(57)【要約】  ドナーDNAをヌクレアーゼに連結する（テザリングする）ための組成物に関する。該組成物は、ドナーDNAとDNA結合ドメインのコンセンサス配列とを含む核酸；並びに、以下：該コンセンサス配列を結合するためのDNA結合ドメインに連結したヌクレアーゼを含む融合タンパク質および該融合タンパク質をコードする核酸のうちの少なくとも１つを含む。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドナーＤＮＡをヌクレアーゼに連結するための組成物であって、前記組成物が、
ドナーＤＮＡおよびＤＮＡ結合ドメインのコンセンサス配列を含む核酸；並びに
以下：
前記配列を結合するためのＤＮＡ結合ドメインに連結されたヌクレアーゼを含む融合タンパク質；および
前記融合タンパク質をコードする核酸
のうちの少なくとも１つ、
を含む組成物。
【請求項２】
前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓタンパク質、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーまたはＭＡＤｚｙｍｅである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ヌクレアーゼがＣａｓタンパク質である、請求項９に記載の組成物。
【請求項４】
前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記融合タンパク質が核内局在化配列を更に含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
Ｃａｓタンパク質および標的ＤＮＡ配列と相互作用するガイドＲＮＡを更に含む、請求項２〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記コンセンサス配列がＬａｃオペレーター（配列番号６６）、ＴＲＰオペレーター（配列番号６８）、ＴＥＴオペレーター（配列番号６７）、ＧＡＬ−４結合部位（配列番号１）またはＩＨＦ結合部位（配列番号２）を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記コンセンサス配列が、Ｌａｃオペレーター、ＴＲＰオペレーター、ＴＥＴオペレーター、ＧＡＬ−４結合部位またはＩＨＦ結合部位に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、Ｌａｃリプレッサー、ＴＥＴリプレッサー、ＴＲＰリプレッサー、ＧＡＬ−４もしくはＩＨＦ、または前記コンセンサス配列を結合するのに十分なその一部分を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ＬＡＣリプレッサー、好ましくは配列番号９のアミノ酸４３〜４０３である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ヌクレアーゼがリンカーを介して前記ＤＮＡ結合ドメインに連結される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記リンカーが、配列番号３〜７、ＧＧＳリンカー、または配列番号９のアミノ酸４０４〜４１９のいずれか１つより選択された配列を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１３】
前記融合タンパク質がＬＡＣリプレッサーおよびＣａｓ９を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ベクターが：
ａ．ドナーＤＮＡおよびＤＮＡ結合ドメインのコンセンサス配列を含む核酸；および
ｂ．融合タンパク質をコードする核酸
の一方または両方を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ベクターが、Ｃａｓ９タンパク質と相互作用するガイドＲＮＡをコードする核酸配列および標的ＤＮＡ配列を更に含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記融合タンパク質がヌクレアーゼ欠損型である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物を含む、単離された宿主細胞。
【請求項１８】
細胞内でＤＮＡを編集する方法であって、前記方法が、
融合タンパク質と標的ＤＮＡ配列との相互作用に適切な条件下で、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物と細胞とを接触させる工程を含む方法。
【請求項１９】
細胞内でＤＮＡを編集する方法であって、前記方法が、
ａ）融合タンパク質と第一の標的ＤＮＡ配列との相互作用に適切な条件下で、請求項１６に記載の組成物と細胞とを接触させる工程；および
ｂ）核酸編集に適当な条件下で、第二の標的ＤＮＡ配列の所でゲノムＤＮＡを編集するのに適合する核酸編集システムと細胞とを接触させる工程
を含む方法。
【請求項２０】
前記標的配列が、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外因性ＤＮＡから選択される、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
編集の効率が、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％である、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞が、対象、好ましくはヒト対象の中にある、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ドナーＤＮＡおよびＤＮＡ結合ドメインのコンセンサス配列を含む核酸；並びに
以下：
前記コンセンサス配列を結合するためのＤＮＡ結合ドメインに連結したヌクレアーゼを含む融合タンパク質；および
前記融合タンパク質をコードする核酸
のうちの少なくとも１つ
を含むキット。
【請求項２４】
前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓタンパク質、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーまたはＭＡＤｚｙｍｅである、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９である、請求項２４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[001]本技術は、ドナーDNAをヌクレアーゼに連結する（テザリングする）ための組成物、インビボ遺伝子編集の効率を改善するためのそれらの組成物の使用に関する。
〔関連出願〕
【０００２】
[002]本出願は、2018年３月25日出願のオーストラリア国仮特許出願第2018900990号の優先権を主張し、その出願の全内容が参照により本明細書中に援用される。
【背景技術】
【０００３】
[003]転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ (TALEN)、CRISPR-Cas9システム(Clustered, Regularly Interspaced, Short Palindromic Repeats and CRISPR associated protein 9)およびジンクフィンガーヌクレアーゼ (ZFN)をはじめとする多数のゲノム編集技術が知られている。TALEN、CRISPR-Cas9タンパク質およびZFNは、エンドヌクレアーゼを利用してゲノムDNA中のほとんど全ての標的配列に二本鎖切断（DSB）を開始させ、そして遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックイン、遺伝子タグ付け、および遺伝子欠損の修正に利用することができる。
【０００４】
[004] II型細菌由来CRISPR-Cas9（Clustered, Regularly Interspaced, Short Palindromic Repeats−CRISPR associated protein 9）システムは、細胞性DNAへの突然変異の標的指向導入のためのツールである。適切に設計されたシングルガイド（sg）RNAは、他の部位での作用を最小限に抑えながら、細胞性DNA中の所望の標的部位に、Cas9媒介性の二本鎖切断(DSB)を誘導する。二本鎖切断は、少なくとも２つの異なるメカニズム、すなわち非相同性末端結合(NHEJ)と相同性組み換え修復(HDR)により、DNA修復を刺激する。NHEJによる細胞性DNAのCas9媒介改変は、20〜60％の効率に到達することが可能であるが、NHEJはエラーが発生しやすく、予測できないパターンの挿入と削除を導入するため、小規模のランダム変異の導入にのみ適する。細胞性DNA上の切断部位に隣接する配列に相同である一本鎖または二本鎖DNA鋳型を用いる共導入CRISPR-Cas9により、HDR媒介性の外来DNAまたはドナーDNAフラグメントの組み込みによる正確なゲノム編集が可能になる。しかしながら、HDRの頻度は本質的に低く、このストラテジーを使用したドナーDNAの挿入効率はわずか0.5〜20％にとどまる。
【０００５】
[005] TALENは、転写活性化因子様 (TAL) タンパク質とFok Iヌクレアーゼとの融合体である。TALタンパク質は、典型的には、特定のヌクレオチド配列を強く認識する２つの可変位置を持つ33〜34アミノ酸の反復モチーフから構成される。 TALのアレイを集成してそれらをFok Iヌクレアーゼに融合させることにより、ゲノムの特異的切断を達成できる。２つのTALENが結合し会合すると、Fok Iドメインは二本鎖切断を誘導し、遺伝子を不活性化することができ、または目的のDNAを挿入するために使用することができる。TALENは染色体を最大約33％の効率で改変できる。
【０００６】
[006]ZFNは、所望の位置でDNA中に二本鎖切断を生成することによりゲノムの標的指向ゲノム編集を可能にする、人工DNA結合タンパク質の１クラスである。ZFNは２つの機能的ドメインから成り、１つは各々が固有のDNAヘキサマーを認識するジンクフィンガーモジュールの連鎖から構成されるDNA結合ドメインである。複数のジンクフィンガーが集合して24塩基以上の配列に対して特異性を持つZFNを形成することができる。２つ目の機能的ドメインは、Fok Iのヌクレアーゼドメインである。ZFNを利用して、クローン集団の１〜20％の効率で単一遺伝子または二対立遺伝子の編集を達成することができる。
【０００７】
[007] 本発明者らは、CRISPR-Cas、TALENおよびZFNなどの遺伝子編集システムの標的特異性を利用して、ドナーDNAを所望の標的DNA配列につなぐ（テザリングする）ための組成物と方法を開発した。
【発明の概要】
【０００８】
[008]第一の態様では、ドナーDNAをヌクレアーゼにつなぐための組成物を含む組成物が提供され、この組成物は、ドナーDNAとDNA結合ドメインのコンセンサス配列とを含む核酸；並びに以下：
前記コンセンサス配列を結合するためのDNA結合ドメインに連結されたヌクレアーゼを含む融合タンパク質；および
前記融合タンパク質をコードする核酸
のうちの少なくとも１つ
を含む。
【０００９】
[009]ヌクレアーゼは、Cas、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、メガヌクレアーゼ、またはジンクフィンガーであることができる。一実施形態では、それはCasタンパク質、例えばCas9である。
【００１０】
[010]融合タンパク質はさらにヌクレアーゼ局在化配列を含んでよい。
【００１１】
[011]組成物はさらに、Casタンパク質および標的DNA配列と相互作用するガイドRNAを含んでよい。
【００１２】
[012]コンセンサスは、Lacオペレーター（配列番号66）、TRPオペレーター（配列番号68）、TETオペレーター（配列番号67）、GAL-4結合部位（配列番号１）、またはIHF結合部位（配列番号２）を含むことができる。
【００１３】
[013]コンセンサス配列は、Lacオペレーター、 TRPオペレーター、TETオペレーター、GAL-4結合部位またはIHF結合部位に対して少なくとも80％、85％、90％、95％または少なくとも99％の同一性を有する配列を含むことができる。
