(57)【要約】  本発明は、ＢＣＭＡ発現癌などのＢ細胞関連状態を治療するための抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の使用を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＣＭＡ発現細胞を枯渇させることを、それを必要とする対象において行う方法であって、前記対象に、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞の治療上有効な量を投与することを含み、前記免疫細胞は、１５０×１０６細胞〜４５０×１０６細胞の投薬量で投与され、前記投与の前に、前記対象は、プロテアソーム阻害薬、レナリドミド、ポマリドミド、サリドマイド、ボルテゾミブ、デキサメタゾン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、カルフィルゾミブ、イキサゾミブ、シスプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、抗ＣＤ３８抗体、パノビノスタット、及びエロツズマブのうちの１つ以上を含む前治療ラインを１つ以上受けたことがある、前記方法。
【請求項２】
ＢＣＭＡ発現細胞によって引き起こされる疾患を治療することを、それを必要とする対象において行う方法であって、前記対象に、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞の治療上有効な量を投与することを含み、前記免疫細胞は、１５０×１０６細胞〜４５０×１０６細胞の投薬量で投与され、前記投与の前に、前記対象は、プロテアソーム阻害薬、レナリドミド、ポマリドミド、サリドマイド、ボルテゾミブ、デキサメタゾン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、カルフィルゾミブ、イキサゾミブ、シスプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、抗ＣＤ３８抗体、パノビノスタット、及びエロツズマブのうちの１つ以上を含む前治療ラインを１つ以上受けたことがある、前記方法。
【請求項３】
ＢＣＭＡを発現するがんを治療することを、それを必要とする対象において行う方法であって、前記対象に、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞の治療上有効な量を投与することを含み、前記免疫細胞は、１５０×１０６細胞〜４５０×１０６細胞の投薬量で投与され、前記投与の前に、前記対象は、プロテアソーム阻害薬、レナリドミド、ポマリドミド、サリドマイド、ボルテゾミブ、デキサメタゾン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、カルフィルゾミブ、イキサゾミブ、シスプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、抗ＣＤ３８抗体、パノビノスタット、及びエロツズマブのうちの１つ以上を含む前治療ラインを１つ以上受けたことがある、前記方法。
【請求項４】
前記ＢＣＭＡを発現するがんが、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、または非ホジキンリンパ腫（例えば、バーキットリンパ腫、慢性リンパ性白血病／小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、及びマントル細胞リンパ腫）である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記対象が、ハイリスク多発性骨髄腫である多発性骨髄腫を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記対象が、再発難治性多発性骨髄腫である多発性骨髄腫を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記投与の前に、前記対象が、
ａ．ダラツムマブ、ポマリドミド、及びデキサメタゾン（ＤＰｄ）；
ｂ．ダラツムマブ、ボルテゾミブ、及びデキサメタゾン（ＤＶｄ）；
ｃ．イキサゾミブ、レナリドミド、及びデキサメタゾン（ＩＲｄ）；
ｄ．ダラツムマブ、レナリドミド及びデキサメタゾン；
ｅ．ボルテゾミブ、レナリドミド及びデキサメタゾン（ＲＶｄ）；
ｆ．ボルテゾミブ、シクロホスファミド及びデキサメタゾン（ＢＣｄ）；
ｇ．ボルテゾミブ、ドキソルビシン及びデキサメタゾン；
ｈ．カルフィルゾミブ、レナリドミド及びデキサメタゾン（ＣＲｄ）；
ｉ．ボルテゾミブ及びデキサメタゾン；
ｊ．ボルテゾミブ、サリドマイド及びデキサメタゾン；
ｋ．レナリドミド及びデキサメタゾン；
ｌ．デキサメタゾン、サリドマイド、シスプラチン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド及びボルテゾミブ（ＶＴＤ−ＰＡＣＥ）；
ｍ．レナリドミド及び低用量デキサメタゾン；
ｎ．ボルテゾミブ、シクロホスファミド及びデキサメタゾン；
ｏ．カルフィルゾミブ及びデキサメタゾン；
ｐ．レナリドミド単独；
ｑ．ボルテゾミブ単独；
ｒ．ダラツムマブ単独；
ｓ．エロツズマブ、レナリドミド、及びデキサメタゾン；
ｔ．エロツズマブ、レナリドミド及びデキサメタゾン；
ｕ．ベンダムスチン、ボルテゾミブ及びデキサメタゾン；
ｖ．ベンダムスチン、レナリドミド、及びデキサメタゾン；
ｗ．ポマリドミド及びデキサメタゾン；
ｘ．ポマリドミド、ボルテゾミブ及びデキサメタゾン；
ｙ．ポマリドミド、カルフィルゾミブ及びデキサメタゾン；
ｚ．ボルテゾミブ及びリポソーム化ドキソルビシン；
ａａ．シクロホスファミド、レナリドミド、及びデキサメタゾン；
ｂｂ．エロツズマブ、ボルテゾミブ及びデキサメタゾン；
ｃｃ．イキサゾミブ及びデキサメタゾン；
ｄｄ．パノビノスタット、ボルテゾミブ及びデキサメタゾン；
ｅｅ．パノビノスタット及びカルフィルゾミブ；または
ｆｆ．ポマリドミド、シクロホスファミド及びデキサメタゾンを含む前治療ラインを１つ以上受けたことがある、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記対象が、前記前治療ラインのうちの２つ以上を受けたことがある、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記対象が、前記前治療ラインのうちの３つ以上を受けたことがある、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象が、前記前治療ラインのうちの４つ以上を受けたことがある、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記対象が、前記前治療ラインのうちの５つ以上を受けたことがある、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記対象が、前記前治療ラインのうちの６つ以上を受けたことがある、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記対象が、前記前治療ラインのうちの７つ以上を受けたことがある、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
前記対象が、前記前治療ラインのうちの３つ以下しか受けていない、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
前記対象が、前記前治療ラインのうちの２つ以下しか受けていない、請求項７に記載の方法。
【請求項１６】
前記対象が、前記前治療ラインのうちの１つ以下しか受けていない、請求項７に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象が、前記投与の時点で、
ａ．血清Ｍタンパク質レベル（血清タンパク質電気泳動［ｓＰＥＰ］）が約０．５ｇ／ｄＬ以上、もしくは尿Ｍタンパク質レベル（尿タンパク質電気泳動［ｕＰＥＰ］）が約２００ｍｇ／２４時間以上、及び／または
ｂ．血清中もしくは尿中に測定可能な疾患がなく、血清免疫グロブリン遊離軽鎖が１０ｍｇ／ｄＬ以上であり、血清免疫グロブリンカッパラムダ遊離軽鎖比が異常である軽鎖多発性骨髄腫（ＭＭ）；及び／または
ｃ．米国東海岸がん臨床試験グループ（ＥＣＯＧ）パフォーマンスステータスが約１以下を示す、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記対象が、更に、
ａ．プロテアソーム阻害薬、免疫調節薬（レナリドミドまたはポマリドミド）及び抗ＣＤ３８抗体による前治療を含む、前記前治療ラインのうちの少なくとも３つを受けたことがあり；
ｂ．前記前治療ラインのうちの少なくとも３つのそれぞれについて、進行（ＰＤ）が治療ラインに対する最良効果でない限り、少なくとも連続２サイクル受けたことがあり；
ｃ．直近の前治療ラインの６０日目もしくは６０日以内の進行（ＰＤ）のエビデンスがあり；及び／または
ｄ．前記前治療ラインのうちの少なくとも１つに対する効果（最小奏効以上）が得られている、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記対象が、更に、
ａ．先に受けた抗骨髄腫治療が１レジメンのみであり；及び／または
ｂ．以下のハイリスク因子：Ｒ−ＩＳＳステージＩＩＩ及び早期再発を有し、前記早期再発は、（ｉ）前記対象が導入法と幹細胞移植を受けている場合、最初の移植日から１２ヶ月未満での進行；もしくは（ｉｉ）前記対象が導入法のみを受けている場合、少なくともプロテアソーム阻害薬、免疫調節薬及びデキサメタゾンを含有していなければならない最後の治療レジメン日から１２ヶ月未満での進行（ＰＤ）として定義される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象が、前記投与後、少なくとも６ヶ月の無増悪生存期間を示す、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象が、前記投与後、少なくとも１２ヶ月の無増悪生存期間を示す、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記キメラ抗原受容体が、ＢＣＭＡを標的とする抗体または抗体断片を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記キメラ抗原受容体が、一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）を含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記キメラ抗原受容体が、ＢＣＭＡ０２  ｓｃＦｖを含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記免疫細胞が、ｂｂ２１２１細胞である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年７月１１日出願の米国仮特許出願第６２／６９６，８０２号の利益を主張するものであり、その開示の全体は、参照により本明細書に援用される。
配列表
本出願には、ＡＳＣＩＩテキストファイルとして本出願とともに提出された配列表が参照により組み込まれる。当該配列表は、１４２４７−３２１−２２８＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔというタイトルで２０１９年７月３日に作成され、サイズは２７，３７９バイトである。
１．背景
１．１．技術分野
本発明は、Ｂ細胞関連状態を治療するための方法に関する。より詳細には、本発明は、マウス抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片を含む、改善されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、これらのＣＡＲを発現するように遺伝子改変された免疫エフェクター細胞、及びＢ細胞関連状態を効果的に治療するためのこれらの組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
１．２．関連技術の説明
いくつかの重要な疾患には、Ｂリンパ球、すなわち、Ｂ細胞が関与している。Ｂ細胞の異常な生理機能は、限定するものではないが、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を含む自己免疫疾患の発症につながることもある。Ｂ細胞の悪性形質転換は、限定するものではないが、リンパ腫、例えば、多発性骨髄腫及び非ホジキンリンパ腫を含むがんを引き起こす。
【０００３】
非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）及び多発性骨髄腫（ＭＭ）を含むＢ細胞悪性腫瘍を有する患者の大多数は、がん死亡件数の多くを占める。様々な治療形態に対するＢ細胞悪性腫瘍の応答は、まちまちである。化学療法及び放射線療法を含むＢ細胞悪性腫瘍の従来の治療方法は、有毒な副作用があるため、有用性が限られている。抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２２、抗ＣＤ２３、抗ＣＤ５２、抗ＣＤ８０、及び抗ＨＬＡ−ＤＲ治療用抗体による免疫療法は、部分的には、良好な薬物動態学プロファイルでないこと、血清プロテアーゼ及び糸球体での濾過によって抗体が迅速に排除されること、ならびに腫瘍部位への浸透及びがん細胞上の標的抗原の発現レベルが限定的であることにより、十分な成功を収めていない。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子改変細胞を使用する試みも、十分な成功を収めていない。加えて、ＣＡＲで使用される所与の抗原結合ドメインの治療有効性は、予測できないものであり、抗原結合ドメインの結合が強すぎれば、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、大量のサイトカイン放出を誘発し、「サイトカインストーム」とみなされる致命的な免疫反応を生じることがあり、抗原結合ドメインの結合が弱すぎれば、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、がん細胞を除去するのに十分な治療効果を示さない。
【発明の概要】
【０００４】
２．概要
本発明は、概して、Ｂ細胞関連疾患、例えば、多発性骨髄腫を治療する、改善された方法を提供する。
【０００５】
一実施形態において、本明細書で提供されるのは、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）発現細胞を枯渇させることを、それを必要とする対象において行う方法であって、対象に、ＢＣＭＡ指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞を投与することを含み、免疫細胞は、１５０×１０６細胞〜４５０×１０６細胞の投薬量で投与され、当該投与の前に、当該対象は、前治療ラインを１つ以上受けたことがある、方法である。
【０００６】
一実施形態において、本明細書で提供されるのは、ＢＣＭＡ発現細胞を枯渇させることを、それを必要とする対象において行う方法であって、対象に、ＢＣＭＡ指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞を投与することを含み、免疫細胞は、１５０×１０６細胞〜４５０×１０６細胞の投薬量で投与され、当該投与の前に、当該対象は、プロテアソーム阻害薬、レナリドミド、ポマリドミド、サリドマイド、ボルテゾミブ、デキサメタゾン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、カルフィルゾミブ、イキサゾミブ、シスプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、抗ＣＤ３８抗体、パノビノスタット、及びエロツズマブのうちの１つ以上を含む前治療ラインを１つ以上受けたことがある、方法である。一実施形態において、抗ＣＤ３８抗体は、ダラツムマブである。
【０００７】
一実施形態において、本明細書で提供されるのは、ＢＣＭＡ発現細胞を枯渇させることを、それを必要とする対象において行う方法であって、対象に、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞の治療上有効な量を投与することを含み、免疫細胞は、１５０×１０６細胞〜４５０×１０６細胞の投薬量で投与され、当該投与の前に、当該対象は、プロテアソーム阻害薬、レナリドミド、ポマリドミド、サリドマイド、ボルテゾミブ、デキサメタゾン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、カルフィルゾミブ、イキサゾミブ、シスプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、抗ＣＤ３８抗体（ダラツムマブなど）、パノビノスタット、またはエロツズマブのうちの１つ以上を含む前治療ラインを１つ以上受けたことがある、方法である。
【０００８】
別の実施形態において、本明細書で提供されるのは、ＢＣＭＡ発現細胞によって引き起こされる疾患を治療することを、それを必要とする対象において行う方法であって、対象に、ＢＣＭＡ指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞を投与することを含み、免疫細胞は、１５０×１０６細胞〜４５０×１０６細胞の投薬量で投与され、当該投与の前に、当該対象は、前治療ラインを１つ以上受けたことがある、方法である。ある特定の実施形態において、本明細書に記載される方法に従って治療されるＢＣＭＡ発現細胞によって引き起こされる疾患には、全身性エリテマトーデス、リウマチ様関節炎、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、抗リン脂質抗体症候群、シャーガス病、グレーヴス病、ウェゲナー肉芽腫症、結節性多発動脈炎、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、多発性硬化症、抗リン脂質抗体症候群、ＡＮＣＡ関連血管炎、グッドパスチャー病、川崎病、及び急速進行性糸球体腎炎が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、本明細書に記載される方法に従って治療されるＢＣＭＡ発現細胞によって引き起こされる疾患にはまた、重鎖病、原発性または免疫細胞関連アミロイドーシス、及び意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０００９】
別の実施形態において、本明細書で提供されるのは、ＢＣＭＡ発現細胞によって引き起こされる疾患を治療することを、それを必要とする対象において行う方法であって、対象に、ＢＣＭＡ指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞を投与することを含み、免疫細胞は、１５０×１０６細胞〜４５０×１０６細胞の投薬量で投与され、当該投与の前に、当該対象は、プロテアソーム阻害薬、レナリドミド、ポマリドミド、サリドマイド、ボルテゾミブ、デキサメタゾン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、カルフィルゾミブ、イキサゾミブ、シスプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、抗ＣＤ３８抗体、パノビノスタット、及びエロツズマブのうちの１つ以上を含む前治療ラインを１つ以上受けたことがある、方法である。一実施形態において、抗ＣＤ３８抗体は、ダラツムマブである。
【００１０】
別の実施形態において、本明細書で提供されるのは、ＢＣＭＡ発現細胞によって引き起こされる疾患を治療することを、それを必要とする対象において行う方法であって、対象に、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞の治療上有効な量を投与することを含み、免疫細胞は、１５０×１０６細胞〜４５０×１０６細胞の投薬量で投与され、当該投与の前に、当該対象は、プロテアソーム阻害薬、レナリドミド、ポマリドミド、サリドマイド、ボルテゾミブ、デキサメタゾン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、カルフィルゾミブ、イキサゾミブ、シスプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、抗ＣＤ３８抗体（ダラツムマブなど）、パノビノスタット、またはエロツズマブのうちの１つ以上を含む前治療ラインをうちの１つ以上受けたことがある、方法である。
【００１１】
別の実施形態において、本明細書で提供されるのは、ＢＣＭＡを発現するがんを治療することを、それを必要とする対象において行う方法であって、対象に、ＢＣＭＡ指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞を投与することを含み、免疫細胞は、１５０×１０６細胞〜４５０×１０６細胞の投薬量で投与され、当該投与の前に、当該対象は、前治療ラインを１つ以上受けたことがある、方法である。
【００１２】
別の実施形態において、本明細書で提供されるのは、ＢＣＭＡを発現するがんを治療することを、それを必要とする対象において行う方法であって、対象に、ＢＣＭＡ指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞を投与することを含み、免疫細胞は、１５０×１０６細胞〜４５０×１０６細胞の投薬量で投与され、当該投与の前に、当該対象は、プロテアソーム阻害薬、レナリドミド、ポマリドミド、サリドマイド、ボルテゾミブ、デキサメタゾン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、カルフィルゾミブ、イキサゾミブ、シスプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、抗ＣＤ３８抗体、パノビノスタット、及びエロツズマブのうちの１つ以上を含む前治療ラインを１つ以上受けたことがある、方法である。一実施形態において、抗ＣＤ３８抗体は、ダラツムマブである。ある特定の実施形態において、ＢＣＭＡを発現するがんは、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、または非ホジキンリンパ腫（例えば、バーキットリンパ腫、慢性リンパ性白血病／小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、またはマントル細胞リンパ腫）である。
【００１３】
別の実施形態において、本明細書で提供されるのは、ＢＣＭＡを発現するがんを治療することを、それを必要とする対象において行う方法であって、対象に、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞の治療上有効な量を投与することを含み、免疫細胞は、１５０×１０６細胞〜４５０×１０６細胞の投薬量で投与され、当該投与の前に、当該対象は、プロテアソーム阻害薬、レナリドミド、ポマリドミド、サリドマイド、ボルテゾミブ、デキサメタゾン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、カルフィルゾミブ、イキサゾミブ、シスプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、抗ＣＤ３８抗体（ダラツムマブなど）、パノビノスタット、またはエロツズマブのうちの１つ以上を含む前治療ラインを１つ以上受けたことがある、方法である。ある特定の実施形態において、ＢＣＭＡを発現するがんは、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、または非ホジキンリンパ腫（例えば、バーキットリンパ腫、慢性リンパ性白血病／小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、またはマントル細胞リンパ腫）である。
【００１４】
別の実施形態において、本明細書で提供されるのは、ＢＣＭＡを発現するがんを治療することを、それを必要とする対象において行う方法であって、対象に、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞の治療上有効な量を投与することを含み、免疫細胞は、１５０×１０６細胞〜４５０×１０６細胞の投薬量で投与され、当該投与の前に、当該対象は、プロテアソーム阻害薬、レナリドミド、ポマリドミド、サリドマイド、ボルテゾミブ、デキサメタゾン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、カルフィルゾミブ、イキサゾミブ、シスプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、抗ＣＤ３８抗体（ダラツムマブなど）、パノビノスタット、またはエロツズマブのうちの１つ以上を含む前治療ラインを１つ以上受けたことがあり、ＢＣＭＡを発現するがんは、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、または非ホジキンリンパ腫（例えば、バーキットリンパ腫、慢性リンパ性白血病／小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、及びマントル細胞リンパ腫）である、方法である。
【００１５】
一実施形態において、本明細書で提供されるのは、再発性、難治性またはハイリスク多発性骨髄腫を治療することを、それを必要とする対象において行う方法であって、対象に、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞（例えば、自己由来Ｔ細胞）を投与することを含み、Ｔ細胞は、約１５０×１０６細胞〜約６００×１０６細胞の範囲の用量で投与（例えば、注入）され、当該投与の前に、当該対象は、プロテアソーム阻害薬、免疫調節薬（ＩＭｉＤ化合物など）、デキサメタゾン及び抗ＣＤ３８抗体のうちの１つ以上を含む前治療ラインを１つ以上（例えば、１つの前治療、２つの前治療、３つの前治療、３つを超える前治療）を受けたことがある、方法である。一実施形態において、本明細書で提供されるのは、再発性、難治性またはハイリスク多発性骨髄腫を治療することを、それを必要とする対象において行う方法であって、対象に、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞（例えば、自己由来Ｔ細胞）を投与することを含み、Ｔ細胞は、約１５０×１０６細胞〜約６００×１０６細胞の範囲の用量で投与（例えば、注入）され、当該投与の前に、当該対象は、プロテアソーム阻害薬、レナリドミド、ポマリドミド、サリドマイド、ボルテゾミブ、デキサメタゾン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、カルフィルゾミブ、イキサゾミブ、シスプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、及び抗ＣＤ３８抗体（ダラツムマブなど）、パノビノスタット、またはエロツズマブのうちの１つ以上を含む前治療ラインを１つ以上（例えば、１つの前治療、２つの前治療、３つの前治療、３を超える前治療）を受けたことがある、方法である。いくつかの実施形態において、対象は、多発性骨髄腫と診断されている。一実施形態において、対象は、ハイリスク多発性骨髄腫である多発性骨髄腫を有する。一実施形態において、対象は、再発難治性多発性骨髄腫である多発性骨髄腫を有する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法に従って治療される対象は、受けた前治療が１つのみである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法に従って治療される対象は、３〜７つの前治療を受けたことがある。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法に従って治療される対象は、３つを超える前治療を受けたことがある。いくつかの実施形態において、対象は、少なくとも１つ、２つまたは３つの治療レジメンに対して難治性である（例えば、最後に受けた前治療に対して難治性である）（例えば、対象が治療レジメンによる治療を完了してから６０日以内に進行を示した場合）。一実施形態において、方法は、再発難治性多発性骨髄腫を治療するためのものである。一実施形態において、方法は、再発性多発性骨髄腫を治療するためのものである。一実施形態において、方法は、難治性多発性骨髄腫を治療するためのものである。一実施形態において、対象は、プロテアソーム阻害薬、免疫調節薬（ＩＭｉＤ化合物など）、デキサメタゾン及び／または抗ＣＤ３８抗体による治療に対して難治性である。一実施形態において、方法は、ハイリスク多発性骨髄腫を治療するためのものである。いくつかの実���形態において、ハイリスク多発性骨髄腫は、Ｒ−ＩＳＳステージＩＩＩの疾患及び／または早期再発を特徴とする疾患（例えば、プロテアソーム阻害薬、免疫調節薬及び／またはデキサメタゾンによる最後の治療レジメンなどの最後の治療レジメン日から１２ヶ月以内の進行）である。一実施形態において、腫瘍を有する対象は、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞の投与前に、腫瘍によるＢＣＭＡの発現について評価されている。一実施形態において、ＢＣＭＡ発現多発性骨髄腫は、本明細書に記載される方法に従って治療される。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、静脈内注入によって投与される。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、１５０×１０６細胞〜４５０×１０６細胞、３００×１０６細胞〜６００×１０６細胞、３５０×１０６細胞〜６００×１０６細胞、３５０×１０６細胞〜５５０×１０６細胞、４００×１０６細胞〜６００×１０６細胞、１５０×１０６細胞〜３００×１０６細胞、または４００×１０６細胞〜５００×１０６細胞の範囲の用量で投与される。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、約１５０×１０６細胞、約２００×１０６細胞、約２５０×１０６細胞、約３００×１０６細胞、約３５０×１０６細胞、約４００×１０６細胞、約４５０×１０６細胞、約５００×１０６細胞、または約５５０×１０６細胞の用量で投与される。一実施形態において、Ｔ細胞は、約４５０×１０６細胞の用量で投与される。いくつかの実施形態において、対象は、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞の１回注入が投与される。いくつかの実施形態において、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞の投与は、繰り返される（例えば、２回目のＴ細胞投与が対象に投与され得る）。
【００１６】
本明細書に記載される実施形態のいずれかの具体的な実施形態において、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞は、約１５０×１０６細胞〜約３００×１０６細胞の投薬量で投与される。本明細書に記載される実施形態のいずれかの具体的な実施形態において、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞は、約３５０×１０６細胞〜約５５０×１０６細胞の投薬量で投与される。本明細書に記載される実施形態のいずれかの具体的な実施形態において、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞は、約４００×１０６細胞〜約５００×１０６細胞の投薬量で投与される。本明細書に記載される実施形態のいずれかの具体的な実施形態において、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞は、約１５０×１０６細胞〜約２５０×１０６細胞の投薬量で投与される。本明細書に記載される実施形態のいずれかの具体的な実施形態において、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞は、約３００×１０６細胞〜約５００×１０６細胞の投薬量で投与される。本明細書に記載される実施形態のいずれかの具体的な実施形態において、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞は、約３５０×１０６細胞〜約４５０×１０６細胞の投薬量で投与される。本明細書に記載される実施形態のいずれかの具体的な実施形態において、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞は、約３００×１０６細胞〜約４５０×１０６細胞の投薬量で投与される。本明細書に記載される実施形態のいずれかの具体的な実施形態において、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞は、約２５０×１０６細胞〜約４５０×１０６細胞の投薬量で投与される。本明細書に記載される実施形態のいずれかの具体的な実施形態において、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞は、約３００×１０６細胞〜約６００×１０６細胞の投薬量で投与される。本明細書に記載される実施形態のいずれかの具体的な実施形態において、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞は、約２５０×１０６細胞〜約５００×１０６細胞の投薬量で投与される。本明細書に記載される実施形態のいずれかの具体的な実施形態において、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞は、約３５０×１０６細胞〜約５００×１０６細胞の投薬量で投与される。本明細書に記載される実施形態のいずれかの具体的な実施形態において、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞は、約４００×１０６細胞〜約６００×１０６細胞の投薬量で投与される。本明細書に記載される実施形態のいずれかの具体的な実施形態において、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞は、約４００×１０６細胞〜約４５０×１０６細胞の投薬量で投与される。本明細書に記載さ��る実施形態のいずれかの具体的な実施形態において、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞は、約２００×１０６細胞〜約４００×１０６細胞の投薬量で投与される。本明細書に記載される実施形態のいずれかの具体的な実施形態において、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞は、約２００×１０６細胞〜約３５０×１０６細胞の投薬量で投与される。本明細書に記載される実施形態のいずれかの具体的な実施形態において、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞は、約２００×１０６細胞〜約３００×１０６細胞の投薬量で投与される。本明細書に記載される実施形態のいずれかの具体的な実施形態において、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞は、約４５０×１０６細胞〜約５００×１０６細胞の投薬量で投与される。本明細書に記載される実施形態のいずれかの具体的な実施形態において、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞は、約２５０×１０６細胞〜約４００×１０６細胞の投薬量で投与される。本明細書に記載される実施形態のいずれかの具体的な実施形態において、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞は、約２５０×１０６細胞〜約３５０×１０６細胞の投薬量で投与される。本明細書に記載される実施形態のいずれかの具体的な実施形態において、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞は、約４５０×１０６細胞の投薬量で投与される。本明細書に記載される実施形態のいずれかの具体的な実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞（例えば、自己由来Ｔ細胞）である。本明細書に記載される実施形態のいずれかの具体的な実施形態において、治療される対象は、投与の前に、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞の製造のための自己由来免疫細胞を採取するために、白血球アフェレーシス手順を受ける。本明細書に記載される実施形態のいずれかの具体的な実施形態において、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は、静脈内注入によって投与される。
【００１７】
本明細書で開示される実施形態のいずれかの具体的な実施形態において、治療される対象には、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞の投与前に、リンパ球除去（ＬＤ）化学療法が施行される。具体的な実施形態において、ＬＤ化学療法は、フルダラビン及び／またはシクロホスファミドを含む。具体的な実施形態において、ＬＤ化学療法は、フルダラビン（例えば、静脈内投与の場合、約３０ｍｇ／ｍ２）及びシクロホスファミド（例えば、静脈内投与の場合、約３００ｍｇ／ｍ２）を含み、期間は１、２、３、４、５、６、または７日（例えば、３日）である。他の具体的な実施形態において、ＬＤ化学療法は、セクション５．９に記載される化学療法剤のいずれかを含む。具体的な実施形態において、対象には、ＬＤ化学療法の施行から１、２、３、４、５、６、または７日後（例えば、ＬＤ化学療法の施行から２または３日後）に、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞が投与される。具体的な実施形態において、対象は、ＬＤ化学療法の開始前に、少なくとも１週間以上、少なくとも２週間以上（少なくとも１４日以上）、少なくとも３週間以上、少なくとも４週間以上、少なくとも５週間以上、または少なくとも６週間以上いかなる療法も受けていない。本明細書で開示される実施形態のいずれかの具体的な実施形態において、治療される対象は、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞の投与前に、前治療レジメンを１回しか受けていない。
【００１８】
上記の実施形態のいずれかの具体的な実施形態において、当該投与の前に、当該対象は、ダラツムマブ、ポマリドミド、及びデキサメタゾン（ＤＰｄ）；ダラツムマブ、ボルテゾミブ、及びデキサメタゾン（ＤＶｄ）；イキサゾミブ、レナリドミド、及びデキサメタゾン（ＩＲｄ）；ダラツムマブ、レナリドミド及びデキサメタゾン；ボルテゾミブ、レナリドミド及びデキサメタゾン（ＲＶｄ）；ボルテゾミブ、シクロホスファミド及びデキサメタゾン（ＢＣｄ）；ボルテゾミブ、ドキソルビシン及びデキサメタゾン；カルフィルゾミブ、レナリドミド及びデキサメタゾン（ＣＲｄ）；ボルテゾミブ及びデキサメタゾン；ボルテゾミブ、サリドマイド及びデキサメタゾン；レナリドミド及びデキサメタゾン；デキサメタゾン、サリドマイド、シスプラチン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド及びボルテゾミブ（ＶＴＤ−ＰＡＣＥ）；レナリドミド及び低用量デキサメタゾン；ボルテゾミブ、シクロホスファミド及びデキサメタゾン；カルフィルゾミブ及びデキサメタゾン；レナリドミド単独；ボルテゾミブ単独；ダラツムマブ単独；エロツズマブ、レナリドミド、及びデキサメタゾン；エロツズマブ、レナリドミド及びデキサメタゾン；ベンダムスチン、ボルテゾミブ及びデキサメタゾン；ベンダムスチン、レナリドミド、及びデキサメタゾン；ポマリドミド及びデキサメタゾン；ポマリドミド、ボルテゾミブ及びデキサメタゾン；ポマリドミド、カルフィルゾミブ及びデキサメタゾン；ボルテゾミブ及びリポソーム化ドキソルビシン；シクロホスファミド、レナリドミド、及びデキサメタゾン；エロツズマブ、ボルテゾミブ及びデキサメタゾン；イキサゾミブ及びデキサメタゾン；パノビノスタット、ボルテゾミブ及びデキサメタゾン；パノビノスタット及びカルフィルゾミブ；またはポマリドミド、シクロホスファミド及びデキサメタゾンを含む前治療ラインを１つ以上受けたことがある。
【００１９】
上記の実施形態のいずれかの具体的な実施形態において、当該投与の前に、当該対象は、プロテアソーム阻害薬、レナリドミド、ポマリドミド、サリドマイド、ボルテゾミブ、デキサメタゾン（例えば、低用量のデキサメタゾン）、シクロホスファミド、ドキソルビシン、カルフィルゾミブ、イキサゾミブ、シスプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、ベンダムスチン、リポソーム化ドキソルビシン、抗ＣＤ３８抗体、パノビノスタット、及びエロツズマブのうちの１つ以上を含む前治療ラインを１つ以上受けたことがある。具体的な実施形態において、抗ＣＤ３８抗体は、ダラツムマブである。
【００２０】
上記のいずれかのより具体的なある特定の実施形態において、当該対象は、当該前治療ラインのうちの２つ以上、当該前治療ラインのうちの３つ以上、当該前治療ラインのうちの４つ以上、当該前治療ラインのうちの５つ以上、当該前治療ラインのうちの６つ以上、または当該前治療ラインのうちの７つ以上を受けたことがある。上記のいずれかのある特定のより具体的な他の実施形態において、当該対象は、当該前治療ラインのうちの３つ以下、当該前治療ラインのうちの２つ以下、または当該前治療ラインのうちの１つ以下を受けたことがある。
【００２１】
上の実施形態のいずれについても、対象は、当該投与の前にリンパ球除去法を受ける。上の実施形態のいずれについても、対象は、当該免疫細胞、例えば、Ｔ細胞を採取及び単離するために、アフェレーシスを受ける。上記の実施形態のいずれかの具体的な実施形態において、当該対象は、当該アフェレーシスの時点で、以下を示す：Ｍタンパク質（血清タンパク質電気泳動［ｓＰＥＰ］もしくは尿タンパク質電気泳動［ｕＰＥＰ］）：ｓＰＥＰ≧０．５ｇ／ｄＬもしくはｕＰＥＰ≧２００ｍｇ／２４時間；血清中もしくは尿中に測定可能な疾患がなく、血清免疫グロブリン遊離軽鎖≧１０ｍｇ／ｄＬ及び異常な血清免疫グロブリンカッパラムダ遊離軽鎖比である軽鎖多発性骨髄腫；及び／または米国東海岸がん臨床試験グループ（ＥＣＯＧ）パフォーマンスステータス≦１。より具体的な実施形態において、当該対象は、アフェレーシスの時点で、更に、プロテアソーム阻害薬、免疫調節薬（レナリドミドまたはポマリドミド）及び抗ＣＤ３８抗体による前治療を含む、当該前治療ラインのうちの少なくとも３つを受けたことがあり；当該前治療ラインのうちの少なくとも３つのそれぞれについて、進行が治療ラインに対する最良効果でない限り、少なくとも連続２サイクルを受けたことがあり；直近の前治療ラインの６０日目もしくは６０日以内の進行のエビデンスがあり；及び／または当該前治療ラインのうちの少なくとも１つに対する効果（最小奏効以上）が得られている。上記の実施形態のいずれかの具体的な実施形態において、当該対象は、当該投与の時点で、次を示す：Ｍタンパク質（血清タンパク質電気泳動［ｓＰＥＰ］もしくは尿タンパク質電気泳動［ｕＰＥＰ］）：ｓＰＥＰ≧０．５ｇ／ｄＬもしくはｕＰＥＰ≧２００ｍｇ／２４時間；血清中もしくは尿中に測定可能な疾患がなく、血清免疫グロブリン遊離軽鎖≧１０ｍｇ／ｄＬ及び異常な血清免疫グロブリンカッパラムダ遊離軽鎖比である軽鎖多発性骨髄腫；及び／または米国東海岸がん臨床試験グループ（ＥＣＯＧ）パフォーマンスステータス≦１。より具体的な実施形態において、当該対象は、投与の時点で、更に、プロテアソーム阻害薬、免疫調節薬（例えば、レナリドミドまたはポマリドミド）及び抗ＣＤ３８抗体による前治療を含む、当該前治療ラインのうちの少なくとも３つを受けたことがあり；当該前治療ラインのうちの少なくとも３つのそれぞれについて、進行が治療ラインに対する最良効果でない限り、少なくとも連続２サイクルを受けたことがあり；直近の前治療ラインの６０日目もしくは６０日以内の進行のエビデンスがあり；及び／または当該前治療ラインのうちの少なくとも１つに対する効果（最小奏効以上）が得られている。
【００２２】
より具体的な別の実施形態において、当該対象は、更に、先に受けた抗骨髄腫治療が１レジメンのみであり；以下のハイリスク因子：Ｒ−ＩＳＳステージＩＩＩ、ならびに（ｉ）対象が導入法と幹細胞移植を受けている場合、最初の移植日から１２ヶ月未満での進行（ＰＤ）；または（ｉｉ）対象が導入法のみを受けている場合、少なくともプロテアソーム阻害薬、免疫調節薬及びデキサメタゾンを含有していなければならない最後の治療レジメン日から１２ヶ月未満でのＰＤとして定義される早期再発を有する。
【００２３】
上記の実施形態のいずれかの具体的な実施形態において、当該対象は、当該投与後少なくとも６ヶ月、または当該投与後少なくとも１２ヶ月の無増悪生存期間を示す。
【００２４】
上記の実施形態のいずれかの具体的な実施形態において、当該キメラ抗原受容体は、ＢＣＭＡを標的とする抗体または抗体断片、例えば、一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）、例えば、ＢＣＭＡ０２  ｓｃＦｖを含む。一実施形態において、キメラ抗原受容体は、ＢＣＭＡを標的とするマウス一本鎖Ｆｖ抗体断片を含む。一実施形態において、キメラ抗原受容体は、ＢＣＭＡポリペプチドに結合するマウス抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ、ＣＤ８αポリペプチドを含むヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態において、キメラ抗原受容体は、ＢＣＭＡを標的とするマウスｓｃＦｖを含み、ここで、ｓｃＦＶは、配列番号９の抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲのものである。一実施形態において、キメラ抗原受容体は、配列番号９であるか、または配列番号９を含む。本明細書の任意の実施形態のより具体的な実施形態において、当該免疫細胞は、ｂｂ２１２１細胞である。一実施形態において、免疫細胞は、ＢＣＭＡを標的とするマウス一本鎖Ｆｖ抗体断片を含む、キメラ抗原受容体を含む。一実施形態において、免疫細胞は、ＢＣＭＡポリペプチドに結合するマウス抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ、ＣＤ８αポリペプチドを含むヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む、キメラ抗原受容体を含む。一実施形態において、免疫細胞は、配列番号９であるか、または配列番号９を含む、キメラ抗原受容体を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】マウスＢ細胞成熟抗原（ｍｕＢＣＭＡ）ＣＡＲコンストラクトの模式図を示す。
【００２６】
【図２Ａ】ＢＣＭＡを発現するＫ５６２細胞と２４時間共培養した後の抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞、抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲＴ細胞、及びＣＡＲ１９Δ  Ｔ細胞から放出されたＩＦＮγの量を示す。
【００２７】
【図２Ｂ】ＢＣＭＡ発現を欠くＫ５６２細胞と２４時間共培養した後の抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞、抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲＴ細胞、及びＣＡＲ１９Δ  Ｔ細胞から放出されたＩＦＮγの量を、ＢＣＭＡを発現するＫ５６２細胞と比較して示す。
【００２８】
【図３】アッセイの前に１０日間刺激した、形質導入していない対照Ｔ細胞、抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞、抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲＴ細胞、及びＣＡＲ１９Δ  Ｔ細胞からの成長培地中の炎症性サイトカインの量を示す。
【００２９】
【図４】抗原刺激のない状態で、抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞、抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲＴ細胞、及びＣＡＲ１９Δ  Ｔ細胞によって産生された炎症性サイトカインの量を示す。
【００３０】
【図５】抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の製造終了時における活性化の表現型マーカーの発現を示す。抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞、抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞、及びＣＡＲ１９Δ  Ｔ細胞におけるＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ２５の発現が測定された。
【００３１】
【図６】抗原刺激のない状態での抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞及び抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞における活性化されたカスパーゼ−３のレベルを示す。カスパーゼ−３は、アポトーシスに必要なステップであり、ＡＩＣＤに重要である。
【００３２】
【図７】ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ヒトＡＢ血清（ＨＡＢＳ）、または１００ｎｇ／ｍｌの可溶性ＢＣＭＡを含有する培地中の抗ＢＣＭＡ０２及び抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞における炎症性サイトカイン放出量を示す。
【００３３】
【図８Ａ】約１００ｍｍ３の実験的な皮下ヒト多発性骨髄腫（ＲＰＭＩ−８２２６）腫瘍を有するＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマ（ＮＳＧ）マウスにおける腫瘍体積を示す。マウスは、ビヒクル、１０７  抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞、１０７  抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞、またはボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標））で処置された。
【００３４】
【図８Ｂ】約１００ｍｍ３の実験的な皮下ヒト多発性骨髄腫（ＲＰＭＩ−８２２６）腫瘍を有するＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマ（ＮＳＧ）マウスにおける腫瘍体積を示す。マウスは、ビヒクル、１０７  抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞、１０７  抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞、またはボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標））で処置された。
【００３５】
【図９】リンパ腫及び白血病細胞株におけるＢＣＭＡ発現のレベル（丸）ならびに各細胞株に対する抗ＢＣＭＡＣＡＲ  Ｔ細胞の活性（ＩＦＮγ放出、四角）を示す。ＢＣＭＡネガティブ（ＢＣＭＡ−）腫瘍細胞株：骨髄性白血病（Ｋ５６２）、急性リンパ芽球性白血病（ＮＡＬＭ−６及びＮＡＬＭ−１６）；マントル細胞リンパ腫（ＲＥＣ−１）；またはホジキンリンパ腫（ＨＤＬＭ−２）は、ＩＦＮγの放出をほとんど、または全く示さなかった。ＢＣＭＡポジティブ（ＢＣＭＡ＋）腫瘍細胞株：Ｂ細胞慢性リンパ芽球性白血病（ＭＥＣ−１）、マントル細胞リンパ腫（ＪｅＫｏ−１）、ホジキンリンパ腫（ＲＰＭＩ−６６６６）、バーキットリンパ腫（Ｄａｕｄｉ細胞及びＲａｍｏｓ細胞）、及び多発性骨髄腫（ＲＰＭＩ−８２２６）は、相当量のＩＦＮγの放出を示した。
【００３６】
【図１０Ａ】腫瘍誘発後８日目にＣＡＲ  Ｔ細胞がマウスに投与された場合のＮＳＧマウスモデルにおけるＢＣＭＡ発現バーキットリンパ腫細胞（Ｄａｕｄｉ細胞）に対する、ビヒクル、抗ＣＤ１９Δ  ＣＡＲ  Ｔ細胞、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞、及び抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ活性を示す。
【００３７】
【図１０Ｂ】腫瘍誘発後１８日目にＣＡＲ  Ｔ細胞がマウスに投与された場合のＮＳＧマウスモデルにおけるＢＣＭＡ発現バーキットリンパ腫細胞（Ｄａｕｄｉ細胞）に対する、ビヒクル、抗ＣＤ１９Δ  ＣＡＲ  Ｔ細胞、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞、及び抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ活性を示す。
【００３８】
【図１１】抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ発現を５０パーセント減少させて達成された、抗ＢＣＭＡＣＡＲ  Ｔ細胞の強力なｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を示す。（Ａ）Ｔ細胞集団には、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ分子をコードするレンチウイルスが４ｘ１０８〜５×１０７形質導入単位で形質導入された（ＭＯＩ５〜４０）。得られたＴ細胞集団は、２６±４％の抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲポジティブＴ細胞を含むように、正規化された。（Ｂ）正規化された抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のＭＦＩは、フローサイトメトリーによってアッセイした場合、８８５〜１８７５の範囲であった。（Ｃ）Ｋ５６２細胞及びＫ５６２−ＢＣＭＡ細胞は、正規化された抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と、２０：１または１０：１のエフェクター（Ｅ;Ｔ細胞）対標的（Ｔ;Ｋ５６２とＫ５６２  ＢＣＭＡ細胞の１：１混合物）比で共培養され、同等の細胞溶解活性を示した。
【００３９】
【図１２Ａ】抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の製造プロセスの信頼度を示す。１１の個々のドナーのＰＢＭＣから製造された抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞産物は、形質導入されていないドナーＴ細胞の対応培養物と比較して、同等レベルの拡大を示す。
【図１２Ｂ】抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の製造プロセスの信頼度を示す。１１のドナーから製造された抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞産物は、同等のレンチウイルス形質導入効率（ＶＣＮ）を示した。
【図１２Ｃ】抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の製造プロセスの信頼度を示す。抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲポジティブＴ細胞の存在率をフローサイトメトリーによって測定したところ、ＢＣＭＡ発現は、全てのドナーで同等であることが分かった。
【図１２Ｄ】抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の製造プロセスの信頼度を示す。１１のドナーから製造された抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞産物は、ＢＣＭＡ発現Ｋ５６２細胞に曝露された場合、治療上関係のあるレベルのＩＦＮγ放出を示した。
【００４０】
