(57)【要約】  本発明は免疫細胞、特にCD8+エフェクターおよびメモリーT細胞の少なくとも1つ、Tヘルパー(Th)1細胞およびナチュラルキラーT(NKT)細胞を含む哺乳動物由来の試料中の免疫細胞のC-X-Cモチーフケモカイン受容体3(CXCR3)亜集団を特異的に同定するための方法、特にin vitro方法に関し、該方法は配列番号1に記載のCXCR3について、哺乳動物遺伝子領域中の少なくとも1つのCpG位置のエピジェネティック修飾/特性(メチル化状態を含む)を分析することを含み、ここで、該遺伝子領域中の少なくとも1つのCpG位置の脱メチル化またはメチル化の欠如が、他の免疫細胞、特にCD8+エフェクターおよびメモリーT細胞の少なくとも1つ、Tヘルパー(Th)1細胞およびナチュラルキラーT(NKT)細胞、と比較した場合に、該試料中の免疫細胞の該CXCR3特異的亜集団の指標となる、方法である。  本発明による分析はエピジェネティックなレベルで上記細胞を同定し、それらを、例えば、他の血液または免疫細胞のような、複合サンプル中の全ての他の細胞と区別することができる。  さらに、本発明は、上記細胞、特に複合サンプルを定量するための改善された方法を提供する。  この方法は、好ましくは全血および/または非トリプシン処理組織中で、細胞を精製および/または濃縮する工程なしに実施することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1に記載のCXCR3について哺乳動物遺伝子領域中の少なくとも1つのCpG位置のメチル化状態を分析することを含む、免疫細胞を含む哺乳動物由来の試料中の免疫細胞のC-X-Cモチーフケモカイン受容体3(CXCR3)亜集団を特異的に同定するための方法であって、前記遺伝子領域中の前記少なくとも1つのCpG位置の脱メチル化またはメチル化の欠如が、他の免疫細胞と比較した場合に、前記試料中の免疫細胞の前記CXCR3特異的亜集団を示す、方法。
【請求項２】
CXCR3特異的免疫細胞の亜集団が、CD8+エフェクターおよびメモリーT細胞、Tヘルパー(Th)1細胞およびナチュラルキラーT(NKT)細胞の少なくとも1つを含み、CD8+メモリーまたはエフェクターT細胞、Tヘルパー(Th)1細胞および/またはナチュラルキラーT(NKT)細胞以外の免疫細胞と比較される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記方法が、CD4に基づいて前記試料を事前選別する工程と、前記メチル化状態の分析に基づいてTヘルパー(Th)1細胞のその後の特異的同定とを含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも1つのCpG位置が、配列番号1に記載の単位複製配列3188中のCpG位置34、71、77、102、130、150、163、170、184、224、227、235、278、299、305、337、379、390、407、419、および429から選択されるCpGから選択される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
分析される少なくとも1つのCpG位置について95%を超える脱メチル化が見出される場合、前記方法がCD8+エフェクターおよびメモリーT細胞を同定することを含む、請求項1、2または4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
重亜硫酸変換性の前記分析が、メチル化特異的酵素消化物、重亜硫酸配列決定、プロモーターメチル化、CpGアイランドメチル化、MSP、重メチル、MethyLight、Ms-SNuPE、および増幅DNAの検出に依存する他の方法から選択される方法を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
CD8+メモリー若しくはエフェクターT細胞、Tヘルパー(Th)1細胞および/またはナチュラルキラーT(NKT)細胞の相対量の定量を、分析した領域における前記メチル化頻度の相対量を、若しくは、GAPDHなどの対照遺伝子におけるメチル化頻度の相対量と、比較することに基づいてさらに含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
前記試料が、ヒト血液サンプルを含む哺乳動物体液、または組織、器官もしくは細胞型血液試料、血液リンパ球の試料、またはそれらの画分から選択される、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
前記方法が、全血および/または非トリプシン処理組織を使用して、同定される前記細胞を精製および/または濃縮する工程なしに実施される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
同定された前記免疫細胞に基づいて前記哺乳動物の免疫状態を結論づける工程をさらに含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
哺乳動物においてCXCR3特異的免疫細胞、若しくはCD8+エフェクターおよびメモリーT細胞、Tヘルパー(Th)1細胞およびナチュラルキラーT(NKT)細胞、若しくはCD8+エフェクターおよびメモリーT細胞の亜集団のレベルをモニタリングする方法であって、請求項7〜10のいずれか一項に記載の方法を実施することを含み、さらに、同定された前記細胞の相対量を、以前に採取された試料に対して、または同じ哺乳動物から平行して採取された試料に対して、および/または対照サンプルに対して、比較する方法。
【請求項１２】
CXCR3特異的免疫細胞、若しくは前記CD8+エフェクターおよびメモリーT細胞、Tヘルパー(Th)1細胞およびナチュラルキラーT(NKT)細胞、若しくはCD8+エフェクターおよびメモリーT細胞の前記亜集団の量を、前記哺乳動物に提供される化学物質および/または生物学的物質に応答して測定および/またはモニターすることをさらに含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
