(57)【要約】  ステージ特異的胚抗原４に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。モノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントは、配列番号３３又は配列番号４０の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号３４又は配列番号３９の配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列５番号３５又は配列番号４１の配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号３６又は配列番号４２の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３７又は配列番号４３の配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３８又は配列番号４４の配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む。また、ステージ特異的胚抗原４を発現する腫瘍を有する被験体に上記モノクローナル１０抗体又は抗原結合フラグメントを投与することによって行われる抗腫瘍法も開示される。さらに、上記配列をコードする核酸及び該核酸を含む組み換え細胞が提供される。【選択図】図１Ａ
2021519611.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３３又は配列番号４０の配列を有する重鎖ＣＤＲ１（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号３４又は配列番号３９の配列を有する重鎖ＣＤＲ２（Ｈ−ＣＤＲ２）、配列番号３５又は配列番号４１の配列を有する重鎖ＣＤＲ３（Ｈ−ＣＤＲ３）、配列番号３６又は配列番号４２の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号３７又は配列番号４３の配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ−ＣＤＲ２）、及び配列番号３８又は配列番号４４の配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
該モノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントがステージ特異的胚抗原４に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
前記Ｈ−ＣＤＲ１が配列番号３３の配列を有し、前記Ｈ−ＣＤＲ２が配列番号３４の配列を有し、前記Ｈ−ＣＤＲ３が配列番号３５の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ１が配列番号４２の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ２が配列番号４３の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ３が配列番号４４の配列を有する、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項３】
配列番号２、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号２２、配列番号２４、及び配列番号２６からなる群から選択される重鎖配列と、配列番号４、配列番号８、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２８、配列番号３０、及び配列番号３２からなる群から選択される軽鎖配列とを含む、単離されたモノクローナル抗体であって、該モノクローナル抗体がステージ特異的胚抗原４に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体。
【請求項４】
前記重鎖配列が配列番号１４であり、前記軽鎖配列が配列番号２８である、請求項３に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項５】
前記重鎖配列が配列番号１４であり、前記軽鎖配列が配列番号３０である、請求項３に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項６】
前記重鎖配列が配列番号１４であり、前記軽鎖配列が配列番号３２である、請求項３に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項７】
前記重鎖配列が配列番号２であり、前記軽鎖配列が配列番号４である、請求項３に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項８】
前記重鎖配列が配列番号６であり、前記軽鎖配列が配列番号８である、請求項３に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項９】
請求項１に記載のモノクローナル抗体、又はその抗原結合フラグメントをコードする、核酸コンストラクト。
【請求項１０】
Ｈ−ＣＤＲ１が配列番号３３の配列を有し、Ｈ−ＣＤＲ２が配列番号３４の配列を有し、Ｈ−ＣＤＲ３が配列番号３５の配列を有し、Ｌ−ＣＤＲ１が配列番号４２の配列を有し、Ｌ−ＣＤＲ２が配列番号４３の配列を有し、Ｌ−ＣＤＲ３が配列番号４４の配列を有する、請求項９に記載の核酸コンストラクト。
