(57)【要約】  Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼを阻害し得る化合物、その化合物を含む組成物及びキット、ならびにその化合物の使用方法を開示する。2021523111.tif 000072【選択図】なし
2021523111.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（Ｉ）の化合物、
2021523111.tif 000067
（Ｉ）
またはその互変異性体もしくは塩であって、式中、
Ｒ1が、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換された複素環または任意に置換されたシクロアルキルであり、Ｒ1が、−Ｑ−Ｌ−Ｚである少なくとも１つの基で置換されており、
Ｑが、−Ｏ−、−ＮＲQ−、−ＮＲQ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＲQ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＲQ−または−ＮＲQ−ＣＯ−Ｏ−であり、
Ｌが、−（ＣＲ1aＲ1b）m−、−（ＣＲ1xＲ1y−ＣＲ1xＲ1y−Ｏ）t1−（ＣＲ1xＲ1y）t2−Ｑ1−、−（ＣＲ1xＲ1y）t2−Ａ−（ＣＲ1xＲ1y−ＣＲ1xＲ1y−Ｏ）t1−Ｑ1−、−（ＣＲ1xＲ1y）t3−Ａ−（ＣＲ1xＲ1y−ＣＲ1xＲ1y−Ｏ）t1−（ＣＲ1xＲ1y）t2−または−（ＣＲ1xＲ1y）t3−Ａ−（ＣＲ1xＲ1y）t4−であり、各Ｑ1が独立して、結合手、−Ｏ−または−ＮＲQ1−であり、各Ａが独立して、結合手、−Ｏ−、−ＮＲQ−、−ＮＲQ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＲQ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＲQ−または−ＮＲQ−ＣＯ−Ｏ−であり、
Ｚが、−ＣＯＯＲ2、−ＳＯ2−ＯＲ3、−ＰＯ（ＯＲ4）（ＯＲ5）、ハロ、アジド、Ｃ2−Ｃ10アルキニル、ビオチン部分、−ＮＲ6Ｒ7、−ＮＲ8−ＣＯ−Ｒ9、−ＣＯ−Ｒ10または−ＮＲ11−ＣＯ−Ｏ−Ｒ12であり、
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11及びＲ12が各出現ごとに独立して、水素、任意に置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたシクロアルケニル、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換された複素環、任意に置換されたヘテロアルキルまたはエネルギーアクセプターであり、
Ｒ6及びＲ7が各出現ごとに独立して、水素、任意に置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換された複素環、任意に置換されたヘテロアルキルもしくはエネルギーアクセプターであるか、またはＲ6及びＲ7が、それらと結合している窒素原子と一体となって、任意に置換された環を形成し、
Ｒ1a、Ｒ1b、ＲQ、ＲQ1、Ｒ1x及びＲ1yが各出現ごとに独立して、水素、Ｃ1−Ｃ4アルキルまたはＣ1−Ｃ4ハロアルキルであり、
ｑが、０、１または２であり、
ｍが各出現ごとに独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２であり、
ｔ１が各出現ごとに独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり、
ｔ２が、０〜５の整数であり、
ｔ３が各出現ごとに、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり、
ｔ４が、０〜５の整数であり、
前記化合物が、４−［４−［［８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−７Ｈ−イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル］メチル］フェノキシ］ブタン酸ではない前記化合物、またはその互変異性体もしくは塩。
【請求項２】
ｑが１である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ1が、−Ｑ−Ｌ−Ｚという１つの置換基で置換されたフェニルであり、任意に、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アシルアミノ、アミノアルキル、スルホニルアミノ、スルフィニルアミノ、スルホニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アミノスルホニル、スルフィニル、−ＣＯＯＨ、ケトン、アミド、カルバメート、シリル、置換シリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、アルキルスルファニル、スルファニル及びアシルから独立して選択した１つまたは２つの置換基でさらに置換されており、
Ｑが、−Ｏ−、−ＮＲQ−、−ＮＲQ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＲQ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＲQ−または−ＮＲQ−ＣＯ−Ｏ−であり、
Ｌが、−（ＣＲ1aＲ1b）m−であり、
Ｚが、−ＳＯ2−ＯＲ3、アジド、−ＮＲ6Ｒ7または−ＮＲ8−ＣＯ−Ｒ9であり、
Ｒ3、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8が独立して、水素、任意に置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたシクロアルケニル、任意に置換されたヘテロアリールまたは任意に置換された複素環であり、
Ｒ9が、任意に置換されたヘテロアルキルまたはエネルギーアクセプターである、請求項１〜２のいずれかに記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ1が、−Ｑ−Ｌ−Ｚという１つの置換基で置換されたフェニルであり、任意に、１つのハロゲンでさらに置換されている、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
下記の式（Ｉａ）の化合物であって、
2021523111.tif 000068
（Ｉａ）
式中、
Ｒ1zがハロゲンである、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｑが、Ｏであり、
Ｌが、−（ＣＲ1aＲ1b）m−であり、
Ｒ1a及びＲ1bが、水素であり、
ｍが、５、６、７、８、９または１０であり、
Ｚが、−ＮＲ8−ＣＯ−Ｒ9であり、
Ｒ8が、水素であり、
Ｒ9が、エネルギーアクセプターである、請求項４〜５のいずれかに記載の化合物。
【請求項７】
前記エネルギーアクセプターが、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、ピレン、シアニン、スクアライン及びホウ素−ジピロメテンから選択した蛍光色素である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
前記−Ｑ−Ｌ−Ｚという基が、
2021523111.tif 000069
2021523111.tif 000070
2021523111.tif 000071
から選択した構造を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
２−（４−（（６−アミノヘキシル）オキシ）−３−フルオロベンジル）−８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
Ｎ−（６−（４−（（８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）ヘキシル）−３’，６’−ビス（ジメチルアミノ）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６−カルボキサミド、
６−（４−（（８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）ヘキサン−１−スルホン酸、
Ｎ−（６−（４−（（８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）ヘキシル）−３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６−カルボキサミド、
Ｎ−（６−（４−（（８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）ヘキシル）−３−（５，５−ジフルオロ−７−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−５Ｈ−５ｌ４，６ｌ４−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−３−イル）プロパンアミド、
Ｎ，Ｎ’−（６−（（６−（４−（（８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）ヘキシル）カルバモイル）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−３’，６’−ジイル）ビス（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）、
Ｎ−（８−（４−（（８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）−３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６−カルボキサミド、
Ｎ−（８−（４−（（８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）−３’，６’−ビス（ジメチルアミノ）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６−カルボキサミド、
３−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）−Ｎ−（８−（４−（（１−ベンジル−３−（４−ヒドロキシフェニル）−６−オキソ−２，６−ジヒドロピロロ［１，２−ａ］ピラジン−７−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）プロパンアミド、
Ｎ−（２−（２−（３−（（８−（４−（（１−ベンジル−３−（４−ヒドロキシフェニル）−６−オキソ−２，６−ジヒドロピロロ［１，２−ａ］ピラジン−７−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）アミノ）−３−オキソプロポキシ）エトキシ）エチル）−３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６−カルボキサミド、
Ｎ−（２−（２−（３−（（８−（４−（（１−ベンジル−３−（４−ヒドロキシフェニル）−６−オキソ−２，６−ジヒドロピロロ［１，２−ａ］ピラジン−７−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）アミノ）−３−オキソプロポキシ）エトキシ）エチル）−３’，６’−ビス（ジメチルアミノ）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６−カルボキサミド、
６−（（８−（４−（（８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）カルバモイル）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−３’，６’−ジイルジアセテート、
２−（４−（（６−アジドヘキシル）オキシ）−３−フルオロベンジル）−８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
５−（（８−（４−（（８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）カルバモイル）−２−（２，７−ジフルオロ−３，６−ジヒドロキシキサンチリウム−９−イル）ベンゾエート、
５−（（８−（４−（（８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）カルバモイル）−２−（３，１１−ジヒドロキシジベンゾ［ｃ，ｈ］キサンテン−１４−イウム−７−イル）ベンゾエート、
Ｎ１−（８−（４−（（８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）−Ｎ４−（２−（５，５−ジフルオロ−１，３−ジメチル−５Ｈ−５λ4，６λ4−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−１０−イル）エチル）コハク酸アミド、
Ｎ1−（８−（４−（（８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）−Ｎ4−（ジベンジルシクロオクテニル）−コハク酸アミド及び
（Ｅ）−シクロオクト−４−エン−１−イル（８−（４−（（８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）カルバメート
からなる群から選択された、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
試料中のＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼの検出方法であって、前記試料と、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物を接触させる工程を含む前記方法。
【請求項１１】
前記試料における発光を検出する工程をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
試料における発光の検出方法であって、
（ａ）前記試料と、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物を接触させる工程、
（ｂ）Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼが前記試料に存在しない場合には、前記試料と、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼを接触させる工程、及び
（ｃ）前記試料における発光を検出する工程、
を含む前記方法。
【請求項１３】
試料中の、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼの標識方法であって、前記試料と、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物を接触させる工程を含む前記方法。
【請求項１４】
試料中の、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼの標識方法であって、
（ａ）前記試料と、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物を接触させる工程、ここで、前記化合物が、少なくとも１つの蛍光色素を含む、
（ｂ）前記接触工程後に、前記試料を洗浄して、任意の未反応であるかまたは分解された化合物を除去する工程、及び
（ｃ）前記洗浄工程後に、前記試料における蛍光を検出する工程、
を含む前記方法。
【請求項１５】
試料中の、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼの標識方法であって、
（ａ）前記試料と、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物を接触させる工程、ここで、前記化合物が、第１の官能基を含む、
（ｂ）前記試料を洗浄して、任意の未反応であるかまたは分解された化合物を除去する工程、
（ｃ）前記試料と、第２の官能基を含む蛍光色素とを接触させる工程、ここで、前記第２の官能基が、前記第１の官能基と反応するか、または前記第１の官能基に結合することができる、
（ｄ）前記試料を洗浄して、任意の未反応の蛍光色素を除去する工程、及び
（ｅ）前記試料における蛍光を検出する工程、
を含む前記方法。
【請求項１６】
前記第１の官能基が、アジドであり、前記第２の官能基が、アルキンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の官能基が、アルキンであり、前記第２の官能基が、アジドである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１の官能基が、ビオチン部分であり、前記第２の官能基が、ストレプトアビジンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
試料からのＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼの単離方法であって、前記試料が、生細胞を含み、前記方法が、
（ａ）Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼを含む生細胞試料と、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物を接触させる工程、ここで、前記化合物が、第１の官能基を有する、
（ｂ）前記試料を洗浄して、任意の未反応であるかまたは分解された化合物を除去する工程、
（ｃ）前記試料と、１つ以上の溶解試薬を接触させる工程、
（ｄ）前記第１の官能基に結合するか、または前記第１の官能基と反応する第２の官能基を有する捕捉剤を前記試料に加えて、前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼを捕捉する工程、
（ｅ）前記試料を洗浄して、捕捉されなかったＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼを除去する工程、及び
（ｆ）工程（ｅ）で捕捉された前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼを単離する工程、
を含む前記方法。
【請求項２０】
試料からのＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼの単離方法であって、前記試料が、生細胞を含み、前記方法が、
（ａ）Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼを含む試料と、１つ以上の溶解試薬を接触させる工程、
（ｂ）Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼを含む生細胞試料と、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物を接触させる工程、ここで、前記化合物が、第１の官能基を有する、
（ｃ）前記試料を洗浄して、任意の未反応であるかまたは分解された化合物を除去する工程、
（ｄ）前記第１の官能基に結合するか、または前記第１の官能基と反応する第２の官能基を有する捕捉剤を前記試料に加えて、前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼを捕捉する工程、
（ｅ）前記試料を洗浄して、捕捉されなかったＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼを除去する工程、及び
（ｆ）工程（ｅ）で捕捉された前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼを単離する工程、
を含む前記方法。
【請求項２１】
前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼが、配列番号２のポリペプチド配列を含む、請求項１０〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
試料中の、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼの阻害方法であって、前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼと、請求項１〜９のいずれかに記載の化合物を接触させる工程を含む前記方法。
【請求項２３】
前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼが、配列番号２のポリペプチド配列を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼを不可逆的に阻害する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼを部分的に阻害する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
試料中の、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼの発光の調節方法であって、
（ａ）前記試料と、基質セレンテラジン及び請求項１〜９のいずれかに記載の化合物を接触させる工程、ならびに
（ｂ）前記試料における発光を検出する工程、
を含み、
請求項１〜９のいずれかに記載の化合物により、前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼによる発光が減少する前記方法。
【請求項２７】
前記試料と、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物を接触させる前に、前記試料と、前記基質セレンテラジンを接触させる工程を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記試料と、前記基質セレンテラジンを接触させる前に、前記試料と、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物を接触させる工程を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
試料中の、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼの発光の調節方法であって、
（ａ）前記試料と、請求項１〜９のいずれかに記載の化合物を接触させる工程、
（ｂ）前記試料と、基質セレンテラジンを接触させる工程、及び
（ｃ）前記試料における発光を検出する工程、
を含み、
請求項１〜９のいずれかに記載の化合物により、前記基質セレンテラジンを加えたときに、前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼによる発光の増大が阻止される前記方法。
【請求項３０】
前記試料が、細胞を含む、請求項１０〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞が、前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞が、前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼを発現する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記基質セレンテラジンが、セレンテラジン、セレンテラジン誘導体、セレンテラジン類似体、プロセレンテラジン、またはキノンでマスクされたセレンテラジンである、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
（ａ）請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物、及び
（ｂ）Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼ、
を含むキット。
【請求項３５】
前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼが、配列番号２のポリペプチド配列を含む、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
基質セレンテラジンをさらに含む、請求項３４に記載のキット。
【請求項３７】
発光アッセイを実施するための説明をさらに含む、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１８年５月１日に出願した米国特許仮出願第６２／６６５，３４６号に基づく優先権の利益を主張するものであり、この仮出願は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
【０００２】
本開示は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼを検出または阻害するのに使用し得る化合物に対するものである。
【背景技術】
【０００３】
生物学、生化学、免疫学、細胞生物学及び分子生物学の分野において、分子イベントをモニタリングする目的で、レポーター分子が日常的に用いられている。深海エビＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ  ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓから分泌されるルシフェラーゼベースのルシフェラーゼは、レポーター分子として使用でき、広範な基質特異性、高い活性及び高い量子収率を含む有益な特徴を持つことが示されている。特定の用途では、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼによる発光シグナルを標識または制御することがさらに有益な場合がある。
【発明の概要】
【０００４】
一態様では、本開示は、下記の式（Ｉ）の化合物もしくはその塩、
2021523111.tif 000003
（Ｉ）
またはその互変異性体もしくは塩であって、式中、
Ｒ1が、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換された複素環または任意に置換されたシクロアルキルであり、Ｒ1が、−Ｑ−Ｌ−Ｚである少なくとも１つの基で置換されており、
Ｑが、−Ｏ−、−ＮＲQ−、−ＮＲQ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＲQ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＲQ−または−ＮＲQ−ＣＯ−Ｏ−であり、
Ｌが、−（ＣＲ1aＲ1b）m−、−（ＣＲ1xＲ1y−ＣＲ1xＲ1y−Ｏ）t1−（ＣＲ1xＲ1y）t2−Ｑ1−、−（ＣＲ1xＲ1y）t2−Ａ−（ＣＲ1xＲ1y−ＣＲ1xＲ1y−Ｏ）t1−Ｑ1−、−（ＣＲ1xＲ1y）t3−Ａ−（ＣＲ1xＲ1y−ＣＲ1xＲ1y−Ｏ）t1−（ＣＲ1xＲ1y）t2−または−（ＣＲ1xＲ1y）t3−Ａ−（ＣＲ1xＲ1y）t4−であり、各Ｑ1が独立して、結合手、−Ｏ−または−ＮＲQ1−であり、各Ａが独立して、結合手、−Ｏ−、−ＮＲQ−、−ＮＲQ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＲQ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＲQ−または−ＮＲQ−ＣＯ−Ｏ−であり、
Ｚが、−ＣＯＯＲ2、−ＳＯ2−ＯＲ3、−ＰＯ（ＯＲ4）（ＯＲ5）、ハロ、アジド、Ｃ2−Ｃ10アルキニル、ビオチン部分、−ＮＲ6Ｒ7、−ＮＲ8−ＣＯ−Ｒ9、−ＣＯ−Ｒ10または−ＮＲ11−ＣＯ−Ｏ−Ｒ12であり、
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11及びＲ12が各出現ごとに独立して、水素、任意に置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたシクロアルケニル、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換された複素環、任意に置換されたヘテロアルキルまたはエネルギーアクセプターであり、
Ｒ6及びＲ7が各出現ごとに独立して、水素、任意に置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換された複素環、任意に置換されたヘテロアルキルもしくはエネルギーアクセプターであるか、またはＲ6及びＲ7が、それらと結合している窒素原子と一体となって、任意に置換された環を形成し、
Ｒ1a、Ｒ1b、ＲQ、ＲQ1、Ｒ1x及びＲ1yが各出現ごとに独立して、水素、Ｃ1−Ｃ4アルキルまたはＣ1−Ｃ4ハロアルキルであり、
ｑが、０、１または２であり、
ｍが各出現ごとに独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２であり、
ｔ１が各出現ごとに独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり、
ｔ２が、０〜５の整数であり、
ｔ３が各出現ごとに、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり、
ｔ４が、０〜５の整数であり、
その化合物が、４−［４−［［８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−７Ｈ−イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル］メチル］フェノキシ］ブタン酸ではない化合物、またはその互変異性体もしくは塩を提供する。
【０００５】
一態様では、本開示は、試料中の、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼの標識方法であって、そのＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼと、本明細書に記載の化合物を接触させることを含む方法を提供する。
【０００６】
一態様では、本開示は、試料中の、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼの標識方法であって、
（ａ）その試料と、本発明で開示される化合物を接触させること、及び
（ｂ）その試料における発光を検出すること、
を含む方法を提供する。
【０００７】
一態様では、本開示は、試料中の、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼの検出方法であって、その試料と、式（Ｉ）の化合物のような、本明細書に記載の化合物を接触させることを含む方法を提供する。
【０００８】
一態様では、本開示は、試料における発光の検出方法であって、
（ａ）その試料と、式（Ｉ）の化合物のような、本明細書に記載の化合物を接触させること、
（ｂ）その試料にＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼが存在しない場合に、その試料と、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼを接触させること、及び
（ｃ）その試料における発光を検出すること、
を含む方法を提供する。
【０００９】
一態様では、本開示は、試料中の、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼの標識方法であって、その試料と、式（Ｉ）の化合物のような、本明細書に記載の化合物を接触させることを含む方法を提供する。
【００１０】
一態様では、本開示は、試料中の、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼの標識方法であって、
