(57)【要約】これだけに限定されないが、ａ）臓器もしくは組織の線維症；ｂ）実質臓器移植片拒絶；またはｃ）心筋梗塞でも心筋虚血でもない心疾患などの障害を有する対象を処置するための方法が開示される。これらの方法は、障害を有するまたは有するリスクがある対象を選択するステップと、対象に、細胞外マトリックス由来の単離されたナノ小胞の治療有効量を投与するステップであって、ナノ小胞がインターロイキン（ＩＬ）−３３を含有し、リシルオキシダーゼを含み、ナノ小胞が、ａ）ＣＤ６３もＣＤ８１も発現しないか、またはｂ）ＣＤ６３ｌｏＣＤ８１ｌｏである、ステップとを含む。追加的な実施形態では、筋芽細胞分化を増大させるための方法が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
障害を有するまたは有するリスクがある対象における前記障害を処置または阻害するための方法であって、
前記障害を有するまたは有するリスクがある対象を選択するステップと、
前記対象に、細胞外マトリックス由来の単離されたナノ小胞の治療有効量を投与するステップであって、前記ナノ小胞がインターロイキン（ＩＬ）−３３を含有し、リシルオキシダーゼを含み、前記ナノ小胞が、ａ）ＣＤ６３もＣＤ８１も発現しないか、またはｂ）ＣＤ６３ｌｏＣＤ８１ｌｏである、ステップと
を含み、
それにより、前記対象における前記障害が処置または阻害され、前記障害が、ａ）臓器もしくは組織の線維症；ｂ）実質臓器移植片拒絶；またはｃ）心筋梗塞でも心筋虚血でもない心疾患である、方法。
【請求項２】
前記細胞外マトリックスが、哺乳動物細胞外マトリックスである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記哺乳動物細胞外マトリックスが、ヒト細胞外マトリックスである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞外マトリックスが、食道組織、膀胱、小腸粘膜下組織、真皮、臍帯、心膜、心臓組織、または骨格筋に由来する、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ナノ小胞が、ｍｉＲ−１４５および／またはｍｉＲ−１８１を含む、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記障害が、前記実質臓器移植片拒絶であり、前記対象が、移植された実質臓器のレシピエントである、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ナノ小胞が、前記移植された実質臓器に投与される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記移植された実質臓器が心臓である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記障害が心疾患である、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記心疾患が、心不全または心虚血である、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記心疾患が、急性冠状動脈症候群、慢性安定狭心症、不安定狭心症、血管形成術、一過性脳虚血発作、虚血性再灌流傷害、跛行、血管閉塞、動脈硬化症、心不全、慢性心不全、急性非代償性心不全、心肥大、心臓線維症、大動脈弁疾患、大動脈弁または僧帽弁狭窄症、心筋症、心房細動、心不整脈、および心膜疾患を含む、請求項１から５までのいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記ナノ小胞が、静脈内に投与される、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記障害が、臓器または組織の線維症である、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記線維症が、肝硬変、肺線維症、心臓線維症、縦隔線維症、関節線維症、骨髄線維症、腎性全身性線維症、ケロイド線維症、強皮症線維症、腎線維症、リンパ組織線維症、動脈線維症、毛細血管線維症、血管線維症、または膵線維症である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記線維症が、肺線維症である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記線維症が、心臓線維症である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記心臓線維症が、
ａ）肥大型心筋症、サルコイドーシス、慢性腎不全、中毒性心筋症、虚血再灌流傷害、急性臓器拒絶、慢性臓器拒絶、老化、慢性高血圧症、非虚血性拡張型心筋症、不整脈、アテローム性動脈硬化症、ＨＩＶ関連慢性血管疾患、および肺高血圧症；または
ｂ）心筋梗塞もしくは心筋虚血
によって引き起こされる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ナノ小胞が、前記患者に吸入によって投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記ナノ小胞が、前記対象に毎週、月２回、または毎月投与される、請求項１から１６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象に追加的な治療剤の治療有効量を投与するステップをさらに含む、請求項１から１９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記追加的な治療剤が、免疫抑制剤である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記免疫抑制剤が、カルシニューリン阻害剤、抗増殖剤、ｍＴＯＲ阻害剤、および／またはステロイドである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記カルシニューリン阻害剤が、タクロリムスまたはシクロスポリンであり、前記抗増殖剤が、ミコフェノール酸であり、前記ｍＴＯＲ阻害剤が、シロリムスであり、および／または前記ステロイドが、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン、またはコルチゾンである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記対象がヒトである、請求項１から２３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
対象における障害の処置または阻害に使用するための組成物であって、細胞外マトリックス由来の単離されたナノ小胞の治療有効量を含み、前記ナノ小胞が、インターロイキン（ＩＬ）−３３を含有し、リシルオキシダーゼを含み、前記ナノ小胞が、ａ）ＣＤ６３もＣＤ８１も発現しないか、またはｂ）ＣＤ６３ｌｏＣＤ８１ｌｏであり、前記障害が、ａ）臓器もしくは組織の線維症；ｂ）実質臓器移植片拒絶；またはｃ）心筋梗塞ではない心疾患である、組成物。
【請求項２６】
追加的な治療剤をさらに含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記追加的な治療剤が、免疫抑制剤である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記免疫抑制剤が、カルシニューリン阻害剤、抗増殖剤、ｍＴＯＲ阻害剤、および／またはステロイドである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記カルシニューリン阻害剤が、タクロリムスまたはシクロスポリンであり、前記抗増殖剤が、ミコフェノール酸であり、前記ｍＴＯＲ阻害剤が、シロリムスであり、および／または前記ステロイドが、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン、またはコルチゾンである、請求項２２に記載の組成物。
【請求項３０】
筋芽細胞分化を増大させるための方法であって、
筋芽細胞に細胞外マトリックス由来の単離されたナノ小胞の有効量を接触させるステップであって、前記ナノ小胞が、インターロイキン（ＩＬ）−３３を含有し、リシルオキシダーゼを含み、前記ナノ小胞が、ａ）ＣＤ６３もＣＤ８１も発現しないか、またはｂ）ＣＤ６３ｌｏＣＤ８１ｌｏである、ステップを含み、
それにより、筋芽細胞分化を増大させる、方法。
【請求項３１】
前記筋芽細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにある、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞外マトリックスが、哺乳動物細胞外マトリックスである、請求項３０または請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記哺乳動物細胞外マトリックスが、ヒト細胞外マトリックスである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞外マトリックスが、食道組織、膀胱、小腸粘膜下組織、真皮、臍帯、心膜、心臓組織、または骨格筋に由来する、請求項３０から３３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ナノ小胞が、ｍｉＲ−１４５および／またはｍｉＲ−１８１を含む、請求項３０から３４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記筋芽細胞が、哺乳動物対象内にある、請求項３０から３５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記哺乳動物対象がヒトである、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、３０１８年５月３日出願の米国仮出願第６２／６６６，６２４号の利益を主張するものである。
政府支援に関する記載
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）から付与されたｇｒａｎｔ  ｎｏ  ＡＲ０７３５２７およびＨＬ１２２４８９の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に関して一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、ａ）臓器または組織の線維症、ｂ）実質臓器移植片拒絶、およびｃ）心疾患を処置するための、インターロイキン（ＩＬ）−３３を含有する膜結合型ナノ小胞（ＭＢＶ）の使用に関連する。
【背景技術】
【０００４】
心疾患または傷害により線維症が引き起こされ、その結果、心筋硬直、機能喪失、および心不全（ＨＦ）が生じる。損傷を受けた心筋細胞（ｃａｒｄｉａｃ  ｍｙｏｃｙｔｅ）が線維芽細胞および付随する過剰な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に置き換えられると心筋虚血（ＭＩ）後の置換性線維症が生じる（Ｔｒａｖｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１８，  １０２１−１０４０  （２０１６））。反応性間質性線維症は、微小血管系の周囲の領域および局所心筋層に影響を及ぼし、心臓移植（ＨＴｘ）後の慢性同種異系移植片拒絶（ＣＲ）に寄与する。ＣＲにより、移植後１１年以内に５０％を超える移植片の喪失が引き起こされる（Ｌｉｂｂｙ  ａｎｄ  Ｐｏｂｅｒ，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １４，  ３８７−３９７  （２００１））。過剰な炎症が有害な心臓リモデリングおよびＨＦへの進行に関係付けられている。多数の実験研究により、ＭＩまたはＨＴｘ後の炎症を適時に消散させることが、免疫により駆動される線維症の発生および進行の防止に役立ち得ることが示されている（Ｆｒａｎｇｏｇｉａｎｎｉｓ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  １１，  ２５５  （２０１４）；Ｓｕｔｈａｈａｒ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｈｅａｒｔ  Ｆａｉｌｕｒｅ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １４，  ２３５−２５０  （２０１７））。しかし、ＭＩまたは虚血再灌流傷害（ＩＲＩ）後の心臓傷害およびＨＴｘ後の免疫媒介性攻撃に起因する線維症を防止するまたは逆転させるために利用可能な有効な治療モダリティは存在しない。
【０００５】
哺乳動物細胞外マトリックス（ＥＣＭ）で構成される生物学的足場が、外科用メッシュ材料、局部的創傷ケア用の粉末、およびハイドロゲルとして開発されており、それらは全て、大動脈および僧帽弁置換術（Ｇｅｒｄｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  ｏｆ  ｔｈｏｒａｃｉｃ  ａｎｄ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｕｒｇｅｒｙ  １４８，  １３７０−１３７８  （２０１４）；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｏｒａｃｉｃ  ｓｕｒｇｅｒｙ  ９１，  ４１６−４２３  （２０１１））、先天性心臓欠損の再構成（Ｓｃｈｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ａｎｄ  Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  １，  １３２−１３６  （２０１０））、およびファロー四徴症（ＴＯＦ）の一次修復中のネイティブな肺動脈弁を強化するための心臓パッチとして（Ｄｈａｒｍａｐｕｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ａｎｄ  Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８，  １７４−１８１  （２０１７））を含めた多数の臨床的適用に関して承認されている。ＥＣＭハイドロゲルは、心筋層の内因性修復を直接促進することが示されており（Ｕｎｇｅｒｌｅｉｄｅｒ  ＆  Ｃｈｒｉｓｔｍａｎ；Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ３，  １０９０−１０９９  （２０１４）；Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ  ＆  Ｃｈｒｉｓｔｍａｎ，  ＪＡＣＣ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｓｃｉ  ２，  ２１２−２２６  （２０１７）；Ｗａｓｓｅｎａａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ６７，  １０７４−１０８６  （２０１６））、現在、心筋梗塞後の心臓組織の修復を容易にするための心臓内注射に関する第Ｉ相臨床試験において調査中である（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：  ＮＣＴ０２３０５６０２）。これらのＥＣＭに基づく材料は、最も一般的には、異種起源のものであり、とりわけ真皮、膀胱または小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）などの、供給源組織の脱細胞化によって調製される（Ｋｅａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８４，  ２５−３４  （２０１５））。異種ＥＣＭ足場は、有害な自然免疫応答も適応免疫応答も引き出さず、実際には、抗炎症性および修復性の自然免疫応答および適応免疫応答を支持する（Ｈｕｌｅｉｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｉｎ  Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ３９：２−１３  （２０１７））。これらの天然に存在するバイオマテリアルの使用には、一般には、「構造的リモデリング」と称されるプロセスである、機能的な、部位に適した組織の少なくとも部分的な再建が伴う（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆ１０００  Ｐｒｉｍｅ  Ｒｅｐ  ６  ：１３  （２０１４））。ほぼ間違いなく、下流の機能的リモデリング転帰の主要な決定因子は、ＥＣＭ生体足場（ｂｉｏｓｃａｆｆｏｌｄ）に対する初期の自然免疫応答である（Ｂｒｏｗｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃｔａ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ，  ８：９７８−９８７（２０１２））。ＥＣＭ生体足場、またはＥＣＭ生体足場の分解生成物は、炎症促進性Ｍ１様マクロファージおよびＴｈ１  Ｔ細胞表現型からリモデリング促進性Ｍ２様マクロ���ァージおよびＴヘルパー２型（Ｔｈ２）細胞応答への変換を促進することによって組織修復を方向付けることが示されている（Ｈｕｌｅｉｈｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ２９：２−１３（２０１７））。多数の研究により、骨格筋（Ｋｕｓｗａｎｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４４，  ３５５−３６７  （２０１６）；Ｓｅｒｒｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉ．  Ｓｉｇｎａｌ．  １０，  ５０８  （２０１７））、および心臓血管系（Ｏｂｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０７，  １８５８１−１８５８６  （２０１０）；Ｔｏｗｎｓｅｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １９１，  １０６９−１０７６  （２０００））を含めた多数の解剖学的部位において瘢痕組織形成ではなく組織リモデリングおよび創傷治癒プロセスを促進するためには、マクロファージの活性化状態への変換が適当な時になされることが必要であることが示されている。この変換は免疫抑制ではなく、局所マクロファージ表現型の表現型変化を促進する免疫調節の構築的形態である（Ｏｌｉｖｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ８，  ｅ６６５３８  （２０１３）；Ｒｅｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３１，  ８６２６−８６３３  （２０１０））。しかし、ＥＣＭのどの成分がこの機能を有するのかは以前には分かっていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｔｒａｖｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１８，  １０２１−１０４０  （２０１６）
【非特許文献２】Ｌｉｂｂｙ  ａｎｄ  Ｐｏｂｅｒ，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １４，  ３８７−３９７  （２００１）
【非特許文献３】Ｆｒａｎｇｏｇｉａｎｎｉｓ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  １１，  ２５５  （２０１４）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
障害を有するまたは有するリスクがある対象における障害を処置または阻害するための方法が開示される。一部の実施形態では、障害は、ａ）臓器もしくは組織の線維症；ｂ）実質臓器移植片拒絶；またはｃ）心筋梗塞でも心筋虚血でもない心疾患である。これらの方法は、障害を有するまたは有するリスクがある対象を選択するステップと、対象に、細胞外マトリックス由来の単離されたナノ小胞の治療有効量を投与するステップとを含み、ここで、ナノ小胞は、インターロイキン（ＩＬ）−３３を含み、ナノ小胞は、ａ）ＣＤ６３もＣＤ８１も発現しないか、またはｂ）ＣＤ６３ｌｏＣＤ８１ｌｏである。
【０００８】
追加的な実施形態では、筋芽細胞分化を増大させるための方法が開示される。これらの方法は、筋芽細胞に細胞外マトリックス由来の単離されたナノ小胞の有効量を接触させるステップを含み、ここで、ナノ小胞は、インターロイキン（ＩＬ）−３３を含み、リシルオキシダーゼを含み、ナノ小胞は、ａ）ＣＤ６３もＣＤ８１も発現しないか、またはｂ）ＣＤ６３ｌｏＣＤ８１ｌｏである。
【０００９】
一部の非限定的な例では、ナノ小胞は、対象におけるマクロファージにおいてＣＤ６８およびＣＤ１１ｂの発現を維持する。
【００１０】
前述のおよび他の特色および利点は、添付図を参照して進めるいくつかの実施形態の以下の詳細な説明からより明白になる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｅは、ＥＣＭ生体足場から単離されたＭＢＶが全長ＩＬ−３３を含有することを示す図である。Ａ、サイトカインアレイ。脱細胞化ＷＴマウス腸（ｎ＝３）または脱細胞化ＩＬ−３３−／−マウス腸（ｎ＝３）から単離されたＭＢＶのサイトカインカーゴを、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍのＭｏｕｓｅ  ＸＬ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ａｒｒａｙ  Ｋｉｔを使用して分析した。このアレイは、２連でスポットされた１１１種のサイトカインを含有する。枠で囲まれた領域は、ＩＬ−３３スポットの位置を示す。Ｂ、脱細胞化ＷＴまたはＩＬ３３−／−マウス腸から単離されたＭＢＶの発現レベルが最も高い１５種のサイトカインの定量のグラフ表示である。Ｃ、脱細胞化ＷＴマウス腸から単離されたＭＢＶの透過型電子顕微鏡イメージング。矢印はＭＢＶを示す。Ｄ、３つの脱細胞化ＷＴマウス腸または３つのＩＬ３３−／−マウス腸から単離されたＭＢＶにおけるＩＬ−３３発現レベルの免疫ブロット分析。Ｅ、実験室で作製されたブタ膀胱マトリックス（ＵＢＭ）、小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）、真皮、および心筋ＥＣＭおよび３種の市販の生物学的足場等価物：ＡＣＥＬＬ（登録商標）ＭＡＴＲＩＳＴＥＭ（商標）（ブタ膀胱）、ＢＤ（登録商標）ＸＥＮＭＡＴＲＩＸ（商標）（ブタ真皮）、およびＣＯＯＫ  ＢＩＯＴＥＣＨ（登録商標）ＢＩＯＤＥＳＩＧＮ（商標）から単離されたＭＢＶにおけるＩＬ−３３発現レベルの免疫ブロット分析。
【図１−２】同上。
【図１−３】同上。
【００１２】
【図２−１】図２Ａ〜２Ｅは、ＥＣＭ内に貯蔵される全長ＩＬ−３３が、ＭＢＶの内腔に組み入れられることによりタンパク質分解から保護されることを示す図である。Ａ、ＭＢＶを分子ふるいクロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分画し、溶出画分を２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度によって連続的にモニタリングした。５００μｌの画分を３０個収集した。別の実験において、ＭＢＶをまず、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００を用いて溶解させ、次いで、ＳＥＣによって分画した。２つのＵＶクロマトグラムのオーバーレイは、インタクトなＭＢＶはより重い画分に溶出し、一方、溶解したＭＢＶの分子成分は主により軽い画分に溶出したことを示す。Ｂ、クロマトグラフィーにかけたインタクトなＭＢＶ（上のパネル）または溶解したＭＢＶ（下のパネル）からの溶出画分を、示されている通りプールし、ＩＬ−３３について免疫ブロットによって分析した。Ｃ、クロマトグラフィーにかけたインタクトなＭＢＶのプール画分６〜８を透過型電子顕微鏡検査によってイメージングした。Ｄ）インタクトなＭＢＶのプール画分６〜８を、直接ビオチン化してＭＢＶ表面タンパク質を標識したか、または、まずＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００を用いて溶解させ、ＭＢＶ抽出物をビオチン化して内腔および表面タンパク質を標識した。ストレプトアビジンプルダウン（ＳＡ）後に単離されたタンパク質、およびストレプトアビジンビーズに結合しなかったタンパク質を表す結合していない画分（非結合）をＩＬ−３３の存在について免疫ブロットによって分析した。矢印はＭＢＶを示す。Ｅ、プロテイナーゼＫ保護アッセイ。クロマトグラフィーにかけたインタクトなＭＢＶのプール画分６〜８を、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００の非存在下または存在下で、示されている濃度のプロテイナーゼＫで処理した。試料をＩＬ−３３について免疫ブロットによって分析した。
【図２−２】同上。
【図２−３】同上。
【００１３】
【図３−１】図３Ａ〜３Ｄは、内腔ＩＬ−３３を含有するＭＢＶが、リモデリング促進性マクロファージ表現型（Ｆ４／８０＋ｉＮＯＳ−Ａｒｇ＋）を非標準ＳＴ２非依存性経路によって活性化することを示す図である。ａ、ｂ、ＷＴマウス（Ａ）またはＳＴ２−／−マウス（Ｂ）から回収した骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を、無処理のままにした（対照）か、または以下の試験物を用いて２４時間にわたって処理した：ＩＦＮγ＋ＬＰＳ、ＩＬ−４、ＩＬ−３３、脱細胞化ＷＴマウス腸から単離されたＭＢＶ（ＷＴ  ＭＢＶ）、脱細胞化ＩＬ−３３−／−マウス腸から単離されたＭＢＶ（ＩＬ−３３−／−ＭＢＶ）、またはブタ小腸粘膜下組織から単離されたＭＢＶ（ＳＩＳ  ＭＢＶ）。細胞をＦ４／８０（マクロファージマーカー）、ｉＮｏｓ（Ｍ１マーカー）、またはＡｒｇ１（Ｍ２マーカー）で免疫標識した。Ｃ、ｉＮＯＳ免疫標識の定量により、ＷＴ  ＢＭＤＭおよびＳＴ２−／−ＢＭＤＭのどちらにおいても、ＩＦＮγ＋ＬＰＳまたはＩＬ−３３−／−マウスから単離されたＭＢＶを用いた処理後に、陰性対照（ＩＬ−４による処理）と比較してｉＮＯＳ発現の有意な増加が示された（陰性対照と比較して、＊＊はｐ＜０．０１を示し、＊はｐ＜０．０５を示し、エラーバーはＳＥＭを表す、ｎ＝３）。Ｄ、アルギナーゼ免疫標識の定量により、ＷＴ  ＢＭＤＭおよびＳＴ２−／−ＢＭＤＭのどちらにおいても、ＩＬ−４またはＷＴマウスから単離されたＭＢＶを用いた処理後に、陰性対照（ＩＦＮγ＋ＬＰＳ）と比較してアルギナーゼ発現の有意な増加が示される（陰性対照と比較して、＊＊はｐ＜０．０１を示し、エラーバーはＳＥＭを表す、ｎ＝３）。
【図３−２】同上。
【図３−３】同上。
【００１４】
【図４】図４Ａ〜４Ｂは、ＩＬ−３３を含有するＭＢＶがＳｔａｔ６リン酸化非依存的にＡｒｇ１発現を上方調節することを示す図である。Ａ、Ｂ、ＷＴマウスまたはＳＴ２−／−マウスから回収した骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を無処理のままにした（対照）か、または、ＩＬ４、ＩＬ−３３、脱細胞化ＷＴマウス腸から単離されたＭＢＶ（ＷＴ  ＭＢＶ）、もしくは脱細胞化ＩＬ−３３−／−マウス腸から単離されたＭＢＶ（ＩＬ−３３−／−ＭＢＶ）を用いて２４時間（Ａ）もしくは３０分間（Ｂ）刺激した。細胞溶解物をアルギナーゼ−１およびＳＴ２発現（Ａ）およびＳｔａｔ６のリン酸化（Ｂ）について免疫ブロットによって分析した。
【００１５】
【図５−１】図５Ａ〜５Ｂは、ＷＴ  ＭＢＶで処理したマクロファージからの分泌物が前駆細胞に関して筋原性であることを示す図である。Ａ、Ｂ、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞を集密になるまで培養し、増殖培地、分化培地、または極性化し、ＭＢＶで処理したマクロファージによって条件付けた培地で処理した。細胞を分化させ、サルコメアミオシン（ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ  ｍｙｏｓｏｓｉｎ）について免疫標識した。
【図５−２】同上。
【００１６】
【図６−１】図６Ａ〜６Ｄは、移植片ＩＬ−３３が全く存在しないことにより、慢性拒絶に関連する線維症および血管症の増加がもたらされることを示す図である。Ａ〜Ｄ、ＩＬ−３３＋Ｂｍ１２（ｉｌ３３＋／＋Ｂｍ１２）またはＩＬ−３３欠損Ｂｍ１２（ｉｌ３３−／−Ｂｍ１２）移植片を、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）ＩＬ−３３発現レシピエント（ＷＴ  Ｂ６）またはＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６）ＩＬ−３３欠損レシピエント（ｉｌ３３−／−Ｂ６）に移植した（ｎ＝６／群）。術後（ＰＯＤ）９０〜１００日目に移植片を回収し、Ｈ＆Ｅ（Ａ、Ｂ）、マッソントリクローム（Ａ、Ｂ）後に評価した。ナイーブｉｌ３３−／−Ｂｍ１２心臓を対照として染色した。（Ｃ）血管閉塞および（Ｄ）線維化領域のパーセンテージをＮＥＡＲＣＹＴＥソフトウェアによって定量した。「＊」はｉｌ３３＋／＋Ｂｍ１２群をＷＴ  Ｂ６群と比べた有意差を示し、Ｐ値を一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって生成し、＊Ｐ＜０．０１、＊＊Ｐ＜０．００５であった。
【図６−２】同上。
【００１７】
【図７】図７Ａ〜７Ｄは、移植片ＩＬ−３３が全く存在しないことにより、心臓移植後初期に局所的な炎症性骨髄細胞が増加したことを示す図である。Ａ〜Ｄ、野生型（ＷＴ）ＩＬ−３３＋Ｂｍ１２移植片およびＩＬ−３３欠損ノックアウト（ＫＯ）Ｂｍ１２移植片をＷＴ  Ｂ６レシピエントに移植した（ｎ＝４〜５／群）。術後（ＰＯＤ）３日目に、移植片浸潤性白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）をフローサイトメトリー分析によって評価した。ナイーブＢｍ１２マウスの心臓から単離された白血球をベースライン対照として含めた（対照；ｎ＝４）。Ａ．各群からの代表的なドットプロットは、ＣＤ４５＋親ゲーティングにおいて見いだされたＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞の頻度を示す。Ｂ．ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋でゲーティングされた細胞からの代表的なドットプロットは、増加したＣＤ１１ｃ＋細胞が主にＭＨＣＩＩｈｉ単球由来樹状細胞（ｍｏｎｏＤＣ）およびＣＤ１１ｃｈｉ炎症性マクロファージであることを示す。矢印は、ゲーティングされた細胞が由来する親集団を示す。Ｃ〜Ｄ．ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃｌｏでゲーティングされた細胞からの代表的なドットプロットは、ＩＬ−３３の非存在下では、心臓移植片におけるＬｙ６ｃｈｉＭＨＣＩＩｈｉサブセットを含めた炎症促進性Ｆ４−８０＋マクロファージの頻度が増加したことを示す。Ｐ値を一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって生成し、＊Ｐ＜０．０５であった。
