(57)【要約】  炎症性サイトカインおよびメディエーターの放出の低減またはその活性の阻害、ならびにこれらのサイトカインおよびメディエーターに関連する疾患および障害の治療に使用するための、特定のテトラペプチドを含む医薬組成物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの炎症性サイトカインの放出の低減、またはその活性の阻害における使用のための、活性成分としての式Ｉ：ｐＧｌｕ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−ＯＨに従うペプチド、またはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体（式中、Ｘ１は、ＡｓｎおよびＴｈｒから選択され；Ｘ２は、Ｔｒｐ、ＰｈｅおよびＴｙｒから選択され；Ｘ３は、Ｌｙｓ、Ｌｙｓ誘導体およびＴｈｒから選択される）、ならびに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２】
前記少なくとも１つの炎症性サイトカインが、インターフェロンガンマ（ＩＦＮガンマ）、インターロイキン１ベータ（ＩＬ−１ベータ）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ）、およびインターロイキン６（ＩＬ−６）からなる群から選択される、請求項１に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項３】
前記少なくとも１つの炎症性サイトカインが、ＴＮＦアルファ、ＩＬ−１−ベータおよびＩＬ−６からなる群から選択される、請求項１に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項４】
少なくとも１つの炎症性メディエーターまたはケモカインの放出の低減における使用のための、活性成分としての式Ｉ：ｐＧｌｕ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−ＯＨに従うペプチド、またはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体（式中、Ｘ１は、ＡｓｎおよびＴｈｒから選択され；Ｘ２は、Ｔｒｐ、ＰｈｅおよびＴｙｒから選択され；Ｘ３は、Ｌｙｓ、Ｌｙｓ誘導体およびＴｈｒから選択される）、ならびに薬学的に医許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項５】
前記少なくとも１つの炎症性メディエーターまたはケモカインが、反応性酸素種（ＲＯＳ）およびＲＡＮＴＥＳ（活性化の際に調節され、正常Ｔ細胞で発現およびおそらくは分泌される）からなる群から選択される、請求項４に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項６】
前記ペプチド誘導体が、ペプチドの側鎖のアミノ基または末端アミノ基に結合したアルキル基を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記アルキル基が、アミド結合により結合されている、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記アルキルが、Ｃ４〜Ｃ３０アルキルである、請求項６または７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記アルキルが、アミド結合を介してＬｙｓ残基の側鎖に結合したＣ８アルキル（オクタノイル）である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記ペプチドが、ｐＧｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ（オクタノイル）−ＯＨ（配列番号１）およびｐＧｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−ＯＨ（配列番号２）、ならびにそれらの薬学的に許容される塩および誘導体からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記ペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記ペプチドが、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
約４〜約８の範囲内のｐＨを有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
局所投与、点眼投与、経口投与、経鼻投与、および非経口投与からなる群から選択される投与経路用に製剤化されている、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
局所投与用であり、クリーム、軟膏、ペースト、ローション、ゲルとして、または点眼剤の形態で製剤化される、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
０．１〜５％ｗ／ｗの前記ペプチド、誘導体または薬学的に許容される塩を含むクリームとして製剤化された、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
眼の疾患または損傷を有する対象に投与するための、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
点眼剤、エマルジョン、クリーム、軟膏、スプレー、ゲルおよび硝子体内注射剤として使用するための液体溶液または懸濁液からなる群から選択される形態で製剤化される、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
眼の疾患または傷害が、ブドウ膜炎、ドライアイ症候群、感染性眼疾患に関連する炎症症状、アレルギー性眼疾患、角膜炎、結膜炎、マイボーム腺機能障害、およびシェーグレン症候群に関連する眼症状からなる群から選択される炎症性疾患または障害である、請求項１７または１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
炎症性自己免疫疾患または障害を有する対象に投与するための、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記自己免疫疾患または障害が、関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、若年性特発性関節炎およびループスからなる群から選択される、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
炎症性腸疾患を有する対象に投与するための、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記炎症性腸疾患が、クローン病および潰瘍性大腸炎からなる群から選択される、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
肺の炎症性疾患または障害を有する対象に投与するための、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記肺の炎症性疾患または障害が、喘息、気管支炎、胸膜炎、肺胞炎、血管炎、肺炎、慢性気管支炎、気管支拡張症、びまん性汎細気管支炎、過敏性肺炎、特発性肺線維症および嚢胞性線維症からなる群から選択される、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
耳の炎症性疾患または障害を有する対象に投与するための、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記耳の炎症性疾患または障害が、耳の感染症、中耳炎、外耳炎、乳様突起炎および耳乳様炎に関連する炎症症状からなる群から選択される、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
少なくとも１つの炎症性または炎症誘引性サイトカインの放出を低減またはその活性を阻害する方法であって、それを必要とする対象に、式Ｉ：ｐＧｌｕ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−ＯＨに従うペプチド、またはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体（式中、Ｘ１は、ＡｓｎおよびＴｈｒから選択され；Ｘ２は、Ｔｒｐ、ＰｈｅおよびＴｙｒから選択され；Ｘ３は、Ｌｙｓ、Ｌｙｓ誘導体およびＴｈｒから選択される）の治療有効量を投与することを含む方法。
【請求項２９】
前記少なくとも１つの炎症性サイトカインが、インターフェロンガンマ（ＩＦＮガンマ）、インターロイキン１ベータ（ＩＬ−１ベータ）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、およびインターロイキン６（ＩＬ−６）からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
炎症性メディエーターまたはケモカインの放出を低減する方法であって、それを必要とする対象に、式Ｉ：ｐＧｌｕ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−ＯＨに従うペプチド、または薬学的に許容されるその塩もしくは誘導体（式中、Ｘ１は、ＡｓｎおよびＴｈｒから選択され；Ｘ２は、Ｔｒｐ、ＰｈｅおよびＴｙｒから選択され；Ｘ３は、Ｌｙｓ、Ｌｙｓ誘導体およびＴｈｒから選択される）の治療有効量を投与することを含む方法。
【請求項３１】
前記炎症性メディエーターまたはケモカインが、ＲＯＳおよびＲＡＮＴＥＳから選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
眼の炎症性疾患もしくは障害、耳の炎症性疾患もしくは障害、肺の炎症性疾患もしくは障害、腸の炎症性疾患もしくは障害、または炎症性自己免疫疾患もしくは障害からなる群から選択される炎症性疾患または障害を処置する方法であって、それを必要とする対象に、式Ｉ：ｐＧｌｕ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−ＯＨに従うペプチド、またはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体（式中、Ｘ１は、ＡｓｎおよびＴｈｒから選択され；Ｘ２は、Ｔｒｐ、ＰｈｅおよびＴｙｒから選択され；Ｘ３は、Ｌｙｓ、Ｌｙｓ誘導体およびＴｈｒから選択される）の治療有効量を投与し、それにより炎症性疾患または障害を処置することを含む方法。
【請求項３３】
投与が、局所、眼、経口、経鼻、および非経口投与からなる群から選択される経路を介する、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記眼の炎症性疾患または障害が、ブドウ膜炎、ドライアイ症候群、感染性眼疾患に関連する炎症症状、アレルギー性眼疾患、角膜炎、結膜炎、マイボーム腺機能不全およびシェーグレン症候群からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記炎症性自己免疫疾患または障害が、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、若年性特発性関節炎、シェーグレン症候群およびループスからなる群より選択される、請求項３２記載の方法。
【請求項３６】
前記腸の炎症性疾患または障害が、クローン病および潰瘍性大腸炎からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記肺の炎症性疾患または障害が、喘息、気管支炎、胸膜炎、肺胞炎、血管炎、肺炎、慢性気管支炎、気管支拡張症、びまん性汎細気管支炎、過敏性肺炎、特発性肺線維症および嚢胞性線維症からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記耳の炎症性疾患または障害が、耳の感染症、中耳炎、外耳炎、乳様突起炎および耳乳様炎に関連する炎症症状からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
前記ペプチド誘導体が、アミド結合を介してペプチドの側鎖のアミノ基または末端アミンに結合したアルキル基を含む、請求項２８〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記アルキルが、Ｃ４〜Ｃ３０アルキルである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記アルキルが、Ｌｙｓ残基の側鎖に結合したＣ８アルキル（オクタノイル）である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ペプチドが、配列番号１のペプチド、配列番号２のペプチド、ならびにそれらの塩および誘導体から選択される、請求項２８〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症性眼障害を含むがこれに限定されない炎症状態における炎症性サイトカインの放出に関連する症状を改善するための医薬組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
炎症は、病原体、損傷した細胞、または刺激物等の有害な刺激に対する体組織の複雑な生物学的反応の一部であり、免疫細胞、血管、および分子メディエーターが関与する防御反応である。炎症の機能は、細胞傷害の最初の原因を排除し、元の傷害および炎症過程から損傷を受けた壊死細胞および組織を一掃し、組織修復を開始することである。
【０００３】
炎症の古典的な兆候は、熱、痛み、発赤、腫れ、機能喪失である。炎症は一般的な反応であり、したがって自然免疫のメカニズムと考えられている。
【０００４】
炎症性疾患には、炎症を特徴とする様々な障害および状態が含まれる。例えば、アレルギー、喘息、移植拒絶反応、自己免疫疾患、および眼の炎症等がある。
【０００５】
炎症性眼障害
ブドウ膜炎は、視力をわずかに低下させ得る、または重度の失明につながり得る炎症性眼疾患の群を表す一般的な用語である。疾患はしばしばブドウ膜と呼ばれる目の一部に影響を及ぼすが、目のこの部分に限定されない。これらの疾患は、水晶体、網膜、視神経、および硝子体にも影響を及ぼし、視力低下または失明を引き起こす。ブドウ膜炎は、眼に生じる問題もしくは疾患によって引き起こされる場合もあり、または体の他の部分に影響を及ぼす炎症性疾患の一部である場合もある。ブドウ膜炎は、急性または慢性となり得、通常は感染性または非感染性に分類される。
【０００６】
