(57)【要約】  本発明は、可変（Ｖ）ドメイン及び挿入ポリペプチドを含む抗体であって、挿入ポリペプチドがＶドメインのフレームワーク３領域内にある、上記抗体を提供する。
2021530222.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
挿入ポリペプチドがＶドメインのフレームワーク３領域内にある、可変（Ｖ）ドメイン及び挿入ポリペプチドを含む抗体。
【請求項２】
ＶドメインがＶＨドメインである、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ＶＬドメインをさらに含む、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
挿入ポリペプチドがＶＨドメインのアミノ酸残基７３と７６の間にある、請求項２に記載の抗体。
【請求項５】
挿入ポリペプチドが、ＶＨドメイン内で、（ｉ）アミノ酸残基７３と７４の間；（ｉｉ）アミノ酸残基７４と７５の間；又は（ｉｉｉ）アミノ酸残基７５と７６の間にある、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
ＶＨドメインの７３と７６の間の１個若しくは複数のアミノ酸残基が挿入ポリペプチドによって置換されている、請求項４又は５に記載の抗体。
【請求項７】
ＶドメインがＶＬドメインである、請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
ＶＨドメインをさらに含む、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
挿入ポリペプチドがＶＬドメインのアミノ酸残基６７と７０の間にある、請求項７に記載の抗体。
【請求項１０】
挿入ポリペプチドが、ＶＬドメイン内で、（ｉ）アミノ酸残基６７と６８の間；（ｉｉ）アミノ酸残基６８と６９の間；又は（ｉｉｉ）アミノ酸残基６９と７０の間にある、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
ＶＬドメインの６７と７０の間の１個若しくは複数のアミノ酸残基が挿入ポリペプチドによって置換れている、請求項９又は１０に記載の抗体。
【請求項１２】
挿入ポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端をフレームワーク３領域に連結する少なくとも１つのアミノ酸のリンカー配列をさらに含む、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１３】
リンカー配列が、挿入ポリペプチド部分のＮ末端の少なくとも２、３、４、５、６、７又は８個以上のアミノ酸である、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１４】
リンカー配列が、挿入ポリペプチド部分のＣ末端の少なくとも２、３、４、５、６、７若しくは８個以上のアミノ酸である、請求項１２又は１３に記載の抗体。
【請求項１５】
完全長抗体又はその結合フラグメントである、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１６】
完全長ＩｇＧ又はその結合フラグメントである、請求項１から１５までのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１７】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＶＨＨ、又はｓｃＦｖであり、特にｄｓｓｃＦｖである、請求項１から１５までのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１８】
Ｆａｂである、請求項１７に記載の抗体。
【請求項１９】
ヒト化されている、請求項１から１８までのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２０】
前記Ｖドメインがヒト血清アルブミンに結合する、請求項１から１９までのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２１】
配列番号３の配列を有するＣＤＲ−Ｌ１；配列番号４の配列を有するＣＤＲ−Ｌ２；配列番号５の配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む、請求項２０に記載の抗体。
【請求項２２】
配列番号２又は配列番号１０２を含むＶＬドメインを含む、請求項２１に記載の抗体。
【請求項２３】
配列番号１を含むＬ鎖を含む、請求項２２に記載の抗体。
【請求項２４】
配列番号８の配列を有するＣＤＲ−Ｈ１；配列番号９の配列を有するＣＤＲ−Ｈ２；配列番号１０の配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインを含む、請求項２０から２３までのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２５】
配列番号７又は配列番号１０３を含むＶＨドメインを含む、請求項２４に記載の抗体。
【請求項２６】
配列番号６を含むＨ鎖を含む、請求項２５に記載の抗体。
【請求項２７】
挿入ポリペプチドがサイトカインである、請求項１から２６までのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２８】
サイトカインがＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＥＰＯから選択される、請求項２７に記載の抗体。
【請求項２９】
挿入ポリペプチドが二次抗体である、請求項１から２６までのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３０】
二次抗体がｓｃＦｖ、特にｄｓｓｃＦｖ、又はＶＨ若しくはＶＬ若しくはＶＨＨなどのドメイン抗体である、請求項２９に記載の抗体。
【請求項３１】
ＶＨＨが配列番号６７、６９及び８９から選択される配列を含む、請求項３０に記載の抗体。
【請求項３２】
二次抗体がＶドメインと同じ抗原に結合する、請求項３０に記載の抗体。
【請求項３３】
二次抗体が、Ｖドメインと比較して異なるエピトープに結合する、請求項３２に記載の抗体。
【請求項３４】
二次抗体が、Ｖドメインを含む抗体とは異なる抗原に結合する、請求項３０に記載の抗体。
【請求項３５】
二次抗体がＩＬ−１７に結合し、Ｖドメインを含む抗体がＨＳＡに結合する、請求項３４に記載の抗体。
【請求項３６】
二次抗体がＣＤ３に結合し、Ｖドメインを含む抗体がＣＤ２８に結合する、請求項３４に記載の抗体。
【請求項３７】
二次抗体がＣＤ２８に結合し、Ｖドメインを含む抗体がＣＤ３に結合する、請求項３４に記載の抗体。
【請求項３８】
挿入ポリペプチドが存在しない抗体と比較した場合に、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％である結合親和性で前記Ｖドメインによってそのコグネイト抗原に結合する、請求項１から３７までのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３９】
二次抗体が存在しない抗体と比較した場合、より大きい結合親和性でそのコグネイト抗原に結合する、請求項３２又は３３に記載の抗体。
【請求項４０】
請求項１から３９までのいずれか一項に記載の抗体をコードする単離されたＤＮＡ分子又は一対のＤＮＡ分子。
【請求項４１】
請求項１から３９までのいずれか一項に記載の抗体をコードするクローニングベクター若しくは発現ベクター又は一対のクローニングベクター若しくは発現ベクター。
【請求項４２】
請求項４１に記載のクローニングベクター若しくは発現ベクター又は一対のクローニングベクター若しくは発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項４３】
請求項４２の宿主細胞を培養するステップと、抗体を単離するステップとを含む、請求項１から３９までのいずれか一項に記載の抗体を産生する方法。
【請求項４４】
請求項１から３９までのいずれか一項に記載の抗体を、１つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と組み合わせて含む医薬組成物。
【請求項４５】
治療において使用するための、請求項１から３９までのいずれか一項に記載の抗体、又は請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
治療有効量の請求項１から３９までのいずれか一項に記載の抗体、又は請求項４４に記載の組成物を、治療を必要とする対象に投与するステップを含む治療方法。
【請求項４７】
医薬品を製造するための請求項１から３９までのいずれか一項に記載の抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、可変（Ｖ）ドメインとＶドメインのフレームワーク３領域内の挿入ポリペプチドとを含む抗体に関する。そのような抗体は、挿入ポリペプチドの機能性及び／又は薬物動態の改善を提供することができる。
【背景技術】
【０００２】
抗体の高特異性及び高親和性により、抗体は理想的な診断剤及び治療剤となる。組換え抗体技術の分野における進歩によって、抗体フラグメント、例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２フラグメントなどが作製されてきた。これらのより小さな分子は、抗体全体の抗原結合活性を保持し、全免疫グロブリン分子と比較して、組織透過特性及び薬物動態特性の改善も示し得る。実際、抗体フラグメントは、用途の広い治療剤であることが判明されつつある。そのようなフラグメントは全免疫グロブリンよりも多くの利点を示すように見えるが、ｉｎ  ｖｉｖｏでの長寿命を付与するＦｃドメインを欠如しているので、血清からのクリアランス速度の上昇という問題もある（Ｍｅｄａｓａｎら、１９９７年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５８：２２１１〜２２１７頁）。抗体分子の血清半減期を改善するためのこれまでのアプローチには、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの、ＦｃＲｎ受容体と相互作用する薬剤又はドメインへの結合が含まれる。ＰＥＧもまた血清半減期を改善することを示している。
【０００３】
二重特異性を有する抗体、すなわち２つの異なる抗原に結合する抗体は、既に開示されている（総説については、Ｓｅｇａｌら、１９９９年、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１：５５８〜５６２頁；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ＆  Ｐａｃｋ、１９９７年、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３：８３〜１０５頁；Ｆｉｓｃｈｅｒ及びＬｅｇｅｒ、２００７年、Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ、７４：３〜１４頁を参照）。ヘテロ二重特異性抗体ベースの分子を作製するためのこれまでのアプローチは、一般に、化学的架橋技術又はタンパク質工学技術を使用してきた。化学的架橋結合は、ヘテロ二量体及びホモ二量体形成が低収率であり、それに続くクロマトグラフィー分離が必要であるという欠点がある。タンパク質工学のアプローチは、非常に精巧であるか（例えば、ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）操作；Ｒｉｄｇｗａｙら、１９９６年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  ９（７）：６１７〜６２１頁）、又は、不適切な安定性の特徴を有する分子（例えばダイアボディ、ｓｃＦｖ）を使用してきた。ある場合には、二重特異性抗体は、両方の抗原がそれぞれの抗体アームに同時に結合できないというような立体障害の問題もあり得る。単一ドメイン抗体又はｓｄＡｂとしても知られている単一可変ドメイン抗体は、抗体の重鎖（ＶＨ）又は軽鎖（ＶＬ）のいずれかの可変領域に対応する。マウス単一ドメイン抗体は、Ｗａｒｄら、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ、３４１、５４４〜５４６頁により開示された。またヒト及び「ラクダ化」ヒト単一ドメイン抗体も開示されている（Ｈｏｌｔら、２００３年、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２１、４８４〜４９０頁）。単一ドメイン抗体はまた、ラクダ科動物（ラクダ及びラマ）並びに軟骨魚類（テンジクザメ（ｗｏｂｂｅｇｏｎｇ）及びコモリザメ（ｎｕｒｓｅ  ｓｈａｒｋ））からも得られている。これらの生物は、それらの免疫系の不可欠で重要な成分として、Ｆｃ相当の定常ドメインフレームワークにマウントされた、高親和性単一Ｖ様ドメイン（ラクダ科ではＶＨＨと呼ばれ、サメではＶ−ＮＡＲと呼ばれる）を進化させている（総説については、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ及びＨｕｄｓｏｎ；２００５年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２３（９）：１１２６〜１１３６頁を参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そのため、１つ又は複数の所望する特性を示す、例えば、機能性の増加（例えば多価結合）若しくは薬物動態の改善（例えば、血清中の半減期の延長）を示す抗体部分を含む融合タンパク質などのさらに操作された抗体を提供することが依然として必要とされている。本発明の目的は、機能性の増加（例えば、その抗原への結合の増加、二重特異性結合、若しくは多価結合）、又は薬物動態の改善（例えば、血清中の半減期の延長）を示す、新規の操作された抗体フォーマットを提供することである。特に、本発明は、特に安定であり、２つの抗原に同時に結合することが可能な新規の二重特異性抗体フォーマットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一態様では、本発明は、挿入ポリペプチドがＶドメインのフレームワーク３領域内にある、可変（Ｖ）ドメイン及び挿入ポリペプチドを含む抗体を提供する。
【０００６】
いくつかの実施形態では、ＶドメインはＶＨドメインであり、抗体はＶＬドメインをさらに含み得る。
【０００７】
いくつかの実施形態では、ＶドメインはＶＬドメインであり、抗体はＶＨドメインをさらに含み得る。
【０００８】
いくつかの実施形態では、挿入ポリペプチドは、ＶＨドメインのアミノ酸残基７３と７６の間にある。例えば、挿入ポリペプチドは、ＶＨドメイン内で、（ｉ）アミノ酸残基７３と７４の間；（ｉｉ）アミノ酸残基７４と７５の間；又は（ｉｉｉ）アミノ酸残基７５と７６の間にあり得る。
【０００９】
いくつかの実施形態では、ＶＨドメインの７３と７６の間の１個又は複数のアミノ酸残基は、挿入ポリペプチドによって置換されている。
【００１０】
いくつかの実施形態では、挿入ポリペプチドは、ＶＬドメインのアミノ酸残基６７と７０の間にある。例えば、挿入ポリペプチドは、ＶＬドメイン内で、（ｉ）アミノ酸残基６７と６８の間；（ｉｉ）アミノ酸残基６８と６９の間；又は（ｉｉｉ）アミノ酸残基６９と７０の間にあり得る。
【００１１】
いくつかの実施形態では、ＶＬドメインの６７と７０の間の１個又は複数のアミノ酸残基は、挿入ポリペプチドによって置換されている。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、挿入ポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端がフレームワーク３領域に連結する、好ましくは少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸のリンカー配列をさらに含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、完全長抗体又はその結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、完全長ＩｇＧ又はその結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＶＨＨ、又はｓｃＦｖであり、特にｄｓｓｃＦｖである。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体はヒト化されている。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合するＶドメインを含む。一実施形態では、抗体は、配列番号３の配列を有するＣＤＲ−Ｌ１；配列番号４の配列を有するＣＤＲ−Ｌ２；配列番号５の配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。一実施形態では、抗体は、配列番号２を含むＶＬドメインを含む。一実施形態では、抗体は、配列番号１を含む軽（Ｌ）鎖を含む。一実施形態では、抗体は、配列番号８の配列を有するＣＤＲ−Ｈ１；配列番号９の配列を有するＣＤＲ−Ｈ２；配列番号１０の配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインを含む。一実施形態では、抗体は、配列番号７を含むＶＨドメインを含む。一実施形態では、抗体は、配列番号６を含む重（Ｈ）鎖を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、挿入ポリペプチドはサイトカインであり、好ましくは、サイトカインは、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＥＰＯから選択される。他の実施形態では、挿入ポリペプチドはスクレロスチンである。他の実施形態では、挿入ポリペプチドは二次抗体であり、好ましくは、二次抗体はｓｃＦｖ、特にｄｓｓｃＦｖ、又はドメイン抗体、例えばＶＨ若しくはＶＬ若しくはＶＨＨである。ＶＨＨは、配列番号６７、６９及び８９から選択される配列を含み得る。そのような実施形態では、抗体は、挿入ポリペプチドが存在しない抗体と比較した場合に、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％である結合親和性で前記Ｖドメインによってそのコグネイト抗原に結合することができる。
【００１６】
いくつかの実施形態では、二次抗体は、Ｖドメインと同じ抗原に結合する。好ましくは、二次抗体は、Ｖドメインとは異なるエピトープに結合する。そのような実施形態では、抗体は、二次抗体が存在しない抗体と比較した場合、より大きい結合親和性でそのコグネイト抗原に結合することができる。いくつかの実施形態では、二次抗体は、一次抗体、すなわちＶドメインを含む抗体とは異なる抗原に結合する。いくつかの実施形態では、二次抗体はＩＬ−１７に結合し、一次抗体、すなわちＶドメインを含む抗体はＨＳＡに結合する。いくつかの実施形態では、二次抗体はＣＤ３に結合し、一次抗体、すなわちＶドメインを含む抗体はＣＤ２８に結合する。いくつかの実施形態では、二次抗体はＣＤ２８に結合し、一次抗体、すなわちＶドメインを含む抗体はＣＤ３に結合する。
【００１７】
本発明はまた、単離されたポリヌクレオチド（単数又は複数）、例えばＤＮＡ分子（単数又は複数）、及び本明細書に開示の抗体をコードするクローニングベクター（単数又は複数）又は発現ベクター（単数又は複数）を提供する。また、前記ポリヌクレオチド（単数若しくは複数）又はベクター（単数若しくは複数）を含む宿主細胞も提供する。本発明は、前記宿主細胞を培養するステップと、抗体を単離するステップとを含む、本明細書に記載の抗体を産生する方法をさらに提供する。
【００１８】
別の態様では、本発明はまた、Ｖドメイン及び本明細書に記載の挿入ポリペプチドを含む抗体を、１つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と組み合わせて含む医薬組成物を提供する。また、治療において使用するための前記抗体又は前記医薬組成物も提供する。また、前記抗体又は前記医薬組成物を、治療を必要とする対象に投与するステップを含む治療方法も提供する。また、医薬品を製造するための前記抗体の使用も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１Ａは、典型的なＦａｂ構造の図であり、フレームワーク３ループ領域を強調表示している。        図１Ｂは、重鎖可変ドメインフレームワーク３領域内の強調表示した特定の残基の図である。        図１Ｃは、軽鎖可変ドメインフレームワーク３領域内の強調表示した特定の残基の図である。
【図２】図２Ａは、ＣＡ６４５／ＩＬ−１５Ｆｗｋ３のＩＬ−１５受容体鎖への結合を示すＳＰＲセンサーグラムの図である。        図２Ｂは、ＣＡ６４５ＶＨドメインのフレームワーク３へのＩＬ−１５挿入を示すモデリングされた構造の図である。
【図３】図３Ａは、ＩＬ−１５を添加した場合及び無添加の場合のＣＡ６４５／ＩＬ−２Ｆｗｋ３のＩＬ−２受容体β鎖への結合を示すＳＰＲセンサーグラムの図である。        図３Ｂは、ＣＡ６４５ＶＨドメインのフレームワーク３へのＩＬ−２挿入を示すモデリングされた構造の図である。
【図４】図４Ａは、ＣＡ６４５／Ｇ−ＣＳＦＦｗｋ３のＨＳＡ及び／又はＧ−ＣＳＦ受容体への結合を示すＳＰＲセンサーグラムの図である。        図４Ｂは、ＣＡ６４５ＶＨドメインのフレームワーク３へのＧ−ＣＳＦ挿入を示すモデリングされた構造の図である。
【図５】図５Ａは、ＣＡ６４５／ＧＭ−ＣＳＦＣＨ１（ヒト）構築物と比較した、ＣＡ６４５／ＧＭ−ＣＳＦＦｗｋ３（ヒト）のＧＭ−ＣＳＦ受容体への結合を示すＳＰＲセンサーグラムの図である。        図５Ｂは、ＣＡ６４５ＶＨドメインのフレームワーク３へのＧＭ−ＣＳＦ挿入を示すモデリングされた構造の図である。
【図６】図６は、ＣＡ６４５／ＧＭ−ＣＳＦＣＨ１（マウス）構築物と比較した、ＣＡ６４５／ＧＭ−ＣＳＦＦｗｋ３（マウス）のＧＭ−ＣＳＦ受容体への結合を示すＳＰＲセンサーグラムの図である。
【図７】図７Ａは、ＥＰＯを添加した場合及び無添加の場合のＣＡ６４５／ＥＰＯＦｗｋ３のＥＰＯ受容体への結合を示すＳＰＲセンサーグラムの図である。        図７Ｂは、ＣＡ６４５ＶＨドメインのフレームワーク３へのＥＰＯ挿入を示すモデリングされた構造の図である。
【図８】図８Ａは、ＨＳＡが存在する場合又は非存在の場合のＣＡ６４５／ＶＨＨ６Ｆｗｋ３のＩＦ−６、ＨＳＡ、ＩＦ−６：ｇｐ８０への結合を示すＳＰＲセンサーグラムの図である。        図８Ｂは、ＣＡ６４５ＶＨドメインのフレームワーク３へのＶＨＨ６挿入を示すモデリングされた構造の図である。
【図９】図９Ａは、ＣＡ６４５／ＶＨＨ１５Ｆｗｋ３のＨＳＡ及び／又はＩＬ−６への結合を示すＳＰＲセンサーグラムの図である。        図９Ｂは、ＣＡ６４５ＶＨドメインのフレームワーク３へのＶＨＨ１５挿入を示すモデリングされた構造の図である。
【図１０】図１０Ａは、様々なリンカー構築物を用いたＣＡ６４５／スクレロスチンＦｗｋ３（コア又は完全長）のＬＲＰ６細胞外ドメインへの結合を示すＳＰＲセンサーグラムの図である。          図１０Ｂは、ＣＡ６４５ＶＨドメインのフレームワーク３へのスクレロスチンコア挿入を示すモデリングされた構造の図である。
【図１１】図１１は、様々なリンカー構築物を用いたＣＡ６４５／スクレロスチンＦｗｋ３（コア又は完全長）のＬＲＰ４細胞外ドメインへの結合を示すＳＰＲセンサーグラムの図である。
