(57)【要約】本開示は、薬物送達ビヒクルとしての乳小胞、乳小胞内に封入された、ないしは別の方法で乳小胞と会合した治療薬を含む組成物、このような乳小胞およびその組成物を製造する方法、ならびにこのような乳小胞および組成物を特定の患者組織または器官に送達させる方法を提供する。また乳小胞を含む組成物も本明細書で提供され、乳小胞が、１つ以上のタンパク質が会合している脂質膜を含み、（ａ）組成物中のカゼインの相対的存在量が、約４０％未満であり、かつ／または（ｂ）組成物中のラクトグロブリンの相対的存在量が、約２５％未満である。
2021529535.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳小胞（ｍｉｌｋ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ）を含む組成物であって、前記乳小胞が、１つ以上のタンパク質が会合している脂質膜を含み、（ａ）前記組成物中のカゼインの相対的存在量が、約４０％未満であり、かつ／または（ｂ）前記組成物中のラクトグロブリンの相対的存在量が、約２５％未満である、組成物。
【請求項２】
前記組成物中のカゼインの前記相対的存在量が、約２０％未満である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物中のカゼインの前記相対的存在量が、約５％未満である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物が、カゼインを実質的に含まない、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
ラクトグロブリンの前記相対的存在量が、約１５％未満である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
ラクトグロブリンの前記相対的存在量が、１０％未満である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記乳小胞に、前記乳小胞内に天然に存在しない生体分子であるカーゴが装填されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記乳小胞のサイズが、約２０〜１，０００ｎｍである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記乳小胞の前記サイズが、約８０〜２００ｎｍである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記乳小胞の前記サイズが、約１２０〜１６０ｎｍである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記乳小胞の前記脂質膜と会合する前記１つ以上のタンパク質が、ブチロフィリンサブファミリー１メンバーＡ１（ＢＴＮ１Ａ１）もしくはその膜貫通フラグメント、ブチロフィリンサブファミリー１メンバーＡ２（ＢＴＮ１Ａ２）もしくはその膜貫通フラグメント、脂肪酸結合タンパク質、ラクトアドヘリン、血小板糖タンパク質４、キサンチンデヒドロゲナーゼ、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧ、ペリリピン、ＲＡＢ１Ａ、ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼＡ、Ｒａｓ関連タンパク質Ｒａｂ−１８、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＴＳＧ１０１、ＨＳＰ７０、ラクトフェリンもしくはその膜貫通フラグメント、ＡＬＧ−２相互作用タンパク質Ｘ、アルファ−ラクトアルブミン、血清アルブミン、多量体免疫グロブリン、ラクトペルオキシダーゼ、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記乳小胞が、ＢＴＮ１Ａ１およびＣＤ８１を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記乳小胞の前記脂質膜と会合する前記１つ以上のタンパク質が、グリコシル化タンパク質を含む、請求項１１または請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記乳小胞が、ウシ乳、ヤギ乳、ラクダ乳、バッファロー乳、ヤク乳、または人乳から得られる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記乳小胞が、ラクトソーム、乳脂肪球（ＭＦＧ）、エクソソーム、細胞外小胞、乳清粒子、乳清由来粒子、これらの凝集体、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記生体分子が、ペプチド、タンパク質、核酸、多糖類、または小分子である、請求項７〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記生体分子が、抗体、ホルモン、増殖因子、酵素、サイトカイン、ケモカイン、毒素、抗毒素、血液凝固因子、またはこれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記生体分子が、干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ノンコーディングＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される核酸である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ｉＲＮＡが、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記生体分子が、疎水性部分にコンジュゲートされている、請求項７〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記疎水性部分が、脂質、ステロール、ステロイド、テルペン、コール酸、アダマンチン酢酸、１−ピレン酪酸、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、フェノキサジン  イソプレン誘導体、トコフェロール、およびトコトリエノールからなる群から選択される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記乳小胞が、以下の特徴：
（ｉ）凍結融解サイクルおよび／または温度処理下での安定性、
（ｉｉ）前記乳小胞に前記生体分子を装填したときのコロイド安定性、
（ｉｉｉ）１乳小胞あたり少なくとも５０００個のコレステロール修飾オリゴヌクレオチドの装填量、
（ｉｖ）酸性ｐＨ下での安定性、
（ｖ）超音波処理時の安定性、
（ｖｉ）酵素消化に対する耐性、ならびに
（ｖｉｉ）前記乳小胞にオリゴヌクレオチドを装填したときのヌクレアーゼ処理に対する耐性のうちの１つ以上を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記（ｄ）の酸性ｐＨが、≦４．５である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記（ｄ）の酸性ｐＨが、≦２．５である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記（ｆ）の酵素消化が、１つ以上の消化酵素による消化を含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２６】
前記１つ以上の消化酵素が、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、および／またはヌクレアーゼを含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記１つ以上の消化酵素が、舌リパーゼ、唾液アミラーゼ、ペプシン、胃リパーゼ、トリプシン、キモトリプシン、カルドキシペプチダーゼ、エラスターゼ、膵リパーゼ、ホスホリパーゼ、ＤＮＡａｓｅ、ＲＮＡａｓｅ、膵アミラーゼ、エレプシン、マルターゼ、ラクターゼ、および／またはスクロースを含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記１つ以上の消化酵素が、ペプシンおよびパンクレアチンを含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記組成物が、薬学的に許容される担体をさらに含む薬学的組成物に製剤化される、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
前記薬学的組成物が、経口投与用である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
乳小胞を含む組成物を調製するための方法であって、前記方法が、
（ｉ）第１の乳サンプルを提供することと、
（ｉｉ）前記第１の乳サンプルからカゼインおよび／またはラクトグロブリンを除去して、第２の乳サンプルを生成することと、
（ｉｉｉ）前記第２の乳サンプルから乳小胞を単離して、前記乳小胞を含む組成物を生成することと、を含む、方法。
【請求項３２】
前記第１の乳サンプルが、ウシ乳、ヤギ乳、ラクダ乳、バッファロー乳、ヤク乳、または人乳からのものである、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１の乳サンプルが、生乳、脱脂乳、初乳、均質乳、または低温殺菌乳である、請求項３１または請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記除去工程（ｉｉ）が、前記第１の乳サンプルを酸性化することによって実行される、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記除去工程（ｉｉ）が、前記第１の乳サンプルをレンネットで凝固させることによって実行される、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記レンネットが、動物レンネットまたは植物レンネットである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記動物レンネットが子ウシ腸に由来し、かつ／または前記植物レンネットが植物性レンネットである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記除去工程（ｉｉ）が、ＥＤＴＡによってカゼインミセルを破壊することによって実行される、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記単離工程（ｉｉｉ）が、超遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、親和性精製、接線流濾過、またはこれらの組み合わせによって実行される、請求項３１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
請求項３１〜３９のいずれか一項に記載の方法によって調製された乳小胞を含む組成物。
【請求項４１】
前記乳小胞に、乳小胞内に天然に存在しない生体分子であるカーゴが装填されている、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記生体分子が、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載されている、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記組成物が、薬学的に許容される担体をさらに含む薬学的組成物に製剤化される、請求項３８〜４２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４４】
前記薬学的組成物が、経口投与用である、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
生体分子を対象に経口送達させる方法であって、それを必要とする対象に、請求項７〜３０および３８〜４４のいずれか一項に記載の組成物を経口投与することを含む、方法。
【請求項４６】
前記対象が、標的疾患を有するか、有することが疑われるか、またはそのリスクがあるヒト患者である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記標的疾患が、過剰増殖性疾患、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー性疾患、心血管疾患、代謝性疾患、または神経変性疾患である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記対象が、前記標的疾患に対して治療されているか、または追加の治療を受けている、請求項４６または請求項４７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年７月２日に出願された米国仮出願第６２／６９３，１１５号の出願日の利益を主張するものであり、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、少なくとも部分的に、乳中に見られる小胞（ｖｅｓｉｃｌｅｓ）に関し、この小胞は、生物学的薬剤、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、または他の薬剤などの小分子および生物製剤を、例えば、膜と会合して、または装填して（例えば、小胞膜、一体型小胞タンパク質、膜脂質またはオリゴ糖を封入し、これらに共有結合的にまたは非共有結合的に付着する）運ぶことができ、いくつかの実施形態では、それらの安定性または他の特性を改善し、および／またはそれらを患者の組織または器官に送達することができる。本開示はまた、このような乳小胞（ｍｉｌｋ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ）を使用する組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
近年、疾患を治療、診断、および監視するための生物製剤および関連する治療薬の目覚ましい発展が見られている。ただし、ペイロードをパッケージ化、安定化、および目的の部位に送達させるために好適なビヒクルを生成するという課題は未解決のままである。多くの治療剤は、インビボでの固有の不安定性および能動的クリアランスメカニズムのため、分解に悩まされている。これらのペイロードを経口送達させる場合、インビボでの安定性が低いことが特に問題になる。胃の酸性状態、消化管で摂取された成分を分解するプロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、ヌクレアーゼの作用と一体になった蠕動運動を含む消化管の過酷な状態は、多くの生物製剤を経口送達させることを特に困難にする。この困難さの規模は、ＩＶ、経皮、および皮下投与を含む非経口手段による送達に限定された生物学製剤の数によって証明されている。生物製剤および関連する治療薬の一般的な経口送達ビヒクルは、健康管理に大きな影響を与える。
【０００４】
最近の取り組みは、生物製剤をポリマーベース、リポソーム、または生分解性および侵食性のマトリックスにパッケージングして、生物製剤封入ナノ粒子をもたらすことに焦点を合わせている。それらの有利な封入特性にもかかわらず、このようなナノ粒子は、毒性または不十分な放出特性のために、広範に使用されていない。さらに、現在のナノ粒子合成技術は、製造目的でスケーリングする能力が制限されている。したがって、効果的で毒性がなく、スケーラブルな送達プラットフォームの開発には、満たされていないニーズがいまだにある。
【０００５】
乳は経口摂取され、免疫発達に重要な様々なｍｉＲＮＡを含有することが知られており、これらのｍｉＲＮＡを保護してエクソソームに送達する。したがって、乳小胞は、これらの複雑な生体分子の完全性を維持しながら、母体から乳幼児に重要なメッセージを伝達する、胃腸特権（ＧＩ特権）の進化的に保存された手段を表している。一例として、乳エクソソームは、酸性ｐＨおよび他の高ストレスまたは分解条件で好ましい安定性プロファイルを有することが観察されている（例えば、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ．２０１２；８（１）：１１８−２３．Ｅｐｕｂ  ２０１１  Ｎｏｖ  ２９を参照されたい）。さらに、循環中のウシｍｉＲＮＡレベルは、様々な量の乳を消費した後、用量依存的に増加することが観察されている（例えば、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１５；１０（３）：ｅ０１２１１２３を参照されたい）。
まとめると、入手可能なデータは、人間が乳の無傷の核酸含有量を吸収する能力を有していることを示唆している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ．２０１２；８（１）：１１８−２３．Ｅｐｕｂ  ２０１１  Ｎｏｖ  ２９
【非特許文献２】ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１５；１０（３）：ｅ０１２１１２３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ｍｉＲＮＡ種を封入ないしは別の方法で運ぶことができる乳小胞、例えば乳エクソソームおよび他の小胞は、様々な治療薬の経口送達を可能にすることができる。本開示は、以前は経口投与できなかったか、または不十分な生物学的利用能、貯蔵不安定性、代謝、オフターゲット毒性、もしくはインビボでの分解などの他の送達課題に悩まされていた治療剤のための好適な送達ビヒクルの緊急の必要性を満たすために乳由来小胞を利用する。
【０００８】
したがって、本開示の一態様は、カーゴ装填乳小胞を特徴とし、乳小胞が１つ以上のタンパク質が会合する脂質膜を含み、乳小胞が外から添加された生体分子であるカーゴを装填している。いくつかの実施形態では、生体分子は、乳小胞内に天然に存在しない分子である。いくつかの実施形態では、乳小胞のサイズは、約２０〜１，０００ｎｍ、例えば、約８０〜２００ｎｍまたは約１２０〜１６０ｎｍである。粒子サイズは、ナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ）または動的光散乱（ＤＬＳ）、またはマイクロ流体抵抗パルスセンシングによって決定することができる。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のカーゴ装填乳小胞は、ブチロフィリンサブファミリー１メンバーＡ１（ＢＴＮ１Ａ１）もしくはその膜貫通フラグメント、ブチロフィリンサブファミリー１メンバーＡ２（ＢＴＮ１Ａ２）もしくはその膜貫通フラグメント、脂肪酸結合タンパク質、ラクトアドヘリン、β−ラクトグロブリン、血小板糖タンパク質４、キサンチンデヒドロゲナーゼ、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧ、ペリリピン、血小板糖タンパク質４、ＲＡＢ１Ａ、ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼＡ、Ｒａｓ関連タンパク質Ｒａｂ−１８、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＴＳＧ１０１、ＨＳＰ７０、ラクトフェリンもしくはその膜貫通フラグメント、ＡＬＧ−２相互作用タンパク質Ｘ、カッパ−カゼイン、アルファ−ラクトアルブミン、血清アルブミン、アルファ−Ｓ１−カゼイン、アルファ−Ｓ２−カゼイン、多量体免疫グロブリン、ラクトペルオキシダーゼ、またはこれらの組み合わせから選択される１つ以上のタンパク質を含み得る。１つの特定の例では、カーゴ装填乳小胞は、ＢＴＮ１Ａ１、ＢＴＮ１Ａ２、またはこれらの組み合わせを含む。カーゴ装填乳小胞中のタンパク質部分の１つ以上は、グリコシル化されてもよい。いくつかの非限定的な例では、グリコシル化タンパク質は、末端β−ガラクトース、末端α−ガラクトース、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、および／またはＮ−アセチル−Ｄ−グリコサミンを含む。
【００１０】
あるいは、またはさらに、本明細書に記載のカーゴ装填乳小胞の脂質は、ヘキソシルセラミド（ＨｅｘＣｅｒ）、ガングリオシドＧＭ１、ガングリオシドＧＭ２、ガングリオシドＧＭ３、ガングリオシドＧＤ１、ラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、Ｌ−アルファ−リゾｒｅホスファチジルイノシトール（ＬＰＩ）、コレステロール（ＣＨＯＬ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、グロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、セラミド（Ｃｅｒ）、またはこれらの組み合わせを含んでもよい。
【００１１】
別の態様では、本開示は、乳小胞を含む組成物を提供し、乳小胞は、１つ以上のタンパク質が会合している脂質膜を含み、組成物中のカゼインの相対的存在量は、約４０％未満（例えば、約３５％未満、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％以下（これらの列挙された範囲の間の任意の数値増分を含む））である。別の態様では、本開示は、乳小胞を含む組成物を提供し、乳小胞は、１つ以上のタンパク質が会合している脂質膜を含み、組成物中のラクトグロブリンの相対的存在量は、約２５％未満（例えば、約２０％未満、約１５％、約１０％以下（これらの列挙された範囲の間の任意の数値増分を含む））である。別の態様では、本開示は、乳小胞を含む組成物を提供し、乳小胞は、１つ以上のタンパク質が会合している脂質膜を含み、組成物中のカゼインの相対的存在量は、約４０％未満（例えば、約３５％未満、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％以下（これらの列挙された範囲の間の任意の数値増分を含む））であり、組成物中のラクトグロブリンの相対的存在量は、約２５％未満（例えば、約２０％未満、約１５％、約１０％以下（これらの列挙された範囲の間の任意の数値増分を含む））である。本明細書で使用される場合、「相対的存在量」という用語は、組成物の総タンパク質含有量におけるカゼインまたはラクトグロブリンが占める割合を指す。いくつかの例では、乳小胞を含む組成物は、カゼインおよび／またはラクトグロブリンを実質的に含まない。カゼインおよび／またはラクトグロブリンは、本明細書に開示される方法に従って、乳小胞から除去され得る。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で提供される方法および乳供給源のいずれかを使用して、乳および／または乳製品および／または乳成分から単離および／または精製された乳小胞を提供する。いくつかの実施形態では、乳小胞は、それらの天然に存在する乳小胞の対応物から改変されている。いくつかの実施形態では、乳小胞の脂質膜は、その天然に存在する乳小胞の対応物の脂質膜から改変されている。いくつかの実施形態では、乳小胞は、以下の分子：脂質、リン脂質、糖脂質、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、リンタンパク質、グリカン、グリセリド、脂肪酸、および本明細書の他の箇所に開示されている他の分子のいずれかのうちの１つ以上の包含（添加）または排除（除外）によって、天然に存在する乳小胞の対応物から改変されている。いくつかの実施形態では、乳小胞は、それがその天然に存在する対応物よりも少ないカゼイン（複数可）および／またはラクトグロブリン（複数可）を含有するむように改変されている。いくつかの例では、乳小胞は、それがカゼインおよび／またはラクトグロブリンを実質的に含まないように改変されている。改変された乳小胞のこれらの実施形態のいずれかでは、乳小胞は、カーゴを含有するようにさらに改変されても、または改変されなくてもよい。いくつかの実施形態では、改変された乳小胞はカーゴを含有しない。いくつかの実施形態では、乳小胞はカーゴを含有する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、乳小胞は、カーゴを装填することによって、それらの天然に存在する乳小胞の対応物から改変されている。乳小胞がカーゴを含有するように改変されているいくつかの実施形態では、カーゴを装填する乳小胞は、天然に存在する乳小胞であってもよい。乳小胞がカーゴを含有するように改変されているいくつかの実施形態では、カーゴを装填する乳小胞は、上記段落および本明細書の他の箇所で記載される改変された乳小胞のいずれかなど、その天然に存在する乳小胞の対応物から改変された乳小胞であってもよい。
【００１４】
いくつかの実施形態では、組成物中の乳小胞には、外から添加された生体分子であるカーゴが装填されている。いくつかの実施形態では、生体分子は、乳小胞内に天然に存在しない分子である。様々な異なるカーゴの例が本明細書に提供されている。乳小胞は、本明細書に開示されるサイズ範囲を有し得る。いくつかの実施形態では、乳小胞の脂質膜と会合する１つ以上のタンパク質（例えば、糖タンパク質）は、ブチロフィリンサブファミリー１メンバーＡ１（ＢＴＮ１Ａ１）もしくはその膜貫通フラグメント、ブチロフィリンサブファミリー１メンバーＡ２（ＢＴＮ１Ａ２）もしくはその膜貫通フラグメント、脂肪酸結合タンパク質、ラクトアドヘリン、血小板糖タンパク質４、キサンチンデヒドロゲナーゼ、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧ、ペリリピン、ＲＡＢ１Ａ、ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼＡ、Ｒａｓ関連タンパク質Ｒａｂ−１８、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＴＳＧ１０１、ＨＳＰ７０、ラクトフェリンもしくはその膜貫通フラグメント、ＡＬＧ−２相互作用タンパク質Ｘ、アルファ−ラクトアルブミン、血清アルブミン、多量体免疫グロブリン、ラクトペルオキシダーゼ、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの例では、乳小胞は、ＢＴＮ１Ａ１およびＣＤ８１を含む。いくつかの実施形態では、カーゴ装填乳小胞は、カゼインの相対的存在量が約４０％未満であり、かつ／またはラクトグロブリンの相対的存在量が約２５％未満である脂質膜を含む。いくつかの実施形態では、カーゴ装填乳小胞は、カゼインおよび／またはラクトグロブリンを実質的に含まない脂質膜を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される乳小胞は、以下の特徴のうちの１つ以上を含み得る：
（ａ）凍結融解サイクルおよび／または温度処理下での安定性、
（ｂ）乳小胞に生体分子を装填したときのコロイド安定性、
（ｃ）１乳小胞あたり少なくとも１０００個（例えば、少なくとも２０００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、または少なくとも５０００個）のコレステロール修飾オリゴヌクレオチドの装填量、
（ｄ）酸性ｐＨ下での安定性（例えば、≦４．５、または≦２．５、
（ｅ）超音波処理時の安定性、
（ｆ）酵素消化に対する耐性（例えば、１つ以上の消化酵素に対する耐性）、
（ｇ）乳小胞にオリゴヌクレオチドを装填したときのヌクレアーゼ処理に対する耐性、ならびに
（ｈ）乳小胞にペプチドまたはタンパク質を装填したときのプロテアーゼ処理に対する耐性。
【００１６】
いくつかの例では、酵素消化は、１つ以上の消化酵素、例えば、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、および／またはヌクレアーゼによる消化を含む。非限定的な例としては、舌リパーゼ、唾液アミラーゼ、ペプシン、胃リパーゼ、トリプシン、キモトリプシン、カルドキシペプチダーゼ、エラスターゼ、膵リパーゼ、ホスホリパーゼ、ＤＮＡａｓｅ、ＲＮＡａｓｅ、膵アミラーゼ、エレプシン、マルターゼ、ラクターゼ、および／またはスクロースが挙げられる。
【００１７】
本明細書に記載の乳小胞は、好適な哺乳動物から得ることができ、例えば、ウシ乳、ヤギ乳、ラクダ乳、バッファロー乳、ヤク乳、または人乳であり得る。いくつかの実施形態では、乳小胞は、生乳、脱脂乳、初乳、均質乳、低温殺菌乳、酸乳、または乳清から得られる。本明細書に記載の乳小胞を単離するための例示的な方法には、分画超遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、親和性精製、接線流濾過、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１８】
いくつかの実施形態では、乳小胞は、ラクトソーム、乳脂肪球（ＭＦＧ）、エクソソーム、細胞外小胞、乳清粒子、乳清由来粒子、またはこれらの凝集体、あるいはこのような球、小胞、および／または粒子の組み合わせである。
【００１９】
本明細書に記載のカーゴ装填乳小胞のいずれにおいても、カーゴは生体分子、例えば、ペプチド、タンパク質、核酸、多糖類、または小分子である。非限定的な例示的なタンパク質、ポリペプチド、および／またはペプチドとしては、抗体、ホルモン、増殖因子、酵素、サイトカイン、ケモカイン、毒素、抗毒素、血液凝固因子、またはこれらの組み合わせが挙げられる。非限定的な例示的な核酸分子としては、干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ノンコーディングＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、またはこれらの組み合わせが挙げられる。特定のｉＲＮＡには、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが含まれる。本明細書に開示されるヌクレオチド分子のいずれか、またはそのフラグメントは、天然に存在するヌクレオチド配列を含み得る。あるいは、ヌクレオチド分子は、合成（非天然）であり得る。いくつかの実施形態では、カーゴは、乳小胞内に天然に存在しない生体分子である。いくつかの実施形態では、カーゴは、乳小胞に内因性であり得るが外から添加される生体分子である。
【００２０】
いくつかの実施形態では、生体分子は、疎水性部分にコンジュゲートすることができる。非限定的な例としては、脂質、ステロール、ステロイド、テルペン、コール酸、アダマンチン酢酸、１−ピレン酪酸、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、フェノキサジン、イソプレン誘導体（例えば、ソラネソール、ファルネソール、ユビキノール、ゲラノールなど）、トコフェロール、またはトコトリエノールが挙げられる。
【００２１】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、改変された、または天然に存在する乳小胞を含む、本明細書に記載の乳小胞のいずれかと、薬学的に許容される担体と、を含む薬学的組成物である。別の態様では、本明細書で提供されるのは、カーゴ装填され得る、改変された、または天然に存在する乳小胞を含む、本明細書に記載の乳小胞のいずれかと、薬学的に許容される担体と、を含む薬学的組成物である。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、経口投与のために製剤化され得る。
【００２２】
