(57)【要約】内臓臓器機能を制御するための方法および組成物が提供される。例えば、本方法および本組成物は、臓器機能の制御、例えば、臓器機能の調節の結果として、疾患を予防、抑制、または治療するのに有用である。一実施形態において、ウイルスベクターは臓器に送達され、ウイルスは、臓器の機能を調節する神経に感染する。一実施形態において、ウイルスベクターは、逆行性ベクターである。一実施形態において、ウイルスベクターは、外因的に送達された作用物質またはエネルギーによって遺伝子産物の活性が制御される遺伝子産物をコードする。したがって、作用物質またはエネルギーの送達によって臓器機能が制御される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺を神経支配する副交感神経線維を有する哺乳動物を提供する工程であって、前記肺が、タンパク質をコードする遺伝子を発現するウイルスベクターに感染しており、前記タンパク質の活性が、作用物質またはエネルギーによって阻害される、前記工程と、前記タンパク質の前記活性を阻害するのに有効な量で前記哺乳動物に、前記作用物質を投与するかまたは前記エネルギーを送達する工程とを含み、それによって、前記哺乳動物において咳を予防、抑制、または治療する、
哺乳動物において咳を予防、抑制、または治療する方法。
【請求項２】
前記ウイルスベクターが、吸入または注射によって前記哺乳動物に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記作用物質が静脈内投与される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項５】
前記哺乳動物が特発性咳または難治性咳を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記哺乳動物が、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）または胃逆流を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、または単純ヘルペスウイルスベクターである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、またはイヌアデノウイルスの逆行形態である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ウイルスベクターが逆行輸送のために改変されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記遺伝子が、光感受性イオンチャネル（光遺伝学）、化学応答性イオンチャネル（化学遺伝学）、超音波感受性イオンチャネル（超音波遺伝学（sonogenetics））、磁場応答性イオンチャネル（磁気遺伝学）、またはデザイナードラッグによってのみ活性化されるデザイナー受容体（ｄｅｓｉｇｎｅｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  ｄｅｓｉｇｎｅｒ  ｄｒｕｇ）（ＤＲＥＡＤＤ）をコードする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ウイルスベクターが、２つ以上の異なるＡＡＶカプシド血清型を含むアデノ随伴ウイルスカプシドを含むｒＡＡＶである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＡＡＶ血清型のうちの１つがＡＡＶ２を含む、請求項６〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＡＡＶ血清型のうちの１つがＡＡＶｒｈ１０を含む、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
哺乳動物において内臓臓器機能を制御する神経線維に遺伝子を送達する方法であって、
哺乳動物に作用物質を投与するかまたはエネルギーを送達する工程を含み、前記哺乳動物の調節神経が、前記内臓臓器を神経支配し、遺伝子産物をコードする遺伝子を含むウイルスベクターに感染しており、前記遺伝子産物のタンパク質の活性が、前記作用物質の投与または前記エネルギーの送達によって阻害または活性化され、投与される前記作用物質または送達される前記エネルギーの量が、前記内臓臓器機能を制御するのに有効である、前記方法。
【請求項１５】
前記神経線維が、迷走神経、心肺神経、胸内臓神経、腰内臓神経、仙骨内臓神経、または骨盤内臓神経である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記哺乳動物の臓器が、胃、腸、膵臓、肝臓、肺、心臓、副腎、腎臓、性腺、または膀胱である、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、または単純ヘルペスウイルスベクターである、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ウイルスベクターが、ニューロンにおける逆行輸送を提供する、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ウイルスベクターが、中枢神経系における逆行輸送を提供するように改変されている、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、またはイヌアデノウイルスの逆行形態である、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記遺伝子産物が、前記作用物質の投与に応答して、前記臓器を制御する前記神経の活性を調節する、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記遺伝子が、光感受性イオンチャネル、化学応答性イオンチャネル、超音波感受性イオンチャネル、磁場応答性イオンチャネル、またはデザイナードラッグによってのみ活性化されるデザイナー受容体（ＤＲＥＡＤＤ）をコードする、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記遺伝子が、チャネルロドプシン、ニコチン性アセチルコリン受容体、グラミシジンＡ、電圧依存性カリウムチャネル、イオンチャネル型グルタミン酸受容体、α−ヘモリシン、または機械受容チャネルをコードする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ウイルスベクターが前記迷走神経に送達される、請求項１４〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
投与される前記作用物質または送達される前記エネルギーによって、前記哺乳動物における食物摂取の制御、肛門括約筋の制御、または尿道括約筋の制御が可能になる、請求項１４〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記内臓臓器が、胃、十二指腸、または小腸である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記遺伝子産物が、前記哺乳動物の前記迷走神経への毒性タンパク質拡散を遮断する、請求項１４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ウイルスベクターが、胃腸系から逆行性に取り込まれる、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記毒性タンパク質が、α−シヌクレイン、タウ、β−アミロイド、またはハンチンチンを含む、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記遺伝子産物が、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ＣｒｉｓｐＲ／Ｃａｓ９、抗体、一本鎖抗体、もしくはイントラボディを含むか、またはそれらをコードする、請求項１４〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
投与または送達される前記量によって、哺乳動物において胃腸管から脳への毒性タンパク質の拡散が防止または阻害される、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１４〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＡＡＶ血清型のうちの１つがＡＡＶ２を含む、請求項１７〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＡＡＶ血清型のうちの１つがＡＡＶｒｈ１０を含む、請求項１７〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ウイルスベクターが、２つ以上の異なるＡＡＶカプシド血清型を含むアデノ随伴ウイルスカプシドを含むｒＡＡＶである、請求項１７〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
投与される前記量によって、前記哺乳動物の内臓臓器における疾患が予防、抑制、または治療される、請求項１４〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
２つ以上の異なるＡＡＶカプシド血清型由来のカプシドタンパク質から形成されるカプシドを含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）。
【請求項３８】
前記血清型のうちの１つがＡＡＶ２を含む、請求項３７に記載の組換えＡＡＶ。
【請求項３９】
前記血清型のうちの１つがＡＡＶｒｈ１０を含む、請求項３７または３８に記載の組換えＡＡＶ。
【請求項４０】
逆行送達を提供する、請求項３７、３８、または３９に記載の組換えＡＡＶ。
【請求項４１】
前記ｒＡＡＶが、治療用遺伝子産物、予防用遺伝子産物、または外因的に制御可能なタンパク質をコードする、請求項３７〜４０のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ。
【請求項４２】
光感受性イオンチャネル（光遺伝学）、化学応答性イオンチャネル（化学遺伝学）、超音波感受性イオンチャネル（超音波遺伝学）、磁場応答性イオンチャネル（磁気遺伝学）、またはデザイナードラッグによってのみ活性化されるデザイナー受容体（ＤＲＥＡＤＤ）をコードする、請求項４１に記載の組換えＡＡＶ。
【請求項４３】
作用物質またはエネルギーの外因的投与によって阻害されるチャネルタンパク質またはＤＲＥＡＤＤをコードする、請求項４１または４２に記載の組換えＡＡＶ。
【請求項４４】
ｈＤ３ｑをコードする、請求項４３に記載の組換えＡＡＶ。
【請求項４５】
前記カプシドが、配列番号５または７に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するカプシドを含む、請求項３７〜４３のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年７月３１日に出願された米国特許出願第６２／７１２，６６９号の出願日の利益を主張するものであり、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
背景
遺伝子治療は、様々な神経学的疾患に対して大きな可能性を示している。近年、臓器機能のニューロン制御は、ニューロン活性の操作を介した臓器機能の治療的調節の機会を表すことが認識されている。現在、迷走神経等の主幹または神経の分岐のいずれかを電気的に刺激することができる刺激因子を含む、神経機能を変化させるための機械的アプローチが利用可能である。しかしながら、これらは刺激される神経内のすべてのニューロンに非特異的に影響を及ぼし、リードの移動および感染を含め、機械デバイスに固有の合併症を有する複雑なインプラントを伴い、一方、パルス発生器は、機能を維持するために定期的に充電および／または周期的に交換する必要もある。
【０００３】
遺伝子治療剤は、ニューロンを内臓臓器に標的化することが可能であるが、これらのニューロンの細胞体を保有する神経節、脳または脊髄領域へのウイルスベクターの注射は、これらの大部分が多くの臓器にニューロンを送る混合集合であるため、個々の臓器の制御を可能にしない。例えば、胃由来の迷走神経の感覚ニューロンは、拡張および満腹感を感知することができる一方で、迷走神経から肺に向かう感覚ニューロンは、咳反射を担う。したがって、下神経節へのニューロン機能を調節するための遺伝子治療剤の注射は、両方のニューロンの集合を標的とし、それによって、咳または代謝障害を単独で治療するときに望ましくないであろう両方の臓器の機能に影響を与える。
【０００４】
したがって、臓器機能を調節し、疾患を改善させるために、特定の臓器へのニューロンのサブセットの機能の遺伝子調節へのアプローチの必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００５】
概要
本開示は、疾患を予防、抑制、または治療するための臓器機能の制御に有用な材料および方法を提供する。一態様において、本方法は、臓器へのウイルスベクターの送達を提供し、次いで、ウイルスベクターが、それらの臓器の機能を調節する神経軸索によって取り込まれる。一実施形態において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。一実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の逆行形態は、胃壁に注射されると、胃の膨張に応答し、満腹感を引き起こす迷走神経感覚ニューロンのサブセットに特異的に取り込まれる。ベクターの逆行形態を提供する分子は、当技術分野で既知であり、限定されないが、ＨＳＶタンパク質、狂犬病ウイルスＧ、糖タンパク質Ｃ型、ＶＳＶ  Ｇ、Ｂ１９Ｇ、偽狂犬病ウイルスタンパク質、ＡＡＶカプシドタンパク質、およびジネイン等の天然ウイルスタンパク質を含む。これは、他の内臓臓器に感覚を提供する他の結節ニューロンに影響を与えずに、下神経節から発するニューロンの特定のサブセットを表す。ウイルスベクターはまた、逆行レンチウイルス（ＬＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、またはイヌアデノウイルス（ＣＡＶ）ベクターを含むが、これらに限定されない他の形態の逆行ベクターであり得る。