【００１８】
【図８−１】図８Ａ〜８Ｄは、ＩＬ３３＋ＭＢＶの投与により移植後初期の炎症促進性浸潤性骨髄細胞の生成が制限されることを示す図である。Ａ〜Ｄ、野生型（ＷＴ）ＩＬ−３３＋Ｂｍ１２移植片、ＩＬ−３３欠損ノックアウト（ＫＯ）Ｂｍ１２移植片を単独で、または、ハイドロゲル中、ＷＴ  ＩＬ−３３＋ＭＢＶで処理したＩＬ−３３欠損ＫＯ  Ｂｍ１２移植片（ＩＬ３３（ハイドロゲル））をＷＴ  Ｂ６レシピエント（ＷＴ；ｎ＝４〜６／群）に移植した。術後（ＰＯＤ）３日目に、移植片浸潤性白血球および脾細胞をフローサイトメトリー分析によって評価した。ナイーブＢｍ１２マウスの心臓および脾臓由来の白血球もベースライン対照として含めた（対照；ｎ＝３〜９）。代表的なドットプロットはＣＤ４５．２＋Ｌｉｎｅａｇｅ−Ｌｙ６Ｇ−ゲーティングにおける単球由来樹状細胞（ＤＣ）（Ａ）およびＣＤ４５．２＋Ｌｉｎｅａｇｅ−Ｌｙ６Ｇ−ＣＤ１１ｃ−ＣＤ１１ｂ＋ゲーティングにおけるマクロファージサブセット（Ｂ）ならびに移植片浸潤性およびレシピエント脾細胞（Ｃ〜Ｄ）の頻度（％）を示す。図は、マクロファージサブセット（Ｄ）のＤＣ（Ｃ）の変化についての統計値の概要を示す。示されているデータのＰ値は一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって生成したものであり、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊＊Ｐ＜０．００１であった。
【図８−２】同上。
【図８−３】同上。
【図８−４】同上。
【００１９】
【図９−１】図９Ａ〜９Ｂは、線維症の処置について示すグラフである。ＩＰＦ患者および年齢を釣り合わせた対照（ｎ＝２）から外植された肺由来のヒト肺線維芽細胞。（Ａ）処理前にＣｏｌ１、Ｃｏｌ３、およびＡＣＴＡ２の発現レベルを決定した。（Ｂ）線維芽細胞を、起源が異なるマトリックス結合型ナノ小胞（ＭＢＶ）：ブタ脱細胞化膀胱マトリックス（ｐＵＢＭ  ＥＣＭ）、ブタ脱細胞化肺（ｐＬｕｎｇ）およびヒト肺組織（ｈＬｕｎｇ）を用い、異なる用量：１ｍｌ当たり粒子１×１０９個および３×１０９個で処理した。４８時間の処理後に、細胞を収集し、老化および線維症マーカー転写物の発現についてｑＲＴ−ＰＣＲによって分析するためにＲＮＡを単離した。＊ｐ＜０．５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図９−２】同上。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
配列表
添付の配列表に列挙されている核酸配列およびアミノ酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２において定義されている通り、ヌクレオチド塩基については標準の文字略語、およびアミノ酸については３文字コードを使用して示されている。各核酸配列の一方の鎖のみが示されているが、示されている鎖へのいずれの言及にも相補鎖が含まれると理解されたい。配列表はＡＳＣＩＩテキストファイル［７１２３−１００７２３−０２ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、２０１９年５月２日、４．０ｋｂ］として提出され、参照により本明細書に組み込まれる。添付の配列表中：
配列番号１〜３はｍｉＲＮＡ配列である。
【００２１】
ＥＣＭ足場材料の分解、およびその後の、「マトリックス結合型ナノ小胞」または「ＭＢＶ」とも称される、生物活性成分を有するナノ小胞の放出の結果、修復性および抗炎症性Ｍ２マクロファージ表現型の活性化がもたらされる。ＭＢＶは、ＥＣＭのコラーゲンネットワークに埋め込まれており、生物学的に活性なシグナル伝達分子（マイクロＲＮＡおよびタンパク質）を分解および変性から保護する、ナノメートルサイズの膜様小胞である。ＥＣＭ生体足場およびそれらの中に存在するＭＢＶは、マクロファージをＭ２様リモデリング促進性表現型に活性化し得る。これらのＭＢＶを、浸潤性レシピエント骨髄細胞集団を標的とし、および／または実質臓器移植後の同種異系移植片による線維性疾患を阻害するために使用することができることが本明細書に開示される。開示される方法は、実質臓器移植後の同種異系移植片による線維性疾患を防止および／または処置することができる。
【００２２】
ＭＢＶが核外インターロイキン−３３（ＩＬ−３３）の豊富な供給源であることが本明細書に開示される。ＩＬ−３３は、一般には間質細胞の核に見いだされ、一般に、ＩＬ−３３受容体であるＳＴ２を介して免疫細胞を活性化するために組織損傷後に放出されるアラーミンまたは自己由来分子とみなされる、ＩＬ−１ファミリーメンバーである（Ｗａｉｎｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐａｒｔ  Ｃ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １６，  ５２５−５３２  （２００９））。ＩＬ−３３は、ＳＴ２＋調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を刺激することによって心臓移植後の移植片生存を促進する（Ｗａｉｎｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐａｒｔ  Ｃ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １６，  ５２５−５３２  （２００９）；Ｂｏｅｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ３，  ２３４３０  （２０１４）。細胞内ＩＬ−３３タンパク質は、ＩＬ−３３のＮ末端を介したクロマチンまたはシグナル伝達分子との相互作用を通じて遺伝子発現をモジュレートすることが示唆されている（Ｊｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０，  ３４２−３５０  （２０１６））。ＥＣＭ内に安定に貯蔵され、ＭＢＶに組み入れられることによってタンパク質分解性の切断から保護されているＩＬ−３３は、特徴付けられていない非標準ＳＴ２非依存性経路を通じたＭ２マクロファージの活性化の強力なメディエーターであることが本明細書に開示される。
【００２３】
ｉｌ３３＋／＋マウス組織ＥＣＭから単離されたＭＢＶはｓｔ２−／−マクロファージの活性化を修復性リモデリング促進性Ｍ２活性化状態に向けるが、ｉｌ３３−／−マウス組織ＥＣＭから単離されたＭＢＶはｓｔ２−／−マクロファージの活性化を修復性リモデリング促進性Ｍ２活性化状態に向けない。ＩＬ３３＋ＭＢＶはＳｔａｔ６リン酸化非依存的にＭ２様マクロファージを生成するので、このＩＬ３３＋ＭＢＶの能力は、よく特徴付けられたＩＬ−４／ＩＬ−１３媒介性Ｍ２マクロファージ分化経路とは別個のものである。さらに、マウス心臓移植モデルにおいて、ＩＬ−３３が欠損した移植片ではＭ１様マクロファージおよび単球由来ＤＣを含めた炎症促進性骨髄細胞による初期の移植片浸潤の有意な増加が示された。ＩＬ−３３欠損心臓移植片の移植後にＩＬ−３３＋ＭＢＶを投与することにより、移植片中の炎症促進性骨髄細胞の頻度が大きく減少した。したがって、これだけに限定されないが、心臓移植などの実質臓器移植後のＩＬ３３＋ＭＢＶ送達により、急性または慢性移植片拒絶などの拒絶の間の骨髄活性化を阻害および／または防止することができる。
【００２４】
さらに、ＭＢＶを使用して、傷害または同種異系実質臓器移植を伴う外科手技後の局所炎症を制御し、軟部組織修復を支持することができる。ＭＢＶを使用することで、ＩＬ−３３による骨髄細胞におけるＳＴ２非依存性遺伝子発現の誘導が可能になる。結果として、この治療により、外傷または虚血性傷害の部位において骨髄性区画を典型的な炎症促進性の有害なサブセット（Ｍ１マクロファージ、炎症性単球、および炎症性単球由来樹状細胞）から離し、有益な修復性または調節性サブセット（すなわち、Ｍ２マクロファージおよびＬｙ６ｃｌｏ単球）にシフトさせることによってその後の線維性疾患を制限することができる。この技術では、局所的骨髄細胞の同様の改変によって欠陥部位における軟部組織および筋肉修復も支持される。
【００２５】
マトリックス結合型ナノ小胞（ＭＢＶ）は、ＥＣＭの線維状ネットワークに埋め込まれている。これらのナノ粒子は、それらのカーゴをＥＣＭ足場製造プロセス中の分解および変性から遮蔽する。エキソソームは、以前に体液および細胞培養上清中でほぼ排他的に同定された微小胞である。ＭＢＶとエキソソームは別個であることが実証されている。ＭＢＶは、例えば、界面活性剤および／または酵素による消化に対して抵抗性であり、異なるマイクロＲＮＡのクラスターを含有し、また、ｍｉＲ−１４５に富むので、他の微小胞とは異なる。ＭＢＶは、エキソソームなどの他の微小胞では見いだされる特徴的な表面タンパク質を有さない。本明細書に開示される通り、ＭＢＶは、細胞の生存に影響を及ぼし、治癒応答をモジュレートして、神経機能を保存するまたは回復させる。ＭＢＶがＲＧＣ生存、軸索成長、および組織リモデリングを示差的に調節することが開示される。
用語
【００２６】
以下の用語および方法の説明は、本開示をよりよく記載するため、および本開示の実施に関して当業者をガイドするために提示する。「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という単数形は、文脈により明確に別段の規定がなされない限り、１つまたは１つより多くを指す。例えば、「１つの（ａ）細胞を含む」という用語は、単一の細胞または複数の細胞を含み、「少なくとも１つの細胞を含む」という句と等価であるとみなされる。「または（ｏｒ）」という用語は、文脈によりそうでないことが明白に示されない限り、示されている要素の選択肢のうちの単一の要素または２つもしくはそれよりも多くの要素の組合せを指す。本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。したがって、「ＡまたはＢを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  Ａ  ｏｒ  Ｂ）」は、追加的な要素を排除することなく、「Ａ、Ｂ、またはＡとＢを含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ａ，Ｂ，ｏｒ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ）」を意味する。本明細書で言及されるＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号の日付は、少なくとも早ければ２０１５年９月１６日に入手可能な配列である。本明細書において引用されている参考文献、特許出願および刊行物、ならびにＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号は全て参照により組み込まれる。本開示の種々の実施形態の精査を容易にするために、以下の特定の用語の説明を提示する。
【００２７】
動物：例えば、哺乳動物および鳥類を含むカテゴリーである、生きている多細胞脊椎動物生物体。哺乳動物という用語は、ヒトおよび非ヒト哺乳動物のどちらも含む。同様に、「対象」という用語は、ヒトおよび動物対象のどちらも含む。
【００２８】
生体適合性：哺乳動物対象に埋め込まれた場合に対象において有害な応答を惹起しない任意の材料。生体適合性材料は、個体に導入されるとその意図された機能を果たすことができ、その個体に対して毒性でも傷害性でもなく、対象において材料に対する免疫学的拒絶を誘導することもない。
【００２９】
心疾患または障害：心臓血管系に負の影響を及ぼす疾患または障害。この用語はまた、急性冠状動脈症候群、心筋梗塞、心筋虚血、慢性安定狭心症、不安定狭心症、血管形成術、脳卒中、一過性脳虚血発作、跛行および血管閉塞などの心血管イベントを指すことも意図されている。したがって、心疾患および障害は、急性冠状動脈症候群、心筋梗塞、心筋虚血、慢性安定狭心症、不安定狭心症、血管形成術、一過性脳虚血発作、虚血性再灌流傷害、跛行、血管閉塞、動脈硬化症、心不全、慢性心不全、急性非代償性心不全、心肥大、心臓線維症、大動脈弁疾患、大動脈弁または僧帽弁狭窄症（ａｏｒｔｉｃ  ｏｒ  ｍｉｔｒａｌ  ｖａｌｖｅ  ｓｔｅｎｏｓｉｓ）、心筋症、心房細動、心不整脈（ｈｅａｒｔ  ａｒｒｈｙｔｈｍｉａ）、および心膜疾患を含み得る。
【００３０】
心機能不全：心臓のポンプ機能のあらゆる機能障害。心機能不全は、例えば、収縮性の機能障害、弛緩能力の機能障害（時には拡張機能不全と称される）、心臓の弁機能の異常または不適正、心臓筋肉（ｈｅａｒｔ  ｍｕｓｃｌｅ）の疾患（時には心筋症と称される）、心臓筋肉への不十分な血液供給を特徴とする狭心症および心筋梗塞などの疾患、アミロイドーシスおよびヘモクロマトーシスなどの浸潤性疾患、全体的または限局的な肥厚（例えば、ある種の心筋症または全身性高血圧症において生じ得るものなど）、ならびに心腔間の異常な伝達（例えば、心房中隔欠損）を含む。さらなる考察に関しては、Ｂｒａｕｎｗａｌｄ，  Ｈｅａｒｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ：  ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  １９９７，  ＷＢ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ＰＡ（以下Ｂｒａｕｎｗａｌｄ）を参照されたい。
【００３１】
心筋症：心筋層（心臓筋肉）のあらゆる疾患または機能不全。心筋症は、起源が炎症性、代謝的、毒性、浸潤性、線維形成性、血液学的、遺伝学的、または不明のものであり得る。心筋症は、主に臨床的および病理学的特徴に基づいて一般に３つの群に分類される：
（１）心臓の肥大および心室の一方または両方の収縮機能障害を特徴とする症候群である拡張型心筋症；
（２）（ａ）心室壁もしくは心室中隔のいずれかの厚さの全体的もしくは限局的な増加、または（ｂ）例えば、遺伝子疾患、高血圧症、もしくは心臓弁機能不全において起こり得る心室壁もしくは心室中隔のいずれかの厚さの全体的もしくは限局的な増加のしやすさの増加と本明細書で定義される肥大型心筋症；または
（３）優性の臨床的特色が通常心臓の弛緩能力の機能障害（拡張機能不全）であり、多くの場合、心臓筋肉へのアミロイド線維、鉄、または糖脂質などの外来物質の浸潤を特徴とする疾患の群である拘束型心筋症および浸潤性心筋症。
【００３２】
Ｗｙｎｎｅ  ａｎｄ  Ｂｒａｕｎｗａｌｄ，  Ｔｈｅ  Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓｅｓ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ４１  ｉｎ  Ｂｒａｕｎｗａｌｄを参照されたい。
【００３３】
富化：混合物中に存在するナノ小胞などの目的の成分の量のその混合物中の他の望ましくない成分の量に対する比率が富化プロセス後に富化プロセス前と比較して高くなるプロセス。
【００３４】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）：これだけに限定されないが、組織内の細胞を囲み、支持し、また、別段の指定のない限り無細胞性である、構造タンパク質、特殊タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、および成長因子を含めた、構造的かつ機能的な生体分子および／または生体高分子の複雑な混合物。ＥＣＭ調製物は「脱細胞化された」または「無細胞性」であるとみなすことができ、細胞が、本明細書に記載されており、当技術分野で公知のプロセスによって供給源組織から取り出されたものであることを意味する。「ＥＣＭ由来ナノ小胞」、「マトリックス結合型ナノ小胞」、「ＭＢＶ」または「ＥＣＭに由来するナノ小胞」などの「ＥＣＭ由来材料」とは、天然のＥＣＭから調製されたか、またはＥＣＭが培養細胞によって産生されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ供給源から調製されたナノ小胞である。ＥＣＭ由来ナノ小胞は下で定義されている。
【００３５】
線維症関連疾患または線維性疾患：線維症が主な病理的基礎、結果または症状である疾患または障害。線維症、または瘢痕は、恒久的な瘢痕、臓器機能不良、および最終的には死亡に至る恐れがある、炎症を起こしたまたは損傷を受けた組織およびその周囲への線維状結合組織（コラーゲンおよびフィブロネクチンなどの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の成分）の過剰な蓄積によって定義される。正常な組織修復は、組織傷害が重症もしくは反復性である場合、または創傷治癒応答自体が調節不全になった場合、次第に不可逆的な線維性応答に進展し得る。線維症関連疾患としては、例えば、ケロイドおよび肥厚性瘢痕などの皮膚の病理的瘢痕；肝臓または胆嚢の硬変症などの硬変症；心臓線維症；肝線維症；腎線維症；肺線維症；骨髄線維症；リウマチ性心臓病；硬化性腹膜炎；糸球体硬化症、強皮症、縦隔線維症、後腹膜線維症、ならびに腱および軟骨の線維症が挙げられる。線維症は、いくつかの因子の結果であり得る。例としては、ほんの数例として、遺伝性遺伝障害；持続感染；毒素、刺激物質または煙への反復的曝露；慢性自己免疫性炎症；移植におけるマイナーヒト白血球抗原ミスマッチ；心筋梗塞；高血清コレステロール；肥満症；および制御が不十分な糖尿病が挙げられ、また、高血圧症線維症は組織傷害によっても誘発され得る。しかし、開始イベントにかかわらず、全ての線維性疾患に共通する特色は、線維性組織リモデリングの重要なメディエーターである、ＥＣＭを産生する筋線維芽細胞の活性化である。本明細書で使用される場合、「組織傷害」は、組織内または組織に変化が生じるような組織のあらゆる損傷または組織に課される変形を指す。組織傷害は、心臓組織傷害または肺組織傷害を含む。心臓組織傷害が心臓の変形または心臓の過負荷に起因し得ることが当業者には容易に認識されよう。したがって、一般に、本明細書に提示される方法および組成物を必要とする対象は、心臓の変形が増大し、したがって、心疾患もしくは障害または心臓線維症などの線維症関連疾患が発生するリスクが増加している対象を含む。心臓線維症に至る恐れがある状態としては、これだけに限定されないが、肥大型心筋症、サルコイドーシス、心筋炎、慢性腎不全、中毒性心筋症、外科手術媒介性虚血再灌流傷害、急性および慢性臓器拒絶、老化、慢性高血圧症、非虚血性拡張型心筋症、不整脈、アテローム性動脈硬化症、ＨＩＶ関連心血管疾患、肺高血圧症が挙げられる。肺線維症に至る恐れがある状態としては、これだけに限定されないが、関節リウマチおよびシェーグレン症候群などの自己免疫疾患、胃食道逆流性疾患（ＧＥＲＤ）、サルコイドーシス、喫煙、アスベストまたはシリカへの曝露、岩および金属塵への曝露、ウイルス感染、放射線への曝露、およびある特定の医薬が挙げられる。
【００３６】
移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）：供与された免疫学的にコンピテントなリンパ球が移植レシピエントの独自の組織に対して反応する、骨髄または他の組織移植の一般的な重篤な併発症。ＧＶＨＤは、血縁ドナーまたは非血縁ドナーのいずれか由来の幹細胞を使用するまたは含有するあらゆる移植の可能性のある併発症である。
【００３７】
ＧＶＨＤには、急性および慢性の２種類がある。急性ＧＶＨＤは、移植後最初の３カ月以内に現れる。急性ＧＶＨＤの徴候としては、手および足における赤みがかった皮膚皮疹が挙げられ、これは、拡散し、より重症になる可能性があり、皮膚剥離または皮膚水疱を伴う。急性ＧＶＨＤは胃および腸にも影響を及ぼす可能性があり、その場合、痙攣、悪心、および下痢が存在する。皮膚および眼の黄変（黄疸）により、急性ＧＶＨＤが肝臓に影響を及ぼしていることが示される。慢性ＧＶＨＤは、その重症度によって順位付けられる：ステージ／グレード１は軽度であり、ステージ／グレード４は重症である。慢性ＧＶＨＤは、移植の３カ月後またはそれよりも後に発生する。慢性ＧＶＨＤの症状は急性ＧＶＨＤのものと同様であるが、さらに、慢性ＧＶＨＤは、眼の粘液腺、口腔内の唾液腺、および胃の内側および腸を滑らかにする腺にも影響を及ぼす可能性がある。
【００３８】
心臓：血液を循環させる、動物の筋肉質の臓器。哺乳動物では、心臓は、４つの房室：右心房、右心室、左心房、左心室で構成される。右心房と左心房は心房中隔によって互いに分離されており、右心室と左心室は心室中隔によって互いに分離されている。右心房と右心室は三尖弁によって互いに分離されている。左心房と左心室は僧帽弁によって互いに分離されている。
【００３９】
心臓の４つの房室の壁は、作業筋または心筋層、および結合組織で構成される。心筋層は、本明細書では心臓細胞（ｃａｒｄｉａｃ  ｃｅｌｌ）、心筋細胞（ｃａｒｄｉａｃ  ｍｙｏｃｙｔｅ）、心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）および／または心筋線維（ｃａｒｄｉａｃ  ｆｉｂｅｒ）とも称され得る心筋細胞（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｃｅｌｌ）で構成される。心筋細胞を対象から単離し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで成長させることができる。腔に最も近い心筋層の内層は心内膜と称され、心筋層の外層は心外膜と称される。左心室内腔は一部が心室中隔および左心室自由壁と結合している。左心室自由壁は、時には、前壁、後壁および側壁；または心尖部（左心室の先端、心房から最も遠い）および心基部（左心室の心房に最も近い部分）などの領域に分けられる。心尖部の（ａｐｉｃａｌ）および心基部の（ｂａｓａｌ）は心臓の対応する領域を指す形容詞である。
【００４０】
動作に関しては、心臓の主要な役割は、対象における組織および細胞の代謝的必要性に見合うように、酸素を含む血液を十分に送り込むことである。心臓は、この課題を心周期と称される律動的かつ高度に調和した収縮と弛緩の周期で実現する。簡潔にするために、心周期を２つの広範なカテゴリー：心室が収縮する心周期の相である心室収縮期；および心室が弛緩する心周期の相である心室拡張期に分けることができる。詳細な考察に関してはＯｐｉｅ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １２  ｉｎ  Ｂｒａｕｎｗａｌｄを参照されたい。本明細書で使用される場合、収縮期および拡張期という用語は、文脈により明確に別段の規定がなされない限り、心室収縮期および拡張期を指すものとする。
【００４１】
健康な間の正常な循環では、右心房は静脈を介して体からの実質的に酸素が除かれた血液を受ける。拡張期には、右心房が収縮し、血液が三尖弁を通って右心室中に流れ込む。右心室が血液で満たされ、次いで、収縮する（収縮期）。収縮期の力により三尖弁が閉じ、それにより血液が肺動脈弁を通って肺動脈中に流れ込む。次いで、血液が肺に行き、そこで二酸化炭素を放出し、酸素を取り込む。酸素を含む血液が肺静脈を介して心臓に戻り、左心房に入る。拡張期には、左心房が収縮し、血液が僧帽弁を通って左心室中に流れ込む。左心室が血液で満たされ、次いで、収縮し、右心室が実質的に同時に収縮する。収縮の力により僧帽弁が閉じ、それにより、血液が大動脈弁を通って大動脈中に流れ込む。大動脈から、酸素を含む血液が体内の全ての組織に循環し、そこで酸素が細胞に送達される。次いで、酸素が除かれた血液が静脈を介して右心房に戻る。
【００４２】
左心室の腔内には、前乳頭筋および後乳頭筋として公知の心室心筋層の大きな基本的に円錐形の伸長が２つ存在する。これらは、腱索または腱と称される糸様伸長を介して僧帽弁の心室の表面に接続されている。乳頭筋および腱の１つの重要な役割は、心室収縮期中に僧帽弁が閉じたままであることを確実にすることである。別の重要な役割は、心臓の収縮の力を増大させることである。同様に、右心室は乳頭筋および腱を有し、これらは三尖弁を繋ぎ止め、収縮の力を増大させる。
【００４３】
遺伝性または後天性の疾患過程および／または正常な老化に起因して、心臓筋肉には、収縮期または拡張期のいずれか、またはその両方に機能不全が発生する可能性がある。収縮期の機能不全は収縮機能不全と称される。拡張期の機能不全は拡張機能不全と称される。詳細な考察に関してはＯｐｉｅ  Ｃｈａｐｔｅｒ  １２、およびＣｏｌｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １３  ｉｎ  Ｂｒａｕｎｗａｌｄを参照されたい。
【００４４】
遺伝性または後天性の疾患過程および／または正常な老化に起因して、心臓弁の１つまたは複数に機能不全が発生する可能性がある。弁の機能不全は、一般に以下の２つの広範なカテゴリーに入る：狭窄、これは、本明細書では、心周期のうち正常に動作する弁が実質的に開いている時の弁の開きが不完全であることと定義される；閉鎖不全、これは、本明細書では、心周期のうち正常に動作する弁が実質的に閉じている時の弁の閉まりが不完全であることと定義される。弁の機能不全は、心室収縮期中に僧帽弁小葉が後方に逸脱して左心房中に入る、僧帽弁逸脱症として公知の状態も含む。この状態は、軽度、中等度、または重度の僧帽弁閉鎖不全に関連し得る。
【００４５】
弁狭窄は、一般には、弁が開いた時の弁にわたる圧力勾配を特徴とする。弁閉鎖不全は、一般には、弁が閉じた時の逆行（「後方」）流を特徴とする。例えば、僧帽弁狭窄症（ｍｉｔｒａｌ  ｓｔｅｎｏｓｉｓ）は、心室拡張期の終わり間近の僧帽弁にわたる圧力勾配を特徴とする（中等度の僧帽弁狭窄症の典型的な例として、左心室内の拡張期圧５ｍｍ  Ｈｇ、左心房内の拡張期圧２０ｍｍ  Ｈｇ、１５ｍｍ  Ｈｇの圧力勾配）。別の例として、僧帽弁閉鎖不全は、心室収縮期中の血液の左心室から左心房への「後方」流を特徴とする。
【００４６】
心不全：心臓が対象における組織および細胞の代謝的必要性に見合うように酸素を含む血液を十分に供給することができないこと。これには、肺静脈または体静脈における鬱血などの循環鬱血が伴う。本明細書で使用される場合、心不全という用語は、あらゆる原因による心不全を包含し、本明細書では、例えば「鬱血性心不全」、「前方心不全」、「後方心不全」、「高拍出性心不全」、「低拍出性心不全」などの用語を包含するものとする。詳細な考察に関してはＣｈａｐｔｅｒｓ  １３−１７  ｉｎ  Ｂｒａｕｎｗａｌｄを参照されたい。
【００４７】
阻害：疾患または障害などの低減。疾患または障害の阻害により、疾患または障害の１つまたは複数の徴候または症状が減少し得る。
【００４８】
インターロイキン（ＩＬ）−３３：ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ＲａおよびＩＬ−１８を含めた他のＩＬ−１サイトカインに関して記載されている保存された構造型である分子β−トレフォイル構造に一部基づいて決定されるサイトカインのＩＬ−１スーパーファミリーのメンバーである。この構造では、β−トレフォイルの１２本のβ鎖が、４つのβ鎖単位であるシュードリピート３つに配置され、そのうちの第１のβ鎖と最後のβ鎖は６鎖β−バレル中の逆平行の板であり、一方、各リピートの第２のβ鎖と第３のβ鎖はβ−バレルの頂上に位置するβ−ヘアピンを形成する。ＩＬ−３３は、高親和性受容体ファミリーメンバーＳＴ２に結合する。ＩＬ−３３は、ヘルパーＴ細胞、肥満細胞、好酸球および好塩基球を誘導して２型サイトカインを産生させる。ヒトＩＬ−３３の例示的なアミノ酸配列は、２０１８年４月５日に入手可能な全て参照により本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＮＰ＿００１１８６５６９．１、ＮＰ＿００１１８６５７０．１、ＮＰ＿００１３００９７３．１、ＮＰ＿００１３００９７４．１、およびＮＰ＿００１３００９７５．１に提示される。
【００４９】
単離された：「単離された」生物学的成分（例えば、核酸、タンパク質、細胞、またはナノ小胞など）は、生物体の細胞内またはＥＣＭ内の、天然に存在する成分である他の生物学的成分から実質的に分離または精製されている。「単離された」核酸およびタンパク質は、標準の精製方法によって精製された核酸およびタンパク質を含む。単離されたナノ小胞は、ＥＣＭの線維状物質から取り出されている。この用語は、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸およびタンパク質ならびに化学的に合成された核酸も包含する。
【００５０】
リシルオキシダーゼ（Ｌｏｘ）：コラーゲンおよびエラスチン前駆体のリシン残基からのアルデヒドの形成を触媒する銅依存性酵素。これらのアルデヒドは、高度に反応性であり、他のリシルオキシダーゼ由来アルデヒド残基と、または修飾されていないリシン残基との自発的な化学反応を受ける。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、これにより、コラーゲンおよびエラスチンの架橋結合がもたらされ、これは、コラーゲン原線維の安定化において、ならびに成熟エラスチンの完全性および弾性に関して役割を果たす。構造が異なる複雑な架橋結合がコラーゲンにおいて（３つのリシン残基に由来するピリジノリン）およびエラスチンにおいて（４つのリシン残基に由来するデスモシン）形成される。Ｌｏｘ酵素をコードする遺伝子が種々の生物体からクローニングされている（Ｈａｍａｌａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １１：  ５０８，  １９９１；Ｔｒａｃｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９：  ４８６３，  １９９０；参照により本明細書に組み込まれる）。ヒトリシルオキシダーゼの配列の残基１５３〜４１７および残基２０１〜４１７は、触媒機能のために重要であることが示されている。ＬｏｘＬ１、ＬｏｘＬ２、ＬｏｘＬ３およびＬｏｘＬ４と称される４つのＬｏｘ様アイソフォームがある。
【００５１】
マクロファージ：細胞デブリ、外来物質、微生物、およびがん細胞を貪食し、分解する白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）の一種。これらの細胞は、ファゴサイトーシスにおけるそれらの役割に加えて、発達、組織の維持および修復において、ならびに、リンパ球などの免疫細胞を含めた他の細胞を動員し、それらに影響を及ぼすという点で、自然免疫および適応免疫の両方において重要な役割を果たす。マクロファージは、Ｍ１およびＭ２と称されている表現型を含めた多くの表現型で存在し得る。主に炎症促進性機能を果たすマクロファージはＭ１マクロファージ（ＣＤ８６＋／ＣＤ６８＋）と称され、一方、炎症を低減し、また、組織修復を刺激し、調節するマクロファージはＭ２マクロファージ（ＣＤ２０６＋／ＣＤ６８＋）と称される。マクロファージの種々の表現型を同定するマーカーは種間で様々である。マクロファージ表現型は、Ｍ１およびＭ２の両極端の間にわたる一連のもの（ｓｐｅｃｔｒｕｍ）によって表されることに留意するべきである。Ｆ４／８０（接着Ｇタンパク質共役型受容体Ｅ１（ＡＤＧＲＥ）遺伝子によってコード）はマクロファージマーカーである。どちらも参照により本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＮＰ＿００１２４３１８１．１、２０１８年４月６日およびＮＰ＿００１９６５、２０１８年３月５日を参照されたい。ナノ小胞は対象におけるマクロファージにおいてＣＤ６８およびＣＤ１１ｂの発現を維持することが本明細書に開示される。
【００５２】
