(57)【要約】Fc領域におけるアミノ酸置換の結果として得られる変更されたFcエフェクター機能を有する第1および第2の抗体の組み合わせを本明細書において提供し、これらアミノ酸置換は、CDCおよび/またはADCCのようなエフェクター機能の共依存性の活性化を可能にする。Fc領域におけるアミノ酸置換の結果として得られるアゴニスト活性または増強されたアゴニスト活性を有する第1および第2の抗体の組み合わせも提供し、このアゴニスト活性は第1および第2の抗体の両方に共依存性である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトIgGの第2のFc領域と第2の抗原に結合することができる第2の抗原結合領域とを含む第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための、ヒトIgGの第1のFc領域と第1の抗原に結合することができる第1の抗原結合領域とを含む第1の抗体であって、
第1のFc領域が、
（a）E430、E345、およびS440からなる群より選択される位置におけるアミノ酸の1個の置換を含むが、ただし、S440における置換はS440YまたはS440Wであり、かつ
（b）K439EまたはS440Kの置換を含むが、ただし該置換は、（a）における置換がS440YまたはS440Wである場合、S440Kではなく、かつ
（c）位置G237におけるアミノ酸の1個の置換、またはG236R、G236K、K322A、E269K、L234A、L234F、L235A、L235Q、およびL235Eからなる群より選択される1個もしくは複数個の置換を含み；
第2のFc領域が、
（d）E430、E345、およびS440からなる群より選択される位置におけるアミノ酸の1個の置換を含むが、ただし、S440における置換がS440YまたはS440Wであり、かつ
（e）K439EまたはS440Kの置換を含むが、ただし該置換は、（d）における置換がS440YまたはS440Wである場合、S440Kではなく、
第1のFc領域がK439Eの置換を有しかつ第2のFc領域がS440Kの置換を有するか、または第1のFc領域がS440Kの置換を有しかつ第2のFc領域がK439Eの置換を有し；アミノ酸位置がEuナンバリングシステムによるヒトIgG1に相当する、
前記第1の抗体。
【請求項２】
ヒトIgGの第2のFc領域と第2の抗原に結合することができる第2の抗原結合領域とを含む第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための、ヒトIgGの第1のFc領域と第1の抗原に結合することができる第1の抗原結合領域とを含む第1の抗体であって、
第1のFc領域が、
（a）E430、E345、およびS440からなる群より選択される位置におけるアミノ酸の1個の置換を含むが、ただし、S440における置換はS440YまたはS440Wであり、かつ
（b）K439EまたはS440Kの置換を含むが、ただし該置換は、（a）における置換がS440YまたはS440Wである場合、S440Kではなく、かつ
（c）位置P329におけるアミノ酸の1個の置換、またはK322Eの置換を含み；
第2のFc領域が、
（d）E430、E345、およびS440からなる群より選択される位置におけるアミノ酸の1個の置換を含むが、ただし、S440における置換はS440YまたはS440Wであり、かつ
（e）K439EまたはS440Kの置換を含むが、ただし該置換は、（d）における置換がS440YまたはS440Wである場合、S440Kではなく、かつ
（f）K326A、K326W、E333A、およびE333Sからなる群より選択される1個または複数個の置換を含み、
第1のFc領域がK439Eの置換を有しかつ第2のFc領域がS440Kの置換を有するか、または第1のFc領域がS440Kの置換を有しかつ第2のFc領域がK439Eの置換を有し；アミノ酸位置がEUナンバリングシステムによるヒトIgG1に相当する、
前記第1の抗体。
【請求項３】
ヒトIgGの第2のFc領域と第2の抗原に結合することができる第2の抗原結合領域とを含む第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための、ヒトIgGの第1のFc領域と第1の抗原に結合することができる第1の抗原結合領域とを含む第1の抗体であって、
第1のFc領域が、
（a）K248EおよびT437Rの置換を含み、かつ
（b）K439EまたはS440Kの置換を含み、かつ
（c）位置G237もしくはP329におけるアミノ酸の1個の置換、またはG236R、G236K、K322A、K332E、E269K、L234A、L234F、L235A、L235Q、およびL235Eからなる群より選択される1個もしくは複数個の置換を含み；
第2のFc領域が、
（d）K248EおよびT437Rの置換を含み、かつ
（e）K439EまたはS440Kの置換を含み、
第1のFc領域がK439Eの置換を有しかつ第2のFc領域がS440Kの置換を有するか、または第1のFc領域がS440Kの置換を有しかつ第2のFc領域がK439Eの置換を有し；アミノ酸位置がEuナンバリングシステムによるヒトIgG1に相当する、
前記第1の抗体。
【請求項４】
第1および第2のFc領域が、E430G、E345K、E430S、E430F、E430T、E345Q、E345R、E345Y、S440W、およびS440Yからなる群より選択される置換を含む、請求項1または2のいずれか一項記載の、第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体。
【請求項５】
第1および第2のFc領域が、E430G、E345K、およびE345Rからなる群より選択される置換を含む、請求項1〜2および4のいずれか一項記載の、第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体。
【請求項６】
第1および第2のFc領域がE430Gの置換を含む、請求項1〜2および4〜5のいずれか一項記載の、第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体。
【請求項７】
第1のFc領域が、G237A、G237T、G237Q、G237R、G237S、G237N、G237D、G237E、G237K、G237V、G237M、G237I、G237L、G237H、G237F、G237Y、G237W、G237Pからなる群より選択される1個の置換を含む、請求項1および3〜6のいずれか一項記載の、第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体。
【請求項８】
第1のFc領域が、G237A、G237T、G237S、G237Q、G237Rからなる群より選択される1個の置換を含む、請求項1および3〜7のいずれか一項記載の、第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体。
【請求項９】
第1のFc領域がG237Qの置換を含む、請求項1および3〜8のいずれか一項記載の、第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体。
【請求項１０】
第1のFc領域が、G236RおよびE269Kからなる群より選択される1個または複数個の置換を含む、請求項1および3〜6のいずれか一項記載の、第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体。
【請求項１１】
第1のFc領域がG236Rの置換を含む、請求項1、3〜6、および10のいずれか一項記載の、第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体。
【請求項１２】
第1のFc領域がE269Kの置換を含む、請求項1、3〜6、および10のいずれか一項記載の、第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体。
【請求項１３】
第1のFc領域がK322Aの置換を含む、請求項1および3〜6のいずれか一項記載の、第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体。
【請求項１４】
第1のFc領域がP329Rの置換を含む、請求項2〜6のいずれか一項記載の、第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体。
【請求項１５】
第1のFc領域がK322Eの置換を含む、請求項2〜6のいずれか一項記載の、第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体。
【請求項１６】
第2のFc領域が、G237A、K326A、K326W、E333A、およびE333Sからなる群より選択される1個または複数個の置換を含む、請求項1および3〜13のいずれか一項記載の、第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体。
【請求項１７】
第2のFc領域がG237Aの置換を含む、請求項1、3〜13、および16のいずれか一項記載の、第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体。
【請求項１８】
第2のFc領域が、K326A、K326W、E333A、およびE333Sからなる群より選択される1個または複数個の置換を含む、請求項1〜15のいずれか一項記載の、第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体。
【請求項１９】
第2のFc領域が、K326A、K326W、E333A、およびE333Sからなる群より選択される1個の置換を含む、請求項1〜15および18のいずれか一項記載の、第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体。
【請求項２０】
第2のFc領域がG237AおよびE333Sの置換を含む、請求項1、3〜13、および16〜17のいずれか一項記載の、第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体。
【請求項２１】
第2のFc領域がK326Aの置換を含む、請求項1〜19のいずれか一項記載の、第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体。
【請求項２２】
第2のFc領域がE333Sの置換を含む、請求項1〜19のいずれか一項記載の、第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体。
【請求項２３】
第2のFc領域が、K326A、K326W、E333A、およびE333Sからなる群より選択される2個の置換を含む、請求項1〜16および18のいずれか一項記載の、第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体。
【請求項２４】
第2のFc領域がK326WおよびE333Sの置換を含む、請求項1〜16、18、および23のいずれか一項記載の、第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体。
【請求項２５】
第2のFc領域がK326AおよびE333Aの置換を含む、請求項1〜16、18、および23のいずれか一項記載の、第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体。
【請求項２６】
第1および/または第2の抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の、第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体。
【請求項２７】
第1および/または第2の抗体がモノクローナル抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の、第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体。
【請求項２８】
第1および/または第2の抗体が、ヒトのIgG1アイソタイプ、IgG2アイソタイプ、IgG3アイソタイプ、またはIgG4アイソタイプである、前記請求項のいずれか一項記載の、第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体。
【請求項２９】
第1および/または第2の抗体がヒトIgG1アイソタイプである、前記請求項のいずれか一項記載の、第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体。
【請求項３０】
第1および第2の抗原が両方とも細胞表面に露出した分子である、前記請求項のいずれか一項記載の、第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体。
【請求項３１】
第1および第2の抗原が、処置すべき疾患または障害のための標的細胞または標的組織である細胞または組織に共存する、前記請求項のいずれか一項記載の、第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体。
【請求項３２】
第1および第2の抗原が同一ではない、前記請求項のいずれか一項記載の、第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体。
【請求項３３】
医薬が、第1および第2の抗原を発現している細胞集団を枯渇させる、前記請求項のいずれか一項記載の、第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体。
【請求項３４】
細胞集団が腫瘍細胞である、請求項33記載の、第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体。
【請求項３５】
細胞集団が血液腫瘍細胞または固形腫瘍細胞である、請求項33〜34のいずれか一項記載の、第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体。
【請求項３６】
細胞集団が、白血球、リンパ球、B細胞、T細胞、制御性T細胞、NK細胞、骨髄系由来サプレッサー細胞、腫瘍関連マクロファージ細胞の集団である、請求項33〜34のいずれか一項記載の、第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体。
【請求項３７】
ヒトIgGのFc領域と抗原に結合することができる抗原結合領域とを含む抗体であって、
該Fc領域が、
（a）E430、E345、およびS440からなる群より選択される位置におけるアミノ酸の1個の置換を含むが、ただし、S440における置換はS440YまたはS440Wであり、かつ
（b）K439EまたはS440Kの置換を含むが、ただし該置換は、（a）における置換がS440YまたはS440Wである場合、S440Kではなく、かつ
（c）位置G237におけるアミノ酸の1個の置換、またはG236R、G236K、K322A、E269K、L234A、L234F、L235A、L235Q、およびL235Eからなる群より選択される1個もしくは複数個の置換を含む、
前記抗体。
【請求項３８】
ヒトIgGのFc領域と抗原に結合することができる抗原結合領域とを含む抗体であって、
該Fc領域が、
（a）K248EおよびT437Rの置換を含み、かつ
（b）K439EまたはS440Kの置換を含み、かつ
（c）位置G237もしくはP329におけるアミノ酸の1個の置換、またはG236R、G236K、K322Aからなる群より選択される1個もしくは複数個の置換を含み、
（d）K332E、E269K、L234A、L234F、L235A、L235Q、L235E、K326A、K326W、E333A、およびE333Sを含む、
前記抗体。
【請求項３９】
Fc領域が、E430G、E345K、E430S、E430F、E430T、E345Q、E345R、E345Y、S440W、およびS440Yからなる群より選択される置換を含む、請求項37記載の抗体。
【請求項４０】
Fc領域が、E430G、E345K、およびE345Rからなる群より選択される置換を含む、請求項37および39のいずれか一項記載の抗体。
【請求項４１】
Fc領域がE430Gの置換を含む、請求項37および39〜41のいずれか一項記載の抗体。
【請求項４２】
Fc領域が、G237A、G237T、G237Q、G237R、G237S、G237N、G237D、G237E、G237K、G237V、G237M、G237I、G237L、G237H、G237F、G237Y、G237W、G237Pからなる群より選択される1個の置換を含む、請求項37〜41のいずれか一項記載の抗体。
【請求項４３】
Fc領域が、G237A、G237T、G237S、G237Q、G237Rからなる群より選択される1個の置換を含む、請求項37〜42のいずれか一項記載の抗体。
【請求項４４】
Fc領域がG237QまたはG237Aの置換を含む、請求項37〜43のいずれか一項記載の抗体。
【請求項４５】
Fc領域が、G236RおよびE269Kからなる群より選択される1個または複数個の置換を含む、請求項37〜41のいずれか一項記載の抗体。
【請求項４６】
Fc領域がG236Rの置換を含む、請求項37〜41および45のいずれか一項記載の抗体。
【請求項４７】
Fc領域がE269Kの置換を含む、請求項37〜41および45のいずれか一項記載の抗体。
【請求項４８】
Fc領域がK322Aの置換を含む、請求項37〜41のいずれか一項記載の抗体。
【請求項４９】
ヒトのIgG1アイソタイプ、IgG2アイソタイプ、IgG3アイソタイプ、またはIgG4アイソタイプである、請求項37〜48のいずれか一項記載の抗体。
【請求項５０】
ヒトIgG1アイソタイプである、請求項37〜49のいずれか一項記載の抗体。
【請求項５１】
第1および第2の抗体を含む組成物であって、第1の抗体が第1の抗原結合領域と請求項1〜15および26〜36のいずれか一項記載の第1のFc領域とを含み、第2の抗体が第2の抗原結合領域と請求項1〜6および16〜36のいずれか一項記載の第2のFc領域とを含む、前記組成物。
【請求項５２】
第1および第2の抗体を含む組成物であって、第1の抗体が、第1の抗原に結合することができる第1の抗原結合領域とヒトIgGの第1のFc領域とを含み、第2の抗体が、第2の抗原に結合することができる第2の抗原結合領域とヒトIgGの第2のFc領域とを含み、
第1のFc領域が、
（a）E430、E345、およびS440からなる群より選択される位置におけるアミノ酸の1個の置換を含むが、ただし、S440における置換はS440YまたはS440Wであり、かつ
（b）K439EまたはS440Kの置換を含むが、ただし該置換は、（a）における置換がS440YまたはS440Wである場合、S440Kではなく、かつ
（c）位置G237におけるアミノ酸の1個の置換、またはG236R、G236K、K322A、E269K、L234A、L234F、L235A、L235Q、およびL235Eからなる群より選択される1個もしくは複数個の置換を含み；
第2のFc領域が、
（d）E430、E345、およびS440からなる群より選択される位置におけるアミノ酸の1個の置換を含むが、ただし、S440における置換はS440YまたはS440Wであり、かつ
（e）K439EまたはS440Kの置換を含むが、ただし該置換は、（d）における置換がS440YまたはS440Wである場合、S440Kではなく、
第1のFc領域がK439Eの置換を有しかつ第2のFc領域がS440Kの置換を有するか、または第1のFc領域がS440Kの置換を有しかつ第2のFc領域がK439Eの置換を有し、
アミノ酸位置がEUナンバリングシステムによるヒトIgG1に相当する、
前記組成物。
【請求項５３】
第1および第2の抗体を含む組成物であって、第1の抗体が、第1の抗原に結合することができる第1の抗原結合領域とヒトIgGの第1のFc領域とを含み、第2の抗体が、第2の抗原に結合することができる第2の抗原結合領域とヒトIgGの第2のFc領域とを含み、
第1のFc領域が、
（a）E430、E345、およびS440からなる群より選択される位置におけるアミノ酸の1個の置換を含むが、ただし、S440における置換はS440YまたはS440Wであり、かつ
（b）K439EまたはS440Kの置換を含むが、ただし該置換は、（a）における置換がS440YまたはS440Wである場合、S440Kではなく、かつ
（c）位置P329におけるアミノ酸の1個の置換、またはK322Eの置換を含み；
第2のFc領域が、
（d）E430、E345、およびS440からなる群より選択される位置におけるアミノ酸の1個の置換を含むが、ただし、S440における置換はS440YまたはS440Wであり、かつ
（e）K439EまたはS440Kの置換を含むが、ただし該置換は、（d）における置換がS440YまたはS440Wである場合、S440Kではなく、かつ
（f）K326A、K326W、E333A、およびE333Sからなる群より選択される1個または複数個の置換を含み、
第1のFc領域がK439Eの置換を有しかつ第2のFc領域がS440Kの置換を有するか、または第1のFc領域がS440Kの置換を有しかつ第2のFc領域がK439Eの置換を有し、アミノ酸位置がEUナンバリングシステムによるヒトIgG1に相当する、
前記組成物。
【請求項５４】
第1および第2の抗体を含む組成物であって、第1の抗体が、第1の抗原に結合することができる第1の抗原結合領域とヒトIgGの第1のFc領域とを含み、第2の抗体が、第2の抗原に結合することができる第2の抗原結合領域とヒトIgGの第2のFc領域とを含み、
第1のFc領域が、
（a）K248EおよびT437Rの置換を含み、かつ
（b）K439EまたはS440Kの置換を含み、かつ
（c）位置G237もしくはP329におけるアミノ酸の1個の置換、またはG236R、G236K、K322A、K332E、E269K、L234A、L234F、L235A、L235Q、およびL235Eからなる群より選択される1個もしくは複数個の置換を含み；
第2のFc領域が、
（d）K248EおよびT437Rの置換を含み、かつ
（e）K439EまたはS440Kの1個の置換を含み、
第1のFc領域がK439Eの置換を有しかつ第2のFc領域がS440Kの置換を有するか、または第1のFc領域がS440Kの置換を有しかつ第2のFc領域がK439Eの置換を有し；アミノ酸位置がEuナンバリングシステムによるヒトIgG1に相当する、
前記組成物。
【請求項５５】
第1および第2のFc領域が、E430G、E345K、E430S、E430F、E430T、E345Q、E345R、E345Y、S440W、およびS440Yからなる群より選択される置換を含む、請求項52〜53のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５６】
第1および第2のFc領域が、E430G、E345K、およびE345Rからなる群より選択される置換を含む、請求項52〜53および55のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５７】
第1および第2のFc領域がE430Gの置換を含む、請求項52〜53および55〜56のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５８】
第1のFc領域が、G237A、G237T、G237Q、G237R、G237S、G237N、G237D、G237E、G237K、G237V、G237M、G237I、G237L、G237H、G237F、G237Y、G237W、G237Pからなる群より選択される1個の置換を含む、請求項52〜57のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５９】
第1のFc領域が、G237A、G237T、G237Q、G237R、およびG237Sからなる群より選択される1個の置換を含む、請求項52〜58のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６０】
第1のFc領域がG237Qの置換を含む、請求項52〜59のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６１】
第1のFc領域が、G236RおよびE269Kからなる群より選択される1個または複数個の置換を含む、請求項52〜57のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６２】
第1のFc領域がG236Rの置換を含む、請求項52〜57および61のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６３】
第1のFc領域がE269Kの置換を含む、請求項52〜57および61のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６４】
第1のFc領域がK322Aの置換を含む、請求項52、54〜57のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６５】
第1のFc領域がP329Rの置換を含む、請求項53〜57のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６６】
第1のFc領域がK322Eの置換を含む、請求項53〜57のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６７】
第2のFc領域が、G237A、K326A、K326W、E333A、およびE333Sからなる群より選択される1個または複数個の置換を含む、請求項52、54〜64のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６８】
第2のFc領域がG237Aの置換を含む、請求項52、54〜64、および67のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６９】
第2のFc領域が、K326A、K326W、E333A、およびE333Sからなる群より選択される1個の置換を含む、請求項52〜67のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７０】
第2のFc領域が、K326A、K326W、E333A、およびE333Sからなる群より選択される2個の置換を含む、請求項52〜67および69のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７１】
第2のFc領域がK326WおよびE333Sの置換を含む、請求項52〜67および69〜70のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７２】
第2のFc領域がK326AおよびE333Aの置換を含む、請求項52〜67および69〜70のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７３】
第2のFc領域がE333Sの置換を含む、請求項52〜67および69のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７４】
第2のFc領域がG237AおよびE333Sの置換を含む、請求項52、54〜67のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７５】
第1および第2の抗原が両方とも細胞表面に露出した分子である、請求項51〜74のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７６】
第1および第2の抗原が同一ではない、請求項51〜75のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７７】
第1の抗体および第2の抗体が、約1:50〜50:1のモル比、例えば、約1:1のモル比、約1:2のモル比、約1:3のモル比、約1:4のモル比、約1:5のモル比、約1:6のモル比、約1:7のモル比、約1:8のモル比、約1:9のモル比、約1:10のモル比、約1:15のモル比、約1:20のモル比、約1:25のモル比、約1:30のモル比、約1:35のモル比、約1:40のモル比、約1:45のモル比、約1:50のモル比、約50:1のモル比、約45:1のモル比、約40:1のモル比、約35:1のモル比、約30:1のモル比、25:1のモル比、20:1のモル比、15:1のモル比、10:1のモル比、9:1のモル比、8:1のモル比、7:1のモル比、6:1のモル比、5:1のモル比、4:1のモル比、3:1のモル比、2:1のモル比で組成物中に存在する、請求項51〜76のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７８】
第1の抗体および第2の抗体が、約1:50〜50:1のモル比、例えば、1:40〜40:1のモル比、例えば、約1:30〜30:1のモル比、例えば、約1:20〜20:1のモル比、例えば、約1:10〜10:1のモル比、例えば、約1:9〜9:1のモル比、例えば、約1:5〜5:1のモル比で組成物中に存在する、請求項51〜77のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７９】
第1の抗体および第2の抗体が1:1のモル比で組成物中に存在する、請求項51〜78のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８０】
薬学的な担体または賦形剤をさらに含む、請求項51〜79のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８１】
薬学的組成物である、請求項51〜80のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８２】
医薬として使用するための前記請求項のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８３】
抗原結合領域が、DR4、DR5、CD20、CD37、CD52、HLA-DR、CD3、CD5、4-1BB、PD1からなる群より選択される抗原に結合することができる、請求項1〜36のいずれか一項記載の第1もしくは第2の抗体、請求項37〜50のいずれか一項記載の抗体、または請求項51〜82のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８４】
抗原結合領域が、
（a）SEQ ID NO:196に示されるCDR1配列、SEQ ID NO:196に示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:198に示されるCDR3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:200に示されるCDR1配列、AATに示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:201に示されるCDR3配列を含むVL領域［DR4］；
（b）SEQ ID NO:50に示されるCDR1配列、SEQ ID NO:51に示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:52に示されるCDR3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:54に示されるCDR1配列、FASに示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:55に示されるCDR3配列を含むVL領域［DR5-01-G56T］；
（c）SEQ ID NO:57に示されるCDR1配列、SEQ ID NO:58に示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:59に示されるCDR3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:61に示されるCDR1配列、RTSに示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:62に示されるCDR3配列を含むVL領域［DR5-05］；
（d）SEQ ID NO:36に示されるCDR1配列、SEQ ID NO:37に示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:38に示されるCDR3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:40に示されるCDR1配列、DASに示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:41に示されるCDR3配列を含むVL領域［CD20、7D8］；
（e）SEQ ID NO:9に示されるCDR1配列、SEQ ID NO:10に示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:11に示されるCDR3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:13に示されるCDR1配列、DASに示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:14に示されるCDR3配列を含むVL領域［CD20、11B8］；
（f）SEQ ID NO:43に示されるCDR1配列、SEQ ID NO:44に示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:45に示されるCDR3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:47に示されるCDR1配列、VATに示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:48に示されるCDR3配列を含むVL領域［CD37］；