【図１３】ＩＬ−２またはＩＬ−２及びＺＳＴＫ４７４の存在下で１０日間培養されたＣＤ６２Ｌポジティブ抗ＢＣＭＡ０２  Ｔ細胞におけるＣＤ１２７、ＣＤ１９７及びＣＤ３８の共発現のベン図を示す。ＺＳＴＫ４７４で処理された抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＩＬ−２のみで培養された抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７及びＣＤ３８を共発現する細胞の割合増加を示した。
【００４１】
【図１４】ＩＬ−２及びＺＳＴＫ４７４で処理した培養物（ｎ＝７）は、ＩＬ−２のみで処理した培養物と比較して、ＣＤ８発現抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の割合増加を示す。ＣＤ８の発現は、蛍光標識された抗ＣＤ８抗体及びフローサイトメトリーを使用して決定された。
【００４２】
【図１５】ＩＬ−２のみまたはＩＬ−２及びＺＳＴＫ４７４と培養した後の、１４のドナーに由来する抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞によって放出されたＩＦＮ−γの量を示す。培養期間の終了時に、同数の抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞が培地のみで２４時間再培養された。２４時間で放出されたＩＦＮ−γの量がＥＬＩＳＡによって定量された。ＺＳＴＫ４７４中での培養は、ＩＬ−２のみで培養された抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の持続的なサイトカインの放出を大きく増加させなかった。
【００４３】
【図１６】進行性Ｄａｕｄｉ腫瘍モデルにおける、ＩＬ−２、もしくはＩＬ−２及びＺＳＴＫ４７４で処理した抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞、またはＩＬ−２及びＺＳＴＫ４７４で処理した短縮型シグナル伝達欠損抗ＢＣＭＡ０２（ｔＢＣＭＡ０２）ＣＡＲ  Ｔ細胞の抗腫瘍活性を示す。ＩＬ−２及びＺＳＴＫ４７４で処理した抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞を投与したマウスの５０％で完全な腫瘍退縮が観察された。
【００４４】
【図１７】多発性骨髄腫腫瘍（ＲＰＭＩ−８２２６）モデルにおける、ＩＬ−２、またはＩＬ−２及びＺＳＴＫ４７４で処理した抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の抗腫瘍活性を示す。ＩＬ−２またはＩＬ−２及びＺＳＴＫ４７４で培養した抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置された動物は、完全に腫瘍成長を阻止した。
【００４５】
４．配列識別子の簡単な説明
配列番号１〜３は、本明細書で企図されるＢＣＭＡ  ＣＡＲの例示的な軽鎖ＣＤＲ配列のアミノ酸配列を記載する。
【００４６】
配列番号４〜６は、本明細書で企図されるＢＣＭＡ  ＣＡＲの例示的な重鎖ＣＤＲ配列のアミノ酸配列を記載する。
【００４７】
配列番号７は、本明細書で企図されるＢＣＭＡ  ＣＡＲの例示的な軽鎖配列のアミノ酸配列を記載する。
【００４８】
配列番号８は、本明細書で企図されるＢＣＭＡ  ＣＡＲの例示的な重鎖配列のアミノ酸配列を記載する。
【００４９】
配列番号９は、本明細書で企図される例示的なＢＣＭＡ  ＣＡＲのアミノ酸配列を記載する。
【００５０】
配列番号１０は、本明細書で企図される例示的なＢＣＭＡ  ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列を記載する。
【００５１】
配列番号１１は、ヒトＢＣＭＡのアミノ酸配列を記載する。
【００５２】
配列番号１２〜２２は、様々なリンカーのアミノ酸配列を記載する。
【００５３】
配列番号２３〜３５は、プロテアーゼ切断部位及び自己切断ポリペプチド切断部位のアミノ酸配列を記載する。
【００５４】
配列番号３６は、ＢＣＭＡ  ＣＡＲをコードするベクターのポリヌクレオチド配列を記載する。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
５．詳細な説明
５．１．概要
本発明は、概して、Ｂ細胞関連状態を治療するための改善された組成物及び方法に関する。本明細書で使用される場合、「Ｂ細胞関連状態」という用語は、不適切なＢ細胞活性及びＢ細胞悪性腫瘍に伴う状態に関する。
【００５６】
特定の実施形態において、本発明は、遺伝子改変された免疫エフェクター細胞を使用する、Ｂ細胞関連状態に対する改善された養子細胞療法に関する。遺伝的アプローチは、免疫認識及びがん細胞の排除を高める潜在的な手段を提供する。１つの有望な戦略は、細胞傷害性をがん細胞にリダイレクトするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように、免疫エフェクター細胞を遺伝子操作することである。しかしながら、Ｂ細胞障害を治療するための既存の養子細胞免疫療法は、養子細胞が、Ｂ細胞の全て、またはＢ細胞の大部分上に発現される抗原を標的とするため、体液性免疫を損なう重大なリスクが存在する。したがって、そのような療法は、臨床的に望ましくないことから、当該技術分野において、体液性免疫を温存し、Ｂ細胞関連状態により効率的な療法が必要とされている。
【００５７】
本明細書で開示される養子細胞療法の改善された組成物及び方法は、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ、ＣＤ２６９または腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバー１７；ＴＮＦＲＳＦ１７としても知られる）を発現するＢ細胞を標的とすることによって、容易に増殖し、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて長期持続性を示し、体液性免疫の障害を低減することができる、遺伝子改変された免疫エフェクター細胞を提供する。
【００５８】
ＢＣＭＡは、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーである（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９２（１）：１２９−１３５，２０００、及びＭａｃｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２１：２３１−２６４，２００３参照）。ＢＣＭＡは、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）及び増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）に結合する（例えば、Ｍａｃｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００３及びＫａｌｌｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２０４：４３−５４，２００５参照）。非悪性細胞のうち、ＢＣＭＡは、主に形質細胞及び成熟Ｂ細胞のサブセットで発現されていることが報告されている（例えば、Ｌａａｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，７７（１）：３８９７−３９０４，１９９２；Ｌａａｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２２（７）：１１４７−１１５４，，１９９４；Ｋａｌｌｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９（１）：９１−９７，２００４；及びＮｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７３（２）：８０７−８１７，２００４参照。ＢＣＭＡ欠損マウスは、健康で、Ｂ細胞の数も正常であるが、寿命の長い形質細胞の生存が害されている（例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２１（１２）：４０６７−４０７４，２００１；及びＳｃｈｉｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３（５５３７）：２  １１１−２１  １４，２００１参照）。ＢＣＭＡ  ＲＮＡは、多発性骨髄腫細胞及び他のリンパ腫において広く検出されており、ＢＣＭＡタンパク質は、複数の研究者によって、多発性骨髄腫患者の形質細胞の表面上で検出されている（例えば、Ｎｏｖａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０３（２）：６８９−６９４，２００４；Ｎｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７３（１９）：５９０３−５９０９，２００７；Ｂｅｌｌｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０５（１０）：３９４５−３９５０，２００５；及びＭｏｒｅａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，７０３（８）：３１４８−３１５７，２００４参照。
【００５９】
様々な実施形態において、マウス抗ＢＣＭＡ抗体配列を含むＣＡＲは、特定のヒト抗体配列を含むＢＣＭＡ  ＣＡＲと比較して極めて有効であり、活発なｉｎ  ｖｉｖｏ増殖をし、ＢＭＣＡを発現しているヒトＢ細胞を認識し、ＢＣＭＡ発現Ｂ細胞に対して細胞傷害活性を示し、また、活性化Ｔ細胞によって放出されたサイトカインが身体に急な炎症反応を引き起こして非感染性の発熱を加速させる致命的な状態であるサイトカインストームを誘発する徴候を示さない。
【００６０】
一実施形態において、マウス抗ＢＣＭＡ抗体または抗原結合断片、膜貫通ドメイン、及び１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲが提供される。
【００６１】
一実施形態において、免疫エフェクター細胞は、本明細書で企図されるＣＡＲを発現するように遺伝子改変され、提供される。ＣＡＲを発現するＴ細胞は、本明細書中、ＣＡＲ  Ｔ細胞またはＣＡＲ改変Ｔ細胞と呼ばれる。
【００６２】
様々な実施形態において、本明細書で企図される遺伝子改変された免疫エフェクター細胞は、Ｂ細胞関連状態、例えば、Ｂ細胞に関連する自己免疫疾患またはＢ細胞悪性腫瘍を有する患者に投与される。
【００６３】
本発明の実施は、反対のことが明示されない限り、当該技術分野の技術範囲内である化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ技術、遺伝子学、免疫学、及び細胞生物学の従来法を採用するものであり、その多くについては、例示を目的として、以下に記載される。そのような技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ｕｐｄａｔｅｄ  Ｊｕｌｙ  ２００８）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ  ＆  ＩＩ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）；Ａｎａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｑ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ  ａｎｄ  Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．，１９９１）；Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；及びＡｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙなどのジャーナルの研究論文を参照されたい。
【００６４】
５．２．定義
別途の定義がない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同一の意味を有する。本発明の実施または検証には、本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法及び材料を使用することができるが、組成物、方法及び材料の好ましい実施形態が本明細書に記載される。本発明の目的上、以下の用語が以下に定義される。
【００６５】
冠詞「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、本明細書において、その冠詞の文法上の目的語が１つまたは１つより多いこと（すなわち、少なくとも１つ、または１つ以上であること）を指すために使用される。例として、「要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または１つ以上の要素を意味する。
【００６６】
選択肢（例えば、「または」）の使用は、その選択肢のいずれか一方、両方またはその任意の組み合わせを意味することを理解されたい。
【００６７】
「及び／または」という用語は、選択肢のいずれか一方、または両方を意味することを理解されたい。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さに対して、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％ほど変動する数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。一実施形態において、「約」または「およそ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さについて、±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、または±１％の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さの範囲を指す。
【００６９】
本明細書全体を通して、文脈上異なる解釈を要する場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という文言は、指定されるステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の包含を示すが、任意の他のステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の排除を示すものではないことが理解される。「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」とは、「〜からなる」という文言に続くものを含み、それらに限定されることを意味する。したがって、「〜からなる」は、列挙された要素が必要または必須であり、他の要素が存在しないことを示す。「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、その文言の後に列挙される任意の要素を含み、他の要素については、列挙される要素に関する開示に明記される活性または作用に干渉または寄与しないものに限定されることを意味する。したがって、「〜から本質的になる」という文言は、列挙された要素が必要または必須であるが、列挙された要素の活性または作用に実質的に影響する他の要素は存在しないことを示す。
【００７０】
本明細書全体を通して、「一実施形態」、「実施形態」、「特定の実施形態」、「関連実施形態」、「ある特定の実施形態」、「追加の実施形態」、もしくは「更なる実施形態」またはこれらの組み合わせへの言及は、実施形態に関して記載される特定の特色、構造または特徴が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体を通して、様々な箇所で現れる前述の文言は、必ずしも全て同じ実施形態を言及するものではない。更に、特定の特徴、構造、または特性は、１つ以上の実施形態において、任意の好適な手段で組み合わせることができる。また、一実施形態における特徴の明白な詳述は、特定の実施形態における特徴を除外する根拠となることも理解される。
【００７１】
５．３．キメラ抗原受容体
様々な実施形態において、免疫エフェクター細胞の細胞傷害性をＢ細胞にリダイレクトする遺伝子操作された受容体が提供される。これらの遺伝子操作された受容体は、本明細書中、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と呼ばれる。ＣＡＲは、所望の抗原（例えば、ＢＣＭＡ）に対する抗体に基づく特異性と、Ｔ細胞受容体活性化細胞内ドメインを組み合わせた分子であり、特定の抗ＢＣＭＡ細胞免疫活性を示すキメラタンパク質が生じる。本明細書で使用される場合、「キメラ」という用語は、起源が異なる様々なタンパク質またはＤＮＡの部分で構成されることを記載するものである。
【００７２】
本明細書で企図されるＣＡＲは、ＢＣＭＡに結合する細胞外ドメイン（結合ドメインまたは抗原特異的結合ドメインとも称される）、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ＣＡＲの抗ＢＣＭＡ抗原結合ドメインと標的細胞の表面上のＢＣＭＡが結合すると、ＣＡＲのクラスター化が生じ、ＣＡＲ含有細胞に活性化刺激が伝達される。ＣＡＲの主な特徴は、免疫エフェクター細胞の特異性をリダイレクトする能力であり、それにより、モノクローナル抗体の細胞特異的標的化、可溶性リガンドまたは細胞特異的共受容体を利用して、増殖、サイトカイン産生、食作用または標的抗原発現細胞の細胞死を媒介することができる分子の産生を、主要組織適合性（ＭＨＣ）に依存せずに誘発する。
【００７３】
様々な実施形態において、ＣＡＲは、マウス抗ＢＣＭＡ特異的結合ドメインを含む細胞外結合ドメイン；膜貫通ドメイン；１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；及び一次シグナル伝達ドメインを含む。
【００７４】
特定の実施形態において、ＣＡＲは、マウス抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片を含む細胞外結合ドメイン；１つ以上のヒンジドメインまたはスペーサードメイン；１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインを含む膜貫通ドメイン；及び一次シグナル伝達ドメインを含む。
【００７５】
５．３．１．結合ドメイン
特定の実施形態において本明細書で企図されるＣＡＲは、Ｂ細胞上に発現されるヒトＢＣＭＡポリペプチドに特異的に結合するマウス抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片を含む、細胞外結合ドメインを含む。本明細書で使用される場合、「結合ドメイン」、「細胞外ドメイン」、「細胞外結合ドメイン」、「抗原特異的結合ドメイン」、及び「細胞外抗原特異的結合ドメイン」という用語は、区別なく用いられ、目的の標的抗原、例えば、ＢＣＭＡに特異的に結合する能力を持つＣＡＲを提供する。結合ドメインは、天然、合成、半合成、または組み換え源のいずれかに由来し得る。
【００７６】
「特異的結合親和性」または「特異的に結合する」または「特異的に結合した」または「特異的結合」または「特異的に標的とする」という用語は、本明細書で使用される場合、抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片（またはそれを含むＣＡＲ）がバックグラウンド結合よりも大きい結合親和性でＢＣＭＡに結合することを記載するものである。結合ドメイン（または結合ドメインを含むＣＡＲまたは結合ドメインを含有する融合タンパク質）は、例えば、約１０５Ｍ−１以上の親和性またはＫａ（すなわち、単位１／Ｍでの特定の結合相互作用の平衡会合定数）でＢＣＭＡに結合または会合する場合、ＢＣＭＡに「特異的に結合する」。ある特定の実施形態において、結合ドメイン（またはその融合タンパク質）は、約１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１、または１０１３Ｍ−１以上のＫａで標的に結合する。「高親和性」結合ドメイン（またはその一本鎖融合タンパク質）は、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、少なくとも１０１３Ｍ−１、またはそれ以上のＫａを有する結合ドメインを指す。
【００７７】
あるいは、親和性は、単位Ｍでの特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）（例えば、１０−５Ｍ〜１０−１３Ｍ、またはそれ以下）として定義され得る。本開示による結合ドメインポリペプチド及びＣＡＲタンパク質の親和性は、従来の技術を使用して、例えば、競合型ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）によって、または標識リガンドを使用するか、もしくはＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）より入手可能）などの表面プラズモン共鳴装置、もしくはＥＰＩＣシステムもしくはＥｎＳｐｉｒｅ（それぞれ、Ｃｏｒｎｉｎｇ及びＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒから入手可能）などの光学バイオセンサー技術する、結合会合、もしくは置換アッセイによって、容易に決定することができる（また、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９４９）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０；及び米国特許第５，２８３，１７３号；同第５，４６８，６１４号、または同等物も参照されたい）。
【００７８】
一実施形態において、特異的結合の親和性は、バックグラウンド結合よりも約２倍、バックグラウンド結合よりも約５倍、バックグラウンド結合よりも約１０倍、バックグラウンド結合よりも約２０倍、バックグラウンド結合よりも約５０倍、バックグラウンド結合よりも約１００倍、またはバックグラウンド結合よりも約１０００倍またはそれ以上大きい。
【００７９】
特定の実施形態において、ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片を含む。「抗体」とは、免疫細胞によって認識されるものなどの抗原決定基を含有するペプチド、脂質、多糖、または核酸などの抗原のエピトープを特異的に認識し結合する軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域を少なくとも含む、ポリペプチドである結合因子を指す。
【００８０】
「抗原（Ａｇ）」とは、動物において抗体の産生またはａＴ細胞応答を刺激することができる、化合物、組成物、または物質を指し、これらには、動物に注射または吸収される組成物（がん特異的タンパク質を含む組成物など）が含まれる。抗原は、本開示の抗原などの異種抗原によって誘発される免疫を含む、特定の体液性免疫または細胞性免疫の産物と反応する。特定の実施形態において、標的抗原は、ＢＣＭＡポリペプチドのエピトープである。
【００８１】
「エピトープ」または「抗原決定基」とは、結合因子が結合する抗原の領域を指す。エピトープは、連続するアミノ酸、またはタンパク質の三次折り畳みによって並置された非連続アミノ酸の両方から形成され得る。連続するアミノ酸から形成されたエピトープは、典型的に、変性溶媒への曝露時に保持されるが、三次折り畳みによって形成されたエピトープは、典型的に、変性溶媒による処理で失われる。エピトープは、典型的には少なくとも３個、より一般には、少なくとも５個、約９個、または約８〜１０個のアミノ酸をユニークな空間的立体構造で含む。
【００８２】
抗体には、ラクダＩｇ、Ｉｇ  ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、ビス−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、及び単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）ならびに抗原結合に関与する全長抗体の一部などの抗体の抗原結合断片が含まれる。この用語はまた、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロコンジュゲート抗体（二重特異性抗体など）及びその抗原結合断片などの遺伝子操作された形態も含む。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９４−１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）；Ｋｕｂｙ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９７も参照されたい。
【００８３】
当業者によって理解されるように、また本明細書に別途記載されるように、完全抗体は、２本の重鎖及び２本の軽鎖を含む。各重鎖は、可変領域ならびに第１、第２、及び第３の定常領域からなり、各軽鎖は、可変領域及び定常領域からなる。哺乳動物の重鎖は、α、δ、ε、γ、及びμに分類される。哺乳動物の軽鎖は、λまたはκに分類される。α、δ、ε、γ、及びμの重鎖を含む免疫グロブリンは、免疫グロブリン（Ｉｇ）Ａ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭに分類される。完全抗体は、「Ｙ」字形状を形成する。Ｙの幹の部分は、２本の重鎖が一緒に結合した第２及び第３の定常領域（ＩｇＥ及びＩｇＭの場合、第４の定常領域も）からなり、ヒンジにはジスルフィド結合（鎖間）が形成される。重鎖γ、α、及びδは、３つのタンデムの（一列に並んだ）Ｉｇドメインで構成される定常領域と、柔軟性を高めるヒンジ領域とを有し、重鎖μ及びεは、４つの免疫グロブリンドメインで構成される定常領域を有する。第２及び第３の定常領域は、それぞれ「ＣＨ２ドメイン」及び「ＣＨ３ドメイン」と呼ばれる。Ｙの各アーム部分は、単一の軽鎖の可変領域及び定常領域に結合した単一の重鎖の可変領域及び第１の定常領域を含む。軽鎖及び重鎖の可変領域は、抗原結合に関与する。
【００８４】
軽鎖及び重鎖の可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる３つの超可変領域によって中断された「フレームワーク」領域を含有する。ＣＤＲは、従来法によって、例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ（Ｗｕ，ＴＴ  ａｎｄ  Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１３２（２）：２１１−５０，（１９７０）；Ｂｏｒｄｅｎ，Ｐ．ａｎｄ  Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．，ＰＮＡＳ，８４：２４４０−２４４３（１９８７）；（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１参照；参照により本明細書に援用される）に従う配列により、またはＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６（４）：９０１−９１７（１９８７），Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７−８８３（１９８９））による構造によって、定義または特定することができる。
【００８５】
様々な軽鎖または重鎖のフレームワーク領域配列がヒトなどの種で比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域、すなわち、構成要素である軽鎖及び重鎖のフレームワーク領域を合わせたものは、ＣＤＲを三次元空間で配置し整列させる作用をする。ＣＤＲが主に抗原のエピトープの結合に関与する。各鎖のＣＤＲは、典型的に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と呼ばれ、Ｎ末端から順に番号が付けられ、典型的に、個々のＣＤＲが位置する鎖によっても特定される。したがって、抗体の重鎖の可変ドメインに位置するＣＤＲは、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３と呼ばれ、抗体の軽鎖の可変ドメインに位置するＣＤＲは、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３と呼ばれる。異なる特異性（すなわち、異なる抗原に対する異なる結合部位）を有する抗体は、異なるＣＤＲを有する。ＣＤＲは、抗体ごとに異なるが、抗原結合に直接関与するのは、ＣＤＲ内の限られた数のアミノ酸位置だけである。ＣＤＲ内のこれらの位置は、特異性決定残基（ＳＤＲ）と呼ばれる。本明細書で企図されるヒト化ＢＣＭＡ  ＣＡＲを構築するのに好適な軽鎖ＣＤＲの例示的な例としては、配列番号１〜３に記載されるＣＤＲ配列が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で企図されるヒト化ＢＣＭＡ  ＣＡＲを構築するのに好適な重鎖ＣＤＲの例示的な例としては、配列番号４〜６に記載されるＣＤＲ配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
「ＶＨ」または「ＶＨ」への言及は、免疫グロブリン重鎖の可変領域を指し、抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、または本明細書で開示される他の抗体断片のものを含む。「ＶＬ」または「ＶＬ」への言及は、免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指し、抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、または本明細書で開示される他の抗体断片のものを含む。
【００８７】
「モノクローナル抗体」は、Ｂリンパ球の単一クローンによって、または単一抗体の軽鎖及び重鎖遺伝子がトランスフェクトされた細胞によって産生された抗体である。モノクローナル抗体は、当業者に知られた方法、例えば、骨髄腫細胞と免疫脾臓細胞の融合からハイブリッド抗体形成細胞を作製することによって、産生される。モノクローナル抗体には、ヒト化モノクローナル抗体が含まれる。
【００８８】
「キメラ抗体」は、ヒトなどのある種に由来するフレームワーク残基と、マウスなどの別の種に由来するＣＤＲ（一般に抗原結合を付与する）とを有する。特定の好ましい実施形態において、本明細書で企図されるＣＡＲは、キメラ抗体またはその抗原結合断片である抗原特異的結合ドメインを含む。
【００８９】
「ヒト化」抗体は、ヒトフレームワーク領域と、非ヒト（例えば、マウス、ラット、または合成）免疫グロブリンに由来する１つ以上のＣＤＲとを含む、免疫グロブリンである。ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリンは、「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは、「アクセプター」と呼ばれる。
【００９０】
特定の実施形態において、マウス抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片には、限定するものではないが、ラクダＩｇ（ラクダ科動物抗体（ＶＨＨ））、Ｉｇ  ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ」）、ビス−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、及び単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）が含まれる。
【００９１】
本明細書で使用される「ラクダＩｇ」または「ラクダ科動物ＶＨＨ」とは、重鎖抗体の最も小さい既知の抗原結合単位を指す（Ｋｏｃｈ−Ｎｏｌｔｅ，ｅｔ  ａｌ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，２１：３４９０−３４９８（２００７））。「重鎖抗体」または「ラクダ科動物抗体」とは、２つのＶＨドメインを含有し、軽鎖を含有しない抗体を指す（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：２５−３８（１９９９）；ＷＯ９４／０４６７８；ＷＯ９４／２５５９１；米国特許第６，００５，０７９号）。
【００９２】
「免疫グロブリン新規抗原受容体」の「ＩｇＮＡＲ」とは、１つの可変新規抗原受容体（ＶＮＡＲ）ドメイン及び５つの定常新規抗原受容体（ＣＮＡＲ）ドメインのホモ二量体からなるサメ免疫レパートリーに由来する抗体クラスを指す。ＩｇＮＡＲは、最も小さい既知の免疫グロブリンベースのタンパク質足場のいくつかを表し、極めて安定しており、効率的な結合特性を有する。その固有の安定性は、（ｉ）基礎となるＩｇ足場に、マウス抗体に見られる従来の抗体ＶＨ及びＶＬドメインと比較して、荷電性で表面に露出した親水性残基が相当数存在することと、（ｉｉ）ループ間ジスルフィド架橋、及びループ内水素結合のパターンを含む、相補性決定領域（ＣＤＲ）ループの安定化した構造的特徴の両方に起因し得る。
【００９３】
抗体は、パパイン消化すると、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる各々が単一の抗原結合部位を含む２つの同一の抗原結合断片と、残りの「Ｆｃ」断片とが生成され、Ｆｃという名称は、容易に結晶化する能力を反映している。ペプシン処理では、Ｆ（ａｂ’）２断片が得られ、この断片は、２つの抗原結合部位を有し、抗原に依然として架橋することができる。
【００９４】
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含有する最小の抗体断片である。一実施形態において、二本鎖Ｆｖ種は、強固に非共有会合した１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種の場合、１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインをフレキシブルペプチドリンカーにより共有結合することができ、それにより、軽鎖及び重鎖が二本鎖Ｆｖ種の構造に類似した「二量体」構造で会合できるようにする。各可変ドメインの３つの超可変領域（ＨＶＲ）が相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を画定するのは、この立体配置においてである。全体として、６つのＨＶＲが、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一可変ドメイン（または抗原に特異的なＨＶＲを３つしか含まないＦｖの半分）であっても、全結合部位よりも低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を有する。
【００９５】
Ｆａｂ断片は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含有し、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’断片は、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に、抗体ヒンジ領域に由来するシステインを１つ以上含む数個の残基が付加されている点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨとは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を持つＦａｂ’の本明細書における表記である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元来、断片の間にヒンジシステインを有する、Ｆａｂ’断片の対として作製された。抗体断片の他の化学的カップリングも知られている。
【００９６】
「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を含む抗体断片であって、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）中に含む断片を指す。同じ鎖上の２つのドメイン間で対合が起こらないような短いリンカーを使用することにより、これらのドメインを別の鎖の相補的ドメインと対合させ、２つの抗原結合部位を形成させる。ダイアボディは、二価または二重特異性であり得る。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ１９９３／０１１６１；Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）において、より完全に記載されている。トリアボディ及びテトラボディについても、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）に記載されている。
【００９７】
「単一ドメイン抗体」または「ｓｄＡｂ」または「ナノボディ」とは、抗体重鎖の可変領域（ＶＨドメイン）または抗体軽鎖の可変領域（ＶＬドメイン）からなる抗体断片を指す（Ｈｏｌｔ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ，２００３，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２１（１１）：４８４−４９０）。
【００９８】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中、いずれかの配向（例えば、ＶＬ−ＶＨまたはＶＨ−ＶＬ）で存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを更に含み、これにより、ｓｃＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成することが可能になる。ｓｃＦｖの概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４），ｐｐ．２６９−３１５を参照されたい。
【００９９】
特定の好ましい実施形態において、本明細書で企図されるＣＡＲは、マウスｓｃＦｖである抗原特異的結合ドメインを含む。一本鎖抗体は、所望の標的に特異的なハイブリドーマのＶ領域遺伝子からクローニングされ得る。そのようなハイブリドーマの産生は、日常的になっている。可変領域重鎖（ＶＨ）及び可変領域軽鎖（ＶＬ）をクローニングするのに使用することができる技術は、例えば、Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９８９；８６：３８３３−３８３７に記載されている。
【０１００】
特定の実施形態において、抗原特異的結合ドメインは、ヒトＢＣＭＡポリペプチドに結合するマウスｓｃＦｖである。本明細書で企図されるＢＣＭＡ  ＣＡＲを構築するのに好適な可変重鎖の例示的な例としては、限定するものではないが、配列番号８に記載されるアミノ酸配列が挙げられる。本明細書で企図されるＢＣＭＡ  ＣＡＲを構築するのに好適な可変軽鎖の例示的な例としては、限定するものではないが、配列番号７に記載されるアミノ酸配列が挙げられる。
【０１０１】
本明細書で提供されるＢＣＭＡ特異的結合ドメインはまた、１、２、３、４、５、または６つのＣＤＲを含む。そのようなＣＤＲは、軽鎖のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３ならびに重鎖のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３から選択される、非ヒトＣＤＲまたは変更された非ヒトＣＤＲであり得る。ある特定の実施形態において、ＢＣＭＡ特異的結合ドメインは、（ａ）軽鎖ＣＤＲＬ１、軽鎖ＣＤＲＬ２、及び軽鎖ＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域と、（ｂ）重鎖ＣＤＲＨ１、重鎖ＣＤＲＨ２、及び重鎖ＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域とを含む。
【０１０２】
５．３．２．リンカー
ある特定の実施形態において、本明細書で企図されるＣＡＲは、様々なドメイン間に、例えば、分子の適切な間隔及び立体構造のために加えられたリンカー残基を含み得る。特定の実施形態において、リンカーは、可変領域連結配列である。「可変領域連結配列」は、ＶＨ及びＶＬドメインを連結し、２つのサブ結合ドメインの相互作用に適合するスペーサー機能を提供するアミノ酸配列であり、その結果得られるポリペプチドは、同じ軽鎖及び重鎖可変領域を含む抗体と同じ標的分子に対する特異的結合親和性を保持する。本明細書で企図されるＣＡＲは、１、２、３、４、または５つ以上のリンカーを含み得る。特定の実施形態において、リンカーの長さは、約１〜約２５個のアミノ酸、約５〜約２０個のアミノ酸、または約１０〜約２０個のアミノ酸、またはその間にある任意の長さのアミノ酸である。いくつかの実施形態において、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５アミノ酸長以上である。
【０１０３】
リンカーの例示的な例としては、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ；グリシン−セリンポリマー（Ｇ１−５Ｓ１−５）ｎ（ここで、ｎは、少なくとも１、２、３、４、または５の整数である）；グリシン−アラニンポリマー；アラニン−セリンポリマー；及び当該技術分野において知られている他のフレキシブルリンカーが挙げられる。グリシン及びグリシン−セリンポリマーは、比較的構造化されておらず、したがって、本明細書に記載されるＣＡＲなどの融合タンパク質のドメイン間の中性テザーとして機能することが可能であり得る。グリシンは、更にアラニンよりも非常に多くのΦ−Ψ空間を利用でき、長い側鎖を持つ残基よりも制限が少ない（Ｓｃｈｅｒａｇａ，Ｒｅｖ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍ．１１１７３−１４２（１９９２）参照）。当業者であれば、特定の実施形態におけるＣＡＲの設計には、完全にまたは部分的に柔軟性のあるリンカーが含まれ得、そのため、リンカーは、所望のＣＡＲ構造を提供するために、フレキシブルリンカーだけでなく、柔軟性のあまりない構造を与える１つ以上の部分も含み得ることを認識するであろう。
【０１０４】
他の例示的なリンカーとしては、次のアミノ酸配列：ＧＧＧ；ＤＧＧＧＳ（配列番号１２）；ＴＧＥＫＰ（配列番号１３）（例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ５５２５−５５３０（１９９７）参照）；ＧＧＲＲ（配列番号１４）（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．１９９５、上掲）；（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ここで、ｎ＝１、２、３、４または５であり、ＧＧＧＧＳは配列番号１５として特定される（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９３，１１５６−１１６０（１９９６．）；ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ（配列番号１６）（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１０６６−１０７０）；ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号１７）（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６）、ＧＧＲＲＧＧＧＳ（配列番号１８）；ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号１９）；ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号２０）；ＬＲＱＫｄ（ＧＧＧＳ）２ＥＲＰ（配列番号２１）が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、フレキシブルリンカーは、ＤＮＡ結合部位及びペプチド自体の両方をモデリングすることが可能なコンピュータプログラムを使用して（Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ  ＆  Ｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ  ９０：２２５６−２２６０（１９９３）、ＰＮＡＳ  ９１：１１０９９−１１１０３（１９９４）、またはファージディスプレイ方法によって合理的に設計することができる。一実施形態において、リンカーは、次のアミノ酸配列：ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号２２）（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０１（４）：１６３７−１６４４（２００３））を含む。
【０１０５】
５．３．３．スペーサードメイン
特定の実施形態において、ＣＡＲの結合ドメインは、１つ以上の「スペーサードメイン」が後に続き、当該ドメインは、適切な細胞／細胞接触、抗原結合及び活性化を可能にするように、抗原結合ドメインをエフェクター細胞表面から離す領域を指す（Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９９；６：４１２−４１９）。スペーサードメインは、天然、合成、半合成、または組み換え源のいずれかに由来し得る。ある特定の実施形態において、スペーサードメインは、限定するものではないが、１つ以上の重鎖定常領域、例えば、ＣＨ２及びＣＨ３を含む、免疫グロブリンの一部である。スペーサードメインは、天然免疫グロブリンヒンジ領域または変更された免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。
【０１０６】
一実施形態において、スペーサードメインは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。
【０１０７】
５．３．４．ヒンジドメイン
ＣＡＲの結合ドメインは、一般に、１つ以上の「ヒンジドメイン」が後に続き、当該ドメインは、適切な細胞／細胞接触、抗原結合及び活性化を可能にするように、抗原結合ドメインをエフェクター細胞表面から離して位置付ける役割を持つ。ＣＡＲは、一般に、結合ドメインと膜貫通ドメイン（ＴＭ）との間に１つ以上のヒンジドメインを含む。ヒンジドメインは、天然、合成、半合成、または組み換え源のいずれかに由来し得る。ヒンジドメインは、天然免疫グロブリンヒンジ領域または変更された免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。
【０１０８】
「変更されたヒンジ領域」とは、（ａ）最大３０％のアミノ酸変化（例えば、最大２５％、２０％、１５％、１０％、または５％のアミノ酸置換または欠失）を含む天然ヒンジ領域、（ｂ）最大３０％のアミノ酸変化（例えば、最大２５％、２０％、１５％、１０％、または５％のアミノ酸置換または欠失）を含む少なくとも１０アミノ酸長（例えば、少なくとも１２、１３、１４または１５アミノ酸長）である天然ヒンジ領域の一部、または（ｃ）コアヒンジ領域（４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５、または少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５アミノ酸長であり得る）を含む天然ヒンジ領域の一部を指す。ある特定の実施形態において、天然免疫グロブリンヒンジ領域中の１つ以上のシステイン残基は、１つ以上の他のアミノ酸残基（例えば、１つ以上のセリン残基）によって置換され得る。変更された免疫グロブリンヒンジ領域は、代替的にまたは付加的に、野生型免疫グロブリンヒンジ領域のプロリン残基が別のアミノ酸残基（例えば、セリン残基）によって置換され得る。
【０１０９】
本明細書に記載されるＣＡＲに使用するのに好適な他の例示的なヒンジドメインとしては、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８及びＣＤ７などの１型膜タンパク質の細胞外領域に由来するヒンジ領域が挙げられ、これらの分子の野生型ヒンジ領域であってもよいし、変更されてもよい。別の実施形態において、ヒンジドメインは、ＣＤ８αヒンジ領域を含む。
【０１１０】
５．３．５．膜貫通ドメイン
膜貫通（ＴＭ）ドメインは、細胞外結合部分及び細胞内シグナル伝達ドメインを融合させ、ＣＡＲを免疫エフェクター細胞の原形質膜に係留させる、ＣＡＲの一部である。ＴＭドメインは、天然、合成、半合成、または組み換え源のいずれかに由来し得る。ＴＭドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ−１に由来し得る（すなわち、少なくともこれらの膜貫通領域（複数可）を含む）。特定の実施形態において、ＴＭドメインは合成であり、ロイシン及びバリンなどの疎水性残基を主に含む。
【０１１１】
一実施形態において、本明細書で企図されるＣＡＲは、ＣＤ８αに由来するＴＭドメインを含む。別の実施形態において、本明細書で企図されるＣＡＲは、ＣＤ８αに由来するＴＭドメインと、ＣＡＲのＴＭドメインと細胞内シグナル伝達ドメインを連結する、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸長の間の短いオリゴペプチドまたはポリペプチドリンカーとを含む。グリシン−セリンベースのリンカーは、特に好適なリンカーを提供する。
【０１１２】
５．３．６．細胞内シグナル伝達ドメイン
特定の実施形態において、本明細書で企図されるＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。「細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、ヒトＢＣＭＡポリペプチドへの効果的なＢＣＭＡ  ＣＡＲ結合のメッセージを免疫エフェクター細胞の内部に伝達して、エフェクター細胞の機能、例えば、活性化、サイトカイン産生、増殖及び細胞傷害活性（ＣＡＲが結合した標的細胞への細胞傷害性因子の放出を含む）、または抗原の細胞外ＣＡＲドメインへの結合によって誘発される他の細胞応答を惹起することに関与するＣＡＲの部分を指す。
【０１１３】
「エフェクター機能」という用語は、免疫エフェクター細胞の特殊な機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能のシグナルを伝達し、その細胞が特殊な機能を発揮するように仕向けるタンパク質の部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体が採用され得るが、多くの場合、ドメイン全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮された部分を使用する場合、そのような短縮された部分は、当該部分がエフェクター機能のシグナルを伝達する限り、ドメイン全体に代えて使用することができる。細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能のシグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の短縮部分を含むことを意味する。
【０１１４】
ＴＣＲのみを通して生成されるシグナルは、Ｔ細胞の完全な活性化に十分ではなく、二次シグナルまたは共刺激シグナルも必要であることが知られている。したがって、Ｔ細胞活性化は、ＴＣＲ（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）を介した抗原依存性の一次活性化を開始する一次シグナル伝達ドメインと、抗原に依存しない方法で二次シグナルまたは共刺激シグナルを提供するように作用する共刺激シグナル伝達ドメインの２つの別個のクラスの細胞内シグナル伝達ドメインによって媒介されると言うことができる。好ましい実施形態において、本明細書で企図されるＣＡＲは、１つ以上の「共刺激シグナル伝達ドメイン」及び「一次シグナル伝達ドメイン」を含む、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０１１５】
一次シグナル伝達ドメインは、刺激性または抑制性のいずれかでＴＣＲ複合体の一次活性化を制御する。刺激を与えるように作用する一次シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシン活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含有し得る。
【０１１６】
本発明で特に有用である一次シグナル伝達ドメインを含有するＩＴＡＭの例示的な例としては、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄ由来のものが挙げられる。特に好ましい実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメイン及び１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。細胞内一次シグナル伝達ドメイン及び共刺激シグナル伝達ドメインは、膜貫通ドメインのカルボキシル末端に任意の順番でタンデムに連結され得る。
【０１１７】
本明細書で企図されるＣＡＲは、ＣＡＲ受容体を発現するＴ細胞の有効性及び増殖を向上させる１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。本明細書で使用される場合、「共刺激シグナル伝達ドメイン」、または「共刺激ドメイン」という用語は、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインを指す。共刺激分子は、抗原への結合時にＴリンパ球の効率的な活性化及び機能に必要な二次シグナルを提供する、抗原受容体またはＦｃ受容体以外の細胞表面分子である。そのような共刺激分子の例示的な例としては、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２ＣＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０が挙げられる。一実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、及びＣＤ１３４からなる群から選択される１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインとを含む。
【０１１８】
別の実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ２８及びＣＤ１３７共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインとを含む。
【０１１９】
更に別の実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ２８及びＣＤ１３４共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインとを含む。
【０１２０】
一実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ１３７及びＣＤ１３４共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインとを含む。
【０１２１】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるＣＡＲは、Ｂ細胞上に発現されるＢＣＭＡポリペプチドに特異的に結合するマウス抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片を含む。
【０１２２】
一実施形態において、ＣＡＲは、ＢＣＭＡポリペプチドに結合するマウス抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ；Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン；ならびにＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２ＣＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０からなる群から選択される共刺激分子由来の１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびにＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄ由来の一次シグナル伝達ドメインを含む。