マイクロＲＮＡ：一般には標的ｍＲＮＡの翻訳を抑止することによって遺伝子発現を転写後調節する約１７〜約２５ヌクレオチド塩基長の小さな非コードＲＮＡ。ｍｉＲＮＡは、負の調節因子として機能し得、したがって、特定のｍｉＲＮＡの量が多いことは標的遺伝子発現のレベルが低いことと相関する。ｍｉＲＮＡには、一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）、未熟ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）、および成熟ｍｉＲＮＡという３つの形態が存在する。一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）は、約数百塩基から１ｋｂを超えるまでのステムループ構造化された転写物として発現される。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ転写物は、核において、ステムループの基部付近のステムの両鎖を切断するドローシャと称されるＲＮａｓｅ  ＩＩエンドヌクレアーゼによって切断される。ドローシャは、ＲＮＡ２重鎖を互い違いに切断し、５’リン酸および３’末端の２ヌクレオチド突出を残す。切断産物である未熟ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）は、約６０〜約１１０ヌクレオチド長であり、フォールドバック様式で形成されたヘアピン構造を有する。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡはＲａｎ−ＧＴＰおよびエクスポーチン−５によって核から細胞質に輸送される。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは細胞質においてダイサーと称される別のＲＮａｓｅ  ＩＩエンドヌクレアーゼによってさらにプロセシングされる。ダイサーは、５’リン酸および３’突出を認識し、ステムループ接合部でループを切断してｍｉＲＮＡ  ２重鎖を形成する。ｍｉＲＮＡ  ２重鎖がＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に結合し、そこでアンチセンス鎖が優先的に分解され、センス鎖成熟ｍｉＲＮＡはＲＩＳＣをその標的部位に向ける。成熟ｍｉＲＮＡはｍｉＲＮＡの生物学的に活性な形態であり、約１７〜約２５ヌクレオチド長である。
【００５３】
筋芽細胞：他の筋芽細胞と融合して筋原線維を形成しておらず、既存の筋原線維にも融合していない筋肉細胞。
【００５４】
ナノ小胞：直径約１０〜約１，０００ｎｍのナノ粒子である細胞外小胞。ナノ小胞は、他の分子の中でも生物学的に活性なシグナル伝達分子（例えば、マイクロＲＮＡ、タンパク質）を運搬する脂質膜結合型粒子である。一般に、ナノ小胞は、脂質二重層により限定され、生体分子を二重層に封入する、および／または二重層に包埋することができる。したがって、ナノ小胞は、原形質膜で囲まれた内腔を含む。異なる型の小胞は、直径、細胞内起源、密度、形状、沈降速度、脂質組成、タンパク質マーカー、核酸含有量および細胞外マトリックス由来であるかまたは分泌されたものであるかなどの起源に基づいて区別することができる。ナノ小胞は、例えば、ＥＣＭ由来のマトリックス結合型ナノ小胞（上記を参照されたい）など、その起源、タンパク質含有量および／またはｍｉＲ含有量によって同定することができる。
【００５５】
「エキソソーム」は、細胞により分泌される膜様小胞であり、直径１０から１５０ｎｍまでにわたる。一般に、後期エンドソームまたは多胞体は、限定されたエンドソーム膜からこれらの封入された小胞中への小胞の内向きの出芽および切断によって形成された内腔内小胞を含有する。次いで、原形質膜と融合すると、エキソサイトーシスの間にこれらの内腔内小胞が多胞体内腔から細胞外の環境、一般には血液、脳脊髄液または唾液などの体液中に放出される。膜のセグメントが陥入し、エンドサイトーシスによって取り込まれると、エキソソームが細胞内に生じる。より小さな小胞に分解され、最終的に細胞から吐き出される内部移行したセグメントは、タンパク質ならびにｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡなどのＲＮＡ分子を含有する。血漿由来のエキソソームはリボソームＲＮＡをほとんど欠く。細胞外マトリックスに由来するエキソソームは、特定のｍｉＲＮＡおよびタンパク質成分を含み、事実上、血液、尿、唾液、精液、および脳脊髄液などのあらゆる体液中に存在することが示されている。エキソソームは、ＣＤ１１ｃおよびＣＤ６３を発現し得、したがって、ＣＤ１１ｃ＋およびＣＤ６３＋であり得る。エキソソームは表面に高レベルのｌｙｓｌオキシダーゼを有さない。
【００５６】
「ＥＣＭに由来するナノ小胞」、「マトリックス結合型ナノ小胞」、「ＭＢＶ」または「ＥＣＭ由来ナノ小胞」は全て同じ膜結合型粒子を指し、当該粒子は、サイズが１０ｎｍ〜１０００ｎｍにわたり、細胞外マトリックスに存在し、細胞挙動に影響を及ぼすタンパク質、脂質、核酸、成長因子およびサイトカインなどの生物学的に活性なシグナル伝達分子を含有する。この用語は、互換的であり、同じ小胞を指す。これらのＭＢＶは、ＥＣＭに埋め込まれ、それに結合しており、単に表面に付着しているのではない。これらのＭＢＶは、凍結融解、ならびにペプシン、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、プロテイナーゼＫ、およびコラゲナーゼなどのプロテアーゼによる消化、ならびに界面活性剤による消化などの厳しい単離条件に対して抵抗性である。一般に、これらのＭＢＶは、とりわけ、ｍｉＲ−１４５、ならびに必要に応じてｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−１４３、およびｍｉＲ−１２５が富化されている。これらのＭＢＶは、ＣＤ６３もＣＤ８１も発現しないか、またはこれらのマーカーをわずかに検出可能なレベルで発現する（ＣＤ６３ｌｏＣＤ８１ｌｏ）。ＭＢＶは、表面にｌｙｓｌオキシダーゼ（Ｌｏｘ）を含有する。ＥＣＭは、組織由来のＥＣＭであってもよく、培養下で細胞に産生させることもでき、商業的な供給源から購入することもできる。ＭＢＶはエキソソームとは別個のものである。
【００５７】
臓器拒絶または移植片拒絶：レシピエントによって発現される活性な免疫応答に起因するものであり、臓器機能不全の非免疫学的原因とは無関係である、臓器の機能的および構造的劣化。
【００５８】
薬学的に許容される担体：本発明において有用な薬学的に許容される担体は従来のものである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ｂｙ  Ｅ．  Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ，  １５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９７５）には、本明細書において開示される融合タンパク質の薬学的送達に適した組成物および製剤が記載されている。
【００５９】
一般に、担体の性質は、使用される特定の投与形式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、水、生理的食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどの薬学的かつ生理的に許容される流体をビヒクルとして含む注射液を含む。固体組成物（例えば、散剤、丸剤、錠剤、またはカプセル剤の形態）に関しては、従来の無毒性固体担体は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプンまたはステアリン酸マグネシウムを含み得る。投与される医薬組成物は、生物学的に中性の担体に加えて、微量の無毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートなどを含有し得る。
【００６０】
医薬品：対象または細胞に適正に投与された場合に所望の治療効果または予防効果をもたらすことができる化学化合物または組成物。「インキュベートすること」は、薬物が細胞と相互作用するのに十分な時間を含む。「接触させること」は、エキソソーム、ｍｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡをコードする核酸などの作用物質を固体または液体の形態で細胞と一緒にインキュベートすることを含む。
【００６１】
ポリヌクレオチド：任意の長さの核酸配列（例えば、直鎖状配列など）。したがって、ポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを含み、染色体内に見いだされる遺伝子配列も含む。「オリゴヌクレオチド」は、ネイティブなリン酸ジエステル結合によって結合した、複数の結合したヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、６ヌクレオチド長から３００ヌクレオチド長の間のポリヌクレオチドである。オリゴヌクレオチド類似体は、オリゴヌクレオチドと同様に機能するが、天然には存在しない部分を有する部分を指す。例えば、オリゴヌクレオチド類似体は、例えば、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドなど、変更された糖部分または糖間連結などの天然に存在しない部分を含有し得る。天然に存在するポリヌクレオチドの機能的な類似体は、ＲＮＡまたはＤＮＡに結合し得、ペプチド核酸（ＰＮＡ）分子を含む。
【００６２】
精製された：「精製された」という用語は、絶対的な純度を求めるものではなく、相対語として意図されている。したがって、例えば、精製された核酸分子調製物とは、その調製物中の言及された核酸（ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ）が、細胞内のその天然の環境下にある核酸（ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ）よりも純度が高いものである。例えば、核酸の調製物は、核酸がその調製物の総タンパク質含有量の少なくとも５０％になるように精製される。同様に、精製されたエキソソーム調製物とは、その調製物中のエキソソームが、微小胞およびエキソソームが存在する細胞を含む環境下にあるエキソソームよりも純度が高いものである。核酸またはエキソソームの精製された集団は、それぞれ純度が約９０％よりも高い、約９１％よりも高い、約９２％よりも高い、約９３％よりも高い、約９４％よりも高い、約９５％よりも高い、約９６％よりも高い、約９７％よりも高い、約９８％よりも高い、約９９％よりも高いもしくは１００％である、または他の核酸もしくは細胞成分を含まない。
【００６３】
疾患の防止または処置：疾患の「防止」は、例えば、緑内障などの疾患の素因を有することが分かっている人における疾患の発生を阻害することを指す。素因を有することが分かっている人の例は、家族内に病歴がある人、または対象に状態の素因を与える因子に曝露されてきた人である。「処置」は、疾患または病的状態が発生し始めた後にその徴候または症状を好転させる治療介入を指す。
【００６４】
ＳＴ２：インターロイキン１受容体ファミリーのメンバー。ＳＴ２は、ＩＬＲ１ＲＬ１としても公知であり、また、細胞内ＴＩＲドメインの機能に基づいてＴｏｌｌ様受容体スーパーファミリーのメンバーでもあるが、細胞外領域は免疫グロブリンドメインで構成される。
【００６５】
ＳＴ２タンパク質は、２つのアイソフォームを有し、心疾患の進行に直接関係付けられる：可溶性の形態（可溶性ＳＴ２またはｓＳＴ２と称される）および膜に結合した受容体の形態（ＳＴ２受容体またはＳＴ２Ｌと称される）。心筋層が伸びると、ＳＴ２遺伝子が上方調節され、それにより、循環可溶性ＳＴ２の濃度が上昇する。ＳＴ２のリガンドはＩＬ−３３である。
【００６６】
虚血性イベントなどの心疾患または傷害に応答してＩＬ−３３がＳＴ２受容体に結合すると、心保護効果が引き出され、その結果、心機能の保存がもたらされる。この心保護的ＩＬ−３３シグナルは、ＩＬ−３３に結合してＩＬ−３３を心保護的シグナル伝達のためにＳＴ２受容体に対して利用できないようにする可溶性ＳＴ２のレベルと相殺される。結果として、心臓は高レベルの可溶性ＳＴ２の存在下ではより大きなストレスにさらされる。
【００６７】
対象：非ヒト霊長類、マウス、ウサギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、およびは虫類などの哺乳動物および非哺乳動物などの全ての脊椎動物を含めたヒトおよび非ヒト動物。当該記載の方法の多くの実施形態では、対象はヒトである。
【００６８】
治療有効量：処置される対象において所望の効果を実現するのに十分な、ＭＢＶなどの特定の物質の量。対象に投与する場合、所望のｉｎ  ｖｉｔｒｏ効果が実現されることが示されている標的組織中濃度（例えば、骨中）が実現される投与量が一般に使用される。
【００６９】
移植：組織、細胞、または臓器、またはその一部を、１対象から別の対象に、１対象から同じ対象の別の部分に、または１対象から同じ対象の同じ部分に移動させること。一実施形態では、心臓、腎臓、皮膚、膵臓または肺などの実質臓器の移植は、実質臓器を１対象から取り出し、その実質臓器を別の対象に導入することを伴う。
【００７０】
同種移植または異種移植は、１個体から別の個体への移植であり、これらの個体は、１つまたは複数の遺伝子座に、２個体における配列が同一ではない遺伝子を有する。同種移植は、遺伝学的に異なる同じ種の２個体間、または２つの異なる種の個体間で行うことができる。自己移植は、同じ個体内の１つの場所から別の場所への組織、細胞、もしくはその一部の移植、または、２個体が遺伝学的に同一の場合の１個体から別の個体への組織もしくはその一部の移植である。
【００７１】
「移植」は、生体適合性基材を、それを必要とする対象内に配置することである。
【００７２】
処置すること、処置、および治療：症状の軽減、寛解、減少、または状態が患者により許容されるものになること、変性もしくは衰退の速度が遅くなること、変性の最終点がより消耗性が低いものになること、対象の身体的もしくは精神的ウェルビーイングが改善されること、または視覚が改善されることなどの任意の客観的または主観的パラメーターを含めた、傷害、病状または状態の減弱または好転に関する任意の成功または成功の兆候。処置は、身体検査、神経学的検査、または精神医学的評価の結果を含めた客観的または主観的パラメーターによって評価することができる。
【００７３】
特に説明がなければ、本明細書において使用される全ての科学技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という単数の用語は、文脈によりそうでないことが明白に示されない限り、複数の指示対象を包含する。同様に、「または（ｏｒ）」という単語は、文脈によりそうでないことが明白に示されない限り、「および（ａｎｄ）」を含むものとする。したがって、「ＡまたはＢを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  Ａ  ｏｒ  Ｂ）」とは、Ａ、またはＢ、またはＡとＢとを含むことを意味する。核酸またはポリペプチドに関して示される全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および全ての分子量または分子質量値はおおよそのものであり、説明のために提示されるものであることがさらに理解されるべきである。本明細書に記載のものと同様または同等である方法および材料を本開示の実施または試験に使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書において言及されている全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。別段の指定がない限り、「約」は５パーセント以内である。矛盾する場合は、用語の説明を含めた本明細書が支配するものとする。さらに、材料、方法および実施例は単に例示的なものであり、限定されるものではない。
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に由来するナノ小胞
【００７４】
ＥＣＭに由来するナノ小胞（マトリックス結合型ナノ小胞、ＭＢＶとも称される）は、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／１５１８６２号に開示されている。ナノ小胞が細胞外マトリックスに包埋されていることが開示されている。これらのＭＢＶは、単離することができ、また、生物学的に活性である。したがって、これらのＭＢＶを治療目的で単独でまたは別のＥＣＭと共に使用することができる。これらのＭＢＶを生物学的足場に単独でまたは別のＥＣＭと共に使用することができる。ＭＢＶはＩＬ−３３を含有し、心疾患および障害ならびに線維性疾患および障害の処置に有用であることが本明細書に開示される。一部の非限定的な例では、ナノ小胞は、対象におけるマクロファージにおいてＣＤ６８およびＣＤ１１ｂの発現を維持する。
【００７５】
細胞外マトリックスは、これだけに限定されないが、哺乳動物組織内の細胞を囲んで支持し、また、別段の指定のない限り無細胞性である、構造タンパク質、特殊タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、および成長因子を含めた、構造的かつ機能的な生体分子および／または生体高分子の複雑な混合物である。一般に、開示されるＭＢＶは、任意の型の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に包埋されたものであり、その場所から単離することができる。したがって、ＭＢＶは、分離可能にＥＣＭの表面に存在しているのではなく、また、エキソソームではない。
【００７６】
細胞外マトリックスは、例えば、これだけに限定することなく、米国特許第４，９０２，５０８号；米国特許第４，９５６，１７８号；米国特許第５，２８１，４２２号；米国特許第５，３５２，４６３号；米国特許第５，３７２，８２１号；米国特許第５，５５４，３８９号；米国特許第５，５７３，７８４号；米国特許第５，６４５，８６０号；米国特許第５，７７１，９６９号；米国特許第５，７５３，２６７号；米国特許第５，７６２，９６６号；米国特許第５，８６６，４１４号；米国特許第６，０９９，５６７号；米国特許第６，４８５，７２３号；米国特許第６，５７６，２６５号；米国特許第６，５７９，５３８号；米国特許第６，６９６，２７０号；米国特許第６，７８３，７７６号；米国特許第６，７９３，９３９号；米国特許第６，８４９，２７３号；米国特許第６，８５２，３３９号；米国特許第６，８６１，０７４号；米国特許第６，８８７，４９５号；米国特許第６，８９０，５６２号；米国特許第６，８９０，５６３号；米国特許第６，８９０，５６４号；および米国特許第６，８９３，６６６号；そのそれぞれの全体が参照によって組み込まれる）に開示されている。しかし、ＥＣＭは、任意の組織から作製することもでき、任意のｉｎ  ｖｉｔｒｏ供給源から作製することもでき、この場合、ＥＣＭは培養細胞によって産生され、ネイティブなＥＣＭの１つまたは複数のポリマー成分（構成物）を含む。ＥＣＭ調製物は、「脱細胞化された」または「無細胞性」であるとみなされ、これは、細胞が供給源組織または培養物から取り出されていることを意味する。
【００７７】
一部の実施形態では、ＥＣＭを脊椎動物、例えば、これだけに限定されないが、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジなどを含めた哺乳動物脊椎動物から単離する。ＥＣＭは、これだけに限定することなく、膀胱、腸、肝臓、心臓、食道、脾臓、胃および真皮を含めた任意の臓器または組織に由来するものであってよい。特定の非限定的な例では、細胞外マトリックスを食道組織、膀胱、小腸粘膜下組織、真皮、臍帯、心膜、心臓組織、または骨格筋から単離する。ＥＣＭは、例えば、これだけに限定することなく、粘膜下組織、上皮基底膜、固有層などを含めた器官から得た任意の部分または組織を含み得る。非限定的な一実施形態では、ＥＣＭは膀胱から単離される。ＥＣＭは腫瘍組織から作製することができる。
【００７８】
ＥＣＭは、基底膜を含んでもよく、含まなくてもよい。別の非限定的な実施形態では、ＥＣＭは、基底膜の少なくとも一部分を含む。ＥＣＭ材料は、毛細血管内皮細胞または線維細胞などの元の組織を構成する細胞要素の一部を保持していてもよく、保持していなくてもよい。一部の実施形態では、ＥＣＭは、基底膜表面と非基底膜表面の両方を含有する。
【００７９】
非限定的な一実施形態では、ＥＣＭはブタ膀胱から回収される（膀胱マトリックスまたはＵＢＭとしても公知）。簡単に述べると、ＥＣＭは、ブタなどの哺乳動物から膀胱組織を取り出し、残留している脂肪組織を含めた外側の結合組織を切り落とすことによって調製される。水道水で繰り返し洗浄することによって残留している全ての尿を除去する。まず、組織を、脱上皮溶液、例えば、これだけに限定することなく、高張性食塩水（例えば、１．０Ｎの食塩水）中に１０分間から４時間までにわたる期間にわたって浸漬することによって組織を層剥離させる。高張性食塩溶液への曝露により、基礎をなす基底膜から上皮細胞を除去する。必要に応じて、カルシウムキレート剤を食塩溶液に添加することができる。最初の層剥離手順後の残りの組織は上皮基底膜および上皮基底膜に対して反内腔側の組織層を含む。比較的脆弱な上皮基底膜は一定して損傷を受け、これを内腔表面に対する任意の機械的剥離によって除去する。次に、この組織をさらなる処理に供して反内腔側組織の大部分を除去するが上皮基底膜および固有層は維持する。外側漿膜、外膜、筋層粘膜、粘膜下層および粘膜筋板の大部分を残りの上皮除去組織から機械的剥離によってまたは酵素処理（例えば、トリプシンまたはコラゲナーゼを使用する）、その後の水分付加、および剥離の組合せによって除去する。これらの組織の機械的除去は、例えば、これだけに限定することなく、Ａｄｓｏｎ−ＢｒｏｗｎピンセットおよびＭｅｔｚｅｎｂａｕｍはさみを用いて腸間膜組織を除去し、筋層および粘膜下層を、スカルペルハンドルまたは湿らせたガーゼに包んだ他の剛体を用いて縦方向に拭う動作を使用して拭いとることによって実現される。切刃、レーザーを伴う自動化ロボット手順および他の組織分離方法も意図されている。これらの組織を除去した後、得られたＥＣＭは、主に上皮基底膜および下にある固有層からなる。
【００８０】
別の実施形態では、ＥＣＭを、ブタ膀胱組織をスカルペルハンドルおよび湿らせたガーゼで縦方向に拭う動作を使用して剥離させて、漿膜および筋層の両方を含む外層を除去することによって調製する。組織セグメントを裏返した後、粘膜の内腔部分を、同じ拭う動作を使用して基礎をなす組織から層剥離させる。粘膜下組織に穴をあけないように注意する。これらの組織を除去した後に得られたＥＣＭは主に粘膜下層からなる（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，２７７，９９９号の図２を参照されたい）。
【００８１】
ＥＣＭを粉末として調製することもできる。そのような粉末は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＧｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２６  （２００５）  １４３１−１４３５の方法に従って作製することができる。例えば、ＵＢＭシートを凍結乾燥させ、次いで、液体窒素中に浸漬させるために切って小さなシートにすることができる。次いで、スナップ凍結材料を、粒子が回転式ナイフミルに入るように十分小さくなるように細かく砕くことができ、それにより、ＥＣＭを粉末化する。同様に、ＥＣＭ組織内でＮａＣｌを沈殿させることにより、材料を均一サイズの粒子に砕き、それをスナップ凍結させ、凍結乾燥させ、粉末化することができる。
【００８２】
非限定的な一実施形態では、ＥＣＭは小腸粘膜下組織またはＳＩＳに由来する。市販の調製物としては、これだけに限定されないが、ＳＵＲＧＩＳＩＳ（商標）、ＳＵＲＧＩＳＩＳ−ＥＳ（商標）、ＳＴＲＡＴＡＳＩＳ（商標）、およびＳＴＲＡＴＡＳＩＳ−ＥＳ（商標）（Ｃｏｏｋ  Ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．；Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．）ならびにＧＲＡＦＴＰＡＴＣＨ（商標）（Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｉｎｃ．；Ｃａｎｔｏｎ  Ｍａｓｓ．）が挙げられる。別の非限定的な実施形態では、ＥＣＭは、真皮に由来する。市販の調製物としては、これだけに限定されないが、ＰＥＬＶＩＣＯＬ（商標）（ヨーロッパではＰＥＲＭＡＣＯＬ（商標）として販売されている；Ｂａｒｄ、Ｃｏｖｉｎｇｔｏｎ，Ｇａ．）、ＲＥＰＬＩＦＯＲＭ（商標）（Ｍｉｃｒｏｖａｓｉｖｅ；Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）およびＡＬＬＯＤＥＲＭ（商標）（ＬｉｆｅＣｅｌｌ；Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ、Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。別の実施形態では、ＥＣＭは、膀胱に由来する。市販の調製物としては、これだけに限定されないが、ＵＢＭ（ＡＣｅｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｊｅｓｓｕｐ、Ｍｄ．）が挙げられる。
【００８３】
ＭＢＶは、以下に開示されている方法を使用して細胞外マトリックスから引き出す（それから放出させる）ことができる。一部の実施形態では、ＥＣＭを、ペプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、またはプロテイナーゼＫなどの酵素を用いて消化し、ＭＢＶを単離する。他の実施形態では、グリシンＨＣＬ、クエン酸、水酸化アンモニウムなどの溶液を用いてｐＨを変化させることによって、これだけに限定されないが、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡなどのキレート剤の使用、これだけに限定されないが、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、ヨウ化ナトリウム、チオシアン酸ナトリウムなどの塩を使用したイオン強度および／もしくはカオトロピック効果によって、またはＥＣＭをグアニジンＨＣｌもしくは尿素のような変性条件に曝露させることによって、ＭＢＶをＥＣＭから放出させ、分離する。
【００８４】
特定の例では、ＭＢＶを、ＥＣＭをペプシン、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、プロテイナーゼＫ、塩類溶液、またはコラゲナーゼなどの酵素で消化した後に調製する。ＥＣＭを凍結融解させるまたは機械的な分解に供することができる。
【００８５】
開示されるＭＢＶはＩＬ−３３を含有する。一部の実施形態では、ＭＢＶにおいてＣＤ６３および／またはＣＤ８１の発現を検出することはできない。したがって、ＭＢＶは、ＣＤ６３および／またはＣＤ８１を発現しない。特定の例では、ナノ小胞においてＣＤ６３およびＣＤ８１のどちらも検出することができない。他の実施形態では、ＭＢＶは、例えばウエスタンブロットによって検出可能なものなど、わずかに検出可能なレベルのＣＤ６３およびＣＤ８１を有する。これらのＭＢＶは、ＣＤ６３ｌｏＣＤ８１ｌｏである。当業者は、例えば、ＣＤ６３およびＣＤ８１に特異的に結合する抗体を使用して、ＣＤ６３ｌｏＣＤ８１ｌｏであるＭＢＶを容易に同定することができる。これらのマーカーの低レベルを蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などの手順および蛍光標識された抗体を使用して確立して、ＣＤ６３およびＣＤ８１の少量および多量についての閾値を決定することができる。開示されるＭＢＶは、生体液中に存在しているので、ＥＣＭの表面に一過性に付着し得るエキソソームなどのナノ小胞とは異なる。
【００８６】
ＭＢＶは、リシルオキシダーゼ（Ｌｏｘ）を含む。一般に、ＥＣＭに由来するナノ小胞のＬｏｘ含有量はエキソソームよりも多い。Ｌｏｘは、ＭＢＶの表面に発現される。ナノＬＣ  ＭＳ／ＭＳプロテオミクス解析を使用して、Ｌｏｘタンパク質を検出することができる。Ｌｏｘの定量は、以前に記載されている通り実施することができる（Ｈｉｌｌ  ＲＣ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．  ２０１５；  １４  （４）：  ９６１−７３）。
【００８７】
ある特定の実施形態では、ＭＢＶは、１つまたは複数のｍｉＲＮＡを含む。特定の非限定的な例では、ＭＢＶは、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５およびｍｉＲ−１８１のうちの１つ、２つ、または３つ全てを含む。ＭｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５およびｍｉＲ−１８１は、当技術分野で公知である。
【００８８】
ｍｉＲ−１４５核酸配列は、参照により本明細書に組み込まれるＭｉＲｂａｓｅ受託番号ＭＩ００００４６１で提供される。ｍｉＲ−１４５核酸配列は、ＣＡＣＣＵＵＧＵＣＣＵＣＡＣＧＧＵＣＣＡＧＵＵＵＵＣＣＣＡＧＧＡＡＵＣＣＣＵＵＡＧＡＵＧＣＵＡＡＧＡＵＧＧＧＧＡＵＵＣＣＵＧＧＡＡＡＵＡＣＵＧＵＵＣＵＵＧＡＧＧＵＣＡＵＧＧＵＵ（配列番号１）である。ｍｉＲ−１８１核酸配列は、参照により本明細書に組み込まれるｍｉＲｂａｓｅ受託番号ＭＩ００００２６９で提供される。ｍｉＲ−１８１核酸配列は、ＡＧＡＡＧＧＧＣＵＡＵＣＡＧＧＣＣＡＧＣＣＵＵＣＡＧＡＧＧＡＣＵＣＣＡＡＧＧＡＡＣＡＵＵＣＡＡＣＧＣＵＧＵＣＧＧＵＧＡＧＵＵＵＧＧＧＡＵＵＵＧＡＡＡＡＡＡＣＣＡＣＵＧＡＣＣＧＵＵＧＡＣＵＧＵＡＣＣＵＵＧＧＧＧＵＣＣＵＵＡ（配列番号２）である。ｍｉＲ−１４３核酸配列は、参照により本明細書に組み込まれるＮＣＢＩ受託番号ＮＲ＿０２９６８４．１、２０１８年３月３０日で提供される。ｍｉＲ−１４３核酸配列は、ＧＣＧＣＡＧＣＧＣＣ  ＣＵＧＵＣＵＣＣＣＡ  ＧＣＣＵＧＡＧＧＵＧ  ＣＡＧＵＧＣＵＧＣＡ  ＵＣＵＣＵＧＧＵＣＡ  ＧＵＵＧＧＧＡＧＵＣ  ＵＧＡＧＡＵＧＡＡＧ  ＣＡＣＵＧＵＡＧＣＵ  ＣＡＧＧＡＡＧＡＧＡ  ＧＡＡＧＵＵＧＵＵＣ  ＵＧＣＡＧＣ（配列番号３）である。
【００８９】
一部の実施形態では、投与後、ＭＢＶは、対象におけるマクロファージにおいてＣＤ６８およびＣＤ１１ｂの発現を維持する。開示されている実験研究では、ナノ小胞で処理したマクロファージは、主に、Ｍ２表現型を示すＦ４／８０＋Ｆｉｚｚ１＋である。したがって、一部の実施形態では、マクロファージはＭ２表現型を維持する。
【００９０】
本明細書に開示されるＭＢＶは、薬学的送達のための組成物に製剤化し、生体足場およびデバイスに使用することができる。ＭＢＶは、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／１５１８６２号に開示されている。
ＭＢＶのＥＣＭからの単離
【００９１】
