(57)【要約】  Ｔ細胞を選別するためのシステムおよび方法が開示される。自家蛍光データは、個々の細胞から取得される。活性化値は、１つ以上の自家蛍光エンドポイントを入力値として使用して計算される。１つ以上の自家蛍光エンドポイントは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ最短蛍光寿命振幅成分（α1）を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞選別装置であって、
細胞選別経路であって、
（ｉ）入口と、
（ｉｉ）前記入口の下流の前記入口に結合された観察ゾーンであって、個々の自家蛍光調査のためにＴ細胞を提示するように構成される観察ゾーンと、
（ｉｉｉ）選別器入口および少なくとも２つの選別器出口を有する細胞選別器であって、前記細胞選別器が、前記観察ゾーンの下流の前記選別器入口を介して前記観察ゾーンに結合され、前記細胞選別器が、選別器信号に基づいて、前記選別器入口から前記少なくとも２つの選別器出口の１つに、細胞を選択的に誘導するように構成される、細胞選別器と、を含む細胞選別経路と、
前記観察ゾーンに位置付けられるＴ細胞からの自家蛍光データセットを取得するように構成される、単一細胞自家蛍光検出器であって、各自家蛍光データセットの自家蛍光寿命情報を取得するように構成される、単一細胞自家蛍光検出器と、
前記細胞選別器および前記単一細胞自家蛍光検出器と電子通信するプロセッサと、
非一時的なコンピュータ可読媒体であって、前記プロセッサによって実行されると、前記プロセッサに
ａ）前記自家蛍光データセットを受け取らせ、
ｂ）活性化値に基づいて、前記選別器信号を前記細胞選別器に提供させる命令をその上に格納し、前記選別器信号が、前記活性化値が所定の閾値を超える場合、前記少なくとも２つの選別器出口の第１の出口に、そして前記活性化値が前記所定の閾値以下である場合、前記少なくとも２つの選別器出口の第２の出口に、前記Ｔ細胞を選択的に誘導するように前記細胞選別器を誘導し、前記活性化値が、前記Ｔ細胞の前記自家蛍光データセットについて少なくとも１つの代謝エンドポイントを入力値として使用して計算され、前記少なくとも１つの代謝エンドポイントが、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）最短蛍光寿命振幅成分（α1）を含む、非一時的なコンピュータ可読媒体と、を含む、Ｔ細胞選別装置。
【請求項２】
前記細胞選別経路が、マイクロ流体経路またはナノ流体経路を含む、請求項１に記載のＴ細胞選別装置。
【請求項３】
前記Ｔ細胞選別装置が、光源をさらに含む、請求項１に記載のＴ細胞選別装置。
【請求項４】
前記Ｔ細胞選別装置が、１ｆｓ〜１０ｎｓの半値全幅パルス幅を有するパルス光源をさらに含む、請求項１に記載のＴ細胞選別装置。
【請求項５】
前記単一細胞自家蛍光検出器が、１ｋＨｚ〜２０ＧＨｚの繰り返し率で前記自家蛍光データセットを取得するように構成される、請求項１に記載のＴ細胞選別装置。
【請求項６】
前記単一細胞自家蛍光検出器が、時間相関単一光子計数を介して、前記自家蛍光データセットを取得するように構成される、請求項１に記載のＴ細胞選別装置。
【請求項７】
前記単一細胞自家蛍光検出器が、光電子増倍管または光ダイオードである、請求項１に記載のＴ細胞選別装置。
【請求項８】
前記Ｔ細胞選別装置が、細胞サイズを測定し、前記細胞サイズを前記プロセッサに通信するように構成される細胞サイズ測定ツールをさらに含む、請求項１に記載のＴ細胞選別装置。
【請求項９】
前記活性化値が、Ｔ細胞の集団の各Ｔ細胞について前記細胞サイズを入力値として使用して計算される、請求項８に記載のＴ細胞選別装置。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの代謝エンドポイントがさらに、光学レドックス比、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ平均蛍光寿命（τm）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ第１蛍光寿命成分（τ1）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ第２蛍光寿命成分（τ2）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）τm、ＦＡＤα1、ＦＡＤτ1、ＦＡＤτ2、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるエンドポイントを含む、請求項１に記載のＴ細胞選別装置。
【請求項１１】
Ｔ細胞を選別する方法であって、前記方法が、
ａ）未知の活性化状態を有するＴ細胞の集団を受け取ることと、
ｂ）前記Ｔ細胞の集団の各Ｔ細胞についての自家蛍光データセットを取得することであって、各自家蛍光データセットが、自家蛍光寿命情報を含む、取得することと、
ｃ）活性化値に基づいて、前記Ｔ細胞の集団の第１の部分を、前記Ｔ細胞の集団の第２の部分から物理的に単離することと、を含み、前記Ｔ細胞の集団の各Ｔ細胞を、前記活性化値が所定の閾値を超える場合、前記第１の部分に、そして前記活性化値が所定の閾値以下である場合、前記第２の部分に入れ、前記活性化値が、前記Ｔ細胞の集団の各Ｔ細胞について自家蛍光データセットの少なくとも１つの代謝エンドポイントを入力値として使用して計算され、前記少なくとも１つの代謝エンドポイントが、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）最短蛍光寿命振幅成分（α1）を含む、方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの代謝エンドポイントが、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ蛍光強度、ＦＡＤ蛍光強度、光学レドックス比、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ平均蛍光寿命（τm）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ第１蛍光寿命成分（τ1）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ第２蛍光寿命成分（τ2）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）τm、ＦＡＤα1、ＦＡＤτ1、ＦＡＤτ2、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるエンドポイントをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記活性化値が、前記Ｔ細胞の集団の各Ｔ細胞について細胞サイズを入力値として使用して計算される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記所定の閾値を、既知の活性化状態を有するＴ細胞の対照集団についての分類、および特徴選択機械学習を介して選択する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記所定の閾値が、ドナー正規化される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記活性化値が前記所定の閾値を超える前記Ｔ細胞が、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、またはＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
Ｔ細胞を活性化されたものとして分類する精度が、少なくとも７５％である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
活性化Ｔ細胞を、それを必要とする対象に投与する方法であって、前記方法が、
ａ）請求項１１に記載の方法と、
