(57)【要約】本開示は、可溶型の免疫チェックポイントタンパク質を発現するように操作された組換え腫瘍溶解性ウイルスを提供する。ある局面において、該腫瘍溶解性ウイルスは、粘液腫ウイルスのような複製可能なウイルスである。該可溶型の免疫チェックポイントタンパク質を発現する該組換え腫瘍溶解性ウイルスを投与する工程を含む、がん処置の方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)可溶型のプログラム細胞死タンパク質1(PD1)と(b)インターロイキン12(IL-12)とをコードする発現カセットを1つまたは複数含み、複製可能である、組換え腫瘍溶解性粘液腫ウイルス。
【請求項２】
突然変異可溶型のPD1(mutPD1)と(b)インターロイキン12(IL-12)とをコードする発現カセットを1つまたは複数含み、複製可能であり、かつ、該mutPD1が抗PD1抗体によるmutPD1の認識を妨げる、請求項1記載の組換え腫瘍溶解性粘液腫ウイルス。
【請求項３】
前記mutPD1が、抗PD1抗体による抗体認識を妨げる突然変異をCDループ中に含有する、請求項2記載の組換え腫瘍溶解性粘液腫ウイルス。
【請求項４】
前記mutPD1が、D85Gを含む点突然変異をCDループ中に含有する、請求項3記載の組換え腫瘍溶解性粘液腫ウイルス。
【請求項５】
前記mutPD1がペンブロリズマブによって認識されない、請求項4記載の組換え腫瘍溶解性粘液腫ウイルス。
【請求項６】
可溶性PD1がヒトPD1の細胞外領域を含む、請求項1または2記載の組換え腫瘍溶解性粘液腫ウイルス。
【請求項７】
ヒトPD1の前記細胞外領域およびIL-12が、単一の発現カセットにおいてコードされている、請求項6記載の組換え腫瘍溶解性粘液腫ウイルス。
【請求項８】
前記発現カセットが、1つまたは複数のウイルスプロモーターの制御下にある、請求項1または2記載の組換え腫瘍溶解性粘液腫ウイルス。
【請求項９】
前記1つまたは複数のウイルスプロモーターが、合成初期/後期ポックスウイルスプロモーターである、請求項8記載の組換え腫瘍溶解性粘液腫ウイルス。
【請求項１０】
前記合成初期/後期ポックスウイルスプロモーターが、SEQ ID NO: 20と少なくとも90%同一である、請求項9記載の組換え腫瘍溶解性粘液腫ウイルス。
【請求項１１】
(i)粘液腫ゲノム中にウイルスM153Rオープンリーディングフレームにおいて；またはM135遺伝子とM136遺伝子との間に、PD1の細胞外領域およびIL-12の発現カセットが組み込まれている、請求項1または2記載の組換え腫瘍溶解性粘液腫ウイルス。
【請求項１２】
PD1の前記細胞外領域が、M135遺伝子とM136遺伝子との間に組み込まれている、請求項11記載の組換え腫瘍溶解性粘液腫ウイルス。
【請求項１３】
前記IL-12が、前記粘液腫ゲノム中に前記ウイルスM153Rオープンリーディングフレームにおいて組み込まれている、請求項11記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１４】
マーカー遺伝子をさらに含む、請求項11記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１５】
IL-12が膜貫通ドメインに融合されている、請求項14記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１６】
前記膜貫通ドメインがSEQ ID NO: 12によってコードされている、請求項15記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１７】
SEQ ID NO: 13によってコードされている、請求項16記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１８】
請求項1または2記載の腫瘍溶解性ウイルスの薬学的組成物。
【請求項１９】
請求項1もしくは2記載の腫瘍溶解性ウイルスまたは請求項18記載の薬学的組成物の有効量を投与する工程を含む、それを必要とする対象における疾患を処置する方法。
【請求項２０】
前記疾患ががんである、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
前記がんがプログラム死リガンド1(PDL1)の増大した発現を有する、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
前記対象が、増大したPDL1を発現するがんを有すると判定されている、請求項20記載の方法。
【請求項２３】
前記がんがPDL1の増大した発現を有さない、請求項20記載の方法。
【請求項２４】
前記がんが、黒色腫、腎臓がん、結腸直腸がん、乳がん、肺がん、頭頸部がん、脳がん、白血病、前立腺がん、膀胱がん、および卵巣がんである、請求項20記載の方法。
【請求項２５】
前記がんが黒色腫である、請求項20記載の方法。
【請求項２６】
前記黒色腫が転移性黒色腫である、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
前記腫瘍溶解性ウイルスを、動脈内に、静脈内に、腹腔内に、または腫瘍内に投与する、請求項19記載の方法。
【請求項２８】
前記腫瘍溶解性ウイルスを2回またはそれ以上投与する、請求項19記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも第2の抗がん療法を前記対象に実施する工程をさらに含む、請求項19記載の方法。
【請求項３０】
前記組換えウイルスの投与と同時にまたは連続的に、前記第2の抗がん療法を実施する、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
前記第2の抗がん療法が免疫調節薬である、請求項29記載の方法。
【請求項３２】
前記第2の抗がん療法が、免疫療法、化学療法、放射線療法、遺伝子療法、手術、ホルモン療法、抗血管新生療法、またはサイトカイン療法である、請求項29記載の方法。
【請求項３３】
前記免疫療法が免疫チェックポイント阻害物質療法である、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
前記免疫チェックポイント阻害物質療法が、PD1、PDL1、またはCTLA4に対して作製された抗体を用いる処置を含む、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
前記抗体が、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、またはイピリムマブである、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
前記抗体がペンブロリズマブである、請求項51記載の方法。
【請求項３７】
以下の工程を含む、それを必要とする対象における疾患を処置する方法：
(a)PDL1の過剰発現について該対象を試験する工程；および
(b)PDL1の増大した発現を有する対象へ、請求項1または2記載の腫瘍溶解性ウイルスの治療有効量を投与する工程。
【請求項３８】
前記疾患ががんである、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
前記がんがプログラム死リガンド1(PDL1)の増大した発現を有する、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
前記がんがPDL1の増大した発現を有さない、請求項38記載の方法。
【請求項４１】
前記がんが、黒色腫、腎臓がん、結腸直腸がん、乳がん、肺がん、頭頸部がん、脳がん、白血病、前立腺がん、膀胱がん、および卵巣がんである、請求項38記載の方法。
【請求項４２】
前記がんが黒色腫である、請求項38記載の方法。
【請求項４３】
前記黒色腫が転移性黒色腫である、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
前記腫瘍溶解性ウイルスを、動脈内に、静脈内に、腹腔内に、または腫瘍内に投与する、請求項37記載の方法。
【請求項４５】
前記腫瘍溶解性ウイルスを2回またはそれ以上投与する、請求項37記載の方法。
【請求項４６】
少なくとも第2の抗がん療法を前記対象に実施する工程をさらに含む、請求項37記載の方法。
【請求項４７】
前記組換えウイルスの投与と同時にまたは連続的に、前記第2の抗がん療法を実施する、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
前記第2の抗がん療法が免疫調節薬である、請求項46記載の方法。
【請求項４９】
前記第2の抗がん療法が、化学療法、免疫療法、放射線療法、遺伝子療法、手術、ホルモン療法、抗血管新生療法、またはサイトカイン療法である、請求項46記載の方法。
【請求項５０】
前記免疫療法が免疫チェックポイント阻害物質療法である、請求項49記載の方法。
【請求項５１】
前記免疫チェックポイント阻害物質療法が、PD1、PDL1、またはCTLA4に対して作製された抗体を用いる処置を含む、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
前記抗体が、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、またはイピリムマブである、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
可溶型のT細胞免疫グロブリンとムチンドメイン含有3(TIM3)とをコードする発現カセットを1つまたは複数含む、組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項５４】
可溶性TIM3がマウスTIM3の細胞外領域を含む、請求項53記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項５５】
前記発現カセットが、1つまたは複数のウイルスプロモーターの制御下にある、請求項53記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項５６】
前記1つまたは複数のウイルスプロモーターが、合成初期/後期ポックスウイルスプロモーターである、請求項56記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項５７】
粘液腫ウイルス、レオウイルス、単純ヘルペスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、麻疹ウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、ラブドウイルス、ピコルナウイルス、コクサッキーウイルス、およびパルボウイルスからなる群より選択される、請求項53記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項５８】
粘液腫ウイルスである、請求項57記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項５９】
粘液腫ゲノム中にウイルスM153Rオープンリーディングフレームにおいて組み込まれている、請求項58記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項６０】
マーカー遺伝子をさらに含む、請求項59記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項６１】
前記マーカー遺伝子が高感度緑色蛍光タンパク質(eGFP)である、請求項60記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項６２】
請求項53記載の腫瘍溶解性ウイルスの薬学的組成物。
【請求項６３】
請求項53記載の腫瘍溶解性ウイルスまたは請求項62記載の薬学的組成物の有効量を投与する工程を含む、それを必要とする対象における疾患を処置する方法。
【請求項６４】
前記疾患ががんである、請求項63記載の方法。
【請求項６５】
前記がんが、黒色腫、腎臓がん、結腸直腸がん、乳がん、肺がん、頭頸部がん、脳がん、白血病、前立腺がん、膀胱がん、および卵巣がんである、請求項70記載の方法。
【請求項６６】
前記がんが黒色腫である、請求項65記載の方法。
【請求項６７】
前記黒色腫が転移性黒色腫である、請求項66記載の方法。
【請求項６８】
前記腫瘍溶解性ウイルスを、動脈内に、静脈内に、腹腔内に、または腫瘍内に投与する、請求項67記載の方法。
【請求項６９】
前記腫瘍溶解性ウイルスを2回またはそれ以上投与する、請求項68記載の方法。
【請求項７０】
少なくとも第2の抗がん療法を前記対象に実施する工程をさらに含む、請求項69記載の方法。
【請求項７１】
前記組換えウイルスの投与と同時にまたは連続的に、前記第2の抗がん療法を実施する、請求項70記載の方法。
【請求項７２】
前記第2の抗がん療法が免疫調節薬である、請求項71記載の方法。
【請求項７３】
前記第2の抗がん療法が、免疫療法、化学療法、放射線療法、遺伝子療法、手術、ホルモン療法、抗血管新生療法、またはサイトカイン療法である、請求項72記載の方法。
【請求項７４】
前記免疫療法が免疫チェックポイント阻害物質療法である、請求項73記載の方法。
【請求項７５】
前記免疫チェックポイント阻害物質療法が、PD1、PDL1、またはCTLA4に対して作製された抗体を用いる処置を含む、請求項74記載の方法。
【請求項７６】
前記抗体が、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、またはイピリムマブである、請求項75記載の方法。
【請求項７７】
以下の工程を含む、それを必要とする対象における疾患を処置する方法：
(a)GAL9の過剰発現について該対象を試験する工程；および
(b)GAL9の増大した発現を有する対象へ、請求項53記載の腫瘍溶解性ウイルスの治療有効量を投与する工程。
【請求項７８】
前記疾患ががんである、請求項77記載の方法。
【請求項７９】
前記がんが、黒色腫、腎臓がん、結腸直腸がん、乳がん、肺がん、頭頸部がん、脳がん、白血病、前立腺がん、膀胱がん、および卵巣がんである、請求項86記載の方法。
【請求項８０】
前記がんが黒色腫である、請求項79記載の方法。
【請求項８１】
前記黒色腫が転移性黒色腫である、請求項80記載の方法。
【請求項８２】
前記腫瘍溶解性ウイルスを、動脈内に、静脈内に、腹腔内に、または腫瘍内に投与する、請求項77記載の方法。
【請求項８３】
前記腫瘍溶解性ウイルスを2回またはそれ以上投与する、請求項77記載の方法。
【請求項８４】
少なくとも第2の抗がん療法を前記対象に実施する工程をさらに含む、請求項77記載の方法。
【請求項８５】
前記組換えウイルスの投与と同時にまたは連続的に、前記第2の抗がん療法を実施する、請求項84記載の方法。
【請求項８６】
前記第2の抗がん療法が免疫調節薬である、請求項84記載の方法。
【請求項８７】
前記第2の抗がん療法が、化学療法、免疫療法、放射線療法、遺伝子療法、手術、ホルモン療法、抗血管新生療法、またはサイトカイン療法である、請求項84記載の方法。
【請求項８８】
前記免疫療法が免疫チェックポイント阻害物質療法である、請求項87記載の方法。
【請求項８９】
前記免疫チェックポイント阻害物質療法が、PD1、PDL1、またはCTLA4に対して作製された抗体を用いる処置を含む、請求項88記載の方法。
【請求項９０】
前記抗体が、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、またはイピリムマブである、請求項89記載の方法。
【請求項９１】
前記抗体がペンブロリズマブである、請求項89記載の方法。
【請求項９２】
ヒトPD1の前記細胞外領域およびIL-12が、複数の発現カセットにおいてコードされている、請求項6記載の組換え腫瘍溶解性粘液腫ウイルス。
【請求項９３】
IL-12が融合タンパク質としてコードされており、IL-12αサブユニットおよびIL-12βサブユニットが可動性リンカーを介して連結されている、請求項92記載の組換え腫瘍溶解性粘液腫ウイルス。
【請求項９４】
前記可動性リンカーが配列(GGGGS)nを有する、請求項93記載の組換え腫瘍溶解性粘液腫ウイルス。