前記哺乳動物が、自己免疫疾患、移植拒絶反応、感染症、癌、および/またはアレルギーに罹患しているか、または罹患している可能性がある、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
CXCR3の遺伝子領域中のCpG位置の重亜硫酸アクセシビリティの分析に基づいて、哺乳動物において、免疫細胞のC-X-Cモチーフケモカイン受容体3(CXCR3)亜集団、もしくはCD8+エフェクターおよびメモリーT細胞、Tヘルパー(Th)1細胞およびナチュラルキラーT(NKT)細胞、および若しくはCD4+ Th1細胞、またはCD8+エフェクターおよびメモリーT細胞、を同定、定量、および/または監視するためのキットであって、
請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法を実施するための成分を含むキット、又は
a)重亜硫酸試薬、および  b)SEQ ID NO 1若しくは、配列番号4 〜 9に記載の配列から選択されるオリゴマー、である領域中のCpG位置から選択されるCpG位置のメチル化状態の分析のための材料、を含むキット。
【請求項１５】
配列番号4〜9のいずれかに記載のオリゴマー、または配列番号1、2、もしくは3に記載のアンプリコン。
【請求項１６】
哺乳動物における、免疫細胞のC-X-Cモチーフケモカイン受容体3(CXCR3)亜集団、もしくはCD8+エフェクターおよびメモリーT細胞、Tヘルパー(Th)1細胞およびナチュラルキラーT(NKT)細胞、もしくはCD4+ Th1細胞、またはCD8+エフェクターおよびメモリーT細胞、を同定、定量、および/またはモニタリングするための、請求項14に記載のキット、または請求項15に記載のオリゴマーまたはアンプリコンの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫細胞、特に、CD8+エフェクターおよびメモリーT細胞の少なくとも1つ、Tヘルパー(Th)1細胞およびナチュラルキラーT(NKT)細胞を含む哺乳動物由来の試料中の免疫細胞のC-X-Cモチーフケモカイン受容体3(CXCR3)亜集団を特異的に同定するための方法、特にin vitro方法に関し、該方法は配列番号1に記載のCXCR3について、哺乳動物遺伝子領域中の少なくとも1つのCpG位置のエピジェネティック修飾/特性(メチル化状態を含む)を分析することを含み、該遺伝子領域中の少なくとも1つのCpG位置の脱メチル化またはメチル化の欠如が他の免疫細胞、特にCD8+エフェクターおよびメモリーT細胞の少なくとも1つ、Tヘルパー(Th)1細胞およびナチュラルキラーT(NKT)細胞と比較した場合に、該試料中の免疫細胞の該CXCR3特異的亜集団における指標である、方法に関する。
本発明による分析はエピジェネティックなレベルで上記細胞を同定し、それらを、例えば、他の血液または免疫細胞のような、複合サンプル中の全ての他の細胞と区別することができる。さらに、本発明は、上記細胞、特に複合サンプルを定量するための改善された方法を提供する。この方法は、好ましくは全血および/または非トリプシン処理組織中で、細胞を精製および/または濃縮する工程なしに実施することができる。
【０００２】
さらに、本発明は、上記の方法を実施するためのキットならびにそのそれぞれの使用に関する。および、哺乳動物の任意の固形臓器、組織または体液内の血液中の、CD8+エフェクターおよびメモリーT細胞、Tヘルパー(Th)1細胞及びナチュラルキラーT(NKT)細胞などの、免疫細胞のCXCR3特異的亜集団を定量的に検出および測定するための、新規でより強固な手段を提供することが、本発明の1つの目的である。
【背景技術】
【０００３】
CD8+メモリーT細胞、ヘルパーT(Th)1細胞及びナチュラルキラーT細胞(NKT)は、感染及び癌と闘うT細胞の重要なサブセットである(例えば、Samji T及びKhanna KM.CD8+メモリーT細胞の解釈 Immunol  Lett.  2017年5月;185:32-39参照)。CD8+メモリーT細胞は、エフェクター(CD3+、CD8+、CD45RA+、CCR7-; CD40L-)、エフェクターメモリー(CD3+、CD8+、CD45RA-、CCR7-; CD40L-)、及びセントラルメモリー(CD3+、CD8+、CD45RA+、CCR7+; CD40L-)CD8+T細胞に細分できる。ヘルパーT(Th)1細胞はCD3+, CD4+, CD45RA-, CCR6-, CXCR3+であり、ナチュラルキラーT細胞(NKT)はCD3+, CD8+, CD56+である。
【０００４】
個体のほとんどすべての細胞が、まったく同じDNAコードをもっているにもかかわらず、高等生物は、さまざまなタイプの組織に異なるパターンの遺伝子発現を課し、それを維持しなければならない。大部分の遺伝子調節は、細胞の現状と外部刺激の変化に依存して、一時的である。一方、持続的な調節は、エピジェネティクス(DNAの基本的な遺伝子コードを変化させない遺伝性の調節パターン)の主要な役割である。DNAメチル化は、エピジェネティック調節の原型である。細胞にとって安定したメモリーとして働き、様々な細胞種の長期的なアイデンティティの維持にきわめて重要な役割を果たす。最近、他の形態のエピジェネティック調節が発見された。
「第5の塩基」5-メチルシトシン(mC)に加えて、第6(5-ヒドロキシメチルシトシン、hmC)、第7(5-ホルミルシトシン、fC)および第8(5-カルボキシシトシン、cC)が見出された(Michael J. Boothら、Quantitative Sequencing of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine at SingleBase Resolution Science 18 May 2012, Vol. 336 no. 6083 pp.934-937.