ｂ）前記Ｔ細胞の集団の第１の部分を、前記対象に導入することと、を含む方法。
【請求項１９】
前記Ｔ細胞の集団の前記第１の部分を、工程ｂ）の前に改変する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｔ細胞の集団の前記第１の部分を、工程ｂ）の前にキメラ抗原受容体を含むように改変する、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年８月２９日に出願された米国仮特許出願番号６２／７２４，４２８の利益を主張し、これは、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
研究されている新しい癌治療の１つは、ＣＡＲＴ細胞（キメラ抗原受容体Ｔ細胞）療法である。ＣＡＲＴ細胞療法は、患者自身の細胞を使用し、それらを「再設計」して癌と闘う。それは非常に複雑な治療である。細胞の収集と改変は困難であり、ＣＡＲＴ細胞療法はしばしば非常に重篤な副作用を引き起こす。現時点では、それは少数の主要な癌センターでのみ提供されている。現在まで、ＣＡＲＴ細胞で治療された患者のほとんどは、血液癌の患者である。
【０００３】
この手順は、患者自身のＴ細胞を彼らの血液から取り除き、それらを実験室に送って、そこでそれらの細胞の表面上にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と呼ばれるタンパク質を生成するように改変することから始まる。これらの特別な受容体は、Ｔ細胞が癌細胞を特定するのを助け、攻撃することを可能にする。「過給された」Ｔ細胞は、実験室で増殖され、成長し、次いで凍結されて病院に返送され、そこで、それらの処理されたＣＡＲＴ細胞は患者の血液内に再注入される。
【０００４】
Ｔ細胞活性化を決定する現在の方法には、フローサイトメトリー、免疫蛍光画像化、および免疫組織化学が含まれるが、これらの方法には造影剤が必要であり、組織または細胞の固定を必要とし得る。選別されたＴ細胞が、ＣＡＲＴ細胞療法などのその後の処置で使用されることを可能にする方式で、活性化状態によってＴ細胞を選別するためのシステムおよび方法の必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００５】
一態様では、本開示は、Ｔ細胞選別装置を提供する。Ｔ細胞選別装置は、細胞選別経路と、単一細胞自家蛍光検出器と、プロセッサと、非一時的なコンピュータ可読媒体とを含む。細胞選別経路は、入口と、観察ゾーンと、細胞選別器とを含む。観察ゾーンは、入口の下流の入口に結合される。観察ゾーンは、個々の自家蛍光調査のためにＴ細胞を提示するように構成される。細胞選別器は、選別器入口および少なくとも２つの選別器出口を有する。細胞選別器は、観察ゾーンの下流の選別器入口を介して観察ゾーンに結合される。細胞選別器は、選別器信号に基づいて、細胞を選別器入口から、少なくとも２つの選別器出口のうちの１つに選択的に誘導するように構成される。単一細胞自家蛍光検出器は、観察ゾーン内に位置付けられるＴ細胞から自家蛍光データセットを取得するように構成される。単一細胞自家蛍光検出器は、各自家蛍光データセットの自家蛍光寿命情報を取得するように構成される。プロセッサは、細胞選別器および単一細胞自家蛍光検出器と電子通信する。非一時的なコンピュータ可読媒体は、プロセッサによって実行される場合、プロセッサに、ａ）自家蛍光データセットを受け取らせ、ｂ）活性化値に基づいて選別器信号を細胞選別器に提供させる命令をその上に格納している。選別器信号は、活性化値が所定の閾値を超える場合、少なくとも２つの選別器出口の第１の出口に、そして活性化値が所定の閾値以下である場合、少なくとも２つの選別器出口の第２の出口にＴ細胞を選択的に誘導するように、細胞選別器を誘導する。活性化値は、Ｔ細胞について、自家蛍光データセットの少なくとも１つの代謝エンドポイントを入力値として使用して計算される。少なくとも１つの代謝エンドポイントは、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）最短自家蛍光寿命の振幅成分（α1）を含む。
【０００６】
別の態様では、本開示は、Ｔ細胞を選別する方法を提供する。この方法は、ａ）未知の活性化状態を有するＴ細胞の集団を受け取ることと、ｂ）Ｔ細胞の集団の各Ｔ細胞についての自家蛍光データセットを取得することであって、各自家蛍光データセットが、自家蛍光寿命情報を含む、取得することと、ｃ）活性化値に基づいて、Ｔ細胞の集団の第１の部分を、Ｔ細胞の集団の第２の部分から物理的に単離することを含み、Ｔ細胞の集団の各Ｔ細胞を、活性化値が所定の閾値を超える場合、第１の部分内に、そして活性化値が所定の閾値以下である場合、第２の部分内に入れ、活性化値は、Ｔ細胞の集団の各Ｔ細胞についての自家蛍光データセットの少なくとも１つの代謝エンドポイントを入力値として使用して計算され、少なくとも１つの代謝エンドポイントが、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈα1を含む。
【０００７】
さらなる態様では、本開示は、活性化されたＴ細胞を、それを必要とする対象に投与する方法を提供する。この方法は、活性化値に基づいて、Ｔ細胞の集団の第１の部分を、Ｔ細胞の集団の第２の部分から物理的に単離することであって、Ｔ細胞の集団の各Ｔ細胞を、活性化値が所定の閾値を超える場合、第１の部分内に、そして活性化値が所定の閾値以下である場合、第２の部分内に入れ、活性化値を、Ｔ細胞の集団の各Ｔ細胞について自家蛍光データセットの少なくとも１つの代謝エンドポイントを入力値として使用して計算し、少なくとも１つの代謝エンドポイントが、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈα1を含む、単離することと、Ｔ細胞集団の第１の部分を対象に導入することと、を含む。この方法は、対象に導入する前に、Ｔ細胞の集団の第１の部分を改変することをさらに含むことができる。改変は、キメラ抗原受容体を含む改変とすることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、本開示の一態様による方法を示すフローチャートである。
【図２】図２は、本開示の一態様による方法を示すフローチャートである。
【図３】図３は、本開示の一態様による装置のブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明をさらに詳細に記載する前に、本発明は、記載された特定の実施形態に限定されないことを理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載することのみを目的としており、限定することを意図するものではないことも理解される。本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ限定される。本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、複数の実施形態を含む。
【００１０】
生物学的分子の改変に関連する特定の構造、装置、および方法が開示される。本発明の概念から逸脱することなく、すでに記載したもの以外の多くの追加の変更が可能であることは、当業者には明らかなはずである。本開示を解釈する際に、すべての用語は、文脈と一致する可能な限り広い意味で解釈されるべきである。「含む」という用語の変形は、非排他的な意味で要素、成分、または工程を指すものとして解釈されるべきであるため、言及される要素、成分、または工程は、明示的に言及されていない他の要素、成分、または工程と組み合わせることができる。特定の要素を「含む」と言及される実施形態はまた、それらの要素「から本質的になる」および「からなる」ことが企図される。特定の値について２つ以上の範囲が列挙される場合、本開示は、明示的に言及されていないそれらの範囲の上限および下限のすべての組み合わせを企図する。例えば、１〜１０または２〜９の値の列挙は、１〜９または２〜１０の値も企図する。
【００１１】