【図１２】図１２Ａは、異なるリンカー配列を有するＣＡ６４５／（ＩＬ−１０Ｆｗｋ３）２のＩＬ−１０受容体への結合を示すＳＰＲセンサーグラムの図である。          図１２Ｂは、ＣＡ６４５ＶＨドメインのフレームワーク３へのＩＬ−１０二量体挿入を示すモデリングされた構造の図である。
【図１３】図１３は、ＩＬ−１５を添加した場合及び無添加の場合のＣＡ４９７／ＩＬ−１５Ｆｗｋ３のＩＬ−２受容体β鎖への結合を示すＳＰＲセンサーグラムの図である。
【図１４】図１４は、ＩＬ−１５を添加した場合及び無添加の場合のＣＡ２４０／ＩＬ−１５Ｆｗｋ３のＩＬ−２受容体β鎖への結合を示すＳＰＲセンサーグラムの図である。
【図１５】図１５は、ＨｙＨＥＬ５／ＶＨＨ  Ｄ３Ｌ１１Ｆｗｋ３のリゾチームへの結合に関する希釈系列を示すＳＰＲセンサーグラムの図である。
【図１６】図１６は、ＨｙＨＥＬ５／ＶＨＨ１５Ｆｗｋ３のリゾチームへの結合に関する希釈系列を示すＳＰＲセンサーグラムの図である。
【図１７】図１７は、ＣＡ６４５／ＶＨＨ  Ｄ３Ｌ１１Ｆｗｋ３のリゾチームへの結合に関する希釈系列を示すＳＰＲセンサーグラムの図である。
【図１８】図１８は、ＨｙＨＥＦ５／ＶＨＨ  Ｄ３Ｌ１１Ｆｗｋ３のリゾチームへの結合可能性についての概略図表示である。
【図１９】図１９は、異なるリンカー配列を有するＣＡ６４５／ＩＬ−１５Ｆｗｋ３のＩＬ−１５受容体鎖への結合を示すＳＰＲセンサーグラムの図である。
【図２０】図２０は、ＤＳＣ曲線の図である（実線：ＣＡ６４５  Ｆａｂ；点線：ＣＡ４９７  ｄｓｓｃＦｖ；逆三角形：ＣＡ６４５  Ｆａｂ−Ｆｗｋ３  ＣＡ４９７  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＬｖＨ）；三角形：ＣＡ６４５  Ｆａｂ−Ｆｗｋ３  ＣＡ４９７  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＨｖＬ））。
【図２１】図２１Ａは、ＣＡ４９７  ＩｇＧ４についての、ＨＳＡの非存在下（黒丸）又は存在下（白丸）におけるＩＬ−１７Ａの阻害曲線の図である。          図２１Ｂは、ＣＡ６４５  Ｆａｂ−Ｆｗｋ３  ＣＡ４９７  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＨｖＬ）についての、ＨＳＡの非存在下（黒丸）又は存在下（白丸）におけるＩＬ−１７Ａの阻害曲線の図である。          図２１Ｃは、ＣＡ６４５  Ｆａｂ−Ｆｗｋ３  ＣＡ４９７  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＬｖＨ）についての、ＨＳＡの非存在下（黒丸）又は存在下（白丸）におけるＩＬ−１７Ａの阻害曲線の図である。
【図２２】図２２は、Ｆｗｋ３領域に挿入された抗ＩＬ−１７  ＣＡ４９７  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＨｖＬ）を含む固定化ＣＡ６４５  ＩｇＧ４ＰへのＩＬ−１７Ａ及びＨＳＡの結合を示すＳＰＲ分析の図である。
【図２３】図２３Ａは、Ｆｗｋ３領域内にｄｓｓｃＦｖ  抗ＣＤ３を含むＩｇＧ４Ｐ  抗ＣＤ２８（実線）；Ｆｗｋ３領域内にｄｓｓｃＦｖ  抗ＣＤ３を含むＩｇＧ４Ｐ  抗ＣＤ３（点線）についてのＤＳＣ曲線の図である。          図２３Ｂは、Ｆｗｋ３領域内にｄｓｓｃＦｖ  抗ＣＤ３を含むＦａｂ  抗ＣＤ２８（実線）；Ｆｗｋ３領域内にｄｓｓｃＦｖ  抗ＣＤ３を含むＦａｂ  抗ＣＤ３（点線）についてのＤＳＣ曲線の図である。
【図２４Ａ】ＣＤ４  Ｔ細胞活性化（患者１）に関するＰＢＭＣにおけるＴ細胞活性化アッセイの図である。白色三角形：抗ＣＤ２８  Ｆａｂ  Ｆｗｋ３−抗ＣＤ３  ｄｓｓｃＦｖ；黒色丸：抗ＣＤ３  Ｆａｂ；黒色逆三角形：抗ＣＤ２８  Ｆａｂ；黒色丸：抗ＣＤ３  Ｆａｂ  Ｆｗｋ３−抗ＣＤ３  ｄｓｓｃＦｖ；白色四角：抗ＣＤ２８  ＩｇＧ４Ｐ  Ｆｗｋ３−抗ＣＤ３  ｄｓｓｃＦｖ；黒色三角形：抗ＣＤ３  ＩｇＧ４Ｐ−Ｆｗｋ３  抗ＣＤ３  ｄｓｓｃＦｖ；＊記号：ＯＫＴ３；白色丸：細胞のみの対照。
【図２４Ｂ】ＣＤ４  Ｔ細胞活性化（患者２）に関するＰＢＭＣにおけるＴ細胞活性化アッセイの図である。白色三角形：抗ＣＤ２８  Ｆａｂ  Ｆｗｋ３−抗ＣＤ３  ｄｓｓｃＦｖ；黒色丸：抗ＣＤ３  Ｆａｂ；黒色逆三角形：抗ＣＤ２８  Ｆａｂ；黒色丸：抗ＣＤ３  Ｆａｂ  Ｆｗｋ３−抗ＣＤ３  ｄｓｓｃＦｖ；白色四角：抗ＣＤ２８  ＩｇＧ４Ｐ  Ｆｗｋ３−抗ＣＤ３  ｄｓｓｃＦｖ；黒色三角形：抗ＣＤ３  ＩｇＧ４Ｐ−Ｆｗｋ３  抗ＣＤ３  ｄｓｓｃＦｖ；＊記号：ＯＫＴ３；白色丸：細胞のみの対照。
【図２４Ｃ】ＣＤ８  Ｔ細胞活性化（患者１）に関するＰＢＭＣにおけるＴ細胞活性化アッセイの図である。白色三角形：抗ＣＤ２８  Ｆａｂ  Ｆｗｋ３−抗ＣＤ３  ｄｓｓｃＦｖ；黒色丸：抗ＣＤ３  Ｆａｂ；黒色逆三角形：抗ＣＤ２８  Ｆａｂ；黒色丸：抗ＣＤ３  Ｆａｂ  Ｆｗｋ３−抗ＣＤ３  ｄｓｓｃＦｖ；白色四角：抗ＣＤ２８  ＩｇＧ４Ｐ  Ｆｗｋ３−抗ＣＤ３  ｄｓｓｃＦｖ；黒色三角形：抗ＣＤ３  ＩｇＧ４Ｐ−Ｆｗｋ３  抗ＣＤ３  ｄｓｓｃＦｖ；＊記号：ＯＫＴ３；白色丸：細胞のみの対照。
【図２４Ｄ】ＣＤ８  Ｔ細胞活性化（患者２）に関するＰＢＭＣにおけるＴ細胞活性化アッセイの図である。白色三角形：抗ＣＤ２８  Ｆａｂ  Ｆｗｋ３−抗ＣＤ３  ｄｓｓｃＦｖ；黒色丸：抗ＣＤ３  Ｆａｂ；黒色逆三角形：抗ＣＤ２８  Ｆａｂ；黒色丸：抗ＣＤ３  Ｆａｂ  Ｆｗｋ３−抗ＣＤ３  ｄｓｓｃＦｖ；白色四角：抗ＣＤ２８  ＩｇＧ４Ｐ  Ｆｗｋ３−抗ＣＤ３  ｄｓｓｃＦｖ；黒色三角形：抗ＣＤ３  ＩｇＧ４Ｐ−Ｆｗｋ３  抗ＣＤ３  ｄｓｓｃＦｖ；＊記号：ＯＫＴ３；白色丸：細胞のみの対照。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
抗体
本発明は、可変（Ｖ）ドメイン及び挿入ポリペプチドを含む抗体であって、挿入ポリペプチドがＶドメインのフレームワーク３（Ｆｗｋ３）領域内にある、上記抗体を提供する。
【００２１】
本発明の抗体は、典型的には、挿入ポリペプチドを抗体のＶドメインのＦｗｋ３領域に組み込むことによって構築される。Ｖドメインは、例えば、ＶＨドメインであってもよく、又はＶＬドメインであってもよい。挿入ポリペプチドが組み込まれている抗体は足場抗体と考えることができ、及び／又は挿入ポリペプチドが抗体でもある場合、挿入ポリペプチドが組み込まれている抗体は、代わりに一次抗体と呼ばれ、一方、挿入ポリペプチドは二次抗体と呼ばれることがある。用語の「足場抗体」及び「一次抗体」は、本開示の文脈において同義的に使用され、挿入ポリペプチドが組み込まれている抗体を意味することができる。
【００２２】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、完全長抗体又はその結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、完全長ＩｇＧ又はその結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、完全長ＩｇＧ１である。いくつかの実施形態では、抗体は、完全長ＩｇＧ４である。いくつかの実施形態では、抗体は、２４１位（Ｋａｂａｔナンバリングシステムによる番号付与）のセリンがプロリンに変わっている、完全長ＩｇＧ４Ｐである。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＶＨＨ、又はｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗体は、ジスルフィド安定化ｓｃＦｖ又は「ｄｓｓｃＦｖ」である。本明細書で使用される場合の「ジスルフィド安定化一本鎖可変フラグメント」又は「ｄｓｓｃＦｖ」とは、ＶＨとＶＬ可変ドメイン間のペプチドリンカーによって安定化され、ＶＨとＶＬの間のドメイン間ジスルフィド結合も含む一本鎖可変フラグメントを意味する（例えば、Ｗｅａｔｈｅｒｉｌｌら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｄｅｓｉｇｎ  ＆  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、２５  （３２１〜３２９頁）、２０１２年；ＷＯ２００７１０９２５４を参照）。いくつかの実施形態では、ＶＨとＶＬの間のドメイン間ジスルフィド結合は、ＶＨ４４位とＶＬ１００位（Ｋａｂａｔナンバリングシステムによる番号付与）の間に形成される。
【００２３】
本明細書で使用される場合の用語「抗体」とは、一般に、完全長（無傷、全）抗体、すなわち、ＩｇＧ抗体の場合には２つの重鎖及び２つの軽鎖のエレメントを含む抗体を意味する。
用語の「抗体構築物」、「操作された抗体」、「抗体融合タンパク質」とは、本発明の文脈において交換可能に使用され、本発明の抗体を指すことができる。
【００２４】
抗体の結合フラグメントは、一般に、少なくとも１つの可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン又は可変重鎖（ＶＨ）ドメインを含み、一本鎖抗体（例えば、完全長重鎖若しくは軽鎖）、Ｆａｂ、改変Ｆａｂ、Ｆａｂ’、改変Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆａｂ−Ｆｖ、Ｆａｂ−ｄｓＦｖ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、例えばＶＨ若しくはＶＬ若しくはＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリボディ、トライアボディ、テトラボディ、並びに上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントが含まれる（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ及びＨｕｄｓｏｎ、２００５年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２３（９）：１１２６〜１１３６頁；Ａｄａｉｒ及びＬａｗｓｏｎ、２００５年、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  −  Ｏｎｌｉｎｅ  ２（３）、２０９〜２１７頁を参照）。これらの抗体結合フラグメントを作製及び製造するための方法は、当技術分野において周知である（例えば、Ｖｅｒｍａら、１９９８年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１６、１６５〜１８１頁を参照）。例えば、抗体結合フラグメントは、任意の適切な酵素切断技術及び／又は酵素消化技術、例えばペプシンによる処理を使用して、任意の全抗体、特に全モノクローナル抗体から得ることができる。或いは、抗体出発材料は、抗体の可変領域及び／又は定常領域をコードするＤＮＡの操作及び再発現に関する組換えＤＮＡ技術の使用によって調製することができる。標準的な分子生物学技術を使用して、所望によりアミノ酸又はドメインを改変、付加又は欠失させることができる。可変領域又は定常領域への任意の変更も、本明細書で使用される場合の用語「可変」領域及び「定常」領域に依然として包含される。抗体フラグメント出発材料は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ラクダ、ラマ、ヤギ又はヒトを含む任意の種から得ることができる。抗体フラグメントの部分は、複数の種から得ることができ、例えば、抗体フラグメントはキメラであり得る。一例では、定常領域は１つの種に由来し、可変領域は別の種に由来する。抗体フラグメントの出発材料は改変することもできる。別の例では、抗体フラグメントの可変領域は、組換えＤＮＡ操作技術を使用して作製されている。そのような操作されたバージョンには、例えば、天然抗体のアミノ酸配列内の、又はこれらの配列への挿入、欠失、又は変更によって、天然抗体可変領域から作製されるものが含まれる。このタイプの特定の例には、少なくとも１つのＣＤＲを含有し、任意選択で、１つの抗体に由来する１つ又は複数のフレームワークアミノ酸及び二次抗体に由来する残りの可変領域ドメインを含有する、それらの操作された可変領域ドメインが含まれる。Ｆａｂ−ＦｖフォーマットはＷＯ２００９／０４０５６２で初めて開示されており、そのジスルフィド安定化バージョンのＦａｂ−ｄｓＦｖはＷＯ２０１０／０３５０１２で初めて開示された。他の抗体フラグメントには、国際特許出願ＷＯ２００５／００３１６９、ＷＯ２００５／００３１７０及びＷＯ２００５／００３１７１に開示されているＦａｂフラグメント及びＦａｂ’フラグメントが含まれる。多価抗体は、複数の特異性、例え���二重特異性を含んでいてもよく、又は単一特異性であってもよい（例えば、ＷＯ９２／２２５８３及びＷＯ０５／１１３６０５を参照）。後者のそのような例の１つは、ＷＯ９２／２２５８３に開示されているＴｒｉ−Ｆａｂ（又はＴＦＭ）である。別の多重特異性フォーマットは、ＷＯ２０１５／１９７７７２に開示されている。
【００２５】
典型的なＦａｂ’分子は重鎖と軽鎖の対を含み、重鎖は可変領域ＶＨ、定常ドメインＣＨ１及び天然又は改変ヒンジ領域を含み、軽鎖は可変領域ＶＬ及び定常ドメインＣＬを含む。
【００２６】
抗体の結合ドメインは、典型的には、６つのＣＤＲを含み、３つは重鎖から、３つは軽鎖からのものである。このような抗体では、ＣＤＲはフレームワーク内にあり、一緒に可変領域を形成する。したがって、一実施形態では、抗体は、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む抗原に特異的な結合ドメインを含む。他の実施形態では、例えば、抗体が単一ドメイン抗体である場合、結合ドメインは、重鎖又は軽鎖のいずれかの単一Ｖドメインからの３つのＣＤＲのみを含み得る。したがって、一実施形態では、抗体は、軽鎖可変領域（ＶＬドメイン）又は重鎖可変領域（ＶＨ若しくはＶＨＨドメイン）のうちの１つを含む抗原に対して特異的な結合ドメインを含む。抗原に結合するＶドメインは、単独で、又は例えば相補的なＶＨ／ＶＬ対として別のＶドメインと協同的に結合することができることは理解されよう。したがって、Ｖドメインを含む抗体は、その抗原に、相補的Ｖ（ＶＨ又はＶＬ）ドメインと協同的に結合し得る。一実施形態では、ＶドメインはＶＨドメインであり、本発明の抗体はＶＬドメインをさらに含み、ＶＨドメインはその抗原に、ＶＨ／ＶＬ対としてＶＬドメインと協同的に結合し、すなわち、本発明の抗体はＶＨドメインを含み、その抗原に、相補的ＶＬドメインと協同的に結合する。一実施形態では、ＶドメインはＶＬドメインであり、本発明の抗体はＶＨドメインをさらに含み、ＶＬはその抗原に、ＶＨ／ＶＬ対としてＶＨドメインと協同的に結合し、すなわち、本発明の抗体はＶＬドメインを含み、その抗原に、相補的ＶＨドメインと協同的に結合する。本発明の抗体の結合ドメインは、典型的には、抗原に結合するＶＨ、ＶＬ、又はＶＨ／ＶＬの対を意味する。
【００２７】
抗体は、一般には、１つ又は複数の結合ドメインを含有する。例えば、未改変のＦａｂフラグメントは、ＶＨ／ＶＬ対によって形成される１つの結合ドメインを含み、全ＩｇＧは２つの結合ドメインを含み、それぞれがＶＨ／ＶＬ対によって形成され、２つの結合ドメインは同一であるか（単一特異性抗体）、又は異なる（二重特異性抗体若しくは二価抗体）。一例では、本発明の抗体は、ＶＨドメイン及びＶＨドメインのＦｗｋ３領域内に挿入ポリペプチドを含み、ＶＨドメインと相補的対を形成するＶＬドメインをさらに含むＦａｂフラグメントであり得る。一例では、ＶＬドメインは未改変であってもよく（すなわち、本発明の抗体は、ＶＨドメインのＦｗｋ３領域内に単一挿入ポリペプチドを含むＦａｂフラグメントである）、又はそのＦｗｋ３領域に挿入ポリペプチドを含んでいてもよい（すなわち、本発明の抗体は、同一の、類似の、又は異なる、２つの挿入ポリペプチドを含むＦａｂフラグメントであり、１つはＶＨドメインのＦｗｋ３領域内に挿入されたものであり、他の１つはＶＬドメインのＦｗｋ３領域内に挿入されたものである）。一例では、本発明の抗体は、ＶＬドメイン及びＶＬドメインのＦｗｋ３領域内に挿入ポリペプチドを含み、ＶＬドメインと相補的対を形成するＶＨドメインをさらに含むＦａｂフラグメントであり得る。一例では、ＶＨドメインは未改変であってもよく（すなわち、本発明の抗体は、ＶＬドメインのＦｗｋ３領域内に単一挿入ポリペプチドを含むＦａｂフラグメントである）か、又はそのＦｗｋ３領域に挿入ポリペプチドを含んでいてもよい（すなわち、本発明の抗体は、同一の、類似の、若しくは異なる、２つの挿入ポリペプチドを含むＦａｂフラグメントであり、１つはＶＬドメインのＦｗｋ３領域内に挿入されたものであり、他の１つはＶＨドメインのＦｗｋ３領域内に挿入されたものである）。別の例では、本発明の抗体は、ＶＨドメイン及びＶＨドメインのＦｗｋ３領域内に挿入ポリペプチドを含み、ＶＨドメインと相補的対を形成するＶＬドメインをさらに含む完全ＩｇＧである。一例では、ＶＬドメインは未改変であってもよく（すなわち、本発明の抗体は、２つの挿入ポリペプチドを含むＩｇＧであって、それぞれがＩｇＧの２つのＶＨドメインの１つに挿入されている、ＩｇＧである）か、又はそのＦｗｋ３領域に挿入ポリペプチドを含んでいてもよい（すなわち、本発明の抗体は、同一の、類似の、若しくは異なる、４つの挿入ポリペプチドを含むＩｇＧであり、それらのそれぞれは、その２つのＶＨドメイン及び２つのＶＬドメインのそれぞれのＦｗｋ３領域に挿入されている）。別の例では、本発明の抗体は、ＶＬドメイン及びＶＬドメインのＦｗｋ３領域内の挿入ポリペプチドを含み、ＶＬと相補的対を形成するＶＨドメインをさらに含む完全ＩｇＧである。ＶＨドメインは、未改変であってもよく（すなわち、本発明の抗体は、２つの挿入ポリペプチドを含むＩｇＧであり、それぞれがＩｇＧの２つのＶＬドメインの１つに挿入されている）か、又はそのＦｗｋ３領域に挿入ポリペプチドを含んでいてもよい（すなわち、本発明の抗体は、同一の、類似の、若しくは異なる４つの挿入ポリペプチドを含むＩｇＧであり、それらのそれぞれは、その２つのＶＬドメイン及び２つのＶＨドメインのそれぞれのＦｗｋ３領域に挿入されている）。
【００２８】
抗体可変ドメイン中の残基は、慣例通りに、Ｋａｂａｔらによって考案されたシステムに従って番号付与される。このシステムは、Ｋａｂａｔら、１９８７年、「免疫学的対象のタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」、米国保健福祉省（ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ＮＩＨ、米国に記載されている。このナンバリングシステムを、別段に指定しない限り、本明細書において使用する。
【００２９】
Ｋａｂａｔ残基指定は、アミノ酸残基の直鎖番号付与に必ずしも直接対応しているわけではない。実際の直鎖アミノ酸配列は、基本的可変ドメイン構造のフレームワーク又は相補性決定領域（ＣＤＲ）であるかどうかにかかわらず、構造成分の短縮又は構造成分への挿入に対応する厳密なＫａｂａｔナンバリングよりも少ないアミノ酸又は追加のアミノ酸を含有し得る。所与の抗体についての残基の正しいＫａｂａｔナンバリングは、抗体の配列中の相同の残基を、当技術分野で公知の方法によって「標準的な」Ｋａｂａｔナンバリングされた配列とアラインさせることにより決定することができる。
【００３０】
重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムによれば、残基３１〜３５（ＣＤＲ−Ｈ１）、残基５０〜６５（ＣＤＲ−Ｈ２）、及び残基９５〜１０２（ＣＤＲ−Ｈ３）に位置している。軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムによれば、残基２４〜３４（ＣＤＲ−Ｌ１）、残基５０〜５６（ＣＤＲ−Ｌ２）、及び残基８９〜９７（ＣＤＲ−Ｌ３）に位置している。ＣＤＲループに加えて、第４のループがフレームワーク３（Ｆｗｋ３）によって形成されるＣＤＲ−２とＣＤＲ−３の間に存在する。図１Ａは、軽鎖及び重鎖を有するＦａｂのコンテキスト内のフレームワーク３ループの描写を提供する。図１Ｂ及び図１Ｃはまた、これらのループからの代表的な残基を示す。Ｋａｂａｔナンバリングシステムは、フレームワーク３を重鎖内の６６〜９４位及び軽鎖内の５７〜８８位として定義する。
【００３１】
したがって、一実施形態では、本発明の抗体は、可変（Ｖ）ドメイン及び挿入ポリペプチドを含み、挿入ポリペプチドは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムによれば、ＶドメインがＶＨドメインである場合には６６〜９４位内にあり、ＶドメインがＶＬドメインである場合には５７〜８８位内にある。
【００３２】
いくつかの実施形態では、挿入ポリペプチドは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムによれば、ＶＨドメインのアミノ酸残基７３と７６との間にある。好ましくは、挿入ポリペプチドは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムによれば、ＶＨドメインのアミノ酸残基７３と７４の間、７４と７５の間、又は７５と７６の間にあり得る。いくつかの実施形態では、挿入ポリペプチドは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムによれば、ＶＨドメインのアミノ酸残基７６と７７の間、又は７７と７８の間にある。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインの１つ又は複数のアミノ酸残基は、挿入ポリペプチドによって置き換えられる。
【００３３】
いくつかの実施形態では、挿入ポリペプチドは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムによれば、ＶＬドメインのアミノ酸残基６７と７０との間にある。好ましくは、挿入ポリペプチドは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムによれば、ＶＬドメインのアミノ酸残基６７と６８の間、６８と６９の間、又は６９と７０の間にあり得る。いくつかの実施形態では、ＶＬドメインの１つ又は複数のアミノ酸残基は、挿入ポリペプチドによって置き換えられる。
【００３４】
本発明の抗体は、定常領域ドメインをさらに含むことができる。本発明の抗体分子の定常領域ドメインは、存在する場合、抗体分子の提唱された機能、特に必要とされ得るエフェクター機能を考慮して選択することができる。例えば、定常領域ドメインは、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭドメインであり得る。特に、抗体エフェクター機能が必要とされる場合、特にＩｇＧ１及びＩｇＧ３アイソタイプのヒトＩｇＧ定常領域ドメインが使用され得る。或いは、抗体エフェクター機能が必要とされない場合、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプが使用され得る。これらの定常領域ドメインの配列バリアントもまた使用することができることは理解されよう。例えば、Ａｎｇａｌら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９３年、３０（１）、１０５〜１０８頁に開示されているように、２４１位のセリンがプロリンに変更されたＩｇＧ４分子を使用することができる。抗体が様々な翻訳後修飾を受け得ることも当業者には理解されよう。これらの修飾のタイプ及び程度は、抗体の発現に使用される宿主細胞系並びに培養条件に多くの場合依存する。このような修飾には、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペラジン形成、アスパラギン酸異性化、及びアスパラギン脱アミド化での変化が含まれ得る。頻用の修飾は、（Ｈａｒｒｉｓ，ＲＪ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ７０５：１２９〜１３４頁、１９９５年に開示されているような）カルボキシペプチダーゼの作用によるカルボキシ末端塩基性残基（例えばリジン又はアルギニン）の欠失である。
