(57)【要約】  酵母細胞のペリプラズム空間に抗体を提示するための組成物及び方法を開示する。特に、抗体が、細胞膜にまたがる（cell membrane-spanning）膜貫通ドメイン、酵母細胞膜の外面にある細胞膜関連タンパク質ドメイン、酵母細胞壁の内面に結合するタンパク質、又は酵母ペリプラズム空間に抗体を提示するためのペリプラズムタンパク質に連結している。さらに、原形質膜又はペリプラズム空間に局在し、提示された抗体が結合のためにアクセス可能なように、目的の標的タンパク質を酵母で共発現させることができる。本開示はさらに、酵母細胞ペリプラズムディスプレイを使用した抗体ライブラリーのハイスループットスクリーニングに関する。【選択図】図１A
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の酵母宿主細胞を含む酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーであって、各酵母宿主細胞が以下：
（a）酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示するための抗体であって、複数の酵母宿主細胞が複数の抗体を提示するように、各酵母宿主細胞において提示される抗体が異なる、前記抗体；
（b）ペリプラズムアンカータンパク質であって、前記抗体がペリプラズム空間に提示されるようにペリプラズムアンカータンパク質が抗体に連結している、前記ペリプラズムアンカータンパク質；及び
（c）目的の標的膜タンパク質であって、目的の膜タンパク質が酵母宿主細胞原形質膜に位置し、酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示された抗体にアクセス可能である、前記目的の標的膜タンパク質
を含む、酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項２】
前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、複合体中で分子結合相互作用によって互いに非共有結合で連結し、又は複合体中で共有非ペプチド結合によって連結している、請求項１に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項３】
前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、融合タンパク質中で互いに共有結合している、請求項１に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項４】
前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体がペリプラズムに提示されるように、酵母宿主細胞のペリプラズム、原形質膜又は細胞壁へのペリプラズムアンカータンパク質の輸送を指示するシグナル配列をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項５】
前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体をペリプラズムに配置する（project into）膜にまたがる膜貫通ドメイン又は膜関連タンパク質ドメインを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項６】
前記膜関連タンパク質ドメインがグリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）原形質膜アンカードメインである、請求項５に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項７】
前記GPI原形質膜アンカードメインが、ヤプシンGPI原形質膜アンカードメインである、請求項６に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項８】
前記ヤプシンGPI原形質膜アンカードメインが、YPS1、YPS2、YPS3、YPS4、YPS5、YPS6、又はYPS7ヤプシンGPI原形質膜アンカードメインである、請求項７に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項９】
前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体をペリプラズムに配置するように細胞壁の内面に結合するタンパク質である、請求項２に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項１０】
前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記融合タンパク質をペリプラズムに配置する、細胞壁の内面に結合するタンパク質である、請求項３に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項１１】
前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記ペリプラズムアンカータンパク質及び連結された抗体がペリプラズムに保持されるように十分に大きい、請求項２に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項１２】
前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記融合タンパク質がペリプラズムに保持されるのに十分な大きさである、請求項３に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項１３】
複数の酵母宿主細胞を含む酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーであって、各酵母宿主細胞が以下：
（a）酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示するための抗体であって、複数の酵母宿主細胞が複数の抗体を提示するように、各酵母宿主細胞において提示される前記抗体が異なり、抗体が酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示されるように、酵母宿主細胞のペリプラズム、原形質膜又は細胞壁への抗体の輸送を指示するシグナル配列に連結されている、前記抗体；及び
（b）目的の標的膜タンパク質であって、目的の膜タンパク質が酵母宿主細胞原形質膜に位置し、酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示された抗体にアクセス可能である、前記目的の標的膜タンパク質
を含む、酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項１４】
前記目的の標的膜タンパク質に前記抗体が結合した際の目的の標的膜タンパク質の活性の増加又は減少の検出を可能にするために、目的の標的膜タンパク質が活性化されたときに活性化される誘導性プロモーターに機能的に連結されたレポーター遺伝子を含むレポーターシステムをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項１５】
前記レポーター遺伝子が、栄養マーカー、抗生物質耐性マーカー、蛍光マーカー、生物発光マーカー、又は対抗選択可能なマーカーである、請求項１４に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項１６】
前記栄養マーカーが、HIS3、HIS7、ARG6、LEU2、URA3、及びTRP1からなる群より選択される、請求項１５に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項１７】
前記抗生物質耐性マーカーが、ジェネティシン、ゼオシン、ハイグロマイシンB、ノーセオトリシン、及びビアラホスからなる群より選択される抗生物質に対する耐性を付与する、請求項１５に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項１８】
前記蛍光マーカーが、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、シアン色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、及びオレンジ色蛍光タンパク質からなる群より選択される、請求項１５に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項１９】
前記生物発光マーカーがルシフェラーゼ又はイクオリン（aequorin）である、請求項１５に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項２０】
前記対抗選択可能なマーカーが、CAN1、URA3、MET15、TRP1、及びTKからなる群より選択される、請求項１５に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項２１】
前記レポーター遺伝子が、前記目的の標的膜タンパク質に前記抗体が結合した際の目的の標的膜タンパク質の活性の前記増加がポジティブセレクション培地上での酵母宿主細胞の増殖により検出可能であるような選択可能なマーカーである、請求項１４に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項２２】
前記レポーター遺伝子が、前記目的の標的膜タンパク質に前記抗体が結合した際の目的の標的膜タンパク質の活性の前記減少がネガティブセレクション培地上での酵母宿主細胞の増殖により検出可能であるような対抗選択可能なマーカーである、請求項１４に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項２３】
前記目的の標的膜タンパク質が、受容体、イオンチャネル、及びトランスポーターからなる群より選択される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項２４】
前記受容体がGタンパク質共役受容体（GPCR）である、請求項２３に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項２５】
前記GPCRが外来性GPCRである、請求項２４に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項２６】
前記酵母宿主細胞がさらに内在性GPCRを含む、請求項２５に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項２７】
前記外来性GPCRによって活性化することが可能な、操作されたGαサブユニットをさらに含み、活性化された操作されたGαサブユニットが、酵母宿主細胞において検出可能なフェロモン応答を活性化することが可能である、請求項２５又は２６に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項２８】
前記操作されたGαサブユニットが、酵母GαサブユニットのN末端ドメイン及び外来性GαサブユニットのC末端ドメインを含むキメラGタンパク質アルファ（Gα）サブユニットである、請求項２７に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項２９】
前記酵母Gαサブユニットが、Gαi、Gαq、Gαs、又はGαoファミリーGタンパク質に属する、請求項２８に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項３０】
前記外来性GPCRが哺乳動物GPCRである、請求項２５〜２９のいずれか一項に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項３１】
前記哺乳動物GPCRによって前記キメラGαサブユニットを活性化することが可能であるように、前記酵母GαサブユニットのC末端残基の少なくとも5個が、哺乳動物Gαサブユニットの対応するC末端残基と置き換えられている、請求項３０に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項３２】
前記哺乳動物GPCRによって前記キメラGαサブユニットを活性化することが可能であるように、前記酵母GαサブユニットのC末端残基の少なくとも20個が、哺乳動物Gαサブユニットの対応するC末端残基と置き換えられている、請求項３１に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項３３】
前記哺乳動物Gαサブユニットが、Gアルファ−S、Gアルファ−I、Gアルファ−O、Gアルファ−T、Gアルファ−Z、Gアルファ−Q、Gアルファ−11、Gアルファ−12、Gアルファ−13、及びトランスデューシンからなる群より選択される、請求項３１又は３２に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項３４】
前記キメラGαサブユニットが、酵母GαサブユニットのN末端残基の少なくとも41個を含む、請求項２８〜３３のいずれか一項に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項３５】
前記哺乳動物GPCRがヒトGPCRである、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項３６】
前記ヒトGPCRが、CXCR4、CXCR5、SSTR2、MOR、AVPR2、FPR2/ALX、ADORA2A、CHRM3、CGRP2、CCR2、CCR4、CCR5、CHRM4、PAC1、b2AR、CXCR2、CYSLTR2、KSHV vGPCR、PKR1、PKR2、CB1、CB2、A3AR、及びAT1Rからなる群より選択される、請求項３５に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項３７】
目的のGPCR標的膜タンパク質が恒常的にリガンド非依存的な活性を有する、請求項２４〜３６のいずれか一項に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項３８】
前記酵母宿主細胞が、目的のGPCR標的膜タンパク質の抗体アンタゴニストの選択のためのFAR1株である、請求項２４〜３７のいずれか一項に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項３９】
前記酵母宿主細胞が、目的のGPCR標的膜タンパク質の抗体アゴニストの選択のためのレポーター遺伝子に機能的に連結されたフェロモン誘導性PRM1プロモーターを含むΔfar1株である、請求項２４〜３６のいずれか一項に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項４０】
前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ナノボディ、抗体の組み換え断片、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、Fv断片、及びscFv断片からなる群より選択される、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項４１】
前記目的の標的膜タンパク質が、その活性を増加又は減少させる変異を含む、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項４２】
前記酵母宿主細胞が、Δfar1、Δsst2、Δste14、Δste3、又はΔmat株である、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項４３】
前記酵母宿主細胞が、欠失し、若しくは不活化されたMATα座、又は欠失し、若しくは不活化されたMATa座を含むΔmat株である、請求項４２に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項４４】
前記酵母宿主細胞が、野生型CLN3タンパク質と比較して酵母宿主細胞中のCLN3の存在量を増加させるC末端切断を含む改変CLN3タンパク質をさらに含む、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項４５】
前記改変CLN3タンパク質が、野生型CLN3タンパク質の少なくともN末端アミノ酸1〜387を保持する、請求項４４に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項４６】
前記改変CLN3タンパク質が、野生型CLN3タンパク質の少なくともN末端アミノ酸1〜408を保持する、請求項４４に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項４７】
前記酵母宿主細胞が一倍体又は二倍体の酵母宿主細胞である、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【請求項４８】
請求項１に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーを製造する方法であって、以下：
（a）酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示するための抗体をコードする第1の複数の組み換えポリヌクレオチドを準備する工程であって、複数の酵母宿主細胞が複数の抗体を提示するように、各酵母宿主細胞において提示される抗体が異なる、前記工程；
（b）ペリプラズムアンカータンパク質をコードする第2の組み換えポリヌクレオチドを準備する工程であって、前記抗体がペリプラズム空間に提示されるようにペリプラズムアンカータンパク質が抗体に連結している、前記工程；
（c）第1の複数の組み換えポリヌクレオチド及び第2の組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞にトランスフェクションする工程；
（d）目的の標的膜タンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞にトランスフェクションする工程；並びに
（e）前記抗体、前記ペリプラズムアンカータンパク質及び前記目的の標的膜タンパク質の発現を可能にする条件下で複数の酵母宿主細胞を培養する工程であって、請求項１に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーが生成されるように、各酵母宿主細胞がペリプラズム空間に異なる抗体を提示し、目的の標的膜タンパク質が原形質膜に局在する、前記工程
を含む前記方法。
【請求項４９】
抗体をコードする前記組み換えポリヌクレオチド、又はペリプラズムアンカータンパク質若しくは目的の標的膜タンパク質をコードする前記組み換えポリヌクレオチドを、発現ベクターによって準備する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
抗体をコードする前記組み換えポリヌクレオチド、又はペリプラズムアンカータンパク質若しくは目的の標的膜タンパク質をコードする前記組み換えポリヌクレオチドが、標的遺伝子座において酵母宿主細胞ゲノムに組み込まれる、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
請求項３に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーを製造する方法であって、以下：
（a）融合タンパク質をコードする複数の組み換えポリヌクレオチドを準備する工程であって、各組み換えポリヌクレオチドが、提示するための異なる抗体が連結したペリプラズムアンカータンパク質を含む異なる融合タンパク質をコードする、前記工程；
（b）融合タンパク質をコードする前記複数の組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞にトランスフェクションする工程；
（c）目的の標的膜タンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞にトランスフェクションする工程；並びに
（d）前記融合タンパク質及び前記目的の標的膜タンパク質の発現を可能にする条件下で前記複数の酵母宿主細胞を培養する工程であって、請求項３に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーが生成されるように、各酵母宿主細胞がペリプラズム空間に異なる抗体を提示し、目的の標的膜タンパク質が原形質膜に局在する、前記工程
を含む前記方法。
【請求項５２】
融合タンパク質をコードする前記組み換えポリヌクレオチド又は目的の標的膜タンパク質をコードする前記組み換えポリヌクレオチドを発現ベクターによって準備する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
融合タンパク質又は目的の標的膜タンパク質をコードする前記組み換えポリヌクレオチドが、標的遺伝子座において酵母宿主細胞ゲノムに組み込まれる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記目的の標的膜タンパク質が、受容体、イオンチャネル、及びトランスポーターからなる群より選択される、請求項４８〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記受容体がGタンパク質共役受容体（GPCR）である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記GPCRによって活性化することが可能な、操作されたGαサブユニットをコードする組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞に導入する工程をさらに含み、活性化された操作されたGαサブユニットが、酵母宿主細胞において検出可能なフェロモン応答を活性化することが可能である、請求項４８〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記操作されたGαサブユニットが、酵母GαサブユニットのN末端ドメイン及び外来性GαサブユニットのC末端ドメインを含むキメラGタンパク質アルファ（Gα）サブユニットである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記酵母Gαサブユニットが、Gαi、Gαq、Gαs、又はGαoファミリーGタンパク質に属する、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記外来性Gαサブユニットが哺乳動物Gαサブユニットである、請求項５７又は５８に記載の方法。
【請求項６０】
哺乳動物GPCRによって前記キメラGαサブユニットを活性化することが可能であるように、前記酵母GαサブユニットのC末端残基の少なくとも5個が、哺乳動物Gαサブユニットの対応するC末端残基と置き換えられている、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記哺乳動物GPCRによって前記キメラGαサブユニットを活性化することが可能であるように、前記酵母GαサブユニットのC末端残基の少なくとも20個が、哺乳動物Gαサブユニットの対応するC末端残基と置き換えられている、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記酵母宿主細胞が、目的の標的GPCRの抗体アンタゴニストの選択のためのFAR1株である、請求項５５〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記酵母宿主細胞が、前記GPCRの抗体アゴニストの選択のためのレポーター遺伝子に機能的に連結されたフェロモン誘導性PRM1プロモーターを含むΔfar1株である、請求項５５〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
目的の標的膜タンパク質の活性を調節する抗体について、請求項１４に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーをスクリーニングする方法であって、選択培地において、請求項１４に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーの酵母宿主細胞の少なくともサブセット（subset）を培養する工程；及び、前記レポーター遺伝子の発現を検出する工程を含み、レポーター遺伝子の発現の増加が、抗体が前記目的の標的膜タンパク質の活性を増加させることを示し、レポーター遺伝子の発現の減少が、抗体が前記目的の標的膜タンパク質の活性を減少させることを示す、前記方法。
【請求項６５】
前記レポーター遺伝子が、栄養マーカー、抗生物質耐性マーカー、蛍光マーカー、生物発光マーカー、又は対抗選択可能なマーカーである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記栄養マーカー発現のポジティブセレクションを行うことをさらに含み、栄養欠乏選択培地での前記酵母宿主細胞の増殖が、前記目的の標的膜タンパク質の活性化を示す、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記栄養マーカーが、HIS3、HIS7、ARG6、LEU2、URA3、及びTRP1である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記抗生物質耐性マーカー発現のポジティブセレクションを行うことをさらに含み、抗生物質を含む選択培地での前記酵母宿主細胞の増殖が、前記目的の標的膜タンパク質の活性化を示す、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
前記抗生物質耐性マーカーが、ジェネティシン、ゼオシン、ハイグロマイシンB、ノーセオトリシン、及びビアラホスからなる群より選択される抗生物質に対する耐性を付与する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記蛍光マーカー発現のポジティブセレクションを行うことをさらに含み、前記酵母宿主細胞が発する蛍光の検出が、前記目的の標的膜タンパク質の活性化を示す、請求項６５に記載の方法。
【請求項７１】
前記蛍光マーカーが、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、シアン色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、及びオレンジ色蛍光タンパク質からなる群より選択される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記生物発光マーカー発現のポジティブセレクションを行うことをさらに含み、前記酵母宿主細胞が発する生物発光の検出が、前記目的の標的膜タンパク質の活性化を示す、請求項６５に記載の方法。
【請求項７３】
前記生物発光マーカーがルシフェラーゼ又はイクオリン（aequorin）である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記対抗選択可能なマーカー発現のネガティブセレクションを行うことをさらに含み、提示された前記抗体が前記目的の標的膜タンパク質に結合した際の目的の標的膜タンパク質の活性の減少が、対抗選択可能なマーカーを発現する細胞に対抗して（against）選択する薬剤を含む培地での前記酵母宿主細胞の増殖によって検出可能である、請求項６５に記載の方法。
【請求項７５】
前記対抗選択可能なマーカーが、CAN1、URA3、MET15、TRP1、及びTKからなる群より選択される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
目的の標的GPCRの活性を調節する抗体について、請求項２７に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーをスクリーニングする方法であって、培地において、請求項２７に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーの酵母宿主細胞の少なくともサブセット（subset）を培養する工程を含み、ペリプラズム空間に提示された抗体を持たない対照酵母宿主細胞と比較した、少なくとも1つの酵母宿主細胞におけるフェロモン応答の活性化又は抑制の検出が、前記少なくとも1つの酵母宿主細胞で提示された前記抗体が前記GPCRに結合し、その活性を調節することを示す、前記方法。
【請求項７７】
前記目的の標的GPCRがヒトGPCRである、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記ヒトGPCRをリガンドと接触させることをさらに含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記GPCRが恒常的にリガンド非依存的な活性を有する、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記酵母宿主細胞がFAR1株であって、酵母宿主細胞において前記GPCRに結合して抑制するアンタゴニストとして作用する抗体によるフェロモン応答の抑制が、酵母宿主細胞の増殖及び細胞周期停止の消滅（cessation）をもたらす、請求項７６〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記酵母宿主細胞が、レポーター遺伝子に機能的に連結されたフェロモン誘導性PRM1プロモーターを含むΔfar1株であり、酵母宿主細胞において前記GPCRに結合して活性化するアゴニストとして作用する抗体によるフェロモン応答の活性化が、レポーター遺伝子の発現増加をもたらす、請求項７６〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記レポーター遺伝子が、栄養マーカー、抗生物質耐性マーカー、蛍光マーカー、生物発光マーカー、又は対抗選択可能なマーカーである、請求項７３に記載の方法。
【請求項８３】
前記酵母宿主細胞の属が、サッカロマイセス（Saccharomyces）、カンジダ（Candida）、ピキア（Pichia）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）、及びヤロウイア（Yarrowia）からなる群より選択される、請求項１〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記酵母宿主細胞の属がサッカロマイセス（Saccharomyces）である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記サッカロマイセス（Saccharomyces）の種が、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
以下を含む酵母宿主細胞：
（a）酵母宿主細胞ペリプラズム空間に提示するための抗体；
（b）ペリプラズムアンカータンパク質であって、前記抗体がペリプラズム空間に提示されるようにペリプラズムアンカータンパク質が抗体に連結している、前記ペリプラズムアンカータンパク質；及び
（c）目的の標的膜タンパク質であって、目的の膜タンパク質が酵母宿主細胞原形質膜に位置し、酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示された抗体にアクセス可能である、前記目的の標的膜タンパク質。
【請求項８７】
前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、複合体中で分子結合相互作用によって互いに非共有結合で連結し、又は複合体中で共有非ペプチド結合によって連結している、請求項８６に記載の酵母宿主細胞。
【請求項８８】
前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、融合タンパク質中で互いに共有結合している、請求項８６に記載の酵母宿主細胞。
【請求項８９】
前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体がペリプラズムに提示されるように、酵母宿主細胞のペリプラズム、原形質膜又は細胞壁へのペリプラズムアンカータンパク質の輸送を指示するシグナル配列をさらに含む、請求項８６〜８８のいずれか一項に記載の酵母宿主細胞。
【請求項９０】
前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体をペリプラズムに配置する（project into）膜にまたがる膜貫通ドメイン又は膜関連タンパク質ドメインを含む、請求項８６〜８８のいずれか一項に記載の酵母宿主細胞。
【請求項９１】
前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体をペリプラズムに配置するように細胞壁の内面に結合するタンパク質である、請求項８６〜８８のいずれか一項に記載の酵母宿主細胞。
【請求項９２】
前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記ペリプラズムアンカータンパク質及び連結された抗体がペリプラズムに保持されるように十分に大きい、請求項８６〜８８のいずれか一項に記載の酵母宿主細胞。
【請求項９３】
前記目的の標的膜タンパク質が、受容体、イオンチャネル、及びトランスポーターからなる群より選択される、請求項８６〜９２のいずれか一項に記載の酵母宿主細胞。
【請求項９４】
前記受容体がGタンパク質共役受容体（GPCR）である、請求項９３に記載の酵母宿主細胞。
【請求項９５】
前記GPCRによって活性化することが可能な、操作されたGαサブユニットをコードする組み換えポリヌクレオチドを前記酵母宿主細胞に導入する工程をさらに含み、活性化された操作されたGαサブユニットが、酵母宿主細胞において検出可能なフェロモン応答を活性化することが可能である、請求項８６〜９４のいずれか一項に記載の酵母宿主細胞。
【請求項９６】
前記操作されたGαサブユニットが、酵母GαサブユニットのN末端ドメイン及び外来性GαサブユニットのC末端ドメインを含むキメラGタンパク質アルファ（Gα）サブユニットである、請求項９５に記載の酵母宿主細胞。
【請求項９７】
前記酵母Gαサブユニットが、Gαi、Gαq、Gαs、又はGαoファミリーGタンパク質に属する、請求項９６に記載の酵母宿主細胞。
【請求項９８】
前記外来性Gαサブユニットが哺乳動物Gαサブユニットである、請求項９６又は９７に記載の酵母宿主細胞。
【請求項９９】
哺乳動物GPCRによって前記キメラGαサブユニットを活性化することが可能であるように、前記酵母GαサブユニットのC末端残基の少なくとも5個が、哺乳動物Gαサブユニットの対応するC末端残基と置き換えられている、請求項９８に記載の酵母宿主細胞。
【請求項１００】
前記哺乳動物GPCRによって前記キメラGαサブユニットを活性化することが可能であるように、前記酵母GαサブユニットのC末端残基の少なくとも20個が、哺乳動物Gαサブユニットの対応するC末端残基と置き換えられている、請求項９９に記載の酵母宿主細胞。
【請求項１０１】
前記酵母宿主細胞が、目的の標的GPCRの抗体アンタゴニストの選択のためのFAR1株である、請求項８６〜１００のいずれか一項に記載の酵母宿主細胞。
【請求項１０２】
前記酵母宿主細胞が、前記GPCRの抗体アゴニストの選択のためのレポーター遺伝子に機能的に連結されたフェロモン誘導性PRM1プロモーターを含むΔfar1株である、請求項８６〜１０１のいずれか一項に記載の酵母宿主細胞。
【請求項１０３】
前記酵母宿主細胞の属が、サッカロマイセス（Saccharomyces）、カンジダ（Candida）、ピキア（Pichia）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）、及びヤロウイア（Yarrowia）からなる群より選択される、請求項８６〜１０１のいずれか一項に記載の酵母宿主細胞。
【請求項１０４】
前記酵母宿主細胞の属がサッカロマイセス（Saccharomyces）である、請求項１０３に記載の酵母宿主細胞。
【請求項１０５】