【請求項１１】
請求項３に記載のモノクローナル抗体をコードする核酸コンストラクト。
【請求項１２】
重鎖配列が配列番号１４であり、軽鎖配列が配列番号２８である、請求項１１に記載の核酸コンストラクト。
【請求項１３】
請求項９に記載の核酸コンストラクトを含む組み換え細胞であって、該細胞がステージ特異的胚抗原４に特異的に結合するモノクローナル抗体を発現する、組み換え細胞。
【請求項１４】
Ｈ−ＣＤＲ１が配列番号３３の配列を有し、Ｈ−ＣＤＲ２が配列番号３４の配列を有し、Ｈ−ＣＤＲ３が配列番号３５の配列を有し、Ｌ−ＣＤＲ１が配列番号４２の配列を有し、Ｌ−ＣＤＲ２が配列番号４３の配列を有し、Ｌ−ＣＤＲ３が配列番号４４の配列を有する、請求項１３に記載の組み換え細胞。
【請求項１５】
請求項１１に記載の核酸コンストラクトを含む組み換え細胞であって、該細胞がステージ特異的胚抗原４に特異的に結合するモノクローナル抗体を発現する、組み換え細胞。
【請求項１６】
重鎖配列が配列番号１４であり、軽鎖配列が配列番号２８である、請求項１５に記載の核酸。
【請求項１７】
腫瘍を治療する方法であって、腫瘍を有する被験体を識別することと、有効量の請求項１に記載のモノクローナル抗体を前記被験体に投与することとを含み、前記腫瘍内の細胞がステージ特異的胚抗原４（「ＳＳＥＡ４」）を発現する、方法。
【請求項１８】
Ｈ−ＣＤＲ１が配列番号３３の配列を有し、Ｈ−ＣＤＲ２が配列番号３４の配列を有し、Ｈ−ＣＤＲ３が配列番号３５の配列を有し、Ｌ−ＣＤＲ１が配列番号４２の配列を有し、Ｌ−ＣＤＲ２が配列番号４３の配列を有し、Ｌ−ＣＤＲ３が配列番号４４の配列を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
腫瘍を治療する方法であって、腫瘍を有する被験体を識別することと、有効量の請求項３に記載のモノクローナル抗体を前記被験体に投与することとを含み、前記腫瘍内の細胞がステージ特異的胚抗原４を発現する、方法。
【請求項２０】
重鎖配列が配列番号１４であり、軽鎖配列が配列番号２８である、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
癌免疫療法の目的は、腫瘍に対する患者自身の免疫応答の強度を高めることである。免疫療法は、癌細胞に対する免疫系の特定の構成要素の活性を賦活することができるか、又は癌細胞によって生じる、免疫応答を抑制するシグナルを打ち消すことができる。
【０００２】
例えば、抗体は、癌細胞表面の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ：Tumor-Associated Antigen）、例えばタンパク質抗原及び糖鎖抗原に特異的に結合する癌ワクチンとして開発されており、抗体依存性細胞傷害活性、抗体依存性食作用、及び補体依存性細胞溶解と並んで、直接細胞増殖抑制効果及び／又は細胞傷害性効果をもたらす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
幾つかの糖鎖ＴＡＡ、例えば、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ、ステージ特異的胚抗原３、及びステージ特異的胚抗原４に対するモノクローナル抗体系抗癌ワクチンが開発されている。しかしながら、癌細胞のより効果的な死滅を促進し、癌再発に対する長期的な耐性を提供するために、糖鎖ＴＡＡに対する親和性がより高い抗癌ワクチンとして改良されたモノクローナル抗体の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上に述べた必要性を満たすため、ステージ特異的胚抗原４（ＳＳＥＡ４：Stage-Specific Embryonic Antigen 4）に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントが提供される。モノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントは、配列番号３３又は配列番号４０の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号３４又は配列番号３９の配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号３５又は配列番号４１の配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号３６又は配列番号４２の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３７又は配列番号４３の配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３８又は配列番号４４の配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０００５】
本発明の範囲に含まれる単離されたモノクローナル抗体は、配列番号２、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号２２、配列番号２４、及び配列番号２６から選択される重鎖配列と、配列番号４、配列番号８、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２８、配列番号３０、及び配列番号３２から選択される軽鎖配列とを含む。
【０００６】
また、腫瘍内の細胞がＳＳＥＡ４を発現する腫瘍を治療する方法も提供される。該方法は、有効量の上記モノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントを投与することによって達成される。
