目に、マウスを安楽死させ、前述のように血液から血清を収集した。マウス抗体の血清濃度は、ＨＤＭ特異的ＩｇＥ（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ、ワシントン州レドモンド、カタログ番号３０３７）およびＨＤＭ特異的ＩｇＧ１（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ、カタログ番号３０３４）キットを製造業者の指示に従って使用して測定した。ＨＤＭ特異的ＩｇＥの場合は１：４に、ＨＤＭ特異的ＩｇＧ１測定の場合は１：１２に、血清試料を希釈した。
【０３７９】
結果
実施例１７の結果によって示されるように、マウス代理抗体１４Ｆ４は、インビトロ細胞アッセイにおいて全３つのＩＬ−１ファミリー経路をブロッキングすることができる。１４Ｆ４がインビボでこれらの経路をブロッキングすることができるか否かを決定するために、本実施例１８は、短時間の薬力学的（ＰＤ）アッセイで個々の経路をブロッキングする１４Ｆ４の能力を試験した。以前の研究は、ＩＬ−１ファミリーサイトカインがインビボで投与された場合に急性効果を有することを実証した（例えば、Ｇａｂｒｉｅｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ：Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，６７：１４４−１５９（２０１５）、Ｒａｍａｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ，７（９）：ｅ４５７８４（２０１２）を参照）。同様に、図１６Ａおよび１６Ｂに表される結果によって示されるように、ＩＬ−１βを全身接種されたマウスは、ＰＢＳを接種されたマウスと比較して、血清ＩＬ−６レベルの急速な増加で応答した（図１６Ａ）。ＩＬ３６αを接種されたマウスは、ＰＢＳを接種されたマウスと比較して、肺気腔への好中球の急速な流入で応答した（図１６Ｂ）。１４Ｆ４による処理は、これらの観察された免疫応答の両方に影響を及ぼした。図１６Ａに示されるように、接種前に１４Ｆ４を投与されたマウスは、血清ＩＬ−６レベルのＩＬ−１β誘導性増加に強い阻害を示した（８８％阻害）。さらに、図１６Ｂに示されるように、接種前に１４Ｆ４を投与されたマウスは、肺気腔におけるＩＬ−３６α誘導性の好中球流入の減少（１００％阻害）を示した。これらの結果は、１４Ｆ４がインビボでＩＬ−１およびＩＬ−３６シグナル伝達経路をブロッキングする能力を有することを強く示唆している。
【０３８０】
本実施例の研究は、１４Ｆ４がヒト喘息に見られる複雑な表現型をブロッキングする能力を有するか否かを決定するためにも使用した。以前の研究では、４日間にわたって１日１回ＩＬ−１βを接種されたマウスは、肺気腔の好中球、マクロファージ、およびリンパ球の数が増加したことが示されている（例えば、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９６（３）：２８３−２９７（２０１７）を参照）。ＩＬ−１β誘導性の好中球の流入は、重度の制御不能なヒト喘息患者に見られるものと同様に、ステロイド耐性であることが示されている。図１７Ａ〜１７Ｅのプロットで表される結果によって示されるように、３日間にわたってＩＬ−１βを接種されたマウスでは、肺気腔で、好中球（図１７Ａ）、ＣＤ４  Ｔ細胞（図１７Ｂ）、Ｔ１−ＳＴ２＋  ＣＤ４  Ｔ細胞（図１７Ｃ）、単球（図１７Ｄ）、および樹状細胞（図１７Ｅ）が有意に増加した。図１８Ａ〜１８Ｃに表されるプロットによって示されるように、複数回ＩＬ−１β接種も、肺組織において、炎症性サイトカインＩＬ−１β（図１８Ａ）およびＩＬ−１７Ａ（図１８Ｂ）、ならびに好中球を誘引するケモカインＣＸＣＬ１（図１８Ｃ）のレベルを増加させた。ＣＸＣＬ２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−２５、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＩＬ−３３、ＴＮＦ−αのレベル、およびＴＳＬＰは、複数回ＩＬ−１β接種後に、検出限界を下回っているか、上方調節されていなかった（データは示していない）。１４Ｆ４による処理は、ＩＬ−１β接種マウスで観察されたこれらの効果を減少させた。図１７Ａ〜１７Ｅに示されるように、３日間にわたってＩＬ−１βを接種され、１４Ｆ４で処理されたマウスでは、肺気腔で、好中球（７４％阻害）（図１７Ａ）、ＣＤ４  Ｔ細胞（７５％阻害）（図１７Ｂ）、Ｔ１−ＳＴ２＋ＣＤ４  Ｔ細胞（７６％阻害）（図１７Ｃ）、単球（５８％阻害）（図１７Ｄ）、および樹状細胞（６４％阻害）（図１７Ｅ）の数が減少した。図１８Ａ〜１８Ｃに示されるように、１４Ｆ４処理により、肺組織で、ＩＬ−１β（８８％阻害）（図１８Ａ）、ＩＬ−１７Ａ（８９％阻害）（図１８Ｂ）、およびＣＸＣＬ１（６８％阻害）（図１８Ｃ）のレベルが有意に減少した。これらの結果は、１４Ｆ４が、数日にわたって発症する、より複雑な免疫応答をブロッキングする能力を有することを強く示唆している。
【０３８１】
１４Ｆ４が還元主義のサイトカイン接種モデルで複雑な免疫表現型をブロッキングする能力を有することを決定した後、関連する複雑なヒトアレルゲンであるハウスダストダニ（ＨＤＭ）によって誘導される喘息のような表現型をブロッキングする１４Ｆ４の能力をさらに試験した（例えば、Ｎｉａｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｍｏｄｅｌｓ＆Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，１（４−５）：２１３−２２０（２００８）を参照）。図１９Ａおよび１９Ｂに示すように、以前の研究と同様に（例えば、Ｐｉｙａｄａｓａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ，５（２）：１１２−１２１（２０１６）を参照）、ＨＤＭを接種したマウスは、生理食塩水を接種したマウスと比較して、ＨＤＭ特異的ＩｇＥ（図１９Ａ）およびＩｇＧ１（図１９Ｂ）のレベルが有意に上昇した。しかしながら、ＨＤＭを接種し１４Ｆ４で処理したマウスは、ＩｇＧ対照で処理したマウスと比較して、ＨＤＭ特異的ＩｇＥ（６４％阻害）（図１９Ａ）およびＨＤＭ特異的ＩｇＧ１（７０％阻害）（図１９Ｂ）で有意な減少を示した。これらの結果は、ＩＬ−１ファミリーのシグナル伝達をブロッキングすると、喘息のような表現型の発症を部分的にブロッキングすることができる可能性があることを示している。
【０３８２】
本発明の前述の開示は、明確化および理解の目的で例および例示としていくらか詳細に説明されてきたが、本明細書に記載の実施例、説明、および実施形態を含む本開示は、例示を目的とし、本開示を制限するものとして解釈されるべきではない。本明細書に記載の実施例、説明、および実施形態に対して様々な改変または変更を行うことができ、本開示および添付の特許請求の範囲の精神および視野内に含まれるべきであることは当業者には明らかであろう。さらに、当業者は、本明細書に記載されているものと同等な多くの方法および手順を認識するであろう。そのような全ての同等物は、本開示の範囲内にあると理解されるべきであり、添付の特許請求の範囲によって網羅される。
【０３８３】
本発明の追加の実施形態は、以下の特許請求の範囲に記載されている。
【０３８４】
そのような個々の出版物、特許、特許出願、または他の文書がそれぞれ参照により、その全体をあらゆる目的で本明細書に組み込むために個別具体的に示され、本明細書にその全体が記載されたかのような場合と同程度に、本明細書で言及される全ての出版物、特許出願、特許、または他の文書の開示は、あらゆる目的でその全体が参照により明示的に組み込まれる。矛盾する場合は、規定用語を含む本明細書が優先されるであろう。
参考文献
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１９．Ｄａｌｌ’  Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｏｆ  ａ  Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｆｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６９（９），５１７１−５１８０（２００２）．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１６９．９．５１７１