【０００５】
言及されたDNA修飾の主要な標的は、2-ヌクレオチド配列シトシン-グアニン(「CpG部位」)であり;この文脈において、シトシン(C)は、ホルミル化、メチル化、ヒドロキシメチル化、またはカルボキシル化されるように単純な化学修飾を受けうる。ヒトゲノムでは、'CpGアイランド'と呼ばれるある種の比較的密なクラスターを除いて、CG配列は、予想よりはるかにまれである。CpGアイランドは、遺伝子プロモーターと関連することが多く、ヒト遺伝子の半数以上が、CpGアイランドを有すると推定されている(Antequera and Bird, Proc Natl Acad Sci USA 90: 11995-9, 1993)。
【０００６】
DNAの異常なメチル化は、健康な細胞から癌性細胞への形質転換と頻繁に関連している。観察された効果の中には、ゲノムワイドな低メチル化、腫瘍抑制遺伝子のメチル化亢進、多くのがん遺伝子の低メチル化がある(Jones and Laird, Nature Genetics 21:163-167, 1999、Esteller, Oncogene 21:5427-5440, 2002、Laird, Nature Reviews/Cancer 3:253-266, 2003などによりレビューされている)。メチル化プロファイルは、腫瘍特異的であることが認識されており(すなわち、特定の遺伝子のメチル化パターンの変化、または個々のCpGさえ、特定の腫瘍タイプの診断用)、現在では、膀胱癌、乳癌、結腸癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、肺癌、および前立腺癌に対する診断マーカーの膨大な確認がある(例えば、Laird, Nature Reviews/Cancer 3:253-266,2003により要約されている)。
【０００７】
シトシン、5-ヒドロキシメチル化の最近記載された修飾の1つについて、CpGアイランドにおける5hmCをマッピングおよび定量するための酸化的重亜硫酸塩配列決定の有用性が示された(Michael J. Boothら、単一塩基解像度における5-メチルシトシンおよび5-ヒドロキシメチルシトシンの定量的配列決定、サイエンス2012年5月18日、第336巻、第6083号、934〜937頁)。5hmCの高レベルは、転写調節因子と関連するCpGアイランドおよび長い散在性核要素において認められた。これらの領域は、胚性幹細胞においてエピジェネティックなリプログラミングを受ける可能性が示唆される。
【０００８】
国際公開第2012/162660号パンフレットはDNAメチル化アレイを使用して、細胞または細胞の混合物を同定し、血液中または組織中の細胞の分布の変化を定量し、疾患状態、特に癌を診断、予後診断および治療するための方法を提供する。この方法は、新鮮な試料および保存試料を使用する。
【０００９】
Kurachiら(in: Kurachiら  ケモカイン受容体CXCR3が、CD8(+)T細胞の短寿命エフェクター細胞への分化を促進し、メモリー変性をもたらす。J Exp Med.2011 年 8 月 1 日 208(8): 1605-20. doi: 10.1084/jem.20102101.Epub 2011 Jul 25)は、CD8(+)T細胞のエフェクター対メモリー細胞運命決定において、初期膨張期の炎症刺激の強さが、決定的な役割を果たすことを開示している。同博士らは、ケモカイン受容体CXCR3が、抗原/炎症部位へのT細胞の動員を調節することにより、メモリー運命よりもむしろエフェクター運命へのCD8(+)T細胞のコミットメントを促進することに関与していることを実証している。全身性ウイルスまたは細菌感染後、CXCR3(-/-)抗原特異的CD8(+)T細胞の収縮が、有意に減弱し、その結果、完全機能のメモリーCD8(+)T細胞が大量に蓄積する。感染後早期には、CXCR3(-/-)抗原特異的CD8(+)T細胞が、IL-12やIFN-αなどの炎症性サイトカインが、豊富に存在する脾臓の辺縁帯に集まることができないため、比較的弱い炎症刺激を受ける。その結果、CXCR3(-/-)CD8(+)T細胞は、野生型CD8(+)T細胞と比較して、CD25の一過性発現を示し、メモリー前駆体エフェクター細胞に優先的に分化する。この一連の事象は、炎症微小環境へのCXCR3媒介T細胞移動の阻害を介して、抗原特異的メモリーCD8(+)T細胞数を増加させるワクチン接種戦略の開発に重要な意味を持つ。
【００１０】
Lleoら(in:Lleoら、X染色体のDNAメチル化プロファイリングにより、原発性胆汁性肝硬変(PBC)におけるCXCR3プロモーター上の異常な脱メチル化が明らかにされている)は、原発性胆汁性肝硬変(PBC)が、PBC患者30例および対照30例を対象として試験され、CD4+、CD8+、およびCD14+細胞のX染色体メチル化プロファイルによって厳密に定義されていることを記載している。選別されたCD4+、CD8+、およびCD14+亜集団からのゲノムDNAを単離し、超音波処理し、メチル化の分析のために免疫沈降した。全ての製品を、UCSCおよび22,532の十分に特徴付けられたRefSeqプロモーター領域によって注釈付けされた27,728のCpGアイランドを含む、カスタムタイル化された4-plexアレイにハイブリダイズした。さらに、次いで、亜硫酸水素塩配列決定を、PBC患者およびコントロールからの独立した試料の次の群についての検証のために使用した。そのため、選択したX連鎖遺伝子の発現レベルを、全被験者のcDNA試料を用いた定量的リアルタイムPCRにより評価した。合計20、15、および19の異なる遺伝子プロモーターは、PBC患者におけるCD4+ T、CD8+ T、およびCD14+細胞におけるDNAメチル化の有意差を反映していた。興味深いことに、CD8+ T細胞ではFUNDC2の高メチル化が認められ、CD4+ T細胞ではCXCR3の著しい脱メチル化が認められ、これは早期PBC患者のCD4+ T細胞におけるCXCR3発現レベルと逆相関していた。このデータは自己免疫の指標となる可能性が高いエピジェネティックな変化を伴う一連の遺伝子を提供し、PBCの自然史におけるCXCR3の役割を強調している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第2012/162660号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Immunol  Lett.  May 2017;185:32-39
