(57)【要約】  本発明は、前立腺癌腫の治療及び／又は予防に使用するための、オイル用のオリーブの搾り出しからの水、及び／又はオリーブ粉砕プロセスのポマースオイル残渣由来のヒドロキシチロソール及び３，４−ＤＨＰＡ−ＥＤＡなどのポリフェノール化合物に富む天然の植物性複合体又は濃縮物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
前立腺癌の治療及び／又は予防に使用するための、ヒドロキシチロソール及び３，４−ＤＨＰＡ−ＥＤＡを含む植物水（vegetation water）及び／若しくはオリーブポマース（pomace）の濃縮物、並びに／又は前記濃縮物を含む組成物。
【請求項２】
前記濃縮物が、
好ましくはチロソール、クロロゲン酸、β−ヒドロキシベルバスコイド、ルチン、ベルバスコイド、及びルテオリンから選択される少なくとも１つのフェノール化合物；並びに／又は
好ましくはナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びカリウムから選択される少なくとも１つの金属；並びに／又は
好ましくは塩化物、硫酸塩、リン酸塩及び硝酸塩から選択される少なくとも１つのアニオン；並びに／又は
グルコース、フルクトース、マンニトール及びスクロースから選択される少なくとも１つの炭水化物；並びに／又は
窒素
をさらに含む、請求項１に記載の使用するための濃縮物及び／又は組成物。
【請求項３】
前記濃縮物が、
（ｉ）植物水及び／又はオリーブポマースの試料を精密ろ過して、精密ろ過の濃縮物及び透過物を得る工程；並びに
（ｉｉ）逆浸透によって、工程（ｉ）から得られた精密ろ過の透過物を濃縮する工程
を含むプロセスによって得られる、請求項１又は２に記載の使用するための濃縮物及び／又は組成物。
【請求項４】
前記精密ろ過工程が、好ましくは管形状によって特徴付けられ、より好ましくは酸化アルミニウム及びジルコニアで作られている、少なくとも１つのセラミック膜の使用を伴う、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用するための濃縮物及び／又は組成物。
【請求項５】
前記逆浸透が、ポリマー膜、好ましくはポリアミドで作られているポリマー膜を使用することによって行われ、前記膜が、好ましくは螺旋形状によって特徴付けられる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用するための濃縮物及び／又は組成物。
【請求項６】
前記前立腺癌が前立腺癌腫であり、好ましくは前記前立腺癌腫が腺房腺癌腫である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用するための濃縮物及び／又は組成物。
【請求項７】
単独で、あるいは抗癌効果を有することが知られている１つ以上の他の物質、化合物、薬物又は組成物と組み合わせて若しくは共同して、好ましくは前立腺癌の治療において、さらにより好ましくは前立腺癌腫の治療において使用される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用するための濃縮物及び／又は組成物。
【請求項８】
前記濃縮物及び／又は組成物が、非経口使用のため、好ましくは皮下又は筋肉内又は静脈内使用のため、より好ましくは静脈内使用のための注射用の水溶液又はエマルジョン又は粉末として製剤化される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用するための濃縮物及び／又は組成物。
【請求項９】
前記濃縮物及び／又は組成物が、好ましくは丸剤、錠剤、粉剤及び顆粒から選択される、経口使用のための製剤であり、ここで、前記粉剤及び顆粒は、好ましくは乾燥及び／又は凍結乾燥によって得られる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用するための濃縮物及び／又は組成物。
【請求項１０】
前記濃縮物及び／又は組成物が、飲料の形態、好ましくは水系及び／又はフルーツ系及び／又はミルク系であり、好ましくはグレープジュース又はマスト系の飲料の形態である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用するための濃縮物及び／又は組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前立腺癌の治療及び／又は予防に使用するための、ポリフェノール化合物に富む、特にヒドロキシチロソール及びオレウロペインアグリコン（３，４−ＤＨＰＡ−ＥＤＡ）に富む天然の植物性複合体に関する。この植物性複合体は、オイル用のオリーブの搾り出しの水（一般的には植物水（vegetation water）して知られる）、及び／又はオリーブ粉砕プロセスのポマース（pomace）オイル残留物に由来する。