ドライアイ疾患（ＤＥＤ）またはドライアイ症候群（ＤＥＳ）としても知られる乾性角結膜炎は、何百万人もの人々が眼科治療を求める一般的な眼疾患である。根本的な病因に関係なく、ドライアイは角膜前涙液膜の異常およびそれに続く付属器、結膜、角膜を含む眼の表面全体の炎症性変化に関連していることが示されている。炎症性サイトカイン、例えばＩＬ−６の活性化は、ＤＥＤの病態生理学に重要な役割を果たす。
【０００７】
ドライアイにおける炎症の役割が認識されて以来、シクロスポリンＡ、コルチコステロイド、タクロリムス、テトラサイクリン誘導体および自己血清（Ｍｉｃｈｅｌｌｅ  Ｈｅｓｓｅｎ  Ｍ．，ａｎｄ  Ｋａｒａｍｕｒｓｅｌ  Ａｋｐｅｋ  Ｅ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｖｉｓ  Ｒｅｓ．２０１４，９（２），２４０−２５０）等、様々な炎症経路を阻害するために設計された多くの処置法が研究されてきた。
【０００８】
米国特許第４，６１９，９１６号は、式ｐＧｌｕ−Ｘ−Ｔｒｐ（式中、ｐＧｌｕは、環化グルタミン酸（ピログルタミン酸）であり、Ｘは、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、ＬｙｓおよびＡｒｇであってもよい）の１３個のトリペプチドを教示している。この参考文献は、炎症を処置するためのペプチドの使用を説明または示唆していない。
【０００９】
米国特許第７，２２０，７２５号および国際特許公開ＷＯ２００２１２２６９は、ｐＧｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ（オクタノイル）−ＯＨ（ＺＥＰ３）およびｐＧｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−ＯＨ（ＺＥＰ４）を含む新規ペプチド、ならびに疼痛を処置するためのその使用を教示している。この参考文献は、炎症を処置するためのペプチドの使用を説明または示唆していない。
【００１０】
米国特許第９，０１２，３９７号およびＷＯ２０１２／１３１６７６は、ペプチドＺＥＰ３またはＺＥＰ４を含む局所医薬組成物、および皮膚疾患の症状を改善するためのその使用を教示している。この参考文献は、炎症を処置するためのペプチドの使用を説明または示唆していない。
【００１１】
Ｇａｙｎｅｓら（Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．５４，Ｅ−Ａｂｓｔｒａｃｔ  ５４１６，２０１３）は、実験的に誘発された化学的角膜損傷のラットモデルにおける、眼痛の低減および侵害受容の経路の変更におけるペプチドＺＥＰ４の鎮痛効果について説明している。この参考文献は、ペプチドの抗炎症活性を説明または示唆していない。
【００１２】
本発明は、炎症カスケードに介入することにより炎症状態を改善する新しい安全かつ効果的な処置を改良および開発する継続的な必要性に対処する。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、炎症性サイトカインの放出に関連する症状を改善するための組成物および方法を提供する。これらのサイトカインは、多くの炎症性疾患の病因および病状の一部であることが知られている。本発明の組成物での処置に適した疾患および障害には、眼、耳、肺、および腸の炎症性疾患が含まれるが、これらに限定されない。処置に適した疾患および障害にはまた、増悪を防止するために医薬の投与が慢性投与となり得る自己免疫疾患も含まれる。
【００１４】
本発明は、インビトロおよびインビボモデルにおいて、ＺＥＰ３およびＺＥＰ４で示されたペプチドが、特定のサイトカインインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ガンマ、ＩＦＮγ）、インターロイキン１ベータ（ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１β）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ、ＴＮＦα）、およびインターロイキン６（ＩＬ−６）、ならびにメディエーター反応性酸素種（ＲＯＳ）およびＲＡＮＴＥＳ（活性化の際に調節され、正常Ｔ細胞で発現およびおそらくは分泌される）を含む、炎症性および炎症誘引性メディエーターの発現および／または放出の減弱において予想外に強い活性を示すという発見に一部基づいている。
【００１５】
驚くべきことに、炎症カスケードの阻害におけるペプチドの活性は、炎症反応が開始される前にペプチドが投与された場合でも発揮されることが見出された。したがって、ペプチドは、様々な炎症性疾患および障害で誘発される症状を改善または抑制することができ、炎症反応を完全に排除するのに有用となり得る。本発明の組成物は、慢性炎症性疾患の増悪を予防するのに有用となり得ることが想定される。
【００１６】
炎症性疾患を処置するための本発明の組成物の使用は、皮膚障害または痛み自体の処置を含まないことを明確に理解されたい。
【００１７】
本発明の一の態様によれば、炎症性サイトカインの放出の低減、またはその活性の阻害における使用のための、活性成分としての式Ｉ：ｐＧｌｕ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−ＯＨに従うペプチド（式中、Ｘ１は、極性アミノ酸残基であり、Ｘ２は、芳香族もしくは疎水性アミノ酸残基であり、Ｘ３は、正に荷電したアミノ酸残基および極性アミノ酸残基である）、またはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体；ならびに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。
【００１８】
いくつかの実施形態によれば、Ｘ１は、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、およびＣｙｓからなる群から選択され、Ｘ２は、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、およびＧｌｙから選択され、Ｘ３は、Ｌｙｓ、Ｌｙｓ誘導体、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＴｙｒから選択される。
【００１９】
さらに他の実施形態によれば、Ｘ１は、ＡｓｎおよびＴｈｒから選択され；Ｘ２は、Ｔｒｐ、ＰｈｅおよびＴｙｒから選択され；Ｘ３は、Ｌｙｓ、Ｌｙｓ誘導体およびＴｈｒから選択される。
【００２０】
いくつかの実施形態によれば、ペプチド誘導体は、ペプチド配列の遊離官能基に結合したアルキル基を含む。
【００２１】
さらに他の実施形態によれば、アルキル基は、アミド結合または連結によって、ペプチドの側鎖またはＮ末端の遊離アミノ基に結合している。
【００２２】
いくつかの実施形態によれば、アルキルは、Ｃ４〜Ｃ３０アルキルである。
【００２３】
いくつかの特定の実施形態によれば、Ｃ８アルキル基（本明細書ではオクタノイル）は、アミド連結によって、ペプチド配列のＬｙｓ残基の側鎖またはペプチドの末端アミノ基に結合している。いくつかの実施形態によれば、ペプチドのカルボキシ末端は、修飾されて、例えば、アミド、アルコールまたはエステル末端を形成する。
【００２４】
いくつかの特定の実施形態によれば、ペプチドは、ｐＧｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ（オクタノイル）−ＯＨ（配列番号１）、ｐＧｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−ＯＨ（配列番号２）ならびにその薬学的に許容される誘導体および塩からなる群から選択される。
【００２５】
いくつかの実施形態によれば、炎症性サイトカインは、ＴＮＦアルファ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＦＮガンマからなる群から選択される。
【００２６】
さらに別の態様によれば、本発明は、炎症性メディエーターまたはケモカイン（メディエーターまたはケモカイン）の放出の低減における使用のための、活性成分としての式Ｉ：ｐＧｌｕ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−ＯＨに従うペプチド（式中、Ｘ１は、極性アミノ酸残基であり；Ｘ２は、芳香族または疎水性アミノ酸残基であり；Ｘ３は、正に荷電したアミノ酸残基および極性アミノ酸残基から選択される）、またはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体；ならびに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００２７】
いくつかの特定の実施形態によれば、ペプチドは、ｐＧｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ（オクタノイル）−ＯＨ（配列番号１）、ｐＧｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−ＯＨ（配列番号２）ならびにその薬学的に許容される誘導体および塩からなる群から選択される。
【００２８】
いくつかの実施形態によれば、炎症性メディエーターまたはサイトカインは、反応性酸素種（ＲＯＳ）およびＲＡＮＴＥＳ（活性化の際に調節され、正常Ｔ細胞で発現およびおそらくは分泌される）からなる群から選択される。
【００２９】
本発明の別の態様によれば、少なくとも１つの炎症性または炎症誘引性サイトカインの放出を低減またはその活性を阻害する方法であって、それを必要とする対象に、式Ｉ：ｐＧｌｕ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−ＯＨ（式中、Ｘ１は、極性アミノ酸残基であり；Ｘ２は、芳香族または疎水性アミノ酸残基であり；Ｘ３は、正に荷電したアミノ酸残基および極性アミノ酸残基から選択される）、またはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体の治療有効量を投与するステップを含む方法が提供される。
【００３０】
別の態様によれば、炎症性メディエーターまたはケモカインの放出を低減する方法であって、それを必要とする対象に、式Ｉ：ｐＧｌｕ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−ＯＨ（式中、Ｘ１は、極性アミノ酸残基であり；Ｘ２は、芳香族または疎水性アミノ酸残基であり、Ｘ３は、正に荷電したアミノ酸残基および極性アミノ酸残基から選択される）、またはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体の治療有効量を投与するステップを含む方法が提供される。
【００３１】
いくつかの実施形態によれば、炎症性メディエーターまたはケモカインは、ＲＯＳおよびＲＡＮＴＥＳからなる群から選択される。
【００３２】
さらに別の態様によれば、本発明は、炎症性疾患または障害を処置する方法を提供する。特定の実施形態によれば、炎症性疾患または障害は、眼の炎症性疾患もしくは障害、耳の炎症性疾患もしくは障害、肺の炎症性疾患もしくは障害、腸の炎症性疾患もしくは障害、または炎症性自己免疫疾患もしくは障害からなる群から選択され、方法は、それを必要とする対象に、式Ｉ：ｐＧｌｕ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−ＯＨに従うペプチド、またはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体（式中、Ｘ１は、極性アミノ酸残基であり；Ｘ２は、芳香族アミノ酸残基および疎水性アミノ酸残基から選択され；Ｘ３は、正に荷電したアミノ酸残基および極性アミノ酸残基から選択される）の治療有効量を投与するステップを含む。
【００３３】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、慢性炎症性疾患を処置する方法を提供する。特定の実施形態によれば、それを必要とする対象に、式Ｉに従うペプチドの治療有効量を投与するステップは、症状が出現または発症する前でも行われる。慢性炎症性疾患を処置するこれらの方法は、増悪を防ぐのに効果的である。
【００３４】
さらに別の態様によれば、本発明は、眼の炎症性疾患または障害を処置する方法であって、それを必要とする対象に、式Ｉ：ｐＧｌｕ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−ＯＨに従うペプチド、またはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体（式中、Ｘ１は、極性アミノ酸残基であり；Ｘ２は、芳香族または疎水性アミノ酸残基であり、Ｘ３は、正に荷電したアミノ酸残基および極性アミノ酸残基から選択される）の治療有効量を投与するステップを含む方法を提供する。
【００３５】
いくつかの実施形態によれば、Ｘ１は、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＴｙｒおよびＣｙｓからなる群から選択され；Ｘ２は、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、およびＧｌｙから選択され；Ｘ３は、Ｌｙｓ、Ｌｙｓ誘導体、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＴｙｒから選択される。
【００３６】
さらに他の実施形態によれば、Ｘ１は、ＡｓｎおよびＴｈｒから選択され；Ｘ２は、Ｔｒｐ、ＰｈｅおよびＴｙｒから選択され；Ｘ３は、Ｌｙｓ、Ｌｙｓ誘導体およびＴｈｒから選択される。
【００３７】
いくつかの特定の実施形態によれば、Ｌｙｓ誘導体は、Ｌｙｓ（オクタノイル）である。
【００３８】
いくつかの実施形態によれば、ペプチド誘導体は、ペプチド配列の官能基に結合したアルキル基を含む。
【００３９】
さらに他の実施形態によれば、アルキル基は、アミド結合によって、ペプチドの側鎖または末端のアミノ基に結合している。
【００４０】
いくつかの実施形態によれば、アルキルは、Ｃ４〜Ｃ３０アルキルである。
【００４１】
いくつかの特定の実施形態によれば、Ｃ８アルキル基（本明細書ではオクタノイル）は、アミド結合によって、Ｌｙｓ残基の側鎖またはペプチド配列の末端アミノ基に結合している。
【００４２】
いくつかの特定の実施形態によれば、ペプチドは、ｐＧｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ（オクタノイル）−ＯＨ（配列番号１）、ｐＧｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−ＯＨ（配列番号２）およびその薬学的に許容される塩または誘導体からなる群から選択される。
【００４３】
いくつかの実施形態によれば、ペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する。
【００４４】