【０００６】
一実施形態において、臓器、例えば、胃、小腸、大腸、膵臓、肝臓、脾臓、胆嚢、肺、腎臓、および心臓を含むがこれらに限定されない内臓臓器の機能を制御する神経線維に１つ以上の遺伝子を送達する方法が提供される。一実施形態において、ウイルス遺伝子治療ベクターは、迷走神経、心肺神経、胸内臓神経、腰内臓神経、仙骨内臓神経、または骨盤内臓神経等の調節神経によって神経支配される臓器の領域に送達される。一実施形態において、臓器は、胃、腸、膵臓、肝臓、肺、心臓、副腎、腎臓、性腺、膀胱、肛門括約筋または尿道括約筋である。一実施形態において、ウイルスベクターは、中枢神経系における逆行輸送のために改変される。一実施形態において、ウイルスベクターを臓器に注射する。一実施形態において、ベクターの送達は、疾患を予防、抑制、または治療する。一実施形態において、ウイルスベクターを胃に注射し、遺伝子の発現は、食物摂取を制御する。一実施形態において、ウイルスベクターは、例えば、吸入を介して肺に送達され、遺伝子の発現は、咳を制御する。一実施形態において、遺伝子の発現は調節神経を活性化する。一実施形態において、遺伝子の発現は調節神経を阻害する。
【０００７】
本開示はまた、標的ニューロンへの逆行取り込みのための改善された特性を有するウイルスベクターを提供する。このベクターは、ＡＡＶの１つの血清型、例えば、ＡＡＶ血清型２からのカプシドタンパク質の混合物を含有するカプシドを含有し、点変異は逆行取り込み（レトロＡＡＶ）を増加させ（Ｔｅｖｒｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ９２：３７２−３７８（２０１６）、参照により本明細書に組み込まれる）、ＡＡＶの異なる血清型、例えばＡＡＶ血清型ｒｈ１０由来のカプシドタンパク質を含有する。このカプシド混合物は、レトロＡＡＶ由来のタンパク質のみを含有するカプシドと比較して、求心性ニューロンへの逆行取り込みおよび効率を劇的に向上させたウイルスベクターを作製する。このベクターは、臓器機能の効率的な制御を提供する。
【０００８】
本開示はまた、臓器機能の調節された制御のための方法を提供する。この方法は、概して、逆行ベクターを介して、臓器に求心するニューロンへの遺伝子の送達を含み、その産物は、外部薬物または刺激に応答して臓器機能を制御する。一例において、この方法を使用して、体重を制御するために満腹感を誘導し、食物摂取を低減することができる。この例において、ニューロンを活性化する、デザイナードラッグによってのみ活性化されるデザイナー受容体（Ｄｅｓｉｇｎｅｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ  Ｄｒｕｇ）（ＤＲＥＡＤＤ）を発現する逆行ＡＡＶ（レトロＡＡＶ）が、胃壁に注射され、胃に求心し、胃の拡張および満腹感に応答する迷走感覚ニューロンに取り込まれる。ＤＲＥＡＤＤ活性化因子、例えば、クロザピン−Ｎ−オキシド（ＣＮＯ）の全身投与後、満腹感が誘導され、食物摂取が減少する。他の例としては、これらのニューロンへの興奮性化学遺伝学的イオンチャネルの送達、続いて適切な薬物での活性化、または興奮性光遺伝学的イオンチャネルＣｈＲ２の送達、続いてＣｈＲ２を活性化するための神経線維への光送達が挙げられる。別の例において、この方法は、他に治療可能な疾患に起因しない難治性咳を制御するために使用される。一例において、阻害性ＤＲＥＡＤＤを発現する逆行ＡＡＶをエアロゾル化し、肺の迷走感覚ニューロンへの取り込みのために吸入し、続いて、ＤＲＥＡＤＤ活性化因子、例えば、ＣＮＯを全身投与して、これらの感覚ニューロンの活性を阻害し、咳の反射を低減させる。一例において、例えば、阻害性ＤＲＥＡＤＤを発現する逆行ＡＡＶを、例えば迷走神経節または下神経節に注射し、続いて、ＤＲＥＡＤＤ活性化因子、例えば、ＣＮＯを全身投与して、これらの感覚ニューロンの活性を阻害し、咳の反射を低減させる。
【０００９】
一実施形態において、ウイルスベクターは、ＣＮＯ、クロザピン、ペルラピン、または化合物２１によって結合されるときに、Ｍ４ムスカリン性アセチルコリン受容体の操作されたバージョンであるｈＭ４Ｄｉをコードし（参照により本明細書に組み込まれるＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｎｅｕｒｏｓｉｃ．，６：４７６（２０１５）を参照されたい）、ｃＡＭＰシグナル伝達の減少および内向き整流カリウムチャネルの活性化の増加を通じて膜過分極を引き起こす。これは、Ｍ４受容体の内因性活性化後に見られるものと同様のニューロン活性の一時的な抑止をもたらす。ｈＭ３Ｄｑ（ｈＤ３ｑ）は、Ｍ３ムスカリン性受容体の操作されたバージョンであり、ＣＮＯによって活性化されると、ホスホリパーゼＣカスケードの活性化によって細胞内カルシウムを変化させ、ニューロンのバースト様の発火を引き起こす。ｒＭ３Ｄは、Ｇタンパク質シグナル伝達に基づくニューロンの脱分極（例えば、ｃＡＭＰの増加）をもたらし、Ｇタンパク質シグナル伝達の代わりにアレスチンに基づくシグナル伝達プロセスを介してニューロン活性を調節することができる。ニューロン励起のための他の選択肢は、同様にＧタンパク質シグナル伝達（例えば、ｃＡＭＰの増加）に基づくニューロン脱分極をもたらす他のｒＭ３Ｄ（例えば、Ｄｏｎｇ、Ａｌｌｅｎ、Ｆａｒｒｅｌｌ、＆  Ｒｏｔｈ、２０１０；Ｆｅｒｇｕｓｏｎ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ、Ｒｏｔｈ、Ｗｅｓｓ、＆  Ｎｅｕｍａｉｅｒ、２０１３を参照されたい）、およびＧタンパク質シグナル伝達の代わりにアレスチンに基づくシグナル伝達プロセスを介してニューロン活性を調節することができるＲｑ（Ｒ１６５Ｌ）である。別の受容体は、阻害性ＤＲＥＡＤＤ受容体Ｐｄｉである。Ｇｉ結合カッパオピオイド受容体（ＫＯＲＤ）の変異形態は、サルビノリンＢ（ＳａｌＢ）によって活性化されるため、ウイルスベクターにも使用され得る。
【００１０】
本開示はまた、毒性タンパク質の移入を防止する迷走神経への遺伝子の移入を介して、胃腸管から脳への毒性タンパク質の拡散を防止する方法を提供する。これは、下神経節等の迷走神経の感覚神経節にウイルスベクターを直接注射することによって、または迷走神経背側運動核等の脳内の迷走神経遠心性細胞体にウイルスベクターを直接注射することによって、または胃腸管の壁にウイルスベクターを注射することによって、または経口投与によって行われ得て、次いで、かかるベクターは、迷走神経軸索に取り込まれ、逆行輸送され、細胞体内で治療剤を発現させる。一例において、標的ニューロン中のα−シヌクレインタンパク質の発現を防止する、α−シヌクレインに対して指向されるｓｈＲＮＡは、胃および／または腸の壁への注射を通じて迷走神経感覚線維に送達されるウイルスの逆行形態、例えば、レトロＡＡＶ／ｒｈ１０ベクターから発現される。迷走神経の感覚ニューロン内で得られるｓｈＲＮＡの発現は、これらのニューロン内の内因性α−シヌクレインの発現を遮断し、その結果、シヌクレイン病理の伝播にはニューロン内での発現が必要であるため、パーキンソン病において観察される広範な脳病理をもたらす、胃腸管における病的な原線維からの毒性シヌクレイン病理の拡散を防止する。別の例において、胃腸管を通して送達される迷走神経感覚線維内のレトロＡＡＶ／ｒｈ１０ベクターは、α−シヌクレインの拡散を防止するために、α−シヌクレインタンパク質に対して指向する抗体を発現する。一実施形態において、ｒＡＡＶは、配列番号５または７に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％アミノ酸配列同一性を有するカプシドを有する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＡＡＶベクターを胃壁に注射した後の脳内迷走神経の背側運動核の領域における求心性（感覚）線維中の蛍光ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質の発現を図示する。既知の逆行トレーサー（コレラ毒素サブユニットＢ）を胃に注射して、求心性運動線維を標識化した。ＡＡＶ血清型２および１の混合ベクター（ＡＡＶ２／１）の注射は、事実上、ニューロンの取り込みを示さなかった。脳における逆行取り込みの増加を示すレトロＡＡＶの注射は、細胞体ではなく背側運動核のニューロン線維内でｍＣｈｅｒｒｙタンパク質発現をもたらし、これは、これらが下神経節から発する感覚線維であることを示唆している。ハイブリッドレトロＡＡＶおよびＡＡＶｒｈ１０カプシドで実施された同じ手順は、同じ脳領域において、ｍＣｈｅｒｒｙを発現する線維数の増加を示した。
【図２】図２Ａは、ＡＡＶベクターを胃壁に注射した後、迷走感覚ニューロンのための細胞体を保有する下神経節内で選択的にｍＣｈｅｒｒｙタンパク質を発現することを図示する。コレラ毒素トレーサーは、下神経節内の少数のニューロン細胞体の標識化を示す。脳内のニューロンへのいくつかの逆行取り込みを観察したにもかかわらず、ＡＡＶ２／１では事実上陽性細胞体は観察されなかった。レトロＡＡＶは、ｍＣｈｅｒｒｙを発現する下神経節内の細胞体の増加した数を示し、有効な逆行取り込みを示すが、結節ニューロンのサブセットのみが標識化されるため、取り込みは選択的である。レトロＡＡＶ／ｒｈ１０ハイブリッドベクターは、レトロＡＡＶ単独と比較して、それでもニューロンのサブセットを表すが、結節におけるニューロン細胞体のより多くの標識化を示す。図２Ｂ．ニューロン細胞数の定量化は、レトロＡＡＶ単独と比較して、胃壁へのレトロＡＡＶ／ｒｈ１０投与後の下神経節内の陽性ニューロンの数の約３倍の増加を示す。
【図３】１ｍｇ／ｋｇのＣＮＯに応答してニューロンを活性化するＤＲＥＡＤＤ（ｈＤ３ｑ）を発現するレトロＡＡＶ／ｒｈ１０を胃壁に注射された通常摂食する絶食マウスの応答を図示する。マーカー遺伝子ｍＣｈｅｒｒｙを発現するレトロＡＡＶ／ｒｈ１０を注射された動物は、ＣＮＯに応答して、通常給餌された。ＤＲＥＡＤＤを発現するレトロＡＡＶ／ｒｈ１０を注射したが、ＣＮＯの代わりに生理食塩水を与えられた動物は、ＣＮＯを与えられたｍＣｈｅｒｒｙ動物と比較して、生理食塩水投与後６時間および２４時間、同一の正常摂食を有していた。ＤＲＥＡＤＤを発現するレトロＡＡＶ／ｒｈ１０を注射し、次いで、ＣＮＯを与えられた動物は、ＣＮＯ投与後数時間にわたって食物摂取が有意に低減したことを示した。ＣＮＯが排泄されると、摂食挙動は正常に戻り、ＣＮＯの後４〜６時間の食物摂取の低減に起因して、対照と比較して、２４時間にわたる総食物摂取が低減したが、一方、ＣＮＯを排泄した後の６〜２４時間の期間は、その期間にわたって、対照と同様の食物摂取量を示した。
【図４】図４Ａ〜図４Ｂは、ＤＲＥＡＤＤ（ｈＤ３ｑ）を発現し、ＣＮＯまたは生理食塩水のいずれかの投与前に２４時間絶食させた、レトロＡＡＶ／ｒｈ１０を胃壁に注射したマウスの応答。マーカー遺伝子ｍＣｈｅｒｒｙを発現するレトロＡＡＶ／ｒｈ１０を注射された動物は、ＣＮＯ投与後の６時間および２４時間にわたって、通常給餌マウスと比較して（図３と比較して）、摂食が増加した。ＤＲＥＡＤＤを発現するレトロＡＡＶ／ｒｈ１０を注射したが、ＣＮＯの代わりに生理食塩水を与えられた動物は、ＣＮＯを与えられたｍＣｈｅｒｒｙ動物と比較して、生理食塩水投与後６時間および２４時間、同一の摂食を有していた。ＤＲＥＡＤＤを発現するレトロＡＡＶ／ｒｈ１０を注射し、次いで、ＣＮＯを与えられた動物は、動物がその前の２４時間飢餓状態にあったにもかかわらず、ＣＮＯ投与後数時間にわたって食物摂取が有意に低減したことを示した。その効果は非常に顕著であり、この絶食群において、ＣＮＯ投与後４〜６時間、食物摂取は、試験前に通常給餌され、次いで、対照ベクターまたは薬物を摂取した動物よりも依然として低かった（図３を参照されたい）。ＣＮＯが排泄されると、この群における摂食挙動は、通常給餌群と比較して、再び元に戻り、対照と比較して治療によって効果的に延長された絶食期間に起因して、ＣＮＯが排泄された後の６〜２４時間、動物は食物摂取が増加した。このれは、ＣＮＯを排泄した後に通常の食物摂取が再開した通常給餌マウスとは異なっていたが、対照と比較して、摂取量は増加しなかった。
【図５】遺伝子治療を送達して臓器機能を制御するための例示的なアプローチを示す。
【図６】３ｍｇ／ｋｇのＣＮＯを用いた絶食マウスにおける摂食挙動に関するデータを図示する。
【図７】３ｍｇ／ｋｇのＣＮＯを用いた通常給餌マウスにおける摂食挙動についてのデータを示す。
【図８】図８Ａ〜図８Ｅは、１ｍｇ／ｋｇのＣＮＯを用いた通常給餌マウスにおける摂食挙動データを図示する。
【図９】図９Ａ〜図９Ｅは、１ｍｇ／ｋｇのＣＮＯを用いた通常給餌マウスにおける低減した摂食挙動の長期安定性を示す。
【図１０】生理食塩水（Ｓ）と比較して、１日１ｍｇ／ｋｇのＣＮＯ（Ｃ）で処理した６０％の高脂肪食に対する、腸内レトロ／ｒｈ１０ＡＡＶ  ＨＤ３ｑ（ＤＲＥＡＤＤ）マウスにおける低減した体重増加を示す。
【図１１】生理食塩水（Ｓ）と比較して、１日１ｍｇ／ｋｇのＣＮＯ（Ｃ）で処理した６０％の高脂肪食に対する、腸内レトロ／ｒｈ１０ＡＡＶ  ＨＤ３ｑ（ＤＲＥＡＤＤ）マウスにおける継続的な低減した体重増加を示す。Ｘ軸は、薬物療法の開始後の日付順の日数を示し、３３日目は、前の図では２４日目である。
【図１２】図１２Ａ〜図１２Ｍは、ｐＮＬＲｅｐ２＿レトロ  Ｃａｐ２（配列番号１）の配列を示す。
【図１３】図１３Ａ〜図１４Ｂは、ｐＮＬＲｅｐ２＿ｒｈ１０Ｃａｐ（配列番号２）の配列を提供する。
【図１４】図１４Ａ〜図１４Ｂは、ＡＡＶ．ＣＢＡ．ｆｌａｇ−ｍＣｈｅｒｙｙ．ＷＰＲＥ（配列番号３）の配列を示す。
【図１５】図１５Ａ〜図１５Ｐは、ＡＡＶｒｈ１０（配列番号４〜５）およびレトロＡＡＶ２（配列番号６〜７）のカプシドの例示的な配列を提供する。