【請求項９５】
2つの別個のDNA構築物から前記IL-12αサブユニットおよびIL-12βサブユニットを発現する、請求項92記載の組換え腫瘍溶解性粘液腫ウイルス。
【請求項９６】
単一のDNA構築物から別個のプロモーターの制御下で前記IL-12αサブユニットおよびIL-12βサブユニットを発現する、請求項92記載の組換え腫瘍溶解性粘液腫ウイルス。
【請求項９７】
単一のDNA構築物から別個のプロモーターの制御下で前記IL-12αサブユニットおよびIL-12βサブユニットを発現する、請求項92記載の組換え腫瘍溶解性粘液腫ウイルス。
【請求項９８】
前記IL-12が、SEQ ID NO: 7および8と少なくとも90%相同である配列を含む、請求項1記載の組換え腫瘍溶解性粘液腫ウイルス。
【請求項９９】
前記突然変異可溶型のPD1が、SEQ ID NO: 5と少なくとも90%相同である配列を含む、請求項2記載の組換え腫瘍溶解性粘液腫ウイルス。
【請求項１００】
前記IL-12αサブユニットが、SEQ ID NO: 7と少なくとも90%相同である配列を含み、かつ前記IL-12βサブユニットが、SEQ ID NO 8と少なくとも90%相同である配列を含む、請求項95記載の組換え腫瘍溶解性粘液腫ウイルス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2018年8月16日に出願された米国仮特許出願第62/718,990号；2018年10月4日に出願された同第62/741,404号；2018年11月2日に出願された同第62/754,622号；および2019年3月4日に出願された同第62/813,375号の恩典を主張し、これらの各々の全体は参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所によって与えられた助成金番号5R01CA194090の下で政府支援によってなされた。政府は本発明においてある特定の権利を有する。
【０００３】
1．分野
本開示は、概して、分子生物学および医学の分野に関する。より具体的には、本開示は、PD1またはTIM3などの免疫チェックポイントタンパク質を発現する腫瘍溶解性ウイルスに関する。
【背景技術】
【０００４】
2．関連技術の説明
様々なタイプのがんを処置するために使用される現在の処置は、がん細胞の被毒または殺滅によって作用する傾向がある。残念ながら、がん細胞に有害である処置は、典型的に、健康な細胞にも同様に有毒である傾向がある。さらに、腫瘍の不均質性は、がんについての有効な処置が理解しにくいままである主な理由の1つである。化学療法および放射線療法のような現在の主流の療法は、毒性の狭い治療濃度域内で使用される傾向がある。これらのタイプの療法は、様々なタイプの腫瘍細胞、およびこれらの処置を実施することができる限られた濃度域のために、限られた適用性を有する。現在開発中の最新の抗がん療法は、健康な細胞に対してより低毒性でありながら腫瘍細胞を選択的に標的にし、それによって健康な細胞を影響されないままにする可能性をより高くしようと試みている。
【０００５】
転移性黒色腫は、5年生存率が16%である高悪性度の疾患であり、大抵の標準的化学療法にほとんど反応しない。インターフェロンおよびインターロイキン2(IL-2)は両方とも、黒色腫の処置について米国食品医薬品局によって承認されている。両方とも、抗腫瘍免疫反応を刺激することによって、それらの利益を媒介する。しかし、毒性および低奏効率はそれらの使用を有意に限定した。米国食品医薬品局(FDA)によって承認された最初の免疫チェックポイント阻害物質は、2011年における転移性黒色腫の処置についての、細胞傷害性Tリンパ球抗原(CTLA)-4および結果としてPD-1経路を遮断する完全ヒト免疫グロブリンG1モノクローナル抗体、イピリムマブであった。プログラム細胞死タンパク質1リガンド1(PDL1またはPD-L1)およびPDL2が黒色腫細胞、T細胞、B細胞、およびナチュラルキラー細胞によって発現されるという知見は、プログラム細胞死タンパク質1(PD1またはPD-1)特異的抗体(例えば、ニボルマブおよびペンブロリズマブ)の開発をもたらした。
【０００６】
従って、PD1経路遮断は、黒色腫を越えて抗がん薬開発において主要な焦点となった。腎細胞がんを有する患者に利益を与えることに加えて、それは、非小細胞肺がんを含む、免疫療法に対して感受性がないと以前は考えられた腫瘍を有する患者における利益を報告した。しかし、これらの免疫療法に関連する毒性に起因して、依然として制限が存在する。従って、高い有効性および低毒性の最善のバランスを有するPD1経路を遮断する免疫療法についての必要性が存在する。
【０００７】
がん療法における免疫チェックポイント阻害は、多数の異なるタイプのがんの処置について有効であることが示された。しかし、全てのがん細胞が等しく反応するとは限らない。その上、毒性、および個々のチェックポイント阻害物質に対する耐性の発現が問題である(Pardoll, 2012; Topalian et al., 2015)。免疫チェックポイント阻害物質についての改善が、上述の欠点に対抗するために必要である。
【０００８】
がん療法についての別の有望な治療アプローチは、腫瘍溶解性ウイルスの使用である。単独でのおよび他の療法と組み合わせての腫瘍溶解性ウイルスを用いる処置は、直接的な腫瘍細胞傷害性を誘発し、腫瘍細胞に対する免疫細胞の活性化を強化する。腫瘍溶解性ウイルスは、それらをより有効にするためにタンパク質を発現するようにそれらがさらに「武装化され」得る点で、新規性を有する(Kaufman et al., 2015)。
【０００９】
最近の研究は、PD1チェックポイント分子のヒト細胞外部分を発現するように粘液腫ウイルスを操作することによって、腫瘍溶解性ウイルスを免疫チェックポイント阻害物質と組み合わせることの有効性を実験的に示した(Bartee et al., 2017)。PD1は、腫瘍細胞上のPDL1へ結合するT細胞上の膜タンパク質である。この相互作用は、腫瘍細胞に対するT細胞の活性化の阻害をもたらすPD1を通してのシグナリングをトリガーし、従って、免疫細胞排除から腫瘍細胞を保護する(Pardoll, 2012)。細胞外PD1タンパク質を発現する粘液腫ウイルス(vPD1)の、腫瘍中の直接注射を通しての、腫瘍細胞の感染で、腫瘍上のPDL1およびT細胞上のPD1の相互作用は局所的に阻害される。これは、細胞外PD1タンパク質が腫瘍細胞PDL1へ直接結合し、T細胞PD1がPDL1に結合することを遮断することによって起こり、T細胞免疫活性化および抗腫瘍効果をもたらす。
【００１０】
腫瘍微小環境中に存在する別の主要な阻害経路はTIM3チェックポイントであり、ここで、腫瘍細胞によって発現される様々なTIM3リガンド(GAL9、ホスファチジルセリン、およびHMGB1を含む)は、抗腫瘍TまたはNK細胞上のTIM3へ結合し、免疫細胞消耗を生じさせる。この経路に打ち勝つための現在の方法は、TIM3-GAL9相互作用を遮断する抗体の全身注射を含むが；しかし、これらの全身処置は高価であり、時間がかかり、低奏効率および顕著な毒性を伴う。従って、免疫チェックポイントを阻害する改善された方法についての満たされない必要性が存在する。
【発明の概要】
【００１１】
概要
本開示のある態様は、(a)可溶型のプログラム細胞死タンパク質1(PD1またはPD-1)と、任意で(b)インターロイキン2(IL-2)またはインターロイキン12(IL-12)またはインターロイキン15(IL-15)とをコードする発現カセットを1つまたは複数含む組換え腫瘍溶解性ウイルスを含む方法および組成物を提供し、ウイルスは複製可能である。いくつかの局面において、可溶性PD1はヒトPD1の細胞外領域を含む。特定の局面において、ヒトPD1の細胞外領域はSEQ ID NO: 4を含む。いくつかの局面において、ヒトPD1の細胞外領域は、SEQ ID NO: 4と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%同一の配列を含む。特定の局面において、ヒトIL-12配列はSEQ ID NO: 7および8を含む。いくつかの局面において、ヒトIL-12は、SEQ ID NO: 7および8と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%同一の配列を含む。特定の局面において、ヒトIL-2配列はSEQ ID NO: 6を含む。いくつかの局面において、ヒトIL-2は、SEQ ID NO: 6と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%同一の配列を含む。ある他の局面において、可溶性PD1の変異導入または突然変異バージョンは、可溶性PD1への抗PD1抗体の阻害性結合を減少させることによって、抗PD1抗体との併用療法の効果を増強するために提供される。特定の局面において、突然変異ヒト可溶性PD1配列はSEQ ID NO: 5を含む。いくつかの局面において、ヒトPD1の細胞外領域は、SEQ ID NO: 5と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%同一の配列を含む。
【００１２】
本開示のある態様は、変異導入された可溶型のPD1をコードする発現カセットを含む組換え腫瘍溶解性ウイルスを含む方法および組成物を提供し、ウイルスは複製可能である。いくつかの局面において、変異導入された可溶性PD1はヒトPD1の細胞外領域を含む。特定の局面において、ヒトPD1の細胞外領域はSEQ ID NO: 5を含む。いくつかの局面において、ヒトPD1の細胞外領域は、SEQ ID NO: 5と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%同一の配列を含む。
【００１３】
ある局面において、IL-12は膜貫通ドメインに融合されている。例えば、いくつかの局面において、IL-12は、CD28、CD8a、またはCD137の膜貫通ドメインに融合され得る。さらなる局面において、IL-12は、膜固定タンパク質へ結合するポリペプチドに融合され得る。IL-12との融合のための膜貫通タンパク質、およびそれについての方法は、例えば、Cheng et al. 2008(参照により本明細書に組み入れられる)に提供されている。いくつかの具体的な局面において、IL-12は、SEQ ID NO:12によってコードされた膜貫通ドメインに融合されている。いくつかの局面において、腫瘍溶解性ウイルスは、SEQ ID NO:13と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%同一の配列によってコードされている。
【００１４】
本開示のさらなる態様は、可溶型のT細胞免疫グロブリンとムチンドメイン含有3(TIM3)とをコードする発現カセットを1つまたは複数含む組換え腫瘍溶解性ウイルスを提供する。ある局面において、可溶性TIM3はマウスまたはヒトTIM3の細胞外領域を含む。
【００１５】
なおさらなる態様において、それを必要とする対象における疾患を処置する方法を提供し、該方法が、(a)GAL9の過剰発現について対象を試験する工程；および(b)GAL9の増大した発現を有する対象へ、腫瘍溶解性ウイルスまたは可溶型のTIM3をコードする発現カセットを1つもしくは複数含む組換え腫瘍溶解性ウイルスの治療有効量を投与する工程を含む。ある局面において、対象は、増大したGAL9発現を示すがんを有する。
【００１６】
ある局面において、1つまたは複数の発現カセットは、ウイルスプロモーターの制御下にあり得る。いくつかの局面において、ウイルスプロモーターは合成初期/後期ポックスウイルスプロモーターである。例えば、いくつかの局面において、合成初期/後期ポックスウイルスプロモーターは、
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の配列と約80%、約85%、約90%、約95%、または約100%同一である。
【００１７】
いくつかの局面において、ウイルスは、粘液腫ウイルス、レオウイルス、単純ヘルペスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、麻疹ウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、ラブドウイルス、ピコルナウイルス、コクサッキーウイルス、およびパルボウイルスからなる群より選択される。特定の局面において、腫瘍溶解性ウイルスは粘液腫ウイルスである。いくつかの局面において、可溶型のTIM3またはPD1の細胞外領域、例えば変異導入されたPD1、および／またはIL-12、もしくはIL-2の発現カセットは、粘液腫ゲノム中にウイルスM153Rオープンリーディングフレームにおいて組み込まれている。例えば、いくつかの局面において、細胞外IL-12発現構築物は、ウイルスM153Rの代わりに挿入されている。さらなる局面において、PD1(細胞外ドメイン)発現構築物は、ウイルスM135の後にまたはウイルスM135とM136との間に挿入されている。さらなる局面において、PD1およびIL-12の両方についての発現構築物は、ウイルスM153Rの代わりにまたはウイルスM135とM136との間に挿入され得る。
【００１８】
さらなる態様において、本明細書において提供される腫瘍溶解性ウイルスの薬学的組成物を提供し、該薬学的組成物は、可溶型のPD1、例えば変異導入されたPD1、(例えば、上記の態様の組換え腫瘍溶解性ウイルス)と、任意でIL-12またはIL-2とをコードする発現カセットを1つまたは複数含む組換え腫瘍溶解性ウイルスを含む。さらなる局面において、組換え腫瘍溶解性ウイルスは、可溶型のTIM3をコードする発現カセットを1つまたは複数含む。
【００１９】
別の態様において、それを必要とする対象における疾患を処置する方法を提供し、該方法は、本明細書において提供される薬学的組成物の有効量を投与する工程を含み、該薬学的組成物は、可溶型のTIM3または可溶型のPD1、例えば変異導入されたPD1と、任意でIL-12またはIL-2とをコードする発現カセットを1つまたは複数含む組換え腫瘍溶解性ウイルスを含む。
【００２０】
いくつかの局面において、疾患は、がん、例えば転移性がんである。ある局面において、がんはプログラム死リガンド1(PDL1)の増大した発現を有する。従って、いくつかの局面において、態様に従う処置のための対象は、PDL1を発現するがんを有すると判定されている対象である。他の局面において、がんはPDL1の増大した発現を有さない。例えば、がんは、黒色腫、腎臓がん、結腸直腸がん、乳がん、肺がん、頭頸部がん、脳がん、白血病、前立腺がん、膀胱がん、および卵巣がんであり得る。特に、がんは黒色腫である。いくつかの局面において、黒色腫は転移性黒色腫である。いくつかの局面において、がんは肺へ転移している。
【００２１】
ある局面において、腫瘍溶解性ウイルスを、動脈内に、静脈内に、腹腔内に、または腫瘍内に投与する。いくつかの局面において、腫瘍溶解性ウイルスを2回またはそれ以上投与する。
【００２２】
いくつかの局面において、腫瘍溶解性ウイルスの投与は、可溶型TIM3または可溶性PD1(例えば変異導入されたPD1)、例えば、約20〜40 kDa、例えば約30 kDaのタンパク質の発現を生じさせる。特定の局面において、発現された可溶性PD1(例えば変異導入されたPD1)はグリコシル化されている。ある局面において、可溶性PD1(例えば変異導入されたPD1)の発現は、投与後長期間、例えば、投与後少なくとも3〜5日間、特に少なくとも6〜14日間、持続する。特定の局面において、可溶性PD1の発現は、処置される対象中の腫瘍に本質的に局在化している。
【００２３】
特定の局面において、腫瘍溶解性ウイルスの投与は、脱毛を生じさせないか、またはせいぜい軽微なレベル程度の脱毛を生じさせる。
【００２４】