２０．Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ，Ｗ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ．”Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６（１）：ｐ．４３−６０（２００５）．
２１．ｄｅ  Ｈａａｓ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｆｃ  ｇａｍｍａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｏｆ  ｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ．”Ｊ  Ｌａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｍｅｄ  １２６，３３０−３４１（１９９５）．
２２．Ｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“ＩＬ−３６  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ．”Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，９（２），２８９５−２９０１（２０１７）．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１８６３２／ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２２８１４
２３．Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｆ．Ａ．，Ｃ．Ｗｉｅｓｍａｎｎ，ａｎｄ  Ｓ．Ｓ．Ｓｉｄｈｕ，“Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｆｏｕｒ−ａｍｉｎｏ−ａｃｉｄ  ｃｏｄｅ：ａ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１０１（３４）：ｐ．１２４６７−７２（２００４）．
２４．Ｆｉｅｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｏｎ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ａｓ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ，”ｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ｅｄｓ．Ｓ．Ｄｕｂｅｌ  ａｎｄ  Ｊ．Ｍ．Ｒｅｉｃｈｅｒｔ），Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ（２０１４）．
２５．Ｆｌａｔｍａｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｏｃｅｓｓ  ａｎａｌｙｔｉｃｓ  ｆｏｒ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｂ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ａｎｄ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８４８，７９−８７（２００７）．
２６．Ｆｏｏｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｏｏｐｓ．”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２４：４８７−４９９（１９９２）．
２７．Ｇａｂｒｉｅｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｔｅｓｔｓ：Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｓｔｕｄｙ  ｅｘａｍｐｌｅｓ，”Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ：Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，６７，１４４−１５９（２０１５）．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｅｊｐｓ．２０１４．１１．００６
２８．Ｇａｒｌａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｆａｍｉｌｙ：ｂａｃｋ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｆｕｔｕｒｅ．”Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３９（６）：１００３−１０１８（２０１３）．
２９．Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  ｎｏｎ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ａｎｔｉ−ＣＤ２０  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０２（２）：１６３−１７１（１９９７）．
３０．Ｇｅｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“”Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ａｓ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅａｒｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，１３：２４５−２５５（２００９）
３１．Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，“Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｙｅａｓｔｓ  ａｎｄ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｉ．”Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２２：１４０９−１４１４（２００４）．
３２．Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ５．”Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９（１９７７）．
３３．Ｇｒａｎｚｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｈａｐｉｎｇ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  Ｅｘ  Ｖｉｖｏ  Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ．”Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：４５８（２０１７）．
３４．Ｇｒｕｂｅｒ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５２（１１）：ｐ．５３６８−７４（１９９４）．
３５．Ｇｕｎｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“ＩＬ−１  ｆａｍｉｌｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｕｓｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｔｏ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅｉｒ  ｓｈａｒｅｄ  ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ，”Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，４７（３），５１０−５２３．ｅ４（２０１７）．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｉｍｍｕｎｉ．２０１７．０８．００４