（ａ）その試料と、式（Ｉ）の化合物のような、本明細書に記載の化合物を接触させることであって、その化合物が、少なくとも１つの蛍光色素を含む接触させること、
（ｂ）その接触工程後に、その試料を洗浄して、任意の未反応であるかまたは分解された化合物を除去すること、及び
（ｃ）その洗浄工程後に、その試料における蛍光を検出すること、
を含む方法を提供する。
【００１１】
一態様では、本開示は、試料中の、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼの標識方法であって、
（ａ）その試料と、式（Ｉ）の化合物のような、本明細書に記載の化合物を接触させることであって、その化合物が、第１の官能基を含む接触させること、
（ｂ）その試料を洗浄して、任意の未反応であるかまたは分解された化合物を除去すること、
（ｃ）その試料と、第２の官能基を含む蛍光色素を接触させることであって、その第２の官能基が、第１の官能基と反応するか、または第１の官能基に結合することができる接触させること、
（ｄ）その試料を洗浄して、任意の未反応の蛍光色素を除去すること、及び
（ｅ）その試料における蛍光を検出すること、
を含む方法を提供する。
【００１２】
一態様では、本開示は、試料からのＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼの単離方法であって、その試料が、生細胞を含み、その方法が、
（ａ）Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼを含む生細胞試料と、式（Ｉ）の化合物のような、本明細書に記載の化合物を接触させることであって、その化合物が、第１の官能基を有する接触させること、
（ｂ）その試料を洗浄して、任意の未反応であるかまたは分解された化合物を除去すること、
（ｃ）その試料と、１つ以上の溶解試薬を接触させること、
（ｄ）その試料に、第１の官能基に結合するか、または第１の官能基と反応する第２の官能基を有する捕捉剤を加えて、そのＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼを捕捉すること、
（ｅ）その試料を洗浄して、捕捉されなかった、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼを除去すること、及び
（ｆ）工程（ｅ）で捕捉された、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼを単離すること、
を含む方法を提供する。
【００１３】
一態様では、本開示は、試料からのＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼの単離方法であって、その試料が、生細胞を含み、その方法が、
（ａ）Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼを含む試料と、１つ以上の溶解試薬を接触させること、
（ｂ）Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼを含む生細胞試料と、式（Ｉ）の化合物のような、本明細書に記載の化合物を接触させることであって、その化合物が、第１の官能基を有する接触させること、
（ｃ）その試料を洗浄して、任意の未反応であるかまたは分解された化合物を除去すること、
（ｄ）その試料に、第１の官能基に結合するか、または第１の官能基と反応する第２の官能基を有する捕捉剤を加えて、そのＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼを捕捉すること、
（ｅ）その試料を洗浄して、捕捉されなかった、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼを除去すること、及び
（ｆ）工程（ｅ）で捕捉された、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼを単離すること、
を含む方法を提供する。
【００１４】
一態様では、本開示は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼの阻害方法であって、そのＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼと、式（Ｉ）の化合物のような、本明細書に記載の化合物を接触させることを含む方法を提供する。
【００１５】
一態様では、本開示は、試料中の、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼの発光の調節方法であって、
（ａ）その試料と、基質セレンテラジン及び式（Ｉ）の化合物のような、本明細書に記載の化合物を接触させること、ならびに
（ｂ）その試料における発光を検出すること、
を含み、
その化合物により、そのＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼによる発光が減少する方法を提供する。
【００１６】
一態様では、本開示は、
（ａ）式（Ｉ）の化合物のような、本明細書に記載の化合物、及び
（ｂ）Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼ、を含むキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】例示的な化合物の生化学的な生物発光活性及び自己発光活性をフリマジン（Ｆｚ）と比較したものを示している。
【図２】ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液中の１０μＭのフリマジン及びフリマジン−ｈを２ｎｇ／ｍＬのＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ（Ｎｌｕｃ）と合わせたものの動態的読み取り値を示している。
【図３】Ａ〜Ｂは、フリマジン−ｈで処理したＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ（Ｎｌｕｃ）が、様々な濃度のフリマジンに応答しなくなることを示している。
【図４Ａ】例示的な化合物のＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ（Ｎｌｕｃ）に対する阻害活性をフリマジンと比較したものを示している。
【図４Ｂ】例示的な化合物のＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ（Ｎｌｕｃ）に対する阻害活性をフリマジンと比較したものを示している。
【図４Ｃ】例示的な化合物のＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ（Ｎｌｕｃ）に対する阻害活性をフリマジンと比較したものを示している。
【図４Ｄ】例示的な化合物のＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ（Ｎｌｕｃ）に対する阻害活性をフリマジンと比較したものを示している。
【図４Ｅ】例示的な化合物のＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ（Ｎｌｕｃ）に対する阻害活性をフリマジンと比較したものを示している。
【図４Ｆ】例示的な化合物のＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ（Ｎｌｕｃ）に対する阻害活性をフリマジンと比較したものを示している。
【図５Ａ】ＪＲＷ−０８５５のＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ（Ｎｌｕｃ）に対する部分的阻害活性を示している。
【図５Ｂ】ＪＲＷ−１０８８のＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ（Ｎｌｕｃ）に対する部分的阻害活性を示している。
【図６Ａ】ＪＲＷ−０８５７が、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ（Ｎｌｕｃ）を阻害しないことを示している。
【図６Ｂ】ＪＲＷ−１０５９が、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ（Ｎｌｕｃ）を阻害しないことを示している。
【図７】ＮａｎｏＢｉＴ（商標）２分子ルシフェラーゼのフリマジン−ｈによる阻害を示している。
【図８】Ａ〜Ｂは、２つの蛍光性ＦＡＭ−基質セレンテラジン、ＪＲＷ−０９０６及びＪＲＷ−０９２６でＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ（Ｎｌｕｃ）が蛍光標識されることを示している。標識の効率は、グルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ（Ｎｌｕｃ）のいずれかとのＨａｌｏＴａｇ（登録商標）融合体を用いて、基質クロロアルカン−ＦＡＭの効率と比較した。
【図９】最初に、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ（Ｎｌｕｃ）をフリマジンに暴露した後でも、フリマジン−ｈがＮｌｕｃを阻害する活性を示している。
【図１０】Ａ〜Ｂは、付加されたアジドを有する基質を用いた後に、付加されたＦＡＭ色素を有するアルキン化合物と反応させた２段階標識プロセスの結果を示している。
【図１１】Ａ〜Ｂは、付加されたアジドを有する基質を用いた後に、付加されたＦＡＭ色素を有するアルキン化合物と反応させた２段階標識プロセスの結果を示している。
【図１２】Ａ〜Ｃは、アルケン−テトラジン対を用いた追加の２段階標識プロセスの結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明で開示するのは、セレンテラジン類似体である。開示されている化合物は、セレンテラジン類似体コア、共有結合鎖リンカー及び官能基を含んでよい。そのセレンテラジン類似体コアは、ルシフェラーゼに、その酵素の結合部位で結合し得る。本発明の化合物は、自殺阻害剤のように、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼに対する標識試薬として有用である場合がある。本発明の化合物が、共有結合でテザリングされた官能基をさらに含むときには、その化合物はさらに、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼを検出するのに使用し得る。開示されている化合物は、配列番号２のルシフェラーゼ（本明細書では同義的に「ＮａｎｏＬｕｃ」、「Ｎｌｕｃ」、「Ｎｌｕｃルシフェラーゼ」及び「ＮＬｕｃ酵素」ともいう）のような、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼの選択的基質であり得る。
【００１９】
開示されている化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼの阻害剤であり得る。開示されている化合物は、配列番号２のルシフェラーゼ（本明細書では同義的に「ＮａｎｏＬｕｃ」、「Ｎｌｕｃ」、「Ｎｌｕｃルシフェラーゼ」及び「ＮＬｕｃ酵素」ともいう）のような、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼを選択的に阻害し得る。開示されている化合物は、そのＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼのルシフェラーゼ活性を不可逆的に阻害する自殺阻害剤であり得る。開示されている化合物は、そのＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼのルシフェラーゼ活性を部分的に低減する部分的阻害剤であり得る。開示されている化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼの自殺基質であって、初めに、そのルシフェラーゼと反応して生物発光シグナルを生成し、続いて、そのＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼを不可逆的に阻害する自殺基質であり得る。開示されている化合物は、ＮａｎｏＬｕｃ及び相補的な酵素系ＮａｎｏＢｉＴを阻害し得る。
【００２０】
開示されている化合物は、生細胞イメージング、細胞選別またはヒストグラム染色で用いるために、蛍光色素または発色団に付加し得る。開示されている化合物は、対象とするＮａｎｏＬｕｃ融合タンパク質を表面または固体に捕捉または固定化するのに使用し得る。開示されている化合物は、様々な生体分子に付加して、ＮａｎｏＬｕｃまたはＮａｎｏＢｉＴを適切な官能基でポストラベリングするのに使用し得る。開示されている化合物は、ＮａｎｏＬｕｃを蛍光標識するための２段階式の方法で使用し得る。例えば、開示されている化合物を反応性官能基に付加してよく、相補的な反応性基を有する蛍光色素を、蛍光標識するＮａｎｏＬｕｃに付加することができる。例示的な実施形態では、開示されている化合物は、アジドを含んでよく、アルキンにコンジュゲートされた蛍光色素を、蛍光標識するＮａｎｏＬｕｃに付加することができる。
【００２１】
開示されている化合物を改変して、細胞透過性化合物及び細胞不透過性化合物の両方を作製し得る。その安定性と、細胞から排出される潜在性から、特定の用途では、選択的阻害剤を用いて、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼによる発光を抑制するのが有益である場合がある。例えば、複数の発光系の時間的マルチプレックス化を伴う用途では、１度に１つの発光シグナルのみを測定及び／または検出可能にするために、各系に対する選択的阻害剤があるのが有益であり得る。加えて、いくつかのプレートベースアッセイでは、特定量のルシフェラーゼが細胞から排出されることがある。細胞外阻害剤の化合物は、排出されたルシフェラーゼによる発光を選択的に抑制可能にするので、特定のアッセイにおけるシグナルノイズ比を向上させるのを助け得る。
【００２２】
１．定義
別段の定義のない限り、本明細書で用いられているすべての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。矛盾が生じた場合には、定義を含め、本書が優先されることになる。好ましい方法及び材料が下に記載されているが、本発明を実施または試験する際には、本明細書に記載の方法及び材料と類似または同等のものを使用することができる。本明細書で言及されているすべての刊行物、特許出願、特許及びその他の参照文献は、参照により、その全体が援用される。本明細書に開示されている材料、方法及び例は、例示的なものに過ぎず、限定するようには意図されていない。
【００２３】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ）」、「有すること」、「有する」、「できる」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ）」という用語、及びそれらの互換表現は、本明細書で使用する場合、追加の行為または構造の可能性を排除しないオープンエンドの移行句、用語または単語であることが意図されている。文脈によって明らかに別段に示されない限り、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という単数形には、複数の指示対象が含まれる。本開示では、明示されているか否かにかかわらず、本明細書に示されている実施形態または要素を「含む」他の実施形態、本明細書に示されている実施形態または要素「からなる」他の実施形態、及び本明細書に示されている実施形態または要素「から本質的になる」他の実施形態も企図される。
【００２４】
本明細書中の数値範囲の列挙に関しては、同程度の精度である、その間の各数字が明示的に企図されている。例えば、６〜９の範囲では、６及び９に加えて、７及び８という数字が企図されており、６．０〜７．０の範囲では、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９及び７．０という数字が明示的に企図されている。
【００２５】
具体的な官能基及び化学用語の定義は、下にさらに詳細に記載されている。本開示の目的では、化学元素は、ＣＡＳ式の元素周期表（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，７５thＥｄ．、内表紙）に従って定められており、具体的な官能基は概して、本明細書に記載のように定義されている。加えて、有機化学の一般原理、ならびに具体的な機能性部分及び反応性は、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｓｏｒｒｅｌｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｏｏｋｓ，Ｓａｕｓａｌｉｔｏ，１９９９、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｍａｒｃｈ  Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５th  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１、Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９、Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ，Ｓｏｍｅ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，３rd  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，１９８７に記載されており、これらの各文献の内容全体は、参照により、本明細書に援用される。
【００２６】
「アルコキシ」という用語は、本明細書で使用する場合、本明細書に定義されているようなアルキル基が、親分子部分に、酸素原子を介して付加されたものを指す。アルコキシの代表的な例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、２−プロポキシ、ブトキシ及びｔｅｒｔ−ブトキシが挙げられるが、これらに限らない。
【００２７】
「アルキル」という用語は、本明細書で使用する場合、１〜１０個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素鎖を意味する。「低級アルキル」または「Ｃ1-Ｃ6アルキル」という用語は、１〜６個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖の炭化水素を意味する。「Ｃ1−Ｃ3アルキル」という用語は、１〜３個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖の炭化水素を意味する。アルキルの代表的な例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、３−メチルヘキシル、２，２−ジメチルペンチル、２，３−ジメチルペンチル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル及びｎ−デシルが挙げられるが、これらに限らない。
【００２８】
「アルケニル」という用語は、本明細書で使用する場合、２〜１０個の炭素原子を含むとともに、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する炭化水素鎖を意味する。アルケニル基は、置換または非置換であってよい。例えば、アルケニル基は、フェニルのようなアリール基で置換されていてよい。
【００２９】
「アルキニル」という用語は、本明細書で使用する場合、２〜１０個の炭素原子を含むとともに、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する炭化水素鎖を意味する。アルキニル基は、置換または非置換であってよい。例えば、アルキニル基は、フェニルのようなアリール基で置換されていてよい。
【００３０】
「アルコキシアルキル」という用語は、本明細書で使用する場合、本明細書で定義されているようなアルコキシ基が、親分子部分に、本明細書に定義されているようなアルキル基を介して付加されたものを指す。
【００３１】
「アルキレン」という用語は、本明細書で使用する場合、１〜１０個の炭素原子、例えば２〜５個の炭素原子の直鎖または分岐鎖の炭化水素から得られた２価の基を指す。アルキレンの代表的な例としては、−ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−及び−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−が挙げられるが、これらに限らない。
【００３２】
「アリール」という用語は、本明細書で使用する場合、フェニル基、または二環式アリールもしくは三環式アリールの縮合環系を指す。二環式縮合環系は、親分子部分に付加され、フェニル基に縮合されたフェニル基によって例示される。三環式縮合環系は、親分子部分に付加され、２つの他のフェニル基に縮合されたフェニル基によって例示される。二環式アリールの代表的な例としては、ナフチルが挙げられるが、これに限らない。三環式アリールの代表的な例としては、アントラセニルが挙げられるが、これに限らない。単環式アリール、二環式アリール及び三環式アリールは、親分子部分に、その環内の任意の炭素原子を介して連結され、非置換または置換であることができる。
【００３３】
「ビオチン部分」という用語は、本明細書で使用する場合、ビオチンのラジカルまたはその一部を指す。例えば、ビオチン部分は、その分子の残部に直接（例えば、その環系の４位で）結合された二環式複素環式環（（３ａＲ，６ａＳ）−テトラヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−２（３Ｈ）−オン）を含んでよく、または、ビオチン部分は、ビオチンにおいて天然で見られる４つのメチレン基のうち、その二環式複素環式環の４位をビオチン−ＣＯＯＨ基に連結する１つ以上のメチレン基を含んでよく、または、ビオチン部分は、その４つのメチレン基及び−Ｃ（Ｏ）−もしくは−ＣＯ（Ｏ）−基とともに、二環式複素環を含んでよい。いくつかの実施形態では、ビオチン部分は、
2021523111.tif 000004
という式のうちのいずれかを有してよい。
【００３４】
「シクロアルキル」という用語は、本明細書で使用する場合、３〜１０個の炭素原子を含み、ヘテロ原子を含まず、任意に１個または２個の二重結合を含む炭素環系を指す。シクロアルキルの代表的な例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル及びシクロデシルが挙げられるが、これらに限らない。
【００３５】
「シクロアルケニル」という用語は、本明細書で使用する場合、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含むとともに、好ましくは、１つの環当たり５〜１０個の炭素原子を有する非芳香族の単環式環系または多環式環系を意味する。例示的な単環式シクロアルケニル環としては、シクロペンテニル、シクロヘキセニルまたはシクロヘプテニルが挙げられる。
【００３６】
「フルオロアルキル」という用語は、本明細書で使用する場合、本明細書に定義されているようなアルキル基において、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個または８個の水素原子がフッ素によって置き換えられている基を意味する。フルオロアルキルの代表的な例としては、２−フルオロエチル、２，２，２−トリフルオロエチル、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、ペンタフルオロエチル、及び３，３，３−トリフルオロプロピルのようなトリフルオロプロピルが挙げられるが、これらに限らない。
【００３７】
「アルコキシフルオロアルキル」という用語は、本明細書で使用する場合、本明細書で定義されているようなアルコキシ基が、親分子部分に、本明細書に定義されているようなフルオロアルキル基を介して付加されたものを指す。
【００３８】
「フルオロアルコキシ」という用語は、本明細書で使用する場合、本明細書に定義されているような少なくとも１つのフルオロアルキル基が、親分子部分に、酸素原子を介して付加されたものを意味する。フルオロアルコキシの代表的な例としては、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ及び２，２，２−トリフルオロエトキシが挙げられるが、これらに限らない。
【００３９】
「ハロゲン」または「ハロ」という用語は、本明細書で使用する場合、Ｃｌ、Ｂｒ、ＩまたはＦを意味する。
【００４０】
「ハロアルキル」という用語は、本明細書で使用する場合、本明細書に定義されているようなアルキル基において、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個または８個の水素原子がハロゲンによって置き換えられている基を意味する。
【００４１】
「ハロアルコキシ」という用語は、本明細書で使用する場合、本明細書に定義されているような少なくとも１つのハロアルキル基が、親分子部分に、酸素原子を介して付加されているものを意味する。
【００４２】
「ヘテロアルキル」という用語は、本明細書で使用する場合、本明細書に定義されているようなアルキル基において、その炭素原子のうちの１つ以上が、Ｓ、Ｓｉ、Ｏ、Ｐ及びＮから選択したヘテロ原子によって置き換えられている基を意味する。そのヘテロ原子は、酸化されていてもよい。ヘテロアルキルの代表的な例としては、アルキルエーテル、第２級アルキルアミン、第３級アルキルアミン、アミド及び硫化アルキルが挙げられるが、これらに限らない。
【００４３】
「ヘテロアリール」という用語は、本明細書で使用する場合、芳香族単環式環、芳香族二環式環系または芳香族三環式環系を指す。芳香族単環式環は、Ｎ、Ｏ及びＳからなる基から独立して選択した少なくとも１つのヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｓ及びＮから独立して選択した１個、２個、３個または４個のヘテロ原子）を含む５員環または６員環である。５員の芳香族単環式環は、２つの二重結合を有し、６員の芳香族単環式環は、３つの二重結合を有する。二環式ヘテロアリール基は、単環式ヘテロアリール環が、親分子部分に付加され、本明細書に定義されているような単環式シクロアルキル基、本明細書に定義されているような単環式アリール基、本明細書に定義されているような単環式ヘテロアリール基または本明細書に定義されているような単環式複素環に融合されたものによって例示される。三環式ヘテロアリール基は、単環式ヘテロアリール環が、親分子部分に付加され、本明細書に定義されているような単環式シクロアルキル基、本明細書に定義されているような単環式アリール基、本明細書に定義されているような単環式ヘテロアリール基または本明細書に定義されているような単環式複素環のうちの２つに融合されたものによって例示される。単環式ヘテロアリールの代表的な例としては、ピリジニル（ピリジン−２−イル、ピリジン−３−イル、ピリジン−４−イルを含む）、ピリミジニル、ピラジニル、チエニル、フリル、チアゾリル、チアジアゾリル、イソオキサゾリル、ピラゾリル及び２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジニルが挙げられるが、これらに限らない。二環式ヘテロアリールの代表的な例としては、クロメニル、ベンゾチエニル、ベンゾジオキソリル、ベンゾトリアゾリル、キノリニル、チエノピロリル、チエノチエニル、イミダゾチアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾフラニル、インドリル、キノリニル、イミダゾピリジン、ベンゾオキサジアゾリル及びベンゾピラゾリルが挙げられるが、これらに限らない。三環式ヘテロアリールの代表的な例としては、ジベンゾフラニル及びジベンゾチエニルが挙げられるが、これらに限らない。単環式ヘテロアリール、二環式ヘテロアリール及び三環式ヘテロアリールは、親分子部分に、その環内に含まれる任意の炭素原子または任意の窒素原子を介して連結されているとともに、非置換または置換であることができる。
【００４４】
「複素環」または「複素環式」という用語は、本明細書で使用する場合、単環式複素環、二環式複素環または三環式複素環を意味する。単環式複素環は、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群から独立して選択した少なくとも１つのヘテロ原子を含む３員環、４員環、５員環、６員環、７員環または８員環である。その３員環または４員環は、二重結合を含まないかまたは１個の二重結合を含み、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群から選択した１個のヘテロ原子を含む。その５員環は、二重結合を含まないかまたは１個の二重結合を含み、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群から選択した１個、２個または３個のヘテロ原子を含む。その６員環は、二重結合を含まないか、または１個もしくは２個の二重結合を含み、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群から選択した１個、２個または３個のヘテロ原子を含む。その７員環及び８員環は、二重結合を含まないか、または１個、２個もしくは３個の二重結合を含み、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群から選択した１個、２個または３個のヘテロ原子を含む。単環式複素環の代表的な例としては、アゼチジニル、アゼパニル、アジリジニル、ジアゼパニル、１，３−ジオキサニル、１，３−ジオキソラニル、１，３−ジチオラニル、１，３−ジチアニル、１，３−ジメチルピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、イソチアゾリニル、イソチアゾリジニル、イソオキサゾリニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、オキサジアゾリニル、オキサジアゾリジニル、オキサゾリニル、オキサゾリジニル、オキセタニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピラニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、ピロリニル、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロチエニル、チアジアゾリニル、チアジアゾリジニル、１，２−チアジナニル、１，３−チアジナニル、チアゾリニル、チアゾリジニル、チオモルホリニル、１，１−ジオキシドチオモルホリニル（チオモルホリンスルホン）、チオピラニル及びトリチアニルが挙げられるが、これらに限らない。その二環式複素環は、フェニル基に融合された単環式複素環、単環式シクロアルキルに融合された単環式複素環、単環式シクロアルケニルに融合された単環式複素環、単環式複素環に融合された単環式複素環、スピロ複素環基、あるいはその環の２つの非隣接原子が、１個、２個、３個もしくは４個の炭素原子のアルキレン架橋または２個、３個もしくは４個の炭素原子のアルケニレン架橋によって連結されている架橋単環式複素環系である。二環式複素環の代表的な例としては、ベンゾピラニル、ベンゾチオピラニル、クロマニル、２，３−ジヒドロベンゾフラニル、２，３−ジヒドロベンゾチエニル、２，３−ジヒドロイソキノリン、２−アザスピロ［３．３］ヘプタン−２−イル、アザビシクロ［２．２．１］ヘプチル（２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−２−イルを含む）、２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドリル、イソインドリニル、オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロリル、オクタヒドロピロロピリジニル及びテトラヒドロイソキノリニルが挙げられるが、これらに限らない。三環式複素環は、フェニル基に融合された二環式複素環、単環式シクロアルキルに融合された二環式複素環、単環式シクロアルケニルに融合された二環式複素環、単環式複素環に融合された二環式複素環、あるいは、その二環式環の２つの非隣接原子が、１個、２個、３個もしくは４個の炭素原子のアルキレン架橋、または２個、３個もしくは４個の炭素原子のアルケニレン架橋によって連結されている二環式複素環によって例示される。三環式複素環の例としては、オクタヒドロ−２，５−エポキシペンタレン、ヘキサヒドロ−２Ｈ−２，５−メタノシクロペンタ［ｂ］フラン、ヘキサヒドロ−１Ｈ−１，４−メタノシクロペンタ［ｃ］フラン、アザ−アダマンタン（１−アザトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン）及びオキサ−アダマンタン（２−オキサトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン）が挙げられるが、これらに限らない。単環式複素環、二環式複素環及び三環式複素環は、親分子部分に、その環内に含まれる任意の炭素原子または任意の窒素原子を介して連結され、非置換または置換であることができる。