ＭＢＶを作製するために、ＥＣＭを任意の目的の細胞に産生させることもでき、商業的供給源から利用することもできる。上記を参照されたい。ＭＢＶは、処置される対象と同じ種から作製することもでき、異なる種から作製することもできる。一部の実施形態では、これらの方法は、ＥＣＭを酵素で消化して消化されたＥＣＭを作製するステップを含む。特定の実施形態では、ＥＣＭをペプシン、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、コラゲナーゼ、メタロプロテイナーゼ、および／またはプロテイナーゼＫのうちの１つまたは複数で消化する。特定の非限定的な例では、ＥＣＭをエラスターゼおよび／またはメタロプロテイナーゼのみで消化する。別の非限定的な例では、ＥＣＭをコラゲナーゼおよび／またはトリプシンおよび／またはプロテイナーゼＫでは消化しない。他の実施形態では、ＥＣＭを界面活性剤で処理する。さらなる実施形態では、方法は、酵素の使用を含まない。特定の非限定的な例では、方法は、ＭＢＶを単離するために、塩化カリウムなどの塩などのカオトロピック剤またはイオン強度を利用する。追加的な実施形態では、ＥＣＭを、ＭＢＶの単離前にＭＢＶ含有量が増加するように操作することができる。
【００９２】
一部の実施形態では、ＥＣＭを酵素で消化する。ＥＣＭを酵素で約１２〜約４８時間、例えば、約１２〜約３６時間などにわたって消化することができる。ＥＣＭを酵素で約１２、約２４、約３６または約４８時間にわたって消化することができる。特定の非限定的な一例では、ＥＣＭを酵素を用いて室温で消化する。しかし、消化は、約４℃、または約４℃から２５℃の間の任意の温度で行うことができる。一般に、ＥＣＭを、酵素を用い、コラーゲン原線維を除去するのに十分な任意の時間の長さにわたって、任意の温度で消化する。消化プロセスは、組織供給源に応じて変動し得る。必要に応じて、ＥＣＭを、酵素での消化前またはその後のいずれかに凍結および融解によって処理する。ＥＣＭをイオン性および／または非イオン性界面活性剤を含めた界面活性剤で処理することができる。
【００９３】
次いで、消化されたＥＣＭを、例えば遠心分離によって処理して、原線維を含まない上清を単離する。一部の実施形態では、消化されたＥＣＭを、例えば、第１のステップとして約３００〜約１０００ｇで遠心分離する。したがって、消化されたＥＣＭを、約４００ｇ〜約７５０ｇで、例えば、約４００ｇ、約４５０ｇ、約５００ｇまたは約６００ｇで遠心分離することができる。この遠心分離は、約１０〜約１５分にわたって、例えば、約１０〜約１２分にわたって、例えば、約１０、約１１、約１２、約１４、約１４、または約１５分にわたって行うことができる。消化されたＥＣＭを含む上清を収集する。
【００９４】
ＭＢＶはＬｏｘを含む。一部の実施形態では、そのようなＭＢＶを単離するための方法は、細胞外マトリックスをエラスターゼおよび／またはメタロプロテイナーゼで消化して消化された細胞外マトリックスを作製するステップと、消化された細胞外マトリックスを遠心分離してコラーゲン原線維レムナントを除去し、したがって原線維を含まない上清を作製するステップと、原線維を含まない上清を遠心分離して固形物を単離するステップと、固形物を担体中に懸濁させるステップとを含む。
【００９５】
一部の実施形態では、消化されたＥＣＭを、第２のステップとして約２０００ｇ〜約３０００ｇで遠心分離することもできる。したがって、消化されたＥＣＭを、約２，５００ｇ〜約３，０００ｇで、例えば、約２，０００ｇ、２，５００ｇ、２，７５０ｇまたは３，０００ｇで遠心分離することができる。この遠心分離は、約２０〜約３０分にわたって、例えば、約２０〜約２５分にわたって、例えば、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９または約３０分にわたって行うことができる。消化されたＥＣＭを含む上清を収集する。
【００９６】
追加的な実施形態では、消化されたＥＣＭを、第３のステップとして約１０，０００〜約１５，０００ｇで遠心分離することができる。したがって、消化されたＥＣＭを、約１０，０００ｇ〜約１２，５００ｇで、例えば、約１０，０００ｇ、１１，０００ｇまたは１２，０００ｇで遠心分離することができる。この遠心分離は、約２５〜約４０分にわたって、例えば、約２５〜約３０分にわたって、例えば、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９または約４０分にわたって行うことができる。消化されたＥＣＭを含む上清を収集する。
【００９７】
これらの遠心分離ステップのうちの１つ、２つ、または３つ全てを独立に利用することができる。一部の実施形態では、３つ全ての遠心分離ステップを利用する。遠心分離ステップを例えば２回、３回、４回、または５回、繰り返すことができる。一実施形態では、３つ全ての遠心分離ステップを３回繰り返す。
【００９８】
一部の実施形態では、消化されたＥＣＭを約５００ｇで約１０分にわたって遠心分離する、約２，５００ｇで約２０分にわたって遠心分離する、および／または約１０，０００ｇで約３０分にわたって遠心分離する。これらのステップ（複数可）、例えば、３つ全てのステップを、２回、３回、４回、または５回、例えば３回、繰り返すことができる。したがって、非限定的な一例では、消化されたＥＣＭを約５００ｇで約１０分にわたって遠心分離し、約２，５００ｇで約２０分にわたって遠心分離し、約１０，０００ｇで約３０分にわたって遠心分離する。これらの３つのステップを３回繰り返す。このようにして、原線維を含まない上清を作製する。
【００９９】
次いで、原線維を含まない上清を遠心分離してＭＢＶを単離する。一部の実施形態では、原線維を含まない上清を約１００，０００ｇ〜約１５０，０００ｇで遠心分離する。したがって、原線維を含まない上清を約１００，０００ｇ〜約１２５，０００ｇで、例えば、約１００，０００ｇ、約１０５，０００ｇ、約１１０，０００ｇ、約１１５，０００ｇまたは約１２０，０００ｇで遠心分離する。この遠心分離は、約６０〜約９０分にわたって、例えば、約７０〜約８０分、例えば、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５または約９０分にわたって行うことができる。非限定的な一例では、線維を含まない上清を約１００，０００ｇで約７０分にわたって遠心分離する。ＭＢＶである固形物を収集する。次いで、これらのＭＢＶを、これだけに限定されないが、緩衝剤などの任意の目的の担体中に再懸濁させることができる。
【０１００】
さらなる実施形態では、ＥＣＭを酵素で消化しない。これらの方法では、ＥＣＭをリン酸緩衝食塩水などの等張食塩溶液中に懸濁させる。次いで、塩を懸濁液に、塩の最終濃度が約０．１Ｍよりも高くなるように添加する。濃度は、例えば、最大約３Ｍ、例えば、約０．１Ｍの塩〜約３Ｍ、または約０．１Ｍ〜約２Ｍであり得る。塩は、例えば、約０．１Ｍ、０．１５Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．７Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ、０．９Ｍ、１．０Ｍ、１．１Ｍ、１．２Ｍ、１．３Ｍ、１．４Ｍ、１．５Ｍ、１．６Ｍ、１．７Ｍ、１．８Ｍ、１．９Ｍ、または２Ｍであり得る。一部の非限定的な例では、塩は、塩化カリウム、塩化ナトリウムまたは塩化マグネシウムである。他の実施形態では、塩は、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、ヨウ化ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム、ナトリウム塩、リチウム塩、セシウム塩またはカルシウム塩である。
【０１０１】
一部の実施形態では、ＥＣＭを塩類溶液中に約１０分〜約２時間、例えば、約１５分〜約１時間、約３０分〜約１時間、または約４５分〜約１時間にわたって懸濁させる。ＥＣＭを塩類溶液中に約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５または１２０分にわたって懸濁させることができる。ＥＣＭを塩類溶液中に４℃から約５０℃まで、例えば、これだけに限定されないが、約４℃〜約２５℃または約４℃〜約３７℃の温度で懸濁させることができる。特定の非限定的な例では、ＥＣＭを塩類溶液中に約４℃で懸濁させる。他の特定の非限定的な例では、ＥＣＭを塩類溶液中に約２２℃または約２５℃（室温）で懸濁させる。別の非限定的な例では、ＥＣＭを塩類溶液中に約３７℃で懸濁させる。
【０１０２】
一部の実施形態では、方法は、細胞外マトリックスを約０．４Ｍよりも高い塩濃度でインキュベートするステップと、消化された細胞外マトリックスを遠心分離してコラーゲン原線維レムナントを除去するステップと、上清を単離するステップと、上清を遠心分離して固形物を単離するステップと、固形物を担体中に懸濁させ、それにより、ＭＢＶを細胞外マトリックスから単離するステップとを含む。
【０１０３】
塩類溶液中でインキュベートした後、ＥＣＭを遠心分離してコラーゲン原線維を除去する。一部の実施形態では、消化されたＥＣＭを約２０００ｇ〜約５０００ｇで遠心分離することもできる。したがって、消化されたＥＣＭを約２，５００ｇ〜約４，５００ｇで、例えば、約２，５００ｇ、約３，０００ｇ、３，５００、約４，０００ｇ、または約４，５００ｇで遠心分離することができる。特定の非限定的な一例では、遠心分離を約３，５００ｇで行う。この遠心分離は、約２０〜約４０分にわたって、例えば、約２５〜約３５分にわたって、例えば、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０分、約３１、約３２、約３３、約３４または約３５分にわたって行うことができる。次いで、上清を収集する。
【０１０４】
追加的な実施形態では、次いで、上清を、第３のステップとして、約１００，０００〜約１５０，０００ｇで遠心分離することができる。したがって、消化されたＥＣＭを、約１００，０００ｇ〜約１２５，０００ｇで、例えば、約１００，０００ｇ、１１０，０００ｇまたは１２０，０００ｇで遠心分離することができる。この遠心分離は、約３０分〜約２．５時間にわたって、例えば、約１時間〜約３時間にわたって、例えば、約３０分、約４５分、約６０分、約９０分、または約１２０分（２時間）にわたって行うことができる。固形物を収集し、緩衝生理食塩水などの溶液中に懸濁させ、それにより、ＭＢＶを単離する。
【０１０５】
さらに他の実施形態では、ＥＣＭを、これだけに限定されないが、リン酸緩衝食塩水などの等張緩衝塩類溶液中に懸濁させる。遠心分離または他の方法を使用して大きな粒子を除去することができる（以下を参照されたい）。次いで、限外濾過を利用して、ＭＢＶをＥＣＭから単離し、粒子は、約１０ｎｍから約１０，０００ｎｍの間、例えば、約１０から約１，０００ｎｍの間、例えば、約１０ｎｍから約３００ｎｍの間である。
【０１０６】
特定の非限定的な例では、等張緩衝食塩溶液は約０．１６４ｍＭの総塩濃度および約７．２〜約７．４のｐＨを有する。一部の実施形態では、等張緩衝食塩溶液は、０．００２ＭのＫＣｌ〜約０．１６４ＭのＫＣＬ、例えば、約０．００２７ＭのＫＣｌを含む（リン酸緩衝食塩水中のＫＣＬの濃度）。次いで、この懸濁液を超遠心分離によって処理する。
【０１０７】
等張緩衝塩類溶液中でインキュベートした後、ＥＣＭを遠心分離してコラーゲン原線維を除去する。一部の実施形態では、消化されたＥＣＭを約２０００ｇ〜約５０００ｇで遠心分離することもできる。したがって、消化されたＥＣＭを約２，５００ｇ〜約４，５００ｇで、例えば、約２，５００ｇ、約３，０００ｇ、３，５００、約４，０００ｇ、または約４，５００ｇで遠心分離することができる。特定の非限定的な一例では、遠心分離を約３，５００ｇで行う。この遠心分離は、約２０〜約４０分にわたって、例えば、約２５〜約３５分にわたって、例えば、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０分、約３１、約３２、約３３、約３４または約３５分にわたって行うことができる。
【０１０８】
高分子量材料を懸濁液から除去するために精密濾過と遠心分離とを使用し、組み合わせることができる。一実施形態では、精密濾過を使用して２００ｎｍを超えるものなどのサイズが大きな分子材料を除去する。別の実施形態では、遠心分離を使用することによってサイズが大きな材料を除去する。第３の実施形態では、精密濾過および超遠心分離の両方を使用して、高分子量材料を除去する。約１０，０００ｎｍよりも大きい、約１，０００ｎｍよりも大きい、約５００ｎｍよりも大きい、または約３００ｎｍよりも大きい材料などの高分子量材料を懸濁ＥＣＭから除去する。
【０１０９】
次いで、精密濾過の流出液、または上清を限外濾過に供する。したがって、約１０，０００ｎｍ未満、約１，０００ｎｍ未満、約５００ｎｍ未満、または約３００ｎｍ未満の粒子を含む流出液を収集し、利用する。次いで、この流出液を、分画分子量（ＭＷＣＯ）が３，０００〜１００，０００である膜を用いた限外濾過に供する。実施例では１００，０００ＭＷＣＯを使用した。
対象を処置するための方法
【０１１０】
本開示の方法は、対象にＩＬ−３３を含有するＭＢＶの治療有効量を投与し、それにより、対象を処置し、対象における疾患または障害を阻害するステップを含む。一部の実施形態では、方法により、疾患または障害を防止する。
【０１１１】
非限定的な一実施形態では、疾患または障害は、臓器または組織の線維症である。例えば、線維症は、肝硬変、肺線維症、心臓線維症、縦隔線維症、関節線維症、骨髄線維症、腎性全身性線維症、ケロイド線維症、強皮症線維症（ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、腎線維症、リンパ組織線維症、動脈線維症、毛細血管線維症、血管線維症、または膵線維症である。一実施形態では、線維症は肺線維症である。線維症は、特発性肺線維症、疾患もしくは環境毒素への曝露に起因する肺線維症、または放射線により誘発される肺線維症を含み得る。さらに別の実施形態では、線維症は、心臓線維症である。心臓線維症は、反応性間質性線維症、置換性線維症、浸潤性線維症、または心内膜心筋線維症を含み得る。一実施形態では、線維症は、急性または慢性臓器拒絶に関連する。例えば、一実施形態では、線維症は、移植された心臓の急性または慢性拒絶に関連する心臓線維症である。
【０１１２】
別の非限定的な実施形態では、疾患または障害は、心疾患または障害である。一実施形態では、疾患または障害は、心筋梗塞ではない心疾患または障害である。別の実施形態では、心疾患または障害は、心筋虚血ではない心疾患または障害である。さらに別の実施形態では、心疾患または障害は、心筋梗塞でも心筋虚血でもない心疾患または障害である。一実施形態では、疾患または障害は、心筋梗塞または心筋虚血である。一実施形態では、心疾患または障害は、心筋梗塞、心筋虚血、急性冠状動脈症候群、慢性安定狭心症、不安定狭心症、血管形成術、一過性脳虚血発作、虚血性再灌流傷害、跛行、血管閉塞、動脈硬化症、心不全、慢性心不全、急性非代償性心不全、心肥大、大動脈弁疾患、大動脈弁または僧帽弁狭窄症、心筋症、心房細動、心不整脈、および心膜疾患から選択される。一実施形態では、心疾患または障害は、急性冠状動脈症候群、慢性安定狭心症、不安定狭心症、血管形成術、一過性脳虚血発作、虚血性再灌流傷害、跛行、血管閉塞、動脈硬化症、心不全、慢性心不全、急性非代償性心不全、心肥大、大動脈弁疾患、大動脈弁または僧帽弁狭窄症、心筋症、心房細動、心不整脈、および心膜疾患から選択される。さらに別の実施形態では、疾患は、急性冠状動脈症候群、慢性安定狭心症、不安定狭心症、血管形成術、一過性脳虚血発作、跛行、血管閉塞、動脈硬化症、心不全、心肥大、および心筋症である。さらに別の実施形態では、疾患は、心筋梗塞、心筋虚血、急性冠状動脈症候群、慢性安定狭心症、不安定狭心症、血管形成術、一過性脳虚血発作、跛行、血管閉塞、動脈硬化症、心不全、心肥大、および心筋症である。
【０１１３】
さらに別の非限定的な実施形態では、疾患または障害は、実質臓器移植片拒絶である。一実施形態では、移植された実質臓器は、肝臓、腎臓、心臓、皮膚、肺、膵臓、または腸である。一実施形態では、移植された実質臓器は肺である。別の実施形態では、移植された実質臓器は心臓である。一実施形態では、移植片拒絶は慢性臓器移植片拒絶である。別の実施形態では、移植片拒絶は急性臓器移植片拒絶である。
【０１１４】
さらに別の非限定的な実施形態では、疾患または障害は、移植された組織、例えば、心臓弁、血管、骨、角膜、または顔、手、もしくは指を含めた複合組織の同種異系移植片の拒絶である。
【０１１５】
心疾患もしくは障害、実質臓器移植片拒絶、または臓器もしくは組織の線維症などの疾患または障害を有するまたはそれが発生するリスクがある対象を、膜に結合したＳＴ２を通じたＩＬ−３３シグナル伝達を増大させることによって処置することができる。参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００８／０００３１９９Ａ１号を参照されたい。ＭＢＶはＩＬ−３３を含み、したがって、これらの対象に対して使用することができることが本明細書に開示される。膜封入型ＩＬ−３３を含有するＭＢＶの使用により、ＩＬ−３３のＳＴ２受容体への結合が妨げられ、炎症促進性キナーゼカスケードの誘導が軽減される。一部の非限定的な例では、ナノ小胞は、対象におけるマクロファージにおいてＣＤ６８およびＣＤ１１ｂの発現を維持する。
【０１１６】
ＩＬ−３３は、ＭＢＶの内腔中に安定に存在する。ＭＢＶ内に封入されたＩＬ−３３は、ＭＢＶの細胞内取り込み後に古典的なＳＴ２受容体シグナル伝達経路をバイパスして、免疫細胞分化および／または機能を方向付ける。
【０１１７】
一部の実施形態では、対象を、開示される方法を使用して処置することができ、この場合、対象は、心疾患または障害を有することがすでに診断されている（本明細書に提示される方法および／または当技術分野で公知の方法を用いて）対象、ならびに今後のある時点で心疾患または障害に罹患するリスクがあるとみなされる対象を含め、心疾患または障害を有するまたはそれが発生するリスクがある。この後者の対象の群は、心血管イベントに罹患するリスクがある対象を含む。さらなる実施形態では、心疾患は心筋梗塞でも心筋虚血でもない。他の実施形態では、障害は、心臓線維症および／または心不全である。一実施形態では、障害は、心不全である。
【０１１８】
方法および組成物は、任意の心疾患または障害の急性、慢性、および予防的処置において有用である。本明細書で使用される場合、急性処置は、虚血性イベントなどの特定の疾患または障害を現在有する対象の処置を指す。予防的処置は、疾患または障害を有するリスクがあるが、現在は疾患または障害を有さないまたはその症状を経験していない対象の処置を指す。処置を必要とする対象が特定の心疾患または障害を有する場合、心疾患または障害を処置することとは、疾患もしくは障害またはその疾患もしくは障害から生じる１つもしくは複数の症状を好転させる、低減するまたは排除することを指す。処置を必要とする対象が、心疾患または障害が発生するリスクがある対象である場合、対象を処置することとは、疾患または障害が発生する対象のリスクを低減することを指す。
【０１１９】
移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を防止または処置するための方法が本明細書に開示される。したがって、ＧＶＨＤまたはＧＶＨＤのリスクを有する対象を処置のために選択することができる。ＧＶＨＤは急性であっても慢性であってもよい。
【０１２０】
一部の実施形態では、実質臓器移植などの移植された臓器のレシピエントである対象を処置する。移植された臓器の例としては、腎臓、皮膚、肝臓、複合組織の同種異系移植片（ＣＴＡ；顔、手、肢、陰茎などのものを含む）または心臓を含めた実質臓器移植片が挙げられる。腎移植は実質臓器移植のおよそ６０％を占め、その次に、肝臓移植が２１％、心臓が８％、肺が４％であり、残りの７％は膵臓および腸などの他の臓器移植が占める。（ＯＰＴＮ／ＳＲＴＲ  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  ２００４）。臓器の型は特に限定されず、心臓、肝臓、腎臓、膵臓、肺、および小腸などの実質性臓器を含む。しかし、開示される方法は、心臓弁、血管、皮膚、骨、および角膜の移植にも適用可能である。したがって、任意の型の臓器移植を受けた対象を処置のために選択することができる。移植は実質臓器移植であり得る。実質臓器は心臓であり得る。ＭＢＶは、移植時に、または移植手順後、例えば、移植の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０日後に投与することができる。一部の非限定的な例では、ＭＢＶを移植片に直接投与することができる。
【０１２１】
実質臓器移植の急性または慢性拒絶などの拒絶を抑制するための方法が開示される。本発明の抑制剤によって抑制される拒絶の型は特に限定されないが、実際の移植医療が問題になる急性拒絶であってよい。これらの拒絶は、同種異系移植片が、組織適合性を決定する主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）の違いに起因して外来抗原と認識され、したがって、レシピエントの細胞傷害性Ｔ細胞およびヘルパーＴ細胞の活性化を通じて攻撃される病理学的状態である。急性拒絶は、一般に移植の３カ月以内に発生する。しかし、拒絶は、移植の３カ月後またはそれよりも後の同種異系移植片組織への細胞浸潤と認識することもできる。開示される方法は、移植の３カ月以内または移植の３カ月後を含めた移植後の任意の時点で有用である。一部の実施形態では、方法により、損傷が抑制されることにより、移植された臓器の生存能力が改善される。
【０１２２】
さらに別の実施形態では、対象は、線維症関連疾患を有するまたは有するリスクがある。ＭＢＶの治療有効量を使用して線維症を低減するための方法も提供される。そのような方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うこともでき、ｉｎ  ｖｉｖｏで行うこともできる。本明細書で使用される場合、「接触させること」は、ＭＢＶなどの作用物質を、１つもしくは複数の細胞と直接相互作用するように、または間接的に、１つもしくは複数の細胞が結果として何らかの方法で影響を受けるように置くことを指す。方法をｉｎ  ｖｉｖｏで行う場合、対象にＭＢＶを線維症の低減に有効な量で投与する。さらなる実施形態では、開示される方法により、線維症が生じている組織または臓器に対してネイティブな解剖学的に適当な細胞が増加する。
【０１２３】
心臓線維症の場合では、対象にＭＢＶを線維症の低減および／または心筋細胞（ｃａｒｄｉａｃ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌ）の増加に有効な量で投与する。ネイティブな細胞の成長または線維症の低減を評価するための方法は、当業者には容易に明らかである。したがって、線維症関連疾患を有するまたはそれが発生するリスクがある対象もＭＢＶを投与することによって処置することができる。特定の非限定的な実施形態では、線維症を処置するための方法が提供される。それらとしては、これだけに限定されないが、肝硬変、肺線維症、心臓線維症、縦隔線維症、関節線維症、骨髄線維症、腎性全身性線維症、ケロイド線維症、強皮症線維症、腎線維症、リンパ組織線維症、動脈線維症、毛細血管線維症、血管線維症、または膵線維症が挙げられる。特定の非限定的な例では、障害は、間質性肺線維症または職業性曝露によって誘発される線維症などの肺の線維症である。
【０１２４】
一部の実施形態では、肺の処置のために、ＭＢＶを含む組成物を吸入用調製物を使用して投与することができる。これらの吸入用調製物は、エアロゾル、粒子などを含み得る。一般に、吸入用の粒子サイズの目標は、当該医薬が吸収のために肺の肺胞領域に到達するように、約１μｍまたはそれ未満である。しかし、肺内の沈着領域を調整するために粒子サイズを改変することができる。したがって、呼吸細気管支および気腔内への沈着を実現するために、より大きな粒子を利用することができる（例えば、直径約１〜約５μｍなど）。
【０１２５】
吸入による投与のために、組成物を、適切な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切な気体を使用し、加圧されたパックまたはネブライザーからのエアロゾル噴霧提示の形態で都合よく送達することができる。加圧されたエアロゾルの場合では、計量量（ｍｅｔｅｒｅｄ  ａｍｏｕｎｔ）を送達するための弁を提供することによって投薬単位を決定することができる。化合物および適切な粉末基剤（ラクトースおよびデンプンなど）の粉末ミックスを含有する、吸入器または吹き入れ器に使用するためのカプセルおよびカートリッジを製剤化することができる。
【０１２６】
別の実施形態では、ＭＢＶと併せて、抗炎症剤、気管支拡張薬、酵素、去痰薬、ロイコトリエンアンタゴニスト、ロイコトリエン形成阻害剤、または肥満細胞安定剤などの追加的な薬剤の治療有効量を投与する。これらは、例えば単一の製剤として同時に投与することもでき、逐次的に投与することもできる。
【０１２７】
処置の効果は、当業者に公知の方法によって肺機能をモニタリングすることにより測定することができる。例えば、肺機能に関する種々の測定可能なパラメーターを、処置前、処置中、または処置後に試験することができる。肺機能は、これだけに限定されないが、吸気流速、呼気流速、および肺容量を含めた、いくつかの物理的に測定可能な肺の働きのいずれかを試験することによってモニタリングすることができる。数式および統計学的方法によって決定される、これらのパラメーターの１つまたは複数の統計的に有意な増加により、処置の有効性が示される。
【０１２８】
診療で最も一般的に使用される肺機能の測定方法は、特定のパラメーターを測定するための吸気および呼気に関する動作の時限測定を伴う。例えば、ＦＶＣにより、患者が最初に深く吸い込んだところから力強く吐き出したリットル単位の総体積を測定する。このパラメーターをＦＥＶ１と併せて評価することにより、気管支収縮を定量的に評価することが可能になる。当業者に周知の数式によって決定されるＦＶＣまたはＦＥＶ１の統計的に有意な増加は気管支収縮の減少を反映し、それにより、治療が有効であることが示される。
【０１２９】
努力肺活量の決定に伴う問題は、努力肺活量に関する動作（すなわち、最大吸気から最大呼気までの努力呼出）が大きく技法依存的であることである。言い換えれば、所与の対象により、一連の連続したＦＶＣ動作の間に異なるＦＶＣ値が生じ得る。努力呼出動作の中点にわたって決定されるＦＥＦ  ２５〜７５または努力呼気流量は、ＦＶＣよりも技法依存性が低い傾向がある。同様に、ＦＥＶ１はＦＶＣよりも技法依存性が低い傾向がある。したがって、当業者に周知の数式によって決定されるＦＥＦ  ２５〜７５またはＦＥＶ１の統計的に有意な増加は気管支収縮の減少を反映し、それにより、治療が有効であることが示される。
【０１３０】
吐き出された空気の体積を肺機能の指標として測定することに加えて、呼気性周期の種々の部分にわたって測定される１分当たりのリットル単位の流量が、患者の肺機能の状態を決定することにおいて有用であり得る。具体的には、努力最大呼出中の最も高い１分当たりのリットル単位の空気流速度として取得されるピーク呼気流量が喘息および他の呼吸器疾患を有する患者の全体的な肺機能とよく相関する。したがって、投与後の、当業者に周知の数式によって決定されるピーク呼気流量の統計的に有意な増加により、治療が有効であることが示される。
【０１３１】
一部の実施形態では、心疾患もしくは障害または線維症関連疾患、または移植片拒絶の診断をすでに受けており、それを処置するための別の治療剤を用いた処置の過程中にある対象を、処置のために選択する。治療剤は、化学的薬剤であっても生物学的薬剤であってもよく、また、食事および／または運動などの薬物によらない処置であってもよい。一部の実施形態では、治療剤（心疾患または障害に対するもの）は、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）のレベルを低下させる治療剤の使用を含む。他の実施形態では、治療剤（心疾患または障害に対するもの）は、スタチンの使用を含む。さらなる実施形態では、ＣＲＰレベルが１ｍｇ／Ｌを超える対象を、処置のために選択する。治療剤は、例えば、移植片拒絶を処置する場合には免疫抑制剤（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）であり得る。例えば、線維症関連疾患に対する治療は、抗炎症剤または免疫抑制剤の使用であり得る。
【０１３２】
一部の実施形態では、例えば心筋梗塞などの一次（第１の）心血管イベントを有するまたは血管形成術を受けた対象を、開示される方法を用いた処置のために選択する。一次心血管イベントを有したことがある対象は、二次（第２の）心血管イベントのリスクが上昇している。一部の実施形態では、対象は、一次心血管イベントを有したことがないが、対象が１つまたは複数の危険因子を有することが原因で心血管イベントを有するリスクが上昇している。一次心血管イベントの危険因子の例としては、高脂血症、肥満症、糖尿病、高血圧症、高血圧前症、全身性炎症のマーカーのレベル（複数可）の上昇、年齢、心血管イベントの家族歴および喫煙が挙げられる。心血管イベントのリスクの度合いは、対象が有する危険因子の数の多さおよび重症度または大きさに依存する。対象における心血管イベントのリスクを危険因子の存在および重症度に基づいて評価するためにリスクチャートおよび予測アルゴリズムが利用可能である。１つのそのような例は、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ  Ｈｅａｒｔ  Ｓｔｕｄｙリスク予測スコアである。対象の１０年算出Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ  Ｈｅａｒｔ  Ｓｔｕｄｙリスクスコアが５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％を超えるまたはそれよりも大きい場合、対象は心血管イベントを有するリスクが上昇している。対象における心血管イベントのリスクを評価するための別の方法は、ＣＲＰなどの全身性炎症のマーカーのレベルの測定値をＦｒａｍｉｎｇｈａｍ  Ｈｅａｒｔ  Ｓｔｕｄｙリスク予測スコアに組み入れる、全般リスクスコアである。対象における心血管イベントのリスクを評価する他の方法としては、冠動脈カルシウムスキャニング、心臓磁気共鳴画像法および／または磁気共鳴血管造影が挙げられる。一部の実施形態では、開示される方法を用いた処置のために選択される対象は、一次心血管イベントを有し、１つまたは複数の他の危険因子を有する。別の実施形態では、対象は、脂質レベルを低下させるためにスタチンによる治療中である。別の実施形態では、対象は、健康な脂質レベルを有する（すなわち、対象は高脂血症ではない）。したがって、一実施形態では、患者に心疾患または障害が発生することを防止するまたは発生するリスクを低減するために、患者にＭＢＶを本発明の方法に従って投与する。言い換えれば、ＭＢＶを患者に、心疾患または障害に対する予防法として投与する。そのような例では、患者は、心疾患または障害の１つまたは複数の危険因子を示していることが原因で予防法を必要としているが、患者は、まだ心疾患もしくは障害と診断されていない、または心疾患もしくは障害の診断に必要な全ての症状を示していない。一部の実施形態では、脳卒中を有しているまたは有していた対象を、処置のために選択する。脳卒中（本明細書では虚血性脳卒中および／または脳血管虚血とも称される）は、Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎにより、限局性または全般的な大脳機能障害の臨床徴候が急速に発生しており、症状が少なくとも２４時間続くことと定義される。脳卒中は、血管に起因する影響以外の明らかな原因がない場合には死亡にも関��付けられる。脳卒中は、一般には、脳への血管または脳内の血管の遮断または閉塞によって引き起こされる。完全に閉塞すると、数秒以内に大脳循環の停止によりニューロン電気的活動の休止が引き起こされる。エネルギー状態およびイオン恒常性が悪化して数分以内に、高エネルギーリン酸塩の枯渇、膜イオンポンプ機能停止、細胞内カリウムの流出、塩化ナトリウムおよび水の流入、ならびに膜脱分極が起こる。閉塞が５〜１０分よりも長く持続すると、不可逆的な損傷がもたらされる。しかし、不完全な虚血では、転帰を評価することは難しく、転帰は残留している灌流および酸素の利用可能性に大きく依存する。大脳血管の血栓性閉塞後に虚血が完全になることはめったにない。側副血行および局所的灌流圧に応じて、いくらかの残留する灌流が通常は虚血領域において持続する。開示される方法は、脳卒中の処置に有用である。