さらに別の実施形態では、本開示は、生体分子を対象に経口送達させる方法を提供し、方法は、それを必要とする対象に本明細書に記載のカーゴ装填乳小胞、またはそれを含む薬学的組成物を経口投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象は、標的疾患、例えば、過剰増殖性疾患、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー性疾患、心血管疾患、代謝性疾患、または神経変性疾患を有するか、有することが疑われる、またはそのリスクがあるヒト患者である。対象は、標的疾患に対して治療されているか、または追加の治療を受けている可能性がある。
【００２３】
さらに、本開示は、生体分子を乳小胞に装填することを可能にする条件下で、乳小胞を生体分子（例えば、本明細書に記載のもの）と接触させることを含む、カーゴ装填乳小胞を調製するための方法を提供する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、乳小胞を含む組成物を調製するための方法は、（ｉ）第１の乳サンプルを提供することと、（ｉｉ）第１の乳サンプルからカゼインおよび／またはラクトグロブリンを除去して、第２の乳サンプルを生成することと、（ｉｉｉ）第２の乳サンプルから乳小胞を単離して、乳小胞を含む組成物を生成することと、を含み得る。いくつかの例では、第１の乳サンプルは、ウシ乳、ヤギ乳、ラクダ乳、バッファロー乳、ヤク乳、または人乳からのものであり得る。あるいは、またはさらに、第１の乳サンプルは、生乳、脱脂乳、初乳、均質乳、乳清、または低温殺菌乳である。
【００２５】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法のいずれかにおける除去工程（ｉｉ）は、第１の乳サンプルを酸性化することによって実行することができる。あるいは、除去工程（ｉｉ）は、第１の乳サンプルをレンネット、例えば、子ウシ腸由来のレンネットなどの動物レンネット、または植物性レンネットなどの植物レンネットで凝固させることによって実行される。他の例では、除去工程（ｉｉ）は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、または別のＣａ２＋キレート剤によってカゼインミセルを破壊することによって実行することができる。
【００２６】
あるいは、またはさらに、本明細書に開示される方法のいずれかの単離工程（ｉｉｉ）は、超遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、親和性精製、接線流濾過、またはこれらの組み合わせによって実行することができる。
【００２７】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、以下の説明に記載されている。本発明の他の特徴または利点は、以下の図面およびいくつかの実施形態の詳細な説明から、ならびに添付の特許請求の範囲からも明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】超遠心分離によって乳および初乳粉末から細胞外小胞を単離するための例示的なプロセスを示す図である。
【図１Ｂ】サイズ排除クロマトグラフィーによって脱脂乳から単離されたエクソソームのタンパク質濃度を示すチャートである。
【図２Ａ】酸性化脱脂乳（ウシ）エクソソーム（２Ａ）およびヤギエクソソーム（２Ｂ）内で特定された代表的なタンパク質を示すチャートを含む。
【図２Ｂ】同上。
【図３Ａ】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による異なる流体システムにおけるエクソソーム内のタンパク質の安定性を示す写真である。図１Ａ：疑似胃液（ＳＧＦ）と０、１、または４時間インキュベートされた初乳、生乳、および脱脂乳からのエクソソームである。図１Ｂ：疑似腸液（ＳＩＦ）と０、１、または４時間インキュベートされた初乳、生乳、および脱脂乳からのエクソソームである。
【図３Ｂ】同上。
【図４】ＳＧＦ（ｐＨ約４．５）およびＳＩＦ（ｐＨ約７）と示されている様々な時間インキュベートされた後の、再構成された初乳粉末（ＣＭ）、生乳（ＲＭ）、脱脂乳（ＳＭ）、およびヤギ乳（ＧＭ）からのエクソソームの粒子濃度（粒子／ｍＬ）を示すチャートである。
【図５Ａ】ＳＧＦまたはＳＩＦと共に様々な時間インキュベートされたエクソソームの粒子サイズおよび粒子濃度を示すチャートを含む。図５Ａ：超遠心分離（ＵＣ）によって調製されたエクソソームまたは酸性化エクソソームの粒子サイズであり、エクソソームは、示された時間、ＳＧＦ（ｐＨ２）中でインキュベートされた。図５Ｂ：超遠心分離（ＵＣ）によって調製されたエクソソームまたは酸性化エクソソームの粒子サイズであり、エクソソームは、示された時間、ＳＧＦ（ｐＨ５）中でインキュベートされた。図５Ｃ：超遠心分離（ＵＣ）によって調製されたエクソソームまたは酸性化エクソソームの粒子濃度であり、エクソソームは、示された時間、ＳＧＦ（ｐＨ２）中でインキュベートされた。図５Ｄ：超遠心分離（ＵＣ）によって調製されたエクソソームまたは酸性化エクソソームの粒子濃度であり、エクソソームは、示された時間、ＳＧＦ（ｐＨ５）中でインキュベートされた。
【図５Ｂ】同上。
【図５Ｃ】同上。
【図５Ｄ】同上。
【図６Ａ】ＳＧＦまたはＳＩＦ中で、または示された化学的および物理的条件下でインキュベートされた後の、異なる乳供給源からのエクソソームの粒子濃度および粒子サイズを示すチャートを含む。図６Ａ：示された条件下で、また示された時間インキュベートされた生乳エクソソームの粒子濃度である。図６Ｂ：示された条件下で、時間もまた示された時間インキュベートされた生乳エクソソームの粒子サイズである。図６Ｃ：示された条件下で、時間もまた示された時間インキュベートされた脱脂乳エクソソームの粒子濃度である。図６Ｄ：示された条件下で、時間もまた示された時間インキュベートされた脱脂乳エクソソームの粒子サイズである。結果は、ナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ）から得られた。
【図６Ｂ】同上。
【図６Ｃ】同上。
【図６Ｄ】同上。
【図７Ａ】カゼイン除去を伴う方法によって調製された乳小胞組成物のタンパク質含有量を示す図を含む。図７Ａ：酸性化によるカゼイン除去および濾過または低速遠心分離とそれに続く接線流濾過（ＡＴＦＦ）、カゼイン除去および酸性化を伴う濾過または低速遠心分離とそれに続く接線流濾過およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＡＴＦＦ／ＳＥＣ）、超遠心分離（ＵＣ）、ＥＤＴＡによるカゼインミセルの破壊とそれに続く超遠心分離（ＥＵＣ）、ならびに酸性化によるカゼイン除去および濾過または低速遠心分離とそれに続く超遠心分離（ＡＵＣ）によって調製された乳小胞組成物のタンパク質含有量のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシー染色を示す写真である。図７Ｂ：乳エクソソーム（細胞外小胞）（ＭＥＶ）単離におけるカゼインバンド（２５〜３０ｋＤａ）の相対的存在量を示すチャートである。図７Ｃ：ＭＥＶ単離における低分子量バンド（ラクトグロブリン濃縮分画）の相対的存在量を示すチャートである。
【図７Ｂ】同上。
【図７Ｃ】同上。
【図８Ａ】植物性レンネットを使用して調製された乳小胞組成物のタンパク質含有量を示す図を含む。図８Ａ：ＡＴＦＦ／ＳＥＣおよび植物性レンネットを用いた凝固によるカゼイン除去ならびに機械的除去または濾過もしくは低速遠心分離とそれに続く接線流濾過およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＶＲ−ＴＦＦ／ＳＥＣ）によって調製された乳小胞組成物のタンパク質含有量のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＣｏｏｍａｓｓｉｅ染色を示す写真である。図８Ｂ：ＶＲＴＦＦ／ＳＥＣアプローチおよびＡＴＣＣ／ＳＥＣアプローチの様々なバッチによる乳小胞収量を示すチャートである。
【図８Ｂ】同上。
【図９】免疫共沈降とそれに続くウエスタンブロットを使用した、乳小胞上のＣＤ８１およびＢＴＮ１Ａ１の共存を示す写真である。
【図１０Ａ】凍結融解サイクルおよび温度処理に対する乳小胞の耐性を示す図を含む。図１０Ａ：凍結融解（ＦＴＣ）を５サイクル行った後、または温度処理（４℃で２４時間、６０℃で４０分間、または１００℃で１０分間）後の乳小胞組成物の粒子濃度を示すチャートである。図１０Ｂ：凍結融解（ＦＴＣ）を５サイクル行った後、または温度処理（４℃で２４時間、６０℃で４０分間、または１００℃で１０分間）後の乳小胞組成物の粒子サイズを示すチャートである。図１０Ｃ：ＳＤＳ／ＰＡＧＥによって決定される、凍結融解（ＦＴＣ）を５サイクル行った後、または温度処理（４℃で２４時間、６０℃で４０分間、または１００℃で１０分間）後の乳小胞組成物のタンパク質含有量を示す写真である。図１０Ｄ〜１０Ｆ：凍結融解を６サイクル行った後、または温度処理（４℃で２４時間、室温で９６時間、６０℃で４０分間、または１００℃で１０分間）後の乳小胞組成物の乳小胞マーカーＣＤ８１（図１０Ｄ）、ＣＤ９（図１０Ｅ）およびＢＴＮ１Ａ１（図１０Ｆ）を示す写真である。
【図１０Ｂ】同上。
【図１０Ｃ】同上。
【図１０Ｄ】同上。
【図１０Ｅ】同上。
【図１０Ｆ】同上。
【図１１Ａ】カゼインの除去が疑似胃液（ＳＧＦ）における乳小胞の安定性に影響を及ぼさないことを示すチャートを含む。図１１Ａおよび１１Ｂ：それぞれ、ｐＨ２のＳＧＦ中でインキュベートされたＵＣおよびＡＵＣによって調製された乳小胞のモード粒子サイズおよび粒子濃度を示すチャートである。図１１Ｃおよび１１Ｄ：それぞれ、ｐＨ５のＳＧＦ中でインキュベートされたＵＣおよびＡＵＣによって調製された乳小胞のモード粒子サイズおよび粒子濃度を示すチャートである。
【図１１Ｂ】同上。
【図１１Ｃ】同上。
【図１１Ｄ】同上。
【図１２】ＡＴＦＦ／ＳＥＣを介して調製された１乳小胞当たりの、コレステロール修飾オリゴヌクレオチドを装填する容量を示すチャートである。
【図１３Ａ】乳小胞が、それに装填されたオリゴヌクレオチドをＳ１ヌクレアーゼ消化から保護することを示す図を含む。図１３Ａ：乳小胞によるＳ１ヌクレアーゼからのオリゴヌクレオチドの保護を試験するためのプロセスを示す図である。ＭＢＣＤは、メチルベータシクロデキストリンを指す。図１３Ｂは、Ｓ１ヌクレアーゼ消化の前後のオリゴヌクレオチド分画を示す写真である。
【図１３Ｂ】同上。
【図１４Ａ】乳小胞によるオリゴヌクレオチドの保護を示す写真を含む。図１４Ａ：レンネットが、乳小胞に装填されたオリゴヌクレオチドのＳ１ヌクレアーゼ消化の乳小胞保護特性に影響を及ぼさないことを示す写真である。図１４Ｂ：ＶＲ−ＴＦＦ／ＳＥＣによって調製された乳小胞に装填されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の保護を示す写真である。
【図１４Ｂ】同上。
【図１５Ａ】乳小胞とは異なり、ＰＥＧ化リポソームがコレステロール修飾オリゴヌクレオチドをＳ１ヌクレアーゼから保護しないことを示す写真を含む。図１５Ａ：ＰＥＧ化リポソームと比較した乳小胞の保護特性を示す写真である。図１５Ｂ：オリゴヌクレオチドのカルシウム／エタノール沈殿物が、Ｓ１ヌクレアーゼからの効率的な保護をもたらさないことを示す写真である。図１５Ｃ：乳エクソソームの存在下でのコレステロール修飾オリゴヌクレオチドの保護を示す写真である。
【図１５Ｂ】同上。
【図１５Ｃ】同上。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
カーゴを装填した乳小胞またはビヒクル（カーゴ装填乳小胞またはビヒクル）であって、カーゴが、このような乳小胞またはビヒクルに外から添加または装填された生体分子である、カーゴを装填した乳小胞またはビヒクル、このようなものを含む薬学的組成物、生体分子をそれを必要とする対象に（例えば、経口的に）送達するための乳小胞の使用方法、ならびにカーゴ装填乳ビヒクルを製造するための方法が、本明細書に開示される。本明細書では、乳小胞と乳ビヒクルは同じ意味で使用されている。
【００３０】
Ｉ．乳小胞
本明細書で使用される乳小胞は、任意の適切な哺乳動物源（例えば、本明細書に記載されるもの）の乳中に見られる任意の粒子を指す。微小胞を含む乳小胞は、典型的には、約２０〜１０００ｎｍのサイズの脂質の小さな集合体の形態である。乳ビヒクル中の脂質は、多くの場合、膜構造を形成し、それに１つまたはタンパク質が会合している（例えば、脂質膜の表面に付着している、かつ／または脂質膜の内部に埋め込まれている）。
【００３１】
ｍｉＲＮＡ種を封入ないしは別の方法で運ぶことができる乳小胞、例えば乳エクソソームおよび他の小胞は、様々な治療薬の経口送達を可能にすることができる。本開示は、以前は経口投与できなかったか、または不十分な生物学的利用能、貯蔵不安定性、代謝、オフターゲット毒性、もしくはインビボでの分解などの他の送達課題に悩まされていた治療剤のための好適な送達ビヒクルの緊急の必要性を満たすために乳由来小胞を利用する。一態様では、本発明は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、核酸の類似体、抗体、ホルモン、および他のペプチドならびにタンパク質などの治療薬のビヒクルとして、乳に由来する小胞を提供する。一態様では、本発明は、診断薬または造影剤用のビヒクルとして乳に由来する小胞を提供する。
【００３２】
いくつかの実施形態では、乳小胞は、形状がほぼ円形または球形である。いくつかの実施形態では、乳小胞は、形状がほぼ卵形、円筒形、管状、立方体、立方体様、楕円体、または多面体である。いくつかの実施形態では、乳小胞は、乳小胞のクラスター、収集物、または形成物の一部であり得る。
【００３３】
いくつかの実施形態では、乳小胞は、薬剤が全身および／または組織の生物学的利用能を有するように、哺乳動物の腸を介して、１つ以上の薬剤、例えば、治療薬を輸送することができる。いくつかの実施形態では、乳小胞は、１つ以上の薬剤、例えば、治療薬を、１つ以上の哺乳動物組織に送達することができる。
【００３４】
また、本明細書に開示される乳小胞を含む組成物が提供され、組成物は、約４０％以下の約２５〜３０ｋＤａの分子量を有するタンパク質（例えば、カゼイン）の相対的存在量および／または約２５％以下の約１０〜２０ｋＤａの分子量を有するタンパク質（例えば、ラクトグロブリン）の相対的存在量を有する。
【００３５】
Ａ．乳小胞のサイズ
いくつかの説明では、例えば、直径が測定可能な直径を有する球形および他の形状の小胞などの関連する測定値である場合、「サイズ」および「直径」という用語は互換的に使用される。乳小胞は、約２０ｎｍ〜１０００ｎｍの直径またはサイズであり得る。いくつかの実施形態では、乳小胞は、約２０ｎｍ〜約２００ｎｍのサイズである。いくつかの実施形態では、乳小胞は、約２０ｎｍ〜約１９０ｎｍまたは約２５ｎｍ〜約１９０ｎｍのサイズである。いくつかの実施形態では、乳小胞は、約３０ｎｍ〜約１８０ｎｍのサイズである。いくつかの実施形態では、乳小胞は、約３５ｎｍ〜約１７０ｎｍのサイズである。いくつかの実施形態では、乳小胞は、約４０ｎｍ〜約１６０ｎｍのサイズである。いくつかの実施形態では、乳小胞は、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１４０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１２０ｎｍ、または約９０ｎｍ〜約１１０ｎｍのサイズである。いくつかの実施形態では、乳小胞は、約２０ｎｍ、約２５ｎｍ、約３０ｎｍ、約３５ｎｍ、約４０ｎｍ、約４５ｎｍ、約５０ｎｍ、約５５ｎｍ、約６０ｎｍ、約６５ｎｍ、約７０ｎｍ、約７５ｎｍ、約８０ｎｍ、約８５ｎｍ、約９０ｎｍ、約９５ｎｍ、約１００ｎｍ、約１０５ｎｍ、約１１０ｎｍ、約１１５ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１２５ｎｍ、約１３０ｎｍ、約１３５ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１４５ｎｍ、約１５０ｎｍ、約１５５ｎｍ、約１６０ｎｍ、約１６５ｎｍ、約１７０ｎｍ、約１７５ｎｍ、約１８０ｎｍ、約１８５ｎｍ、約１９０ｎｍ、約１９５ｎｍ、または約２００ｎｍのサイズもしくは直径である。いくつかの実施形態では、小胞組成物または乳から単離された、もしくは乳に由来する複数の小胞における平均小胞サイズは、約２０ｎｍ、約２５ｎｍ、約３０ｎｍ、約３５ｎｍ、約４０ｎｍ、約４５ｎｍ、約５０ｎｍ、約５５ｎｍ、約６０ｎｍ、約６５ｎｍ、約７０ｎｍ、約７５ｎｍ、約８０ｎｍ、約８５ｎｍ、約９０ｎｍ、約９５ｎｍ、約１００ｎｍ、約１０５ｎｍ、約１１０ｎｍ、約１１５ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１２５ｎｍ、約１３０ｎｍ、約１３５ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１４５ｎｍ、約１５０ｎｍ、約１５５ｎｍ、約１６０ｎｍ、約１６５ｎｍ、約１７０ｎｍ、約１７５ｎｍ、約１８０ｎｍ、約１８５ｎｍ、約１９０ｎｍ、約１９５ｎｍ、または約２００ｎｍの平均サイズである。いくつかの実施形態では、小胞組成物または乳から単離された、もしくは乳に由来する複数の小胞における平均小胞サイズは、約２０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約２０ｎｍ〜約１９０ｎｍ、約２５ｎｍ〜約１９０ｎｍ、約３０ｎｍ〜約１８０ｎｍ、約３５ｎｍ〜約１７０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約１６０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１５０、約６０〜約１４０ｎｍ、約７０〜約１３０、約８０〜約１２０、または約９０〜約１１０ｎｍの平均サイズである。
【００３６】
いくつかの実施形態では、乳小胞は、約２０ｎｍ〜約１００ｎｍのサイズである。いくつかの実施形態では、乳小胞は、約２５ｎｍ〜約９５ｎｍのサイズである。いくつかの実施形態では、乳小胞は、約２０ｎｍ〜約９０ｎｍのサイズである。いくつかの実施形態では、乳小胞は、約２０ｎｍ〜約８５ｎｍのサイズである。いくつかの実施形態では、乳小胞は、約２０ｎｍ〜約８０ｎｍのサイズである。いくつかの実施形態では、乳小胞は、約２０ｎｍ〜約７５ｎｍのサイズである。いくつかの実施形態では、乳小胞は、約２０ｎｍ〜約７０ｎｍのサイズである。いくつかの実施形態では、乳小胞は、約２５ｎｍ〜約８０ｎｍのサイズである。いくつかの実施形態では、乳小胞は、約３０ｎｍ〜約７０ｎｍのサイズである。いくつかの実施形態では、乳小胞は、約３０ｎｍ〜約６０ｎｍのサイズである。いくつかの実施形態では、乳小胞は、約４０ｎｍ〜約７０ｎｍのサイズである。いくつかの実施形態では、乳小胞は、約４０ｎｍ〜約６０ｎｍのサイズである。いくつかの実施形態では、小胞組成物または乳から単離された、もしくは乳に由来する複数の小胞における平均小胞サイズは、約２０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約２０ｎｍ〜約９５ｎｍ、約２０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約８５ｎｍ、約２０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約２０〜約７５ｎｍ、約２５ｎｍ〜約８５ｎｍ、約２５ｎｍ〜約８０、約２５〜約７５ｎｍ、約３０〜約８０ｎｍ、約３０〜約８５ｎｍ、約３０〜約７５ｎｍ、約４０〜約８０、約４０〜約８５ｎｍ、約４０〜約７５ｎｍ、約４５〜約８０ｎｍ、約４５〜約８５、約４５〜約７５ｎｍ、約５０〜約７５ｎｍ、約５０〜約８０ｎｍ、約５０〜約８５ｎｍ、約５５〜約７５ｎｍ、約５５〜約８０ｎｍ、約５５〜約８５ｎｍ、約６０〜約７５ｎｍ、約６０〜約８０ｎｍ、約６０〜約８５ｎｍ、約２５〜約７０ｎｍ、約３０〜約７０ｎｍ、約４０〜約７０ｎｍ、約５０〜約７０ｎｍ、約３０〜約６０ｎｍ、約３０〜約５０ｎｍの平均サイズである。
【００３７】
いくつかの実施形態では、乳小胞は、約８０ｎｍ〜約２００ｎｍのサイズである。いくつかの実施形態では、乳小胞は、約８５ｎｍ〜約１９５ｎｍのサイズである。いくつかの実施形態では、乳小胞は、約９０ｎｍ〜約１９０ｎｍのサイズである。いくつかの実施形態では、乳小胞は、約９５ｎｍ〜約１８５ｎｍのサイズである。いくつかの実施形態では、乳小胞は、約１００ｎｍ〜約１８０ｎｍのサイズである。いくつかの実施形態では、乳小胞は、約１０５ｎｍ〜約１７５ｎｍのサイズである。いくつかの実施形態では、乳小胞は、約１１０ｎｍ〜約１７０ｎｍのサイズである。いくつかの実施形態では、乳小胞は、約１１５ｎｍ〜約１６５ｎｍのサイズである。いくつかの実施形態では、乳小胞は、約１２０ｎｍ〜約１６０ｎｍのサイズである。いくつかの実施形態では、乳小胞は、約１２５ｎｍ〜約１５５ｎｍのサイズである。いくつかの実施形態では、乳小胞は、約１３０ｎｍ〜約１５０ｎｍのサイズである。いくつかの実施形態では、乳小胞は、約１３５ｎｍ〜約１４５ｎｍのサイズである。いくつかの実施形態では、小胞組成物または乳から単離された、もしくは乳に由来する複数の小胞における平均小胞サイズは、約８０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１９０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１８０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１７０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１６０ｎｍ、約８０〜約１５０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１４０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１３０、約８０〜約１２０ｎｍ、約８０〜約１１０ｎｍ、約８０〜約１００ｎｍ、約３０〜約７５ｎｍ、約４０〜約８０、約４０〜約８５ｎｍ、約４０〜約７５ｎｍ、約４５〜約８０ｎｍ、約４５〜約８５、約４５〜約７５ｎｍ、約５０〜約７５ｎｍ、約５０〜約８０ｎｍ、約５０〜約８５ｎｍ、約５５〜約７５ｎｍ、約５５〜約８０ｎｍ、約５５〜約８５ｎｍ、約６０〜約７５ｎｍ、約６０〜約８０ｎｍ、約６０〜約８５ｎｍ、約２５〜約７０、約３０〜約７０、約４０〜約７０ｎｍ、約５０〜約７０ｎｍ、約３０〜約６０ｎｍ、約３０〜約５０ｎｍの平均サイズである。
【００３８】
いくつかの実施形態では、乳小胞は、約２００ｎｍ超のサイズである。いくつかの実施形態では、乳小胞は、約２００〜約１０００ｎｍのサイズである。いくつかの実施形態では、乳小胞は、約２００〜約４００ｎｍのサイズ、例えば、約２００ｎｍ〜約２５０ｎｍ、約２５０ｎｍ〜約３００ｎｍ、約３００〜約３５０ｎｍ、約３５０ｎｍ〜約４００ｎｍのサイズである。いくつかの実施形態では、乳小胞は、約４００〜約６００ｎｍのサイズ、例えば、約４００ｎｍ〜約４５０ｎｍ、約４５０ｎｍ〜約５００ｎｍ、約５００〜約５５０ｎｍ、約５５０ｎｍ〜約６００ｎｍのサイズである。いくつかの実施形態では、乳小胞は、約６００〜約８００ｎｍのサイズ、例えば、約６００ｎｍ〜約６５０ｎｍ、約６５０ｎｍ〜約７００ｎｍ、約７００〜約７５０ｎｍ、約７５０ｎｍ〜約８００ｎｍのサイズである。いくつかの実施形態では、乳小胞は、約８００〜約１０００ｎｍのサイズ、例えば、約８００ｎｍ〜約８５０ｎｍ、約８５０ｎｍ〜約９００ｎｍ、約９００〜約９５０ｎｍ、約９５０ｎｍ〜約１０００ｎｍのサイズである。いくつかの実施形態では、小胞組成物または乳から単離された、もしくは乳に由来する複数の小胞における平均小胞サイズは、約２００ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約２００ｎｍ〜約９００ｎｍ、約２００ｎｍ〜約８００ｎｍ、約２００ｎｍ〜約７００ｎｍ、約２００ｎｍ〜約６００ｎｍ、約２００〜約５００ｎｍ、約２００ｎｍ〜約４００ｎｍ、約２００ｎｍ〜約３００、約３００〜約１０００ｎｍ、約３００〜約９００ｎｍ、約３００〜約８００ｎｍ、約３００〜約７００ｎｍ、約３００〜約６００、約３００〜約５００ｎｍ、約３００〜約４００ｎｍ、約４００〜約１０００ｎｍ、約４００〜約９００、約４００〜約８００ｎｍ、約４００〜約７００ｎｍ、約４００〜約６００ｎｍ、約４００〜約５００ｎｍ、約５００〜約１０００ｎｍ、約５００〜約９００ｎｍ、約５００〜約８００ｎｍ、約５００約７００ｎｍ、約５００〜約６００ｎｍ、約６００〜約１０００ｎｍ、約６００〜約９００ｎｍ、約６００〜約８００ｎｍ、約６００〜約７００ｎｍ、約７００〜約１０００ｎｍ、約７００〜約９００ｎｍ、約７００〜約８００ｎｍ、約８００〜約１０００ｎｍ、約８００〜約９００ｎｍ、約９００〜約１０００ｎｍの平均サイズである。
【００３９】
本明細書に開示される乳小胞のサイズは、動的光散乱（ＤＬＳ）またはナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ）によって決定される。
【００４０】
Ｂ．乳小胞の供給源
本明細書に記載の乳ビヒクルは、任意の形態の乳または任意の好適な哺乳動物の乳成分に由来することができる。本明細書で使用される「乳」という用語は、哺乳動物が出産した後に、それらの子に栄養を提供することを含むがこれらに限定されない、成熟した雌哺乳動物の乳腺によって産生されるタンパク質、脂肪、ラクトース、およびビタミンならびにミネラルを含有する不透明な液体を指す。いくつかの実施形態では、「乳」という用語は、抗体およびミネラルが豊富な分娩直後に哺乳動物の乳腺によって分泌される液体である初乳をさらに含める。乳ビヒクルは、霊長類（例えば、ヒト、類人猿、サル、キツネザル）、げっ歯類（例えば、マウス、ラットなど）、食肉目（例えば、ネコ、イヌなど）、ウサギ目（例えば、ウサギなど）、クジラ偶蹄目（例えば、ブタ、ウシ、シカ、ヒツジ、ラクダ、ヤギ、バッファロー、ヤクなど）、奇蹄目（例えば、ウマ、ロバなど）が挙げられるがこれらに限定されない任意の哺乳動物種に由来し得る。ある特定の実施形態では、乳もしくは初乳、またはそれに由来する小胞は、ヒト、ウシ、バッファロー、ブタ、ヤギ、ラット、マウス、ヒツジ、ラクダ、ロバ、ウマ、ラマ、アルパカ、ビキューナ、トナカイ、ムース、またはヤクの乳もしくは初乳からのものである。いくつかの実施形態では、乳はウシ乳である。
【００４１】
本明細書で使用される乳は、生乳（全乳）、初乳、脱脂乳、低温殺菌乳、均質乳、酸乳（カゼインが除去された乳）、または乳清などの乳成分を含む任意の形態の乳を含む。
【００４２】
いくつかの実施形態では、小胞は、新生児の出産直後に哺乳動物の乳腺によって産生される最初の形態の乳である初乳に由来する。いくつかの実施形態では、乳は、全乳または生乳であり、これは、さらなる処理なしに雌の哺乳動物から直接得られる。いくつかの実施形態では、乳は、通常、乳脂肪が実質的に除去されている、無脂肪乳または脱脂乳である。いくつかの実施形態では、乳は、減脂肪乳、例えば、１％または２％の乳脂肪を有する乳である。いくつかの実施形態では、乳は低温殺菌乳であり、これは通常、乳を加熱し、次いで急速に冷却して特定の細菌を排除することによって調製される。いくつかの実施形態では、乳は、ＨＴＳＴ（高温短時間殺菌）または瞬間殺菌されている。いくつかの実施形態では、乳は、ＵＨＴまたはＵＰ（超高温瞬間）殺菌されている。いくつかの実施形態では、乳は、滅菌乳、例えば、照射乳である。いくつかの実施形態では、乳は均質乳であり、これは、乳（例えば、低温殺菌乳）中の脂肪分子が、クリームとして分離するのではなく統合されたままになるように分解されたプロセスによって調製することができる。これは通常、添加剤を使用しない物理的なプロセスである。いくつかの実施形態では、乳は、均質化、低温殺菌、滅菌、および／または照射のうちの１つ以上の組み合わせを使用して処理される。
【００４３】
乳の均質化、低温殺菌、滅菌、および照射の方法は当技術分野において既知である。例えば、乳を均質化するための方法および機械装置またはメカニズムが既知である。均質化は、乳中の脂肪球が分解されてサイズが小さくなり、乳全体に均一に浮遊したままになる機械的プロセスである。均質化は、乳を小さな穴を通して高圧で押し出すことによって行われる。他の均質化方法は、固形物を粉砕（摩砕）するために、押出成形機、ハンマーミル、またはコロイドミルの使用を用いる。ＨＴＳＴ殺菌では、乳または初乳を、１６５ｏＦに１５秒間加熱する必要がある。ＵＨＴまたはＵＰ殺菌では、乳または初乳を２８０〜２８４ｏＦに２〜４秒間加熱する必要がある。乳または初乳は、コバルト元素（コバルト６０）またはセシウム元素（セシウム１３７）の放射性形態から放出されるガンマ線を使用するガンマ線放射、Ｘ線が、高エネルギーの電子流を標的物質（通常は重金属のうちの１つ）から食品に反射することによって生成されるＸ線放射、および高エネルギー電子の流れが電子加速器から食品に推進される電子ビームまたはｅ−ビーム放射を含む、様々な方法を使用して照射することができる。
【００４４】
いくつかの実施形態では、乳は凍結乾燥することができる。凍結乾燥乳は、製造業者の説明によって推奨される、および／または当技術分野において既知であるような標準的な手順を使用して、例えば、蒸留水を凍結乾燥乳と室温で混合して、乳が水に対して最終濃度５重量％で存在するようにすることによって再構成することができる。
【００４５】
本明細書に記載の乳小胞は、乳に見られる任意のタイプの粒子であり得る。例としては、ラクトソーム、乳脂肪球（ＭＦＧ）、乳エクソソーム、および乳清粒子が挙げられるが、これらに限定されない。ラクトソームは、トリアシルグリセロールを含有しないナノメートルサイズの脂質−タンパク質粒子（約２５ｎｍ）である。Ａｒｇｏｖ−Ａｒｇａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ，２０１０，５８（２１）：１１２３４。ＭＦＧは、リン脂質、糖脂質、糖タンパク質、炭水化物などの複数の生理活性化合物の供給源である乳産生細胞から分泌される、乳脂肪を取り囲む脂質−タンパク質膜を有する乳粒子である。乳脂肪球は、主に分泌乳腺上皮細胞（乳腺細胞）の膜に由来する関連タンパク質、炭水化物、および脂質を含有するリン脂質三層に取り囲まれている。この三層は、総称してＭＦＧＭとして知られている。ＭＦＧＭは、総乳脂肪球の推定２％〜６％を構成するにすぎないが、特に豊富なリン脂質源であり、総乳リン脂質の大部分を占めている。対照的に、乳脂肪球の内部コアは、主にトリアシルグリセロールで構成されている。Ｌｏｐｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１），Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ．Ｂ，Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ．８３（１）：２９−４１．Ｇａｌｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．５８（７）：４２５０−４２５７．Ｋｅｅｎａｎ，Ｔ．Ｗ．（２００１），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｍｍａｒｙ  Ｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ．６（３）：３６５−３７１。乳エクソソームとは、複数の細胞型から細胞外間隙に分泌される、乳に含まれる細胞外小胞を指す。通常、乳エクソソームは、約８０〜１６０ｎｍのサイズを有する。Ｓａｍｕｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．７：５９３３。乳清粒子は、乳清タンパク質を含有する乳中で見られる。
【００４６】
Ｃ．乳小胞の生物学的成分
本明細書に記載の乳小胞は、以下の分子：脂質、タンパク質、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、リン脂質、リンタンパク質、ペプチド、グリカン、脂肪酸、ステロール、ステロイド、およびこれらの組み合わせのうちの１つ以上を含み得る。典型的には、本明細書に記載の乳小胞は、１つ以上のタンパク質が会合している脂質ベースの膜を含む。タンパク質は脂質膜の表面に付着するか、脂質膜に埋め込まれ得る。あるいは、またはさらに、タンパク質は脂質膜によって封入され得る。場合によっては、乳小胞は、ｍｉＲＮＡなどの内在性ＲＮＡを含有してもよい。