（g）SEQ ID NO:2に示されるCDR1配列、SEQ ID NO:3に示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:4に示されるCDR3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:6に示されるCDR1配列、NTNに示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:7に示されるCDR3配列を含むVL領域［CD52、CAMPATH-1H］；
（h）SEQ ID NO:161に示されるCDR1配列、SEQ ID NO:162に示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:163に示されるCDR3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:165に示されるCDR1配列、LVSに示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:166に示されるCDR3配列を含むVL領域［CD52、h2E8］；
（i）SEQ ID NO:168に示されるCDR1配列、SEQ ID NO:169に示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:170に示されるCDR3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:172に示されるCDR1配列、AASに示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:173に示されるCDR3配列を含むVL領域［HLA-DR、hul243］；
（j）SEQ ID NO:175に示されるCDR1配列、SEQ ID NO:176に示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:177に示されるCDR3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:179に示されるCDR1配列、DNNに示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:180に示されるCDR3配列を含むVL領域［HLA-DR、1D09C3］；
（k）SEQ ID NO:182に示されるCDR1配列、SEQ ID NO:183に示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:184に示されるCDR3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:186に示されるCDR1配列、DTSに示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:187に示されるCDR3配列を含むVL領域［CD3、huCLB T3/4］；または
（l）SEQ ID NO:189に示されるCDR1配列、SEQ ID NO:190に示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:191に示されるCDR3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:193に示されるCDR1配列、ATSに示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:194に示されるCDR3配列を含むVL領域［CD5］
を含む、請求項1〜36および83のいずれか一項記載の第1もしくは第2の抗体、請求項37〜50および83のいずれか一項記載の抗体、または請求項51〜83のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８５】
疾患を有する個体を処置する方法であって、請求項1〜37および83〜84のいずれか一項記載の第1および第2の抗体、請求項37〜50および83〜84のいずれか一項記載の抗体、または請求項51〜84のいずれか一項記載の組成物の有効量を個体へ投与する工程を含む、前記方法。
【請求項８６】
疾患が、がん、自己免疫疾患、炎症性疾患、および感染性疾患の群より選択される、請求項85記載の方法。
【請求項８７】
さらなる治療剤を投与する工程を含む、請求項85〜86のいずれか一項記載の方法。
【請求項８８】
第1の抗原および第2の抗原を発現している細胞集団を枯渇させる方法であって、請求項1〜84のいずれか一項記載の第1および第2の抗体、抗体、または組成物に該細胞集団を接触させる工程を含む、前記方法。
【請求項８９】
細胞集団が、血液腫瘍細胞集団または固形腫瘍細胞集団のような腫瘍細胞集団である、請求項88記載の方法。
【請求項９０】
第1の抗原および第2の抗原を発現している細胞集団において増殖を誘導する方法であって、請求項1〜84のいずれか一項記載の第1および第2の抗体、抗体、または組成物に該細胞集団を接触させる工程を含む、前記方法。
【請求項９１】
細胞集団が血中に存在する、請求項88〜90のいずれか一項記載の方法。
【請求項９２】
細胞集団が白血球である、請求項88〜91のいずれか一項記載の方法。
【請求項９３】
細胞集団が白血球細胞集団のサブセットである、請求項88〜92のいずれか一項記載の方法。
【請求項９４】
細胞集団がリンパ球細胞集団である、請求項88〜93のいずれか一項記載の方法。
【請求項９５】
細胞集団が、B細胞集団、T細胞集団、NK細胞集団、制御性T細胞集団、骨髄系由来サプレッサー細胞集団である、請求項94記載の方法。
【請求項９６】
第1および/または第2の抗原がTNFR-SFのメンバーである、請求項85〜95のいずれか一項記載の方法。
【請求項９７】
請求項1〜15、26〜36、および83〜84のいずれか一項定義の第1の抗体を含む第1の容器と、請求項1〜6、16〜36、および83〜84のいずれか一項定義の第2の抗体を含む第2の容器とを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、Fc領域におけるアミノ酸置換の結果として得られる変更されたFcエフェクター機能、即ち、増加したFcエフェクター機能または減少したFcエフェクター機能を有する抗体、およびそのような抗体の組み合わせの使用、およびそのような抗体を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
補体依存性細胞傷害（CDC）、抗体依存性細胞傷害（ADCC）、および抗体依存性細胞貪食（ADCP）のような、モノクローナル抗体のFcによって媒介されるエフェクター機能は、効力および毒性によって定義される治療濃度域に寄与する。CDCは、C1qが抗体のFc領域に結合することによって開始される。C1qは、ストークに接着した6個の結合性の球状ヘッドからなる多量体タンパク質である。個々の球状結合ヘッドは、IgGに対する低い親和性を有し；古典的補体経路を誘発するためには、C1qは、細胞表面上の複数のIgG1分子に結合することによってアビディティを増さなければならない。ADCCおよびADCPは、IgG Fc領域がエフェクター細胞上のFcγ受容体（FcγR）に結合することによって開始される。
【０００３】
細胞表面における標的結合時のIgG六量体化は、高アビディティのC1q結合を支持することが示されている。六量体化は、分子間非共有結合性Fc-Fc相互作用によって媒介され、Fc-Fc相互作用は、E345RおよびE430Gを含む、CH3ドメインにおける点変異によって増強され得る。
【０００４】
WO2013/004842（特許文献1）は、補体依存性細胞傷害（CDC）のようなエフェクター機能の変更をもたらす1個または複数個のアミノ酸修飾を有するバリアントFc領域を含む抗体またはポリペプチドを開示している。WO2014/108198（特許文献2）は、補体依存性細胞傷害（CDC）の増加をもたらす1個または複数個のアミノ酸修飾を有するバリアントFc領域を含む、抗体のようなポリペプチドを開示している。
【０００５】
WO2012/130831（特許文献3）は、ポリペプチドのFc領域における1個または複数個のアミノ酸置換の結果として変更されたエフェクター機能を有するFc領域含有ポリペプチドに関する。これらのポリペプチドは、野生型IgG Fc領域を含むポリペプチドと比較して低下した親和性をヒトFcyRIIIaおよび/またはFcyRIIaおよび/またはFcyRIに対して示し、野生型ヒトIgG Fc領域を含むポリペプチドによって誘導されるADCCの少なくとも20％にまで低下した、ポリペプチドによって誘導されるADCCを示す。WO2012/130831（特許文献3）は、増強されたFc-Fc相互作用および/または増強された六量体形成能力を有する抗体を開示していない。
【０００６】
前記のように、抗体間のFc-Fc相互作用を増強させる以前の努力は、抗体が結合した標的細胞の細胞死をもたらし得る、CDCおよび/またはADCCのようなエフェクター機能の増強という効果を有する。
【０００７】
しかしながら、標的抗原が、健常細胞および病原性細胞の両方において体内で広範に発現されている場合、抗体は、正常細胞を死滅させることによって毒性となり得る。従って、病原性細胞に選択的であり、従って、健常細胞の死滅を防止し得る組み合わせで、増強されたエフェクター機能を有する抗体のエフェクター機能を、別の抗体に依存性にする必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】WO2013/004842
【特許文献２】WO2014/108198
【特許文献３】WO2012/130831
【発明の概要】
【０００９】
発明の目的
増強されたエフェクター機能を有する個々に作用する抗体は、標的細胞に対する特異性を達成するため、抗体の抗原結合領域にのみ頼っており、そのことは、適当な標的を、疾患細胞において高度に選択的に発現されている標的に限定し得る。エフェクター機能を減少させる変異を有する個々に作用する抗体は、それらの抗体の抗原標的を発現している健常細胞を救うことができるが、エフェクター機能を減少させる変異によって、効力が限定され得る。従って、個々の各抗体が病原性細胞および正常細胞の両方に結合し得るが、両方の抗体が同一の病原性細胞に結合した場合にのみ、またはその場合に優先的に、増強されたエフェクター機能が活性化される抗体の組み合わせを作製することが、明らかに必要である。個々の標的結合からのエフェクター機能活性化のこの脱共役は、エフェクター機能の活性化が、抗体の組み合わせが同時に結合した細胞に対して選択的となるため、従来、健常細胞に対する望ましくない毒性のため、または疾患細胞に対する効力の欠如のため、抗体治療のために最適に使用され得なかった標的に結合する抗体の創造を可能にする。
【００１０】
従って、両方の抗体が同時に結合した標的細胞に対して最大の活性を提供するよう改変された第1の抗体および第2の抗体であって、両方の抗体が同時に結合した細胞に対する活性と比較して、第1の抗体は、第1の抗体のみが結合した標的細胞に対して活性を提供しないかまたは最小の活性を提供し、第2の抗体は、第2の抗体のみが結合した標的細胞に対して最小のまたは低下した活性を提供する、第1の抗体および第2の抗体を提供することが、本発明の目的である。
【００１１】
両方とも、ヒトIgGのFc領域と抗原結合領域とを含む第1の抗体および第2の抗体であって、両方とも、Fc-Fc相互作用を増加させる置換、自己オリゴマー化阻害置換を有し、第1の抗体が、CDCおよび/またはADCCのようなエフェクター機能の低下のための置換をさらに有し、第1の抗体が、エフェクター機能の低下のための置換を含まない第1の親抗体と比較して低下したCDCおよび/またはADCCのようなエフェクター機能を有し、第1および第2の抗体の組み合わせが、個々に第1および第2の抗体と比較して増強されたエフェクターを有する、第1の抗体および第2の抗体を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【００１２】
第1の親抗体と比較して、Fc-Fc相互作用を増加させる置換、自己オリゴマー化阻害置換、ならびにCDCおよび/またはADCCのようなエフェクター機能の低下のための置換を有する、ヒトIgGのFc領域と抗原結合領域とを含む第1の抗体、ならびに第2の親抗体と比較して、Fc-Fc相互作用を増加させる置換、自己オリゴマー化阻害置換、ならびにCDCおよび/またはADCCのようなエフェクター機能の増強のための置換を有する、ヒトIgGのFc領域と抗原結合領域とを含む第2の抗体であって、第1の抗体および第2の抗体の活性が、相補的な自己オリゴマー化阻害置換によって共依存性にされている、第1の抗体および第2の抗体を提供することが、本発明の別の目的である。
【００１３】
第1の親抗体と比較して、Fc-Fc相互作用を増加させる置換、自己オリゴマー化阻害置換、ならびにCDCおよび/またはADCCのようなエフェクター機能の低下のための置換を有する、ヒトIgGのFc領域と抗原結合領域とを含む第1の抗体、ならびに第2の親抗体と比較した時、Fc-Fc相互作用を増加させる置換、自己オリゴマー化阻害置換、および結合時の標的受容体の活性化の増加のようなアゴニスト活性を誘導する置換を有する、ヒトIgGのFc領域と抗原結合領域とを含む第2の抗体であって、第1および第2の抗体の活性が、相補的な自己オリゴマー化阻害置換によって共依存性にされている、第1の抗体および第2の抗体を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【００１４】
第1の親抗体と比較して、Fc-Fc相互作用を増加させる置換、自己オリゴマー化阻害置換、および結合時の標的受容体の活性化の低下のようなアゴニスト活性の低下のための置換を有する、ヒトIgGのFc領域と抗原結合領域とを含む第1の抗体、ならびに第2の親抗体と比較して、Fc-Fc相互作用を増加させる置換、自己オリゴマー化阻害置換、および結合時の標的受容体の活性化の低下のようなアゴニスト活性の低下のための置換を有する、ヒトIgGのFc領域と抗原結合領域とを含む第2の抗体であって、第1および第2の抗体の組み合わせが、相補的な自己オリゴマー化阻害置換によって共依存性にされている増強されたアゴニスト活性を有する、第1の抗体および第2の抗体を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【００１５】
第1の親抗体と比較して、Fc-Fc相互作用を増加させる置換、自己オリゴマー化阻害置換、ならびにCDCおよび/またはADCCのようなエフェクター機能を低下させる置換を有する、ヒトIgGのFc領域と抗原結合領域とを含む第1の抗体、ならびに第2の親抗体と比較して、自己オリゴマー化阻害置換、Fc-Fc相互作用を増加させ、抗体の抗原結合領域が対応する抗原に結合した時のシグナリングを活性化し、任意で、増強されたシグナリングを誘導する置換を有する、ヒトIgGのFc領域と抗原結合領域とを含む第2の抗体であって、第1の抗体および第2の抗体の活性が、相補的な自己オリゴマー化阻害置換によって共依存性にされている、第1の抗体および第2の抗体を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【００１６】
発明の概要
本明細書中に記載されるように、本発明は、Fc領域が、1個のFc-Fc増強置換ならびにCDCおよび/またはADCCのようなエフェクター機能を低下させる1個または複数個の置換を有する、Fc領域と抗原結合領域とを有する第1の抗体と、Fc領域が、Fc-Fc増強置換を有し、任意で、CDCおよび/またはADCCのようなFcエフェクター機能を増強する1個または複数個の置換を有する、Fc領域と抗原結合領域とを含む第2の抗体との組み合わせであって、第1および第2の抗体が、第1および第2の抗体のヘテロオリゴマー化を共依存性にする相補的な自己オリゴマー化阻害置換をさらに有する、組み合わせに関する。
【００１７】
理論によって限定されるわけではないが、第1および第2の抗体のエフェクター機能またはシグナリング機能、例えば、アゴニスト活性を共依存性にする相補的な置換を有する本発明の第1の抗体と第2の抗体との組み合わせは、組み合わせの毒性を低下させ、組み合わせの治療濃度域を増加させることができると考えられる。さらに、本発明の第1の抗体と第2の抗体との組み合わせは、第1の抗体および第2の抗体によって認識される抗原を発現する細胞集団を特異的に枯渇させるために使用され得る。従って、本発明の第1の抗体と第2の抗体との組み合わせは、第1および第2の抗体によって認識される第1または第2の抗原のみを発現している健常な細胞集団または組織を枯渇させることなく、第1の抗体および第2の抗体によって認識される第1および第2の抗原を発現している腫瘍細胞集団を特異的に枯渇させるために使用され得る。
【００１８】
一つの局面において、本発明は、ヒトIgGの第2のFc領域と第2の抗原に結合することができる第2の抗原結合領域とを含む第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための、ヒトIgGの第1のFc領域と第1の抗原に結合することができる第1の抗原結合領域とを含む第1の抗体であって、
第1のFc領域が、
（a）E430、E345、およびS440からなる群より選択される位置におけるアミノ酸の1個の置換を含むが、ただし、S440における置換はS440YまたはS440Wであり、かつ
（b）K439EまたはS440Kの置換を含むが、ただし該置換は、（a）における置換がS440YまたはS440Wである場合、S440Kではなく、かつ
（c）位置G237におけるアミノ酸の1個の置換、またはG236R、G236K、K322A、E269K、K322E、およびP329Rからなる群より選択される1個もしくは複数個の置換を含み；
第2のFc領域が、
（d）E430、E345、およびS440からなる群より選択される位置におけるアミノ酸の1個の置換を含むが、ただし、S440における置換はS440YまたはS440Wであり、かつ
（e）K439EまたはS440Kの置換を含むが、ただし該置換は、（d）における置換がS440YまたはS440Wである場合、S440Kではなく、かつ
（f）第1のFc領域がK322EまたはP329Rの置換を含む場合、K326A、K326W、E333A、およびE333Sからなる群より選択される1個または複数個の置換を含み、
第1のFc領域がK439Eの置換を有しかつ第2のFc領域がS440Kの置換を有するか、または第1のFc領域がS440Kの置換を有しかつ第2のFc領域がK439Eの置換を有し；アミノ酸位置がEUナンバリングシステム（Edelman et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.1969 May；63(1):78-85；Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition.1991 NIH Publication No.91-3242）によるヒトIgG1に相当する、
第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体を提供する。
【００１９】
一つの局面において、本発明は、ヒトIgGの第2のFc領域と第2の抗原に結合することができる第2の抗原結合領域とを含む第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための、ヒトIgGの第1のFc領域と第1の抗原に結合することができる第1の抗原結合領域とを含む第1の抗体であって、
第1のFc領域が、
（a）E430、E345、およびS440からなる群より選択される位置におけるアミノ酸の1個の置換を含むが、ただし、S440における置換はS440YまたはS440Wであり、かつ
（b）K439EまたはS440Kの置換を含むが、ただし該置換は、（a）における置換がS440YまたはS440Wである場合、S440Kではなく、かつ
（c）L234、L235、G237、G236からなる群より選択される1個もしくは複数個の置換、またはK322AおよびE269Kからなる群より選択される1個もしくは複数個の置換を含み；
第2のFc領域が、
（d）E430、E345、およびS440からなる群より選択される位置におけるアミノ酸の1個の置換を含むが、ただし、S440における置換はS440YまたはS440Wであり、かつ
（e）K439EまたはS440Kの置換を含むが、ただし該置換は、（d）における置換がS440YまたはS440Wである場合、S440Kではなく、
第1のFc領域がK439Eの置換を有しかつ第2のFc領域がS440Kの置換を有するか、または第1のFc領域がS440Kの置換を有しかつ第2のFc領域がK439Eの置換を有し；アミノ酸位置がEuナンバリングシステムによるヒトIgG1に相当する、
第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体を提供する。
【００２０】
一つの局面において、本発明は、ヒトIgGの第2のFc領域と第2の抗原に結合することができる第2の抗原結合領域とを含む第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための、ヒトIgGの第1のFc領域と第1の抗原に結合することができる第1の抗原結合領域とを含む第1の抗体であって、
第1のFc領域が、
（a）E430、E345、およびS440からなる群より選択される位置におけるアミノ酸の1個の置換を含むが、ただし、S440における置換はS440YまたはS440Wであり、かつ
（b）K439EまたはS440Kの置換を含むが、ただし該置換は、（a）における置換がS440YまたはS440Wである場合、S440Kではなく、かつ
（c）アミノ酸位置G237における1個の置換、またはG236R、G236K、K322A、E269K、L234A、L234F、L235A、L235Q、およびL235Eからなる群より選択される1個もしくは複数個の置換を含み；
第2のFc領域が、
（d）E430、E345、およびS440からなる群より選択される位置におけるアミノ酸の1個の置換を含むが、ただし、S440における置換はS440YまたはS440Wであり、かつ
（e）K439EまたはS440Kの置換を含むが、ただし該置換は、（d）における置換がS440YまたはS440Wである場合、S440Kではなく、
第1のFc領域がK439Eの置換を有しかつ第2のFc領域がS440Kの置換を有するか、または第1のFc領域がS440Kの置換を有しかつ第2のFc領域がK439Eの置換を有し；アミノ酸位置がEuナンバリングシステムによるヒトIgG1に相当する、
第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体を提供する。
【００２１】
一つの局面において、本発明は、ヒトIgGの第2のFc領域と第2の抗原に結合することができる第2の抗原結合領域とを含む第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための、ヒトIgGの第1のFc領域と第1の抗原に結合することができる第1の抗原結合領域とを含む第1の抗体であって、
第1のFc領域が、
（a）E430、E345、およびS440からなる群より選択される位置におけるアミノ酸の1個の置換を含むが、ただし、S440における置換はS440YまたはS440Wであり、かつ
（b）K439EまたはS440Kの置換を含むが、ただし該置換は、（a）における置換がS440YまたはS440Wである場合、S440Kではなく、かつ
（c）位置P329におけるアミノ酸の1個の置換、またはK322Eの置換を含み；
第2のFc領域が、
（d）E430、E345、およびS440からなる群より選択される位置におけるアミノ酸の1個の置換を含むが、ただし、S440における置換はS440YまたはS440Wであり、かつ
（e）K439EまたはS440Kの置換を含むが、ただし該置換は、（d）における置換がS440YまたはS440Wである場合、S440Kではなく、かつ
（f）K326A、K326W、E333A、およびE333Sからなる群より選択される1個または複数個の置換を含み、
第1のFc領域がK439Eの置換を有しかつ第2のFc領域がS440Kの置換を有するか、または第1のFc領域がS440Kの置換を有しかつ第2のFc領域がK439Eの置換を有し；アミノ酸位置がEUナンバリングシステムによるヒトIgG1に相当する、
第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体を提供する。
【００２２】
別の局面において、本発明は、ヒトIgGの第2のFc領域と第2の抗原に結合することができる第2の抗原結合領域とを含む第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための、ヒトIgGの第1のFc領域と第1の抗原に結合することができる第1の抗原結合領域とを含む第1の抗体であって、
第1のFc領域が、
（a）K248EおよびT437Rの置換を含み、かつ
（b）K439EまたはS440Kの置換を含み、かつ
（c）位置G237もしくはP329におけるアミノ酸の1個の置換、またはG236R、G236K、K322A、K332E、E269K、L234A、L234F、L235A、L235Q、およびL235Eからなる群より選択される1個もしくは複数個の置換を含み；
第2のFc領域が、
（d）K248EおよびT437Rの置換を含み、かつ
（e）K439EまたはS440Kの置換を含み、
第1のFc領域がK439Eの置換を有しかつ第2のFc領域がS440Kの置換を有するか、または第1のFc領域がS440Kの置換を有しかつ第2のFc領域がK439Eの置換を有し；アミノ酸位置がEuナンバリングシステムによるヒトIgG1に相当する、
第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体を提供する。
【００２３】
E430、E345に相当する位置における置換、またはS440YもしくはS440Wの置換は、本発明によるFc-Fc増強置換と見なされる。
【００２４】
K439EまたはS440Kの置換は、本発明による相補的な自己オリゴマー化阻害置換と見なされる。即ち、例えば、K439Eを有する第1の抗体は、K439Eの置換を有する別の抗体とオリゴマーを形成することができないが、K439Eの置換を有する抗体は、S440Kの置換を有する別の抗体とオリゴマーを形成することができる。S440Kの置換を有する抗体は、S440Kの置換を有する別の抗体とオリゴマーを形成することができない。
【００２５】
位置G237におけるアミノ酸の置換、またはG236R、G236K、K322A、E269K、K322E、P329R、L234A、L234F、L235A、L235Q、およびL235Eからなる群より選択される1個もしくは複数個の置換は、本発明によるC1q結合部位調節置換と見なされ、CDCおよび/またはADCCのようなエフェクター機能を低下させる。
【００２６】
K326A、K326W、E333A、およびE333Sからなる群より選択される1個または複数個の置換は、本発明によるC1q結合部位調節置換と見なされ、CDCおよび/またはADCCのようなエフェクター機能を増加させる。
【００２７】
一つの態様において、第2のFc領域はG237Aの置換を含む。
【００２８】
G237Aの置換は、本発明によるFcγ受容体調節置換と見なされ、Fcγ受容体結合を減少させる。
【００２９】
即ち、本発明者らは、本発明の第1の局面において、Fc-Fc増強置換、自己オリゴマー化阻害置換、ならびにCDCおよび/またはADCCのようなエフェクター機能を低下させる1個または複数個の置換を有する第1の抗体、ならびにFc-Fc増強置換、自己オリゴマー化阻害置換を有し、任意で、CDCおよび/またはADCCのようなエフェクター機能を増強する1個または複数個の置換を有する第2の抗体であって、第1および第2の抗体が、相補的なオリゴマー化阻害置換を有し、従って、第1および第2の抗体のヘテロオリゴマー化が共依存性にされている、第1の抗体および第2の抗体を組み合わせることによって、Fc-Fc増強置換および自己オリゴマー化阻害置換を有するが、C1q調節置換を有しない抗体の組み合わせと比較した時、その抗体の組み合わせについて、疾患細胞におけるエフェクター機能活性と健常細胞におけるエフェクター機能活性との間の安全域を改善することが可能となり得る。
【００３０】
さらなる局面において、本発明は、ヒトIgGのFc領域と抗原に結合することができる抗原結合領域とを含む抗体であって、
Fc領域が、
（a）E430、E345、およびS440からなる群より選択される位置におけるアミノ酸の1個の置換を含むが、ただし、S440における置換はS440YまたはS440Wであり、かつ
（b）K439EまたはS440Kの置換を含むが、ただし該置換は、（a）における置換がS440YまたはS440Wである場合、S440Kではなく、かつ
（c）位置G237におけるアミノ酸の1個の置換、またはG236R、G236K、K322A、E269K、L234A、L234F、L235A、L235Q、およびL235Eからなる群より選択される1個もしくは複数個の置換を含む、
抗体を提供する。
【００３１】
別の局面において、本発明は、ヒトIgGのFc領域と抗原に結合することができる抗原結合領域とを含む抗体であって、
Fc領域が、
（a）K248EおよびT437Rの置換を含み、かつ
（b）K439EまたはS440Kの置換を含み、かつ
（c）位置G237もしくはP329におけるアミノ酸の1個の置換、またはG236R、G236K、K322Aからなる群より選択される1個もしくは複数個の置換を含み、
（d）K332E、E269K、L234A、L234F、L235A、L235Q、L235E、K326A、K326W、E333A、およびE333Sを含む、
抗体を提供する。
【００３２】
一つの局面において、本発明は、第1および第2の抗体を含む組成物であって、第1の抗体が、第1の抗原結合領域と本明細書中に記載された任意の態様または局面による第1のFc領域とを含み、第2の抗体が、第2の抗原結合領域と本明細書中に記載された任意の態様または局面による第2のFc領域とを含む、組成物を提供する。
【００３３】
一つの局面において、本発明は、第1および第2の抗体を含む組成物であって、第1の抗体が、第1の抗原に結合することができる第1の抗原結合領域とヒトIgGの第1のFc領域とを含み、第2の抗体が、第2の抗原に結合することができる第2の抗原結合領域とヒトIgGの第2のFc領域とを含み、
第1のFc領域が、
（a）E430、E345、およびS440からなる群より選択される位置におけるアミノ酸の1個の置換を含むが、ただし、S440における置換はS440YまたはS440Wであり、かつ
（b）K439EまたはS440Kの置換を含むが、ただし該置換は、（a）における置換がS440YまたはS440Wである場合、S440Kではなく、かつ
（c）位置G237におけるアミノ酸の1個の置換、またはG236R、G236K、K322A、E269K、K322E、およびP329Rからなる群より選択される1個もしくは複数個の置換を含み；
第2のFc領域が、
（d）E430、E345、およびS440からなる群より選択される位置におけるアミノ酸の1個の置換を含むが、ただし、S440における置換はS440YまたはS440Wであり、かつ
（e）K439EまたはS440Kの置換を含むが、ただし該置換は、（d）における置換がS440YまたはS440Wである場合、S440Kではなく、かつ
（f）第1のFc領域がK322EまたはP329Rの置換を含む場合、K326A、K326W、E333A、およびE333Sからなる群より選択される1個または複数個の置換を含み、
第1のFc領域がK439Eの置換を有しかつ第2のFc領域がS440Kの置換を有するか、または第1のFc領域がS440Kの置換を有しかつ第2のFc領域がK439Eの置換を有し、アミノ酸位置がEUナンバリングシステムによるヒトIgG1に相当する、
組成物を提供する。
【００３４】
一つの局面において、本発明は、第1および第2の抗体を含む組成物であって、第1の抗体が、第1の抗原に結合することができる第1の抗原結合領域とヒトIgGの第1のFc領域とを含み、第2の抗体が、第2の抗原に結合することができる第2の抗原結合領域とヒトIgGの第2のFc領域とを含み、
第1のFc領域が、
（a）E430、E345、およびS440からなる群より選択される位置におけるアミノ酸の1個の置換を含むが、ただし、S440における置換はS440YまたはS440Wであり、かつ
（b）K439EまたはS440Kの置換を含むが、ただし該置換は、（a）における置換がS440YまたはS440Wである場合、S440Kではなく、かつ
（c）位置G237におけるアミノ酸の1個の置換、またはG236R、G236K、K322A、E269K、L234A、L234F、L235A、L235Q、およびL235Eからなる群より選択される1個もしくは複数個の置換を含み；
第2のFc領域が、
（d）E430、E345、およびS440からなる群より選択される位置におけるアミノ酸の1個の置換を含むが、ただし、S440における置換はS440YまたはS440Wであり、かつ
（e）K439EまたはS440Kの置換を含むが、ただし該置換は、（d）における置換がS440YまたはS440Wである場合、S440Kではなく、
第1のFc領域がK439Eの置換を有しかつ第2のFc領域がS440Kの置換を有するか、または第1のFc領域がS440Kの置換を有しかつ第2のFc領域がK439Eの置換を有し、アミノ酸位置がEUナンバリングシステムによるヒトIgG1に相当する、
組成物を提供する。
【００３５】
一つの局面において、本発明は、第1および第2の抗体を含む組成物であって、第1の抗体が、第1の抗原に結合することができる第1の抗原結合領域とヒトIgGの第1のFc領域とを含み、第2の抗体が、第2の抗原に結合することができる第2の抗原結合領域とヒトIgGの第2のFc領域とを含み、