いくつかの局面において、処置の方法は、対象に少なくとも第2の抗がん療法を実施する工程をさらに含む。いくつかの局面において、組換えウイルスの投与と同時にまたは連続的に、第2の抗がん療法を実施する。例えば、第2の抗がん療法は免疫調節薬であり得る。他の局面において、第2の抗がん療法は、化学療法、免疫療法、放射線療法、遺伝子療法、手術、ホルモン療法、抗血管新生療法、およびサイトカイン療法より選択される。いくつかの局面において、第2の抗がん療法は、T細胞、例えばCD8+ T細胞(例えば、CD25+/CD69hiCD8+ T細胞)の投与を含む。いくつかの局面において、免疫療法は免疫チェックポイント阻害物質療法である。特定の局面において、免疫チェックポイント阻害物質療法は、PD1、PDL1、またはCTLA4に対して作製された抗体を用いる処置を含む。特定の局面において、抗体は、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、またはイピリムマブである。好ましい局面において、処置方法は、PD1に対して作製された抗体を用いる処置を含む。特に好ましい局面において、処置はペンブロリズマブを用いる処置を含む。
【００２５】
別の態様において、本開示は、それを必要とする対象における疾患を処置する方法を提供し、該方法が、(a)PDL1の過剰発現について対象を試験する工程；および(b)PDL1の増大した発現を有する対象へ、可溶性PD1(例えば変異導入されたPD1)をコードする発現カセットを含む組換え腫瘍溶解性ウイルスを含む本明細書において提供される腫瘍溶解性ウイルスの治療有効量を投与する工程を含む。
【００２６】
いくつかの局面において、疾患は、がん、例えば転移性がんである。ある局面において、がんはプログラム死リガンド1(PDL1)の増大した発現を有する。他の局面において、がんはPDL1の増大した発現を有さない。例えば、がんは、黒色腫、腎臓がん、結腸直腸がん、乳がん、肺がん、頭頸部がん、脳がん、白血病、前立腺がん、膀胱がん、および卵巣がんである。特に、がんは黒色腫である。いくつかの局面において、黒色腫は転移性黒色腫である。いくつかの局面において、がんは肺へ転移している。
【００２７】
ある局面において、腫瘍溶解性ウイルスを、動脈内に、静脈内に、腹腔内に、または腫瘍内に投与する。いくつかの局面において、腫瘍溶解性ウイルスを2回またはそれ以上投与する。
【００２８】
いくつかの局面において、腫瘍溶解性ウイルスの投与は、可溶型のTIM3または可溶性PD1、例えば突然変異PD1、例えば、約20〜40 kDa、例えば約30 kDaのタンパク質の発現を生じさせる。特定の局面において、発現された可溶性PD1はグリコシル化されている。ある局面において、可溶性TIM3または可溶性PD1の発現は、投与後長期間、例えば、投与後少なくとも3〜5日間、特に少なくとも6〜14日間、持続する。特定の局面において、可溶性TIM3またはPD1の発現は、処置される対象中の腫瘍に本質的に局在化している。特定の局面において、腫瘍溶解性ウイルスの投与は、脱毛を生じさせないか、またはせいぜい軽微なレベル程度の脱毛を生じさせる。
【００２９】
いくつかの局面において、処置の方法は、対象に少なくとも第2の抗がん療法を実施する工程をさらに含む。いくつかの局面において、組換えウイルスの投与と同時にまたは連続的に、第2の抗がん療法を実施する。例えば、第2の抗がん療法は免疫調節薬であり得る。他の局面において、第2の抗がん療法は、化学療法、免疫療法、放射線療法、遺伝子療法、手術、ホルモン療法、抗血管新生療法、またはサイトカイン療法である。いくつかの局面において、第2の抗がん療法は、T細胞、例えばCD8+ T細胞(例えば、CD25+/CD69hiCD8+ T細胞)の投与を含む。40。いくつかの局面において、免疫療法は免疫チェックポイント阻害物質療法である。特定の局面において、免疫チェックポイント阻害物質療法は、PD1、PDL1、またはCTLA4に対して作製された抗体を用いる処置を含む。特定の局面において、抗体は、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、またはイピリムマブである。
【００３０】
本明細書において使用される場合、指定の成分に関して、「本質的に含まない」は、指定の成分のいずれも、組成物中へ意図的に製剤化されなかったこと、および／または汚染物質としてもしくは微量でのみ存在することを意味するために本明細書において使用される。組成物の意図的でない汚染に起因する指定の成分の総量は、従って、0.05%を遥かに下回る。最も好ましいのは、標準的な分析方法では指定の成分の量を検出することができない組成物である。
【００３１】
本明細書において使用される場合、「1つの（a）」または「1つの（an）」は、1つまたは複数を意味し得る。特許請求の範囲において使用される場合、「含む」という語と共に使用される場合、「1つの（a）」または「1つの（an）」という語は、1つまたは複数を意味し得る。
【００３２】
特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、本開示は、選択肢のみおよび「および／または」を指す定義をサポートするが、選択肢のみを指すように明示的に示されない限りまたは選択肢が互いに排他的でない限り、「および／または」を意味するために使用される。本明細書において使用される場合、「別の」は少なくとも第2またはそれ以上を意味し得る。
【００３３】
本出願の全体にわたって、「約」という用語は、ある値が、この値を決定するために用いられる装置、方法についての固有の誤差変動、または研究対象間に存在する変動を含むことを示すために使用される。
【００３４】
本開示の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。しかし、詳細な説明および具体例は、本開示の好ましい態様を示すが、説明のために与えられるに過ぎないことが理解されるべきであり、何故ならば、本開示の精神および範囲内の様々な変更および改変がこの詳細な説明から当業者に明らかとなると考えられるためである。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
以下の図面は本明細書の一部を形成し、本開示のある局面をさらに示すために含まれる。本開示は、本明細書に提示される具体的な態様の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面のうちの1つまたは複数を参照することによって、よりよく理解され得る。
【図１】組換えウイルスゲノム構造の略図。
【図２】皮下B16F10 (B16F10 PD1L-KO)対側異種移植モデル中におけるvPD1-IL2有効性試験。
【図３】皮下B16F10 (B16F10 PD1L-KO)対側異種移植モデル中におけるvPD1-IL12有効性試験。
【図４】皮下B16F10 (B16F10 PD1L-KO)対側異種移植モデル中におけるvPD1-IL15有効性試験。
【図５】皮下B16F10 (B16F10 PD1L-KO)対側異種移植モデル中におけるvPD1-IL18有効性試験。
【図６】インビボSC対側モデル。出発腫瘍サイズ。
【図７】インビボSC対側モデル。処置結果を示す。研究は、vPD1/IL12構築物が、試験された他の構築物よりも優れていたことを実証する。
【図８】PD-1の外部ドメイン中のC'Dループの配列アラインメント。ヒトPD-1(hPD-1)の二次構造要素がアラインメントの上部に示され、一方、マウスPD-1(mPD-1)の二次構造要素が下部に示される。
【図９】可溶性TIM3粘液腫ウイルスを用いる療法を描写する略図。
【図１０】MYXV療法はCD8+ T細胞およびNK細胞上のTIM3を誘導する。ウイルス処置の開始から6日後の示される免疫学的サブセット上のTIM3発現の解析。
【図１１】図11A〜11C: TIM3遮断は黒色腫のMYXV処置を改善する。SQ B16/F10腫瘍を示されるように処置した。(A)出発体積のパーセントとしての腫瘍体積。可視の腫瘍の完全な根絶が白丸でマークされる。(B)動物の全生存期間。(C)動物において観察された脱毛の例。
【図１２】図12A〜12D: vTIM3は感染細胞から可溶性TIM3を分泌する。(A)vGFPおよびvTIM3のゲノム構造の略図。(B)B16/F10細胞中における新しいウイルスの産生。(C)感染後24時間での細胞生存度を分析するMTTアッセイ。(D)TIM3トランスジーンの発現。
【図１３】図13A〜13C: vTIM3は毒性低下を伴う併用療法の有効性を再現する。(A)出発体積のパーセントとしての腫瘍体積。可視の腫瘍の完全な根絶が白丸でマークされる。(B)動物の全生存期間。(C)示される療法で処置された動物において観察された平均脱毛スコア。
【図１４】図14A〜14B: TIM3中における突然変異の作製。(A)TIM3トランスジーンについての提案される突然変異の略図。(B)新たに作製された組換えvTIM3突然変異ウイルスからの、変異導入されたTIM3の発現。GAL9突然変異はグリコシル化の喪失に起因してより低いMWで泳動することに注意のこと。
【図１５Ａ】マウス研究を描写する略図。
【図１５Ｂ】経時的な個々の腫瘍成長。
【図１５Ｃ】全生存期間。
【図１６】図16A〜16B: vPD1は局所腫瘍に対して有効であるが転移性腫瘍に対しては有効でない。単一(A)または対側(B)B16/F10腫瘍を同系マウスにおいて確立した。左側腹部上の腫瘍を次いで対照ウイルス(vGFP)またはvPD1で処置した。対側モデル中の右側腹部上の腫瘍を未処置のままにした。個々の腫瘍の応答性および全生存期間を次いでモニターした。
【図１７】図17A〜17D: 可溶性PD1およびIL12の両方を発現するMYXVは転移性疾患に対して非常に有効である。(A)可溶性PD1および炎症性サイトカインの両方を発現するウイルスのゲノム構造。対側LLC腫瘍を同系マウスにおいて確立した。左側腹部上の腫瘍を示されるように次いで処置し、右側腹部上の腫瘍を未処置のままにした。(B)個々の腫瘍の応答性および(C)全生存期間を次いでモニターした。(D)上記のように処置された嵩高い対側LLC腫瘍を有するマウスの写真。
【図１８】図18A〜18C: vPD1/IL12は転移性肺がんに対して有効である。(A)対側LLC腫瘍を同系マウスにおいて確立した。左側腹部上の腫瘍を示されるように次いで処置し、右側腹部上の腫瘍を未処置のままにした。(B)個々の腫瘍の応答性および(C)全生存期間を次いでモニターした。
【図１９】図19A〜19C: vPD1/IL12は転移性黒色腫に対して有効である。(A)対側B16/F10腫瘍を同系マウスにおいて確立した。左側腹部上の腫瘍を示されるように次いで処置し、右側腹部上の腫瘍を未処置のままにした。(B)個々の腫瘍の応答性および(C)全生存期間を次いでモニターした。
【図２０】図20A〜20C: vPD1/IL12は自然転移性乳がんに対して有効である。(A)単一の4T1腫瘍を同系マウスにおいて確立し、確立および転移させた。原発腫瘍を示されるように次いで処置した。(B)個々の腫瘍の応答性および(C)全生存期間を次いでモニターした。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
例示的な態様の説明
腫瘍微小環境中に存在する主要な阻害経路のうちの2つは、腫瘍細胞上に発現されたPDL1が抗腫瘍T細胞上のPD1へ結合してT細胞消耗を生じさせるPD1-PDL1チェックポイント、ならびにTIM3チェックポイントである。これらの経路に打ち勝つための現在の方法は、PD1-PDL1またはTIM3-GAL9相互作用を遮断する抗体の全身注射を含むが；しかし、これらの全身処置は高価であり、時間がかかり、低奏効率および顕著な毒性を伴う。
【００３７】
本開示のある態様は、がんにおけるPD1-PDL1またはTIM3経路を標的にする組成物および方法を提供する。いくつかの局面において、ヒトPD1タンパク質またはTIM3タンパク質の細胞外部分をIL-2またはIL-12と共に発現するように操作された、組換え腫瘍溶解性ウイルスを提供する。ある局面において、腫瘍溶解性ウイルスは、粘液腫ウイルスのような複製可能なウイルスである。特に、PD1またはTIM3の細胞外領域およびIL-2またはIL-12は、複製に必要でないウイルスゲノムの領域中に組み込まれる1つまたは複数の発現カセットによってコードされ得る。本研究において、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解性ウイルス療法中のアウトカムを有意に改善することができる腫瘍阻害を提供した。
【００３８】
従って、本開示のさらなる態様は、可溶型のPD1またはTIM3およびIL-2またはIL-12を発現する組換え腫瘍溶解性ウイルスを投与する工程を含む、がん処置の方法も提供する。従って、本開示の本局面は、低毒性および高奏効率を有する、サイトカイン療法と組み合わせての、PD1-PDL1またはTIM3-GAL9経路を標的にする療法についての方法および組成物を提供する。
【００３９】
I．定義
「腫瘍溶解性ウイルス」という用語は、本明細書において使用される場合、正常細胞に対して影響を有しないかまたは最小限の影響を有しながら、インビトロおよびインビボのいずれかで、がん細胞または過剰増殖性細胞中で選択的に複製し、これらの成長を遅らせるかまたはこれらの死を誘導することができるウイルスを指す。例示的な腫瘍溶解性ウイルスとしては、水疱性口内炎ウイルス(VSV)、ニューカッスル病ウイルス(NDV)、単純ヘルペスウイルス(HSV)、レオウイルス、麻疹ウイルス、レトロウイルス、インフルエンザウイルス、シンビスウイルス（Sinbis virus）、ワクシニアウイルス、およびアデノウイルスが挙げられる。
【００４０】
「プロモーター」は、転写の開始および速度が制御される核酸配列の領域である制御配列である。それは、核酸配列の特定の転写を開始するために、RNAポリメラーゼおよび他の転写因子のような、調節タンパク質および分子が結合し得る遺伝要素を含有し得る。「機能的に配置された」、「機能的に連結された」、「制御下の」、および「転写制御下の」という句は、プロモーターが、核酸配列の転写開始および／または発現を制御するためにその配列に関して正しい機能的位置および／または配向にあることを意味する。
【００４１】
「自然免疫」または「自然免疫反応」という用語は、微生物または高分子などのような、特異的な環境抗原への曝露の前にまたはこれから独立して存在する、免疫学的および非免疫学的の両方の、宿主防御のレパートリーを指す。例えば、抗原に対する最初の宿主免疫反応は自然免疫系を伴う。
【００４２】
「免疫原」または「抗原」という用語は、本明細書において使用される場合、対象中に導入されると免疫系によって認識され、免疫反応を誘発することができる、因子を指す。ある態様において、発生される免疫反応は自然細胞性免疫反応であり、本開示の組換え腫瘍溶解性ウイルスは、自然細胞性免疫反応を抑制または減少させることができる。
【００４３】
本明細書において用いられる場合、「有効量」という句は、そのレシピエントに対して有利な効果を与えるために十分に高い濃度を提供するために十分な用量を指す。特定の対象についての具体的な治療有効用量レベルは、処置される障害、障害の重症度、具体的な化合物の活性、投与の経路、化合物のクリアランス速度、処置の期間、化合物と組み合わせてまたは同時に使用される薬物、対象の年齢、体重、性別、食事、および全体的健康、ならびに医学および科学において周知の同様の因子を含む様々な因子に依存する。
【００４４】
本明細書において使用される場合、「感染多重度」(MOI)という用語は、細胞1個当たり添加される感染性ウイルス粒子の数を意味する。
【００４５】
II．腫瘍溶解性ウイルス
A．腫瘍溶解性ウイルスプラットフォーム
一局面において、本開示は、概して、組換え複製可能腫瘍溶解性ウイルスに関する。一態様において、PD1またはTIM3をコードする異種核酸配列を有する組換え腫瘍溶解性ウイルスを提供する。本開示の方法に従って投与され得る腫瘍溶解性ウイルスとしては、非限定的に、アデノウイルス(例えば、Delta-24、Delta-24-RGD、ICOVIR-5、ICOVIR-7、Onyx-015、ColoAd1、H101、AD5/3-D24-GMCSF)、レオウイルス、単純ヘルペスウイルス(HSV; OncoVEX GMCSF)、ニューカッスル病ウイルス、麻疹ウイルス、レトロウイルス(例えば、インフルエンザウイルス)、ポックスウイルス(例えば、コペンハーゲン、ウエスタンリザーブ、ワイス株を含むワクシニアウイルス)、粘液腫ウイルス、ラブドウイルス(例えば、水疱性口内炎ウイルス(VSV))、ピコルナウイルス(例えば、セネカバレーウイルス; SVV-001)、コクサッキーウイルス、およびパルボウイルスが挙げられる。
【００４６】