３６．Ｇｕｎｔｈｅｒ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｅ．Ｊ．Ｓｕｎｄｂｅｒｇ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ａｇｏｎｉｓｔ  ａｎｄ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ＩＬ−３６  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９３，９２１−９３０（２０１４）．
３７．Ｇｕｙｅｒ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｙ  ｍｏｕｓｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１７，５８７−５９３（１９７６）．
３８．Ｈａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１６）．ＰＣＴ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．ＷＯ２０１６０７７３８１Ａ１．
３９．Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔｒｏｎｇ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ＩｇＧ３  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ．”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：１４９９−１５０２（１９８５）．
４０．Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｌ６，ａｎ  ＩｇＧ２ａ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈａｔ  ｒｅａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｏｓｔ  ｈｕｍａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：７０５９−７０６３（１９８６）．
４１．Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，Ｔ．Ｐｒｏｓｐｅｒｏ，ａｎｄ  Ｇ．Ｗｉｎｔｅｒ，“‘Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ’：ｓｍａｌｌ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｄ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，９０（１４）：ｐ．６４４４−８（１９９３）．
４２．Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，（２００１）．
４３．Ｈｏｔｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｒｉｓｋ  ｍｉｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｆａｓｔ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ．”ｍＡｂｓ，４（６）：７５３−７６０（２０１２）．
４４．Ｈｕｄｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．ａｎｄ  Ｃ．Ｓｏｕｒｉａｕ，“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．”Ｎａｔ  Ｍｅｄ，９（１）：ｐ．１２９−３４（２００３）．
４５．Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃ１ｑ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｏｎ  ｒｉｔｕｘａｎ，ａ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｗｉｔｈ  ａ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｆｃ．”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６４：４１７８−  ４１８４（２０００）．
４６．Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，２０８９２）：Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，１９９１．，２０１９）．
４７．Ｋａｋｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ＩＬ−３３／ＳＴ２  ｐａｔｈｗａｙ：ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ａｎｄ  ｎｏｖｅｌ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，７（１０），８２７−８４０（２００８）．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｒｄ２６６０．
４８．Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｃｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｓｔａｂｌｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｃｏｓｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＡＤＣＣ．”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０−６８８（２００６）．
４９．Ｋａｓｈｍｉｒｉ，Ｓ．Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．，“ＳＤＲ  ｇｒａｆｔｉｎｇ−−ａ  ｎｅｗ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ．”Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６（１）：ｐ．２５−３４（２００５）．
５０．Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ＮＬＲＰ３  Ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ，ＩＬ−１β−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  Ｓｅｖｅｒｅ，Ｓｔｅｒｏｉｄ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ａｓｔｈｍａ，”Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９６（３），２８３−２９７（２０１７）．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１６４／ｒｃｃｍ．２０１６０９−１８３０ＯＣ
５１．Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ＩｇＧ１  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，”Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４：２４２９−２４３４（１９９４）
５２．Ｋｌｉｍｋａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉ−ＣＤ３０  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｇｕｉｄｅｄ  ｐｈａｇｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｐａｎｎｉｎｇ．”Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，８３（２）：ｐ．２５２−６０（２０００）．
５３．Ｋｏｅｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９０（３６）：２１７７３−２１７８６（２０１５）．
５４．Ｋｏｍａｉ−Ｋｏｍａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３３  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  Ｔｈ１  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｓ  ｏｎ  ＩＬ−１２，”Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，２２１（３），４１２−４１７（２０１６）．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｉｍｂｉｏ．２０１５．１１．０１３
５５．Ｋｏｓｔｅｌｎｙ，Ｓ．Ａ．，Ｍ．Ｓ．Ｃｏｌｅ，ａｎｄ  Ｊ．Ｙ．Ｔｓｏ，“Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒｓ．”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４８（５）：ｐ．１５４７−５３（１９９２）．
５６．Ｋｏｚｂｏｒ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  ｈｕｍａｎ  ｈｙｂｒｉｄ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３３（６）：ｐ．３００１−５（１９８４）．
５７．Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．−  ＮＬＭ  Ｃａｔａｌｏｇ  −  ＮＣＢＩ，（ａｖａｉｌａｂｌｅ  ａｔ  ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｌｍｃａｔａｌｏｇ／１０１２７５６３６）．
５８．Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．”Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４：３６７−３８２（１９８７）．
５９．Ｋｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ＩｇＧ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，”ＭＡｂｓ，３（５），４２２−４３０（２０１１）．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．４１６１／ｍａｂｓ．３．５．１６９８３
６０．Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ａｉｒｗａｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ｉｎ  ａｓｔｈｍａ．”Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１８（５）：６８４−６９２（２０１２）．
６１．Ｌｅｅ，Ｃ．Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｆａｂ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｓｃａｆｆｏｌｄ．”Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，３４０（５）：ｐ．１０７３−９３（２００４）．
６２．Ｌｅｅ，Ｃ．Ｖ．，Ｓ．Ｓ．Ｓｉｄｈｕ，ａｎｄ  Ｇ．Ｆｕｈ，“Ｂｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｍｉｍｉｃｓ  ｎａｔｕｒａｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ．”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２８４（１−２）：ｐ．１１９−３２（２００４）．
６３．Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ＩｇＧｓ  ｉｎ  ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ．”Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２４（２）：２１０−２１５（２００６）．
６４．Ｌｉ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｖｉａ  ａ  ｈｕｍａｎ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，１０３（１０）：ｐ．３５５７−６２（２００６）．
６５．Ｌｉｅｗ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１６）．“Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３３  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．”Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６（１１）：６７６−６８９（２０１６）．
６６．Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．，“Ｆｕｌｌｙ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｐｌａｔｆｏｒｍｓ．”Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０（４）：ｐ．４５０−９（２００８）．
６７．Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．，“Ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌｓ．”Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２３（９）：ｐ．１１１７−２５（２００５）．
６８．Ｍａｔｈｅｒ，“Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｍｏｕｓｅ  ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．”Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３−２５２（１９８０）．
６９．Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉｕｍ．”Ａｎｎａｌｓ  Ｎ  Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３：４４−６８（１９８２）．
７０．Ｍａｒｋｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｄｂｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２４８：１６１−１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）．