いくつかの実施形態によれば、ペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する。
【００４５】
いくつかの実施形態によれば、医薬組成物は、配列番号１および配列番号２から選択される配列で示されるアミノ酸配列を有するペプチドの誘導体または塩を含む。
【００４６】
いくつかの実施形態によれば、方法は、配列番号１および配列番号２から選択される配列で示されるアミノ酸配列を有するペプチドの誘導体または塩を投与することを含む。
【００４７】
いくつかの実施形態によれば、医薬組成物は、配列番号１および配列番号２のいずれか１つに示されるペプチドのナトリウム塩を含む。
【００４８】
いくつかの実施形態によれば、医薬組成物は、局所投与、点眼投与、経口投与、経鼻投与、および非経口投与からなる群から選択される経路を介した投与用に製剤化される。
【００４９】
様々な実施形態によれば、局所投与用の製剤は、クリーム、軟膏、ペースト、ローション、ゲル、または点眼剤の形態から選択され得る。
【００５０】
いくつかの特定の実施形態によれば、局所投与で使用するための、配列番号１および２から選択されるペプチドまたはその薬学的に許容される塩を含むクリーム製剤が提供される。
【００５１】
いくつかの実施形態によれば、クリーム組成物は、０．１〜５％ｗ／ｗのペプチドを含む。他の実施形態によれば、組成物は、０．５〜２％のペプチドを含む。さらに他の実施形態によれば、組成物は約１％のペプチドを含む。
【００５２】
いくつかの実施形態によれば、本発明による組成物は、約４〜約８のｐＨを有する。いくつかの実施形態によれば、組成物は、約４．５〜約６．５のｐＨを有する。さらに他の実施形態によれば、組成物は、約７〜約９のｐＨを有する。
【００５３】
いくつかの実施形態によれば、医薬組成物は、ポリソルベート８０、エデト酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、二酸化ケイ素、メチルパラベン、白色ワセリン、ミリスチン酸イソプロピル、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセリルからなる群から選択される少なくとも１つの賦形剤を含む。
【００５４】
他の実施形態によれば、眼の疾患または損傷を有する対象に投与するための組成物は、点眼剤、エマルジョン、クリーム、軟膏、スプレーおよびゲルとして使用するための液体溶液または懸濁液からなる群から選択される形態で製剤化される。
【００５５】
いくつかの実施形態によれば、眼の疾患または損傷は、ブドウ膜炎、ドライアイ症候群、感染性眼疾患に関連する炎症症状、アレルギー性眼疾患、角膜炎、結膜炎、マイボーム腺機能不全およびシェーグレン症候群からなる群から選択される炎症性疾患または障害である。
【００５６】
さらなる実施形態によれば、医薬組成物は、点眼剤、眼軟膏、アイスプレー、眼科用懸濁液、眼科用エマルジョン、眼科用溶液、眼科用ゲル、または硝子体内注射として製剤化される。
【００５７】
さらなる実施形態によれば、炎症性疾患または障害は、自己免疫疾患または障害である。
【００５８】
さらなる実施形態によれば、自己免疫疾患または障害は、関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、若年性特発性関節炎、ループス、およびシェーグレン症候群からなる群から選択される。
【００５９】
さらなる実施形態によれば、炎症性疾患または障害は炎症性腸疾患である。
【００６０】
さらなる実施形態によれば、炎症性腸疾患は、クローン病、潰瘍性大腸炎およびセリアック病からなる群から選択される。
【００６１】
さらなる実施形態によれば、炎症性疾患または障害は、肺の炎症性疾患または障害である。
【００６２】
さらなる実施形態によれば、肺の炎症性疾患または障害は、喘息、気管支炎、胸膜炎、肺胞炎、血管炎、肺炎、慢性気管支炎、気管支拡張症、びまん性汎細気管支炎、過敏性肺炎、特発性肺線維症および嚢胞性線維症からなる群から選択される。
【００６３】
さらなる実施形態によれば、炎症性疾患または障害は、耳の炎症性疾患または障害である。
【００６４】
さらなる実施形態によれば、耳の炎症性疾患または障害は、耳の感染症、中耳炎、外耳炎、乳様突起炎および耳乳様炎に関連する炎症症状からなる群から選択される。
【００６５】
さらなる特徴の実施形態によれば、投与は、点眼投与である。
【００６６】
さらなる実施形態によれば、投与は、経口投与である。
【００６７】
さらなる実施形態によれば、投与は、経鼻投与である。
【００６８】
さらなる実施形態によれば、投与は、非経口投与である。
【００６９】
本発明は、炎症性サイトカインおよびメディエーターの放出の低減または活性の阻害において、ならびに炎症性サイトカインおよびメディエーターに関連する疾患または障害の処置において使用するための医薬組成物を提供することにより、現在知られている構成の欠点にうまく対処する。
【００７０】
別段に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および／または科学用語は、本発明が関連する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様または同等の方法および材料を本発明の実施形態の実践または試験に使用することができるが、例示的な方法および／または材料を以下に説明する。矛盾する場合は、定義を含む特許明細書が優先される。さらに、材料、方法、および例は、単なる例示であり、必ずしも限定することを意図していない。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
本発明のいくつかの実施形態は、添付の図面を参照して、例としてのみ本明細書で説明される。ここで特に図面を詳細に参照すると、示されている詳細は、例示のためのものであり、本発明の実施形態の説明に役立つ議論を目的としていることが強調されている。この点で、図面と併せて行われる説明により、本発明の実施形態がどのように実践され得るかが当業者に明らかとなる。
【００７２】
【図１】炎症誘発性マクロファージ細胞により産生されるＴＮＦαの量に対する、濃度範囲：３．１２５−１００μｇ／ｍｌのＺＥＰ４（Ｚ）の効果を示す棒グラフである。＊＊＊＊でマークされた線は、ｐ＜０．０００１での統計的に有意な差を表す。
【図２】リポ多糖（ＬＰＳ、１００ｎｇ／ｍｌ）およびパルミチン酸（ＰＡ、１００、２００または４００μＭ）で処理した炎症誘発性マクロファージ細胞により産生されるＴＮＦαの量に対するＺＥＰ４（Ｚ）（５０μｇ／ｍｌ）の効果を示す棒グラフである。＊＊＊＊でマークされた線は、ｐ＜０．０００１での統計的に有意な差を表す。
【図３】炎症誘発性マクロファージ細胞により産生されるＴＮＦαの量に対するＺＥＰ３（Ｚ）（濃度範囲：３．１２５〜１００μｇ／ｍｌ）の効果を示す棒グラフである。＊＊＊＊、＊＊＊、＊＊、＊およびｎ．ｓ．でマークされた線は、それぞれｐ＜０．０００１、ｐ＜０．００１、ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．１での統計的に有意な差、および非有意を表す。
【図４】炎症ニゲリシン誘発性マクロファージ細胞により産生されるＩＬ−１ベータの量に対するＺＥＰ４（Ｚ）（５０μｇ／ｍｌ）の効果を示す棒グラフである。＊＊＊＊でマークされた線は、ｐ＜０．０００１での統計的に有意な差を表す。
【図５】炎症誘発性マクロファージ細胞の生存能に対するＺＥＰ３の効果を示す棒グラフである。
【図６】ＬＤＨアッセイにより決定された、７０ｍＭ  ＮａＣｌ（黒い棒）またはＮＨＥ２０（灰色の棒）に曝露された炎症誘発角膜上皮細胞の生存能に対する様々な濃度でのＺＥＰ３の保護効果を示す棒グラフである。＊＊＊＊および＊でマークされた線は、それぞれｐ＜０．０００１およびｐ＜０．０５での統計的に有意な差を表す。
【図７】４−ヒドロキシノネナール（４−ＨＮＥ）に２４時間曝露された炎症誘発角膜上皮細胞により産生されるＩＬ−６の量に対する、様々な濃度のＺＥＰ３の効果を示す棒グラフである。＊でマークされた線は、ｐ＜０．０５での統計的に有意な差を表す。
【図８】は、４−ＨＮＥに２４時間曝露された炎症誘発角膜上皮細胞により産生される反応性酸素種（ＲＯＳ、ＤＣＦＤＡキットで測定される）の量に対する様々な濃度でのＺＥＰ３の保護効果を示す棒グラフである。＊＊＊＊、＊＊＊および＊＊でマークされた線は、それぞれｐ＜０．０００１、ｐ＜０．００１およびｐ＜０．０１での統計的に有意な差を表す。
【図９】異なる濃度でのＺＥＰ３、ならびに培地、刺激およびデキサメタゾン対照による刺激に応答した、４人のヒトドナーからの正常なＰＢＭＣにおけるＩＦＮ−γ産生を説明する図である。統計的に有意な差は、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１で表され、一元配置分散分析に続くＤｕｎｅｔｔｅの多重比較により刺激対照と比較されている。
【図１０】異なる濃度でのＺＥＰ３、ならびに培地、刺激およびデキサメタゾン対照による刺激に応答した、４人のヒトドナーからの正常なＰＢＭＣにおけるＩＬ−１０の産生を説明する図である。統計的に有意な差は、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１で表され、一元配置分散分析に続くＤｕｎｅｔｔｅの多重比較により刺激対照と比較されている。
【図１１】異なる濃度でのＺＥＰ３、ならびに培地、刺激およびデキサメタゾン対照による刺激に応答した、４人のヒトドナーからの正常なＰＢＭＣにおけるＩＬ−１Ｂ産生を説明する図である。統計的に有意な差は、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１として表され、一元配置分散分析に続くＤｕｎｅｔｔｅの多重比較により刺激対照と比較されている。
【図１２】異なる濃度でのＺＥＰ３、ならびに培地、刺激およびデキサメタゾン対照による刺激に応答した、４人のヒトドナーからの正常なＰＢＭＣにおけるＲＡＮＴＥＳ産生を表す図である。統計的に有意な差は、＊ｐ＜０．０５として表され、一元配置分散分析に続くＤｕｎｅｔｔｅの多重比較により刺激対照と比較されている。
【図１３Ａ−１３Ｂ】マウスオキサゾロン誘発性アトピー性皮膚炎モデルにおける、賦形剤およびベタメタゾン対照と比較したＺＥＰ３、ＺＥＰ３Ｎａ（図１３Ａ）またはＺＥＰ４（図１３Ｂ）で局所的に処置されたマウスの背中の皮膚の厚さの経時的変化を示すグラフである。統計的に有意な差は、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．００１として表され、一元配置分散分析に続くＤｕｎｅｔｔｅの多重比較により刺激対照と比較されている。
【図１４Ａ−１４Ｂ】マウスオキサゾロン誘発性アトピー性皮膚炎モデルにおける、賦形剤およびベタメタゾン対照と比較したＺＥＰ３、ＺＥＰ３Ｎａ（図１４Ａ）またはＺＥＰ４（図１４Ｂ）で局所的に処置されたマウスの、ベースライン補正された右耳の厚さの経時的変化を説明する図である。
【図１５Ａ−１５Ｂ】マウスオキサゾロン誘発性アトピー性皮膚炎モデルにおける、賦形剤およびベタメタゾン対照と比較したＺＥＰ３、ＺＥＰ３Ｎａ（図１５Ａ）またはＺＥＰ４（図１５Ｂ）で局所的に処置されたマウスの経時的な紅斑スコアの推移を示すグラフである。統計的に有意な差は、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１として表され、一元配置分散分析に続くＤｕｎｅｔｔｅの多重比較により刺激対照と比較されている。
【図１６Ａ−１６Ｂ】マウスオキサゾロン誘発性アトピー性皮膚炎モデルにおける、賦形剤およびベタメタゾン対照と比較したＺＥＰ３、ＺＥＰ３Ｎａ（図１６Ａ）またはＺＥＰ４（図１６Ｂ）で局所的に処置されたマウスの経時的な鱗屑スコアの変化を表す図である。統計的に有意な差は、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１として表され、一元配置分散分析に続くＤｕｎｅｔｔｅの多重比較により刺激対照と比較されている。
【図１７Ａ−１７Ｂ】マウスオキサゾロン誘発性アトピー性皮膚炎モデルにおける、賦形剤およびベタメタゾン対照と比較したＺＥＰ３、ＺＥＰ３Ｎａ（図１７Ａ）またはＺＥＰ４（図１７Ｂ）で局所的に処置されたマウスにおける、８日目〜２８日目の動物の体重の相対的な変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
本発明は、炎症カスケードの阻害に使用するための、特定のペプチドならびにその塩および誘導体を含む医薬組成物に関する。炎症性メディエーターの阻害は、いくつかの炎症性疾患および障害、例えば眼の炎症性疾患および障害の予防および処置において有益である。
【００７４】
本明細書に例示されるように、炎症性サイトカイン放出に対する阻害効果は、マウスマクロファージ細胞株、ヒト単球細胞株、ヒトケラチノサイト細胞株、ヒト末梢血単球（ヒトＰＢＭＣ）およびヒト角膜上皮細胞（ＨＣＥＣ）を含むいくつかのモデルにおいてインビトロで、また炎症性アトピー性皮膚炎（ＡＤ）マウスモデルにおいてインビボで実証された。
【００７５】
実験的角膜炎症に対するペプチドの有益な効果は、ヒト角膜上皮細胞培養モデルにおいて実証された。
【００７６】
本発明の原理および動作は、図面および付随する説明を参照してよりよく理解され得る。
【００７７】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、以下の説明に記載される、または実施例によって例示される詳細に必ずしも限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実践または実行することができる。また、本明細書で使用される表現または用語は、説明を目的としたものであり、限定として解釈されるべきではないことを理解されたい。
【００７８】
本発明を実践に移している間、発明者らは、驚くべきことに、ペプチドＺＥＰ３およびＺＥＰ４、ならびにそれらのナトリウム塩形態が、炎症のために誘発されたマクロファージおよび角膜上皮細胞による炎症性サイトカインＴＮＦアルファ、ＩＬ−１ベータおよびＩＬ−６の発現を低減し（下記の実施例１〜７）、炎症刺激されたヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮγ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１βおよびＲＡＮＴＥＳの発現を低下させた（下記の実施例１２）ことを発見した。さらに、マウスのアトピー性皮膚炎の炎症モデルにおいて、ＺＥＰ４、ＺＥＰ３、およびそのナトリウム塩がＺＥＰ３Ｎａを形成し、インビボで臨床病変を大幅に低減した（下記の実施例１３）。結果は、本発明のペプチドが炎症を独自に阻害または予防できることを示している。
【００７９】
