(57)【要約】本発明は、普遍的に許容可能な「容易に入手可能である」低免疫原性多能性細胞及びその分化した心臓、内皮、神経、膵島又は網膜色素細胞を提供する。このような低免疫細胞は、それを必要とする患者を処置するために使用される。本細胞は、免疫応答を惹起する主要免疫抗原を欠き、食作用性のエンドサイトーシスを回避するために改変されている。
2021530232.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
低免疫誘導多能性幹細胞（ＨＩＰ細胞）から分化させられた単離低免疫心臓細胞であって、
内在性β−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除され、ＣＤ４７発現が上昇している、単離低免疫心臓細胞。
【請求項２】
前記ＨＩＰ細胞がヒトｉＰＳＣであり、前記Ｂ２Ｍ遺伝子がヒトＢ２Ｍ遺伝子であり、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子がヒトＢ２Ｍ遺伝子であり、前記ＣＤ４７発現上昇が、プロモーターの制御下でヒトＣＤ４７遺伝子の少なくとも１コピーを前記ｉＰＳＣに導入した結果である、請求項１に記載の単離低免疫心臓細胞。
【請求項３】
前記ＨＩＰ細胞がマウスｉＰＳＣであり、前記Ｂ２Ｍ遺伝子がマウスＢ２Ｍ遺伝子であり、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子がマウスＢ２Ｍ遺伝子であり、前記ＣＤ４７発現上昇が、プロモーターの制御下でマウスＣＤ４７遺伝子の少なくとも１コピーを前記ｉＰＳＣに導入した結果である、請求項１に記載の単離低免疫心臓細胞。
【請求項４】
Ｂ２Ｍ遺伝子活性の前記排除が、前記Ｂ２Ｍ遺伝子の両アレルを破壊するクラスター化された規則的配置の短回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９反応の結果である、請求項１〜３の何れか１項に記載の単離低免疫心臓細胞。
【請求項５】
ＣＩＩＴＡ遺伝子活性の前記排除が、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子の両アレルを破壊するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９反応の結果である、請求項１〜４の何れか１項に記載の単離低免疫心臓細胞。
【請求項６】
前記ＨＩＰ細胞を死に誘導するトリガー物質により活性化される自殺遺伝子をさらに含む、請求項１〜５の何れか１項に記載の単離低免疫心臓細胞。
【請求項７】
前記自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子であり、前記トリガー物質がガンシクロビルである、請求項６に記載の単離低免疫心臓細胞。
【請求項８】
前記ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子が、配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むタンパク質をコードする、請求項７に記載の単離低免疫心臓細胞。
【請求項９】
前記ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子が、配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、請求項７に記載の単離低免疫心臓細胞。
【請求項１０】
前記自殺遺伝子がエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子であり、前記トリガー物質が５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）である、請求項６に記載の単離低免疫心臓細胞。
【請求項１１】
前記ＣＤ遺伝子が、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むタンパク質をコードする、請求項１０に記載の単離低免疫心臓細胞。
【請求項１２】
前記ＣＤ遺伝子が、配列番号５のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、請求項１０に記載の単離低免疫心臓細胞。
【請求項１３】
前記自殺遺伝子が誘導型カスパーゼ９タンパク質をコードし、前記トリガー物質が二量体誘導化合物（ＣＩＤ）である、請求項６に記載の単離低免疫心臓細胞。
【請求項１４】
前記誘導型カスパーゼ９タンパク質が、配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む、請求項１３に記載の単離低免疫心臓細胞。
【請求項１５】
前記誘導型カスパーゼ９タンパク質が、配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の単離低免疫心臓細胞。
【請求項１６】
前記ＣＩＤが化合物ＡＰ１９０３である、請求項１３〜１５の何れか１項に記載の単離低免疫心臓細胞。
【請求項１７】
前記単離低免疫心臓細胞が、心筋細胞、結節心筋細胞、伝導性心筋細胞、作業心筋細胞、心筋細胞前駆体、心筋細胞祖先細胞、心臓幹細胞及び心臓筋肉細胞からなる群から選択される、請求項１３〜１６の何れか１項に記載の単離低免疫心臓細胞。
【請求項１８】
心臓状態又は疾患に罹患している患者を処置する方法であって、請求項１〜１７の何れか１項に記載の単離低免疫心臓細胞集団の治療的有効量を含む組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１９】
前記組成物が治療的に有効な担体をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記投与が、前記患者の心臓組織への移植、静脈内注射、動脈内注射、冠動脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、心筋内注射、経心内膜注射、経心外膜注射又は点滴を含む、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記心臓状態又は疾患が、小児心筋症、加齢性心筋症、拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、慢性虚血性心筋症、周産期心筋症、炎症性心筋症、他の心筋症、心筋炎、心筋虚血性再灌流障害、心室機能不全、心不全、うっ血性心不全、冠動脈疾患、末期心疾患、アテローム性動脈硬化症、虚血、高血圧、再狭窄、狭心症、リウマチ性心臓、動脈炎又は循環器疾患からなる群から選択される、請求項１８〜２０の何れか１項に記載の方法。
【請求項２２】
インビトロ分化によって低免疫多能性細胞（ＨＩＰ細胞）集団から低免疫心臓細胞集団を作製する方法であって、前記ＨＩＰ細胞において、内在性β−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除され、ＣＤ４７発現が上昇しており、
前記方法が、
（ａ）ＧＳＫ阻害剤を含む培地中でＨＩＰ細胞集団を培養し；
（ｂ）前駆心臓細胞集団を作製するために、ＷＮＴアンタゴニスを含む培地中で前記ＨＩＰ細胞集団を培養し；
（ｃ）心臓細胞集団を作製するために、インスリンを含む培地中で前記前駆心臓細胞集団を培養すること
を含む、方法。
【請求項２３】
前記ＧＳＫ阻害剤が、ＣＨＩＲ−９９０２１、その誘導体又はその変異体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＧＳＫ阻害剤が、約２μＭ〜約１０μＭの範囲の濃度である、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＷＮＴアンタゴニスが、ＩＷＲ１、その誘導体又はその変異体である、請求項２２〜２４の何れか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＷＮＴアンタゴニスが、約２μＭ〜約１０μＭの範囲の濃度である、請求項２２〜２５の何れか１項に記載の方法。
【請求項２７】
グルコース不含培地中で段階（ｃ）の前記前駆心臓細胞集団を培養することをさらに含む、請求項２２〜２６の何れか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＨＩＰ細胞が自殺遺伝子を含む場合、トリガー物質を含む培地中で段階（ｃ）の前記前駆心臓細胞集団を培養することをさらに含み、
前記自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子である場合、前記トリガー物質がガンシクロビルであるか、前記自殺遺伝子がエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子である場合、前記トリガー物質が５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）であるか、又は前記自殺遺伝子が誘導型カスパーゼ９タンパク質をコードする場合、前記トリガー物質が二量体誘導化合物（ＣＩＤ）である、請求項２２〜２７の何れか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＨＩＰ細胞が自殺遺伝子を含む場合、トリガー物質を含む培地中で段階（ｄ）の前記心臓細胞集団を培養することをさらに含み、
前記自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子である場合、前記トリガー物質がガンシクロビルであるか、前記自殺遺伝子がエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子である場合、前記トリガー物質が５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）であるか、又は前記自殺遺伝子が誘導型カスパーゼ９タンパク質をコードする場合、前記トリガー物質が二量体誘導化合物（ＣＩＤ）である、請求項２２〜２８の何れか１項に記載の方法。
【請求項３０】
非心臓細胞から前記低免疫心臓細胞集団を単離することをさらに含む、請求項２２〜２９の何れか１項に記載の方法。
【請求項３１】
単離した低免疫心臓細胞集団を凍結保存することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
低免疫多能性幹細胞（ＨＩＰ細胞）から分化させられた単離低免疫内皮細胞であって、内在性β−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除され、ＣＤ４７発現が上昇している、単離低免疫内皮細胞。
【請求項３３】
前記ＨＩＰ細胞がヒトｉＰＳＣであり、前記Ｂ２Ｍ遺伝子がヒトＢ２Ｍ遺伝子であり、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子がヒトＢ２Ｍ遺伝子であり、前記ＣＤ４７発現上昇が、プロモーターの制御下でヒトＣＤ４７遺伝子の少なくとも１コピーを前記ｉＰＳＣに導入した結果である、請求項３２に記載の単離低免疫内皮細胞。
【請求項３４】
前記ｉＰＳ  ＨＩＰ細胞ＣがマウスｉＰＳＣであり、前記Ｂ２Ｍ遺伝子がマウスＢ２Ｍ遺伝子であり、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子がマウスＢ２Ｍ遺伝子であり、前記ＣＤ４７発現上昇が、プロモーターの制御下でマウスＣＤ４７遺伝子の少なくとも１コピーを前記ｉＰＳＣに導入した結果である、請求項３２に記載の単離低免疫内皮細胞。
【請求項３５】
Ｂ２Ｍ遺伝子活性の前記排除が、前記Ｂ２Ｍ遺伝子の両アレルを破壊する、クラスター化された規則的配置の短回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９反応の結果である、請求項３２〜３４の何れか１項に記載の単離低免疫内皮細胞。
【請求項３６】
ＣＩＩＴＡ遺伝子活性の前記排除が、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子の両アレルを破壊するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９反応の結果である、請求項３２〜３５の何れか１項に記載の単離低免疫内皮細胞。
【請求項３７】
前記ＨＩＰ細胞を死に誘導するトリガー物質により活性化される自殺遺伝子をさらに含む、請求項３２〜３６の何れか１項に記載の単離低免疫内皮細胞。
【請求項３８】
前記自殺遺伝子が、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子であり、前記トリガー物質がガンシクロビルである、請求項３７に記載の単離低免疫内皮細胞。
【請求項３９】
前記ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子が、配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むタンパク質をコードする、請求項３８に記載の単離低免疫内皮細胞。
【請求項４０】
前記ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子が、配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、請求項３８に記載の単離低免疫内皮細胞。
【請求項４１】
前記自殺遺伝子がエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子であり、前記トリガー物質が５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）である、請求項３７に記載の単離低免疫内皮細胞。
【請求項４２】
前記ＣＤ遺伝子が、配列番号５に対する少なくとも９０％の配列同一性を含むタンパク質をコードする、請求項４１に記載の単離低免疫内皮細胞。
【請求項４３】
前記ＣＤ遺伝子が、配列番号５のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、請求項４１に記載の単離低免疫内皮細胞。
【請求項４４】
前記自殺遺伝子が誘導型カスパーゼ９タンパク質をコードし、前記トリガー物質が二量体誘導化合物（ＣＩＤ）である、請求項４１に記載の単離低免疫内皮細胞。
【請求項４５】
前記誘導型カスパーゼ９タンパク質が、配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む、請求項４４に記載の単離低免疫内皮細胞。
【請求項４６】
前記誘導型カスパーゼ９タンパク質が、配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項４４に記載の単離低免疫内皮細胞。
【請求項４７】
前記ＣＩＤが化合物ＡＰ１９０３である、請求項４４〜４６の何れか１項に記載の単離低免疫内皮細胞。
【請求項４８】
前記単離低免疫内皮細胞が、毛細血管内皮細胞、血管内皮細胞、大動脈内皮細胞、脳内皮細胞及び腎臓内皮細胞からなる群から選択される、請求項４４〜４６の何れか１項に記載の単離低免疫内皮細胞。
【請求項４９】
血管状態又は疾患に罹患している患者を処置する方法であって、治療的有効量の請求項３２〜４８の何れか１項に記載の単離低免疫内皮細胞集団を含む組成物を投与することを含む、方法。
【請求項５０】
前記組成物が治療的に有効な担体をさらに含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記投与が、前記患者の組織への移植、静脈内注射、動脈内注射、冠動脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、心筋内注射、経心内膜注射、経心外膜注射又は点滴を含む、請求項４９又は５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記血管状態又は疾患が、血管損傷、循環器疾患、血管疾患、虚血性疾患、心筋梗塞、うっ血性心不全、高血圧、虚血性組織損傷、虚血肢、脳卒中、神経障害及び脳血管疾患からなる群から選択される、請求項４９〜５１の何れか１項に記載の方法。
【請求項５３】
インビトロ分化による低免疫多能性幹細胞（ＨＩＰ細胞）集団から低免疫内皮細胞集団を作製する方法であって、前記ＨＩＰ細胞において、内在性β−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除され、ＣＤ４７発現が上昇しており、
前記方法が、
（ａ）ＧＳＫ阻害剤を含む第１の培地中でＨＩＰ細胞集団を培養し；
（ｂ）前駆内皮細胞集団を作製するためにＶＥＧＦ及びｂＦＧＦを含む第２の培地中で前記ＨＩＰ細胞集団を培養し；
（ｃ）低免疫内皮細胞集団を作製するためにＲＯＣＫ阻害剤及びＡＬＫ阻害剤を含む第３の培地中で前記前駆内皮細胞集団を培養すること
を含む、方法。
【請求項５４】
前記ＧＳＫ阻害剤が、ＣＨＩＲ−９９０２１、その誘導体又はその変異体である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＧＳＫ阻害剤が約１μＭ〜約１０μＭの範囲の濃度である、請求項５３又は５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、その誘導体又はその変異体である、請求項５３〜５５の何れか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＲＯＣＫ阻害剤が約１μＭ〜約２０μＭの範囲の濃度である、請求項５３〜５６の何れか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＡＬＫ阻害剤が、ＳＢ−４３１５４２、その誘導体又はその変異体である、請求項５３〜５５の何れか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＡＬＫ阻害剤が約０．５μＭ〜約１０μＭの濃度範囲である、請求項５３〜５６の何れか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記第１の培地が２μＭ〜約１０μＭのＣＨＩＲ−９９０２１を含む、請求項５３〜５９の何れか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記第２の培地が、５０ｎｇ／ｍＬ  ＶＥＧＦ及び１０ｎｇ／ｍＬ  ｂＦＧＦを含む、請求項５３〜６０の何れか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記第２の培地がＹ−２７６３２及びＳＢ−４３１５４２をさらに含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記第３の培地が１０μＭ  Ｙ−２７６３２及び１μＭ  ＳＢ−４３１５４２を含む、請求項５３〜６２の何れか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記第３の培地がＶＥＧＦ及びｂＦＧＦをさらに含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記第１の培地及び／又は前記第２の培地がインスリンを欠く、請求項５３〜６４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＨＩＰ細胞が自殺遺伝子を含む場合、前記第２の培地がトリガー物質をさらに含み、
前記自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子である場合、前記トリガー物質がガンシクロビルであるか、前記自殺遺伝子がエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子である場合、前記トリガー物質が５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）であるか、又は前記自殺遺伝子が誘導型カスパーゼ９タンパク質をコードする場合、前記トリガー物質が二量体誘導化合物（ＣＩＤ）である、請求項５３〜６５の何れか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記ＨＩＰ細胞が自殺遺伝子を含む場合、前記第３の培地がトリガー物質をさらに含み、
前記自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子である場合、前記トリガー物質がガンシクロビルであるか、前記自殺遺伝子がエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子である場合、前記トリガー物質が５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）であるか、又は前記自殺遺伝子が誘導型カスパーゼ９タンパク質をコードする場合、前記トリガー物質が二量体誘導化合物（ＣＩＤ）である、請求項５３〜６６の何れか１項に記載の方法。
【請求項６８】
非内皮細胞から前記低免疫内皮細胞集団を単離することをさらに含む、請求項５３〜６７の何れか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記単離した低免疫内皮細胞集団を凍結保存することをさらに含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
低免疫多能性幹細胞（ＨＩＰ細胞）から分化させられた単離低免疫ドーパミン作動性ニューロン（ＤＮ）であって、
内在性β−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除され、ＣＤ４７発現が上昇している、単離低免疫ドーパミン作動性ニューロン（ＤＮ）。
【請求項７１】
前記ＨＩＰ細胞がヒトｉＰＳＣであり、前記Ｂ２Ｍ遺伝子がヒトＢ２Ｍ遺伝子であり、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子がヒトＢ２Ｍ遺伝子であり、前記ＣＤ４７発現上昇が、プロモーターの制御下でヒトＣＤ４７遺伝子の少なくとも１コピーを前記ｉＰＳＣに導入した結果である、請求項７０に記載の単離低免疫ドーパミン作動性ニューロン。
【請求項７２】
前記ＨＩＰ細胞がマウスｉＰＳＣであり、前記Ｂ２Ｍ遺伝子がマウスＢ２Ｍ遺伝子であり、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子がマウスＢ２Ｍ遺伝子であり、前記ＣＤ４７発現上昇が、プロモーター制御下でマウスＣＤ４７遺伝子の少なくとも１コピーを前記ｉＰＳＣに導入した結果である、請求項７０に記載の単離低免疫ドーパミン作動性ニューロン。
【請求項７３】
Ｂ２Ｍ遺伝子活性の前記排除が、前記Ｂ２Ｍ遺伝子の両アレルを破壊するクラスター化された規則的配置の短回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９反応の結果である、請求項７０〜７２の何れか１項に記載の単離低免疫ドーパミン作動性ニューロン。
【請求項７４】
ＣＩＩＴＡ遺伝子活性の前記排除が、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子の両アレルを破壊するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９反応の結果である、請求項７０〜７３の何れか１項に記載の単離低免疫ドーパミン作動性ニューロン。
【請求項７５】
前記ＨＩＰ細胞を死に誘導するトリガー物質により活性化される自殺遺伝子をさらに含む、請求項７０〜７４の何れか１項に記載の単離低免疫ドーパミン作動性ニューロン。
【請求項７６】
前記自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子であり、前記トリガー物質がガンシクロビルである、請求項７５に記載の単離低免疫ドーパミン作動性ニューロン。
【請求項７７】
前記ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子が、配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むタンパク質をコードする、請求項７６に記載の単離低免疫ドーパミン作動性ニューロン。
【請求項７８】
前記ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子が、配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、請求項７６に記載の単離低免疫ドーパミン作動性ニューロン。
【請求項７９】
前記自殺遺伝子がエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子であり、前記トリガー物質が５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）である、請求項７５に記載の単離低免疫ドーパミン作動性ニューロン。
【請求項８０】
前記ＣＤ遺伝子が、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むタンパク質をコードする、請求項７９に記載の単離低免疫ドーパミン作動性ニューロン。
【請求項８１】
前記ＣＤ遺伝子が、配列番号５のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、請求項７９に記載の単離低免疫ドーパミン作動性ニューロン。
【請求項８２】
前記自殺遺伝子が、誘導型カスパーゼ９タンパク質をコードし、前記トリガー物質が二量体誘導化合物（ＣＩＤ）である、請求項７５に記載の単離低免疫ドーパミン作動性ニューロン。
【請求項８３】
前記誘導型カスパーゼ９タンパク質が、配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む、請求項８２に記載の単離低免疫ドーパミン作動性ニューロン。
【請求項８４】
前記誘導型カスパーゼ９タンパク質が配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項８２に記載の単離低免疫ドーパミン作動性ニューロン。
【請求項８５】
前記ＣＩＤが化合物ＡＰ１９０３である、請求項８２〜８４の何れか１項に記載の単離低免疫ドーパミン作動性ニューロン。
【請求項８６】
前記単離低免疫ドーパミン作動性ニューロンが、神経幹細胞、神経祖先細胞、未熟ドーパミン作動性ニューロン及び成熟ドーパミン作動性ニューロンからなる群から選択される、請求項８２〜８５の何れか１項に記載の単離低免疫ドーパミン作動性ニューロン。
【請求項８７】
神経変性疾患又は状態に罹患している患者を処置する方法であって、治療的有効量の請求項７０〜８６の何れか１項に記載の単離低免疫ドーパミン作動性ニューロン集団を含む組成物を投与することを含む、方法。
【請求項８８】
前記組成物が治療的に有効な担体をさらに含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記単離低免疫ドーパミン作動性ニューロン集団が生体分解性足場上にある、請求項８７又は８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記投与が移植又は注入を含む、請求項８７〜８９の何れか１項に記載の方法。
【請求項９１】
前記神経変性疾患又は状態が、パーキンソン病、ハンチントン病及び多発性硬化症からなる群から選択される、請求項８７〜９０の何れか１項に記載の方法。
【請求項９２】
インビトロ分化によって低免疫多能性細胞（ＨＩＰ細胞）集団から低免疫ドーパミン作動性ニューロン集団を作製する方法であって、前記ＨＩＰ細胞中で、内在性β−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除され、ＣＤ４７発現が上昇しており、
前記方法が、
（ａ）未熟ドーパミン作動性ニューロン集団を作製するために、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、線維芽細胞増殖因子８（ＦＧＦ８）、ＷＮＴ１、レチノイン酸、ＧＳＫ３β阻害剤、ＡＬＫ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤からなる群から選択される１つ以上の因子を含む第１の培地中で前記ＨＩＰ細胞集団を培養し；
（ｂ）低免疫ドーパミン作動性ニューロン集団を作製するために、前記第１の培地とは異なる第２の培地中で前記未熟ドーパミン作動性ニューロン集団を培養すること、
を含む、方法。
【請求項９３】
前記ＧＳＫ３β阻害剤が、ＣＨＩＲ−９９０２１、その誘導体又はその変異体である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記ＧＳＫ３β阻害剤が、約２μＭ〜約１０μＭの範囲の濃度である、請求項９２又は９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記ＡＬＫ阻害剤が、ＳＢ−４３１５４２、その誘導体又はその変異体である、請求項９２〜９４の何れか１項に記載の方法。
【請求項９６】
前記ＡＬＫ阻害剤が、約１μＭ〜約１０μＭの範囲の濃度である、請求項９２〜９５の何れか１項に記載の方法。
【請求項９７】
前記第１の培地及び／又は第２の培地が動物血清を欠く、請求項９２〜９６の何れか１項に記載の方法。
【請求項９８】
前記ＨＩＰ細胞が自殺遺伝子を含む場合、トリガー物質を含む培地中で段階（ａ）の前記未熟ドーパミン作動性ニューロン集団を培養することをさらに含み、
前記自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子である場合、前記トリガー物質がガンシクロビルであるか、前記自殺遺伝子がエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子である場合、前記トリガー物質が５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）であるか、又は前記自殺遺伝子が誘導型カスパーゼ９タンパク質をコードする場合、前記トリガー物質が二量体誘導化合物（ＣＩＤ）である、請求項９２〜９５の何れか１項に記載の方法。
【請求項９９】
前記ＨＩＰ細胞が自殺遺伝子を含む場合、トリガー物質を含む培地中で段階（ｂ）の前記ドーパミン作動性ニューロン集団を培養することをさらに含み、
前記自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子である場合、前記トリガー物質がガンシクロビルであるか、前記自殺遺伝子がエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子である場合、前記トリガー物質が５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）であるか、又は前記自殺遺伝子が誘導型カスパーゼ９タンパク質をコードする場合、前記トリガー物質が二量体誘導化合物（ＣＩＤ）である、請求項９２〜９８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１００】
非ドーパミン作動性ニューロンから前記低免疫ドーパミン作動性ニューロン集団を単離することをさらに含む、請求項９２〜９９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記単離された低免疫ドーパミン作動性ニューロン集団を凍結保存することをさらに含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
内在性β−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除され、ＣＤ４７発現が上昇している、低免疫誘導多能性幹細胞（ＨＩＰ細胞）から分化させられた単離低免疫膵島細胞。
【請求項１０３】
前記ＨＩＰ細胞がヒトｉＰＳＣであり、前記Ｂ２Ｍ遺伝子がヒトＢ２Ｍ遺伝子であり、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子がヒトＢ２Ｍ遺伝子であり、前記ＣＤ４７発現上昇が、プロモーターの制御下でヒトＣＤ４７遺伝子の少なくとも１コピーを前記ｉＰＳＣに導入した結果である、請求項１０２に記載の単離低免疫膵島細胞。
【請求項１０４】
前記ＨＩＰ細胞がマウスｉＰＳＣであり、前記Ｂ２Ｍ遺伝子がマウスＢ２Ｍ遺伝子であり、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子がマウスＢ２Ｍ遺伝子であり、前記ＣＤ４７発現上昇が、プロモーターの制御下でマウスＣＤ４７遺伝子の少なくとも１コピーを前記ｉＰＳＣに導入した結果である、請求項１０２に記載の単離低免疫膵島細胞。
【請求項１０５】
Ｂ２Ｍ遺伝子活性の前記排除が、前記Ｂ２Ｍ遺伝子の両アレルを破壊するクラスター化された規則的配置の短回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９反応の結果である、請求項１０２〜１０４の何れか１項に記載の単離低免疫膵島細胞。
【請求項１０６】
ＣＩＩＴＡ遺伝子活性の前記排除が、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子の両アレルを破壊するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９反応の結果である、請求項１０２〜１０５の何れか１項に記載の単離低免疫膵島細胞。
【請求項１０７】
前記ＨＩＰ細胞を死に誘導するトリガー物質により活性化される自殺遺伝子をさらに含む、請求項１０２〜１０６の何れか１項に記載の単離低免疫膵島細胞。
【請求項１０８】
前記自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子であり、前記トリガー物質がガンシクロビルである、請求項１０７に記載の単離低免疫膵島細胞。
【請求項１０９】
前記ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子が、配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むタンパク質をコードする、請求項１０８に記載の単離低免疫膵島細胞。
【請求項１１０】
前記ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子が、配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、請求項１０８に記載の単離低免疫膵島細胞。
【請求項１１１】
前記自殺遺伝子がエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子であり、前記トリガー物質が５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）である、請求項１０７に記載の単離低免疫膵島細胞。
【請求項１１２】
前記ＣＤ遺伝子が、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むタンパク質をコードする、請求項１１１に記載の単離低免疫膵島細胞。
【請求項１１３】
前記ＣＤ遺伝子が、配列番号５のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、請求項１１１に記載の単離低免疫膵島細胞。
【請求項１１４】
前記自殺遺伝子が、誘導型カスパーゼ９タンパク質をコードし、前記トリガー物質が二量体誘導化合物（ＣＩＤ）である、請求項１０７に記載の単離低免疫膵島細胞。
【請求項１１５】
前記誘導型カスパーゼ９タンパク質が、配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む、請求項１１４に記載の単離低免疫膵島細胞。
【請求項１１６】
前記誘導型カスパーゼ９タンパク質が、配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項１１４に記載の単離低免疫膵島細胞。
【請求項１１７】
前記ＣＩＤが化合物ＡＰ１９０３である、請求項１１４〜１１６の何れか１項に記載の単離低免疫膵島細胞。
【請求項１１８】
前記単離低免疫膵島細胞が、膵島祖先細胞、未熟膵島細胞及び成熟膵島細胞からなる群から選択される、請求項１１４〜１１７の何れか１項に記載の単離低免疫膵島細胞。
【請求項１１９】
治療的有効量の請求項１０２〜１１８の何れか１項に記載の単離低免疫膵島細胞集団を含む組成物を投与することを含む、糖尿病に罹患している患者を処置する方法。
【請求項１２０】
前記組成物が治療的に有効な担体をさらに含む、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
前記単離低免疫膵島細胞集団が生体分解性足場上にある、請求項１１９又は１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記投与が移植又は注入を含む、請求項１１９〜１２１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２３】
インビトロ分化により低免疫原性多能性細胞（ＨＩＰ細胞）集団から低免疫膵島細胞集団を作製する方法であって、低免疫原性ｉＰＳＣにおいて、内在性β−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除され、ＣＤ４７発現が上昇しており、
前記方法が、
（ａ）未熟膵島細胞集団を作製するために、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＥＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）及び血管内皮胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦβ）スーパーファミリー、骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ２）、骨形成タンパク質−７（ＢＭＰ７）、ＧＳＫ３β阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＢＭＰ１型受容体阻害剤及びレチノイン酸からなる群から選択される１つ以上の因子を含む第１の培地中で前記ＨＩＰ細胞集団を培養し；
（ｂ）膵島細胞集団を作製するために、前記第１の培地とは異なる第２の培地中で前記未熟膵島細胞集団を培養すること
を含む方法。
【請求項１２４】
前記ＧＳＫ３β阻害剤が、ＣＨＩＲ−９９０２１、その誘導体又はその変異体である、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
前記ＧＳＫ３β阻害剤が、約２μＭ〜約１０μＭの範囲の濃度である、請求項１２３又は１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
前記ＡＬＫ阻害剤が、ＳＢ−４３１５４２、その誘導体又はその変異体である、請求項１２３〜１２５の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２７】
前記ＡＬＫ阻害剤が、約１μＭ〜約１０μＭの範囲の濃度である、請求項１２３〜１２６の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２８】
前記第１の培地及び／又は第２の培地が動物血清を欠く、請求項１２３〜１２７の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２９】
前記ＨＩＰ細胞が自殺遺伝子を含む場合、トリガー物質を含む培地中で段階（ａ）の前記未熟膵島細胞集団を培養することをさらに含み、
前記自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子である場合、前記トリガー物質がガンシクロビルであるか、前記自殺遺伝子がエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子である場合、前記トリガー物質が５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）であるか、又は前記自殺遺伝子が誘導型カスパーゼ９タンパク質をコードする場合、前記トリガー物質が二量体誘導化合物（ＣＩＤ）である、請求項１２３〜１２８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３０】
前記ＨＩＰ細胞が自殺遺伝子を含む場合、トリガー物質を含む培地中で段階（ｂ）の前記膵島細胞集団を培養することをさらに含み、
前記自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子である場合、前記トリガー物質がガンシクロビルであるか、前記自殺遺伝子がエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子である場合、前記トリガー物質が５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）であるか、又は前記自殺遺伝子が誘導型カスパーゼ９タンパク質をコードする場合、前記トリガー物質が二量体誘導化合物（ＣＩＤ）である、請求項１２３〜１２９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３１】