【００１４】
[014] DNA結合ドメインは、LACリプレッサー、TETリプレッサー、TRPリプレッサー、GAL-4もしくはIHF、またはコンセンサス配列を結合するのに十分なその一部分を含んでよい。
【００１５】
[015] DNA結合ドメインは、LACリプレッサー、好ましくは配列番号９のアミノ酸43〜403である。
【００１６】
[016] ヌクレアーゼは、リンカーを介してDNA結合ドメインに連結され得る。リンカーは、配列番号３〜７、GGSリンカー、または配列番号９のアミノ酸404〜419のいずれか１つから選択された配列を含み得る。
【００１７】
[017] 一実施形態では、融合タンパク質は、LACリプレッサーとCas9とを含む。
【００１８】
[018] 組成物は、ベクターを含むことができ、該ベクターは
a. ドナーDNAとDNA結合ドメインのコンセンサス配列とを含む核酸；および
b. 融合タンパク質をコードする核酸
のいずれか一方または両方を含む。
【００１９】
[019] 前記ベクターは、Cas9および標的DNA配列と相互作用するガイドRNAをコードする核酸配列をさらに含み得る。
【００２０】
[020] 幾つかの実施形態では、融合タンパク質がヌクレアーゼ欠損型である。
【００２１】
[021] 第二の態様では、第１の態様の組成物を含む単離された宿主細胞が提供される。
【００２２】
[022] 第三の態様では、細胞内でDNAを編集するための方法が提供される。融合タンパク質と標的DNA配列との相互作用に適した条件下で、細胞を第１の態様の組成物と接触させる。
【００２３】
[023] 第三の態様では、細胞内でDNAを編集する方法が提供され、この方法は
a) 融合タンパク質と第一の標的DNA配列との相互作用に適した条件下で、細胞を請求項15に記載の組成物と接触させる工程；および
b) 核酸編集に適した条件下で、第二の標的DNA配列のところでゲノムDNAを編集するように適応させた核酸編集システムと前記細胞とを接触させる工程
を含む。
【００２４】
[024] 標的DNA配列は、ゲノムDNA、ミトコンドリアDNA、ウイルスDNA、または外因性DNAから選択することができる。
【００２５】
[025] 一実施形態では、編集の効率は少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％である。
【００２６】
[026] 細胞は対象、好ましくはヒト対象の中にあってよい。
【００２７】
[027] 第四の態様では、キットであって、
ドナーDNAとDNA結合ドメインのコンセンサス配列とを含む核酸；並びに以下：
前記コンセンサス配列を結合するためのDNA結合ドメインに連結されたヌクレアーゼを含む融合タンパク質および
前記融合タンパク質をコードする核酸
のうちの少なくとも１つ
を含むキットが提供される。
【００２８】
[028] 一実施形態では、キット中の融合タンパク質は、Casタンパク質、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーまたはMADzymeを含む。一実施形態では、CasはCas9である。
【００２９】
[029] 本明細書全体を通して、文脈が他の意味を要求しない限り、「含む（comprise)」という語、または「含む（comprises)」もしくは「含んでいる（comprising)」などの変形は、言及された要素、整数もしくは工程、または要素、整数もしくは工程の群の包含を意味するが、他の任意の要素、整数もしくは工程、または他の任意の要素、整数もしくは工程の群の除外を意味するものではないと解釈されるだろう。
【００３０】
[030] 本明細書に含まれている文書、行為、材料、装置、文献等に関するいかなる議論も、単に本発明の文脈を提供することを目的としている。これらの事項は全て先行技術背景の一部を構成しているという承認、またはそれが本明細書の各請求項の優先日より前に存在していたとして、本発明に関連する分野での普通の一般知識であったという承認として解釈してはならない。
【００３１】
[031] 本発明がより明確に理解され得るために、以下の図面と実施例を参照して好ましい実施形態が記載される。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】[032]図１は、改変型核酸編集システムを含む、本明細書に開示される組成物の２つの実施形態の描写である。
【図２】[033]図２は、活性Cas9遺伝子配列と、ゲノム標的DNA配列へのCrispr/Cas 9の複合体の結合を指令することができるそれのガイドRNAと、Crispr/Cas9で誘起される二本鎖切断の修復に使用することができるドナーDNA配列とを含有する、プラスミドベクター地図である。
【図３】[034]図３は二元システムに用いられるプラスミドの地図であり、lacリプレッサー融合体を含むCrispr/Cas 9遺伝子配列とガイドRNAとが、テザー構成用発現ベクター上に存在することを示す。
【図４】[035]図４は、図３と同じ二元システムに用いられるプラスミド地図であり、ドナーDNA配列が第二のテザー遺伝子ターゲティング用ベクター上に存在することを示す。
【図５】図５はin vitroシステムを構築するためのプラスミドの地図であり、それは精製Crispr/Cas 9が細胞へのトランスフェクション前に遺伝子ターゲティング用ベクターに結合させるために用いられる。
【図６】[036]図６は、図５と同じin vitroシステムを構築するためのプラスミド地図である。
【図７】[037]図７は、in vivoテザー構成体遺伝子ターゲティング用プラスミドの構築のためのワークフロー図であり、Ａは、中央のSspI認識配列とプラスミドSspI認識配列を構成しない隣接のSsp I適合性の突出端とを有する、Ugプロモーターを含むU6発現カセットの合成を表す。Ｂは、中央のNotIクローニング部位とEco1091適合性突出端を含む、CMVプロモーター−SV40−ポリAカセットの合成を表す。Ｃは、NotI適合性突出端を有するCas9−lacリプレッサー融合タンパク質をコードする遺伝子の合成を表す。Ｄは、SspI適合性突出端を持つゲノムターゲティング用DNA配列に相補的なRNAをコードする遺伝子の合成を表す。Ｅは、隣接するSalI制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含むオリゴヌクレオチドを用いたドナーDNA配列のPCR増幅およびSalIによる消化を表す。
【図８Ａ】[038]図８は、pGT1の構築のためのワークフロー図である。Ａ．不活性化されたBbsI制限エンドヌクレアーゼ部位を有するラクトースリプレッサー遺伝子の作製。Ｂ．Flag/SV40 NLS、lacIおよびCas9を含む３つの重複するDNAフラグメントを作出し、これらをpSpCas9 BB-2A-GFP(px458)（Ｃ）中にクローニングして、pGT1を作製した。pGT1のベクター地図がＤに示される。
【図８Ｂ】図８Ａの説明に同じ。
【図８Ｃ】図８Ａの説明に同じ。
【図８Ｄ】図８Ａの説明に同じ。
【図９】[038]図９は、pGT9の構築に使用されるptetリプレッサープラスミドのベクター地図である。
【図１０Ａ】図10は、pGT9の構築のワークフロー図である。Ａ：tetリプレッサーカセットをpUC57中にクローニングしてptetリプレッサーを作製する。Ｂ：３つのポリメラーゼ連鎖反応産物 Flag/S40 NLS、lacIおよびCas9を作製し、それらをpSpCas9 BB-2A-GFP(px458)（Ｃ）中にクローニングしてpGT9を構築した。pGT9のベクター地図がＤに示される。
【図１０Ｂ】図１０Ａの説明に同じ。
【図１０Ｃ】図１０Ａの説明に同じ。
【図１０Ｄ】図１０Ａの説明に同じ。
【図１１】[039]図11は、delF508突然変異とlacOまたはtetO認識配列を有する500塩基対ドナーフラグメントを示す、ドナーフラグメントの概略図である。
【図１２】[040]図12は、ゲノムCFTR標的Cas9誘起二本鎖切断とドナーフラグメントとの間の相同組み換えによる相同性組み換え修復のための、本明細書に記載の組成物を用いてゲノム標的へのdelF508DNA配列の移入を触媒することを表す概略図である。
【図１３】[041]図13は、pGT1ベクター（ラクトースリプレッサー−Cas9融合体）と、ドナーDNAの３′末端上の130117ガイド（ゲノム標的正方向（Forward）鎖）およびラクトースオペレーターとの組み合わせ（図13、レーン７）が、未改変のCas9および同じドナーDNAフラグメントを有するpx458ベクターと比較して、より高い遺伝子編集効率を提供することを表す。
【図１４】[042]図14は、pGT9テトラサイクリンリプレッサー−Cas9融合ベクター、ガイド配列およびドナーフラグメントを用いる遺伝子編集が、対照のpx458ベクターよりも顕著に優れた遺伝子編集頻度を与えなかったことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
[043] 本開示は、改変型核酸編集システムを用いてドナーDNAをDNA標的配列に連結する（テザリングする）ための組成物、方法およびキットを提供する。本開示は、CRISPR−Cas9などの改変型核酸編集システムを使用する、in vivo細胞性DNA修飾（遺伝子編集など）効率の改善を提供する。このプロセスの一実施形態を図１に示す。改変型遺伝子編集システムは、ドナーDNAを含む核酸への結合に適応し、核酸を編集すべきヌクレオチド配列の箇所またはその近傍の細胞DNA上の特定部位に核酸をつなぐ（テザリングする）。
【００３４】
改変型核酸編集システム（ヌクレアーゼ−DNA結合ドメイン融合体）
【００３５】
[044] 本明細書に記載される組成物と方法は、部位特異的結合力のある任意の核酸編集システムのヌクレアーゼを含み得る。例えば、有用なヌクレアーゼとしては、Casヌクレアーゼ、TALEN、メガヌクレアーゼ、ZFNおよびMADzymeが挙げられる。ヌクレアーゼは、それをDNA結合ドメインと組み合わせることで改変される。
【００３６】
[045]ヌクレアーゼとDNA結合ドメインは、リンカーを介して連結することができる。適切なリンカーとしては、例えば、配列(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n、(Gly)n、または (Gly)nS、(EAAAK)n、(AP)n、(XP)n、またはA(EAAAK)n を含むリンカーが挙げられ、ここでnは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20のいずれか１つであり、そしてXは任意アミノ酸である。他の適切なリンカーは、配列KESGSVSSEQLAQFRSLD、EGKSSGSGSESKST、GSAGSAAGSGEF、KESGSVSSEQLAQFRSLE、またはGGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSGを含む。
【００３７】
[046] Casシステムは、３つの主要なタイプ（タイプI、タイプIIおよびタイプIII）と、それらの遺伝的内容および構造的差異に基づいて12のサブタイプに分類される。ただし、すべてのCRISPR-Casシステムのコアとなる決定的な特徴は、Cas遺伝子とそのタンパク質である：cas1とcas2はタイプとサブタイプに渡って共通であるが、Cas3、Cas9およびCas10は、それぞれタイプI、タイプII、およびタイプIIIに特徴的な遺伝子である。
【００３８】
[047] 任意のCasを使用することができる。例えば、Casヌクレアーゼは、Cas1、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10であり得る。幾つかの実施形態では、CasはCas9である。
【００３９】
[048] Cas9（CRISPR関連タンパク質９）は、遺伝子不活性化のためまたは非相同末端結合および相同組み換えのそれぞれを通した異種遺伝子の導入のための、DNA中の部位特異的二本鎖切断を誘導するのに使用されるRNAガイド付きDNAヌクレアーゼである。Cas9を発現させるためのシステムと核酸配列は商業的に入手可能である。Cas9は、ヒトや他の哺乳動物のシステムに合うようにコドン最適化されていてよい。Cas9タンパク質は、Ｃ末端に核局在化シグナルを含んでもよい。Cas9をコードするRNAは、哺乳動物細胞での発現を助けるためにキャッピングおよびポリアデニル化されることがあり、そして免疫刺激を低減するための修飾を含んでいてよい。当該組成物と方法において使用することができる、Cas9並びに機能的誘導体および相同体のアミノ酸配列とコード核酸配列は、当技術分野において公知である。