したがって、本発明の一態様によれば、炎症性疾患または障害の病因または病状に関与する少なくとも１つのサイトカインまたはメディエーターの放出を低減する、またはその活性を阻害するための医薬組成物が提供される。医薬組成物は、活性成分としてのペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む。ペプチドは、配列番号１および２のいずれかに示されるアミノ酸配列を有し、またはその薬学的に許容される塩である。
【００８０】
したがって、本発明は、特定のサイトカインおよびメディエーターの過剰な放出または活性に関連する炎症性病状を改善および処置するための方法を提供する。
【００８１】
いくつかの実施形態によれば、炎症性病状は、少なくとも１つのサイトカインまたはメディエーターの過剰放出または活性に関連する疾患または障害であり、少なくとも１つのサイトカインまたはメディエーターは、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１０、ＴＮＦアルファ、ＩＬ−６、ＲＯＳおよびＲＡＮＴＥＳからなる群から選択される。
【００８２】
本明細書で使用される「炎症性疾患または障害」という語句は、炎症に関連する疾患、状態または障害を指す。本明細書で使用される「炎症」という用語は、対象の免疫系が組織の損傷、感染、抗原負荷等に対する応答を調整するプロセスを指す。炎症は、組織への血液供給の増加、組織の毛細血管透過性の増、および／または白血球の組織への移動の増加加に関連し得る。
【００８３】
炎症性サイトカインは主に活性化マクロファージによって産生され、炎症反応の上方調節に関与する。
【００８４】
炎症は、対象から得られた生体試料中のＴＮＦα、ＩＬ−１−アルファ、ＩＬ−１−ベータ、ＩＦＮ−ガンマおよびＩＬ−６等（ただしこれらに限定されない）の炎症性サイトカインのレベルの上昇によって診断され得る。生物学的試料は、例えば、涙、血液、血清、血漿、尿、痰、唾液、糞便、精液、髄液、骨髄、リンパ液、またはＣＳＦ、皮膚の外分泌物、呼吸器、腸管、および泌尿生殖器系、乳、人間の臓器または組織、洗浄により得られた試料、複数回の滲出液、インビトロまたはエクスビボの細胞培養の試料、ならびに細胞培養成分であってもよい。
【００８５】
反応性酸素種（ＲＯＳ）は、炎症性疾患の進行に重要な役割を果たす、重要なシグナル伝達分子である。炎症部位での多形核好中球（ＰＭＮ）により増大したＲＯＳ生成は、内皮機能障害および組織損傷を引き起こす。炎症状態では、ＰＭＮによって生成される酸化ストレスが内皮間接合部の開口をもたらし、内皮バリアを通過する炎症細胞の移動を促進する。
【００８６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、炎症性疾患または障害は、目の炎症性疾患または障害である。炎症性眼疾患または障害は、ブドウ膜炎、ドライアイ症候群、ウイルス性、細菌性または真菌性眼感染に関連する炎症症状、アレルギー性眼疾患、角膜炎、結膜炎、マイボーム腺機能不全およびシェーグレン症候群であってもよいが、これらに限定されない。
【００８７】
一実施形態において、眼の炎症性疾患または障害は、ブドウ膜炎である。本明細書で使用される「ブドウ膜炎」という用語は、強膜と、虹彩、毛様体、および脈絡膜を含む網膜との間の層であるブドウ膜の炎症を指す。ブドウ膜炎は、一般に虹彩炎、扁平部炎、脈絡膜炎、脈絡網膜炎、前部ブドウ膜炎、および後部ブドウ膜炎とも呼ばれる。ブドウ膜炎の最も一般的な形態は前部ブドウ膜炎であり、通常は虹彩に隔離されている目の前部の炎症を伴う。この状態は、しばしば虹彩炎と呼ばれる。
【００８８】
一実施形態において、眼の炎症性疾患または状態は、ドライアイ症候群である。本明細書で使用される「ドライアイ症候群（ＤＥＳ）」という語句は、罹患したまたは機能不全の涙腺機能単位に起因する変化した涙液組成の状態を指す。証拠は、炎症が涙分泌腺の構造変化を引き起こすことを示唆している。涙腺機能不全、蒸発の増加、および／またはクリアランス不良から生じる涙液組成の変化は、眼の表面に炎症誘引作用を及ぼす。この炎症は、部分的には、刺激症状、眼表面上皮疾患、およびドライアイの角膜上皮バリア機能の変化の原因となる。ＤＥＳの抗炎症療法は、ドライアイで確認されている炎症性メディエーター／経路の１つ以上を標的とする。ＤＥＳはまた、ドライアイ疾患（ＤＥＤ）、乾性角結膜炎および乾性角膜炎として当業者に知られている。
【００８９】
一実施形態において、眼の炎症性疾患または状態は、シェーグレン症候群に関連する。本明細書で使用される「シェーグレン症候群」という語句は、涙の減少、口渇、および他の粘膜乾燥を特徴とする全身性自己免疫炎症性障害を指し、しばしば関節リウマチ等の自己免疫リウマチ障害に関連する。目および口の乾燥は、この症候群の最も一般的な症状である。症状は単独で発生することもあれば、関節リウマチまたは他の結合組織疾患に関連する症状を伴うこともある。唾液腺の関連する拡大が生じる可能性もある。他の臓器が影響を受ける可能性もある。この症候群は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、強皮症、多発性筋炎、およびその他の疾患に関連する可能性もある。
【００９０】
いくつかの実施形態において、眼の炎症性疾患または状態は、眼が関与する手順、例えば、角膜移植／角膜形成術、角膜プロテーゼ手術、ラメラ移植、または選択的内皮移植に起因する。
【００９１】
いくつかの実施形態において、眼の炎症性疾患または状態は、これらに限定されないが、角膜眼表面炎症状態、角膜新血管形成、末梢潰瘍性角膜炎および微生物性角膜炎を含む角膜炎、結膜炎、または類天疱瘡症候群等、眼の表面に影響を及ぼしている。
【００９２】
いくつかの実施形態において、眼の炎症性疾患または状態は、これらに限定されないが、交感神経性眼瞼下垂、フォクト−小柳−原田（ＶＫＨ）症候群、バードショット網膜脊髄症、眼瘢痕性類天疱瘡（ＯＣＰ）、シェーグレン症候またはフックスの異時性虹彩毛様体炎等の眼を冒す自己免疫障害である。
【００９３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、炎症性疾患または障害は、自己免疫疾患または障害である。自己免疫疾患または障害は、関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎、尋常性天疱瘡、強直性脊椎炎、若年性特発性関節炎、ループスおよびシェーグレン症候群であってもよいが、これらに限定されない。
【００９４】
一実施形態において、自己免疫疾患または障害は、関節リウマチである。本明細書で使用される「関節リウマチ」という語句は、複数の関節が炎症を起こす慢性の自己免疫障害を指す。滑膜の関節ライニングの炎症は、関節の痛みおよび硬直を伴い、通常は骨および関節の破壊、変形、機能障害、さらには死をもたらす。
【００９５】
一実施形態において、自己免疫疾患または障害は、ループスである。本明細書で使用される「ループス」という用語は、皮膚、関節および内臓を含む多くの臓器系に影響を及ぼし得るエリテマトーデスと呼ばれる慢性の炎症性自己免疫障害を指す。ループスは、全身性ループス、ループス腎炎、およびループス脳炎を含む、いくつかの特定のタイプのループスを含む一般用語である。全身性ループス（ＳＬＥ）では、体の自然な防御が体に逆らい、不正な免疫細胞が体の組織を攻撃する。体の血液細胞、器官、および組織に反応し得る抗体が産生される場合がある。この反応は影響を受けた系を攻撃する免疫細胞をもたらし、慢性疾患を引き起こす。ループス腎炎はループス糸球体疾患とも呼ばれ、通常はＳＬＥの合併症である腎障害であり、糸球体への損傷および進行性の腎機能の喪失を特徴とする。ループス脳炎は、脳および／または中枢神経系の炎症であるＳＬＥの別の合併症を指す。
【００９６】
本発明の一実施形態において、炎症性疾患または障害は、変形性関節症（ＯＡ）である。ＯＡはまた、肥大性変形性関節症、変形性関節症、および変性関節疾患とも呼ばれる。ＯＡは骨格関節の慢性変性疾患であり、すべての年齢の成人における特定の関節、通常は膝、腰、手関節および脊椎に影響を及ぼす。ＯＡは、「潰瘍」またはクレーターの関連する発達を伴う関節軟骨の変性および薄化、骨棘形成、縁における骨の肥大、ならびに滑膜の変化および罹患した関節の拡大を含むいくつかの症状を特徴とする。さらに、変形性関節症は、特に長時間の活動の後、痛みおよび硬直を伴う。本発明のペプチド、その塩および誘導体、ならびにそれらを含む医薬組成物は、変形性関節症を処置するために使用することができる。変形性関節症の特徴的なＸ線撮影の特徴には、関節腔狭窄、軟骨下硬化、骨増殖症、軟骨下嚢胞形成、緩い骨体（または「関節ネズミ」）が含まれる。
【００９７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、炎症性疾患または障害は、炎症性腸疾患である。炎症性腸疾患は、クローン病、潰瘍性大腸炎およびセリアック病であってもよいが、これらに限定されない。
【００９８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、炎症性疾患または障害は、肺の炎症性疾患または障害である。肺の炎症性疾患または障害は、喘息、気管支炎、胸膜炎、肺胞炎、血管炎、肺炎、慢性気管支炎、気管支拡張症、びまん性汎細気管支炎、過敏性肺炎、特発性肺線維症および嚢胞性線維症であってもよいが、これらに限定されない。
【００９９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、炎症性疾患または障害は、耳の炎症性疾患または障害である。耳の炎症性疾患または障害は、耳の感染症、中耳炎、外耳炎、乳様突起炎および耳乳様炎に関連する炎症症状であってもよいが、これらに限定されない。
【０１００】
本発明はまた、ＲＯＳ、ＲＡＮＴＥＳおよび単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）を含むがこれらに限定されない炎症性メディエーターおよびケモカインの過剰放出に関連する疾患または障害の処置に使用するための医薬組成物を提供する。本発明の組成物で処置可能なＲＯＳの放出に関連する炎症性疾患には、肺疾患、心血管疾患、腎臓病関連血管石灰化および炎症性代謝疾患が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０１】
ケモカインＲＡＮＴＥＳおよびＭＣＰ−１は、肺アレルギー性炎症、肺白血球浸潤、気管支過敏症、および喘息の発病における好酸球の動員に関与する。
【０１０２】
「処置」または「処置する」という用語は、本明細書において互換的に使用され得、疾患もしくは障害の発症を阻害、予防もしくは停止すること、および／または疾患もしくは障害の軽減、寛解または退行を引き起こすことを指す。
【０１０３】
本発明の組成物および方法に使用されるペプチド、誘導体および塩は、固相および液相ペプチド合成を含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の任意の方法を使用して合成され得る。本発明の組成物に使用されるペプチドのいくつかは、組換え法または組換え法と合成法との組み合わせを使用して生成され得る。
【０１０４】
本発明の１つの実施形態において、ペプチドは、ｐＧｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ（オクタノイル）−ＯＨ（配列番号１；以下「ＺＥＰ３」と呼ばれる）のペプチドでありｐＧｌｕは、ピログルタミン酸である。ペプチドＺＥＰ３は、例えば、米国特許第７，２２０，７２５号に記載の手順により生成され得る。
【０１０５】
本発明の一実施形態において、ペプチドは、ｐＧｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−ＯＨ（配列番号２；以下「ＺＥＰ４」と呼ばれる）である。ペプチドＺＥＰ４は、例えば、以下の手順により生成され得る。
【０１０６】
ペプチドＺＥＰ４の合成は、クロロトリチルクロリドレジン（ＣＴＣ）の固体担体上での９−フルオロメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）アミノ酸の逐次合成によって行われる。ＣＴＣ樹脂（１２５ｇｒ）にＦｍｏｃ−トレオニン（ｔ−ブチル；７９ｇｒ）をロードし、ジイソプロピルアミン（ＤＩＰＥＡ；１６０ｇｒ）を固体担体へのアミノ酸のカップリング剤として使用する。Ｆｍｏｃ保護基を２５％ピペリジンの混合物で除去し、樹脂−ペプチドを濾過してジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で洗浄する。第２のアミノ酸Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（８５ｇｒ）を、３−［ビス（ジメチルアミノ）メチルイミニル］−３Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−オキシド、ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）／ヒドロキシベンゾチアゾール（ＯＨＢＴ）］の混合物により活性化し、ＤＩＥＡの添加により第１のアミノ酸にカップリングする。上記のようにＦｍｏｃ基を除去し、樹脂−ペプチドを濾過し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で洗浄する。第３のアミノ酸Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（ｔｒｔ）（１１９ｇｒ）を、ＨＢＴＵ／ＨＯＢＴにより活性化し、ＤＩＥＡの添加によりカップリングする。上記のようにＦｍｏｃ基を除去し、樹脂−ペプチドを濾過し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で洗浄する。第４のアミノ酸ｐＧｌｕ（２６ｇｒ）を、ＨＢＴＵ／ＨＯＢＴにより活性化し、ＤＩＥＡによりカップリングする。
【０１０７】
ペプチド−樹脂をＤＭＦで完全に洗浄した後、ＩＰＡで洗浄し、減圧下で乾燥させる。ペプチドを、ＴＦＡ（９５％）およびトリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）（５％）により、室温で２時間、樹脂ならびにＴｈｒおよびＡｓｎの保護基から切断する。メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）を添加することによりペプチドを沈殿させ、濾過し、乾燥させる（収量４６ｇｒ）。
【０１０８】
粗生成物（４６ｇｒ）をアセトニトリル（ＡＣＮ）／水の混合物に溶解し、分取ＨＰＬＣシステム（４“、ＲＰ  Ｃ−１８  １００−１２０Ａポアサイズ）にロードし、相Ａ−水中０．１％ＴＦＡおよび相Ｂ−ＡＣＮからなる勾配系を使用して精製する。溶出は、４５分間で相Ｂを徐々に増加させる（３％から３３％）ことにより行う。９７％を超える純度の画分を収集する。組み合わせた画分を、相Ａ：０．２％酢酸および相Ｂ：ＡＣＮからなる勾配を使用して、同じＨＰＬＣシステムで溶出する。溶出は、３０分間で相Ｂを徐々に増加させる（１０％から４０％）ことにより行う。９７％を超える純度の画分を収集し、組み合わせ、凍結乾燥する（収量２９ｇｒ）。最終生成物は、５３０．５のＭ．Ｗ（ＭＳ）および９７．３％の純度（ＨＰＬＣ）を有する。