【００３５】
本発明において使用するための抗体は、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体であり得る。
【００３６】
一実施形態では、本発明の抗体はマウス抗体ではない。用語「マウス抗体」とは、マウスＢ細胞のみに由来する重鎖及び軽鎖を有する抗体を意味する。したがって、この抗体は、その産生を可能にする細胞の起源がどのようであろうと、マウスのアミノ酸配列から構成されている。
【００３７】
一実施形態では、本発明の抗体はキメラ抗体である。用語「キメラ抗体」とは、それを構成するそれぞれの軽鎖及び／又はそれぞれの重鎖の配列が、少なくとも２つの異なる動物、特に哺乳動物に由来するハイブリッド配列を含むか、又はそれらからなる抗体若しくはその抗原結合フラグメントを意味し、特に、ウサギ、マウス、ラット、又はカニクイザルの可変領域とヒト定常領域を組み合わせた抗体を意味する。
【００３８】
一実施形態では、本発明の抗体はヒト化抗体である。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する非ヒト種由来の抗体分子である（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号を参照）。特に、用語「ヒト化」とは、ヒト抗体などのアクセプター抗体の重鎖及び／又は軽鎖可変領域フレームワークにグラフトされた、重鎖及び／又は軽鎖が非ヒト抗体（例えば、ウサギ、マウス、ラット、カニクイザル又はラマのモノクローナル抗体）由来の１つ又は複数のＣＤＲを含有する抗体又はその抗原結合フラグメントを意味する。ＣＤＲ全体が移されるのではなく、本明細書で上述したＣＤＲのいずれか１つからの特異性決定残基の１つ又は複数のみがヒト抗体フレームワークに移され得る（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉら、２００５年、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６、２５〜３４頁を参照）。ヒト化抗体の選択されたフレームワーク残基は、非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ又は特異性決定残基が由来する抗体）からの対応する残基（いわゆるドナー残基）で置換され、例えば、抗体の特異性又は親和性を回復又は改善することができる。
【００３９】
完全ヒト抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の両方の可変領域（単数又は複数）及び定常領域（単数又は複数）（存在する場合）がすべてヒト起源であるか、或いは、必ずしも同じ抗体からのものではない、ヒト起源の配列と実質的に同一である、抗体である。完全ヒト抗体の例には、例えば、ＥＰ０５４６０７３  Ｂ１、米国特許第５，５４５，８０６号、米国特許第５，５６９，８２５号、米国特許第５，６２５，１２６号、米国特許第５，６３３，４２５号、米国特許第５，６６１，０１６号、米国特許第５，７７０，４２９号、ＥＰ  ０４３８４７４  Ｂ１及びＥＰ０４６３１５１  Ｂ１において一般論として開示されているように、例えば、ファージディスプレイ法によって産生される抗体、並びにマウス免疫グロブリン可変領域及び／又は定常領域遺伝子がそれらのヒト対応物によって置換されたマウスにより産生される抗体が含まれ得る。
【００４０】
本明細書に記載のＶドメイン及び挿入ポリペプチドを含む抗体は、さらに改変させることができ、例えば、その薬物動態特性又は抗原結合に影響を及ぼし得るさらなる化合物に、例えば化学的にコンジュゲートさせることができる。
【００４１】
一例では、本発明の抗体は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に結合されている。例えば、ＰＥＧに連結された抗体は、血清半減期をさらに延長することを示し得る。特定の一例では、抗体は抗体フラグメントであり、ＰＥＧ分子は、抗体フラグメントに位置する任意の利用可能なアミノ酸側鎖又は末端アミノ酸官能基、例えば、任意の遊離アミノ基、イミノ基、チオール基、ヒドロキシル基若しくはカルボキシル基を介して結合することができる。このようなアミノ酸は、抗体フラグメント内に天然に存在し得るか、又は組換えＤＮＡ法を使用してフラグメントへと操作され得る（例えば、米国特許第５，２１９，９９６号；米国特許第５，６６７，４２５号；ＷＯ９８／２５９７１、ＷＯ２００８／０３８０２４を参照）。一例では、本発明の抗体は改変されたＦａｂフラグメントであり、改変は、エフェクター分子の結合を可能にするための１つ又は複数のアミノ酸のその重鎖のＣ末端への付加である。適切には、付加されたアミノ酸は、エフェクター分子が結合され得る１つ又は複数のシステイン残基を含む改変されたヒンジ領域を形成する。複数の部位を使用して、２つ以上のＰＥＧ分子を結合させることができる。
【００４２】
適切には、ＰＥＧ分子は、抗体フラグメント内に位置する少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を介して共有結合的に連結され得る。改変された抗体フラグメントに結合したそれぞれのポリマー分子は、抗体フラグメント内に位置するシステイン残基の硫黄原子に共有結合的に連結し得る。共有結合は、一般に、ジスルフィド結合、特に硫黄−炭素結合である。チオール基が結合点として使用される場合、適切に活性化されたエフェクター分子、例えばチオール選択的誘導体、例えばマレイミド及びシステイン誘導体などを使用することができる。活性化ポリマーは、上記のように、ポリマー−改変抗体フラグメントの調製における出発材料として使用することができる。活性化ポリマーは、チオール反応性基、例えばα−ハロカルボン酸又はエステル、例えば、ヨードアセトアミド、イミド、例えばマレイミド、ビニルスルホン又はジスルフィドなどを含有する任意のポリマーであり得る。そのような出発材料は、市販品を入手することができる（例えば、Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｉｎｃ．、ハンツビル、アラバマ州、米国）か、又は従来の化学的手順を使用して市販の出発材料から調製することができる。特定のＰＥＧ分子としては、２０Ｋメトキシ−ＰＥＧ−アミン（Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｉｎｃ．；Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ  ＧｍｂＨ；及びＳｕｎＢｉｏから入手可能）並びにＭ−ＰＥＧ−ＳＰＡ（Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｉｎｃ．から入手可能）が挙げられる。
【００４３】
好ましくは、本発明の抗体は、１０−５Ｍ以下、１０−６Ｍ以下、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ以下、１０−１０Ｍ以下、又は１０−１１Ｍ以下のそのコグネイト抗原に対する結合親和性（その解離定数ＫＤによって測定した場合）を有する。親和性は、公知の技術、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）を含む表面プラズモン共鳴技術などによって測定することができる。親和性は、室温２５℃又は３７℃で測定することができる。親和性は、生理学的ｐＨ、すなわち、約ｐＨ７．４で測定することができる。
【００４４】
本発明によって提供される抗体の親和性は、当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して変化させることができることは理解されよう。したがって、本発明はまた、アルブミンに対する改善された親和性を有する、本発明の抗体分子のバリアントに関する。そのようなバリアントは、ＣＤＲの変異導入（Ｙａｎｇら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ、２５４．、３９２〜４０３頁、１９９５年）、鎖シャフリング（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０、７７９〜７８３頁、１９９２年）、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）の突然変異誘発株の使用（Ｌｏｗら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２６０．、３５９〜３６８頁、１９９６年）、ＤＮＡシャフリング（Ｐａｔｔｅｎら、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  ＢｉｏｔｅｃｈｎｏＬ、８、７２４〜７３３頁、１９９７年）、ファージディスプレイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ、２５６．、７７〜８８頁、１９９６年）、及びセクシャルＰＣＲ（Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３９１．、２８８〜２９１頁、１９９８年）を含む多くの親和性成熟プロトコルによって得ることができる。
【００４５】
ヒト血清アルブミン結合抗体
一実施形態では、本発明の抗体は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合するＶドメインを含む。そのような実施形態では、その抗体は、挿入ポリペプチドの血清半減期の延長に有用であり得る。アルブミンに結合するＶドメインは、単独で、又は、例えば相補的ＶＨ／ＶＬ対として、別のＶドメインと協同的に結合することができることは理解されよう。したがって、いくつかの実施形態では、Ｖドメインを含む抗体は、相補的ＶＨドメイン又はＶＬドメインと協同的にアルブミンに結合する。一実施形態では、ＶドメインはＶＨドメインであり、本発明の抗体はＶＬドメインをさらに含み、ＶＨは、ＶＨ／ＶＬ対として、ＶＬドメインと協同的にアルブミンに結合する、すなわち、本発明の抗体はＶＨドメインを含み、相補的ＶＬと協同的にアルブミンに結合する。一実施形態では、ＶドメインはＶＬドメインであり、本発明の抗体はＶＨドメインをさらに含み、ＶＬは、ＶＨ／ＶＬ対として、ＶＨドメインと協同的にアルブミンに結合する、すなわち、本発明の抗体はＶＬドメインを含み、相補的ＶＨと協同的にアルブミンに結合する。本発明の抗体がアルブミンに結合する場合、ＶＨ／ＶＬは、典型的には、「アルブミン結合ドメイン」と呼ばれる。そのため、本発明の抗体のアルブミン結合ドメインは、アルブミンに結合するＶＨ、ＶＬ、又はＶＨ／ＶＬの対を意味する。
【００４６】
一実施形態では、本発明の抗体は、カニクイザル血清アルブミン、マウス血清アルブミン、及び／又はラット血清アルブミンに結合する。
【００４７】
一実施形態では、ヒト血清アルブミンに結合するＶドメインを含む本発明の抗体は、ヒト化されている。一実施形態では、アルブミン結合ドメインを含む本発明の抗体は、重鎖及び／又は軽鎖が、ヒト抗体の重鎖及び／又は軽鎖可変領域フレームワークにグラフトされたウサギ、マウス又はラットのモノクローナル抗体由来の１つ又は複数のＣＤＲを含有する、ヒト化抗体である。一実施形態では、アルブミン結合ドメインを含む本発明の抗体は、重鎖及び／又は軽鎖が、ヒト抗体の重鎖及び／又は軽鎖可変領域フレームワークにグラフトされたウサギ抗体由来の１つ又は複数のＣＤＲを含有し、重鎖及び／又は軽鎖可変領域フレームワークが、ドナー残基であるアミノ酸などの少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、ヒト化抗体である。
【００４８】
一実施形態では、ヒト血清アルブミンに結合するＶドメインを含む本発明の抗体は、以下に示すような軽鎖及び／又は重鎖配列を含む。（可変ドメインには下線が引かれている；ＣＤＲは太字及びイタリック体で示されている。）一実施形態では、ヒト血清アルブミンに結合するＶドメインを含む本発明の抗体は、以下から選択される軽鎖及び／又は重鎖配列を含む。一実施形態では、ヒト血清アルブミンに結合するＶドメインを含む本発明の抗体は、以下から選択される軽鎖及び／又は重鎖可変ドメイン配列を含む。一実施形態では、ヒト血清アルブミンに結合するＶドメインを含む本発明の抗体は、以下から選択されるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３配列のうちの少なくとも１つ、並びに／又はＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３配列のうちの少なくとも１つを含む。一実施形態では、ヒト血清アルブミンに結合するＶドメインを含む本発明の抗体は、以下から選択される、軽鎖及び／又は重鎖配列；並びに／或いは軽鎖及び／又は重鎖可変ドメイン配列；並びに／或いはＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３配列のうちの少なくとも１つ；並びに／或いはＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３配列のうちの少なくとも１つを含む。
【００４９】
ＣＡ６４５軽鎖（ｇＬ５）
【数１】
2021530222.tif 000003
【００５０】
ＶＬドメイン（ｇＬ５）：
【数２】
2021530222.tif 000004
【００５１】
ＣＡ６４５重鎖（ｇＨ５）
【数３】
2021530222.tif 000005
【００５２】
ＶＨドメイン（ｇＨ５）：
【数４】
2021530222.tif 000006
【００５３】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ジスルフィド結合がＶＬドメインとＶＨドメインの間で形成され得るように追加のシステイン残基を含む、上記のようなヒト血清アルブミンに結合するＶＬドメイン及びＶＨドメインのバリアント（それぞれ配列番号２及び配列番号７）を含む。追加のシステイン含有バリアントは、以下の配列を有することができる（追加のシステイン残基には下線を引いている）：
【００５４】
ＣＡ６４５−Ｃｙｓ  ＶＬドメイン（ｇＬ５）：
【数５】
2021530222.tif 000007
【００５５】
ＣＡ６４５−Ｃｙｓ  ＶＨドメイン（ｇＨ５）：
【数６】
2021530222.tif 000008
【００５６】
ヒト血清アルブミンに結合し、本発明の抗体で使用することができるＶＬドメイン及びＶＨドメインの追加の例は、以下に記載のような配列番号１０５、１０６、１０７、１０８及び１０９を含む（ＣＤＲは太字及びイタリック体）。
【００５７】
ＣＡ６４５  ＶＨドメイン（ｇＨ１）：
【数７】
2021530222.tif 000009
【００５８】
ＣＡ６４５  ＶＨドメイン（ｇＨ３７）：
【数８】
2021530222.tif 000010
【００５９】
ＣＡ６４５  ＶＨドメイン（ｇＨ４７）：
【数９】
2021530222.tif 000011
【００６０】
ＣＡ６４５  ＶＬドメイン（ｇＬ１）：
【数１０】
2021530222.tif 000012
【００６１】
ＣＡ６４５  ＶＬドメイン（ｇＬ４）：
【数１１】
2021530222.tif 000013
【００６２】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ジスルフィド結合がＶＬドメインとＶＨドメインの間に形成され得るような追加のシステイン残基を含む、上記のようなヒト血清アルブミンに結合するＶＬドメイン及びＶＨドメインのバリアント（配列番号１０５から配列番号１０９）を含む。追加のシステイン含有バリアントは、以下の配列を有することができる（追加のシステイン残基には下線を引いている）：
【００６３】
ＣＡ６４５−Ｃｙｓ  ＶＬ（ｇＬ４）：
【数１２】
2021530222.tif 000014
【００６４】
いくつかの実施形態では、アルブミン結合ドメインのＶＨフレームワークはヒトであり（例えば、ＶＨ３  １−３  ３−２３などのＶＨ３）、またドナー残基であるアミノ酸などの例えば１、２、３、４、５又は６個のアミノ酸置換を含む。そのような実施形態では、ＶＨは、配列番号７、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７に示す配列、又は少なくとも９５、９６、９７、９８若しくは９９％の類似性又は同一性を有するそれらのいずれか１つのバリアントを有し得る。
【００６５】
いくつかの実施形態では、アルブミン結合ドメインのＶＬフレームワークはヒトであり（例えば、２−１−（１）Ｌ５などのＶκ１）、またドナー残基であるアミノ酸などの例えば１、２、３、４、５又は６個のアミノ酸置換を含む。そのような実施形態では、ＶＬは、配列番号２、配列番号１０２、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０に示す配列、又は少なくとも９５、９６、９７、９８若しくは９９％の類似性又は同一性を有するそれらのいずれか１つのバリアントを有し得る。
【００６６】
いくつかの実施形態では、アルブミン結合ドメインは、配列番号７及び２、７及び１０２、７及び１０８、７及び１０９、７及び１１０、１０３及び２、１０３及び１０２、１０３及び１０８、１０３及び１０９、１０３及び１１０、１０５及び２、１０５及び１０２、１０５及び１０８、１０５及び１０９、１０５及び１１０、１０６及び２、１０６及び１０２、１０６及び１０８、１０６及び１０９、１０６及び１１０、１０７及び２、１０７及び１０２、１０７及び１０８、１０７及び１０９、１０７及び１１０の組合せから選択されるＶＨ配列並びにＶＬ配列、又は少なくとも９５、９６、９７、９８若しくは９９％の類似性若しくは同一性を有するそれらのいずれかの１つ若しくは複数のバリアントを含む。
【００６７】
いくつかの実施形態では、アルブミン結合ドメインのＶＬ配列及びＶＨ配列は、それぞれ、配列番号１０２及び配列番号１０３である。いくつかの実施形態では、アルブミン結合ドメインのＶＬ配列及びＶＨ配列は、それぞれ、配列番号２及び配列番号７である。
【００６８】
一実施形態では、ヒト血清アルブミンに結合するＶドメインを含む抗体は、Ｆａｂ又はｓｃＦｖである。配列番号２及び７のＶＬドメイン及びＶＨドメインは、Ｆａｂフォーマットにとって好ましい。一実施形態では、ヒト血清アルブミンに結合するＶドメインを含む抗体は、相補的Ｖ（ＶＬ又はＶＨ）ドメインと協同的にアルブミンに結合するｓｃＦｖである。そのような実施形態では、ｓｃＦｖは、（Ｇ４Ｓ）４リンカー（配列番号１６）によってＶＨ−ＶＬ又はＶＬ−ＶＨ配向で連結された、上記のようなＶＨドメインのいずれか１つ及びＶＬドメインのいずれか１つを含むことができる。配列番号２及び７のＶＬドメイン及びＶＨドメインは、ｓｃＦｖフォーマットにとって好ましい。配列番号２のＶＬドメインは、Ｃ末端に追加の２つのアミノ酸ＲＴを含み得る。一実施形態では、ヒト血清アルブミンに結合するＶドメインを含む抗体は、（Ｇ４Ｓ）４リンカーによって分離された配列番号２及び７のＶＬドメイン及びＶＨドメインを含むｓｃＦｖである。一例では、ｓｃＦｖはＶＨ−ＶＬ配向である。別の例では、ｓｃＦｖはＶＬ−ＶＨ配向である。一実施形態では、ヒト血清アルブミンに結合するＶドメインを含む抗体は、以下に示すような配列番号１４３を含むか、又はそれを有するｓｃＦｖである。特定の一実施形態では、ヒト血清アルブミンに結合するＶドメインを含む抗体は、ｄｓｓｃＦｖである。一実施形態では、ヒト血清アルブミンに結合するＶドメインを含む抗体は、相補的Ｖ（ＶＬ又はＶＨ）ドメインと協同的にアルブミンに結合するｄｓｓｃＦｖである。そのような実施形態では、ｄｓｓｃＦｖは、上記のようなＶＨドメインのいずれか１つ及びＶＬドメインのいずれか１つを含むことができ、まだ存在しない場合、ＶＬドメインとＶＨドメインとの間にジスルフィド結合が形成され得るような追加のシステイン残基を含むことができ、ここで、ＶＬ及びＶＨドメインは、（Ｇ４Ｓ）４リンカーによってＶＨ−ＶＬ又はＶＬ−ＶＨ配向で連結されている。配列番号１０２及び１０３のＶＬドメイン及びＶＨドメインは、ｄｓｓｃＦｖフォーマットにとって好ましい。配列番号１０２のＶＬドメインは、Ｃ末端に追加の２つのアミノ酸ＲＴを含み得る。一実施形態では、ヒト血清アルブミンに結合するＶドメインを含む抗体は、（Ｇ４Ｓ）４リンカー（配列番号１６）によって分離された配列番号１０２及び１０３のＶＬドメイン及びＶＨドメインを含むｄｓｓｃＦｖである。一例では、ｄｓｓｃＦｖはＶＨ−ＶＬ配向である。別の例では、ｄｓｓｃＦｖはＶＬ−ＶＨ配向である。一実施形態では、ヒト血清アルブミンに結合するＶドメインを含む抗体は、以下に示すような配列番号１４４を含むか、又はそれを有するｄｓｓｃＦｖである。
【００６９】
ＣＡ６４５  ｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）：
【数１３】
2021530222.tif 000015
【００７０】
ＣＡ６４５  ｄｓｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）ここでは、追加のシステイン残基に下線が引いてある：
【数１４】
2021530222.tif 000016
【００７１】
別の実施形態では、ヒト血清アルブミンに結合するＶドメインを含む抗体は、完全長ＩｇＧである。配列番号２及び７のＶＬドメイン及びＶＨドメインは、ＩｇＧフォーマットにとって好ましい。一実施形態では、ヒト血清アルブミンに結合するＶドメインを含む抗体は、ＩｇＧ１である。一実施形態では、ヒト血清アルブミンに結合するＶドメインを含む抗体は、ＩｇＧ４である。一実施形態において、ヒト血清アルブミンに結合するＶドメインを含む抗体は、ＩｇＧ４Ｐである。
１つ又は複数（例えば１、２、３若しくは４個）のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失が、本発明によって提供されるＣＤＲ又は他の配列（例えば可変ドメイン）に対して、そのコグネイト抗原（例えばＨＳＡ）に結合する抗体の能力を有意に変化させることなく行われ得ることは理解されよう。任意のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失の効果は、当業者により容易に試験され得る。例えば、１つ又は複数（例えば１、２、３若しくは４個）のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失は、本発明によって提供される抗体又はフラグメントにおいて使用されるフレームワーク領域に対して行うことができ、コグネイト抗原への結合親和性は保持されるか、又は増加される。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインのフレームワーク３の７２位のアミノ酸は野生型アミノ酸であり、前記ＶＨドメインの７２位に天然に存在する。
【００７２】
そのため、本発明はまた、本明細書で示した配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％類似性又は同一性である配列を含む抗体も包含する。本明細書で使用される場合の「同一性」とは、アラインされた配列内の任意の特定の位置で、アミノ酸残基が配列間で同一であることを示す。本明細書で使用される場合の「類似性」とは、アラインされた配列内の任意の特定の位置で、アミノ酸残基が配列間で類似のタイプであることを示す。例えば、ロイシンは、イソロイシン又はバリンによって置換され得る。多くの場合、相互に置換され得る他のアミノ酸としては、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：