非膵島細胞から前記低免疫膵島細胞集団を単離することをさらに含む、請求項１２３〜１３０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３２】
前記単離された低免疫膵島細胞集団を凍結保存することをさらに含む、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
低免疫誘導多能性幹細胞（ＨＩＰ細胞）から分化させられた単離低免疫網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞であって、
内在性β−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除され、ＣＤ４７発現が上昇している、単離低免疫網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞。
【請求項１３４】
前記ＨＩＰ細胞がヒトｉＰＳＣであり、前記Ｂ２Ｍ遺伝子がヒトＢ２Ｍ遺伝子であり、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子がヒトＢ２Ｍ遺伝子であり、前記ＣＤ４７発現上昇が、プロモーターの制御下でヒトＣＤ４７遺伝子の少なくとも１コピーを前記ｉＰＳＣに導入した結果である、請求項１３３に記載の単離低免疫ＲＰＥ細胞。
【請求項１３５】
前記ＨＩＰ細胞がマウスｉＰＳＣであり、前記Ｂ２Ｍ遺伝子がマウスＢ２Ｍ遺伝子であり、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子がマウスＢ２Ｍ遺伝子であり、前記ＣＤ４７発現上昇が、プロモーターの制御下でマウスＣＤ４７遺伝子の少なくとも１コピーを前記ｉＰＳＣに導入した結果である、請求項１３３に記載の単離低免疫ＲＰＥ細胞。
【請求項１３６】
Ｂ２Ｍ遺伝子活性の前記排除が、前記Ｂ２Ｍ遺伝子の両アレルを破壊するクラスター化された規則的配置の短回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９反応の結果である、請求項１３３〜１３５の何れか１項に記載の単離低免疫ＲＰＥ細胞。
【請求項１３７】
ＣＩＩＴＡ遺伝子活性の前記排除が、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子の両アレルを破壊するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９反応の結果である、請求項１３３〜１３６の何れか１項に記載の単離低免疫ＲＰＥ細胞。
【請求項１３８】
前記ＨＩＰ細胞を死に誘導するトリガー物質により活性化される自殺遺伝子をさらに含む、請求項１３３〜１３７の何れか１項に記載の単離改変ＲＰＥ細胞。
【請求項１３９】
前記自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子であり、前記トリガー物質がガンシクロビルである、請求項１３８に記載の単離低免疫ＲＰＥ細胞。
【請求項１４０】
前記ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子が、配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むタンパク質をコードする、請求項１３９に記載の単離低免疫ＲＰＥ細胞。
【請求項１４１】
前記ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子が、配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、請求項１３９に記載の単離低免疫ＲＰＥ細胞。
【請求項１４２】
前記自殺遺伝子がエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子であり、前記トリガー物質が５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）である、請求項１３８に記載の単離低免疫ＲＰＥ細胞。
【請求項１４３】
前記ＣＤ遺伝子が、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むタンパク質をコードする、請求項１４２に記載の単離低免疫ＲＰＥ細胞。
【請求項１４４】
前記ＣＤ遺伝子が、配列番号５のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、請求項１４２に記載の単離低免疫ＲＰＥ細胞。
【請求項１４５】
前記自殺遺伝子が、誘導型カスパーゼ９タンパク質をコードし、前記トリガー物質が二量体誘導化合物（ＣＩＤ）である、請求項１３８に記載の単離低免疫ＲＰＥ細胞。
【請求項１４６】
前記誘導型カスパーゼ９タンパク質が、配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む、請求項１４５に記載の単離低免疫ＲＰＥ細胞。
【請求項１４７】
前記誘導型カスパーゼ９タンパク質が、配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項１４５に記載の単離低免疫ＲＰＥ細胞。
【請求項１４８】
前記ＣＩＤが化合物ＡＰ１９０３である、請求項１４５〜１４７の何れか１項に記載の単離低免疫ＲＰＥ細胞。
【請求項１４９】
前記単離低免疫ＲＰＥ細胞が、ＲＰＥ祖先細胞、未熟ＲＰＥ細胞、成熟ＲＰＥ細胞及び機能的ＲＰＥ細胞からなる群から選択される、請求項１４５〜１４８の何れか１項に記載の単離低免疫ＲＰＥ細胞。
【請求項１５０】
治療的有効量の請求項１３３〜１４９の何れか１項に記載の単離低免疫ＲＰＥ細胞集団を含む組成物を投与することを含む、眼科状態に罹患している患者を処置する方法。
【請求項１５１】
前記組成物が、治療的に有効な担体をさらに含む、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５２】
前記単離低免疫ＲＰＥ細胞集団が生体分解性足場上にある、請求項１５０又は１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
前記投与が、前記患者の網膜への移植又は注入を含む、請求項１５０〜１５２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５４】
前記眼科状態が、滲出型黄斑変性、萎縮型黄斑変性、若年性黄斑変性、レーバー先天黒内障、網膜色素変性症及び網膜剥離からなる群から選択される、請求項１５０〜１５３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５５】
インビトロ分化によって低免疫多能性細胞（ＨＩＰ細胞）集団から低免疫網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞集団を作製する方法であって、前記ＨＩＰ細胞において、内在性β−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除され、ＣＤ４７発現が上昇しており、
前記方法が、
（ａ）前駆ＲＰＥ細胞集団を作製するために、アクチビンＡ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ４／７、ＤＫＫ１、ＩＧＦ１、ノギン、ＢＭＰ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤及びＶＥＧＦＲ阻害剤からなる群から選択される因子の何れか１つを含む第１の培地中で前記ＨＩＰ細胞集団を培養し；
（ｂ）低免疫ＲＰＥ細胞集団を作製するために、前記第１の培地とは異なる第２の培地中で前記前駆ＲＰＥ細胞集団を培養すること
を含む、方法。
【請求項１５６】
前記ＡＬＫ阻害剤が、ＳＢ−４３１５４２、その誘導体又はその変異体である、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１５７】
前記ＡＬＫ阻害剤が、約２μＭ〜約１０μＭの範囲の濃度である、請求項１５５又は１５６に記載の方法。
【請求項１５８】
前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、その誘導体又はその変異体である、請求項１５５〜１５７の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５９】
前記ＲＯＣＫ阻害剤が、約１μＭ〜約１０μＭの範囲の濃度である、請求項１５５〜１５８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６０】
前記第１の培地及び／又は第２の培地が動物血清を欠く、請求項１５５〜１５９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６１】
前記ＨＩＰ細胞が自殺遺伝子を含む場合、トリガー物質を含む培地中で段階（ａ）の前駆ＲＰＥ細胞集団を培養することをさらに含み、
前記自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子である場合、前記トリガー物質がガンシクロビルであるか、前記自殺遺伝子がエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子である場合、前記トリガー物質が５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）であるか、又は前記自殺遺伝子が誘導型カスパーゼ９タンパク質をコードする場合、前記トリガー物質が二量体誘導化合物（ＣＩＤ）である、請求項１５５〜１６０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６２】
前記ＨＩＰ細胞が自殺遺伝子を含む場合、トリガー物質を含む培地中で段階（ｂ）の前記ＰＲＥ細胞集団を培養することをさらに含み、
前記自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子である場合、前記トリガー物質がガンシクロビルであるか、前記自殺遺伝子がエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子である場合、前記トリガー物質が５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）であるか、又は前記自殺遺伝子が誘導型カスパーゼ９タンパク質をコードする場合、前記トリガー物質が二量体誘導化合物（ＣＩＤ）である、請求項１５５〜１６１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６３】
非ＲＰＥ細胞から前記低免疫ＲＰＥ細胞集団を単離することをさらに含む、請求項１５５〜１６２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６４】
前記単離した低免疫ＲＰＥ細胞集団を凍結保存することをさらに含む、請求項１６３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、全てその全体において本明細書中で参照により組み込まれる、２０１８年７月１７日に提出の米国仮特許出願第６２／６９８，９６５号明細書、２０１８年７月１７日に提出の同第６２／６９８，９７３号明細書、２０１８年７月１７日に提出の同第６２／６９８，９７８号明細書、２０１８年７月１７日に提出の同第６２／６９８，９８１号明細書及び２０１８年７月１７日に提出の同第６２／６９８，９８４号明細書の優先権を主張する。
【０００２】
再生細胞療法は、損傷臓器及び組織を再生させるための重要で有望な処置である。移植用の臓器は入手が困難であり、待機時間が長いことから、当然のことだが、容易に入手可能な細胞株を患者に移植することによって組織を再生可能であることは好ましい。再生細胞療法は、動物モデル（例えば心筋梗塞後）での移植後に障害組織を回復させるための有望な最初の結果を示した。しかし、移植レシピエントの免疫系が同種物質を拒絶する傾向があることにより、治療の潜在的効果が大きく低下し、このような処置の周囲の起こり得るプラス効果が低下する。
【０００３】
従って、本発明は、普遍的に許容可能な「容易に入手可能である」低免疫原性多能性細胞及びその分化した心臓、内皮、神経、膵島又は網膜色素細胞を提供する。このような低免疫細胞が、それを必要とする患者を処置するために使用される。これらの細胞は、免疫応答を惹起する主要免疫抗原を欠き、食作用性のエンドサイトーシスを回避するように改変される。
【背景技術】
【０００４】
再生細胞療法は、損傷臓器及び組織を再生させるための重要で有望な治療である。移植用の臓器は入手が困難であり、待機時間が長いことから、当然のことだが、容易に入手可能な細胞株を患者に移植することによって組織を再生可能であることは好ましい。再生細胞療法は、動物モデル（例えば心筋梗塞後）での移植後に障害組織を回復させるための有望な最初の結果を示した。しかし、移植レシピエントの免疫系が同種物質を拒絶する傾向があることにより、治療の潜在的効果が大きく低下し、このような処置の周囲の起こり得るプラス効果が低下する。
【０００５】
自己誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は理論的に患者特異的な細胞に基づく臓器修復ストラテジーのための無限の細胞供給源を構成する。しかし、それらの作製は、技術及び製造の面で困難な点があり、何らかの急性処置モダリティーを概念的に妨げる冗長な工程である。同種ｉＰＳＣに基づく治療法は、製造の観点からより容易であり、十分にスクリーニングされ、標準化された高品質の細胞生成物の作製を可能にする。しかし、それらが同種起源であるため、このような細胞生成物は拒絶される。細胞の抗原性の低下又は排除により、普遍的に許容可能な細胞生成物が作製され得る。多能性幹細胞は３つ胚葉のあらゆる細胞タイプに分化し得るので、幹細胞療法の適用の可能性は幅広い。移植部位の臓器環境で分化及び成熟を継続する祖先細胞を移植することによって、エクスビボ又はインビボで分化が行われ得る。エクスビボ分化によって、研究者又は医師が手順を密に監視することが可能になり、細胞の適正な集団が移植前に作製されることが確実になる。
【０００６】
しかし、殆どの場合、臨床移植療法において、未分化多能性幹細胞は、それらが奇形腫を形成する傾向ゆえに回避される。むしろ、このような治療法は、分化した細胞（例えば心不全に罹患している患者の心筋に移植する幹細胞由来心筋細胞）を使用する傾向がある。このような多能性細胞又は組織の臨床適用は、それらの移植後の細胞の増殖及び生存を制御する「安全機能」から利益を得る。
【０００７】
本技術は、疾患又は欠損細胞を再生させるか又は置き換えるために使用される細胞を作製することが可能な幹細胞を追求する。迅速に増殖し、多くの可能な細胞タイプに分化するので、多能性幹細胞（ＰＳＣ）が使用され得る。
【０００８】
今まで、ＰＳＣに基づくアプローチの前臨床での成功は、免疫抑制又は免疫欠損モデルでのみ、又は細胞が封入され、宿主の免疫系から保護される場合にのみ、達成されている。しかし、同種臓器移植で使用されるような全身的な免疫抑制は、再生アプローチに正当なものではない。免疫抑制薬は、重い副作用があり、感染及び悪性腫瘍のリスクを顕著に上昇させる。
【０００９】
当技術分野において、再生医学で使用され得る、低免疫原性多能性幹細胞から作製される細胞が求められている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
いくつかの態様では、低免疫多能性幹細胞（ＨＩＰ細胞）から分化した、単離された改変低免疫心臓、内皮、神経、膵島又は網膜色素細胞が本明細書中で提供される。ＨＩＰ細胞は、例えば、内在性β−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性が低下しているか又は排除されており、内在性クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が低下しているか又は排除されており、ＣＤ４７発現が上昇している。
【００１１】
一部の実施形態では、ＨＩＰ細胞はヒト改変誘導多能性幹細胞（ヒト改変ｉＰＳＣ）であり、Ｂ２Ｍ遺伝子はヒトＢ２Ｍ遺伝子であり、ＣＩＩＴＡ遺伝子はヒトＢ２Ｍ遺伝子であり、ＣＤ４７発現上昇は、プロモーターの制御下でヒトＣＤ４７遺伝子の少なくとも１コピーを細胞に導入した結果である。ある一定の実施形態では、ＨＩＰは、マウス改変誘導多能性幹細胞（マウス改変ｉＰＳＣ）であり、Ｂ２Ｍ遺伝子はマウスＢ２Ｍ遺伝子であり、ＣＩＩＴＡ遺伝子はマウスＢ２Ｍ遺伝子であり、ＣＤ４７発現上昇は、プロモーターの制御下でマウスＣＤ４７遺伝子の少なくとも１コピーを細胞に導入した結果である。一部の例では、Ｂ２Ｍ遺伝子活性の排除は、Ｂ２Ｍ遺伝子の両アレルを破壊するクラスター化された規則的配置の短回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９反応の結果である。一部の例では、ＣＩＩＴＡ遺伝子活性の排除は、ＣＩＩＴＡ遺伝子の両アレルを破壊するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９反応の結果である。
【００１２】
一部の実施形態では、本方法は、ＨＩＰ細胞を死に誘導するトリガー物質により活性化される自殺遺伝子をさらに含む。一部の実施形態では、自殺遺伝子は単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子であり、トリガー物質はガンシクロビルである。一部の例では、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子は、配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むタンパク質をコードする。他の例では、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子は、配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。
【００１３】
他の実施形態では、自殺遺伝子はエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子であり、トリガー物質は５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）である。一部の例では、ＣＤ遺伝子は、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むタンパク質をコードする。他の例では、ＣＤ遺伝子は、配列番号５のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。
【００１４】
他の実施形態では、自殺遺伝子は誘導型カスパーゼ９タンパク質をコードし、トリガー物質は二量体誘導化合物（ＣＩＤ）である。一部の例では、誘導型カスパーゼ９タンパク質は、配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む。他の例では、誘導型カスパーゼ９タンパク質は、配列番号６のアミノ酸配列を含む。一部の例では、ＣＩＤは化合物ＡＰ１９０３である。
【００１５】
一部の実施形態では、単離低免疫心臓細胞は、心筋細胞、結節心筋細胞、伝導性心筋細胞、作業心筋細胞、心筋細胞前駆体、心筋細胞祖先細胞、心臓幹細胞及び心臓筋肉細胞からなる群から選択される。
【００１６】
一部の態様では、心臓状態又は疾患に罹患している患者を処置する方法が本明細書中で提供される。本方法は、治療的有効量の、本明細書中に記載の単離された改変低免疫心臓細胞の何れか１つの集団を含む組成物を投与することを含む。一部の実施形態では、本組成物は、治療的に有効な担体をさらに含む。
【００１７】
一部の実施形態では、投与は、患者の心臓組織への移植、静脈内注射、動脈内注射、冠動脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、心筋内注射、経心内膜注射、経心外膜注射又は点滴を含む。
【００１８】
一部の実施形態では、心臓状態又は疾患は、小児心筋症、加齢性心筋症、拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、慢性虚血性心筋症、周産期心筋症、炎症性心筋症、他の心筋症、心筋炎、心筋虚血性再灌流障害、心室機能不全、心不全、うっ血性心不全、冠動脈疾患、末期心疾患、アテローム性動脈硬化症、虚血、高血圧、再狭窄、狭心症、リウマチ性心臓、動脈炎又は循環器疾患からなる群から選択される。
【００１９】
一部の態様では、インビトロ分化により低免疫多能性細胞（ＨＩＰ細胞）集団から低免疫心臓細胞集団を作製する方法が本明細書中で提供され、ＨＩＰ細胞において、内在性β−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除され、ＣＤ４７発現が上昇している。本方法は、（ａ）ＧＳＫ阻害剤を含む培地中でＨＩＰ細胞集団を培養し；（ｂ）前駆心臓細胞集団を作製するために、ＷＮＴアンタゴニスを含む培地中でＨＩＰ細胞集団を培養し；（ｃ）低免疫心臓細胞集団を作製するために、インスリンを含む培地中で前駆心臓細胞集団を培養することを含む。
【００２０】
一部の実施形態では、ＧＳＫ阻害剤は、ＣＨＩＲ−９９０２１、その誘導体又はその変異体である。一部の例では、ＧＳＫ阻害剤は、約２μＭ〜約１０μＭの範囲の濃度である。一部の実施形態では、ＷＮＴアンタゴニスは、ＩＷＲ１、その誘導体又はその変異体である。一部の例では、ＷＮＴアンタゴニスは、約２μＭ〜約１０μＭの範囲の濃度である。
【００２１】
一部の実施形態では、本方法は、ＨＩＰ細胞が自殺遺伝子を含む場合、トリガー物質を含む培地中で段階（ｃ）の前駆心臓細胞集団を培養することをさらに含み、自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子である場合、トリガー物質はガンシクロビルであるか、自殺遺伝子がエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子である場合、トリガー物質は５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）であるか、又は自殺遺伝子が誘導型カスパーゼ９タンパク質をコードする場合、トリガー物質は二量体誘導化合物（ＣＩＤ）である。ある一定の実施形態では、本方法は、ＨＩＰ細胞が自殺遺伝子を含む場合、トリガー物質を含む培地中で段階（ｄ）の低免疫心臓細胞集団を培養することをさらに含み、自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子である場合、トリガー物質はガンシクロビルであるか、自殺遺伝子がエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子である場合、トリガー物質は５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）であるか、又は自殺遺伝子が誘導型カスパーゼ９タンパク質をコードする場合、トリガー物質は二量体誘導化合物（ＣＩＤ）である。
【００２２】
一部の実施形態では、本方法は、非心臓細胞から低免疫心臓細胞集団を単離することをさらに含む。他の実施形態では、本方法は、単離した低免疫心臓細胞集団を凍結保存することをさらに含む。
【００２３】
一部の実施形態では、単離された改変低免疫内皮細胞は、毛細血管内皮細胞、血管内皮細胞、大動脈内皮細胞、脳内皮細胞及び腎臓内皮細胞からなる群から選択される。
【００２４】
一部の態様では、血管状態又は疾患に罹患している患者を処置する方法が本明細書中で提供される。一部の実施形態では、本方法は、単離された改変低免疫内皮細胞集団の治療的有効量を含む組成物を投与することを含む。
【００２５】
本方法は、本明細書中に記載の単離された改変低免疫内皮細胞のうち何れか１つの集団の治療的有効量を含む組成物を投与することを含む。一部の実施形態では、本組成物は、治療的に有効な担体をさらに含む。一部の実施形態では、投与は、患者の心臓組織への移植、静脈内注射、動脈内注射、冠動脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、心筋内注射、経心内膜注射、経心外膜注射又は点滴を含む。
【００２６】
一部の実施形態では、血管状態又は疾患は、血管損傷、循環器疾患、血管疾患、虚血性疾患、心筋梗塞、うっ血性心不全、高血圧、虚血性組織損傷、虚血肢、脳卒中、神経障害及び脳血管疾患からなる群から選択される。
【００２７】
一部の態様では、インビトロ分化によって低免疫原性多能性幹細胞（ＨＩＰ細胞）の集団から低免疫内皮細胞集団を作製する方法が本明細書中で提供され、ＨＩＰ細胞において、内在性β−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除されており、ＣＤ４７発現が上昇している。本方法は、（ａ）ＧＳＫ阻害剤を含む第１の培地中でＨＩＰ細胞集団を培養し；（ｂ）前駆内皮細胞集団を作製するために、ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦを含む第２の培地中でＨＩＰ細胞集団を培養し；（ｃ）低免疫内皮細胞集団を作製するために、ＲＯＣＫ阻害剤及びＡＬＫ阻害剤を含む第３の培地中で前駆内皮細胞集団を培養することを含む。
【００２８】
一部の実施形態では、ＧＳＫ阻害剤は、ＣＨＩＲ−９９０２１、その誘導体又はその変異体である。一部の例では、ＧＳＫ阻害剤は約１μＭ〜約１０μＭの範囲の濃度である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ−２７６３２、その誘導体又はその変異体である。一部の例では、ＲＯＣＫ阻害剤は約１μＭ〜約２０μＭの範囲の濃度である。一部の実施形態では、ＡＬＫ阻害剤は、ＳＢ−４３１５４２、その誘導体又はその変異体である。一部の例では、ＡＬＫ阻害剤は約０．５μＭ〜約１０μＭの濃度範囲である。
【００２９】
一部の実施形態では、第１の培地は２μＭ〜約１０μＭのＣＨＩＲ−９９０２１を含む。一部の実施形態では、第２の培地は、５０ｎｇ／ｍＬ  ＶＥＧＦ及び１０ｎｇ／ｍＬ  ｂＦＧＦを含む。他の実施形態では、第２の培地はＹ−２７６３２及びＳＢ−４３１５４２をさらに含む。様々な実施形態では、第３の培地は１０μＭ  Ｙ−２７６３２及び１μＭ  ＳＢ−４３１５４２を含む。ある一定の実施形態では、第３の培地はＶＥＧＦ及びｂＦＧＦをさらに含む。特定の例では、第１の培地及び／又は第２の培地はインスリンを欠く。
【００３０】
一部の実施形態では、本方法は、低免疫内皮細胞集団を非内皮細胞から単離することをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、単離した低免疫内皮細胞集団を凍結保存することをさらに含む。
【００３１】
一部の実施形態では、単離低免疫ドーパミン作動性ニューロンは、神経幹細胞、神経祖先細胞、未熟ドーパミン作動性ニューロン及び成熟ドーパミン作動性ニューロンからなる群から選択される。
【００３２】
一部の態様では、神経変性疾患又は状態に罹患している患者を処置する方法が本明細書中で提供される。一部の実施形態では、本方法は、単離低免疫ドーパミン作動性ニューロンの何れか１つの集団の治療的有効量を含む組成物を投与することを含む。一部の実施形態では、本組成物は、治療的に有効な担体をさらに含む。一部の実施形態では、単離低免疫ドーパミン作動性ニューロンの集団は生体分解性足場上にある。投与は移植又は注入を含み得る。一部の実施形態では、神経変性疾患又は状態は、パーキンソン病、ハンチントン病及び多発性硬化症からなる群から選択される。
【００３３】
一部の態様では、インビトロ分化によって低免疫誘導多能性幹細胞（ＨＩＰ細胞）集団から低免疫ドーパミン作動性ニューロン集団を作製する方法が本明細書中で提供され、ＨＩＰ細胞において、内在性β−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除され、ＣＤ４７発現が上昇している。一部の実施形態では、本方法は、（ａ）未熟ドーパミン作動性ニューロンの集団を作製するために、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、ＢＤＮＦ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ８、ＷＮＴ１、レチノイン酸、ＧＳＫ３β阻害剤、ＡＬＫ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤からなる群から選択される１つ以上の因子を含む第１の培地中でＨＩＰ細胞集団を培養し；（ｂ）ドーパミン作動性ニューロン集団を作製するために、第１の培地とは異なる第２の培地中で未熟ドーパミン作動性ニューロン集団を培養することを含む。
【００３４】
一部の実施形態では、ＧＳＫβ阻害剤は、ＣＨＩＲ−９９０２１、その誘導体又はその変異体である。一部の例では、ＧＳＫβ阻害剤は、約２μＭ〜約１０μＭの範囲の濃度である。一部の実施形態では、ＡＬＫ阻害剤は、ＳＢ−４３１５４２、その誘導体又はその変異体である。一部の例では、ＡＬＫ阻害剤は、約１μＭ〜約１０μＭの範囲の濃度である。一部の実施形態では、第１の培地及び／又は第２の培地は動物血清を欠く。
【００３５】
一部の実施形態では、本方法は、ＨＩＰ細胞が自殺遺伝子を含む場合、トリガー物質を含む培地中で段階（ａ）の未熟ドーパミン作動性ニューロン集団を培養することをさらに含み、自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子である場合、トリガー物質はガンシクロビルであるか、自殺遺伝子がエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子である場合、トリガー物質は５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）であるか、又は自殺遺伝子が誘導型カスパーゼ９タンパク質をコードする場合、トリガー物質は二量体誘導化合物（ＣＩＤ）である。
【００３６】
一部の実施形態では、本方法は、非ドーパミン作動性ニューロンから低免疫ドーパミン作動性ニューロン集団を単離することも含む。
【００３７】
一部の実施形態では、単離低免疫膵島細胞は、膵島祖先細胞、未熟膵島細胞及び成熟膵島細胞からなる群から選択される。
【００３８】
一部の態様では、糖尿病に罹患している患者を処置する方法が本明細書中で提供される。本方法は、本明細書中に記載の単離低免疫膵島細胞の何れか１つの集団の治療的有効量を含む組成物を投与することを含む。一部の実施形態では、本組成物は、治療的に有効な担体をさらに含む。一部の実施形態では、単離低免疫膵島細胞集団は生体分解性足場上にある。一部の例では、投与は移植又は注入を含む。
【００３９】
一部の態様では、インビトロ分化により低免疫多能性細胞（ＨＩＰ細胞）の集団から低免疫膵島細胞集団を作製する方法が本明細書中で提供され、ＨＩＰ細胞において、内在性β−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除され、ＣＤ４７発現が上昇している。本方法は、（ａ）未熟膵島細胞集団を作製するために、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＥＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）及び血管内皮胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦβ）スーパーファミリー、骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ２）、骨形成タンパク質−７（ＢＭＰ７）、ＧＳＫ３β阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＢＭＰ１型受容体阻害剤及びレチノイン酸からなる群から選択される１つ以上の因子を含む第１の培地中でＨＩＰ細胞集団を培養し；（ｂ）低免疫膵島細胞集団を作製するために、第１の培地とは異なる第２の培地中で未熟膵島細胞集団を培養することを含む。
【００４０】
一部の実施形態では、ＧＳＫ阻害剤は、ＣＨＩＲ−９９０２１、その誘導体又はその変異体である。一部の例では、ＧＳＫ阻害剤は、約２μＭ〜約１０μＭの範囲の濃度である。一部の実施形態では、ＡＬＫ阻害剤は、ＳＢ−４３１５４２、その誘導体又はその変異体である。一部の例では、ＡＬＫ阻害剤は、約１μＭ〜約１０μＭの範囲の濃度である。一部の実施形態では、第１の培地及び／又は第２の培地は動物血清を欠く。
【００４１】
一部の実施形態では、本方法は、ＨＩＰ細胞が自殺遺伝子を含む場合、トリガー物質を含む培地中で段階（ａ）の未熟膵島細胞集団を培養することをさらに含み、自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子である場合、トリガー物質はガンシクロビルであるか、自殺遺伝子がエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子である場合、トリガー物質は５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）であるか、又は自殺遺伝子が誘導型カスパーゼ９タンパク質をコードする場合、トリガー物質は二量体誘導化合物（ＣＩＤ）である。
【００４２】
特定の実施形態では、本方法は、ＨＩＰ細胞が自殺遺伝子を含む場合、トリガー物質を含む培地中で段階（ｂ）の膵島細胞集団を培養することをさらに含み、自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子である場合、トリガー物質はガンシクロビルであるか、自殺遺伝子がエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子である場合、トリガー物質は５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）であるか、又は自殺遺伝子が誘導型カスパーゼ９タンパク質をコードする場合、トリガー物質は二量体誘導化合物（ＣＩＤ）である。
【００４３】
一部の実施形態では、本方法は、非膵島細胞から低免疫膵島細胞集団を単離することも含む。一部の実施形態では、本方法は、単離した低免疫膵島細胞集団を凍結保存することをさらに含む。
【００４４】
一部の実施形態では、単離低免疫ＲＰＥ細胞は、ＲＰＥ祖先細胞、未熟ＲＰＥ細胞、成熟ＲＰＥ細胞及び機能的ＲＰＥ細胞からなる群から選択される。
【００４５】
一部の態様では、眼科状態に罹患している患者を処置する方法が本明細書中で提供される。本方法は、本明細書中に記載の単離低免疫ＲＰＥ細胞集団の何れか１つの集団の治療的有効量を含む組成物を投与することを含む。一部の実施形態では、本組成物は、治療的に有効な担体をさらに含む。一部の実施形態では、単離低免疫ＲＰＥ細胞集団は生体分解性足場上にある。一部の実施形態では、投与は、患者の網膜への移植又は注入を含む。一部の実施形態では、眼科状態は、滲出型黄斑変性、萎縮型黄斑変性、若年性黄斑変性、レーバー先天黒内障、網膜色素変性症及び網膜剥離からなる群から選択される。
【００４６】
一部の態様では、インビトロ分化により低免疫多能性細胞（ＨＩＰ細胞）集団から低免疫網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞集団を作製する方法が本明細書中で提供され、ＨＩＰ細胞において、内在性β−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除され、ＣＤ４７発現が上昇している。本方法は、（ａ）前駆ＲＰＥ細胞集団を作製するために、アクチビンＡ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ４／７、ＤＫＫ１、ＩＧＦ１、ノギン、ＢＭＰ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤及びＶＥＧＦＲ阻害剤からなる群から選択される因子の何れか１つを含む第１の培地中でＨＩＰ細胞集団を培養し；（ｂ）低免疫ＲＰＥ細胞集団を作製するために、第１の培地とは異なる第２の培地中で前駆ＲＰＥ細胞集団を培養することを含む。
【００４７】
一部の実施形態では、ＡＬＫ阻害剤は、ＳＢ−４３１５４２、その誘導体又はその変異体である。一部の例では、ＡＬＫ阻害剤は、約２μＭ〜約１０μＭの範囲の濃度である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ−２７６３２、その誘導体又はその変異体である。一部の例では、ＲＯＣＫ阻害剤は、約１μＭ〜約１０μＭの範囲の濃度である。
【００４８】
一部の実施形態では、第１の培地及び／又は第２の培地は動物血清を欠く。
【００４９】
一部の実施形態では、本方法は、ＨＩＰ細胞が自殺遺伝子を含む場合、トリガー物質を含む培地中で段階（ａ）の前駆ＲＰＥ細胞集団を培養することをさらに含み、自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子である場合、トリガー物質はガンシクロビルであるか、自殺遺伝子がエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子である場合、トリガー物質は５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）であるか、又は自殺遺伝子が誘導型カスパーゼ９タンパク質をコードする場合、トリガー物質は二量体誘導化合物（ＣＩＤ）である。
【００５０】
一部の実施形態では、本方法は、ＨＩＰ細胞が自殺遺伝子を含む場合、トリガー物質を含む培地中で段階（ｂ）のＰＲＥ細胞集団を培養することをさらに含み、自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子である場合、トリガー物質はガンシクロビルであるか、自殺遺伝子がエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子である場合、トリガー物質は５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）であるか、又は自殺遺伝子が誘導型カスパーゼ９タンパク質をコードする場合、トリガー物質は二量体誘導化合物（ＣＩＤ）である。
【００５１】
一部の実施形態では、本方法は、非ＲＰＥ細胞から低免疫ＲＰＥ細胞集団を単離することをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、単離した低免疫ＲＰＥ細胞集団を凍結保存することをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、マウスＮＫ細胞（およそ９５％ＮＫ細胞及び５％マクロファージ）と温置したマウスＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣのＥｌｉｓｐｏｔの結果を示す。
【図２】図２は、ヒトＮＫ細胞（およそ９５％ＮＫ細胞及び５％マクロファージ）と温置したヒトＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣのＥｌｉｓｐｏｔの結果を示す。
【図３】図３は、ヒトＮＫ細胞（およそ９５％ＮＫ細胞及び５％マクロファージ）と温置したマウスＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣのＥｌｉｓｐｏｔの結果を示す。
【図４】図４は、マウスＮＫ細胞（およそ９５％ＮＫ細胞及び５％マクロファージ）と温置したヒトＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣのＥｌｉｓｐｏｔの結果を示す。
【図５】図５は、ヒトマクロファージと同時培養した蛍ルシフェラーゼ標識ヒトＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣの食作用アッセイの結果を示す。
【図６】図６は、マウスマクロファージと同時培養した蛍ルシフェラーゼ標識マウスＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣの食作用アッセイの結果を示す。
【図７】図７は、マウスマクロファージと同時培養した蛍ルシフェラーゼ標識ヒトＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣの食作用アッセイの結果を示す。
【図８】図８は、ヒトマクロファージと同時培養した蛍ルシフェラーゼ標識マウスＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣの食作用アッセイの結果を示す。
【図９】図９は、分化方法のダイアグラムを提供する。
【図１０】図１０は、分化開始直前にマトリゲル（商標）上で培養したヒトｉＰＳＣを示す（１００ｘ拡大率）。
【図１１】図１１は、培地交換前の分化第２日の細胞を示す（１００ｘ拡大率）。