第1のFc領域が、
（a）E430、E345、およびS440からなる群より選択される位置におけるアミノ酸の1個の置換を含むが、ただし、S440における置換はS440YまたはS440Wであり、かつ
（b）K439EまたはS440Kの置換を含むが、ただし該置換は、（a）における置換がS440YまたはS440Wである場合、S440Kではなく、かつ
（c）位置P329におけるアミノ酸の1個の置換、またはK322Eの置換を含み；
第2のFc領域が、
（d）E430、E345、およびS440からなる群より選択される位置におけるアミノ酸の1個の置換を含むが、ただし、S440における置換はS440YまたはS440Wであり、かつ
（e）K439EまたはS440Kの置換を含むが、ただし該置換は、（d）における置換がS440YまたはS440Wである場合、S440Kではなく、かつ
（f）K326A、K326W、E333A、およびE333Sからなる群より選択される1個または複数個の置換を含み、
第1のFc領域がK439Eの置換を有しかつ第2のFc領域がS440Kの置換を有するか、または第1のFc領域がS440Kの置換を有しかつ第2のFc領域がK439Eの置換を有し、アミノ酸位置がEuナンバリングシステムによるヒトIgG1に相当する、
組成物を提供する。
【００３６】
別の局面において、本発明は、第1および第2の抗体を含む組成物であって、第1の抗体が、第1の抗原に結合することができる第1の抗原結合領域とヒトIgGの第1のFc領域とを含み、第2の抗体が、第2の抗原に結合することができる第2の抗原結合領域とヒトIgGの第2のFc領域とを含み、
第1のFc領域が、
（a）K248EおよびT437Rの置換を含み、かつ
（b）K439EまたはS440Kの置換を含み、かつ
（c）位置G237もしくはP329におけるアミノ酸の1個の置換、またはG236R、G236K、K322A、K332E、E269K、L234A、L234F、L235A、L235Q、およびL235Eからなる群より選択される1個もしくは複数個の置換を含み；
第2のFc領域が、
（d）K248EおよびT437Rの置換を含み、かつ
（e）1個のK439EまたはS440Kの置換を含み、
第1のFc領域がK439Eの置換を有しかつ第2のFc領域がS440Kの置換を有するか、または第1のFc領域がS440Kの置換を有しかつ第2のFc領域がK439Eの置換を有し；アミノ酸位置がEuナンバリングシステムによるヒトIgG1に相当する、
組成物を提供する。
【００３７】
別の局面において、本発明は、第1の抗原および第2の抗原を発現している細胞集団を枯渇させる方法であって、本明細書中で定義される第1および第2の抗体、または第1および第2の抗体による組成物、または組成物に細胞集団を接触させる工程を含む方法に関する。
【００３８】
別の局面において、本発明は、疾患を有する個体を処置する方法であって、本明細書中に記載される請求項記載の第1および第2の抗体の有効量または本明細書中に記載される組成物の有効量を個体へ投与する工程を含む方法に関する。
【００３９】
別の局面において、本発明は、本明細書中で定義される第1の抗体を含む第1の容器と、本明細書中で定義される第2の抗体を含む第2の容器とを含むキットに関する。
【００４０】
別の局面において、本発明は、がん、自己免疫疾患、炎症性疾患、または感染性疾患の処置において使用するための、本明細書中に記載される第1および第2の抗体または組成物に関する。
【００４１】
別の局面において、本発明は、疾患を有する個体を処置する方法であって、本明細書中に記載される第1および第2の抗体または組成物の有効量を個体へ投与する工程を含む方法に関する。
【００４２】
本発明のこれらおよびその他の局面、具体的には、第1および第2の抗体の様々な使用および治療的適用は、以下にさらに詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】P329R変異の導入による抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％のプールした正常ヒト血清（NHS）の存在下、濃度抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、（A）ヨウ化プロピジウム（PI）陽性細胞のパーセンテージによって決定された溶解率および（B）用量応答-応答曲線下面積（AUC）を、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して正規化して提示される。
【図２】K322E変異の導入による抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、（A）PI陽性細胞のパーセンテージによって決定された溶解率および（B）AUCを、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して正規化して提示される。
【図３Ａ】図3は、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋抗CD20-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントへのK322E変異の導入による、異なる細胞株に対するCDC活性の選択性を示す。インビトロCDCアッセイを、30μg/mLの抗体を用いて、20％NHSの存在下、バーキットリンパ腫細胞株Wien 133（A）、Daudi（B）、Raji（C）およびRamos（D）、急性リンパ芽球性リンパ腫（ALL）細胞株REH（E）、骨髄腫細胞株U266B1（F）、ならびにB細胞リンパ腫細胞株 U-698-M（G）を使用して実施した。CDC活性は、PI陽性細胞のパーセンテージによって決定された溶解率を、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）ならびにREH、U266B1およびWien 133についてはIgG1-CAMPATH-1H-E430G（100％）またはDaudi、Raji、RamosおよびU-698-MについてはIgG1-11B8-E430G（100％）に対して細胞株毎に正規化して提示される。
【図３Ｂ】図3Aの説明を参照のこと。
【図３Ｃ】図3Aの説明を参照のこと。
【図３Ｄ】図3Aの説明を参照のこと。
【図３Ｅ】図3Aの説明を参照のこと。
【図３Ｆ】図3Aの説明を参照のこと。
【図３Ｇ】図3Aの説明を参照のこと。
【図４】C1q結合阻害変異（G236R、K322A、E269K、K322EまたはP329R）を有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして提示される。正規化は、非結合対照抗体ミックスIgG1-b12-K439E＋IgG1-b12-S440K（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【図５】抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋C1q結合増強変異（E333S、K326WまたはK326A/E333A）を有する抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして提示される。正規化は、非結合対照抗体ミックスIgG1-b12-K439E＋IgG1-b12-S440K（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【図６Ａ】図6は、C1q結合阻害変異G236R（A）、K322A（B）、E269K（C）、K322E（D）またはP329R（E）を有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋C1q結合増強変異（E333S、K326WまたはK326A/E333A）を有する抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして提示される。正規化は、非結合対照抗体ミックスIgG1-b12-K439E＋IgG1-b12-S440K（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【図６Ｂ】図6Aの説明を参照のこと。
【図６Ｃ】図6Aの説明を参照のこと。
【図６Ｄ】図6Aの説明を参照のこと。
【図６Ｅ】図6Aの説明を参照のこと。
【図７Ａ】図7は、C1q結合阻害変異G236RまたはK322Aを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eの抗体バリアント（A、B）およびC1q結合増強変異E333Sを有する抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの抗体バリアント（C、D）の、ヒトリンパ腫細胞株Wien 133（A、C）およびRaji（B、D）への結合を示す。抗体結合をフローサイトメトリーによって試験した。結合は、蛍光強度の幾何平均（MFI）として表される。結合についての陰性対照として、一次抗体なしの試料または非結合抗gp120抗体IgG1-b12を使用した。
【図７Ｂ】図7Aの説明を参照のこと。
【図７Ｃ】図7Aの説明を参照のこと。
【図７Ｄ】図7Aの説明を参照のこと。
【図８Ａ】図8は、C1q結合阻害変異G236RまたはK322Aを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eの抗体バリアント（A、C）およびC1q結合増強変異E333Sを有する抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの抗体バリアント（B、D）のADCC能を示す。（A、B）Raji標的細胞を、抗体希釈系列と高親和性FcγRIIIa（V158）およびホタルルシフェラーゼの発現を駆動するNFAT応答エレメントを安定発現するJurkatヒトT細胞と共インキュベートする、ADCCレポーターバイオアッセイを実施した。ルシフェラーゼ産生を発光読み出しによって定量した。（C、D）Wien 133標的細胞を抗体希釈系列とヒトPBMC（E：T 100：1）と共インキュベートする、インビトロユウロピウムTDA（EuTDA）ADCCアッセイを実施した。上清中のEuTDA蛍光キレートのシグナルを測定することによって、細胞溶解を判定した。
【図８Ｂ】図8Aの説明を参照のこと。
【図８Ｃ】図8Aの説明を参照のこと。
【図８Ｄ】図8Aの説明を参照のこと。
【図９Ａ】図9は、C1q結合阻害変異G236RまたはK322Aを有するFc-Fc相互作用が増強された抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-K439E＋C1q結合増強変異E333Sを有するまたは有さないFc-Fc相互作用が増強された抗CD20 IgG1-11B8-S440Kのバリアントの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。試験したFc-Fc相互作用増強変異は、E430G、E345K、E345RおよびE345R-E430Gであった。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCおよび最大溶解として提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【図９Ｂ】図9Aの説明を参照のこと。
【図９Ｃ】図9Aの説明を参照のこと。
【図１０Ａ】図10は、G236位（G236RまたはG236K）もしくはG237位（G237A、G237T、G237QまたはG237R）にC1q結合調節変異または二重変異G237A-K322Aを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋C1q結合調節変異E333S、E333A、K326A、K326W-E333S、G237AまたはG237A-E333Sを有するまたは有さない抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCおよび最大溶解として提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【図１０Ｂ】図10Aの説明を参照のこと。
【図１１】C1q結合阻害変異G236Rを有するまたは有さない抗CD52 CAMPATH-1H-E430G-K439E＋C1q結合増強変異E333Sを有するまたは有さない抗CD20 11B8-E430G-S440Kの混合抗体アイソタイプバリアント（IgG1、IgG2、IgG3およびヒンジ安定化IgG4）によるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【図１２Ａ】図12は、C1q結合阻害変異G236RまたはK322Aを有するまたは有さない抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋C1q結合増強変異E333Sを有するまたは有さない抗CD37 IgG1-CD37-37.3-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによる、（A）Daudi細胞および（B）Wien 133細胞に対するCDC活性の選択性を示す。標的細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-CD37-37.3-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【図１２Ｂ】図12Aの説明を参照のこと。
【図１３Ａ】図13は、C1q結合阻害変異G236Rを有するまたは有さない抗DR5 IgG1-DR5-01-G56T-E430G-K439E＋C1q結合増強変異E333Sを有するまたは有さないIgG1-DR5-05-E430G-S440Kの（A）単一抗体バリアントまたは（B）抗体バリアントのアゴニスト混合物の、BxPC-3ヒト膵臓がん細胞に対するDR5媒介細胞傷害性を示す。3日間の生存率アッセイを実施し、CellTiter-Gloキットを使用して細胞生存率を判定した。
【図１３Ｂ】図13Aの説明を参照のこと。
【図１４】C1q結合調節変異G237A、G236R、A327K、K322EまたはP329Rを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430Gの抗体バリアントによるCDC活性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12-S440K（0％；示さない）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G（100％）に対して実施された。
【図１５Ａ】図15は、C1q結合阻害変異G236RまたはK322Aを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eの抗体バリアント（A、B、C）およびC1q結合増強変異E333Sを有する抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの抗体バリアント（D、E、F）のヒトFcRnへの結合を示す。FcRn ELISAを、5μg/mLのヒトFcRnのコート組換え細胞外ドメイン（FcRnhsECDHis-B2M-BIO）および抗体希釈系列を用いて実施した。結合した抗体の量をHRPコンジュゲートヤギ抗ヒトIgG1抗体および化学発光基質ABTSを用いて判定した。吸光度を405nmで測定した。
【図１５Ｂ】図15Aの説明を参照のこと。
【図１５Ｃ】図15Aの説明を参照のこと。
【図１５Ｄ】図15Aの説明を参照のこと。
【図１５Ｅ】図15Aの説明を参照のこと。
【図１５Ｆ】図15Aの説明を参照のこと。
【図１６Ａ】図16は、SCIDマウスにおける静脈内投与された抗体500μgのクリアランス率を示す。（A〜C）血漿試料中の総ヒトIgGをELISAによって判定し、（A）IgG1-CAMPATH-1Hバリアント、(B）IgG1-11B8バリアント、および（C）IgG1-CAMPATH-1Hバリアント＋IgG1-11B8バリアントの組み合わせについて濃度対時間曲線にプロットした。各データ点は、トリプリケート試料の平均＋/−標準偏差を表す。（D）抗体の投与後21日目までのクリアランスを、式D*1,000/AUC（式中、Dは注射用量であり、AUCは濃度-時間曲線の曲線下面積である）に従って決定した。
【図１６Ｂ】図16Aの説明を参照のこと。
【図１６Ｃ】図16Aの説明を参照のこと。
【図１６Ｄ】図16Aの説明を参照のこと。
【図１７Ａ】図17は、C1q結合阻害変異G236RまたはG237Tを有する固定化IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439EバリアントおよびC1q結合増強変異K326AまたはE333Sを有するIgG1-11B8-E430G-S440Kバリアントの、FcγRIIAアロタイプ131H（A）、FcγRIIAアロタイプ131R（B）、FcγRIIB（C）、FcγRIIIAアロタイプ158V（D）およびFcγRIIIAアロタイプ158F（E）の二量体Hisタグ化ビオチン化ECDへの結合をELISAアッセイで試験して示す。結合は、20μg/mLの抗体試料について、抗体なしの対照（バックグラウンド）およびIgG1-11B8-E430G-S440Kへの結合（100％）と相対的に提示される。検出は、ストレプトアビジン-ポリHRPおよびABTSを使用して実施した。
【図１７Ｂ】図17Aの説明を参照のこと。
【図１７Ｃ】図17Aの説明を参照のこと。
【図１７Ｄ】図17Aの説明を参照のこと。
【図１７Ｅ】図17Aの説明を参照のこと。
【図１８】C1q結合阻害変異（G236RまたはG237T）を有するまたは有さない抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋C1q結合増強変異E333Sを有するまたは有さないFcγR結合阻害変異G237Aを有する抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして、および40μg/mLのIgGでの溶解として提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【図１９Ａ】図19は、血液細胞のフローサイトメトリー解析によって判定された全血中のIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8のバリアントの組み合わせの選択的活性を示す。Y軸：エフェクター細胞の存在下で一晩（o/n）インキュベーションした後の、総リンパ球集団（CD66b陰性）のB細胞画分（CD19陽性/CD3陰性）またはT細胞画分（CD19陰性/CD3陽性）。X軸：異なる処置群。記号は、1ドナー当たり2つの別々のインキュベーションで試験された、5人の異なる健常ドナー由来の細胞を表す。（A）IgG1-11B8-G237A-E430G-S440Kと混合されたIgG1-CAMPATH-1H-G236R-E430G-K439Eの選択的活性。（B）IgG1-11B8-G237A-E430G-S440Kと混合された、追加のG237変異を含有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eバリアントの選択的活性。（C）追加のC1q結合増強E333S変異を含有するIgG1-11B8-G237A-E430G-S440Kと混合された、追加のG236RまたはG237変異を含有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eバリアントの選択的活性。（D）IgG1-11B8-G237A-E430G-S440Kと混合された追加の変異G236R、G237QまたはG237Rを有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eの共依存性抗体組み合わせと比較した、異なるB細胞ターゲティング抗体によるB細胞枯渇の深度。Y軸：上記の通り決定されたB細胞画分の対数スケール表示。
【図１９Ｂ】図19Aの説明を参照のこと。
【図１９Ｃ】図19Aの説明を参照のこと。
【図１９Ｄ】図19Aの説明を参照のこと。
【図２０−１】図20は、抗CD52成分中にC1q結合阻害変異および抗CD20成分中にC1q結合増強変異を有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439EおよびIgG1-11B8-E430G-S440K抗体バリアントの組み合わせによる、CD20およびCD52の異なる発現レベルを有する異なる細胞株に対するCDC活性の選択性を示す。インビトロCDCアッセイを、0.01〜40μg/mLの抗体を用いて、20％NHSの存在下、バーキットリンパ腫細胞株Daudi（A）、Raji（B）およびRamos（C）、ALL細胞株REH（D）、ならびにB細胞リンパ腫細胞株U-698-M（E）を使用して実施した。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして、および最大溶解として提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【図２０−２】図20-1の説明を参照のこと。
【図２０−３】図20-1の説明を参照のこと。
【図２０−４】図20-1の説明を参照のこと。
【図２０−５】図20-1の説明を参照のこと。
【図２０−６】図20-1の説明を参照のこと。
【図２０−７】図20-1の説明を参照のこと。
【図２０−８】図20-1の説明を参照のこと。
【図２０−９】図20-1の説明を参照のこと。
【図２０−１０】図20-1の説明を参照のこと。
【図２１】C1q結合阻害変異G236Rを有するまたは有さない抗CD37 IgG1-CD37-37.3-E430G-K439E＋C1q結合増強変異E333Sを有するまたは有さない抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。（A）Daudi細胞および（B）WIL2-S細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして、および40μg/mLのIgGでの溶解として提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CD37-37.3-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【図２２】（A）FcγR結合阻害変異およびC1q結合調節変異G236R、G237AまたはG237Tのいずれかと組み合わせた、Fc：Fc相互作用増強変異E430GまたはE345R、自己オリゴマー化阻害変異K439Eを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hの抗体バリアントの、ヒトリンパ腫細胞株Wien 133への結合を示す。抗体結合をフローサイトメトリーによって試験し、野生型IgG1-Campath-1HのBmax値（100％）に対して正規化して提示する。結合についての陰性対照として、非結合抗gp120抗体IgG1-b12を使用した。（B）C1q結合調節変異G236R、G237AまたはG237Tのいずれかと組み合わせた変異E430GおよびK439Eを有するIgG1-Campath-1H抗体バリアントによるRaji細胞への最大結合（Bmax）を、野生型IgG1-Campath-1Hの結合に対して正規化して示す。（C）C1q結合調節変異G236R、G237AまたはG237Tのいずれかと組み合わせた変異E430GおよびS440Kを有するIgG1-Campath-1H抗体バリアントのRaji細胞に結合する見かけのKd値。
【図２３Ａ】図23は、C1q結合調節変異K326AもしくはE333A（A）またはE333S、G237AもしくはG237A-E333S（B）のいずれかと組み合わせた、Fc-Fc相互作用増強変異E430G、自己オリゴマー化阻害変異S440Kを有する抗CD20 IgG1-11B8の抗体バリアントの、ヒトリンパ腫細胞株Rajiへの結合を示す。抗体結合をフローサイトメトリーによって試験し、野生型IgG1-11B8のBmax値（100％）に対して正規化して提示する。結合についての陰性対照として、非結合抗gp120抗体IgG1-b12を使用した。（C、D）C1q結合調節変異K326AもしくはE333A（C）またはE333S、G237AもしくはG237A-E333S（D）のいずれかと組み合わせた、変異E430GおよびS440Kを有するIgG1-11B8抗体バリアントによるRaji細胞への最大結合（Bmax）を、野生型IgG1-11B8の結合に対して正規化して示す。（E、F）C1q結合調節変異K326AもしくはE333A（E）またはE333S、G237AもしくはG237A-E333S（F）のいずれかと組み合わせた変異E430GおよびS440Kを有するIgG1-11B8抗体バリアントのRaji細胞に結合する見かけのKd値。
【図２３Ｂ】図23Aの説明を参照のこと。
【図２３Ｃ】図23Aの説明を参照のこと。
【図２３Ｄ】図23Aの説明を参照のこと。
【図２３Ｅ】図23Aの説明を参照のこと。
【図２３Ｆ】図23Aの説明を参照のこと。
【図２４Ａ】図24は、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hおよび抗CD20 IgG1-11B8抗体バリアントのFcRn結合を示す。（A、C）（A）pH 6.0または（C）pH 7.4で40μg/mLの抗体濃度を使用した、Fc-Fc相互作用増強変異E430G、自己オリゴマー化阻害変異K439EおよびC1q結合調節変異G237AまたはG237Tを有する抗CD52抗体IgG1-CAMPATH-1HのバリアントについてのヒトFcRnへの結合を示す。（B、D）（B）pH 6.0または（D）pH 7.4で40μg/mLの抗体濃度を使用した、Fc-Fc相互作用増強変異E430G、自己オリゴマー化阻害変異S440KおよびC1q結合調節変異K326A、E333A、G237AまたはG237A-E333Sを有する抗CD20抗体IgG1-11B8のバリアントによるヒトFcRnへの結合。FcRn ELISAを、2μg/mLのヒトFcRnのコート組換え細胞外ドメイン（FcRnECDHis-B2M-BIO）および抗体希釈系列を用いて実施した。結合した抗体の量をHRPコンジュゲートヤギ抗ヒトIgG1抗体および化学発光基質ABTSを用いて判定した。吸光度を405nmで測定した。
【図２４Ｂ】図24Aの説明を参照のこと。
【図２４Ｃ】図24Aの説明を参照のこと。
【図２４Ｄ】図24Aの説明を参照のこと。
【図２５Ａ】図25は、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hもしくは抗IgG1-11B8抗体バリアントまたはそれらの混合物を注射したマウスから収集された血液試料中で測定された場合の総ヒトIgG（hIgG）濃度を示す。（A）野生型IgG1-CAMPATH-1H、IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G237QまたはIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G236Rを注射したマウスから収集された血液試料中の総hIgG濃度。（B）野生型IgG1-11B8、IgG1-11B8-E430G-S440K-G237AまたはIgG1-11B8-E430G-S440K-E333Sを注射したマウスから収集された血液試料中の総hIgG濃度。（C）野生型IgG1-CAMPATH-1H＋IgG1-11B8の混合物または（A）および（B）のような変異を保有するIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8抗体バリアントの混合物を注射したマウスから収集された血液試料中の総hIgG濃度。すべての図面で、点線は、SCIDマウスにおける野生型IgG1抗体についての予測された経時的IgG1濃度を表す。（D）抗体の投与後21日目までのクリアランスを、式D*1000/AUC（式中、Dは注射用量であり、AUCは濃度-時間曲線の曲線下面積である）に従って決定した。
【図２５Ｂ】図25Aの説明を参照のこと。
【図２５Ｃ】図25Aの説明を参照のこと。
【図２５Ｄ】図25Aの説明を参照のこと。
【図２６Ａ】図26は、変異E430G、K439EまたはS440KおよびG236R、G237A、G237QまたはG237Rを保有するIgG1-CAMPATH-1H、IgG1-11B8およびIgG1-b12の抗体バリアントとインキュベートした試料中で検出されたC4dの、抗体を含有しない陰性対照試料中で検出された平均C4d濃度の減算後の濃度（μg/ml単位）を示す。陽性対照試料は、Fc-Fc相互作用増強変異E345R、E430GおよびS440Y（RGY）を保有する抗体バリアントを含む。
【図２６Ｂ】図26Aの説明を参照のこと。
【図２７Ａ】図27は、補体供給源としての正常ヒト血清と氷上でインキュベートしたWien 133細胞へのC1q結合を、変異E430G、K439EまたはS440KおよびG236R、G237T、K326AまたはE333Sを保有する抗体IgG1-CAMPATH-1H、IgG1-11B8およびIgG1-b12のバリアントでのオプソニン化後、フローサイトメトリーによって検出して示す。平均蛍光強度値は、対数アゴニスト応答モデルを適合させることによって推定された抗体なしの対照反応（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物の最高レベル（100％）に対して正規化された。（A）対照反応のC1q結合。（B〜D）非結合対照IgG1-b12または異なるIgG1-11B8バリアントと混合された、（B）IgG1-CAMPATH-E430G-K439E、(C）IgG1-CAMPATH-E430G-K439E-G236R、および（D）IgG1-CAMPATH-E430G-K439E-G237RのC1q結合。
【図２７Ｂ】図27Aの説明を参照のこと。
【図２７Ｃ】図27Aの説明を参照のこと。
【図２７Ｄ】図27Aの説明を参照のこと。
【図２８Ａ】図28は、自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440KおよびC1q結合調節変異を保有するIgG1-CAMPATH-1H-E430GおよびIgG1-11B8-E430G抗体バリアントによるFcγR結合を示す。（A〜E）（A）高親和性アロタイプFcγRIIA 131H、(B）低親和性アロタイプFcγRIIA 131R、(C）FcγRIIB、(D）高親和性アロタイプFcγRIIIA 158V、または（E）低親和性アロタイプFcγRIIIA 158Fの、ELISAアッセイで試験した場合の二量体Hisタグ化ビオチン化ECDへの固定化抗体バリアントの結合。（F）ELISAで試験した抗体バリアントへの固定化FcγRIaの結合。結合は、20μg/mLの抗体試料について提示され、一次抗体なしでインキュベートしたウェル中のシグナルの減算後、野生型IgG1-CAMPATH-1Hについて観察された平均シグナル（100％）に対して実験毎に正規化された。検出は、ストレプトアビジン-ポリHRPおよびABTSを使用して実施した。
【図２８Ｂ】図28Aの説明を参照のこと。
【図２８Ｃ】図28Aの説明を参照のこと。
【図２８Ｄ】図28Aの説明を参照のこと。
【図２８Ｅ】図28Aの説明を参照のこと。
【図２８Ｆ】図28Aの説明を参照のこと。
【図２９Ａ】図29は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を調節する変異の導入による、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H、抗CD20 IgG1-11B8および抗CD52 IgG1-h2E8の混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、3つの独立した実験で測定し、（A）非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して正規化された平均AUC、ならびに（B）40μg/mlの抗体濃度でのヨウ化プロピジウム陽性によって判定された平均溶解率として提示される。
【図２９Ｂ】図29Aの説明を参照のこと。
【図３０Ａ】図30（A、B）は、表示の通りの自己オリゴマー化阻害変異およびC1q結合調節変異を保有する、単剤および組み合わせた抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G、抗CD20 IgG1-11B8-E430G、および非抗原結合IgG1-b12-E430G抗体バリアントのCDC有効性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して正規化されたAUCとして提示される。
【図３０Ｂ】図30Aの説明を参照のこと。
【図３０Ｃ】図30Aの説明を参照のこと。
【図３０Ｄ】図30Aの説明を参照のこと。
【図３１】（A）FcγRIIaまたは（B）FcγRIIIaのいずれかを安定発現するJurkatレポーター細胞株の活性化を、Rajiリンパ腫細胞と異なる濃度のIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8抗体バリアントと共培養した際の発光（RLU）のレベルによって測定して示す。発光値は、IgG1-b12について観察された発光値（0％）および野生型IgG1-Campath-1H＋野生型IgG1-11B8について観察された発光値（100％）に対して実験毎に正規化された後、3つ（FcγRIIa）または2つ（FcγRIIIa）の実験レプリケートで平均された。