−  フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）；
−  リシン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）；
−  アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）；
−  アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；並びに、
−  システイン及びメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）。
【００７３】
同一性及び類似性の程度は簡単に算出することができる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８年；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３年；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、  Ｐａｒｔ  １、  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４年；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，  Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１年、ＮＣＢＩから入手可能なＢＬＡＳＴ（商標）ソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９０年）、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３〜４１０頁；Ｇｉｓｈ，Ｗ．及びＳｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．、１９９３年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  ３：２６６〜２７２頁；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ら、１９９６年、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２６６：１３１〜１４１頁；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９〜３４０２頁；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．及びＭａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．、１９９７年、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ７：６４９〜６５６頁）。
【００７４】
本発明の抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、挿入ポリペプチド、例えば、治療用タンパク質又は二次抗体などの半減期を延長するのに十分な結合親和性でアルブミンに結合することができる。一実施形態では、挿入ポリペプチドはＨＳＡに結合する。そのような実施形態では、挿入ポリペプチドは、足場抗体の半減期を延長するのに十分な結合親和性でアルブミンに結合することができる。２．５μＭ以下のアルブミンのＫＤは、ｉｎ  ｖｉｖｏで半減期を延長することが報告されている（Ｎｇｕｙｅｎ，Ａ．ら  （２００６年）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｄｅｓｉｇｎ  ＆  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、１９（７）、２９１〜２９７頁）。一例では、本発明の抗体は、ナノモル又はマイクロモル、例えば３ｎＭ以下のＫＤである高結合親和性でアルブミンに結合することができる。親和性は、天然の又は組換え血清アルブミンを使用する表面プラズモン共鳴を含む、当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して測定することができる。
【００７５】
いくつかの実施形態では、挿入ポリペプチドは、アルブミン結合ペプチドである。アルブミン結合ペプチドの例は、Ｗ０２００７／１０６１２０で提供されており、以下のものが含まれる：
【表１】
2021530222.tif 000017
【００７６】
一実施形態では、挿入ポリペプチドは、ＨＳＡに結合する二次抗体である。そのような実施形態では、挿入ポリペプチドは、Ｖドメインを含む抗体、すなわち足場抗体に関する上記の特徴を有し得る。いくつかの実施形態では、挿入ポリペプチドは、上記のような、ＣＤＲのうちの少なくとも１つ、ＶＬドメイン若しくはＶＨドメインのうちの少なくとも１つ、又はアルブミンに結合する軽鎖若しくは重鎖のうちの少なくとも１つを含み得る。一実施形態では、挿入ポリペプチドは、それぞれ、配列番号３、配列番号４及び配列番号５の配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３のうちの少なくとも１つ、並びに／或いは、それぞれ、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０の配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３のうちの１つを含む。
【００７７】
挿入ポリペプチド
本発明によれば、本開示は、Ｖドメインのフレームワーク３領域内に挿入ポリペプチドを含む抗体に関する。Ｖドメインは、ＶＬドメインであってもよく、ＶＨドメインであってもよい。一例では、本発明の抗体は、ＶＬ及びＶＨの両方のフレームワーク３領域内に挿入ポリペプチドを含むことができ、すなわち、本発明の抗体は、２つの挿入ポリペプチドを含むことができ、１つの挿入ポリペプチドがＶＬのフレームワーク３領域に挿入され、１つの挿入ポリペプチドがＶＨのフレームワーク３領域に挿入され、またそれらの挿入ポリペプチドは同一であるか、類似であるか、又は異なる。一実施形態では、挿入ポリペプチドは、抗体に対して異種である。本明細書で使用される場合、「異種」とは、一般に、それが比較されている残りの実体とは遺伝子型で異なる実体に由来することを意味する。この文脈においては、それは、挿入されたポリペプチドが、通常、天然の抗体配列に存在しないことを意味する。一実施形態では、挿入ポリペプチドは、完全長タンパク質である。一実施形態では、挿入ポリペプチドは、完全長タンパク質のフラグメントである。一実施形態では、挿入ポリペプチドは、完全長タンパク質の機能的フラグメントである。一実施形態では、挿入ポリペプチドは、それ自体で発現される場合、機能的である。一実施形態では、挿入ポリペプチドは、本発明の抗体のＶドメインのフレームワーク３領域に存在する場合、機能的であり、及び／又は機能性を保持する。したがって、一実施形態では、本発明は、可変（Ｖ）ドメイン及び挿入ポリペプチドを含む抗体であって、挿入ポリペプチドがＶドメインのフレームワーク３（Ｆｗｋ３）領域内にあり、挿入ポリペプチドが、本発明の抗体のＶドメインのフレームワーク３領域に存在する場合、機能的であり、及び／又は、機能性を保持する、上記抗体を提供する。
【００７８】
一実施形態では、挿入ポリペプチドは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、又は２００個のアミノ酸を含む。一実施形態では、挿入ポリペプチドは、２５０、３００又は３５０個未満のアミノ酸を含む。一実施形態では、挿入ポリペプチドは、２５０個未満のアミノ酸を含む。一実施形態では、挿入ポリペプチドは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、又は２００個のアミノ酸及び２５０個未満のアミノ酸を含む。一実施形態では、挿入ポリペプチドは、５０から２５０個、好ましくは１００から２５０個、より好ましくは１５０から２５０個のアミノ酸を含む。
【００７９】
一実施形態では、挿入ポリペプチドは、治療用又は診断用のポリペプチドであり得る。適切な治療用ポリペプチドとしては、例えば、受容体アゴニスト又はアンタゴニスト、酵素阻害剤、金属キレート剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、心血管治療薬及び化学療法薬が挙げられる。いくつかの実施形態では、挿入ポリペプチドはサイトカインである。サイトカインは、例えば、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＰＯから選択することができる。他の実施形態では、挿入ポリペプチドはスクレロスチンである。いくつかの実施形態では、挿入ポリペプチドは、任意選択で連結された、２つ以上のポリペプチド配列、例えば、同一のポリペプチドの２つのコピーを含む。有利には、そのような実施形態では、挿入ポリペプチドは、多量体、特に機能的多量体を形成することができる。いくつかの実施形態では、挿入ポリペプチドは、２、３、又は４つのポリペプチド配列を含み、ポリペプチドの二量体、三量体、又は四量体を形成することができる。いくつかの実施形態では、挿入ポリペプチドは、ホモ二量体、ホモ三量体、又はホモ四量体を形成する。いくつかの実施形態では、挿入ポリペプチドは、少なくとも２つのサイトカインを含む。一実施形態では、挿入ポリペプチドは、ペプチドリンカー、例えば（Ｇ４Ｓ）３（配列番号１５）によって任意選択で分離されている２つのヒトＩＬ−１０配列を含む、すなわち、２つのヒトＩＬ−１０配列は、本発明の抗体のＶドメインのＦｗｋ３領域に挿入される。そのような実施形態では、２つのヒトＩＬ−１０配列は、本発明の抗体に組み込まれたＩＬ−１０のホモ二量体を形成する。
いくつかの実施形態では、挿入ポリペプチドは、ケモカインである。ケモカインは、例えば、ＣＣＬ（Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド）、ＣＸＣＬ（ＣＸＣモチーフケモカインリガンド）から選択することができる。いくつかの実施形態では、挿入ポリペプチドはホルモンである。ホルモンは、例えば、インスリン又はレプチンから選択することができる。いくつかの実施形態では、挿入ポリペプチドは増殖因子である。
【００８０】
驚いたことに、本発明者らは、Ｖドメインのフレームワーク３ループ領域内の抗体にポリペプチドを挿入すると、抗体又は挿入ポリペプチドの機能を有意に障害しないことを見出した。特に、本明細書における実施例は、抗体及び挿入ポリペプチドの両方のそれぞれの結合パートナーへの特異的及びコグネイト結合が、いくつかの試験した融合タンパク質構築物について見られることを明らかにしている。
【００８１】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、挿入ポリペプチドが存在しない抗体と比較した場合、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％である結合親和性で前記Ｖドメインによってそのコグネイト抗原に結合する。抗原に結合するＶドメインが単独で、又は抗体フォーマットに応じて、例えば相補的ＶＨ／ＶＬ対として、別のＶドメインと協同的に結合することができることは理解されよう。したがって、Ｖドメインを含む抗体は、その抗原に、相補的Ｖ（ＶＨ又はＶＬ）ドメインと協同的に結合することができる。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、挿入ポリペプチドが存在しない抗体と比較した場合、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％である結合親和性でそのコグネイト抗原に結合する。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ＶＨドメインを含み、挿入ポリペプチドが存在しない抗体と比較した場合、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％である結合親和性で、その抗原に、相補的ＶＬと協同的に結合する。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ＶＬドメインを含み、挿入ポリペプチドが存在しない抗体と比較した場合、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％である結合親和性で、その抗原に、相補的ＶＨと協同的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体の挿入ポリペプチド部分は、抗体に連結されていない場合の遊離ポリペプチドと比較した場合、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％である結合親和性でそのコグネイト結合パートナーに結合する。
【００８２】
したがって、一実施形態では、本発明の抗体は、可変（Ｖ）ドメイン及び挿入ポリペプチドを含み、挿入ポリペプチドがＶドメインのフレームワーク３（Ｆｗｋ３）領域内にあり、Ｖドメイン及び挿入ポリペプチドを含む抗体の両方が、挿入ポリペプチドが存在する場合、機能的であり、及び／又は機能性を保持する。そのような実施形態では、本発明の抗体は、足場抗体及び挿入ポリペプチドの両方の機能性を有する。有利には、本発明の抗体は、足場抗体及び挿入ポリペプチドの両方の機能性を同時に機能させることができる。
【００８３】
可変（Ｖ）ドメインを含む抗体は、挿入ポリペプチドがＶドメインのフレームワーク３領域内に存在する場合、機能的である、及び／又は保持性を保持すると考えられ、本発明の抗体は、挿入ポリペプチドが存在しない可変（Ｖ）ドメインを含む抗体の機能のうちの少なくとも１つの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％を示す。挿入ポリペプチドは、Ｖドメインのフレームワーク３領域内に存在する場合、機能的である、及び／又は機能性を保持していると考えられ、挿入ポリペプチドは、それ単独で発現される場合、すなわち抗体に連結されていない場合の遊離ポリペプチドと比較した場合、挿入ポリペプチドの機能のうちの少なくとも１つの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％を示す。
【００８４】
抗体及び／又は挿入ポリペプチドの機能的又は機能性は、例えば、標的結合（例えば抗原結合）、結合親和性、交差反応性、中和、血清中の半減期、細胞表面タンパク質、例えばＴ細胞表面受容体の活性化を含む、前記抗体及び／又は挿入ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を意味する。機能性、例えば標的細胞の結合親和性、中和及び活性化を測定するための方法は当技術分野においては周知であり、例えば、本明細書で提供した実施例に記載した方法を含む。例えば、標準的なアッセイ、例えばスキャッチャード分析、又は表面プラズモン共鳴技術（例えばＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）の使用）を使用して、標的結合（例えば抗原結合）及び結合親和性を決定することができる。
【００８５】
驚いたことに、本発明の抗体のＶドメイン（ＶＬ若しくはＶＨドメイン）は、存在する場合、その対応する又は相補的なＶドメイン（ＶＨ若しくはＶＬ）と依然として機能的結合ドメインを形成することができる。
【００８６】
いくつかの実施形態では、挿入ポリペプチドは、二次抗体又はその結合フラグメントであり得る。そのような実施形態では、挿入ポリペプチドは、上記のような抗体のいずれかの特徴を有することができる。特に、いくつかの実施形態では、挿入ポリペプチドは、ｓｃＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、例えばＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨである。いくつかの実施形態では、挿入ポリペプチドは、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体であり得る。挿入ポリペプチドは、１つ若しくは複数のＣＤＲを含み得るか、又は１つ若しくは複数のＣＤＲからなり得る。例えば、挿入ポリペプチドは、任意選択で連結される、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３及び／若しくはＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３のうちの少なくとも１つを含み得るか、又はそれらからなり得る。
【００８７】
これが二価抗体又は二重特異性抗体として機能することは、当業者には理解されよう。したがって、一態様では、本発明は、２つの異なるエピトープに同時に結合することが可能な、新規の二価抗体フォーマット又は二重特異性抗体フォーマットを提供する。いくつかの態様では、エピトープは、同一抗原上に存在する別個のエピトープである。別の態様では、本発明は、２つの異なる抗原に同時に結合することが可能な新規の二重特異性抗体フォーマットを提供する。
【００８８】
一実施形態では、第１又は第２の抗体又は抗体フラグメントが結合する目的の抗原は、細胞関連タンパク質、例えば、細菌細胞、酵母細胞、Ｔ細胞、内皮細胞又は腫瘍細胞などの細胞上の細胞表面タンパク質であってもよく、又はそれは可溶性タンパク質であってもよい。目的の抗原はまた、任意の医学的に関連するタンパク質、例えば、疾患又は感染中にアップレギュレートされるタンパク質、例えば、受容体及び／又はそれらの対応するリガンドであってもよい。細胞表面タンパク質の特定の例としては、接着分子、例えば、β１インテグリンなどのインテグリン、例えば、ＶＬＡ−４、Ｅ−セレクチン、Ｐセレクチン又はＬ−セレクチン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤｌｌａ、ＣＤｌｌｂ、ＧＤＩＳ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤＷ５２、ＣＤ６９、ＣＤ  １３４（０Ｘ４０）、ＩＣＯＳ、ＢＣＭＰ７、ＣＤ  １３７、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤＣＰ１、ＤＰＣＲ１、ＤＰＣＲ１、ｄｕｄｕｌｉｎ２、ＦＬＪ２０５８４、ＦＬＪ４０７８７、ＨＥＫ２、ＫＩＡＡ０６３４、ＫＩＡＡ０６５９、ＫＩＡＡ１２４６、ＫＩＡＡ１４５５、ＦＴＢＰ２、ＦＴＫ、ＭＡＦ２、ＭＲＰ２、ネクチン様２、ＮＫＣＣ１、ＰＴＫ７、ＲＡＩＧ１、ＴＣＡＭ１、ＳＣ６、ＢＣＭＰ１０１、ＢＣＭＰ８４、ＢＣＭＰ１１、ＤＴＤ、がん胎児抗原（ＣＥＡ）、ヒト乳脂肪グロブリン（ＨＭＦＧ１及び２）、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ抗原、並びにＶＥＧＦ、また適切な場合にはそれらの受容体が挙げられる。可溶性抗原としては、インターロイキン、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１６又はＩＬ−１７、ウイルス抗原、例えば、呼吸器多核体ウイルス抗原又はサイトメガロウイルス抗原、免疫グロブリン、例えばＩｇＥ、インターフェロン、例えばインターフェロンα、インターフェロンβ又はインターフェロンγ、腫瘍壊死因子−α、腫瘍壊死因子−β、コロニー刺激因子、例えばＧ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦ、及び血小板由来増殖因子、例えばＰＤＧＦ−α、ＰＤＧＦ−β、並びに適切な場合にはそれらの受容体が挙げられる。他の抗原としては、細菌細胞表面抗原、細菌毒素、ウイルス、例えばインフルエンザ、ＥＢＶ、Ｈｅｐ  Ａ、Ｂ及びＣ、バイオテロ剤、放射性核種及び重金属、ヘビ毒及びクモ毒及び毒素が挙げられる。
【００８９】
いくつかの実施形態では、足場抗体も挿入ポリペプチドも、ハプテン（４−ヒドロキシ−３−ニトロフェニル）アセチル（ＮＰ）又はハプテン（４−ヒドロキシ−５−ヨード−３−ニトロフェニル）アセチル（ＮＩＰ）に結合しない。いくつかの実施形態では、抗体は、ＢＩ−８マウス抗体とは異なる。
【００９０】
一実施形態では、二次抗体は、抗体のＶドメインとは異なる抗原に結合する。
【００９１】
他の実施形態では、二次抗体は、抗体のＶドメインと同じ抗原に結合する。好ましくは、二次抗体は、抗体のＶドメインと比較して異なるエピトープに結合する。そのような実施形態では、抗体は、二次抗体が存在しない抗体と比較した場合、より大きい結合親和性でそのコグネイト抗原に結合することができる。
【００９２】
一実施形態では、挿入ポリペプチドは、ＩＬ−１７、特にＩＬ−１７Ａに結合する二次抗体である。一実施形態では、挿入ポリペプチドは、ＩＬ−１７ＡＡ、ＩＬ−１７ＡＦ、及びＩＬ−１７ＦＦに結合する二次抗体である。一実施形態では、ＩＬ−１７に結合する二次抗体は、ｓｃＦｖである。一実施形態では、ＩＬ−１７に結合する二次抗体は、ｄｓｓｃＦｖである。一実施形態では、本発明の抗体は、ＨＳＡ及びＩＬ−１７の両方に結合するＦａｂフラグメントであり、特に、Ｖドメインを含む抗体はＨＳＡに結合し、挿入ポリペプチドはＩＬ−１７に結合するｄｓｓｃＦｖである、すなわち、足場抗体はＨＳＡに結合するＦａｂフラグメントであり、足場抗体のＶドメインのＦｗｋ３領域に挿入された二次抗体はＩＬ−１７に結合するｄｓｓｃＦｖである。別の実施形態では、本発明の抗体は、ＨＳＡ及びＩＬ−１７の両方に結合する全ＩｇＧであり、特に、Ｖドメインを含む抗体はＨＳＡに結合し、挿入ポリペプチドはＩＬ−１７に結合するｄｓｓｃＦｖである、すなわち、足場抗体はＨＳＡに結合する完全ＩｇＧであり、足場抗体のＶドメインのＦｗｋ３領域に挿入された二次抗体はＩＬ−１７に結合するｄｓｓｃＦｖである。一実施形態では、本発明の抗体は、それぞれ、配列番号１２９（フレームワーク３に挿入されたＣＡ４９７  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＨｖＬ）を有するＣＡ６４５  Ｆａｂ重鎖）及び配列番号１の重鎖及び軽鎖を含むか、又はそれらを有するＦａｂフラグメント、或いはその機能性、例えばＨＳＡ及び／又はＩＬ−１７への結合を保持しているという条件で、少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８若しくは９９％の類似性又は同一性を有するそれらのいずれかの１つ又は複数のバリアントである。一実施形態では、本発明の抗体は、それぞれ、配列番号１３０（フレームワーク３に挿入されたＣＡ４９７  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＬｖＨ）を有するＣＡ６４５  Ｆａｂ重鎖）及び配列番号１の重鎖及び軽鎖を含むか、又はそれらを有するＦａｂフラグメント、或いはその機能性、例えばＨＳＡ及び／又はＩＬ−１７への結合を保持しているという条件で、少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８若しくは９９％の類似性又は同一性を有するそれらのいずれかの１つ又は複数のバリアントである。一実施形態では、本発明の抗体は、それぞれ、配列番号１３１（フレームワーク３に挿入されたＣＡ４９７  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＨｖＬ）を有するＣＡ６４５  ＩｇＧ４Ｐ重鎖）及び配列番号１の重鎖及び軽鎖を含むか、又はそれらを有する全ＩｇＧ、或いはその機能性、例えばＨＳＡ及び／又はＩＬ−１７への結合を保持しているという条件で、少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８若しくは９９％の類似性又は同一性を有するそれらのいずれかの１つ又は複数のバリアントである。一実施形態では、本発明の抗体は、それぞれ、配列番号１３２（フレームワーク３に挿入されたＣＡ４９７  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＬｖＨ）を有するＣＡ６４５  ＩｇＧ４Ｐ重鎖）及び配列番号１の重鎖及び軽鎖を含むか、又はそれらを有する全ＩｇＧ、或いはその機能性、例えばＨＳＡ及び／又はＩＬ−１７への結合を保持しているという条件で、��なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８若しくは９９％の類似性又は同一性を有するそれらのいずれかの１つ又は複数のバリアントである。