【図１６】図１６Ａ〜図１６Ｂは、ヒトＭ３およびＭ４の配列を提供する。ｈＭ３についてのＤＲＥＡＤＤは、残基１４９および／または２３９、例えばｍＭ３におけるＹ１４９ＣまたはＡ２３９Ｇで置換を有していてもよく、ｈＭ４についてのＤＲＥＡＤＤＳは、残基１１３および／または２０３、例えばｍＭ４におけるＹ１１３ＣまたはＡ２０３Ｇで置換を有していてもよい（配列番号１２）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
詳細な説明
定義
「ベクター」は、ポリヌクレオチドを含むか、またはポリヌクレオチドと会合し、インビトロまたはインビボのいずれかで細胞へのポリヌクレオチドの送達を媒介するために使用することができる巨大分子または巨大分子の会合を指す。例示的なベクターとして、例えば、プラスミド、ウイルスベクター、リポソーム、および他の遺伝子送達ビヒクルが挙げられる。「標的ポリヌクレオチド」または「導入遺伝子」と称されることがある、送達されるポリヌクレオチドは、哺乳動物における免疫応答を誘発するのに好適な遺伝子ポリペプチドまたはペプチドにおける目的のコード配列、および／または選択可能もしくは検出可能なマーカーを含んでもよい。
【００１３】
本明細書で使用される「形質導入」、「トランスフェクション」、「形質転換」、または「形質導入すること」は、ポリヌクレオチド、例えば、細胞内の導入遺伝子の発現をもたらす外因性ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するためのプロセスを指す用語であり、宿主細胞に外因性ポリヌクレオチドを導入するための組換えウイルスの使用を含む。細胞内のポリヌクレオチドの形質導入、トランスフェクションまたは形質転換は、限定されないが、例えば、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリーおよびウェスタンブロットによる、タンパク質発現（定常状態レベルを含む）、ハイブリダイゼーションアッセイ、例えばノーザンブロット、サザンブロット、およびゲルシフトモビリティアッセイによるＤＮＡおよびＲＮＡの測定を含む、当技術分野で周知の方法によって決定され得る。外因性ポリヌクレオチドの導入に使用される方法には、ウイルス感染またはトランスフェクション、リポフェクション、形質転換、およびエレクトロポレーション、ならびに他の非ウイルス遺伝子送達技術などの周知の技術が含まれる。導入されたポリヌクレオチドは、宿主細胞において安定にまたは一過性に維持され得る。
【００１４】
「遺伝子送達」は、遺伝子移入のために外因性ポリヌクレオチドを細胞に導入することを指し、標的化、結合、取り込み、輸送、局在化、レプリコン組み込みおよび発現を包含し得る。
【００１５】
「遺伝子移入」は、標的化、結合、取り込み、輸送、局在化、およびレプリコン組み込みを包含し得るが、遺伝子のその後の発現とは異なる、かつそれを暗示しない外因性ポリヌクレオチドの細胞への導入を指す。
【００１６】
「遺伝子発現」または「発現」は、遺伝子転写、翻訳、および翻訳後修飾のプロセスを指す。
【００１７】
「感染性」ウイルスまたはウイルス粒子は、ウイルス種が指向性である細胞に送達することができるポリヌクレオチド構成要素を含むものである。この用語は、必ずしもウイルスの任意の複製能力を暗示するものではない。
【００１８】
「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそのアナログを含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドまたはキャップヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログ等の修飾ヌクレオチドを含んでもよく、非ヌクレオチド構成要素によって中断されてもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組み立ての前または後に付与され得る。本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドという用語は、二本鎖分子および一本鎖分子を互換的に指す。別段の指定または要求がない限り、ポリヌクレオチドである本明細書に記載の本発明の任意の実施形態は、二本鎖形態、および二本鎖形態を構成することが知られているかまたは予想される２つの相補的な各々の一本鎖形態の両方を包含する。
【００１９】
「単離された」ポリヌクレオチド、例えば、プラスミド、ウイルス、ポリペプチド、または他の物質は、物質または類似の物質が天然に存在するか、または最初にそこから調製される場合もある他の構成要素の少なくとも一部を欠く物質の調製物を指す。したがって、例えば、単離された物質は、それを元となる混合物から濃縮するために精製技術を使用することによって調製されてもよい。単離された核酸、ペプチド、またはポリペプチドは、それが自然界に見出される形態またはそれとは異なる設定で存在する。例えば、所与のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子）は、隣接する（ｎｅｉｇｈｂｏｒｉｎｇ）遺伝子に近接して宿主細胞染色体上に見出され、ＲＮＡ配列、例えば、特定のタンパク質をコードする特異的ｍＲＮＡ配列は、多数のタンパク質をコードする多数の他のｍＲＮＡとの混合物として細胞内に見出される。単離された核酸分子は、一本鎖形態または二本鎖形態で存在してもよい。単離された核酸分子がタンパク質を発現するために利用される場合、この分子は、センス鎖またはコード鎖を少なくとも含有し得る（すなわち、分子は一本鎖であってもよい）が、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含有し得る（すなわち、分子は二本鎖であってもよい）。濃縮は、溶液の体積当たりの重量等の絶対基準で測定することができるか、または元の混合物中に存在する第２の潜在的に干渉する物質と関連して測定することができる。本発明の実施形態の濃縮を高めることは、ますます好ましい。したがって、例えば、２倍濃縮、１０倍濃縮、１００倍濃縮、または１０００倍濃縮。
【００２０】
「転写調節配列」は、それが作動可能に連結した遺伝子またはコード配列の転写を制御するゲノム領域を指す。本発明で使用される転写調節配列は、概して、少なくとも１つの転写プロモーターを含み、１つ以上のエンハンサーおよび／または転写ターミネーターも含み得る。
【００２１】
「作動可能に連結された」とは、２つ以上の構成要素が配置されており、そのように記載された構成要素が、それらが連携された様式で機能することを可能にする関係にあることを指す。例示として、転写調節配列（ＴＲＳ）またはプロモーターがコード配列の転写を促進する場合、ＴＲＳまたはプロモーターは、コード配列に作動可能に連結される。作動可能に連結されたＴＲＳは、概して、コード配列とシスで連結されるが、必ずしもコード配列に直接隣接するとは限らない。
【００２２】
「異種」は、比較されるエンティティとは遺伝子型が異なるエンティティに由来することを意味する。例えば、遺伝子工学の技術によって異なる細胞型に導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである（発現された場合、異種ポリペプチドをコードすることができる）。同様に、そのネイティブなコード配列から除去され、異なるコード配列に作動可能に連結されたプロモーター等の転写調節エレメントは、異種転写調節エレメントである。
【００２３】
「ターミネーター」は、リードスルー転写を減少または防止する傾向があるポリヌクレオチド配列を指す（すなわち、ターミネーターの一方の側に由来する転写がターミネーターの他方の側まで続くことを減少または防止する）。転写が妨害される程度は、典型的には、塩基配列の機能および／またはターミネーター配列の長さである。特に、多くの分子生物学的系において周知であるように、概して「転写終結配列」と称される特定のＤＮＡ配列は、おそらくＲＮＡポリメラーゼ分子が、ＤＮＡが転写されるのを停止および／または離脱させることによって、ＲＮＡポリメラーゼによるリードスルー転写を妨害する傾向がある特定の配列である。かかる配列特異的ターミネーターの典型的な例としては、ポリアデニル化（「ポリＡ」）配列、例えば、ＳＶ４０ポリＡが挙げられる。かかる配列特異的ターミネーターに加えて、またはその代わりに、プロモーターとコード領域との間の比較的長いＤＮＡ配列の挿入はまた、コード領域の転写を妨害する傾向があり、概して、介在する配列の長さに比例する。この効果は、ＲＮＡポリメラーゼ分子が転写されるＤＮＡから離脱するいくつかの傾向が常に存在し、コード領域に到達する前に横断される配列の長さを増加させることは、コード領域の転写が完了する前、またはおそらく開始される前に離脱が生じる可能性を一般的に増加させるために生じると推測される。したがって、ターミネーターは、１つの方向（「単一方向」ターミネーター）または両方の方向（「双方向」ターミネーター）からの転写を防止することができ、配列特異的終結配列または配列非特異的ターミネーターまたはその両方から構成され得る。様々なかかるターミネーター配列が当該技術分野で既知であり、本発明の文脈内でのかかる配列の例示的な使用が以下に提供される。
【００２４】
「宿主細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」、「パッケージング細胞株」、および他のかかる用語は、例えば、組換えウイルスまたは組換え融合ポリペプチドを産生するために本発明において有用な、ヒト細胞を含む哺乳動物細胞等の高級真核細胞を示す。これらの細胞は、形質導入された元々の細胞の子孫を含む。単一の細胞の子孫は、必ずしも元の親細胞と完全に同一ではない（形態またはゲノム相補性において）場合があることを理解されたい。
【００２５】
ポリヌクレオチドに適用される「組換え」は、ポリヌクレオチドが、クローニング、制限、および／またはライゲーションステップの種々の組み合わせ、および天然に見られるポリヌクレオチドとは異なる構築物をもたらす他の手順の産物であるということを意味する。組換えウイルスは、組換えポリヌクレオチドを含むウイルス粒子である。この用語は、元々のポリヌクレオチド構築物の複製、および元々のウイルス構築物の子孫をそれぞれ含む。
【００２６】
「制御エレメント」または「制御配列」は、ポリヌクレオチドの複製、重複、転写、スプライシング、翻訳、または分解を含む、ポリヌクレオチドの機能的調節に寄与する分子の相互作用に関与するヌクレオチド配列である。調節は、プロセスの頻度、速度、または特異性に影響を与える可能性があり、本質的に増強または阻害であり得る。当該技術分野で既知の制御エレメントとして、例えば、プロモーターおよびエンハンサー等の転写調節配列が挙げられる。プロモーターは、特定の条件下でＲＮＡポリメラーゼを結合させ、通常、プロモーターから（３’の方向に）下流に位置するコード領域の転写を開始することができるＤＮＡ領域である。プロモーターとしては、ＡＡＶプロモーター、例えば、Ｐ５、Ｐ１９、Ｐ４０、およびＡＡＶ  ＩＴＲプロモーター、ならびに異種プロモーターが挙げられる。
【００２７】
「発現ベクター」は、目的の遺伝子産物をコードする領域を含むベクターであり、意図した標的細胞における遺伝子産物の発現をもたらすために用いられる。発現ベクターはまた、標的におけるタンパク質の発現を促進するためにコード領域に作動可能に連結された制御エレメントも含む。制御エレメントと、発現のためにそれらが作動可能に連結された１つまたは複数の遺伝子との組み合わせは、時には「発現カセット」と称され、その多くは当該技術分野で既知であり、かつ入手可能であるか、または当該技術分野で入手可能な構成要素から容易に構築することができる。
【００２８】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書では、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために互換的に使用される。また、この用語は、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、脂質付加、または標識構成要素とのコンジュゲーションで修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。
【００２９】
「外因性」という用語は、細胞または生物におけるタンパク質、遺伝子、核酸、またはポリヌクレオチドに関連して使用される場合、人工的または天然の手段によって細胞または生物に導入されたタンパク質、遺伝子、核酸、またはポリヌクレオチドを指す。外因性核酸は、異なる生物もしくは細胞由来であってもよく、または生物もしくは細胞内に天然に存在する核酸の１つ以上の追加のコピーであってもよい。非限定的な例として、外因性核酸は、天然細胞の染色体位置とは異なる染色体位置にあるか、さもなければ、天然に見出されるものとは異なる核酸配列、例えば、１つの遺伝子からのプロモーターを異なる遺伝子由来の遺伝子産物のオープンリーディングフレームに連結する発現カセットに隣接する（ｆｌａｎｋ）。
【００３０】
「形質転換された」または「トランスジェニック」は、少なくとも１つの組換えＤＮＡ配列の存在によって変化または増強された任意の宿主細胞または細胞株を含むために本明細書で使用される。本発明の宿主細胞は、典型的には、単離された直鎖ＤＮＡ配列として、プラスミド発現ベクター内のＤＮＡ配列でトランスフェクションするか、または組換えウイルスベクターによる感染によって産生される。
【００３１】
「配列相同性」という用語は、２つの核酸配列間の塩基マッチの割合、または２つのアミノ酸配列間のアミノ酸マッチの割合を意味する。配列相同性が、５０％等の率として表される場合、その率は、いくつかの他の配列と比較される、選択された配列の長さにわたるマッチの割合を示す。ギャップ（２つの配列のいずれかにおいて）は、マッチングを最大化することを可能にし、ギャップ長は通常、１５塩基以下が使用され、６塩基以下が好ましく、２塩基以下がより好ましい。プローブまたは治療としてオリゴヌクレオチドを使用する場合、標的核酸とオリゴヌクレオチド配列との間の配列相同性は、概して、２０個の可能なオリゴヌクレオチド塩基対マッチのうち、１７個以上の標的塩基マッチであり（８５％）、１０個の可能な塩基対マッチのうち、９個以上のマッチであり（９０％）、または２０個の可能な塩基対マッチのうち、１９個以上のマッチである（９５％）。
