(57)【要約】本明細書では、少なくとも２つの異なる核酸ベクターを含み、該少なくとも２つの異なるベクターの各々がステレオシリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含む、組成物、及び対象において非症候性感音性聴力喪失を治療するためのこれらの組成物の使用が提供される。【選択図】図１０
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの異なる核酸ベクターを含む組成物であって、
前記少なくとも２つの異なるベクターの各々が、ステレオシリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、前記コードされた部分の各々が、少なくとも３０アミノ酸残基の長さであり、前記コードされた部分の各々のアミノ酸配列が任意選択で、前記コードされた部分のうちの異なる部分のアミノ酸配列と部分的に重複してもよく、
前記少なくとも２つの異なるベクターのうちのいずれの単一のベクターも、完全長ステレオシリンタンパク質をコードしておらず、
前記コード配列のうちの少なくとも１つが、ステレオシリンゲノムＤＮＡの２つの隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、前記２つの隣接するエクソンの間にイントロン配列を欠いており、
哺乳類細胞に導入されるとき、前記少なくとも２つの異なるベクターが互いに相同組換えを経て、それによって、完全長ステレオシリンタンパク質をコードする組換え核酸が形成される、前記組成物。
【請求項２】
前記少なくとも２つの異なるベクターの各々が、プラスミド、トランスポゾン、コスミド、人工染色体、またはウイルスベクターである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記少なくとも２つの異なるベクターの各々が、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記少なくとも２つの異なるベクターの各々が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターから選択されるウイルスベクターである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ウイルスベクターが、ＡＡＶベクターである、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記コードされた部分のうちのいずれの部分のアミノ酸配列も、前記コードされた部分のうちの異なる部分のアミノ酸配列と重複していない、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記コードされた部分の各々のアミノ酸配列が、前記コードされた部分のうちの異なる部分のアミノ酸配列と部分的に重複する、請求項７に記載の組成物。
【請求項８】
前記重複するアミノ酸配列が、約３０アミノ酸残基〜約１０００アミノ酸残基の長さである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ベクターが、２つの異なるベクターを含み、前記２つの異なるベクターの各々が、イントロンの異なるセグメントを含み、前記イントロンが、ステレオシリンゲノムＤＮＡに存在するイントロンのヌクレオチド配列を含み、前記２つの異なるセグメントの配列が、少なくとも１００ヌクレオチド重複する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記２つの異なるセグメントの配列が、約１００ヌクレオチド〜約８００ヌクレオチド重複する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記少なくとも２つの異なるベクターの各々のヌクレオチド配列が、約５００ヌクレオチド〜約１０，０００ヌクレオチドの長さである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記少なくとも２つの異なるベクターの各々のヌクレオチド配列が、５００ヌクレオチド〜５，０００ヌクレオチドの長さである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物中の異なるベクターの数が２つである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記２つの異なるベクターのうちの第１のベクターが、前記ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分をコードするコード配列を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ステレオシリンタンパク質の前記Ｎ末端部分が、３０アミノ酸〜１６００アミノ酸の長さである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ステレオシリンタンパク質の前記Ｎ末端部分が、２００アミノ酸〜１５００アミノ酸の長さである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記第１のベクターが、プロモーター及びコザック配列のうちの一方または両方をさらに含む、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記第１のベクターが、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであるプロモーターを含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記２つの異なるベクターのうちの第２のベクターが、前記ステレオシリンタンパク質のＣ末端部分をコードするコード配列を含む、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ステレオシリンタンパク質の前記Ｃ末端部分が、３０アミノ酸〜１６００アミノ酸の長さである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ステレオシリンタンパク質の前記Ｃ末端部分が、２００アミノ酸〜１５００アミノ酸の長さである、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記第２のベクターが、ポリ（ｄＡ）配列をさらに含む、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の組成物を含むキット。
【請求項２５】
前記組成物を含む充填済みシリンジをさらに含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
哺乳動物の蝸牛に、治療上有効量の請求項１〜２３のいずれか１項に記載の組成物を導入することを含む、方法。
【請求項２７】
前記哺乳動物がヒトである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記哺乳動物が、欠陥のあるステレオシリン遺伝子を有すると以前に特定されている、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
哺乳類細胞において完全長ステレオシリンタンパク質の発現を増加させる方法であって、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の組成物を前記哺乳類細胞に導入することを含む、前記方法。
【請求項３０】
前記哺乳類細胞が蝸牛外有毛細胞である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記哺乳類細胞が、欠陥のあるステレオシリン遺伝子を有すると以前に判定されている、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
哺乳動物の蝸牛内の外有毛細胞において完全長ステレオシリンタンパク質の発現を増加させる方法であって、
前記哺乳動物の前記蝸牛に、治療上有効量の請求項１〜２３のいずれか１項に記載の組成物を導入することを含む、前記方法。
【請求項３４】
前記哺乳動物が、欠陥のあるステレオシリン遺伝子を有すると以前に特定されている、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記哺乳動物がヒトである、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
欠陥のあるステレオシリン遺伝子を有すると特定された対象において無症候性感音性聴力喪失を治療する方法であって、
治療上有効量の請求項１〜２３のいずれか１項に記載の組成物を前記対象の前記蝸牛に投与することを含む、前記方法。
【請求項３７】
前記対象がヒトである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記投与ステップの前に、前記対象が欠陥のあるステレオシリン遺伝子を有することを判定することをさらに含む、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
２つの異なる核酸ベクターを含む組成物であって、
前記２つの異なる核酸ベクターのうちの第１の核酸ベクターが、プロモーターと、前記プロモーターの３’側に位置付けられた、ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分をコードする第１のコード配列と、前記第１のコード配列の前記３’末端に位置付けられたスプライシングドナーシグナル配列とを含み、
前記２つの異なる核酸ベクターのうちの第２の核酸ベクターが、スプライシングアクセプターシグナル配列と、前記スプライシングアクセプターシグナル配列の前記３’末端に位置付けられた、ステレオシリンタンパク質のＣ末端部分をコードする第２のコード配列と、前記第２のコード配列の前記３’末端におけるポリアデニル化配列とを含み、
前記コードされた部分の各々が、少なくとも３０アミノ酸残基の長さであり、前記コードされた部分の各々のアミノ酸配列が重複せず、前記２つの異なるベクターのうちのいずれの単一のベクターも、完全長ステレオシリンタンパク質をコードしておらず、
哺乳類細胞に導入されるとき、前記スプライシングドナーシグナル配列と前記スプライシングアクセプターシグナル配列との間でスプライシングが生じて、それによって、完全長ステレオシリンタンパク質をコードする組換え核酸が形成される、前記組成物。
【請求項４０】
前記コード配列のうちの少なくとも１つが、ステレオシリンゲノムＤＮＡの２つの隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、前記２つの隣接するエクソンの間にイントロン配列を欠いている、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
２つの異なる核酸ベクターを含む組成物であって、
前記２つの異なる核酸ベクターのうちの第１の核酸ベクターが、プロモーターと、前記プロモーターの３’側に位置付けられた、ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分をコードする第１のコード配列と、前記第１のコード配列の前記３’末端に位置付けられたスプライシングドナーシグナル配列と、前記スプライシングドナーシグナル配列の３’側に位置付けられた第１の検出可能マーカー遺伝子とを含み、
前記２つの異なる核酸ベクターのうちの第２の核酸ベクターが、第２の検出可能マーカー遺伝子と、前記第２の検出可能マーカー遺伝子の３’側に位置付けられたスプライシングアクセプターシグナル配列と、前記スプライシングアクセプターシグナル配列の前記３’末端に位置付けられた、ステレオシリンタンパク質のＣ末端部分をコードする第２のコード配列と、前記第２のコード配列の前記３’末端に位置付けられたポリアデニル化配列とを含み、
前記コードされた部分の各々が、少なくとも３０アミノ酸残基の長さであり、前記コードされた部分の各々のアミノ酸配列が重複せず、前記２つの異なるベクターのうちのいずれの単一のベクターも、完全長ステレオシリンタンパク質をコードしておらず、
哺乳類細胞に導入されるとき、前記スプライシングドナーシグナルと前記スプライシングアクセプターシグナルとの間でスプライシングが生じて、それによって、完全長ステレオシリンタンパク質をコードする組換え核酸が形成される、前記組成物。
【請求項４２】
前記コード配列のうちの少なくとも１つが、ステレオシリンゲノムＤＮＡの２つの隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、前記２つの隣接するエクソンの間にイントロン配列を欠いている、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記第１の検出可能マーカー遺伝子または前記第２の検出可能マーカー遺伝子が、アルカリホスファターゼである、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
前記第１の検出可能マーカー遺伝子及び前記第２の検出可能マーカー遺伝子が同じである、請求項４１または４３に記載の組成物。
【請求項４５】
２つの異なる核酸ベクターを含む組成物であって、
前記２つの異なる核酸ベクターのうちの第１の核酸ベクターが、プロモーターと、前記プロモーターに対して３’側に位置付けられた、ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分をコードする第１のコード配列と、前記第１のコード配列の前記３’末端に位置付けられたスプライシングドナーシグナル配列と、前記スプライシングドナーシグナル配列に対して３’側に位置付けられたＦ１ファージ組換え誘導領域とを含み、
前記２つの異なる核酸ベクターのうちの第２の核酸ベクターが、Ｆ１ファージ組換え誘導領域と、前記Ｆ１ファージ組換え誘導領域の３’側に位置付けられたスプライシングアクセプターシグナル配列と、前記スプライシングアクセプターシグナル配列の前記３’末端に位置付けられた、ステレオシリンタンパク質のＣ末端部分をコードする第２のコード配列と、前記第２のコード配列の前記３’末端に位置付けられたポリアデニル化配列とを含み、
前記コードされた部分の各々が、少なくとも３０アミノ酸残基の長さであり、前記コードされた部分の各々のアミノ酸配列が重複せず、前記２つの異なるベクターのうちのいずれの単一のベクターも、完全長ステレオシリンタンパク質をコードしておらず、
哺乳類細胞に導入されるとき、前記スプライシングドナーシグナルと前記スプライシングアクセプターシグナルとの間でスプライシングが生じて、それによって、完全長ステレオシリンタンパク質をコードする組換え核酸が形成される、前記組成物。
【請求項４６】
前記コード配列のうちの少なくとも１つが、ステレオシリンゲノムＤＮＡの２つの隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、前記２つの隣接するエクソンの間にイントロン配列を欠いている、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
Ｃａｓ９ヌクレアーゼと、
ガイドＲＮＡであって、前記ガイドＲＮＡの５’末端に、配列番号５の１３９５５〜１４１５１位内の２０個の連続するヌクレオチドに相補的である２０個のヌクレオチドからなる相補的領域を含む、前記ガイドＲＮＡと、を含み、配列番号５の内因性ステレオシリン偽遺伝子配列における既定の部位のナンセンス変異を除去するためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ＲＮＡ先導型ゲノム編集において使用することができ、
哺乳類細胞に導入されるとき、前記ステレオシリン偽遺伝子の遺伝子座で、完全長ステレオシリンタンパク質をコードする核酸が再構成される、組成物。
【請求項４８】
少なくとも１つの核酸ベクターを含む組成物であって、前記少なくとも１つの核酸ベクターが、配列番号５の１３９５５〜１４１５１位における連続ヌクレオチド配列に少なくとも８０％相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含み、
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１５〜３０ヌクレオチドの長さであり、
哺乳類細胞に導入されるとき、ステレオシリン偽遺伝子の遺伝子座で、完全長ステレオシリンタンパク質をコードする核酸が生成される、前記組成物。
【請求項４９】
請求項３９〜４８のいずれか１項に記載の組成物を含むキット。
【請求項５０】
前記組成物を含む充填済みシリンジをさらに含む、請求項４９に記載のキット。
【請求項５１】
哺乳動物の蝸牛に、治療上有効量の請求項３９〜４８のいずれか１項に記載の組成物を導入することを含む、方法。
【請求項５２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記哺乳動物が、欠陥のあるステレオシリン遺伝子を有すると以前に特定されている、請求項５１または５２に記載の方法。
【請求項５４】
哺乳類細胞において完全長ステレオシリンタンパク質の発現を増加させる方法であって、請求項３９〜４８のいずれか１項に記載の組成物を前記哺乳類細胞に導入することを含む、前記方法。
【請求項５５】
前記哺乳類細胞が蝸牛外有毛細胞である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記哺乳類細胞が、欠陥のあるステレオシリン遺伝子を有すると以前に判定されている、請求項５４〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
哺乳動物の蝸牛内の外有毛細胞において完全長ステレオシリンタンパク質の発現を増加させる方法であって、
前記哺乳動物の前記蝸牛に、治療上有効量の請求項３９〜４８のいずれか１項に記載の組成物を導入することを含む、前記方法。
【請求項５９】
前記哺乳動物が、欠陥のあるステレオシリン遺伝子を有すると以前に特定されている、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記哺乳動物がヒトである、請求項５８または５９に記載の方法。
【請求項６１】
欠陥のあるステレオシリン遺伝子を有すると特定された対象において無症候性感音性聴力喪失を治療する方法であって、
治療上有効量の請求項３９〜４８のいずれか１項に記載の組成物を前記対象の前記蝸牛に投与することを含む、前記方法。
【請求項６２】
前記対象がヒトである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記投与ステップの前に、前記対象が欠陥のあるステレオシリン遺伝子を有することを判定することをさらに含む、請求項６１または６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記２つのベクターのうちの１つが、配列番号１３を含み、前記２つのベクターのうちの第２のベクターが、配列番号１７を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項６５】
前記少なくとも２つの異なるベクターのうちの１つが、ステレオシリンタンパク質をコードする配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６６】
ステレオシリンタンパク質をコードする前記配列が、配列番号１１と少なくとも９０％同一である、請求項６５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１８年７月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／６９７，６５２号の優先権を主張し、その全内容は参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本開示は全般的に、ヒト対象において聴力喪失を治療するための核酸の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
非症候性難聴は、症候性難聴とは対照的に、他の徴候及び症状に関連しない聴力喪失である。遺伝性難聴の症例の７０〜８０パーセントが非症候性である。非症候性難聴の原因は複合的であるが、研究者らは、変化した場合に非症候性難聴に関連する３０個超の遺伝子（例えば、ステレオシリン（ＳＴＲＣ））を同定している。現在の治療は主として、軽度から重度の聴力喪失に対する聴力増幅、及び重度から深刻な聴力喪失に対する蝸牛移植からなる。しかしながら、非症候性難聴を予防するかまたは好転させるための薬剤及び方法に対する長年認識されてきた必要性が残っている。
【０００４】
聴力喪失は、伝音性（外耳道または中耳から発生する）、感音性（内耳または聴神経から発生する）、または混合型であり得る。非症候性難聴のほとんどの形態は、内耳における構造への損傷によって引き起こされる永久的聴力喪失に関連するが（感音性難聴）、一部の形態は、中耳における変化を伴い得る（伝音性聴力喪失）。ヒトの感音性聴力喪失の大多数は、蝸牛内のコルチ器の有毛細胞における異常（良好でない有毛細胞機能）によって引き起こされる。有毛細胞は出生時に異常である場合もあれば、個体の生涯の間に損傷を受ける（例えば、騒音性外傷または感染の結果として）場合もある。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、少なくとも２つの異なる核酸ベクターを含み、該少なくとも２つの異なるベクターの各々がステレオシリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含む、組成物を用いて、哺乳類細胞において活性ステレオシリンタンパク質（例えば、完全長ステレオシリンタンパク質）をコードする配列を生成し、それによって、治療を必要とする対象において非症候性感音性聴力喪失を治療することができるという発見に基づく。
【０００６】
本明細書では、少なくとも２つの異なる核酸ベクターを含む組成物が提供され、該少なくとも２つの異なるベクターの各々は、ステレオシリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、該コードされた部分の各々は、少なくとも３０アミノ酸残基の長さであり、該コードされた部分の各々のアミノ酸配列は任意選択で、該コードされた部分のうちの異なる部分のアミノ酸配列と部分的に重複してもよく、該少なくとも２つの異なるベクターのうちのいずれの単一のベクターも、完全長ステレオシリンタンパク質をコードしておらず、該コード配列のうちの少なくとも１つは、ステレオシリンゲノムＤＮＡの２つの隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、該２つの隣接するエクソンの間にイントロン配列を欠いており、哺乳類細胞に導入されるとき、該少なくとも２つの異なるベクターは互いに相同組換えを経て、それによって、完全長ステレオシリンタンパク質をコードする組換え核酸が形成される。本明細書に記載される組成物のうちのいずれかの一部の実施形態では、該少なくとも２つの異なるベクターの各々は、プラスミド、トランスポゾン、コスミド、人工染色体、またはウイルスベクターである。本明細書に記載される組成物のうちのいずれかの一部の実施形態では、該少なくとも２つの異なるベクターの各々は、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）である。本明細書に記載される組成物のうちのいずれかの一部の実施形態では、該少なくとも２つの異なるベクターの各々は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターから選択されるウイルスベクターである。本明細書に記載される組成物のうちのいずれかの一部の実施形態では、該ウイルスベクターは、ＡＡＶベクターである。
【０００７】
本明細書に記載される組成物のうちのいずれかの一部の実施形態では、該コードされた部分のうちのいずれの部分のアミノ酸配列も、該コードされた部分のうちの異なる部分のアミノ酸配列と重複していない。本明細書に記載される組成物のうちのいずれかの一部の実施形態では、該コードされた部分の各々のアミノ酸配列は、該コードされた部分のうちの異なる部分のアミノ酸配列と部分的に重複する。本明細書に記載される組成物のうちのいずれかの一部の実施形態では、該重複するアミノ酸配列は、約３０アミノ酸残基〜約１０００アミノ酸残基の長さである。
【０００８】
本明細書に記載される組成物のうちのいずれかの一部の実施形態では、該ベクターは、２つの異なるベクターを含み、該２つの異なるベクターの各々は、イントロンの異なるセグメントを含み、該イントロンは、ステレオシリンゲノムＤＮＡに存在するイントロンのヌクレオチド配列を含み、該２つの異なるセグメントの配列は、少なくとも１００ヌクレオチド重複する。本明細書に記載される組成物のうちのいずれかの一部の実施形態では、該２つの異なるセグメントの配列は、約１００ヌクレオチド〜約８００ヌクレオチド重複する。本明細書に記載される組成物のうちのいずれかの一部の実施形態では、該少なくとも２つの異なるベクターの各々のヌクレオチド配列は、約５００ヌクレオチド〜約１０，０００ヌクレオチドの長さ（例えば、約５００ヌクレオチド〜約５，０００ヌクレオチドの長さ）である。
【０００９】
本明細書に記載される組成物のうちのいずれかの一部の実施形態では、該組成物中の異なるベクターの数は、２つである。一部の実施形態では、該２つのベクターのうちの１つは、配列番号１３を含み、該２つのベクターのうちの第２のベクターは、配列番号１７を含む。
【００１０】
本明細書に記載される組成物のうちのいずれかの一部の実施形態では、該少なくとも２つの異なるベクターのうちの１つは、ステレオシリンタンパク質をコードする配列を含む。一部の実施形態では、ステレオシリンタンパク質をコードする該配列は、配列番号１１と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一である。
【００１１】
本明細書に記載される組成物のうちのいずれかの一部の実施形態では、該２つの異なるベクターのうちの第１のベクターは、該ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分をコードするコード配列を含む。本明細書に記載される組成物のうちのいずれかの一部の実施形態では、該ステレオシリンタンパク質の該Ｎ末端部分は、３０アミノ酸〜１６００アミノ酸の長さ（例えば、約２００アミノ酸〜約１５００アミノ酸の長さ）である。本明細書に記載される組成物のうちのいずれかの一部の実施形態では、該第１のベクターは、プロモーター及びコザック配列のうちの一方または両方をさらに含む。本明細書に記載される組成物のうちのいずれかの一部の実施形態では、該第１のベクターは、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであるプロモーターを含む。
【００１２】
本明細書に記載される組成物のうちのいずれかの一部の実施形態では、該２つの異なるベクターのうちの第２のベクターは、該ステレオシリンタンパク質のＣ末端部分をコードするコード配列を含む。本明細書に記載される組成物のうちのいずれかの一部の実施形態では、該ステレオシリンタンパク質の該Ｃ末端部分は、３０アミノ酸〜１６００アミノ酸の長さ（例えば、２００アミノ酸〜１５００アミノ酸の長さ）である。本明細書に記載される組成物のうちのいずれかの一部の実施形態では、該第２のベクターは、ポリ（ｄＡ）配列をさらに含む。本明細書に記載される組成物のうちのいずれかの一部の実施形態は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。
【００１３】
本明細書ではまた、本明細書に記載される組成物のうちのいずれかを含むキットも提供される。本明細書に記載されるキットのうちのいずれかの一部の実施形態は、該組成物を含む充填済みシリンジをさらに含む。
【００１４】
本明細書ではまた、哺乳動物の蝸牛に、治療上有効量の本明細書に記載される組成物のうちのいずれかを導入することを含む方法も提供される。本明細書に記載される方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、該哺乳動物は、ヒトである。本明細書に記載される方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、該哺乳動物は、欠陥のあるステレオシリン遺伝子を有すると以前に特定されている。
【００１５】
本明細書ではまた、哺乳類細胞において完全長ステレオシリンタンパク質の発現を増加させる方法も提供され、該方法は、本明細書に記載される組成物のうちのいずれかを該哺乳類細胞に導入することを含む。本明細書に記載される方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、該哺乳類細胞は、蝸牛外有毛細胞である。本明細書に記載される方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、該哺乳類細胞は、ヒト細胞である。本明細書に記載される方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、該哺乳類細胞は、欠陥のあるステレオシリン遺伝子を有すると以前に判定されている。
【００１６】
本明細書ではまた、哺乳動物の蝸牛内の外有毛細胞において完全長ステレオシリンタンパク質の発現を増加させる方法も提供され、該方法は、該哺乳動物の蝸牛に、治療上有効量の本明細書に記載される組成物のうちのいずれかを導入することを含む。本明細書に記載される方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、該哺乳動物は、欠陥のあるステレオシリン遺伝子を有すると以前に特定されている。本明細書に記載される方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、該哺乳動物は、ヒトである。
【００１７】
本明細書ではまた、欠陥のあるステレオシリン遺伝子を有すると特定された対象において無症候性感音性聴力喪失を治療する方法も提供され、該方法は、治療上有効量の本明細書に記載される組成物のうちのいずれかを該対象の蝸牛に投与することを含む。本明細書に記載される方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、該対象は、ヒトである。本明細書に記載される方法のうちのいずれかの一部の実施形態は、該投与ステップの前に、該対象が欠陥のあるステレオシリン遺伝子を有することを判定することをさらに含む。
【００１８】
本明細書ではまた、２つの異なる核酸ベクターを含む組成物も提供され、該２つの異なる核酸ベクターのうちの第１の核酸ベクターは、プロモーターと、該プロモーターの３’側に位置付けられた、ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分をコードする第１のコード配列と、該第１のコード配列の該３’末端に位置付けられたスプライシングドナーシグナル配列とを含み、該２つの異なる核酸ベクターの第２の核酸ベクターは、スプライシングアクセプターシグナル配列と、該スプライシングアクセプターシグナル配列の該３’末端に位置付けられた、ステレオシリンタンパク質のＣ末端部分をコードする第２のコード配列と、該第２のコード配列の該３’末端におけるポリアデニル化配列とを含み、該コードされた部分の各々は、少なくとも３０アミノ酸残基の長さであり、該コードされた部分の各々のアミノ酸配列は重複せず、該２つの異なるベクターのうちのいずれの単一のベクターも、完全長ステレオシリンタンパク質をコードしておらず、哺乳類細胞に導入されるとき、該スプライシングドナーシグナル配列と該スプライシングアクセプターシグナル配列との間でスプライシングが生じて、それによって、完全長ステレオシリンタンパク質をコードする組換え核酸が形成される。本明細書に記載される組成物のうちのいずれかの一部の実施形態では、該コード配列のうちの少なくとも１つは、ステレオシリンゲノムＤＮＡの２つの隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、該２つの隣接するエクソンの間にイントロン配列を欠いている。
【００１９】
また、２つの異なる核酸ベクターを含む組成物も提供され、該２つの異なる核酸ベクターのうちの第１の核酸ベクターは、プロモーターと、該プロモーターの３’側に位置付けられた、ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分をコードする第１のコード配列と、該第１のコード配列の該３’末端に位置付けられたスプライシングドナーシグナル配列と、該スプライシングドナーシグナル配列の３’側に位置付けられた第１の検出可能マーカー遺伝子とを含み、該２つの異なる核酸ベクターの第２の核酸ベクターは、第２の検出可能マーカー遺伝子と、該第２の検出可能マーカー遺伝子の３’側に位置付けられたスプライシングアクセプターシグナル配列と、該スプライシングアクセプターシグナル配列の該３’末端に位置付けられた、ステレオシリンタンパク質のＣ末端部分をコードする第２のコード配列と、該第２のコード配列の該３’末端に位置付けられたポリアデニル化配列とを含み、該コードされた部分の各々は、少なくとも３０アミノ酸残基の長さであり、該コードされた部分の各々のアミノ酸配列は重複せず、該２つの異なるベクターのうちのいずれの単一のベクターも、完全長ステレオシリンタンパク質をコードしておらず、哺乳類細胞に導入されるとき、該スプライシングドナーシグナルと該スプライシングアクセプターシグナルとの間でスプライシングが生じて、それによって、完全長ステレオシリンタンパク質をコードする組換え核酸が形成される。本明細書に記載される組成物のうちのいずれかの一部の実施形態では、該コード配列のうちの少なくとも１つは、ステレオシリンゲノムＤＮＡの２つの隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、該２つの隣接するエクソンの間にイントロン配列を欠いている。本明細書に記載される組成物のうちのいずれかの一部の実施形態では、該第１または第２の検出可能マーカー遺伝子は、アルカリホスファターゼである。本明細書に記載される組成物のうちのいずれかの一部の実施形態では、該第１及び第２の検出可能マーカー遺伝子は、同じである。
【００２０】
本明細書ではまた、２つの異なる核酸ベクターを含む組成物も提供され、該２つの異なる核酸ベクターのうちの第１の核酸ベクターは、プロモーターと、該プロモーターに対して３’側に位置付けられた、ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分をコードする第１のコード配列と、該第１のコード配列の該３’末端に位置付けられたスプライシングドナーシグナル配列と、該スプライシングドナーシグナル配列に対して３’側に位置付けられたＦ１ファージ組換え誘導領域とを含み、該２つの異なる核酸ベクターの第２の核酸ベクターは、Ｆ１ファージ組換え誘導領域と、該Ｆ１ファージ組換え誘導領域の３’側に位置付けられたスプライシングアクセプターシグナル配列と、該スプライシングアクセプターシグナル配列の該３’末端に位置付けられた、ステレオシリンタンパク質のＣ末端部分をコードする第２のコード配列と、該第２のコード配列の該３’末端に位置付けられたポリアデニル化配列とを含み、該コードされた部分の各々は、少なくとも３０アミノ酸残基の長さであり、該コードされた部分の各々のアミノ酸配列は重複せず、該２つの異なるベクターのうちのいずれの単一のベクターも、完全長ステレオシリンタンパク質をコードしておらず、哺乳類細胞に導入されるとき、該スプライシングドナーシグナルと該スプライシングアクセプターシグナルとの間でスプライシングが生じて、それによって、完全長ステレオシリンタンパク質をコードする組換え核酸が形成される。本明細書に記載される組成物のうちのいずれかの一部の実施形態では、該コード配列のうちの少なくとも１つは、ステレオシリンゲノムＤＮＡの２つの隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、該２つの隣接するエクソンの間にイントロン配列を欠いている。
【００２１】
本明細書ではまた、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと、ガイドＲＮＡであって、該ガイドＲＮＡの５’末端に、配列番号５の１３９５５〜１４１５１位内の２０個の連続するヌクレオチドに相補的である２０個のヌクレオチドからなる相補的領域を含む、該ガイドＲＮＡと、を含み、配列番号５の内因性ステレオシリン偽遺伝子配列における既定の部位のナンセンス変異を除去するためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ＲＮＡ先導型ゲノム編集において使用することができ、哺乳類細胞に導入されるとき、該ステレオシリン偽遺伝子の遺伝子座で、完全長ステレオシリンタンパク質をコードする核酸が再構成される、組成物も提供される。
【００２２】
本明細書ではまた、少なくとも１つの核酸ベクターを含む組成物であって、該少なくとも１つの核酸ベクターが、配列番号５の１３９５５〜１４１５１位における連続ヌクレオチド配列に少なくとも８０％相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含み、哺乳類細胞に導入されるとき、ステレオシリン偽遺伝子の遺伝子座で、完全長ステレオシリンタンパク質をコードする核酸が生成される、該組成物も提供される。
【００２３】
本明細書ではまた、本明細書に記載される組成物のうちのいずれかを含むキットも提供される。本明細書に記載されるキットのうちのいずれかの一部の実施形態は、該組成物を含む充填済みシリンジをさらに含む。
【００２４】
また、哺乳動物の蝸牛に、治療上有効量の本明細書に記載される組成物のうちのいずれかを導入することを含む方法も提供される。本明細書に記載される方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、該哺乳動物は、ヒトである。本明細書に記載される方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、該哺乳動物は、欠陥のあるステレオシリン遺伝子を有すると以前に特定されている。
【００２５】
本明細書ではまた、哺乳類細胞において完全長ステレオシリンタンパク質の発現を増加させる方法も提供され、該方法は、本明細書に記載される組成物のうちのいずれかを該哺乳類細胞に導入することを含む。本明細書に記載される方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、該哺乳類細胞は、蝸牛外有毛細胞である。本明細書に記載される方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、該哺乳類細胞は、ヒト細胞である。本明細書に記載される方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、該哺乳類細胞は、欠陥のあるステレオシリン遺伝子を有すると以前に判定されている。
【００２６】
本明細書ではまた、哺乳動物の蝸牛内の外有毛細胞において完全長ステレオシリンタンパク質の発現を増加させる方法も提供され、該方法は、該哺乳動物の蝸牛に、治療上有効量の本明細書に記載される組成物のうちのいずれかを導入することを含む。本明細書に記載される方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、該哺乳動物は、欠陥のあるステレオシリン遺伝子を有すると以前に特定されている。本明細書に記載される方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、該哺乳動物は、ヒトである。
【００２７】
本明細書ではまた、欠陥のあるステレオシリン遺伝子を有すると特定された対象において無症候性感音性聴力喪失を治療する方法も提供され、該方法は、治療上有効量の本明細書に記載される組成物のうちのいずれかを該対象の蝸牛に投与することを含む。本明細書に記載される方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、該対象は、ヒトである。本明細書に記載される方法のうちのいずれかの一部の実施形態は、該投与ステップの前に、該対象が欠陥のあるステレオシリン遺伝子を有することを判定することをさらに含む。
【００２８】
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、冠詞の文法上の目的語の１つまたは１つよりも多く（すなわち、少なくとも１つ）を指す。例として、「（ａｎ）要素」は、１つの要素及び１つよりも多くの要素を包含する。
【００２９】
「ステレオシリン遺伝子における変異」という用語は、野生型ステレオシリンタンパク質と比較して１つもしくは複数のアミノ酸の欠失、１つもしくは複数のアミノ酸置換、及び１つもしくは複数のアミノ酸挿入のうちの１つもしくは複数を有するステレオシリンタンパク質の生産をもたらす、及び／または変異を有しない哺乳類細胞におけるコードされたステレオシリンタンパク質の発現されたレベルと比較して、哺乳類細胞におけるコードされたステレオシリンタンパク質の発現されたレベルの減少をもたらす、野生型ステレオシリン遺伝子における修飾を指す。一部の実施形態では、変異は、１つまたは複数のアミノ酸（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸）の欠失を有するステレオシリンタンパク質の生産をもたらし得る。一部の実施形態では、変異は、ステレオシリン遺伝子におけるフレームシフトをもたらし得る。「フレームシフト」という用語は、当該技術分野で、コード配列のリーディングフレームのシフトをもたらす、コード配列における任意の変異を包含することが知られている。一部の実施形態では、フレームシフトは、機能しないタンパク質をもたらし得る。一部の実施形態では、点変異は、ナンセンス変異（すなわち、遺伝子のエクソンにおいて未成熟終止コドンをもたらす）であり得る。ナンセンス変異は、機能的である場合も、そうでない場合もある短縮型タンパク質（対応する野生型タンパク質と比較して）の生産をもたらし得る。一部の実施形態では、変異は、ステレオシリンｍＲＮＡもしくはステレオシリンタンパク質、またはｍＲＮＡ及びタンパク質の両方の発現の喪失（またはレベルの減少）をもたらし得る。一部の実施形態では、変異は、野生型ステレオシリンタンパク質と比較して１つまたは複数の生物学的活性（機能）の喪失または減少を有する、変化したステレオシリンタンパク質の生産をもたらし得る。
【００３０】
一部の実施形態では、変異は、１つまたは複数のヌクレオチドのステレオシリン遺伝子への挿入である。一部の実施形態では、変異は、ステレオシリン遺伝子の制御配列、すなわち、コード配列ではない遺伝子の一部分にある。一部の実施形態では、制御配列における変異は、プロモーターまたはエンハンサー領域にあり得、ステレオシリン遺伝子の適切な転写を阻止または低減し得る。「保存的変異」という用語は、（コドン縮重に起因して）変異の部位でコードされたアミノ酸を変化させない変異を指す。
【００３１】
修飾は、部位特異的変異誘発及びＰＣＲ媒介性変異誘発等の、当該技術分野で既知の標準的技法によってヌクレオチド配列に導入することができる。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えられる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、及びヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸）、極性無電荷側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、及びトリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、及びメチオニン）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、及びイソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。
【００３２】
別途明記されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、互いの縮重バージョンであり、故に同じアミノ酸配列をコードする、全てのヌクレオチド配列が含まれる。
【００３３】
「内因性」という用語は、生物、細胞、または組織内からの任意の材料を指す。
【００３４】
「外因性」という用語は、材料が導入されている同じ生物、細胞、または組織からは生産されない、またはそれに由来しない、生物、細胞、または組織の外部から導入されるか、またはその外部に由来する任意の材料を指す。
【００３５】
「単離され（た）」という用語は、天然の状態から変化しているか、またはそれから除去されていることを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸またはペプチドは、「単離され」ていないが、その天然の状態の共存材料から部分的または完全に分離された同じ核酸またはペプチドは、「単離され」ている。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在し得るか、または例えば、宿主細胞等の生来の環境でない環境に存在し得る。
【００３６】
「トランスフェクトされた」、「形質転換された」、または「形質導入された」という用語は、外因性核酸が細胞に移入または導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」、「形質転換された」、または「形質導入された」哺乳類細胞は、外因性核酸でトランスフェクト、形質転換、または形質導入された哺乳類細胞である。
【００３７】
「発現」という用語は、タンパク質をコードする特定のヌクレオチド配列の転写及び／または翻訳を指す。
【００３８】
「一過性発現」という用語は、組み込まれていないコード配列の短い一定期間（例えば、数時間または数日）にわたる発現を指す。細胞（例えば、哺乳類細胞）において一過性で発現されるコード配列は、複数回の細胞分裂に際して失われる。
【００３９】
「対象」という用語は、任意の哺乳動物を含むことを意図する。一部の実施形態では、対象は、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）、ウサギ、非ヒト霊長類、またはヒトである。一部の実施形態では、対象は、非症候性難聴を有するか、またはそれを発症するリスクがある。一部の実施形態では、対象は、ステレオシリン遺伝子における変異を有すると以前に特定されている。一部の実施形態では、対象は、ステレオシリン遺伝子における変異を有すると特定されており、かつ無症候性感音性聴力喪失と診断されている。一部の実施形態では、対象は、無症候性感音性聴力喪失を有すると特定されている。
【００４０】
治療は、それが対象（例えば、ヒト）において病態（例えば、無症候性感音性聴力喪失）の１つまたは複数の症状の数、重症度、及び頻度のうちの１つまたは複数の低減をもたらす場合、「治療上有効」である。一部の実施形態では、治療上有効量の組成物は、活性ステレオシリンタンパク質（例えば、野生型完全長ステレオシリンタンパク質、または所望の活性を有するステレオシリンタンパク質のバリアント）の発現レベルの増加（例えば、該組成物での治療前の発現レベルと比較して）をもたらし得る。一部の実施形態では、治療上有効量の組成物は、標的細胞（例えば、蝸牛外有毛細胞）において活性ステレオシリンタンパク質（例えば、野生型完全長ステレオシリンタンパク質、または活性バリアント）の発現レベルの増加をもたらし得る。一部の実施形態では、治療上有効量の組成物は、標的細胞において、活性ステレオシリンタンパク質（例えば、野生型完全長ステレオシリンタンパク質、または活性バリアント）の発現レベルの増加、及び／またはステレオシリンタンパク質の１つもしくは複数の活性の増加（例えば、治療前の対象におけるレベル（複数可）、ステレオシリン遺伝子における変異を有する対象におけるレベル（複数可）、または無症候性感音性聴力喪失を有する対象もしくは対象の集団におけるレベル（複数可）等の参照レベルと比較して）をもたらし得る。
【００４１】
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖または二本鎖形態のいずれかでのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）もしくはリボ核酸（ＲＮＡ）、またはそれらの組み合わせを指す。特に限定されない限り、この用語は、参照ヌクレオチドと類似した結合特性を有する天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。別途指示されない限り、特定の核酸配列はまた、明示的に示される配列のみならず、相補的配列も黙示的に包含する。本明細書に記載される核酸のうちのいずれかの一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡである。本明細書に記載される核酸のうちのいずれかの一部の実施形態では、核酸は、ＲＮＡである。
【００４２】
「活性ステレオシリンタンパク質」という用語は、さもなければ野生型哺乳動物である哺乳動物の聴覚有毛細胞において完全長ステレオシリンタンパク質をコードする両方の野生型対立遺伝子に取って代わる場合、かつその哺乳動物の聴覚有毛細胞において発現される場合、その哺乳動物が、完全に野生型である類似の哺乳動物の正常な聴力レベルに近似する聴力レベルを有することをもたらすＤＮＡによってコードされる、タンパク質を意味する。活性ステレオシリンタンパク質の非限定的な例は、完全長ステレオシリンタンパク質（例えば、本明細書に記載される完全長ステレオシリンタンパク質のうちのいずれか）である。
【００４３】
例えば、活性ステレオシリンタンパク質は、１個のアミノ酸置換〜約１６０個のアミノ酸置換、１個のアミノ酸置換〜約１５５個のアミノ酸置換、１個のアミノ酸置換〜約１５０個のアミノ酸置換、１個のアミノ酸置換〜約１４５個のアミノ酸置換、１個のアミノ酸置換〜約１４０個のアミノ酸置換、１個のアミノ酸置換〜約１３５個のアミノ酸置換、１個のアミノ酸置換〜約１３０個のアミノ酸置換、１個のアミノ酸置換〜約１２５個のアミノ酸置換、１個のアミノ酸置換〜約１２０個のアミノ酸置換、１個のアミノ酸置換〜約１１５個のアミノ酸置換、１個のアミノ酸置換〜約１１０個のアミノ酸置換、１個のアミノ酸置換〜約１０５個のアミノ酸置換、１個のアミノ酸置換〜約１００個のアミノ酸置換、１個のアミノ酸置換〜約９５個のアミノ酸置換、１個のアミノ酸置換〜約９０個のアミノ酸置換、１個のアミノ酸置換〜約８５個のアミノ酸置換、１個のアミノ酸置換〜約８０個のアミノ酸置換、１個のアミノ酸置換〜約７５個のアミノ酸置換、１個のアミノ酸置換〜約７０個のアミノ酸置換、１個のアミノ酸置換〜約６５個のアミノ酸置換、１個のアミノ酸置換〜約６０個のアミノ酸置換、１個のアミノ酸置換〜約５５個のアミノ酸置換、１個のアミノ酸置換〜約５０個のアミノ酸置換、１個のアミノ酸置換〜約４５個のアミノ酸置換、１個のアミノ酸置換〜約４０個のアミノ酸置換、１個のアミノ酸置換〜約３５個のアミノ酸置換、１個のアミノ酸置換〜約３０個のアミノ酸置換、１個のアミノ酸置換〜約２５個のアミノ酸置換、１個のアミノ酸置換〜約２０個のアミノ酸置換、１個のアミノ酸置換〜約１５個のアミノ酸置換、１個のアミノ酸置換〜約１０個のアミノ酸置換、１個のアミノ酸置換〜約９個のアミノ酸置換、１個のアミノ酸置換〜約８個のアミノ酸置換、１個のアミノ酸置換〜約７個のアミノ酸置換、１個のアミノ酸置換〜約６個のアミノ酸置換、１個のアミノ酸置換〜約５個のアミノ酸置換、１個のアミノ酸置換〜約４個のアミノ酸置換、１個のアミノ酸置換〜約３個のアミノ酸置換、約２個のアミノ酸置換〜約１６０個のアミノ酸置換、約２個のアミノ酸置換〜約１５５個のアミノ酸置換、約２個のアミノ酸置換〜約１５０個のアミノ酸置換、約２個のアミノ酸置換〜約１４５個のアミノ酸置換、約２個のアミノ酸置換〜約１４０個のアミノ酸置換、約２個のアミノ酸置換〜約１３５個のアミノ酸置換、約２個のアミノ酸置換〜約１３０個のアミノ酸置換、約２個のアミノ酸置換〜約１２５個のアミノ酸置換、約２個のアミノ酸置換〜約１２０個のアミノ酸置換、約２個のアミノ酸置換〜約１１５個のアミノ酸置換、約２個のアミノ酸置換〜約１１０個のアミノ酸置換、約２個のアミノ酸置換〜約１０５個のアミノ酸置換、約２個のアミノ酸置換〜約１００個のアミノ酸置換、約２個のアミノ酸置換〜約９５個のアミノ酸置換、約２個のアミノ酸置換〜約９０個のアミノ酸置換、約２個のアミノ酸置換〜約８５個のアミノ酸置換、約２個のアミノ酸置換〜約８０個のアミノ酸置換、約２個のアミノ酸置換〜約７５個のアミノ酸置換、約２個のアミノ酸置換〜約７０個のアミノ酸置換、約２個のアミノ酸置換〜約６５個のアミノ酸置換、約２個のアミノ酸置換〜約６０個のアミノ酸置換、約２個のアミノ酸置換〜約５５個のアミノ酸置換、約２個のアミノ酸置換〜約５０個のアミノ酸置換、約２個のアミノ酸置換〜約４５個のアミノ酸置換、約２個のアミノ酸置換〜約４０個のアミノ酸置換、約２個のアミノ酸置換〜約３５個のアミノ酸置換、約２個のアミノ酸置換〜約３０個のアミノ酸置換、約２個のアミノ酸置換〜約２５個のアミノ酸置換、約２個のアミノ酸置換〜約２０個のアミノ酸置換、約２個のアミノ酸置換〜約１５個のアミノ酸置換、約２個のアミノ酸置換〜約１０個のアミノ酸置換、約２個のアミノ酸置換〜約９個のアミノ酸置換、約２個のアミノ酸置換〜約８個のアミノ酸置換、約２個のアミノ酸置換〜約７個のアミノ酸置換、約２個のアミノ酸置換〜約６個のアミノ酸置換、約２個のアミノ酸置換〜約５個のアミノ酸置換、約２個のアミノ酸置換〜約４個のアミノ酸置換、約３個のアミノ酸置換〜約１６０個のアミノ酸置換、約３個のアミノ酸置換〜約１５５個のアミノ酸置換、約３個のアミノ酸置換〜約１５０個のアミノ酸置換、約３個のアミノ酸置換〜約１４５個のアミノ酸置換、約３個のアミノ酸置換〜約１４０個のアミノ酸置換、約３個のアミノ酸置換〜約１３５個のアミノ酸置換、約３個のアミノ酸置換〜約１３０個のアミノ酸置換、約３個のアミノ酸置換〜約１２５個のアミノ酸置換、約３個のアミノ酸置換〜約１２０個のアミノ酸置換、約３個のアミノ酸置換〜約１１５個のアミノ酸置換、約３個のアミノ酸置換〜約１１０個のアミノ酸置換、約３個のアミノ酸置換〜約１０５個のアミノ酸置換、約３個のアミノ酸置換〜約１００個のアミノ酸置換、約３個のアミノ酸置換〜約９５個のアミノ酸置換、約３個のアミノ酸置換〜約９０個のアミノ酸置換、約３個のアミノ酸置換〜約８５個のアミノ酸置換、約３個のアミノ酸置換〜約８０個のアミノ酸置換、約３個のアミノ酸置換〜約７５個のアミノ酸置換、約３個のアミノ酸置換〜約７０個のアミノ酸置換、約３個のアミノ酸置換〜約６５個のアミノ酸置換、約３個のアミノ酸置換〜約６０個のアミノ酸置換、約３個のアミノ酸置換〜約５５個のアミノ酸置換、約３個のアミノ酸置換〜約５０個のアミノ酸置換、約３個のアミノ酸置換〜約４５個のアミノ酸置換、約３個のアミノ酸置換〜約４０個のアミノ酸置換、約３個のアミノ酸置換〜約３５個のアミノ酸置換、約３個のアミノ酸置換〜約３０個のアミノ酸置換、約３個のアミノ酸置換〜約２５個のアミノ酸置換、約３個のアミノ酸置換〜約２０個のアミノ酸置換、約３個のアミノ酸置換〜約１５個のアミノ酸置換、約３個のアミノ酸置換〜約１０個のアミノ酸置換、約３個のアミノ酸置換〜約９個のアミノ酸置換、約３個のアミノ酸置換〜約８個のアミノ酸置換、約３個のアミノ酸置換〜約７個のアミノ酸置換、約３個のアミノ酸置換〜約６個のアミノ酸置換、約３個のアミノ酸置換〜約５個のアミノ酸置換、約４個のアミノ酸置換〜約１６０個のアミノ酸置換、約４個のアミノ酸置換〜約１５５個のアミノ酸置換、約４個のアミノ酸置換〜約１５０個のアミノ酸置換、約４個のアミノ酸置換〜約１４５個のアミノ酸置換、約４個のアミノ酸置換〜約１４０個のアミノ酸置換、約４個のアミノ酸置換〜約１３５個のアミノ酸置換、約４個のアミノ酸置換〜約１３０個のアミノ酸置換、約４個のアミノ酸置換〜約１２５個のアミノ酸置換、約４個のアミノ酸置換〜約１２０個のアミノ酸置換、約４個のアミノ酸置換〜約１１５個のアミノ酸置換、約４個のアミノ酸置換〜約１１０個のアミノ酸置換、約４個のアミノ酸置換〜約１０５個のアミノ酸置換、約４個のアミノ酸置換〜約１００個のアミノ酸置換、約４個のアミノ酸置換〜約９５個のアミノ酸置換、約４個のアミノ酸置換〜約９０個のアミノ酸置換、約４個のアミノ酸置換〜約８５個のアミノ酸置換、約４個のアミノ酸置換〜約８０個のアミノ酸置換、約４個のアミノ酸置換〜約７５個のアミノ酸置換、約４個のアミノ酸置換〜約７０個のアミノ酸置換、約４個のアミノ酸置換〜約６５個のアミノ酸置換、約４個のアミノ酸置換〜約６０個のアミノ酸置換、約４個のアミノ酸置換〜約５５個のアミノ酸置換、約４個のアミノ酸置換〜約５０個のアミノ酸置換、約４個のアミノ酸置換〜約４５個のアミノ酸置換、約４個のアミノ酸置換〜約４０個のアミノ酸置換、約４個のアミノ酸置換〜約３５個のアミノ酸置換、約４個のアミノ酸置換〜約３０個のアミノ酸置換、約４個のアミノ酸置換〜約２５個のアミノ酸置換、約４個のアミノ酸置換〜約２０個のアミノ酸置換、約４個のアミノ酸置換〜約１５個のアミノ酸置換、約４個のアミノ酸置換〜約１０個のアミノ酸置換、約４個のアミノ酸置換〜約９個のアミノ酸置換、約４個のアミノ酸置換〜約８個のアミノ酸置換、約４個のアミノ酸置換〜約７個のアミノ酸置換、約４個のアミノ酸置換〜約６個のアミノ酸置換、約５個のアミノ酸置換〜約１６０個のアミノ酸置換、約５個のアミノ酸置換〜約１５５個のアミノ酸置換、約５個のアミノ酸置換〜約１５０個のアミノ酸置換、約５個のアミノ酸置換〜約１４５個のアミノ酸置換、約５個のアミノ酸置換〜約１４０個のアミノ酸置換、約５個のアミノ酸置換〜約１３５個のアミノ酸置換、約５個のアミノ酸置換〜約１３０個のアミノ酸置換、約５個のアミノ酸置換〜約１２５個のアミノ酸置換、約５個のアミノ酸置換〜約１２０個のアミノ酸置換、約５個のアミノ酸置換〜約１１５個のアミノ酸置換、約５個のアミノ酸置換〜約１１０個のアミノ酸置換、約５個のアミノ酸置換〜約１０５個のアミノ酸置換、約５個のアミノ酸置換〜約１００個のアミノ酸置換、約５個のアミノ酸置換〜約９５個のアミノ酸置換、約５個のアミノ酸置換〜約９０個のアミノ酸置換、約５個のアミノ酸置換〜約８５個のアミノ酸置換、約５個のアミノ酸置換〜約８０個のアミノ酸置換、約５個のアミノ酸置換〜約７５個のアミノ酸置換、約５個のアミノ酸置換〜約７０個のアミノ酸置換、約５個のアミノ酸置換〜約６５個のアミノ酸置換、約５個のアミノ酸置換〜約６０個のアミノ酸置換、約５個のアミノ酸置換〜約５５個のアミノ酸置換、約５個のアミノ酸置換〜約５０個のアミノ酸置換、約５個のアミノ酸置換〜約４５個のアミノ酸置換、約５個のアミノ酸置換〜約４０個のアミノ酸置換、約５個のアミノ酸置換〜約３５個のアミノ酸置換、約５個のアミノ酸置換〜約３０個のアミノ酸置換、約５個のアミノ酸置換〜約２５個のアミノ酸置換、約５個のアミノ酸置換〜約２０個のアミノ酸置換、約５個のアミノ酸置換〜約１５個のアミノ酸置換、約５個のアミノ酸置換〜約１０個のアミノ酸置換、約５個のアミノ酸置換〜約９個のアミノ酸置換、約５個のアミノ酸置換〜約８個のアミノ酸置換、約５個のアミノ酸置換〜約７個のアミノ酸置換、約６個のアミノ酸置換〜約１６０個のアミノ酸置換、約６個のアミノ酸置換〜約１５５個のアミノ酸置換、約６個のアミノ酸置換〜約１５０個のアミノ酸置換、約６個のアミノ酸置換〜約１４５個のアミノ酸置換、約６個のアミノ酸置換〜約１４０個のアミノ酸置換、約６個のアミノ酸置換〜約１３５個のアミノ酸置換、約６個のアミノ酸置換〜約１３０個のアミノ酸置換、約６個のアミノ酸置換〜約１２５個のアミノ酸置換、約６個のアミノ酸置換〜約１２０個のアミノ酸置換、約６個のアミノ酸置換〜約１１５個のアミノ酸置換、約６個のアミノ酸置換〜約１１０個のアミノ酸置換、約６個のアミノ酸置換〜約１０５個のアミノ酸置換、約６個のアミノ酸置換〜約１００個のアミノ酸置換、約６個のアミノ酸置換〜約９５個のアミノ酸置換、約６個のアミノ酸置換〜約９０個のアミノ酸置換、約６個のアミノ酸置換〜約８５個のアミノ酸置換、約６個のアミノ酸置換〜約８０個のアミノ酸置換、約６個のアミノ酸置換〜約７５個のアミノ酸置換、約６個のアミノ酸置換〜約７０個のアミノ酸置換、約６個のアミノ酸置換〜約６５個のアミノ酸置換、約６個のアミノ酸置換〜約６０個のアミノ酸置換、約６個のアミノ酸置換〜約５５個のアミノ酸置換、約６個のアミノ酸置換〜約５０個のアミノ酸置換、約６個のアミノ酸置換〜約４５個のアミノ酸置換、約６個のアミノ酸置換〜約４０個のアミノ酸置換、約６個のアミノ酸置換〜約３５個のアミノ酸置換、約６個のアミノ酸置換〜約３０個のアミノ酸置換、約６個のアミノ酸置換〜約２５個のアミノ酸置換、約６個のアミノ酸置換〜約２０個のアミノ酸置換、約６個のアミノ酸置換〜約１５個のアミノ酸置換、約６個のアミノ酸置換〜約１０個のアミノ酸置換、約６個のアミノ酸置換〜約９個のアミノ酸置換、約６個のアミノ酸置換〜約８個のアミノ酸置換、約７個のアミノ酸置換〜約１６０個のアミノ酸置換、約７個のアミノ酸置換〜約１５５個のアミノ酸置換、約７個のアミノ酸置換〜約１５０個のアミノ酸置換、約７個のアミノ酸置換〜約１４５個のアミノ酸置換、約７個のアミノ酸置換〜約１４０個のアミノ酸置換、約７個のアミノ酸置換〜約１３５個のアミノ酸置換、約７個のアミノ酸置換〜約１３０個のアミノ酸置換、約７個のアミノ酸置換〜約１２５個のアミノ