【図３２】Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を調節する変異を保有するIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8抗体バリアントの非等モル比の混合物によって誘導されたWien 133細胞に対する共依存性CDCを示す。（A）等モルおよび非等モル濃度比のIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G236RおよびIgG1-11B8-E430G-S440K-G237Aを含有する混合物によって誘導された共依存性CDC。（B）等モルおよび非等モル濃度比のIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G237QおよびIgG1-11B8-E430G-S440K-G237Aを含有する混合物によって誘導された共依存性CDC。
【図３３】Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を阻害する変異の導入による、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hの抗体バリアントと抗HLA-DR IgG1-HLA-DR-huL243バリアント（A）または抗HLA-DR IgG1-HLA-DR-1D09C3バリアント（B）のいずれかとの混合物によるCDC活性の選択性を示す。Oci-Ly17細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）および（A）IgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-HLA-DR-huL243-E430Gの混合物（100％）または（B）IgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-HLA-DR-1D09C3-E430Gの混合物（100％）に対して正規化されたAUCとして提示される。
【図３４】Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を阻害する変異の導入による、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hおよび抗CD20 IgG1-11B8の混合抗体バリアントの選択的共依存性CDC活性を示す。CDC有効性を、変異L234A、L234A-L235A、L234F、L234F-L235E、L235A、L235Q、G236RまたはG237Qのいずれかを有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eのバリアント、およびこれらのバリアントと非結合対照抗体IgG1-b12またはIgG1-11B8-E430G-S440Kのいずれかとの混合物について示す。CDC有効性は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して正規化されたAUCとして提示される。
【図３５Ａ】図35は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を阻害する変異の導入による、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hおよび抗CD20 IgG1-11B8の混合抗体バリアントの選択的共依存性CDC活性を示す。（A）Fc-Fc相互作用増強変異E430G、E430N、E430T、E430V、E430Y、E345A、E345K、E345Q、E345RまたはE345Y、自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440KおよびC1q結合阻害変異G236RまたはG237Aを保有するIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8の抗体バリアントの単剤またはそれらの混合物としてのCDC有効性。（B）Fc-Fc相互作用増強変異E430G、E430N、E430T、E430V、E430Y、E345A、E345Q、E345VまたはE345Y、自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440KおよびC1q結合阻害変異G236RまたはG237Aを保有するIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8の抗体バリアントの単剤またはそれらの混合物としてのCDC有効性。（C）一致するFc-Fc相互作用増強変異E430G、E430N、E430T、E430V、E430Y、E345A、E345Q、E345VまたはE345Y、自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440KおよびC1q結合阻害変異G236RまたはG237Aを保有するIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8の抗体バリアントの単剤またはそれらの混合物としてのCDC有効性。（D）Fc-Fc相互作用増強変異E430GまたはK248E-T437R、自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440KおよびC1q結合調節変異G236R、G237AまたはE333Sを保有するIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8の抗体バリアントの単剤またはそれらの混合物としてのCDC有効性。CDC有効性は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して正規化されたAUCとして提示される。
【図３５Ｂ】図35Aの説明を参照のこと。
【図３５Ｃ】図35Aの説明を参照のこと。
【図３５Ｄ】図35Aの説明を参照のこと。
【図３６Ａ】図36は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を調節する変異を保有するIgG1-CD37-37-3およびIgG1-11B8抗体バリアントの混合物によって誘導されたRajiリンパ腫細胞に対する共依存性CDCを示す。（A）表示の抗体バリアントの希釈物またはそれらの混合物によって誘導された細胞溶解の、最小溶解（IgG1-b12で0％）および最大溶解（IgG1-CD37-37-3-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物で100％）に対して正規化された相対曲線下面積（AUC）。（B）表示の抗体バリアントおよびそれらの混合物によって誘導された最大溶解率。
【図３６Ｂ】図36Aの説明を参照のこと。
【図３７Ａ】図37は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を調節する変異の導入による、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hおよび抗CD20 IgG1-11B8の混合抗体バリアントの選択的共依存性CDC活性を示す。患者CLL試料を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、抗体バリアントとインキュベーションした際の生存B細胞のパーセンテージとして提示される。患者1（A）、2（B）および3（C）由来のCLL試料を使用した結果を示す。
【図３７Ｂ】図37Aの説明を参照のこと。
【図３７Ｃ】図37Aの説明を参照のこと。
【図３８Ａ】図38は、全血試料と、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を調節する変異を保有するIgG1-CAMPATH-1H、IgG1-huCLB-T3/4およびIgG1-CD5-INSERMの抗体バリアントの混合物とのインキュベーション後のフローサイトメトリーによって検出された、B細胞、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞の画分を示す。表示のIgG1-CAMPATH-1H、IgG1-huCLB-T3/4およびIgG1-b12抗体バリアントとのインキュベーション後の4人のドナーの全血試料中で検出された、（A）B細胞、(B）CD4+ T細胞および（C）CD8+ T細胞のパーセンテージ。表示のIgG1-CAMPATH-1H、IgG1-CD5-INSERMおよびIgG1-b12抗体バリアントとのインキュベーション後の4人のドナーの全血試料中で検出された、（D）B細胞、(E）CD4+ T細胞および（F）CD8+ T細胞のパーセンテージ。分率を［100％×（試料中の細胞数/「抗体なしの試料」中の細胞数）×（「抗体なしの試料」中の顆粒球数/試料中の顆粒球数）］として算出した。
【図３８Ｂ】図38Aの説明を参照のこと。
【図３８Ｃ】図38Aの説明を参照のこと。
【図３８Ｄ】図38Aの説明を参照のこと。
【図３８Ｅ】図38Aの説明を参照のこと。
【図３８Ｆ】図38Aの説明を参照のこと。
【図３９】Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を阻害する（G237T）または増強する（K326W-E333S）変異を保有する抗DR4および抗DR5抗体バリアントによる、がん細胞におけるプログラム細胞死の協同的活性化を示す。（A）表示の抗体バリアントと72時間インキュベーションした後のBxPC-3ヒト膵臓がん細胞の生存率。（B）表示の抗体バリアントと72時間インキュベーションした後のCOLO 205ヒト結腸がん細胞の生存率。生存細胞のパーセンテージを、以下の式を使用して算出した：生存細胞％＝［（抗体試料の発光−スタウロスポリン試料の発光）/（抗体なしの試料の発光−スタウロスポリン試料の発光）］＊100。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
発明の詳細な説明
本発明の態様の説明において、明瞭さのために特定の専門用語を使用する。しかしながら、本発明は、そのように選択した特定の用語に限定されることを意図せず、特定の各用語は、同様の目的を達成するために同様の様式で機能するあらゆる技術的等価物を包含することを理解されたい。
【００４５】
定義
「親抗体」という用語は、本発明によるC1q結合調節置換を有しない点を除き、本発明による抗体と同一である抗体として理解される。従って、親抗体は、Fc-Fc増強置換および自己オリゴマー化阻害置換を有していてもよい。「C1q結合調節置換」という用語は、位置G237におけるアミノ酸の1個の置換、もしくはG236R、G236K、K322A、E269K、K322E、およびP329Rからなる群より選択される1個もしくは複数個の置換のような、C1q結合を阻害し得る置換、またはK326A、K326W、E333A、およびE333Sからなる群より選択される1個もしくは複数個の置換のような、C1q結合を増強し得る置換として理解される。
【００４６】
用語「免疫グロブリンのFc領域と結合領域とを含むポリペプチド」は、本発明との関連において、免疫グロブリンのFc領域と、例えば細胞、細菌、またはビリオン上に存在する任意の分子、例えばポリペプチドに対する結合能を有する結合領域とを含むポリペプチドをいう。免疫グロブリンのFc領域は、典型的にはパパイン（これは当業者に公知である）での抗体の消化後に生成し得る抗体断片であって、免疫グロブリンの2つのCH2-CH3領域と連結領域、例えばヒンジ領域とを含む抗体断片と定義される。抗体重鎖の定常ドメインによって抗体アイソタイプ、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD、またはIgEが規定される。Fc領域は、Fc受容体と称される細胞表面受容体および補体系のタンパク質とともに、抗体のエフェクター機能を媒介する。結合領域は、ポリペプチド配列、例えばタンパク質、タンパク質リガンド、受容体、抗原結合領域、または細胞、細菌、もしくはビリオンに対する結合能を有するリガンド結合領域であり得る。結合領域が例えば受容体である場合、「免疫グロブリンのFc領域と結合領域とを含むポリペプチド」は、免疫グロブリンのFc領域と結合領域との融合タンパク質として調製されたものであってもよい。結合領域が抗原結合領域である場合、「免疫グロブリンのFc領域と結合領域とを含むポリペプチド」は、キメラ、ヒト化、もしくはヒト抗体などの抗体または重鎖のみの抗体またはScFv-Fc融合体であり得る。免疫グロブリンのFc領域と結合領域とを含むポリペプチドは典型的には、連結領域、例えばヒンジ領域と免疫グロブリンの重鎖の2つのCH2-CH3領域とを含むものであり得、したがって、「免疫グロブリンのFc領域と結合領域とを含むポリペプチド」は、「少なくとも免疫グロブリンのFc領域と結合領域とを含むポリペプチド」であり得る。用語「免疫グロブリンのFc領域」は、本発明との関連において、免疫グロブリン、例えばヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA1、IgGA2、IgM、またはIgEの抗体のサブタイプに応じた連結領域、例えばヒンジとCH2およびCH3領域とが存在していることを意味する。ポリペプチドはヒト起源に限定されず、例えばマウスまたはカニクイザル起源などの任意の起源であり得る。用語「野生型Fc領域」は、本発明においては、天然に生じる通りのアミノ酸配列を有する免疫グロブリンFc領域を意味する。
【００４７】
用語「ヒンジ領域」は、本明細書で用いる場合、免疫グロブリン重鎖のヒンジ領域を指すことを意図する。したがって、例えば、ヒトIgG1抗体のヒンジ領域は、EUナンバリングによるアミノ酸216〜230に対応する。
【００４８】
用語「CH2領域」または「CH2ドメイン」は、本明細書で用いる場合、免疫グロブリン重鎖のCH2領域を指すことを意図する。したがって、例えば、ヒトIgG1抗体のCH2領域は、EUナンバリングによるアミノ酸231〜340に対応する。しかしながら、CH2領域はまた、本明細書に記載のその他の任意のサブタイプのものであってもよい。
【００４９】
用語「CH3領域」または「CH3ドメイン」は、本明細書で用いる場合、免疫グロブリン重鎖のCH3領域を指すことを意図する。したがって、例えば、ヒトIgG1抗体のCH3領域は、EUナンバリングによるアミノ酸341〜447に対応する。しかしながら、CH3領域はまた、本明細書に記載のその他の任意のサブタイプのものであってもよい。
【００５０】
用語「免疫グロブリン」は、1対の低分子量の軽（L）鎖と1対の重（H）鎖の2対のポリペプチド鎖からなり、これらの4つすべてがジスルフィド結合によって強力に相互連結されている、構造的に関連している一類型の糖タンパク質を指す。免疫グロブリンの構造は充分に特徴づけられている。例えば、Fundamental Immunology Ch.7（Paul, W., ed., 2nd ed.Raven Press, N.Y.（1989））を参照のこと。簡単には、各重鎖は典型的には、重鎖可変領域（本明細書においてVHと略記）と重鎖定常領域とで構成されている。重鎖定常領域は典型的には、3つのドメインCH1、CH2、およびCH3で構成されている。重鎖同士は、いわゆる「ヒンジ領域」でジスルフィド結合によって相互連結されている。各軽鎖は典型的には、軽鎖可変領域（本明細書においてVLと略記）と軽鎖定常領域とで構成されている。軽鎖定常領域は典型的には、1つのドメインCLで構成されている。VH領域とVL領域は、超可変性の領域（または超可変領域、これは、配列および/または構造で規定されるループの形態が超可変的であり得る）であって相補性決定領域（CDR）とも称される領域と、散在する、より保存されたフレームワーク領域（FR）と称される領域とにさらに細分され得る。各VHおよびVLは典型的には、3つのCDRと4つのFRで構成されており、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順に配列されている:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4（Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196, 901 917（1987）も参照のこと）。特に記載のない限り、あるいは文脈と矛盾しない限り、本明細書におけるCDR配列は、DomainGapAlign (Lefranc MP., Nucleic Acids Research 1999;27:209-212 and Ehrenmann F., Kaas Q. and Lefranc M.-P. Nucleic Acids Res., 38, D301-307 (2010); インターネットhttpアドレスwww.imgt.org/も参照されたい)を用いたIMGT規則に従って同定される。特に記載のない限り、あるいは文脈と矛盾しない限り、本明細書におけるFc領域/Fcドメイン内のアミノ酸位置に対する言及はEUナンバリングに従う（Edelman et al., Proc Natl Acad Sci U S A.1969 May;63（1）:78-85;Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest.5th Edition - 1991 NIH Publication No.91-3242）。
【００５１】
用語「抗体」（Ab）は、本発明との関連において、抗原に対して特異的に結合する能力を有する免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子の断片、またはこれらのいずれかの誘導体をいう。本発明の抗体は、免疫グロブリンのFcドメインと抗原結合領域とを含む。抗体は一般的に、2つのCH2-CH3領域と連結領域、例えばヒンジ領域、例えば、少なくともFcドメインとを含む。したがって、本発明の抗体はFc領域と抗原結合領域とを含むものであり得る。免疫グロブリン分子の重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常または「Fc」領域は、宿主の組織または要素、例えば、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および補体系の成分、例えば、補体活性化の古典的経路の第1成分であるC1qに対する免疫グロブリンの結合を媒介し得る。また、抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体または同様の分子であってもよい。用語「二重特異性抗体」は、少なくとも2種類の異なる、典型的には重複しないエピトープに対する特異性を有する抗体をいう。かかるエピトープは、同じ標的上に存在するものであっても異なる標的上に存在するものであってもよい。エピトープが異なる標的上に存在する場合、かかる標的は同じ細胞上に存在するものであってもよく、異なる細胞上または細胞型に存在するものであってもよい。上記のように、特に記載のない限り、あるいは文脈と明らかに矛盾しない限り、本明細書における抗体という用語は、Fc領域の少なくとも一部分を含んでおり、抗原に対して特異的に結合する能力を保持している抗体断片を包含する。かかる断片は、任意の公知の手法、例えば酵素的切断、ペプチド合成、および組換え発現手法によって得ることができる。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によっても発揮され得ることが示されている。用語「Ab」または「抗体」に包含される結合断片の例としては、非限定的に、一価抗体（GenmabによるWO2007059782に記載）;2つの重鎖のみからなり、例えばラクダ科の動物に天然に存在する重鎖抗体（例えば、Hamers-Casterman（1993）Nature 363:446）;ThioMabs（Roche, WO2011069104）、非対称である鎖交換改変操作ドメイン（SEEDまたはSeed-body）および二重特異性抗体様分子（Merck, WO2007110205）;Triomab（Pharma/Fresenius Biotech, Lindhofer et al.1995 J Immunol 155:219;WO2002020039）;FcΔAdp（Regeneron, WO2010151792）、Azymetric Scaffold（Zymeworks/Merck, WO2012/058768）、mAb-Fv（Xencor, WO2011/028952）、Xmab（Xencor）、二重可変ドメイン免疫グロブリン（Abbott, DVD-Ig,米国特許第7,612,181号）;二重ドメインダブルヘッド抗体（Unilever;Sanofi Aventis, WO20100226923）、ジ-ダイアボディ（ImClone/Eli Lilly）、ノブ・イントゥ・ホール（Knobs-into-holes）による抗体フォーマット（Genentech, WO9850431 ）;DuoBody（Genmab, WO 2011/131746）;二重特異性IgG1およびIgG2（Pfizer/ Rinat, WO11143545）、DuetMab（MedImmune, US2014/0348839）、静電的ステアリング（Electrostatic steering）抗体フォーマット（Amgen, EP1870459およびWO 2009089004;Chugai, US201000155133;Oncomed, WO2010129304A2）;二重特異性IgG1およびIgG2（Rinat neurosciences Corporation, WO11143545）、CrossMAb（Roche, WO2011117329）、LUZ-Y（Genentech）、Biclonic（Merus, WO2013157953）、二重ターゲティングドメイン抗体（GSK/Domantis）、2つの標的を認識するTwo-in-one AntibodiesまたはDual action Fab（Genentech, NovImmune、Adimab）、架橋型Mab（Karmanos Cancer Center）、共有結合融合mAb（AIMM）、CovX-body（CovX/Pfizer）、FynomAb（Covagen/Janssen ilag）、DutaMab（Dutalys/Roche）、iMab（MedImmune）、IgG様二重特異性（ImClone/Eli Lilly, Shen, J., et al.J Immunol Methods, 2007.318（1-2）:p.65-74）、TIG-body、DIG-bodyおよびPIG-body（Pharmabcine）、二重親和性再ターゲティング分子（Fc-DARTまたはIg-DART, Macrogenics, WO/2008/157379, WO/2010/080538）、BEAT（Glenmark）、Zybody（Zyngenia）、一般的な軽鎖を用いたアプローチ（Crucell/ Merus, US7262028）または一般的な重鎖を用いたアプローチ（NovImmuneによるκλBody, WO2012023053）、ならびにFc領域を含む抗体断片と融合させたポリペプチド配列を含む融合タンパク質、例えばscFv融合体、例えばZymoGenetics/BMSによるBsAb、Biogen IdecによるHERCULES（US007951918）、Emergent BioSolutions/TrubionおよびZymogenetics/BMSによるSCORPIONS、Ts2Ab（MedImmune/AZ（Dimasi, N., et al.J Mol Biol, 2009.393（3）:p.672-92）、Genetech/RocheによるscFv融合体、NovartisによるscFv融合体、ImmunomedicsによるscFv融合体、Changzhou Adam Biotech IncによるscFv融合体（CN 102250246）、RocheによるTvAb（WO 2012025525, WO 2012025530）、f-StarによるmAb2（WO2008/003116）、ならびに二重scFv融合体が挙げられる。また、抗体という用語は、特に記載のない限り、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（例えば、ヒトモノクローナル抗体）、例えば、Symphogen and Merusが利用した技術によって得られる抗体混合物（組換えポリクローナル抗体）（Oligoclonics）、WO2015/158867に記載のような多量体型Fcタンパク質、WO2014/031646に記載のような融合タンパク質、ならびに抗体様ポリペプチド、例えばキメラ抗体およびヒト化抗体も包含することも理解されたい。作製される抗体は潜在的に任意のアイソタイプを有し得る。
【００５２】
用語「完全長抗体」は、本明細書で用いる場合、そのアイソタイプの野生型抗体に通常みられるものに対応する重鎖と軽鎖の定常ドメインおよび可変ドメインのすべてを含む抗体（例えば親抗体）をいう。
【００５３】
用語「ヒト抗体」は、本明細書で用いる場合、ヒト生殖細胞系列型免疫グロブリン配列に由来する可変領域と定常領域とを有する抗体を包含することを意図する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列型免疫グロブリン配列にコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロでランダムもしくは部位特異的変異誘発によって、またはインビボで体細胞変異導入された変異、挿入、または欠失）を含んでもよい。しかしながら、用語「ヒト抗体」は、本明細書で用いる場合、別の哺乳動物種、例えばマウスの生殖細胞系列型に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列にグラフトされている抗体を包含することは意図しない。
【００５４】
用語「キメラ抗体」は、本明細書で用いる場合、両方の鎖型（即ち重鎖および軽鎖）が抗体の改変操作の結果としてキメラである抗体をいう。キメラ鎖は、ヒト起源の定常領域に連結された外来可変ドメイン（起源が非ヒト種であるか、または合成もしくはヒトを含む任意の種から改変操作されたもの）を含む鎖である。
【００５５】
用語「ヒト化抗体」は、本明細書で用いる場合、両方の鎖型が抗体の改変操作の結果としてヒト化されている抗体をいう。ヒト化鎖は典型的には、可変ドメインの相補性決定領域（CDR）は外来である（起源がヒト以外の種または合成である）が、鎖の残部はヒト起源のものである鎖である。ヒト化の評価は、方法論自体ではなく、得られるアミノ酸配列に基づくので、グラフト以外のプロトコルを使用することが可能である。
【００５６】
用語「モノクローナル抗体」、「モノクローナルAb」、「モノクローナル抗体組成物」、「mAb」などは、本明細書で用いる場合、単分子組成のAb分子の調製物をいう。モノクローナル抗体組成物は、ある特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す。したがって、用語「ヒトモノクローナル抗体」は、ヒト生殖細胞系列型免疫グロブリン配列に由来する可変領域と定常領域とを有する単一結合特異性を示すAbをいう。ヒトmAbはハイブリドーマによって生成させ得、ハイブリドーマは、ヒト重鎖導入遺伝子レパートリーと軽鎖導入遺伝子レパートリーとを含み、機能性ヒト抗体を産生するように再編成されたゲノムを有するトランスジェニックまたは染色体導入非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得られ、不死化細胞と融合させたB細胞を含む。
【００５７】
用語「アイソタイプ」は、本明細書で用いる場合、重鎖定常領域遺伝子にコードされている免疫グロブリンクラス（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA1、IgGA2、IgE、もしくはIgM、またはその任意のアロタイプ、例えばIgG1m（za）およびIgG1m（f））をいう。さらに、各重鎖アイソタイプは、カッパ（κ）またはラムダ（λ）のいずれかの軽鎖と結合され得る。本明細書で用いる用語「混合アイソタイプ」は、あるアイソタイプの構造形体を別のアイソタイプに由来する類似領域と結合し、それによりハイブリッドアイソタイプを生じさせることにより得られる免疫グロブリンのFc領域をいう。混合アイソタイプは、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA1、IgGA2、IgE、またはIgMから選択される2種類以上のアイソタイプで構成された配列を有するFc領域を含むものであってもよく、それにより、例えば、IgG1/IgG3、IgG1/IgG4、IgG2/IgG3、IgG2/IgG4、またはIgG1/IgAなどの組合せが生成され得る。
【００５８】
用語「抗原結合領域」、「抗原に結合する領域」、「結合領域」、または抗原結合ドメインは、本明細書で用いる場合、抗原に対する結合能を有する抗体領域をいう。この結合領域は典型的には抗体のVHおよびVLドメインによって規定される。VHおよびVLドメインは、超可変性の領域（または超可変領域、これは、配列および/または構造で規定されるループの形態が超可変的であり得る）であって相補性決定領域（CDR）とも称される領域と、散在する、より保存されたフレームワーク領域（FR）と称される領域とにさらに細分され得る。抗原は、例えば細胞、細菌、またはビリオン上に存在する任意の分子、例えばポリペプチドであり得る。
【００５９】
用語「標的」は、本明細書で用いる場合、抗体の抗原結合領域が結合する分子をいう。標的としては、生成された抗体が向かう任意の抗原が挙げられる。用語「抗原」および「標的」は、抗体に関連して互換的に用いられ、本発明の任意の局面または態様に関して同じ意味および目的を構成し得る。
【００６０】
用語「エピトープ」は、抗体可変ドメインに対する特異的結合能を有する分子決定基を意味する。エピトープは通常、表面分子群、例えばアミノ酸、糖側鎖、またはその組合せからなり、通常、特異的な三次元の構造的特徴ならびに特異的な荷電特徴を有する。立体構造エピトープと非立体構造エピトープは、前者に対する結合は変性溶媒の存在下で失われるが後者に対する結合は失われないという点で区別される。エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基（エピトープの免疫優性成分とも称される）および結合に直接関与しない他のアミノ酸残基を含み得る。
【００６１】
本発明の「抗体」または「抗体バリアント」または「親抗体のバリアント」とは、「親抗体」と比べて1つまたは複数の変異を含む抗体分子である。これらの異なる用語は互換的に用いられ、本発明の任意の局面または態様に関して同じ意味および目的を構成し得る。例示的な親抗体フォーマットとしては、野生型抗体、完全長抗体もしくはFc含有抗体断片、二重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、限定されない。これらの異なる用語は互換的に用いられ、本発明の任意の局面または態様に関して同じ意味および目的を構成し得る。アミノ酸置換は、天然アミノ酸が、天然に存在する別のアミノ酸または天然に存在しないアミノ酸誘導体に交換され得る。アミノ酸置換は保存的であっても非保存的であってもよい。本発明との関連において、保存的置換は、以下の3つの表のうちの1つまたは複数に示されるアミノ酸クラス内での置換によって規定され得る。
【００６２】
保存的置換についてのアミノ酸残基のクラス
2021522303.tif 000002
【００６３】
代替的な保存的アミノ酸残基置換のクラス
2021522303.tif 000003
【００６４】
アミノ酸残基の代替的な物理的・機能的分類
2021522303.tif 000004
【００６５】
本発明との関連において、バリアントにおける置換は、
本来のアミノ酸 - 位置 - 置換されたアミノ酸
として示し;
コードXaaおよびXを含む3文字コードまたは1文字コードを使用してアミノ酸残基を示す。したがって、表記「E345R」または「Glu345Arg」は、バリアントが、バリアントにおいて親抗体の345位のアミノ酸に対応するアミノ酸位置にグルタミン酸のアルギニンでの置換を含むことを意味する。
【００６６】
位置そのものは抗体に存在しないが、バリアントがアミノ酸の挿入を含む場合、例えば、
位置 - 置換されたアミノ酸、例えば「448E」という表記を使用する。
【００６７】
かかる表記は、一連の相同なポリペプチドまたは抗体における1つまたは複数の修飾との関連において特に関係がある。
【００６８】
同様に、1つまたは複数の置換アミノ酸残基の実体が重要でない場合は、
本来のアミノ酸 - 位置、すなわち「E345」と表す。
【００６９】
1つまたは複数の本来のアミノ酸および/あるいは1つまたは複数の置換されたアミノ酸が、1つより多いが全部ではないアミノ酸を含み得る修飾、345位におけるグルタミン酸が、アルギニン、リジン、またはトリプトファンになる場合、
「Glu345Arg,Lys,Trp」または「E345R,K,W」または「E345R/K/W」または「E345 to R, K or W」
が、本発明との関連において互換的に使用され得る。
【００７０】
さらに、用語「置換」は、その他の19種類の天然アミノ酸のうちのいずれか1つ、または他のアミノ酸、例えば非天然アミノ酸への置換を包含する。例えば、345位のアミノ酸Eの置換には、置換345A、345C、345D、345G、345H、345F、345I、345K、345L、345M、345N、345P、345Q、345R、345S、345T、345V、345W、および345Yの各々が包含される。これは345Xという表示と等価であり、ここで、Xは任意のアミノ酸を示す。また、このような置換は、E345A,E345Cなど、またはE345A,Cなど、ならびにE345A/C/などとも表示され得る。同じことが、本明細書に記載のいずれの位置にも同様にあてはまり、かかる置換の任意の1つが本明細書において具体的に包含される。
【００７１】