【０１２３】
一実施形態において、ＣＡＲは、ＢＣＭＡポリペプチドに結合するマウス抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ；Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン；ならびにＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２ＣＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０からなる群から選択される共刺激分子由来の１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびにＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄ由来の一次シグナル伝達ドメインを含む。
【０１２４】
一実施形態において、ＣＡＲは、ＢＣＭＡポリペプチドに結合するマウス抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ；Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン；ならびにＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２ＣＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０１からなる群から選択される共刺激分子由来の１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびにＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄからなる群から選択されるポリペプチド由来の１つ以上の一次シグナル伝達ドメインを含む。
【０１２５】
一実施形態において、ＣＡＲは、ＢＣＭＡポリペプチドに結合するマウス抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ；ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、ＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、及びＣＤ８αヒンジからなる群から選択されるヒンジドメイン；Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン；ならびにＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２ＣＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０からなる群から選択される共刺激分子由来の１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびにＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄからなる群から選択されるポリペプチド由来の１つ以上の一次シグナル伝達ドメインを含む。
【０１２６】
一実施形態において、ＣＡＲは、ＢＣＭＡポリペプチドに結合するマウス抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ；ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、ＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、及びＣＤ８αヒンジからなる群から選択されるヒンジドメイン；Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン；ＣＡＲのＴＭドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに連結する、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸長の間の短いオリゴペプチドまたはポリペプチドリンカー；ならびにＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２ＣＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０からなる群から選択される共刺激分子由来の１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびにＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄ由来の一次シグナル伝達ドメインを含む。
【０１２７】
一実施形態において、ＣＡＲは、ＢＣＭＡポリペプチドに結合するマウス抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ；ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、ＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、及びＣＤ８αヒンジからなる群から選択されるヒンジドメイン；Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン；ＣＡＲのＴＭドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに連結する、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸長の間の短いオリゴペプチドまたはポリペプチドリンカー；ならびにＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２ＣＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０からなる群から選択される共刺激分子由来の１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびにＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄからなる群から選択されるポリペプチド由来の１つ以上の一次シグナル伝達ドメインを含む。
【０１２８】
特定の実施形態において、ＣＡＲは、ＢＣＭＡポリペプチドに結合するマウス抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ；ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３ポリペプチド及びＣＤ８αポリペプチドを含むヒンジドメイン；約３〜約１０個のアミノ酸のポリペプチドリンカーを含むＣＤ８α膜貫通ドメイン；ＣＤ１３７細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびにＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
【０１２９】
特定の実施形態において、ＣＡＲは、ＢＣＭＡポリペプチドに結合するマウス抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ；ＣＤ８αポリペプチドを含むヒンジドメイン；約３〜約１０個のアミノ酸のポリペプチドリンカーを含むＣＤ８α膜貫通ドメイン；ＣＤ１３４細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；及びＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
【０１３０】
特定の実施形態において、ＣＡＲは、ＢＣＭＡポリペプチドに結合するマウス抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ；ＣＤ８αポリペプチドを含むヒンジドメイン；約３〜約１０個のアミノ酸のポリペプチドリンカーを含むＣＤ８α膜貫通ドメイン；ＣＤ２８細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；及びＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
【０１３１】
特定の実施形態において、ＣＡＲは、ＢＣＭＡポリペプチドに結合するマウス抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ；ＣＤ８αポリペプチドを含むヒンジドメイン；ＣＤ８α膜貫通ドメイン；ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；及びＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
【０１３２】
更に、本明細書で企図されるＣＡＲの設計は、改変されていないＴ細胞または他のＣＡＲを発現するように改変されたＴ細胞と比較して、ＣＡＲを発現するＴ細胞の増殖、長期持続性、及び許容可能な細胞傷害性の改善を可能にする。
【０１３３】
５．４．ポリペプチド
本発明は、部分的に、ＣＡＲポリペプチド及びその断片、それを含む細胞及び組成物、ならびにポリペプチドを発現するベクターを企図する。好ましい実施形態において、配列番号９に記載される１つ以上のＣＡＲを含むポリペプチドが提供される。
【０１３４】
「ポリペプチド」、「ポリペプチド断片」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、区別なく用いられ、反対のことが明示されない限り、従来の意味に従って、すなわち、一連のアミノ酸として、使用される。ポリペプチドは、特定の長さに限定されず、例えば、全長タンパク質配列または全長タンパク質の断片を含み得、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ならびに当該技術分野において知られている天然及び非天然の両方の他の修飾を含み得る。様々な実施形態において、本明細書で企図されるＣＡＲポリペプチドは、タンパク質のＮ末端にシグナル（またはリーダー）配列を含み、この配列は、翻訳と同時にまたは翻訳後に、タンパク質の輸送を誘導する。本明細書で開示されるＣＡＲに有用な好適なシグナル配列の例示的な例としては、ＩｇＧ１重鎖シグナル配列及びＣＤ８αシグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない。ポリペプチドは、よく知られた様々な組み換え技術及び／または合成技術のいずれかを使用して調製することができる。本明細書で企図されるポリペプチドは、具体的に、本開示のＣＡＲ、または本明細書で開示されるＣＡＲの１つ以上のアミノ酸から欠失がある配列、付加のある配列、及び／または置換のある配列を包含する。
【０１３５】
「単離されたペプチド」または「単離されたポリペプチド」などは、本明細書で使用される場合、細胞環境から、及び細胞の他の構成成分との会合からのペプチドまたはポリペプチド分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ単離及び／または精製を指す（すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏ物質と大きく会合していない）。同様に、「単離された細胞」とは、ｉｎ  ｖｉｖｏ組織または器官から得られた細胞を指し、細胞外マトリックスを実質的に含まない。
【０１３６】
ポリペプチドは、「ポリペプチドバリアント」を含む。ポリペプチドバリアントは、１つ以上の置換、欠失、付加及び／または挿入の点で、天然ポリペプチドとは異なり得る。そのようなバリアントは、天然に生じ得るか、または例えば上のポリペプチド配列のうちの１つ以上を改変することによって、合成的に生成され得る。例えば、特定の実施形態において、ＣＡＲポリペプチドの結合ドメイン、ヒンジ、ＴＭドメイン、共刺激シグナル伝達ドメインまたは一次シグナル伝達ドメインに１つ以上の置換、欠失、付加及び／または挿入を導入することによって、ＣＡＲの結合親和性及び／または他の生物学的性質を改善することが望ましいことがある。好ましくは、本発明のポリペプチドは、当該ポリペプチドに対して、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１３７】
ポリペプチドは、「ポリペプチド断片」を含む。ポリペプチド断片は、天然または組み換え産生ポリペプチドのアミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失、及び／または内部欠失または置換を有する単量体または多量体であり得るポリペプチドを指す。ある特定の実施形態において、ポリペプチド断片は、少なくとも５〜約５００アミノ酸長のアミノ酸鎖を含み得る。ある特定の実施形態において、断片は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、または４５０アミノ酸長であることが理解される。特に有用なポリペプチド断片は、抗体の抗原結合ドメインまたは断片を含む機能性ドメインを含む。マウス抗ＢＣＭＡ抗体の場合、有用な断片には、重鎖または軽鎖のＣＤＲ３領域であるＣＤＲ領域；重鎖または軽鎖の可変領域；２つのＣＤＲを含む抗体鎖の一部または可変領域などが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３８】
ポリペプチドは、ポリペプチドの合成、精製もしくは特定を容易にするために、またはポリペプチドの固体支持体に対する結合を高めるために、リンカーまたは他の配列（例えば、ポリ−Ｈｉｓ）にインフレームに融合されるか、またはコンジュゲートされ得る。
【０１３９】
上記のように、本発明のポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失、短縮、及び挿入を含む、様々な方法で変更され得る。そのような操作方法は、一般に当該技術分野において知られている。例えば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、ＤＮＡの変異によって調製することができる。変異導入及びヌクレオチド配列の変更の方法は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８２：４８８−４９２）、Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５４：３６７−３８２）、米国特許第４，８７３，１９２号、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．，１９８７）及びこれらにおいて引用されている参考文献を参照されたい。目的のタンパク質の生物活性に影響しない適切なアミノ酸置換に関するガイダンスは、Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７８）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルに見出すことができる。
【０１４０】
ある特定の実施形態において、バリアントは、保存的置換を含有する。「保存的置換」は、アミノ酸を、類似の性質を有する別のアミノ酸で置き換えたものであり、ペプチド化学分野の当業者であれば、ポリペプチドの二次構造及び疎水性親水性の性質が実質的に変化しないことを予想するであろう。本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドの構造に改変を行うことができ、それでもなお、所望の特性を有するバリアントまたは誘導体ポリペプチドをコードする機能性分子が得られる。ポリペプチドのアミノ酸配列を変更して、同等であるか、または更に改善されたバリアントポリペプチドを創出することが望ましい場合、当業者は、例えば、表１に従って、例えば、コードＤＮＡ配列のコドンのうちの１つ以上を変更することができる。
表１−アミノ酸コドン
【表１】
2021530483.tif 000003
【０１４１】
生物活性を失うことなく、どのアミノ酸残基を置換、挿入、または欠失することができるかを決定するガイダンスは、ＤＮＡＳＴＡＲ（商標）ソフトウェアなどの当該技術分野においてよく知られているコンピュータプログラムを使用して見出すことができる。好ましくは、本明細書で開示されるタンパク質バリアント中のアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち、類似の荷電アミノ酸または非荷電アミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化は、その側鎖に関係するアミノ酸のファミリーのうちの１つの置換を伴う。天然アミノ酸は、一般に、４つのファミリー：酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性（リシン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、及び無電荷極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン）アミノ酸に分けられる。フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンは、時折、芳香族アミノ酸に一緒に分類される。ペプチドまたはタンパク質において、アミノ酸の好適な保存的置換は、当業者に知られており、一般に、得られる分子の生物活性を変更することなく行うことができる。当業者であれば、一般に、必須ではない領域中の単一のアミノ酸置換は、ポリペプチドの生物活性を実質的に変更しないことを認識している（例えば、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８７，Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４）。例示的な保存的置換は、米国仮特許出願第６１／２４１，６４７号に記載されており、その開示は、参照により本明細書に援用される。
【０１４２】
そのようは変更を行う際には、アミノ酸の疎水性親水性指標が考慮され得る。相互作用的な生物学的機能をタンパク質に付与する場合における疎水性親水性アミノ酸指標の重要さは、一般に、当該技術分野において理解されている（Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２；参照により本明細書に援用される）。各アミノ酸は、その疎水性及び電荷特性に基づいて、疎水性親水性指標が割り当てられている（Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。その値は、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／システイン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）である。
【０１４３】
ある特定のアミノ酸は、類似の疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸で置換することができ、それでもなお、類似の生物活性を有するタンパク質が得られ、すなわち、生物学的に機能する同等のタンパク質を得ることができることは、当該技術分野において知られている。そのような変化を行う際には、疎水性親水性指標が±２以内のアミノ酸置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、±０．５以内のものが更により特に好ましい。同様のアミノ酸の置換を親水性に基づいて効果的に行うことができることも当該技術分野において理解されている。
【０１４４】
米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されるように、次の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。アミノ酸は、類似の親水性値を有する別のアミノ酸で置換することができ、それでもなお、生物学的に同等のタンパク質、特に、免疫学的に同等のタンパク質を得ることができることが理解される。そのような変化の際には、親水性値が±２以内のアミノ酸置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、±０．５以内のものが更により特に好ましい。
【０１４５】
上で概説したように、アミノ酸置換は、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、その疎水性、親水性、電荷、大きさなどに基づき得る。
【０１４６】
ポリペプチドバリアントは、グリコシル化形態、他の分子との凝集性コンジュゲート、及び無関係な化学部分（例えば、ＰＥＧ化分子）との共有結合コンジュゲートを更に含む。共有結合バリアントは、当該技術分野において知られているように、アミノ酸鎖中に見られる基またはＮ末端もしくはＣ末端の残基に官能基を連結することによって調製することができる。バリアントはまた、アレルバリアント、種バリアント、及びムテインも含む。タンパク質の機能的活性に影響しない領域の短縮または欠失もまたバリアントである。
【０１４７】
一実施形態において、２つ以上ポリペプチドの発現が望ましい場合、それらをコードするポリヌクレオチド配列は、本明細書に別途考察されるように、ＩＲＥＳ配列によって分けることができる。別の実施形態において、２つ以上ポリペプチドは、１つ以上の自己切断ポリペプチド配列を含む融合タンパク質として発現され得る。
【０１４８】
本発明のポリペプチドには、融合ポリペプチドが含まれる。好ましい実施形態において、融合ポリペプチド及び融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、ＣＡＲが提供される。融合ポリペプチド及び融合タンパク質とは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以上のポリペプチドセグメントを有するポリペプチドを指す。融合ポリペプチドは、典型的に、Ｃ末端をＮ末端に連結させるが、Ｃ末端をＣ末端に、Ｎ末端をＮ末端に、またはＮ末端をＣ末端に連結することもできる。融合タンパク質のポリペプチドは、任意の順序または指定の順序であり得る。融合ポリペプチドまたは融合タンパク質はまた、融合ポリペプチドの所望の転写活性が保存される限り、保存的改変バリアント、多型バリアント、アレル、変異体、サブ配列、及び種間ホモログも含み得る。融合ポリペプチドは、化学的合成方法もしくは２つの部分間の化学的連結によって作製され得るか、または一般に他の標準的な技術を使用して調製され得る。融合ポリペプチドを含むライゲートされたＤＮＡ配列は、本明細書に別途記載される好適な転写または翻訳制御要素に作動可能に連結される。
【０１４９】
一実施形態において、融合パートナーは、本来の組み換えタンパク質よりも高い収率で、タンパク質の発現を支援する配列（発現エンハンサー）を含む。他の融合パートナーは、タンパク質の可溶性を高めるように、またはタンパク質が所望の細胞内区画を標的とすることを可能にするように、または細胞膜を通した融合タンパク質の運搬を容易にするように選択され得る。
【０１５０】
融合ポリペプチドは、本明細書に記載されるポリペプチドドメインのそれぞれの間にポリペプチド切断シグナルを更に含み得る。加えて、ポリペプチド部位は、任意のリンカーペプチド配列中に入れることができる。例示的なポリペプチド切断シグナルとしては、プロテアーゼ切断部位、ヌクレアーゼ切断部位（例えば、稀な制限酵素認識部位、自己切断リボザイム認識部位）及び自己切断ウイルスオリゴペプチドなどのポリペプチド切断認識部位が挙げられる（ｄｅＦｅｌｉｐｅ  ａｎｄ  Ｒｙａｎ，２００４．Ｔｒａｆｆｉｃ，５（８）；６１６−２６参照）。
【０１５１】
好適なプロテアーゼ切断部位及び自己切断ペプチドは、当業者に知られている（例えば、Ｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７．Ｊ．Ｇｅｎｅｒ．Ｖｉｒｏｌ．７８，６９９−７２２；Ｓｃｙｍｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．５，５８９−５９４参照）。例示的なプロテアーゼ切断部位としては、ポティウイルスＮＩａプロテアーゼ（例えば、タバコエッチウイルスプロテアーゼ）、ポティウイルスＨＣプロテアーゼ、ポティウイルスＰ１（Ｐ３５）プロテアーゼ、ビオウイルスＮＩａプロテアーゼ、ビオウイルスＲＮＡ−２コードプロテアーゼ、口蹄疫ウイルスＬプロテアーゼ、エンテロウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス２Ａプロテアーゼ、ピコルナ３Ｃプロテアーゼ、コモウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ネポウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ＲＴＳＶ（イネツングロ球状ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ＰＹＶＦ（パースニップ黄色斑点ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ヘパリン、トロンビン、第Ｘａ因子及びエンテロキナーゼの切断部位が挙げられるが、これらに限定されない。その高い切断厳密性により、ＴＥＶ（タバコエッチウイルス）プロテアーゼ切断部位、例えば、ＥＸＸＹＸＱ（Ｇ／Ｓ）（配列番号２３）、例えば、ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号２４）及びＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号２５）（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸を表す（ＴＥＶによる切断は、ＱとＧの間またはＱとＳの間に生じる））が一実施形態において好ましい。
【０１５２】
特定の実施形態において、自己切断ペプチドは、ポティウイルス及びカルジオウイルス２Ａペプチド、ＦＭＤＶ（口蹄疫病ウイルス）、ウマ鼻炎Ａウイルス、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス、ならびにブタテッショウイルスから得られるポリペプチド配列を含む。
【０１５３】
ある特定の実施形態において、自己切断ポリペプチド部位は、２Ａまたは２Ａ様の部位、配列またはドメインを含む（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００１．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７−１０４１）。
表２：例示的な２Ａ部位は、以下の配列を含む：
【表２】
2021530483.tif 000004
【０１５４】
好ましい実施形態において、本明細書で企図されるポリペプチドは、ＣＡＲポリペプチドを含む。
【０１５５】
５．５．ポリヌクレオチド
好ましい実施形態において、１つ以上のＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、配列番号１０が提供される。本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、ゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、プラス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（＋））、マイナス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（−））、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）または組み換えＤＮＡを指す。ポリヌクレオチドには、一本鎖及び二本鎖ポリヌクレオチドが含まれる。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載される参照配列のいずれか（例えば、配列表を参照）に対して、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する、ポリヌクレオチドまたはバリアントを含み、ここで、典型的に、バリアントは、参照配列の少なくとも１つの生物活性を維持する。様々な例示的な実施形態において、本発明は、部分的に、発現ベクター、ウイルスベクター、及びトランスファープラスミドを含むポリヌクレオチド、ならびにそれを含む組成物及び細胞を企図する。
【０１５６】
特定の実施形態において、本発明のポリペプチドの少なくとも約５、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、１０００、１２５０、１５００、１７５０、または２０００個以上連続するアミノ酸残基及び全ての中間の長さをコードするポリヌクレオチドが本発明によって提供される。この文脈における「中間の長さ」は、引用した値の任意の長さ、例えば、６、７、８、９など、１０１、１０２、１０３など、１５１、１５２、１５３など、２０１、２０２、２０３などを意味することが容易に理解される。
【０１５７】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチドバリアント」及び「バリアント」などという用語は、参照ポリヌクレオチド配列と実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチド、または以下に定義されるストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。これらの用語は、参照ポリヌクレオチドと比較して１つ以上のヌクレオチドが付加もしくは欠失されているか、または異なるヌクレオチドと置き換えられている、ポリヌクレオチドを含む。この点に関して、突然変異、付加、欠失及び置換を含むある特定の変更は、参照ポリヌクレオチドに対して行うことができ、それにより、変更されたポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または生物活性を保持することは当該技術分野においてよく理解されている。
【０１５８】
「配列同一性」、または例えば「〜に対して５０％同一の配列」を含めた記述は、本明細書で使用される場合、配列が、比較ウインドウにわたって、ヌクレオチド単位基準またはアミノ酸単位基準でどの程度同一であるかを指す。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」は、最適にアライメントされた２つの配列を比較ウインドウにわたって比較し、両方の配列で同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ及びＭｅｔ）が存在する位置の数を求めて一致する位置の数を得、一致する位置の数を比較ウインドウの位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算され得る。本明細書に記載される参照配列のいずれかに対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド及びポリペプチドが含まれ、典型的に、ポリペプチドバリアントは、参照ポリペプチドの少なくとも１つの生物活性を維持する。
【０１５９】
２つ以上のポリヌクレオチド間またはポリペプチド間の配列関係を記述するために使用される用語には、「参照配列」、「比較ウインドウ」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」、及び「実質的な同一性」が含まれる。「参照配列」は、ヌクレオチド及びアミノ酸残基を含め、長さが少なくとも１２であるが、しばしば１５〜１８、多くの場合、少なくとも２５モノマー単位である。２つのポリヌクレオチドは、それぞれ、（１）２つのポリヌクレオチド間で類似する配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部のみ）及び（２）２つのポリヌクレオチド間で多様である配列を含み得るので、２つ（以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的に、２つのポリヌクレオチドの配列を「比較ウインドウ」にわたって比較して、配列類似性のある局所領域を特定及び比較することによって実施される。「比較ウインドウ」とは、２つの配列の最適なアライメントを行った後、配列を同数の連続する位置の参照配列と比較する、少なくとも６個、通常は約５０〜約１００個、より通常は約１００〜約１５０個の連続する位置からなる概念上のセグメントを指す。比較ウインドウは、２つの配列の最適アライメントを得るために、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、約２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。比較ウインドウのアライメントを行うための配列の最適アライメントは、アルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）をコンピュータで実行することによって、または調査及び選択された様々な方法のいずれかによって生成されるベストアライメント（すなわち、比較ウインドウにわたって最大の相同性パーセンテージをもたらすもの）によって実施され得る。また、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９によって開示されているＢＬＡＳＴファミリーのプログラムを参照してもよい。配列解析の詳細な考察は、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ，１９９４−１９９８（第１５章単元１９．３）に見出すことができる。
【０１６０】
本明細書で使用される場合、「単離されたポリヌクレオチド」とは、天然状態では隣接して置かれている配列から精製されたポリヌクレオチド、例えば、通常は断片に隣接している配列から取り出されたＤＮＡ断片を指す。「単離されたポリヌクレオチド」はまた、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組み換えＤＮＡ、または天然に存在せず、人の手によって作られた他のポリヌクレオチドも指す。
【０１６１】
ポリヌクレオチドの方向を記載する用語には、５’（通常、遊離リン酸基を有するポリヌクレオチドの末端）及び３’（通常、遊離ヒドロキシル（ＯＨ）基を有するポリヌクレオチドの末端）が含まれる。ポリヌクレオチド配列は、５’→３’方向または３’→５’方向で注釈され得る。ＤＮＡ及びｍＲＮＡについて、５’→３’鎖は、その配列がプレメッセンジャー（ｐｒｅｍＲＮＡ）の配列と同一であるので［ＤＮＡ中のチミン（Ｔ）の代わりであるＲＮＡのウラシル（Ｕ）は除く］、「センス」鎖、「プラス」鎖、または「コード」鎖と呼ばれる。ＤＮＡ及びｍＲＮＡについて、ＲＮＡポリメラーゼによって転写された鎖である相補性３’→５’鎖は、「鋳型」鎖、「アンチセンス」鎖、「マイナス」鎖、または「非コード」鎖と呼ばれる。本明細書で使用される場合、「逆方向」という用語は、３’→５’方向で書かれた５’→３’配列、または５’→３’方向で書かれた３’→５’配列を指す。
【０１６２】
「相補的」及び「相補性」という用語は、塩基対合規則によって関係が示されるポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を指す。例えば、ＤＮＡ配列５’ＡＧＴＣＡＴＧ３’の相補鎖は、３’ＴＣＡＧＴＡＣ５’である。後者の配列は、左側を５’末端、右側を３’末端にした逆相補鎖５’ＣＡＴＧＡＣＴ３’として書かれることが多い。その逆相補鎖と等しい配列は、パリンドローム配列と言われる。相補性は、「部分的」であり得、核酸塩基のいくつかのみが塩基対合規則に従って一致する。あるいは、核酸間で「完全」または「全」相補性であってもよい。
【０１６３】
更に、当業者であれば、遺伝コードの縮重の結果として、本明細書に記載されるポリペプチド、またはそのバリアントの断片をコードするヌクレオチド配列は多数存在することが理解される。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、任意のネイティブ遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する。しかしながら、コドン使用頻度の違いによって変わるポリヌクレオチド、例えば、ヒト及び／または霊長類コドン選択に応じて最適化されたポリヌクレオチドが本発明によって具体的に企図される。更に、本明細書で提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子のアレルもまた使用され得る。アレルは、ヌクレオチドの欠失、付加及び／または置換などの１つ以上の突然変異の結果として変更される内因性遺伝子である。
【０１６４】
本明細書で使用される「核酸カセット」という用語は、ＲＮＡを発現し、その後タンパク質を発現することができるベクター内の遺伝子配列を指す。核酸カセットは、目的の遺伝子、例えば、ＣＡＲを含有する。核酸カセットは、カセット内の核酸がＲＮＡに転写され、必要な場合にはタンパク質またはポリペプチドに翻訳され、形質転換細胞の活性に必要とされる適切な翻訳後修飾を受け、適切な細胞内区画を標的とすることまたは細胞外区画への分泌によって生物活性に適切な区画へ移動していくことができるように、ベクター内に位置的及び連続的に配向される。好ましくは、カセットは、ベクターへの容易な挿入に適合された３’末端及び５’末端を有し、例えば、各末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有する。本発明の好ましい実施形態において、核酸カセットは、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療に使用されるキメラ抗原受容体の配列を含有する。カセットは、除去され得、単一単位としてプラスミドまたはウイルスベクターに挿入され得る。
【０１６５】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの目的のポリヌクレオチドを含む。本明細書で使用される場合、「目的のポリヌクレオチド」という用語は、ポリペプチド（すなわち、目的のポリペプチド）をコードし、発現が望まれる発現ベクターに挿入されるポリヌクレオチドを指す。ベクターは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の目的のポリヌクレオチドを含み得る。ある特定の実施形態において、目的のポリヌクレオチドは、疾患または障害の治療または予防に治療効果をもたらすポリペプチドをコードする。目的のポリヌクレオチド、及びそのポリヌクレオチドからコードされたポリペプチドは、野生型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにその機能性バリアント及び断片の両方を含む。特定の実施形態において、機能性バリアントは、対応する野生型参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有する。ある特定の実施形態において、機能性バリアントまたは断片は、対応する野生型ポリペプチドの生物活性の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％を有する。
【０１６６】
一実施形態において、目的のポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードしないが、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、もしくはｓｈＲＮＡ、リボザイム、または他の阻害性ＲＮＡを転写するための鋳型として機能する。様々な他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＣＡＲをコードする目的のポリヌクレオチド及び１つ以上の追加の目的のポリヌクレオチド、例えば、限定するものではないが、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びリボザイム、例えば、限定するものではないが、阻害性核酸配列を含む。
【０１６７】
本明細書で使用される場合、「ｓｉＲＮＡ」または「低分子干渉ＲＮＡ」という用語は、動物において配列特異的転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、転写阻害、またはエピジェネティックＲＮＡｉのプロセスを媒介する、短いポリヌクレオチド配列を指す（Ｚａｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３；Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６；Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，９５０−９５１；Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ，４０２，１２８−１２９；Ｓｈａｒｐ，１９９９，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．，１３，１３９−１４１；及びＳｔｒａｕｓｓ，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，８８６）。ある特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、同じ数のヌクレオシドを有する第１の鎖及び第２の鎖を含むが、第１の鎖及び第２の鎖は、第１の鎖及び第２の鎖上の２つの末端ヌクレオシドが相補鎖上の残基に対合しないようにオフセットされる。ある特定の場合において、対合しない２つのヌクレオシドは、チミジン残基である。ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡまたはその断片が標的遺伝子の下方制御を媒介することができるように、標的遺伝子に対して十分な相同性のある領域を含み、ヌクレオチドに関して十分な長さである必要がある。したがって、ｓｉＲＮＡは、標的ＲＮＡに対して少なくとも部分的に相補性のある領域を含む。ｓｉＲＮＡと標的との間に完全な相補性がある必要はないが、その相関性は、ｓｉＲＮＡまたはその切断産物が、標的ＲＮＡのＲＮＡｉ切断によるものなどの配列特異的サイレンシングを行うことを可能にするのに十分でなければならない。標的鎖との相補性または相同性の程度は、アンチセンス鎖において最も重要である。特にアンチセンス鎖における完全な相補性が望ましいことが多いが、いくつかの実施形態は、標的ＲＮＡに対して、１つ以上だが、好ましくは、１０、８、６、５、４、３、２またはそれ以下のミスマッチを含む。ミスマッチは、末端領域で最も許容されるものであり、存在する場合、好ましくは、末端領域か、または例えば、５’末端及び／または３’末端の６、５、４、または３ヌクレオチド以内の領域にある。センス鎖は、分子の二本鎖の特徴全体を維持するように、アンチセンス鎖との十分な相補性があることのみを必要とする。
【０１６８】
加えて、ｓｉＲＮＡは、改変されるか、またはヌクレオシド類似体を含み得る。ｓｉＲＮＡの一本鎖領域は、改変されるか、またはヌクレオシド類似体、例えば、対合していない領域またはヘアピン構造領域を含み得、例えば、２つの相補性領域を連結する領域は、改変またはヌクレオシド類似体を有し得る。例えば、エキソヌクレアーゼに対してｓｉＲＮＡの１つ以上の３’末端または５’末端を安定化させる改変、またはアンチセンスｓｉＲＮＡ剤をＲＩＳＣに取り込まれやすくする改変もまた有用である。改変は、Ｃ３（またはＣ６、Ｃ７、Ｃ１２）アミノリンカー、チオールリンカー、カルボキシルリンカー、非ヌクレオチドスペーサー（Ｃ３、Ｃ６、Ｃ９、Ｃ１２、脱塩基、トリエチレングリコールヘキサエチレングリコール）、特別なビオチン、またはホスホロアミダイトとして入手可能であり、別のＤＭＴ保護ヒドロキシル基を有し、ＲＮＡ合成中に複数のカップリングを可能にするフルオレセイン試薬を含み得る。ｓｉＲＮＡの各鎖は、３０、２５、２４、２３、２２、２１、または２０ヌクレオチド長以下であり得る。鎖は、好ましくは、少なくとも１９ヌクレオチド長である。例えば、各鎖は、２１〜２５ヌクレオチド長であり得る。好ましいｓｉＲＮＡは、１７、１８、１９、２９、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド対の二重鎖領域、及び２〜３ヌクレオチドの１つ以上のオーバーハング、好ましくは、２〜３ヌクレオチドの１または２つの３’オーバーハングを有する。
【０１６９】
本明細書で使用される場合、「ｍｉＲＮＡ」または「マイクロＲＮＡ」という用語は、典型的に、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡとして知られる約７０ヌクレオチドのフォールドバックＲＮＡ前駆体構造から切り出された、２０〜２２ヌクレオチドの小さな非コードＲＮＡを指す。ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡと標的の間の相補性の程度に応じた２つの方法のうちの１つで、その標的を負に制御する。まず、タンパク質をコードするｍＲＮＡ配列に対して完全なまたはほぼ完全な相補性で結合するｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ媒介干渉（ＲＮＡｉ）経路を誘発する。そのｍＲＮＡ標的の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）内にある不完全な相補性部位に結合することによって制御作用を発揮するｍｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ経路に使用されるものに類似した、またはおそらく同一であるＲＩＳＣ複合体を介して、転写後、見かけ上では翻訳のレベルで、標的遺伝子の発現を抑制する。翻訳調節と一致して、この機序を使用するｍｉＲＮＡは、その標的遺伝子のタンパク質レベルを低下させるが、これらの遺伝子のｍＲＮＡレベルは、最小限の影響しか受けない。ｍｉＲＮＡは、天然に存在するｍｉＲＮＡと、任意のｍＲＮＡ配列を特異的に標的とすることができる人工的に設計されたｍｉＲＮＡとの両方を包含する。例えば、一実施形態において、当業者は、ヒトｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−３０またはｍｉＲ−２１）一次転写物として発現される短いヘアピンＲＮＡコンストラクトを設計することができる。この設計は、Ｄｒｏｓｈａプロセシング部位をヘアピンコンストラクトに付加するものであり、ノックダウン効率を大幅に高めることが示されている（Ｐｕｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。ヘアピンステムは、２２ヌクレオチドのｄｓＲＮＡ（例えば、アンチセンスは所望の標的に対する完全な相補性を有する）及びヒトｍｉＲ由来の１５〜１９ヌクレオチドループからなる。ヘアピンの片側または両側上にｍｉＲループ及びｍｉＲ３０フランキング配列を加えると、マイクロＲＮＡを含まない従来のｓｈＲＮＡ設計と比較した場合、発現されたヘアピンのＤｒｏｓｈａ及びＤｉｃｅｒプロセシングが１０倍を超えて増加する。Ｄｒｏｓｈａ及びＤｉｃｅｒプロセシングが増えることで、より多くのｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ産物に転換され、発現されたヘアピンの効果も大きくなる。
【０１７０】
本明細書で使用される場合、「ｓｈＲＮＡ」または「小ヘアピンＲＮＡ」という用語は、単一の自己相補性ＲＮＡ鎖によって形成される二本鎖構造を指す。阻害には、標的遺伝子のコーディング配列またはノンコーディング配列のいずれかの一部と同一であるヌクレオチド配列を含有するｓｈＲＮＡコンストラクトが好ましい。標的配列に対して挿入、欠失、及び一点変異を含むＲＮＡ配列もまた、阻害に効果的であることが分かっている。阻害性ＲＮＡと標的遺伝子の一部との間で、９０％を超える配列同一性、または更に１００％の配列同一性があることが好ましい。ある特定の好ましい実施形態において、ｓｈＲＮＡの二重鎖形成部の長さは、少なくとも２０、２１または２２ヌクレオチド長であり、例えば、Ｄｉｃｅｒ依存性切断によって生成されるＲＮＡ産物のサイズに相当する。ある特定の実施形態において、ｓｈＲＮＡコンストラクトは、少なくとも２５、５０、１００、２００、３００または４００塩基長である。ある特定の実施形態において、ｓｈＲＮＡコンストラクトは、４００〜８００塩基長である。ｓｈＲＮＡコンストラクトは、ループ配列及びループサイズの変化に対して非常に耐性がある。
【０１７１】
本明細書で使用される場合、「リボザイム」という用語は、標的ｍＲＮＡの部位特異的切断を可能にする触媒活性のあるＲＮＡ分子を指す。いくつかのサブタイプ、例えば、ハンマーヘッド型及びヘアピン型リボザイムが記載されている。リボザイムの触媒活性及び安定性は、非触媒性塩基のリボヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドで置換することによって改善することができる。部位特異的認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザイムを使用して特定のｍＲＮＡを破壊することができるが、ハンマーヘッド型リボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補性塩基対を形成するフランキング領域によって指定された位置でｍＲＮＡを切断する。唯一の要件は、標的ｍＲＮＡが次の２つの塩基配列：５’−ＵＧ−３’を有することである。ハンマーヘッド型リボザイムの構築及び作製は、当該技術分野においてよく知られている。
【０１７２】
ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはリボザイムを含む目的のポリヌクレオチドの送達に好ましい方法は、本明細書に別途記載されるように、例えば、構成的高発現ｐｏｌ  ＩＩＩ、例えば、ヒトＵ６  ｓｎＲＮＡプロモーター、マウスＵ６  ｓｎＲＮＡプロモーター、ヒト及びマウスＨ１  ＲＮＡプロモーターならびにヒトｔＲＮＡ−ｖａｌプロモーター、または構成的高発現ｐｏｌ  ＩＩプロモーターなどの１つ以上の制御配列を含む。
【０１７３】
本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に別途開示されるように、または当技術分野において知られているように、コーディング配列自体の長さにかかわらず、プロモーター及び／またはエンハンサー、非翻訳領域（ＵＴＲ）、シグナル配列、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、マルチクローニングサイト、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ、ＦＲＴ、及びＡｔｔ部位）、終止コドン、転写終結シグナル、及び自己切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグなどの他のＤＮＡ配列と組み合わせてもよく、そのため、その全体的な長さは、大きく変動し得る。したがって、ほぼあらゆる長さのポリヌクレオチド断片を採用することができ、その全長は、好ましくは、目的の組み換えＤＮＡプロトコルにおける調製及び使用が容易であることに限られることが企図される。
【０１７４】
ポリヌクレオチドは、当該技術分野において知られ、利用可能である、様々な十分に確立された技術のいずれかを使用して、調製、操作及び／または発現することができる。所望のポリペプチドを発現させるために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が適切なベクターに挿入され得る。ベクターの例は、プラスミド、自己複製配列、及び転移要素である。更なる例示的なベクターとしては、限定するものではないが、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体、ラムダファージまたはＭ１３ファージなどのバクテリオファージ、及び動物ウイルスが挙げられる。ベクターとして有用な動物ウイルスのカテゴリーの例としては、限定するものではないが、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、及びパポバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられる。発現ベクターの例としては、哺乳動物細胞における発現には、ｐＣｌｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）；哺乳動物細胞におけるレンチウイルス媒介遺伝子移入及び発現には、ｐＬｅｎｔｉ４／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）、及びｐＬｅｎｔｉ６．２／Ｖ５−ＧＷ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。特定の実施形態において、本明細書で開示されるキメラタンパク質のコーディング配列は、哺乳動物細胞におけるキメラタンパク質の発現のために、そのような発現ベクターにライゲーションされ得る。
【０１７５】
一実施形態において、本明細書で企図されるＣＡＲをコードするベクターは、配列番号３６に記載されるポリヌクレオチド配列を含む。
【０１７６】
特定の実施形態において、ベクターは、エピソームベクター、または染色体外に維持されるベクターである。本明細書で使用される場合、「エピソーム」という用語は、宿主の染色体ＤＮＡ内に組み込まれることなく、また分裂する宿主細胞から次第に失われることなく、複製することが可能なベクターを指し、当該ベクターは、染色体外またはエピソームで複製することも意味する。ベクターは、リンパ球向性ヘルペスウイルスもしくはガンマヘルペスウイルス、アデノウイルス、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、または酵母に由来するＤＮＡ複製起点または「ｏｒｉ」、具体的には、ＥＢＶのｏｒｉＰに対応するリンパ球向性ヘルペスウイルスまたはガンマヘルペスウイルスの複製起点をコードする配列を有するように操作される。具体的な態様において、リンパ球向性ヘルペスウイルスは、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、サルヘルペスウイルス（ＨＳ）、またはマレック病ウイルス（ＭＤＶ）であり得る。エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）及びカポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）は、ガンマヘルペスウイルスの例でもある。典型的に、宿主細胞は、複製を活性化するウイルス複製トランス活性化因子タンパク質を含む。
【０１７７】
発現ベクターに存在する「調節要素」または「制御配列」は、宿主細胞のタンパク質と相互作用して転写及び翻訳を実施する、ベクターの非翻訳領域（複製起点、選択カセット、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（Ｓｈｉｎｅ  Ｄａｌｇａｒｎｏ配列またはＫｏｚａｋ配列）イントロン、ポリアデニル化配列、５’及び３’非翻訳領域）である。そのような要素は、その強度及び特異性が異なり得る。利用されるベクター系及び宿主に応じて、ユビキタスプロモーター及び誘導性プロモーターを含む、任意の数の好適な転写及び翻訳要素が使用され得る。
【０１７８】
特定の実施形態において、本発明の実施の際に使用するためのベクターは、限定するものではないが、発現ベクター及びウイルスベクターを含み、プロモーター及び／またはエンハンサーなどの外因性、内因性、または異種調節配列を含む。「内因性」調節配列は、ゲノム中の所与の遺伝子に自然に連結しているものである。「外因性」調節配列は、遺伝子操作（すなわち、分子生物学的技術）によって、遺伝子に、その遺伝子の転写が、連結されたエンハンサー／プロモーターによって誘導されるように並列に配置されているものである。「異種」調節配列は、遺伝子操作される細胞とは異なる種に由来する外因性配列である。
【０１７９】