【００３２】
２つのアミノ酸配列は、それらの配列間に部分的または完全な同一性が存在する場合、相同である。例えば、８５％の相同性は、２つの配列が最大マッチングのためにアラインメントされたときに、アミノ酸の８５％が同一であることを意味する。マッチングを最大化する際に、（マッチングされる２つの配列のいずれかにおいて）ギャップが許容され、ギャップ長が５以下が好ましく、２以下がより好ましい。あるいは、かつ好ましくは、２つのタンパク質配列（またはそれらに由来する少なくとも３０アミノ酸長のポリペプチド配列）は、変異データ行列および６以上のギャップペナルティを用いたプログラムＡＬＩＧＮを使用して、（標準偏差単位で）５を超えるアラインメントスコアを有する場合、この用語が本明細書で使用されるように、相同である。ＡＬＩＧＮプログラムを用いて最適にアラインメントされたときにアミノ酸が５０％以上同一である場合、２つの配列またはその一部は、さらに相同である。
【００３３】
「〜に対応する」という用語は、ポリヌクレオチド配列が参照ポリヌクレオチド配列のすべてもしくは一部に構造的に関連していること、またはポリペプチド配列が参照ポリペプチド配列のすべてもしくは一部に構造的に関連していること、例えば、それらが少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくともそれ以上、例えば少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有することを意味するために本明細書で使用される。対照的に、「〜に相補的である」という用語は、本明細書では、相補性配列が参照ポリヌクレオチド配列のすべてまたは一部と相同であることを意味するために使用される。例示のために、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は、参照配列「ＴＡＴＡＣ」に対応し、参照配列「ＧＴＡＴＡ」に相補的である。
【００３４】
「配列同一性」という用語は、２つのポリヌクレオチド配列が比較ウィンドウにわたって（すなわち、ヌクレオチドごとに基づいて）同一であることを意味する。「配列同一性率」という用語は、２つのポリヌクレオチド配列が比較ウィンドウにわたって（すなわち、ヌクレオチドごとに基づいて）同一であることを意味する。「配列同一性率」という用語は、比較ウィンドウにわたって２つの最適にアラインメントされた配列を比較し、両方の配列において同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が生じる位置の数を決定して、マッチした位置の数を得て、このマッチした位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割り算し、その結果に１００を掛け算して配列同一性率を得ることによって計算される。本明細書で使用される「実質的同一性」という用語は、ポリヌクレオチド配列の特徴を示し、ポリヌクレオチドは、少なくとも２０個のヌクレオチド位置の比較ウィンドウにわたって、多くは少なくとも２０〜５０個のヌクレオチドのウィンドウにわたって、参照配列と比較して、少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０〜９５％の配列同一性、より通常は少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含み、配列同一性率は、参照配列を、比較ウィンドウにわたって、参照配列の合計２０％以下の欠失または付加を含んでいてもよいポリヌクレオチド配列と比較することによって計算される。
【００３５】
「保存的」アミノ酸置換は、例えば、極性酸性アミノ酸としてのアスパラギン酸−グルタミン酸、極性塩基性アミノ酸としてのリジン／アルギニン／ヒスチジン、非極性または疎水性アミノ酸としてのロイシン／イソロイシン／メチオニン／バリン／アラニン／グリシン／プロリン、極性または非帯電親水性アミノ酸としてのセリン／トレオニンである。保存的アミノ酸置換は、側鎖に基づくグループ化も含む。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり、脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびトレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンである。例えば、ロイシンをイソロイシンもしくはバリンで置き換えること、アスパラギン酸をグルタミン酸で置き換えること、トレオニンをセリンで置き換えること、またはアミノ酸を構造的に関連するアミノ酸で同様に置き換えることは、得られるポリペプチドの特性に大きな影響を及ぼさないと予測することが合理的である。アミノ酸変化が機能性ポリペプチドをもたらすかどうかは、ポリペプチドの特定の活性をアッセイすることによって容易に決定することができる。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて群に分けられる。（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；（５）鎖配向に影響を与える残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および（６）芳香族；ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
【００３６】
本開示はまた、非保存的置換を有するポリペプチドを想定する。非保存的置換は、上述のクラスのうちの１つのメンバーを別のメンバーと交換することを伴う。
【００３７】
遺伝子移入ベクター
本開示は、遺伝子をニューロンもしくは神経線維に送達するのに有用な遺伝子移入ベクター、例えば、ウイルス遺伝子移入ベクター、または毒性タンパク質等の毒性のある遺伝子産物を胃腸管から脳に拡散させるのに有用な遺伝子移入ベクターを提供する。遺伝子移入ベクターおよび方法の種々の態様を以下に考察する。したがって、パラメータの任意の組み合わせを遺伝子移入ベクターおよび方法に従って使用することができる。
【００３８】
「遺伝子移入ベクター」は、コードされたタンパク質の合成が行われる好適な宿主細胞内で異種核酸配列を担持する能力を有する任意の分子または組成物である。典型的には、遺伝子移入ベクターは、当該技術分野で既知である組換えＤＮＡ技術を使用して、異種核酸配列を組み込むように操作されている核酸分子である。望ましくは、遺伝子移入ベクターは、ＤＮＡから構成される。好適なＤＮＡ系の遺伝子移入ベクターの例としては、プラスミドおよびウイルスベクターが挙げられる。しかしながら、リポソーム等の核酸に基づかない遺伝子移入ベクターは、当該技術分野でも既知であり、当該技術分野で使用される。本発明の遺伝子移入ベクターは、単一種類の核酸（例えば、プラスミド）または非核酸分子（例えば、脂質またはポリマー）に基づいていてもよい。遺伝子移入ベクターは、宿主細胞ゲノムに組み込まれ得るか、またはエピソームの形態で宿主細胞中に存在し得る。
【００３９】
一実施形態において、遺伝子移入ベクターは、ウイルスベクターである。好適なウイルスベクターとして、例えば、レトロウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）系のベクター、パルボウイルス系のベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）系のベクター、ＡＡＶ−アデノウイルスキメラベクター、およびアデノウイルス系のベクターが挙げられる。これらのウイルスベクターは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２００１）、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９９４）に記載される標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して調製することができる。
【００４０】
一実施形態において、本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを提供する。ＡＡＶベクターは、発現される遺伝子、およびＡＡＶベクターに実質的に影響を与えない追加の構成要素（例えば、インビトロでのベクターの操作を容易にするポリ（Ａ）配列または制限酵素部位等の遺伝的エレメント）を含んでもよい。アデノ随伴ウイルスは、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅファミリーのメンバーであり、約５，０００ヌクレオチド未満の直鎖一本鎖ＤＮＡゲノムを含む。ＡＡＶは、効率的な複製のために、ヘルパーウイルス（すなわち、アデノウイルスもしくはヘルペスウイルス）との共感染、またはヘルパー遺伝子の発現を必要とする。治療用核酸の投与に使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、約９６％の親ゲノムが欠失しており、その結果、ＤＮＡ複製およびパッケージングのための認識シグナルを含有する末端リピート（ＩＴＲ）のみが残る。これにより、ウイルス遺伝子の発現に起因する免疫学的副作用または毒性の副作用が排除される。加えて、特定のＡＡＶタンパク質を産生細胞に送達することは、所望な場合、ＡＡＶ  ＩＴＲを含むＡＡＶベクターを細胞ゲノムの特定の領域に組み込むことを可能にする（例えば、米国特許第６，３４２，３９０号および同第６，８２１，５１１号を参照されたい）。組み込まれたＡＡＶゲノムを含む宿主細胞は、細胞成長または形態に変化を示さない（例えば、米国特許第４，７９７，３６８号を参照されたい）。
【００４１】
ＡＡＶ  ＩＴＲは、非構造複製（Ｒｅｐ）タンパク質および構造カプシド（Ｃａｐ）タンパク質（ビリオンタンパク質（ＶＰ）としても知られる）のための固有のコードヌクレオチド配列に隣接する。末端の１４５ヌクレオチドは自己相補的であり、Ｔ字型ヘアピンを形成するエネルギー的に安定した分子内二本鎖が形成され得るように構成される。これらのヘアピン構造は、細胞ＤＮＡポリメラーゼ複合体のプライマーとして機能することにより、ウイルスＤＮＡ複製の起源として機能する。Ｒｅｐ遺伝子は、Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０をコードする。Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８は、ｐ５プロモーターから転写され、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０は、ｐ１９プロモーターから転写される。Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８タンパク質は、生産的複製中にヘリカーゼおよびニッカーゼの機能を発揮し、ＡＡＶ末端の分解能を可能にする多機能ＤＮＡ結合タンパク質である（例えば、Ｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ、６１：４４７（１９９０）を参照されたい）。これらのタンパク質はまた、ヘルパーウイルス内の内因性ＡＡＶプロモーターおよびプロモーターからの転写を調節する（例えば、Ｐｅｒｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：１０７９（１９９７）を参照されたい）。他のＲｅｐタンパク質は、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８の機能を改変する。ｃａｐ遺伝子は、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから転写される。
【００４２】
ＡＡＶベクターは、当該技術分野で既知の任意のＡＡＶ血清型を使用して生成され得る。いくつかのＡＡＶ血清型および１００を超えるＡＡＶバリアントは、アデノウイルスストックから、またはヒトもしくは非ヒト霊長類組織から単離されてきた（例えば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１４（３）：３１６（２００６）にまとめられている）。概して、ＡＡＶ血清型は、核酸配列およびアミノ酸配列レベルで有意な相同性を有するゲノム配列を有し、その結果、異なる血清型が、同一の遺伝機能のセットを有し、本質的に物理的および機能的に等価であるビリオンを産生し、実際には同一の機構によって複製し、組み立てられる。ＡＡＶ血清型１〜６および７〜９は、それらが他のすべての既存の特性決定された血清型に特異的な中和血清と効率的に交差反応しないという点で、「真の」血清型であると定義される。対照的に、ＡＡＶ血清型６、１０（Ｒｈ１０とも称される）、および１１は、「真の」血清型の定義に従わないため、「バリアント」血清型とみなされる。ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）は、その病原性の欠如、広範囲の感染性、および長期導入遺伝子発現を確立する能力のために、遺伝子治療用途に広く使用されてきた（例えば、Ｃａｒｔｅｒ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１６：５４１（２００５）、およびＷｕ  ｅｔ  ａｌ．（上記）を参照されたい）。種々のＡＡＶ血清型のゲノム配列およびそれらの比較は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号Ｕ８９７９０、Ｊ０１９０１、ＡＦ０４３３０３、およびＡＦ０８５７１６；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：６８２３（１９９７）；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５（１９８３）；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：１３０９（１９９９）；Ｒｕｔｌｅｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２：３０９（１９９８）；およびＷｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：８６３５（２０００））に開示されている。