【００４７】
乳小胞の脂質膜
乳小胞は、脂肪酸、ステロール、ステロイド、コレステロール、およびリン脂質から選択される１つ以上の脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の乳小胞の脂質膜は、セラミドもしくはその誘導体、ガングリオシド、アルファ−リゾホスファチジルイノシトール（ＬＰＩ）などのホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、コレステロール（ＣＨＯＬ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、グリセロールもしくはその誘導体、例えばジアシルグリセロール（ＤＡＧ）もしくはホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、スフィンゴ脂質、またはこれらの組み合わせを含んでもよい。セラミドは、スフィンゴシンと脂肪酸とから構成される脂質分子のファミリーである。例としては、セラミド（Ｃｅｒ）、ラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）、ヘキソシルセラミド（ＨｅｘＣｅｒ）、およびグロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）が挙げられるが、これらに限定されない。ガングリオシドは、１つ以上のシアル酸、例えば、ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）を含むグリコスフィゴリピド（ｇｌｙｃｏｓｐｈｉｇｏｌｉｐｉｄ）から構成される分子のファミリーである。例としては、ＧＭ１、ＧＭ２、ＧＭ３、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＤ２、ＧＴ１ｂ、ＧＴ３、およびＧＱ１が挙げられるが、これらに限定されない。スフィンゴ脂質は、スフィンゴイド塩基の骨格およびスフィンゴシンを含む脂肪族アミノアルコールのセットと、を含有する脂質の部類である。例としては、スフィンゴミエリン（ＳＭ）が挙げられる。
【００４８】
あるいは、またはさらに、乳小胞は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、コレステリルエステル（ＣＥ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、および／またはリゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）などの脂質を含有してもよい。
【００４９】
乳小胞のタンパク質、ポリペプチド、およびペプチド
本明細書に記載の乳小胞は、１つ以上のタンパク質を含み得、これはまた、本明細書に記載されている脂質膜と会合することができる。「タンパク質」、「ペプチド」、または「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって互いに連結されたアミノ酸残基のポリマーを含む。この用語は、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを指す。典型的には、タンパク質は少なくとも３個のアミノ酸の長さになる。タンパク質は、個々のタンパク質またはタンパク質の集合を指す場合がある。場合によっては、ペプチドは１０個以上であるが、５０個未満のアミノ酸を含有してもよい。場合によっては、ポリペプチドまたはタンパク質は、５０個以上のアミノ酸を含有してもよい。他の例では、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、約１０ｋＤａ〜約３０ｋＤａ、または約３０ｋＤａ〜約１５０または約３００ｋＤａの質量を有し得る。
【００５０】
非天然アミノ酸（すなわち、天然には存在しないがポリペプチド鎖に組み込むことができる化合物）および／または当技術分野において既知であるアミノ酸類似体を代わりに使用することができるが、例示的なタンパク質は天然アミノ酸のみを含有し得る。また、タンパク質中の１つ以上のアミノ酸は、例えば、炭水化物基、ヒドロキシル基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基などの化学物質、コンジュゲーションもしくは官能化のためのリンカー、または他の修飾の添加によって修飾され得る。タンパク質はまた、単一分子であり得るか、または多分子複合体であり得る。タンパク質は、天然に存在するタンパク質またはペプチドのフラグメントであってもよい。タンパク質は、天然に存在するタンパク質、組換えタンパク質、合成タンパク質、またはこれらの任意の組み合わせであってもよい。
【００５１】
いくつかの実施形態では、乳小胞は、以下のポリペプチドから選択される１つ以上のポリペプチドを含む：ブチロフィリンサブファミリー１、ブチロフィリンサブファミリー１メンバーＡ１、ブチロフィリンサブファミリー１メンバーＡ１アイソフォームＸ２、ブチロフィリンサブファミリー１メンバーＡ１アイソフォームＸ３、血清アルブミン、脂肪酸結合タンパク質、脂肪酸結合タンパク質（心臓）、ラクトアドヘリン、ラクトアドヘリンアイソフォームＸ１、β−ラクトグロビン、β−ラクトグロビン前駆体、ラクトトランスフェリン前駆体、アルファ−Ｓ１−カゼインアイソフォームＸ４、アルファ−Ｓ２−カゼイン前駆体、カゼイン、κ−カゼイン前駆体、アルファ−ラクトアルブミン前駆体、血小板糖タンパク質４、キサンチンデヒドロゲナーゼオキシダーゼ、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧ、ペリリピン、ペリリピン−２アイソフォームＸ１、ＲＡＢ１Ａ（ＲＡＳ癌遺伝子ファミリーメンバー）、ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼＡ、ｒａｓ関連タンパク質ＲＡＢ−１８、ＥｐＣａｍ、ＣＤ８１、ＴＳＧ１０１、ＨＳＰ７０、ポリマー免疫グロブリン受容体、ラクトフェリン、ＣＤ６３、Ｔｓｇ１０１、Ａｌｉｘ、ＣＤ８１、およびラクトペルオキシダーゼアイソフォームＸ１。いくつかの実施形態では、乳小胞はブチロフィリンを含む。いくつかの実施形態では、乳小胞はブチロフィリンサブファミリー１を含む。いくつかの実施形態では、乳小胞はブチロフィリンサブファミリー１メンバーＡ１を含む。いくつかの実施形態では、乳小胞はラクトアドヘリンを含む。いくつかの実施形態では、乳小胞は、以下のポリペプチドのうちの１つ以上を含む：ＣＤ８１、ＣＤ６３、Ｔｓｇ１０１、ＣＤ９、Ａｌｉｘ、ＥｐＣＡＭ。いくつかの実施形態では、乳小胞は、本明細書に開示されるタンパク質のいずれかのフラグメント、例えば、膜貫通フラグメントを含み得る。特定の例では、乳小胞は、ＢＴＮ１Ａ１、ＢＴＮ１Ａ２、またはこれらの組み合わせを含む。これらのポリペプチドのうちの１つ以上は、乳小胞の安定性、カーゴの装填、輸送、細胞もしくは組織への取り込み、および／または生物学的利用能を増強し得る。
【００５２】
乳小胞内のタンパク質部分のいずれかは、グリコシル化され得、すなわち、１つ以上のグリコシル化部位で１つ以上のグリカンに連結され得る。グリカンは、例えば、糖タンパク質、糖脂質、またはプロテオグリカンなどの複合糖質の炭水化物部分を含む、グリコシド的に連結された１つ以上の単糖からなる化合物である。グリカンは、単糖残基のホモポリマーまたはヘテロポリマーであり得、直鎖または分岐鎖であり得る。グリカンは、Ｏ−グリコシド結合（ペプチド鎖のセリンもしくはスレオニン残基の酸素に結合）またはＮ−結合型連鎖（Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒもしくはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（式中、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）の配列のアスパラギンの側鎖の窒素に結合）を有することができる。グリカンはレクチンに結合し、細胞間認識および細胞−マトリックス相互作用において多くの特定の生物学的役割を果たす。
【００５３】
本明細書に記載されるように乳小胞の生体膜に存在することができるグリコシル化タンパク質は、任意の適切なグリカンを含むことができる。グリカンの例としては、Ｎ−グリカン（例えば、Ｎ−アセチル−グルコサミンおよびＮ−グリカン鎖）、Ｏ−グリカン、Ｃ−グリカン、シアル酸、ガラクトースまたはマンノース残基、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、グリカンは、アルファ結合マンノース、Ｇａｌβ１〜３ＧａｌＮＡｃ１Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、ＧａｌＮＡｃ、またはシアル酸から選択される。いくつかの実施形態では、乳小胞は、ガラクトース、マンノース、Ｏ−グリカン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、および／またはＮ−グリカン鎖またはこれらの任意の組み合わせから選択されるグリカンを有する１つ以上の糖タンパク質または糖ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、乳小胞は、Ｄ−もしくはＬ−グルコース、エリスロース、フコース、ガラクトース、マンノース、リキソース、グロース、キシロース、アラビノース、リボース、２’−デオキシリボース、グルコサミン、ラクトサミン、ポリラクトサミン、グルクロン酸、シアル酸、シアリル−ルイスＸ（ＳＬｅｘ）、Ｎ−アセチル−グルコサミン、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、ノイラミン酸、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）、Ｎ−グリカン鎖、Ｏ−グリカン鎖、コア１、コア２、コア３、もしくはコア４構造、またはこれらのリン酸もしくは酢酸修飾類似体、またはこれらの組み合わせから選択されるグリカンを有する１つ以上の糖タンパク質または糖ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、乳小胞は、以下のグリカンのうちの１つ以上を有する糖タンパク質を含む：末端ｂ−ガラクトース、末端α−ガラクトース、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン。
【００５４】
場合によっては、本明細書に記載のグリカンのいずれかが、乳小胞中に遊離形態で存在し得、これもまた本開示の範囲内である。
【００５５】
いくつかの実施形態では、乳小胞またはそのようなものを含む組成物は、４０％以下（例えば、約４０％未満、約３５％、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％以下）の相対的存在量で約２５〜３０ｋＤａの分子量を有するタンパク質を含有する。場合によっては、約２５〜３０ｋＤａの分子量を有するタンパク質はカゼインである。いくつかの例では、乳小胞またはそのようなものを含む組成物は、カゼインを実質的に含まなくてもよく、例えば、従来の方法では検出できないか、または従来の方法では微量しか検出できない。あるいは、またはさらに、乳小胞またはそのようなものを含む組成物は、２５％以下（例えば、約２５％未満、約２０％、約１５％、約１０％、約５％以下）の相対的存在量で約１０〜２０ｋＤａの分子量を有するタンパク質を含有する。場合によっては、約１０〜２０ｋＤａの分子量を有するタンパク質はラクトグロブリンである。いくつかの例では、乳小胞またはそのようなものを含む組成物は、ラクトグロブリンを実質的に含まなくてもよい。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「カゼイン」という用語は、約２５〜３０ｋＤａの分子量を有する哺乳動物の乳に一般的に見られる関連するリンタンパク質のファミリーを指す。例示的な種としては、アルファ−Ｓ１−カゼイン（αＳ１）、アルファ−Ｓ２−カゼイン（αＳ２）、β−カゼイン、κ−カゼインが挙げられる。カゼインタンパク質は、当技術分野において既知のような特定の種、例えば、上記のものを指す場合がある。あるいは、それは少なくとも２つの異なる種の混合物を指す場合がある。場合によっては、カゼインは、哺乳動物の乳中に見られる全てのカゼインタンパク質の集団、例えば、本明細書に記載されているもの（例えば、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ヤク、バッファロー、ラクダ、またはヒト）のいずれかであり得る。
【００５７】
α−ラクトグロブリンおよびβ−ラクトグロブリンを含むラクトグロブリンは、約１０〜２０ｋＤａの分子量を有する哺乳動物の乳に見られる乳清タンパク質のファミリーである。β−ラクトグロブリンの分子量は、典型的には約１８ｋＤａであり、α−ラクトグロブリンの分子量は、典型的には約１５ｋＤａである。「ラクトグロブリン」という用語は、ある特定の種、例えば、α−ラクトグロブリンまたはβ−ラクトグロブリンを指す場合がある。あるいは、それは異なる種の混合物、例えば、α−ラクトグロブリンとβ−ラクトグロブリンとの混合物を指す場合がある。
【００５８】
本明細書に開示される他の特徴（例えば、安定性）に加えて、カゼインおよび／またはラクトグロブリンが枯渇した乳小胞または乳小胞を含む組成物は、従来の超遠心分離法によって調製された乳小胞と比較して、オリゴヌクレオチド装填能力などのより高いカーゴ装填能力を有する。
【００５９】
Ｄ．乳小胞の安定性
本明細書に記載の乳小胞は、例えば、低または高ｐＨ、超音波処理、酵素消化、凍結融解サイクル、温度処理などの過酷な条件下で安定である。安定または安定性は、乳小胞が、標準条件下での乳小胞と比較して、実質的に同じ無傷の物理構造および実質的に同じ機能を維持することを意味する。例えば、乳小胞のかなりの部分（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれ以上）は、酸性条件下（例えば、ｐＨ≦６．５）に一定期間置かれた場合、実質的な構造変化を有さないであろう。あるいは、またはさらに、乳小胞は、乳小胞のかなりの部分（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれ以上）が、消化酵素などの酵素の存在下で実質的な構造変化を有することがないように、酵素消化に耐性であり得る。さらに、凍結融解サイクルの複数のラウンド（例えば、最大６サイクル）の後に安定である乳小胞は、複数の凍結融解サイクル後に、実質的な構造変化および／または機能性変化を有さないかなりの部分（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれ以上）を有するであろう。本明細書に記載の乳小胞の少なくとも部分的な安定性のために、このような乳小胞は、ストレス状態または治療薬が不活性化、代謝、もしくは分解される条件、例えば唾液、消化酵素、胃の酸性状態、蠕動運動、および／または胃腸管で摂取された成分を分解する様々な消化酵素、例えば、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、およびヌクレアーゼへの曝露に耐えながらそれらのカーゴを送達することができる。
【００６０】
いくつかの実施形態では、乳小胞は、哺乳動物種の消化管または胃腸管において安定である。いくつかの実施形態では、乳小胞は、哺乳動物種の食道において安定である。いくつかの実施形態では、乳小胞は、哺乳動物種の胃において安定である。いくつかの実施形態では、乳小胞は、哺乳動物種の小腸において安定である。いくつかの実施形態では、乳小胞は、哺乳動物種の大腸において安定である。いくつかの実施形態では、乳小胞は、約ｐＨ１．５〜約ｐＨ７．５のｐＨ範囲で安定である。いくつかの実施形態では、乳小胞は、約ｐＨ２．５〜約ｐＨ７．５のｐＨ範囲で安定である。いくつかの実施形態では、乳小胞は、約ｐＨ４．０〜約ｐＨ７．５のｐＨ範囲で安定である。いくつかの実施形態では、乳小胞は、約ｐＨ４．５〜約ｐＨ７．０のｐＨ範囲で安定である。いくつかの実施形態では、乳小胞は、約ｐＨ１．５〜約ｐＨ３．５のｐＨ範囲で安定である。いくつかの実施形態では、乳小胞は、約ｐＨ２．５〜約ｐＨ３．５のｐＨ範囲で安定である。いくつかの実施形態では、乳小胞は、約ｐＨ２．５〜約ｐＨ６．０のｐＨ範囲で安定である。いくつかの実施形態では、乳小胞は、約ｐＨ４．５〜約ｐＨ６．０のｐＨ範囲で安定である。いくつかの実施形態では、乳小胞は、約ｐＨ６．０〜約ｐＨ７．５のｐＨ範囲で安定である。いくつかの実施形態では、乳小胞は、１．５〜７．５のｐＨ範囲で安定である。いくつかの実施形態では、乳小胞は、２．５〜７．５のｐＨ範囲で安定である。いくつかの実施形態では、乳小胞は、４．０〜７．５のｐＨ範囲で安定である。いくつかの実施形態では、乳小胞は、４．５〜７．０のｐＨ範囲で安定である。いくつかの実施形態では、乳小胞は、１．５〜３．５のｐＨ範囲で安定である。いくつかの実施形態では、乳小胞は、２．５〜３．５のｐＨ範囲で安定である。いくつかの実施形態では、乳小胞は、２．５〜ｐＨ６．０のｐＨ範囲で安定である。いくつかの実施形態では、乳小胞は、４．５〜６．０のｐＨ範囲で安定である。いくつかの実施形態では、乳小胞は、６．０〜７．５のｐＨ範囲で安定である。いくつかの実施形態では、乳小胞は、約ｐＨ１．５、ｐＨ２．０、ｐＨ２．５、ｐＨ３．０、ｐＨ３．５、ｐＨ４．０、ｐＨ４．５、ｐＨ５．０、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、またはｐＨ７．５で安定であり、かつ約ｐＨ１．５から約ｐＨ７．５の間で増加する。
【００６１】
いくつかの実施形態では、乳小胞は、例えば、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ヌクレアーゼ、ペプシン、ペプシノゲン、リパーゼ、トリプシン、キモトリプシン、アミラーゼ、胆汁およびパンクレアチン（膵臓における消化酵素）などの消化酵素の存在下で安定である。いくつかの実施形態では、乳小胞は、ペプシンまたはパンクレアチンの存在下で安定である。特定の実施形態では、本明細書に開示される乳小胞は、そこに装填されたカーゴ（例えば、オリゴヌクレオチド）を酵素消化（例えば、ヌクレアーゼ消化）から保護することができる。
【００６２】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される乳小胞は、凍結融解サイクルの複数のラウンドの後に安定である。例えば、乳小胞は、少なくとも２回の凍結融解サイクル、例えば、少なくとも３サイクル、少なくとも４サイクル、少なくとも５サイクル、または少なくとも６サイクル後に安定である。場合によっては、乳小胞は、最大１０回の凍結融解サイクル、たとえば、最大９サイクル、最大８サイクル、最大７サイクル、または最大６サイクルまで安定である。
【００６３】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される乳小胞は、温度処理後、例えば、低温（例えば、４℃で）で一定期間（例えば、１〜３日）または高温で一定期間、例えば、６０〜８０℃で３０分〜２時間、もしくは１００〜１２０℃で５〜２０分インキュベートされた後に安定である。
【００６４】
さらに、本明細書に開示される乳小胞は、コロイド安定性を有する。コロイド安定性とは、分散液の長期的な完全性、および沈降または粒子の凝集などの現象に抵抗するその能力を指す。これは典型的には、分散した相の粒子が沈殿物を生成せずに懸濁状態を維持できる時間によって定義される。
【００６５】
あるいは、またはさらに、乳小胞は、物理的プロセス、例えば、超音波処理、遠心分離、および濾過の下で安定であり得る。
【００６６】
Ｅ．乳小胞の改変
いくつかの実施形態では、乳小胞は、天然の（未改変の）乳小胞である。いくつかの実施形態では、乳小胞は、天然の乳小胞に存在する１つ以上の脂質、タンパク質、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、リン脂質、リンタンパク質、ペプチド、グリカン、脂肪酸、および／またはステロールを変更するように改変される。いくつかの実施形態では、乳小胞は、天然に存在する生体分子の数量、濃度、または量を変更することによって、例えば、天然に存在する生体分子（例えば、グリカンなどの炭水化物、脂肪酸、脂質）の添加または完全もしくは部分的除去によって改変される。いくつかの実施形態では、乳小胞は、天然には存在しない生体分子（例えば、グリカンなどの炭水化物、脂肪酸、脂質）の添加によって改変される。
【００６７】
いくつかの実施形態では、乳小胞は、乳小胞内の１つ以上の脂質を変更するように改変される。いくつかの実施形態では、乳小胞の脂質成分は、例えば、乳小胞内に天然に存在しない１つ以上の脂質の添加によって、または乳小胞内に天然に存在する１つ以上の脂質の量を変更（増加または減少）することによって、改変または変更される。いくつかの実施形態では、乳小胞は、以下の脂質のうちの１つ以上から選択される１つ以上の脂質を増加させるように改変される：ＬＰＥ、ＰＥＯ／ＰＥＰ、Ｃｅｒ、ＤＡＧ、ＧＭ２、ＰＡ、Ｇｂ３、ＬａｃＣｅｒ、ＧＭ１、ＧＭ３、ＨｅｘＣｅｒ、ＧＤ１、ＰＳ、Ｃｈｏｌ、ＬＰＩ、およびＳＭ。乳小胞の脂質成分は、例えば、リポソームおよび／または脂質ナノ粒子などの脂質二重層を有する別の小胞との融合を含む、既知の方法によって変更または改変することができる。
【００６８】
いくつかの実施形態では、乳小胞は、１つ以上の糖タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、乳小胞は、生体膜を含み、生体膜は、１つ以上の糖タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、生体膜は、乳小胞の天然の生体膜と比較して改変されている。いくつかの実施形態では、生体膜は、その天然糖タンパク質（複数可）のうちの１つ以上の数が増加するように改変されている。いくつかの実施形態では、生体膜は、その天然糖タンパク質（複数可）のうちの１つ以上の数が減少するように改変されている。いくつかの実施形態では、乳小胞は、天然の生体膜に天然に存在しない１つ以上の糖タンパク質を含むように改変されている。
【００６９】
いくつかの実施形態では、減少した数のその天然糖タンパク質（複数可）のうちの１つ以上を有する乳小胞は、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼまたはメタロプロテアーゼから選択される酵素を使用して生成される。いくつかの実施形態では、酵素は、トリプシン、ＡｓｐＮ、ＧｌｕＣ、ＡｒｇＣ、キモトリプシン、プロテイナーゼＫ、およびＬｙｓ−Ｃから選択される。いくつかの実施形態では、生体膜は、その天然糖タンパク質（複数可）のうちの１つ以上が排除されるか、または存在しないように改変される。いくつかの実施形態では、生体膜は、その天然の糖タンパク質（複数可）のうちの１つ以上が低減されるように改変される。
【００７０】
いくつかの実施形態では、乳小胞は、乳小胞内に存在するかまたは乳小胞に会合するグリコポリペプチド上に存在する炭水化物部分の量または含有量を変更するように改変される。いくつかの実施形態では、乳小胞は、乳小胞のグリカン含有量を増加、減少させ、ないしは別の方法で変更するように、例えば、乳小胞内に天然に存在しない１つ以上のグリカンの添加を介して、または乳小胞内に天然に存在する１つ以上のグリカンの量を変更する（増加または減少させる）ことによって、改変される。
【００７１】
いくつかの実施形態では、乳小胞の生体膜は、その天然の糖タンパク質（複数可）のうちの１つ以上が変更されるように改変される。いくつかの実施形態では、１つ以上の天然糖タンパク質は、糖タンパク質（複数可）上に存在するグリカン残基の数が増加するように変更される。いくつかの実施形態では、乳小胞は、１つ以上のグリカンを糖タンパク質に付加するグリコシル化を使用して生成される。いくつかの実施形態では、乳小胞は、以下のグリカンのうちの１つ以上を有する１つ以上の糖タンパク質を増加させるように改変される：末端ｂ−ガラクトース、末端α−ガラクトース、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン。
【００７２】
いくつかの実施形態では、１つ以上の天然糖タンパク質は、糖タンパク質（複数可）上に存在するグリカン残基の数が減少するように変更される。いくつかの実施形態では、グリカン残基の数は、糖タンパク質（複数可）上に存在する１つ以上のグリカン残基の切断によって減少される。いくつかの実施形態では、乳小胞は、グリコシダーゼ、エキソグリコシダーゼ、エンドグリコシダーゼ、グリコアミダーゼ、ノイラミニダーゼ、ガラクトシダーゼ、ペプチド：Ｎ−グリコシダーゼ（ＰＮＧａｓｅ）、グリコヒドロラーゼ、およびこれらの任意の組み合わせから選択される酵素を使用して生成され、乳エクソソームを酵素と接触させて、１つ以上のグリカンを除去する。いくつかの実施形態では、酵素は、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ、β（１−４）ガラクトシダーゼ、Ｏ−グリコシダーゼ、Ｎ−グリコシダーゼ、Ｎ−グリコヒドロラーゼ、Ｅｎｄｏ  Ｈ、Ｅｎｄｏ  Ｄ、Ｅｎｄｏ  Ｆ２、Ｅｎｄｏ  Ｆ３、およびこれらの任意の組み合わせから選択される。
【００７３】
いくつかの実施形態では、グリカン残基の数は、糖タンパク質（複数可）上に存在する１つ以上のグリカン残基の切断によって減少される。いくつかの実施形態では、乳小胞は、グリコシダーゼ、エキソグリコシダーゼ、エンドグリコシダーゼ、グリコアミダーゼ、ノイラミニダーゼ、ガラクトシダーゼ、ペプチド：Ｎ−グリコシダーゼ（ＰＮＧａｓｅ）、グリコヒドロラーゼ、およびこれらの任意の組み合わせから選択される酵素を使用して生成され、乳エクソソームを酵素と接触させて、１つ以上のグリカンを除去する。いくつかの実施形態では、酵素は、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ、β（１−４）ガラクトシダーゼ、Ｏ−グリコシダーゼ、Ｎ−グリコシダーゼ、Ｎ−グリコヒドロラーゼ、Ｅｎｄｏ  Ｈ、Ｅｎｄｏ  Ｄ、Ｅｎｄｏ  Ｆ２、Ｅｎｄｏ  Ｆ３、およびこれらの任意の組み合わせから選択される。
【００７４】
いくつかの実施形態では、２つ以上の天然糖タンパク質は、少なくとも１つの糖タンパク質が増加した数のグリカン残基を有し、かつ少なくとも１つの他の糖タンパク質が減少した数のグリカン残基を有するか、またはそのグリカン残基（複数可）を欠落するように変更され、増加した数のグリカン残基を有する糖タンパク質（複数可）が、減少した数のグリカン残基を有するか、またはグリカン残基を欠落している糖タンパク質とは異なる。いくつかの実施形態では、１つ以上の天然糖タンパク質は、それが修飾されたグリカンを含むように変更される。いくつかの実施形態では、修飾されたグリカンは、天然の糖タンパク質（複数可）におけるグリカンのものとは異なる少なくとも１つの炭水化物部分を含む。いくつかの実施形態では、修飾されたグリカンは、１つ以上のガラクトース、マンノース、Ｏ−グリカン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、および／またはＮ−グリカン鎖またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、グリカンは、１つ以上のＤ−もしくはＬ−グルコース、エリスロース、フコース、ガラクトース、マンノース、リキソース、グロース、キシロース、アラビノース、リボース、２’−デオキシリボース、グルコサミン、ラクトサミン、ポリラクトサミン、グルクロン酸、シアル酸、シアリル−ルイスＸ（ＳＬｅｘ）、Ｎ−アセチル−グルコサミン、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、ノイラミン酸、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）、Ｎ−グリカン鎖、Ｏ−グリカン鎖、コア１、コア２、コア３、もしくはコア４構造、またはこれらのリン酸もしくは酢酸修飾類似体、またはこれらの組み合わせを含むものから選択される。いくつかの実施形態では、修飾されたグリカンは、その炭水化物鎖（複数可）のうちの１つ以上の一部を欠いている。いくつかの実施形態では、修飾されたグリカンは、その炭水化物鎖（複数可）のうちの１つ以上を欠落している。いくつかの実施形態では、修飾されたグリカンは、１つ以上の変更された炭水化物鎖を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の天然糖タンパク質は、糖タンパク質（複数可）上に存在する少なくとも１つのグリカンが、天然糖タンパク質（複数可）中に天然に存在しないグリカンで置換されるように変更される。その関連する開示が、本明細書で参照される目的および主題のために参照により組み込まれる、ＷＯ２０１８／１７０３３２も参照されたい。
【００７５】
いくつかの実施形態では、乳小胞上のグリカン残基の数または含有量を変更することは、乳小胞のコロイド安定性に影響を与える。いくつかの実施形態では、乳小胞上のグリカン残基の数または含有量を変更することは、乳小胞とＧＩ細胞との間の相互作用を調節し、例えば、ＧＩ細胞における乳小胞の取り込みを増強させる。
【００７６】
本明細書に記載されるような乳小胞への改変は、従来の方法を介して行うことができる。例えば、天然源から単離された乳小胞は、サイズ分布を変化させるために、好適なサイズ、例えば、５０ｎＭ、７５ｎＭ、または１００ｎＭを有するフィルターを通しての押出成形（例えば、１回または複数回）に供されてもよい。別の例では、１つ以上の天然源から単離された乳小胞は、粒子の融合を引き起こすために（例えば、場合によっては高圧下での）均質化に供されてもよい。あるいは、他の天然もしくは人工の脂質膜小胞またはタンパク質ミセルもしくは凝集体の存在下で、天然源から単離された乳小胞に対して押出成形または均質化を行って、融合粒子を生成することができる。このような融合は、例えば、人工脂質膜粒子に存在し得る天然には存在しない脂質を組み込む、得られた粒子のタンパク質および／または脂質含有量の変化をもたらし得る。別の例では、追加の脂質は、乳小胞を目的の特定の脂質で飽和させることによって、または乳小胞を目的の脂質（例えば、コレステロール、リン脂質、セラミド、および／またはスフィンゴミエリン）を含有し得る脂質被膜とインキュベートすることによって、追加の脂質を天然源から単離された乳小胞中に組み込むことができる。
【００７７】
さらに、天然源から単離された乳小胞は、特定の脂質含有量を除去することによって改変され得る。例えば、メチル−ベータ−シクロデキストリンを使用して、乳小胞からコレステロールを抽出することができる。
【００７８】
さらに、乳小胞は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、グリカンなどの好適な部分を、従来の方法を介して乳小胞の表面タンパク質にコンジュゲートすることによって改変することができる。
【００７９】
ＩＩ．カーゴ装填乳小胞
本明細書に記載の乳小胞のいずれも、生体分子の対象への送達を容易にするために、生体分子（カーゴ）を運ぶためのビヒクルとして使用することができる。本明細書に開示される乳小胞の他の優れた特徴に加えて、乳小胞は、そこに装填されたカーゴを、例えば酵素による消化からの分解から保護することができる。したがって、本明細書では、診断および／または治療目的で、装填されたカーゴを対象に（例えば、経口的に）送達するために使用することができる、カーゴ装填乳小胞も提供される。場合によっては、カーゴは治療薬である。
【００８０】