本明細書で使用される場合、「活性化された」および「活性化」という用語は、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、および／またはＣＤ８＋であるＴ細胞を指す。
【００１２】
本明細書で使用される場合、「ＦＡＤ」という用語は、フラビンアデニンジヌクレオチドを指す。
【００１３】
本明細書で使用される場合、「メモリ」という用語は、不揮発性媒体、例えば、磁気媒体もしくはハードディスク、光学記憶装置、またはフラッシュメモリ；システムメモリなどの揮発性媒体、例えば、ＤＲＡＭ、ＳＲＡＭ、ＥＤＯ  ＲＡＭ、ＲＡＭＢＵＳ  ＲＡＭ、ＤＲ  ＤＲＡＭなどのランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）；またはソフトウェア媒体などのインストール媒体、例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、もしくはフロッピーディスクを含み、そこにプログラムを格納し得、および／またはデータ通信をバッファリングし得る。「メモリ」という用語はまた、他のタイプのメモリまたはそれらの組み合わせを含み得る。
【００１４】
本明細書で使用される場合、「ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ」という用語は、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび／または還元型ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸を指す。
【００１５】
本明細書で使用される場合、「プロセッサ」という用語は、１つ以上のプロセッサおよびメモリ、ならびに／または１つ以上のプログラム可能なハードウェア要素を含み得る。本明細書で使用される場合、「プロセッサ」という用語は、任意のタイプのプロセッサ、ＣＰＵ、マイクロコントローラ、デジタル信号プロセッサ、またはソフトウェア命令を実行することができる他の装置を含むことが意図される。
【００１６】
本明細書で使用される場合、「レドックス比」または「光学レドックス比」という用語は、ＦＡＤ蛍光強度に対するＮＡＤ（Ｐ）Ｈ蛍光強度の比、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ蛍光強度に対するＦＡＤ蛍光強度の比、ＦＡＤ蛍光強度を含む任意の算術的組み合わせに対するＮＡＤ（Ｐ）Ｈ蛍光強度の比、またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ蛍光強度を含む任意の算術的組み合わせに対するＦＡＤ蛍光強度の比を指す。
【００１７】
自家蛍光エンドポイントは、光子数／強度および蛍光寿命を含む。細胞の蛍光寿命は、単一の値、平均蛍光寿命とすることができ、または異なる寿命を持つ複数の亜種の寿命値から妥協され得る。この場合、複数の寿命および寿命成分振幅値が抽出される。ＮＡＤ（Ｐ）ＨおよびＦＡＤはどちらも、クエンチされた（短寿命）およびクエンチされていない（長寿命）構成で存在することができ、したがって、ＮＡＤ（Ｐ）ＨおよびＦＡＤの蛍光減衰は２つの成分に適合される。一般に、ＮＡＤＨおよびＦＡＤ蛍光寿命減衰は、２成分指数関数減衰である、Ｉ（ｔ）＝α1ｅ-t/τ1＋α2ｅ-t/τ2＋Ｃ（式中、Ｉ（ｔ）は、レーザーパルス後の時間ｔの関数としての蛍光強度であり、α1およびα2は、それぞれ短および長寿命成分の画分寄与（すなわち、α1＋α2＝１）であり、τ1およびτ2は、それぞれ短および長寿命成分であり、Ｃは、背景光を考慮する）に適合される。ただし、寿命減衰は、より多くの成分（理論的には任意の数の成分であるが、実際には最大約５〜６）に適合させることができ、それは追加の寿命および成分振幅の定量化を可能にする。慣例により、寿命および振幅は、短いものから長いものまで番号が付けられるが、これは逆にしてもよい。平均寿命は、（τm＝α1τ1＋α2τ2．．．．．）である寿命成分から計算することができる。蛍光寿命および寿命成分振幅は、周波数領域データおよびゲート付きカメラ／検出器から概算することもできる。ゲート検出の場合、α1を、初期の時間ビンで検出された強度を、後期の時間ビンで割ることによって概算し得る。あるいは、蛍光異方性を、自家蛍光の偏光感知検出によって測定することができ、したがって、遊離ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを１００〜７００ｐｓの範囲の短回転拡散時間として識別することができる。
【００１８】
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈα1は、遊離ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの寄与を指し、機器応答および／または散乱によって支配されない（すなわち、５０％より大きい）最短寿命である。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈα1は、２００〜１５００ｎｓ、２００〜１０００ｎｓ、または２００〜６００ｎｓのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ寿命値に関連付けられる寄与である。明確にするために、「最短」寿命に関連する特徴を含む本明細書の請求項を、機器応答および／または散乱によって支配される犠牲的最短寿命を含むように寿命値を定義することによって回避することはできない。
【００１９】
種々の態様は、種々の機能構成要素および処理工程の観点から本明細書に記載され得る。そのような構成要素および工程は、指定された機能を実行するように構成された任意の数のハードウェア構成要素によって実現され得ることを理解されたい。
【００２０】
方法
本開示は、種々の方法を提供する。種々の方法が、他の方法との使用に適していることを理解されたい。同様に、種々の方法が、本明細書の他の場所で記載されるシステムとの使用に適していることを理解されたい。本開示の特徴が所与の方法に関して記載される場合、その特徴はまた、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、本明細書に記載される他の方法およびシステムに有用であることが明確に企図される。
【００２１】
図１を参照すると、本開示は、Ｔ細胞を選別する方法１００を提供する。プロセスブロック１０２において、方法１００は、未知の活性化状態を有するＴ細胞の集団を受け取ることを含む。プロセスブロック１０４において、方法１００は、Ｔ細胞の集団の各Ｔ細胞についての自家蛍光データセットを取得することを含む。プロセスブロック１０６において、方法１００は、活性化値に基づいて、Ｔ細胞の集団の第１の部分を、Ｔ細胞の集団の第２の部分から物理的に単離することを含む。
【００２２】
プロセスブロック１０４で取得される自家蛍光データセットは、寿命情報を含み、本開示の知識および現場からの自身の知識を有する分光学的技術分野の当業者によって理解されるように、種々の方法で取得することができる。例えば、自家蛍光データを、蛍光減衰データから取得することができる。別の例として、自家蛍光データを、検出器（例えば、カメラ）をゲート制御することによって取得して、減衰中の特定の時間にデータを取得して、本明細書に記載の自家蛍光エンドポイントを概算することができる。さらに別の例として、周波数領域アプローチを使用して寿命を測定することができる。あるいは、蛍光異方性を、自家蛍光の偏光感知検出によって測定し、したがって、遊離ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを１００〜７００ｐｓの範囲の短回転拡散時間として識別することができる。本明細書に記載される方法に必要な自家蛍光エンドポイントを決定するために必要な寿命情報を、どんな形であれ適切に測定、推定、または決定することができる限り、自家蛍光データが取得される特定の方法は、本発明の範囲に限定することを意図しない。
【００２３】