【０１０９】
開示された組成物および方法に使用されるペプチドの塩および誘導体もまた、本発明の範囲内に含まれる。
【０１１０】
本明細書で使用される場合、「塩」という用語は、ペプチド分子のカルボキシル基の塩、およびアミノ基またはグアニジノ基の酸付加塩の両方を指す。カルボキシル基の塩は、当技術分野で知られている手段によって形成することができ、例えばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、第二鉄または亜鉛塩等の無機塩、および例えばアミン、例えばトリエタノールアミン、ピペリジン、プロカイン等で形成される塩等の有機塩基との塩が含まれる。酸付加塩には、例えば、鉱酸、例えば酢酸またはシュウ酸等との塩が含まれる。ここで、塩とは、ハイドロゲル形成および／またはカルシウムミネラルのミネラル化を増強するためにペプチド溶液に添加されるイオン成分も説明している。
【０１１１】
本明細書で使用される本発明のペプチドの「誘導体」は、当技術分野において知られている手段により、残基またはＮ末端もしくはＣ末端基の側鎖として生じる官能基から調製され得る誘導体を包含し、それらが薬学的に許容されるままである限り、すなわち、それらがペプチドの活性を破壊せず、それを含む組成物に毒性特性を付与せず、その免疫原性特性に悪影響を及ぼさない限り、本発明に含まれる。
【０１１２】
これらの誘導体には、例えば、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアまたは一級もしくは二級アミンとの反応により生成されるカルボキシル基のアミド、アシル部分（例えば、アルカノイルまたはアロイル基）との反応により形成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体、あるいはアシル部分との反応により形成される遊離ヒドロキシル基（例えば、セリルまたはスレオニル残基のもの）のＯ−アシル誘導体が含まれ得る。
【０１１３】
本発明の１つの実施形態において、ペプチドは、配列番号１に示されるペプチドのナトリウム塩（ｐＧｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ（オクタノイル）−ＯＨ  ｎＮａ（式中、ｎは、１または２である）、以下「ＺＥＰ３ナトリウム塩」またはＺＥＰ３Ｎａと呼ばれる）である。
【０１１４】
ＺＥＰ３ナトリウム塩は、例えば、以下の手順で生成され得る。
ＺＥＰ３（３．１ｇ）を、水中のＮａＨＣＯ３（１００ｍＭ）（５０ｇ／ｌ）に溶解する。溶液をＨＰＬＣイオン交換カラム（２．５×２２ｃｍ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８、１００Ａ、１５ミクロン）に注入し、移動相Ａ：Ｈ２Ｏ中のＮａＨＣＯ３  ２ｍＭ；移動相Ｂ：ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（８／２）中のＮａＨＣＯ３  ２ｍＭ；および移動相Ｃ：水中のＮａＨＣＯ３  １００ｍＭからなる勾配により溶出する。実行当たりのロード：最大５％（Ｗ／Ｗ％ペプチド／固定相）。流量：４．８ｃｍ／分（２４ｍｌ／分）。勾配の手順は次の通りである：相Ｃを２０分；相Ａを５分；相Ｂを１８分；および相Ｃを７分。生成物を含む画分を収集し、減圧下で濃縮してアセトニトリル（１１０ｇ／ｌ）を除去し、次いでフリーズドライする［収量２．２ｇ（７１％）］。最終生成物は、９９．７％の純度（ＨＰＬＣ）、３．１％のナトリウム含有量、および５０ｍｇ／ｍｌの水に対する溶解度を有する。
【０１１５】
本発明の一実施形態において、ペプチドは、配列番号２に記載されるペプチドのナトリウム塩（ｐＧｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−ＯＨ．ｎＮａ（式中、ｎは、１または２である）；以下「ＺＥＰ４ナトリウム塩」またはＺＥＰ４Ｎａと呼ばれる）である。ＺＥＰ４ナトリウム塩は、例えば、以下の手順で生成され得る。
ＺＥＰ４（５ｇ）を、水中のＮａＨＣＯ３（１００ｍＭ）（５０ｇ／ｌ）に溶解する。溶液をＨＰＬＣイオン交換カラム（２．５×２２ｃｍ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８、１００Ａ、１５ミクロン）に注入し、移動相Ａ：Ｈ２Ｏ中のＮａＨＣＯ３  ２ｍＭ；移動相Ｂ：ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（８／２）中のＮａＨＣＯ３  ２ｍＭ；および移動相Ｃ：水中のＮａＨＣＯ３  １００ｍＭからなる勾配により溶出する。実行当たりのロード：最大５％（Ｗ／Ｗ％ペプチド／固定相）。流量：４．８ｃｍ／分（２４ｍｌ／分）。勾配の手順は次の通りである：相Ｃを２０分、次いで相Ａを５分、次いで相Ｂを２０分、および相Ｃを１０分。生成物を含む画分を収集し、減圧下で濃縮してアセトニトリル（１１０ｇ／ｌ）を除去し、次いでフリーズドライする［収量４ｇ（８０％）］。最終生成物は、９７．５％の純度（ＨＰＬＣ）、２．５％のナトリウム含有量、５０ｍｇ／ｍｌの水に対する溶解度を有する。
【０１１６】
本発明のペプチドは、それ自体で、または医薬組成物の一部（活性成分）として治療に使用され得る。
【０１１７】
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」は、生理学的に好適な担体および賦形剤等の他の化学成分を含む、本明細書に記載の１つまたは複数の活性成分の調製物を指す。医薬組成物の目的は、生物への化合物の投与を容易にすることである。
【０１１８】
以下「生理学的に許容される担体」および「薬学的に許容される担体」という語句は、互換的に使用され得、生物に著しい刺激を引き起こさず、投与される化合物の生物学的活性および特性を抑制しない担体または希釈剤を指す。アジュバントはこれらの語句に含まれる。
【０１１９】
本明細書において、「賦形剤」という用語は、活性成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。賦形剤の例には、限定されないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびデンプンの種類、多糖、シクロデキストリン、懸濁剤、例えばポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、イオン性または非イオン性界面活性剤、可溶化剤、乳化剤、例えばレシチン、浸透促進剤、ポリカルボン酸、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ワックス、鉱油、プロピレングリコール、ならびにポリエチレングリコールが含まれる。
【０１２０】
薬物の製剤化および投与の技術は、参照により本明細書に組み込まれる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡの最新版に見出すことができる。
【０１２１】
好適な投与経路には、例えば、眼内、局所、経口、直腸、経粘膜、経鼻、腸、または非経口送達（筋肉内、皮下および髄内注射、ならびに髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、または眼内注射を含む）が含まれる。
【０１２２】
本発明の医薬組成物は、当該技術分野で周知のプロセスによって、例えば、従来の混合、溶解、懸濁、可溶化、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、封入、噴霧乾燥、または凍結乾燥プロセスによって製造され得る。
【０１２３】
したがって、本発明による使用するための医薬組成物は、医薬として使用され得る調製物への活性成分の処理を容易にする、賦形剤および助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容される担体を使用して従来の方法で製剤化され得る。適切な製剤は、選択された投与経路に依存する。
【０１２４】
本明細書に記載の医薬組成物は、点眼投与用に製剤化され得る。本明細書で使用される「点眼投与」という語句は、外眼部（例えば、結膜嚢）または硝子体内への本発明のペプチドまたは医薬組成物の投与を指す。点眼投与に好適な剤形は、点眼剤、眼軟膏、アイスプレー、眼科用懸濁液、眼科用エマルジョン、眼科用溶液、眼科用ゲル、または硝子体内注射であってもよいが、これらに限定されない。
【０１２５】
本明細書に記載の医薬組成物は、局所投与用に製剤化され得る。局所投与に好適な剤形は、液滴、液体洗浄剤、ゲル、軟膏、エマルジョン、懸濁液、ローション、スプレー、噴霧液体、坐剤、クリーム、粉末、フォーム、結晶およびリポソームであってもよいが、これらに限定されない。
【０１２６】
注射の場合、医薬組成物の活性成分は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンガー液、または生理食塩緩衝液等の生理学的に適合性のある緩衝液中で製剤化され得る。本発明の医薬組成物に適した１つの投与経路は、Ｅｒｉｋｋｓｏｎに対する米国特許第６，５２５，０３０号に記載されている骨膜下注射である。経粘膜投与の場合、透過する障壁に適した浸透剤が製剤に使用される。そのような浸透剤は、一般に当技術分野において知られている。
【０１２７】
経口投与の場合、医薬組成物は、活性化合物を当技術分野において周知の薬学的に許容される担体と組み合わせることにより容易に製剤化され得る。そのような担体によって、患者による経口摂取のために、医薬組成物を錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液、エマルジョン等として製剤化することが可能になる。経口使用のための薬理学的調製物は、固体賦形剤を使用して作製することができ、得られた混合物を任意選択で粉砕し、所望により好適な助剤を添加した後、顆粒の混合物を処理して、錠剤または糖衣錠コアを得ることができる。好適な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールもしくはソルビトールを含む糖；例えばトウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボメチルセルロースナトリウム等のセルロース調製物；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）等の生理学的に許容されるポリマー等の充填剤である。所望により、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩、例えばアルギン酸ナトリウム等の崩壊剤が添加されてもよい。本明細書で使用される場合、「経口投与」という用語は、舌、歯肉、口蓋、舌下、または他の頬側表面を含む、任意の口腔表面への医薬化合物の投与を含む。
【０１２８】
糖衣錠のコアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および好適な有機溶媒または溶媒混合物を任意に含み得る濃縮糖溶液が使用され得る。識別のため、または活性化合物用量の異なる組み合わせを特徴付けるために、染料または色素が錠剤または糖衣錠コーティングに添加されてもよい。
【０１２９】
経口で使用され得る医薬組成物には、ゼラチンでできた押し込み型カプセル、ならびにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトール等の可塑剤でできた軟質密封カプセルが含まれる。押し込み型カプセルは、ラクトース等の充填剤、デンプン等の結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウム等の滑剤、および任意選択で安定剤と混合した活性成分を含んでもよい。軟カプセルでは、活性成分は、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコール等の好適な液体に溶解または懸濁されてもよい。さらに、安定剤が添加されてもよい。経口投与用のすべての製剤は、選択された投与経路に好適な投薬量である必要がある。
【０１３０】
口腔内投与の場合、組成物は、従来の方法で製剤化された錠剤またはロゼンジの形態をとることができる。
【０１３１】
経鼻吸入による投与の場合、本発明による使用のための活性成分は、好適な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素の使用により、過圧パックまたは噴霧器からエアロゾルスプレーの形態で便利に送達される。加圧エアロゾルの場合、計量された量を送達するためのバルブを提供することにより、投薬量単位を決定することができる。ディスペンサーで使用するための、例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物およびラクトースまたはデンプン等の好適な粉末基剤の粉末混合物を含むように製剤化され得る。
【０１３２】
本明細書に記載の医薬組成物は、例えば、ボーラス注射または持続注入による非経口投与用に製剤化されてもよい。注射用の製剤は、単位剤形で、例えば、任意選択で保存剤を添加して、アンプルまたは複数回投与用容器で提供されてもよい。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンであってもよく、また可溶化剤、懸濁剤、安定剤および／または分散剤等の製剤化剤を含んでもよい。
【０１３３】
非経口投与用の医薬組成物には、水溶性形態の活性製剤の水溶液が含まれる。さらに、活性成分の懸濁液は、適切な油性または水ベース注射用懸濁液として調製され得る。好適な親油性溶媒またはビヒクルには、ゴマ油等の脂肪油、もしくはオレイン酸エチル等の合成脂肪酸エステル、トリグリセリドエマルジョンまたはリポソームが含まれる。水性注射用懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストラン等の懸濁液の粘度を増加させる物質を含んでもよい。任意選択で、懸濁液はまた、高濃度の溶液の調製を可能にするために、好適な安定剤、または活性成分の溶解度を増加させる薬剤を含んでもよい。
【０１３４】
代替として、活性成分は、使用前に、好適なビヒクル、例えば、発熱物質を含まない無菌の水ベース溶液を構成するための粉末形態であってもよい。
【０１３５】
本発明の医薬組成物は、例えば、カカオバターまたは他のグリセリド等の従来の坐剤基剤を使用して、坐剤または停留浣腸剤等の直腸組成物に製剤化されてもよい。
【０１３６】