【０００７】
さらに、上記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸コンストラクトと並んで、該核酸コンストラクトを含む組み換え細胞が開示される。組み換え細胞は、ＳＳＥＡ４に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを発現する。
【０００８】
本発明の幾つかの実施形態の詳細を、以下の記載及び図面の両方において述べる。本発明のその他の特徴、目的及び利点は、本明細書、また添付の特許請求の範囲から明らかとなろう。最後に、本明細書に引用される全ての参照文献は、引用することでそれらの全体が本明細書の一部をなす。
【０００９】
以下の説明は、添付の図面について言及する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】生殖細胞系列ヒトＩＧＨＶ４−５９ｘ０１重鎖可変領域（ｈｕＩＧＨＶ４−５９ｘ０１：配列番号６０）と、抗ＳＳＥＡ４マウスモノクローナル抗体１（ｍｕＭＡｂ１  Ｈ；配列番号２の残基２０〜１３８）及びヒトモノクローナル抗体１配列（ｈｕＭＡｂ１  Ｈ、配列番号１０の残基２０〜１３８；ｈｕＭＡｂ１  Ｈ１、配列番号１２の残基２０〜１３８；ｈｕＭＡｂ１  Ｈ２、配列番号１４の残基２０〜１３８）の対応するアミノ酸配列とのアミノ酸アライメントを示す図であり、ＣＤＲ領域は、この図及び他の全ての図において四角枠で囲まれている。
【図１Ｂ】生殖細胞系列ヒトＩＧＫＶ３−１１ｘ０１軽鎖可変領域（ｈｕＩＧＫＶ３−１１ｘ０１；配列番号６１）と、抗ＳＳＥＡ４マウスモノクローナル抗体１（ｍｕＭＡｂ１  Ｌ；配列番号４の残基２３〜１２８）及びヒトモノクローナル抗体１配列（ｈｕＭＡｂ１  Ｌ、配列番号１６の残基２３〜１２８；ｈｕＭＡｂ１  Ｌ１、配列番号１８の残基２３〜１２８；ｈｕＭＡｂ１  Ｌ２、配列番号２０の残基２３〜１２８）の対応するアミノ酸配列とのアミノ酸アライメントを示す図である。
【図２Ａ】生殖細胞系列ヒトＩＧＨＶ４−５９ｘ０１重鎖可変領域（ｈｕＩＧＨＶ４−５９ｘ０１：配列番号６０）と、抗ＳＳＥＡ４マウスモノクローナル抗体２（ｍｕＭＡｂ２  Ｈ；配列番号６の残基２０〜１３９）及びヒトモノクローナル抗体２配列（ｈｕＭＡｂ２  Ｈ、配列番号２２の残基２０〜１３９；ｈｕＭＡｂ２  Ｈ１、配列番号２４の残基２０〜１３９；ｈｕＭＡｂ２  Ｈ２、配列番号２６の残基２０〜１３９）の対応するアミノ酸配列とのアミノ酸アライメントを示す図である。
【図２Ｂ】生殖細胞系列ヒトＩＧＫＶ３−１１ｘ０１軽鎖可変領域と、抗ＳＳＥＡ４マウスモノクローナル抗体２（ｍｕＭＡｂ２  Ｌ；配列番号８の残基２３〜１２８）及びヒトモノクローナル抗体２配列（ｈｕＭＡｂ２  Ｌ、配列番号２８の残基２３〜１２８；ｈｕＭＡｂ２  Ｌ１、配列番号３０の残基２３〜１２８；ｈｕＭＡｂ２  Ｌ２、配列番号３２の残基２３〜１２８）の対応するアミノ酸配列とのアミノ酸アライメントを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
上記のように、ステージ特異的胚抗原４（ＳＳＥＡ４）に特異的に結合する、指定のＣＤＲ領域を有するモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント、例えば、単鎖Ｆｖが提供される。例示的なモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントにおいて、重鎖ＣＤＲ１（Ｈ−ＣＤＲ１）は配列番号３３の配列を有し、重鎖ＣＤＲ２（Ｈ−ＣＤＲ２）は配列番号３４の配列を有し、重鎖ＣＤＲ３（Ｈ−ＣＤＲ３）は配列番号３５の配列を有し、軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ−ＣＤＲ１）は配列番号４２の配列を有し、軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ−ＣＤＲ２）は配列番号４３の配列を有し、軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）は配列番号４４の配列を有する。
【００１２】
前段落で特定されるＣＤＲ領域を有するモノクローナル抗体の例は、（ｉ）配列番号１４の重鎖配列と配列番号２８の軽鎖配列、（ｉｉ）配列番号１４の重鎖配列と配列番号３０の軽鎖配列、（ｉｉｉ）配列番号１４の重鎖配列と配列番号３２の軽鎖配列、（ｉｖ）配列番号２の重鎖配列と配列番号４の軽鎖配列、及び（ｖ）配列番号６の重鎖配列と配列番号８の軽鎖配列という重鎖配列と軽鎖配列との組み合わせを有する。
【００１３】
モノクローナル抗体又は結合フラグメントをコードする核酸コンストラクトは、上記に挙げたＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、及びＬ−ＣＤＲ３の領域をコードする配列を含む。一例では、核酸コンストラクトは、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号４２、配列番号４３、及び配列番号４４のアミノ酸をコードする。
【００１４】
別の態様では、核酸コンストラクトは、上記で説明した重鎖及び軽鎖の配列の組み合わせを有するモノクローナル抗体をコードする。かかる核酸コンストラクトの具体例は、それぞれ、（ｉ）配列番号１３と配列番号２７、（ｉｉ）配列番号１３と配列番号２９、（ｉｉｉ）配列番号１３と配列番号３１、（ｉｖ）配列番号１と配列番号３、及び（ｖ）配列番号５と配列番号７の配列の組み合わせのうちの１つを含む。