プロセスブロック１０６の物理的単離は、取得した自家蛍光データから決定される活性化値に応答するものである。所与のＴ細胞の活性化値が所定の閾値を超える場合、そのＴ細胞は第１の部分内に入れられる。所与のＴ細胞の活性化値が所定の閾値以下である場合、そのＴ細胞は第２の部分内に入れられる。    この物理的単離の結果、Ｔ細胞の集団の第１の部分は活性化Ｔ細胞が有意に濃縮され、一方、Ｔ細胞の集団の第２の部分は活性化Ｔ細胞が有意に減少している。
【００２４】
場合によっては、プロセスブロック１０６の物理的単離は、細胞を３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上の部分に単離することを含むことができる。これらの場合、異なる部分は、部分の数より１つ少ない数の所定の閾値によって分離される（すなわち、３つの部分＝２つの所定の閾値）。活性化値が所定の閾値のすべてを超える（すなわち、最高閾値を超える）部分は、最高濃度の活性化Ｔ細胞を含む。活性化値がいずれの所定の閾値も超えない（すなわち、最低閾値を超えない）部分は、最低濃度の活性化Ｔ細胞を含む。複数の所定の閾値を使用することにより、活性化Ｔ細胞の濃度が非常に高いまたは非常に低いＴ細胞の集団の部分に調製することができる。
【００２５】
活性化値は、Ｔ細胞の集団の各Ｔ細胞について自家蛍光データセットの少なくとも１つの代謝エンドポイントを入力値として使用して計算される。活性化値は、少なくとも１つの代謝エンドポイントを変数として使用する、既知の活性化状態を有するＴ細胞の集団についてのデータに対する機械学習プロセスによって生成される方程式を使用して計算される。場合によっては、活性化値は、異なる種類の活性化について異なる予測可能性を有することができる（すなわち、ＣＤ８＋活性化は、ＣＤ４＋活性化よりも予測可能またはその逆である）。
【００２６】
少なくとも１つの代謝エンドポイントは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ最短寿命振幅成分またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈα1。を含む少なくとも１つの代謝エンドポイントはまた、所望により、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ蛍光強度、ＦＡＤ蛍光強度、光学レドックス比（すなわち、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ／ＦＡＤまたはＦＡＤ／ＮＡＤ（Ｐ）ＨまたはＦＡＤ／［ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋ＦＡＤ］またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ／［ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋ＦＡＤ］などのＮＡＤ（Ｐ）ＨおよびＦＡＤ強度の組み合わせ（上記の定義を参照））、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ第２最短寿命振幅成分またはＮＡＤＰＨα2、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ第３最短寿命振幅成分またはＮＡＤＰＨα3、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ平均蛍光寿命またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈτm、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ第１蛍光寿命またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈτ1、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ第２蛍光寿命またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈτ2、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ第３蛍光寿命またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈτ3、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ第４蛍光寿命またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈτ4、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ第５蛍光寿命またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈτ5、ＦＡＤ第１振幅成分またはＦＡＤα1、ＦＡＤ第２最短寿命振幅成分またはＦＡＤα2、ＦＡＤ第３最短寿命振幅成分またはＦＡＤα3、ＦＡＤ平均蛍光寿命またはＦＡＤτm、ＦＡＤ第１蛍光寿命またはＦＡＤτ1、ＦＡＤ第２蛍光寿命またはＦＡＤのτ2、ＦＡＤ第３蛍光寿命またはＦＡＤτ3、ＦＡＤ第４蛍光寿命またはＦＡＤτ4、およびＦＡＤ第５蛍光寿命またはＦＡＤτ5の１つ以上を含むことができる。
【００２７】
場合によっては、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、またはそれより多い入力値が使用される。
【００２８】
２つ以上の入力値が使用される場合、これらの２つの入力値は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈα1および細胞サイズとすることができる。３つの入力値が使用される場合、これらの３つの入力値は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈα1、細胞サイズ、およびレドックス比とすることができる。４つの入力値が使用される場合には、これらの４つの入力値は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈα1、細胞サイズ、レドックス比、およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈτ1とすることができる。５つ以上の入力値が使用される場合、これらの５つ以上の入力値は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈα1、細胞サイズ、レドックス比、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈτ1、および上記で言及した代謝エンドポイントの１つ以上とすることができる。
【００２９】
１つのエンドポイントが使用される場合、活性化値は単にエンドポイント値であり、これは次いで、物理的単離工程の目的で閾値と比較される。もう２つのエンドポイントが使用される場合、活性化値を得るために数式を使用する。この式は、単一の活性化値を生成する多変数方程式である。多変数方程式は、線形回帰、ロジスティック回帰、ランダムフォレスト、サポートベクターマシン、ニューラルネットワーク、二次回帰、ｋ−平均法などを含むがこれらに限定されない分類および特徴選択機械学習を使用して選択、決定、または別の方法で計算することができる。
【００３０】
方法１００は、ＣＤ４＋、ＣＤ３＋、および／またはＣＤ８＋活性化状態に基づいて、Ｔ細胞を選別することができる。
【００３１】
方法１００は、驚くべき精度で活性化したＴ細胞を分類することができる。精度は、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％であり得る。
【００３２】