前記サッカロマイセス（Saccharomyces）の種が、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である、請求項１０４に記載の酵母宿主細胞。
【請求項１０６】
ペリプラズムアンカータンパク質に連結した抗体。
【請求項１０７】
前記抗体が酵母宿主細胞ペリプラズム空間に局在する、請求項１０６に記載の抗体。
【請求項１０８】
前記抗体が酵母宿主細胞中で産生されたとき、抗体が酵母宿主細胞ペリプラズム空間に局在する、請求項１０６に記載の抗体。
【請求項１０９】
前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、複合体中で分子結合相互作用によって互いに非共有結合で連結し、又は複合体中で共有非ペプチド結合によって連結している、請求項１０６〜１０８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１０】
前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、融合タンパク質中で互いに共有結合している、請求項１０６〜１０８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１１】
前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体がペリプラズムに提示されるように、酵母宿主細胞のペリプラズム、原形質膜又は細胞壁への前記ペリプラズムアンカータンパク質の輸送を指示するシグナル配列をさらに含む、請求項１０７〜１１０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１２】
前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体をペリプラズムに配置する（project into）膜にまたがる膜貫通ドメイン又は膜関連タンパク質ドメインを含む、請求項１０７〜１１０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１３】
前記膜関連タンパク質ドメインがグリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）原形質膜アンカードメインである、請求項１１２に記載の抗体。
【請求項１１４】
前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体をペリプラズムに配置するように細胞壁の内面に結合するタンパク質である、請求項１０７〜１１０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１５】
前記ペリプラズムアンカータンパク質が、ペリプラズムアンカータンパク質及び連結された抗体がペリプラズムに保持されるように十分に大きい、請求項１０７〜１１０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１６】
前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ナノボディ、抗体の組み換え断片、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、Fv断片、及びscFv断片からなる群より選択される、請求項１０６〜１１５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１７】
前記酵母宿主細胞の属が、サッカロマイセス（Saccharomyces）、カンジダ（Candida）、ピキア（Pichia）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）、及びヤロウイア（Yarrowia）からなる群より選択される、請求項１０７〜１１６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１８】
前記酵母宿主細胞の属がサッカロマイセス（Saccharomyces）である、請求項１１７に記載の抗体。
【請求項１１９】
前記サッカロマイセス（Saccharomyces）の種が、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である、請求項１１８に記載の抗体。
【請求項１２０】
請求項１０６〜１１９のいずれか一項に記載の抗体を含む酵母宿主細胞。
【請求項１２１】
抗体がペリプラズム空間に局在するように、前記抗体をペリプラズムアンカータンパク質に連結することを含む、酵母宿主細胞ペリプラズム空間への抗体の局在化方法。
【請求項１２２】
前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、複合体中で分子結合相互作用によって互いに非共有結合で連結し、又は複合体中で共有非ペプチド結合によって連結している、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、融合タンパク質中で互いに共有結合している、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体がペリプラズムに提示されるように、酵母宿主細胞のペリプラズム、原形質膜又は細胞壁へのペリプラズムアンカータンパク質の輸送を指示するシグナル配列をさらに含む、請求項１２１〜１２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２５】
前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体をペリプラズムに配置する（project into）膜にまたがる膜貫通ドメイン又は膜関連タンパク質ドメインを含む、請求項１２１〜１２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２６】
前記膜関連タンパク質ドメインがグリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）原形質膜アンカードメインである、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体をペリプラズムに配置するように細胞壁の内面に結合するタンパク質である、請求項１２１〜１２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２８】
前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記ペリプラズムアンカータンパク質及び連結された抗体がペリプラズムに保持されるように十分に大きい、請求項１２０〜１２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２９】
前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ナノボディ、抗体の組み換え断片、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、Fv断片、及びscFv断片からなる群より選択される、請求項１２１〜１２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３０】
前記酵母宿主細胞の属が、サッカロマイセス（Saccharomyces）、カンジダ（Candida）、ピキア（Pichia）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）、及びヤロウイア（Yarrowia）からなる群より選択される、請求項１２１〜１２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３１】
前記酵母宿主細胞の属がサッカロマイセス（Saccharomyces）である、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
前記サッカロマイセス（Saccharomyces）の種が、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である、請求項１３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2017年12月11日に出願した米国仮出願第62/597,388号に対する優先権を主張するものであり、その内容はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦支援研究に関する表明
本発明は、アメリカ国立科学財団が授与した助成金No.1747391の下で、政府の支援を得て行われた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本開示は、タンパク質ライブラリーのハイスループットスクリーニングの方法及び細胞ディスプレイに関する。特に、本開示は、酵母のペリプラズム空間中にタンパク質を提示する方法、及び、特異的結合又は機能的特徴についてタンパク質ライブラリーをスクリーニングするためのかかる方法の使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
分子ディスプレイ技術は、様々な生物工学的並びに生物医学的な用途のためのタンパク質並びにペプチドの発見、生成、及び最適化に貴重であることが示されている。ファージディスプレイ（Smith (1985) Science 228:1315-1317）、mRNA（Wilson et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:3750-3755）及びDNAディスプレイ（Yonezawa et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:e118）、リボソームディスプレイ（Hanes & Pluckthun (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4937-4942）、真核生物ウイルスディスプレイ（Bupp & Roth (2002) Mol. Ther. 5:329-335；Muller et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21:1040-1046）、細菌ディスプレイ（Lu et al. (1995) Biotechnology13:366-372）、酵母ディスプレイ（Boder & Wittrup (1997) Nat. Biotechnol. 15:553-557）を含む様々なアプローチが、所望の特徴について組み換えタンパク質のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするために開発されている。このようなディスプレイ技術は、改良された安定性、所望の結合親和性及び酵素活性を持つタンパク質を同定するためにタンパク質工学において広く使用されており、また、指向性進化、親和性成熟、治療用のタンパク質及び抗体工学、バイオ燃料生産、環境汚染物質の吸着、エピトープマッピング、並びにタンパク質−タンパク質相互作用の研究を含む様々な用途での使用が見出されている。
【０００５】
特に酵母ディスプレイは、多種多様な原核生物及び真核生物タンパク質を提示するために使用されている（Cherf et al. (2015) Methods Mol. Biol. 1319:155-175）。酵母細胞での発現においては、真核生物タンパク質の適切な折りたたみ及びグリコシル化が可能になるという利点が提供される。従来の酵母ディスプレイでは、組み換えタンパク質は細胞壁タンパク質と融合することによって酵母細胞の表面に提示される。サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）は細胞表面提示に最も一般的に使用される種であったが、ピキア（Pichia）、カンジダ（Candida）、ヤロウイア（Yarrowia）株を含む他の酵母種は、いくつかの用途での使用が見出されている（Tanaka et al. (2012) Appl. Microbiol. Biotechnol. 95(3):577-591, Buerth et al. (2016) Appl. Microbiol. Biotechnol. 100(16):6981-6990, Madzak (2015) Appl. Microbiol. Biotechnol. 99(11):4559-4577）。
【発明の概要】
【０００６】
特に膜タンパク質とのタンパク質−タンパク質相互作用のハイスループットスクリーニングのために、タンパク質をより効果的に提示する改良された方法が依然として必要とされている。
【０００７】
本開示は、酵母細胞のペリプラズム空間中にタンパク質を提示することによる、特異的結合又は機能的特徴についてのタンパク質ライブラリーのハイスループットスクリーニングに関する。
【０００８】
1つの態様において、本発明は、複数の酵母宿主細胞を含む酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーを含み、各前記酵母宿主細胞は以下を含む：（a）酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示するためのタンパク質変異体であって、複数の酵母宿主細胞が複数のタンパク質変異体を提示するように、各酵母宿主細胞において提示されるタンパク質変異体が異なる、前記タンパク質変異体；（b）ペリプラズムアンカータンパク質であって、前記タンパク質変異体がペリプラズム空間に提示されるようにペリプラズムアンカータンパク質がタンパク質変異体に連結している、前記ペリプラズムアンカータンパク質；及び（c）目的の標的膜タンパク質であって、目的の膜タンパク質が酵母宿主細胞原形質膜に位置し、酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示されたタンパク質変異体にアクセス可能である、前記目的の標的膜タンパク質。前記酵母宿主細胞は、一倍体又は二倍体であり得る。
【０００９】
特定の実施形態において、前記タンパク質変異体及びペリプラズムアンカータンパク質は、融合タンパク質中で互いに共有結合している。他の実施形態において、前記タンパク質変異体及びペリプラズムアンカータンパク質は、複合体中で分子結合相互作用によって互いに非共有結合で連結される。他の実施形態において、前記タンパク質変異体及びペリプラズムアンカータンパク質は、複合体中で非ペプチド結合によって連結されたものによって連結される（linced）。いくつかの実施形態において、前記非ペプチド結合はジスルフィド結合である。
【００１０】
特定の実施形態において、前記ペリプラズムアンカータンパク質は、融合した前記タンパク質変異体がペリプラズム内に提示されるように、酵母宿主細胞のペリプラズム、原形質膜、又は細胞壁への融合タンパク質の輸送を指示するシグナル配列を含む。使用可能な例示的なシグナル配列は、プレプロアルファ因子シグナル配列である。
【００１１】
特定の実施形態において、前記ペリプラズムアンカータンパク質は、前記融合したタンパク質変異体をペリプラズムに配置する細胞膜にまたがる膜貫通ドメインを含む。
【００１２】
特定の実施形態において、前記ペリプラズムアンカータンパク質は、提示された前記タンパク質変異体をペリプラズムに配置するように、細胞膜の外面に局在する細胞膜関連タンパク質ドメインを含む。特定の実施形態において、前記細胞膜関連タンパク質ドメインは、グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）原形質膜アンカードメインである。例えば、前記GPI原形質膜アンカードメインは、YPS1、YPS2、YPS3、YPS4、YPS5、YPS6、又はYPS7ヤプシンGPI原形質膜アンカードメインのようなヤプシンGPI原形質膜アンカードメインであり得るが、これらに限定されない。
【００１３】
特定の実施形態において、前記ペリプラズムアンカータンパク質は、提示された前記タンパク質変異体をペリプラズムに配置するように、細胞壁の内面に結合するタンパク質である。
【００１４】
特定の実施形態において、前記ペリプラズムアンカータンパク質は、酵母宿主細胞のペリプラズムへの前記融合タンパク質の輸送を指示するシグナル配列を含み、ペリプラズムアンカータンパク質は、融合タンパク質がペリプラズム内に保持されるのに十分に大きい。
【００１５】
特定の実施形態において、前記アンカータンパク質は、ペリプラズム内で複合体を形成し、その結果、前記融合タンパク質がペリプラズム内に保持されるのに十分に大きい、ペリプラズムタンパク質複合体の構成要素である。
【００１６】
別の実施形態において、前記融合タンパク質はさらにタグを含む。
【００１７】
特定の実施形態において、前記タンパク質変異体は、抗体、抗体模倣体（mimetics）、アプタマー、抗原、酵素、受容体、ホルモン、基質、アゴニスト、アンタゴニスト、又はリガンドである。
【００１８】
特定の実施形態において、前記タンパク質変異体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ナノボディ、抗体の組み換え断片、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、Fv断片、及びscFv断片からなる群より選択される抗体である。
【００１９】
特定の実施形態において、前記酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーの各酵母宿主細胞は、提示された前記タンパク質変異体にアクセス可能な位置に発現する目的の標的タンパク質をさらに含む（例えば、提示されたタンパク質変異体が目的の標的タンパク質に結合するのに十分近接している）。例えば、前記目的の標的タンパク質は、酵母宿主細胞の原形質膜又はペリプラズム内に位置し得る。前記目的の標的タンパク質は、例えば、膜タンパク質、受容体、イオンチャネル、又はトランスポーターであり得る。1つの実施形態において、前記目的の標的タンパク質は、Gタンパク質共役受容体（GPCR）である。
【００２０】
特定の実施形態において、各酵母宿主細胞は、前記提示されたタンパク質変異体とのタンパク質−タンパク質相互作用に対する目的の標的タンパク質の応答を検出するためのレポーターシステムをさらに含む。特定の実施形態において、前記提示されたタンパク質変異体は、前記目的の標的タンパク質のアンタゴニストであり、前記応答は、目的の標的タンパク質にアンタゴニストが結合した際の目的の標的タンパク質の活性の減少であって、ここで、前記レポーターシステムが、目的の標的タンパク質にアンタゴニストが結合した際の目的の標的タンパク質の活性の前記減少を検出する。他の実施形態において、前記提示されたタンパク質変異体は、前記目的の標的タンパク質のアゴニストであり、前記応答は、目的の標的タンパク質にアゴニストが結合した際の目的の標的タンパク質の活性の増加であって、ここで、レポーターシステムが、目的の標的タンパク質にアゴニストが結合した際の目的の標的タンパク質の活性の前記増加を検出する。
【００２１】
特定の実施形態において、前記目的の標的タンパク質の活性化は、酵母宿主細胞の増殖を増加させる。この場合、酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーは、酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーの酵母宿主細胞の少なくともサブセットを培地中で培養することによって、前記目的の標的タンパク質のアゴニストについてスクリーニングすることができ、ここで、培地中での酵母宿主細胞の増殖は、酵母宿主細胞で提示された前記タンパク質変異体が目的の標的タンパク質のアゴニストであることを示す。
【００２２】
他の実施形態において、前記目的の標的タンパク質の活性化は、酵母宿主細胞の増殖を減少させる。この場合、酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーは、酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーの酵母宿主細胞の少なくともサブセットを培地中で培養することによって、前記目的の標的タンパク質のアンタゴニストについてスクリーニングすることができ、ここで、培地中での酵母宿主細胞の増殖は、酵母宿主細胞で提示された前記タンパク質変異体が目的の標的タンパク質のアンタゴニストであることを示す。
【００２３】
別の実施形態において、本発明は、複数の酵母宿主細胞を含む酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーを含み、各前記酵母宿主細胞は以下を含む：
（a）酵母宿主細胞ペリプラズム空間に提示するための抗体に融合したペリプラズムアンカータンパク質を含む融合タンパク質であって、複数の酵母宿主細胞が複数の抗体を提示するように、各酵母宿主細胞において提示される抗体が異なる、前記融合タンパク質；及び
（b）目的の標的膜タンパク質であって、目的の膜タンパク質が酵母宿主細胞原形質膜に位置し、酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示された抗体にアクセス可能である、前記目的の標的膜タンパク質。
【００２４】
前記目的の標的膜タンパク質は、例えば、受容体、イオンチャネル、及びトランスポーターであり得る。いくつかの実施形態において、前記目的の標的膜タンパク質は、その活性を増加又は減少させる変異を含む。
【００２５】
前記目的の標的膜タンパク質と共に提示され得る抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ナノボディ、抗体の組み換え断片、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、Fv断片、及びscFv断片を含み得るが、これらに限定されない。
【００２６】
特定の実施形態において、前記酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーは、前記目的の標的膜タンパク質に前記抗体が結合した際の目的の標的膜タンパク質の活性の増加又は減少の検出を可能にするために、目的の標的膜タンパク質が活性化されたときに活性化される誘導性プロモーターに機能的に連結されたレポーター遺伝子を含むレポーターシステムさらに含む。例えば、前記レポーター遺伝子は、栄養マーカー（例えば、HIS3、HIS7、ARG6、LEU2、URA3、及びTRP1）、抗生物質耐性マーカー（例えば、ジェネティシン（例えば、aphA1）、ゼオシン（例えば、ble）、ハイグロマイシンB、ノーセオトリシン、若しくはビアラホスなどの抗生物質に対する耐性を付与する）、蛍光マーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、シアン色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、及びオレンジ色蛍光タンパク質のもの）、生物発光マーカー（例えば、ルシフェラーゼ若しくはイクオリン（aequorin））、又は対抗選択可能なマーカー（例えば、CAN1、URA3、MET15、TRP1、及びTK）であり得る。特定の実施形態において、前記レポーター遺伝子は、前記目的の標的膜タンパク質に前記抗体が結合した際の目的の標的膜タンパク質の活性の増加がポジティブセレクション培地上での酵母宿主細胞の増殖により検出可能であるような選択可能なマーカーである。他の実施形態において、前記レポーター遺伝子は、前記目的の標的膜タンパク質に前記抗体が結合した際の目的の標的膜タンパク質の活性の減少が対抗選択薬剤を含む培地上での酵母宿主細胞の増殖により検出可能であるような対抗選択可能なマーカーである。
【００２７】
特定の実施形態において、前記目的の標的膜タンパク質は、Gタンパク質共役受容体（GPCR）であり、例えば、哺乳動物GPCR（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類、実験動物又は家畜に由来）のような外来性のGPCRである。特定の実施形態において、哺乳動物GPCRは、CXCR4、CXCR5、SSTR2、MOR、AVPR2、FPR2/ALX、ADORA2A、CHRM3、CGRP2、CCR2、CCR4、CCR5、CHRM4、PAC1、b2AR、CXCR2、CYSLTR2、KSHV vGPCR、PKR1、PKR2、CB1、CB2、A3AR、及びAT1Rからなる群より選択されるヒトGPCRである。
【００２８】
特定の実施形態において、前記酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーは、前記GPCRによって活性化することが可能な、操作されたGαサブユニットをさらに含み、ここで、活性化した操作されたGαサブユニットは、酵母宿主細胞において検出可能なフェロモン応答を活性化することが可能である。
【００２９】
特定の実施形態において、前記操作されたGαサブユニットは、酵母GαサブユニットのN末端ドメイン及び外来性GαサブユニットのC末端ドメインを含むキメラGタンパク質α（Gα）サブユニットである。例えば、前記酵母Gαサブユニットは、Gαi、Gαq、Gαs、又はGαoファミリーGタンパク質に属し得る。前記キメラGαサブユニットにおいて、前記哺乳動物GPCRによって前記キメラGαサブユニットを活性化することが可能であるように、前記酵母GαサブユニットのC末端残基の少なくとも5個が、哺乳動物Gαサブユニットの対応するC末端残基と置き換えられていてもよい。いくつかの実施形態において、前記哺乳動物GPCRによって前記キメラGαサブユニットを活性化することが可能であるように、前記酵母GαサブユニットのC末端残基の少なくとも20個が、哺乳動物Gαサブユニットの対応するC末端残基と置き換えられる。別の実施形態において、前記キメラGαサブユニットは、前記酵母GαサブユニットのN末端残基の少なくとも41個を含む。
【００３０】
例示的な哺乳動物Gαサブユニットとしては、Gアルファ−S、Gアルファ−I、Gアルファ−O、Gアルファ−T、Gアルファ−Z、Gアルファ−Q、Gアルファ−11、Gアルファ−12、Gアルファ−13、及びトランスデューシンが含まれる。
【００３１】
いくつかの実施形態において、前記目的の標的GPCRは、恒常的にリガンド非依存的な活性を有する。他の実施形態において、前記目的の標的GPCRを活性化するためにリガンドが添加される。
【００３２】
特定の実施形態において、前記酵母宿主細胞は、一倍体又は二倍体の酵母宿主細胞である。特定の実施形態において、前記酵母宿主細胞は、Δfar1、Δsst2、Δste14、Δste3又はΔmat株である。Δmat株は、例えば、欠失し、若しくは不活化されたMATα座、又は欠失し、若しくは不活化されたMATa座を含み得る。
【００３３】
別の実施形態において、前記酵母宿主細胞は、野生型CLN3タンパク質と比較して酵母宿主細胞中のCLN3の存在量を増加させるC末端切断を含む改変CLN3タンパク質をさらに含む。例えば、前記改変CLN3タンパク質は、野生型CLN3タンパク質の少なくともN末端アミノ酸1〜387若しくは1〜408を保持し、又は、これらの範囲内のいずれかの数のN末端アミノ酸を保持する；例えば、1〜388、1〜389、1〜390、1〜391、1〜392、1〜393、1〜394、1〜395、1〜396、1〜397、1〜398、1〜399、1〜400、1〜401、1〜402、1〜403、1〜404、1〜405、1〜406、1〜407、若しくは1〜408。ここで、前記C末端切断は、野生型CLN3タンパク質の残った残基の全て、又はいくつかの欠失を含む。
【００３４】
別の実施形態において、前記酵母宿主細胞は、GPCRの抗体アンタゴニストの選択のためのFAR1株である。
【００３５】
別の実施形態において、前記酵母宿主細胞は、GPCRの抗体アゴニストの選択のためのレポーター遺伝子に機能的に連結されたフェロモン誘導性PRM1プロモーターを含むΔfar1株である。
【００３６】
別の態様において、本発明は、複数の酵母宿主細胞を含む酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーを提供し、各前記酵母宿主細胞は以下を含む：
（a）酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示するための抗体であって、複数の酵母宿主細胞が複数の抗体を提示するように、各酵母宿主細胞において提示される前記抗体が異なり、抗体が酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示されるように、酵母宿主細胞のペリプラズム、原形質膜又は細胞壁への抗体の輸送を指示するシグナル配列に連結されている、前記抗体；及び
（b）目的の標的膜タンパク質であって、目的の膜タンパク質が酵母宿主細胞原形質膜に位置し、酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示された抗体にアクセス可能である、前記目的の標的膜タンパク質。
【００３７】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーを作製する方法を含み、前記方法は以下を含む：
（a）融合タンパク質をコードする複数の組み換えポリヌクレオチドを準備する工程であって、各組み換えポリヌクレオチドが、提示するための異なる抗体が融合したペリプラズムアンカータンパク質を含む異なる融合タンパク質をコードする、前記工程；
（b）融合タンパク質をコードする前記複数の組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞にトランスフェクションする工程；
（c）目的の標的膜タンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞にトランスフェクションする工程；並びに
（d）前記融合タンパク質及び前記目的の標的膜タンパク質の発現を可能にする条件下で前記複数の酵母宿主細胞を培養する工程であって、各酵母宿主細胞がペリプラズム空間に異なる抗体を提示し、目的の標的膜タンパク質が原形質膜（つまり、提示された抗体が結合するためにアクセス可能である場所）に局在する、前記工程。
特定の実施形態において、融合タンパク質をコードする前記組み換えポリヌクレオチド又は目的の標的膜タンパク質をコードする前記組み換えポリヌクレオチドは発現ベクターによって準備する。他の実施形態において、融合タンパク質又は目的の標的膜タンパク質をコードする前記組み換えポリヌクレオチドが、標的遺伝子座において酵母宿主細胞ゲノムに組み込まれる。
【００３８】
別の態様において、本発明は、酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーを作製する方法を提供し、前記方法は以下を含む：
（a）酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示するための抗体をコードする第1の複数の組み換えポリヌクレオチドを準備する工程であって、複数の酵母宿主細胞が複数の抗体を提示するように、各酵母宿主細胞において提示される抗体が異なる、前記工程；
（b）ペリプラズムアンカータンパク質をコードする第2の組み換えポリヌクレオチドを準備する工程であって、前記抗体がペリプラズム空間に提示されるようにペリプラズムアンカータンパク質が抗体に連結している、前記工程；
（c）第1の複数の組み換えポリヌクレオチド及び第2の組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞にトランスフェクションする工程；
（d）目的の標的膜タンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞にトランスフェクションする工程；並びに
（e）前記抗体、前記ペリプラズムアンカータンパク質及び前記目的の標的膜タンパク質の発現を可能にする条件下で複数の酵母宿主細胞を培養する工程であって、酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーが生成されるように、各酵母宿主細胞がペリプラズム空間に異なる抗体を提示し、目的の標的膜タンパク質が原形質膜に局在する、前記工程。
【００３９】
前記融合タンパク質及び目的の標的膜タンパク質の発現は、一般に、プロモーターの存在に依存し、プロモーターは、ベクターに含まれていてもよく、又は、組み換えポリヌクレオチドが組み込まれた染色体遺伝子座に含まれていてもよい。前記プロモーターは、恒常的なプロモーターであっても誘導可能なプロモーターであってもよい。特定の実施形態において、各組み換えポリヌクレオチドは、融合タンパク質又は目的の標的膜タンパク質をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターを含む。前記組み換えポリヌクレオチドは、前記プロモーターを含むベクターによって準備してもよい。他の実施形態において、染色体標的遺伝子座は、染色体標的遺伝子座に組み込まれる融合タンパク質又は目的の標的膜タンパク質をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されることになる（becomes）プロモーターを含む。
【００４０】
別の実施形態において、前記方法は、GPCRによって活性化することが可能な操作されたGαサブユニットをコードする組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞に導入することをさらに含み、ここで、活性化された操作されたGαサブユニットは、前記酵母宿主細胞において検出可能なフェロモン応答を活性化することが可能である。
【００４１】
別の実施形態において、本発明は、ペリプラズム標的化発現ベクターを含み、前記ベクターは以下を含む：
（a）シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（b）シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドの後（下流）における、タンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドのインフレーム挿入に適したクローニング部位；
（c）グリコホスファチジルイノシトール（GPI）原形質膜アンカードメインをコードするポリヌクレオチドであって、ベクターが、シグナルペプチド及びGPI原形質膜アンカードメインに融合したタンパク質変異体を含む融合タンパク質の生成が可能であるように、配置されている前記ポリヌクレオチド；並びに
（d）前記融合タンパク質をコードする配列に機能的に連結されたプロモーター。
1つの実施形態において、前記シグナルペプチドは、プレプロアルファ因子シグナル配列を含む。別の実施形態において、クローニング部位は、1つ以上の制限酵素部位を含む。特定の実施形態において、GPI原形質膜アンカードメインは、例えば限定されるものではないが、YPS1、YPS2、YPS3、YPS4、YPS5、YPS6、又はYPS7ヤプシンGPI原形質膜アンカードメインのような、ヤプシンGPI原形質膜アンカードメインである。別の実施形態において、前記ペリプラズム標的化発現ベクターは、リンカーをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ここで、リンカーをコードする前記ポリヌクレオチドは、クローニング部位とGPI原形質膜アンカードメインをコードするポリヌクレオチドとの間に配置される。前記リンカーはさらにタグを含むことができる。別の実施形態において、前記ペリプラズム標的化発現ベクターは、選択可能なマーカーをさらに含む。
【００４２】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーを作製する方法を含み、前記方法は以下を含む：
（a）各組み換えポリヌクレオチドが異なる抗体変異体をコードする、抗体変異体をコードする複数の組み換えポリヌクレオチドを準備する工程；
（b）本明細書に記載のペリプラズム標的化発現ベクターを複数の酵母宿主細胞にトランスフェクションする工程；
（c）抗体変異体をコードする複数の前記組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞にトランスフェクションする工程であって、各酵母宿主細胞において、抗体変異体をコードする組み換えポリヌクレオチドが、提示するための抗体変異体に融合されたペリプラズムアンカータンパク質を含む融合タンパク質の発現を可能にするために、相同組み換えによってペリプラズム標的化発現ベクターのクローニング部位に組み込まれる、前記工程；