【図１２】図１２は、培地交換前の分化第３日の細胞を示す（１００ｘ拡大率）。
【図１３】図１３は、培地交換前の分化第５日の細胞を示す（１００ｘ拡大率）。
【図１４】図１４は、培地交換前の分化第７日の細胞を示す（１００ｘ拡大率）。
【図１５】図１５は、培地交換前の分化第９日の細胞を示す（１００ｘ拡大率）。
【図１６】ＨＩＰ−ＣＭ細胞を分化させ、ｒｔＰＣＲにより示されるように濃縮した。
【図１７】図１７は、移植後２８日にｈｉＣＭが拒絶されず、他の臓器に移動しなかったことを示す。
【図１８】図１８は、心筋梗塞２８日後のレシピエント心臓の組織病理学及びトリクローム染色を示す。ｈｉＣＭの同種レシピエントにおける梗塞サイズが顕著に縮小し、左心室のサイズも顕著に縮小した。
【図１９Ａ】図１９Ａは、左心室パラメーターの顕著な改善を表す詳細なＰＶ−ｌｏｏｐ分析を示す。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、駆出率（ＥＦ、拡張期の最後のその心室中の血液の体積に対する、拍あたりの心室から駆出される血液体積の比）及び１回拍出量（ＳＶ、１回の収縮において心室により駆出される血液の体積）により測定した場合に、ｈｉＣＭが心臓機能を回復させたことを示す。
【図１９Ｃ】図１９Ｃは、心室１回仕事係数（ＳＷ、大動脈への１回拍出量を駆出するために左心室により行われる仕事）及び心臓出力（ＣＯ、単位時間に心室により汲み出される血液量）により測定した場合に、ｈｉＣＭが心臓機能を回復させたことを示す。
【図２０】図２０は、野生型又はＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｈｉＣＭが同種ヒト化マウスに筋肉内移植された分析の結果を示す。
【図２１】図２１は、低免疫ｈｉＣＭ細胞も心筋梗塞後の移植後に生存したことを示す。
【図２２】図２２は、分割前のＭＥＦ上のマウス低ＩＰＳＣコロニーを示す（１００ｘ拡大率）。
【図２３】図２３は、分化開始直前のゼラチン上のＥＳＣマウス低ＩＰＳＣを示す（１００ｘ拡大率）。
【図２４】図２４は、５μＭ  ＣＨＩＲから２μＭ  ＣＨＩＲに分化培地を交換する前の、分化第２日の細胞を示す（１００ｘ拡大率）。
【図２５】図２５は、培地を交換する前の、ＥＣ分化第４日の細胞を示す（１００ｘ拡大率）。
【図２６】図２６は、分化第７日のＥＣ細胞を示す（１００ｘ拡大率）。
【図２７】図２７は、第１２及び１４日後及びＭＡＣＳ選別前の細胞を示す（１００ｘ拡大率）。
【図２８】図２８は、ｍｉＰＳＣ及びＨＩＰ細胞の両方からのＥＣ細胞が、ＶＥ−カドヘリン発現を含め、分化した遺伝子発現プロファイルを示し、親細胞はその発現プロファイルを示さなかったことを示すｒｔＰＣＲを示す。
【図２９】図２９は、後肢虚血マウスモデルに移植された野生型及び低免疫誘導内皮細胞の生体発光分析を示す（Ａ．フェモラリス（大腿輪、Ａ．ｆｅｍｏｒａｌｉｓ）の除去後）。全動物のＢＬＩ値をプロットした。Ｂ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇの移植片が全て生き残った一方で、非常に免疫原性が高いｗｔ  ｍＥＣは１５日以内に拒絶され、経時的なＢＬＩシグナル低下を示した。
【図３０】ＮＫ細胞殺傷時のＣｄ４７過剰発現の阻害効果を評価した。Ｂ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ｍｉＰＳＣ又はＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｍｉＰＳＣ由来のｍｉＥＣを用いて、ＮＫ細胞でのＩＦＮ−γ  Ｅｌｉｓｐｏｔを行った。Ｂ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ｍｉＰＳＣからの派生物のみがＮＫ細胞殺傷に感受性があった。
【図３１】図３１は、Ｂ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｈｉＰＳＣが対応するｈｉＥＣ派生物に首尾よく分化したことを示す。ｒｔＰＣＲは、全派生物が多能性遺伝子発現を失ったことを示す。
【図３２】野生型又はＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｈｉＥＣ移植片を同種ヒト化ＮＳＧ−ＳＧＭ３マウスに注入した。５日後にＩＦＮ−γ  Ｅｌｉｓｐｏｔを行った。低免疫細胞はＩＦＮ−γ応答を誘発しなかったが、野生型は誘発した。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
Ａ．導入
本発明は、低免疫原性多能性（ＨＩＰ）細胞由来の（から分化した）心臓細胞の作製及び最終的にはそれを必要とする患者への移植を提供する。
【００５４】
ＰＣＴ／ＵＳ１８／１３６８８号明細書に記載のように、低免疫原性多能性（ＨＩＰ）細胞は、免疫反応を惹起し得る主要免疫抗原を欠き、食作用を回避するように改変される。これにより、特異的な組織及び臓器を生成させるための「容易に入手可能な」細胞生成物の誘導が可能になる。ヒト患者においてヒト同種ＨＩＰ細胞派生物を使用可能であることの利点により、一般に同種移植で見られる長期の補助免疫抑制療法及び薬物使用を回避することができるようになることを含め、顕著な有益性が得られる。細胞療法は、各患者に対する個々の処置を必要とせずに使用し得るので、コストも顕著に削減される。
【００５５】
自己細胞供給源から作製される細胞生成物は、数個又は１個の単一の抗原性突然変異でさえも免疫拒絶に対する対象になり得ることが示されている。従って、自己細胞生成物は、本質的に非免疫原性ではない。また、細胞操作及び品質管理は非常に労力及びコストがかかるので、自己細胞は、急性処置の選択肢に対しては容易に利用可能となり得ない。従って、様々なヒト疾患を処置するために使用するための、普遍的に許容可能な多くのタイプの細胞に分化し得るＨＩＰ細胞などの普遍的な細胞供給源が当技術分野で必要とされる。
【００５６】
本願は、それらの全体において本開示が参照により本明細書中に組み込まれる２０１８年１月１４日提出の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／１３６８８号明細書及び２０１７年１月１３日提出の米国仮特許出願第６２／４４５，９６９号明細書に関連し、特に実施例、図面、図面の説明及び低免疫原性多能性幹細胞を作製すること及び他の細胞タイプへこのような細胞を分化させることについての説明に関する。
【００５７】
Ｂ．定義
「多能性細胞」という用語は、未分化状態に留まりながら自己更新及び増殖し得、適正な条件下で特別な細胞タイプに分化するように誘導され得る細胞を指す。「多能性細胞」という用語は、本明細書中で使用される場合、胚性幹細胞及び、胎児、羊膜又は体細胞の幹細胞を含め、他のタイプの幹細胞を包含する。代表的なヒト幹細胞株はＨ９ヒト胚性幹細胞株を含む。さらなる代表的な幹細胞株は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｈｏｗａｒｄ  Ｈｕｇｈｅｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＨＵＥＳ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（その全体において本明細書中で参照により組み込まれるＣｏｗａｎ，Ｃ．Ａ．ｅｔ．ａｌ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊ．Ｍｅｄ．３５０：１３．（２００４）に記載のとおり）を通じて利用可能にされるものを含む。
【００５８】
「多能性幹細胞」は、本明細書中で使用される場合、３つの胚葉：内胚葉（例えば胃関連、消化管、肺など）、中胚葉（例えば筋肉、骨、血液、泌尿生殖器組織など）又は外胚葉（例えば表皮組織及び神経系組織）の何れかに分化する能力を有する。「多能性幹細胞」という用語は、本明細書中で使用される場合、「誘導多能性幹細胞」又は「ｉＰＳＣ」、非多能性細胞由来の多能性幹細胞のタイプも包含する。親細胞の例は、様々な手段により多能性の未分化表現型を誘導するように初期化されている体細胞を含む。このような「ｉＰＳ」又は「ｉＰＳＣ」細胞は、ある特定の制御遺伝子の発現を誘導することにより、又はある特定のタンパク質の外因性適用により、作製され得る。ｉＰＳ細胞の誘導のための方法は当技術分野で公知であり、以下でさらに記載する（例えば、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２７（１１）：２６６７−７４（２００９）；Ｈｕａｎｇｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６（７）：７９５（２００８）；Ｗｏｌｔｊｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４５８（７２３９）：７６６−７７０（２００９）；及びＺｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ８：３８１−３８４（２００９）；これらのそれぞれはそれらの全体において本明細書中に参照により組み込まれる）。誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の作製を以下で概説する。本明細書中で使用される場合、「ｈｉＰＳＣ」は、ヒト誘導多能性幹細胞であり、「ｍｉＰＳＣ」はマウス誘導多能性幹細胞である。
【００５９】
「多能性幹細胞の特徴」は、他の細胞から多能性幹細胞を区別する細胞の特徴を指す。適切な条件下で、３つの胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）の全てからの細胞系列と関連する特徴をまとめて示す細胞タイプへの分化が起き得る子孫を生じさせる能力は、多能性幹細胞の特徴である。分子マーカーのある特定の組み合わせの発現又は非発現も多能性幹細胞の特徴である。例えば、ヒト多能性幹細胞は、少なくとも数個及び一部の実施形態では、次の非限定リスト：ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−４９／６Ｅ、ＡＬＰ、Ｓｏｘ２、Ｅ−カドヘリン、ＵＴＦ−１、Ｏｃｔ４、Ｒｅｘ１及びＮａｎｏｇからのマーカーの全てを発現する。多能性幹細胞に関連する細胞形態学も多能性幹細胞の特徴である。本明細書中で記載のように、細胞は、内胚葉性の祖先細胞及び／又は肝細胞へと初期化されるという多能性を経る必要はない。
【００６０】
本明細書中で使用される場合、「多能性」又は「多能性細胞」は、限定数の他の特定の細胞タイプを生じさせ得る細胞タイプを指す。例えば、誘導多能性細胞は、内胚葉性細胞を形成可能である。さらに、多能性血液幹細胞は、リンパ球、単球、好中球などを含め、血液細胞のいくつかのタイプにそれ自身分化し得る。
【００６１】
本明細書中で使用される場合、「少能性」という用語は、成体幹細胞が数種類の異なる細胞タイプにしか分化する能力がないことを指す。例えば、リンパ系又は骨髄幹細胞は、それぞれリンパ系又は骨髄系列の何れかの細胞を形成させることが可能である。
【００６２】
本明細書中で使用される場合、「単能性」という用語は、１つの細胞タイプを形成する細胞の能力を意味する。例えば、精原幹細胞が形成可能であるのは精子細胞のみである。
【００６３】
本明細書中で使用される場合、「全能性」という用語は、細胞が生物全体を形成させる能力を意味する。例えば哺乳動物において、全能性であるのは、接合体及び第１の卵割段階の卵割球のみである。
【００６４】
本明細書中で使用される場合、「非多能性細胞」は、多能性細胞ではない哺乳動物細胞を指す。このような細胞の例としては、分化した細胞並びに祖先細胞が挙げられる。分化した細胞の例としては、骨髄、皮膚、骨格筋肉、脂肪組織及び末梢血液から選択される組織からの細胞が挙げられるが限定されない。代表的な細胞タイプとしては、線維芽細胞、肝細胞、筋芽細胞、ニューロン、骨芽細胞、破骨細胞及びＴ細胞が挙げられるが限定されない。誘導多能性細胞、内胚葉性祖先細胞及び肝細胞を作製するために使用される出発細胞は非多能性細胞であり得る。
【００６５】
分化した細胞としては、多能性細胞、少能性細胞、単能性細胞、祖先細胞及び最終分化した細胞が挙げられるが限定されない。特定の実施形態では、能力が低い細胞は、より強力な細胞に対して「分化している」とみなされる。
【００６６】
「体細胞」は、生物の体を形成する細胞である。体細胞は、生物において、臓器、皮膚、血液、骨及び結合組織を構成する細胞を含むが、生殖細胞は含まない。
【００６７】
細胞は、例えば、ヒト又は非ヒト哺乳動物由来であり得る。代表的な非ヒト哺乳動物としては、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ及び非ヒト霊長類が挙げられるが限定されない。一部の実施形態では、細胞は、成人ヒト又は非ヒト哺乳動物由来である。一部の実施形態では、細胞は新生児ヒト、成人又は非ヒト哺乳動物由来である。
【００６８】
本明細書中で使用される場合、「対象」又は「患者」という用語は、何らかの動物、例えば家畜化された動物、動物園の動物又はヒトを指す。「対象」又は「患者」は、イヌ、ネコ、鳥、家畜又はヒトのような哺乳動物であり得る。「対象」及び「患者」の具体例としては、肝臓、心臓、肺、腎臓、膵臓、脳、神経組織、血液、骨、骨髄などに関連する疾患又は障害がある個体（特にヒト）が挙げられるが限定されない。
【００６９】
哺乳動物細胞は、ヒト又は非ヒト哺乳動物由来であり得る。代表的な非ヒト哺乳動物としては、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ及び非ヒト霊長類（例えばチンパンジー、マカク及び類人猿）が挙げられるが限定されない。
【００７０】
「低免疫原性多能性細胞」、「低免疫多能性細胞」又は「ＨＩＰ細胞」は、本明細書中で、その多能性の特徴を保持し、また同種宿主に移植したときに免疫学的拒絶応答の低下が起こる多能性細胞を意味する。好ましい実施形態では、ＨＩＰ細胞は免疫応答を生じさせない。従って、「低免疫原性」又は「低免疫」は、本明細書中で概説されるように免疫改変前の親（即ち「野生型」又は「ｗｔ」）細胞の免疫応答と比較した場合、免疫応答が顕著に低下しているか又は排除されていることを指す。多くのケースで、ＨＩＰ細胞は、免疫学的にサイレントであり、また多能性の可能性を保持する。ＨＩＰの特徴に対するアッセイを以下で概説する。
【００７１】
「ＨＬＡ」又は「ヒト白血球抗原」複合体は、ヒトにおいて主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質をコードする遺伝子複合体である。ＨＬＡ複合体を構成するこれらの細胞表面タンパク質は、抗原に対する免疫応答の制御に関与する。ヒトにおいて、２つのＭＨＣ、クラスＩ及びクラスＩＩ、「ＨＬＡ−Ｉ」及び「ＨＬＡ−ＩＩ」がある。ＨＬＡ−Ｉは、細胞内部からペプチドを提示する３つのタンパク質、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃを含み、ＨＬＡ−Ｉ複合体により提示される抗原は、キラーＴ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞又は細胞傷害性Ｔ細胞としても知られる）を引き付ける。ＨＬＡ−Ｉタンパク質はβ−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）と会合する。ＨＬＡ−ＩＩは、５つのタンパク質、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ＨＬＡ−ＤＱ及びＨＬＡ−ＤＲを含み、これらはＴリンパ球に対して細胞の外側から抗原を提示する。これはＣＤ４＋細胞（Ｔヘルパー細胞としても知られる）を刺激する。遺伝子がヒト（ＨＬＡ）由来であるか又はマウス（ＭＨＣ）由来であるかに依存するので、「ＭＨＣ」又は「ＨＬＡ」の何れかの使用は限定することを意味しないことを理解されたい。従って、これは哺乳動物細胞に関するので、これらの用語は本明細書中で交換可能に使用され得る。
【００７２】
「遺伝子ノックアウト」は、本明細書中で、それが存在する宿主細胞において特定の遺伝子を不活性にして、その結果、関心のあるタンパク質が産生されないか又は不活性形態になるかの何れかになる工程を意味する。当業者により理解されるように、及び下でさらに記載されるように、これは、遺伝子から核酸配列を除去するか又はその配列を他の配列で妨害するか、読み枠を変更するか又は核酸の制御因子を変更することを含め、多くの様々な方法により遂行され得る。例えば関心のある遺伝子のコード領域の全て又は一部を除去し得るか、又は「ナンセンス」配列で置き換え得、プロモーターなどの制御配列の全て又は一部を除去し得るか又は置き換え得、翻訳開始配列を除去し得るか又は置き換え得るなどである。
【００７３】
「遺伝子ノックイン」は、本明細書中で、宿主細胞に遺伝子機能を追加する工程を意味する。これにより、コードされるタンパク質のレベル上昇が起こる。当業者により理解されるように、これは、遺伝子の１つ以上のさらなるコピーを宿主細胞に付加するか又はタンパク質発現を向上させる内在性遺伝子の制御因子を変化させることを含め、いくつかの方法で遂行され得る。これは、プロモーターを修飾するか、異なるプロモーターを付加するか、エンハンサーを付加するか又は他の遺伝子発現配列を修飾することにより遂行され得る。
【００７４】
「β−２ミクログロブリン」又は「β２Ｍ」又は「Ｂ２Ｍ」タンパク質は、以下で示されるアミノ酸及び核酸配列を有するヒトβ２Ｍタンパク質を指し；このヒト遺伝子は受入番号ＮＣ＿００００１５．１０：４４７１１４８７−４４７１８１５９を有する。
【００７５】
「ＣＤ４７タンパク質」タンパク質は、下で示されるアミノ酸及び核酸配列を有するヒトＣＤ４７タンパク質を指し；このヒト遺伝子は受入番号ＮＣ＿０００００３．１２：１０８０４３０９４−１０８０９４２００を有する。
【００７６】
「ＣＩＩＴＡタンパク質」タンパク質は、下で示されるアミノ酸及び核酸配列を有するヒトＣＩＩＴＡタンパク質を指し；ヒト遺伝子は受入番号ＮＣ＿００００１６．１０：１０８６６２０８−１０９４１５６２を有する。
【００７７】
細胞との関連での「野生型」は、天然で見出される細胞を意味する。しかし多能性幹細胞との関連で、本明細書中で使用される場合、これは、多能性を生じさせる核酸変化を含有し得るが、低免疫原性を達成するための本発明の遺伝子編集手順を経なかったｉＰＳＣも意味する。
【００７８】
「同系」は、本明細書中で、宿主生物の遺伝学的類似性又は同一性及び免疫学的適合性がある細胞移植を指し；例えば免疫応答は生じない。
【００７９】
「同種」は、本明細書中で、免疫応答が生じる宿主生物及び細胞移植物の遺伝学的相違を指す。
【００８０】
「Ｂ２Ｍ−／−」は、本明細書中で、二倍体細胞において両染色体でＢ２Ｍ遺伝子が不活性化されていることを意味する。本明細書中で記載のように、これは様々な方法で行われ得る。
【００８１】
「ＣＩＩＴＡ−／−」は、本明細書中で、二倍体細胞において両染色体でＣＩＩＴＡ遺伝子が不活性化されていることを意味する。本明細書中で記載のように、これは様々な方法で行われ得る。
【００８２】
「ＣＤ４７ｔｇ」（「導入遺伝子」を表す）又は「ＣＤ４７＋」）は本明細書中で、一部の例ではＣＤ４７遺伝子の少なくとも１個のさらなるコピーを有することにより、宿主細胞がＣＤ４７を発現することを意味する。
【００８３】
「Ｏｃｔポリペプチド」は、転写因子のオクタマーファミリーの天然のメンバー又は、最も近縁な天然ファミリーメンバーと比較して類似の（少なくとも５０％、８０％又は９０％活性以内）転写因子活性を維持するそれらの変異体又は、天然のファミリーメンバーの少なくともＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドの何れかを指し、転写活性化ドメインをさらに含み得る。代表的なＯｃｔポリペプチドとしては、Ｏｃｔ−１、Ｏｃｔ−２、Ｏｃｔ−３／４、Ｏｃｔ−６、Ｏｃｔ−７、Ｏｃｔ−８、Ｏｃｔ−９及びＯｃｔ−１１が挙げられる。Ｏｃｔ３／４（本明細書中で「Ｏｃｔ４」と呼ぶ）は、ＰＯＵドメイン、Ｐｉｔ−１、Ｏｃｔ−１、Ｏｃｔ−２及びｕｒｉｃ−８６で保存される１５０アミノ酸配列、を含有する（その全体において参照により本明細書中に組み込まれる、Ｒｙａｎ，Ａ．Ｋ．＆  Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ｇ．，Ｇｅｎｅ  Ｄｅｖ．１１：１２０７−１２２５（１９９７）を参照）。一部の実施形態では、変異体は、天然のＯｃｔポリペプチドファミリーメンバーと、例えば上記で列挙されるものなど又はＧｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ−００２６９２．２（ヒトＯｃｔ４）又はＮＰ−０３８６６１．１（マウスＯｃｔ４）で列挙されるものなどと比較して、それらの配列全体にわたり、少なくとも８５％、９０％又は９５％のアミノ酸配列同一性を有する。Ｏｃｔポリペプチド（例えばＯｃｔ３／４又はＯｃｔ４）は、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ又は他の動物由来であり得る。一般に、操作される細胞の種と同じ種のタンパク質が使用される。Ｏｃｔポリペプチドは、非多能性細胞において多能性を誘導するのを助け得る多能性因子であり得る。
【００８４】
「Ｋｌｆポリペプチド」は、Ｋｒｕｐｐｅｌ様因子（Ｋｌｆ）のファミリーの天然のメンバー、ショウジョウバエ胚パターン調節因子Ｋｒｕｐｐｅｌのものと同様のアミノ酸配列を含有するジンクフィンガータンパク質又は、最も近縁な天然のファミリーメンバーと比較して類似の（少なくとも５０％、８０％又は９０％活性以内）転写因子活性を維持する天然メンバーの変異体、又は天然のファミリーメンバーの少なくともＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドの何れかを指し、転写活性化ドメインをさらに含み得る。（その全体において本明細書中で参照により組み込まれる、Ｄａｎｇ，Ｄ．Ｔ．，Ｐｅｖｓｎｅｒ，Ｊ．＆Ｙａｎｇ，Ｖ．Ｗ．，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３２：１１０３−１１２１（２０００）を参照）。代表的なＫｌｆファミリーメンバーとしては、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ３、Ｋｌｆ−４、Ｋｌｆ５、Ｋｌｆ６、Ｋｌｆ７、Ｋｌｆ８、Ｋｌｆ９、Ｋｌｆ１０、Ｋｌｆ１１、Ｋｌｆ１２、Ｋｌｆ１３、Ｋｌｆ１４、Ｋｌｆ１５、Ｋｌｆ１６及びＫｌｆ１７が挙げられる。Ｋｌｆ２及びＫｌｆ−４は、マウスにおいてｉＰＳ細胞を作製可能な因子であることが分かり、関連する遺伝子Ｋｌｆ１及びＫｌｆ５もそうであったが、効率は低かった（その全体において本明細書中で参照により組み込まれる、Ｎａｋａｇａｗａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１０１−１０６（２００７）参照）。一部の実施形態では、変異体は、天然のＫｌｆポリペプチドファミリーメンバー、例えば上で列挙されるものなど又はＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＡＸ１６０８８（マウスＫｌｆ４）若しくはＣＡＸ１４９６２（ヒトＫｌｆ４）で列挙されるものなどと比較して、それらの全配列にわたり少なくとも８５％、９０％又は９５％のアミノ酸配列同一性を有する。Ｋｌｆポリペプチド（例えばＫｌｆ１、Ｋｌｆ４及びＫｌｆ５）は、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ又は他の動物由来であり得る。一般に、操作される細胞の種と同じ種のタンパク質が使用される。Ｋｌｆポリペプチドは、多能性因子であり得る。Ｋｌｆ４遺伝子又はポリペプチドの発現は、開始細胞又は開始細胞集団において多能性の誘導を助け得る。
【００８５】
「Ｍｙｃポリペプチド」は、Ｍｙｃファミリーの天然メンバーの何れかを指す（例えばその全体において本明細書中で参照により組み込まれるＡｄｈｉｋａｒｙ，Ｓ．＆Ｅｉｌｅｒｓ，Ｍ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６：６３５−６４５（２００５）を参照）。これは、最も近縁な天然のファミリーメンバーと比較した場合に類似の（即ち少なくとも５０％、８０％又は９０％活性以内）転写因子活性を維持する変異体も含む。これは、天然のファミリーメンバーの少なくともＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをさらに含み、転写活性化ドメインをさらに含み得る。代表的なＭｙｃポリペプチドは、例えばｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ及びＬ−Ｍｙｃを含む。一部の実施形態では、変異体は、天然のＭｙｃポリペプチドファミリーメンバー、例えば上で列挙されるものなど、又はＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＡＡ２５０１５（ヒトＭｙｃ）で列挙されるものなど、と比較して、それらの全配列にわたり、少なくとも８５％、９０％又は９５％のアミノ酸配列同一性を有する。Ｍｙｃポリペプチド（例えばｃ−Ｍｙｃ）は、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ又は他の動物由来であり得る。一般に、操作される細胞の種と同じ種のタンパク質が使用される。Ｍｙｃポリペプチドは多能性因子であり得る。
【００８６】
「Ｓｏｘポリペプチド」は、ＳＲＹ関連ＨＭＧ−ｂｏｘ（Ｓｏｘ）転写因子の天然メンバーの何れかを指し、最も近縁な天然のファミリーメンバーと比較した場合に類似の（即ち少なくとも５０％、８０％又は９０％活性以内）転写因子活性を維持する高移動度群（ＨＭＧ）ドメイン又はそれらの変異体の存在を特徴とする。これは、天然のファミリーメンバーの少なくともＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドも含み、転写活性化ドメインをさらに含み得る（例えばその全体において本明細書中で参照により組み込まれるＤａｎｇ，Ｄ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３２：１１０３−１１２１（２０００）を参照）。代表的なＳｏｘポリペプチドとしては、例えばＳｏｘ１、Ｓｏｘ−２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ４、Ｓｏｘ５、Ｓｏｘ６、Ｓｏｘ７、Ｓｏｘ８、Ｓｏｘ９、Ｓｏｘ１０、Ｓｏｘ１１、Ｓｏｘ１２、Ｓｏｘ１３、Ｓｏｘ１４、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｓｏｘ１８、Ｓｏｘ−２１及びＳｏｘ３０が挙げられる。Ｓｏｘ１は、Ｓｏｘ２と同様の効率でｉＰＳ細胞をもたらすことが示されており、遺伝子Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５及びＳｏｘ１８もｉＰＳ細胞を産生させることが示されているが、Ｓｏｘ２よりも幾分効率が低い（その全体において本明細書中で参照により組み込まれるＮａｋａｇａｗａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１０１−１０６（２００７）を参照）。一部の実施形態では、変異体は、天然のＳｏｘポリペプチドファミリーメンバー、例えば上で列挙されるものなど又はＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＡＡ８３４３５（ヒトＳｏｘ２）に挙げられるものなどと比較して、それらの全配列にわたり少なくとも８５％、９０％又は９５％のアミノ酸配列同一性を有する。Ｓｏｘポリペプチド（例えばＳｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５又はＳｏｘ１８）は、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ又は他の動物由来であり得る。一般に、操作される細胞の種と同じ種のタンパク質が使用される。Ｓｏｘポリペプチドは多能性因子であり得る。本明細書中で論じるように、ＳＯＸ２タンパク質はｉＰＳＣの作製において特定の用途がある。
【００８７】
「分化した低免疫原性多能性細胞」又は「分化したＨＩＰ細胞」又は「ｄＨＩＰ細胞」は、本明細書中で、低免疫原性を保持するように改変されているｉＰＳ細胞を意味し（例えばＢ２Ｍ及びＣＩＩＴＡのノックアウト及びＣＤ４７のノックイン）、次に対象への最終的な移植のための細胞タイプに分化させられる。従って、例えばＨＩＰ細胞は、肝細胞（「ｄＨＩＰ肝細胞」）、ベータ様膵臓細胞又は膵島オルガノイド（「ｄＨＩＰベータ細胞」）、内皮細胞（「ｄＨＩＰ内皮細胞」）などへと、分化させられ得る。
【００８８】
パーセント「同一性」という用語は、２つ以上の核酸又はポリペプチド配列という観点で、以下に記載の配列比較アルゴリズム（例えばＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮ又は当業者にとって利用可能な他のアルゴリズム）の１つを使用して、又は目視検査によって測定した場合、比較し、一致が最大となるように並べたとき、同じであるヌクレオチド又はアミノ酸残基が指定のパーセンテージとなる２つ以上の配列又はサブ配列を指す。適用に依存して、パーセント「同一性」は、比較される配列の領域にわたり、例えば機能的ドメインにわたり存在し得るか又は、或いは、比較しようとする２つの配列の全長にわたり存在し得る。配列比較の場合、一般的には１つの配列を、試験配列が比較される参照配列とする。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じてサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。次に、配列比較アルゴリズムが、指定されるプログラムパラメーターに基づき、参照配列に対する試験配列についてパーセント配列同一性を計算する。
【００８９】
比較のための配列の最適アライメントは、例えばＳｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性方法（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｍｅｔｈｏｄ）に対する検索によって、これらのアルゴリズムのコンピュータライズドインプリメンテーション（ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ  ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）によって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．の、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）又は目視検査（一般にＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，以下を参照）によって、遂行され得る。
【００９０】
パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するのに適切なアルゴリズムの一例はＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これはＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公開されている。
【００９１】
「阻害剤」、「活性化因子」及び「修飾因子」は、生物学的関連分子の機能又は発現に影響を及ぼす。「修飾因子」という用語は、阻害剤及び活性化因子の両方を含む。これらは、標的分子の発現又は活性に対するインビトロ及びインビボアッセイを用いて同定され得る。
【００９２】
「阻害剤」は、例えば発現を阻害するか又は標的分子又はタンパク質に結合する物質である。これらは、部分的又は全体的に刺激を遮断し得るか又はプロテアーゼ阻害剤活性を有し得る。これらは、記載される標的タンパク質の活性の不活性化、脱感作又は下方制御を含め、活性化を軽減、低下、防止又は遅延させ得る。修飾因子は、標的分子又はタンパク質のアンタゴニストであり得る。
【００９３】
「活性化因子」は、例えば標的分子又はタンパク質の機能又は発現を誘導又は活性化する物質である。これらは、結合して、標的分子活性を刺激し得るか、上昇させ得るか、開き得るか、活性化し得るか、又は促進し得る。活性化因子は標的分子又はタンパク質のアゴニストであり得る。
【００９４】
「相同体」は、ヌクレオチド配列、ペプチド配列、機能又は構造レベルで参照分子と同様である生理活性分子である。相同体は、参照配列とある一定のパーセント同一性を共有する配列誘導体を含み得る。従って、一実施形態では、相同又は誘導体配列は、少なくとも７０パーセントの配列同一性を共有する。特定の実施形態では、相同又は誘導体配列は、少なくとも８０又は８５パーセントの配列同一性を共有する。特定の実施形態では、相同又は誘導体配列は、少なくとも９０パーセントの配列同一性を共有する。特定の実施形態では、相同又は誘導体配列は、少なくとも９５パーセントの配列同一性を共有する。より具体的な実施形態では、相同又は誘導体配列は、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの配列同一性を共有する。相同又は誘導体核酸配列はまた、高ストリンジェンシーハイブリッド形成条件下で参照核酸配列に結合し続けるそれらの能力によっても定められ得る。参照分子に対して構造又は機能的類似性を有する相同体は、参照分子の化学誘導体であり得る。構造及び機能的相同体並びに誘導体について検出し、作製し、スクリーニングする方法は当技術分野で公知である。
【００９５】
「ハイブリッド形成」は一般に、相補鎖がそれらの融解温度を下回る環境で存在するときに変性ＤＮＡが再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリッド形成可能な配列との間の所望の相同性の度合いが高いほど、使用され得る相対温度は高くなる。結果として、より高い相対温度はよりストリンジェンシーの高い反応条件を作る傾向があり、一方でより低い温度はストリンジェンシーがより低くなるということになる。ハイブリッド形成反応のストリンジェンシーのさらなる詳細及び説明については、その全体において本明細書中で参照により組み込まれるＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９５）を参照。
【００９６】
ハイブリッド形成反応の「ストリンジェンシー」は、当業者により容易に決定可能であり、一般にプローブの長さ、洗浄温度及び塩濃度に依存する経験的計算である。一般に、正確なアニーリングのためには、プローブが長いほど高い温度が必要となり、一方でプローブが短いほど必要な温度は低くなる。
【００９７】
「ストリンジェントな条件」又は「高ストリンジェンシー条件」は、本明細書中で定義される場合、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温、例えば５０℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを使用するもの；（２）ハイブリッド形成中にホルムアミドなどの変性剤、例えば４２℃で、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／Ｐｈ６．５の５０Ｍｍリン酸ナトリウム緩衝液、７５０Ｍｍ  塩化ナトリウム、７５Ｍｍクエン酸ナトリウム入りの５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、を使用するもの；又は（３）４２℃で、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０Ｍｍリン酸ナトリウム（Ｐｈ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハート溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｌ／ｍＬ）、０．１％ＳＤＳ及び１０％硫酸デキストランを使用し、０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中で４２℃で１０分間洗浄し、続いて５５℃でＥＤＴＡ含有０．１ｘＳＳＣからなる１０分間の高ストリンジェンシー洗浄を行う、溶液中での一晩のハイブリッド形成により同定され得る。
【００９８】
本願全体を通じて与えられる全ての最大の数値制限は、全てのより低い数値制限が本明細書中で明らかに書かれているかのように、全てのより低い数値制限を含むものとする。本願全体を通じて与えられる全ての最小の数値制限は、全てのより高い数値制限が本明細書中で明らかに書かれているかのように、全てのより高い数値制限を含むものとする。本願全体を通じて与えられる全ての数値範囲は、全てのより狭い数値範囲が全て本明細書中で明らかに書かれているかのように、このようなより広い数値範囲内に入る全てのより狭い数値範囲を含む。
【００９９】
本明細書中で使用される場合、「修飾」という用語は、親分子から修飾された分子を物理的に区別する変化を指す。一実施形態では、本明細書中に記載の方法に従い調製されるＣＤ４７、ＨＳＶｔｋ、ＥＣ−ＣＤ又はｉＣａｓｐ９変異体ポリペプチド中のアミノ酸変化は、野生型タンパク質、天然の突然変異体タンパク質又はこのような変異体ポリペプチドの修飾を含まない別の改変タンパク質など、本明細書中に記載の方法に従い修飾されていない対応する親とそれを区別する。別の実施形態では、変異体ポリペプチドは、未修飾ポリペプチドと変異体ポリペプチドの機能を区別する１つ以上の修飾を含む。例えば、変異体ポリペプチド中のアミノ酸変化は、その受容体結合プロファイルに影響を及ぼす。他の実施形態では、変異体ポリペプチドは、置換、欠失又は挿入修飾又はそれらの組み合わせを含む。別の実施形態では、変異体ポリペプチドは、未修飾ポリペプチドの親和性と比較して、受容体に対してその親和性を向上させる１つ以上の修飾を含む。
【０１００】
一実施形態では、変異体ポリペプチドは、対応するネイティブ又は親配列と比較して、１つ以上の置換、挿入又は欠失を含む。ある一定の実施形態では、変異体ポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１〜４０、４１〜５０又は５１個以上の修飾を含む。
【０１０１】
「エピソームベクター」は、本明細書中で、細胞の細胞質に存在し得、自律的に複製し得る遺伝子ベクターを意味し；例えば、これは宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれない。多くのエピソームベクターが当技術分野で公知であり、下で記載する。
【０１０２】
遺伝子との関連での「ノックアウト」は、ノックアウトを有する宿主細胞が遺伝子の機能的タンパク質産物を産生しないことを意味する。本明細書中で概説するように、ノックアウトは、様々な方法で、コード配列の全て又は一部を除去し、機能的タンパク質が産生されないように（短縮又はナンセンス配列の何れか）フレームシフト突然変異を導入し、遺伝子が転写されないように調節因子（例えばプロモーター）を除去又は改変し、ｍＲＮＡなどへの結合を通じて翻訳を妨害することによる結果であり得る。一般に、ノックアウトは、細胞の子孫も永久的にノックアウトを保有するようにゲノムＤＮＡレベルでもたらされる。
【０１０３】
遺伝子の文脈において、「ノックイン」は、ノックインを有する宿主細胞が細胞において活性のあるより機能的なタンパク質を有することを意味する。本明細書中で概説するように、ノックインは、様々な方法で、通常はタンパク質をコードする導入遺伝子（ｔｇ）の少なくとも１コピーの細胞への導入により、行われ得るが、これはまた、調節コンポーネントを置き換えることによっても、例えば内在性遺伝子に構成的プロモーターを付加することによって、行われ得る。一般に、ノックイン技術の結果、宿主細胞への導入遺伝子のさらなるコピーの組み込みが起こる。
【０１０４】
ＶＩＩ．低免疫原性多能性細胞
本発明は、マウス及びヒトＨＩＰ細胞を作製し、野生型細胞を用いて開始し、それらを多能性にし（例えば誘導多能性幹細胞又はｉＰＳＣを作製）、次いでｉＰＳＣ集団からＨＩＰ細胞を作製するための、組成物及び方法を提供する。
【０１０５】
内在性Ｂ２Ｍ遺伝子の両アレルを不活性化する１つ以上の変化；内在性ＣＩＩＴＡ遺伝子の両アレルを不活性化する１つ以上の変化；及びヒトＨＩＰ幹細胞においてＣＤ４７遺伝子の発現上昇を引き超す１つ以上の変化を含む、低免疫原性多能性（ＨＩＰ）幹細胞が本明細書中で提供され；ヒトＨＩＰ幹細胞は、前記Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの変化を含むが前記ＣＤ４７遺伝子発現上昇を含まない誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）により発揮される第２のＮＫ細胞応答よりも低い第１のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞応答をもたらし、第１及び第２のＮＫ細胞応答は、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの変化を含むがＣＤ４７遺伝子発現上昇を含まないヒトＨＩＰ又はｉＰＳＣの何れかとともにインビトロで温置されるＮＫ細胞からのＩＦＮ−γレベルを決定することによって測定される。ＨＩＰ幹細胞はマウスＨＩＰ幹細胞であり得る。一部の実施形態では、ＨＩＰ幹細胞はヒトＨＩＰ幹細胞である。