図２を参照すると、本開示は、活性化Ｔ細胞を、それを必要とする対象に投与する方法２００を提供する。プロセスブロック２０２において、方法２００は、上記の方法１００を含み、これは、活性化のために濃縮されたＴ細胞の集団の第１の部分をもたらす。オプションのプロセスブロック２０４において、方法２００は、所望により、Ｔ細胞の集団の第１の部分を改変することを含む。プロセスブロック２０６において、方法２００は、Ｔ細胞の集団の第１の部分を対象に投与することを含む。
【００３３】
Ｔ細胞を、選別前に、投与される対象から採取することができる。選別されたＴ細胞を、対象に直接導入することができ、または対象に導入する前に追加の処理を施すことができる。ある場合には、選別されたＴ細胞を、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むように改変することができる。
【００３４】
本明細書に記載の方法は、少なくとも３つの点で驚くべき結果を本発明者らにもたらした。第１に、これらの方法が活性化Ｔ細胞と静止Ｔ細胞を区別するのに効果的かどうかは当初は明らかではなかったため、有効性自体が驚くべきものであり、かつ本方法によって達成された分類の質はさらに驚くべきものであった。第２に、本発明者らは、異なるエンドポイントが最強の分類結果をもたらすと予想し、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ最短寿命振幅成分（すなわち、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈα1）が、最強の分類エンドポイントであると判明したときに驚いた。既存の方法は、活性化状態を決定するために細胞サイズに重きを置くので、細胞サイズが分類において、本明細書に記載の方法よりも重要な役割を果たすと予想したかもしれない。明らかに、本明細書に記載の方法におけるエンドポイントの１つとして細胞サイズを含めることは、分類を改善するが、本発明者らは、細胞サイズが分類精度へより大きく寄与すると予測した。蛍光エンドポイント自体に関して、本発明者らは、レドックス比が分類精度へ最も強く寄与するであろうと予測したが、驚くべきことに、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ最短寿命振幅成分が最も強く寄与したことを発見した。第３に、驚くべきＮＡＤ（Ｐ）Ｈ最短寿命振幅成分はさておき、いずれの単一のエンドポイントによって達成される分類精度の程度は、驚くべきものであった。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ第１振幅成分のみを使用して達成される８０〜９０％を超える分類精度は、予測し得なかった。
【００３５】
システム
本開示はまた、システムを提供する。本システムは、本明細書に記載の方法での使用に適することができる。本開示の特徴が所与のシステムに関して記載される場合、その特徴はまた、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、本明細書に記載される他のシステムおよび方法と組み合わせることができることが明示的に企図される。
【００３６】
図３を参照すると、本開示は、Ｔ細胞選別装置３００を提供する。装置３００は、細胞選別経路３０２を含む。細胞選別経路３０２は、入口３０４と、観察ゾーン３０６と、細胞選別器３０８とを含む。観察ゾーン３０６は、入口３０４の下流の入口３０４に結合される。装置３００はまた、単一細胞自家蛍光検出器３１０を含む。装置３００は、プロセッサ３１２と、メモリなどの非一時的なコンピュータ可読媒体３１４とを含む。
【００３７】
入口３０４は、任意のナノ流体、マイクロ流体、または他の細胞選別入口であり得る。流体工学技術分野の当業者は、適切な入口３０４の知識を有し、本開示は、入口３０４の１つの特定の実装に拘束されることを意図しない。
【００３８】
観察ゾーン３０６は、個々の自家蛍光調査のためにＴ細胞を提示するように構成される。当業者は、適切な観察ゾーン３０６の知識を有しており、本開示は、観察ゾーン３０６の１つの特定の実装に拘束されることを意図するものではない。
【００３９】
細胞選別器３０８は、選別器入口３１６および少なくとも２つの選別器出口３１８を有する。細胞選別器は、観察ゾーン３０６の下流の選別器入口３１６を介して観察ゾーン３０６に結合される。細胞選別器３０８は、選別器信号に基づいて、細胞を選別器入口３１６から少なくとも２つの選別器出口３１８のうちの１つに選択的に誘導するように構成される。
【００４０】
入口３０４、観察ゾーン３０６、および細胞選別器３０８は、市販のフロー選別器を含む、フロー選別器において有用であることが当業者に知られている構成要素であり得る。当業者によって理解されるように、細胞選別経路はさらに、所望により、フロー調節器を含むことができる。フロー調節器は、単一細胞自家蛍光検出器３１０が、自家蛍光寿命情報を取得することを可能にする速度で観察ゾーンを通って細胞が流れるように、構成することができる。本開示と組み合わせて使用することができる流体工学の選別についての有用な概説は、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ，ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｄｅｂｕｌｋｉｎｇ  ｔｏ  ｒａｒｅ  ｃｅｌｌ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，”  Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，２０１５  Ｍａｒ  ７、１５（５），１２３０−４９であり、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００４１】
単一細胞自家蛍光検出器３１０は、光学技術分野の当業者によって理解されるように、単一細胞自家蛍光を測定するのに適した任意の検出器であり得る。適切な単一細胞自家蛍光検出器３１０の例には、光電子増倍管、カメラ、光ダイオード、アバランシェ光ダイオード、ストリークカメラ、電荷捕捉装置などが含まれるが、これらに限定されない。
【００４２】
単一細胞自家蛍光検出器３１０は、直接に（すなわち、プロセッサ３１２が、検出器３１０と直接通信し、信号を受け取る）または間接に（すなわち、プロセッサ３１２が、検出器３１０に特化したサブコントローラと通信し、検出器３１０からの信号は、プロセッサ３１２への送信前に、変更または非変更され得る）プロセッサ３１２によって制御され得る。蛍光寿命情報は、時間領域法（時間相関単一光子計数、ゲート検出）または周波数領域法を使用して取得することができる。装置３００は、目的の自家蛍光信号を単離するように調整された種々の光学フィルタを含むことができる。光学フィルタは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび／またはＦＡＤの自家蛍光波長に調整することができる。
【００４３】
装置３００は、所望により、細胞を光学的に励起して自家蛍光を開始させるための光源３２０を含むことができる。適切な光源３２０には、レーザー、ＬＥＤ、ランプ、フィルタ処理された光、ファイバーレーザーなどが含まれるが、これらに限定されない。光源３２０をパルス化することができ、これには、自然にパルス化される光源と、外部構成要素によって切断されるか、または別の方法で光学的に変調される連続光源とが含まれる。光源３２０は、１ｆｓ〜１０ｎｓの半値全幅（ＦＷＨＭ）パルス幅を有する光のパルスを提供することができる。場合によっては、ＦＷＨＭパルス幅は、３０ｆｓ〜１ｎｓである。光源３２０は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび／またはＦＡＤの吸収に調整される波長を放出することができる。
【００４４】
単一細胞自家蛍光検出器３１０は、１ｋＨｚ〜２０ＧＨｚの繰り返し率で自家蛍光データセットを取得するように構成され得る。場合によっては、繰り返し率は、１ＭＨｚ〜１ＧＨｚであり得る。その他の場合では、繰り返し率は、２０ＭＨｚ〜１００ＭＨｚであり得る。光源３２０は、これらの繰り返し率で動作するように構成され得る。
【００４５】