（c）目的の標的膜タンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞にトランスフェクションする工程；並びに
（d）前記融合タンパク質及び前記目的の標的膜タンパク質の発現を可能にする条件下で前記複数の酵母宿主細胞を培養する工程であって、各酵母宿主細胞がペリプラズム空間に異なる抗体を提示し、目的の標的膜タンパク質が原形質膜（つまり、提示された抗体が結合するためにアクセス可能である場所）に局在する、前記工程。
別の実施形態において、前記方法は、GPCRによって活性化することが可能な操作されたGαサブユニットをコードする組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞に導入することをさらに含み、ここで、活性化された操作されたGαサブユニットは、前記酵母宿主細胞において検出可能なフェロモン応答を活性化することが可能である。
【００４３】
別の態様において、本発明は、目的の標的膜タンパク質の活性を調節する抗体について、本明細書に記載のレポーターシステムを含む酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーをスクリーニングする方法を含み、この方法は以下を含む：選択培地において、本明細書に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーの酵母宿主細胞の少なくともサブセットを培養する工程；及び、レポーター遺伝子の発現を検出する工程であって、レポーター遺伝子の発現の増加が、抗体が目的の標的膜タンパク質の活性を増加させることを示し、レポーター遺伝子の発現の減少が、抗体が前記目的の標的膜タンパク質の活性を減少させることを示す、前記方法。
【００４４】
例示的なレポーター遺伝子には、栄養マーカー（例えば、HIS3、HIS7、ARG6、LEU2、URA3、及びTRP1）、抗生物質耐性マーカー（例えば、ジェネティシン（aphA1）、ゼオシン（ble）、ハイグロマイシンB、ノーセオトリシン、及びビアラホスなどの抗生物質に対する耐性を付与する）、蛍光マーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、シアン色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、及びオレンジ色蛍光タンパク質のもの）、生物発光マーカー（例えば、ルシフェラーゼ又はイクオリン（aequorin））、並びに対抗選択可能なマーカー（例えば、CAN1、URA3、MET15、TRP1、及びTK）が含まれる。
【００４５】
別の実施形態において、前記方法は、栄養マーカー発現のポジティブセレクションを行うことをさらに含み、ここで、栄養欠乏選択培地での前記酵母宿主細胞の増殖は、前記目的の標的膜タンパク質の活性化を示す。
【００４６】
別の実施形態において、前記方法は、抗生物質耐性マーカー発現のポジティブセレクションを行うことをさらに含み、ここで、抗生物質を含む選択培地での前記酵母宿主細胞の増殖は、前記目的の標的膜タンパク質の活性化を示す。
【００４７】
別の実施形態において、前記方法は、蛍光マーカー発現のポジティブセレクションを行うことをさらに含み、ここで、前記酵母宿主細胞が発する蛍光の検出は、前記目的の標的膜タンパク質の活性化を示す。
【００４８】
別の実施形態において、前記方法は、生物発光マーカー発現のポジティブセレクションを行うことをさらに含み、ここで、前記酵母宿主細胞が発する生物発光の検出は、前記目的の標的膜タンパク質の活性化を示す。
【００４９】
別の実施形態において、前記方法は、対抗選択可能なマーカー発現のネガティブセレクションを行うことをさらに含み、ここで、提示された前記抗体が前記目的の標的膜タンパク質に結合した際の目的の標的膜タンパク質の活性の減少は、対抗選択可能なマーカーを発現する細胞に対抗して（against）選択する薬剤を含む培地での前記酵母宿主細胞の増殖によって検出可能である。
【００５０】
別の実施形態において、本発明は、目的の標的GPCRの活性を調節する抗体について酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーをスクリーニングする方法を含み、前記方法は、培地において、酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーの酵母宿主細胞の少なくともサブセット（subset）を培養する工程を含み、ここで、ペリプラズム空間に提示された抗体を持たない対照酵母宿主細胞と比較した、少なくとも1つの酵母宿主細胞におけるフェロモン応答の活性化又は抑制の検出は、前記少なくとも1つの酵母宿主細胞で提示された前記抗体が前記GPCRに結合し、その活性を調節することを示す。いくつかの実施形態において、前記方法は、ヒトGPCRをリガンドと接触させることをさらに含む。他の実施形態において、前記GPCRは恒常的にリガンド非依存的な活性を有する。
【００５１】
特定の実施形態において、酵母宿主細胞は、前記GPCRによって活性化することが可能な、操作されたGαサブユニットをさらに含み、ここで、活性化した操作されたGαサブユニットは、酵母宿主細胞において検出可能なフェロモン応答を活性化することが可能である。特定の実施形態において、前記操作されたGαサブユニットは、酵母GαサブユニットのN末端ドメイン及び外来性GαサブユニットのC末端ドメインを含むキメラGタンパク質α（Gα）サブユニットである。例えば、前記酵母Gαサブユニットは、Gαi、Gαq、Gαs、又はGαoファミリーGタンパク質に属し得る。前記キメラGαサブユニットにおいて、哺乳動物GPCRによって前記キメラGαサブユニットを活性化することが可能であるように、前記酵母GαサブユニットのC末端残基の少なくとも5個が、哺乳動物Gαサブユニットの対応するC末端残基と置き換えられていてもよい。いくつかの実施形態において、前記哺乳動物GPCRによって前記キメラGαサブユニットを活性化することが可能であるように、前記酵母GαサブユニットのC末端残基の少なくとも20個が、哺乳動物Gαサブユニットの対応するC末端残基と置き換えられる。別の実施形態において、前記キメラGαサブユニットは、前記酵母GαサブユニットのN末端残基の少なくとも41個を含む。例示的な前記哺乳動物Gαサブユニットとしては、Gアルファ−S、Gアルファ−I、Gアルファ−O、Gアルファ−T、Gアルファ−Z、Gアルファ−Q、Gアルファ−11、Gアルファ−12、Gアルファ−13、及びトランスデューシンが含まれる。
【００５２】
特定の実施形態において、前記酵母宿主細胞がFAR1株であって、酵母宿主細胞において前記GPCRに結合して抑制するアンタゴニストとして作用する抗体によるフェロモン応答の抑制が、酵母宿主細胞の増殖及び細胞周期停止の消滅（cessation）をもたらす。他の実施形態において、前記酵母宿主細胞が、レポーター遺伝子に機能的に連結されたフェロモン誘導性PRM1プロモーターを含むΔfar1株であり、酵母宿主細胞において前記GPCRに結合して活性化するアゴニストとして作用する抗体によるフェロモン応答の活性化が、レポーター遺伝子の発現増加をもたらす。
【００５３】
別の態様において、本発明は、以下を含む酵母宿主細胞を提供する：
（a）酵母宿主細胞ペリプラズム空間に提示するための抗体；
（b）ペリプラズムアンカータンパク質であって、前記抗体がペリプラズム空間に提示されるようにペリプラズムアンカータンパク質が抗体に連結している、前記ペリプラズムアンカータンパク質；及び
（c）目的の標的膜タンパク質であって、目的の膜タンパク質が酵母宿主細胞原形質膜に位置し、酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示された抗体にアクセス可能である、前記目的の標的膜タンパク質。
【００５４】
別の態様において、本発明は、ペリプラズムアンカータンパク質に連結された抗体を提供する。いくつかの実施形態において、前記抗体は酵母宿主細胞において産生され、抗体は酵母宿主細胞ペリプラズム空間に局在する。いくつかの実施形態において、前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、複合体中で分子結合相互作用によって互いに非共有結合で連結し、又は複合体中で共有非ペプチド結合によって連結している。いくつかの実施形態において、前記非ペプチド結合はジスルフィド結合である。いくつかの実施形態において、前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、融合タンパク質中で互いに共有結合している。
【００５５】
別の態様において、本発明は、抗体がペリプラズム空間に局在するように、前記抗体をペリプラズムアンカータンパク質に連結することを含む、酵母宿主細胞ペリプラズム空間への抗体の局在化方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、複合体中で分子結合相互作用によって互いに非共有結合で連結し、又は複合体中で共有非ペプチド結合によって連結している。いくつかの実施形態において、前記非ペプチド結合はジスルフィド結合である。いくつかの実施形態において、前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、融合タンパク質中で互いに共有結合している。
【００５６】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー、及び、目的の標的タンパク質に結合し、及び/又はその活性を調節する能力について、複数のタンパク質変異体をスクリーニングするための説明書を含むキットを含む。
【００５７】
本発明のこれらの実施形態及び他の実施形態は、本明細書の開示を考慮して当業者であれば容易に思い到るであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１Ａ】図１A〜１Dは、GPCRの機能を調節する抗体についてのスクリーニングのための新規な酵母細胞ディスプレイ法を示す。図１Aは、（1）機能的ヒトGPCRと酵母との共役、並びに（2）親和性分子の分泌、及び（3）親和性分子の局在化のユニークな組み合わせを、ハイスループットで高度に操作可能な酵母細胞プラットフォームにおいて一緒に示している。機能的で、適切に折りたたまれたGPCRにより、ヒト生物という文脈において治療薬として機能する可能性がより高いナノボディ又はScFv（IgG抗体に容易に変換できる）が得られる。
【図１Ｂ】図１Bは、アンタゴニストを見つけるための「アンタゴニスト選択株」の使用を示す。
【図１Ｃ】図１Cは、アゴニストを見つけるための「アゴニスト選択株」の使用を示す。フェロモン応答系のアウトプットと共役したレポーター及び選択可能なマーカーのロジックを変化させることにより、プラットフォームを使用してアゴニスト又はアンタゴニストを選択することができる。
【図１Ｄ】図１Dは、直接的な機能的スクリーニングにより、従来のスクリーニングでは通常見逃されていたであろう治療用抗体候補が得られ、これにより、GPCR標的の新規な結合様式及び機能的調節が得られる可能性があることを示す。酵母における遺伝子操作が容易であるため、抗体及びGPCRの発現レベルを調節すること、並びに、選択可能な、及びスクリーニング可能なレポーターを非常に感受性を持つように調整することの両方ができる。どちらも、親和性は低いが機能的な候補を見つけることを可能にし、後で容易に親和性を成熟させることができる。
【図２】「ハロアッセイ」でバックグラウンド/偽陽性を減少させる方法を示す。親株（左）及び現在のプラットフォーム株（NIY326、右）の細胞107個を寒天培地上に平板培養した。プレート上にろ紙ディスクを置き、1mMのα因子3μlをスポットした。リガンドに応答して増殖しない（望ましい表現型応答）区域が両方で観察されたが、親株（左）ではサプレッサー変異体が発生し、フェロモンの存在下でコロニーに成長した（ハロ領域のコロニー）。プラットフォーム株NI326（右）では、明瞭なハロ区域、及び、アンタゴニスト選択において偽陽性として作用するであろうバックグラウンドサプレッサー変異の欠如によって示されるように、バックグラウンド率を約10-7に減少した。
【図３】親和性分子標的化ベクターの構造と概念を示す。分泌シグナルの下流で、かつ、リンカー及びGPIの細胞外膜アンカードメインの上流に親和性分子をクローニングした。細胞内で発現させたとき、このタンパク質は細胞外空間に分泌され、その後、GPIドメインはプロセシングを受けて、膜に結合するGPIを含むドメインが残される。このドメインは親和性分子をこの細胞に係留し、細胞外面の標的GPCRと自由に相互作用できるようにする。
【図４Ａ】図４A及び４Bは親和性分子発現/標的化ベクターの確認を示す。図４Aは、発現した抗GFPナノボディが適切に折りたたまれて局在すれば、細胞の外側から（細胞壁消化後に）投与されたGFPが細胞膜を標識するはずであることを示す。
【図４Ｂ】図４Bは、本発明者らの標的化ベクターを使用して、抗GFPナノボディを発現させた酵母の画像を示しており、細胞壁消化及び精製GFPタンパク質投与後は、膜におけるGFPの結合を示す。対照細胞では蛍光は観察されなかった（データは示していない）。左、明視野；右、GFPチャネル。
【図５Ａ】図５A及び５Bはα因子耐性クローンのプラスミド依存性の確認を示す。図５Aは、戦略の概略図を示す。
【図５Ｂ】図５Bは、ハロアッセイでの分析ではα因子耐性増殖を示し、次いで、プラスミドを強制的に欠落させた後には耐性を示さなかった「候補」クローンの例を示す。
【図６】ワークフローの概略図を示す。
【図７】様々な方法でペリプラズム空間に提示されたVHHドメインアゴニストを使用した、カンナビノイド受容体2型（CB2受容体）の活性化が、酵母細胞の増殖速度へ与える影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
癌や炎症などの疾患における多くの治療標的は、細胞膜関連タンパク質に関係している。しかし、インパクトの大きい（high-impact）疾患に対して最大の治療上の可能性を有する細胞膜関連タンパク質の多くは、薬にするのが困難である。それらのタンパク質の機能に影響を及ぼす低分子は容易に見つかるが、しばしば非特異的である。低分子とは異なり、抗体並びに関連する親和性分子（例えば、ナノボディ、ScFv及びFab）は、それらの潜在的に優れた特異性、機能的多様性、及び薬理学的特性により、魅力的な医薬分類である。さらに、抗体は、細胞外のドメイン及びループとより良好に相互作用する、低分子よりも洗練された方法で、細胞膜関連タンパク質（例えばGPCR）の構造を（したがって機能も）調節することができる。しかし、現在までのところ、承認されたGPCR抗体治療薬は米国では1つもなく、世界中で唯一、日本にしかない。
【００６０】
現在の酵母又はファージディスプレイのワークフローでは、強固に結合するものの、しばしば細胞膜関連タンパク質（例えばGPCR）の機能に影響しない抗体が同定される。使用される抗原は、in vivoで抗体がアクセス可能な機能的なタンパク質を表していない断片であることが多いか、又は不均一に構造化された完全長のタンパク質調製物である。またこのワークフローでは、ほとんどの抗体は全く機能的にアッセイされないので、全ての機能的多様性のうちの膨大な部分を見落としている。必要なのは、細胞膜関連タンパク質（例えばGPCR）の機能を調節する抗体を直接選択するためのハイスループットプラットフォームである。
【００６１】
細胞膜関連タンパク質（例えばGPCR）の機能を変化させる抗体を開発することはそれほど簡単ではない（Jo 2015, Hutchings 2010）。多くの現行の解決策におけるこの主な原因として以下の問題がある：（1）使用される抗原が欠如している。細胞外のペプチド又は断片に由来する抗原は、ウエスタンブロットのための抗体を開発するのにはよいが、治療上適切な標的を構造的には再現していない。さらに、均一に、機能的に折りたたまれた完全長のタンパク質を、脂質若しくは界面活性剤中で、免疫化、ファージディスプレイ、又は酵母ディスプレイに十分な量で調製することが困難であり得る。（2）その高い親和性によって選択される抗体はほとんどが機能的でない。それらは前記タンパク質の機能に影響しない領域に結合する。（3）ワークフローは、選択された抗体において、著しい抗体の多様性を（したがって機能性も）失う。まず強固に結合する抗体を選択し、残りを捨てることによって、膨大な量の機能的多様性が失われる。抗体候補サブセットを自己分泌的に、機能的にスクリーニングするために哺乳動物細胞系が作製され（Zhang 2014）、部分的に問題（2）に対処しているが、形質転換効率（約104）により、及び、選択（スクリーニング）可能なリードアウト（readouts）の操作可能性（engineerability）が限られていることにより、小さなサブセットの候補のスクリーニングに限定される。
【００６２】
我々のイノベーション（innovation）には、ハイスループットプラットフォームにおいて、細胞膜関連タンパク質及び酵母フェロモン応答の共役と、同じ細胞内でシスに作用する親和性分子の発現とを組み合わせことが含まれる。これにより、酵母ペリプラズム空間における、親和性分子の直接的かつハイスループットな機能的選択が可能になる。抗体及び関連する親和性分子は、複雑な折りたたみパターンを有する大きな分子であり、そのパターンは結合活性を保持するために維持されなければならない。構造化されていない短いペプチドは酵母ペリプラズム空間に局在化することができるが、抗体及び関連する親和性分子が酵母ペリプラズム空間に提示され、結合活性を保持できることはこれまで知られていなかった。
【００６３】
本発明の実施には、特に明記しない限り、当業者の技術の範囲内で、薬理学、化学、生化学、組み換えDNA技術及び免疫学の従来の方法を使う。このような技術は文献で全て説明されている。例えば、High Throughput Screening: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, W.P. Janzen ed., Humana Press, 第三版, 2016)；G Protein-Coupled Receptors: Structure, Signaling, and Physiology (S. Siehler and G. Milligan eds., Cambridge University Press, 2010)；Handbook of Experimental Immunology, Vols.I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications)；A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., 現行版（current addition）)；Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第三版, 2001); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.)を参照。
【００６４】
ここで、本明細書に引用される全ての刊行物、特許及び特許出願は、前掲又は以降を問わず、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００６５】
I．定義
本発明の記載の中で、下記の用語を使うが、以下に示すように定義されるものとする。
【００６６】
本明細書並びに添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形の「a」、「an」及び「the」は、内容が明確に別の指示をしない限り、複数の参照物を含むということに留意すべきである。したがって、例えば、「細胞（a cell）」への言及は、2つ以上の細胞の混合物などを含む。
【００６７】
「約」という用語は、特に所与の量への言及において、プラス又はマイナス5%の偏差を包含することを意味する。
【００６８】
「約」という用語は、特に所与の量への言及において、与えられた量自体を包含し、記載する。
【００６９】
「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指し、それらは最小の長さに限定されない。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、二量体、多量体などがこの定義の内に含まれる。完全長タンパク質及びその断片の両方がこの定義に包含される。前記用語には、また、ポリペプチドの発現後修飾（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、ヒドロキシル化など）も含まれる。さらに、本発明の目的においては、「ポリペプチド」は、本来（天然）の配列に対する欠失、付加及び置換などの改変を含むタンパク質を指す。これらの改変は、部位特異的変異誘発を介するように意図的であってもよく、又は、タンパク質を産生する宿主の突然変異若しくはPCR増幅によるエラーを介するなど、偶発的であってもよい。
【００７０】
「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、並びにハイブリッド抗体、変化させた抗体、キメラ抗体、及びヒト化抗体を包含する。抗体という用語には、以下が含まれる：ハイブリッド（キメラ）抗体分子（例えば、Winter et al. (1991) Nature 349:293-299；及び米国特許第4,816,567号を参照）；F(ab')2及びF(ab)断片；Fv分子（非共有結合性ヘテロダイマー、例えば、Inbar et al. (1972) Proc Natl Acad Sci USA 69:2659-2662；及びEhrlich et al. (1980) Biochem 19:4091-4096を参照）；一本鎖Fv分子（scFv）（例えば、Huston et al. (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85:5879-5883を参照）；ナノボディ又は単一ドメイン抗体（sdAb）（例えば、Wang et al. (2016) Int J Nanomedicine 11:3287-3303、Vincke et al. (2012) Methods Mol Biol 911:15-26を参照）；二量体及び三量体抗体断片コンストラクト；ミニボディ（例えば、Pack et al. (1992) Biochem 31:1579-1584；Cumber et al. (1992) J Immunology 149B:120-126を参照）；ヒト化抗体分子（例えば、Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327；Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534-1536；及び英国特許公開第GB 2,276,169号1994年9月21日公開）；並びにそのような分子から得られたいずれかの機能的な断片であって、ここで、そのような断片が親抗体分子の特異的結合特性を保持しているもの。
【００７１】
「特異的に（又は選択的に）結合する」という句は、抗原（例えば、GPCR）に対する抗体の結合への言及と共に、タンパク質及び他の生物製剤の不均一な集団において抗原の存在を確定する結合反応を指す。したがって、所定（designated）の免疫アッセイ条件下では、指定された（specified）抗体は特定の（particular）抗原に結合し（バックグラウンドの少なくとも2倍）、試料中に存在する他の抗原には、有意な量で実質的に結合しない。そのような条件下での抗原への特異的な結合には、特定の抗原に対する特異性について選択された抗体が必要であり得る。例えば、ラット、マウス、又はヒトなどの指定の種からの抗原に対して作製された抗体を選択して、その抗原に特異的な免疫反応性を示し、多型変異体及び対立遺伝子を除いて、他のタンパク質には免疫反応性を示さない抗体のみを得ることができる。この選択は、他の種からの分子と交差反応する抗体を除外することによって達成され得る。特定の抗原に特異的な免疫反応性を示す抗体を選択するために、様々な免疫アッセイ方式を使用することができる。例えば、固相ELISA免疫アッセイは、タンパク質に特異的な免疫反応性を示す抗体を選択するために日常的に使用される（特異的な免疫反応性を判定するために使用できる免疫アッセイの方式及び条件の説明については、例えば、Harlow & Lane. Antibodies, A Laboratory Manual (1988)を参照）。典型的には、特異的又は選択的な反応は、バックグラウンドシグナル又はノイズの少なくとも2倍、より典型的にはバックグラウンドの10〜100倍を超えるであろう。
【００７２】
あるタンパク質が、特異的に（例えば、鍵と鍵穴型の機構により）、非特異的に、又は非特異的と特異的な結合の何らかの組合せにより結合する場合、別のタンパク質と「相互作用する」といわれる。第一のタンパク質が、他のタンパク質と結合するより高い親和性及び/又はより高い特異性で、第二のタンパク質と結合する（非特異的及び/又は特異的に）場合、第二のタンパク質と「優先的に相互作用」する。「親和性」という用語は、結合の強さを指し、解離定数（Kd）として定量的に表現できる。特異的な結合は、必ずしも各タンパク質の指定のアミノ酸残基及び/又はモチーフ間の相互作用を必要としないことは理解されるべきである。例えば、特定の実施形態において、第一のタンパク質は第二のタンパク質と優先的に相互作用し得るが、それでもなお、弱いが検出可能なレベル（例えば、目的のポリペプチドに対して示される結合の10%以下）で他のポリペプチドと結合する可能性があってもよい。典型的には、弱い結合、又はバックグラウンド結合は、目的のポリペプチド又は化合物との優先的相互作用と容易に識別可能である（例えば、適切な対照の使用によって）。
【００７３】
本明細書中で使用される場合、「結合ペア」という用語は、互いに特異的に結合する第一及び第二の分子を指す。結合ペアの第一のメンバーの、試料中の結合ペアの第二のメンバーとの「特異的な結合」は、試料中の他の構成要素に対してよりも高い親和性及び特異性での、第一のメンバーの第二のメンバーへの結合、又はその逆によって証明される。結合ペアのメンバー間の結合は、典型的には非共有結合性である。例としては、抗原−抗体、受容体−ホルモン、受容体−リガンド、受容体−アゴニスト、及び受容体−アンタゴニストの結合ペアが含まれる。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「リガンド」という用語は、別の分子に結合する分子を指し（例えば、抗体に結合する抗原、受容体に結合するホルモン、アゴニスト、若しくはアンタゴニスト、イオンチャネルに結合する神経伝達物質、又は酵素に結合する基質、阻害剤、若しくはアロステリック効果剤）、例えば、天然及び合成生体分子、例えばタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸分子、炭水化物、糖、脂質、リポタンパク質、低分子、天然及び合成の有機及び無機物質、合成ポリマー、アプタマーなどを含む。
【００７５】
「ポリヌクレオチド」という用語は、当技術分野で公知な様に、一般に核酸分子を指す。「ポリヌクレオチド」は、二本鎖及び一本鎖配列の両方を含むことができ、原核生物配列、真核生物mRNA、ウイルス、原核生物若しくは真核生物mRNA由来のcDNA、ウイルス（例えば、RNA及びDNAウイルス並びにレトロウイルス）、原核生物DNA若しくは真核生物（例えば、哺乳動物）DNA由来のゲノムRNA及びDNA配列、並びに、特に合成DNA配列を指すが、これらに限定されない。前記用語はまた、DNA及びRNAの公知の塩基類似体のいずれかを含む配列を捕捉し、本来（天然）の配列に対する欠失、付加及び置換（一般に天然に保存的なもの）などの改変を含む。これらの改変は、部位特異的変異誘発を介するように意図的であってもよく、又は、例えば、提示のための変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主の突然変異を介するように、偶発的であってもよい。ポリヌクレオチドの改変は、例えば、宿主細胞におけるポリペプチド産物の発現を促進することを含む、任意の数々の効果を有し得る。
【００７６】
ポリヌクレオチドは、生物学的に活性のあるタンパク質又はポリペプチドをコードすることができる。ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの性質に依存して（例えば、ポリヌクレオチドが抗原又はエピトープをコードする場合）、ポリヌクレオチドはわずか10ヌクレオチドを含むものでもよい。典型的には、ポリヌクレオチドは、少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30又はそれよりも多いアミノ酸のペプチドをコードする。
【００７７】
「変異体」、「類似体」及び「ムテイン」という用語は、本明細書に記載される所望の活性（例えば、効果的なポリペプチドの提示）を保持する、参照分子の生物学的に活性のある誘導体を指す。一般に、「変異体」及び「類似体」という用語は、改変により生物学的活性が損なわれず、以下に定義されるように参照分子と「実質的に相同」である限り、本来（天然）のポリペプチド配列及び構造を有し、本来（天然）の分子に対して1以上のアミノ酸の付加、置換及び/又は欠失を有する化合物を指す。一般に、このような類似体のアミノ酸配列は、2つの配列をアラインメントした場合に参照配列に対する高度な配列相同性、例えば、50%を超える、一般には60%〜70%を超える、さらに特に80%〜85%以上、例えば、少なくとも90%〜95%、又はそれ以上のアミノ酸配列相同性を有するであろう。しばしば類似体は、同数のアミノ酸を含んでいても、本明細書中で説明されるような置換を含むであろう。「ムテイン」という用語は、1つ以上のアミノ酸様分子を有するポリペプチド、例えば限定されるものではないが、アミノ及び/又はイミノ分子のみを含む化合物、アミノ酸の類似体（例えば、非天然アミノ酸などを含む）を1つ以上含むポリペプチド、置換された連結を有するポリペプチド、並びに、天然及び非天然（例えば、合成）両方の環状化、分枝分子などの当技術分野で公知の他の修飾をさらに含む。前記用語は、1つ以上のN−置換グリシン残基（「ペプトイド」）及び他の合成アミノ酸又はペプチドを含む分子をも含む（ペプトイドの記述に関しては、例えば、米国特許第5,831,005号；第5,877,278号；及び第5,977,301号；Nguyen et al., Chem. Biol. (2000) 7:463-473；及びSimon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:9367-9371を参照）。ポリペプチド類似体及びムテインを作製する方法は、当技術分野で公知であり、以下にさらに記載する。
【００７８】
類似体には、一般に、天然に保存的な置換（つまり、その側鎖に関連のあるアミノ酸のファミリー内で起こる置換）が含まれる。具体的には、アミノ酸は、一般に、以下の4つのファミリーに分けられる：（1）酸性―アスパラギン酸及びグルタミン酸；（2）塩基性―リジン、アルギニン、ヒスチジン；（3）非極性―アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；並びに（4）非荷電極性―グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンは時に、芳香族アミノ酸に分類されることがある。例えば、ロイシンのイソロイシン若しくはバリンへの、アスパラギン酸のグルタミン酸への、トレオニンのセリンへの単独置換、又は、あるアミノ酸の、構造的に関連したアミノ酸への類似した保存的な置き換えが、生物学的活性に大きな影響を及ぼさないであろうことは、合理的に予測可能である。例えば、目的のポリペプチドは、その分子の所望の機能が無傷のままである限り、約5〜10までの保存的若しくは非保存的なアミノ酸置換、又はさらに約15〜25までの保存的若しくは非保存的なアミノ酸置換、又は5〜25までの任意の整数の置換を含むことができる。当業者は、当技術分野で周知のHopp/Woods及びKyte-Doolittleプロットを参照することにより、目的の分子の変化に耐え得る領域を容易に決定することができる。
【００７９】
本明細書において、核酸分子を記載するために使用される「組み換え」とは、ゲノム、cDNA、ウイルス、半合成、又は合成由来のポリヌクレオチドであって、その由来又は操作に起因して、天然においては関連しているポリヌクレオチドの全て若しくは一部と関連していないものを意味する。タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドに関して使用される「組み換え」という用語は、組み換えポリヌクレオチドの発現によって産生されたポリペプチドを意味する。一般に目的の遺伝子は、クローニングされ、次いで、以下にさらに記載するように、形質転換された生物において発現される。宿主生物は発現条件下で外来遺伝子を発現し、タンパク質を産生する。
【００８０】
「ポリヌクレオチドコード配列」又は選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、適切な調節配列（又は「制御エレメント」）の制御下に配置された場合に、in vivoでポリペプチドへと、転写され（DNAの場合）、翻訳される（mRNAの場合）核酸分子である。コード配列の境界は、5'（アミノ）末端の開始コドン及び3'（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンによって決定される。転写終止配列がコード配列の3'側に位置してもよい。典型的な「制御エレメント」には、例えば、プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終止シグナル、及びポリアデニル化配列などの転写調節因子；並びに、例えば、翻訳開始の最適化のための配列（例えば、シャイン−ダルガノ（リボソーム結合部位）配列、Kozak配列（つまり、例えばコード配列の5'側に位置する翻訳の最適化のための配列）、リーダー配列（異種の又は本来（天然）の）、翻訳開始コドン（ATGなど）、翻訳終止配列など）のような翻訳調節因子が含まれるが、これらに限定されない。プロモーターには、誘導性プロモーター（このプロモーターに機能的に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が分析物、補因子、調節タンパク質などによって誘導される）、抑制可能プロモーター（このプロモーターに機能的に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が分析物、補因子、調節タンパク質などによって誘導される）、及び恒常的プロモーターが含まれ得る。
【００８１】
「機能的に連結された」とは、かかる（so described）構成要素が通常の機能を果たすように設計される、要素の配置を指す。したがって、コード配列に機能的に連結された所与のプロモーターは、適切な酵素が存在するときにコード配列の発現を実行することが可能である。プロモーターは、その発現を指示するために機能する限り、コード配列と連続していなくてもよい。したがって、例えば、プロモーター配列とコード配列との間に介在する（intervening）転写されたが非翻訳の配列が存在してもよく、そのプロモーター配列は、それでも、コード配列に「機能的に連結されている」とみなすことができる。
【００８２】
「断片」とは、無傷の完全長配列及び構造の一部のみからなる分子を意味する。この断片には、ペプチドのC末端欠失、N末端欠失、及び/又は内部欠失を含み得る。特定のタンパク質又はペプチドの活性断片は、一般に、完全長分子の少なくとも約5〜10個の連続したアミノ酸残基、好ましくは完全長分子の少なくとも約15〜25個の連続したアミノ酸残基、及び最も好ましくは完全長分子の少なくとも約20〜50個若しくはそれ以上の連続したアミノ酸残基を含み、又は、問題の断片が生物学的活性を保持しているのであれば、5個のアミノ酸と完全長配列との間の任意の整数を含むであろう。
【００８３】