本発明に関連する使用に好適な医薬組成物には、活性成分が意図された目的を達成するのに有効な量で含まれている組成物が含まれる。より具体的には、治療有効量は、処置されている対象の疾患または障害の症状を予防、緩和、または改善するのに有効な活性成分の量を意味する。
【０１３７】
治療有効量の決定は、特に本明細書で提供される詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１３８】
本発明の方法において使用される任意の調製物について、治療的有効量または用量は、最初にインビトロおよび細胞培養アッセイから推定することができる。例えば、用量は、所望の濃度または力価を達成するように動物モデルにおいて処方され得る。そのような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。
【０１３９】
本明細書に記載される活性成分の毒性および治療有効性は、細胞培養または実験動物におけるインビトロでの標準的な製薬手順によって決定することができる。これらのインビトロおよび細胞培養アッセイならびに動物試験から得られたデータは、ヒトに使用するための様々な投与量を処方する際に使用することができる。投与量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じて異なり得る。正確な処方、投与経路、および投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択され得る。（例えば、Ｆｉｎｇｌ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９７５），「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ｃｈ．１，ｐ．１を参照されたい。）
【０１４０】
投薬量および間隔は、最小有効濃度（ＭＥＣ）を達成するのに十分な活性成分のレベルに個別に調整され得る。ＭＥＣは調製ごとに異なるが、インビトロデータから推定され得る。ＭＥＣを達成するために必要な投薬量は、個々の特性および投与経路に依存する。検出アッセイは、血漿または組織濃度を決定するために使用され得る。
【０１４１】
処置される状態の重症度および応答性に依存して、投薬は単回または複数回の投与であってもよく、処置のコースは数日から数週間続いてもよく、または病状の減少が達成されてもよい。
【０１４２】
投与される組成物の量は、当然ながら、処置されている対象、苦痛の重症度、投与様式、処方する医師の判断等に依存するであろう。
【０１４３】
したがって、本発明のいくつかの実施形態の組成物および／または物品は、所望により、活性成分を含む１つまたは複数の単位剤形を含み得る、ＦＤＡ承認キット等のパックまたはディスペンサーデバイスで提示され得る。パックは、例えば、ブリスターパック等の金属またはプラスチック箔を含み得る。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が添付されてもよい。パックまたはディスペンサーはまた、医薬品の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって規定された形式の容器に関連する通知に対応してもよく、この通知は、組成物または人間もしくは獣医学における投与の形態の、機関による承認を反映している。そのような通知は、例えば、処方箋医薬品に関する米国食品医薬品局によって承認されたラベル、または承認された製品の添付文書であってもよい。適合性のある医薬担体に製剤化された本発明の調製物を含む組成物はまた、上記でさらに詳述されるように、適応状態の処置のために調製され、適切な容器（例えば、凍結乾燥バイアル）に入れられ、ラベル付けされ得る。
【０１４４】
本発明のペプチドまたは医薬組成物は、炎症性サイトカインおよびメディエーターの放出または活性を阻害するために、またそれを必要とする対象に治療有効量のペプチドまたは医薬組成物を提供することにより炎症性疾患または障害を処置するために使用され得る。
【０１４５】
本明細書で使用される「それを必要とする対象」という語句は、炎症性疾患または障害と診断された哺乳動物の男性または女性対象（例えばヒト）を指す。特定の実施形態において、この用語は、炎症性疾患または障害を発症するリスクがある個体を包含する。対象は、いかなる性別または年齢であってもよく、新生児、乳児、少年、青年、成人および高齢者を含む。
【０１４６】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、±１０％を指す。
【０１４７】
「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する」という用語およびそれらの変化形は、「含むが、それに限定されない」ことを意味する。
【０１４８】
「〜からなる」という用語は、「〜を含み、それに限定される」を意味する。
【０１４９】
「〜から本質的になる」という用語は、組成物、方法、または構造が追加の成分、ステップ、および／または部分を含み得るが、ただし追加の成分、ステップ、および／または部分が請求される組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特性を実質的に変更しない場合に限ることを意味する。
【０１５０】
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他の意味を示さない限り、複数の参照を含む。例えば、用語「化合物」または「少なくとも１つの化合物」は、それらの混合物を含む複数の化合物を含み得る。
【０１５１】
本出願を通して、本発明の様々な実施形態は、範囲形式で提示され得る。範囲形式での説明は、単に便宜および簡潔さのためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、すべての可能な部分範囲およびその範囲内の個々の数値を具体的に開示していると見なされるべきである。例えば、１〜６等の範囲の説明は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６等の具体的に開示された部分範囲、ならびに１、２、３、４、５および６等のその範囲内の個々の数字を有すると見なされるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
【０１５２】
本明細書で数値範囲が示される場合は常に、示された範囲内の任意の引用された数字（分数または整数）を含むことを意味する。第１の表示数と第２の表示数との間の「範囲（ｒａｎｇｉｎｇ）／範囲（ｒａｎｇｅｓ）」および第１の表示数「から」第２の表示数「までの範囲（ｒａｎｇｉｎｇ）／範囲（ｒａｎｇｅｓ）」という表現は、本明細書では互換的に使用され、第１および第２の表示数、ならびにそれらの間のすべての分数および整数の数字を含むことを意味する。
【０１５３】
本明細書で使用される場合、「方法」という用語は、所与の作業を達成するための様式、手段、技術および手順を指し、化学、薬学、生物学、生化学および医学分野の従事者に既知の、または彼らによって既知の様式、手段、技術および手順から容易に開発される様式、手段、技術および手順を含むが、それらに限定されない。
【０１５４】
明確にするために別個の実施形態に関連して説明される本発明のある特定の特徴は、単一の実施形態に組み合わせて提供することもできることが理解される。逆に、簡潔にするために単一の実施形態に関連して説明される本発明の様々な特徴は、別個に、または任意の適切な部分的組み合わせで、または本発明の任意の他の説明された実施形態で適切に提供されてもよい。様々な実施形態に関連して説明されるある特定の特徴は、実施形態がそれらの要素なしでは機能しない場合を除いて、それらの実施形態の不可欠な特徴と見なされるべきではない。
【０１５５】
上記で描写され、以下の特許請求の範囲で請求されるような本発明の様々な実施形態および態様は、以下の実施例において実験的に裏付けられる。
【実施例】
【０１５６】
ここで、上記の説明と共に本発明を非限定的に説明する以下の実施例を参照する。
【０１５７】
実施例１−炎症誘発性マクロファージ細胞によるＴＮＦアルファの発現に対するＺＥＰ４の効果
材料および方法
ペプチドｐＧｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−ＯＨ（以下「ＺＥＰ４」と呼ばれる、配列番号２）を、上記のように合成した。
【０１５８】
Ｂ６マクロファージ細胞によるＴＮＦアルファの発現
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに由来するマクロファージを、２４ウェルプレート（５００μｌウェル）で２００，０００細胞／ｍＬの密度で培養し、３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。インキュベーション後、ある特定の実験群の培養液を１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳを含む新鮮な培地と交換し、続いて３時間インキュベートした。次いで、ある特定の実験群の培地（ＬＰＳを含むまたはＬＰＳを含まない）を、３．１２５から１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度でＺＥＰ４を含む新鮮な培地と交換し、続いて１時間インキュベートした。次いで、パルミチン酸（ＰＡ、２００μＭ）を適切なウェルに加え、プレートをさらに２４時間インキュベートし、次いで各ウェルのＴＮＦアルファの量を測定した。表１に、様々な処理群および対照群を示す。処理群におけるＴＮＦアルファ産生の低減は、ＬＰＳおよびＰＡ（ＣＬＰ２００）で処理された細胞と比較して計算した。
【０１５９】
結果
下の図１および表１は、ＺＥＰ４が、ＬＰＳおよびパルミチン酸で２４時間処理された炎症誘発性マクロファージ細胞によって産生されるＴＮＦアルファの量を大幅に低減したことを示している。３．１２５μｇ／ｍｌのＺＥＰ４濃度は、ＴＮＦアルファ発現の７０．６％の低減をもたらした。ＺＥＰ４の最も効果的な濃度は５０μｇ／ｍｌで、これによりＴＮＦアルファ発現が７７．０％低減した（ｐ＜０．０００１）。
【表１】
2021519773.tif 000002
【０１６０】
実施例２−炎症誘発性マクロファージ細胞によるＴＮＦアルファの発現に対するＺＥＰ４の効果
材料および方法
ペプチドＺＥＰ４（配列番号２）を、上記のように合成した。
Ｂ６マクロファージ細胞によるＴＮＦアルファの発現
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに由来するマクロファージを、２４ウェルプレート（５００μｌウェル）で２００，０００細胞／ｍＬの密度で培養し、３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。インキュベーション後、培地を１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳを含む新鮮な培地と交換し、３時間インキュベートした。次いで、処理群のＬＰＳ含有培地を、５０μｇ／ｍｌのＺＥＰ４を含む新鮮な培地と交換し、続いて１時間インキュベートした。次いで、パルミチン酸のアリコート（１００、２００または４００μＭ）を適切なウェルに加えた。プレートをさらに２４時間インキュベートし、各ウェルのＴＮＦアルファの量を測定した。表２に、様々な処理群および対照群を示す。処理群におけるＴＮＦアルファ産生の低減は、ＰＡ濃度に応じて、ＬＰＳおよびＰＡで処理された細胞と比較して計算した。
【０１６１】
結果
下の図２および表２は、１００、２００および４００μＭのパルミチン酸濃度が、それぞれ４１６、４６２および５９３ｐｇ／ｍＬのマクロファージＴＮＦアルファ発現を誘導したことを示している。５０μｇ／ｍｌの濃度のＺＥＰ４は、すべてのパルミチン酸濃度でマクロファージによるＴＮＦアルファ発現を実質的に低減した（＊＊＊＊ｐ＜０／０００１）。
【表２】
2021519773.tif 000003
【０１６２】
実施例３−炎症誘発性マクロファージ細胞によるＴＮＦアルファの発現に対するＺＥＰ３の効果
材料および方法
ペプチドｐＧｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ（オクタノイル）−ＯＨ（以下「ＺＥＰ３」と呼ばれる、配列番号１）を、米国特許第７，２２０，７２５号に記載のように合成した。
【０１６３】
Ｂ６マクロファージ細胞によるＴＮＦアルファの発現
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに由来するマクロファージ細胞を、２４ウェルプレート（５００μｌウェル）で２００，０００細胞／ｍＬの密度で培養し、３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。インキュベーション後、ある特定の実験群の培地を１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳを含む新鮮な培地と交換し、続いて３時間インキュベートした。次いで、ある特定の実験群の培地（ＬＰＳを含むまたはＬＰＳを含まない）を、３．１２５から１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度でＺＥＰ３を含む新鮮な培地と交換し、１時間インキュベートした。次いで、パルミチン酸（２００μＭ）アリコートを適切なウェルに加え、プレートをさらに２４時間インキュベートし、次いで各ウェルのＴＮＦアルファの量を測定した。表３に、様々な処理群および対照群を示す。処理群におけるＴＮＦアルファ産生の低減は、ＬＰＳおよびＰＡで処理された細胞と比較して計算した。
【０１６４】
結果
下の図３および表３は、ＺＥＰ３が、ＬＰＳおよびパルミチン酸で処理されたマクロファージ細胞によるＴＮＦアルファ発現を大幅に低減したことを示している。実験条件下でのＺＥＰ３の最も効果的な濃度は３．１２５μｇ／ｍｌであった（ＴＮＦアルファ発現の８２．９％の低減；ｐ＜０．０００１）。ＺＥＰ３  ＥＤ５０は、５１．９４μｇ／ｍＬと推定された。
【表３】
2021519773.tif 000004
【０１６５】
実施例４−ニゲリシン活性化マクロファージ細胞によるＩＬ−１ベータの発現に対するＺＥＰ４の効果
材料および方法
ペプチドＺＥＰ４（配列番号２）を、上記のように合成した。
ニゲリシン活性化マクロファージによるＩＬ−１ベータの発現。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに由来するマクロファージ細胞を、２４ウェルプレート（５００μｌウェル）で２００，０００細胞／ｍＬの密度で培養し、３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。一晩のインキュベーション後、培地を１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳを含む新鮮な培地と交換した。３時間後、ＬＰＳ含有培地を５０μｇ／ｍｌのＺＥＰ４を含む新鮮な培地と交換して処理ウェルに移した。１時間のインキュベーション後、ニゲリシン（２０ｍＭ）のアリコートをＺＥＰ４処理およびＬＰＳ対照ウェルに加えた。プレートをさらに２４時間インキュベートし、各ウェルのＩＬ−１ベータの量を測定した。表４に、様々な対照群および処理群を示す。処理群におけるＴＮＦアルファ産生の低減は、ＬＰＳおよびニゲリシン（ＬＰＳ＋Ｎ）で処理された細胞と比較して計算した。