本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼが結合するポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の認識部位を指す。ＲＮＡポリメラーゼは、プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを開始及び転写する。特定の実施形態において、哺乳動物細胞内で作動可能なプロモーターは、転写が開始される部位からおよそ２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域及び／または転写開始から７０〜８０塩基上流に見られる別の配列、ＣＮＣＡＡＴ領域（Ｎは、任意のヌクレオチドであり得る）を含む。
【０１８０】
「エンハンサー」という用語は、転写の向上をもたらすことが可能であり、また、いくつかの場合では別の調節配列に対する方向に関係なく機能することができる配列を含有するＤＮＡのセグメントを指す。エンハンサーは、プロモーター及び／または他のエンハンサー要素と協働的または付加的に機能することができる。「プロモーター／エンハンサー」という用語は、プロモーターとエンハンサーの両機能を提供することが可能な配列を含有するＤＮＡのセグメントを指す。
【０１８１】
「作動可能に連結される」という用語は、記載される要素が、その意図された様式で機能することを可能にする関係にある並列を指す。一実施形態において、この用語は、核酸発現調節配列（プロモーター、及び／またはエンハンサーなど）と第２のポリヌクレオチド配列、例えば、目的のポリヌクレオチドとの間の機能的連結を指し、ここで、発現調節配列は、第２の配列に対応する核酸の転写を誘導する。
【０１８２】
本明細書で使用される場合、「構成的発現調節配列」という用語は、作動可能に連結される配列の転写を断続的または連続的に可能にする、プロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーを指す。構成的発現調節配列は、多種多様な細胞及び組織種における発現を可能にする「ユビキタス」プロモーター、エンハンサー、もしくはプロモーター／エンハンサー、または限定された種類の細胞及び組織型における発現を可能にする「細胞特異的」、「細胞型特異的」、「細胞株特異的」、もしくは「組織特異的」プロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーでそれぞれあり得る。
【０１８３】
本発明の特定の実施形態において使用するのに好適な例示的なユビキタス発現調節配列としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ウイルス性シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター、ワクシニアウイルス由来のＨ５、Ｐ７．５、及びＰ１１プロモーター、伸長因子１−アルファ（ＥＦ１ａ）プロモーター、初期成長応答１（ＥＧＲ１）、フェリチンＨ（ＦｅｒＨ）、フェリチンＬ（ＦｅｒＬ）、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、真核生物翻訳開始因子４Ａ１（ＥＩＦ４Ａ１）、熱ショック７０ｋＤａタンパク質５（ＨＳＰＡ５）、熱ショックタンパク質９０ｋＤａベータメンバー１（ＨＳＰ９０Ｂ１）、熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）、β−キネシン（β−ＫＩＮ）、ヒトＲＯＳＡ２６遺伝子座（Ｉｒｉｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５，１４７７−１４８２（２００７））、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／トリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β−アクチンプロモーターならびに骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーの負調節領域欠失ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーター（Ｃｈａｌｌｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６９（２）：７４８−５５（１９９５））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８４】
一実施形態において、本発明のベクターは、ＭＮＤプロモーターを含む。
【０１８５】
一実施形態において、本発明のベクターは、ヒトＥＦ１ａ遺伝子の最初のイントロンを含む、ＥＦ１ａプロモーターを含む。
【０１８６】
一実施形態において、本発明のベクターは、ヒトＥＦ１ａ遺伝子の最初のイントロンを欠く、ＥＦ１ａプロモーターを含む。
【０１８７】
特定の実施形態において、Ｔ細胞特異的プロモーター由来のＣＡＲを含むポリヌクレオチドを発現することが望ましい場合がある。
【０１８８】
本明細書で使用される場合、「条件付き発現」は、限定するものではないが、誘導性発現；抑制性発現；特定の生理学的、生物学的、または病状を有する細胞または組織における発現などを含む、任意の種類の条件付き発現を指し得る。この定義は、細胞型または組織特異的発現を排除することを意図するものではない。本発明のある特定の実施形態は、目的のポリヌクレオチドの条件付き発現を提供し、例えば、発現は、細胞、組織、生物などを、ポリヌクレオチドを発現させるか、または目的のポリヌクレオチドによってコードされるポリヌクレオチドの発現を増加もしくは減少させる、処理または条件に供することによって調節される。
【０１８９】
誘導性プロモーター／系の例示的な例としては、グルココルチコイドまたはエストロゲン受容体をコードする遺伝子のプロモーターなどのステロイド誘導性プロモーター（対応するホルモンでの処理によって誘導可能）、メタロチオニンプロモーター（様々な重金属での処理によって誘導可能）、ＭＸ−１プロモーター（インターフェロンによって誘導可能）、「ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ」ミフェプリストン制御可能系（Ｓｉｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｇｅｎｅ，３２３：６７）、クミン酸誘導性遺伝子スイッチ（ＷＯ２００２／０８８３４６）、テトラサイクリン依存性制御系などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９０】
条件付き発現はまた、部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼを使用することによって達成することもできる。本発明のある特定の実施形態によれば、ベクターは、部位特異的リコンビナーゼによって媒介される組み換えのための部位（複数可）を少なくとも１つ（典型的に２つ）含む。本明細書で使用される場合、「リコンビナーゼ」または「部位特異的リコンビナーゼ」という用語は、１つ以上の組み換え部位（例えば、２、３、４、５、７、１０、１２、１５、２０、３０、５０など）を伴う組み換え反応に関与して切り出しまたは組み込みを行うタンパク質、酵素、共因子または関連タンパク質を含み、それらは、野生型タンパク質（Ｌａｎｄｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：６９９−７０７（１９９３）参照）、またはその変異体、誘導体（例えば、組み換えタンパク質配列またはその断片を含有する融合タンパク質）、断片、及びバリアントであり得る。本発明の特定の実施形態において使用するのに好適なリコンビナーゼの例示的な例としては、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、Ｆｌｐ、Ｆｉｓ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、ΦＣ３１、Ｃｉｎ、Ｔｎ３レゾルバーゼ、ＴｎｄＸ、ＸｅｒＣ、ＸｅｒＤ、ＴｎｐＸ、Ｈｊｃ、Ｇｉｎ、ＳｐＣＣＥ１、及びＰａｒＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９１】
ベクターは、多種多様な部位特異的リコンビナーゼのいずれかのための組み換え部位を１つ以上含み得る。部位特異的リコンビナーゼの標的部位は、ベクター、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターの組み込みに必要な任意の部位（複数可）に追加されることを理解されたい。本明細書で使用される場合、「組み換え配列」、「組み換え部位」、または「部位特異的組み換え部位」という用語は、リコンビナーゼが認識及び結合する特定の核酸配列を指す。
【０１９２】
例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼの１つの組み換え部位は、ｌｏｘＰであり、これは、８塩基対のコア配列の両側に２つの１３塩基対の逆方向反復（リコンビナーゼ結合部位として機能する）を含む、３４塩基対の配列である（Ｓａｕｅｒ，Ｂ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：５２１−５２７（１９９４）の図１参照）。他の例示的なｌｏｘＰ部位としては、ｌｏｘ５１１（Ｈｏｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｂｅｔｈｋｅ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９９７）、ｌｏｘ５１７１（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｓａｉｔｏ，１９９８）、ｌｏｘ２２７２（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｓａｉｔｏ，１９９８）、ｍ２（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）、ｌｏｘ７１（Ａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、及びｌｏｘ６６（Ａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９３】
ＦＬＰリコンビナーゼに好適な認識部位には、ＦＲＴ（ＭｃＬｅｏｄ，ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、Ｆ１，Ｆ２，Ｆ３（Ｓｃｈｌａｋｅ  ａｎｄ  Ｂｏｄｅ，１９９４）、Ｆ４，Ｆ５（Ｓｃｈｌａｋｅ  ａｎｄ  Ｂｏｄｅ，１９９４）、ＦＲＴ（ＬＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）、ＦＲＴ（ＲＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）。
【０１９４】
認識配列の他の例は、リコンビナーゼ酵素λインテグラーゼ、例えば、ｐｈｉ−ｃ３１によって認識されるａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、及びａｔｔＲ配列である。φＣ３１  ＳＳＲは、異型部位ａｔｔＢ（長さ３４ｂｐ）とｔｔＰ（長さ３９ｂｐ）との間の組み換えのみを媒介する（Ｇｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。ａｔｔＢ及びａｔｔＰは、それぞれ細菌及びファージゲノム上のファージインテグラーゼ結合部位にちなんで名付けられており、どちらもφＣ３１ホモ二量体によって結合される可能性のある不完全な逆方向反復を含有する（Ｇｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。生成部位であるａｔｔＬ及びａｔｔＲは、更なるφＣ３１媒介組み換えに対して効果的に不活性であり（Ｂｅｌｔｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、これにより、反応は不可逆となる。挿入を触媒するには、ａｔｔＢ含有ＤＮＡをゲノムａｔｔＰ部位に挿入するほうが、ａｔｔＰ部位をゲノムａｔｔＢ部位に挿入するよりも容易であることが分かっている（Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｂｅｌｔｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。したがって、典型的な戦略は、相同組み換えによって、ａｔｔＰ含有「ドッキング部位」を、定義した遺伝子座に配置し、次いで、それを挿入のためにａｔｔＢ含有移入配列と合わせることである。
【０１９５】
本明細書で使用される場合、「配列内リボソーム進入部位」または「ＩＲＥＳ」とは、シストロン（タンパク質コード領域）のＡＴＧなどの開始コドンへの直接的な配列内リボソーム進入を促進し、それにより、キャップ非依存的な遺伝子翻訳をもたらす要素を指す。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  １５（１２）：４７７−８３）及びＪａｃｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ｋａｍｉｎｓｋｉ．１９９５．ＲＮＡ  １（１０）：９８５−１０００を参照されたい。特定の実施形態において、本発明によって企図されるベクターは、１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の目的のポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、複数のポリペプチドのそれぞれの効率的な翻訳を達成するために、ポリヌクレオチド配列は、１つ以上のＩＲＥＳ配列または自己切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列によって分離され得る。
【０１９６】
本明細書で使用される場合、「Ｋｏｚａｋ配列」という用語は、リボソームの小さいサブユニットへのｍＲＮＡの最初の結合を大幅に容易にし、翻訳を増加させる、短いヌクレオチド配列を指す。コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、（ＧＣＣ）ＲＣＣＡＴＧＧである（ここで、Ｒはプリン（ＡまたはＧ）である）（Ｋｏｚａｋ，１９８６．Ｃｅｌｌ．４４（２）：２８３−９２，ａｎｄ  Ｋｏｚａｋ，１９８７．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５（２０）：８１２５−４８）。特定の実施形態において、本発明によって企図されるベクターは、コンセンサスＫｏｚａｋ配列を有し、所望のポリペプチド、例えば、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１９７】
本発明のいくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを有する細胞は、直接的な毒性及び／または無秩序な増殖のリスクを低減するために、誘導性自殺遺伝子を含む、自殺遺伝子を利用する。具体的な態様において、自殺遺伝子は、ポリヌクレオチドを有する宿主または細胞に対して免疫原性でないものである。使用され得る自殺遺伝子のある特定の例は、カスパーゼ−９またはカスパーゼ−８またはシトシンデアミナーゼである。カスパーゼ−９は、特定の二量体誘導化合物（ＣＩＤ）を使用して活性化することができる。
【０１９８】
ある特定の実施形態において、ベクターは、本発明の免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を、ｉｎ  ｖｉｖｏでのネガティブ選択に感受性となるようにする遺伝子セグメントを含む。「ネガティブ選択」とは、注入された細胞が、その個体のｉｎ  ｖｉｖｏ条件の変化の結果として排除され得ることを意味する。ネガティブ選択の可能な表現型は、投与される薬剤、例えば、化合物に対して感受性を付与する遺伝子の挿入により生じ得る。ネガティブ選択遺伝子は、当該技術分野において知られており、とりわけ、次のもの：ガンシクロビル感受性を付与する単純ヘルペスウイルスＩ型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＩＴＫ）遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １１：２２３，１９７７）；細胞ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子、細胞アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）遺伝子、及び細菌シトシンデアミナーゼ（Ｍｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：３３（１９９２））を含む。
【０１９９】
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞などの遺伝子改変された免疫エフェクター細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるネガティブ選択表現型の細胞の選択を可能にするポジティブマーカーを更に含む、ポリヌクレオチドを含む。ポジティブ選択マーカーは、遺伝子であって、宿主細胞に導入されたとき、その遺伝子を有する細胞のポジティブ選択を可能にする優性表現型を発現する遺伝子であり得る。この種の遺伝子は、当該技術分野において知られており、とりわけ、ハイグロマイシンＢに対する耐性を付与するハイグロマイシン−Ｂホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｈ）、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性をコードするＴｎ５由来のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏまたはａｐｈ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、及び多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子を含む。
【０２００】
好ましくは、ポジティブ選択マーカー及びネガティブ選択要素は、ネガティブ選択要素の脱落がポジティブ選択マーカーの脱落も必然的に伴うように連結される。更により好ましくは、ポジティブ選択マーカー及びネガティブ選択マーカーは、一方の脱落が他方の脱落に強制的につながるように融合される。上述される所望のポジティブ選択及びネガティブ選択の特徴の両方を付与するポリペプチドを発現産物としてもたらす融合ポリヌクレオチドの一例は、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼチミジンキナーゼ融合遺伝子（ＨｙＴＫ）である。この遺伝子の発現は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるポジティブ選択のためのハイグロマイシンＢ耐性、及びｉｎ  ｖｉｖｏにおけるネガティブ選択のためのガンシクロビル感受性を付与するポリペプチドをもたらす。Ｌｕｐｔｏｎ  Ｓ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．ａｎｄ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ  １  １：３３７４−３３７８，１９９１を参照されたい。加えて、好ましい実施形態において、キメラ受容体をコードする本発明のポリヌクレオチドは、融合遺伝子、特にｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるポジティブ選択のためのハイグロマイシンＢ耐性、及びｉｎ  ｖｉｖｏにおけるネガティブ選択のためのガンシクロビル感受性を付与する融合遺伝子を含有するレトロウイルスベクター、例えば、上掲のＬｕｐｔｏｎ，Ｓ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）に記載されているＨｙＴＫレトロウイルスベクターに存在する。また、優性ポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーとを融合することから得られる二機能性選択融合遺伝子の使用について記載している、Ｓ．Ｄ．ＬｕｐｔｏｎによるＰＣＴ  ＵＳ９１／０８４４２及びＰＣＴ／ＵＳ９４／０５６０１の公開物も参照されたい。
【０２０１】
好ましいポジティブ選択マーカーは、ｈｐｈ、ｎｃｏ、及びｇｐｔからなる群から選択される遺伝子に由来し、好ましいネガティブ選択マーカーは、シトシンデアミナーゼ、ＨＳＶ−ＩＴＫ、ＶＺＶＴＫ、ＨＰＲＴ、ＡＰＲＴ及びｇｐｔからなる群から選択される遺伝子に由来する。特に好ましいマーカーは、二機能性選択融合遺伝子であり、ポジティブ選択マーカーは、ｈｐｈまたはｎｅｏに由来し、ネガティブ選択マーカーは、シトシンデアミナーゼまたはＴＫ遺伝子もしくは選択マーカーに由来する。
【０２０２】
ウイルスベクター
【０２０３】
特定の実施形態において、細胞（例えば、免疫エフェクター細胞）は、ＣＡＲをコードするレトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターが形質導入される。例えば、免疫エフェクター細胞は、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、Ｏｘ４０の細胞内シグナル伝達ドメイン、または任意のこれらの組み合わせと、ＢＣＭＡポリペプチドに結合するマウス抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片を含むＣＡＲをコードするベクターが形質導入される。したがって、これらの形質導入細胞は、ＣＡＲ媒介細胞傷害性応答を惹起することができる。
【０２０４】
レトロウイルスは、遺伝子送達の一般的なツールである（Ｍｉｌｌｅｒ，２０００，Ｎａｔｕｒｅ．３５７：４５５−４６０）。特定の実施形態において、レトロウイルスは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを細胞に送達するのに使用される。本明細書で使用される場合、「レトロウイルス」という用語は、そのゲノムＲＮＡを線状二本鎖ＤＮＡコピーに逆転写し、その後、そのゲノムＤＮＡを宿主ゲノムに共有結合的に組み込むＲＮＡウイルスを指す。ウイルスが宿主ゲノムに組み込まれた状態は、「プロウイルス」と呼ばれる。プロウイルスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの鋳型として機能し、新しいウイルス粒子の産生に必要な構造タンパク質及び酵素をコードするＲＮＡ分子の発現を誘導する。
【０２０５】
特定の実施形態での使用に好適な例示的なレトロウイルスとしては、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーヴェイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプーマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ））ならびにレンチウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０６】
本明細書で使用される場合、「レンチウイルス」という用語は、複合レトロウイルスの群（または属）を指す。例示的なレンチウイルスとしては、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス；ＨＩＶ１型、及びＨＩＶ２型を含む）；ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス；ヤギ関節炎・脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）；ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、ＨＩＶベースのベクター骨格（すなわち、ＨＩＶシス作動配列要素）が好ましい。特定の実施形態において、レンチウイルスは、ＣＡＲを含むポリヌクレオチドを細胞に送達するのに使用される。
【０２０７】
レトロウイルスベクター、より具体的にはレンチウイルスベクターは、本発明の特定の実施形態を実施する際に使用され得る。したがって、「レトロウイルス」または「レトロウイルスベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、それぞれ「レンチウイルス」及び「レンチウイルスベクター」を含むことを意味する。
【０２０８】
「ベクター」という用語は、本明細書中、別の核酸分子を輸送または運搬することが可能な核酸分子を指すために使用される。輸送された核酸は、一般に、ベクター核酸分子に連結、例えば、挿入される。ベクターは、細胞内で自律複製を誘導する配列を含み得るか、宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを可能にするのに十分な配列を含み得る。有用なベクターには、例えば、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、細菌人工染色体、及びウイルスベクターが含まれる。有用なウイルスベクターには、例えば、複製欠損レトロウイルス及びレンチウイルスが含まれる。
【０２０９】
当業者には明らかなように、「ウイルスベクター」という用語は、典型的には核酸分子の輸送もしくは細胞のゲノム内への組み込みを容易にするウイルス由来核酸要素を含む核酸分子（例えば、トランスファープラスミド）、または核酸輸送を媒介するウイルス粒子のいずれかを指すように広く使用される。ウイルス粒子は、典型的に、様々なウイルス構成成分を含み、核酸（複数可）に加えて宿主細胞の構成成分を含むこともある。
【０２１０】
ウイルスベクターという用語は、核酸を細胞内に輸送することが可能なウイルスもしくはウイルス粒子、または輸送される核酸自体のいずれかを指し得る。ウイルスベクター及びトランスファープラスミドは、主にウイルスに由来する構造的及び／または機能的遺伝子要素を含有する。「レトロウイルスベクター」という用語は、主にレトロウイルスに由来する構造的及び機能的遺伝子要素、またはその一部を含有する、ウイルスベクターまたはプラスミドを指す。「レンチウイルスベクター」という用語は、主にレンチウイルスに由来する構造的及び機能的遺伝子要素、またはその一部（ＬＴＲを含む）を含有する、ウイルスベクターまたはプラスミドを指す。「ハイブリッドベクター」という用語は、レトロウイルス配列、例えば、レンチウイルス配列及びレンチウイルスではないウイルス配列の両方を含有する、ベクター、ＬＴＲまたは他の核酸を指す。一実施形態において、ハイブリッドベクターは、逆転写、複製、組み込み及び／またはパッケージングのためのレトロウイルス配列、例えば、レンチウイルス配列を含む、ベクターまたはトランスファープラスミドを指す。
【０２１１】
特定の実施形態において、「レンチウイルスベクター」及び「レンチウイルス発現ベクター」という用語は、レンチウイルストランスファープラスミド及び／または感染性レンチウイルス粒子を指すために使用され得る。本明細書中、クローニング部位、プロモーター、制御要素、異種核酸などの要素について言及がなされる場合、これらの要素の配列は、本発明のレンチウイルス粒子中ではＲＮＡの形態で存在し、本発明のＤＮＡプラスミド中ではＤＮＡの形態で存在することを理解されたい。
【０２１２】
プロウイルスの両端には、「長い末端反復」または「ＬＴＲ」と呼ばれる構造がある。「長い末端反復（ＬＴＲ）」という用語は、レトロウイルスＤＮＡの両端に位置する塩基対のドメインを指し、その天然配列の状態では、正位反復配列であり、Ｕ３、Ｒ及びＵ５領域を含有する。ＬＴＲは、一般に、レトロウイルス遺伝子の発現（例えば、遺伝子転写の促進、開始及びポリアデニル化）及びウイルス複製に対して基本的な機能を提供する。ＬＴＲは、転写調節要素、ポリアデニル化シグナルならびにウイルスゲノムの複製及び組み込みに必要な配列を含む、多数の制御シグナルを含有する。ウイルスＬＴＲは、Ｕ３、Ｒ及びＵ５と呼ばれる３つの領域に分けられる。Ｕ３領域は、エンハンサー及びプロモーター要素を含有する。Ｕ５領域は、プライマー結合部位とＲ領域の間の配列であり、ポリアデニル化配列を含有する。Ｒ（反復）領域は、Ｕ３領域とＵ５領域に挟まれている。ＬＴＲは、Ｕ３、Ｒ及びＵ５領域で構成され、ウイルスゲノムの５’及び３’の両末端にある。５’ＬＴＲに隣接するのは、ゲノムの逆転写（ｔＲＮＡプライマー結合部位）及びウイルスＲＮＡの粒子中への効率的なパッケージングに必要な配列（プサイ部位）である。
【０２１３】
本明細書で使用される場合、「パッケージングシグナル」または「パッケージング配列」という用語は、ウイルスＲＮＡをウイルスカプシドまたは粒子内に挿入するのに必要とされる、レトロウイルスゲノム内に位置する配列を指す。例えば、Ｃｌｅｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５．Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６９，Ｎｏ．４；ｐｐ．２１０１−２１０９を参照されたい。いくつかのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムのカプシド形成に必要な最小パッケージングシグナル（プサイ［Ψ］配列とも呼ばれる）を使用する。したがって、本明細書で使用される場合、「パッケージング配列」、「パッケージングシグナル」、「プサイ」及び記号「Ψ」という用語は、ウイルス粒子形成中のレトロウイルスＲＮＡ鎖のカプシド形成に必要とされるノンコーディング配列に関して使用される。
【０２１４】
様々な実施形態において、ベクターは、改変された５’ＬＴＲ及び／または３’ＬＴＲを含む。ＬＴＲの一方または両方は、１つ以上の欠失、挿入、または置換を含むがこれらに限定されない１つ以上の改変を含み得る。３’ＬＴＲの改変は、多くの場合、ウイルスを複製欠損させることによって、レンチウイルス系またはレトロウイルス系の安全性を改善するために行われる。本明細書で使用される場合、「複製欠損」という用語は、感染性ビリオンが産生されないような、完全で有効な複製ができないウイルスを指す（例えば、複製欠損レンチイルス子孫）。「複製可能」という用語は、ウイルスのウイルス複製が感染性ビリオンを産生することができるような、複製可能な野生型ウイルスまたは変異ウイルスを指す（例えば、複製可能なレンチウイルス子孫）。
【０２１５】
「自己不活性型」（ＳＩＮ）ベクターは、１回を超えたウイルス複製のウイルス転写を防ぐために、Ｕ３領域として知られる右側（３’）ＬＴＲエンハンサー−プロモーター領域が改変（例えば、欠失または置換）されている、複製欠損ベクター、例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを指す。これは、ウイルス複製中に、右側（３’）ＬＴＲ  Ｕ３領域が左側（５’）ＬＴＲ  Ｕ３領域の鋳型として使用されるため、Ｕ３エンハンサー−プロモーターなしでは、ウイルス転写物が作製されないからである。本発明の更なる実施形態において、３’ＬＴＲは、Ｕ５領域が、例えば、理想的なポリ（Ａ）配列と置き換えられるように改変される。３’ＬＴＲ、５’ＬＴＲ、または３’及び５’ＬＴＲの両方に対する改変などのＬＴＲへの改変もまた、本発明に含まれることに留意されたい。
【０２１６】
ウイルス粒子の産生中にウイルスゲノムの転写を駆動するために、５’ＬＴＲのＵ３領域を異種プロモーターに置き換えることによって、更なる安全性の向上が提供される。使用することができる異種プロモーターの例としては、例えば、ウイルス性シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、前初期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーターが挙げられる。典型的なプロモーターは、Ｔａｔに依存しない方法で高レベルの転写を駆動することが可能である。この置換により、ウイルス産生系に完全なＵ３配列が存在しないので、複製可能ウイルスを生成する組み換えの可能性が低減する。ある特定の実施形態において、異種プロモーターは、ウイルスゲノムが転写される方法を調節することにおいて利点を有する。例えば、異種プロモーターは、誘導因子が存在する場合にのみ、ウイルスゲノムの全てまたは一部の転写が生じるように誘導することができる。誘導因子には、１つ以上の化学化合物、または温度もしくはｐＨなどの宿主細胞が培養される生理学的条件が含まれるが、これらに限定されない。
【０２１７】
いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、ＴＡＲ要素を含む。「ＴＡＲ」という用語は、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ）ＬＴＲのＲ領域に位置する「トランス活性化応答」遺伝要素を指す。この要素は、レンチウイルストランス活性化因子（ｔａｔ）遺伝要素と相互作用して、ウイルス複製を増大させる。しかしながら、この要素は、５’ＬＴＲのＵ３領域が異種プロモーターによって置き換えられている実施形態では必要とされない。
【０２１８】
「Ｒ領域」は、キャッピング基の開始（すなわち、転写の開始）で始まり、ポリＡ配列が開始する直前で終わるレトロウイルスＬＴＲ内の領域を指す。Ｒ領域はまた、Ｕ３領域とＵ５領域に挟まれているものとしても定義される。Ｒ領域は、逆転写中、新生ＤＮＡをゲノムの一端からもう一端に輸送するのを可能にする役割を果たす。
【０２１９】
本明細書で使用される場合、「ＦＬＡＰ要素」という用語は、配列がレトロウイルス（例えば、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２）のセントラルポリプリン配列及びセントラルターミネーション配列（ｃＰＰＴ及びＣＴＳ）を含む、核酸を指す。好適なＦＬＡＰ要素は、米国特許第６，６８２，９０７号及びＺｅｎｎｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１：１７３に記載されている。ＨＩＶ−１の逆転写中、プラス鎖ＤＮＡのセントラルポリプリン配列（ｃＰＰＴ）における中央開始及びセントラルターミネーション配列（ＣＴＳ）における中央終了により、三本鎖ＤＮＡ構造であるＨＩＶ−１セントラルＤＮＡフラップの形成をもたらす。いかなる理論に束縛されることを望むものではないが、ＤＮＡフラップは、レンチウイルスゲノム核内輸送のシス活性決定基として作用し得、及び／またはウイルス力価を増大させ得る。特定の実施形態において、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクター骨格は、ベクター中の目的の異種遺伝子の上流または下流に１つ以上のＦＬＡＰ要素を含む。例えば、特定の実施形態において、トランスファープラスミドは、ＦＬＡＰ要素を含む。一実施形態において、本発明のベクターは、ＨＩＶ−１から単離されたＦＬＡＰ要素を含む。
【０２２０】
一実施形態において、レトロウイルスまたはレンチウイルスのトランスファーベクターは、１つ以上の核外輸送要素を含む。「核外輸送要素」という用語は、細胞の核から細胞質へのＲＮＡ転写物の運搬を制御する、シス作用転写後制御因子を指す。ＲＮＡ核外輸送要素の例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）（例えば、Ｃｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１０５３；及びＣｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１．Ｃｅｌｌ  ５８：４２３参照）、及びＢ型肝炎ウイルス転写後制御要素（ＨＰＲＥ）が挙げられるが、これらに限定されない。一般に、ＲＮＡ核外輸送要素は、遺伝子の３’ＵＴＲ内に配置され、１つまたは複数のコピーとして挿入することができる。
【０２２１】
特定の実施形態において、ウイルスベクター中の異種配列の発現は、転写後制御要素、効率的なポリアデニル化部位、及び任意選択により転写終結シグナルをベクターに組み込むことによって増加する。様々な転写後制御要素、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御要素（ＷＰＲＥ；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：２８８６）；Ｂ型肝炎ウイルスに存在する転写後制御要素（ＨＰＲＥ）（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：３８６４）；及び同等物（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，９：１７６６）がタンパク質での異種核酸の発現を増加することができる。特定の実施形態において、本発明のベクターは、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥなどの転写後制御要素を含む。
【０２２２】
特定の実施形態において、本発明のベクターは、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥなどの転写後制御要素（ＰＴＥ）を欠くか、または含まない。それは、いくつかの場合、これらの要素は、細胞の形質転換のリスクを増大させ、及び／またはｍＲＮＡ転写物の量を実質的にもしくは大幅に増加させず、もしくはｍＲＮＡ安定性を上げることがないからである。したがって、いくつかの実施形態において、本発明のベクターは、ＰＴＥを欠くか、または含まない。他の実施形態において、本発明のベクターは、更なる安全性対策としてＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを欠くか、または含まない。
【０２２３】
異種核酸転写の効率的な終了及びポリアデニル化をもたらす要素は、異種遺伝子発現を増加させる。転写終結シグナルは、一般に、ポリアデニル化シグナルの下流に見られる。特定の実施形態において、ベクターは、発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの３’側にポリアデニル化配列を含む。本明細書で使用される「ポリＡ部位」または「ポリＡ配列」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる新生ＲＮＡ転写の終了及びポリアデニル化の両方を誘導するＤＮＡ配列を指す。ポリアデニル化配列は、コーディング配列の３’末端にポリＡテールを付加することによって、ｍＲＮＡの安定性を促進することができ、それにより、翻訳効率の増大に寄与する。ポリＡテールを欠く転写物は不安定であり、迅速に分解されるため、組み換え転写物の効率的なポリアデニル化が望ましい。本発明のベクターにおいて使用することができるポリＡシグナルの例示的な例としては、理想的なポリＡ配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ）、ウシ成長ホルモンポリＡ配列（ＢＧＨｐＡ）、ウサギβ−グロビンポリＡ配列（ｒβｇｐＡ）、または当該技術分野において知られている別の好適な異種もしくは内因性ポリＡ配列が挙げられる。
【０２２４】
ある特定の実施形態において、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターは、１つ以上のインシュレーター要素を更に含む。インシュレーター要素は、ゲノムＤＮＡ中に存在するシス作用要素によって媒介され、輸送された配列の無秩序な発現をもたらし得る組み込み部位効果（すなわち、位置効果）からレンチウイルス発現配列（例えば、治療用ポリペプチド）を保護するのに寄与し得る（例えば、Ｂｕｒｇｅｓｓ−Ｂｅｕｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９９：１６４３３；及びＺｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，１０９：４７１参照）。いくつかの実施形態において、トランスファーベクターは、３’ＬＴＲに１つ以上のインシュレーター要素を含み、プロウイルスが宿主ゲノムに組み込まれた際には、プロウイルスは、３’ＬＴＲが複製されるため、５’ＬＴＲまたは３’ＬＴＲの両方に１つ以上のインシュレーターを含む。本発明で使用するのに好適なインシュレーターには、ニワトリβ−グロビンインシュレーターが含まれるが、これらに限定されない（Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３．Ｃｅｌｌ  ７４：５０５；Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７．ＰＮＡＳ  ９４：５７５；及びＢｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９．Ｃｅｌｌ  ９８：３８７参照；これらは参照により本明細書に援用される）。インシュレーター要素の例としては、ニワトリＨＳ４などのβ−グロビン遺伝子座に由来するインシュレーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２５】
本発明のある特定の具体的な実施形態によれば、ウイルスベクター骨格配列の大部分または全ては、レンチウイルス、例えば、ＨＩＶ−１に由来する。しかしながら、レトロウイルス配列及び／またはレンチウイルス配列には多くの異なる供給源が使用されるか、または組み合わせることができ、ある特定のレンチウイルス配列における置換及び変更も、本明細書に記載されるトランスファーベクターの機能の能力を損なうことなく、多数適用され得ることを理解されたい。更に、様々なレンチウイルスベクターが当該技術分野において知られており、Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６ａ，１９９６ｂ，ａｎｄ  １９９８）；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）；Ｄｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、米国特許第６，０１３，５１６号；及び同第５，９９４，１３６号を参照されたい。それらの多くを、本発明のウイルスベクターまたはトランスファープラスミドを産生するように適合させることができる。
【０２２６】
様々な実施形態において、本発明のベクターは、ＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む。ベクターは、１つ以上のＬＴＲを有し得、ＬＴＲのいずれかは、１つ以上のヌクレオチド置換、付加、または欠失などの１つ以上の改変を含む。ベクターは、形質導入効率を高めるための１つまたは複数のアクセサリー要素（例えば、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）、ウイルスパッケージング（例えば、プサイ（Ψ）パッケージングシグナル、ＲＲＥ）、及び／または治療用遺伝子の発現を増加させる他の要素（例えば、ポリ（Ａ）配列）を更に含み得、更に含み得、任意選択により、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを含み得る。
【０２２７】
特定の実施形態において、本発明のトランスファーベクターは、左側（５’）レトロウイルスＬＴＲ；セントラルポリプリン配列／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）；レトロウイルス核外輸送要素；本明細書で企図されるＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、Ｔ細胞中で活性のあるプロモーター；及び右側（３’）レトロウイルスＬＴＲ；ならびに任意選択によりＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを含む。
【０２２８】
特定の実施形態において、本発明のトランスファーベクターは、左側（５’）レトロウイルスＬＴＲ；レトロウイルス核外輸送要素；本明細書で企図されるＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、Ｔ細胞中で活性のあるプロモーター；右側（３’）レトロウイルスＬＴＲ；及びポリ（Ａ）配列；ならびに任意選択によりＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを含む。別の特定の実施形態において、本発明は、左側（５’）ＬＴＲ；ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ；ＲＲＥ；本明細書で企図されるＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、Ｔ細胞中で活性のあるプロモーター；右側（３’）ＬＴＲ；及びポリアデニル化配列；ならびに任意選択によりＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを含む、レンチウイルスベクターを提供する。
【０２２９】
ある特定の実施形態において、本発明は、左側（５’）ＨＩＶ−１  ＬＴＲ；プサイ（Ψ）パッケージングシグナル；ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ；ＲＲＥ；本明細書で企図されるＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、Ｔ細胞中で活性のあるプロモーター；右側（３’）自己不活性型（ＳＩＮ）ＨＩＶ−１  ＬＴＲ；及びウサギβ−グロビンポリアデニル化配列；ならびに任意選択によりＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを含む、レンチウイルスベクターを提供する。
【０２３０】
別の実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＬＴＲ；セントラルポリプリン配列／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）；レトロウイルス核外輸送要素；及び本明細書で企図されるＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、Ｔ細胞中で活性のあるプロモーター；ならびに任意選択によりＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを含む、ベクターを提供する。
【０２３１】
特定の実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＬＴＲ；ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ；ＲＲＥ；本明細書で企図されるＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、Ｔ細胞中で活性のあるプロモーター；及びポリアデニル化配列；ならびに任意選択によりＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを含む、ベクターを提供する。
【０２３２】
ある特定の実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＳＩＮ  ＨＩＶ−１  ＬＴＲ；Ｐｓｉ（Ψ）パッケージングシグナル；ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ；ＲＲＥ；本明細書で企図されるＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、Ｔ細胞中で活性のあるプロモーター；及びウサギβ−グロビンポリアデニル化配列；ならびに任意選択によりＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを含む。
【０２３３】
様々な実施形態において、ベクターは、組み込みウイルスベクターである。
【０２３４】
様々な他の実施形態において、ベクターは、エピソームまたは非組み込みウイルスベクターである。
【０２３５】
様々な実施形態において、本明細書で企図されるベクターは、非組み込みまたは組み込み欠損レトロウイルスを含む。一実施形態において、「組み込み欠損」レトロウイルスまたはレンチウイルスとは、ウイルスゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込む能力がないインテグラーゼを有するレトロウイルスまたはレンチウイルスを指す。様々な実施形態において、インテグラーゼタンパク質は、そのインテグラーゼ活性を特異的に低下させるように変異させる。組み込み能力のないレンチウイルスベクターは、インテグラーゼタンパク質をコードするｐｏｌ遺伝子を改変して、組み込み欠損インテグラーゼをコードする変異ｐｏｌ遺伝子をもたらすことによって得られる。そのような組み込み能力のないウイルスベクターは、特許出願第ＷＯ２００６／０１０８３４号に記載されており、その全体は、参照により本明細書に援用される。
【０２３６】
インテグラーゼ活性を低下させるのに好適なＨＩＶ−１  ｐｏｌ遺伝子における例示的な変異としては、Ｈ１２Ｎ、Ｈ１２Ｃ、Ｈ１６Ｃ、Ｈ１６Ｖ、Ｓ８１Ｒ、Ｄ４１Ａ、Ｋ４２Ａ、Ｈ５１Ａ、Ｑ５３Ｃ、Ｄ５５Ｖ、Ｄ６４Ｅ、Ｄ６４Ｖ、Ｅ６９Ａ、Ｋ７１Ａ、Ｅ８５Ａ、Ｅ８７Ａ、Ｄ１１６Ｎ、Ｄ１１６１、Ｄ１１６Ａ、Ｎ１２０Ｇ、Ｎ１２０１、Ｎ１２０Ｅ、Ｅ１５２Ｇ、Ｅ１５２Ａ、Ｄ３５Ｅ、Ｋ１５６Ｅ、Ｋ１５６Ａ、Ｅ１５７Ａ、Ｋ１５９Ｅ、Ｋ１５９Ａ、Ｋ１６０Ａ、Ｒ１６６Ａ、Ｄ１６７Ａ、Ｅ１７０Ａ、Ｈ１７１Ａ、Ｋ１７３Ａ、Ｋ１８６Ｑ、Ｋ１８６Ｔ、Ｋ１８８Ｔ、Ｅ１９８Ａ、Ｒ１９９ｃ、Ｒ１９９Ｔ、Ｒ１９９Ａ、Ｄ２０２Ａ、Ｋ２１１Ａ、Ｑ２１４Ｌ、Ｑ２１６Ｌ、Ｑ２２１Ｌ、Ｗ２３５Ｆ、Ｗ２３５Ｅ、Ｋ２３６Ｓ、Ｋ２３６Ａ、Ｋ２４６Ａ、Ｇ２４７Ｗ、Ｄ２５３Ａ、Ｒ２６２Ａ、Ｒ２６３Ａ及びＫ２６４Ｈが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３７】
インテグラーゼ活性を低下させるのに好適なＨＩＶ−１  ｐｏｌ遺伝子における例示的な変異としては、Ｄ６４Ｅ、Ｄ６４Ｖ、Ｅ９２Ｋ、Ｄ１１６Ｎ、Ｄ１１６１、Ｄ１１６Ａ、Ｎ１２０Ｇ、Ｎ１２０１、Ｎ１２０Ｅ、Ｅ１５２Ｇ、Ｅ１５２Ａ、Ｄ３５Ｅ、Ｋ１５６Ｅ、Ｋ１５６Ａ、Ｅ１５７Ａ、Ｋ１５９Ｅ、Ｋ１５９Ａ、Ｗ２３５Ｆ、及びＷ２３５Ｅが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３８】
特定の実施形態において、インテグラーゼは、アミノ酸Ｄ６４、Ｄ１１６またはＥ１５２のうちの１つ以上に変異を含む。一実施形態において、インテグラーゼは、アミノ酸Ｄ６４、Ｄ１１６及びＥ１５２に変異を含む。特定の実施形態において、欠損ＨＩＶ−１インテグラーゼは、Ｄ６４Ｖ変異を含む。
【０２３９】
「宿主細胞」は、本発明の組み換えベクターまたはポリヌクレオチドを、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで、エレクトロポレーション、トランスフェクション、感染、または形質導入を行った細胞を含む。宿主細胞は、パッケージング細胞、プロデューサー細胞、及びウイルスベクターに感染した細胞を含み得る。特定の実施形態において、本発明のウイルスベクターに感染した宿主細胞は、治療法を必要とする対象に投与される。ある特定の実施形態において、「標的細胞」という用語は、宿主細胞と区別なく用いられ、トランスフェクト、感染、または形質導入を行った所望の細胞型の細胞を指す。好ましい実施形態において、標的細胞は、Ｔ細胞である。
【０２４０】
妥当なウイルス力価を達成するには、多くの場合、大規模なウイルス粒子産生が必要とされる。ウイルス粒子は、ウイルス構造及び／またはアクセサリー遺伝子、例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、もしくはｎｅｆ遺伝子または他のレトロウイルス遺伝子を含むパッケージング細胞株にトランスファーベクターをトランスフェクトすることによって産生される。
【０２４１】
本明細書で使用される場合、「パッケージングベクター」という用語は、パッケージングシグナルを欠き、１、２、３、４つ以上ウイルス構造遺伝子及び／またはアクセサリー遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む、発現ベクターまたはウイルスベクターを指す。典型的に、パッケージングベクターは、パッケージング細胞に含まれ、トランスフェクション、形質導入または感染を介して細胞内に導入される。トランスフェクション、形質導入または感染のための方法は、当業者によく知られている。本発明のレトロウイルス／レンチウイルストランスファーベクターは、トランスフェクション、形質導入または感染を介してパッケージング細胞株に導入され、プロデューサー細胞または細胞株が生成され得る。本発明のパッケージングベクターは、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションを含む、標準的な方法によって、ヒト細胞または細胞株に導入することができる。いくつかの実施形態において、パッケージングベクターは、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ブラストサイジン、ゼオシン、チミジンキナーゼ、ＤＨＦＲ、ＧｌｎシンテターゼまたはＡＤＡなどの優性選択マーカーとともに、細胞内に導入され、続いて、適切な薬物の存在下での選択及びクローンの単離がなされる。選択マーカー遺伝子は、パッケージングベクターによって、例えば、ＩＲＥＳまたは自己切断ウイルスペプチドによってコードされる遺伝子に物理的に連結され得る。
【０２４２】
ウイルスエンベロープタンパク質（ｅｎｖ）は、細胞株から生成される組み換えレトロウイルスによって最終的に感染及び形質転換され得る宿主細胞の範囲を決定する。ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶ及びＥＩＶなどのレンチウイルスの場合において、ｅｎｖタンパク質はｇｐ４１及びｇｐ１２０を含む。好ましくは、本発明のパッケージング細胞によって発現されるウイルスｅｎｖタンパク質は、前述されているウイルスｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子とは別個のベクター上にコードされる。
【０２４３】
本発明に利用され得るレトロウイルス由来のｅｎｖ遺伝子の例示的な例としては、ＭＬＶエンベロープ、１０Ａ１エンベロープ、ＢＡＥＶ、ＦｅＬＶ−Ｂ、ＲＤ１１４、ＳＳＡＶ、エボラ、センダイ、ＦＰＶ（家禽ペストウイルス）、及びインフルエンザウイルスエンベロープが挙げられるが、これらに限定されない。同様に、ＲＮＡウイルス（例えば、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ、Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、ＲｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅのＲＮＡウイルス科）及びＤＮＡウイルス（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｘｙｉｒｉｄａｅ、及びＩｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅの科）に由来するエンベロープをコードする遺伝子も利用され得る。代表的な例としては、ＦｅＬＶ、ＶＥＥ、ＨＦＶＷ、ＷＤＳＶ、ＳＦＶ、Ｒａｂｉｅｓ、ＡＬＶ、ＢＩＶ、ＢＬＶ、ＥＢＶ、ＣＡＥＶ、ＳＮＶ、ＣｈＴＬＶ、ＳＴＬＶ、ＭＰＭＶ、ＳＭＲＶ、ＲＡＶ、ＦｕＳＶ、ＭＨ２、ＡＥＶ、ＡＭＶ、ＣＴ１０、及びＥＩＡＶが挙げられる。
【０２４４】