【背景技術】
【０００２】
特に注目を集めているオリーブオイルの特徴の１つは、その中に含まれるポリフェノールの含有量が多いことである。これらの化合物は、フリーラジカルの形成を阻害することができる植物起源の天然抗酸化剤である。
【０００３】
オリーブオイルの有益な性質は、とりわけイタリアにおいて、オリーブ樹木の栽培及びオイル生産においてかなりの増加をもたらし、その結果、高い汚染物負荷を特徴とし、したがってかなりの環境影響を生み出すオリーブオイル、主に植物水及びポマースの副産物の生成が増加した。
【０００４】
この物質の処分は、国レベルと地域レベルの両方で厳しく規制されており、法律の施行（１９９６年１１月の法律５７４）は、これらの廃棄物から利益を得ることができない生産者に負担を強いるコストを課しているが、しかしながら、これらの廃棄物は、医療／医薬品の可能性が高い分子が豊富である。
【０００５】
ヒドロキシチロソールは、植物水中に最も多く存在し、最も研究されている化合物であるポリフェノールを構成する。本物質は、植物水中及びポマース中に存在し、また、とりわけオリーブ葉中に存在する物質であるオレウロペインの加水分解によっても生成される。
【０００６】
最近の研究では、ヒドロキシチロソール自体がＰＣ１２細胞（褐色細胞腫の細胞株）に対して細胞保護作用を有し、Ｕ９３７細胞（ヒト骨髄単球系）及びＣ２Ｃ１２細胞（マウス筋芽細胞系）に投与すると抗アポトーシス作用を示し、誘導された新生物の場合のインビボ乳房腫瘍増殖を阻害し、ＨＬ６０及びＨＬ６０Ｒ腫瘍系（ヒト前骨髄球性白血病及びその多剤耐性誘導体系）の研究における化学予防剤であり、月経前症候群及び骨粗鬆症を予防することが実証されている。
【０００７】
さらに、ヒドロキシチロソール（最大２５０〜５００ｍｇ／ｋｇ／日までの高濃度でも）のインビボ投与は毒性影響を何ら及ぼさないことが実証されている。
【０００８】
他の研究では、オレウロペインを単独で投与すると、大腸癌細胞株、転移性乳癌細胞株及びＥＲ陰性乳癌細胞株において抗腫瘍活性を有し、細胞骨格の構造を不安定にする能力を有することが実証されている。
【発明の概要】
【０００９】
植物水に関する多くの研究が実施されてきたが、これらの廃棄物に価値をもたらす可能性のある新しい特性を特定する必要性は依然として非常に高いと感じられており、そうでなければ生産者にとって負担のかかるコストと環境汚染物質を示すだけである。特に、この廃棄物の価値を高める可能性のある新たな栄養学的及び／又は医学的／薬理学的特性を同定する必要性が感じられる。
【００１０】
この点に関して、出願人は驚くべきことに、植物水は、上述のものに加えて、他の形態の癌、特に周知のように、世界中の男性集団における癌の主要な原因を表す前立腺癌に対して、治療的及び／又は予防的効果を実施することができることを見出した。
【００１１】
特に、出願人は、精密ろ過を受けた植物水の浸透物を、逆浸透を介して濃縮することにより、前立腺癌の治療及び／又は予防のためのポリフェノール化合物に富む植物性複合体を得、純粋なヒドロキシチロソール、すなわち、他の精製技術によって植物水から及び/又はポマースから単離されたヒドロキシチロソールよりも高い有効性を有することを観察した。
【００１２】
この治療効果及び／又は化学予防効果は、ヒトの健康にとって特に有利である。実際、植物水の濃縮物は、単独で、又は種々の亜型の前立腺癌に対する既知の抗腫瘍作用を有するさらなる物質と共同して、そのような新生物を治療するための治療に使用することができる。
【００１３】
本発明のさらなる利点は、以下の詳細な説明及び添付の図面、特に以下の図面から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、種々の希釈で、本発明のポリフェノール濃縮物（試料Ａ００９）又は精製ヒドロキシチロソール（ＨｙＴ）又はエタノール（ＥｔＯＨ、ビヒクル対照）で処理された２つのヒト前立腺癌腫細胞株（ＰＣ−３及びＤＵ−１４５）の細胞増殖を評価するために実施された（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイの結果を示す。アッセイは、３つの化合物の各々での処理の２４、４８、７２及び９６時間後に実施した。ＮＴ＝未処理細胞；ＯＤ＝光学濃度。
【図２】図２は、いずれも１：５００又は１：２５０の希釈で、本発明のポリフェノール濃縮物（試料Ａ００９）又は精製ヒドロキシチロソール（ＨｙＴ）又はエタノール（ＥｔＯＨ）で処理されたヒト前立腺癌腫細胞株（ＰＣ−３及びＤＵ−１４５）におけるインビトロでのフィブロネクチン細胞接着アッセイの結果を示す。ＮＴ＝未処理細胞。