【００１５】
さらに、上記核酸コンストラクトのいずれかを含み、ＳＳＥＡ４に特異的に結合するモノクローナル抗体又は結合フラグメントを発現する組み換え細胞が提供される。特定の組み換え細胞は、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号４２、配列番号４３、及び配列番号４４のＣＤＲ配列を有するモノクローナル抗体又は結合フラグメントを発現する。かかる組み換え細胞の例は、配列番号１４の重鎖配列及び配列番号２８の軽鎖配列を有するモノクローナル抗体を発現する。
【００１６】
腫瘍を治療するための上に言及される方法は、本出願で開示されるモノクローナル抗体のいずれかを投与することによって行われ得る。一例では、モノクローナル抗体は、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号４２、配列番号４３、及び配列番号４４を含む。モノクローナル抗体は、配列番号１４の重鎖配列及び配列番号２８の軽鎖配列を有することができる。
【００１７】
腫瘍治療法は、乳房、結腸、胃腸、腎臓、肺、肝臓、卵巣、膵臓、直腸、胃、精巣、胸腺、子宮頸部、前立腺、膀胱、皮膚、鼻咽頭、食道、口腔、頭頸部、骨、軟骨、筋肉、リンパ節、骨髄、及び脳の癌の治療に有効であり得る。
【００１８】
更に詳述することなしに、当業者であれば、本明細書の開示に基づき、本開示を最大限に利用することができると考えられる。したがって、以下の具体的な実施例は、単に説明的なものであって、決して本開示の残りの部分を限定するものではないと解釈されるべきである。本明細書で引用される全ての出版物及び特許文献は、引用することによりその全体が本明細書の一部をなす。
【実施例】
【００１９】
実施例１：ハイブリドーマ生産
ＳＳＥＡ４に対するマウスモノクローナル抗体を、標準的な手順を用いて産生した。簡潔には、アジュバントと一緒に、ウシ血清アルブミンに融合したＳＳＥＡ４（ＢＳＡ−ＳＳＥＡ４）を２週間に１回、１０週間までマウスに注射した。血液サンプル中の抗ＳＳＥＡ４抗体力価を、標準的な条件下でＢＳＡ−ＳＳＥＡ４を結合したＥＬＩＳＡプレートを用いて酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によりアッセイした。
【００２０】
また、ＢＳＡ−ＳＳＥＡ４  ＥＬＩＳＡにより最も高い力価を有するマウスに由来する血液サンプルを、ＳＳＥＡ４を発現するヒト膵臓癌（ＨＰＡＣ）細胞を用いるＥＬＩＳＡによって試験した。
【００２１】
抗体力価が最も高い２匹のマウスから脾細胞を単離し、標準的な手法を用いて骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマを形成した。高力価の抗ＳＳＥＡ４抗体を産生するハイブリドーマを、標準的なサブクローニング手順、並びにＢＳＡ−ＳＳＥＡ４及びＨＰＡＣ細胞によるＥＬＩＳＡアッセイを用いて同定した。ＨＰＡＣ及びＳＳＥＡ４を発現しないヒト黒色腫細胞株Ａ３７５の両方に結合した抗体を産生するハイブリドーマについては、それ以上追求しなかった。
【００２２】
ＨＰＡＣ細胞及びＡ３７５細胞をハイブリドーマ上清とインキュベートし、続いて蛍光標識二次抗体とインキュベートすることによる蛍光活性化細胞選別アッセイを用いて、細胞表面ＳＳＥＡ４に結合する抗体を検証した。マウスモノクローナル抗体１（ｍｕＭＡｂ１）及びマウスモノクローナル抗体２（ｍｕＭＡｂ２）と指定される２つのモノクローナル抗体を、更なる分析のため選択した。これらのモノクローナル抗体はいずれもＢＳＡ−ＳＳＥＡ４及びＨＰＡＣ細胞に結合し、Ａ３７５細胞には結合しない。
【００２３】
アイソタイプ分析は、ｍｕＭＡｂ１がＩｇＧ１カッパ抗体であり、ｍｕＭＡｂ２がＩｇＧ３カッパ抗体であることを示した。
【００２４】
ハイブリドーマ上清中のモノクローナル抗体濃度及びＳＳＥＡ４に対する結合親和性を、以下の２つの項目に記載されるとおりに決定した。ｍｕＭＡｂ１に対するＫｄ値は０．２２ｎＭであり、ｍｕＭＡｂ２に対するＫｄ値は０．０８ｎＭであった。
【００２５】
実施例２：ＥＬＩＳＡによる抗体濃度の決定
培地サンプル中のｍｕＭＡｂ抗体の濃度を、ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングされた以下の一次抗体を用いてＥＬＩＳＡによって決定した。マウスＭＡｂの場合には、１μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェルのＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Jackson ImmunoResearch  番号１１５−００５−０６２）で一晩、ＥＬＩＳＡプレートをコーティングした。ハイブリドーマ上清又は一過性トランスフェクション（下記を参照されたい）による培地サンプルの連続希釈物とのインキュベーション後、ウェルを十分に洗浄し、１：８０００希釈のペルオキシダーゼＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Jackson ImmunoResearch  番号１１５−０３５−０６２）を加えることにより結合した抗体を検出した。十分洗浄した後、ＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質（１成分）（ＫＰＬ  番号５０−６６−０６）を加え、４０５ｎｍで各ウェルの吸光度を測定した。
【００２６】