【非特許文献２】Science 18 May 2012, Vol. 336 no. 6083 pp.934-937
【非特許文献３】Proc Natl Acad Sci USA 90: 11995-9, 1993
【非特許文献４】Oncogene 21:5427-5440, 2002、
【非特許文献５】Nature Reviews/Cancer 3:253-266, 2003
【非特許文献６】Science  18 May 2012,336,6083,934〜937
【非特許文献７】J Exp Med.1  Aug.  2011, 208(8): 1605-20
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図1は、本発明によるアンプリコン（単位複製配列）番号3188(配列番号2)上のCpG部位の分析を示す
【図２】図2は、本発明の単位複製配列3188の配列を示す。プライマーおよびプローブ配列を示し(それぞれ下線、二重下線)、CpG位置は太字である。
【図３】図3は本発明によるアンプリコンのゲノム領域を示し、アンプリコン3188の位置は、ボックスとして示される
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上記に鑑みて、本発明の目的は、CD8+メモリーT細胞、Tヘルパー(Th)1細胞およびナチュラルキラーT細胞(NKT)などの免疫細胞のCXCR3+特異的亜集団をより簡便かつ確実に検出、同定、識別、および定量するための優れたツールとしてのDNAメチル化分析に基づく改善された、特に確実な方法を提供することである。
【００１５】
本発明は免疫細胞を含む哺乳動物由来の試料中の免疫細胞のC-X-Cモチーフケモカイン受容体3(CXCR3)亜集団を特異的に同定するための方法を提供することによって上記目的を解決し、該方法は配列番号1に記載のCXCR3について哺乳動物遺伝子領域中の少なくとも1つのCpG位置のメチル化状態を分析することを含み、該遺伝子領域中の少なくとも1つのCpG位置の脱メチル化またはメチル化の欠如が他の免疫細胞と比較した場合に、該試料中の免疫細胞の該CXCR3特異的亜集団を示す。
【００１６】
好ましいのは、CXCR3特異的免疫細胞の亜集団が、CD8+エフェクターおよびメモリーT細胞の少なくとも1つ、Tヘルパー(Th)1細胞およびナチュラルキラーT(NKT)細胞を含み、CD8+メモリーまたはエフェクターT細胞、Tヘルパー(Th)1細胞および/またはナチュラルキラーT(NKT)細胞以外の免疫細胞と比較される方法である。同定された全ての細胞は、免疫細胞のCXCR3+特異的亜集団に属する。
【００１７】
CXCR3は、白血球輸送を調節することができる。ケモカインのCXCR3への結合は、様々な細胞応答、特にインテグリン活性化、細胞骨格変化および走化性移動を誘導する。CXCR3-ligand相互作用は、Th1細胞を引き寄せ、Th1細胞の成熟を促進する。ケモカイン誘発性の細胞脱感作(リン酸化依存性受容体内在化)の結果として、細胞応答は典型的には迅速であり、持続時間も短い。細胞応答性は、細胞内受容体の脱リン酸化とそれに続く細胞表面へのリサイクリングの後に回復する。CXCR3の特徴は、in vitro培養エフェクター/メモリーT細胞、および多くのタイプの炎症組織に存在するT細胞におけるその顕著な発現である; CXCR3は、活性化後にナイーブ細胞上で迅速に誘導され、優先的に、Th1型CD4+ T細胞およびエフェクターCD8+ T細胞上で高度に発現されたままである。加えて、CXCL9、CXCL10およびCXCL11は、炎症病変における局所細胞により一般的に産生され、CXCR3およびそのケモカインが、炎症細胞の動員に関与することを示唆する。ヒトCXCR3の遺伝子は、X染色体上に見出される; Ensembl-ID: ENSG00000186810。
【００１８】
本発明はさらに、特定のエピジェネティックマーカーとして、発明者らによるCXCR3遺伝子の領域の驚くべき同定に基づいており、このように、CD8+メモリーまたはエフェクターT細胞、Tヘルパー(Th)1細胞および/またはナチュラルキラーT(NKT)細胞などの免疫細胞のCXCR3特異的亜集団の特異的同定、ならびに前記分析の臨床ルーチン出願を可能にする。
【００１９】
驚くべきことに、重亜硫酸塩変換可能および非変換可能シトシンの識別パターンは、特に、および排他的に、免疫細胞、特に、配列番号1によるアンプリコンを使用して、特に、配列番号2および/または3に従う重亜硫酸塩変換配列(AMP 3188についてのCpG変換配列およびTpG変換配列)に、示されるような、CD8+メモリー若しくはエフェクターT細胞、Tヘルパー(Th)1細胞および/またはナチュラルキラーT(NKT)細胞、のCXCR3特異的亜集団についての、配列番号1によるゲノム領域に、限定される。
【００２０】
本発明者らは、CD8+メモリー若しくはエフェクターT細胞、Tヘルパー(Th)1細胞および/またはナチュラルキラーT(NKT)細胞において、開示されるようなCpGモチーフが、ほとんど完全に脱メチル化される(すなわち、70%を超える、好ましくは80%を超える、好ましくは90%を超える、最も好ましくは95%を超える)のに対して、一方、同じモチーフは、非CD8+メモリー若しくはエフェクターT細胞、非Tヘルパー(Th)1細胞および/または非ナチュラルキラーT(NKT)細胞において、完全にメチル化されることを具体的に実証し得た。
好ましい実施形態として、この方法は、CD8+エフェクターおよびメモリーT細胞の同定を提供し、ここで、開示されるようなCpGモチーフは、完全に脱メチル化される(すなわち、95%を超える)。
これにより、前記CD8+エフェクターおよびメモリーT細胞を、前記試料中の他の全ての細胞から区別して同定することができる。
好ましい実施形態として、この方法は、免疫細胞マーカーCD4に基づいて、上記試料を予め選別する工程、およびメチル化状態の上記分析に基づいて、Tヘルパー(Th)1細胞を特異的に同定する次の工程をさらに包含する。
【００２１】