７１．Ｍａｓｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，“ＰＡＮＤＡｓｅｑ：ｐａｉｒｅｄ−ｅｎｄ  ａｓｓｅｍｂｌｅｒ  ｆｏｒ  ｉｌｌｕｍｉｎａ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．”ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１３：３１（２０１２）．
７２．ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｈａｇｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ．”Ｎａｔｕｒｅ，３４８（６３０１）：ｐ．５５２−４（１９９０）．
７３．Ｎｉａｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ａｓｔｈｍａ：Ａｃｕｔｅ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．”Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｍｏｄｅｌｓ  ＆  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，１（４−５），２１３−２２０（２００８）．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１２４２／ｄｍｍ．０００３２３
７４．Ｎｏｌｄ−Ｐｅｔｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１８  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  α−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８４（３８），２５９００−２５９１１（２００９）．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１０９．００４１８４
７５．Ｎｏｗａｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ：Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｂａｒｒｉｅｒ．”Ｃｅｌｌ  １６８（３）：３６２−３７５（２０１７）．
７６．Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｆｕｃｏｓｅ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｎｔｈａｌｐｙ  ａｎｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ＩｇＧ１  ａｎｄ  Ｆｃ−γ−ＲＩＩＩａ．”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３３６：１２３９−１２４９（２００４）．
７７．Ｏｓｂｏｕｒｎ，Ｊ．，Ｍ．Ｇｒｏｖｅｓ，ａｎｄ  Ｔ．Ｖａｕｇｈａｎ，“Ｆｒｏｍ  ｒｏｄｅｎｔ  ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．”Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６（１）：ｐ．６１−８（２００５）．
７８．Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．，“Ａ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｗｈｉｌｅ  ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ  ｔｈｅｉｒ  ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．”Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９１．２８（４−５）：ｐ．４８９−９８（１９９１）．
７９．Ｐｅｔｋｏｖａ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ａ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ＦｃＲｎ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍｏｒａｌｌｙ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ．”Ｉｎｔｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８（１２）：１７５９−１７６９（２００６）．
８０．Ｐｉｙａｄａｓａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１６）．“Ｂｉｏｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ａｉｒｗａｙ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｈｏｕｓｅ  ｄｕｓｔ  ｍｉｔｅ−ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ａｓｔｈｍａ，”Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ，５（２），１１２−１２１（２０１６）．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１２４２／ｂｉｏ．０１４４６４
８１．Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｌａｃｋ  ｏｆ  ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ  ｉｎ  ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｈ  ａｎｄ  Ｌ  ｃｈａｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ  ａｓ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  Ｈ  ａｎｄ  Ｌ  ｃｈａｉｎ  ‘ｒｏｕｌｅｔｔｅ’．”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５０（３）：ｐ．８８０−７（１９９３）．
８２．Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ＩｇＥ．”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５１（５）：ｐ．２６２３−３２（１９９３）．
８３．Ｑｕｅｅｎ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，８６（２４）：ｐ．１００２９−３３（１９８９）．
８４．Ｒａｍａｄａｓ，ｅｔ  ａｌ．，“ＩＬ−３６α  ｅｘｅｒｔｓ  ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｕｎｇｓ  ｏｆ  ｍｉｃｅ．”ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ，７（９），ｅ４５７８４（２０１２）．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００４５７８４
８５．Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．ａｎｄ  Ｊ．Ｐ．Ｋｉｎｅｔ，“Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．”Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９，４５７−４９２（１９９１）．