「実質的に精製された」とは、一般に、物質が、それが存在する試料の大部分の割合を占めるような、物質（化合物、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、ポリペプチド組成物）の単離を指す。典型的には、あるサンプルにおいて、実質的に精製された成分は、サンプルの50%、好ましくは80%〜85%、より好ましくは90〜95%を占める。目的のポリヌクレオチド及びポリペプチドを精製するための技術は、当技術分野で周知であり、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー及び密度による沈降を含む。
【００８４】
ポリペプチドを指しているとき、「単離された」とは、示された分子が、その分子が天然に見出されるか、又は、同種の他の生物学的高分子が実質的に存在しない中で存在する生物体全体から、切り離され、及び分離されることを意味する。ポリヌクレオチドに関する「単離された」という用語は、通常は、天然ではそれと会合する配列の全体若しくは一部を欠いた核酸分子であるか；又は、天然に存在する通りだが、それに会合した異種配列を有する配列であるか；又は、染色体から解離された分子である。
【００８５】
「相同性」とは、2つのポリヌクレオチド又は2つのポリペプチド分子間の同一性%を指す。2つの核酸、又は2つのポリペプチド配列が互いに「実質的に相同」であるのは、その配列が、その分子の規定された長さにわたって、少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約75%、より好ましくは少なくとも約80%〜85%、好ましくは少なくとも約90%、及び最も好ましくは少なくとも約95%〜98%の配列同一性を示すときである。本明細書中で使用される場合、実質的に相同とは、指定された配列と完全な同一性を示す配列をも指す。
【００８６】
一般に、「同一性」とは、2つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列における、それぞれ、ヌクレオチドとヌクレオチド又はアミノ酸とアミノ酸との正確な対応を指す。同一性%は、配列を整列させ、2つの整列された配列間の正確な一致数をカウントし、参照配列の長さで割り、結果に100をかけることにより、2つの分子間の配列情報（参照配列及び参照配列との同一性%が未知の配列）を直接比較することによって決定することができる。容易に利用可能なコンピュータプログラムを分析の補助に使用することができる：例えば、Smith and Watermanの局所相同性アルゴリズム（Advances in Appl. Math. 2:482 489, 1981）をペプチド解析用に改造したALIGN（Dayhoff, M.O. Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff ed., 5 Suppl. 3:353 358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC.）など。ヌクレオチド配列の同一性を決定するためのプログラムは、Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8（Genetics Computer Group, Madison, WIから入手可能）で使用可能である：例えば、BESTFIT, FASTA及びGAPプログラム（これらもSmith and Watermanアルゴリズムに依拠している）など。これらのプログラムは、製造業者によって推奨され、上述のWisconsin Sequence Analysis Packageに記載されているデフォルトパラメータを用いて容易に利用される。例えば、参照配列に対する特定のヌクレオチド配列の同一性%は、Smith and Watermanの相同性アルゴリズムを使用して、デフォルトのスコア表及び6ヌクレオチド位置のギャップペナルティで決定することができる。
【００８７】
本発明の文脈で同一性%を確立する別の方法は、MPSRCHプログラムパッケージ（開発：John F. Collins及びShane S. Sturrok、配布：IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA)、著作権：エジンバラ大学）を使用することである。この一連のパッケージから、スコア表にデフォルトパラメータ（例えば、ギャップ開放ペナルティ12、ギャップ延長ペナルティ1、ギャップ6）を使用してSmith-Watermanアルゴリズムを使うことができる。作成されたデータのうち、「マッチ」値が「配列同一性」を反映する。配列間の類似性又は同一性%を計算するための他の適当なプログラムは、当該技術分野で一般に知られている：例えば、別のアラインメントプログラムとしては、BLAST（デフォルト値で使用）である。例えば、BLASTN及びBLASTPは、下記のデフォルトパラメータを使用して使用することができる：遺伝暗号＝標準；フィルター＝なし；ストランド＝両方；カットオフ＝60；期待数＝10；行列=BLOSUM62；記述＝50配列；並び替え=HIGH SCORE；データベース＝非重複、GenBank＋EMBL＋DDBJ＋PDB＋GenBank CDS translations＋Swiss protein＋Spupdate＋PIR。これらのプログラムの詳細は容易に入手可能である。
【００８８】
あるいは、相同領域間で安定な二本鎖を形成する条件下でポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションし、続いて一本鎖特異的ヌクレアーゼで消化し、消化された断片のサイズを決定することによって相同性を決定することもできる。実質的に相同なDNA配列は、例えば、その特定の系に対して規定されるストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において同定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件を規定することは、当該分野の技術範囲内である。例えば、Sambrook et al., 前掲; DNA Cloning, 前掲; Nucleic Acid Hybridization, 前掲を参照。
【００８９】
「発現カセット」又は「発現コンストラクト」とは、目的の配列又は遺伝子の発現を指示すること可能な集合（assembly）を指す。発現カセットは、一般に、上記のように、目的の配列又は遺伝子に（転写を指示するように）機能的に連結された、プロモーターなどの制御エレメント、及び、しばしばポリアデニル化配列をも含む。本発明の特定の実施形態では、本明細書に記載される発現カセットは、プラスミド又はウイルスベクターコンストラクト内に含まれていてもよい。発現カセットの構成要素に加えて、そのコンストラクトは、また、1つ以上の選択可能なマーカー、コンストラクトが一本鎖DNAとして存在することを可能にするシグナル(例えば、M13複製起点）、少なくとも1つのマルチクローニング部位、及び複製起点（例えば、酵母における自律的複製配列）を含んでもよい。
【００９０】
「トランスフェクション」という用語は、細胞による外来DNAの取り込みを指すために使用される。細胞膜の内部に外来性DNAが導入されたとき、細胞は「トランスフェクション」されている。数々のトランスフェクション技術が、当該技術分野で一般に知られている。例えば、Graham et al. (1973) Virology, 52:456、Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning, a laboratory manual, 第三版, Cold Spring Harbor Laboratories, New York、Davis et al. (1995) Basic Methods in Molecular Biology, 第二版, McGraw-Hill、並びにChu et al. (1981) Gene 13:197を参照。このような技術を用いて、1つ以上の外来性のDNA部位を適当な宿主細胞に導入することができる。この用語は、遺伝物質の安定的及び一過的な取り込みの両方を指し、ペプチド又は抗体結合DNAの取り込みを含む。
【００９１】
「ベクター」は、核酸配列を標的細胞に移入することが可能である（例えば、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、粒子担体、及びリポソーム）。典型的には、「ベクターコンストラクト」、「発現ベクター」、及び「遺伝子導入ベクター」は、目的の核酸の発現を指示することが可能であり、かつ、核酸配列を標的細胞に移入することができる任意の核酸コンストラクトを意味する。したがって、この用語は、クローニング及び発現媒体、並びにプラスミド及びウイルスベクターを含む。
【００９２】
「形質転換」という用語は、その挿入に使用される方法に関係なく、宿主細胞への外来性ポリヌクレオチドの挿入を指す。例えば、直接の取り込み、形質導入又はf接合（f-mating）が含まれる。外来性ポリヌクレオチドは、非組み込みベクター（例えばプラスミド）として維持されてもよいし、あるいは、宿主ゲノム中に組み込まれてもよい。
【００９３】
「組み換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」、及び、単細胞主体（unicellular entities）で培養された微生物又は真核細胞株を示す他のこのような用語は、組み換えベクター又は他の移入されたDNAの受容者として使用され得る、又は使用されている細胞を指し、トランスフェクションされた元の（original）細胞の元の子孫を含む。
【００９４】
「コード配列」又は選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、適切な調節配列（又は「制御エレメント」）の制御下に配置された場合に、in vivoでポリペプチドへと、転写され（DNAの場合）、翻訳される（mRNAの場合）核酸分子である。コード配列の境界は、5'（アミノ）末端の開始コドン及び3'（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンによって決定することができる。コード配列は、ウイルス、原核生物又は真核生物mRNA由来のcDNA、ウイルス又は原核生物DNA由来のゲノムDNA配列、さらには合成DNA配列を含み得るが、これらに限定されない。転写終止配列がコード配列の3'側に位置してもよい。
【００９５】
典型的な「制御エレメント」には、転写プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終止シグナル、ポリアデニル化配列（翻訳停止コドンの3'側に位置する）、翻訳開始の最適化のための配列（コード配列の5'側に位置する）、及び翻訳終止配列が含まれるが、これらに限定されない。
【００９６】
「標識」及び「検出可能な標識」という用語は、検出可能な分子を指し、放射性同位体、安定（非放射性）重同位体、蛍光体（fluorescers）、化学発光体（chemiluminescers）、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、発色団（chromophores）、色素、金属イオン、金属ゾル、リガンド（例えば、ビオチン又はハプテン）などを含むが、これらに限定されない。「蛍光体」という用語は、検出可能な範囲の蛍光を示すことが可能な物質又はその一部を指す。本発明で使用され得る標識の具体例には、放射性標識（例えば、3H、125I、35S、14C、又は32P）、安定（非放射性）重同位体（例えば、13C又は15N）、フィコエリトリン、フルオレセイン、7−ニトロベンゾ−2−オキサ−1, 3−ジアゾール（NBD）、YPet、CyPet、カスケードブルー（Cascade blue）、アロフィコシアニン、Alexa色素（例えば、Alexa 350、Alexa 430、Alexa 488、Alexa 532、Alexa 546、Alexa 555、Alexa 594、Alexa 647、Alexa 660、Alexa 680、及びAlexa 750）、Atto色素（例えば、Atto 488、Atto 532、Atto 550、Atto 565、Atto 590、Atto 610、Atto 620、Atto 635、Atto 647、Atto 655、及びAtto 680）、シアニン色素（例えば、Cy3、Cy5、及びCy7）、TYE 563、TYE 665、TYE 705、TEX 615、JOE、TET、HEX、TAMRA、ROX、ローダミン、ダンシル（dansyl）、ウンベリフェロン、テキサスレッド、ルミノール、アクリジニウムエステル（acradimum esters）、ビオチン又は他のストレプトアビジン結合タンパク質、磁気ビーズ、高電子密度試薬、緑色蛍光タンパク質（GFP）、高感度緑色蛍光タンパク質（EGFP）、黄色蛍光タンパク質（YFP）、高感度黄色蛍光タンパク質（EYFP）、青色蛍光タンパク質（BFP）、赤色蛍光タンパク質（RFP）、TagRFP、ドロンパ（Dronpa）、パドロン（Padron）、mApple、mCherry、rsCherry、rsCherryRev、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケ（Renilla）ルシフェラーゼ、NADPH、β-ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、クロラムフェニコール（chloramphenical）アセチルトランスフェラーゼ、並びにウレアーゼが含まれるが、これらに限定されない。酵素タグは、その対応する基質と共に使用される。本発明の実施に関連する標準的な手順の多くと同様に、当業者であれば、使用可能な追加の標識に気が付くであろう。
【００９７】
II．発明を実施するための形態
本発明を詳細に記載する前に、本発明は、特定の構成又は工程のパラメータに限定されず、そのようなものは、当然のことながら、変更し得ることを理解されたい。また、本明細書で使用される専門用語は、本発明の特定の実施形態を説明することだけを目的としており、それを限定する意図はないことも理解されたい。
【００９８】
本明細書に記載のものと類似した、又は同等の多くの方法及び材料を、本発明の実施に際して使用することができるが、好ましい材料及び方法は本明細書に記載されている。
【００９９】
本発明は、酵母細胞のペリプラズム空間に組み換えタンパク質を提示するための方法の開発に基づく。特に、組み換えタンパク質が、酵母ペリプラズム空間にタンパク質を提示するため、細胞膜にまたがる膜貫通ドメイン、酵母細胞膜の外面にある細胞膜関連タンパク質ドメイン、酵母細胞壁の内面に結合するタンパク質、又はペリプラズムタンパク質に連結している。組み換えタンパク質は、また、分泌シグナルに組み換えタンパク質を連結することによってペリプラズムに標的化することもできる。さらに、目的の標的タンパク質を、原形質膜又はペリプラズム空間に局在し、提示されたタンパク質にアクセス可能なように、酵母で共発現させることができる。特定の実施形態において、本発明者らは、ヒトGPCRに結合し、その機能を調節する抗体についてスクリーニングするために、この酵母ペリプラズムディスプレイ法を使用している（実施例を参照）。酵母細胞のペリプラズム空間に提示された抗体は、細胞膜に発現したGPCRに結合するのに充分近接している。本発明者らはさらに、ヒトGPCRを酵母フェロモン応答経路と共役させることにより、ペリプラズムディスプレイを使用したアンタゴニスト及びアゴニストについてのGPCRのハイスループットスクリーニングのための方法を開発した。
【０１００】
本発明のさらなる理解のために、酵母ペリプラズムディスプレイ、及び、それをタンパク質ライブラリーのハイスループットスクリーニングのために使用する方法に関して、より詳細な考察を以下に提供する。
【０１０１】
A．酵母における組み換えタンパク質のペリプラズムディスプレイ
一態様において、本発明は、酵母宿主細胞のペリプラズム空間におけるタンパク質の提示に関する。いくつかの実施形態において、酵母宿主細胞は、酵母ペリプラズム空間に提示するためのタンパク質、このペリプラズム空間に提示するタンパク質に連結されたペリプラズムアンカータンパク質、及び、酵母宿主細胞のペリプラズム空間に位置する目的の標的膜タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ペリプラズム空間に提示されるタンパク質が目的の標的膜タンパク質に特異的に結合し、又はその機能に影響を及ぼすかどうかを判定するために、前記酵母宿主細胞を使用することができる。酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示されるタンパク質は、組み換えタンパク質を酵母細胞のペリプラズム空間に局在化するペリプラズムアンカータンパク質に、組み換えタンパク質を連結することによって調製することができる。連結は、共有結合でも非共有結合でもよい。例えば、組み換えタンパク質は、融合タンパク質中でペリプラズムアンカータンパク質と共有結合で連結されてもよい。あるいは、組み換えタンパク質変異体はペリプラズムアンカータンパク質と複合体を形成し、ここで、組み換えタンパク質とペリプラズムアンカータンパク質とが、複合体中で分子結合相互作用によって非共有結合で連結されてもよい。あるいは、組み換えタンパク質変異体とペリプラズムアンカータンパク質とが、複合体中で非ペプチド結合によって共有結合で連結されてもよい。いくつかの実施形態において、この非ペプチド結合はジスルフィド結合である。酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示されるタンパク質は、提示されるタンパク質と分泌シグナルとを連結することによっても調製することができる。いくつかの実施形態において、酵母宿主細胞の属は、サッカロマイセス（Saccharomyces）、カンジダ（Candida）、ピキア（Pichia）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）、及びヤロウイア（Yarrowia）からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、酵母宿主細胞の属はサッカロマイセス（Saccharomyces）である。いくつかの実施形態において、酵母宿主細胞の種は、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である。
【０１０２】
別の態様において、本発明は、ペリプラズムアンカータンパク質に連結された抗体に関する。いくつかの実施形態において、ペリプラズムアンカータンパク質に連結された抗体は、追加の修飾、部分又は相互作用するタンパク質をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記追加の修飾は翻訳後修飾である。いくつかの実施形態において、前記部分は、親和性タグ、エピトープ、標識などである。いくつかの実施形態において、前記抗体は、酵母宿主細胞ペリプラズム空間に局在する。いくつかの実施形態において、抗体が酵母宿主細胞内で産生され、又は酵母宿主細胞に導入される場合、抗体は酵母宿主細胞ペリプラズム空間に局在化される。いくつかの実施形態において、抗体がペリプラズム空間に局在するように、抗体はペリプラズムアンカータンパク質と連結される。ペリプラズムアンカータンパク質と抗体の連結は、共有結合でも非共有結合でもよい。例えば、抗体は、融合タンパク質中でペリプラズムアンカータンパク質と共有結合で連結されてもよい。あるいは、抗体はペリプラズムアンカータンパク質と複合体を形成し、ここで、抗体とペリプラズムアンカータンパク質とが、複合体中で分子結合相互作用によって非共有結合で連結されてもよい。あるいは、抗体とペリプラズムアンカータンパク質とが、複合体中で非ペプチド結合によって共有結合で連結されてもよい。いくつかの実施形態において、この非ペプチド結合はジスルフィド結合である。本明細書に記載の抗体を含む酵母宿主細胞も提供される。いくつかの実施形態において、酵母宿主細胞の属は、サッカロマイセス（Saccharomyces）、カンジダ（Candida）、ピキア（Pichia）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）、及びヤロウイア（Yarrowia）からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、酵母宿主細胞の属はサッカロマイセス（Saccharomyces）である。いくつかの実施形態において、酵母宿主細胞の種は、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である。
【０１０３】
別の態様において、本発明は、抗体がペリプラズム空間に局在するように、抗体をペリプラズムアンカータンパク質と連結することを含む、酵母宿主細胞ペリプラズム空間への抗体の局在化方法に関する。いくつかの実施形態において、抗体がペリプラズム空間に局在するように、抗体はペリプラズムアンカータンパク質と連結される。ペリプラズムアンカータンパク質と抗体の連結は、共有結合でも非共有結合でもよい。例えば、抗体は、融合タンパク質中でペリプラズムアンカータンパク質と共有結合で連結されてもよい。あるいは、抗体はペリプラズムアンカータンパク質と複合体を形成し、ここで、抗体とペリプラズムアンカータンパク質とが、複合体中で分子結合相互作用によって非共有結合で連結されてもよい。あるいは、抗体とペリプラズムアンカータンパク質とが、複合体中で非ペプチド結合によって共有結合で連結されてもよい。いくつかの実施形態において、この非ペプチド結合はジスルフィド結合である。いくつかの実施形態において、酵母宿主細胞の属は、サッカロマイセス（Saccharomyces）、カンジダ（Candida）、ピキア（Pichia）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）、及びヤロウイア（Yarrowia）からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、酵母宿主細胞の属はサッカロマイセス（Saccharomyces）である。いくつかの実施形態において、酵母宿主細胞の種は、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である。
【０１０４】
別の態様において、本発明は、酵母のペリプラズム空間中にタンパク質を提示することにより、特異的結合又は機能的特徴についてタンパク質ライブラリーをハイスループットスクリーニングするための方法に関する。酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーは、組み換えタンパク質を酵母細胞のペリプラズム空間に局在化するペリプラズムアンカータンパク質に、組み換えタンパク質を連結することによって調製することができる。連結は、共有結合でも非共有結合でもよい。例えば、組み換えタンパク質は、融合タンパク質中でペリプラズムアンカータンパク質と共有結合で連結されてもよい。あるいは、組み換えタンパク質変異体はペリプラズムアンカータンパク質と複合体を形成し、ここで、組み換えタンパク質とペリプラズムアンカータンパク質とが、複合体中で分子結合相互作用によって非共有結合で連結されてもよい。あるいは、組み換えタンパク質変異体とペリプラズムアンカータンパク質とが、複合体中で非ペプチド結合によって共有結合で連結されてもよい。いくつかの実施形態において、この非ペプチド結合はジスルフィド結合である。酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーは、組み換えタンパク質と分泌シグナルとを連結することによっても調製することができる。いくつかの実施形態において、酵母宿主細胞の属は、サッカロマイセス（Saccharomyces）、カンジダ（Candida）、ピキア（Pichia）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）、及びヤロウイア（Yarrowia）からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、酵母宿主細胞の属はサッカロマイセス（Saccharomyces）である。いくつかの実施形態において、酵母宿主細胞の種は、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である。
【０１０５】
ペリプラズム空間への局在化は、様々な方法で達成することができる。特定の実施形態において、組み換えタンパク質は、分泌シグナルと組み換えタンパク質とを連結し、結果として組み換えタンパク質が細胞外空間に分泌されることによって、ペリプラズムに局在化される。特定の実施形態において、ペリプラズムアンカータンパク質は、連結された組み換えタンパク質がペリプラズム中に提示されるように、ペリプラズムアンカータンパク質の、酵母宿主細胞ペリプラズム、原形質膜、又は細胞壁への運搬を指示するシグナル配列を含む。例えば、ペリプラズムアンカータンパク質は、ペリプラズムアンカータンパク質及び連結された組み換えタンパク質の、酵母宿主細胞ペリプラズムへの運搬を指示するシグナル配列を含み得る。好ましくは、ペリプラズムアンカータンパク質は、ペリプラズムアンカータンパク質及び連結された組み換えタンパク質がペリプラズム中に保持されるのに充分に大きい。あるいは、ペリプラズムアンカータンパク質は、ペリプラズム中での複合体形成の結果、ペリプラズム中に保持されるのに充分に大きい、ペリプラズムタンパク質複合体の構成要素であってもよい。他の実施形態において、ペリプラズムアンカータンパク質は、連結された組み換えタンパク質がペリプラズム内に配置されるように、細胞膜の外面に局在化する膜にまたがる膜貫通ドメイン又は膜関連タンパク質ドメインを含む。例えば、この目的のために、原形質膜に局在化するグリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）アンカードメインが使用できる。1つの実施形態において、GPI原形質膜アンカードメインは、例えば限定されるものではないが、YPS1、YPS2、YPS3、YPS4、YPS5、YPS6、又はYPS7ヤプシンGPI原形質膜アンカードメインのような、ヤプシンGPI原形質膜アンカードメインである。別の実施形態において、ペリプラズムアンカータンパク質は、提示されたタンパク質変異体をペリプラズムに配置するように、細胞壁の内面に結合するタンパク質である。特定の実施形態において、ペリプラズムアンカータンパク質及び組み換えタンパク質は融合タンパク質変異体中で共有結合し、ペリプラズムアンカータンパク質は、融合したタンパク質変異体がペリプラズムに提示されるように、この融合タンパク質の、酵母宿主細胞ペリプラズム、原形質膜、又は細胞壁への輸送を指示するシグナル配列を含む。例えば、ペリプラズムアンカータンパク質は、融合タンパク質の酵母宿主細胞ペリプラズムへの運搬を指示するシグナル配列を含み得る。好ましくは、ペリプラズムアンカータンパク質は、融合タンパク質がペリプラズム内に保持されるのに充分に大きい。あるいは、ペリプラズムアンカータンパク質は、ペリプラズム中での複合体形成の結果、融合タンパク質がペリプラズム内に保持されるのに充分に大きい、ペリプラズムタンパク質複合体の構成要素であってもよい。他の実施形態において、ペリプラズムアンカータンパク質は、融合したタンパク質変異体がペリプラズム内に配置されるように、細胞膜の外面に局在化する膜にまたがる膜貫通ドメイン又は膜関連タンパク質ドメインを含む。例えば、この目的のために、原形質膜に局在化するグリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）アンカードメインを使用でき���。1つの実施形態において、GPI原形質膜アンカードメインは、例えば限定されるものではないが、YPS1、YPS2、YPS3、YPS4、YPS5、YPS6、又はYPS7ヤプシンGPI原形質膜アンカードメインのような、ヤプシンGPI原形質膜アンカードメインである。別の実施形態において、ペリプラズムアンカータンパク質は、提示されたタンパク質変異体をペリプラズムに配置するように、細胞壁の内面に結合するタンパク質である。特定の実施形態において、ペリプラズムアンカータンパク質は、ペリプラズムに局在する能力を保持する完全長タンパク質の断片である。
【０１０６】
任意の種類のタンパク質が酵母細胞のペリプラズム空間に提示されてよく、それには、抗体、抗体模倣体、アプタマー、抗原、酵素、受容体、トランスポーター、イオンチャネル、ホルモン、基質、アゴニスト、アンタゴニスト、又はリガンドが含まれるが、これらに限定されない。酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーは、目的の標的分子の存在下で結合及び/又は生物学的活性についてスクリーニングすることができる、複数のそのようなタンパク質を表示する。細胞外に置く（located）場合、標的分子は、スクリーニングのために提示されたタンパク質に到達するために酵母細胞壁を貫通できなければならない。特定の実施形態において、目的の標的タンパク質は、提示されたタンパク質変異体にアクセス可能な位置（例えば、提示されたタンパク質変異体が目的の標的タンパク質に結合し、及び/又はその活性を調節するのに十分に近接した位置）において、酵母細胞中で提示されたタンパク質変異体と共発現される。例えば、目的の標的タンパク質は、タンパク質変異体が提示される場所付近の酵母宿主細胞の原形質膜又はペリプラズムに局在化され得る。特に、この方法は、原形質膜に局在する受容体、イオンチャネル、トランスポーター、及び他の膜タンパク質に適用可能である。したがって、酵母ペリプラズムディスプレイを使用して、その本来（天然）の環境と実質的に類似した環境の中で標的膜タンパク質に対しタンパク質を表示することができる。
【０１０７】
ペリプラズムアンカータンパク質及び提示されたタンパク質変異体を含む、融合コンストラクトに含まれる任意のポリペプチドは、ペプチド結合によって互いに直接的に連結されてもよいし、又はアミノ酸配列若しくはリンカーを介在して離されていてもよい。リンカーアミノ酸配列は、典型的には短く、例えば20個以下のアミノ酸（つまり、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1）であろう。例としては、クローニングを容易にする短いペプチド配列、ポリグリシンリンカー（Glyn：n=2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれ以上）、ヒスチジンタグ（Hisn：n=3、4、5、6、7、8、9、10又はそれ以上）、グリシン及びセリン残基を含むリンカー（n=1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15又はそれ以上）、GSAT、SEG、並びにZ-EGFRリンカーが含まれる。リンカーには、クローニング及び操作を補助する制限酵素部位が含まれ得る。他の適当なリンカーアミノ酸配列は、当業者にとって明らかであろう。（例えば、Argos (1990) J. Mol. Biol. 211(4):943-958；Crasto et al. (2000) Protein Eng. 13:309-312；George et al. (2002) Protein Eng. 15:871-879；Arai et al. (2001) Protein Eng. 14:529-532；及びthe Registry of Standard Biological Parts (partsregistry.org/Protein_domains/Linker)を参照）。
【０１０８】
場合によっては、融合コンストラクトには、タグが含まれ得る。本発明の実施に使用できるタグには、Hisタグ、Strepタグ、TAPタグ、Sタグ、SBPタグ、Argタグ、カルモジュリン結合ペプチドタグ、セルロース結合ドメインタグ、DsbAタグ、c-mycタグ、グルタチオンSトランスフェラーゼタグ、FLAGタグ、HATタグ、マルトース結合タンパク質タグ、NusAタグ、及びチオレドキシンタグが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０９】
B．ペリプラズムアンカーを付したタンパク質変異体及び標的タンパク質をコードするポリヌクレオチド、並びにライブラリーの構築
ペリプラズムアンカーを付したタンパク質変異体及び目的の標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、任意の数々の方法で生成することができ、これらは全て当技術分野でよく知られている。例えば、ポリヌクレオチドは、当技術分野で周知の組み換え技術を使用して作製することができる。当業者は、標準的な方法論及び本明細書の教示を使用して、所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を容易に決定することができる。
【０１１０】
オリゴヌクレオチドプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて考案することができ、ゲノム又はcDNAライブラリーを調べる（probe）ために使用することができる。次いで、所望の配列を有するポリヌクレオチドを、標準的な技術、及び、例えば、完全長配列の所望の位置で遺伝子を切断するために使われる制限酵素を使用して、さらに単離することができる。同様に、目的の配列を有するポリヌクレオチドは、フェノール抽出のような公知の技術を使用して、それを含有する細胞及び組織から直接単離することができ、配列は、所望のタンパク質変異体を生成するようにさらに操作される。DNAの取得及び単離に使用される技術の説明については、例えば、Sambrook et al.（前掲）を参照。
【０１１１】
タンパク質変異体をコードする配列は、合成的に（例えば、公知の配列に基づいて）生成することもできる。ヌクレオチド配列は、所望の特定のアミノ酸配列に対して適切なコドンを用いて設計することができる。完全な配列は、一般に、標準的な方法によって調製され、完全なコード配列に集められた重複のあるオリゴヌクレオチドから組み立てられる。例えば、Edge (1981) Nature 292:756；Nambair et al. (1984) Science 223:1299；Jay et al. (1984) J. Biol. Chem. 259:6311; Stemmer et al. (1995) Gene 164:49-53を参照。
【０１１２】
組み換え技術を使用して簡単に、特許請求の範囲に記載された発明において有用なタンパク質変異体（例えば、抗体）をコードする配列をクローニングし、その後、所望のアミノ酸のためのコドンを生じるために適切な塩基対の置き換えによってin vitroで変異誘発することができる。このような変化には、1個のアミノ酸に変化をもたらす1塩基対ほどの少量のものが含まれてもよく、いくつかの塩基対の変化を包含してもよい。あるいは、ミスマッチの二本鎖の融解温度より低い（below）温度で親ヌクレオチド配列（一般に、RNA配列に対応するcDNA）にハイブリダイズする、ミスマッチプライマーを使用して、変異を起こすことができる。プライマーは、プライマーの長さ及び塩基組成を比較的狭い範囲内に保ち、変異塩基を中央の位置に保つことによって特異的にすることができる。例えば、Innis et al, (1990) PCR Applications: Protocols for Functional Genomics；Zoller and Smith, Methods Enzymol. (1983) 100:468を参照。プライマー伸長は、DNAポリメラーゼを使用して行われ、プライマー伸長鎖の分離によって得られた変異DNAを含む複製物、及び複製産物が選択される。選択は、変異体プライマーをハイブリダイゼーションプローブとして使用することによって達成することができる。この手法は、複数の点変異の生成にも適用可能である。例えば、Dalbie-McFarland et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79:6409を参照。
【０１１３】