【００４３】
ＡＡＶ  ｒｅｐ配列およびＩＴＲ配列は、ほとんどのＡＡＶ血清型にわたって特に保存される。例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、およびＡＡＶ６のＲｅｐ７８タンパク質は、約８９〜９３％同一であると報告されている（Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３（２）：９３９（１９９９）を参照されたい）。ＡＡＶ血清型２、３Ａ、３Ｂ、および６は、ゲノムレベルで約８２％の全ヌクレオチド配列同一性を共有することが報告されている（Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌ  ｅｔ  ａｌ．、上記）。さらに、多くのＡＡＶ血清型のｒｅｐ配列およびＩＴＲは、哺乳動物細胞におけるＡＡＶ粒子の産生中に、他の血清型から対応する配列を効率的に交差補完（例えば、機能的に置換）することが知られている。
【００４４】
概して、ＡＡＶ粒子の細胞指向性を決定するｃａｐタンパク質、および関連するｃａｐタンパク質をコードする配列は、異なるＡＡＶ血清型にわたって、Ｒｅｐ遺伝子よりも著しく低く保存される。Ｒｅｐ配列およびＩＴＲ配列が他の血清型の対応する配列を交差補完する能力を考慮すると、ＡＡＶベクターは、血清型の混合物を含み、それによって「キメラ」または「シュードタイプ」ＡＡＶベクターであり得る。キメラＡＡＶベクターは、典型的には、２つ以上の（例えば、２、３、４等の）異なるＡＡＶ血清型に由来するＡＡＶカプシドタンパク質を含む。対照的に、シュードタイプＡＡＶベクターは、別のＡＡＶ血清型のカプシドにパッケージングされた１つのＡＡＶ血清型の１つ以上のＩＴＲを含む。キメラおよびシュードタイプＡＡＶベクターは、例えば、米国特許第６，７２３，５５１号、Ｆｌｏｔｔｅ、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：１（２００６）；Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１（２００４）；Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９９：１１８５４（２００２）；Ｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３：６７（２００６）；およびＧａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３：７７（２００６）にさらに記載される。
【００４５】
一実施形態において、ＡＡＶベクターは、ヒトに感染するＡＡＶ（例えばＡＡＶ２）を使用して生成される。あるいは、ＡＡＶベクターは、非ヒト霊長類、例えば、大型類人猿（例えば、チンパンジー）、旧世界ザル（例えば、マカク）、および新世界ザル（例えば、マーモセット）に感染するＡＡＶを使用して生成される。一実施形態において、ＡＡＶベクターは、ヒトに感染するＡＡＶを用いたシュードタイプの非ヒト霊長類に感染するＡＡＶを使用して生成される。かかるシュードタイプＡＡＶベクターの例は、例えば、Ｃｅａｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１３：５２８（２００６）に開示される。一実施形態において、ＡＡＶ２逆位末端リピート（ＩＴＲ）を用いたシュードタイプのアカゲザルに感染するＡＡＶ由来のカプシドタンパク質を含むＡＡＶベクターを生成することができる。特定の実施形態において、本発明のＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２  ＩＴＲを用いたシュードタイプのアカゲザルに感染するＡＡＶ１０由来のカプシドタンパク質（「ＡＡＶｒｈ．１０」とも称される）を含む（例えば、Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１７（８）：１０４２（２０１０）；およびＭａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２２：１５２５  （２０１１）を参照されたい）。
【００４６】
発現される遺伝子に加えて、ＡＡＶベクターは、宿主細胞における核酸配列の発現を提供する、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、転写ターミネーター、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）等の発現制御配列を含み得る。例示的な発現制御配列は当該技術分野で既知であり、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ．（１９９０）に記載される。
【００４７】
種々の異なる供給源由来の構成的プロモーター、誘導性プロモーター、および抑制性プロモーターを含む多数のプロモーターは、当該技術分野で周知である。プロモーターの代表的な供給源としては、例えば、ウイルス、哺乳動物、昆虫、植物、酵母、および細菌が挙げられ、これらの供給源由来の好適なプロモーターは、容易に入手可能であるか、または例えば、ＡＴＣＣ、ならびに他の商業的もしくは個々の供給源等の受託者から公的に入手可能な配列に基づいて合成的に作製され得る。プロモーターは、一方向（すなわち、１つの方向で転写を開始する）または双方向（すなわち、３’または５’のいずれかの方向で転写を開始する）であり得る。プロモーターの非限定的な例としては、例えば、Ｔ７細菌発現系、ｐＢＡＤ（ａｒａＡ）細菌発現系、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、およびＲＳＶプロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターとしては、例えば、Ｔｅｔ系（米国特許第５，４６４，７５８号および同第５，８１４，６１８号）、Ｅｃｄｙｓｏｎｅ誘導性系（Ｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９３：３３４６（１９９６））、Ｔ−ＲＥＸＴＭ系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、ＣＡ）、ＬＡＣＳＷＩＴＣＨ（商標）系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、サンディエゴ、ＣＡ）、およびＣｒｅ−ＥＲＴタモキシフェン誘導性リコンビナーゼ系（Ｉｎｄｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２７：４３２４（１９９９）；Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２８：ｅ９９（２０００）；米国特許第７，１１２，７１５号；ならびにＫｒａｍｅｒ  ＆  Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３０８：１２３（２００５））が挙げられる。
【００４８】
本明細書で使用される「エンハンサー」という用語は、例えば、それが作動可能に連結した核酸配列の転写を増加させるＤＮＡ配列を指す。エンハンサーは、核酸配列のコード領域から多数のキロ塩基離れた場所に位置していてもよく、調節因子の結合、ＤＮＡメチル化のパターン、またはＤＮＡ構造の変化を媒介することができる。様々な異なる供給源からの多数のエンハンサーが当該技術分野で周知であり、クローニングされたポリヌクレオチドとしてまたはその中で入手可能である（例えば、ＡＴＣＣ、ならびに他の商業的または個々の供給源等の受託者から）。プロモーター（一般に使用されるＣＭＶプロモーター等）を含む多数のポリヌクレオチドは、エンハンサー配列も含む。エンハンサーは、コード配列の上流、中、または下流に位置し得る。一実施形態において、核酸配列は、ＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ−アクチンプロモーター（「ＣＡＧプロモーター」とも称される）に作動可能に連結される（例えば、Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ、１０８：１９３（１９９１）；Ｄａｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９６：２２９６（１９９９）；およびＳｏｎｄｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１５：４８１（２００７）を参照されたい）。
【００４９】
典型的には、ＡＡＶベクターは、十分に特性決定されたプラスミドを使用して生成される。例えば、ヒト胚腎臓２９３Ｔ細胞を、導入遺伝子に特異的なプラスミドのうちの１つ、ならびにアデノウイルスヘルパーならびにＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含有する別のプラスミド（必要に応じてＡＡＶｒｈ．１０、８または９に特異的）でトランスフェクトする。７２時間後、細胞を採取し、ベクターを５回の凍結／解凍サイクルによって、細胞から放出させる。その後の遠心分離およびベンゾナーゼ処理によって、細胞デブリおよび、カプシドに包まれていないＤＮＡを除去する。イオジキサノール勾配およびイオン交換カラムを使用して、各ＡＡＶベクターをさらに精製してもよい。次に、精製されたベクターをサイズ排除遠心分離スピンカラムによって必要な濃度まで濃縮する。最後に、緩衝液を交換して、（例えば）１倍のリン酸緩衝生理食塩水中で、製剤化された最終ベクター産物を作製する。ウイルス価は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）リアルタイムＰＣＲによって測定することができ、ウイルス純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価することができる。
【００５０】
薬学的組成物および送達
本発明は、上述の遺伝子移入ベクターと、薬学的に許容される（例えば、生理学的に許容される）担体と、を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる組成物を提供する。組成物が本発明の遺伝子移入ベクターおよび薬学的に許容される担体から本質的になる場合、組成物に実質的に影響を与えない追加の構成要素（例えば、アジュバント、緩衝液、安定剤、抗炎症剤、可溶化剤、防腐剤等）を含むことができる。組成物が本発明の遺伝子移入ベクターおよび薬学的に許容される担体からなる場合、組成物は任意の追加の構成要素を含まない。任意の好適な担体は、本発明の文脈内で使用することができ、かかる担体は、当該技術分野で周知である。担体の選択は、部分的に、組成物が投与され得る特定の部位および組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定される。組成物は、本明細書に記載の遺伝子移入ベクターを除き、任意に滅菌され得る。組成物は、保管のために冷凍または凍結乾燥させ、使用前に、好適な無菌担体中で再構成することができる。組成物は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ（２００１）に記載される従来の技術に従って生成され得る。
【００５１】
組成物に好適な製剤としては、水溶液および非水溶液、抗酸化剤、緩衝液、および静菌剤を含有し得る等張滅菌溶液、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および防腐剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁液が挙げられる。製剤は、アンプルおよびバイアルなどの単位用量または多用量密封容器で提示されてもよく、使用直前に滅菌液体担体、例えば水を添加することだけを必要とする冷凍乾燥（凍結乾燥）させた状態で保管され得る。即時調合溶液および懸濁液は、前述の種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。一実施形態において、担体は、緩衝生理食塩水である。一実施形態において、本発明の遺伝子移入ベクターは、投与前に遺伝子移入ベクターを損傷から保護するように製剤化された組成物で投与される。例えば、組成物は、遺伝子移入ベクターを調製、保管、または投与するために使用されるデバイス、例えば、ガラス器具、シリンジ、または針の上での遺伝子移入ベクターの喪失を低減するように製剤化することができる。組成物は、遺伝子移入ベクターの光感受性および／または温度感受性を低下させるように製剤化することができる。この目的のために、組成物は、薬学的に許容される液体担体、例えば上述のもの、ならびにポリソルベート８０、Ｌ−アルギニン、ポリビニルピロリドン、トレハロース、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される安定化剤を含み得る。かかる組成物の使用は、遺伝子移入ベクターの保存期間を延長し、投与を促進し、本発明の方法の効率を増加させるであろう。遺伝子移入ベクターを含有する組成物の製剤は、例えば、Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖｅｌ．，６（２）：１７４−１７８（２００３）およびＷｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１２：１７１−１７８（２００５））にさらに記載される。
【００５２】