前記領域内のCpGモチーフの差次的メチル化は、例えばHIV感染症およびAIDS、Graft versus Host(GvH)、血液学的悪性腫瘍、関節リウマチ、多発性硬化症、またはあらゆる想定される診断状況における細胞傷害性T細胞関連免疫状態のような、自己免疫疾患、拒絶反応、癌、アレルギー、原発性および続発性免疫不全症における前記細胞を同定および定量するために必要とされるのであろうCD8+メモリーまたはエフェクターT細胞、Tヘルパー(Th)1細胞および/またはナチュラルキラーT(NKT)細胞などのCXCR3特異的免疫細胞の亜集団を同定するための価値あるツールである。
このアッセイは、CXCR3特異的免疫細胞、例えば、CD8+メモリーまたはエフェクターT細胞、Tヘルパー(Th)1細胞および/またはナチュラルキラーT(NKT)細胞の亜集団を、精製または任意の染色手順なしで測定することを可能にする。
【００２２】
本発明による方法の別の好ましい局面は、次いで、分析される領域における前記メチル化頻度の相対量を、好ましくは完全に脱メチル化された対照遺伝子(例えば、GAPDH)におけるメチル化頻度の相対量と比較することに基づいて、CXCR3特異的免疫細胞、好ましくはCD8+メモリー若しくはエフェクターT細胞、Tヘルパー(Th)1細胞および/またはナチュラルキラーT(NKT)細胞の亜集団の細胞の相対量の定量をさらに含む。
したがって、前記定量は本明細書に記載され、分析されるように、CXCR3(例えば、配列番号1)の遺伝子領域における重亜硫酸塩変換可能DNA対非変換可能DNAの比に基づいて達成される。
最も好ましいのは、CXCR3特異的免疫細胞の亜集団、特にCD8+メモリーまたはエフェクターT細胞、Tヘルパー(Th)1細胞および/またはナチュラルキラーT(NKT)細胞の相対量の定量化であり、これはCXCR3の亜硫酸水素塩変換可能DNAの相対量、および細胞非特異的遺伝子の亜硫酸水素塩変換可能DNAの相対量(好ましくは「対照遺伝子」または「対照領域」と称される、例えば、GAPDHの遺伝子など)の分析に基づく。
【００２３】
本発明による方法のさらに好ましい実施形態において、重亜硫酸変換性の前記分析は、配列番号1に基づいて適切に設計することができる好適なプライマー対の少なくとも1つのプライマー、好ましくは配列番号4〜9のいずれかに記載のオリゴマーでの増幅を含む。
【００２４】
FACSおよびmRNA測定とは対照的に、本発明による方法を使用して、測定および分析は精製、貯蔵とは無関係に、およびかなりの程度まで、また組織の質まで行うことができる。
【００２５】
好ましくは、増幅がポリメラーゼ、酵素、PCRまたは化学増幅反応、または以下に記載されるような当業者に知られている他の増幅方法を含む。例えば、MSP、HeavyMethyl、Scorpion、MS-SNUPE、MethylLight、ビスルファイト配列決定、ピロシークエンシング、メチル特異的制限アッセイおよび/またはデジタルPCRの記述(例えば、Cancer Diagnostics, Prognostics, and Response to Treatment Clinical Chemistry 55:8 1471-1483 (2009)における単一-Locus DNAメチル化バイオマーカーを検出するためのKristensen and Hansen PCR-Based Methodを参照のこと)。
【００２６】
この増幅により、本発明の方法を実施するための特に好ましい「ツール」であるCXCR3遺伝子領域のアンプリコンが産生され、その結果、配列番号4〜9のいずれかに記載のオリゴマー、または本明細書に記載の配列番号4および6または7および9に基づくプライマー対により増幅されたアンプリコンが本発明の好ましい実施形態を構成し、したがって、配列番号1の配列(および必要に応じてそれに相補的な配列)を使用して、増幅のためのプライマーを設計することができ、すなわち、関連する配列中の「ビーコン」として役立つ。同様に、さらなるプライマーおよびプローブは、配列番号1による単位複製配列に基づいて設計され得る。増幅は、ゲノムおよび/または亜硫酸水素塩(すなわち、「変換された」)DNA配列のいずれかで起こり得る。
【００２７】
当業者は、さらに、分析されるサイトの量を最小限にするために、CpG位置の特定のサブセット、例えば、配列番号1による単位複製配列におけるCpG位置から選択されるCpG位置の少なくとも1つを選択することができ、好ましくは、配列番号1による単位複製配列3188におけるCpG位置34、71、77、102、130、150、163、170、184、224、227、235、278、299、305、337、379、390、407、419、および429から選択される。好ましいのは3、4、5、6、7、8、9、または10個の位置の組み合わせであり、その分析は本発明の記述において有益であるために十分なデータおよび/または情報を生じる。
【００２８】
当業者はさらに、分析される部位の量を最小限にするために、CpG位置の特定のサブセット、例えば、同定されるべき3つの細胞型すべてについてのCpG位置71、77、102、130、150、163、170および184の少なくとも1つ、または特定の亜硫酸水素塩変換可能領域(配列番号1)の単位複製配列番号3188におけるCD8+ T細胞についての224、227、235、278、299、305および337の少なくとも1つ、または配列番号1による亜硫酸水素塩変換可能領域上に存在するすべての部位を選択することができる。AMP 3188における位置102および/または184のうちの1つ以上は除外され得る。
【００２９】
CpG位置の重亜硫酸塩変換性を分析するために、DNAメチル化を分析するための任意の既知の方法を使用することができる。本発明による方法の好ましい態様において、メチル化状態の分析は、メチル化特異的酵素消化物、重亜硫酸配列決定、ピロシーケンシング、プロモーターメチル化、CpGアイランドメチル化、MSP、重メチル、MethyLight、Ms-SNuPE、または増幅DNAの検出に依存する他の方法から選択される方法を含む。これらの方法は当業者に周知であり、それぞれの文献に見出すことができる。
【００３０】
本発明による方法の好ましい実施形態では、前記方法が、例えばDNAチップ上での日常的な適用に適している。上記の情報およびそれぞれの文献に基づいて、当業者は、上記の方法をそのような設定に調整することができる。
【００３１】
本発明による方法のさらに別の好ましい実施形態では、前記方法が、好ましくは全血および/または非トリプシン処理組織を使用して、同定される前記細胞を精製および/または濃縮する工程なしに実施される。
【００３２】