ヒト化ｍＡｂ（下記を参照されたい）の場合には、１μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェルのＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγフラグメント特異的（Jackson ImmunoResearch  番号１０９−００６−０９８）で一晩、ＥＬＩＳＡプレートをコーティングした。結合したヒト化抗体の検出は、上記のマウス抗体の場合と同様に、１：１００００希釈のペルオキシダーゼＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγフラグメント特異的（Jackson ImmunoResearch  番号１０９−０３５−００８）を用いて行った。
【００２７】
実施例３：ＥＬＩＳＡによる抗体親和性の決定
以下の試薬セットを用いて抗原結合親和性の決定のため、標準的なＥＬＩＳＡ手順を実施した。１：１０００希釈のＢＳＡ−ＳＳＥＡ４でＥＬＩＳＡプレートをコーティングした。連続希釈したハイブリドーマ上清のサンプル又は一過性トランスフェクションサンプルを各ウェルに添加し、続いて十分に洗浄した。ｍｕＭＡｂ１に対して１：２５００希釈のＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃγサブクラス１特異的（Jackson ImmunoResearch  番号１１５−００５−２０５）、ｍｕＭＡｂ２に対して１：２５００希釈のＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃγサブクラス３特異的（Jackson ImmunoResearch  番号１１５−００５−２０９）、全てのヒト化抗体に対して１：２５００希釈のＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Jackson ImmunoResearch  番号１０９−００５−０８８）の二次抗体を用いて、プレート上の抗原に結合したｍｕＭＡｂ及びｈｕＭＡｂを検出した。
【００２８】
１：６０００希釈のペルオキシダーゼＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅウシ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Jackson ImmunoResearch  番号８０５−０３５−１８０）を使用してプレートに結合した二次抗体を検出し、上述のとおりに展開した。
【００２９】
実施例４：抗体遺伝子のクローニング
ＶＨ及びＶＬの抗体配列を、ハイブリドーマから以下のとおりにクローニングした。製造業者の指示のとおりにＴＲＩＺＯＬ試薬（Invitrogen、カタログ番号１５５９６−０２６）を用いておよそ５×１０６個〜７×１０６個のハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを単離した。全ＲＮＡ  ６μｇと、マウスＩｇＧ１  ＶＨ：ＴＡＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＡＣＡＡＣＣＡＣＡ（配列番号４５）、マウスＩｇＧ３  ＶＨ：ＧＧＧＧＧＴＡＣＴＧＧＧＣＴＴＧＧＧＴＡＴ（配列番号４６）、及びマウスカッパＶＬ：ＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＧＡＣ（配列番号４７）の遺伝子特異的プライマーとを用いて、Ｍａｘｉｍａ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成キット（Thermo Fisher  カタログ番号Ｋ１６６１）を使用して第１鎖ｃＤＮＡの合成を行った。
【００３０】
第１鎖ｃＤＮＡの合成に続いて、ターミナルトランスフェラーゼを用いて各第１鎖ｃＤＮＡの５’末端にポリＡ配列を付加した。結果として得られた５’末端テイルｃＤＮＡ産物を２ラウンドのＰＣＲ増幅に供した。５’ＧＴＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号４８）、マウスＩｇＧ１  ＶＨに対する３’プライマー：ＣＴＴＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴＧＣ（配列番号４９）、マウスＩｇＧ３  ＶＨに対する３’プライマー：ＣＴＴＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＧＡＴＴＣＴＣＴＴＧＡＴＣＡＡＣＴＣＡＧＴＣＴ（配列番号５０）、及びマウスカッパＶＬに対する３’プライマー：ＣＴＴＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＧＡＣＡＡＴＧＧＧ（配列番号５１）のプライマーと共に、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ  ＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ（Agilent Technologies  カタログ番号６００６７９）を用いて、第１ラウンドのＰＣＲ反応を行った
【００３１】
Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（Fisher Scientific  カタログ番号Ｆ５３０Ｌ）を用いる第２ラウンドのＰＣＲにおいて、５’ＧＴＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号４８）、マウスＩｇＧ１  ＶＨに対する３’プライマー：ＡＴＴＡＡＧＴＣＧＡＣＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＧＣ（配列番号５２）、マウスＩｇＧ３  ＶＨに対する３’プライマー：ＡＴＴＡＡＧＴＣＧＡＣＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧ（配列番号５３）、及びマウスカッパＶＬに対する３’プライマー：ＣＴＡＣＣＴＣＧＡＧＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＴＣ（配列番号５４）のプライマーを用いて、第１ラウンドＰＣＲ産物の一部（１／２０）を更に増幅した。
【００３２】
得られたＰＣＲ産物を、ＶＨ  ＰＣＲフラグメントの場合はＣｌａＩ／ＳａｌＩ、及びＶＬ  ＰＣＲフラグメントの場合はＣｌａＩ／ＸｈｏＩの制限酵素対で消化し、標準的な組み換えＤＮＡ手順を用いてクローニングベクターに挿入した。全長ＶＨ／ＶＬクローンを同定するため、適切なサイズ範囲のインサートを含むクローンを配列決定した。
【００３３】
実施例５：全長マウス抗体発現ベクターの構築
全長マウスＩｇＧ重鎖及び軽鎖発現プラスミドを以下のとおりに構築した。
【００３４】
全長のＶＨ配列及びＶＬ配列を含むと上記で同定されたハイブリドーマに由来する全ＲＮＡ  ６μｇを用いて、Ｍａｘｉｍａ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成キット（Thermo Fisher  カタログ番号Ｋ１６６１）を使用し、逆転写酵素（ＲＴ）により第１鎖ｃＤＮＡの合成を行った。オリゴｄＴプライマー及びランダムヘキサマープライマーを別々のＲＴ反応で採用した。オリゴｄＴ産物とランダムプライム化ＲＴ産物とを合わせて、上記で得られた配列情報を用いて設計された下記プライマーセットと共に、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（Fisher Scientific  カタログ番号Ｆ５３０Ｌ）を使用するＰＣＲ増幅のラウンドを経て、ｍｕＭＡｂ１及びｍｕＭＡｂ２に対する全長ｃＤＮＡの供給源として使用した。ｍｕＭＡｂ１及びｍｕＭＡｂ２カッパ軽鎖に対して、５’プライマーＣＡＧＴＣＣＧＣＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＴＴＴＣＡＡＧＴＧＣＡＧＡＴＴＴＴＣ（配列番号５５）、３’プライマーＡＧＧＡＡＧＡＴＣＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣ（配列番号５６）。ｍｕＭＡｂ１マウスＩｇＧ１重鎖に対して、５’ＣＡＧＴＣＣＧＣＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＴＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＴＴ（配列番号５７）、３’プライマーＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＡＴＣＣＡＧＡＧＴＴＣＣＡ（配列番号５８）。ｍｕＭＡｂ２マウスＩｇＧ３重鎖に対して、５’プライマーＣＡＧＴＣＣＧＣＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＴＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＴＴ（配列番号５７）、３’プライマーＣＡＴＧＡＧＡＴＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＧＧＧＡＧＣＧＡＧＡ（配列番号５９）。
【００３５】
増幅されたｍｕＭＡｂ１及びｍｕＭＡｂ２のマウスカッパ軽鎖配列、並びにｍｕＭＡｂ２マウスＩｇＧ３重鎖配列を、ＳａｃＩＩ／ＢｇｌＩＩ制限フラグメントとして哺乳動物発現プラスミドに直接クローニングした。ｍｕＭＡｂ１マウスＩｇＧ１重鎖増幅産物は、ＣＨ１領域のほぼ中間点に対応する内部ＢａｍＨＩ部位を過ぎたところにある遺伝子コード配列の５’末端を表す。それをＳａｃＩＩ／ＢａｍＨＩ制限フラグメントとして先で構築された全長マウスＩｇＧ１重鎖発現プラスミドにクローニングした。全てのクローンをシーケンシングによって検証した。
【００３６】
ｍｕＭＡｂ１及びｍｕＭＡｂ２のアミノ酸配列に対応する配列番号を下記表１に示す。
【００３７】
【表１】
2021519611.tif 000003
【００３８】
実施例６：ヒト化
ｍｕＭＡｂ１及びｍｕＭＡｂ２をヒト化するため、マウス配列をヒト免疫グロブリン遺伝子データベースと比較することにより、マウス抗体配列に対して最も相同性の程度が高いヒト免疫グロブリン生殖細胞系列の配列を同定した。結果は、ｍｕＭＡｂ１とｍｕＭＡｂ２との両方の重鎖に最も近いヒト生殖細胞系列の配列はｈｕＩＧＨＶ４−５９ｘ０１であり、ｍｕＭＡｂ１とｍｕＭＡｂ２との両方の軽鎖に最も近いヒト生殖細胞系列の配列はｈｕＩＧＫＶ３−１１ｘ０１であることを示した。
【００３９】
ｍｕＭＡｂ１及びｍｕＭＡｂ２のヒト化のため、ＣＤＲ領域をヒト配列にグラフトして、ｈｕＭＡｂ１及びｈｕＭＡｂ２をそれぞれ作製した。ｈｕＭＡｂ１及びｈｕＭＡｂ２の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列に対応する配列番号を上記表１に示す。
【００４０】