他の実施形態において、本発明のウイルスをシュードタイピングするためのエンベロープタンパク質には、次のウイルス：Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ２及びＨ５Ｎ１（鳥インフル）などのＡ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、Ｃ型インフルエンザウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ロタウイルス、ノーウォークウイルス群のいずれかのウイルス、腸管アデノウイルス、パルボウイルス、デング熱ウイルス、サル痘、モノネガウイルス目のリッサウイルス、例えば、狂犬病ウイルス、ラゴスコウモリウイルス、モコラウイルス、ドゥベンヘイジウイルス、ヨーロッパコウモリウイルス１＆２及びオーストラリアコウモリウイルス、エフェメロウイルス、ベジクロウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ヘルペスウイルス、例えば、単純ヘルペスウイルス１型及び２型、水痘帯状疱疹、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）、ヒトヘルペスウイルス６型及び８型、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、パピローマウイルス、マウスガンマヘルペスウイルス、アレナウイルス、例えば、アルゼンチン出血熱ウイルス、ボリビア出血熱ウイルス、サビア関連出血熱ウイルス、ベネズエラ出血熱ウイルス、ラッサ熱ウイルス、マチュポウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄｉａｅ、例えば、クリミア−コンゴ出血熱ウイルス、ハンタウイルス、腎症候性出血熱原因ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ（フィロウイルス）、例えば、エボラ出血熱及びマールブルグ出血熱、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、例えば、キャサヌル森林病疾患ウイルス、オムスク出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎原因ウイルス及びＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、例えば、ヘンドラウイルス及びニパウイルス、大痘瘡及び小痘瘡（天然痘）、アルファウイルス、例えば、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ＳＡＲＳ関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、ウエストナイルウイルス、ならびに任意の脳炎原因ウイルスに由来するもののいずれかが含まれるが、これらに限定されない。
【０２４５】
一実施形態において、本発明は、ＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質を用いてシュードタイプ化された組み換えレトロウイルス、例えば、レンチウイルスを産生するパッケージング細胞を提供する。
【０２４６】
本明細書で使用される「シュードタイプ」または「シュードタイピング」という用語は、ウイルスエンベロープタンパク質が、好ましい特性を有する別のウイルスのものに置き換えられているウイルスを指す。例えば、ＨＩＶは、水疱性口内炎ウイルスのＧ−タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）エンベロープタンパク質を用いてシュードタイプ化することができ、それにより、ＨＩＶは、広範囲の細胞への感染が可能となる。これは、ウイルスが、ＨＩＶエンベロープタンパク質（ｅｎｖ遺伝子によってコードされる）により、通常、ＣＤ４＋提示細胞を標的とするためである。本発明の好ましい実施形態において、レンチウイルスエンベロープタンパク質は、ＶＳＶ−Ｇを用いてシュードタイプ化される。一実施形態において、本発明は、ＶＳＶ−Ｇエンベロープ糖タンパク質を用いてシュードタイプ化された組み換えレトロウイルス、例えば、レンチウイルスを産生するパッケージング細胞を提供する。
【０２４７】
本明細書で使用される場合、「パッケージング細胞株」という用語は、パッケージングシグナルを含有しないが、ウイルス粒子の正しいパッケージングに必要なウイルス構造タンパク質及び複製酵素（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ）を安定的にまたは一過性に発現する、細胞株に関して使用される。本発明のパッケージング細胞の調製には、任意の好適な細胞株が採用される。一般に、細胞は、哺乳動物細胞である。特定の実施形態において、パッケージング細胞株の産生に使用される細胞は、ヒト細胞である。使用することができる好適な細胞株には、例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、ＦＬＹ細胞、Ｐｓｉ−２細胞、ＢＯＳＣ２３細胞、ＰＡ３１７細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＳＣ１細胞、ＢＳＣ４０細胞、ＢＭＴ１０細胞、ＶＥＲＯ細胞、Ｗ１３８細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｂ−５０細胞、３Ｔ３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｗ１６３細胞、２１１細胞、及び２１１Ａ細胞が含まれる。好ましい実施形態において、パッケージング細胞は、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、またはＡ５４９細胞である。別の好ましい実施形態において、細胞は、Ａ５４９細胞である。
【０２４８】
本明細書で使用される場合、「プロデューサー細胞株」という用語は、パッケージング細胞株及びパッケージングシグナルを含むトランスファーベクターコンストラクトを含む、組み換えレトロウイルス粒子を産生することが可能な細胞株を指す。感染性ウイルス粒子及びウイルスストック溶液の作製は、従来技術を使用して実施され得る。ウイルスストック溶液を調製する方法は、当該技術分野において知られており、例えば、Ｙ．Ｓｏｎｅｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：６２８−６３３、及びＮ．Ｒ．Ｌａｎｄａｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：５１１０−５１１３に例示されている。感染性ウイルス粒子は、従来技術を使用して、パッケージング細胞から回収され得る。例えば、感染性粒子は、当該技術分野において知られているように、細胞溶解、または細胞培養物の上清の回収によって回収することができる。任意選択により、回収されたウイルス粒子は、所望により、精製され得る。好適な精製技術は、当業者によく知られている。
【０２４９】
トランスフェクションではなく、ウイルス感染によるレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを使用した遺伝子（複数可）または他のポリヌクレオチド配列の送達は、「形質導入」と呼ばれる。一実施形態において、レトロウイルスベクターは、感染及びプロウイルス組み込みにより細胞内に形質導入される。ある特定の実施形態において、標的細胞、例えば、Ｔ細胞が「形質導入される」とは、当該細胞が、ウイルスまたはレトロウイルスベクターを使用した感染によって細胞に送達された遺伝子または他のポリヌクレオチド配列を含むことである。特定の実施形態において、形質導入細胞は、その細胞内ゲノムに、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターによって送達された１つ以上の遺伝子または他のポリヌクレオチド配列を含む。
【０２５０】
特定の実施形態において、１つ以上のポリペプチドを発現するウイルス本発明のベクターが形質導入された宿主細胞は、Ｂ細胞悪性腫瘍を治療及び／または予防するために対象に投与される。本発明のある特定の実施形態に従って利用され得る遺伝子療法におけるウイルスベクターの使用に関する他の方法は、例えば、Ｋａｙ，Ｍ．Ａ．（１９９７）Ｃｈｅｓｔ  １１１（６  Ｓｕｐｐ．）：１３８Ｓ−１４２Ｓ；Ｆｅｒｒｙ，Ｎ．ａｎｄ  Ｈｅａｒｄ，Ｊ．Ｍ．（１９９８）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：１９７５−８１；Ｓｈｉｒａｔｏｒｙ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｌｉｖｅｒ  １９：２６５−７４；Ｏｋａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．１１：１７９−８６；Ｔｈｕｌｅ，Ｐ．Ｍ．ａｎｄ  Ｌｉｕ，Ｊ．Ｍ．（２０００）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１７４４−５２；Ｙａｎｇ，Ｎ．Ｓ．（１９９２）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：３３５−５６；Ａｌｔ，Ｍ．（１９９５）Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．２３：７４６−５８；Ｂｒｏｄｙ，Ｓ．Ｌ．ａｎｄ  Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｒ．Ｇ．（１９９４）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７１６：９０−１０１；Ｓｔｒａｙｅｒ，Ｄ．Ｓ．（１９９９）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ  ８：２１５９−２１７２；Ｓｍｉｔｈ−Ａｒｉｃａ，Ｊ．Ｒ．ａｎｄ  Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｊ．Ｓ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｃａｒｄｉｏｌ．Ｒｅｐ．３：４３−４９；及びＬｅｅ，Ｈ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：４８３−８に見出すことができる。
【０２５１】
５．６．遺伝子改変細胞
本発明は、特定の実施形態において、本明細書で企図されるＣＡＲを発現するように遺伝子改変された、Ｂ細胞関連状態の治療に使用するための細胞を企図する。本明細書で使用される場合、「遺伝子操作された」または「遺伝子改変された」という用語は、細胞内の全遺伝物質にＤＮＡまたはＲＮＡの形態の追加の遺伝物質を付加することを指す。「遺伝子改変された細胞」、「改変細胞」、及び、「リダイレクト細胞」という用語は、区別なく用いられる。本明細書で使用される場合、「遺伝子療法」という用語は、遺伝子の発現を回復、修正、もしくは改変する、または治療用ポリペプチド、例えば、ＣＡＲを発現させる目的のために、細胞内の全遺伝物質にＤＮＡまたはＲＮＡの形態の追加の遺伝物質を導入することを指す。
【０２５２】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるＣＡＲは、免疫エフェクター細胞の特異性を目的の標的抗原、例えば、ＢＣＭＡポリペプチドにリダイレクトするために、免疫エフェクター細胞に導入され、発現される。「免疫エフェクター細胞」は、１つ以上のエフェクター機能（例えば、細胞傷害性細胞殺傷活性、サイトカインの分泌、ＡＤＣＣ及び／またはＣＤＣの誘導）を有する免疫系の任意の細胞である。
【０２５３】
本発明の免疫エフェクター細胞は、自己由来／自家（「自己」）または非自己由来（「非自己」、例えば、同種、同系または異種）であり得る。
【０２５４】
「自己由来」は、本明細書で使用される場合、同じ対象に由来する細胞を指す。
【０２５５】
「同種異系」とは、本明細書で使用される場合、比較する細胞と遺伝的に異なる同種の細胞を指す。
【０２５６】
「同系」は、本明細書で使用される場合、比較する細胞と遺伝的に同一である異なる対象の細胞を指す。
【０２５７】
「異種」は、本明細書で使用される場合、比較する細胞と異なる種の細胞を指す。好ましい実施形態において、本発明の細胞は、同種である。
【０２５８】
本明細書で企図されるＣＡＲとともに使用される例示的な免疫エフェクター細胞としては、Ｔリンパ球が挙げられる。「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」という用語は、当該技術分野において認識されており、胸腺細胞、未熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、休止Ｔリンパ球、または活性化Ｔリンパ球を含むことが意図される。Ｔ細胞は、Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞、例えば、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）またはＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞であり得る。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４＋  Ｔ細胞）ＣＤ４＋  Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８＋  Ｔ細胞）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋  Ｔ細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−  Ｔ細胞、またはＴ細胞の任意の他のサブセットであり得る。特定の実施形態において使用するのに好適なＴ細胞の他の例示的な集団としては、ナイーブＴ細胞及びメモリーＴ細胞が挙げられる。
【０２５９】
当業者に理解されるように、他の細胞も本明細書に記載されるＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞として使用され得る。特に、免疫エフェクター細胞にはまた、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、好中球、及びマクロファージが含まれる。免疫エフェクター細胞にはまた、エフェクター細胞の前駆体も含まれ、そのような前駆体細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫エフェクター細胞への分化を誘導することができる。したがって、特定の実施形態において、免疫エフェクター細胞は、対象に投与すると、成熟免疫エフェクター細胞に分化するか、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで成熟免疫エフェクター細胞に分化するように誘導することができる、臍帯血、骨髄または誘導末梢血から得られた細胞のＣＤ３４＋集団内に含有される造血幹細胞（ＨＳＣ）などの免疫エフェクター細胞の前駆体を含む。
【０２６０】
本明細書で使用される場合、ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを含有するように遺伝子操作された免疫エフェクター細胞は、「ＢＣＭＡ特異的リダイレクト免疫エフェクター細胞」と呼ばれ得る。
【０２６１】
本明細書で使用される「ＣＤ３４＋細胞」という用語は、その細胞表面上にＣＤ３４タンパク質を発現する細胞を指す。本明細書で使用される「ＣＤ３４」は、多くの場合、細胞−細胞接着因子として作用し、Ｔ細胞のリンパ節への侵入に関与する細胞表面糖タンパク質（例えば、シアロムチンタンパク質）を指す。ＣＤ３４＋細胞集団は、造血幹細胞（ＨＳＣ）を含有し、患者に投与すると、ＨＳＣは、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、好中球及び単球／マクロファージ系統の細胞を含む、全ての造血系統に分化及び寄与する。
【０２６２】
本発明は、本明細書で企図されるＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞を作製するための方法を提供する。一実施形態において、方法は、免疫エフェクター細胞が本明細書に記載される１つ以上のＣＡＲを発現するように、個体から単離された免疫エフェクター細胞をトランスフェクトまたは形質導入することを含む。ある特定の実施形態において、免疫エフェクター細胞は、個体から単離され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで更なる操作を行うことなく、遺伝子改変される。次いで、そのような細胞を個体に直接再投与することができる。更なる実施形態において、免疫エフェクター細胞は、まずｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化させ、刺激を与えて増殖させてから、ＣＡＲを発現するように遺伝子改変される。この点に関して、免疫エフェクター細胞は、遺伝子改変される（すなわち、本明細書で企図されるＣＡＲを発現するように形質導入またはトランスフェクトされる）前及び／または後に培養され得る。
【０２６３】
特定の実施形態において、細胞源は、本明細書に記載される免疫エフェクター細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ操作または遺伝子改変の前に、対象から得る。特定の実施形態において、ＣＡＲ改変免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞を含む。Ｔ細胞は、限定するものではないが、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺物、感染部位から得られた組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含む、多数の源から得ることができる。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、沈殿、例えば、ＦＩＣＯＬＬ（商標）分離などの当業者に知られている任意の数の技術を使用して対象から採取された血液単位から得ることができる。一実施形態において、個体の循環血に由来する細胞は、アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス産物は、典型的に、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、及び血小板を含むリンパ球を含有する。一実施形態において、アフェレーシスによって採取された細胞は、血漿分画を除去し、後続の処理に適切な緩衝液または培地中に細胞を配置するために、洗浄され得る。細胞は、ＰＢＳにより、またはカルシウム、マグネシウム、及び全てではないにしてもほとんどの他の二価カチオンを含まない別の好適な溶液により、洗浄することができる。当業者によって理解されるように、洗浄工程は、当業者に知られている方法によって、例えば、半自動化フロースルー遠心分離器を使用することなどによって、達成することができる。例えば、Ｃｏｂｅ２９９１細胞プロセッサー、Ｂａｘｔｅｒ  ＣｙｔｏＭａｔｅなど。洗浄後、細胞は、様々な生体適合性緩衝液、または緩衝剤を含むもしくは含まない他の食塩水中に再懸濁され得る。ある特定の実施形態において、アフェレーシス試料の望ましくない構成成分は、細胞を直接再懸濁した培地から除去され得る。
【０２６４】
ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、単球を除去することによって、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）密度勾配による遠心分離によって、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離される。次のマーカー：ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、及びＣＤ４５ＲＯのうちの１つ以上を発現するＴ細胞の特定のサブ集団は、ポジティブまたはネガティブ選択技術によって更に単離することができる。一実施形態において、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、及びＣＤ４５ＲＯを発現するＴ細胞の特定のサブ集団は、ポジティブまたはネガティブ選択技術によって更に単離される。例えば、ネガティブ選択によるＴ細胞集団の濃縮は、ネガティブ選択された細胞に固有の表面マーカーに対する抗体の組み合わせにより達成することができる。本明細書で使用される１つの方法は、ネガティブ選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを使用するネガティブ磁気免疫付着またはフローサイトメトリーを介したセルソーティング及び／または細胞選択である。例えば、ネガティブ選択によってＣＤ４＋細胞を濃縮するには、モノクローナル抗体カクテルは、典型的に、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ８に対する抗体を含む。フローサイトメトリー及びセルソーティングは、本発明に使用するための目的の細胞集団を単離するためにも使用され得る。
【０２６５】
ＰＢＭＣは、本明細書で企図される方法を使用して、ＣＡＲを発現するように、直接遺伝子改変され得る。ある特定の実施形態において、ＰＢＭＣの単離後、Ｔリンパ球は更に単離され、ある特定の実施形態において、細胞傷害性Ｔリンパ球及びヘルパーＴリンパ球の両方は、遺伝子改変及び／または拡大の前または後のいずれかで、ナイーブ、メモリー、及びエフェクターのＴ細胞サブ集団に選別され得る。
【０２６６】
ＣＤ８＋細胞は、標準的な方法を使用することによって得ることができる。いくつかの実施形態において、ＣＤ８＋細胞は、ＣＤ８＋細胞の各タイプに関連する細胞表面抗原を特定することによって、ナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞、及びエフェクター細胞に更に選別される。
【０２６７】
ある特定の実施形態において、ナイーブＣＤ８＋  Ｔリンパ球は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ１２７、及びＣＤ４５ＲＡを含む、ナイーブＴ細胞の表現型マーカーの発現によって特徴付けられる。
【０２６８】
特定の実施形態において、メモリーＴ細胞は、ＣＤ８＋末梢血リンパ球のＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ６２Ｌ−の両方のサブセットに存在する。ＰＢＭＣは、抗ＣＤ８抗体及び抗ＣＤ６２Ｌ抗体で染色した後、ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ８＋分画及びＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ８＋分画に選別される。いくつかの実施形態において、セントラルメモリーＴ細胞の表現型マーカーの発現は、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、及びＣＤ１２７を含み、グランザイムＢについてネガティブである。いくつかの実施形態において、セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ８＋  Ｔ細胞である。
【０２６９】
いくつかの実施形態において、エフェクターＴ細胞は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、及びＣＤ１２７についてネガティブであり、グランザイムＢ及びパーフォリンについてポジティブである。
【０２７０】
ある特定の実施形態において、ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、サブ集団に更に選別される。例えば、ＣＤ４＋  Ｔヘルパー細胞は、細胞表面抗原を有する細胞集団を特定することによって、ナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞、及びエフェクター細胞に選別することができる。ＣＤ４＋リンパ球は、標準的な方法によって得ることができる。いくつかの実施形態において、ナイーブＣＤ４＋  Ｔリンパ球は、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋  ＣＤ４＋  Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、セントラルメモリーＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌポジティブ及びＣＤ４５ＲＯポジティブである。いくつかの実施形態において、エフェクターＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４５ＲＯネガティブである。
【０２７１】
Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞は、既知の方法を使用して単離した後に遺伝子改変を行うことができ、または免疫エフェクター細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化及び拡大（または前駆体の場合は分化）してから、遺伝子改変を行うことができる。特定の実施形態において、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞は、本明細書で企図されるキメラ抗原受容体を用いて遺伝子改変され（例えば、ＣＡＲをコードする核酸を含むウイルスベクターが形質導入される）、次いで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化及び拡大される。様々な実施形態において、Ｔ細胞は、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号；同第６，５３４，０５５号；同第６，９０５，６８０号；同第６，６９２，９６４号；同第５，８５８，３５８号；同第６，８８７，４６６号；同第６，９０５，６８１号；同第７，１４４，５７５号；同第７，０６７，３１８号；同第７，１７２，８６９号；同第７，２３２，５６６号；同第７、１７５，８４３号；同第５，８８３，２２３号；同第６，９０５，８７４号；同第６，７９７，５１４号；同第６，８６７，０４１号；及び米国特許出願第２００６０１２１００５号に記載されているような方法を使用して、ＣＡＲを発現するように遺伝子改変する前または後に、活性化及び拡大することができる。
【０２７２】
一般に、Ｔ細胞は、ＣＤ３  ＴＣＲ複合体に関連するシグナルを刺激する因子及びＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドを結合させた表面との接触によって、拡大される。Ｔ細胞集団は、表面上に固定された抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合断片、または抗ＣＤ２抗体との接触によって、またはカルシウムイオノフォアと組み合わせたプロテインキナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）との接触によって、刺激され得る。Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激も企図される。
【０２７３】
特定の実施形態において、ＰＢＭＣまたは単離されたＴ細胞は、ＩＬ−２、ＩＬ−７、及び／またはＩＬ−１５などの適切なサイトカインを含む培地中で、一般に、ビーズまたは他の表面に結合した抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体などの刺激因子及び共刺激因子と接触される。ＣＤ４＋  Ｔ細胞またはＣＤ８＋  Ｔ細胞のいずれかの増殖を刺激するためには、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体。抗ＣＤ２８抗体の例としては、９．３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８（Ｄｉａｃｉｏｎｅ，Ｂｅｓａｎｃｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）が挙げられ、当該技術分野において一般に知られている他の方法と同様に使用することができる（Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．３０（８）：３９７５−３９７７，１９９８；Ｈａａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０（９）：１３１９１３２８，１９９９；Ｇａｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ．２２７（１−２）：５３−６３，１９９９）。同じビーズに結合された抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体は、「サロゲート」抗原提示細胞（ＡＰＣ）として機能する。他の実施形態において、Ｔ細胞は、ＵＳ６０４０１７７；ＵＳ５８２７６４２；及びＷＯ２０１２１２９５１４に記載されるものなどの方法を使用して、フィーダー細胞ならびに適切な抗体及びサイトカインにより、活性化及び刺激されて、増殖し得る。
【０２７４】
他の実施形態において、人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）は、様々な共刺激分子及びサイトカインの安定した発現及び分泌を誘導するように、Ｋ５６２、Ｕ９３７、７２１．２２１、Ｔ２、及びＣ１Ｒ細胞を操作することによって製造される。特定の実施形態において、Ｋ３２またはＵ３２  ａＡＰＣを使用して、ＡＡＰＣ細胞表面上に１つ以上の抗体ベース刺激分子を提示することを誘導する。ａＡＰＣ上における遺伝子の様々な組み合わせの発現により、ヒトＴ細胞の活性化要件の正確な決定が可能になり、これにより、特定の成長要件及び異なる機能を有するＴ細胞サブセットの最適な繁殖に合わせてａＡＰＣを調整することができる。ａＡＰＣは、天然ＡＰＣの使用とは対照的に、外因性サイトカインの付加を必要とすることなく、機能性ヒトＣＤ８Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ成長及び長期間の拡大を支援する。Ｔ細胞の集団は、限定するものではないが、ＣＤ１３７Ｌ（４−１ＢＢＬ）、ＣＤ１３４Ｌ（ＯＸ４０Ｌ）、及び／またはＣＤ８０もしくはＣＤ８６を含む、様々な共刺激分子を発現するａＡＰＣによって拡大することができる。最後に、ａＡＰＣは、遺伝子改変Ｔ細胞を拡大し、ＣＤ８  Ｔ細胞上のＣＤ２８発現を維持するのに効率的なプラットフォームを提供する。ＷＯ０３／０５７１７１及びＵＳ２００３／０１４７８６９において提供されるａＡＰＣは、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０２７５】
一実施形態において、ＣＤ３４＋細胞は、本発明による核酸コンストラクトが形質導入される。ある特定の実施形態において、形質導入されたＣＤ３４＋細胞は、対象、一般に細胞が単離された元々の対象への投与後、ｉｎ  ｖｉｖｏで成熟免疫エフェクター細胞に分化する。別の実施形態において、ＣＤ３４＋細胞は、本明細書に記載されるＣＡＲに曝露される前、または当該ＣＡＲを用いて遺伝子改変された後、前述する方法に従って、次のサイトカイン：Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬＴ３）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、巨核球成長分化因子（ＴＰＯ）、ＩＬ−３及びＩＬ−６のうちの１つ以上により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激され得る（Ａｓｈｅｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，ＰＮＡＳ  １０１（１０）：３５５７−３５６２；Ｉｍｒｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【０２７６】
本発明は、がんの治療のための改変された免疫エフェクター細胞の集団を提供し、改変された免疫エフェクター細胞は、本明細書で開示されるＣＡＲを含む。例えば、改変された免疫エフェクター細胞の集団は、本明細書に記載されるＢ細胞悪性腫瘍と診断された患者（自己由来ドナー）から得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から調製される。ＰＢＭＣは、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、またはＣＤ４＋及びＣＤ８＋であり得るＴリンパ球の不均一な集団を形成する。
【０２７７】
ＰＢＭＣはまた、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞などの他の細胞傷害性リンパ球を含み得る。本明細書で企図されるＣＡＲのコーディング配列を運ぶ発現ベクターを、ヒトドナーのＴ細胞、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞の集団に導入することができる。正常に形質導入された発現ベクターを運ぶＴ細胞は、フローサイトメトリーを使用してＣＤ３ポジティブＴ細胞を単離するように選別され、次いで、抗ＣＤ３抗体及びもしくは抗ＣＤ２８抗体ならびにＩＬ−２、または本明細書に別途記載される当該技術分野において知られている任意の他の方法を使用する細胞活性化に加えて、更に繁殖させて、これらのＣＡＲタンパク質発現Ｔ細胞の数を増やすことができる。ＣＡＲタンパク質を発現するＴ細胞、ヒト対象に使用するための保存及び／または調製のためのＴ細胞の凍結保存には、標準的な手順が使用される。一実施形態において、Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ形質導入、培養及び／または拡大は、仔ウシ血清及びウシ胎児血清などの非ヒト動物由来産物の不在下で実施される。ＰＢＭＣの不均一集団には遺伝子改変がなされることから、得られる形質導入細胞は、本明細書で企図されるＢＣＭＡ標的化ＣＡＲを含む改変細胞の不均一集団である。
【０２７８】
更なる実施形態において、免疫エフェクター細胞のドナー集団を遺伝子改変する際には、例えば、１、２、３、４、５またはそれ以上の異なる発現ベクターの混合物を使用することができ、各ベクターは、本明細書で企図される様々なキメラ抗原受容体タンパク質をコードする。これにより得られる改変された免疫エフェクター細胞は、改変細胞の混合集団を形成し、ある割合の改変細胞が１つを超える異なるＣＡＲタンパク質を発現する。
【０２７９】
一実施形態において、本発明は、ＢＣＭＡタンパク質を標的とする遺伝子改変されたマウス、ヒトまたはヒト化ＣＡＲタンパク質発現免疫エフェクター細胞を保存する方法を提供し、免疫エフェクター細胞を、解凍時に細胞が生存可能なままであるように、凍結保存することを含む。ＣＡＲタンパク質を発現する免疫エフェクター細胞の一部は、Ｂ細胞関連状態に罹患している患者の将来の治療のための当該細胞の恒久的な供給源を提供するために、当該技術分野において知られている方法によって凍結保存することができる。必要な場合、凍結保存した形質転換された免疫エフェクター細胞は、より多くの当該細胞を得るために、解凍、成長及び拡大することができる。
【０２８０】
本明細書で使用される場合、「凍結保存」とは、（典型的に）７７Ｋまたは−１９６℃（液体窒素の沸点）などの氷点下温度に冷却することによる細胞の保存を指す。保存される細胞の低温での凍結または室温までの加温による損傷を防ぐために、多くの場合、凍結保存剤が氷点下温度で使用される。凍結保存剤及び最適な冷却速度により、細胞の損傷を防ぐことができる。使用することができる凍結保存剤には、限定するものではないが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｌｏｖｅｌｏｃｋ  ａｎｄ  Ｂｉｓｈｏｐ，Ｎａｔｕｒｅ，１９５９；１８３：１３９４−１３９５；Ａｓｈｗｏｏｄ−Ｓｍｉｔｈ，Ｎａｔｕｒｅ，１９６１；１９０：１２０４−１２０５）、グリセロール、ポリビニルピロリドン（Ｒｉｎｆｒｅｔ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９６０；８５：５７６）、及びポリエチレングリコール（Ｓｌｏｖｉｔｅｒ  ａｎｄ  Ｒａｖｄｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，１９６２；１９６：４８）が含まれる。好ましい冷却速度は、１〜３℃／分である。少なくとも２時間後、Ｔ細胞は、−８０℃の温度に達し、長期間の極低温保存容器などでの恒久的な保存のために液体窒素（−１９６℃）中に直接入れることができる。
【０２８１】
５．７．Ｔ細胞成熟プロセス
本明細書で企図される方法によって製造されるＴ細胞は、改善された養子免疫療法組成物を提供する。いかなる特定の理論に束縛されることを望むものではないが、本明細書で企図される方法によって製造されるＴ細胞組成物は、生存率の増加、分化が相対的に少ない拡大、及びｉｎ  ｖｉｖｏでの持続性を含む、優れた性質を備えていると考えられる。一実施形態において、Ｔ細胞を製造する方法は、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路を調節する１つ以上の因子と細胞を接触させることを含む。一実施形態において、Ｔ細胞を製造する方法は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ細胞シグナル伝達経路を調節する１つ以上の因子と細胞を接触させることを含む。様々な実施形態において、Ｔ細胞は、任意の供給源から得られ、製造プロセスの活性化段階及び／または拡大段階中に因子と接触させることができる。得られるＴ細胞組成物は、増殖し、次のバイオマーカー：ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８のうちの１つ以上を発現する能力を有する、発達的に強力なＴ細胞に富んでいる。一実施形態において、１つ以上のＰＩ３Ｋ阻害剤で処理されたＴ細胞を含む細胞の集団は、次のバイオマーカー：ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８のうちの１つ以上または全てを共発現するＣＤ８＋  Ｔ細胞の集団について濃縮される。
【０２８２】
一実施形態において、維持された増殖レベル及び低減された分化を備える改変Ｔ細胞が製造される。特定の実施形態において、Ｔ細胞は、１つ以上の刺激シグナル及びＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の阻害剤である因子の存在下で活性化し、増殖するようにＴ細胞を刺激することによって製造される。
【０２８３】
次いで、Ｔ細胞は、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現するように改変することができる。一実施形態において、Ｔ細胞は、本明細書で企図される抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲを含むウイルスベクターをＴ細胞に形質導入することによって改変される。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の阻害剤の存在下での刺激及び活性化の前に改変される。別の実施形態において、Ｔ細胞は、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の阻害剤の存在下での刺激及び活性化の後に改変される。特定の実施形態において、Ｔ細胞は、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の阻害剤の存在下での刺激及び活性化の１２時間、２４時間、３６時間、または４８時間以内に改変される。
【０２８４】
Ｔ細胞が活性化したら、細胞を培養して増殖させる。Ｔ細胞は、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７日間、少なくとも２週間、少なくとも１、２、３、４、５、または６ヶ月間以上、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上の拡大ラウンドで、培養され得る。
【０２８５】
様々な実施形態において、Ｔ細胞組成物は、ＰＩ３Ｋ経路の１つ以上の阻害剤の存在下で製造される。阻害剤は、経路中の１つ以上の活性または単一の活性を標的とし得る。いかなる特定の理論に束縛されることを望むものではないが、製造プロセスの刺激段階、活性化段階、及び／または拡大段階中におけるＰＩ３Ｋ経路の１つ以上の阻害剤による処理またはそのＴ細胞との接触は、幼若Ｔ細胞を優先的に増加させ、それにより、優れた治療用Ｔ細胞組成物が産生されることが企図される。
【０２８６】
特定の実施形態において、操作されたＴ細胞受容体を発現するＴ細胞の増殖を増大させるための方法が提供される。そのような方法は、例えば、対象からＴ細胞源を採取すること、ＰＩ３Ｋ経路の１つ以上の阻害剤の存在下でＴ細胞を刺激及び活性化すること、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ、例えば、抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲを発現するようにＴ細胞を改変すること、及び培地中でＴ細胞を拡大することを含み得る。
【０２８７】
ある特定の実施形態において、次のバイオマーカー：ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８のうちの１つ以上の発現に富むＴ細胞の集団を産生するための方法。一実施形態において、幼若Ｔ細胞は、次の生物学的マーカー：ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８のうちの１つ以上、または全てを含む。一実施形態において、ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、及びＬＡＧ３の発現を欠く幼若Ｔ細胞が提供される。本明細書に別途考察されるように、幼若Ｔ細胞バイオマーカーの発現レベルは、より分化したＴ細胞または免疫エフェクター細胞集団における当該マーカーの発現レベルと比較される。
【０２８８】
一実施形態において、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、本明細書で企図されるＴ細胞の製造方法のＴ細胞源として使用される。ＰＢＭＣは、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、またはＣＤ４＋及びＣＤ８＋であり得るＴリンパ球の不均一な集団を形成し、単球、Ｂ細胞、ＮＫ細胞及びＮＫＴ細胞などの他の単核細胞を含み得る。本明細書で企図される操作されたＴＣＲまたはＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、ヒトドナーのＴ細胞、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞の集団に導入することができる。正常に形質導入された発現ベクターを運ぶＴ細胞は、フローサイトメトリーを使用してＣＤ３ポジティブＴ細胞を単離するように選別され、次いで、抗ＣＤ３抗体及びまたは抗ＣＤ２８抗体ならびにＩＬ−２、ＩＬ−７、及び／またはＩＬ−１５、または本明細書に別途記載される当該技術分野において知られている任意の他の方法を使用する細胞活性化に加えて、更に繁殖させて、改変Ｔ細胞の数を増やすことができる。
【０２８９】
本明細書で企図される製造方法は、ヒト対象に使用するための保存及び／または調製のための改変Ｔ細胞の凍結保存を更に含み得る。Ｔ細胞は、解凍時に細胞が生存可能なままであるように、凍結保存される。必要な場合、凍結保存した形質転換された免疫エフェクター細胞は、より多くの当該細胞を得るために、解凍、成長及び拡大することができる。本明細書で使用される場合、「凍結保存」とは、（典型的に）７７Ｋまたは−１９６℃（液体窒素の沸点）などの氷点下温度に冷却することによる細胞の保存を指す。保存される細胞の低温での凍結または室温までの加温による損傷を防ぐために、多くの場合、凍結保存剤が氷点下温度で使用される。凍結保存剤及び最適な冷却速度により、細胞の損傷を防ぐことができる。使用することができる凍結保存剤には、限定するものではないが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｌｏｖｅｌｏｃｋ  ａｎｄ  Ｂｉｓｈｏｐ，Ｎａｔｕｒｅ，１９５９；１８３：１３９４−１３９５；Ａｓｈｗｏｏｄ−Ｓｍｉｔｈ，Ｎａｔｕｒｅ，１９６１；１９０：１２０４−１２０５）、グリセロール、ポリビニルピロリドン（Ｒｉｎｆｒｅｔ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９６０；８５：５７６）、及びポリエチレングリコール（Ｓｌｏｖｉｔｅｒ  ａｎｄ  Ｒａｖｄｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，１９６２；１９６：４８）が含まれる。好ましい冷却速度は、１〜３℃／分である。少なくとも２時間後、Ｔ細胞は、−８０℃の温度に達し、長期間の極低温保存容器などでの恒久的な保存のために液体窒素（−１９６℃）中に直接入れることができる。
【０２９０】
５．８．Ｔ細胞
本発明は、改善されたＣＡＲ  Ｔ細胞組成物の製造を企図する。ＣＡＲ  Ｔ細胞産生に使用されるＴ細胞は、自己由来／自家（「自己」）または非自己由来（「非自己」、例えば、同種、同系または異種）であり得る。好ましい実施形態において、Ｔ細胞は、哺乳動物の対象から得られる。より好ましい実施形態において、Ｔ細胞は、霊長類の対象から得られる。最も好ましい実施形態において、Ｔ細胞は、ヒト対象から得られる。
【０２９１】
Ｔ細胞は、限定するものではないが、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺物、感染部位から得られた組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含む、多数の源から得ることができる。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、沈殿、例えば、ＦＩＣＯＬＬ（商標）分離などの当業者に知られている任意の数の技術を使用して対象から採取された血液単位から得ることができる。一実施形態において、個体の循環血に由来する細胞は、アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス産物は、典型的に、Ｔ細胞を含むリンパ球、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球及び血小板を含有する。一実施形態において、アフェレーシスによって採取された細胞は、血漿分画を除去し、後続の処理に適切な緩衝液または培地中に細胞を配置するために、洗浄され得る。細胞は、ＰＢＳにより、またはカルシウム、マグネシウム、及び全てではないにしてもほとんどの他の二価カチオンを含まない別の好適な溶液により、洗浄することができる。当業者によって理解されるように、洗浄工程は、当業者に知られている方法によって、例えば、半自動化フロースルー遠心分離器を使用することなどによって、達成することができる。例えば、Ｃｏｂｅ２９９１細胞プロセッサー、Ｂａｘｔｅｒ  ＣｙｔｏＭａｔｅなど。洗浄後、細胞は、様々な生体適合性緩衝液、または緩衝剤を含むもしくは含まない他の食塩水中に再懸濁され得る。ある特定の実施形態において、アフェレーシス試料の望ましくない構成成分は、細胞を直接再懸濁した培地から除去され得る。
【０２９２】
特定の実施形態において、本明細書で企図される製造方法には、Ｔ細胞、例えば、ＰＢＭＣを含む細胞の集団が使用される。他の実施形態において、本明細書で企図される製造方法には、Ｔ細胞の単離されたまたは精製された集団が使用される。細胞は、赤血球を溶解し、単球を除去することによって、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）密度勾配による遠心分離によって、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離することができる。いくつかの実施形態において、ＰＢＭＣの単離後、細胞傷害性Ｔリンパ球及びヘルパーＴリンパ球の両方は、活性化、拡大、及び／または遺伝子改変の前または後のいずれかで、ナイーブ、メモリー、及びエフェクターのＴ細胞サブ集団に選別され得る。
【０２９３】
次のマーカー：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２、ＣＤ１２７、及びＨＬＡ−ＤＲのうちの１つ以上を発現するＴ細胞の特定のサブ集団は、ポジティブまたはネガティブ選択技術によって更に単離することができる。一実施形態において、（ｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７；または（ｉｉ）ＣＤ３８もしくはＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８からなる群から選択されるマーカーのうちの１つ以上を発現するＴ細胞の特定のサブ集団は、ポジティブまたはネガティブ選択技術によって更に単離される。様々な実施形態において、製造されるＴ細胞組成物は、次のマーカー：ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、及びＬＡＧ３のうちの１つ以上を発現しないか、または実質的に発現しない。
【０２９４】
一実施形態において、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８からなる群から選択されるマーカーのうちの１つ以上の発現は、ＰＩ３Ｋ阻害剤を用いずに活性化及び拡大されたＴ細胞の集団と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、またはそれ以上増加する。
【０２９５】
一実施形態において、ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、及びＬＡＧ３からなる群から選択されるマーカーのうちの１つ以上の発現は、ＰＩ３Ｋ阻害剤を用いて活性化及び拡大されたＴ細胞の集団と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、またはそれ以上減少する。
【０２９６】
一実施形態において、本明細書で企図される製造方法は、ナイーブＴ細胞または発達的に強力なＴ細胞の１つ以上のマーカーを含むＣＡＲ  Ｔ細胞の数を増加させる。いかなる特定の理論に束縛されることを望むものではないが、本発明者らは、Ｔ細胞を含む細胞の集団を１つ以上のＰＩ３Ｋ阻害剤で処理することにより、既存のＣＡＲ  Ｔ細胞療法と比較して、発達的に強力なＴ細胞の拡大が増加し、よりロバストで有効な養子ＣＡＲ  Ｔ細胞免疫療法が提供されると考える。
【０２９７】
本明細書で企図される方法を使用して製造されるＴ細胞で増加するナイーブＴ細胞または発達的に強力なＴ細胞のマーカーの例示的な例としては、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、ナイーブＴ細胞は、次のマーカー：ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ−１、ＢＴＬＡ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、及びＬＡＧ３のうちの１つ以上を発現しない発現しないか、または実質的に発現しない。
【０２９８】
Ｔ細胞に関して、本明細書で企図される様々な拡大方法から生じるＴ細胞集団は、採用される条件に応じて、様々な特定の表現型性質を有し得る。様々な実施形態において、拡大されたＴ細胞集団は、次の表現型マーカー：ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、ＣＤ３８、及びＨＬＡ−ＤＲのうちの１つ以上を含む。
【０２９９】
一実施形態において、そのような表現型マーカーは、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８のうちの１つ以上、または全ての増加した発現を含む。特定の実施形態において、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８を含む、ナイーブＴ細胞の表現型マーカーの発現によって特徴付けられるＣＤ８＋  Ｔリンパ球が拡大される。
【０３００】
特定の実施形態において、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８を含み、グランザイムＢについてネガティブである、セントラルメモリーＴ細胞の表現型マーカーの発現によって特徴付けられるＴ細胞が拡大される。いくつかの実施形態において、セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ８＋  Ｔ細胞である。
【０３０１】
ある特定の実施形態において、ＣＤ６２Ｌを含み、ＣＤ４５ＲＡ及び／またはＣＤ４５ＲＯの発現についてネガティブであるナイーブＣＤ４＋細胞の表現型マーカーの発現によって特徴付けられるＣＤ４＋  Ｔリンパ球が拡大される。いくつかの実施形態において、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４５ＲＯポジティブを含むセントラルメモリーＣＤ４＋細胞の表現型マーカーの発現によって特徴付けられるＣＤ４＋細胞。いくつかの実施形態において、エフェクターＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌポジティブ及びＣＤ４５ＲＯネガティブである。
【０３０２】
ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、個体から単離され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化及び刺激をして増殖させてから、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現するように遺伝子改変される。この点に関して、Ｔ細胞は、遺伝子改変される（すなわち、本明細書で企図される抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現するように形質導入またはトランスフェクトされる）前及び／または後に培養され得る。
【０３０３】
５．８．１．活性化及び拡大
Ｔ細胞組成物の十分な治療量を達成するために、Ｔ細胞は、多くの場合、刺激、活性化及び／または拡大の１回以上のラウンドに供される。Ｔ細胞は、一般に、例えば、米国特許６，３５２，６９４号；同第６，５３４，０５５号；同第６，９０５，６８０号；同第６，６９２，９６４号；同第５，８５８，３５８号；同第６，８８７，４６６号；同第６，９０５，６８１号；同第７，１４４，５７５号；同第７，０６７，３１８号；同第７，１７２，８６９号；同第７，２３２，５６６号；同第７，１７５，８４３号；同第５，８８３，２２３号；同第６，９０５，８７４号；同第６，７９７，５１４号；及び同第６，８６７，０４１号に記載される方法を使用して、活性化及び拡大させることができ、その各々は、全体が参照により本明細書に援用される。抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現するように改変されたＴ細胞は、Ｔ細胞が改変される前及び／または後に活性化及び拡大することができる。加えて、Ｔ細胞は、活性化及び／または拡大の前、最中、及び／または後に、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路を調節する１つ以上の因子と接触させ得る。一実施形態において、本明細書で企図される方法によって製造されるＴ細胞は、１、２、３、４、または５回以上の活性化ラウンド及び拡大ラウンドを受け、その各々は、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路を調節する１つ以上の因子を含み得る。
【０３０４】
一実施形態において、共刺激リガンドは、抗原提示細胞（例えば、ａＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞など）上に存在し、Ｔ細胞上の同種の共刺激分子に特異的に結合することによって、所望のＴ細胞応答を、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合によってもたらされる一次シグナルに加えて、媒介するシグナルをもたらす。好適な共刺激リガンドには、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＶＥＭ、リンフォトキシンベータ受容体、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、アゴニストまたはＴｏｌｌリガンド受容体に結合する抗体、及びＢ７−Ｈ３に特異的に結合するリガンドが含まれるが、これらに限定されない。
【０３０５】
特定の実施形態において、共刺激リガンドは、限定するものではないが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−ＩＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、１ＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及びＣＤ８３に特異的に結合するリガンドを含む、Ｔ細胞上に存在する共刺激分子に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む。