酸置換、約７個のアミノ酸置換〜約１２０個のアミノ酸置換、約７個のアミノ酸置換〜約１１５個のアミノ酸置換、約７個のアミノ酸置換〜約１１０個のアミノ酸置換、約７個のアミノ酸置換〜約１０５個のアミノ酸置換、約７個のアミノ酸置換〜約１００個のアミノ酸置換、約７個のアミノ酸置換〜約９５個のアミノ酸置換、約７個のアミノ酸置換〜約９０個のアミノ酸置換、約７個のアミノ酸置換〜約８５個のアミノ酸置換、約７個のアミノ酸置換〜約８０個のアミノ酸置換、約７個のアミノ酸置換〜約７５個のアミノ酸置換、約７個のアミノ酸置換〜約７０個のアミノ酸置換、約７個のアミノ酸置換〜約６５個のアミノ酸置換、約７個のアミノ酸置換〜約６０個のアミノ酸置換、約７個のアミノ酸置換〜約５５個のアミノ酸置換、約７個のアミノ酸置換〜約５０個のアミノ酸置換、約７個のアミノ酸置換〜約４５個のアミノ酸置換、約７個のアミノ酸置換〜約４０個のアミノ酸置換、約７個のアミノ酸置換〜約３５個のアミノ酸置換、約７個のアミノ酸置換〜約３０個のアミノ酸置換、約７個のアミノ酸置換〜約２５個のアミノ酸置換、約７個のアミノ酸置換〜約２０個のアミノ酸置換、約７個のアミノ酸置換〜約１５個のアミノ酸置換、約７個のアミノ酸置換〜約１０個のアミノ酸置換、約７個のアミノ酸置換〜約９個のアミノ酸置換、約８個のアミノ酸置換〜約１６０個のアミノ酸置換、約８個のアミノ酸置換〜約１５５個のアミノ酸置換、約８個のアミノ酸置換〜約１５０個のアミノ酸置換、約８個のアミノ酸置換〜約１４５個のアミノ酸置換、約８個のアミノ酸置換〜約１４０個のアミノ酸置換、約８個のアミノ酸置換〜約１３５個のアミノ酸置換、約８個のアミノ酸置換〜約１３０個のアミノ酸置換、約８個のアミノ酸置換〜約１２５個のアミノ酸置換、約８個のアミノ酸置換〜約１２０個のアミノ酸置換、約８個のアミノ酸置換〜約１１５個のアミノ酸置換、約８個のアミノ酸置換〜約１１０個のアミノ酸置換、約８個のアミノ酸置換〜約１０５個のアミノ酸置換、約８個のアミノ酸置換〜約１００個のアミノ酸置換、約８個のアミノ酸置換〜約９５個のアミノ酸置換、約８個のアミノ酸置換〜約９０個のアミノ酸置換、約８個のアミノ酸置換〜約８５個のアミノ酸置換、約８個のアミノ酸置換〜約８０個のアミノ酸置換、約８個のアミノ酸置換〜約７５個のアミノ酸置換、約８個のアミノ酸置換〜約７０個のアミノ酸置換、約８個のアミノ酸置換〜約６５個のアミノ酸置換、約８個のアミノ酸置換〜約６０個のアミノ酸置換、約８個のアミノ酸置換〜約５５個のアミノ酸置換、約８個のアミノ酸置換〜約５０個のアミノ酸置換、約８個のアミノ酸置換〜約４５個のアミノ酸置換、約８個のアミノ酸置換〜約４０個のアミノ酸置換、約８個のアミノ酸置換〜約３５個のアミノ酸置換、約８個のアミノ酸置換〜約３０個のアミノ酸置換、約８個のアミノ酸置換〜約２５個のアミノ酸置換、約８個のアミノ酸置換〜約２０個のアミノ酸置換、約８個のアミノ酸置換〜約１５個のアミノ酸置換、約８個のアミノ酸置換〜約１０個のアミノ酸置換、約１０個のアミノ酸置換〜約１６０個のアミノ酸置換、約１０個のアミノ酸置換〜約１５５個のアミノ酸置換、約１０個のアミノ酸置換〜約１５０個のアミノ酸置換、約１０個のアミノ酸置換〜約１４５個のアミノ酸置換、約１０個のアミノ酸置換〜約１４０個のアミノ酸置換、約１０個のアミノ酸置換〜約１３５個のアミノ酸置換、約１０個のアミノ酸置換〜約１３０個のアミノ酸置換、約１０個のアミノ酸置換〜約１２５個のアミノ酸置換、約１０個のアミノ酸置換〜約１２０個のアミノ酸置換、約１０個のアミノ酸置換〜約１１５個のアミノ酸置換、約１０個のアミノ酸置換〜約１１０個のアミノ酸置換、約１０個のアミノ酸置換〜約１０５個のアミノ酸置換、約１０個のアミノ酸置換〜約１００個のアミノ酸置換、約１０個のアミノ酸置換〜約９５個のアミノ酸置換、約１０個のアミノ酸置換〜約９０個のアミノ酸置換、約１０個のアミノ酸置換〜約８５個のアミノ酸置換、約１０個のアミノ酸置換〜約８０個のアミノ酸置換、約１０個のアミノ酸置換〜約７５個のアミノ酸置換、約１０個のアミノ酸置換〜約７０個のアミノ酸置換、約１０個のアミノ酸置換〜約６５個のアミノ酸置換、約１０個のアミノ酸置換〜約６０個のアミノ酸置換、約１０個のアミノ酸置換〜約５５個のアミノ酸置換、約１０個のアミノ酸置換〜約５０個のアミノ酸置換、約１０個のアミノ酸置換〜約４５個のアミノ酸置換、約１０個のアミノ酸置換〜約４０個のアミノ酸置換、約１０個のアミノ酸置換〜約３５個のアミノ酸置換、約１０個のアミノ酸置換〜約３０個のアミノ酸置換、約１０個のアミノ酸置換〜約２５個のアミノ酸置換、約１０個のアミノ酸置換〜約２０個のアミノ酸置換、約１０個のアミノ酸置換〜約１５個のアミノ酸置換、約１５個のアミノ酸置換〜約１６０個のアミノ酸置換、約１５個のアミノ酸置換〜約１５５個のアミノ酸置換、約１５個のアミノ酸置換〜約１５０個のアミノ酸置換、約１５個のアミノ酸置換〜約１４５個のアミノ酸置換、約１５個のアミノ酸置換〜約１４０個のアミノ酸置換、約１５個のアミノ酸置換〜約１３５個のアミノ酸置換、約１５個のアミノ酸置換〜約１３０個のアミノ酸置換、約１５個のアミノ酸置換〜約１２５個のアミノ酸置換、約１５個のアミノ酸置換〜約１２０個のアミノ酸置換、約１５個のアミノ酸置換〜約１１５個のアミノ酸置換、約１５個のアミノ酸置換〜約１１０個のアミノ酸置換、約１５個のアミノ酸置換〜約１０５個のアミノ酸置換、約１５個のアミノ酸置換〜約１００個のアミノ酸置換、約１５個のアミノ酸置換〜約９５個のアミノ酸置換、約１５個のアミノ酸置換〜約９０個のアミノ酸置換、約１５個のアミノ酸置換〜約８５個のアミノ酸置換、約１５個のアミノ酸置換〜約８０個のアミノ酸置換、約１５個のアミノ酸置換〜約７５個のアミノ酸置換、約１５個のアミノ酸置換〜約７０個のアミノ酸置換、約１５個のアミノ酸置換〜約６５個のアミノ酸置換、約１５個のアミノ酸置換〜約６０個のアミノ酸置換、約１５個のアミノ酸置換〜約５５個のアミノ酸置換、約１５個のアミノ酸置換〜約５０個のアミノ酸置換、約１５個のアミノ酸置換〜約４５個のアミノ酸置換、約１５個のアミノ酸置換〜約４０個のアミノ酸置換、約１５個のアミノ酸置換〜約３５個のアミノ酸置換、約１５個のアミノ酸置換〜約３０個のアミノ酸置換、約１５個のアミノ酸置換〜約２５個のアミノ酸置換、約１５個のアミノ酸置換〜約２０個のアミノ酸置換、約２０個のアミノ酸置換〜約１６０個のアミノ酸置換、約２０個のアミノ酸置換〜約１５５個のアミノ酸置換、約２０個のアミノ酸置換〜約１５０個のアミノ酸置換、約２０個のアミノ酸置換〜約１４５個のアミノ酸置換、約２０個のアミノ酸置換〜約１４０個のアミノ酸置換、約２０個のアミノ酸置換〜約１３５個のアミノ酸置換、約２０個のアミノ酸置換〜約１３０個のアミノ酸置換、約２０個のアミノ酸置換〜約１２５個のアミノ酸置換、約２０個のアミノ酸置換〜約１２０個のアミノ酸置換、約２０個のアミノ酸置換〜約１１５個のアミノ酸置換、約２０個のアミノ酸置換〜約１１０個のアミノ酸置換、約２０個のアミノ酸置換〜約１０５個のアミノ酸置換、約２０個のアミノ酸置換〜約１００個のアミノ酸置換、約２０個のアミノ酸置換〜約９５個のアミノ酸置換、約２０個のアミノ酸置換〜約９０個のアミノ酸置換、約２０個のアミノ酸置換〜約８５個のアミノ酸置換、約２０個のアミノ酸置換〜約８０個のアミノ酸置換、約２０個のアミノ酸置換〜約７５個のアミノ酸置換、約２０個のアミノ酸置換〜約７０個のアミノ酸置換、約２０個のアミノ酸置換〜約６５個のアミノ酸置換、約２０個のアミノ酸置換〜約６０個のアミノ酸置換、約２０個のアミノ酸置換〜約５５個のアミノ酸置換、約２０個のアミノ酸置換〜約５０個のアミノ酸置換、約２０個のアミノ酸置換〜約４５個のアミノ酸置換、約２０個のアミノ酸置換〜約４０個のアミノ酸置換、約２０個のアミノ酸置換〜約３５個のアミノ酸置換、約２０個のアミノ酸置換〜約３０個のアミノ酸置換、約２０個のアミノ酸置換〜約２５個のアミノ酸置換、約２５個のアミノ酸置換〜約１６０個のアミノ酸置換、約２５個のアミノ酸置換〜約１５５個のアミノ酸置換、約２５個のアミノ酸置換〜約１５０個のアミノ酸置換、約２５個のアミノ酸置換〜約１４５個のアミノ酸置換、約２５個のアミノ酸置換〜約１４０個のアミノ酸置換、約２５個のアミノ酸置換〜約１３５個のアミノ酸置換、約２５個のアミノ酸置換〜約１３０個のアミノ酸置換、約２５個のアミノ酸置換〜約１２５個のアミノ酸置換、約２５個のアミノ酸置換〜約１２０個のアミノ酸置換、約２５個のアミノ酸置換〜約１１５個のアミノ酸置換、約２５個のアミノ酸置換〜約１１０個のアミノ酸置換、約２５個のアミノ酸置換〜約１０５個のアミノ酸置換、約２５個のアミノ酸置換〜約１００個のアミノ酸置換、約２５個のアミノ酸置換〜約９５個のアミノ酸置換、約２５個のアミノ酸置換〜約９０個のアミノ酸置換、約２５個のアミノ酸置換〜約８５個のアミノ酸置換、約２５個のアミノ酸置換〜約８０個のアミノ酸置換、約２５個のアミノ酸置換〜約７５個のアミノ酸置換、約２５個のアミノ酸置換〜約７０個のアミノ酸置換、約２５個のアミノ酸置換〜約６５個のアミノ酸置換、約２５個のアミノ酸置換〜約６０個のアミノ酸置換、約２５個のアミノ酸置換〜約５５個のアミノ酸置換、約２５個のアミノ酸置換〜約５０個のアミノ酸置換、約２５個のアミノ酸置換〜約４５個のアミノ酸置換、約２５個のアミノ酸置換〜約４０個のアミノ酸置換、約２５個のアミノ酸置換〜約３５個のアミノ酸置換、約２５個のアミノ酸置換〜約３０個のアミノ酸置換、約３０個のアミノ酸置換〜約１６０個のアミノ酸置換、約３０個のアミノ酸置換〜約１５５個のアミノ酸置換、約３０個のアミノ酸置換〜約１５０個のアミノ酸置換、約３０個のアミノ酸置換〜約１４５個のアミノ酸置換、約３０個のアミノ酸置換〜約１４０個のアミノ酸置換、約３０個のアミノ酸置換〜約１３５個のアミノ酸置換、約３０個のアミノ酸置換〜約１３０個のアミノ酸置換、約３０個のアミノ酸置換〜約１２５個のアミノ酸置換、約３０個のアミノ酸置換〜約１２０個のアミノ酸置換、約３０個のアミノ酸置換〜約１１５個のアミノ酸置換、約３０個のアミノ酸置換〜約１１０個のアミノ酸置換、約３０個のアミノ酸置換〜約１０５個のアミノ酸置換、約３０個のアミノ酸置換〜約１００個のアミノ酸置換、約３０個のアミノ酸置換〜約９５個のアミノ酸置換、約３０個のアミノ酸置換〜約９０個のアミノ酸置換、約３０個のアミノ酸置換〜約８５個のアミノ酸置換、約３０個のアミノ酸置換〜約８０個のアミノ酸置換、約３０個のアミノ酸置換〜約７５個のアミノ酸置換、約３０個のアミノ酸置換〜約７０個のアミノ酸置換、約３０個のアミノ酸置換〜約６５個のアミノ酸置換、約３０個のアミノ酸置換〜約６０個のアミノ酸置換、約３０個のアミノ酸置換〜約５５個のアミノ酸置換、約３０個のアミノ酸置換〜約５０個のアミノ酸置換、約３０個のアミノ酸置換〜約４５個のアミノ酸置換、約３０個のアミノ酸置換〜約４０個のアミノ酸置換、約３０個のアミノ酸置換〜約３５個のアミノ酸置換、約３５個のアミノ酸置換〜約１６０個のアミノ酸置換、約３５個のアミノ酸置換〜約１５５個のアミノ酸置換、約３５個のアミノ酸置換〜約１５０個のアミノ酸置換、約３５個のアミノ酸置換〜約１４５個のアミノ酸置換、約３５個のアミノ酸置換〜約１４０個のアミノ酸置換、約３５個のアミノ酸置換〜約１３５個のアミノ酸置換、約３５個のアミノ酸置換〜約１３０個のアミノ酸置換、約３５個のアミノ酸置換〜約１２５個のアミノ酸置換、約３５個のアミノ酸置換〜約１２０個のアミノ酸置換、約３５個のアミノ酸置換〜約１１５個のアミノ酸置換、約３５個のアミノ酸置換〜約１１０個のアミノ酸置換、約３５個のアミノ酸置換〜約１０５個のアミノ酸置換、約３５個のアミノ酸置換〜約１００個のアミノ酸置換、約３５個のアミノ酸置換〜約９５個のアミノ酸置換、約３５個のアミノ酸置換〜約９０個のアミノ酸置換、約３５個のアミノ酸置換〜約８５個のアミノ酸置換、約３５個のアミノ酸置換〜約
８０個のアミノ酸置換、約３５個のアミノ酸置換〜約７５個のアミノ酸置換、約３５個のアミノ酸置換〜約７０個のアミノ酸置換、約３５個のアミノ酸置換〜約６５個のアミノ酸置換、約３５個のアミノ酸置換〜約６０個のアミノ酸置換、約３５個のアミノ酸置換〜約５５個のアミノ酸置換、約３５個のアミノ酸置換〜約５０個のアミノ酸置換、約３５個のアミノ酸置換〜約４５個のアミノ酸置換、約３５個のアミノ酸置換〜約４０個のアミノ酸置換、約４０個のアミノ酸置換〜約１６０個のアミノ酸置換、約４０個のアミノ酸置換〜約１５５個のアミノ酸置換、約４０個のアミノ酸置換〜約１５０個のアミノ酸置換、約４０個のアミノ酸置換〜約１４５個のアミノ酸置換、約４０個のアミノ酸置換〜約１４０個のアミノ酸置換、約４０個のアミノ酸置換〜約１３５個のアミノ酸置換、約４０個のアミノ酸置換〜約１３０個のアミノ酸置換、約４０個のアミノ酸置換〜約１２５個のアミノ酸置換、約４０個のアミノ酸置換〜約１２０個のアミノ酸置換、約４０個のアミノ酸置換〜約１１５個のアミノ酸置換、約４０個のアミノ酸置換〜約１１０個のアミノ酸置換、約４０個のアミノ酸置換〜約１０５個のアミノ酸置換、約４０個のアミノ酸置換〜約１００個のアミノ酸置換、約４０個のアミノ酸置換〜約９５個のアミノ酸置換、約４０個のアミノ酸置換〜約９０個のアミノ酸置換、約４０個のアミノ酸置換〜約８５個のアミノ酸置換、約４０個のアミノ酸置換〜約８０個のアミノ酸置換、約４０個のアミノ酸置換〜約７５個のアミノ酸置換、約４０個のアミノ酸置換〜約７０個のアミノ酸置換、約４０個のアミノ酸置換〜約６５個のアミノ酸置換、約４０個のアミノ酸置換〜約６０個のアミノ酸置換、約４０個のアミノ酸置換〜約５５個のアミノ酸置換、約４０個のアミノ酸置換〜約５０個のアミノ酸置換、約４０個のアミノ酸置換〜約４５個のアミノ酸置換、約４５個のアミノ酸置換〜約１６０個のアミノ酸置換、約４５個のアミノ酸置換〜約１５５個のアミノ酸置換、約４５個のアミノ酸置換〜約１５０個のアミノ酸置換、約４５個のアミノ酸置換〜約１４５個のアミノ酸置換、約４５個のアミノ酸置換〜約１４０個のアミノ酸置換、約４５個のアミノ酸置換〜約１３５個のアミノ酸置換、約４５個のアミノ酸置換〜約１３０個のアミノ酸置換、約４５個のアミノ酸置換〜約１２５個のアミノ酸置換、約４５個のアミノ酸置換〜約１２０個のアミノ酸置換、約４５個のアミノ酸置換〜約１１５個のアミノ酸置換、約４５個のアミノ酸置換〜約１１０個のアミノ酸置換、約４５個のアミノ酸置換〜約１０５個のアミノ酸置換、約４５個のアミノ酸置換〜約１００個のアミノ酸置換、約４５個のアミノ酸置換〜約９５個のアミノ酸置換、約４５個のアミノ酸置換〜約９０個のアミノ酸置換、約４５個のアミノ酸置換〜約８５個のアミノ酸置換、約４５個のアミノ酸置換〜約８０個のアミノ酸置換、約４５個のアミノ酸置換〜約７５個のアミノ酸置換、約４５個のアミノ酸置換〜約７０個のアミノ酸置換、約４５個のアミノ酸置換〜約６５個のアミノ酸置換、約４５個のアミノ酸置換〜約６０個のアミノ酸置換、約４５個のアミノ酸置換〜約５５個のアミノ酸置換、約４５個のアミノ酸置換〜約５０個のアミノ酸置換、約５０個のアミノ酸置換〜約１６０個のアミノ酸置換、約５０個のアミノ酸置換〜約１５５個のアミノ酸置換、約５０個のアミノ酸置換〜約１５０個のアミノ酸置換、約５０個のアミノ酸置換〜約１４５個のアミノ酸置換、約５０個のアミノ酸置換〜約１４０個のアミノ酸置換、約５０個のアミノ酸置換〜約１３５個のアミノ酸置換、約５０個のアミノ酸置換〜約１３０個のアミノ酸置換、約５０個のアミノ酸置換〜約１２５個のアミノ酸置換、約５０個のアミノ酸置換〜約１２０個のアミノ酸置換、約５０個のアミノ酸置換〜約１１５個のアミノ酸置換、約５０個のアミノ酸置換〜約１１０個のアミノ酸置換、約５０個のアミノ酸置換〜約１０５個のアミノ酸置換、約５０個のアミノ酸置換〜約１００個のアミノ酸置換、約５０個のアミノ酸置換〜約９５個のアミノ酸置換、約５０個のアミノ酸置換〜約９０個のアミノ酸置換、約５０個のアミノ酸置換〜約８５個のアミノ酸置換、約５０個のアミノ酸置換〜約８０個のアミノ酸置換、約５０個のアミノ酸置換〜約７５個のアミノ酸置換、約５０個のアミノ酸置換〜約７０個のアミノ酸置換、約５０個のアミノ酸置換〜約６５個のアミノ酸置換、約５０個のアミノ酸置換〜約６０個のアミノ酸置換、約５０個のアミノ酸置換〜約５５個のアミノ酸置換、約６０個のアミノ酸置換〜約１６０個のアミノ酸置換、約６０個のアミノ酸置換〜約１５５個のアミノ酸置換、約６０個のアミノ酸置換〜約１５０個のアミノ酸置換、約６０個のアミノ酸置換〜約１４５個のアミノ酸置換、約６０個のアミノ酸置換〜約１４０個のアミノ酸置換、約６０個のアミノ酸置換〜約１３５個のアミノ酸置換、約６０個のアミノ酸置換〜約１３０個のアミノ酸置換、約６０個のアミノ酸置換〜約１２５個のアミノ酸置換、約６０個のアミノ酸置換〜約１２０個のアミノ酸置換、約６０個のアミノ酸置換〜約１１５個のアミノ酸置換、約６０個のアミノ酸置換〜約１１０個のアミノ酸置換、約６０個のアミノ酸置換〜約１０５個のアミノ酸置換、約６０個のアミノ酸置換〜約１００個のアミノ酸置換、約６０個のアミノ酸置換〜約９５個のアミノ酸置換、約６０個のアミノ酸置換〜約９０個のアミノ酸置換、約６０個のアミノ酸置換〜約８５個のアミノ酸置換、約６０個のアミノ酸置換〜約８０個のアミノ酸置換、約６０個のアミノ酸置換〜約７５個のアミノ酸置換、約６０個のアミノ酸置換〜約７０個のアミノ酸置換、約６０個のアミノ酸置換〜約６５個のアミノ酸置換、約７０個のアミノ酸置換〜約１６０個のアミノ酸置換、約７０個のアミノ酸置換〜約１５５個のアミノ酸置換、約７０個のアミノ酸置換〜約１５０個のアミノ酸置換、約７０個のアミノ酸置換〜約１４５個のアミノ酸置換、約７０個のアミノ酸置換〜約１４０個のアミノ酸置換、約７０個のアミノ酸置換〜約１３５個のアミノ酸置換、約７０個のアミノ酸置換〜約１３０個のアミノ酸置換、約７０個のアミノ酸置換〜約１２５個のアミノ酸置換、約７０個のアミノ酸置換〜約１２０個のアミノ酸置換、約７０個のアミノ酸置換〜約１１５個のアミノ酸置換、約７０個のアミノ酸置換〜約１１０個のアミノ酸置換、約７０個のアミノ酸置換〜約１０５個のアミノ酸置換、約７０個のアミノ酸置換〜約１００個のアミノ酸置換、約７０個のアミノ酸置換〜約９５個のアミノ酸置換、約７０個のアミノ酸置換〜約９０個のアミノ酸置換、約７０個のアミノ酸置換〜約８５個のアミノ酸置換、約７０個のアミノ酸置換〜約８０個のアミノ酸置換、約７０個のアミノ酸置換〜約７５個のアミノ酸置換、約８０個のアミノ酸置換〜約１６０個のアミノ酸置換、約８０個のアミノ酸置換〜約１５５個のアミノ酸置換、約８０個のアミノ酸置換〜約１５０個のアミノ酸置換、約８０個のアミノ酸置換〜約１４５個のアミノ酸置換、約８０個のアミノ酸置換〜約１４０個のアミノ酸置換、約８０個のアミノ酸置換〜約１３５個のアミノ酸置換、約８０個のアミノ酸置換〜約１３０個のアミノ酸置換、約８０個のアミノ酸置換〜約１２５個のアミノ酸置換、約８０個のアミノ酸置換〜約１２０個のアミノ酸置換、約８０個のアミノ酸置換〜約１１５個のアミノ酸置換、約８０個のアミノ酸置換〜約１１０個のアミノ酸置換、約８０個のアミノ酸置換〜約１０５個のアミノ酸置換、約８０個のアミノ酸置換〜約１００個のアミノ酸置換、約８０個のアミノ酸置換〜約９５個のアミノ酸置換、約８０個のアミノ酸置換〜約９０個のアミノ酸置換、約８０個のアミノ酸置換〜約８５個のアミノ酸置換、約９０個のアミノ酸置換〜約１６０個のアミノ酸置換、約９０個のアミノ酸置換〜約１５５個のアミノ酸置換、約９０個のアミノ酸置換〜約１５０個のアミノ酸置換、約９０個のアミノ酸置換〜約１４５個のアミノ酸置換、約９０個のアミノ酸置換〜約１４０個のアミノ酸置換、約９０個のアミノ酸置換〜約１３５個のアミノ酸置換、約９０個のアミノ酸置換〜約１３０個のアミノ酸置換、約９０個のアミノ酸置換〜約１２５個のアミノ酸置換、約９０個のアミノ酸置換〜約１２０個のアミノ酸置換、約９０個のアミノ酸置換〜約１１５個のアミノ酸置換、約９０個のアミノ酸置換〜約１１０個のアミノ酸置換、約９０個のアミノ酸置換〜約１０５個のアミノ酸置換、約９０個のアミノ酸置換〜約１００個のアミノ酸置換、約９０個のアミノ酸置換〜約９５個のアミノ酸置換、約１００個のアミノ酸置換〜約１６０個のアミノ酸置換、約１００個のアミノ酸置換〜約１５５個のアミノ酸置換、約１００個のアミノ酸置換〜約１５０個のアミノ酸置換、約１００個のアミノ酸置換〜約１４５個のアミノ酸置換、約１００個のアミノ酸置換〜約１４０個のアミノ酸置換、約１００個のアミノ酸置換〜約１３５個のアミノ酸置換、約１００個のアミノ酸置換〜約１３０個のアミノ酸置換、約１００個のアミノ酸置換〜約１２５個のアミノ酸置換、約１００個のアミノ酸置換〜約１２０個のアミノ酸置換、約１００個のアミノ酸置換〜約１１５個のアミノ酸置換、約１００個のアミノ酸置換〜約１１０個のアミノ酸置換、約１００個のアミノ酸置換〜約１０５個のアミノ酸置換、約１１０個のアミノ酸置換〜約１６０個のアミノ酸置換、約１１０個のアミノ酸置換〜約１５５個のアミノ酸置換、約１１０個のアミノ酸置換〜約１５０個のアミノ酸置換、約１１０個のアミノ酸置換〜約１４５個のアミノ酸置換、約１１０個のアミノ酸置換〜約１４０個のアミノ酸置換、約１１０個のアミノ酸置換〜約１３５個のアミノ酸置換、約１１０個のアミノ酸置換〜約１３０個のアミノ酸置換、約１１０個のアミノ酸置換〜約１２５個のアミノ酸置換、約１１０個のアミノ酸置換〜約１２０個のアミノ酸置換、約１１０個のアミノ酸置換〜約１１５個のアミノ酸置換、約１２０個のアミノ酸置換〜約１６０個のアミノ酸置換、約１２０個のアミノ酸置換〜約１５５個のアミノ酸置換、約１２０個のアミノ酸置換〜約１５０個のアミノ酸置換、約１２０個のアミノ酸置換〜約１４５個のアミノ酸置換、約１２０個のアミノ酸置換〜約１４０個のアミノ酸置換、約１２０個のアミノ酸置換〜約１３５個のアミノ酸置換、約１２０個のアミノ酸置換〜約１３０個のアミノ酸置換、約１２０個のアミノ酸置換〜約１２５個のアミノ酸置換、約１３０個のアミノ酸置換〜約１６０個のアミノ酸置換、約１３０個のアミノ酸置換〜約１５５個のアミノ酸置換、約１３０個のアミノ酸置換〜約１５０個のアミノ酸置換、約１３０個のアミノ酸置換〜約１４５個のアミノ酸置換、約１３０個のアミノ酸置換〜約１４０個のアミノ酸置換、約１３０個のアミノ酸置換〜約１３５個のアミノ酸置換、約１４０個のアミノ酸置換〜約１６０個のアミノ酸置換、約１４０個のアミノ酸置換〜約１５５個のアミノ酸置換、約１４０個のアミノ酸置換〜約１５０個のアミノ酸置換、約１４０個のアミノ酸置換〜約１４５個のアミノ酸置換、約１５０個のアミノ酸置換〜約１６０個のアミノ酸置換、または約１５０個のアミノ酸置換〜約１５５個のアミノ酸置換を含む、野生型完全長ステレオシリンタンパク質（例えば、野生型ヒト完全長ステレオシリンタンパク質）の配列を含み得る。当業者であれば、異なる種由来の野生型ステレオシリンタンパク質の間で保存されているアミノ酸を、活性を失うことなく変異させることができる一方で、異なる種由来の野生型ステレオシリンタンパク質の間で保存されていないアミノ酸は、それらが活性に関与する可能性が（異なる種の間で保存されていないアミノ酸よりも）高いため、変異させるべきでないことを理解しよう。
【００４４】
活性ステレオシリンタンパク質は、例えば、１個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜約４５個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜約４０個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜約３５個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜約３０個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜約２５個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜約１５個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜約１０個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜約９個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜約８個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜約７個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜約６個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜約５個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜約４個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜約３個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜約４５個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜約４０個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜約３５個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜約３０個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜約２５個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜約１５個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜約１０個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜約９個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜約８個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜約７個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜約６個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜約５個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜約４個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜約４５個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜約４０個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜約３５個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜約３０個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜約２５個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜約１５個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜約１０個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜約９個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜約８個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜約７個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜約６個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜約５個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜約４５個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜約４０個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜約３５個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜約３０個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜約２５個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜約１５個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜約１０個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜約９個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜約８個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜約７個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜約６個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約４５個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約４０個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約３５個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約３０個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約２５個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約１５個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約１０個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約９個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約８個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約７個のアミノ酸、約６個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸、約６個のアミノ酸〜約４５個のアミノ酸、約６個のアミノ酸〜約４０個のアミノ酸、約６個のアミノ酸〜約３５個のアミノ酸、約６個のアミノ酸〜約３０個のアミノ酸、約６個のアミノ酸〜約２５個のアミノ酸、約６個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸、約６個のアミノ酸〜約１５個のアミノ酸、約６個のアミノ酸〜約１０個のアミノ酸、約６個のアミノ酸〜約９個のアミノ酸、約６個のアミノ酸〜約８個のアミノ酸、約７個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸、約７個のアミノ酸〜約４５個のアミノ酸、約７個のアミノ酸〜約４０個のアミノ酸、約７個のアミノ酸〜約３５個のアミノ酸、約７個のアミノ酸〜約３０個のアミノ酸、約７個のアミノ酸〜約２５個のアミノ酸、約７個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸、約７個のアミノ酸〜約１５個のアミノ酸、約７個のアミノ酸〜約１０個のアミノ酸、約７個のアミノ酸〜約９個のアミノ酸、約８個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸、約８個のアミノ酸〜約４５個のアミノ酸、約８個のアミノ酸〜約４０個のアミノ酸、約８個のアミノ酸〜約３５個のアミノ酸、約８個のアミノ酸〜約３０個のアミノ酸、約８個のアミノ酸〜約２５個のアミノ酸、約８個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸、約８個のアミノ酸〜約１５個のアミノ酸、約８個のアミノ酸〜約１０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜約４５個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜約４０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜約３５個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜約３０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜約２５個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜約１５個のアミノ酸、約１５個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸、約１５個のアミノ酸〜約４５個のアミノ酸、約１５個のアミノ酸〜約４０個のアミノ酸、約１５個のアミノ酸〜約３５個のアミノ酸、約１５個のアミノ酸〜約３０個のアミノ酸、約１５個のアミノ酸〜約２５個のアミノ酸、約１５個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸〜約４５個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸〜約４０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸〜約３５個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸〜約３０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸〜約２５個のアミノ酸、約２５個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸、約２５個のアミノ酸〜約４５個のアミノ酸、約２５個のアミノ酸〜約４０個のアミノ酸、約２５個のアミノ酸〜約３５個のアミノ酸、約２５個のアミノ酸〜約３０個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸〜約４５個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸〜約４０個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸〜約３５個のアミノ酸、約３５個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸、約３５個のアミノ酸〜約４５個のアミノ酸、約３５個のアミノ酸〜約４０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸〜約４５個のアミノ酸、約４５個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸が欠失した、野生型完全長ステレオシリンタンパク質（例えば、野生型ヒト完全長ステレオシリンタンパク質）の配列を含み得る。野生型完全長ステレオシリンタンパク質の配列から２つ以上のアミノ酸が欠失している一部の実施形態では、該２つ以上の欠失したアミノ酸は、野生型完全長ステレオシリンタンパク質の配列において連続している可能性がある。野生型完全長ステレオシリンタンパク質の配列から２つ以上のアミノ酸が欠失している他の実施形態では、該２つ以上の欠失したアミノ酸は、野生型完全長ステレオシリンタンパク質の配列において連続していない。当業者であれば、異なる種由来の野生型完全長ステレオシリンタンパク質の間で保存されていないアミノ酸を、活性を失うことなく欠失させることができる一方で、異なる種由来の野生型完全長ステレオシリンタンパク質の間で保存されているアミノ酸は、それらが活性に関与する可能性が（異なる種の間で保存されていないアミノ酸よりも）高いため、欠失させるべきでないことを理解しよう。
【００４５】
一部の例では、活性ステレオシリンタンパク質は、例えば、１個のアミノ酸〜約１００個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜約９５個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜約９０個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜約８５個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜約８０個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜約７５個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜約７０個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜約６５個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜約６０個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜約５５個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜約４５個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜約４０個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜約３５個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜約３０個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜約２５個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜約１５個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜約１０個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜約９個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜約８個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜約７個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜約６個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜約５個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜約４個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜約３個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜約１００個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜約９５個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜約９０個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜約８５個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜約８０個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜約７５個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜約７０個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜約６５個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜約６０個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜約５５個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜約４５個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜約４０個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜約３５個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜約３０個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜約２５個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜約１５個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜約１０個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜約９個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜約８個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜約７個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜約６個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜約５個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜約４個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜約１００個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜約９５個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜約９０個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜約８５個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜約８０個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜約７５個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜約７０個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜約６５個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜約６０個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜約５５個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜約４５個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜約４０個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜約３５個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜約３０個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜約２５個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜約１５個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜約１０個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜約９個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜約８個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜約７個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜約６個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜約５個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜約１００個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜約９５個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜約９０個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜約８５個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜約８０個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜約７５個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜約７０個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜約６５個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜約６０個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜約５５個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜約４５個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜約４０個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜約３５個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜約３０個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜約２５個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜約１５個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜約１０個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜約９個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜約８個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜約７個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜約６個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約１００個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約９５個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約９０個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約８５個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約８０個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約７５個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約７０個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約６５個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約６０個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約５５個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約４５個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約４０個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約３５個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約３０個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約２５個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約１５個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約１０個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約９個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約８個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約７個のアミノ酸、約６個のアミノ酸〜約１００個のアミノ酸、約６個のアミノ酸〜約９５個のアミノ酸、約６個のアミノ酸〜約９０個のアミノ酸、約６個のアミノ酸〜約８５個のアミノ酸、約６個のアミノ酸〜約８０個のアミノ酸、約６個のアミノ酸〜約７５個のアミノ酸、約６個のアミノ酸〜約７０個のアミノ酸、約６個のアミノ酸〜約６５個のアミノ酸、約６個のアミノ酸〜約６０個のアミノ酸、約６個のアミノ酸〜約５５個のアミノ酸、約６個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸、約６個のアミノ酸〜約４５個のアミノ酸、約６個のアミノ酸〜約４０個のアミノ酸、約６個のアミノ酸〜約３５個のアミノ酸、約６個のアミノ酸〜約３０個のアミノ酸、約６個のアミノ酸〜約２５個のアミノ酸、約６個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸、約６個のアミノ酸〜約１５個のアミノ酸、約６個のアミノ酸〜約１０個のアミノ酸、約６個のアミノ酸〜約９個のアミノ酸、約６個のアミノ酸〜約８個のアミノ酸、約７個のアミノ酸〜約１００個のアミノ酸、約７個のアミノ酸〜約９５個のアミノ酸、約７個のアミノ酸〜約９０個のアミノ酸、約７個のアミノ酸〜約８５個のアミノ酸、約７個のアミノ酸〜約８０個のアミノ酸、約７個のアミノ酸〜約７５個のアミノ酸、約７個のアミノ酸〜約７０個のアミノ酸、約７個のアミノ酸〜約６５個のアミノ酸、約７個のアミノ酸〜約６０個のアミノ酸、約７個のアミノ酸〜約５５個のアミノ酸、約７個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸、約７個のアミノ酸〜約４５個のアミノ酸、約７個のアミノ酸〜約４０個のアミノ酸、約７個のアミノ酸〜約３５個のアミノ酸、約７個のアミノ酸〜約３０個のアミノ酸、約７個のアミノ酸〜約２５個のアミノ酸、約７個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸、約７個のアミノ酸〜約１５個のアミノ酸、約７個のアミノ酸〜約１０個のアミノ酸、約７個のアミノ酸〜約９個のアミノ酸、約８個のアミノ酸〜約１００個のアミノ酸、約８個のアミノ酸〜約９５個のアミノ酸、約８個のアミノ酸〜約９０個のアミノ酸、約８個のアミノ酸〜約８５個のアミノ酸、約８個のアミノ酸〜約８０個のアミノ酸、約８個のアミノ酸〜約７５個のアミノ酸、約８個のアミノ酸〜約７０個のアミノ酸、約８個のアミノ酸〜約６５個のアミノ酸、約８個のアミノ酸〜約６０個のアミノ酸、約８個のアミノ酸〜約５５個のアミノ酸、約８個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸、約８個のアミノ酸〜約４５個のアミノ酸、約８個のアミノ酸〜約４０個のアミノ酸、約８個のアミノ酸〜約３５個のアミノ酸、約８個のアミノ酸〜約３０個のアミノ酸、約８個のアミノ酸〜約２５個のアミノ酸、約８個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸、約８個のアミノ酸〜約１５個のアミノ酸、約８個のアミノ酸〜約１０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜約１００個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜約９５個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜約９０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜約８５個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜約８０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜約７５個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜約７０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜約６５個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜約６０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜約５５個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜約４５個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜約４０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜約３５個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜約３０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜約２５個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜約１５個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸〜約１００個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸〜約９５個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸〜約９０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸〜約８５個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸〜約８０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸〜約７５個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸〜約７０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸〜約６５個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸〜約６０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸〜約５５個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸〜約４５個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸〜約４０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸〜約３５個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸〜約３０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸〜約２５個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸〜約１００個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸〜約９５個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸〜約９０個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸〜約８５個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸〜約８０個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸〜約７５個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸〜約７０個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸〜約６５個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸〜約６０個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸〜約５５個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸〜約４５個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸〜約４０個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸〜約３５個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸〜約１００個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸〜約９５個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸〜約９０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸〜約８５個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸〜約８０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸〜約７５個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸〜約７０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸〜約６５個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸〜約６０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸〜約５５個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸〜約４５個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸〜約１００個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸〜約９５個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸〜約９０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸〜約８５個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸〜約８０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸〜約７５個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸〜約７０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸〜約６５個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸〜約６０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸〜約５５個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸〜約１００個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸〜約９５個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸〜約９０個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸〜約８５個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸〜約８０個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸〜約７５個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸〜約７０個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸〜約６５個のアミノ酸、約７０個のアミノ酸〜約１００個のアミノ酸、約７０個のアミノ酸〜約９５個のアミノ酸、約７０個のアミノ酸〜約９０個のアミノ酸、約７０個のアミノ酸〜約８５個のアミノ酸、約７０個のアミノ酸〜約８０個のアミノ酸、約７０個のアミノ酸〜約７５個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸〜約１００個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸〜約