【００４５】
「ヒドロキシル」という用語は、本明細書で使用する場合、−ＯＨ基を意味する。
【００４６】
場合によっては、ヒドロカルビル置換基（例えば、アルキルまたはシクロアルキル）内の炭素原子の数は、「Ｃx−Ｃy−」という接頭句によって示されており、そのｘは、その置換基内の炭素原子の最小数、ｙは、最大数である。したがって、例えば、「Ｃ1−Ｃ3−アルキル」とは、１〜３個の炭素原子を含むアルキル置換基を指す。
【００４７】
「置換基」という用語は、アリール基、ヘテロアリール基、フェニル基またはピリジニル基上で、その基の任意の原子において「置換された」基を指す。いずれの原子も置換することができる。
【００４８】
「置換された」という用語は、水素置換基以外の１つ以上の基でさらに置換されてよい基を指す。置換基としては、ハロゲン、＝Ｏ、＝Ｓ、シアノ、ニトロ、フルオロアルキル、アルコキシフルオロアルキル、フルオロアルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヘテロアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、アリールアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルキレン、アリールオキシ、フェノキシ、ベンジルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アミノアルキル、アリールアミノ、スルホニルアミノ、スルフィニルアミノ、スルホニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アミノスルホニル、スルフィニル、−ＣＯＯＨ、ケトン、アミド、カルバメート及びアシルが挙げられるが、これらに限らない。
【００４９】
本明細書に記載の化合物では、基及びその置換基は、その原子及び置換基の許容される原子価に従って選択して、その選択及び置換により、例えば、転位、環化、脱離などによるような変換が自動的には行われない安定な化合物が得られるようにしてよい。
【００５０】
本明細書で使用する場合、「ハロゲン」または「ハロ」という用語は、フルオロラジカル、クロロラジカル、ブロモラジカルまたはヨードラジカルを指す。
【００５１】
本明細書で使用する場合、「生物発光」または「発光」という用語は、酵素と、光を発生させる基質との反応により生成される光を指してよい。このような酵素（生物発光酵素）の例としては、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ、例えば、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ  ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、例えば、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓまたはＰｈｏｔｕｒｉｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａルシフェラーゼ、コメツキムシルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、ウミホタルルシフェラーゼ、発光タンパク質エクオリン、発光タンパク質オベリンなどが挙げられる。
【００５２】
本明細書で使用する場合、「生理活性剤」という用語は、生体分子（タンパク質及び核酸など）と相互作用でき、その生体分子の生物学的活性を変化させる分子または分子の機能性成分を指してよい。例えば、その生体分子は、細胞におけるシグナル伝達、代謝及びその他の生物学的プロセスを調節する酵素、輸送体または受容体として機能してよい。生理活性剤は、そのような生体分子の活性を増強または阻害し得る。生理活性剤としては、例えば、疾患もしくは障害に対する医薬剤、酵素阻害剤、または細胞受容体の阻害剤を挙げてよい。好適な生理活性剤としては、ダサチニブのようなキナーゼ阻害剤を挙げてよい。生理活性剤としては、生体分子と相互作用するタンパク質及び表面も挙げてよい。例えば、生理活性剤としては、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質のようなタンパク質を挙げてよい。
【００５３】
本明細書で使用する場合、「捕捉剤」という用語は、試料からタンパク質を捕捉できる作用剤を指す。例えば、捕捉剤は、試料中の対象となるタンパク質の官能基に結合できるか、またはその官能基と反応できる官能基を含むビーズまたは表面であってよい。例示的な捕捉剤としては、ストレプトアビジンビーズまたはストレプトアビジン被覆表面が挙げられる。
【００５４】
本明細書で使用する場合、「基質セレンテラジン」という用語は、ルシフェラーゼ（例えば海洋性ルシフェラーゼ）のような広範な生物発光タンパク質の作用を受けると発光する種類のレポーター分子を指す。基質セレンテラジンには、セレンテラジン、ならびにその類似体及び誘導体が含まれる。
【００５５】
「エネルギーアクセプター」または「アクセプター分子」という用語は、エネルギーの吸収（例えば共鳴エネルギー移動）に応じて、容易に検出可能なシグナルを生成する任意の小分子（例えば発色団）、巨大分子（例えば、自己蛍光タンパク質、フィコビリタンパク質、ナノ粒子、表面など）、または分子複合体を指す。特定の実施形態では、エネルギーアクセプターは、フルオロフォアまたはその他の検出可能な発色団である。好適なフルオロフォアとしては、キサンテン誘導体（例えば、フルオレセイン、ローダミン、オレゴングリーン、エオシン、テキサスレッドなど）、シアニン誘導体（例えば、シアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニン、メロシアニンなど）、ナフタレン誘導体（例えば、ダンシル誘導体及びプロダン誘導体）、オキサジアゾール誘導体（例えば、ピリジルオキサゾール、ニトロベンゾオキサジアゾール、ベンゾオキサジアゾールなど）、ピレン誘導体（例えば、カスケードブルー）、オキサジン誘導体（例えば、ナイルレッド、ナイルブルー、クレシルバイオレット、オキサジン１７０など）、アクリジン誘導体（例えば、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリジンイエローなど）、アリールメチン誘導体（例えば、オーラミン、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーンなど）、テトラピロール誘導体（例えば、ポルフィン、フタロシアニン、ビリルビンなど）、ＣＦ色素（Ｂｉｏｔｉｕｍ）、ＢＯＤＩＰＹ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＡＬＥＸＡ  ＦＬｕｏＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＤＹＬＩＧＨＴ  ＦＬＵＯＲ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｅｒｃｅ）、ＡＴＴＯ及びＴＲＡＣＹ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）、ＤＹ及びＭＥＧＡＳＴＯＫＥＳ（Ｄｙｏｍｉｃｓ）、ＳＵＬＦＯ  ＣＹ色素（ＣＹＡＮＤＹＥ，ＬＬＣ）、ＳＥＴＡＵ及びＳＱＵＡＲＥ色素（ＳＥＴＡ  ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌｓ）、ＱＵＡＳＡＲ及びＣＡＬ  ＦＬＵＯＲ色素（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＳＵＲＥＬＩＧＨＴ色素（ＡＰＣ、ＲＰＥ、ＰｅｒＣＰ、フィコビリソーム）（Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＡＰＣ、ＡＰＣＸＬ、ＲＰＥ、ＢＰＥ（Ｐｈｙｃｏ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）、自己蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＫａｔｅ）、量子ドットナノクリスタルなどが挙げられるが、これらに限らない。いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、ローダミン類似体（例えば、カルボキシローダミン類似体）である。特定の実施形態では、エネルギーアクセプターとしては、ＮＣＴのような小分子蛍光色素、クエンチャー、量子ドットのような蛍光粒子、発光金属錯体、及び他の任意の既知のエネルギーアクセプターが挙げられるが、これらに限らない。
【００５６】
「発光酵素」、「生物発光酵素」または「ルシフェラーゼ」という用語は、本明細書において同義的に使用する場合、生物発光で用いられる種類の酸化酵素であって、基質が与えられると光を生成及び放出させる酵素を指す。ルシフェラーゼは、ルシフェラーゼ基質を用いる天然のルシフェラーゼ、組み換えルシフェラーゼまたは変異ルシフェラーゼであってよい。ルシフェラーゼの基質は、ルシフェリン、ルシフェリン誘導体、ルシフェリン類似体、プレルシフェリン誘導体、プレルシフェリン類似体、セレンテラジン、セレンテラジン誘導体またはセレンテラジン類似体であり得る。発光酵素は、天然のものである場合には、当業者が生物から容易に採取し得る。発光酵素が、天然の発光酵素、または組み換え発光酵素もしくは変異発光酵素、例えば、天然の発光酵素のルシフェラーゼ−セレンテラジン反応またはルシフェラーゼ−ルシフェリン反応における活性を保持する発光酵素である場合には、その発光酵素をコードする核酸を発現するようにトランスフォーメーションした細菌、酵母、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などの培養液から容易に得ることができる。さらに、その組み換え発光酵素または変異発光酵素は、そのルシフェラーゼをコードする核酸を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの無細胞系から得ることができる。好適な発光酵素としては、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｏｉｄｅａのような生物発光性の十脚目動物から得られるルシフェラーゼ（例えばＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼ）、甲虫ルシフェラーゼ（例えば、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ、Ｐｈｏｔｕｒｉｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａなど）、刺胞動物のような海洋生物（例えばウミシイタケルシフェラーゼ）、十脚目のＡｒｉｓｔｅｉｄａｅ科、Ｓｏｌｅｎｏｃｅｒｉｄａｅ科、Ｌｕｃｉｆｅｒｉｄａｅ科、Ｓｅｒｇｅｓｔｉｄａｅ科、Ｐａｓｉｐｈｅｉｄａｅ科及びＴｈａｌａｓｓｏｃａｒｉｄｉｄａｅ科、カイアシルシフェラーゼ（Ｇａｕｓｓｉａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓルシフェラーゼのようなＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼ、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｌｏｎｇａルシフェラーゼ及びＭｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａルシフェラーゼのようなＭｅｔｒｉｄｉａルシフェラーゼ、Ｖａｒｇｕｌａ  ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉルシフェラーゼのようなＶａｒｇｕｌａルシフェラーゼ、Ｐｌｅｕｒｏｍａｍｍａ  ｘｉｐｈｉａｓルシフェラーゼなど）、ならびにエクオリンのような発光タンパク質、そしてそれらのバリアント、組み換え体及び変異体が挙げられる。
【００５７】
「発光反応混合物」は、発光酵素に光シグナルを生成させる、すなわち発光させる物質を含む。その混合物は、酵素、例えば、ルシフェラーゼ酵素またはルシフェラーゼも含んでよい。発光シグナルを生成するのに必要な物質、ならびに特定の濃度及び／または量は、使用する発光酵素、及び実施するアッセイの種類に応じて変動することになる。多くの場合、その溶液には、適正なｐＨでの反応を維持するための緩衝剤、酵素活性を保持するのを助けるＰＲＩＯＮＥＸまたはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のような添加剤、還元剤、洗浄剤などを含む他の物質を加えることになる。
【００５８】
本明細書で使用する場合、「Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ」及び「Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼ」という用語は、同義的に用いられており、その野生型、バリアント及び変異体を含め、深海エビＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ  ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓから分泌されるルシフェラーゼ（例えば配列番号１）を指す。例えば、好適なＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼバリアントは、米国特許第８，５５７，９７０号及び同第８，６６９，１０３号に記載されており、これらはそれぞれ、参照により、その全体が本明細書に援用される。例示的なＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼとしては、例えば、配列番号２のルシフェラーゼ（本明細書では同義的に「ＮａｎｏＬｕｃ」、「Ｎｌｕｃ」、「Ｎｌｕｃルシフェラーゼ」及び「ＮＬｕｃ酵素」ともいう）が挙げられる。
【００５９】
本明細書で使用する場合、「レポーター部分」という用語は、適切な条件下で、検出可能なシグナルを直接または間接的に生成する部分を指してよい。例示的なレポーター部分としては、フルオロフォア、発光分子、色素、放射性標識、及びルシフェラーゼのような酵素に対する基質が挙げられるが、これらに限らない。いくつかの実施形態では、例えば、レポーター部分が、酵素に対する基質であるときには、そのレポーター部分は、検出可能なシグナルを間接的に生成し得る。そして、酵素と基質の反応により、蛍光または発光のような検出可能なシグナルが生成される。本明細書で使用する場合、「生物発光レポーター部分」という用語は、ルシフェラーゼの基質である部分を指してよい。例えば、その生物発光レポーター部分は、ルシフェリン、ルシフェリン誘導体、例えば、プレルシフェリン、アミノルシフェリン、キノリル−ルシフェリン、ナフチルルシフェリン、フルオロルシフェリン、クロロルシフェリン、ルシフェリン誘導体の前駆体、セレンテラジン、セレンテラジン誘導体またはセレンテラジン類似体、例えばフリマジンであることができる。生成された発光シグナルは、発光測定装置を用いて検出してよい。本明細書で使用する場合、「蛍光レポーター部分」という用語は、蛍光を発する部分を指してよい。例えば、蛍光レポーター部分は、クマリン、Ｒ１１０、フルオレセイン、ＤＤＡＯ、レゾルフィン、クレシルバイオレット、シリルキサンテンまたはカルボピロニンのようなフルオロフォアであってよい。蛍光は、蛍光光度計を用いて検出してよい。
【００６０】
本明細書で使用する場合、「自殺基質」または「標識試薬」とは、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼに結合し、触媒作用を受けて、光を放出し、その結果、そのＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼを阻害する化合物を指す。その自殺基質は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼと共有結合付加体を形成することによって、そのＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼを阻害し得る。
【００６１】
特定の方法の工程（例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）など）を説明することによって、方法が説明されているときには、その方法の工程は、列挙されている順序で実施するものと理解する。例えば、方法において、工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）が、その順序で列挙されている場合には、工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、列挙されている順序で逐次実施するものと理解する。
【００６２】
２．化合物
本発明で提供するのは、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼ及び／またはＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼの活性を標識／検出し得る化合物である。本発明で提供するのは、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼ及び／またはＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼの活性を阻害し得る化合物である。開示されている化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼの阻害剤であり得る。開示されている化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼのルシフェラーゼ活性を不可逆的に阻害する自殺阻害剤であり得る。開示されている化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼのルシフェラーゼ活性を部分的に低減する部分的阻害剤であり得る。開示されている化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼの基質であり得る。開示されている化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼの基質であって、初めに、そのルシフェラーゼと反応して生物発光シグナルを生成し、続いて、そのＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼを阻害する基質であり得る。例えば、開示されている化合物は、初めに、そのルシフェラーゼと反応して生物発光シグナルを生成し、続いて、そのＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼに基質セレンテラジンを加えると生成される生物発光シグナルを阻害し得る。開示されている化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼの自殺基質であって、初めに、そのルシフェラーゼと反応して生物発光シグナルを生成し、続いて、そのＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼを不可逆的に阻害する自殺基質であり得る。開示されている化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼの基質であって、初めに、そのルシフェラーゼと反応して生物発光シグナルを生成し、続いて、そのＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼを部分的に阻害する基質であり得る。開示されている化合物は、そのＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼと共有結合付加体を形成することによって、そのＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼを阻害し得る。開示されている化合物は、ＮａｎｏＬｕｃ、及び相補的な酵素系ＮａｎｏＢｉＴを阻害し得る。
【００６３】
本発明の化合物には、下記の式（Ｉ）の化合物、
2021523111.tif 000005
（Ｉ）
またはその互変異性体もしくは塩が含まれ、式中、
Ｒ1は、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換された複素環または任意に置換されたシクロアルキルであり、Ｒ1は、−Ｑ−Ｌ−Ｚである少なくとも１つの基で置換されており、
Ｑは、−Ｏ−、−ＮＲQ−、−ＮＲQ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＲQ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＲQ−または−ＮＲQ−ＣＯ−Ｏ−であり、
Ｌは、−（ＣＲ1aＲ1b）m−、−（ＣＲ1xＲ1y−ＣＲ1xＲ1y−Ｏ）t1−（ＣＲ1xＲ1y）t2−Ｑ1−、−（ＣＲ1xＲ1y）t2−Ａ−（ＣＲ1xＲ1y−ＣＲ1xＲ1y−Ｏ）t1−Ｑ1−、−（ＣＲ1xＲ1y）t3−Ａ−（ＣＲ1xＲ1y−ＣＲ1xＲ1y−Ｏ）t1−（ＣＲ1xＲ1y）t2−または−（ＣＲ1xＲ1y）t3−Ａ−（ＣＲ1xＲ1y）t4−であり、各Ｑ1は独立して、結合手、−Ｏ−または−ＮＲQ1−であり、各Ａは独立して、結合手、−Ｏ−、−ＮＲQ−、−ＮＲQ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＲQ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＲQ−または−ＮＲQ−ＣＯ−Ｏ−であり、
Ｚは、−ＣＯＯＲ2、−ＳＯ2−ＯＲ3、−ＰＯ（ＯＲ4）（ＯＲ5）、ハロ、アジド、−ＮＲ6Ｒ7、−ＮＲ8−ＣＯ−Ｒ9、−ＣＯ−Ｒ10または−ＮＲ11−ＣＯ−Ｏ−Ｒ12であり、
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11及びＲ12は各出現ごとに独立して、水素、任意に置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたシクロアルケニル、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換された複素環、任意に置換されたヘテロアルキルまたはエネルギーアクセプターであり、
Ｒ6及びＲ7は各出現ごとに独立して、水素、任意に置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換された複素環、任意に置換されたヘテロアルキルもしくはエネルギーアクセプターであるか、またはＲ6及びＲ7は、それらと結合している窒素原子と一体となって、任意に置換された環を形成し、
Ｒ1a、Ｒ1b、ＲQ、ＲQ1、Ｒ1x及びＲ1yは各出現ごとに独立して、水素、Ｃ1−Ｃ4アルキルまたはＣ1−Ｃ4ハロアルキルであり、
ｑは、０、１または２であり、
ｍは各出現ごとに独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２であり、
ｔ１は各出現ごとに独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり、
ｔ２は、０〜５の整数であり、
ｔ３は各出現ごとに、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり、
ｔ４は、０〜５の整数であり、
その化合物は、４−［４−［［８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−７Ｈ−イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル］メチル］フェノキシ］ブタン酸ではない。
【００６４】
いくつかの実施形態では、その化合物は、下記の式（Ｉ’）の化合物、
2021523111.tif 000006
（Ｉ’）
またはその互変異性体もしくは塩であり、式中、
Ｒ1は、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換された複素環または任意に置換されたシクロアルキルであり、Ｒ1は、−Ｑ−Ｌ−Ｚである少なくとも１つの基で置換されており、
Ｑは、−Ｏ−、−ＮＲQ−、−ＮＲQ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＲQ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＲQ−または−ＮＲQ−ＣＯ−Ｏ−であり、
Ｌは、−（ＣＲ1aＲ1b）m−、−（ＣＲ1xＲ1y−ＣＲ1xＲ1y−Ｏ）t1−（ＣＲ1xＲ1y）t2−Ｑ1−または−（ＣＲ1xＲ1y）t2−Ａ−（ＣＲ1xＲ1y−ＣＲ1xＲ1y−Ｏ）t1−Ｑ1−であり、各Ｑ1は独立して、結合手、−Ｏ−または−ＮＲQ1−であり、Ａは、結合手、−Ｏ−、−ＮＲQ−、−ＮＲQ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＲQ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＲQ−または−ＮＲQ−ＣＯ−Ｏ−であり、
Ｚは、−ＣＯＯＲ2、−ＳＯ2−ＯＲ3、−ＰＯ（ＯＲ4）（ＯＲ5）、ハロ、アジド、−ＮＲ6Ｒ7または−ＮＲ8−ＣＯ−Ｒ9であり、
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ8及びＲ9は各出現ごとに独立して、水素、任意に置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換された複素環、任意に置換されたヘテロアルキルまたはエネルギーアクセプターであり、
Ｒ6及びＲ7は各出現ごとに独立して、水素、任意に置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換された複素環、任意に置換されたヘテロアルキルもしくはエネルギーアクセプターであるか、またはＲ6及びＲ7は、それらと結合している窒素原子と一体となって、任意に置換された環を形成し、
Ｒ1a、Ｒ1b、ＲQ、ＲQ1、Ｒ1x及びＲ1yは各出現ごとに独立して、水素、Ｃ1−Ｃ4アルキルまたはＣ1−Ｃ4ハロアルキルであり、
ｑは、０、１または２であり、
ｍは各出現ごとに独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２であり、
ｔ１は各出現ごとに独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり、
ｔ２は、０〜５の整数であり、
その化合物は、４−［４−［［８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−７Ｈ−イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル］メチル］フェノキシ］ブタン酸ではない。
【００６５】
いくつかの実施形態では、ｑは、１である。
【００６６】
いくつかの実施形態では、Ｒ1は、−Ｑ−Ｌ−Ｚという１つの置換基で置換されたフェニルであり、任意に、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アシルアミノ、アミノアルキル、スルホニルアミノ、スルフィニルアミノ、スルホニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アミノスルホニル、スルフィニル、−ＣＯＯＨ、ケトン、アミド、カルバメート、シリル、置換シリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、アルキルスルファニル、スルファニル及びアシルから独立して選択した１個または２個の置換基でさらに置換されており、
Ｑは、−Ｏ−、−ＮＲQ−、−ＮＲQ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＲQ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＲQ−または−ＮＲQ−ＣＯ−Ｏ−であり、
Ｌは、−（ＣＲ1aＲ1b）m−、−（ＣＲ1xＲ1y）t3−Ａ−（ＣＲ1xＲ1y−ＣＲ1xＲ1y−Ｏ）t1−（ＣＲ1xＲ1y）t2−または−（ＣＲ1xＲ1y）t3−Ａ−（ＣＲ1xＲ1y）t4−であり、
各Ａは独立して、−ＮＲQ−ＣＯ−であり、
Ｒ1a、Ｒ1b、ＲQ、Ｒ1x及びＲ1yは各出現ごとに、水素であり、
ｍは、６、７または８であり、
ｔ１は、６、７または８であり、
ｔ２は、１、２または３であり、
ｔ３は、６、７または８であり、
ｔ４は、１、２または３であり、
Ｚは、−ＳＯ2−ＯＲ3、アジド、−ＮＲ6Ｒ7、−ＮＲ8−ＣＯ−Ｒ9、−ＣＯ−Ｒ10、または−ＮＲ11−ＣＯ−ＯＲ12であり、
Ｒ3、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11及びＲ12は独立して、水素、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたシクロアルケニル、任意に置換されたヘテロアリールまたは任意に置換された複素環である。
【００６７】
いくつかの実施形態では、Ｒ1は、−Ｑ−Ｌ−Ｚという１つの置換基で置換されたフェニルであり、任意に、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アシルアミノ、アミノアルキル、スルホニルアミノ、スルフィニルアミノ、スルホニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アミノスルホニル、スルフィニル、−ＣＯＯＨ、ケトン、アミド、カルバメート、シリル、置換シリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、アルキルスルファニル、スルファニル及びアシルから独立して選択した１つまたは２つの置換基でさらに置換されており、
Ｑは、−Ｏ−、−ＮＲQ−、−ＮＲQ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＲQ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＲQ−または−ＮＲQ−ＣＯ−Ｏ−であり、
Ｌは、−（ＣＲ1aＲ1b）m−であり、
Ｚは、−ＳＯ2−ＯＲ3、アジド、−ＮＲ6Ｒ7または−ＮＲ8−ＣＯ−Ｒ9であり、