【００９３】
一実施形態では、本発明の抗体は、ＣＤ３及びＣＤ２８の両方に結合する。一実施形態では、本発明の抗体は、ＣＤ３及びＣＤ２８の両方に結合するＦａｂフラグメントであり、特に、Ｖドメインを含む抗体はＣＤ３に結合し、挿入ポリペプチドはＣＤ２８に結合するｄｓｓｃＦｖである、すなわち、足場抗体はＣＤ３に結合するＦａｂフラグメントであり、足場抗体のＶドメインのＦｗｋ３領域に挿入された二次抗体はＣＤ２８に結合するｄｓｓｃＦｖである。一実施形態では、本発明の抗体は、ＣＤ３及びＣＤ２８の両方に結合するＦａｂフラグメントであり、特に、Ｖドメインを含む抗体はＣＤ２８に結合し、挿入ポリペプチドはＣＤ３に結合するｄｓｓｃＦｖである、すなわち、足場抗体はＣＤ２８に結合するＦａｂフラグメントであり、足場抗体のＶドメインのＦｗｋ３領域に挿入された二次抗体はＣＤ３に結合するｄｓｓｃＦｖである。別の実施形態では、本発明の抗体は、ＣＤ３及びＣＤ２８の両方に結合する全ＩｇＧであり、特に、Ｖドメインを含む抗体はＣＤ３に結合し、挿入ポリペプチドはＣＤ２８に結合するｄｓｓｃＦｖである、すなわち、足場抗体はＣＤ３に結合する全ＩｇＧであり、足場抗体のＶドメインのＦｗｋ３領域に挿入された二次抗体はＣＤ２８に結合するｄｓｓｃＦｖである。別の実施形態では、本発明の抗体は、ＣＤ３及びＣＤ２８の両方に結合する全ＩｇＧであり、特に、Ｖドメインを含む抗体はＣＤ２８に結合し、挿入ポリペプチドはＣＤ３に結合するｄｓｓｃＦｖである、すなわち、足場抗体はＣＤ２８に結合する完全ＩｇＧであり、足場抗体のＶドメインのＦｗｋ３領域に挿入された二次抗体はＣＤ３に結合するｄｓｓｃＦｖである。一実施形態では、本発明の抗体は、それぞれ、配列番号１３９（フレームワーク３に挿入された抗ＣＤ３  ｄｓｓｃＦｖを有する抗ＣＤ２８  Ｆａｂ重鎖）及び配列番号１３６の重鎖及び軽鎖を含むか、又はそれらを有するＦａｂフラグメント、或いはその機能性、例えばＣＤ３及び／又はＣＤ２８への結合を保持しているという条件で、少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８若しくは９９％の類似性又は同一性を有するそれらのいずれかの１つ又は複数のバリアントである。別の実施形態では、本発明の抗体は、それぞれ、配列番号１４１（フレームワーク３に挿入された抗ＣＤ３  ｄｓｓｃＦｖを有する抗ＣＤ２８  ＩｇＧ４Ｐ重鎖）及び配列番号１３６の重鎖及び軽鎖を含むか、又はそれらを有する全ＩｇＧ、或いはその機能性、例えばＣＤ３及び／又はＣＤ２８への結合を保持しているという条件で、少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８若しくは９９％の類似性又は同一性を有するそれらのいずれかの１つ又は複数のバリアントである。
【００９４】
本発明において使用するための例示的な配列には、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３及び配列番号１４４が含まれる。本発明のＦａｂフラグメントにおいて使用するための重鎖及び軽鎖の組合せの例には、配列番号５４及び配列番号１、配列番号５６及び配列番号１、配列番号５８及び配列番号１、配列番号６０及び配列番号１、配列番号６１及び配列番号１、配列番号６３及び配列番号１、配列番号６４及び配列番号１、配列番号６６及び配列番号１、配列番号６８及び配列番号１、配列番号７０及び配列番号１、配列番号７３及び配列番号１、配列番号７４及び配列番号１、配列番号７５及び配列番号１、配列番号７６及び配列番号１、配列番号９３及び配列番号１、配列番号９４及び配列番号１、配列番号９５及び配列番号１、配列番号１０１及び配列番号１、配列番号１２９及び配列番号１、配列番号１３０及び配列番号１、配列番号１３９及び配列番号１３６、配列番号１４０及び配列番号１３３が含まれる。本発明の全ＩｇＧにおいて使用するための重鎖及び軽鎖の組合せの例には、配列番号１３１及び配列番号１、配列番号１３２及び配列番号１、配列番号１４１及び配列番号１３６、配列番号１４２及び配列番号１３３が含まれる。
【００９５】
リンカー配列
いくつかの実施形態では、挿入ポリペプチドは、抗体のフレームワーク３領域に直接連結される。本明細書で使用される場合の直接連結されるとは、異種挿入ポリペプチドのＮ末端アミノ酸及びＣ末端アミノ酸が、本発明の抗体のＶドメインのフレームワーク３領域に、ペプチド結合によって連結されるという事実を意味することを意図する。
【００９６】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、リンカー配列をさらに含む。そのような実施形態では、リンカー配列は、好ましくは、抗体及び挿入ポリペプチドの両方に対して異種であり、すなわち、リンカー配列は、通常、天然の抗体配列又は挿入ポリペプチドにその位置で存在しない。
【００９７】
いくつかの実施形態では、リンカー配列は、挿入ポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端をフレームワーク３領域に連結する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、又は３１個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、挿入ポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端をフレームワーク３領域に連結する１〜３１個、又は５〜３１個、又は６〜２８個、又は１０〜２６個、又は１５〜２６個、又は１０〜２１個、又は５〜１０個のアミノ酸を含む。
【００９８】
いくつかの実施形態では、リンカー配列は、挿入ポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端をフレームワーク３領域に連結する最大３０個のアミノ酸を含む。
【００９９】
いくつかの実施形態では、挿入ポリペプチドのＮ末端のリンカーは、挿入ポリペプチドのＣ末端のリンカーと組成及び／又は長さにおいて異なる。いくつかの実施形態では、挿入ポリペプチドのＮ末端のリンカーは、挿入ポリペプチドのＣ末端のリンカーと組成及び／若しくは長さにおいて同一であるか、又は類似している。いくつかの実施形態では、リンカー配列はヒト配列に由来する。いくつかの実施形態では、リンカーはヒトリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカー配列は非ヒト配列に由来する。いくつかの実施形態では、リンカーはウシ配列に由来する。いくつかの実施形態では、リンカーはウシリンカーである。
【０１００】
挿入ポリペプチドをＶドメインのフレームワーク３領域に連結するための適切なリンカー領域の例としては、限定するものではないが、フレキシブルリンカー配列及びリジッドリンカー配列が挙げられる。フレキシブルリンカー配列には、Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８年、ＰＮＡＳ  ８５：５８７９〜５８８３頁；Ｗｒｉｇｈｔ及びＤｅｏｎａｒａｉｎ、  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００７年、４４（１１）：２８６０〜２８６９頁；Ａｌｆｔｈａｎら、Ｐｒｏｔ．  Ｅｎｇ．、１９９５年、８（７）：７２５〜７３１頁；Ｌｕｏら、Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９５年、１１８（４）：８２５〜８３１頁；Ｔａｎｇら、１９９６年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１（２６）：１５６８２〜１５６８６頁；並びにＴｕｒｎｅｒら、１９９７年、ＪＩＭＭ  ２０５、４２〜５４頁において開示されているものが含まれる（代表例については以下の表１を参照されたい）。
【表２−１】
2021530222.tif 000018
【表２−２】
2021530222.tif 000019
【０１０１】
（Ｓ）は、配列１３〜１７においてはオプションである。Ｘは、任意の残基を表す。
【０１０２】
特定の実施形態では、抗体は、配列番号１０６及び１０７のリンカー配列を含む。
【０１０３】
リジッドリンカーの例には、ペプチド配列ＧＡＰＡＰＡＡＰＡＰＡ（配列番号５１）、ＰＰＰＰ（配列番号５２）、ＰＰＰ、ＩＰＦＴＶ（配列番号８２）及びＥＹＨＧＬＱ（配列番号１０４）が含まれる。さらなる例には、ウシ抗体のＣＤＲＨ３の伸長されたｓｔａｌｋ由来の配列（Ｗａｎｇら、Ｃｅｌｌ、２０１３年、１５３：１３７９〜１３９３頁）が含まれる；好ましい配列には、長鎖リンカー配列、例えば、ＴＳＶＨＱＥＴＫＫＹＱＳ（配列番号９６）及びＳＹＴＹＮＹＥＷＨＶＤＶ（配列番号９７）（ウシＣＤＨ３  ｓｔａｌｋ由来の溶媒曝露残基及び埋没残基の両方を含む）；並びに短鎖リンカー配列、例えば、ＥＴＫＫＹＱＳ（配列番号９８）及びＳＹＴＹＮＹＥ（配列番号９９）（ウシＣＤＨ３  ｓｔａｌｋ由来の溶媒曝露残基のみを含む）が含まれる。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のリンカー配列のいずれかのバリアント、例えば、元のリンカー配列に対して１、２、３、４個又はそれ以上のアミノ酸残基が置換、挿入、又は除去されているバリアントを使用することができる。リンカー配列のバリアントはまた、リンカー配列がリンカー配列を繰り返すことにより伸長される反復バリアントも含むことができる。一実施形態では、繰り返される好ましいリンカー配列は、モチーフ（ＧｍＳ）ｎにつながる配列番号１３であり、式中、ｍは４であり、ｎは任意の整数（例えば、１、２又は３）であり得る。他の実施形態では、ｍは、１〜１０の異なる整数であり得る。
【０１０５】
挿入ポリペプチドが直接的に又はリンカー配列を介して連結されているか否かにかかわらず、いくつかの実施形態では、フレームワーク３領域内の１個又は複数のアミノ酸は、ポリペプチド挿入の連結の結果として欠失され得る。いくつかの実施形態では、挿入ポリペプチドは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムによれば、ＶＨドメインのアミノ酸残基７３と７５との間にあり、７４位のアミノ酸が欠失される。
【０１０６】
医薬組成物及び使用方法
本発明の抗体及び本明細書に記載されているような抗体は、炎症性疾患及び炎症性障害、免疫疾患及び免疫障害、線維性障害、並びにがんを含む疾患又は障害の処置において有用である。
【０１０７】
用語「炎症性疾患」又は「炎症性障害」及び「免疫疾患又は免疫障害」は、関節リウマチ、乾癬性関節炎、スチル病、マックルウェルズ病、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎、ＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）、喘息、アレルギー性鼻、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、血管炎、Ｉ型糖尿病、移植及び移植片対宿主疾患を含む。
【０１０８】
用語「線維性障害」は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、全身性硬化症（又は強皮症）、腎線維症、糖尿病性腎症、ＩｇＡ腎症、高血圧、末期腎疾患、腹膜線維症（持続性携帯型腹膜透析）、肝硬変、加齢性黄斑変性症（ＡＲＭＤ）、網膜症、反応性心筋線維症、瘢痕、ケロイド、火傷、皮膚潰瘍、血管形成術、冠状脈バイパス術、関節形成術及び白内障術を含む。
【０１０９】
用語「がん」は、皮膚で発見される、又はより一般的には、体内臓器、例えば、乳房、卵巣、前立腺、肺、腎臓、膵臓、胃、膀胱、又は腸の内壁で発見される、上皮から生じる悪性の新たな増殖を含む。がんは隣接する組織内に浸潤し、離れた臓器、例えば、骨、肝臓、肺、又は脳に広がる（転移する）傾向がある。
【０１１０】
したがって、本発明のさらなる態様によれば、１つ又は複数の薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を伴って本発明の抗体を含む医薬組成物が提供される。
【０１１１】
また、疾患又は障害の治療用医薬を製造するための本発明の抗体の使用も提供される。最も好ましくは、疾患又は障害は、炎症性疾患又は炎症性障害である。
【０１１２】
本発明による医薬組成物は、例えば、非経口投与、皮下投与、又は眼内投与に適した剤形をとることができる。適切な場合、例えば、抗体がそのＶドメインを介してアルブミンに結合する場合、当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して、本発明の抗体をヒト又は組換えの血清アルブミンと予め製剤化することが望ましいことがある。
【０１１３】
医薬製剤が液体、例えば、溶液又は懸濁液である場合、製剤は、アルブミン、例えばヒト血清アルブミン、特に組換えアルブミン、例えば組換えヒト血清アルブミンをさらに含むことができる。適切な量は、全製剤の２％ｗ／ｗ未満、特に１、０．５、又は０．１％ｗ／ｗ未満の範囲であり得る。これは、製剤中の抗体成分の安定化を促進し得る。医薬組成物は、水性溶媒を用いて、後で復元するために凍結乾燥することができる。一実施形態では、本発明による凍結乾燥抗体を含む単位用量容器、例えばバイアルが提供される。
【０１１４】
本発明の抗体は、注射による、例えば、ボーラス注射又は注入による非経口投与用に製剤化することができる。注射用製剤は単位剤形で、例えば、ガラス製アンプル又は複数回投与用容器、例えばガラス製バイアル内で提示することができる。注射用組成物は、油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又は乳濁液などの剤形をとることができ、また懸濁剤、安定化剤、保存剤及び／又は分散剤などの処方剤を含有することができる。或いは、有効成分は、使用前に、適切なビヒクル、例えば滅菌発熱性物質除去蒸留水で構成するための粉末剤形であってもよい。
【０１１５】
組成物は、所望する場合、有効成分を含む１つ若しくは複数の単位用量剤形を含有し得るパック又はディスペンサーデバイス内で提示され得る。パック又はディスペンシングデバイスには、投与の説明書が添付されていてもよい。
【０１１６】
本発明の抗体フォーマットは、溶媒中に、例えば、溶液又は懸濁液の剤形で分散させて送達することができる。これは、適切な生理学的溶液、例えば、生理食塩水又は他の薬学的に許容される溶媒又は緩衝液に懸濁することができる。当技術分野で公知の緩衝液は、約４．０〜５．０のｐＨを達成するように、水１ｍｌ当たり０．０５ｍｇ〜０．１５ｍｇのエデト酸二ナトリウム、８．０ｍｇ〜９．０ｍｇのＮａＣｌ、０．１５ｍｇ〜０．２５ｍｇのポリソルベート、０．２５ｍｇ〜０．３０ｍｇの無水クエン酸、及び０．４５ｍｇ〜０．５５ｍｇのクエン酸ナトリウムを含有することができる。懸濁液は、例えば、凍結乾燥した抗体を使用することができる。
【０１１７】
治療用懸濁液又は溶液製剤はまた、１つ又は複数の賦形剤も含有することができる。賦形剤は当技術分野においては周知であり、緩衝液（例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液及び重炭酸塩緩衝液）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、並びにグリセロールが挙げられる。溶液又は懸濁液は、リポソーム又は生分解性ミクロスフェアにカプセル化することができる。製剤は、一般に、滅菌製造プロセスを使用する実質的に滅菌された剤形で提供される。
【０１１８】
これには、製剤に使用される緩衝溶媒／溶液の濾過による製造及び滅菌、滅菌緩衝溶媒溶液中の抗体の無菌的懸濁、及び当技術分野の通常の技術者が精通している方法による製剤の滅菌容器内への分注が含まれ得る。
【０１１９】
特定の状態の予防又は処置に必要な本発明の抗体の量は、抗体及び処置しようとする状態に応じて変わる。しかし、一般には、１日用量は、体重１ｋｇ当たり約１０ｎｇ〜１０００ｍｇ、１００ｎｇ〜１００ｍｇ、又は０．１ｍｇ〜１０ｍｇの範囲であり得る。
【０１２０】
本発明はまた、遺伝子治療によって、特にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターによって、本明細書に記載の抗体を送達するための方法及び組成物を提供する。
【０１２１】
したがって、本発明は、ウイルスキャプシドを有するウイルスベクターと、末端逆位反復配列（ＩＴＲ）に隣接する発現カセットを含む人工ゲノムとを含む医薬組成物であって、発現カセットが本明細書に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含む、上記医薬組成物を提供する。ＩＴＲ配列は、本明細書に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド配列を含む人工ゲノムを、ウイルスベクターのビリオンにパッケージングするために使用することができる。
【０１２２】
発現カセット内の導入遺伝子は、発現調節エレメントに、例えば、ヒト細胞における導入遺伝子の発現を調節するプロモーターに作動可能に連結されている。
【０１２３】
ウイルスベクターは、好ましくは、ＡＡＶベースのウイルスベクターである。様々なＡＡＶキャプシドが当技術分野で開示されている。またＡＡＶベクターを作製する方法も文献に広く開示されている（例えば、ＷＯ２００３／０４２３９７；ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９；米国特許第７，５８８，７７２  Ｂ２号）。ＡＡＶキャプシドの供給源は、所望の組織を標的とするＡＡＶから選択することができる。例えば、適切なＡＡＶには、例えば、ＡＡＶ９（米国特許第７，９０６，１１１号；米国特許出願公開第２０１１−０２３６３５３−Ａ１号）、ｒｈ１０（ＷＯ２００３／０４２３９７）及び／又はｈｕ３７（米国特許第７，９０６，１１１  Ｂ２号；米国特許出願公開第２０１１０２３６３５３号）が含まれ得る。しかし、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ−ＴＴ、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８及びＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ（又はそれらのバリアント）並びにその他を含む他のＡＡＶもまた選択することができる。
【０１２４】
対象への送達に適したＡＡＶウイルスベクターを作製並びに単離する方法は、当技術分野で公知である（米国特許第７，７９０，４４９  Ｂ２号；米国特許第７，２８２，１９９  Ｂ２号；ＷＯ２００３／０４２３９７；ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９；及び米国特許第７，５８８，７７２  Ｂ２号）。
【０１２５】
本発明によるウイルスキャプシドを有するウイルスベクターと人工ゲノムとを含む医薬組成物は、重鎖及び軽鎖の両方が確実に発現されるように設計される。本発明による抗体の重鎖及び軽鎖のポリヌクレオチド配列は、単一構築物で操作され、例えば、切断可能なリンカー又は内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）エレメントによって分離させることができ、それによって、重鎖及び軽鎖は別々に発現される。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、自己切断型フューリン／Ｆ２Ａリンカーである（Ｆａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３：５８４〜５９０頁、２００５年、及びＦａｎｇら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １５：１１５３〜９頁、２００７年）。例えば、フューリン／Ｆ２Ａリンカーを発現カセット内に組み込み、重鎖及び軽鎖のポリヌクレオチドコード配列を分離することができる。
【０１２６】
いくつかの他の実施形態では、本発明による抗体の重鎖及び軽鎖のポリヌクレオチド配列は、切断不可能なフレキシブルリンカーを介して接続されている。いくつかの実施形態では、そのようなリンカーは、フレキシブルペプチドリンカー、例えばｓｃＦｖ（これにはＧｌｙ及びＳｅｒが含まれる）をコードするものであってもよく、それにより重鎖ドメイン並びに軽鎖ドメインは、互いに対して自由に動く。
【０１２７】
本発明をここで以下の実施例を参照して説明するが、これらは単なる例示であり、本発明の範囲を限定するものとして決して解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１２８】
一般的な方法
フレームワーク３の挿入
３つのＣＤＲループに加えて、従来型及び単鎖ラクダ科動物ＶＨＨ両方の抗体の軽鎖及び重鎖は、フレームワーク３によって形成される第４のループを有する（図１Ａ）。Ｋａｂａｔナンバリングシステムは、フレームワーク３を重鎖の６６〜９４位及び軽鎖の５７〜８８位として定義する。
【０１２９】
遺伝子設計及び一過性細胞発現
フレームワーク３が挿入されたバリアントを含む、軽鎖及び重鎖のＶ領域をコードする遺伝子は、自動合成方法（ＡＴＵＭ）により設計及び構築した。ヒトＣκ領域（Ｋｍ３アロタイプ）及び重鎖γ１  ＣＨ１領域をそれぞれコードするＤＮＡを含有する発現ベクターに遺伝子をクローニングした。次いで、重鎖及び軽鎖発現ベクターをＨＥＫ２９３細胞にコトランスフェクトし、ＳＰＲ結合アッセイを使用して、組換え抗体／Ｆａｂ融合タンパク質分子をスクリーニングした。
以下の実施例に記載のＣＡ６４５  Ｆａｂ融合タンパク質の軽Ｖ領域又は軽鎖は、それぞれ、配列番号２（ＣＡ６４５  ＶＬドメイン（ｇＬ５））若しくは配列番号１（ＣＡ６４５軽鎖ｇＬ５）を含んでいたか、又はそれらを有していた。代替の軽鎖又は軽Ｖ領域、例えば、配列番号１０８又は配列番号１０９のＶＬドメインを含む軽Ｖ領域を使用することができる。
【０１３０】
表面プラズモン共鳴による抗体／Ｆａｂ融合タンパク質結合能力の決定
すべての表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ＥＤＴＡ  ２ｍＭ、及び０．００５％（ｖ／ｖ）Ｐ２０（ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液）を含有するｐＨ７．４のランニング緩衝液を使用し、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００システムで２５℃にて実施した。