本明細書で用いる場合、用語「エフェクター細胞」は、免疫応答の認識相や活性化相に対して、免疫応答のエフェクター相に関与する免疫細胞をいう。例示的な免疫細胞としては、骨髄系統またはリンパ系統が起源の細胞、例えば、リンパ球（例えば、B細胞およびT細胞、例えば細胞傷害性T細胞（CTL））、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、単球、好酸球、多形核細胞、例えば好中球、顆粒球、肥満細胞、および好塩基球が挙げられる。一部のエフェクター細胞はFc受容体（FcR）または補体受容体を発現し、特異的免疫機能を発揮する。一部の態様では、例えばナチュラルキラー細胞などのエフェクター細胞はADCC誘導能を有する。例えば、FcRを発現する単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、およびクッパー細胞は、標的細胞の特異的死滅および免疫系の他の成分への抗原提示、または抗原を提示する細胞への結合に関与する。一部の態様では、ADCCは、抗体駆動型古典的補体活性化によってさらに増強され、標的細胞上への活性化C3断片の沈着をもたらし得る。C3切断産物は、骨髄系細胞上に発現される補体受容体（CR）、例えばCR3のリガンドである。エフェクター細胞上のCRによる補体断片の認識は、増強されたFc受容体媒介性ADCCを促進させ得る。一部の態様では、抗体駆動型古典的補体活性化により、標的細胞上にC3断片がもたらされる。このようなC3切断産物は、直接補体依存性細胞傷害（CDCC）を促進させ得る。一部の態様では、エフェクター細胞が標的抗原、標的粒子、または標的細胞を貪食し得る。エフェクター細胞上における特定のFcRまたは補体受容体の発現は、体液因子、例えばサイトカインによって調節され得る。例えば、FcγRIの発現は、インターフェロンγ（IFN γ）および/またはG-CSFによって上方調節されることがわかっている。この増強された発現により、標的に対するFcγRI担持細胞の細胞傷害活性が増大する。エフェクター細胞は標的抗原を貪食し得るか、または標的細胞を貪食して溶解させ得る。一部の態様では、抗体駆動型古典的補体活性化により、標的細胞上にC3断片がもたらされる。このようなC3切断産物は、エフェクター細胞による貪食を直接、または抗体媒介性貪食を増強させることにより間接的に促進させ得る。
【００７２】
用語「Fcエフェクター機能」または「Fcによって媒介されるエフェクター機能」は、本明細書で用いる場合、ポリペプチドまたは抗体が細胞膜上のその標的、例えば抗原に結合することの結果である機能を指すことを意図し、ここで、Fcエフェクター機能は、ポリペプチドまたは抗体のFc領域によるものである。Fcエフェクター機能の例としては、（i）C1q結合、（ii）補体活性化、（iii）補体依存性細胞傷害（CDC）、（iv）抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ADCC）、（v）Fcガンマ受容体結合、（vi）抗体依存性細胞貪食（ADCP）、（vii）補体依存性細胞傷害（CDCC）、（viii）補体増強型細胞傷害、（ix）オプソニン化抗体の、該抗体によって媒介される補体受容体に対する結合、（x）オプソニン化、および（xi）任意の（i）〜（x）の組合せが挙げられる。
【００７３】
用語「クラスタリング依存性機能」は、本明細書で用いる場合、任意で細胞上、細胞膜上、ビリオン上、または別の粒子上の抗原に結合したポリペプチドまたは抗体のオリゴマー化後の抗原複合体の形成の結果である機能を指すことを意図する。クラスタリング依存性エフェクター機能の例としては、（i）抗体オリゴマー形成、（ii）抗体オリゴマー安定性、（iii）抗原オリゴマー形成、（iv）抗原オリゴマー安定性、（v）アポトーシスの誘導、（vi）増殖の調節、例えば増殖の低減、阻害、または刺激、および（vii）任意の（i）〜（vi）の組合せが挙げられる。
【００７４】
「アゴニスト（agonistic）」という用語は、本明細書中で使用されるように、細胞内シグナリングなどの生物学的応答をもたらす細胞膜上の受容体の刺激または活性化として理解される。そのようなアゴニスト効果は、アポトーシス（プログラム細胞死）の誘導または免疫細胞の活性化または細胞内経路の活性化をもたらし得る。
【００７５】
アゴニスト活性または増加したアゴニスト活性は、細胞内デスドメインを発現する標的に対する抗体について、以下の工程を使用して、実施例16に記載されるように、生存度アッセイにおいて決定され得る：
（i）抗体に対応する標的、例えばDR5を発現する細胞株を、96穴平底プレートに37℃で一晩播種する工程、
（ii）抗体、例えば抗DR5抗体のある範囲（0.0003〜20,000ng/mL）の段階希釈物を添加し、37℃で3日間インキュベートする工程、
（iii）例えばCellTiter-Glo発光細胞生存度アッセイの使用によって、ATPの存在を定量することによって、細胞生存度を決定する工程、
（iv）式：生細胞％＝[(抗体試料の発光 - スタウロスポリン試料の発光)/(抗体を含まない試料の発光 - スタウロスポリン試料の発光)]＊100を使用して生細胞を計算する工程。
【００７６】
アゴニスト活性または増加したアゴニスト活性は、細胞内シグナリング経路を活性化する標的に対する抗体について、以下の工程を使用して、実施例29、30、31、および32に記載されるように、レポーターアッセイにおいて決定されてもよい：
（i）NFAT応答要素の下流の標的およびルシフェラーゼレポーター遺伝子によって安定的にトランスフェクトされたJurkat細胞を播種し、細胞を96穴平底プレートにおいて37℃で一晩インキュベートする工程、
（ii）抗体、例えば、ある範囲の抗体、例えば、19.5〜5,000ng/mLの段階希釈物を添加し、5時間インキュベートする工程、
（iii）ホタルルシフェラーゼ基質（5'-フルオロルシフェリン）を細胞に添加し、5〜10分間インキュベートする工程、
（iv）Envision MultiLable Plateリーダーを使用して、発光を決定する工程。
【００７７】
用語「ベクター」は、本明細書で用いる場合、ベクター内にライゲーションされた核酸セグメントの転写の誘導能を有する核酸分子を指すことを意図する。ベクターの型の一例は「プラスミド」であり、これは、円環状の二本鎖DNAループの形態である。ベクターの別の型はウイルスベクターであり、この場合、核酸セグメントはウイルスゲノム内にライゲーションされ得る。一部の特定のベクターは、ベクターが導入された宿主細胞内での自己複製能を有する（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよび哺乳動物エピソームベクター）。他のベクター（例えば、哺乳動物の非エピソームベクター）を宿主細胞のゲノム内に、宿主細胞内への導入の際に組み込んでもよく、それにより宿主のゲノムとともに複製される。さらに、一部の特定のベクターは、これに作動可能に連結されている遺伝子の発現指令能を有する。かかるベクターを本明細書において「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と称する。一般に、組換えDNA手法において有用な発現ベクターは多くの場合、プラスミドの形態である。プラスミドはベクターの最も一般的な使用形態であるため、本明細書では「プラスミド」および「ベクター」を互換的に用い得る。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たすかかる他の形態の発現ベクター、例えばウイルスベクター（例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）を包含することを意図する。
【００７８】
用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、本明細書で用いる場合、内部に発現ベクターが導入されている細胞を指すことを意図する。かかる用語は、特定の対象細胞だけでなく、かかる細胞の子孫も指すことを意図していることを理解されたい。後続世代において変異または環境的影響のいずれかにより、なんらかの修飾が起こる可能性があるため、かかる子孫は、実際には親細胞と同一でない可能性があるが、それでもなお本明細書で用いる用語「宿主細胞」の範囲に包含される。組換え宿主細胞としては、例えば、トランスフェクトーマ（transfectoma）、例えばCHO細胞、HEK-293細胞、PER.C6、NS0細胞、およびリンパ系細胞、ならびに原核生物細胞、例えば大腸菌（E.coli）、および他の真核生物宿主、例えば植物細胞および真菌が挙げられる。
【００７９】
用語「トランスフェクトーマ」は、本明細書で用いる場合、Abまたは標的抗原を発現している組換え真核生物宿主細胞、例えばCHO細胞、PER.C6、NS0細胞、HEK-293細胞、植物細胞、または真菌、例えば、酵母細胞を包含する。
【００８０】
用語「調製物」は、細胞、細胞膜、ビリオン、または他の構造に関連する抗原（例えば、細胞表面上に発現された抗原）と相互作用した場合に増大されたオリゴマー形成能を有し得、抗原によって増強されたシグナル伝達および/または活性化がもたらされ得る、抗体バリアントおよび異なる抗体バリアントの混合物の調製物を指す。
【００８１】
本明細書で用いる場合、用語「親和性」は、単一の部位において1つの分子、例えば抗体が、別の例えば標的または抗原に結合する強度、例えば、抗原に対する抗体の個々の抗原結合部位の一価結合の強度である。
【００８２】
本明細書で用いる場合、用語「アビディティ」は、2つの構造間、例えば、標的と同時に相互作用する抗体の複数の抗原結合部位間または例えば抗体とC1qとの間の複数の結合部位の合計強度をいう。1つより多くの結合性相互作用が存在する場合、2つの構造は、すべての結合部位が解離した場合にのみ解離し、したがって、解離速度は個々の結合部位の場合より遅くなり、それにより、個々の結合部位が結合する強度（親和性）と比べてより大きな有効総結合強度（アビディティ）がもたらされる。
【００８３】
本明細書で用いる場合、用語「オリゴマー」は、少なくとも原則的には無限の数の単量体からなるポリマーとは対照的に、1つより多いが限定数の単量体単位からなる分子（例えば、抗体）をいう。例示的なオリゴマーは、二量体、三量体、四量体、五量体、および六量体である。多くの場合、オリゴマー内の単量体単位の数を表示するのにギリシャ語の接頭語が使用され、例えば、四量体（tetramer）は4つの単位、六量体（hexamer）は6つの単位で構成されている。
【００８４】
「オリゴマー化」という用語は、本明細書中で使用されるように、モノマーを有限の重合度で変換する過程をさすものとする。本明細書中で、本発明による標的結合領域を含む抗体は、例えば、細胞表面において、標的結合の後に、Fc領域の非共有結合性の会合を介して、六量体のようなオリゴマーを形成することができることが観察される。本願に関して、「自己オリゴマー化」または「同種オリゴマー化」とは、翻訳後修飾を無視して、同一のタンパク質配列を有する抗体分子の間のオリゴマー化の過程をさすものとする。「ヘテロオリゴマー化」という用語は、本明細書中で使用されるように、翻訳後修飾を無視して、異なるタンパク質配列を有する抗体分子の間のオリゴマー化の過程をさすものとする。ヘテロオリゴマー化に関与する異なる抗体は、例えば、異なる標的タンパク質、糖タンパク質、グリカン、または糖脂質のような異なる抗原に結合し得る。
【００８５】
「自己オリゴマー化阻害置換」という用語は、翻訳後修飾を無視して、同一のタンパク質配列を有する抗体分子の間のオリゴマー化の過程を阻害する、免疫グロブリンのFc領域と抗原結合領域とを含む抗体における置換をさすものとする。自己オリゴマー化の阻害は、例えば、実施例2および15に記載された方法によって測定される、ポリペプチドのCDC活性のEC50の増加または最大CDC溶解活性の低下をもたらし得る。自己オリゴマー化阻害置換の例は、K439EおよびS440Kである。
【００８６】
用語「クラスタリング」は、本明細書で用いる場合、非共有結合性相互作用による抗体、ポリペプチド、抗原、または他のタンパク質のオリゴマー化を指すことを意図する。
【００８７】
用語「Fc-Fc増強」は、本明細書で用いる場合、2つのFc領域含有抗体またはポリペプチドが標的結合後にオリゴマーを形成するように、ポリペプチドのFc領域間の結合強度を増大させること、またはFc領域間の相互作用を安定化することを指すことを意図する。
【００８８】
Fc-Fc増強置換とは、本明細書中で使用されるように、位置S440における置換がS440YまたはS440Wであることを条件として、EUナンバリングによるヒトIgG1に対応する位置E430、E345、またはS440における置換をさす。従って、Fc-Fc増強置換とは、本明細書中で使用されるように、アミノ酸置換E430G、E345K、E430S、E430F、E430T、E345Q、E345R、E345Y、S440W、およびS440Yをさす。好ましい態様において、Fc-Fc増強置換は、E430G、E345K、またはE345Rである。
【００８９】
2種の抗原に関して、本明細書中で使用される時、「共存する」という用語またはその文法上の変動は、一方では、2種の抗原が、同一の細胞において同時発現されている状況をさすものとする。抗原は、既に細胞上で相互に近接していてもよいし、または抗原は、本発明の結合ポリペプチド、例えば、抗体のオリゴマー化を介して接近してもよい。さらに、「共存する」という用語は、2種の抗原が、異なる細胞において発現されているが、そのような細胞が、相互に極めて近くに位置している状況もさすものとする。
【００９０】
「共依存性」という用語は、本明細書中で使用されるように、自己オリゴマー化阻害置換を含む2種以上の異なるFcドメイン含有ポリペプチドの、同一の標的、細胞、またはビリオンとの同時結合に依存性である機能的効果をさすものとする。本発明に関して、共依存性であり得る機能的効果には、クラスタリングに依存性の機能、Fcによって媒介されるエフェクター機能、およびFcγRまたはC1のようなエフェクター分子の結合が含まれるが、Fcドメイン含有ポリペプチドの標的抗原との個々の結合は必ずしも含まれない。本明細書中で使用されるように、自己オリゴマー化阻害置換を含む異なるFcドメイン含有ポリペプチドは、各々、種々の標的、細胞、またはビリオンに個々に結合し得るが、共依存性の機能的転帰は、2種以上の異なる成分の、同一の標的、細胞、またはビリオンとの同時結合に依存する。本明細書中で使用されるように、共依存性の機能的効果は、共依存性のFc含有ポリペプチド混合物における異なる成分の間の非共有結合性のFc-Fc相互作用の回復によって、自己オリゴマー化阻害置換を含む2種以上の異なるFcドメイン含有ポリペプチドによって特異的に回収される。
【００９１】
「安全域」という用語は、本明細書中で使用されるように、薬物の有効性および安全性の指数をさすものとし、薬物の最小治療用量（病変組織に対する効力）と最小毒性用量（健常組織に対する効力）との間の範囲として定義される。
【００９２】
「C1q結合」という用語は、本明細書中で使用されるように、C1qと抗体との間の直接相互作用をさすものとする。直接C1q結合は、例えば、人工表面上に固定化された抗体を使用することによって評価され得る。C1qの抗体オリゴマーとの高アビディティ結合をもたらす多価相互作用は、細胞表面上またはビリオン表面上の所定の抗原に結合している時に、評価され得る。
【００９３】
C1qのポリペプチドまたは抗体との結合は、以下の工程を使用して、ELISAアッセイにおいて決定され得る。（i）96穴Microlon ELISAプレートを、100μl PBS中の1μg/mLのポリペプチドまたは抗体によって4℃で一晩コーティングする、（ii）プレートを、100μL/ウェルのC1qの段階希釈系列（3倍希釈で最終C1q濃度範囲30〜0.01μg/mL）と共に37℃で1時間インキュベートする、（iii）プレートを100μL/ウェルのウサギ抗ヒトC1qと共にRTで1時間インキュベートする、（iv）プレートを100μL/ウェルのブタ抗ウサギIgG-HRPと共にRTで1時間インキュベートする、（v）プレートを100μL/ウェルの基質、1mg/ml 2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)と共にRTで15分間インキュベートする、（vi）100μLの2％シュウ酸/ウェルを添加することによって、反応を中止する。吸光度を、BioTek EL808 Microplateリーダーで405nmにおいて測定する。
【００９４】
C1q結合置換という用語は、本明細書中で使用されるように、免疫グロブリンのFc領域と抗原結合領域とを含むポリペプチドにおける、C1qとの直接相互作用を増強する置換をさすものとする。増強されたC1q結合は、例えば、前記のC1q結合を決定する方法によって測定される、C1qと、免疫グロブリンのFc領域と抗原結合領域とを含むポリペプチドとの間の相互作用の減少したEC50をもたらす。
【００９５】
本明細書で用いる場合、用語「補体活性化」は、表面上の抗体-抗原複合体に、C1と称される大きな巨大分子複合体が結合することによって開始される、古典的補体経路の活性化をいう。C1は、6つの認識タンパク質C1qとセリンプロテアーゼのヘテロ四量体C1r2C1s2とからなる複合体である。C1は、C4のC4aとC4bへの切断およびC2のC2aとC2bへの切断から開始する一連の切断反応を伴う古典的補体カスケードの初期事象における最初のタンパク質複合体である。C4bは沈着し、C2aと一緒にC3転換酵素と称される酵素活性転換酵素を形成し、これにより補体成分C3がC3bとC3aに切断され、C5転換酵素が形成される。このC5転換酵素はC5をC5aとC5bに分割し、最後の成分が膜上に沈着し、これによりさらに、終末補体成分C5b、C6、C7、C8、およびC9が膜侵襲複合体（MAC）へと構築される補体活性化の後期事象が誘発される。補体カスケードにより、補体依存性細胞傷害（CDC）としても知られる、細胞溶解を引き起こす、細胞膜における孔の発生がもたらされる。補体活性化は、C1q有効性、CDC動態CDCアッセイ（WO2013/004842、WO2014/108198に記載のような）を使用することにより、またはBeurskens et al. in Journal of Immunology, 2012 vol. 188 no. 7, April 1, 3532-3541に記載の方法であるC3bおよびC4bの細胞沈着により評価され得る。
【００９６】
用語「補体依存性細胞傷害」（「CDC」）は、本明細書で用いる場合、抗体が細胞またはビリオン上の標的に結合しているときに、MAC構築体によって作られた膜における孔の結果として細胞またはビリオンの溶解をもたらす、抗体媒介性補体活性化のプロセスを指すことを意図する。
【００９７】
用語「抗体依存性細胞介在性細胞傷害」（「ADCC」）は、本明細書で用いる場合、結合抗体の定常領域を認識するFc受容体を発現している細胞による、抗体で被覆された標的細胞またはビリオンの死滅の機構を指すことを意図する。用語「抗体依存性細胞貪食」（「ADCP」）は、本明細書で用いる場合、食細胞による内部移行による、抗体で被覆された標的細胞またはビリオンの除去機構を指すことを意図する。内部移行を受けた、抗体で被覆された標的細胞またはビリオンは、ファゴソームと称される小胞内に内包され、次いでこれが1つまたは複数のリソソームと融合してファゴリソソームを形成する。ADCPは、エフェクター細胞としてマクロファージおよびビデオ顕微鏡法を用いるインビトロ細胞傷害アッセイを使用することにより、van Bij et al.in Journal of Hepatology Volume 53, Issue 4, October 2010, Pages 677-685に記載のようにして評価され得る。
【００９８】
用語「補体依存性細胞傷害」（「CDCC」）は、本明細書で用いる場合、抗体媒介性補体活性化の結果として、標的細胞またはビリオンに共有結合している補体第3成分（C3）の切断産物を認識する補体受容体を発現している細胞による標的細胞またはビリオンの死滅の機構を指すことを意図する。CDCCは、ADCCについて記載のものと同様の様式で評価され得る。
【００９９】
用語「血漿半減期」は、本明細書で用いる場合、血漿中のポリペプチド濃度が、除去中（分布相後）に、その初期濃度の半分まで低下するのにかかる時間を指す。抗体では、分布相は典型的には1〜3日間であり、この相中に、血漿と組織との間での再分布のため血漿濃度の約50%の低減がみられる。血漿半減期は、当技術分野において周知の方法で測定され得る。
【０１００】
用語「血漿クリアランス率」は、本明細書で用いる場合、ポリペプチドが、生きている生物に投与したときに血液から除去される速度の定量的測定値である。血漿クリアランス率は、用量/AUC（mL/日/kg）として計算され得、ここで、AUC値（曲線下面積）は濃度-時間曲線から求められる。
【０１０１】
用語「抗体-薬物コンジュゲート」は、本明細書で用いる場合、少なくとも1つの型の悪性細胞に対する特異性、薬物、および薬物を例えば抗体とカップリングさせるリンカーを有する抗体またはFc含有ポリペプチドを指す。リンカーは、悪性細胞の存在下で切断性または非切断性である;この場合、抗体-薬物コンジュゲートは悪性細胞を死滅させる。
【０１０２】
用語「抗体-薬物コンジュゲート取込み」は、本明細書で用いる場合、抗体-薬物コンジュゲートが細胞上の標的に結合された後、細胞膜によって取込み/封じ込みが行なわれ、それにより細胞内に引き込まれるプロセスをいう。抗体-薬物コンジュゲート取込みは、WO 2011/157741に記載の「インビトロ死滅アッセイにおける抗TF ADCによる抗体媒介性内部移行および細胞死滅（antibody-mediated internalization and cell killing by anti-TF ADC in an in vitro killing assay）」のようにして評価され得る。
【０１０３】
用語「アポトーシス」は、本明細書で用いる場合、細胞において起こり得るプログラム細胞死（PCD）のプロセスをいう。生化学的事象により特徴的な細胞の変化（形態構造）および死がもたらされ得る。このような変化としては、細胞質の水疱様突起（blebbing）、細胞の収縮、核の断片化、クロマチンの凝集、および染色体DNAの断片化が挙げられる。ある特定の受容体に抗体が結合することによって、アポトーシスが誘導され得る。
【０１０４】
用語「プログラム細胞死」または「PCD」は、本明細書で用いる場合、細胞内プログラムによって媒介される任意の形態の細胞の死をいう。異なる形態のPCDが存在し、種々の型のPCDは、細胞内シグナル伝達に干渉すると妨害され得る能動的細胞プロセスによって実行されることが共通している。特定の一態様において、細胞または組織における任意の形態のPCDの発生は、細胞または組織をコンジュゲート型アネキシンVで染色し、ホスファチジルセリン曝露と相関させることにより調べ得る。
【０１０５】
用語「アネキシンV」は、本明細書で用いる場合、細胞表面上のホスファチジルセリン（PS）に結合する一群のアネキシンのタンパク質をいう。
【０１０６】
用語「FcRn」は、本明細書で用いる場合、Fc受容体である新生児型Fc受容体を指すことを意図する。これは、最初、齧歯類において、母乳から齧歯類新生仔の腸の上皮を通して新生仔の血流へのIgG輸送能を有する特有の受容体として見出された。さらなる研究により、ヒトにおける同様の受容体が明らかになった。しかしながら、ヒトでは、これは、成長中の胎児への母体のIgGの輸送の助長を補助する胎盤中に見出され、また、IgG代謝回転の監視に役割を果たしていることが示されている。FcRnは、6.0〜6.5の酸性pHでIgGに結合するが中性またはそれより高いpHでは結合しない。したがって、FcRnは、わずかに酸性pHの腸管腔（腸内部）からIgGに結合することができ、pHが中性から塩基性（pH 7.0〜7.5）である基底外側（身体内部）への効率的な一方向性輸送を確実にすることができる。また、この受容体は、内皮細胞内でのエンドサイトーシスの経路内に存在することにより成人のIgG再利用においても役割を果たす。酸性のエンドソーム内のFcRn受容体は、飲作用によって内部移行を受けたIgGに結合し、これを細胞表面に再利用させ、塩基性pHの血液中に放出し、それによりリソソーム分解を受けることを抑制する。この機構は、血中のIgGの半減期が他のアイソタイプと比べて長いことの説明となり得る。
【０１０７】
用語「プロテインA」は、本明細書で用いる場合、最初に細菌黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の細胞壁において見出された56 kDaのMSCRAMM表面タンパク質を指すことを意図する。これはspa遺伝子にコードされており、その調節は、DNAトポロジー、細胞オスモル濃度、およびArlS-ArlRと称される二成分系によって制御される。これは、その免疫グロブリンとの結合能のため、生化学の研究において有用性が見出されている。これは、3-ヘリックスバンドルにフォールディングされる5つの相同Ig結合ドメインで構成されている。各ドメインが、多くの哺乳動物種に由来するタンパク質、最も顕著にはIgGに対する結合能を有する。これは、ほとんどの免疫グロブリンの重鎖Fc領域（FcRn受容体の保存された結合部位と重複）に結合し、また、ヒトVH3ファミリーのFab領域とも相互作用する。血清中でのこのような相互作用により、IgG分子は、そのFab領域単独ではなくFc領域によって細菌に結合し、それにより、この細菌がオプソニン化、補体活性化、および貪食を攪乱する。
【０１０８】
用語「プロテインG」は、本明細書で用いる場合、C群およびG群の連鎖球菌によって発現される免疫グロブリン結合タンパク質を指すことを意図しており、プロテインAとよく似ているが特異性が異なる。これは、Fc領域に対するその結合による抗体精製において用途が見出されている65 kDa（G148プロテインG）および58 kDa（C40プロテインG）の細胞表面タンパク質である。
【０１０９】
発明の具体的な態様
本明細書中に記載されるように、第1の局面において、本発明は、第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体であって、第1および第2の抗体の活性が共依存性であり、第1の抗体が、1個のFc-Fc増強置換、自己オリゴマー化阻害置換、ならびにCDCおよび/またはADCCのようなエフェクター機能を低下させる1個または複数個の置換を有するFc領域を有し、第2の抗体が、1個のFc-Fc増強自己オリゴマー化阻害置換を有し、任意で、CDCおよび/またはADCCのようなFcエフェクター機能を増強する1個または複数個の置換を有するFc領域を有する、第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体に関する。従って、第1の抗体の効果が第2の抗体の存在に依存し、第2の抗体の効果が第1の抗体の存在に依存する、そのような第1および第2の抗体の組み合わせは、そのような第1および第2の抗体の組み合わせの使用についての安全域を増加させ得る。
【０１１０】
本発明者らによって示されるように、1個のFc-Fc増強置換、ならびにCDCおよび/またはADCCのようなエフェクター機能を低下させる1個または複数個の置換、ならびに相補的な自己オリゴマー化阻害置換を有するFc領域を有する第1の抗体は、単一の抗体として使用された時に、CDC活性を示さないかまたは極めて限定されたCDC活性のみを示す。同様に、1個のFc-Fc増強置換、ならびにCDCおよび/またはADCCのようなFcエフェクター機能を増強する1個または複数個の置換、ならびに相補的な自己オリゴマー化阻害置換を有するFc領域を有する本発明による第2の抗体は、単一の抗体として使用された時に、限定されたCDC活性のみを示す。単一の薬剤は、CDCを誘導する能力を示さないかまたは限定された能力を示すが、しかしながら、驚くべきことに、本発明による第1および第2の抗体の組み合わせは、誘導されるCDCレベルを回復させることができる。
【０１１１】
一つの局面において、本発明は、ヒトIgGの第2のFc領域と第2の抗原に結合することができる第2の抗原結合領域とを含む第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための、ヒトIgGの第1のFc領域と第1の抗原に結合することができる第1の抗原結合領域とを含む第1の抗体であって、
第1のFc領域が、
（a）E430、E345、およびS440からなる群より選択される位置におけるアミノ酸の1個の置換を含むが、ただし、S440における置換はS440YまたはS440Wであり、かつ
（b）K439EまたはS440Kの置換を含むが、ただし該置換は、（a）における置換がS440YまたはS440Wである場合、S440Kではなく、かつ
（c）L234、L235、G237、G236からなる群より選択される1個もしくは複数個の置換、またはK322AおよびE269Kからなる群より選択される1個もしくは複数個の置換を含み；
第2のFc領域が、
（d）E430、E345、およびS440からなる群より選択される位置におけるアミノ酸の1個の置換を含むが、ただし、S440における置換はS440YまたはS440Wであり、かつ
（e）K439EまたはS440Kの置換を含むが、ただし該置換は、（d）における置換がS440YまたはS440Wである場合、S440Kではなく；
第1のFc領域がK439Eの置換を有しかつ第2のFc領域がS440Kの置換を有するか、または第1のFc領域がS440Kの置換を有しかつ第2のFc領域がK439Eの置換を有し；アミノ酸位置がEuナンバリングシステムによるヒトIgG1に相当する、
第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体を提供する。
【０１１２】
別の局面において、本発明は、ヒトIgGの第2のFc領域と第2の抗原に結合することができる第2の抗原結合領域とを含む第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための、ヒトIgGの第1のFc領域と第1の抗原に結合することができる第1の抗原結合領域とを含む第1の抗体であって、
第1のFc領域が、
（a）E430、E345、およびS440からなる群より選択される位置におけるアミノ酸の1個の置換を含むが、ただし、S440における置換はS440YまたはS440Wであり、かつ
（b）K439EまたはS440Kの置換を含むが、ただし該置換は、（a）における置換がS440YまたはS440Wである場合、S440Kではなく、かつ
（c）位置G237におけるアミノ酸の1個の置換、またはG236R、G236K、K322A、E269K、K322E、P329R、L234A、L234F、L235A、L235Q、およびL235Eからなる群より選択される1個もしくは複数個の置換を含み；
第2のFc領域が、
（d）E430、E345、およびS440からなる群より選択される位置におけるアミノ酸の1個の置換を含むが、ただし、S440における置換はS440YまたはS440Wであり、かつ
（e）K439EまたはS440Kの置換を含むが、ただし該置換は、（d）における置換がS440YまたはS440Wである場合、S440Kではなく、かつ
（f）第1のFc領域がK322EまたはP329Rの置換を含む場合、K326A、K326W、E333A、およびE333Sからなる群より選択される1個または複数個の置換を含み；
第1のFc領域がK439Eの置換を有しかつ第2のFc領域がS440Kの置換を有するか、または第1のFc領域がS440Kの置換を有しかつ第2のFc領域がK439Eの置換を有し；アミノ酸位置がEUナンバリングシステム（Edelman et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.1969 May；63(1):78-85；Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition.1991 NIH Publication No.91-3242）によるヒトIgG1に相当する、
第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体を提供する。
【０１１３】
一つの局面において、本発明は、ヒトIgGの第2のFc領域と第2の抗原に結合することができる第2の抗原結合領域とを含む第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための、ヒトIgGの第1のFc領域と第1の抗原に結合することができる第1の抗原結合領域とを含む第1の抗体であって、
第1のFc領域が、
（a）E430、E345、およびS440からなる群より選択される位置におけるアミノ酸の1個の置換を含むが、ただし、S440における置換はS440YまたはS440Wであり、かつ
（b）K439EまたはS440Kの置換を含むが、ただし該置換は、（a）における置換がS440YまたはS440Wである場合、S440Kではなく、かつ
（c）位置G237におけるアミノ酸の1個の置換、またはG236R、G236K、K322A、E269K、L234A、L234F、L235A、L235Q、およびL235Eからなる群より選択される1個もしくは複数個の置換を含み；
第2のFc領域が、
（d）E430、E345、およびS440からなる群より選択される位置におけるアミノ酸の1個の置換を含むが、ただし、S440における置換はS440YまたはS440Wであり、かつ
（e）K439EまたはS440Kの置換を含むが、ただし該置換は、（d）における置換がS440YまたはS440Wである場合、S440Kではなく；
第1のFc領域がK439Eの置換を有しかつ第2のFc領域がS440Kの置換を有するか、または第1のFc領域がS440Kの置換を有しかつ第2のFc領域がK439Eの置換を有し；アミノ酸位置がEuナンバリングシステムによるヒトIgG1に相当する、
第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体を提供する。
【０１１４】