【００４０】
[049] Cas9は、編集システムをgRNAによって認識されるヌクレオチド配列に指し向けるガイドRNA（gRNA）と組み合わせて送達されてもよい。一般に、gRNAは任意のヌクレオチド配列を標的とするように設計することができる。gRNA構造は、例えば、Ran FA、 "Genome editing using the CRISPR-Cas9 System." PNAS 8(11):2281-308 (2013); およびPyzocha他、"RNA-guided genome editing of mammalian cells." Methods Mol. Biol. 1114:269- 77 (2014)中に開示されており、それらの全内容が参照により本明細書に組み込まれる。一般にCas9の場合、gRNAは、Cas9を下流のNGGプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）を有する相補的20ヌクレオチド配列にガイドする。
【００４１】
[050] ガイド配列の作製を含む CRISPR-Cas9システムは、米国特許第8,697,359号に更に開示されており、その全内容が参照により本明細書中に組み込まれる。
【００４２】
[051] CRISPR-Cas9システムの代わりに、代替の核酸編集システムを使用してもよい。例えば、適切なシステムには、任意のCRISPR/casシステム（例えば任意のカスケード様CRISPR/cas、タイプI CRISPR/cas、タイプII CRISPR/cas、およびタイプIII CRISPR/cas)、ジンクフィンガーヌクレアーゼ (ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALENs)、メガヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびMADzymes (例えば、それぞれ配列番号69と70によりコードされる、ヒトまたは大腸菌E. coli MADzymes）が挙げられる。
【００４３】
[052] 改変型核酸編集システムのDNA結合ドメイン成分は、任意の配列特異的高親和性DNA結合ドメインであり得る。本明細書で使用される「DNA結合ドメイン」という用語は、DNAを結合することができる任意の完全タンパク質またはそのフラグメントを指す。従って、「DNA結合ドメイン」という用語には、LACリプレッサーなどの完全タンパク質と、DNA結合活性を保持しているタンパク質フラグメントが含まれる。
【００４４】
[053] 幾つかの実施形態では、(オフ)ターゲット効果を低減するために、DNA結合ドメインは哺乳動物由来ではない。例えば、DNA結合ドメインは、細菌または酵母由来であることができる。本明細書に記載される組成物と方法において有用なDNA結合ドメインは、LACリプレッサー、TETリプレッサー、TRPリプレッサー、GAL-4、またはIHFから成る群より選択され得る。これらの各々は、当技術分野で既知である特定のコンセンサス配列に結合する。
【００４５】
[054] コンセンサス配列は、Lacオペレーター（例えば配列番号66）、TRPオペレーター（例えば配列番号68）、TETオペレーター（例えば配列番号67）、GAL-4結合部位（5′-CGG-N11-CCG-3′) またはIHF結合部位 (5' - WATCAANNNNTTR - 3')であることができる。W はAまたはTであり、そしてRはAまたはGであり、そしてNは任意のヌクレオチドである。
【００４６】
[055] 核酸編集システムは、精製されたタンパク質の形でまたは該核酸編集システムをコードする核酸の形で、本明細書に開示される組成物中に存在することができる。核酸は、ベクター、例えば、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターに作動可能に連結された核酸編集システムをコードする配列を含むプラスミドベクターであることができる。
【００４７】
[056] 「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を含む。本明細書に記載の通りに核酸を細胞に送達するために使用されるベクターには、当業者に既知でありそのような目的で使用されるベクターが含まれる。一定の例示的ベクターは、プラスミド、レンチウイルスまたはアデノ随伴ウイルスであってよい。ベクターには、一本鎖、二本鎖、または部分的に二本鎖である核酸分子；１つ以上の自由端を含む核酸分子、自由端を含まない核酸分子（例えば環状）；DNA、RNAまたはその両方を含む核酸分子；および当該技術分野で既知のポリヌクレオチドの他の変形が含まれるが、それらに限定されない。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、これは例えば標準的な分子クローニング技術により、追加のDNAセグメントを挿入することができる環状二本鎖DNAループを指す。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、この場合、ウイルス由来のDNAまたはRNA配列が、ウイルス中にパッケージングするためのベクターの中に存在する（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）。ウイルスベクターはまた、宿主細胞へのトランスフェクションのためにウイルスにより運ばれるポリヌクレオチドを含む。特定のベクターは、それらが導入された宿主細胞中で自己複製することができる（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクター、およびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指令することができる発現ベクターである。組み換えDNA技術において有用な汎用発現ベクターは、しばしばプラスミドの形である。組み換え発現ベクターは、細胞中での核酸の発現に適当な形態で改変型核酸編集システムをコードする１つ以上の核酸を含み得る。このことは、組み換え発現ベクターが１つ以上の調節要素を含むことを意味し、それらの要素は、発現に使用する予定の宿主細胞に基づいて選択することができる。すなわち、調節要素が発現させようとする核酸配列に作動可能に連結されている。「作動可能に連結された」とは、目的のヌクレオチド配列が、そのヌクレオチド配列の発現を可能にする方法で調節要素に連結されていることを意味する（例えば、インビトロ転写／翻訳システム中またはベクターが宿主細胞に導入される場合には宿主細胞中での発現）。
【００４８】
[057]「調節要素」には、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム侵入部位（IRES）、および他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナルおよびポリU配列などの転写終結シグナル）が含まれる。調節要素は当技術分野で公知である。調節要素には、様々なタイプの宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現を指令するもの、および、特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指令するもの（例えば、組織特異的調節配列）が含まれる。組織特異的プロモーターは、主として筋肉、ニューロン、骨、皮膚、血液、特定の臓器（例えば肝臓、膵臓）または特定の細胞型（例えばリンパ球）などの目的の所望の組織において発現を指令することができる。
【００４９】
[058] 調節要素はまた、組織特異的または細胞型特異的であってもなくてもよい、細胞周期依存的または発生段階依存的な方式などの、時間依存的な方式で発現を指令することもできる。幾つかの実施形態では、ベクターは１つ以上のpol IIIプロモーター（例えば1、2、3、4、5またはそれ以上のpol IIIプロモーター）、１つ以上のpol IIプロモーター（例えば1、2、3、4、5またはそれ以上のpol IIプロモーター）、１つ以上のpol Iプロモーター（例えば1、2、3、4、5またはそれ以上のpol Iプロモーター）、またはそれらの組み合わせを含むことができる。pol IIIプロモーターの例としては、限定されないが、U6およびHIプロモーターが挙げられる。pol IIプロモーターの例としては、限定されないが、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルス (RSV) LTRプロモーター（場合によりRSVエンハンサーを有する）、サイトメガロウイルス (CMV)プロモーター（場合により CMVエンハンサーを有する）、SV40プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ (PGK)プロモーター、並びにEFIaプロモーターおよび本明細書に記載のPol IIプロモーター類が挙げられる。「調節要素」の用語には、エンハンサー要素、例えばWPRE；CMVエンハンサー；HTLV-IのLTR中のR-U5' セグメント；SV40エンハンサー；およびウサギβ−グロビンのエクソン２と３の間のイントロン配列も包含される。発現ベクターの設計は、形質転換しようとする宿主細胞の選択、所望の発現レベルなどの要因に依存しうることは、当業者に理解されるであろう。ベクターは宿主細胞中に導入されるとそれにより転写産物（例えばガイドRNA）、タンパク質、ペプチド、例えば融合タンパク質（改変型核酸編集システムなど）または融合ペプチドを産生することができる。
【００５０】
[059] ベクターは、１つ以上のターミネーター配列を含んでよい。ターミネーター配列は、転写中にコード配列の終端をマークする核酸配列の一部を含む。
【００５１】
[060]ベクターは、エピトープタグまたはレポーター遺伝子配列をコードする１つ以上の配列を含むことができる。エピトープタグの非限定的な例としては、ヒスチジン（His）タグ、V5タグ、FLAGタグ、インフルエンザ血球凝集素（HA）タグ、Mycタグ、VSV-Gタグ、およびチオレドキシン（Trx)タグが挙げられる。レポーター遺伝子の例としては、限定されないが、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ（GST）、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（HRP）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（GFP)、HcRed、DsRed、シアン蛍光タンパク質(CFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、および青色蛍光タンパク質（BFP）を含む自己蛍光タンパク質が挙げられる。エピトープタグ、レポーター遺伝子、またはその両者は、改変型核酸編集システムとの融合体（ヌクレアーゼ−DNA結合ドメイン融合体）としてベクターから発現され得る。
【００５２】
[061] 代替的にまたは付加的に、組成物は融合タンパク質をコードするmRNAを含んでもよい。
【００５３】
[062] mRNAは修飾することができるが、その修飾は、リン酸骨格の１つ以上の修飾（例えばホスホロチオエート結合またはボラノホスフェート結合）、2′-O-メチルおよび／または2′−フルオロおよび／または4′−チオ修飾などのリボース環修飾、並びにロック核酸または未ロック核酸から選択される。その他の修飾には、プソイドウリジン、2−チオウリジン、4−チオウリジン、5−アザウリジン、5−ヒドロキシウリジン、5−アミノウリジン、5−メチルウリジン、2−チオプソイドウリジン、4−チオプソイドウリジン、5−ヒドロキシプソイドウリジン、5−メチルプソイドウリジン、5−アミノプソイドウリジン、プソイドイソシチジン、5−メチルシチジン、N4−メチルシチジン、2−チオシチジン、5−アザシチジン、5−ヒドロキシシチジン、5−アミノシチジン、N4−メチルプソイドイソシチジン、2−チオプソイドイソシチジン、5−ヒドロキシプソイドイソシチジン、5−アミノプソイドイソシチジン、5−メチルプソイドイソシチジン、N6−メチルアデノシン、7−デアザアデノシン、6−チオグアノシン、7−デアザグアノシン、8−アザグアノシン、6−チオ−7−デアザグアノシン、6−チオ−8−アザグアノシン、7−デアザ−8−アザグアノシン、および6−チオ−7−デアザ−8−アザグアノシンが含まれる。