【図３】図３は、いずれも１：５００又は１：２５０の希釈で、本発明のポリフェノール濃縮物（試料Ａ００９）又は精製ヒドロキシチロソール（ＨｙＴ）又はエタノール（ＥｔＯＨ）で処理されたヒト前立腺癌腫細胞株（ＰＣ−３及びＤＵ−１４５）におけるインビトロでのコラーゲン細胞遊走アッセイ（ボイデンチャンバー）の結果を示す。ＮＴ＝未処理細胞；Ｋ−＝（血清及び増殖因子不含培地中の細胞）。
【図４】図４は、いずれも１：５００又は１：２５０の希釈で、本発明のポリフェノール濃縮物（試料Ａ００９）又は精製ヒドロキシチロソール（ＨｙＴ）又はエタノール（ＥｔＯＨ）で処理されたヒト前立腺癌腫細胞株（ＰＣ−３及びＤＵ−１４５）の細胞に対するインビトロでのマトリゲル細胞浸潤アッセイ（ボイデンチャンバー）の結果を示す。ＮＴ＝未処理細胞；Ｋ−＝（血清及び増殖因子不含培地中の細胞）。
【図５】図５は、種々の希釈で、本発明のポリフェノール濃縮物（試料Ａ００９）又は精製ヒドロキシチロソール（ＨｙＴ）又はエタノール（ＥｔＯＨ）で処理されたヒト癌細胞株（ＰＣ−３及びＤＵ−１４５）におけるアポトーシス細胞のパーセンテージを評価するために実施された７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）アッセイの結果を示す。アッセイは、３つの化合物の各々での処理の２４及び４８時間後に実施した。ＮＴ＝未処理細胞。
【図６】図６は、種々の希釈で、本発明のポリフェノール濃縮物（試料Ａ００９）又は精製ヒドロキシチロソール（ＨｙＴ）又はエタノール（ＥｔＯＨ）で処理されたヒト癌細胞株（ＰＣ−３及びＤＵ−１４５）におけるサイトカイン放出のサイトフルオロメトリー分析を示す。ＮＴ＝未処理細胞。
【図７】図７は、種々の希釈で、本発明のポリフェノール濃縮物（試料Ａ００９）で処理されたヒト癌細胞株（ＰＣ−３、ＤＵ−１４５及びＬＮＣＡｐ）におけるサイトカイン放出のセクレトームアレイによる解析を示す。ＮＴ＝未処理細胞。
【図８】図８は、種々の希釈で、本発明のポリフェノール濃縮物（試料Ａ００９）又は精製ヒドロキシチロソール（ＨｙＴ）、又はビンクリスチン１０μＭ（Ｖｉｎ）で処理されたＰＣ−３細胞株の細胞周期のフローサイト蛍光分析の結果を示す。アッセイは、３つの化合物の各々での処理の２４及び４８時間後に実施した。ＮＴ＝未処理細胞。
【図９】図９は、種々の希釈で、本発明のポリフェノール濃縮物（試料Ａ００９）又は精製ヒドロキシチロソール（ＨｙＴ）、又はビンクリスチン１０μＭ（Ｖｉｎ）で処理されたＤＵ−１４５細胞株の細胞周期のフローサイト蛍光分析の結果を示す。アッセイは、３つの化合物の各々での処理の２４及び４８時間後に実施した。ＮＴ＝未処理細胞。
【図１０】図１０は、種々の希釈で、本発明のポリフェノール濃縮物（試料Ａ００９）又は精製ヒドロキシチロソール（ＨｙＴ）、又はビンクリスチン１０μＭ（Ｖｉｎ）で処理されたＬＮＣａｐ細胞株の細胞周期のフローサイト蛍光分析の結果を示す。アッセイは、３つの化合物の各々での処理の２４及び４８時間後に実施した。ＮＴ＝未処理細胞。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、前立腺癌の治療及び／又は予防に使用するための、ポリフェノール化合物、好ましくはヒドロキシチロソール及び／又は３，４−ＤＨＰＡ−ＥＤＡを含む植物水及び／又はポマースの植物性複合体又は濃縮物に関する。このような植物水及び／又はポマースの濃縮物は、実際に、腫瘍の進行と戦う際に様々なレベルで作用することによって、このタイプの癌と闘うのに特に効果的であることが実証されている。
【００１６】
以下、この植物性複合体又は濃縮物を単に「濃縮物」又は「ポリフェノール濃縮物」という用語で参照する。
【００１７】
本発明の第２の態様は、癌、特に前立腺癌の治療及び／又は予防における使用のために薬理学的に許容される濃縮物及びさらなる賦形剤／成分を含む組成物に関する。
【００１８】
本発明の文脈において、「前立腺癌」という表現は、腺に影響を与える良性又は悪性新生物を意味する。特に、以下、前立腺癌について言及する。
【００１９】
前立腺は男性生殖器に属する器官であり、精液の産生に介在する。成人男性では、前立腺の大きさは約３ｃｍ、重さは約２０ｇである。前立腺には多くの小さな腺があり、精液の液体部分の約２０％を分泌する。前立腺の機能はアンドロゲン、特に精巣で産生されるテストステロン、副腎で産生されるデヒドロエピアンドロステロン、前立腺自身で産生されるジヒドロテストステロンによって調節されている。
【００２０】
前立腺癌腫では、前立腺を構成する小腺の細胞が癌細胞に変化する。前立腺癌の具体的な原因は、まだ完全には同定されていない。前立腺新生物の最も頻度の高い型は腺房腺癌腫（前立腺の腺房構造から発生する）であり、他の型の前立腺新生物は、例えば、腺管腺癌腫（前立腺管の細胞に由来する）、腺扁平上皮癌腫又は扁平上皮癌腫、粘液癌腫、及び小細胞癌腫である。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態において、本発明の濃縮物及び／又は組成物は、前立腺の悪性癌腫、特に腺房腺癌腫の治療及び／又は予防のために使用することができる。実際、本明細書に記載される濃縮物は、種々のレベルで腫瘍の発生及び進行と戦うことができる特性を有し、従って、その使用は、好ましくは、悪性タイプの前立腺新生物の治療及び／又は予防において有利かつ効果的であることが驚くほど観察されている。