いくつかの実施形態では、本開示は、カーゴ装填小胞または治療剤装填小胞を提供する。「カーゴ装填小胞」、「治療剤装填小胞」または「治療薬装填小胞」という用語は、治療薬および診断薬を含む１つ以上のカーゴの装填を含むことを意味する。本明細書で使用される場合、「カーゴ装填小胞」、「治療剤装填小胞」または「治療薬装填小胞」に関連して使用される「装填される」または「装填」という用語は、１つ以上のカーゴ（これは、（１）小胞内に封入されている、（２）小胞の脂質膜に会合するか、もしくは部分的に埋め込まれている（すなわち、小胞の内部の内側に部分的に突き出ている）、（３）脂質膜および会合成分の外側部分と会合しているか、もしくは結合している（すなわち、部分的に突出しているか、もしくは完全に小胞の外側にある）、または（４）小胞の脂質膜内に完全に配置されている（すなわち、脂質膜内に完全に含有されている）のいずれかである治療薬または診断薬などの生体分子であり得る）を有する小胞を指す。
【００８１】
「カーゴ装填」という用語は、上記（１）〜（４）の結果として得られるカーゴ装填または治療薬装填小胞のうちのいずれか１つ以上が達成されるように、外因性カーゴまたは治療薬を乳小胞に装填、添加、または含めるプロセスを指す。したがって、いくつかの実施形態では、治療剤は小胞内に封入されている。いくつかの実施形態では、治療薬は、小胞の脂質膜と会合しているか、または部分的に埋め込まれている（すなわち、小胞の内部に内側に部分的に突出している）。いくつかの実施形態では、治療薬は、脂質膜の外側部分と会合するか、またはそれに結合する（すなわち、小胞の外側に部分的に突出する）。いくつかの実施形態では、治療薬は、小胞の脂質膜内に完全に配置されている（すなわち、脂質膜内に完全に含有されている）。本明細書で使用される場合、「カーゴ」という用語は、例えば、生物製剤、小分子、治療薬、および／または診断薬を含む、乳小胞中にまたは乳小胞によって装填され得る任意の生体分子または薬剤を含むことを意味する。
【００８２】
いくつかの実施形態では、１つ以上のカーゴ、例えば、治療薬は、乳小胞の内部または内面に存在する。いくつかの実施形態では、乳小胞の内部または内面に存在する１つ以上の薬剤、例えば治療薬は、例えば、化学相互作用、電磁相互作用、疎水性相互作用、静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、連鎖、結合（水素結合、イオン結合、共有結合など）を介して、乳小胞と会合している。いくつかの実施形態では、乳小胞の内部または内面に存在する１つ以上の薬剤、例えば治療薬は、乳小胞と会合しておらず、例えば、薬剤は小胞に付着していない。いくつかの実施形態では、乳小胞は、空洞を有し、かつ／または嚢胞を形成する。いくつかの実施形態では、乳小胞は、１つ以上の薬剤、例えば、治療薬を封入することができる。
【００８３】
いくつかの実施形態では、１つ以上のカーゴ、例えば、治療薬は、小胞の外部または外面に存在する。いくつかの実施形態では、乳小胞の外部または外面に存在する１つ以上の薬剤、例えば治療薬は、例えば、化学相互作用、電磁相互作用、疎水性相互作用、静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、連鎖、結合（水素結合、イオン結合、共有結合など）を介して、乳小胞と会合している。いくつかの実施形態では、治療薬は、ステロール、ステロイド、または脂質などの疎水性基にコンジュゲートしている。いくつかの実施形態では、疎水性基は、乳小胞への治療薬の装填および／または標的組織もしくは器官への治療薬の送達を容易にする。
【００８４】
いくつかの実施形態では、乳小胞には、単一のカーゴ、例えば、単一の治療薬が装填されている。いくつかの実施形態では、乳小胞には、２つ（またはそれ以上）の異なる治療薬が装填されている。いくつかの実施形態では、乳小胞には、２つ以上の分子、または単一の治療薬もしくは２つ（またはそれ以上）の異なる治療薬のコピーが装填されている。いくつかの実施形態では、乳小胞には、３つ以上の分子、または単一の治療薬もしくは２つ（またはそれ以上）の異なる治療薬のコピーが装填されている。いくつかの実施形態では、乳小胞には、２〜５個の分子、または単一の治療薬もしくは２つ（またはそれ以上）の異なる治療薬のコピーが装填されている。いくつかの実施形態では、乳小胞またはその薬学的組成物は、１〜４，０００、１０〜４，０００、５０〜３，５００、１００〜３，０００、２００〜２，５００、３００〜１，５００、５００〜１，２００、７５０〜１，０００、１〜２，０００、１〜１，０００、１〜５００、１０〜４００、５０〜３００、１〜２５０、１〜１００、２〜５０、２〜２５、２〜１５、２〜１０、３〜５０、３〜２５、３〜２５、３〜１０、４〜５０、４〜２５、４〜１５、４〜１０、５〜５０、５〜２５、５〜１５、もしくは５〜１０個の分子、または単一の治療薬もしくは２つ（またはそれ以上）の異なる治療薬のコピー、またはこれらの任意の増分が装填されている。
【００８５】
Ａ．カーゴ
本明細書に記載のカーゴ装填乳小胞中のカーゴ（生体分子）は、任意のタイプのものであり得る。例としては、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物、および小分子が挙げられるが、これらに限定されない。カーゴは、例えば、本明細書に記載されるように改変された、乳小胞内に天然に存在しない生体分子であり得る。
【００８６】
いくつかの実施形態では、生体分子は生物学的薬剤である。本明細書で使用される場合、「生物製剤」という用語は、「生物学的治療薬」という用語と互換的に使用される。当業者であれば、このような生物製剤が本明細書に記載されるものを含むことを認識するであろう。いくつかの例では、生物学的治療薬は、アレルゲン、アジュバント、抗原、または免疫原であり得る。例としては、自己免疫抗原および食物アレルゲンが挙げられる。他の例では、生物学的治療薬は、抗体、ホルモン、因子、補因子、代謝酵素、免疫調節酵素、インターフェロン、インターロイキン、胃腸酵素、止血に関与する酵素もしくは因子、増殖調節酵素、ワクチン、抗血栓剤（ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ）、抗血栓溶解剤（ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ）、毒素、または抗毒素であり得る。
【００８７】
（ｉ）核酸
他の実施形態では、生体分子は、核酸、例えば、一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチド治療薬などのオリゴヌクレオチド治療薬である。いくつかの例では、オリゴヌクレオチド治療薬は、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、ｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡなどのアンチセンス、ｍｉＲＮＡ、モルホリノオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはｓｓＤＮＡ（ＬＮＡ、ＢＮＡ、２’−Ｏ−Ｍｅ−ＲＮＡ、２’−ＭＥＯ−ＲＮＡ、２’−Ｆ−ＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない天然および修飾ヌクレオチドを含む）、またはその類似体もしくはコンジュゲートであり得る。
【００８８】
いくつかの実施形態では、核酸は、約３０〜約２００ヌクレオチド（ｎｔ）の長さのｎｃＲＮＡ、または約２００〜約８００ｎｔの長さの長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、ｌｎｃＲＮＡは、長鎖遺伝子間ノンコーディングＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）、プレ転写物、プレｍｉＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、競合的内在性ＲＮＡ（ｃｅＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、偽遺伝子、ｒＲＮＡ、またはｔＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｎｃＲＮＡは、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、プライマリーｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）、または未成熟ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）から選択される。
【００８９】
いくつかの例では、本開示は、本明細書に記載の乳小胞に装填され、それによって送達され得る以下の脂質修飾二本鎖ＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、ＣＡ２５８１６５１またはＵＳ８，１３８，１６１に記載されているもののうちの１つであり、これらのそれぞれが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００９０】
ｎｃＲＮＡおよびＩｎｃＲＮＡ
改良されたバイオインフォマティクスと組み合わせた次世代シーケンシング技術の広範な用途は、量および多様性の両方の観点から、トランスクリプトームの複雑さを明らかにするのに役立っている。ヒトでは、ゲノムの７０〜９０％が転写されるが、実際にタンパク質をコードしているのは約２％にすぎない。したがって、体は、過去１０年間で多くの注目を集めてきた、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）と呼ばれる巨大な部類の非翻訳転写物を生成する。最近の研究は、ＩｎｃＲＮＡが多数の細胞シグナル伝達経路に関与し、分子メカニズムの幅広い選択を介して遺伝子発現を積極的に調節しているという事実を明らかにしている。
【００９１】
ヒトおよびその他の哺乳動物のゲノムは、数万の長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）を広範囲に転写する。公的研究コンソーシアムＧｅｎＣｏｄｅ（バージョン＃２７）によって生成されたデータの最新版は、ヒトゲノム中の１６，０００個をわずかに下回るｌｎｃＲＮＡをカタログ化し、２８，０００個近くの転写物を生成し、他のデータベースが含まれると、４０，０００個を超えるｌｎｃＲＮＡが知られている。
【００９２】
これらのｍＲＮＡ様の転写物は、遺伝子調節のほぼ全てのレベルにおいて、また胚発生などの生物学的プロセスにおいて制御的な役割を果たすことが判明している。異常に発現したｌｎｃＲＮＡが、正常な生理学的プロセスならびに癌を含む複数の病的状態において重要な役割を果たすことも示唆する証拠が相次いでいる。ｌｎｃＲＮＡは、伸張オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を欠く２００ヌクレオチドを超える（例えば、約２００〜約１２００ｎｔ、約２５００ｎｔ、またはそれ以上）の転写物として一般的に定義される群である。「ノンコーディングＲＮＡ」（ｎｃＲＮＡ）という用語は、ｌｎｃＲＮＡ、ならびに、例えば、約３０〜２００ｎｔなどの約２００ｎｔ未満のより短い転写物を含む。いくつかのｌｎｃＲＮＡ、例えば、ｇａｄｄ７４およびｌｎｃＲＮＡ−ＲｏＲ５は、サイクリン、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）、ＣＤＫ阻害剤、ｐ５３などの細胞周期調節因子を調節し、したがって細胞周期の進行に柔軟性および堅牢性の追加層を提供する。さらに、一部のｌｎｃＲＮＡは、動原体（ｋｉｎｅｔｏｃｈｏｒｅ）形成に不可欠である、セントロメアサテライト（ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｉｃ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ）ＲＮＡなどの有糸分裂プロセスに連結しており、したがって、ヒトおよびハエの有糸分裂中の染色体分離（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ）に重要である。別の核ｌｎｃＲＮＡであるＭＡ−ｌｉｎｃ１は、シスで機能して、細胞増殖の調節因子である隣接遺伝子Ｐｕｒαの発現を抑制することにより、Ｍ期出口を調節する。細胞周期の調節解除が、癌の発生と増殖に密接に関連しているため、細胞周期を調節するｌｎｃＲＮＡは発癌性を有している可能性がある。
【００９３】
したがって、いくつかの実施形態では、目的の特定の組織または器官などへのｎｃＲＮＡの送達は、異常なＲＮＡ発現レベルを修正するか、または疾患を引き起こすｌｎｃＲＮＡのレベルを調節する。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、治療剤がノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）である、治療剤装填乳小胞を提供する。いくつかの実施形態では、ｎｃＲＮＡは、約２００ヌクレオチド（ｎｔ）以上の長さの長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、治療剤は、約２５ｎｔまたは約３０ｎｔ〜約２００ｎｔの長さのｎｃＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｌｎｃＲＮＡは、約２００ｎｔ〜約１２００ｎｔの長さである。いくつかの実施形態では、ｌｎｃＲＮＡは、約２００ｎｔ〜約１，１００、約１，０００、約９００、約８００、約７００、約６００、約５００、約４００、または約３００ｎｔの長さである。
【００９４】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）
いくつかの実施形態では、治療剤はｍｉＲＮＡである。当業者によって認識されるように、ｍｉＲＮＡは、生物学的に活性な形態で、約１７〜約２５ヌクレオチド塩基（ｎｔ）の長さである小さなノンコーディングＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、約１７〜約２５、約１７〜約２４、約１７〜約２３、約１７〜約２２、約１７〜約２１、約１７〜約２０、約１７〜約１９、約１８〜約２５、約１８〜約２４、約１８〜約２３、約１８〜約２２、約１８〜約２１、約１８〜約２０、約１９〜約２５、約１９〜約２４、約１９〜約２３、約１９〜約２２、約１９〜約２１、約２０〜約２５、約２０〜約２４、約２０〜約２３、約２０〜約２２、約２１〜約２５、約２１〜約２４、約２１〜約２３、約２２〜約２５、約２２〜約２４、または約２２ｎｔの長さである。ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの翻訳を減少させることにより、転写後の遺伝子発現を調節する。ｍｉＲＮＡは負の調節因子として機能すると考えられている。
【００９５】
ｍｉＲＮＡには、一般に３つの形式がある：すなわち、プライマリーｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）、未成熟型ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）、および成熟型ｍｉＲＮＡである。プライマリーｍｉＲＮＡは、約数百の塩基から１ｋｂを超えるステムループ構造の転写物として発現される。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ転写物は、ステムループの基部近くのステムの両方の鎖を切断するＲＮａｓｅＩＩエンドヌクレアーゼであるドローシャ（Ｄｒｏｓｈａ）によって核内で切断される。ドローシャは、ＲＮＡ二本鎖を千鳥状に切断し、３’末端に５’リン酸および２ｎｔオーバーハングを残す。切断された産物である未成熟型ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）は、折り返し方式で形成されたヘアピン構造を有して、約６０〜約１１０ｎｔの長さである。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、Ｒａｎ−ＧＴＰとＥｘｐｏｒｔｉｎ−５によって核から細胞質に輸送される。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、細胞質内でダイサー（Ｄｉｃｅｒ）と呼ばれる別のＲＮａｓｅＩＩエンドヌクレアーゼによってさらに処理される。ダイサーは５’リン酸および３’オーバーハングを認識し、ステムループ接合部でループを切断してｍｉＲＮＡ二本鎖を形成する。ｍｉＲＮＡ二本鎖はＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に結合し、アンチセンス鎖が優先的に分解され、センス鎖成熟ｍｉＲＮＡがＲＩＳＣをその標的部位に向ける。ｍｉＲＮＡの生物学的に活性な形態であり、約１７〜約２５ｎｔの長さであるものは、成熟ｍｉＲＮＡである。いくつかの実施形態では、現在開示されている主題の微小胞によって封入されたｍｉＲＮＡは、Ｔ細胞およびＢ細胞の成熟ならびに自然免疫応答の調節因子として作用することが知られているｍｉＲ−１５５、または好中球の増殖と活性化の調節因子として知られているｍｉＲ−２２３から選択される。ｉＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）などの他の非天然ｍｉＲＮＡまたは天然もしくは非天然オリゴヌクレオチドは、乳由来の小胞中に存在する可能性があり、本明細書で使用される用語として、封入された治療薬を表すことができる。
【００９６】
短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）
いくつかの実施形態では、治療剤は、ｓｉＲＮＡである。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、短鎖干渉ＲＮＡまたはサイレンシングＲＮＡとも呼ばれ、２０〜２５塩基対の長さ（ｍｉＲＮＡと同様の長さ）の二本鎖ＲＮＡ分子の部類である。ｓｉＲＮＡは通常、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を介して生物学的効果を発揮する。ｓｉＲＮＡは一般に、リボヌクレアーゼダイサーによるより長い前駆体ＲＮＡの酵素的切断によって生成される２ヌクレオチドのオーバーハングを有している。ｓｉＲＮＡは、特定の遺伝子の発現を、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を介した破壊のためにそれらのＲＮＡを標的とすることにより制限することができる。転写後にｍＲＮＡを分解し、翻訳を妨げることにより、相補的なヌクレオチド配列を有する特定の遺伝子の発現を妨害する。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ関連の経路で抗ウイルスメカニズムとして作用したり、またはゲノムのクロマチン構造の形成に役割を果たしたりすることもある。
【００９７】
いくつかの例では、ＲＮＡは、修飾リボヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡ分子であり、該ｓｉＲＮＡは、（ａ）その３’末端に２塩基のデオキシヌクレオチド「ＴＴ」配列を含み、（ｂ）ＲＮａｓｅに耐性であり、（ｃ）ウイルス複製を阻害することが可能である。いくつかの例では、ｓｉＲＮＡ分子は、２’修飾されている。いくつかの実施形態では、２’修飾は、フルオロ修飾、メチル修飾、メトキシエチル修飾、およびプロピル修飾からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、フルオロ修飾は、２’−フルオロ修飾または２’、または２’−フルオロ修飾である。
【００９８】
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡの少なくとも１つのピリミジンが修飾されており、該ピリミジンは、シトシン、シトシンの誘導体、ウラシル、またはウラシルの誘導体である。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ中のピリミジンの全てが修飾されている。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡの両方の鎖は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、約１０〜約３０個のリボヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、約１９〜約２３個のリボヌクレオチドからなる。
【００９９】
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ５、ｓｉＲＮＡＣ１、ｓｉＲＮＡＣ２、ｓｉＲＮＡ５Ｂ１、ｓｉＲＮＡ５Ｂ２またはｓｉＲＮＡ５Ｂ４のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、少なくとも１つの受容体結合リガンドに連結されている。いくつかの実施形態では、受容体結合リガンドは、ｓｉＲＮＡ分子の５’末端または３’末端に結合している。いくつかの実施形態では、受容体結合リガンドは、該ｓｉＲＮＡ分子の複数の末端に結合している。いくつかの実施形態では、受容体結合リガンドは、コレステロール、ＨＢＶ表面抗原、および低密度リポタンパク質からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、受容体結合リガンドはコレステロールである。
【０１００】
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、少なくとも１つのリボヌクレオチドの２’位置での修飾を含み、この少なくとも１つのリボヌクレオチドの２’位置での修飾は、該ｓｉＲＮＡを分解に対して耐性にする。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリボヌクレオチドの２’位置での修飾は、２’−フルオロ修飾または２’，２’−フルオロ修飾である。
【０１０１】
一実施形態では、本開示は、標的細胞におけるＲＮＡ干渉を媒介する二本鎖（ｄｓＲＮＡ）分子を提供し、ｄｓＲＮＡ中のピリミジンのうちの１つ以上の骨格糖が、２’−フルオリン、２’−Ｏ−メチル、２’−ＭＯＥ、ホスホロチオエート結合（例えば、それらの立体異性体およびホスホジエーテル結合の他の修飾、架橋ヌクレオチド、例えば、ロックされたヌクレオチドを含む）、またはこれらの組み合わせを含むように修飾されている。場合によっては、修飾には、逆塩基および／または脱塩基ヌクレオチドが含まれ得る。あるいは、またはさらに、修飾には、ガンマ−ＰＮＡおよび／またはＰＮＡ−オリゴペプチドハイブリッドなどのペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれ得る。本明細書に記載の改変のいずれも、該当する場合、本明細書に開示されている他の種類の核酸分子に適用することができる。
【０１０２】
本明細書に開示される核酸ベースのカーゴ分子のいずれも、適用可能な任意の位置に１つ以上の修飾を含み得る。例えば、修飾の非限定的な例は、糖の２’位で修飾された１つ以上のヌクレオチド、例えば、２’−Ｏアルキル、２’−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、または２’−フルオロ修飾ヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子への修飾は、１つ以上のピリミジン、脱塩基残基、デソキシヌクレオチド、またはＲＮＡ分子の３’末端での逆塩基のリボース上の２’−フルオロ、２’−アミノまたは２’−Ｏ−メチル修飾を含み得る。あるいは、またはさらに、核酸ベースのカーゴ分子は、修飾された核酸分子が、修飾されていない対応物と比較してヌクレアーゼ消化に対してより耐性であり得るように、骨格に１つ以上の修飾を含み得る。このような骨格修飾としては、ホスホロチオエート、ホスホロチオ、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間結合、または短鎖ヘテロ原子もしくは複素環糖間結合が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかのオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチド、およびヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオチド、特に、ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２、ＣＨ、〜Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られている）、ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２、ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２およびＯ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２骨格（天然のホスホジエステル骨格は、Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨとして表される）；アミド骨格（Ｄｅ  Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｅ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２８：３６６−３７４；１９９５）；モルホリノ骨格構造（米国特許第５，０３４，５０６号）；ペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格（オリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格がポリアミドバックボーンに置き換えられ、ヌクレオチドがポリアミド骨格のアザ窒素原子に直接または間接的に結合する；例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７；１９９１を参照されたい）である。リン含有結合としては、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルならびに他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および通常の３’−５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’−５’結合類似体、ならびにヌクレオチド単位の隣接する対が３’−５’から５’−３’に、または２’−５’から５’−２’に連結されている逆極性を有するものが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、その関連する開示が、本明細書で参照される目的および主題のために参照により組み込まれる、ＷＯ２０１７／０７７３８６を参照されたい。
【０１０３】
一実施形態では、本明細書に記載の乳小胞のいずれかにおける核酸分子は、標的細胞におけるＲＮＡ干渉を媒介する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であり、ｓｉＲＮＡ中のピリミジンのうちの１つ以上の骨格糖が、２’−フッ素を含むように修飾されている。一実施形態では、第１および第２の実施形態のｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ分子中のピリミジンの骨格糖の全てが、２’−フッ素を含むように修飾される。一実施形態では、第３の実施形態の２’−フッ素のｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの３’末端に２塩基のデオキシヌクレオチド「ＴＴ」配列を含むようにさらに修飾される。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、約１０〜約３０ヌクレオチド長であり、標的細胞におけるＲＮＡ干渉を媒介する。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、ヌクレアーゼ分解に対する安定性の増加を与えるように化学修飾されるが、標的核酸に結合する能力を保持する。
【０１０５】
乳小胞に装填された核酸分子はまた、乳小胞が由来する乳中に天然に存在しない可能性がある。追加の例としては、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、プレ転写物、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、競合的内在性ＲＮＡ（ｃｅＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、偽遺伝子、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡまたは本明細書に記載の他の核酸およびその類似体が挙げられる。
【０１０６】
本明細書に記載の核酸分子は、以下のポリペプチドをコードするＲＮＡを標的とし得る：血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ）、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、凝固因子ＶＩＩ（ＦＶＩＩ）、低酸素誘導因子１、アルファサブユニット（Ｈｉｆ−１α）、胎盤増殖因子（ＰＬＧＦ）、ラミンＡ／Ｃ、および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）。例示的な一本鎖オリゴヌクレオチド剤を以下の表１に示す。追加の適切なｍｉＲＮＡ標的は、例えば、Ｊｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：１８６２−１８７９，２００４（ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ＰＬｏＳ  ３：１３２８，２００５）、およびＴｈｅ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ  Ｓ．，ＮＡＲ  ３２：Ｄ１０９−Ｄ１１１，２００４）に記載されている。
【０１０７】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）
いくつかの実施形態では、治療用カーゴは、天然に存在するｍＲＮＡまたは修飾ｍＲＮＡ分子であり得るｍＲＮＡ分子である。いくつかの例では、ｍＲＮＡは、天然に存在しないヌクレオシドおよび／またはヌクレオチドの導入によって修飾され得る。本明細書に開示されるように、任意の修飾ヌクレオシドおよび／またはヌクレオチドを使用して、修飾ｍＲＮＡを作製することができる。例としては、関連する開示が、本明細書で参照される目的および主題のために参照により組み込まれる、ＵＳ２０１６／０２５６５７３に記載されているものが挙げられる。他の例では、ｍＲＮＡ分子は、低減したウラシル含有量を有するように改変され得る。例えば、その関連する開示が、本明細書で参照される目的および主題のために参照により組み込まれる、ＵＳ２０１６／０２３７１３４も参照されたい。
【０１０８】
（ｉｉ）アレルゲン、アジュバント、抗原、または免疫原