一つの局面において、本発明は、ヒトIgGの第2のFc領域と第2の抗原に結合することができる第2の抗原結合領域とを含む第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための、ヒトIgGの第1のFc領域と第1の抗原に結合することができる第1の抗原結合領域とを含む第1の抗体であって、
第1のFc領域が、
（a）E430、E345、およびS440からなる群より選択される位置におけるアミノ酸の1個の置換を含むが、ただし、S440における置換はS440YまたはS440Wであり、かつ
（b）K439EまたはS440Kの置換を含むが、ただし該置換は、（a）における置換がS440YまたはS440Wである場合、S440Kではなく、かつ
（c）位置P329におけるアミノ酸の1個の置換、またはK322Eの置換を含み；
第2のFc領域が、
（d）E430、E345、およびS440からなる群より選択される位置におけるアミノ酸の1個の置換を含むが、ただし、S440における置換はS440YまたはS440Wであり、かつ
（e）K439EまたはS440Kの置換を含むが、ただし該置換は、（d）における置換がS440YまたはS440Wである場合、S440Kではなく、かつ
（f）K326A、K326W、E333A、およびE333Sからなる群より選択される1個または複数個の置換を含み、
第1のFc領域がK439Eの置換を有しかつ第2のFc領域がS440Kの置換を有するか、または第1のFc領域がS440Kの置換を有しかつ第2のFc領域がK439Eの置換を有し；アミノ酸位置がEUナンバリングシステムによるヒトIgG1に相当する、
第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体を提供する。
【０１１５】
E430、E345に相当する位置における置換、またはS440YもしくはS440Wの置換は、本発明によるFc-Fc増強置換と見なされ、そのような置換は、増強されたFc-Fc相互作用およびオリゴマー化の効果をポリペプチドまたは抗体に導入する。増強されたオリゴマー化は、抗体の抗原結合領域が対応する標的抗原に結合した時に起こる。増強されたオリゴマー化は、例えば、六量体のようなオリゴマーを生成する。六量体のようなオリゴマー構造の生成は、ポリペプチドのC1q結合アビディティを増加させることによって、Fcエフェクター機能、例えば、CDCを増加させる効果を有する。
【０１１６】
一つの態様において、第1の抗体は、E430、E345に対応する位置における多くとも1個の置換、またはS440YもしくはS440Wの置換を含む。一つの態様において、第2の抗体は、E430、E345に対応する位置における多くとも1個の置換、またはS440YもしくはS440Wの置換を含む。従って、一つの態様において、Fc領域は、E430、E345に対応する位置における多くとも1個の置換、またはS440YもしくはS440Wの置換を含む。本発明の一つの態様において、第1のFcおよび第2のFc領域は、E430G、E345K、E430S、E430F、E430T、E345Q、E345R、E345Y、S440W、およびS440Yからなる群より選択される置換を含む。従って、一つの態様において、第1のFc領域がE430Gの置換を有し、第2のFc領域がE345K置換を有していてよい。別の態様において、第1のFc領域がE345K置換を有し、第2の抗体がE430Gの置換を有していてもよい。第1および第2のFc領域における置換は、Fc-Fc増強置換の群より独立に選択され得る。
【０１１７】
本発明の一つの態様において、第1および第2のFc領域は、E430G、E345K、およびE345Rからなる群より選択される置換を含む。
【０１１８】
本発明の一つの態様において、第1および第2のFc領域はE430Gの置換を含む。本発明の一つの態様において、第1および第2のFc領域はE345Kの置換を含む。本発明の一つの態様において、第1および第2のFc領域はE345Rの置換を含む。本発明の一つの態様において、第1および第2のFc領域はS440Yの置換を含む。
【０１１９】
第1および第2のFc領域は、本発明による相補的なオリゴマー化阻害置換と見なされるK439EまたはS440Kの置換をさらに含む。即ち、例えば、K439Eを有する第1の抗体は、K439Eの置換を有する別の抗体とオリゴマーを形成することができないが、K439Eの置換を有する抗体は、S440Kの置換を有する別の抗体とオリゴマーを形成することができる。S440Kの置換を有する抗体は、S440Kの置換を有する別の抗体とオリゴマーを形成することができないが、K439Eの置換を有する抗体とオリゴマーを形成することができる。従って、本発明の一つの態様において、第1のFc領域はK439Eの置換を含み、第2のFc領域はS440Kの置換を含む。本発明の一つの態様において、第1のFc領域はS440Kの置換を含み、第2のFc領域はK439Eの置換を含む。Fc領域が、オリゴマー化阻害置換であるS440Kを含む時、Fc領域は、Fc-Fc増強置換であるS440YまたはS440Wを含み得ない。従って、オリゴマー化阻害置換であるS440Kを有するFc領域は、E430またはE345に対応するアミノ酸位置にFc-Fc増強置換を有し得る。
【０１２０】
別の局面において、本発明は、ヒトIgGの第2のFc領域と第2の抗原に結合することができる第2の抗原結合領域とを含む第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための、ヒトIgGの第1のFc領域と第1の抗原に結合することができる第1の抗原結合領域とを含む第1の抗体であって、
第1のFc領域が、
（a）K248EおよびT437Rの置換を含み、かつ
（b）K439EまたはS440Kの置換を含み、かつ
（c）位置G237もしくはP329におけるアミノ酸の1個の置換、またはG236R、G236K、K322A、K332E、E269K、L234A、L234F、L235A、L235Q、およびL235Eからなる群より選択される1個もしくは複数個の置換を含み；
第2のFc領域が、
（d）K248EおよびT437Rの置換を含み、かつ
（e）K439EまたはS440Kの置換を含み、
第1のFc領域がK439Eの置換を有しかつ第2のFc領域がS440Kの置換を有するか、または第1のFc領域がS440Kの置換を有しかつ第2のFc領域がK439Eの置換を有し；アミノ酸位置がEuナンバリングシステムによるヒトIgG1に相当する、
第2の抗体と組み合わせて医薬として使用するための第1の抗体を提供する。
【０１２１】
本明細書中の任意の局面または態様によるE430、E345に対応する位置におけるFc-Fc増強置換、またはS440YもしくはS440Wの置換は、以下の2個の置換T248EおよびT437Rに置換されてもよい。
【０１２２】
本発明の一つの態様において、第1のFc領域は、CDCおよび/またはADCCのようなエフェクター機能を低下させる置換を含む。従って、本発明の一つの態様において、第1のFc領域は、CDCを低下させる置換を含む。本発明の一つの態様において、第1のFc領域は、ADCCを低下させる置換を含む。本発明の一つの態様において、第1のFc領域は、CDCおよびADCCを低下させる置換を含む。本発明の一つの態様において、第1のFc領域は、位置G237における1個のアミノ酸置換を含む。アミノ酸位置G237における置換は、CDCを誘導する抗体の能力を低下させる効果を有し得る。これによって、CDC活性の低下に加えて、Fcγ受容体結合も低下させ、それによって、Fcγ受容体によって媒介されるエフェクター機能も低下させることができる置換を第1のFc領域が含む態様が、提供される。
【０１２３】
本発明の一つの態様において、第1のFc領域は、G237A、G237T、G237Q、G237R、G237S、G237N、G237D、G237E、G237K、G237V、G237M、G237I、G237L、G237H、G237F、G237Y、G237W、およびG237Pからなる群より選択される1個の置換を含む。
【０１２４】
本発明者らは、ヒトIgG1における237に対応する位置におけるグリシンを、天然に存在するアミノ酸の様々なクラスを代表する、アラニン、トレオニン、グルタミン、またはアルギニンのようなアミノ酸に置換することによって、CDCを誘導する抗体の能力が低下することを見出した。従って、G237の別の天然のアミノ酸への置換は、CDCを誘導する抗体の能力を低下させると考えられる。アミノ酸位置G237における置換は、Fc-Fc増強置換および自己オリゴマー化阻害置換を有する抗体の、単独でCDCを誘導する能力を低下させ得る。
【０１２５】
本発明の一つの態様において、第1のFc領域は、G237T、G237A、G237Q、およびG237Rからなる群より選択される1個の置換を含む。一つの態様において、第1のFc領域はG237Tの置換を含む。本発明の一つの態様において、第1のFc領域はG237Aの置換を含む。本発明の一つの態様において、第1のFc領域はG237Sの置換を含む。本発明の一つの態様において、第1のFc領域はG237Qの置換を含む。本発明の一つの態様において、第1のFc領域はG237Rの置換を含む。
【０１２６】
本発明の一つの態様において、第1のFc領域は、G236R、G236K、E269K、およびP329Rからなる群より選択される1個または複数個の置換を含む。本発明の一つの態様において、第1のFc領域はL234FおよびL235Eの置換を含む。これによって、CDC活性の低下に加えて、Fcγ受容体結合も低下させ、それによって、Fcγ受容体によって媒介されるエフェクター機能も低下させる置換を第1のFc領域が含む態様が、提供される。
【０１２７】
本発明の一つの態様において、第1のFc領域は、G236R、G236K、およびE269Kからなる群より選択される1個または複数個の置換を含む。本発明の一つの態様において、第1のFc領域は、G236RおよびE269Kからなる群より選択される1個または複数個の置換を含む。本発明の一つの態様において、第1のFc領域はG263RまたはG236Kの置換を含む。本発明の一つの態様において、第1のFc領域はG236Rの置換を含む。本発明の一つの態様において、第1のFc領域はG236Kの置換を含む。本発明の一つの態様において、第1のFc領域はG269Kの置換を含む。
【０１２８】
本発明の一つの態様において、第1のFc領域は、K322AおよびK322Eからなる群より選択される1個の置換を含む。これによって、Fcγ受容体に結合する抗体の能力を保持しながら、CDC活性を誘導する抗体の能力を低下させることができる置換を第1のFc領域が含む態様が、提供される。
【０１２９】
本発明の一つの態様において、第1のFc領域はK322A置換を含む。
【０１３０】
本発明の一つの態様において、第1のFc領域はK322Eの置換を含む。
【０１３１】
本発明の一つの態様において、第1のFc領域は位置P329におけるアミノ酸置換を含む。
【０１３２】
本発明の一つの態様において、第1のFc領域は、P329R、P329K、P329E、P329D、およびP329Aからなる群より選択される1個の置換を含む。本発明の一つの態様において、第1のFc領域はP329Rの置換を含む。本発明の一つの態様において、第1のFc領域はP329Rの置換を含む。本発明の一つの態様において、第1のFc領域はP329Kの置換を含む。本発明の一つの態様において、第1のFc領域はP329Eの置換を含む。本発明の一つの態様において、第1のFc領域はP329Dの置換を含む。本発明の一つの態様において、第1のFc領域はP329Aの置換を含む。
【０１３３】
これによって、抗体の増強されたFc-Fc相互作用およびオリゴマー化の効果を導入するFc-Fc増強置換を有する第1のFc領域を第1の抗体が含む態様が、提供される。増強されたオリゴマー化は、抗体の抗原結合領域が、対応する標的抗原に結合した時に起こる。増強されたオリゴマー化は、例えば、六量体のようなオリゴマーを生成する。六量体のようなオリゴマー構造の生成は、ポリペプチドのC1q結合アビディティを増加させることによって、Fcエフェクター機能、例えば、CDCを増加させる効果を有する。しかしながら、自己オリゴマー化阻害置換、ならびにCDCおよび/またはADCCのようなエフェクター機能を低下させる置換を導入することによって、減少したCDCおよび/またはADCCのようなエフェクター機能を有する抗体が生成され、それは、第2の抗体と組み合わせられた抗体の毒性プロファイルの改善された調節を可能にし得る。第1の抗体が、減少したCDCおよび/またはADCCのようなエフェクター機能を有するとは、同一のFc-Fc増強置換および自己オリゴマー化阻害置換を有するが、エフェクター機能を低下させる置換を有しない親抗体と、第1の抗体が比較された時として理解される。
【０１３４】
本発明の一つの態様において、第2のFc領域は、CDCおよび/またはADCCのようなエフェクター機能を増加させる置換を含む。従って、一つの態様において、第2のFc領域は、CDCを増加させる置換を含む。一つの態様において、第2のFc領域は、ADCCを増加させる置換を含む。一つの態様において、第2のFc領域は、CDCおよびADCCを増加させる置換を含む。第2の抗体が、増加したCDCおよび/またはADCCのようなエフェクター機能を有するとは、同一のFc-Fc増強置換および自己オリゴマー化阻害置換を有するが、エフェクター機能を増強する置換を有しない親抗体と、第2の抗体が比較された時として理解される。
【０１３５】
本発明の一つの態様において、第2のFc領域は、G237A、K326A、K326W、E333A、およびE333Sからなる群より選択される1個または複数個の置換を含む。
【０１３６】
本発明の一つの態様において、第2のFc領域はG237Aの置換を含む。本発明の一つの態様において、第2のFc領域は、G237Aのような、Fcγ受容体結合を低下させる置換を含む。
【０１３７】
本発明の一つの態様において、第2のFc領域は、K326A、K326W、E333A、およびE333Sからなる群より選択される1個または複数個の置換を含む。
【０１３８】
本発明の一つの態様において、第2のFc領域は、K326A、K326W、E333A、およびE333Sからなる群より選択される1個の置換を含む。
【０１３９】
本発明の一つの態様において、第2のFc領域は、K326A、K326W、E333A、およびE333Sからなる群より選択される1個の置換を含む。本発明の一つの態様において、第2のFc領域はK326Aの置換を含む。本発明の一つの態様において、第2のFc領域はK326Wの置換を含む。本発明の一つの態様において、第2のFc領域はE333Aの置換を含む。本発明の一つの態様において、第2のFc領域はE333Sの置換を含む。
【０１４０】
本発明の一つの態様において、第2のFc領域は、K326A、K326W、E333A、およびE333Sからなる群より選択される2個の置換を含む。
【０１４１】
本発明の一つの態様において、第2のFc領域はK326WおよびE333Sの置換を含む。本発明の一つの態様において、第2のFc領域はK326AおよびE333Aの置換を含む。
【０１４２】
本発明の一つの態様において、第2のFc領域はG237AおよびE333Sの置換を含む。
【０１４３】
本発明の一つの態様において、第2のFc領域はK326Aの置換を含む。
【０１４４】
本発明の一つの態様において、第2のFc領域はE333Sの置換を含む。
【０１４５】
これによって、抗体の増強されたFc-Fc相互作用およびオリゴマー化の効果を導入するFc-Fc増強置換を有する第2のFc領域を第2の抗体が含む態様が、提供される。増強されたオリゴマー化は、抗体の抗原結合領域が対応する標的抗原に結合した時に起こる。増強されたオリゴマー化は、例えば、六量体のようなオリゴマーを生成する。六量体のようなオリゴマー構造の生成は、ポリペプチドのC1q結合アビディティを増加させることによって、Fcエフェクター機能、例えば、CDCを増加させる効果を有する。しかしながら、CDCおよび/またはADCCのようなエフェクター機能を増加させる置換を導入することによって、増加したオリゴマー化、ならびに増加したCDCおよび/またはADCCのようなエフェクター機能を有する抗体が生成され、それは、第1の抗体と組み合わせられた抗体の改善された効力を可能にし得る。第2の抗体が、減少したCDCおよび/またはADCCのようなエフェクター機能を有するとは、同一のFc-Fc増強置換および自己オリゴマー化阻害置換を有するが、エフェクター機能を増加させる置換を有しない親抗体と、第2の抗体が比較された時として理解される。
【０１４６】
以下の表は、具体的な置換を含む第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドの組み合わせを記載する、態様の非限定的なリストを提供し、従って、例えば、下記表の態様1は、ヒトIgGのそれぞれE430G、K439E、およびG236Rに対応する位置における置換を含む第1の抗体の、ヒトIgGのそれぞれE430GおよびS440Kの置換を含む第2の抗体との組み合わせである。本明細書中に記載されるように、態様1〜177の全ての第1および第2の抗体は、任意で、さらなる置換を含んでいてもよい。
【０１４７】
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【０１４８】
以下の表は、具体的な置換を含む第1の抗体および第2の抗体の組み合わせを記載する、態様の好ましいリストを提供し、従って、例えば、下記表の態様1は、ヒトIgGのそれぞれE430G、K439E、およびG236Rに対応する位置における置換を含む第1の抗体の、ヒトIgGのそれぞれE430GおよびS440Kの置換を含む第2の抗体との組み合わせである。本明細書中に記載されるように、下記の態様1〜36の全ての第1および第2の抗体は、任意で、さらなる置換を含んでいてもよい。
【０１４９】
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2021522303.tif 000015
【０１５０】
一つの態様において、第1のFc領域はE430G、K439E、およびG236Rの置換を含み、第2のFc領域はE430GおよびS440Kの置換を含む。一つの態様において、第1のFc領域はE430G、K439E、およびG237Qの置換を含み、第2のFc領域はE430GおよびS440Kの置換を含む。一つの態様において、第1のFc領域はE430GおよびK439Eの置換を含み、第2のFc領域はE430G、S440K、およびG236Rの置換を含む。一つの態様において、第1のFc領域はE430GおよびK439Eの置換を含み、第2のFc領域はE430G、S440K、およびG237Qの置換を含む。一つの態様において、第1のFc領域はE430G、K439E、およびG236Rの置換を含み、第2のFc領域はE430G、S440K、およびG237Aの置換を含む。一つの態様において、第1のFc領域はE430G、K439E、およびG236Rの置換を含み、第2のFc領域はE430G、S440K、およびE333Sの置換を含む。一つの態様において、第1のFc領域はE430G、K439E、およびG237Aの置換を含み、第2のFc領域はE430G、S440K、およびG236Rの置換を含む。一つの態様において、第1のFc領域はE430G、K439E、およびE333Sの置換を含み、第2のFc領域はE430G、S440K、およびG236Rの置換を含む。一つの態様において、第1のFc領域はE430G、K439E、およびG237Qの置換を含み、第2のFc領域はE430G、S440K、およびG237Aの置換を含む。一つの態様において、第1のFc領域はE430G、K439E、およびG237Qの置換を含み、第2のFc領域はE430G、S440K、およびE333Sの置換を含む。一つの態様において、第1のFc領域はE430G、K439E、およびG237Aの置換を含み、第2のFc領域はE430G、S440K、およびG237Qの置換を含む。一つの態様において、第1のFc領域はE430G、K439E、およびE333Sの置換を含み、第2のFc領域はE430G、S440K、およびG237Qの置換を含む。一つの態様において、第1のFc領域はE345K、K439E、およびG236Rの置換を含み、第2のFc領域はE345K、S440K、およびE333Sの置換を含む。一つの態様において、第1のFc領域はE345R、K439E、およびG236Rの置換を含み、第2のFc領域はE345K、S440K、およびE333Sの置換を含む。一つの態様において、第1のFc領域はE345R、K439E、およびG237Qの置換を含み、第2のFc領域はE345KおよびS440Kの置換を含む。
【０１５１】
本発明の一つの態様において、第1および/または第2の抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である。本発明の一つの態様において、第1および第2の抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である。本発明の一つの態様において、第1および第2の抗体はヒト抗体である。本発明の一つの態様において、第1および第2の抗体はヒト化抗体である。本発明の一つの態様において、第1の抗体はヒト抗体であり、第2の抗体はヒト化抗体である。本発明の一つの態様において、第1の抗体はヒト化抗体であり、第2の抗体はヒト抗体である。
【０１５２】
本発明の一つの態様において、第1および/または第2の抗体はモノクローナル抗体である。本発明の一つの態様において、第1および第2の抗体はモノクローナル抗体である。本発明の一つの態様において、第1および第2の抗体は二重特異性抗体である。一つの態様において、第1の抗体はモノクローナル抗体であり、第2の抗体は二重特異性抗体である。一つの態様において、第1の抗体は二重特異性抗体であり、第2の抗体はモノクローナル抗体である。
【０１５３】
抗体に関して本明細書中に記載された態様は、免疫グロブリンのFc領域と抗原結合領域とを含む抗体をさし、抗体は、免疫グロブリンの第1のFc領域および第1の抗原結合領域、ならびに免疫グロブリンの第2のFc領域および第2の抗原結合領域を有する第2のポリペプチドまたは抗体を有する二重特異性抗体のような多重特異性抗体であってもよいことが理解される。
【０１５４】
本発明の一つの態様において、第1および/または第2の抗体は、IgG1アイソタイプ、IgG2アイソタイプ、IgG3アイソタイプ、またはIgG4アイソタイプである。本発明の一つの態様において、第1および第2の抗体は、IgG1アイソタイプ、IgG2アイソタイプ、IgG3アイソタイプ、またはIgG4アイソタイプである。本発明の一つの態様において、第1および第2の抗体は、ヒトのIgG1アイソタイプ、IgG2アイソタイプ、IgG3アイソタイプ、またはIgG4アイソタイプである。本発明の一つの態様において、第1および第2の抗体は、IgG1アイソタイプ、IgG2アイソタイプ、またはIgG4アイソタイプである。本発明の一つの態様において、第1および第2の抗体は、ヒトのIgG1アイソタイプ、IgG2アイソタイプ、またはIgG4アイソタイプである。本発明の一つの態様において、第1および/または第2の抗体はIgG1アイソタイプである。本発明の一つの態様において、第1および/または第2の抗体はヒトIgG1アイソタイプである。本発明の一つの態様において、第1および第2の抗体はIgG1アイソタイプである。一つの態様において、第1および第2の抗体はIgG2アイソタイプである。本発明の一つの態様において、第1および第2の抗体はIgG4アイソタイプである。本発明の一つの態様において、第1の抗体はIgG1アイソタイプであり、第2の抗体はIgG2アイソタイプである。本発明の一つの態様において、第1の抗体はIgG2アイソタイプであり、第2の抗体はIgG1アイソタイプである。
【０１５５】
本発明の一つの態様において、第1の抗体はIgG1アイソタイプの重鎖を含む。本発明の一つの態様において、第2の抗体はIgG1アイソタイプの重鎖を含む。本発明の一つの態様において、第1の抗体はIgG2アイソタイプの重鎖を含む。本発明の一つの態様において、第2の抗体はIgG2アイソタイプの重鎖を含む。本発明の一つの態様において、第1の抗体はIgG3アイソタイプの重鎖を含む。本発明の一つの態様において、第2の抗体はIgG3アイソタイプの重鎖を含む。本発明の一つの態様において、第1の抗体はIgG4アイソタイプの重鎖を含む。本発明の一つの態様において、第2の抗体はIgG4アイソタイプの重鎖を含む。
【０１５６】
本発明の一つの態様において、第1の抗体はIgG1アイソタイプの重鎖を含み、第2の抗体はIgG1アイソタイプの重鎖を含む。
【０１５７】
好ましい態様において、第1の抗体はヒトIgG1アイソタイプの第1のFc領域を含み、かつ/または第2の抗体はヒトIgG1アイソタイプの第2のFc領域を含む。
【０１５８】
本発明の一つの態様において、抗体は、または第1および/もしくは第2の抗体は、表1より選択される配列を含む第1および/または第2の定常領域を含む。
【０１５９】
本発明の一つの態様において、抗体は、または第1および/もしくは第2の抗体は、SEQ ID NO:63〜122、135〜138、140〜145からなる群より選択される配列を含む第1および/または第2の定常領域を含む。
【０１６０】
本発明の一つの態様において、第1および/または第2の抗体は、SEQ ID NO:63〜122、135〜138、140〜145からなる群より選択される配列を含む第1および/または第2の重鎖定常領域を含み、ここで、第1および第2の重鎖配列は、その群より独立に選択される。
【０１６１】
本発明の一つの態様において、抗体は、または第1および/もしくは第2の抗体は、SEQ ID NO:63〜122、135〜138、および140〜145からなる群より選択される配列を含む第1および/または第2の定常領域を含み、ここで、多くとも5個の付加的な置換、例えば、多くとも4個の付加的な置換、例えば、多くとも3個の付加的な置換、例えば、多くとも2個の付加的な置換、例えば、多くとも1個の付加的な置換が導入されている。
【０１６２】
本発明の一つの態様において、抗体、例えば、第1または第2の抗体は、SEQ ID NO:84に示される配列を含む定常領域を含む。本発明の一つの態様において、抗体、例えば、第1または第2の抗体は、SEQ ID NO:87に示される配列を含む定常領域を含む。本発明の一つの態様において、抗体、例えば、第1または第2の抗体は、SEQ ID NO:101に示される配列を含む定常領域を含む。本発明の一つの態様において、抗体、例えば、第1または第2の抗体は、SEQ ID NO:107に示される配列を含む定常領域を含む。本発明の一つの態様において、抗体、例えば、第1または第2の抗体は、SEQ ID NO:105に示される配列を含む定常領域を含む。本発明の一つの態様において、抗体、例えば、第1または第2の抗体は、SEQ ID NO:103に示される配列を含む定常領域を含む。本発明の一つの態様において、抗体、例えば、第1または第2の抗体は、SEQ ID NO:85に示される配列を含む定常領域を含む。本発明の一つの態様において、抗体、例えば、第1または第2の抗体は、SEQ ID NO:104に示される配列を含む定常領域を含む。本発明の一つの態様において、抗体、例えば、第1または第2の抗体は、SEQ ID NO:82に示される配列を含む定常領域を含む。本発明の一つの態様において、抗体、例えば、第1または第2の抗体は、SEQ ID NO:66に示される配列を含む定常領域を含む。本発明の一つの態様において、抗体、例えば、第1または第2の抗体は、SEQ ID NO:68に示される配列を含む定常領域を含む。本発明の一つの態様において、抗体、例えば、第1または第2の抗体は、SEQ ID NO:73に示される配列を含む定常領域を含む。
【０１６３】
本発明の一つの態様において、第1および第2の抗原は、両方とも、細胞表面に露出した分子である。一つの態様において、第1および第2の抗原は、同一の細胞において発現されている。一つの態様において、第1および第2の抗原は、同一の組織において発現されている。
【０１６４】
本発明の一つの態様において、第1および第2の抗原は、処置すべき疾患または障害のための標的細胞または標的組織である細胞または組織に共存する。本発明の一つの態様において、第1および第2の抗原は同一ではない。
【０１６５】
本発明の一つの態様において、第1および第2の抗体は、第1および第2の抗原を発現している細胞集団を枯渇させる。
【０１６６】
本発明の一つの態様において、細胞集団は腫瘍細胞である。
【０１６７】
本発明の一つの態様において、細胞集団は、血液腫瘍細胞または固形腫瘍細胞である。
【０１６８】
本発明の一つの態様において、細胞集団は、白血球細胞集団のような白血球である。
【０１６９】
本発明の一つの態様において、細胞集団は、リンパ球細胞集団のようなリンパ球である。
【０１７０】
本発明の一つの態様において、細胞集団は、B細胞集団のようなB細胞である。本発明の一つの態様において、細胞集団は、B細胞集団のサブセットである。
【０１７１】
本発明の一つの態様において、細胞集団は、T細胞集団のようなT細胞である。本発明の一つの態様において、細胞集団は、T細胞集団のサブセットである。本発明の一つの態様において、細胞集団は制御性T細胞である。
【０１７２】
本発明の一つの態様において、細胞集団はNK細胞である。本発明の一つの態様において、細胞集団は骨髄系由来サプレッサー細胞である。本発明の一つの態様において、細胞集団は腫瘍関連マクロファージである。
【０１７３】
第1および第2の抗体によって認識される第1および第2の抗原を発現している特定の細胞集団を枯渇させるための医薬として、本発明による第1の抗体および第2の抗体が使用される態様が、本明細書中に記載される。従って、本発明による第1および第2の抗体は、第1または第2の抗原のみを発現する健常組織を枯渇させずに、第1および第2の抗体によって認識される第1および第2の抗原を発現する腫瘍細胞を枯渇させるために使用され得る。本発明による第1および第2の抗体は、リンパ球の特定のサブセット、例えば、B細胞もしくはT細胞またはさらにはB細胞のサブセットもしくはT細胞のサブセットのような免疫系の特定の細胞集団の枯渇においても特に有用であり得る。
【０１７４】
本発明の一つの態様において、抗体は、単一特異性抗体、二重特異性抗体、または多重特異性抗体である。本発明の一つの態様において、抗体は天然抗体である。
【０１７５】
天然の、例えばヒトFcドメインを有する抗体は、例えば、グリコシル化に影響するかまたは抗体が二重特異性抗体であることを可能にする変異のような、本発明の変異以外の変異を有する抗体であってもよい。「天然抗体」という用語は、遺伝学的に導入された変異を含まない抗体を意味する。従って、天然に存在する修飾、例えば、異なるアロタイプを含む抗体は、本発明の意味において、「天然抗体」として理解されるべきであり、従って、親抗体として理解されてよい。天然抗体は、本発明による第1の抗体における少なくとも3個の置換または第2の抗体における少なくとも2個の置換の鋳型として働いて、本発明の第1の抗体および第2の抗体を提供することができる。本発明の変異以外の置換を含む親抗体の例は、IgG4様CH3領域を含む2種の抗体の分子の半分の交換を促進し、従って、凝集物が同時に形成されることなく二重特異性抗体が形成されるよう、還元条件を利用する、WO2011/131746（Genmab）に記載されたような二重特異性抗体である。親抗体の他の例には、異種二量体二重特異性抗体のような二重特異性抗体：トリオマブ（Triomab）（Fresenius）；二重特異性のIgG1およびIgG2（Rinat neurosciences Corporation）；FcΔAdp（Regeneron）；ノブ・イントゥ・ホール（Knobs-into-holes）（Genentech）；静電的ステアリング（Electrostatic steering）（Amgen、Chugai、Oncomed）；SEEDボディ（SEEDbodies）（Merck）；アジメトリック・スキャフォールド（Azymetric scaffold）（Zymeworks）；mAb-Fv（Xencor）；ならびにLUZ-Y（Genentech）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。他の例示的な親抗体フォーマットには、非限定的に、野生型抗体、完全長抗体、もしくはFc含有抗体断片、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはそれらのいずれかの組み合わせが含まれる。
【０１７６】
本発明の一つの局面において、抗体は、ヒトIgGのFc領域と抗原に結合することができる抗原結合領域とを含み、ここで、Fc領域は、
E430、E345、およびS440からなる群より選択される位置におけるアミノ酸の1個の置換を含むが、ただし、S440における置換はS440YまたはS440Wであり、かつ
K439EまたはS440Kの置換を含むが、ただし該置換は、（a）における置換がS440YまたはS440Wである場合、S440Kではなく、かつ
位置G237におけるアミノ酸の1個の置換、またはG236R、G236K、K322A、E269K、L234A、L234F、L235A、L235Q、およびL235Eからなる群より選択される1個もしくは複数個の置換を含む。
【０１７７】
別の局面において、抗体は、ヒトIgGのFc領域と抗原に結合することができる抗原結合領域とを含み、ここで、Fc領域は、
K248EおよびT437Rの置換を含み、かつ
K439EまたはS440Kの置換を含み、かつ
位置G237もしくはP329におけるアミノ酸の1個の置換、またはG236R、G236K、K322A、K332E、E269K、L234A、L234F、L235A、L235Q、L235E、K326A、K326W、E333A、およびE333Sからなる群より選択される1個もしくは複数個の置換を含む。
【０１７８】
本発明の一つの態様において、Fc領域は、E430G、E345K、E430S、E430F、E430T、E345Q、E345R、E345Y、S440W、およびS440Yからなる群より選択される置換を含む。