Ｒ3、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は独立して、水素、任意に置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたヘテロアリールまたは任意に置換された複素環であり、
Ｒ9は、任意に置換されたヘテロアルキルまたはエネルギーアクセプターである。
【００６８】
いくつかの実施形態では、Ｒ1は、−Ｑ−Ｌ−Ｚという１つの置換基で置換されたフェニルであり、任意に、１つのハロゲンでさらに置換されている。
【００６９】
いくつかの実施形態では、Ｑは、Ｏである。
【００７０】
いくつかの実施形態では、Ｌは、−（ＣＲ1aＲ1b）m−である。いくつかの実施形態では、各出現ごとに、Ｒ1a及びＲ1bは、水素である。いくつかの実施形態では、ｍは、６である。いくつかの実施形態では、ｍは、８である。
【００７１】
いくつかの実施形態では、Ｌは、−（ＣＲ1xＲ1y）t3−Ａ−（ＣＲ1xＲ1y−ＣＲ1xＲ1y−Ｏ）t1−（ＣＲ1xＲ1y）t2−である。いくつかの実施形態では、各出現ごとに、Ｒ1x及びＲ1yは、水素である。いくつかの実施形態では、Ａは、−ＮＲQ−ＣＯ−であり、ＲQは、Ｈである。いくつかの実施形態では、ｔ１は２であり、ｔ２は２であり、ｔ３は８である。
【００７２】
いくつかの実施形態では、Ｌは、−（ＣＲ1xＲ1y）t3−Ａ−（ＣＲ1xＲ1y）t4−である。いくつかの実施形態では、各出現ごとに、Ｒ1x及びＲ1yは、水素である。いくつかの実施形態では、Ａは、−ＮＲQ−ＣＯ−であり、ＲQは、Ｈである。いくつかの実施形態では、ｔ３は８であり、ｔ４は２である。
【００７３】
いくつかの実施形態では、その化合物は、下記の式（Ｉａ）の化合物であり、
2021523111.tif 000007
（Ｉａ）
式中、Ｒ1zは、ハロゲンである。
【００７４】
いくつかの実施形態では、Ｑは、Ｏであり、Ｌは、−（ＣＲ1aＲ1b）m−であり、Ｒ1a及びＲ1bは、水素であり、ｍは、５、６、７、８、９または１０であり、Ｚは、−ＮＲ8−ＣＯ−Ｒ9であり、Ｒ8は、水素であり、Ｒ9は、エネルギーアクセプターである。
【００７５】
いくつかの実施形態では、そのエネルギーアクセプターは、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、ピレン、シアニン、スクアライン及びホウ素−ジピロメテンから選択した蛍光色素である。
【００７６】
いくつかの実施形態では、−Ｑ−Ｌ−Ｚという基は、
2021523111.tif 000008
2021523111.tif 000009
から選択した構造を有する。
【００７７】
いくつかの実施形態では、その化合物は、
２−（４−（（６−アミノヘキシル）オキシ）−３−フルオロベンジル）−８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
Ｎ−（６−（４−（（８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）ヘキシル）−３’，６’−ビス（ジメチルアミノ）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６−カルボキサミド、
６−（４−（（８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）ヘキサン−１−スルホン酸、
Ｎ−（６−（４−（（８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）ヘキシル）−３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６−カルボキサミド、
Ｎ−（６−（４−（（８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）ヘキシル）−３−（５，５−ジフルオロ−７−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−５Ｈ−５ｌ４，６ｌ４−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−３−イル）プロパンアミド、
Ｎ，Ｎ’−（６−（（６−（４−（（８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）ヘキシル）カルバモイル）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−３’，６’−ジイル）ビス（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）、
Ｎ−（８−（４−（（８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）−３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６−カルボキサミド、
Ｎ−（８−（４−（（８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）−３’，６’−ビス（ジメチルアミノ）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６−カルボキサミド、
３−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）−Ｎ−（８−（４−（（１−ベンジル−３−（４−ヒドロキシフェニル）−６−オキソ−２，６−ジヒドロピロロ［１，２−ａ］ピラジン−７−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）プロパンアミド、
Ｎ−（２−（２−（３−（（８−（４−（（１−ベンジル−３−（４−ヒドロキシフェニル）−６−オキソ−２，６−ジヒドロピロロ［１，２−ａ］ピラジン−７−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）アミノ）−３−オキソプロポキシ）エトキシ）エチル）−３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６−カルボキサミド、
Ｎ−（２−（２−（３−（（８−（４−（（１−ベンジル−３−（４−ヒドロキシフェニル）−６−オキソ−２，６−ジヒドロピロロ［１，２−ａ］ピラジン−７−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）アミノ）−３−オキソプロポキシ）エトキシ）エチル）−３’，６’−ビス（ジメチルアミノ）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６−カルボキサミド、
６−（（８−（４−（（８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）カルバモイル）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−３’，６’−ジイルジアセテート、
２−（４−（（６−アジドヘキシル）オキシ）−３−フルオロベンジル）−８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
５−（（８−（４−（（８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）カルバモイル）−２−（２，７−ジフルオロ−３，６−ジヒドロキシキサンチリウム−９−イル）ベンゾエート、
５−（（８−（４−（（８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）カルバモイル）−２−（３，１１−ジヒドロキシジベンゾ［ｃ，ｈ］キサンテン−１４−イウム−７−イル）ベンゾエート、
Ｎ１−（８−（４−（（８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）−Ｎ４−（２−（５，５−ジフルオロ−１，３−ジメチル−５Ｈ−５λ4，６λ4−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−１０−イル）エチル）コハク酸アミド、
Ｎ1−（８−（４−（（８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）−Ｎ4−（ジベンジルシクロオクテニル）−コハク酸アミド及び
（Ｅ）−シクロオクト−４−エン−１−イル（８−（４−（（８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）カルバメート
からなる群から選択されている。
【００７８】
これらの化合物の構造は、実施例に示されている。化合物の名称は、ＣＨＥＭＤＲＡＷ（登録商標）ＵＬＴＲＡ  ｖ．１２．０の一部としてのＳｔｒｕｃｔ＝Ｎａｍｅという命名アルゴリズムを用いることによって割り当てることができる。
【００７９】
本発明の化合物は、不斉中心またはキラル中心が存在する立体異性体として存在し得る。立体異性体は、キラル炭素原子の周囲の置換基の配置に応じて、「Ｒ体」または「Ｓ体」となる。本明細書で使用する「Ｒ体」及び「Ｓ体」という用語は、ＩＵＰＡＣ  １９７４  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｅ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｉｎ  Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．，１９７６，４５：１３−３０で定義されているような配置である。本開示では、様々な立体異性体及びその混合物が企図されており、これらは、本発明の範囲内に具体的に含まれる。立体異性体には、エナンチオマー及びジアステレオマー、ならびにエナンチオマーまたはジアステレオマーの混合物が含まれる。本発明の化合物の個々の立体異性体は、不斉中心もしくはキラル中心を含む市販の出発物質から合成によって、または、ラセミ混合物を調製してから、当業者に周知の分割方法によって調製してよい。これらの分割方法は、（１）Ｆｕｒｎｉｓｓ，Ｈａｎｎａｆｏｒｄ，Ｓｍｉｔｈ，ａｎｄ  Ｔａｔｃｈｅｌｌ，“Ｖｏｇｅｌ’ｓ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，５th  ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９８９），Ｌｏｎｇｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＆  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ，Ｅｓｓｅｘ  ＣＭ２０  ２ＪＥ，Ｅｎｇｌａｎｄに記載されているように、エナンチオマー混合物をキラル補助剤に結合させ、得られたジアステレオマー混合物を再結晶またはクロマトグラフィーによって分離し、任意に、その光学的に純粋な生成物を補助剤から遊離させる方法か、（２）キラルクロマトグラフィーカラムで、光学エナンチオマー混合物を直接分離する方法か、または（３）分別再結晶法によって例示される。
【００８０】
当然のことながら、本発明の化合物は、互変異性体及び幾何異性体を有することがあり、これらの異性体も、本発明の態様を構成する。
【００８１】
Ｒ9が、フルオレセインのような蛍光色素であるエネルギーアクセプターである化合物では、その蛍光色素を導入するための試薬は、異性体混合物として市販されていることがあるのは当業者には明らかであろう。例えば、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステルは、５−異性体、６−異性体及び異性体混合物として市販されている。本発明におけるいくつかの実施形態では、化合物は、それぞれ５−異性体または６−異性体として示されている。しかしながら、本開示は、使用する特定の出発物質に応じて、追加の異性体及びその混合物を網羅するように意図されている。
【００８２】
本開示には、１つ以上の原子が、天然において通常見られる原子質量または質量数とは異なる原子質量または質量数である原子によって置き換えられている点を除き、式（Ｉ）で示されている化合物と同一である同位体標識化合物も含まれる。本発明の化合物に含めるのに適する同位体の例は、水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素及び塩素であり、それぞれ、2Ｈ、3Ｈ、13Ｃ、14Ｃ、15Ｎ、18Ｏ、17Ｏ、31Ｐ、32Ｐ、35Ｓ、18Ｆ及び36Ｃｌなどであるが、これらに限らない。重水素、すなわち2Ｈのように、より重い同位体で置換すると、代謝安定性の上昇に起因する特定の治療上の利点（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の延長または必要用量の減少）を得ることができるので、このような置換は、状況によっては好ましいことがある。本発明の化合物には、医療用の撮像、及び受容体の分布を求めるための陽電子断層撮影（ＰＥＴ）試験のために、陽電子放出同位体を組み込んでもよい。式（Ｉ）の化合物に組み込むことができる好適な陽電子放出同位体は、11Ｃ、13Ｎ、15Ｏ及び18Ｆである。同位体標識した式（Ｉ）の化合物は概して、当業者に知られている従来の技法、または添付の実施例に記載されているプロセスと類似のプロセスであって、非同位体標識試薬の代わりに、適切な同位体標識試薬を用いるプロセスによって調製できる。
【００８３】
Ａ．式（Ｉ）の化合物の特性
式（Ｉ）の化合物は、発光を発生させるルシフェラーゼの基質であり得る。「発光」とは、適切な条件下、例えば、セレンテラジン類似体のような好適な基質の存在下におけるルシフェラーゼの光出力を指す。その光出力は、発光反応（基質セレンテラジンを加えると開始し得る）の開始時における瞬時またはほぼ瞬時の光出力測定値（「Ｔ＝０」の発光または「閃光」と称する場合もある）として測定し得る。様々な実施形態における発光反応は、溶液中で行う。別の実施形態では、その発光反応は、固体支持体上で行う。その溶液は、例えば、細胞から得られた溶解液を原核生物または真核生物の発現系に含み得る。別の実施形態では、無細胞系で発現を行うか、またはルシフェラーゼタンパク質を細胞外の培地に分泌させ、後者の場合には、溶解液を作製する必要がなくなる。いくつかの実施形態では、その反応は、適切な材料、例えば、セレンテラジン類似体、緩衝剤などを、発光タンパク質の入った反応容器（例えば、９６ウェルプレートのようなマルチウェルプレートのウェル）に注入することによって開始させる。さらに別の実施形態では、本発明の化合物（例えば、式（Ｉ）の化合物）を宿主に導入し、その宿主またはその一部（生物全体、またはその細胞、組織、外植片もしくは摘出物を挙げることができる）において、発光の測定を行う。特定の実施形態では、発光の測定は、細胞表面のような、宿主の表面で行う。さらに別の実施形態では、本発明の化合物（例えば、式（Ｉ）の化合物）を宿主に導入し、発光の測定を細胞外の空間で行う。例えば発光測定装置または光電子増倍管を用いて、光出力を測定できる読み取り装置に、反応容器を配置してよい。光出力または発光は、例えば、同じ反応容器で、数秒、数分、数時間などの期間にわたって経時的に測定してもよい。光出力または発光は、時間平均値、シグナル減衰半減期、ある期間にわたるシグナルの合計またはピーク出力として記録してもよい。発光は、相対発光値（ＲＬＵ）で測定してもよい。
【００８４】
式（Ｉ）の化合物は、セレンテラジンまたはフリマジンのような既知のセレンテラジン類似体に対して、ＲＬＵが１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上または１００以上であることができる。
【００８５】
「細胞透過性」、「細胞膜透過性」または「膜透過性」は、本明細書で同義的に使用する場合、化合物が細胞膜を透過できることを指す。この用語は、化合物が細胞膜内に部分的に埋め込まれることができることを指すこともある。この用語は、化合物が細胞膜を完全に通過して、細胞内空間に到達できることを指すこともある。本発明で開示するセレンテラジン類似体は、細胞透過性が低下していてもよい。
【００８６】
「生体適合性」とは、細胞（例えば、原核細胞または真核細胞）のセレンテラジン類似体（例えば、式（Ｉ）の化合物）に対する耐性を指す。セレンテラジン類似体の生体適合性は、宿主細胞に対してそのセレンテラジン類似体が加えるストレスに関するものである。
【００８７】
本発明のセレンテラジン類似体（例えば、式（Ｉ）の化合物）の生体適合性の向上は、細胞生存能及び／または細胞の増殖速度を測定することによって求め得る。例えば、本発明のセレンテラジン類似体の生体適合性の向上は、そのセレンテラジン類似体に暴露した細胞のルシフェラーゼ発現の非存在下における細胞生存能を、天然型のセレンテラジンまたは既知のセレンテラジンの場合と比較して測定し、そのセレンテラジン類似体のその細胞に対する適合性及び／または毒性の程度を求めることによって求め得る。
【００８８】
特には、生体適合性の向上は、細胞生存能解析（例えば、ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙアッセイを用いるもの）、アポトーシスアッセイ（例えば、ＣＡＳＰＡＳＥ−ＧＬＯ（登録商標）アッセイ技術を用いるもの）、または当該技術分野において知られている別の方法を用いて求め得る。式（Ｉ）の化合物が細胞生存能またはアポトーシスに及ぼす作用と、天然型のセレンテラジン類似体または既知のセレンテラジン類似体が細胞生存能またはアポトーシスに及ぼす作用を比較し得る。
【００８９】
生体適合性の向上は、本発明のセレンテラジン類似体（例えば、式（Ｉ）の化合物）が細胞増殖または遺伝子発現に及ぼす作用を測定することによっても求め得る。例えば、式（Ｉ）の化合物の生体適合性の向上は、式（Ｉ）の化合物に暴露した細胞の試料において、天然型のセレンテラジンもしくは既知のセレンテラジンに暴露したか、またはセレンテラジンに暴露しなかった細胞と比較して、ある期間経過した後の細胞数を測定するか、またはストレス応答遺伝子の発現を求めることによって求め得る。式（Ｉ）の化合物が細胞増殖または遺伝子発現に及ぼす作用を、天然型のセレンテラジンまたは既知のセレンテラジンと比較してもよい。
【００９０】
Ｂ．式（Ｉ）の化合物の合成
式（Ｉ）の化合物は、合成プロセスまたは代謝プロセスによって調製し得る。その化合物の代謝プロセスによる調製には、ヒトもしくは動物の体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で行うプロセス、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うプロセスが含まれる。
【００９１】
式（Ｉ）の化合物は、別段に述べられていない限り、Ｒ1基及びｑが、本発明の概要の節に示されているような意味を有する場合、スキーム１〜３及び一般的手順Ａ〜Ｇに示されているようにして合成できる。好適な合成方法としては、例えば、２０１７年２月１４日に出願されたＳｈａｋｈｍｉｎらの「ＣＯＥＬＥＮＴＥＲＡＺＩＮＥ  ＡＮＡＬＯＧＵＥＳ」という標題の米国特許出願第１５／４３１，９６１号（代理人整理番号０１６０２６−９５７４−ＵＳ０１）に開示されている方法も挙げることができ、この特許出願は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
【００９２】
下記のスキームの説明で用いられている略称は、ＴＢＤＭＳがｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルであり、ＴＭＧがテトラメチルグアニジンであり、ＭｅＯＨがメタノールであり、ＤＣＭがジクロロメタンであり、ＴＦＡがトリフルオロ酢酸である。
スキーム１．パラ−ヒドロキシ６位フェニル基を有する化合物の合成
2021523111.tif 000010
スキーム２．スルホネート含有化合物の合成
2021523111.tif 000011
【００９３】
一般的手順Ａ（ＨＷＥ反応）：メタノール中のアルデヒド（１ｅｑ）及びメチル２−（（３−ベンジル−５−フェニルピラジン−２−イル）アミノ）−２−（ジエトキシホスホリル）アセテート（１ｅｑ）の溶液に、１，１，３，３−テトラメチルグアニジン（３ｅｑ）を加えた。その溶液を室温で０．５〜２時間撹拌した。その混合物をジクロロメタン及び約０．１ＭのＨＣｌで希釈し、水層をジクロロメタンで抽出した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製した。
【００９４】
一般的手順Ｂ（還元）：ジクロロメタン及びメタノール（１：１）中のデヒドロ−セレンテラジン（１ｅｑ）の懸濁液を氷浴で冷やした。水素化ホウ素ナトリウム（５ｅｑ）を加え、その混合物を０．５〜２時間撹拌した。その混合物をジクロロメタン及び約０．１ＭのＨＣｌで希釈し、水層をジクロロメタンで抽出した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製した。
【００９５】
一般的手順Ｃ（ＴＢＤＭＳの脱保護）：メタノール（１０ｍＬ）中のセレンテラジン類似体の溶液に、ＨＣｌ（６Ｍ、１ｍＬ）を加えた。その溶液を２〜６時間撹拌した。その混合物をＤＣＭ及び水で希釈し、水層をジクロロメタンで抽出した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製した。
【００９６】
一般的手順Ｄ（ＴＦＡの脱保護）：ジクロロメタン（１０ｍＬ）中のセレンテラジン類似体の溶液に、トリフルオロ酢酸（１ｍＬ）を加えた。その溶液を２〜６時間撹拌した。その混合物をトルエンで希釈し、濃縮し、トルエンに再懸濁させ、濃縮した。これを２回繰り返した。その粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーで精製した。
【００９７】
一般的手順Ｅ（スルホネートによるＨＷＥ反応）：メタノール中のスルホン化アルデヒド（１ｅｑ）及びメチル２−（（３−ベンジル−５−フェニルピラジン−２−イル）アミノ）−２−（ジエトキシホスホリル）アセテート（１ｅｑ）の溶液に、水酸化ナトリウム（２Ｍ、３ｅｑ）を加えた。その溶液を室温で０．５〜２時間撹拌した。その混合物をエタノールで希釈し、セライトに加え、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製した。
【００９８】
一般的手順Ｆ（スルホネートによる還元）：ジクロロメタン及びメタノール（１：１）中のデヒドロ−セレンテラジン（１ｅｑ）の懸濁液を氷浴で冷やした。水素化ホウ素ナトリウム（５ｅｑ）を加え、その混合物を０．５〜２時間撹拌した。その混合物をエタノールで希釈し、セライトに加え、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製した。
【００９９】
一般的手順Ｇ（スクシンイミドエステルの反応）：ジクロロメタン及びメタノール（１０：１）中のアミノ−セレンテラジン（１ｅｑ）の溶液に、ルチジン（５ｅｑ）及びスクシンイミドエステル（１ｅｑ）を加えた。その混合物を２〜１８時間撹拌した。その混合物をメタノールで希釈し、セライトに加え、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製した。
【０１００】
個々の各工程の最適な反応条件及び反応時間は、採用した特定の反応物質及び使用したその反応物質に存在する置換基に応じて変動し得る。具体的な手順は、実施例の節に示されている。反応は、従来の方式で、例えば、溶媒を残渣から除去し、当該技術分野において一般に知られている手法（結晶化、蒸留、抽出、トリチュレーション及びクロマトグラフィーなどであるが、これらに限らない）に従ってさらに精製することによって後処理できる。別段の記載のない限り、その出発物質及び試薬は、市販ものであるか、または当業者が市販の材料から、化学文献に記載されている方法を用いて調製できるかのいずれかである。出発物質は、市販されていない場合、標準的な有機化学的技法、既知の合成技法と類似の技法、構造的に類似の化合物、または上記のスキームもしくは合成例の節に記載されている手順と類似の技法から選択した手順によって調製できる。
【０１０１】
反応条件、試薬及び一連の合成経路の適切な操作、反応条件と適合できない任意の化学官能基の保護、ならびにその方法の反応順序における好適な時点での脱保護を含め、常法的な実験が本発明の範囲に含まれる。好適な保護基、ならびにそのような好適な保護基を用いて、それぞれに異なる置換基を保護及び脱保護する方法は、当業者に周知であり、その例は、ＰＧＭ  Ｗｕｔｓ  ａｎｄ  ＴＷ  ＧｒｅｅｎｅによるＧｒｅｅｎｅ’ｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（４th  ｅｄ．）（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（２００６））という標題の本に見ることができ、この文献は、参照により、その全体が本明細書に援用される。本発明の化合物の合成は、上記の合成スキーム及び具体例における方法と類似の方法によって行うことができる。
【０１０２】
開示されている化合物の光学活性体が必要なときには、その光学活性体は、光活性出発物質（例えば、不斉誘導の好適な反応工程によって調製する）を用いて、本明細書に記載の手順のうちの１つを行うか、または標準的な手順（クロマトグラフ分離、再結晶もしくは酵素による分割など）を用いて、その化合物もしくは中間体の立体異性体の混合物を分割することによって得ることができる。
【０１０３】
同様に、化合物の純粋な幾何異性体が必要なときには、その幾何異性体は、純粋な幾何異性体を出発物質として用いて、上記の手順のうちの１つを行うか、またはクロマトグラフ分離のような標準的な手順を用いて、その化合物もしくは中間体の幾何異性体の混合物を分割することによって得ることができる。
【０１０４】
塩基付加塩は、開示されている化合物を最終的に単離及び精製する際に、カルボキシル基と、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムもしくはアルミニウムなどの金属のカチオンの水酸化物、炭酸塩もしくは重炭酸塩のような好適な塩基、または有機第１級アミン、第２級アミンもしくは第３級アミンを反応させることによって調製し得る。第４級アミン塩（メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジエチルアミン、エチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルホリン、ジシクロヘキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルフェネチルアミン、１−エフェナミン及びＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペリジン、ピペラジンなどに由来するようなもの）を調製できる。
【０１０５】
記載されているような合成スキーム及び具体例は、例示的なものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではないことは認識し得る。本発明の範囲は、添付の請求項で定義されているからである。その合成方法及び具体例のあらゆる代替形態、改変形態及び等価物は、請求の範囲内に含まれる。
【０１０６】
３．Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ
開示されている化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼの基質であり得る。開示されている化合物を用いて、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼを標識／検出し得る。開示されている化合物を用いて、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼを阻害し得る。開示されている化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼのルシフェラーゼ活性を阻害し得る。そのＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼは、野生型Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ、または配列番号２のルシフェラーゼのような、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼのバリアントであってよい。Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼバリアントは、米国特許第８，５５７，９７０号及び同第８，６６９，１０３号に記載されており、それらの各特許は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
【０１０７】
天然型のＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ  ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓルシフェラーゼの成熟した１９ｋＤａのサブユニットのポリペプチド配列は、配列番号１に示されている。Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来の合成ルシフェラーゼのうち、本明細書に記載の方法で使用できる合成ルシフェラーゼの例示的なポリペプチド配列は、配列番号２に示されている（本明細書では同義的に「ＮａｎｏＬｕｃ」、「Ｎｌｕｃ」、「Ｎｌｕｃルシフェラーゼ」及び「ＮＬｕｃ酵素」ともいう）。
【０１０８】
４．基質セレンテラジン
開示されている化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼの基質であり得る。本発明の開示されている化合物を用いて、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼを標識／検出し得る。開示されている化合物を用いて、ルシフェラーゼ活性を阻害し得る。開示されている化合物は、基質であるセレンテラジンまたはセレンテラジン誘導体がルシフェラーゼに結合するのと競合するか、またはその結合を妨げることによって、ルシフェラーゼ活性を阻害し得る。基質セレンテラジンは、ルシフェラーゼ及びその他の生物発光タンパク質の作用を受けると発光する種類のレポーター分子である。基質セレンテラジンの例としては、ＷＯ２００３／０４０１００、米国特許出願公開第２００８／０２４８５１１号及び米国特許出願公開第２０１２／０１１７６６７号に記載されているものに加えて、セレンテラジン、セレンテラジン誘導体及び／または類似体（２−フラニルメチル−デオキシ−セレンテラジン（フリマジン）、セレンテラジン−ｎ、セレンテラジン−ｆ、セレンテラジン−ｈ、セレンテラジン−ｈｃｐ、セレンテラジン−ｃｐ、セレンテラジン−ｃ、セレンテラジン−ｅ、セレンテラジン−ｆｃｐ、ビス−デオキシセレンテラジン（「セレンテラジン−ｈｈ」）、セレンテラジン−ｉ、セレンテラジン−ｉｃｐ、セレンテラジン−ｖ及び２−メチル−セレンテラジンなど）、プロセレンテラジン（すなわち、その化合物をルシフェラーゼの基質に変換する非発光酵素の基質ではない化合物）、キノンでマスクされたセレンテラジンなどが挙げられるが、これらに限らない。基質セレンテラジンのさらなる例は、例えば、米国特許出願公開第２０１２／０１０７８４９号、米国特許出願公開第２０１３／０１３０２８９号、米国特許出願第１４／６０８，９１０号及び米国特許出願第１４／６０９，３７２号に記載されており、これらの各特許は、参照により、本明細書に援用される。
【０１０９】
５．Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼの検出方法、標識方法及び単離方法