組成物はまた、形質導入効率を増強するように製剤化することができる。加えて、当業者は、本発明の遺伝子移入ベクターが、他の治療薬または生物学的活性剤を含む組成物中に存在し得ることを理解するであろう。例えば、炎症を制御する因子、例えば、イブプロフェンまたはステロイドは、遺伝子移入ベクターのインビボ投与に関連する腫脹および炎症を低減するために組成物の一部であり得る。免疫系刺激因子またはアジュバント、例えば、インターロイキン、リポ多糖、および二本鎖ＲＮＡを投与して、免疫応答を増強または修飾することができる。抗生物質、すなわち、殺菌剤および殺真菌剤は、遺伝子移入手順に関連する感染等の既存の感染を治療する、および／または将来の感染のリスクを低減するために存在することができる。
【００５３】
注射可能なデポ形態は、ポリラクチド−ポリグリコリド等の生分解性ポリマー中に主題の化合物のマイクロカプセルマトリックスを形成することによって作製される。薬物対ポリマーの比率、および用いられる特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。デポ注射用製剤はまた、体組織と適合性のあるリポソームまたはマイクロエマルション中に薬物を捕捉することによって調製される。
【００５４】
特定の実施形態において、本発明の製剤は、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、アクリルおよびメタクリル酸エステルのポリマー、ポリビニルポリマー、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタンおよびそのコポリマー、セルロース、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、乳酸およびグリコール酸のポリマー、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリ（ブチ酸（ｂｕｔｉｃ  ａｃｉｄ））、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）、多糖、タンパク質、ポリヒアルロン酸、ポリシアノアクリレート、ならびにそれらのブレンド、混合物、またはコポリマーからなる群から選択される生体適合性ポリマーを含む。
【００５５】
組成物は、スポンジ、生体適合性メッシュワーク、機械的リザーバ、または機械的インプラントなどの制御性放出または徐放性放出を可能にするデバイス内またはデバイス上に投与することができる。インプラント（例えば、米国特許第５，４４３，５０５号を参照されたい）、デバイス（例えば、米国特許第４，８６３，４５７号を参照されたい）、例えば、移植可能なデバイス、例えば、機械的リザーバ、またはインプラント、またはポリマー組成物から構成されるデバイスは、本発明の遺伝子移入ベクターの投与に特に有用である。組成物はまた、例えば、ゲルフォーム、ヒアルロン酸、ゼラチン、コンドロイチン硫酸塩、ビス−２−ヒドロキシエチルテレフタレート（ＢＨＥＴ）等のポリホスホエステル、および／またはポリ乳酸−グリコール酸を含む徐放性製剤の形態で投与することができる（例えば、米国特許第５，３７８，４７５号を参照されたい）。
【００５６】
遺伝子移入ベクターを含む組成物の送達は、当技術分野で既知のデバイスを使用して、脳内（実質内、脳室内、または槽内を含むがこれらに限定されない）、髄腔内（腰部または大槽を含むがこれらに限定されない）、または静脈内を含むがこれらに限定されない全身的、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。送達はまた、移植されるデバイスの外科的移植を介してもよい。
【００５７】
哺乳動物に投与される組成物中の遺伝子移入ベクターの用量は、哺乳動物のサイズ（体重）、任意の副作用の程度、特定の投与経路等を含むいくつかの因子に依存するであろう。一実施形態において、本発明の方法は、「治療有効量」の本明細書に記載の本発明の遺伝子移入ベクターを含む組成物を投与する工程を含む。「治療有効量」とは、所望の治療結果を達成するために必要な投薬量および期間にわたって有効な量を指す。治療有効量は、個体の病態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する遺伝子移入ベクターの能力等の因子に応じて変化し得る。特定の治療効果を達成するために必要とされる組成物中の遺伝子移入ベクターの用量は、典型的には、細胞当たりのベクターゲノムコピー（ｇｃ／細胞）または体重１ｋｇ当たりのベクターゲノムコピー（ｇｃ／ｋｇ）単位で投与される。当業者であれば、これらおよび当該技術分野で周知である他の因子に基づいて、特定の疾患または障害を有する患者を治療するための適切な遺伝子移入ベクターの用量範囲を容易に決定することができる。治療有効量は、１×１０１０ゲノムコピー〜１×１０１３ゲノムコピーであり得る。
【００５８】
一実施形態において、ベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、またはレンチウイルスベクターである。一実施形態において、ＡＡＶベクターは、シュードタイプである。一実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ５、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｈｕ．２０、ＡＡＶｈｕ．４３、ＡＡＶｈｕ．８、ＡＡＶｈｕ．２、またはＡＡＶ７カプシドを用いたシュードタイプである。一実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ５を用いたシュードタイプである。一実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶｒｈ．１０である。上述の遺伝子治療ベクターの量を含む薬学的組成物がさらに提供される。ウイルスベクターの用量は、約１×１０１１〜約１×１０１６ゲノムコピー、約１×１０１２〜約１×１０１５ゲノムコピー、約１×１０１１〜約１×１０１３ゲノムコピー、または約１×１０１３〜約１×１０１５ゲノムコピーであり得る。
【００５９】
本発明の一実施形態において、組成物は、哺乳動物に１回投与される。組成物の単回投与は、最小限の副作用で、哺乳動物における持続的な発現をもたらすと考えられる。しかしながら、特定の場合において、細胞の組成物への十分な曝露を確実にするために、治療期間中に組成物を複数回投与することが適切な場合がある。例えば、組成物は、治療期間中、哺乳動物に２回以上（例えば、２、３、４、５、６、６、８、９、または１０回、またはそれ以上）投与することができる。
【００６０】
例示的な実施形態
本開示は、疾患を予防、抑制、または治療するための臓器機能の制御に有用な材料および方法を提供する。一態様において、本方法は、臓器へのウイルスベクターの送達を提供し、次いで、ウイルスベクターが、それらの臓器の機能を調節する神経軸索によって取り込まれる。一実施形態において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。一実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の逆行形態は、胃壁に注射されると、胃の膨張に応答し、満腹感を引き起こす迷走神経感覚ニューロンのサブセットに特異的に取り込まれる。これは、他の内臓臓器に感覚を提供する他の結節ニューロンに影響を与えずに、下神経節から発するニューロンの特定のサブセットを表す。ウイルスベクターはまた、逆行レンチウイルス（ＬＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、またはイヌアデノウイルス（ＣＡＶ）ベクターを含むが、これらに限定されない他の形態の逆行ベクターであり得る。
【００６１】
本開示はまた、標的ニューロンへの逆行取り込みのための改善された特性を有するウイルスベクターを提供する。このベクターは、ＡＡＶの１つの血清型、例えば、ＡＡＶ血清型２からのカプシドタンパク質の混合物を含有するカプシドを含有し、点変異は逆行取り込み（レトロＡＡＶ）を増加させ（Ｔｅｖｒｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ９２：３７２−３７８（２０１６）、参照により本明細書に組み込まれる）、ＡＡＶの異なる血清型、例えばＡＡＶ血清型ｒｈ１０由来のカプシドタンパク質を含有する。このカプシド混合物は、レトロＡＡＶ由来のタンパク質のみを含有するカプシドと比較して、求心性ニューロンへの逆行取り込みおよび効率を劇的に向上させたウイルスベクターを作製する。このベクターは、臓器機能の効率的な制御を提供する。
【００６２】
本開示はまた、臓器機能の調節された制御のための方法を提供する。この方法は、概して、逆行ベクターを介して、臓器に求心するニューロンへの遺伝子の送達を含み、その産物は、外部薬物または刺激に応答して臓器機能を制御する。一例において、この方法を使用して、満腹感を誘導し、体重を制御するために食物摂取を低減することができる。この例において、ニューロンを活性化する、デザイナードラッグによってのみ活性化されるデザイナー受容体（ＤＲＥＡＤＤ）を発現する逆行ＡＡＶ（レトロＡＡＶ）が、胃壁に注射され、胃に求心し、胃の拡張および満腹感に応答する迷走感覚ニューロンに取り込まれる。ＤＲＥＡＤＤ活性化因子、例えば、クロザピン−Ｎ−オキシド（ＣＮＯ）の全身投与後、満腹感が誘導され、食物摂取が減少する。他の例としては、これらのニューロンへの興奮性化学遺伝学的イオンチャネルの送達、続いて適切な薬物での活性化、または興奮性光遺伝学的イオンチャネルＣｈＲ２の送達、続いてＣｈＲ２を活性化するための神経線維への光送達が挙げられる。別の例において、この方法は、他に治療可能な疾患に起因しない難治性咳を制御するために使用される。この例において、阻害性ＤＲＥＡＤＤを発現する逆行ＡＡＶをエアロゾル化し、肺の迷走感覚ニューロンへの取り込みのために吸入し、続いて、ＤＲＥＡＤＤ活性化因子、例えば、ＣＮＯを全身投与して、これらの感覚ニューロンの活性を阻害し、咳の反射を低減させる。
【００６３】
本開示はまた、毒性タンパク質の移入を防止する迷走神経への遺伝子の移入を介して、胃腸管から脳への毒性タンパク質の拡散を防止する方法を提供する。これは、下神経節等の迷走神経の感覚神経節にウイルスベクターを直接注射することによって、または迷走神経背側運動核等の脳内の迷走神経遠心性細胞体にウイルスベクターを直接注射することによって、または胃腸管の壁にウイルスベクターを注射することによって、または経口投与によって行われ得て、次いで、かかるベクターは、迷走神経軸索に取り込まれ、逆行輸送され、細胞体内で治療剤を発現させる。一例において、標的ニューロン中のα−シヌクレインタンパク質の発現を防止する、α−シヌクレインに対して指向されるｓｈＲＮＡは、胃および／または腸の壁への注射を通じて迷走神経感覚線維に送達されるウイルスの逆行形態、例えば、レトロＡＡＶ／ｒｈ１０ベクターから発現される。迷走神経の感覚ニューロン内で得られるｓｈＲＮＡの発現は、これらのニューロン内の内因性α−シヌクレインの発現を遮断し、その結果、毒性シヌクレイン病理の伝播にはニューロン内での発現が必要であるため、パーキンソン病において観察される広範な脳病理をもたらす、胃腸管における病的な原線維からの毒性シヌクレイン病理の拡散を防止する。別の例において、胃腸管を通して送達される迷走神経感覚線維内のレトロＡＡＶ／ｒｈ１０ベクターは、拡散を防止するために、α−シヌクレインタンパク質に対して指向する抗体を発現する。
【００６４】
一実施形態において、臓器機能を制御する神経線維に遺伝子を送達する方法が提供され、この方法は、調節神経によって神経支配される標的臓器の領域に遺伝子治療ベクターを送達する工程を含む。一実施形態において、神経線維は、迷走神経、心肺神経、胸内臓神経、腰内臓神経、仙骨内臓神経および骨盤内臓神経からなる群から選択される。一実施形態において、臓器は、胃、腸、膵臓、肝臓、肺、心臓、副腎、腎臓、性腺、膀胱、肛門括約筋および尿道括約筋からなる群から選択される。一実施形態において、遺伝子治療ベクターは、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスからなる群から選択されるウイルスベクターである。一実施形態において、遺伝子治療ベクターは、アデノ随伴ウイルスおよびレンチウイルスならびにイヌアデノウイルスの逆行形態を含む、中枢神経系における逆行輸送のために選択される改変ウイルスベクターである。
【００６５】
一実施形態において、ニューロン活性を調節することができる遺伝子を、ニューロン内の取り込みおよび逆行輸送のために臓器に遺伝子治療ベクターを注射することによって、臓器を制御する神経に送達する工程を含む、疾患を改善するために臓器の機能を調節する方法が提供される。一実施形態において、神経線維は、迷走神経、心肺神経、胸内臓神経、腰内臓神経、仙骨内臓神経および骨盤内臓神経からなる群から選択される。一実施形態において、臓器は、胃、腸、膵臓、肝臓、肺、心臓、副腎、腎臓、性腺、膀胱、肛門括約筋および尿道括約筋からなる群から選択される。一実施形態において、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスからなる群から選択されるウイルスベクター。一実施形態において、アデノ随伴ウイルスおよびレンチウイルスならびにイヌアデノウイルスの逆行形態を含む、中枢神経系における逆行輸送のために選択される改変ウイルスベクターが使用される。一実施形態において、送達される遺伝子は、外因性の作用物質または刺激に応答して臓器を制御する神経の活性を調節する。一実施形態において、送達される遺伝子は、１つ以上の光感受性イオンチャネル（光遺伝学）、化学応答性イオンチャネル（化学遺伝学）、超音波感受性イオンチャネル（超音波遺伝学（sonogenetics））、磁場応答性イオンチャネル（磁気遺伝学）、または、デザイナードラッグによってのみ活性化されるデザイナー受容体（ＤＲＥＡＤＤ）をコードする。
【００６６】