【０１０６】
低免疫原性多能性細胞は、ＨＬＡ−Ｉ機能低下、ＨＬＡ−ＩＩ機能低下及びＮＫ細胞殺傷に対する感受性の低下の結果として、対象への移植時に、より拒絶されにくくなり得る。
【０１０７】
一部の実施形態では、低免疫原性多能性細胞は、β−２ミクログロブリンタンパク質発現が低下しているか又はそれを欠く。好ましい実施形態では、β−２ミクログロブリンタンパク質をコードする遺伝子が削除されるか又はノックアウトされる。より好ましい実施形態では、β−２ミクログロブリンタンパク質は、配列番号１に対して少なくとも９０％（例えば９１％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）の配列同一性を有する。より好ましい実施形態では、β−２ミクログロブリンタンパク質は配列番号１の配列を有する。
【０１０８】
一部の実施形態では、ＨＬＡ−Ａタンパク質発現の低下によりＨＬＡ−Ｉ機能が低下する。好ましい実施形態では、ＨＬＡ−Ａタンパク質をコードする遺伝子は削除又はノックアウトされる。一部の実施形態では、ＨＬＡ−Ｂタンパク質発現低下によってＨＬＡ−Ｉ機能が低下する。好ましい実施形態では、ＨＬＡ−Ｂタンパク質をコードする遺伝子が削除又はノックアウトされる。一部の実施形態では、ＨＬＡ−Ｃタンパク質発現低下によってＨＬＡ−Ｉ機能を低下させる。好ましい実施形態では、ＨＬＡ−Ｃタンパク質をコードする遺伝子が削除又はノックアウトされる。別の実施形態では、低免疫原性多能性細胞はＨＬＡ−Ｉ機能を含まない。
【０１０９】
一部の実施形態では、低免疫原性多能性細胞は、ＣＩＩＴＡタンパク質発現が低下しているか又はそれを欠く。好ましい実施形態では、ＣＩＩＴＡタンパク質をコードする遺伝子が削除又はノックアウトされる。より好ましい実施形態では、ＣＩＩＴＡタンパク質は、配列番号２に対して少なくとも９０％（例えば９１％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）の配列同一性を有する。より好ましい実施形態では、ＣＩＩＴＡタンパク質は配列番号２の配列を有する。
【０１１０】
一部の実施形態では、ＨＬＡ−ＤＰタンパク質発現の減少によりＨＬＡ−ＩＩ機能が低下する。好ましい実施形態では、ＨＬＡ−ＤＰタンパク質をコードする遺伝子が削除又はノックアウトされる。一部の実施形態では、ＨＬＡ−ＤＲタンパク質発現低下によりＨＬＡ−ＩＩ機能が低下する。好ましい実施形態では、ＨＬＡ−ＤＲタンパク質をコードする遺伝子が削除又はノックアウトされる。一部の実施形態では、ＨＬＡ−ＤＱタンパク質発現低下によりＨＬＡ−ＩＩ機能が低下する。好ましい実施形態では、ＨＬＡ−ＤＱタンパク質をコードする遺伝子が削除又はノックアウトされる。本発明は、ＨＬＡ−ＩＩ機能を含まない低免疫原性多能性細胞を提供する。
【０１１１】
本発明は、マクロファージ食作用又はＮＫ細胞殺傷に対する感受性が低下した低免疫原性多能性細胞を提供する。感受性の低下は、ＣＤ４７タンパク質の発現上昇により起こる。一部の実施形態では、ＣＤ４７発現上昇は、内在性ＣＤ４７遺伝子遺伝子座に対する修飾の結果である。他の実施形態では、ＣＤ４７発現上昇は、ＣＤ４７導入遺伝子によるものである。好ましい実施形態では、ＣＤ４７タンパク質は、配列番号３に対して少なくとも９０％（例えば９１％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）の配列同一性を有する。より好ましい実施形態では、ＣＤ４７タンパク質は配列番号３の配列を有する。
【０１１２】
本方法の別の実施形態では、マクロファージ食作用に対する多能性細胞の感受性を低下させるタンパク質の発現上昇は、内在性遺伝子遺伝子座に対する修飾の結果である。好ましい実施形態では、内在性遺伝子遺伝子座はＣＤ４７タンパク質をコードする。別の実施形態では、タンパク質発現上昇は、導入遺伝子の発現の結果である。好ましい実施形態では、導入遺伝子はＣＤ４７タンパク質をコードする。より好ましい実施形態では、ＣＤ４７タンパク質は、配列番号３に対して少なくとも９０％（例えば９１％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）の配列同一性を有する。より好ましい実施形態では、ＣＤ４７タンパク質は配列番号３の配列を有する。
【０１１３】
一部の実施形態では、ＨＩＰ細胞におけるＣＤ４７タンパク質のレベルは、対応する多能性幹細胞、例えば胚性幹細胞又は誘導多能性幹細胞でのレベルよりも高い。一部の例では、マウスＨＩＰ細胞でのマウスＣＤ４７タンパク質のレベルは、対応するマウス多能性幹細胞でのレベルよりも高い（例えば少なくとも０．５倍高い、少なくとも１．０倍高い、少なくとも１．５倍高い、少なくとも２倍高い、少なくとも３倍高い、少なくとも４倍高い、少なくとも５倍高い、少なくとも６倍高い、少なくとも７倍高い、少なくとも８倍高い、少なくとも８倍以上高い）。ある特定の例では、ヒトＨＩＰ細胞でのヒトＣＤ４７タンパク質のレベルは、対応するヒト多能性幹細胞のレベルよりも高い（例えば少なくとも０．５倍高い、少なくとも１．０倍高い、少なくとも１．５倍高い、少なくとも２倍高い、少なくとも３倍高い、少なくとも４倍高い、少なくとも５倍高い、少なくとも６倍高い、少なくとも７倍高い、少なくとも８倍高い、少なくとも８倍以上高い）。
【０１１４】
本方法の別の実施形態は、低免疫原性多能性又は分化した子孫細胞の死滅を引き起こすトリガーにより活性化される自殺遺伝子を発現させることをさらに含む。好ましい実施形態では、自殺遺伝子は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ）であり、トリガーはガンシクロビルである。より好ましい実施形態では、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子は、配列番号４に対して少なくとも９０％（例えば９１％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）の配列同一性を有するタンパク質をコードする。より好ましい実施形態では、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子は、配列番号４の配列を有するタンパク質をコードする。
【０１１５】
本方法の別の実施形態では、自殺遺伝子は、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ遺伝子（ＥＣ−ＣＤ）であり、トリガーは５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）である。好ましい実施形態では、ＥＣ−ＣＤ遺伝子は、配列番号５に対して少なくとも９０％（例えば９１％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）の配列同一性を有するタンパク質をコードする。より好ましい実施形態では、ＥＣ−ＣＤ遺伝子は、配列番号５の配列を有するタンパク質をコードする。
【０１１６】
本方法の別の実施形態では、自殺遺伝子は誘導性カスパーゼタンパク質をコードし、トリガーは特異的な二量体誘導化合物（ＣＩＤ）である。本方法の好ましい実施形態では、本遺伝子は、配列番号６に対してなくとも９０％（例えば９１％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）の配列同一性を含む誘導性カスパーゼタンパク質をコードする。より好ましい実施形態では、本遺伝子は、配列番号６の配列を含む誘導性カスパーゼタンパク質をコードする。より好ましい実施形態では、ＣＩＤはＡＰ１９０３である。
【０１１７】
Ａ．遺伝子変化のための方法
本方法は、多能性細胞及びＨＩＰ細胞の両方を作製するために細胞内又は無細胞条件下で核酸配列を修飾する方法を含む。代表的な技術としては、相同組み換え、ノックイン、ＺＦＮ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ）、ＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的配置の短回文配列リピート（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ））／Ｃａｓ９及び他の部位特異的なヌクレアーゼ技術が挙げられる。これらの技術により、所望の遺伝子座部位での２本鎖ＤＮＡ破壊が可能になる。これらの制御された２本鎖破壊は、特異的な遺伝子座部位で相同組み換えを促進する。この工程は、配列を認識し結合するエンドヌクレアーゼでの、染色体など、核酸分子の特異的な配列を標的とすることに焦点を当て、核酸分子での２本鎖破壊を誘導する。２本鎖破壊は、エラープローン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同組み換え（ＨＲ）の何れかにより修復される。
【０１１８】
当業者により認められるように、本発明の多能性細胞を改変するために多くの様々な技術を使用し得、本明細書中で概説するように低免疫原性になるようにｉＰＳＣを改変する。
【０１１９】
一般に、これらの技術は、個々に又は組み合わせて使用され得る。例えばＨＩＰ細胞の作製において、ＣＤ４７の機能性をノックインするためのウイルス技術（例えばレンチウイルス）とともに、改変細胞での活性Ｂ２Ｍ及び／又はＣＩＩＴＡタンパク質の発現を低下させるためにＣＲＩＳＰＲが使用され得る。また、当業者により認められるように、一実施形態は、ＣＤ４７機能性をノックインするためのレンチウイルスの最終段階とともに、Ｂ２ＭをノックアウトするためのＣＲＩＳＰＲ段階、続いてＣＩＩＴＡをノックアウトするためのＣＲＩＳＰＲ段階を連続的に利用したが、これらの遺伝子は様々な技術を使用して様々な順序で操作され得る。
【０１２０】
下でより詳細に論じるように、初期化遺伝子の一過性発現は一般に多能性幹細胞を作製／誘導するために行われる。
【０１２１】
ａ．ＣＲＩＳＰＲ技術
一実施形態では、当技術分野で公知のように、クラスター化された規則的配置の短回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ）／Ｃａｓ（「ＣＲＩＳＰＲ」）技術を使用して、細胞を操作する。開始ｉＰＳＣを作製するため又はｉＰＳＣからＨＩＰ細胞を作製するために、ＣＲＩＳＰＲを使用し得る。ＣＲＩＳＰＲに基づく多数の技術があり、例えば参照により本明細書によって組み込まれるＤｏｕｄｎａ  ａｎｄ  Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２５８０９６を参照。ＣＲＩＳＰＲ技術及びキットは市販されている。
【０１２２】
ｂ．ＴＡＬＥＮ技術
一部の実施形態では、本発明のＨＩＰ細胞は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）法を使用して作製される。ＴＡＬＥＮは、実際に何らかの所望のＤＮＡ配列に結合し、切断するように改変され得るヌクレアーゼと組み合わせられた制限酵素である。ＴＡＬＥＮキットは市販されている。
【０１２３】
ｃ．ジンクフィンガー技術
一実施形態では、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ技術を使用して細胞を操作する。Ｚｎフィンガーヌクレアーゼは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合させることにより作製される人工的制限酵素である。ジンクフィンガードメインは特異的な所望のＤＮＡ配列を標的とするために改変され得、これにより、ジンクフィンガーヌクレアーゼが複雑なゲノム内でユニークな配列を標的とすることが可能になる。内在性ＤＮＡ修復機構の長所により、ＣＲＩＳＰＲ及びＴＡＬＥＮと同様に、より高等な生物のゲノムを適正に改変するためにこれらの試薬を使用し得る。
【０１２４】
ｄ．ウイルスに基づく技術
レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びセンダイウイルスベクターの使用を含むが限定されない、本発明のＨＩＰ細胞を作製するために（並びにｉＰＳＣのオリジナル作製（ｏｒｉｇｉｎａｌ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）のため）使用し得る多岐にわたるウイルス技術がある。ｉＰＳＣの作製において使用されるエピソームベクターを下で記載する。
【０１２５】
ｅ．干渉ＲＮＡを使用した遺伝子の下方制御
他の実施形態では、ＨＬＡ分子で使用されるタンパク質をコードする遺伝子は、ＲＮＡｉ技術により下方制御される。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、しばしば特異的なｍＲＮＡ分子の分解を引き起こすことにより、ＲＮＡ分子が遺伝子発現を阻害する過程である。２つのタイプのＲＮＡ分子−マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）−がＲＮＡ干渉の中心となる。これらは、標的ｍＲＮＡ分子に結合し、それらの活性を上昇又は低下させる。ＲＮＡｉは、ウイルス及びトランスポゾン由来のものなどの寄生性の核酸に対する細胞防御を助ける。ＲＮＡｉは発生にも影響を与える。
【０１２６】
ｓｄＲＮＡ分子は、１９〜２１塩基のガイド（アンチセンス）鎖を含む非対称ｓｉＲＮＡのクラスである。これらは、５’ホスフェート、２’Ｏｍｅ又は２’Ｆ修飾ピリミジン及び６個のホスホチオエートを３’位置に含有する。これらは、３’複合化ステロール部分、２個のホスホチオエートを３’位置に、及び２’Ｏｍｅ修飾ピリミジンを含有するセンス鎖も含有する。両鎖は、３を超えない長さの未修飾プリンの連続ストレッチとともに２’Ｏｍｅプリンを含有する。ｓｄＲＮＡは、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第８，７９６，４４３号明細書で開示される。
【０１２７】
これらの技術の全てに対して、本明細書中で概説するように組み換え核酸を作製するために周知の組み換え技術が使用される。ある一定の実施形態では、組み換え核酸（所望のポリペプチド、例えばＣＤ４７又は破壊配列の何れかをコードする）は、発現コンストラクト中で１つ以上の制御ヌクレオチド配列に操作可能に連結され得る。制御ヌクレオチド配列は、一般に処置しようとする宿主細胞及び対象に適切である。様々な宿主細胞に対して、多くのタイプの適切な発現ベクター及び適切な調節配列が当技術分野で公知である。一般的には、１つ以上の調節ヌクレオチド配列としては、プロモーター配列、リーダー又はシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終結配列、翻訳開始及び終結配列及びエンハンサー又は活性化因子配列が挙げられ得るが限定されない。当技術分野で公知のような構成的又は誘導性プロモーターも企図される。プロモーターは、天然のプロモーター又は複数のプロモーターのエレメントを組み合わせるハイブリッドプロモーターの何れかであり得る。発現コンストラクトは、プラスミドなど、エピソーム上で細胞中に存在し得るか、又は発現コンストラクトは染色体に挿入され得る。特定の実施形態では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするために選択可能マーカー遺伝子を含む。ある一定の実施形態は、少なくとも１個の調節配列に操作可能に連結される変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。本明細書中での使用のための調節配列は、プロモーター、エンハンサー及び他の発現制御エレメントを含む。ある一定の実施形態では、発現ベクターは、形質転換しようとする宿主細胞の選択、発現させようと所望する特定の変異体ポリペプチド、ベクターのコピー数、そのコピー数を制御するための能力又はベクターによりコードされる何らかの他のタンパク質、例えば抗生物質マーカーなど、の発現のために設計される。
【０１２８】
適切なプロモーターの例としては、例えば次の遺伝子からのプロモーター：ハムスターのユビキチン／Ｓ２７ａプロモーター（国際公開第９７／１５６６４号パンフレット）、サル空胞化ウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、マウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の末端反復配列領域、マウス乳癌ウイルスプロモーター（ＭＭＴＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス末端反復配列領域及びヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターが挙げられる。他の異種哺乳動物プロモーターの例は、アクチン、免疫グロブリン又は熱ショックプロモーターである。一部の実施形態では、伸長因子１−アルファプロモーターが使用される。
【０１２９】
さらなる実施形態では、哺乳動物宿主細胞での使用のためのプロモーターは、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（英国特許第２，２１１，５０４号明細書、１９８９年７月５日公開）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びサルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られ得る。さらなる実施形態では、異種哺乳動物プロモーターが使用される。例としては、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター及び熱ショックプロモーターが挙げられる。ＳＶ４０の初期及び後期プロモーターは、都合よく、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含有するＳＶ４０制限断片として得られる。Ｆｉｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２７３：１１３−１２０（１９７８）。ヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモーターは、都合よく、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として得られる。Ｇｒｅｅｎａｗａｙ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １８：３５５−３６０（１９８２）。前述の参考文献はそれらの全体において参照により組み込まれる。
【０１３０】
Ｂ．多能性細胞の作製
本発明は、多能性細胞から非免疫原性多能性細胞を作製する方法を提供する。従って、第１段階は多能性幹細胞を提供することである。
【０１３１】
マウス及びヒト多能性幹細胞（一般にｉＰＳＣと呼ばれ；マウス細胞の場合はｍｉＰＳＣ又はヒト細胞の場合はｈｉＰＳＣ）の作製は一般に当技術分野で公知である。当業者により認められるように、ｉＰＣＳの作製のために様々な異なる方法がある。４つの転写因子、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ及びＫｌｆ４のウイルス導入を使用して、マウス胚又は成体線維芽細胞から最初の誘導が行われた；その全体において、及び具体的には文献中で概説される技術に対して、参照により本明細書によって組み込まれるＴａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｙａｍａｎａｋａ  Ｃｅｌｌ  １２６：６６３−６７６（２００６）を参照。そのときから、多くの方法が開発された；両者ともそれらの全体において、及び特にｈｉＰＳＣを作製するための方法について、参照により本発明により明確に組み込まれる、概説に対するＳｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ７（１）：１１６−１２５（２０１５）及びＬａｋｓｈｍｉｐａｔｈｙ  ａｎｄ  Ｖｅｒｍｕｒｉ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  ２０１３を参照（例えば後者の参考文献の第３章を参照）。
【０１３２】
一般に、ｉＰＳＣは、通常はエピソームベクターを使用して導入される、宿主細胞中での１つ以上の「初期化因子」の一過性発現により作製される。これらの条件下で少量の細胞がｉＰＳＣになるように誘導される（選択マーカーが使用されないので一般にこの段階の効率は低い）。細胞が「初期化」され、多能性になると、これらはエピソームベクターを失い、内在遺伝子を使用して因子を産生する。このエピソームベクターの喪失の結果、「ゼロフットプリント（ｚｅｒｏ  ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ）」細胞と呼ばれる細胞が得られる。（特に宿主細胞のゲノムにおいて）遺伝子修飾が少ないほど良いのでこれは望ましい。従って、得られるｈｉＰＳＣに永久的な遺伝子修飾がないことが好ましい。
【０１３３】
また当業者により認識されるように、使用され得るか又は使用される多くの初期化因子が変動し得る。一般に、より少ない初期化因子が使用される場合、多能性状態への細胞の形質転換の効率が低下し、「多能性」も低下し、例えばより少ない初期化因子では、十分に多能性ではないが、より少ない細胞タイプにのみ分化可能であり得る細胞が得られ得る。
【０１３４】
一部の実施形態では、１個の初期化因子、ＯＣＴ４が使用される。他の実施形態では、２つの初期化因子、ＯＣＴ４及びＫＬＦ４が使用される。他の実施形態では、３つの初期化因子、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４及びＳＯＸ２が使用される。他の実施形態では、４つの初期化因子、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２及びｃ−Ｍｙｃが使用される。他の実施形態では、ＳＯＫＭＮＬＴ；ＳＯＸ２、ＯＣＴ４（ＰＯＵ５Ｆ１）、ＫＬＦ４、ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８及びＳＶ４０Ｌ  Ｔ抗原から選択される、５、６又は７個の初期化因子が使用され得る。
【０１３５】
一般に、当技術分野で公知のもの及び市販のものなど、エピソームベクターにおいてこれらの初期化因子遺伝子が提供される。例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎは、ｈｉＰＳＣのゼロフットプリント（ｚｅｒｏ  ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ）作製のためのセンダイウイルス初期化キットを販売しており、カタログ番号Ａ３４５４６を参照。ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒは、ＥＢＮＡに基づく系も販売しており、カタログ番号Ａ１４７０３を参照。
【０１３６】
さらに、利用可能な多くの市販ｈｉＰＳＣ株がある；例えばゼロフットプリント（ｚｅｒｏ  ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ）、ウイルス組み込みのないヒトｉＰＳＣ細胞株であるＧｉｂｃｏ（登録商標）エピソームｈｉＰＳＣ株、Ｋ１８９４５を参照（Ｂｕｒｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、上出も参照）。
【０１３７】
一般に、当技術分野で公知のように、ｉＰＳＣは、本明細書中で記載のように初期化因子を一過性に発現させることにより、ＣＤ３４＋臍帯血細胞、線維芽細胞など、非多能性細胞から作製される。
【０１３８】
例えば、成功したｉＰＳＣはまた、初期化効率が低下するものの、Ｃ−Ｍｙｃを省略してＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４のみを使用して作製された。
【０１３９】
一般に、ｉＰＳＣは、ＫＬＦ４、Ｎａｎｏｇ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＥＳＲＲＢ、ＴＢＸ３、ｃ−Ｍｙｃ及びＴＣＬ１を含むある一定の因子の発現を特徴とする。本発明の目的のためのこれらの因子の新しい発現又は発現上昇は、内在遺伝子座の誘導若しくは調整を介し得るか又は導入遺伝子からの発現からのものであり得る。
【０１４０】
例えば、マウスｉＰＳＣは、その全体において、及び具体的にはｍｉＰＳＣの作製のための方法及び試薬に対して、参照により本明細書によって組み込まれるＤｉｅｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．２０１５，Ｊａｎ．２８；５：８０８１（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ０８０８１）の方法を使用して作製され得る。また、例えば全体において及び具体的には本明細書中で概説される方法に対して、参照により本明細書によって組み込まれるＢｕｒｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１１  ６（４）：１８２９３も参照。
【０１４１】
一部の例では、細胞の多能性は、一般にＰＣＴ／ＵＳ１８／１３６８８号明細書で示されるように、又は本明細書中で概説されるように、及び実施例で分化反応を遂行することにより、例えば初期化因子についてアッセイすることにより、本明細書中で概説されるように測定されるか又は確認される。
【０１４２】
Ｃ．低免疫原性多能性細胞の作製
本発明は、本明細書中で定められるように、患者への低免疫原性細胞の作製、操作、増殖及び移植を対象とする。多能性細胞からのＨＩＰ細胞の作製は３個という少ない遺伝子変化により行われ、その結果、細胞活性の破壊が最小限となるが、細胞に対して免疫サイレンシングを与える。
【０１４３】
本明細書中で論じられるように、一実施形態は、ＭＨＣＩ及びＩＩ（細胞がヒトである場合はＨＬＡＩ及びＩＩ）のタンパク質活性の低下又は排除を利用する。これは、それらの構成成分をコードする遺伝子を変化させることにより行われ得る。一実施形態では、遺伝子のコード領域又は調節配列は、ＣＲＩＳＰＲを使用して破壊される。別の実施形態では、干渉ＲＮＡ技術を使用して、遺伝子翻訳を減少させる。第３の変化は、ＣＤ４７など、マクロファージ食作用に対する感受性を調節する遺伝子における変化であり、これは一般的にウイルス技術を使用した遺伝子の「ノックイン」である。
【０１４４】
低免疫多能性細胞（ＨＩＰ細胞）のさらなる説明は、２０１８年１月１４日提出の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／１３６８８号明細書及び２０１７年１月１３日提出の米国仮特許出願第６２／４４５，９６９号明細書で見出され得、その全体におけるこれらの開示は本明細書中で、参照により、特に実施例、図面、図面の説明及び低免疫原性多能性幹細胞の作製及び他の細胞タイプへのこのような細胞の分化の説明が組み込まれる。
【０１４５】
一部の例では、ＣＲＩＳＰＲは遺伝子修飾のために使用されており、細胞株の高効率編集を可能にするＣａｓ９コンストラクトを含有するｈｉＰＳＣ細胞が使用され得；例えばＬｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＨｕｍａｎ  Ｅｐｉｓｏｍａｌ  Ｃａｓ９  ｉＰＳＣ細胞株、Ａ３３１２４を参照。
【０１４６】
１．ＨＬＡ−Ｉ低下
本発明のＨＩＰ細胞は、ＭＨＣＩ機能（細胞がヒト細胞由来である場合はＨＬＡ  Ｉ）の低下を含む。
【０１４７】
当業者により認められるように、機能の低下は、遺伝子から核酸配列を除去するか、配列を他の配列で妨害するか、又は核酸の調節コンポーネントを変化させることを含め、多くの方法において遂行され得る。例えば、関心のある遺伝子のコード領域の全て又は一部を除去し得るか、又は「ナンセンス」配列で置換し得、フレームシフト突然変異を作製し得、プロモーターなどの調節配列の全て又は一部を除去又は置換し得、翻訳開始配列を除去又は置換し得るなどである。
【０１４８】
当業者により認められるように、多能性細胞におけるＭＨＣＩ機能（細胞がヒト細胞である場合はＨＬＡ  Ｉ）の良好な低下は、当技術分野で公知の技術を使用して、及び下に記載のように；例えば、ＨＬＡ複合体に結合する標識される抗体を使用したＦＡＣＳ技術；例えばヒト主要組織適合ＨＬＡクラスＩ抗原のアルファ鎖に結合する市販のＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ抗体を使用して、測定され得る。
【０１４９】
Ｂ２Ｍ変化
一実施形態では、多能性幹細胞、本明細書中で開示されるヒト配列、におけるＨＬＡ−Ｉ活性の低下は、β−２ミクログロブリン遺伝子の発現を破壊することにより行われる。この変化は一般に本明細書中で、遺伝子「ノックアウト」と呼び、本発明のＨＩＰ細胞において、これは宿主細胞において両アレル上で行われる。一般に、両破壊を行うための技術は同じである。
【０１５０】
特に有用な実施形態は、遺伝子を破壊するためにＣＲＩＳＰＲ技術を使用する。一部の例では、遺伝子のコード領域に小さい欠失／挿入を導入するためにＣＲＩＳＰＲ技術が使用され、機能的タンパク質が産生されないようになり、しばしば、フレームシフト突然変異の結果、停止コドンが生じ、短縮された非機能的タンパク質が作製されるようになる。
【０１５１】
従って、有用な技術は、マウスでのＢ２Ｍ遺伝子又はヒトでのＢ２Ｍ遺伝子のコード配列を標的とするために設計されるＣＲＩＳＰＲ配列を使用することである。遺伝子編集後、遺伝子移入したｉＰＳＣ培養物を単一細胞に解離させる。単一細胞をフルサイズのコロニーになるように増殖させ、ＣＲＩＳＰＲ切断部位からの異常な配列の存在についてスクリーニングすることによりＣＲＩＳＰＲ編集について試験する。両アレルで欠失があるクローンを拾う。このようなクローンは、ＰＣＲにより示されるようにＢ２Ｍを発現せず、ＦＡＣＳ分析により示されるようにＨＬＡ−Ｉを発現しなかった（例えば実施例１及び６参照）。
【０１５２】
Ｂ２Ｍ遺伝子が不活性化されているか否かを試験するためのアッセイは公知であり、本明細書中に記載されている。一実施形態では、本アッセイは、Ｂ２Ｍタンパク質に対する抗体で探索する、細胞溶解物のウエスタンブロットである。別の実施形態では、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）又は逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、不活性変化の存在を確認する。
【０１５３】
さらに、ＨＬＡ  Ｉ複合体が細胞表面上で発現されないことを確認するために細胞を試験し得る。これは、上で論じるような１つ以上のＨＬＡ細胞表面構成成分に対する抗体を使用して、ＦＡＣＳ分析によりアッセイされ得る。
【０１５４】
両アレルでＢ２Ｍ遺伝子を抑制しようとする場合、他のものでは不良な結果であったことは注目すべきことである。例えばＧｏｒｎａｌｕｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｄｏｉ／１０．１０３８／ｎｂｔ．３８６０）を参照。
【０１５５】
２．ＨＬＡ−ＩＩ低下
ＨＬＡ  Ｉの低下に加えて、本発明のＨＩＰ細胞は、ＭＨＣ  ＩＩ機能（細胞がヒト由来の場合はＨＬＡ  ＩＩ）も欠く。
【０１５６】
当業者により認められるように、機能の低下は、遺伝子からの核酸配列の除去、遺伝子への核酸配列の付加、読み枠の破壊、配列を他の配列で妨害すること又は核酸の調節コンポーネントの変化を含む、多くの方法で遂行され得る。一実施形態では、関心のある遺伝子のコード領域の全て又は一部を除去し得るか又は「ナンセンス」配列で置換し得る。別の実施形態では、プロモーターなどの調節配列を除去又は置換し得、翻訳開始配列を除去又は置換し得るなどである。
【０１５７】
多能性細胞又はそれらの派生物におけるＭＨＣ  ＩＩ機能（細胞がヒト由来の場合はＨＬＡ  ＩＩ）の低下の成功は、タンパク質に対する抗体を使用してウエスタンブロッティング、ＦＡＣＳ技術、ＲＰＡ技術、ＲＴ−ＰＣＲ技術などの当技術分野で公知の技術を使用して測定され得る。
【０１５８】
ＣＩＩＴＡの変化
一実施形態では、ＨＬＡ−ＩＩ活性の低下は、多能性幹細胞においてＣＩＩＴＡ遺伝子の発現を破壊することにより行われ、そのヒト配列は本明細書中で示す。この変化は一般に、本明細書中で遺伝子「ノックアウト」と呼ばれ、本発明のＨＩＰ細胞において、宿主細胞中の両アレル上で行われる。
【０１５９】
ＣＩＩＴＡ遺伝子が不活性化されているか否かを試験するためのアッセイは公知であり、本明細書中に記載される。一実施形態では、本アッセイは、ＣＩＩＴＡタンパク質に対する抗体で探索する細胞溶解物のウエスタンブロットである。別の実施形態では、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）又は逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、不活性化する変化の存在を確認する。
【０１６０】
さらに、ＨＬＡ  ＩＩ複合体が細胞表面上で発現されないことを確認するために、本細胞を試験し得る。再び、このアッセイは当技術分野で公知のように行われ（ＰＣＴ／ＵＳ１８／１３６８８号明細書、例えばＰＣＴ／ＵＳ１８／１３６８８号明細書の図２１参照）、一般に、下で概説されるようなヒトＨＬＡクラスＩＩ  ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ及び殆どのＤＱ抗原に結合する市販抗体に基づいて、ウエスタンブロット又はＦＡＣＳ分析の何れかを使用して行われる。
【０１６１】
特に有用な実施形態は、ＣＩＩＴＡ遺伝子を破壊するためにＣＲＩＳＰＲ技術を使用する。全てのＭＨＣ  ＩＩ分子に対する必須の転写因子である、マウスにおけるＣｉｉｔａ遺伝子又はヒトにおけるＣＩＩＴＡ遺伝子のコード配列を標的とするためにＣＲＩＳＰＲを設計した。遺伝子編集後、遺伝子移入したｉＰＳＣ培養物を単一細胞に解離させた。これらをフルサイズのコロニーに増殖させ、ＣＲＩＳＰＲ切断部位からの異常な配列の存在についてスクリーニングすることによりＣＲＩＳＰＲ編集の成功について試験した。欠失のあるクローンは、ＰＣＲにより判定した場合、ＣＩＩＴＡを発現せず、ＦＡＣＳ分析により判定した場合、ＭＨＣ  ＩＩ／ＨＬＡ−ＩＩを発現しなかった。
【０１６２】
３．マクロファージ食作用及び／又はＮＫ細胞殺傷の低下
ＨＬＡ  Ｉ及びＩＩ（又はＭＨＣ  Ｉ及びＩＩ）の減少に加えて、一般的にはＢ２Ｍ及びＣＩＩＴＡノックアウトを使用して、本発明のＨＩＰ細胞は、マクロファージ食作用及びＮＫ細胞殺傷に対する感受性が低下している。得られたＨＩＰ細胞は、１つ以上のＣＤ４７トランス遺伝子により、免疫マクロファージ及び自然経路を「回避する」。
【０１６３】
ＨＩＰ細胞及びＨＩＰ細胞由来の細胞がＮＫ細胞殺傷及び／又はマクロファージ食作用を逃れるか又は回避するための能力は、ＰＣＴ／ＵＳ１８／１３６８８号明細書の図１４Ａ〜１４Ｃ及び３４Ａ〜３４Ｃで示され、その内容、特に図面、図面の説明及び実施例が本明細書中で参照により組み込まれる。例えば、図１４Ｂ〜１４Ｃは、マウスＨＩＰ細胞（例えばＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ＣＤ４７トランスジェニックマウスｉＰＳＣ）がＮＫ細胞によるＣＤ１０７ａ発現の誘導ができず、従ってＮＫ細胞応答を惹起しなかったことを示す。さらに、このようなマウスＨＩＰ細胞がＮＫ細胞の活性化又はＩＦＮγの放出を誘導しなかったことが示された。ＮＫ細胞をＨＩＰ細胞由来の分化細胞（内皮細胞、平滑筋細胞及び心筋細胞など）と温置した場合、ＮＫ細胞応答は誘導されなかった（例えばＰＣＴ／ＵＳ１８／１３６８８号明細書の図３４Ａ〜３４Ｃ）を参照。
【０１６４】
ＣＤ４７発現上昇
一部の実施形態では、マクロファージ食作用及びＮＫ細胞殺傷感受性の低下は、ＨＩＰ細胞表面上でのＣＤ４７上昇によるものである。これは、「ノックイン」又はトランスジェニック技術を使用して当業者により認められるように、いくつかの方法で行われる。一部の例では、ＣＤ４７発現上昇は、１つ以上のＣＤ４７導入遺伝子によるものである。
【０１６５】
従って、一部の実施形態では、ＣＤ４７遺伝子の１コピー以上をＨＩＰ細胞に誘導性又は構成的プロモーターの制御下で付加するが、後者が好ましい。一部の実施形態では、レンチウイルスコンストラクトが本明細書中で記載のように使用されるか、又は当技術分野で公知である。ＣＤ４７遺伝子は、当技術分野で公知のような適切なプロモーターの制御下で、宿主細胞のゲノムに組み込み得る。
【０１６６】
Ｂ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ｉＰＳＣからＨＩＰ細胞株を作製した。ブラストサイジンマーカーを使用して、ＣＤ４７を発現するレンチウイルスベクターを含有する細胞を選択した。ＣＤ４７遺伝子配列を合成し、ブラストサイジン耐性があるプラスミドレンチウイルスｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５にＤＮＡをクローニングした（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）。
【０１６７】
一部の実施形態では、内在性ＣＤ４７遺伝子の調節配列を変化させることにより、例えば構成的プロモーターへと、又は異なる誘導性プロモーターへと、内在性プロモーターを交換することにより、ＣＤ４７遺伝子の発現を上昇させ得る。これは一般にＣＲＩＳＰＲなどの公知の技術を使用して行われ得る。
【０１６８】
変化させたら、抗ＣＤ４７抗体を使用した、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡアッセイ又はＦＡＣＳアッセイなど、実施例に記載のものなどの公知の技術を使用して、十分なＣＤ４７発現の存在をアッセイし得る。一般に、「十分」は、この文脈において、ＮＫ細胞殺傷及び／又はマクロファージ食作用を抑制するＨＩＰ細胞表面上でのＣＤ４７の発現の上昇を意味する。それらのＭＨＣ  Ｉが排除されると、細胞上の天然発現レベルが低すぎてＮＫ細胞溶解からそれらを保護できない。
【０１６９】
４．自殺遺伝子
一部の実施形態では、本発明は、「自殺遺伝子」又は「自殺スイッチ」を含む低免疫原性多能性細胞（ＨＩＰ細胞）を提供する。これらは、望ましくない方式で増殖し、分裂する場合に低免疫原性多能性細胞の死を引き起こし得る「安全スイッチ」として機能するように組み込まれる。「自殺遺伝子」消失アプローチは、特異的な化合物により活性化された場合のみ細胞死滅を引き起こすタンパク質をコードする遺伝子移入ベクターにおいて自殺遺伝子を含む。自殺遺伝子は、選択的に無毒性化合物を強毒性代謝産物に変換する酵素をコードし得る。この結果は、酵素を発現する細胞を特異的に除去している。一部の実施形態では、自殺遺伝子はヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子であり、トリガーはガンシクロビルである。他の実施形態では、自殺遺伝子はエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＥＣ−ＣＤ）遺伝子であり、トリガーは５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）である（両者ともそれらの全体において参照により本明細書中で組み込まれる、Ｂａｒｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐ．２０（１０）：１９３２−１９４３（２０１２），Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．８：７３−８（１９９８））。
【０１７０】
他の実施形態では、自殺遺伝子は誘導性カスパーゼタンパク質である。誘導性カスパーゼタンパク質は、アポトーシスを誘導可能なカスパーゼタンパク質の少なくとも一部を含む。一実施形態では、カスパーゼタンパク質の一部は配列番号６で例示される。好ましい実施形態では、誘導性カスパーゼタンパク質はｉＣａｓｐ９である。これは、ヒトカスパーゼ９をコードする遺伝子に一連のアミノ酸を通じて連結される、Ｆ３６Ｖ突然変異がある、ヒトＦＫ５０６−結合タンパク質、ＦＫＢＰ１２の配列を含む。ＦＫＢＰ１２−Ｆ３６Ｖは、低分子二量体化剤ＡＰ１９０３に高い親和性で結合する。従って本発明でのｉＣａｓｐ９の自殺機能は二量体誘導化合物（ＣＩＤ）の投与により惹起される。一部の実施形態では、ＣＩＤは低分子薬ＡＰ１９０３である。二量体化はアポトーシスの迅速な誘導を引き起こす。（それぞれがそれらの全体において本明細書中に参照により組み込まれる、国際公開第２０１１１４６８６２号パンフレット；Ｓｔａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ  ３６５；１８（２０１１）；Ｔｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１３：９１３−９２４（２００７）参照）。