【０３０６】
好適な共刺激リガンドは、可溶形態で提供されるか、または改変Ｔ細胞上に発現される操作されたＴＣＲもしくはＣＡＲに結合するＡＰＣもしくはａＡＰＣ上に発現される、標的抗原を更に含む。
【０３０７】
様々な実施形態において、本明細書で企図されるＴ細胞を製造するための方法は、Ｔ細胞を含む細胞の集団を活性化すること、及びＴ細胞の集団を拡大することを含む。Ｔ細胞活性化は、Ｔ細胞ＴＣＲ／ＣＤ３複合体によるか、またはＣＤ２表面タンパク質の刺激を介した一次刺激シグナルを提供することによって、また、アクセサリー分子、例えば、ＣＤ２８による二次共刺激シグナルを提供することによって、達成することができる。
【０３０８】
ＴＣＲ／ＣＤ３複合体は、好適なＣＤ３結合因子、例えば、ＣＤ３リガンドまたは抗ＣＤ３モノクローナル抗体とＴ細胞を接触させることによって、刺激され得る。ＣＤ３抗体の例示的な例としては、ＯＫＴ３、Ｇ１９−４、ＢＣ３、及び６４．１が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３０９】
別の実施形態において、ＣＤ２結合因子は、一次刺激シグナルをＴ細胞にもたらすために使用され得る。ＣＤ２結合因子の例示的な例としては、ＣＤ２リガンド及び抗ＣＤ２抗体、例えば、Ｔ１１．１抗体またはＴ１１．２抗体と組み合わせたＴ１１．３抗体（Ｍｅｕｅｒ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｃｅｌｌ  ３６：８９７−９０６）及び９−１抗体と組み合わせた９．６抗体（ＴＩ１．１と同じエピトープを認識する）（Ｙａｎｇ，Ｓ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：１０９７−１１００）が挙げられるが、これらに限定されない。上記の抗体のいずれかと同じエピトープに結合する他の抗体も使用することができる。追加の抗体、または抗体の組み合わせは、本明細書に別途開示される標準的な技術によって、調製及び特定することができる。
【０３１０】
ＴＣＲ／ＣＤ３複合体により、またはＣＤ２を介してもたらされる一次刺激シグナルに加えて、Ｔ細胞応答の誘導には、第２の共刺激シグナルが必要である。特定の実施形態において、ＣＤ２８結合因子は、共刺激シグナルをもたらすために使用することができる。ＣＤ２８結合因子の例示的な例としては、天然ＣＤ２８リガンド、例えば、ＣＤ２８に対する天然リガンド（例えば、Ｂ７−１（ＣＤ８０）及びＢ７−２（ＣＤ８６）などのＢ７ファミリータンパク質のメンバー）；及びＣＤ２８分子に架橋することが可能な抗ＣＤ２８モノクローナル抗体またはその断片、例えば、モノクローナル抗体９．３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８、ＫＯＬＴ−２、１５Ｅ８、２４８．２３．２、及びＥＸ５．３Ｄ１０が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３１１】
一実施形態において、一次刺激シグナルをもたらす分子、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体またはＣＤ２を介して刺激をもたらす分子、及び共刺激分子は、同じ表面に結合される。
【０３１２】
ある特定の実施形態において、刺激シグナル及び共刺激シグナルをもたらす結合因子は、細胞の表面上に局在化される。これは、細胞表面上におけるその発現に好適な形態で結合因子をコードする核酸を細胞にトランスフェクトもしくは形質導入することによって、または別の方法で結合因子を細胞表面に結合させることによって達成することができる。
【０３１３】
別の実施形態において、一次刺激シグナルをもたらす分子、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体またはＣＤ２を介して刺激をもたらす分子、及び共刺激分子は、抗原提示細胞上に提示される。
【０３１４】
一実施形態において、一次刺激シグナルをもたらす分子、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体またはＣＤ２を介して刺激をもたらす分子、及び共刺激分子は、異なる表面上に提供される。
【０３１５】
ある特定の実施形態において、一次刺激シグナル及び共刺激シグナルをもたらす結合因子のうちの１つは、可溶性（溶液で提供される）であり、他の因子（複数可）は、１つ以上の表面上に提供される。
【０３１６】
特定の実施形態において、刺激シグナル及び共刺激シグナルをもたらす結合因子は、いずれも可溶形態で提供される（溶液で提供される）。
【０３１７】
様々な実施形態において、本明細書で企図されるＴ細胞を製造するための方法は、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体でＴ細胞を活性化することを含む。
【０３１８】
本明細書で企図される方法によって製造されるＴ細胞組成物は、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路を阻害する１つ以上の因子の存在下で活性化及び／または拡大されたＴ細胞を含む。抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現するように改変されたＴ細胞は、Ｔ細胞が改変される前及び／または後に活性化及び拡大することができる。特定の実施形態において、Ｔ細胞の集団は、活性化され、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現するように改変され、次いで、拡大のために培養される。
【０３１９】
一実施形態において、本明細書で企図される方法によって製造されるＴ細胞は、高い増殖能及び自己再生能力を示すマーカーを発現するが、Ｔ細胞分化のマーカーを発現しないか、または実質的に検出可能なマーカーを発現しない、数の増加したＴ細胞を含む。これらのＴ細胞は、繰り返し活性化され、ロバストに拡大し得、それにより、改善された治療用Ｔ細胞組成物が提供される。
【０３２０】
一実施形態において、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路を阻害する１つ以上の因子の存在下で活性化及び拡大されたＴ細胞の集団は、ＰＩ３Ｋ阻害剤を用いずに活性化及び拡大されたＴ細胞の集団と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２５０倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、またはそれ以上拡大される。
【０３２１】
一実施形態において、幼若Ｔ細胞のマーカーの発現によって特徴付けられるＴ細胞の集団は、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路を阻害する１つ以上の因子の存在下で活性化及び拡大され、ＰＩ３Ｋ阻害剤を用いずに活性化及び拡大されたＴ細胞の集団と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２５０倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、またはそれ以上拡大される。
【０３２２】
一実施形態において、本明細書で企図される方法によって活性化されたＴ細胞を拡大することは、数時間（約３時間）〜約７日〜約２８日間またはその間の任意の時間単位の整数値の間、Ｔ細胞を含む細胞の集団を培養することを更に含む。別の実施形態において、Ｔ細胞組成物は、１４日間培養され得る。特定の実施形態において、Ｔ細胞は、約２１日間培養される。別の実施形態において、Ｔ細胞組成物は、約２〜３日間培養される。Ｔ細胞の培養時間が６０日以上になり得るように、数サイクルの刺激／活性化／拡大が望ましい場合もある。
【０３２３】
特定の実施形態において、Ｔ細胞培養に適切な条件は、適切な培地（例えば、最小必須培地もしくはＲＰＭＩ培地１６４０またはＸ−ｖｉｖｏ１５、（Ｌｏｎｚａ））ならびに増殖及び生存に必要な１つ以上の因子、例えば、限定するものではないが、血清（例えば、ウシ胎児またはヒト血清）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＧＦβ、及びＴＮＦ−αまたは当業者に知られている細胞成長に好適な任意の他の添加物を含む。
【０３２４】
細胞培地の更なる例示的な例としては、限定するものではないが、ＲＰＭＩ  １６４０、Ｃｌｉｃｋｓ、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ１５、及びＸ−Ｖｉｖｏ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒが挙げられ、これらには、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、及びビタミンが追加され、無血清であるか、または適切な量の血清（または血漿）が添加され、または定義された一連のホルモン、及び／またはＴ細胞の成長及び拡大に十分な量のサイトカイン（複数可）が添加される。
【０３２５】
Ｔ細胞拡大のための他の添加物の例示的な例としては、界面活性剤、ピアスマネート、ＨＥＰＥＳなどのｐＨ緩衝液、ならびにＮ−アセチル−システイン及び２−メルカプトエタノールなどの還元剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３２６】
抗生物質、例えば、ペニシリン及びストレプトマイシンは、実験培地中にのみ含まれ、対象に注入される細胞の培養物中には含まれない。標的細胞は、成長を支持するのに必要な条件下、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）及び雰囲気（例えば、大気圧＋５％ＣＯ２）に維持される。
【０３２７】
特定の実施形態において、ＰＢＭＣまたは単離されたＴ細胞は、ＩＬ−２、ＩＬ−７、及び／またはＩＬ−１５などの適切なサイトカインを含む培地中で、一般に、ビーズまたは他の表面に結合した抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体などの刺激因子及び共刺激因子と接触される。
【０３２８】
他の実施形態において、人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）は、様々な共刺激分子及びサイトカインの安定した発現及び分泌を誘導するように、Ｋ５６２、Ｕ９３７、７２１．２２１、Ｔ２、及びＣ１Ｒ細胞を操作することによって製造され得る。特定の実施形態において、Ｋ３２またはＵ３２  ａＡＰＣを使用して、ＡＡＰＣ細胞表面上に１つ以上の抗体ベース刺激分子を提示することを誘導する。Ｔ細胞の集団は、限定するものではないが、ＣＤ１３７Ｌ（４−１ＢＢＬ）、ＣＤ１３４Ｌ（ＯＸ４０Ｌ）、及び／またはＣＤ８０もしくはＣＤ８６を含む、様々な共刺激分子を発現するａＡＰＣによって拡大することができる。最後に、ａＡＰＣは、遺伝子改変Ｔ細胞を拡大し、ＣＤ８  Ｔ細胞上のＣＤ２８発現を維持するのに効率的なプラットフォームを提供する。ＷＯ０３／０５７１７１及びＵＳ２００３／０１４７８６９において提供されるａＡＰＣは、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０３２９】
５．８．２．因子（剤）
様々な実施形態において、細胞内のＰＩ３Ｋ経路を調節する因子とＴ細胞を接触させることを含む、未分化または発達的に強力なＴ細胞を拡大させる、Ｔ細胞を製造するための方法が提供される。様々な実施形態において、細胞内のＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路を調節する因子とＴ細胞を接触させることを含む、未分化または発達的に強力なＴ細胞を拡大させる、Ｔ細胞を製造するための方法が提供される。細胞は、活性化及び拡大の前、その間及び／または後に接触させることができる。Ｔ細胞組成物は、分化の実質的な増加なく、複数の拡大ラウンドを受けることができるように、十分なＴ細胞効果を保持している。
【０３３０】
本明細書で使用される場合、「調節する」、「調節因子」、または「調節剤」という用語または同等の用語は、細胞シグナル伝達経路に変化を引き起こす因子の能力を指す。調節因子は、経路の構成成分の量、活性を増加もしくは減少させるか、または細胞シグナル伝達経路の所望の作用もしくは出力を増加もしくは減少させ得る。一実施形態において、調節因子は、阻害剤である。別の実施形態において、調節因子は、活性化剤である。
【０３３１】
「因子（剤）」とは、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の調節に使用される、化合物、小分子、例えば、小有機分子、核酸、ポリペプチド、またはその断片、アイソフォーム、バリアント、類似体、もしくは誘導体を指す。
【０３３２】
「小分子」とは、約５ｋＤ未満、約４ｋＤ未満、約３ｋＤ未満、約２ｋＤ未満、約１ｋＤ、または約．５ｋＤ未満の分子量を有する組成物を指す。小分子は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、ペプトイド、炭水化物、脂質、それらの構成成分または他の有機もしくは無機分子を含み得る。真菌、細菌、または藻類抽出物などの化学的及び／または生物学的混合物のライブラリーは、当該技術分野において知られており、本発明のアッセイのいずれかを用いてスクリーニングすることができる。分子ライブラリーの合成方法は、当該技術分野において知られている（例えば、Ｃａｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４ａ；Ｃａｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４ｂ；Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；ＤｅＷｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｇａｌｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。
【０３３３】
「類似体」とは、本発明の所望の活性を有する化合物、ヌクレオチド、タンパク質またはポリペプチドまたは化合物と類似または同一の活性または機能（複数可）を有する小さい有機化合物、ヌクレオチド、タンパク質、またはポリペプチドを指すが、好ましい実施形態の配列または構造と類似または同一の配列または構造を必ずしも含む必要はない。
【０３３４】
「誘導体」とは、アミノ酸残基の置換、欠失もしくは付加の導入によって変更された親タンパク質もしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含むか、またはヌクレオチドの置換もしくは欠失、付加もしくは変異のいずれかの導入によって改変された核酸もしくはヌクレオチドを含む、化合物、タンパク質またはポリペプチドのいずれかを指す。誘導体の核酸、ヌクレオチド、タンパク質またはポリペプチドは、親ポリペプチドと類似または同一の機能を有する。
【０３３５】
様々な実施形態において、ＰＩ３Ｋ経路を調節する因子は、ＰＩ３Ｋ経路の構成成分を活性化する。「活性化剤」、または「アゴニスト」とは、限定するものではないが、ＰＩ３Ｋの１つ以上の活性を阻害する分子を含む、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路中の分子の１つ以上の活性を促進、増加、または誘発する因子を指す。
【０３３６】
様々な実施形態において、ＰＩ３Ｋ経路を調節する因子は、ＰＩ３Ｋ経路の構成成分を阻害する。「阻害剤」または「アンタゴニスト」とは、限定するものではないが、ＰＩ３Ｋを含む、ＰＩ３Ｋ経路中の分子の１つ以上の活性を阻害、減少、または低下させる因子を指す。一実施形態において、阻害剤は、デュアル分子阻害剤である。特定の実施形態において、阻害剤は、同じまたは実質的に同じ活性を有する分子クラスを阻害し得るか（ｐａｎ阻害剤）、または分子の活性を特異的に阻害し得る（選択的または特異的阻害剤）。阻害はまた、不可逆的または可逆的であり得る。
【０３３７】
一実施形態において、阻害剤は、少なくとも１ｎＭ、少なくとも２ｎＭ、少なくとも５ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ、少なくとも５０ｎＭ、少なくとも１００ｎＭ、少なくとも２００ｎＭ、少なくとも５００ｎＭ、少なくとも１μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも５０μＭ、または少なくとも１００μＭのＩＣ５０を有する。ＩＣ５０の決定は、当該技術分野において知られている任意の従来技術を使用して、達成することができる。例えば、ＩＣ５０は、ある範囲の濃度の試験阻害剤の存在下で、所与の酵素の活性を測定することによって、決定することができる。次いで、実験的に得られた酵素活性の値を、使用された阻害剤の濃度に対してプロットする。５０％酵素活性を示す阻害剤の濃度（いかなる阻害剤もない状態での活性と比較して）が「ＩＣ５０」値とされる。同様に、他の阻害剤の濃度も、活性の適切な決定を介して定義され得る。
【０３３８】
様々な実施形態において、Ｔ細胞は、ＰＩ３Ｋ経路の１つ以上の調節因子と、少なくとも１ｎＭ、少なくとも２ｎＭ、少なくとも５ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ、少なくとも５０ｎＭ、少なくとも１００ｎＭ、少なくとも２００ｎＭ、少なくとも５００ｎＭ、少なくとも１μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも５０μＭ、少なくとも１００μＭ、または少なくとも１Ｍの濃度で接触または処理または培養される。
【０３３９】
特定の実施形態において、Ｔ細胞は、ＰＩ３Ｋ経路の１つ以上の調節因子と、少なくとも１２時間、１８時間、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７日間、少なくとも２週間、少なくとも１、２、３、４、５、または６ヶ月以上、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上の拡大ラウンドで、接触または処理または培養され得る。
【０３４０】
５．８．３．ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路
ラパマイシン経路のホスファチジル−イノシトール−３キナーゼ／Ａｋｔ／哺乳動物標的は、成長因子シグナル伝達を、細胞の増殖、分化、代謝、及び生存と結びつける導管として機能する。ＰＩ３Ｋは、高度に保存された細胞内脂質キナーゼのファミリーである。クラスＩＡのＰＩ３Ｋは、直接的であるか、またはアダプター分子のインスリン受容体基質ファミリーとの相互作用を介するかのいずれかで、成長因子である受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）によって活性化される。この活性により、セリン／トレオニンキナーゼＡｋｔの制御因子であるホスファチジル−イノシトール−３，４，５−トリスリン酸（ＰＩＰ３）の産生が生じる。ｍＴＯＲは、明確に異なる活性を付与する異なる結合パートナーによってそれぞれ特徴付けられる２つの明確に異なる複合体を介した標準的なＰＩ３Ｋ経路を通じて作用する。ｍＴＯＲＣ１（ＰＲＡＳ４０、ラプトル、及びｍＬＳＴ８／ＧｂＬを含むｍＴＯＲ複合体）は、成長因子シグナルをタンパク質の翻訳、細胞成長、増殖、及び生存に関連付ける、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達の下流エフェクターとして機能する。ｍＴＯＲＣ２（リクトル、ｍＳＩＮ１、プロトル、及びｍＬＳＴ８を含むｍＴＯＲ複合体）は、Ａｋｔの上流活性化因子として機能する。
【０３４１】
成長因子受容体の媒介によりＰＩ３Ｋが活性化すると、Ａｋｔは、そのプレクストリン相同ドメインとＰＩＰ３との相互作用を介して膜に動員され、それにより、その活性化ループが露出し、構造的に活性なホスホイノシタイド依存性タンパク質キナーゼ１（ＰＤＫ１）によってトレオニン３０８（Ｔｈｒ３０８）でのリン酸化が可能になる。最大活性化の場合、Ａｋｔは、そのＣ末端疎水性のモチーフのセリン４７３（Ｓｅｒ４７３）でもｍＴＯＲＣ２によってリン酸化される。ＤＮＡ−ＰＫ及びＨＳＰもまた、Ａｋｔ活性の制御に重要であることが示されている。Ａｋｔは、ＴＳＣ２の阻害性リン酸化を介してｍＴＯＲＣ１を活性化し、ＴＳＣ２は、ＴＳＣ１とともに、ｍＴＯＲＣ１の正の制御因子であるＲｈｅｂ  ＧＴＰａｓｅを阻害することによってｍＴＯＲＣ１を負に制御する。ｍＴＯＲＣ１は、十分に定義された２つの基質ｐ７０Ｓ６Ｋ（以後、Ｓ６Ｋ１と呼ぶ）及び４Ｅ−ＢＰ１を有し、いずれもタンパク質合成を厳密に制御する。したがって、ｍＴＯＲＣ１は、成長因子シグナル伝達をタンパク質の翻訳及び細胞増殖と関連付ける、ＰＩ３Ｋの重要な下流エフェクターである。
【０３４２】
５．８．４．ＰＩ３Ｋ阻害剤
本明細書で使用される場合、「ＰＩ３Ｋ阻害剤」という用語は、ＰＩ３Ｋに結合し、その少なくとも１つの活性を阻害する核酸、ペプチド、化合物、または小有機分子を指す。ＰＩ３Ｋタンパク質は、クラス１のＰＩ３Ｋ、クラス２のＰＩ３Ｋ、及びクラス３のＰＩ３Ｋの３つのクラスに分けることができる。クラス１のＰＩ３Ｋは、４つのｐ１１０触媒サブユニット（ｐ１１０α、ｐ１１０β、ｐ１１０δ、及びｐ１１０γ）のうちの１つ及び制御サブユニットの２つのファミリーのうちの１つからなるヘテロ二量体として存在する。本発明のＰＩ３Ｋ阻害剤は、好ましくは、クラス１  ＰＩ３Ｋ阻害剤を標的とする。一実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、クラス１  ＰＩ３Ｋ阻害剤の１つ以上のアイソフォームに対する選択性を示す（すなわち、ｐ１１０α、ｐ１１０β、ｐ１１０δ、及びｐ１１０γまたはｐ１１０α、ｐ１１０β、ｐ１１０δ、及びｐ１１０γのうちの１つ以上に対する選択性）。別の態様において、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、アイソフォーム選択性を示さないものであり、これは「ｐａｎ−ＰＩ３Ｋ阻害剤」とみなされる。一実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＰＩ３Ｋ触媒ドメインへの結合についてＡＴＰと競合する。
【０３４３】
ある特定の実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、例えば、ＰＩ３Ｋ、及びＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ｍＴＯＲ経路中の追加のタンパク質を標的とすることができる。特定の実施形態において、ｍＴＯＲ及びＰＩ３Ｋの両方を標的とするＰＩ３Ｋ阻害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤またはＰＩ３Ｋ阻害剤のいずれかと呼ぶことができる。ＰＩ３Ｋのみを標的とするＰＩ３Ｋ阻害剤は、選択的ＰＩ３Ｋ阻害剤と呼ばれ得る。一実施形態において、選択的ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＰＩ３Ｋに対する５０％阻害濃度が、経路中のｍＴＯＲ及び／または他のタンパク質に対する阻害剤のＩＣ５０よりも少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、またはそれ以上低いＩＣ５０を示す剤を指すことが理解され得る。
【０３４４】
特定の実施形態において、例示的なＰＩ３Ｋ阻害剤は、約２００ｎＭ以下、好ましくは、約１００ｎｍ以下、更により好ましくは、約６０ｎＭ以下、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約１ｎＭ、１００μＭ、５０μＭ、２５μＭ、１０μＭ、１μＭ、またはそれ以下のＩＣ５０（活性の５０％を阻害する濃度）でＰＩ３Ｋを阻害する。一実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、約２ｎＭ〜約１００ｎｍ、より好ましくは、約２ｎＭ〜約５０ｎＭ、更により好ましくは、約２ｎＭ〜約１５ｎＭのＩＣ５０でＰＩ３Ｋを阻害する。
【０３４５】
本明細書で企図されるＴ細胞製造方法において使用するのに好適なＰＩ３Ｋ阻害剤の例示的な例としては、ＢＫＭ１２０（クラス１  ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ１４７（クラス１  ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、（ｐａｎ−ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、及びＰＸ−８６６（クラス１  ＰＩ３Ｋ阻害剤；ｐ１１０α、ｐ１１０β、及びｐ１１０γのアイソフォーム、Ｏｎｃｏｔｈｙｒｅｏｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３４６】
選択的ＰＩ３Ｋ阻害剤の他の例示的な例としては、ＢＹＬ７１９、ＧＳＫ２６３６７７１、ＴＧＸ−２２１、ＡＳ２５２４２、ＣＡＬ−１０１、ＺＳＴＫ４７４、及びＩＰＩ−１４５が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３４７】
ｐａｎ−ＰＩ３Ｋ阻害剤の更なる例示的な例としては、ＢＥＺ２３５、ＬＹ２９４００２、ＧＳＫ１０５９６１５、ＴＧ１００７１３、及びＧＤＣ−０９４１が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３４８】
５．８．５．ＡＫＴ阻害剤
本明細書で使用される場合、「ＡＫＴ阻害剤」という用語は、ＡＫＴの少なくとも１つの活性を阻害する核酸、ペプチド、化合物、または小有機分子を指す。ＡＫＴ阻害剤は、脂質系阻害剤（例えば、ＡＫＴが原形質膜に局在化するのを阻止する、ＡＫＴのプレクストリン相同ドメインを標的とする阻害剤）、ＡＴＰ競合阻害剤、及びアロステリック阻害剤を含む、いくつかのクラスに分けることができる。一実施形態において、ＡＫＴ阻害剤は、ＡＫＴ触媒部位に結合することによって作用する。特定の実施形態において、Ａｋｔ阻害剤は、ｍＴＯＲなどの下流ＡＫＴ標的のリン酸化を阻害することによって作用する。別の実施形態において、ＡＫＴ活性は、Ａｋｔを活性化する入力シグナルを阻害することによって、例えば、ＡＫＴのＤＮＡ−ＰＫ活性化、ＡＫＴのＰＤＫ−１活性化、及び／またはＡｋｔのｍＴＯＲＣ２活性化を阻害することによって、阻害される。
【０３４９】
ＡＫＴ阻害剤は、３つ全てのＡＫＴアイソフォームＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３を標的とすることができるか、またはアイソフォーム選択的であり、ＡＫＴアイソフォームのうちの１つもしくは２つのみを標的とし得る。一実施形態において、ＡＫＴ阻害剤は、ＡＫＴ及びＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ｍＴＯＲ経路中の追加のタンパク質を標的とすることができる。ＡＫＴのみを標的とするＡＫＴ阻害剤は、選択的ＡＫＴ阻害剤と呼ばれ得る。一実施形態において、選択的ＡＫＴ阻害剤は、ＡＫＴに対する５０％阻害濃度が、経路中の他のタンパク質に対する阻害剤のＩＣ５０よりも少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、またはそれ以上低いＩＣ５０を示す剤を指すことが理解され得る。
【０３５０】
特定の実施形態において、例示的なＡＫＴ阻害剤は、約２００ｎＭ以下、好ましくは、約１００ｎｍ以下、更により好ましくは、約６０ｎＭ以下、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約１ｎＭ、１００μＭ、５０μＭ、２５μＭ、１０μＭ、１μＭ、またはそれ以下のＩＣ５０（活性の５０％を阻害する濃度）でＡＫＴを阻害する。一実施形態において、ＡＫＴは、約２ｎＭ〜約１００ｎｍ、より好ましくは、約２ｎＭ〜約５０ｎＭ、更により好ましくは、約２ｎＭ〜約１５ｎＭのＩＣ５０でＡＫＴを阻害する。
【０３５１】
アウリスタチンベースの抗体−薬物コンジュゲートとの組み合わせで使用されるＡＫＴ阻害剤の例示的な例としては、例えば、ペリホシン（Ｋｅｒｙｘ）、ＭＫ２２０６（Ｍｅｒｃｋ）、ＶＱＤ−００２（ＶｉｏＱｕｅｓｔ）、ＸＬ４１８（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、ＧＳＫ６９０６９３、ＧＤＣ−００６８、及びＰＸ３１６（ＰＲＯＬＸ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）が挙げられる。
【０３５２】
選択的Ａｋｔ１阻害剤の例示的な非限定的な例は、Ａ−６７４５６３である。
【０３５３】
選択的Ａｋｔ２阻害剤の例示的な非限定的な例は、ＣＣＴ１２８９３０である。
【０３５４】
特定の実施形態において、Ａｋｔ阻害剤  ＡｋｔのＤＮＡ−ＰＫ活性化、ＡｋｔのＰＤＫ−１活性化、ＡｋｔのｍＴＯＲＣ２活性化、またはＡｋｔのＨＳＰ活性化。
【０３５５】
ＤＮＡ−ＰＫ阻害薬の例示的な例としては、ＮＵ７４４１、ＰＩ−１０３、ＮＵ７０２６、ＰＩＫ−７５、及びＰＰ−１２１が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３５６】
５．８．６．ｍＴＯＲ阻害剤
「ｍＴＯＲ阻害剤」または「ｍＴＯＲを阻害する因子」という用語は、ｍＴＯＲタンパク質の少なくとも１つの活性、例えば、その基質（例えば、ｐ７０Ｓ６キナーゼ１、４Ｅ−ＢＰ１、ＡＫＴ／ＰＫＢ及びｅＥＦ２）のうちの少なくとも１つに対するセリン／トレオニンタンパク質キナーゼ活性などを阻害する核酸、ペプチド、化合物、または小有機分子を指す。ｍＴＯＲ阻害剤は、ｍＴＯＲＣ１、ｍＴＯＲＣ２またはｍＴＯＲＣ１及びｍＴＯＲＣ２の両方に直接結合し、ｍＴＯＲＣ１、ｍＴＯＲＣ２またはｍＴＯＲＣ１及びｍＴＯＲＣ２の両方を阻害することができる。
【０３５７】
ｍＴＯＲＣ１及び／またはｍＴＯＲＣ２活性の阻害は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路におけるシグナル伝達の減少によって決定することができる。そのようなシグナル伝達経路の出力の減少を確立するには、多種多様な読み取りを利用することができる。いくつかの非限定的な例示的な読み取りとしては、（１）限定するものではないが、５４７３及びＴ３０８を含む残基でのＡｋｔのリン酸化の減少；（２）例えば、限定するものではないが、Ｆｏｘ０１／Ｏ３ａ  Ｔ２４／３２、ＧＳＫ３ａ／β；Ｓ２１／９、及びＴＳＣ２  Ｔ１４６２を含む、Ａｋｔ基質のリン酸化の低下によって証明される、Ａｋｔの活性化の減少；（３）限定するものではないが、リボソームＳ６  Ｓ２４０／２４４、７０Ｓ６Ｋ  Ｔ３８９、及び４ＥＢＰ１  Ｔ３７／４６を含む、ｍＴＯＲの下流のシグナル伝達分子のリン酸化の減少；ならびに（４）がん性細胞の増殖阻害が挙げられる。
【０３５８】
一実施形態において、ｍＴＯＲ阻害剤は、活性部位阻害剤である。これらは、ｍＴＯＲのＡＴＰ結合部位（ＡＴＰ結合ポケットとも呼ばれる）に結合し、ｍＴＯＲＣ１及びｍＴＯＲＣ２の両方の触媒活性を阻害する、ｍＴＯＲ阻害剤である。本明細書で企図されるＴ細胞製造方法において使用するのに好適な活性部位阻害剤のクラスの１つは、ＰＩ３Ｋ及びｍＴＯＲの両方を標的とし、直接阻害するデュアル特異性阻害剤である。デュアル特異性阻害剤は、ｍＴＯＲ及びＰＩ３Ｋの両方のＡＴＰ結合部位に結合する。そのような阻害薬の例示的な例としては、イミダゾキナゾリン、ワートマニン、ＬＹ２９４００２、ＰＩ−１０３（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、ＳＦ１１２６（Ｓｅｍａｆｏｒｅ）、ＢＧＴ２２６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ７６５（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）及びＮＶＰ−ＢＥＺ２３５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３５９】
本明細書で企図される方法において使用するのに好適なｍＴＯＲ活性部位阻害剤の別のクラスは、１つ以上のＩ型ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ、例えば、ＰＩ３キナーゼα、β、γ、またはδと比較して、ｍＴＯＲＣ１及びｍＴＯＲＣ２活性を選択的に阻害する。これらの活性化部位阻害剤は、ｍＴＯＲの活性部位に結合するが、ＰＩ３Ｋの活性部位には結合しない。そのような阻害剤の例示的な例としては、ピラゾロピリミジン、Ｔｏｒｉｎ１（Ｇｕｅｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｓａｂａｔｉｎｉ）、ＰＰ２４２（２−（４−アミノ−１−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−５−オール）、ＰＰ３０、Ｋｕ−００６３７９４、ＷＡＹ−６００（Ｗｙｅｔｈ）、ＷＡＹ−６８７（Ｗｙｅｔｈ）、ＷＡＹ−３５４（Ｗｙｅｔｈ）、及びＡＺＤ８０５５（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ，８，６２７−６４４，２００９）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３６０】
一実施形態において、選択的ｍＴＯＲ阻害剤は、ｍＴＯＲＣ１及び／またはｍＴＯＲＣ２に対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）が、１、２、３、もしくはそれ以上のＩ型ＰＩ３−キナーゼまたはＩ型ＰＩ３−キナーゼの全てに対する阻害剤のＩＣ５０よりも少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、またはそれ以上低いＩＣ５０を示す剤を指す。
【０３６１】
本発明において使用するためのｍＴＯＲ阻害剤の別のクラスは、本明細書において、「ラパログ」と呼ばれる。本明細書で使用される場合、「ラパログ」という用語は、ｍＴＯＲ  ＦＲＢドメイン（ＦＫＢＰラパマイシン結合ドメイン）に特異的に結合し、ラパマイシンに構造的に関係し、ｍＴＯＲ阻害性質を保持する化合物を指す。ラパログという用語は、ラパマイシンを除外する。ラパログは、ラパマイシンのエステル、エーテル、オキシム、ヒドラゾン、及びヒドロキシルアミン、ならびにラパマイシンコア構造上の官能基が、例えば、還元または酸化によって改変された化合物を含む。そのような化合物の薬学的に許容される塩もまた、ラパマイシン誘導体とみなされる。本明細書で企図される方法において使用するのに好適なラパログの例示的な例としては、限定するものではないが、テムシロリムス（ＣＣ１７７９）、エベロリムス（ＲＡＤ００１）、デフォロリムス（ＡＰ２３５７３）、ＡＺＤ８０５５（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、及びＯＳＩ−０２７（ＯＳＩ）が挙げられる。
【０３６２】
一実施形態において、因子は、ｍＴＯＲ阻害剤のラパマイシン（シロリムス）である。
【０３６３】
特定の実施形態において、本発明において使用するための例示的なｍＴＯＲ阻害剤は、約２００ｎＭ以下、好ましくは、約１００ｎｍ以下、更により好ましくは、約６０ｎＭ以下、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約１ｎＭ、１００μＭ、５０μＭ、２５μＭ、１０μＭ、１μＭ、またはそれ以下のＩＣ５０（活性の５０％を阻害する濃度）でｍＴＯＲＣ１、ｍＴＯＲＣ２またはｍＴＯＲＣ１とｍＴＯＲＣ２の両方のいずれかを阻害する。一態様において、本発明において使用するためのｍＴＯＲ阻害剤は、約２ｎＭ〜約１００ｎｍ、より好ましくは、約２ｎＭ〜約５０ｎＭ、更により好ましくは、約２ｎＭ〜約１５ｎＭのＩＣ５０でｍＴＯＲＣ１、ｍＴＯＲＣ２またはｍＴＯＲＣ１とｍＴＯＲＣ２の両方のいずれかを阻害する。
【０３６４】
一実施形態において、例示的なｍＴＯＲ阻害剤は、約２００ｎＭ以下、好ましくは、約１００ｎｍ以下、更により好ましくは、約６０ｎＭ以下、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約１ｎＭ、１００μＭ、５０μＭ、２５μＭ、１０μＭ、１μＭ、またはそれ以下のＩＣ５０（活性の５０％を阻害する濃度）でＰＩ３Ｋ及びｍＴＯＲＣ１もしくはｍＴＯＲＣ２またはｍＴＯＲＣ１とｍＴＯＲＣ２の両方及びＰＩ３Ｋのいずれかを阻害する。一態様において、本発明において使用するためのｍＴＯＲ阻害剤は、約２ｎＭ〜約１００ｎｍ、より好ましくは、約２ｎＭ〜約５０ｎＭ、更により好ましくは、約２ｎＭ〜約１５ｎＭのＩＣ５０でＰＩ３Ｋ及びｍＴＯＲＣ１もしくはｍＴＯＲＣ２またはｍＴＯＲＣ１とｍＴＯＲＣ２の両方及びＰＩ３Ｋを阻害する。
【０３６５】
本明細書で企図される特定の実施形態において使用するのに好適なｍＴＯＲ阻害剤の更なる例示的な例としては、ＡＺＤ８０５５、ＩＮＫ１２８、ラパマイシン、ＰＦ−０４６９１５０２、及びエベロリムスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３６６】
ｍＴＯＲは、ウェスタンブロットにおいて蛍光特異的抗体によって測定したとき、生理学的な基質タンパク質であるｐ７０  Ｓ６リボソームタンパク質キナーゼＩ（ｐ７０Ｓ６Ｋ１）及びｅＩＦ４Ｅ結合タンパク質１（４ＥＢＰ１）に対してロバストで特異的な触媒活性を示すことが分かっている。
【０３６７】
一実施形態において、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤は、ＢＩ−Ｄ１８７０、Ｈ８９、ＰＦ−４７０８６７１、ＦＭＫ、及びＡＴ７８６７からなる群から選択されるｓ６キナーゼ阻害剤である。
【０３６８】
５．９．組成物及び製剤
本明細書で企図される組成物は、本明細書で企図される１つ以上のポリペプチド、ポリヌクレオチド、それを含むベクター、遺伝子改変された免疫エフェクター細胞などを含み得る。組成物には、医薬組成物が含まれるが、これに限定されない。「医薬組成物」とは、単独で、または１つ以上の他の治療法との組み合わせのいずれかで、細胞または動物に投与するための、薬学的に許容されるまたは生理学的に許容される溶液に製剤化された組成物を指す。所望される場合、本発明の組成物は、他の薬剤、例えば、サイトカイン、成長因子、ホルモン、小分子、化学療法剤、プロドラッグ、薬物、抗体、または他の様々な薬学的に活性な薬剤などと組み合わせて投与することができることも理解されたい。組成物中に更に含まれ得る他の構成成分については、実質的に制限はないが、その追加の薬剤が、意図された治療法を提供するという組成物の機能に悪影響を与えない場合に限る。
【０３６９】
「薬学的に許容される」という文言は、本明細書において、適切な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応または他の問題もしくは合併症を伴うことなく、妥当な利益／リスク比に見合った、ヒト及び動物の組織との接触に使用するのに好適な化合物、物質、組成物及び／または剤形を指すために使用される。
【０３７０】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤」には、限定するものではないが、ヒトまたは飼育動物への使用が許容されるものとして米国食品医薬品局から承認を受けている、任意のアジュバント、担体、賦形剤、滑剤、甘味剤、希釈剤、防腐剤、色素／着色剤、風味向上剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、安定剤、等張化剤、溶媒、界面活性剤、または乳化剤が含まれる。例示的な薬学的に許容される担体としては、ラクトース、グルコース及びスクロースなどの糖；トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプンなどのデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロースなどのセルロース及びその誘導体；トラガカント；モルト；ゼラチン；タルク；カカオ脂、ワックス、動物性及び植物性脂肪、パラフィン、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、酸化亜鉛；ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油及びダイズ油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張生理食塩水；リンゲル溶液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；ならびに医薬製剤に採用される任意の他の適合性物質が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３７１】
特定の実施形態において、本発明の組成物は、本明細書で企図される、ある量のＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を含む。本明細書で使用される場合、「量」という用語は、臨床結果を含む、有益なまたは所望の予防上または治療上の結果を達成するための、遺伝子改変された治療用細胞、例えば、Ｔ細胞の「有効な量」または「有効量」を指す。
【０３７２】
「予防上有効な量」は、所望の予防上の結果を達成するのに効果的な遺伝子改変された治療用細胞の量を指す。典型的であって、必ずしもそうではないが、予防上有効な量は、疾患の早期段階前または早期段階において対象に使用される予防用量であるので、治療上有効な量よりも少ない。
【０３７３】
遺伝子改変された治療用細胞の「治療上有効な量」は、個体の病状、年齢、性別、及び体重などの因子、ならびに個体において所望の応答を引き起こす幹細胞及び前駆細胞の能力に応じて変動し得る。治療上有効な量はまた、治療上有益な効果が、ウイルスまたは形質導入された治療用細胞の任意の毒性または有害作用を上回るものでもある。「治療上有効な量」という用語は、対象（例えば、患者）を「治療する」のに有効な量を含む。治療量が示される場合、投与される本発明の組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、及び状態の個体差を考慮して、医師によって決定され得る。本明細書に記載されるＴ細胞を含む医薬組成物は、１０２〜１０１０細胞／ｋｇ体重、好ましくは、１０５〜１０６細胞／ｋｇ体重の投薬量（これらの範囲内の全ての整数値を含む）で投与され得ると一般的に言うことができる。細胞の数は、組成物中に含まれる細胞の種類に依存するだけでなく、組成物の意図される最終的用途にも依存する。本明細書で提供される使用については、細胞は、一般に、１リットル以下の体積であり、５００ｍＬ以下、更に２５０ｍＬまたは１００ｍＬ以下であり得る。したがって、所望の細胞の密度は、典型的に１０６細胞／ｍｌ超であり、一般に１０７細胞／ｍｌ、一般に１０８細胞／ｍｌ以上である。臨床的に意義のある免疫細胞の数は、複数回の注入に分割することができ、累積で１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、または１０１２細胞以上である。本発明のいくつかの態様において、特に、注入される細胞の全てが特定の標的抗原（例えば、κまたはλ軽鎖）にリダイレクトされるので、１０６／キログラム（患者当たり１０６〜１０１１）の範囲でより少ない数の細胞が投与され得る。ＣＡＲ発現細胞組成物は、これらの範囲内の投薬量で複数回投与され得る。細胞は、療法を受ける患者に対して、同種、同系、異種、または自己由来であり得る。所望する場合、治療は、免疫応答の誘発を向上させる本明細書に記載のマイトジェン（例えば、ＰＨＡ）またはリンフォカイン、サイトカイン、及び／またはケモカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１８、及びＴＮＦ−ベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、Ｆｌｔ３−Ｌ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１αなど）の投与を含み得る。
【０３７４】
一般に、本明細書に記載されるように活性化及び拡大された細胞を含む組成物は、免疫不全の個体で生じる疾患の治療及び予防に利用され得る。特に、本明細書で企図されるＣＡＲ改変Ｔ細胞を含む組成物は、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療に使用される。本発明のＣＡＲ改変Ｔ細胞は、単独で、あるいは担体、希釈剤、賦形剤、及び／またはＩＬ−２もしくは他のサイトカインもしくは細胞集団などの他の成分と組み合わせた医薬組成物としてのいずれかで投与され得る。特定の実施形態において、本明細書で企図される医薬組成物は、ある量の遺伝子改変されたＴ細胞を、１つ以上の薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤との組み合わせで含む。
【０３７５】
Ｔ細胞などのＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞集団を含む本発明の医薬組成物は、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；ならびに防腐剤を含み得る。本発明の組成物は、好ましくは、非経口投与、例えば、血管内（静脈内または動脈内）、腹腔内または筋肉内投与用に製剤化される。
【０３７６】
液体医薬組成物は、溶液、懸濁液または他の同様の形態のいずれであっても、次のうちの１つ以上：注射用水、食塩水、好ましくは、生理食塩水、リンゲル液、等張塩化ナトリウムなどの滅菌希釈剤、溶媒もしくは懸濁溶媒として機能し得る合成モノグリセリドもしくはジグリセリドなどの不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝液、及び塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性を調整するための剤を含み得る。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器または多用量バイアル中に封入することができる。注射可能な医薬組成物は、好ましくは、無菌である。
【０３７７】
特定の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、有効量のＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を単独で、または１つ以上の治療薬との組み合わせで含む。したがって、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞組成物は、単独で、または他の既知のがん治療、例えば、放射線療法、化学療法、移植、免疫療法、ホルモン療法、光線力学的療法などと組み合わせて、投与され得る。組成物は、抗生物質と組み合わせて投与されてもよい。そのような治療薬は、本明細書に記載される特定の疾患状態、例えば、特定のがんのための標準治療として当該技術分野において承認されているものであってよい。企図される例示的な治療薬には、サイトカイン、成長因子、ステロイド、ＮＳＡＩＤ、ＤＭＡＲＤ、抗炎症薬、化学療法剤、放射線療法剤、治療用抗体、または他の活性剤及び補助剤が含まれる。
【０３７８】
ある特定の実施形態において、本明細書で開示されるＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を含む組成物は、任意数の化学療法剤とともに投与され得る。化学療法剤の例示的な例としては、チオテパ及びシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ、及びウレドパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、及びトリメチローロメラミンレジュームを含むエチレンイミン及びメチルアメラミン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロソウレア；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアミシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質；メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗物質；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルウリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤；フロリン酸などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デホファミン；デメコルシン；ジアジコン；エフォルミチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）及びドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｈｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン及びカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害薬ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオミチン（ＤＭＦＯ）；Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ（商標）（ベキサロテン）、Ｐａｎｒｅｔｉｎ（商標）（アリトレチノイン）などのレチノイン酸誘導体；ＯＮＴＡＫ（商標）（デニロイキンジフチトクス）；エスペラミシン；カペシタビン；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が挙げられる。この定義には、がんに対するホルモン作用を制御または阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含む抗エストロゲン；ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリンなどの抗アンドロゲン剤；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体も含まれる。
【０３７９】
様々な他の治療薬が本明細書に記載される組成物とともに使用され得る。一実施形態において、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を含む組成物は、抗炎症薬と投与される。抗炎症薬または薬物には、ステロイド及び糖質コルチコイド（ベタメタゾン、ブデソニド、デキサメタゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロンを含む）、非ステロイド性抗炎症薬物（ＮＳＡＩＤＳ）、例えば、アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセン、メトトレキサート、スルファサラジン、レフルノミド、抗ＴＮＦ薬、シクロホスファミド及びミコフェノール酸が含まれるが、これらに限定されない。
【０３８０】
他の例示的なＮＳＡＩＤは、イブプロフェン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、ＶＩＯＸＸ（登録商標）（ロフェコキシブ）及びＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標）（セレコキシブ）などのＣｏｘ−２阻害薬、ならびにシアリレートからなる群から選択される。例示的な鎮痛薬は、アセトアミノフェン、オキシコドン、トラマドール、及びプロポキシフェン塩酸塩からなる群から選択される。例示的な糖質コルチコイドは、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、及びプレドニゾンからなる群から選択される。例示的な生体応答調節薬としては、細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ４、ＣＤ５など）に対する分子、ＴＮＦアンタゴニスト（例えば、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標））、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））及びインフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））などのサイトカイン阻害薬、ケモカイン阻害薬ならびに接着分子阻害薬が含まれる。生体応答調節薬には、モノクローナル抗体及び組み換え形態の分子が含まれる。例示的なＤＭＡＲＤには、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、メトトレキサート、ペニシラミン、レフルノミド、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、Ｇｏｌｄ（経口（オーラノフィン）及び筋肉内）及びミノサイクリンが含まれる。
【０３８１】
本明細書で企図されるＣＡＲ改変Ｔ細胞との組み合わせに好適な治療用抗体の例示的な例としては、バビツキシマブ、ベバシズマブ（アバスチン）、ビヴァツヅマブ、ブリナツモマブ、コナツムマブ、ダラツムマブ、デュリゴツマブ、ダセツズマブ、ダロツズマブ、エロツズマブ（ＨｕＬｕｃ６３）、ゲムツズマブ、イブリツモマブ、インダツキシマブ、イノツズマブ、ロルボツズマブ、ルカツムマブ、ミラツズマブ、モキセツモマブ、オカラツズマブ、オファツムマブ、リツキシマブ、シルツキシマブ、テプロツムマブ、及びウブリツキシマブが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３８２】
ＰＤ−１もしくはＰＤ−Ｌ１及び／またはＣＴＬＡ−４に対する抗体は、本明細書で開示されるＣＡＲ  Ｔ細胞、例えば、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞、例えば、ＢＣＭＡ−２一本鎖Ｆｖ断片を含むキメラ抗原受容体を発現するＣＡＲ  Ｔ細胞、例えば、ｂｂ２１２１と組み合わせて使用され得る。特定の実施形態において、ＰＤ−１抗体は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、及びピジリズマブからなる群から選択される。特定の実施形態において、ＰＤ−Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、及びＢＭＳ−９８６５５９からなる群から選択される。特定の実施形態において、ＣＴＬＡ−４抗体は、イピリムマブ及びトレメリムマブからなる群から選択される。
【０３８３】
ある特定の実施形態において、本明細書に記載される組成物は、サイトカインとともに投与される。本明細書で使用される「サイトカイン」とは、細胞間メディエーターとして別の細胞に作用する、１つの細胞集団によって放出されるタンパク質の総称を意味する。そのようなサイトカインの例としては、リンフォカイン、モノカイン、及び従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインのなかでも、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン；肝臓成長因子；線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子アルファ及びベータ；ミュラー管抑制因子；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮細胞成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−ベータなどの神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ−アルファ及びＴＧＦ−ベータなどのトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子Ｉ及びＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン−アルファ、ベータ、及びガンマなどのインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；顆粒球マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；及び顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２；ＩＬ−１５、ＩＬ−２１などのインターロイキン（ＩＬ）、ＴＮＦ−アルファまたはＴＮＦ−ベータなどの腫瘍壊死因子；ならびにＬＩＦ及びｋｉｔリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子が含まれる。本明細書で使用される場合、サイトカインという用語は、天然源由来または組み換え細胞培養由来のタンパク質、及び天然配列サイトカインと生物学的活性が同等である物を含む。