【０１６６】
結果
以下の図４および表４は、５０μｇ／ｍｌの濃度のＺＥＰ４が、ニゲリシン活性化マクロファージによるＩＬ−１ベータの放出を５３．８％低減したことを示している（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【表４】
2021519773.tif 000005
【０１６７】
実施例５−炎症誘発性マクロファージ細胞の生存能に対するＺＥＰ３の効果
材料および方法
ペプチドＺＥＰ３（配列番号１）を、米国特許第７，２２０，７２５号に記載のように合成した。
ＬＰＳおよびパルミチン酸によって活性化されたマクロファージの生存能に対するＺＥＰ３の効果
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに由来するマクロファージを、２４ウェルプレート（５００μｌウェル）で２００，０００細胞／ｍＬの密度で培養し、３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。一晩のインキュベーション後、培地を１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳを含む新鮮な培地と交換し、続いて３時間インキュベートした。次いで、処理群のＬＰＳ含有培地を、５０μｇ／ｍｌの濃度でＺＥＰ３を含む新鮮な培地と交換し、続いて１時間インキュベートした。次いで、パルミチン酸（１００、２００または４００μＭ）を適切なウェルに加えた。プレートをさらに２４時間インキュベートし、ＬＤＨ細胞毒性アッセイキットを使用して細胞の生存能を推定した。表５に、様々な処理群および対照群を示す。
【０１６８】
結果
下の図５および表５は、ＺＥＰ３が実験条件下で炎症誘発性マクロファージ細胞の生存能への有意な効果を有さなかったことを示している。
【表５】
2021519773.tif 000006
【０１６９】
実施例６−炎症誘発性マクロファージ細胞によるＴＮＦアルファの発現に対するＺＥＰ３前処理の効果
材料および方法
ペプチドＺＥＰ３（配列番号１）を、米国特許第７，２２０，７２５号に記載のように合成した。
Ｂ６マクロファージ細胞によるＴＮＦアルファの発現
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに由来するマクロファージを、２４ウェルプレート（５００μｌウェル）で２００，０００細胞／ｍＬの密度で培養し、３７℃および５％ＣＯ２のインキュベータに一晩置いた。一晩のインキュベーション後、培地を５０μｇ／ｍｌのＺＥＰ３を含む新鮮な培地と交換した。１時間のインキュベーション後、１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳを適切なウェルに加え、プレートをさらに２４時間インキュベートし、次いで各ウェルのＴＮＦアルファの量を測定した。
【０１７０】
結果
下の表６は、ＬＰＳ誘導の前にＺＥＰ３でマクロファージ細胞を前処理すると、細胞によって産生されるＴＮＦアルファが４６．７％低減したことを示している（＊＊ｐ＜０．０５）。
【表６】
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【０１７１】
実施例７−角膜上皮細胞培養ドライアイ疾患モデルにおけるＺＥＰ３の抗炎症効果
実験的角膜炎症におけるペプチドの抗炎症効果を、ＬＰＳ、４−ＨＮＥ、ニゲリシン等の様々なインフラマソーム誘導物質を使用してドライアイ疾患（ＤＥＤ）をモデル化する細胞培養モデルで試験した。用量−反応モデルを使用して、ヒト初代角膜上皮細胞をペプチドで前処理し、続いてＤＥＤ誘導物質に曝露した。ＩＬ−６の発現、および細胞生存能、ＲＯＳ産生を測定した。
【０１７２】
材料および方法
ヒト初代角膜上皮細胞（ＰＣＳ−７００−０１０；ＨＣＥＣ）を、３から１２μｇ／ｍｌの範囲の濃度のＺＥＰ３で２時間処理し、次いでＬＰＳ、４−ＨＮＥまたはニゲリシンに２４時間曝露した。インキュベーション後、細胞培養における炎症誘引性サイトカインＩＬ−６、細胞生存能、および反応性酸素種（ＲＯＳ）産生のレベルを測定した。
【０１７３】
結果
図７に示されるように、細胞培養におけるＩＬ−６のレベルは、未処理の細胞培養における５２．４５±０．９１２１ｐｇ／ｍＬから、ＺＥＰ３で処理された細胞における３８．０８±１．３６８ｐｇ／ｍＬまで減少した（２７．４％の低減；Ｐ＜０．０５）。
【０１７４】
図８に示されるように、細胞培養におけるＲＯＳのレベル（相対蛍光単位；ＲＦＵとして報告される）は、未処理の細胞培養における２７０４３±９５２ＲＦＵから、ＺＥＰ３で処理された細胞培養における１３０００±８００ＲＦＵまで減少した（５１．９％の低減；Ｐ＜０．０００１）。
【０１７５】
図６に示されるように、細胞死密度は、未処理の細胞培養における２１．１２５±．９４２％から、ＺＥＰ３で処理された培養細胞における３．６２５±１．０９２％まで減少した（８２．８％の低減；Ｐ＜０．０００１）。
ＺＥＰ３ペプチドは、角膜炎症の低減、ＨＣＥＣの生存能の回復およびＲＯＳ産生の減少に効果的であり、ＤＥＡ重症度に重要な因子であると結論付けられる。結果は、様々な病状によって引き起こされるＤＥＤの予防および処置における、このペプチドおよび類似のペプチドの使用の基礎を提供する。
【０１７６】
上記の実施例１〜７は、ペプチドＺＥＰ３（配列番号１）およびＺＥＰ４（配列番号２）が、炎症誘発性マクロファージおよび角膜上皮細胞における炎症性サイトカインＴＮＦアルファ、ＩＬ−１ベータおよびＩＬ−６の発現を低減したことを示す。さらに、ペプチドは、炎症ストレスに曝露された細胞の生存能を回復することができた。結果は、本発明のペプチドがマクロファージおよび角膜上皮細胞における炎症を効果的に阻害または予防することができることを示している。
【０１７７】
実施例８−ラットのエンドトキシン誘発性ブドウ膜炎（ＥＩＵ）に対するＺＥＰ３、ＺＥＰ３ナトリウム塩およびＺＥＰ４の効果
Ｄｅ  Ｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ  ６１：６６７−６７５，１９９５に従ってモデルを実行する。体重１８０〜２００ｇの雄のルイスラットにおいて、０．１ｍＬの滅菌水で希釈された２００μｇのＬＰＳを足蹠注射することによりＥＩＵを誘発する。次いで、動物を（４ペプチド）×（３つの濃度）＝１２群に無作為化する。未処置の誘発群を誘発の対照として使用する。
【０１７８】
ＥＩＵのピークの重症度に対応する２４時間後に、動物を細隙灯生体顕微鏡で検査する。臨床的な眼の炎症は、次のように０〜７のスケールを使用して各眼でスコアリングされる：虹彩充血および前眼房内の細胞は０〜２（０＝兆候なし；１＝軽度；２＝重度）、フレア、縮瞳および前房蓄膿は、兆候がない場合は０、存在する場合は１と評価される。可能な最大スコアは７（５つのパラメータスコアの合計）である。
【０１７９】
実施例９−ドライアイの制御環境チャンバ（ＣＥＣ）マウスモデルにおけるＺＥＰ３、ＺＥＰ３ナトリウム塩およびＺＥＰ４の効果
モデル手順は、Ｂａｒａｂｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（ＩＯＶＳ  ４６：２７６６−２７７１，２００５）に記載されている。簡潔には、８〜１２週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、相対湿度（ＲＨ）、温度（Ｔ）、および気流（ＡＦ）が制御および監視される制御環境チャンバ（ＣＥＣ）内で使用する。マウスを無作為化し、ＺＥＰ３、ＺＥＰナトリウム塩およびＺＥＰ４（試験ペプチド）で処置する。無処置の誘発群を対照として使用する。次いで、マウスをＣＥＣに入れ、特定の環境制御条件（ＲＨ＝１８．５％±５．１％、ＡＦ＝１５Ｌ／分、Ｔ＝２１−２３℃）に３、７、１４、および２８日間曝露する。対照マウスは、通常の環境（ＲＨ＝５０％〜８０％、ＡＦなし、Ｔ＝２１〜２３℃）で同じ期間維持する。綿糸試験、角膜フルオレセイン染色（スコア、０〜１５）、ならびに上および下の結膜の杯細胞密度による水性涙液産生が、マスクされた観察者によって測定される。
【０１８０】
実施例１０−ドライアイのスコポラミン誘発性ラットモデルにおけるＺＥＰ３、ＺＥＰ３ナトリウム塩およびＺＥＰ４の効果
体重３００ｇ〜３５０ｇの雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを使用する。スコポラミンを充填した浸透圧ポンプ（２ＭＬ４  Ａｌｚｅｔ（登録商標）；ＣｅｄａｒＬａｎｅ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、Ｏｎｔａｒｉｏ）を介して動物に継続的および全身的に送達され、肩甲骨の間の中背部に皮下移植されるスコポラミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）を使用して、ドライアイを誘発する。創傷は、２〜３個の創傷クリップで閉じる。手術後、および翌日に再び、動物にカルプロフェン（０．５ｍｇ／１００ｇ）非ステロイド性抗炎症薬および齧歯類の強力な長時間作用型鎮痛薬を皮下注射する。外科用ポンプの埋め込み前およびイソフルオラン９９．９％ＵＳＰ（Ａｂｒａｘｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ  Ｈｉｌｌ、Ｏｎｔａｒｉｏ）チャンバでのすべてのエンドポイント試験の前に、動物を麻酔する。スコポラミンは１２．５ｍｇ／日で送達し、データは１４日目に評価する。
【０１８１】
０．１７５ｇ／ｍＬの臭化水素酸スコポラミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  Ｍｏ．）の滅菌溶液を生理食塩水（０．９％）中で調製し、０．２２ｕｍシリンジエンドフィルタ（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＣ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．）で濾過する。製造者の指示に従って、２ＭＬ４  Ａｌｚｅｔ（登録商標）ポンプに０．１７５ｇ／ｍＬスのコポラミン溶液２ｍＬを充填する。
【０１８２】
試験したラットの眼の群は以下の通りである：群１：対照ラット（６匹のラットからのｎ＝１２の眼）。群２：ラット（６匹のラットからのｎ＝１２の目）にスコポラミンの全身投与によりドライアイを誘導し、フルオレセイン染色の測定を１４日目に行った。群３：ラット（７匹のラットからのｎ＝１４の目）にスコポラミンの全身投与によりドライアイを誘導し、８日目に生理食塩水で局所的に１回処置する。群４：ラット（７匹のラットからのｎ＝１４の目）にスコポラミンの全身投与によりドライアイを誘導し、８日目に試験ペプチドで局所的に１回処置する。
【０１８３】
エンドポイントは次の通りである：（ｉ）生理食塩水処置対照と比較した、１３日目に測定される角膜フルオレセイン染色の低減；（ｉｉ）未処置またはスコポラミン処置対照と比較した、１３日目に測定される水性涙液産生および水性涙液回転率。
【０１８４】
実施例１１−乾性角結膜炎のウサギモデルにおけるＺＥＰ３、ＺＥＰ３ナトリウム塩およびＺＥＰ４の効果
涙腺排泄管を外科的に閉じ、瞬膜、瞬膜腺、およびハーダー腺を除去することによって、８匹のニュージーランド白ウサギの右眼に乾性角結膜炎（ＫＣＳ）を形成する。すべてのウサギを８週間未処置のままにし、Ｊ．Ｇｉｌｂａｒｄら（Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．９６：６７７，１９７８）により説明されるように、０．１〜０．４μＬの涙液試料を採取して涙液層浸透圧の上昇を測定することによりＫＣＳを確認する。保存された等張緩衝液でＵＴＰまたは類似体の３．０ｍｍｏｌ溶液を調製する。ウサギを無作為化し、ＺＥＰ３、ＺＥＰナトリウム塩およびＺＥＰ４（試験ペプチド）で処置する。未処置群を対照として使用する。処置開始後、最初の投与前の浸透圧測定のために、０．１〜０．４μＬの涙液試料をすべてのウサギから採取する。２０週目に動物を屠殺し、アルシアンブルーおよび過ヨウ素酸シッフ試薬で染色することにより杯細胞密度を測定する（Ｄ．Ｄａｒｔｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．６７：２７，１９９６）。
【０１８５】
実施例１２−ヒトＰＢＭＣでの炎症のインビトロモデルにおけるサイトカイン産生に対するＺＥＰ３およびそのナトリウム塩（ＺＥＰ３Ｎａ）の効果
サイトカイン産生に対するペプチドＺＥＰ３（配列番号１）の効果を、炎症のインビトロヒトモデルで評価した。リポ多糖（ＬＰＳ）を使用してヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を刺激し、サイトカインを産生させた。
【０１８６】
方法：簡潔には、いかなるコルチコステロイドまたは他の炎症性薬物も投与されていない４人の健康な非喫煙者の凍結保存されたヒトＰＢＭＣを、ＲＰＭＩ１６４０で１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（完全成長培地、ＣＧＭ）で成長させた。
【０１８７】
ヒトＰＢＭＣを解凍し、すべての群（１〜６、表７）に播種し、処理前に１時間静置した。細胞群を、４０、１００および１５０μｇ／ｍｌの濃度の試験項目であるＺＥＰ３（配列番号１）、またはデキサメタゾンで１時間処理し、続いてＬＰＳで２４時間刺激する。上清収集の４時間前にＡｌｍａｒ  Ｂｌｕｅを添加する。ＬＰＳ添加の２４時間後、５８５ｎｍで蛍光を発するアルマーブルー（細胞生存能に相関する）を測定し、上清をサイトカイン測定用に収集する。各群を３回する。
【表７】
2021519773.tif 000008
【０１８８】