本発明による方法の別の好ましい実施形態において、同定は、CXCR3特異的免疫細胞、特にCD8+メモリーおよびエフェクターT細胞、Tヘルパー(Th)1細胞およびナチュラルキラーT細胞(NKT)、および好ましくはTh1細胞、すべての主要な末梢血細胞型および/または非血液細胞、好ましくは限定されないが、細胞傷害性T細胞、顆粒球、単球、B細胞、CD56++ NK細胞、および他のTヘルパー細胞、ならびに血液以外の器官に由来する他の細胞型からのCD8+メモリーおよびエフェクターT細胞の前記亜集団の区別を含む。
【００３３】
本発明による方法のさらに別の好ましい実施形態では、試料がヒト血液サンプルを含む哺乳動物体液、または組織、器官もしくは白血球の試料、またはそのような組織、器官もしくは白血球の精製もしくは分離された画分、または細胞型試料から選択される。好ましくは、前記哺乳動物が、マウス、ヤギ、イヌ、ブタ、ネコ、ウシラット、サルまたはヒトである。必要であれば、試料を適切にプールすることができる。
【００３４】
次いで、本発明による方法の別の好ましい態様は、CD8+メモリーおよびエフェクターT細胞、Tヘルパー(Th)1細胞およびナチュラルキラーT細胞(NKT)、ならびに好ましくは前記CD8+メモリーおよびエフェクターT細胞などの、同定されたCXCR3特異的免疫細胞の前記亜集団に基づいて、前記哺乳動物の免疫状態を結論付ける工程をさらに含む。
これらの細胞は、定量され得、そしてさらなる詳細な亜集団を比較定量するためのベンチマークとして使用され得るか、または予測および/またはスクリーニングおよび/または診断および/または予後および/または有害事象検出因子として使用され得るか、または全体的な免疫活性状態を決定するために、この集団を最終的に検出するために使用され得る。
【００３５】
本発明による方法のさらに別の好ましい実施形態では、哺乳動物が、これらに限定されないは、以下を患っているか、または患っている可能性が高い；
限定されないが、クルーズ・トリパノソーマ感染、マラリア及びＨＩＶ感染で例示される、自己免疫疾患、移植拒絶、感染症、癌、および/またはアレルギー；
限定されないが、血管系腫瘍、例えば、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、非ホジキン性リンパ腫、ホジキン病、慢性リンパ性白血病、移植片対宿主および宿主対移植片病、菌状息肉症、節外性T細胞リンパ腫、皮膚性T細胞リンパ腫、未分化大細胞型リンパ腫、血管免疫芽球性T細胞リンパ腫および他のT細胞、B細胞およびNK細胞新生物、T細胞不全、限定されないが、例えば、リンパ球減少症、重症複合免疫不全症(SCID)、Omenn症候群、軟骨毛髪形成不全、後天性免疫不全症候群(AIDS)、及び遺伝性疾患、例えば、DiGeorge症候群、染色体切断症候群(CBS)、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、全身性硬化症、皮膚筋炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、乾癬、白斑、水疱性類天疱瘡、円形脱毛症、特発性拡張型心筋症、1型糖尿病、グレーブス病、橋本病、重症筋無力症、IgA腎症、膜性腎症、および悪性貧血；ならびに、
B細胞およびT細胞複合障害、例えば、限定されないが、毛細血管拡張性運動失調症(AT)およびヴィスコットオールドリッチ症候群(WAS)；ならびに、
がん腫、例えば、限定されないが、乳がん、結腸直腸がん、胃がん、膵がん、肝細胞がん、胆管がん、黒色腫、および頭頸部がん。
【００３６】
次いで、本発明による方法の別の好ましい態様は、CXCR3特異的免疫細胞、特にCD8+エフェクターおよびメモリーT細胞、Tヘルパー(Th)1細胞およびナチュラルキラーT(NKT)細胞の少なくとも1つの亜集団の量を、前記哺乳動物に提供される化学物質および/または生物学的物質に応答して、すなわち前記患者の治療に応答して、測定および/またはモニターすることをさらに含む、上記の方法に関する。
前記方法は、上記の工程と、同定された前記細胞の前記相対量を、同じ哺乳動物からより早くまたは平行して採取された試料および/または対照サンプルと比較する工程とを含む。
本発明の方法によって提供される結果に基づいて、主治医は患者の免疫状態について結論を下すことができ、それに応じて基礎疾患の治療を調整することができる。
【００３７】
好ましくは、前記方法は、細胞を、好ましくは、全血および/または非トリプシン他組織中で、または、例えば、CD8+エフェクターおよびメモリーT細胞、Tヘルパー(Th)1細胞およびナチュラルキラーT(NKT)細胞のうちの少なくとも1つの、CXCR3特異的免疫細胞の前記亜集団を潜在的に含む任意の他の生体サンプルで、精製および/または富化する工程なしに、例えば、患者への細胞移入のためのサンプルとして、実施される。
【００３８】
次いで、本発明による方法の別の好ましい態様は、CXCR3特異的免疫細胞の前記亜集団、特に、患者への移植のために同定されたCD8+エフェクターおよびメモリーT細胞、Tヘルパー(Th)1細胞およびナチュラルキラーT(NKT)細胞のうちの少なくとも1つ、を処方することをさらに含む、上記の方法に関する。
これらの目的のための医薬調製物およびそれらの製造のための方法は、移植医療の分野で公知の方法に従って行われる。
【００３９】
本発明による方法の別の好ましい態様は、配列番号4〜9のいずれかに記載のオリゴマー、または配列番号1〜3に記載のアンプリコンに関する。
【００４０】
本発明のさらに別の好ましい局面は次いで、C-X-Cモチーフケモカイン受容体3(CXCR3)免疫細胞、好ましくはCD8+エフェクターおよびメモリーT細胞、Tヘルパー(Th)1細胞およびナチュラルキラーT(NKT)細胞、およびより好ましくはCD4+ Th1細胞、またはCD8+エフェクターおよびメモリーT細胞の亜集団を、CXCR3の遺伝子領域における重亜硫酸塩接近性の分析に基づいて哺乳動物において同定、定量および/またはモニターするためのキットであって、本明細書に記載されるような本発明による方法を実施するための成分、特にa)重亜硫酸塩試薬、ならびにb)配列番号1に従う領域におけるCpG位置のメチル化状態の分析のための材料(例えば、配列番号4〜9に従う配列から選択されるオリゴマー)を含むキットを含むキットに関する。
【００４１】