【０１７１】
５．ＨＩＰ細胞表現型に対するアッセイ及び多能性の保持
ＨＩＰ細胞が作製されたら、一般に本明細書中に及び実施例に記載のように、これらをそれらの低免疫原性及び／又は多能性保持についてアッセイし得る。
【０１７２】
例えば、ＰＣＴ／ＵＳ１８／１３６８８号明細書の図１３及び図１５で例示されるような多くの技術を使用して、低免疫原性をアッセイし得る。これらの技術には、同種宿主への移植及び宿主免疫系を回避するＨＩＰ細胞増殖（例えば奇形腫）についての監視が含まれる。ルシフェラーゼを発現させるために、ＨＩＰ派生物に対して形質導入を行い、次に生体発光イメージングを使用して追跡し得る。同様に、ＨＩＰ細胞が宿主動物において免疫反応を引き起こさないことを確認するために、ＨＩＰ細胞に対する宿主動物のＴ細胞及び／又はＢ細胞応答を試験する。Ｅｌｉｓｐｏｔ、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、ＰＣＲ又はマスサイトメトリー（ＣＹＴＯＦ）によってＴ細胞機能を評価する。ＦＡＣＳ又はルミネックスを使用して、Ｂ細胞応答又は抗体応答を評価する。さらに又は或いは、一般にＰＣＴ／ＵＳ１８／１３６８８号明細書の図１４Ａ〜１４Ｃで示されるように、自然免疫応答、例えばＮＫ細胞殺傷を回避するためのその能力について細胞をアッセイし得る。インビトロ又はインビボでＮＫ細胞リトリティック（ｌｙｔｏｌｙｔｉｃ）活性を評価する（図１５で示されるように）。
【０１７３】
同様に、多くの方法で多能性の保持が試験される。一実施形態では、一般に本明細書中に記載され、ＰＣＴ／ＵＳ１８／１３６８８号明細書の図２９で示されるように、ある種の多能性特異的な因子の発現によって、多能性をアッセイする。さらに又は或いは、多能性の指標としてＨＩＰ細胞を１つ以上の細胞タイプに分化させる。
【０１７４】
Ｄ．ＨＩＰ細胞の好ましい実施形態
ＨＩＰ細胞として又はＨＩＰ細胞の分化産物としての何れかでヒト患者などの同種宿主に移植された場合に多能性を示すが宿主免疫応答を生じさせない低免疫原性多能性幹細胞（「ＨＩＰ細胞」）が本明細書中で提供される。
【０１７５】
一実施形態では、ヒト多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）は、ａ）各アレルでのＢ２Ｍ遺伝子の破壊（例えばＢ２Ｍ−／−）、ｂ）各アレルでのＣＩＩＴＡ遺伝子の破壊（例えばＣＩＩＴＡ−／−）及びｃ）ＣＤ４７遺伝子の過剰発現（ＣＤ４７＋、例えばＣＤ４７遺伝子の１つ以上のさらなるコピーを導入すること又はゲノム遺伝子を活性化することを通じて）により低免疫原性が付与される。これにより、ｈｉＰＳＣ集団Ｂ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇが付与される。好ましい実施形態では、細胞は非免疫原性である。別の実施形態では、ＨＩＰ細胞に、上記のようであるが、必要なときにインビボで細胞を死滅させるために誘導される誘導性自殺遺伝子を含むことによりさらに修飾される非免疫原性Ｂ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇが与えられる。
【０１７６】
Ｅ．ＨＩＰ細胞の維持
作製されたら、ｉＰＳＣの維持のために知られているようにＨＩＰ細胞を未分化状態に維持し得る。例えば分化を防ぎ、多能性を維持する培地を使用してマトリゲル上でＨＩＰ細胞を培養する。
【０１７７】
一部の実施形態では、ＨＩＰ細胞を凍結保存する。異なる細胞タイプへの分化前に細胞を凍結保存し得る。言い換えると、分化前に、本明細書中に記載のＨＩＰ細胞を凍結融解し、分化方法に供する前に培養する。他の実施形態では、ＨＩＰ細胞は分化前に凍結保存しない。一部の実施形態では、分化したＨＩＰ細胞を患者への投与前に凍結保存する。他の実施形態では、分化したＨＩＰ細胞を患者への投与前に凍結保存しない。
【０１７８】
Ｆ．ＨＩＰ細胞の分化
本発明は、対象への続く移植のために異なる細胞タイプに分化させるＨＩＰ細胞を提供する。当業者により認められるように、分化のための方法は、公知の技術を使用して所望の細胞タイプに依存する。懸濁液中で細胞を分化させ、次に細胞生存を促進するためにマトリゲル、ゼラチン又はフィブリン／トロンビン形態などのゲルマトリクス形態に入れる。当技術分野で公知のように、例えば、一般に細胞特異的マーカーの存在を評価することによって分化をアッセイする。
【０１７９】
一部の実施形態では、肝細胞機能の喪失又は肝臓の肝硬変に対処するために、ＨＩＰ細胞を肝細胞に分化させる。ＨＩＰ細胞を肝細胞に分化させるために使用され得る多くの技術がある；例えばそれらの全体において、及び特に分化のための方法及び試薬に対して、参照により本明細書により明確に全て組み込まれる、Ｐｅｔｔｉｎａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｐｒｅ３２８８８，Ｓｎｙｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ６９８：３０５−３１４（２０１１），Ｓｉ−Ｔａｙｅｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ５１：２９７−３０５（２０１０）及びＡｓｇａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｖ（：４９３−５０４（２０１３）を参照。一般に関連する肝細胞及び／又はアルブミン、アルファフェトプロテイン及びフィブリノーゲンを含むが限定されない特異的なマーカーの存在を評価することによって、当技術分野で公知のように分化をアッセイする。アンモニアの代謝、ＬＤＬ貯蔵及び取り込み、ＩＣＧ取り込み及び放出及びグリコーゲン貯蔵など、分化は機能面でも測定され得る。
【０１８０】
一部の実施形態では、Ｉ型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）に対処するための移植用にＨＩＰ細胞をベータ様細胞又は膵島オルガノイドに分化させる。細胞系はＴ１ＤＭに対処するための有望な方法であり、例えば参照により本明細書中で組み込まれるＥｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｄｏｉ／１０．１０３８／ｎｒｇａｓｔｒｏ．２０１７．９３を参照。さらにＰａｇｌｉｕｃａ  ｅｔ  ａｌ．は、ｈｉＰＳＣからのβ細胞分化の成功について報告している（その全体において、及び特にヒト多能性幹細胞からの機能的ヒトβ細胞の大規模産生についてそこで概説される方法及び試薬に対して、参照により本明細書によって組み込まれるｄｏｉ／１０．１０６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１４．０９．０４０を参照）。さらに、Ｖｅｇａｓ  ｅｔ  ａｌ．は、ヒト多能性幹細胞からのヒトβ細胞の産生と、その後の宿主による免疫拒絶を回避するための封入を示す；（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４０３０、その全体において、特にヒト多能性幹細胞からの機能的ヒトβ細胞の大規模産生についてそこで概説される方法及び試薬に対して、参照により本明細書によって組み込まれる）。
【０１８１】
一般に、インスリンを含むが限定されないβ細胞関連の又は特異的なマーカーの存在を評価することによって、当技術分野で公知のように分化をアッセイする。グルコース代謝の測定など、分化はまた機能面でも測定され得、一般的にはその全体において、及び具体的にはそこで概説されるバイオマーカーに対して、参照により本明細書によって組み込まれるＭｕｒａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｓ．２０１６．０９．００２を参照。
【０１８２】
ｄＨＩＰベータ細胞を作製したら、門脈／肝臓、網、胃腸粘膜、骨髄、筋肉又は皮下嚢にこれらを移植し得る（細懸濁液として、又は本明細書中で論じるようなゲルマトリクス内の何れかで）。
【０１８３】
一部の実施形態では、視力を脅かす眼疾患に対処するために、ＨＩＰ細胞を網膜色素上皮（ＲＰＥ）に分化させる。その全体において、及び特に分化技術及び試薬についてそこで概説される方法及び試薬に対して、参照により本明細書によって組み込まれるＫａｍａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２０１４：２：２０５−１８で概説される技術を使用して、ヒト多能性幹細胞をＲＰＥ細胞に分化させた；ＲＰＥ細胞のシート作製のための技術及び患者への移植に対してその全体においてまた組み込まれるＭａｎｄａｉ  ｅｔ  ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ１６０８３６８も参照。
【０１８４】
当技術分野で公知のように、一般的には、ＲＰＥ関連及び／又は特異的なマーカーの存在を評価することにより、又は機能性を測定することにより、分化をアッセイし得る。例えばその全体において、及び具体的には結果セクションの第１段落で概説されるマーカーに対して、参照により本明細書によってまた組み込まれるＫａｍａｏ  ｅｔ  ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍｃｒ．２０１３．１２．００７も参照。
【０１８５】
一部の実施形態では、心血管系疾患に対処するためにＨＩＰ細胞を心筋細胞に分化させる。カーディオミオクト（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｔｅ）のｈｉＰＳＣの分化について、技術は当技術分野で公知であり、実施例で論じる。当技術分野で公知のように、一般に心筋細胞関連の又は特異的なマーカーの存在を評価することによって、又は機能面を測定することによって分化をアッセイし得る；例えばその全体において、及び具体的に心筋細胞を含む幹細胞を分化させる方法に対して、参照により本明細書によって組み込まれるＬｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．Ｃｅｌｌ．２０１６．０６．００１を参照。
【０１８６】
一部の実施形態では、新しい血管を形成させて末梢動脈性疾患に対処するために、内皮コロニー形成細胞（ＥＣＦＣ）へとＨＩＰ細胞を分化させる。内皮細胞を分化させるための技術は公知である。例えば、その全体において、及び具体的にはヒト多能性幹細胞からの内皮細胞の作製のため、及びまた移植技術のための方法及び試薬に対して、参照により組み込まれるＰｒａｓａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３０４８を参照。一般に内皮細胞関連又は特異的マーカーの存在を評価することにより、又は機能面で測定することにより、当技術分野で公知のように分化をアッセイし得る。
【０１８７】
一部の実施形態では、自己免疫甲状腺炎に対処するために、甲状腺祖先細胞及び甲状腺ホルモンを分泌し得る甲状腺濾胞オルガノイドへとＨＩＰ細胞を分化させる。甲状腺細胞を分化させるための技術は当技術分野で公知である。例えばその全体において、及び具体的にはヒト多能性幹細胞からの甲状腺細胞作製のための方法及び試薬に対して、及びまた移植技術に対して、参照により本明細書によって明確に組み込まれる、Ｋｕｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１５．０９．００４を参照。一般的に、甲状腺細胞に関連するか又は特異的なマーカーの存在を評価することにより、又は機能面で測定することにより、当技術分野で公知のように分化をアッセイし得る。
【０１８８】
ＶＩＩＩ．ＨＩＰ細胞由来の低免疫心臓細胞
一部の実施形態では、心臓細胞は、本明細書中に記載のＨＩＰ細胞由来である。例えばヒト心臓細胞は、ヒトＨＩＰ細胞を分化させることによって作製され得る。同様に、マウス心臓細胞はマウスＨＩＰ細胞を分化させることによって作製され得る。このような心臓細胞は低免疫心臓細胞である。
【０１８９】
誘導又は胚性多能性幹細胞を心臓細胞に分化させるための有用な方法が、例えば米国特許第２０１７０１５２４８５号明細書、同第２０１７００５８２６３号明細書、同第２０１７０００２３２５号明細書、同第２０１６０３６２６６１号明細書、同第２０１６００６８８１４号明細書、同第９０６２２８９号明細書、同第７８９７３８９号明細書及び同第７４５２７１８号明細書に記載される。
【０１９０】
誘導又は胚性多能性幹細胞から心臓細胞を作製するためのさらなる方法は、例えばＸｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００６，１５（５）：６３１−９、Ｂｕｒｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，２０１２，１０：１６−２８及びＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ，２０１５，１５（２）：３６５−３７５に記載される。
【０１９１】
様々な実施形態において、ＨＩＰ細胞（例えばマウスＨＩＰ細胞及びヒトＨＩＰ細胞）は、ＢＭＰ経路阻害剤、ＷＮＴシグナル伝達活性化因子、ＷＮＴシグナル伝達阻害剤、ＷＮＴアゴニスト、ＷＮＴアンタゴニス、Ｓｒｃ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＰＣＫ活性化因子、サイトカイン、増殖因子、心臓作用物質、化合物などを含む培地中で培養され得る。
【０１９２】
ＷＮＴシグナル伝達活性化因子としてはＣＨＩＲ９９０２１が挙げられるが限定されない。ＰＣＫ活性化因子としてはＰＭＡが挙げられるが限定されない。ＷＮＴシグナル伝達阻害剤としては、ＫＹ０２１１１、ＳＯ３０３１（ＫＹ０１−Ｉ）、ＳＯ２０３１（ＫＹ０２−Ｉ）及びＳＯ３０４２（ＫＹ０３−Ｉ）及びＸＡＶ９３９から選択される化合物が挙げられるが限定されない。Ｓｒｃ阻害剤としてはＡ４１９２５９が挙げられるが限定されない。ＥＧＦＲ阻害剤としてはＡＧ１４７８が挙げられるが限定されない。
【０１９３】
ｉＰＳＣから心臓細胞を作製するための物質の非限定例としては、アクチビンＡ、ＢＭＰ−４、Ｗｎｔ３ａ、ＶＥＧＦ、可溶性ｆｒｉｚｚｌｅｄタンパク質、シクロスポリンＡ、アンジオテンシンＩＩ、フェニレフリン、アスコルビン酸、ジメチルスルホキシド、５−アザ−２’−デオキシシチジンなどが挙げられる。
【０１９４】
本発明の細胞は、心臓細胞へのＨＩＰ細胞の分化を支持及び／又は促進するために、合成面などの面上で培養され得る。一部の実施形態では、この面は、選択される１つ以上のアクリラート単量体のホモポリマー又はコポリマーを含むが限定されないポリマー物質を含む。アクリラート単量体及びメタクリラート単量体の非限定例としては、テトラ（エチレングリコール）ジアクリラート、グリセロールジメタクリラート、１，４−ブタンジオールジメタクリラート、ポリ（エチレングリコール）ジアクリラート、ジ（エチレングリコール）ジメタクリラート、テトラ（エチレングリコール）ジメタクリラート、１，６−ヘキサンジオールプロポキシラートジアクリラート、ネオペンチルグリコールジアクリラート、トリメチロールプロパンベンゾアートジアクリラート、トリメチロールプロパンエトキシラート（１ＥＯ／ＯＨ）メチル、トリシクロ［５．２．１．０２，６］デカン−ジメタノールジアクリラート、ネオペンチルグリコールエトキシラートジアクリラート及びトリメチロールプロパントリアクリラートが挙げられる。アクリラートは、当技術分野で公知のように合成されるか又はＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．及びＳａｒｔｏｍｅｒ，Ｉｎｃなどの市販業者から入手される。
【０１９５】
ポリマー性物質は、支持物質の表面上に分散され得る。細胞を培養するのに適切な有用な支持物質は、セラミック物質、ガラス、プラスチック、ポリマー又はコポリマー、それらの何らかの組み合わせ又は別の物質上のある物質のコーティングを含む。一部の例では、ガラスとしては、ソーダ石灰ガラス、パイレックスガラス、ｖｙｃｏｒガラス、石英ガラス、ケイ素又はこれらの誘導体などが挙げられる。
【０１９６】
一部の例では、プラスチック又は樹状ポリマーを含むポリマーとしては、ポリ（塩化ビニル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（メチルメタクリラート）、ポリ（ビニル酢酸−マレイン酸無水物）、ポリ（ジメチルシロキサン）モノメタクリラート、環状オレフィンポリマー、フルオロカーボンポリマー、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンイミン又はこれらの誘導体などが挙げられる。一部の例では、コポリマーとしては、ポリ（ビニル酢酸−コ−マレイン酸無水物）、ポリ（スチレン−コ−マレイン酸無水物）、ポリ（エチレン−コ−アクリル酸）又はこれらの誘導体などが挙げられる。
【０１９７】
本発明の改変心臓細胞としては、心筋細胞、結節心筋細胞、伝導性心筋細胞、作業心筋細胞、心筋細胞前駆体、心筋細胞祖先細胞、心臓幹細胞及び心臓筋肉細胞が挙げられるが限定されない。一部の実施形態では、心筋細胞前駆体は、成熟（最終段階）心筋細胞を含む子孫を生じさせることが可能である（脱分化又は初期化なし）細胞を指す。心筋細胞前駆細胞は、ＧＡＴＡ−４、Ｎｋｘ２．５及び転写因子のＭＥＦ−２ファミリーから選択される１つ以上のマーカーを使用して同定され得ることが多い。一部の例では、心筋細胞は、次のリストからの１つ以上のマーカー（時として少なくとも３又は５個のマーカー）を発現する未熟心筋細胞又は成熟心筋細胞を指す：心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）、心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）、サルコメアミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ＧＡＴＡ−４、Ｎｋｘ２．５、Ｎ−カドヘリン、β１−アドレノセプター（β１−ＡＲ）、ＡＮＦ、転写因子のＭＥＦ−２ファミリー、クレアチンキナーゼＭＢ（ＣＫ−ＭＢ）、ミオグロビン又は心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）。一部の実施形態では、改変心臓細胞は自発的な周期的収縮活性を示す。一部の例では、適切なＣａ２＋濃度及び電解質バランスである適切な組織培養環境中で心臓細胞を培養する場合、培地に何らかさらなる構成成分を添加することなく、細胞が細胞の１つの軸を横断して周期的に収縮し、次いで収縮から解放されることが観察され得る。一部の実施形態では、心臓細胞は低免疫心臓細胞である。
【０１９８】
処置なしで左心室壁組織の５５％を瘢痕組織にする心臓クライオインジャリーに対する動物モデルにおいて、本明細書中で記載のように調製される心臓細胞の有効性を評価し得る（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．６２：６５４，１９９６；Ｓａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．８：２０７４，１９９９，Ｓａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１１８：７１５，１９９９）。処置の成功によって、瘢痕の面積が減少し、瘢痕の拡大が制限され、収縮期、拡張期及び最大圧により判定した場合、心臓機能が改善し得る。心臓損傷はまた、左前下行枝動脈の遠位部分で塞栓形成コイルを使用してモデルを作製し得（Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．７：２３９，１９９８）、処置の有効性を組織学及び心臓機能により評価し得る。
【０１９９】
一部の実施形態では、改変心臓細胞（例えば低免疫心臓細胞）を患者、例えばそれを必要とするヒト患者に投与する。小児心筋症、加齢性心筋症、拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、慢性虚血性心筋症、周産期心筋症、炎症性心筋症、他の心筋症、心筋炎、心筋虚血性再灌流障害、心室機能不全、心不全、うっ血性心不全、冠動脈疾患、末期心疾患、アテローム性動脈硬化症、虚血、高血圧、再狭窄、狭心症、リウマチ性心臓、動脈炎又は循環器疾患に罹患している患者に心臓細胞を投与し得る。一部の例では、患者は心筋梗塞になっている。特定例では、患者は冠動脈バイパス術を受けている。
【０２００】
組織及び／又は単離細胞を心臓に移植するために、周知の外科手術技術を使用して患者に改変心臓細胞を移植し得る。一部の実施形態では、注射（例えば心筋内注射、冠動脈内注射、経心内膜注射、経心外膜注射、経皮的注射）、点滴及び移植によって細胞を患者の心臓組織に導入する。
【０２０１】
改変心臓細胞の投与（送達）としては、皮下又は、静脈内、動脈内（例えば冠動脈内）、筋肉内、腹腔内、心筋内、経心内膜、経心外膜、鼻腔内投与並びにクモ膜下腔を含む非経口及び点滴技術が挙げられるが限定されない。
【０２０２】
一部の実施形態では、改変心臓細胞を投与された患者に心臓薬も投与する。併用療法での使用に適切な心臓薬の代表的な例としては、増殖因子、増殖因子をコードするポリヌクレオチド、血管新生剤、カルシウムチャネル遮断剤、降圧剤、有糸分裂阻害薬、イノトロピック剤（ｉｎｏｔｒｏｐｉｃ  ａｇｅｎｔ）、抗アテローム剤、抗凝固薬、ベータブロッカー、抗不整脈剤、抗炎症剤、血管拡張薬、血栓溶解剤、心臓グリコシド、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、原虫阻害物質、ナイトレート、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、脳ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）；抗悪性腫瘍薬、ステロイドなどが挙げられるが限定されない。
【０２０３】
様々な方法において本発明の方法による治療の効果を監視し得る。例えば、処置の有効性を判定するために心電図（ＥＣＧ）又はホルターモニターを利用し得る。ＥＣＧは、心臓リズム及び電気インパルスの目安であり、治療が対象の心臓で電気的状態の崩壊を改善又は維持したか、予防したか又は遅延させたか否かを判定するための非常に有効な非侵襲的方法である。心臓の異常、不整脈障害などを監視するために長時間にわたり装着され得るホルター心電図、携帯型ＥＣＧの使用も、治療の有効性を評価するための信頼性の高い方法である。心室機能の改善を判定するためにＥＣＧ又は核研究を使用し得る。
【０２０４】
当業者により認められるように、細胞タイプ及びこれらの細胞の最終的な用途の両方に依存する当技術分野で公知の技術を使用して、分化させたＨＩＰ派生物を移植する。一般に、患者において静脈内で又は特定の位置での注射の何れかにより、本発明の分化したＨＩＰ細胞を移植する。特定の位置に移植した場合、それらを維持しながら分散を防ぐためにゲルマトリクス中で細胞を懸濁し得る。
【０２０５】
ＩＸ．ＨＩＰ細胞由来の内皮細胞
一部の実施形態では、内皮細胞は本明細書中に記載のＨＩＰ細胞由来である。例えば、ヒトＨＩＰ細胞を分化させることによりヒト内皮細胞を作製し得る。同様に、マウスＨＩＰ細胞を分化させることによりマウス内皮細胞を作製し得る。このような内皮細胞は低免疫内皮細胞である。
【０２０６】
誘導又は胚性多能性幹細胞を内皮細胞に分化させるための有用な方法は、例えば米国特許出願公開第２００４／０００９５８９号明細書、国際公開第２０１１／０９０６８４号パンフレット及び同第２０１２／００６４４０号パンフレットに記載される。
【０２０７】
様々な実施形態で、ＧＳＫ３阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＢＭＰ経路阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＷＮＴシグナル伝達活性化因子、ＷＮＴシグナル伝達阻害剤、ＷＮＴアゴニスト、ＷＮＴアンタゴニス、Ｓｒｃ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＰＣＫ活性化因子、サイトカイン、増殖因子、内皮細胞分化化合物、内皮細胞促進化合物などを含む培地中でＨＩＰ細胞（例えばマウスＨＩＰ細胞及びヒトＨＩＰ細胞）を培養し得る。
【０２０８】
ＷＮＴシグナル伝達活性化因子（例えばＧＳＫ３阻害剤）としてはＣＨＩＲ−９９０２１が挙げられるが限定されない。ＰＣＫ活性化因子としてはＰＭＡが挙げられるが限定されない。ＷＮＴシグナル伝達阻害剤としては、ＫＹ０２１１１、ＳＯ３０３１（ＫＹ０１−Ｉ）、ＳＯ２０３１（ＫＹ０２−Ｉ）及びＳＯ３０４２（ＫＹ０３−Ｉ）及びＸＡＶ９３９から選択される化合物が挙げられるが限定されない。Ｓｒｃ阻害剤としてはＡ４１９２５９が挙げられるが限定されない。ＥＧＦＲ阻害剤としてはＡＧ１４７８が挙げられるが限定されない。
【０２０９】
ｉＰＳＣから内皮細胞を作製するための物質の非限定例としては、アクチビンＡ、ＢＭＰ−４、Ｗｎｔ３ａ、ＶＥＧＦ、可溶性ｆｒｉｚｚｌｅｄタンパク質、シクロスポリンＡ、アンジオテンシンＩＩ、フェニレフリン、アスコルビン酸、ジメチルスルホキシド、５−アザ−２’−デオキシシチジンなどが挙げられる。
【０２１０】
ＨＩＰ細胞の低免疫内皮細胞への分化を支持及び／又は促進するための合成面など、面上で本発明の細胞を培養し得る。一部の実施形態では、この面は、選択される１つ以上のアクリラート単量体のホモポリマー又はコポリマーを含むが限定されないポリマー材料を含む。アクリラート単量体及びメタクリラート単量体の非限定例としては、テトラ（エチレングリコール）ジアクリラート、グリセロールジメタクリラート、１，４−ブタンジオールジメタクリラート、ポリ（エチレングリコール）ジアクリラート、ジ（エチレングリコール）ジメタクリラート、テトラ（エチレングリコール）ジメタクリラート、１，６−ヘキサンジオールプロポキシラートジアクリラート、ネオペンチルグリコールジアクリラート、トリメチロールプロパンベンゾアートジアクリラート、トリメチロールプロパンエトキシラート（１  ＥＯ／ＯＨ）メチル、トリシクロ［５．２．１．０２，６］デカン−ジメタノールジアクリラート、ネオペンチルグリコールエトキシラートジアクリラート及びトリメチロールプロパントリアクリラートが挙げられる。アクリラートは当技術分野で公知のように合成されるか又はＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．及びＳａｒｔｏｍｅｒ，Ｉｎｃ．などの市販業者から得られる。
【０２１１】
一部の実施形態では、ポリマーマトリクス上に内皮細胞を播種し得る。一部の例では、ポリマーマトリクスは生体分解性である。適切な生体分解性マトリクスは当技術分野で周知であり、コラーゲン−ＧＡＧ、コラーゲン、フィブリン、ＰＬＡ、ＰＧＡ及びＰＬＡ／ＰＧＡコポリマーが挙げられる。さらなる生体分解性物質としては、ポリ（無水物）、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（プロピルフメラート）、ポリ（カプロラクトン）、ポリアミド、ポリアミノ酸、ポリアセタール、生体分解性ポリシアノアクリラート、生体分解性ポリウレタン及び多糖類が挙げられる。
【０２１２】
非生体分解性ポリマーも使用され得る。他の非生体分解性、また生体適合性ポリマーとしては、ポリピロール、ポリアニリン、ポリチオフェン、ポリスチレン、ポリエステル、非生体分解性ポリウレタン、ポリ尿素、ポリ（エチレン酢酸ビニル）、ポリプロピレン、ポリメタクリラート、ポリエチレン、ポリカーボネート及びポリ（エチレンオキシド）が挙げられる。ポリマーマトリクスは、例えば粒子、スポンジ、チューブ、球、鎖、コイル状鎖、毛細管ネットワーク、フィルム、繊維、メッシュ又はシートとして、何らかの形状で形成され得る。天然又は合成細胞外マトリクス材料及び因子を含むようにポリマーマトリクスを修飾し得る。
【０２１３】
支持材料の面上にポリマー性物質を分散させ得る。細胞培養に適切な有用な支持材料としては、セラミック物質、ガラス、プラスチック、ポリマー又はコポリマー、それらの何らかの組み合わせ又は別の物質上のある物質のコーティングが挙げられる。一部の例では、ガラスとしては、ソーダ石灰ガラス、パイレックスガラス、ｖｙｃｏｒガラス、石英ガラス、ケイ素又はこれらの誘導体などが挙げられる。
【０２１４】
一部の例では、樹状ポリマーを含むプラスチック又はポリマーとしては、ポリ（塩化ビニル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（メチルメタクリラート）、ポリ（ビニル酢酸−マレイン酸無水物）、ポリ（ジメチルシロキサン）モノメタクリラート、環状オレフィンポリマー、フルオロカーボンポリマー、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンイミン又はこれらの誘導体などが挙げられる。一部の例では、コポリマーとしては、ポリ（ビニル酢酸−コ−マレイン酸無水物）、ポリ（スチレン−コ−マレイン酸無水物）、ポリ（エチレン−コ−アクリル酸）又はこれらの誘導体などが挙げられる。
【０２１５】
本発明の改変内皮細胞は１つ以上の内皮細胞マーカーを発現し得る。このようなマーカーの非限定例としては、ＶＥ−カドヘリン（ＣＤ１４４）、ＡＣＥ（アンジオテンシン変換酵素）（ＣＤ１４３）、ＢＮＨ９／ＢＮＦ１３、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）、ＣＤ６２Ｅ（Ｅ−セレクチン）、ＣＤ１０５（エンドグリン）、ＣＤ１４６、エンドカン（ＥＳＭ−１）、Ｅｎｄｏｇｌｙｘ−１、エンドムチン、エオタキシン−３．ＥＰＡＳ１（内皮ＰＡＳドメインタンパク質１）、第ＶＩＩＩ因子関連抗原、ＦＬＩ−１、Ｆｌｋ−１（ＫＤＲ、ＶＥＧＦＲ−２）、ＦＬＴ−１（ＶＥＧＦＲ−１）、ＧＡＴＡ２、ＧＢＰ−１（グアニル酸−結合タンパク質−１）、ＧＲＯ−アルファ、ＨＥＸ、ＩＣＡＭ−２（細胞間接着分子２）、ＬＭ０２、ＬＹＶＥ−１、ＭＲＢ（マジックラウンドアバウト）、ヌクレオリン、ＰＡＬ−Ｅ（パソロジスク・アナトミー・ライデン−エンドセリウム（ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｃｈｅ  ａｎａｔｏｍｉｅ  Ｌｅｉｄｅｎ−ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ））、ＲＴＫ、ｓＶＣＡＭ−１、ＴＡＬＩ、ＴＥＭ１（腫瘍内皮マーカー１）、ＴＥＭ５（腫瘍内皮マーカー５）、ＴＥＭ７（腫瘍内皮マーカー７）、トロンボモジュリン（ＴＭ、ＣＤ１４１）、ＶＣＡＭ−１（血管細胞接着分子−１）（ＣＤ１０６）、ＶＥＧＦ（血管内皮胞増殖因子）、ｖＷＦ（フォン・ヴィルブランド因子）、ＺＯ−１、内皮細胞−選択的接着分子（ＥＳＡＭ）、ＣＤ１０２、ＣＤ９３、ＣＤ１８４、ＣＤ３０４及びＤＬＬ４が挙げられる。
【０２１６】
内皮細胞としては、内皮祖先細胞、毛細血管内皮細胞、動脈内皮細胞、静脈内皮細胞、リンパ血管内皮細胞、他の血管内皮細胞、大動脈内皮細胞、脳血管関門の内皮細胞、心臓内皮細胞、腎臓内皮細胞及び肝臓内皮細胞が挙げられるが限定されない。異なる内皮細胞のタイプ及び特徴は、Ａｔｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，ａｎｄ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１１，３１：１４７６−１４８４及び米国特許第５，９８０，０８８号明細書に記載されている。一部の実施形態では、本発明の単離改変内皮細胞は、血管内皮細胞、脳内皮細胞、腎臓内皮細胞及び大動脈内皮細胞からなる群から選択される。好ましい実施形態では、内皮細胞は毛細血管内皮細胞である。
【０２１７】
一部の実施形態では、障害／状態を処置するか若しくは障害／状態の症状を回復させるのに有用な、酵素、ホルモン、受容体、リガンド又は薬物などであるが限定されない関心のあるタンパク質をコードする外因性遺伝子を発現させるために、改変内皮細胞が遺伝子修飾される。内皮細胞を遺伝子修飾するための標準的方法は例えば米国特許第５，６７４，７２２号明細書に記載されている。
【０２１８】
このような内皮細胞は、疾患の予防又は処置に有用なポリペプチド又はタンパク質の構成的合成及び送達を提供するために使用され得る。このように、ポリペプチドは個体の血流又は身体の他の領域（例えば中枢神経系）に直接分泌される。一部の実施形態では、インスリン、血液凝固因子（例えば第ＶＩＩＩ因子又はフォン・ヴィルブランド因子）、アルファ−１抗トリプシン、アデノシンデアミナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、インターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３）などを分泌させるために、内皮細胞が修飾され得る。
【０２１９】
ある一定の実施形態では、移植される移植片との関連でそれらの性能を改善する方法で改変内皮細胞を修飾し得る。非限定的代表例としては、腔内血餅形成を防ぐための血小板溶解薬の分泌又は発現、平滑筋肥大による管腔狭窄を防ぐための平滑筋増殖の阻害剤の分泌及び内皮細胞増殖を刺激するための内皮細胞分裂促進因子又は自己分泌因子の発現及び／又は分泌及び移植片管腔の内皮細胞の裏打ちの広がり又は持続時間の改善が挙げられる。
【０２２０】
一部の実施形態では、特異的な臓器又は肢への分泌生成物の治療レベルの送達のために改変内皮細胞を利用する。例えば、インビトロで改変された（形質転換された）内皮細胞で裏打ちされた血管移植物を特異的な臓器又は肢に移植し得る。形質導入された内皮細胞の分泌生成物は、灌流される組織に対して高濃度で送達され、それにより標的とされる解剖学的位置に所望の効果を到達させる。
【０２２１】
他の実施形態では、血管形成する腫瘍において内皮細胞により発現されるときに血管形成を破壊又は阻害する遺伝子を含有させるために、改変内皮細胞を遺伝子修飾する。一部の例では、腫瘍処置の完了時に移植された内皮細胞の負の選択を可能にする、本明細書中に記載の選択可能な自殺遺伝子の何れか１つを発現させるためにも内皮細胞を遺伝子修飾し得る。
【０２２２】
一部の実施形態では、改変内皮細胞を患者、例えばそれを必要とするヒト患者に投与する。循環器疾患、血管疾患、末梢血管疾患、虚血性疾患、心筋梗塞、うっ血性心不全、末梢血管閉塞性疾患、脳卒中、再灌流障害、虚血肢、神経障害（例えば末梢神経障害又は糖尿病性神経障害）、臓器不全（例えば肝不全、腎不全など）、糖尿病、関節リウマチ、骨粗しょう症、血管損傷、組織損傷、高血圧、冠動脈疾患による狭心症及び心筋梗塞、腎臓血管高血圧、腎臓動脈狭窄による腎不全、下肢の跛行などであるが限定されない疾患又は状態に罹患している患者に内皮細胞を投与し得る。ある一定の実施形態では、患者は、一部の例では脳血管疾患によるものであり得る一過性虚血性発作又は脳卒中に罹患したことがあるか又は罹患している。一部の実施形態では、例えばアテローム性動脈硬化症、心筋梗塞及び虚血肢で起こるような組織虚血を処置するために、及び損傷血管を修復するために、改変内皮細胞を投与する。一部の例では、移植片の生体工学で細胞を使用する。
【０２２３】
例えば、虚血性組織の修復、血管及び心臓弁の形成、人工血管の改変、損傷のある血管の修復及び改変組織での血管形成の誘導（例えば移植前）のための細胞療法において改変内皮細胞を使用し得る。さらに、腫瘍を標的とし、処置するための薬剤を送達するために内皮細胞をさらに修飾し得る。
【０２２４】
具体的な実施形態では、血管細胞又は血管新生を必要とする組織に対する修復又は置換の方法が本明細書中で提供される。この方法は、このような組織での血管新生を促進するために、このような処置を必要とするヒト患者に単離内皮細胞を含有する組成物を投与することを含む。血管細胞又は血管新生を必要とする組織は、とりわけ、心臓組織、肝臓組織、膵臓組織、腎臓組織、筋肉組織、神経組織、骨組織であり得、これらは、損傷があり、過剰な細胞死を特徴とする組織、損傷のリスクがある組織又は人工的に改変された組織であり得る。
【０２２５】
ある一定の実施形態では、血管再建術で使用される人工移植物（例えばＤａｃｒｏｎ及びＧｏｒｔｅｘなどの合成物質から形成される血管）を改善するために改変内皮細胞を使用する。例えば、人工動脈移植物は、生体臓器又は肢を灌流する疾患のある動脈を置換するために使用されることが多い。他の実施形態では、人工心臓弁の表面をカバーして弁の表面の血栓形成性を低下させることにより塞栓形成のリスクを低下させるために改変内皮細胞を使用する。
【０２２６】
組織及び／又は単離細胞を血管に移植するための周知の外科的技術を使用して、改変内皮細胞を患者に移植し得る。一部の実施形態では、注射（例えば心筋内注射、冠動脈内注射、経心内膜注射、経心外膜注射、経皮的注射）、点滴、埋め込み及び移植によって、患者の心臓組織に細胞を導入する。
【０２２７】
改変内皮細胞の投与（送達）としては、静脈内、動脈内（例えば冠動脈内）、筋肉内、腹腔内、心筋内、経心内膜、経心外膜、鼻腔内投与並びにくも膜下腔内及び点滴技術を含む皮下又は非経口が挙げられるが限定されない。
【０２２８】
当業者により認められるように、細胞タイプ及びこれらの細胞の最終的な用途の両方に依存する当技術分野で公知の技術を使用して、分化したＨＩＰ派生物を移植する。一般に、静脈内で又は患者の特定の位置での注射によるかの何れかで本発明の分化したＨＩＰ細胞を移植する。特定の位置で移植する場合、それらが定着する一方で分散を防ぐためにゲルマトリクス中で細胞を懸濁し得る。
【０２２９】
Ｘ．ＨＩＰ細胞由来の低免疫ドーパミン作動性ニューロン
一部の実施形態では、ドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロンは本明細書中に記載のＨＩＰ細胞由来である。例えば、ヒトＨＩＰ細胞を分化させることによりヒトＤＡニューロンを作製し得る。同様に、マウスＨＩＰ細胞を分化させることによりマウスＤＡニューロンを作製し得る。このようなＤＡニューロンは低免疫ＤＡニューロンである。
【０２３０】
多能性幹細胞をＤＡニューロンに分化させるための有用な方法は、例えば米国特許第９，９６８，６３７号明細書及び同第７，６７４，６２０号明細書に記載されており、この開示は、本願を含めそれらの全体において、本明細書中で参照により組み込まれる。ヒト多能性幹細胞からＤＡ細胞を作製するためのさらなる方法は、例えばＫｉｍ，Ｊ．−Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００２，４１８，５０−５６；Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ，Ｌ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００２，９９（４），２３４４−２３４９；Ｇｒｏｗ，Ｄ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１６，５（９）：１１３３−４４及びＣｈｏ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００８，１０５：３３９２−３３９７で見出され得る。
【０２３１】
「ドーパミン作動性ニューロン」という用語は、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ドーパミン合成に対する律速酵素を発現する神経細胞を指す。好ましくは、ドーパミン作動性ニューロンは神経伝達物質ドーパミンを分泌し、ドーパミン−β−ヒドロキシラーゼの発現は僅かであるか又はない。ドーパミン作動性ニューロンは、次のうち１つ以上を発現し得る：ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、１−芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ、小胞モノアミン輸送体２、ドーパミン輸送体、Ｎｕｒｒ−１及びドーパミン−２受容体（Ｄ２受容体）。ドーパミン作動性ニューロンは、神経幹細胞、神経祖先細胞、未熟ドーパミン作動性ニューロン及び成熟ドーパミン作動性ニューロンを含む。
【０２３２】
「神経幹細胞」という用語は、神経細胞経路に沿って部分的に分化し、例えばネスチンを含むいくつかの神経マーカーを発現する多能性細胞のサブセットを指す。神経幹細胞は、ニューロン又はグリア細胞（例えば星状細胞及び乏突起膠細胞）に分化し得る。「神経祖先細胞」という用語は、ＦＯＸＡ２及び低レベルのβ−チューブリンを発現するが、チロシンヒドロキシラーゼを発現しない（即ちＦＯＸＡ２＋／β−チューブリンＬＯ／ＴＨ−表現型を有する）培養された細胞を指す。このような神経祖先細胞は、例えば本明細書中に記載のものなど、適切な因子の培養時に、様々な神経サブタイプ；特に様々なドーパミン作動性神経サブタイプを分化させる能力を有する。
【０２３３】