本開示の化合物は、ルシフェラーゼ基質、例えばセレンテラジン類似体が用いられてきたいずれの方法でも使用し得る。例えば、本開示の化合物は、試料中の１つ以上の分子、例えば、酵素、酵素反応の補因子、酵素基質、酵素阻害剤、酵素活性化剤もしくはＯＨラジカル、または１つ以上の状態、例えば酸化還元状態を検出するためにセレンテラジンの類似体を用いる生物発光方法で使用し得る。その試料としては、動物（例えば脊椎動物）、植物、真菌、生理液（例えば、血液、血漿、尿、粘膜分泌物）、細胞、細胞溶解液、細胞上清または細胞の精製画分（例えば細胞内画分）を挙げてよい。このような分子の存在、量、スペクトル分布、発光キネティクスまたは比活性を検出または定量し得る。その分子は、多相溶液（例えば、乳濁液もしくは懸濁液）を含む溶液中、または固体支持体（例えば、粒子、毛細管もしくはアッセイ容器）上で検出または定量し得る。
【０１１０】
特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物を用いて、小分子を定量し得る。いくつかの実施形態では、セレンテラジン（例えば、天然型のセレンテラジン、既知のセレンテラジンまたは式（Ｉ）の化合物）は、所定の生化学的活性、例えば、アポトーシスまたは薬物代謝のプローブとして使用できる。いくつかの実施形態では、そのセレンテラジン濃度は、対象となるその特異的酵素の作用を受け得る「プロセレンテラジン」または「プロ基質」による特異的な酵素活性と結び付けられている。いくつかの実施形態では、プロセレンテラジンは、ルシフェラーゼと合わせたときには、発光を直接補佐することはできないが、対象となる特異的な酵素による触媒的な処理を通じて、セレンテラジンに変換されることができる分子である。いくつかの実施形態では、そのアプローチは、薬物代謝で使用されるような酵素、例えば、シトクロムＰ４５０酵素、モノアミンオキシダーゼ及びグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ならびにアポトーシス、例えば、カスパーゼで使用できる。例えば、セレンテラジン（例えば、天然型のセレンテラジン、既知のセレンテラジンまたは式（Ｉ）の化合物）を改変して、６’−Ｏ−メチルのような切断可能な基を含めることができる。いくつかの実施形態では、特異的なシトクロムＰ４５０酵素とともにインキュベートすると、その６’Ｏ−メチルが切断されて、プロセレンテラジンがセレンテラジンに変換され、そのセレンテラジンをルシフェラーゼによって検出できる。いくつかの実施形態では、プロセレンテラジンと、発光を補佐するのに必要な他の成分、例えば、ルシフェラーゼのような発光タンパク質を組み合わせて、単一の試薬及びホモジニアスアッセイ系をもたらすことができる。例えば、その試薬を試料に加えると、プロセレンテラジンがセレンテラジンに変換されるのに応じて発光する。各種実施形態では、プロセレンテラジンからセレンテラジンが生成されることと関連付けることができる他の酵素、小分子または他の細胞プロセス用に、類似のアッセイ系を開発できる。
【０１１１】
特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、生細胞における発光の検出に用いることができる。いくつかの実施形態では、ルシフェラーゼを細胞内で（レポーターとして、または別段の形で）発現させることができ、培養下で細胞を透過することになるセレンテラジン（例えば、式（Ｉ）の化合物）で処理したその細胞は、ルシフェラーゼと反応して発光する。式（Ｉ）の化合物は、細胞透過性であることに加えて、細胞生存能の点で、天然型のセレンテラジンに相当する生体適合性を示す。いくつかの実施形態では、培地中での天然型のセレンテラジンの安定性を向上させることが知られている化学修飾を含む式（Ｉ）の化合物を合成し、よりロバスト性の高い、生細胞ルシフェラーゼベースのレポーターアッセイに、その化合物を使用することができる。さらに別の実施形態では、様々な顕微鏡及びイメージング技法を用いて、ルシフェラーゼ及び式（Ｉ）の化合物を含む試料（細胞、組織、動物などを含む）をアッセイし得る。さらに別の実施形態では、分泌型ルシフェラーゼを細胞内で、生細胞レポーター系の一部として発現させる。
【０１１２】
開示されている化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼを用いて、酵素の存在または活性を検出する目的で使用するアッセイで使用し得る。例えば、開示されている化合物は、試料中の１つ以上の分子、例えば、対象とするタンパク質（例えば、酵素、結合パートナー、リガンドなど）、酵素反応の補因子、酵素基質、酵素阻害剤、酵素活性化剤もしくはＯＨラジカル、または１つ以上の状態、例えば酸化還元状態を検出するために、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ、及び基質であるセレンテラジンまたはセレンテラジン誘導体を用いる生物発光方法で使用し得る。
【０１１３】
開示されている化合物は、その活性部位で共有結合を形成することによって、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼを標識する方法で使用し得る。その方法は、本発明で開示される化合物と、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼを発現するかまたは含む細胞を接触させることを含んでよい。その方法は、本発明で開示される化合物と、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼを発現するかまたは含む細胞を接触させることを含んでよく、その開示されている化合物は、そのＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼと選択的に反応して、そのルシフェラーゼを不活化し得る。その方法は、その試料と、本発明で開示される化合物を接触させることを含んでよく、本発明で開示されるその化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼから、速い減衰速度で発光させる。
【０１１４】
その方法は、本発明で開示される化合物と、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼ融合タンパク質における結合パートナーを接触させることを含んでよく、その融合タンパク質がインタクトな状態であると、開示されているその化合物は、そのＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼを標識する。開示されている化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼを用いて、酵素の存在または活性を検出する目的、そのルシフェラーゼと選択的に反応することによって、そのＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼからのシグナルを選択的に阻害する目的で使用するアッセイで使用し得る。
【０１１５】
開示されている化合物は、様々な官能基に付加し得る。開示されている化合物は、阻害効力に影響を及ぼさずに、酵素ポケットから溶媒中までに及ぶ官能基を含み得る。例えば、−Ｑ−Ｌ−Ｚという基は、蛍光色素部分または蛍光源性色素部分のようなエネルギーアクセプターを含んでよく、そのアクセプターは、ＮａｎｏＬｕｃベースの細胞選別及び標識用途で蛍光タグとして使用し得る。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、開示されている化合物を用いて、タンパク質または表面を標識し得る。例えば、式（Ｉ）の化合物は、適切なリンカーによってその化合物に結合された反応性基または官能基（ハロゲンもしくは阻害剤など）を通じて、標的タンパク質（酵素または受容体など）と相互作用し得る。いくつかの実施形態では、開示されている化合物を用いて、Ｎｌｕｃ融合タンパク質を捕捉したり、またはＮｌｕｃの生物発光を消光し得る表面、樹脂もしくは生体分子を作製したりし得る。
【０１１７】
（１）細胞の取り込み、選別及び標識
いくつかの実施形態では、開示されている化合物は、生細胞イメージング、細胞の取り込みまたは細胞の選別及び標識に用いるための薬物、ヌクレオチド、糖、タンパク質、ポリマー、固体表面、発色団、色素などのような様々な生体分子及び巨大分子に付加し得る。例えば、開示されている化合物を様々な官能基に付加して、ＮｌｕｃまたはＮａｎｏＢｉＴを所望の官能基でポストラベリング可能にし得る。
【０１１８】
開示されている化合物は、蛍光色素または蛍光源性色素のような発色団または色素に付加し得る。例えば、開示されている化合物は、ＮｌｕｃまたはＮａｎｏＢｉＴを蛍光標識するのに用いるための蛍光色素に付加し得る。例えば、開示されている化合物は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）で用いる蛍光色素に付加し得る。細胞に、Ｎｌｕｃ−ＨＴ融合タンパク質のようなＮｌｕｃ融合タンパク質をトランスフェクションし、その細胞を、蛍光色素に付加された本開示の化合物に暴露し得る。細胞透過性化合物−色素コンジュゲートは、そのＮｌｕｃ融合タンパク質を発現している細胞において、Ｎｌｕｃを標識し、蛍光を発生させる。適切なインキュベーション工程及び洗浄工程の後、その蛍光細胞をＦＡＣＳによって選別し、それを後の生化学的実験で使用することができる。別の例として、開示されている化合物は、生細胞イメージングで用いるための蛍光色素または発色団に付加し、それによって、細胞内イベント、細胞外イベント及び細胞表面イベントの生物発光イメージングを可能にし得る。
【０１１９】
開示されている化合物は、化学反応またはバイオ直交性反応のための様々な官能基に付加し得る。例えば、開示されている化合物は、様々な官能基に付加して、クリックケミストリー、シアノベンズチアゾール化学反応、トリアゼン化学反応などで使用し得る。例えば、開示されている化合物は、ＮａｎｏＬｕｃを蛍光標識するための２段階式の方法で使用し得る。このような実施形態では、開示されている化合物を反応性官能基に付加してよく、相補的な反応性基を有する蛍光色素を加えて、ＮａｎｏＬｕｃを蛍光標識できる。細胞に、Ｎｌｕｃ融合タンパク質をトランスフェクションし、その細胞を、アジドに付加された本開示の化合物に暴露し得る。蛍光色素コンジュゲートを加えることができ、アジドに付加されたその化合物に結合したＮｌｕｃ融合タンパク質が、蛍光標識されることになる。
【０１２０】
（２）タンパク質の単離
いくつかの実施形態では、開示されている化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ融合タンパク質を捕捉または単離するのに使用し得る。いくつかの実施形態では、開示されている化合物は、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）及びＨａｌｏＴａｇ（登録商標）ベースの技術を用いて、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ融合タンパク質を単離するのに使用し得る。いくつかの実施形態では、開示されている化合物は、クリックケミストリーを用いて、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ融合タンパク質を単離するのに使用し得る。例えば、開示されている化合物は、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）及びアジドまたはアルキンで修飾されたビーズまたは表面を用いて、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ融合タンパク質を単離するのに使用し得る。別の実施形態では、開示されている化合物は、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）及びストレプトアビジンで修飾されたビーズまたは表面を用いて、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ融合タンパク質を単離するのに使用し得る。いくつかの実施形態では、開示されている化合物は、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）及びシアノベンゾチアゾールで修飾されたビーズまたは表面を用いて、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ融合タンパク質を単離するのに使用し得る。いくつかの実施形態では、開示されている化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ融合タンパク質の単離に用いるための薬物、ヌクレオチド、糖、タンパク質、ポリマー及び固体表面のような様々な生体分子及び巨大分子に付加し得る。例えば、細胞に、Ｎｌｕｃ−ＨＴ融合タンパク質のようなＮｌｕｃ融合タンパク質をトランスフェクションし、その細胞を、官能基に付加された本開示の化合物に暴露し得る。その官能基は、固体支持体に結合して、それによって、そのＮｌｕｃ融合タンパク質を単離可能にする分子であってよい。
【０１２１】
６．Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ活性の阻害方法
開示されている化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼを阻害する方法で使用し得る。開示されている化合物は、その活性部位で共有結合を形成することによって、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼを阻害し得る。その方法は、本発明で開示される化合物と、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼを発現するかまたは含む細胞を接触させることを含んでよく、その際、開示されている化合物は、そのＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼと選択的に反応して、そのＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼを不活化し得る。その方法は、試料と、基質セレンテラジン及び本発明で開示される化合物を接触させることを含んでよく、その際、本発明で開示される化合物により、そのＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼによる発光が減少する。その方法は、試料と、本発明で開示される化合物を接触させる前に、試料と基質セレンテラジンを接触させることを含んでよい。その方法は、試料と基質セレンテラジンを接触させる前に、試料と、本発明で開示される化合物を接触させることを含んでよい。
【０１２２】
その方法は、本発明で開示される化合物と、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼ融合タンパク質における結合パートナーを接触させることを含んでよく、その際、その融合タンパク質がインタクトな状態であると、開示されている化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼを阻害する。複数の生物発光系の時間的マルチプレックス化を伴う用途、またはいくつかのプレートベースの発光アッセイにおけるように、発光シグナルを抑制するのが望ましい場合のある実施形態において、開示されている化合物は、そのルシフェラーゼを阻害して、発光シグナルを選択的に抑制する役割を果たし得る。例えば、開示されている化合物を用いて、細胞内及び／または細胞外のＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ活性を阻害し得る。
【０１２３】
（１）細胞不透過性化合物の使用
特定の実施形態では、本発明で開示する方法は、試料（例えば細胞）と、細胞透過性基質のセレンテラジン、及び細胞不透過性となるように改変されている本明細書に記載の化合物の混合物とを接触させることを含む。このような実施形態では、開示されている化合物及び方法を用いて、ハイスループットスクリーニング作業のアッセイ形式の初期の輝度を確立した後に、細胞から排出され得るいずれのルシフェラーゼも選択的に阻害して、その細胞外で発生し得る発光を選択的に阻害し得る。このような方法は、細胞内で、より選択的なシグナルを提供し得る。
【０１２４】
（２）細胞透過性化合物の使用
特定の実施形態では、本発明で開示する方法は、試料（例えば細胞）と、細胞透過性基質のセレンテラジン、及び細胞透過性である本明細書に記載の化合物の混合物とを接触させることを含む。このような実施形態では、開示されている化合物は、細胞に侵入し、その細胞内のＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼを選択的に阻害することができる。このような方法は、２つ以上のルシフェラーゼの使用を伴うマルチプレックスアッセイにおいて有益なことがあり、細胞内の別のルシフェラーゼによる発光を選択的に観測する目的で、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼによる発光を阻害可能にし得る。
【０１２５】
（３）マルチプレックス化
開示されている化合物を使用して、他のルシフェラーゼ及びアッセイとの時間的マルチプレックス化に適用されているように、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼを阻害し得る。いくつかの実施形態では、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼまたはそのバリアントを、異なる波長の光を発する別の酵素（例えばルシフェラーゼ）、例えば、緑色ホタルルシフェラーゼ、例えば、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｏｒｐのＬｕｃ２）または赤色コメツキムシルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．のＣｈｒｏｍａ−Ｌｕｃ（商標）ルシフェラーゼ）とマルチプレックス化し得る。例えば、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼを機能的レポーターとして使用する場合、緑色ホタルルシフェラーゼまたは赤色Ｃｈｒｏｍａ−Ｌｕｃ（商標）ルシフェラーゼを使用して、遺伝子調節に対する非特異的な作用を制御したり、またはトランスフェクション効率を正規化したりできる。いくつかの実施形態では、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼから生成される発光（約４６０ｎｍ）及び赤色Ｃｈｒｏｍａ−Ｌｕｃから生成される発光（約６１０ｎｍ）は、波長識別フィルターを備えた発光測定装置を用いて容易に分解でき、同じ試料からの両方のシグナルを測定可能となる。このような実施形態では、本明細書に記載の化合物を使用して、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼを選択的に阻害して、もう一方のルシフェラーゼからのシグナルを選択的に観測できるようにできる。
【０１２６】
別の例では、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼは、転写レポーターとして使用して、異なる波長の光を発するルシフェラーゼであって、アッセイ試薬に含まれるルシフェラーゼと対にすることができる。別の例では、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼは、１つ以上の追加のルシフェラーゼとともに使用してよく、その場合、各ルシフェラーゼの発光は、選択的酵素阻害剤の使用を通じて、別々に測定し得る。例えば、適切な基質及び緩衝剤を加えて、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼの発光を測定したら、適切な基質及び緩衝剤、ならびにＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼに対して選択的である本明細書に記載の化合物１つ以上を加えて、第２のルシフェラーゼを測定し得る。別の例では、アッセイ試薬に含まれるＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼは、細胞のアポトーシスを推定するために、細胞生存能またはカスパーゼ活性を推定する目的で、細胞生理の所定の側面、例えばＡＴＰを測定するのに使用し得る。
【０１２７】
（４）自殺阻害
いくつかの実施形態では、開示されている化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼを不可逆的に阻害する自殺阻害剤として使用し得る。開示されている化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼの自殺基質であって、初めに、そのルシフェラーゼと反応して生物発光シグナルを生成し、続いて、そのＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼを不可逆的に阻害する自殺基質であり得る。開示されている化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼと共有結合付加体を形成することによって、そのＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼを阻害し得る。開示されている化合物は、ＮａｎｏＬｕｃ、及び相補的な酵素系ＮａｎｏＢｉＴを阻害し得る。いくつかの実施形態では、開示されている化合物は、リガンド−受容体結合アッセイに適用される自殺基質として使用し得る。
【０１２８】
７．試料
開示されている化合物は、生体成分を含む試料とともに使用し得る。その試料は、細胞を含んでよい。その試料は、成分の不均一混合物（インタクト細胞、細胞抽出物、細胞溶解液、細菌、ウイルス、細胞小器官、エクソソーム及びそれらの混合物を含む）、または単一成分もしくは均一な成分群（例えば、天然アミノ酸、合成アミノ酸、核酸重合体、糖鎖重合体もしくは脂質膜複合体）を含んでよい。開示されている化合物は概して、使用濃度範囲内では、生細胞及びその他の生体成分に対して無毒であり得る。
【０１２９】
その試料としては、動物（例えば脊椎動物）、植物、真菌、生理液（例えば、血液、血漿、尿、粘膜分泌物など）、細胞、細胞溶解液、細胞上清または細胞の精製画分（例えば細胞内画分）を挙げてよい。特定の実施形態では、その試料は、細胞であってよい。いくつかの実施形態では、その試料は、生細胞であってよい。その細胞は、真核細胞、例えば、酵母細胞、トリ細胞、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞（ヒト、サル、マウス、イヌ、ウシ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ヤギもしくはブタの細胞が挙げられるが、これらに限らない）、原核細胞、２つ以上の異なる生物に由来する細胞、あるいはその細胞溶解液または上清であってよい。その細胞は、組み換え技法によって遺伝子が改変されていなくてもよく（非組み換え細胞）、あるいは、組み換えＤＮＡ及び／または組み換えＤＮＡとともに安定して増幅されるゲノム、遺伝子を破壊するように、例えば、プロモーター、イントロンもしくはオープンリーディングフレームを破壊するように、またはある１つのＤＮＡ断片を別のＤＮＡ断片と置き換えるように改変されたゲノムを一過性にトランスフェクションされた組み換え細胞であってもよい。その組み換えＤＮＡまたは置換ＤＮＡ断片は、本発明の方法によって検出される分子、検出される分子のレベルもしくは活性を変化させる部分、及び／またはその分子のレベルもしくは活性を変化させる分子もしくは部分と無関係な遺伝子産物をコードしてよい。その細胞は、ルシフェラーゼを発現してもしなくてもよい。その細胞は、組み換え技法によって、遺伝子が改変されていてもよい。
【０１３０】
８．キット
開示するのは、１つ以上の酵素（例えば、ＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼまたはＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓバリアントルシフェラーゼ）の存在または活性を判断するためのキットである。そのキットは、ＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼまたはＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓバリアントルシフェラーゼを阻害し得る本発明の化合物または組成物、基質であるセレンテラジンまたは基質であるセレンテラジン誘導体、ＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼまたはＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓバリアントルシフェラーゼ、発光アッセイを実施するための説明、及び反応緩衝液（複数可）のうちの１つ以上を含んでよい。その反応緩衝液は、ルシフェラーゼ以外の酵素反応及び発光酵素反応のための個々の調合物に存在しても、一段階式のアッセイ用の単一の調合物に存在してもよい。そのキットは、ルシフェラーゼ以外の酵素（複数可）に対する他の阻害剤、活性化剤及び／または促進剤も含んでよい。そのキットは、そのアッセイのためのポジティブコントロール及び／またはネガティブコントロールも含んでよい。
【実施例】
【０１３１】
９．実施例
下記の実施例では、「一般的手順」という場合には、発明を実施するための形態の節において、スキーム１〜３に従って説明した手順を指す。
【０１３２】
実施例で使用されている略称は、ＤＢＣＯが、ジベンジルシクロオクチンであり、ＤＣＭが、ジクロロメタンであり、ＤＭＥＭが、ダルベッコ改変イーグル培地であり、ＤＭＦが、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドであり、ＤＭＳＯが、ジメチルスルホキシドであり、ＦＡＭが、フルオレセインであり、ＪＯＥが、カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセインであり、ＳＥが、スクシンイミジルエステルであり、Ｒ１１０が、ローダミン１１０であり、ＴＣＯが、トランス−シクロオクテンであり、ＴＦＡが、トリフルオロ酢酸である。
【０１３３】
実施例１
２−（４−（（６−アミノヘキシル）オキシ）−３−フルオロベンジル）−８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン（ＪＲＷ−０８５５）
2021523111.tif 000012
工程１．ｔｅｒｔ−ブチル（Ｚ）−（６−（４−（（８−ベンジル−６−（４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）フェニル）−３−オキソイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２（３Ｈ）−イリデン）メチル）−２−フルオロフェノキシ）ヘキシル）カルバメート（ＪＲＷ−０８５２）
2021523111.tif 000013
【０１３４】
一般的手順Ａに従って、ｔｅｒｔ−ブチル（６−（２−フルオロ−４−ホルミルフェノキシ）ヘキシル）カルバメート（２７１ｍｇ、０．８０ｍｍｏｌ）と、メチル２−（（３−ベンジル−５−（４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）フェニル）ピラジン−２−イル）アミノ）−２−（ジエトキシホスホリル）アセテート（４００ｍｇ、０．６７ｍｍｏｌ）を反応させて、粗生成物（４９０ｍｇ）を黒色固体として得た。
【０１３５】
工程２．ｔｅｒｔ−ブチル（６−（４−（（８−ベンジル−６−（４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）フェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）ヘキシル）カルバメート（ＪＲＷ−０８５３）
2021523111.tif 000014
【０１３６】
一般的手順Ｂに従って、ｔｅｒｔ−ブチル（Ｚ）−（６−（４−（（８−ベンジル−６−（４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）フェニル）−３−オキソイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２（３Ｈ）−イリデン）メチル）−２−フルオロフェノキシ）ヘキシル）カルバメート（４９０ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）と、水素化ホウ素ナトリウム（１２３ｍｇ、３．２ｍｍｏｌ）を反応させて、粗生成物（２２０ｍｇ）をオレンジ色固体として得た。
【０１３７】
工程３．２−（４−（（６−アミノヘキシル）オキシ）−３−フルオロベンジル）−８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン（ＪＲＷ−０８５５）
2021523111.tif 000015
【０１３８】
一般的手順Ｄに従って、ｔｅｒｔ−ブチル（６−（４−（（８−ベンジル−６−（４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）フェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）ヘキシル）カルバメート（２２０ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）と、トリフルオロ酢酸（３ｍＬ）を反応させて、所望の生成物（３工程全体で６０ｍｇ、１６％）をオレンジ色固体として得た。1Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ3ＯＤ） δ ７．６７ − ７．５２ （ｍ， １Ｈ）， ７．５２ − ７．４４ （ｍ， ２Ｈ）， ７．４４ − ７．３８ （ｍ， ２Ｈ）， ７．３６ − ７．２９ （ｍ， ２Ｈ）， ７．２９ − ７．２２ （ｍ， １Ｈ）， ７．１７ − ７．０４ （ｍ， ２Ｈ）， ７．００ （ｔ， Ｊ ＝ ８．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．９５ − ６．８６ （ｍ， ２Ｈ）， ４．４３ （ｓ， ２Ｈ）， ４．１２ （ｓ， ２Ｈ）， ４．０４ （ｔ， Ｊ ＝ ６．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．０１ − ２．８７ （ｍ， ２Ｈ）， １．８７ − １．７７ （ｍ， ２Ｈ）， １．７５ − １．６４ （ｍ， ２Ｈ）， １．６１ − １．４３ （ｍ， ４Ｈ）；ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ５４１ ［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ ８４．４ ％ （ＡＵＣ）， ＴR ４．４２ 分；ＵＶ （ＭｅＯＨ） λ ２６４ ｎｍ， ε １１，０２７．
【０１３９】
実施例２
４−（（６−（４−（（８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）ヘキシル）カルバモイル）−２−（３，６−ビス（ジメチルアミノ）キサンチリウム−９−イル）ベンゾエート（ＪＲＷ−０８５７）
2021523111.tif 000016
一般的手順Ｇに従って、２−（４−（（６−アミノヘキシル）オキシ）−３−フルオロベンジル）−８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン（６０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）と、２−（３，６−ビス（ジメチルアミノ）キサンチリウム−９−イル）−４−（（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）カルボニル）ベンゾエート（２９ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ）を反応させて、所望の生成物（９ｍｇ、８％）を赤色固体として得た。注：化合物は、溶液において不安定であった。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ９５４ ［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ ６０．７ ％ （ＡＵＣ）， ＴR ６．５８ 分；ＵＶ （ＭｅＯＨ） λ ５４２ｎｍ， ε ７３，３５９．