装置３００は、所望により、細胞サイズ測定ツール３２２を含むことができる。細胞サイズ測定ツール３２２は、光学顕微鏡を含むがこれに限定されない、細胞のサイズを測定することができる任意の装置であり得る。場合によっては、単一細胞自家蛍光検出器３１０および細胞サイズ測定ツール３２２を、単一の光学サブシステム内に統合することができる。
【００４６】
プロセッサ３１２は、検出器３１０および細胞選別器３０８と電子通信する。プロセッサ３１２はまた、存在する場合、オプションの光源３２０およびオプションの細胞サイズ測定ツール３２２と電子通信する。
【００４７】
非一時的なコンピュータ可読媒体３１４は、プロセッサによって実行される場合、プロセッサに本明細書に記載の方法の少なくとも一部を実行させる命令をその上に格納している。
【００４８】
実施例１
末梢血を、健康なドナーからヘパリンを含む滅菌注射器内に採取した。ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、またはＣＤ８＋Ｔ細胞を全血から抽出し（ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ，ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｔ細胞活性化培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で培養した。単離の２４時間後、ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８に対する四量体抗体を培地に添加してＴ細胞を活性化した。活性化状態（ＣＤ６９＋）およびＴ細胞サブタイプ（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋）を、抗体免疫蛍光法で確認した。蛍光強度および寿命の画像を、時間相関単一光子計数電子機器による蛍光寿命画像化に適合された特注の多光子蛍光顕微鏡（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，ＷＩ）を使用して取得した。Ｔ細胞を１００倍の対物レンズで画像化した（ＮＡ＝１．３）。調整可能なチタンサファイアレーザーは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ励起のために７５０ｎｍ、ＦＡＤ励起のために８９０ｎｍの励起光を提供した。サンプルでのレーザー出力は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ用は３．０〜３．５ｍＷ、ＦＡＤ用は５．３〜５．７ｍＷであった。４４０／８０ｎｍおよび５５０／１００ｎｍのバンドパスフィルタを使用して、ＮＡＤ（Ｐ）ＨおよびＦＡＤ蛍光発光をそれぞれフィルタ処理した。蛍光発光を、ＧａＡｓＰＰＭＴによって検出し、２５６個の時間ビンでの蛍光寿命の減衰を、時間相関単一光子計数電子機器（ＳＰＣ−１５０，Ｂｅｃｋｅｒ＆Ｈｉｃｋｌ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、各ピクセルについて取得した。赤血球からの第２高調波発生を、機器の応答関数として使用して、２４０ｐｓの半値全幅を有した。蛍光寿命減衰を、機器の応答関数からデコンボリューションし、２成分指数関数減衰モデルである、Ｉ（ｔ）＝α1＊ｅｘｐ（−ｔ／τ1）＋α2＊ｅｘｐ（−ｔ／τ2）＋Ｃ（式中、Ｉ（ｔ）は、レーザーパルス後の時間ｔの関数としての蛍光強度であり、α1およびα2は、それぞれ短および長寿命成分の画分寄与であり（すなわち、α1＋α2＝１）、τ1およびτ2は、それぞれ短および長寿命であり、Ｃは背景光を考慮する）に適合させた。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ強度画像を、カスタマイズされた画像処理ルーチンを使用して、ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒのエッジ検出および閾値処理方法を使用して、細胞質、ミトコンドリア、および核にセグメント化した。光学レドックス比の画像（ＮＡＤ（Ｐ）ＨおよびＦＡＤの合計強度で割ったＮＡＤ（Ｐ）Ｈの蛍光強度）ならびにＮＡＤ（Ｐ）ＨおよびＦＡＤの平均蛍光寿命（τm＝α1＊τ1＋α2＊τ2）を計算した（Ｍａｔｌａｂ）。光学レドックス比、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈτm、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈτ1、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈτ2、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈα1、ＦＡＤτm、ＦＡＤτ1、ＦＡＤτ2、およびＦＡＤα1を含むＯＭＩエンドポイントを、各セグメント化細胞の細胞内の全てのピクセルにわたって平均した。μｍ2による細胞サイズもまた、細胞内のピクセル数から計算した。
【００４９】
結果は、６人のドナーにわたる静止および活性化ＣＤ３＋およびＣＤ８＋のＴ細胞間の細胞サイズ、光学レドックス比、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈα1、ＦＡＤα1、およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈτ1の有意な増加（ｐ＜０．００１）を示している。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈτm、およびＦＡＤτ1は、静止Ｔ細胞と比較して、活性化ＣＤ３＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞で有意に（ｐ＜０．００１）減少した。ＦＡＤτmは、静止ＣＤ３＋Ｔ細胞と比較して、活性化ＣＤ３＋Ｔ細胞で有意に減少したが、ＦＡＤτmでの有意差は、静止および活性化ＣＤ８＋のＴ細胞間に観察されなかった。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈτ2は、静止ＣＤ３＋Ｔ細胞と比較して、活性化ＣＤ３＋Ｔ細胞では有意に増加し、静止ＣＤ８＋Ｔ細胞と比較して、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞では有意に減少した。ＦＡＤτ2は、静止ＣＤ３＋Ｔ細胞と比較して、活性化ＣＤ３＋Ｔ細胞で有意に増加し、静止および活性化ＣＤ８＋のＴ細胞間のＦＡＤτ2では有意差は観察されなかった。同様の結果は、活性化抗体とともに２４時間培養したＴ細胞で得られた。一貫した結果が、１人のドナーのＴ細胞での繰り返し実験から得られた
【００５０】
ＣＤ３＋およびＣＤ８＋静止および活性化データセットを、分類のためにトレーニングおよびテストデータに分割した。培養条件によって静止または活性化されることが既知の４人のドナーからの細胞を使用して、モデルをトレーニングし（ｎ＝４１３１個のＣＤ３＋細胞、２６５５個のＣＤ８＋細胞）、活性化状態の同細胞ＣＤ６９検証を行った３人のドナーからの細胞を使用して、モデルをテストした（ｎ＝６９６個のＣＤ３＋細胞、５９５個のＣＤ８＋細胞）。特徴を重み付けするための利得比、ランダムフォレスト、およびカイ２乗法は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈα1を、ＣＤ３＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化状態の分類に最も重要な特徴として明らかにした。ＣＤ３＋Ｔ細胞の場合、利得比が決定した特徴の重要性の順序は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈα1、細胞サイズ、レドックス比、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈτ1、ＦＡＤα1、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈτm、ＦＡＤτ2、ＦＡＤτ1、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈτ2、およびＦＡＤτmであった。