一態様において、組換え腫瘍溶解性ウイルスは粘液腫ウイルスを含む。粘液腫ウイルス(MYVX)は、ポックスウイルス科のメンバーであり、レポリポックスウイルス属についての原型である。それはアナウサギ(オリクトラグス・クニクルス（Oryctolagus cuniculus）)についてのみ病原性であり、ここで、それは粘液腫症と呼ばれる致死的疾患を引き起こし、2つの北米種、シルヴィラグス・オージュボンニ（Sylvilagus audubonni）およびシルヴィラグス・ヌッタルリ（Sylvilagus nuttalli）については、ここで、それは重症度の低い疾患を引き起こす。粘液腫ウイルスは、もっぱら宿主細胞の細胞質中で複製し、そのゲノムは171個のオープンリーディングフレームをコードする(Smallwood et al., 2010)。これらの遺伝子のいくつかは、宿主防御機構に干渉するかまたは宿主防御機構を調節することができるタンパク質をコードし、いくつかは臨床設定において有望である。
【００４７】
ポックスウイルス科の他のメンバーと同様に、粘液腫ウイルスゲノムは、単一の二重鎖DNA(dsDNA)からなり、これの中心部分は、ポックスウイルス属のメンバー間で保存されているおよそ100個の必須遺伝子をコードする。逆方向末端反復内に位置する12個の遺伝子の各々2コピー含む、遺伝子の残りは、宿主防御機構に干渉しそして宿主防御機構を調節するタンパク質をコードする。これらのタンパク質のいくつかが宿主細胞遺伝子と配列類似性を共有しており、これは共進化経路を示唆している(Johnston and McFadden, 2003)。ウイロセプター（viroceptor）と呼ばれる、あるものが分泌され、例えばTNFのような特異的リガンドに結合することができる。ウイロカイン（virokine）として公知の、他のものも分泌され、宿主免疫阻害物質を模倣し、一方、ウイロミティゲーター（viromitigator）は、アポトーシスを阻害する宿主域因子として機能する(Johnston and McFadden, 2003; Kerr and McFadden, 2002)。これらの特徴は、多数の治療設定における可能性のある有用性を粘液腫ウイルスに提供する。粘液腫ウイルスがコードする免疫調節タンパク質のうちの1つであるSerp-1は、急性不安定冠動脈症候群(例えば、不安定狭心症および軽度心臓発作)について臨床試験中である。ウサギγインターフェロンを阻害する分泌糖タンパク質である、粘液腫ウイルスのM-T7タンパク質は、動脈に対するバルーン血管形成術損傷のウサギモデルにおいて炎症反応を阻害することがさらに示され(Liu et al., 2000)、様々な他の免疫調節タンパク質が抗炎症または抗免疫治療薬として開発され得る可能性が高い。
【００４８】
粘液腫ウイルスは、多様な組織群に由来する様々なヒトがん細胞株に生産的に感染することが示され(Sypula et al., 2004)、従って、様々ながんに対する処置において有用な腫瘍溶解性ウイルスとしての開発についての可能性を有する。野生型粘液腫ウイルスは、参照により本明細書に完全に組み入れられる、出願PCT/CA2004/000341中に記載されるように、不十分な先天性抗ウイルス反応を有する、ヒト細胞を含む、細胞、例えば、インターフェロンに非反応性である細胞に選択的に感染しかつ細胞を殺滅することができる。さらに、粘液腫ウイルスは、宿主免疫反応を回避しこれに干渉するのがうまく、様々な臨床設定において治療用物質として使用され得る免疫調節タンパク質の供給源として役立ち得る(Lucas and McFadden, 2004)。その上、粘液腫ウイルスはヒトにおいて感染性ではないが、多数のヒトがん細胞株に生産的に感染することができ、しかし正常なヒト細胞には感染することができず、さらに、ヒト神経膠腫のマウスモデルにおいて生存期間を延ばすことが示された。これらの特徴は、粘液腫ウイルスが、抗炎症または抗免疫療法として、または腫瘍溶解剤としてなど、様々な臨床設定における実行可能な治療用物質であることが判明することができたことを示唆する。
【００４９】
粘液腫ウイルスは、骨髄腫、黒色腫、神経膠芽腫、膵臓がんなどを含む、様々な悪性腫瘍に対して確立された腫瘍溶解能力を有する。ウイルスは、2つの別個の機構を通して抗腫瘍効果を示すと考えられている。第一に、ウイルスは腫瘍細胞に直接感染しかつ腫瘍細胞を殺滅する。第二に、腫瘍細胞のウイルス感染は二次抗腫瘍免疫反応を誘導する。これらの機構の組み合わせは原発腫瘍を減量させるのに有効であるが、それは腫瘍微小環境内の免疫阻害に起因して長期治癒をしばしばもたらさない。
【００５０】
本開示の粘液腫ウイルスは抗腫瘍活性を増強するために弱毒化され得る。例えば、粘液腫ウイルスは、1つまたは複数の遺伝子を不活性化するために遺伝子操作され得る。特に、機能的M135Rを発現しない粘液腫ウイルスは、腫瘍溶解研究のためを含む、不十分な先天性抗ウイルス反応を有する細胞の処置に有用であり、何故ならば、普通でない封じ込め戦略が処置を受ける患者に必要とされないため、このウイルスは腫瘍溶解性ウイルス療法についてより安全な選択肢を提供するためである(参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願第20090035276号)。ある局面において、粘液腫ウイルスは、SG33株のような、粘液腫ウイルスの弱毒化株である(参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第8613915号)。本開示に従って使用され得る弱毒化粘液腫ウイルスは、特に遺伝子M151R、M152R、M153R、M154L、M156R、およびM001Rのうちの1つまたは複数の欠失によって、好ましくは遺伝子M008.1R、M008R、M007R、M006R、M005R、M004.1R、M004R、M003.2R、M003.1R、およびM002Rのうちの1つまたは複数の追加の欠失によって、毒性野生型粘液腫ウイルスから得てもよい。
【００５１】
粘液腫ウイルスは、接着細胞および懸濁培養を含む、多数の細胞株中で増殖させることができ、最小限の精製が必要とされる。例えば、粘液腫ウイルスは、RK13(ウサギ腎臓上皮)、BHK-21(乳仔ハムスター腎臓)、BGMK(バッファローミドリザル腎臓)、Vero(アフリカミドリザル腎臓上皮)、BSC-40(アフリカミドリザル腎臓)、およびCV-1(アフリカミドリザル腎臓線維芽細胞)細胞を含む、いくつかの細胞株中で増えることができる。最小限の精製は、インビトロおよびインビボ研究の両方について適切であるストックを提供するために必要とされる。粘液腫ウイルスのストックを増殖させ、精製し、そして定量化するためのプロトコールは当技術分野において公知である(参照により本明細書に組み入れられる、Smallwood et al., 2010)。
【００５２】
B．組換え腫瘍溶解性ウイルス
組換えウイルスは、組換えウイルスを作製するために当技術分野において公知の手順によって構築され得る。PD1、例えば突然変異PD1、またはTIM3をコードする発現カセットは、ウイルス複製に非必須の領域において腫瘍溶解性ウイルスのゲノム中に挿入される。例えば、発現カセットは、M135オープンリーディングフレームとM136オープンリーディングフレームとの間のような、遺伝子間領域で、粘液腫ウイルス中に組み込まれ得る。組換えウイルスは、SEQ ID NO:3に示される、ヒトPD1の細胞外部分のヌクレオチド配列と(例えば、ヌクレオチド配列の全長と)少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、またはそれ以上同一であるヌクレオチド配列を含む発現カセットを含み得る。SEQ ID NO:3のヌクレオチド配列は、例えばコドン最適化を通して、組換えウイルス中の発現について最適化され得る。発現カセットは、可溶性TIM3(SEQ ID NO:11)またはSEQ ID ID NO:11と少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、またはそれ以上同一である配列をコードし得る。
【００５３】
一般的組換えとしても公知の、相同組換え(HR)は、ヌクレオチド配列が2つの同様のまたは同一のDNA鎖間で交換される、あらゆる種類の生き物において使用される遺伝子組換えの1つの種類である。この技術は、1980年代半ば以来、哺乳動物細胞中におけるゲノム操作のための標準方法であった。プロセスはDNAの物理的破壊および最終的な再結合のいくつかのステップを伴う。このプロセスは、DNA中の潜在的に致死の二本鎖切断を修復するために最も広く使用されている。加えて、相同組換えは、真核生物が精子および卵子のような生殖細胞を作るプロセスである、減数分裂中にDNA配列の新しい組み合わせを生成する。これらのDNAの新しい組み合わせは子孫において遺伝的多様性を示し、これは、集団が経時的に環境条件の変化に進化的に適応することを可能にする。相同組換えはまた、細菌およびウイルスの異なる株および種間で遺伝物質を交換するために遺伝子水平伝播において使用される。相同組換えはまた、標的生物中に遺伝子変化を導入するための分子生物学における技術として使用される。
【００５４】
本開示において有用なベクター中に含まれる発現カセットは、好ましくは、タンパク質コーディング配列へ機能的に連結された真核生物転写プロモーターを(5'から3'方向に)含有する。プロモーターの非限定的な例としては、初期または後期ウイルスプロモーター、例えば、SV40初期または後期プロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)初期プロモーター；真核細胞プロモーター、例えば、βアクチンプロモーター(Ng, 1989; Quitsche et al., 1989)、GADPHプロモーター(Alexander et al., 1988, Ercolani et al., 1988)、メタロチオネインプロモーター(Karin et al., 1989; Richards et al., 1984)；ならびに連結応答要素プロモーター、例えば、サイクリックAMP応答要素プロモーター(cre)、血清応答要素プロモーター(sre)、ホルボールエステルプロモーター(TPA)、および最小TATAボックス近傍の応答要素プロモーター(tre)が挙げられる。また、ヒト成長ホルモンプロモーター配列（例えば、Genbankに記載されているヒト成長ホルモン最小プロモーター、アクセッション番号X05244、ヌクレオチド283-341）またはマウス乳腺腫瘍プロモーター（ATCCから入手可能、カタログ番号ATCC 45007）を使用することも可能である。具体例は、合成初期/後期(sE/L)ポックスウイルスプロモーターであり得る(例えば、SEQ ID NO: 10の構築物のプロモーターを参照されたい)。
【００５５】
発現カセットは、組換えウイルスを生成するために未改変腫瘍溶解性ウイルスで次いで感染される細胞中に導入される。細胞中への発現カセットの導入は、本明細書に記載されるようなまたは当業者に公知であるような、細胞の形質転換のための核酸送達についての任意の好適な方法を使用し得る。そのような方法としては、DNAの直接送達、例えば、エクスビボトランスフェクション(Wilson et al., 1989, Nabel et al, 1989)、注入(各々が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,994,624号、同第5,981,274号、同第5,945,100号、同第5,780,448号、同第5,736,524号、同第5,702,932号、同第5,656,610号、同第5,589,466号および同第5,580,859号)、例えばマイクロインジェクション(参照により本明細書に組み入れられる、Harland and Weintraub, 1985;米国特許第5,789,215号)；エレクトロポレーション(参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,384,253号; Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984)；リン酸カルシウム沈殿(Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe et al., 1990)；DEAE-デキストラン続いてポリエチレングリコールの使用(Gopal, 1985)；直接超音波負荷(Fechheimer et al., 1987)；リポソーム媒介トランスフェクション(Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987; Wong et al., 1980; Kaneda et al., 1989; Kato et al., 1991)および受容体媒介トランスフェクション(Wu and Wu, 1987; Wu and Wu, 1988)；微粒子銃(PCT出願番号第WO 94/09699号および同第95/06128号; 米国特許第5,610,042号、同第5,322,783号、同第5,563,055号、同第5,550,318号、同第5,538,877号および同第5,538,880号、各々は参照により本明細書に組み入れられる)；炭化ケイ素繊維と共の撹拌(Kaeppler et al., 1990; 米国特許第5,302,523号および同第5,464,765号、各々は参照により本明細書に組み入れられる)；アグロバクテリウム媒介形質転換(米国特許第5,591,616号および同第5,563,055号、各々は参照により本明細書に組み入れられる)；乾燥/阻害媒介DNA取り込み(Potrykus et al., 1985)、ならびにそのような方法の任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。これらのような技術の適用を通して、細胞小器官、細胞、組織、または生物は安定にまたは一過性に形質転換され得る。
【００５６】
組換えウイルスは選択マーカーなどによって細胞から次いで精製される。そのようなマーカーは、発現ベクターを含有する細胞の容易な識別を可能にする、識別可能変化を細胞へ与える。一般に、選択マーカーは、選択を可能にする特性を与えるものである。正の選択マーカーは、マーカーの存在がその選択を可能にするものであり、負の選択マーカーは、その存在がその選択を妨げるものである。正の選択マーカーの例は薬物耐性マーカーである。通常、薬物選択マーカーを含めることは、形質転換体のクローニングおよび識別に役立ち、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、DHFR、GPT、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する耐性を与える遺伝子は、有用な選択マーカーである。条件の実行に基づいて形質転換体の区別を可能にする表現型を与えるマーカーに加えて、その原理が比色分析である、GFPのようなスクリーニング可能なマーカーを含む、他のタイプのマーカーも検討される。あるいは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(tk)またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)のような、負の選択マーカーとしてのスクリーニング可能な酵素が用いられ得る。使用されるマーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現され得る限り、重要でないと考えられている。例えば、組換え腫瘍溶解性ウイルスは、タグ無しであり得、または緑色蛍光タンパク質(GFP)、赤色蛍光タンパク質(RFP)、トマトレッド(tdRed)、もしくは他の蛍光タンパク質のような蛍光タンパク質を発現することができる。選択マーカーおよびスクリーニング可能なマーカーのさらなる例は、当業者に周知である。
【００５７】
インビトロおよびインビボでの粘液腫複製についての蛍光マーカーとして役立つ、トマト赤色蛍光(tdTr)を発現するトランスジーンは、Liu et al. (2009) J. Virology 83:5933-5938に記載されている。Liuは、tdTrに融合されたIL-15を発現するミクソウイルス(vMyx-IL-15-tdTr)は有意に弱毒化され、ウサギにおいて致死的な粘液腫症を誘発しなかったことを観察した。構築物はIL-15を分泌し、正常なウイルス複製を支持した。従って、Liuは、vMyx-IL-15-tdTrは腫瘍溶解性ウイルス療法のインビボ動物研究についての安全な候補であり、tdTrは組換えミクソウイルスにおける使用についての好適なマーカーであると結論付けた。