９５個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸〜約９０個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸〜約８５個のアミノ酸、約９０個のアミノ酸〜約１００個のアミノ酸、約９０個のアミノ酸〜約９５個のアミノ酸、もしくは約９５個のアミノ酸〜約１００個のアミノ酸が、そのＮ末端から除去された、及び／または１個のアミノ酸〜１００個のアミノ酸（または本明細書に記載されるこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）が、そのＣ末端から除去された、野生型完全長ステレオシリンタンパク質の配列を含み得る。
【００４６】
一部の実施形態では、活性ステレオシリンタンパク質は、例えば、１個のアミノ酸〜５０個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜４５個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜４０個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜３５個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜３０個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜２５個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜２０個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜１５個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜１０個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜９個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜８個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜７個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜６個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜５個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜４個のアミノ酸、１個のアミノ酸〜３個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜５０個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜４５個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜４０個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜３５個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜３０個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜２５個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜２０個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜１５個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜１０個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜９個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜８個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜７個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜６個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜５個のアミノ酸、約２個のアミノ酸〜４個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜５０個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜４５個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜４０個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜３５個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜３０個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜２５個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜２０個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜１５個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜１０個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜９個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜８個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜７個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜６個のアミノ酸、約３個のアミノ酸〜５個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜５０個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜４５個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜４０個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜３５個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜３０個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜２５個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜２０個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜１５個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜１０個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜９個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜８個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜７個のアミノ酸、約４個のアミノ酸〜６個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜５０個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜４５個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜４０個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜３５個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜３０個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜２５個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜２０個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜１５個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜１０個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜９個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜８個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜７個のアミノ酸、約６個のアミノ酸〜５０個のアミノ酸、約６個のアミノ酸〜４５個のアミノ酸、約６個のアミノ酸〜４０個のアミノ酸、約６個のアミノ酸〜３５個のアミノ酸、約６個のアミノ酸〜３０個のアミノ酸、約６個のアミノ酸〜２５個のアミノ酸、約６個のアミノ酸〜２０個のアミノ酸、約６個のアミノ酸〜１５個のアミノ酸、約６個のアミノ酸〜１０個のアミノ酸、約６個のアミノ酸〜９個のアミノ酸、約６個のアミノ酸〜８個のアミノ酸、約７個のアミノ酸〜５０個のアミノ酸、約７個のアミノ酸〜４５個のアミノ酸、約７個のアミノ酸〜４０個のアミノ酸、約７個のアミノ酸〜３５個のアミノ酸、約７個のアミノ酸〜３０個のアミノ酸、約７個のアミノ酸〜２５個のアミノ酸、約７個のアミノ酸〜２０個のアミノ酸、約７個のアミノ酸〜１５個のアミノ酸、約７個のアミノ酸〜１０個のアミノ酸、約７個のアミノ酸〜９個のアミノ酸、約８個のアミノ酸〜５０個のアミノ酸、約８個のアミノ酸〜４５個のアミノ酸、約８個のアミノ酸〜４０個のアミノ酸、約８個のアミノ酸〜３５個のアミノ酸、約８個のアミノ酸〜３０個のアミノ酸、約８個のアミノ酸〜２５個のアミノ酸、約８個のアミノ酸〜２０個のアミノ酸、約８個のアミノ酸〜１５個のアミノ酸、約８個のアミノ酸〜１０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜５０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜４５個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜４０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜３５個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜３０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜２５個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜２０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜１５個のアミノ酸、約１５個のアミノ酸〜５０個のアミノ酸、約１５個のアミノ酸〜４５個のアミノ酸、約１５個のアミノ酸〜４０個のアミノ酸、約１５個のアミノ酸〜３５個のアミノ酸、約１５個のアミノ酸〜３０個のアミノ酸、約１５個のアミノ酸〜２５個のアミノ酸、約１５個のアミノ酸〜２０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸〜５０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸〜４５個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸〜４０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸〜３５個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸〜３０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸〜２５個のアミノ酸、約２５個のアミノ酸〜５０個のアミノ酸、約２５個のアミノ酸〜４５個のアミノ酸、約２５個のアミノ酸〜４０個のアミノ酸、約２５個のアミノ酸〜３５個のアミノ酸、約２５個のアミノ酸〜３０個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸〜５０個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸〜４５個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸〜４０個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸〜３５個のアミノ酸、約３５個のアミノ酸〜５０個のアミノ酸、約３５個のアミノ酸〜４５個のアミノ酸、約３５個のアミノ酸〜４０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸〜５０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸〜４５個のアミノ酸、または約４５個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸が挿入されている、野生型完全長ステレオシリンタンパク質の配列を含み得る。一部の例では、該１個のアミノ酸〜５０個のアミノ酸（またはその任意の部分範囲）は、野生型完全長タンパク質の配列に連続配列として挿入され得る。一部の例では、該１個のアミノ酸〜５０個のアミノ酸（またはその任意の部分範囲）は、野生型完全長タンパク質の配列に連続配列としては挿入されない。当該技術分野で理解され得るように、該１個のアミノ酸〜５０個のアミノ酸は、野生型完全長タンパク質の配列のうち、種の間であまり保存されていない一部分に挿入され得る。
【００４７】
別途規定されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本発明で使用するための方法及び材料が本明細書に記載されるが、当該技術分野で既知の他の好適な方法及び材料もまた使用することができる。これらの材料、方法、及び例は例示説明にすぎず、限定することは意図していない。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリ、及び他の参考文献は、参照によりそれらの全体が援用される。矛盾がある場合、定義を含めて本明細書が優位に立つ。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】本明細書に記載される本方法のうちのいずれかにおいて使用され得るＳＴＲＣベクター（ｐＩＴＲ−２０１、配列番号１２、４３２４塩基対（ｂｐ））の遺伝子地図の例示的な略図である。当該ベクターは、逆位末端反復（ＩＴＲ）配列（配列番号１８）、５’ＦＶＩＩＩスタッファー配列（配列番号１９）、ＣＭＶエンハンサー（配列番号２０）、ＣＭＶプロモーター（配列番号２１）、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）配列（配列番号２４）、５’ＳＴＲＣコード配列（配列番号２５）、スプライシングドナーシグナル配列（ＳＤ）（配列番号６）、Ｆ１ファージ由来の高度組換え誘導（ｈｉｇｈｌｙ  ｒｅｃｏｍｂｉｎｏｇｅｎｉｃ）配列（ＡＫ、配列番号２６）、及びＩＴＲ配列（配列番号３６）を含む。
【図２】本明細書に記載される本方法のうちのいずれかにおいて使用され得るＳＴＲＣベクター（ｐＩＴＲ−２０２、配列番号１３、４４３４ｂｐ）の遺伝子地図の例示的な略図である。当該ベクターは、ＩＴＲ配列（配列番号１８）、ＡＫ配列（配列番号２６）、ＳＤ配列（配列番号６）、３’ＳＴＲＣコード配列（配列番号２８）、３’ＵＴＲ配列（配列番号３３）、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨｐＡ）（配列番号３４）、３’ＦＶＩＩＩスタッファー配列（配列番号３５）、及びＩＴＲ配列（配列番号３６）を含む。
【図３】本明細書に記載される本方法のうちのいずれかにおいて使用され得るＳＴＲＣベクター（ｐＩＴＲ−２０２ＧＦＰ、配列番号１４、４６９３ｂｐ）の遺伝子地図の例示的な略図である。当該ベクターは、ＩＴＲ配列（配列番号１８）、ＡＫ配列（配列番号２６）、ＳＤ配列（配列番号６）、３’ＳＴＲＣコード配列（配列番号２８）、Ｔ２Ａ配列（配列番号２９）、ｔＧＦＰ配列（配列番号３１）、３’ＵＴＲ配列（配列番号３３）、ｂＧＨｐＡ配列（配列番号３４）、及びＩＴＲ配列（配列番号３６）を含む。
【図４】本明細書に記載される本方法のうちのいずれかにおいて使用され得るＳＴＲＣベクター（ｐＩＴＲ−２０３、配列番号１５、４６１９ｂｐ）の遺伝子地図の例示的な略図である。当該ベクターは、ＩＴＲ配列（配列番号１８）、５’ＦＶＩＩＩスタッファー＿５００配列（配列番号３７）、ＣＭＶエンハンサー（配列番号２０）、ＣＭＶプロモーター配列（配列番号２１）、５’ＵＴＲ配列（配列番号２４）、５’ＳＴＲＣコード配列（配列番号２５）、ＳＤ配列（配列番号６）、ＡＰ配列（ＡＰ）（配列番号２７）、及びＩＴＲ配列（配列番号３６）を含む。
【図５】本明細書に記載される本方法のうちのいずれかにおいて使用され得るＳＴＲＣベクター（ｐＩＴＲ−２０４、配列番号１６、４７２９ｂｐ）の遺伝子地図の例示的な略図である。当該ベクターは、ＩＴＲ配列（配列番号１８）、ＡＰ配列（配列番号２７）、スプライシングアクセプターシグナル（ＳＡ）配列（配列番号７）、３’ＳＴＲＣコード配列（配列番号２８）、３’ＵＴＲ配列（配列番号３３）、ｂＧＨｐＡ配列（配列番号３４）、及びＩＴＲ配列（配列番号３６）を含む。
【図６】本明細書に記載される本方法のうちのいずれかにおいて使用され得るＳＴＲＣベクター（ｐＩＴＲ−２０５、配列番号１７、４４６０ｂｐ）の遺伝子地図の例示的な略図である。当該ベクターは、ＩＴＲ配列（配列番号１８）、ＣＭＶエンハンサー（配列番号２０）、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーター（配列番号２２）、キメライントロン配列（配列番号２３）、５’ＵＴＲ配列（配列番号２４）、５’ＳＴＲＣコード配列（配列番号２５）、ＳＤ配列（配列番号６）、ＡＫ配列（配列番号２６）、及びＩＴＲ配列（配列番号３６）を含む。
【図７】ポリクローナルＳＴＲＣ抗体を用いた、トランスフェクションから７２時間後のシングルまたはデュアルＳＴＲＣベクターでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞からのＳＴＲＣタンパク質レベルの免疫ブロットの画像である。β−アクチン（ＡＣＴＢ）をローディング対照として使用した。列１−染色済みＰａｇｅ  Ｒｕｌｅ、列２−４００ｎｇ  ｐＩＴＲ−２０１と４００ｎｇ  ｐＩＴＲ−２０２、列３−４００ｎｇ  ｐＩＴＲ−２０１と４００ｎｇ  ｐＩＴＲ−２０２ＧＦＰ、列４−４００ｎｇ  ｐＩＴＲ−２０３と４００ｎｇ  ｐＩＴＲ−２０４、列５−４００ｎｇ  ｐＩＴＲ−２０５と４００ｎｇ  ｐＩＴＲ−２０２、列６−４００ｎｇ  ｐＩＴＲ−２０５と４００ｎｇ  ｐＩＴＲ−２０２ＧＦＰ、列７−８００ｎｇ  ｐＩＴＲ−２０２ＧＦＰ、及び列８−トランスフェクトされていない対照細胞溶解物。
【図８】ポリクローナルＳＴＲＣ抗体を用いた、トランスフェクションから７２時間後の異なるＭＯＩ（２．６Ｅ５、８．６Ｅ４、２．６Ｅ５、及び８．６Ｅ４）のデュアルＳＴＲＣベクター（ＡＡＶ２．ＳＴＲＣ及びＡｎｃ８０．ＳＴＲＣ）で形質導入されたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞からのＳＴＲＣタンパク質レベルの免疫ブロットの画像である。β−アクチン（ＡＣＴＢ）をローディング対照として使用した。
【図９】ＡＡＶ２．ＳＴＲＣ（ＭＯＩ８．６Ｅ４及びＭＯＩ２．６Ｅ５で）及びＡｎｃ８０．ＳＴＲＣ（ＭＯＩ８．６Ｅ４及び２．６Ｅ５で）でそれぞれ形質導入されたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞における、ＧＡＰＤＨに対するＳＴＲＣ（５’ＳＴＲＣ、３’ＳＴＲＣ、及び完全長ＳＴＲＣ）の相対ＲＮＡ発現量を示す棒グラフである。
【図１０】ＡＡＶ２．ＳＴＲＣ（ＭＯＩ１．３Ｅ１０で）及びＡｎｃ８０．ＳＴＲＣ（ＭＯＩ３．９Ｅ１０で）にそれぞれ１６時間感染させたＷＴマウス由来のＰ１−３蝸牛外植片における、ＧＡＰＤＨに対するＳＴＲＣ（５’ＳＴＲＣ、３’ＳＴＲＣ、及び完全長ＳＴＲＣ）の相対ＲＮＡ発現量を示す棒グラフである。
【図１１Ａ】Ｍｙｏ７ａ及びファロイジン染色を示す、模擬感染ＷＴマウス由来のＰ１−３蝸牛外植片の例示的な蛍光画像である。
【図１１Ｂ】Ｍｙｏ７ａ及びファロイジン染色を示す、模擬感染ＷＴマウス由来のＰ１−３蝸牛外植片の例示的な蛍光画像である。倍率２０倍。
【図１１Ｃ】Ｍｙｏ７ａ及びファロイジン染色を示す、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０．ＳＴＲＣ感染（ＭＯＩ７．８Ｅ８  ＶＧ／蝸牛で）ＷＴマウス由来のＰ１−３蝸牛外植片の例示的な蛍光画像である。
【図１１Ｄ】Ｍｙｏ７ａ及びファロイジン染色を示す、ＡＡＶａｎｃ８０．ｄＳＴＲＣ感染（ＭＯＩ２．６Ｅ８  ＶＧ／蝸牛で）ＷＴマウス由来のＰ１−３蝸牛外植片の例示的な蛍光画像である。倍率２０倍。
【図１１Ｅ】Ｍｙｏ７ａ及びファロイジン染色を示す、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０．ＳＴＲＣ感染（ＭＯＩ７．８Ｅ８  ＶＧ／蝸牛で）ＷＴマウス由来のＰ１−３蝸牛外植片の例示的な蛍光画像である。倍率２０倍。
【図１２Ａ】Ｍｙｏ７ａ及びファロイジン染色を示す、ＡＡＶ２．ＳＴＲＣ感染（ＭＯＩ７．８Ｅ８  ＶＧ／蝸牛で）ＷＴマウス由来のＰ１−３蝸牛外植片の例示的な蛍光画像である。
【図１２Ｂ】Ｍｙｏ７ａ及びファロイジン染色を示す、ＡＡＶ２．ＳＴＲＣ感染（ＭＯＩ２．６Ｅ８  ＶＧ／蝸牛で）ＷＴマウス由来のＰ１−３蝸牛外植片の例示的な蛍光画像である。倍率２０倍。
【図１２Ｃ】Ｍｙｏ７ａ及びファロイジン染色を示す、ＡＡＶ２．ＳＴＲＣ感染（ＭＯＩ７．８Ｅ８  ＶＧ／蝸牛で）ＷＴマウス由来のＰ１−３蝸牛外植片の例示的な蛍光画像である。倍率２０倍。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
本明細書では、少なくとも２つの異なる核酸ベクターを含む組成物が提供され、該少なくとも２つの異なるベクターの各々は、ステレオシリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、該コードされた部分の各々は、少なくとも３０アミノ酸残基の長さであり、該コードされた部分の各々のアミノ酸配列は任意選択で、該コードされた部分のうちの異なる部分のアミノ酸配列と部分的に重複してもよく、該少なくとも２つの異なるベクターのうちのいずれの単一のベクターも、活性ステレオシリンタンパク質（例えば、完全長ステレオシリンタンパク質）をコードしておらず、該コード配列のうちの少なくとも１つは、ステレオシリンゲノムＤＮＡの２つの隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、該２つの隣接するエクソンの間にイントロン配列を欠いており、染色体ＤＮＡを含む哺乳類細胞に導入されるとき、該少なくとも２つの異なるベクターは互いに、かつ該細胞の該染色体ＤＮＡと相同組換えを経て、それによって、該染色体ＤＮＡに挿入された組換え核酸が形成され、ここで、該組換え核酸は、活性ステレオシリンタンパク質（例えば、完全長ステレオシリンタンパク質）をコードする。また、本明細書に記載される組成物のうちのいずれかを含むキットも提供される。本明細書ではまた、哺乳動物の蝸牛に、治療上有効量の本明細書に記載される組成物のうちのいずれかを導入することを含む方法も提供される。
【００５０】
本明細書ではまた、哺乳類細胞において活性ステレオシリンタンパク質（例えば、完全長ステレオシリンタンパク質）の発現を増加させる方法も提供され、該方法は、本明細書に記載される組成物のうちのいずれかを該哺乳類細胞に導入することを含む。本明細書ではまた、哺乳動物の蝸牛内の外有毛細胞において活性ステレオシリンタンパク質（例えば、完全長ステレオシリンタンパク質）の発現を増加させる方法も提供され、該方法は、該哺乳動物の蝸牛に、治療上有効量の本明細書に記載される組成物のうちのいずれかを導入することを含む。本明細書ではまた、欠陥のあるステレオシリン遺伝子を有すると特定された対象において無症候性感音性聴力喪失を治療する方法も提供され、該方法は、治療上有効量の本明細書に記載される組成物のうちのいずれかを該対象の蝸牛に投与することを含む。
【００５１】
該組成物、キット、及び方法の追加の非限定な態様が本明細書に記載され、これらは限定なしに任意の組み合わせで使用することができる。
【００５２】
ステレオシリン
ＳＴＲＣ遺伝子は、通常は内耳に発現され、内耳における特化した有毛細胞の不動毛に関連するタンパク質である、ステレオシリンをコードする（例えば、Ｖｅｒｐｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４５６：２５５−２５８，２００８、及びＺｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．４４：２３３−２４０，２００７を参照されたい）。約１０〜５０μｍの長さである不動毛は、聴覚及び平衡に重要である。不動毛は、聴覚において機械感受性の役割を果たす。音に応答して曲がることによって、それらは、音刺激の機械受容のための構造を形成する。
【００５３】
ヒトＳＴＲＣ遺伝子は、染色体１５ｑ１５上に位置する。それは、約１９キロ塩基（ｋｂ）を包含する２９個のエクソンを含有する（Ｖｅｒｐｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２９（３）：３４５−３４９，２００１、ＮＣＢＩ受託番号ＮＧ０１１６３６．１）。この遺伝子は、染色体１５ｑ１５上でテロメアからセントロメアの向きに縦列重複し、それらのタンデムコピーは、染色体上で１００ｋｂ未満の間隔を置いて位置する。第２のコピーのコード配列は、エクソン２０における終止コドンによって中断されており、これは、それが機能しない短縮型タンパク質をコードする「偽遺伝子」であることを意味する（これ以降、「ＳＴＲＣ遺伝子」への言及は、エクソン２０において終止コドンを有しない遺伝子を意味し、一方で、「偽遺伝子」または「ＳＴＲＣ偽遺伝子」への言及は、エクソン２０において終止コドンを有する遺伝子を表す）。一部の例では、完全長ＳＴＲＣタンパク質は、完全長野生型ＳＴＲＣタンパク質である。ヒトＳＴＲＣ遺伝子から発現される完全長野生型ＳＴＲＣタンパク質は、１７７５残基の長さであり、シグナルペプチド及びいくつかの疎水性セグメントを含有する。シグナルペプチドが野生型タンパク質のプロセシング中に切断されると、結果として生じる成熟野生型ステレオシリンタンパク質は、１７１９残基の長さである。一部の実施形態では、完全長ＳＴＲＣタンパク質は、成熟野生型ステレオシリンタンパク質のアミノ酸配列のＮ末端側に位置付けられた異種シグナルペプチドを含み得る。
【００５４】
ＳＴＲＣ遺伝子における種々の変異が、聴力喪失（例えば、無症候性感音性聴力喪失）に関連付けられている。例えば、ホモ接合型の１ｂｐの挿入が、常染色体劣性非症候性感音性難聴−１６（ＤＦＮＢ１６）を有する同族パキスタン人家族のエクソン１３において特定された（Ｖｅｒｐｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）。ＤＦＮＢ１６を有する家族において見出された別の例としては、エクソン５における４ｂｐの欠失と、エクソン１７〜２９を包含するより大きな欠失との両方が挙げられる。これら２つの欠失は、父親及び母親からそれぞれ受け継がれた。この４ｂｐの欠失は、エクソン５におけるアウトオブフレームの５つのアミノ酸及び未成熟終止コドンの翻訳をもたらすと予測された。
【００５５】
無症候性感音性聴力喪失を有する対象において検出されたステレオシリン遺伝子における追加の例示的な変異、及びステレオシリンをコードする核酸を配列決定する方法は、例えば、Ｖｅｒｐｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４５６：２５５−２５９，２００８、Ｖｅｒｐｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｓ．Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５１９：１９４−２１０，２０１１、Ｈｏｆｒｉｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８７：４９−５５，２０１５、及びＭａｎｄｅｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  １６：６３９−６４７，２０１４に記載されている。遺伝子における変異の検出方法は、当該技術分野で周知である。かかる技法の非限定的な例としては、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ＰＣＲ、配列決定法、サザンブロット法、及びノーザンブロット法が挙げられる。
【００５６】
例示的なヒト野生型ステレオシリンタンパク質は、配列番号１の配列であるか、またはそれを含む。野生型ステレオシリンタンパク質をコードする核酸の非限定的な例は、配列番号２及び配列番号３であるか、またはそれを含む。当該技術分野で理解され得るように、配列番号２におけるコドンの少なくともいくつかまたは全ては、非ヒト哺乳動物またはヒトにおける最適な発現を可能にするようにコドン最適化され得る。
【００５７】
本明細書に記載される組成物のうちのいずれかの一部の実施形態では、ステレオシリンタンパク質は、配列番号１または配列番号１１と少なくとも７５％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一である配列を含む。一部の実施形態では、ステレオシリンタンパク質は、それが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸置換及び／または欠失を含むことを除いて、配列番号１と同一である配列を含み得る。
【００５８】
ヒト完全長野生型ステレオシリンタンパク質（配列番号１）（シグナル配列は太字で示される）
【化１】
2021530227.tif 000003
【００５９】
ヒトステレオシリンシグナル配列（配列番号１０）
【化２】
2021530227.tif 000004
【００６０】
ヒト完全長野生型ステレオシリンタンパク質（シグナル配列は太字）（配列番号１１）
【化３】
2021530227.tif 000005
【００６１】
ヒト野生型ステレオシリンｃＤＮＡ（配列番号２）
【化４】
2021530227.tif 000006
【化５】
2021530227.tif 000007
【化６】
2021530227.tif 000008
【００６２】
ヒト野生型ステレオシリンｃＤＮＡ−コドン最適化済み（配列番号３）
【化７】
2021530227.tif 000009
【化８】
2021530227.tif 000010
【化９】
2021530227.tif 000011
【００６３】
ヒト野生型ステレオシリンゲノムＤＮＡ配列の非限定的な例は、配列番号４である。配列番号４におけるエクソンは、ヌクレオチド１〜１４２位（エクソン１）、ヌクレオチド４４５〜１２３０位（エクソン２）、ヌクレオチド１３１９〜１３４３位（エクソン３）、ヌクレオチド２１１１〜３３６８位（エクソン４）、ヌクレオチド４３２５〜４３８７位（エクソン５）、ヌクレオチド４４８９〜４６０５位（エクソン６）、ヌクレオチド４７４８〜４９１４位（エクソン７）、ヌクレオチド５５７０〜５７５６位（エクソン８）、ヌクレオチド５８９５〜６０１０位（エクソン９）、ヌクレオチド６２９２〜６４２４位（エクソン１０）、ヌクレオチド６７７７〜６９５９位（エクソン１１）、ヌクレオチド７２６４〜７３０２位（エクソン１２）、ヌクレオチド７４８６〜７６５３位（エクソン１３）、ヌクレオチド７８１７〜７８８２位（エクソン１４）、ヌクレオチド８３６４〜８４８９位（エクソン１５）、ヌクレオチド９４６７〜９５２５位（エクソン１６）、ヌクレオチド１０５９８〜１０７２１位（エクソン１７）、ヌクレオチド１０８２６〜１０９３８位（エクソン１８）、ヌクレオチド１３４０２〜１３５３７位（エクソン１９）、ヌクレオチド１３９５５〜１４１５１位（エクソン２０）、ヌクレオチド１４３５０〜１４４４０位（エクソン２１）、ヌクレオチド１４６４９〜１４８０５位（エクソン２２）、ヌクレオチド１５３９０〜１５５５９位（エクソン２３）、ヌクレオチド１７２５０〜１７４０５位（エクソン２４）、ヌクレオチド１７７８７〜１７９２９位（エクソン２５）、ヌクレオチド１８１１９〜１８２６７位（エクソン２６）、ヌクレオチド１８５０９〜１８６０５位（エクソン２７）、ヌクレオチド１８６９４〜１８８４１位（エクソン２８）、及びヌクレオチド１９０４１〜１９２３８位（エクソン２９）である。イントロンは、配列番号４におけるこれらのエクソンの各々の間、すなわち、ヌクレオチド１４３〜４４４位（イントロン１）、ヌクレオチド１２３１〜１３１８位（イントロン２）、ヌクレオチド１３４４〜２１１０位（イントロン３）、ヌクレオチド３３６９〜４３２４位（イントロン４）、ヌクレオチド４３８８〜４４８８位（イントロン５）、ヌクレオチド４６０６〜４７４７位（イントロン６）、ヌクレオチド４９１５〜５５６９位（イントロン７）、ヌクレオチド５７５７〜５８９４位（イントロン８）、ヌクレオチド６０１１〜６２９１位（イントロン９）、ヌクレオチド６４２５〜６７７６位（イントロン１０）、ヌクレオチド６９６０〜７２６３位（イントロン１１）、ヌクレオチド７３０３〜７４８５位（イントロン１２）、ヌクレオチド７６５４〜７８１６位（イントロン１３）、ヌクレオチド７８８３〜８３６３位（イントロン１４）、ヌクレオチド８４９０〜９４６６位（イントロン１５）、ヌクレオチド９５２６〜１０５９７位（イントロン１６）、ヌクレオチド１０７２２〜１０８２５位（イントロン１７）、ヌクレオチド１０９３９〜１３４０１位（イントロン１８）、ヌクレオチド１３５３８〜１３９５４位（イントロン１９）、ヌクレオチド１４１５２〜１４３４９位（イントロン２０）、ヌクレオチド１４４４１〜１４６４８位（イントロン２１）、ヌクレオチド１４８０６〜１５３８９位（イントロン２２）、ヌクレオチド１５５６０〜１７２４９位（イントロン２３）、ヌクレオチド１７４０６〜１７７８６位（イントロン２４）、ヌクレオチド１７９３０〜１８１１８位（イントロン２５）、ヌクレオチド１８２６８〜１８５０８位（イントロン２６）、ヌクレオチド１８６０６〜１８６９３位（イントロン２７）、及びヌクレオチド１８８４２〜１９０４０位（イントロン２８）に位置する。
【００６４】
ヒト野生型ステレオシリン遺伝子（配列番号４）
【化１０】
2021530227.tif 000012
【化１１】
2021530227.tif 000013
【化１２】
2021530227.tif 000014
【化１３】
2021530227.tif 000015
【化１４】
2021530227.tif 000016
【化１５】
2021530227.tif 000017
【化１６】
2021530227.tif 000018
【化１７】
2021530227.tif 000019
【００６５】
ヒトＳＴＲＣ偽遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号５に示される。
【００６６】
ヒトステレオシリン偽遺伝子１（ＳＴＲＣＰ１）（配列番号５）
【化１８】
2021530227.tif 000020
【化１９】
2021530227.tif 000021
【化２０】
2021530227.tif 000022
【化２１】
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【化２２】
2021530227.tif 000024
【化２３】
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【化２４】
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【化２５】
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【化２６】
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【００６７】
一部の実施形態では、ステレオシリンは、配列番号８または配列番号９と少なくとも７０％、少なくとも７２％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７８％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列によってコードされ得る。
【００６８】
当業者であれば、異なる種由来の同じタンパク質の間で保存されていないアミノ酸の変異が、タンパク質の機能に影響を有する可能性が低く、したがって、これらのアミノ酸を変異のために選択するべきであることを理解しよう。異なる種由来の同じタンパク質の間で保存されているアミノ酸は、これらの変異がタンパク質の機能の変化をもたらす可能性が高いため、変異させるべきではない。他の哺乳類種由来のステレオシリンの非限定的な例が下記に示される。
【００６９】
マウスステレオシリンタンパク質（配列番号８）
【化２７】
2021530227.tif 000029
【化２８】
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【００７０】
イヌステレオシリンタンパク質（配列番号９）
【化２９】
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【化３０】
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【００７１】
ベクター
本明細書に提供される組成物は、少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ）の核酸ベクターを含み、ここで、該少なくとも２つの異なるベクターの各々は、ステレオシリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、該コードされた部分の各々は、少なくとも３０アミノ酸（例えば、約３０アミノ酸〜約１６００アミノ酸、約３０アミノ酸〜約１５５０アミノ酸、約３０アミノ酸〜約１５００アミノ酸、約３０アミノ酸〜約１４５０アミノ酸、約３０アミノ酸〜約１４００アミノ酸、約３０アミノ酸〜約１３５０アミノ酸、約３０アミノ酸〜約１３００アミノ酸、約３０アミノ酸〜約１２５０アミノ酸、約３０アミノ酸〜約１２００アミノ酸、約３０アミノ酸〜約１１５０アミノ酸、約３０アミノ酸〜約１１００アミノ酸、約３０アミノ酸〜約１０５０アミノ酸、約３０アミノ酸〜約１０００アミノ酸、約３０アミノ酸〜約９５０アミノ酸、約３０アミノ酸〜約９００アミノ酸、約３０アミノ酸〜約８５０アミノ酸、約３０アミノ酸〜約８００アミノ酸、約３０アミノ酸〜約７５０アミノ酸、約３０アミノ酸〜約７００アミノ酸、約３０アミノ酸〜約６５０アミノ酸、約３０アミノ酸〜約６００アミノ酸、約３０アミノ酸〜約５５０アミノ酸、約３０アミノ酸〜約５００アミノ酸、約３０アミノ酸〜約４５０アミノ酸、約３０アミノ酸〜約４００アミノ酸、約３０アミノ酸〜約３５０アミノ酸、約３０アミノ酸〜約３００アミノ酸、約３０アミノ酸〜約２５０アミノ酸、約３０アミノ酸〜約２００アミノ酸、約３０アミノ酸〜約１５０アミノ酸、約３０アミノ酸〜約１００アミノ酸、約３０アミノ酸〜約５０アミノ酸、約５０アミノ酸〜約１６００アミノ酸、約５０アミノ酸〜約１５５０アミノ酸、約５０アミノ酸〜約１５００アミノ酸、約５０アミノ酸〜約１４５０アミノ酸、約５０アミノ酸〜約１４００アミノ酸、約５０アミノ酸〜約１３５０アミノ酸、約５０アミノ酸〜約１３００アミノ酸、約５０アミノ酸〜約１２５０アミノ酸、約５０アミノ酸〜約１２００アミノ酸、約５０アミノ酸〜約１１５０アミノ酸、約５０アミノ酸〜約１１００アミノ酸、約５０アミノ酸〜約１０５０アミノ酸、約５０アミノ酸〜約１０００アミノ酸、約５０アミノ酸〜約９５０アミノ酸、約５０アミノ酸〜約９００アミノ酸、約５０アミノ酸〜約８５０アミノ酸、約５０アミノ酸〜約８００アミノ酸、約５０アミノ酸〜約７５０アミノ酸、約５０アミノ酸〜約７００アミノ酸、約５０アミノ酸〜約６５０アミノ酸、約５０アミノ酸〜約６００アミノ酸、約５０アミノ酸〜約５５０アミノ酸、約５０アミノ酸〜約５００アミノ酸、約５０アミノ酸〜約４５０アミノ酸、約５０アミノ酸〜約４００アミノ酸、約５０アミノ酸〜約３５０アミノ酸、約５０アミノ酸〜約３００アミノ酸、約５０アミノ酸〜約２５０アミノ酸、約５０アミノ酸〜約２００アミノ酸、約５０アミノ酸〜約１５０アミノ酸、約５０アミノ酸〜約１００アミノ酸、約１００アミノ酸〜約１６００アミノ酸、約１００アミノ酸〜約１５５０アミノ酸、約１００アミノ酸〜約１５００アミノ酸、約１００アミノ酸〜約１４５０アミノ酸、約１００アミノ酸〜約１４００アミノ酸、約１００アミノ酸〜約１３５０アミノ酸、約１００アミノ酸〜約１３００アミノ酸、約１００アミノ酸〜約１２５０アミノ酸、約１００アミノ酸〜約１２００アミノ酸、約１００アミノ酸〜約１１５０アミノ酸、約１００アミノ酸〜約１１００アミノ酸、約１００アミノ酸〜約１０５０アミノ酸、約１００アミノ酸〜約１０００アミノ酸、約１００アミノ酸〜約９５０アミノ酸、約１００アミノ酸〜約９００アミノ酸、約１００アミノ酸〜約８５０アミノ酸、約１００アミノ酸〜約８００アミノ酸、約１００アミノ酸〜約７５０アミノ酸、約１００アミノ酸〜約７００アミノ酸、約１００アミノ酸〜約６５０アミノ酸、約１００アミノ酸〜約６００アミノ酸、約１００アミノ酸〜約５５０アミノ酸、約１００アミノ酸〜約５００アミノ酸、約１００アミノ酸〜約４５０アミノ酸、約１００アミノ酸〜約４００アミノ酸、約１００アミノ酸〜約３５０アミノ酸、約１００アミノ酸〜約３００アミノ酸、約１００アミノ酸〜約２５０アミノ酸、約１００アミノ酸〜約２００アミノ酸、約１００アミノ酸〜約１５０アミノ酸、約１５０アミノ酸〜約１６００アミノ酸、約１５０アミノ酸〜約１５５０アミノ酸、約１５０アミノ酸〜約１５００アミノ酸、約１５０アミノ酸〜約１４５０アミノ酸、約１５０アミノ酸〜約１４００アミノ酸、約１５０アミノ酸〜約１３５０アミノ酸、約１５０アミノ酸〜約１３００アミノ酸、約１５０アミノ酸〜約１２５０アミノ酸、約１５０アミノ酸〜約１２００アミノ酸、約１５０アミノ酸〜約１１５０アミノ酸、約１５０アミノ酸〜約１１００アミノ酸、約１５０アミノ酸〜約１０５０アミノ酸、約１５０アミノ酸〜約１０００アミノ酸、約１５０アミノ酸〜約９５０アミノ酸、約１５０アミノ酸〜約９００アミノ酸、約１５０アミノ酸〜約８５０アミノ酸、約１５０アミノ酸〜約８００アミノ酸、約１５０アミノ酸〜約７５０アミノ酸、約１５０アミノ酸〜約７００アミノ酸、約１５０アミノ酸〜約６５０アミノ酸、約１５０アミノ酸〜約６００アミノ酸、約１５０アミノ酸〜約５５０アミノ酸、約１５０アミノ酸〜約５００アミノ酸、約１５０アミノ酸〜約４５０アミノ酸、約１５０アミノ酸〜約４００アミノ酸、約１５０アミノ酸〜約３５０アミノ酸、約１５０アミノ酸〜約３００アミノ酸、約１５０アミノ酸〜約２５０アミノ酸、約１５０アミノ酸〜約２００アミノ酸、約２００アミノ酸〜約１６００アミノ酸、約２００アミノ酸〜約１５５０アミノ酸、約２００アミノ酸〜約１５００アミノ酸、約２００アミノ酸〜約１４５０アミノ酸、約２００アミノ酸〜約１４００アミノ酸、約２００アミノ酸〜約１３５０アミノ酸、約２００アミノ酸〜約１３００アミノ酸、約２００アミノ酸〜約１２５０アミノ酸、約２００アミノ酸〜約１２００アミノ酸、約２００アミノ酸〜約１１５０アミノ酸、約２００アミノ酸〜約１１００アミノ酸、約２００アミノ酸〜約１０５０アミノ酸、約２００アミノ酸〜約１０００アミノ酸、約２００アミノ酸〜約９５０アミノ酸、約２００アミノ酸〜約９００アミノ酸、約２００アミノ酸〜約８５０アミノ酸、約２００アミノ酸〜約８００アミノ酸、約２００アミノ酸〜約７５０アミノ酸、約２００アミノ酸〜約７００アミノ酸、約２００アミノ酸〜約６５０アミノ酸、約２００アミノ酸〜約６００アミノ酸、約２００アミノ酸〜約５５０アミノ酸、約２００アミノ酸〜約５００アミノ酸、約２００アミノ酸〜約４５０アミノ酸、約２００アミノ酸〜約４００アミノ酸、約２００アミノ酸〜約３５０アミノ酸、約２００アミノ酸〜約３００アミノ酸、約２００アミノ酸〜約２５０アミノ酸、約２５０アミノ酸〜約１６００アミノ酸、約２５０アミノ酸〜約１５５０アミノ酸、約２５０アミノ酸〜約１５００アミノ酸、約２５０アミノ酸〜約１４５０アミノ酸、約２５０アミノ酸〜約１４００アミノ酸、約２５０アミノ酸〜約１３５０アミノ酸、約２５０アミノ酸〜約１３００アミノ酸、約２５０アミノ酸〜約１２５０アミノ酸、約２５０アミノ酸〜約１２００アミノ酸、約２５０アミノ酸〜約１１５０アミノ酸、約２５０アミノ酸〜約１１００アミノ酸、約２５０アミノ酸〜約１０５０アミノ酸、約２５０アミノ酸〜約１０００アミノ酸、約２５０アミノ酸〜約９５０アミノ酸、約２５０アミノ酸〜約９００アミノ酸、約２５０アミノ酸〜約８５０アミノ酸、約２５０アミノ酸〜約８００アミノ酸、約２５０アミノ酸〜約７５０アミノ酸、約２５０アミノ酸〜約７００アミノ酸、約２５０アミノ酸〜約６５０アミノ酸、約２５０アミノ酸〜約６００アミノ酸、約２５０アミノ酸〜約５５０アミノ酸、約２５０アミノ酸〜約５００アミノ酸、約２５０アミノ酸〜約４５０アミノ酸、約２５０アミノ酸〜約４００アミノ酸、約２５０アミノ酸〜約３５０アミノ酸、約２５０アミノ酸〜約３００アミノ酸、約３００アミノ酸〜約１６００アミノ酸、約３００アミノ酸〜約１５５０アミノ酸、約３００アミノ酸〜約１５００アミノ酸、約３００アミノ酸〜約１４５０アミノ酸、約３００アミノ酸〜約１４００アミノ酸、約３００アミノ酸〜約１３５０アミノ酸、約３００アミノ酸〜約１３００アミノ酸、約３００アミノ酸〜約１２５０アミノ酸、約３００アミノ酸〜約１２００アミノ酸、約３００アミノ酸〜約１１５０アミノ酸、約３００アミノ酸〜約１１００アミノ酸、約３００アミノ酸〜約１０５０アミノ酸、約３００アミノ酸〜約１０００アミノ酸、約３００アミノ酸〜約９５０アミノ酸、約３００アミノ酸〜約９００アミノ酸、約３００アミノ酸〜約８５０アミノ酸、約３００アミノ酸〜約８００アミノ酸、約３００アミノ酸〜約７５０アミノ酸、約３００アミノ酸〜約７００アミノ酸、約３００アミノ酸〜約６５０アミノ酸、約３００アミノ酸〜約６００アミノ酸、約３００アミノ酸〜約５５０アミノ酸、約３００アミノ酸〜約５００アミノ酸、約３００アミノ酸〜約４５０アミノ酸、約３００アミノ酸〜約４００アミノ酸、約３００アミノ酸〜約３５０アミノ酸、約３５０アミノ酸〜約１６００アミノ酸、約３５０アミノ酸〜約１５５０アミノ酸、約３５０アミノ酸〜約１５００アミノ酸、約３５０アミノ酸〜約１４５０アミノ酸、約３５０アミノ酸〜約１４００アミノ酸、約３５０アミノ酸〜約１３５０アミノ酸、約３５０アミノ酸〜約１３００アミノ酸、約３５０アミノ酸〜約１２５０アミノ酸、約３５０アミノ酸〜約１２００アミノ酸、約３５０アミノ酸〜約１１５０アミノ酸、約３５０アミノ酸〜約１１００アミノ酸、約３５０アミノ酸〜約１０５０アミノ酸、約３５０アミノ酸〜約１０００アミノ酸、約３５０アミノ酸〜約９５０アミノ酸、約３５０アミノ酸〜約９００アミノ酸、約３５０アミノ酸〜約８５０アミノ酸、約３５０アミノ酸〜約８００アミノ酸、約３５０アミノ酸〜約７５０アミノ酸、約３５０アミノ酸〜約７００アミノ酸、約３５０アミノ酸〜約６５０アミノ酸、約３５０アミノ酸〜約６００アミノ酸、約３５０アミノ酸〜約５５０アミノ酸、約３５０アミノ酸〜約５００アミノ酸、約３５０アミノ酸〜約４５０アミノ酸、約３５０アミノ酸〜約４００アミノ酸、約４００アミノ酸〜約１６００アミノ酸、約４００アミノ酸〜約１５５０アミノ酸、約４００アミノ酸〜約１５００アミノ酸、約４００アミノ酸〜約１４５０アミノ酸、約４００アミノ酸〜約１４００アミノ酸、約４００アミノ酸〜約１３５０アミノ酸、約４００アミノ酸〜約１３００アミノ酸、約４００アミノ酸〜約１２５０アミノ酸、約４００アミノ酸〜約１２００アミノ酸、約４００アミノ酸〜約１１５０アミノ酸、約４００アミノ酸〜約１１００アミノ酸、約４００アミノ酸〜約１０５０アミノ酸、約４００アミノ酸〜約１０００アミノ酸、約４００アミノ酸〜約９５０アミノ酸、約４００アミノ酸〜約９００アミノ酸、約４００アミノ酸〜約８５０アミノ酸、約４００アミノ酸〜約８００アミノ酸、約４００アミノ酸〜約７５０アミノ酸、約４００アミノ酸〜約７００アミノ酸、約４００アミノ酸〜約６５０アミノ酸、約４００アミノ酸〜約６００アミノ酸、約４００アミノ酸〜約５５０アミノ酸、約４００アミノ酸〜約５００アミノ酸、約４００アミノ酸〜約４５０アミノ酸、約４５０アミノ酸〜約１６００アミノ酸、約４５０アミノ酸〜約１５５０アミノ酸、約４５０アミノ酸〜約１５００アミノ酸、約４５０アミノ酸〜約１４５０アミノ酸、約４５０アミノ酸〜約１４００アミノ酸、約４５０アミノ酸〜約１３５０アミノ酸、約４５０アミノ酸〜約１３００アミノ酸、約４５０アミノ酸〜約１２５０アミノ酸、約４５０アミノ酸〜約１２００アミノ酸、約４５０アミノ酸〜約１１５０アミノ酸、約４５０アミノ酸〜約１１００アミノ酸、約４５０アミノ酸〜約１０５０アミノ酸、約４５０アミノ酸〜約１０００アミノ酸、約４５０アミノ酸〜約９５０アミノ酸、約４５０アミノ酸〜約９００アミノ酸、約４５０アミノ酸〜約８５０アミノ酸、約４５０アミノ酸〜約８００アミノ酸、約４５０アミノ酸〜約７５０アミノ酸、約４５０アミノ酸〜約７００アミノ酸、約４５０アミノ酸〜約６５０アミノ酸、約４５０アミノ酸〜約６００ア