【０３８４】
特定の実施形態において、組成物は、本明細書で開示されるＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で培養され、次のマーカー：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２、ＣＤ１２７、及びＨＬＡ−ＤＲのうちの１つ以上を発現し、ポジティブまたはネガティブ選択技術によって更に単離することができる、本明細書で企図されるＣＡＲ  Ｔ細胞を含む。一実施形態において、組成物は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７及びＣＤ３８、またはＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８からなる群から選択されるマーカーのうちの１つ以上を発現するＴ細胞の特定のサブ集団を含み、ポジティブまたはネガティブ選択技術によって更に単離される。様々な実施形態において、組成物は、次のマーカー：ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、及びＬＡＧ３のうちの１つ以上を発現しないか、または実質的に発現しない。
【０３８５】
一実施形態において、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８からなる群から選択されるマーカーのうちの１つ以上の発現は、ＰＩ３Ｋ阻害剤を用いずに活性化及び拡大されたＴ細胞の集団と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、またはそれ以上増加する。
【０３８６】
一実施形態において、ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、及びＬＡＧ３からなる群から選択されるマーカーのうちの１つ以上の発現は、ＰＩ３Ｋ阻害剤を用いて活性化及び拡大されたＴ細胞の集団と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、またはそれ以上減少する。
【０３８７】
５．１０．治療方法
本明細書で企図される遺伝子改変された免疫エフェクター細胞は、限定するものではないが、免疫制御状態及び血液悪性腫瘍を含むＢ細胞関連状態の治療に使用される養子免疫療法の改善された方法を提供する。
【０３８８】
５．１０．１．具体的な実施形態
一実施形態において、本明細書で提供されるのは、ＢＣＭＡ発現細胞を枯渇させることを、それを必要とする対象において行う方法であって、対象に、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞の治療上有効な量を投与することを含み、免疫細胞は、１５０×１０６細胞〜４５０×１０６細胞の投薬量で投与され、当該投与の前に、当該対象は、プロテアソーム阻害薬、レナリドミド、ポマリドミド、サリドマイド、ボルテゾミブ、デキサメタゾン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、カルフィルゾミブ、イキサゾミブ、シスプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、抗ＣＤ３８抗体（ダラツムマブなど）、パノビノスタット、またはエロツズマブのうちの１つ以上を含む前治療ラインを１つ以上受けたことがある、方法である。
【０３８９】
別の実施形態において、本明細書で提供されるのは、ＢＣＭＡ発現細胞によって引き起こされる疾患を治療することを、それを必要とする対象において行う方法であって、対象に、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞の治療上有効な量を投与することを含み、免疫細胞は、１５０×１０６細胞〜４５０×１０６細胞の投薬量で投与され、当該投与の前に、当該対象は、プロテアソーム阻害薬、レナリドミド、ポマリドミド、サリドマイド、ボルテゾミブ、デキサメタゾン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、カルフィルゾミブ、イキサゾミブ、シスプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、抗ＣＤ３８抗体（ダラツムマブなど）、パノビノスタット、またはエロツズマブのうちの１つ以上を含む前治療ラインを１つ以上受けたことがある、方法である。
【０３９０】
別の実施形態において、本明細書で提供されるのは、ＢＣＭＡを発現するがんを治療することを、それを必要とする対象において行う方法であって、対象に、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞の治療上有効な量を投与することを含み、免疫細胞は、１５０×１０６細胞〜４５０×１０６細胞の投薬量で投与され、当該投与の前に、当該対象は、プロテアソーム阻害薬、レナリドミド、ポマリドミド、サリドマイド、ボルテゾミブ、デキサメタゾン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、カルフィルゾミブ、イキサゾミブ、シスプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、抗ＣＤ３８抗体（ダラツムマブなど）、パノビノスタット、またはエロツズマブのうちの１つ以上を含む前治療ラインを１つ以上受けたことがあり、ＢＣＭＡを発現するがんは、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、または非ホジキンリンパ腫（例えば、バーキットリンパ腫、慢性リンパ性白血病／小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、及びマントル細胞リンパ腫）である、方法である。
【０３９１】
上記の実施形態のいずれかの具体的な実施形態において、当該投与の前に、当該対象は、ダラツムマブ、ポマリドミド、及びデキサメタゾン（ＤＰｄ）；ダラツムマブ、ボルテゾミブ、及びデキサメタゾン（ＤＶｄ）；イキサゾミブ、レナリドミド、及びデキサメタゾン（ＩＲｄ）；ダラツムマブ、レナリドミド及びデキサメタゾン；ボルテゾミブ、レナリドミド及びデキサメタゾン（ＲＶｄ）；ボルテゾミブ、シクロホスファミド及びデキサメタゾン（ＢＣｄ）；ボルテゾミブ、ドキソルビシン及びデキサメタゾン；カルフィルゾミブ、レナリドミド及びデキサメタゾン（ＣＲｄ）；ボルテゾミブ及びデキサメタゾン；ボルテゾミブ、サリドマイド及びデキサメタゾン；レナリドミド及びデキサメタゾン；デキサメタゾン、サリドマイド、シスプラチン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド及びボルテゾミブ（ＶＴＤ−ＰＡＣＥ）；レナリドミド及び低用量デキサメタゾン；ボルテゾミブ、シクロホスファミド及びデキサメタゾン；カルフィルゾミブ及びデキサメタゾン；レナリドミド単独；ボルテゾミブ単独；ダラツムマブ単独；エロツズマブ、レナリドミド、及びデキサメタゾン；エロツズマブ、レナリドミド及びデキサメタゾン；ベンダムスチン、ボルテゾミブ及びデキサメタゾン；ベンダムスチン、レナリドミド、及びデキサメタゾン；ポマリドミド及びデキサメタゾン；ポマリドミド、ボルテゾミブ及びデキサメタゾン；ポマリドミド、カルフィルゾミブ及びデキサメタゾン；ボルテゾミブ及びリポソーム化ドキソルビシン；シクロホスファミド、レナリドミド、及びデキサメタゾン；エロツズマブ、ボルテゾミブ及びデキサメタゾン；イキサゾミブ及びデキサメタゾン；パノビノスタット、ボルテゾミブ及びデキサメタゾン；パノビノスタット及びカルフィルゾミブ；またはポマリドミド、シクロホスファミド及びデキサメタゾンを含む前治療ラインを１つ以上受けたことがある。
【０３９２】
上記のいずれかのより具体的なある特定の実施形態において、当該対象は、当該前治療ラインのうちの２つ以上、当該前治療ラインのうちの３つ以上、当該前治療ラインのうちの４つ以上、当該前治療ラインのうちの５つ以上、当該前治療ラインのうちの６つ以上、または当該前治療ラインのうちの７つ以上を受けたことがある。上記のいずれかのある特定のより具体的な他の実施形態において、当該対象は、当該前治療ラインのうちの３つ以下、当該前治療ラインのうちの２つ以下、または当該前治療ラインのうちの１つ以下を受けたことがある。
【０３９３】
上の実施形態のいずれについても、対象は、当該投与の前にリンパ球除去法を受ける。上の実施形態のいずれについても、対象は、当該免疫細胞、例えば、Ｔ細胞を採取及び単離するために、アフェレーシスを受ける。上記の実施形態のいずれかの具体的な実施形態において、当該対象は、当該アフェレーシスの時点で、以下を示す：Ｍタンパク質（血清タンパク質電気泳動［ｓＰＥＰ］もしくは尿タンパク質電気泳動［ｕＰＥＰ］）：ｓＰＥＰ≧０．５ｇ／ｄＬもしくはｕＰＥＰ≧２００ｍｇ／２４時間；血清中もしくは尿中に測定可能な疾患がなく、血清免疫グロブリン遊離軽鎖≧１０ｍｇ／ｄＬ及び異常な血清免疫グロブリンカッパラムダ遊離軽鎖比である軽鎖多発性骨髄腫；及び／または米国東海岸がん臨床試験グループ（ＥＣＯＧ）パフォーマンスステータス≦１。より具体的な実施形態において、当該対象は、アフェレーシスの時点で、更に、プロテアソーム阻害薬、免疫調節薬（レナリドミドまたはポマリドミド）及び抗ＣＤ３８抗体による前治療を含む、当該前治療ラインのうちの少なくとも３つを受けたことがあり；当該前治療ラインのうちの少なくとも３つのそれぞれについて、進行が治療ラインに対する最良効果でない限り、少なくとも連続２サイクルを受けたことがあり；直近の前治療ラインの６０日目もしくは６０日以内の進行のエビデンスがあり；及び／または当該前治療ラインのうちの少なくとも１つに対する効果（最小奏効以上）が得られている。
【０３９４】
より具体的な別の実施形態において、当該対象は、更に、先に受けた抗骨髄腫治療が１レジメンのみであり；以下のハイリスク因子：Ｒ−ＩＳＳステージＩＩＩ、ならびに（ｉ）対象が導入法と幹細胞移植を受けている場合、最初の移植日から１２ヶ月未満での進行；または（ｉｉ）対象が導入法のみを受けている場合、少なくともプロテアソーム阻害薬、免疫調節薬及びデキサメタゾンを含有していなければならない最後の治療レジメン日から１２ヶ月未満でのＰＤとして定義される早期再発を有する。
【０３９５】
上記の実施形態のいずれかの具体的な実施形態において、当該対象は、当該投与後少なくとも６ヶ月、または当該投与後少なくとも１２ヶ月の無増悪生存期間を示す。
【０３９６】
上記の実施形態のいずれかの具体的な実施形態において、当該キメラ抗原受容体は、ＢＣＭＡを標的とする抗体または抗体断片、例えば、一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）、例えば、ＢＣＭＡ０２  ｓｃＦｖを含む。本明細書の任意の実施形態のより具体的な実施形態において、当該免疫細胞は、ｂｂ２１２１細胞である。
【０３９７】
５．１０．２．一般的な実施形態
特定の実施形態において、一次免疫エフェクター細胞の特異性は、本明細書で企図されるＣＡＲを用いて一次免疫エフェクター細胞を遺伝子改変することによって、Ｂ細胞にリダイレクトされる。様々な実施形態において、ＢＣＭＡポリペプチドに結合するマウス抗ＢＣＭＡ抗原結合ドメイン；ヒンジドメイン；膜貫通（ＴＭ）ドメイン、ＴＭドメインをＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインに連結する短いオリゴペプチドまたはポリペプチドリンカー；ならびに１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；及び一次シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲをコードする特定のポリヌクレオチドを用いて免疫エフェクター細胞を遺伝子改変するには、ウイルスベクターが使用される。
【０３９８】
一実施形態において、本発明は、ＢＣＭＡ発現Ｂ細胞を標的とするＣＡＲを発現するようにＴ細胞が遺伝子改変される種類の細胞療法を含む。別の実施形態において、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＡＲ  Ｔ細胞の治療的性質及び持続性を増加させるために、ＩＬ−２及びＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で培養される。次いで、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、それを必要とするレシピエントに注入される。注入された細胞は、レシピエントの疾患原因Ｂ細胞を殺傷することができる。抗体療法とは異なり、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで複製可能であり、長期間持続することから、持続的ながん療法につながり得る。
【０３９９】
一実施形態において、本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞は、ロバストなｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｔ細胞拡大を経ることができ、長時間持続し得る。別の実施形態において、本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞は、再活性化して任意の更なる腫瘍形成または成長を阻害することができる、特定のメモリーＴ細胞になる。
【０４００】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞を含む組成物は、異常なＢ細胞活性に関連する状態の治療に使用される。
【０４０１】
本明細書で企図されるＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞を使用して治療、予防、または緩和され得る状態の例示的な例としては、全身性エリテマトーデス、リウマチ様関節炎、重症筋無力症、自己免疫溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、抗リン脂質抗体症候群、シャーガス病、グレーヴス病、ウェゲナー肉芽腫症、結節性多発動脈炎、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、多発性硬化症、抗リン脂質抗体症候群、ＡＮＣＡ関連血管炎、グッドパスチャー病、川崎病、及び急速進行性糸球体腎炎が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４０２】
改変された免疫エフェクター細胞は、重鎖病、原発性または免疫細胞関連アミロイドーシス、及び意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）などの形質細胞障害における適用も有し得る。
【０４０３】
本明細書で使用される場合、「Ｂ細胞悪性腫瘍」とは、以下に考察されるＢ細胞（免疫系細胞の１種）において形成されるがんの一種を指す。
【０４０４】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるＣＡＲ改変Ｔ細胞を含む組成物は、例えば、限定するものではないが、多発性骨髄腫（ＭＭ）及び非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）などのＢ細胞悪性腫瘍を含む、血液悪性腫瘍の治療に使用される。
【０４０５】
多発性骨髄腫は、成熟形質細胞形態のＢ細胞悪性腫瘍であり、これらの細胞型の単クローンの腫瘍性形質転換を特徴とする。これらの形質細胞は、骨髄（ＢＭ）中で増殖し、隣接する骨、時には血液に浸潤し得る。非定型多発性骨髄腫には、顕性多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞白血病、非分泌型骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、及び髄外性形質細胞腫が含まれる（例えば、Ｂｒａｕｎｗａｌｄ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  ２００１）参照）。
【０４０６】
多発性骨髄腫の病期は、以下のように決めることができる：
表３：Ｄｕｒｉｅ−ＳａｌｍｏｎによるＭＭ病期診断基準
【表３】
2021530483.tif 000005
表４：国際病期分類によるＭＭ病期診断基準
【表４】
2021530483.tif 000006
【０４０７】
非ホジキンリンパ腫は、リンパ球（白血球）のがんの大きなグループを包含する。非ホジキンリンパ腫は、あらゆる年齢で生じ得、多くの場合、通常よりも大きいリンパ節、発熱、及び体重減少を特徴とする。非ホジキンリンパ腫には、多くの異なる種類がある。例えば、非ホジキンリンパ腫は、アグレッシブ（成長が速い）及びインドレント（成長が遅い）の種類に分けることができる。非ホジキンリンパ腫は、Ｂ細胞及びＴ細胞に由来し得るが、本明細書で使用される場合、「非ホジキンリンパ腫」及び「Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫」という用語は、区別なく用いられる。Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）には、バーキットリンパ腫、慢性リンパ性白血病／小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、及びマントル細胞リンパ腫が含まれる。骨髄移植または幹細胞移植後に生じるリンパ腫は、通常、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫である。
【０４０８】
慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）は、インドレントな（成長が遅い）がんであり、Ｂリンパ球と呼ばれる未成熟な白血球、またはＢ細胞の増加はゆっくり生じる。がん細胞は、血液及び骨髄を介して広がり、リンパ節または肝臓及び脾臓などの他の器官にも影響を与え得る。ＣＬＬは、最終的に、骨髄を機能不全にする。時折、疾患後期において、当該疾患は、小リンパ球性リンパ腫と呼ばれる。
【０４０９】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞またはそれを含む組成物の治療上有効な量を、それを必要とする対象に、単独で、または１つ以上の治療薬と組み合わせて投与することを含む、方法が提供される。ある特定の実施形態において、本発明の細胞は、異常なＢ細胞活性に関連する状態またはＢ細胞悪性腫瘍を発症するリスクのある患者の治療に使用される。したがって、本発明は、異常なＢ細胞活性に関連する状態またはＢ細胞悪性腫瘍を治療または予防するための方法であって、それを必要とする対象に、本明細書で企図されるＣＡＲ改変細胞の治療上有効な量を投与することを含む、方法を提供する。
【０４１０】
本明細書で使用される場合、「個体」及び「対象」という用語は、多くの場合、区別なく用いられ、遺伝子療法ベクター、細胞ベースの治療法、及び本明細書に別途開示される方法で治療することができる疾患、障害または状態の症状を呈する、任意の動物を指す。好ましい実施形態において、対象は、遺伝子療法ベクター、細胞ベースの治療法、及び本明細書に別途開示される方法で治療することができる造血系の疾患、障害または状態、例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍の症状を呈する、任意の動物を含む。好適な対象（例えば、患者）には、実験動物（マウス、ラット、ウサギまたはモルモットなど）、家畜及び飼育動物またはペット（ネコまたはイヌなど）が含まれる。非ヒト霊長類、好ましくは、ヒト患者が含まれる。典型的な対象には、Ｂ細胞悪性腫瘍を有するヒト患者、Ｂ細胞悪性腫瘍と診断されたヒト患者、またはＢ細胞悪性腫瘍を有するリスクのあるヒト患者が含まれる。
【０４１１】
本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、遺伝子療法ベクター、細胞ベースの治療法、及び本明細書に別途開示される方法で治療することができる特定の疾患、障害または状態の診断を受けた対象を指す。
【０４１２】
本明細書で使用される場合、「治療」または「治療すること」は、疾患または病的状態の症状または病態に対する任意の有益なまたは所望の効果を含み、更に、治療される疾患または状態の１つ以上の測定可能なマーカーにおける最小の減少も含み得る。治療は、任意選択により、疾患もしくは状態の症状の低減もしくは緩和、または疾患もしくは状態の進行の遅延のいずれかを伴い得る。「治療」は、必ずしも、疾患もしくは状態、またはその関連症状の完全な根絶または治癒を示すものではない。
【０４１３】
本明細書で使用される場合、「予防する」、及び「予防される」、「予防すること」などの類似の用語は、疾患または状態の発生または再発を予防すること、阻害すること、またはその可能性を低下させるためのアプローチを示す。また、疾患もしくは状態の開始もしくは再発を遅延させること、または疾患もしくは状態の症状の発生もしくは再発を遅延させることも指す。本明細書で使用される場合、「予防」及び類似の用語はまた、疾患または状態の開始または再発前の疾患または状態の強度、影響、症状及び／または負荷を減少させることを含む。
【０４１４】
「向上する」もしくは「促進する」、または「増加する」もしくは「拡大する」とは、一般に、本明細書で企図される組成物、例えば、遺伝子改変されたＴ細胞またはＣＡＲをコードするベクターが、ビヒクルまたはコントロール分子／組成物のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、より大きい生理学的応答（すなわち、下流作用）を発生、惹起、または引き起こす能力を指す。測定可能な生理学的応答は、とりわけ、当該技術分野における理解及び本明細書の説明から明らかなＴ細胞の拡大、活性化、持続性の増加、及び／またはがん細胞殺傷能の増加を含み得る。「増加した」または「向上した」量は、典型的に「統計的に有意な」量であり、ビヒクルまたはコントロール組成物によってもたらされる応答の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０倍、またはそれ以上（例えば、５００、１０００倍）（それらの間及び１を超える全ての整数及び小数点、例えば、１．５、１．６、１．７．１．８などを含む）である増加を含み得る。
【０４１５】
「減少する」もしくは「低下する」、または「弱める」、または「低減する」、または「軽減する」とは、一般に、本明細書で企図される組成物が、ビヒクルまたはコントロール分子／組成物のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、より小さい生理学的応答（すなわち、下流作用）を発生、惹起、または引き起こす能力を指す。「減少した」または「低減した」量は、典型的に「統計的に有意な」量であり、ビヒクル、コントロール組成物によってもたらされる応答（参照応答）、または特定の細胞系列における応答の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０倍、またはそれ以上（例えば、５００、１０００倍）（それらの間及び１を超える全ての整数及び小数点、例えば、１．５、１．６、１．７．１．８などを含む）である減少を含み得る。
【０４１６】
「維持する」、または「保存する」、または「維持」、または「変化なし」、または「実質的変化なし」、または「実質的な減少なし」とは、一般に、本明細書で企図される組成物が、ビヒクル、コントロール分子／組成物のいずれかによって引き起こされる応答、または特定の細胞系列における応答と比較した場合、細胞において実質的に類似の生理学的応答（すなわち、下流作用）を発生、惹起、または引き起こす能力を指す。同等の応答は、参照応答と大幅に異ならないか、または測定可能な差がないものである。
【０４１７】
一実施形態において、Ｂ細胞関連状態を治療することを、それを必要とする対象において行う方法は、本明細書で企図される遺伝子改変された免疫エフェクター細胞を含む組成物の有効量、例えば、治療上有効な量を投与することを含む。適切な投薬量は臨床試験によって決定され得るが、投与の量及び頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患の種類及び重症度などの因子によって決定される。
【０４１８】
一実施形態において、対象に投与される組成物中のＴ細胞の量は、少なくとも０．１×１０５細胞、少なくとも０．５×１０５細胞、少なくとも１×１０５細胞、少なくとも５×１０５細胞、少なくとも１×１０６細胞、少なくとも０．５×１０７細胞、少なくとも１×１０７細胞、少なくとも０．５×１０８細胞、少なくとも１×１０８細胞、少なくとも０．５×１０９細胞、少なくとも１×１０９細胞、少なくとも２×１０９細胞、少なくとも３×１０９細胞、少なくとも４×１０９細胞、少なくとも５×１０９細胞、または少なくとも１×１０１０細胞である。特定の実施形態において、約１×１０７  ＣＡＲ  Ｔ細胞〜約１×１０９  ＣＡＲ  Ｔ細胞、約２×１０７  ＣＡＲ  Ｔ細胞〜約０．９×１０９  ＣＡＲ  Ｔ細胞、約３×１０７  ＣＡＲ  Ｔ細胞〜約０．８×１０９  ＣＡＲ  Ｔ細胞、約４×１０７  ＣＡＲ  Ｔ細胞〜約０．７×１０９  ＣＡＲ  Ｔ細胞、約５×１０７  ＣＡＲ  Ｔ細胞〜約０．６×１０９  ＣＡＲ  Ｔ細胞、または約５×１０７  ＣＡＲ  Ｔ細胞〜約０．５×１０９  ＣＡＲ  Ｔ細胞が対象に投与される。
【０４１９】
一実施形態において、対象に投与される組成物中のＴ細胞の量は、少なくとも０．１×１０４細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．５×１０４細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０４細胞／ｋｇ体重、少なくとも５×１０４細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０５細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．５×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．５×１０７細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０７細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．５×１０８細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０８細胞／ｋｇ体重、少なくとも２×１０８細胞／ｋｇ体重、少なくとも３×１０８細胞／ｋｇ体重、少なくとも４×１０８細胞／ｋｇ体重、少なくとも５×１０８細胞／ｋｇ体重、または少なくとも１×１０９細胞／ｋｇ体重である。特定の実施形態において、約１×１０６  ＣＡＲ  Ｔ細胞／ｋｇ体重〜約１×１０８  ＣＡＲ  Ｔ細胞／ｋｇ体重、約２×１０６  ＣＡＲ  Ｔ細胞／ｋｇ体重〜約０．９×１０８  ＣＡＲ  Ｔ細胞／ｋｇ体重、約３×１０６  ＣＡＲ  Ｔ細胞／ｋｇ体重〜約０．８×１０８  ＣＡＲ  Ｔ細胞／ｋｇ体重、約４×１０６  ＣＡＲ  Ｔ細胞／ｋｇ体重〜約０．７×１０８  ＣＡＲ  Ｔ細胞／ｋｇ体重、約５×１０６  ＣＡＲ  Ｔ細胞／ｋｇ体重〜約０．６×１０８  ＣＡＲ  Ｔ細胞／ｋｇ体重、または約５×１０６  ＣＡＲ  Ｔ細胞／ｋｇ体重〜約０．５×１０８  ＣＡＲ  Ｔ細胞／ｋｇ体重が対象に投与される。
【０４２０】
当業者であれば、所望の治療法を達成するには、本発明の組成物の複数回投与が必要であり得ることを認識するだろう。例えば、組成物は、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１年、２年、５年、１０年、またはそれ以上のスパンにわたって、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回以上投与され得る。
【０４２１】
ある特定の実施形態において、活性化された免疫エフェクター細胞を対象に投与し、その後続いて再採血し（またはアフェレーシスを行う）、そこから得られた免疫エフェクター細胞を本発明に従って活性化し、それらの活性化及び拡大された免疫エフェクター細胞を患者に再注入することが望ましい場合がある。このプロセスは、数週間ごとに複数回実施され得る。ある特定の実施形態において、免疫エフェクター細胞は、１０ｃｃ〜４００ｃｃの採血から活性化され得る。ある特定の実施形態において、免疫エフェクター細胞は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、１００ｃｃ、１５０ｃｃ、２００ｃｃ、２５０ｃｃ、３００ｃｃ、３５０ｃｃ、または４００ｃｃ以上の採血から活性化される。理論に束縛されるものではないが、この複数回の採血／複数回の再注入のプロトコルを使用すると、免疫エフェクター細胞のある特定の集団を選び出すのに役立ち得る。
【０４２２】
本明細書で企図される組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、経口摂取、輸液、移入または移植を含む、任意の簡便な様式で実施され得る。好ましい実施形態において、組成物は、非経口投与される。「非経口投与」及び「非経口的に投与される」という文言は、本明細書で使用される場合、経腸投与及び局所投与以外の、通常は注射による投与形態を指し、限定するものではないが、血管内、静脈内、筋肉内、動脈内、脊髄内、嚢内、眼窩内、腫瘍内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内及び胸骨内の注射及び注入を含む。一実施形態において、本明細書で企図される組成物は、腫瘍、リンパ節、または感染部位に直接注射によって対象に投与される。
【０４２３】
一実施形態において、それを必要とする対象は、対象におけるＢ細胞関連状態に対する細胞免疫応答を増加させるために、有効量の組成物が投与される。免疫応答は、感染細胞を殺傷することが可能な細胞傷害性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、及びヘルパーＴ細胞応答によって媒介される細胞性免疫応答を含み得る。Ｂ細胞を活性化することにより抗体産生をもたらすことが可能なヘルパーＴ細胞によって主に媒介される体液性免疫反応もまた誘導され得る。本発明の組成物によって誘発された免疫応答の種類を分析するには、様々な技術が使用され得、当該技術分野、例えば、Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ、Ａｄａ  Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｄａｖｉｄ  Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅｔｈａｎ  Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ、Ｗａｒｒｅｎ  Ｓｔｒｏｂｅｒによって編集されたＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００１）（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ）に十分記載されている。
【０４２４】
Ｔ細胞媒介性殺傷の場合、ＣＡＲのリガンド結合は、Ｔ細胞へのＣＡＲシグナル伝達を開始し、Ｔ細胞が様々な機序によって標的細胞のアポトーシスを誘導することが可能なタンパク質を産生または放出するように誘導する、様々なＴ細胞シグナル伝達経路の活性化をもたらす。これらのＴ細胞媒介機序は、（限定するものではないが）細胞内細胞傷害性顆粒のＴ細胞から標的細胞への移動、標的細胞殺傷を直接的に（または他の殺傷エフェクター細胞の動員を介して間接的に）誘導することができる炎症促進性サイトカインのＴ細胞分泌、及び標的細胞上の同種の死受容体（例えば、Ｆａｓ）に結合した後に標的細胞のアポトーシスを誘導するＴ細胞表面上の死受容体リガンド（例えば、ＦａｓＬ）の上方制御を含む。
【０４２５】
一実施形態において、本発明は、Ｂ細胞関連状態と診断された対象を治療する方法であって、ＢＣＭＡ発現Ｂ細胞関連状態と診断された対象から免疫エフェクター細胞を取り出すことと、本明細書で企図されるＣＡＲをコードする核酸を含むベクターを用いて当該免疫エフェクター細胞を遺伝子操作し、それにより、改変された免疫エフェクター細胞の集団を産生することと、改変された免疫エフェクター細胞の集団を同じ対象に投与することとを含む、方法を提供する。好ましい実施形態において、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞を含む。
【０４２６】
ある特定の実施形態において、本発明はまた、対象における標的細胞集団に対する免疫エフェクター細胞媒介性免疫調節因子応答を刺激するための方法であって、ＣＡＲ分子をコードする核酸コンストラクトを発現する免疫エフェクター細胞集団を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。
【０４２７】
本明細書に記載される細胞組成物を投与するための方法は、対象において本発明のＣＡＲを直接発現するか、または対象へ導入されたときにＣＡＲを発現する成熟免疫エフェクター細胞に分化する免疫エフェクター細胞の遺伝子改変された前駆体の再導入時に発現するかのいずれかである、ｅｘ  ｖｉｖｏで遺伝子改変された免疫エフェクター細胞の再導入をもたらすのに有効な任意の方法を含む。方法の１つは、本発明による核酸コンストラクトをｅｘ  ｖｉｖｏで末梢血Ｔ細胞に形質導入すること、形質導入された細胞を対象内に戻すことを含む。
【０４２８】
本明細書に引用される全ての公開物、特許出願、及び発行特許は、その個々の公開物、特許出願、または発行特許が参照により援用されることが具体的かつ個別に示される場合と同様に、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０４２９】
理解を明確にするために、上記の発明について、例示及び例によりある程度詳細に説明してきたが、本発明の教示に照らして、添付する特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく、本発明にある特定の変更及び改変がなされ得ることは、当業者には容易に明らかであろう。以下の実施例は、例示としてのみ提供するものであり、限定するためではない。当業者であれば、本質的に類似の結果をもたらすように変更または改変され得る非致命的な様々なパラメーターを認識するだろう。
【実施例】
【０４３０】
６．１．実施例１：ＢＣＭＡ  ＣＡＲの構築
マウス抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ抗体を含有するＣＡＲは、抗ＢＭＣＡ  ｓｃＦｖに作動可能に連結されたＭＮＤプロモーター、ＣＤ８α由来のヒンジ及び膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ１３７共刺激ドメイン、続いてＣＤ３ζ鎖の細胞内シグナル伝達ドメインを含有するように設計した。例えば、図１を参照されたい。図１に示されるＢＣＭＡ  ＣＡＲは、免疫エフェクター細胞上での表面発現のためのＣＤ８αシグナルペプチド（ＳＰ）配列を含む。例示的なＢＣＭＡ  ＣＡＲのポリヌクレオチド配列は、配列番号１０に記載され（抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲのポリヌクレオチド配列）、ＢＣＭＡ  ＣＡＲの例示的なポリペプチド配列は、配列番号９に記載され（抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲのポリペプチド配列）、例示的なＣＡＲコンストラクトのベクターマップは、図１に示される。表５は、ＢＣＭＡ  ＣＡＲレンチウイルスベクターの様々なヌクレオチドセグメントの識別情報、Ｇｅｎｂａｎｋ参照、供給源名及び引用文献を示す。
表５．
【表５】
2021530483.tif 000007
2021530483.tif 000008
2021530483.tif 000009
2021530483.tif 000010
【０４３１】
６．２．実施例２：マウスＢＣＭＡ  ＣＡＲの評価
６．２．１．序文
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む遺伝子操作されたＴ細胞の養子移入は、がん治療の有望なアプローチとして浮上している。ＣＡＲは、膜貫通領域を介してＴ細胞シグナル伝達ドメインに融合された抗原反応性一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）からなる人工分子である。この実施例において、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的なＣＡＲ分子が評価された。ＢＣＭＡは、多発性骨髄腫、形質細胞腫、及びいくつかのリンパ腫において発現されるが、正常な発現は、形質細胞に限られる（Ａｖｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｃａｒｐｅｎｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｃｈｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【０４３２】
抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲは、マウス抗ＢＣＭＡ抗体（Ｃ１１Ｄ５．３）に由来する配列を使用して構築された。抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲは、改変配列を使用して構築されたものであり、抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲの「ヒト化」型である。一連のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞及び抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞はいずれも腫瘍特異性、高ＣＡＲ発現を示し、抗原発現標的に対して強力な反応性をもたらした。抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞及び抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＢＣＭＡ発現腫瘍細胞株に対して同等の反応性を有することが示された。抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞及び抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞はいずれもマウス腫瘍モデルにおいて退縮をもたらすことが可能であったが、抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、抗原非依存性炎症サイトカイン分泌を示したことから、高サイトカインレベルに関連する臨床毒性を引き起こす可能性がある。
【０４３３】
６．２．２．結果
６．２．２．１．抗ＢＣＭＡ１０  Ｔ細胞からの持続的な炎症性サイトカインの放出は、アポトーシスに関連した。
ＢＣＭＡタンパク質は、多発性骨髄腫の患者の血清中で検出される（Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。多発性骨髄腫患者の平均血清ＢＣＭＡは、１０ｎｇ／ｍＬであるが、ピークレベルは最大１００ｎｇ／ｍＬであった。抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞候補に対する生理学的に可溶性なＢＣＭＡのレベルの影響を評価した。
【０４３４】
抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞、抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞及びＣＡＲ１９Δ  Ｔ細胞からのＩＦＮγ放出を、可溶性ＢＣＭＡとの２４時間の培養後、試験した（図２Ａ）。抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の応答は、ＢＣＭＡとの２４時間の培養後、最大１ｕｇ／ｍＬまで、最小のサイトカイン放出であった。対照的に、抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞の応答は、培地に加えられた可溶性ＢＣＭＡの濃度に比例してＩＦＮγレベルが増加した。多発性骨髄腫患者で報告された最大レベルである１００ｎｇ／ｍＬのＢＣＭＡで、抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞によって分泌された２８．８ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγと比較して、８２．１ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγを分泌した。ＩＦＮγは、抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞＋ＢＣＭＡ抗原を欠く対照細胞株を用いたいくつかの共培養実験でも検出された（図２Ｂ、Ｋ５６２共培養）。これらのデータは、抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞が可溶性ＢＣＭＡによる刺激に対して増加した感受性を有し、Ｔ細胞において抗原非依存性サイトカイン応答を生じる可能性があることを示唆した。
【０４３５】
抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞、抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞（培養開始から１０日）、及びＣＡＲ１９Δ  Ｔ細胞からの持続的サイトカイン分泌の可能性を試験した。ＣＡＲ  Ｔ細胞の製造後、抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞、抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞、及びＣＡＲ１９Δ  Ｔ細胞の培養物からの成長培地を炎症性サイトカインの存在について分析した。抗原刺激がない状態にもかかわらず、抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞培養物は、抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞培養物における１ｎｇ／ｍＬ未満のＩＦＮγと比較して、１０ｎｇ／ｍＬを超えるＩＦＮγを含有した（図３）。抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞培養物はまた、有意に（ｐ＜０．００１）多いＴＮＦαを含有した。抗原刺激なしで抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞によって産生されるサイトカインの量を更に定量するために、２４時間の培養中、５×１０４  ＣＡＲ  Ｔ細胞からのサイトカイン放出を測定した。抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、有意に高い量の炎症性サイトカインＭＩＰ１α、ＩＦＮγ、ＧＭＣＳＦ、ＭＩＰ１β、ＩＬ−８、及びＴＮＦαを産生した（図４、ｐ＜０．０００１）。試験したサイトカイン全てのうち、ＭＩＰ１α及びＩＦＮγの濃度が最も高かった。抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、４．７ｎｇ  ＭＩＰ１α／５×１０４細胞／２４時間、３．０ｎｇ  ＩＦＮγ／５×１０４細胞／２４時間、及び他のサイトカインでは約１ｎｇ／５×１０４細胞／２４時間以下を産生した。抗炎症性サイトカインＩＬ−１０、ＩＬ−２、及びＩＬ−４において有意差は検出されなかった。
【０４３６】
抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞の製造終了時でのＴ細胞活性化の表現型マーカーの発現を測定して、持続的な炎症性サイトカインの分泌が抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞の過活動状態を示すかどうかを試験した。ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ２５は、通常、Ｔ細胞の活性化から１２〜２４時間後にピーク発現を示し、次いで経時的に減少する表面マーカーである。３人の正常ドナーから調製されたＣＡＲ  Ｔ細胞は、平均４０±２％の抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞がＨＬＡ−ＤＲを発現することを示した。これらの細胞におけるＨＬＡ−ＤＲの発現は、形質導入していない（４３±２．３％）Ｔ細胞及びＣＡＲ１９Δ（３２±２．２％）対照Ｔ細胞と同等であった。対照的に、８８±１．２％の抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞がＨＬＡ−ＤＲを発現した（図５）。別の活性化マーカーであるＣＤ２５の発現もまた、抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞のほうが抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して高かった（５３±０．９％対３５±２．４％）。したがって、抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、追加抗原の不在下で、活性化Ｔ細胞の表現型の特徴を示した。
【０４３７】
Ｔ細胞の過活性は、多くの場合、アポトーシスによる活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）に関連する。活性化されたカスパーゼ−３のレベルを測定して、抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞の過活性が、抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較してより高いアポトーシスレベルをもたらすことができるかどうかを調べた。２人のドナーに由来する抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞の４８％が、抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の１６％と比較して、活性型カスパーゼ−３を有した（図６）。したがって、追加ＢＣＭＡ抗原の不在下で、抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、活性化及び炎症性サイトカインの分泌の増加に伴って、アポトーシス細胞の頻度が高くなっている。
【０４３８】
抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞及び抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＣＡＲ  Ｔ細胞が低ＢＣＭＡレベルに選択的に応答し得るかどうか、またはＴ細胞成長に使用されるヒト血清中の無関係抗原に交差反応し得るかどうかについて評価した。Ｔ抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞及び抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ヒト血清を含まない培地中に２日間維持し、次いで、１００ｎｇ／ｍＬの可溶性ＢＣＭＡの存在下または不在下で、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ヒト血清（ＨＡＢＳ）、またはＨＡＢＳを含有する培地に交換した（図７）。ＩＦＮγ放出は、ＥＬＩＳＡによって２４時間後にアッセイした。抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞及び抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞はいずれも可溶性ＢＣＭＡに応答した。しかしながら、抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞よりも１０倍多いＩＦＮγを分泌した。ＢＣＭＡの不在下では、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ｐ＝０．０００２）またはヒトＡＢ血清（ＨＡＢＳ）（ｐ＝０．０００７）での培養に関係なく、抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞のみがＩＦＮγを放出した。これらのデータは、炎症性サイトカインの分泌が抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞に固有であることを示唆した。
【０４３９】
６．２．２．２．多発性骨髄腫マウスモデルにおける抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞の低い抗腫瘍作用
過活性化及びアポトーシスの増加は、患者におけるＣＡＲ  Ｔ細胞の持続性及び最終的な臨床有効性に悪影響を与え得る。抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞及び抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞の抗腫瘍作用をマウス腫瘍モデルで試験した。実験的な皮下ヒト多発性骨髄腫（ＲＰＭＩ−８２２６）の腫瘍約１００ｍｍ３を有するＮＯＤ−ｓｃｉｄガンマ（ＮＳＧ）マウスを、１０７  抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞、１０７  抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞、またはボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標））で処置した。ＲＰＭＩ−８２２６の成長を測径器でモニターした。２つの独立した実験（図８Ａ及び８Ｂ）において、ボルテゾミブは、ビヒクル対照動物と比較して、腫瘍成長を制御した。抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞を養子移入した動物は、迅速かつ長期間の腫瘍クリアランスを示した（挿入したグラフは初期の腫瘍退縮を拡大して示すものである）。抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞の養子移入もまた腫瘍退縮を生じたが、抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、いずれの実験も遅れたものであった。
【０４４０】
６．２．３．結論
抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞及び抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて同等の抗腫瘍作用を示したが、抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、患者の治療における安全性及び有効性に悪影響を与え得る特徴を有した。抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、生理学的レベルのＢＣＭＡタンパク質に曝露されると、炎症性サイトカインの分泌を伴ってロバストに応答した。サイトカインストームまたはサイトカイン放出症候群は、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法に関連する既知の臨床毒性である。ＢＣＭＡに対するサイトカイン放出の問題は、抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞の持続的活性の観察後に悪化した。抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、抗原刺激がない状態であっても、高レベルの炎症性サイトカインを放出した。継続的なサイトカイン分泌は、抗腫瘍作用に悪影響を与えるだけでなく、実質的な臨床毒性をもたらす可能性がある。実際、発明者らは、多発性骨髄腫マウスモデルにおいて、抗ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞培養物と比較して、アポトーシス細胞の組成が高く、抗腫瘍作用が劣ることを見出した。
参照
Ａｖｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）．ＢＡＦＦ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａｂｌａｓｔｓ
ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｍｏｒｙ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，１１２（２），２８６−２９７．
Ｃａｒｐｅｎｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）．Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ，ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ  ｗｉｔｈ
ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＣＤ２８  ａｎｄ  ＣＤＩ  ３７  ｄｏｍａｉｎｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳ  Ａ，１０６（９），３３６０−３３６５．
Ｃｈｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）．Ｈｏｄｇｋｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ＴＡＣ！  ａｎｄ  ＢＣＭＡ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ
ａｎｄ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ＢＡＦＦ  ａｎｄ  ＡＰＲＩＬ．Ｂｌｏｏｄ，
１０９（２），７２９−７３９．
Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｓｅｒｕｍ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｓ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ
ｍｙｅｌｏｍａ  ａｎｄ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ，１５８（６），７２７−７３８．
【０４４１】
６．３．実施例３：リンパ腫における最小ＢＣＭＡ発現は、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を活性化する
ＢＣＭＡの発現が抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞を活性化するのに十分であるかどうかを決定するために、リンパ腫細胞株及び白血病細胞株（Ｄａｕｄｉ及びＲａｊｉ）上のＢＣＭＡ発現のレベルを測定した。
【０４４２】
リンパ腫細胞、白血病細胞、及び多発性骨髄腫細胞上のＢＣＭＡ発現をフローサイトメトリーを使用して定量した。このアッセイにおいて、ＢＣＭＡ発現の蛍光強度を既知数の結合抗体（抗体結合能、ＡＢＣ）と相関させることによって、細胞上の相対ＢＣＭＡ発現を評価した。リンパ腫細胞株におけるＢＣＭＡ発現レベルを、抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞を活性化することが分かっている多発性骨髄腫細胞株（ＲＰＭＩ−８２２６）のＢＣＭＡ発現レベルと比較した。１２５９０±１２７５のＢＣＭＡ０２分子がＲＰＭＩ−８２２６細胞の表面上に発現していた。対照的に、Ｄａｕｄｉ細胞は、１１７３±２３４のＢＣＭＡ０２分子を発現し、ＪｅＫｏ−１細胞（マントル細胞リンパ腫細胞株）は、２２２±１３８のみのＢＣＭＡ０２分子を発現していた（図９、丸）。