【００２２】
実際、前立腺癌細胞株の細胞（特にＰＣ−３及びＤＵ−１４５株の細胞）について実施されたインビトロ研究は、本発明による濃縮物が、とりわけ、細胞増殖を減少させることができ、純粋なヒドロキシチロソールと比較してより高い有効性を有することを実証した。
【００２３】
さらに、本発明の濃縮物は、癌細胞のフィブロネクチンマトリックスへのインビトロ接着を阻害するのにも有効であることが実証されている。この結果は、本発明の濃縮物で処理された前立腺癌細胞が、フィブロネクチン層（細胞外マトリックスの成分）に付着及び移動し、基底膜マトリックス（マトリゲル）に侵入（通過）するそれらの能力の低下のために、発生転移においてより大きな困難を有するという事実に関係している可能性がある。さらに、（ボイデンチャンバーを用いた）インビトロ研究は、本発明の濃縮物が前立腺癌細胞の遊走及び浸潤能力を妨げることを示した。特に、処理された細胞は移動する能力が低く、それは、化合物の活性化を阻害することによって、又はそれを効率的でなくすることによって、細胞移動経路に対する化合物の作用を示唆し、かくして、腫瘍が周囲の組織を通して増殖する能力を低下させる。
【００２４】
さらに、インビトロ試験は、ポリフェノール濃縮物が、ＶＥＧＦ、ＣＸＣＬ８（ＩＬ−８）及びＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ−１）のような腫瘍血管新生及び炎症を促進するサイトカインの放出を減少させることができることを示した。
【００２５】
前立腺癌腫細胞株に関するインビトロ研究はさらに、ポリフェノール濃縮物が前立腺癌腫細胞株の細胞周期を妨げることができることを示した。
【００２６】
植物水は、好ましくは、３相（オイル、植物水及びポマース）、及び／又は２相（オイル及びポマース＋植物水）オリーブ粉砕プロセスから誘導される。粉砕によって生成された植物水は、好ましくは３〜５の範囲の酸性ｐＨ溶液で処理することができ、より好ましくは約４又は５である。ｐＨは、好ましくは、強酸、及び／又はペクトリシス酵素、すなわち、オリーブ皮のセルロース基質を加水分解する酵素を添加することによって最適化される。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態によれば、ポマースは、孔食され、希釈され、及び／又は予備ろ過される。ポマースは、好ましくは、０．５〜１ｍｍ、より好ましくは約０．７ｍｍの範囲の最大粒径を有する。粒径の一例は、振動スクリーンでふるい分けして得られるものである。孔食されたオリーブポマースは、必要に応じて、ｐＨが好ましくは３〜５、より好ましくは３．５〜４．０を含む水性マトリックス中に可溶化又は分散させることができる。
【００２８】
可溶化工程は、さもなければオリーブ皮の固体マトリックス中にトラップされたままであるポリフェノールを可溶化する目的を有する。
【００２９】
本発明の好ましい実施形態において、濃縮物は、好ましくは、チロソール、クロロゲン酸、β−ヒドロキシベルバスコイド、ルチン、ベルバスコイド、及びルテオリンから選択される少なくとも１つのさらなるフェノール化合物；及び／又は好ましくはナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びカリウムから選択される少なくとも１つの金属；及び／又は好ましくは、塩化物、硫酸塩、リン酸塩及び硝酸塩から選択される少なくとも１つのアニオン；及び／又はグルコース、フルクトース、マンニトール及びスクロースから選択される少なくとも１つの炭水化物をさらに含む。
【００３０】
本発明のさらなる実施形態において、濃縮物は、好ましくは１５〜６０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは２０〜４０ｍｇ／ｋｇ（活性溶液１リットルあたり窒素のｍｇ）を含む量の窒素含有物質（タンパク質、アミノ酸）を含む。
【００３１】
いずれにせよ、濃縮物中に最も多量に存在するフェノール化合物はヒドロキシチロソール及び３，４−ＤＨＰＡ−ＥＤＡである。
【００３２】
ヒドロキシチロソールの量は、植物水１リットルあたり１〜１０グラム（ｇ／Ｌ）、より好ましくは１．５〜５ｇ／Ｌ、さらにより好ましくは２〜３ｇ／Ｌであるのが好ましい。
【００３３】
３，４−ＤＨＰＡ−ＥＤＡの量は、好ましくは０．５〜８ｇ／Ｌ、より好ましくは１〜６ｇ／Ｌ、さらにより好ましくは１．５〜２．５ｇ／Ｌである。
【００３４】