ミノ酸、約４５０アミノ酸〜約５５０アミノ酸、約４５０アミノ酸〜約５００アミノ酸、約５００アミノ酸〜約１６００アミノ酸、約５００アミノ酸〜約１５５０アミノ酸、約５００アミノ酸〜約１５００アミノ酸、約５００アミノ酸〜約１４５０アミノ酸、約５００アミノ酸〜約１４００アミノ酸、約５００アミノ酸〜約１３５０アミノ酸、約５００アミノ酸〜約１３００アミノ酸、約５００アミノ酸〜約１２５０アミノ酸、約５００アミノ酸〜約１２００アミノ酸、約５００アミノ酸〜約１１５０アミノ酸、約５００アミノ酸〜約１１００アミノ酸、約５００アミノ酸〜約１０５０アミノ酸、約５００アミノ酸〜約１０００アミノ酸、約５００アミノ酸〜約９５０アミノ酸、約５００アミノ酸〜約９００アミノ酸、約５００アミノ酸〜約８５０アミノ酸、約５００アミノ酸〜約８００アミノ酸、約５００アミノ酸〜約７５０アミノ酸、約５００アミノ酸〜約７００アミノ酸、約５００アミノ酸〜約６５０アミノ酸、約５００アミノ酸〜約６００アミノ酸、約５００アミノ酸〜約５５０アミノ酸、約５５０アミノ酸〜約１６００アミノ酸、約５５０アミノ酸〜約１５５０アミノ酸、約５５０アミノ酸〜約１５００アミノ酸、約５５０アミノ酸〜約１４５０アミノ酸、約５５０アミノ酸〜約１４００アミノ酸、約５５０アミノ酸〜約１３５０アミノ酸、約５５０アミノ酸〜約１３００アミノ酸、約５５０アミノ酸〜約１２５０アミノ酸、約５５０アミノ酸〜約１２００アミノ酸、約５５０アミノ酸〜約１１５０アミノ酸、約５５０アミノ酸〜約１１００アミノ酸、約５５０アミノ酸〜約１０５０アミノ酸、約５５０アミノ酸〜約１０００アミノ酸、約５５０アミノ酸〜約９５０アミノ酸、約５５０アミノ酸〜約９００アミノ酸、約５５０アミノ酸〜約８５０アミノ酸、約５５０アミノ酸〜約８００アミノ酸、約５５０アミノ酸〜約７５０アミノ酸、約５５０アミノ酸〜約７００アミノ酸、約５５０アミノ酸〜約６５０アミノ酸、約５５０アミノ酸〜約６００アミノ酸、約６００アミノ酸〜約１６００アミノ酸、約６００アミノ酸〜約１５５０アミノ酸、約６００アミノ酸〜約１５００アミノ酸、約６００アミノ酸〜約１４５０アミノ酸、約６００アミノ酸〜約１４００アミノ酸、約６００アミノ酸〜約１３５０アミノ酸、約６００アミノ酸〜約１３００アミノ酸、約６００アミノ酸〜約１２５０アミノ酸、約６００アミノ酸〜約１２００アミノ酸、約６００アミノ酸〜約１１５０アミノ酸、約６００アミノ酸〜約１１００アミノ酸、約６００アミノ酸〜約１０５０アミノ酸、約６００アミノ酸〜約１０００アミノ酸、約６００アミノ酸〜約９５０アミノ酸、約６００アミノ酸〜約９００アミノ酸、約６００アミノ酸〜約８５０アミノ酸、約６００アミノ酸〜約８００アミノ酸、約６００アミノ酸〜約７５０アミノ酸、約６００アミノ酸〜約７００アミノ酸、約６００アミノ酸〜約６５０アミノ酸、約６５０アミノ酸〜約１６００アミノ酸、約６５０アミノ酸〜約１５５０アミノ酸、約６５０アミノ酸〜約１５００アミノ酸、約６５０アミノ酸〜約１４５０アミノ酸、約６５０アミノ酸〜約１４００アミノ酸、約６５０アミノ酸〜約１３５０アミノ酸、約６５０アミノ酸〜約１３００アミノ酸、約６５０アミノ酸〜約１２５０アミノ酸、約６５０アミノ酸〜約１２００アミノ酸、約６５０アミノ酸〜約１１５０アミノ酸、約６５０アミノ酸〜約１１００アミノ酸、約６５０アミノ酸〜約１０５０アミノ酸、約６５０アミノ酸〜約１０００アミノ酸、約６５０アミノ酸〜約９５０アミノ酸、約６５０アミノ酸〜約９００アミノ酸、約６５０アミノ酸〜約８５０アミノ酸、約６５０アミノ酸〜約８００アミノ酸、約６５０アミノ酸〜約７５０アミノ酸、約６５０アミノ酸〜約７００アミノ酸、約７００アミノ酸〜約１６００アミノ酸、約７００アミノ酸〜約１５５０アミノ酸、約７００アミノ酸〜約１５００アミノ酸、約７００アミノ酸〜約１４５０アミノ酸、約７００アミノ酸〜約１４００アミノ酸、約７００アミノ酸〜約１３５０アミノ酸、約７００アミノ酸〜約１３００アミノ酸、約７００アミノ酸〜約１２５０アミノ酸、約７００アミノ酸〜約１２００アミノ酸、約７００アミノ酸〜約１１５０アミノ酸、約７００アミノ酸〜約１１００アミノ酸、約７００アミノ酸〜約１０５０アミノ酸、約７００アミノ酸〜約１０００アミノ酸、約７００アミノ酸〜約９５０アミノ酸、約７００アミノ酸〜約９００アミノ酸、約７００アミノ酸〜約８５０アミノ酸、約７００アミノ酸〜約８００アミノ酸、約７００アミノ酸〜約７５０アミノ酸、約７５０アミノ酸〜約１６００アミノ酸、約７５０アミノ酸〜約１５５０アミノ酸、約７５０アミノ酸〜約１５００アミノ酸、約７５０アミノ酸〜約１４５０アミノ酸、約７５０アミノ酸〜約１４００アミノ酸、約７５０アミノ酸〜約１３５０アミノ酸、約７５０アミノ酸〜約１２５０アミノ酸、約７５０アミノ酸〜約１２００アミノ酸、約７５０アミノ酸〜約１１５０アミノ酸、約７５０アミノ酸〜約１１００アミノ酸、約７５０アミノ酸〜約１０５０アミノ酸、約７５０アミノ酸〜約１０００アミノ酸、約７５０アミノ酸〜約９５０アミノ酸、約７５０アミノ酸〜約９００アミノ酸、約７５０アミノ酸〜約８５０アミノ酸、約７５０アミノ酸〜約８００アミノ酸、約８００アミノ酸〜約１６００アミノ酸、約８００アミノ酸〜約１５５０アミノ酸、約８００アミノ酸〜約１５００アミノ酸、約８００アミノ酸〜約１４５０アミノ酸、約８００アミノ酸〜約１４００アミノ酸、約８００アミノ酸〜約１３５０アミノ酸、約８００アミノ酸〜約１３００アミノ酸、約８００アミノ酸〜約１２５０アミノ酸、約８００アミノ酸〜約１２００アミノ酸、約８００アミノ酸〜約１１５０アミノ酸、約８００アミノ酸〜約１１００アミノ酸、約８００アミノ酸〜約１０５０アミノ酸、約８００アミノ酸〜約１０００アミノ酸、約８００アミノ酸〜約９５０アミノ酸、約８００アミノ酸〜約９００アミノ酸、約８００アミノ酸〜約８５０アミノ酸、約８５０アミノ酸〜約１６００アミノ酸、約８５０アミノ酸〜約１５５０アミノ酸、約８５０アミノ酸〜約１５００アミノ酸、約８５０アミノ酸〜約１４５０アミノ酸、約８５０アミノ酸〜約１４００アミノ酸、約８５０アミノ酸〜約１３５０アミノ酸、約８５０アミノ酸〜約１３００アミノ酸、約８５０アミノ酸〜約１２５０アミノ酸、約８５０アミノ酸〜約１２００アミノ酸、約８５０アミノ酸〜約１１５０アミノ酸、約８５０アミノ酸〜約１１００アミノ酸、約８５０アミノ酸〜約１０５０アミノ酸、約８５０アミノ酸〜約１０００アミノ酸、約８５０アミノ酸〜約９５０アミノ酸、約８５０アミノ酸〜約９００アミノ酸、約９００アミノ酸〜約１６００アミノ酸、約９００アミノ酸〜約１５５０アミノ酸、約９００アミノ酸〜約１５００アミノ酸、約９００アミノ酸〜約１４５０アミノ酸、約９００アミノ酸〜約１４００アミノ酸、約９００アミノ酸〜約１３５０アミノ酸、約９００アミノ酸〜約１３００アミノ酸、約９００アミノ酸〜約１２５０アミノ酸、約９００アミノ酸〜約１２００アミノ酸、約９００アミノ酸〜約１１５０アミノ酸、約９００アミノ酸〜約１１００アミノ酸、約９００アミノ酸〜約１０５０アミノ酸、約９００アミノ酸〜約１０００アミノ酸、約９００アミノ酸〜約９５０アミノ酸、約９５０アミノ酸〜約１６００アミノ酸、約９５０アミノ酸〜約１５５０アミノ酸、約９５０アミノ酸〜約１５００アミノ酸、約９５０アミノ酸〜約１４５０アミノ酸、約９５０アミノ酸〜約１４００アミノ酸、約９５０アミノ酸〜約１３５０アミノ酸、約９５０アミノ酸〜約１３００アミノ酸、約９５０アミノ酸〜約１２５０アミノ酸、約９５０アミノ酸〜約１２００アミノ酸、約９５０アミノ酸〜約１１５０アミノ酸、約９５０アミノ酸〜約１１００アミノ酸、約９５０アミノ酸〜約１０５０アミノ酸、約９５０アミノ酸〜約１０００アミノ酸、約１０００アミノ酸〜約１６００アミノ酸、約１０００アミノ酸〜約１５５０アミノ酸、約１０００アミノ酸〜約１５００アミノ酸、約１０００アミノ酸〜約１４５０アミノ酸、約１０００アミノ酸〜約１４００アミノ酸、約１０００アミノ酸〜約１３５０アミノ酸、約１０００アミノ酸〜約１３００アミノ酸、約１０００アミノ酸〜約１２５０アミノ酸、約１０００アミノ酸〜約１２００アミノ酸、約１０００アミノ酸〜約１１５０アミノ酸、約１０００アミノ酸〜約１１００アミノ酸、約１０００アミノ酸〜約１０５０アミノ酸、約１０５０アミノ酸〜約１６００アミノ酸、約１０５０アミノ酸〜約１５５０アミノ酸、約１０５０アミノ酸〜約１５００アミノ酸、約１０５０アミノ酸〜約１４５０アミノ酸、約１０５０アミノ酸〜約１４００アミノ酸、約１０５０アミノ酸〜約１３５０アミノ酸、約１０５０アミノ酸〜約１３００アミノ酸、約１０５０アミノ酸〜約１２５０アミノ酸、約１０５０アミノ酸〜約１２００アミノ酸、約１０５０アミノ酸〜約１１５０アミノ酸、約１０５０アミノ酸〜約１１００アミノ酸、約１１００アミノ酸〜約１６００アミノ酸、約１１００アミノ酸〜約１５５０アミノ酸、約１１００アミノ酸〜約１５００アミノ酸、約１１００アミノ酸〜約１４５０アミノ酸、約１１００アミノ酸〜約１４００アミノ酸、約１１００アミノ酸〜約１３５０アミノ酸、約１１００アミノ酸〜約１３００アミノ酸、約１１００アミノ酸〜約１２５０アミノ酸、約１１００アミノ酸〜約１２００アミノ酸、約１１００アミノ酸〜約１１５０アミノ酸、約１１５０アミノ酸〜約１６００アミノ酸、約１１５０アミノ酸〜約１５５０アミノ酸、約１１５０アミノ酸〜約１５００アミノ酸、約１１５０アミノ酸〜約１４５０アミノ酸、約１１５０アミノ酸〜約１４００アミノ酸、約１１５０アミノ酸〜約１３５０アミノ酸、約１１５０アミノ酸〜約１３００アミノ酸、約１１５０アミノ酸〜約１２５０アミノ酸、約１１５０アミノ酸〜約１２００アミノ酸、約１２００アミノ酸〜約１６００アミノ酸、約１２００アミノ酸〜約１５５０アミノ酸、約１２００アミノ酸〜約１５００アミノ酸、約１２００アミノ酸〜約１４５０アミノ酸、約１２００アミノ酸〜約１４００アミノ酸、約１２００アミノ酸〜約１３５０アミノ酸、約１２００アミノ酸〜約１３００アミノ酸、約１２００アミノ酸〜約１２５０アミノ酸、約１２５０アミノ酸〜約１６００アミノ酸、約１２５０アミノ酸〜約１５５０アミノ酸、約１２５０アミノ酸〜約１５００アミノ酸、約１２５０アミノ酸〜約１４５０アミノ酸、約１２５０アミノ酸〜約１４００アミノ酸、約１２５０アミノ酸〜約１３５０アミノ酸、約１２５０アミノ酸〜約１３００アミノ酸、約１３００アミノ酸〜約１６００アミノ酸、約１３００アミノ酸〜約１５５０アミノ酸、約１３００アミノ酸〜約１５００アミノ酸、約１３００アミノ酸〜約１４５０アミノ酸、約１３００アミノ酸〜約１４００アミノ酸、約１３００アミノ酸〜約１３５０アミノ酸、約１３５０アミノ酸〜約１６００アミノ酸、約１３５０アミノ酸〜約１５５０アミノ酸、約１３５０アミノ酸〜約１５００アミノ酸、約１３５０アミノ酸〜約１４５０アミノ酸、約１３５０アミノ酸〜約１４００アミノ酸、約１４００アミノ酸〜約１６００アミノ酸、約１４００アミノ酸〜約１５５０アミノ酸、約１４００アミノ酸〜約１５００アミノ酸、約１４００アミノ酸〜約１４５０アミノ酸、約１４５０アミノ酸〜約１６００アミノ酸、約１４５０アミノ酸〜約１５５０アミノ酸、約１４５０アミノ酸〜約１５００アミノ酸、約１５００アミノ酸〜約１６００アミノ酸、約１５００アミノ酸〜約１５５０アミノ酸、または約１５５０アミノ酸〜約１６００アミノ酸）であり、該コードされた部分の各々のアミノ酸配列は任意選択で、該コードされた部分のうちの異なる部分のアミノ酸配列と部分的に重複してもよく、該少なくとも２つの異なるベクターのうちのいずれの単一のベクターも、活性ステレオシリンタンパク質（例えば、完全長ステレオシリンタンパク質（例えば、完全長野生型ステレオシリンタンパク質））をコードしておらず、染色体ＤＮＡを含有する哺乳類細胞に導入されるとき、該少なくとも２つの異なるベクターは互いに、かつ該細胞の染色体ＤＮＡと相同組換えを経て、それによって、該染色体ＤＮＡに挿入され
た組換え核酸が形成され、ここで、該組換え核酸は、活性ステレオシリンタンパク質（例えば、完全長ステレオシリンタンパク質）をコードする。一部の実施形態では、該核酸ベクターのうちの１つは、ステレオシリンタンパク質の一部分をコードするコード配列を含み得、ここで、該コードされた部分は、例えば、約９００アミノ酸〜約１６００アミノ酸、約９００アミノ酸〜約１５５０アミノ酸、約９００アミノ酸〜約１５００アミノ酸、約９００アミノ酸〜約１４５０アミノ酸、約９００アミノ酸〜約１４００アミノ酸、約９００アミノ酸〜約１３５０アミノ酸、約９００アミノ酸〜約１３００アミノ酸、約９００アミノ酸〜約１２５０アミノ酸、約９００アミノ酸〜約１２００アミノ酸、約９００アミノ酸〜約１１５０アミノ酸、約９００アミノ酸〜約１１００アミノ酸、約９００アミノ酸〜約１０５０アミノ酸、約９００アミノ酸〜約１０００アミノ酸、約９００アミノ酸〜約９５０アミノ酸、約９５０アミノ酸〜約１６００アミノ酸、約９５０アミノ酸〜約１５５０アミノ酸、約９５０アミノ酸〜約１５００アミノ酸、約９５０アミノ酸〜約１４５０アミノ酸、約９５０アミノ酸〜約１４００アミノ酸、約９５０アミノ酸〜約１３５０アミノ酸、約９５０アミノ酸〜約１３００アミノ酸、約９５０アミノ酸〜約１２５０アミノ酸、約９５０アミノ酸〜約１２００アミノ酸、約９５０アミノ酸〜約１１５０アミノ酸、約９５０アミノ酸〜約１１００アミノ酸、約９５０アミノ酸〜約１０５０アミノ酸、約９５０アミノ酸〜約１０００アミノ酸、約１０００アミノ酸〜約１６００アミノ酸、約１０００アミノ酸〜約１５５０アミノ酸、約１０００アミノ酸〜約１５００アミノ酸、約１０００アミノ酸〜約１４５０アミノ酸、約１０００アミノ酸〜約１４００アミノ酸、約１０００アミノ酸〜約１３５０アミノ酸、約１０００アミノ酸〜約１３００アミノ酸、約１０００アミノ酸〜約１２５０アミノ酸、約１０００アミノ酸〜約１２００アミノ酸、約１０００アミノ酸〜約１１５０アミノ酸、約１０００アミノ酸〜約１１００アミノ酸、約１０００アミノ酸〜約１０５０アミノ酸、約１０５０アミノ酸〜約１６００アミノ酸、約１０５０アミノ酸〜約１５５０アミノ酸、約１０５０アミノ酸〜約１５００アミノ酸、約１０５０アミノ酸〜約１４５０アミノ酸、約１０５０アミノ酸〜約１４００アミノ酸、約１０５０アミノ酸〜約１３５０アミノ酸、約１０５０アミノ酸〜約１３００アミノ酸、約１０５０アミノ酸〜約１２５０アミノ酸、約１０５０アミノ酸〜約１２００アミノ酸、約１０５０アミノ酸〜約１１５０アミノ酸、約１０５０アミノ酸〜約１１００アミノ酸、約１１００アミノ酸〜約１６００アミノ酸、約１１００アミノ酸〜約１５５０アミノ酸、約１１００アミノ酸〜約１５００アミノ酸、約１１００アミノ酸〜約１４５０アミノ酸、約１１００アミノ酸〜約１４００アミノ酸、約１１００アミノ酸〜約１３５０アミノ酸、約１１００アミノ酸〜約１３００アミノ酸、約１１００アミノ酸〜約１２５０アミノ酸、約１１００アミノ酸〜約１２００アミノ酸、約１１００アミノ酸〜約１１５０アミノ酸、約１１５０アミノ酸〜約１６００アミノ酸、約１１５０アミノ酸〜約１５５０アミノ酸、約１１５０アミノ酸〜約１５００アミノ酸、約１１５０アミノ酸〜約１４５０アミノ酸、約１１５０アミノ酸〜約１４００アミノ酸、約１１５０アミノ酸〜約１３５０アミノ酸、約１１５０アミノ酸〜約１３００アミノ酸、約１１５０アミノ酸〜約１２５０アミノ酸、約１１５０アミノ酸〜約１２００アミノ酸、約１２００アミノ酸〜約１６００アミノ酸、約１２００アミノ酸〜約１５５０アミノ酸、約１２００アミノ酸〜約１５００アミノ酸、約１２００アミノ酸〜約１４５０アミノ酸、約１２００アミノ酸〜約１４００アミノ酸、約１２００アミノ酸〜約１３５０アミノ酸、約１２００アミノ酸〜約１３００アミノ酸、約１２００アミノ酸〜約１２５０アミノ酸、約１２５０アミノ酸〜約１６００アミノ酸、約１２５０アミノ酸〜約１５５０アミノ酸、約１２５０アミノ酸〜約１５００アミノ酸、約１２５０アミノ酸〜約１４５０アミノ酸、約１２５０アミノ酸〜約１４００アミノ酸、約１２５０アミノ酸〜約１３５０アミノ酸、約１２５０アミノ酸〜約１３００アミノ酸、約１３００アミノ酸〜約１６００アミノ酸、約１３００アミノ酸〜約１５５０アミノ酸、約１３００アミノ酸〜約１５００アミノ酸、約１３００アミノ酸〜約１４５０アミノ酸、約１３００アミノ酸〜約１４００アミノ酸、約１３００アミノ酸〜約１３５０アミノ酸、約１３５０アミノ酸〜約１６００アミノ酸、約１３５０アミノ酸〜約１５５０アミノ酸、約１３５０アミノ酸〜約１５００アミノ酸、約１３５０アミノ酸〜約１４５０アミノ酸、約１３５０アミノ酸〜約１４００アミノ酸、約１４００アミノ酸〜約１６００アミノ酸、約１４００アミノ酸〜約１５５０アミノ酸、約１４００アミノ酸〜約１５００アミノ酸、約１４００アミノ酸〜約１４５０アミノ酸、約１４５０アミノ酸〜約１６００アミノ酸、約１４５０アミノ酸〜約１５５０アミノ酸、約１４５０アミノ酸〜約１５００アミノ酸、約１５００アミノ酸〜約１６００アミノ酸、約１５００アミノ酸〜約１５５０アミノ酸、または約１５５０アミノ酸〜約１６００アミノ酸の長さである。
【００７２】
これらの組成物の一部の実施形態では、該コード配列のうちの少なくとも１つは、ステレオシリンゲノムＤＮＡの２つの隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、該２つの隣接するエクソンの間に天然に存在するイントロン配列を欠いている。
【００７３】
一部の実施形態では、該コードされた部分のうちのいずれの部分のアミノ酸配列も、該コードされた部分のうちの異なる部分のアミノ酸配列と部分的にさえ重複していない。一部の実施形態では、該コードされた部分のうちの１つまたは複数のアミノ酸配列は、該コードされた部分のうちの異なる部分のアミノ酸配列と部分的に重複する。一部の実施形態では、該コードされた部分の各々のアミノ酸配列は、該コードされた部分のうちの異なる部分のアミノ酸配列と部分的に重複する。
【００７４】
一部の実施形態では、重複するアミノ酸配列は、約３０アミノ酸残基〜約１０００アミノ酸（例えば、または本明細書に記載されるこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）の長さである。
【００７５】
一部の例では、ベクターは、２つの異なるベクターを含み、これらの各々が、イントロンの異なるセグメントを含み、該イントロンは、ステレオシリンゲノムＤＮＡに存在するイントロンのヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載される配列番号４における例示的なイントロンのうちのいずれか）を含み、該２つの異なるセグメントは、少なくとも１００ヌクレオチド（例えば、約１００ヌクレオチド〜約５，０００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド〜約４，５００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド〜約４，０００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド〜約３，５００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド〜約３，０００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド〜約２，５００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド〜約２，０００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド〜約１，５００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド〜約１，０００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド〜約８００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド〜約６００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド〜約４００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド〜約２００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド〜約５，０００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド〜約４，５００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド〜約４，０００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド〜約３，５００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド〜約３，０００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド〜約２，５００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド〜約２，０００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド〜約１，５００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド〜約１，０００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド〜約８００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド〜約６００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド〜約４００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド〜約５，０００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド〜約４，５００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド〜約４，０００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド〜約３，５００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド〜約３，０００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド〜約２，５００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド〜約２，０００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド〜約１，５００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド〜約１，０００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド〜約８００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド〜約６００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド〜約５，０００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド〜約４，５００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド〜約４，０００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド〜約３，５００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド〜約３，０００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド〜約２，５００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド〜約２，０００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド〜約１，５００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド〜約１，０００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド〜約８００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約５，０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約４，５００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約４，０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約３，５００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約３，０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約２，５００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約２，０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約１，５００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約１，０００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約５，０００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約４，５００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約４，０００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約３，５００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約３，０００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約２，５００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約２，０００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約１，５００ヌクレオチド、約１，５００ヌクレオチド〜約５，０００ヌクレオチド、約１，５００ヌクレオチド〜約４，５００ヌクレオチド、約１，５００ヌクレオチド〜約４，０００ヌクレオチド、約１，５００ヌクレオチド〜約３，５００ヌクレオチド、約１，５００ヌクレオチド〜約３，０００ヌクレオチド、約１，５００ヌクレオチド〜約２，５００ヌクレオチド、約１，５００ヌクレオチド〜約２，０００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド〜約５，０００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド〜約４，５００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド〜約４，０００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド〜約３，５００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド〜約３，０００ヌクレオチド、約２，０００ヌクレオチド〜約２，５００ヌクレオチド、約２，５００ヌクレオチド〜約５，０００ヌクレオチド、約２，５００ヌクレオチド〜約４，５００ヌクレオチド、約２，５００ヌクレオチド〜約４，０００ヌクレオチド、約２，５００ヌクレオチド〜約３，５００ヌクレオチド、約２，５００ヌクレオチド〜約３，０００ヌクレオチド、約３，０００ヌクレオチド〜約５，０００ヌクレオチド、約３，０００ヌクレオチド〜約４，５００ヌクレオチド、約３，０００ヌクレオチド〜約４，０００ヌクレオチド、約３，０００ヌクレオチド〜約３，５００ヌクレオチド、約３，５００ヌクレオチド〜約５，０００ヌクレオチド、約３，５００ヌクレオチド〜約４，５００ヌクレオチド、約３，５００ヌクレオチド〜約４，０００ヌクレオチド、約４，０００ヌクレオチド〜約５，０００ヌクレオチド、約４，０００ヌクレオチド〜約４，５００ヌクレオチド、約４，５００ヌクレオチド〜約５，０００ヌクレオチド）の長さだけ配列が重複する。
【００７６】
該異なるベクターのうちのいずれか２つにおいて重複するヌクレオチド配列は、ステレオシリン遺伝子の１つまたは複数のエクソンの一部または全て（例えば、本明細書に記載される配列番号４における例示的なエクソンのうちのいずれか１つまたは複数）を含み得る。
【００７７】
一部の実施形態では、該組成物中の異なるベクターの数は、２つ、３つ、４つ、または５つである。組成物中の異なるベクターの数が２つである組成物中では、２つの異なるベクターのうちの第１のベクターは、ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分をコードするコード配列を含み得る。一部の例では、ステレオシリン遺伝子のＮ末端部分は、約３０アミノ酸〜約１７８０アミノ酸（または上述のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）の長さである。一部の例では、該第１のベクターは、プロモーター（例えば、本明細書に記載されるかまたは当該技術分野で既知のプロモーターのうちのいずれか）及びコザック配列（例えば、本明細書に記載されるかまたは当該技術分野で既知の例示的なコザック配列のうちのいずれか）のうちの一方または両方をさらに含む。一部の例では、該第１のベクターは、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであるプロモーターを含む。一部の例では、該２つの異なるベクターのうちの第２のベクターは、該ステレオシリンタンパク質のＣ末端部分をコードするコード配列を含む。一部の例では、該ステレオシリンタンパク質のＣ末端部分は、３０アミノ酸〜約１７８０アミノ酸（または上述のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）の長さである。一部の例では、該第２のベクターは、ポリ（Ａ）配列をさらに含む。
【００７８】
組成物中の異なるベクターの数が２つである一部の例では、該２つのベクターのうちの１つによってコードされるＮ末端部分は、野生型ステレオシリンタンパク質（例えば、配列番号１）のアミノ酸１位から、およそアミノ酸１，５００位、およそアミノ酸１，４９０位、およそアミノ酸１，４８０位、およそアミノ酸１，４７０位、およそアミノ酸１，４６０位、およそアミノ酸１，４５０位、およそアミノ酸１，４４０位、およそアミノ酸１，４３０位、およそアミノ酸１，４２０位、およそアミノ酸１，４１０位、およそアミノ酸１，４００位、およそアミノ酸１，３９０位、およそアミノ酸１，３８０位、およそアミノ酸１，３７０位、およそアミノ酸１，３６０位、およそアミノ酸１，３５０位、およそアミノ酸１，３４０位、およそアミノ酸１，３３０位、およそアミノ酸１，３２０位、およそアミノ酸１，３１０位、およそアミノ酸１，３００位、およそアミノ酸１，２９０位、およそアミノ酸１，２８０位、およそアミノ酸１，２７０位、およそアミノ酸１，２６０位、およそアミノ酸１，２５０位、およそアミノ酸１，２４０位、およそアミノ酸１，２３０位、およそアミノ酸１，２２０位、およそアミノ酸１，２１０位、およそアミノ酸１，２００位、およそアミノ酸１，１９０位、およそアミノ酸１，１８０位、およそアミノ酸１，１７０位、およそアミノ酸１，１６０位、およそアミノ酸１，１５０位、およそアミノ酸１，１４０位、およそアミノ酸１，１３０位、およそアミノ酸１，１２０位、およそアミノ酸１，１１０位、およそアミノ酸１，１００位、およそアミノ酸１，０９０位、およそアミノ酸１，０８０位、およそアミノ酸１，０７０位、およそアミノ酸１，０６０位、およそアミノ酸１，０５０位、およそアミノ酸１，０４０位、およそアミノ酸１，０３０位、およそアミノ酸１，０２０位、およそアミノ酸１，０１０位、およそアミノ酸１，０００位、およそアミノ酸９９０位、およそアミノ酸９８０位、およそアミノ酸９７０位、およそアミノ酸９６０位、およそアミノ酸９５０位、およそアミノ酸９４０位、およそアミノ酸９３０位、およそアミノ酸９２０位、およそアミノ酸９１０位、およそアミノ酸９００位、およそアミノ酸８９０位、およそアミノ酸８８０位、およそアミノ酸８７０位、およそアミノ酸８６０位、およそアミノ酸８５０位、およそアミノ酸８４０位、およそアミノ酸８３０位、およそアミノ酸８２０位、およそアミノ酸８１０位、およそアミノ酸８００位、およそアミノ酸７９０位、およそアミノ酸７８０位、およそアミノ酸７７０位、およそアミノ酸７６０位、およそアミノ酸７５０位、およそアミノ酸７４０位、およそアミノ酸７３０位、およそアミノ酸７２０位、およそアミノ酸７１０位、およそアミノ酸７００位、およそアミノ酸６９０位、およそアミノ酸６８０位、およそアミノ酸６７０位、およそアミノ酸６６０位、およそアミノ酸６５０位、およそアミノ酸６４０位、およそアミノ酸６３０位、およそアミノ酸６２０位、およそアミノ酸６１０位、およそアミノ酸６００位、およそアミノ酸５９０位、およそアミノ酸５８０位、およそアミノ酸５７０位、およそアミノ酸５６０位、およそアミノ酸５５０位、およそアミノ酸５４０位、およそアミノ酸５３０位、およそアミノ酸５２０位、およそアミノ酸５１０位、およそアミノ酸５００位、およそアミノ酸４９０位、およそアミノ酸４８０位、およそアミノ酸４７０位、およそアミノ酸４６０位、およそアミノ酸４５０位、およそアミノ酸４４０位、およそアミノ酸４３０位、およそアミノ酸４２０位、およそアミノ酸４１０位、およそアミノ酸４００位、およそアミノ酸３９０位、およそアミノ酸３８０位、およそアミノ酸３７０位、およそアミノ酸３６０位、およそアミノ酸３５０位、およそアミノ酸３４０位、およそアミノ酸３３０位、およそアミノ酸３２０位、およそアミノ酸３１０位、およそアミノ酸３００位、およそアミノ酸２９０位、およそアミノ酸２８０位、およそアミノ酸２７０位、およそアミノ酸２６０位、およそアミノ酸２５０位、およそアミノ酸２４０位、およそアミノ酸２３０位、およそアミノ酸２２０位、およそアミノ酸２１０位、およそアミノ酸２００位、およそアミノ酸１９０位、およそアミノ酸１８０位、およそアミノ酸１７０位、およそアミノ酸１６０位、およそアミノ酸１５０位、およそアミノ酸１４０位、およそアミノ酸１３０位、およそアミノ酸１２０位、およそアミノ酸１１０位、およそアミノ酸１００位、およそアミノ酸９０位、およそアミノ酸８０位、およそアミノ酸７０位、およそアミノ酸６０位、およそアミノ酸５０位、またはおよそアミノ酸４０位を含む部分を含み得る。
【００７９】
組成物中の異なるベクターの数が２つである一部の例では、前駆体ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分は、野生型ステレオシリンタンパク質（例えば、配列番号１）のアミノ酸１位〜アミノ酸３１０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸３２０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸３３０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸３４０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸３５０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸３６０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸３７０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸３８０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸３９０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸４００位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸４１０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸４２０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸４３０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸４４０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸４５０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸４６０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸４７０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸４８０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸４９０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸５００位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸５１０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸５２０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸５３０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸５４０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸５５０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸５６０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸５７０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸５８０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸５９０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸６００位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸６１０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸６２０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸６３０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸６４０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸６５０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸６６０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸６７０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸６８０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸６９０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸７００位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸７１０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸７２０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸７３０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸７４０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸７５０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸７６０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸７７０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸７８０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸７９０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸８００位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸８１０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸８２０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸８３０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸８４０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸８５０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸８６０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸８７０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸８８０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸８９０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸９００位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸９１０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸９２０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸９３０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸９４０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸９５０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸９６０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸９７０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸９８０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸９９０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，０００位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，０１０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，０２０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，０３０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，０４０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，０５０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，０６０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，０７０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，０８０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，０９０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，１００位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，１１０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，１２０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，１３０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，１４０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，１５０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，１６０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，１７０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，１８０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，１９０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，２００位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，２１０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，２２０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，２３０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，２４０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，２５０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，２６０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，２７０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，２８０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，２９０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，３００位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，３１０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，３２０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，３３０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，３４０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，３５０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，３６０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，３７０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，３８０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，３９０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，４００位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，４１０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，４２０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，４３０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，４４０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，４５０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，４６０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，４７０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，４８０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，４９０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，５００位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，５１０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，５２０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，５３０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，５４０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，５５０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，５６０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，５７０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，５８０位、アミノ酸１位〜およそアミノ酸１，５９０位、またはアミノ酸１位〜およそアミノ酸１，６００位を含む部分を含み得る。
【００８０】
本明細書で使用されるとき、「ベクター」という用語は、少なくとも１つの外因性核酸断片を運搬することのできるポリヌクレオチドを含む組成物、例えば、プラスミドベクター、トランスポゾン、コスミド、人工染色体（例えば、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ））、またはウイルスベクター（例えば、本明細書に記載されるような任意のアデノウイルスベクター（例えば、ｐＳＶまたはｐＣＭＶベクター）、任意のレトロウイルスベクター）、及び任意のＧａｔｅｗａｙ（登録商標）ベクターを意味する。ベクターは、例えば、発現のために十分なシス作用エレメントを含む可能性があり、発現のための他のエレメントは、宿主哺乳類細胞によって、またはインビトロ発現系において供給され得る。「ベクター」という用語は、適切な調節エレメントに関連付けられた際に複製能を持つ任意の遺伝子エレメント（例えば、プラスミド、トランスポゾン、コスミド、人工染色体、またはウイルスベクター等）を含む。故に、この用語は、ウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはレトロウイルスベクター）のみならず、クローニング及び発現ベクターも含む。
【００８１】
ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み込む、コスミド、プラスミド（例えば、裸でまたはリポソームに含まれて）、及びウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）を含めた、当該技術分野で既知の全てのベクターが含まれる。当業者であれば、本明細書に記載される核酸のうちのいずれかを作製するために好適なベクター及び哺乳類細胞を選択可能であろう。一部の実施形態では、ベクターは、プラスミド（すなわち、細胞の内部で自律的に複製することができる環状ＤＮＡ分子）である。一部の実施形態では、ベクターは、コスミドであり得る（例えば、ｐＷＥ及びｓＣｏｓシリーズ（Ｗａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７），Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９））。
【００８２】
一部の実施形態では、ベクター（複数可）は、人工染色体である。人工染色体は、大きなＤＮＡインサートを運搬するためのベクターとして使用され得る、遺伝子操作された染色体である。一部の実施形態では、人工染色体は、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）である（例えば、Ｋｏｕｐｒｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  １１（４）：５１７−５３５，２０１４、Ｂａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．５３：８４３−８５３，２００６、Ｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｖ．２（１）：４３−５０，２００６、Ｋａｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９（９）：１５９１−１６０１，２０１１、Ｋａｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．１８：３８４−３９３，２０１１、及びＫａｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３２１：２８０−２９０，２００４を参照されたい）。
【００８３】
一部の実施形態では、ベクター（複数可）は、酵母人工染色体（ＹＡＣ）である（例えば、Ｍｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：１８９−１９３，１９８３、Ｉｋｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：４３１−４３９，１９９８を参照されたい）。一部の実施形態では、ベクター（複数可）は、細菌人工染色体（ＢＡＣ）である（例えば、ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１、ｐＥＣＢＡＣ１、及びｐＢＡＣ１０８Ｌ）。一部の実施形態では、ベクター（複数可）は、Ｐ１由来人工染色体（ＰＡＣ）である。人工染色体の例は、当該技術分野で既知である。
【００８４】
一部の実施形態では、ベクター（複数可）は、ウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、及びレトロウイルス）である。ウイルスベクターの非限定的な例が本明細書に記載される。一部の実施形態では、ベクター（複数可）は、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である（例えば、Ａｓｏｋａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０：６９９−７０８０，２０１２を参照されたい）。「組換えＡＡＶベクター」または「ｒＡＡＶ」は典型的には、最低限でも導入遺伝子またはその一部分及び制御配列、ならびに任意選択で５’及び３’ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）で構成される。かかる組換えＡＡＶベクターは、カプシド中にパッケージングされ、選択の標的細胞（例えば、外有毛細胞）に送達される。
【００８５】
ベクターのＡＡＶ配列は典型的には、シス作用５’及び３’ＩＴＲ配列を含む（例えば、Ｂ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ，ｉｎ“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ”，ｅｄ．，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｒ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１５５  １６８，１９９０を参照されたい）。典型的なＡＡＶ  ＩＴＲ配列は、約１４５ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、典型的なＩＴＲ配列の少なくとも７５％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％）がＡＡＶベクターに組み込まれる。これらのＩＴＲ配列を修飾する能力は、当業者の技能の範囲内である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９、及びＫ．Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７０：５２０  ５３２，１９９６を参照されたい）。一部の実施形態では、本明細書に記載されるコード配列のうちのいずれかには、ＡＡＶベクターにおいて５’及び３’ＡＡＶ  ＩＴＲ配列が隣接する。ＡＡＶ  ＩＴＲ配列は、現在同定されたＡＡＶ型を含めた、任意の既知のＡＡＶから得られてもよい。
【００８６】
５’ＡＡＶ  ＩＴＲ配列の非限定的な例は、配列番号１８である。３’ＡＡＶ  ＩＴＲ配列の非限定的な例は、配列番号３６である。
【００８７】
本明細書に記載されるようなＡＡＶベクターは、本明細書に記載される制御エレメントのうちのいずれか（例えば、プロモーター、ポリＡ配列、及びＩＲＥＳのうちの１つまたは複数）を含んでもよい。
【００８８】
一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１ベクター、ＡＡＶ２ベクター、ＡＡＶ３ベクター、ＡＡＶ４ベクター、ＡＡＶ５ベクター、ＡＡＶ６ベクター、ＡＡＶ７ベクター、ＡＡＶ８ベクター、ＡＡＶ９ベクター、ＡＡＶ２．７ｍ８ベクター、ＡＡＶ８ＢＰ２ベクター、及びＡＡＶ２９３ベクターからなる群から選択される。本明細書で使用され得る追加の例示的なＡＡＶベクターは、当該技術分野で既知である。例えば、Ｋａｎａａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ８：１８４−１９７，２０１７、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６（７）：１２５２−１２６０、Ａｄａｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．５：３０７５，２０１４、Ｉｓｇｒｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．１０（１）：４２７，２０１９、及びＧａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８（１２）：６３８１−６３８８を参照されたい。
【００８９】
一部の実施形態では、本明細書に提供されるＡＡＶベクターは、配列番号１２〜１７と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）である配列を含むか、またはそれからなる。
【００９０】
ｐＩＴＲ−２０１（配列番号１２）
【化３１】
2021530227.tif 000033
【化３２】
2021530227.tif 000034
【００９１】
ｐＩＴＲ−２０２（配列番号１３）
【化３３】
2021530227.tif 000035
【化３４】
2021530227.tif 000036
【化３５】
2021530227.tif 000037
【００９２】
ｐＩＴＲ−２０２ＧＦＰ（配列番号１４）
【化３６】
2021530227.tif 000038
【化３７】
2021530227.tif 000039
【化３８】
2021530227.tif 000040
【００９３】
ｐＩＴＲ−２０３（配列番号１５）
【化３９】
2021530227.tif 000041