いくつかの実施形態では、治療薬は、アレルゲン、アジュバント、抗原、または免疫原である。いくつかの実施形態では、アレルゲン、抗原、または免疫原は、アレルゲン耐性を増加させるか、あるいはアナフィラキシー、気管支炎症、気道狭窄、または喘息などのアレルギーもしくは免疫応答の可能性を低減するために所望の免疫応答を誘発する。いくつかの実施形態では、アレルゲン、抗原、または免疫原は、ウイルスもしくは病原体の耐性を増加させるか、または抗癌免疫応答を誘発するために、所望の免疫応答を誘発する。いくつかの実施形態では、アレルゲンまたは抗原は、アレルギー性もしくは自己免疫疾患を治療するために所望の免疫応答を誘発する。いくつかの実施形態では、治療薬は、自己免疫疾患を治療するための免疫寛容を増加させるか、または自己免疫疾患を治療するための自己免疫応答を減少させる。
【０１０９】
本明細書で使用される場合、「アジュバント」という用語は、以下のようなメカニズムによって免疫応答（例えば、ワクチン、自己免疫、または癌の状況における）を増強する任意の物質を指す：抗原曝露の部位へのプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）の動員；遅延／持続放出（デポ生成）による抗原の送達の増加；サイトカイン産生による免疫調節（Ｔｈ１またはＴｈ２応答の選択）；Ｔ細胞応答の誘導（ペプチド−ＭＨＣ複合体の長期曝露（シグナル１）ならびにＡＰＣ表面でのＴ細胞活性化共刺激因子の発現の刺激（シグナル２）およびターゲティング（例えば、ＡＰＣ上のレクチン受容体を標的とする炭水化物アジュバント）など。
【表１】
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【０１１０】
いくつかの実施形態では、アレルゲンは、食物、動物（例えば、ウヌ、ネコ、もしくはウサギなどのペット）、または環境アレルゲン（塵埃、花粉、またはカビなど）から選択される。いくつかの実施形態では、アレルゲンは、アワビ（ａｂａｌｏｎｅ）、アワビ（ｐｅｒｌｅｍｏｅｎ）、アセロラ、スケトウダラ、アーモンド、アニシード（ａｎｉｓｅｅｄ）、リンゴ、アプリコット、アボカド、バナナ、大麦、ピーマン、ブラジルナッツ、そば粉（ｂｕｃｋｗｈｅａｔ）、キャベツ、カモミール、コイ、ニンジン、カゼイン、カシュー、トウゴマ、セロリ、根セロリ、サクランボ、クリの実、ヒヨコマメ、ガルバンゾ、ベンガルグラム、ココア、ココナッツ、タラ、綿実、コジェッティ、ズッキーニ、カニ、ナツメヤシの実、卵（ケイラン）、イチジク、魚、亜麻の種（ｆｌａｘ  ｓｅｅｄ）、亜麻仁（ｌｉｎｓｅｅｄ）、カエル、ガーデンプラム、ニンニク、グルテン、ブドウ、ヘーゼルナッツ、キウイフルーツ（チャイニーズグーズベリー）、マメ科植物、レンズマメ、レタス、ロブスター、ハウチワマメ（Ｌｕｐｉｎもしくはｌｕｐｉｎｅ）、ライチ、サバ、トウモロコシ（コーン）、マンゴー、メロン、乳（ウシ乳）、スケトウダラ、マスタード、オート麦、カキ、モモ、ピーナッツ（または他の挽いたナッツもしくはモンキーナッツ）、ナシ、ペカン、柿、ピスタチオ、松の実、パイナップル、ザクロ、ケシの種、ジャガイモ、カボチャ、米、ライ麦、サーモン、ゴマ、甲殻類（例えば、甲殻類動物、黒クルマエビ、茶色エビ、ヨシエビ（ｇｒｅａｓｙｂａｃｋ  ｓｈｒｉｍｐ）、インドエビ、ネプチューンローズエビ、白エビ）、カタツムリ、ダイズ（ｓｏｙ）、大豆（ｓｏｙｂｅａｎ）（ｓｏｙａ）、イカ、イチゴ、二酸化硫黄（亜硫酸塩）、ヒマワリの種、トマト、木の実、マグロ、カブ、クルミ、または小麦（例えば、製パン用小麦、パスタ小麦、カムット、スペルト小麦）から選択される。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、アレルゲンは、アレルゲンタンパク質、ペプチド、オリゴ糖もしくは多糖、毒素、毒液、核酸、またはｗｗｗ．ａｌｌｅｒｇｅｎｏｎｌｉｎｅ．ｏｒｇ／ｄａｔａｂａｓｅｂｒｏｗｓｅ．ｓｈｔｍｌに列挙されているものなどの他のアレルゲンから選択される。いくつかの実施形態では、アレルゲンは、空中浮遊真菌、ダニもしくは昆虫アレルゲン、植物アレルゲン、毒液もしくは唾液アレルゲン、動物アレルゲン、接触アレルゲン、寄生虫アレルゲン、または細菌性気道アレルゲンから選択される。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、治療薬は自己免疫抗原である。いくつかの実施形態では、自己免疫抗原は、以下の表２に列挙される疾患、障害、または病態に対する抗原から選択される。いくつかの実施形態では、抗原は、以下の表２に列挙されたものから選択される。
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【０１１３】
本発明で使用するための追加の例示的な治療薬、それらの機能、および臨床使用の例を、以下の表３および表４に提供する。
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【表３−７】
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【表３−８】
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【表３−９】
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【表３−１０】
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【表３−１１】
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【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【表４−５】
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【表４−６】
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【表４−７】
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【表４−８】
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【表４−９】
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【表４−１０】
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【０１１４】
いくつかの実施形態では、治療薬は、リラグルチド（Ｖｉｃｔｏｚａ（登録商標）、Ｓａｘｅｎｄａ（登録商標））、セマグルチド、エキセナチド（Ｂｙｅｔｔａ（登録商標）、Ｂｙｄｕｒｅｏｎ（登録商標））、もしくはデュラグルチド（Ｔｒｕｌｉｃｉｔｙ（登録商標））などのインクレチン（例えば、ヒトインクレチン）のインクレチン模倣物もしくは誘導体；またはオクトレオチド、カルシトニン（サケカルシトニンを含む）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、テリパラチド（ＰＴＨの組換え型）インスリン、エクセナチド、リラグルチド、リキシセナチド、アルビグルチドおよび／もしくはデュラグルチドなどのＧＬＰ−１のペプチドアゴニスト、ＧＬＰ−１／ＧＩＰコアゴニスト、ＧＬＰ−２アゴニスト、またはペプチドＧＰＣＲアゴニストである。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、生体分子は脳反応性抗原である。以下の表５に例を示す。
【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【０１１６】
本明細書に記載のカーゴ装填乳小胞の作製で使用するための他の生物学的分子は、例えば、ＷＯ２０１８／１０２３９７ならびにそこに引用されている参考文献に見出すことができ、それぞれの関連する開示は、本明細書で参照される目的または主題のために参照により組み込まれる。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、生体分子カーゴはペプチドである。いくつかの実施形態では、ペプチドは、乳小胞に封入されている。いくつかの実施形態では、ペプチドは、乳小胞と会合している。いくつかの実施形態では、乳小胞に会合するか、または封入されたペプチドカーゴは、例えば消化酵素による酵素消化から保護される。いくつかの実施形態では、ペプチドカーゴは、胃の酸性条件、蠕動運動、および／または胃腸管で摂取された成分を分解する様々なプロテアーゼへの曝露から保護される。
【０１１８】
Ｂ．カーゴの修飾
いくつかの実施形態では、乳小胞に装填されたカーゴは、例えば、疎水性部分によって修飾されて、乳小胞によるその取り込みを増強することができる。いくつかの実施形態では、疎水性部分は、脂質、ステロール、ステロイド、テルペン、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジンから選択される。
【０１１９】
本明細書に記載の生体分子のいずれも、本明細書にも記載されているように、疎水性基と（例えば、共有結合的に）コンジュゲートされ得る。例としては、ｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ホルモン、抗体などのタンパク質もしくは本明細書に記載の他のもの、ペプチド模倣物、または小分子が挙げられる。いくつかの実施形態では、治療薬は、脂質またはステロイドもしくは他の疎水性基を含むように修飾されたｓｉＲＮＡであり、例えば、以下に詳細に記載されるものである。いくつかの実施形態では、疎水性基は、脂肪酸もしくはステロールまたはコレステロールなどのステロイドである。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、治療薬は、ネロリドール、ファルネソール、リモネン、リナロール、ゲラニオール、カルボン、フェンコン、またはメントールなどのテルペン；パルミチン酸またはミリスチン酸などの脂質；コレステロール；オレイル；レチニル；コレステリル残基；コール酸；アダマンタン酢酸；１−ピレン酪酸；ジヒドロテストステロン；１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール；ゲラニルオキシヘキシル基；ヘキサデシルグリセロール；ゲラニルオキシヘキシル基；ヘキサデシルグリセロール；ボルネオール；１，３−プロパンジオール；ヘプタデシル基；Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸；Ｏ３−（オレオイル）コレン酸；ジメトキシトリチル；またはフェノキサジンから選択される疎水性基を含むか、または含むように修飾される。いくつかの実施形態では、疎水性基はコレステロールである。いくつかの実施形態では、疎水性基は脂溶性ビタミンである。いくつかの実施形態では、疎水性基は、葉酸、コレステロール、炭水化物、ビタミンＡ、ビタミンＥ、またはビタミンＫから選択される。
【０１２１】
他の疎水性基としては、例えば、ステロイド（例えば、ウバオール、ヘシゲニン、ジオスゲニン）、テルペン（例えば、トリテルペン、例えば、サルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導体化リトコール酸）、ビタミン（例えば、葉酸、ビタミンＡ、ビオチン、ピリドキサール、またはビタミンＥ）、炭水化物、タンパク質、およびタンパク質結合剤、ならびに親油性分子、例えば、コレステロール、コール酸、コリン酸、リトコール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、グリセロールのチオール類似体（例えば、エステル（例えば、モノ、ビス、またはトリス脂肪酸エステル、例えば、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、またはＣ２０脂肪酸）およびそれらのエーテル、例えば、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、またはＣ２０アルキル；例えば、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、１，３−ビス−Ｏ（オクタアデシル）グリセロール）、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ステアリン酸（例えば、ジセリルジステアレート）、オレイン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチドコンジュゲート（例、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ナプロキセン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾールコンジュゲート、テトラアザ大環状化合物のＥｕ３＋錯体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、またはＡＰが挙げられる。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、疎水性基は、ステロール、ステロイド、ホパノイド、ヒドロキシステロイド、セコステロイド、または親油性を有するそれらの類似体である。例示的なステロール部分としては、植物ステロール、マイコステロール、または動物ステロールが挙げられる。例示的な動物ステロールとしては、コレステロールおよび２４Ｓ−ヒドロキシコレステロールが挙げられ、例示的な植物ステロールには、エルゴステロール（マイコステロール）、カンペステロール、シトステロール、およびスチグマステロールが挙げられる。いくつかの実施形態では、ステロールは、エルゴステロール、７−デヒドロコレステロール、コレステロール、２４Ｓ−ヒドロキシコレステロール、ラノステロール、シクロアルテノール、フコステロール、サリンゴステロール、カンペステロール、β−シトステロール、シトスタノール、コプロスタノール、アベナステロール、またはスチグマステロールから選択される。ステロールは、遊離ステロール、アシル化（ステロールエステル）、アルキル化（ステリルアルキルエーテル）、硫酸化（ステロール硫酸）、またはグリコシド部分（ステリルグリコシド）に結合しており、それ自体がアシル化することができる（アシル化ステロールグリコシド）。例示的なステロイド部分としては、ジヒドロテストステロン、ウバオール、ヘシゲニン、ジオスゲニン、プロゲステロン、またはコルチゾールが挙げられる。
【０１２３】
疎水性部分は、化学的に実行可能な任意の位置で、例えば、５’および／または３’末端の核酸分子上（または、それが二本鎖である場合、核酸分子の一方または両方の鎖上）で、治療薬にコンジュゲートすることができる。特定の実施形態では、疎水性部分は、３’末端、より具体的には、二本鎖分子のセンス鎖の３’末端にのみコンジュゲートしている。疎水性部分は、核酸分子に直接コンジュゲートするか、またはリンカーを介してコンジュゲートしてもよい。疎水性部分は、アダマンタン、コレステロール、ステロイド、長鎖脂肪酸、脂質、リン脂質、糖脂質、またはそれらの誘導体であり得る。
【０１２４】
例えば、ステロールは、利用可能な−ＯＨ基で治療剤にコンジュゲートすることができる。例示的なステロールは、以下に示す一般的な骨格を有する：
【化１】
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さらなる例として、エルゴステロールは以下の構造を有している：
【化２】
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コレステロールは以下の構造を有している：
【化３】
2021529535.tif 000035
【０１２５】
したがって、いくつかの実施形態では、ステロールまたはステロイドの遊離−ＯＨ基を使用して、治療剤をステロールまたはステロイドにコンジュゲートする。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、疎水性基は、脂肪酸、ホスファチド、リン脂質、またはそれらの類似体（エホファチジルコリン、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、セファリン、またはホスファチジルセリンまたはその類似体またはその一部、例えばその部分的に加水分解された部分）などの脂質である。いくつかの実施形態では、脂肪酸は、短鎖、中鎖、または長鎖脂肪酸である。いくつかの実施形態では、脂肪酸は飽和脂肪酸である。いくつかの実施形態では、脂肪酸は不飽和脂肪酸である。いくつかの実施形態では、脂肪酸はモノ不飽和脂肪酸である。いくつかの実施形態では、脂肪酸は、ω−３（オメガ−３）またはω−６（オメガ−６）脂肪酸などの多価不飽和脂肪酸である。いくつかの実施形態では、脂質、例えば、脂肪酸は、Ｃ２〜Ｃ６０鎖を有する。いくつかの実施形態では、脂質、例えば、脂肪酸は、Ｃ２〜Ｃ２８鎖を有する。いくつかの実施形態では、脂質、例えば、脂肪酸は、Ｃ２〜Ｃ４０鎖を有する。いくつかの実施形態では、脂質、例えば、脂肪酸は、Ｃ２〜Ｃ１２またはＣ４〜Ｃ１２鎖を有する。いくつかの実施形態では、脂質、例えば、脂肪酸は、Ｃ４〜Ｃ４０鎖を有する。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、治療薬は、２つの脂質によって修飾され得る。いくつかの実施形態では、２つの脂質、例えば脂肪酸は、一緒になって、６〜８０個の炭素原子（６〜８０の等価炭素数（ＥＣＮ））、例えば、１０〜７０、２０〜６０、３０〜６０、３０〜５０、または４０〜８０個の炭素数を有する。
【０１２８】
好適な脂肪酸としては、飽和直鎖脂肪酸、飽和分岐脂肪酸、不飽和脂肪酸、ヒドロキシ脂肪酸、およびポリカルボン酸が挙げられる。いくつかの実施形態では、このような脂肪酸は、最大３２個の炭素原子を有する。
【０１２９】
有用な飽和直鎖脂肪酸の例としては、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、ヘキサコサン酸、オクタコサン酸、トリアコンタン酸およびｎ−ドトリアコンタン酸などの偶数の炭素原子を有するもの、ならびにプロピオン酸、ｎ−吉草酸、エナント酸、ペラルゴン酸、ヘンデカン酸、トリデカン酸などの奇数の炭素原子を有するもの、ペンタデカン酸、ヘプタデカン酸、ノナデカン酸、ヘネイコサン酸、トリコサン酸、ペンタコサン酸、およびヘプタコサン酸などの奇数の炭素原子を有するものが挙げられる。
【０１３０】
適切な飽和分岐脂肪酸の例としては、イソ酪酸、イソカプロン酸、イソカプリル酸、イソカプリン酸、イソラウリン酸、１１−メチルドデカン酸、イソミリスチン酸、１３−メチル−テトラデカン酸、イソパルミチン酸、１５−メチル−ヘキサデカン酸、イソステアリン酸、１７−メチルオクタデカン酸、イソアラチン酸、１９−メチル−エイコサン酸、α−エチル−ヘキサン酸、α−ヘキシルデカン酸、α−ヘプチルウンデカン酸、２−デシルテトラデカン酸、２−ウンデシルテトラデカン酸、２−デシルペンタデカン酸、２−ウンデシルペンタデカン酸、およびＦｉｎｅオキソコール１８００酸（Ｎｉｓｓａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．製）が挙げられる。適切な飽和奇数炭素分枝脂肪酸としては、６−メチル−オクタン酸、８−メチル−デカン酸、１０−メチル−ドデカン酸、１２−メチル−テトラデカン酸、１４−メチルヘキサデカン酸、１６−メチル−オクタデカン酸、１８−メチル−エイコサン酸、２０−メチル−ドコサン酸、２２−メチル−テトラコサン酸、２４−メチル−ヘキサコサン酸、および２６−メチルオクタコサン酸が挙げられる。
【０１３１】
好適な不飽和脂肪酸の例としては、４−デセン酸、カプロル酸、４−ドデセン酸、５−ドデセン酸、ラウロレイン酸、４−テトラデセン酸、５−テトラデセン酸、９−テトラデセン酸、パルミトリン酸、６−オクタデセン酸、オレイン酸、９−オクタデセン酸、１１−オクタデセン酸、９−エイコセン酸、シス−１１−エイコセン酸、セトレイン酸、１３−ドコセン酸、１５−テトラコセン酸、１７−ヘキサコセン酸、６，９，１２，１５−ヘキサデカテトラエン酸、リノール酸、リノレン酸、α−エレオステアリン酸、β−エレオステアリン酸、プニン酸、６，９，１２，１５−オクタデカテトラエン酸、パリナリン酸、５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸、５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸、７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸、４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸などが挙げられる。
【０１３２】
好適なヒドロキシ脂肪酸の例としては、α−ヒドロキシラウリン酸、α−ヒドロキシミリスチン酸、α−ヒドロキシパルミチン酸、α−ヒドロキシステアリン酸、ω−ヒドロキシラウリン酸、α−ヒドロキシアラシック酸、９−ヒドロキシ−１２−オクタデセン酸、リシノール酸、α−ヒドロキシベヘン酸、９−ヒドロキシ−トランス−１０，１２−オクタデカジエン酸、カモレン酸、イプロル酸、９，１０−ジヒドロキシステアリン酸、１２−ヒドロキシステアリン酸などが挙げられる。好適なポリカルボン酸の例としては、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、Ｄ、Ｌ−リンゴ酸などが挙げられる。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、各脂肪酸は、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプロン酸、ウンデシル酸、ラウリン酸、トリデシル酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸から独立して選択される。パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、ノナデシル酸、アラキジン酸、ヘネイコシル酸、ベヘン酸、トリコシル酸、リグノセリン酸、ペンタコシル酸、セロチン酸、ヘプタコシル酸、モンタン酸、ノナコシル酸、メリシン酸、ヘナトリアコンチル酸（Ｈｅｎａｔｒｉａｃｏｎｔｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ラッセル酸（Ｌａｃｃｅｒｏｉｃ  ａｃｉｄ）、プシリン酸（Ｐｓｙｌｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ゲジン酸（ｇｅｄｄｉｃ  ａｃｉｄ）、セロプラスチック酸（ｃｅｒｏｐｌａｓｔｉｃ  ａｃｉｄ）、ヘキサトリアコンチル酸（ｈｅｘａｔｒｉａｃｏｎｔｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ヘプタトリアコンタン酸（ｈｅｐｔａｔｒｉａｃｏｎｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、またはオクタトリアコンタン酸（ｏｃｔａｔｒｉａｃｏｎｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）から独立して選択される。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、各脂肪酸は、α−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、リノール酸、ガンマ−リノール酸、ジホモ−ガンマ−リノール酸、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、パルミトリン酸、バクセン酸から独立して選択される。酸、パウリン酸、オレイン酸、エライジン酸、ゴンド酸、エルシン酸、ネルボン酸、ミード酸、アドレン酸、ボセオペンタエン酸、オズボンド酸、イワシ酸、ヘリン酸、ドコサヘキサエン酸、またはテトラコサテトラエン酸、もしくは別のモノ不飽和または多価不飽和脂肪酸から独立して選択される。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、脂肪酸の一方または両方が必須脂肪酸である。特定の必須脂肪酸の有益な健康効果を考慮して、開示された治療剤装填エクソソームの治療利益は、このような脂肪酸を治療薬に含めることによって増加させることができる。いくつかの実施形態では、必須脂肪酸は、リノレン酸、ガンマ−リノレン酸、ジホモ−ガンマ−リノレン酸、アラキドン酸、アドレニン酸、ドコサペンタエンｎ−６酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、２０：４ｎ−３酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸ｎ−３酸、またはドコサヘキサエン酸からなる群から選択されるｎ−６またはｎ−３必須脂肪酸である。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、各脂肪酸は、オールシス−７，１０，１３−ヘキサデカトリエン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、テトラコサペンタエン酸、テトラコサヘキサエン酸、またはリポ酸から独立して選択される。他の実施形態では、脂肪酸は、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、またはリポ酸から選択される。脂肪酸の他の例としては、オールシス−７，１０，１３−ヘキサデカトリエン酸、α−リノレン酸（ＡＬＡまたはオールシス−９，１２，１５−オクタデカトリエン酸）、ステアリドン酸（ＳＴＤまたはオールシス−６、９，１２，１５−オクタデカテトラエン酸）、エイコサトリエン酸（ＥＴＥまたはオールシス−１１，１４，１７−エイコサトリエン酸）、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡまたはオールシス−８，１１，１４，１７−エイコサテトラエン酸）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ、クルパノドン酸またはオールシス−７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡまたはオールシス−４，７，１０，１３、１６，１９−ドコサヘキサエン酸）、テトラコサペンタエン酸（オールシス−９，１２，１５，１８，２１−ドコサヘキサエン酸）、またはテトラコサヘキサエン酸（ニシン酸またはオールシス−６，９，１２，１５，１８，２１−テトラコセン酸）が挙げられる。いくつかの実施形態では、脂肪酸は、リポ酸などの中鎖脂肪酸である。
【０１３７】
脂肪酸鎖は、その鎖の長さが大きく異なり、鎖の長さに従って、例えば、短いものから非常に長いものまで分類され得る。短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）は、炭素数が約５以下の脂肪酸（例えば、酪酸）である。いくつかの実施形態では、脂肪酸のそれぞれは、独立してＳＣＦＡである。いくつかの実施形態では、脂肪酸のうちの１つは、独立してＳＣＦＡである。中鎖脂肪酸（ＭＣＦＡ）には、中鎖トリグリセリドを形成することできる約６〜１２個の炭素の鎖を有する脂肪酸が含まれる。いくつかの実施形態では、脂肪酸のそれぞれは、独立してＭＣＦＡである。いくつかの実施形態では、脂肪酸のうちの１つは、独立してＭＣＦＡである。長鎖脂肪酸（ＬＣＦＡ）には、１３〜２１個の炭素の鎖を有する脂肪酸が含まれる。いくつかの実施形態では、脂肪酸のそれぞれは、独立してＬＣＦＡである。いくつかの実施形態では、脂肪酸のうちの１つは、独立してＬＣＦＡである。超長鎖脂肪酸（ＶＬＣＦＡ）には、２２〜６０、２２〜５０、または２２〜４０個の炭素など、２２個以上の炭素の鎖を有する脂肪酸が含まれる。いくつかの実施形態では、脂肪酸のそれぞれは、独立して、ＶＬＣＦＡである。いくつかの実施形態では、脂肪酸のうちの１つは、独立してＶＬＣＦＡである。いくつかの実施形態では、脂肪酸のうちの１つは独立してＭＣＦＡであり、１つは独立してＬＣＦＡである。
【０１３８】
ＩＩＩ．薬学的に許容される組成物
別の実施形態によれば、本開示は、本開示の治療剤装填乳小胞と、薬学的に許容される担体、アジュバント、またはビヒクルとを含む組成物を提供する。治療剤充填乳小胞によって封入ないしは別の方法で運ばれる治療薬の量は、それを必要とする患者の関連する疾患、障害、または病態を治療するのに有効な量である。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、このような組成物を必要とする患者への投与のために製剤化される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、患者への経口投与のために製剤化される。本明細書で使用される「患者」という用語は、動物、例えば、ヒトなどの哺乳動物を意味する。
【０１３９】
「薬学的に許容される担体、アジュバント、またはビヒクル」という用語は、それが製剤化される治療剤装填小胞の薬理学的活性を破壊しない非毒性の担体、アジュバント、またはビヒクルを指す。本発明の組成物に使用できる薬学的に許容される担体、アジュバントまたはビヒクルとしては、イオン交換樹脂、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩などの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、植物性飽和脂肪酸の部分的なグリセリド混合物、水、プロタミン硫酸塩、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩などの塩もしくは電解質、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸塩、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４０】
本開示の組成物は、経口的に、非経口的に、吸入スプレーによって、局所的に、直腸的に、鼻腔的に、口腔内（ｂｕｃｃａｌｌｙ）に、膣内に、または移植されたリザーバーを介して投与され得る。本明細書で使用される「非経口」という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、肝内、病変内、および頭蓋内の注射または注入技術を含む。好ましくは、組成物は、経口、腹腔内、または静脈内に投与される。本発明の組成物の無菌注射可能形態は、水性または油性懸濁液であり得る。これらの懸濁液は、好適な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して、当技術分野において既知の技術に従って製剤化することができる。無菌注射可能な調製物はまた、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液として、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の無菌の注射可能な溶液または懸濁液であり得る。使用できる許容可能なビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンゲル液および等張塩化ナトリウム溶液がある。さらに、無菌の固定油は、従来、溶媒または懸濁媒体として使用されている。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、治療剤装填乳小胞またはその薬学的組成物は、経口、静脈内、皮下、鼻腔内、吸入、筋肉内、眼内、腹腔内、気管内、経皮、口腔内（ｂｕｃｃａｌ）、舌下、直腸、局所、局所注射、または外科的移植経路によって投与される。いくつかの実施形態では、投与経路は経口である。
【０１４２】