チロソールの量は、好ましくは０．１〜０．４ｇ／Ｌ、より好ましくは０．１５ｇ／Ｌ及び０．２５ｇ／Ｌである。
【００３５】
クロロゲン酸の量は、好ましくは０．０６〜０．２４ｇ／Ｌ、より好ましくは０．８〜０．１６ｇ／Ｌである。
【００３６】
β−ヒドロキシベルバコシドの量は、好ましくは０．３〜１．５、より好ましくは０．５〜１ｇ／Ｌである。
【００３７】
ルチンの量は、好ましくは０．０５〜０．２ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０８〜０．１５ｇ／Ｌである。
【００３８】
ベルバコシドの量は、好ましくは０．４〜１．７ｇ／Ｌ、より好ましくは０．６〜１ｇ／Ｌである。
【００３９】
ルテオリンの量は、好ましくは０．１〜０．５ｇ／Ｌ、より好ましくは０．１５〜０．２８ｇ／Ｌである。
【００４０】
ナトリウムの量は、好ましくは７５〜３００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１２０〜１８０ｍｇ／Ｌである。
【００４１】
カルシウムの量は、好ましくは５〜１０ｇ／Ｌ、より好ましくは２〜５ｇ／Ｌである。
【００４２】
マグネシウムの量、好ましくは２２０〜９００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは４００〜５００ｍｇ／Ｌである。
【００４３】
カリウムの量は、好ましくは３〜１５ｇ／Ｌ、より好ましくは６〜９ｇ／Ｌである。
【００４４】
塩化物の量は、好ましくは１．５〜７ｇ／Ｌ、より好ましくは２．５〜４．５ｇ／Ｌである。
【００４５】
硫酸塩の量は、好ましくは１２〜４５ｇ／Ｌ、より好ましくは１８〜２８ｇ／Ｌである。
【００４６】
リン酸塩の量は、好ましくは１．５〜７ｇ／Ｌ、より好ましくは２．５〜５ｇ／Ｌである。
【００４７】
硝酸塩の量は、好ましくは１２〜５０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１８〜３０ｍｇ／Ｌである。
【００４８】
グルコースの量は、好ましくは１５〜６０ｇ／Ｌ、より好ましくは２５〜３５ｇ／Ｌである。
【００４９】
フルクトースの量は、好ましくは３．５〜１５ｇ／Ｌ、より好ましくは５〜９ｇ／Ｌである。
【００５０】
マンニトールの量は、好ましくは１〜４ｇ／Ｌ、より好ましくは１．５〜３ｇ／Ｌである。
【００５１】
スクロースの量は、好ましくは４〜１６ｇ／Ｌ、より好ましくは６〜１０ｇ／Ｌである。
【００５２】
本発明の好ましい実施形態において、濃縮物は、（ｉ）植物水及び／又はオリーブポマースの試料を精密ろ過して、精密ろ過の濃縮物及び透過物を得る工程；並びに（ｉｉ））逆浸透によって、工程（ｉ）から得られた精密ろ過の透過物を濃縮する工程を含むプロセスによって得られる／得ることができる。
【００５３】
精密ろ過は、前述のように可溶化工程の後に行うことが好ましい。
【００５４】
精密ろ過は、濃縮物、即ち、懸濁液中の植物水／ポマースの含有量の濃縮画分、例えば、微細断片、繊維、及び細胞及び細菌のような赤血球物質を分離する目的を有する。これは、このタイプのマトリックスの標準条件下で実施される。
【００５５】
精密ろ過工程に続いて、濃縮物に加えて、出発物質に応じて変化し、植物水／ポマースの溶解成分、例えば、タンパク質、糖、塩、ポリフェノール、有機酸及び種々の可溶性有機分子を含有する色によって特徴付けられる透過物、すなわち透明画分を得る。
【００５６】
精密ろ過は、好ましくは、少なくとも１つ、好ましくは２つのセラミック膜を用いて行う。  膜は、好ましくは管形状を特徴とする。好ましい実施形態では、膜は、酸化アルミナ及び／又はジルコニアで構成される。
【００５７】
膜は、好ましくは、約３０〜約４０ｍｍ、好ましくは約２５ｍｍの範囲の外径；及び／又は約５００〜約１５００ｍｍ、好ましくは約１２００ｍｍの範囲の長さ；及び／又は直径、好ましくは約２．５〜約５ｍｍ、好ましくは約３．５ｍｍの範囲の液圧直径；及び／又は約０．１５〜約０．７ｍ２、好ましくは約０．３５ｍ２の範囲のろ過表面；及び／又は約０．１ミクロン〜約３００ｋＤａの範囲の粒径又は分子量カットオフ値を有する一連のチャネルを有する。
【００５８】
上述した植物水／ポマースの精密ろ過から得られた透過物を濃縮するための逆浸透工程は、このタイプのマトリックスの標準条件下で、好ましくはポリアミド製のポリマー膜を用いて実施される。
【００５９】
特に、膜は、螺旋巻き構造及び／又は高塩拒絶を伴う分子量カットオフを有し、すなわち、９９．９％の割合で塩化ナトリウム分子を拒絶することができる。これは、浸透膜が生物医学的に関心のある分子を保持し、水分子のみを通過させることを意味する。
【００６０】
ポリマー膜は、好ましくは約５〜約１５ｍ２、より好ましくは約７ｍ２の範囲のろ過面を有する。
【００６１】