【化４０】
2021530227.tif 000042
【００９４】
ｐＩＴＲ−２０４（配列番号１６）
【化４１】
2021530227.tif 000043
【化４２】
2021530227.tif 000044
【００９５】
ｐＩＴＲ−２０５（配列番号１７）
【化４３】
2021530227.tif 000045
【化４４】
2021530227.tif 000046
【化４５】
2021530227.tif 000047
【００９６】
一部の実施形態では、ベクター（複数可）は、アデノウイルスである（例えば、Ｄｍｉｔｒｉｅｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９７０６−９７１３、及びＰｏｕｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ８：１００７４−１００８６，２０１０を参照されたい）。一部の実施形態では、ベクター（複数可）は、レトロウイルスである（例えば、Ｍａｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｆｕｔｕｒｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５：１５０７−２３を参照されたい）。
【００９７】
一部の実施形態では、ベクター（複数可）は、レンチウイルスである（例えば、Ｍａｔｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．１８：４７７−４９０、Ｂａｎａｓｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１７：１５０−７、及びＷａｎｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７：１３１６−３２を参照されたい）。レンチウイルスベクターは、とりわけ、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７（８）：１４５３−１４６４（２００９）に提供されるような自己不活化型レンチウイルスベクターを含めた、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部分に由来するベクターを指す。診療所で使用され得る非限定的なレンチウイルスベクターには、Ｏｘｆｏｒｄ  ＢｉｏＭｅｄｉｃａからのＬＥＮＴＩＶＥＣＴＯＲ（登録商標）遺伝子送達技術、ＬｅｎｔｉｇｅｎからのＬＥＮＴＩＭＡＸ（商標）ベクター系等が含まれる。他の種類のレンチウイルスベクターもまた利用可能であり、当業者には既知であろう。
【００９８】
本明細書に提供されるベクターは、異なるサイズのものであり得る。本明細書に記載される組成物、キット、及び方法のうちのいずれかにおいて使用されるベクターの選定は、ベクターのサイズに左右され得る。
【００９９】
一部の実施形態では、ベクター（複数可）は、プラスミドであり、最大約１ｋｂ、最大約２ｋｂ、最大約３ｋｂ、最大約４ｋｂ、最大約５ｋｂ、最大約６ｋｂ、最大約７ｋｂ、最大約８ｋｂ、最大約９ｋｂ、最大約１０ｋｂ、最大約１１ｋｂ、最大約１２ｋｂ、最大約１３ｋｂ、最大約１４ｋｂ、または最大約１５ｋｂの全長を含み得る。一部の実施形態では、ベクター（複数可）は、プラスミドであり、約１ｋｂ〜約２ｋｂ、約１ｋｂ〜約３ｋｂ、約１ｋｂ〜約４ｋｂ、約１ｋｂ〜約５ｋｂ、約１ｋｂ〜約６ｋｂ、約１ｋｂ〜約７ｋｂ、約１ｋｂ〜約８ｋｂ、約１ｋｂ〜約９ｋｂ、約１ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１ｋｂ〜約１１ｋｂ、約１ｋｂ〜約１２ｋｂ、約１ｋｂ〜約１３ｋｂ、約１ｋｂ〜約１４ｋｂ、または約１ｋｂ〜約１５ｋｂの範囲の全長を有し得る。
【０１００】
一部の実施形態では、ベクター（複数可）は、トランスポゾン（例えば、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン）であり、２００ｋｂ超を含み得る。一部の例では、ベクター（複数可）は、約１ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１ｋｂ〜約２０ｋｂ、約１ｋｂ〜約３０ｋｂ、約１ｋｂ〜約４０ｋｂ、約１ｋｂ〜約５０ｋｂ、約１ｋｂ〜約６０ｋｂ、約１ｋｂ〜約７０ｋｂ、約１ｋｂ〜約８０ｋｂ、約１ｋｂ〜約９０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約５０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約７０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約７０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約７０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約９０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約２００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約４００ｋｂ、または約１００ｋｂ〜約５００ｋｂの範囲の全長を有するトランスポゾンである。
【０１０１】
一部の実施形態では、ベクターは、コスミドであり、最大５５ｋｂの全長を有し得る。一部の例では、ベクターは、コスミドであり、約１ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１ｋｂ〜約２０ｋｂ、約１ｋｂ〜約３０ｋｂ、約１ｋｂ〜約４０ｋｂ、約１ｋｂ〜約５０ｋｂ、約１ｋｂ〜約５５ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約５５ｋｂ、約１５ｋｂ〜約５５ｋｂ、約１５ｋｂ〜約５０ｋｂ、約１５ｋｂ〜約４０ｋｂ、約１５ｋｂ〜約３０ｋｂ、約１５ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約５５ｋｂ、約２０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約２５ｋｂ〜約５５ｋｂ、約２５ｋｂ〜約５０ｋｂ、約２５ｋｂ〜約４０ｋｂ、約２５ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約５５ｋｂ、約３０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約３５ｋｂ〜約５５ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５５ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、または約４５ｋｂ〜約５５ｋｂのヌクレオチドの総数を有する。
【０１０２】
一部の実施形態では、ベクター（複数可）は、人工染色体であり、約１００ｋｂ〜約２０００ｋｂのヌクレオチドの総数を有し得る。一部の実施形態では、人工染色体（複数可）は、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）であり、約１ｋｂ〜約１０ｋｂ、１ｋｂ〜約２０ｋｂ、約１ｋｂ〜約３０ｋｂ、約１ｋｂ〜約４０ｋｂ、約１ｋｂ〜約５０ｋｂ、約１ｋｂ〜約６０、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、または約５０ｋｂ〜約６０ｋｂの範囲のヌクレオチドの総数を有し得る。
【０１０３】
一部の実施形態では、人工染色体（複数可）は、酵母人工染色体（ＹＡＣ）であり、最大１０００ｋｂのヌクレオチドの総数を有し得る。一部の実施形態では、人工染色体（複数可）は、約１００ｋｂ〜約１，０００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約９００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約８００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約７００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約６００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約１，０００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約９００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約８００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約７００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約６００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約１，０００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約９００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約８００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約７００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約６００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約１，０００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約９００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約８００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約７００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約６００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１，０００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約９００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約８００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約７００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約６００ｋｂ、約６００ｋｂ〜約１，０００ｋｂ、約６００ｋｂ〜約９００ｋｂ、約６００ｋｂ〜約８００ｋｂ、約６００ｋｂ〜約７００ｋｂ、約７００ｋｂ〜約１，０００ｋｂ、約７００ｋｂ〜約９００ｋｂ、約７００ｋｂ〜約８００ｋｂ、約８００ｋｂ〜約１，０００ｋｂ、約８００ｋｂ〜約９００ｋｂ、または約９００ｋｂ〜約１，０００ｋｂの範囲のヌクレオチドの総数を有するＹＡＣである。
【０１０４】
一部の実施形態では、人工染色体（複数可）は、細菌人工染色体（ＢＡＣ）であり、最大７５０ｋｂのヌクレオチドの総数を有し得る。一部の実施形態では、人工染色体（複数可）は、ＢＡＣであり、約１００ｋｂ〜約７５０ｋｂ、約１００ｋｂ〜約７００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約６００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約２００ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約７５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約７００ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約６００ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約５００ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約４００ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約７５０ｋｂ、約２００ｋｂ〜約７００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約６００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約７５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約７００ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約６００ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約５００ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約４００ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約７５０ｋｂ、約３００ｋｂ〜約７００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約６００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約３５０ｋｂ〜約７５０ｋｂ、約３５０ｋｂ〜約７００ｋｂ、約３５０ｋｂ〜約６００ｋｂ、約３５０ｋｂ〜約５００ｋｂ、約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約７５０ｋｂ、約４００ｋｂ〜約７００ｋｂ、約４５０ｋｂ〜約６００ｋｂ、約４５０ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約７５０ｋｂ、約５００ｋｂ〜約７００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約６００ｋｂ、約５５０ｋｂ〜約７５０ｋｂ、約５５０ｋｂ〜約７００ｋｂ、約５５０ｋｂ〜約６００ｋｂ、約６００ｋｂ〜約７５０ｋｂ、約６００ｋｂ〜約７００ｋｂ、または約６５０ｋｂ〜約７５０ｋｂの範囲のヌクレオチドの総数を有し得る。
【０１０５】
一部の実施形態では、人工染色体（複数可）は、Ｐ１由来人工染色体（ＰＡＣ）であり、最大３００ｋｂのヌクレオチドの総数を有し得る。一部の実施形態では、Ｐ１由来人工染色体（複数可）であり、約１００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約２００ｋｂ、または約２００ｋｂ〜約３００ｋｂの範囲のヌクレオチドの総数を有し得る。
【０１０６】
一部の実施形態では、ベクター（複数可）は、ウイルスベクターであり、最大１０ｋｂのヌクレオチドの総数を有し得る。一部の実施形態では、ウイルスベクター（複数可）であり、約１ｋｂ〜約２ｋｂ、１ｋｂ〜約３ｋｂ、約１ｋｂ〜約４ｋｂ、約１ｋｂ〜約５ｋｂ、約１ｋｂ〜約６ｋｂ、約１ｋｂ〜約７ｋｂ、約１ｋｂ〜約８ｋｂ、約１ｋｂ〜約９ｋｂ、約１ｋｂ〜約１０ｋｂ、約２ｋｂ〜約３ｋｂ、約２ｋｂ〜約４ｋｂ、約２ｋｂ〜約５ｋｂ、約２ｋｂ〜約６ｋｂ、約２ｋｂ〜約７ｋｂ、約２ｋｂ〜約８ｋｂ、約２ｋｂ〜約９ｋｂ、約２ｋｂ〜約１０ｋｂ、約３ｋｂ〜約４ｋｂ、約３ｋｂ〜約５ｋｂ、約３ｋｂ〜約６ｋｂ、約３ｋｂ〜約７ｋｂ、約３ｋｂ〜約８ｋｂ、約３ｋｂ〜約９ｋｂ、約３ｋｂ〜約１０ｋｂ、約４ｋｂ〜約５ｋｂ、約４ｋｂ〜約６ｋｂ、約４ｋｂ〜約７ｋｂ、約４ｋｂ〜約８ｋｂ、約４ｋｂ〜約９ｋｂ、約４ｋｂ〜約１０ｋｂ、約５ｋｂ〜約６ｋｂ、約５ｋｂ〜約７ｋｂ、約５ｋｂ〜約８ｋｂ、約５ｋｂ〜約９ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約６ｋｂ〜約７ｋｂ、約６ｋｂ〜約８ｋｂ、約６ｋｂ〜約９ｋｂ、約６ｋｂ〜約１０ｋｂ、約７ｋｂ〜約８ｋｂ、約７ｋｂ〜約９ｋｂ、約７ｋｂ〜約１０ｋｂ、約８ｋｂ〜約９ｋｂ、約８ｋｂ〜約１０ｋｂ、または約９ｋｂ〜約１０ｋｂの範囲のヌクレオチドの総数を有し得る。
【０１０７】
一部の実施形態では、ベクター（複数可）は、レンチウイルスであり、最大８ｋｂのヌクレオチドの総数を有し得る。一部の例では、レンチウイルス（複数可）は、約１ｋｂ〜約２ｋｂ、約１ｋｂ〜約３ｋｂ、約１ｋｂ〜約４ｋｂ、約１ｋｂ〜約５ｋｂ、約１ｋｂ〜約６ｋｂ、約１ｋｂ〜約７ｋｂ、約１ｋｂ〜約８ｋｂ、約２ｋｂ〜約３ｋｂ、約２ｋｂ〜約４ｋｂ、約２ｋｂ〜約５ｋｂ、約２ｋｂ〜約６ｋｂ、約２ｋｂ〜約７ｋｂ、約２ｋｂ〜約８ｋｂ、約３ｋｂ〜約４ｋｂ、約３ｋｂ〜約５ｋｂ、約３ｋｂ〜約６ｋｂ、約３ｋｂ〜約７ｋｂ、約３ｋｂ〜約８ｋｂ、約４ｋｂ〜約５ｋｂ、約４ｋｂ〜約６ｋｂ、約４ｋｂ〜約７ｋｂ、約４ｋｂ〜約８ｋｂ、約５ｋｂ〜約６ｋｂ、約５ｋｂ〜約７ｋｂ、約５ｋｂ〜約８ｋｂ、約６ｋｂ〜約８ｋｂ、約６ｋｂ〜約７ｋｂ、または約７ｋｂ〜約８ｋｂのヌクレオチドの総数を有し得る。
【０１０８】
一部の実施形態では、ベクター（複数可）は、アデノウイルスであり、最大８ｋｂのヌクレオチドの総数を有し得る。一部の実施形態では、アデノウイルス（複数可）であり、約１ｋｂ〜約２ｋｂ、約１ｋｂ〜約３ｋｂ、約１ｋｂ〜約４ｋｂ、約１ｋｂ〜約５ｋｂ、約１ｋｂ〜約６ｋｂ、約１ｋｂ〜約７ｋｂ、約１ｋｂ〜約８ｋｂ、約２ｋｂ〜約３ｋｂ、約２ｋｂ〜約４ｋｂ、約２ｋｂ〜約５ｋｂ、約２ｋｂ〜約６ｋｂ、約２ｋｂ〜約７ｋｂ、約２ｋｂ〜約８ｋｂ、約３ｋｂ〜約４ｋｂ、約３ｋｂ〜約５ｋｂ、約３ｋｂ〜約６ｋｂ、約３ｋｂ〜約７ｋｂ、約３ｋｂ〜約８ｋｂ、約４ｋｂ〜約５ｋｂ、約４ｋｂ〜約６ｋｂ、約４ｋｂ〜約７ｋｂ、約４ｋｂ〜約８ｋｂ、約５ｋｂ〜約６ｋｂ、約５ｋｂ〜約７ｋｂ、約５ｋｂ〜約８ｋｂ、約６ｋｂ〜約７ｋｈ、約６ｋｂ〜約８ｋｂ、または約７ｋｂ〜約８ｋｂの範囲のヌクレオチドの総数を有し得る。
【０１０９】
一部の実施形態では、ベクター（複数可）は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶベクター）であり、最大５ｋｂのヌクレオチドの総数を含み得る。一部の実施形態では、ＡＡＶベクター（複数可）は、約１ｋｂ〜約２ｋｂ、約１ｋｂ〜約３ｋｂ、約１ｋｂ〜約４ｋｂ、約１ｋｂ〜約５ｋｂ、約２ｋｂ〜約３ｋｂ、約２ｋｂ〜約４ｋｂ、約２ｋｂ〜約５ｋｂ、約３ｋｂ〜約４ｋｂ、約３ｋｂ〜約５ｋｂ、または約４ｋｂ〜約５ｋｂの範囲のヌクレオチドの総数を含み得る。
【０１１０】
一部の実施形態では、ベクター（複数可）は、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ベクターであり、最大５ｋｂのヌクレオチドの総数を含み得る。一部の実施形態では、各Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ベクター（複数可）は、約１ｋｂ〜約２ｋｂ、約１ｋｂ〜約３ｋｂ、約１ｋｂ〜約４ｋｂ、約１ｋｂ〜約５ｋｂ、約２ｋｂ〜約３ｋｂ、約２ｋｂ〜約４ｋｂ、約２ｋｂ〜約５ｋｂ、約３ｋｂ〜約４ｋｂ、約３ｋｂ〜約５ｋｂ、または約４ｋｂ〜約５ｋｂの範囲のヌクレオチドの総数を含む。
【０１１１】
本明細書に提供される組成物、キット、及び方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、該少なくとも２つの異なるベクターは、実質的に同じ種類のベクターであり得、サイズが異なってもよい。一部の実施形態では、該少なくとも２つの異なるベクターは、異なる種類のベクターであり得、実質的に同じサイズを有しても、または異なるサイズを有してもよい。
【０１１２】
一部の実施形態では、該少なくとも２つのベクターのうちのいずれかは、約５００ヌクレオチド〜約１０，０００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド〜約９，５００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド〜約９，０００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド〜約８，５００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド〜約８，０００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド〜約７，８００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド〜約７，６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド〜約７，４００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド〜約７，２００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド〜約７，０００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド〜約６，８００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド〜約６，６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド〜約６，４００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド〜約６，２００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド〜約６，０００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド〜約５，８００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド〜約５，６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド〜約５，４００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド〜約５，２００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド〜約５，０００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド〜約４，８００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド〜約４，４００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド〜約４，２００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド〜約４，０００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド〜約３，８００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド〜約３，６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド〜約３，４００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド〜約３，２００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド〜約３，０００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド〜約２，８００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド〜約２，６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド〜約２，４００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド〜約２，２００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド〜約２，０００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド〜約１，８００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド〜約１，６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド〜約１，４００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド〜約１，２００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド〜約１，０００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド〜約８００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約１０，０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約９，５００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約９，０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約８，５００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約８，０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約７，８００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約７，６００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約７，４００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約７，２００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約７，０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約６，８００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約６，６００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約６，４００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約６，２００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約６，０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約５，８００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約５，６００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約５，４００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約５，２００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約５，０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約４，８００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約４，６００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約４，４００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約４，２００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約４，０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約３，８００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約３，６００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約３，４００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約３，２００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約３，０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約２，８００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約２，６００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約２，４００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約２，２００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約２，０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約１，８００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約１，６００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約１，４００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約１，２００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド〜約１，０００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約１０，０００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約９，０００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約８，５００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約８，０００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約７，８００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約７，６００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約７，４００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約７，２００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約７，０００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約６，８００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約６，６００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約６，４００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約６，２００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約６，０００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約５，８００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約５，６００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約５，４００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約５，２００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約５，０００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約４，８００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約４，６００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約４，４００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約４，２００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約４，０００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約３，８００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約３，６００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約３，４００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約３，２００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約３，０００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約２，６００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約２，４００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約２，２００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約２，０００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約１，８００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約１，６００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約１，４００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド〜約１，２００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド〜約１０，０００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド〜約９，５００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド〜約９，０００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド〜約８，５００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド〜約８，０００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド〜約７，８００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド〜約７，６００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド〜約７，４００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド〜約７，２００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド〜約７，０００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド〜約６，８００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド〜約６，６００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド〜約６，４００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド〜約６，２００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド〜約６，０００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド〜約５，８００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド〜約５，６００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド〜約５，４００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド〜約５，０００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド〜約４，８００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド〜約４，６００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド〜約４，４００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド〜約４，２００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド〜約４，０００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド〜約３，８００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド〜約３，６００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド〜約３，４００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド〜約３，２００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド〜約３，０００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド〜約２，８００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド〜約２，６００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド〜約２，４００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド〜約２，２００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド〜約２，０００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド〜約１，８００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド〜約１，６００ヌクレオチド、約１，２００ヌクレオチド〜約１，４００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド〜約１０，０００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド〜約９，５００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド〜約９，０００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド〜約８，５００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド〜約８，０００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド〜約７，８００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド〜約７，６００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド〜約７，４００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド〜約７，２００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド〜約７，０００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド〜約６，８００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド〜約６，６００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド〜約６，４００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド〜約６，２００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド〜約６，０００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド〜約５，８００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド〜約５，６００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド〜約５，４００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド〜約５，２００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド〜約５，０００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド〜約４，８００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド〜約４，６００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド〜約４，４００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド〜約４，２００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド〜約４，０００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド〜約３，８００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド〜約３，６００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド〜約３，４００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド〜約３，２００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド〜約３，０００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド〜約２，６００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド〜約２，４００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド〜約２，２００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド〜約２，０００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド〜約１，８００ヌクレオチド、約１，４００ヌクレオチド〜約１，６００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド〜約１０，０００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド〜約９，５００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド〜約９，０００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド〜約８，５００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド〜約８，０００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド〜約７，８００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド〜約７，６００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド〜約７，４００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド〜約７，２００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド〜約７，０００ヌクレオチド、約１，６００ヌクレオチド〜約６，８００ヌクレオチド、約１，６
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チド、約４，４００ヌクレオチド〜約７，８００ヌクレオチド、約４，４００ヌクレオチド〜約７，６００ヌクレオチド、約４，４００ヌクレオチド〜約７，４００ヌクレオチド、約４，４００ヌクレオチド〜約７，２００ヌクレオチド、約４，４００ヌクレオチド〜約
７，０００ヌクレオチド、約４，４００ヌクレオチド〜約６，８００ヌクレオチド、約４，４００ヌクレオチド〜約６，６００ヌクレオチド、約４，４００ヌクレオチド〜約６，４００ヌクレオチド、約４，４００ヌクレオチド〜約６，２００ヌクレオチド、約４，４００ヌクレオチド〜約６，０００ヌクレオチド、約４，４００ヌクレオチド〜約５，８００ヌクレオチド、約４，４００ヌクレオチド〜約５，６００ヌクレオチド、約４，４００ヌクレオチド〜約５，４００ヌクレオチド、約４，４００ヌクレオチド〜約５，２００ヌクレオチド、約４，４００ヌクレオチド〜約５，０００ヌクレオチド、約４，４００ヌクレオチド〜約４，８００ヌクレオチド、約４，４００ヌクレオチド〜約４，６００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド〜約１０，０００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド〜約９，５００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド〜約９，０００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド〜約８，５００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド〜約８，０００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド〜約７，８００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド〜約７，６００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド〜約７，４００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド〜約７，２００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド〜約７，０００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド〜約６，８００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド〜約６，６００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド〜約６，４００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド〜約６，２００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド〜約６，０００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド〜約５，８００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド〜約５，６００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド〜約５，４００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド〜約５，２００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド〜約５，０００ヌクレオチド、約４，６００ヌクレオチド〜約４，８００ヌクレオチド、約４，８００ヌクレオチド〜約１０，０００ヌクレオチド、約４，８００ヌクレオチド〜約９，５００ヌクレオチド、約４，８００ヌクレオチド〜約９，０００ヌクレオチド、約４，８００ヌクレオチド〜約８，５００ヌクレオチド、約４，８００ヌクレオチド〜約８，０００ヌクレオチド、約４，８００ヌクレオチド〜約７，８００ヌクレオチド、約４，８００ヌクレオチド〜約７，６００ヌクレオチド、約４，８００ヌクレオチド〜約７，４００ヌクレオチド、約４，８００ヌクレオチド〜約７，２００ヌクレオチド、約４，８００ヌクレオチド〜約７，０００ヌクレオチド、約４，８００ヌクレオチド〜約６，８００ヌクレオチド、約４，８００ヌクレオチド〜約６，６００ヌクレオチド、約４，８００ヌクレオチド〜約６，４００ヌクレオチド、約４，８００ヌクレオチド〜約６，２００ヌクレオチド、約４，８００ヌクレオチド〜約６，０００ヌクレオチド、約４，８００ヌクレオチド〜約５，８００ヌクレオチド、約４，８００ヌクレオチド〜約５，６００ヌクレオチド、約４，８００ヌクレオチド〜約５，４００ヌクレオチド、約４，８００ヌクレオチド〜約５，２００ヌクレオチド、約４，８００ヌクレオチド〜約５，０００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド〜約１０，０００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド〜約９，５００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド〜約９，０００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド〜約８，５００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド〜約８，０００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド〜約７，８００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド〜約７，６００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド〜約７，４００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド〜約７，２００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド〜約７，０００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド〜約６，８００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド〜約６，６００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド〜約６，４００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド〜約６，２００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド〜約６，０００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド〜約５，８００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド〜約５，６００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド〜約５，４００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド〜約５，２００ヌクレオチド、約５，２００ヌクレオチド〜約１０，０００ヌクレオチド、約５，２００ヌクレオチド〜約９，５００ヌクレオチド、約５，２００ヌクレオチド〜約９，０００ヌクレオチド、約５，２００ヌクレオチド〜約８，５００ヌクレオチド、約５，２００ヌクレオチド〜約８，０００ヌクレオチド、約５，２００ヌクレオチド〜約７，８００ヌクレオチド、約５，２００ヌクレオチド〜約７，６００ヌクレオチド、約５，２００ヌクレオチド〜約７，４００ヌクレオチド、約５，２００ヌクレオチド〜約７，２００ヌクレオチド、約５，２００ヌクレオチド〜約７，０００ヌクレオチド、約５，２００ヌクレオチド〜約６，８００ヌクレオチド、約５，２００ヌクレオチド〜約６，６００ヌクレオチド、約５，２００ヌクレオチド〜約６，４００ヌクレオチド、約５，２００ヌクレオチド〜約６，２００ヌクレオチド、約５，２００ヌクレオチド〜約６，０００ヌクレオチド、約５，２００ヌクレオチド〜約５，８００ヌクレオチド、約５，２００ヌクレオチド〜約５，６００ヌクレオチド、約５，２００ヌクレオチド〜約５，４００ヌクレオチド、約５，４００ヌクレオチド〜約１０，０００ヌクレオチド、約５，４００ヌクレオチド〜約９，５００ヌクレオチド、約５，４００ヌクレオチド〜約９，０００ヌクレオチド、約５，４００ヌクレオチド〜約８，５００ヌクレオチド、約５，４００ヌクレオチド〜約８，０００ヌクレオチド、約５，４００ヌクレオチド〜約７，８００ヌクレオチド、約５，４００ヌクレオチド〜約７，６００ヌクレオチド、約５，４００ヌクレオチド〜約７，４００ヌクレオチド、約５，４００ヌクレオチド〜約７，２００ヌクレオチド、約５，４００ヌクレオチド〜約７，０００ヌクレオチド、約５，４００ヌクレオチド〜約６，８００ヌクレオチド、約５，４００ヌクレオチド〜約６，６００ヌクレオチド、約５，４００ヌクレオチド〜約６，４００ヌクレオチド、約５，４００ヌクレオチド〜約６，２００ヌクレオチド、約５，４００ヌクレオチド〜約６，０００ヌクレオチド、約５，４００ヌクレオチド〜約５，８００ヌクレオチド、約５，４００ヌクレオチド〜約５，６００ヌクレオチド、約５，６００ヌクレオチド〜約１０，０００ヌクレオチド、約５，６００ヌクレオチド〜約９，５００ヌクレオチド、約５，６００ヌクレオチド〜約９，０００ヌクレオチド、約５，６００ヌクレオチド〜約８，５００ヌクレオチド、約５，６００ヌクレオチド〜約８，０００ヌクレオチド、約５，６００ヌクレオチド〜約７，８００ヌクレオチド、約５，６００ヌクレオチド〜約７，６００ヌクレオチド、約５，６００ヌクレオチド〜約７，４００ヌクレオチド、約５，６００ヌクレオチド〜約７，２００ヌクレオチド、約５，６００ヌクレオチド〜約７，０００ヌクレオチド、約５，６００ヌクレオチド〜約６，８００ヌクレオチド、約５，６００ヌクレオチド〜約６，６００ヌクレオチド、約５，６００ヌクレオチド〜約６，４００ヌクレオチド、約５，６００ヌクレオチド〜約６，２００ヌクレオチド、約５，６００ヌクレオチド〜約６，０００ヌクレオチド、約５，６００ヌクレオチド〜約５，８００ヌクレオチド、約５，８００ヌクレオチド〜約１０，０００ヌクレオチド、約５，８００ヌクレオチド〜約９，５００ヌクレオチド、約５，８００ヌクレオチド〜約９，０００ヌクレオチド、約５，８００ヌクレオチド〜約８，５００ヌクレオチド、約５，８００ヌクレオチド〜約８，０００ヌクレオチド、約５，８００ヌクレオチド〜約７，８００ヌクレオチド、約５，８００ヌクレオチド〜約７，６００ヌクレオチド、約５，８００ヌクレオチド〜約７，４００ヌクレオチド、約５，８００ヌクレオチド〜約７，２００ヌクレオチド、約５，８００ヌクレオチド〜約７，０００ヌクレオチド、約５，８００ヌクレオチド〜約６，８００ヌクレオチド、約５，８００ヌクレオチド〜約６，６００ヌクレオチド、約５，８００ヌクレオチド〜約６，４００ヌクレオチド、約５，８００ヌクレオチド〜約６，２００ヌクレオチド、約５，８００ヌクレオチド〜約６，０００ヌクレオチド、約６，０００ヌクレオチド〜約１０，０００ヌクレオチド、約６，０００ヌクレオチド〜約９，５００ヌクレオチド、約６，０００ヌクレオチド〜約９，０００ヌクレオチド、約６，０００ヌクレオチド〜約８，５００ヌクレオチド、約６，０００ヌクレオチド〜約８，０００ヌクレオチド、約６，０００ヌクレオチド〜約７，８００ヌクレオチド、約６，０００ヌクレオチド〜約７，６００ヌクレオチド、約６，０００ヌクレオチド〜約７，４００ヌクレオチド、約６，０００ヌクレオチド〜約７，２００ヌクレオチド、約６，０００ヌクレオチド〜約７，０００ヌクレオチド、約６，０００ヌクレオチド〜約６，８００ヌクレオチド、約６，０００ヌクレオチド〜約６，６００ヌクレオチド、約６，０００ヌクレオチド〜約６，４００ヌクレオチド、約６，０００ヌクレオチド〜約６，２００ヌクレオチド、約６，２００ヌクレオチド〜約１０，０００ヌクレオチド、約６，２００ヌクレオチド〜約９，０００ヌクレオチド、約６，２００ヌクレオチド〜約８，５００ヌクレオチド、約６，２００ヌクレオチド〜約８，０００ヌクレオチド、約６，２００ヌクレオチド〜約７，８００ヌクレオチド、約６，２００ヌクレオチド〜約７，６００ヌクレオチド、約６，２００ヌクレオチド〜約７，４００ヌクレオチド、約６，２００ヌクレオチド〜約７，２００ヌクレオチド、約６，２００ヌクレオチド〜約７，０００ヌクレオチド、約６，２００ヌクレオチド〜約６，８００ヌクレオチド、約６，２００ヌクレオチド〜約６，６００ヌクレオチド、約６，２００ヌクレオチド〜約６，４００ヌクレオチド、約６，４００ヌクレオチド〜約１０，０００ヌクレオチド、約６，４００ヌクレオチド〜約９，５００ヌクレオチド、約６，４００ヌクレオチド〜約９，０００ヌクレオチド、約６，４００ヌクレオチド〜約８，５００ヌクレオチド、約６，４００ヌクレオチド〜約８，０００ヌクレオチド、約６，４００ヌクレオチド〜約７，８００ヌクレオチド、約６，４００ヌクレオチド〜約７，６００ヌクレオチド、約６，４００ヌクレオチド〜約７，４００ヌクレオチド、約６，４００ヌクレオチド〜約７，２００ヌクレオチド、約６，４００ヌクレオチド〜約７，０００ヌクレオチド、約６，４００ヌクレオチド〜約６，８００ヌクレオチド、約６，４００ヌクレオチド〜約６，６００ヌクレオチド、約６，６００ヌクレオチド〜約１０，０００ヌクレオチド、約６，６００ヌクレオチド〜約９，５００ヌクレオチド、約６，６００ヌクレオチド〜約９，０００ヌクレオチド、約６，６００ヌクレオチド〜約８，５００ヌクレオチド、約６，６００ヌクレオチド〜約８，０００ヌクレオチド、約６，６００ヌクレオチド〜約７，８００ヌクレオチド、約６，６００ヌクレオチド〜約７，６００ヌクレオチド、約６，６００ヌクレオチド〜約７，４００ヌクレオチド、約６，６００ヌクレオチド〜約７，２００ヌクレオチド、約６，６００ヌクレオチド〜約７，０００ヌクレオチド、約６，６００ヌクレオチド〜約６，８００ヌクレオチド、約６，８００ヌクレオチド〜約１０，０００ヌクレオチド、約６，８００ヌクレオチド〜約９，５００ヌクレオチド、約６，８００ヌクレオチド〜約９，０００ヌクレオチド、約６，８００ヌクレオチド〜約８，５００ヌクレオチド、約６，８００ヌクレオチド〜約８，０００ヌクレオチド、約６，８００ヌクレオチド〜約７，８００ヌクレオチド、約６，８００ヌクレオチド〜約７，６００ヌクレオチド、約６，８００ヌクレオチド〜約７，４００ヌクレオチド、約６，８００ヌクレオチド〜約７，２００ヌクレオチド、約