本開示の薬学的に許容される組成物は、カプセル、錠剤、水性懸濁液または溶液が挙げられるが、これらに限定されない、任意の経口的に許容される剤形で経口投与され得る。経口用錠剤の場合、一般的に使用される担体としては、ラクトースおよびコーンスターチが挙げられる。ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤も、通常、添加される。カプセル形態での経口投与の場合、有用な希釈剤としては、ラクトースおよび乾燥コーンスターチが挙げられる。経口使用に水性懸濁液が必要な場合、有効成分は乳化剤および懸濁剤と組み合わされる。必要に応じて、特定の甘味料、香味料、または着色剤を添加することもできる。
【０１４３】
本明細書に記載の経口投与用の薬学的組成物は、食物と一緒に、または食物なしで、対象に投与することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される薬学的に許容される組成物は、食物なしで投与される。他の実施形態では、本発明の薬学的に許容される組成物は、食物と一緒に投与される。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、治療剤装填乳小胞の治療的、診断的、および予後的属性は、非経口的手段を介して達成される。送達後に乳由来の小胞を使用して封入された治療薬の全身分布を達成することは、このアプローチの主な目的であるが、リガンドの標的化の使用を通して目的の部位への選択的送達を達成することも可能である（例えば、抗体、ペプチド、アプタマー、または他のもの：例えば、Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ａ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ  ２０１３；１９（３５）：６３１５−６３２９を参照されたい）。
【０１４５】
治療剤充填乳小胞の送達を助けるために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の刺激の少ない固定油を使用することができる。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体などの脂肪酸は、オリーブ油またはヒマシ油などの天然の薬学的に許容される油、特にそれらのポリオキシエチル化バージョンと同様に、注射剤の調製に有用である。これらの油溶液または懸濁液はまた、エマルジョンおよび懸濁液を含む薬学的に許容される剤形の製剤に一般的に使用されるカルボキシメチルセルロースもしくは同様の分散剤などの長鎖アルコール希釈剤または分散剤を含有し得る。
【０１４６】
薬学的に許容される固体、液体、または他の剤形の製造に一般的に使用される、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、Ｓｐａｎおよび他の乳化剤または生物学的利用能増強剤などの他の一般的に使用される界面活性剤もまた、製剤の目的で使用され得る。
【０１４７】
あるいは、本開示の薬学的に許容される組成物は、直腸投与用の坐剤の形態で投与されてもよい。これらは、薬剤を、室温では固体であるが直腸温では液体であり、したがって直腸で融解して薬物を放出する好適な非刺激性賦形剤と混合することによって調製することができる。このような材料としては、カカオバター、蜜蝋、ポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１４８】
眼科用途の場合、薬学的に許容される組成物は、等張のｐＨ調整滅菌生理食塩水中の微粉化懸濁液として、または好ましくは、塩化ベンジルアルコニウムなどの防腐剤を含むか、または含まない等張のｐＨ調整滅菌生理食塩水中の溶液として製剤化することができる。あるいは、眼科用途の場合、薬学的に許容される組成物は、ワセリンなどの軟膏に製剤化することができる。
【０１４９】
本開示の薬学的に許容される組成物はまた、鼻エアロゾルまたは吸入によって投与されてもよい。このような組成物は、医薬製剤の分野において周知の技術に従って調製され、ベンジルアルコールまたは他の好適な防腐剤、生物学的利用能を増強させるための吸収促進剤、フルオロカーボン、および／または他の従来の可溶化剤または分散剤を使用して、生理食塩水中の溶液として調製することができる。
【０１５０】
単一剤形で組成物を生成するために担体材料と組み合わせることができる本開示の治療剤装填乳小胞の量は、治療される宿主、特定の投与方法、および当業者に知られている他の要因に応じて変化するであろう。好ましくは、提供される組成物は、これらの組成物を投与されている患者に０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の投与量の治療薬を投与できるように製剤化されるべきである。
【０１５１】
また、任意の特定の患者に対する特定の投与量および治療レジメンは、使用される特定の治療剤装填乳小胞の活性、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食事療法、投与時間、排泄率、薬剤の組み合わせ、治療を行う医師の判断、および治療中の特定の疾患の重症度など、様々な要因に依存することも理解されたい。組成物中の本開示の治療剤装填乳小胞の量はまた、組成物中の特定の治療剤装填小胞に依存するであろう。
【０１５２】
ＩＶ．対象へのカーゴの送達および関連する疾患の治療のためのカーゴ装填乳小胞の使用
本開示によれば、治療薬および診断薬を含む様々な生体分子（カーゴ）を、乳小胞内に装填または封入することができる。乳小胞を担体として使用すると、例えば腸内の薬剤の破壊を最小限に抑えるか、もしくは肝臓の初回通過効果（ｆｉｒｓｔ−ｐａｓｓ  ｅｆｆｅｃｔ）を最小限に抑えることによって、経口生物学的利用能を改善する、または標的組織への治療薬の送達を改善する、またはインビボでの薬剤の溶解性および安定性を含む、治療薬の溶解性および安定性を増加させるなどの生体分子の所望の特性を増強させる。一態様では、治療薬は、疎水性基を含むか、または、疎水性基を含むように化学的に修飾されている。好適な疎水性基としては、ステロール、ステロイド、脂質、リン脂質、または合成もしくは天然の疎水性ポリマーが挙げられる。理論に束縛されるものではないが、治療薬の疎水性修飾、例えば、脂質、ステロール、またはステロイドのタグ付けは、より高い装填効率が可能になるように、乳小胞内へのまたは乳小胞上へのその装填を容易にすると考えられる。
【０１５３】
本明細書に記載の方法を実施するために、有効量のカーゴ装填乳小胞のいずれかを、好適な経路、例えば本明細書に記載の経路を介して治療を必要とする対象に投与することができる。一例では、カーゴ装填乳小胞は、経口投与される。カーゴ装填乳小胞は、乳小胞に装填された生体分子に応じて、目的の標的疾患を治療または診断するのに効果的であろう。いくつかの実施形態では、疾患、障害、または病態は、過剰増殖性障害、ウイルスもしくは微生物感染、自己免疫疾患、アレルギー状態、炎症性疾患、心血管疾患、代謝性疾患、または神経変性疾患から選択される。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、治療薬は、疾患の診断および予後、ならびに治療に対する応答の測定に使用することができる。別の実施形態では、治療剤装填小胞（例えば、治療剤装填乳由来小胞）の投与に続いて、特定の細胞型による処理または特定の細胞型との相互作用により、当技術分野において既知の手段によって評価されて、診断もしくは予後を提供し、または治療への応答を測定する。
【０１５５】
本明細書に開示される様々な治療薬のいずれも、本開示による乳小胞への会合および／または封入と適合性であり得る。いくつかの実施形態では、治療薬は生物製剤である。いくつかの実施形態では、生物製剤は、ｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、または他のオリゴヌクレオチド治療薬から選択される。
【０１５６】
本明細書に記載のカーゴ装填乳小胞は、癌、自己免疫障害、肝障害、遺伝子治療、免疫腫瘍学、および本明細書に詳細に記載される他の疾患、障害、および病態の状況における診断、予後、または治療剤として有用である。別の態様では、本開示による治療剤装填乳小胞は、過剰増殖性障害、ウイルスもしくは微生物感染、自己免疫疾患、アレルギー状態、炎症性疾患、障害、もしくは病態、心血管疾患、代謝性疾患、または神経変性疾患を治療、予防、または改善するのに有用である。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、カーゴ装填乳小胞中の生体分子は、自己免疫抗原である。このようなカーゴ装填乳小胞は、関節リウマチ、糖尿病、インスリン依存性エリテマトーデス（全身性）、多発性硬化症、乾癬、膵炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、自己免疫性脳脊髄炎、実験的バセドウ病、サルコイドーシス、強皮症、原発性胆汁性肝硬変、慢性リンパ球性甲状腺炎、リンパ球減少症、セリアック病、心筋炎、シャーガス病、重症筋無力症、糸球体腎炎、ＩＧＡ、再生不良性貧血、ループス腎炎、ハンマン−リッチ症候群、肝炎、慢性活動性皮膚筋炎、糸球体腎炎、膜性粘膜皮膚リンパ節症候群、類天疱瘡、水疱性ベーチェット症候群、脊椎炎、強直性肝炎、自己免疫性クッシング症候群、ギランバレー症候群、胆管炎、硬化性抗リン脂質抗体症候群、白斑、甲状腺中毒症、ウェグナー肉芽腫症、特発性紫斑病、レイノー血小板減少症、自己免疫溶血性貧血、クリオグロブリン血症、混合性結合組織病、側頭動脈炎、尋常性天疱瘡、アジソン病、リウマチ熱、悪性貧血、円形脱毛症、（ループス）エリテマトーデス、円板状ナルコレプシー、高安動脈炎、自己免疫性神経炎、実験的結節性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、疱疹状皮膚炎、自己免疫性心筋炎、メニエール病、慢性炎症性脱髄性多発根神経炎、ランバート−イートン筋無力症候群、硬化性萎縮性苔癬、チャーグ−ストラウス症候群、エリテマトーデス、ライター病、抗糸球体基底膜抗体病、自己免疫性多腺性内分泌障害、フェルティ症候群、グッドパスチャー症候群、無酸症、自己免疫性リンパ増殖性多発根神経炎、ブドウ膜脳炎症候群、多軟骨炎、再発性アトピー性アレルギー、特発性血小板減少症、スティッフパーソン症候群、自己免疫性多腺性内分泌不全症−カンジダ症−外胚葉−ジストロフィー、表皮剥離、表皮水疱症、自己免疫性精巣炎、眼前庭聴覚（Ｏｃｕｌｏｖｅｓｔｉｂｕｌｏａｕｄｉｔｏｒｙ）症候群、眼炎、交感神経性脊髄炎、シルダー横断性汎発性脳硬化症（Ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ  Ｄｉｆｆｕｓｅ  Ｃｅｒｅｂｒａｌ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｃｈｉｌｄｅｒ）、視神経脊髄炎、スティル病、成人発症自己免疫性ブドウ膜炎、モーレン潰瘍、自己免疫症候群ＩＩ型、多腺性自己免疫性下垂体炎、水晶体起因性ブドウ膜炎、落葉性天疱瘡、オプソクローヌス−ミオクローヌス症候群、Ｂ型インスリン抵抗性、自己免疫性萎縮性胃炎、ループス肝炎、自己免疫性難聴、急性出血性白質脳炎、自己免疫性副甲状腺機能低下症、または橋本甲状腺炎などの自己免疫疾患を治療、予防、または改善するために使用することができる。
【０１５８】
その他の例としては、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、軸索および神経性神経障害（ＡＭＡＮ）、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、キャッスルマン病（ＣＤ）、セリアック病、チャガス病、慢性炎症性脱髄性多発根神経炎（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多発性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ−ストラウス瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜性食道炎、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心臓ブロック、コクサッキー心筋炎、クレスト（ＣＲＥＳＴ）症候群、クローン病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎（ＥｏＥ）、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、本態性混合型クリオグロブリン血症、エバンス症候群、線維筋痛、線維性肺胞炎、巨細胞動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎性肉芽腫症、バセドウ病、ギランバレー症候群、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病（ＨＳＰ）、妊娠疱疹もしくは妊娠性類天疱瘡（ＰＧ）、低ガンマグロブリン血症、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、封入体筋炎（ＩＢＭ）、間質性膀胱炎（ＩＣ）、若年性関節炎、若年性糖尿病（１型糖尿病）、若年性筋炎（ＪＭ）、川崎病、ランバート−イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質結膜炎、線状ＩｇＡ皮膚症（ＬＡＤ）、ループス、慢性ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎（ＭＰＡ）、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッカ−ハーベルマン病、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎、好中球減少症、眼瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ（ＰＲ）、ＰＡＮＤＡＳ（小児自己免疫性溶連菌関連性精神神経障害）、傍腫瘍性小脳変性症（ＰＣＤ）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、パリーロンバーグ症候群、扁平部炎（周辺性ブドウ膜炎）、パーソネイジ−ターナー症候群、天疱瘡、末梢神経障害、静脈周囲性脳脊髄炎、悪性貧血（ＰＡ）、ＰＯＥＭＳ症候群（多発神経障害（ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）、臓器腫大（ｏｒｇａｎｏｍｅｇａｌｙ）、内分泌障害（ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｐａｔｈｙ）、単クローン性ガンマグロブリン血症（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ｇａｍｍｏｐａｔｈｙ）、皮膚変化（ｓｋｉｎ  ｃｈａｎｇｅｓ））、結節性多動脈炎、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、プロゲステロン皮膚炎、乾癬、乾癬性関節炎、赤芽球癆（ＰＲＣＡ）、壊疽性膿皮症、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多軟骨炎、むずむず脚症候群（ＲＬＳ）、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ（ＲＡ）、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子および精巣自己免疫、スティッフパーソン症候群（ＳＰＳ）、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、交感性眼炎（ＳＯ）、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞��動脈炎、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ−ハント症候群（ＴＨＳ）、横断性脊髄炎、１型糖尿病、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、硝子体炎、またはウェグナー肉芽腫症（現在は多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）と呼ばれている）が挙げられる。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、本開示は、免疫応答を調節する方法を提供し、それを必要とする患者に有効量の治療剤装填乳小胞を投与することを含む。いくつかの実施形態では、患者は、癌などの過剰増殖性疾患、障害、または病態に罹患している。いくつかの実施形態では、患者は、自己免疫疾患、障害、または病態に罹患している。いくつかの実施形態では、インビボでの治療薬の標的は、以下の表６に列挙されたもののうちの１つである。いくつかの実施形態では、治療剤装填乳小胞は、表６に列挙された化合物、またはその薬学的に許容される塩と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、小胞に装填された治療薬および表６の同時投与された化合物は、表６の標的を調節する。表６で使用されている略語を以下に示す。
【０１６０】
ＡＭＰＣＰ、アデノシン５’−（α，βメチレン）二リン酸；ＡＲＧ、アルギナーゼ；ＣＯＸ２、シクロオキシゲナーゼ２；ＣＳＦ、コロニー刺激因子；ＣＴＬ、細胞傷害性Ｔリンパ球；ＤＣ、樹状細胞；ＨＩＦ１α、低酸素誘導因子１α；ＩＤＯ、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ；ＩＦＮ、インターフェロン；ＩＬ、インターロイキン；ｉＮＯＳ、誘導一酸化窒素合成酵素；ＭＤＳＣ、骨髄由来サプレッサー細胞；ＭＯＡ、作用機序；ＭＳＰ、マクロファージ刺激タンパク質；ＮＫ、ナチュラルキラー；ＰＤＥ５、ホスホジエステラーゼタイプ５；ＰＧＥ２、プロスタグランジンＥ２；ＰＭＮＣ、末梢血単核細胞；ＲＯＳ、活性酸素種；ＴＡＦ、腫瘍関連線維芽細胞；ＴＡＭ、腫瘍関連マクロファージ；ＴＣＲ、Ｔ細胞受容体；ＴＤＯ、トリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ；ＴＨ、Ｔヘルパー；ＴＧＦβ、トランスフォーミング増殖因子−β；ＴＬＲ、Ｔｏｌｌ様受容体；ＴＭＥ、腫瘍微小環境；ＴＮＦ、腫瘍壊死因子；ＴＲｅｇ、調節性Ｔ；ＴＳＰ１、トロンボスポンジン１。
【０１６１】
＊列挙されているのは、癌免疫療法のために提案されている小分子の薬物標的である。
【０１６２】
‡いくつかの例では、提供される臨床開発状態は、非免疫腫瘍学の適応症である。これらの場合、文献は自然免疫機能への影響に照らして臨床的考察を支持している。科学文献はｍＡｂを使用したＣＸＣＲ２拮抗作用を示しているが、いくつかの小分子ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２アンタゴニストは臨床試験に達しており、原則として同様の有効性を示す可能性がある。
【０１６３】
カーゴ装填乳小胞の他の有用性は、ＷＯ２０１８／１０２３９７ならびにそこに引用されている参考文献に見出すことができ、それぞれの関連する開示は、本明細書で参照される目的または主題のために参照により組み込まれる。
【表６−１】
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【表６−２】
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【表６−３】
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【表６−４】
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【表６−５】
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【表６−６】
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【０１６４】
Ｖ．併用療法
本明細書に記載のカーゴ装填乳小胞またはその薬学的に許容される組成物のいずれかを、１つ以上の追加の治療薬および／または治療プロセスと組み合わせて、それを必要とする患者に投与することができる。
【０１６５】
本開示のカーゴ装填乳小胞は、単独で、または１つ以上の他の治療化合物と組み合わせて投与することができ、可能な併用療法は、固定された組み合わせの形態、または本開示の治療剤装填乳小胞の投与および１つ以上の他の治療用化合物が交互になるか、もしくは独立して与えられる投与、または固定された組み合わせと１つ以上の他の治療用化合物との併用投与をとる。本開示の治療剤装填乳小胞は、特に、化学療法、放射線療法、免疫療法、光線療法、外科的介入、またはこれらの組み合わせと併用した腫瘍療法のために、さらにまたは加えて投与することができる。上記のように、他の治療戦略との関連での補助療法と同様に、長期療法も同様に可能である。他の可能な治療法は、腫瘍退縮後の患者の状態を維持するための治療、またはさらには例えばリスクのある患者における化学予防療法である。
【０１６６】
このような追加の薬剤は、複数回投与レジメンの一部として、提供された治療剤装填乳小胞含有組成物とは別に投与することができる。あるいは、それらの薬剤は、単一の組成物において本開示の治療剤装填乳小胞と一緒に混合された、単一の剤形の一部であってもよい。複数の投与レジメンの一部として投与される場合、２つの活性剤は、同時に、連続して、または互いに一定期間内に投入され得る。
【０１６７】
本明細書で使用される場合、「組み合わせ」、「組み合わせた」という用語、および関連する用語は、本開示による治療薬の同時または連続投与を指す。例えば、本開示の治療剤装填乳小胞は、別の治療薬と、別々の単位剤形、または単一の単位剤形で一緒に同時に、または連続して投与されてもよい。したがって、本発明は、本開示の治療剤装填乳小胞、追加の治療薬、および薬学的に許容される担体、アジュバント、またはビヒクルを含む単一の単位剤形を提供する。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、第１の治療薬と同じ乳小胞に封入されている。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、第１の治療薬とは異なる乳小胞に封入されている。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、乳小胞に封入されていない。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、治療剤装填乳小胞とは別の組成物で製剤化される。
【０１６８】
単一の剤形を生成するために担体材料と組み合わせることができる、開示された治療剤装填乳小胞および追加の治療薬（上記のような追加の治療薬を含む組成物中）の両方の量は、治療される患者および特定の投与方法に応じて変化する。特定の実施形態では、本開示の組成物は、開示された治療剤装填乳小胞の０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の投与量を投与できるように製剤化されるべきである。
【０１６９】
追加の治療薬を含むこれらの組成物において、その追加の治療薬および本開示の治療薬装填乳小胞は、相乗的に作用し得る。したがって、そのような組成物中の追加の治療薬の量は、その治療薬のみを利用する単剤療法で必要とされる量よりも少ないであろう。このような組成物では、０．０１〜１，０００μｇ／ｋｇ体重／日の追加の治療薬の投与量を投与することができる。
【０１７０】
本発明の組成物中に存在する追加の治療薬の量は、その治療薬を唯一の活性剤として含む組成物で通常投与される量を超えないであろう。好ましくは、現在開示されている組成物中の追加の治療薬の量は、唯一の治療活性剤としてその薬剤を含む組成物中に通常存在する量の約５０％〜１００％の範囲である。
【０１７１】
本開示の治療剤装填乳小胞を組み合わせることができる薬剤の例としては、アリセプト（Ａｒｉｃｅｐｔ（登録商標））およびエクセロン（Ｅｘｃｅｌｏｎ（登録商標））などのアルツハイマー病治療薬；Ｌ−ドーパ（Ｌ−ＤＯＰＡ）／カルビドパ（ｃａｒｂｉｄｏｐａ）、エンタカポン（ｅｎｔａｃａｐｏｎｅ）、ロピンロール（ｒｏｐｉｎｒｏｌｅ）、プラミペキソール（ｐｒａｍｉｐｅｘｏｌｅ）、ブロモクリプチン（ｂｒｏｍｏｃｒｉｐｔｉｎｅ）、ペルゴリド（ｐｅｒｇｏｌｉｄｅ）、トリヘキセフェニジル（ｔｒｉｈｅｘｅｐｈｅｎｄｙｌ）、およびアマンタジンなどのパーキンソン病治療薬；ベータ−インターフェロン（例えば、アボネクス（Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）およびレビフ（Ｒｅｂｉｆ（登録商標））、コパキソン（Ｃｏｐａｘｏｎｅ（登録商標））、およびミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）などの多発性硬化症（ＭＳ）治療薬；アルブテロール（ａｌｂｕｔｅｒｏｌ）およびシンギュラー（Ｓｉｎｇｕｌａｉｒ（登録商標））などの喘息治療薬；ジプレキサ（ｚｙｐｒｅｘａ）、リスペルダル（ｒｉｓｐｅｒｄａｌ）、セロクエル（ｓｅｒｏｑｕｅｌ）、およびハロペリドールなどの総合失調症治療薬；副腎皮質ステロイド、ＴＮＦ阻害剤、ＩＬ−１  ＲＡ、アザチオプリン、シクロホスファミド、およびスルファサラジンなどの抗炎症薬；シクロスポリン、タクロリムス、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、インターフェロン、副腎皮質ステロイド、シクロホスファミド、アザチオプリン、およびスルファサラジンなどの免疫抑制剤を含む、免疫調節剤；アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、ＭＡＯ阻害剤、インターフェロン、抗痙攣剤、イオンチャネル阻害剤、リルゾル（ｒｉｌｕｚｏｌｅ）、およびパーキンソン病治療薬などの神経栄養因子；ベータ遮断薬、ＡＣＥ阻害剤、利尿剤、硝酸塩、カルシウムチャネル阻害剤、およびスタチンなどの心血管疾患治療薬；副腎皮質ステロイド、コレスチラミン、インターフェロン、および抗ウイルス剤などの肝臓病治療薬；コルチコステロイド、抗白血病薬、および増殖因子などの血液疾患治療薬；薬物動態を延長または改善する薬剤、例えばチトクロムＰ４５０（すなわち、代謝分解の阻害剤）およびＣＹＰ３Ａ４阻害剤（例えば、ケトコナゾールおよびリトナビル）、ならびにガンマグロブリンなどの免疫不全治療薬が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７２】
特定の実施形態では、本発明の併用療法、またはその薬学的に許容される組成物は、モノクローナル抗体またはｓｉＲＮＡ治療剤を含み、これらは、開示された乳小胞に封入されても、または封入されなくてもよい。
【０１７３】
別の実施形態では、本発明は、炎症性疾患、障害、または病態を、それを必要とする患者に、カーゴ装填乳小胞および１つ以上の追加の治療薬を投与することによって治療する方法を提供する。このような追加の治療薬は、小分子または生物製剤であり得、例えば、アセトアミノフェン、アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセン、エトドラク、およびセレコキシブなどの非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）、コルヒチン、プレドニゾン、プレドニゾン、メチルプレドニゾン、ヒドロコルチゾンなどのコルチコステロイド、プロベネシド、アロプリノール、フェブキソスタット、およびスルファサラジンが挙げられる。他の例としては、タネズマブなどのモノクローナル抗体、ヘパリンおよびワルファリンなどの止瀉薬、ジフェノキシレート、ロペルアミドなどの下痢止め薬、コレスチラミン、アロステロン、およびルビプロストンなどの胆汁酸結合剤、ジシクロミンなどの抗コリン作用薬もしくは鎮痙薬、アルブテロールおよびレバルブテロールなどのベータ−２アゴニスト、臭化イプラトロピウムおよびチオトロピウムなどの抗コリン作用薬、ジプロピオン酸ベクロメタゾンおよびトリアムシノロンアセトニドなどの吸入コルチコステロイドが挙げられる。
【０１７４】
本発明の治療剤装填エクソソームはまた、抗増殖性化合物と組み合わせて有利に使用され得る。このような抗増殖性化合物として、アロマターゼ阻害剤；抗エストロゲン；トポイソメラーゼＩ阻害剤；トポイソメラーゼＩＩ阻害剤；微小管活性化合物；；アルキル化化合物；ヒストンデアセチラーゼ阻害剤；細胞分化プロセスを誘発する化合物；シクロオキシゲナーゼ阻害剤；ＭＭＰ阻害剤；ｍＴＯＲ阻害剤；抗腫瘍性代謝拮抗剤；白金化合物；タンパク質または脂質キナーゼ活性を標的とする／減少させる化合物、およびさらなる抗血管新生化合物；タンパク質または脂質ホスファターゼの活性を標的とする、減少させる、または阻害する化合物；ゴナドレリンアゴニスト；抗アンドロゲン；メチオニンアミノペプチダーゼ阻害剤；マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤；ビスフォスフォネート；生物学的応答調節物質；抗増殖性抗体；ヘパラナーゼ阻害剤；Ｒａｓ発癌性アイソフォームの阻害剤；テロメラーゼ阻害剤；プロテアソーム阻害剤；血液悪性腫瘍の治療に使用される化合物；Ｆｌｔ−３の活性を標的とする、減少させる、または阻害する化合物；Ｃｏｎｆｏｒｍａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓからの１７−ＡＡＧ（１７−アリルアミノゲルダナマイシン、ＮＳＣ３３０５０７）、１７−ＤＭＡＧ（１７−ジメチルアミノエチルアミノ−１７−デメトキシ−ゲルダナマイシン、ＮＳＣ７０７５４５）、ＩＰＩ−５０４、ＣＮＦ１０１０、ＣＮＦ２０２４、ＣＮＦ１０１０などのＨｓｐ９０阻害剤；テモゾロミド（Ｔｅｍｏｄａｌ（登録商標））；ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅからのＳＢ７１５９９２もしくはＳＢ７４３９２１、またはＣｏｍｂｉｎａｔｏＲｘからのペンタミジン／クロルプロマジンなどのキネシン紡錘体タンパク質阻害剤；Ａｒｒａｙ  ＢｉｏＰｈａｒｍａからのＡＲＲＹ１４２８８６、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａからのＡＺＤ６２４４、ＰｆｉｚｅｒからのＰＤ１８１４６１、およびロイコボリンなどのＭＥＫ阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７５】
本明細書に記載のカーゴ装填乳小胞と併用するための追加の治療薬は、当技術分野において既知であり、および／またはＷＰ２０１８／１０２３９７ならびにそこに引用されている参考文献に開示されており、それぞれの関連する開示は、本明細書で参照される目的または主題のために参照により組み込まれる。
【０１７６】
ＶＩ．乳小胞の作製方法およびカーゴの装填方法
一態様では、乳小胞は、乳生産動物の一次供給源から採取され得る。いくつかの実施形態では、乳小胞は、好適な哺乳動物源のいずれかからの乳もしくは初乳または乳成分に由来する（例えば、単離または操作される）。例としては、ウシ、ヒト、バッファロー、ヤギ、ヒツジ、ラクダ、ロバ、ウマ、トナカイ、ムース、またはヤクが挙げられる。いくつかの実施形態では、乳はウシからのものである。いくつかの実施形態では、乳もしくは初乳は、粉末形態である。いくつかの実施形態では、乳小胞は、乳中に天然に存在する乳小胞構造を再現するように適合された乳腺上皮細胞株から産生され、その後単離される。別の態様では、適切な乳小胞は、トランスジェニックウシまたは他の乳生産哺乳動物によって生産された乳から単離され、その特性が、薬物送達、例えば経口薬物送達に望ましい特性を有する乳小胞を生産するために最適化される。
【０１７７】
一態様では、乳小胞は、バッチ処理のようなプロセスで１種の細胞株を使用して提供され、乳小胞は、細胞株培地から定期的に採取され得る。細胞株ベースの産生方法の課題は、ウシ胎児血清（細胞の増殖に使用される培地）に存在するエクソソームによる汚染の可能性があることである。別の態様では、この課題は、好適な無血清培地条件を使用することで克服することができ、その結果、目的の細胞株から精製された乳小胞が培養培地から採取される。