【０１４０】
実施例３
ナトリウム６−（４−（（８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）ヘキサン−１−スルホネート（ＪＲＷ−０８９２−２）
2021523111.tif 000017
工程１．ナトリウム（Ｚ）−６−（４−（（８−ベンジル−６−（４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）フェニル）−３−オキソイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２（３Ｈ）−イリデン）メチル）−２−フルオロフェノキシ）ヘキサン−１−スルホネート（ＪＲＷ−０８９０）
2021523111.tif 000018
【０１４１】
一般的手順Ｅに従って、ナトリウム６−（２−フルオロ−４−ホルミルフェノキシ）ヘキサン−１−スルホネート（１０８ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）と、メチル２−（（３−ベンジル−５−（４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）フェニル）ピラジン−２−イル）アミノ）−２−（ジエトキシホスホリル）アセテート（２００ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を反応させて、粗生成物を赤黒色固体として得た。
【０１４２】
工程２．ナトリウム６−（４−（（８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）ヘキサン−１−スルホネート（ＪＲＷ−０８９２−２）
2021523111.tif 000019
【０１４３】
一般的手順Ｆに従って、ナトリウム（Ｚ）−６−（４−（（８−ベンジル−６−（４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）フェニル）−３−オキソイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２（３Ｈ）−イリデン）メチル）−２−フルオロフェノキシ）ヘキサン−１−スルホネート（０．３３ｍｍｏｌ）と、水素化ホウ素ナトリウム（６３ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ）を反応させて、所望の生成物（２工程全体で４９ｍｇ、２３％）をオレンジ色固体として得た。1Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ3ＯＤ） δ ７．６２ − ７．４３ （ｍ， ２Ｈ）， ７．４３ − ７．３８ （ｍ， ２Ｈ）， ７．３６ − ７．２８ （ｍ， ２Ｈ）， ７．２８ − ７．２１ （ｍ， １Ｈ）， ７．１５ − ６．９６ （ｍ， ３Ｈ）， ６．９４ − ６．８６ （ｍ， ２Ｈ）， ４．４３ （ｓ， ２Ｈ）， ４．１２ （ｓ， ２Ｈ）， ４．０９ − ３．９６ （ｍ， ２Ｈ）， ２．８７ − ２．７９ （ｍ， ２Ｈ）， １．９３ − １．７２ （ｍ， ４Ｈ）， １．６０ − １．４６ （ｍ， ４Ｈ）；ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ６０６ ［Ｍ ＋ Ｈ − Ｎａ］+；ＨＰＬＣ ９７．６ ％ （ＡＵＣ）， ＴR ４．３３ 分；ＵＶ （ＭｅＯＨ） λ ２６４ｎｍ， ε ２５，５５９．
【０１４４】
実施例４
４−（（６−（４−（（８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）ヘキシル）カルバモイル）−２−（３，６−ジヒドロキシキサンチリウム−９−イル）ベンゾエート（ＪＲＷ−０８９３）
2021523111.tif 000020
一般的手順Ｇに従って、２−（４−（（６−アミノヘキシル）オキシ）−３−フルオロベンジル）−８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン（５３ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）と、２−（３，６−ジヒドロキシキサンチリウム−９−イル）−４−（（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）カルボニル）ベンゾエート（５５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を反応させて［注：ＦＡＭ−ＳＥは、５−異性体と６−異性体の混合物であった］、所望の生成物（２６ｍｇ、３０％）をオレンジ色固体として得た。1Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ3ＯＤ） δ ８．５４ − ８．４２ （ｍ， ２Ｈ）， ８．３５ − ８．２７ （ｍ， １Ｈ）， ７．９２ − ７．８８ （ｍ， １Ｈ）， ７．８２ − ７．７６ （ｍ， ２Ｈ）， ７．６０ − ７．４９ （ｍ， ３Ｈ）， ７．４９ − ７．３６ （ｍ， ４Ｈ）， ７．３６ − ７．１５ （ｍ， ５Ｈ）， ７．１３ − ７．００ （ｍ， ２Ｈ）， ６．９６ − ６．９０ （ｍ， ２Ｈ）， ４．６２ （ｓ， ２Ｈ）， ４．２６ （ｓ， ２Ｈ）， ４．１１ − ３．９６ （ｍ， ２Ｈ）， ３．４２ （ｔ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．８９ − １．６１ （ｍ， ４Ｈ）， １．６１ − １．４１ （ｍ， ４Ｈ）；ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ８９９ ［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ ７３．４ ％ （ＡＵＣ）， ＴR ５．２２ 分；ＵＶ （ＭｅＯＨ） λ ４４４ｎｍ， ε ２３，８４３．
【０１４５】
実施例５
Ｎ−（６−（４−（（８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）ヘキシル）−３−（５，５−ジフルオロ−７−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−５Ｈ−５ｌ４，６ｌ４−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−３−イル）プロパンアミド（ＪＲＷ−０９００）
2021523111.tif 000021
一般的手順Ｇに従って、２−（４−（（６−アミノヘキシル）オキシ）−３−フルオロベンジル）−８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン（２０ｍｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）と、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル３−（５，５−ジフルオロ−７−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−５Ｈ−５ｌ４，６ｌ４−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−３−イル）プロパノエート（１５ｍｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）を反応させて、所望の生成物（１０ｍｇ、３２％）を黒色固体として得た。1Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ3ＯＤ） δ ８．３７ （ｓ， １Ｈ）， ７．７３ （ｄ， Ｊ ＝ ８．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．４９ − ７．４４ （ｍ， ２Ｈ）， ７．３７ − ７．２９ （ｍ， ２Ｈ）， ７．２９ − ７．２２ （ｍ， １Ｈ）， ７．２２ − ６．８９ （ｍ， ９Ｈ）， ６．８２ （ｓ， １Ｈ）， ６．３７ − ６．２６ （ｍ， １Ｈ）， ５．５３ − ５．４１ （ｍ， １Ｈ）， ４．５８ （ｓ， ２Ｈ）， ４．２６ （ｓ， ２Ｈ）， ４．０２ （ｔ， Ｊ ＝ ６．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．３２ − ３．２７ （ｍ， ２Ｈ）， ３．２４ （ｔ， Ｊ ＝ ６．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．８０ − ２．７０ （ｍ， ２Ｈ）， １．８１ − １．６７ （ｍ， ２Ｈ）， １．５６ − １．４０ （ｍ， ４Ｈ）， １．３６ − １．２５ （ｍ， ４Ｈ）；ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ８５２ ［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ ９７．１ ％ （ＡＵＣ）， ＴR ５．７４ 分；ＵＶ （ＭｅＯＨ） λ ５７８ｎｍ， ε ７２，２８０．
【０１４６】
実施例６
Ｎ，Ｎ’−（６−（（６−（４−（（８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）ヘキシル）カルバモイル）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−３’，６’−ジイル）ビス（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）（ＪＲＷ−０９０５）
2021523111.tif 000022
一般的手順Ｇに従って、２−（４−（（６−アミノヘキシル）オキシ）−３−フルオロベンジル）−８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン（５０ｍｇ、０．０９２ｍｍｏｌ）と、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル３−オキソ−３’，６’−ビス（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６−カルボキシレート（６７ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を反応させて［注：Ｒ１１０−ＳＥは、５−異性体と６−異性体の混合物であった］、所望の生成物（３５ｍｇ、３５％）をオレンジ色固体として得た。６−異性体が例示及び命名されているが、この実施例における生成物は、５−異性体と６−異性体の混合物である。1Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ3ＯＤ） δ ８．５０ − ８．４４ （ｍ， １Ｈ）， ８．２３ − ８．０９ （ｍ， ２Ｈ）， ７．９２ − ７．８４ （ｍ， ２Ｈ）， ７．６６ − ７．５５ （ｍ， ２Ｈ）， ７．５２ − ７．４４ （ｍ， ２Ｈ）， ７．４３ − ７．１７ （ｍ， １０Ｈ）， ７．１３ − ６．８２ （ｍ， １０Ｈ）， ４．４４ − ４．３７ （ｍ， ２Ｈ）， ４．１３−４．０７ （ｍ， ２Ｈ）， ４．０６ − ３．９３ （ｍ， ２Ｈ）， ３．４６ （ｔ， Ｊ ＝ ６．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．８９ − １．６４ （ｍ， ４Ｈ）， １．６２ − １．４５ （ｍ， ４Ｈ）；ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ １０８９ ［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ ６１．４ ％ （ＡＵＣ）， ＴR ５．９７ 分；ＵＶ （ＭｅＯＨ） λ ４３４ｎｍ， ε ８，７９１．
【０１４７】
実施例７
２−（４−（（８−アミノオクチル）オキシ）−３−フルオロベンジル）−８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン（ＪＲＷ−０９０４）
2021523111.tif 000023
工程１．ｔｅｒｔ−ブチル（Ｚ）−（８−（４−（（８−ベンジル−６−（４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）フェニル）−３−オキソイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２（３Ｈ）−イリデン）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）カルバメート（ＪＲＷ−０９０１）
2021523111.tif 000024
【０１４８】
一般的手順Ａに従って、ｔｅｒｔ−ブチル（８−（２−フルオロ−４−ホルミルフェノキシ）オクチル）カルバメート（３５７ｍｇ、０．９７ｍｍｏｌ）と、メチル２−（（３−ベンジル−５−（４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）フェニル）ピラジン−２−イル）アミノ）−２−（ジエトキシホスホリル）アセテート（５３０ｍｇ、０．８８ｍｍｏｌ）を反応させて、粗生成物（３６０ｍｇ）を黒色固体として得た。
【０１４９】
工程２．ｔｅｒｔ−ブチル（８−（４−（（８−ベンジル−６−（４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）フェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）カルバメート（ＪＲＷ−０９０２）
2021523111.tif 000025
【０１５０】
一般的手順Ｂに従って、ｔｅｒｔ−ブチル（Ｚ）−（８−（４−（（８−ベンジル−６−（４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）フェニル）−３−オキソイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２（３Ｈ）−イリデン）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）カルバメート（３６０ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）と、水素化ホウ素ナトリウム（８７ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ）を反応させて、粗生成物をオレンジ色固体として得た。
【０１５１】
工程３．２−（４−（（８−アミノオクチル）オキシ）−３−フルオロベンジル）−８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン（ＪＲＷ−０９０４）
2021523111.tif 000026
【０１５２】
一般的手順Ｃ及びＤに従って、ｔｅｒｔ−ブチル（８−（４−（（８−ベンジル−６−（４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）フェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）カルバメートと、ＨＣｌ／ＭｅＯＨ及びＴＦＡ／ＤＣＭを反応させて、所望の生成物（３工程全体で１９２ｍｇ、７３％）をオレンジ色固体として得た。1Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ3ＯＤ） δ ７．６７ − ７．３８ （ｍ， ４Ｈ）， ７．３２ （ｔ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．２８ − ７．２３ （ｍ， １Ｈ）， ７．１５ − ７．０２ （ｍ， ２Ｈ）， ７．０３ − ６．９６ （ｍ， １Ｈ）， ６．９５ − ６．８６ （ｍ， ２Ｈ）， ４．４３ （ｓ， ２Ｈ）， ４．１２ （ｓ， ２Ｈ）， ４．０２ （ｔ， Ｊ ＝ ６．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．９２ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．８７ − １．７４ （ｍ， ２Ｈ）， １．７４ − １．６０ （ｍ， ２Ｈ）， １．５７ − １．４７ （ｍ， ２Ｈ）， １．４６ − １．３８ （ｍ， ６Ｈ）；ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ５６９ ［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ ９７．０ ％ （ＡＵＣ）， ＴR ４．４７ 分；ＵＶ （ＭｅＯＨ） λ ４３８ｎｍ， ε ５，７８７．
【０１５３】
実施例８
４−（（８−（４−（（８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）カルバモイル）−２−（３，６−ジヒドロキシキサンチリウム−９−イル）ベンゾエート（ＪＲＷ−０９０６）
2021523111.tif 000027
一般的手順Ｇに従って、２−（４−（（８−アミノオクチル）オキシ）−３−フルオロベンジル）−８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン（３０ｍｇ、０．０５３ｍｍｏｌ）と、２−（３，６−ジヒドロキシキサンチリウム−９−イル）−４−（（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）カルボニル）ベンゾエート（３０ｍｇ、０．０６３ｍｍｏｌ）を反応させて［注：ＦＡＭ−ＳＥは、５−異性体と６−異性体の混合物であった］、所望の生成物（２５ｍｇ、５２％）をオレンジ色固体として得た。６−異性体が例示及び命名されているが、この実施例における生成物は、５−異性体と６−異性体の混合物である。1Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ3ＯＤ） δ ８．８４ （ｄ， Ｊ ＝ １．７ Ｈｚ， ０．５Ｈ， 異性体Ａ）， ８．５２ − ８．４４ （ｍ， １．５Ｈ）， ８．３１ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ ２１．２， ８．１， １．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．８９ （ｄ， Ｊ ＝ １．７ Ｈｚ， ０．５Ｈ， 異性体Ｂ）， ７．８２ − ７．７６ （ｍ， ２Ｈ）， ７．６４ − ７．４９ （ｍ， ３Ｈ）， ７．４８ − ７．３７ （ｍ， ４Ｈ）， ７．３７ − ７．１７ （ｍ， ５Ｈ）， ７．１４ − ６．９９ （ｍ， ３Ｈ）， ６．９８ − ６．８９ （ｍ， ２Ｈ）， ４．６２ （ｓ， ２Ｈ）， ４．２６ （ｓ， ２Ｈ）， ４．０２ − ３．９９ （ｍ， ２Ｈ）， ３．５１ − ３．３８ （ｍ， ２Ｈ）， １．８７ − １．５９ （ｍ， ４Ｈ）， １．５９ − １．３６ （ｍ， ８Ｈ）；ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ９２７ ［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ ８９．５ ％ （ＡＵＣ）， ＴR ５．５７ 分；ＵＶ （ＭｅＯＨ） λ ４４４ｎｍ， ε ２４，０７１．
【０１５４】
実施例９
４−（（８−（４−（（８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）カルバモイル）−２−（３，６−ビス（ジメチルアミノ）キサンチリウム−９−イル）ベンゾエート（ＪＲＷ−０９１２）
2021523111.tif 000028
一般的手順Ｇに従って、２−（４−（（８−アミノオクチル）オキシ）−３−フルオロベンジル）−８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン（５０ｍｇ、０．０８８ｍｍｏｌ）と、２−（３，６−ビス（ジメチルアミノ）キサンチリウム−９−イル）−４−（（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）カルボニル）ベンゾエート（４６ｍｇ、０．０８８ｍｍｏｌ）を反応させて、所望の生成物（１８ｍｇ、２０％）を黒赤色固体として得た。注：化合物は、溶液において不安定であった。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ９８１ ［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ ６４．８ ％ （ＡＵＣ）， ＴR ５．０９ 分；ＵＶ （ＭｅＯＨ） λ ５５２ｎｍ， ε １２５，４４５．
【０１５５】
実施例１０
３−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）−Ｎ−（８−（４−（（１−ベンジル−３−（４−ヒドロキシフェニル）−６−オキソ−２，６−ジヒドロピロロ［１，２−ａ］ピラジン−７−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）プロパンアミド（ＪＲＷ−０９２５）
2021523111.tif 000029
工程１．４−（（８−アミノオクチル）オキシ）−３−フルオロベンズアルデヒド（ＪＲＷ−０９１８）
2021523111.tif 000030
【０１５６】
一般的手順Ｄに従って、ｔｅｒｔ−ブチル（８−（２−フルオロ−４−ホルミルフェノキシ）オクチル）カルバメート（２５０ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ）と、トリフルオロ酢酸（１ｍＬ）を反応させて、粗生成物を無色油として得た。
【０１５７】
工程２．ｔｅｒｔ−ブチル（２−（２−（３−（（８−（２−フルオロ−４−ホルミルフェノキシ）オクチル）アミノ）−３−オキソプロポキシ）エトキシ）エチル）カルバメート（ＪＲＷ−０９１９）
2021523111.tif 000031
【０１５８】
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の２，２−ジメチル−４−オキソ−３，８，１１−トリオキサ−５−アザテトラデカン−１４−オイックアシッド（２２６ｍｇ、０．８２ｍｍｏｌ）の溶液に、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（２０８ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ′−エチルカルボジイミド塩酸塩（２６０ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（２６３ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を加えた。ＤＭＦ（５ｍＬ）中の４−（（８−アミノオクチル）オキシ）−３−フルオロベンズアルデヒド（０．６８ｍｍｏｌ）を加え、その混合物を６０℃まで３０分加熱した。その反応物を酢酸エチルで希釈し、有機層を水で洗浄した。その有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製して、所望の生成物（３００ｍｇ、８３％）を無色油として得た。1Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ3） δ ９．８７ （ｄ， Ｊ ＝ ２．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．７３ − ７．５３ （ｍ， ２Ｈ）， ７．１１ − ７．０４ （ｍ， １Ｈ）， ６．３１ （ｓ， １Ｈ）， ５．００ （ｓ， １Ｈ）， ４．１３ （ｔ， Ｊ ＝ ６．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．７６ （ｔ， Ｊ ＝ ５．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．６３ （ｓ， ４Ｈ）， ３．５６ （ｄｄ， Ｊ ＝ ５．６， ４．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４０ − ３．１８ （ｍ， ４Ｈ）， ２．４９ （ｔ， Ｊ ＝ ５．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．９４ − １．８１ （ｍ， ２Ｈ）， １．４７ （ｓ， １３Ｈ）， １．４３ − １．３１ （ｍ， ６Ｈ）；ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ５２７ ［Ｍ＋Ｈ］+．
【０１５９】
工程３．ｔｅｒｔ−ブチル（Ｅ）−（２−（２−（３−（（８−（４−（（１−ベンジル−３−（４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）フェニル）−６−オキソピロロ［１，２−ａ］ピラジン−７（６Ｈ）−イリデン）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）アミノ）−３−オキソプロポキシ）エトキシ）エチル）カルバメート（ＪＲＷ−０９２２）
2021523111.tif 000032
【０１６０】
一般的手順Ａに従って、ｔｅｒｔ−ブチル（２−（２−（３−（（８−（２−フルオロ−４−ホルミルフェノキシ）オクチル）アミノ）−３−オキソプロポキシ）エトキシ）エチル）カルバメート（２８５ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）と、メチル２−（（３−ベンジル−５−（４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）フェニル）ピラジン−２−イル）アミノ）−２−（ジエトキシホスホリル）アセテート（３２５ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）を反応させて、粗生成物（４３０ｍｇ）を黒色固体として得た。
【０１６１】
工程４．ｔｅｒｔ−ブチル（２−（２−（３−（（８−（４−（（１−ベンジル−３−（４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）フェニル）−６−オキソ−２，６−ジヒドロピロロ［１，２−ａ］ピラジン−７−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）アミノ）−３−オキソプロポキシ）エトキシ）エチル）カルバメート（ＪＲＷ−０９２３）
2021523111.tif 000033
【０１６２】
一般的手順Ｂに従って、ｔｅｒｔ−ブチル（Ｅ）−（２−（２−（３−（（８−（４−（（１−ベンジル−３−（４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）フェニル）−６−オキソピロロ［１，２−ａ］ピラジン−７（６Ｈ）−イリデン）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）アミノ）−３−オキソプロポキシ）エトキシ）エチル）カルバメート（４３０ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）と、水素化ホウ素ナトリウム（８６ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ）を反応させて、粗生成物（３７０ｍｇ）をオレンジ色固体として得た。
【０１６３】
工程５．−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）−Ｎ−（８−（４−（（１−ベンジル−３−（４−ヒドロキシフェニル）−６−オキソ−２，６−ジヒドロピロロ［１，２−ａ］ピラジン−７−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）プロパンアミド（ＪＲＷ−０９２５）
2021523111.tif 000034
【０１６４】
一般的手順Ｃ及びＤに従って、ｔｅｒｔ−ブチル（２−（２−（３−（（８−（４−（（１−ベンジル−３−（４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）フェニル）−６−オキソ−２，６−ジヒドロピロロ［１，２−ａ］ピラジン−７−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）アミノ）−３−オキソプロポキシ）エトキシ）エチル）カルバメート（３７０ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）と、ＨＣｌ／ＭｅＯＨ及びＴＦＡ／ＤＣＭを反応させて、所望の生成物（３工程全体で１８０ｍｇ、４６％）をオレンジ色固体として得た。1Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ3ＯＤ） δ ７．７０ − ７．３８ （ｍ， ５Ｈ）， ７．３６ − ７．２１ （ｍ， ３Ｈ）， ７．１６ − ６．９６ （ｍ， ３Ｈ）， ６．９４ − ６．８７ （ｍ， ２Ｈ）， ４．４３ （ｓ， ２Ｈ）， ４．１２ （ｓ， ２Ｈ）， ４．０２ （ｔ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．８０ − ３．５９ （ｍ， ８Ｈ）， ３．１９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．１５ − ３．０７ （ｍ， ２Ｈ）， ２．４５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．８４ − １．７１ （ｍ， ２Ｈ）， １．５６ − １．４５ （ｍ， ４Ｈ）， １．４５ − １．２９ （ｍ， ６Ｈ）；ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ７２７ ［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ ９５．３ ％ （ＡＵＣ）， ＴR ４．３６ 分；ＵＶ （ＭｅＯＨ） λ ４３６ｎｍ， ε ６，４２６．
【０１６５】
実施例１１
４−（（２−（２−（３−（（８−（４−（（１−ベンジル−３−（４−ヒドロキシフェニル）−６−オキソ−２，６−ジヒドロピロロ［１，２−ａ］ピラジン−７−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）アミノ）−３−オキソプロポキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）−２−（３，６−ジヒドロキシキサンチリウム−９−イル）ベンゾエート（ＪＲＷ−０９２６）
2021523111.tif 000035