詳細な方法：製造者の指示に従って細胞を解凍し、ＣＧＭで洗浄し、トリパンブルー染色を使用して生存率を評価した。ＣＧＭ中で２×１０＾６細胞／ｍＬの原液を調製した。１００μＬの原液を９６ウェル黒壁プレート（ドナー当たり１プレート）の適切なウェルに加え、ウェル当たり２×１０５細胞を播種した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。１００μＬの２Ｘの試験項目、デキサメタゾン、または１ＸのＣＧＭを適切なウェルに加え、最終体積を２００μＬ／ウェルにした。プレートを３７℃、５％ＣＯ２でさらに１時間インキュベートした。１時間後、２０μＬのＬＰＳを群２〜９に添加し、最終体積を２２０μＬにした。２０μＬのＩＭを群１に添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２０時間インキュベートした。２０時間の時点で、２０μＬのＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅをすべてのウェルに添加した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２でさらに４時間インキュベートした。ＬＰＳ刺激後２４時間で、細胞生存能の評価のためにプレートを読み取り、細胞培養上清を回収し、サイトカイン分析のために−８０℃で保存した。残りの細胞を滅菌ＰＢＳで１回洗浄した。細胞をトリプシン溶液中でインキュベートしてプレートから分離し、遠心してペレットにし、トリプシン溶液を除去した。次いで、細胞を任意選択のさらなる分析のために−８０℃で保存した。Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイを使用して、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅアッセイ後に収集された上清試料に存在するＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１７ａ、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＲＡＮＴＥＳ、およびＴＮＦアルファの濃度を決定した。サイトカインアッセイの使用において、製造者のプロトコルに従った。サイトカイン産生および試料刺激のパーセンテージ対刺激対照の平均を計算した。
【０１８９】
結果：図９〜１２に示されるように、ＺＥＰ３は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ、図９）、ＩＬ−１０（図１０）、ＩＬ−１β（図１１）およびＲＡＮＴＥＳ（図１２）を含む炎症の主要なメディエーターの有意な低減を惹起することが示され、その抗炎症効果の概念を裏付けている。測定されたサイトカインのいくつかでは、用量依存的な反応が観察された。試験したすべての濃度のペプチドで処理した後、細胞の生存能に有意な変化やいかなるドナーの傾向も観察されなかったが、これはペプチドがＰＢＭＣに対して細胞毒性を有さないことを示している。ＩＬ−４およびＩＬ−１７ａのレベルは、すべての試験群で検出限界を下回っていた。
【０１９０】
サイトカイン産生の低減はＺＥＰ３に直接関連しており、ヒト血液細胞におけるＺＥＰ３の抗炎症効果が確認された。
【０１９１】
実施例１３−インビボアトピー性皮膚炎モデル
ＺＥＰ３（配列番号１）、およびそのナトリウム塩形態（ＺＥＰ３Ｎａ）、およびＺＥＰ４（配列番号２）の局所投与の効果を、オキサゾロン誘発性アトピー性皮膚炎（ＡＤ）マウスモデルで評価した。このモデルは広く使用されており、人間のＡＤ療法のための薬を評価するための受け入れられた動物モデルとして文献にも詳しく記載されている（Ａｖｃｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１３  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．８，３３１−３５５；Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  Ｔ．Ｋ．２００６，Ｂａｓｉｃ  Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．９９，１０４−１１５）。
【０１９２】
方法：動物の剃毛および脱毛後の０日目の背部に、エタノール中の２％オキサゾロンを局所投与して動物を感作した（感作期）。次いで、１週間後、エタノール中の１％オキサゾロンを背中および右耳に２日ごとに１０回、すなわち合計３週間局所投与することにより、チャレンジを行った。試験化合物は、すぐに使用できるクリーム製剤として、局所経路を介して２日ごとにチャレンジ段階中に塗布した。塗布面はチャレンジと同じであった（背中＋耳）。背中に１００μＬを置き、背中をスムーズにマッサージした。次いで、指手袋に残った製剤を耳の内面に付着させた。１日おきに、背中の皮膚および耳の厚さをノギスで測定し、次の臨床スコアを背中の皮膚から記録した：紅斑および鱗屑。動物の体重も１日おきに測定した（開始時のマウスのおおよその体重は約２０ｇである）。背中の皮膚領域の補正デジタル写真を、８、１８、および２８日目に撮影した。２８日目に実験を終了し、動物から血液を採取し、血漿検体を分離した。安楽死させた動物に対し、右耳および背中の皮膚の試料を収集して−８０°Ｃで凍結する（背中の皮膚および血漿からの試料）か、またはさらなる分析のためにホルマリン中に保存した（背中の皮膚および右耳の試料）。表８は、投与群について説明している。
【表８】
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【０１９３】
試験化合物の局所投与に使用された製剤は、以下の通りである：
ＺＥＰ３  ｐＨ７．１の１％クリームで、プロピレングリコール、ポリソルベート８０、エデト酸二ナトリウム、二酸化ケイ素（ｓｙｌｏｉｄ）、メチルパラベン、白色ワセリン、ミリスチン酸イソプロピル、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセリルを含む。
ＺＥＰ３Ｎａ  ｐＨ８．０の１％クリームで、プロピレングリコール、ポリソルベート８０、エデト酸二ナトリウム、二酸化ケイ素（ｓｙｌｏｉｄ）、メチルパラベン、白色ワセリン、ミリスチン酸イソプロピル、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセリルを含む。
ＺＥＰ４  ｐＨ４．５の１％クリームで、プロピレングリコール、グリセリン、ポリソルベート８０、ＥＤＴＡ二ナトリウム、キサンタンガム、二酸化ケイ素（ｓｙｌｏｉｄ）、メチルパラベン、白色ワセリン、ミリスチン酸イソプロピル、セチルアルコール、ステアリルアルコール、およびグリセリルモノステアレート（ｋｏｌｌｉｗａｘ）を含む。
【０１９４】
結果：アトピー性皮膚炎誘発マウスに５０ｍｇ／ｋｇで投与された試験化合物ＺＥＰ３、ＺＥＰ３ＮａおよびＺＥＰ４は、忍容性が良好であった。すべてのペプチドは、アトピー性皮膚炎、背中の皮膚の厚さ（図１３Ａおよび１３Ｂ）、耳の厚さ（図１４Ａおよび１４Ｂ）、および紅斑（図１５Ａおよび１５Ｂ）の臨床病変を有意に低減した。鱗屑は、ＺＥＰ３で処置されたマウスでは１８日目から２４日目に減少し（図１６Ａ）、ＺＥＰ３Ｎａ（図１６Ａ）またはＺＥＰ４（図１６Ｂ）で処置されたマウスでは１４日目から２４日目に減少し、遅延効果を示している。ＺＥＰ３、ＺＥＰ３Ｎａ、またはＺＥＰ４で処置されたマウスの体重は、賦形剤と比較して正常な挙動を示した（図１７Ａおよび１７Ｂ）。
【０１９５】
詳細には、ＺＥＰ３、ＺＥＰ３Ｎａ、およびＺＥＰ４の体重は、試験の最初の数日間は非常に安定しており、２８日目に約３〜４％の増加を示した（図１７Ａおよび１７Ｂ）。ベタメタゾンで処置された群では、予測通り、約８〜１０％の体重減少が観察された。
【０１９６】
ベタメタゾン処置マウスを除いて、試験の最初の数日間は背中の皮膚の厚さが増加し、次いで試験の終わりまで非常に安定したままであった（図１３Ａおよび１３Ｂ）。２８日目に、賦形剤を投与した陰性対照群では約１１０％、ＺＥＰ３  １％を投与した群３では９０％、ＺＥＰ３Ｎａ  １％を投与した群４では１０５％、およびＺＥＰ４  １％を投与した群５では約９０％の増加が認められ、一方ベタメタゾンを投与した陽性対照群２では４０％の減少が認められた。グラフにおいて、処置群の全て（群３、４、および５）が、背中の皮膚の厚さが陰性対照群１よりも低い傾向を示した。２０日目（−２５．５％）および２４日目（−１６．６％）のＺＥＰ３について、対照群１に対する背中の厚さの有意差が概略的に示された。ＺＥＰ４については、１４日目に対照群１に対する背中の厚さの有意差が概略的に示された（−１３．５％）。
【０１９７】
右耳の厚さ：このモデルで通常観察されるように、すべての群が最初の数日から試験の終わりまで重要な肥厚を示したが、但し陽性対照群２は、試験の全体にわたり、約１５〜２０％の僅かな増加を示すのみであった（図１４Ａおよび１４Ｂ）。有意差は、ＺＥＰ３では２０、２２および２８日目（対照と比較して−１０．１〜−１８．０％）、ＺＥＰ３  Ｎａでは１８、２０および２２日目（対照と比較して−１８．４〜−２２．７％）、またＺＥＰ４では２０、２２、２８日目（対照と比較して−１２．３〜−１６．０％）に概略的に示された。
【０１９８】
紅斑スコアリングは、陰性対照群（群１）の１６日目に最大となり、２６〜２８日目にはわずかに０まで減少した。試験群３、４および５で記録された紅斑スコアリングは、陰性対照群１と同様であった（図１５Ａおよび１５Ｂ）。有意差は、ＺＥＰ３では２２日目および２４日目、ＺＥＰ３Ｎａでは２４日目、ＺＥＰ４では１２日目、１６日目、２２日目および２４日目に示された。
【０１９９】
鱗屑スコアリングは、最初の数日間は徐々に増加し、次いでわずかに減少し、試験の後半では非常に安定したままであった（図１６Ａおよび１６Ｂ）。すべての処置群３、４、および５は、１４日目から２８日目まで、陰性対照群１よりも低い鱗屑スコアを示した。
【０２００】
合計スコア（紅斑および鱗屑スコアの合計）も、処置群３、４および５の方が、陰性対照群１よりも１４日目から２８日目まで低かった。合計スコアの有意差は、ＺＥＰ３では２０、２４および２８日目、ＺＥＰ３Ｎａでは１４、１８、２０および２２日目、ＺＥＰ４では１２〜２０、２４、２８日目で示された。
【０２０１】
結論：５０ｍｇ／ｋｇでアトピー性皮膚炎誘発マウスに投与された化合物ＺＥＰ３およびＺＥＰ４およびそのナトリウム塩は、忍容性が良好であり、背中の皮膚の厚さ、耳の厚さ、紅斑、および鱗屑の低減によって示されるように、アトピー性皮膚炎の臨床病変を有意に低減した。
【０２０２】
実施例１４手根中手骨変形性関節症（ＣＭＣ関節炎）のＺＥＰ３による処置
７５歳の男性被験者が、親指のＣＭＣ型関節炎であることが整形外科医により診断された。彼のつま先は腫れ、赤く、痛みを伴うので歩くことができなかった。
【０２０３】
０．５％クリームのＺＥＰ３ナトリウム塩を、１日に５回、腫れた領域に塗布した。対象は、処置後１日以内に軽減し、３〜４日以内に状態が解消したと報告した。
【０２０４】
実施例１５ヒトケラチノサイトのＴＮＦアルファ分泌に対するＺＥＰ３およびＺＥＰ３Ｎａペプチドの効果
ＴＮＦアルファは、ケラチノサイトの主要な炎症誘引性メディエーターである。ＴＮＦアルファレベルに対する影響を測定することにより、化合物を抗炎症効果について試験した。
【０２０５】
方法：ＳＣＣＥ０２０細胞（ＥｐｉＧＲＯ（商標）ヒト表皮ケラチノサイト）を４継代に対しての完全成長培地（ＥｐｉＧＲＯ（商標）ヒトケラチノサイト完全培地；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ番号ＳＣＭＫ００１）中で成長させた。継代５では、細胞を、ウェル当たり１ｍｌの完全増殖培地の体積で３つ播種した（３×１０５細胞／ウェル）。追加の３つの対照ウェルには、細胞を含まない培地のみが含まれていた。付着したら、細胞培地をサプリメントなしのＬ−グルタミンを含む基本培地（飢餓培地）に置き換え、細胞を一晩飢餓状態にした。播種の２４時間後の翌日、細胞をＺＥＰ３またはＺＥＰ３Ｎａまたは適切な希釈剤（ＰＢＳもしくはＤＭＳＯ）で処理した。４時間のインキュベーション後、ＬＰＳ（Ｅ．Ｃｏｌｉ  ０５５：Ｂ５から；Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｌ６５２９−１ＭＧ）を２０または３０μｇ／ｍｌの最終濃度でウェルに加えた。実験群（各処理につき３つのウェル）を表９にまとめる。
【０２０６】
細胞を組織培養インキュベータで２４時間インキュベートした。すべてのウェルから細胞上清を収集した後、処理群（１、２、３、８、９、１０、１３、１４（ＤＭＳＯ群なし））からの細胞をペレット化し、さらに分析するために−８０°Ｃで保存した。細胞を次のように収集した：上清の収集後、ウェルをトリプシンで濯ぎ、次いでプレート表面から分離するまでトリプシンでインキュベートし、遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、細胞ペレットとして保存した。上清中のＴＮＦ−α濃度は、ＥＬＩＳＡ（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＨＳ  ＥＬＩＳＡ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＨＳＴＡ００Ｄ）により、５回測定した。
【０２０７】
結果：ＺＥＰ３およびＺＥＰ４は、ヒトケラチノサイト細胞培養におけるＴＮＦアルファレベルを効果的に減少させた。試料中のＴＮＦアルファ濃度は、標準曲線の傾向線の方程式：ＯＤ＝０．０６３ｘ＋０．１７１８に従って計算した。ＴＮＦアルファ産生の阻害パーセントは、対応する対照群（同じ条件、ペプチドなし）と比較して、各処理群で計算した。結果を表９にまとめる。
【表９】
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【０２０８】
結論：ＥＬＩＳＡによる定量試験は、ＬＰＳのみでシミュレートした細胞によって分泌された量と比較して、ＺＥＰ３またはＺＥＰ３Ｎａのいずれかと共にＬＰＳ処理されたヒトケラチノサイトにおいてＴＮＦ−α産生の用量依存的阻害を示した。
【０２０９】
本発明は、その特定の実施形態に関連して説明されてきたが、多くの代替、修正、および変形が当業者に明らかであることは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および広い範囲内にあるそのようなすべての代替、修正、および変形が包含されることが意図される。
【０２１０】
本明細書で言及されているすべての出版物、特許、および特許出願は、個々の出版物、特許、または特許出願が参照により本明細書に組み込まれることが具体的かつ個別に示されている場合と同程度に、参照により全体が本明細書に組み込まれる。さらに、本出願における任意の参考文献の引用または特定は、そのような参考文献が本発明の先行技術として利用可能であることの承認として解釈されるべきではない。セクションの見出しが使用されている限りにおいて、それらは必ずしも限定的であると解釈されるべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年12月24日(2020.12.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021519773000001.app
【国際調査報告】
2021519773.tif 000033
2021519773.tif 000034
2021519773.tif 000035