【００５８】
必要に応じて、蛍光マーカーを発現するトランスジーンのような、1つまたは複数の遺伝要素が、FlpリコンビナーゼまたはCre-lox組換えベースのシステムのような、当技術分野において公知の方法を使用して、ウイルストランスポゾンから切除され得る。
【００５９】
C．PD1
PD-1およびCD279(表面抗原分類279)としても公知の、プログラム細胞死タンパク質1は、T細胞炎症活性を抑制することにより免疫系をダウンレギュレートしそして自己寛容を促進することによって人体の細胞に対する免疫系の反応を調節することにおける役割を有する、細胞の表面上に見られるタンパク質である。これは自己免疫疾患を予防するが、それはまた免疫系ががん細胞を殺滅するのを妨げ得る。
【００６０】
ヒトPD-1の細胞外ドメインのアミノ酸配列は、Uniprotアクセッション番号Q15116、SEQ ID NO: 4で見られ、168アミノ酸長であり、これは、異なるシグナル配列によって置き換えられ得るか、または、分泌を指示するために必要とされない場合、本開示のPD-1配列から省略され得る、20アミノ酸シグナル配列を含む。
【００６１】
PD-1は免疫チェックポイントであり、2つの機構を通して自己免疫から保護する。第一に、それはリンパ節中の抗原特異的T細胞のアポトーシス(プログラム細胞死)を促進する。第二に、それは制御性T細胞(抗炎症性の、抑制性T細胞)におけるアポトーシスを減少させる。PD-1を遮断する新しいクラスの薬物である、PD-1阻害物質は、腫瘍を攻撃するために免疫系を活性化し、あるタイプのがんを処置するために使用される。
【００６２】
ヒトにおけるPD-1タンパク質は、PDCD1遺伝子によってコードされている。PD-1は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する細胞表面受容体であり、T細胞およびプロB細胞上に発現される。PD-1は、2つのリガンド、PD-L1およびPD-L2に結合する。PD-1は、268個のアミノ酸のI型膜タンパク質である。PD-1は、T細胞調節因子の拡大CD28/CTLA-4ファミリーのメンバーである。タンパク質の構造は、細胞外IgVドメイン続いて膜貫通領域および細胞内尾部を含む。細胞内尾部は、免疫受容抑制性チロシンモチーフおよび免疫受容チロシンスイッチモチーフ（immunoreceptor tyrosine-based switch motif）中に位置する2つのリン酸化部位を含有し、これは、PD-1がT細胞受容体TCRシグナルを負に調節することを示唆している。これは、リガンド結合時のPD-1の細胞質尾部へのSHP-1およびSHP-2ホスファターゼの結合と一致している。加えて、PD-1ライゲーションは、T細胞受容体ダウンモジュレーションをトリガーするE3ユビキチンリガーゼCBL-bおよびc-CBLをアップレギュレートする。PD-1は、活性化されたT細胞、B細胞、およびマクロファージの表面上に発現され、これは、CTLA-4と比較して、PD-1はより広く免疫反応を負に調節することを示唆している。
【００６３】
PD-1は、B7ファミリーのメンバーである、2つのリガンド、PD-L1およびPD-L2を有する。PD-L1タンパク質は、LPSおよびGM-CSF処置に応答してマクロファージおよび樹状細胞(DC)上に、ならびにTCRおよびB細胞受容体シグナリングでT細胞およびB細胞上にアップレギュレートされ、一方、安静時のマウスにおいて、PD-L1 mRNAは、心臓、肺、胸腺、脾臓、および腎臓中に検出され得る。PD-L1は、IFN-γを用いる処置で、PA1骨髄腫、P815肥満細胞腫、およびB16黒色腫を含む、ほぼ全てのマウス腫瘍細胞株上に発現される。PD-L2発現はより限定的であり、主にDCおよび少数の腫瘍株によって発現される。
【００６４】
いくつかの証拠は、PD-1およびそのリガンドは免疫反応を負に調節することを示唆している。PD-1ノックアウトマウスは、それぞれ、C57BL/6およびBALB/cバックグラウンドにおいて、ループス様糸球体腎炎および拡張型心筋症を発症することが示された。インビトロにおいて、PD-L1-Igを用いる抗CD3刺激T細胞の処理は、T細胞増殖およびIFN-γ分泌を減少させた。IFN-γは、T細胞炎症活性を促進する重要な炎症性サイトカインである。T細胞増殖の減少はまた、弱められたIL-2分泌と相関し、まとめると、これらのデータは、PD-1はT細胞応答を負に調節することを示唆している。
【００６５】
PD-L1トランスフェクトDCならびにPD-1発現トランスジェニック(Tg) CD4+およびCD8+ T細胞を使用する実験は、CD8+ T細胞は、これはTCRシグナリングの強度に依存し得るが、PD-L1による阻害により敏感であることを示唆している。CD8+ T細胞応答を負に調節することにおける役割と一致して、慢性感染症のLCMVウイルスベクターモデルを使用して、Rafi Ahmedのグループは、PD-1-PD-L1相互作用は、ウイルス特異的CD8+ T細胞のエフェクター機能の活性化、拡張、および獲得を阻害し、これは、PD-1-PD-L1相互作用を遮断することによって逆転され得ることを示した。
【００６６】
腫瘍細胞上のPD-L1の発現は、エフェクターT細胞上のPD-1の結合を通して抗腫瘍活性を阻害する。腫瘍上のPD-L1の発現は、食道がん、膵臓がん、および他のタイプのがんにおける生存の減少と相関し、免疫療法についての標的としてのこの経路を強調する。単球上に発現されかつ単球活性化時にアップレギュレートされるPD-1をそのリガンドPD-L1によってトリガーすることは、CD4 T-細胞機能を阻害するIL-10産生を誘導する。
【００６７】
マウスにおいて、この遺伝子の発現は、抗CD3抗体が注射されると胸腺において誘導され、多数の胸腺細胞がアポトーシスを受ける。BALB/cバックグラウンドにおいて繁殖されたこの遺伝子を欠損しているマウスは、拡張型心筋症を発症し、うっ血性心不全が原因で死んだ。これらの研究は、この遺伝子産物はまたT細胞機能において重要であり得、自己免疫疾患の予防に寄与し得ることを示唆している。CD8+ T細胞上のPD1の過剰発現は、(例えば、慢性感染症またはがんにおける)T細胞消耗の指標の1つである。
【００６８】
PD1についての主要なリガンドである、PD-L1は、いくつかのがんにおいて高度に発現され、従って、がん免疫回避におけるPD1の役割は十分に確立されている。免疫系をブーストするPD-1を標的にするモノクローナル抗体が、がんの処置について開発されている。多くの腫瘍細胞が、免疫抑制性PD-1リガンドである、PD-L1を発現し；PD-1およびPD-L1間の相互作用の阻害は、インビトロでT細胞応答を増強し、前臨床抗腫瘍活性を媒介し得る。これは免疫チェックポイント遮断として公知である。
【００６９】
抗PD1治療薬および抗CTLA4治療薬の両方を使用する併用療法が、チェックポイント阻害の分野内の重要な腫瘍処置として浮上した。PD1抗体およびCTLA4抗体の組み合わせは、様々ながんの処置においていずれかの抗体単独よりも有効であることが示された。2つの抗体の効果は冗長でないと考えられる。抗CTLA4処置は、増強された抗原特異的T細胞依存性免疫反応をもたらし、一方、抗PD-1は、がん細胞を溶解するCD8+ T細胞能力を再活性化すると考えられる。
【００７０】
臨床試験において、併用療法は、抗CTLA4処置に起因する毒性のレベルの増大にもかかわらず、単一の共阻害遮断に無反応である患者における腫瘍サイズを減少させることにおいて有効であることが示された。PD1およびCTLA4の組み合わせは、腫瘍組織に能動的に浸潤するCD8+ T細胞の数を最大10倍より高く誘導した。著者は、より高レベルのCD8+ T細胞浸潤は、抗CTLA-4がT調節細胞へのCD4 T細胞の変換を阻害し、抗PD-1でT調節抑制をさらに減少させたことに起因したと仮定した。この組み合わせは、がんのサイズを減少させた、腫瘍に対するよりロバストな炎症反応を促進した。ごく最近になって、FDAは、2015年10月に、抗CTLA4(イピリムマブ)および抗PD1(ニボルマブ)の両方を用いる併用療法を承認した。
【００７１】
腫瘍を抗PD1処置に対して受容可能にするために必要な分子因子および受容体は、依然として不明である。がん細胞の表面上のPD-L1発現は重要な役割を果たす。PD-L1陽性腫瘍は、併用処置に応答する可能性が2倍高かった。しかし、PD-L1陰性腫瘍を有する患者もまた抗PD1に対して限られた応答を有し、これは、PD-L1発現が療法の有効性の絶対的な決定要因ではないことを示している。
【００７２】
腫瘍中のより高い突然変異負荷は、抗PD1処置のより大きな効果と相関する。臨床試験において、抗PD1処置から利益を得た患者は、療法に応答しなかった患者よりも高い突然変異平均数中央値を有した、黒色腫、膀胱がん、および胃がんのようながんを有した。しかし、より高い腫瘍負荷とPD-1免疫遮断の臨床有効性との相関は依然として不明である。
【００７３】
D．IL-12
インターロイキン12(IL-12)は、抗原刺激に応答して、樹状細胞、マクロファージ、好中球、およびヒトBリンパ芽球様細胞(NC-37)によって天然に産生されるインターロイキンである。IL-12は4つのαヘリックスの束から構成される。それは、2つの別個の遺伝子、IL-12A(p35)およびIL-12B(p40)によってコードされたヘテロ二量体サイトカインである。活性なヘテロ二量体(「p70」と呼ばれる)、およびp40のホモ二量体は、タンパク質合成後に形成される。ヒトIL-12αサブユニットのアミノ酸配列は、Uniprotアクセッション番号P29459、SEQ ID NO: 7で見られ、219アミノ酸長であり、これは、異なるシグナル配列によって置き換えられ得るか、または、分泌を指示するために必要とされない場合、本発明のIL-12αサブユニット配列から省略され得る、22アミノ酸シグナル配列を含む。ヒトIL-12βサブユニットのアミノ酸配列は、Uniprotアクセッション番号P29460、SEQ ID NO: 8で見られ、328アミノ酸長であり、これは、異なるシグナル配列によって置き換えられ得るか、または、分泌を指示するために必要とされない場合、本発明のIL-12βサブユニット配列から省略され得る、22アミノ酸シグナル配列を含む。IL-12αおよびβサブユニットをコードするヌクレオチド配列は、例えばコドン最適化を通して、組換えウイルス中の発現について最適化され得る。
【００７４】
ある態様において、IL-12αサブユニットおよびIL-12βサブユニットは、単一のDNA構築物由来の融合タンパク質として発現され得る。そのような場合、単一のシグナルペプチドのみが、好ましくは発現される融合タンパク質のN末端で、必要とされる。そのような場合、可動性リンカーペプチドが、IL-12αサブユニットおよびIL-12βサブユニットを連結するために使用され得る。好適なリンカーペプチド配列は当技術分野において公知であり、例えば、(GGGS)nを含み、ここでn = 1〜4である。
【００７５】
IL-12はTh1細胞へのナイーブT細胞の分化に関与する。それは、T細胞の増殖および機能を刺激し得る、T細胞刺激因子として公知である。それは、T細胞およびナチュラルキラー(NK)細胞からのインターフェロン-ガンマ(IFN-γ)および腫瘍壊死因子-アルファ(TNF-α)の産生を刺激し、IFN-γのIL-4媒介抑制を減少させる。IL-12を産生するT細胞は、IL-12活性に関連する補助受容体、CD30を有する。
【００７６】
IL-12は、ナチュラルキラー細胞およびTリンパ球の活性において重要な役割を果たす。IL-12は、NK細胞およびCD8+ 細胞傷害性Tリンパ球の細胞傷害活性の増強を媒介する。また、NK細胞中にIL-2とIL-12のシグナル伝達との間に関連性が存在すると考えられる。IL-2は、2つのIL-12受容体、IL-12R-β1およびIL-12R-β2の発現を刺激し、NK細胞中におけるIL-12シグナリングに関与する重要なタンパク質の発現を維持する。増強された機能的反応は、IFN-γ産生および標的細胞の死滅によって実証される。
【００７７】
IL-12はまた抗血管新生活性を有し、これはそれが新しい血管の形成を遮断し得ることを意味する。それは、インターフェロンγの産生を増大させることによってこれを行い、これは、次に、誘導タンパク質-10(IP-10またはCXCL10)と呼ばれるケモカインの産生を増大させる。IP-10は次いでこの抗血管新生効果を媒介する。免疫反応およびその抗血管新生活性を誘導するその能力に起因して、IL-12を可能性のある抗がん薬として試験することへの関心があった。しかし、それは、今日に至るまで、試験された腫瘍において実質的な活性を有するとは示されなかった。IL-12と乾癬および炎症性腸疾患といった疾患との間に、処置において有用であり得る関連性がある。
【００７８】
IL-12は、IL-12Rβ1およびIL-12Rβ2によって形成されたヘテロ二量体受容体である、IL-12受容体へ結合する。IL-12Rβ2はIL-12機能において重要な役割を果たすと考えられ、何故ならば、それは、活性化T細胞上に見られ、Th1細胞発生を促進するサイトカインによって刺激され、Th2細胞発生を促進するサイトカインによって阻害されるためである。結合すると、IL-12R-β2はチロシンリン酸化され、キナーゼTyk2およびJak2についての結合部位を提供する。これらのキナーゼは、T細胞およびNK細胞中におけるIL-12シグナリングに関与するSTAT4のような重要な転写因子タンパク質を活性化することにおいて重要である。この経路はJAK-STAT経路として公知である。
【００７９】
IL-12は自己免疫と関連付けられる。自己免疫疾患に罹患している人々へのIL-12の投与は、自己免疫現象を悪化させることが示された。これはTh1免疫反応の誘導におけるその重要な役割に起因すると考えられている。対照的に、マウス中のIL-12遺伝子ノックアウトまたはIL-12特異的抗体を用いるマウスの処置は、疾患を改善した。
【００８０】
インターロイキン12(IL-12)は、活性化された抗原提示細胞(樹状細胞、マクロファージ)によって産生される。それは、Th1応答の発現を促進し、TおよびNK細胞によるIFNγ産生の強力な誘導因子である。
【００８１】
カルメット-ゲラン菌（Bacillus Calmette-Guerin）およびサルモネラ・エンテリティディス（Salmonella enteritidis）感染症を有する小児は、IL-12 p40サブユニット遺伝子内に大きなホモ接合型欠失を有することが分かり、活性化された樹状細胞および貪食細胞による機能的IL-12 p70サイトカインの発現を不可能にした。結果として、小児のリンパ球によるIFNγ産生は著しく損なわれた。これは、IL-12が、マイコバクテリアおよびサルモネラ属のような細胞内細菌に対する防御免疫に必須であることを示唆した。
【００８２】
この考えは、IL-12についての受容体がリンパ球によるIFNγ産生のために重要であるという観察によって支持される。重度特発性マイコバクテリアおよびサルモネラ感染症を有した7人の非血縁患者由来のTおよびNK細胞は、IL-12での刺激時にIFNγを産生しなかった。患者はその他の点では健康であった。彼らは、IL-12受容体β1鎖中に突然変異を有することが分かり、これは細胞外ドメイン中に未成熟終止コドンを生じさせ、これはこのサイトカインに対する無応答性を生じさせ、これは、再度、宿主防御におけるIL-12の重要な役割を示す。
【００８３】
慢性粘膜皮膚カンジダ症をもたらす欠陥のあるTh1およびTh17免疫反応は、IL-12シグナル伝達経路中のさらに下流の突然変異に起因する。形質はSTAT1遺伝子中における突然変異へマッピングされ、これらは、IL-12またはIL-23受容体関連Jak2およびTyk2活性に応答してのインターフェロン-γ、IL-17、およびIL-22の産生の低下と関連付けられた。
【００８４】
E．IL-2