一般的手順Ｇに従って、−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）−Ｎ−（８−（４−（（１−ベンジル−３−（４−ヒドロキシフェニル）−６−オキソ−２，６−ジヒドロピロロ［１，２−ａ］ピラジン−７−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）プロパンアミド（５０ｍｇ、０．０６９ｍｍｏｌ）と、２−（３，６−ジヒドロキシキサンチリウム−９−イル）−４−（（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）カルボニル）ベンゾエート（３２ｍｇ、０．０６９ｍｍｏｌ）を反応させて［注：ＦＡＭ−ＳＥは、５−異性体と６−異性体の混合物であった］、所望の生成物（３５ｍｇ、４７％）を橙褐色固体として得た。６−異性体が例示及び命名されているが、この実施例における生成物は、５−異性体と６−異性体の混合物である。1Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ3ＯＤ） δ ８．８５ （ｄ， Ｊ ＝ １．７ Ｈｚ， ０．５Ｈ， 異性体Ａ）， ８．５３ − ８．４４ （ｍ， １．５Ｈ）， ８．４０ − ８．２６ （ｍ， １Ｈ）， ７．９６ − ７．８８ （ｍ， ０．５Ｈ， 異性体Ｂ）， ７．８２ − ７．７６ （ｍ， ２Ｈ）， ７．６４ − ７．４８ （ｍ， ４Ｈ）， ７．４８ − ７．４２ （ｍ， ２Ｈ）， ７．４２ − ７．３７ （ｍ， ２Ｈ）， ７．３６ − ７．２８ （ｍ， ２Ｈ）， ７．２８ − ７．１８ （ｍ， ３Ｈ）， ７．１３ − ６．９７ （ｍ， ３Ｈ）， ６．９７ − ６．８９ （ｍ， ２Ｈ）， ４．６３ （ｓ， ２Ｈ）， ４．２７ （ｓ， ２Ｈ）， ４．０２ − ３．９８ （ｍ， ２Ｈ）， ３．８２ − ３．５３ （ｍ， １０Ｈ）， ３．２８ − ３．１３ （ｍ， ２Ｈ）， ２．５９ − ２．５２ （ｍ， １Ｈ）， ２．５１ − ２．４３ （ｍ， １Ｈ）， １．８２ − １．６８ （ｍ， ２Ｈ）， １．５８ − １．４１ （ｍ， ４Ｈ）， １．４２ − １．２７ （ｍ， ８Ｈ）；ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ １０８６ ［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ ７４．９ ％ （ＡＵＣ）， ＴR ５．０８ 分；ＵＶ （ＭｅＯＨ） λ ４４４ｎｍ， ε ２３，６１４．
【０１６６】
実施例１２
４−（（２−（２−（３−（（８−（４−（（１−ベンジル−３−（４−ヒドロキシフェニル）−６−オキソ−２，６−ジヒドロピロロ［１，２−ａ］ピラジン−７−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）アミノ）−３−オキソプロポキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）−２−（３，６−ビス（ジメチルアミノ）キサンチリウム−９−イル）ベンゾエート（ＪＲＷ−０９２７）
2021523111.tif 000036
一般的手順Ｇに従って、−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）−Ｎ−（８−（４−（（１−ベンジル−３−（４−ヒドロキシフェニル）−６−オキソ−２，６−ジヒドロピロロ［１，２−ａ］ピラジン−７−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）プロパンアミド（５０ｍｇ、０．０６８ｍｍｏｌ）と、２−（３，６−ビス（ジメチルアミノ）キサンチリウム−９−イル）−４−（（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）カルボニル）ベンゾエート（３６ｍｇ、０．０６８ｍｍｏｌ）を反応させて、所望の生成物（１８ｍｇ、２３％）を黒赤色固体として得た。注：化合物は、溶液において不安定であった。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ １１４０ ［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ ３７．６ ％ （ＡＵＣ）， ＴR ４．７９ 分；ＵＶ （ＭｅＯＨ） λ ５５２ｎｍ， ε ８９，４１５．
【０１６７】
実施例１３
６−（（８−（４−（（８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）カルバモイル）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−３’，６’−ジイルジアセテート（ＪＲＷ−０９７２）
2021523111.tif 000037
一般的手順Ｇに従って、２−（４−（（８−アミノオクチル）オキシ）−３−フルオロベンジル）−８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン（５０ｍｇ、０．０６８ｍｍｏｌ）と、６−（（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）カルボニル）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−３’，６’−ジイルジアセテート（５８ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を反応させて［注：ＦＡＭ−ＳＥは、５−異性体と６−異性体の混合物であった］、所望の生成物（４２ｍｇ、４７％）をオレンジ色固体として得た。６−異性体が例示及び命名されているが、この実施例における生成物は、５−異性体と６−異性体の混合物である。注：化合物は、溶液において不安定であった。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ １０１１ ［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ ４５．７ ％ （ＡＵＣ）， ＴR ５．８３ 分；ＵＶ （ＭｅＯＨ） λ ４４４ｎｍ， ε ３２，８２６．
【０１６８】
実施例１４
２−（４−（（６−アジドヘキシル）オキシ）−３−フルオロベンジル）−８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン（ＪＲＷ−０９７５）
2021523111.tif 000038
工程１．４−（（６−アジドヘキシル）オキシ）−３−フルオロベンズアルデヒド（ＪＲＷ−０８９１）
2021523111.tif 000039
【０１６９】
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の４−（（６−ブロモヘキシル）オキシ）−３−フルオロベンズアルデヒド（２５０ｍｇ、０．０８２ｍｍｏｌ）の溶液に、ナトリウムアジド（１０７ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）を加えた。その反応物を６０℃まで１８時間加熱した。その反応物を酢酸エチルで希釈し、有機層を水で洗浄した。その有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮して、粗生成物（２２０ｍｇ）を無色油として得た。1Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ3） δ ９．８８ （ｄ， Ｊ ＝ ２．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．７３ − ７．５３ （ｍ， ２Ｈ）， ７．０８ （ｔ， Ｊ ＝ ８．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．１５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．３２ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．９０ （ｄｔ， Ｊ ＝ ８．０， ６．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．８１ − １．４０ （ｍ， ６Ｈ）．
【０１７０】
工程２．２−（４−（（６−アジドヘキシル）オキシ）−３−フルオロベンジリデン）−８−ベンジル−６−（４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）フェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（２Ｈ）−オン（ＪＲＷ−０９６９）
2021523111.tif 000040
【０１７１】
一般的手順Ａに従って、４−（（６−アジドヘキシル）オキシ）−３−フルオロベンズアルデヒド（１０６ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）と、メチル２−（（３−ベンジル−５−（４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）フェニル）ピラジン−２−イル）アミノ）−２−（ジエトキシホスホリル）アセテート（２００ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を反応させて、粗生成物（１２０ｍｇ）を黒色固体として得た。
【０１７２】
工程３．２−（４−（（６−アジドヘキシル）オキシ）−３−フルオロベンジル）−８−ベンジル−６−（４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）フェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン（ＪＲＷ−０９７４）
2021523111.tif 000041
【０１７３】
一般的手順Ｂに従って、２−（４−（（６−アジドヘキシル）オキシ）−３−フルオロベンジリデン）−８−ベンジル−６−（４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）フェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（２Ｈ）−オン（１２０ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）と、水素化ホウ素ナトリウム（２０ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）を反応させて、粗生成物を黄色固体として得た。
【０１７４】
工程４．２−（４−（（６−アジドヘキシル）オキシ）−３−フルオロベンジル）−８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン（ＪＲＷ−０９７５）
2021523111.tif 000042
【０１７５】
一般的手順Ｃに従って、２−（４−（（６−アジドヘキシル）オキシ）−３−フルオロベンジル）−８−ベンジル−６−（４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）フェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン（０．１８ｍｍｏｌ）と、ＨＣｌ／ＭｅＯＨを反応させて、所望の生成物（３工程全体で６７ｍｇ、３６％）をオレンジ色固体として得た。1Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ3ＯＤ） δ ７．６７ − ７．４３ （ｍ， ３Ｈ）， ７．４３ − ７．３７ （ｍ， ２Ｈ）， ７．３５ − ７．２０ （ｍ， ３Ｈ）， ７．１５ − ７．０３ （ｍ， ２Ｈ）， ６．９８ （ｔ， Ｊ ＝ ８．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．９２ − ６．８６ （ｍ， ２Ｈ）， ４．４１ （ｓ， ２Ｈ）， ４．１１ （ｓ， ２Ｈ）， ４．０１ （ｔ， Ｊ ＝ ６．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．２９ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．７７ （ｄｔ， Ｊ ＝ ８．０， ６．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．７０ − １．３８ （ｍ， ６Ｈ）；ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ５６７ ［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ ９９．０ ％ （ＡＵＣ）， ＴR ５．８５ 分；ＵＶ （ＭｅＯＨ） λ ４３８ｎｍ， ε １０，４１９．
【０１７６】
実施例１５
６−（（８−（４−（（８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）カルバモイル）−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−３’，６’−ジイルジアセテート（ＪＲＷ−０９８６）
2021523111.tif 000043
一般的手順Ｇに従って、２−（４−（（８−アミノオクチル）オキシ）−３−フルオロベンジル）−８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン（４２ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ）と、４’，５’−ジクロロ−６−（（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）カルボニル）−２’，７’−ジメトキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−３’，６’−ジイルジアセテート（５５ｍｇ、０．０８１ｍｍｏｌ）を反応させて［注：ＪＯＥ−ＳＥは、５−異性体と６−異性体の混合物であった］、所望の生成物（４０ｍｇ、４７％）を赤色固体として得た。６−異性体が例示及び命名されているが、この実施例における生成物は、５−異性体と６−異性体の混合物である。注：化合物は、溶液において不安定であった。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ １１４１ ［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ ７３．４ ％ （ＡＵＣ）， ＴR ６．４５ 分；ＵＶ （ＭｅＯＨ） λ ４７２ｎｍ， ε ４，４３３．
【０１７７】
実施例１６
８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−２−（（２−オキソ−２Ｈ−クロメン−６−イル）メチル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン（ＪＲＷ−０９９５）
2021523111.tif 000044
工程１．８−ベンジル−６−（４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）フェニル）−２−（（２−オキソ−２Ｈ−クロメン−６−イル）メチレン）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（２Ｈ）−オン（ＪＲＷ−０９９２）
2021523111.tif 000045
【０１７８】
一般的手順Ａに従って、２−オキソ−２Ｈ−クロメン−６−カルバルデヒド（５２ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）と、メチル２−（（３−ベンジル−５−（４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）フェニル）ピラジン−２−イル）アミノ）−２−（ジエトキシホスホリル）アセテート（１５０ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を反応させて、粗生成物を黒色固体として得た。
【０１７９】
工程２．８−ベンジル−６−（４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）フェニル）−２−（（２−オキソ−２Ｈ−クロメン−６−イル）メチル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン（ＪＲＷ−０９９３）
2021523111.tif 000046
【０１８０】
一般的手順Ｂに従って、８−ベンジル−６−（４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）フェニル）−２−（（２−オキソ−２Ｈ−クロメン−６−イル）メチレン）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（２Ｈ）−オン（０．２５ｍｍｏｌ）と、水素化ホウ素ナトリウム（４７ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）を反応させて、粗生成物（４５ｍｇ）をオレンジ色固体として得た。
【０１８１】
工程３．８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−２−（（２−オキソ−２Ｈ−クロメン−６−イル）メチル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン（ＪＲＷ−０９９５）
2021523111.tif 000047
【０１８２】
一般的手順Ｃに従って、８−ベンジル−６−（４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）フェニル）−２−（（２−オキソ−２Ｈ−クロメン−６−イル）メチル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン（４５ｍｇ、０．０７６ｍｍｏｌ）と、ＨＣｌ／ＭｅＯＨを反応させて、所望の生成物（３工程全体で３２ｍｇ、２７％）をオレンジ色固体として得た。1Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ3ＯＤ） δ ７．９０ （ｄ， Ｊ ＝ ９．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．６８ − ７．５３ （ｍ， ３Ｈ）， ７．５１ − ７．３５ （ｍ， ４Ｈ）， ７．３５ − ７．１８ （ｍ， ４Ｈ）， ６．９３ − ６．８６ （ｍ， ２Ｈ）， ６．４１ （ｄ， Ｊ ＝ ９．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４１ （ｓ， ２Ｈ）， ４．２５ （ｓ， ２Ｈ）；ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ４７６ ［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ ８５．３ ％ （ＡＵＣ）， ＴR ４．４７ 分；ＵＶ （ＭｅＯＨ） λ ４３９ｎｍ， ε ８２１４．
【０１８３】
実施例１７
Ｎ−（８−（４−（（８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）−１１−オキソ−２，３，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ−ピラノ［２，３−ｆ］ピリド［３，２，１−ｉｊ］キノリン−１０−カルボキサミド（ＪＲＷ−１０２３）
2021523111.tif 000048
一般的手順Ｇに従って、２−（４−（（８−アミノオクチル）オキシ）−３−フルオロベンジル）−８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン（５０ｍｇ、０．０８８ｍｍｏｌ）と、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル１１−オキソ−２，３，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ−ピラノ［２，３−ｆ］ピリド［３，２，１−ｉｊ］キノリン−１０−カルボキシレート（６７ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を反応させて、所望の生成物（２４ｍｇ、３３％）をオレンジ色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ８３６ ［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ ７６．０ ％ （ＡＵＣ）， ＴR ６．４３分．
【０１８４】
実施例１８
Ｎ−（８−（４−（（８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）−７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−カルボキサミド（ＪＲＷ−１０１８）
2021523111.tif 000049
一般的手順Ｇに従って、２−（４−（（８−アミノオクチル）オキシ）−３−フルオロベンジル）−８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン（４１ｍｇ、０．０７２ｍｍｏｌ）と、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−カルボキシレート（４３ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を反応させて、所望の生成物（３６ｍｇ、６７％）を褐色固体として得た。1Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ3ＯＤ） δ ８．７１ （ｓ， １Ｈ）， ８．４５ （ｓ， １Ｈ）， ７．８４ − ７．６９ （ｍ， ２Ｈ）， ７．６３ （ｄ， Ｊ ＝ ８．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．５３ （ｓ， １Ｈ）， ７．４８ − ７．３９ （ｍ， ２Ｈ）， ７．３５ − ７．１８ （ｍ， ３Ｈ）， ７．１２ − ６．９６ （ｍ， ３Ｈ）， ６．９６ − ６．８５ （ｍ， ３Ｈ）， ６．７５ （ｄ， Ｊ ＝ ２．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．６１ （ｓ， ２Ｈ）， ４．２４ （ｓ， ２Ｈ）， ４．００ （ｔ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４０ − ３．３５ （ｍ， ２Ｈ）， １．８１ − １．６９ （ｍ， ２Ｈ）， １．６６ − １．５３ （ｍ， ２Ｈ）， １．５３ − １．３３ （ｍ， ８Ｈ）；ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ７５７ ［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ ９１．２ ％ （ＡＵＣ）， ＴR ５．６９ 分；ＵＶ （ＭｅＯＨ） λ ３５０ｎｍ， ε ２３６４６．
【０１８５】
実施例１９
２−（４−（（８−アジドオクチル）オキシ）−３−フルオロベンジル）−８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン（ＪＲＷ−１０２２）
2021523111.tif 000050
工程１．４−（（８−ブロモオクチル）オキシ）−３−フルオロベンズアルデヒド（ＪＲＷ−１０１６）
2021523111.tif 000051
【０１８６】
アセトニトリル（２０ｍＬ）中の３−フルオロ−４−ヒドロキシベンズアルデヒド（１．１ｇ、７．９ｍｍｏｌ）の溶液に、１，８−ジブロモオクタン（２．８ｇ、１０ｍｍｏｌ）及び炭酸セシウム（３．１ｇ、９．４ｍｍｏｌ）を加えた。その反応物を６０℃まで１８時間加熱した。その反応物を酢酸エチルで希釈し、有機層を水で洗浄した。その有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮して、所望の生成物（１．５６ｇ、６０％）を無色油として得た。1Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ3） δ ９．８７ （ｄ， Ｊ ＝ ２．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．８５ − ７．４８ （ｍ， ２Ｈ）， ７．０８ （ｔ， Ｊ ＝ ８．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．１３ （ｔ， Ｊ ＝ ６．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４３ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．００ − １．７３ （ｍ， ４Ｈ）， １．７３ − １．２０ （ｍ， ８Ｈ）．
【０１８７】
工程２．４−（（８−アジドオクチル）オキシ）−３−フルオロベンズアルデヒド（ＪＲＷ−１０１７）
2021523111.tif 000052
【０１８８】
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の４−（（８−ブロモオクチル）オキシ）−３−フルオロベンズアルデヒド（２５０ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）の溶液に、ナトリウムアジド（９８ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）を加えた。その反応物を６０℃まで１８時間加熱した。その反応物を酢酸エチルで希釈し、有機層を水で洗浄した。その有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮して、粗生成物（２２０ｍｇ）を無色油として得た。1Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ3） δ ９．８７ （ｄ， Ｊ ＝ ２．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．８０ − ７．４８ （ｍ， ２Ｈ）， ７．２５ − ６．８７ （ｍ， １Ｈ）， ４．１３ （ｔ， Ｊ ＝ ６．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．２９ （ｔ， Ｊ ＝ ６．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．００ − １．７５ （ｍ， ２Ｈ）， １．７５ − １．２４ （ｍ， １０Ｈ）．
【０１８９】
工程３．２−（４−（（８−アジドオクチル）オキシ）−３−フルオロベンジリデン）−８−ベンジル−６−（４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）フェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（２Ｈ）−オン（ＪＲＷ−１０２０）
2021523111.tif 000053
【０１９０】
一般的手順Ａに従って、４−（（８−アジドオクチル）オキシ）−３−フルオロベンズアルデヒド（６４ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）と、メチル２−（（３−ベンジル−５−（４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）フェニル）ピラジン−２−イル）アミノ）−２−（ジエトキシホスホリル）アセテート（１１０ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を反応させて、粗生成物を黒色固体として得た。
【０１９１】
工程４．２−（４−（（８−アジドオクチル）オキシ）−３−フルオロベンジル）−８−ベンジル−６−（４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）フェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン（ＪＲＷ−１０２１）
2021523111.tif 000054
【０１９２】
一般的手順Ｂに従って、２−（４−（（８−アジドオクチル）オキシ）−３−フルオロベンジリデン）−８−ベンジル−６−（４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）フェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（２Ｈ）−オン（０．１８ｍｍｏｌ）と、水素化ホウ素ナトリウム（２０ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）を反応させて、粗生成物を黄色固体として得た。
【０１９３】
工程５．２−（４−（（８−アジドオクチル）オキシ）−３−フルオロベンジル）−８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン（ＪＲＷ−１０２２）
2021523111.tif 000055
【０１９４】
一般的手順Ｃに従って、２−（４−（（８−アジドオクチル）オキシ）−３−フルオロベンジル）−８−ベンジル−６−（４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）フェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン（０．１８ｍｍｏｌ）と、ＨＣｌ／ＭｅＯＨを反応させて、所望の生成物（３工程全体で６４ｍｇ、６０％）をオレンジ色固体として得た。1Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ3ＯＤ） δ ７．６９ − ７．３７ （ｍ， ５Ｈ）， ７．３５ − ７．２０ （ｍ， ３Ｈ）， ７．１６ − ７．０３ （ｍ， ２Ｈ）， ６．９８ （ｔ， Ｊ ＝ ８．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．９３ − ６．８７ （ｍ， ２Ｈ）， ４．４２ （ｓ， ２Ｈ）， ４．１１ （ｓ， ２Ｈ）， ４．０１ （ｔ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．２７ （ｔ， Ｊ ＝ ６．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．８５ − １．７１ （ｍ， ２Ｈ）， １．６７ − １．３０ （ｍ， １０Ｈ）；ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ５９５ ［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ ９９．２ ％ （ＡＵＣ）， ＴR ６．２５ 分；ＵＶ （ＭｅＯＨ） λ ４３８ｎｍ， ε １０，５３６．
【０１９５】
実施例２０
５−（（８−（４−（（８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）カルバモイル）−２−（２，７−ジフルオロ−３，６−ジヒドロキシキサンチリウム−９−イル）ベンゾエート（ＪＲＷ−１０５８）
2021523111.tif 000056
一般的手順Ｇに従って、２−（４−（（８−アミノオクチル）オキシ）−３−フルオロベンジル）−８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン（１５ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）と、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル２’，７’−ジフルオロ−３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−カルボキシレート（１３ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）を反応させて、所望の生成物（１２ｍｇ、４８％）を赤色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ９６３ ［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ ５８．１ ％ （ＡＵＣ）， ＴR ５．５０ 分；ＵＶ （ＭｅＯＨ） λ ２８０ｎｍ， ε ２１，６００．
【０１９６】
実施例２１
５−（（８−（４−（（８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）カルバモイル）−２−（３，１１−ジヒドロキシジベンゾ［ｃ，ｈ］キサンテン−１４−イウム−７−イル）ベンゾエート（ＪＲＷ−１０５９）