【０１３３】
虚血性イベントは血管系のどこでも起こり得るが、頸動脈分岐部および内頸動脈の起点が、脳虚血をもたらす大脳血管の血栓性閉塞の発生頻度が最も高い部位である。狭窄症または血栓症に起因する血流の減少の症状は、中大脳動脈疾患によって引き起こされる症状と同様である。眼動脈を通る血流は一過性黒内障または一過性単眼盲が生じるのに十分に影響を受けることが多い。重症両側性内頸動脈狭窄症の結果、大脳半球の低灌流が生じ得る。これは、急性に虚血した半球と同側の急性頭痛と共に顕在化する。血流の閉塞または減少の結果として前交通動脈より遠位の１つの前大脳動脈の虚血が伴い、それにより、反対側の脚、および、頻度は低いが近位の腕に運動感覚および皮質感覚の症状が生じる。前大脳動脈の閉塞または不十分な灌流の他の顕在化は、歩行失調および時には傍矢状前頭葉の損傷に起因した尿失禁を含む。自発語の減少として顕在化する言語障害が全身性の精神運動活動の低下に関連し得る。
【０１３４】
脳卒中を有する対象は、経験する症状によって、および／またはＣＴおよびＭＲイメージングなどの介入的および非介入的診断ツールを含めた身体検査によって脳卒中と診断される。脳卒中を有する対象は、以下の症状の１つまたは複数を示し得る：麻痺、衰弱、感覚および／または視覚の低下、しびれ、刺痛、失語症（例えば、話すことができないことまたは不明瞭発語、読み書きの困難）、失認（すなわち、知覚刺激を認識または識別することができないこと）、記憶喪失、協調困難、嗜眠、眠気または意識消失、排尿調節または排便調節の欠如、および認知機能低下（例えば、認知症、注意持続時間の限定、集中できないこと）。医用画像技法を使用すると、脳卒中を有する対象を、梗塞を有する対象また脳内出血を有する対象として同定することが可能であり得る。
【０１３５】
提供される組成物および方法は、脳卒中を経験した患者に使用することもでき、脳卒中を防止するための予防的処置とすることもできる。塞栓の放出、血圧の低下または脳への血流の減少のリスクがある外科的または診断的手順を有する対象に対して、手順の結果として生じる任意の虚血性イベントに起因する傷害を低減するために、短期予防的処置が指示される。脳への血流の減少が導かれる恐れがある心臓の状態、または脳脈管構造に直接影響を及ぼす状態を有する対象に対しては長期または慢性予防的処置が指示される。予防的なものである場合、上記の通り、処置は、虚血性脳卒中のリスクがある対象に対するものである。対象が脳卒中を経験している場合、処置は、急性処置を含み得る。脳卒中の対象に対する急性処置とは、状態の症状の発症時もしくは発症の４８時間以内、好ましくは状態の症状の発症の２４時間以内、より好ましくは１２時間以内、より好ましくは６時間以内、なおより好ましくは１、２もしくは３時間以内、または診断時すぐに、または医療関係者により脳卒中が生じたことが疑われた時に本発明の組成物を投与することを意味する。
【０１３６】
さらに他の実施形態では、対象は、心筋梗塞を有するまたは心筋梗塞を有するリスクがある対象であり得る。「心筋梗塞を有する」とは、対象が心筋梗塞を現在有しているまたは罹患したことがあることを意味する。一部の実施形態では、投与は、心血管イベント、または心疾患もしくは障害の診断もしくは疑いの前（やがて疑われるもしくは診断される場合）、または４８時間以内に行われるが、心血管イベント、または心疾患もしくは障害の診断もしくは疑いの後、例えば、その後１４日以内の投与が対象に有益な場合もある。即時投与は、心血管イベントまたは心疾患もしくは障害の診断または疑いから１５、２０、３０、４０もしくは５０分以内、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１８、２０もしくは２２時間以内または１もしくは２日以内の投与も含み得る。さらに別の実施形態では、ＩＬ−３３を含有するＭＢＶを、心血管イベントまたは心疾患もしくは障害の診断または疑い時またはその直後に開始して、数日間、１週間または数週間（例えば、１、２、３または４週間）にわたって投与することができる。
【０１３７】
心筋梗塞を診断するためのいくつかの臨床検査が当技術分野で周知である。一般に、検査は、４つの主要なカテゴリーに分けることができる：（１）組織壊死および炎症の非特異的指標、（２）心電図、（３）血清中酵素の変化（例えば、クレアチンホスホキナーゼレベル）および（４）心臓イメージング。当業者は、対象が心筋梗塞のリスクを有するか、それに罹患しているか、またはそれに罹患したことがあるかを決定するために前述の検査のいずれかを容易に適用することができる。
【０１３８】
対象は、心不全を有し得る。心不全は、心臓のポンプ機能障害という共通因子によって結び付けられた多様な病因の臨床的症候群であり、心臓が、代謝を行う組織の要求と釣り合うように血液を送り出すことができないまたは充満圧の上昇によってしか血液を送り出すことができないことを特徴とする。
【０１３９】
さらに他の実施形態では、対象は、心肥大を有する。この状態は、一般には、明白な先立つ原因を伴わない、通常は非拡張房室（ｎｏｎｄｉｌａｔｅｄ  ｃｈａｍｂｅｒ）の左室肥大を特徴とする。現行の診断方法は心電図および心エコー図を含む。しかし、多くの患者は無症候であり、疾患が分かっている患者の親類であり得る。残念ながら、この疾患の最初の顕在化は突然死であり得、これは小児および若年成人において、多くの場合、労作中または労作後に頻繁に起こる。
【０１４０】
別の実施形態では、対象は、心疾患もしくは障害またはそれらのリスクのマーカーのレベルが上昇している。マーカーは、例えば、コレステロール、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬＣ）または全身性炎症のマーカーであり得る。マーカーのレベル（複数可）の上昇は、レベルが健康な対象集団（例えば、心疾患または障害の徴候および症状を有さないヒト対象）の平均を超えているレベルである。マーカーがＣＲＰである場合、ＣＲＰレベル＞１がレベルの上昇とみなされる。
【０１４１】
線維症を有する対象を選択することができる。一部の実施形態では、対象は、肝硬変、肺線維症、心臓線維症、縦隔線維症、関節線維症、骨髄線維症、腎性全身性線維症、ケロイド線維症、強皮症線維症、腎線維症、リンパ組織線維症、動脈線維症、毛細血管線維症、血管線維症、または膵線維症と診断されている。これだけに限定されないが、シリカ、アスベスト、ベリリウム、炭塵、またはボーキサイトを含めた無機粒子に曝露している、または曝露するリスクがある対象を処置のために選択することができる。間質性肺線維症を有する対象を処置のために選択することができる。心臓線維症を有する対象を処置のために選択することができる。開示される方法を使用して、対象における線維症を処置または阻害することができる。
【０１４２】
医薬組成物は、ＭＢＶ、および必要に応じて１つまたは複数の追加的な作用物質を含み得る。これらの組成物は、対象に投与するため、または疾患過程を遅延させる、防止する、発生リスクを低減する、もしくは処置する、もしくは低減するために、様々なやり方で製剤化することができる。本明細書に記載の組成物は、組成物により最初の病変の転移が防止されるような適用のために製剤化することもできる。一部の実施形態では、組成物を心臓内投与などの局所投与のために製剤化する。局所投与は、移植片に対し、対象への移植前および／または移植後になされるものであり得る。ＭＢＶは、非経口投与、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮内、腹腔内、胸骨内、もしくは関節内注射もしくは注入、または舌下、経口、局部、鼻腔内、もしくは経粘膜投与によるもの、または肺への吸入によるものを含めた任意の経路によって投与することができる。適当な投与経路は医師が選択することができる。ＭＢＶを含む医薬組成物は、局所使用および全身使用のどちらのためにも製剤化することができ、ヒト医学または獣医学において使用するために製剤化することができる。一部の実施形態では、組成物を注射またはカテーテルによって投与することができる。投与は静脈内または筋肉内であり得る。
【０１４３】
開示された組成物を１回または繰り返し投与することができる。開示された組成物を局所的にまたは全身的に投与することができる。開示された組成物を点滴注入などの静脈内注射、皮下注射、局所投与または任意の他の経路により、月に１回から数回、例えば、週に２回、週に１回、２週間毎に１回、または４週間毎に１回、投与することができる。毎日、週２回、毎週、月２回または毎月などの定義された時間間隔にわたってなど、複数の処置が構想される。投与スケジュールは、例えば、週に２回または週に１回の投与間隔を２週間毎に１回、３週間毎に１回、または４週間毎に１回に延ばすことによって調整することができる。一部の実施形態では、方法は、移植後の臓器機能および／または血液検査値の変化をモニタリングするステップを含む。組成物を対象に臓器移植前、臓器移植時、または臓器移植後に投与することができる。投与は、疾患の抑制または防止が望まれる任意のときに、例えば、対象のある特定の年齢で、または実質臓器移植を受けた後に開始することができる。
【０１４４】
本開示の方法および組成物は一般にはヒト対象を処置するために使用されるが、他の霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシなどの他の脊椎動物における同様または同一の疾患を処置するためにも使用することができる。適切な投与フォーマットは、医療実践者により、各対象に対して個別に最良に決定され得る。種々の薬学的に許容される担体およびそれらの製剤は、標準の製剤専門書、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｂｙ  Ｅ．  Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎに記載されている。Ｗａｎｇ，  Ｙ．  Ｊ．  ａｎｄ  Ｈａｎｓｏｎ，  Ｍ．  Ａ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｎｏ．  １０，  Ｓｕｐｐ．  ４２：  ２Ｓ，  １９８８も参照されたい。医薬組成物の剤形は、選択される投与形式によって決定される。一部の実施形態では、対象はヒトであり、ＭＢＶはヒト組織由来である。
【０１４５】
一部の実施形態では、開示された組成物を心臓移植片などの目的の患部領域または組織における細胞に局所投与した場合、開示された組成物により、筋肉細胞増殖が増加し、および／または炎症が低減する。
【０１４６】
ＭＢＶ（ＥＣＭ由来ナノ小胞）を例えば注射または注入用の非経口用組成物として提供する場合、一般に、水性担体、例えば、ｐＨ約３．０〜約８．０、好ましくはｐＨ約３．５〜約７．４、例えば、約７．２〜約７．４の等張性緩衝液に懸濁させる。有用な緩衝液としては、クエン酸ナトリウム−クエン酸およびリン酸ナトリウム−リン酸、および酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液が挙げられる。
【０１４７】
調製物の治療有効量が注射または送達後長時間または数日にわたって血流中に送達されるように持続性または「デポ」緩徐放出調製物の形態を使用することができる。持続放出組成物の適切な例としては、適切なポリマー材料（例えば、成形品、例えば、フィルムもしくはマイクロカプセルの形態の半透性ポリマーマトリックスなど）、適切な疎水性材料（例えば、許容される油中エマルションなど）またはイオン交換樹脂、およびやや難溶性の誘導体（例えば、やや難溶性の塩など）が挙げられる。持続放出製剤は経口的に、直腸に、非経口的に、大槽内に（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌｙ）、膣内に、腹腔内に、局部的に（散剤、軟膏剤、ゲル剤、滴剤または経皮吸収パッチとして）、頬側に、または経口もしくは鼻スプレーとして投与することができる。医薬組成物は、生分解性ポリマーならびに／または多糖ゼリー化および／もしくは生体接着性ポリマー、両親媒性ポリマー、粒子の界面特性を改変する作用物質、ならびに薬理活性のある物質を含む粒子の形態であってよい。これらの組成物は、活性物質の制御放出を可能にするある特定の生体適合性特色を示す。米国特許第５，７００，４８６号を参照されたい。
【０１４８】
開示される方法において有用な薬学的に許容される担体および賦形剤は、従来のものである。例えば、非経口製剤は、通常、例えば水、生理的食塩水、他の平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどの、薬学的および生理的に許容される流体ビヒクルである注射液を含む。含めることができる賦形剤は、例えば、ヒト血清アルブミンまたは血漿調製物などのタンパク質である。所望であれば、投与される医薬組成物は、微量の無毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートも含有し得る。そのような剤形の実際の調製方法は公知である、または当業者には明らかになる。
【０１４９】
投与されるＭＢＶの量は、処置される対象、病気の重症度、および投与様式に依存し、処方する臨床医の判断に委ねることが最良である。これらの縛りの中で、投与される製剤は、ある量のＭＢＶを処置される対象において所望の効果を実現するために有効な量で含有する。
【０１５０】
正確な用量は、当業者により、特定の画分の効力、対象の年齢、体重、性別および生理的状態に基づいて容易に決定される。適切な濃度としては、これだけに限定されないが、約１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｇｒ／ｍｌが挙げられる。
【０１５１】
処置することを必要とする対象を処置するための本明細書に提示される方法は、追加的な治療剤の使用を含み得る。ＭＢＶを含む組成物は、追加的な治療剤も含み得る。そのような追加的な治療剤としては、抗脂血症薬、抗炎症剤、抗血栓剤、線維素溶解剤、抗血小板剤、直接トロンビン阻害剤、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体阻害剤、細胞接着分子に結合し、白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）のそのような分子に付着する能力を阻害する薬剤（例えば、抗細胞接着分子抗体）、アルファ−アドレナリン作動性遮断薬、ベータ−アドレナリン作動性遮断薬、シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤、アンジオテンシン系阻害剤、抗不整脈薬、カルシウムチャネル遮断薬、利尿薬、強心薬、血管拡張薬、昇圧剤、チアゾリジンジオン、カンナビノイド−１受容体遮断薬、免疫抑制剤およびこれらの任意の組合せが挙げられる。
【０１５２】
抗脂血症薬は、総コレステロールを減少させる、ＬＤＬＣを減少させる、トリグリセリドを減少させる、および／またはＨＤＬＣを増加させる薬剤である。抗脂血症薬としては、スタチン、非スタチン抗脂血症薬およびこれらの組合せが挙げられる。スタチンは、ヒト総コレステロール、ＬＤＬＣおよびトリグリセリドレベルの低下に有効であることが示された医薬のクラスである。スタチンは、コレステロール合成のステップで作用する。スタチンは、細胞により合成されるコレステロールの量を減少させることにより、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子の阻害を通じて、肝細胞によるＬＤＬＣの取り込みの増加を完結させるイベントのサイクルを開始させる。ＬＤＬＣの取り込みが増加すると、血液中の総コレステロールおよびＬＤＬＣレベルが低下する。両方の因子の血中レベルが低いことは、アテローム性動脈硬化症および心臓病のリスクが低いことに関連付けられ、スタチンはアテローム硬化症の罹患率および死亡率を低下させるために広く使用されている。
【０１５３】
スタチンとの例としては、これだけに限定されないが、シンバスタチン（ＺＯＣＯＲ（登録商標））、ロバスタチン（ＭＥＶＡＣＯＲ（登録商標））、プラバスタチン（ＰＲＡＶＡＣＨＯＬ（登録商標））、フルバスタチン（ＬＥＳＣＯＬ（登録商標））、アトルバスタチン（ＬＩＰＩＴＯＲ（登録商標））、セリバスタチン（ＢＡＹＣＯＬ（登録商標））、ロスバスタチン（ＣＲＥＳＴＯＲ（登録商標））、ピタバスタチン（ｐｉｔｉｖａｓｔａｔｉｎ）ならびに米国特許第４，４４４，７８４号；米国特許第４，２３１，９３８号；米国特許第４，３４６，２２７号；米国特許第４，７３９，０７３号；米国特許第５，２７３，９９５号；米国特許第５，６２２，９８５号；米国特許第５，１３５，９３５号；米国特許第５，３５６，８９６号；米国特許第４，９２０，１０９号；米国特許第５，２８６，８９５号；米国特許第５，２６２，４３５号；米国特許第５，２６０，３３２号；米国特許第５，３１７，０３１号；米国特許第５，２８３，２５６号；米国特許第５，２５６，６８９号；米国特許第５，１８２，２９８号；米国特許第５，３６９，１２５号；米国特許第５，３０２，６０４号；米国特許第５，１６６，１７１号；米国特許第５，２０２，３２７号；米国特許第５，２７６，０２１号；米国特許第５，１９６，４４０号；米国特許第５，０９１，３８６号；米国特許第５，０９１，３７８号；米国特許第４，９０４，６４６号；米国特許第５，３８５，９３２号；米国特許第５，２５０，４３５号；米国特許第５，１３２，３１２号；米国特許第５，１３０，３０６号；米国特許第５，１１６，８７０号；米国特許第５，１１２，８５７号、米国特許第５，１０２，９１１号；米国特許第５，０９８，９３１号；米国特許第５，０８１，１３６号；米国特許第５，０２５，０００号；米国特許第５，０２１，４５３号；米国特許第５，０１７，７１６号；米国特許第５，００１，１４４号；米国特許第５，００１，１２８号；米国特許第４，９９７，８３７号；米国特許第４，９９６，２３４号；米国特許第４，９９４，４９４号；米国特許第４，９９２，４２９号；米国特許第４，９７０，２３１号；米国特許第４，９６８，６９３号；米国特許第４，９６３，５３８号；米国特許第４，９５７，９４０号；米国特許第４，９５０，６７５号；米国特許第４，９４６，８６４号；米国特許第４，９４６，８６０号；米国特許第４，９４０，８００号；米国特許第４，９４０，７２７号；米国特許第４，９３９，１４３号；米国特許第４，９２９，６２０号；米国特許第４，９２３，８６１号；米国特許第４，９０６，６５７号；米国特許第４，９０６，６２４号；および米国特許第４，８９７，４０２号に記載されている多数の他のものが挙げられる。
【０１５４】
ヒトへの使用に関してすでに承認されているスタチンの例としては、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチンおよびロスバスタチンが挙げられる。以下の参考文献により、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤に関するさらなる情報が提供される：Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  （Ｍａｙ  １２，  １９９７），  ９：  １−６；Ｃｈｏｎｇ  （１９９７）  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  １７：  １１５７−１１７７；Ｋｅｌｌｉｃｋ  （１９９７）  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ  ３２：  ３５２；Ｋａｔｈａｗａｌａ  （１９９１）  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  １１：  １２１−１４６；Ｊａｈｎｇ  （１９９５）  Ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ  ２０：  ３８７−４０４、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｌｉｐｉｄｏｌｏｇｙ，  （１９９７），  ８，  ３６２−３６８。注目すべき別のスタチン薬は、Ｗａｔａｎａｂｅ  （１９９７）  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５：  ４３７−４４４の化合物３ａ（Ｓ−４５２２）である。
【０１５５】
非スタチン抗高脂血症剤としては、これだけに限定されないが、フィブリン酸誘導体（フィブラート系薬剤）、胆汁酸捕捉剤または樹脂、ニコチン酸剤、コレステロール吸収阻害剤、アシル−補酵素Ａ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）阻害剤、コレステリルエステル転移タンパク質（ＣＥＴＰ）阻害剤、ＬＤＬ受容体アンタゴニスト、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）アンタゴニスト、ステロール調節性結合性タンパク質切断活性化タンパク質（ＳＣＡＰ）活性化剤、ミクロソームトリグリセリド転移タンパク質（ＭＴＰ）阻害剤、スクアレンシンターゼ阻害剤およびペルオキシソーム増殖活性化受容体（ＰＰＡＲ）アゴニストが挙げられる。フィブリン酸誘導体の例としては、これだけに限定されないが、ゲムフィブロジル（ＬＯＰＩＤ（登録商標））、フェノフィブラート（ＴＲＩＣＯＲ（登録商標））、クロフィブラート（ＡＴＲＯＭＩＤ（登録商標））およびベザフィブラートが挙げられる。胆汁酸捕捉剤または樹脂の例としては、これだけに限定されないが、コレセベラム（ＷＥＬＣＨＯＬ（登録商標））、コレスチラミン（ＱＵＥＳＴＲＡＮ（登録商標）またはＰＲＥＶＡＬＩＴＥ（登録商標））およびコレスチポール（ＣＯＬＥＳＴＩＤ（登録商標））、ＤＭＤ−５０４、ＧＴ−１０２２７９、ＨＢＳ−１０７およびＳ−８９２１が挙げられる。ニコチン酸剤の例としては、これだけに限定されないが、ナイアシンおよびプロブコールが挙げられる。コレステロール吸収阻害剤の例としては、これだけに限定されないが、エゼチミブ（ＺＥＴＩＡ（登録商標））が挙げられる。ＡＣＡＴ阻害剤の例としては、これだけに限定されないが、アバシミブ、ＣＩ−９７６（Ｐａｒｋｅ  Ｄａｖｉｓ）、ＣＰ−１１３８１８（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＰＤ−１３８１４２−１５（Ｐａｒｋｅ  Ｄａｖｉｓ）、ＦＦ１３９４、ならびに米国特許第６，２０４，２７８号；米国特許第６，１６５，９８４号；米国特許第６，１２７，４０３号；米国特許第６，０６３，８０６号；米国特許第６，０４０，３３９号；米国特許第５，８８０，１４７号；米国特許第５，６２１，０１０号；米国特許第５，５９７，８３５号；米国特許第５，５７６，３３５号；米国特許第５，３２１，０３１号；米国特許第５，２３８，９３５号；米国特許第５，１８０，７１７号；米国特許第５，１４９，７０９号、および米国特許第５，１２４，３３７号に記載されている多数の他のものが挙げられる。ＣＥＴＰ阻害剤の例としては、これだけに限定されないが、トルセトラピブ、ＣＰ−５２９４１４、ＣＥＴｉ−１、ＪＴＴ−７０５、ならびに米国特許第６，７２７，２７７号；米国特許第６，７２３，７５３号；米国特許第６，７２３，７５２号；米国特許第６，７１０，０８９号；米国特許第６，６９９，８９８号；米国特許第６，６９６，４７２号；米国特許第６，６９６，４３５号；米国特許第６，６８３，０９９号；米国特許第６，６７７，３８２号；米国特許第６，６７７，３８０号；米国特許第６，６７７，３７９号；米国特許第６，６７７，３７５号；米国特許第６，６７７，３５３号；米国特許第６，６７７，３４１号；米国特許第６，６０５，６２４号；米国特許第６，５８６，４４８号；米国特許第６��５２１，６０７号；米国特許第６，４８２，８６２号；米国特許第６，４７９，５５２号；米国特許第６，４７６，０７５号；米国特許第６，４７６，０５７号；米国特許第６，４６２，０９２号；米国特許第６，４５８，８５２号；米国特許第６，４５８，８５１号；米国特許第６，４５８，８５０号；米国特許第６，４５８，８４９号；米国特許第６，４５８，８０３号；米国特許第６，４５５，５１９号；米国特許第６，４５１，８３０号；米国特許第６，４５１，８２３号；米国特許第６，４４８，２９５号；米国特許第５，５１２，５４８号に記載されている多数の他のものが挙げられる。ＦＸＲアンタゴニストの１つの例は、ググルステロンである。ＳＣＡＰ活性化剤の１つの例は、ＧＷ５３２（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）である。ＭＴＰ阻害剤の例としては、これだけに限定されないが、インプリタピドおよびＲ−１０３７５７が挙げられる。スクアレンシンターゼ阻害剤の例としては、これだけに限定されないが、ザラゴジン酸が挙げられる。ＰＰＡＲアゴニストの例としては、これだけに限定されないが、ＧＷ−４０９５４４、ＧＷ−５０１５１６、およびＬＹ−５１０９２９が挙げられる。
【０１５６】
抗炎症剤としては、これだけに限定されないが、アルクロフェナク、アルクロメタゾンプロピオン酸エステル、アルゲストンアセトニド、アルファアミラーゼ、アムシナファル、アムシナフィド、アンフェナクナトリウム、塩酸アミプリロース、アナキンラ、アニロラク、アニトラザフェン、アパゾン、バルサラジド二ナトリウム、ベンダザック、ベノキサプロフェン、塩酸ベンジダミン、ブロメライン、ブロペラモール、ブデソニド、カルプロフェン、シクロプロフェン、シンタゾン、クリプロフェン、クロベタゾールプロピオン酸エステル、クロベタゾン酪酸エステル、クロピラク、プロピオン酸クロチカゾン、コルメタソンアセタート、コルトドキソン、デフラザコート、デソニド、デスオキシメタゾン、デキサメタゾンプロピオン酸エステル、ジクロフェナクカリウム、ジクロフェナクナトリウム、ジフロラゾン酢酸エステル、ジフルミドンナトリウム、ジフルニサル、ジフルプレドナート、ジフタロン、ジメチルスルホキシド、ドロシノニド、エンドリソン、エンリモマブ、エノリカムナトリウム、エピリゾール、エトドラク、エトフェナメート、フェルビナク、フェナモール、フェンブフェン、フェンクロフェナック、フェンクロラク、フェンドサール、フェンピパロン、フェンチアザク、フラザロン、フルアザコルト、フルフェナム酸、フルミゾール、酢酸フルニソリド、フルニキシン、フルニキシンメグルミン、フルオコルチンブチル、酢酸フルオロメトロン、フルクァゾン（Ｆｌｕｑｕａｚｏｎｅ）、フルルビプロフェン、フルレトフェン、フルチカゾンプロピオン酸エステル、フラプロフェン、フロブフェン、ハルシノニド、ハロベタソールプロピオン酸塩、ハロプレドン酢酸エステル、イブフェナック、イブプロフェン、イブプロフェンアルミニウム、イブプロフェンピコノール、イロニダプ、インドメタシン、インドメタシンナトリウム、インドプロフェン、インドキソール、イントラゾール、イソフルプレドンアセタート、イソキセパク、イソキシカム、ケトプロフェン、ロフェミゾール塩酸塩、ロモキシカム、エタボン酸ロテプレドノール、メクロフェナム酸ナトリウム、メクロフェナム酸、メクロリソンジブチレート、メフェナム酸、メサラミン、メセクラゾン、スレプタン酸メチルプレドニゾロン、モルニフルメート、ナブメトン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、ナプロキソール、ニマゾン、オルサラジンナトリウム、オルゴテイン、オルパノキシン、オキサプロジン、オキシフェンブタゾン、塩酸パラニリン、ペントサンポリ硫酸ナトリウム、フェンブタゾンナトリウムグリセレート、ピルフェニドン、ピロキシカム、桂皮酸ピロキシカム、ピロキシカムオラミン、ピルプロフェン、プレドナザート、プリフェロン、プロドール酸、プロカゾン、プロキサゾール、クエン酸プロキサゾール、リメキソロン、ロマザリット、サルコレクス、サルナセジン、サルサレート、サリチレート（Ｓａｌｙｃｉｌａｔｅ）、塩化サングイナリウム（Ｓａｎｇｕｉｎａｒｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、セクラゾン、セルメタシン、スドキシカム、スリンダク、スプロフェン、タルメタシン、タルニフルメート、タロサラート、テブフェロン、テニダップ、テニダップナトリウム、テノキシカム、テシカ���、テシミド、テトリダミン、チオピナク、チキソコルトールピバレート、トルメチン、トルメチンナトリウム、トリクロニド、トリフルミダート、ジドメタシン、グルココルチコイドおよびゾメピラクナトリウムが挙げられる。
【０１５７】
抗血栓剤および／または線維素溶解剤としては、これだけに限定されないが、組織プラスミノーゲンアクチベーター（例えば、ＡＣＴＩＶＡＳＥ（登録商標）、ＡＬＴＥＰＬＡＳＥ（登録商標））（不活性プラスミノーゲンのプラスミンへの変換を触媒する）。これは、プレカリクレイン、キニノーゲン、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩａ因子、プラスミノーゲンプロアクチベーター、および組織プラスミノーゲンアクチベーターＴＰＡの相互作用によって起こり得る）、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、アニソイレート化プラスミノーゲン−ストレプトキナーゼ活性化因子複合体、プロ−ウロキナーゼ、（プロ−ＵＫ）、ｒＴＰＡ（ＡＣＴＩＶＡＳＥ（登録商標）、ＡＬＴＥＰＬＡＳＥ（登録商標））；ｒは組換え型であることを示す）、ｒプロ−ＵＫ、アボキナーゼ、エミナーゼ、スレプターゼ、アナグレリド塩酸塩、ビバリルジン、ダルテパリンナトリウム、ダナパロイドナトリウム、ダゾキシベン塩酸塩、硫酸エフェガトラン、エノキサパリンナトリウム、イフェトロバン、イフェトロバンナトリウム、チンザパリンナトリウム、レタプラーゼ、トリフェナグレル、ワルファリン、デキストラン、アミノカプロン酸（ＡＭＩＣＡＲ（登録商標））およびトラネキサム酸（ＡＭＳＴＡＴ（登録商標））が挙げられる。
【０１５８】
抗血小板剤としては、これだけに限定されないが、クロピドグレル（Ｃｌｏｐｒｉｄｏｇｒｅｌ）、スルフィンピラゾン、アスピリン、ジピリダモール、クロフィブラート、ピリジノールカルバメート、ＰＧＥ、グルカゴン、抗セロトニン薬、カフェイン、テオフィリンペントキシフィリン、チクロピジンおよびアナグレリドが挙げられる。直接トロンビン阻害剤としては、これだけに限定されないが、ヒルジン、ヒルゲン、ヒルログ、アルガトロバン（ａｇａｔｒｏｂａｎ）、ＰＰＡＣＫおよびトロンビンアプタマーが挙げられる。糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体阻害剤には抗体および非抗体の両方があり、それらとして、これだけに限定されないが、ＲＥＯＰＲＯ（登録商標）（アブシキマブ（ａｂｃｉｘａｍａｂ））、ラミフィバンおよびチロフィバンが挙げられる。細胞接着分子に結合し、白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）のそのような分子に付着する能力を阻害する薬剤としては、ポリペプチド剤が挙げられる。そのようなポリペプチドとしては、従来の方法体系に従って調製されたポリクローナルおよびモノクローナル抗体が挙げられる。そのような抗体はすでに当技術分野で公知であり、それらとして、抗ＩＣＡＭ１抗体および他のそのような抗体が挙げられる。
【０１５９】