６，８００ヌクレオチド〜約７，０００ヌクレオチド、約７，０００ヌクレオチド〜約１０，０００ヌクレオチド、約７，０００ヌクレオチド〜約９，５００ヌクレオチド、約７，０００ヌクレオチド〜約９，０００ヌクレオチド、約７，０００ヌクレオチド〜約８，５００ヌクレオチド、約７，０００ヌクレオチド〜約８，０００ヌクレオチド、約７，０００ヌクレオチド〜約７，８００ヌクレオチド、約７，０００ヌクレオチド〜約７，６００ヌクレオチド、約７，０００ヌクレオチド〜約７，４００ヌクレオチド、約７，０００ヌクレオチド〜約７，２００ヌクレオチド、約７，２００ヌクレオチド〜約１０，０００ヌクレオチド、約７，２００ヌクレオチド〜約９，５００ヌクレオチド、約７，２００ヌクレオチド〜約９，０００ヌクレオチド、約７，２００ヌクレオチド〜約８，５００ヌクレオチド、約７，２００ヌクレオチド〜約８，０００ヌクレオチド、約７，２００ヌクレオチド〜約７，８００ヌクレオチド、約７，２００ヌクレオチド〜約７，６００ヌクレオチド、約７，２００ヌクレオチド〜約７，４００ヌクレオチド、約７，４００ヌクレオチド〜約１０，０００ヌクレオチド、約７，４００ヌクレオチド〜約９，５００ヌクレオチド、約７，４００ヌクレオチド〜約９，０００ヌクレオチド、約７，４００ヌクレオチド〜約８，５００ヌクレオチド、約７，４００ヌクレオチド〜約８，０００ヌクレオチド、約７，４００ヌクレオチド〜約７，８００ヌクレオチド、約７，４００ヌクレオチド〜約７，６００ヌクレオチド、約７，６００ヌクレオチド〜約１０，０００ヌクレオチド、約７，６００ヌクレオチド〜約９，５００ヌクレオチド、約７，６００ヌクレオチド〜約９，０００ヌクレオチド、約７，６００ヌクレオチド〜約８，５００ヌクレオチド、約７，６００ヌクレオチド〜約８，０００ヌクレオチド、約７，６００ヌクレオチド〜約７，８００ヌクレオチド、約７，８００ヌクレオチド〜約１０，０００ヌクレオチド、約７，８００ヌクレオチド〜約９，５００ヌクレオチド、約７，８００ヌクレオチド〜約９，０００ヌクレオチド、約７，８００ヌクレオチド〜約８，５００ヌクレオチド、約７，８００ヌクレオチド〜約８，０００ヌクレオチド、約８，０００ヌクレオチド〜約１０，０００ヌクレオチド、約８，０００ヌクレオチド〜約９，５００ヌクレオチド、約８，０００ヌクレオチド〜約９，０００ヌクレオチド、約８，０００ヌクレオチド〜約８，５００ヌクレオチド、約８，５００ヌクレオチド〜約１０，０００ヌクレオチド、約８，５００ヌクレオチド〜約９，５００ヌクレオチド、約８，５００ヌクレオチド〜約９，０００ヌクレオチド、約９，０００ヌクレオチド〜約１０，０００ヌクレオチド、約９，０００ヌクレオチド〜約９，５００ヌクレオチド、または約９，５００ヌクレオチド〜約１０，０００ヌクレオチド（境界値を含む）の範囲のヌクレオチドの総数を有し得る。
【０１１３】
本明細書では、本明細書に記載される組成物及び方法のうちのいずれかにおいて使用され得る例示的なベクターが提供される。例えば、図１〜６を参照されたい。
【０１１４】
当該技術分野で既知の様々な異なる方法を用いて、本明細書に開示されるベクターのうちのいずれかを哺乳類細胞（例えば、蝸牛外有毛細胞）に導入することができる。核酸を哺乳類細胞に導入するための方法の非限定的な例としては、リポフェクション、トランスフェクション（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、高分岐有機化合物を用いたトランスフェクション、カチオン性ポリマーを用いたトランスフェクション、デンドリマーベースのトランスフェクション、光学トランスフェクション、粒子ベースのトランスフェクション（例えば、ナノ粒子トランスフェクション）、またはリポソーム（例えば、カチオン性リポソーム）を用いたトランスフェクション）、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、細胞圧搾、ソノポレーション、原形質体融合、インペールフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、流体力学的送達、遺伝子銃、マグネトフェクション、ウイルストランスフェクション、及びヌクレオフェクションが挙げられる。
【０１１５】
当業者であれば、本明細書に記載されるベクターのうちのいずれかを、例えばリポフェクションによって哺乳類細胞に導入することができ、内因性の遺伝子座（例えば、ステレオシリン遺伝子座またはステレオシリン偽遺伝子１遺伝子座）に安定に組み込むことができることを理解しよう。一部の実施形態では、本明細書に提供されるベクターは、内因性の欠陥のあるステレオシリン遺伝子座に安定に組み込まれ、それによって、欠陥のあるステレオシリン遺伝子が、機能している（例えば、野生型）ステレオシリンタンパク質をコードする核酸と置き換えられる。
【０１１６】
変異（複数可）及び／または欠失（複数可）を内因性遺伝子に導入するために使用され得る種々の分子生物学技法もまた、当該技術分野で既知である。かかる技法の非限定的な例としては、部位特異的変異誘発、ＣＲＩＳＰＲ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９誘導性ノックイン変異及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９誘導性ノックアウト変異）、及びＴＡＬＥＮが挙げられる。これらの方法を用いて、標的細胞の染色体に存在する欠陥のある内因性遺伝子の配列を補正することができる。
【０１１７】
本明細書に記載されるベクターのうちのいずれかは、調節配列、例えば、転写開始配列、転写終結配列、プロモーター配列、エンハンサー配列、ＲＮＡスプライシング配列、ポリアデニル化（ポリＡ）配列、及びコザックコンセンサス配列の群から選択される調節配列をさらに含み得る。これらの調節配列の非限定的な例が本明細書に記載される。一部の実施形態では、プロモーターは、ネイティブプロモーター、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、及び／または組織特異的プロモーターであり得る。
【０１１８】
プロモーター
「プロモーター」という用語は、特定の遺伝子（例えば、ステレオシリン遺伝子）の転写を開始するために必要とされる、哺乳類細胞における酵素／タンパク質によって認識されるＤＮＡ配列を意味する。プロモーターは典型的には、例えば、ＲＮＡポリメラーゼ及び／または任意の関連因子が結合し、転写が開始されるヌクレオチド配列を指す。プロモーターの非限定的な例が本明細書に記載される。プロモーターの追加の例は、当該技術分野で既知である。
【０１１９】
一部の実施形態では、ステレオシリンタンパク質（例えば、ヒトステレオシリンタンパク質）のＮ末端部分をコードするベクターは、プロモーター及び／またはエンハンサーを含み得る。ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分をコードするベクターは、本明細書に記載されるかまたは当該技術分野で既知のプロモーター及び／またはエンハンサーのうちのいずれかを含み得る。
【０１２０】
一部の実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、哺乳類細胞プロモーター、ウイルスプロモーター、キメラプロモーター、操作されたプロモーター、組織特異的プロモーター、または当該技術分野で既知の任意の他の種類のプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、哺乳類ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター等のＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、Ｈ１プロモーター、ヒトＵ６プロモーター、マウスＵ６プロモーター、またはブタＵ６プロモーターを含むが、これらに限定されない、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。プロモーターは一般に、有毛細胞等の蝸牛細胞において転写を促進することができるものであろう。一部の例では、プロモーターは、蝸牛特異的プロモーターまたは蝸牛指向性プロモーターである。
【０１２１】
本明細書で使用され得る様々なプロモーターが当該技術分野で既知である。本明細書で使用され得るプロモーターの非限定的な例としては、ヒトＥＦ１ａ、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（米国特許第５，１６８，０６２号）、ヒトユビキチンＣ（ＵＢＣ）、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ１、ポリオーマアデノウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、β−グロビン、β−アクチン、α−フェトプロテイン、γ−グロビン、β−インターフェロン、γ−グルタミルトランスフェラーゼ、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス、ラットインスリン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、メタロチオネインＩＩ（ＭＴ  ＩＩ）、アミラーゼ、カテプシン、ＭＩムスカリン受容体、レトロウイルスＬＴＲ（例えば、ヒトＴ細胞性白血病ウイルスＨＴＬＶ）、ＡＡＶ  ＩＴＲ、インターロイキン−２、コラゲナーゼ、血小板由来成長因子、アデノウイルス５  Ｅ２、ストロメリシン、マウスＭＸ遺伝子、グルコース制御タンパク質（ＧＲＰ７８及びＧＲＰ９４）、α−２−マクログロブリン、ビメンチン、ＭＨＣクラスＩ遺伝子Ｈ−２κ  ｂ、ＨＳＰ７０、プロリフェリン、腫瘍壊死因子、甲状腺刺激ホルモンα遺伝子、免疫グロブリン軽鎖、Ｔ細胞受容体、ＨＬＡ  ＤＱα及びＤＱβ、インターロイキン−２受容体、ＭＨＣクラスＩＩ、ＭＨＣクラスＩＩ  ＨＬＡ−ＤＲα、筋クレアチンキナーゼ、プレアルブミン（トランスチレチン）、エラスターゼＩ、アルブミン遺伝子、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ＨＡ−ｒａｓ、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、Ｈ２Ｂ（ＴＨ２Ｂ）ヒストン、ラット成長ホルモン、ヒト血清アミロイド（ＳＡＡ）、トロポニンＩ（ＴＮ  Ｉ）、デュシェンヌ筋ジストロフィー、ヒト免疫不全ウイルス、ならびにテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）プロモーターが挙げられる。プロモーターの追加の例は、当該技術分野で既知である。例えば、Ｌｏｄｉｓｈ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２００７を参照されたい。一部の実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶ最初期プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、例えば、配列番号２１を含むか、またはそれからなるＣＭＶプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ＣＡＧプロモーターまたはＣＡＧ／ＣＢＡプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ＣＢＡプロモーター、例えば、配列番号２２を含むか、またはそれからなるＣＢＡプロモーターである。
【０１２２】
「構成的」プロモーターという用語は、タンパク質（例えば、ステレオシリンタンパク質）をコードする核酸に作動可能に連結された際に、ほとんどまたは全ての生理的条件下で哺乳類細胞において核酸からのＲＮＡの転写を引き起こすヌクレオチド配列を指す。
【０１２３】
構成的プロモーターの例としては、限定されないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  ４１：５２１−５３０，１９８５を参照されたい）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、ベータ−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びＥＦ１−アルファプロモーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる。
【０１２４】
誘導性プロモーターは遺伝子発現の制御を可能にし、外因性で供給される化合物、温度等の環境因子、もしくは特定の生理的状態、例えば、急性期、細胞の特定の分化状態の存在によって、または複製中の細胞においてのみ制御され得る。誘導性プロモーター及び誘導系は、限定されないが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、及びＡｒｉａｄを含めた、様々な商業的供給源から入手可能である。誘導性プロモーターの追加の例は、当該技術分野で既知である。
【０１２５】
外因性で供給される化合物によって制御される誘導性プロモーターの例としては、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（ＷＯ９８／１００８８）；エクジソン昆虫プロモーター（Ｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：３３４６−３３５１，１９９６）、テトラサイクリン抑制系（Ｇｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：５５４７−５５５１，１９９２）、テトラサイクリン誘導系（Ｇｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：１７６６−１７６９，１９９５、また、Ｈａｒｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：５１２−５１８，１９９８も参照されたい）、ＲＵ４８６誘導系（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：２３９−２４３，１９９７）及びＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：４３２−４４１，１９９７）、及びラパマイシン誘導系（Ｍａｇａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：２８６５−２８７２，１９９７）が挙げられる。
【０１２６】
「組織特異的」プロモーターという用語は、ある特定の細胞型及び／または組織においてのみ活性なプロモーターを指す（例えば、特定の遺伝子の転写が、組織特異的プロモーターに結合する転写制御タンパク質を発現する細胞内でのみ生じる）。
【０１２７】
一部の実施形態では、制御配列は、組織特異的遺伝子発現能を与える。一部の実例では、組織特異的制御配列は、組織特異的様態で転写を誘導する組織特異的転写因子に結合する。
【０１２８】
例示的な組織特異的プロモーターには、以下のもの、すなわち、肝臓特異的チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、インスリンプロモーター、グルカゴンプロモーター、ソマトスタチンプロモーター、膵ポリペプチド（ＰＰＹ）プロモーター、シナプシン−１（Ｓｙｎ）プロモーター、クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、哺乳類デスミン（ＤＥＳ）プロモーター、アルファ−ミオシン重鎖（ａ−ＭＨＣ）プロモーター、及び心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。追加の例示的なプロモーターには、ベータ−アクチンプロモーター、Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター（Ｓａｎｄｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：１００２−１００９，１９９６）、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーター（Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１５０３−１５１４，１９９６）、骨オステオカルシンプロモーター（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．２４：１８５−１９６，１９９７）；骨シアロタンパク質プロモーター（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１１：６５４−６６４，１９９６）、ＣＤ２プロモーター（Ｈａｎｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：１０６３−１０６８，１９９８）；免疫グロブリン重鎖プロモーター；Ｔ細胞受容体アルファ鎖プロモーター、神経細胞、例えば神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１３：５０３−５１５，１９９３）、神経フィラメント軽鎖遺伝子プロモーター（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：５６１１−５６１５，１９９１）、及び神経特異的ｖｇｆ遺伝子プロモーター（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  １５：３７３−３８４，１９９５）が含まれる。
【０１２９】
一部の実施形態では、組織特異的プロモーターは、蝸牛特異的プロモーターである。一部の実施形態では、組織特異的プロモーターは、蝸牛有毛細胞特異的プロモーターである。蝸牛有毛細胞特異的プロモーターの非限定的な例としては、ＡＴＯＨ１プロモーター、ＰＯＵ４Ｆ３プロモーター、ＬＨＸ３プロモーター、ＭＹＯ７Ａプロモーター、ＭＹＯ６プロモーター、α９ＡＣＨＲプロモーター、及びα１０ＡＣＨＲプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、プロモーターは、ＰＲＥＳＴＩＮプロモーターまたはＯＮＣＯＭＯＤプロモーター等の外有毛細胞特異的プロモーターである。例えば、Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０５：１４９−１５５，２０００、Ｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２３１：１９９−２０３，２００４、及びＲｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｏｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｙｎｇｏｌ．６６：９９−１１５，２００９を参照されたい。
【０１３０】
エンハンサー及び５’キャップ
一部の事例では、ベクターは、プロモーター配列及び／またはエンハンサー配列を含み得る。「エンハンサー」という用語は、目的とするタンパク質（例えば、ステレオシリンタンパク質）をコードする核酸の転写レベルを増加させることができるヌクレオチド配列を指す。エンハンサー配列（５０〜１５００塩基対の長さ）は一般に、転写関連タンパク質（例えば、転写因子）に追加の結合部位を提供することによって転写レベルを増加させる。一部の実施形態では、エンハンサー配列は、イントロン配列内に見出される。プロモーター配列とは異なり、エンハンサー配列は、転写開始部位から（例えば、プロモーターと比較して）はるかに遠く離れて作用することができる。エンハンサーの非限定的な例としては、ＲＳＶエンハンサー、ＣＭＶエンハンサー、及びＳＶ４０エンハンサーが挙げられる。一部の実施形態では、ＣＭＶエンハンサー配列は、配列番号２０を含むか、またはそれからなる。
【０１３１】
ポリ（Ａ）配列
一部の実施形態では、本明細書に提供されるベクターのうちのいずれかは、ポリ（Ａ）配列を含み得る。真核生物のほとんどの新生ｍＲＮＡは、それらの３’末端に、一次転写産物の切断及び共役したポリアデニル化反応を含む複合プロセス中に付加される、ポリ（Ａ）テールを持つ（例えば、Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １０８：５０１−５１２，２００２を参照されたい）。ポリ（Ａ）テールは、ｍＲＮＡ安定性及び移行性を付与する（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｂ．Ａｌｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９９４）。一部の実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、ステレオシリンタンパク質のＣ末端をコードする核酸配列に対して３’側に位置付けられる。
【０１３２】
本明細書で使用されるとき、「ポリアデニル化」は、メッセンジャーＲＮＡ分子への、ポリアデニリル（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌｙｌ）部分、またはその修飾バリアントの共有結合を指す。真核生物において、ほとんどのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子は、３’末端でポリアデニル化される。３’ポリ（Ａ）テールは、酵素であるポリアデニル酸ポリメラーゼの作用によりプレｍＲＮＡに付加される、アデニンヌクレオチドの長い連なり（例えば、５０、６０、７０、１００、２００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、または５０００）である。より高等の真核生物においては、ポリ（Ａ）テールは、特定の配列であるポリアデニル化シグナルまたは「ポリ（Ａ）配列」を含有する転写産物に付加される』ポリ（Ａ）テール及びそれに結合したタンパク質は、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼによる分解から保護するのを助ける。ポリアデニル化はまた、転写終結、ｍＲＮＡの核外への搬出、及び翻訳にも重要である。ポリアデニル化は、ＤＮＡのＲＮＡへの転写直後に核内で生じるが、追加として、より後で細胞質においても生じ得る。転写が終結した後、ｍＲＮＡ鎖は、ＲＮＡポリメラーゼに関連するエンドヌクレアーゼ複合体の作用により切断される。切断部位は通常、切断部位の近くにある塩基配列ＡＡＵＡＡＡの存在を特徴とする。ｍＲＮＡが切断された後、アデノシン残基が切断部位の空いている３’末端に付加される。
【０１３３】
本明細書で使用されるとき、「ポリ（Ａ）配列」は、ｍＲＮＡのエンドヌクレアーゼ切断及び切断されたｍＲＮＡの３’末端への一連のアデノシンの付加を誘発する配列である。
【０１３４】
使用され得るいくつかのポリ（Ａ）配列が存在し、これには、ウシ成長ホルモン（ｂｇｈ）（Ｗｏｙｃｈｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１（１３）：３９４４−３９４８，１９８４、米国特許第５，１２２，４５８号）、マウス−β−グロビン、マウス−α−グロビン（Ｏｒｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．４（２）：４５３−４５６，１９８５、Ｔｈｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ７１（２）：３１３−３１９，１９８８）、ヒトコラーゲン、ポリオーマウイルス（Ｂａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５（９）：４７８３−４７９０，１９９５）、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ  ＴＫ）、ＩｇＧ重鎖遺伝子ポリアデニル化シグナル（ＵＳ２００６／００４０３５４）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）（Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ  １５（７）：１３４０−１３４７，２００７）、ＳＶ４０後期及び初期ポリ（Ａ）部位等のＳＶ４０ポリ（Ａ）部位からなる群（Ｓｃｈｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２（１２）：５３８６−５３９３，１９９２）に由来するものが含まれる。一部の実施形態では、ｂＧＨポリＡ配列は、配列番号３４を含むか、またはそれからなる。
【０１３５】
ポリ（Ａ）配列は、ＡＡＴＡＡＡの配列であり得る。ＡＡＴＡＡＡ配列は、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ、ＣＡＴＡＡＡ、ＴＡＴＡＡＡ、ＧＡＴＡＡＡ、ＡＣＴＡＡＡ、ＡＡＴＡＴＡ、ＡＡＧＡＡＡ、ＡＡＴＡＡＴ、ＡＡＡＡＡＡ、ＡＡＴＧＡＡ、ＡＡＴＣＡＡ、ＡＡＣＡＡＡ、ＡＡＴＣＡＡ、ＡＡＴＡＡＣ、ＡＡＴＡＧＡ、ＡＡＴＴＡＡ、またはＡＡＴＡＡＧを含めた、ポリアデニル化をシグナル伝達することが可能な、ＡＡＴＡＡＡに対して相同性を有する他のヘキサヌクレオチド配列と置換されてもよい（例えば、ＷＯ０６／１２４１４を参照されたい）。
【０１３６】
一部の実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、合成ポリアデニル化シグナル部位である（例えば、Ｌｅｖｉｔｔ  ｅｌ  ａｌ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３（７）：１０１９−１０２５，１９８９を参照されたい）。一部の実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、可溶性ニューロピリン−１（ｓＮＲＰ）（ＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＣＧＡＡＡＴＧ、配列番号３８）のポリアデニル化シグナルである（例えば、ＷＯ０５／０７３３８４を参照されたい）。ポリ（Ａ）配列の追加の例は、当該技術分野で既知である。
【０１３７】
内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）
一部の実施形態では、ステレオシリンタンパク質のＣ末端をコードするベクターは、ポリヌクレオチド内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含み得る。ＩＲＥＳ配列は、単一の遺伝子転写産物から１つよりも多くのポリペプチドを生産するために使用される。ＩＲＥＳは、ＩＲＥＳが位置する場所からすぐ下流のｍＲＮＡでの任意の位置から翻訳開始が起こることを可能にする、複雑な二次構造を形成する（例えば、Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８（３）：１１０３−１１１２，１９８８を参照されたい）。
【０１３８】
例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）、コオロギ麻痺ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、及びポリオウイルス（ＰＶ）からのＩＲＥＳ配列を含めた、当業者に既知のいくつかのＩＲＥＳ配列が存在する。例えば、Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２、及びＨｅｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５（１３）：１５９３−６１２，２００１を参照されたい。
【０１３９】
一部の実施形態では、ステレオシリンタンパク質のＣ末端をコードするベクターに組み込まれるＩＲＥＳ配列は、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）である。口蹄疫ウイルス２Ａ配列は、ポリタンパク質の切断を媒介することが示された低分子ペプチド（およそ１８アミノ酸の長さ）である（Ｒｙａｎ，Ｍ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  ４：９２８−９３３，１９９４、Ｍａｔｔｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７０：８１２４−８１２７，１９９６、Ｆｕｒｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：８６４−８７３，２００１、及びＨａｌｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ４：４５３−４５９，１９９９）。２Ａ配列の切断活性は、プラスミド及び遺伝子療法ベクター（ＡＡＶ及びレトロウイルス）を含む人工系において以前に実証された（Ｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  ４：９２８−９３３，１９９４、Ｍａｔｔｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７０：８１２４−８１２７，１９９６、Ｆｕｒｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：８６４−８７３，２００１、及びＨａｌｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ４：４５３−４５９，１９９９、ｄｅ  Ｆｅｌｉｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６：１９８−２０８，１９９９、ｄｅ  Ｆｅｌｉｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １１：１９２１−１９３１，２０００、及びＫｌｕｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：８１１−８１７，２００１）。
【０１４０】
レポーター配列
本明細書に提供されるベクターのうちのいずれかは任意選択で、レポータータンパク質をコードする配列（「レポーター配列」）を含み得る。レポーター配列の非限定的な例としては、ベータ−ラクタマーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、及びルシフェラーゼをコードするＤＮＡ配列が挙げられる。レポーター配列の追加の例は、当該技術分野で既知である。レポーター配列の発現を駆動する制御エレメントに関連付けられた際、レポーター配列は、酵素、Ｘ線撮影、比色、蛍光、または他の分光撮影アッセイ；蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）アッセイ；免疫学的アッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、及び免疫組織化学法）を含めた従来の手段によって検出可能なシグナルを提供することができる。
【０１４１】
一部の実施形態では、レポーター配列は、ターボ緑色蛍光タンパク質（ｔＧＦＰ）（配列番号３１）である。
【０１４２】
ｔＧＦＰ  ｃＤＮＡ（配列番号３１）
【化４６】
2021530227.tif 000048
【０１４３】
ｔＧＦＰタンパク質（配列番号３２）
【化４７】
2021530227.tif 000049
【０１４４】
一部の実施形態では、レポーター配列は、ＬａｃＺ遺伝子であり、哺乳類細胞（例えば、蝸牛外有毛細胞）における、ＬａｃＺ遺伝子を運搬するベクターの存在が、ベータ−ガラクトシダーゼ活性に関してアッセイによって検出される。他の実施形態では、レポーターは、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質）またはルシフェラーゼであり、哺乳類細胞（例えば、蝸牛外有毛細胞）における、蛍光タンパク質またはルシフェラーゼを運搬するベクターの存在が、蛍光技法（例えば、蛍光顕微鏡法またはＦＡＣＳ）により、またはルミノメーター（例えば、分光光度計またはＩＶＩＳ撮像装置）において光生産により測定されてもよい。一部の実施形態では、レポーター配列を用いて、本明細書に記載されるベクターのうちのいずれかの組織特異的標的化能力及び組織特異的プロモーター制御活性を検証することができる。
【０１４５】
隣接領域非翻訳領域（ＵＴＲ）
一部の実施形態では、本明細書に記載されるベクターのうちのいずれか（例えば、該少なくとも２つの異なるベクターのうちのいずれか）は、非翻訳領域を含み得る。一部の実施形態では、ベクターは、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲを含み得る。
【０１４６】
遺伝子の非翻訳領域（ＵＴＲ）は、転写されるが、翻訳はされない。５’ＵＴＲは、転写開始部位で開始し、開始コドンまで継続するが、開始コドンは含まない。３’ＵＴＲは、終止コドンの直後から開始し、転写終結シグナルまで継続する。核酸分子の安定性及び翻訳の点でＵＴＲが果たす制御性の役割についての証拠が増えてきている。ＵＴＲの制御性特徴は、ステレオシリンタンパク質の安定性を強化するために、本明細書に記載されるようなベクター、組成物、キット、または方法のうちのいずれかに組み込むことができる。
【０１４７】
天然の５’ＵＴＲは、翻訳開始において役割を果たす配列を含む。それらは、リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与することが一般に知られている、コザック配列のようなシグネチャを含有する。コザック配列は、コンセンサス配列ＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧを有し、ここで、Ｒは、開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のプリン（ＡまたはＧ）であり、この後には別の「Ｇ」が続く。５’ＵＴＲはまた、例えば、伸長因子の結合に関与する二次構造を形成することが知られている。
【０１４８】
例えば、一部の実施形態では、５’ＵＴＲが、本明細書に記載されるベクターのうちのいずれかに含まれる。以下の遺伝子、すなわち、アルブミン、血清アミロイドＡ、アポリポタンパク質Ａ／Ｂ／Ｅ、トランスフェリン、アルファフェトプロテイン、エリスロポエチン、及び第ＶＩＩＩ因子からの５’ＵＴＲを含めた、５’ＵＴＲの非限定的な例を用いて、ｍＲＮＡ等の核酸分子の発現を強化することができる。
【０１４９】
一部の実施形態では、蝸牛内の細胞によって転写されるｍＲＮＡからの５’ＵＴＲが、本明細書に記載されるベクター、組成物、キット、及び方法のうちのいずれかに含まれ得る。
【０１５０】
３’ＵＴＲは、それらの中に埋め込まれた一続きのアデノシン及びウリジンを有することが知られている。これらのＡＵリッチシグネチャは、高い回転率を有する遺伝子において特に広く見られる。それらの配列特徴及び機能的特性に基づいて、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）は、下記の３つの部類に分離することができる（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：５７７７−５７８８，１９９５；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５：２０１０−２０１８，１９９５）。クラスＩ  ＡＲＥは、Ｕリッチ領域内にＡＵＵＵＡモチーフのいくつかの分散したコピーを含有する。例えば、ｃ−Ｍｙｃ及びＭｙｏＤ  ｍＲＮＡは、クラスＩ  ＡＲＥを含有する。クラスＩＩ  ＡＲＥは、２つ以上の重複するＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）九量体を持つ。ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−アルファｍＲＮＡは、クラスＩＩ  ＡＲＥを含有する例である。クラスＩＩＩ  ＡＲＥは、あまりよく定義されていない。これらのＵリッチ領域は、ＡＵＵＵＡモチーフを含有しない。このクラスの２つのよく研究された例は、ｃ−Ｊｕｎ及びミオゲニンｍＲＮＡである。
【０１５１】
ＡＲＥに結合するほとんどのタンパク質は、メッセンジャーを不安定にすることが知られているが、一方で、ＥＬＡＶファミリーのメンバー、とりわけＨｕＲは、ｍＲＮＡの安定性を増加させることが実証された。ＨｕＲは、これら３つのクラス全てのＡＲＥに結合する。ＨｕＲ特異的結合部位を核酸分子の３’ＵＴＲに導入操作することにより、ＨｕＲ結合、ひいてはインビボでのメッセージの安定化がもたらされよう。
【０１５２】
例示的なヒト野生型５’ＵＴＲは、配列番号２４の配列であるか、またはそれを含む。例示的なヒト野生型３’ＵＴＲは、配列番号３３の配列であるか、またはそれを含む。
【０１５３】
本明細書に記載される組成物のうちのいずれかの一部の実施形態では、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、または両方が、ベクター（例えば、本明細書に記載されるベクターのうちのいずれか）に含まれる。例えば、本明細書に記載される５’ＵＴＲのうちのいずれかを、本明細書に記載されるコード配列のうちのいずれかにおいて開始コドンに作動的に連結することができる。例えば、３’ＵＴＲのうちのいずれかを、本明細書に記載されるコード配列のうちのいずれかにおいて３’末端コドン（最後のコドン）に作動的に連結することができる。
【０１５４】
本明細書に記載される組成物のうちのいずれかの一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、配列番号２４内の任意の箇所からの少なくとも１０個の連続（例えば、少なくとも１５個の連続、少なくとも２０個の連続、少なくとも２５個の連続、少なくとも３０個の連続、少なくとも３５個の連続、少なくとも４０個の連続、少なくとも４５個の連続、少なくとも５０個の連続、少なくとも５５個の連続、少なくとも６０個の連続、少なくとも６５個の連続、または少なくとも７０個の連続）ヌクレオチドを含む。
【０１５５】
例えば、５’ＵＴＲは、配列番号２４のヌクレオチド１〜７０位、ヌクレオチド１〜６０位、ヌクレオチド１〜５０位、ヌクレオチド１〜４０位、ヌクレオチド１〜３０位、ヌクレオチド１〜２０位、ヌクレオチド１〜１０位、ヌクレオチド１０〜７０位、ヌクレオチド１０〜６０位、ヌクレオチド１０〜５０位、ヌクレオチド１０〜４０位、ヌクレオチド１０〜３０位、ヌクレオチド１０〜２０位、ヌクレオチド２０〜７０位、ヌクレオチド２０〜６０位、ヌクレオチド２０〜５０位、ヌクレオチド２０〜４０位、ヌクレオチド２０〜３０位、ヌクレオチド３０〜７０位、ヌクレオチド３０〜６０位、ヌクレオチド３０〜５０位、ヌクレオチド３０〜４０位、ヌクレオチド４０〜７０位、ヌクレオチド４０〜６０位、ヌクレオチド４０〜５０位、ヌクレオチド５０〜７０位、ヌクレオチド５０〜６０位、ヌクレオチド６０〜７０位、ヌクレオチド１００〜１０５位のうちの１つまたは複数を含み得るか、またはそれからなり得る。
【０１５６】
本明細書に記載される組成物のうちのいずれかの一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、配列番号２４と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）同一である配列を含む。
【０１５７】
本明細書に記載される組成物のうちのいずれかの一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号３３内の任意の箇所からの少なくとも１０個の連続（例えば、少なくとも１５個の連続、少なくとも２０個の連続、少なくとも２５個の連続、少なくとも３０個の連続、少なくとも３５個の連続、少なくとも４０個の連続、少なくとも４５個の連続、少なくとも５０個の連続、少なくとも５５個の連続、少なくとも６０個の連続、少なくとも６５個の連続、少なくとも７０個の連続、少なくとも７５個の連続、少なくとも８０個の連続、少なくとも８５個の連続、少なくとも９０個の連続、少なくとも９５個の連続、少なくとも１００個の連続、または少なくとも１０５個の連続）ヌクレオチドを含む。
【０１５８】
例えば、３’ＵＴＲは、配列番号３３のヌクレオチド１〜１０７位、ヌクレオチド１〜１０５位、ヌクレオチド１〜１００位、ヌクレオチド１〜９０位、ヌクレオチド１〜８０位、ヌクレオチド１〜７０位、ヌクレオチド１〜６０位、ヌクレオチド１〜５０位、ヌクレオチド１〜４０位、ヌクレオチド１〜３０位、ヌクレオチド１〜２０位、ヌクレオチド１〜１０位、ヌクレオチド１０〜１０７位、ヌクレオチド１０〜１０５位、ヌクレオチド１０〜１００位、ヌクレオチド１０〜９０位、ヌクレオチド１０〜８０位、ヌクレオチド１０〜７０位、ヌクレオチド１０〜６０位、ヌクレオチド１０〜５０位、ヌクレオチド１０〜４０位、ヌクレオチド１０〜３０位、ヌクレオチド１０〜２０位、ヌクレオチド２０〜１０７位、ヌクレオチド２０〜１０５位、ヌクレオチド２０〜１００位、ヌクレオチド２０〜９０位、ヌクレオチド２０〜８０位、ヌクレオチド２０〜７０位、ヌクレオチド２０〜６０位、ヌクレオチド２０〜５０位、ヌクレオチド２０〜４０位、ヌクレオチド２０〜３０位、ヌクレオチド３０〜１０７位、ヌクレオチド３０〜１０５位、ヌクレオチド３０〜１００位、ヌクレオチド３０〜９０位、ヌクレオチド３０〜８０位、ヌクレオチド３０〜７０位、ヌクレオチド３０〜６０位、ヌクレオチド３０〜５０位、ヌクレオチド３０〜４０位、ヌクレオチド４０〜１０７位、ヌクレオチド４０〜１０５位、ヌクレオチド４０〜１００位、ヌクレオチド４０〜９０位、ヌクレオチド４０〜８０位、ヌクレオチド４０〜７０位、ヌクレオチド４０〜６０位、ヌクレオチド４０〜５０位、ヌクレオチド５０〜１０７位、ヌクレオチド５０〜１０５位、ヌクレオチド５０〜１００位、ヌクレオチド５０〜９０位、ヌクレオチド５０〜８０位、ヌクレオチド５０〜７０位、ヌクレオチド５０〜６０位、ヌクレオチド６０位〜、ヌクレオチド６０〜１０７位、ヌクレオチド６０〜１０５位、ヌクレオチド６０〜１００位、ヌクレオチド６０〜９０位、ヌクレオチド６０〜８０位、ヌクレオチド６０〜７０位、ヌクレオチド７０〜１０７位、ヌクレオチド７０〜１０５位、ヌクレオチド７０〜１００位、ヌクレオチド７０〜９０位、ヌクレオチド７０〜８０位、ヌクレオチド８０〜１０７位、ヌクレオチド８０〜１０５位、ヌクレオチド８０〜１００位、ヌクレオチド８０〜９０位、ヌクレオチド９０〜１０７位、ヌクレオチド９０〜１０５位、ヌクレオチド９０〜１００位、ヌクレオチド１００〜１０７位、ヌクレオチド１００〜１０５位のうちの１つまたは複数を含み得るか、またはそれからなり得る。
【０１５９】
本明細書に記載される組成物のうちのいずれかの一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号３３と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）同一である配列を含む。
【０１６０】
ＳＴＲＣのヒト５’ＵＴＲ（配列番号２４）
【化４８】
2021530227.tif 000050
【０１６１】
ＳＴＲＣのヒト３’ＵＴＲ（配列番号３３）
【化４９】
2021530227.tif 000051
【０１６２】
一部の実施形態では、３’ＵＴＲ  ＡＲＥの導入、除去、または修飾を用いて、ステレオシリンタンパク質をコードするｍＲＮＡの安定性を調節することができる。他の実施形態では、ＡＲＥを除去するか、または変異させて、ステレオシリンタンパク質の細胞内安定性を増加させ、ひいてはその翻訳及び生産を増加させることができる。
【０１６３】
他の実施形態では、非ＵＴＲ配列が５’または３’ＵＴＲに組み込まれてもよい。一部の実施形態では、イントロンまたはイントロン配列の一部分が、本明細書に提供されるベクター、組成物、キット、及び方法のうちのいずれかにおいて、該ポリヌクレオチドの隣接領域に組み込まれてもよい。イントロン配列の組み込みは、ｍＲＮＡレベルと同様に、タンパク質生産を増加させ得る。イントロンは、ステレオシリン遺伝子からのイントロンであり得るか、または、異種遺伝子からのイントロン、例えば、ハイブリッドアデノウイルス／マウス免疫グロブリンイントロン（Ｙｅｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｅｒ．８（５）：５７５−５８４，１９９７）、ＳＶ４０イントロン（Ｏｓｔｅｄｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０２（８）：２９５２−２９５７，２００５）、ＭＶＭイントロン（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６（２）：２８０−２８９，２００８）、第ＩＸ因子短縮型イントロン１（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６（２）：２８０−２８９，２００８、Ｋｕｒａｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１０）：５２７６−５２８１，１９９５）、キメラβ−グロブリンスプライスドナー／免疫グロブリン重鎖スプライスアクセプターイントロン（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６（２）：２８０−２８９，２００８、Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ  ７：１７，２０１４）、ＳＶ４０後期スプライスドナー／スプライスアクセプターイントロン（１９Ｓ／１６Ｓ）（Ｙｅｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８（５）：５７５−５８４，１９９７）、ハイブリッドアデノウイルススプライスドナー／ＩｇＧスプライスアクセプター（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ  ７：１７，１９９１、Ｈｕａｎｇ  ａｎｄ  Ｇｏｒｍａｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０（４）：１８０５−１８１０，１９９０）であり得る。
【０１６４】
スプライスドナー及びスプライスアクセプター配列の非限定的な例は、それぞれ配列番号６及び７である。
【０１６５】
本明細書に記載されるベクターのうちのいずれかの一部の実施形態では、ベクターは、キメライントロン配列（配列番号２３）を含む。
【０１６６】
本明細書に記載されるベクターのうちのいずれかの一部の実施形態では、ベクターは、Ｔ２Ａ配列（配列番号２９）を含む。
【０１６７】
Ｔ２Ａ  ｃＤＮＡ配列（配列番号２９）
【化５０】
2021530227.tif 000052
【０１６８】
Ｔ２Ａタンパク質（配列番号３０）
【化５１】
2021530227.tif 000053
【０１６９】
追加の配列
本明細書に提供されるベクターのうちのいずれかは、任意選択で、ベクターにおける塩基対の総数を最適化するために追加のヌクレオチド配列（「スタッファー配列」）を含み得る。例えば、パッケージングを最適化するために、各ベクターは、総計約４，０００塩基対〜約４，７００塩基対、例えば、約４，０００塩基対〜約４，６５０塩基対、約４，０００塩基対〜約４，６００塩基対、約４，０００塩基対〜約４，５５０塩基対、約４，０００塩基対〜約４，５００塩基対、約４，０００塩基対〜約４，４５０塩基対、約４，０００塩基対〜約４，４００塩基対、約４，０００塩基対〜約４，３５０塩基対、約４，０００塩基対〜約４，３００塩基対、約４，０００塩基対〜約４，２５０塩基対、約４，０００塩基対〜約４，２００塩基対、約４，０００塩基対〜約４，１５０塩基対、約４，０００塩基対〜約４，１００塩基対、約４，０００塩基対〜約４，０５０塩基対、約４，０５０塩基対〜約４，７００塩基対、約４，０５０塩基対〜約４，６５０塩基対、約４，０５０塩基対〜約４，６００塩基対、約４，０５０塩基対〜約４，５５０塩基対、約４，０５０塩基対〜約４，５００塩基対、約４，０５０塩基対〜約４，４５０塩基対、約４，０５０塩基対〜約４，４００塩基対、約４，０５０塩基対〜約４，３５０塩基対、約４，０５０塩基対〜約４，３００塩基対、約４，０５０塩基対〜約４，２５０塩基対、約４，０５０塩基対〜約４，２００塩基対、約４，０５０塩基対〜約４，１５０塩基対、約４，０５０塩基対〜約４，１００塩基対、約４，１００塩基対〜約４，７００塩基対、約４，１００塩基対〜約４，６５０塩基対、約４，１００塩基対〜約４，６００塩基対、約４，１００塩基対〜約４，５５０塩基対、約４，１００塩基対〜約４，５００塩基対、約４，１００塩基対〜約４，４５０塩基対、約４，１００塩基対〜約４，４００塩基対、約４，１００塩基対〜約４，３５０塩基対、約４，１００塩基対〜約４，３００塩基対、約４，１００塩基対〜約４，２５０塩基対、約４，１００塩基対〜約４，２００塩基対、約４，１００塩基対〜約４，１５０塩基対、約４，１５０塩基対〜約４，７００塩基対、約４，１５０塩基対〜約４，６５０塩基対、約４，１５０塩基対〜約４，６００塩基対、約４，１５０塩基対〜約４，５５０塩基対、約４，１５０塩基対〜約４，５００塩基対、約４，１５０塩基対〜約４，４５０塩基対、約４，１５０塩基対〜約４，４００塩基対、約４，１５０塩基対〜約４，３５０塩基対、約４，１５０塩基対〜約４，３００塩基対、約４，１５０塩基対〜約４，２５０塩基対、約４，１５０塩基対〜約４，２００塩基対、約４，２００塩基対〜約４，７００塩基対、約４，２００塩基対〜約４，６５０塩基対、約４，２００塩基対〜約４，６００塩基対、約４，２００塩基対〜約４，５５０塩基対、約４，２００塩基対〜約４，５００塩基対、約４，２００塩基対〜約４，４５０塩基対、約４，２００塩基対〜約４，４００塩基対、約４，２００塩基対〜約４，３５０塩基対、約４，２００塩基対〜約４，３００塩基対、約４，２００塩基対〜約４，２５０塩基対、約４，２５０塩基対〜約４，７００塩基対、約４，２５０塩基対〜約４，６５０塩基対、約４，２５０塩基対〜約４，６００塩基対、約４，２５０塩基対〜約４，５５０塩基対、約４，２５０塩基対〜約４，５００塩基対、約４，２５０塩基対〜約４，４５０塩基対、約４，２５０塩基対〜約４，４００塩基対、約４，２５０塩基対〜約４，３５０塩基対、約４，２５０塩基対〜約４，３００塩基対、約４，３００塩基対〜約４，７００塩基対、約４，３００塩基対〜約４，６５０塩基対、約４，３００塩基対〜約４，６００塩基対、約４，３００塩基対〜約４，５５０塩基対、約４，３００塩基対〜約４，５００塩基対、約４，３００塩基対〜約４，４５０塩基対、約４，３００塩基対〜約４，４００塩基対、約４，３００塩基対〜約４，３５０塩基対、約４，３５０塩基対〜約４，７００塩基対、約４，３５０塩基対〜約４，６５０塩基対、約４，３５０塩基対〜約４，６００塩基対、約４，３５０塩基対〜約４，５５０塩基対、約４，３５０塩基対〜約４，５００塩基対、約４，３５０塩基対〜約４，４５０塩基対、約４，３５０塩基対〜約４，４００塩基対、約４，４００塩基対〜約４，７００塩基対、約４，４００塩基対〜約４，６５０塩基対、約４，４００塩基対〜約４，６００塩基対、約４，４００塩基対〜約４，５５０塩基対、約４，４００塩基対〜約４，５００塩基対、約４，４００塩基対〜約４，４５０塩基対、約４，４５０塩基対〜約４，７００塩基対、約４，４５０塩基対〜約４，６５０塩基対、約４，４５０塩基対〜約４，６００塩基対、約４，４５０塩基対〜約４，５５０塩基対、約４，４５０塩基対〜約４，５００塩基対、約４，５００塩基対〜約４，７００塩基対、約４，５００塩基対〜約４，６５０塩基対、約４，５００塩基対〜約４，６００塩基対、約４，５００塩基対〜約４，５５０塩基対、約４，５５０塩基対〜約４，７００塩基対、約４，５５０塩基対〜約４，６５０塩基対、約４，５５０塩基対〜約４，６００塩基対、約４，６００塩基対〜約４，７００塩基対、約４，６００塩基対〜約４，６５０塩基対、または約４，６５０塩基対〜約４，７００塩基対（境界値を含む）を含有するように設計され得る。
【０１７０】