ＣＤ８＋Ｔ細胞の場合、利得比が決定した特徴の重要性の順序は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈα1、レドックス比、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈτm、細胞サイズ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈτ2、ＦＡＤτ1、ＦＡＤτm、ＦＡＤτ2、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈτ1、およびＦＡＤα1であった。１０個の特徴すべて、細胞サイズのみ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈα1のみ、レドックス比および細胞サイズ、レドックス比、細胞サイズおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈα1、ならびにレドックス比、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈτm、およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈα1でトレーニングした場合、ロジスティック回帰分類モデルは、活性化または静止としてのＣＤ３＋Ｔ細胞の分類について、９７．５％、７０．８％、９６．５％、９０．１％、９７．１％、および９３．９％の精度をもたらした。１０個の特徴すべて、細胞サイズのみ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈα1のみ、レドックス比および細胞サイズ、レドックス比、細胞サイズ、およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈα1、ならびにレドックス比、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈτm、およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈα1でトレーニングした場合、ロジスティック回帰分類モデルは、活性化または静止としてのＣＤ８＋Ｔ細胞の分類について、９９．６％、６８．７％、９９．４％、９５．７％、９９．９％、および９８．４％の精度をもたらした。同様の精度（約９４〜９９％）は、１０個の特徴すべてでトレーニングした場合、ランダムフォレストおよびサポートベクターマシンを含む異なる分類モデルで達成された。分類精度の向上は、ドナー正規化データでのトレーニングおよびテストによっては達成されなかった。
【００５１】
すべての以前の結果は、単離された皿で成長した静止および活性化Ｔ細胞に関するものであった。この方法が、混合集団における活性化Ｔ細胞を非活性化Ｔ細胞から区別するのに強力であることを確認するために、４８時間別々に培養し、次いで画像化の１時間前に混合して共培養した静止および活性化Ｔ細胞を評価した。静止Ｔ細胞および活性化Ｔ細胞の混合共培養は、自家蛍光エンドポイントにいくつかの変化を引き起こす。例えば、レドックス比は、静止Ｔ細胞なしで培養された活性化ＣＤ３＋Ｔ細胞のそれと比較して、活性化および静止Ｔ細胞の混合共培養における活性化ＣＤ３＋Ｔ細胞において有意に減少した。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈα1は、活性化および静止Ｔ細胞の混合培養における活性化ＣＤ３＋Ｔ細胞で有意に増加し、ランダムフォレスト特徴選択法によって決定されるように、分類にとって最も重要な特徴（約０．３５の正規化された重み）のままであった。ＮＡＤ（Ｐ）ＨτmおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈτ2は、約０．２２および約０．１の正規化された重みを有する２番目および３番目に重要な特徴であった。混合培養内の静止および活性化Ｔ細胞のロジスティック回帰分類は、１０個の特徴すべて、細胞サイズのみ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈα1のみ、およびレドックス比および細胞サイズでトレーニングした場合、それぞれ９５．５％、７６．６％、１００％、および７２．７％の精度をもたらした。
【００５２】
本開示は、以下の記述も含む。
１．Ｔ細胞選別装置であって、
細胞選別経路であって、
（ｉ）入口と
（ｉｉ）入口の下流の入口に結合された観察ゾーンであって、個々の自家蛍光調査のためにＴ細胞を提示するように構成される観察ゾーンと、
（ｉｉｉ）選別器入口および少なくとも２つの選別器出口を有する細胞選別器であって、観察ゾーンの下流の選別器入口を介して観察ゾーンに結合され、選別器信号に基づいて、細胞を、選別器入口から少なくとも２つの選別器出口の１つに選択的に誘導するように構成される細胞選別器と、を含む細胞選別経路と、
観察ゾーンに位置付けられるＴ細胞から自家蛍光データセットを取得するように構成される単一細胞自家蛍光検出器であって、各自家蛍光データセットについて自家蛍光寿命情報を取得するように構成される単一細胞自家蛍光検出器と、
細胞選別器および単一細胞自家蛍光検出器と電子通信するプロセッサと、
非一時的なコンピュータ可読媒体であって、プロセッサによって実行されると、プロセッサに
ａ）自家蛍光データセットを受け取らせ、
ｂ）活性化値に基づいて、選別器信号を細胞選別器に提供させる命令を、その上に格納し、選別器信号が、活性化値が所定の閾値を超える場合、少なくとも２つの選別器出口の第１の出口に、そして活性化値が所定の閾値以下である場合、少なくとも２つの選別器出口の第２の出口に、Ｔ細胞を選択的に誘導するように細胞選別器を誘導し、活性化値が、Ｔ細胞について自家蛍光データセットの少なくとも１つの代謝エンドポイントを入力値として使用して計算され、少なくとも１つの代謝エンドポイントが、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）最短蛍光寿命振幅成分（α1）を含む、非一時的なコンピュータ可読媒体と、を含む、Ｔ細胞選別装置。
２．細胞選別経路が、マイクロ流体経路またはナノ流体経路を含む、記述１のＴ細胞選別装置。
３．Ｔ細胞選別装置が、入口に結合されたフロー調節器をさらに含む、記述１または２のＴ細胞選別装置。
４．フロー調節器は、単一細胞自家蛍光分光計が、各自家蛍光データセットの自家蛍光寿命情報を取得することを可能にする速度で、観察ゾーンを通って細胞が流れるように構成される、先行する記述のいずれか１つのＴ細胞選別装置。
５．Ｔ細胞選別装置が、光源をさらに含む、先行する記述のいずれか１つのＴ細胞選別装置。
６．光源がパルス光源である、先行する記述のいずれか１つのＴ細胞選別装置。
７．パルス光源が、チタンサファイアレーザーである、先行する記述のいずれか１つのＴ細胞選別装置。
８．光源が、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈからの蛍光を励起するように調整される波長を有する光を放出する、先行する記述のいずれか１つのＴ細胞選別装置。
９．単一細胞自家蛍光分光計が、１ｆｓ〜１０ｎｓの半値全幅パルス幅を有するパルス光源を含む、先行する記述のいずれか１つのＴ細胞選別装置。
１０．単一細胞自家蛍光分光計が、３０ｆｓ〜１ｎｓの半値全幅パルス幅を有するパルス光源を含む、先行する記述のいずれか１つのＴ細胞選別装置。
１１．単一細胞自家蛍光検出器が、１ｋＨｚ〜２０ＧＨｚの繰り返し率で自家蛍光データセットを取得するように構成される、先行する記述のいずれか１つのＴ細胞選別装置。
１２．単一細胞自家蛍光検出器が、１ＭＨｚ〜１ＧＨｚの繰り返し率で自家蛍光データセットを取得するように構成される、先行する記述のいずれか１つのＴ細胞選別装置。