増殖培地中でＨＩＰ細胞及びＨＩＰ細胞由来のＤＡニューロンを培養し得る。例示的な増殖培地としては、ヒト胚性幹細胞培地（ｈＥＳＣ培地）、ダルベッコ改変イーグル培地哺乳動物細胞培地（ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｒ（ＫＯＳＲ）、最小必須培地イーグル−アルファ改変（アルファＭＥＭ）、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ＤＭＥＭ（ＫＯ−ＤＭＥＭ）、Ｎ−２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＭＳ−５間質性細胞培地などが挙げられるが限定されない。
【０２３４】
ＤＡニューロンの分化、増殖、拡大、維持及び／又は成熟を促進する有用な添加物としては、Ｗｎｔ１、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、ＦＧＦ８、ＦＧＦ８ａ、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）、ＴＧＦ−β３、インターロイキン１ベータ（ＩＬ１β）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ＧＳＫ−３阻害剤（例えばＣＨＩＲ−９９０２１）、ＴＧＦ−β阻害剤（例えばＳＢ−４３１５４２）、Ｂ−２７サプリメント、ドルソモルフィン、プルモルファミン、ノギン、レチノイン酸、ｃＡＭＰ、アスコルビン酸、ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、ニュールツリン、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、Ｎ−アセチルシステイン、ｃ−キットリガンド、その修飾形態、その模倣物、その類似体及びその変異体が挙げられるが限定されない。一部の実施形態では、ＷＮＴ経路、ＮＯＴＣＨ経路、ＳＨＨ経路、ＢＭＰ経路、ＦＧＦ経路、ＴＧＦβ経路などを活性化又は阻害する１つ以上の因子の存在下でＤＡニューロンを分化させる。分化プロトコール及びその詳細な記載は、例えば米国特許第９，９６８，６３７号明細書及び同第７，６７４，６２０号明細書、Ｋｉｍ，Ｊ．−Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００２，４１８，５０−５６；Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ，Ｌ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００２，９９（４），２３４４−２３４９；Ｇｒｏｗ，Ｄ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１６，５（９）：１１３３−４４及びＣｈｏ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００８，１０５：３３９２−３３９７で提供され、発明を実施するための形態、実施例、方法、オンライン方法及び結果を含むそれらの全体での開示が本明細書中で参照により組み込まれる。
【０２３５】
ＤＡ分化の特徴を調べ、監視し、ＤＡ表現型を評価するために、分子及び遺伝子マーカーの何れかの数の発現が評価され得る。例えば遺伝子マーカーの存在は、当業者にとって公知の様々な方法により決定され得る。分子マーカー発現は、ｑＰＣＲに基づくアッセイ、免疫アッセイ、免疫細胞化学アッセイ、免疫ブロッティングアッセイなどであるが限定されない定量法によって決定され得る。
【０２３６】
ＤＡニューロンのための代表的なマーカーとしては、ＴＨ、β−チューブリン、ペアードボックスタンパク質（Ｐａｘ６）、インスリン遺伝子エンハンサータンパク質（ＩＳＬ１）、ネスチン、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、Ｇタンパク質活性化内向き整流カリウムチャネル２（ＧＩＲＫ２）、微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ−２）、核内受容体関連１タンパク質（ＮＵＲＲ１）、ドーパミン輸送体（ＤＡＴ）、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）、ＦＯＸ３、ダブルコルチン及びＬＩＭホメオボックス転写因子１−ベータ（ＬＭＸ１Ｂ）などが挙げられる。
【０２３７】
ＤＡニューロンは、細胞電気生理学的メーカー（ｍａｋｅｒ）によっても評価され得る。細胞の電気生理学は、当業者にとって公知のアッセイを使用することによって評価され得る。例えば、全細胞及び穿孔処理パッチクランプ、細胞の電気生理学的活性を検出するためのアッセイ、細胞の活動電位の大きさ及び持続時間を測定するためのアッセイ及びＤＡ細胞のドーパミン産生を検出するための機能アッセイである。
【０２３８】
一部の実施形態では、ＤＡニューロン分化は、自発的な律動的活動電位及び脱分極電流の注入時のスパイク周波数順応（ｓｐｉｋｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ａｄａｐｔｉｏｎ）を伴う高周波活動電位を特徴とする。他の実施形態では、ＤＡ分化はドーパミン産生を特徴とする。産生されるドーパミンのレベルは、その最大振幅の半分に到達した点の活動電位の幅（スパイクの最大幅の半分）を測定することにより計算される。
【０２３９】
一部の実施形態では、神経変性疾患又は状態を処置するために、ＨＩＰ細胞由来のＤＡニューロンを患者、例えばヒト患者に投与する。一部の例では、神経変性疾患又は状態はパーキンソン病、ハンチントン病及び多発性硬化症からなる群から選択される。他の実施形態では、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、トゥレット症候群（ＴＳ）、統合失調症、精神病及びうつなどの精神神経障害の１つ以上の症状を処置するか又は寛解させるためにＤＡニューロンを使用する。また他の実施形態では、ＤＡニューロン障害がある患者を処置するためにＤＡニューロンを使用する。
【０２４０】
患者において静脈内で又は特定の位置への注射よるかの何れかで、分化したＤＡニューロンを移植し得る。一部の実施形態では、変性によりパーキンソン病（ＰＤ）が起こるＤＡニューロンを置き換えるために、分化したＤＡ細胞を脳の、黒質（特に緻密な領域に又はその隣）、腹側被蓋野の領域（ＶＴＡ）、尾状核、被殻、側坐核、視床下核又は何らかのそれらの組み合わせに移植する。分化したＤＡ細胞を細胞懸濁液として標的領域に注入し得る。或いは、このような送達装置に含有される場合、分化したＤＡ細胞を支持マトリクス又は足場に埋め込み得る。一部の実施形態では、足場は生体分解性である。他の実施形態では、足場は生体分解性ではない。足場は天然又は合成（人工）材料を含み得る。
【０２４１】
細胞組成物の治療処方物の一般的な原理は、参照により本明細書中で具体的に組み込まれるＣｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｇ．Ｍｏｒｓｔｙｎ  ＆  Ｗ．Ｓｈｅｒｉｄａｎ  ｅｄｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６及びＨｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｅ．Ｂａｌｌ，Ｊ．Ｌｉｓｔｅｒ  ＆  Ｐ．Ｌａｗ，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，２０００で見出される。一部の実施形態では、分化したＤＡニューロンは医薬組成物の形態で供給される。リポソーム、微粒子又はマイクロカプセルなどであるが限定されない適切なビヒクルを使用することにより、ＤＡニューロンの送達を達成し得る。他の実施形態では、分化したＤＡニューロンは、等張賦形剤を含む医薬組成物中で投与される。本医薬組成物は、ヒト投与のために十分に無菌的な条件下で調製される。
【０２４２】
当業者により認められるように、分化したＨＩＰ派生物は、細胞タイプ及びこれらの細胞の最終的な用途の両方に依存する当技術分野で公知の技術を使用して移植されるか又は植え込まれる。一般に、患者の特定の位置に本発明の分化したＨＩＰ細胞を移植又は注入する。特定の位置に移植した場合、それらが定着する一方で分散を防ぐために細胞をゲルマトリクス中で懸濁し得る。
【０２４３】
ＸＩ．ＨＩＰ細胞由来の低免疫膵島細胞
一部の実施形態では、膵島細胞（膵臓ベータ細胞とも呼ばれる）は本明細書中に記載のＨＩＰ細胞由来である。例えば、ヒトＨＩＰ細胞を分化させることによりヒト膵島細胞を作製し得る。同様に，マウスＨＩＰ細胞分化させることによりマウス膵島細胞を作製し得る。このような膵島細胞は低免疫膵島細胞である。
【０２４４】
一部の実施形態では、膵島細胞は、本明細書中に記載のＨＩＰ細胞由来である。膵島細胞への多能性幹細胞の分化に有用な方法は、例えば米国特許第９，６８３，２１５号明細書、同第９，１５７，０６２号明細書及び同第８，９２７，２８０号明細書に記載される。
【０２４５】
一部の実施形態では、本明細書中で開示されるような方法により作製される膵島細胞はインスリンを分泌する。一部の実施形態では、膵島細胞は、例えば限定されないがグルコースに応答したインスリン分泌及びベータ細胞マーカーの発現など、内在性膵島細胞の少なくとも２つの特徴を示す。
【０２４６】
代表的なベータ細胞マーカー又はベータ細胞前駆マーカーとしては、ｃ−ペプチド、Ｐｄｘ１、グルコース輸送担体２（Ｇｌｕｔ２）、ＨＮＦ６、ＶＥＧＦ、グルコキナーゼ（ＧＣＫ）、プロホルモンコンバターゼ（ＰＣ１／３）、Ｃｄｃｐ１、ＮｅｕｒｏＤ、Ｎｇｎ３、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、Ｎｋｘ６．２、Ｐａｘ４、Ｐａｘ６、Ｐｔｆｌａ、Ｉｓｌ１、Ｓｏｘ９、Ｓｏｘ１７及びＦｏｘＡ２が挙げられるが限定されない。
【０２４７】
一部の実施形態では、単離膵島細胞は、グルコース上昇に応答してインスリンを産生する。様々な実施形態では、単離膵島細胞は、グルコース上昇に応答してインスリンを分泌する。一部の実施形態では、細胞は、玉石細胞形態及び／又は約１７μｍ〜約２５μｍの直径などの個別の形態を有する。
【０２４８】
一部の実施形態では、低免疫膵島細胞にＨＩＰ細胞を分化させる方法は、ＦＧＦ１０を含む培地中でＨＩＰ幹細胞を培養することを含む。一部の例では、培地は、角化細胞増殖因子（ＫＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）；トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦα）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦβ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、Ｗｎｔ３ａ、アクチビンＡ、Ｎｏｄａｌ、ＫＡＡＤ−ＣＹＣ、（塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、ニコチンアミド、インドラタム（ｉｎｄｏｌａｔａｍ）Ｖ、ＨＤＡＣ阻害剤、ＩＤＥ１及びＩＤＥ２からなる群から選択される１つ以上の分化因子を含む。一部の実施形態では、次の：インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＥＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）及び血管内皮胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦβ）スーパーファミリー、骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ２）、骨形成タンパク質−７（ＢＭＰ７）、ＧＳＫ３β阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＢＭＰ１型受容体阻害剤、レチノイン酸及び何らかのそれらの組み合わせのうち１つ以上を含む培地中で細胞を培養することにより、ＨＩＰ細胞を膵島細胞に分化させ得る。
【０２４９】
一部の実施形態では、単独で本明細書中で記載のように、低免疫多能性幹細胞（ＨＩＰ細胞）集団を式（Ｉ）の化合物の１つ以上、例えばＩＤＥ１又はＩＤＥ２に接触させ得るか又は曝露し得、他の実施形態では、多能性幹細胞集団は、米国特許第８，９２７，２８０号明細書に開示されるような式（Ｉ）の化合物と多能性細胞を接触させるのと同時に（例えばそれと組み合わせて）、それに続いて又はその前の何れかで、少なくとも１個のさらなる物質と接触させ得る。
【０２５０】
一部の実施形態では、米国特許第８，９２７，２８０号明細書で開示されるような式（Ｉ）の化合物と組み合わせた使用のためのさらなる化合物としては、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦβ）ファミリーメンバー（例えばＮｏｄａｌ又はアクチビンＡ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーメンバー（例えばＦＧＦ１０）、Ｗｎｔ増殖因子ファミリーメンバー（例えばＷｎｔ３ａ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）及び／又はＡＫＴ／ＰＩ３Ｋ経路のメンバーの物質が挙げられ得るが限定されない。ＴＧＦ−ベータ３／ＢＭＰ経路の定義及び詳細は、当技術分野、例えばＫａｗａｂａｔａ  Ｍ．及びＭｉｙａｚｏｎｏ  Ｋ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ），１２５，９−１６（１９９９）；Ｗｒａｎａ  Ｊ．Ｌ．，Ｍｉｎｅｒ．Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ  Ｍｅｔａｂ．，２４，１２０−１３０（１９９８）；及びＭａｒｋｏｗｉｔｚ  Ｓ．Ｄ．及びＲｏｂｅｒｔｓ  Ａ．Ｂ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．，７，９３−１０２（１９９６）で開示される。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、シクロパミン、ＴＧＦファミリーメンバー（ＴＧＦ−アルファ、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＴＧＦ−β−１、ＴＧＦ−ベータ−３）、エキセンディン４、ニコチンアミド、ｎ−ブチラート、ＤＭＳＯ、全トランス型レチノイン酸、ＧＬＰ−Ｉ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ４）、他の増殖因子（ＥＧＦ、ベータセルリン、成長ホルモン、ＨＧＦ）、他のホルモン（プロラクチン、コレシトキニン（ｃｈｏｌｅｃｙｔｏｋｉｎｉｎ）、ガストリンＩ、胎盤性ラクトゲン）、ＴＧＦ−βファミリーアンタゴニスト（ノギン、フォリスタチン、コーディン）、ＩＢＭＸ、ワートマニン、デキサメタゾン、Ｒｅｇ、ＩＮＧＡＰ、ｃＡＭＰ又はｃＡＭＰ活性化因子（フォルスコリン）及び／又は細胞外マトリクス構成成分（ラミニン、フィブロネクチン）を含むが限定されない、少なくとも１つのさらなる化合物又は因子と組み合わせて式（Ｉ）の化合物、例えばＩＤＥ１及び／又はＩＤＥ２、に曝露され得る。
【０２５１】
一部の実施形態では、細胞を膵島細胞に分化させるために、ＨＩＰ細胞を少なくとも１つのヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤（例えばクラスＩ／ＩＩ  ＨＤＡＣ阻害剤）と接触させる。ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）は、アセチル基をヒストンにおいてｅ−Ｎ−アセチルリジンアミノ酸から除去する酵素のクラスである。代表的なＨＤＡＣとしては、クラスＩ  ＨＤＡＣ：ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８；及びクラスＩＩ  ＨＤＡＣ：ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７Ａ、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０が挙げられる。Ｉ型哺乳動物ＨＤＡＣとしては、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８及びＨＤＡＣ１１が挙げられる。ＩＩ型哺乳動物ＨＤＡＣとしては、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９及びＨＤＡＣ１が挙げられる。
【０２５２】
多くのＨＤＡＣの負の制御因子の構造クラス（例えばＨＤＡＣ阻害剤）が開発され、例えば低分子量カルボキシラート（例えば約２５０ａｍｕ未満）、ヒドロキサミン酸、ベンズアミド、エポキシケトン、環状ペプチド及びハイブリッド分子である（例えばその全体において参照により本明細書によって組み込まれるＤｒｕｍｍｏｎｄ  Ｄ  Ｃ，Ｎｏｂｌｅ  Ｃ  Ｏ，Ｋｉｒｐｏｔｉｎ  Ｄ  Ｂ，Ｇｕｏ  Ｚ，Ｓｃｏｔｔ  Ｇ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ａｓ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔｓ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ４５：４９５−５２８，（本明細書中の具体例を含む）を参照）。Ｉ／ＩＩ型ＨＤＡＣの負の制御因子の非限定例としては、ヒドロキサム酸スベロイルアニリド（ＳＡＨＡ（例えばＭＫ０６８３、ボリノスタット）及び他のヒドロキサム酸）、ＢＭＬ−２１０、デプデシン（例えば，（−）−デプデシン）、ＨＣトキシン、Ｎｕｌｌｓｃｒｉｐｔ（４−（１，３−ジオキソ−１Ｈ，３Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］イソキノリン−２−イル）−Ｎ−ヒドロキシブタンアミド）、フェニルブチラート（例えばフェニル酪酸ナトリウム）及びバルプロ酸（（ＶＰＡ）及び他の短鎖脂肪酸）、スクリプタイド、スラミンナトリウム、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、ＡＰＨＡ化合物８、アピシジン、酪酸ナトリウム、酪酸ピバロイルオキシメチル（Ｐｉｖａｎｅｘ、ＡＮ−９）、トラポキシンＢ、クラミドシン、デプシペプチド（ＦＲ９０１２２８又はＦＫ２２８としても知られる）、ベンズアミド（例えばＣＩ−９９４（即ちＮ−アセチルジナリン）及びＭＳ−２７−２７５）、ＭＧＣＤ０１０３、ＮＶＰ−ＬＡＱ−８２４、ＣＢＨＡ（ｍ−カルボキシケイ皮酸ビスヒドロキサミン酸）、ＪＮＪ１６２４１１９９、ツバシン、Ａ−１６１９０６、プロキサミド、オキサムフラチン、３−Ｃｌ−ＵＣＨＡ（即ち６−（３−クロロフェニルウレイド）カプロンヒドロキサム酸）、ＡＯＥ（２−アミノ−８−オキソ−９，１０−エポキシデカン酸）、ＣＨＡＰ３１、ＣＨＡＰ５０、ＩＤＥ１及びＩＤＥ２が挙げられる。他の阻害剤としては、例えばＨＤＡＣのドミナントネガティブ形態（例えば触媒的に不活性な形態）、ＨＤＡＣのｓｉＲＮＡ阻害剤及びＨＤＡＣに特異的に結合する抗体が挙げられる。阻害剤は、例えばＢＩＯＭＯＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｆｕｋａｓａｗａ、Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ、Ｇｌｏｕｃｅｓｔｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ａｔｏｎ  Ｐｈａｒｍａ、Ｔｉｔａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  ＡＧ、Ｐｈａｒｍｉｏｎ、ＭｅｔｈｙｌＧｅｎｅ及びＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている。一部の実施形態では、ＩＤＥ１又はＩＤＥ２は好ましいヒストンデアセチラーゼ阻害剤である。
【０２５３】
例えば細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の１つ又は複数の構成成分とＨＩＰ細胞の単層を重ねて接触させることにより、ＨＩＰ細胞の分化を達成し得る。一部の実施形態では、ラミニン、例えばラミニン１；コラーゲン、例えばコラーゲンＩＶ；エンタクチン；ヘパリン硫酸プロテオグリカン；ナイドジェンの１つ以上である細胞外マトリクス構成成分とＨＩＰ細胞の層を接触させる。細胞外マトリクス構成成分は、基底膜由来物質、例えば、細胞、例えば腫瘍細胞、例えばＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）腫瘍細胞、が沈着した基底膜であり得る。一部の実施形態では、細胞外マトリクス構成成分は、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎから市販されているマトリゲル（商標）である。細胞外構成成分は、１つ以上の増殖因子、１つ以上のマトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、例えばＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３及びそれらの組み合わせをさらに含み得る。
【０２５４】
少なくとも１、２、３、５、７、１０、１２、１４、１６、１８、２１、２５、２８、３０、３５、４０、４２、４８、５０日又はそれを超える期間にわたり、細胞外マトリクス又は細胞外マトリクスの１つ又は複数の構成成分の存在下でＨＩＰ細胞を培養し得る。
【０２５５】
一部の実施形態では、ＨＩＰ由来膵島細胞は、患者、例えばそれを必要とするヒト患者に投与され得る。一部の例では、患者は、このような細胞を使用して処置され得る疾患、障害又は状態を有する。言い換えると、ＨＩＰ由来膵島細胞の投与は、当技術分野で周知のように、インスリン代謝に付随する少なくとも１つの有害作用又は症状を軽減又は緩和し得る。一部の実施形態では、患者は、インスリン機能異常のためにグルコース利用が異常である疾患を含み得る不十分なインスリン活性を特徴とする疾患を有する。インスリン機能異常は、インスリン産生（例えば発現及び／又は細胞小器官を通じた輸送、例えばβ細胞喪失の結果起こるインスリン欠乏など）；分泌（例えばインスリン分泌応答の障害）；インスリン分子そのものの形態（例えば一次、二次又は三次構造）；標的細胞におけるインスリンの効果（例えば末梢組織を含む体の組織でのインスリン抵抗性）；及びインスリンに対する標的細胞の応答における何らかの異常性又は機能障害を含み得る。
【０２５６】
対象、特にヒト対象に膵島細胞を投与する一般的方法が本明細書中に記載されている。例えば、対象における標的部位への細胞の注入又は移植によって膵島細胞を対象に投与し得る。さらに、対象において細胞の注入又は移植により導入を促進する送達装置に細胞を挿入し得る。このような送達装置としては、チューブ、例えばレシピエント対象の身体に細胞及び液体を注入するためのカテーテルが挙げられる。好ましい実施形態では、チューブはさらに、対象に所望の位置で本発明の細胞が導入され得る針、例えばシリンジを有する。異なる形態で、このような送達装置、例えばシリンジに膵島細胞を挿入し得る。例えば、このような送達装置中に含有される場合、溶液中で細胞を懸濁し得るか又は支持マトリクス中に埋め込まれ得る。
【０２５７】
本明細書中で使用される場合、「溶液」という用語は、本発明の細胞が生存可能なままである薬学的に許容可能な担体又は希釈剤を含む。薬学的に許容可能な担体及び希釈剤としては、生理食塩水、水性緩衝液、溶媒及び／又は分散媒体が挙げられる。このような担体及び希釈剤の使用は当技術分野で周知である。溶液は好ましくは、無菌性であり、細胞及び溶液をシリンジに通し得る程度に流動性である。一部の実施形態では、溶液は、製造及び保管の条件下で安定であり、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの使用を通じて細菌及び真菌などの微生物の混入作用から防御される。このような溶液は、薬学的に許容可能な担体又は希釈剤中で本明細書中に記載の膵島細胞を組み込み、続いて滅菌ろ過することにより調製され得る。
【０２５８】
膵島細胞が組み込まれ得るか又は埋め込まれ得る支持マトリクスとしては、レシピエント適合性であり、レシピエントにとって有害ではない生成物に分解するマトリクスが挙げられる。天然及び／又は合成生体分解性マトリクスは、このようなマトリクスの例である。天然の生体分解性マトリクスとしては、例えば哺乳動物由来の凝固血漿及びコラーゲンマトリクスが挙げられる。合成の生体分解性マトリクスとしては、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル及びポリ乳酸などの合成ポリマーが挙げられる。合成ポリマーの他の例及び細胞をマトリクスに組み込むか又は埋め込む方法は当技術分野で公知である。例えば米国特許第４，２９８，００２号明細書及び同第５，３０８，７０１号明細書を参照。マトリクスは、インビボで脆弱な膵臓細胞に対する支持及び／又は保護を提供する。
【０２５９】
当業者により認められるように、細胞タイプ及びこれらの細胞の最終的用途の両方に依存する当技術分野で公知の技術を使用して、分化したＨＩＰ派生物を移植するか又は植え込む。一般に患者の特定の位置に本発明の分化したＨＩＰ細胞を移植又は注入する。特定の位置に移植した場合、それらが定着する一方で分散を防ぐためにゲルマトリクス中で細胞を懸濁し得る。
【０２６０】
ＸＩＩ．ＨＩＰ細胞由来の低免疫網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞
一部の実施形態では、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞は、本明細書中に記載のＨＩＰ細胞由来である。例えばヒトＲＰＥ細胞は、ヒトＨＩＰ細胞を分化させることにより作製し得る。同様にマウスＲＰＥ細胞はマウスＨＩＰ細胞を分化させることにより作製し得る。このようなＲＰＥ細胞は低免疫ＲＰＥ細胞である。
【０２６１】
本明細書中に記載のＨＩＰ細胞は、ＲＰＥ祖先細胞、未熟ＲＰＥ細胞、成熟ＲＰＥ細胞及び機能的ＲＰＥ細胞を含む網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞に分化し得る。
【０２６２】
胚性多能性幹細胞をＲＰＥ細胞に分化させるための有用な方法は、例えば米国特許第９，４５８，４２８号明細書及び同第９，８５０，４６３号明細書に記載され、それらの全体における開示は、明細書を含め、参照により本明細書中に組み込まれる。ヒト胚又は誘導多能性幹細胞からＲＰＥ細胞を作製するためのさらなる方法は、例えばＬａｍｂａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００６，１０３（３４）：１２７６９−１２７７４；Ｍｅｌｌｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２０１２，３０（４）：６７３−６８６；Ｉｄｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，２００９，５（４）：３９６−４０８；Ｒｏｗｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０１２，２２７（２）：４５７−４６６，Ｂｕｃｈｈｏｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｒａｎｓ  Ｍｅｄ，２０１３，２（５）：３８４−３９３及びｄａ  Ｃｒｕｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，２０１８，３６：３２８−３３７で見出され得る。
【０２６３】
「ＲＰＥ」細胞という用語は、ネイティブＲＰＥ細胞と同様又は実質的に同様である遺伝子発現プロファイルを有する色素網膜上皮細胞を指す。多能性幹細胞由来のこのようなＲＰＥ細胞は、平面基質上で密集するまで増殖させる場合、ネイティブＲＰＥ細胞の多角形の平面シート形態を保持し得る。
【０２６４】
増殖培地中でＨＩＰ細胞及びＨＩＰ細胞由来のＲＰＥ細胞を培養し得る。例示的な増殖培地としては、Ｘ−ＶＩＶＯ  １０（商標）（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５（商標）（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＭＴＥＳＲ２（商標）（幹細胞技術）、ＮＵＴＲＩＳＴＥＭ（商標）（ＳｔｅｍＧｅｎｔ）及びＨＥＳＣＧＲＯ（商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）が挙げられるが限定されない。５〜４０％ゼノフリーＫｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＸＦ−ＫＯＳＲ（商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補給したＬｏｎｚａ  Ｘ−ＶＩＶＯ  １０（商標）、ＭＸ−３０２（Ｂ−２７サプリメント入りのイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ））、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８（商標）培地、ダルベッコ改変イーグル培地哺乳動物細胞培地（ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、最少必須培地イーグル（ＭＥＭ）、Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地１６４０（ＲＰＭＩ−１６４０）、ＭＣＤＢ培地など。
【０２６５】
ＲＰＥ細胞の分化、増殖、拡大、維持及び／又は成熟を促進する有用な添加物としては、ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤（例えばＬＤＮ−１９３１８９、ドルソモルフィン、コーディン、セルブルス（ｃｅｒｂｕｒｕｓ）及びノギン）、ＷＮＴシグナル伝達の阻害剤（例えばＤｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質（ＤＫＫ１）、ＩＷＰ−２、ＩＷＰ−３、ＩＷＰ−４、ＸＡＶ９３９、デクリーテッド（ｄｅｃｒｅｔｅｄ）ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（ＳＦＲＰ１及びＳＦＲＰ２）及びＷｎｔ阻害因子１（ＷＩＦ−１））、ＦＧＦシグナル伝達の阻害剤（例えばＳＵ５４０２、ＡＺＤ４５４７及びＰＤ１７３０７４）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ１）、ニコチンアミド、安息香酸、３−アミノ安息香酸、６−アミノニコチンアミド、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の阻害剤（例えば３−アミノベンズアミド、イニパリブ（ＢＳＩ  ２０１）、オラパリブ（ＡＺＤ−２２８１）及びルカパリブ（ＡＧ０１４６９９、ＰＦ−０１３６７３３８）、ベリパリブ（ＡＢＴ−８８８）、ＣＥＰ９７２２、ＭＫ４８２７及びＢＭＮ−６７３）、ＲＯＣＫ阻害剤（例えばＹ−２７６３２、チアゾビビン、ＧＳＫ４２９２８６Ａ及びファスジル）、塩基性線維芽細胞増殖因子１（ｂＦＧＦ１）、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＳＵＮ１３８３７、Ｆ２Ａ４−Ｋ−ＮＳ、トリコスタチンＡ、アクチビンＡ、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β１、血管作動性腸ペプチド（ＶＩＰ）、フォルスコリン、ロリプラム、Ｂ−２７サプリメント、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、Ｎ２サプリメント、タウリン、プロゲステロン、ビタミンＡ、ブレビスタチン、その修飾形態、その模倣物、その類似体及びその変異体が挙げられるが限定されない。分化プロトコール及びその詳細な説明は、例えばそれらの全体におけるその開示が発明を実施するための形態、実施例、方法、オンライン法及び結果を含め、本明細書中に参照により組み込まれる、米国特許第９，４５８，４２８号明細書及び同第９，８５０，４６３号明細書及びｄａ  Ｃｒｕｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，２０１８，３６：３２８−３３７で提供される。
【０２６６】
一部の実施形態では、低免疫ＲＰＥ細胞を分化させるか、増殖させるか又は細胞培養基質上に固定化する。代表的な細胞培養基質は、次のもの、マトリゲル（商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）などの一般的に使用される基質、マウス胚性線維芽細胞フィード細胞層、ヒト胚性線維芽細胞、ヒト卵管上皮又はヒト包皮線維芽細胞フィーダー層である。Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＥＬＬｓｔａｒｔ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＧＥＬｓｔａｒｔ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＳｔｅｍＡｄｈｅｒｅ（商標）（Ｐｒｉｍｏｒｉｇｅｎ）などであるが限定されない、ゼノフリー基質も使用され得る。さらなる細胞培養基質は、精製ヒトビトロネクチン、組み換えヒトビトロネクチン、組み換えヒトフィブロネクチン（例えばＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）；Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）、精製ヒトラミニン、組み換えラミニン、組み換えラミニン５１１、組み換えラミニン５２１、ポリ−Ｄ−リジンなどを含むものの１つ以上を含み得る。
【０２６７】
ある一定の実施形態では、ＲＰＥ細胞を合成基質などの生体適合性基質上に分化、増殖又は固定させる。非限定基質としては、ポリマー性基質、ポリエステル膜、ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）膜、ポリ（ＤＬ−乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）膜、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）膜、ポリカプロラクトン膜、メチルメタクリラート及びポリ（エチレングリコール）から作製されるエレクトロスピニング人工足場などが挙げられる。代表的な基質は、例えばその全体における開示が本明細書中で参照により組み込まれる米国特許第８，８０８，６８７号明細書に記載される。基質のための適切な材料の代表例としては、パリレンポリプロピレン、ポリイミド、ガラス、ニチノール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、コラーゲン、化学的に処理したコラーゲン、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリ（グリセロール−セバシン酸）ＰＧＳ、ポリ（スチレン−イソブチル−スチレン）、ポリウレタン、エチル酢酸ビニル（ＥＶＡ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、Ｋｙｎａｒ（ポリビニリデンフルオリド；ＰＶＤＦ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリメチルメタクリラート（ＰＭＭＡ）、Ｐｅｂａｘ、アクリリック、ポリオレフィン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）及び他のシリコーンエラストマー、ポリプロピレン、ヒドロキシアペタイト（ｈｙｄｒｏｘｙａｐｅｔｉｔｅ）、チタン、金、銀、白金、他の金属及び合金、セラミック、プラスチック及びそれらの混合物又は組み合わせが挙げられるが限定されない。基質を構築するために使用されるさらなる適切な材料としては、ポリ−パラ−キシレン（例えばパリレンＡ、パリレンＡＭ、パリレンＣ、アンモニア処理パリレン、ポリドーパミンで処理したパリレンＣを含むが限定されないパリレン）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリエチレン−酢酸ビニル、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−トリメチレンカーボネート）、コラーゲン、ヘパリン処理コラーゲン、変性コラーゲン、修飾コラーゲド（ｃｏｌｌａｇｅｄ）（例えばゼラチンを伴うシリコーン）、他の細胞増殖マトリクス（ＳＹＮＴＨＥＭＡＸ（商標）など）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（グリコール酸）及び／又は他のポリマー、コポリマー又はブロックコポリマー、環状アルギニン−グリシン−アスパラギンを含有するポリ（カプロラクトン）、環状又は直鎖状アルギニン−グリシン−アスパラギン酸、ポリカプロラクトン及びポリエチレングリコールのブレンド物（ＰＣＬ−ＰＥＧ）、熱可塑性ポリウレタン、シリコーン修飾ポリエーテルウレタン、ポリ（カーボネートウレタン）又はポリイミドが挙げられるが限定されない。代表的な熱可塑性ポリウレタンは、脂肪族ポリウレタン、芳香族ポリウレタン、ポリウレタンハイドロゲル形成物質、親水性ポリウレタン又はそれらの組み合わせを含み得るポリマー又はコポリマーである。非限定例としては、エラスタン（ポリ（エーテルウレタン））、例えばエラスタン（商標）８０Ａ、Ｌｕｂｒｉｚｏｌ、Ｔｅｃｏｐｈｉｌｉｃ．（商標）、Ｐｅｌｌｅｔｈａｎｅ（商標）、Ｃａｒｂｏｔｈａｎｅ（商標）、Ｔｅｃｏｔｈａｎｅ（商標）、Ｔｅｃｏｐｌａｓｔ（商標）及びＥｓｔａｎｅ（商標）などが挙げられる。シリコーン修飾ポリエーテルウレタンとしては、Ｃａｒｂｏｓｉｌ（商標）２０又はＰｕｒｓｉｌ（商標）２０  ８０Ａなどが挙げられ得る。ポリ（カーボネートウレタン）としては、Ｂｉｏｎａｔｅ（商標）８０Ａ又は同様のポリマーが挙げられ得る。
【０２６８】
一部の実施形態では、基質は生体分解性である。他の実施形態では、基質は非生体分解性である。特定の実施形態では、基質は、１つ以上の生体分解性構成成分及び１つ以上の非生体分解性構成成分を含む。
【０２６９】
ＲＰＥ分化の特徴を調べ、監視し、ＲＰＥ表現型を評価するために、分子及び遺伝子マーカーのいくつかの数の発現を評価し得る。例えば、当業者にとって公知の様々な方法により、遺伝子マーカーの存在を判定し得る。ｑＰＣＲに基づくアッセイ、免疫アッセイ、免疫細胞化学アッセイ、免疫ブロッティングアッセイなどであるが限定されない定量法により分子マーカーの発現を判定し得る。
【０２７０】
ＲＰＥ細胞に対する代表的なマーカーとしては、ペアードボックスタンパク質（Ｐａｘ６）、Ｒａｘホメオボックスタンパク質（Ｒａｘ）、ＬＩＭ／ホメオボックスタンパク質２（Ｌｈｘ２）、ホメオボックスタンパク質ＳＩＸ３、チロシナーゼ酵素（ＴＹＲ）、小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ）、細胞性レチンアルデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）、トリプシン−１（陽イオン性トリプシノーゲン、ＴＹＲＰ１）、トリプシン−２（陰イオン性トリプシノーゲン、ＴＹＲＰ２）、プレメラノソームタンパク質（ＰＭＥＬ１７）、シルバー遺伝子座タンパク質相同体（ＳＩＬＶ）、ｃｅｈ−１０ホメオドメイン含有相同体（Ｃｈｘ１０）、ベストロフィン−１（ＢＥＳＴ）及び網膜色素上皮特異的な６５ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ６５）が挙げられる。
【０２７１】
ＲＰＥ細胞はまた、細胞生理学的マーカー及び形態学的マーカーによっても評価し得る。細胞の形態を調べるために、免疫細胞化学及び電子顕微鏡を使用し得る。当業者にとって公知の機能アッセイを使用してＲＰＥ細胞を評価し得る。例えば、ＨＩＰ細胞由来のＲＰＥ細胞の特徴を調べるために、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）分泌プロファイリング、杆体外節（ＲＯＳ）食作用アッセイ、１１−シスレチノールへのトランスレチノール変換に対するアッセイ、増殖因子の極性分泌を調べるためのアッセイ及び電子障壁を作るタイトジャンクションを検出するためのアッセイを使用し得る。
【０２７２】
分化の一部の実施形態では、多能性幹細胞は神経誘導を受け、１つ以上の網膜前駆細胞マーカー、Ｐａｘ６、Ｒａｘ、Ｌｈｘ２、Ｓｉｘ３又は何らかの他の分子、神経誘導の生理学的又は形態学的マーカーを発現する。他の実施形態では、分化している細胞は、ＲＰＥ特異化を受け、及び／又はロゼット構造を形成する。細胞が分化し続けているので、ロゼット構造は平坦になり未熟ＲＰＥ細胞の層又はシートになり得る。未熟ＲＰＥ細胞の層は、多角形及び／又は六角形の形状の平面状の細胞を含み得る。