スタッファー配列は、望ましいベクターサイズ（例えば、約４ｋｂ〜約５ｋｂのベクターサイズ、または本明細書に提供されるベクターサイズのうちのいずれか）を達成するために、本明細書に記載されるベクターのうちのいずれかに含めることができる、転写されておらず、かつ制御機能を果たさない、例えば最大１０００ｂｐの、任意のヌクレオチド配列であり得る。例えば、スタッファー配列は、約１００ｂｐ〜約１０００ｂｐ（例えば、約１００ｂｐ〜約９００ｂｐ、約１００ｂｐ〜約８５０ｂｐ、約１００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約１００ｂｐ〜約７５０ｂｐ、約１００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約１００ｂｐ〜約６５０ｂｐ、約１００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約１００ｂｐ〜約５５０ｂｐ、約１００ｂｐ〜約５００ｂｐ、約１００ｂｐ〜約４５０ｂｐ、約１００ｂｐ〜約４００ｂｐ、約１００ｂｐ〜約３５０ｂｐ、約１００ｂｐ〜約３００ｂｐ、約１００ｂｐ〜約２５０ｂｐ、約１００ｂｐ〜約２００ｂｐ、約１００ｂｐ〜約１５０ｂｐ、約１５０ｂｐ〜約１０００ｂｐ、約１５０ｂｐ〜約９００ｂｐ、約１５０ｂｐ〜約８５０ｂｐ、約１５０ｂｐ〜約８００ｂｐ、約１５０ｂｐ〜約７５０ｂｐ、約１５０ｂｐ〜約７００ｂｐ、約１５０ｂｐ〜約６５０ｂｐ、約１５０ｂｐ〜約６００ｂｐ、約１５０ｂｐ〜約５５０ｂｐ、約１５０ｂｐ〜約５００ｂｐ、約１５０ｂｐ〜約４５０ｂｐ、約１５０ｂｐ〜約４００ｂｐ、約１５０ｂｐ〜約３５０ｂｐ、約１５０ｂｐ〜約３００ｂｐ、約１５０ｂｐ〜約２５０ｂｐ、約１５０ｂｐ〜約２００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約１０００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約９００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約８５０ｂｐ、約２００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約７５０ｂｐ、約２００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約６５０ｂｐ、約２００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約５５０ｂｐ、約２００ｂｐ〜約５００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約４５０ｂｐ、約２００ｂｐ〜約４００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約３５０ｂｐ、約２００ｂｐ〜約３００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約２５０ｂｐ、約２５０ｂｐ〜約１０００ｂｐ、約２５０ｂｐ〜約９００ｂｐ、約２５０ｂｐ〜約８５０ｂｐ、約２５０ｂｐ〜約８００ｂｐ、約２５０ｂｐ〜約７５０ｂｐ、約２５０ｂｐ〜約７００ｂｐ、約２５０ｂｐ〜約６５０ｂｐ、約２５０ｂｐ〜約６００ｂｐ、約２５０ｂｐ〜約５５０ｂｐ、約２５０ｂｐ〜約５００ｂｐ、約２５０ｂｐ〜約４５０ｂｐ、約２５０ｂｐ〜約４００ｂｐ、約２５０ｂｐ〜約３５０ｂｐ、約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約１０００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約９００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約８５０ｂｐ、約３００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約７５０ｂｐ、約３００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約６５０ｂｐ、約３００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約５５０ｂｐ、約３００ｂｐ〜約５００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約４５０ｂｐ、約３００ｂｐ〜約４００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約３５０ｂｐ、約３５０ｂｐ〜約１０００ｂｐ、約３５０ｂｐ〜約９００ｂｐ、約３５０ｂｐ〜約８５０ｂｐ、約３５０ｂｐ〜約８００ｂｐ、約３５０ｂｐ〜約７５０ｂｐ、約３５０ｂｐ〜約７００ｂｐ、約３５０ｂｐ〜約６５０ｂｐ、約３５０ｂｐ〜約６００ｂｐ、約３５０ｂｐ〜約５５０ｂｐ、約３５０ｂｐ〜約５００ｂｐ、約３５０ｂｐ〜約４５０ｂｐ、約３５０ｂｐ〜約４００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約１０００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約９００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約８５０ｂｐ、約４００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約７５０ｂｐ、約４００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約６５０ｂｐ、約４００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約５５０ｂｐ、約４００ｂｐ〜約５００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約４５０ｂｐ、約４５０ｂｐ〜約１０００ｂｐ、約４５０ｂｐ〜約９００ｂｐ、約４５０ｂｐ〜約８５０ｂｐ、約４５０ｂｐ〜約８００ｂｐ、約４５０ｂｐ〜約７５０ｂｐ、約４５０ｂｐ〜約７００ｂｐ、約４５０ｂｐ〜約６５０ｂｐ、約４５０ｂｐ〜約６００ｂｐ、約４５０ｂｐ〜約５５０ｂｐ、約４５０ｂｐ〜約５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約１０００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約９００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約８５０ｂｐ、約５００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約７５０ｂｐ、約５００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約６５０ｂｐ、約５００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約５５０ｂｐ、約５５０ｂｐ〜約１０００ｂｐ、約５５０ｂｐ〜約９００ｂｐ、約５５０ｂｐ〜約８５０ｂｐ、約５５０ｂｐ〜約８００ｂｐ、約５５０ｂｐ〜約７５０ｂｐ、約５５０ｂｐ〜約７００ｂｐ、約５５０ｂｐ〜約６５０ｂｐ、約５５０ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約１０００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約９００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約８５０ｂｐ、約６００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約７５０ｂｐ、約６００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約６５０ｂｐ、約６５０ｂｐ〜約１０００ｂｐ、約６５０ｂｐ〜約９００ｂｐ、約６５０ｂｐ〜約８５０ｂｐ、約６５０ｂｐ〜約８００ｂｐ、約６５０ｂｐ〜約７５０ｂｐ、約６５０ｂｐ〜約７００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約１０００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約９００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約８５０ｂｐ、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約７５０ｂｐ、約７５０ｂｐ〜約１０００ｂｐ、約７５０ｂｐ〜約９００ｂｐ、約７５０ｂｐ〜約８５０ｂｐ、約７５０ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約１０００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約９００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約８５０ｂｐ、約８５０ｂｐ〜約１０００ｂｐ、約８５０ｂｐ〜約９００ｂｐ、約９００ｂｐ〜約１０００ｂｐ、約９００〜約９５０ｂｐ、または約９５０ｂｐ〜約１０００ｂｐ）の任意のヌクレオチド配列であり得る。配列番号１９、３５、及び３７は、本明細書に記載されるベクターのうちのいずれかにおいて使用され得る例示的なヒト第ＦＶＩＩＩ因子スタッファー配列である。追加のスタッファー配列は、当該技術分野で既知である。スタッファー配列を含む例示的なベクターが、図１、２、及び４に示される。
【０１７１】
哺乳類細胞
本明細書ではまた、本明細書に記載される核酸、ベクター（例えば、本明細書に記載される少なくとも２つの異なるベクター）、または組成物のうちのいずれかを含む細胞（例えば、哺乳類細胞）も提供される。当業者であれば、本明細書に記載される核酸及びベクターが任意の哺乳類細胞に導入され得ることを理解しよう。ベクター及びベクターを哺乳類細胞に導入するための方法の非限定的な例が本明細書に記載される。
【０１７２】
一部の実施形態では、細胞は、ヒト細胞、マウス細胞、ブタ細胞、ウサギ細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、ラット細胞、または非ヒト霊長類細胞である。一部の実施形態では、細胞は、蝸牛の特殊化した細胞である。一部の実施形態では、細胞は、蝸牛内有毛細胞または蝸牛外有毛細胞である。一部の実施形態では、細胞は、蝸牛内有毛細胞である。一部の実施形態では、細胞は、蝸牛外有毛細胞である。
【０１７３】
一部の実施形態では、哺乳類細胞は、インビトロにある。一部の実施形態では、哺乳類細胞は、哺乳動物中に存在する。一部の実施形態では、哺乳類細胞は、対象から得られ、かつエクスビボで培養された自家細胞である。
【０１７４】
方法
本明細書ではまた、哺乳動物（例えば、ヒト）の蝸牛に、治療上有効量の本明細書に記載される組成物のうちのいずれかを導入する方法も提供される。また、哺乳動物（例えば、ヒト）の蝸牛内の外有毛細胞において活性ステレオシリンタンパク質（例えば、完全長ステレオシリンタンパク質）の発現を増加させる方法も提供され、該方法は、該哺乳動物の蝸牛に、治療上有効量の本明細書に記載される組成物のうちのいずれかを導入することを含む。また、欠陥のあるステレオシリン遺伝子を有すると特定された対象（例えば、ヒト）において無症候性感音性聴力喪失を治療する方法も提供され、該方法は、治療上有効量の本明細書に記載される組成物のうちのいずれかを対象の蝸牛に投与することを含む。
【０１７５】
これらの方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、該哺乳動物は、欠陥のあるステレオシリン遺伝子（例えば、ステレオシリン遺伝子によってコードされるステレオシリンタンパク質の発現及び／または活性の減少をもたらす変異を有するステレオシリン遺伝子）を有すると以前に特定されている。これらの方法のうちのいずれかの一部の実施形態は、導入または投与ステップの前に、該対象が欠陥のあるステレオシリン遺伝子を有することを判定することをさらに含む。これらの方法のうちのいずれかの一部の実施形態は、対象においてステレオシリン遺伝子における変異を検出することをさらに含み得る。該方法のうちのいずれかの一部の実施形態は、対象が無症候性感音性聴力喪失を有すると特定するか、または診断することをさらに含み得る。
【０１７６】
これらの方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物のうちのいずれかの２回以上の用量が、哺乳動物または対象の蝸牛に導入または投与される。これらの方法のうちのいずれかの一部の実施形態は、該組成物の第１の用量を哺乳動物または対象の蝸牛に導入または投与することと、第１の用量の導入または投与に続いて哺乳動物または対象の聴力機能を評価することと、該組成物の追加の用量を、（例えば、当該技術分野で既知の任意の聴力検査を用いて判定したときに）正常な範囲の聴力機能を有しないことが見出された哺乳動物または対象の蝸牛に投与することとを含み得る。
【０１７７】
本明細書に記載される方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、該組成物は、蝸牛内投与用に製剤化することができる。本明細書に記載される方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物は、蝸牛内投与または局所投与を介して投与することができる。本明細書に記載される方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、該組成物は、医療デバイス（例えば、本明細書に記載される例示的な医療デバイスのうちのいずれか）の使用により投与される。
【０１７８】
一部の実施形態では、蝸牛内投与は、本明細書に記載されるかまたは当該技術分野で既知の方法のうちのいずれかを用いて実施することができる。例えば、組成物は、以下の外科的技法を用いて、蝸牛に投与または導入することができる。まず、０度、２．５ｍｍ硬性内視鏡での可視化を用いて、外耳道をきれいにし、ラウンドナイフを用いておよそ５ｍｍの外耳道鼓膜弁の輪郭を鋭く線引きする。次いで、外耳道鼓膜弁を挙上し、後方から中耳に進入する。鼓索神経を特定して分割し、キュレットを用いて、上鼓室側壁の（ｓｃｕｔａｌ）骨を除去して、正円窓膜を露出させる。投与または導入された組成物の頂部への分布を強化するために、手術用レーザを用いて、卵円窓に小さな２ｍｍの開窓を作製して、組成物の経正円窓膜注入の際に外リンパ置換を可能にしてもよい。次いで、微量注入デバイスをプライミングし、術野に至らしめる。デバイスを正円窓へと操縦し、先端を正円窓の骨質突出部内に設置して、マイクロニードル（複数可）による膜の穿通を可能にする。フットペダルを連動させて、組成物を測定された一定量で注入できるようにする。次いで、デバイスを後退させ、正円窓及びアブミ骨底をゼルフォームパッチで封止する。
【０１７９】
本明細書に記載される方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、対象または哺乳動物は、齧歯類、非ヒト霊長類、またはヒトである。本明細書に記載される方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、対象または哺乳動物は、成体、ティーンエイジャー、若齢個体、幼齢個体、幼児期個体、乳児期個体、または新生児期個体である。本明細書に記載される方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、対象または哺乳動物の年齢は、１〜５、１〜１０、１〜２０、１〜３０、１〜４０、１〜５０、１〜６０、１〜７０、１〜８０、１〜９０、１〜１００、１〜１１０、２〜５、２〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１１０、１０〜３０、１０〜４０、１０〜５０、１０〜６０、１０〜７０、１０〜８０、１０〜９０、１０〜１００、１０〜１１０、２０〜４０、２０〜５０、２０〜６０、２０〜７０、２０〜８０、２０〜９０、２０〜１００、２０〜１１０、３０〜５０、３０〜６０、３０〜７０、３０〜８０、３０〜９０、３０〜１００、４０〜６０、４０〜７０、４０〜８０、４０〜９０、４０〜１００、５０〜７０、５０〜８０、５０〜９０、５０〜１００、６０〜８０、６０〜９０、６０〜１００、７０〜９０、７０〜１００、７０〜１１０、８０〜１００、８０〜１１０、または９０〜１１０歳である。本明細書に記載される方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、対象または哺乳動物の月齢は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１ヶ月である。
【０１８０】
本明細書に記載される方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、対象または哺乳動物は、非症候性感音性聴力喪失を有するか、またはそれを発症するリスクがある。本明細書に記載される方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、対象または哺乳動物は、ステレオシリン遺伝子における変異を有すると以前に特定されている（本明細書での「ステレオシリン遺伝子」への言及は全て、ステレオシリン偽遺伝子ではない遺伝子を指す）。本明細書に記載される方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、対象または哺乳動物は、本明細書に記載されるか、または無症候性感音性聴力喪失に関連することが当該技術分野で知られている、ステレオシリン遺伝子における変異のうちのいずれかを有する。
【０１８１】
本明細書に記載される方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、対象または哺乳動物は、ステレオシリン遺伝子における変異の保因者であると特定されている（例えば、遺伝子検査を介して）。本明細書に記載される方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、対象またはヒトは、ステレオシリン遺伝子における変異を有すると特定されており、かつ無症候性感音性聴力喪失と診断されている。本明細書に記載される方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、対象またはヒトは、無症候性感音性聴力喪失を有すると特定されている。
【０１８２】
一部の実施形態では、無症候性感音性聴力喪失の治療成功は、当該技術分野で既知の従来の機能的聴力検査のうちのいずれかを用いて対象において判定することができる。機能的聴力検査の非限定的な例は、種々の種類の聴力測定アッセイ（例えば、純音検査、語音検査、中耳の検査、聴性脳幹反応、及び耳音響放射）である。
【０１８３】
本明細書ではまた、哺乳類細胞において活性ステレオシリンタンパク質（例えば、完全長ステレオシリンタンパク質）の発現を増加させる方法も提供され、該方法は、本明細書に記載される組成物のうちのいずれかを該哺乳類細胞に導入することを含む。これらの方法の一部の実施形態では、該哺乳類細胞は、蝸牛外有毛細胞である。これらの方法の一部の実施形態では、該哺乳類細胞は、ヒト細胞（例えば、ヒト蝸牛外有毛細胞）である。これらの方法の一部の実施形態では、該哺乳類細胞は、インビトロにある。これらの方法の一部の実施形態では、該哺乳類細胞は、哺乳動物中にある。これらの方法の一部の実施形態では、該哺乳類細胞は、哺乳動物から元々得られ、エクスビボで培養されるものである。一部の実施形態では、哺乳類細胞は、欠陥のあるステレオシリン遺伝子を有すると以前に判定されている。
【０１８４】
本明細書に記載される組成物のうちのいずれかを哺乳類細胞に導入するための方法は、当該技術分野で既知である（例えば、リポフェクションを介して、またはウイルスベクター、例えば、本明細書に記載されるウイルスベクターのうちのいずれかの使用により）。
【０１８５】
本明細書に記載されるような活性ステレオシリンタンパク質（例えば、完全長ステレオシリンタンパク質）の発現の増加は、例えば、対照と比較して、またはベクター（複数可）の導入前の活性ステレオシリンタンパク質（例えば、完全長ステレオシリンタンパク質）の発現レベルと比較してのものである。
【０１８６】
ステレオシリンの発現及び／または活性を検出する方法は、当該技術分野で既知である。一部の実施形態では、ステレオシリンタンパク質の発現レベルは、直接検出することができる（例えば、ステレオシリンタンパク質の検出、またはステレオシリンｍＲＮＡの検出）。ステレオシリンの発現及び／または活性を直接検出するために使用され得る技法の非限定的な例としては、リアルタイムＰＣＲ、ウェスタンブロット法、免疫沈降法、免疫組織化学法、または免疫蛍光法が挙げられる。一部の実施形態では、ステレオシリンタンパク質の発現は、間接的に検出することができる（例えば、機能的聴力検査、機能的網膜及び視力検査により）。
【０１８７】
薬学的組成物及びキット
一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物のうちのいずれかは、本明細書に記載される核酸、またはベクターのうちのいずれかの哺乳類細胞中への進入を促進する１つまたは複数の薬剤（例えば、リポソームまたはカチオン性脂質）をさらに含み得る。
【０１８８】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるベクターのうちのいずれかは、天然及び／または合成ポリマーを用いて製剤化することができる。本明細書に記載される組成物のうちのいずれかに含まれ得るポリマーの非限定的な例としては、ＤＹＮＡＭＩＣ  ＰＯＬＹＣＯＮＪＵＧＡＴＥ（登録商標）（Ａｒｒｏｗｈｅａｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．、Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）及びＲｏｃｈｅ  Ｍａｄｉｓｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）による製剤、限定されないが、ＳＭＡＲＴＴ  ＰＯＬＹＭＥＲ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（登録商標）（ＰｈａｓｅＲＸ、Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ．）等のＰｈａｓｅＲＸポリマー製剤、ＤＭＲＩ／ＤＯＰＥ、ポロキサマー、Ｖｉｃａｌ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）によるＶＡＸＦＥＣＴＩＮ（登録商標）アジュバント、キトサン、Ｃａｌａｎｄｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｃａｌｉｆ．）によるシクロデキストリン、デンドリマー及びポリ（乳酸−グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）ポリマー、ＲＯＮＤＥＬ（商標）（ＲＮＡｉ／オリゴヌクレオチドナノ粒子送達）ポリマー（Ａｒｒｏｗｈｅａｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｃａｌｉｆ．）、ならびに、限定されないが、ＰｈａｓｅＲＸ（Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ．）により生産されるブロック共重合体等のｐＨ反応性ブロック共重合体が挙げられ得るが、これらに限定されない。これらのポリマーのうちの多くは、哺乳類細胞へのインビボでのオリゴヌクレオチドの送達において有効性を実証した（例えば、ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１９：１２５−１３２，２００８、Ｒｏｚｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０４：１２９８２−１２８８７，２００７、Ｒｏｚｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０４：１２９８２−１２８８７，２００７、Ｈｕ−Ｌｉｅｓｋｏｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５：８９８４−８９８２，２００５、Ｈｅｉｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０４：５７１５−５７２１，２００７を参照されたい）。
【０１８９】
本明細書に記載される組成物のうちのいずれかは、例えば、薬学的組成物であり得る。薬学的組成物は、本明細書に記載される組成物のうちのいずれかと、１つまたは複数の薬学的にまたは生理的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含み得る。かかる組成物は、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水等の１つもしくは複数の緩衝液；グルコース、マンノース、スクロース、及びデキストラン等の１つもしくは複数の炭水化物；マンニトール；１つもしくは複数のタンパク質、ポリペプチド、もしくはグリシン等のアミノ酸；１つもしくは複数の酸化防止剤；ＥＤＴＡもしくはグルタチオン等の１つもしくは複数のキレート剤；及び／または１つもしくは複数の防腐剤を含んでもよい。
【０１９０】
一部の実施形態では、該組成物は、薬学的に許容される担体（例えば、リン酸緩衝食塩水、食塩水、または静菌水）を含む。製剤化されると、溶液は、剤形に適合する様態で、かつ治療上有効であるような量で投与される。製剤は、注射液、注射用ゲル、薬物放出カプセル等の様々な剤形で容易に投与される。
【０１９１】
本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容される担体」という用語は、薬剤投与に適合する溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤等を含む。補助的な活性化合物もまた、本明細書に記載される組成物のうちのいずれかに組み込むことができる。
【０１９２】
一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物のうちのいずれかの単回用量は、少なくとも１ｎｇ、少なくとも２ｎｇ、少なくとも４ｎｇ、約６ｎｇ、約８ｎｇ、少なくとも１０ｎｇ、少なくとも２０ｎｇ、少なくとも３０ｎｇ、少なくとも４０ｎｇ、少なくとも５０ｎｇ、少なくとも６０ｎｇ、少なくとも７０ｎｇ、少なくとも８０ｎｇ、少なくとも９０ｎｇ、少なくとも１００ｎｇ、少なくとも２００ｎｇ、少なくとも３００ｎｇ、少なくとも４００ｎｇ、少なくとも５００ｎｇ、少なくとも１μｇ、少なくとも２μｇ、少なくとも４μｇ、少なくとも６μｇ、少なくとも８μｇ、少なくとも１０μｇ、少なくとも１２μｇ、少なくとも１４μｇ、少なくとも１６μｇ、少なくとも１８μｇ、少なくとも２０μｇ、少なくとも２２μｇ、少なくとも２４μｇ、少なくとも２６μｇ、少なくとも２８μｇ、少なくとも３０μｇ、少なくとも３２μｇ、少なくとも３４μｇ、少なくとも３６μｇ、少なくとも３８μｇ、少なくとも４０μｇ、少なくとも４２μｇ、少なくとも４４μｇ、少なくとも４６μｇ、少なくとも４８μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも５２μｇ、少なくとも５４μｇ、少なくとも５６μｇ、少なくとも５８μｇ、少なくとも６０μｇ、少なくとも６２μｇ、少なくとも６４μｇ、少なくとも６６μｇ、少なくとも６８μｇ、少なくとも７０μｇ、少なくとも７２μｇ、少なくとも７４μｇ、少なくとも７６μｇ、少なくとも７８μｇ、少なくとも８０μｇ、少なくとも８２μｇ、少なくとも８４μｇ、少なくとも８６μｇ、少なくとも８８μｇ、少なくとも９０μｇ、少なくとも９２μｇ、少なくとも９４μｇ、少なくとも９６μｇ、少なくとも９８μｇ、少なくとも１００μｇ、少なくとも１０２μｇ、少なくとも１０４μｇ、少なくとも１０６μｇ、少なくとも１０８μｇ、少なくとも１１０μｇ、少なくとも１１２μｇ、少なくとも１１４μｇ、少なくとも１１６μｇ、少なくとも１１８μｇ、少なくとも１２０μｇ、少なくとも１２２μｇ、少なくとも１２４μｇ、少なくとも１２６μｇ、少なくとも１２８μｇ、少なくとも１３０μｇ、少なくとも１３２μｇ、少なくとも１３４μｇ、少なくとも１３６μｇ、少なくとも１３８μｇ、少なくとも１４０μｇ、少なくとも１４２μｇ、少なくとも１４４μｇ、少なくとも１４６μｇ、少なくとも１４８μｇ、少なくとも１５０μｇ、少なくとも１５２μｇ、少なくとも１５４μｇ、少なくとも１５６μｇ、少なくとも１５８μｇ、少なくとも１６０μｇ、少なくとも１６２μｇ、少なくとも１６４μｇ、少なくとも１６６μｇ、少なくとも１６８μｇ、少なくとも１７０μｇ、少なくとも１７２μｇ、少なくとも１７４μｇ、少なくとも１７６μｇ、少なくとも１７８μｇ、少なくとも１８０μｇ、少なくとも１８２μｇ、少なくとも１８４μｇ、少なくとも１８６μｇ、少なくとも１８８μｇ、少なくとも１９０μｇ、少なくとも１９２μｇ、少なくとも１９４μｇ、少なくとも１９６μｇ、少なくとも１９８μｇ、または少なくとも２００μｇの少なくとも２つの異なるベクターの総和量を、例えば緩衝液中に含み得る。
【０１９３】
本明細書に提供される組成物は、例えば、それらの意図される投与経路に適合するように製剤化することができる。意図される投与経路の非限定的な例は、局所投与（例えば、蝸牛内投与）である。
【０１９４】
一部の実施形態では、治療用組成物は、脂質ナノ粒子を含むように製剤化される。一部の実施形態では、治療用組成物は、ポリマーナノ粒子を含むように製剤化される。一部の実施形態では、治療用組成物は、小環状ＤＮＡを含むように製剤化される。一部の実施形態では、治療用組成物は、ＣＥＬｉＤ  ＤＮＡを含むように製剤化される。一部の実施形態では、治療用組成物は、合成外リンパ液を含むように製剤化される。例示的な合成外リンパ液は、２０〜２００ｍＭのＮａＣｌ、１〜５ｍＭのＫＣｌ、０．１〜１０ｍＭのＣａＣｌ２、１〜１０ｍＭのグルコース、２〜５０ｍＭのＨＥＰＥＳを含み、約６〜約９のｐＨを有する。
【０１９５】
また、本明細書に記載される組成物のうちのいずれかを含むキットも提供される。一部の実施形態では、キットは、固体組成物（例えば、本明細書に記載される少なくとも２つの異なるベクターを含む凍結乾燥組成物）と、凍結乾燥組成物を可溶化させるための液体とを含み得る。一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載される組成物のうちのいずれかを含む充填済みシリンジを含み得る。
【０１９６】
一部の実施形態では、キットは、（例えば、水性組成物、例えば、水性薬学的組成物として製剤化された）本明細書に記載される組成物のうちのいずれかを含むバイアルを含む。
【０１９７】
一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載される方法のうちのいずれかを実施するための説明書を含み得る。
【０１９８】
投与経路
注射用途に好適な剤形には、滅菌注射液または分散液を即時調製するための滅菌水溶液または分散液及び滅菌粉末が含まれる。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中で、ならびに油中で調製されてもよい。通例の貯蔵及び使用条件下では、これらの調製物は、微生物の成長を阻止するための防腐剤を含有する。多くの場合、当該形態は、滅菌されており、容易なシリンジ通過性が存在する程度に流動的である。それは製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌等の微生物の汚染作用から保護されていなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、それらの好適な混合物、及び／または植物油を含有する、溶媒または分散媒であり得る。適正な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散液の場合には要求される粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の阻止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましいであろう。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中で使用することによってもたらされ得る。
【０１９９】
例えば、注射用水溶液の投与の場合、溶液は、必要であれば好適に緩衝され得、液体希釈剤が最初に十分な食塩水またはグルコースと等張にされ得る。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内投与にとりわけ好適である。この関連で、用いられ得る滅菌水性媒体は、当業者に既知であろう。例えば、１回分の投薬量を、１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶解させ、１０００ｍｌの皮下点滴流体に加えるか、または計画される注入部位に注射してもよい（例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”１５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐａｇｅｓ  １０３５−１０３８  ａｎｄ  １５７０−１５８０を参照されたい）。宿主の状態に応じて、投薬量のいくらかの変動が必然的に生じよう。いずれにせよ、投与を担当する者が、個々の宿主に適切な用量を決定する。
【０２００】
滅菌注射液は、必要とされる量の活性ＡＡＶを、必要に応じて本明細書に列挙される種々の他の成分を含む、適切な溶媒に組み込み、続いて滅菌濾過することによって調製される。一般に、分散液は、種々の滅菌活性成分を、基本的な分散媒、及び上記に列挙した成分からの必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥技法及び凍結乾燥技法であり、これは活性成分と、事前に滅菌濾過されたその溶液からの任意の追加的な所望の成分との粉末をもたらす。
【０２０１】
本明細書に開示される組成物のうちのいずれかはまた、中性形態または塩形態で製剤化され得る。薬学的に許容される塩には、（タンパク質の遊離アミノ基とともに形成される）酸付加塩、及び、例えば、塩酸もしくはリン酸等の無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等のような有機酸とともに形成される酸付加塩が含まれる。遊離カルボキシル基とともに形成される塩はまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄等の無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等のような有機塩基から誘導され得る。製剤化されると、溶液は、剤形に適合する様態で、かつ治療上有効であるような量で投与される。製剤は、注射液、薬物放出カプセル等の様々な剤形で容易に投与される。
【０２０２】
本明細書で使用されるとき、「担体」には、ありとあらゆる溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイド等が含まれる。薬学的活性物質のためのかかる媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野で周知である。補助的な活性成分もまた、組成物に組み込むことができる。「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与されたときにアレルギー反応または類似の有害反応を引き起こさない分子実体及び組成物を指す。
【０２０３】
リポソーム、ナノカプセル、ミクロ粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞等のような送達ビヒクルが、本発明の組成物を好適な宿主細胞に導入するのに使用され得る。特に、ベクターにより送達される導入遺伝子は、送達のために、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア、またはナノ粒子等のいずれかにカプセル封入されて製剤化され得る。
【０２０４】
かかる製剤は、本明細書に開示される核酸、またはベクターのうちのいずれかの薬学的に許容される製剤の導入に好ましい場合がある。リポソームの形成及び使用は、当業者に一般に既知である。最近、改善された血清中安定性及び循環半減期を有するリポソームが開発された（米国特許第５，７４１，５１６号）。さらに、可能性のある薬物担体としてのリポソーム及びリポソーム様調製物の種々の方法が記載されている（米国特許第５，５６７，４３４号、同第５，５５２，１５７号、同第５，５６５，２１３号、同第５，７３８，８６８号、及び同第５，７９５，５８７号）。
【０２０５】
リポソームは、他の手順によるトランスフェクションに通常は抵抗性であるいくつかの細胞型で成功裏に使用されている。加えて、リポソームは、ウイルスに基づく送達系に典型的であるＤＮＡの長さの制約を受けない。リポソームは、遺伝子、薬物、放射線療法剤、ウイルス、転写因子、及びアロステリックエフェクターを様々な培養細胞株及び動物に導入するために効果的に使用されている。加えて、リポソーム媒介性薬物送達の有効性を調査するいくつかの臨床試験が成功裏に完了している。
【０２０６】
リポソームは、水性媒体中に分散され、同心円状の多層二分子膜小胞（多層小胞（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を自発的に形成する、リン脂質から形成される。ＭＬＶは一般に、２５ｎｍ〜４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理は、コア中に水溶液を含有する、２００〜５００．ＡＮＧ．の範囲の直径を有する小さな単層小胞（ＳＵＶ）の形成をもたらす。
【０２０７】
代替として、本明細書に記載されるベクターのうちのいずれかのナノカプセル製剤が使用されてもよい。ナノカプセルは一般に、安定的かつ再現可能な方法で物質を封入することができる。細胞内でのポリマー過負荷による副作用を回避するために、（およそ０．１μｍのサイズの）そのような超微細な粒子は、インビボで分解され得るポリマーを用いて設計すべきである。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリレートナノ粒子の使用が企図される。
【０２０８】
上述の送達方法に加えて、以下の技法もまた、本明細書に記載される組成物のうちのいずれかを宿主に送達する代替の方法として企図される。ソノフォレーシス（すなわち、超音波）は、米国特許第５，６５６，０１６号において、循環系内への及び循環系を通過する薬物透過の速度及び有効性を強化するためのデバイスとして使用され、記載されている。企図される他の薬物送達代替法は、骨内注射（米国特許第５，７７９，７０８号）、マイクロチップデバイス（米国特許第５，７９７，８９８号）、眼用製剤（Ｂｏｕｒｌａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）、経皮マトリックス（米国特許第５，７７０，２１９号及び同第５，７８３，２０８号）、及びフィードバック制御送達（米国特許第５，６９７，８９９号）である。
【０２０９】
主題の組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、経口摂取、輸注、埋め込み、または移植によるものを含む、任意の好都合な様態で実行され得る。本明細書に記載される組成物は、経動脈的、皮下、皮内、結節内、骨髄内、筋肉内に、静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって、または腹腔内で患者に投与され得る。一態様では、本発明の核酸組成物は、皮内または皮下注射によって患者に投与される。一態様では、本発明の核組成物は、ｉ．ｖ．注射によって投与される。
【０２１０】
デバイス及び手術方法
本明細書では、無症候性感音性聴力喪失を治療するための治療的送達系が提供される。一態様では、治療的送達系は、ｉ）それを必要とするヒト対象の内耳の正円窓膜に１つまたは複数の切開を作出することができる医療デバイスと、ｉｉ）有効用量の組成物（例えば、本明細書に記載される組成物のうちのいずれか）とを含む。一部の実施形態では、医療デバイスは、複数のマイクロニードルを含む。
【０２１１】
本明細書ではまた、聴力喪失（例えば、無症候性感音性聴力喪失）の治療のための手術方法も提供される。一部の実施形態では、該方法は、ヒト対象の蝸牛に第１の切開点にて第１の切開点を導入するステップと、治療上有効量の本明細書に提供される組成物のうちのいずれかを蝸牛内投与するステップとを含む。一部の実施形態では、該組成物は、第１の切開点にて対象に投与される。一部の実施形態では、該組成物は、第１の切開の中へとまたはそれを通して対象に投与される。
【０２１２】
本明細書に記載される方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物のうちのいずれかは、蝸牛の卵円窓膜の中へとまたはそれを通して対象に投与される。本明細書に記載される方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物のうちのいずれかは、蝸牛の正円窓膜の中へとまたはそれを通して対象に投与される。本明細書に記載される方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、該組成物は、正円窓膜に複数の切開を作出することができる医療デバイスを用いて投与される。一部の実施形態では、医療デバイスは、複数のマイクロニードルを含む。一部の実施形態では、医療デバイスは、略円形の第１の面を含む複数のマイクロニードルを含み、各マイクロニードルが少なくとも約１０ミクロンの直径を有する。一部の実施形態では、医療デバイスは、該組成物を保有することが可能な基部及び／またはリザーバを含む。一部の実施形態では、医療デバイスは、該組成物を移送することが可能な内腔を個々に含む、複数の中空マイクロニードルを含む。一部の実施形態では、医療デバイスは、少なくとも部分真空を生成するための手段を含む。
【０２１３】
本発明は、以下の実施例を参照することによりさらに詳述される。これらの実施例は、例示説明の目的で提供されるにすぎず、別途明記されない限り、限定することを意図するものではない。故に、本発明は、決して以下の実施例に限定されるものとして解釈されるべきでなく、むしろ、本明細書に提供される教示の結果として明白となる、ありとあらゆる変形形態を包含するように解釈されるできである。
【０２１４】
さらなる説明を伴わずに、当業者は、前述の説明及び以下の例示説明となる実施例を用いて、本発明の化合物を作製及び利用するとともに、特許請求される方法を実施することができると考えられる。以下の実施例は、本発明の種々の態様を具体的に指示するものであり、決して本開示の残りの部分を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２１５】
実施例１：ウイルスベクターの構築
組換えＡＡＶを、Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３（５）：３９９４−４００３，１９９９により使用されるようなアデノウイルス不含法（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｆｒｅｅ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いたトランスフェクションにより生成する。ＡＡＶ  ＩＴＲを有するシスプラスミド、ＡＡＶ  Ｒｅｐ及びＣａｐ遺伝子を有するトランスプラスミド、ならびにアデノウイルスゲノムからの必須領域を有するヘルパープラスミドを、２９３細胞に１：１：２の比でコトランスフェクトする。ここで使用するＡＡＶベクターは、下記に記載される構築物を用いる複数のデュアルベクター戦略下で、ヒトステレオシリンまたはマウスステレオシリンを発現する。Ｐｒｙａｄｋｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌ．２：１５００９，２０１５により要約されるように、ＡＡＶ血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、ｒｈ８、ｒｈ１０、ｒｈ３９、ｒｈ４３、及びＡｎｃ８０を各々、３組のステレオシリン構築物を封入するように調製して、（ｉ）コンカテマー化−トランススプライシング戦略、（ｉｉ）ハイブリッドイントロン−相同組換え−トランススプライシング戦略、及び（ｉｉｉ）エクソン相同組換え戦略を試験する。
【０２１６】
実施例２：ウイルス粒子の生成及び精製
組換えＡＡＶ−１を、Ｐｒｙａｄｋｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：１５００９，２０１５により記載されるように、トリプルトランスフェクションプロトコルを用いて生産し、２回の連続塩化セシウム（ＣｓＣｌ）密度勾配によって精製する。２回目の遠心分離の終わりに、ＣｓＣｌ密度勾配管から１１個の５００μｌ画分を回収し、１×ＰＢＳ中での透析により精製する。画分をドットブロットによって分析して、ｒＡＡＶゲノムを含有する画分を決定する。各調製物のウイルスゲノム数（ｖｇ）を、ＡＡＶベクターゲノムのＩＴＲ領域に対応するプライマー及びプローブを用いて、定量的リアルタイムＰＣＲベースの力価測定法によって決定する（Ｂａｒｔｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．１３：２０−２８，２００６）。
【０２１７】
実施例３：ウイルス粒子の製剤化
１ｅ１４ｖｇ／ｍＬの力価で生産されたＡＡＶを人工外リンパ中で、３．２ｅ１３、１．０ｅ１３、３．２ｅ１２、１．０ｅ１２ｖｇ／ｍＬの希釈度で調製する。人工外リンパは、以下の試薬を組み合わせることによって調製する。ＮａＣｌ、１２０ｍＭ；ＫＣｌ、３．５ｍＭ；ＣａＣｌ２、１．５ｍＭ；グルコース、５．５ｍＭ；ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭ。人工外リンパをＮａＯＨで滴定して、そのｐＨを７．５に調整する（１３０ｍＭの総Ｎａ+濃度）（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌ．１１０：１−１９，２００５）。
【０２１８】
実施例４：デバイスの説明
ＡＡＶ−ＳＴＲＣ製剤は、正円窓膜（ＲＷＭ）の一貫した安全な穿通用に設計された特殊マイクロカテーテルを用いて蝸牛に送達する。マイクロカテーテルは、送達手順を実施する外科医が、外耳道を介して中耳腔に進入し、マイクロカテーテルの末端をＲＷＭに接触させることができるような形状となっている。マイクロカテーテルの遠位端は、１０〜１，０００ミクロンの直径を有する少なくとも１つのマイクロニードルで構成され、このマイクロニードルは、ＡＡＶ−ＳＴＲＣがおよそ１ｕＬ／分の速度で鼓室階の蝸牛外リンパに進入できるようにするのに十分であるが、外科的修復を伴わずに治癒するのに十分に小さい穿孔をＲＷＭに作り出す。マイクロニードル（複数可）に近位の、マイクロカテーテルの残りの部分には、およそ１ｅ１３ｖｇ／ｍＬの力価のＡＡＶ−ＳＴＲＣ／人工外リンパ製剤が充填される。マイクロカテーテルの近位端は、およそ１ｕＬ／分の精確な低容量注入を可能にするマイクロマニピュレータに連結される。
【０２１９】
実施例５：動物モデル１Ａ：老化マウスにおける手術方法
人工外リンパ中で調製したＡＡＶ−ＳＴＲＣを、Ｓｈｕら（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｕｍ．２０１６．０５３，Ｊｕｎｅ  ２０１６）に記載されるようにマウスの鼓室階に投与する。６週齢の雄性マウスに、キシラジン（２０ｍｇ／ｋｇ）及びケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射を用いて麻酔をかける。電気温熱パッドを用いて体温を３７℃に維持する。右耳介後部から切開を作製し、鼓室胞を露出させる。鼓室胞を外科用針で穿孔し、小さい穴を拡張して、蝸牛へのアクセスをもたらす。鼓室階の蝸牛側壁の骨を、膜性側壁を無傷で残すように、歯科用ドリルで薄くする。ガラスマイクロピペットと結合したナノリットルマイクロインジェクションシステムを用いて、総計およそ３００ｎＬの人工外リンパ中のＡＡＶ−ＳＴＲＣを２ｎＬ／秒の速度で鼓室階に送達する。ガラスマイクロピペットを注入後５分間留置する。蝸牛切開及び注射後、鼓室胞の開口部を歯科用セメントで封止し、筋肉及び皮膚を縫合する。マウスを麻酔から覚醒させ、マウスの疼痛を０．１５ｍｇ／ｋｇの塩酸ブプレノルフィンで３日間管理する。
【０２２０】
実施例６：動物モデル２：モルモットにおける往復運動マイクロポンプ
外科的手技
Ｔａｎｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，ＤＯＩ：１０．１０３９／ｃ５ｌｃ０１３９６ｈ，２０１５により記載されるような往復運動マイクロポンプによる蝸牛内送達後の分布及び毒性を評価するために、人工外リンパ中で調製したＡＡＶ−ＳＴＲＣをモルモットに投与する。各々およそ３５０ｇの体重の雄性モルモット（ｎ＝１６）に、ペントバルビタールナトリウム（Ｎｅｍｂｕｔａｌ；２５ｍｇ  ｋｇ−１、腹腔内注射）、フェンタニル（０．２ｍｇ  ｋｇ−１、筋肉内）、及びハロペリドール（１０ｍｇ  ｋｇ−１、筋肉内）の組み合わせで麻酔をかける。エピネフリンと併せたリドカインを局所麻酔として切開部位に皮下投与する。背側アプローチを用いて、鼓室胞に５ｍｍ直径の穴を作製し、正円窓膜のおよそ０．５ｍｍ遠位に蝸牛切開を作出する。マイクロポンプのカニューレ（下記に記載される）を蝸牛切開部に挿入し、蝸牛の頂端側に３ｍｍ通し、一般的なシアノアクリレート接着剤で鼓室胞に接着させる。複合活動電位（ＣＡＰ）測定のために、ペルフルオロアルコキシアルカン絶縁銀線電極（無被覆直径２０３μｍ）を正円窓窩の近くに挿入し、鼓室胞に接着させる。
【０２２１】
歪成分耳音響放射（ＤＰＯＡＥ）及びＣＡＰの測定のための手順を、Ｔａｎｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ  １７：３−２１，２０１５に以前に記載されたように実施する。ＤＰＯＡＥは、外科手術の結果として生じるあらゆる損傷をモニタリングするために、蝸牛切開手技の前及び後に３２、２４、１６、１２、８、５．６、４、及び２．７８ｋＨｚの特性周波数で測定する。
【０２２２】
１ｅ１４ｖｇ／ｍＬの最大力価でのＡＡＶ−ＳＴＲＣを、Ｔａｎｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，ＤＯＩ：１０．１０３９／ｃ５ｌｃ０１３９６ｈ，２０１５により記載されるようなマイクロポンプを用いて、モルモットに投与する。マイクロポンプシステムは、４つの選択可能なポートを有する。これらのポートは、（ｉ）人工外リンパ貯蔵に使用される大きな流体キャパシタ、（ｉｉ）蝸牛に連結する排出口、（ｉｉｉ）一体化ＡＡＶ−ＳＴＲＣリザーバからの排出口、（ｉｖ）一体化ＡＡＶ−ＳＴＲＣリザーバへの注入口に連結されている。各ポートは、中央ポンプチャンバに流体連結され、各々が弁により個々に対処されている。ＡＡＶ−ＳＴＲＣ送達を往復運動させるための一連の事象は、以下の通りである。（ｉ）内部ＡＡＶ−ＳＴＲＣ−リフレッシュループを動作させて、ＡＡＶ−ＳＴＲＣをＡＡＶ−ＳＴＲＣリザーバから主要注入−回収ラインへと移送する、（ｉｉ）ＡＡＶ−ＳＴＲＣを蝸牛に注入し、一部の人工外リンパを人工外リンパ貯蔵キャパシタから排出する、（ｉｉｉ）追加の用量を得るために最初の２つのステップを数回繰り返すことができる、（ｉｖ）ＡＡＶ−ＳＴＲＣをしばらくの間拡散させた後、ステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）で注入した容量に等しい容量の外リンパを蝸牛から回収して、人工外リンパ貯蔵キャパシタを再び満たす。このプロセスは、正味ゼロの流体容量が蝸牛に追加される様態での薬物の正味送達をもたらす。
【０２２３】
マイクロポンプにおける流体キャパシタは、薄い（２５．４μｍ）可撓性のポリイミド膜である天井を有する円筒型のチャンバである。ポンプチャンバは３．５ｍｍの直径を有し、流体貯蔵キャパシタは１４ｍｍの直径を有し、残りのキャパシタの全ては４ｍｍの直径を有する。この同じ膜が、弁の各々にて流動を遮断するように撓ませられる。弁チャンバは３．１ｍｍの直径を有する。薬物リザーバを構成する蛇行チャネルは、幅７６２μｍの正方形の断面及び４１０ｍｍの長さを有し、総容量が２３８μＬである。ポンプにおける他のマイクロチャネルの全ては、４００μｍの幅及び２５４μｍの高さを有する。
【０２２４】
モルモットにおける急性薬物送達
マイクロポンプにＡＡＶ−ＳＴＲＣ及び人工外リンパを充填し、カニューレを、特性周波数感度２４〜３２ｋＨｚの位置の間の蝸牛の領域に作製した蝸牛切開部に挿入し、頂端側に３ｍｍ通し、１２〜１６ｋＨｚ領域において終端させる。ＡＡＶ−ＳＴＲＣ／人工外リンパ注入の開始前に、ベースラインＤＰＯＡＥ及びＣＡＰ聴力検査を実施する。次いで、ポンプを作動し、およそ１μＬの人工外リンパを、総計およそ１０μＬの人工外リンパが蝸牛に送達されるまで５分毎に注入する。２０分の待機時間後、およそ１０μＬの外リンパを蝸牛から回収する。次いで、ＡＡＶ−ＳＴＲＣ送達を、総計およそ１０μＬの流体が送達されるまで５分毎におよそ１μＬの速度で開始する。
【０２２５】
動物を処置後１週間、１ヶ月、３ヶ月、及び６ヶ月で屠殺し（ｎ＝１群当たり４匹）、それらの蝸牛を摘出する。コルチ器沿いのＡＡＶ形質導入及びＳＴＲＣ発現の程度を、抗ＳＴＲＣ抗体での免疫染色を介して評価する。有毛細胞（Ｍｙｏ７ａ）及び支持細胞（Ｓｏｘ２）のマーカーに対する抗体を用いて、ＩＨＣ、ＯＨＣ、支持細胞、及び不動毛の形態を定量する。アネキシンＶ染色を用いて、蝸牛感覚上皮沿いの細胞におけるアポトーシスの証拠を評価する。
【０２２６】
実施例７：動物モデル３：ヒツジ
経ＲＷＭ注入を介した蝸牛への送達後の分布及び毒性を評価するために、人工外リンパ中で調製したＡＡＶ−ＳＴＲＣを若齢ヒツジに投与する。処置前の内有毛細胞（ＩＨＣ）及び外有毛細胞（ＯＨＣ）機能を評価するために、ベースライン聴性脳幹反応（ＡＢＲ）及び歪成分耳音響放射（ＤＰＯＡＥ）を月齢３ヶ月の雌性ヒツジ（ｎ＝４０）において両側で測定する。ベースラインＡＢＲ及びＤＰＯＡＥ測定に続いて、１．０ｅ１４、３．２ｅ１３、１．０ｅ１３、及び３．２ｅ１２ｖｇ／ｍＬの力価の２０ｕＬのＡＡＶ１−ＳＴＲＣをヒツジの左鼓室階の中に注射する（ｎ＝１群当たり１０匹）。各動物の右耳を無処置の対照として残す。外科的手技から１日、５日、及び１０日後にＡＢＲ及びＤＰＯＡＥ測定を両側で再び行う。手技後６ヶ月で、全ての動物から追加の両側ＡＢＲ及びＤＰＯＡＥ測定を行い、その後、動物を屠殺し、それらの蝸牛を取り出す。
【０２２７】
屠殺した動物の半分（ｎ＝用量コホートの各々から５匹）において、有毛細胞構造を特定するとともに、蝸牛感覚上皮沿いのＳＴＲＣタンパク質発現を評価するために、免疫染色を実施する。有毛細胞（Ｍｙｏ７ａ）、支持細胞（Ｓｏｘ２）、及びステレオシリンのマーカーに対する抗体を以前に記載されたように用いる（Ｄｕｎｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１３，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３３（２２）：９５０８−９５１９）。コルチ器の基底回転、中回転、及び頂回転にて、有毛細胞及びＳＴＲＣを発現する有毛細胞の総数を２００ｕｍ領域内で計数する。
【０２２８】
屠殺した動物の残りの半分（各用量コホートからの残りの５匹の動物）において、蝸牛組織試料を、上述したのと同じ基底領域、中領域、及び頂端領域から収集し、ステレオシリンｍＲＮＡ転写産物に関してアッセイする。
【０２２９】
実施例８：動物モデル３Ａ：ＣＲＩＳＰＲで生成したトランスジェニック大型動物モデル（ヒツジ）
Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡを共発現するプラスミドの生成
ｐＸ３３０−Ｕ６−キメラ＿ＢＢ−ＣＢｈ−ｈＳｐＣａｓ９プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号４２２３０）をＢｓｂＩで消化し、Ａｎｔａｒｔｉｃ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅを用いて脱リン酸化し、直線化したベクターをゲル精製する。ＳＴＲＣに対するＣａｓ９及びｓｇＲＮＡを発現するバイシストロン性ベクター（ｐＸ３３０−ｃａｓ９−ＳＴＲＣ）を生成するために、ステレオシリンエクソン１を標的とするオリゴの対をアニールし、リン酸化し、直線化したベクターにライゲーションする（Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９（６１２１）：８１９−２３，２０１３）。
【０２３０】
細胞におけるゲノム編集アッセイ
Ａ１５アストログリアヒツジ細胞株（Ｖｉｌｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ａｎｉｍ  ３６（１）：４５−９）を１０％胎仔ウシ血清、２ｍＭグルタミン、１％ピルビン酸ナトリウム、及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンでのＤＭＥＭ中で維持する。細胞を２４ウェルプレート中で、リポフェクタミンＬＴＸ試薬を用いて、ステレオシリンに対するＣａｓ９及びｓｇＲＮＡを共発現する２μｇのｐＸ３３０−ｃａｓ９−ＳＴＲＣでトランスフェクトする。３日後、トランスフェクトした細胞からのゲノムＤＮＡを抽出し、試料の純度を説明するために、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００分光光度計を用いてＡ２６０／Ａ２８０比及びＡ２６０／Ａ２３０比を測定して定量する。
【０２３１】
ＳＴＲＣエクソン１の標的遺伝子座でのｓｇＲＮＡ配列の遺伝子変異活性を、Ｔ７ＥＩミスマッチ検出アッセイを用いて定量する。目的とするＤＮＡ配列を、特異的プライマーを用いて高忠実度（ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ）ポリメラーゼ（Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ  ＩＩ融合ポリメラーゼ）でＰＣＲ増幅する。次いで、結果として生じるＰＣＲ産物を変性させ、ゆっくりと再アニールさせて（９５℃、２分；９５℃から８５℃へ、−２℃／秒；８５℃から２５℃へ、−１℃／秒）、ホモ二本鎖／ヘテロ二本鎖混合物を生成する。次いで、これを、５ＵのＴ７ＥＩ制限酵素によって３７℃で３０分間消化する。消化産物を２％アガロースゲル電気泳動によって分離する。Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを用いて、以前に記載されたように（Ｍｅｎｏｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１１  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ．Ａｎ  ＩＳＴＴ  Ｍａｎｕａｌ．Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ．ｐ１１７−３６）、切断産物の未切断産物に対する比を用いてＮＨＥＪ頻度を算出する。ＮＨＥＪ頻度は、遺伝子修飾％＝１００×（１−（１−切断率）＾（１／２）として算出される。
【０２３２】
ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９  ｍＲＮＡの生成
以前に記載されたように（Ｂｅｌｌｅｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，２０１５）、ｐＸ３３０−ｃａｓ９−ＳＴＲＣプラスミドのＰＣＲ増幅によって、Ｔ７プロモーターをｓｇＲＮＡテンプレートに付加する。ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ゲル及びＰＣＲクリーンアップを用いて、ＰＣＲ産物を精製する。該ＰＣＲ産物は、製造業者のマニュアルに従ってＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｔ７キットを用いた、インビトロ転写用のテンプレートとして使用される。転写の完了後、ＤＮａｓｅ  Ｉ処理を実施する。
【０２３３】
Ｃａｓ９  ｍＲＮＡを、ＰｍｅＩ消化Ｃａｓ９発現ＪＤＳ２４６プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号４３８６１）、及び、製造業者のマニュアルに従ってｍＭＥＳＳＡＧＥ  ｍＭＡＣＨＩＮＥ（登録商標）Ｔ７  ＵＬＴＲＡ転写キットを用いて転写する。転写の完了後、ポリ（Ａ）テーリング反応及びＤＮａｓｅ  Ｉ処理を実施する。Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡは両方とも、ＭＥＧＡｃｌｅａｒ（商標）キットを用いて精製され、溶出緩衝液で溶出される。
【０２３４】
胚のインビトロでの生成
以前に記載されたような（Ｃｒｉｓｐｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１４  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ，２４（１）：３１−４１）通例の手順に従ったインビトロでの受精によって、ヒツジ胚を生成する。簡潔に述べると、屠殺場からのヒツジ卵巣を研究室に輸送し、卵丘卵母細胞複合体（ＣＯＣ）を回復培地中で吸引する。選択したＣＯＣを、５％ＣＯ２の加湿空気雰囲気中、３９℃で２４時間、成熟培地中に置く。次いで、膨張したＣＯＣを、スイムアップ法で上に向かって遊走してくることにより選別された１×１０６用量の凍結融解精液を含む、１００μｌ液滴で受精させる。受精は、５％ＣＯ２の加湿雰囲気で、３９℃で２２時間行う。
【０２３５】
受精卵へのマイクロインジェクション
受精後速やかに、６００個の推定受精卵を、マイクロインジェクションを行うか（ＣＲＩＳＰＲ群、ｎ＝２００；及び緩衝液群、ｎ＝２００）、または行わない（対照群、ｎ＝２００）３つの実験群に無作為に割り当てる。ＣＲＩＳＰＲ群のマイクロインジェクションは、注入緩衝液（１０ｍＭのトリスｐＨ７．５、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）中で希釈した５ｎｇ／μｌのｓｇＲＮＡ及び２０ｎｇ／μｌのＣａｓ９  ｍＲＮＡにより細胞質内で実施され、緩衝液群は同じ手順だが緩衝液単独で注入される。最後に、注入された胚及び注入されていない胚を、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、及び９０％Ｎ２の加湿雰囲気中、３９℃で、鉱油下の培養基に移す。２日目の卵割比率（総卵母細胞当たりの卵割した受精卵）及び６日目の発生比率（総卵母細胞当たりの桑実胚及び胚盤胞）を全ての実験群について記録する。６日目の後、ＣＲＩＳＰＲ群の２０個の胚からのＤＮＡをＳａｎｇｅｒ配列決定によって分析して、ＳＴＲＣ遺伝子レベルでの変異を検出する。