一実施形態において、ベクターを内臓臓器に注射することによって迷走神経線維にウイルスベクターを送達して食物摂取を低減させる工程によって、食物摂取を制御する方法が提供される。一実施形態において、臓器は、胃、十二指腸または小腸である。一実施形態において、送達される遺伝子は、外因性の作用物質または刺激に応答して臓器を制御する神経の活性を調節する。一実施形態において、送達される遺伝子は、光感受性イオンチャネル（光遺伝学）、化学応答性イオンチャネル（化学遺伝学）、超音波感受性イオンチャネル（超音波遺伝学）、磁場応答性イオンチャネル（磁気遺伝学）、または、デザイナードラッグによってのみ活性化されるデザイナー受容体（ＤＲＥＡＤＤ）のうちの１つ以上をコードする。
【００６７】
一実施形態において、ウイルスベクターの吸入を介して肺の神経線維にウイルスベクターを送達する工程によって咳を予防する方法が提供される。一実施形態において、送達される遺伝子は、外因性の作用物質または刺激に応答して臓器を制御する神経の活性を調節する。一実施形態において、遺伝子は、光感受性イオンチャネル（光遺伝学）、化学応答性イオンチャネル（化学遺伝学）、超音波感受性イオンチャネル（超音波遺伝学）、磁場応答性イオンチャネル（磁気遺伝学）、または、デザイナードラッグによってのみ活性化されるデザイナー受容体（ＤＲＥＡＤＤ）のうちの１つ以上を含む１つ以上のタンパク質をコードする。
【００６８】
一実施形態において、改善された逆行送達および内臓臓器を制御するニューロンへの取り込みのためのウイルスベクターが提供される。一実施形態において、ベクターは、例えばＡＡＶ  レトロおよびＡＡＶｒｈ１０由来のカプシドの混合物を含むカプシドを有するアデノ随伴ウイルスベクターを含む。
【００６９】
一実施形態において、毒性タンパク質の拡散を遮断することができる遺伝子を発現する迷走神経へのウイルスベクターの送達を介して、胃腸管から脳への毒性タンパク質の拡散を防止する方法が提供される。一実施形態において、ウイルスベクターは、胃腸系から逆行性に取り込まれる。一実施形態において、標的とされる毒性タンパク質は、α−シヌクレイン、タウ、β−アミロイド、またはハンチンチンからなる群から選択される。一実施形態において、毒性タンパク質の拡散を防止するために迷走神経から発現される遺伝子は、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ＣｒｉｓｐＲ／Ｃａｓ９、抗体、一本鎖抗体、またはイントラボディからなる群から選択される。
【００７０】
一実施形態において、哺乳動物において咳を予防、抑制、または治療する方法が提供される。本方法は、例えば、外因性の作用物質の投与またはエネルギーの送達によってタンパク質の活性が阻害されるタンパク質をコードする遺伝子を含むウイルスベクターを含む組成物を、哺乳動物の肺を神経支配する副交感神経線維に対して間接的に送達する工程（例えば、注射する工程）と、哺乳動物において咳を予防、抑制、または治療するのに有効な量で、作用物質またはエネルギーに哺乳動物を曝露する工程と、を含む。一実施形態において、組成物は、吸入によって投与される。一実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。一実施形態において、哺乳動物は、特発性咳または難治性咳を有する。一実施形態において、哺乳動物は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）または胃逆流を有する。一実施形態において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、または単純ヘルペスウイルスベクターである。一実施形態において、ウイルスは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、またはイヌアデノウイルスの逆行形態である。一実施形態において、ウイルスは、逆行輸送のために改変される。一実施形態において、ＡＡＶは、２つ以上のＡＡＶ血清型由来のタンパク質を含むカプシドを有する。一実施形態において、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ２およびＡＡＶｒｈ１０である。一実施形態において、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ５およびＡＡＶｒｈ１０である。一実施形態において、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ２およびＡＡＶ５である。一実施形態において、遺伝子は、光感受性イオンチャネル（光遺伝学）、化学応答性イオンチャネル（化学遺伝学）、超音波感受性イオンチャネル（超音波遺伝学）、磁場応答性イオンチャネル（磁気遺伝学）、または、デザイナードラッグによってのみ活性化されるデザイナー受容体（ＤＲＥＡＤＤ）をコードする。
【００７１】
一実施形態において、咳を予防、抑制、または治療する方法が提供され、方法は、有効量の遺伝子を含むウイルスベクターを含む組成物を含む組成物を、哺乳動物の肺の神経線維に送達する工程を含む。一実施形態において、遺伝子の発現は、ニューロン活性を阻害する。一実施形態において、遺伝子は、ＤＲＥＡＤＤもしくはいくつかの他の化学遺伝学的チャネル、ニューロンを阻害するためのＧＡＢＡの産生のためのＧＡＤ、または励起タンパク質もしくはチャネルを遮断するためのｓｉＲＮＡをコードする。一実施形態において、組成物は、吸入または注射を介して、例えば迷走神経または下神経節に直接投与される。一実施形態において、遺伝子は、外因性の作用物質または刺激に応答して臓器を制御する神経の活性を調節する。一実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。一実施形態において、哺乳動物は、特発性咳または難治性咳を有する。一実施形態において、哺乳動物は、ＣＯＰＤまたは胃逆流を有する。一実施形態において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、または単純ヘルペスウイルスベクターである。一実施形態において、ウイルスは、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、またはイヌアデノウイルスの逆行形態である。一実施形態において、ウイルスは、逆行輸送のために改変される。一実施形態において、遺伝子は、光感受性イオンチャネル（光遺伝学）、化学応答性イオンチャネル（化学遺伝学）、超音波感受性イオンチャネル（超音波遺伝学）、磁場応答性イオンチャネル（磁気遺伝学）、または、デザイナードラッグによってのみ活性化されるデザイナー受容体（ＤＲＥＡＤＤ）をコードする。一実施形態において、ウイルスベクターは、２つ以上の異なるＡＡＶカプシド血清型を含むキメラアデノ随伴ウイルスカプシドを含むｒＡＡＶである。一実施形態において、バイタルベクターは、迷走性求心物質を形質導入する。一実施形態において、ＡＡＶ血清型のうちの１つは、ＡＡＶ２を含む。一実施形態において、ＡＡＶ血清型のうちの１つは、ＡＡＶｒｈ１０を含む。
【００７２】
一実施形態において、哺乳動物において内臓臓器機能を制御するために神経線維に遺伝子を送達する方法が提供される。一実施形態において、内臓臓器は、脳または筋肉を含まない。本方法は、タンパク質をコードする遺伝子を含むウイルスベクターを含む組成物を、調節神経によって神経支配される哺乳動物の臓器のうちの１つ以上の領域に送達する工程であって、タンパク質の活性が、外因性の作用物質の投与またはエネルギーの送達によって阻害される、工程と、作用物質またはエネルギーを有効量で哺乳動物に曝露する工程と、を含む。一実施形態において、神経線維は、迷走神経、心肺神経、胸内臓神経、腰内臓神経、仙骨内臓神経、または骨盤内臓神経である。一実施形態において、制御される哺乳動物の臓器は、胃、腸、膵臓、肝臓、肺、心臓、副腎、腎臓、性腺、膀胱、肛門括約筋、または尿道括約筋である。一実施形態において、組成物は、胃、腸、膵臓、肝臓、肺、心臓、副腎、腎臓、性腺、膀胱、肛門括約筋もしくは尿道括約筋、または血管、管もしくは他の空洞に投与される。一実施形態において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、または単純ヘルペスウイルスベクターである。一実施形態において、ウイルスベクターは、ニューロンにおける逆行輸送を提供する。一実施形態において、ウイルスは、中枢神経系における逆行輸送を提供するように改変される。一実施形態において、ウイルスは、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、またはイヌアデノウイルスの逆行形態である。一実施形態において、遺伝子は、外因性の作用物質または刺激に応答して臓器を制御する神経の活性を調節する。一実施形態において、遺伝子は、光感受性イオンチャネル（光遺伝学）、化学応答性イオンチャネル（化学遺伝学）、超音波感受性イオンチャネル（超音波遺伝学）、磁場応答性イオンチャネル（磁気遺伝学）、または、デザイナードラッグによってのみ活性化されるデザイナー受容体（ＤＲＥＡＤＤ）をコードする。一実施形態において、遺伝子は、チャネルロドプシン、例えば、ＴＲＥＫ−１、ニコチン性アセチルコリン受容体、グラミシジンＡ、電圧依存性カリウムチャネル、イオンチャネル型グルタミン酸受容体、ＮａＶ１．５、ＫＣＮＱ１、ＫＣＮＡ、ＭＥＣ−４、ＤＥＧ／ＥＮａＣ／ＡＳＩＣイオンチャネル、または機械受容イオンチャネル（ＭｓｃＬ）、例えば、ＴＲＰＶ４をコードする。一実施形態において、組成物は、迷走神経に送達される。一実施形態において、投与される量は、哺乳動物における食物摂取の制御を可能にする。一実施形態において、内臓臓器は、胃、十二指腸または小腸である。一実施形態において、遺伝子は、哺乳動物の迷走神経への毒性タンパク質の拡散を遮断することができる遺伝子産物をコードする。一実施形態において、ウイルスベクターは、胃腸系から逆行性に取り込まれる。一実施形態において、毒性タンパク質は、α−シヌクレイン、タウ、β−アミロイド、またはハンチンチンを含む。一実施形態において、遺伝子は、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ＣｒｉｓｐＲ／Ｃａｓ９、抗体、一本鎖抗体、またはイントラボディをコードする。一実��形態において、投与される量によって、哺乳動物において胃腸管から脳への毒性タンパク質の拡散が防止または阻害される。一実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。一実施形態において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、または単純ヘルペスウイルスベクターである。一実施形態において、ウイルスは、中枢神経系における逆行輸送を提供するように改変される。一実施形態において、ウイルスは、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、またはイヌアデノウイルスの逆行形態である。一実施形態において、ＡＡＶ血清型のうちの１つは、ＡＡＶ２を含む。一実施形態において、ＡＡＶ血清型のうちの１つは、ＡＡＶｒｈ１０を含む。一実施形態において、ウイルスベクターは、２つ以上の異なるＡＡＶカプシド血清型を含むキメラアデノ随伴ウイルスカプシドを含むｒＡＡＶである。一実施形態において、投与される量によって、哺乳動物の内臓臓器における疾患が予防、抑制、または治療される。
【００７３】
一実施形態において、２つ以上の異なるＡＡＶ血清型からのカプシドタンパク質から形成されるカプシド（キメラＡＡＶカプシド）を含むｒＡＡＶが提供される。一実施形態において、血清型のうちの１つは、ＡＡＶ２を含む。一実施形態において、血清型のうちの１つは、ＡＡＶｒｈ１０を含む。一実施形態において、カプシド血清型の一方はＡＡＶ２を含み、他方はＡＡＶｒｈ１０を含む。一実施形態において、カプシド血清型の一方はＡＡＶ２を含み、他方はＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９を含む。一実施形態において、カプシド血清型の一方はＡＡＶｒｈ１０を含み、他方はＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９を含む。一実施形態において、カプシド血清型の一方はＡＡＶ５を含み、他方はＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９を含む。一実施形態において、カプシド血清型の一方はＡＡＶ９を含み、他方はＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ５、またはＡＡＶ８を含む。一実施形態において、カプシド血清型のうちの１つは、逆行送達を提供する。一実施形態において、ｒＡＡＶは、治療用遺伝子産物、予防用遺伝子産物または外因的に活性化可能なタンパク質をコードする。
【００７４】
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに説明される。
【実施例】
【００７５】
実施例１
図は、調節された遺伝子治療を介して摂食挙動を制御する方法を示す。肥満は、最も一般的な公衆衛生上の問題の１つである。世界中で７億人を超える肥満（ＢＭＩ＞３０ｋｇ／ｍ２）の罹患率は、過去２５年間で倍増している（ＧＢＤ  ｏｂｅｓｉｔｙ  ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｓ、Ｈｅａｌｔｈ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｏｖｅｒｗｅｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｏｂｅｓｉｔｙ  ｉｎ  １９５  Ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ  Ｏｖｅｒ  ２５  ｙｅａｒｓ、ＮＥＪＭ  ３７７：１３、２０１７）。米国でＢＭＩ＞３０の７８００万人を超える肥満は、糖尿病、心血管疾患、およびがんを含む多数の疾患の寿命の短縮およびリスクの増加に関連している。重度の肥満（＞４０ｋｇ／ｍ２）は、強い満たされていない需要を有しつつ、急速に増える集合を表す。２０１０年に米国で約１，５００万人、２０２５年までに米国で２，５００万まで増加すると予測されている（Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ、ｅｔ  ａｌ  Ｏｂｅｓｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｅｖｅｒｅ  Ｏｂｅｓｉｔｙ  Ｆｏｒｅｃａｓｔｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ２０３０、Ａｍ  Ｊ  Ｐｒｅｖ  Ｍｅｄ  ４２：５６３、２０１２）。過剰な体重が５〜１５％減少すると、無作為化試験における心血管疾患および他の疾患の危険因子が低減する（Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｏｎ  Ｇｅｎｅｒａｌ、Ｃａｌｌ  ｔｏ  Ａｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｅｖｅｎｔ  ａｎｄ  Ｄｅｃｒｅａｓｅ  Ｏｖｅｒｗｅｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｏｂｅｓｉｔｙ、２００１）。