逆浸透工程により、精密ろ過により得られた透過物を好ましくは約４倍濃縮することができ、これは、１００Ｌの精密ろ過透過から２５Ｌの濃縮物を得ることを意味する。この場合、容積濃度比（ＶＣＲ）は４、すなわち１００／２５である。
【００６２】
ＶＣＲは、開始マトリックス（植物水）に基づいて、そして何よりもその塩含有量に基づいて変化することができる。なぜなら、逆浸透プロセスは、濃縮されるマトリックスの浸透圧を相殺しなければならないからである。
【００６３】
本発明は、さらに、上述の方法で得ることができる／得られた植物水／オリーブポマースの濃縮物（又は植物性複合体）に関する。
【００６４】
濃縮物は、好ましくは、フェノール化合物、及び／又は金属、及び／又は炭水化物、及び／又はアニオン及び／又は窒素の含有量に関して前述した組成物を有する。
【００６５】
本発明のさらなる態様によれば、上記の濃縮物及び／又は組成物は、単独で、又は前立腺癌、特に前立腺癌腫の治療において抗癌効果を有することが知られている他の物質、化合物、薬物又は組成物と組み合わせて使用される。このような他の物質、化合物、薬物又は組成物は、好ましくはビンカアルカロイド及びタキサンから選択することができる。
【００６６】
１つの実施形態において、本発明のポリフェノール濃縮物及び／又は組成物は、前立腺癌（前立腺癌腫）の治療及び／又は予防のために有利に使用される。１つの実施形態において、本発明の濃縮物及び／又は組成物は、前立腺癌の最も一般的かつ広範な形態である腺房腺癌腫の治療及び／又は化学予防において使用される。別の実施形態では、本発明の濃縮物及び／又は組成物は、前立腺癌の最も侵攻性の形態の１つである前立腺の小細胞癌腫の治療に使用される。
【００６７】
本発明の別の態様では、上述の植物水及び／又はポマースの濃縮物及び／又は組成物は、非経口的使用のために、好ましくは皮下又は筋肉内又は静脈内使用のために、より好ましくは静脈内使用のために、水溶液又はエマルジョン又は粉末の形態で調製される。非経口的使用のための前記調製物は、ビヒクル、可溶化剤、安定剤、局所麻酔剤、防腐剤、抗菌剤、等張化剤及びそれらの混合物から選択される少なくとも１つの添加剤をさらに含むことができる。
【００６８】
本発明の別の態様において、上記の濃縮物及び／又は組成物は、飲料の形態である。本発明による飲料は、種々のタイプの飲料の製剤中に通常存在する１つ以上の任意の賦形剤をさらに含むことができる。上記の濃縮物及び／又は組成物を濃縮した飲料は、機能的タイプとして定義可能であり、すなわち、本明細書に見出され、記載される治療効果により、食物性サプリメントとして使用される。
【００６９】
飲料は、好ましくは、水及び／又はフルーツ及び／又はミルクベースであり得る。本発明の特に好ましい実施形態において、飲料は、フルーツベース、好ましくはブドウベースである。特に、グレープジュース及び／又はマストが好ましく、好ましくは有機グレープ由来である。
【００７０】
あるいは、濃縮物及び／又は組成物は、種々のタイプ、例えば、丸剤、ロゼンジ剤、錠剤、又は粉剤若しくは顆粒剤の経口使用のための処方で調製することができ、例えば、乾燥及び／又は凍結乾燥プロセスの結果として、好ましくは入手可能である。
【００７１】
この場合においても、飲料については、経口製剤は、前立腺癌、特に前立腺癌腫を予防する目的で、栄養補助食品として摂取される。
【００７２】
任意に、飲料及び／又は経口製剤は、前述のように、前立腺癌に対して有効性を有することが知られている１つ以上のさらなる物質、化合物、薬物又は組成物と関連して摂取される。
【００７３】
任意に、濃縮物及び／又は組成物はまた、前立腺癌の治療に関して生物学的に関連する又はアジュバント機能を有するさらなる薬剤／分子を含み得る；例えば、そのような他の薬剤／分子は、抗炎症及び／又は抗生物質及び／又は抗血管新生機能を有することができる。
【実施例】
【００７４】
前立腺癌腫細胞株における細胞増殖に対するポリフェノール濃縮物の効果の評価
細胞生存率及び増殖に対する本発明のポリフェノール濃縮物（Ａ００９）の効果は、２つの前立腺癌細胞株の細胞に対するＭＴＴ（テトラゾリウム塩、［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）比色生存率アッセイによって評価した（図１）。
【００７５】
ＭＴＴアッセイは、ミトコンドリア酵素コハク酸デヒドロゲナーゼにより代謝されるＭＴＴ化合物の能力に基づいている。塩を還元すると、水に不溶な青色の生成物であるホルマザンの結晶が生成する。生存可能な細胞は、生存不可能な細胞とは異なり、塩を減少させ、生成されるホルマザンの量は、存在する細胞の数に比例する。形成された結晶は可溶化され、吸光度（又は光学濃度、ＯＤ）レベルは分光光度計の読み取りによって決定される。
【００７６】