【０１７９】
本発明の一つの態様において、Fc領域は、E430G、E345K、およびE345Rからなる群より選択される置換を含む。
【０１８０】
本発明の一つの態様において、Fc領域はE430Gの置換を含む。
【０１８１】
本発明の一つの態様において、Fc領域は、S440における置換がS440YまたはS440Wであることを条件として、E430、E345、およびS440からなる群より選択される位置におけるアミノ酸の多くとも1個の置換を含む。
【０１８２】
本発明の一つの態様において、Fc領域は、G237A、G237T、G237Q、G237R、G237S、G237N、G237D、G237E、G237K、G237V、G237M、G237I、G237L、G237H、G237F、G237Y、G237W、G237Pからなる群より選択される1個の置換を含む。
【０１８３】
本発明の一つの態様において、Fc領域は、G237A、G237T、G237S、G237Q、G237Rからなる群より選択される1個の置換を含む。本発明の一つの態様において、Fc領域はG237Qの置換を含む。
【０１８４】
本発明の一つの態様において、Fc領域は、G236RおよびE269Kからなる群より選択される1個または複数個の置換を含む。
【０１８５】
本発明の一つの態様において、Fc領域はG236Rの置換を含む。
【０１８６】
本発明の一つの態様において、Fc領域はE269Kの置換を含む。
【０１８７】
本発明の一つの態様において、Fc領域はK322Aの置換を含む。
【０１８８】
標的および使用の方法
本発明による第1および/または第2の抗体は、同一の細胞において発現されている標的に結合することができる。一つの態様において、標的は、シグナル伝達経路を活性化し、阻害し、調節し、かつ/または制御する標的である。
【０１８９】
本発明による標的として特に適当であり得る標的の例は、細胞表面受容体およびリガンドである。
【０１９０】
以下のタンパク質クラスも、本発明による第1および/または第2の抗体のための抗原結合標的として特に適当であり得る：腫瘍壊死受容体スーパーファミリー、GPIアンカータンパク質、脂質付加型タンパク質、ヒドロラーゼ（EC 3.）および制御因子スーパーファミリー、B7ファミリー関連タンパク質、免疫グロブリンスーパーファミリー、インターロイキン受容体ファミリー、インテグリン、Ig様細胞接着分子ファミリー、受容体型プロテインチロシンホスファターゼ、C型レクチン、テトラスパニン、膜貫通4ドメイン、活性化白血球免疫グロブリン様受容体、C-Cモチーフケモカイン受容体、Gタンパク質共役受容体、トール様受容体、受容体型チロシンキナーゼ。本発明の一つの態様において、第1および第2の抗原結合領域は、同一のタンパク質クラスからの標的抗原に結合することができる。本発明の一つの態様において、第1および第2の抗原結合領域は、異なるタンパク質クラスからの標的抗原に結合することができる。本発明の一つの態様において、第1の抗原結合領域は、GPIアンカータンパク質のタンパク質クラスからの標的抗原に結合することができ、第2の抗原結合領域は、テトラスパニンのタンパク質クラスからの標的抗原に結合することができる。本発明の一つの態様において、第1の抗原結合領域は、テトラスパニンのタンパク質クラスからの標的抗原に結合することができ、第2の抗原結合領域は、GPIアンカータンパク質のタンパク質クラスからの標的抗原に結合することができる。本発明の一つの態様において、第1の抗原結合領域は、GPIアンカータンパク質のタンパク質クラスからの標的抗原に結合することができ、第2の抗原結合領域は、膜貫通4ドメインのタンパク質クラスからの標的抗原に結合することができる。本発明の一つの態様において、第1の抗原結合領域は、膜貫通4ドメインのタンパク質クラスからの標的抗原に結合することができ、第2の抗原結合領域は、GPIアンカータンパク質のタンパク質クラスからの標的抗原に結合することができる。
【０１９１】
本発明の一つの態様において、第1の抗原結合領域は、腫瘍壊死受容体スーパーファミリーのタンパク質クラスからの標的抗原に結合することができ、第2の抗原結合領域は、腫瘍壊死受容体スーパーファミリーのタンパク質クラスからの標的抗原に結合することができる。
【０１９２】
本発明の一つの態様において、第1の抗原結合領域は、腫瘍壊死受容体スーパーファミリーのタンパク質クラスからの標的抗原に結合することができ、第2の抗原結合領域は、免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質クラスからの標的抗原に結合することができる。
【０１９３】
細胞表面受容体には、例えば、造血因子受容体ファミリー、サイトカイン受容体ファミリー、チロシンキナーゼ受容体ファミリー、セリン/トレオニンキナーゼ受容体ファミリー、TNF受容体ファミリー、Gタンパク質共役受容体ファミリー、GPIアンカー受容体ファミリー、チロシンホスファターゼ受容体ファミリー、接着因子ファミリー、およびホルモン受容体ファミリーのような受容体ファミリーに属する受容体が含まれる。これらの受容体ファミリーに属する受容体およびそれらの特徴に関する様々な参照は、入手可能であり、例えば、Cooke B A.,King R J B.,van der Molen H J.ed.New Comprehensive Biochemistry Vol.18B "Hormones and their Actions Part II"pp.1-46(1988)Elsevier Science Publishers BV.,New York,USA；Patthy L.(1990)Cell,61:13-14；Ullrich A.,et al.(1990)Cell,61:203-212；Massagul J.(1992)Cell,69:1067-1070；Miyajima A.,et al.(1992)Annu.Re(v)Immunol.,10:295-331；Taga T.and Kishimoto T.(1992)FASEB J.,7:3387-3396；Fantl W I.,et al.(1993)Annu.Rev.Biochem.,62:453-481；Smith C A.,et al.(1994)Cell,76:959-962；Flower D R.(1999)Biochim.Biophys.Acta,1422:207-234；およびM.Miyasaka ed.,Cell Technology,supplementary volume,Handbook series,"Handbook for Adhesion Factors"(1994)(Shujunsha,Tokyo,Japan)を含む。
【０１９４】
本発明の一つの態様において、抗体は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（TNFR-SF）またはGタンパク質共役受容体（GPCR）スーパーファミリーのメンバーに結合する抗原結合領域を含む。
【０１９５】
本発明の一つの態様において、第1の抗体および/または第2の抗体は、細胞表面受容体に結合し、細胞表面受容体には、例えば、ホルモン受容体およびサイトカイン受容体が含まれる。例示的なサイトカイン受容体には、例えば、造血因子受容体、リンホカイン受容体、増殖因子受容体、分化調節因子受容体等が含まれる。サイトカイン受容体の例は、エリスロポエチン（EPO）受容体、トロンボポエチン（TPO）受容体、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）受容体、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）受容体、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体、腫瘍壊死因子（TNF）受容体、インターロイキン1（IL-1）受容体、インターロイキン2（IL-2）受容体、インターロイキン3（IL-3）受容体、インターロイキン4（IL-4）受容体、インターロイキン5（IL-5）受容体、インターロイキン6（IL-6）受容体、インターロイキン7（IL-7）受容体、インターロイキン9（IL-9）受容体、インターロイキン10（IL-10）受容体、インターロイキン11（IL-11）受容体、インターロイキン12（IL-12）受容体、インターロイキン13（IL-13）受容体、インターロイキン15（IL-15）受容体、インターフェロンα（IFNα）受容体、インターフェロンβ（IFNβ）受容体、インターフェロンγ（IFNγ）受容体、成長ホルモン（GH）受容体、インスリン受容体、血液幹細胞増殖因子（SCF）受容体、血管上皮増殖因子（VEGF）受容体、上皮細胞増殖因子（EGF）受容体、神経成長因子（NGF）受容体、線維芽細胞増殖因子（FGF）受容体、血小板由来増殖因子（PDGF）受容体、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）受容体、白血球遊走阻止因子（LIF）受容体、毛様体神経栄養因子（CNTF）受容体、オンコスタチンM（OSM）受容体、およびノッチファミリー受容体である。
【０１９６】
腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（TNFRSF）は、細胞外システインリッチドメインを介して腫瘍壊死因子スーパーファミリー（TNFSF）のリガンドに結合する能力を特徴とする受容体の群である。TNF受容体は、細胞膜において三量体の複合体を形成する。TNFRSFには、以下の29種のタンパク質のリストが含まれる；TNFR1（Uniprot P19438）、FAS（Uniprot P25445）、DR3（Uniprot Q93038）、DR4（Uniprot O00220）、DR5（Uniprot O14763）、DR6（Uniprot O75509）、NGFR（Uniprot P08138）、EDAR（Uniprot Q9UNE0）、DcR1（Uniprot O14798）、DcR2（Uniprot Q9UBN6）、DcR3（Uniprot O95407）、OPG（Uniprot O00300）、TROY（Uniprot Q9NS68）、XEDAR（Uniprot Q9HAV5）、LTbR（Uniprot P36941）、HVEM（Uniprot Q92956）、TWEAKR（Uniprot Q9NP84）、CD120b（Uniprot P20333）、OX40（Uniprot P43489）、CD40（Uniprot P25942）、CD27（Uniprot P26842）、CD30（Uniprot P28908）、4-1BB（Uniprot Q07011）、RANK（Uniprot Q9Y6Q6）、TACI（Uniprot O14836）、BLySR（Uniprot Q96RJ3）、BCMA（Uniprot Q02223）、GITR（Uniprot Q9Y5U5）、RELT（Uniprot Q969Z4）。
【０１９７】
本発明の一つの態様において、抗体は、または第1および/もしくは第2の抗体は、DR4、DR5、CD20、CD37、CD52、HLA-DR、CD3、およびCD5からなる群より選択される抗原に結合することができる抗原結合領域を含む。一つの態様において、抗原結合領域はDR4に結合することができる。一つの態様において、抗原結合領域はDR5に結合することができる。一つの態様において、抗原結合領域はCD20に結合することができる。一つの態様において、抗原結合領域はCD37に結合することができる。一つの態様において、抗原結合領域はCD52に結合することができる。一つの態様において、抗原結合領域はHLA-DRに結合することができる。一つの態様において、抗原結合領域はCD3に結合することができる。一つの態様において、抗原結合領域はCD5に結合することができる。
【０１９８】
本発明の一つの態様において、抗体は、または第1および/もしくは第2の抗体は、
SEQ ID NO:196に示されるCDR1配列、SEQ ID NO:196に示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:198に示されるCDR3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:200に示されるCDR1配列、AATに示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:201に示されるCDR3配列を含むVL領域［DR4］；
SEQ ID NO:50に示されるCDR1配列、SEQ ID NO:51に示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:52に示されるCDR3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:54に示されるCDR1配列、FASに示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:55に示されるCDR3配列を含むVL領域［DR5-01-G56T］；
SEQ ID NO:57に示されるCDR1配列、SEQ ID NO:58に示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:59に示されるCDR3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:61に示されるCDR1配列、RTSに示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:62に示されるCDR3配列を含むVL領域［DR5-05］；
SEQ ID NO:36に示されるCDR1配列、SEQ ID NO:37に示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:38に示されるCDR3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:40に示されるCDR1配列、DASに示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:41に示されるCDR3配列を含むVL領域［CD20、7D8］；
SEQ ID NO:9に示されるCDR1配列、SEQ ID NO:10に示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:11に示されるCDR3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:13に示されるCDR1配列、DASに示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:14に示されるCDR3配列を含むVL領域［CD20、11B8］；
SEQ ID NO:43に示されるCDR1配列、SEQ ID NO:44に示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:45に示されるCDR3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:47に示されるCDR1配列、VATに示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:48に示されるCDR3配列を含むVL領域［CD37］；
SEQ ID NO:2に示されるCDR1配列、SEQ ID NO:3に示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:4に示されるCDR3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:6に示されるCDR1配列、NTNに示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:7に示されるCDR3配列を含むVL領域［CD52、CAMPATH-1H］；
SEQ ID NO:161に示されるCDR1配列、SEQ ID NO:162に示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:163に示されるCDR3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:165に示されるCDR1配列、LVSに示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:166に示されるCDR3配列を含むVL領域［CD52、h2E8］；
SEQ ID NO:168に示されるCDR1配列、SEQ ID NO:169に示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:170に示されるCDR3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:172に示されるCDR1配列、AASに示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:173に示されるCDR3配列を含むVL領域［HLA-DR、hul243］；
SEQ ID NO:175に示されるCDR1配列、SEQ ID NO:176に示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:177に示されるCDR3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:179に示されるCDR1配列、DNNに示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:180に示されるCDR3配列を含むVL領域［HLA-DR、1D09C3］；
SEQ ID NO:182に示されるCDR1配列、SEQ ID NO:183に示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:184に示されるCDR3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:186に示されるCDR1配列、DTSに示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:187に示されるCDR3配列を含むVL領域［CD3、huCLB T3/4］；または
SEQ ID NO:189に示されるCDR1配列、SEQ ID NO:190に示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:191に示されるCDR3配列を含むVH領域、ならびにSEQ ID NO:193に示されるCDR1配列、ATSに示されるCDR2配列、およびSEQ ID NO:194に示されるCDR3配列を含むVL領域［CD5］
を含む抗原結合領域を含む。
【０１９９】
一つの局面において、本発明は、第1および第2の抗体を含む組成物であって、第1の抗体が、第1の抗原結合領域と本明細書中に開示された任意の態様による第1のFc領域とを含み、第2の抗体が、第2の抗原結合領域と本明細書中に開示された任意の局面または態様による第2のFc領域とを含む、組成物に関する。
【０２００】
別の局面において、本発明は、第1および第2の抗体を含む組成物であって、第1の抗体が、第1の抗原に結合することができる第1の抗原結合領域とヒトIgGの第1のFc領域とを含み、第2の抗体が、第2の抗原に結合することができる第2の抗原結合領域とヒトIgGの第2のFc領域とを含み、
第1のFc領域が、
E430、E345、およびS440からなる群より選択される位置におけるアミノ酸の1個の置換を含むが、ただし、S440における置換はS440YまたはS440Wであり、かつ
K439EまたはS440Kの置換を含むが、ただし該置換は、（a）における置換がS440YまたはS440Wである場合、S440Kではなく、かつ
位置G237におけるアミノ酸の1個の置換、またはG236R、G236K、K322A、E269K、K322E、P329R、L234A、L234F、L235A、L235Q、およびL235Eからなる群より選択される1個もしくは複数個の置換を含み；
第2のFc領域が、
E430、E345、およびS440からなる群より選択される位置におけるアミノ酸の1個の置換を含むが、ただし、S440における置換はS440YまたはS440Wであり、かつ
K439EまたはS440Kの置換を含むが、ただし該置換は、（d）における置換がS440YまたはS440Wである場合、S440Kではなく、かつ
第1のFc領域がK322EまたはP329Rの置換を含む場合、K326A、K326W、E333A、およびE333Sからなる群より選択される1個または複数個の置換を含み、
第1のFc領域がK439Eの置換を有しかつ第2のFc領域がS440Kの置換を有するか、または第1のFc領域がS440Kの置換を有しかつ第2のFc領域がK439Eの置換を有し、アミノ酸位置がEUナンバリングシステムによるヒトIgG1に相当する、
組成物に関する。
【０２０１】
一つの局面において、本発明は、第1および第2の抗体を含む組成物であって、第1の抗体が、第1の抗原に結合することができる第1の抗原結合領域とヒトIgGの第1のFc領域とを含み、第2の抗体が、第2の抗原に結合することができる第2の抗原結合領域とヒトIgGの第2のFc領域とを含み、
第1のFc領域が、
E430、E345、およびS440からなる群より選択される位置におけるアミノ酸の1個の置換を含むが、ただし、S440における置換はS440YまたはS440Wであり、かつ
K439EまたはS440Kの置換を含むが、ただし該置換は、（a）における置換がS440YまたはS440Wである場合、S440Kではなく、かつ
位置G237におけるアミノ酸の1個の置換、またはG236R、G236K、K322A、E269K、L234A、L234F、L235A、L235Q、およびL235Eからなる群より選択される1個もしくは複数個の置換を含み；
第2のFc領域が、
E430、E345、およびS440からなる群より選択される位置におけるアミノ酸の1個の置換を含むが、ただし、S440における置換はS440YまたはS440Wであり、かつ
K439EまたはS440Kの置換を含むが、ただし該置換は、（d）における置換がS440YまたはS440Wである場合、S440Kではなく；
第1のFc領域がK439Eの置換を有しかつ第2のFc領域がS440Kの置換を有するか、または第1のFc領域がS440Kの置換を有しかつ第2のFc領域がK439Eの置換を有し、アミノ酸位置がEUナンバリングシステムによるヒトIgG1に相当する、
組成物を提供する。
【０２０２】
一つの局面において、本発明は、第1および第2の抗体を含む組成物であって、第1の抗体が、第1の抗原に結合することができる第1の抗原結合領域とヒトIgGの第1のFc領域とを含み、第2の抗体が、第2の抗原に結合することができる第2の抗原結合領域とヒトIgGの第2のFc領域とを含み、
第1のFc領域が、
E430、E345、およびS440からなる群より選択される位置におけるアミノ酸の1個の置換を含むが、ただし、S440における置換はS440YまたはS440Wであり、かつ
K439EまたはS440Kの置換を含むが、ただし該置換は、（a）における置換がS440YまたはS440Wである場合、S440Kではなく、かつ
位置P329におけるアミノ酸の1個の置換、またはK322Eの置換を含み；
第2のFc領域が、
E430、E345、およびS440からなる群より選択される位置におけるアミノ酸の1個の置換を含むが、ただし、S440における置換はS440YまたはS440Wであり、かつ
K439EまたはS440Kの置換を含むが、ただし該置換は、（d）における置換がS440YまたはS440Wである場合、S440Kではなく、かつ
K326A、K326W、E333A、およびE333Sからなる群より選択される1個または複数個の置換を含み、
第1のFc領域がK439Eの置換を有しかつ第2のFc領域がS440Kの置換を有するか、または第1のFc領域がS440Kの置換を有しかつ第2のFc領域がK439Eの置換を有し、アミノ酸位置がEUナンバリングシステムによるヒトIgG1に相当する、
組成物を提供する。
【０２０３】
本発明の一つの態様において、第1および第2のFc領域を含む組成物は、E430G、E345K、E430S、E430F、E430T、E345Q、E345R、E345Y、S440W、およびS440Yからなる群より選択される置換を含む。
【０２０４】
本発明の一つの態様において、第1および第2のFc領域を含む組成物は、E430G、E345K、およびE345Rからなる群より選択される置換を含む。
【０２０５】
本発明の一つの態様において、第1および第2のFc領域を含む組成物はE430Gの置換を含む。
【０２０６】
本発明の一つの態様において、第1のFc領域を含む組成物は、G237A、G237T、G237Q、G237R、G237S、G237N、G237D、G237E、G237K、G237V、G237M、G237I、G237L、G237H、G237F、G237Y、G237W、およびG237Pからなる群より選択される1個の置換を含む。
【０２０７】
本発明の一つの態様において、第1のFc領域を含む組成物は、G237A、G237T、G237Q、G237R、およびG237Sからなる群より選択される1個の置換を含む。
【０２０８】
本発明の一つの態様において、第1のFc領域を含む組成物は、G237A、G237T、G237Q、およびG237Rからなる群より選択される1個の置換を含む。
【０２０９】
第1のFc領域がG237Qの置換を含む、請求項43〜50のいずれか一項記載の組成物。
【０２１０】
第1のFc領域がG237Tの置換を含む、請求項43〜50のいずれか一項記載の組成物。
【０２１１】
本発明の一つの態様において、第1のFc領域を含む組成物は、G236RおよびG236Kからなる群より選択される1個または複数個の置換を含む。
【０２１２】
本発明の一つの態様において、第1のFc領域を含む組成物は、G236R、G236K、およびE269Kからなる群より選択される1個または複数個の置換を含む。本発明の一つの態様において、第1のFc領域を含む組成物は、G236RおよびE269Kからなる群より選択される1個または複数個の置換を含む。本発明の一つの態様において、第1のFc領域を含む組成物は、G263RまたはG236Kの置換を含む。
【０２１３】
本発明の一つの態様において、第1のFc領域を含む組成物は、K322EおよびK322Aからなる群より選択される1個の置換を含む。
【０２１４】
本発明の一つの態様において、第1のFc領域を含む組成物はP329Rの置換を含む。
【０２１５】
本発明の一つの態様において、第1のFc領域を含む組成物はG236Rの置換を含む。
【０２１６】
本発明の一つの態様において、第1のFc領域を含む組成物は、位置P329におけるアミノ酸の1個の置換を含む。
【０２１７】
本発明の一つの態様において、第1のFc領域を含む組成物は、P329R、P329A、P329T、P329Q、P329R、P329S、P329N、P329D、P329E、P329K、P329V、P329M、P329I、P329L、P329H、P329F、P329Y、P329W、およびP329Pからなる群より選択される1個の置換を含む。
【０２１８】
本発明の一つの態様において、第1のFc領域を含む組成物は、P329R、P329K、P329E、P329D、およびP329Aからなる群より選択される1個の置換を含む。
【０２１９】
本発明の一つの態様において、第1のFc領域を含む組成物はP329Rの置換を含む。
【０２２０】
本発明の一つの態様において、第1のFc領域を含む組成物はK322Aの置換を含む。
【０２２１】
本発明の一つの態様において、第1のFc領域を含む組成物はE269Kの置換を含む。
【０２２２】
本発明の一つの態様において、第2のFc領域を含む組成物は、G237A、K326A、K326W、E333A、およびE333Sからなる群より選択される1個または複数個の置換を含む。
【０２２３】
本発明の一つの態様において、第2のFc領域を含む組成物は、K326A、K326W、E333A、およびE333Sからなる群より選択される1個または複数個の置換を含む。
【０２２４】
本発明の一つの態様において、第2のFc領域を含む組成物は、K326A、K326W、E333A、およびE333Sからなる群より選択される1個の置換を含む。
【０２２５】
本発明の一つの態様において、第2のFc領域を含む組成物はG237Aの置換を含む。
【０２２６】
本発明の一つの態様において、第2のFc領域を含む組成物はK326Aの置換を含む。
【０２２７】
本発明の一つの態様において、第2のFc領域を含む組成物はE333Sの置換を含む。
【０２２８】
本発明の一つの態様において、第2のFc領域を含む組成物は、K326A、K326W、E333A、およびE333Sからなる群より選択される2個の置換を含む。
【０２２９】
本発明の一つの態様において、第2のFc領域を含む組成物はK326WおよびE333Sの置換を含む。
【０２３０】
本発明の一つの態様において、第2のFc領域を含む組成物はK326AおよびE333Aの置換を含む。
【０２３１】
本発明の一つの態様において、第2のFc領域を含む組成物はG237AおよびE333Sの置換を含む。
【０２３２】
本発明の一態様では、第1の抗体と第2の抗体とを含む組成物は、組成物中で1:50〜50:1のモル比、例えば1:1のモル比、1:2のモル比、1:3のモル比、1:4のモル比、1:5のモル比、1:6のモル比、1:7のモル比、1:8のモル比、1:9のモル比、1:10のモル比、1:15のモル比、1:20のモル比、1:25のモル比、1:30のモル比、1:35のモル比、1:40のモル比、1:45のモル比、1:50のモル比、50:1のモル比、45:1のモル比、40:1のモル比、35:1のモル比、30:1のモル比、25:1のモル比、20:1のモル比、15:1のモル比、10:1のモル比、9:1のモル比、8:1のモル比、7:1のモル比、6:1のモル比、5:1のモル比、4:1のモル比、3:1のモル比、2:1のモル比で存在している。
【０２３３】
本発明の一つの態様において、第1の抗体および第2の抗体は、約1:50〜50:1のモル比、例えば、約1:40〜40:1のモル比、例えば、約1:30〜30:1のモル比、例えば、約1:20〜20:1のモル比、例えば、約1:10〜10:1のモル比、例えば、約1:9〜9:1のモル比、例えば、約1:5〜5:1のモル比で組成物中に存在する。
【０２３４】
本発明の一つの態様において、第1および第2の抗体ならびに/または付加的なポリペプチドは、等モル比で組成物中に存在する。
【０２３５】
本発明の一つの態様において、任意の局面または態様による組成物は、薬学的組成物である。
【０２３６】
一つの局面において、本発明は、第1の抗原および第2の抗原を発現している細胞集団を枯渇させる方法であって、本明細書中に開示された任意の局面または態様による第1および第2の抗体または組成物に細胞集団を接触させる工程を含む方法に関する。
【０２３７】
本発明の一つの態様において、細胞集団は、血液腫瘍細胞集団または固形腫瘍細胞集団のような腫瘍細胞集団である。
【０２３８】
本発明の一つの態様において、細胞集団は血中に存在する。
【０２３９】
本発明の一つの態様において、細胞集団は白血球細胞集団のような白血球である。
【０２４０】
本発明の一つの態様において、細胞集団は白血球細胞集団のサブセットである。
【０２４１】
本発明の一つの態様において、細胞集団はリンパ球細胞集団である。
【０２４２】
本発明の一つの態様において、細胞集団はB細胞集団である。本発明の一つの態様において、細胞集団はB細胞集団のサブセットである。
【０２４３】
本発明の一つの態様において、細胞集団はT細胞集団である。本発明の一つの態様において、細胞集団はT細胞集団のサブセットである。本発明の一つの態様において、細胞集団は、制御性T細胞集団のような制御性T細胞である。
【０２４４】
本発明の一つの態様において、細胞集団はNK細胞集団である。
【０２４５】
本発明の一つの態様において、細胞集団は骨髄系由来サプレッサー細胞である。
【０２４６】
治療用途
本発明の任意の局面または態様による第1および第2の抗体、二重特異性抗体、または組成物は、医薬として、すなわち治療用途のために使用され得る。
【０２４７】
一局面において、本発明により、医薬としての使用のための、本明細書に開示の任意の局面または態様による第1および第2の抗体または組成物を提供する。
【０２４８】
別の局面において、本発明により、がん、自己免疫疾患、炎症性疾患、または感染性疾患の処置における使用のための、本明細書に開示の任意の局面または態様による抗体または組成物を提供する。
【０２４９】
別の局面において、本発明は、有効量の本明細書に開示の任意の局面または態様による第1および第2の抗体または組成物を個体に投与する工程を含む、疾患を有する個体を処置する方法に関する。
【０２５０】
局面において、本発明は、疾患を有する個体を処置する方法であって、本明細書中に開示された任意の局面もしくは態様による第1および第2の抗体の有効量または本明細書中に開示された任意の局面もしくは態様による組成物の有効量を個体へ投与する工程を含む方法に関する。
【０２５１】
本発明の一態様では、疾患は、がん、自己免疫疾患、炎症性疾患、および感染性疾患の群から選択される。
【０２５２】
本発明の一態様では、方法は、さらなる治療剤を投与する工程を含む。
【０２５３】
本発明の一態様では、本明細書に開示の任意の局面または態様による方法は、さらなる治療剤をさらに投与することに関する。
【０２５４】