本発明はまた、本明細書中に記載されるような哺乳動物において、免疫細胞、好ましくはCD8+エフェクターおよびメモリーT細胞、Tヘルパー(Th)1細胞およびナチュラルキラーT(NKT)細胞、より好ましくはCD4+ Th1細胞、またはCD8+エフェクターおよびメモリーT細胞のC-X-Cモチーフケモカイン受容体3(CXCR3)亜集団を同定、定量および/またはモニターするための、本発明によるオリゴマーまたは単位複製配列またはキットの使用を包含する。
【００４２】
上記のように、最近、3つの新しいシトシン修飾が発見された。従って、将来の科学的発見は、過去に記載された修飾のエピジェネティックパターンを補正することが期待される。シトシン修飾のこれらの過去のパターンは、亜硫酸水素塩変換可能(非メチル化、非修飾)および非変換可能(メチル化、修飾)シトシンを包含する。両方の末端は記載されるように、補正される必要がある。新規な科学的発見によれば、(i)非重亜硫酸塩変換性シトシンは5-メチルシトシン(mC)および5-ヒドロキシメチルシトシン(hmC)を包含し、(ii)重亜硫酸塩変換性(すなわち「重亜硫酸塩変換性」)シトシンは、5-ホルミルシトシン(fC)、5-カルボキシシトシン(cC)、ならびに非修飾シトシンを包含する。
【００４３】
さらに、過去の発明は、(i)染色質の全量に対する重亜硫酸塩変換可能シトシンの比(細胞型非依存性、100%重亜硫酸塩変換可能DNA遺伝子座)、または(ii)非重亜硫酸塩変換可能シトシン(hmCおよびmC)に対する重亜硫酸塩変換可能シトシン(fC、cC、非修飾シトシン)の比に基づく。
これらの比は、細胞型、細胞分化、細胞段階病理学的細胞ステージを特徴付ける。従って、新しい技術は新規の、より特異的な比率をもたらし、現在の細胞特異的、細胞状態特異的ならびにエピジェネティック修飾の病理学的パターンを補足し、したがって、潜在的な新規バイオマーカーを定義する可能性がある。
バイオマーカーとして発見される新規な比率は、以下のように定義することができる:
バイオマーカー比  =  a/b
a  =  Σ(Cおよび/またはmCおよび/またはhmCおよび/またはfCおよび/またはfCおよび/またはcC)
b  =  Σ(Cおよび/またはmCおよび/またはhmCおよび/またはfCおよび/またはcC)であり、aおよびbは、1〜4種類の修飾によって互いに異なる。
新規なDNA修飾の発見は、この一覧を拡大するのであろう。
【００４４】
本出願の定義の目的のために、DNA配列における「エピジェネティック修飾」は、(i)亜硫酸水素塩変換可能シトシン(5-ホルミルシトシン、(fC)および/または5-カルボキシシトシン(cC))および(ii)非亜硫酸塩変換可能シトシン((5-メチルシトシン(mC)、5-ヒドロキシメチルシトシン、(hmC)を含む))の用語によって言及される。
両方の種類のメチル化、mCおよびhmCは亜硫酸水素塩変換可能ではないので、これらの2つを区別することは不可能である。
同様に、fC、cCならびに非修飾シトシンは亜硫酸水素塩変換可能であり、また互いに区別することもできない。
用語「メチル化」DNAは、mCならびにhmCを包含する。用語「非メチル化」DNAは、fC、cC、および非修飾DNAを包含する。
今後、DNA修飾の新規変異体が発見されることが期待される。
各タイプの修飾は、亜硫酸水素塩変換可能であるか、またはそうでないかのいずれかである。
しかしながら、本発明の方法は2つの群を確実に区別するので、これらの新規な修飾はマーカーとしても使用可能である。
【００４５】
さらに、DNAの修飾とは別に、ヒストンも翻訳後修飾を受け、DNAや核タンパク質との相互作用を変化させる。修飾には、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、スモイル化、シトルリン化、およびADP-リボシル化が含まれる。ヒストンH2A、H2B、H3のコアも修飾できる。ヒストン修飾は、遺伝子調節、DNA修復、染色体凝縮(有糸分裂)および精子形成(減数分裂)などの多様な生物学的過程で作用する。また、これらの修飾について、修飾の特定のパターンは様々な細胞型、細胞段階、分化状態に特異的であり、このようなパターンは特定の細胞および細胞段階を同定するために、亜硫酸水素塩変換性または類似の方法について分析され得る。本発明はまた、これらの修飾の使用を包含する。
【００４６】
要約すると、CXCR3遺伝子領域、特に本明細書に記載のアンプリコンをマーカーとして使用して、本発明者らは免疫細胞、好ましくはCD8+エフェクターおよびメモリーT細胞、Tヘルパー(Th)1細胞およびナチュラルキラーT(NKT)細胞の少なくとも1つのC-X-Cモチーフケモカイン受容体3(CXCR3)亜集団を、試料中の他の細胞型、例えば他の血液および/または免疫細胞との関係で、非常に特異的に同定し、定量し、特に識別させた。
【００４７】
本発明は以下の実施例において、添付の図面および配列表を参照して、さらに記載されるが、これらに限定されるものではない。
本発明の目的のために、本明細書中に引用される全ての参考文献は、それらの全体が参考として援用される。
【００４８】
図1は、本発明によるアンプリコン（単位複製配列）番号3188(配列番号2)上のCpG部位の分析を示す。表中の水平ボックスは示される位置(AMP3188:34が、Amplicon 3188....のCpG 1に対応するなど)を有する、分析されるアンプリコン中のCpG位置(例えば、CpG 1、2など)に対応し、列は、分析される細胞型に対応する。
BLC - B cells; 
CTL - cytotoxic T cells; 
GRC - granulocytes; 
MOC - monocytes; 
NKC - natural killer cells; 
T4m - CD4+ central memory cells; 
T4n - CD4+ naive T cells; 
T8m - CD8+ central memory T cells; 
T8n - CD8+ naive T cells; 
THC - T helper cells; 
THE - T helper cells type 1; 及び
THZ - T helper cells type 2
【００４９】
図2は、本発明の単位複製配列3188の配列を示す。プライマーおよびプローブ配列を示し(それぞれ下線、二重下線)、CpG位置は太字である。
【００５０】