使用される細胞モデルは、２つのヒト前立腺癌細胞株：ＰＣ−３及びＤＵ−１４５である。ＰＣ−３細胞系の細胞は、前立腺癌の骨転移に由来するアンドロゲン非依存性細胞であり、高い転移能を有する。ＤＵ−１４５細胞株の細胞は中枢神経系転移に由来し、ＤＵ−１４５細胞の転移能はＰＣ−３細胞よりも低い。
【００７７】
ＰＣ−３及びＤＵ−１４５細胞を培養し、本発明のポリフェノール濃縮物（Ａ００９）、又はヒドロキシチロソール（ＨｙＴ）、又はエタノール（ＥｔＯＨ）で処理し、各物質を１：１００００〜１：５０００〜１：２５００〜１：１０００〜１：５００〜１：１００、１：１００、１：５０の希釈で評価した。
【００７８】
アッセイは、処理前、及び処理後２４、４８、７２及び９６時間に実施した。
【００７９】
細胞生存率（及びその結果としての増殖）は、５４０ｎｍで読み取った分光光度計により測定した光学密度（ＯＤ）、すなわち培養細胞数及び使用した培養培地のｐＨ（７．１〜７．２）に基づいて細胞増殖を評価するための最適波長によって評価される。
【００８０】
図１に示されるデータに関して、本発明の濃縮物（Ａ００９）は、２つの癌細胞株に対して抗増殖効果を有することが観察され得る。Ａ００９による細胞増殖（増殖、又は培養中の総細胞数の増加として理解される）阻害の影響は、用量依存性であり、時間依存性である。
【００８１】
Ａ００９で得られた結果と、純粋なヒドロキシチロソール（ポリフェノール濃縮物中の主成分を代表する）で得られた結果とを比較すると、これらの結果は完全に同等であることが観察され、従って、オリーブ油産業の廃産物を実質的に代表する物質から得られた天然起源の濃縮物は、精製ヒドロキシチロソールのものと類似の注目すべき抗酸化特性を有することが重要である。この理由から、本発明の濃縮物の治療及び／又は化学予防の可能性は極めて有望である。このようにして、Ａ００９の１：２５０及び１：５００希釈を、その後の機能的研究のために選択した。
【００８２】
インビトロでの前立腺癌腫細胞株における細胞接着、遊走及び浸潤に対するポリフェノール濃縮物の効果の評価。
本発明のポリフェノール濃縮物（Ａ００９）が、癌細胞の最も一般的な特徴のいくつか、すなわち、原発腫瘍からの転移の発生など、腫瘍進行のいくつかの基本的プロセスに依存する、癌細胞の接着、遊走及び浸潤能力と闘う能力を評価した。
【００８３】
使用される細胞モデルは、前述の実施例に記載された２つのヒト前立腺癌細胞株ＰＣ−３及びＤＵ−１４５である。
【００８４】
上記の特性を、フィブロネクチン接着アッセイ、コラーゲン遊走アッセイ（ボイデンチャンバーを用いる）及びマトリゲル侵入アッセイ（ボイデンチャンバーを用いる）によってそれぞれ調べた。細胞を抽出物又は純粋なヒドロキシチロソールで２４時間前処理した。接着アッセイのために、細胞をフィブロネクチン層（２μｇ／ｍＬ）上に播種し、９０分間インキュベートした。付着細胞をＤａｐｉ蛍光色素で染色し、蛍光顕微鏡で計数した。遊走及び侵入アッセイのために、細胞を個々のボイデンチャンバーの上部コンパートメントに装填した。あらかじめフィブロネクチン（２μｇ／ｍＬ）及びマトリゲル（１ｍｇ／ｍＬ）で被覆したポリカーボネートフィルター（８μｍ孔）を、ボイデン系の下部室と上部室の間に介在させた。６時間（移動）及び１８時間（侵入）のインキュベーション後、フィルターを回収し、Ｄａｐｉ蛍光色素で染色し、細胞を蛍光顕微鏡で計数した。
【００８５】
ＰＣ−３及びＤＵ−１４５細胞をインビトロで培養し、次いで、ポリフェノール濃縮物Ａ００９、又はヒドロキシチロソール（ＨｙＴ）、又はエタノール（ＥｔＯＨ）で処理し、各物質を１：５００及び１：２５０希釈で評価した；ＮＴは、細胞のいずれの処理も存在しないことを示す。
【００８６】
治療２４時間後に効果を評価した。
【００８７】
図２、図３及び図４を参照すると、本発明による濃縮物は、フィブロネクチンマトリックス上の両癌株の細胞の接着を阻害し（図２）、細胞移動（図３）及びボイデンチャンバー内の侵入の両方を妨げることが観察され得る（図４）。抽出物Ａ００９は純粋なヒドロキシチロソールよりも高い活性を示した。
【００８８】
前立腺癌腫細胞株におけるインビトロでのポリフェノール濃縮物のアポトーシス促進活性の評価
ＰＣ−３及びＤＵ−１４５細胞株をインビトロで培養し、次いで、ポリフェノール濃縮物Ａ００９、又はヒドロキシチロソール（ＨｙＴ）、又はエタノール（ＥｔＯＨ）で処理し、各物質を１：５００及び１：２５０希釈で評価した；ＮＴは、細胞のいずれの処理も存在しないことを示す。
【００８９】
７−ＡＡＤ（７−アミノアクチノマイシンＤ）は、無傷の膜を有する生細胞から排除されるが、死んだ細胞又は損傷した細胞に浸透し、ＧＣ塩基対間のインターカレートにより高親和性の二本鎖ＤＮＡと結合する蛍光細胞生存性色素である。
【００９０】
図５を参照すると、本発明による濃縮物は、処理の開始から２４時間又は４８時間後に、１：５００希釈又は１：２５０希釈のいずれかで、ＰＣ−３細胞株上で、未処理細胞と比較して、有意なアポトーシス促進活性を示さないことが観察され得る。