インターロイキン-2(IL-2)は、免疫系におけるサイトカインシグナル伝達分子の1つの種類である、インターロイキンである。それは、免疫を担う白血球細胞(白血球、しばしばリンパ球)の活性を調節するタンパク質である。IL-2は、異物(「非自己」)と「自己」とを区別することにおける、微生物感染に対する身体の自然反応の一部である。IL-2は、リンパ球によって発現される、IL-2受容体へ結合することによってその効果を媒介する。ヒトIL-2のアミノ酸配列は、Uniprotアクセッション番号P60568、SEQ ID NO: 6で見られ、153アミノ酸長であり、これは、異なるシグナル配列によって置き換えられ得るか、または、分泌を指示するために必要とされない場合、本発明のIL-2配列から省略され得る、20アミノ酸シグナル配列を含む。IL-2をコードするヌクレオチド配列は、例えばコドン最適化を通して、組換えウイルス中の発現について最適化され得る。
【００８５】
好ましい態様において、本発明において有用なIL-2は、SEQ ID NO: 9の高親和性バリアントIL-2アミノ酸配列であり、これは、異なるシグナル配列によって置き換えられ得る、20アミノ酸シグナル配列を含み、これはまた、C末端Hisタグを含有する。Levin et al. (2012) Nature 484:529-533。IL-2の機能に必要でない場合、シグナル配列およびHisタグのいずれかまたは両方が省略され得る。
【００８６】
IL-2は、各メンバーが4αヘリックス束を有する、サイトカインファミリーのメンバーであり；このファミリーはまたIL-4、IL-7、IL-9、IL-15およびIL-21を含む。IL-2は、α、βおよびγと呼ばれる、3つの鎖からなる複合体である、IL-2受容体を通して信号を送る。γ鎖は全てファミリーメンバーによって共有される。
【００８７】
IL-2受容体(IL-2R)αサブユニットは、そのリガンドに対して低親和性を有するが、(βおよびγサブユニットへ結合された場合に)IL-2R親和性を100倍増加する能力を有する。IL-2Rのβおよびγサブユニットのヘテロ二量体化は、T細胞中のシグナリングに必須である。
【００８８】
IL-2の遺伝子発現調節は、多数のレベルにおいてまたは異なる方法によってであり得る。チェックポイントのうちの1つは、MHC-ペプチド複合体を認識した後のTリンパ球の抗原受容体、TCR受容体を通してのシグナリングである。TCRからのシグナル伝達経路は、次いで、ホスホリパーゼC(PLC)依存性経路を通過する。PLCは、3つの主要な転写因子およびそれらの経路を活性化する：NFAT、NFkBおよびAP-1。CD28からの同時刺激後、IL-2およびこれらの経路の発現の最適な活性化が誘導される。
【００８９】
同時に、Oct-1が発現される。それは活性化を助ける。Oct1はTリンパ球中に発現され、Oct2は細胞活性化後に誘導される。NFATは多数のファミリーメンバーを有し、それらの全てが細胞質中に位置し、シグナリングはカルシニューリンを通過し、NFATは脱リン酸化され、従って、核へ移行される。AP-1は二量体であり、c-Junおよびc-Fosタンパク質から構成される。それは、NFkBおよびOctを含む他の転写因子と協力する。NFkBは、CD28を通しての同時刺激後、核へ移行される。NFkBはヘテロ二量体であり、IL-2プロモーター上に2つの結合部位がある。
【００９０】
IL-2は、主にT細胞に対するその直接効果を介して、免疫系の重要な機能、寛容および免疫において必須の役割を有する。T細胞が成熟する、胸腺において、それは、身体中の正常な健康な細胞を攻撃するようにそうでなければプライムされる他のT細胞を抑制する、制御性T細胞へのある未熟T細胞の分化を促進することによって自己免疫疾患を予防する。IL-2はまた、初期T細胞がまた抗原によって刺激されると、エフェクターT細胞へのおよびメモリーT細胞へのT細胞の分化を促進し、従って、身体が感染症を撃退するのを助ける。その発現および分泌は厳しく調節され、免疫反応をマウントするおよび衰えさせることにおける一過性の正および負のフィードバックループの両方の一部として機能する。抗原選択T細胞クローンの数および機能の拡大に依存する、T細胞免疫記憶の発達におけるその役割を通して、それは、細胞媒介性免疫に耐えることにおいて重要な役割を果たす。
【００９１】
アルデスロイキンは組換えインターロイキン-2の一形態である。それは、組換えDNA技術を使用して製造され、タンパク質治療薬として販売され、プロロイキンとして商標化されている。それは、大量間欠用量でのがん(悪性黒色腫、腎細胞がん)の処置について食品医薬品局(FDA)によっておよびいくつかの欧州諸国において承認されており、持続用量で広範囲に使用されている。
【００９２】
Interkingは、残基125にセリンを有する組換えIL-2であり、Shenzhen Neptunusから販売されている。
【００９３】
米国および世界中で様々な投薬量のIL-2が使用されている。異なる投薬量の有効性と副作用はしばしば意見の相違点である。通常、米国では、がんの種類、治療への反応、および全体的な患者の健康に影響される、より高い投薬量のオプションが使用される。患者は典型的に、連続5日間、1日3回、15分間処置される。次のおよそ10日間は、患者が処置間に回復するのに役立つ。IL-2は、副作用の適切なモニタリングを可能にするために入院患者ベースで静脈内送達される。
【００９４】
低用量レジメンは、典型的に外来患者ベースで皮膚の下にIL-2を注射することを含む。あるいは、それは、化学療法の送達と同様であり、しばしばそれを含む、入院患者ベースで1〜3日間にわたって与えられ得る。病変内IL-2は、移動中の黒色腫転移を処置するために一般的に使用され、高い完全奏効を示し、一般に十分に許容される。
【００９５】
IL-2は狭い治療域を有し、投薬のレベルによって通常、副作用の重症度が決まるる。いくつかの一般的な副作用は、インフルエンザ様症状(発熱、頭痛、筋肉および関節痛、倦怠感)、悪心/嘔吐、乾燥したかゆみを伴う皮膚または発疹、脱力感または息切れ、下痢、低血圧、眠気または混乱、および食欲不振を含む。毛細血管漏出症候群、呼吸問題、重篤な感染症、発作、アレルギー反応、心臓問題、または様々な他の可能性のある合併症のような、より深刻で危険な副作用が見られることがある。
【００９６】
III．治療的投与
別の局面において、本開示は、腫瘍細胞の成長を阻害するかまたは腫瘍細胞を殺滅するために十分な感染多重度で本開示に従う組換え腫瘍溶解性ウイルスを投与することによって、腫瘍細胞の成長を阻害するかもしくは腫瘍細胞を殺滅することを促進するか、または黒色腫のようながんを処置する方法を提供する。ある態様において、組換え腫瘍溶解性ウイルスは、1回を超えて、好ましくは2回、3回、または最大10回、投与される。
【００９７】
本開示の方法を使用して処置され得る腫瘍細胞またはがんの例としては、乳がん、卵巣がん、腎細胞がん(RCC)、黒色腫(例えば、転移性悪性黒色腫)、前立腺がん、結腸がん、肺がん(小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんを含む)、骨がん、骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、軟骨肉腫、膵臓がん、皮膚がん、線維肉腫、慢性または急性白血病、例えば、急性リンパ性白血病(ALL)、成人T細胞白血病(T-ALL)、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、リンパ管肉腫、リンパ腫(例えば、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫、リンパ球性リンパ腫、原発性CNSリンパ腫、T細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫(ALCL)、皮膚T細胞リンパ腫、結節性小分割細胞型リンパ腫（nodular small cleaved-cell lymphomas）、末梢T細胞リンパ腫、レンネルトリンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、T細胞白血病/リンパ腫(ATLL)、中心芽細胞性（entroblastic）/中心細胞性(cb/cc)濾胞性リンパ腫がん、B細胞系のびまん性大細胞型リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ節症(AILD)様T細胞リンパ腫およびHIV関連体腔リンパ腫)、キャッスルマン病、カポジ肉腫、血管肉腫、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症および他のB細胞リンパ腫、鼻咽腔がん（nasopharangeal carcinoma）、頭部または頸部がん、粘液肉腫、脂肪肉腫、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮がん、直腸がん、肛門部がん、胃がん、精巣がん、子宮がん、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、腟がん、外陰部がん、移行上皮がん、食道がん、悪性ガストリン産生腫瘍、小腸がん、胆管細胞がん、腺がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織の肉腫、尿道、陰茎がん、精巣がん、悪性奇形腫、小児期固形腫瘍、膀胱がん、腎臓または尿管がん、腎盂がん、悪性髄膜腫、中枢神経系(CNS)の新生物、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、下垂体腺腫、類表皮がん、扁平上皮がん、アスベストによって誘導されたもの、例えば中皮腫を含む、環境誘導のがん、およびこれらのがんの組み合わせが挙げられる。多くのがんは、免疫チェックポイントタンパク質、例えばPDL1(PDL1+)を過剰発現する。本開示の方法は、PDL1状態にかかわらず、腫瘍またはがんを処置するために使用され得る。
【００９８】
本開示に従う腫瘍溶解性ウイルスは、局所または全身投与され得る。例えば、非限定的に、本開示に従う腫瘍溶解性ウイルスは、血管内に(動脈内にもしくは静脈内に)、腫瘍内に、筋肉内に、皮内に、腹腔内に、皮下に、経口的に、非経口的に、鼻腔内に、気管内に、経皮的に、脊髄内に、眼にまたは頭蓋内に、投与することができる。
【００９９】
さらに別の態様において、方法は、好ましくは動脈を介したまたは留置医療器具を介した、組換え腫瘍溶解性ウイルスの非経口投与を伴う。組換え腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍特異的抗原へ結合する抗体(例えば、キメラ、ヒト化、またはヒトモノクローナル抗体)のような、免疫療法薬または免疫調節薬と共に投与され得る。別の態様において、組換え腫瘍溶解性ウイルス処置は、手術(例えば、腫瘍切除)、放射線治療、化学療法、または免疫療法と組み合わされ得、補完治療前、中、または後に実施することができる。
【０１００】
他の態様において、方法は、本発明の粘液腫ウイルスでの細胞のエクスビボ形質導入、続いての対象への細胞を含む組成物の投与を伴う。ある態様において、細胞は、自家、即ち、対象自身の細胞であり得る。自家の態様において、細胞は、アフェレーシスと類似のプロセスで、対象から得られ、本発明の粘液腫ウイルスで形質導入され、そして対象へ再投与され得る。細胞中へのウイルスのエクスビボ送達のための例示的な製剤は、当技術分野において公知の様々な形質導入作用因子、例えばリン酸カルシウム、エレクトロポレーション、熱ショック、および様々なリポソーム製剤(即ち、脂質媒介トランスフェクション)の使用を含み得る。リポソームは、下記により詳細に説明されるように、僅かな水性流体を封入する脂質二重層である。DNAは、(その電荷によって)カチオン性リポソームの外表面へ自然に会合し、これらのリポソームは細胞膜と相互作用する。
【０１０１】
ある態様において、組換え腫瘍溶解性ウイルスおよび免疫療法薬または免疫調節薬は、剤がウイルスの活性に干渉しないように、同時にまたは連続的に投与され得る。ある態様において、組換え腫瘍溶解性ウイルスは、動脈内に、静脈内に、腹腔内に、腫瘍内に、またはそれらの任意の組み合わせに、投与される。さらに別の態様において、インターフェロン、例えば、インターフェロン-αまたはペグ化インターフェロンが、本開示に従う組換え腫瘍溶解性ウイルスを投与する前に投与される。
【０１０２】
本開示に従う腫瘍溶解性ウイルスは、単回投与または複数回投与で投与され得る。ウイルスは、1×105プラーク形成単位(PFU)、5×105 PFU、少なくとも1×106 PFU、5×106または約5×106 PFU、1×107、少なくとも1×107 PFU、1×108または約1×108 PFU、少なくとも1×108 PFU、約または少なくとも5×108 PFU、1×109または少なくとも1×109 PFU、5×109または少なくとも5×109 PFU、1×1010 PFUまたは少なくとも1×1010 PFU、5×1010または少なくとも5×1010 PFU、1×1011または少なくとも1×1011、1×1012または少なくとも1×1012、1×1013または少なくとも1×1013の投薬量で投与され得る。例えば、ウイルスは、約107〜1013、約108〜1013、約109〜1012、または約108〜1012の投薬量で投与され得る。
【０１０３】
A．併用療法
がん細胞の死滅、がん細胞成長の阻害、血管新生の阻害を増大させるかまたはそうでなければ腫瘍細胞の悪性表現型の逆転もしくは減少を向上させるために、追加の療法が上述の本開示の方法のいずれかと組み合わされ得る。これらの組成物は、細胞を殺滅するかまたは細胞の増殖を阻害するために有効な併用量で提供される。このプロセスは、細胞を同時に発現構築物および剤または因子と接触させることを伴い得る。これは、両方の剤を含む単一の組成物または薬理学的製剤と細胞とを接触させることによって、または、同時に、2つの別個の組成物または製剤と細胞とを接触させることによって達成され得、ここで、一方の組成物は腫瘍溶解性ウイルスを含み、他方は第2の剤療法を含む。
【０１０４】
あるいは、処置は、数分から数週間の範囲の間隔を空けて他の剤または処置に先行し得るかまたはこれに続き得る。剤が細胞へ別々に適用される態様において、剤が有利に組み合わされた効果を細胞に対して依然として発揮することができるように、かなりの期間が各送達間で経過しないことを一般に保証する。そのような場合、互いの約12〜24時間以内に、より好ましくは、互いの約6〜12時間以内に、両方の治療法と細胞とを接触させることが検討され、わずか約12時間の遅延時間が最も好ましい。場合によっては、著しく処置期間を延長することが望ましい場合があり、しかし、数日(2、3、4、5、6、または7)から数週間(1、2、3、4、5、6、7、または8)から数ヵ月(1、2、3、4、5、6、7、または8)がそれぞれの実施間で経過する。
【０１０５】
いずれかの剤の複数回の投与が望ましいことも考えられる。様々な組み合わせが用いられ得、例えば、1回または複数回の腫瘍溶解性ウイルス処置が、第2の剤の投与前に実施されるか；または第2の剤が、腫瘍溶解性ウイルス投与の前に投与され得る。連続投与（連続実施）は、腫瘍溶解性ウイルス療法の1回または複数回の実施または第2の剤の1回または複数回の投与を含み得る。再び、細胞死滅を達成するために、両方の剤が、細胞を殺滅するために有効な併用量で細胞へ送達される。例えば、特許請求されるPD1 + IL-2/IL-12試薬および免疫調節因子の組み合わせ。
【０１０６】
本開示のある態様によれば、いったん対象がそのような療法(例えば、vMYX-PD1療法)に対する応答者またはこれに応答する可能性が高いと同定されると、腫瘍溶解性ウイルス療法と併用して使用され得る、がんを処置するための方法を提供する。本開示のアッセイが、対象は、粘液腫ウイルスのような複製可能な腫瘍溶解性ウイルスを用いる処置に応答する可能性が低いことを示す場合に、そのような療法が用いられてもよい。あるいは、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスのみを用いる処置に応答する可能性が低いと本方法によって対象が同定される場合、アデノウイルスのような複製可能な腫瘍溶解性ウイルスと組み合わせて、そのような療法が用いられてもよい。