図3は本発明によるアンプリコンのゲノム領域を示し、アンプリコン3188の位置は、ボックスとして示される。
【００５１】
配列番号1は、本発明による単位複製配列番号3188の配列を示す(図3参照)。
【００５２】
配列番号2および3は、それぞれ、単位複製配列3188のCpG変換配列およびTpG変換配列を示す。
【００５３】
配列番号4〜9は、本発明による特異的オリゴマー(プライマーおよびプローブ)の配列を示す。
【実施例】
【００５４】
実施例1
CD8+メモリーおよびエフェクターT細胞、Tヘルパー(Th)1細胞およびナチュラルキラーT細胞(NKT)を同定するために、配列番号1の配列に従ってヒトゲノム領域、特にAMP 3188の領域に由来する亜硫酸水素塩変換試料に対してqPCRを行った。血液細胞亜型におけるアンプリコン領域の実際のエピジェネティックなプロファイリングのために、分析された免疫細胞集団は図1のように示された。
【００５５】
示された好ましいqPCRアッセイ系の重亜硫酸塩変換標的領域(図2も参照):
CpGテンプレート変異体(メチル化、すなわち非変換CG)(配列番号2):
GGTGTAGTTTTTAGAGTTGGGAGGGTGGTTTTTCGGGAGATTTGGTGGTGTTGGGGTTGTTAGTGAGTTTCGGGAGCGAGGATATTGGGGAGAGTTAGAGTCGGTAGAGGGAGGGAGGAGTTTGGAATGCGGGGAAGTTAGATTGTGGGCGAAAGGGGAGTTCGGATTTCGGTTTTATAAGTTCGAGTAGGAGGTTTTTGAGGTTTTAGATTAGGATGAATTTCGGCGGGAAGACGATGGTTGTTTTTGGAGTTTTTTTTGGTTGGGGTAGTTTAGGCGTAAGAGTAGTATTTATATTCGTTTTCGGAATTTGATTTTTATAAAGGTATAGAGTAGCGGGTTGAGGTAGTAGTGTATGTAGTTTAGGTTTGAGGTGATCGATTTGGTTACGTTTATTTTGTTTTTTCGGTTATAGTTGCGGGTTAAAGCGTTTAGGTTTATGAGGATGTTTATTAGTATTATTAGGTGATAGGGGGTTTAG
【００５６】
TpGテンプレート変異体(メチル化されていない、すなわち変換されたCG)(配列番号3):
GGTGTAGTTTTTAGAGTTGGGAGGGTGGTTTTTTGGGAGATTTGGTGGTGTTGGGGTTGTTAGTGAGTTTTGGGAGTGAGGATATTGGGGAGAGTTAGAGTTGGTAGAGGGAGGGAGGAGTTTGGAATGTGGGGAAGTTAGATTGTGGGTGAAAGGGGAGTTTGGATTTTGGTTTTATAAGTTTGAGTAGGAGGTTTTTGAGGTTTTAGATTAGGATGAATTTTGGTGGGAAGATGATGGTTGTTTTTGGAGTTTTTTTTGGTTGGGGTAGTTTAGGTGTAAGAGTAGTATTTATATTTGTTTTTGGAATTTGATTTTTATAAAGGTATAGAGTAGTGGGTTGAGGTAGTAGTGTATGTAGTTTAGGTTTGAGGTGATTGATTTGGTTATGTTTATTTTGTTTTTTTGGTTATAGTTGTGGGTTAAAGTGTTTAGGTTTATGAGGATGTTTATTAGTATTATTAGGTGATAGGGGGTTTAG
【００５７】
好ましいアッセイ状態は以下の通りであった:
TpGシステム:
プライマー:1.5μM最終濃度
プローブ:0.125μM最終濃度
作業溶液プローブ(20×):2.5μM
作業溶液プライマーミックス(20×):30μM
作業用溶液λ-DNA(10x):50ng/μl
添加剤(例えば、Mg2+):-μM最終濃度
Roche Master-Mix:1x
反応量: 10μl
サーモプロファイル:
インキュベーション前:95℃で35分間。
アニーリング/エロンゲーション:61℃、15秒。
変性:95℃で1分間。
サイクル数:50
【００５８】
CpGシステム:
プライマー:1.5μM最終濃度
プローブ:0.125μM最終濃度
作業溶液プローブ(20×):2.5μM
作業溶液プライマーミックス(20×):30μM
作業用溶液λ-DNA(10x):50ng/μl
添加剤(例えば、Mg2+):-μM最終濃度
Roche Master-Mix:1x
反応量: 10μl
サーモプロファイル:
インキュベーション前:95℃で35分間。
アニーリング/エロンゲーション:61℃、15秒。
変性:95℃で1分間。
サイクル数:50
【００５９】
好ましいプライマーおよびプローブ配列は以下であった:
TpG-System        Sequence 5' → 3' + 任意の修飾
Primer_FW          GGGTGAAAGGGGAGTTTG (配列番号4)
Primer_Rv          CAAAAACAAATATAAATACTACTCTTACAC (配列番号5)
Probe              FAM-TGAATTTTGGTGGGAAGATGATGGTTG-BHQ1(配列番号6)
【００６０】
CpG-System        Sequence 5' → 3' + 任意の修飾
Primer_FW          GCGAAAGGGGAGTTCG (配列番号7)
Primer_Rv          CGAAAACGAATATAAATACTACTCTTACGC (配列番号8)
Probe              FAM-ATTTCGGCGGGAAGACGATGGTTG-BHQ1(配列番号9)
【００６１】
FAM-フルオレセイン
BHQ1-非蛍光Black Hole Quencher登録商標-1(Sigma Aldrich)
【００６２】
結果:
上記のようなアッセイの適用が成功した後、以下の脱メチル化レベルが、目的の細胞型について単位複製配列3188において見出された:
【表１】
2021530967.tif 000002
【図１】
2021530967.tif 000003
【図２】
2021530967.tif 000004
【図３】
2021530967.tif 000005
【配列表】
2021530967000001.app
【国際調査報告】
2021530967.tif 000006
2021530967.tif 000007
2021530967.tif 000008