2021523111.tif 000057
一般的手順Ｇに従って、２−（４−（（８−アミノオクチル）オキシ）−３−フルオロベンジル）−８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン（２５ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ）と、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル３，１１−ジヒドロキシ−３’−オキソ−３’Ｈ−スピロ［ジベンゾ［ｃ，ｈ］キサンテン−７，１’−イソベンゾフラン］−５’−カルボキシレート（２５ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ）を反応させて、所望の生成物（１３ｍｇ、２８％）を褐色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ １０２８ ［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ ８２．３ ％ （ＡＵＣ）， ＴR ５．７１ 分；ＵＶ （ＭｅＯＨ） λ ５２８ｎｍ， ε １１，８００．
【０１９７】
実施例２２
Ｎ１−（８−（４−（（８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）−Ｎ４−（２−（５，５−ジフルオロ−１，３−ジメチル−５Ｈ−５λ4，６λ4−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−１０−イル）エチル）コハク酸アミド（ＪＲＷ−１０８８）
2021523111.tif 000058
【０１９８】
一般的手順Ｇに従って、２−（４−（（８−アミノオクチル）オキシ）−３−フルオロベンジル）−８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン（３０ｍｇ、０．０５２ｍｍｏｌ）と、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４−（（２−（５，５−ジフルオロ−１，３−ジメチル−５Ｈ−５λ4，６λ4−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−１０−イル）エチル）アミノ）−４−オキソブタノエート（４８ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を反応させて、所望の生成物（１６ｍｇ、３３％）を褐色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ９１４ ［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ ７５．６ ％ （ＡＵＣ）， ＴR ５．６３ 分；ＵＶ （ＭｅＯＨ） λ ４９０ｎｍ， ε ４８，７５４．
【０１９９】
実施例２３
発光特性
発光アッセイ手順：スクリーニングする各化合物をＤＭＳＯ（５ｍＭ）に溶解してから、ＮＡＮＯ−ＧＬＯ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒにおいて１００μＭまでさらに希釈した。最初に、基質をＮＡＮＯ−ＧＬＯ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ中に２倍段階希釈することによって、Ｋｍ値を求めた。続いて、基質希釈液と、ＴＢＳ＋０．０１％ＢＳＡにおいて４ｎｇ／ｍｌまで希釈した当量のＮａｎｏＬｕｃを合わせた。基質の１００ｕＭ希釈液とＴＢＳ＋０．０１％ＢＳＡを合わせることによって、自己発光を測定した。発光値及び自己発光値は、基質を加えてから３分後に、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）−Ｍｕｌｔｉ＋という発光測定装置で測定した。ＴＢＳ＋０．０１％ＢＳＡにおいて、当量の１００ｕＭ基質と、４ｎｇ／ｍｌのＮａｎｏＬｕｃを合わせることによって、シグナルの減衰を測定してから、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）−Ｍｕｌｔｉ＋を用いて、試料を５分間隔で２時間、読み取った。１００ｕＭにおける発光値及び自己発光値が図１に示されている。Ｋｍは、非線形のミカエルリス−メンテンの回帰を用いたＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて算出した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍの非線形減衰（プラトーを０に設定した）を用いて、シグナル半減期の値を算出した。光出力、シグナル半減期及びＫｍの値は、表１にまとめられている。値は、各カテゴリーにおいて、フリマジンを１とした場合の相対値として表されている（２ｎｇ／ｍｌのＮａｎｏＬｕｃにおいて約２．０×１０7のＲＬＵ）。
表１
2021523111.tif 000059
2021523111.tif 000060
ＮＴ−未試験
ＮＣ−算出不能
【０２００】
動態的読み取り手順：フリマジン（８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン）またはフリマジン−ｈ（８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−（４−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン）をエタノール：プロピレングリコール（８５：１５）（５ｍＭ）に溶解してから、ＮＡＮＯ−ＧＬＯ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒにおいて様々な濃度までさらに希釈した。続いて、各希釈基質を当量で、ｐＨ６．８のリン酸緩衝生理食塩水中に希釈した精製ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼと合わせた。各基質の光出力をＧｌｏＭａｘ（登録商標）−Ｍｕｌｔｉ＋という発光測定装置で、様々な長さの時間にわたって測定した。フリマジン及びフリマジン−ｈのシグナル半減期の動態的読み取り値が図２に示されている。
【０２０１】
実施例２４
ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ（Ｎｌｕｃ）の阻害
化合物は、ＮａｎｏＬｕｃによるフリマジンの発光をブロックする能力についても試験した。典型的には、ＤＭＥＭ中のＮａｎｏＬｕｃ（０．４μｇ／ｍＬ）を、フリマジンまたは試験化合物（５０μＭ）のいずれかとともにインキュベートしながら、ＲＬＵを発光測定装置ＧｌｏＭａｘ（登録商標）で１０〜６０分モニタリングした。設定時間の経過後、プレートをその装置から取り出し、試験化合物の入ったウェルに、ある用量のフリマジン（１０μＭ）を加え、１０〜６０分モニタリングした。
【０２０２】
自殺阻害：図３Ａ〜Ｂには、Ｎｌｕｃルシフェラーゼのフリマジン−ｈによる阻害が示されている。フリマジン−ｈ（１０μＭ）をＮａｎｏＬｕｃとともに、ＮａｎｏＧｌｏ中で１５分、またはＤＭＥＭ中で１０分インキュベートした。この明るいシグナルは速やかに、フリマジンのポジティブコントロールウェルで観察されるシグナルの数分の１まで低下する。インキュベーション期間後、フリマジン−ｈの入ったウェルに、様々な濃度のフリマジンを加え、これらのフリマジンを追加しても、生物発光は増大せず、ＮａｎｏＬｕｃが阻害されることが示されている。
【０２０３】
例示的なＮｌｕｃ自殺基質の他の例が、図４Ａ〜Ｆに示されている。勘案すると、これらの結果から、フリマジン−ｈ、ＪＲＷ−０８９３、ＪＲＷ−０８９２−２、ＪＲＷ−０９０６、ＪＲＷ−０９２６、ＪＲＷ−０９７５及びＪＲＷ−１０５８が、ＮａｎｏＬｕｃの例示的な自殺基質であることが示されている。
【０２０４】
図９には、Ｎｌｕｃルシフェラーゼのフリマジン−ｈによる阻害が示されている。これは、図３と比較すると、逆添加実験である。フリマジン（１０μＭ）をＮａｎｏＬｕｃとともに、ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液中で１５分インキュベートした。インキュベーション期間後、フリマジンの入ったウェルに、様々な濃度のフリマジン−ｈを加え、これらのフリマジン−ｈの添加により、シグナルが急速に減衰する。これにより、フリマジン−ｈが、フリマジンと競合してＮｌｕｃから排除することができ、生物発光反応が起きる際に、Ｎｌｕｃが、その自殺基質によって阻害されることが示されている。
【０２０５】
部分的阻害：Ｎｌｕｃに対する非常に弱い基質である試験化合物では、フリマジンを加えたところ、生物発光は部分的にしか阻害されなかった。これらの部分的阻害剤では典型的には、ＮａｎｏＬｕｃとインキュベートした場合、フリマジンの生物発光活性の約１％未満になった。図５Ａ〜Ｂには、ＪＲＷ−０８５５及びＪＲＷ−１０８８の部分的阻害活性が示されている。ＪＲＷ−０８５５及びＪＲＷ−１０８８は、ＮａｎｏＬｕｃとともに、ＤＭＥＭ中で１２分インキュベートした。図に示されているように、ＪＲＷ−０８５５及びＪＲＷ−１０８８とＮａｎｏＬｕｃとの反応における初期発光シグナルは、フリマジンとＮａｎｏＬｕｃとの反応における初期発光シグナルよりも有意に低かった。インキュベーション期間後、１０μＭのフリマジンをウェルに加えた。フリマジンを加えたところ、生物発光が部分的に回復し、Ｎｌｕｃが、ＪＲＷ−０８５５及びＪＲＷ−１０８８によって部分的にしか阻害されないことが示された。他の例示的な部分的Ｎｌｕｃ阻害剤としては、ＪＲＷ−０９０４、ＪＲＷ−０９２５、ＪＲＷ−０９９５、ＪＲＷ−１０１８及びＪＲＷ−１０２２が挙げられた。
【０２０６】
阻害の欠如：ＮａｎｏＬｕｃの基質ではない試験化合物では、フリマジンを加えたところ、生物発光は阻害されなかった。図６Ａ〜Ｂには、ＪＲＷ−０８５７及びＪＲＷ−１０５９が、ＮａｎｏＬｕｃを阻害できないことが示されている。フリマジンを加えたところ、生物発光が大きく増大したことから、ＮａｎｏＬｕｃが阻害されないことが示された。ＮａｎｏＬｕｃを阻害しなかった試験化合物の例としては、ＪＲＷ−０８５７、ＪＲＷ−０９００、ＪＲＷ−０９１２、ＪＲＷ−０９２７、ＪＲＷ−０９７２、ＪＲＷ−０９８６及びＪＲＷ−１０２３が挙げられる。
【０２０７】
勘案すると、これらの試験の結果から、ＮａｎｏＬｕｃの阻害は、開示されている化合物をＮａｎｏＬｕｃとインキュベートすると生じる初期生物発光反応の結果であることが示唆されている。したがって、阻害活性を有する化合物は、自殺基質と称する。これらの基質の作用機序を理解するためには、さらなる試験が必要である。
【０２０８】
実施例２５
ＮａｎｏＢｉＴ（商標）２分子ルシフェラーゼ系の阻害
化合物は、ＮａｎｏＢｉＴ（商標）２分子ルシフェラーゼを阻害する能力についても試験した。ＨｉＢｉＴ（配列番号３）及びＬｇＢｉＴ（配列番号４）（ＮａｎｏＢｉＴ（商標）ルシフェラーゼの２つのサブユニット）をフリマジンまたはフリマジン−ｈとともに１５分インキュベートした。インキュベーション期間後、１０μＭのフリマジンを加えた。図７に示されているように、フリマジン−ｈは、Ｎｌｕｃとインキュベーション後、初めに、フリマジンの発光シグナルに匹敵する発光シグナルを生成する。このシグナルは、フリマジンのポジティブコントロールウェルで観察されるシグナルの数分の１まで速やかに低下する。フリマジンのポジティブコントロールウェルにフリマジンを加えると、生物発光が増大する。対照的に、フリマジンをフリマジン−ｈのウェルに加えると、生物発光は増大しないことから、ＮａｎｏＢｉＴ（商標）ルシフェラーゼが、フリマジン−ｈによって効果的に阻害されることが示されている。
【０２０９】
実施例２６
蛍光イメージング
自殺基質がＮａｎｏＬｕｃを標識するのをさらに示すために、ＮａｎｏＬｕｃを２つの蛍光性ＦＡＭ−基質セレンテラジン、ＪＲＷ−０９０６及びＪＲＷ−０９２６とともにインキュベートした。それらのＮａｎｏＬｕｃ自殺基質の効率は、ＨａｌｏＴａｇタンパク質（配列番号５）がグルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはＮａｎｏＬｕｃのいずれかに融合されている融合タンパク質によって、クロロアルカン−ＦＡＭという基質と比較した。
【０２１０】
ＦＡＭクロロアルカンまたはセレンテラジンＦＡＭという基質のいずれかをグルタチオントランスフェラーゼ−ＨａｌｏＴａｇ（ＧＳＴ−ＨＴ）またはＮａｎｏＬｕｃ−ＨａｌｏＴａｇ（Ｎｌｕｃ−ＨＴ）融合体のいずれかとともにインキュベートした。その反応物は、０．５μＭのタンパク質（ＧＳＴ−ＨＴまたはＮｌｕｃ−ＨＴ）及び５０μＭの標識（１００×過剰の標識）を有するものであり、３０分、室温でインキュベートした。続いて、各試料の試料漸増量をＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルに流した。蛍光（４７３ｅｘ）（Ｃｙ２フィルターセット）を読み取り、定量した。図８Ａに示されているように、基質であるクロロアルカン及びセレンテラジンのいずれでも、用量依存的な標識が見られる。結果は、図８Ｂに定量化されている。図８Ｂに示されているように、ＦＡＭが付加された自殺基質（ＪＲＷ−０９０６）は、クロロアルカン−ＨＴ系の約５０％の効率で、ＮａｎｏＬｕｃを標識できる。
【０２１１】
実施例２７
３−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）−Ｎ−（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）プロパンアミド（ＪＲＷ−１５０５）
2021523111.tif 000061
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エタン−１−アミン（６０ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）及び２，５−ジオキソピロリジン−１−イル３−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）プロパノエート（８０ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）の溶液に、トリメチルアミン（５４ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）を加えた。その反応物を室温で３時間撹拌した。その反応物を酢酸エチルで希釈し、有機層を水で洗浄した。その有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、クロマトグラフにかけて、所望の生成物（３８ｍｇ、３４％）を無色油として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ４０９ ［Ｍ＋Ｈ］+．
【０２１２】
実施例２８
（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）コハク酸アミド−ＤＢＣＯ（ＪＲＷ−１５５０）
2021523111.tif 000062
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エタン−１−アミン（２０ｍｇ、０．０９０ｍｍｏｌ）及び２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４−ＤＢＣＯ−アミノ−４−オキソブタノエート（３６ｍｇ、０．０９０ｍｍｏｌ）の溶液に、トリメチルアミン（１８ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を加えた。その反応物を室温で４時間撹拌した。その反応物を酢酸エチルで希釈し、有機層を水で洗浄した。その有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、クロマトグラフにかけて、所望の生成物（３７ｍｇ、８０％）を淡褐色油として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ５１２ ［Ｍ＋Ｈ］+．
【０２１３】
実施例２９
Ｎ1−（８−（４−（（８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）−Ｎ4−ＤＢＣＯ−コハク酸アミド（ＪＲＷ−１５４９）
2021523111.tif 000063
一般的手順Ｇに従って、２−（４−（（８−アミノオクチル）オキシ）−３−フルオロベンジル）−８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン（２５ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ）と、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４−ＤＢＣＯ−アミノ−４−オキソブタノエート（２１ｍｇ、０．０５３ｍｍｏｌ）を反応させて、所望の生成物（２３ｍｇ、６２％）をオレンジ色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ８５７ ［Ｍ＋Ｈ］+．
【０２１４】
実施例３０
（Ｅ）−シクロオクト−４−エン−１−イル（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバメート（ＪＲＷ−１５６７）
2021523111.tif 000064
ＤＣＭ（５ｍＬ）中の２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エタン−１−アミン（２０ｍｇ、０．０９０ｍｍｏｌ）及び（Ｅ）−シクロオクト−４−エン−１−イル（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）カーボネート（２４ｍｇ、０．０９０ｍｍｏｌ）の溶液に、トリメチルアミン（１８ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を加えた。その反応物を室温で３時間撹拌した。その反応物をＤＣＭで希釈し、セライトを加えた。その混合物を濃縮し、クロマトグラフにかけて、所望の生成物（２７ｍｇ、８１％）を無色油として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ３７６ ［Ｍ＋Ｈ］+．
【０２１５】
実施例３１
（Ｅ）−シクロオクト−４−エン−１−イル（８−（４−（（８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）−３−オキソ−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−２−フルオロフェノキシ）オクチル）カルバメート（ＪＲＷ−１５６６）
2021523111.tif 000065
一般的手順Ｇに従って、２−（４−（（８−アミノオクチル）オキシ）−３−フルオロベンジル）−８−ベンジル−６−（４−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン（２５ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ）と、（Ｅ）−シクロオクト−４−エン−１−イル（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）カーボネート（１４ｍｇ、０．０５３ｍｍｏｌ）を反応させて、所望の生成物（１３ｍｇ、４０％）をオレンジ色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ７２１ ［Ｍ＋Ｈ］+．
【０２１６】
実施例３２
２−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−４−（（３−（４−（６−メチル−１，２，４，５−テトラジン−３−イル）フェノキシ）プロピル）カルバモイル）安息香酸（ＪＲＷ−１５７７）
2021523111.tif 000066
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の３−（４−（６−メチル−１，２，４，５−テトラジン−３−イル）フェノキシ）プロパン−１−アミン塩酸塩（２５ｍｇ、０．０８９ｍｍｏｌ）及び４−（（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）カルボニル）−２−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）安息香酸（３１ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）の溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（３４ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を加えた。その反応物を室温で２時間撹拌した。その反応物を酢酸エチルで希釈し、有機層をＮＨ4Ｃｌの溶液で洗浄した。その有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、クロマトグラフにかけて、所望の生成物（１６ｍｇ、３０％）を赤色固体として得た。ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ ６０４ ［Ｍ＋Ｈ］+．
【０２１７】
実施例３３
アジド−ＤＢＣＯ対での直接標識及び２段階標識の蛍光イメージングによる比較
実施例２６では、色素が付加された自殺基質が、ＮａｎｏＬｕｃを標識することが蛍光イメージングによって示されている。この実施例では、アジドが付加された自殺基質が、２段階式の手順（その第２の工程は、ＤＢＣＯが付加されたＦＡＭ色素との銅フリーのクリックケミストリーである）で、ＮａｎｏＬｕｃ−ＨａｌｏＴａｇタンパク質を標識することが示されている。この実施例では、ＮａｎｏＬｕｃをＪＲＷ−０９２６で直接標識する方法、ＮａｎｏＬｕｃをＪＲＷ−０９７５及びＤＢＣＯ−ＦＡＭで２段階標識する方法、ＮａｎｏＬｕｃをＪＲＷ−１０２２及びＤＢＣＯ−ＦＡＭで２段階標識する方法、ＨａｌｏＴａｇをＦＡＭ−ＨＴリガンドで直接標識する方法、ならびにアジドが付加されたＳＥで２段階標識する方法という５つの方法を比較した。この実施例で使用した化合物の構造は、図１０Ａに示されている。
【０２１８】
１００ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）中の０．５ｕＭのＮａｎｏＬｕｃ−ＨａｌｏＴａｇを１時間、５０ｕＭのチューブ１（ＪＲＷ−１５０５）、チューブ２（ＦＡＭ−ＨａｌｏＴａｇリガンド）、チューブ３（ＪＲＷ−０９２６）、チューブ４（ＪＲＷ−０９７５）、チューブ５（ＪＲＷ−１０２２）及びチューブ６（ＳＥ−アジド）とともにインキュベートした。第２の工程では、１００ｕＭのＤＢＣＯ−ＦＡＭを４時間、チューブ１、４、５及び６においてインキュベートしてから、すべての試料についてＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルで解析した（図１０Ｂ）。ＮａｎｏＬｕｃ−ＨａｌｏＴａｇのサイズに対応するバンドの蛍光（４７３ｅｘ）（Ｃｙ２フィルターセット）を読み取り、定量した。
【０２１９】
チューブ１では、２段階標識がＨａｌｏＴａｇリガンド−アジド及びＤＢＣＯ−ＦＡＭで行われることが示されている。チューブ２及び３では、ＨａｌｏＴａｇまたはＮａｎｏＬｕｃがクロロアルカンまたは自殺基質で直接標識されることが示されている。チューブ４及び５では、アジドが付加された自殺基質で２段階標識が行われることが示されている。チューブ６では、そのタンパク質上の利用可能なリシンでの２段階標識が示されている。
【０２２０】
第２の実験では、１００ｍＭのトリス（またはＤＰＢＳ緩衝液）（ｐＨ８．０）中の１．５ｕＭのＮａｎｏＬｕｃ−ＨａｌｏＴａｇを５０ｕＭのＪＲＷ−０９７５、ＦＡＭ−ＨａｌｏＴａｇリガンド、ＪＲＷ−０９２６、ＪＲＷ−１０２２またはＳＥ−アジドとともに、１時間インキュベートした。第２の工程では、１００ｕＭのＤＢＣＯ−ＦＡＭを４時間、チューブ３、４及び５とともにインキュベートしてから、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルで分析した（図１１Ａ）。ＮａｎｏＬｕｃ−ＨａｌｏＴａｇのサイズに対応するバンドの蛍光（４７３ｅｘ）（Ｃｙ２フィルターセット）を読み取り、定量した（図１１Ｂ）。
【０２２１】
両方の実験から得られたデータによって、アジド付加されたリガンド及びＤＢＣＯ−ＦＡＭでの２段階標識が示されている。しかしながら、この構成では、直接標識の方が効率的であると見られる。
【０２２２】
実施例３４
ＴＣＯ−テトラジン対での直接標識及び２段階標識の蛍光イメージングによる比較
実施例３３と同様に、ＮａｎｏＬｕｃ−ＨａｌｏＴａｇタンパク質を化合物とともにインキュベートして、直接標識するか、ＦＡＭを用いる２段階プロセスによって標識するかした。この実施例で使用した追加の化合物の構造は、図１２Ａに示されている。化合物をＮａｎｏＬｕｃ−ＨａｌｏＴａｇ融合タンパク質とともにインキュベートし、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル上での蛍光イメージングによって解析した。
【０２２３】
チューブ１．１では、２段階標識がＤＢＣＯ−ＨａｌｏＴａｇリガンド（ＪＲＷ−１５５０）及びアジド−ＦＡＭで行われることが示されている。チューブ１．２では、ＨａｌｏＴａｇがＦＡＭ−ＨａｌｏＴａｇリガンド（図１０Ａに示されている構造）で直接標識されることが示されている。チューブ１．３では、２段階標識が、アジドの付加された自殺基質（ＪＲＷ−１０２２）及びＤＢＣＯ−ＦＡＭ（図１０Ａに示されている構造）で行われることが示されている。チューブ１．４では、ＤＢＣＯの付加された自殺基質（ＪＲＷ−１５４９）及びアジド−ＦＡＭで標識がほぼ行われないことが示されている。チューブ１．５では、ＳＥ−ＤＢＣＯ及びアジド−ＦＡＭによって、そのタンパク質上の利用可能なリシンでの標識がほぼ行われないことが示されている。チューブ２．１では、２段階標識がＴＣＯ−ＨａｌｏＴａｇリガンド（ＪＲＷ−１５６７）及びテトラジン−ＦＡＭ（ＪＲＷ−１５７７）で行われることが示されている。チューブ２．２では、ＨａｌｏＴａｇがＦＡＭ−ＨａｌｏＴａｇリガンドで直接標識されることが示されている。チューブ２．３では、ＮａｎｏＬｕｃが、ＴＣＯの付加された自殺基質（ＪＲＷ−１５６６）及びテトラジン−ＦＡＭ（ＪＲＷ−１５７７）で２段階標識されることが示されている。チューブ２．４では、そのタンパク質上において、利用可能なリシンで、ＳＥ−ＴＣＯ及びテトラジン−ＦＡＭ（ＪＲＷ−１５７７）によって２段階標識されることが示されている。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルが図１２Ｂに示されており、バンド量解析の結果が図１２Ｃに示されている。
【０２２４】
両方の実施例から得られたデータによって、アジドの付加されたリガンド及びＤＢＣＯ−ＦＡＭでの２段階標識が示されている。ＤＢＣＯが付加されたリガンドによる実験では、アジドが付加されたリガンドでの標識は示されていない。ＴＣＯが付加されたリガンドでの２段階標識は、テトラジンが付加されたリガンドで示されている。これらの構成では、直接標識の方が効率的であると見られるが、ＴＣＯ及びテトラジン−ＦＡＭを有する自殺基質は、直接標識の場合とほぼ同等であり、アジド−ＦＡＭを有するＤＣＢＯリガンド、アジドリガンド、及びＤＢＣＯ−ＦＡＭよりもかなり効率的である。
【０２２５】
上記の詳細な説明及び添付の実施例は、例示的なものに過ぎず、本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではなく、本発明の範囲は、添付の請求項及びそれらの均等物によってのみ定義されることは理解される。
【０２２６】
開示されている実施形態に対する様々な変更及び修正は、当業者には明らかであろう。このような変更及び修正は、化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、組成物、調合物または本発明の使用方法に関するものを含め（ただし、これらに限らない）、本発明の趣旨及び範囲から逸脱せずに行ってよい。
【０２２７】
付録
配列番号１−天然型の成熟Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼのアミノ酸配列
ＦＴＬＡＤＦＶＧＤＷＱＱＴＡＧＹＮＱＤＱＶＬＥＱＧＧＬＳＳＬＦＱＡＬＧＶＳＶＴＰＩＱＫＶＶＬＳＧＥＮＧＬＫＡＤＩＨＶＩＩＰＹＥＧＬＳＧＦＱＭＧＬＩＥＭＩＦＫＶＶＹＰＶＤＤＨＨＦＫＩＩＬＨＹＧＴＬＶＩＤＧＶＴＰＮＭＩＤＹＦＧＲＰＹＰＧＩＡＶＦＤＧＫＱＩＴＶＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＹＤＥＲＬＩＮＰＤＧＳＬＬＦＲＶＴＩＮＧＶＴＧＷＲＬＣＥＮＩＬＡ
【０２２８】
配列番号２−ＮａｎｏＬｕｃ（Ｎｌｕｃ）のアミノ酸配列
ＭＶＦＴＬＥＤＦＶＧＤＷＲＱＴＡＧＹＮＬＤＱＶＬＥＱＧＧＶＳＳＬＦＱＮＬＧＶＳＶＴＰＩＱＲＩＶＬＳＧＥＮＧＬＫＩＤＩＨＶＩＩＰＹＥＧＬＳＧＤＱＭＧＱＩＥＫＩＦＫＶＶＹＰＶＤＤＨＨＦＫＶＩＬＨＹＧＴＬＶＩＤＧＶＴＰＮＭＩＤＹＦＧＲＰＹＥＧＩＡＶＦＤＧＫＫＩＴＶＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＩＤＥＲＬＩＮＰＤＧＳＬＬＦＲＶＴＩＮＧＶＴＧＷＲＬＣＥＲＩＬＡ
【０２２９】
配列番号３−ＨｉＢｉＴ
ＶＳＧＷＲＬＦＫＫＩＳ
【０２３０】
配列番号４−ＬｇＢｉＴ
ＭＶＦＴＬＥＤＦＶＧＤＷＲＱＴＡＧＹＮＬＤＱＶＬＥＱＧＧＶＳＳＬＦＱＮＬＧＶＳＶＴＰＩＱＲＩＶＬＳＧＥＮＧＬＫＩＤＩＨＶＩＩＰＹＥＧＬＳＧＤＱＭＧＱＩＥＫＩＦＫＶＶＹＰＶＤＤＨＨＦＫＶＩＬＨＹＧＴＬＶＩＤＧＶＴＰＮＭＩＤＹＦＧＲＰＹＥＧＩＡＶＦＤＧＫＫＩＴＶＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＩＤＥＲＬＩＮＰＤＧＳＬＬＦＲＶＴＩＮ
【０２３１】
配列番号５−ＨａｌｏＴａｇタンパク質
ＭＡＥＩＧＴＧＦＰＦＤＰＨＹＶＥＶＬＧＥＲＭＨＹＶＤＶＧＰＲＤＧＴＰＶＬＦＬＨＧＮＰＴＳＳＹＶＷＲＮＩＩＰＨＶＡＰＴＨＲＣＩＡＰＤＬＩＧＭＧＫＳＤＫＰＤＬＧＹＦＦＤＤＨＶＲＦＭＤＡＦＩＥＡＬＧＬＥＥＶＶＬＶＩＨＤＷＧＳＡＬＧＦＨＷＡＫＲＮＰＥＲＶＫＧＩＡＦＭＥＦＩＲＰＩＰＴＷＤＥＷＰＥＦＡＲＥＴＦＱＡＦＲＴＴＤＶＧＲＫＬＩＩＤＱＮＶＦＩＥＧＴＬＰＭＧＶＶＲＰＬＴＥＶＥＭＤＨＹＲＥＰＦＬＮＰＶＤＲＥＰＬＷＲＦＰＮＥＬＰＩＡＧＥＰＡＮＩＶＡＬＶＥＥＹＭＤＷＬＨＱＳＰＶＰＫＬＬＦＷＧＴＰＧＶＬＩＰＰＡＥＡＡＲＬＡＫＳＬＰＮＣＫＡＶＤＩＧＰＧＬＮＬＬＱＥＤＮＰＤＬＩＧＳＥＩＡＲＷＬＳＴＬＥＩＳＧ
【図１】
2021523111.tif 000073
【図２】
2021523111.tif 000074
【図３】
2021523111.tif 000075
【図４Ａ】
2021523111.tif 000076
【図４Ｂ】
2021523111.tif 000077
【図４Ｃ】
2021523111.tif 000078
【図４Ｄ】
2021523111.tif 000079
【図４Ｅ】
2021523111.tif 000080
【図４Ｆ】
2021523111.tif 000081
【図５Ａ】
2021523111.tif 000082
【図５Ｂ】
2021523111.tif 000083
【図６Ａ】
2021523111.tif 000084
【図６Ｂ】
2021523111.tif 000085
【図７】
2021523111.tif 000086
【図８】
2021523111.tif 000087
【図９】
2021523111.tif 000088
【図１０】
2021523111.tif 000089
【図１１】
2021523111.tif 000090
【図１２】
2021523111.tif 000091
【配列表】
2021523111000001.app
【国際調査報告】
2021523111.tif 000092
2021523111.tif 000093
2021523111.tif 000094