【０１７８】
一態様では、乳小胞は、乳または初乳溶液から単離または誘導される。バルク溶液からの乳小胞の分離は、注意して行う必要がある。いくつかの実施形態では、０．２ミクロンフィルターなどのフィルターを使用して、溶液からより大きな破片を除去する。いくつかの実施形態では、乳の乳小胞の分離方法（例えば、８０〜１２０ナノメートルの範囲）は、サイズ、電荷、密度、形態、タンパク質含有量、脂質含有量、または固定された表面上の抗体によって認識される（免疫隔離）エピトープなどの特定の乳小胞特性に基づく分離を含む。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、分離方法は、遠心分離工程を含む。いくつかの実施形態では、分離方法は、ポリマーを除くＰＥＧベースの体積法を含む。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、分離方法は、バルク溶液から所望の乳小胞を分離するための超遠心分離を含む。いくつかの実施形態では、２０，０００×ｇで最大３０分間の初期スピンと、それに続く約１００，０００×ｇ〜約１２０，０００×ｇの範囲で約１〜約２時間の複数回のスピンを含む連続工程により、乳由来小胞に富むペレットまたは単離物が得られる。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、超遠心分離は、例えば、リン酸緩衝生理食塩水または選択された溶液に再懸濁され得る乳由来の小胞を提供する。いくつかの実施形態では、小胞は、ショ糖密度勾配に曝露されたときのそれらの属性を評価し、１．１３〜１．１９ｇ／ｍＬの範囲の分画を選ぶことによって、所望の特性についてさらに評価される。
【０１８２】
他の実施形態では、本開示の小胞の単離は、異なるサイズの粒子を排除するフィルターの組み合わせを使用することを含み、例えば、０．４５μＭまたは０．２２μＭフィルターを使用して、目的のものよりも大きい小胞または粒子を排除することができる。乳小胞は、抗体、レクチン、または目的の小胞に特異的に結合する他の分子を含むいくつかの手段によって精製することができ、最終的にはビーズ（例えば、アガロース／セファロースビーズ、磁気ビーズ、または精製を容易にする他のビーズ）と組み合わせて、所望の小胞に濃縮することができる。目的の小胞タイプに由来するマーカーもまた、小胞を精製するために使用され得る。例えば、表面結合タンパク質などの所与のバイオマーカーを発現する小胞は、所望の小胞を他のタイプから区別するために無細胞液から精製され得る。小胞を精製する他の技術としては、密度勾配遠心分離（例えば、スクロースまたは多用途密度勾配遠心分離媒体（ｏｐｔｉｐｒｅｐ）勾配）、および電荷分離が挙げられる。これら全ての濃縮および精製技術は、他の方法と組み合わせたるか、または単独で使用することができる。小胞を精製するさらなる方法は、ＥｘｏＱｕｉｃｋ（商標）（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）またはＴｏｔａｌ  Ｅｘｏｓｏｍｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）などの市販の試薬を使用して選択的に沈殿させることである。
【０１８３】
好適な乳小胞はまた、エクソソーム分泌細胞からのような人工的な生産手段によって誘導され得、および／または当技術分野において既知であるように操作され得る。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、乳小胞は、粒子サイズを評価するためのナノ粒子達キング分析、サイズおよび構造を評価するための透過型電子顕微鏡法エクソソームに会合した目的の種を追跡するための、電子顕微鏡法の前に行われる小胞またはその内容物の免疫金標識、免疫ブロット法、またはブラッドフォードアッセイを使用したタンパク質含有量の評価のうちの１つ以上によってさらに特性化される。
【０１８５】
本開示と互換性のある小胞に治療薬を封入するための様々な方法が当技術分野において既知である。したがって、本開示は、開示された治療薬を乳由来の小胞に封入または装填する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、小胞をエレクトロポレーション、超音波処理、鹸化、押出成形、凍結／融解サイクル、または２つ以上の溶媒の混合物中の治療薬および小胞の分配に曝露して、治療薬の小胞中の封入または装填をもたらす工程を含む。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、乳小胞の単離は、生乳（すなわち、低温殺菌されていない、および／または均質化されていない乳または初乳）を高速で遠心分離して小胞を単離することによって達成される。いくつかの実施形態では、乳由来の小胞は、１００ｍＬの乳あたり約５０ｍｇを超える（例えば、約３００ｍｇを超える）量の小胞を提供する方法で単離される。いくつかの実施形態では、本発明は、以下の工程：ある量の乳（例えば、生乳または初乳）を提供する工程と、乳に対して遠心分離、例えば連続遠心分離を実行して、１００ｍＬの乳あたり約５０ｍｇを超える乳由来の小胞を生成する工程と、を含む、乳由来の小胞を単離する方法を提供する。いくつかの実施形態では、連続遠心分離により、１００ｍＬの乳あたり３００ｍｇを超える乳由来の小胞が得られる。いくつかの実施形態では、一連の連続遠心分離は、４℃で３０分間の２０，０００×ｇでの第１の遠心分離、４℃で６０分間の１００，０００×ｇでの第２の遠心分離、および４℃で９０分間の１２０，０００×ｇでの第３の遠心分離を含む。いくつかの実施形態では、次いで、単離された小胞を約５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの濃度で保管して、凝固を防ぎ、単離された小胞を１つ以上の治療薬の封入または装填に効果的に使用できるようにする。いくつかの実施形態では、単離された小胞に、０．２２μｍフィルターを通過させて、いかなる凝固した粒子ならびに細菌などの微生物も除去する。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、乳小胞（例えば、本明細書に開示されるもの）を単離するための方法であり、この方法は、投入乳材料からカゼインおよび／またはラクトグロブリンを低減または排除するための１つ以上の工程を含む。カゼインは、約２５〜３０ｋＤａの分子量を有する、乳中のタンパク質の大部分である。ラクトグロブリンは、約１０〜２０ｋＤａの分子量を有する、乳中のタンパク質の大部分である。簡単に言えば、このような方法は、従来の方法または本明細書に開示される方法に従って脱脂乳サンプルを生成するために、大量にある乳タンパク質および／または脂肪を除去するための１つ以上の脱脂工程を含み得る。次いで、脱脂された乳サンプルは、カゼインミセルを破壊し、カゼインを凝固させ、乳サンプルからカゼインを除去するための１つ以上の工程に供することができる。したがって、カゼインが枯渇した乳サンプルは、乳小胞を濃縮するための工程、例えば、当技術分野において既知であるか、または本明細書に開示される手法、例えば、クロマトグラフィーベースの方法（例えば、スケーラブルな調製のための）および超遠心分離ベースの方法に供することができる。
【０１８８】
カゼインを除去するための当技術分野において既知の任意の手法を、本明細書に開示される方法で使用することができる。いくつかの実施形態では、カゼイン除去は、化学的に、例えば、酸性化によって達成され得る。例えば、好適な酸溶液（例えば、酢酸、塩酸、クエン酸など）または好適な酸の粉末（例えば、クエン酸粉末）を、脱脂乳サンプルなどの乳サンプルに添加して、カゼインまたはカゼインミセルを凝固させることができ、これらは、従来の方法、例えば、低速遠心分離（例えば、≦２０，０００ｇ）または濾過によって除去することができる。あるいは、乳の酸性化は、ＣＯ２ガスを用いた乳の飽和によって達成することができる。
【０１８９】
他の実施形態では、カゼイン除去は、カゼインを凝固または消化することができる酵素を使用して、例えば、レンネットを使用して、達成することができる。本明細書で使用される場合、「レンネット」は、乳中のカゼインを凝固させることができる酵素の混合物を指す。いくつかの例では、本明細書に開示される方法で使用されるレンネットは、動物、例えば、子牛などの反芻動物の胃で産生される酵素の複雑なセットに由来する。このようなレンネットは、乳中のカゼインを凝固させるプロテアーゼ酵素であるキモシン、および任意にペプシンおよびリパーゼなどの他の酵素を含んでもよい。他の例では、本明細書に開示される方法で使用されるレンネットは、植物に由来し、例えば、植物性レンネットである。植物性レンネットは、乳を凝固させ、凝乳（ｃｕｒｄｓ）および乳清を乳から分離する酵素または酵素の混合物であり得る。場合によっては、本明細書で使用される植物性レンネットは、ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉなどのカビから抽出された市販の植物性レンネットであり得る。あるいは、１つ以上の組換えカゼイン凝固酵素をカゼイン除去に使用してもよい。このような組換え酵素は、従来の組換え技術によって好適な宿主（例えば、細菌、酵母、昆虫細胞、または哺乳動物細胞）を使用して産生され得る。
【０１９０】
さらに他の実施形態では、本明細書に開示される方法は、カゼインミセルを破壊するためのＥＤＴＡまたはＥＧＴＡなどのＣａ２＋キレート剤の使用を含み得、その後、それは除去され得る。
【０１９１】
カゼインを（部分的または完全に）除去した後、乳サンプルは、そこに含有される乳小胞を濃縮するための１つ以上の工程、例えば、超遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、親和性精製、接線流濾過、またはこれらの組み合わせに供することができる。いくつかの例では、本明細書に開示される方法は、乳小胞濃縮のための接線流濾過（ＴＦＦ）工程を含み得る。場合によっては、この方法は、ＴＦＦ工程後に、サイズ排除クロマトグラフィーをさらに含んでもよい。あるいは、濃縮は、超遠心分離などの従来の手法によって達成することができる。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の乳小胞組成物は、それらの単離時に小胞中に存在することによって、またはそれらの最初の単離後に、治療薬として使用するためのｍｉＲＮＡを装填することのいずれかによって、小胞に装填される１つ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、小胞に装填されたｍｉＲＮＡは、小胞の供給源において天然に存在しない。例えば、哺乳動物の乳小胞には、自然な状態で装填されたｍｉＲＮＡが含まれることがあり、そのようなｍｉＲＮＡは、それらの単離時に小胞に装填されたままになる。このような天然に存在するｍｉＲＮＡは、小胞に人工的に装填されるｍｉＲＮＡ治療薬（または他のｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、もしくは他の生物製剤）とは区別される。
【０１９３】
小胞への装填、例えば封入は、治療剤装填乳由来小胞の膜を、例えば洗剤で破壊してその内容物を放出することによって確認することができる。含有量レベルは、例えば、タンパク質／ＲＮＡ／ＤＮＡ定量化アッセイを介して評価することができる。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、現在開示されている乳に由来する小胞は、ストレス状態または治療薬が不活性化、代謝、もしくは分解される条件、例えば唾液、消化酵素、胃の酸性状態、蠕動運動、および／または胃腸管で摂取された成分を分解する様々な消化酵素、例えば、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、およびヌクレアーゼへの曝露に耐えながらそれらのカーゴを送達することができる。
【０１９５】
ＶＩＩ．定義
本明細書で使用される用語は、当業者によって十分に理解されると考えられているが、定義は、現在開示されている主題の説明を容易にするために本明細書に記載されている。
【０１９６】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、現在開示されている主題が属する当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法、デバイス、および材料を、現在開示される主題の実施または試験に使用することができるが、代表的な方法、デバイス、および材料を次に説明する。
【０１９７】
「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という用語は、特許請求の範囲を含め、本出願で使用される場合、「１つ以上」を指す。したがって、例えば、「ａ  ｃｅｌｌ」への言及は、複数のそのような細胞などを含む。
【０１９８】
特に明記しない限り、本明細書および特許請求の範囲で使用される成分の量、反応条件などの特性などを表す全ての数字は、全ての場合において「約」という用語によって修飾されると理解されるべきである。したがって、反対に示されない限り、本明細書および特許請求の範囲に記載された数値パラメータは、本発明の範囲内で得られることが求められる特性に応じて変化し得る近似値である。
【０１９９】
本明細書で使用される「約（ａｂｏｕｔ）」または「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味し、これは、値がどのように測定または決定されるかに部分的に依存し、すなわち、測定システムの限界である。例えば、「約」は、当技術分野の慣行に従って、許容可能な標準偏差内を意味することができる。あるいは、「約」は、所与の値の最大±２０％、好ましくは最大±１０％、より好ましくは最大±５％、より好ましくは最大±１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的系または過程に関して、この用語は、値の１桁以内、好ましくは２倍以内を意味することができる。特定の値が本出願および特許請求の範囲に記載されている場合、特に明記しない限り、「約」という用語は暗黙的であり、これに関連して、特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味する。
【０２００】
本明細書で使用される場合、範囲は、「約」１つの特定の値から、または「約」１つの値から、「約」別の特定の値までとして表すことができる。本明細書に開示される多くの値があり、各値はまた、値自体に加えて、その特定の値について「約」として本明細書に開示されることも理解される。例えば、値「１０」が開示されているならば、このときは「約１０」も開示されている。２つの特定の単位間の各単位も開示されることも理解される。例えば、「１０〜１５」の範囲が開示されているならば、このときは、１１、１２、１３、および１４も開示されている。
【０２０１】
「治療」、「治療する」、および「治療すること」という用語は、本明細書に記載されるように、疾患もしくは障害、またはその１つ以上の症状の逆転、緩和、発症の遅延、または進行の阻害を指す。いくつかの実施形態では、治療は、１つ以上の症状が発生した後に施すことができる。他の実施形態では、治療は、症状がない状態で施すことができる。例えば、治療は、症状の発症の前に（例えば、症状の病歴を考慮して、および／または遺伝的もしくは他の感受性因子を考慮して）高感受性個体に施すことができる。症状が解消した後、例えば再発を予防または遅延させるために、治療を継続することもできる。
【０２０２】
本明細書で使用される場合、「癌」という用語は、白血病、癌腫、黒色腫、および肉腫を含む、動物に見られる全ての種類の癌または新生物または悪性腫瘍を指す。
【０２０３】
「白血病」とは、造血器官の進行性の悪性疾患を広く指し、一般に白血球およびそれらの前駆細胞の血液および骨髄中での歪んだ増殖および発達により特性付けられる。白血病疾患としては、例えば、急性非リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性前骨髄球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、無白血病性白血病、白血球血症性白血病（ｌｅｕｋｏｃｙｔｈｅｍｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、好塩基球性白血病（ｂａｓｏｐｈｙｌｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、芽球細胞性白血病、ウシ白血病、慢性骨髄球性白血病、皮膚白血病、胎生細胞性白血病、好酸球性白血病、グロス白血病、有毛細胞白血病、血芽球性白血病、血球母細胞性白血病、組織球白血病、幹細胞白血病、急性単球性白血病、白血球減少性白血病、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、リンパ行性白血病、リンパ球様白血病、リンパ肉腫細胞白血病、マスト細胞白血病、巨核球白血病、小骨髄芽球性白血病、単球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄球性白血病、骨髄様顆粒球性白血病、骨髄単球性白血病、ネーゲリ白血病、形質細胞白血病、多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、前骨髄球性白血病、リーダー細胞性白血病、シリング白血病、幹細胞白血病、亜白血性白血病、および未分化細胞白血病が挙げられる。
【０２０４】
「癌腫」という用語は、周囲の組織に浸潤して転移を引き起こす傾向がある上皮細胞からなる悪性の新規の増殖を指す。例示的な癌腫としては、例えば、腺房腺癌、小葉癌、腺様嚢胞癌、腺腫様腺癌、副腎皮質の癌腫、肺胞癌、肺胞上皮細胞癌、基底細胞癌、基底細胞癌腫、類基底細胞癌、基底扁平上皮細胞癌、細気管支肺胞癌、細気管支癌、気管支原性癌、脳状癌（ｃｅｒｅｂｒｉｆｏｒｍ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、胆管細胞癌、絨毛癌、膠質癌、コメド癌、子宮体癌、篩状癌、鎧状癌、皮膚癌、円筒形癌（ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、円筒細胞癌、腺管癌、導管性癌、硬膜癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｄｕｒｕｍ）、胎生期癌、脳様癌、類表皮癌、上皮アデノイド癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｅ  ａｄｅｎｏｉｄｅｓ）、外向発育癌、潰瘍癌、線維性癌、ゼラチン状癌腫、膠様癌、巨細胞癌（ｇｉａｎｔ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腺癌、顆粒膜細胞癌、毛母癌、血液様癌、肝細胞癌、ヒュルトレ細胞癌、肺硝子癌（ｈｙａｌｉｎｅ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腎明細胞癌、幼児型胎児性癌、上皮内癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｓｉｔｕ）、表皮内癌、上皮内癌（ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、クロンペッカー癌（Ｋｒｏｍｐｅｃｈｅｒ’ｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、クルチツキー細胞癌（Ｋｕｌｃｈｉｔｚｋｙ−ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、大細胞癌、レンズ状癌（ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、レンズ状癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒｅ）、脂肪肉腫、小葉癌、リンパ上皮癌、髄様癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｅｄｕｌｌａｒｅ）、髄様癌（ｍｅｄｕｌｌａｒｙ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、黒色癌、軟癌腫、粘液性癌、粘液性癌腫、粘液細胞癌、粘表皮癌、粘膜癌、粘液癌、粘液腫様癌、鼻咽頭癌、燕麦細胞癌、骨化性癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｓｓｉｆｉｃａｎｓ）、骨化性癌（ｏｓｔｅｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳頭状癌、門脈周囲癌、前浸潤癌、棘細胞癌、髄質様癌、腎臓の腎細胞癌、予備細胞癌、肉腫様癌腫、シュナイダー癌腫、硬性癌、陰嚢癌、印環細胞癌、単純癌、小細胞癌、ソラノイド癌（ｓｏｌａｎｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、スフェロイド細胞癌（ｓｐｈｅｒｏｉｄａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、紡錘細胞癌、海綿様癌、扁平上皮癌、扁平上皮細胞癌、ストリング癌（ｓｔｒｉｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、血管拡張性癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｔｉｃｕｍ）、毛細管拡張様癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔｏｄｅｓ）、移行上皮癌、結節癌、管状癌、結節状癌、疣贅性癌および絨毛癌が挙げられる。
【０２０５】
「肉腫」という用語は、一般に、胚性結合組織のような物質で構成され、一般に細線維性または均質な物質中に埋め込まれた密に充填された細胞からなる腫瘍を指す。肉腫としては、例えば、軟骨肉腫、繊維肉腫、リンパ肉腫、黒色肉腫、粘液肉腫、骨肉腫、アベメシー肉腫、脂肪肉腫（ａｄｉｐｏｓｅ  ｓａｒｃｏｍａ）、脂肪肉腫（ｌｉｐｏｓａｒｃｏｍａ）、胞巣状軟部肉腫、エナメル芽細胞肉腫、ブドウ状肉腫、緑色腫肉腫（ｃｈｌｏｒｏｍａ  ｓａｒｃｏｍａ）、絨毛癌、胎児性肉腫、ウィルムス腫瘍肉腫、子宮内膜肉腫、間質性肉腫、ユーイング肉腫、筋膜肉腫、線維芽細胞肉腫、巨細胞肉腫、顆粒球性肉腫、ホジキン肉腫、特発性多発性色素性出血性肉腫、Ｂ細胞の免疫芽球性肉腫、リンパ腫、Ｔ細胞の免疫芽球性肉腫、イエンセン肉腫、カポジ肉腫、クッパー細胞肉腫、血管肉腫、白血肉腫、悪性間葉腫肉腫、傍骨性骨肉腫、網状赤血球肉腫、ラウス肉腫、漿液瘤嚢胞性肉腫、滑膜肉腫または毛細管拡張性肉腫（ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｌｔｉｃ  ｓａｒｃｏｍａ）が挙げられる。
【０２０６】
「黒色腫」という用語は、皮膚および他の器官のメラニン細胞系から生じる腫瘍を意味するように受け取られる。黒色腫には、例えば、肢端黒子型黒色腫、メラニン欠乏性黒色腫、良性若年性黒色腫、クラウドマン黒色腫、Ｓ９１黒色腫、ハーディング・パッセー黒色腫、若年性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、悪性黒色腫、結節型黒色腫、爪下黒色腫、および表在拡大型黒色腫が挙げられる。
【０２０７】
追加の癌としては、例えば、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、横紋筋肉腫、原発性血小板血症、原発性マクログロブリン血症、小細胞肺腫瘍、原発性脳腫瘍、胃癌、大腸癌、悪性膵臓癌、悪性カルチノイド、前癌性皮膚病変、精巣癌、リンパ腫、甲状腺癌、神経芽細胞腫、食道癌、泌尿生殖器癌、悪性高カルシウム血症、頸部癌、子宮内膜癌、および副腎皮質癌が挙げられる。いくつかの実施形態では、癌は、乳癌、子宮癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、および膵臓癌からなる群から選択される。
【０２０８】
さらなる詳細なしに、当業者が、上記の説明に基づいて、本発明を最大限に利用することができると考えられる。したがって、本明細書で提供される特定の実施形態は、単なる例示として解釈されるべきであり、いかなる方法であれ、本開示の残りの部分を限定するものではない。本明細書で引用される全ての刊行物は、本明細書で参照される目的または主題のために参照により組み込まれる。
【実施例】
【０２０９】
実施例１：乳からのエクソソームの単離
サイズ排除クロマトグラフィー法または分画超遠心分離法のいずれかを使用して、生乳（ウシおよびヤギ）からエクソソームを単離した。両方の手順を以下に詳しく説明する。
【０２１０】
超遠心分離を使用した単離
サイズ排除クロマトグラフィーによる精製の前に、生乳から過剰な脂肪を除去した。まず、乳を、Ｏｐｔｉｍａ  ＸＥ−９０超遠心分離機を用いて、１３，０００ＲＣＦで４℃にて３０分間遠心分離した。遠心分離工程の完了後、上清をペレットからデカントして取り除き、続いて濾過して、残っている固形物を全て除去した。濾過した上清をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と混合し、Ｏｐｔｉｍａ  ＸＥ−９０超遠心機を用いて、１００，０００ＲＣＦで４℃にて６９分間、２回目の遠心分離を行った。上清をペレットから除去し、Ｏｐｔｉｍａ  ＸＥ−９０超遠心機で１３５，０００ＲＣＦで、４℃にて１０３分間、３回目の遠心分離を行う。
【０２１１】
次に、上清をペレットからピペッティングすることにより、上清を注意深く除去した。続いて、ペレット（エクソソームを含有する）をＰＢＳ中に再懸濁し、Ｏｐｔｉｍａ  ＸＥ−９０超遠心機を用いて、１３５，０００ＲＣＦで４℃にて１０３分間遠心分離した。ペレットをＰＢＳに再懸濁し、１３５，０００ＲＣＦで４℃にて１０３分間、さらに２サイクル遠心分離して、ペレット化したエクソソームを完全に洗浄する。３回目の洗浄（および１３５，０００ＲＣＦでの４回目の遠心分離）の後、エクソソームをＰＢＳに再懸濁し、さらなる実験での使用に利用可能な状態にする。
【０２１２】
超遠心分離を使用して乳エクソソームを単離するための例示的なフローチャートが図１Ａに提供されている。この手順で得られた結果を以下の表７に示す。
【表７】
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【０２１３】
サイズ排除クロマトグラフィーを使用した単離
サイズ排除クロマトグラフィーによる精製の前に、生乳から過剰な脂肪を除去した。まず、乳を、Ｏｐｔｉｍａ  ＸＥ−９０超遠心分離機を用いて、１３，０００ＲＣＦで４℃にて３０分間遠心分離した。遠心分離工程の完了後、上清をペレットからデカントして取り除き、続いて濾過して、残っている固形物を全て除去した。濾過した上清をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と混合し、Ｏｐｔｉｍａ  ＸＥ−９０超遠心機を用いて、１００，０００ＲＣＦで４℃にて７１分間、２回目の遠心分離を行った。続いて、上清（乳清液）をペレットからデカントし、Ａｍｉｃｏｎ濾過を使用して３，５００ｒｐｍで１３５分間濃縮し、最終容量を約８ｍＬに断続的に再懸濁した。次いで、ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ５００−ＨＲまたはｑＥＶクロマトグラフィー樹脂のいずれかを使用して乳清液を分画した。
【０２１４】
ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ５００−ＨＲサイズ排除カラムは、ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ５００−ＨＲの懸濁液をガラスカラムに充填し、過剰のＰＢＳで洗浄することによって調製した。濃縮された乳清液をカラムに充填し、重力によって流動させた。ＰＢＳを溶離剤として使用し、１ｍＬの分画を収集した。
【０２１５】
ｑＥＶサイズ排除カラムは、Ｉｚｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）から入手した。カラムは使用前に過剰のＰＢＳですすいだ。濃縮乳清液をカラムに充填した。ＰＢＳを溶離剤として使用し、１ｍＬの分画を収集した。
【０２１６】
分画は、ＢＣＡタンパク質アッセイ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびウエスタンブロット分析を使用して特性化し、エクソソームを含有する分画を特定した。その後、これらの分画をプールし、濃縮し、さらなる実験での使用に利用可能な状態にする。
【０２１７】
ＳＥＣによって調製されたエクソソームのタンパク質濃度を図１Ｂに示す。結果は、ＳＥＣによって調製されたエクソソームが、ＵＣによって調製されたエクソソームと比較して、より高い濃度および収量を伴って、より小さいことを示している。
【０２１８】
実施例２：エクソソームの特性評価
プロテオミクス分析
ウシ脱脂乳とヤギ乳からのエクソソームをプロテオミクス分析にかけた。単離されたエクソソームを、エクソソームを破壊し、エクソソーム内に含有されるタンパク質を放出させるのに十分な量のＲＩＰＡ緩衝液を用いて、室温でプローブソニケーターを使用して１０回の１秒間サイクルで超音波処理した。次いで、１０μｇの各サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＮｕＰＡＧＥゲルに充填した。サンプルを短時間実行し、各サンプルの移行ウィンドウ（約１ｃｍのレーン）を切除した。切除したゲル内サンプルを２５ｍＭの重炭酸アンモニウム、続いてアセトニトリルで洗浄した。次いで、ゲル内サンプルを１０ｍＭのジチオスレイトール中で６０℃で還元した後、５０ｍＭのヨードアセトアミド中で室温でアルキル化した。次いで、トリプシンをサンプルに添加し、軌道振とう器内で３７℃で４時間インキュベートして、タンパク質を消化した。消化物を５％のトリフルオロ酢酸でクエンチし、サンプルを遠心分離した。消化されたペプチドを個別にトラッピングカラムに充填し、ペプチドの特定のためにＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析器に接続された分析カラムで溶出した。次いで、特定されたペプチドデータを既知のタンパク質配列データベースと比較して、ウシ脱脂乳およびヤギ乳のエクソソームに存在するタンパク質を特定した。
【０２１９】
図２Ａおよび図２Ｂは、それぞれ、酸性化された脱脂乳エクソソームおよびヤギエクソソームにおいて特定された代表的なタンパク質を示す。酸乳とは、酸沈殿によってカゼインが除去された乳サンプルを指す。
【０２２０】
消化緩衝液の安定性分析
ウシ生乳およびヤギ乳からのエクソソームの安定性を、動的光散乱、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析を含む、様々なタンパク質プロファイルおよび物理的特性を評価することによって、異なる消化緩衝液（ラット血清、疑似腸液、疑似胃液、およびｐＨ２のリン酸緩衝液）で、経時的に（０、１、４、および２４時間）測定した。煮沸を受けた生乳からのエクソソームの安定性も評価した。図３Ａおよび３Ｂ。
【０２２１】
以前に単離されたエクソソームをＰＢＳで希釈し、アリコートした。各アリコートを、異なる消化緩衝液（ラット血清、疑似腸液、疑似胃液、およびｐＨ２のリン酸緩衝液）と個別に混合した。次いで、サンプルを軌道振とう器に入れ、３７℃で０、１、４、２４時間インキュベートした。追加のアリコートセットをＰＢＳ中で９５℃で１５分間煮沸した。インキュベーション時間後、各サンプルを室温で５分間、ＲＩＰＡ緩衝液が最終容量の１／３になるような量のＲＩＰＡ緩衝液と混合した。これで、サンプルの特性評価の準備が整った。この研究の結果を図４に示す。