アルファ−アドレナリン作動性遮断薬の例としては、これだけに限定されないが、ドキサゾシン（ｄｏｘａｚｏｃｉｎ）、プラゾシン（ｐｒａｚｏｃｉｎ）、タムスロシン、およびテラゾシン（ｔａｒａｚｏｓｉｎ）が挙げられる。ベータ−アドレナリン作動性受容体遮断剤は、狭心症、高血圧症および心不整脈（ｃａｒｄｉａｃ  ａｒｒｈｙｔｈｍｉａ）においてカテコールアミンの心血管に対する影響をアンタゴナイズする薬物のクラスである。ベータ−アドレナリン作動性受容体遮断薬としては、これだけに限定されないが、アテノロール、アセブトロール、アルプレノロール、ベフノロール、ベタキソロール、ブニトロロール、カルテオロール、セリプロロール、ヒドロキサロール、インデノロール、ラベタロール、レボブノロール、メピンドロール、メチプラノール、メチンドール、メトプロロール、メトリゾラノロール、オクスプレノロール、ピンドロール、プロプラノロール、プラクトロール、プラクトロール、ソタロルナドロール、チプレノロール、トマロロール、チモロール、ブプラノロール、ペンブトロール、トリメプラノール、２−（３−（１，１−ジメチルエチル）−アミノ−２−ヒドロキシプロポキシ）−３−ピリデネカルボニトリルＨＣｌ、１−ブチルアミノ−３−（２，５−ジクロロフェノキシ）−２−プロパノール、１−イソプロピルアミノ−３−（４−（２−シクロプロピルメトキシエチル）フェノキシ）−２−プロパノール、３−イソプロピルアミノ−１−（７−メチルインダン−４−イルオキシ）−２−ブタノール、２−（３−ｔ−ブチルアミノ−２−ヒドロキシ−プロピルチオ）−４−（５−カルバモイル−２−チエニル）チアゾール、７−（２−ヒドロキシ−３−ｔ−ブチルアミノプロポキシ）フタリドが挙げられる。上で識別された化合物は、異性体混合物として使用することもでき、それらのそれぞれの左旋型または右旋型で使用することもできる。
【０１６０】
選択的ＣＯＸ−２阻害剤が当技術分野で公知であり、利用することができる。それらとして、これだけに限定されないが、米国特許第５，５２１，２１３号；米国特許第５，５３６，７５２号；米国特許第５，５５０，１４２号；米国特許第５，５５２，４２２号；米国特許第５，６０４，２５３号；米国特許第５，６０４，２６０号；米国特許第５，６３９，７８０号；米国特許第５，６７７，３１８号；米国特許第５，６９１，３７４号  ；米国特許第５，６９８，５８４号；米国特許第５，７１０，１４０号  米国特許第５，７３３，９０９号；米国特許第５，７８９，４１３号；米国特許第５，８１７，７００号；米国特許第５，８４９，９４３号；米国特許第５，８６１，４１９号；米国特許第５，９２２，７４２号；米国特許第５，９２５，６３１号；および米国特許第５，６４３，９３３号に記載されているＦ  ＣＯＸ−２阻害剤が挙げられる。いくつかの上で識別されたＣＯＸ−２阻害剤が選択的ＣＯＸ−２阻害剤のプロドラッグであり、それらの作用は、ｉｎ  ｖｉｖｏで活性かつ選択的ＣＯＸ−２阻害剤に変換されることによって発揮される。上で識別されたＣＯＸ−２阻害剤プロドラッグから形成される活性かつ選択的ＣＯＸ−２阻害剤は、ＰＣＴ公開第ＷＯ９５／００５０１号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９５／１８７９９号、および米国特許第５，４７４，９９５号に記載されている。
【０１６１】
アンジオテンシン系阻害剤は、アンジオテンシンＩＩの機能、合成または異化を妨げる薬剤である。これらの薬剤としては、これだけに限定されないが、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンジオテンシンＩＩアンタゴニスト、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、アンジオテンシンＩＩの異化を活性化する薬剤、および最終的にアンジオテンシンＩＩが生じるアンジオテンシンＩの合成を妨げる薬剤が挙げられる。そのような化合物のクラスの例としては、抗体（例えば、レニンに対するもの）、アミノ酸およびその類似体（より大きな分子とコンジュゲートしたものを含む）、ペプチド（アンジオテンシンおよびアンジオテンシンＩのペプチド類似体を含む）、プロ−レニン関連類似体などが挙げられる。最も強力で有用なレニン−アンジオテンシン系阻害剤にはレニン阻害剤、ＡＣＥ阻害剤、およびアンジオテンシンＩＩアンタゴニストがある。
【０１６２】
アンジオテンシンＩＩアンタゴニストは、アンジオテンシンＩＩ受容体に結合し、その活性に干渉することによってアンジオテンシンＩＩの活性に干渉する化合物である。アンジオテンシンＩＩアンタゴニストは周知であり、ペプチド化合物および非ペプチド化合物を含む。大多数のアンジオテンシンＩＩアンタゴニストは、８位のフェニルアラニンを、ある他のアミノ酸で置き換えることによってアゴニスト活性を減弱させたわずかに改変された同類物である。ｉｎ  ｖｉｖｏにおける変性を遅くする他の置換えによって安定性を増強することができる。アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニストの例としては、これだけに限定されないが、カンデサルタン（Ａｌａｃａｎｄ）、ＩＲＢＥＳＡＲＴＡＮ（登録商標）（Ａｖａｐｒｏ）、ロサルタン（ＣＯＺＡＡＲＳ（登録商標））、テルミサルタン（ＭＩＣＡＲＤＩＳ（登録商標））、およびバルサルタン（ＤＩＯＶＡＮ（登録商標））が挙げられる。アンジオテンシンＩＩアンタゴニストの他の例としては、ペプチド性化合物（例えば、サララシン、［（Ｓａｒ１）（Ｖａｌ５）（Ａｌａ８）］アンジオテンシン−（１−８）オクタペプチドおよび関連する類似体）；Ｎ置換イミダゾール−２−オン（米国特許第５，０８７，６３４号）；２−ｎ−ブチル−４−クロロ−１−（２−クロロベンジル）イミダゾール−５−酢酸を含めたイミダゾール酢酸誘導体（Ｌｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．  ２４７  （１），  １−７  （１９８８）を参照されたい）；４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−６−カルボン酸および類似体誘導体（米国特許第４，８１６，４６３号）；Ｎ２−テトラゾールベータ−グルクロニド類似体（米国特許第５，０８５，９９２号）；置換型ピロール、ピラゾール、およびトリアゾール（米国特許第５，０８１，１２７号）；フェノールおよび複素環式誘導体、例えば、１，３−イミダゾールなど（米国特許第５，０７３，５６６号）；イミダゾ縮合７員環複素環（米国特許第５，０６４，８２５号）；ペプチド（例えば、米国特許第４，７７２，６８４号）；アンジオテンシンＩＩに対する抗体（例えば、米国特許第４，３０２，３８６号）；およびビフェニル−メチル置換イミダゾールなどのアラルキルイミダゾール化合物（例えば、ＥＰ第２５３，３１０号、１９８８年１月２０日）；ＥＳ８８９１（Ｎ−モルホリノアセチル−（−１−ナフチル）−Ｌ−アラニル−（４，チアゾリル）−Ｌ−アラニル（３５，４５）−４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−シクロ−ヘキサペンタノイル−Ｎ−ヘキシルアミド、Ｓａｎｋｙｏ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｌｔｄ．、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）；ＳＫＦ１０８５６６（Ｅ−アルファ−２−［２−ブチル−１−（カルボキシフェニル）メチル］１Ｈ−イミダゾール−５−イル［メチラン］−２−チオフェンプロパン酸、Ｓｍｉｔｈ  Ｋｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＰＡ）；ＬＯＳＡＲＴＡＮ（登録商標）（ＤＵＰ７５３／ＭＫ９５４、ＤｕＰｏｎｔ  Ｍｅｒｃｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）；レミキリン（ＲＯ４２−５８９２、Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎ  ＬａＲｏｃｈｅ  ＡＧ）；Ａ２��ゴニスト（Ｍａｒｉｏｎ  Ｍｅｒｒｉｌｌ  Ｄｏｗ）ならびにある特定の非ペプチド複素環（Ｇ．Ｄ．Ｓｅａｒｌｅ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）が挙げられる。
【０１６３】
アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）は、アンジオテンシンＩのアンジオテンシンＩＩへの変換を触媒する酵素である。ＡＣＥ阻害剤としては、アミノ酸およびその誘導体、ジペプチドおよびトリペプチドを含めたペプチド、ならびに、ＡＣＥの活性を阻害し、それにより、昇圧物質であるアンジオテンシンＩＩの形成を減少させるまたは排除することによってレニン−アンジオテンシン系に介入するＡＣＥに対する抗体が挙げられる。ＡＣＥ阻害剤は、高血圧症、鬱血性心不全、心筋梗塞および腎疾患を処置するために医学的に使用されている。ＡＣＥ阻害薬として有用であることが公知の化合物のクラスとしては、カプトプリル（米国特許第４，１０５，７７６号）およびゾフェノプリル（米国特許第４，３１６，９０６号）などのアシルメルカプトおよびメルカプトアルカノイルプロリン、エナラプリル（米国特許第４，３７４，８２９号）、リシノプリル（米国特許第４，３７４，８２９号）、キナプリル（米国特許第４，３４４，９４９号）、ラミプリル（米国特許第４，５８７，２５８号）、およびペリンドプリル（米国特許第４，５０８，７２９号）などのカルボキシアルキルジペプチド、シラザプリル（米国特許第４，５１２，９２４号）およびベナゼプリル（ｂｅｎａｚａｐｒｉｌ）（米国特許第４，４１０，５２０号）などのカルボキシアルキルジペプチド模倣体、ホシノプリル（米国特許第４，３３７，２０１号）およびトランドラプリル（ｔｒａｎｄｏｌｏｐｒｉｌ）などのホスフィニルアルカノイルプロリンが挙げられる。
【０１６４】
レニン阻害剤は、レニンの活性に干渉する化合物である。レニン阻害剤としては、アミノ酸およびその誘導体、ペプチドおよびその誘導体、ならびにレニンに対する抗体が挙げられる。米国特許の対象であるレニン阻害剤の例は、以下の通りである：ペプチドの尿素誘導体（米国特許第５，１１６，８３５号）；非ペプチド結合が連結したアミノ酸（米国特許第５，１１４，９３７号）；ジペプチド誘導体およびトリペプチド誘導体（米国特許第５，１０６，８３５号）；アミノ酸およびその誘導体（米国特許第５，１０４，８６９号および第５，０９５，１１９号）；ジオールスルホンアミドおよびスルフィニル（米国特許第５，０９８，９２４号）；修飾ペプチド（米国特許第５，０９５，００６号）；ペプチジルベータ−アミノアシルアミノジオールカルバメート（米国特許第５，０８９，４７１号）；ピロールイミダゾロン（米国特許第５，０７５，４５１号）；フッ素および塩素スタチンまたはスタトン含有ペプチド（米国特許第５，０６６，６４３号）；ペプチジルアミノジオール（米国特許第５，０６３，２０８号および第４，８４５，０７９号）；Ｎ−モルホリノ誘導体（米国特許第５，０５５，４６６号）；ペプスタチン誘導体（米国特許第４，９８０，２８３号）；Ｎ−複素環式アルコール（米国特許第４，８８５，２９２号）レニンに対するモノクローナル抗体（米国特許第４，７８０，４０１号）；ならびに種々の他のペプチドおよびその類似体（米国特許第５，０７１，８３７号；米国特許第５，０６４，９６５号；米国特許第５，０６３，２０７号；米国特許第５，０３６，０５４号；米国特許第５，０３６，０５３号、米国特許第５，０３４，５１２号、および第４，８９４，４３７号）。
【０１６５】
カルシウムチャネル遮断薬は、高血圧症、狭心症、および心不整脈（などのいくつかの心血管障害を含めた種々の疾患の制御において重要な治療的価値を有する化学的に多様なクラスの化合物である（Ｆｌｅｃｋｅｎｓｔｅｉｎ，  Ｃｉｒ．  Ｒｅｓ．  ｖ．  ５２，  （ｓｕｐｐｌ．  １），  ｐ．  １３−１６  （１９８３）  ；Ｆｌｅｃｋｅｎｓｔｅｉｎ，  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８３）；ＭｃＣａｌｌ，  Ｄ．，  Ｃｕｒｒ  Ｐｒａｃｔ  Ｃａｒｄｉｏｌ，  ｖ．  １０，  ｐ．  １−１１  （１９８５））。カルシウムチャネル遮断薬は、細胞カルシウムチャネルを調節することによってカルシウムの細胞への進入を妨げるまたは遅くする薬物の不均一な群である。（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  Ｎｉｎｅｔｅｅｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｔｏｎ，  Ｐａ．，  ｐ．  ９６３  （１９９５））。現在利用可能であり、本発明に従って有用なカルシウムチャネル遮断薬の大部分は、３つの主要な薬物の化学群のうちの１つに属する。ジヒドロピリジン、例えば、ニフェジピン、フェニルアルキルアミン、例えば、ベラパミル、およびベンゾチアゼピン、例えば、ジルチアゼム。本発明に従って有用な他のカルシウムチャネル遮断薬としては、これだけに限定されないが、アミノン、アムロジピン、ベンシクラン、フェロジピン、フェンジリン、フルナリジン、イスラジピン、ニカルジピン、ニモジピン、ペルヘキシレン、ガロパミル、チアパミルおよびチアパミル類似体（例えば、１９９３ＲＯ−１１−２９３３など）、フェニロイン、バルビツール酸、およびペプチドダイノルフィン、オメガ−コノトキシン、およびオメガ−アガトキシンなど、ならびに／または薬学的に許容されるその塩が挙げられる。
【０１６６】
利尿薬としては、これだけに限定されないが、炭酸脱水素酵素阻害剤、ループ利尿薬、カリウム保持性利尿薬、チアジドおよび関連する利尿薬が挙げられる。血管拡張薬としては、これだけに限定されないが、冠状動脈血管拡張薬および末梢血管拡張薬が挙げられる。昇圧剤は、血管収縮を生じさせ、および／または血圧を上昇させる薬剤である。昇圧剤としては、これだけに限定されないが、ドーパミン、エフェドリン、エピネフリン、メトキサミンＨＣｌ（ＶＡＳＯＸＹＬ（登録商標））、フェニレフリン、フェニレフリンＨＣｌ（ＮＥＯ−ＳＹＮＥＰＨＲＩＮＥ（登録商標））、およびメタラミノールが挙げられる。チアゾリジンジオンとしては、これだけに限定されないが、ロシグリタゾン（ｒｏｓｉｇｌｅｔａｚｏｎｅ）（ＡＶＡＮＤＩＡ（登録商標））、ピオグリタゾン（ＡＣＴＯＳ（登録商標））、トログリタゾン（Ｒｅｚｕｌｉｎ）が挙げられる。これらのいずれも開示されている方法および組成物に使用することができる。
【０１６７】
免疫抑制剤としては、これだけに限定されないが、ステロイド、カルシニューリン阻害剤、抗増殖剤（ａｎｔｉ−ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）、生物学的製剤、およびモノクローナルまたはポリクローナル抗体が挙げられる。生物学的製剤としては、これだけに限定されないが、組換えまたは合成ペプチドおよびタンパク質、ならびに合成形態の核酸が挙げられる。ステロイドは、コルチコステロイドであり得る。コルチコステロイドの例としては、これだけに限定されないが、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン、およびメチルプレドニゾンが挙げられる。カルシニューリン阻害剤の例としては、これだけに限定されないが、タクロリムス、ＦＫ５０６、ＡＤＶＡＧＲＡＦＴ（登録商標）、ＰＲＯＧＲＡＦ（登録商標）、ＥＮＶＡＲＳＵＳ  ＸＲ（登録商標）、ＨＥＣＯＲＩＡ（登録商標）、ＡＳＴＡＧＲＡＦ  ＸＬ（登録商標）、およびシクロスポリン（ＣＥＱＵＡＳ（登録商標）、ＮＥＯＲＡＬ（登録商標）、ＲＥＳＴＡＳＩＳ（登録商標））、ＮＥＯＲＡＬ（登録商標）、ＰＩＭＥＣＲＯＬＩＭＵＳ（登録商標）、ＳＡＮＤＩＭＭＵＮＥ（登録商標）、ＰＲＯＴＯＰＩＣ（登録商標）、ＧＥＮＧＲＡＦＴ（登録商標）、およびＥＬＩＤＥＬ（登録商標）が挙げられる。モノクローナル抗体の例としては、これだけに限定されないが、抗ＣＤ３抗体（ムロモナブ−ＣＤ３、ＯＲＴＨＯＣＬＯＮＥ（登録商標）ＯＫＴ３）、ビシリズマブ（ＮＵＶＩＯＮ（登録商標））、抗ＣＤ５２（アレムツズマブ（Ａｌｔｅｍｔｕｚｕｍａｂ）（ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標）−１Ｈ））、抗ＣＤ２５（バシリキシマブ（ＳＩＭＵＬＥＣＴ（登録商標）））、抗ＣＤ２０（リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））、オビヌツズマブ（ＧＡＺＹＶＡ（登録商標））、オクレリズマブ（ＯＣＲＥＶＵＳ（登録商標）））、抗補体タンパク質（エクリズマブ（ＳＯＬＩＲＩＳ（登録商標）））、抗共刺激分子（ブレセルマブ、ＬＵＬＩＺＵＭＡＢ（登録商標））、および抗サイトカインまたはサイトカイン受容体（トシリズマブ（ＡＣＴＥＭＲＡ（登録商標））、ウステキヌマブ（ＳＴＥＬＡＲＡ（登録商標））、カナキヌマブ（ＩＬＡＲＩＳ（登録商標））、セクキヌマブ（ＣＯＳＥＮＴＹＸ（登録商標））、シルツキシマブ（ＳＹＬＶＡＮＴ（登録商標））、ブロダルマブ（ＳＩＬＩＱ（登録商標））、イキセキズマブ（ＴＡＬＴＺ（登録商標））、サリルマブ（ＫＥＶＡＺＲＡ（登録商標））、グセルクマブ（ＴＲＥＭＦＹＡ（登録商標））、およびチルドラキズマブ（ＩＬＵＭＹＡ（登録商標）））が挙げられる。ポリクローナル抗体の例としては、これだけに限定されないが、抗胸腺細胞グロブリン−ウマ科の動物（ＡＴＧＡＭ（登録商標））および抗胸腺細胞グロブリン−ウサギ（ＲＡＴＧサイモグロブリン）、ポリクローナルヒトＩｇＧ免疫グロブリン（ＩＶＩＧ、ＢＩＶＩＧＡＭ（登録商標）、ＣＡＲＩＭＵＮＥ（登録商標）、ＣＵＴＡＱＵＩＧ（登録商標））が挙げられる。生物学的タンパク質の例としては、これだけに限定されないが、可溶性ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ（ＡＢＡＴＡＣＥＰＴ（登録商標））、Ｃ１−エステラーゼ阻害剤（Ｃ１−ＩＮＨ、ＣＩＮＲＹＺＥ（登録商標）、ＨＡＥＧＡＲＤＡ（登録商標））、ＩＬ−１またはＩＬ−１Ｒアンタゴニスト（アナキンラ（ＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標））、リロナセプト（ＡＲＣＡＬＹＳＴ（登録商標））、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓのＩｇＧ分解酵素（ＩｄｅＳ）が挙げられる。抗増殖剤または代謝拮抗剤としては、これだけに限定されないが、ミコフェノール酸モフェチル、ミコフェノール酸ナトリウム、アザチオプリン、シクロホスファミド、ラパマイシン、シロリムス（ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標））、エベロリムス（ＡＦＩＮＩＴＯＲ（登録商標））が挙げられる。他の免疫抑制剤（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔ）としては、これだけに限定されないが、スルファサラジン、アザルフィジン、メトキサレン、およびサリドマイドが挙げられる。これらのいずれも開示された組成物および方法に使用することができる。一部の実施形態では、免疫抑制剤は、カルシニューリン阻害剤、抗増殖剤（ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）、ｍＴＯＲ阻害剤、および／またはステロイドである。特定の非限定的な例では、カルシニューリン阻害剤は、タクロリムスまたはシクロスポリンであり、抗増殖剤は、ミコフェノール酸であり、ｍＴＯＲ阻害剤は、シロリムスであり、および／またはステロイドは、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン、またはコルチゾンである。
【０１６８】
提示される方法は、食事および／または運動などの他の治療の使用も含み得る。一部の実施形態では、これらの治療を、ＭＢＶを用いた治療的処置に加える。「共投与すること」とは、本明細書で使用される場合、２つまたはそれよりも多くの治療剤（例えば、ＭＢＶおよび第２の治療剤）を単一の組成物中の混和物として同時に、または逐次的に、および一部の実施形態では、化合物が相加効果またはさらには相乗効果を発揮することができるように十分に近い時間内に投与することを指す。他の実施形態では、治療剤を併用して投与する。さらに他の実施形態では、１つの治療剤を別の治療剤の前またはその後に投与する。
【０１６９】
投与されるＭＢＶの用量は治療的に有効なものであり、投与経路を含めたいくつかの因子に依存し、熟練臨床医が決定することができる。一部の実施形態では、ＭＢＶの濃度は、１ｍｌ当たり約１×１０５〜約１×１０１２個、例えば、１ｍｌ当たり１×１０６〜約１×１０１１個、１ｍｌ当たり約１×１０７〜約１×１０１１個、または１ｍｌ当たり約１×１０８〜約１×１０１０個である。一部の非限定的な例では、局所的に投与する場合、１ｍｌ当たり約１×１０８〜約１×１０１０個の用量、例えば、１ｍｌ当たり約１×１０８個、１ｍｌ当たり約５×１０８個、１ｍｌ当たり約１×１０９個、１ｍｌ当たり約５×１０９個、または１ｍｌ当たり約１×１０１０個が提供される。局所的に投与する場合、体積は部位に適したものである。例示的な非限定的な体積は、硝子体内には０．１ｍｌであり、移植領域の表面上に拡散させる場合には１．０ｍｌであり、３ｃｍの長さの皮膚切開部の縁に注射する場合には１．５ｍｌであり、腔全体がおよそ１．４０ｍｍ３である脳卒中腔に注射する場合には０．１５ｍｌである。当業者は、場所に適した体積を容易に特定することができる。一般に、体積は、処置に有効であり、目的の部位における損傷を誘発しない。
【０１７０】
一般に、活性化合物または薬剤の用量は、１日当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇから１日当たり１０００ｍｇ／ｋｇまでであり得る。１日当たり１回または数回の投与で経口投与するためには１〜５ｍｇ／ｋｇ、５〜５０ｍｇ／ｋｇまたは５０〜１００ｍｇ／ｋｇにわたる用量が適し得ることが予想される。静脈内投与などの他の投与の形態では低い用量がもたらされる。適用された初回用量でヒト対象における応答が不十分である場合には、より高い用量（または異なる、より局在化される送達経路による有効により高い用量）を患者の耐容性が許す範囲内で使用することができる。化合物の適当な全身性レベルを実現するために１日当たり複数回投与が意図されている。
【０１７１】
投与される場合、医薬調製物は、薬学的に許容される量で、薬学的に許容される組成物として適用される。そのような調製物は、常套的に、塩、緩衝剤、保存剤、適合性の担体、および必要に応じて他の治療剤を含有する。薬に使用される場合、塩は、薬学的に許容されるものであるべきであるが、薬学的に許容される塩ではない塩も、その薬学的に許容される塩を調製するために都合よく使用することができ、本発明の範囲から除外されない。そのような薬理学的および薬学的に許容される塩としては、これだけに限定されないが、以下の酸から調製される塩が挙げられる：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸など。また、薬学的に許容される塩は、ナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩など、アルカリ性金属またはアルカリ土類塩として調製することができる。参照により本明細書に組み込まれる米国公開出願第２００８／０００３１９９号、ＩＬ−３３  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓを参照されたい。
筋芽細胞分化を増大させるための方法
【０１７２】
筋芽細胞分化を増大させるための方法も開示される。これらの方法は、筋芽細胞に細胞外マトリックス由来の単離されたナノ小胞の有効量を接触させるステップであって、ナノ小胞が、インターロイキン（ＩＬ）−３３を含有し、リシルオキシダーゼを含み、ナノ小胞が、ａ）ＣＤ６３もＣＤ８１も発現しないか、またはｂ）ＣＤ６３ｌｏＣＤ８１ｌｏである、ステップを含む。筋芽細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏのものであってもｉｎ  ｖｉｔｒｏのものであってもよい。
【０１７３】
筋肉細胞の決定、分化、および多核合胞体への融合のプロセスである筋形成は、傷害後の正常な筋肉発達および組織再生に必須である。
【０１７４】
一部の実施形態では、梗塞後心機能不全の結果を限定することを目的とする処置は、損傷を受けた左心室に細胞（筋細胞または幹細胞）を移植することを含む。移植された細胞は、心臓の収縮に関与することによって心室駆出率を上昇させる。心筋内移植のためには多数の潜在的に収縮性の細胞が必要である。したがって、開示される方法は、心臓または骨格筋移植片として使用するために適した細胞集団を拡大増殖させることができる。
例示的な実施形態
【０１７５】
条項１．障害を有するまたは有するリスクがある対象における障害を処置または阻害するための方法であって、障害を有するまたは有するリスクがある対象を選択するステップと、対象に、細胞外マトリックス由来の単離されたナノ小胞の治療有効量を投与するステップであって、ナノ小胞がインターロイキン（ＩＬ）−３３を含有し、リシルオキシダーゼを含み、ナノ小胞が、ａ）ＣＤ６３もＣＤ８１も発現しないか、またはｂ）ＣＤ６３ｌｏＣＤ８１ｌｏである、ステップとを含み、それにより、対象における障害が処置または阻害され、障害が、ａ）臓器もしくは組織の線維症；ｂ）実質臓器移植片拒絶；またはｃ）心筋梗塞でも心筋虚血でもない心疾患である、方法。
【０１７６】
条項２．細胞外マトリックスが、哺乳動物細胞外マトリックスである、条項１に記載の方法。
【０１７７】
条項３．哺乳動物細胞外マトリックスが、ヒト細胞外マトリックスである、条項２に記載の方法。
【０１７８】
条項４．細胞外マトリックスが、食道組織、膀胱、小腸粘膜下組織、真皮、臍帯、心膜、心臓組織、または骨格筋に由来する、条項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【０１７９】
条項５．ナノ小胞が、ｍｉＲ−１４５および／またはｍｉＲ−１８１を含む、条項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【０１８０】
条項６．障害が、実質臓器移植片拒絶であり、対象が、移植された実質臓器のレシピエントである、条項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
【０１８１】
条項７．ナノ小胞が、移植された実質臓器に投与される、条項６に記載の方法。
【０１８２】
条項８．移植された実質臓器が、心臓である、条項７に記載の方法。
【０１８３】
条項９．障害が、心疾患である、条項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
【０１８４】
条項１０．心疾患が、心不全または心虚血である、条項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
【０１８５】
条項１１．心疾患が、急性冠状動脈症候群、慢性安定狭心症、不安定狭心症、血管形成術、一過性脳虚血発作、虚血性再灌流傷害、跛行、血管閉塞、動脈硬化症、心不全、慢性心不全、急性非代償性心不全、心肥大、心臓線維症、大動脈弁疾患、大動脈弁または僧帽弁狭窄症、心筋症、心房細動、心不整脈、および心膜疾患を含む、条項１から５までのいずれかに記載の方法。
【０１８６】
条項１２．ナノ小胞が、静脈内に投与される、条項１から１１までのいずれか一項に記載の方法。
【０１８７】
条項１３．障害が、臓器または組織の線維症である、条項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
【０１８８】
条項１４．線維症が、肝硬変、肺線維症、心臓線維症、縦隔線維症、関節線維症、骨髄線維症、腎性全身性線維症、ケロイド線維症、強皮症線維症、腎線維症、リンパ組織線維症、動脈線維症、毛細血管線維症、血管線維症、または膵線維症である、条項１３に記載の方法。
【０１８９】
条項１５．線維症が、肺線維症である、条項１４に記載の方法。
【０１９０】
条項１６．線維症が、心臓線維症である、条項１４に記載の方法。
【０１９１】
条項１７．心臓線維症が、
ａ）肥大型心筋症、サルコイドーシス、慢性腎不全、中毒性心筋症、虚血再灌流傷害、急性臓器拒絶、慢性臓器拒絶、老化、慢性高血圧症、非虚血性拡張型心筋症（ｎｏｎ−ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｄｅｌａｔｅｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ）、不整脈、アテローム性動脈硬化症、ＨＩＶ関連慢性血管疾患、および肺高血圧症；または
ｂ）心筋梗塞もしくは心筋虚血
によって引き起こされる、条項１６に記載の方法。
【０１９２】
条項１８．ナノ小胞が、患者に吸入によって投与される、条項１５に記載の方法。
【０１９３】
条項１９．ナノ小胞が、対象に毎週、月２回、または毎月投与される、条項１から１６までのいずれか一項に記載の方法。
【０１９４】
条項２０．対象に追加的な治療剤の治療有効量を投与するステップをさらに含む、条項１から１９までのいずれか一項に記載の方法。
【０１９５】
条項２１．追加的な治療剤が、免疫抑制剤である、条項２０に記載の方法。
【０１９６】
条項２２．免疫抑制剤が、カルシニューリン阻害剤、抗増殖剤、ｍＴＯＲ阻害剤、および／またはステロイドである、条項２１に記載の方法。
【０１９７】
条項２３．カルシニューリン阻害剤が、タクロリムスまたはシクロスポリンであり、抗増殖剤が、ミコフェノール酸であり、ｍＴＯＲ阻害剤が、シロリムスであり、および／またはステロイドが、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン、またはコルチゾンである、条項２２に記載の方法。
【０１９８】
条項２４．対象がヒトである、条項１から２３までのいずれか一項に記載の方法。
【０１９９】
条項２５．障害を有するまたは有するリスクがある対象における障害を処置または阻害するための方法であって、障害を有するまたは有するリスクがある対象を選択するステップと、対象に、細胞外マトリックス由来の単離されたナノ小胞の治療有効量を投与するステップであって、ナノ小胞がインターロイキン（ＩＬ）−３３を含有し、リシルオキシダーゼを含み、ナノ小胞が、ａ）ＣＤ６３もＣＤ８１も発現しないか、またはｂ）ＣＤ６３ｌｏＣＤ８１ｌｏである、ステップとを含み、それにより、対象における障害が処置または阻害され、障害が、臓器または組織の線維症である、方法。
【０２００】
条項２６．細胞外マトリックスが、哺乳動物細胞外マトリックスである、条項２５に記載の方法。
【０２０１】
条項２７．哺乳動物細胞外マトリックスが、ヒト細胞外マトリックスである、条項２６に記載の方法。
【０２０２】
条項２８．細胞外マトリックスが、食道組織、膀胱、小腸粘膜下組織、真皮、臍帯、心膜、心臓組織、または骨格筋に由来する、条項２５から２７までのいずれか一項に記載の方法。
【０２０３】
条項２９．ナノ小胞が、ｍｉＲ−１４５および／またはｍｉＲ−１８１を含む、条項２５から２８までのいずれか一項に記載の方法。
【０２０４】
条項３０．線維症が、肝硬変、肺線維症、心臓線維症、縦隔線維症、関節線維症、骨髄線維症、腎性全身性線維症、ケロイド線維症、強皮症線維症、腎線維症、リンパ組織線維症、動脈線維症、毛細血管線維症、血管線維症、または膵線維症である、条項２５から２９までのいずれか一項に記載の方法。
【０２０５】
条項３１．線維症が、肺線維症である、条項３０に記載の方法。
【０２０６】
条項３２．線維症が、心臓線維症である、条項３０に記載の方法。
【０２０７】
条項３３．心臓線維症が、