ディスプレイライブラリーの多様性は、使用される変異誘発法に依存するであろう。カセット変異誘発は、変異誘発カセットを核酸に挿入することにより、多数の変異を迅速に生成するために使用することができる（例えば、Worrall (1994) Methods Mol. Biol. 30:199-210、Kegler-Ebo et al. (1994) Nucleic Acids Research. 22 (9):1593-1599を参照）。さらに、無作為変異誘発を用いて、ディスプレイライブラリーのための多数の変異体を生成することもできる。無作為変異誘発の適当な方法には、エラープローンPCR、ローリングサークルエラープローンPCR、化学的変異誘発、DNA修復経路を欠損した変異体（mutator）株における変異誘発、トランスポゾン系を使用した挿入変異誘発、又はDNAシャッフリングが含まれるが、これらに限定されない（例えば、McCullum et al. (2010) Methods Mol. Biol. 634:103-109、Fujii et al. (2014) Methods Mol. Biol. 1179:23-29、Muteeb (2010) Methods Mol. Biol. 634:411-419、Bose (2016) Methods Mol. Biol. 1373:111-115、Labrou (2010) Curr Protein Pept Sci. 11(1):91-100、Wilson et al. (2011)  Methods Mol. Biol. 765:359-371を参照）。このような方法は、親核酸分子に対する改変を有する多数の変異体を効率的に生成するために使用され得る。いくつかの実施形態において、DNAライブラリーは、当技術分野で公知の方法を使用して、特有の配列を有する、少なくとも106、好ましくは少なくとも108、及びより好ましくは少なくとも1010の変異体を含むように構築される。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、抗体ライブラリーは、血液提供者から得られたBリンパ球からの天然抗体をクローニングすることによって、酵母ペリプラズムディスプレイのために構築される。抗体の軽鎖及び重鎖、又は可変ドメイン相補性決定領域（例えば、Fab）を含むその断片をコードする核酸は、PCRによって増幅され、ベクター中にクローニングされ得る。ScFv抗体は、1つのオープンリーディングフレーム中で、リンカーを介して軽鎖と重鎖とを連結するベクターにクローニングすることによって作製することができる。血液提供者はどの種でもよい。いくつかの実施形態において、ヒト抗体のライブラリーの作製のために、ヒトの血液提供者が使用される。他の実施形態において、ラクダ科動物抗体のライブラリーの作製のために、ラクダ科動物の血液提供者が使用される。ラクダ科動物抗体は、例えば、ヒトコブラクダ（Dromedary camels）、フタコブラクダ（bactrian camels）、ラマ及びアルパカから得ることができる。このようなラクダ科動物は、軽鎖を欠く特有の型の抗体を産生する。これらの重鎖抗体（HCAb）又はその可変ドメイン断片（例えば、単一ドメイン抗体若しくはナノボディ）を使用して、抗体ライブラリーを構築することができる（例えば、Vincke et al. (2012) Methods Mol. Biol. 911:15-26、Krah et al. (2016) Immunopharmacol. Immunotoxicol. 38(1):21-8を参照；参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０１１５】
タンパク質変異体（例えば、抗体）のコード配列が単離及び/又は合成された後、それらは、酵母での発現のための任意の適当なベクター又はレプリコンにクローニングされ得る。「ベクター」は、細胞の内部に目的の核酸を送達するために使用することができる組成物（composition of matter）である。多数のベクターが当技術分野で公知であり、それには、プラスミド、ウイルス、イオン性又は両親媒性の化合物と会合する（associated with）ポリヌクレオチド、及び線状ポリヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。したがって、「ベクター」という用語は、自律的に複製するプラスミド又はウイルスを含む。発現コンストラクトは、生細胞中で複製することができ、又は合成的に作製することができる。本出願の目的においては、「発現コンストラクト」、「発現ベクター」、及び「ベクター」という用語は、本発明の適用を一般的、例示的な意味で説明するために互換的に使用し、そこに本発明を限定する意図はない。
【０１１６】
特定の実施形態において、目的のポリヌクレオチドをコードする核酸は、プロモーターの転写制御下にある。「プロモーター」は、遺伝子の特異的な転写を開始するために必要とされる、その細胞の合成機構又は導入された合成機構によって認識されるDNA配列を指す。プロモーターという用語は、本明細書では、RNAポリメラーゼI、II、又はIIIのための開始部位の周りにクラスター化した転写制御モジュールの群を指すために使用される。エンハンサーエレメントは、コンストラクトの発現レベルを増加させるためにプロモーターと共に使用されてもよい。特定の実施形態において、発現ベクターは、目的の標的タンパク質又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに「機能的に連結された」プロモーターを含む。本明細書で使用される「機能的に連結された」又は「転写制御下にある」という句は、プロモーターが、RNAポリメラーゼによる転写の開始、及び、目的の標的タンパク質又は融合タンパク質の発現を制御するために、ポリヌクレオチドに対して適正な位置及び方向にあることを意味する。
【０１１７】
典型的には、転写ターミネーター/ポリアデニル化シグナルも発現コンストラクト中に存在するであろう。このような配列の例としては、SV40に由来するもの（Sambrook et al.（前掲）に記載）、並びにウシ成長ホルモンターミネーター配列（例えば、米国特許第5,122,458号を参照）が挙げられるが、これらに限定しない。さらに、5'UTR配列をコード配列に隣接して配置し、その発現を増強することができる。このような配列は、内部リボソーム侵入部位（IRES）を含むUTRを含み得る。
【０１１８】
IRESを含めることにより、1つのベクターからの1つ以上のオープンリーディングフレームの翻訳が可能になる。IRESエレメントは真核生物のリボソーム翻訳開始複合体を引き寄せ、翻訳開始を促進する。例えば、Kaufman et al., Nuc. Acids Res. (1991) 19:4485-4490；Gurtu et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1996) 229:295-298；Rees et al., BioTechniques (1996) 20:102-110；Kobayashi et al., BioTechniques (1996) 21:399-402；及びMosser et al., BioTechniques (1997) 22 150-161を参照。多数のIRES配列が公知であり、多種多様なウイルスに由来する配列が含まれ、例えば、C型肝炎ウイルスIRES、ヒトライノウイルス2型IRES（Dobrikova et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (2003) 100(25):15125-15130）、口蹄疫ウイルスからのIRESエレメント（Ramesh et al., Nucl. Acid Res. (1996) 24:2697-2700）、ジアルジアウイルスIRES（Garlapati et al., J. Biol. Chem. (2004) 279(5):3389-3397）、ポリオリーダー配列、A型肝炎ウイルスリーダー、脳心筋炎ウイルス（EMCV）UTR（Jang et al. J. Virol. (1989) 63:1651-1660）などのピコルナウイルスのリーダー配列などに由来する。様々な非ウイルス性IRES配列もまた、本発明において用いられるであろう。それには、酵母からのIRES配列、並びにヒトアンジオテンシンIIの1型受容体IRES（Martin et al., Mol. Cell Endocrinol. (2003) 212:51-61）、線維芽細胞成長因子IRES（FGF-1 IRES及びFGF-2 IRES、Martineau et al. (2004) Mol. Cell. Biol. 24(17):7622-7635）、血管内皮増殖因子IRES（Baranick et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105(12):4733-4738、Stein et al. (1998) Mol. Cell. Biol. 18(6):3112-3119、Bert et al. (2006) RNA 12(6):1074-1083）、並びにインスリン様成長因子2 IRES（Pedersen et al. (2002) Biochem. J. 363(Pt 1):37-44）が含まれるが、これらに限定されない。これらのエレメントは、簡便に例えばClontech社（Mountain View, CA）、Invivogen社（San Diego, CA）、Addgene社（Cambridge, MA）及びGeneCopoeia社（Rockville, MD）によって販売されているプラスミド中に含まれて市販されている。実験的に検証されたIRES構造のデータベース（IRESite：iresite.org）も参照。IRES配列は、例えば、発現カセットから、提示するためのタンパク質変異体に融合されたペリプラズムアンカータンパク質を含む融合タンパク質と目的の標的タンパク質とを組合せて発現するために、ベクターに含まれ得る。
【０１１９】
あるいは、ウイルスT2Aペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用して、単一のベクターからの複数のタンパク質産物の生成を可能にすることができる。2Aリンカーペプチドはマルチシストロン性コンストラクト中のコード配列の間に挿入される。自己切断性である2Aペプチドによって、マルチシストロン性コンストラクトからの共発現タンパク質を等モルレベルで生成することが可能になる。口蹄疫ウイルス、ウマ鼻炎Aウイルス、トセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルス及びブタテッショウウイルス1に由来する2Aペプチドを含む様々なウイルス由来の2Aペプチドが使用され得るが、これらに限定されない。例えば、Kim et al. (2011) PLoS One 6(4):e18556、Trichas et al. (2008) BMC Biol. 6:40、Provost et al. (2007) Genesis 45(10):625-629、Furler et al. (2001) Gene Ther. 8(11):864-873を参照；その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１２０】
特定の実施形態において、発現コンストラクトは、酵母細胞を形質転換するのに適当なプラスミドを含む。酵母発現プラスミドは、典型的には、酵母特異的複製起点（ORI）及び栄養選択マーカー（例えば、HIS3、URA3、LYS2、LEU2、TRP1、MET15、ura4＋、leu1＋、ade6＋）、抗生物質選択マーカー（例えば、aphA1若しくはble）、蛍光マーカー（例えば、mCherry、緑色蛍光タンパク質）、生物発光マーカー（例えば、ルシフェラーゼ）、又は形質転換された酵母細胞の選択のための他のマーカーを含む。酵母プラスミドは、細菌宿主（例えば、大腸菌）と酵母細胞との間のシャトルを可能にする構成要素をさらに含むことができる。酵母組み込みプラスミド（YIp：ORIを欠き、相同組み換えにより宿主染色体に組み込まれる）；酵母複製プラスミド（YRp：自律複製配列（ARS）を含み、独立して複製できる）；酵母セントロメアプラスミド（YCp：ARSの一部及びセントロメア配列（CEN）の一部を含む低コピーベクター）；並びに酵母エピソームプラスミド（YEp：細胞あたり50以上のコピーを安定的に増幅させることを可能にする2ミクロンサークル（天然酵母プラスミド）からの断片を含む高コピー数プラスミド）を含む多くの異なる型の酵母プラスミドが利用可能である。
【０１２１】
調節配列を含めることも望ましく、これにより宿主細胞の増殖に相関した（relative to）タンパク質配列の発現の調節が可能となる。このような調節配列は、当業者に知られており、例としては、化学的又は物理的刺激（調節化合物の存在を含む）に応答して遺伝子の発現をオン・オフするものが挙げられる。例えば、PRM1又はFUS2プロモーターのようなフェロモン誘導性プロモーターを使用して、転写をフェロモンシグナル伝達経路の活性化に依存させることができる。制御配列及び他の調節配列は、ベクターへの挿入前にコード配列にライゲーションしてもよい。あるいは、コード配列を、すでに制御配列及び適切な制限酵素部位を含む発現ベクター中に直接クローニングしてもよい。
【０１２２】
場合によっては、適切な配向で制御配列に結合することができるように（つまり、適切な読み枠を維持するために）、コード配列を改変することが必要であり得る。変異体又は類似体は、タンパク質をコードする配列の一部の欠失、配列の挿入、及び/若しくは配列内の1つ以上のヌクレオチドの置換によって調製することができる。部位特異的突然変異誘発のようなヌクレオチド配列を改変する技術は、当業者に周知である。例えば、Sambrook et al.（前掲）；DNA Cloning, Vol. I及びII（前掲）；Nucleic Acid Hybridization（前掲）。
【０１２３】
1つの実施形態において、タンパク質変異体をコードする組み換えポリヌクレオチドは、以下を含むペリプラズム標的化発現ベクターにクローニングされる：
（a）シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（b）シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドの後（下流）における、タンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドのインフレーム挿入に適したクローニング部位；
（c）グリコホスファチジルイノシトール（GPI）原形質膜アンカードメインをコードするポリヌクレオチドであって、ベクターが、シグナルペプチド及びGPI原形質膜アンカードメインに融合したタンパク質変異体を含む融合タンパク質を産生可能であるように、配置されている前記ポリヌクレオチド；並びに
（d）前記融合タンパク質をコードする配列に機能的に連結されたプロモーター。
特定の実施形態において、GPI原形質膜アンカードメインは、例えば限定されるものではないが、YPS1、YPS2、YPS3、YPS4、YPS5、YPS6、又はYPS7ヤプシンGPI原形質膜アンカードメインのような、ヤプシンGPI原形質膜アンカードメインである。ペリプラズム標的化発現ベクターは、GPI原形質膜アンカードメインをコードするポリヌクレオチドとクローニング部位との間に配置されたリンカーをコードするポリヌクレオチドをさらに含み得る。このクローニング部位は、1つ以上の制限酵素部位を含み得る。ペリプラズム標的化発現ベクターは、選択可能なマーカーをさらに含み得る。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、親和性タグ、エピトープ、標識などをタンパク質変異体に付加し、酵母細胞における全提示レベルの測定を可能にする。本明細書で使用される場合、「親和性タグ」という用語は、第2の生体分子の精製若しくは検出を提供するために、又は第2の生体分子が基板と結合するための部位を提供するために、第2の生体分子に結合することができるポリペプチド断片などの生体分子を指す。親和性タグの例としては、ポリヒスチジントラクト（poly-histidine tract）、プロテインA（Nilsson et al. (1985) EMBO J. 4:1075；Nilsson et al. (1991) Methods Enzymol. 198:3）、グルタチオンSトランスフェラーゼ（Smith and Johnson (1988) Gene 67:31）、Glu-Glu親和性タグ（Grussenmeyer et al., (1985) PNAS USA 82:7952）、P物質、FLAGペプチド（Hopp et al. (1988) Biotechnology 6:1204）、ストレプトアビジン結合ペプチド、又は他の抗原性エピトープ若しくは結合ドメインなど（Ford et al. (1991) Protein Expression and Purification 2:950）（これらは全て、参照によって本明細書に組み込まれる）が含まれる。本明細書で使用される場合、「標識」は、その生体分子若しくはその生体分子のある形態（複合体など）を検出可能又は測定可能にするために、生体分子に結合させることができる分子又は原子である。標識の例としては、蛍光剤、生物発光タンパク質、光活性剤、放射性同位体、常磁性イオン、キレート剤などが挙げられる。
【０１２５】
発現ベクターを使用して、適切な酵母宿主細胞を形質転換する。多くの酵母宿主が当技術分野で知られており、ここでの発現コンストラクトと共に使用されることになるであろうものには、限定するものではないが、以下が含まれる：サッカロマイセス・アルボリコルス（Saccharomyces arboricolus）、サッカロマイセス・バヤヌス（Saccharomyces bayanus）、サッカロマイセス・ブラウディ（Saccharomyces boulardii）、サッカロマイセス・ブルデリ（Saccharomyces bulderi）、サッカロマイセス・カリオカヌス（Saccharomyces cariocanus）、サッカロマイセス・カリオカス（Saccharomyces cariocus）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイセス・シェバリエリ（Saccharomyces chevalieri）、サッカロマイセス・ダイレネンシス（Saccharomyces dairenensis）、サッカロマイセス・エリプソイデウス（Saccharomyces ellipsoideus）、サッカロマイセス・ユーバヤヌス（Saccharomyces eubayanus）、サッカロマイセス・イグジグース（Saccharomyces exiguus）、サッカロマイセス・フロレンチヌス（Saccharomyces florentinus）、サッカロマイセス・フラジリス（Saccharomyces fragilis）、サッカロマイセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）、サッカロマイセス・クドリアベゼビイ（Saccharomyces kudriavzevii）、サッカロマイセス・マルチニエ（Saccharomyces martiniae）、サッカロマイセス・ミカタエ（Saccharomyces mikatae）、サッカロマイセス・モナセンシス（Saccharomyces monacensis）、サッカロマイセス・ノルベンシス（Saccharomyces norbensis）、サッカロマイセス・パラドキサス（Saccharomyces paradoxus）、サッカロマイセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）、サッカロマイセス・スペンセロルム（Saccharomyces spencerorum）、サッカロマイセス・トゥリセンシス（Saccharomyces turicensis）、サッカロマイセス・ウニスポルス（Saccharomyces unisporus）、サッカロマイセス・ウバルム（Saccharomyces uvarum）、サッカロマイセス・ゾナトゥス（Saccharomyces zonatus）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・アスカラフィダルム（Candida ascalaphidarum）、カンジダ・アンフィクシアエ（Candida amphixiae）、カンジダ・アンタルクティカ（Candida antarctica）、カンジダ・アルゲンティア（Candida argentea）、カンジダ・アトランティカ（Candida atlantica）、カンジダ・アトモスファエリカ（Candida atmosphaerica）、カンジダ・アウリス（Candida auris）、カンジダ・ブラタエ（Candida blattae）、カンジダ・ブロメリアセアルム（Candida bromeliacearum）、カンジダ・カルポフィラ（Candida carpophila）、カンジダ・カルバジャリス（Candida carvajalis）、カンジダ・ケラムビキダルム（Candida cerambycidarum）、カンジダ・チャウリオデス（Candida chauliodes）、カンジダ・コリダリス（Candida corydali）、カンジダ・ドッセイ（Candida dosseyi）、カンジダ・ドゥブリニエンシス（Candida dubliniensis）、カンジダ・エルガテンシス（Candida ergatensis）、カンジダ・フルクタス（Candida fructus）、カンジダ・グラブラタ（Candida glabrata）、カンジダ・フェルメンタティ（Candida fermentati）、カンジダ・ギリエルモンディ（Candida guilliermondii）、カンジダ・ハエムロニイ（Candida haemulonii）、カンジダ・フミリス（Candida humilis）、カンジダ・インセクタメンス（Candida insectamens）、カンジダ・インセクトラム（Candida insectorum）、カンジダ・インターメディア（Candida intermedia）、カンジダ・イェフレシィ（Candida jeffresii）、カンジダ・ケフィール（Candida kefyr）、カンジダ・ケロセニエ（Candida keroseneae）、カンジダ・クルーセイ（Candida krusei）、カンジダ・ルイシタニアエ（Candida lusitaniae）、カンジダ・リクソソフィア（Candida lyxosophila）、カンジダ・マルトーサ（Candida maltosa）、カンジダ・マリーナ（Candida marina）、カンジダ・メンブラニファシエンス（Candida membranifaciens）、カンジダ・モギ（Candida mogii）、カンジダ・オレオフィラ（Candida oleophila）、カンジダ・オレゴネンシス（Candida oregonensis）、カンジダ・パラプシローシス（Candida parapsilosis）、カンジダ・クエルシトルーサ（Candida quercitrusa）、カンジダ・ルゴーサ（Candida rugosa）、カンジダ・サケ（Candida sake）、カンジダ・シャハテア（Candida shehatea）、カンジダ・テムノキラエ（Candida temnochilae）、カンジダ・テヌイス（Candida tenuis）、カンジダ・テアエ（Candida theae）、カンジダ・トレランス（Candida tolerans）、カンジダ・トロピカーリス（Candida tropicalis）、カンジダ・ツチヤエ（Candida tsuchiyae）、カンジダ・シノラボランティウム（Candida sinolaborantium）、カンジダ・ソエ（Candida sojae）、カンジダ・サブハシ（Candida subhashii）、カンジダ・ビスワナチ（Candida viswanathii）、カンジダ・ユチリス（Candida utilis）、カンジダ・ウバツベンシス（Candida ubatubensis）、カンジダ・ゼンプリニナ（Candida zemplinina）、ピキア・ファリノサ（Pichia farinosa）、ピキア・アノマラ（Pichia anomala）、ピキア・ヒーディ（Pichia heedii）、ピキア・ギリエルモンディ（Pichia guilliermondii）、ピキア・クルイベリ（Pichia kluyveri）、ピキア・メンブラニファシエンス（Pichia membranifaciens）、ピキア・ノルヴェゲンシス（Pichia norvegensis）、ピキア・オーメリ（Pichia ohmeri）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、ピキア・サブペリキュローサ（Pichia subpelliculosa）、クルイベロマイセス・エスツアリー（Kluyveromyces aestuarii）、クルイベロマイセス・アフリカヌス（Kluyveromyces africanus）、クルイベロマイセス・バシリスポラス（Kluyveromyces bacillisporus）、クルイベロマイセス・ブラタエ（Kluyveromyces blattae）、クルイベロマイセス・ドブザンスキー（Kluyveromyces dobzhanskii）、クルイベロマイセス・ヒュベイエンシス（Kluyveromyces hubeiensis）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、クルイベロマイセス・ロデリ（Kluyveromyces lodderae）、クルイベロマイセス・マルシアヌス（Kluyveromyces marxianus）、クルイベロマイセス・ノンファーメンタス（Kluyveromyces nonfermentans）、クルイベロマイセス・ピセア（Kluyveromyces piceae）、クルイベロマイセス・シネンシス（Kluyveromyces sinensis）、クルイベロマイセス・サーモトレランス（Kluyveromyces thermotolerans）、クルイベロマイセス・ワルティ（Kluyveromyces waltii）、クルイベロマイセス・ウィッカーハミー（Kluyveromyces wickerhamii）、クルイベロマイセス・ヤロウィ（Kluyveromyces yarrowii）、ヤロウイア・ブブラ（Yarrowia bubula）、ヤロウイア・デフォルマンス（Yarrowia deformans）、ヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、ヤロウイア・ポルシナ（Yarrowia porcina）、及びヤロウイア・ヤクシメンシス（Yarrowia yakushimensis）。いくつかの実施形態において、酵母はサッカロマイセス（Saccharomyces）の種である。いくつかの実施形態において、酵母はサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である。
【０１２６】
センス又はアンチセンス遺伝子コンストラクトの発現を実行するためには、発現コンストラクトを酵母細胞内に送達しなければならない。この送達は、以下のような、当技術分野でよく知られた、酵母細胞を形質転換する実験手法を使用してin vitroで達成することができる：例えば、スフェロプラスト形質転換、アルカリイオン処理（例えば、Cs＋又はLi＋）、エレクトロポレーション、生物界間接合、エレクトロポレーション、並びに遺伝子銃及びガラスビーズ法（例えば、Kawai et al. (2010) Bioeng. Bugs. 1(6):395-403、Gietz et al. (1995) Yeast 11(4):355-360、Gietz et al. (2007) Nat. Protoc. 2(1):38-41、Hinnen et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929-1933、Avery et al. (1995) Mol. Med. 1(4):344-365、Ito et al. (1983) J. Bacteriol. 153:163-168、Johnston et al. (1988) Science 240:1538-1541、Dohmen et al. (1991) Yeast 7(7):691-246、Hayama et al. (2002) J. Biosci. Bioeng. 94(2):166-171、及びWang et al. (2001) Crit. Rev. Biotechnol. 21(3):177-218を参照；参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０１２７】
発現コンストラクトが細胞内に送達された後、目的の遺伝子をコードする核酸は、異なる場所に配置され、発現し得る。特定の実施形態において、前記遺伝子をコードする核酸は、相同組み換えを介して細胞のゲノムに安定的に組み込まれ得る。この組み込みは、対応する位置及び方向で（遺伝子置換）、遺伝子内で（遺伝子破壊）、又はランダムに非特異的な位置（遺伝子増強）で行われ得る。その遺伝子破壊が酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーのスクリーニング又は細胞増殖を妨害しない限り、標的遺伝子座における、遺伝子を破壊するコンストラクトの組み込みは許容され得る（例えば、スクリーニングに使用する場合、フェロモン応答の破壊を回避する）。さらに別の実施形態において、前記核酸は、別個のエピソームのDNA断片として細胞内で安定的に維持され得る。このような核酸断片又は「エピソーム」は、宿主細胞周期と無関係な又は同調した複製及び維持を可能にするのに充分な配列をコードする。発現コンストラクトがどのようにして細胞に送達され、細胞内のどこに核酸が残るかは、使われる発現コンストラクトの種類に依存する。
【０１２８】
特定の実施形態において、発現コンストラクトは、単純に裸の組み換えDNA又はプラスミドからなることができる。コンストラクトの移入は、細胞膜を物理的又は化学的に透過させる上述の方法のいずれかによって行うことができる。
【０１２９】
さらに別の実施形態において、裸のDNA発現コンストラクトを、微粒子銃によって細胞内に移入することができる。この方法は、DNAコーティングされた微小射出物（microprojectiles）を、酵母細胞の壁及び膜に穴をあけ、それらを殺さずに細胞に入ることができるような高速にまで加速する能力に依存する（Armaleo et al. (1990) Curr. Genet. 17(2):97-103）。小粒子を加速するための幾つかの装置が開発されている。そのような装置の1つでは、高圧放電に依存して電流を発生させ、それが今度は原動力を提供する（Yang et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:9568-9572）。微小射出物は、タングステン又は金のビーズのような生物学的に不活性な物質からなり得る。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、タンパク質変異体をコードする線状DNA分子の収集物（collection）が生成される。形質転換に先立って線状DNA分子をベクターにクローニングするのではなく、酵母細胞を、空のベクターとタンパク質変異体をコードする線状DNA分子の収集物（後に、例えば酵母宿主細胞における相同組み換えにより、in vivoでベクターに組み込まれる）で、一緒に形質転換する。
【０１３１】
C．キット
キットは、本明細書に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー、又は酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーを調製するための薬剤（ペリプラズムアンカータンパク質に連結されたタンパク質変異体の産生のためのタンパク質変異体をコードする核酸をクローニングするための適当なベクターなど）、酵母細胞、トランスフェクション剤、酵母細胞を増殖させるのに適当な培地、細胞のポジティブ及びネガティブセレクションのための薬剤、並びに必要な他の試薬を含み得る。本明細書に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーの生成及び/又はスクリーニングのための説明書（例えば、書面、CD-ROM、DVD、ブルーレイ、フラッシュドライブ、デジタルダウンロードなど）は、通常、前記キットに含まれる。
【０１３２】
キットは、本明細書に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー、又は酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーを調製するための薬剤（ペリプラズムアンカータンパク質との融合物の産生のためのタンパク質変異体をコードする核酸をクローニングするための適当なベクターなど）、酵母細胞、トランスフェクション剤、酵母細胞を増殖させるのに適当な培地、細胞のポジティブ及びネガティブセレクションのための薬剤、並びに必要な他の試薬を含み得る。本明細書に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーの生成及び/又はスクリーニングのための説明書（例えば、書面、CD-ROM、DVD、ブルーレイ、フラッシュドライブ、デジタルダウンロードなど）は、通常、前記キットに含まれる。
【０１３３】
1つの実施形態において、このキットは、ペリプラズム標的化発現ベクターを含み、前記ベクターは以下を含む：
（a）シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（b）シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドの後（下流）における、タンパク質変異体（例えば、抗体）をコードするポリヌクレオチドのインフレーム挿入に適したクローニング部位；
（c）グリコホスファチジルイノシトール（GPI）原形質膜アンカードメインをコードするポリヌクレオチドであって、ベクターが、シグナルペプチド及びGPI原形質膜アンカードメインに融合したタンパク質変異体を含む融合タンパク質の生成が可能であるように、配置されている前記ポリヌクレオチド；並びに
（d）前記融合タンパク質をコードする配列に機能的に連結されたプロモーター。
別の実施形態において、前記シグナルペプチドは、プレプロアルファ因子シグナル配列を含む。特定の実施形態において、前記GPI原形質膜アンカードメインは、例えば限定されるものではないが、YPS1、YPS2、YPS3、YPS4、YPS5、YPS6、又はYPS7ヤプシンGPI原形質膜アンカードメインのような、ヤプシンGPI原形質膜アンカードメインである。別の実施形態において、前記ペリプラズム標的化発現ベクターは、リンカーをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ここで、リンカーをコードする前記ポリヌクレオチドは、クローニング部位とGPI原形質膜アンカードメインをコードするポリヌクレオチドとの間に配置される。リンカーはさらにタグを含むことができる。別の実施形態において、ペリプラズム標的化発現ベクターは、選択可能なマーカーをさらに含む。別の実施形態において、クローニング部位は、1つ以上の制限酵素部位を含む。
【０１３４】