【００５４】
[063] いくつかの実施形態では、修飾は、以下のうちの１つ以上のために選択される：免疫刺激の低減、RNA安定化、コードされたタンパク質の発現の改善。例えば、RNAは、TLR3、TLR7およびTLR8などのパターン認識受容体を介した免疫刺激を低減させるために2−チオウリジンと5−メチルシチジンの組み合わせを有することができる。一部の実施形態では、mRNAは、開裂に対してmRNAを安定化しかつ発現効率を改善するために１つ以上のプソイドウリジンを有する。
【００５５】
[064] 改変型核酸編集システムは、DNA結合ドメインも含む。DNA結合ドメインは、改変型核酸編集システムの細胞性DNA中への局在化を促進する。
【００５６】
[065] 本明細書に開示されるベクターの構築は、合成核酸、または例えばPCRによって産生された核酸を、１つ以上の部位特異的ヌクレアーゼによって切断されているプラスミドに連結させることによるなど、当技術分野で公知の標準的手法による。
【００５７】
[066] 本明細書に開示されるベクターを作製するための代替ストラテジーがある。１つのアプローチでは、ベクター全体が、例えば大型DNA分子の合成を専門とする会社により、市販のサービスを利用してde novo合成される。
【００５８】
[067] あるいは、pUC19などの標準的な実験用プラスミドを改変するための古典的クローニング技術と合成生物学の組み合わせがある。このアプローチでは、Cas9-lacオペロン融合遺伝子、ガイドRNAおよびドナーDNA配列をコードする遺伝子カセットをde novo合成し、T4 DNAリガーゼを使用してベクター骨格中に存在する特有の制限エンドヌクレアーゼ部位に個別にクローニングする。ドナーDNA配列は、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅され、ベクター骨格中にクローニングされた産物をもたらす。改変されたCas9タンパク質のアフィニティー精製用に、別のDNA結合ドメインまたはエピトープを追加する、Cas9-lacリプレッサー融合タンパク質の改変は、組み換えPCRに続き、ベクター骨格中の制限エンドヌクレアーゼ部位への連結によって実施できる。本明細書に開示されているプラスミドベクターを調整するためのこのプロセスを説明するワークフローは図７に示される。
ヌクレアーゼ欠損
【００５９】
[068] 幾つかの実施形態では、核酸編集システムはヌクレアーゼ欠損である。これらの実施形態では、ヌクレアーゼ欠損核酸編集システムは、ドナーDNAが追加の核酸編集システムによる使用に利用できるように、ドナーDNAを標的核酸配列の近くにつなぐ（テザリングする）ために使用される。
【００６０】
[069] 例えば、ヌクレアーゼ欠損遺伝子編集システムは、ヌクレアーゼ活性が低減または除去されており、あるいは、ヌクレアーゼ活性が存在しないかまたは検出レベル内で実質的に存在しない。幾つかの実施形態では、遺伝子編集システムのヌクレアーゼ活性は、既知のアッセイを使って検出不可能であり、すなわち既知のアッセイの検出レベルより低い。
【００６１】
[070] ヌクレアーゼ欠損遺伝子編集システムは、標準的な分子生物学技術を使用して当業者により調製することができる。典型的には、この技術は、ヌクレアーゼ活性を実質的に排除または完全に排除するためにヌクレアーゼ活性にとって重要な１つ以上のアミノ酸を削除または変更することを含む。
【００６２】
[071] 幾つかの実施形態では、Cas9はヌクレアーゼ欠損Cas9である。ヌクレアーゼ欠損Cas9は、Cas9の１つ以上のアミノ酸が変更または削除されているものであってよい。例えば、ヌクレアーゼ欠損Cas9は、アミノ酸D10、H840、D839およびN863のうちの１つ以上を削除または変異させることにより構築することができる（Jinke他、Science 337、 816-821 (2012)参照）。これらのアミノ酸は、ヌクレアーゼ活性を実質的に取り除くまたは完全に取り除くために、削除するかまたはアラニンもしくはグリシンで置換することができる。
ドナーDNA
【００６３】
[072] 「ドナーDNA」という用語は、細胞DNA（例えばゲノムDNA、ミトコンドリアDNA、またはウイルスDNAの）中に挿入しようとする核酸配列を含む。ドナー核酸配列は、細胞によって発現されうる。ドナー核酸は、外因性、細胞にとって外来性、または細胞内に天然に存在しないものであることができる。
【００６４】
[073] ドナーDNAは、DNA結合ドメインにより結合することができる配列と会合される。例えば、ドナーDNAは、DNA結合ドメインのコンセンサス配列と隣接しているか、コンセンサス配列と同じベクター上に存在しているか、またはコンセンサス配列と同じポリヌクレオチド上に存在していてもよい。
標的核酸配列
【００６５】
[074] 標的核酸配列は、任意の核酸配列、例えばゲノム核酸配列、または核酸編集システムのヌクレアーゼが共局在化することができる遺伝子などを含む。標的核酸は、タンパク質へと発現されることができる核酸配列を含む。一態様によれば、標的核酸は、ゲノムDNA、ミトコンドリアDNA、プラスミドDNA、ウイルスDNA、または外因性DNAである。
【００６６】
[075] 当業者は、標的核酸配列に共局在化するガイドRNA、TALEN、ZFN、メガヌクレアーゼ、およびホーミングエンドヌクレアーゼを容易に同定または設計することができるだろう。
方法
【００６７】
[076] 本明細書に記載の組成物およびベクターは、細胞内のDNAを編集するために使用することができる。この方法は、改変型核酸編集システムと標的DNAとの相互作用に適した条件下で、改変型遺伝子編集システムを含む組成物または改変型遺伝子編集システムをコードするベクターと細胞とを接触させることを含む。この方法はまた、第一の標的DNA配列と相互作用するヌクレアーゼ欠損改変型核酸編集システムおよび第二の標的DNA配列のところでDNAを編集するための従来の核酸編集システムの使用を含む。
【００６８】
[077] DNA編集の効率を高めるために、ドナーDNAは、核酸編集に容易に利用できるように、標的DNA配列の近傍に配置される。
【００６９】
[078] ヌクレアーゼ欠損改変型編集システムを使用する実施形態では、これは、従来型の核酸編集システムをその標的配列と共局在化させた時に、ドナーDNAが従来の核酸編集システムに近接するように第一の標的配列と第二の標的配列の間隔を空けることにより達成される。
【００７０】
[079] 例えば、第一および第二の標的配列は、約75〜150塩基対だけ離れており、約150〜250、250〜350、450〜550、550〜650、650〜750、750〜850、850〜950、950〜1050塩基対だけ、または約１〜1.5 kbだけ離れている。
【００７１】
[080] この方法は、細胞への組成物またはベクターの送達を必要とする。核酸ベクター、RNAまたはタンパク質の非ウイルス送達の方法には、リポフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドDNA、人工ウイルス粒子、DNAの薬剤亢進取り込み、ナノ粒子、およびエレクトロポレーション／ヌクレオフェクションが含まれる。リポフェクション試薬は市販されている（例えば、TransfectamTMおよびLipofectinTM）。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適したカチオン性脂質および中性脂質が知られている。送達は、細胞（例えばインビトロまたはエクスビボ投与）または標的組織（例えばインビボ投与）に向かうものであり得る。生来という用語は、タンパク質、酵素、RNAまたはガイドRNA種自体の他に、それらをコードする対応する核酸も包含する。
送達ビヒクル
【００７２】
[081] 本明細書に与えられる本開示の組成物およびベクターのための送達ビヒクルは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターであり得る。幾つかの実施形態では、改変型核酸編集システムは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクター中に提供される。他の実施形態では、ウイルスベクター中にガイドRNAが提供され、そして非ウイルスベクター中に改変型編集システムが提供される。さらに他の実施形態では、非ウイルスベクター中ガイドRNAがに提供され、そしてウイルスベクター中に改変型核酸編集システムが提供される。
【００７３】
[082] 幾つかの実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルス随伴ウイルス（AAV）、アデノウイルス、レトロウイルスおよびレンチウイルスベクターから選択される。ウイルスベクターは、それが組織の存在または発現にとって望ましいプロファイルを提供する限り、本明細書に記載のシステムの任意成分を送達することができるが、いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、１つ以上の改変型核酸編集システム、ガイドRNAの発現を提供し、場合によりドナーDNAの送達を提供する。幾つかの実施形態では、ウイルス送達システムは、アデノ随伴ウイルス（AAV）2/8である。しかしながら、様々な実施形態では、AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6およびAAV8のような別のAAV血清型が使用される。幾つかの実施形態では、気道上皮細胞を標的とする場合にAAV6が使用され、骨格筋細胞を標的とする場合にAAV7が使用され（AAV1およびAAV5と同様に）、そして幹細胞の場合にはAAV8が使用される。幾つかの実施形態では、AAV1およびAAV5は、血管内皮細胞への送達に使用することができる。さらに、大部分のAAVがニューロン向性を示し、一方でAAV5も星状細胞を形質導入させる。幾つかの実施形態では、ハイブリッドAAVベクターが使用される。幾つかの実施形態では、免疫原性を回避するために、各血清型は一度だけ投与される。従って、その後の投与は異なるAAV血清型を採用する。
【００７４】
[083] 幾つかの実施形態では、送達システムは、非ウイルス性送達ビヒクルを含む。幾つかの態様において、非ウイルス性送達ビヒクルは脂質ベースである。他の態様において、非ウイルス性送達ビヒクルはポリマーである。幾つかの実施形態では、非ウイルス性送達ビヒクルは生分解性である。幾つかの実施形態では、非ウイルス性送達ビヒクルは、脂質封入システムおよび／またはポリマー粒子である。
【００７５】
[084] 特定の実施形態では、送達システムは脂質粒子を含む。幾つかの実施形態では、脂質ベースのベクターは、サイズが約１〜約100ナノメートルの脂質粒子である脂質ナノ粒子である。幾つかの実施形態では、脂質ベースのベクターは、脂質またはリポソームである。リポソームは、脂質二重層を含む人工球状小胞である。
【００７６】
[085] 脂質ベースのベクターは、小型の核酸−脂質粒子（SNALP）であり得る。SNALPは、核酸をカプセル封入する小型（直径約200 nm未満）の脂質ベースナノ粒子を含む。幾つかの実施形態では、SNALPはRNA分子の送達に有用である。幾つかの実施形態では、SNALP製剤は、被験者の肝臓などの特定組織へと核酸を送達する。
【００７７】
[086] いくつかの実施形態では、ガイドRNA、改変型核酸編集システム（またはそれをコードするRNA）は、ポリマーベクターを介して送達される。幾つかの実施形態では、ポリマーベクターはポリマーまたはポリマーソームである。ポリマーは、モノマーの長い繰り返し鎖を含み、例えば線状ポリマー、分岐ポリマー、デンドリマーおよび多糖類が含まれる。線状ポリマーは単鎖のモノマーを含むが、分子ポリマーはモノマーの側鎖を含む。デンドリマーも、分子のコアの周りに対称的に配置されている分岐分子である。多糖類は高分子炭水化物分子であり、一緒に結合した長い単糖単位から構成されている。ポリマーソームは、小胞膜を形成する合成両親媒性コポリマーから構成された人工小胞であり、小胞膜の内部に中空または水性コアを有している場合がある。