【０１０７】
がんを有する人のおよそ60%は、予防的、診断的、病期分類、治癒的および緩和的手術を含む、何らかの手術を受ける。治癒的手術は、本開示の処置、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法および／または代替療法のような、他の療法と併用して使用され得るがん処置である。
【０１０８】
治癒的手術は、がん組織の全部または一部が物理的に除去され、切除されかつ／または破壊される、切除術を含む。腫瘍切除術は、腫瘍の少なくとも一部の物理的除去を指す。腫瘍切除術に加えて、手術による処置は、レーザー手術、凍結手術、電気手術、および顕微鏡下手術(モーズ手術)を含む。本開示は、表在がん、前がん、または偶発的な量の正常組織の除去と併用して使用され得ることがさらに検討される。
【０１０９】
ある局面において、療法は、手術前に、またはがん細胞、組織、または腫瘍の一部または全部の切除時に、腫瘍内注射によって実施される。処置はまた、追加の抗がん療法と共にこれらの領域の灌流、直接注射または局所適用によって達成され得る。そのような処置は、例えば、1、2、3、4、5、6、もしくは7日毎に、1、2、3、4、および5週間毎に、または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、もしくは12ヵ月毎に、繰り返され得る。これらの処置は様々な投薬量のものであり得る。
【０１１０】
多種多様の化学療法剤が本開示に従って使用され得る。「化学療法」という用語は、がんを処置するための薬物の使用を指す。「化学療法剤」は、がんの処置において投与される化合物または組成物を含意するために使用される。これらの剤または薬物は、細胞内でのそれらの活性様式よって分類され、例えば、それらが細胞周期に対して影響を与えるのか否か、およびどの段階でそれらが細胞周期に対して影響を与えるのかによって分類される。あるいは、剤は、DNAを直接架橋する、DNA中にインターカレートする、または核酸合成に影響を与えることによって染色体異常および有糸分裂異常を誘導するその能力に基づいて特徴付けられ得る。大抵の化学療法剤は、以下のカテゴリー：アルキル化剤、代謝拮抗薬、抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害物質、および有糸分裂阻害物質に分類される。
【０１１１】
アルキル化剤はゲノムDNAと直接相互作用してがん細胞が増殖するのを妨げる。このカテゴリーの薬物は、細胞周期の全ての期に影響を及ぼす剤を含み、慢性白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、悪性黒色腫、多発性骨髄腫、ならびに乳房、肺、および卵巣の特定のがんを処置するために一般的に使用される。これらとしては、ナイトロジェンマスタード類、例えば、メクロレタミン(ナイトロジェンマスタード)、クロラムブシル、シクロホスファミド(Cytoxan（登録商標）)、イホスファミドおよびメルファラン、ニトロソ尿素類、例えば、ストレプトゾシン、カルムスチン(BCNU)およびロムスチン、スルホン酸アルキル類、例えば、ブスルファン、トリアジン類、例えば、ダカルバジン（dacarbzine）(DTIC)およびテモゾロミド(Temodar（登録商標）)、エチレンイミン類、例えば、チオテパおよびアルトレタミン(ヘキサメチルメラミン)、ならびに白金薬物、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、およびオキサリプラチン（oxalaplatin）が挙げられる。
【０１１２】
代謝拮抗薬はDNAおよびRNA合成を妨害する。アルキル化剤とは異なり、それらはS期の間に細胞周期に特異的に影響を及ぼす。それらは、慢性白血病、ならびに乳房、卵巣および胃腸管の腫瘍に対抗するために使用されてきた。代謝拮抗薬としては、5-フルオロウラシル(5-FU)、6-メルカプトプリン(6-MP)、カペシタビン(Xeloda（登録商標）)、クラドリビン、クロファラビン、シタラビン(Ara-C（登録商標）)、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン(Gemzar（登録商標）)、ヒドロキシ尿素（hydroxyruea）、メトトレキサート、ペメトレキセド、ペントスタチンおよびチオグアニンが挙げられる。
【０１１３】
抗腫瘍抗生物質は抗微生物活性および細胞傷害活性の両方を有する。これらの薬物はさらに、化学的に酵素および有糸分裂を阻害することや細胞膜を変化させることにより、DNAに干渉する。これらの剤は細胞周期の全ての期において作用し、様々ながんを処置するために使用される。代表例としては、ダウノルビシン、ドキソルビシン(Adriamycin（登録商標）)、エピルビシン、イダルビシン、アクチノマイシン-D、ブレオマイシンおよびマイトマイシン-Cが挙げられる。一般に、これらの化合物は、25〜100 mg/kgの範囲の用量でボーラスi.v.注射によって投与される。
【０１１４】
トポイソメラーゼ阻害物質は、DNA鎖がコピーされ得るようにDNA鎖を分離するのを助ける酵素である、トポイソメラーゼに干渉し、ある白血病、ならびに肺がん、卵巣がん、胃腸がん、および他のがんを処置するために使用され、トポテカン、イリノテカン、エトポシド(VP-16)およびテニポシドを含む。
【０１１５】
有糸分裂阻害物質、しばしば植物アルカロイドは、細胞周期のM期中に作用し、有糸分裂を妨害するか、または酵素が細胞再生に必要なタンパク質を産生するのを阻害する。代表例としては、タキサン類、例えば、パクリタキセル(Taxol（登録商標）)およびドセタキセル(Taxotere（登録商標）)、エポチロン類、例えば、イキサベピロン(Ixempra（登録商標）)、ビンカアルカロイド類、例えば、ビンブラスチン(Velban（登録商標）)、ビンクリスチン(Onocovin（登録商標）)およびビノレルビン(Navelbine（登録商標）)、ならびにエストラムスチン(Emcyt（登録商標）)が挙げられる。
【０１１６】
いくつかの態様において、免疫療法は、免疫チェックポイント阻害物質を用いる処置であり得る。免疫チェックポイントは、シグナルを上げる(例えば、共刺激分子)かまたはシグナルを下げる。免疫チェックポイント遮断によって標的にされ得る阻害性免疫チェックポイントは、アデノシンA2A受容体(A2AR)、B7-H3(CD276としても公知)、BおよびTリンパ球アテニュエーター(BTLA)、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4(CTLA-4、CD152としても公知)、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)、キラー細胞免疫グロブリン(KIR)、リンパ球活性化遺伝子-3(LAG3)、プログラム死1(PD-1)、T細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン3(TIM-3)、およびT細胞活性化のVドメインIgサプレッサー(VISTA)を含む。
【０１１７】
免疫チェックポイント阻害物質は、薬物、例えば小分子、リガンドもしくは受容体の組換え形態であり得、または、特に、抗体、例えば、免疫チェックポイントタンパク質に対して作製されたヒト抗体である(例えば、国際特許公開公報WO2015016718; Pardoll, 2012；両方とも参照により本明細書に組み入れられる)。免疫チェックポイントタンパク質の公知の阻害物質またはその類似体が使用され得、特に、抗体のキメラ化、ヒト化、またはヒト形態が使用され得る。当業者は知っているように、代替のかつ／または等価の名称が、本開示において言及されるある抗体について使用され得る。そのような代替のかつ／または等価の名称は、本開示の文脈において交換可能である。例えば、ランブロリズマブはまた、代替かつ等価の名称MK-3475およびペンブロリズマブの下で公知であることが知られている。例示的な免疫チェックポイント阻害物質としては、PD-1阻害物質、例えば、ペンブロリズマブおよびニボルマブ；PD-L1阻害物質、例えば、アテゾリズマブ、アベルマブ、およびデュルバルマブ；ならびにCTLA-4阻害物質、例えば、イピリムマブが挙げられる。
【０１１８】
ある好ましい態様において、相加的抗腫瘍効果は、粘液腫vPD1をT細胞上のPD1の遮断と直接組み合わせることによって達成され得る。臨床的に、これは、PDL1との相互作用を遮断する、PD1に結合する抗体の使用を通して達成され得る。個々の免疫チェックポイント阻害の組み合わせは、遥かにより良い抗腫瘍活性を達成することが、臨床的に観察される(参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、Johnson and Win, 2017)。本発明に従って抗PD1抗体および粘液腫vPD1を組み合わせる追加の利点は、転移性疾患の設定においてであり得る。腫瘍内注射を介して局所投与される粘液腫vPD1は、PK/PD問題に起因して転移性疾患について最適でない場合がある。
【０１１９】
本発明に従う腫瘍溶解性ウイルスを抗PD1抗体と組み合わせることは有望なアプローチであるが、可能性のある合併症が、抗PD1抗体と粘液腫ウイルスから発現された可溶性PD1との相互作用を通して起こり得る。この可能性を改善するために、2つの臨床的に承認された抗PD1抗体間での抗体認識を妨げる突然変異をCDループ中に含有するPD1構築物を発現する粘液腫ウイルスを生成した。一態様において、PD1タンパク質中の位置D85Gでの部位突然変異は、PD1への抗PD1抗体ペンブロリズマブの結合を完全に無効にする(参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、Tan et al., 2017；および参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、Na et al.)。従って、この態様において、切断PD1粘液腫構築物中のCDループの間に単一点突然変異または単一点突然変異の組み合わせを導入することは、抗PD1抗体の阻害性結合を減少させると考えられる。
【０１２０】
他の化学療法剤としては、標的療法薬、例えば、イマチニブ(Gleevec（登録商標）)、ゲフィチニブ(Iressa（登録商標）)、スニチニブ(Sutent（登録商標）)、ソラフェニブ(Nexavar（登録商標）)、ボルテゾミブ(Velcade（登録商標）)、ベバシズマブ(Avastin（登録商標）)、トラスツズマブ(Herceptin（登録商標）)、セツキシマブ(Erbitux（登録商標）)、およびパニツムマブ(Vectibix（登録商標）)、ホルモン療法薬、例えば、抗エストロゲン、例えば、フルベストラント(Faslodex（登録商標）)、タモキシフェン、トレミフェン（toremifine）、アロマターゼ阻害物質、例えば、アナストロゾール、エキセメスタン（exemstane）およびレトロゾール、プロゲスチン、例えば、酢酸メゲストロール、およびゴナドトロピン放出ホルモン、ならびに免疫療法薬、例えば、腫瘍特異的抗原(例えば、前立腺特異抗原、がん胎児性抗原、泌尿器腫瘍関連抗原、胎児性抗原、チロシナーゼ(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、シアリルルイス抗原、MucA、MucB、PLAP、エストロゲン受容体、ラミニン受容体（laminin reeptor）、erb Bおよびp155)に対する抗体が挙げられ、これらは、薬物または毒素(例えば、放射性核種、リシンA鎖、コレラ毒素、百日咳毒素)へコンジュゲートされ得る。
【０１２１】
放射線治療とも呼ばれる、放射線療法は、電離放射線を用いるがんおよび他の疾患の処置であり、これは、局所固形腫瘍、例えば、皮膚、舌、喉頭、脳、乳房もしくは頸部のがんを処置するために使用され得、または造血細胞(白血病)およびリンパ系(リンパ腫)のがんを処置するために使用され得る。放射線治療は、非限定的に、y線、X線および／または腫瘍細胞への放射性同位体の指向送達の使用を含む。マイクロ波およびUV照射のような、DNA損傷因子の他の形態が検討される。X線についての線量範囲は、長期間(3〜4週間)についての50〜200レントゲンの一日線量から、2000〜6000レントゲンの単回線量までの範囲である。
【０１２２】
放射線療法はまた、がん部位へ直接放射線量を送達するための、放射標識抗体(例えば、放射免疫療法、原体照射法)、高分解能強度変調放射線療法、および定位放射線手術の使用を含む。脳および他の腫瘍についての定位放射線手術(ガンマナイフ)は、何百もの異なる角度からのγ放射線療法の正確に標的に向けられたビームを用いる。約4〜5時間を要する、たった1回のセッションが必要である。
【０１２３】
B．薬学的組成物
本明細書に記載される組換え腫瘍溶解性ウイルスは、薬学的に許容される担体と共に製剤化された医薬品または医薬として投与され得る。従って、組換え腫瘍溶解性ウイルスは、医薬または薬学的組成物の製造において使用され得る。本開示の薬学的組成物は、非経口投与用の液剤または凍結乾燥散剤として製剤化され得る。散剤は、使用前に好適な希釈剤または他の薬学的に許容される担体の添加によって再構成され得る。液体製剤は、緩衝、等張、水溶液であり得る。散剤はまた乾燥形態で噴霧され得る。好適な希釈剤の例は、正常等張食塩水、水中の標準5%デキストロース、または緩衝酢酸ナトリウムもしくはアンモニウム溶液である。そのような製剤は、非経口投与に特に適しているが、経口投与に用いることも、または定量吸入器もしくは吹きいれ用の噴霧器に入れることもできる。ポリビニルピロリドン、ゼラチン、ヒドロキシセルロース、アカシア、ポリエチレングリコール、マンニトール、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどのような賦形剤を添加することが、望ましい場合がある。
【０１２４】
あるいは、治療用物質は、経口投与のためにカプセル化されても、錠剤化されてもまたは乳剤もしくはシロップ剤中に調製されてもよい。薬学的に許容される固体または液体担体が、組成物を増強もしくは安定化するために、または組成物の調製を容易にするために添加され得る。固体担体としては、デンプン、ラクトース、硫酸カルシウム二水和物、白土、ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸、タルク、ペクチン、アカシア、寒天またはゼラチンが挙げられる。液体担体としては、シロップ、落花生油、オリーブ油、生理食塩水、および水が挙げられる。担体はまた、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの徐放性材料を単独で、またはワックスと共に含み得る。固体担体の量は変動するが、1投薬単位当たり約20 mg〜約1 gである。薬学的調製物は、錠剤形態のための粉砕、混合、造粒、および、必要に応じて、圧縮；またはゼラチン硬カプセル形態のための粉砕、混合および充填を含む、従来の調剤技術に従って作製される。液体担体を用いる場合、調製物はシロップ剤、エリキシル剤、乳剤、または水性もしくは非水性懸濁剤の形態であり得る。直腸投与について、本開示の化合物は、カカオ脂、グリセリン、ゼラチン、またはポリエチレングリコールのような賦形剤と組み合わせて、坐剤へ成型してもよい。
【０１２５】
治療用物質は、他の医学的に有用な薬物または生物学的作用物質を含むように製剤化され得る。治療用物質はまた、本開示の化合物が対象にする疾患または状態に有用な他の薬物または生物学的作用物質の投与と併せて投与され得る。
【０１２６】
本開示の生物学的または薬学的組成物は、その中に含有される組換え腫瘍溶解性ウイルスが対象への組成物の投与で生物学的に利用可能となるのを可能にするように製剤化され得る。投与後の血清、腫瘍、および他の組織中の組換え腫瘍溶解性ウイルスのレベルは、抗体ベースのアッセイ(例えばELISA)のような、様々な十分に確立された技術によってモニターすることができる。ある態様において、組換え腫瘍溶解性ウイルス組成物は、それを必要とする対象(例えば、腫瘍を有する対象)、例えば、非ヒト動物またはヒトへの非経口投与のために製剤化される。好ましい投与経路としては、静脈内、動脈内、皮下、腫瘍内、または筋肉内が挙げられる。
【０１２７】