別の実施形態において、キットは、複数の酵母宿主細胞を含む酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーを含み、各酵母宿主細胞は、以下を含む：（a）酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示するためのタンパク質変異体（例えば、抗体）と融合したペリプラズムアンカータンパク質を含む融合タンパク質であって、複数の酵母宿主細胞が複数のタンパク質変異体を提示するように、各酵母宿主細胞において提示されるタンパク質変異体が異なる、前記融合タンパク質；（b）目的の標的Gタンパク質共役受容体（GPCR）であって、目的の標的GPCRが酵母宿主細胞原形質膜に位置し、酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示されたタンパク質変異体にアクセス可能である、前記目的の標的GPCR；及び（c）前記GPCRによって活性化することが可能な、操作されたGαサブユニットであって、活性化した操作されたGαサブユニットは、酵母宿主細胞において検出可能なフェロモン応答を活性化することが可能である、前記Gαサブユニット。特定の実施形態において、前記操作されたGαサブユニットは、酵母GαサブユニットのN末端ドメイン及び外来性GαサブユニットのC末端ドメインを含むキメラGタンパク質α（Gα）サブユニットである。例えば、前記酵母Gαサブユニットは、Gαi、Gαq、Gαs、又はGαoファミリーGタンパク質に属し得る。前記キメラGαサブユニットにおいて、哺乳動物GPCRによって前記キメラGαサブユニットを活性化することが可能であるように、前記酵母GαサブユニットのC末端残基の少なくとも5個が、哺乳動物Gαサブユニットの対応するC末端残基と置き換えられていてもよい。いくつかの実施形態において、前記哺乳動物GPCRによって前記キメラGαサブユニットを活性化することが可能であるように、前記酵母GαサブユニットのC末端残基の少なくとも20個が、哺乳動物Gαサブユニットの対応するC末端残基と置き換えられる。別の実施形態において、前記キメラGαサブユニットは、前記酵母GαサブユニットのN末端残基の少なくとも41個を含む。特定の実施形態において、哺乳動物GPCRはマウスGPCRである。特定の実施形態において、哺乳動物GPCRは、CXCR4、CXCR5、SSTR2、MOR、AVPR2、FPR2/ALX、ADORA2A、CHRM3、CGRP2、CCR2、CCR4、CCR5、CHRM4、PAC1、b2AR、CXCR2、CYSLTR2、KSHV vGPCR、PKR1、PKR2、CB1、CB2、A3AR、及びAT1Rからなる群より選択されるヒトGPCRである。
【０１３５】
別の実施形態において、キットは、酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーを含み、前記ライブラリーは複数の酵母宿主細胞を含み、各酵母宿主細胞は、提示するためのタンパク質変異体に融合されたペリプラズムアンカータンパク質を含む融合タンパク質を含み、ここで、ペリプラズムアンカータンパク質は、前記融合タンパク質がペリプラズムに保持されるのに十分に大きく、複数の酵母宿主細胞が複数のタンパク質変異体を提示するように、各酵母宿主細胞において提示されるタンパク質変異体が異なる。
【０１３６】
別の実施形態において、キットは、酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーを含み、前記ライブラリーは複数の酵母宿主細胞を含み、各酵母宿主細胞が、目的の標的膜タンパク質に連結された提示するためのタンパク質変異体を含む融合タンパク質を含み、ここで、複数の酵母宿主細胞が複数のタンパク質変異体を目的の標的膜タンパク質と共に提示するように、各酵母宿主細胞において提示されるタンパク質変異体が異なる。
【０１３７】
D．用途
本発明は、結合、触媒、集合、輸送などを含む、有用な又は所望の機能を果たすタンパク質のスクリーニングに広く適用することができる。例えば、酵母ペリプラズムディスプレイは、受容体のアゴニスト及びアンタゴニストの同定、治療用のタンパク質及び抗体の操作、タンパク質−タンパク質相互作用の同定、並びにエピトープマッピングに使用することができる。
【０１３８】
酵母ペリプラズムディスプレイは、受容体、イオンチャネル、又はトランスポーターのような膜タンパク質である標的タンパク質に結合し、及び/若しくはその機能を調節する候補について、タンパク質ライブラリーをスクリーニングするのに特に適している。タンパク質の膜への局在化によって、ペリプラズム空間中に提示されたタンパク質変異体にアクセス可能になる（例えば、提示されたタンパク質変異体が目的の標的タンパク質に結合するのに十分近接している）。
【０１３９】
特定の実施形態において、前記目的の標的タンパク質の活性化は、酵母宿主細胞の増殖を増加させる。この場合、酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーは、酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーの酵母宿主細胞の少なくともサブセットを培地中で培養することによって、目的の標的タンパク質のアゴニストについてスクリーニングすることができ、ここで、培地中での酵母宿主細胞の増殖は、酵母宿主細胞で提示された前記タンパク質変異体が目的の標的タンパク質のアゴニストであることを示す。
【０１４０】
他の実施形態において、前記目的の標的タンパク質の活性化は、酵母宿主細胞の増殖を減少させる。この場合、酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーは、酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーの酵母宿主細胞の少なくともサブセットを培地中で培養することによって、前記目的の標的タンパク質のアンタゴニストについてスクリーニングすることができ、ここで、培地中での酵母宿主細胞の増殖は、酵母宿主細胞で提示された前記タンパク質変異体が目的の標的タンパク質のアンタゴニストであることを示す。
【０１４１】
特定の実施形態において、各酵母宿主細胞は、前記目的の標的タンパク質に提示されたタンパク質変異体が結合した際の目的の標的タンパク質の活性の増加又は減少の検出を可能にするために、目的の標的タンパク質が活性化されたときに活性化される誘導性プロモーターに機能的に連結されたレポーター遺伝子を含むレポーターシステムをさらに含む。例えば、前記レポーター遺伝子は、栄養マーカー（例えば、HIS3、HIS7、ARG6、LEU2、URA3、及びTRP1）、抗生物質耐性マーカー（例えば、ジェネティシン（例えば、aphA1）、ゼオシン（例えば、ble）、ハイグロマイシンB、ノーセオトリシン、若しくはビアラホスなどの抗生物質に対する耐性を付与する）、蛍光マーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、シアン色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、及びオレンジ色蛍光タンパク質）、生物発光マーカー（例えば、ルシフェラーゼ若しくはイクオリン（aequorin））、又は対抗選択可能なマーカー（例えば、CAN1、URA3、MET15、TRP1、及びTK）であり得る。
【０１４２】
例えば、ポジティブセレクション（つまり、レポーター遺伝子の発現の活性化についての選択）を使用して、目的の標的膜タンパク質に提示されたタンパク質変異体が結合した際の目的の標的膜タンパク質の活性の増加を検出することができる。栄養マーカーの発現は、例えば、栄養欠乏選択培地での酵母宿主細胞の増殖によって検出することができる。抗生物質耐性マーカーの発現は、例えば、抗生物質を含む選択培地での酵母宿主細胞の増殖によって検出することができる。蛍光マーカーの発現は、例えば、酵母宿主細胞が発する蛍光によって検出することができる。生物発光マーカーの発現は、例えば、酵母宿主細胞が発する生物発光によって検出することができる。
【０１４３】
あるいは、対抗選択（つまり、レポーター遺伝子の発現の喪失についての、増殖に基づく選択）を使用して、目的の標的膜タンパク質に提示されたタンパク質変異体が結合した際の目的の標的膜タンパク質の活性の減少を検出することができる。対抗選択可能なマーカーは、アポトーシスの誘導によって、毒性のない薬物を毒性のある化合物に変換することによって、又は、毒性のある分子を細胞内に輸送することによって、細胞を死滅させることができる。対抗選択は、対抗選択可能なマーカーを発現する細胞を選択的に死滅させる薬剤を含む培地中で、酵母宿主細胞を培養することによって行うことができる。例示的な対抗選択可能なマーカーとしては、CAN1（カナバニンを用いた対抗選択）、URA3（5−フルオロオロチン酸（5-FOA）を用いた対抗選択）、MET15（メチル水銀（methylmercury）を用いた対抗選択）、TRP1（5−フルオロアントラニル酸（5-FAA）を用いた対抗選択）、ヒトヘルペスウイルスチミジンキナーゼTK（フロクスウリジン（floxuridine：FUDR）を用いた対抗選択）が挙げられる。
【０１４４】
特に、酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーは、GPCRに結合し、その機能を調節する抗体についてのスクリーニングに使用され得る。いくつかの実施形態において、酵母宿主細胞中のGPCRは、哺乳動物GPCR（例えば、ヒトGPCR）と置き換えられる。いくつかの実施形態において、酵母宿主細胞は、哺乳動物GPCR（例えば、ヒトGPCR）及び内在性酵母GPCRを発現する。いくつかの実施形態において、アンタゴニスト及びアゴニストは、提示された抗体の結合に対するGPCRの応答と酵母フェロモン分泌レベルとを共役させるレポーターシステムを使用して同定される（実施例を参照）。この目的のために、酵母宿主細胞は、GPCRによって活性化することが可能な、操作されたGαサブユニットを発現するように遺伝的に改変することができ、ここで、活性化された操作されたGαサブユニットは、酵母宿主細胞において検出可能なフェロモン応答を活性化することが可能である。特定の実施形態において、前記操作されたGαサブユニットは、酵母GαサブユニットのN末端ドメイン及び外来性GαサブユニットのC末端ドメインを含むキメラGタンパク質α（Gα）サブユニットである。例えば、前記酵母Gαサブユニットは、Gαi、Gαq、Gαs、又はGαoファミリーGタンパク質に属し得る。前記キメラGαサブユニットにおいて、哺乳動物GPCRによってキメラGαサブユニットを活性化することが可能であるように、酵母GαサブユニットのC末端残基の少なくとも5個が、哺乳動物Gαサブユニットの対応するC末端残基と置き換えられていてもよい。いくつかの実施形態において、哺乳動物GPCRによってキメラGαサブユニットを活性化することが可能であるように、酵母GαサブユニットのC末端残基の少なくとも20個が、哺乳動物Gαサブユニットの対応するC末端残基と置き換えられる。別の実施形態において、前記キメラGαサブユニットは、酵母GαサブユニットのN末端残基の少なくとも41個を含む。例示的な哺乳動物Gαサブユニットとしては、Gアルファ−S、Gアルファ−I、Gアルファ−O、Gアルファ−T、Gアルファ−Z、Gアルファ−Q、Gアルファ−11、Gアルファ−12、Gアルファ−13、及びトランスデューシンが含まれる。
【０１４５】
特に、GPCRのアンタゴニスト及びアゴニストについてのスクリーニングにおいて、Δfar1、Δsst2、Δste14、Δste3又はΔmat酵母株が有用である。Δmat株は、例えば、欠失し、若しくは不活化されたMATα座、又は欠失し、若しくは不活化されたMATa座を含み得る。酵母宿主細胞は、野生型CLN3タンパク質と比較して酵母宿主細胞中のCLN3の存在量を増加させるC末端切断を含む改変CLN3タンパク質をさらに含み得る。例えば、前記改変CLN3タンパク質は、野生型CLN3タンパク質の少なくともN末端アミノ酸1〜387若しくは1〜408を保持し、又は、これらの範囲内のいずれかの数のN末端アミノ酸を保持し得る；例えば、1〜388、1〜389、1〜390、1〜391、1〜392、1〜393、1〜394、1〜395、1〜396、1〜397、1〜398、1〜399、1〜400、1〜401、1〜402、1〜403、1〜404、1〜405、1〜406、1〜407、若しくは1〜408。ここで、前記C末端切断は、野生型CLN3タンパク質の残った残基の全て、又はいくつかの欠失を含む。ペリプラズムディスプレイライブラリーの調製に使用される酵母宿主細胞は、一倍体又は二倍体であり得る。アンタゴニスト及びアゴニストの選択に使用するために設計された例示的な酵母株は、それぞれ実施例２及び５に記載する。
【０１４６】
特定の実施形態において、酵母宿主細胞はFAR1株であり、酵母宿主細胞においてGPCRに結合して抑制するアンタゴニストとして作用する抗体によるフェロモン応答の抑制が、酵母宿主細胞の増殖及び細胞周期停止の消滅（cessation）をもたらす。他の実施形態において、酵母宿主細胞は、レポーター遺伝子に機能的に連結されたフェロモン誘導性PRM1プロモーターを含むΔfar1株であり、酵母宿主細胞においてGPCRに結合して活性化するアゴニストとして作用する抗体によるフェロモン応答の活性化が、レポーター遺伝子の発現増加をもたらす。
【０１４７】
任意の種由来の、任意の型のGPCRが、本明細書に記載のペリプラズムディスプレイを使用してスクリーニングされ得る。いくつかの実施形態において、目的の標的GPCRは、哺乳動物GPCR（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類、実験動物又は家畜に由来）である。例えば、哺乳動物GPCRは、ヒトGPCR（例えば、CXCR4、CXCR5、SSTR2、MOR、AVPR2、FPR2/ALX、ADORA2A、CHRM3、CGRP2、CCR2、CCR4、CCR5、CHRM4、PAC1、b2AR、CXCR2、CYSLTR2、KSHV vGPCR、PKR1、PKR2、CB1、CB2、A3AR、及びAT1R）であってもよい。目的の標的GPCRは、恒常的にリガンド非依存的な活性を有してもよい。あるいは、アゴニスト又はアンタゴニストについてのスクリーニング中に目的の標的GPCRを活性化するためにリガンドを添加してもよい。いくつかの実施形態において、酵母宿主細胞は、目的の標的GPCR（例えば、目的のヒトGPCR）、及び内在性酵母GPCRを発現する。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、前記タンパク質変異体は抗体である。任意の種類の抗体が、本明細書に記載の方法により、酵母ペリプラズムディスプレイを使用してスクリーニングでき、前記抗体には以下が含まれる：モノクローナル抗体、ハイブリッド抗体、変化させた抗体、キメラ抗体、及びヒト化抗体、並びに；ハイブリッド（キメラ）抗体分子（例えば、Winter et al. (1991) Nature 349:293-299；及び米国特許第4,816,567号を参照）、F(ab')2及びF(ab)断片、Fv分子（非共有結合性ヘテロダイマー、例えば、Inbar et al. (1972) Proc Natl Acad Sci USA 69:2659-2662；及びEhrlich et al. (1980) Biochem 19:4091-4096を参照）、一本鎖Fv分子（scFv）（例えば、Huston et al. (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85:5879-5883を参照）、ナノボディ又は単一ドメイン抗体（sdAb）（例えば、Wang et al. (2016) Int J Nanomedicine 11:3287-3303、Vincke et al. (2012) Methods Mol Biol 911:15-26を参照）、二量体及び三量体抗体断片コンストラクト、ミニボディ（例えば、Pack et al. (1992) Biochem 31:1579-1584；Cumber et al. (1992) J Immunology 149B:120-126を参照）、ヒト化抗体分子（例えば、Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327；Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534-1536；及び英国特許公開第GB 2,276,169号1994年9月21日公開）、並びにそのような分子から得られた任意の機能的な断片であって、ここで、そのような断片が親抗体分子の特異的結合特性を保持しているもの。
【０１４９】
他の実施形態において、前記タンパク質変異体はアプタマーである。アプタマーはコンビナトリアルライブラリーから単離され、指向性変異又は変異誘発の反復、及び選択によって改良することができる。アプタマーの生成方法についての記載は、例えば、Aptamers: Tools for Nanotherapy and Molecular Imaging (R.N. Veedu ed., Pan Stanford, 2016)、Nucleic Acid and Peptide Aptamers: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, G. Mayer ed., Humana Press, 2009)、Aptamers Selected by Cell-SELEX for Theranostics (W. Tan, X. Fang eds., Springer, 2015)、Cox et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. 9(10):2525-2531、Cox et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30(20): e108、Kenan et al. (1999) Methods Mol. Biol. 118:217-231、Platella et al. (2016) Biochim. Biophys. Acta Nov 16 pii: S0304-4165(16)30447-0、及びLyu et al. (2016) Theranostics 6(9):1440-1452を参照；参照によって、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０１５０】
さらに他の実施形態において、前記タンパク質変異体は抗体模倣体である。任意の型の抗体模倣体が使用でき、限定するものではないが、以下が含まれる：アフィボディ分子（Nygren (2008) FEBS J. 275 (11):2668-2676）、アフィリン（affilin）（Ebersbach et al. (2007) J. Mol. Biol. 372 (1):172-185）、アフィマー（affimer）（Johnson et al. (2012) Anal. Chem. 84 (15):6553-6560）、アフィチン（affitin）（Krehenbrink et al. (2008) J. Mol. Biol. 383 (5):1058-1068）、アルファボディ（alphabody）（Desmet et al. (2014) Nature Communications 5:5237）、アンチカリン（Skerra (2008) FEBS J. 275 (11):2677-2683）、アビマー（avimer）（Silverman et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23 (12):1556-1561）、設計アンキリン反復タンパク質（darpin）（Stumpp et al. (2008) Drug Discov. Today 13 (15-16):695-701）、フィノマー（fynomer）（Grabulovski et al. (2007) J. Biol. Chem. 282 (5):3196-3204）、及びモノボディ（Koide et al. (2007) Methods Mol. Biol. 352:95-109）。
【０１５１】
さらに、酵母ペリプラズムディスプレイによるスクリーニング及び複数回の変異誘発を用いた指向性進化を行い、目的の標的タンパク質に高い親和性で結合するタンパク質変異体（例えば、抗体）のライブラリーを濃縮することができる。指向性進化は、所望の機能活性を有するが結合親和性が弱い候補の結合特性を改良するために特に有用であり得る。
【０１５２】
III．例示的な実施形態
本明細書で提供される実施形態は以下を含む：
（１）複数の酵母宿主細胞を含む酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーであって、各酵母宿主細胞が以下：
（a）酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示するための抗体であって、複数の酵母宿主細胞が複数の抗体を提示するように、各酵母宿主細胞において提示される抗体が異なる、前記抗体；
（b）ペリプラズムアンカータンパク質であって、前記抗体がペリプラズム空間に提示されるようにペリプラズムアンカータンパク質が抗体に連結している、前記ペリプラズムアンカータンパク質；及び
（c）目的の標的膜タンパク質であって、目的の膜タンパク質が酵母宿主細胞原形質膜に位置し、酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示された抗体にアクセス可能である、前記目的の標的膜タンパク質
を含む、酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（２）前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、複合体中で分子結合相互作用によって互いに非共有結合で連結し、又は複合体中で共有非ペプチド結合によって連結している、実施形態１に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（３）前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、融合タンパク質中で互いに共有結合している、実施形態１に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（４）前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体がペリプラズムに提示されるように、酵母宿主細胞のペリプラズム、原形質膜又は細胞壁へのペリプラズムアンカータンパク質の輸送を指示するシグナル配列をさらに含む、実施形態１〜３のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（５）前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体をペリプラズムに配置する（project into）膜にまたがる膜貫通ドメイン又は膜関連タンパク質ドメインを含む、実施形態１〜３のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（６）前記膜関連タンパク質ドメインがグリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）原形質膜アンカードメインである、実施形態５に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（７）前記GPI原形質膜アンカードメインが、ヤプシンGPI原形質膜アンカードメインである、実施形態６に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（８）前記ヤプシンGPI原形質膜アンカードメインが、YPS1、YPS2、YPS3、YPS4、YPS5、YPS6、又はYPS7ヤプシンGPI原形質膜アンカードメインである、実施形態７に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（９）前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体をペリプラズムに配置するように細胞壁の内面に結合するタンパク質である、実施形態２に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１０）前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記融合タンパク質をペリプラズムに配置する、細胞壁の内面に結合するタンパク質である、実施形態３に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１１）前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記ペリプラズムアンカータンパク質及び連結された抗体がペリプラズムに保持されるように十分に大きい、実施形態２に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１２）前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記融合タンパク質がペリプラズムに保持されるのに十分な大きさである、実施形態３に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１３）複数の酵母宿主細胞を含む酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーであって、各酵母宿主細胞が以下：
（a）酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示するための抗体であって、複数の酵母宿主細胞が複数の抗体を提示するように、各酵母宿主細胞において提示される前記抗体が異なり、抗体が酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示されるように、酵母宿主細胞のペリプラズム、原形質膜又は細胞壁への抗体の輸送を指示するシグナル配列に連結されている、前記抗体；及び
（b）目的の標的膜タンパク質であって、目的の膜タンパク質が酵母宿主細胞原形質膜に位置し、酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示された抗体にアクセス可能である、前記目的の標的膜タンパク質
を含む、酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１４）前記目的の標的膜タンパク質に前記抗体が結合した際の目的の標的膜タンパク質の活性の増加又は減少の検出を可能にするために、目的の標的膜タンパク質が活性化されたときに活性化される誘導性プロモーターに機能的に連結されたレポーター遺伝子を含むレポーターシステムをさらに含む、実施形態１〜１３のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１５）前記レポーター遺伝子が、栄養マーカー、抗生物質耐性マーカー、蛍光マーカー、生物発光マーカー、又は対抗選択可能なマーカーである、実施形態１４に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１６）前記栄養マーカーが、HIS3、HIS7、ARG6、LEU2、URA3、及びTRP1からなる群より選択される、実施形態１５に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１７）前記抗生物質耐性マーカーが、ジェネティシン、ゼオシン、ハイグロマイシンB、ノーセオトリシン、及びビアラホスからなる群より選択される抗生物質に対する耐性を付与する、実施形態１５に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１８）前記蛍光マーカーが、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、シアン色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、及びオレンジ色蛍光タンパク質からなる群より選択される、実施形態１５に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１９）前記生物発光マーカーがルシフェラーゼ又はイクオリン（aequorin）である、実施形態１５に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（２０）前記対抗選択可能なマーカーが、CAN1、URA3、MET15、TRP1、及びTKからなる群より選択される、実施形態１５に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（２１）前記レポーター遺伝子が、前記目的の標的膜タンパク質に前記抗体が結合した際の目的の標的膜タンパク質の活性の前記増加がポジティブセレクション培地上での酵母宿主細胞の増殖により検出可能であるような選択可能なマーカーである、実施形態１４に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（２２）前記レポーター遺伝子が、前記目的の標的膜タンパク質に前記抗体が結合した際の目的の標的膜タンパク質の活性の前記減少がネガティブセレクション培地上での酵母宿主細胞の増殖により検出可能であるような対抗選択可能なマーカーである、実施形態１４に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（２３）前記目的の標的膜タンパク質が、受容体、イオンチャネル、及びトランスポーターからなる群より選択される、実施形態１〜２２のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（２４）前記受容体がGタンパク質共役受容体（GPCR）である、実施形態２３に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（２５）前記GPCRが外来性GPCRである、実施形態２４に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（２６）前記酵母宿主細胞がさらに内在性GPCRを含む、実施形態２５に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（２７）前記外来性GPCRによって活性化することが可能な、操作されたGαサブユニットをさらに含み、活性化された操作されたGαサブユニットが、酵母宿主細胞において検出可能なフェロモン応答を活性化することが可能である、実施形態２５又は２６に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（２８）前記操作されたGαサブユニットが、酵母GαサブユニットのN末端ドメイン及び外来性GαサブユニットのC末端ドメインを含むキメラGタンパク質アルファ（Gα）サブユニットである、実施形態２７に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（２９）前記酵母Gαサブユニットが、Gαi、Gαq、Gαs、又はGαoファミリーGタンパク質に属する、実施形態２８に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（３０）前記外来性GPCRが哺乳動物GPCRである、実施形態２５〜２９のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（３１）前記哺乳動物GPCRによって前記キメラGαサブユニットを活性化することが可能であるように、前記酵母GαサブユニットのC末端残基の少なくとも5個が、哺乳動物Gαサブユニットの対応するC末端残基と置き換えられている、実施形態３０に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（３２）前記哺乳動物GPCRによって前記キメラGαサブユニットを活性化することが可能であるように、前記酵母GαサブユニットのC末端残基の少なくとも20個が、哺乳動物Gαサブユニットの対応するC末端残基と置き換えられている、実施形態３１に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（３３）前記哺乳動物Gαサブユニットが、Gアルファ−S、Gアルファ−I、Gアルファ−O、Gアルファ−T、Gアルファ−Z、Gアルファ−Q、Gアルファ−11、Gアルファ−12、Gアルファ−13、及びトランスデューシンからなる群より選択される、実施形態３１又は３２に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（３４）前記キメラGαサブユニットが、酵母GαサブユニットのN末端残基の少なくとも41個を含む、実施形態２８〜３３のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（３５）前記哺乳動物GPCRがヒトGPCRである、実施形態３０〜３４のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（３６）前記ヒトGPCRが、CXCR4、CXCR5、SSTR2、MOR、AVPR2、FPR2/ALX、ADORA2A、CHRM3、CGRP2、CCR2、CCR4、CCR5、CHRM4、PAC1、b2AR、CXCR2、CYSLTR2、KSHV vGPCR、PKR1、PKR2、CB1、CB2、A3AR、及びAT1Rからなる群より選択される、実施形態３５に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（３７）目的のGPCR標的膜タンパク質が恒常的にリガンド非依存的な活性を有する、実施形態２４〜３６のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（３８）前記酵母宿主細胞が、目的のGPCR標的膜タンパク質の抗体アンタゴニストの選択のためのFAR1株である、実施形態２４〜３７のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（３９）前記酵母宿主細胞が、目的のGPCR標的膜タンパク質の抗体アゴニストの選択のためのレポーター遺伝子に機能的に連結されたフェロモン誘導性PRM1プロモーターを含むΔfar1株である、実施形態２４〜３６のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（４０）前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ナノボディ、抗体の組み換え断片、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、Fv断片、及びscFv断片からなる群より選択される、実施形態１〜３９のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（４１）前記目的の標的膜タンパク質が、その活性を増加又は減少させる変異を含む、実施形態１〜４０のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（４２）前記酵母宿主細胞が、Δfar1、Δsst2、Δste14、Δste3、又はΔmat株である、実施形態１〜４０のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（４３）前記酵母宿主細胞が、欠失し、若しくは不活化されたMATα座、又は欠失し、若しくは不活化されたMATa座を含むΔmat株である、実施形態４２に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（４４）前記酵母宿主細胞が、野生型CLN3タンパク質と比較して酵母宿主細胞中のCLN3の存在量を増加させるC末端切断を含む改変CLN3タンパク質をさらに含む、実施形態１〜４３のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（４５）前記改変CLN3タンパク質が、野生型CLN3タンパク質の少なくともN末端アミノ酸1〜387を保持する、実施形態４４に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（４６）前記改変CLN3タンパク質が、野生型CLN3タンパク質の少なくともN末端アミノ酸1〜408を保持する、実施形態４４に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（４７）前記酵母宿主細胞が一倍体又は二倍体の酵母宿主細胞である、実施形態１〜４６のいずれかに記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【０１５３】