【０１３１】
ポリクローナルヤギＦ（ａｂ）２フラグメント抗ヒトＦ（ａｂ）２（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ製品  コード番号１０９−００６−０９７）を、アミンカップリングによってＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の表面に固定化した。簡潔に説明すると、カルボキシメチルデキストラン表面を、５０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシミド及び２００ｍＭの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドの新たな１：１（ｖ／ｖ）混合物を用いて、１０μＬ／分の流速で５分間、活性化した。１０ｍＭ酢酸ｐＨ５．０緩衝液中の抗ヒトＦ（ａｂ）２を、同じ流速で１０分間パルスにて、５０μｇ／ｍＬでチップに共有結合させた。最後に、表面を、１Ｍのエタノールアミン．ＨＣｌ  ｐＨ８．５の１０分間パルスで失活させた。参照のフローセルは、上記の手順からタンパク質を省くことによりチップ上で調製した。
【０１３２】
Ｆａｂ−ループ挿入構築物を含む上清、野生型Ｆａｂを含む上清、又は対照の上清を、それぞれのリガンド又は受容体の結合について試験する前に、ＨＰＳ−ＥＰ緩衝液で５分の１に希釈した。
【０１３３】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）はＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ（カタログ番号００９−０００−０５１）から提供され、これをＨＢＳ−ＥＰ緩衝液で１０００ｎＭに希釈した。以下のサイトカイン及び受容体は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌｔｄ．から入手した：ＩＬ−１５、ＩＬ−１５−Ｒα−ｈＦｃ、ＩＬ−２、ＩＬ−２−ｓＲβ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ−Ｒα、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ−Ｒα、ＥＰＯ、ＥＰＯ−Ｒ、ＩＬ−６、ＬＲＰ４（ｅｃｄ）−ｈＦｃ、ＬＲＰ６（ｅｃｄ）−ｈＦｃ、リゾチーム、ＫＬＫ５。これらのタンパク質を、典型的には、１００μｇ／ｍＬで復元し、−２０℃で保存した。実験目的において、それらをＨＢＳ−ＥＰ緩衝液で、典型的には５０、１００、又は２００ｎＭに新たに希釈した。
【０１３４】
典型的なＳＰＲサイクルには、ランニング緩衝液としてのＨＢＳ−ＥＰを用いた１０μＬ／分の流速が含まれ、希釈した上清を１分間注入して抗体／Ｆａｂ融合タンパク質を捕捉させた。この後、希釈したコグネイトリガンド又は受容体又は緩衝液対照の３０μｌを注入した。続いて解離段階を少なくとも３分間モニターした。いくつかの実験では、抗体部分の関連コグネイト抗原の３０μＬ追加注入が含まれており、ＣＡ６４５  Ｆａｂを抗体ポリペプチド部分として使用する融合タンパク質構築物の場合にはＨＳＡが含まれていた。いくつかの実験では、コグネイト受容体／リガンド（抗体／Ｆａｂ融合タンパク質の挿入部分）が２倍モル過剰のその結合パートナーと予混合された、特異性対照サイクルが含まれていた。各サイクルは、５ｍＭ  ＮａＯＨの５μＬ注入を間に挟んだ、４０ｍＭ  ＨＣｌの２回の１０μＬ注入を含む再生ステップで終了させた。
【０１３５】
レポートポイントは、融合タンパク質構築物の捕捉を測定するための上清及びリガンド／受容体注入１０秒前と、コグネイトリガンド／受容体の結合を評価するためのリガンド／受容体注入の終了５秒前及び１５秒後に収集した。収集されたレポートポイント及びセンサーグラムのデータは、ポリクローナル捕捉フローセルと参照フローセルの間のレゾナンスユニット（ＲＵ）の差を示した。
【０１３６】
レポートポイント及びセンサーグラムのデータには、融合タンパク質構築物の捕捉表面からのあらゆる緩慢な解離に対処するため、リガンド／受容体サイクルからそれぞれの対照サイクルを減算することにより処理を行った。すべての実験において、それぞれの野生型Ｆａｂ上清を、リガンド／受容体のすべての非特異的結合をチェックする目的で含めた。有意な場合、上記からこれを減算した。
【０１３７】
解離定数（ＫＤ）が推定された例では、流量を３０μＬ／分に増加することにより、上記の方法を変更した。Ｆａｂ構築物が捕捉された後、９０μｌのコグネイトリガンド又は緩衝液対照が注入され、その後１８０秒の解離段階が続いた。ある範囲の濃度（０．１、０．２、０．５、１、２、５、及び１０ｎＭ）に対するリガンド結合を試験した。ゼロリガンドセンサーグラムの減算によってドリフトについて、及び野生型Ｆａｂ補正センサーグラムの減算によって非特異的相互作用について、センサーグラムを補正した。親和性定数は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン４．１．１）のＬａｎｇｍｕｉｒモデルを使用して、補正したセンサーグラムに適合された個別の解離及び会合の速度定数から算出した。
【０１３８】
（例１）
ＩＬ−１５挿入ポリペプチドを有するＣＡ６４５  Ｆａｂ
インターロイキン１５（ＩＬ−１５）は免疫応答において役割を果たすサイトカインであり、Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖を促進するように機能する。それは構造的にＩＬ−２と類似しており、その受容体はＩＬ−２受容体と共通の鎖を共有する。
【０１３９】
上記の方法に従って、融合タンパク質を生成及び発現させ、以下に示すように、ヒトＩＬ−１５配列をＣＡ６４５  Ｆａｂ構築物のフレームワーク３領域に挿入した。
【０１４０】
ヒトＩＬ−１５配列：
【数１５】
2021530222.tif 000020
【０１４１】
フレームワーク３、下線のリンカーに挿入されたヒトＩＬ−１５（太字及びイタリック体）を有するＣＡ６４５  Ｆａｂ重鎖：
【数１６】
2021530222.tif 000021
【０１４２】
図２Ａは、１００ｎＭのＩＬ−２−Ｒβ、ＩＬ−１５−Ｒα（これらは両方ともＩＬ−１５の結合パートナーである）及び１０００ｎＭのＨＳＡ（ＣＡ６４５のリガンド）で試験した場合のこのＣＡ６４５／ＩＬ−１５抗体融合タンパク質についての結合能力のＢｉａｃｏｒｅ分析を示す。図２Ａで明らかにわかるように、結合が３つのリガンドのすべてに対して見られ、このことは、フレームワーク３領域のＣＡ６４５  Ｆａｂ部分とＩＬ−１５グラフトの両方において機能性が保持されていることを示唆している。図２Ｂは、ＣＡ６４５／ＩＬ−１５Ｆｗｋ３タンパク質のモデリングされた描写を示す。
【０１４３】
（例２）
ＩＬ−２挿入ポリペプチドを有するＣＡ６４５  Ｆａｂ
インターロイキン２（ＩＬ−２）は、活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞によって主に産生される多能性サイトカインであり、正常な免疫応答の生成において重要な役割を果たす。ＩＬ−２は、活性化Ｔリンパ球の増殖及び拡大を促進し、Ｂ細胞の成長を強化し、単球及びナチュラルキラー細胞を活性化する。
【０１４４】
融合タンパク質を上記の方法に従って生成及び発現させ、以下に示すように、ヒトＩＬ−２配列をＣＡ６４５  Ｆａｂ構築物のフレームワーク３領域に挿入した。
【０１４５】
ヒトＩＬ−２配列：
【数１７】
2021530222.tif 000022
【０１４６】
フレームワーク３、下線のリンカーに挿入されたヒトＩＬ−２（太字及びイタリック体）を有するＣＡ６４５  Ｆａｂ重鎖：
【数１８】
2021530222.tif 000023
【０１４７】
図３Ａは、２００ｎＭのＩＬ−１５（競合リガンド）との事前インキュベーションのある場合及び無い場合の、１００ｎＭのＩＬ−２−Ｒβ（ＩＬ−２の結合パートナー）で試験した場合のこのＣＡ６４５／ＩＬ−２抗体融合タンパク質の結合能力についてのＢｉａｃｏｒｅ分析を示す。図３Ａに示すように、ＩＬ−２−Ｒβに対して見られる結合は、モル過剰の競合リガンドの存在下で消失したが、このことは、融合タンパク質のフレームワーク３内のＩＬ−２部分に対して見られる結合が真の機能的相互作用であり、非特異的でないことを示唆している。図３Ｂは、ＣＡ６４５／ＩＬ−２Ｆｗｋ３タンパク質のモデリングされた描写を示す。
【０１４８】
（例３）
Ｇ−ＣＳＦ挿入ポリペプチドを有するＣＡ６４５  Ｆａｂ
顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は、骨髄由来の成熟顆粒球の産生を刺激するように作用する、様々な異なる細胞タイプ（例えば、内皮、マクロファージ）によって産生されるサイトカインである。
【０１４９】
融合タンパク質を上記の方法に従って生成及び発現させ、以下に示すように、ヒトＧ−ＣＳＦ配列をＣＡ６４５  Ｆａｂ構築物のフレームワーク３領域に挿入した。
【０１５０】
ヒトＧ−ＣＳＦ配列：
【数１９】
2021530222.tif 000024
【０１５１】
フレームワーク３、下線のＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーに挿入されたヒトＧ−ＣＳＦ（太字及びイタリック体）を有するＣＡ６４５  Ｆａｂ重鎖：
【数２０】
2021530222.tif 000025
【０１５２】
図４Ａは、１００ｎＭのＧ−ＣＳＦ−Ｒα（Ｇ−ＣＳＦの結合パートナー）、１０００ｎＭのＨＳＡ（ＣＡ６４５のリガンド）、及びＧ−ＣＳＦ−ＲαとＨＳＡの両方で試験した場合のこのＣＡ６４５／Ｇ−ＣＳＦ抗体融合タンパク質の結合能力についてのＢｉａｃｏｒｅ分析を示す。図４Ａは、他の実施例との一致を示し、融合タンパク質のＧ−ＣＳＦ部分とＦａｂ部分の両方が機能的に活性であり、それらのそれぞれの結合パートナーに結合することが可能であることを示す。図４Ａは、両方の結合パートナーの存在下で、ＳＰＲトレースで認められたシグナルが、単一バインダートレースで認められたものについて相加的であることをさらに示しており、このことは、両方の機能性部分への結合が同時に生じる可能性があることを示唆している。図４Ｂは、ＣＡ６４５／Ｇ−ＣＳＦＦｗｋ３タンパク質のモデリングされた描写を示す。
【０１５３】
（例４）
ＧＭ−ＣＳＦ挿入ポリペプチドを有するＣＡ６４５  Ｆａｂ
ＧＭ−ＣＳＦは、幹細胞を刺激し、顆粒球（好中球、好酸球及び好塩基球）並びに単球を産生するサイトカインである。
【０１５４】
融合タンパク質を上記の方法に従って生成及び発現させ、以下に示すように、ヒト及びマウスのＧＭ−ＣＳＦ配列をＣＡ６４５  Ｆａｂ構築物のフレームワーク３領域に挿入した。
【０１５５】
ヒトＧＭ−ＣＳＦ（ｈＧＭ−ＣＳＦ）配列：
【数２１】
2021530222.tif 000026
【０１５６】
フレームワーク３、下線のＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーに挿入されたヒトＧＭ−ＣＳＦ（太字及びイタリック体）を有するＣＡ６４５  Ｆａｂ重鎖：
【数２２】
2021530222.tif 000027
【０１５７】
ＣＨ１のＣ末端、下線のＧｌｙ−ＳｅｒリンカーにヒトＧＭ−ＣＳＦ（太字及びイタリック体）を有するＣＡ６４５  Ｆａｂ重鎖（比較目的のため）：
【数２３】
2021530222.tif 000028
【０１５８】
マウスＧＭ−ＣＳＦ（ｍＧＭ−ＣＳＦ）配列：
【数２４】
2021530222.tif 000029
【０１５９】
フレームワーク３、下線のＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーに挿入されたマウスＧＭ−ＣＳＦ（太字及びイタリック体）を有するＣＡ６４５  Ｆａｂ重鎖：
【数２５】
2021530222.tif 000030
【０１６０】
ＣＨ１のＣ末端、下線のＧｌｙ−ＳｅｒリンカーにマウスＧＭ−ＣＳＦ（太字及びイタリック体）を有するＣＡ６４５  Ｆａｂ重鎖（比較目的のため）：
【数２６】
2021530222.tif 000031
【０１６１】
図５Ａ及び図６は、コグネイトＧＭ−ＣＳＦ受容体を（１００ｎＭで）用いて試験した場合のＣＡ６４５／ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体融合タンパク質及びＣＡ６４５／ｍＧＭ−ＣＳＦ抗体融合タンパク質の結合能力についてのＢｉａｃｏｒｅ分析を（それぞれ）示す。結果は、ＧＭ−ＣＳＦ受容体への結合が特異的であり、挿入ポリペプチドの存在に依存していることを実証している。これらの図はまた、ＧＭ−ＣＳＦペプチドの定常ドメイン（ＣＨ１）融合の個別のトレースも示しているが、これはこのフレームワーク３挿入が同等の様式で機能することを示唆している。図５Ｂは、ＣＡ６４５／ＧＭ−ＣＳＦＦｗｋ３タンパク質のモデリングされた描写を示す。
【０１６２】
（例５）
ＥＰＯ挿入ポリペプチドを有するＣＡ６４５  Ｆａｂ
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、骨髄における赤血球産生を刺激する、細胞低酸素症に応答して腎臓により放出されるサイトカインである。
【０１６３】
融合タンパク質を上記の方法に従って生成及び発現させ、以下に示すように、ヒトＥＰＯ配列をＣＡ６４５  Ｆａｂ構築物のフレームワーク３領域に挿入した。
【０１６４】
ヒトＥＰＯ配列：
【数２７】
2021530222.tif 000032
【０１６５】
フレームワーク３、下線のＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーに挿入されたヒトＥＰＯ（太字及びイタリック体）を有するＣＡ６４５  Ｆａｂ重鎖：
【数２８】
2021530222.tif 000033
【０１６６】
図７Ａは、５００ｎＭの可溶性ＥＰＯ（競合リガンド）との事前インキュベーションのある場合及び無い場合の、５０ｎＭのＥＰＯ−Ｒ（ＥＰＯの結合パートナー）で試験した場合のこのＣＡ６４５／ＥＰＯ抗体融合タンパク質の結合能力についてのＢｉａｃｏｒｅ分析を示す。図７Ａは、他の実施例との一致を示し、融合タンパク質のＥＰＯ部分が機能的に活性であり、そのコグネイト受容体に結合することができることを示す。さらに、ＥＰＯの事前インキュベーションで見られるシグナルの減少は相互作用の特異性を示しており、一方、未修飾ＣＡ６４５  Ｆａｂは、見られた結合がＥＰＯグラフトに由来していることを実証するさらなる対照としての役割を果たしている。図７Ｂは、ＣＡ６４５／ＥＰＯＦｗｋ３タンパク質のモデリングされた描写を示す。
【０１６７】
（例６）
ＣＡ６４５  ＦａｂをＶＨＨ６挿入物と共に有する抗体／Ｆａｂ融合タンパク質
ＶＨＨ６は、ＩＬ−６：ｇｐ８０複合体に結合することができるが、個々の成分単独には結合することができないという点において接合部エピトープに結合する、操作された単一ドメイン重鎖ラクダ抗体である。
【０１６８】
融合タンパク質を上記の方法に従って生成及び発現させ、以下に示すように、ＶＨＨ６配列をＣＡ６４５  Ｆａｂ構築物のフレームワーク３領域に挿入した。
【０１６９】
ラクダＶＨＨ６配列：
【数２９】
2021530222.tif 000034
【０１７０】
フレームワーク３、下線のＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーに挿入されたＶＨＨ６（太字及びイタリック体）を有するＣＡ６４５  Ｆａｂ重鎖：
【数３０】
2021530222.tif 000035
【０１７１】
図８Ａは、１００ｎＭのＩＬ−６（ＶＨＨ６は単独で複合体に結合するのでＶＨＨ６の陰性対照）、１００ｎＭのＩＬ−６／ｇｐ８０融合体（ＶＨＨ６の結合パートナー）、１０００ｎＭのＨＳＡ（ＣＡ６４５の結合パートナー）、及びＩＬ−６融合体とＨＳＡの両方で試験した場合のこのＣＡ６４５／ＶＨＨ６抗体融合タンパク質の結合能力についてのＢｉａｃｏｒｅ分析を示す。図８Ａは、他の実施例との一致を示し、抗体融合タンパク質のＶＨＨ６部分とＣＡ６４５部分の両方が結合フラグメントとして機能的に活性であり、それらのそれぞれの結合パートナーに結合することができることを示す。図８Ａは、両方の結合パートナーの存在下で、ＳＰＲトレースで認められたシグナルが単一バインダートレースで認められたものについて相加的であることをさらに示しており、これは両方の機能性部分への結合が同時に生じる可能性があることを示唆している。図８Ｂは、ＣＡ６４５／ＶＨＨ６Ｆｗｋ３タンパク質のモデリングされた描写を示す。
【０１７２】
（例７）
ＣＡ６４５  ＦａｂをＶＨＨ１５挿入物と共に有する抗体／Ｆａｂ融合タンパク質
ＶＨＨ１５は、ＩＬ−６を認識して結合する、操作された単一ドメイン重鎖ラクダ抗体である。
【０１７３】
融合タンパク質を上記の方法に従って生成及び発現させ、以下に示すように、ＶＨＨ１５配列をＣＡ６４５  Ｆａｂ構築物のフレームワーク３領域に挿入した。
【０１７４】
ラクダＶＨＨ１５配列：
【数３１】
2021530222.tif 000036
【０１７５】
フレームワーク３、下線のＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーに挿入された、ＶＨＨ１５、抗ＩＬ−６ラクダドメイン抗体（太字及びイタリック体）を有するＣＡ６４５  Ｆａｂ重鎖：
【数３２】
2021530222.tif 000037
【０１７６】
図９Ａは、１００ｎＭのＩＬ−６（ＶＨＨ１５のリガンド）、１０００ｎＭのＨＳＡ（ＣＡ６４５のリガンド）、及びＩＬ−６とＨＳＡの両方で試験した場合の、このＣＡ６４５／ＶＨＨ１５抗体融合タンパク質の結合能力についてのＢｉａｃｏｒｅ分析を示す。図９Ａは、他の実施例との一致を示し、抗体融合タンパク質のＶＨＨ１５部分とＦａｂ部分の両方が結合フラグメントとして機能的に活性であり、それらのそれぞれの結合パートナーに結合することができることを示す。図９Ａは、両方の結合パートナーの存在下で、ＳＰＲトレースで認められたシグナルが、単一バインダートレースで認められたものについて相加的であることをさらに示しており、これは両方の機能性部分への結合が同時に生じる可能性があることを示唆している。図９Ｂは、ＣＡ６４５／ＶＨＨ１５Ｆｗｋ３タンパク質のモデリングされた描写を示す。
【０１７７】
（例８）
スクレロスチン挿入ポリペプチドを有するＣＡ６４５  Ｆａｂ
スクレロスチンはヒトのＳＯＳＴ遺伝子産物であり、骨形成のプロセスに関与しており、主として骨細胞で発現されている。スクレロスチンは、Ｗｎｔシグナル伝達経路の調節タンパク質として、ＬＲＰ型共受容体への結合を介して機能する。
【０１７８】
融合タンパク質を上記の方法に従って生成及び発現させ、以下に示すように、コア又は全スクレロスチン配列をＣＡ６４５  Ｆａｂ構築物のフレームワーク３領域に挿入した。
【０１７９】
ヒト成熟完全長スクレロスチン配列：
【数３３】
2021530222.tif 000038
【０１８０】
ヒトスクレロスチンのコアドメインの配列：
【数３４】
2021530222.tif 000039
【０１８１】
フレームワーク３、下線の単一Ｓリンカーに挿入されたヒトスクレロスチンのコアドメイン（太字及びイタリック体）を有するＣＡ６４５  Ｆａｂ重鎖：
【数３５】
2021530222.tif 000040
【０１８２】
フレームワーク３、下線のＧｌｙ−Ｓｅｒ（２Ｘ  Ｇ４Ｓ）リンカーに挿入されたヒトスクレロスチンのコアドメイン（太字及びイタリック体）を有するＣＡ６４５  Ｆａｂ重鎖：
【数３６】
2021530222.tif 000041
【０１８３】
フレームワーク３、下線のリジッドリンカーに挿入されたヒトスクレロスチンのコアドメイン（太字及びイタリック体）を有するＣＡ６４５  Ｆａｂ重鎖：
【数３７】
2021530222.tif 000042
【０１８４】
フレームワーク３、下線のＧｌｙ−Ｓｅｒ（１Ｘ  Ｇ４Ｓ）リンカーに挿入されたヒト成熟完全長スクレロスチン（太字及びイタリック体）を有するＣＡ６４５  Ｆａｂ重鎖：
【数３８】
2021530222.tif 000043
【０１８５】
図１０Ａ及び図１１は、ＬＲＰ６及びＬＲＰ４（スクレロスチンの結合パートナー）をそれぞれ固定化細胞外ドメインに結合させるための５分の１希釈上清として試験した場合における、このＣＡ６４５／スクレロスチン抗体融合タンパク質の能力についてのＢｉａｃｏｒｅ分析を示す。この実験ではまた、様々なリンカー領域構築物の影響についても調べた。試験した構築物のすべてがＬＲＰ６及びＬＲＰ４への結合を示したことが認められた。図１０Ｂは、ＣＡ６４５／スクレロスチンコア−Ｆｗｋ３タンパク質のモデリングされた描写を示す。
【０１８６】
（例９）
ＩＬ−１０挿入ポリペプチド（ＩＬ−１０二量体）を有するＣＡ６４５  Ｆａｂ
ヒトサイトカイン合成阻害因子（ＣＳＩＦ）としても知られているインターロイキン１０（ＩＬ−１０）は、抗炎症性サイトカインである。これは一般的にホモ二量体として機能する。
【０１８７】
融合タンパク質を上記の方法に従って生成及び発現させ、以下に示すように、２つのヒトＩＬ−１０配列をＣＡ６４５  Ｆａｂ構築物のフレームワーク３領域に挿入した。
【０１８８】
ヒトＩＬ−１０単量体配列：
【数３９】
2021530222.tif 000044
【０１８９】
フレームワーク３、下線のリンカーに挿入された２つのヒトＩＬ−１０（太字及びイタリック体）単量体を有するＣＡ６４５  Ｆａｂ重鎖：
【数４０】
2021530222.tif 000045
【０１９０】
図１２Ａは、２００ｎＭのＩＬ−１０（競合リガンド）との事前インキュベーションのある場合及び無い場合の、１００ｎＭのＩＬ−１０受容体（ＩＬ−１０の結合パートナー）で試験した場合におけるこのＣＡ６４５／ＩＬ−１０抗体融合タンパク質の結合能力についてのＢｉａｃｏｒｅ分析を示す。図１２Ａに示すように、ＩＬ−１０受容体に見られる結合は、モル過剰の競合リガンドの存在下では消失したが、このことは融合タンパク質のフレームワーク３のＩＬ−１０部分に見られる結合が真の機能性相互作用であり、非特異的でないことを示唆している。この結果はまた、挿入されたＩＬ−１０単量体がフレームワーク３構築物内で機能的二量体を形成可能であることも示唆している。図１２Ｂは、ＣＡ６４５／ＩＬ−１０Ｆｗｋ３タンパク質のモデリングされた描写を示す。
【０１９１】
（例１０）
他のＦａｂを有する抗体−フレームワーク３挿入構築物
融合タンパク質を上記の方法に従って生成及び発現させて、以下に示すように、ヒトＩＬ−１５配列をＣＡ４９７及びＣＡ２４０Ｆａｂ構築物のフレームワーク３領域に挿入した。
【０１９２】
抗ＩＬ−１７Ａ  ＣＡ４９７  Ｆａｂ重鎖配列（Ｆａｂ、ＩｇＧ１由来のＣＨ１；可変ドメインに下線；ＣＤＲは太字及びイタリック体）
【数４１】
2021530222.tif 000046
【０１９３】
フレームワーク３、下線のＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーに挿入されたヒトＩＬ−１５（太字及びイタリック体）を有する抗ＩＬ−１７Ａ  ＣＡ４９７  Ｆａｂ重鎖：
【数４２】
2021530222.tif 000047
【０１９４】
抗ＩＬ−１７Ａ  ＣＡ４９７  Ｆａｂ軽鎖配列：
【数４３】
2021530222.tif 000048
【０１９５】
抗ＩＬ−６  ＣＡ２４０  Ｆａｂ重鎖配列（Ｆａｂ、ＩｇＧ１由来のＣＨ１；可変ドメインに下線、ＣＤＲは太字及びイタリック体）：
【数４４】
2021530222.tif 000049
【０１９６】
フレームワーク３、下線のＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーに挿入されたヒトＩＬ−１５（太字及びイタリック体）を有する抗ＩＬ−６  ＣＡ２４０  Ｆａｂ重鎖：