【０２７３】
一部の実施形態では、低免疫ＲＰＥを、必要とする患者に移植する。黄斑変性罹患患者又はＲＰＥ細胞損傷患者にＲＰＥ細胞を移植し得る。一部の実施形態では、患者は、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、早期ＡＭＤ、中期ＡＭＤ、後期ＡＭＤ、非血管新生加齢性黄斑変性、萎縮型黄斑変性（萎縮型加齢性黄斑変性）、滲出型黄斑変性（滲出型加齢性黄斑変性）、若年性黄斑変性（ＪＭＤ）（例えばシュタルガルト病、ベスト病及び若年性網膜分離症）、レーバー先天黒内障又は網膜色素変性症を有する。他の実施形態では、患者は網膜剥離に罹患している。
【０２７４】
必要とする患者に移植され得るＲＰＥパッチを作製するために、本明細書中に記載の基質の何れかにＲＰＥ細胞を固定化し得る。ＲＰＥ細胞の１つ以上の層を含むパッチを眼の組織に外科手術により投与するか又は送達し得る。一部の例では、神経網膜又は網膜下の空間にパッチを送達する。ある一定の実施形態では、内視鏡により、カテーテルに基づく方法を介して、血管内に、筋肉内に、又は特定の眼組織のための当技術分野で公知の他の手段により、パッチを送達する。パッチの配置は、立体生物顕微鏡、眼底写真、スペクトルドメイン光干渉断層撮影（ＳＤ−ＯＣＴ）及び当業者により認められる他の方法を使用して決定され得る。
【０２７５】
当業者により認められるように、細胞タイプ及びこれらの細胞の最終的用途の両方に依存する当技術分野で公知の技術を使用して、分化したＨＩＰ派生物を移植するか又は埋め込む。一般に、患者の特定の位置に本発明の分化したＨＩＰ細胞を移植又は注入する。特定の位置に移植する場合、それらが定着する一方で分散することを防ぐために、ゲルマトリクス中で細胞を懸濁し得る。
【０２７６】
本明細書中に記載の本発明がより詳細に理解され得るように、次の実施例を説明する。これらの実施例は単なる例示目的であり、何ら本発明を限定するものとして解釈されるものではないことを理解されたい。
【実施例】
【０２７７】
ＸＩＩＩ．実施例
実施例１：マウス誘導多能性幹細胞の作製
本明細書中に記載の方法の出典はＤｉｅｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ，２０１５，８０８１である。
【０２７８】
マウスのマウス尾部先端の線維芽細胞を分離し、ＩＶ型コラゲナーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）で単離し、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、Ｌ−グルタミン、４．５ｇ／Ｌグルコース、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）とともに、加湿インキュベーター中、３７℃、２０％Ｏ２及び５％ＣＯ２で維持した。
【０２７９】
次にＮｅｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ系を使用し、４個の初期化因子、Ｏｃｔ４、ＫＬＦ４、Ｓｏｘ２及びｃ−Ｍｙｃを発現する新規コドン最適化ミニイントロン（ｍｉｎｉ−ｉｎｔｒｏｎｉｃ）プラスミド（ｃｏ−ＭＩＰ）（ＤＮＡ１０〜１２μｍ）を使用して、１ｘ１０６個のマウス線維芽細胞を初期化した。遺伝子移入後、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー層上に線維芽細胞を播種し、酪酸ナトリウム（０．２ｍＭ）及び５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸の添加により線維芽細胞培地中で維持した。
【０２８０】
ＥＳＣ様コロニーが出現したとき、ＤＭＥＭ、２０％ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、β−メルカプトエタノール及び１０ｎｇ／ｍＬ白血病阻害因子（ＬＩＦ）を含有するマウスｉＰＳＣ培地に培地を変えた。２回の継代後、マウスｉＰＳＣを０．２％ゼラチンコーティングプレートに移し、さらに増殖させた。全ての継代で、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を使用して、マウス多能性マーカーＳＳＥＡ−１についてｉＰＳＣを選別した。
【０２８１】
上記方法によりマウス低免疫原性ｉＰＳＣを作製するために単離マウスｉＰＳＣを使用し得る。
【０２８２】
実施例２：ヒト誘導多能性幹細胞の作製
Ｇｉｂｃｏ（商標）ヒトエピソームｉＰＳＣ株（カタログ番号Ａ１８９４５、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）は、３プラスミド、７因子（ＳＯＫＭＮＬＴ；ＳＯＸ２、ＯＣＴ４（ＰＯＵ５Ｆ１）、ＫＬＦ４、ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８及びＳＶ４０Ｌ  Ｔ抗原）ＥＢＮＡに基づくエピソーム系を使用して、ＣＤ３４＋臍帯血から得た。このｉＰＳＣ株は、初期化事象からのゲノムへの組み込みがなかったので、ゼロフットプリント（ｚｅｒｏ  ｆｏｏｔ−ｐｒｉｎｔ）であるとみなされる。全ての初期化遺伝子不含であることが示された。ヒトｉＰＳＣを凍結融解し、培養し、継代するためのプロトコールは製品マニュアルで提供される。
【０２８３】
インビボ奇形腫アッセイ及びインビトロ多能性遺伝子発現アッセイ（例えばＰＣＲ及びアレイ）によって又は多能性マーカーに対する蛍光染色によってヒトｉＰＳＣの多能性を判定し得る。
【０２８４】
Ｇｉｂｃｏ（商標）ヒトエピソームｉＰＳＣ株は、正常な核型及び、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧ（ＲＴ−ＰＣＲにより示されるように）及びＯＣＴ４、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１（ＩＣＣにより示されるように）のような多能性マーカーの内在性発現を有する。全ゲノム発現及びエピジェネティックプロファイリング分析から、このエピソームｈｉＰＳＣ株がヒト胚性幹細胞株とは分子的に区別できないことが示される（Ｑｕｉｎｔａｎｉｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ，２０１４，９（１）：ｅ８５４１９）。定方向分化及び奇形腫分析で、これらのｈｉＰＳＣは外胚葉性、内胚葉性及び中胚葉性の系列に対するそれらの分化能を保持した（Ｂｕｒｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１１，６（４）：ｅ１８２９３）。さらに血管、造血系、神経及び心臓系列が安定的な効率で導かれた（Ｂｕｒｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，上出）。
【０２８５】
【表１】
2021530232.tif 000003
【０２８６】
上記方法によりヒト低免疫原性ｉＰＳＣ（ＨＩＰ細胞）を作製するために単離ヒトｉＰＳＣを使用し得る。
【０２８７】
実施例３：低免疫原性多能性細胞は、ＮＫ細胞殺傷及びマクロファージ食作用に対してより感受性が低かった。
低免疫原性多能性細胞（例えばマウスｂ２ｍ−／−ｃｉｉｔａ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣ及びヒトＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣ）の能力及び免疫自然応答経路を逃れるための能力を評価するために、実施例を行った。
【０２８８】
特に、酵素結合免疫スポット（Ｅｌｉｓｐｏｔ）アッセイを行った。マウスＨＩＰ細胞又はヒトＨＩＰ細胞（マウスＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣ又はヒトＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣ）とＮＫ細胞を同時培養し、ＩＦＮγ放出を測定した（例えばＥｌｉｓｐｏｔプレートリーダーを使用して自然ＩＦＮγスポット頻度を測定した）。一部の例において、抗ＣＤ４７抗体を使用することによってＣＤ４７を遮断した。
【０２８９】
およそ９５％ＮＫ細胞及び５％マクロファージなどのマウスＮＫ細胞と同時培養したマウスＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣは、ＮＫ細胞活性化を刺激できなかった（図１）。ＥｌｉｓｐｏｔアッセイにおいてマウスＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ｉＰＳＣは、ＮＫ細胞によるＩＦＮγ放出を惹起し、一方でマウスＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣは惹起しなかった。ＣＤ４７の遮断（例えば抗ＣＤ４７抗体の使用）は、マウスＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ｉＰＳＣにおいて効果がなかった。しかし、ＣＤ４７遮断は、Ｂ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣが有した防御を完全に消失させた。ＮＫ細胞を活性化し、従ってＩＦＮγを放出させることが知られているＹＡＣ−１細胞を対照とした。
【０２９０】
ヒトＮＫ細胞と同時培養したヒトＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣもＮＫ細胞活性化を刺激できなかった。図２は、ＥｌｉｓｐｏｔアッセイにおいてヒトＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ｉＰＳＣがＮＫ細胞によるＩＦＮγ放出を惹起し、一方でヒトＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣは惹起しなかったことを示す。ＣＤ４７の遮断は、ヒトＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ｉＰＳＣにおいて効果がなかったが、これはヒトＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣが有した保護を消失させた。ＮＫ細胞を活性化し、従ってＩＦＮγを放出することが知られているＫ５６２細胞を対照とした。
【０２９１】
図３は、ヒトＮＫ細胞（およそ９５％ＮＫ細胞及び５％マクロファージ）とともに温置したマウスＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣのＥｌｉｓｐｏｔの結果を示す。マウスＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ｉＰＳＣ及びマウスＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣは、ヒトＮＫ細胞によるＩＦＮγ放出を惹起した。ＣＤ４７の遮断は、ＮＫ細胞応答に対して効果がなかった。ＹＡＣ−１細胞は、ヒトＮＫ細胞による強いＩＦＮγ放出を誘発し、これを対照とした。
【０２９２】
図４は、マウスＮＫ細胞（およそ９５％ＮＫ細胞及び５％マクロファージ）とともに温置したヒトＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣのＥｌｉｓｐｏｔの結果を示す。ヒトＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ｉＰＳＣ及びヒトＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣは、マウスＮＫ細胞によるＩＦＮγ放出を惹起した。ＣＤ４７の遮断はＮＫ細胞応答に対して効果がなかった。ヒトＫ５６２細胞は、マウスＮＫ細胞による強いＩＦＮγ放出を誘導し、これを対照とした。
【０２９３】
本発明のＨＩＰ細胞がマクロファージ食作用に対して感受性であるか否かを判定するために、マクロファージ食作用アッセイも行った。簡潔に述べると、本明細書中に記載のＨＩＰ細胞を蛍ルシフェラーゼで標識し、マクロファージと同時培養した。ルシフェラーゼレポーターアッセイにより、ＨＩＰ細胞の生存能又は存在を分析した。
【０２９４】
図５は、ヒトマクロファージと同時培養した蛍ルシフェラーゼで標識されるヒトＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣの食作用アッセイの結果を示す。マクロファージと温置した場合、ヒトＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ｉＰＳＣの生存能シグナルは顕著に減弱した。一方で、ヒトＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣの生存能シグナルはヒトマクロファージの存在下で変化しなかった。全てのＨＩＰ細胞を死滅させたＴｒｉｔｏｎＸ−１００を対照として使用した。ＣＤ４７の遮断によって、ヒトＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣの防御特性が排除され、それらがマクロファージ食作用又は排除に対して感受性になった。
【０２９５】
図６は、マウスマクロファージと同時培養した蛍ルシフェラーゼ標識マウスＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣの食作用アッセイの結果を示す。
【０２９６】
マクロファージと温置した場合、マウスＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ｉＰＳＣの生存能シグナルが顕著に低下した。一方で、マウスマクロファージの存在下でマウスＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣの生存能シグナルは変化しなかった。全てのＨＩＰ細胞を死滅させたＴｒｉｔｏｎＸ−１００を対照として使用した。ＣＤ４７の遮断によって、マウスＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣの保護機能が排除され、それらがマクロファージ食作用又は排除に対して感受性になった。全てのＨＩＰ細胞を死滅させたＴｒｉｔｏｎＸ−１００を対照として使用した。
【０２９７】
図７は、マウスマクロファージと同時培養した蛍ルシフェラーゼ標識ヒトＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣの食作用アッセイの結果を示す。ヒトＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ｉＰＳＣ及びヒトＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣの両方の生存能シグナルは、マウスマクロファージと同時培養した場合、顕著に低下した。全てのＨＩＰ細胞を死滅させたＴｒｉｔｏｎＸ−１００を対照として使用した。
【０２９８】
図８は、ヒトマクロファージと同時培養した蛍ルシフェラーゼ標識マウスＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣの食作用アッセイの結果を示す。ヒトマクロファージと同時培養した場合、マウスＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ｉＰＳＣ及びマウスＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣの両方の生存能シグナルが顕著に低下した。全てのＨＩＰ細胞を死滅させたＴｒｉｔｏｎＸ−１００を対照として使用した。
【０２９９】
本明細書中で提供される結果から、マウスＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣ及びヒトＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｉＰＳＣは、ＮＫ細胞活性化及びマクロファージ食作用など、自然免疫応答を逃れることが可能であったことが示される。
【０３００】
実施例４：ヒト誘導多能性幹細胞由来の心筋細胞の作製
ヒトＨＩＰ細胞由来心筋細胞（ＣＭ）を作製するための方法を本明細書中で提供する。代表的な実施形態では、ヒトＨＩＰ細胞を心筋細胞のインビトロ単層に分化させた。本明細書中に記載の代表的な手順の出典は、その全体において、及び具体的には細胞を分化させるための技術に対して、参照により本明細書によって組み込まれる、Ｓｈａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ，２０１５，９７，ｄｏｉ：１０．３７９１／５２６２８であった。
【０３０１】
６ウェルプレート中で希釈マトリゲル（３５６２３１，Ｃｏｒｎｉｎｇ）上にヒトＨＩＰ細胞を播種し、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８Ｆｌｅｘ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）中で維持した。培地を２４時間ごとに交換した。
【０３０２】
細胞が９０％〜１００％培養密度になった後、分化を開始させ（図１０）、第０日のＣＭ分化培地から、２％Ｂ−２７マイナスインスリン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号Ａ１８９５６０１）及び２μＭ〜８μＭ  ＣＨＩＲ−９９０２１（Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍ、カタログ番号Ｓ１２６３）を含有する５ｍＬのＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号６１８７０）に交換した。一部の例では、ＣＨＩＲ−９９０２１の濃度は６μＭであった。分化第０日〜第２日には培地交換を行わなかった。
【０３０３】
第２日（図１１）に、ＣＨＩＲ−９９０２１なしで２％Ｂ−２７マイナスインスリンを含有するＲＰＭＩ１６４０へとＣＭ分化培地を交換した。細胞を撹拌しないように注意した。
【０３０４】
第３日（図１２）に、ＣＭ分化培地から、２％Ｂ−２７マイナスインスリン及び５μＬ  ＩＷＲ１（ＷＮＴ阻害剤、Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍ、カタログ番号Ｓ７０８６）を含有するＲＰＭＩ１６４０へと交換した。細胞を撹拌しないように注意した。培地交換した後、３７℃インキュベーター中で４８時間、細胞を乱さないようにした。分化第３日〜第５日には培地交換を行わなかった。
【０３０５】
第５日（図１３）に、培地交換してＣＭ分化培地から２％Ｂ−２７マイナスインスリンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地に戻し、４８時間温置した。第５日のＣＭ分化培地は、第２日の培地と同じであった。培地交換後、３７℃インキュベーター中で４８時間、細胞を乱さないようにした。
【０３０６】
第７日（図１４）に、ＣＭ分化培地から、Ｂ２７プラスインスリン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１７５０４０４４）を含有するＲＰＭＩ１６４０へと交換し、その後１日ごとに同じ培地で培地交換した。およそ第８日〜第１０日で最初に心筋細胞の自発的拍動が見られた。
【０３０７】
分化の１０日後（図１５）、細胞面積の５０％超が拍動した。枝様構造は非常に明白であった。一部の例では、細胞は最終分化し、もはや増殖しなかった。細胞が拍動してから、第７日のＣＭ分化培地中で心筋細胞の培養を維持した。培地を１日おきに交換した。
【０３０８】
一部の例では、分化した細胞が拍動しなかった場合又は小さな拍動領域があった場合、細胞をグルコース飢餓に供した。グルコース飢餓によって非心筋細胞が培養プレートから剥がれた。分化第１０日に、Ｂ−２７プラスインスリン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１７５０４０４４）を含有するグルコースなしのＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１８７９）を含む精製培地へと培地交換した。精製培地中で細胞を３日間にわたり維持した（分化第１３日まで）。
【０３０９】
第１３日に、培養中で心筋細胞を維持するために第７日のＣＭ分化培地へと培地交換した。一部の例では、第１４日に精製手順（グルコース飢餓）を反復し、第１７日に培地をＣＭ分化培地に交換するようにした。残りの細胞は高度に精製された心筋細胞であった。
【０３１０】
第７日の第７日ＣＭ分化培地中で単離及び精製心筋細胞を維持した。培地を１日おきに交換した。一部の実施形態では、１枚の６ウェルプレートにおいて約１ｘ１０６個の心筋細胞を播種した。
【０３１１】
凍結培地中で拍動する心筋細胞を凍結し、液体窒素中で保管した。一部の例では、凍結培地は、９０％熱不活性化ＦＣＳ及び１０％ＤＭＣＯ又はゼノフリー同等物を含んだ。凍結融解後、心筋細胞は拍動し続けた。
【０３１２】
図９は分化方法のダイアグラムを提供する。図１０は、分化開始直前のマトリゲル（商標）上で培養したヒトｉＰＳＣを示す（１００ｘ拡大率）。図１１は、培地交換前の分化第２日の細胞を示す（１００ｘ拡大率）。単層に細胞が残り、およそ１０％が浮遊細胞であった。培地交換前に分化培地が黄色味を帯びた。図１２は、培地交換前の分化第３日の細胞を示す（１００ｘ拡大率）。単層に細胞が残り、およそ２０％が浮遊細胞であった。分化第２日と比較して培地の黄色味は少なかった。一部の小胞様構造が単層で見られた。図１３は、培地交換前、分化第５日の細胞を示す（１００ｘ拡大率）。単層に細胞が残り、およそ１５％が浮遊細胞であった。心筋細胞は他の細胞クラスターの上に出現した。図１４は、培地交換前、分化第７日の細胞を示す（１００ｘ拡大率）。単層に細胞が残り、およそ１５％が浮遊細胞であった。枝様構造が見えた。図１５は、培地交換前、分化第９日の細胞を示す（１００ｘ拡大率）。拍動する心筋細胞が見え、写真でより暗く見えた。
【０３１３】
実施例５：誘導心筋細胞に分化させたマウスＨＩＰ細胞
ｍＨＩＰ細胞をマウス誘導心筋細胞（ｈｍｉＣＭ）に分化させた。分化前に、フィーダー細胞を除去するために、ゼラチンコーティングディッシュ上でｍＨＩＰ細胞及びｍｉＰＳＣを２回継代した。第０日に、コーティングのない１０ｃｍプレートで２日間、ＩＭＥＭ／ハムＦ１２（３：１、両方ともＣｏｒｎｉｎｇ）＋０．５％Ｎ２−サプリメント、１％Ｂ２７レチノイン酸、０．０５％ＢＳＡ、１％ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ、１％グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、５ｍｇ／ｍＬアスコルビン酸及び４０ｎＬ／ｍＬ  ＭＴＧ（両方ともＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中で細胞８０，０００個／ｍＬを用いて分化を開始させた。第２日に、コーティングのない１０ｃｍプレートにおいて２日間、０．５％Ｎ２−サプリメント、１％Ｂ２７レチノイン酸、０．０５％ＢＳＡ、１％ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ、１％グルタミン（全てＧｉｂｃｏ）、５ｍｇ／ｍＬアスコルビン酸及び４０ｎＬ／ｍＬ  ＭＴＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）入りのＩＭＥＭ／ハムＦ１２（３：１、両方ともＣｏｒｎｉｎｇ）中に細胞を移した。第４日に、１％グルタミン、５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸、５ｎｇ／ｍＬ  ＶＥＧＦ、５００μｇ／ｍＬ  ｈＦＧＦｂ及び２５ｎｇ／ｍＬ  ｈＦＧＦ１０（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含有するＳＰ３４培地中でゼラチンコーティング６ウェルプレートに細胞を播種した。第７日に、１％グルタミン及び５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸を含有するＳＰ３４培地へと培地交換し、１日おきに交換した。第１１〜１４日前後に細胞拍動が開始し、それらの機能を示した。
【０３１４】
陰性選択のために抗ＣＤ１５  ｍＡｂコーティング磁気マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、製造者のプロトコールに従いＭＡＣＳを使用した分離によって細胞を濃縮した。ｈｉＣＭｓ及びｍｉＣＭを含有するフロースルーを再び播種し、異なるアッセイに使用した。Ｇａｔａ４及びＭｈｙ６に対するｒｔＰＣＴによって分化を確認した（図１６）。Ｇａｔａ４フォワードプライマー（配列番号７は、
５’−ＣＴＧＴＣＡＴＣＴＣＡＣＴＡＴＧＧＧＣＡ−３’
リバースプライマー（配列番号８は、
５’−ＣＣＡＡＧＴＣＣＧＡＧＣＡＧＧＡＡＴＴＴ−３’
Ｍｈｙ６フォワードプライマー（配列番号９）は、
５’−ＡＴＣＡＴＴＣＣＣＡＡＣＧＡＧＣＧＡＡＡＧ−３’
リバースプライマー（配列番号１０）は、
５’−ＡＡＧＴＣＣＣＣＡＴＡＧＡＧＡＡＴＧＣＧＧ−３’であった。
【０３１５】
分化は免疫蛍光（ＩＦ）によっても確認した。一次抗体は、α−サルコメアアクチニン（ＥＡ−５３、Ａｂｃａｍ）又はトロポニンＩ（ａｂ４７００３、Ａｂｃａｍ）に対するものであり、続いて対応する二次抗体はＡＦ４８８又はＡＦ５５５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と複合化したものであった（データは示さない）。
【０３１６】
実施例６：移植した低ｍＣＭは同種レシピエントにおいて長期生存する。
同種レシピエントマウス（ＢＡＬＢ／ｃ）の梗塞境界域にｈｉＣＭ及びｍｉＣＭを移植した。細胞株は、ルシフェラーゼ（＋）であり、ｌｕｃ（＋）ＣＭを生じさせ、インビボで生体発光（ＢＬＩ）により追跡した。
【０３１７】
ルシフェラーゼを発現させるためのＨＩＰ細胞及びｉＰＳＣ形質導入。Ｆｌｕｃを発現させるために細胞に対して形質導入を行った。１００，０００個のｍＨＩＰ細胞又はｍｉＰＳＣをゼラチンコーティング６ウェルプレートに播種し、３７℃及び５％ＣＯ２で一晩温置した。翌日、培地を交換し、再改変ＥＦ１ａプロモーター（ＧｅｎＴａｒｇｅｔ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）下でルシフェラーゼＩＩ遺伝子を発現する１バイアルのＦｌｕｃレンチウイルス粒子を１．５ｍＬ培地に添加した。３６時間後、１ｍＬの培地を添加した。さらに２４時間後、完全培地交換を行った。２日後、Ｄ−ルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を添加することにより、ルシフェラーゼ発現を確認した。ＩＶＩＳ  ２００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）により最大光子ｓ−１ｃｍ−２／ステラジアンでシグナルを定量した。
【０３１８】
ｈｉＣＭは拒絶されず、移植後２８日で他の臓器に移動しなかった（図１７）。ｈｉＣＭは、同種移植後、免疫認識を逃れ、長期生存を示した。注入は心臓筋肉へのものだったので、移植細胞を光学的にマッピングした。ｈｉＣＭの結果、「スーパー細胞」生着が起こったが、ｍｉＣＭではなかった（データを示さない）。
【０３１９】
光学的マッピング：
全心臓ランゲンドルフ標本。手術から４〜５週間後、マウスを頸椎脱臼により安楽死させた。ヒアス（ｈｅａｒｓ）を素早く切除し、組成（ｍｍｏｌ／Ｌ）９３ＮａＣｌ、２０ＮａＨＣＯ３、１Ｎａ２ＨＰＯ４、１ＭｇＳＯ４、５ＫＣｌ、１．８ＣａＣｌ２、２０酢酸Ｎａ、２０グルコースの氷冷改変タイロード液に入れた。カニューレに大動脈を介して心臓を組み込み、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２ガス混合物を通気させることによりｐＨを７．４に維持しながら３７℃にて同じタイロード液を使用して９ｍＬ／ｍｉｎで逆行性に灌流した。次に、収縮を阻害し、動きの人為現象を最小限にするために１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ２，３−ブタンジオンモノオキシム（ＢＤＭ）及び１０μｍｏｌ／Ｌブレビスタチン（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅｘｅｔｅｒ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）を含有するタイロード液へと灌流液を切り替えた。左心室（ＬＶ）のイメージングを可能にするために特注のＰｅｒｓｐｅｘチャンバーに心臓を水平に置いた。心臓の近くに置いた２Ａｇ／ＡｇＣｌディスク電極を使用して、実験の間中、偽性心電図（ＥＣＧ）を監視し、参照電極は灌流浴槽中に置いた。２００ｍｓ（５Ｈｚ）のサイクル長で生理学的心内膜から心外膜の伝導経路を介して心臓のペーシングを可能にするために、単独の刺激装置に接続される２本の白金電極を右心房（ＲＡ）付属器上に置いた。
【０３２０】
以前に詳述されるように光学的測定を行った（その全体において参照により本明細書中に組み込まれるＫｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ａｒｒｈｙｔｈｍｉａ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌ  ６：８０９−１７（２０１３））。簡潔に述べると、１０分間にわたり２ｍＭ電圧感受性色素（ジ−４−ＡＮＥＰＰＳ）の５０μＬボーラスを心臓に負荷した。５９０ｎｍのロングパス発光フィルターとともにＣａｒｄｉｏＣＭＯＳ−ＳＭ１２８カメラ（Ｒｅｄｓｈｉｒｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｄｅｃａｔｕｒ，ＧＡ）を使用して、ＬＶからの広視野の単一光子落射蛍光記録を作製した。４７０ｎｍのＬＥＤ光により励起がもたらされた。画像解像度は１２８ｘ１２８ピクセル／フレームであり、２．５ｋＨｚのフレーム率で記録を行った。Ｔｉ：Ｓａｐｐｈｉｒｅ  ６９０〜１０８０ｎｍ波長可変レーザー（Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩ，Ｃｏｈｅｒｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を備えたＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０  ＮＬＯ正立顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して２光子（２Ｐ）レーザー走査顕微鏡（２ＰＬＳＭ）を遂行した。これらの２Ｐ測定は、高度の深さ分解能をもたらし、電気的活性を示す別々の組織層の同定を可能にする（Ｒｕｂａｒｔ，２００４）。ジ−４−ＡＮＥＰＰＳを９２０ｎｍで励起し、それぞれ５１０〜５６０ｎｍ及び５９０〜６５０ｎｍの２つのバイアルカリＰＭＴ検出器によって発光を回収し、比率計測による測定を行うことが可能になる。心外膜表面で観察される細胞配向の方向で、短いスキャンの場合は０．３９ｍｓのスキャン時間及び長いスキャンの場合は１．９３ｍｓのスキャン時間でラインスキャンを行った。トリガー心拍の到着後にラインスキャンを開始し、心臓のペースを調整するために使用される電気刺激心拍により同調させた。
【０３２１】
ＮＺで梗塞瘢痕から離れた心筋において、可視的な瘢痕の端部のＢＺで、ＮＺに隣接して、及び瘢痕の中心に向かってＩＺ内で、連続的広視野及び２Ｐ電圧記録を作成した。ＢＺ及びＩＺ内でレムナント電気活性の領域を同定するために１０ｘ／０．３ＮＡ対物レンズ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した広視野の電気的マッピングを最初に使用した。次に、電気活性領域をさらに局在化させるために、４０ｘ／０．８ＮＡ対物（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて電気シグナルを示す領域で、広視野の電気的マッピングを反復した。最後に、フレームスキャンモードで２Ｐ励起を使用して光軸面の構造をイメージングし、次に、心外膜表面の下方で個別の深さでラインスキャンモードを使用して電気シグナルを記録した。面の下方で５０μｍで開始し、シグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）が低すぎて明らかな活動電位（ＡＰ）シグナルを区別できなくなるまで、深度を深めて（５０〜１００μｍ段階）一連の記録を行った。明確な構造を可視化する能力は深い層ほど低下し；識別可能な画像が得られ得る最大深度はゾーンに依存し得るが、ラインスキャン記録からの電気シグナルは常に、構造が画像化され得る層を超えて記録され得る。従って、より深い層での組織構造の画像から直接電気活性の源を同定することは可能ではなかった。１対の高感度ＧａＡｓＰ  ＰＭＴ検出器を利用し、ＦｌｕｏＶｏｌｔ及びＲｈｏｄ２ＡＭの組み合わせを使用し、８４０ｎｍで励起して、改変正立２Ｐレーザー走査装置（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ；Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯ）を使用して、分析の一部を行った。より高い感度設定で知見を検証するためにこれらを使用した。
【０３２２】
瘢痕における電気活性源の決定。瘢痕における電気活性の細胞源を決定するために、Ｆｕｒａ−２／ＡＭを心筋に予め負荷することにより電圧シグナルが測定された領域で細胞内Ｃａ２＋の測定を行った。シグナルが残留筋細胞から生じた場合、電気刺激に応答してＣａ２＋過渡応答（ＣａＴｓ）が予想される。しかし、電圧シグナルが異常な筋細胞又は他の細胞実体（即ち線維芽細胞又は筋線維芽細胞）から生じていた場合、ＣａＴｓは、電気刺激に応答して生じ得ない（Ｃｈｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【０３２３】
Ｆｕｒａ−２を排出する陰イオン輸送体を遮断し、従って細胞における色素保持を向上させるために１ｍｍｏｌ／Ｌプロベネシドとともにこれらの実験用のタイロード液を補給した（その全体において本明細書中で参照により組み込まれるＤｉ  Ｖｉｒｇｉｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２５６：９５９−６３（１９８８））。ＤＭＳＯ−プルロニック酸Ｆ−１２７（２５％ｗ／ｖ）中の１ｍｍｏｌ／Ｌ保存液としてＦｕｒａ−２／ＡＭを調製した。色素の１００μＬボーラスを灌流ライン中のバブルトラップに注入して、色素の希釈及び心臓への緩徐な添加を可能にした。蛍光シグナルが低いか又は時間依存的に喪失するがゆえに必要とされる場合、色素のさらなるボーラスを注入した。Ｆｕｒａ−２／ＡＭは７６０ｎｍで２Ｐ励起し、ショートパス６５０ｎｍダイクロイックミラーを通じて蛍光発光を誘導し、５１０〜５６０ｎｍで回収した。同じ焦点面で同じスキャンライン及び１．９３ｍｓスキャン時間を使用して何らかの電圧シグナルが検出された直後にＣａ２＋測定を行った。
【０３２４】
データ分析及び解釈。３ｘ３ピクセルアレイから広視野の電圧シグナルを平均した。正確なサイクル長の時間及びラインスキャン率からの情報を利用して、２５回の連続刺激（記録の５ｓ）からの平均電圧又はＣａ２＋トレースを並べて生成させる特注ソフトウェアを使用して、２Ｐ電圧及びＣａ２＋シグナルを処理した。平均したトレースからＡＰシグナルの特徴を分析した。これらの測定は、１０〜９０％上昇過程の立ち上がり時間（ＴＲｉｓｅ）及び５０％活性化から５０、７５及び９０％再分極のＡＰ持続時間を含んだ（それぞれＡＰＤ５０、ＡＰＤ７５及びＡＰＤ９０）。刺激時間に対するＬＶ壁におけるその時点でのＡＰの到達時間として活性化時間を決定した。
【０３２５】
単回刺激心拍（シグナル）後のトレース全体のピーク振幅を拡張期中のトレースのピーク振幅（ノイズ）により除したものとしてＳ／Ｎを計算した（補足図面Ｓ１）。１のＳ／Ｎ値は、ベースラインのノイズを超え、上回るシグナルは示さなかった。個々のトレース及び対応するＳ／Ｎ値の観察に基づいて、Ｓ／Ｎ＞１．４を有意義な一過性シグナル（電圧又はＣａ２＋）とみなした。動き又はノイズスパイクにより生じる人為的シグナルを除外するためにＳ／Ｎ＞１．４の全てのトレースをさらに精査した。全データを平均±標準誤差として表した。スチューデントのｔ検定を使用してデータ群を比較した。
【０３２６】
心筋梗塞後２８日でのレシピエント心臓の組織病理及びトリクローム染色から、ｈｉＣＭの同種レシピエントにおける梗塞サイズも左心室サイズも顕著に縮小したことが明らかになった。各１５０μｍのギャップがある２５枚のスライドから梗塞の長さを測定した（１０番目のスライドごと、各スライドにおいて３枚の切片で５μｍ；スライド１〜２５０）。発明者らは、ｈｉＣＭ細胞を受容したレシピエントにおいてアルファ−サルコメア陽性ドナー心筋細胞及び未熟血管構造を同定した。一方、同種ｍｉＣＭでは細胞は検出されなかった（図１８）。
【０３２７】
詳細なＰＶ−ｌｏｏｐ分析から、左心室パラメーターの顕著な改善が明らかになった。ＩＴから、同種細胞の生存だけでなく、それらが生着し、心筋梗塞後の心臓を機能面で回復させたことが示された（図１９Ａ）。ｍｉＣＭ（緑）又はｈｉＣＭ「スーパー細胞」（赤）注入の何れかを受けた梗塞心臓のＰＶ−ｌｏｏｐ分析。
【０３２８】
次のパラメーターは、ｈｉＣＭが心臓機能を回復させたことを示し：駆出率（ＥＦ）は、心拍あたりの心室から駆出される血液体積の、拡張末期の心室の血液体積に対する比である。１回の拍出量（ＳＶ）は、１回の収縮で心室により駆出される血液体積である。これは、拡張末期の体積と収縮末期の体積との間の差である（図１９Ｂ）。心室の１回仕事係数（ＳＷ）は、大動脈への１回拍出量を駆出するために左心室により行われる作業として定義される。心臓出力（ＣＯ）は、単位時間に心室により拍出される血液量として定義される（図１９Ｃ）。収縮末期の血圧体積関係（ＥＳＰＶＲ）は、任意の心腔体積で心室により発現され得る最大血圧を示す。ＥＳＰＶＲは、前負荷、後負荷及び心拍の変化に対して比較的感受性が低い。これによって、駆出率、心臓出力及び１回拍出量のような他の血行動態パラメーターを超える収縮機能の指標改善が起こる。
【０３２９】
心筋梗塞の結果、Ｐ−Ｖ−ループ分析で体積が増加し、圧力が低下し、心臓のポンプ機能が低下する。心筋梗塞後にＨＩＰ−心筋細胞を注入した場合、圧力及び体積の変化が妨げられ、心臓再生及びリモデリング予防が示される。
【０３３０】
実施例７：ｈｉＣＭに分化させたヒトＨＩＰ細胞
ヒトＨＩＰ細胞を低免疫心筋細胞に分化させた。６ウェルプレート中の希釈マトリゲル（３５６２３１、Ｃｏｒｎｉｎｇ）上にｈＨＩＰ細胞を播種し、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８  Ｆｌｅｘ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）中で維持した。９０％培養密度で分化を開始させ、２％Ｂ−２７マイナスインスリン（Ｇｉｂｃｏ）及び６μＭ  ＣＨＩＲ−９９０２１（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）を含有する５ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０へと培地を交換した。２日後、ＣＨＩＲ不含の２％Ｂ−２７マイナスインスリンを含有するＲＰＭＩ−１６４０へと培地交換した。第３日に、さらに２日間、５μＬのＩＷＲ１を培地に添加した。第５日に、培地を交換して２％Ｂ−２７マイナスインスリン培地を含有するＲＰＭＩ−１６４０に戻し、４８時間置いた。第７日に、Ｂ２７プラスインスリンを含有するＲＰＭＩ−１６４０（Ｇｉｂｃｏ）へと培地交換し、その後３日ごとに同じ培地で培地交換を行った。
【０３３１】
分化後第１０日に心筋細胞の精製を行った。簡潔に述べると、低グルコース培地へと培地交換し、３日間維持した。第１３日に、培地を交換して、Ｂ２７プラスインスリンを含有するＲＰＭＩ−１６４０に戻した。第１４日に再びこの手順を反復した。
【０３３２】
トロポニン（ｃＴＮＴ、データは示さない）に対してｒｔＰＣＲにより分化表現型を確認した。フォワードプライマー（配列番号１１）は：
５’−ＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＴＴＧＧＧＣＡＴＧＡＡＣＧ  Ａ−３’、
リバースプライマー（配列番号１２）は：
５’−ＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＧＣＴＧＡＡ’であった。
【０３３３】