【０２３６】
系のインビボでの効率を決定するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９受精卵マイクロインジェクションによって生成した胚盤胞を、雌レシピエントに移植する。極めて良好または良好に分類される（すなわち、Ｓｔｒｉｎｇｆｅｌｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．２０１０，Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙにおいて定義されるグレード１）初期胚盤胞、胚盤胞、及び拡張胚盤胞のみが、受精後６日目に移植される。胚移植は、黄体と同側の子宮角の頭側に胚を配置する、腹腔鏡手術により補助される低侵襲手術によって実施される。Ｍｅｎｃｈａｃａ  ｅｔ  ａｌ．２００４，Ｒｅｐｒｏｄ  Ｆｅｒｔｉｌ  Ｄｅｖ．１６（４）：４０３−４１３に記載されるような、以前に記載された排卵を制御する標準的なプロトコルを用いて、雌ヒツジレシピエントを発情周期の６日目になるよう予め同調させる。
【０２３７】
胎仔及び子ヒツジのモニタリング
妊娠診断及び胎仔発達を、５及び３．５ＭＨｚプローブを装備したＢモード超音波検査を用いることによって、３０日目及び１０５日目にそれぞれ実施する。実験の０日目は胚受精の瞬間として定義される。妊娠の１０５日目の胎仔の発達を調べるためにいくつかのパラメーター、すなわち、胸郭径、大横径、後頭鼻骨（ｏｃｃｉｐｉｔｏｎａｓａｌ）長、及び心拍数を測定する。出産時に、妊娠期間、性別、直腸温、心拍数及び呼吸数、体重、胸郭周囲長、大横径、頭殿長及び後頭骨鼻長、体高、股関節部の高さ、股関節部の幅及び胸部の幅を記録した。出生時、ならびに１５、３０、及び６０日後に、体重及び形態計測の変量を決定する。
【０２３８】
トランスジェニック動物の特定及び遺伝子型判定
ＫＯファウンダー及びオフターゲット部位を特定し、その特徴を明らかにするために、出生から７日後に子ヒツジの皮膚及び四肢筋から試料を採取し、Ｔ７ＥＩアッセイ、ウェスタンブロット試験、及び組織学的検査を実施する。総ＤＮＡを全ての動物の皮膚生検及び一部の動物の筋から単離する。試料を、キャピラリー電気泳動を用いて分析する。ＳＴＲＣエクソン１の遺伝子型判定を、ＰＣＲ増幅産物の直接的配列決定によって、及び筋生検においては、個々の増幅産物配列を有する単離された細菌クローンのさらなる配列決定によって実施する。
【０２３９】
ステレオシリン発現の分析
筋繊維におけるミオスタチンの存在を決定するためにウェスタンブロッティングを実施する。等量の総タンパク質を１２％（ｖ／ｖ）ゲル電気泳動で泳動させ、ＰＶＤＦ膜に電気泳動的に転写する。モノクローナルマウス抗ステレオシリン抗体をウェスタンブロッティングで使用する。洗浄した膜を１：５００００希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＰＲ）に連結した二次抗体とともにインキュベートする。ウェスタンブロット化学発光を用いてＨＰＲ活性を検出する。
【０２４０】
トランスジェニックヒツジモデルにおけるＡＡＶ−ＳＴＲＣレスキュー治療
経ＲＷＭ注入を介した蝸牛への送達後に正常な聴力機能を回復させる能力を評価するために、人工外リンパ中で調製したＡＡＶ−ＳＴＲＣをＳＴＲＣノックアウトトランスジェニックヒツジに投与する。処置前の内有毛細胞（ＩＨＣ）及び外有毛細胞（ＯＨＣ）機能を評価するために、ベースライン聴性脳幹反応（ＡＢＲ）及び歪成分耳音響放射（ＤＰＯＡＥ）を月齢３ヶ月の雌性ヒツジ（ｎ＝３０）において両側で測定する。ベースラインＡＢＲ及びＤＰＯＡＥ測定に続いて、１．０ｅ１４、３．２ｅ１３、及び１．０ｅ１３ｖｇ／ｍＬの力価の２０ｕＬのＡＡＶ１−ＳＴＲＣをヒツジの左鼓室階の中に注射する（ｎ＝１群当たり１０匹）。各動物の右耳を無処置の対照として残す。外科的手技から１日、５日、及び１０日後にＡＢＲ及びＤＰＯＡＥ測定を両側で再び行う。手技後６ヶ月で、全ての動物から追加の両側ＡＢＲ及びＤＰＯＡＥ測定を行い、その後、動物を屠殺し、それらの蝸牛を取り出す。
【０２４１】
屠殺した動物の半分（ｎ＝用量コホートの各々から５匹）において、有毛細胞構造を特定するとともに、蝸牛感覚上皮沿いのＳＴＲＣタンパク質発現を評価するために、免疫染色を実施する。有毛細胞（Ｍｙｏ７ａ）、支持細胞（Ｓｏｘ２）、及びステレオシリンのマーカーに対する抗体を以前に記載されたように用いる（Ｄｕｎｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３３（２２）：９５０８−９５１９，２０１３）。コルチ器の基底回転、中回転、及び頂回転にて、有毛細胞及びＳＴＲＣを発現する有毛細胞の総数を２００ｕｍ領域内で計数する。
【０２４２】
屠殺した動物の残りの半分（各用量コホートからの残りの５匹の動物）において、蝸牛組織試料を、上述したのと同じ基底領域、中領域、及び頂端領域から収集し、以前に記載されたようにステレオシリンｍＲＮＡ転写産物に関してアッセイする（Ｄｕｎｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１３，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３３（２２）：９５０８−９５１９，２０１３、Ｈｅｉｄｒｙｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１７：３８１４−３８２１，２００８、Ｈｅｉｄｒｙｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１８：２７７９−２７９０，２００９）。
【０２４３】
実施例９：ヒト臨床例（小児処置）
患者に全身麻酔をかける。外科医は、外耳道から鼓膜にアプローチし、鼓膜につながる外耳道の下縁に小さな切開を作製し、鼓膜をフラップとして挙上して、中耳空間を露出させる。手術用レーザを用いて、アブミ骨底に小さな開口部（およそ２ｍｍ）を作製する。次いで、外科医は、人工外リンパ中１ｅ１３ｖｇ／ｍＬの力価で調製したＡＡＶ−ＳＴＲＣの溶液を充填したマイクロカテーテルで正円窓膜を穿通する。マイクロカテーテルを、およそ１ｕＬ／分の速度でおよそ２０ｕＬのＡＡＶ−ＳＴＲＣ溶液を注入するマイクロマニピュレータに連結するＡＡＶ−ＳＴＲＣ注入の完了時に、外科医は、マイクロカテーテルを回収し、アブミ骨底及びＲＷＭの穴をゼルフォームパッチで修復する。手技は、鼓膜フラップを元に戻して完了する。
【０２４４】
実施例１０：ＳＴＲＣ変異を検出するための母体血の非侵襲性出生前検査
母体血試料（２０〜４０ｍＬ）をセルフリーＤＮＡ管中に収集する。少なくとも７ｍＬの血漿を、２，０００ｇで２０分間、続いて３，２２０ｇで３０分間、１回目のスピンの後に上清を移す二重遠心分離プロトコルを介して、各試料から単離する。ＱＩＡＧＥＮ  ＱＩＡｍｐ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉ  Ａｃｉｄキットを用いて、ｃｆＤＮＡを７〜２０ｍＬの血漿から単離し、４５μＬのＴＥ緩衝液中で溶出させる。純粋な母体ゲノムＤＮＡを、１回目の遠心分離後に得られるバフィーコートから単離する。
【０２４５】
プローブ−プローブ相互作用の可能性を最小限に抑えながらプローブを選択するためのアッセイの熱力学的モデリングを、以前に記載された増幅アプローチ（Ｓｔｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１９（１０）：１８４３−１８４８，２００９）と組み合わせることによって、１１，０００のアッセイの多重化を達成することができる。母体ｃｆＤＮＡ及び母体ゲノムＤＮＡ試料を、１１，０００の標的特異的アッセイを用いて１５サイクルにわたって前増幅し、アリコートを、ネステッドプライマーを用いた１５サイクルの第２のＰＣＲ反応に移す。１２サイクルの第３ラウンドのＰＣＲにおいてバーコード化タグを付加することによって、試料を配列決定用に調製する。標的は、ステレオシリン機能喪失変異の部位であることが知られている１５番染色体におけるゲノム配列を含む（Ｍａｎｄｅｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  １６（６）：６３９−６４７，２０１４）。次いで、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑシーケンサーを用いて増幅産物を配列決定する。市販のソフトウェアを用いてゲノム配列のアライメントを実施する。
【０２４６】
実施例１１：アデノウイルス（ＡＡＶ）トランススプライシング戦略
少なくとも２つの異なる核酸ベクター（例えば、ＡＡＶベクター）は、分子間コンカテマー化及びトランススプライシング後に細胞内で活性ステレオシリン遺伝子（例えば、完全長ステレオシリン遺伝子）を再構成するためのものであり得る。例えば、その全体が本明細書に援用される、Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７：１２；６７１６−６７２１，２０００を参照されたい。
【０２４７】
一部の例では、２つの異なる核酸ベクターが使用される。第１の核酸ベクターは、プロモーター（例えば、本明細書に記載されるプロモーターのうちのいずれか）と、該プロモーターの３’側に位置付けられた、ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分（例えば、本明細書に記載されるステレオシリンタンパク質の一部分のサイズのうちのいずれか及び／または本明細書に記載されるステレオシリンタンパク質のＮ末端部分のいずれか）をコードする第１のコード配列と、該第１のコード配列の該３’末端に位置付けられたスプライシングドナーシグナル配列とを含み得る。第２の核酸ベクターは、スプライシングアクセプターシグナル配列と、該スプライシングアクセプターシグナル配列の該３’末端に位置付けられた、ステレオシリンタンパク質のＣ末端部分（すなわち、該ステレオシリンタンパク質のうちのＮ末端部分に含まれない部分全体）（例えば、本明細書に記載されるステレオシリンタンパク質の一部分のサイズのうちのいずれか及び／または本明細書に記載されるステレオシリンタンパク質のＣ末端部分のいずれか）をコードする第２のコード配列と、該第２のコード配列の該３’末端におけるポリアデニル化配列（例えば、本明細書に記載されるポリアデニル化配列のうちのいずれか）とを含み得る。一部の実施形態では、該コードされた部分の各々は、少なくとも３０アミノ酸残基の長さ（例えば、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも７５アミノ酸、または少なくとも１００アミノ酸の長さ）であり、該コードされた部分の各々のアミノ酸配列は、他のコードされた部分の配列と重複せず、該２つの異なるベクターのうちのいずれの単一のベクターも、活性ステレオシリンタンパク質（例えば、完全長ステレオシリンタンパク質）をコードしていない。哺乳類細胞（例えば、本明細書に記載される哺乳類細胞のうちのいずれか）に導入されるとき、該スプライシングドナーシグナル配列と該スプライシングアクセプターシグナル配列との間でスプライシングが生じて、それによって、活性ステレオシリンタンパク質（例えば、完全長ステレオシリンタンパク質）をコードする組換え核酸が形成される。
【０２４８】
別の例では、３つの異なる核酸ベクターを使用することができる。第１の核酸ベクターは、プロモーター配列（例えば、本明細書に記載されるプロモーター配列のうちのいずれか）の一部分と、該プロモーターの３’側に位置付けられた、ステレオシリンタンパク質の第１の部分をコードするステレオシリン遺伝子の第１のコード配列（例えば、本明細書に記載されるステレオシリンコード配列のうちのいずれか）と、該第１のコード配列の該３’末端に位置付けられた第１のスプライシングドナーシグナル配列とを含み得る。第２の核酸ベクターは、第１のスプライシングアクセプターシグナル配列と、該第１のスプライシングアクセプターシグナル配列の該３’末端に位置付けられた、ステレオシリンタンパク質の第２の部分をコードするステレオシリン遺伝子の第２のコード配列と、該第２のコード配列の該３’末端に位置付けられた第２のスプライシングドナーシグナル配列（例えば、本明細書に記載されるスプライシングドナーシグナルのうちのいずれか）とを含み得る。該第２の核酸ベクターの特徴は、自己スプライシングが生じ得ない（すなわち、該第２の核酸ベクターの該第２のスプライシングドナーシグナル配列と該第１のスプライシングアクセプターシグナル配列との間でスプライシングが生じない）ことであろう。一部の実施形態では、該第１の核酸ベクターの該スプライシングドナーシグナル配列及び該第２の核酸ベクターの該第２のスプライシングドナーシグナルは、同じである（例えば、本明細書に記載されるかまたは当該技術分野で既知のスプライシングドナーシグナルのうちのいずれか）。一部の実施形態では、該第１の核酸ベクターの該第１のスプライシングドナーシグナル配列及び該第２の核酸ベクターの該第２のスプライシングドナーシグナル配列は、異なる（例えば、本明細書に記載されるかまたは当該技術分野で既知のスプライシングドナーシグナル配列のうちのいずれか）。第３の核酸ベクターは、第２のスプライシングアクセプターシグナル配列と、該第２のスプライシングアクセプターシグナル配列の該３’末端に位置付けられた、ステレオシリンタンパク質の第３の部分をコードするステレオシリン遺伝子の第３のコード配列と、該第３のコード配列の該３’末端に位置付けられたポリアデニル化配列（例えば、本明細書に記載されるポリアデニル化配列のうちのいずれか）とを含む。３つの核酸ベクターが使用される、かかる方法において、該第１のスプライシングドナー配列及び該第１のスプライシングアクセプター配列は、一緒に会合する（再結合する）ことができ、該第２のスプライシングドナー配列及び該第２のスプライシングアクセプター配列は、一緒に会合する（再結合する）ことができ、該第１、第２、及び第３のコード配列によってコードされるステレオシリンタンパク質の部分は重複せず、哺乳類細胞（例えば、本明細書に記載される哺乳類細胞のうちのいずれか）に導入されるとき、該第１のスプライシングドナー配列と該第１のスプライシングアクセプター配列との間、及び該第２のスプライシングドナー配列と該第２のスプライシングアクセプター配列との間でスプライシングが生じて、活性ステレオシリンタンパク質（例えば、完全長ステレオシリンタンパク質）をコードする組換え核酸が形成される。上記に提供される戦略に基づいて、当業者であれば、４つ、５つ、または６つの異なる核酸ベクターを用いて戦略を開発する方法を理解しよう。
【０２４９】
これらの方法の例のうちのいずれにおいても、該コードされた部分の各々のアミノ酸配列は、重複しておらず、かついずれの単一のベクターも、活性ステレオシリンタンパク質（例えば、完全長ステレオシリンタンパク質）をコードしていない。
【０２５０】
該少なくとも２つの異なるベクターの各々は、ステレオシリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、該コードされた部分の各々は、少なくとも３０アミノ酸（例えば、約３０アミノ酸〜約１６００アミノ酸、または本明細書に記載されるこの範囲の他の部分範囲のうちのいずれか）であり得る。
【０２５１】
一部の実施形態では、該コード配列の各々は、配列番号４の少なくとも１つのエクソン及び少なくとも１つのイントロン（例えば、少なくとも２つのエクソン及び少なくとも１つのイントロン、少なくとも２つのエクソン及び少なくとも２つのイントロン、少なくとも３つのエクソン及び少なくとも１つのイントロン、少なくとも３つのエクソン及び少なくとも２つのイントロン、または少なくとも３つのエクソン及び少なくとも３つのイントロン）を含み得る。一部の実施形態では、該少なくとも２つの異なるベクターの各々は、ステレオシリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、該コードされた部分の各々は、該コードされた部分の各々が重複しないように、配列番号１のアミノ酸配列の最大８０％（例えば、配列番号１の最大１０％、最大２０％、最大３０％、最大４０％、最大５０％、最大６０％、または最大７０％）をコードし得る。一部の実施形態では、該少なくとも２つの異なるベクターの各々は、ステレオシリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、該コードされた部分の各々が、該コードされた部分の各々が重複しないように、配列番号１のアミノ酸配列の最大８０％（例えば、配列番号１の最大１０％、最大２０％、最大３０％、最大４０％、最大５０％、最大６０％、または最大７０％）をコードする。
【０２５２】
該少なくとも２つの核酸ベクターの各々は、ヘッドトゥテール（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ）組換えを可能にする逆位末端反復配列（ＩＴＲ）をさらに含んでもよい。ＩＴＲはその後、スプライシングを介して除去される。例えば、ＩＴＲは、その全体が本明細書に援用される、Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７（１２）：６７１６−６７２１，２０００に記載されるような、回文構造の二重Ｄ  ＩＴＲであり得る。例えば、ＩＴＲは、Ｇｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６：１２４−１３０，２００８、及びＧｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２２：７７−８３，２０１１に記載されるような、ＡＡＶ血清型２  ＩＴＲであり得る。本明細書に記載されるベクターのうちのいずれかの一部の実施形態では、ベクターは、５’ＩＴＲ及び／または３’ＩＴＲを含み得る。一部の実施形態では、５’ＩＴＲは、配列番号１８を含むか、またはそれからなる。一部の実施形態では、３’ＩＴＲは、配列番号３６を含むか、またはそれからなる。
【０２５３】
スプライシングアクセプター及び／またはドナーシグナル配列の非限定的な例は、当該技術分野で既知である。例えば、Ｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１４（１）：３７−４４，２００３、及びＬａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（１１）：１４３５−１４３９，２００５，２００５を参照されたい。該スプライシングドナー及びアクセプターシグナル配列は、遺伝子（例えば、ステレオシリン遺伝子）の任意の内因性イントロンスプライシングシグナルであり得る。例えば、該スプライシングドナーシグナル配列は、５’−ＧＴＡＡＧＴＡＴＣＡＡＧＧＴＴＡＣＡＡＧＡＣＡＧＧＴＴＴＡＡＧＧＡＧＡＣＣＡＡＴＡＧＡＡＡＣＴＧＧＧＣＴＴＧＴＣＧＡＧＡＣＡＧＡＧＡＡＧＡＣＴＣＴＴＧＣＧＴＴＴＣＴ−３’（配列番号６）であり得、該スプライシングアクセプターシグナルは、５’−ＧＡＴＡＧＧＣＡＣＣＴＡＴＴＧＧＴＣＴＴＡＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＧＣＣＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＧ−３’（配列番号７）であり得る（例えば、Ｔｒａｐａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６（２）：１９４−２１１，２０１４を参照されたい）。スプライシング及びスプライシング効率を評価する方法は、当該技術分野で既知である（例えば、Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（１１）：１４３５−１４３９，２００５を参照されたい）。
【０２５４】
実施例１２：アルカリホスファターゼ（ＡＰ）の高度に組換え誘導性の外因性遺伝子領域を用いたハイブリッドベクタートランススプライシング戦略
少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ）の異なる核酸ベクター（例えば、ＡＡＶベクター）をまた本明細書に記載される方法のうちのいずれかで用いて、分子間コンカテマー化、マーカー遺伝子媒介性組換え、及びトランススプライシング後に細胞内で活性ステレオシリン遺伝子（例えば、完全長ステレオシリン遺伝子）を再構成することができる。この戦略は、それが相同組換え及び／またはトランススプライシングを含むため、ハイブリッド戦略である。例えば、各々その全体が本明細書に援用される、Ｇｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６：１２４−１３０，２００８、Ｇｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２２：７７−８３，２０１１、及びＤｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：３８３−３９１，２００１を参照されたい。本明細書で使用されるとき、検出可能マーカー遺伝子は、コード配列非依存性の組換えを可能にする高度に組換え誘導性のＤＮＡ配列であり得る。検出可能マーカー遺伝子の非限定的な例は、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）遺伝子である。例えば、検出可能マーカー遺伝子は、８７２ｂｐの長さである、ヒト胎盤ＡＰ相補的ＤＮＡの中央の３分の１であり得る（例えば、Ｇｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００８を参照されたい）。少なくとも２つの異なる核酸ベクターは、検出可能マーカー遺伝子（例えば、本明細書に記載される検出可能マーカー遺伝子のうちのいずれか）を含有する。ハイブリッドベクターは、実施例１０に記載されるようなトランススプライシングベクターに基づいて構築されるため、活性ステレオシリン遺伝子（例えば、完全長ステレオシリン遺伝子）は、ＩＴＲ媒介性組換え及びトランススプライシングまたは検出可能マーカー遺伝子媒介性（例えば、ＡＰ遺伝子媒介性）組換え及びトランススプライシングのいずれかを用いて再構成され得る。トランススプライシング後、活性ステレオシリン遺伝子（例えば、完全長ステレオシリン遺伝子）が、哺乳類細胞（例えば、本明細書に記載される任意の哺乳類細胞）のゲノムＤＮＡにおいて再構成される。
【０２５５】
一例では、２つの異なる核酸ベクターが使用される。第１の核酸ベクターは、プロモーター（例えば、本明細書に記載されるプロモーターのうちのいずれか）と、該プロモーターの３’側に位置付けられた、ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分（例えば、本明細書に記載されるステレオシリンタンパク質の一部分のサイズのうちのいずれか及び／または本明細書に記載されるステレオシリンタンパク質のＮ末端部分のうちのいずれか）をコードする第１のコード配列と、該第１のコード配列の該３’末端に位置付けられたスプライシングドナーシグナル配列と、該スプライシングドナーシグナル配列の３’側に位置付けられた第１の検出可能マーカー遺伝子とを含み得る。第２の核酸ベクターは、第２の検出可能マーカー遺伝子と、該第２の検出可能マーカー遺伝子の３’側に位置付けられたスプライシングアクセプターシグナル配列と、該スプライシングアクセプターシグナル配列の該３’末端に位置付けられた、ステレオシリンタンパク質のＣ末端部分（例えば、本明細書に記載されるステレオシリンタンパク質の一部分のサイズのうちのいずれか及び／または本明細書に記載されるステレオシリンタンパク質のＣ末端部分のいずれか）をコードする第２のコード配列と、該第２のコード配列の該３’末端におけるポリアデニル化配列（例えば、本明細書に記載されるポリアデニル化配列のうちのいずれか）とを含み得る。一部の実施形態では、該コードされた部分の各々は、少なくとも３０アミノ酸残基の長さ（例えば、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも７５アミノ酸、または少なくとも１００アミノ酸の長さ）であり、該コードされた部分の各々のアミノ酸配列は重複せず、該２つの異なるベクターのうちのいずれの単一のベクターも、活性ステレオシリンタンパク質（例えば、完全長ステレオシリンタンパク質）をコードしていない。哺乳類細胞（例えば、本明細書に記載される哺乳類細胞のうちのいずれか）に導入されるとき、該スプライシングドナーシグナル配列と該スプライシングアクセプターシグナル配列との間でスプライシングが生じて、それによって、活性ステレオシリンタンパク質（例えば、完全長ステレオシリンタンパク質）をコードする組換え核酸が形成される。
【０２５６】
別の例では、３つの異なる核酸ベクターを使用することができる。第１の核酸ベクターは、プロモーター配列（例えば、本明細書に記載されるプロモーター配列のうちのいずれか）の一部分と、該プロモーターの３’側に位置付けられた、ステレオシリンタンパク質の第１の部分をコードするステレオシリン遺伝子の第１のコード配列（例えば、本明細書に記載されるステレオシリンコード配列のうちのいずれか）と、該第１のコード配列の該３’末端に位置付けられた第１のスプライシングドナーシグナル配列と、第１の検出可能マーカー遺伝子とを含み得る。第２の核酸ベクターは、第２の検出可能マーカー遺伝子と、該第２の検出可能マーカー遺伝子の３’側に位置付けられた第１のスプライシングアクセプターシグナル配列と、該第１のスプライシングアクセプターシグナル配列の該３’末端に位置付けられた、ステレオシリンタンパク質の第２の部分をコードするステレオシリン遺伝子の第２のコード配列と、該第２のコード配列の該３’末端に位置付けられた第２のスプライシングドナーシグナル配列（例えば、本明細書に記載されるスプライシングドナーシグナルのうちのいずれか）と、第３の検出可能マーカー遺伝子とを含み得る。該第２の核酸ベクターの特徴は、自己スプライシングが生じ得ない（すなわち、該第２の核酸ベクターの該第２のスプライシングドナーシグナル配列と該第１のスプライシングアクセプターシグナル配列との間でスプライシングが生じない）ことであろう。一部の実施形態では、該第１の核酸ベクターの該スプライシングドナーシグナル配列及び該第２の核酸ベクターの該第２のスプライシングドナーシグナルは、同じである（例えば、本明細書に記載されるかまたは当該技術分野で既知のスプライシングドナーシグナルのうちのいずれか）。一部の実施形態では、該第１の核酸ベクターの該第１のスプライシングドナーシグナル配列及び該第２の核酸ベクターの該第２のスプライシングドナーシグナル配列は、異なる（例えば、本明細書に記載されるかまたは当該技術分野で既知のスプライシングドナーシグナル配列のうちのいずれか）。第３の核酸ベクターは、第４の検出可能マーカー遺伝子と、該第４の検出可能マーカー遺伝子の３’側に位置付けられた第２のスプライシングアクセプターシグナル配列と、該第２のスプライシングアクセプターシグナル配列の該３’末端に位置付けられた、ステレオシリンタンパク質の第３の部分をコードするステレオシリン遺伝子の第３のコード配列と、該第３のコード配列の該３’末端に位置付けられたポリアデニル化配列（例えば、本明細書に記載されるポリアデニル化配列のうちのいずれか）とを含み得る。３つの核酸ベクターが使用される、かかる方法において、該第１のスプライシングドナー配列及び該第１のスプライシングアクセプター配列は、一緒に会合する（再結合する）ことができ、該第２のスプライシングドナー配列及び該第２のスプライシングアクセプター配列は、一緒に会合する（再結合する）ことができ、該第１、第２、及び第３のコード配列によってコードされるステレオシリンタンパク質の部分は重複せず、哺乳類細胞（例えば、本明細書に記載される哺乳類細胞のうちのいずれか）に導入されるとき、該第１のスプライシングドナー配列と該第１のスプライシングアクセプター配列との間、及び該第２のスプライシングドナー配列と該第２のスプライシングアクセプター配列との間でスプライシングが生じて、活性ステレオシリンタンパク質（例えば、完全長ステレオシリンタンパク質）をコードする組換え核酸が形成される。当該技術分野で理解され得るように、３つの核酸ベクターが使用されるとき、該少なくとも２つの異なる核酸ベクターのうちの２つは、検出可能マーカー遺伝子（例えば、ＡＰマーカー遺伝子）を含む可能性があり、かつ該少なくとも２つの異なる核酸ベクターのうちの１つは、検出可能マーカー遺伝子を含む核酸ベクターにおけるスプライシングドナーシグナル配列に相補的であるスプライシングアクセプターシグナル配列を含んでもよい。例えば、一部の実施形態では、該第１及び第２の核酸ベクターは、検出可能マーカー遺伝子（例えば、ＡＰマーカー遺伝子）を含む可能性があり、かつ該第３の核酸ベクターは、該第２の核酸ベクターにおける該スプライシングドナーシグナル配列に相補的であるスプライシングアクセプターシグナル配列を含み、かつ該第３の核酸ベクターは、検出可能マーカー遺伝子（例えば、ＡＰマーカー遺伝子）を含まない。他の例では、該第２及び第３の核酸ベクターは、検出可能マーカー遺伝子（例えば、ＡＰマーカー遺伝子）を含む可能性があり、かつ該第１の核酸ベクターは、該第２の核酸ベクターにおける該スプライシングアクセプターシグナル配列に相補的であるスプライシングドナーシグナル配列を含み、かつ該第１の核酸ベクターは、検出可能マーカー遺伝子（例えば、ＡＰマーカー遺伝子）を含まない。
【０２５７】
上記に提供される戦略に基づいて、当業者であれば、４つ、５つ、または６つのベクターを用いて戦略を開発する方法を理解しよう。
【０２５８】
該少なくとも２つの核酸ベクター（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ）において提供されるコード配列は、重複しない。該少なくとも２つの異なるベクターの各々は、ステレオシリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含む可能性があり、該コードされた部分の各々が、例えば、少なくとも３０アミノ酸（例えば、約３０アミノ酸〜約１６００アミノ酸、または本明細書に記載されるこの範囲の他の部分範囲のうちのいずれか）である。
【０２５９】
一部の実施形態では、該少なくとも２つの異なるベクターの各々は、ステレオシリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、該コードされた部分の各々が、配列番号４の少なくとも１つのエクソン及び少なくとも１つのイントロン（例えば、少なくとも２つのエクソン及び少なくとも１つのイントロン、少なくとも２つのエクソン及び少なくとも２つのイントロン、少なくとも３つのエクソン、少なくとも１つのイントロン、少なくとも３つのエクソン及び少なくとも２つのイントロン、または少なくとも３つのエクソン及び少なくとも３つのイントロン）をコードする。一部の実施形態では、該少なくとも２つの異なるベクターの各々は、ステレオシリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、該コードされた部分の各々が、該コードされた部分の各々が重複しないように、配列番号１の最大８０％（例えば、配列番号１の最大１０％、最大２０％、最大３０％、最大４０％、最大５０％、最大６０％、最大７０％）をコードする。一部の実施形態では、該少なくとも２つの異なるベクターの各々は、ステレオシリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、該コードされた部分の各々が、該コードされた部分の各々が重複しないように、配列番号１の最大８０％（例えば、配列番号１の最大１０％、最大２０％、最大３０％、最大４０％、最大５０％、最大６０％、または最大７０％）をコードする。
【０２６０】
実施例１０に記載されるように、該少なくとも２つの核酸ベクターの各々は、ヘッドトゥテール組換えを可能にする逆位末端反復配列（ＩＴＲ）をさらに含んでもよい。ＩＴＲはその後、スプライシングを介して除去される。ＩＴＲならびにスプライシングアクセプター及び／またはスプライシングドナーシグナル配列の例は、当該技術分野で既知であり、実施例１０に記載されている。
【０２６１】
実施例１３：Ｆ１ファージの高度に組換え誘導性の外因性遺伝子領域（ＡＫ）を用いたハイブリッドベクタートランススプライシング戦略
少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ）の異なる核酸ベクター（例えば、ＡＡＶベクター）をまた本明細書に記載される方法のうちのいずれかで用いて、分子間コンカテマー化、マーカー遺伝子媒介性組換え、及びトランススプライシング後に細胞内で活性ステレオシリン遺伝子（例えば、完全長ステレオシリン遺伝子）を再構成することができる。この戦略は、それが相同組換え及び／またはトランススプライシングを含むため、ハイブリッド戦略である。例えば、その全体が本明細書に援用される、Ｔｒａｐａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６（２）：１９４−２１１，２０１４を参照されたい。本明細書で使用されるとき、Ｆ１ファージ組換え誘導領域（ＡＫ）は、コード配列非依存性の組換えを可能にするために使用される。Ｆ１ファージ組換え誘導領域は、Ｔｒａｐａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）に記載されるようなＦ１ファージゲノム由来の７７ｂｐの組換え誘導領域であってもよい。少なくとも２つの異なる核酸ベクターは、Ｆ１ファージ組換え誘導領域を含有する。ハイブリッドベクターは、実施例１０に記載されるようなトランススプライシングベクターに基づいて構築されるため、活性ステレオシリンタンパク質（例えば、完全長ステレオシリンタンパク質）をコードする核酸は、ＩＴＲ媒介性組換え及びトランススプライシング、またはＦ１ファージ組換え誘導領域により誘導される組換え及びトランススプライシングのいずれかを用いて生成され得る。トランススプライシング後、活性ステレオシリンタンパク質（例えば、完全長ステレオシリンタンパク質）をコードする核酸が、哺乳類細胞（例えば、本明細書に記載される哺乳類細胞のうちのいずれか）において生成される。
【０２６２】
一例では、２つの異なる核酸ベクターが使用される。第１の核酸ベクターは、プロモーター（例えば、本明細書に記載されるプロモーターのうちのいずれか）と、該プロモーターの３’側に位置付けられた、ステレオシリンタンパク質のＮ末端部分（例えば、本明細書に記載されるステレオシリンタンパク質の一部分のサイズのうちのいずれか及び／または本明細書に記載されるステレオシリンタンパク質のＮ末端部分のうちのいずれか）をコードする第１のコード配列と、該第１のコード配列の該３’末端に位置付けられたスプライシングドナーシグナル配列と、該スプライシングドナーシグナル配列の３’側に位置付けられたＦ１ファージ組換え誘導領域とを含み得る。第２の核酸ベクターは、Ｆ１ファージ組換え誘導領域と、該Ｆ１ファージ組換え誘導領域の３’側に位置付けられたスプライシングアクセプターシグナル配列と、該スプライシングアクセプターシグナル配列の該３’末端に位置付けられた、ステレオシリンタンパク質のＣ末端部分（例えば、本明細書に記載されるステレオシリンタンパク質の一部分のサイズのうちのいずれか及び／または本明細書に記載されるステレオシリンタンパク質のＣ末端部分のいずれか）をコードする第２のコード配列と、該第２のコード配列の該３’末端におけるポリアデニル化配列（例えば、本明細書に記載されるポリアデニル化配列のうちのいずれか）とを含み得る。一部の実施形態では、該コードされた部分の各々は、少なくとも３０アミノ酸残基の長さ（例えば、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも７５アミノ酸、または少なくとも１００アミノ酸の長さ）であり、該コードされた部分の各々のアミノ酸配列は重複せず、該２つの異なるベクターのうちのいずれの単一のベクターも、活性ステレオシリンタンパク質（例えば、完全長ステレオシリンタンパク質）をコードしていない。哺乳類細胞（例えば、本明細書に記載される哺乳類細胞のうちのいずれか）に導入されるとき、該スプライシングドナーシグナル配列と該スプライシングアクセプターシグナル配列との間でスプライシングが生じて、それによって、活性ステレオシリンタンパク質（例えば、完全長ステレオシリンタンパク質）をコードする組換え核酸が形成される。
【０２６３】
別の例では、３つの異なる核酸ベクターが使用される。第１の核酸ベクターは、プロモーター配列（例えば、本明細書に記載されるプロモーター配列のうちのいずれか）の一部分と、該プロモーターの５’側に位置付けられた、ステレオシリンタンパク質の第１の部分をコードするステレオシリン遺伝子の第１のコード配列（例えば、本明細書に記載されるステレオシリンコード配列のうちのいずれか）と、該第１のコード配列の該３’末端に位置付けられた第１のスプライシングドナーシグナル配列と、Ｆ１ファージ組換え誘導領域とを含み得る。第２の核酸ベクターは、Ｆ１ファージ組換え誘導領域と、該Ｆ１ファージ組換え誘導領域の３’側に位置付けられた第１のスプライシングアクセプターシグナル配列と、該第１のスプライシングアクセプターシグナル配列の該３’末端に位置付けられた、ステレオシリンタンパク質の第２の部分をコードするステレオシリン遺伝子の第２のコード配列と、該第２のコード配列の該３’末端に位置付けられた第２のスプライシングドナーシグナル配列（例えば、本明細書に記載されるスプライシングドナーシグナルのうちのいずれか）と、Ｆ１ファージ組換え誘導領域とを含み得る。該第２の核酸ベクターの特徴は、自己スプライシングが生じ得ない（すなわち、該第２の核酸ベクターの該第２のスプライシングドナーシグナル配列と該第１のスプライシングアクセプターシグナル配列との間でスプライシングが生じない）ことであろう。一部の実施形態では、該第１の核酸ベクターの該スプライシングドナーシグナル配列及び該第２の核酸ベクターの該第２のスプライシングドナーシグナルは、同じである（例えば、本明細書に記載されるかまたは当該技術分野で既知のスプライシングドナーシグナルのうちのいずれか）。一部の実施形態では、該第１の核酸ベクターの該第１のスプライシングドナーシグナル配列及び該第２の核酸ベクターの該第２のスプライシングドナーシグナル配列は、異なる（例えば、本明細書に記載されるかまたは当該技術分野で既知のスプライシングドナーシグナル配列のうちのいずれか）。第３の核酸ベクターは、Ｆ１ファージ組換え誘導領域と、該Ｆ１ファージ組換え誘導領域の３’側に位置付けられた第２のスプライシングアクセプターシグナル配列と、該第２のスプライシングアクセプターシグナル配列の該３’末端に位置付けられた、ステレオシリンタンパク質の第３の部分をコードするステレオシリン遺伝子の第３のコード配列と、該第３のコード配列の該３’末端に位置付けられたポリアデニル化配列（例えば、本明細書に記載されるポリアデニル化配列のうちのいずれか）とを含み得る。３つの核酸ベクターが使用される、かかる方法において、該第１のスプライシングドナー配列及び該第１のスプライシングアクセプター配列は、一緒に会合する（再結合する）ことができ、該第２のスプライシングドナー配列及び該第２のスプライシングアクセプター配列は、一緒に会合する（再結合する）ことができ、該第１、第２、及び第３のコード配列によってコードされるステレオシリンタンパク質の部分は重複せず、哺乳類細胞（例えば、本明細書に記載される哺乳類細胞のうちのいずれか）に導入されるとき、該第１のスプライシングドナー配列と該第１のスプライシングアクセプター配列との間、及び該第２のスプライシングドナー配列と該第２のスプライシングアクセプター配列との間でスプライシングが生じて、活性ステレオシリンタンパク質（例えば、完全長ステレオシリンタンパク質）をコードする組換え核酸が形成される。当該技術分野で理解され得るように、３つの核酸ベクターが使用されるとき、該異なる核酸ベクターのうちの２つは、Ｆ１ファージ組換え誘導領域を含む可能性があり、かつ該異なる核酸ベクターのうちの１つは、Ｆ１ファージ組換え誘導領域を含む核酸ベクターにおけるスプライシングドナーシグナル配列に相補的であるスプライシングアクセプターシグナル配列を含んでもよい。例えば、一部の実施形態では、該第１及び第２の核酸ベクターは、Ｆ１ファージ組換え誘導領域を含む可能性があり、かつ該第３の核酸ベクターは、該第２の核酸ベクターにおける該スプライシングドナーシグナル配列に相補的であるスプライシングアクセプターシグナルを含み、かつ該第３の核酸ベクターは、Ｆ１ファージ組換え誘導領域（例えば、ＡＰマーカー遺伝子）を含まない。他の例では、該第２及び第３の核酸ベクターは、Ｆ１ファージ組換え誘導領域を含む可能性があり、かつ該第１の核酸ベクターは、該第２の核酸ベクターにおける該スプライシングアクセプターシグナル配列に相補的であるスプライシングドナーシグナル配列を含み、かつ該第１の核酸ベクターは、Ｆ１ファージ組換え誘導領域を含まない。上記に提供される戦略に基づいて、当業者であれば、４つ、５つ、または６つのベクターを用いて戦略を開発する方法を理解しよう。
【０２６４】
該少なくとも２つの核酸ベクター（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ）の各々において提供されるコード配列は、重複しない。該少なくとも２つの異なるベクターの各々は、ステレオシリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、該コードされた部分の各々が、少なくとも３０アミノ酸（例えば、約３０アミノ酸〜約１６００アミノ酸、または本明細書に記載されるこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）である。
【０２６５】
一部の実施形態では、該少なくとも２つの異なるベクターの各々は、ステレオシリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、該コードされた部分の各々が、配列番号４の少なくとも１つのエクソン及び少なくとも１つのイントロン（例えば、少なくとも２つのエクソン及び少なくとも１つのイントロン、少なくとも２つのエクソン及び少なくとも２つのイントロン、少なくとも３つのエクソン、少なくとも１つのイントロン、少なくとも３つのエクソン及び少なくとも２つのイントロン、または少なくとも３つのエクソン及び少なくとも３つのイントロン）をコードする。一部の実施形態では、該少なくとも２つの異なるベクターの各々は、ステレオシリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、該コードされた部分の各々が、該コードされた部分の各々が重複しないように、配列番号１の最大８０％（例えば、配列番号１の最大１０％、最大２０％、最大３０％、最大４０％、最大５０％、最大６０％、または最大７０％）をコードする。一部の実施形態では、該少なくとも２つの異なるベクターの各々は、ステレオシリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、該コードされた部分の各々が、該コードされた部分の各々が重複しないように、配列番号１の最大８０％（例えば、配列番号１の最大１０％、最大２０％、最大３０％、最大４０％、最大５０％、最大６０％、または最大７０％）をコードする。
【０２６６】
実施例１０に記載されるように、該少なくとも２つの核酸ベクターの各々は、ヘッドトゥテール組換えを可能にする逆位末端反復配列（ＩＴＲ）をさらに含んでもよい。ＩＴＲはその後、スプライシングを介して除去される。ＩＴＲならびにスプライシングアクセプター及び／またはスプライシングドナーシグナルの例は、当該技術分野で既知であり、実施例１０に記載されている。
【０２６７】
実施例１４：望まれない残基を欠いているＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介性ノックインＳＴＲＣ偽遺伝子
機能的ＳＴＲＣ遺伝子及びＳＴＲＣ偽遺伝子のゲノム配列は、９８．９％同一であり、コード領域は、９９．６％相同である（Ｆｒａｎｃｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．Ａ．１５８Ａ（２）：２９８−３０８，２０１２）。Ｆｒａｎｃｅｙらは、エクソン１６〜２８の間の５６ｂｐが相違していると決定した。Ｖｅｒｐｙらは、ＳＴＲＣ偽遺伝子のエクソン２０におけるナンセンス変異が、偽遺伝子から発現されるタンパク質を不活性なものにしていると決定した（Ｖｅｒｐｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２９：３４５−３４９，２００１）。哺乳類細胞において活性ステレオシリンタンパク質（例えば、完全長ステレオシリンタンパク質）をコードする配列を生成し、それによって、治療を必要とする対象において非症候性感音性聴力喪失を治療するために、ＳＴＲＣ偽遺伝子（配列番号５）のエクソン２０におけるナンセンス変異を補正する（例えば、修飾する、置き換える）ためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ベクターを含む組成物を用いて、機能的ＳＴＲＣ遺伝子の発現を得てもよい。内因性遺伝子に変異を導入するために使用され得る種々のＣＲＩＳＲＰ−Ｃａｓ９技法もまた、当該技術分野で既知である。例えば、Ｍｅｒｋｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．１１（６）：８７５−８８３，２０１５、Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４４（９）：ｅ８５，２０１６、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ５：ｅ３９６，２０１６、及びＶｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５１３：１１９−１４０，２０１７を参照されたい。例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）と、ガイドＲＮＡであって、該ガイドＲＮＡの５’末端に、配列番号５の１３９５５〜１４１５１位内の約２０個（例えば、２０、２１、または２２個）の連続するヌクレオチドに相補的である約２０個（例えば、２０、２１、または２２個）のヌクレオチドからなる相補的領域を含む、該ガイドＲＮＡと、を含む組成物を、配列番号５の内因性ステレオシリン偽遺伝子配列における既定の部位のナンセンス変異を除去するためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ＲＮＡ先導型ゲノム編集において使用することができ、哺乳類細胞に導入されるとき、該ステレオシリン偽遺伝子の遺伝子座で、活性ステレオシリンタンパク質（例えば、完全長ステレオシリンタンパク質）をコードする核酸が再構成される。
【０２６８】
実施例１５：ＡＡＶ媒介性アンチセンスオリゴヌクレオチド送達
ＳＴＲＣ偽遺伝子から機能的ＳＴＲＣ転写産物を生成するための追加のアプローチは、エクソンスキッピングを介したＡＡＶ媒介性アンチセンスオリゴヌクレオチド送達の使用を含む。例えば、Ｃｈａｍｏｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ５：ｅ３０７，２０１６、Ｋａｗｅｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１５（４）：３９５−４１５，２０１５、Ｂｒｅｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．５：ｅ３３７９，２０１６、Ｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．４６１（３）：４８１−４８６，２０１５、及びＪｉｒｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｈｅｒ．２４（１）：２５−３６，２０１４を参照されたい。Ｂｒｅｍｅｒらに示されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、目的とする特定のエクソンに結合して、ＲＮＡレベルでインフレームエクソンスキッピングをもたらし、それによって遺伝子機能を回復させるように設計することができる。
【０２６９】
ステレオシリン遺伝子の場合、Ｂｒｅｍｅｒら（２０１６）において使用される技法等の技法を用いて、エクソンスキッピングの標的としてのＳＴＲＣ偽遺伝子のエクソン２０の適格性を決定するための研究を行うことができる。ＳＴＲＣ偽遺伝子のエクソン２０の適格性が決定されると、エクソン２０における１７〜２３個の塩基対に対応する配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを生成し、それらの融解温度、ＧＣ含量、オフターゲット結合、及び結合エネルギーに関して分析することができる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドとして合成され、ＲＴ−ＰＣＲによってエクソンスキッピングに関して分析される。細胞における補正されたＳＴＲＣ偽遺伝子のデノボ発現量を決定するために、細胞（例えば、哺乳類細胞、ヒト細胞、または本明細書に記載される任意の細胞）が、当該技術分野で既知のトランスフェクション方法を用いて、ステレオシリン遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、ＳＴＲＣ偽遺伝子のエクソン２０の一部に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチド）を含む核酸ベクター（例えば、ＡＡＶベクター）内でトランスフェクトされ、補正されたＳＴＲＣ偽遺伝子の発現量が、ＲＴ−ＰＣＲ、免疫蛍光法、またはウェスタンブロット、ならびに機能的生化学アッセイ等の方法を用いてステレオシリンタンパク質に関して決定される。例えば、一部の実施形態では、配列番号５の１３９５５〜１４１５１位内のヌクレオチド配列の少なくとも一部分（例えば、少なくとも５個の連続ヌクレオチド、少なくとも１０個の連続ヌクレオチド、少なくとも１５個の連続ヌクレオチド、少なくとも２０個の連続ヌクレオチド、少なくとも２５個の連続ヌクレオチド、少なくとも３０個の連続ヌクレオチド、少なくとも３５個の連続ヌクレオチド、少なくとも４０個の連続ヌクレオチド、少なくとも４５個の連続ヌクレオチド、少なくとも５０個の連続ヌクレオチド、少なくとも５５個の連続ヌクレオチド、少なくとも６０個の連続ヌクレオチド、少なくとも６５個の連続ヌクレオチド、少なくとも７０個の連続ヌクレオチド、少なくとも７５個の連続ヌクレオチド、少なくとも８０個の連続ヌクレオチド、少なくとも８５個の連続ヌクレオチド、少なくとも９０個の連続ヌクレオチド、少なくとも９５個の連続ヌクレオチド、少なくとも１００個の連続ヌクレオチド、少なくとも１０５個の連続ヌクレオチド、少なくとも１１０個の連続ヌクレオチド、少なくとも１１５個の連続ヌクレオチド、少なくとも１２０個の連続ヌクレオチド、少なくとも１２５個の連続ヌクレオチド、少なくとも１３０個の連続ヌクレオチド、少なくとも１３５個の連続ヌクレオチド、少なくとも１４０個の連続ヌクレオチド、少なくとも１４５個の連続ヌクレオチド、少なくとも１５０個の連続ヌクレオチド、少なくとも１５５個の連続ヌクレオチド、少なくとも１６０個の連続ヌクレオチド、少なくとも１６５個の連続ヌクレオチド、少なくとも１７０個の連続ヌクレオチド、少なくとも１７５個の連続ヌクレオチド、少なくとも１８０個の連続ヌクレオチド、少なくとも１８５個の連続ヌクレオチド、または少なくとも１９０個の連続ヌクレオチド）に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む核酸ベクターを含む組成物が、哺乳類細胞に導入され、機能的ステレオシリンタンパク質が生成される。当業者であれば、エクソン２０のアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、１３９５５〜１４１４１位により画定される領域内の配列に相補的な配列番号５のアンチセンスオリゴヌクレオチド）が、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０ヌクレオチドの長さであるか、または下端にそれらの数のうちの１つ及び上端により高い数を有する任意の範囲の数であろうことを理解しよう。一部の実施形態では、エクソン２０のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、２０ヌクレオチドの長さであろう。一部の実施形態では、エクソン２０のアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、１３９５５〜１４１４１位を含む配列に相補的な配列番号５のアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、１５〜３０ヌクレオチドの長さであろう。一部の実施形態では、エクソン２０のアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号５のアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、配列番号５の１３９５５〜１４１５１位により画定される領域の一部分の相補配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）であろう。
【０２７０】
実施例１６．ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞におけるＳＴＲＣ発現
ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を２４ウェルフォーマットにおいて７Ｅ４細胞／ウェルで一晩播種し、ｊｅｔＰＲＩＭＥ試薬を用いて例示的なシングルまたはデュアルＳＴＲＣベクターでトランスフェクトした。トランスフェクションから７２時間後、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を２００μＬ  ＲＩＰＡ緩衝液／ウェルで採取した。３０マイクロリットルの試料を各ウェル中の４〜１２％ビス−トリスタンパク質ゲル上にロードした。ＳＴＲＣポリクローナル抗体を用いてＳＴＲＣタンパク質発現量を決定した。ベータ−アクチン（ＡＣＴＢ）をローディング対照として使用した。
【０２７１】
図７に示されるように、ＣＢＡ／ＣＡＧプロモーター（ｐＩＴＲ−２０５とｐＩＴＲ−２０２及びｐＩＴＲ−２０５とｐＩＴＲ−２０２ＧＦＰ）を用いたデュアルＳＴＲＣベクターは、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞においてより著しい完全長ＳＴＲＣタンパク質をもたらした。この結果は、ＳＴＲＣタンパク質が本明細書に記載される例示的なＳＴＲＣベクターによって発現され得ることを裏付けた。
【０２７２】
次に、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を異なるＭＯＩのデュアルＳＴＲＣベクターで形質導入し、エトポシド試薬とともに、２４ウェルフォーマットにおいて１．２Ｅ５細胞／ウェルで一晩播種した。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞をトランスフェクションから７２時間後に２００μＬ  ＲＩＰＡ緩衝液／ウェルで採取した。図８に示されるように、ＡＡＶ２ベクターで形質導入されたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞は、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０ベクターで形質導入されたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞と比較して、完全長ＳＴＲＣタンパク質のより高い発現量を示した。
【０２７３】
図９は、Ａｎｃ８０．ＳＴＲＣ（ＭＯＩ８．６Ｅ４及びＭＯＩ２．６Ｅ５で）またはＡＡＶ２．ＳＴＲＣ（ＭＯＩ８．６Ｅ４及びＭＯＩ２．６Ｅ５で）のいずれかに感染させたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞において、ＧＡＰＤＨに対して高いレベルのＳＴＲＣ  ＲＮＡ発現量を示した。
【０２７４】
実施例１７．Ｐ１−３蝸牛マウス外植片におけるＳＴＲＣ発現
ＷＴマウス由来のＰ２蝸牛を播種後に感染させ、感染から７２時間後、ＲＮＡ及び免疫蛍光検査のために採取した。図１０に示されるように、ＭＯＩ３．９Ｅ１０のＡｎｃ８０．ＳＴＲＣ及びＭＯＩ１．３Ｅ１０のＡＡＶ２．ＳＴＲＣにそれぞれ感染させた蝸牛外植片において、完全長ＳＴＲＣが効率的に発現された。
【０２７５】
図１１Ａ〜Ｅ及び１２Ａ〜Ｃに示されるように、Ｐ１−３蝸牛外植片の外有毛細胞及び内細胞は、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０．ｄＳＴＲＣ（７．８Ｅ  ＶＧ／蝸牛、２．６Ｅ８  ＶＧ／蝸牛）及びＡＡＶ２．ｄＳＴＲＣ（７．８Ｅ８  ＶＧ／蝸牛及び２．６Ｅ８  ＶＧ／蝸牛）で形質導入されたときにＭｙｏ７ａ及びファロイジンを発現した。図１１Ａ及び１１Ｂは、自然の蝸牛構造を示し、ここにおいて、Ｍｙｏ７ａは外有毛細胞及び内有毛細胞の両方において発現される一方で、ファロイジンは内有毛細胞でのみ発現される。ＡＡＶ．Ａｎｃ８０．ＳＴＲＣで形質導入されたＰ１−３蝸牛外植片（図１１Ｃ〜Ｅ）、及びＡＡＶ２．ＳＴＲＣで形質導入されたＰ１−３蝸牛外植片（図１２Ａ〜Ｃ）において、類似した染色パターンが観察された。
【０２７６】
いずれのベクターでのトランスフェクションも、蝸牛の外有毛細胞または内有毛細胞の構造健全性を破壊しなかった。無感染の外植片とＡＡＶ２．ｄＳＴＲＣ及びＡＡＶ．Ａｎｃ８０．ｄＳＴＲＣ感染外植片との間を比較すると、強固な数の生存有毛細胞が示され、このことは、当該ベクターが比較的安全であることを示唆している。故に、図１１Ａ〜Ｅ及び１２Ａ〜Ｃは、生存能力があり組織化された外有毛細胞、内有毛細胞、及び不動毛束によりＳＴＲＣベクターの毒性の欠如を示した。
【０２７７】
他の実施形態
本発明は発明を実施するための形態に関連して説明されているが、上記の説明は例示説明を意図しており、本発明の範囲を限定することは意図しておらず、本発明の範囲は添付の特許請求によって定義されることを理解されたい。他の態様、利点、及び変更形態が、添付の特許請求の範囲内にある。
【０２７８】
本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりそれらの全体が援用される。矛盾がある場合、定義を含めて本明細書が優位に立つ。加えて、節の見出し、これらの材料、方法、及び例は例示説明にすぎず、限定することは意図していない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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