【数４５】
2021530222.tif 000050
【０１９７】
抗ＩＬ−６  ＣＡ２４０  Ｆａｂ軽鎖配列：
【数４６】
2021530222.tif 000051
【０１９８】
図１３及び図１４は、ＩＬ−１５（競合リガンド）との事前インキュベーションのある場合及び無い場合の、１００ｎＭ  ＩＬ−２−Ｒβ（ＩＬ−１５の結合パートナー）で試験した場合におけるＣＡ４９７／ＩＬ−１５及びＣＡ２４０／ＩＬ−１５（それぞれの）抗体融合タンパク質の結合能力についてのＢｉａｃｏｒｅ分析を示す。両方の実験で示すように、ＩＬ−２−Ｒβに見られる結合は、モル過剰の競合リガンドの存在下で消失したが、このことは、融合タンパク質のフレームワーク３内のＩＬ−１５部分に見られる結合が真の機能的相互作用であり、非特異的でないことを示唆している。
【０１９９】
（例１１）
フレームワーク３に挿入されたＶＨＨを有するＦａｂ構築物
ＨｙＨＥＬ５は、以下の配列を有する抗リゾチームＦａｂである。
【０２００】
ＨｙＨＥＬ５重鎖：
【数４７】
2021530222.tif 000052
【０２０１】
ＨｙＨＥＬ５軽鎖：
【数４８】
2021530222.tif 000053
【０２０２】
Ｄ３Ｌ１１は、以下の配列を有する抗リゾチームＶＨＨである：
【０２０３】
Ｄ３Ｌ１１：
【数４９】
2021530222.tif 000054
【０２０４】
以下の融合体構築物を生成し、一次抗体のフレームワーク３領域内への二次抗体分子の挿入であって、ここでそれらの抗体が同一標的抗原に結合する、該挿入が、個々の抗体のいずれかに比べて抗原に対する親和性が高くなるかどうかについて試験した。
【０２０５】
フレームワーク３、下線のＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーに挿入された抗リゾチームＶＨＨ  Ｄ３Ｌ１１（太字）を有する抗リゾチームＨｙＨＥＬ５軽鎖：
【数５０】
2021530222.tif 000055
【０２０６】
フレームワーク３、下線のＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーに挿入された抗ＩＬ−６  ＶＨＨ１５（太字）を有する抗リゾチームＨｙＨＥＬ５軽鎖：
【数５１】
2021530222.tif 000056
【０２０７】
フレームワーク３、下線のＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーに挿入された抗リゾチームＶＨＨ  Ｄ３Ｌ１１（太字）を有するＣＡ６４５軽鎖：
【数５２】
2021530222.tif 000057
【０２０８】
リゾチームへの結合について試験した場合における、それぞれの構築物に対して実施された希釈系列からのＳＰＲトレースを図１５〜図１７に示す。上記の方法を使用するその後の分析から、それぞれの構築物について算出したリゾチームの結合親和性を以下の表に明示する。
【表３】
2021530222.tif 000058
【０２０９】
上記の結果から明白であるように、Ｆａｂ及びＶＨＨ挿入の両方がリゾチームに結合する構築物については、リゾチームに対する結合親和性が増加する（すなわち、ＫＤで減少が見られる）。図１８は、どのようにこれが分子レベルで起こり得るのかを説明している。またこれにより、そのような抗体の同一標的分子での多価相互作用を可能にするにはリンカーの長さが重要となり得るという仮説も立てられる。
【０２１０】
（例１２）
ウシリンカーを使用するＩＬ−１５挿入ポリペプチドを有するＣＡ６４５  Ｆａｂ
リンカーを、例１に記載のＣＡ６４５／ＩＬ−１５Ｆｗｋ３タンパク質について、ウシリンカーを含む他のタイプのリンカーに変更したバリアントを生成し、それらの結合に対する効果を試験した。元の重鎖構築物（配列番号５４）と同様に、さらなる構築物を以下に示すように生成した：
【０２１１】
ウシ長鎖リンカー（下線）を用いてフレームワーク３に挿入されたヒトＩＬ−１５（太字及びイタリック体）を有するＣＡ６４５  Ｆａｂ重鎖
【数５３】
2021530222.tif 000059
【０２１２】
ウシ短鎖リンカー（下線）を用いてフレームワーク３に挿入されたヒトＩＬ−１５（太字及びイタリック体）を有するＣＡ６４５  Ｆａｂ重鎖
【数５４】
2021530222.tif 000060
【０２１３】
２ＸＧ４Ｓリンカー（下線）を用いてフレームワーク３に挿入されたヒトＩＬ−１５（太字及びイタリック体）を有するＣＡ６４５  Ｆａｂ重鎖
【数５５】
2021530222.tif 000061
【０２１４】
図１９は、例１の構築物（元のリンカー）及びＩＬ−１５挿入を有していない野生型ＣＡ６４５  Ｆａｂと比較した、１００ｎＭ  ＩＬ−２−Ｒβで試験した場合における上記のＣＡ６４５／ＩＬ−１５Ｆｗｋ３構築物についてのＢｉａｃｏｒｅ結合分析を示す。試験したすべての構築物の結合が成功したことが認められた。
【０２１５】
（例１３）
フレームワーク３に挿入されたｄｓｓｃＦｖを有するＣＡ６４５  Ｆａｂフラグメント
遺伝子設計
本発明の２つの抗体を上記の方法に従って生成及び発現させ、以下に示すように、抗ＩＬ−１７Ａ  ＣＡ４９７  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＨｖＬ、又はｖＬｖＨ）をＣＡ６４５  Ｆａｂフラグメント（足場抗体）のフレームワーク３領域に挿入した。得られた抗体は、それぞれ、ＣＡ６４５  Ｆａｂ−Ｆｗｋ３  ＣＡ４９７  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＨｖＬ）、又はＣＡ６４５  Ｆａｂ−Ｆｗｋ３  ＣＡ４９７  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＬｖＨ）と称する場合がある。ＣＡ４９７  ｄｓｓｃＦｖ及びＣＡ６４５  Ｆａｂを対照として生成した。フレームワーク３挿入を有するバリアントを含む、軽鎖及び重鎖のＶ領域をコードする遺伝子は、自動合成手法（ＡＴＵＭ）により設計し構築した。軽鎖Ｖ領域遺伝子（例えば、配列番号２のＣＡ６４５  ＶＬドメインをコードする）を、ヒトＣκ領域（Ｋｍ３アロタイプ）をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターにクローニングした。重鎖Ｖ領域遺伝子は、ＩｇＧ１  ＣＨ１領域をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターにクローニングした。
【０２１６】
ＣＡ４９７  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＨｖＬ）
【数５６】
2021530222.tif 000062
【０２１７】
ＣＡ４９７  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＬｖＨ）
【数５７】
2021530222.tif 000063
【０２１８】
フレームワーク３、下線のリンカーに挿入されたＣＡ４９７  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＨｖＬ）（太字及びイタリック体）を有するＣＡ６４５  Ｆａｂ重鎖
【数５８】
2021530222.tif 000064
【０２１９】
フレームワーク３、下線のリンカーに挿入されたＣＡ４９７  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＬｖＨ）（太字及びイタリック体）を有するＣＡ６４５  Ｆａｂ重鎖：
【数５９】
2021530222.tif 000065
【０２２０】
一過性細胞発現
操作したＦａｂフラグメントを、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ  ２９３  トランスフェクションキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、製造業者の説明書による）を使用してＨＥＫ−２９３細胞において、又はＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ  ＣＨＯトランスフェクションキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、製造業者の説明書による）を使用してＣＨＯ−Ｋ１由来細胞系のＣＨＯ−Ｓ  ＸＥ細胞において（Ｃａｉｎ  Ｋら、「ＸＢＰ１及びＥＲＯ１−Ｌαを発現するように操作されたＣＨＯ細胞系は一過性タンパク質発現のレベルを増加させる（Ａ  ＣＨＯ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｔｏ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ＸＢＰ１  ａｎｄ  ＥＲＯ１−Ｌα  ｈａｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．）」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ２０１３年；２９：６９７〜７０６頁）のいずれかで一過的に発現させた。ＨＥＫ−２９３細胞を小規模発現（２ｍｌ）で使用し、直接ＳＰＲ分析用の抗体構築物を調製した。ＣＨＯ−Ｓ  ＸＥ細胞を大規模発現（２００ｍｌ）で使用し、さらなる特性決定の前に精製用の抗体構築物を調製した。
【０２２１】
精製
アフィニティークロマトグラフィーを使用し、Ｆａｂフラグメントを培養上清から精製した。抗体を含有する上清をＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４を用いた洗浄ステップの後、結合物質を、０．１Ｍリン酸クエン酸緩衝液ｐＨ２．６の容量パーセントの増加に対するＰＢＳｐＨ７．４の勾配で溶出させた。溶出液を２ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）で中和した。フラクションをプールし、２８０ｎｍの吸光度で定量し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ遠心フィルター（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮した。構築物の単量体フラクションを分離するため、ＰＢＳ  ｐＨ７．４を用いて平衡化したＨｉＬｏａｄ  １６／６０、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのサイズ排除クロマトグラフィーを使用した。単量体Ｆａｂを含有するフラクションをプールし、定量し、濃縮し、４℃で保存した。
【０２２２】
ＵＰＬＣ（超高速液体クロマトグラフィー）：
２μｇの試料をＳＥＣ  ＢＥＨ２００カラムに注入し、ＰＢＳ、ｐＨ７．４で予備平衡化し、１０分間流した。蛍光強度を溶出時間に対して記録し、ピーク面積をＥＭｐｏｗｅｒソフトウェアで手動により選定した。
【０２２３】
ＵＰＬＣ溶出プロファイルを取得して分析した。ピークは、単量体が９８％を超えているようであった（ＣＡ６４５  Ｆａｂ−Ｆｗｋ３  ＣＡ４９７  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＬｖＨ）については９９．４２％、ＣＡ６４５  Ｆａｂ−Ｆｗｋ３  ＣＡ４９７  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＨｖＬ）については９９．５１％）。対照のＣＡ４９７  ｄｓｓｃＦｖ及びＣＡ６４５  Ｆａｂは、それぞれ、９９．９９％及び９８．４３％の多量体形態を示した（データは示さず）。したがって、精製タンパク質は均質であり、多量体形態又は凝集体はなかった。
【０２２４】
分子の安定性
分子の安定性は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）法による融解温度（Ｔｍ）（アンフォールディングの測定）分析によって測定した。サーモグラムは、自動型ＭｉｃｒｏＣａｌ  ＶＰ  ＤＳＣ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｌｔｄ）で、０〜１００℃、１℃／分のステップ速度を使用し、プレインキュベーションスキャン時間１５分、フィルタリング期間５秒、及びパッシブ設定したフィードバックを用いて得た。データは、手動ベースライン減算及び濃度補正の前に緩衝液減算を行った。サーモグラムは、Ｏｒｉｇｉｎ７．０の非２状態モデル（ｎｏｎ−２−ｓｔａｔｅ  ｍｏｄｅｌ）に適合させた。
【０２２５】
結果を図２０（ＤＳＣ曲線；縦軸：（Ｃｐ）比熱；横軸：摂氏温度（℃））及び以下の表３に示す。ＣＡ４９７  ｄｓｓｃＦｖ及びＣＡ６４５  Ｆａｂは、それぞれ、５８．４０℃と８３．５７℃の単一遷移を示した。Ｆａｂ−Ｆｗｋ３にｄｓｓｃＦｖフォーマットが挿入された組合せの場合、ＣＡ４９７  ｄｓｓｃＦｖ  Ｔｍはほぼ同じであり（２〜３℃の差）、ＣＡ６４５  Ｆａｂは約４〜５℃のＴｍの変動がある。したがって、本発明によるこの抗体フォーマットにおけるＣＡ４９７  ｄｓｓｃＦｖ及びＣＡ６４５  Ｆａｂの対合は、いずれかのドメインの構造的安定性に有意な影響を及ぼすことはない。
【表４】
2021530222.tif 000066
【０２２６】
中和アッセイ
Ｈｅｌａ細胞におけるヒト組換えＩＬ−１７Ａに対する抗体ＣＡ４９７  ＩｇＧ４、ＣＡ６４５  Ｆａｂ−Ｆｗｋ３  ＣＡ４９７  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＨｖＬ）及びＣＡ６４５  Ｆａｂ−Ｆｗｋ３  ＣＡ４９７  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＬｖＨ）の効力を、ＨＳＡの存在下又は非存在下で試験した。Ｈｅｌａ細胞は、ＡＴＣＣのセルバンクから入手した（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）。細胞を、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン、ゲンタマイシン及びグルタミンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。１×１０４個の細胞を９６ウェル平底組織培養プレートに播種した。細胞を一晩インキュベートし、アッセイ緩衝液で一度洗浄した。ヒトＩＬ−１７Ａ（２５ｎｇ  ｍｌ−１）を、固定濃度のヒトＴＮＦ−αの存在下でインキュベートし、この混合物を試験した抗体とプレインキュベートした。次いで、サイトカイン及び抗体をＨｅｌａ細胞に添加し、一晩インキュベートした細胞を刺激した。Ｈｅｌａ細胞系では、ＩＬ−１７ＡはＴＮＦ−ａｌｐｈａと相乗作用し、ＩＬ−６の産生を誘導するが、これは例えばＥＬＩＳＡにより定量化することができる。細胞培養上清中のＩＬ−６の産生は、細胞に添加されたＩＬ−１７Ａの量に比例する。ヒトＩＬ−６レベルをＥＬＩＳＡによって測定し、ヒトＩＬ−６の公知の標準濃度と比較することによって定量化した。このアッセイでは、ＩＬ−６の分泌の阻害はＩＬ−１７Ａの阻害と相関している。
【０２２７】
阻害曲線を図２１に示すが（横軸：抗体（阻害剤）濃度（ｎｇ／ｍｌ）、縦軸：ＩＬ−６分泌の阻害（％））、これは、親抗体ＣＡ４９７  ＩｇＧ４と両方の抗体融合構築物がヒト組換えＩＬ−１７Ａを強く中和したことを示している。さらに、これらの結果は、ｄｓｓｃＦｖ抗ＩＬ−１７がＦａｂ  抗ＨＳＡのＦｗｋ３領域に挿入された場合に機能性を保持していたことを示している。これらの実験から算出されたＥＣ５０値（以下の表４）は、抗体ＣＡ６４５  Ｆａｂ−Ｆｗｋ３  ＣＡ４９７  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＬｖＨ）並びにＣＡ６４５  Ｆａｂ−Ｆｗｋ３  ＣＡ４９７  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＨｖＬ）が、ヒト組換えＩＬ−１７Ａ（２５ｎｇ．ｍｌ−１）に対して、それぞれ１０．５ｎｇ／ｍｌ並びに１０．６ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０をもたらすことと、中和効力がＨＳＡの存在によって影響されることはなかった（ＨＳＡの存在下で、ＥＣ５０はそれぞれ１０．８ｎｇ／ｍｌ及び８．７ｎｇ／ｍｌ）ことを示した。また、ＣＡ６４５  Ｆａｂ−Ｆｗｋ３  ＣＡ４９７  ｄｓｓｃＦｖ構築物は、親ＣＡ４９７  ＩｇＧ４抗体の１つに匹敵する中和効力を有していた。
【表５】
2021530222.tif 000067
【０２２８】
（例１４）
フレームワーク３に挿入されたｄｓｓｃＦｖを有する完全ＣＡ６４５  ＩｇＧ
融合タンパク質を上記の方法に従って生成及び発現させ、以下に示すように、ＣＡ４９７  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＨ−ｖＬ）又はＣＡ４９７  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＬ−ｖＨ）をＣＡ６４５  ＩｇＧ４Ｐ構築物のフレームワーク３領域に挿入した。得られた抗体融合タンパク質は、ＣＡ６４５  ＩｇＧ４Ｐ  Ｆｗｋ３−ＣＡ４９７  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＨｖＬ）及びＣＡ６４５  ＩｇＧ４Ｐ  Ｆｗｋ３−ＣＡ４９７  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＬｖＨ）と称する場合がある。
【０２２９】
遺伝子設計
フレームワーク３挿入を有するバリアントを含む、軽鎖及び重鎖のＶ領域をコードする遺伝子を自動合成手法（ＡＴＵＭ）によって設計及び構築した。軽鎖Ｖ領域遺伝子（例えば、配列番号２のＣＡ６４５  ＶＬドメインをコードするもの）を、ヒトＣκ領域（Ｋｍ３アロタイプ）をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターにクローニングした。重鎖Ｖ領域遺伝子を、完全長抗体のＩｇＧ４Ｐ定常領域をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターにクローニングした。
【０２３０】
フレームワーク３、下線のリンカーに挿入されたＣＡ４９７  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＨｖＬ）（太字及びイタリック体）を有するＣＡ６４５  ＩｇＧ４Ｐ重鎖：
【数６０】
2021530222.tif 000068
【０２３１】
フレームワーク３、下線のリンカーに挿入されたＣＡ４９７  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＬｖＨ）（太字及びイタリック体）を有するＣＡ６４５  ＩｇＧ４Ｐ重鎖：
【数６１】
2021530222.tif 000069
【０２３２】
一過性の細胞発現
操作した抗体を、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ  ２９３  トランスフェクションキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、製造業者の説明書による）を使用してＨＥＫ−２９３細胞において、又はＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ  ＣＨＯトランスフェクションキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、製造業者の説明書による）を使用してＣＨＯ−Ｋ１由来細胞系のＣＨＯ−Ｓ  ＸＥ細胞においてのいずれかで一過的に発現させた。ＨＥＫ−２９３細胞を小規模発現（２ｍｌ）で使用し、直接ＳＰＲ分析用の抗体構築物を調製した。ＣＨＯ−Ｓ  ＸＥ細胞を大規模発現（２００ｍｌ）で使用し、さらなる特性決定の前に精製用の抗体構築物を調製した。
【０２３３】
精製
アフィニティークロマトグラフィーを使用し、ＩｇＧを培養上清から精製した。ＩｇＧを含有する上清をＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４を用いた洗浄ステップの後、結合物質を、０．１Ｍリン酸クエン酸緩衝液ｐＨ２．６の容量パーセントの増加に対するＰＢＳｐＨ７．４の勾配で溶出させた。溶出液を２ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）で中和した。フラクションをプールし、２８０ｎｍの吸光度で定量し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ遠心フィルター（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮した。ＩｇＧベースの構築物の単量体フラクションを分離するため、ＰＢＳ  ｐＨ７．４を用いて平衡化したＨｉＬｏａｄ  １６／６０、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのサイズ排除クロマトグラフィーを使用した。単量体ＩｇＧ構築物を含むフラクションをプールし、定量し、濃縮し、４℃で保存した。
【０２３４】
ＩＬ−１７及びＨＳＡへの同時結合
ＩＬ−１７Ａ及びＨＳＡのＣＡ６４５  ＩｇＧ４Ｐ  Ｆｗｋ３−ＣＡ４９７  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＨｖＬ）への同時結合を試験するため、後者を、以前と同じ手順で、ポリクローナルヤギＦ（ａｂ）２の代わりにＢｉａｃｏｒｅチップに固定化した。低レベル、中レベル、高レベルの固定化抗体へ結合を得るためにＩＬ−１７ＡとＨＳＡの両方で３つの濃度を選択したが、詳しくは、これらは、それぞれ、０．１５〜０．３、０．４〜０．６、０．６５〜０．７５の範囲の抗体に対するリガンドの化学量論比に対応していた。ＩＬ−１７Ａの場合、濃度は４、２０、１００ｎＭであり、ＨＳＡの場合、濃度はそれぞれ４０、２００、１０００ｎＭであった。上記の低濃度、中濃度及び高濃度は、個別のリガンドとして、又はＩＬ−１７Ａ／ＨＳＡ混合物として、前述したように個々のサイクルでＳＰＲにより試験し、レポートポイントについては、緩衝液対照サイクルの減算による補正を行った。結果を図２２に示すが、これは、ＣＡ６４５  ＩｇＧ４Ｐ  Ｆｗｋ３−ＣＡ４９７  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＨｖＬ）が濃度依存方式でＩＦ−１７ＡとＨＳＡの両方に結合することを示している。図２２は、両方の結合パートナーの存在下で、シグナルが相加的であることをさらに示しており、このことは、ＩＦ−１７ＡとＨＳＡの両方への結合が同時に生じる可能性があることを示唆している。
【０２３５】
（例１５）
ＣＤ３とＣＤ２８の両方に結合する本発明の抗体
遺伝子設計
抗体を上記の方法に従って生成及び発現させ、以下の表５に示すように、抗ＣＤ３又は抗ＣＤ２８足場抗体（ＩｇＧ４Ｐ若しくはＦａｂフラグメント）のフレームワーク３領域に抗ＣＤ３  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＨ−ｖＬ）を挿入した。本発明によって得られた抗体構築物は、抗ＣＤ２８  Ｆａｂ  Ｆｗｋ３−抗ＣＤ３  ｄｓｓｃＦｖ（配列番号１３６のＬＣ、配列番号１３９のＨＣ）、抗ＣＤ３  Ｆａｂ  Ｆｗｋ３−抗ＣＤ３  ｄｓｓｃＦｖ（配列番号１３３のＬＣ、配列番号１４０のＨＣ）、抗ＣＤ２８  ＩｇＧ４Ｐ  Ｆｗｋ３−抗ＣＤ３  ｄｓｓｃＦｖ（配列番号１３６のＬＣ、配列番号１４１のＨＣ）、抗ＣＤ３  ＩｇＧ４Ｐ  Ｆｗｋ３−抗ＣＤ３  ｄｓｓｃＦｖ（配列番号１３３のＬＣ、配列番号１４２のＨＣ）と称する場合がある。