【０４４３】
別の一連の実験において、リンパ腫細胞株及び白血病細胞株において観察された微小レベルのＢＣＭＡに対する抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性を試験した（図９、四角）。抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞を標準的な方法を使用して作製し、ＢＣＭＡポジティブ腫瘍細胞株及びＢＣＭＡネガティブ腫瘍細胞株との共培養後の活性をＩＦＮγ  ＥＬＩＳＡによって評価した。抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の反応性は、ＢＣＭＡ  ｍＲＮＡ発現の相対量（閾値より上）及び／または共培養後の様々な腫瘍細胞株上のＢＣＭＡ受容体の密度と相関した（図９）。ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞をＢＣＭＡネガティブ（ＢＣＭＡ−）腫瘍細胞株：骨髄性白血病（Ｋ５６２）、急性リンパ芽球性白血病（ＮＡＬＭ−６及びＮＡＬＭ−１６）；マントル細胞リンパ腫（ＲＥＣ−１）；またはホジキンリンパ腫（ＨＤＬＭ−２）と共培養すると、あるとしてもわずかだがＩＦＮγが放出される。対照的に、ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞をＢＣＭＡポジティブ（ＢＣＭＡ＋）腫瘍細胞株：Ｂ細胞慢性リンパ芽球性白血病（ＭＥＣ−１）、マントル細胞リンパ腫（ＪｅＫｏ−１）、ホジキンリンパ腫（ＲＰＭＩ−６６６６）、バーキットリンパ腫（Ｄａｕｄｉ細胞及びＲａｍｏｓ細胞）、及び多発性骨髄腫（ＲＰＭＩ−８２２６）と共培養すると、相当量のＩＦＮγが放出された。
【０４４４】
ＢＣＭＡ発現バーキットリンパ腫細胞（Ｄａｕｄｉ細胞）に対する抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の反応性について、ｉｎ  ｖｉｖｏ動物試験にまで拡張した。Ｄａｕｄｉ細胞はＣＤ１９も発現する。抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ活性を抗ＣＤ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ活性と比較した。ＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマ（ＮＳＧ）マウスに２×１０６  Ｄａｕｄｉ細胞をＩＶ注射し、大きな全身性腫瘍組織量を蓄積させてから、ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置した。ＣＡＲ  Ｔ細胞を腫瘍誘発後８日目及び１８日目に投与した（それぞれ図１０Ａ及び１０Ｂ）。ビヒクル及び陰性対照（抗ＣＤ１９Δ  ＣＡＲ  Ｔ細胞）は、生物発光の対数期増加によって示されるように、腫瘍成長を阻止することができず、体重減少及び死亡という結果になった（図１０Ａ、一番左側の２つのマウスパネル）。抗ＣＤ１９及び抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、腫瘍成長を阻止し、体重及び生存を維持する結果となった。抗ＣＤ１９及び抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、８日目に投与した場合、等しく効果的であった（図１０Ａ、一番右側の２つのマウスパネル）。抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞はまた、腫瘍誘発から１８日後に投与した場合、腫瘍組織量の減少にも効果的であった。図１０Ｂ、一番右のパネル。
【０４４５】
６．４．実施例４：抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の強力なｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性
抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の強力なｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性は、５０パーセント減少させた抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ発現で達成された。Ｔ細胞集団に、抗ＢＣＭ０２Ａ  ＣＡＲ分子をコードするレンチウイルスを４×１０８〜５×１０７形質導入単位で形質導入した。得られたＴ細胞集団は、抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞存在比率の減少（陽性率でアッセイ）及び抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ分子の発現の減少（平均蛍光強度：ＭＦＩでアッセイ）を示した。
【０４４６】
ＣＡＲ分子発現の減少が抗ＢＣＭＡ０２活性に与える影響を決定した。抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲポジティブＴ細胞の存在比率は、２６±４％のＢＣＭＡ反応性Ｔ細胞を含むように、形質導入していないＴ細胞で正規化した（図１１Ａ）。正規化した抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞のＭＦＩは、８８５〜１８７５の範囲であった（図１１Ｂ）。Ｋ５６２は、ＢＣＭＡ発現を欠くＣＭＬ細胞株である。Ｋ５６２細胞をＢＣＭＡを発現するように操作し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞溶解アッセイに使用して、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ発現が異なる抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性を評価した（図１１Ｃ）。Ｋ５６２細胞は、細胞トレースバイオレットで標識し、ＢＣＭＡを安定的に発現するＫ５６２細胞（Ｋ５６２−ＢＣＭＡ）は、ＣＦＳＥで標識した。Ｔ細胞、Ｋ５６２細胞、及びＫ５６２−ＢＣＭＡ細胞を回収し、洗浄し、外因性サイトカインを含まない培地中に再懸濁した。細胞を、２０：１または１０：１のエフェクター（Ｅ；Ｔ細胞）対標的（Ｔ；Ｋ５６２とＫ５６２  ＢＣＭＡ細胞の１：１混合物）比で、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中、４時間培養した。次いで、細胞を生／死で染色し、ＦＡＣＳによって解析した。細胞傷害性は、Ｔ細胞を含まない条件に対して正規化したＫ５６２：Ｋ５６２−ＢＣＭＡ細胞の比率の差によって決定した。
【０４４７】
６．５．実施例５：抗ＢＣＭＡＣＡＲ  Ｔ細胞の製造プロセス
固有の抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞産物がそれぞれの患者の治療に合わせて製造される。抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞産物の製造プロセスの信頼度を、１１の個々の正常ドナーＰＢＭＣから抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞を作製することによって評価した。各ドナーに由来する抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の拡大は、並行して実施された形質導入していない対応培養物と同等であった（図１２Ａ）。
【０４４８】
培養期間の終了時（１０日目）に、Ｔ細胞の形質導入効率を、ｑＰＣＲ及びレンチウイルス特異的プライマーセットを使用して、組み込まれたレンチウイルス数を定量することによって評価した（ベクターコピー数、ＶＣＮ）。１１のドナーに由来する抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞培養物は、同等のレンチウイルス形質導入効率を示した（図１２Ｂ）。抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲポジティブＴ細胞の存在率をフローサイトメトリーによって測定したところ、ＢＣＭＡ発現は、全てのドナーで同等であることが分かった（図１２Ｃ）。
【０４４９】
各抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞産物の活性を、ＢＣＭＡを発現するように操作したＫ５６２細胞との共培養後のＩＦＮγ放出によって評価した。全ての抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ０２  Ｔ細胞産物は、ＢＣＭＡ発現Ｋ５６２細胞に曝露された場合、治療上関係のあるレベルのＩＦＮγ放出を示した（図１２Ｄ）。
【０４５０】
６．６．実施例６：ＩＬ−２またはＩＬ−２及びＺＳＴＫ４７４で処理したＣＡＲ  Ｔ細胞上のＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８の発現
ＩＬ−２及びＺＳＴＫ４７４とともに培養されたＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＩＬ−２のみで培養されたＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、ＣＤ６２Ｌの発現の増加を示す。ＩＬ−２及びＺＳＴＫ４７４とともに培養した抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞上の２９の追加細胞表面マーカーの発現解析を、マルチパラメーターマスサイトメトリー（ＣｙＴＯＦ）を使用して実施し、ＩＬ−２のみで培養したＣＡＲ  Ｔ細胞と比較した。３つの追加のマーカー（ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８）は、ＩＬ−２のみで処理したＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、ＩＬ−２＋ＺＳＴＫ４７４で処理したＣＡＲ  Ｔ細胞において発現の増加を示した。したがって、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８の共発現は、ＺＳＴＫ４７４培養ＣＡＲ  Ｔ細胞を更に層化した。ＩＬ−２を含有する培地で培養した後に、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７及びＣＤ３８を共発現した抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔは、ＩＬ−２及びＺＳＴＫ４７４とともに培養した抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の２４．５％と比較して、７．４４％であった。図１３のベン図は、ＣＤ６２Ｌポジティブ抗ＢＣＭＡ０２Ｔ細胞におけるＣＤ１２７、ＣＤ１９７及びＣＤ３８の共発現を図示するものである。
【０４５１】
６．７．実施例７：ＺＳＴＫ４７４処理はＣＤ８  Ｔ細胞の存在率を増加させる
ＩＬ−２のみまたはＩＬ−２及びＺＳＴＫ４７４で処理した抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＣＤ８発現を定量した。ＣＤ８の発現は、蛍光標識された抗ＣＤ８抗体及びフローサイトメトリーを使用して決定した。ＩＬ−２及びＺＳＴＫ４７４とともに培養した７つの正常ドナーに由来する抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＩＬ−２のみで培養した抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、大幅に高いＣＤ８発現を有した。図１４。
【０４５２】
６．８．実施例８：ＺＳＴＫ４７４処理した抗ＢＣＭＡＣＡＲ  Ｔ細胞における抗原非依存性活性の欠如
抗原の不在下におけるＣＡＲ  Ｔ細胞の持続的活性は、生物活性の低下と関連している。抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の持続的活性を、ＩＬ−２及びＺＳＴＫ４７４の存在下で培養した後の抗原不在下におけるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の放出を定量し、ＩＬ−２のみの標準培養条件と比較することによって評価した。抗ＢＣＭＡＣＡＲ  Ｔ細胞培養物を、大規模な臨床製造プロセスに直接拡張できるシステムを使用して調製した。簡潔に述べると、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、静置フラスコ中、ＩＬ−２（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）及びＣＤ３及びＣＤ２８に特異的な抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を含有する培地で培養した。培養開始から１日後に、２×１０８形質導入単位の抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲをコードするレンチウイルスを加えた。
【０４５３】
抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＩＬ−２及び最適用量のＺＳＴＫ４７４を含有する新しい培地を加えることによって、合計で１０日の培養日数の間、対数期に維持した。製造の終了時に、同数の抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞を培地のみで２４時間再培養した。２４時間で放出されたＩＦＮ−γの量がＥＬＩＳＡによって定量された。このアッセイにおいて、２００ｐｇ／ｍＬを下回るＩＦＮ−γレベルは、持続的活性を示さない。図１５は、１４のドナーに由来する抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞によって放出されたＩＦＮ−γの量と持続的活性の欠如とが、ＣＡＲ  Ｔ細胞がＺＳＴＫ４７４とともに培養されたか否かにかかわらず一致することを示している。
【０４５４】
６．９．実施例９：ＺＳＴＫ４７４処理した抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、リンパ腫腫瘍モデルにおいて治療活性を示す
Ｄａｕｄｉ腫瘍を使用して、ＩＬ−２またはＩＬ−２及びＺＳＴＫ４７４とともに培養した抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の抗腫瘍活性を調べた。Ｄａｕｄｉ細胞は、低レベルのＢＣＭＡタンパク質を発現し、進行性で、治療するのが困難なリンパ腫腫瘍モデルを提供する。
【０４５５】
２×１０６  Ｄａｕｄｉ腫瘍細胞をホタルルシフェラーゼ遺伝子で標識し、静脈内注射により、ＮＯＤ  ｓｃｉｄ  ＩＬ−２受容体ガンマ鎖ノックアウトマウス（ＮＳＧ）に注射した。腫瘍を形成させた後、１×１０７  ＣＡＲ  Ｔ細胞を腫瘍担持マウスに注射した。マウスに、ｉ）ＩＬ−２もしくはＩＬ−２及びＺＳＴＫ４７４で１０日間処理した抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞；またはｉｉ）ＩＬ−２及びＺＳＴＫ４７４で１０日間処理した短縮型シグナル伝達欠損抗ＢＣＭＡ０２（ｔＢＣＭＡ０２）ＣＡＲ  Ｔ細胞を注射した。Ｘｅｎｏｇｅｎ−ＩＶＩＳイメージングシステムを使用して、生物発光によって、腫瘍成長をモニターした。
【０４５６】
ＩＬ−２及びＺＳＴＫ４７４で処理した抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞を投与したマウスの５０％で完全な腫瘍退縮が観察された。図１６。
【０４５７】
６．１０．実施例１０：ＺＳＴＫ４７４処理したＣＡＲ  Ｔ細胞は、ヒト骨髄腫のマウスモデルにおいて治療活性を示す
動物皮下多発性骨髄腫腫瘍（ＲＰＭＩ−８２２６）１００ｍｍ３を有する動物に、同量のＣＡＲ  Ｔ細胞（１×１０６  抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲポジティブＴ細胞）または対応するＴ細胞ドナーに由来する未改変Ｔ細胞（形質導入されていないＴ細胞）を注入した。抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、実施例８に記載されているように、ＩＬ−２またはＩＬ−２及びＺＳＴＫ４７４で処理した。
【０４５８】
ＩＬ−２またはＩＬ−２及びＺＳＴＫ４７４で培養した抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置された動物は、完全に腫瘍成長を阻止した。図１７。対照的に、形質導入されていない動物またはビヒクルで処置された動物は、腫瘍成長を制御することができなかった。図１７。
【０４５９】
６．１１．実施例１１：再発難治性多発性骨髄腫の被験者及び最初の治療から１年以内に進行したハイリスク多発性骨髄腫の被験者におけるＢＢ２１２１  ＣＡＲ  Ｔ細胞の有効性及び安全性を決めるための第２相マルチコホートオープンラベル多施設試験。
この実施例は、セクション６．１１．１において更に扱われる、ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（上記の抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ）をコードする抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲレンチウイルスベクターが形質導入された細胞を含む自己由来Ｔリンパ球に富む集団である、ｂｂ２１２１の第２相臨床試験について概説するものである。
【０４６０】
この試験は、再発難治性多発性骨髄腫（ＲＲＭＭ）の被験者（コホート１）及び最初の治療から１年以内に進行したハイリスク（ＨＲ）多発性骨髄腫（ＭＭ）（ＨＲＭＭ）の被験者（コホート２）におけるｂｂ２１２１の有効性及び安全性を決めるためのマルチコホートオープンラベル多施設第２相試験である。本試験に参加し、更にコホート１または２に参加する被験者の具体的な組み入れ基準及び除外基準は、セクション６．１１．２にて扱われる。本試験は、およそ１２２名の被験者を登録し、以下に列挙される２つのコホートのうちの１つに無作為に割り付け、およそ１０３名の被験者に対してｂｂ２１２１での治療を行った。登録から注入までの脱落率は、１５％と推定される。
【０４６１】
６．１１．１．Ｂｂ２１２１
Ｂｂ２１２１は、ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（上記の抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ）をコードする抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲレンチウイルスベクターが形質導入された細胞を含む自己由来Ｔリンパ球に富む集団を含む。抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲレンチウイルスベクターを使用して自己由来Ｔ細胞の形質導入を行う。このベクターは、マウス白血病ウイルス由来骨髄増殖性肉腫ウイルス増強プロモーターを使用して、細胞外抗原認識ドメイン（ＶＬ及びＶＨ）、ＣＤ８αヒンジドメイン、膜貫通ドメイン（ＣＤ８  ＴＭ）、ならびに細胞内ＣＤ１３７共刺激（４−１ＢＢ）及びＣＤ３ゼータ鎖シグナル伝達ドメインからなるマルチドメインタンパク質であるキメラ受容体の発現を駆動する。
【０４６２】
６．１１．２．試験集団
本試験の組み入れ基準は、以下を含む：
（１）年齢１８歳以上；
（２）被験者は、以下のように定義される測定可能な疾患を有する：
（ｉ）Ｍタンパク質（血清タンパク質電気泳動［ｓＰＥＰ］もしくは尿タンパク質電気泳動［ｕＰＥＰ］）：ｓＰＥＰ≧０．５ｇ／ｄＬもしくはｕＰＥＰ≧２００ｍｇ／２４時間；及び／または
（ｉｉ）血清中もしくは尿中に測定可能な疾患がない軽鎖ＭＭ：血清免疫グロブリン遊離軽鎖≧１０ｍｇ／ｄＬ及び異常な血清免疫グロブリンカッパラムダ遊離軽鎖比；
（３）米国東海岸がん臨床試験グループ（ＥＣＯＧ）パフォーマンスステータス≦１；ならびに
（４）脱毛症及びグレード２のニューロパチーを除き、前治療に起因するあらゆる非血液学的毒性がグレード１またはベースラインまで回復していること。
更に、特定のコホート内の被験者には、特定のコホート組み入れ基準がある。コホート１のＲＲＭＭ（再発難治性多発性骨髄腫）被験者は、
（ｉ）抗骨髄腫治療を少なくとも３レジメン受けていなければならない（造血幹細胞移植を伴うまたは伴わない及び維持療法を伴うまたは伴わない導入療法は１レジメンとみなす）；
（ｉｉ）各レジメンの治療サイクルは、進行（ＰＤ）が治療ラインに対する最良効果でない限り、少なくとも連続２サイクル受けていなければならない；
（ｉｉｉ）プロテアソーム阻害薬、免疫調節薬及び抗ＣＤ３８抗体による前治療を受けていなければならない；
（ｉｖ）直近の前治療レジメンの６０日目もしくは６０日以内のＰＤのエビデンスがなければならない；及び／または
（ｖ）少なくとも１つの前治療レジメンに対する効果（最小奏効［ＭＲ］以上）が得られていなければならない。
【０４６３】
更に、コホート２のＨＲＭＭ（ハイリスク多発性骨髄腫）被験者は、
（ｉ）先に受けた抗骨髄腫治療が１レジメンのみでなければならない（造血幹細胞移植を伴うまたは伴わない及び維持療法を伴うまたは伴わない包含は１レジメンとみなす）；
（ｉｉ）次のＨＲ因子：改訂版国際病期分類（Ｒ−ＩＳＳ）によってステージＩＩＩとして定義されるＨＲ疾患（Ｒ−ＩＳＳステージＩＩＩ）及び早期再発（移植を受けている被験者の場合、最初の移植日から１２ヶ月未満でのＰＤ；または導入法のみを受けている被験者の場合、少なくともプロテアソーム阻害薬、免疫調節薬及びデキサメタゾンを含有していなければならない最後の治療レジメン日から１２ヶ月未満でのＰＤとして定義される）を有していなければならない。
【０４６４】
除外基準。以下のいずれかに該当する場合、被験者は登録から除外される：
（１）白血球アフェレーシスの２８日以内に任意の試験薬を使用した被験者；
（２）白血球アフェレーシスの過去１４日以内に以下のいずれかを受けた被験者：
（ａ）血漿アフェレーシス；
（ｂ）大手術（試験責任医師による定義）；
（ｃ）骨髄腫関連骨病変に対する局所療法以外の放射線療法；及び
（ｄ）任意の全身性抗骨髄腫薬物療法の使用；
（３）中枢神経系（ＣＮＳ）に骨髄腫の病変が認められる被験者；
（４）肺白血球停滞及び播種性血管内凝固の臨床エビデンスを有する被験者；
（５）てんかん、痙攣発作、不全麻痺、失語症、脳卒中、くも膜下出血またはその他のＣＮＳ出血、重度の脳損傷、認知症、パーキンソン病、小脳疾患、器質性脳症候群、精神病などの臨床的に重大なＣＮＳ病態の既往歴または現病歴。被験者がｂｂ２１２１治療後にグレード４の神経毒症状を認めた場合にのみ、この除外基準がｂｂ２１２１による再治療を行う前に適用される（コホート１）；
（６）形質細胞白血病、ワルデンストレームマクログロブリン血症、ＰＯＥＭＳ症候群（多発性神経障害、臓器巨大症、内分泌障害、モノクローナルタンパク質、及び皮膚変化）、または臨床的に重大なアミロイド症を有するまたは既往歴のある被験者；
（７）非分泌型ＭＭを有する被験者；
（８）以下の検査所見異常のいずれかを有する被験者：
（ａ）絶対好中球数（ＡＮＣ）＜１，０００／μＬ；
（ｂ）輸血（スクリーニング７日以内の血小板輸血）の補助がない場合の血小板数＜５０，０００ｍｍ３；
（ｃ）ヘモグロビン＜８ｇ／ｄＬ（＜４．９ｍｍｏｌ／Ｌ）（このレベルに達するための被験者への輸血は認められない）；
（ｄ）血清クレアチニンクリアランス（ＣｒＣｌ）＜４５ｍＬ／分；
（ｅ）補正血清カルシウム＞１３．５ｍｇ／ｄＬ（＞３．４ｍｍｏｌ／Ｌ）；
（ｆ）血清アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）またはアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）＞２．５×正常値上限（ＵＬＮ）；
（ｇ）血清総ビリルビン＞１．５×ＵＬＮまたはジルベール症候群が記録されている被験者の場合＞３．０ｍｇ／ｄＬ；及び
（ｈ）国際標準比（ＩＮＲ）もしくは部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）＞１．５×ＵＬＮ、または３０日以内にグレード２以上の出血の既往歴、または抗凝固薬（例えば、ワルファリン、低分子量ヘパリン、第Ｘａ因子阻害薬）の長期的な治療的投与を継続する必要がある被験者；
（９）心エコー図（ＥＣＨＯ）またはマルチゲートスキャン（ＭＵＧＡ）による左室駆出率＜４５％；
（１０）クラスＩＩＩまたはＩＶのうっ血性心不全（ＣＨＦ）または重度の非虚血性心筋症、試験治療開始前６ヶ月以内の不安定またはコントロール不良の狭心症、心筋梗塞または心室性不整脈の既往歴のある被験者；
（１１）酸素飽和度（Ｓａ０２）＜９２％室内気として定義される十分な肺機能でないもの；
（１２）長期的な免疫抑制薬（例えば、あらゆる用量のシクロスポリンまたは全身ステロイド）の治療継続。コルチコステロイドの間欠的な局所、吸入、鼻腔内投与は許容される；
（１３）同種造血幹細胞移植またはがんに対する任意の遺伝子療法に基づく治療法もしくはがんの試験的細胞療法もしくはＢＣＭＡ標的療法による治療の前治療歴；
（１４）白血球アフェレーシス前１２週間以内に自己由来幹細胞移植（ＡＳＣＴ）を受けた被験者；
（１５）原発性免疫不全の既往歴のある被験者；
（１６）ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）陽性、慢性もしくは活動性Ｂ型肝炎または活動性Ａ型もしくはＣ型肝炎である被験者；
（１７）適切な抗生物質または他の治療にもかかわらず、制御不能な全身性の真菌、細菌、ウイルスまたは他の感染症（結核を含む）を有する被験者；
（１８）ＭＭ以外の悪性腫瘍の既往歴のある被験者。ただし、以下の非侵襲性悪性腫瘍を例外とし、５年以上罹患していない被験者は除く：
（ａ）皮膚基底細胞癌；
（ｂ）皮膚扁平上皮癌；
（ｃ）子宮頸部上皮内癌；
（ｄ）乳房上皮内癌；及び
（ｅ）前立腺癌の偶発的組織学的所見（ＴＮＭ［腫瘍、リンパ節、転移］臨床的病期分類を使用した場合Ｔ１ａまたはＴ１ｂ）または治癒的な前立腺癌；
（１９）妊娠中、授乳中、もしくは母乳養育中の女性、または本試験参加中に妊娠する意志のある女性の被験者；
（２０）ｂｂ２１２１製品の任意の構成成分：シクロホスファミド、フルダラビン、及び／またはトシリズマブに対して過敏症であることが認められる被験者；
（２１）被験者の試験参加を妨げるような何らかの重大な医学的状態、検査所見の異常、または精神疾患を有する被験者；
（２２）検査所見の異常の存在を含め、試験に参加した場合に被験者が許容できないリスクにさらされると考えられる何らかの状態を有している被験者。これには、全身性の真菌、細菌、ウイルス、または他の感染症であって、コントロール不良（適切な抗菌治療にもかかわらず、感染に伴う徴候／症状が改善なく持続するものとして定義される）、またはＩＶ抗菌薬による管理を要するものが含まれる；ならびに
（２３）試験データの解釈力に混乱をもたらす何らかの状態を有する被験者。
【０４６５】
６．１１．３．試験デザイン
試験は、４つの期間から構成される：
（１）前治療期間（スクリーニング、白血球アフェレーシス及び任意選択のブリッジング療法ならびにベースライン評価）；
（２）治療期間（リンパ球除去（ＬＤ）化学療法（フルダラビン及びシクロホスファミド）及びｂｂ２１２１注入）；
（３）治療後の追跡調査期間（ｂｂ２１２１注入後最低２４ヶ月間、または最後の被験者が最初の注入を受けてから最大５年のＰＤが記録されるまでのいずれか長いほう）；及び
（４）生存の追跡調査。
【０４６６】
前治療期間中、スクリーニングを受けた被験者は、ｂｂ２１２１製品の作製を可能にするために白血球アフェレーシスを受ける。被験者は、試験責任医師の判断により、ブリッジング療法を受ける場合もある。ｂｂ２１２１医薬品が問題なく製造されたら、ブリッジング療法を受けた被験者に対する病期分類評価を含む追加のベースライン評価を実施して、ＬＤ化学療法の開始前に適格性及び安全性の継続性を評価する。
【０４６７】
治療期間は、リンパ球除去化学療法から始まり、続いて、治療１日目にｂｂ２１２１を１５０〜４５０×１０６細胞の用量で注入を行う。
【０４６８】
コホート１．先の抗骨髄腫治療レジメンが３以上であるＲＲＭＭ被験者をおよそ７３名登録して、安全性及び有効性の評価に関するこのコホートでおよそ６２名の被験者がｂｂ２１２１で治療されることを確実にする。コホート１では、プロトコルに定義された特定基準を満たすのであれば、ブリッジング療法の有無にかかわらず、リンパ球除去（ＬＤ）化学療法の第２コースを含む、ｂｂ２１２１の２回目投与による再治療が検討されてもよい。再治療された被験者は、本試験において、２回目の注入後最低６ヶ月間、または最後の被験者が最初の注入を受けてから最大５年のＰＤが記録されるまでのいずれか長い期間、追跡される。被験者は、以下の特定基準を満たすのであれば、ｂｂ２１２１の２回目の注入を受ける資格がある：
・最初のｂｂ２１２１注入から少なくとも８週間が経過している；
・被験者は、単離されたＰＢＭＣまたは元の白血球アフェレーシス材料から製造されたｂｂ２１２１製品の残りがある；
・最初のｂｂ２１２１に対する最良効果が、国際骨髄腫作業部会（ＩＭＷＧ）による多発性骨髄腫の統一効果判定基準に従った効果判定基準に基づいて、安定（ＳＤ）以上であった；
・ＩＭＷＧ基準に従った進行（ＰＤ）のエビデンス；
・先のｂｂ２１２１治療でグレード４のサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）または神経毒症状の既往歴がない；
・登録の適格基準を引き続き満たしている（中枢神経系（ＣＮＳ）に骨髄腫が認められる被験者の除外、がんに対する任意の遺伝子療法に基づく治療法、またはＢＣＭＡ標的療法による治療を受けたことがある被験者の除外、ならびに好中球及び血小板に関する除外基準を除く）；
・リンパ球除去（ＬＤ）化学療法の開始に関する適格基準は、以下を満たす必要がある。
・全脳または指定された脳放射線治療を必要とするＣＮＳ内の骨髄腫進行を有する被験者に対する放射線療法（頭皮または頭蓋病変に対する緩和目的の最小透過の限局性放射線療法を除く）から少なくとも８週間の間隔があり；及び
・被験者は、最初のｂｂ２１２１注入以降、いかなるＭＭ療法も受けていない。
【０４６９】
コホート２．先の抗骨髄腫治療レジメンが１であり、改訂版国際病期分類（Ｒ−ＩＳＳ）によるステージＩＩＩとして定義されるＨＲ疾患及び早期再発を有するＭＭ被験者をおよそ４９名登録して、およそ４１名の被験者がｂｂ２１２１で治療されることを確実にする。早期再発は、移植適格（ＴＥ）被験者に対する最初の自己由来幹細胞移植（ＡＳＣＴ）から１２ヶ月以内の進行（ＰＤ）、及び移植非適格（ＴＮＥ）に対する前治療の１２ヶ月以内のＰＤ（前レジメンは、少なくともプロテアソーム阻害薬、免疫調節薬及びデキサメタゾンを含有していなければならない）として定義する。
【０４７０】
被験者が試験を途中で中止するか、または試験を完了した際には、長期間にわたるｂｂ２１２１関連毒性、ウイルスベクター安全性、生存状態、及びその後の抗骨髄腫療法を別個の長期追跡調査プロトコル下でモニタリングする。
【０４７１】
６．１１．４．評価項目
本試験の主要評価項目は、ＲＲＭＭの被験者及び最初の治療から１年以内に進行したＨＲ  ＭＭの被験者におけるｂｂ２１２１の有効性の評価である。副次的評価項目は、ＲＲＭＭの被験者及び最初の治療から１年以内に進行したＨＲ  ＭＭの被験者におけるｂｂ２１２１の安全性の評価；末梢血及び骨髄におけるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）＋  Ｔ細胞の拡大及び持続性の特性評価（ベクターコピー数［ＶＣＮ］による）；抗ＣＡＲ抗体応答の発現の評価；微小残存腫瘍（ＭＲＤ）陰性状態に達した被験者の割合の評価（ＥｕｒｏＦｌｏｗ及び次世代シーケンシング［ＮＧＳ］による）；ならびに健康関連の生活の質（ＨＲＱｏＬ）の変化の評価を含む。主要及び副次的評価項目は、以下の表に列挙される：
【表６】
2021530483.tif 000011
【０４７２】
コホート１またはコホート２の被験者は、白血球アフェレーシスとｂｂ２１２１の投与の間にブリッジング療法を受けることができる（リンパ球除去化学療法の開始の１４日前または１４日よりも前に投与される場合）。ブリッジング療法は、コルチコステロイド、アルキル化剤、免疫調節薬、プロテアソーム阻害薬、及び／または抗ＣＤ３８抗体を、試験責任医師の判断に基づいて、単剤として、または組み合わせで含み得る。被験者がこれまでに曝露を受けていない実験薬及び骨髄腫療法は、ブリッジング療法として使用するべきではない。
【０４７３】
６．１１．５．治療方法
ＬＤ化学療法：フルダラビン及びシクロホスファミドをそれぞれ毎日割り当てられた３０ｍｇ／ｍ２及び３００ｍｇ／ｍ２の用量で連続３日間（−５日目に開始）、静脈内（ＩＶ）投与し、その後２日の休薬とする。ＬＤ化学療法の完了後、ｂｂ２１２１を１５０〜４５０×１０６ＣＡＲ＋  Ｔ細胞の範囲の用量でＩＶ注入として投与する。
【０４７４】
６．１２．実施例１２：再発難治性多発性骨髄腫（ＲＲＭＭ）の被験者におけるＢＢ２１２１の有効性及び安全性を標準的な３剤併用レジメンと比較するための第３相多施設無作為化オープンラベル試験
本実施例は、ｂｂ２１２１の第３相臨床試験について概説するものである。本試験は、再発難治性多発性骨髄腫（ＲＲＭＭ）の被験者におけるｂｂ２１２１（上記セクション６．１１．１においてより詳しく論じられている、ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（上記の抗ＢＣＭＡ０２  ＣＡＲ）をコードする抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲレンチウイルスベクターが形質導入された細胞を含む自己由来Ｔリンパ球に富む集団である）の有効性及び安全性を標準的な３剤併用レジメンと比較する、第３相無作為化オープンラベル試験である。比較するものとして使用される特定の３剤併用レジメンには、（１）ダラツムマブ（Ｄ）、ポマリドミド（Ｐ）及びデキサメタゾン（ｄ）（まとめてＤＰｄ）；（２）ダラツムマブ、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）；Ｖ）及びデキサメタゾン（まとめてＤＶｄ）；（３）イキサゾミブ（Ｉ）、レナリドミド（ＲＥＶＬＩＭＩＤ（登録商標）；Ｒ）及びデキサメタゾン（まとめてＩＲｄ）が含まれる。
【０４７５】
６．１２．１．試験集団
試験集団は、レナリドミド（ＲＥＶＬＩＭＩＤ（登録商標））またはポマリドミド（ＰＯＭＡＬＹＳＴ（登録商標））及びプロテアソーム阻害薬（ＰＩ）を含む少なくとも２つの前レジメンを受けたことがあり、かつ、最後の療法中またはその後６０日以内に記録された増悪を有していなければならないＭＭ被験者から構成される。デキサメタゾンの有無にかかわらないポマリドミドと組み合わせたダラツムマブ（ＤＰ±ｄ）をそれまでに受けている被験者は含まれない場合がある。デキサメタゾンの有無にかかわらないボルテゾミブと組み合わせたダラツムマブ（ＤＶ±ｄ）への前曝露、またはデキサメタゾンのありなしにかかわらないレナリドミドと組み合わせたイキサゾミブ（ＩＲ±ｄ）への前曝露は許容されるが、被験者は、本試験への組み入れ前の最後の前レジメンとしてＤＶ±ｄまたはＩＲ±ｄを受けていない場合もある。
【０４７６】
本試験の組み入れ基準は、以下を含む：
（１）被験者は、同意説明文書（ＩＣＦ）への署名時に１８歳以上である；
（２）被験者は、試験に関連する何らかの評価／手順が実施される前に、ＩＣＦを理解し、自発的にＩＣＦに署名しなければならない。
（３）被験者は、本プロトコル内の試験来院スケジュール及び他のプロトコル要件を進んで厳守することができ、治療群Ａに無作為化された被験者については、被験者は、遺伝子療法試験の規制ガイドラインで義務づけられている最大１５年間の継続追跡調査に同意する。
（４）被験者は、多発性骨髄腫（ＭＭ）の記録された診断、ならびに（ｉ）（ａ）血清Ｍタンパク質レベル（血清タンパク質電気泳動［ｓＰＥＰ］）が約０．５ｇ／ｄＬ以上、もしくは（ｂ）尿Ｍタンパク質レベル（尿タンパク質電気泳動［ｕＰＥＰ］）が約２００ｍｇ／２４時間以上；及び／または（ｉｉ）血清中もしくは尿中に測定可能な疾患がない軽鎖ＭＭ：血清免疫グロブリン遊離軽鎖が約１０ｍｇ／ｄＬ（１００ｍｇ／Ｌ）以上及び異常な血清免疫グロブリンカッパラムダ遊離軽鎖比として定義される測定可能な疾患を有する；
（５）被験者は、前ＭＭレジメンを少なくとも２レジメン受けたことがある。造血幹細胞移植を伴うまたは伴わない及び維持療法を伴うまたは伴わない導入療法は、１レジメンとみなす；
（６）被験者は、プロテアソーム阻害薬及び免疫調節化合物を含むレジメンによる前治療を少なくとも連続２サイクル受けている。
（７）被験者は、最後の治療レジメンに対して難治性でなければならない。難治性は、試験への組み入れ前の最後の抗骨髄腫レジメンによる治療中、または治療を完了してから（レジメンに含まれる任意の薬物の最終投与から数えて）６０日以内に記録された進行として定義される。
（８）被験者は、少なくとも１つの前治療レジメンに対する効果（最小奏効［ＭＲ］以上）が得られている；
（９）被験者は、約１以下の米国東海岸がん臨床試験グループ（ＥＣＯＧ）パフォーマンスステータスを有していなければならない；
（１０）被験者は、脱毛症及びグレード２のニューロパチーを除き、前治療に起因するあらゆる非血液学的毒性がグレード１またはベースラインまで回復していなければならない；
（１１）被験者は、白血球アフェレーシスに適切な血管アクセスを有していなければならない；
（１２）妊娠可能な女性被験者（ＦＣＢＰ）は、
（ａ）試験責任医師によって評価された陰性の妊娠検査を有していなければならない。
（ｂ）異性との性的接触を完全に禁欲するか、または避妊の効果的な手段を中断することなく使用することに同意し、それを遵守しなければならない。
（ｃ）試験参加中の母乳養育を控えることに同意しなければならない。
（ｄ）卵細胞の提供を慎まなければならない。
（１３）男性被験者は、試験に参加している間、完全に禁欲するか、または妊娠女性または妊娠可能な女性との性的接触時にコンドームを使用することに同意し、精子の提供を慎まなければならない。
【０４７７】
除外基準以下のいずれかに該当する場合、被験者は登録から除外される：
（１）被験者は、試験参加を妨げるような何らかの重大な医学的状態、検査所見の異常、または精神疾患を有する；
（２）被験者は、検査所見の異常の存在を含め、試験に参加した場合に被験者が許容できないリスクにさらされると考えられる何らかの状態を有している；
（３）被験者は、試験データの解釈力に混乱をもたらす何らかの状態を有する；
（４）被験者は、非分泌型ＭＭを有する；
（５）被験者は、以下の検査所見異常のいずれかを有する：
（ａ）絶対好中球数（ＡＮＣ）＜１，０００／Μｌ；
（ｂ）骨髄有核細胞の５０％未満が形質細胞である被験者の場合、血小板数：＜７５，０００／μＬ及び骨髄有核細胞の５０％以上が形質細胞である被験者の場合、血小板数＜５０，０００／μＬ（このレベルに達するための被験者への輸血は認められない）；
（ｃ）ヘモグロビン＜８ｇ／ｄＬ（＜４．９ｍｍｏｌ／Ｌ）（このレベルに達するための被験者への輸血は認められない）；
（ｄ）血清クレアチニンクリアランス（ＣｒＣｌ）＜４５ｍＬ／分；
（ｅ）補正血清カルシウム＞１３．５ｍｇ／ｄＬ（＞３．４ｍｍｏｌ／Ｌ）；
（ｆ）血清アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）またはアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）＞２．５×正常値上限（ＵＬＮ）；
（ｇ）血清総ビリルビン＞１．５×ＵＬＮまたはジルベール症候群が記録されている被験者の場合＞３．０ｍｇ／ｄＬ；及び
（ｈ）国際標準比（ＩＮＲ）もしくは活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）＞１．５×ＵＬＮ、または３０日以内にグレード２以上の出血の既往歴、または抗凝固薬（例えば、ワルファリン、低分子量ヘパリン、第Ｘａ因子阻害薬）の長期的な治療的投与を継続する必要がある被験者；
（６）被験者は、酸素飽和度（ＳａＯ２）＜９２％室内気として定義される十分な肺機能を有していない；
（７）被験者は、ＭＭ以外の悪性腫瘍の既往歴がある。ただし、以下の非侵襲性悪性腫瘍を例外とし、被験者は、５年以上罹患していない場合は除く：
（ａ）皮膚基底細胞癌；
（ｂ）皮膚扁平上皮癌；
（ｃ）子宮頸部上皮内癌；
（ｄ）乳房上皮内癌；及び
（ｅ）前立腺癌の偶発的組織学的所見（腫瘍、リンパ節、転移［ＴＮＭ］臨床的病期分類を使用した場合Ｔ１ａまたはＴ１ｂ）または治癒目的で治療可能な前立腺癌；
（８）被験者は、形質細胞白血病、ワルデンストレームマクログロブリン血症、ＰＯＥＭＳ症候群（多発性神経障害、臓器巨大症、内分泌障害、モノクローナルタンパク質、及び皮膚変化）、またはアミロイド症を有するまたは既往歴がある；
（９）中枢神経系（ＣＮＳ）に骨髄腫の病変が認められる被験者；
（１０）被験者は、肺白血球停滞及び播種性血管内凝固の臨床エビデンスを有する；
（１１）被験者は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を認め、１秒間努力呼気肺活量（ＦＥＶ１）の予想正常値が５０％である。ＣＯＰＤの疑いがある被験者には努力呼気検査（ＦＥＶ１）が求められ、予測正常値が５０％未満である場合は、被験者を除外しなければならない。
（１２）被験者は、てんかん、痙攣発作、不全麻痺、失語症、脳卒中、くも膜下出血またはその他のＣＮＳ出血、重度の脳損傷、認知症、パーキンソン病、小脳疾患、器質性脳症候群、精神病などの臨床的に重大なＣＮＳ病態の既往歴または現病歴を有する；
（１３）被験者は、直近の抗骨髄腫治療レジメンの一部として、デキサメタゾンの有無にかかわらないポマリドミド（ＰＯＭ）と組み合わせたダラツムマブ（ＤＡＲＡ）（ＤＰ±ｄ）で治療されていると、ブリッジング療法としてＤＰｄ（すなわち、ダラツムマブ、ポマリドミド及びデキサメタゾン）を受けることはできないが、治療群Ａに無作為化された場合は、試験責任医師の判断に従って、ブリッジングとして、ＤＶｄ（すなわち、ダラツムマブ、ボルテゾミブ及びデキサメタゾン）またはＩＲｄ（すなわち、イキサゾミブ、レナリドミド及びデキサメタゾン）を受けることができる；
（１４）被験者は、直近の抗骨髄腫治療レジメンの一部として、ＤＰ±ｄで治療されていると、ＤＰｄを受けることはできないが、治療群Ｂに無作為化された場合、試験責任医師の判断に従って、ＤＶｄまたはＩＲｄを受けることができる；
（１５）被験者は、直近の抗骨髄腫治療レジメンの一部として、デキサメタゾン（ｄｅｘ）の有無にかかわらないボルテゾミブ（ＢＴＺ）と組み合わせたＤＡＲＡ（ＤＶ±ｄ）で治療されていると、ブリッジング療法としてＤＶｄを受けることはできないが、治療群Ａに無作為化された場合、試験責任医師の判断に従って、ブリッジングとしてＤＰｄまたはＩＲｄを受けることができる；
（１６）被験者は、直近の抗骨髄腫治療レジメンの一部として、ＤＶ±ｄで治療されていると、ＤＶｄを受けることはできないが、治療群Ｂに無作為化された場合、試験責任医師の判断に従って、ＤＰｄまたはＩＲｄを受けることができる；
（１７）被験者は、直近の抗骨髄腫治療レジメンの一部として、ｄｅｘの有無にかかわらないレナリドミド（ＬＥＮ）と組み合わせたイキサゾミブ（ＩＸＡ）（ＩＲ±ｄ）で治療されていると、ブリッジング療法としてＩＲｄを受けることはできないが、治療群Ａに無作為化された場合、試験責任医師の判断に従って、ブリッジングとしてＤＰｄまたはＤＶｄを受けることができる；
（１８）被験者は、直近の抗骨髄腫治療レジメンの一部として、ＩＲ±ｄで治療されていると、ＩＲｄを受けることはできないが、治療群Ｂに無作為化された場合、試験責任医師の判断に従って、ＤＰｄまたはＤＶｄを受けることができる；
（１９）同種造血幹細胞移植、がんに対する任意の遺伝子療法に基づく治療法、がんの試験的細胞療法またはＢＣＭＡ標的療法による治療の前治療歴；
（２０）被験者は、無作為化前１２週間以内に自己由来幹細胞移植（ＡＳＣＴ）を受けている；
（２１）無作為化前２８日以内に任意の試験薬を使用した被験者。
（２２）被験者は、無作為化前の１４日以内に以下のいずれかを受けている：
（ａ）血漿アフェレーシス；
（ｂ）大手術（試験責任医師による定義）；
（ｃ）骨髄腫関連骨病変に対する局所療法以外の放射線療法；及び
（ｄ）任意の全身性抗骨髄腫薬物療法の使用；
（２３）心エコー図（ＥＣＨＯ）またはマルチゲートスキャン（ＭＵＧＡ）による左室駆出率（ＬＶＥＦ）＜４５％；
（２４）長期的な免疫抑制薬（例えば、あらゆる用量のシクロスポリンまたは全身ステロイド）の治療継続。コルチコステロイドの間欠的な局所、吸入、鼻腔内投与は許容される；
（２５）被験者は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）陽性、慢性もしくは活動性Ｂ型肝炎または活動性Ａ型もしくはＣ型肝炎である；
（２６）被験者は、コントロール不良の全身性の真菌、細菌、ウイルス、または他の感染症（適切な抗菌治療にもかかわらず、感染に伴う徴候／症状が改善なく持続するものとして定義される）、またはＩＶ抗菌薬による管理を要する。
（２７）被験者は、クラスＩＩＩまたはＩＶのうっ血性心不全（ＣＨＦ）または重度の非虚血性心筋症、無作為化前６ヶ月以内の不安定またはコントロール不良の狭心症、心筋梗塞または心室性不整脈の既往歴がある；
（２８）ＤＡＲＡ、サリドマイド、レナリドミド、ＰＯＭ、ＢＴＺ、ＩＸＡまたはｄｅｘに対する過敏症。これには、先のサリドマイド、ＰＯＭまたはレナリドミド療法中のグレード３以上の発疹が含まれる；
（２９）ｂｂ２１２１製品の任意の構成成分：シクロホスファミド、フルダラビン、及び／またはトシリズマブに対する過敏症、またはＤＡＲＡ、ＰＯＭ、ＬＥＮ、ＩＸＡ、ＢＴＺもしくはｄｅｘの製剤中に含有される賦形剤に対する過敏症があることが認められる被験者；
（３０）被験者は、妊娠中、授乳中、もしくは母乳養育中の女性、または本試験参加中に妊娠する意志のある女性である；
（３１）治療群Ｂに無作為化され、ＰＯＭまたはＬＥＮを含むレジメンに割り当てられる被験者の場合、プロトコルで規定された血栓塞栓症予防を受けることができない、または受ける意志がない；及び
（３２）被験者は、ボルテゾミブに忍容性がなければ、治療群Ａに無作為化された場合、ブリッジング療法としてＤＶｄを受けることができず、または治療群Ｂに無作為化された場合、ＤＶｄを受けることができない。
【０４７８】
６．１２．２．試験デザイン
およそ３９０名の被験者を治療群Ａまたは治療群Ｂの間に２：１に無作為化する。およそ２６０名の被験者を治療群Ａとなるように無作為化し、およそ１３０名の被験者を治療群Ｂとなるように無作為化する。治療群Ａは、ｂｂ２１２１から構成され、治療群Ｂは、試験責任医師の判断による標準的な３剤併用レジメン：ＤＰｄ、ＤＶｄ、またはＩＲｄから構成される。適格被験者は、双方向応答技術（ＩＲＴ）を使用して無作為化し、以下の因子によって層化する：
・先のダラツムマブ治療ありと、先のダラツムマブ治療なし
・先の抗骨髄腫レジメンが２または３と、先の抗骨髄腫レジメンが３超；及び
・ハイリスク細胞遺伝学的異常あり（例えば、ｔ（４；１４）またはｔ（１４；１６）またはｄｅｌ１７ｐ）（ベースラインまたは過去の細胞遺伝学的結果から）のハイリスク細胞遺伝学的異常と、これらのハイリスク細胞遺伝学的異常なしまたは未知
【０４７９】
治療群Ａに無作為化された被験者は、ｂｂ２１２１製品の作製を可能にするために白血球アフェレーシスを受ける。試験責任医師の判断により、被験者は、白血球アフェレーシス後、リンパ球除去（ＬＤ）化学療法の開始１４日以上前に最終用量が投与される場合に限り、ブリッジングＭＭ療法として１サイクル以下のＤＰｄを受けることができる。ｂｂ２１２１医薬品が問題なく製造されたら、追加のベースライン評価を実施して、リンパ球除去（ＬＤ）化学療法の開始の少なくとも３日前に適格性及び安全性の継続性を評価する（ブリッジングＭＭ療法を受けた被験者に対する病期分類評価を含む）。治療に適格である被験者は、３日連続のフルダラビン及びシクロホスファミドによるＬＤ化学療法を受け、その後２日休薬し、続いて１日目のｂｂ２１２１注入を行う。被験者は、進行（ＰＤ）が記録されるか、または同意の撤回があるまで、安全性及び有効性について追跡される。ｂｂ２１２１を投与された全ての被験者は、長期的安全性についてモニタリングされる。
【０４８０】
治療群Ｂに無作為化された被験者は、試験責任医師の判断により次の試験治療のいずれかを受ける：静脈内（ＩＶ）ダラツムマブ、経口ポマリドミド、及び経口またはＩＶデキサメタゾン（ＤＰｄ）；静脈内ダラツムマブ、皮下（ＳＣ）ボルテゾミブ、及び経口またはＩＶデキサメタゾン（ＤＶｄ）；ならびに経口イキサゾミブ、経口レナリドミド、及び経口デキサメタゾン（ＩＲｄ）。被験者は、安全性及び有効性について追跡され、ＰＤ、許容されない毒性または同意の撤回があるまで、試験治療を継続することができる。
【０４８１】
６．１２．３．評価項目
無増悪生存期間（ＰＦＳ）：ＰＦＳは、無作為化から最初に記録された進行または試験の何らかの原因による死亡のどちらか早いものまでの時間として算出される。進行日は、試験中にそれまでの未評価なく、何らかの進行が観察された最も早い時に割り当てられる。有害事象または療法の変更による試験からの離脱が進行または死亡の記録前に発生した場合、これらの観察は、最後の完全な骨髄腫奏効評価により進行がないことが決定された日に打ち切りとする。
【０４８２】
主な副次的評価項目：全生存期間（ＯＳ）。ＯＳは、無作為化から何らかの理由による死亡までの時間として算出される。
【０４８３】
他の副次的評価項目：
【０４８４】
無事象生存期間（ＥＦＳ）：ＥＦＳは、無作為化から最初に記録された進行、被験者が別の抗骨髄腫治療を受けた最初の日、または試験の何らかの原因による死亡のいずれか早いものまでの時間として算出される。
【０４８５】
全奏効率（ＯＲＲ）：奏効例は、少なくとも部分奏効（ＰＲ）を示す任意の被験者である。全奏効率（ＯＲＲ）は、奏効例の割合として定義される。後続の抗骨髄腫治療を受けた後の被験者からの奏効がカウントされるが、これらの患者は、分母に含まれる。
【０４８６】
微小残存腫瘍（ＭＲＤ）陰性：ＭＲＤ評価可能被験者のうち、フローサイトメトリー（ＥｕｒｏＦｌｏｗ）及び次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用して、ＭＲＤ陰性（１０５有核細胞中最小１つとして定義）である割合。
【０４８７】
完全奏効（ＣＲ）率：ＣＲ率は、少なくともＣＲのある被験者の割合として定義される。
【０４８８】
上記の奏効及びＭＲＤ評価項目については、国際骨髄腫作業部会（ＩＭＷＧ）評価基準を使用して、骨髄腫奏効を分類する。ＩＴＴ集団は主解析の分母として使用し、ＥＥ集団は裏付け解析に使用する。
【０４８９】
奏効までの期間（ＴＴＲ）：ＴＴＲは、奏効例に関するＩＭＷＧガイドラインに基づいて、無作為化から最初に記録された奏効（ＰＲ以上）までの時間として算出される。
【０４９０】
奏効持続期間（ＤＯＲ）：ＤＯＲは、記録された最初の奏効（ＰＲ以上）から増悪の確認までの時間として定義される。
【０４９１】
次の抗骨髄腫治療までの時間：次の抗骨髄腫治療までの時間は、無作為化から被験者が別の抗骨髄腫治療を受けた最初の日までの時間として算出される。解析時に別の抗骨髄腫治療を受けていない被験者は、最後の評価（次の抗骨髄腫治療が治療段階の終了前に行われた場合）または最後の追跡来院（次の抗骨髄腫治療が長期追跡調査段階中に行われた場合）の日に打ち切る。
【０４９２】
次の抗骨髄腫療法後の無増悪生存期間（ＰＦＳ２）：無作為化から第２の客観的増悪または何らかの原因による死亡のどちらか早いものまでの時間。
【０４９３】
６．１２．４．治療方法
ｂｂ２１２１  ＣＡＲ  Ｔ療法の場合、リンパ球除去（ＬＤ）療法として、フルダラビン及びシクロホスファミドをそれぞれ毎日３０ｍｇ／ｍ２及び３００ｍｇ／ｍ２の用量で連続３日間（−５日目に開始）、静脈内（ＩＶ）投与し、その後２日の休薬とする。ＬＤ化学療法の完了後、ｂｂ２１２１を１５０〜４５０×１０６ＣＡＲ＋  Ｔ細胞の範囲の用量でＩＶ注入として投与する。
【０４９４】
ＤＰｄ療法の場合、ダラツムマブは、開始用量１６ｍｇ／ｋｇで、１ヶ月目及び２ヶ月目の１、８、１５、及び２２日目（２８日／月）；３〜６ヶ月目の１、１５日目（２８日／月）；及び７ヶ月目以降１日目（２８日／月）に静脈内投与する。ポマリドミドは、４ｍｇ／日で、１〜２１日目（２８日／月）に経口投与する。デキサメタゾンは、４０ｍｇ（７５歳を上回る場合２０ｍｇ）で、１、８、１５及び２２日目（２８日／月）に投与する。ダラツムマブの投与日：７５歳以下の被験者の場合、デキサメタゾンは、ダラツムマブ注入前に２０ｍｇをＩＶ投与し、ダラツムマブ注入後に２０ｍｇを経口投与する；７５歳を超える被験者の場合、デキサメタゾンは、ダラツムマブ注入の前に２０ｍｇをＩＶ投与する。
【０４９５】
ＤＶｄ療法の場合、ダラツムマブは、１６ｍｇ／ｋｇの開始用量で、１〜３ヶ月目の１、８、１５日目（２１日／月）；４〜８ヶ月目の１日目（２１日／月）；及び９ヶ月目以降１日目（２８日／月）に静脈内投与する。ボルテゾミブは、１．３ｍｇ／ｍ２の開始用量で、１〜８ヶ月目の１、４、８及び１１日目（２１日／月）に皮下（ＳＣ）投与する。ボルテゾミブ投与は、８ヶ月目後は中止しなければならない。デキサメタゾンは、２０ｍｇの開始用量で、１〜８ヶ月目の１、２、４、５、８、９、１１及び１２日目に投与される；７５歳以下の被験者の場合、デキサメタゾンは、ダラツムマブ注入前に２０ｍｇをＩＶ投与し、注入の翌日に２０ｍｇを経口投与し、非ＤＡＲＡ投与日には、デキサメタゾンは、２０ｍｇで経口投与する；７５歳を超える被験者で、低体重（ＢＭＩ＜１８．５）であり、管理不十分な真性糖尿病またはステロイド療法に対する先の不耐性／ＡＥを有する場合、デキサメタゾン投与は、週２０ｍｇの用量で投与してもよい。デキサメタゾン投与は、８ヶ月目後は中止しなければならない。
【０４９６】
ＩＲｄ療法の場合、イキサゾミブは、４ｍｇ／日の開始用量で、１、８及び１５日目（２８日／月）に経口投与する。レナリドミドは、２５ｍｇ／日で、１〜２１日目（２８日／月）に経口投与する。デキサメタゾンは、４０ｍｇ／日で、１、８、１５及び２２日目（２８日／月）に投与する。
【０４９７】
一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、本明細書及び特許請求の範囲で開示される特定の実施形態に対する主張を制限するように解釈されるべきではなく、そのような特許請求の範囲が権利を与えられる同等物の完全な範囲とともに、全ての可能な実施形態を含むように解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。
【図１】
2021530483.tif 000012
【図２Ａ】
2021530483.tif 000013
【図２Ｂ】
2021530483.tif 000014
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2021530483.tif 000019
【図８Ａ】
2021530483.tif 000020
【図８Ｂ】
2021530483.tif 000021
【図９】
2021530483.tif 000022
【図１０Ａ】
2021530483.tif 000023
【図１０Ｂ】
2021530483.tif 000024
【図１１】
2021530483.tif 000025
【図１２Ａ】
2021530483.tif 000026
【図１２Ｂ】
2021530483.tif 000027
【図１２Ｃ】
2021530483.tif 000028
【図１２Ｄ】
2021530483.tif 000029
【図１３】
2021530483.tif 000030
【図１４】
2021530483.tif 000031
【図１５】
2021530483.tif 000032
【図１６】
2021530483.tif 000033
【図１７】
2021530483.tif 000034
【手続補正書】
【提出日】令和3年4月9日(2021.4.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021530483000001.app
【国際調査報告】
2021530483.tif 000035
2021530483.tif 000036
2021530483.tif 000037
2021530483.tif 000038