【００７８】
[087] 改変型核酸編集システムをコードするRNAを投与するために、様々なポリマーベースのシステムを使用することができる。例示的なポリマー材料には、ポリ（D,L−乳酸−co−グリコール酸）（PLGA）、ポリ（カプロラクトン）（PCL）、エチレン酢酸ビニルポリマー（EVA）、ポリ（乳酸）（PLA）、ポリ（L-乳酸）（PLLA）、ポリ（グリコール酸）（PGA）、ポリ（L-乳酸−co−グリコール酸）（PLLGA）、ポリ（D,L-ラクチド）（PDLA）、ポリ（L-ラクチド）（PLLA）、PLGA−b−ポリ（エチレングリコール）-PLGA（PLGA-bPEG-PLGA）、PLLA-bPEG-PLLA、PLGA-PEG-マレイミド（PLGA-PEG-mal）、ポリ（D,L-ラクチド-co-カプロラクトン）、ポリ（D,L-ラクチド-co-カプロラクトン-co-グリコリド）、ポリ（D,L-ラクチド-co-PEO-co-D,L-ラクチド）、ポリ（D,L-ラクチド-co-PPO-co-D,L-ラクチド）、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリウレタン、ポリ-L-リジン（PLL）、ヒドロキシプロピルメタクリレート（HPMA）、ポリエチレングリコール、ポリ-L-グルタミン酸、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ（エステルアミド）、ポリアミド、ポリ（エステルエーテル）、ポリカーボネート、ポリエチレンやポリプロピレンなどのポリアルキレン、ポリ（エチレングリコール）（PEG）などのポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド（PEO）、ポリ（エチレンテレフタレート）などのポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルアルコール（PVA）、ポリビニルエーテル、ポリ（酢酸ビニル）などのポリビニルエステル、ポリ（塩化ビニル）などのポリハロゲン化ビニル、ポリビニルピロリドン、ポリシロキサン、ポリスチレン（PS）、ポリウレタン、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースなどの誘導体化セルロース、ポリ（メチル（メタ）アクリレート）（PMMA）、ポリ（エチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ヘキシル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソデシル（メタ）アクリレート）、ポリ（ラウリル（メタ）アクリレート）、ポリ（フェニル（メタ）アクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）（ポリアクリル酸）などのアクリル酸のポリマー、並びにそれらのコポリマーおよび混合物、ポリジオキサノンとそのコポリマー、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリプロピレンフマレート、ポリオキシメチレン、ポロキサマー、ポリ（オルト）エステル、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド-co-カプロラクトン）、トリメチレンカーボネート、ポリビニルピロリドン、ポリオルトエステル、ポリホスファゼン、ポリ（β-アミノエステル）(PBAE)、およびポリホスホエステル、並びに２つ以上のそのようなポリマーのブレンドおよび／またはブロックコポリマーが挙げられる。ポリマーベースの系には、シクロデキストリンポリマー（CDP）ベースのナノ粒子、例えば、CDP−アドマンタン（AD）−PEGコンジュゲート、およびCDP-SD-PEG−トランスフェリンコンジュゲートも含まれる。
【００７９】
[088] 一実施形態では、ナノ粒子は、Kormann他、"Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice." Nat. Biotechnol. 29: 154-157 (2011)中に開示されるように、TLR応答を減少させるように化学的に改変されたCas9 mRNAを用いて製剤化される。さらなる実施形態では、例えば、Chen他、"Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation." J. Amer. Chem. Soc. 134:6948-6951 (2012)中に開示されるように、制御されたマイクロ流体混合システムを使って製剤化される。
【００８０】
[089] 幾つかの実施形態では、脂質ベースの送達システムは、脂質封入システムを含む。脂質封入システムは、必要な循環時間と生分解性を提供するだけでなく、望ましい組織分布と細胞への侵入特性を駆動するように、設計することができる。脂質封入は逆ミセルを含み、そして／または高分子マトリックスを更に含み得る。幾つかの実施形態では、粒子は、選択的方式をはじめとする、組織への粒子の送達を増強するための親油性送達化合物を含む。そのような化合物は一般に、親油性基と共役アミノ酸またはペプチド（例えば線状または環状ペプチド、およびその異性体を含む）を含むことができる。
【００８１】
[090] 脂質またはポリマー粒子は、約50 nm〜約5μmの範囲のサイズ（例えば平均サイズ）を有することができる。幾つかの実施形態では、粒子は約10 nm〜約100μm、または約20 nm〜約50μm、または約50 nm〜約５μm、または約70 nm〜約500 nm、または約70 nm〜約200 nm、または約50 nm〜約100 nmの範囲内である。免疫系による急速なクリアランスを回避するように粒子を選択することができる。粒子は球形でも非球形でもよい。
【００８２】
[091] 幾つかの実施形態では、非ウイルス性送達ビヒクルは、細胞透過性ペプチドまたは細胞内在化配列などのペプチドであり得る。細胞透過性ペプチドは、原形質膜を貫通することができる小さなペプチドである。例示的な細胞透過性ペプチドとしては、限定されないが、アンテナペディア配列、TAT、HIV-Tat、ペネトラチン、Antp-3A（Antp変異体）、ブフォリンII、トランスポータン、MAP（モデル両親媒性ペプチド）、K-FGF、Ku70、プリオン、pVEC、Pep-１、SynB I、Pep-7、I-IN-1、BGSC（ビス-グアニジニウム−スペルミジン−コレステロール）、およびBGTC（ビス−グアニジニウム−トレン−コレステロール）が挙げられる。
【００８３】
[0072] 幾つかの実施形態では、ガイドRNAまたは改変型核酸編集システムをコードするRNAは、５′末端または３′末端のところで修飾される。好ましい実施形態では、修飾は、RNAの３′末端において行われる。RNAは、コレステロール、他の親油性分子、ポリマー、ペプチド、抗体、アプタマーおよび／または小分子にコンジュゲートすることにより修飾されてもよい。幾つかの実施形態では、RNAは、Ｎ−アセチルガラクトサミン（GalNAc）に接合される。GalNAcは、肝細胞上のアシアロ糖タンパク質受容体（ASGPR）に結合するので、RNAを肝臓にターゲティングするために使用することができる。幾つかの実施形態では、RNAは、三価のターゲティング用リガンド、例えば三本触覚性（triantennary）GalNAcにコンジュゲートされる。そのようなコンジュゲートは、３′末端の所で３つのGalNAc分子にコンジュゲートされたRNAを含む。
【００８４】
[092] 送達ビヒクル（例えば、コンジュゲート、ウイルスまたは非ウイルス性ベクター、またはそれらの任意の組み合わせ）は、インジェクションを含む当該技術分野で既知の任意方法により、場合により標的組織への直接インジェクションにより、投与することができる。幾つかの実施形態では、ガイドRNA、改変型核酸編集システム、および場合によりドナーDNAは、同じまたは異なる送達ビヒクルで同時に投与される。他の実施形態では、ガイドRNAと改変型核酸編集システム、および場合によりドナーDNAが、同じまたは別個の送達ビヒクルを介して順次投与される。幾つかの実施形態において、ガイドRNAおよび／またはドナーDNAは、該ガイドRNAおよび／またはドナーDNAが改変型核酸編集システムの投与前に標的細胞またｈ組織中に集積するように、該ガイドRNAおよび／またはドナーDNAが改変型核酸編集システムの投与の1、3、5、7、10、14または30日前に投与される。幾つかの実施形態では、ガイドRNA、ドナーDNAおよび／または核酸編集システムは、複数の投与回数、例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20またはそれ以上の投与回数で投与される。様々な実施形態では、gRNA、ドナーDNAおよび／または核酸編集システムは、週に１日から約１か月までの期間に渡って投与される。
【００８５】
[093] 一実施形態では、ガイドRNAおよびドナーDNAの一方または両方が、改変型核酸編集システムの投与前に組織または細胞に投与されるAAVベクターにおいて提供される。さらなる実施形態では、gRNAを含むAAVベクターは、ナノ粒子形の改変型核酸編集システムの投与の1、2、3、4、5、6、7、8、9または10日前に投与され、AAVベクターからのガイドRNAの発現を可能にする。さらなる実施形態では、改変型核酸編集システムは、複数回、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15日毎に１回投与される。
【００８６】
[094] 別の実施形態では、ドナーDNAは、AAVベクターを介して送達され、そして改変型核酸編集システムとガイドRNAのいずれか一方または両方の投与の1、2、3、4、5、6、7、8、9または10日前に注入される。
【００８７】
[095] 特定の実施形態では、ガイドRNAとドナーDNAのうちのいずれか一方または両方が、最初に投与されるAAVベクターにおいて提供され、そして改変型核酸編集システムがその後に脂質ベースの送達ビヒクルにおいて１以上の投与回数で投与される。
【００８８】
[096] 別の実施形態では、本明細書に記載の組成物の各成分（例えば、改変型核酸編集システム、ガイドRNAおよびドナーDNA）は、異なるビヒクルを使ってそれぞれ送達されるか、あるいは１以上の成分が同一の送達ビヒクルを使って送達されうる。さらなる実施形態において、改変型核酸編集システム、ガイドRNAおよびドナーDNAは、複数の時点で、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15日毎に投与される。別の実施形態では、改変型核酸編集システム、ガイドRNAおよびドナーDNAの投与は、異なる時点で施される。
【００８９】
[097] 幾つかの実施形態では、改変型核酸編集システムの発現は一時的である。幾つかの実施形態では、改変型核酸編集システムのそのような一時的発現は、オフターゲット効果を最小限にする。例えば、改変型核酸編集システムの発現は、送達ビヒクルおよび／またはプロモーターの選択を介して制御される。
【００９０】
[098] 幾つかの実施形態では、本開示は、従来の核酸編集システムの安全性および／または効力の増大を可能にする組成物と方法を提供する。有利には、本開示の方法は、遺伝子編集の効率が各投与と共に増加するような従来型のおよび改変型の核酸編集システムを用いる反復投与のために提供される。例えば、幾つかの実施形態では、本開示の方法は、本明細書に記載の改変型核酸編集システムと併せて使用される場合、従来型核酸編集システムによる遺伝子編集の効率の増加をもたらす。例えば、遺伝子編集の効率（％）は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約10％、約11％、約12％、約13％、約14％、約15％、約16％、約17％、約18％、約19％、約20％、約21％、約22％、約23％、約24％、約25％、約26％、約27％、約28％、約29％、約30％、約31％、約32％、約33％、約34％、約35％、約36％、約37％、約38％、約39％、約40％、約41％、約42％、約43％、約44％、約45％、約46％、約47％、約48％、約49％、約50％、約51％、約52％、約53％、約54％、約55％、約56％、約57％、約58％、約59％、約60％、約61％、約62％、約63％、約64％、約65％、約66％、約67％、約68％、約69％、約70％、約71％、約72％、約73％、約74％、約75％またはそれ以上だけ増加する。