【００９１】
しかしながら、濃縮物は、未処理細胞と比較して、アポトーシス促進活性の有意な変動を示し、ヒドロキシチロソールで処理され、そして濃縮物で１：５００希釈で処理された細胞は、１：２５０希釈での処理の開始から４８時間後に、ＤＵ−１４５細胞株上で処理される。この結果は、ＤＵ−１４５系統の方が感度が高いことを示しており、癌の起源が投与された物質に対する感受性に何らかの役割を果たしていることを示唆している。
【００９２】
前立腺癌細胞におけるサイトカイン放出のポリフェノール濃縮物によるインビトロ調節の評価。
ＰＣ−３及びＤＵ−１４５細胞株をインビトロで培養し、次いで、ポリフェノール濃縮物Ａ００９又はヒドロキシチロソール（ＨｙＴ）又はエタノール（ＥｔＯＨ）で処理し、各物質を１：５００及び１：２５０希釈で評価した；ＮＴは、細胞のいずれの処理も存在しないことを示す。
【００９３】
次いで、フローサイトフルオロメトリーにより、抽出物Ａ００９が前立腺癌腫細胞による血管新生促進性及び炎症誘発性サイトカイン（ＶＥＧＦ、ＣＸＣＬ／８ＩＬ−８、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１）の放出を調節することができるかどうかを評価した（図６）。詳細には、濃縮物は、１：２５０希釈及び１：５００希釈のいずれにおいても、処理の６時間後にＤＵ−１４５細胞中のＶＥＧＦ、ＣＸＣＬ８／ＩＬ−８及びＣＸＣＬ１２／ＳＤＦのレベルが減少する一般的な傾向を示す。
【００９４】
フローサイトメトリーによって得られたデータを検証し、より高い感度を特徴とするＢｉｏ−Ｐｌｅｘ技術に依存するセクレトームアレイを用いて、より広いパネルのサイトカインに拡張した。２つの前立腺癌腫細胞株（ＰＣ−３、ＤＵ−１４５）から得た上清を、抽出物Ａ００９（血清マンド増殖因子不含培地）の２つの異なるバッチで２４時間処理した後、化学ルミネセンスにより高感度でサイトカインレベルを測定することができるＢＩＯ−ＰＬＥＸプラットフォームを用いて分析した。さらに、第３の細胞系、ＬＮＣａｐ（図７）におけるＶＥＧＦ及びＣＸＣＬ８／ＩＬ−８の放出を調節する抽出物の能力について評価した。ＬＮＣａｐ細胞は、腫瘍学の分野で一般的に使用されるヒト細胞株である。ＬＮＣａＰ細胞は、１９７７年に５０歳の白人男性からの左鎖骨上リンパ節転移に由来するアンドロゲン感受性ヒト前立腺腺癌腫細胞である。これらは接着性の上皮細胞であり、凝集して個々の細胞として成長する。得られたデータは、抽出物Ａ００９が３つの異なる前立腺癌腫株による炎症誘発性及び血管新生促進性サイトカインの放出を妨げることができることを示す。
【００９５】
インビトロでの前立腺癌細胞株におけるポリフェノール濃縮物の細胞周期を停止させる能力の評価。
ＰＣ−３、ＤＵ−１４５及びＬＮｃａｐ細胞株をインビトロで培養し、次いでポリフェノール濃縮物Ａ００９又はヒドロキシチロソール（ＨｙＴ）で処理した。各物質を１：５００及び１：２５０希釈で評価したところ、ＮＴは細胞の処理がないことを示す。アポトーシスを誘導できる薬剤ビンクリスチン（１０μＭ）を陽性対照として使用した。
【００９６】
ＤＮＡインターカレート剤としてヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いたフローサイトフルオロメトリーにより細胞周期を評価した。実際、ＤＮＡインターカレート剤を用いたサイトフルオロメトリー分析により、細胞が現在存在する細胞周期のどの相を決定することが可能である。正常な条件下では、すべての正常な二倍体細胞は細胞周期のＧ０／Ｇ１期にあり、同じ真核生物では同じ量のＤＮＡ（２ｎ）をもつはずである。このサイクルのＳ期にＤＮＡが合成されると、細胞のＤＮＡ含量が増加し、４ｎに達し、Ｇ２期及び有糸分裂（Ｍ）の間、元の細胞が２つの娘細胞に分裂し、それぞれが２ｎの核酸含量をもつようになる。
【００９７】
図８を参照すると、ポリフェノール濃縮物は、細胞周期のいずれの段階においてもＰＣ−３細胞の細胞周期を妨害しない。
【００９８】
図９を参照すると、ポリフェノール濃縮物は、１：２５０希釈で４８時間処理した後、ＤＵ−１４５細胞の細胞周期のＳ期を妨害することができる。
【００９９】
図１０を参照すると、ポリフェノール濃縮物は、１：２５０及び１：５００希釈での処理の２４及び４８時間後に、ＬＮｃａｐ細胞の細胞周期のＳ期を妨害することができる。これらの結果は、３細胞株の異なる感受性を示し、ホルモン感受性（ＬｎＣＡＰ細胞）が前立腺癌腫細胞を抽出物Ａ００９の効果により感受性にすることができる因子であることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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