【０２２２】
サンプルを、標準的なＤＬＳ機器を使用した動的光散乱によって分析した。サンプルを、４〜２０％のＭｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ゲルカセット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したサンプルを、抗ＣＤ８１および抗ＣＤ４７抗体を用いたウエスタンブロット分析にさらに供した。
【０２２３】
腸液の安定性分析
脱脂乳、生乳、および粉末初乳からのエクソソームの安定性を、動的光散乱、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析を含む、様々なタンパク質プロファイルおよび物理的特性を評価することによって、０．５％のパンクレアチンを含有する腸液中で経時的に測定した。
【０２２４】
以前に単離されたエクソソームをＰＢＳで希釈し、独立したサンプルにアリコートし、０．５％のパンクレリパーゼを含有する腸液と混合した。次いで、サンプルを軌道振とう器に入れ、３７℃で０、１、４、２４時間インキュベートした。インキュベーション時間後、各サンプルを室温で５分間、ＲＩＰＡ緩衝液が最終容量の１／３になるような量のＲＩＰＡ緩衝液と混合した。これで、サンプルの特性評価の準備が整った。
【０２２５】
サンプルを、標準的なＤＬＳ装置を使用した動的光散乱によって分析した。サンプルを、４〜２０％のＭｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ゲルカセット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて動的光散乱、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析を含む、様々なタンパク質プロファイルおよび物理的特性を評価することによって分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したサンプルを、抗ＣＤ８１、抗Ａｌｉｘ、および抗ＴＳＧ１０１抗体、抗ＣＤ６３抗体、および／または抗ＥｐＣＡＭ抗体のカクテルを使用したウエスタンブロット分析にさらに供した。図４を参照されたい。
【０２２６】
ナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ）
粒子サイズおよび粒子濃度を測定するために、ナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ）を実行した。ＮＴＡは、ブラウン運動の速度を粒子サイズに関連付ける、液体中の粒子を視覚化および分析するための方法であある。結果を図５Ａ〜５Ｄおよび図６Ａ〜６Ｄに示す。
【０２２７】
粒子サイズおよび濃度は、ｐＨ２、および１００℃への加熱下では、ＳＧＦおよびペプシンで誘導された生乳エクソソームでは比較的変化しなかった。図６Ａ〜６Ｂ。同様に、粒子サイズおよび濃度は、ｐＨ２、および１００℃への加熱下では、ＳＧＦおよびペプシンと共にＳＩＦおよびパンクレアチンで誘導された脱脂乳エクソソームでは比較的変化しなかった。図６Ｃ〜６Ｄ。
【０２２８】
実施例３：酸性化によるカゼイン除去を伴うむ乳小胞の調製
乳からエクソソームを単離する従来の手法は、通常、超遠心分離に基づいている。この実施例は、酸性化によるカゼインの除去を伴う、乳から乳小胞を単離するための例示的な方法を提供する。また、本明細書では、従来の超遠心分離法から得られた乳小胞と比較して、こうして得られた乳小胞の特性評価が提供される。
【０２２９】
調製方法
分画超遠心分離（ＵＣ）を以下のように実行して、バルク溶液から所望の乳小胞を分離した。乳サンプルを、２０，０００×ｇで最大３０分間スピンし、続いて約１００，０００×ｇ〜約１３０，０００×ｇの範囲で約１〜約２時間の複数回のスピンを行った。このようにして生成された、乳由来の小胞が豊富なペレットが収集される。
【０２３０】
酸性化とそれに続く超遠心分離（ＡＵＣ）法による例示的なカゼイン除去を以下のように実行した。新鮮な生乳を、７〜２０ｋｇを２０〜４０分間遠心分離して脱脂した。次いで、脱脂乳サンプルに酢酸を添加して、カゼインを凝固させた。カゼイン沈殿物を除去し、乳エクソソーム（細胞外小胞またはＥＶ）を、約１００，０００×ｇ〜約１３０，０００×ｇの範囲で約１〜約２時間、いくつかの遠心分離工程を使用して単離した。乳由来の小胞が豊富な最終ペレットを、ＰＢＳに再懸濁した。
【０２３１】
ＥＤＴＡとそれに続く超遠心分離（ＥＵＣ）法による例示的なカゼインミセルの破壊を以下のように実行した。新鮮な生乳を、７〜２０ｋｇを２０〜４０分間遠心分離して脱脂した。次いで、脱脂乳サンプルにＥＤＴＡ溶液を添加して、カゼインミセルを破壊した。ＥＶを、約１００，０００×ｇ〜約１３０，０００×ｇの範囲で約１〜約２時間、いくつかの遠心分離工程を使用して単離した。乳由来の小胞が豊富な最終ペレットを、ＰＢＳに再懸濁した。
【０２３２】
酸性化とそれに続く接線流濾過およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＡＴＦＦ／ＳＥＣ）法による例示的なカゼイン除去を以下のように実行した。新鮮な生乳を、７〜２０ｋｇを２０〜４０分間遠心分離して脱脂した。次いで、脱脂乳サンプルに酢酸を添加して、カゼインを凝固させた。カゼイン沈殿物を除去し、ＥＶを洗浄し、接線流濾過を使用して濃縮した。このように形成された透過液を、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ樹脂を使用するサイズ排除クロマトグラフィーを使用してさらに精製した。得られた乳小胞を収集し、ＰＢＳに再懸濁した。
【０２３３】
タンパク質含有量の特性評価
様々なエクソソーム（ＥＶ）のタンパク質プロファイルを分析するために、サンプル（それぞれ、２０ｕｇのタンパク質を含有する）を４Ｘ  Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（１０％メルカプトエタノールを含む）と混合し、９５℃で５分間変性させた。次いで、標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ手順を使用してサンプルを分解し、タンパク質検出のためにゲルをＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色で染色した。
【０２３４】
図７Ａに示されるように、ＡＵＣまたはＡＴＦＦ／ＳＥＣ法のいずれかを使用して単離されたエクソソーム（ＥＶ）は、同様のタンパク質プロファイルを有し、ＵＣまたはＥＵＣ法と比較して主に主要なタンパク質汚染が枯渇している。
【０２３５】
ゲルスキャンを分析して、２つの主要な汚染タンパク質グループであるカゼインおよびラクトグロブリンの相対的存在量を評価した。簡単に言うと、２５〜３０ｋＤａのバンド（主に乳由来のサンプル中のカゼイン）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのＣｏｏｍａｓｓｉｅ染色を使用して定量化した。ゲルスキャンは、標準的な手順に従ってＩｍａｇｅＪを使用して定量化し、各レーンの合計シグナルによって正規化させた。１０〜２０ｋＤａのバンド（主に乳由来のサンプル中のラクトグロブリンからなる）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのＣｏｏｍａｓｓｉｅ染色を使用して定量化した。ゲルスキャンは、標準的な手順に従ってＩｍａｇｅＪを使用して定量化し、各レーンの合計シグナルによって正規化させた。カゼインおよびラクトグロブリンの両方が、ＡＵＣおよびＡＴＦＦ／ＳＥＣ法によって、従来のＵＣ法と比較して４〜５倍効率的に枯渇した。図７Ｂおよび７Ｃ。ＥＵＣ法で調製されたＥＶ組成物中のカゼインおよびラクトグロブリンの相対的存在量も、従来のＵＣ法で調製されたＥＶ組成物よりも有意に低かった。
【０２３６】
実施例４：植物性レンネットを用いた凝固によるカゼイン除去を伴う乳小胞の調製
得られたエクソソーム（ＥＶ）のタンパク質プロファイルおよびエクソソームマーカーの存在に関するカゼイン単離の様々な方法の効果を比較するために、ＡＴＦＦ／ＳＥＣおよびＶＲＴＦＦ／ＳＥＣ法によって調製された乳エクソソーム中の乳エクソソームおよび乳エクソソームマーカーの相対量を分析した。
【０２３７】
ＡＴＦＦ／ＳＥＣは、上記の実施例３で説明したように実行した。植物性レンネットを用いた凝固とそれに続く接線流濾過およびサイズ排除クロマトグラフィー法（ＶＲＴＦＦ／ＳＥＣ）による例示的なカゼイン除去を以下のように実施した。カゼインは、植物性レンネットを使用して生乳（または脱脂乳）で凝固させた。凝固したカゼインを、標準的な手順に従って除去した。得られたＥＶを洗浄し、接線流濾過を使用して濃縮した。サイズ排除クロマトグラフィーを使用して透過液をさらに精製し、得られたＥＶ組成物を収集した。
【０２３８】
ＥＶ単離物を４Ｘ  Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（１０％のメルカプトエタノールを含む）と混合し、９５℃で５分間インキュベートした。次いで、標準のＳＤＳ−ＰＡＧＥ手順を使用してサンプルを分離し、ＰＶＤＦ膜に移動させた。次に、抗ＣＤ８１、抗ＢＴＮ１Ａ１、または抗ＸＯＲ抗体を使用して膜をブロットした。
【０２３９】
図８Ａに示されるように、カゼインのレンネット凝固は、エクソソーム（ＥＶ）および乳エクソソーム（ＭＥＶ）特異的マーカーの喪失または分解をもたらさなかった。
【０２４０】
レンネット酵素混合物を使用してカゼインを除去することによる乳エクソソームの収量への影響を評価するために、ＶＲＴＦＦ／ＳＥＣおよびＡＴＦＦ／ＳＥＣによって調製されたエクソソームの最終濃度をＮａｎｏｓｉｇｈｔトラッキング分析によって測定し、投入材料の量に対して再算出した。ＥＶ単離物を０．１ｕｍ濾過した１ＸＰＢＳで希釈し、標準的なＮａｎｏｓｉｇｈｔトラッキング分析（ＮＴＡ）プロトコルを使用して実行し、粒子の濃度およびサイズを決定した。粒子収量は、粒子濃度にＥＶ単離物の体積を掛けることによって決定した。図８Ｂに示すように、ＡＴＦＦ／ＳＥＣ（酸性化によるカゼインの除去）とＶＲＴＦＦ／ＳＥＣ（植物性レンネットによるカゼインの除去）との両方で、同様の粒子収量が得られる。
【０２４１】
実施例５：乳小胞の特性評価
本明細書に開示された方法（例えば、上記の実施例３および４を参照）によって調製された乳小胞組成物の様々な特徴を分析した。いくつかの例を以下に示す。
【０２４２】
（ｉ）乳小胞のバイオマーク
従来のエクソソームマーカー（例、ＣＤ８１）がＢＴＮ１Ａ１陽性粒子に存在するかどうかを評価するために、共免疫沈降アッセイを実行した。簡単に言うと、乳ＥＶを様々な量の抗ＢＴＮ１Ａ１抗体とインキュベートし、プロテインＡ磁気ビーズを使用してプルダウンした。非結合物質を結合物質から洗い流し、溶解した結合物質を、抗ＢＴＮ１Ａ１および抗ＣＤ８１抗体を使用する標準的なウエスタンブロッティング手順によって分析した。
【０２４３】
このアッセイは、ＣＤ８１関連シグナルがＢＴＮ１Ａ１陽性粒子に富んでいることを示し、本明細書に開示される方法（例えば、上記の実施例３および４に例示されるようなカゼイン除去を伴う）によって調製された乳ＥＶがＢＴＮ１Ａ１およびＣＤ８１の両方の存在を有し得ることを示唆する。図９。
【０２４４】
（ｉｉ）乳エクソソームは、凍結融解サイクルおよび温度処理に耐える
ＡＴＦＦ／ＳＥＣを介して調製されたカゼイン枯渇エクソソームを、以下のように、様々な温度条件での安定性ならびに凍結融解サイクルでの耐性について評価した。
【０２４５】
エクソソーム（ＥＶ）を、酸で促進された凝固およびチーズクロスによる濾過、続いて上記のＴＦＦを使用して、カゼインが枯渇した乳から単離させた。続いて、ＴＦＦで単離されたＥＶを、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ樹脂を使用したサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で精製した。ＥＶ原液の粒子濃度は、４×１０１２粒子／ｍｌであった。ＥＶ原液を、１００ｍＭのトレハロース／ＰＢＳまたはＰＢＳと１：１の比で混合することにより、２×１０１２粒子／ｍｌの最終粒子濃度にした。サンプルを、−８０℃で２４時間、４℃で２４時間、室温で９６時間、６０℃で４０分間、または１００℃で１０分間保管した。さらに、ＰＢＳ中のＥＶの１つのサンプルおよび５０ｍＭのトレハロース／ＰＢＳ中の１つのサンプルを６回の凍結融解サイクルにかけた。各凍結融解サイクルは、サンプルをドライアイスに５分間入れた後、３７℃で５分間インキュベートすることによって実施した。
【０２４６】
粒子サイズおよび濃度は、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ  ＮＳ３００ナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ）機器を使用して測定した。簡単に言うと、測定した全てのサンプルを、０．１μｍ濾過した１×ＰＢＳで希釈した。各サンプルを、流量３０に設定されたシリンジポンプを使用して、１ｍｌシリンジを介して機器に注入した。各サンプルの粒子の流れを、カメラレベル１４を使用して５×３０秒間記録し、レベル５設定を使用して分析した。処理または保管条件なしで粒子濃度が変化し、１００℃で１０分間の処理のみで粒子サイズが減少した。図１０Ａおよび１０Ｂ。
【０２４７】
さらに、サンプルのタンパク質プロファイルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を介して上記に開示されたように、異なる温度条件または凍結融解サイクルでインキュベートされた後に分析した。簡単に言うと、各サンプルを４ＸＬａｅｍｍｌｉ緩衝液（１０％のメルカプトエタノールを含有する）と混合し、９５℃で５分間インキュベートした。タンパク質含有量について、サンプルを、ＸＣｅｌｌ  Ｓｕｒｅｌｏｃｋ  ＭｉｄｉＣｅｌｌ上を４〜１２％のＮｕＰＡＧＥ  ＭＩｄｉ  Ｇｅｌを２００Ｖで作動させて分析した。タンパク質を、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  ＳａｆｅＳｔａｉｎを使用して視覚化した。染色されたゲルを、Ｌｉｃｏｒ  ＣＬｘ  Ｏｄｄｉｓｓｅｙイメージングシステム（７００ｎｍレーザー）を使用して画像化した。ＡＴＦＦ／ＳＥＣによって単離された粒子のタンパク質プロファイルに変化をもたらす処理または保管条件はなかった。図１０Ｃ。
【０２４８】
加えて、温度処理または凍結融解サイクル後の乳小胞バイオマーカーのレベルを調べるために、ウエスタンブロット分析を実行した。簡単に言うと、エクソソーム（ＥＶ）単離物を４Ｘ  Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（１０％のメルカプトエタノールを含む）と混合し、９５℃で５分間インキュベートした。標準のＳＤＳ−ＰＡＧＥ手順を使用してサンプルを分離し、ＰＶＤＦ膜に移動させた。次に、抗ＣＤ８１、抗ＢＴＮ１Ａ１、または抗ＸＯＲ抗体を使用して膜をブロットした。ほとんどの処理または保管条件は、ＢＴＮ１Ａ１およびＸＯＲの存在量に有意な変化をもたらさなかった。１０分間煮沸すると、ＣＤ８１およびＸＯＲレベルが低下した。図１０Ｄ〜１０Ｆ。
【０２４９】
（ｉｉｉ）コレステロール修飾ｓｉＲＮＡを装填した乳エクソソームのコロイド安定性
コロイド安定性とは、分散液の長期的な完全性、および沈降または粒子の凝集などの現象に抵抗するその能力を指す。これは典型的には、分散した相の粒子が懸濁状態を維持できる時間によって定義される。コレステロール修飾オリゴヌクレオチド（「ｃｈｏｌーＯＮ」）の存在下での乳ＥＶのコロイド安定性をテストするために、カゼイン除去なしの従来の超遠心分離手法（「ＵＣ」）により、または本明細書に開示されるように酸性化によるカゼイン除去を伴う接線流濾過とそれに続くサイズ排除クロマトグラフィー（ＡＴＦＦ／ＳＥＣ）を使用して乳から単離されたＥＶを、コレステロール−ｓｉＲＮＡ−ＤＹ６７７と共に、５０００／１のｓｉＲＮＡ／ＥＶの比率で室温で１．５時間インキュベートした。サンプルを４ｏＣで２４時間放置した。カゼインを除去せずに超遠心分離（ＵＣ）によって単離された初乳粉末からのＥＶを、コレステロール−ｓｉＲＮＡ−ＤＹ６７７と共に、５００／１、１０００／１、または５０００／１のｓｉＲＮＡ／ＥＶの比率で、室温で１．５時間インキュベートした。サンプルを４ｏＣで２４時間保持した。結果は、カゼイン含有乳ＥＶ単離物および初乳由来ＥＶ単離物が、コレステロール修飾ｓｉＲＮＡとインキュベートしたときにコロイド安定性を失ったことを示している。対照的に、ＡＴＦＦ／ＳＥＣ法で調製された単離された乳ＥＶは、コロイド安定性を維持した。
【０２５０】
さらに、従来のＵＳ手法によって調製された乳ＥＶ単離物、および本明細書に開示されたＡＴＦＦ／ＳＥＣ法によって調製されたものを、ｃｈｏｌ−ＯＮと共に、０／１、５０００／１、および２００００／１のｃｈｏｌ−ＯＮ／ＥＶの比率で室温で１．５時間インキュベートした。サンプルを４ｏＣで２４時間放置し、２０００ｇで２分間遠心分離して、沈殿物が形成された場合はそれを収集して可視化した。このようにして得られた結果は、カゼイン含有乳ＥＶ単離物が、コレステロール修飾ＯＮとインキュベートするとコロイド安定性を失い−遠心分離後に沈殿物が見られたことを示している。対照的に、遠心分離後にＡＴＦＦ／ＳＥＣ法で調製した乳ＥＶサンプルでは沈殿物は観察されず、ＡＴＦＦ／ＳＥＣ法で調製した乳ＥＶはコロイド安定性を維持していることを示している。
【０２５１】
（ｉｖ）カゼインの除去は、疑似胃液中の粒子の安定性に影響を与えない
さらに、低ｐＨでカゼインを除去して、またはカゼインを除去せずに調製された乳エクソソームの安定性を分析した。ＵＣまたはＡＵＣのエクソソームを、疑似胃液と共にｐＨ２または５で０〜４時間インキュベートした。粒子サイズおよび濃度を、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ  ＮＳ３００  ＮＴＡ機器を使用して測定した。測定した全てのサンプルを、０．１μｍ濾過した１×ＰＢＳで２０，０００倍に希釈した。各サンプルを、流量３０に設定されたシリンジポンプを使用して、１ｍｌシリンジを介して機器に注入した。各サンプルの粒子の流れを、カメラレベル１４を使用して５×３０秒間記録し、レベル５設定を使用して分析した。
【０２５２】
図１１Ａ〜１１Ｄに示されるように、ＵＣおよびＡＵＣのエクソソームの両方は、粒子の有意な損失なしに、低ｐＨでのインキュベーションに十分に耐える。
【０２５３】
（ｖ）カゼインが枯渇した乳小胞の装填容量
カゼインが枯渇した乳小胞へのコレステロール修飾オリゴヌクレオチドの装填効率を評価するために、接線流濾過とそれに続く酸性化によるカゼイン除去を伴うサイズ排除クロマトグラフィー（ＡＴＦＦ／ＳＥＣ）を使用して単離した乳からのＥＶをコレステロール−ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ５．５と共に、６００／１、１２００／１、２４００／１、または４８００／１のｓｉＲＮＡ／ＥＶの比率で、室温で１．５時間インキュベートした。全てのサンプルは、４０ｋＤａをカットオフする２ｍｌのＺｅｂａスピンカラムを使用して精製し、未結合のｓｉＲＮＡを除去した。全てのサンプルの吸光度および蛍光スペクトルを、精製の前後に測定した。Ｃｙ５．５色素の吸光度および蛍光の両方について、精製前後の曲線下面積の比率を使用して、装填％を計算した。
【０２５４】
結果は、ＡＴＦＦ／ＳＥＣ  ＥＶを用いた様々な濃度のコレステロール修飾ｓｉＲＮＡとのインキュベーションにより、エクソソームあたり少なくとも約５０００個のｓｉＲＮＡを効率的に装填できることを示している。図１２。様々なｓｉＲＮＡ／ＥＶ比での装填容量を以下の表８に示す。
【表８】
2021529535.tif 000043
【０２５５】
（ｖｉ）カゼインが枯渇した乳小胞は、オリゴヌクレオチドをＳ１ヌクレアーゼ消化から保護する
装填されたオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ保護は、カゼイン除去の３つの方法：（ｉ）酸性化促進カゼイン凝固、（ｉｉ）子牛レンネット促進カゼイン凝固、および（ｉｉｉ）植物性レンネット促進カゼイン凝固により、投入材料を使用して保護された。図１３Ａは、装填されたオリゴヌクレオチドのＥＶ保護を評価するための例示的なプロセスを示す。簡単に言うと、ｃｈｏｌ−ＯＮを、接線流濾過を使用して乳から分離したＥＶと共に、室温で１．５時間インキュベートした後、上記の（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）の手法で、それぞれ、６００／１、３５０／１および３５０／１（ｃｈｏｌ−ＯＮ／ＥＶ）の比率で上記のようにカゼインを枯渇させたサイズ排除クロマトグラフィーを行った。
【０２５６】
Ｓ１ヌクレアーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）分解アッセイを、酢酸緩衝液ｐＨ＝４．６（６０ｍＭのＮａＯＡｃ、１ｍＭのＺｎＳＯ４）で実施した。緩衝液中またはＥＶ（接線流濾過とそれに続く（ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）の手法によるカゼイン枯渇を伴うサイズ排除クロマトグラフィーを使用して単離された乳ＥＶ）中の各オリゴヌクレオチド（ＯＮ）サンプル（コレステロールを含むか、または含まない）を２つのアリコートに分割した。一方のアリコートに、Ｓ１ヌクレアーゼを１０Ｕ／ｕｌの最終ヌクレアーゼ濃度で添加し、他方のアリコートに、ブランク対照と同じ量の緩衝液（６０ｍＭのＮａＯＡｃ、１ｍＭのＺｎＳＯ４、ｐＨ＝４．６）を添加した。全てのサンプルを、３７ｏＣで４５分間インキュベートした。次いで、各ＯＮ／ＥＶサンプルを３つのアリコートに分割した。アリコートの１つに、２０ｍＭのメチルベータシクロデキストリン（ＭＢＣＤ）を添加し、５分間インキュベートし、反応を３０ｍＭのＥＤＴＡでクエンチした。次いで、このアリコートを８５ｏＣに５分間加熱して、Ｓ１ヌクレアーゼを不活性化した。他の２つのアリコートには、反応をクエンチさせた後、ＰＢＳ緩衝液またはＰＢＳ中の３０ｍＭのＭＢＣＤのいずれかを添加した。全てのサンプルを室温で１０分間インキュベートし、２０％のＴＢＥ  ＰＡＧＥ上で、ＸＣｅｌｌ  ＳｕｒｅＬｏｃｋ（商標）Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌを使用して２００Ｖで作動させて分析した。ゲルをＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ（ＴＢＥ緩衝液中１０，０００倍）で、４ｏＣの振とう器上で１０分間染色した。箱入りのＵＶ光を使用してゲルを画像化し、色素を可視化した。
【０２５７】
図１３Ｂおよび図１４Ａ〜１４Ｂに示されるように、上記の手法（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含むカゼイン枯渇を伴う方法によって調製された乳小胞は、装填されたオリゴヌクレオチドをＳ１ヌクレアーゼ消化から保護した。保護の効率を以下の表９に示す。
【表９】
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【０２５８】
（ｖｉｉ）ペグ化リポソームは、コレステロール修飾オリゴヌクレオチドをＳ１ヌクレアーゼ消化から保護しない
コレステロール−ＯＮ保護の特異性を評価するために、ペグ化リポソームを標準プロトコルに従って調製した。簡単に言うと、ＤＯＰＣ／ＤＯＰＥ／ＤＰＰＥ−ＰＥＧ２０００を２ドラムガラスバイアル内で４９．５／４９．５／１ｍｏｌ％で混合した。脂質を１００ｕｌのクロロホルム中に溶解し、バイアルを手動で回転させながら空気流下で蒸発させて、バイアルの壁に薄膜を形成させた。脂質膜を真空下で１時間乾燥させて、微量のクロロホルムを除去した。脂質膜を、コレステロール−ＯＮ−ＤＹ６７７  ８０ｍＭのＮａＯＡｃ緩衝液ｐＨ＝４．５で水和させた。懸濁液を５分間ボルテックスした後、１００ｎｍのポリカーボネートメンブレンを備えたＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ押出機を使用して押出成形した。混合物を、押出機に１１回通した。得られたサンプルは、４０ｋＤａをカットオフする２ｍｌのＺｅｂａ脱塩スピンカラムを使用して精製した。
【０２５９】
コレステロール−ＯＮ−ＤＹ６７７を、接線流濾過を使用して乳から分離されたＥＶと共に、室温で１．５時間インキュベートした後、６００／１（ＯＮ／ＥＶ）の比率で酸性化（ＡＴＦＦ／ＳＥＣ）によるカゼイン枯渇を伴うサイズ排除クロマトグラフィーを行った。
【０２６０】
Ｓ１ヌクレアーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）分解アッセイを、酢酸緩衝液ｐＨ＝４．６（８０ｍＭのＮａＯＡｃ、５ｍＭのＺｎＳＯ４）で実施した。ＥＶ（ＡＴＦＦ／ＳＥＣ）、リポソーム、または緩衝液中の各ＯＮ−ＤＹ６７７サンプル（コレステロールを含むか、または含まない）を、２つのアリコートに分割した。一方のアリコートに、Ｓ１ヌクレアーゼを２０Ｕ／ｕｌの最終ヌクレアーゼ濃度で添加し、他方のアリコートに、ブランク対照と同じ量の緩衝液（８０ｍＭのＮａＯＡｃ、５ｍＭのＺｎＳＯ４、ｐＨ＝４．６）を添加した。全てのサンプルを３７ｏＣで４５分間インキュベートし、３０ｍＭのＥＤＴＡでクエンチした。サンプルを８５ｏＣに５分間加熱して、Ｓ１ヌクレアーゼを不活性化した。各サンプルを２つのアリコートに分割し、反応をクエンチさせた後、ＰＢＳまたはＰＢＳ中の３０ｍＭのＭＢＣＤのいずれかを１つのアリコートに添加した。全てのサンプルを、室温で１０分間インキュベートした。次いで、サンプルを、２０％のＴＢＥ  ＰＡＧＥ上で、ＸＣｅｌｌ  ＳｕｒｅＬｏｃｋ（商標）Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌを使用して２００Ｖで作動させて分析した。ゲルを、Ｌｉｃｏｒ  ＣＬｘ  Ｏｄｄｉｓｓｅｙイメージングシステム（７００ｎｍチャネル）を使用して画像化した。
【０２６１】
図１５Ａに示されるように、ペグ化リポソームは、カゼイン枯渇乳ＥＶとは対照的に、Ｓ１ヌクレアーゼ消化アッセイにおいてコレステロール−ＯＮを保護しない。保護効率を以下の表１０に示す。
【表１０】
2021529535.tif 000045
【０２６２】
以下の表１１は、ヌクレアーゼ消化アッセイにおける修飾または非修飾オリゴヌクレオチド（ＯＮ）の相対的な保護効率を示している。
【表１１】
2021529535.tif 000046
【０２６３】
（ｖｉｉｉ）オリゴヌクレオチドのカルシウム／エタノール沈殿物は、Ｓ１ヌクレアーゼ消化からの効率的な保護をもたらさない。
この研究では、エクソソームに装填されたコレステロール−ＯＮと従来のトランスフェクションプロトコル（すなわち、Ｃａ／エタノールトランスフェクション）を使用してトランスフェクトされたオリゴヌクレオチドとの保護効率をさらに比較する。
【０２６４】
ＯＮ−ＤＹ６７７を、接線流濾過を使用して乳から分離されたＥＶと共に、室温で１．５時間インキュベートした後、６００／１（ＯＮ／ＥＶ）の比率で酸性化（ＡＴＦＦ／ＳＥＣ）によるカゼイン枯渇を伴うサイズ排除クロマトグラフィーを行った。あるいは、ＯＮ−ＤＹ６７７を、ＣａＣｌ２／４０％エタノールを使用して、接線流濾過とそれに続く酸性化によるカゼイン枯渇を伴うサイズ排除クロマトグラフィー（ＡＴＦＦ／ＳＥＣ）によって分離された乳ＥＶにトランスフェクトした。ＣａＣｌ２およびエタノールを添加した後、ＥＶを６００／１（ＯＮ／ＥＶ）の比率でＯＮと混合した。サンプルを室温で１．５時間インキュベートした。全てのサンプルは、１３５，０００ｇ、４ｏＣで１０４分間の超遠心分離によって精製し、次いで、ボルテックスによってＰＢＳに再懸濁させた。
【０２６５】
Ｓ１ヌクレアーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）分解アッセイを、上記の説明に従って実行した。コレステロール−ＯＮとは対照的に、ＯＮにトランスフェクトされたＣａ／エタノールは、ヌクレアーゼ保護アッセイで乳エクソソームによって保護されない。図１５Ａおよび１５Ｂ。装填およびヌクレアーゼ保護効率を以下の表１２に示す。
【表１２】
2021529535.tif 000047
【０２６６】
その他の実施形態
本明細書に開示されている全ての特性は、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書で開示されている各特性は、同一、同等、または類似の目的を果たす代替特性に置き換えることができる。したがって、特に明記しない限り、開示される各特性は、同等または類似の特性の一般的なシリーズの例にすぎない。
【０２６７】
上記の説明から、当業者は、本開示の本質的な特徴を容易に確認することができ、その精神および範囲から逸脱することなく、開示を様々な使用法および条件に適合させるために様々な変更および修正を行うことができる。したがって、他の実施形態も特許請求の範囲内にある。
【図１Ａ】
2021529535.tif 000048
【図１Ｂ】
2021529535.tif 000049
【図２Ａ】
2021529535.tif 000050
【図２Ｂ】
2021529535.tif 000051
【図３Ａ】
2021529535.tif 000052
【図３Ｂ】
2021529535.tif 000053
【図４】
2021529535.tif 000054
【図５Ａ】
2021529535.tif 000055
【図５Ｂ】
2021529535.tif 000056
【図５Ｃ】
2021529535.tif 000057
【図５Ｄ】
2021529535.tif 000058
【図６Ａ】
2021529535.tif 000059
【図６Ｂ】
2021529535.tif 000060
【図６Ｃ】
2021529535.tif 000061
【図６Ｄ】
2021529535.tif 000062
【図７Ａ】
2021529535.tif 000063
【図７Ｂ】
2021529535.tif 000064
【図７Ｃ】
2021529535.tif 000065
【図８Ａ】
2021529535.tif 000066
【図８Ｂ】
2021529535.tif 000067
【図９】
2021529535.tif 000068
【図１０Ａ】
2021529535.tif 000069
【図１０Ｂ】
2021529535.tif 000070
【図１０Ｃ】
2021529535.tif 000071
【図１０Ｄ】
2021529535.tif 000072
【図１０Ｅ】
2021529535.tif 000073
【図１０Ｆ】
2021529535.tif 000074
【図１１Ａ】
2021529535.tif 000075
【図１１Ｂ】
2021529535.tif 000076
【図１１Ｃ】
2021529535.tif 000077
【図１１Ｄ】
2021529535.tif 000078
【図１２】
2021529535.tif 000079
【図１３Ａ】
2021529535.tif 000080
【図１３Ｂ】
2021529535.tif 000081
【図１４Ａ】
2021529535.tif 000082
【図１４Ｂ】
2021529535.tif 000083
【図１５Ａ】
2021529535.tif 000084
【図１５Ｂ】
2021529535.tif 000085
【図１５Ｃ】
2021529535.tif 000086
【配列表】
2021529535000001.app
【国際調査報告】
2021529535.tif 000087
2021529535.tif 000088