【００９１】
[099] 別の実施形態では、ガイドRNA、改変型核酸編集システムおよびドナーDNAのうちの少なくとも１つが、同じ送達ビヒクル上にあるなど、同時に組織または細胞に投与され、そして１以上の構成要素（すなわち、改変型核酸編集システムおよびガイドRNA）が誘導性プロモーターの制御下にある。一例として、一実施形態では、誘導性プロモーターは、例えば、テトラサイクリン誘導性プロモーターなどの小分子誘導性プロモーターであってよい。
【００９２】
[0100] 送達ビヒクルは（ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターまたはRNAコンジュゲートのいずれに関係なく）は、インジェクションを含む、当技術分野で公知の任意方法によって、場合により標的組織または細胞への直接インジェクションによって投与することができる。核酸修飾は、例えば、PCR増幅および／またはゲノムDNAからの標的領域の配列決定を用いる定期的な生検により、あるいは発現された転写物のRT-PCRおよび／または配列決定により、経時的にモニタリングすることができる。あるいは、レポーター遺伝子またはレポーター配列の検出により、核酸修飾をモニタリングすることができる。あるいは、核酸修飾は、改変型遺伝子産物の発現もしくは活性、または細胞もしくは組織または対象における治療効果によってモニタリングすることができる。
【００９３】
[0101] 幾つかの実施形態では、細胞または組織は対象の中にある。例えば、対象は、ヒト、特に治療的または予防的介入を必要とするヒトであり得る。あるいは、対象は、家畜、家禽、家畜動物、または実験動物を含む動物である。様々な実施形態では、対象はヒト、ウマ、ウシ、イヌ、ネコ、げっ歯類またはブタなどの哺乳動物である。
【００９４】
[0102] 幾つかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、本開示の送達システム、組成物、方法および／またはキットを使用して、対象から細胞または細胞集団を取得し、そしてその細胞または細胞集団中の標的ポリヌクレオチドをex vivoで改変することを含む。さらなる実施形態では、１以上のex vivo改変細胞は、ex vivo改変後に対象に再導入されてもよい。従って、本開示は、対象において疾患または障害を治療する方法を提供し、該方法は対象から１以上の細胞を取得すること、従来の核酸編集システムと本明細書に記載の改変型核酸編集システムの両方を使用して、細胞中の１以上の標的ヌクレオチド配列をex vivoで改変し、そしてその改変された標的ヌクレオチド配列を有する細胞を、疾患または障害を有する対象に再導入することを含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列の改変が起こった細胞は、疾患または障害を有する対象に再導入する前に、in vitroで拡大される。
【００９５】
[0103] 他の実施形態では、改変型核酸編集システム、ガイドRNAおよびドナーDNAのうちの少なくとも１つが、in vitroで細胞に投与される。
【００９６】
[0104] 幾つかの実施形態では、少なくとも１つの構成要素（例えば、ガイドRNA、ドナーDNA、改変型核酸編集システムまたは核酸ベクター）は、例えば、肝臓、心臓、肺（気道上皮細胞を含む）、骨格筋、CNS（例えば神経細胞）、内皮細胞、血液細胞、骨髄細胞、血液細胞前駆細胞、幹細胞、脂肪細胞、または免疫細胞であり得る、細胞または組織中に蓄積する。組織ターゲティングまたは分布は、ウイルス送達ビヒクルの選択と設計によって制御することができ、または幾つかの実施形態では、脂質またはポリマー送達ビヒクルの選択と設計によって達成される。
【００９７】
[0105] 幾つかの実施形態では、本明細書に開示の方法を使用する標的配列の改変（編集）の効率（％）は、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％である。
【００９８】
[0106] 幾つかの実施形態では、本明細書に開示の方法および組成物を使用する標的配列の改変（編集）の効率は、ドナーDNAを連結する（テザリングする）ことなく同じ改変（編集）を作製する方法に比較して、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍またはそれ以上の増加を提供する。
【００９９】
[0107] 幾つかの実施形態では、標的配列改変の効率は100％未満であり、または100％より少数の細胞に対する効果が治療効果を奏する。例えば、治療効果は、約0.01％〜約100％、約0.01％〜約50％、約0.05％〜約40％、約0.1％〜約30％、約0.5％〜約25％、約0.1％〜約20％、約１％〜約15％、約１％〜約10％、または約１％〜約５％の核酸改変の効率である場合に治療効果が達成され得る。従って、ヌクレオチド配列改変の効率が比較的低い（例えば50％未満、または40％未満、または30％未満、または20％未満、または10％未満、または５％未満、または１％未満、または0.5％未満、または0.1％未満）場合であっても、導入されたまたは修正もしくは改変された遺伝子産物の適度な発現が、疾患または障害に対して治療効果をもたらし得る。
【０１００】
[0108] 幾つかの実施形態では、本明細書に開示の送達システムおよび組成物は、標的配列への一貫した送達のために各構成要素の比率が達成されるうように処方される。一実施形態では、ガイドRNAと改変型核酸編集システムとの比率が、標的配列への一貫した送達のために最適化される。別の実施形態では、ドナーDNAとガイドRNAおよび／または改変型核酸編集システムとの比率が、標的配列への一貫した送達のために最適化される。例えば、一実施形態では、改変されたCas9：ガイドRNA：ドナーDNAの比は、約1：1：1から約1：1：100である。さらなる実施形態では、その比率は約1：1：2から約1：1：90、約1：1：5から約1：1：75、または約1：1：10から約1：1：50である。他の実施形態では、その比率は約1：1：1以下、例えば約1：1：0.01、例えば1：1：0.01から約1：1：1、約1：1：0.02から約1：1：0.75、または約1：1：0.05から約1：1：0.5、または約1：1：0.1から約1：1：0.5である。組成物がガイドRNAを含まない他の実施形態では、改変型核酸編集システム：ドナーDNAの比は、約1：100から約100：1、または約1：50から約50：１、または約1：25から約25：1、または約1：10〜約10：1、または約1：5〜約5：1、または約1：2〜約2：1、または約1：1である。
【０１０１】
キット
[0109] 一実施形態では、上記の方法、組成物および送達システムとして開示される構成要素のいずれか１つまたは複数を含むキットが提供される。キットの構成要素は、個別にまたは組み合わせて提供することができ、バイアル、ボトルまたはチューブなどの任意の適切な容器に提供することができる。幾つかの実施形態では、本明細書で開示されるキットは、本明細書で開示される実施形態で使用するための１つまたは複数の試薬を含む。例えば、キットには、１つ以上の反応または保存緩衝液を含めることができる。試薬は、特定の方法で使用可能な形態で、または使用前に１つ以上の他の成分の添加を必要とする形態（例えば、濃縮形態または凍結乾燥形態）で提供され得る。適切な緩衝液には、リン酸緩衝生理食塩水、炭酸ナトリウム緩衝液、重炭酸ナトリウム緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、MOPS緩衝液、HEPES緩衝液、およびそれらの組み合わせが含まれる。幾つかの実施形態では、緩衝液はアルカリ性である。一部の実施形態では、緩衝液は約７〜約10のpHを有する。
【０１０２】
[0110] 例えばキットは、ドナーDNAおよび改変型核酸編集システムを含むことができる。キットはガイドRNAを更に含むことができる。キットは、標的細胞における改変型核酸編集システムおよびガイドRNAのいずれか一方または両方の発現に備える発現システムを提供することができる。キットは、１回以上の投与量のRNA送達システムを提供することができ、各投与量は、標的細胞または組織における改変型核酸編集システムの発現を提供する。
【０１０３】
[0111] キットは、ユーザー定義の標的配列と共に使用するために特注で作製されてもよい。
【０１０４】
[0112] 広範に記載される本発明の精神または範囲から逸脱することなく、特定の実施形態に示されるように本発明に様々な変更および／または修正を行うことが可能であることは当業者に理解されよう。従って、本実施形態は、あらゆる点で例示的であり、限定的でないと見なされるべきである。
【０１０５】
〔実施例〕
実施例１：Crispr/Cas9複合体をゲノム標的DNA配列につなぐ（テザリングする）ためのプラスミド
【０１０６】
[0113] 図２は、活性Cas9遺伝子配列とそのガイドRNAを含むプラスミドベクターの地図である。Cas9のコード配列はlacリプレッサーDNA結合ドメインと隣接している。この融合体は、CMVプロモーターに作動可能に連結している。発現されると、lacリプレッサーDNA結合ドメインは、プラスミド骨格配列中のlacオペレーター配列と結合する。
【０１０７】
[0114] ゲノム標的DNA配列に相補的なドナーDNAも該ベクター中にクローニングされ、標的DNA配列中のCrispr/Cas9が生成した二本鎖切断部位の間の相同組み換え用の鋳型を提供する。一実施形態では、Crispr/Cas9ヌクレアーゼがプラスミド配列に結合するのを防ぎ、かつ組み換え細胞系の同定に役立つ選択可能マーカーを含むように、ドナーDNA配列が改変される。ドナーDNA配列が標的染色体遺伝子の機能を変更するために変異型DNA配列を含みうること、またはそれが変異体標的DNA配列を修正するために「野生型」配列を含み得ることは想定される。
実施例２：二元テザリングシステム用プラスミド
【０１０８】
[0115] 図３と４は、lacリプレッサー融合体を含むCrispr/Cas9遺伝子配列とガイドRNAとが、テザー発現ベクター（図３）上に存在しており、そしてドナーDNA配列が第二のテザード（テザリングされる方の）遺伝子ターゲティング用ベクター（図４）上に存在している、二元システムにおいて用いられるプラスミド地図である。両ベクターの同時トランスフェクションは、標的特異的Crispr/Cas9/lacリプレッサーヌクレアーゼが、テザードターゲティング用プラスミド（図４）上のlacオペレーター配列を結合し、それによって遺伝子ターゲティング用プラスミドを標的DNAへ局在化させるのに必要である。
【０１０９】
[0116] ラクトースオペレーター配列またはテトラサイクリン耐性オペレーター配列をHindIII/SalI制限エンドヌクレアーゼで消化したpUC19中にクローニングするために用いられる相補的オリゴヌクレオチドの配列。正しい配向により、その後のLacOとTetO二本鎖をpUC19中にクローニングして、１以上の連続したオペレーターを有するプラスミドを作成することができ、その生成したプラスミドを哺乳細胞中での相同性組み換えによる遺伝子編集のためのドナーDNA分子をクローニングするために用いることができる。
【０１１０】
【表１】
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【０１１１】
実施例３：in vitroテザリングシステム用プラスミド
[0117] 図５と６は、精製されたCrispr/Cas9を用いて細胞へのトランスフェクション前に遺伝子ターゲティング用ベクターを結合させる、in vitroテザリングシステム用ベクターのプラスミド地図である。Hisタグ付きCrispr/Cas9-lacリプレッサー融合体が図５に示されるプラスミドから発現され、次いで該融合体が固定化金属アフィニティークロマトグラフィーにより精製される。図５は、lacリプレッサータンパク質オペレーター−結合ドメインが Cas 9のＣ末端に融合されていることを示す。しかしながら、配列番号８と９中に示すように、好ましくはXTENリンカーのようなリンカーを使ってCas9のＮ末端にlacリプレッサーが融合されているのが好ましい配置である。いずれの場合も、精製された融合タンパク質は、次いで遺伝子ターゲティング用ベクターと混合される（すなわち図４）。精製された融合タンパク質と遺伝子ターゲティング用ベクターとの複合体が、ガイドRNA発現プラスミド（図６）と共に細胞中にトランスフェクトされる。