免疫蛍光（ＩＦ）染色でも分化表現型を確認した。一次抗体はα−サルコメアアクチニン（ＥＡ−５３、Ａｂｃａｍ）及びトロポニンＩ（ａｂ４７００３、Ａｂｃａｍ）に対するものであり、続いて対応する二次抗体はＡＦ４８８又はＡＦ５５５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と複合化されたものであった。細胞核をＤＡＰＩで染色した。Ｌｅｉｃａ  ＳＰ５レーザー共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）を使用してイメージングを行った（データは示さない）。
【０３３４】
心筋細胞の自発的拍動は、最初に分化第１０日前後で見られた。心筋細胞はヒト心臓組織と同様の拍動数を示し、心臓刺激（イソプレナリンによる）及び心臓抑制（ｃａｒｄｉａｃ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ）（ベラパミルによる）に感受性がある。
【０３３５】
実施例８：ヒト化マウスにおけるｈｉＣＭ細胞生存同種間移植
Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）から購入した同種ヒト化マウス（ヒト化ＮＳＧ−ＳＧＭ３マウス（１８〜３０週）への移植後に低免疫心筋細胞が生存した。ヒトＣＤ３４＋造血系幹細胞生着ＮＳＧ−ＳＧＭ３マウスは、多系統ヒト免疫細胞を発現させ、宿主に対してドナー細胞免疫反応性がないＴ細胞依存性免疫応答を示す機能的ヒト免疫系を示す。動物を無作為に実験群に割り当てた。全ての動物でヒトＣＤ４５＋細胞集団間のＣＤ３＋細胞のパーセンテージを評価し、ＣＤ３パーセンテージはＷＴとＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ群との間で有意差はなかった（その全体において本明細書中で参照により組み込まれるＤｅｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ３７（３）：２５２−２５８（２０１９））。
【０３３６】
同種ヒト化マウスの筋肉内に移植した野生型又はＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｈｉＣＭは、さらなるヒト化マウスモデルでマウスデータを確認した。生体発光（ＢＬＩ）により心筋細胞を長軸方向に追跡した。時間経過とともに全ｗｔ  ｈｉＣＭ移植物が拒絶された（動物５匹）。５つのＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｈｉＣＭ移植片全てが永久的に生存した（図２０）。心筋梗塞後の移植の後にも低免疫ｈｉＣＭ細胞が生存した（図２１）。
【０３３７】
実施例９：マウス誘導多能性幹細胞由来の内皮細胞の作製
ヒトｉＰＳＣ由来内皮細胞（ＥＣ）を作製するための方法が本明細書中で提供される。代表的な実施形態では、マウスｉＰＳＣ（マウスＨＩＰ細胞など）を内皮細胞のインビトロ単層に分化させ得る。
【０３３８】
このプロトコールは、６ウェル方式プレート又は１０ｃｍディッシュを使用することを含む。標準的トリプシンで細胞をトリプシン処理した。しかし、トリプシン処理した細胞を遠心分離しなかった。むしろ、使用したトリプシンの体積の３倍を超える体積の培地中で、トリプシン処理したコロニーを再懸濁した。
【０３３９】
分化（およそ１２日）前、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を凍結融解した−ＭＥＦ培地を使用してゼラチンコーティングプレート上で１ｘ１０６個のＭＥＦ／ウェル（６ウェルプレート）。１バイアルのｉＰＳＣを凍結融解し、ＭＥＦ上、３枚の６ウェルに移した。ＥＳＣ培地を毎日交換した。ＭＥＦ上でコロニーをＥＳＣ培地中で１：３〜１：６に分割した（凍結融解からおよそ８日後）。分割前にＭＥＦ上でＮＴ−ＥＳＣコロニーを観察した（１００ｘ拡大率）。ＥＳＣ培地中で１：３〜１：６でゼラチン上にＭＥＦからコロニーを分割した（前分化からおよそ４日後；第−２日とも呼ぶ）。
【０３４０】
第０日〜第２日に、分化プロトコールを開始するために細胞を７０〜８５％培養密度にした。ＥＣ分化培地＃１は、ＲＰＭＩ及びＢ−２７サプリメントマイナスインスリン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び５μＭ  ＣＨＩＲ−９９０２１（Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）を２日間、含んだ。約２．５ｍＬの培地／６ウェルプレート又は１０ｃｍプレートを使用した。第０〜２日は培地を交換しなかった。細胞を動かさずにインキュベーター中に置いておいた。
【０３４１】
第２日〜第４日に、細胞培養物の形態を観察した。ＲＰＭＩ及びＢ−２７サプリメントマイナスインスリンを含有し、２μＭ  ＣＨＩＲ−９９０２１を含むＥＣ分化培地＃２へと培地を交換した。細胞のかき混ぜを回避するように注意した。
【０３４２】
第４日〜第７日に、ＲＰＭＩ培地マイナスインスリンを含む内皮細胞（ＥＣ）分化培地＃３を使用した。第４日及び第６日に培地交換を実施した。未分化細胞クラスターは浮遊したままであり、最初のＥＣコロニーが出現した。
【０３４３】
第７日〜第１７日に、ＥＣコロニーはプレートで密集状態になるまで増殖し続けた。内皮細胞（ＥＣ）分化培地＃３は、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＲＯＣＫ阻害剤、ＳＢ４３１５４２及びＹ−２７６３２を補給したＥＣ培地（Ｌｏｎｚａ，Ｂｅｎｉｃｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を含む。ＥＣ分化中、およそ１日おきに培地を交換した（第７日、第９日、第１１日及び第１３日など）。
【０３４４】
材料及び試薬
トリプシン：Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１２６０５−０１０
ゼラチンコーティング：ＥｍｂｒｙｏＭａｘ（登録商標）０．１％ゼラチン溶液、カタログ番号ＥＳ−００６−Ｂ。プレート表面を溶液で被覆し、コーティングしたプレートを使用まで３７℃で保管した。
【０３４５】
ＭＥＦ培地：ＤＭＥＭ＋ｇｌｕｔａｍａｘ＋ピルビン酸ナトリウム、４．５ｇ／Ｌグルコース（Ｇｉｂｃｏ）、１５％ＦＢＳ、ＮＥＡＡ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）入り。
【０３４６】
第０日〜第２日用のＥＣ培地：ＲＰＭＩ及びＢ−２７サプリメントマイナスインスリン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ａ１８９５６０１、５μＭ  ＣＨＩＲ−９９０２１（Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡ．カタログ番号Ｓ２９２４）及び１％Ｐ／Ｓ。
【０３４７】
第２日〜第４日用のＥＣ培地：ＲＰＭＩ及びＢ−２７サプリメントマイナスインスリン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ａ１８９５６０１、２μＭ  ＣＨＩＲ−９９０２１（Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡ．カタログ番Ｓ２９２４）及び１％Ｐ／Ｓ。
【０３４８】
第０日〜第２日培地用に５μＭ（１：２０００）にＣＨＩＲ保存溶液（１０ｍＭ）を培地中で希釈した。第２日〜第４日の培地用に２μＭ（１：５０００）になるように培地中でＣＨＩＲ保存溶液を希釈した。
【０３４９】
第４日〜第７日用のＥＣ培地（ＲＰＭＩ培地マイナスインスリン）：ＲＰＭＩ及びＢ−２７サプリメントマイナスインスリン、５０ｎｇ／ｍＬ血管内皮胞増殖因子（ＶＥＧＦ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）、１０ｎｇ／ｍＬ線維芽細胞増殖因子塩基性（ＦＧＦｂ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１０μＭ  Ｙ−２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）及び１μＭ  ＳＢ４３１５４２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）入り、３日間。
【０３５０】
第７日〜第１４日用のＥＣ培地（ＬｏｎｚａからのＥＣ培地）：ＥＧＭ−２  ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ培地（又はＣＣ−３１６２  ＥＧＭＴＭ−２  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔＴＭ，ＥＢＭＴＭ−２プラスＧｒｏｗｔｈ  ＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔのＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓＴＭ、５００ｍＬ）、１０μＭ  Ｙ−２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、１μＭ  ＳＢ４３１５４２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、２５ｎｇ／ｍＬ  ＶＥＧＦ及び２ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ。
【０３５１】
ＣＤ３１＋細胞を選別し、多能性幹細胞由来のマウスＥＣから選択した。ＭＡＣＳを含む磁気ビーズに基づく選別方法を実施した。例えばＣＤ３１＋細胞の陽性選択のためにＣＤ３１マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−０９７−４１８）を使用した。第１２日〜第１４日の後及びＭＡＣＳ選別前の細胞（１００ｘ拡大率）を観察した。ＥＣコロニーは８０％〜９０％培養密度であり、未分化細胞クラスターが存在した。紡錘形態で長い細胞は間葉系の分化細胞に相当した。
【０３５２】
ＣＤ３１＋細胞のＭＡＣＳ選択のための代表的プロトコールは次のとおりである。
１．細胞をＰＢＳで１回洗浄。
２．トリプシン：０．５ｍＬ／ウェル；３７℃で５分間温置。
３．培地（第７日〜１４日培地）、１ｍＬ／ウェルでトリプシン処理を停止。
４．１０００μＬ−エッペンドルフピペットを使用：凝集塊を分解させるためにウェルを再懸濁。
５．凝集塊を除去するために５０ｍＬファルコンチューブにおいて黄色の１００μｍメッシュフィルターを使用し、５０ｍＬチューブ中で細胞を回収。
６．５０ｍＬチューブを３００ｇ、５分間、４℃でスピン。
７．５０ｍＬチューブ中でペレットが見られる。大きなペレット＝ａｐｐ．９０Ｍｉｏ  細胞。
８．１０個のＭｉｏ細胞あたりを計算：９０μＬ  ＭＡＣＳ緩衝液＋１０μＬビーズ。
９．乾燥した細胞ペレットを得るために上清を除去。
１０．ＭＡＣＳ緩衝液中で１０００μＬエッペンドルフピペットを使用してペレットを再懸濁。
１１．黄色の２００μＬエッペンドルフピペットでビーズを１０に添加し再懸濁。
１２．ボルテックス処理（非常に短時間）。
１３．４℃（冷蔵庫）で３０分間温置。
１４．５０ｍＬチューブに緩衝液を添加することにより１〜２ｍＬ  ＭＡＣＳ緩衝液／１０個のＭｉｏ細胞で洗浄。
１５．３００ｇで５分間、４℃にて遠心分離。
１６．ＭｉｄｉＭＡＣＳカラムを磁石に置く。カラムに３ｍＬ  ＭＡＣＳ緩衝液を添加（「プライミング」として）。カラム下：５０ｍＬファルコンチューブ。
１７．細胞ペレットから上清を除去（ペレットは乾燥させる必要あり）。
１８．ペレット上で５００μＬ  ＭＡＣＳ緩衝液を添加（ペレットサイズにかかわらず常に５００μＬを使用）。
１９．カラムに５００μＬ（細胞＋ＭＡＣＳ緩衝液）を添加し、カラムを通過するまで待機。
２０．３ｍＬの純粋なＭＡＣＳ緩衝液をカラムに添加し、カラムを通過するまで待機：３回実施（洗浄段階）。
２１．磁石からカラムを除去し、１５ｍＬファルコンチューブに置く。
２２．５ｍＬ  ＭＡＣＳ緩衝液をカラムに添加し、「スタンプ」又は「プランジャー」を使用：１５ｍＬファルコンチューブに５ｍＬを押し入れてＣＤ３１＋細胞を溶出。
２３．３００ｇで５分間４℃にて細胞をスピン。
２４．ペレット化（大きい場合およそ５〜１０Ｍｉｏ）：１ｘ６ウェルプレートに播種（ゼラチンコーティング）。
２５．培地：第７日〜第１４日用のＥＣ分化培地。ＭＡＣＳ後に第３日前にプレートを動かさなかった；その前にインキュベーターからプレートを出さない。
２６．第５日まで第７日〜１４日にわたり分化培地を維持。
２７．ＭＡＣＳ選別後、第５日に培地を交換：Ｌｏｎｚａ  ＥＧＭ−２  ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ培地（ＣＣ−３１６２  ＥＧＭＴＭ−２  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔＴＭ、ＥＢＭＴＭ−２プラスＧｒｏｗｔｈ  ＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓのＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓＴＭ、５００ｍＬ）＋１０μＭ  Ｙ−２７６３２。
２８．１日おきに培地交換。ゼラチンコーティングプレート上で細胞を維持。
２９．必要な場合、トリプシンを用いて細胞を１：３に分割した。
３０．ＥＣの特徴を調べるために、当業者にとって公知の方法により、免疫細胞化学、ＬＤＬアッセイ及び／又はチューブ形成アッセイを実施した。
【０３５３】
図２２は、分割前のＭＥＦのＮＴ−ＥＳＣコロニーを示す（１００ｘ拡大率）。図２３は、分化開始直前のゼラチン上のＮＴ−ＥＳＣを示す（１００ｘ拡大率）。図２４は、５μＭ  ＣＨＩＲから２μＭ  ＣＨＩＲに分化培地を交換する前の分化第２日の細胞を示す（１００ｘ拡大率）。ＣＨＩＲは中胚葉性分化を引き起こす。非中胚葉性細胞は凝集塊を形成し、浮遊して見え得る。図２５は、培地交換前のＥＣ分化第４日の細胞を示す（１００ｘ拡大率）。ＥＣコロニーは、浮遊する未分化細胞凝集塊の下に出現する。図２６は、分化第７日のＥＣ細胞を示す（１００ｘ拡大率）。ＥＣコロニーが見え、より密集している。数個の未分化細胞クラスターのみが見えた。図２７は、第１２日〜第１４日後及びＭＡＣＳ選別前の細胞を示す（１００ｘ拡大率）。
【０３５４】
実施例１０−マウス内皮細胞（ｍｉＥＣ）に分化したＨＩＰ細胞
ＨＩＰ  ｉＰＳＣ及びｍｉＰＳＣを内皮細胞（ｍｉＥＣ）に分化させたが、ＨＩＰ細胞由来ｍｉＥＣのみが同種宿主において長期間生存した。６ウェルプレート中のゼラチン上にＨＩＰ及びｍｉＰＳＣを播種し、マウスｉＰＳＣ培地中で維持した。細胞が６０％培養密度に到達した後、分化を開始させ、２％Ｂ−２７マイナスインスリン（両者ともＧｉｂｃｏ）及び５μＭ  ＣＨＩＲ−９９０２１（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有するＲＰＭＩ−１６４０へと培地を交換した。第２日に、削減培地（ｒｅｄｕｃｅｄ  ｍｅｄｉａ）：２％Ｂ−２７マイナスインスリン（両者ともＧｉｂｃｏ）及び２μＭ  ＣＨＩＲ−９９０２１（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）を含有するＲＰＭＩ−１６４０へと培地を交換した。第４日〜第７日に、ＲＰＭＩ−１６４０ＥＣ培地、２％Ｂ−２７マイナスインスリンプラス５０ｎｇ／ｍＬマウス血管内皮胞増殖因子（ｍＶＥＧＦ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、１０ｎｇ／ｍＬマウス線維芽細胞増殖因子塩基性（ｍＦＧＦｂ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１０μＭ  Ｙ−２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及び１μＭ  ＳＢ４３１５４２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＲＰＭＩ−１６４０に細胞を曝露した。第７日から内皮細胞クラスターが見られ、ＥＧＭ−２  ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ培地（Ｌｏｎｚａ）プラス１０％ＦＣＳ  ｈｉ（Ｇｉｂｃｏ）、２５ｎｇ／ｍＬ  ｍＶＥＧＦ、２ｎｇ／ｍＬ  ｍＦＧＦｂ、１０μＭ  Ｙ−２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び１μＭ  ＳＢ４３１５４２中で細胞を維持した。２１日後に分化工程を完了し、分化工程中に未分化細胞が剥離した。精製のために、抗ＣＤ１５  ｍＡｂコーティング磁気マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を使用して製造者のプロトコールに従い、細胞をＭＡＣＳ精製に通した。
【０３５５】
ｒｔＰＣＲ）及び免疫蛍光により内皮細胞分化を確認した。ＥＧＭ−２  ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ培地プラスサプリメント及び１０％ＦＣＳ  ｈｉ中でフロースルーからの高度精製ＨＩＰ及びｍｉＥＣを培養した。３〜４日ごとに細胞を１：３に継代するためにＴｒｙｐＬＥを使用した。上記のようにＰＣＲを行った。次のプライマーを使用した：ＶＥ−カドヘリンフォワードプライマー（配列番号１３）：５’−ＧＧＡＴＧＣＡＧＡＧＧＣＴＣＡＣＡＧＡＧ−３’及びリバースプライマー（配列番号１４）：５’−ＣＴＧＧＣＧＧＴＴＣＡＣＧＴＴＧＧＡＣＴ−３’。ｍｉＰＳＣ及びＨＩＰ細胞の両方からのＥＣ細胞は、ＶＥ−カドヘリン発現を含め、分化した遺伝子発現プロファイルを示し、親細胞はそれを示さなかった（図２８）。
【０３５６】
ＣＤ３１（ａｂ２８３６４，Ａｂｃａｍ）及びＶＥ−カドヘリン（ｓｃ−６４５８，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）に対する免疫蛍光（ＩＦ）によってもそれらの表現型を確認した。簡潔に述べると、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで細胞を１５分間固定した。細胞膜を透過処理液（ＡＳＢ−０１０２，Ａｐｐｌｉｅｄ  ＳｔｅｍＣｅｌｌ）で透過処理し、続いてブロッキング溶液（ＡＳＢ−０１０３，Ａｐｐｌｉｅｄ  ＳｔｅｍＣｅｌｌ）を使用し、一次抗体と温置した。可視化のために、ＡＦ４８８又はＡＦ５５５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と複合化した二次抗体と細胞を温置した。ＤＡＰＩでの核染色後、画像を得て、Ｌｅｉｃａ  ＳＰ５レーザー共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）で分析した。ｍｉＰＳＣ及びＨＩＰ細胞の両方からのＥＣ細胞がＣＤ３１及びＶＥ−カドヘリンに対して両方陽性に染色された（データは示さない）。
【０３５７】
免疫蛍光アッセイによってチューブ形成も確認した。２．５ｘ１０５個のｍｉＥＣを５μＭ  ＣＦＳＥ及び０．１μｇ／ｍＬ  Ｈｏｅｃｈｓｔ（両方ともＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で室温にて１０分間染色し、２４ウェルプレートにおいて１０ｍｇ／ｍＬ未希釈マトリゲル（３５６２３１，Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）上に播種した。４８時間後、ＩＦによりチューブ形成を可視化した（データは示さない）。
【０３５８】
実施例６−ｍＨＩＰ細胞由来内皮細胞は同種移植で生存する
同種低ｍＥＣは、後肢虚血モデルにおいてインビボで生存した。Ａ．フェモラリス（大腿輪、Ａ．ｆｅｍｏｒａｌｉｓ）の除去後、Ｆｌｕｃ＋ｗｔ又はＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｍＥＣの移植物を同種マウスに移植し、ＢＬＩにより長軸方向に追跡した。群あたり１５匹の動物を使用した。
【０３５９】
生体発光イメージング（ＢＬＩ）の場合、Ｄ−ルシフェリン蛍カリウム塩（３７５ｍｇ／ｋｇ；Ｂｉｏｓｙｎｔｈ  ＡＧ，Ｓｔａａｄ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）をＰＢＳ（ｐＨ７．４）（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で溶解させ、麻酔下のマウスの腹腔内に注射した（２５０μＬ／マウス）。ＩＶＩＳ  ２００  ｓｙｓｔｅｍ（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を使用して動物を画像化した。最大光子／秒／ｃｍ２／ステラジアン（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）の単位で関心のある領域（ＲＯＩ）の生体発光を定量した。Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）を使用してＲＯＩからの最大シグナルを測定した。第０日、第１日及び第３０日まで１日おき、及びその後１０日ごとにマウスを監視した。
【０３６０】
全動物のＢＬＩ値をプロットした。免疫原性が非常に高いｗｔ  ｍＥＣは１５日以内に拒絶され、経時的にＢＬＩシグナル低下を示し、一方でＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ移植物は全て生存した（図２９）。
【０３６１】
実施例１１−ｍＨＩＰ細胞由来ＥＣ細胞はインビトロで免疫応答を逃れる
ＨＩＰ細胞由来内皮細胞は、インビトロでＩＦＮ−γ又はナチュラルキラー応答を誘発しなかった。
【０３６２】
Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ。一方向性の酵素結合免疫スポット（Ｅｌｉｓｐｏｔ）アッセイの場合、細胞注入から５日後にレシピエント脾臓細胞を脾臓から単離し、応答細胞として使用した。ドナー細胞をマイトマイシンで処理し（５０μｇ／ｍＬで３０分）、刺激細胞として使用した。１００，０００個の刺激細胞を１ｘ１０６個のレシピエント応答脾臓細胞と２４時間温置し、Ｅｌｉｓｐｏｔプレートリーダーを使用してＩＦＮ−γ及びＩＬ−４スポットの頻度を数え上げた。
【０３６３】
ドナー特異的抗体。５６℃に３０分間加熱することによって、レシピエントマウスからの血清を非働化した。等量の血清及び細胞懸濁液（５ｘ１０６／ｍＬ）を４℃で４５分間温置した。ＦＩＴＣ複合化ヤギ抗マウスＩｇＭ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で細胞を標識し、フローサイトメトリー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により分析した。
【０３６４】
インビトロでのマウスＮＫ細胞Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ。ポリＩ：Ｃ注射（２００μＬ滅菌生理食塩水中の１５０ｎｇポリＩ：Ｃ、腹腔内（ｉ．ｐ．）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）後に、ＮＫ細胞を新鮮なＢＡＬＢ／ｃ脾臓から単離した。赤血球溶解後、抗ＣＤ４９ｂ  ｍＡｂコーティング磁気ビーズ選別により細胞を精製し、応答細胞として使用した。この細胞集団は＞９９％ＣＤ３−であり、ＮＫ細胞（＞９０％）及び、骨髄細胞を含む他の細胞（＜１０％）を含有した。Ｅｌｉｓｐｏｔ原理を使用して、ＩＬ−２（１ｎｇ／ｍＬ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）の存在下でＮＫ細胞をＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−又はＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−Ｃｄ４７ｔｇ  ｍｉＰＳＣと同時培養し、それらのＩＦＮ−γ放出を測定した。ＹＡＣ−１細胞（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を陽性対照とした。マイトマイシン処理（５０μｇ／ｍＬで３０分間）刺激細胞をＮＫ細胞とともに（１：１）２４時間温置し、Ｅｌｉｓｐｏｔプレートリーダーを使用してＩＦＮ−γスポット頻度を数え上げた。
【０３６５】
ｗｔ  ｍｉＰＳＣ由来ｍｉＥＣのＣ５７ＢＬ／６又はＢＡＬＢ／ｃレシピエントへの注入から５日後、ＩＦＮ−γ  Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイのために脾臓細胞を回収した（箱は中央値とともに２５ｔｈ〜７５ｔｈパーセンタイル、ひげは最小−最大、群あたり動物６匹、両側スチューデントｔ検定）。ＩＦＮ−γ応答は、全ての同種レシピエントにおいて非常により強かった。５日後にレシピエント血清と温置したｗｔ  ｍｉＰＳＣ由来ｍｉＥＣに対するＩｇＭ結合の平均蛍光（ＭＦＩ）（箱は中央値とともに２５ｔｈ〜７５ｔｈパーセンタイル、ひげは最小−最大、群あたり動物６匹、両側スチューデントｔ検定）。全ての同種レシピエントにおいて顕著により強いＩｇＭ応答があった（図３０）。
【０３６６】
同様に、Ｃ５７ＢＬ／６又はＢＡＬＢ／ｃレシピエントにＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｍｉＰＳＣ由来ｍｉＥＣを注入し、５日後にＩＦＮ−γ  Ｅｌｉｓｐｏｔを実施した（箱は中央値とともに２５ｔｈ〜７５ｔｈパーセンタイル、ひげは最小−最大、群あたり動物６匹、両側スチューデントｔ検定）。Ｂ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−Ｃｄ４７ｔｇ  ｍｉＰＳＣ由来ｍｉＥＣへのＩｇＭ結合の平均蛍光（ＭＦＩ））、５日後にレシピエント血清と温置した（箱は中央値とともに２５ｔｈ〜７５ｔｈパーセンタイル、ひげは最小−最大、群あたり６匹、両側スチューデントｔ検定）。同種レシピエントにおいて測定可能なＩＦＮ−γ応答又はＩｇＭ応答はなかった。ＮＫ細胞殺傷に対するＣｄ４７過剰発現の阻害効果を評価するために、Ｂ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ｍｉＰＳＣ又はＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｍｉＰＳＣ由来のｍｉＥＣを用いてＮＫ細胞でのＩＦＮ−γ  Ｅｌｉｓｐｏｔを実施した（箱は中央値とともに２５ｔｈ〜７５ｔｈパーセンタイル、ひげは最小−最大、独立実験６回、ボンフェローニの事後検定とのＡＮＯＶＡ）。Ｂ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−ｍｉＰＳＣからの派生物のみがＮＫ細胞殺傷に感受性であった（図３０）。
【０３６７】
実施例１２−ＨＩＰ細胞由来内皮細胞形態学
ＨＩＰ細胞由来内皮細胞は典型的なＥＣ形態を示した。マトリゲル中のＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−Ｃｄ４７ｔｇ  ｍｉＥＣ移植片を同種ＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に移植した。これらの低免疫原性派生物は、同種レシピエントにおいて経時的に、インビボでさらに成熟したか又はそれらの形態を変化させた。
【０３６８】
１：１希釈マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中の８００，０００個のＢ２ｍ−／−Ｃｉｉｔａ−／−Ｃｄ４７ｔｇ  ｍｉＥＣを同種ＢＡＬＢ／ｃマウスに注入した。５６日まで複数の時間点でマトリゲルプラグを回収し、１％グルタルアルデヒド入りのＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド中で２４時間固定した。試料を脱水し、パラフィン中で包埋し、５μＭの厚さの切片に切った。組織病理に対して、切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色し（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ）、倒立光学顕微鏡で画像を撮影した。細胞の源が免疫蛍光染色で示された。切片を再水和し、抗原回収及びブロッキングを行った。ルシフェラーゼ（ａｂ２１１７６）、ＶＥ−カドヘリン（ＳＣ−６４５８）に対する抗体及びＡＦ４８８又はＡＦ５５５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と複合化した対応する二次抗体とともに試料を温置した。細胞核をＤＡＰＩで対比染色し、Ｌｅｉｃａ  ＳＰ５レーザー共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で画像を撮影した。
【０３６９】
ｍｉＥＣ及び免疫細胞の同時染色実験に対して、ＶＥ−カドヘリン（ＳＣ−６４５８、Ｓｉｇｍａ）及びＣＤ３（ａｂ１６６６９、Ａｂｃａｍ）に対する一次抗体を使用し、続いてＡＦ４８８又はＡＦ５５５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と複合化された対応する二次抗体を使用した。未熟な血管形成が観察された。データは示さない．
【０３７０】
移植したｍｉＥＣが、第１４日前後に環状構造において組織化を開始し、第３週前後で赤血球を含有した原始的血管を形成した（データは示さない）。
【０３７１】
実施例６からの動物から採取した細胞の灌流ドップラー（Ｐｅｒｉｓｃａｎ  ＰＩＭ  ＩＩ”（ＰＥＲＩＭＥＤ  Ｌｔｄ．，Ｉｔａｌｙ）から新しい血管形成が明らかになり、低ＥＣ群で肢をレスキューした（データは示さない）。
【０３７２】
実施例１３−内皮細胞に分化したヒトＨＩＰ細胞
ヒトＨＩＰ細胞をｈｉＥＣ細胞に分化させた。野生型ｈｉＰＳＣ及びヒトＨＩＰ細胞を６ウェルプレート中の希釈マトリゲル（３５６２３１、Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に播種し、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８  Ｆｌｅｘ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）中で維持した。６０％培養密度で分化を開始させ、２％Ｂ−２７マイナスインスリン（両方ともＧｉｂｃｏ）及び５μＭ  ＣＨＩＲ−９９０２１（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）を含有するＲＰＭＩ−１６４０へと培地を交換した。第２日に、削減培地（ｒｅｄｕｃｅｄ  ｍｅｄｉａ）：２％Ｂ−２７マイナスインスリン（Ｇｉｂｃｏ）及び２μＭ  ＣＨＩＲ−９９０２１（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）を含有するＲＰＭＩ−１６４０へと培地を交換した。第４日〜第７日に、ＲＰＭＩ−１６４０ＥＣ培地、２％Ｂ−２７マイナスインスリン＋５０ｎｇ／ｍＬヒト血管内皮胞増殖因子（ＶＥＧＦ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１０ｎｇ／ｍＬヒト線維芽細胞増殖因子塩基性（ＦＧＦｂ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１０μＭ  Ｙ−２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び１μＭ  ＳＢ４３１５４２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＲＰＭＩ−１６４０に細胞を曝露した。第７日から内皮細胞クラスターが見え、ＥＧＭ−２  ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ培地（Ｌｏｎｚａ）＋１０％ＦＣＳ  ｈｉ（Ｇｉｂｃｏ）、２５ｎｇ／ｍＬ  ＶＥＧＦ、２ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦｂ、１０μＭ  Ｙ−２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び１μＭ  ＳＢ４３１５４２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中で細胞を維持した。１４日後に分化工程を完了させ、未分化細胞が分化工程中に剥離した。精製のために、２０μＭ  ＰｌｕｒｉＳｌｎ−１（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）で４８時間、細胞を処理した。ＥＧＭ−２  ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ培地（Ｌｏｎｚａ）＋サプリメント及び１０％ＦＣＳ  ｈｉ（Ｇｉｂｃｏ）中で高度精製ＥＣを培養した。３〜４日ごとに細胞を１：３で継代するために、ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓを使用した。
【０３７３】
それらの表現型を確認するために上記のようにＩＦ染色を実施した。ＣＤ３１（ａｂ２８３６４、Ａｂｃａｍ）及びＶＥ−カドヘリン（ｓｃ−６４５８、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に対して一次抗体を使用し、続いてＡＦ４８８又はＡＦ５５５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と複合化された対応する二次抗体を使用した。細胞核をＤＡＰＩで染色した。Ｌｅｉｃａ  ＳＰ５レーザー共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）を使用してイメージングを行った。ＶＥ−カドヘリン（フォワード（配列番号１５）：５’−ＡＡＧＡＴＧＣＡＧＡＧＧＣＴＣＡＴＧ−３’及びリバースプライマー（配列番号１６）：５’−ＣＡＴＧＡＧＣＣＴＣＴＧＣＡＴＣＴＴ−３’）に対するＰＣＲを上記のように行った。
【０３７４】
ｗｔ  ｈｉＰＳＣ（ａ）及びＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｈｉＰＳＣ（ｂ）の、対応するｈｉＥＣ派生物への分化に成功した。ｈｉＰＳＣ及びＨＩＰ細胞の両方からのＥＣ細胞は、ＣＤＨ５発現を含む分化した遺伝子発現プロファイルを示し、親細胞は示さなかった。共焦点免疫蛍光により、ｍｉＥＣはＣＤ３１及びＶＥ−カドヘリンに対して陽性であった。全ての派生物はそれらの多能性遺伝子の発現を喪失した（２つの独立した実験の代表的写真）（図３１及びデータは示さない）。
【０３７５】
実施例１４−ｈｉＥＣ細胞はヒト化マウス中で生存した
ヒトＨＩＰ細胞は、ヒト化免疫系を有するマウスに移植され、生存した。ヒト化ＮＳＧ−ＳＧＭ３マウス（１８〜３０週）はＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（カタログ番号ＳＭＧ３−ＣＤ３４，Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）から購入した。ヒトＣＤ３４＋造血系幹細胞（ＨＳＥ）−生着ＮＳＧ−ＳＧＭ３マウスは多系統ヒト免疫細胞を発現した。これらは、宿主に対するドナー細胞免疫反応性がないＴ細胞依存性免疫反応を示す機能的ヒト免疫系を示した。動物を無作為に実験群に割り当てた。全動物においてヒトＣＤ４５＋細胞集団中のＣＤ３＋細胞のパーセンテージを評価し、ＣＤ３パーセンテージは野生型とＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ群との間で有意差はなかった。全てのヒト化ＮＳＧ−ＳＧＭ３マウスはＨＬＡ−Ａ型であり、細胞移植物に対するミスマッチの数を計算した。ｈｉＥＣ群でのＥｌｉｓｐｏｔアッセイにおいて、常に２個のミスマッチがあった。
【０３７６】
同種ヒト化ＮＳＧ−ＳＧＭ３マウスに野生型又はＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｈｉＥＣ移植物を注入した。５日後にＩＦＮ−γ  Ｅｌｉｓｐｏｔを実施した（平均±ｓ．ｄ．、動物３匹／群、両側スチューデントｔ検定）。ナイーブマウスでのバックグラウンドスポット頻度が示される（平均±ｓ．ｄ．、４匹／群、両側スチューデントｔ検定）。５日後に、何れかのｈｉＥＣに対するＩｇＭ結合のｌ，ＭＦＩをレシピエント血清と温置した（平均±ｓ．ｄ．、３匹／群、両側スチューデントｔ検定）。ナイーブマウスにおけるバックグラウンド蛍光を示す（平均±ｓ．ｄ．、３匹／群、スチューデントｔ検定）。Ｂ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ｈｉＥＣ又はＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＣＤ４７ｔｇ  ｈｉＥＣを用いてヒトＮＫ細胞でのＩＦＮ−γ  Ｅｌｉｓｐｏｔを実施した（箱は中央値とともに２５ｔｈ〜７５ｔｈパーセンタイル、ひげは最小−最大、群あたり６匹、ボンフェローニ事後検定とともにＡＮＯＶＡ）（図３２）。
【０３７７】
本明細書中で開示又は参照する全ての刊行物及び特許文書は、それらの全体において参照により組み込まれる。前述の記載は、例示及び説明の目的のためにのみ与えられている。この記載は、開示される正確な形態に本発明を限定するものではない。
【０３７８】
本発明の範囲は、本明細書に添付される特許請求の範囲により定められるものとする。
【０３７９】
非公式配列リスト
配列番号１−ヒトβ−２−ミクログロブリンタンパク質
【化１】
2021530232.tif 000004
配列番号２−ヒトＣＩＩＴＡタンパク質、１６０アミノ酸Ｎ−末端
【化２】
2021530232.tif 000005
配列番号３−ヒトＣＤ４７タンパク質
【化３】
2021530232.tif 000006
配列番号４−単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）タンパク質
【化４】
2021530232.tif 000007
配列番号５−エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）タンパク質
【化５】
2021530232.tif 000008
配列番号６−短縮ヒトカスパーゼ９タンパク質
【化６】
2021530232.tif 000009
【図１】
2021530232.tif 000010
【図２】
2021530232.tif 000011
【図３】
2021530232.tif 000012
【図４】
2021530232.tif 000013
【図５】
2021530232.tif 000014
【図６】
2021530232.tif 000015
【図７】
2021530232.tif 000016
【図８】
2021530232.tif 000017
【図９】
2021530232.tif 000018
【図１０】
2021530232.tif 000019
【図１１】
2021530232.tif 000020
【図１２】
2021530232.tif 000021
【図１３】
2021530232.tif 000022
【図１４】
2021530232.tif 000023
【図１５】
2021530232.tif 000024
【図１６】
2021530232.tif 000025
【図１７】
2021530232.tif 000026
【図１８】
2021530232.tif 000027
【図１９Ａ】
2021530232.tif 000028
【図１９Ｂ】
2021530232.tif 000029
【図１９Ｃ】
2021530232.tif 000030
【図２０】
2021530232.tif 000031
【図２１】
2021530232.tif 000032
【図２２】
2021530232.tif 000033
【図２３】
2021530232.tif 000034
【図２４】
2021530232.tif 000035
【図２５】
2021530232.tif 000036
【図２６】
2021530232.tif 000037
【図２７】
2021530232.tif 000038
【図２８】
2021530232.tif 000039
【図２９】
2021530232.tif 000040
【図３０】
2021530232.tif 000041
【図３１】
2021530232.tif 000042
【図３２】
2021530232.tif 000043
【配列表】
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【国際調査報告】
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2021530232.tif 000051
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