ヒト化の程度を最大化し、ＣＤＲループの構造的支持を提供するため、ｈｕＭＡｂ１及びｈｕＭＡｂ２の配列中の突然変異をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで設計した。重鎖及び軽鎖の配列中のアミノ酸変化及びそれらの位置を、下記表２〜表５、並びに図１Ａ、図１Ｂ、図２Ａ及び図２Ｂに示す。
【００４１】
【表２】
2021519611.tif 000004
【００４２】
【表３】
2021519611.tif 000005
【００４３】
【表４】
2021519611.tif 000006
【００４４】
【表５】
2021519611.tif 000007
【００４５】
突然変異した全長重鎖及び軽鎖の遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対応する配列番号を上記表１に示す。
【００４６】
上記抗体の全てのＣＤＲ配列の配列番号を下記表６に示す。
【００４７】
【表６】
2021519611.tif 000008
【００４８】
実施例７：ヒト化抗体発現ベクターの構築
標準的な組み換えＤＮＡ技術を用いて、全長ヒト化重鎖及び軽鎖発現プラスミドの構築を行った。（ｉ）ＣＨ１領域の始めにＮｈｅＩ制限部位を生成するために導入されたサイレント突然変異を有する全長ヒトＩｇＧ１重鎖、及び（ｉｉ）ＣＬ定常領域の始めにＢｓｉＷＩ制限部位を生成するために導入されたサイレント突然変異を有する全長ヒトカッパ軽鎖を含むコンストラクトに、フラグメントを適切にクローニングした。
【００４９】
上記で検討した突然変異バリアントに基づく配列を有するＤＮＡフラグメントを、標準的な手法を用いて合成し、適切な発現ベクターにクローニングした。
【００５０】
実施例８：２９３Ｔ細胞における一過性トランスフェクションによる組み換え抗体の産生
ヒト２９３Ｔ胚性腎臓上皮細胞株を、１０％熱不活性化胎児ウシ血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、及びペニシリン／ストレプトマイシン（GIBCO  カタログ番号１５１４０）で補足したＤＭＥＭ（HyClone  カタログ番号ＳＨ３０２４３．０２）で維持した。ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）媒介トランスフェクションを介して、発現コンストラクトを細胞に導入した。簡潔には、１：１の比率で重鎖と軽鎖との発現プラスミドを組み合わせることによりＤＮＡミックスを調製した。その後、１．５：１のＰＥＩ対ＤＮＡ比でＰＥＩ／ＤＮＡ複合体を形成し、２０分間インキュベートした後、培養細胞に添加した。トランスフェクションの２日後、培養培地を取り除き、新鮮な培地に置き換えた。トランスフェクション後５日目に、分析のため上清を採取した。
【００５１】
組み換え抗体の大規模な生産を、上記のとおりにヒト２９３Ｔ細胞に重鎖及び軽鎖の発現プラスミドをトランスフェクトすることによって行った。３日後、トランスフェクトされた細胞を採取し、シェーカーフラスコ中の６ｍＭのＬ−グルタミンを補足した血清不含培地（HyClone  ＣＤＭ４ＨＥＫ２９３  カタログ番号ＳＨ３０８５８０２）に播種した。細胞増殖及び抗体産生をモニターし、細胞生存率が５０％を下回った場合に抗体精製のため培養上清を採取した。
【００５２】
重鎖と軽鎖との種々の組み合わせの発現を、上記の重鎖及び軽鎖発現プラスミドの同時トランスフェクションにより行った。これらの組み換え抗体の親和性を下記表７に示す。
【００５３】
【表７】
2021519611.tif 000009
【００５４】
また、２つの組み換えヒト化抗体、すなわち、ｈｕＭＡｂ３及びｈｕＭＡｂ４の結合親和性を、標準的な手順を用いる表面プラズモン共鳴アッセイによって決定した。ｈｕＭＡｂ３のＫｄ値は５０ｎＭ〜９０ｎＭであった。ｈｕＭＡｂ４のＫｄ値はおよそ０．４μＭであった。
【００５５】
結果は、ＥＬＩＳＡ又は表面プラズモン共鳴のいずれかによって測定されるように、ｈｕＭＡｂ３がＳＳＥＡ４に対して高い親和性を有することを示した。
【００５６】
その他の実施形態
本明細書に開示されるあらゆる特徴は、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書に開示されるそれぞれの特徴は、同じ目的、同等の目的又は同様の目的を担う代替的な特徴により置き換えることができる。特段の定めがない限り、開示されるそれぞれの特徴は、包括的な一連の同等の特徴又は同様の特徴の１つの例であるにすぎない。
【００５７】
上記説明から、当業者は本発明の必須の特性を容易に把握することができ、その趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明に様々な変化及び変更を加えることで、本発明を様々な用途及び条件に適合させることができる。したがって、その他の実施形態も添付の特許請求の範囲の範囲内である。
【図１Ａ】
2021519611.tif 000010
【図１Ｂ】
2021519611.tif 000011
【図２Ａ】
2021519611.tif 000012
【図２Ｂ】
2021519611.tif 000013
【配列表】
2021519611000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年2月5日(2021.2.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３３又は配列番号４０の配列を有する重鎖ＣＤＲ１（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号３４又は配列番号３９の配列を有する重鎖ＣＤＲ２（Ｈ−ＣＤＲ２）、配列番号３５又は配列番号４１の配列を有する重鎖ＣＤＲ３（Ｈ−ＣＤＲ３）、配列番号３６又は配列番号４２の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号３７又は配列番号４３の配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ−ＣＤＲ２）、及び配列番号３８又は配列番号４４の配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
該モノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントがステージ特異的胚抗原４に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
前記Ｈ−ＣＤＲ１が配列番号３３の配列を有し、前記Ｈ−ＣＤＲ２が配列番号３４の配列を有し、前記Ｈ−ＣＤＲ３が配列番号３５の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ１が配列番号４２の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ２が配列番号４３の配列を有し、前記Ｌ−ＣＤＲ３が配列番号４４の配列を有する、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項３】
配列番号２、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号２２、配列番号２４、及び配列番号２６からなる群から選択される重鎖配列と、配列番号４、配列番号８、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２８、配列番号３０、及び配列番号３２からなる群から選択される軽鎖配列とを含む、単離されたモノクローナル抗体であって、該モノクローナル抗体がステージ特異的胚抗原４に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体。
【請求項４】
前記重鎖配列が配列番号１４であり、前記軽鎖配列が配列番号２８である、請求項３に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項５】
前記重鎖配列が配列番号１４であり、前記軽鎖配列が配列番号３０である、請求項３に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項６】
前記重鎖配列が配列番号１４であり、前記軽鎖配列が配列番号３２である、請求項３に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項７】
前記重鎖配列が配列番号２であり、前記軽鎖配列が配列番号４である、請求項３に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項８】
前記重鎖配列が配列番号６であり、前記軽鎖配列が配列番号８である、請求項３に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項９】
請求項１に記載のモノクローナル抗体、又はその抗原結合フラグメントをコードする、核酸コンストラクト。
【請求項１０】
Ｈ−ＣＤＲ１が配列番号３３の配列を有し、Ｈ−ＣＤＲ２が配列番号３４の配列を有し、Ｈ−ＣＤＲ３が配列番号３５の配列を有し、Ｌ−ＣＤＲ１が配列番号４２の配列を有し、Ｌ−ＣＤＲ２が配列番号４３の配列を有し、Ｌ−ＣＤＲ３が配列番号４４の配列を有する、請求項９に記載の核酸コンストラクト。
【請求項１１】
請求項３に記載のモノクローナル抗体をコードする核酸コンストラクト。
【請求項１２】
重鎖配列が配列番号１４であり、軽鎖配列が配列番号２８である、請求項１１に記載の核酸コンストラクト。
【請求項１３】
請求項９に記載の核酸コンストラクトを含む組み換え細胞であって、該細胞がステージ特異的胚抗原４に特異的に結合するモノクローナル抗体を発現する、組み換え細胞。
【請求項１４】
Ｈ−ＣＤＲ１が配列番号３３の配列を有し、Ｈ−ＣＤＲ２が配列番号３４の配列を有し、Ｈ−ＣＤＲ３が配列番号３５の配列を有し、Ｌ−ＣＤＲ１が配列番号４２の配列を有し、Ｌ−ＣＤＲ２が配列番号４３の配列を有し、Ｌ−ＣＤＲ３が配列番号４４の配列を有する、請求項１３に記載の組み換え細胞。
【請求項１５】
請求項１１に記載の核酸コンストラクトを含む組み換え細胞であって、該細胞がステージ特異的胚抗原４に特異的に結合するモノクローナル抗体を発現する、組み換え細胞。
【請求項１６】
重鎖配列が配列番号１４であり、軽鎖配列が配列番号２８である、請求項１５に記載の核酸。
【請求項１７】
腫瘍を治療するための組成物であって、請求項１に記載のモノクローナル抗体を含む組成物。
【請求項１８】
Ｈ−ＣＤＲ１が配列番号３３の配列を有し、Ｈ−ＣＤＲ２が配列番号３４の配列を有し、Ｈ−ＣＤＲ３が配列番号３５の配列を有し、Ｌ−ＣＤＲ１が配列番号４２の配列を有し、Ｌ−ＣＤＲ２が配列番号４３の配列を有し、Ｌ−ＣＤＲ３が配列番号４４の配列を有する、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
腫瘍を治療するための組成物であって、請求項３に記載のモノクローナル抗体を含む組成物。
【請求項２０】
重鎖配列が配列番号１４であり、軽鎖配列が配列番号２８である、請求項１９に記載の組成物。
【国際調査報告】
2021519611.tif 000014
2021519611.tif 000015
2021519611.tif 000016
2021519611.tif 000017