【０１１２】
実施例４：GeneTetheredドナーDNA断片による、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス制御因子（CFTR）遺伝子の遺伝子編集
【０１１３】
[0118] 嚢胞性線維症は、白人集団において最も高頻度に認められる遺伝病の１つであり、1/27ほど多くの個体がCFTR遺伝子中に突然変異を担持している。CF患者に認められる最も頻度の高い突然変異は、delF508またはF508delであり、この突然変異はタンパク質中の508番目のフェニルアラニン残基の欠失を引き起こす、エクソン11中のフレーム内３塩基対欠失の結果である。幾つかの不死化ヒト細胞系がCF患者から作製されており、それらはdelF508突然変異に対してホモ接合性であるCFBE41o- 細胞系を含む。しかしながら、HEK293細胞中のCFTR遺伝子は、正常の、すなわち野生型のCFTR遺伝子配列である。
【０１１４】
[0119] 本実施例では、px458 Cas9ベクターが、ラクトースリプレッサータンパク質またはテトラサイクリンリプレッサータンパク質を遺伝子工作し、フレーム内でCas9タンパク質配列と融合させて「GeneTether」を構築することにより改変される。このGeneTether改変は、遺伝子編集用のドナーDNA分子を機能的Cas9タンパク質に結合させることができ、かつ、Cas9が作製した二本鎖切断部位にドナーDNA分子を局在化することで、相同性指令の修復の強化、オンターゲット変異の削減、およびP53 DNA修復システムの誘発の減少をもたらすことができる。これらの改変されたCas9タンパク質を、ラクトースオペレーターまたはテトラサイクリンオペレーターDNA配列を含むドナーDNA分子と共に細胞中にトランスフェクトし、delF508変異を野生型のHEK293 CFTR遺伝子中に導入する遺伝子編集効率を測定した。
LacおよびTetテザー改変Cas9の構築
【０１１５】
[0120] ラクトースとテトラサイクリンリプレッサータンパク質は、十分に定義されたオペレーター配列を高特異性でかつ高親和性で結合する。GeneTetherは、Cas9（および他のCasタンパク質）、TALENまたはZNFと融合されたラクトースまたはテトラサイクリンリプレッサータンパク質であり、それは各々のオペレーター配列を含むDNA分子に結合するだろう。GeneTetherで改変されたCasタンパク質、TALENまたはZNFの、それらのゲノム標的への結合は、結果としてリプレッサータンパク質融合体に結合した任意のDNA分子を同じゲノム部位に物理的に局在化するだろう（図１）。ゲノムDNA標的配列に対して相同であるDNA分子の局在化は、相同性組み換えDNA修復経路による遺伝子編集の効率を高め、かつDNAの突然変異を最小限に抑える。
ラクトースリプレッサー改変Cas9の構築
【０１１６】
[0121] ラクトースリプレッサー遺伝子を、lacI Primer2f/Primer2r（表２）とQ5高忠実度耐熱性ポリメラーゼ（New England Biolabs社）を使って、製造元の教示に従って、ポリメラーゼ連鎖反応により大腸菌DH5αから増幅させた。1083塩基対生産物をゲル精製し（Monarch（登録商標）DNAゲル抽出キット、New England Biolabs社) 、そして更なる改変に使用した。ラクトースリプレッサー遺伝子配列中の２つのBbsI制限エンドヌクレアーゼ部位を、変異誘発性プライマーlacIBbs2f、lacIBbs2r、lacIBbs3fおよびlaciBbs3rを用いるポリメラーゼ連鎖反応増幅を使って不活性化し、コドン164と277中にＡからＧへの変異（この変異はグルタミン酸コドンをそのまま保持する）を作製した（図中、LacIBbsAssembled)。プライマー対のlacI Primer1f/lacI Bbs Primer2r、lacI Bbs Primer2f/lacI Bbs Primer3r、およびlacI Bbs Primer3f/lacI Primerr（表２）を使った３つのゲル精製したQ5高忠実度ポリメラーゼによるポリメラーゼ連鎖反応生成物を用いて、全長1083塩基対BbsI-不活性化ラクトースリプレッサータンパク質遺伝子を再構成した (NEBuilder HIFI Assembly、New England Biolabs社)。
【０１１７】
【表２−１】
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【０１１８】
【表２−２】
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【０１１９】
【表２−３】
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【０１２０】
[0122] ラクトースリプレッサー−Cas9融合体の構築は、図８に概略される通りに実施した。Q5高忠実度ポリメラーゼを用いるポリメラーゼ連鎖反応により増幅させた３つの重複するDNA断片を、AgeI/BglII で消化したpSpCas9 BB-2A-GFP(px458) (Genescript,Inc社製）中にクローニングし、NEBuilderシステム（New England Biolabs社）を用いてGeneTetherラクトースリプレッサー−Cas9融合プラスミドpGT1（図８Ｄ、配列番号63）を構築した。この構築に用いた３つのポリメラーゼ連鎖反応産物は、ポリメラーゼ連鎖反応プライマー Primer1fAge/Primer1rとPrimer3f/Primer3rを使ってpx458ベクター中に作製し、そしてBbsI-不活性化ラクトースリプレッサー遺伝子は、Primer2f/Primer2r (表２)を使って増幅させた。得られたプラスミドpGT1を、コロニーポリメラーゼ連鎖反応によりスクリーニングし、そしてDNA配列決定（Quintara Biosciences社）、制限エンドヌクレアーゼマッピング、および診断用ポリメラーゼ連鎖反応増幅により、ラクトースリプレッサー−Cas9融合遺伝子配列を確かめた。
【０１２１】
テトラサイクリンリプレッサー−改変Cas9の構築
【０１２２】
[0123] ヒトコドン優先性を有するクラスBのTN10テトラサイクリンリプレッサーをコードする遺伝子を、pUC57ベクター中にクローニングした合成DNA分子（Genescript, Inc.社）としてオーダーした（図９および配列番号65）。テトラサイクリンリプレッサー−Cas9融合体の構築は、pGT1ラクトースリプレッサー−Cas9融合体と同様に実施した（図10）。この構築に使用した３つのポリメラーゼ連鎖反応産物は、ポリメラーゼ連鎖反応プライマーPrimer1fAge/Primer1rおよび Primer3f/Primer3rを使ってベクターpx458ベクター中に作製し、そしてテトラサイクリンリプレッサー遺伝子はプライマーNLSリンカー付Primer1f／tetリンカー付Cas9 Primer 1rを使って増幅させた。得られたプラスミドpGT9 (配列番号63)を、コロニーポリメラーゼ連鎖反応によりスクリーニングし、そしてテトラサイクリンリプレッサー−Cas9融合遺伝子配列をDNA配列決定（Quintara Biosciences社）、制限エンドヌクレアーゼマッピングおよび診断用ポリメラーゼ連鎖反応増幅により確かめた。
【０１２３】
[0124]ガイドDNAオリゴヌクレオチドをアニールして、BbsI適合性突出端を有する二本鎖分子を構築し、続いてそれをゲル精製済みのBbsI制限エンドヌクレアーゼ消化したpx458、pGT1およびpGT9中に連結させた。
【０１２４】
【表３】
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【０１２５】
[0125] CFTRドナーDNAの作製。CFTR遺伝子エクソン11上のほぼ中央に位置する５キロ塩基対CFTR DNA断片を、Q5高忠実度DNAポリメラーゼとプライマーCF96310fとCF101310rとを使ったポリメラーゼ連鎖反応により作製した。CFTR delF508変異を含むドナーDNA断片は、そのdelF508変異についてホモ接合性であるCFBE41o-細胞系由来のゲノムDNAを使って作製した。野生型（非変異体）CFTR遺伝子配列を含むドナーDNA断片は、HEK293細胞系由来のゲノムDNAを使って作製した。
【０１２６】
[0126] 遺伝子編集に用いるドナーDNA断片は、ラクトースオペレーター配列（AATTGTGAGCGCTCACAATT、配列番号57）またはテトラサイクリンオペレーター配列（CACTCCCTATCAGTGATAGAGAAA、配列番号58）のいずれかを含むように該フラグメントの５′または３′末端のところを改変した。500塩基対ドナーDNA分子を作出するために、Q5高忠実度耐熱性ポリメラーゼを使ったポリメラーゼ連鎖反応により、プライマー対lacOsymCF1f/CF5rを用いてラクトースオペレーター配列をドナーDNAの５′末端に付加し、またはプライマー対Cf1f/lacOsymCF5rを使ってラクトースオペレーター配列をドナーDNAフラグメントの３′末端に付加した（図中、Donor DNA Molecules)。テトラサイクリンオペレーター配列を有するドナーDNA分子は、プライマー対tetoCF1f/CF5r と CF1f/tetoCF5rを使って作製した。そのドナーDNAフラグメントをゲル精製した後、遺伝子編集のための細胞内トランスフェクションに使用した。
px458、pGT1、pGT9 Cas9ベクターと500塩基対ドナーDNAフラグメントを用いた細胞トランスフェクション
【０１２７】
[0127] HEK293細胞中に、リポフェクタミン（登録商標）3000（Invitrogen社製）を使って12ウェルプレート中で500 ngのプラスミドDNAと500 ngのゲル精製したドナーDNAフラグメントをトランスフェクションした。px458、pGT1およびpGT9プラスミドは、トランスフェクションした細胞中で発現されるとトランスフェクション効率のモニタリングを可能にする緑色蛍光タンパク質レポーター遺伝子を含有する。緑色蛍光タンパク質の発現は、トランスフェクション後48時間目に蛍光顕微鏡法によって視覚化した。トランスフェクション後48〜72時間目に、トランスフェクションした細胞入りの12ウェルプレートをリン酸塩緩衝化食塩水（PBS）で１回洗浄し、そして遺伝子編集効率の分析用にDNAを収得するまで−80℃で保存した。
対立遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応分析によるdelF508突然変異の分析
【０１２８】
[0128] CFTR野生型細胞の集団におけるdelF508変異の存在は、Taqポリメラーゼとプライマー対CF1Bｆ/CF8Crを用いるポリメラーゼ連鎖反応を使って検出することができる。CF1BfプライマーはドナーDNAフラグメントの５′側または外側に位置しているので、388塩基対生成物は「インサイドアウト（内側から外側への）」アプローチから作出され、遺伝子編集事象についての特異的な診断薬であり、ランダムに組み込まれたまたは組み込まれなかったドナーDNA分子を増幅しない。
【０１２９】
[0129] 12ウェルプレート（Genejet（登録商標）ゲノム精製キット、ThermoFisher社製) の各ウェルから直接ゲノムDNAを調製し、そして紫外分光法によってDNA濃度を決定した。対立遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応は、100 ngのゲノムDNAと500μMプライマー、1.5 mM MgCl2、ホットスタートTaqポリメラーゼ(New England Biolabs社製)を用いて実施した。delF508変異DNA配列の半定量的増幅用の熱循環プログラムは、95℃で２分；95℃で30秒、50℃で30秒および72℃で１分の35回のサイクル；続いて72℃で8分であった。388塩基対ポリメラーゼ連鎖反応産物は、Gelred（登録商標）（Biotium社製）で染色した1.5％アガロースゲル上で、紫外線により視覚化した。PCR生成物の半定量測定のため、異なる比率の野生型とdelF508変異型DNAを含む標準ゲノムDNAサンプルを、実験用DNAサンプルと並行して増幅させた。