８６．Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．”Ｎａｔｕｒｅ，３３２（６１６２）：ｐ．３２３−７（１９８８）．
８７．Ｒｉｐｋａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｗｏ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｍｕｔａｎｔｓ  ａｆｆｅｃｔｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ＧＤＰ−ｍａｎｎｏｓｅ  ｔｏ  ＧＤＰ−ｆｕｃｏｓｅ．”Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，．２４９：５３３−５４５（１９８６）．
８８．Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“ＦｃＲｎ：ｔｈｅ  ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏｍｅｓ  ｏｆ  ａｇｅ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７（９），７１５−７２５（２００７）．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｒｉ２１５５
８９．Ｒｏｓｏｋ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒａｐｉｄ  ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｃａｒｃｉｎｏｍａ  ＢＲ９６  Ｆａｂ．”Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７１（３７）：ｐ．２２６１１−８（１９９６）．
９０．Ｓａｌｕｊａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＩＬ−３３  ａｎｄ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．”Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓｌ．Ａｌｌｅｒｇｙ  ５：３３（２０１５）．
９１．Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｂａｓｏｐｈｉｌｓ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，”Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，７７８，９０−９５（２０１６）．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｅｊｐｈａｒ．２０１５．０４．０４９
９２．Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  ｆｏｒ  Ｆｃ  ｇａｍｍａ  ＲＩ，Ｆｃ  Ｇａｍｍａ  ＲＩＩ，Ｆｃ  ｇａｍｍａ  ＲＩＩＩ，ａｎｄ  ＦｃＲｎ  ａｎｄ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ＩｇＧ１  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｆｃ  ｇａｍｍａ  Ｒ．”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（９）：６５９１−  ６６０４（２００１）．
９３．Ｓｉｄｈｕ，Ｓ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ．”Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，３３８（２）：ｐ．２９９−３１０（２００４）．
９４．Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ＩＬ−１  ｆａｍｉｌｙ：ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．”Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０（２）：８９−１０２（２０１０）．
９５．Ｓｉｍｓ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ＣＤ１８  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃａｎ  ｂｌｏｃｋ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｃｅｌｌ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５１（４）：ｐ．２２９６−３０８（１９９３）．
９６．Ｓｍｅｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｏｌｕｂｌｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｂｙ  ａ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｍｏｄｅ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈａｔ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ，”Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，５２（７），２２０２−２２１１（２００５）．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ａｒｔ．２１１０８
９７．Ｓｏｌａ，（１９８７）．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．
９８．Ｓｕｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，“ＩＬ−１ａｌｐｈａ  ｒｅｌｅａｓｅｄ  ｆｒｏｍ  ｄａｍａｇｅｄ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｔｏ  ｔｒｉｇｇｅｒ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．”Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７（３）：６８４−６９３（２０１４）．
９９．Ｔｏｗｎｅ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（ＩＬ）−１Ｆ６，ＩＬ−１Ｆ８，ａｎｄ  ＩＬ−１Ｆ９  ｓｉｇｎａｌ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＩＬ−１Ｒｒｐ２  ａｎｄ  ＩＬ−１ＲＡｃＰ  ｔｏ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ｌｅａｄｉｎｇ  ｔｏ  ＮＦ−ｋａｐｐａＢ  ａｎｄ  ＭＡＰＫｓ．”Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７９（１４）：ｐ．１３６７７−８８（２００４）．
１００．Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（Ｊａｎｕｓｉｎｓ）  ｔａｒｇｅｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｏｎ  ＨＩＶ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ，”ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０（１２）：３６５５−９（１９９１）．