（４８）実施形態１に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーを製造する方法であって、以下：
（a）酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示するための抗体をコードする第1の複数の組み換えポリヌクレオチドを準備する工程であって、複数の酵母宿主細胞が複数の抗体を提示するように、各酵母宿主細胞において提示される抗体が異なる、前記工程；
（b）ペリプラズムアンカータンパク質をコードする第2の組み換えポリヌクレオチドを準備する工程であって、前記抗体がペリプラズム空間に提示されるようにペリプラズムアンカータンパク質が抗体に連結している、前記工程；
（c）第1の複数の組み換えポリヌクレオチド及び第2の組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞にトランスフェクションする工程；
（d）目的の標的膜タンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞にトランスフェクションする工程；並びに
（e）前記抗体、前記ペリプラズムアンカータンパク質及び前記目的の標的膜タンパク質の発現を可能にする条件下で複数の酵母宿主細胞を培養する工程であって、実施形態１に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーが生成されるように、各酵母宿主細胞がペリプラズム空間に異なる抗体を提示し、目的の標的膜タンパク質が原形質膜に局在する、前記工程
を含む前記方法。
（４９）抗体をコードする前記組み換えポリヌクレオチド、又はペリプラズムアンカータンパク質若しくは目的の標的膜タンパク質をコードする前記組み換えポリヌクレオチドを、発現ベクターによって準備する、実施形態４８に記載の方法。
（５０）抗体をコードする前記組み換えポリヌクレオチド、又はペリプラズムアンカータンパク質若しくは目的の標的膜タンパク質をコードする前記組み換えポリヌクレオチドが、標的遺伝子座において酵母宿主細胞ゲノムに組み込まれる、実施形態４８に記載の方法。
（５１）実施形態３に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーを製造する方法であって、以下：
（a）融合タンパク質をコードする複数の組み換えポリヌクレオチドを準備する工程であって、各組み換えポリヌクレオチドが、提示するための異なる抗体が連結したペリプラズムアンカータンパク質を含む異なる融合タンパク質をコードする、前記工程；
（b）融合タンパク質をコードする前記複数の組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞にトランスフェクションする工程；
（c）目的の標的膜タンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞にトランスフェクションする工程；並びに
（d）前記融合タンパク質及び前記目的の標的膜タンパク質の発現を可能にする条件下で前記複数の酵母宿主細胞を培養する工程であって、実施形態３に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーが生成されるように、各酵母宿主細胞がペリプラズム空間に異なる抗体を提示し、目的の標的膜タンパク質が原形質膜に局在する、前記工程
を含む前記方法。
（５２）融合タンパク質をコードする前記組み換えポリヌクレオチド又は目的の標的膜タンパク質をコードする前記組み換えポリヌクレオチドを発現ベクターによって準備する、実施形態５１に記載の方法。
（５３）融合タンパク質又は目的の標的膜タンパク質をコードする前記組み換えポリヌクレオチドが、標的遺伝子座において酵母宿主細胞ゲノムに組み込まれる、実施形態５１に記載の方法。
（５４）前記目的の標的膜タンパク質が、受容体、イオンチャネル、及びトランスポーターからなる群より選択される、実施形態４８〜５３のいずれかに記載の方法。
（５５）前記受容体がGタンパク質共役受容体（GPCR）である、実施形態５４に記載の方法。
（５６）前記GPCRによって活性化することが可能な、操作されたGαサブユニットをコードする組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞に導入する工程をさらに含み、活性化された操作されたGαサブユニットが、酵母宿主細胞において検出可能なフェロモン応答を活性化することが可能である、実施形態４８〜５５のいずれかに記載の方法。
（５７）前記操作されたGαサブユニットが、酵母GαサブユニットのN末端ドメイン及び外来性GαサブユニットのC末端ドメインを含むキメラGタンパク質アルファ（Gα）サブユニットである、実施形態５６に記載の方法。
（５８）前記酵母Gαサブユニットが、Gαi、Gαq、Gαs、又はGαoファミリーGタンパク質に属する、実施形態５７に記載の方法。
（５９）前記外来性Gαサブユニットが哺乳動物Gαサブユニットである、実施形態５７又は５８に記載の方法。
（６０）哺乳動物GPCRによって前記キメラGαサブユニットを活性化することが可能であるように、前記酵母GαサブユニットのC末端残基の少なくとも5個が、哺乳動物Gαサブユニットの対応するC末端残基と置き換えられている、実施形態５９に記載の方法。
（６１）前記哺乳動物GPCRによって前記キメラGαサブユニットを活性化することが可能であるように、前記酵母GαサブユニットのC末端残基の少なくとも20個が、哺乳動物Gαサブユニットの対応するC末端残基と置き換えられている、実施形態６０に記載の方法。
（６２）前記酵母宿主細胞が、目的の標的GPCRの抗体アンタゴニストの選択のためのFAR1株である、実施形態５５〜６１のいずれかに記載の方法。
（６３）前記酵母宿主細胞が、前記GPCRの抗体アゴニストの選択のためのレポーター遺伝子に機能的に連結されたフェロモン誘導性PRM1プロモーターを含むΔfar1株である、実施形態５５〜６１のいずれかに記載の方法。
【０１５４】
（６４）目的の標的膜タンパク質の活性を調節する抗体について、実施形態１４に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーをスクリーニングする方法であって、選択培地において、実施形態１４に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーの酵母宿主細胞の少なくともサブセット（subset）を培養する工程；及び、前記レポーター遺伝子の発現を検出する工程を含み、レポーター遺伝子の発現の増加が、抗体が前記目的の標的膜タンパク質の活性を増加させることを示し、レポーター遺伝子の発現の減少が、抗体が前記目的の標的膜タンパク質の活性を減少させることを示す、前記方法。
（６５）前記レポーター遺伝子が、栄養マーカー、抗生物質耐性マーカー、蛍光マーカー、生物発光マーカー、又は対抗選択可能なマーカーである、実施形態６４に記載の方法。
（６６）前記栄養マーカー発現のポジティブセレクションを行うことをさらに含み、栄養欠乏選択培地での前記酵母宿主細胞の増殖が、前記目的の標的膜タンパク質の活性化を示す、実施形態６５に記載の方法。
（６７）前記栄養マーカーが、HIS3、HIS7、ARG6、LEU2、URA3、及びTRP1である、実施形態６６に記載の方法。
（６８）前記抗生物質耐性マーカー発現のポジティブセレクションを行うことをさらに含み、抗生物質を含む選択培地での前記酵母宿主細胞の増殖が、前記目的の標的膜タンパク質の活性化を示す、実施形態６５に記載の方法。
（６９）前記抗生物質耐性マーカーが、ジェネティシン、ゼオシン、ハイグロマイシンB、ノーセオトリシン、及びビアラホスからなる群より選択される抗生物質に対する耐性を付与する、実施形態６８に記載の方法。
（７０）前記蛍光マーカー発現のポジティブセレクションを行うことをさらに含み、前記酵母宿主細胞が発する蛍光の検出が、前記目的の標的膜タンパク質の活性化を示す、実施形態６５に記載の方法。
（７１）前記蛍光マーカーが、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、シアン色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、及びオレンジ色蛍光タンパク質からなる群より選択される、実施形態７０に記載の方法。
（７２）前記生物発光マーカー発現のポジティブセレクションを行うことをさらに含み、前記酵母宿主細胞が発する生物発光の検出が、前記目的の標的膜タンパク質の活性化を示す、実施形態６５に記載の方法。
（７３）前記生物発光マーカーがルシフェラーゼ又はイクオリン（aequorin）である、実施形態７２に記載の方法。
（７４）前記対抗選択可能なマーカー発現のネガティブセレクションを行うことをさらに含み、提示された前記抗体が前記目的の標的膜タンパク質に結合した際の目的の標的膜タンパク質の活性の減少が、対抗選択可能なマーカーを発現する細胞に対抗して（against）選択する薬剤を含む培地での前記酵母宿主細胞の増殖によって検出可能である、実施形態６５に記載の方法。
（７５）前記対抗選択可能なマーカーが、CAN1、URA3、MET15、TRP1、及びTKからなる群より選択される、実施形態７４に記載の方法。
（７６）目的の標的GPCRの活性を調節する抗体について、実施形態２７に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーをスクリーニングする方法であって、培地において、実施形態２７に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーの酵母宿主細胞の少なくともサブセット（subset）を培養する工程を含み、ペリプラズム空間に提示された抗体を持たない対照酵母宿主細胞と比較した、少なくとも1つの酵母宿主細胞におけるフェロモン応答の活性化又は抑制の検出が、前記少なくとも1つの酵母宿主細胞で提示された前記抗体が前記GPCRに結合し、その活性を調節することを示す、前記方法。
（７７）前記目的の標的GPCRがヒトGPCRである、実施形態７６に記載の方法。
（７８）前記ヒトGPCRをリガンドと接触させることをさらに含む、実施形態７７に記載の方法。
（７９）前記GPCRが恒常的にリガンド非依存的な活性を有する、実施形態７８に記載の方法。
（８０）前記酵母宿主細胞がFAR1株であって、酵母宿主細胞において前記GPCRに結合して抑制するアンタゴニストとして作用する抗体によるフェロモン応答の抑制が、酵母宿主細胞の増殖及び細胞周期停止の消滅（cessation）をもたらす、実施形態７６〜７９のいずれかに記載の方法。
（８１）前記酵母宿主細胞が、レポーター遺伝子に機能的に連結されたフェロモン誘導性PRM1プロモーターを含むΔfar1株であり、酵母宿主細胞において前記GPCRに結合して活性化するアゴニストとして作用する抗体によるフェロモン応答の活性化が、レポーター遺伝子の発現増加をもたらす、実施形態７６〜７９のいずれかに記載の方法。
（８２）前記レポーター遺伝子が、栄養マーカー、抗生物質耐性マーカー、蛍光マーカー、生物発光マーカー、又は対抗選択可能なマーカーである、実施形態７３に記載の方法。
（８３）前記酵母宿主細胞の属が、サッカロマイセス（Saccharomyces）、カンジダ（Candida）、ピキア（Pichia）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）、及びヤロウイア（Yarrowia）からなる群より選択される、実施形態１〜８２のいずれかに記載の方法。
（８４）前記酵母宿主細胞の属がサッカロマイセス（Saccharomyces）である、実施形態８３に記載の方法。
（８５）前記サッカロマイセス（Saccharomyces）の種が、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である、実施形態８４に記載の方法。
【０１５５】
（８６）以下を含む酵母宿主細胞：
（a）酵母宿主細胞ペリプラズム空間に提示するための抗体；
（b）ペリプラズムアンカータンパク質であって、前記抗体がペリプラズム空間に提示されるようにペリプラズムアンカータンパク質が抗体に連結している、前記ペリプラズムアンカータンパク質；及び
（c）目的の標的膜タンパク質であって、目的の膜タンパク質が酵母宿主細胞原形質膜に位置し、酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示された抗体にアクセス可能である、前記目的の標的膜タンパク質。
（８７）前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、複合体中で分子結合相互作用によって互いに非共有結合で連結し、又は複合体中で共有非ペプチド結合によって連結している、実施形態８６に記載の酵母宿主細胞。
（８８）前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、融合タンパク質中で互いに共有結合している、実施形態８６に記載の酵母宿主細胞。
（８９）前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体がペリプラズムに提示されるように、酵母宿主細胞のペリプラズム、原形質膜又は細胞壁へのペリプラズムアンカータンパク質の輸送を指示するシグナル配列をさらに含む、実施形態８６〜８８のいずれかに記載の酵母宿主細胞。
（９０）前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体をペリプラズムに配置する（project into）膜にまたがる膜貫通ドメイン又は膜関連タンパク質ドメインを含む、実施形態８６〜８８のいずれかに記載の酵母宿主細胞。
（９１）前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体をペリプラズムに配置するように細胞壁の内面に結合するタンパク質である、実施形態８６〜８８のいずれかに記載の酵母宿主細胞。
（９２）前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記ペリプラズムアンカータンパク質及び連結された抗体がペリプラズムに保持されるように十分に大きい、実施形態８６〜８８のいずれかに記載の酵母宿主細胞。
（９３）前記目的の標的膜タンパク質が、受容体、イオンチャネル、及びトランスポーターからなる群より選択される、実施形態８６〜９２のいずれかに記載の酵母宿主細胞。
（９４）前記受容体がGタンパク質共役受容体（GPCR）である、実施形態９３に記載の酵母宿主細胞。
（９５）前記GPCRによって活性化することが可能な、操作されたGαサブユニットをコードする組み換えポリヌクレオチドを前記酵母宿主細胞に導入する工程をさらに含み、活性化された操作されたGαサブユニットが、酵母宿主細胞において検出可能なフェロモン応答を活性化することが可能である、実施形態８６〜９４のいずれかに記載の酵母宿主細胞。
（９６）前記操作されたGαサブユニットが、酵母GαサブユニットのN末端ドメイン及び外来性GαサブユニットのC末端ドメインを含むキメラGタンパク質アルファ（Gα）サブユニットである、実施形態９５に記載の酵母宿主細胞。
（９７）前記酵母Gαサブユニットが、Gαi、Gαq、Gαs、又はGαoファミリーGタンパク質に属する、実施形態９６に記載の酵母宿主細胞。
（９８）前記外来性Gαサブユニットが哺乳動物Gαサブユニットである、実施形態９６又は９７に記載の酵母宿主細胞。
（９９）哺乳動物GPCRによって前記キメラGαサブユニットを活性化することが可能であるように、前記酵母GαサブユニットのC末端残基の少なくとも5個が、哺乳動物Gαサブユニットの対応するC末端残基と置き換えられている、実施形態９８に記載の酵母宿主細胞。
（１００）前記哺乳動物GPCRによって前記キメラGαサブユニットを活性化することが可能であるように、前記酵母GαサブユニットのC末端残基の少なくとも20個が、哺乳動物Gαサブユニットの対応するC末端残基と置き換えられている、実施形態９９に記載の酵母宿主細胞。
（１０１）前記酵母宿主細胞が、目的の標的GPCRの抗体アンタゴニストの選択のためのFAR1株である、実施形態８６〜１００のいずれかに記載の酵母宿主細胞。
（１０２）前記酵母宿主細胞が、前記GPCRの抗体アゴニストの選択のためのレポーター遺伝子に機能的に連結されたフェロモン誘導性PRM1プロモーターを含むΔfar1株である、実施形態８６〜１０１のいずれかに記載の酵母宿主細胞。
（１０３）前記酵母宿主細胞の属が、サッカロマイセス（Saccharomyces）、カンジダ（Candida）、ピキア（Pichia）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）、及びヤロウイア（Yarrowia）からなる群より選択される、実施形態８６〜１０１のいずれかに記載の酵母宿主細胞。
（１０４）前記酵母宿主細胞の属がサッカロマイセス（Saccharomyces）である、実施形態１０３に記載の酵母宿主細胞。
（１０５）前記サッカロマイセス（Saccharomyces）の種が、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である、実施形態１０４に記載の酵母宿主細胞。
【０１５６】
（１０６）ペリプラズムアンカータンパク質に連結した抗体。
（１０７）前記抗体が酵母宿主細胞ペリプラズム空間に局在する、実施形態１０６に記載の抗体。
（１０８）前記抗体が酵母宿主細胞中で産生されたとき、抗体が酵母宿主細胞ペリプラズム空間に局在する、実施形態１０６に記載の抗体。
（１０９）前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、複合体中で分子結合相互作用によって互いに非共有結合で連結し、又は複合体中で共有非ペプチド結合によって連結している、実施形態１０６〜１０８のいずれかに記載の抗体。
（１１０）前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、融合タンパク質中で互いに共有結合している、実施形態１０６〜１０８のいずれかに記載の抗体。
（１１１）前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体がペリプラズムに提示されるように、酵母宿主細胞のペリプラズム、原形質膜又は細胞壁への前記ペリプラズムアンカータンパク質の輸送を指示するシグナル配列をさらに含む、実施形態１０７〜１１０のいずれかに記載の抗体。
（１１２）前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体をペリプラズムに配置する（project into）膜にまたがる膜貫通ドメイン又は膜関連タンパク質ドメインを含む、実施形態１０７〜１１０のいずれかに記載の抗体。
（１１３）前記膜関連タンパク質ドメインがグリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）原形質膜アンカードメインである、実施形態１１２に記載の抗体。
（１１４）前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体をペリプラズムに配置するように細胞壁の内面に結合するタンパク質である、実施形態１０７〜１１０のいずれかに記載の抗体。
（１１５）前記ペリプラズムアンカータンパク質が、ペリプラズムアンカータンパク質及び連結された抗体がペリプラズムに保持されるように十分に大きい、実施形態１０７〜１１０のいずれかに記載の抗体。
（１１６）前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ナノボディ、抗体の組み換え断片、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、Fv断片、及びscFv断片からなる群より選択される、実施形態１０６〜１１５のいずれかに記載の抗体。
（１１７）前記酵母宿主細胞の属が、サッカロマイセス（Saccharomyces）、カンジダ（Candida）、ピキア（Pichia）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）、及びヤロウイア（Yarrowia）からなる群より選択される、実施形態１０７〜１１６のいずれかに記載の抗体。
（１１８）前記酵母宿主細胞の属がサッカロマイセス（Saccharomyces）である、実施形態１１７に記載の抗体。
【０１５７】
（１１９）前記サッカロマイセス（Saccharomyces）の種が、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である、実施形態１１８に記載の抗体。
【０１５８】
（１２０）実施形態１０６〜１１９のいずれかに記載の抗体を含む酵母宿主細胞。
（１２１）抗体がペリプラズム空間に局在するように、前記抗体をペリプラズムアンカータンパク質に連結することを含む、酵母宿主細胞ペリプラズム空間への抗体の局在化方法。
（１２２）前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、複合体中で分子結合相互作用によって互いに非共有結合で連結し、又は複合体中で共有非ペプチド結合によって連結している、実施形態１２１に記載の方法。
（１２３）前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、融合タンパク質中で互いに共有結合している、実施形態１２２に記載の方法。
（１２４）前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体がペリプラズムに提示されるように、酵母宿主細胞のペリプラズム、原形質膜又は細胞壁へのペリプラズムアンカータンパク質の輸送を指示するシグナル配列をさらに含む、実施形態１２１〜１２３のいずれかに記載の方法。
（１２５）前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体をペリプラズムに配置する（project into）膜にまたがる膜貫通ドメイン又は膜関連タンパク質ドメインを含む、実施形態１２１〜１２３のいずれかに記載の方法。
（１２６）前記膜関連タンパク質ドメインがグリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）原形質膜アンカードメインである、実施形態１２５に記載の方法。
（１２７）前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記抗体をペリプラズムに配置するように細胞壁の内面に結合するタンパク質である、実施形態１２１〜１２３のいずれかに記載の方法。
（１２８）前記ペリプラズムアンカータンパク質が、前記ペリプラズムアンカータンパク質及び連結された抗体がペリプラズムに保持されるように十分に大きい、実施形態１２０〜１２３のいずれかに記載の方法。
（１２９）前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ナノボディ、抗体の組み換え断片、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、Fv断片、及びscFv断片からなる群より選択される、実施形態１２１〜１２８のいずれかに記載の方法。
（１３０）前記酵母宿主細胞の属が、サッカロマイセス（Saccharomyces）、カンジダ（Candida）、ピキア（Pichia）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）、及びヤロウイア（Yarrowia）からなる群より選択される、実施形態１２１〜１２９のいずれかに記載の方法。
（１３１）前記酵母宿主細胞の属がサッカロマイセス（Saccharomyces）である、実施形態１３０に記載の方法。
（１３２）前記サッカロマイセス（Saccharomyces）の種が、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である、実施形態１３１に記載の方法。
【０１５９】
（１３３）複数の酵母宿主細胞を含む酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーであって、各酵母宿主細胞が以下：
（a）酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示するための抗体であって、複数の酵母宿主細胞が複数の抗体を提示するように、各酵母宿主細胞において提示される抗体が異なる、前記抗体；
（b）ペリプラズムアンカータンパク質であって、前記抗体がペリプラズム空間に提示されるようにペリプラズムアンカータンパク質が抗体に連結している、前記ペリプラズムアンカータンパク質；及び
（c）目的の標的膜タンパク質であって、目的の膜タンパク質が酵母宿主細胞原形質膜に位置し、酵母宿主細胞のペリプラズム空間に提示された抗体にアクセス可能である、前記目的の標的膜タンパク質
を含む、酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１３４）前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、融合タンパク質中で互いに共有結合している、実施形態１３３に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１３５）前記抗体及びペリプラズムアンカータンパク質が、分子結合相互作用によって互いに非共有結合で連結している、実施形態１３３に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１３６）前記目的の標的膜タンパク質に前記抗体が結合した際の目的の標的膜タンパク質の活性の増加又は減少の検出を可能にするために、目的の標的膜タンパク質が活性化されたときに活性化される誘導性プロモーターに機能的に連結されたレポーター遺伝子を含むレポーターシステムをさらに含む、実施形態１３３に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１３７）前記レポーター遺伝子が、栄養マーカー、抗生物質耐性マーカー、蛍光マーカー、生物発光マーカー、又は対抗選択可能なマーカーである、実施形態１３６に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１３８）前記栄養マーカーが、HIS3、HIS7、ARG6、LEU2、URA3、及びTRP1からなる群より選択される、実施形態１３７に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１３９）前記抗生物質耐性マーカーが、ジェネティシン、ゼオシン、ハイグロマイシンB、ノーセオトリシン、及びビアラホスからなる群より選択される抗生物質に対する耐性を付与する、実施形態１３７に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１４０）前記蛍光マーカーが、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、シアン色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、及びオレンジ色蛍光タンパク質からなる群より選択される、実施形態１３７に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１４１）前記生物発光マーカーがルシフェラーゼ又はイクオリン（aequorin）である、実施形態１３７に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１４２）前記対抗選択可能なマーカーが、CAN1、URA3、MET15、TRP1、及びTKからなる群より選択される、実施形態１３７に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１４３）前記レポーター遺伝子が、前記目的の標的膜タンパク質に前記抗体が結合した際の目的の標的膜タンパク質の活性の前記増加がポジティブセレクション培地上での酵母宿主細胞の増殖により検出可能であるような選択可能なマーカーである、実施形態１３６に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１４４）前記レポーター遺伝子が、前記目的の標的膜タンパク質に前記抗体が結合した際の目的の標的膜タンパク質の活性の前記減少がネガティブセレクション培地上での酵母宿主細胞の増殖により検出可能であるような対抗選択可能なマーカーである、実施形態１３６に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１４５）前記目的の標的膜タンパク質が、受容体、イオンチャネル、及びトランスポーターからなる群より選択される、実施形態１３３に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１４６）前記受容体がGタンパク質共役受容体（GPCR）である、実施形態１４５に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１４７）前記GPCRが外来性GPCRである、実施形態１４６に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１４８）前記外来性GPCRによって活性化することが可能な、操作されたGαサブユニットをさらに含み、活性化された操作されたGαサブユニットが、酵母宿主細胞において検出可能なフェロモン応答を活性化することが可能である、実施形態１４７に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１４９）前記操作されたGαサブユニットが、酵母GαサブユニットのN末端ドメイン及び外来性GαサブユニットのC末端ドメインを含むキメラGタンパク質アルファ（Gα）サブユニットである、実施形態１４８に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１５０）前記酵母Gαサブユニットが、Gαi、Gαq、Gαs、又はGαoファミリーGタンパク質に属する、実施形態１４９に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１５１）前記外来性GPCRが哺乳動物GPCRである、実施形態１４９に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１５２）前記哺乳動物GPCRによって前記キメラGαサブユニットを活性化することが可能であるように、前記酵母GαサブユニットのC末端残基の少なくとも5個が、哺乳動物Gαサブユニットの対応するC末端残基と置き換えられている、実施形態１５１に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１５３）前記哺乳動物GPCRによって前記キメラGαサブユニットを活性化することが可能であるように、前記酵母GαサブユニットのC末端残基の少なくとも20個が、哺乳動物Gαサブユニットの対応するC末端残基と置き換えられている、実施形態１５２に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１５４）前記哺乳動物Gαサブユニットが、Gアルファ−S、Gアルファ−I、Gアルファ−O、Gアルファ−T、Gアルファ−Z、Gアルファ−Q、Gアルファ−11、Gアルファ−12、Gアルファ−13、及びトランスデューシンからなる群より選択される、実施形態１５１に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１５５）前記キメラGαサブユニットが、酵母GαサブユニットのN末端残基の少なくとも41個を含む、実施形態１４９に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１５６）前記哺乳動物GPCRがヒトGPCRである、実施形態１５１に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１５７）前記ヒトGPCRが、CXCR4、b2AR、CXCR2、CYSLTR2、KSHV vGPCR、PKR1、PKR2、CB2、A3AR、及びAT1Rからなる群より選択される、実施形態１５６に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１５８）前記GPCRが恒常的にリガンド非依存的な活性を有する、実施形態１４６に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１５９）前記酵母宿主細胞が、前記GPCRの抗体アンタゴニストの選択のためのFAR1株である、実施形態１４６に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１６０）前記酵母宿主細胞が、前記GPCRの抗体アゴニストの選択のためのレポーター遺伝子に機能的に連結されたフェロモン誘導性PRM1プロモーターを含むΔfar1株である、実施形態１４６に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１６１）前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ナノボディ、抗体の組み換え断片、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、Fv断片、及びscFv断片からなる群より選択される、実施形態１３３に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１６２）前記目的の標的膜タンパク質が、その活性を増加又は減少させる変異を含む、実施形態１３３に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１６３）前記酵母宿主細胞が、Δfar1、Δsst2、Δste14、Δste3、又はΔmat株である、実施形態１３３に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１６４）前記Δmat株が、欠失し、若しくは不活化されたMATα座、又は欠失し、若しくは不活化されたMATa座を含む、実施形態１６３に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１６５）前記酵母宿主細胞が、野生型CLN3タンパク質と比較して酵母宿主細胞中のCLN3の存在量を増加させるC末端切断を含む改変CLN3タンパク質をさらに含む、実施形態１３３に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１６６）前記改変CLN3タンパク質が、野生型CLN3タンパク質の少なくともN末端アミノ酸1〜387を保持する、実施形態１６５に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１６７）前記改変CLN3タンパク質が、野生型CLN3タンパク質の少なくともN末端アミノ酸1〜408を保持する、実施形態１６６に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１６８）前記酵母宿主細胞が一倍体又は二倍体の酵母宿主細胞である、実施形態１３３に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１６９）前記ペリプラズムアンカータンパク質が、融合したタンパク質変異体がペリプラズムに提示されるように、酵母宿主細胞のペリプラズム、原形質膜又は細胞壁への融合タンパク質の輸送を指示するシグナル配列をさらに含む、実施形態１３３に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１７０）前記ペリプラズムアンカータンパク質が、融合したタンパク質変異体をペリプラズムに配置する（project into）膜にまたがる膜貫通ドメイン又は膜関連タンパク質ドメインを含む、実施形態１３３に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１７１）前記膜関連タンパク質ドメインがグリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）原形質膜アンカードメインである、実施形態１７０に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１７２）前記GPI原形質膜アンカードメインが、ヤプシンGPI原形質膜アンカードメインである、実施形態１７１に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１７３）前記ヤプシンGPI原形質膜アンカードメインが、YPS1、YPS2、YPS3、YPS4、YPS5、YPS6、又はYPS7ヤプシンGPI原形質膜アンカードメインである、実施形態１７２に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１７４）前記ペリプラズムアンカータンパク質が、提示されたタンパク質変異体をペリプラズムに配置するように細胞壁の内面に結合するタンパク質である、実施形態１３３に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