ａ）肥大型心筋症、サルコイドーシス、慢性腎不全、中毒性心筋症、虚血再灌流傷害、急性臓器拒絶、慢性臓器拒絶、老化、慢性高血圧症、非虚血性拡張型心筋症、不整脈、アテローム性動脈硬化症、ＨＩＶ関連慢性血管疾患、および肺高血圧症；または
ｂ）心筋梗塞もしくは心筋虚血
によって引き起こされる、条項３２に記載の方法。
【０２０８】
条項３３．１．心臓線維症が、急性臓器拒絶によって引き起こされる、条項３３に記載の方法。
【０２０９】
条項３３．２．心臓線維症が、慢性臓器拒絶によって引き起こされる、条項３３に記載の方法。
【０２１０】
条項３４．ナノ小胞を患者に吸入によってまたは静脈内に投与する、条項２５から３３．２までのいずれか一項に記載の方法。
【０２１１】
条項３５．ナノ小胞が、対象に毎週、月２回、または毎月投与される、条項２５から３３．２までのいずれか一項に記載の方法。
【０２１２】
条項３６．対象に追加的な治療剤の治療有効量を投与するステップをさらに含む、条項２５から３５までのいずれか一項に記載の方法。
【０２１３】
条項３７．追加的な治療剤が、免疫抑制剤である、条項３６に記載の方法。
【０２１４】
条項３８．免疫抑制剤が、カルシニューリン阻害剤、抗増殖剤、ｍＴＯＲ阻害剤、および／またはステロイドである、条項３７に記載の方法。
【０２１５】
条項３９．カルシニューリン阻害剤が、タクロリムスまたはシクロスポリンであり、抗増殖剤が、ミコフェノール酸であり、ｍＴＯＲ阻害剤が、シロリムスであり、および／またはステロイドが、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン、またはコルチゾンである、条項３８に記載の方法。
【０２１６】
条項４０．対象がヒトである、条項２５から３９までのいずれか一項に記載の方法。
【０２１７】
条項４１．障害を有するまたは有するリスクがある対象における障害を処置または阻害するための方法であって、障害を有するまたは有するリスクがある対象を選択するステップと、対象に、細胞外マトリックス由来の単離されたナノ小胞の治療有効量を投与するステップであって、ナノ小胞がインターロイキン（ＩＬ）−３３を含有し、リシルオキシダーゼを含み、ナノ小胞が、ａ）ＣＤ６３もＣＤ８１も発現しないか、またはｂ）ＣＤ６３ｌｏＣＤ８１ｌｏである、ステップとを含み、それにより、対象における障害が処置または阻害され、障害が、実質臓器移植片拒絶である、方法。
【０２１８】
条項４２．細胞外マトリックスが、哺乳動物細胞外マトリックスである、条項４１に記載の方法。
【０２１９】
条項４３．哺乳動物細胞外マトリックスが、ヒト細胞外マトリックスである、条項４２に記載の方法。
【０２２０】
条項４４．細胞外マトリックスが、食道組織、膀胱、小腸粘膜下組織、真皮、臍帯、心膜、心臓組織、または骨格筋に由来する、条項４１から４３までのいずれか一項に記載の方法。
【０２２１】
条項４５．ナノ小胞が、ｍｉＲ−１４５および／またはｍｉＲ−１８１を含む、条項４１から４３までのいずれか一項に記載の方法。
【０２２２】
条項４６．ナノ小胞が、移植された実質臓器に投与される、条項４１から４５までのいずれか一項に記載の方法。
【０２２３】
条項４７．移植された実質臓器が、心臓である、条項４６に記載の方法。
【０２２４】
条項４７．１．移植された実質臓器が、肺、腎臓または肝臓である、条項４６に記載の方法。
【０２２５】
条項４８．ナノ小胞が、静脈内に投与される、条項４１から４７．１までのいずれか一項に記載の方法。
【０２２６】
条項４９：ナノ小胞が、吸入によって投与される、条項４１から４６までおよび４７．１のいずれか一項に記載の方法。
【０２２７】
条項５０．ナノ小胞が、対象に毎週、月２回、または毎月投与される、条項４１から４９までのいずれか一項に記載の方法。
【０２２８】
条項５１．対象に追加的な治療剤の治療有効量を投与するステップをさらに含む、条項４１から５０までのいずれか一項に記載の方法。
【０２２９】
条項５２．追加的な治療剤が、免疫抑制剤である、条項５１に記載の方法。
【０２３０】
条項５３．免疫抑制剤が、カルシニューリン阻害剤、抗増殖剤、ｍＴＯＲ阻害剤、および／またはステロイドである、条項５２に記載の方法。
【０２３１】
条項５４．カルシニューリン阻害剤が、タクロリムスまたはシクロスポリンであり、抗増殖剤が、ミコフェノール酸であり、ｍＴＯＲ阻害剤が、シロリムスであり、および／またはステロイドが、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン、またはコルチゾンである、条項５３に記載の方法。
【０２３２】
条項５５．対象がヒトである、条項４１から５４までのいずれか一項に記載の方法。
【０２３３】
条項５５．１．実質臓器移植片拒絶が急性拒絶である、条項４１から５５までのいずれか一項に記載の方法。
【０２３４】
条項５５．２．実質臓器移植片拒絶が慢性拒絶である、条項４１から５５までのいずれか一項に記載の方法。
【０２３５】
条項５６．障害を有するまたは有するリスクがある対象における障害を処置または阻害するための方法であって、障害を有するまたは有するリスクがある対象を選択するステップと、対象に、細胞外マトリックス由来の単離されたナノ小胞の治療有効量を投与するステップであって、ナノ小胞がインターロイキン（ＩＬ）−３３を含有し、リシルオキシダーゼを含み、ナノ小胞が、ａ）ＣＤ６３もＣＤ８１も発現しないか、またはｂ）ＣＤ６３ｌｏＣＤ８１ｌｏである、ステップとを含み、それにより、対象における障害が処置または阻害され、障害が、心筋梗塞でも心筋虚血でもない心疾患である、方法。
【０２３６】
条項５７．細胞外マトリックスが、哺乳動物細胞外マトリックスである、条項５６に記載の方法。
【０２３７】
条項５８．哺乳動物細胞外マトリックスが、ヒト細胞外マトリックスである、条項５７に記載の方法。
【０２３８】
条項５９．細胞外マトリックスが、食道組織、膀胱、小腸粘膜下組織、真皮、臍帯、心膜、心臓組織、または骨格筋に由来する、条項５６から５８までのいずれか一項に記載の方法。
【０２３９】
条項６０．ナノ小胞が、ｍｉＲ−１４５および／またはｍｉＲ−１８１を含む、条項５５から５８までのいずれか一項に記載の方法。
【０２４０】
条項６１．心疾患が、心不全または心虚血である、条項５６から６０までのいずれか一項に記載の方法。
【０２４１】
条項６２．心疾患が、急性冠状動脈症候群、慢性安定狭心症、不安定狭心症、血管形成術、一過性脳虚血発作、虚血性再灌流傷害、跛行、血管閉塞、動脈硬化症、心不全、慢性心不全、急性非代償性心不全、心肥大、心臓線維症、大動脈弁疾患、大動脈弁または僧帽弁狭窄症、心筋症、心房細動、心不整脈、および心膜疾患を含む、条項５６から６０までのいずれかに記載の方法。
【０２４２】
条項６３．ナノ小胞が、静脈内に投与される、条項５５から６２までのいずれか一項に記載の方法。
【０２４３】
条項６４．ナノ小胞が、対象に毎週、月２回、または毎月投与される、条項５５から６２までのいずれか一項に記載の方法。
【０２４４】
条項６５．対象に追加的な治療剤の治療有効量を投与するステップをさらに含む、条項５５から６４までのいずれか一項に記載の方法。
【０２４５】
条項６６．対象がヒトである、条項５５から６５までのいずれか一項に記載の方法。
【０２４６】
条項６６．１．心障害が心不全である、条項５５から６６までのいずれか一項に記載の方法。
【０２４７】
条項６６．２．心障害が心筋症である、条項５５から６６までのいずれか一項に記載の方法。
【０２４８】
条項６６．３．心障害が虚血性再灌流傷害である、条項５５から６６までのいずれか一項に記載の方法。
【０２４９】
条項６７．対象における障害の処置または阻害に使用するための組成物であって、細胞外マトリックス由来の単離されたナノ小胞の治療有効量を含み、ナノ小胞が、インターロイキン（ＩＬ）−３３を含有し、リシルオキシダーゼを含み、ナノ小胞が、ａ）ＣＤ６３もＣＤ８１も発現しないか、またはｂ）ＣＤ６３ｌｏＣＤ８１ｌｏであり、障害が、ａ）臓器もしくは組織の線維症；ｂ）実質臓器移植片拒絶；またはｃ）心筋梗塞ではない心疾患である、組成物。
【０２５０】
条項６８．細胞外マトリックスが、哺乳動物細胞外マトリックスである、条項６７に記載の組成物。
【０２５１】
条項６９．哺乳動物細胞外マトリックスが、ヒト細胞外マトリックスである、条項６７に記載の組成物。
【０２５２】
条項７０．細胞外マトリックスが、食道組織、膀胱、小腸粘膜下組織、真皮、臍帯、心膜、心臓組織、または骨格筋に由来する、条項６７〜６９のいずれか一項に記載の組成物。
【０２５３】
条項７１．ナノ小胞が、ｍｉＲ−１４５および／またはｍｉＲ−１８１を含む、条項６７〜７０のいずれか一項に記載の組成物。
【０２５４】
条項７２．障害が、実質臓器移植片拒絶であり、対象が、移植された実質臓器のレシピエントである、条項６７〜７１のいずれか一項に記載の組成物。
【０２５５】
条項７３．ナノ小胞が、移植された実質臓器への投与のために製剤化される、条項７０に記載の組成物。
【０２５６】
条項７４．移植された実質臓器が、心臓である、条項７３に記載の組成物。
【０２５７】
条項７５．障害が、心疾患である、条項６５〜７１のいずれか一項に記載の組成物。
【０２５８】
条項７６．心疾患が、心不全または心虚血である、条項７５に記載の組成物。
【０２５９】
条項７７．心疾患が、急性冠状動脈症候群、慢性安定狭心症、不安定狭心症、血管形成術、一過性脳虚血発作、虚血性再灌流傷害、跛行、血管閉塞、動脈硬化症、心不全、慢性心不全、急性非代償性心不全、心肥大、心臓線維症、大動脈弁疾患、大動脈弁または僧帽弁狭窄症、心筋症、心房細動、心不整脈、および心膜疾患を含む、条項７５に記載の組成物。
【０２６０】
条項７８．ナノ小胞が、静脈内投与用に製剤化される、条項６７〜７７のいずれか一項に記載の組成物。
【０２６１】
条項７９．障害が、臓器または組織の線維症である、条項６７〜７１のいずれか一項に記載の組成物。
【０２６２】
条項８０．線維症が、肝硬変、肺線維症、心臓線維症、縦隔線維症、関節線維症、骨髄線維症、腎性全身性線維症、ケロイド線維症、強皮症線維症、腎線維症、リンパ組織線維症、動脈線維症、毛細血管線維症、血管線維症、または膵線維症である、条項７９に記載の組成物。
【０２６３】
条項８１．線維症が、肺線維症である、条項８０に記載の組成物。
【０２６４】
条項８２．線維症が、心臓線維症である、条項８０に記載の組成物。
【０２６５】
条項８３．心臓線維症が、
ａ）肥大型心筋症、サルコイドーシス、慢性腎不全、中毒性心筋症、虚血再灌流傷害、急性臓器拒絶、慢性臓器拒絶、老化、慢性高血圧症、非虚血性拡張型心筋症、不整脈、アテローム性動脈硬化症、ＨＩＶ関連慢性血管疾患、および肺高血圧症；または
ｂ）心筋梗塞もしくは心筋虚血
によって引き起こされる、条項８２に記載の組成物。
【０２６６】
条項８３．ナノ小胞が、患者に吸入によって投与される、条項６７〜８１のいずれか一項に記載の組成物。
【０２６７】
条項８４．ナノ小胞が、対象に毎週、月２回、または毎月投与される、条項６７〜８３のいずれか一項に記載の組成物。
【０２６８】
条項８５．追加的な治療剤の治療有効量をさらに含む、条項６７〜８４のいずれか一項に記載の組成物。
【０２６９】
条項８６．追加的な治療剤が、免疫抑制剤である、条項８５に記載の組成物。
【０２７０】
条項８７．免疫抑制剤が、カルシニューリン阻害剤、抗増殖剤、ｍＴＯＲ阻害剤、および／またはステロイドである、条項８６に記載の組成物。
【０２７１】
条項８８．カルシニューリン阻害剤が、タクロリムスまたはシクロスポリンであり、抗増殖剤が、ミコフェノール酸であり、ｍＴＯＲ阻害剤が、シロリムスであり、および／またはステロイドが、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン、またはコルチゾンである、条項８７に記載の組成物。
【０２７２】
条項８９．対象がヒトである、条項６７〜８８のいずれか一項に記載の組成物。
【０２７３】
条項９０．筋芽細胞分化を増大させるための方法であって、
筋芽細胞に細胞外マトリックス由来の単離されたナノ小胞の有効量を接触させるステップであって、ナノ小胞が、インターロイキン（ＩＬ）−３３を含有し、リシルオキシダーゼを含み、ナノ小胞が、ａ）ＣＤ６３もＣＤ８１も発現しないか、またはｂ）ＣＤ６３ｌｏＣＤ８１ｌｏである、ステップを含み、
それにより、筋芽細胞分化を増大させる方法。
【０２７４】
条項９１．筋芽細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにある、条項９０に記載の方法。
【０２７５】
条項９２．細胞外マトリックスが、哺乳動物細胞外マトリックスである、条項９０または条項９１に記載の方法。
【０２７６】
条項９３．哺乳動物細胞外マトリックスが、ヒト細胞外マトリックスである、条項９２に記載の方法。
【０２７７】
条項９４．細胞外マトリックスが、食道組織、膀胱、小腸粘膜下組織、真皮、臍帯、心膜、心臓組織、または骨格筋に由来する、条項９０から９３までのいずれか一項に記載の方法。
【０２７８】
条項９５．ナノ小胞が、ｍｉＲ−１４５および／またはｍｉＲ−１８１を含む、条項９０から９４までのいずれか一項に記載の方法。
【０２７９】
条項９６．筋芽細胞が、哺乳動物対象内にある、条項９０から９５までのいずれか一項に記載の方法。
【０２８０】
条項９７．哺乳動物対象がヒトである、条項９６に記載の方法。
【０２８１】
条項９８．障害を有するまたは有するリスクがある対象における障害を処置または阻害するための方法であって、障害を有するまたは有するリスクがある対象を選択するステップと、対象に、細胞外マトリックス由来の単離されたナノ小胞の治療有効量を投与するステップであって、ナノ小胞がインターロイキン（ＩＬ）−３３を含有し、リシルオキシダーゼを含み、ナノ小胞が、ａ）ＣＤ６３もＣＤ８１も発現しないか、またはｂ）ＣＤ６３ｌｏＣＤ８１ｌｏである、ステップとを含み、それにより、対象における障害が処置または阻害され、障害が、心筋梗塞または心筋虚血である、方法。
【０２８２】
条項９９．細胞外マトリックスが、哺乳動物細胞外マトリックスである、条項９８に記載の方法。
【０２８３】
条項１００．哺乳動物細胞外マトリックスが、ヒト細胞外マトリックスである、条項９９に記載の方法。
【０２８４】
条項１０１．細胞外マトリックスが、食道組織、膀胱、小腸粘膜下組織、真皮、臍帯、心膜、心臓組織、または骨格筋に由来する、条項９８から１００までのいずれか一項に記載の方法。
【０２８５】
条項１０２．ナノ小胞が、ｍｉＲ−１４５および／またはｍｉＲ−１８１を含む、条項９８から１０１までのいずれか一項に記載の方法。
【０２８６】
条項１０３．障害が、心筋虚血である、条項９８から１０２までのいずれか一項に記載の方法。
【０２８７】
条項１０４．障害が、心筋梗塞である、条項９８から１０２までのいずれかに記載の方法。
【０２８８】
条項１０５．ナノ小胞が、静脈内に投与される、条項９８から１０４までのいずれか一項に記載の方法。
【０２８９】
条項１０６．ナノ小胞が、対象に毎週、月２回、または毎月投与される、条項９８から１０５までのいずれか一項に記載の方法。
【０２９０】
条項１０７．対象に追加的な治療剤の治療有効量を投与するステップをさらに含む、条項９８から１０６までのいずれか一項に記載の方法。
【０２９１】
条項１０８．対象がヒトである、条項９８から１０７までのいずれか一項に記載の方法。
【０２９２】
本開示を以下の非限定的な実施例によって例示する。
【実施例】
【０２９３】
心筋虚血は、損傷を受けた心筋細胞（ｃａｒｄｉａｃ  ｍｙｏｃｙｔｅ）が線維芽細胞および付随する過剰な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）により置き換えられた後に線維症を引き起こし、これにより、心筋硬直および心不全の増大がもたらされる。線維症はまた、移植（Ｔｘ）後１１年以内に移植片の＞５０％の喪失を引き起こす慢性心臓同種異系移植片拒絶にも寄与する。心臓傷害後の線維症を防止するまたは逆転させるために利用可能な治療モダリティは存在しない。
【０２９４】
免疫抑制剤は、同種異系移植片線維症をもたらす病原性リモデリングプロセスに対しては効果がない。ＩＬ−３３は、一般には間質細胞の核に見いだされ、一般に、組織損傷後に放出されてＩＬ−３３受容体、ＳＴ２を介して免疫細胞を活性化するアラーミン、または自己由来分子とみなされる、ＩＬ−１ファミリーメンバーである。新たなエビデンスにより、ＩＬ３３がＳＴ２＋調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を刺激することによって心血管および骨格筋修復を促進することが示されている。しかし、以前に記載された、ＩＬ−３３を使用して組織修復を促進する方法は、可溶性ＩＬ−３３サイトカインの使用だけに依拠するものであり、ＳＴ２を発現する細胞が多数あることを考慮すると、オフターゲット効果を有する可能性がある。ＩＬ−３３を送達するための新しい方法、および、これだけに限定されないが心疾患などの、ＩＬ−３３が役割を果たす種々の状態の新しい処置方法が依然として必要とされる。
【０２９５】
ＥＣＭ足場は、心臓の修復を含めた多数の臨床的適用に関してＦＤＡに承認されている。心筋梗塞後のＥＣＭハイドロゲルの心臓内注射の使用に関して調査する第Ｉ相試験が現在進行中であるが、ＥＣＭにより心臓組織リモデリングが方向付けられる機構は部分的にしか分かっていない。ＥＣＭ足場に包埋されたマトリックス結合型ナノ小胞（ＭＢＶ）が核外インターロイキン−３３（ＩＬ−３３）の豊富な供給源であることが本明細書に開示される。ｂＩＬ−３３は、一般には間質細胞の核に見いだされ、一般に、免疫系に細胞傷害を警告し、その結果、ＩＬ−３３受容体であるＳＴ２を伴う炎症促進性メディエーターの産生をもたらすアラーミンとみなされる。エビデンスから、ＩＬ−３３が、特に心臓ストレス後のＩＬ−３３の誘導が転帰の改善と相関している心血管疾患のモデルにおいて、組織修復のプロモーターとして機能し得ることが示唆される。ＩＬ−３３がＥＣＭ内に安定に貯蔵され、ＭＢＶに組み入れられることによる不活化から保護されることが決定された。結果から、ＩＬ３３＋／＋マウス組織由来のＭＢＶでは修復性リモデリング促進性Ｍ２表現型へのＳＴ２−／−マクロファージ分化が方向付けられるが、ＩＬ３３−／−マウス組織由来のＭＢＶではそれが方向付けられないことが示され、さらに、ＭＢＶに関連するＩＬ−３３によりマクロファージの活性化が非標準ＳＴ２非依存性経路によってモジュレートされることが示唆される。ＩＬ−３３がＥＣＭ−ＭＢＶの不可欠な構成要素であることの発見により、免疫により駆動される病理学的線維症の調節に関する機構的洞察がもたらされる。ＥＣＭ足場を心臓の修復のために使用することができる。
（実施例１）
ＥＣＭ生体足場から単離されたマトリックス結合型ナノ小胞は全長ＩＬ−３３を含有する
【０２９６】
ＭＢＶのＥＣＭ生体足場からの単離およびｍｉＲＮＡカーゴの特徴付けは以前に記載されている（Ｈｕｌｅｉｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉ  Ａｄｖ  ２，  ｅ１６００５０２  （２０１６）；Ｈｕｌｅｉｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  ｐａｒｔ  Ａ  ２３，  １２８３−１２９４  （２０１７））。ＭＢＶに関連するタンパク質シグナル伝達分子を同定するために、予備的なサイトカイン、ケモカイン、および成長因子スクリーニングを、脱細胞化野生型（ｗｔ）マウス小腸または脱細胞化ｉｌ３３−／−マウス小腸から単離されたＭＢＶを用い、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍのＭｏｕｓｅ  ＸＬ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ａｒｒａｙ  Ｋｉｔを使用して実施した（図１Ａ）。ＭＢＶの発現レベルが最も高いタンパク質の定量から、ＩＬ−３３が、ｗｔマウスから単離されたＭＢＶ（ＩＬ３３＋ＭＢＶ）においてｉｌ３３−／−マウスから単離されたＭＢＶ（ＩＬ３３−ＭＢＶ）と比較して高度に発現され、単離されたＭＢＶ中に存在する他のタンパク質の発現の差は最小であったことが示された（図１Ｂ）。さらに、脱細胞化ＷＴマウス腸から単離されたＭＢＶの透過型電子顕微鏡検査イメージングから、これらの小胞が直径およそ１００ｎｍであることが示された（図１Ｃ）。サイトカインスクリーニングからの結果を免疫ブロット分析によってさらに検証し、それにより、ＭＢＶに関連するＩＬ−３３がタンパク質の全長（３２ｋＤａ）形態であり（図１Ｄ）、より小さな記載された切断産物ではないことが示された（Ｌｅｆｒａｎｃａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０９，  １６７３−１６７８  （２０１２）；Ｃａｙｒｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９，  ３７５  （２０１８））。その後、ＭＢＶにおける全長ＩＬ−３３発現の存在を、臨床的適用に一般に使用されるＥＣＭ外科用メッシュで観察し、これには、実験室で作製したものおよび市販の等価物、膀胱マトリックス（ＵＢＭ）およびＡＣＥＬＬ（登録商標）ＭＡＴＲＩＳＴＥＭ（商標）；小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）およびＣｏｏｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（登録商標）ＢＩＯＤＥＳＩＧＮ（商標）；真皮およびＢＤ（登録商標）ＸＥＮＭＡＴＲＩＸ（商標）；ならびに心臓ＥＣＭを含めた（図１Ｅ）。結果から、実験室で作製した足場におけるＩＬ−３３発現レベルがそれらのそれぞれの市販の対応物と同様であることが示され、これにより、これらの結果が実験室での製造プロトコールのアーチファクトではないことが示される。
（実施例２）
ＩＬ−３３はＭＢＶの内腔内に貯蔵され、タンパク質分解から保護される
【０２９７】
検出されたＩＬ−３３がＭＢＶ単離プロセスの夾雑物ではないことを検証するために、ＭＢＶを、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ＣＬ−２Ｂ樹脂を使用し、分子ふるいクロマトグラフィー（ＳＥＣ）により、溶出画分を２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度によって連続的にモニタリングしながらさらに精製した（図２Ａ）。免疫ブロット分析により、重ＭＢＶ画分中にＩＬ−３３が存在することが確認された（図２Ｂ、上のパネル）。別の実験において、ＭＢＶをまず、１％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００を用いて溶解させ、次いで、抽出物をＳＥＣによって分析した。ＵＶクロマトグラムにおけるシフト（図２Ａ）、および免疫ブロット分析（図２Ｂ、下のパネル）によって決定された通り、結果から、溶解したＭＢＶ由来の分子成分がより軽い画分中に主に溶出したことが示される。さらに、プール画分６〜８の透過型電子顕微鏡検査により、これらの画分中に小胞が存在することが示された（図２Ｃ）。これらの結果から、ＩＬ−３３がＭＢＶに付随しており、ＭＢＶ単離物の可溶性夾雑物ではないことが確認された。次に、ＩＬ−３３がＭＢＶの表面膜上に存在するのか、それとも内腔内に貯蔵されているのかを決定した。画分６〜８由来のプールされたＭＢＶをＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンでビオチン化した。スルホン酸基によりビオチンが脂質膜を透過することが妨げられ、それにより、外表面タンパク質のみが標識される（Ｄｉａｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｒｅｐｏｒｔｓ  ６，  ３７９７５  （２０１６））。ビオチン化後、ＭＢＶを溶解させ、ストレプトアビジンプルダウンアッセイに供して、表面タンパク質を結合していない内腔成分から分画した。免疫ブロット分析から、ＩＬ−３３が結合していない画分中にのみ存在し、トレプトアビジン（ＳＡ）ビーズによってプルダウンされなかったことが示された（図２Ｄ）。別の実験において、ＭＢＶをまず、１％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００を用いて溶解させ、次いで、ビオチン化に供した。これにより、ＭＢＶの表面成分および内腔成分の両方をビオチン化することが可能になった。免疫ブロット分析から、ストレプトアビジンプルダウン後、ＩＬ−３３はＳＡビーズに結合していることが示された（図２Ｄ）。累積的に、これらのデータから、ＩＬ−３３がＭＢＶの内腔内に貯蔵されていることが示唆された。これらの結果を確認するために、プロテイナーゼＫ保護アッセイを実施した。プール画分６〜８由来のＭＢＶを、漸増濃度のプロテイナーゼＫと一緒に、１％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００の非存在または存在下、３７℃で３０分間インキュベートした。免疫ブロット分析によって示された通り（図２Ｅ）、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００の非存在下では、ＩＬ−３３はプロテイナーゼＫによって分解されなかった。しかし、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００によるＭＢＶ膜の透過処理により、ＩＬ−３３がプロテイナーゼＫに到達可能になり、ＩＬ−３３がプロテイナーゼＫの影響を受けやすくなり、その結果、ＩＬ−３３の分解がもたらされる（図２Ｅ）。これらの結果から、ＭＢＶに関連するＩＬ−３３が小胞膜の内腔内に存在し、そこでタンパク質分解から保護されることが確認された。
（実施例３）
ＩＬ３３＋ＭＢＶはリモデリング促進性マクロファージ表現型を非標準ＳＴ２非依存性経路によって活性化する
【０２９８】
ＩＬ−３３＋またはＩＬ−３３−ＭＢＶの骨髄細胞に対する影響に関する広範囲にわたる機構的調査をｉｎ−ｖｉｔｒｏで行った。ＭＢＶの内腔内のＩＬ−３３の位置を考慮すると、ＩＬ−３３を封入することにより、その同類のＳＴ２受容体への結合が妨げられると仮定され、ＳＴ２非依存性形質導入機構の存在が示唆される。このシナリオを調査するために、Ｂ６  ｗｔマウス（図３Ａ）またはｓｔ２−／−マウス（図３Ｂ）から単離された骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を、Ｍ１様マクロファージ表現型を誘導するためにインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）およびリポ多糖（ＬＰＳ）を用いて刺激し、Ｍ２様表現型を誘導するためにインターロイキン−４（ＩＬ−４）を用いて刺激し、組換えＩＬ−３３、脱細胞化ｗｔマウス腸から単離されたＭＢＶ（ＩＬ３３＋ＭＢＶ）、またはｉｌ３３−／−マウス腸（ＩＬ３３−ＭＢＶ）、またはブタ小腸粘膜下組織から単離されたＭＢＶ（ＳＩＳ  ＭＢＶ）を用いて刺激した。結果から、マクロファージが、ＩＬ−４により刺激された（Ｍ２）細胞の発現パターンと同様に、ＳＩＳ  ＭＢＶおよびＩＬ３３＋ＭＢＶに応答してアルギナーゼ１（Ａｒｇ−１）を発現したことが示された（図３Ａ、３Ｄ）。対照的に、ＩＬ３３−ＭＢＶではｉＮＯＳの発現が誘導されたが、Ａｒｇ−１の発現は誘導されなかった（図３Ａ、３Ｃ）。ｓｔ２−／−マウスから単離されたマクロファージを用いて同様の効果が観察された。具体的には、ＩＬ３３＋ＭＢＶではｓｔ２−／−マクロファージの修復性のリモデリング促進性Ｍ２様表現型への活性化が方向付けられたが、ＩＬ３３−ＭＢＶではそれが方向付けられなかった（図３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ）。その後、免疫標識アッセイからの結果をウエスタンブロット分析によって確認し、それにより、マクロファージをＩＬ３３＋ＭＢＶで刺激することによりＡｒｇ−１発現の上方調節を誘導することができるが、ＩＬ３３−ＭＢＶではそれができないことが示された（図４Ａ）。さらに、ＩＬ３３＋ＭＢＶはＭ２マクロファージをＳＴＡＴ６リン酸化非依存的に活性化するので、このＩＬ３３＋ＭＢＶのＡｒｇ−１発現を誘導する能力は、よく特徴付けられたＩＬ−４／ＩＬ−１３媒介性Ｍ２マクロファージ分化経路とは別個であることが示された（図４Ｂ）。これらのデータから、ＭＢＶに関連するＩＬ−３３が、特徴付けられていない非標準ＳＴ２非依存性経路を通じてマクロファージの活性化をモジュレートすることが実証される。
（実施例４）
マクロファージ分泌物への曝露後の骨格筋前駆細胞の筋形成の評価
【０２９９】
選択的に活性化されるＭ２マクロファージに関連するセクレトームは骨格筋芽細胞の筋原性であることが示されている４１，４２。以前に、本発明者らは、ＥＣＭで処理したマクロファージによって条件付けした培地によりＣ２Ｃ１２筋芽細胞の筋管形成およびサルコメアミオシン発現が促進されることを示した４３。本試験は、ＩＬ３３＋ＭＢＶを用いて刺激したマクロファージによって条件付けした培地により、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞の筋管形成がＩＬ−４により誘導されたＭ２様マクロファージの生物学的活性と同様に促進されるが、ＩＬ３３−ＭＢＶを用いて刺激したマクロファージによって条件付けした培地ではそれが促進されないという点で、同様の結果を示す
（図５Ａ、Ｂ）。
（実施例５）
実施例１〜４の材料および方法
【０３００】
マウス腸の脱細胞化：新鮮な小腸を成体野生型（ｗｔ）Ｂ６マウスまたは成体ＩＬ−３３−／−Ｂ６マウスから得た。小腸をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄して、腸の内容物全てを完全に除去し、即時脱細胞化のために各腸から１．５ｃｍの長さの断片を得た。試料を以前に記載されている通り（Ｏｌｉｖｅｉｒａ  ＡＣ，  ｅｔ  ａｌ．  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ．  ２０１３；  ８  （６）：  ｅ６６５３８）脱細胞化した。簡単に述べると、試料をまず、５ＭのＮａＣｌ中に、連続した穏やかな撹拌の下で７２時間にわたって浸漬した。脱細胞化溶液を２４時間ごとに交換した。次いで、マウス腸ＥＣＭを凍結乾燥させ、Ｗｉｌｅｙ  Ｍｉｌｌを使用し、＃４０メッシュスクリーンを用いて破砕して微粒子にした。
【０３０１】
皮膚ＥＣＭの調製：皮膚ＥＣＭを以前に記載されている通り調製した（Ｒｅｉｎｇ  ＪＥ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．  ２０１０；  ３１  （３３）：  ８６２６−３３）。簡単に述べると、市場体重（約１１０ｋｇ）ブタ（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｃ．）から全層皮膚を回収し、皮下脂肪および表皮を機械的層剥離によって除去した。次いで、この組織を０．２５％トリプシン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で６時間、７０％エタノールで１０時間、３％Ｈ２Ｏ２で１５分間、０．２６％ＥＤＴＡ／０．６９％トリス中１％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で６時間、溶液を交換してさらに１６時間、および０．１％過酢酸／４％エタノール（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ  Ｍｉｄｌａｎｄ）で２時間処理した。各化学物質の変更の間に水洗浄を実施し、最終ステップ後に水洗浄とリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）洗浄を交互に実施した。化学的曝露は全てオービタルシェーカーにおいて３００ｒｐｍで撹拌しながら行った。次いで、皮膚ＥＣＭを凍結乾燥させ、Ｗｉｌｅｙ  Ｍｉｌｌを使用し、＃４０メッシュスクリーンを用いて破砕して微粒子にした。