【００７６】
肥満外科手術は、重度の肥満を有する患者にとって現在の主要な選択肢である。最も一般的な手技は、胃のサイズを低減し、早期の満腹感を誘導するためのスリーブ状胃切除術である。１５００〜２５００万人が手術基準（ＢＭＩ＞４０、または深刻な体重に関連する健康問題を有するＢＭＩ３０〜４０）を満たしているにもかかわらず、２０１７年に米国では２２８，０００件の肥満外科手術が実施された（ｈｔｔｐｓ：／／ａｓｍｂｓ．ｏｒｇ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｅｓｔｉｍａｔｅ−ｏｆ−ｂａｒｉａｔｒｉｃ−ｓｕｒｇｅｒｙ−ｎｕｍｂｅｒｓ）。１４％以上が、再手術であった。外科手術後のレジメンには、通常の食事に戻る前に、１〜３日入院し、その後７日間は液体のみ、３週間はピューレ状の食物が必要である（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍａｙｏｃｌｉｎｉｃ．ｏｒｇ／ｔｅｓｔｓ−ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ／ｓｌｅｅｖｅ−ｇａｓｔｒｅｃｔｏｍｙ／ａｂｏｕｔ／ｐａｃ−２０３８５１８３）。吸収不良のため、毎日のマルチビタミンおよびカルシウムのサプリメントならびに毎月のＢ１２注射が生活のために必要である。肥満外科手術は、１３〜２１％の合併症発生率を伴っていた。低侵襲性の遺伝子治療アプローチは、術後の管理を必要とせずかつ外科的合併症の危険性が最小限である、外来患者処置選択肢を提供するであろう。
【００７７】
図１は、迷走神経の背核を標的とするための胃腸管へのＡＡＶ送達のデータ、迷走神経の背核におけるｍＣｈｅｒｒｙシグナルを示す。様々なＡＡＶベクターを、胃体部に注射し（１×１０１２ｐ／ｍｌ）、蛍光標識したコレラ毒素サブユニットＢ（ＣＴＢ−５９４）を陽性対照として注射した。手術の当日、マウスは、胃腸管の求心性ニューロンおよび遠心性ニューロンの細胞体を標識するために、逆行性トレーサーＦｌｕｏｒｏｇｏｌｄの腹腔内注射も受けた。手術後４週間の下神経節および脳を、ＡＡＶベクターによるニワトリβ−アクチンプロモーター制御下でのカセットとして発現される（ＡＡＶ．ＣＢＡ．ｍＣｈｅｒｒｙ）ｍＣｈｅｒｒｙレッド蛍光タンパク質の組織学的分析のために採取した。
【００７８】
図２は、迷走神経の背核を標的とするための胃腸管へのＡＡＶ送達、下神経節におけるｍＣｈｅｒｒｙシグナルを示す。様々なＡＡＶベクターを、胃体部に注射し（１×１０１２ｐ／ｍｌ）、蛍光標識したコレラ毒素サブユニットＢ（ＣＴＢ−５９４）を陽性対照として注射した。手術の当日、マウスは、胃腸管の求心性ニューロンおよび遠心性ニューロンの細胞体を標識するために、逆行性トレーサーＦｌｕｏｒｏｇｏｌｄの腹腔内注射も受けた。手術後４週間の下神経節および脳を、ＡＡＶベクターによるニワトリβ−アクチンプロモーター制御下でのカセットとして発現される（ＡＡＶ．ＣＢＡ．ｍＣｈｅｒｒｙ）ｍＣｈｅｒｒｙレッド蛍光タンパク質の組織学的分析のために採取した。
【００７９】
図３は、１ｍｇ／ｋｇのＣＮＯを用いた絶食マウスにおける摂食挙動のデータであり、図４は、１ｍｇ／ｋｇのＣＮＯを用いた通常給餌マウスにおける摂食挙動のデータである。
【００８０】
ウイルスベクターを送達して臓器機能を制御する１つのアプローチを図５に示す。例えば、ｈＭ３ＤｑをコードするｒＡＡＶを有する組成物（例えば、ＤＲＥＡＤＤ  ｈＭ３Ｄｑに改変された図１６の配列番号１０または１１を参照されたい）は、内視鏡的または腹腔鏡的に、例えば、一実施形態において迷走求心性神経へのウイルス送達を可能にする、胃のより大きな曲率に送達され得る。いくつかの実施形態において、投与は、迷走遠心性神経または運動ニューロンへの送達を可能にし得る。一実施形態において、組成物は、心臓、肝臓、肺、副腎、甲状腺、膵臓、腸、腎臓、膀胱、または脾臓を含むが、これらに限定されない内臓臓器に送達される。
【００８１】
一実施形態において、キメラＡＡＶカプシドは、１つのＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ２）と別のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶｒｈ１０カプシド）との０．１：１、０．５：１、１：１、１：３、１：４、１：５、１：１５、１：２０、１：５０、１：１００、１：５００の比率を含む。
【００８２】
実施例２
咳の反射は、通常、肺の気道内の潜在的な閉塞性または感染性の作用因子を排出するために重要である。難治性咳は、通常、胃逆流、喘息からの慢性炎症、または慢性閉塞性肺疾患もしくは悪性腫瘍等の咳の根本的な原因に対処しようとすることによって治療される。しかしながら、多くの人々にとって、慢性咳は、対処することができる明らかに継続的な刺激物も刺激もなく、主要な問題である。これは、回復させる必要があるが、多くは回復させることができる異常がないために疼痛自体に対処する必要がある、根本的な病態に起因する可能性がある、難治性疼痛と同様である。可逆性の病態を伴わない難治性咳を有する患者では、治療の選択肢はほとんどない。咳を抑えるために麻薬を使用することができるが、これらは特に慢性的な使用で大きな発病率を有している。
【００８３】
動物モデルにおける咳を抑えるために、阻害性ＤＲＥＡＤＤ  ｈＭ４Ｄｉを発現するレトロＡＡＶ２／ｒｈ１０（１×１０１２ｐ／ｍｌ）（例えば、ＤＲＥＡＤＤ  ｈＭ４Ｄｉに改変された図１６のＭ４についての配列番号１２を参照されたい）をエアロゾル化し、モルモットの気管および上部気道に噴霧する。モルモットは、強固な咳反射を示すために利用され、一方、ラットおよびマウスは、効果的な咳反射を有しない。曝露の６週間後、免疫染色を使用した組織学的評価は、気管および上気道に感覚を提供する下神経節内のニューロンの部分集合内での阻害性オプシンの発現を確認する。次に、モルモットの第２の群を２つのコホートに分ける。１つのコホートは、上部気道に噴霧した同じレトロＡＡＶ２／ｒｈ１０．ｈＭ４Ｄｉエアロゾル化ベクターを再び摂取し、第２のコホートは、陰性対照としてｍＣｈｅｒｒｙを発現するレトロＡＡＶ２／ｒｈ１０を摂取する。６週間後、動物を、閉じたプレキシガラスチャンバーに配置する。このチャンバーには、咳によるチャンバー内の空気圧の変化をアッセイするための圧力モニターが含まれており、また、咳の音を捕捉することができるマイクも含まれている。これらは、咳の頻度、全体的な数および強度を継続的に監視することを可能にし、モニターは、音と圧力の両方の変化が一致したときに真の咳が生じることを確認するために、時間をロックした。咳を誘導するために、次いで、チャンバーに５Ｌ／分の速度で噴霧した２Ｍクエン酸が充填され、これは、動物に永久的な傷害を引き起こさないが、気道を刺激し、咳を引き起こすように十分に希釈される。その後、両方のコホートをこの酸ガスに曝露し、両方の群の咳の数、頻度、および強度を１０分間にわたって評価して、ベースライン時の群間に差がないことを確認する。未処理のモルモットの第３の群をクエン酸チャンバーに曝露して、逆行ベクターおよびエアロゾル化スプレーの存在が、ナイーブ動物と比較してベースライン咳に影響しないことを確認する。第２のセッションでは、すべてのコホートは、次に、酸ガスチャンバに配置される３０分前に１ｍｇ／ｋｇのＣＮＯを与えられる。その後、咳の数、頻度および強度を定量化し、ビヒクル条件下およびＣＮＯ条件下で、群間および群内の両方を比較する。これにより、阻害性ＤＲＥＡＤＤを含むＡＡＶを摂取したモルモットが、ＣＮＯ制御因子の投与後に、ＣＮＯの投与前と比較して、ｍＣｈｅｒｒｙおよびナイーブ対照群と比較して、酸ガスに曝露したときに咳が低減したことが確認される。
【００８４】
すべての刊行物、特許、および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。上の明細書では、本発明はその特定の実施形態に関連して記載されており、多くの詳細は例示のために記載されているが、本発明は追加の実施形態の影響を受けやすく、本明細書の特定の詳細は、本発明の基本原理から逸脱することなくかなり変化し得ることは当業者には明白であろう。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
2021533126.tif 000008
【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
2021533126.tif 000011
【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０】
2021533126.tif 000021
【図１１】
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【図１２Ａ】
2021533126.tif 000023
【図１２Ｂ】
2021533126.tif 000024
【図１３Ａ】
2021533126.tif 000025
【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
2021533126.tif 000029
【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１３Ｈ】
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【図１３Ｉ】
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【図１３Ｊ】
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【図１３Ｋ】
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【図１３Ｌ】
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【図１３Ｍ】
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【図１３Ｎ】
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【図１３Ｏ】
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【図１３Ｐ】
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【図１３Ｑ】
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【図１３Ｒ】
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【図１３Ｓ】
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【図１３Ｔ】
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【図１３Ｕ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１５Ｆ】
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【図１５Ｇ】
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【図１５Ｈ】
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【図１５Ｉ】
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【図１５Ｊ】
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【図１５Ｋ】
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【図１５Ｌ】
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【図１５Ｍ】
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【図１５Ｎ】
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【図１５Ｏ】
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【図１５Ｐ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年4月5日(2021.4.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021533126000001.app
【国際調査報告】
2021533126.tif 000066
2021533126.tif 000067
2021533126.tif 000068
2021533126.tif 000069