（１７５）前記ペリプラズムアンカータンパク質が、融合タンパク質がペリプラズムに保持されるのに十分に大きい、実施形態１３３に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリー。
【０１６０】
（１７６）実施形態１３４に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーを製造する方法であって、以下：
（a）融合タンパク質をコードする複数の組み換えポリヌクレオチドを準備する工程であって、各組み換えポリヌクレオチドが、提示するための異なる抗体が連結したペリプラズムアンカータンパク質を含む異なる融合タンパク質をコードする、前記工程；
（b）融合タンパク質をコードする前記複数の組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞にトランスフェクションする工程；
（c）目的の標的膜タンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞にトランスフェクションする工程；並びに、
（d）前記融合タンパク質及び前記目的の標的膜タンパク質の発現を可能にする条件下で前記複数の酵母宿主細胞を培養する工程であって、実施形態１３４に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーが生成されるように、各酵母宿主細胞がペリプラズム空間に異なる抗体を提示し、目的の標的膜タンパク質が原形質膜に局在する、前記工程
を含む前記方法。
（１７７）融合タンパク質をコードする前記組み換えポリヌクレオチド又は目的の標的膜タンパク質をコードする前記組み換えポリヌクレオチドを発現ベクターによって準備する、実施形態１７６に記載の方法。
（１７８）融合タンパク質又は目的の標的膜タンパク質をコードする前記組み換えポリヌクレオチドが、標的遺伝子座において酵母宿主細胞ゲノムに組み込まれる、実施形態１７６に記載の方法。
（１７９）前記目的の標的膜タンパク質が、受容体、イオンチャネル、及びトランスポーターからなる群より選択される、実施形態１７６に記載の方法。
（１８０）前記受容体がGタンパク質共役受容体（GPCR）である、実施形態１７９に記載の方法。
（１８１）前記GPCRによって活性化することが可能な、操作されたGαサブユニットをコードする組み換えポリヌクレオチドを複数の酵母宿主細胞に導入する工程をさらに含み、活性化された操作されたGαサブユニットが、酵母宿主細胞において検出可能なフェロモン応答を活性化することが可能である、実施形態１８０に記載の方法。
（１８２）前記操作されたGαサブユニットが、酵母GαサブユニットのN末端ドメイン及び外来性GαサブユニットのC末端ドメインを含むキメラGタンパク質アルファ（Gα）サブユニットである、実施形態１８１に記載の方法。
（１８３）前記酵母Gαサブユニットが、Gαi、Gαq、Gαs、又はGαoファミリーGタンパク質に属する、実施形態１８２に記載の方法。
（１８４）前記外来性Gαサブユニットが哺乳動物Gαサブユニットである、実施形態１８２に記載の方法。
（１８５）哺乳動物GPCRによって前記キメラGαサブユニットを活性化することが可能であるように、前記酵母GαサブユニットのC末端残基の少なくとも5個が、哺乳動物Gαサブユニットの対応するC末端残基と置き換えられている、実施形態１８４に記載の方法。
（１８６）前記哺乳動物GPCRによって前記キメラGαサブユニットを活性化することが可能であるように、前記酵母GαサブユニットのC末端残基の少なくとも20個が、哺乳動物Gαサブユニットの対応するC末端残基と置き換えられている、実施形態１８５に記載の方法。
（１８７）前記酵母宿主細胞が、目的の標的GPCRの抗体アンタゴニストの選択のためのFAR1株である、実施形態１８１に記載の方法。
（１８８）前記酵母宿主細胞が、前記GPCRの抗体アゴニストの選択のためのレポーター遺伝子に機能的に連結されたフェロモン誘導性PRM1プロモーターを含むΔfar1株である、実施形態１８１に記載の方法。
【０１６１】
（１８９）目的の標的膜タンパク質の活性を調節する抗体について、実施形態１３６に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーをスクリーニングする方法であって、選択培地において、実施形態１３６に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーの酵母宿主細胞の少なくともサブセット（subset）を培養する工程；及び、前記レポーター遺伝子の発現を検出する工程を含み、レポーター遺伝子の発現の増加が、抗体が前記目的の標的膜タンパク質の活性を増加させることを示し、レポーター遺伝子の発現の減少が、抗体が前記目的の標的膜タンパク質の活性を減少させることを示す、前記方法。
（１９０）前記レポーター遺伝子が、栄養マーカー、抗生物質耐性マーカー、蛍光マーカー、生物発光マーカー、又は対抗選択可能なマーカーである、実施形態１８９に記載の方法。
（１９１）前記栄養マーカー発現のポジティブセレクションを行うことをさらに含み、栄養欠乏選択培地での前記酵母宿主細胞の増殖が、前記目的の標的膜タンパク質の活性化を示す、実施形態１９０に記載の方法。
（１９２）前記栄養マーカーが、HIS3、HIS7、ARG6、LEU2、URA3、及びTRP1である、実施形態１９１に記載の方法。
（１９３）前記抗生物質耐性マーカー発現のポジティブセレクションを行うことをさらに含み、抗生物質を含む選択培地での前記酵母宿主細胞の増殖が、前記目的の標的膜タンパク質の活性化を示す、実施形態１９０に記載の方法。
（１９４）前記抗生物質耐性マーカーが、ジェネティシン、ゼオシン、ハイグロマイシンB、ノーセオトリシン、及びビアラホスからなる群より選択される抗生物質に対する耐性を付与する、実施形態１９３に記載の方法。
（１９５）前記蛍光マーカー発現のポジティブセレクションを行うことをさらに含み、前記酵母宿主細胞が発する蛍光の検出が、前記目的の標的膜タンパク質の活性化を示す、実施形態１９０に記載の方法。
（１９６）前記蛍光マーカーが、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、シアン色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、及びオレンジ色蛍光タンパク質からなる群より選択される、実施形態１９５に記載の方法。
（１９７）前記生物発光マーカー発現のポジティブセレクションを行うことをさらに含み、前記酵母宿主細胞が発する生物発光の検出が、前記目的の標的膜タンパク質の活性化を示す、実施形態１９０に記載の方法。
（１９８）前記生物発光マーカーがルシフェラーゼ又はイクオリン（aequorin）である、実施形態１９７に記載の方法。
（１９９）前記対抗選択可能なマーカー発現のネガティブセレクションを行うことをさらに含み、提示された前記抗体が前記目的の標的膜タンパク質に結合した際の目的の標的膜タンパク質の活性の減少が、対抗選択可能なマーカーを発現する細胞に対抗して（against）選択する薬剤を含む培地での前記酵母宿主細胞の増殖によって検出可能である、実施形態１９０に記載の方法。
（２００）前記対抗選択可能なマーカーが、CAN1、URA3、MET15、TRP1、及びTKからなる群より選択される、実施形態１９９に記載の方法。
【０１６２】
（２０１）目的の標的GPCRの活性を調節する抗体について、実施形態１４８に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーをスクリーニングする方法であって、培地において、実施形態１４８に記載の酵母ペリプラズムディスプレイライブラリーの酵母宿主細胞の少なくともサブセット（subset）を培養する工程を含み、ペリプラズム空間に提示された抗体を持たない対照酵母宿主細胞と比較した、少なくとも1つの酵母宿主細胞におけるフェロモン応答の活性化又は抑制の検出が、前記少なくとも1つの酵母宿主細胞で提示された前記抗体が前記GPCRに結合し、その活性を調節することを示す、前記方法。
（２０２）ヒトGPCRをリガンドと接触させることをさらに含む、実施形態２０１に記載の方法。
（２０３）前記GPCRが恒常的にリガンド非依存的な活性を有する、実施形態２０１に記載の方法。
（２０４）前記酵母宿主細胞がFAR1株であって、酵母宿主細胞において前記GPCRに結合して抑制するアンタゴニストとして作用する抗体によるフェロモン応答の抑制が、酵母宿主細胞の増殖及び細胞周期停止の消滅（cessation）をもたらす、実施形態２０１に記載の方法。
（２０５）前記酵母宿主細胞が、レポーター遺伝子に機能的に連結されたフェロモン誘導性PRM1プロモーターを含むΔfar1株であり、酵母宿主細胞において前記GPCRに結合して活性化するアゴニストとして作用する抗体によるフェロモン応答の活性化が、レポーター遺伝子の発現増加をもたらす、実施形態２０１に記載の方法。
（２０６）前記レポーター遺伝子が、栄養マーカー、抗生物質耐性マーカー、蛍光マーカー、生物発光マーカー、又は対抗選択可能なマーカーである、実施形態２０５に記載の方法。
【０１６３】
IV. 実験
本発明は、本発明を実施するための具体的な実施形態に係る以下の実施例を参照することにより、より完全に理解されるであろう。実施例は説明のためにのみ提供されるのであって、決して本発明の範囲を限定するためのものではない。その観点から様々な改変又は変更は、当業者に示唆され、本出願の精神及び目的、並びに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることになる。
【０１６４】
使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確さを保証する努力がなされているが、多少の実験誤差や偏差は当然に認められるべきである。
【０１６５】
実施例１：GPCRの機能を調節する抗体の選択のための酵母ディスプレイ
概要
癌や炎症などの疾患における多くの治療標的は、Gタンパク質共役受容体（GPCR）に関係している。しかし、インパクトの大きい（high-impact）疾患に対して最大の治療上の可能性を有するGPCRの多くは、薬にするのが困難である。GPCRの機能に影響を及ぼす低分子は容易に見つかるが、GPCRリガンド結合ポケット間での構造上の類似性のためにしばしば非特異的であり、著しいオフターゲットの副作用を引き起こす可能性がある。低分子とは異なり、抗体並びに関連する親和性分子（例えば、ナノボディ、ScFv及びFab）は、それらの潜在的に優れた特異性、機能的多様性、及び薬理学的特性により、魅力的な医薬分類である。さらに、抗体は、細胞外のドメイン及びループとより良好に相互作用する、低分子よりも洗練された方法でGPCRの構造を（したがって機能も）調節することができる。しかし、現在までのところ、承認されたGPCR抗体治療薬は米国では1つもなく、世界中で唯一、日本にしかない。
【０１６６】
現在の酵母又はファージディスプレイのワークフローでは、強固に結合するものの、しばしばGPCRの機能に影響しない抗体が同定される。使用される抗原は、in vivoで抗体がアクセス可能な機能的GPCRを再現していないか、又は不均一に構造化された完全長のタンパク質調製物であるGPCR断片であることが多い。またこのワークフローでは、ほとんどの抗体は全く機能的にアッセイされないので、全ての機能的多様性のうちの膨大な部分を見落としている。必要なのは、GPCRの機能を調節する抗体を直接選択するためのハイスループットプラットフォームである。
【０１６７】
しかし、GPCRの機能を変化させる抗体を開発することはそれほど簡単ではない（Jo 2015, Hutchings 2010）。多くの現行の解決策におけるこの主な原因として以下の問題がある：
（1）使用される抗原が欠如している。細胞外のGPCRペプチド又は断片に由来する抗原は、ウエスタンブロットのための抗体を開発するのにはよいが、治療上適切な標的を構造的には再現していない。さらに、均一に、機能的に折りたたまれた完全長のタンパク質を、脂質若しくは界面活性剤中で、免疫化、ファージディスプレイ、又は酵母ディスプレイに十分な量で調製することが困難であり得る。
（2）その高い親和性によって選択される抗体はほとんどが機能的でない。それらはGPCRの機能に影響しない領域に結合する。
（3）ワークフローは、選択された抗体において、著しい抗体の多様性を（したがって機能性も）失う。まず強固に結合する抗体を選択し、残りを捨てることによって、膨大な量の機能的多様性が失われる。
抗体候補サブセットを自己分泌的に、機能的にスクリーニングするために哺乳動物細胞系が作製され（Zhang 2014）、部分的に問題（2）に対処しているが、形質転換効率（約104）により、及び、選択（スクリーニング）可能なリードアウト（readouts）の操作可能性（engineerability）が限られていることにより、小さなサブセットの候補のスクリーニングに限定される。
【０１６８】
我々のイノベーション（innovation）には、GPCR及び酵母フェロモン応答の共役と、同じ細胞内でシスに作用する親和性分子のハイスループットプラットフォームにおける発現とを組み合わせことが含まれる。これにより、親和性分子の直接的かつハイスループットな機能的選択が可能になる（図１）。これを行うために、酵母に最適な2つの戦略を組み合わせる：
【０１６９】
１．酵母フェロモン応答リードアウトと共役したヒトGPCRの機能的発現
酵母は、in vitroにおける生化学的及び構造的研究のために、ヒト由来の完全長で機能的なGPCRを発現するために選択される系である。注目すべきことに、酵母はまた、ヒトGPCRを酵母フェロモン応答経路に機能的に共役させ、そのリードアウトに応じた、GPCRと機能的に相互作用する低分子、ペプチド、又はタンパク質のリガンドのスクリーニング（選択）に成功的に使用されている（King 1990, Brown 2000, Erlenbach 2001, Minic 2005, Dowell 2009, Dong 2010, Liu 2016）。共役の最も「一般的」な方法は、酵母GαサブユニットであるGpa1を改変してヒトGPCRに結合し、関連する（cognate）ヒトGαの5つのC末端残基を移植することでGpa1中の本来（天然）の5つのC末端アミノ酸を置き換え「Gα移植物」を製造することによってシグナルを伝達するというものである（Conklin 1993, Brown 2000, Erlenbach 2001）。他の方法には、ヒト受容体の関連するGαの完全長のものによるGpa1の完全な置き換え（King 1990）、又は、より複雑なGpa1/Gαキメラ（各々の異なる部分を組み合わせたヒト/酵母ハイブリッドGα（hybrid human/yeast Gα））の構築（Klein 1998, Price 1995）が含まれる。
【０１７０】
２．親和性分子（抗体、ナノボディ、及びScFv）の酵母ディスプレイ
酵母において、IgG、ScFv、Fab、及びナノボディのような親和性分子を発現し、分泌することに関しても、相当な知識が存在する（Horwitz 1988, Hamilton 2006, Jeong 2011）。複数の抗体臨床候補は、Adimabのような酵母ディスプレイ中心の企業によって開発された。多くの学術研究所や企業は、細胞壁の細胞外表面に共有結合しているタンパク質（例えばAga1やAga2）に親和性分子を融合させることで、酵母においてこれらの分子を発現させ、「提示」する方法を改良してきた（Boder 1997, Bidlingmaier 2015）。109もの複雑なライブラリーが、酵母において日常的に開発されており、これは通常の結合の研究に充分であり、本発明者らの機能的選択プラットフォームにとっては十分以上である（図１に記載された理由による）。
【０１７１】
さらに本発明者らは、分泌された親和性分子を、従来の酵母ディスプレイの場合のように外側へ向けて細胞壁に係留するのではなく、むしろ細胞膜の細胞外面に係留するように努めた。この方法によれば、親和性分子がその膜内のGPCRとシスに機能的に相互作用することができる。本発明者らは4つの異なるドメインを調べ、調べたドメインとGFPとの融合物（GFP fusions to the tested domains）を発現する細胞の膜蛍光の評価に基づき、YPS1のGPIアンカードメイン（Frieman 2003）が最良であると判定した。
【０１７２】
実施例２：低バックグラウンド酵母株
本発明者らは、GPCRリガンドで処理した場合に増殖せず、増殖を可能にするようなしばしば起こる変異も起こしにくい酵母株を作製した。本発明者らは、10-7のバックグラウンド（偽陽性）率を目指した。
【０１７３】
接合型「a」の一倍体酵母（「MATa」細胞）は、接合フェロモンであるアルファ因子（α因子）がそれに関連する（cognate）GPCR受容体（Ste2）を活性化すると細胞周期の停止に陥る。この増殖静止表現型は、Ste2アンタゴニストの選択に使用することができる。残念ながら、自発的な「フェロモン耐性」変異体は、驚くほどの比率で発生する。本発明者らの親世代の一倍体株におけるバックグラウンド又は「偽陽性」の比率は、約10-4である。すなわち、106個の細胞をα因子プレートに広げると約100個のコロニーが増殖する。このバックグラウンドを減らすために、発明者らはフェロモン応答性の二倍体基礎株（Herskowitz 1989）を操作した。機能欠損変異による偽陽性は、二倍体でははるかに頻度が低いようである。しかし、正常な二倍体酵母はMATa遺伝子とMATアルファ遺伝子との両方を担持している（a/アルファ細胞はSte2を発現せず、フェロモンにも応答しない）。本発明者らは、ゲノムからMATアルファ遺伝子座全体を欠失させることによりMATa一倍体のように振る舞う二倍体を構築した。このMATa/Δmatアルファ二倍体はバックグラウンド率が約100倍低かった。
【０１７４】
前記二倍体株の「偽陽性」のほとんどは、フェロモンに全く応答しなかった。それらはおそらく、シグナル伝達カスケードを不活性化する機能獲得変異を担持していたのであろう。そこで本発明者らは、機能するフェロモン応答経路をもつ細胞でのみ活性を示す選択可能なマーカーを開発した。このマーカーは、その発現が、前記経路のシグナル伝達の基礎レベルに依存する。つまり、このシグナル伝達は、フェロモンやフェロモン受容体を必要とせず、代わりに、関連する（cognate）Gタンパク質の確率論的な「ベースライン」の活性化に依存する（Hagen 1991；Oehlen 1995）。この低い基礎シグナル伝達は、細胞周期の停止を引き起こすには十分ではない（その応答には、α因子によるGPCR（Ste2）の活性化が必要である）。恒常的に発現する酵母遺伝子の中には、発現されるフェロモン応答経路の基礎活性に依存するものがいくつかある。本発明者らは、このような遺伝子の1つであるMFA1のプロモーターを配置し、細胞が自身のヒスチジンを合成するのに必要な遺伝子であるHIS3の発現を駆動することにより、本発明者らの選択可能なマーカーを構築した（Daniel 2006）。このP(MFA1)-HIS3コンストラクトは、Gタンパク質からフェロモン応答の転写因子Ste12へシグナルを伝達できる場合にのみ、ヒスチジンを欠く培地（H- 培地）での細胞に増殖を付与する。P(MFA1)-HIS3を担持し、α因子と共にH- 培地に平板培養した操作された二倍体株（NIY326）のバックグラウンド率は10-7であった。
【０１７５】
【表１】
2021505675.tif 000003
【０１７６】
実施例３：ペリプラズム局在ナノボディライブラリーの構築
発明者らは、N末端分泌シグナルであるMFアルファプレプロ（Brake 1984）、続いて単一のFLAGエピトープ（DYKDDDDK）を含む18アミノ酸のリンカー、最後にYPS1グリコホスファチジルイノシトール（GPI）アンカードメインを持つ、キメラの発現を駆動する一組のペリプラズム標的化発現ベクターを構築した。このプレプロシグナルは小胞体内への移行及び分泌のためにタンパク質を標的化し、後に切断される。一方、小胞体中でのYPS1 GPIドメインのプロセシングにより、原形質膜に係留された状態にキメラを保持するN末端GPIアンカーが生じる（Frieman 2003）。MFアルファプレプロをコードする配列の直ぐ後（下流）の制限酵素部位により、（例えば、ナノボディcDNAライブラリーの作製のための）親和性分子のクローニングが可能になる。前記ベクターは選択可能なマーカーURA3を担持し、これによりウラシル欠乏培地でのポジティブセレクション、及び対抗選択も可能になる（下記参照）。
【０１７７】
本発明者らは、抗GFPナノボディをクローニングすることにより、これらの発現ベクターがナノボディを膜の細胞外面に局在させることを確認した（Kirchhoffer 2009）。発明者らがこれらの細胞の細胞壁を消化し、GFPを細胞外に投与したところ、それらの細胞膜に一致した緑色蛍光が観察され（図４）、抗GFPナノボディのペリプラズム局在が確認された。
【０１７８】
発明者らは、次にナノボディライブラリーを構築した。ソースとしては、大腸菌ベクターで以前にクローンニングしたクローン価106のナノボディのライブラリー（Salema 2013）が使用された。発明者らは、PCRによりナノボディをコードする配列を増幅し、低バックグラウンドプラットフォーム株NIY326（van Leeuwen 2015）を用いて、酵母相同組み換えにより原形質膜標的化ベクターにクローニングした。ウラシル及びヒスチジン欠乏（U-/H-）寒天培地上で約1×106の独立コロニーが得られた。発明者らは、コロニーを低温保存培地にこそげ取り、分割量のスラリーを-80℃で保存した（ライブラリー001）。
【０１７９】
実施例４：Ste2の自己分泌性アンタゴニストとして作用するナノボディの選択
A．ナノボディライブラリーからのフェロモン耐性クローンの選択：
本発明者らは、実施例３に記載したライブラリー001からフェロモン耐性クローンを選択した。数枚のU-/H- プレート上でα因子と共に細胞108個を播種し、5日間インキュベートした。増殖した約300個のうち90個のコロニーの無作為サンプルを解析した。次に本発明者らは、それらのα因子上での増殖能がプラスミド依存的であるかを判定した。URA3を発現する細胞に対し毒性がある5-FOAを含む培地上でそれらを平板培養することにより、プラスミドを自発的に失ったクローンを選択した。そして、5-FOA選択前に増殖したが、その後には増殖しなかったクローンを試験した。本発明者らはハロアッセイ（halo assay）を行い、最初に単離した90個のうち12個のクローンが、ハロアッセイで5-FOA選択をした後にα因子含有寒天培地上で増殖能を失うことを見出した（図５）。
【０１８０】
B．特異性及び作用場所の試験：
候補ナノボディ親和性分子が特異的であるか（つまり、フェロモン応答を遮断するために標的受容体Ste2を必要とするか）を試験するために、本発明者らはMATアルファ株において前記候補を発現する。MATアルファ細胞はa因子受容体Ste3を発現し、Ste2を発現しない。Ste3はSte2と遠い類縁関係しかないGPCRであり、そのリガンドであるa因子フェロモンはα因子とは全く異なった、グリコシル化されたペプチドである。MATa及びMATアルファの両者とも、その受容体の下流にあるフェロモンシグナル伝達カスケードは同一である。MATa及びMATアルファ細胞はともに、その関連するフェロモンに応答して、それらの細胞周期を停止させ、フェロモン誘導性遺伝子を活性化する。本発明者らのMATa及びMATアルファ試験用細胞は、フェロモン誘導性転写レポーターP(PRM1)-YFPを担持し、アンタゴニスト候補の非存在下及び存在下における経路機能を試験するために使用することができる。そこで、本発明者らは、それらの関連するフェロモンに曝露したMATa及びMATアルファ細胞において、細胞周期の停止及びYFPの誘導を測定することにより、アンタゴニスト候補の効果を比較して特異性を評価する。MATa（Ste2）株のみでアンタゴニストとして作用すれば、候補を進める。
【０１８１】
C．精製ナノボディを細胞外に投与することによる作用場所の評価
可能性は低いが、GPCRの拮抗作用は、Ste2の原形質膜への局在の混乱（disruption）及び細胞内での結合から生じる可能性があった。いかなる「結合剤」抗体も潜在的にこのように作用する可能性があるため、本発明者らは、外来的に添加した際の前記候補のGPCRの機能調節能を試験している。
【０１８２】
本発明者らは、ナノボディタンパク質を発現、精製し、フェロモン存在下で細胞に投与し、フェロモン中での増殖並びにレポーター誘導アッセイを使用してSte2（及びSte3）の機能への影響を測定する。本発明者らは、ベクターpET28b及びBL21(DE3)細胞を使用して、C末端6×Hisタグと共に前記候補を細菌で発現し、非変性6His親和性精製法を使用してそれらを精製する（Bornhorst 2000）。そのサイズが小さい（15kDa）ため、ナノボディは酵母細胞壁を通って拡散することができる（Ries 2012）。本発明者らは、この機能試験に加え、組み換えナノボディを蛍光色素（Alexa 488、GFPの波長に対応；Kit #A20181、Thermo-Fisher Scientific）で標識し、対照Ste3発現細胞では起きない、Ste2発現細胞での原形質膜の染色能を試験する。また、免疫蛍光実験により、細胞壁の有無（リチカーゼ（lyticase）酵素処理で容易に除去できる）によって固定細胞の染色を比較することができ、それによって、ナノボディが細胞壁を通して効率的に拡散できることを確認することができる。最後に、免疫蛍光法を使用して、アンタゴニスト候補がリガンドではなく受容体に直接結合してその効果を発揮することを確認する。
【０１８３】
実施例５：アゴニスト選択株
本発明者らは、増殖にSte2刺激を必要とするアゴニスト選択株を構築する。P(MFA1)-HIS3マーカーを欠く本発明者らのプラットフォーム株のバージョンにおいて、CRISPR-Cas9アプローチ（Horwitz 2015）を使用してFAR1の両方のゲノムコピーを欠失させることによりフェロモン誘導性細胞周期停止機能を無効にする。次に、この二倍体株のPRM1対立遺伝子のうち1つのPRM1のオープンリーディングフレームをHIS3のORFで置き換え、P(PRM1)-HIS3選択マーカーを作製する。他の株にP(PRM1)-HIS3を組み込んだところ、著しい「漏れやすさ」は観察されなかった（つまり、これらの細胞はα因子の存在下でのみ、H- プレート上で増殖する）。本発明者らは、特異性試験のために、この株のMATa及びMATαバージョンを作製する。予想通り、フェロモンカスケードをオンにする突然変異がそれをオフにする突然変異よりもまれであるため（Brown 2000）、P(PRM1)-HIS3株の偽陽性率はアンタゴニスト選択株よりもはるかに低い。ナノボディライブラリーを発現する細胞を平板培養したときに、H- プレートで弱い「増殖体」の存在が観察される場合、本発明者らは、HIS3発現の漏れやすさによる増殖を遮断するHis3阻害剤である3−アミノトリアゾールを経験的に決定された最小限の濃度で使用している（酵母HIS3選択用途のための標準的な戦略）。
【０１８４】
本発明者らは、アンタゴニストスクリーニングと同様に、H- プレートでの増殖に基づいて、Ste2に対する候補アゴニストナノボディを発現する酵母クローンを選択する。Ste3アゴニスト選択株において（P(PRM1)-HIS3及びP(PRM1)-YFPレポーターを使用して）ヒットを試験することにより、特異性を確認すると共に、増殖がプラスミド（発現）依存的であるかどうかを試験する。また、本発明者らは上記のように、細菌でナノボディを生産し、細胞に直接添加してその有効性を試験している。
【０１８５】
実施例６：酵母フェロモン経路とヒトGPCRとの共役
A．Gpa1移植物パネル
ヒトGPCRを酵母フェロモン経路と共役させるために広く使用されている方法は、そのC末端アミノ酸の5つをヒトGαのものに変更するように、酵母Gα（Gpa1）を改変し、「GPA1移植物」を生成するというものである（Brown 2000, Erlenbach 2001）。各受容体について、適切なGαはしばしば経験的に見出される（Dowell 2009）。ほとんどの場合、Gαi、Gαq、Gαs又はGαoのいずれかへの移植により共役が達成される（Dong 2010）。本発明者らは、CRISPRアプローチ（Horwitz 2015）を使用して、これら4種類のGα移植株につき、アゴニスト及びアンタゴニストのGPA1移植株二倍体のパネルを作製している。
【０１８６】
B．本発明の系におけるヒトGPCRの試験
ほとんどの場合、ヒトGPCRは、P(ACT1)のような適度なプロモーターにより駆動されるゲノム組み込みコンストラクトから酵母において最もよく発現する（Shiroishi 2012, Schutz 2016）。よく発現するGPCRは、しばしば、N末端切断可能な分泌シグナル（典型的にはMFアルファプレプロ）、続いて免疫検出のためのFLAGエピトープタグを有し、及び、ときには、C末端GFPを有するキメラである。本発明者らはこれらの特徴を持つベクターを構築しており、個々の事例に応じて容易に改変可能である。本発明者らは、表２の受容体をこれらのベクターにクローニングし、それらの発現レベル及び原形質膜局在を蛍光顕微鏡及び/又は抗FLAG免疫蛍光法により試験する。
【０１８７】
本発明者らは、GPCR発現コンストラクトを用いて、移植株を形質転換する。各GPCRについてまた、アゴニスト選択株においてP(PRM1)-HIS3及びP(PRM1)-YFPレポーターを使用し、フェロモン応答とのそれらの共役の強さを試験する。
【０１８８】
【表２】
2021505675.tif 000004
【０１８９】
実施例７：GPCRの機能を調節する抗体のスクリーニング
A．選ばれたGPCRの抗体選択プロセスへの提示（Submit）
以下を除いて、Ste2に関する本発明者らの先の実験（previous work）と同様のアプローチに従う。本発明者らは、多様化ヒトScFvライブラリー（108-109の多様性が保証されている、Oak Biosciences）を使用している。このライブラリーを前述のものと同じ親和性分子ベクターにクローニングし、YPS1 GPIアンカーを持つキメラとしてScFvを原形質膜に発現させる。アンタゴニストの選択のために、共役した受容体からのシグナル伝達が細胞周期の停止を引き起こすほど強いとは予想されない。そこで本発明者らは、対抗選択可能なマーカーP(FUS2)-CAN1を使用している（Erlenbach 2001）。P(FUS2)はP(PRM1)と同様、フェロモン誘導性プロモーターである。CAN1は、アルギニン（毒性のあるアルギニン類似体カナバニンも）の原形質膜トランスポーターをコードしている。P(FUS2)-CAN1を担持する細胞は、フェロモン応答と共役した活性化ヒトGPCRを担持するならば、カナバニンプレートでは増殖できない。この表現型により、カナバニンプレートでヒトGPCRに対する拮抗抗体を選択することが可能になる。アゴニストの選択のためには、本発明者らは、前述のようにP(PRM1)-HIS3マーカーを使用する。候補を選択した後、上記のように、これらのクローンのプラスミド非含有誘導体（plasmid-free derivatives）を単離し、それらのフェロモン遮断表現型のプラスミド依存性を試験した。
【０１９０】
B．候補抗体の特異性と作用場所の試験
（1）他のGPCRで試験する
本発明者らは、他の受容体を発現する株に前記プラスミドを形質転換することにより、プラスミド依存性のある前記候補の特異性を検証する。この場合、MATa（Ste2）及びMATα（Ste3）株、並びに、GPA1移植物を介してフェロモン応答と共役する少なくとも2つの他のヒトGPCRを発現する株でそれらを試験する（つまり、アゴニスト又はアンタゴニストが他のGPCRに作用しないことを確認するためである）。
【０１９１】
（2）精製ナノボディタンパク質を細胞外に投与して試験する
ナノボディ（15kDa）は酵母細胞壁を通って拡散できるが（Ries 2012）、より大きなScFv（27kDa）は著しく制限される可能性がある。本発明者らは、細胞壁の消化のあり及びなしによって、酵母において標識された候補ScFvの免疫蛍光法を行う。
【０１９２】
実施例８：抗CB2 VHHドメインアゴニストの提示が増殖速度に及ぼす影響の試験
アゴニストの提示が酵母細胞の増殖速度に及ぼす影響を決定するために、本発明者らは、ヒトGPCRタンパク質、ヒトカンナビノイド受容体2型（CB2受容体）を発現する酵母株を構築し、それらを、空のプラスミド（VHHなし）又は単一ドメインVHH抗体Ab101が異なる方法で提示されるアゴニスト発現プラスミド（plasmids）のいずれかで形質転換した。本発明者らは、VHHドメインが（1）Yps1原形質膜アンカーに連結された短いリンカーによって、（2）Yps1原形質膜アンカーに連結された長いリンカーによって、（3）可溶性ペリプラズム（periplasmid）酵素Suc2に連結されたN末端融合物によって、及び（4）タグ付けされていないVHHのペリプラズムへの直接分泌によって提示される4つの異なるアゴニストVHH発現プラスミドを試験した。2〜5個の独立したクローンを、選択のない状態で飽和まで増殖させた。飽和細胞を使用して、プレートリーダーでの自動吸光度測定（OD630）のために、96ウェルマイクロタイタープレートにおいて技術的二回反復を伴う培養を開始した。2種類の培養培地製剤を用いた。一つ目の培養培地製剤は、フェロモン応答レポーターの発現を必要としない（選択なし）。二つ目の培養培地製剤は、一つ目のものと同じであったが、フェロモン応答レポーター発現の結果としてのみ生産され得るアミノ酸を1つ欠いている（選択）。吸光度測定は5分ごとに48時間とおして行った。各技術的反復について、生の吸光度測定値から最大増殖速度を計算的に抽出した。生成された全てのデータをグラフ化し、増殖速度の中央値を横棒で示した（図７）。グラフの下の図は、各提示様式を描いている（図７）。
【０１９３】
4種類の各アゴニストVHH発現プラスミドは、空のプラスミドで形質転換した細胞（VHHなし）と比較して、二つ目の培養培地製剤において増殖速度を増加させた。これは、ペリプラズムにおけるアゴニストの様々な提示方法が、GPCRタンパク質CB2受容体活性の活性化に使用できることを示す。本発明者らは特に、CB2受容体が、長い、又は短いリンカーいずれかを介して細胞膜アンカータンパク質に共有結合しているVHHドメイン抗体によって活性化され得ることを示した。また、機能的なVHHドメインアゴニスト抗体が、抗体をペリプラズムタンパク質Suc2（融合タンパク質がペリプラズムに保持されるように十分に大きい）に融合させることによってペリプラズムに局在化させることができることが示された。Suc2は、非共有相互作用によって連結された複数のSuc2タンパク質を含むオリゴマーを形成し、この多量体化は、ペリプラズムにおけるSuc2の保持に必要である。したがって、この状態はまた、抗体とアンカータンパク質との間の非共有相互作用を部分的に介したペリプラズムにおける保持をも示す。最後に、この実験は、タグ付けされていないVHHドメイン抗体のペリプラズムへの直接分泌によって、CB2受容体を活性化できることを示している。
【０１９４】
本発明の好適な実施形態が幾分詳細に記載されているが、本明細書に記載されている本発明の精神及び範囲から外れることなく、明らかな変更を行うことができることが理解される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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