適切な製剤は、当技術分野において公知であるように、選択される投与経路に依存する。例えば、全身製剤は、注射、例えば、皮下、動脈内、静脈内、筋肉内、髄腔内または腹腔内注射による投与のために設計されたもの、ならびに腫瘍内、経皮、経粘膜、経口、鼻腔内、または肺内投与のために設計されたものを含む態様である。一態様において、全身または腫瘍内製剤は無菌である。注射についての態様において、本開示の組換え腫瘍溶解性ウイルス組成物は、水溶液中に、またはハンクス溶液、リンゲル溶液、マンニトール溶液もしくは生理的食塩水緩衝液のような生理学的に適合性の溶液もしくは緩衝液中に、製剤化され得る。ある態様において、本明細書に記載される組換え腫瘍溶解性ウイルス組成物のいずれも、懸濁化剤、安定剤または分散剤のような、製剤化剤（formulator agent）を含有してもよい。経粘膜投与の態様において、透過されるバリアに適した浸透剤、可溶化剤、または軟化剤が、製剤中に使用され得る。例えば、1-ドデシルヘキサヒドロ-2H-アゼピン-2-オン(Azon（登録商標）)、オレイン酸、プロピレングリコール、メントール、ジエチレングリコールエトキシグリコールモノエチルエーテル(Transcutol（登録商標）)、ポリソルベートポリエチレンソルビタンモノラウレート(Tween（登録商標）-20)、および薬物7-クロロ-1-メチル-5-フェニル-3H-1,4-ベンゾジアゼピン-2-オン(ジアゼパム)、ミリスチン酸イソプロピル、ならびに当技術分野において一般的に知られているような他の浸透剤、可溶化剤または軟化剤が、本開示の組成物のいずれにおいても使用され得る。
【０１２８】
投与は、経路の組み合わせ、例えば、動脈内経路を使用する最初の投与、および静脈内もしくは腫瘍内経路を介した後続の投与、またはそれらの任意の組み合わせを使用して達成することができる。
【実施例】
【０１２９】
IV．実施例
以下の実施例は本開示の好ましい態様を実証するために含まれる。以下の実施例中に開示される技術は、本開示の実施において十分に機能することが本発明者によって見出された技術を示し、従って、その実施についての好ましいモードを構成すると考えられ得ることが、当業者によって認識されるべきである。しかし、当業者は、本開示を考慮して、多くの変更が、本開示の精神および範囲から逸脱することなく、開示される具体的な態様においてなされ得、依然として同様または類似の結果を得ることができることを認識するべきである。
【０１３０】
実施例1 - vMYX-PD1構築物の作製および特徴決定
組換えウイルス構築物は、可溶性PD1、または可溶性PD1および任意で様々なインターロイキンを用いて作製され得る。例えば、図1中の代表的な組換えウイルスゲノム構造の略図を参照されたい。
【０１３１】
vPD1および突然変異vPD1を構築するために、ヒトPD1の細胞外領域(アミノ酸1〜168)を、以下のプライマーを使用してPCRによって、前もって構築された鋳型プラスミド(PlasmIDデータベース、クローンHsCD00345685)から増幅した。
【０１３２】
順方向プライマー：
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【０１３３】
逆方向プライマー：
2021533789.tif 000004
【０１３４】
可溶性PD1ヌクレオチド配列：
2021533789.tif 000005
【０１３５】
天然可溶性PD1アミノ酸配列(1〜168)
Q15116  20アミノシグナルペプチド
2021533789.tif 000006
【０１３６】
変異導入された可溶性PD1アミノ酸配列(1〜168) (D85G置換はPD1へのペンブロリズマブの結合を無効にする)
20アミノシグナルペプチド
2021533789.tif 000007
【０１３７】
ヒトIL-2アミノ酸配列(1〜153)
P60568  20アミノシグナルペプチド
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【０１３８】
ヒトIL-12、サブユニットαアミノ酸配列(1〜219)
P29459  22アミノシグナルペプチド
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【０１３９】
ヒトIL-12、サブユニットβアミノ酸配列(1〜328)
P29460  22アミノシグナルペプチド
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【０１４０】
高親和性ヒトIL-2アミノ酸バリアント(1〜164)
P60568  20アミノシグナルペプチド
2021533789.tif 000011
【０１４１】
図2は、皮下B16F10 (B16F10 PD1L-KO)対側異種移植モデル中におけるvPD1-IL2有効性試験を示す。図3は、皮下B16F10 (B16F10 PD1L-KO)対側異種移植モデル中におけるvPD1-IL12有効性試験を示す。図4は、皮下B16F10 (B16F10 PD1L-KO)対側異種移植モデル中におけるvPD1-IL15有効性試験の結果を示す。同様に、図5は、皮下B16F10 (B16F10 PD1L-KO)対側異種移植モデル中におけるvPD1-IL18有効性試験からの結果を示す。総合すれば、IL-2およびIL-15は腫瘍サイズの中程度の減少を示すと考えられ、一方、IL-12は最大の減少を提供する。IL-18は最小の効果を有すると考えられる。
【０１４２】
図6および7に示されるように、インビボ皮下(SC)対側マウスモデルを用いて、種々のウイルス構築物を試験した。3つの腫瘍内注射を左側(WT-B16/F10)に2日離して行い、一方、右側(PDL1-KO-B16/F10)は未処置であった。注射腫瘍(左)および対側非注射腫瘍(右)は、vPD1/IL12およびvPD1/IL2処置に対して反応すると考えられる。vPD1/IL15は中程度の反応を同様に示したが、vPD/IL18は無視できる効果を示す。総合すれば、IL-12は、驚くべきことに、試験された他の構築物と比べて、注射腫瘍および対側腫瘍の両方のサイズにおいてより大きな減少を示す。
【０１４３】
（表１）ウイルス処置生データ
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【０１４４】
図15に示されるように、vPD1単独、vIL12単独、およびvPD1+IL12の組み合わせの有効性を評価するために、マウス研究を行った。マウスの両側腹部上に4×106個のB16/F10細胞を注射した。腫瘍が確立された後、より大きな腫瘍を5日間にわたって示されるウイルスの3回の注射で処置した(0、2、および4日目)。総腫瘍負荷が400 mm2を超えるとマウスを安楽死させる時まで、腫瘍の成長およびマウスの体重をモニターした。vPD1+IL12の組み合わせが、腫瘍成長の減少およびマウスの全生存期間の延長に対して最も有意な効果を有したことが分かった。
【０１４５】
ウイルスのさらなる開発はIL12への膜貫通ドメインの付加を含んだ。膜貫通ドメインはIL12が血液中へ漏れるのを妨げる。
【０１４６】
膜貫通および細胞質ドメイン
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【０１４７】
PD1-IL12-膜貫通ドメイン構築物
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【０１４８】
実施例2 - vMYX-TIM3構築物の作製
未改変粘液腫ウイルス(ローザンヌ株)を、以下の重要な要素を含有するプラスミド、pBS-M135/M136-sE/L GFP+TIM3で相同組換えすることによって、vTIM3を作製した。
- pBluescriptプラスミド骨格
- M134/M135と相同な粘液腫ゲノムの領域
- コンセンサスポックスウイルス合成初期/後期プロモーターによって駆動されるeGFP
- 第2のコンセンサスポックスウイルス合成初期/後期プロモーターによって駆動されるマウスTIM3のaa1〜195
- M136と相同な粘液腫ゲノムの領域
【０１４９】
TIM3-GFP構築物
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【０１５０】
可溶性TIM3
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【０１５１】
pBS-M135/M136-sE/L GFP+TIM3をBSC40細胞へトランスフェクトし、次いで、これらを未改変粘液腫ウイルス(ローザンヌ株)で感染させた。細胞を72時間培養し、これは組換えウイルスを産生し、ここで、M135およびM136間のウイルスゲノムの非翻訳領域は、eGFPおよび可溶性TIM3の両方を発現するカセットによって置き換えられている(図12A)。GFP+クローンを選択することによって、組換えウイルスを、次いで、BSC40細胞上において四重プラーク精製した。最終ウイルス(vTIM3)のクローン性を次いでPCRを使用して確認した。
【０１５２】
vTIM3のインビトロ特徴決定： vTIM3は感染細胞から可溶性PD1を分泌する：ウイルス感染細胞からの可溶性PD1の分泌を、感染の24時間後に、生理食塩水(モック)、vGFP(対照ウイルス)、またはvTIM3のいずれかで感染されたB16/F10黒色腫細胞からの上清をウエスタンブロッティングすることによって確認した。TIM3の可溶性部分と一致する強いバンドが、vTIM3で感染された細胞の上清において特異的に観察された(図12D)。
【０１５３】
vTIM3はインビトロで正常な複製および腫瘍溶解能を示す： TIM3トランスジーンの挿入がMYXV複製を変更するかどうかを判定するために、一段増殖曲線を様々な細胞においてvGFPおよびvTIM3の両方に対して行った。両方のウイルスが、全ての試験された細胞タイプ中で同一の複製を示したことが観察された(図12Bおよび12C)。TIM3トランスジーンの分泌が、感染細胞を直接殺滅するMYXVの能力を変更するかどうかをさらに試験するために、次に、vGFPおよびvTIM3の両方がB16/F10黒色腫細胞を殺滅するのにどれぐらい有効であったかを問うた。B16/F10細胞に、示される感染多重度でvGFPまたはvTIM3のいずれかを感染させた。24時間後、MTTアッセイを使用して、細胞生存度を分析した。vGFPおよびvTIM3の両方が、インビトロで感染黒色腫細胞を殺滅する同一の能力を示したことが観察された(図13)。
【０１５４】
インビボでの黒色腫に対する腫瘍溶解能力： 増大した腫瘍溶解能をvTIM3がインビボで示すかどうかを試験するために、確立した黒色腫腫瘍を退縮させるその能力をマウスにおいて試験した。C57/B6マウスに5×105 B16/F10黒色腫細胞を皮下移植した。腫瘍細胞の注射の7日後に(腫瘍がおよそ15〜20 mm2である時に)、処置を開始した。処置は、7および12日目に与えられた生理食塩水、1×107 FFUのvGFP、または1×107 FFUのvTIM3のいずれかの2回の腫瘍内注射からなった。動物を次いで腫瘍サイズについて毎日モニターし、腫瘍が任意の方向で150mmに達すると安楽死させた。vGFPで処置された動物は腫瘍成長の減少を示し、しかし、これらの動物中の腫瘍の大部分は依然として進行し、最終的には安楽死を必要とした(図13)。対照的に、vTIM3で処置された多くのマウスは、定着腫瘍の急速な退縮を示し、7/12の動物において完全な永続的な寛解を生じさせた。
【０１５５】
各TIM3リガンドについての以前に立証された結合部位が突然変異誘発によって除去された、可溶性TIM3タンパク質のバリアントを発現する一連のウイルスを構築した(図14)。これらのウイルスの各々を、インビボでα腫瘍免疫を誘発し定着腫瘍を根絶するそれらの能力について試験する。これは、vTIM3ベースのチェックポイント遮断に関与する機構を同定し、同様に、改善された治療有効性を有する次世代vTIM3構築物の構築を可能にする。
【０１５６】
実施例3 - 転移性疾患におけるvMYX療法
可溶性PD1の分泌型を発現する組換えMYXV(vPD1)を、転移性がんに対するその活性を決定するためにさらに研究した。残念ながら、vPD1は、(例えば、抗腫瘍免疫の維持を通して)局所性疾患の根絶には極めて有効であるが（例えば、図16を参照されたい）、追加の実験は、それは非注射の転移性腫瘍に対しては低下した有効性を有することを示した(図16Bを参照されたい)。vPD1の未処置病変を有効に退縮させることができないことに起因して、このウイルスの臨床的可能性を前進させるために、改善された全身有効性を生じさせると考えられる、vPD1骨格へ付加することができた追加の改変を研究した。追加の組換えウイルスは、可溶性PD1と、追加の可溶性T細胞チェックポイントタンパク質または一連の炎症性サイトカインのいずれかとの両方を発現した(図17Aを参照されたい)。これらのウイルスの各々を、次いで、クローン性まで精製し、標準対側腫瘍モデルにおいて注射および非注射ルイス肺がん(LLC)の両方を退縮させるその能力について試験した。結果は、試験された分子のうち、IL-12(p40/p35融合タンパク質としてコードされている)の包含のみが、非注射病変に対してvPD1骨格の有効性を有意に改善したことを示した(図17B〜C)。印象的なことに、しかし、vPD1/IL12は、実質的に全ての処置マウスにおいて注射および非注射病変の両方を完全に退縮させることができ(10/12の動物において>120日間持続する永続的な完全奏功)、ほぼ90%の有効な「治癒率」を生じさせた。注目すべきことには、嵩高い十分に確立された疾患を有する動物(350〜400mm2の総腫瘍負荷を示す初期「モック」コホートからの動物)においてさえ、vPD1/IL12を用いる単一の腫瘍の処置は、処置腫瘍の完全除去および未処置腫瘍中の有意な退縮の両方を引き起こすことができた(図17D)。これらの研究は、vPD1/IL12ウイルスが、末期の転移性疾患に対してさえ強い臨床的可能性を有する新規の治療用物質であるということを実証する。
【０１５７】
この刺激的な初期所見に向かって前進するために、vPD1/IL12ウイルスの治療的広がりをさらに研究した。これを達成するために、IL12融合タンパク質を発現する単一組換えMYXV(vIL12)を、転移性疾患：LLC肺がん(SQ対側腫瘍モデル)、B16/F10黒色腫(SQ対側腫瘍モデル)、4T1およびトリプルネガティブ乳がん(肺へ自然転移性の単一SQ腫瘍)の前臨床モデルにおいて、このウイルスの有効性と、vPD1およびvPD1/IL12の両方の有効性とで比較した。全てのモデルからの結果は以下を明確に実証した：1)vPD1/IL12ウイルスは、免疫学的に「熱い」(LLCおよびB16/F10)および免疫学的に「冷たい」(4T1およびID8)疾患形態の両方を示す腫瘍を含む、広範囲の異なる悪性腫瘍からの処置および未処置病変の両方を退縮させることができた。2)この臨床効果は、単独組換えウイルス(vPD1またはvIL12)を用いる処置の後にいかなるモデルにおいても観察されず、これは、vPD1/IL12の治療効果が組み合わせ相乗効果の独特な形態に起因することを示している(図18〜20)。
【０１５８】
本明細書において開示および特許請求される方法の全ては、本開示を考慮して過度の実験無しで作成および実行することができる。本開示の組成物および方法は好ましい態様によって記載されたが、本開示の概念、精神および範囲を逸脱することなく、本明細書に記載される方法および方法の工程または工程の順序に対して変更が適用され得ることが当業者に明らかであろう。より具体的には、化学的におよび生理学的に関連するある作用物質が、同じまたは同様の結果が達成されながら、本明細書に記載される作用物質の代わりに使用され得ることが明らかであろう。当業者に明らかなそのような同様の置換および改変の全てが、添付の特許請求の範囲によって定義されるような本開示の精神、範囲、および概念内にあるものと見なされる。
【０１５９】
参照文献
以下の参照文献は、本明細書に記載されたものを補う例示的な手順または他の詳細を提供する程度まで、参照により本明細書に具体的に組み入れられる。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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