１３．単一細胞自家蛍光検出器が、２０ＭＨｚ〜１００ＭＨｚの繰り返し率で自家蛍光データセットを取得するように構成される、先行する記述のいずれか１つのＴ細胞選別装置。
１４．単一細胞自家蛍光検出器が、時間相関単一光子計数を介して自家蛍光データセットを取得するように構成される、先行する記述のいずれか１つのＴ細胞選別装置。
１５．単一細胞自家蛍光検出器が、光電子増倍管または光ダイオードである、先行する記述のいずれか１つのＴ細胞選別装置。
１６．単一細胞自家蛍光検出器が、目的の蛍光信号を透過するように構成される検出器側フィルタを含む、先行する記述のいずれか１つのＴ細胞選別装置。
１７．検出器側フィルタが、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ蛍光を透過するように構成される、直前の記述のＴ細胞選別装置。
１８．Ｔ細胞選別装置が、細胞サイズを測定し、細胞サイズをプロセッサに通信するように構成される細胞サイズ測定ツールをさらに含む、先行する記述のいずれか１つのＴ細胞選別装置。
１９．Ｔ細胞選別装置が、観察ゾーン内に位置付けられる細胞の画像を取得し、その画像をプロセッサに通信するように構成される細胞イメージャをさらに含む、先行する記述のいずれか１つのＴ細胞選別装置。
２０．Ｔ細胞活性化状態を特徴づける方法であって、
ａ）所望により、未知の活性化状態のＴ細胞の集団を受け取ることと、
ｂ）Ｔ細胞の集団の１つのＴ細胞についての自家蛍光データセットを取得することであって、自家蛍光データセットは、所望により自家蛍光寿命情報を含む、取得することと、
ｃ）活性化値に基づいて、そのＴ細胞の活性化状態を特定することと、を含み、活性化値を、自家蛍光データセットの少なくとも一部を使用して計算し、活性化値が、所望により、そのＴ細胞について自家蛍光データセットの少なくとも１つの代謝エンドポイントを入力値として使用して計算され、少なくとも１つの代謝のエンドポイントが、所望により、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈα1を含む、方法。
２１．Ｔ細胞を選別する方法であって、
ａ）未知の活性化状態のＴ細胞の集団を受け取ることと、
ｂ）Ｔ細胞の集団の各Ｔ細胞についての自家蛍光データセットを取得することであって、各自家蛍光データセットが、自家蛍光寿命情報を含む、取得することと、
ｃ）活性化値に基づいて、Ｔ細胞の集団の第１の部分を、Ｔ細胞集団の第２の部分から物理的に単離することと、を含み、Ｔ細胞の集団の各Ｔ細胞を、活性化値が所定の閾値を超える場合、第１の部分に、そして活性化値が所定の閾値以下である場合、第２の部分に入れ、活性化値が、Ｔ細胞の集団の各Ｔ細胞について自家蛍光データセットの少なくとも１つの代謝エンドポイントを入力値として使用して計算され、少なくとも１つの代謝エンドポイントが、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈα1を含む、方法。
２２．少なくとも１つの代謝エンドポイントが、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ蛍光強度、ＦＡＤ蛍光強度、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ／ＦＡＤまたはＦＡＤ／ＮＡＤ（Ｐ）ＨまたはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ／［ＦＡＤ＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ］またはＦＡＤ／［ＦＡＤ＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ］として定義される光学レドックス比、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ平均蛍光寿命（τm）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ第１蛍光寿命成分（τ1）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ第２蛍光寿命成分（τ2）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）τm、ＦＡＤα1、ＦＡＤτ1、ＦＡＤτ2、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるエンドポイントをさらに含む、先行する記述のいずれか１つのＴ細胞選別装置または方法。
２３．少なくとも１つの代謝エンドポイントが、光学レドックス比を含む、先行する記述のいずれか１つのＴ細胞選別装置または方法。
２４．少なくとも１つの代謝エンドポイントが、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈτ1を含む、先行する記述のいずれか１つのＴ細胞選別装置または方法、
２５．少なくとも１つの代謝エンドポイントが、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈτmを含む、先行する記述のいずれか１つのＴ細胞選別装置または方法。
２６．少なくとも１つの代謝エンドポイントが、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈτ2を含む、先行する記述のいずれか１つのＴ細胞選別装置または方法、
２７．少なくとも１つの代謝エンドポイントが、ＦＡＤτmを含む、先行する記述のいずれか１つのＴ細胞選別装置または方法。
２８．少なくとも１つの代謝エンドポイントが、ＦＡＤα1を含む、先行する記述のいずれか１つのＴ細胞選別装置または方法。
２９．少なくとも１つの代謝エンドポイントが、ＦＡＤτ1を含む、先行する記述のいずれか１つのＴ細胞選別装置または方法。
３０．少なくとも１つの代謝エンドポイントが、ＦＡＤτ2を含む、先行する記述のいずれか１つのＴ細胞選別装置または方法。
３１．活性化値が、Ｔ細胞の集団の各Ｔ細胞について細胞サイズを入力値として使用して計算される、先行する記述のいずれか１つのＴ細胞選別装置または方法。
３２．所定の閾値が、既知の活性化状態を有するＴ細胞の対照集団についての分類、および特徴選択機械学習を介して選択される、先行する記述のいずれか１つのＴ細胞選別装置または方法。
３３．所定の閾値が、ドナー正規化される、先行する記述のいずれか１つのＴ細胞選別装置または方法。
３４．活性化値が所定の閾値を超えるＴ細胞が、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、またはＣＤ８＋Ｔ細胞である、先行する記述のいずれか１つのＴ細胞選別装置または方法。
３５．Ｔ細胞を活性化されたものとして分類する精度が、少なくとも７５％である、先行する記述のいずれか１つのＴ細胞選別装置または方法。
３６．Ｔ細胞を活性化されたものとして分類する精度が、少なくとも８０％である、直前の記述のＴ細胞選別装置または方法。
３７．Ｔ細胞を活性化されたものとして分類する精度が、少なくとも９０％である、直前の記述のＴ細胞選別装置または方法。
３８．Ｔ細胞を活性化されたものとして分類する精度が、少なくとも９５％である、直前の記述のＴ細胞選別装置または方法。
３９．活性化Ｔ細胞を、それを必要とする対象に投与する方法であって、
ａ）記述２１〜直前の記述のいずれか１つの方法と、
ｂ）Ｔ細胞の集団の第１の部分を、対象に導入することと、を含む方法。
４０．Ｔ細胞の集団の第１の部分が、工程ｂ）の前に改変される、記述３９の方法。
４１．Ｔ細胞の集団の第１の部分が、工程ｂ）の前にキメラ抗原受容体を含むように改変される、記述４０の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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2021533808.tif 000007