１０１．Ｔｕｔｔ，Ａ．，Ｇ．Ｔ．Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，“Ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｆ（ａｂ’）３  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｔｈａｔ  ｕｓｅ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ＴＣＲ／ＣＤ３  ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｎｄ  ＣＤ２  ｔｏ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ａｎｄ  ｒｅｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｓｔｉｎｇ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４７（１）：ｐ．６０−９（１９９１）．
１０２．Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎ  ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０）．
１０３．ｖａｎ  Ｄｉｊｋ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ  Ｊ．Ｇ．ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，“Ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｓ  ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．”Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ，５（４）：ｐ．３６８−７４（２００１）．
１０４．Ｖｏｌｌｍｅｒｓ，Ｈ．Ｐ．ａｎｄ  Ｓ．Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，“Ｄｅａｔｈ  ｂｙ  ｓｔｒｅｓｓ：ｎａｔｕｒａｌ  ＩｇＭ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．”Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｉｎｄ  Ｅｘｐ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２７（３）：ｐ．１８５−９１（２００５）．
１０５．Ｖｏｌｌｍｅｒｓ，Ｈ．Ｐ．ａｎｄ  Ｓ．Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，“Ｔｈｅ  ‘ｅａｒｌｙ  ｂｉｒｄｓ：’  ｎａｔｕｒａｌ  ＩｇＭ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ．”Ｈｉｓｔｏｌ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ，２０（３）：ｐ．９２７−３７（２００５）．
１０６．Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−１β  ｗｉｔｈ  ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．”Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１：９０５−９１２（２０１０）．
１０７．Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．”ＴＩＢＴＥＣＨ，１５：２６−３２（１９９７）．
１０８．Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ＦＵＴ８  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌｓ：ａｎ  ｉｄｅａｌ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ  ｄｅｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．”Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）．
１０９．Ｙａｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐｐ．２５５−２６８（２００３）．
１１０．Ｙｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ａｔｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３６  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ．”Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９１（３２），１６５９７−１６６０９（２０１６）．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１６．７２３０６４
１１１．Ｚａｐａｔａ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｌｉｎｅａｒ  Ｆ（ａｂ’）２  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  ８，１０５７−１０６２（１９９５）．
【図１Ａ】
2021533829.tif 000047
【図１Ｂ】
2021533829.tif 000048
【図１Ｃ】
2021533829.tif 000049
【図１Ｄ】
2021533829.tif 000050
【図１Ｅ】
2021533829.tif 000051
【図１Ｆ】
2021533829.tif 000052
【図２】
2021533829.tif 000053
【図３】
2021533829.tif 000054
【図４Ａ】
2021533829.tif 000055
【図４Ｂ】
2021533829.tif 000056
【図４Ｃ】
2021533829.tif 000057
【図４Ｄ】
2021533829.tif 000058
【図４Ｅ】
2021533829.tif 000059
【図４Ｆ】
2021533829.tif 000060
【図４Ｇ】
2021533829.tif 000061
【図４Ｈ】
2021533829.tif 000062
【図５Ａ】
2021533829.tif 000063
【図５Ｂ】
2021533829.tif 000064
【図５Ｃ】
2021533829.tif 000065
【図５Ｄ】
2021533829.tif 000066
【図５Ｅ】
2021533829.tif 000067
【図５Ｆ】
2021533829.tif 000068
【図６Ａ】
2021533829.tif 000069
【図６Ｂ】
2021533829.tif 000070
【図６Ｃ】
2021533829.tif 000071
【図７】
2021533829.tif 000072
【図８】
2021533829.tif 000073
【図９】
2021533829.tif 000074
【図１０】
2021533829.tif 000075
【図１１】
2021533829.tif 000076
【図１２】
2021533829.tif 000077
【図１３】
2021533829.tif 000078
【図１４Ａ】
2021533829.tif 000079
【図１４Ｂ】
2021533829.tif 000080
【図１４Ｃ】
2021533829.tif 000081
【図１５】
2021533829.tif 000082
【図１６Ａ】
2021533829.tif 000083
【図１６Ｂ】
2021533829.tif 000084
【図１７Ａ】
2021533829.tif 000085
【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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