【０３０２】
膀胱マトリックス（ＵＢＭ）の調製：ＵＢＭを以前に記載されている通り調製した（Ｍａｓｅ  ＶＪ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ．  ２０１０；  ３３  （７）：  ５１１）。市場体重動物由来のブタ膀胱をＴｉｓｓｕｅ  Ｓｏｕｒｃｅ，ＬＬＣから取得した。簡単に述べると、漿膜、外筋層、粘膜下層、および筋層粘膜を機械的に除去した。粘膜の管腔尿路上皮細胞を脱イオン水で洗浄することによって基底膜から解離させた。残りの組織は基底膜および下にある粘膜の固有層からなり、４％エタノールを含む０．１％過酢酸中、３００ｒｐｍで２時間にわたって撹拌することによって脱細胞化した。次いで、組織をＰＢＳおよび滅菌水で広範囲にわたってすすいだ。次いで、ＵＢＭを凍結乾燥させ、Ｗｉｌｅｙ  Ｍｉｌｌを使用し、＃６０メッシュスクリーンを用いて破砕して微粒子にした。
【０３０３】
小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）の調製：ＳＩＳを以前に記載されている通り調製した（Ｂａｄｙｌａｋ  ＳＦ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｒｅｓ．  １９８９；  ４７  （１）：  ７４−８０）。簡単に述べると、６カ月齢の市場体重（約１１０〜約１２０ｋｇ）ブタから空腸を回収し、縦方向に開裂した。粘膜の表層を機械的に除去した。同様に、漿膜および外筋層を機械的に除去し、粘膜下層および粘膜の基底部分を残した。４％エタノールを含む０．１％過酢酸中、３００ｒｐｍで２時間にわたって撹拌することによって組織の脱細胞化および消毒を完了した。次いで、組織をＰＢＳおよび滅菌水で広範囲にわたってすすいた。次いで、ＳＩＳを凍結乾燥させ、Ｗｉｌｅｙ  Ｍｉｌｌを使用し、＃６０メッシュスクリーンを用いて破砕して微粒子にした。
【０３０４】
心臓ＥＣＭの調製：心臓ＥＣＭを以前に記載されている通り調製した（Ｗａｉｎｗｒｉｇｈｔ  ＪＭ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２０１０；１６（３）：５２５−３２）。簡単に述べると、ブタ心臓を安楽死の直後に得、−８０℃で少なくとも１６時間にわたって凍結させ、解凍した。大動脈にカニューレを挿入し、１型試薬グレード（１型）水および２×ＰＢＳを交互にそれぞれ毎分１リットルで１５分間灌流させた。０．０２％トリプシン／０．０５％ＥＤＴＡ／０．０５％ＮａＮ３を３７℃で、３％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００／０．０５％ＥＤＴＡ／０．０５％ＮａＮ３、および４％デオキシコール酸の段階的な灌流を行った（それぞれ毎分およそ１．２リットルで２時間）。最後に、心臓に０．１％過酢酸／４％ＥｔＯＨを毎分１．７リットルで１時間にわたって灌流させた。各化学溶液の後、１型水および２×ＰＢＳを心臓に流して、細胞溶解ならびに細胞デブリおよび化学残留物の除去を補助した。次いで、心臓ＥＣＭを凍結乾燥させ、Ｗｉｌｅｙ  Ｍｉｌｌを使用し、＃６０メッシュスクリーンを用いて破砕して微粒子にした。
【０３０５】
マトリックス結合型ナノ小胞（ＭＢＶ）の単離：ＭＢＶを以前に記載されている通り単離した（Ｈｕｌｅｉｈｅｌ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉ  Ａｄｖ．  ２０１６；２（６）：  ｅ１６００５０２）。簡単に述べると、酵素により消化されたＥＣＭを５００ｇ（１０分間）、２５００ｇ（２０分間）、および１０，０００ｇ（３０分間）での連続的な遠心分離に供して、コラーゲン原線維レムナントを除去した。上記の遠心分離ステップをそれぞれ３回実施した。次いで、線維を含まない上清を４℃、１００，０００ｇで７０分間にわたって遠心分離した（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｏｐｔｉｍａ  Ｌ−９０Ｋ  ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）。１００，０００ｇのペレットを洗浄し、ＰＢＳ  ５００μｌ中に懸濁させ、０．２２μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通過させた。
【０３０６】
サイトカイン抗体アレイ：ＭＢＶ内に貯蔵されたサイトカインを、Ｍｏｕｓｅ  ＸＬ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ａｒｒａｙ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）を使用し、製造者の指示に従って分析した。脱細胞化ＷＴマウス腸（ｎ＝３）または脱細胞化ＩＬ−３３−／−マウス腸（ｎ＝３）から単離されたＭＢＶから抽出物を調製した。抽出物を希釈し、アレイ膜と一緒に終夜インキュベートした。アレイをすすいで非結合タンパク質を除去し、抗体カクテルと一緒にインキュベートし、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼおよび化学発光検出試薬を使用して展開した。Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを使用して平均スポット画素密度を定量した。
【０３０７】
透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）：以前に記載されている通り炭素をコーティングしたグリッドにローディングし、４％パラホルムアルデヒド中に固定したＭＢＶに対してＴＥＭイメージングを行った（Ｈｕｌｅｉｈｅｌ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉ  Ａｄｖ．  ２０１６；２（６）：  ｅ１６００５０２）。グリッドを８０ｋＶにおいて高解像度Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓデジタルカメラを備えたＪＥＯＬ  １２１０  ＴＥＭを用いてイメージングした。ＪＥＯＬ  ＴＥＭソフトウェアを使用して代表的な画像からＭＢＶのサイズを決定した。
【０３０８】
分子ふるいクロマトグラフィー（ＳＥＣ）：ＳＥＣによるＭＢＶの分画を以前に記載されている通り実施した（Ｂｏｉｎｇ，  ＡＮ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｌｅｓ．  ２０１４；  ３（１））。簡単に述べると、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−２Ｂ樹脂（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）１５ｍｌを１ｃｍ×２０ｃｍのガラスカラム中に積層し、ＰＢＳで洗浄し、平衡化した。ＭＢＶ  １ｍｌをカラムにローディングし、ＰＢＳを溶出緩衝液として使用して画分収集（画分当たり０．３ｍｌおよび合計３０画分の収集）をすぐに開始した。溶出画分を、Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  ＬＰ  ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ）を使用してＵＶ２８０ｎｍによって連続的にモニタリングした。ＭＢＶを１％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００中で３０分間インキュベートすることによって溶解したＭＢＶを調製し、次いで、上記の通りＳＥＣに供した。
【０３０９】
ＭＢＶタンパク質のビオチン化：ＭＢＶタンパク質のビオチン化を以前に記載されている通り、軽微な改変を伴って実施した（Ｄｉａｚ  Ｇ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．  ２０１６；６：  ３７９７５）。インタクトなＭＢＶ  １００マイクログラムを、１０ｍＭのスルホ−ＮＨＳ−ビオチンの非存在下または存在下、室温で３０分間インキュベートした。スルホ−ＮＨＳ−ビオチンにスルホン酸基が存在することにより、試薬がＭＢＶ膜を透過することが妨げられる。インキュベーション後、１０ｋＤａのＭＷＣＯ濾過カラムを使用して過剰なスルホ−ＮＨＳ−ビオチンを除去し、次いで、ＭＢＶを１％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００を用いて溶解させた。別の実験において、ＭＢＶ  １００マイクログラムをまず、１％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００中に溶解させた。溶解後、緩衝液交換を実施して、１％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００溶液を１×ＰＢＳで置き換えた。次いで、ＭＢＶ抽出物を１０ｍＭのスルホ−ＮＨＳ−ビオチンの非存在下または存在下、室温で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、１０ｋＤａのＭＷＣＯ濾過カラムを使用して過剰なスルホ−ＮＨＳ−ビオチンを除去した。ＭＢＶ±ビオチンまたはＭＢＶ抽出物±ビオチンを１×ＰＢＳ中５００μｌまで希釈し、予洗したストレプトアビジン−セファロース樹脂（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）５０μｌと一緒にインキュベートした。オービタルロッカーにおいて室温で２時間インキュベートした後、１０，０００×ｇで５分間にわたって遠心分離することによってストレプトアビジン−セファロース樹脂をペレット化した。結合していない画分を表す上清を新しい管に移し、樹脂を３００ｍＭのＮａＣｌで５回洗浄した。溶出緩衝液（２％ＳＤＳ、６Ｍの尿素）と一緒に室温で１５分間、次いで９６℃で１５分間インキュベートすることにより、結合したタンパク質を樹脂から溶出させた。
【０３１０】
プロテイナーゼＫ保護アッセイ：プロテイナーゼＫ保護アッセイを以前に記載されている通り実施した（ｄｅ  Ｊｏｎｇ  ＯＧ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．  ２０１６；２０（２）：  ３４２−３５０）。簡単に述べると、ＭＢＶを、ＰＢＳまたはＰＢＳ中漸増濃度のプロテイナーゼＫ中、１％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００の存在を伴ってまたは伴わずに、最終体積を試料当たり２０μｌとし、３７℃で１時間インキュベートした。１０ｍＭのＤＴＴを含む９５℃の２×Ｌａｅｍｍｌｉ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２０μｌを添加することによってアッセイを停止した。９５℃で５分間インキュベートした後、試料を免疫ブロット分析のために使用した。
【０３１１】
マクロファージの単離および活性化：マウス骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を以前に記載されている通り単離し、特徴付けた（Ｈｕｌｅｉｈｅｌ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  ｐａｒｔ  Ａ．  ２０１７；  ２３  （２１−２２）：  １２８３−１２９４）。簡単に述べると、６〜８週齢のＣ５７ｂｌ／６マウスから骨髄を回収した。骨髄から回収した細胞を洗浄し、１ｍＬ当たり細胞１×１０６個でプレーティングし、マクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）の存在下、４８時間ごとに完全培地交換を行って７日間にわたってマクロファージに分化させた。次いで、マクロファージを以下のうちの１つを用いて２４時間にわたって活性化させた：（１）ＭＩＦＮγ＋ＬＰＳ表現型（Ｍ１様）を促進するために、２０ｎｇ／ｍＬのインターフェロン−γ（ＩＦＮγ）および１００ｎｇ／ｍＬのリポ多糖（ＬＰＳ）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、（２）ＭＩＬ−４表現型（Ｍ２様）を促進するために、２０ｎｇ／ｍＬのインターロイキン（ＩＬ）−４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、（３）１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、または（４）２５μｇ／ｍＬのＷＴマウスＭＢＶ、ＩＬ−３３−／−ＭＢＶ、もしくはＳＩＳ−ＭＢＶ。３７℃でのインキュベーション期間後、細胞を滅菌ＰＢＳで洗浄し、免疫標識のために２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて固定した。
【０３１２】
マクロファージ免疫標識：非特異的結合を防止するために、細胞をＰＢＳ、０．１％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）−Ｘ、０．１％ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０、４％ヤギ血清、および２％ウシ血清アルブミンで構成されるブロッキング溶液中、室温で１時間インキュベートした。次いで、ブロッキング緩衝液を除去し、細胞を以下の一次抗体のうちの１つの溶液中でインキュベートした：（１）モノクローナル抗Ｆ４／８０（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、１：２００希釈、汎マクロファージマーカーとして、（２、３）ポリクローナル抗誘導性一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、１：１００希釈、Ｍ１様マーカーとして、および抗アルギナーゼ１（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、１：２００希釈、Ｍ２様マーカーとして。細胞を４℃で１６時間インキュベートし、一次抗体を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄した。フルオロフォアとコンジュゲートした二次抗体（Ａｌｅｘａロバ抗ウサギ４８８またはロバ抗ラット４８８；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）溶液を適当なウェルに添加し、室温で１時間置いた。次いで、抗体を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＤＡＰＩを使用して核を対比染色した。サイトカインにより活性化したマクロファージを使用して、標準曝露時間（陽性対照）を確立し、これをその後、群全体を通して一定に保持した。ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒ（Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を使用して画像を定量した。データを、処理したマクロファージを適当なＭ０培地対照と比較した、対応のないスチューデントのｔ検定、または多重比較のためにＴｕｋｅｙのポストホック検定を用いた一元配置分散分析のいずれかを使用して統計的有意性に関して解析した。データを最低Ｎ＝３の平均±標準偏差として報告した。ｐ値＜０．０５を統計的に有意であるとみなした。
【０３１３】
Ｃ２Ｃ１２筋形成アッセイ：高血清培地（２０％ウシ胎仔血清）では、細胞増殖が細胞周期内で維持され、分化が阻害される。逆に、低血清培地（１％ウシ胎仔血清、１％ウマ血清）では、細胞周期からの退出および筋管形成が誘導され、陽性対照がもたらされる。これらは、それぞれ増殖培地および分化培地と称される。筋分化潜在性を、骨格筋芽細胞の融合指数を調査することによって決定した。Ｃ２Ｃ１２骨格筋芽細胞を増殖培地中、およそ８０％集密に達するまで培養した。次いで、培地を、マクロファージ上清および増殖培地の５０：５０溶液からなる処置培地または増殖培地もしくは分化培地である対照に交換した。５〜７日後、または分化培地対照に筋管形成が示されたときに、細胞を免疫標識のために２％パラホルムアルデヒドで固定した。固定された細胞を以前に記載されたプロトコールに従って室温で１時間ブロッキングし、抗サルコメアミオシン抗体中でインキュベートした。一次インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１：２００の希釈度のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒロバ抗マウス４８８二次抗体中、室温で１時間インキュベートし、ＤＡＰＩで対比染色した。各ウェルについいて、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ顕微鏡を使用して５つの２０倍視野の画像を取得した。
（実施例６）
移植片拒絶におけるＩＬ−３３およびＭＢＶ
【０３１４】
急性心臓移植（ＨＴｘ）拒絶は、一般には、アロ抗原に対するレシピエントのＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を制御する免疫抑制剤治療によって防がれる。しかし、そのような免疫抑制治療は、慢性心臓移植拒絶（ＣＲ）に対しては効果がなく、結果生じる免疫媒介性線維症および血管リモデリングにより、移植後およそ１１年以内に進行性心筋機能不全および大多数のＨＴｘの喪失がもたらされる。最近の試験により、炎症性マクロファージ、単球、および単球由来樹状細胞（ＤＣ）などの自然免疫細胞が、移植プロセスに関連する虚血再灌流傷害（ＩＲＩ）後に放出される損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）に対するそれらの強力な炎症促進性応答に起因してＣＲにおいて重要な役割を果たすことが示されている。実質臓器にレシピエント単球およびレシピエント単球由来ＤＣが急速に浸潤し、これらが、ＣＲを開始し、持続させるアロ反応性Ｔ細胞に対する重要な局所的刺激として作用する。したがって、損傷関連分子パターンを含有する自己分子が組織傷害の間に放出され、浸潤性自然免疫細胞における炎症促進性応答を刺激することが明らかである。しかし、同じく免疫応答を制御するために傷害部位に存在する局所的な内在性の負の調節因子は十分に理解されていない。間質細胞の核内に隔離されているＩＬ−１ファミリーメンバーであるＩＬ−３３は、そのような免疫調節特性を有し得る。組換えＩＬ−３３の送達により、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）が拡大増殖すること（ｅｘｐａｎｄｉｎｇ）によって心臓移植後の移植片生存が促進される。種々の臓器のＥＣＭから単離されたＭＢＶがＩＬ−３３の豊富かつ安定な供給源であることが発見されたことが本明細書に開示される。ＩＬ−３３は核タンパク質であることが理解されているが、ＩＬ−３３を核内での隔離から解放し、ＩＬ−３３の免疫細胞に対する媒介効果を可能にする機構は欠如している。本明細書で提示されているデータから、ＭＢＶ内のＩＬ−３３が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける自然免疫細胞分化を方向付けることができる隔離されていない免疫調節性ＩＬ−３３の重要な供給源であることが確立される。
（実施例７）
ＩＬ−３３が存在しないと慢性拒絶が増加する
【０３１５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験により、マクロファージを免疫調節性かつ潜在的に修復性のＭ２サブセットにシフトさせる強力な能力が明らかになった（図３Ａ〜３Ｃ、図４Ａ〜４Ｂ）。ＭＢＶ内に位置するものを含めたＩＬ−３３の心臓移植転帰に対する影響を試験するために、ＩＬ−３３が欠損したまたはＩＬ−３３が十分であるＢｍ１２マウス由来の心臓を、野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）レシピエントマウスに移植した。これらのマウスは、核およびＭＢＶのどちらにおいてもＩＬ−３３を欠く。Ｂｍ１２マウスは、Ｈ２−Ａｂ１ｂとは３ヌクレオチドが異なり、その結果、ＷＴ  Ｂ６マウスの免疫系によって非自己であると認識される３つのアミノ酸置換が生じているＨ２−Ａｂ１ｂｍ１２を発現する。これらの試験では、ＩＬ−３３が欠損した（ＫＯ）またはＩＬ−３３が十分であるＢｍ１２移植片（ＷＴ）を、Ｂ６レシピエントに移植し、慢性拒絶に関連する血管閉塞および線維症の発生を移植後９０〜１００日目に評価した（図６Ａ〜６Ｄ）。ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＋Ｅ；図６Ａ）およびトリクローム染色（図６Ｂ）およびコンピュータ支援画像解析により、ＩＬ−３３を欠くＨＴｘでは血管症（図６Ｃ）および筋線維喪失／線維性疾患（図６Ｄ）が有意に増加することが確認された。したがって、ＩＬ−３３が全く存在しないと慢性拒絶の発生が明白に増加した。
（実施例８）
ＩＬ−３３＋ＭＢＶは移植後の炎症性骨髄細胞の生成を制御する
【０３１６】
機構的試験において、移植片ＩＬ−３３およびＩＬ−３３＋ＭＢＶの再建を完全に欠くことの影響、具体的には、このことが慢性拒絶を統合する局所的免疫細胞にどのように影響を及ぼすかを調査した。これらの試験では、白血球を単離し、術後３日目にフローサイトメトリー分析によって評価した。ナイーブＢｍ１２マウスの心臓（ナイーブ対照）から単離された白血球をベースライン対照として含めた（ｎ＝４）。フローサイトメトリー分析から代表的なドットプロット（図７Ａ〜７Ｄ）を生成し、その統計解析が示されている（Ｐ値は一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって生成した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊＊Ｐ＜０．００１）。ＩＬ−３３を欠く心臓移植により、Ｔｘ後初期に、単球由来樹状細胞（ｍｏｎｏＤＣ）（図７Ａ〜７Ｂ：ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋Ｆ４−８０ｌｏＭＨＣＩＩｈｉ）および炎症性マクロファージ（図７Ｃ〜７Ｄ；ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４−８０ｈｉＬｙ６ｃｈｉＭＨＣＩＩｈｉ）などの局所的な炎症性骨髄細胞の存在下で例示される初期の炎症反応が有意に増加した。この炎症性骨髄細胞の増加は、ＩＬ−３３＋ＭＢＶを使用した局所的ＩＬ−３３の再建によって補正することができた（図８Ａ〜８Ｄ）。これは、心臓移植片におけるＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃｈｉｍｏｎｏＤＣ（図８Ａ、８Ｃ）およびＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０ｈｉＬｙ６ｃｈｉ炎症性マクロファージ（図８Ｂ、８Ｄ）の有意な減少によって実証される。総合して、これらのデータから、ＭＢＶ内のＩＬ−３３が、移植後の移植片における炎症性骨髄細胞の生成を制御する重要な局所的因子として同定される。
【０３１７】
局所炎症の低減により、初期の拒絶およびその後の慢性拒絶の発生を制限することができる。全ての実質臓器（心臓、腎臓、肝臓、肺）が、線維性疾患および加速された血管病理を伴う一種の慢性拒絶を受ける。一般に利用される齧歯類固形移植モデルにおける所見に基づいて、他の実質臓器移植の直後の局所的ＩＬ−３３＋ＭＢＶ送達は、局所的骨髄細胞の炎症能が制限され、移植転帰の改善が促進されるように作用する。虚血時間の延長および実質臓器移植後初期の組織損傷に起因する炎症は、移植転帰不良ならびに急性および慢性拒絶の増加に関連する。逆に、虚血時間が短いことにより浸潤性の自然骨髄性細胞によって媒介される炎症反応が低減／制限される場合には、生きているドナー移植後に最良の移植転帰が観察される。移植後に利用される現行の免疫抑制剤（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔ  ａｇｅｎｔ）は、主に適応免疫細胞（Ｔ細胞およびＢ細胞）を標的とする。これらは、ステロイドを除いて、自然免疫細胞に対しては効果がない。これらの薬物は、一般には、拒絶応答を開始する自然細胞（ｉｎｎａｔｅ  ｃｅｌｌ）に対しては強力な影響を及ぼさない。したがって、自然骨髄性細胞を標的とするためのＭＢＶと適応免疫細胞を標的とする免疫抑制剤（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔ）との組合せが高度に有効な組合せである。
（実施例９）
実施例７〜８の材料および方法
【０３１８】
動物：Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）およびＢｍ１２マウスはＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。ｉｌ３３−／−マウスは、Ｓ．Ｎａｋａｅ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｏｋｙｏ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）８４からの寄贈品であった。Ｂｍ１２マウスをｉｌ３３−／−バックグラウンドに対して６回戻し交配することによりＢｍ１２×ｉｌ３３−／−マウスを生成した。Ｓｔ２−／−マウスは、元々は記載の通り８５ＢＡＬＢ／ｃバックグラウンドに対して生成されたものであり、Ｄｒ．Ａｎｎｅ  Ｓｐｅｒｌｉｎｇ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｉｃａｇｏ）から、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドに対して７回戻し交配した後のものを得た。次いで、これらのマウスをＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドに対してさらに３回戻し交配した。動物を、病原体を含まない特定の設備内に収容した。
【０３１９】
血管化心臓移植：慢性拒絶のマウスモデルにおける心臓移植ドナーとしてＨ２−Ａｂ１ｂに野生型（ＷＴ）Ｂ６マウスと比較して３つのアミノ酸置換を有するＢ６  Ｂｍ１２が一般に使用される。Ｂｍ１２マウスとＩＬ−３３欠損Ｂ６マウスを交配させることにより、慢性拒絶におけるＩＬ−３３の役割を定義することができた。Ｂｍ１２またはＢｍ１２×ｉｌ３３−／−心臓をＣ５７ＢＬ／６またはＣ５７ＢＬ／６  ｉｌ３３−／−レシピエントの腹部に異所性に移植した。簡単に述べると、ドナー心臓をレシピエントに、ドナー上行大動脈および肺動脈のそれぞれレシピエント腹大動脈および下大静脈への端側吻合によって移植した。移植片機能を毎日、心臓収縮の腹部触診によって評価した。いくつかの実験では、ＩＬ−３３＋ＭＢＶをブタ由来ＵＢＭハイドロゲル中に１ｍｇ／ｍｌのＭＢＶの最終濃度まで希釈した。移植片の再灌流後に、移植片に希釈したＭＢＶ４０μｇを含有するハイドロゲルで覆った。消化管を置き換え、移植された心臓の周囲のその正常な位置を再び占めるようにすると同時に、ハイドロゲル中のＭＢＶを心臓表面に安定に接着させた。移植片機能を、示されている回収日まで毎日、心臓収縮の腹部触診によって検証した。
【０３２０】
脾臓および移植片浸潤性白血球の単離：マウスを麻酔し、ＰＢＳ＋０．５％ヘパリンを、左心室を介し、右心室を出た流体が目に見える血液を全く含有しなくなるまで灌流させた。脾臓を単離し、機械的解離およびＲＢＸ溶解後に単一細胞浮遊液を生成した。次いで、心臓を取り出し、断片に切り、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）においてプログラムＥを使用し、Ｇｅｎｔｌｅ  ＭＡＣＳ  Ｃ管中の、３５０μ／ｍｌのＩＶ型コラゲナーゼおよび１μｌ／ｍｌのＤＮＡｓｅ  Ｉを含有する培地中でホモジナイズした。次いで、４０μｍの細胞濾過器を使用した濾過および１５００ｇでのＬｙｍｐｈｏｌｙｔｅ−Ｍ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）密度勾配で２０分間の遠心分離によって単一細胞浮遊液を得た。細胞を間期にＰａｓｔｅｕｒピペットを使用して取り出し、洗浄、細胞計数、および分析のために新しい管に移した。
【０３２１】
フローサイトメトリー：単離された脾細胞および移植片浸潤性白血球を、熱失活させたヤギ血清（５％）と一緒にインキュベートしてＦｃＲをブロックし、生／死識別染色で処理し、次いで、蛍光色素とコンジュゲートしたＡｂの種々の組合せ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅまたはＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で標識して骨髄性細胞集団を評価した。ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でデータを取得し、ＦｌｏｗＪｏ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．１（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を使用して解析した。
【０３２２】
組織学的および免疫組織化学染色：ナイーブマウスの心臓および心臓移植片をホルマリン固定し、パラフィン包埋し、４μｍに切片作製した後、Ｈ＋Ｅまたはマッソントリクロームを用いて標準のプロトコールに従って染色した。ＮｅａｒＣＹＴＥソフトウェア（ｎｅａｒｃｔｙｅ．ｏｒｇを通じてインターネットで入手可能）を使用して、青色の線維症＋領域（ｍｍ２）を全組織領域（ｍｍ２）で割ったものを算出し、それに１００を掛けて％線維化領域測定値をもたらした。動脈閉塞のパーセンテージを、閉塞した動脈を各心臓試料中の動脈の総数と比べて手動で比較することによって算出した。
（実施例１０）
線維症の処置
【０３２３】
間質性肺線維症（ＩＰＦ）患者および年齢を釣り合わせた正常（対照）患者の外植された肺からヒト肺線維芽細胞を単離した。線維症のマーカーであるＣｏｌ１、Ｃｏｌ３、フィブロネクチン、およびＡＣＴＡ２の発現レベルを、ＭＢＶを用いた処置の前後に決定した。ＭＢＶを３つの異なる供給源組織：ブタ脱細胞化膀胱マトリックス（ＵＢＭ）、ブタ脱細胞化肺（ｐＬｕｎｇ）、およびヒト肺組織（ｈＬｕｎｇ）から単離した。ＭＢＶを培養培地に２つの異なる濃度（１ｍｌ当たり粒子１×１０９個および３×１０９個）で添加した。結果から、全ての処置でこれらの線維症のマーカーの発現レベルの顕著な低下が示された。脱細胞化肺から単離されたＭＢＶではより顕著な低下がもたらされた。図９Ａ、９Ｂを参照されたい。したがって、ＭＢＶの投与を、肺および他の組織における線維症を低減するための治療として使用することができる。
【０３２４】
記載されている方法または組成物の正確な詳細は、記載の発明の主旨から逸脱することなく変形させるまたは改変することができることが明らかである。本発明者らは、以下の特許請求の範囲の範囲および主旨の中に入る全てのそのような改変および変形を特許請求する。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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