【表６】
2021530222.tif 000070
【０２３６】
抗ＣＤ３軽鎖、ムロモナブ（ヒト化ＯＫＴ３）（可変ドメインに下線；ＣＤＲは太字及びイタリック体）：
【数６２】
2021530222.tif 000071
【０２３７】
抗ＣＤ３重鎖Ｆａｂ、ＩｇＧ１由来のＣＨ１、ムロモナブ（ヒト化ＯＫＴ３）（可変ドメインに下線；ＣＤＲは太字及びイタリック体）：
【数６３】
2021530222.tif 000072
【０２３８】
抗ＣＤ３重鎖ＩｇＧ４Ｐ、ムロモナブ（ヒト化ＯＫＴ３）（可変ドメインに下線；ＣＤＲは太字及びイタリック体）：
【数６４】
2021530222.tif 000073
【０２３９】
抗ＣＤ２８軽鎖、セラリズマブ（可変ドメインに下線；ＣＤＲは太字及びイタリック体）：
【数６５】
2021530222.tif 000074
【０２４０】
抗ＣＤ２８重鎖Ｆａｂ、ＩｇＧ１由来のＣＨ１、セラリズマブ（可変ドメインに下線；ＣＤＲは太字及びイタリック体）：
【数６６】
2021530222.tif 000075
【０２４１】
抗ＣＤ２８重鎖ＩｇＧ４Ｐ、セラリズマブ（可変ドメインに下線；ＣＤＲは太字及びイタリック体）：
【数６７】
2021530222.tif 000076
【０２４２】
フレームワーク３、下線のリンカーに挿入された抗ＣＤ３  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＨｖＬ）（太字及びイタリック体）を有する抗ＣＤ２８  Ｆａｂ重鎖：
【数６８】
2021530222.tif 000077
【０２４３】
フレームワーク３、下線のリンカーに挿入された抗ＣＤ３  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＨｖＬ）（太字及びイタリック体）を有する抗ＣＤ３  Ｆａｂ重鎖：
【数６９】
2021530222.tif 000078
【０２４４】
フレームワーク３、下線のリンカーに挿入された抗ＣＤ３  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＨｖＬ）（太字及びイタリック体）を有する抗ＣＤ２８  ＩｇＧ４Ｐ重鎖：
【数７０】
2021530222.tif 000079
【０２４５】
フレームワーク３、下線のリンカーに挿入された抗ＣＤ３  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＨｖＬ）（太字及びイタリック体）を有する抗ＣＤ３  ＩｇＧ４Ｐ重鎖：
【数７１】
2021530222.tif 000080
【０２４６】
ＵＰＬＣ（超高速液体クロマトグラフィー）：
２μｇの試料をＳＥＣ  ＢＥＨ２００カラムに注入し、ＰＢＳ、ｐＨ７．４で予備平衡化し、１０分間流した。蛍光強度を溶出時間に対して記録し、ピーク面積をＥＭｐｏｗｅｒソフトウェアで手動により選定した。
【０２４７】
ＵＰＬＣ溶出プロファイルを取得して分析した。ピークは、単量体が９８％を超えているようであった（抗ＣＤ３  ＩｇＧ４Ｐ  Ｆｗｋ３−抗ＣＤ３  ｄｓｓｃＦｖ：９９．０２％、抗ＣＤ３  Ｆａｂ  Ｆｗｋ３−抗ＣＤ３  ｄｓｓｃＦｖ：９９．７９％、抗ＣＤ２８  Ｆａｂ  Ｆｗｋ３−抗ＣＤ３  ｄｓｓｃＦｖ：９９．４８％）が、ただし、抗ＣＤ２８  ＩｇＧ４Ｐ  Ｆｗｋ３−抗ＣＤ３  ｄｓｓｃＦｖの１２．１２％の低分子量ショルダーは除く。いずれのフォーマットについても多量体化の証拠はなかった。
【０２４８】
分子の安定性
分子の安定性は、上記のように、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）法による融解温度（Ｔｍ）（アンフォールディングの測定）分析によって測定した。ＤＳＣ曲線を図２３の（Ａ）及び（Ｂ）に示し、Ｔｍ値を以下の表６及び表７に示した。
【表７】
2021530222.tif 000081
【０２４９】
抗ＣＤ３  Ｆａｂ  Ｆｗｋ３−抗ＣＤ３  ｄｓｓｃＦｖのＤＳＣ曲線は、７０．０４℃で単一アンフォールディング遷移を示した。これに対し、抗ＣＤ２８を含有する構築物のアンフォールディングは単一遷移では正確に説明することはできないが、非２状態の２遷移（ｔｗｏ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）モデルに対して良好に適合する；そのうちの低いものはｄｓｓｃＦｖ成分に起因する可能性がある。これらの結果は、６５℃〜７５℃の値が典型的なＩｇＧの値と一致しているので、フレームワーク３の位置内にＦａｂを挿入することにより安定な構築物が得られたことを特に示している。
【表８】
2021530222.tif 000082
【０２５０】
抗ＣＤ３  ＩｇＧ４Ｐ  Ｆｗｋ３−抗ＣＤ３  ｄｓｓｃＦｖのＤＳＣ曲線は、６８．５５℃で単一アンフォールディング遷移を示した。これに対し、抗ＣＤ２８を含有する構築物のアンフォールディングは単一遷移では正確に説明することはできないが、非２状態の２遷移モデルに対して良好に適合する；そのうちの低いものはｄｓｓｃＦｖ成分に起因する可能性がある。これらの結果は、６５℃〜７５℃のＴｍ値が典型的なＩｇＧ様分子の値であるので、フレームワーク３の位置内にＩｇＧを挿入することにより安定な構築物が得られたことを特に示している。
【０２５１】
ヒト機能性ＰＢＭＣアッセイにおけるフレームワーク３挿入を有するＦａｂ及びＩｇＧ４Ｐ構築物の評価
構築物は、以下に記載の方法に従って、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の培養においてＴ細胞活性化を刺激するそれらの能力について試験した。
【０２５２】
試薬
ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の検出、生細胞と死細胞の識別、並びに活性化マーカーＣＤ６９の測定に使用される抗体は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した（抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８、抗ＣＤ６９抗体、及び生細胞／死細胞を識別する抗体は、それぞれ、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＢＶ４２１及び近赤外フルオロフォアに結合させた）。すべての細胞培養は、５％熱不活化ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）及び２ｍＭのグルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加えたＲＰＭＩ１６４０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で実施した。すべてのフローサイトメトリー染色は、１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）、及び０．１％アジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）を加えたダルベッコＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む標準的なフローサイトメトリー緩衝液を使用して実施した。ヒトＯＫＴ３（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＴ細胞Ｔｒａｎｓａｃｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）は、抗ＣＤ３及びＣＤ２８のコロイド懸濁液であった。すべてのフローサイトメトリーデータは、ｉＱＵＥｐｌｕｓ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して取得した。Ｔ細胞はＦｏｒｅｃｙｔソフトウェア（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して同定し、データ変換及びグラフィック表示のためにデータメトリクスをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７（ＧｒａｐｈＰａｄ）にインポートした。
【０２５３】
方法
表５の抗体構築物を、２５μｇ／ｍｌから５分の１希釈ステップ８回で希釈した。分析後のステップにおいて、すべてのこれら値をｎＭ濃度に変換し、すべての構築物を等しく比較できるようにした。９６ウェル「Ｕ」型ボトム組織培養プレートに１．５×１０５個のＰＢＭＣ（ドナー１及びドナー２として匿名化された異なる２名のドナー由来）を希釈した抗体と混合した。ＯＫＴ３（５μｇ／ｍｌ）、Ｔｒａｎｓａｃｔ（１００分の１希釈したＣＤ３／ＣＤ２８）、及び培地単独が実験の参照対照であった。混合した後、プレートを摂氏３７度で２４時間インキュベートした。この時間の後、プレートを氷上で冷却し、回転させ（すべてのその後の回転は５分間摂氏４度で５００ｇにて行った）、上清を各ウェルから除去した。プレートを再度洗浄し、上清を吸引し、２０μｌの抗体カクテルを各ウェルに添加した（すべての抗体はフローサイトメトリー緩衝液で１：２０に希釈し、カクテル１ｍｌ当たり１μｌの生／死染色を添加した）。プレートを暗所の氷上に１時間静置した。この時間の後、プレートをさらに２回洗浄し、上清をすべてのウェルから除去した。最後にプレートを２０μｌのフローサイトメトリー緩衝液に再懸濁し、ウェル当たり少なくとも１０，０００個の細胞を得た。
【０２５４】
結果
これらの結果を図２４に示す（Ａ〜Ｄ；縦軸はＣＤ６９（ＭＦＩ）の発現レベルを表し、横軸はｎＭでの抗体構築物濃度を表す）。実験は、陽性対照（ＯＫＴ３）がＣＤ４  Ｔ細胞及びＣＤ８  Ｔ細胞の両方で、初期活性化マーカーのＣＤ６９を誘導したことから成功したと思われた。活性化の最小（細胞のみ）レベルは、細胞のみの対照によって決定した。図２４の（Ａ）及び（Ｂ）から明らかなように、試験した構築物のＣＤ４  Ｔ細胞でのＣＤ６９の誘導は、ドナーの間で一致していた。
【０２５５】
ＣＤ３及びＣＤ２８を（Ｆａｂ又はＩｇＧ４Ｐフォーマットのいずれかにおいて）含有する本発明の抗体は、ＣＤ４  Ｔ細胞の最も効力のある活性化因子であった。このアッセイにおいて予測されたとおり、Ｆｃを含有する構築物は、他の（非）Ｔ細胞、特に単球上のＦｃ受容体を介して追加の活性をもたらし、それにより共刺激シグナルが増強され得る。この点において、抗ＣＤ３  ＩｇＧ４Ｐ  Ｆｗｋ３−抗ＣＤ３  ｄｓｓｃＦｖもまた、このアッセイで（全ＩｇＧ抗ＣＤ３抗体であるＯＫＴ３対照と同様に）活性を示した。このデータは、ＣＤ３とＣＤ２８の両方に結合する本発明の抗体が混合型ＰＢＭＣアッセイにおいてヒトＣＤ４  Ｔ細胞の機能的活性化因子であること、またそれにより二重特異性抗体の機能を果たし得ることを実証している。
【０２５６】
さらに、ＣＤ８  Ｔ細胞の活性化も同じアッセイにおいて測定した。前記のように、すべての陽性対照及び陰性対照を予定通り実施した。図２４の（Ｃ）及び（Ｄ）から明らかなように、試験した構築物のＣＤ８  Ｔ細胞でのＣＤ６９の誘導は、ドナー間で一致していた。ＣＤ３及びＣＤ２８を（Ｆａｂ又はＩｇＧ４Ｐフォーマットのいずれかにおいて）含有する本発明の抗体は、ＣＤ８  Ｔ細胞の最も効力のある活性化因子であった。抗ＣＤ３  ＩｇＧ４Ｐ  Ｆｗｋ３−抗ＣＤ３  ｄｓｓｃＦｖもまた、このアッセイで（全ＩｇＧ抗ＣＤ３抗体であるＯＫＴ３対照と同様に）活性を示した。このデータは、ＣＤ３とＣＤ２８の両方に結合する本発明の抗体が混合型ＰＢＭＣアッセイにおいてヒトＣＤ８  Ｔ細胞の機能的活性化因子であること、またそれにより二重特異性抗体の機能を果たし得ることを実証している。
【０２５７】
これらの結果は、本発明による抗体が足場抗体（例えば、抗ＣＤ２８  Ｆａｂ又はＩｇＧ４Ｐ）と、挿入ポリペプチド、すなわち挿入ポリペプチドが足場抗体のＦｗｋ３領域に存在する場合の二次抗体（例えば抗ＣＤ３  ｄｓｓｃＦｖ）の両方の機能性を有することを示している。
【０２５８】
本明細書の文脈における含む（Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）は、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）を意味することを意図する。
【０２５９】
技術的に適切である場合、本発明の実施形態は組み合わされ得る。実施形態は、ある特定の特徴／要素を含むものとして本明細書に記載されている。本開示はまた、前記の特徴／要素からなるか、又はそれから本質的になる別個の実施形態にまで及ぶ。
【０２６０】
本発明を例として説明してきたが、これらの例は決して限定することを意味するものではなく、以下の特許請求の範囲内で変更することができることは当然理解されよう。本発明のそれぞれの実施形態の好ましい特徴は、他のそれぞれの実施形態に関して変更すべきところは変更される。本明細書に引用されている、限定するものではないが特許及び特許出願を含むすべての刊行物は、あたかもそれぞれの刊行物が参照によって本明細書に組み込まれるよう詳細に且つ個別に示されているかのように、参照によって本明細書に組み込まれる。
【配列表フリーテキスト】
【０２６１】
配列番号１：＜２２３＞  ＣＡ６４５軽鎖ｇＬ５
配列番号２：＜２２３＞  ＣＡ６４５  ＶＬドメイン（ｇＬ５）
配列番号３：＜２２３＞  ＣＡ６４５  ＣＤＲ  Ｌ１
配列番号４：＜２２３＞  ＣＡ６４５  ＣＤＲ  Ｌ２
配列番号５：＜２２３＞  ＣＡ６４５  ＣＤＲ  Ｌ３
配列番号６：＜２２３＞  ＣＡ６４５重鎖ｇＨ５
配列番号７：＜２２３＞  ＣＡ６４５  ＶＨドメイン（ｇＨ５）
配列番号８：＜２２３＞  ＣＡ６４５  ＣＤＲ  Ｈ１
配列番号９：＜２２３＞  ＣＡ６４５  ＣＤＲ  Ｈ２
配列番号１０：＜２２３＞  ＣＡ６４５  ＣＤＲ  Ｈ３
配列番号１１〜１８：＜２２３＞  フレキシブルリンカー
配列番号１９〜２３：＜２２３＞  フレキシブルリンカー
配列番号１９〜２３：＜２２３＞  Ｘａａは任意の天然に存在するアミノ酸であり得る。
配列番号２４〜５０：＜２２３＞  フレキシブルリンカー
配列番号５１〜５２：＜２２３＞  リジッドリンカー
配列番号５４：＜２２３＞  ＣＡ６４５  Ｆａｂ  ＨＣ  Ｆｗｋ３  ＩＬ−１５
配列番号５６：＜２２３＞  ＣＡ６４５  Ｆａｂ  ＨＣ  Ｆｗｋ３  ＩＬ−２
配列番号５８：＜２２３＞  ＣＡ６４５  Ｆａｂ  ＨＣ  Ｆｗｋ３  Ｇ−ＣＳＦ
配列番号６０：＜２２３＞  ＣＡ６４５  Ｆａｂ  ＨＣ  Ｆｗｋ３  ＧＭ−ＣＳＦ
配列番号６１：＜２２３＞  ＣＨ１のＣ末端にＧＭ−ＣＳＦを有するＣＡ６４５  Ｆａｂ  ＨＣ
配列番号６３：＜２２３＞  ＣＡ６４５  Ｆａｂ  ＨＣ  Ｆｗｋ３  ｍＧＭ−ＣＳＦ
配列番号６４：＜２２３＞  ＣＨ１のＣ末端のｍＧＭ−ＣＳＦを有するＣＡ６４５  Ｆａｂ  ＨＣ
配列番号６６：＜２２３＞  ＣＡ６４５  Ｆａｂ  ＨＣ  Ｆｗｋ３  ＥＰＯ
配列番号６７：＜２２３＞  ＶＨＨ６
配列番号６８：＜２２３＞  ＣＡ６４５  Ｆａｂ  ＨＣ  Ｆｗｋ３  ＶＨＨ６
配列番号６９：＜２２３＞  ＶＨＨ１５
配列番号７０：＜２２３＞  ＣＡ６４５  Ｆａｂ  ＨＣ  Ｆｗｋ３  ＶＨＨ１５
配列番号７２：＜２２３＞  ヒトスクレロスチンのコアドメイン
配列番号７３：＜２２３＞  フレームワーク３、単一Ｓリンカーに挿入されたヒトスクレロスチンコアドメインを有するＣＡ６４５  Ｆａｂ重鎖
配列番号７４：＜２２３＞  フレームワーク３、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（２Ｘ  Ｇ４Ｓ）リンカーに挿入されたヒトスクレロスチンコアドメインを有するＣＡ６４５  Ｆａｂ重鎖
配列番号７５：＜２２３＞  フレームワーク３、リジッドリンカーに挿入されたヒトスクレロスチンコアドメインを有するＣＡ６４５  Ｆａｂ重鎖
配列番号７６：＜２２３＞  フレームワーク３、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（１Ｘ  Ｇ４Ｓ）リンカーに挿入されたヒト成熟完全長スクレロスチンを有するＣＡ６４５  Ｆａｂ重鎖
配列番号７７〜８１：＜２２３＞  フレキシブルリンカー
配列番号８２：＜２２３＞  リジッドリンカー
配列番号８３：＜２２３＞  フレームワーク３、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーに挿入されたヒトＩＬ−１５を有するＣＡ４９７  Ｆａｂ重鎖
配列番号８４：＜２２３＞  ＣＡ４９７  Ｆａｂ軽鎖
配列番号８５：＜２２３＞  フレームワーク３、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーに挿入されたヒトＩＬ−１５を有するＣＡ２４０  Ｆａｂ重鎖
配列番号８６：＜２２３＞  ＣＡ２４０  Ｆａｂ軽鎖
配列番号８７：＜２２３＞  ＨｙＨＥＬ５重鎖
配列番号８８：＜２２３＞  ＨｙＨＥＬ５軽鎖
配列番号８９：＜２２３＞  Ｄ３Ｌ１１
配列番号９０：＜２２３＞  フレームワーク３、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーに挿入された抗リゾチームＶＨＨ  Ｄ３Ｌ１１を有する抗リゾチームＨｙＨＥＬ５軽鎖
配列番号９１：＜２２３＞  フレームワーク３、  Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーに挿入された抗ＩＬ−６  ＶＨＨ１５を有する抗リゾチームＨｙＨＥＬ５軽鎖
配列番号９２：＜２２３＞  フレームワーク３、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーに挿入された抗リゾチームＶＨＨ  Ｄ３Ｌ１１を有するＣＡ６４５軽鎖
配列番号９３：＜２２３＞  ウシ長鎖リンカーを用いてフレームワーク３に挿入されたヒトＩＬ−１５を有するＣＡ６４５  Ｆａｂ重鎖
配列番号９４：＜２２３＞  ウシ短鎖リンカーを用いてフレームワーク３に挿入されたヒトＩＬ−１５を有するＣＡ６４５  Ｆａｂ重鎖
配列番号９５：＜２２３＞  ２ｘＧ４Ｓリンカーを用いてフレームワーク３に挿入されたヒトＩＬ−１５を有するＣＡ６４５  Ｆａｂ重鎖
配列番号９６〜９９：＜２２３＞  リンカー
配列番号１０１：＜２２３＞  フレームワーク３に挿入された２つのヒトＩＬ−１０単量体を有するＣＡ６４５  Ｆａｂ重鎖
配列番号１０２：＜２２３＞  ＣＡ６４５−Ｃｙｓ  ＶＬドメイン（ｇＬ５）
配列番号１０３：＜２２３＞  ＣＡ６４５−Ｃｙｓ  ＶＨドメイン（ｇＨ５）
配列番号１０４：＜２２３＞  リジッドリンカー
配列番号１０５：＜２２３＞  ＣＡ６４５  ＶＨドメイン（ｇＨ１）
配列番号１０６：＜２２３＞  ＣＡ６４５  ＶＨドメイン（ｇＨ３７）
配列番号１０７：＜２２３＞  ＣＡ６４５  ＶＨドメイン（ｇＨ４７）
配列番号１０８：＜２２３＞  ＣＡ６４５  ＶＬドメイン（ｇＬ１）
配列番号１０９：＜２２３＞  ＣＡ６４５  ＶＬドメイン（ｇＬ４）
配列番号１１０：＜２２３＞  ＣＡ６４５−Ｃｙｓ  ＶＬドメイン（ｇＬ４）
配列番号１１１〜１２４：＜２２３＞  アルブミン結合ペプチド
配列番号１２５：＜２２３＞  ＣＡ４９７  Ｆａｂ重鎖
配列番号１２６：＜２２３＞  ＣＡ２４０  Ｆａｂ重鎖
配列番号１２７：＜２２３＞  ＣＡ４９７  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＨｖＬ）
配列番号１２８：＜２２３＞  ＣＡ４９７  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＬｖＨ）
配列番号１２９：＜２２３＞  ＣＡ６４５  Ｆａｂ  ＨＣ  Ｆｗｋ３  ＣＡ４９７  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＨｖＬ）
配列番号１３０：＜２２３＞  ＣＡ６４５  Ｆａｂ  ＨＣ  Ｆｗｋ３  ＣＡ４９７  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＬｖＨ）
配列番号１３１：＜２２３＞  ＣＡ６４５  ＩｇＧ４Ｐ  ＨＣ  Ｆｗｋ３  ＣＡ４９７  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＨｖＬ）
配列番号１３２：＜２２３＞  ＣＡ６４５  ＩｇＧ４Ｐ  ＨＣ  Ｆｗｋ３  ＣＡ４９７  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＬｖＨ）
配列番号１３３：＜２２３＞  抗ＣＤ３軽鎖
配列番号１３４：＜２２３＞  抗ＣＤ３  Ｆａｂ  ＨＣ
配列番号１３５：＜２２３＞  抗ＣＤ３  ＩｇＧ４Ｐ  ＨＣ
配列番号１３６：＜２２３＞  抗ＣＤ２８軽鎖
配列番号１３７：＜２２３＞  抗ＣＤ２８  Ｆａｂ  ＨＣ
配列番号１３８：＜２２３＞  抗ＣＤ２８  ＩｇＧ４Ｐ  ＨＣ
配列番号１３９：＜２２３＞  抗ＣＤ２８  Ｆａｂ  ＨＣ  Ｆｗｋ３  抗ＣＤ３  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＨｖＬ）
配列番号１４０：＜２２３＞  抗ＣＤ３  Ｆａｂ  ＨＣ  Ｆｗｋ３  抗ＣＤ３  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＨｖＬ）
配列番号１４１：＜２２３＞  抗ＣＤ２８  ＩｇＧ４Ｐ  ＨＣ  Ｆｗｋ３  抗ＣＤ３  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＨｖＬ）
配列番号１４２：＜２２３＞  抗ＣＤ３  ＩｇＧ４Ｐ  ＨＣ  Ｆｗｋ３  抗ＣＤ３  ｄｓｓｃＦｖ（ｖＨｖＬ）
配列番号１４３：＜２２３＞  ＣＡ６４５  ｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）
配列番号１４４：＜２２３＞  ＣＡ６４５  ｄｓｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）
【図１】
2021530222.tif 000083
【図２】
2021530222.tif 000084
【図３】
2021530222.tif 000085
【図４】
2021530222.tif 000086
【図５】
2021530222.tif 000087
【図６】
2021530222.tif 000088
【図７】
2021530222.tif 000089
【図８】
2021530222.tif 000090
【図９】
2021530222.tif 000091
【図１０】
2021530222.tif 000092
【図１１】
2021530222.tif 000093
【図１２】
2021530222.tif 000094
【図１３】
2021530222.tif 000095
【図１４】
2021530222.tif 000096
【図１５】
2021530222.tif 000097
【図１６】
2021530222.tif 000098
【図１７】
2021530222.tif 000099
【図１８】
2021530222.tif 000100
【図１９】
2021530222.tif 000101
【図２０】
2021530222.tif 000102
【図２１】
2021530222.tif 000103
【図２２】
2021530222.tif 000104
【図２３】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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