細胞のトランスフェクション
【０１３０】
[0130] ２種類のテザー（ラクトースリプレッサー−Cas9融合体またはテトラサイクリンリプレッサー−Cas融合体）を、５′ラクトースもしくはテトラサイクリンオペレーター配列または３′ラクトースもしくはテトラサイクリンオペレーター配列（図11および12）を含み、かつdelF508欠失配列を含む、ドナーDNA分子と組み合わせて使用した。ゲノムCFTR標的Cas9誘起二本鎖切断とドナーフラグメントとの間の相同組み換えによる相同性組み換え修復は、そのdelF508 DNA配列をゲノム標的へと移入するのを触媒するだろう（図12）。
【０１３１】
[0131] Cas9酵素がゲノムDNA標的は認識するが、delF508ドナーDNAフラグメントを認識して切断しないようにするために、未変異の野生型CFTRエクソン11のDNA配列に相補的であるがdelF508 DNA配列には相補的でない、Cas9 ガイド配列を選択した。
【０１３２】
[0132] トランスフェクションの24時間前に、ウェルあたり約5×105 個のHEK293細胞を、Corning社製12ウェル組織培養プレートに播種し、各ウェルがトランスフェクションの時点で50〜80％密集度になるようにした。細胞上の培地をトランスフェクション前に交換した。
【０１３３】
[0133] トランスフェクション用に、500 ngのpx458、pGT1またはpGT9を50μLのDMEM培地中で500 ngのドナーDNAフラグメントと混合した。次いで2μLのP3000試薬を前記DNA/DMEM 溶液に添加し、十分に混合し、室温で５分間インキュベートした。リポフェクタミン3000の溶液は、1.5μLの未希釈リポフェクタミン3000を50μLのDMEMに添加し、そして同容積のDNA/DMEM溶液とリポフェクタミン/DMEM溶液とを混合し、室温で12〜15分間インキュベートした。次いで100μLのDNA/P3000/リポフェクタミン溶液を、コーニング社製12ウェルプレートの各ウェルに添加した。トランスフェクション２日後、細胞を蛍光顕微鏡で検査して好結果のトランスフェクションの程度を評価した。
GeneTetherは遺伝子編集効率を高める
【０１３４】
[0134] 遺伝子編集効率に対するGeneTether改変Cas9ベクターの効果について幾つかの変数を調査した。ラクトースリプレッサー−Cas9融合タンパク質、テトラサイクリンリプレッサー−Cas9融合タンパク質、ゲノム標的のtop鎖またはbottom鎖に相補的なCas9ガイド、およびドナーDNAフラグメントの5′または3′末端にラクトースオペレーター配列と共にdelF508欠失を含む500 bbのドナーDNA分子。
【０１３５】
[0135] pGT1ベクター（ラクトースリプレッサー−Cas9融合体）と、130117ガイド（ゲノム標的Forward（正方向）鎖）およびドナーDNAの3′末端上のラクトースオペレーターとの組み合わせ（図13、レーン７）は、未改変のCas9と同じDNAフラグメントを有するpx458ベクターに比較して、高い遺伝子編集効率を示した（図13のレーン３とレーン７の388塩基対生成物を比較されたい）。ImageJソフトウェア (https://imagej.nih.gov）を使ったバンド強度の測定は、テザリングされたドナーDNA複合体がpx458未改変Cas9に比較しておよそ７倍高い遺伝子編集効率を有することを示す。実際、レーン７のバンド強度とWT:delF508 DNA（レーン14〜19）の再構成混合物のバンド強度との比較は、delF508変異がゲノムDNAのほぼ10％に存在することを示唆している。それらの実験のトランスフェクション効率は10％未満であったので、pGT1/130117ガイド/3′ラクトースオペレーター配列の組み合わせによってトランスフェクトされた細胞の最大100％が、好結果の遺伝子編集を受けていた。
【０１３６】
[0136] 未変性のCas9に等しいかまたはわずかに良い結果に遺伝子編集が果たされたpGT1/ガイド/ドナーDNAの別の組み合わせ（図13；レーン９対レーン５） は、Cas9タンパク質活性がラクトースリプレッサー融合体により影響を受けないことを証明した。ラクトースオペレーター配列の置換は、3′置換をわずかに高く選択するかもしれない（図13；レーン７と９対レーン３と５）。ガイド配列を含まないpx458によりトランスフェクションされたドナーDNAは、低レベルの遺伝子編集を示した（図13；レーン10と11）。幾分薄い388 bp生産物は、レーン10、12および13でははっきりと認められ、これは対立遺伝子特異的PCRに用いられるPCRプライマーの人為的な低レベルのミスプライミングのためであると思われる。
【０１３７】
[0137] pGT9テトラサイクリンリプレッサー−Cas9融合ベクター、ガイド配列およびドナーフラグメントを用いた遺伝子編集は、対照のpx458ベクターよりも適度に良好な遺伝子編集頻度を与えなかった（図14、レーン２〜５対レーン６〜９）。ドナーDNAフラグメントの3′末端の所でのテトラサイクリンの置換は、ラクトースオペレーター配列の置換と同様にわずかに良好な遺伝子編集効率をもたらすように見える（図14、レーン２、４、６、８対レーン３、５、７）。
【０１３８】
[0138] それらの結果は、pGT1によりコードされるGeneTetherラクトースリプレッサー−Cas9融合タンパク質が、px458ベクター中に見られる未変性のCas9に比較して遺伝子編集効率をわずかに増加させることができることを証明する。実際、pGT1/130117ガイド/delF508 lacO 500の組み合わせが、ほぼ100％のトランスフェクションした細胞中でWT（野生型）からdelF508（欠失型）への好結果の遺伝子編集を引き起こすことが可能であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年1月24日(2020.1.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドナーＤＮＡをヌクレアーゼに連結することにより少なくとも５０％まで遺伝子編集の効率を改善するための組成物であって、前記組成物が、
ドナーＤＮＡおよびＤＮＡ結合ドメインのコンセンサス配列を含む核酸；並びに
以下：
前記配列を結合するためのＤＮＡ結合ドメインに連結されたヌクレアーゼを含む融合タンパク質；および
前記融合タンパク質をコードする核酸
のうちの少なくとも１つ
を含む組成物。
【請求項２】
遺伝子編集の効率が、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓタンパク質、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーまたはＭＡＤｚｙｍｅである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ヌクレアーゼがＣａｓタンパク質である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記融合タンパク質が核内局在化配列を更に含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
Ｃａｓタンパク質および標的ＤＮＡ配列と相互作用するガイドＲＮＡを更に含む、請求項３〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記コンセンサス配列が、Ｌａｃオペレーター（配列番号６６）、ＴＲＰオペレーター（配列番号６８）、ＴＥＴオペレーター（配列番号６７）、ＧＡＬ−４結合部位（配列番号１）またはＩＨＦ結合部位（配列番号２）を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記コンセンサス配列が、Ｌａｃオペレーター、ＴＲＰオペレーター、ＴＥＴオペレーター、ＧＡＬ−４結合部位またはＩＨＦ結合部位に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、Ｌａｃリプレッサー、ＴＥＴリプレッサー、ＴＲＰリプレッサー、ＧＡＬ−４もしくはＩＨＦ、または前記コンセンサス配列を結合するのに十分なその一部分を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ＬＡＣリプレッサー、好ましくは配列番号９のアミノ酸４３〜４０３である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ヌクレアーゼがリンカーを介して前記ＤＮＡ結合ドメインに連結される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記リンカーが、配列番号３〜７、ＧＧＳリンカー、または配列番号９のアミノ酸４０４〜４１９のいずれか１つより選択された配列を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１４】
前記融合タンパク質がＬＡＣリプレッサーおよびＣａｓ９を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ベクターが：
ａ．ドナーＤＮＡおよびＤＮＡ結合ドメインのコンセンサス配列を含む核酸；および
ｂ．融合タンパク質をコードする核酸
の一方または両方を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ベクターが、Ｃａｓ９タンパク質と相互作用するガイドＲＮＡをコードする核酸配列および標的ＤＮＡ配列を更に含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記融合タンパク質がヌクレアーゼ欠損型である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物を含む、単離された宿主細胞。
【請求項１９】
細胞内でＤＮＡを編集する方法であって、前記方法が、
融合タンパク質と標的ＤＮＡ配列との相互作用に適切な条件下で、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物と細胞とを接触させる工程を含み、
編集の効率が、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％である、方法。
【請求項２０】
細胞内でＤＮＡを編集する方法であって、前記方法が、
ａ）融合タンパク質と第一の標的ＤＮＡ配列との相互作用に適切な条件下で、請求項１７に記載の組成物と細胞とを接触させる工程；および
ｂ）核酸編集に適当な条件下で、第二の標的ＤＮＡ配列の所でゲノムＤＮＡを編集するのに適合する核酸編集システムと細胞とを接触させる工程
を含み、
編集の効率が、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％である、方法。
【請求項２１】
前記標的配列が、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外因性ＤＮＡから選択される、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞が、対象、好ましくはヒト対象の中にある、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも５０％まで遺伝子編集の効率を改善するためのキットであって、前記キットが、
ドナーＤＮＡおよびＤＮＡ結合ドメインのコンセンサス配列を含む核酸；並びに
以下：
前記コンセンサス配列を結合するためのＤＮＡ結合ドメインに連結したヌクレアーゼを含む融合タンパク質；および
前記融合タンパク質をコードする核酸
のうちの少なくとも１つ
を含むキット。
【請求項２４】
前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓタンパク質、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーまたはＭＡＤｚｙｍｅである、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９である、請求項２４に記載のキット。
【国際調査報告】
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