本発明の一態様では、上記さらなる治療剤は、化学療法薬（非限定的にパクリタキセル、テモゾロミド、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、イリノテカン、ドキソルビシン、ゲムシタビン、5-フルオロウラシル、ペメトレキセドを含む）、キナーゼ阻害薬（非限定的にソラフェニブ、スニチニブ、もしくはエベロリムスを含む）、アポトーシス調節剤（非限定的に組換えヒトTRAILもしくはビリナパントを含む）、RAS阻害薬、プロテアソーム阻害薬（非限定的にボルテゾミブを含む）、ヒストンデアセチラーゼ阻害薬（非限定的にボリノスタットを含む）、栄養補助食品、サイトカイン（非限定的にIFN-γ）、抗体または抗体模倣物（非限定的に抗EGFR、抗IGF-1R、抗VEGF、抗CD20、抗CD38、抗HER2、抗PD-1、抗PD-L1、抗CTLA4、抗CD40、抗CD137、抗GITR抗体および抗体模倣物を含む）、抗体-薬物コンジュゲートからなる群より選択される1種または複数種の抗がん剤である。
【０２５５】
パーツキット（kit-of-parts）
第1および第2の抗体に関して以下に記載する態様は、免疫グロブリンのFc領域と抗原結合領域とを含む抗体に言及していることが理解される。
【０２５６】
本発明はまた、本明細書に記載の第1および第2の抗体を含む、治療において同時、別々、または逐次の使用のためのパーツキットに関する。さらに、かかる第1および第2の抗体は、本明細書に記載の任意の方法に従って得ることができる。
【０２５７】
一局面において、本発明は、本明細書に記載の任意の局面または態様による抗体または組成物を含むパーツキットであって、第1および第2の抗体または組成物が、1つまたは複数の容器内、例えばバイアル内に存在しているパーツキットに関する。
【０２５８】
本発明の一態様では、パーツキットは、治療において同時、別々、または逐次の使用のための、本明細書に記載の任意の局面または態様による第1および第2の抗体または組成物を含む。
【０２５９】
別の局面において、本発明は、診断方法における使用のための、本明細書に記載の態様のいずれかによる第1および第2の抗体、組成物、またはパーツキットの使用に関する。
【０２６０】
別の局面において、本発明は、本明細書に記載の任意の態様による第1および第2の抗体、組成物、またはパーツキットを、ヒトまたは他の哺乳動物の身体の少なくとも一部分に投与する工程を含む、診断方法に関する。
【０２６１】
別の局面において、本発明は、ヒトまたは他の哺乳動物の身体の少なくとも一部分のイメージングにおける、本明細書に記載の態様のいずれかによる第1および第2の抗体、組成物、またはパーツキットの使用に関する。
【０２６２】
別の局面において、本発明は、本明細書に記載の任意の態様による第1および第2の抗体、組成物、またはパーツキットを投与する工程を含む、ヒトまたは他の哺乳動物の身体の少なくとも一部分のイメージングのための方法に関する。
【０２６３】
さらなる使用
第1および第2の抗体または抗体に関して以下に記載する態様は、免疫グロブリンのFc領域と抗原結合領域とをそれぞれが含む第1および第2の抗体または抗体に言及していることが理解される。
【０２６４】
さらなる一局面において、本発明は、医薬としての使用のための、特に、疾患または障害の処置用の医薬としての使用のための、上記の通りの本発明の第1および第2の抗体に関する。かかる疾患および障害の例としては、非限定的に、がん、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染性疾患、細菌、ウイルス、または真菌による感染が挙げられる。
【０２６５】
別の局面において、本発明は、疾患、例えばがんの処置のための、本明細書に記載の第1および第2の抗体、二重特異性抗体、組成物、およびパーツキットに関する。
【０２６６】
別の局面において、本発明は、本明細書に記載の第1および第2の抗体、組成物、またはパーツキットの投与を含む、ヒト疾患の処置のための方法に関する。
【０２６７】
別の局面において、本発明は、第1および第2の抗体、組成物、またはパーツキットの投与を含む、ヒトのがんの処置のための方法に関する。
【０２６８】
「処置」は、症状または疾患状態を緩和する、軽快させる、停止させる、または根絶する（治癒する）目的を伴う有効量の本発明の治療活性化合物の投与をいう。
【０２６９】
「有効量」または「治療有効量」は、必要な投薬量および期間で所望の治療結果が得られるのに有効な量をいう。抗体の治療有効量は、疾患の状態、個体の年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を誘起する抗体の能力などの要因に応じて異なり得る。また、治療有効量は、抗体または抗体の一部分の任意の毒性効果または有害な効果より治療有益性効果の方が勝る量である。
【０２７０】
投薬量
抗体に関して以下に記載する態様は、免疫グロブリンのFc領域と抗原結合領域とを含む抗体に言及していることが理解され、抗体はまた、免疫グロブリンの第1のFc領域と第1の抗原結合領域および免疫グロブリンの第2のFc領域と第2の抗原結合領域を有する第2のポリペプチドまたは抗体を有する二重特異性抗体などの多重特異性抗体であってもよい。
【０２７１】
抗体の効率的な投薬量および投薬量レジメンは、処置対象の疾患または病状に依存し、当業者によって決定され得る。本発明の抗体の治療有効量の例示的で非限定的な範囲は約0.1〜100 mg/kg、例えば約0.1〜50 mg/kg、例えば約0.1〜20 mg/kg、例えば約0.1〜10 mg/kg、例えば約0.5、例えば、約0.3、約1、約3、約5または約8 mg/kgである。
【０２７２】
また、本発明の抗体を、併用療法で投与してもよい、すなわち、処置対象の疾患または病状に関連する他の治療剤と組み合わせてもよい。したがって、一態様では、抗体含有医薬は、1種または複数種のさらなる治療剤、例えば細胞傷害剤、化学療法剤、または血管新生抑制剤との併用のためのものである。かかる併用投与は同時であっても、別々であっても、逐次であってもよい。
【０２７３】
さらなる一態様では、本発明により、疾患、例えばがんを処置または予防するための方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の本発明のバリアントまたは薬学的組成物を放射線療法および/または手術との併用で投与する工程を含む方法を提供する。
【０２７４】
調製方法
抗体に関して以下に記載する態様は、免疫グロブリンのFc領域と抗原結合領域とを含む抗体に言及していることが理解され、抗体はまた、免疫グロブリンの第1のFc領域と第1の抗原結合領域および免疫グロブリンの第2のFc領域と第2の抗原結合領域を有する第2の抗体を有する多重特異性抗体であってもよい。
【０２７５】
本発明によりまた、上記の局面のいずれか1つによる抗体をコードする単離された核酸およびベクター、ならびに抗体をコードするベクターおよび発現系も提供する。抗体およびそのバリアントに好適な核酸構築物、ベクター、および発現系は当技術分野において公知であり、本実施例に記載している。バリアント抗体が重鎖（またはそのFc含有断片）だけでなく軽鎖も含む態様では、重鎖部分と軽鎖部分をコードするヌクレオチド配列を、同じ核酸またはベクターに存在させても、異なる核酸またはベクターに存在させてもよい。
【０２７６】
本発明によりまた、宿主細胞内で上記の局面のいずれか1つによる抗体を産生させるための方法であって、ポリペプチドまたは抗体が重鎖の少なくともFc領域を含み、以下の工程:
a）バリアントのFc領域をコードするヌクレオチド構築物を準備する工程、
b）ヌクレオチド構築物を宿主細胞内で発現させる工程、および
c）抗体バリアントを宿主細胞の細胞培養物から回収する工程
を含む方法も提供する。
【０２７７】
一部の態様では、抗体は重鎖抗体である。しかしながら、ほとんどの態様では、抗体は軽鎖も含み、したがって、宿主細胞は、同じかまたは異なるかのいずれかであるベクター上の軽鎖コード構築物をさらに発現する。
【０２７８】
抗体の組換え発現に適した宿主細胞は当技術分野において周知であり、CHO、HEK-293、Expi293、PER-C6、NS/0、およびSp2/0細胞が挙げられる。一態様では、宿主細胞は、タンパク質のAsn結合グリコシル化が行なわれ得る細胞、例えば真核生物細胞、例えば哺乳動物細胞、例えばヒト細胞である。さらなる一態様では、宿主細胞は、ヒト様グリコシル化またはヒト型グリコシル化を有する糖タンパク質を産生するように遺伝子改変された非ヒト細胞である。かかる細胞の例は、遺伝子修飾されたメタノール資化性酵母（Pichia pastoris）（Hamilton et al., Science 301（2003）1244-1246;Potgieter et al., J.Biotechnology 139（2009）318-325）および遺伝子修飾されたコウキクサ（Lemna minor）（Cox et al., Nature Biotechnology 12（2006）1591-1597）である。
【０２７９】
一態様では、宿主細胞は、C末端リジンK447残基を抗体重鎖から効率的に除去することのできない宿主細胞である。例えば、Liu et al.（2008）J Pharm Sci 97:2426（参照により本明細書に組み入れられる）の表2には、いくつかのかかる抗体産生系、例えば、Sp2/0、NS/0、またはトランスジェニック動物の乳腺（ヤギ）が列記されており、これらの場合、部分的なC末端リジン除去のみが得られる。一態様では、宿主細胞は、改変されたグリコシル化機構を有する宿主細胞である。かかる細胞は当技術分野において報告されており、本発明のバリアントを発現させ、それにより、改変されたグリコシル化を有する抗体を産生させるための宿主細胞として使用され得る。例えば、Shields, R.L.et al.（2002）J.Biol.Chem.277:26733-26740;Umana et al.（1999）Nat.Biotech.17:176-1、ならびにEP1176195;WO03/035835;およびWO99/54342を参照のこと。改変されたグリコフォームを作製するためのさらなる方法は当技術分野において公知であり、非限定的に、Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294;Shields et al, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740;Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473）、US6602684、WO00/61739A1;WO01/292246A1;WO02/311140A1;WO 02/30954A1;Potelligent（商標）技術（Biowa, Inc.Princeton, N.J.）;GlycoMAb（商標）グリコシル化改変技術（GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland）;US 20030115614;Okazaki et al., 2004, JMB, 336:1239-49に記載のものが挙げられる。
【０２８０】
本発明はまた、上記の本発明の方法によって得られる、または得ることができる抗体に関する。
【０２８１】
さらなる一局面において、本発明は、本発明の抗体の産生能を有する宿主細胞に関する。一態様では、宿主細胞は、本発明のヌクレオチド構築物で形質転換またはトランスフェクトされている。
【０２８２】
本発明を、さらなる限定と解釈されるべきでない以下の実施例によってさらに例示する。
【０２８３】
（表１）配列リスト
2021522303.tif 000016
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【０２８４】
実施例5〜23において試験された置換を定義する表
2021522303.tif 000056
【０２８５】
自己オリゴマー化阻害置換を定義する表
2021522303.tif 000057
【０２８６】
FcγR結合阻害C1q結合阻害置換を定義する表
2021522303.tif 000058
【実施例】
【０２８７】
実施例1
抗体発現構築物
本明細書において使用されるヒト抗体およびヒト化抗体の発現のために、可変重（VH）鎖および可変軽（VL）鎖配列を遺伝子合成（GeneArt Gene Synthesis; ThermoFisher Scientific）によって調製し、ヒトIgG重鎖（HC）の定常領域（定常領域ヒトIgG1m(f)HC：SEQ ID NO 22；定常領域ヒトIgG2 HC：SEQ ID NO 31；定常領域ヒトIgG3 HC：SEQ ID NO 32；または定常領域ヒトIgG4 HC：SEQ ID NO 33）および/またはヒトカッパ軽鎖（LC）の定常領域（SEQ ID NO 34）を含有するpcDNA3.3発現ベクター（ThermoFisher Scientific）にクローニングした。所望の変異を遺伝子合成によって導入した。本出願におけるCD20抗体バリアントは、過去に記載されたCD20抗体IgG1-CD20-11B8に由来するVHおよびVL配列（WO2004/035607；VH：SEQ ID NO 8；VL：SEQ ID NO 12）を有する。本出願におけるCD52抗体バリアントは、過去に記載されたCD52抗体CAMPATH-1Hに由来するVHおよびVL配列（Crowe et al., 1992 Clin Exp Immunol. 87(1):105-110；VH：SEQ ID NO 1；VL：SEQ ID NO 5）および過去に記載されたCD52抗体h2E8に由来するVHおよびVL配列（US2014/0127236；VH：SEQ ID NO 160；VL：SEQ ID NO 164）を有する。本出願におけるCD37抗体バリアントは、過去に記載されたCD37抗体IgG1-CD37-37.3に由来するVHおよびVL配列（WO2011/112978；VH：SEQ ID NO 42；VL：SEQ ID NO 46）を有する。本出願におけるDR4抗体バリアントは、過去に記載されたDR4抗体DR4-chCTB007に由来するVHおよびVL配列（US2009/0136503A1；VH：SEQ ID NO 200；VL：SEQ ID NO 204）を有する。本出願におけるDR5抗体バリアントは、過去に記載されたDR5抗体DR5-01-G56Tに由来するVHおよびVL配列（WO 2017/093447；VH：SEQ ID NO 49；VL：SEQ ID NO 53）およびDR5-05に由来するVHおよびVL配列（WO2014/009358；VH：SEQ ID NO 56；VL：SEQ ID NO 60）を有する。本出願におけるHLA-DR抗体バリアントは、過去に記載されたHLA-DR抗体HLA-DR-hul243に由来するVHおよびVL配列（US8722047B2；VH：SEQ ID NO 168；VL：SEQ ID NO 172）および過去に記載されたHLA-DR抗体HLA-DR-1D09C3に由来するVHおよびVL配列（US7521047B2；VH：SEQ ID NO 176；VL：SEQ ID NO 180）を有する。本出願におけるCD3抗体バリアントは、過去に記載されたCD3抗体huCLB-T3/4に由来するVHおよびVL配列（Parren et al., Res. Immunol 1991 Nov-Dec;142(9):749-63；VH：SEQ ID NO 184；VL：SEQ ID NO 188）を有する。本出願におけるCD5抗体バリアントは、過去に記載されたCD5抗体CD5-INSERMに由来するVHおよびVL配列（WO2010145895；VH：SEQ ID NO 192；VL：SEQ ID NO 196）を有する。HIV gp120特異的抗体であるヒトIgG1抗体b12を一部の実験において陰性対照として使用した（Barbas et al., J Mol Biol. 1993 Apr 5;230(3):812-23；VH：SEQ ID NO 15；VL：SEQ ID NO 19）。
【０２８８】
一過性発現抗体構築物
抗体の重鎖と軽鎖の両方をコードするプラスミドDNA混合物を、基本的にはVink等によって記載されているように（Vink et al., 2014 Methods 65(1):5-10）、293fectin（Life Technologies）を使用して、Expi293F細胞（Gibco, Cat No A14635）に一過性トランスフェクトした。上清中の抗体濃度を280nmでの吸光度によって測定した。抗体を含有する上清をインビトロアッセイにそのまま使用するか、または抗体を後述するように精製した。
【０２８９】
抗体精製および品質評価
抗体をプロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。培養上清を、0.20μMのデッドエンドフィルター上で濾過して5mLのMabSelect SuReカラム（GE Healthcare）上にロードし、0.02Mのクエン酸ナトリウム-NaOH（pH 3）で洗浄および溶出させた。精製直後に溶出物をHiPrep脱塩カラム（GE Healthcare）上にロードし、抗体を、12.6mM NaH2PO4, 140mM NaCl（pH 7.4）緩衝液（B.BraunまたはThermo Fisher）に緩衝液交換した。緩衝液交換後、試料を0.2μmのデッドエンドフィルター上で無菌濾過した。精製したタンパク質を、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲルキャピラリー電気泳動（CE-SDS）および高速サイズ排除クロマトグラフィー（HP-SEC）を含めた多数の生物分析アッセイによって分析した。濃度を280nmでの吸光度によって測定した。精製した抗体を2〜8℃で貯蔵した。
【０２９０】
実施例2：Fc-Fc相互作用増強変異E430Gを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-K439E＋抗CD20 IgG1-11B8-S440KへのP329R変異の導入による混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性
インビトロCDC有効性に対する変異P329Rの効果を、抗CD20抗体IgG1-11B8および抗CD52抗体IgG1-CAMPATH-1Hのバリアントの混合物を使用して試験した。異なる濃度の精製抗体（終濃度範囲0.001〜60.0μg/mL）を、20％NHSを用いたWien 133細胞に対するインビトロCDCアッセイで試験した。抗体IgG1-11B8およびIgG1-CAMPATH-1Hに異なる変異を導入した：E430G（これは、増強されたFc-Fc相互作用を誘導する）；P329R（これは、抗体への直接C1q結合を阻害する）；および変異K439EまたはS440Kのいずれか（これは、分子間Fc-Fc相互作用の阻害を通じてホモ六量体抗体複合体の形成を阻害し、かつ、交差補体Fc-Fc相互作用を通じてヘテロ六量体抗体複合体の形成を促進する）。対照として、個々の成分とそれからなる混合物の濃度の直接比較が可能となるように、単一抗体も非結合アイソタイプ対照抗体IgG1-b12またはIgG1-b12-E430Gと1：1で混合した。CDCアッセイのために、0.2％ウシ血清アルブミン（BSA；Roche, Cat No. 10735086001）を含むRPMI（Lonza, Cat No. BE12-115F）中の0.1×106個のWien 133細胞（Geoff Hale博士（BioAnaLab Limited, Oxford, UK）の好意により提供された）を、ポリスチレン丸底96ウェルプレート（Greiner bio-one Cat # 650101）中、精製抗体の濃度系列と、総容量80μLにて、シェーカー上、RTで15分間プレインキュベートした。次に、正常ヒト血清（NHS；Sanquin, Reference No. M0008）20μLを補体供給源として加え、37℃のインキュベーター内で45分間インキュベートした（NHS終濃度20％；3倍希釈で抗体終濃度0.001〜10.0μg/mL）。プレートを氷上に置くことによって反応を停止した後、遠心分離によって細胞をペレット化し、上清を2μg/mLのヨウ化プロピジウム溶液（PI；Sigma Aldrich, Cat No. P4170）20μLに交換して置き換えた。PI陽性細胞の数をIntellicyt iQueスクリーナー（Westburg）でのフローサイトメトリーによって判定し、溶解率を（PI陽性細胞の数/細胞の総数）×100％として算出した。GraphPad PRISMで対数変換濃度を使用した非線形用量応答適合の最良適合値を使用してデータを解析し、3つの実験レプリケートの用量応答曲線下面積を算出した。相対曲線下面積（AUC）値は、最小溶解（IgG1-b12で0％）および最大溶解（IgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物で100％）に対する正規化を表す。
【０２９１】
抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G＋抗CD20 IgG1-11B8-E430G（共にSEQ ID NO 26を含有する）の1：1混合物は、Wiens 133細胞の効率的な細胞溶解を誘導した（図1は、P329R変異の導入による抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％のプールした正常ヒト血清（NHS）の存在下、濃度抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、（A）ヨウ化プロピジウム（PI）陽性細胞のパーセンテージによって決定された溶解率および（B）用量応答-応答曲線下面積（AUC）を、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して正規化して提示される。
【０２９２】
図2は、K322E変異の導入による抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、（A）PI陽性細胞のパーセンテージによって決定された溶解率および（B）AUCを、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して正規化して提示される。
【０２９３】
図3は、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋抗CD20-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントへのK322E変異の導入による、異なる細胞株に対するCDC活性の選択性を示す。インビトロCDCアッセイを、30μg/mLの抗体を用いて、20％NHSの存在下、バーキットリンパ腫細胞株Wien 133（A）、Daudi（B）、Raji（C）およびRamos（D）、急性リンパ芽球性リンパ腫（ALL）細胞株REH（E）、骨髄腫細胞株U266B1（F）、ならびにB細胞リンパ腫細胞株 U-698-M（G）を使用して実施した。CDC活性は、PI陽性細胞のパーセンテージによって決定された溶解率を、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）ならびにREH、U266B1およびWien 133についてはIgG1-CAMPATH-1H-E430G（100％）またはDaudi、Raji、RamosおよびU-698-MについてはIgG1-11B8-E430G（100％）に対して細胞株毎に正規化して提示される。
【０２９４】
図4は、C1q結合阻害変異（G236R、K322A、E269K、K322EまたはP329R）を有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして提示される。正規化は、非結合対照抗体ミックスIgG1-b12-K439E＋IgG1-b12-S440K（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０２９５】
図5は、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋C1q結合増強変異（E333S、K326WまたはK326A/E333A）を有する抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして提示される。正規化は、非結合対照抗体ミックスIgG1-b12-K439E＋IgG1-b12-S440K（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０２９６】
図6は、C1q結合阻害変異G236R（A）、K322A（B）、E269K（C）、K322E（D）またはP329R（E）を有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋C1q結合増強変異（E333S、K326WまたはK326A/E333A）を有する抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして提示される。正規化は、非結合対照抗体ミックスIgG1-b12-K439E＋IgG1-b12-S440K（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０２９７】
図7は、C1q結合阻害変異G236RまたはK322Aを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eの抗体バリアント（A、B）およびC1q結合増強変異E333Sを有する抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの抗体バリアント（C、D）の、ヒトリンパ腫細胞株Wien 133（A、C）およびRaji（B、D）への結合を示す。抗体結合をフローサイトメトリーによって試験した。結合は、蛍光強度の幾何平均（MFI）として表される。結合についての陰性対照として、一次抗体なしの試料または非結合抗gp120抗体IgG1-b12を使用した。
【０２９８】
図8は、C1q結合阻害変異G236RまたはK322Aを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eの抗体バリアント（A、C）およびC1q結合増強変異E333Sを有する抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの抗体バリアント（B、D）のADCC能を示す。（A、B）Raji標的細胞を、抗体希釈系列と高親和性FcγRIIIa（V158）およびホタルルシフェラーゼの発現を駆動するNFAT応答エレメントを安定発現するJurkatヒトT細胞と共インキュベートする、ADCCレポーターバイオアッセイを実施した。ルシフェラーゼ産生を発光読み出しによって定量した。（C、D）Wien 133標的細胞を抗体希釈系列とヒトPBMC（E：T 100：1）と共インキュベートする、インビトロユウロピウムTDA（EuTDA）ADCCアッセイを実施した。上清中のEuTDA蛍光キレートのシグナルを測定することによって、細胞溶解を判定した。
【０２９９】
図9は、C1q結合阻害変異G236RまたはK322Aを有するFc-Fc相互作用が増強された抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-K439E＋C1q結合増強変異E333Sを有するまたは有さないFc-Fc相互作用が増強された抗CD20 IgG1-11B8-S440Kのバリアントの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。試験したFc-Fc相互作用増強変異は、E430G、E345K、E345RおよびE345R-E430Gであった。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCおよび最大溶解として提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０３００】
図10は、G236位（G236RまたはG236K）もしくはG237位（G237A、G237T、G237QまたはG237R）にC1q結合調節変異または二重変異G237A-K322Aを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋C1q結合調節変異E333S、E333A、K326A、K326W-E333S、G237AまたはG237A-E333Sを有するまたは有さない抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCおよび最大溶解として提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０３０１】
図11は、C1q結合阻害変異G236Rを有するまたは有さない抗CD52 CAMPATH-1H-E430G-K439E＋C1q結合増強変異E333Sを有するまたは有さない抗CD20 11B8-E430G-S440Kの混合抗体アイソタイプバリアント（IgG1、IgG2、IgG3およびヒンジ安定化IgG4）によるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０３０２】
図12は、C1q結合阻害変異G236RまたはK322Aを有するまたは有さない抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋C1q結合増強変異E333Sを有するまたは有さない抗CD37 IgG1-CD37-37.3-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによる、（A）Daudi細胞および（B）Wien 133細胞に対するCDC活性の選択性を示す。標的細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-CD37-37.3-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０３０３】
図13は、C1q結合阻害変異G236Rを有するまたは有さない抗DR5 IgG1-DR5-01-G56T-E430G-K439E＋C1q結合増強変異E333Sを有するまたは有さないIgG1-DR5-05-E430G-S440Kの（A）単一抗体バリアントまたは（B）抗体バリアントのアゴニスト混合物の、BxPC-3ヒト膵臓がん細胞に対するDR5媒介細胞傷害性を示す。3日間の生存率アッセイを実施し、CellTiter-Gloキットを使用して細胞生存率を判定した。
【０３０４】
図14は、C1q結合調節変異G237A、G236R、A327K、K322EまたはP329Rを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430Gの抗体バリアントによるCDC活性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12-S440K（0％；示さない）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G（100％）に対して実施された。
【０３０５】
図15は、C1q結合阻害変異G236RまたはK322Aを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eの抗体バリアント（A、B、C）およびC1q結合増強変異E333Sを有する抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの抗体バリアント（D、E、F）のヒトFcRnへの結合を示す。FcRn ELISAを、5μg/mLのヒトFcRnのコート組換え細胞外ドメイン（FcRnhsECDHis-B2M-BIO）および抗体希釈系列を用いて実施した。結合した抗体の量をHRPコンジュゲートヤギ抗ヒトIgG1抗体および化学発光基質ABTSを用いて判定した。吸光度を405nmで測定した。
【０３０６】
図16は、SCIDマウスにおける静脈内投与された抗体500μgのクリアランス率を示す。（A〜C）血漿試料中の総ヒトIgGをELISAによって判定し、（A）IgG1-CAMPATH-1Hバリアント、(B）IgG1-11B8バリアント、および（C）IgG1-CAMPATH-1Hバリアント＋IgG1-11B8バリアントの組み合わせについて濃度対時間曲線にプロットした。各データ点は、トリプリケート試料の平均＋/−標準偏差を表す。（D）抗体の投与後21日目までのクリアランスを、式D*1,000/AUC（式中、Dは注射用量であり、AUCは濃度-時間曲線の曲線下面積である）に従って決定した。
【０３０７】
図17は、C1q結合阻害変異G236RまたはG237Tを有する固定化IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439EバリアントおよびC1q結合増強変異K326AまたはE333Sを有するIgG1-11B8-E430G-S440Kバリアントの、FcγRIIAアロタイプ131H（A）、FcγRIIAアロタイプ131R（B）、FcγRIIB（C）、FcγRIIIAアロタイプ158V（D）およびFcγRIIIAアロタイプ158F（E）の二量体Hisタグ化ビオチン化ECDへの結合をELISAアッセイで試験して示す。結合は、20μg/mLの抗体試料について、抗体なしの対照（バックグラウンド）およびIgG1-11B8-E430G-S440Kへの結合（100％）と相対的に提示される。検出は、ストレプトアビジン-ポリHRPおよびABTSを使用して実施した。
【０３０８】
図18は、C1q結合阻害変異（G236RまたはG237T）を有するまたは有さない抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋C1q結合増強変異E333Sを有するまたは有さないFcγR結合阻害変異G237Aを有する抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして、および40μg/mLのIgGでの溶解として提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０３０９】
図19は、血液細胞のフローサイトメトリー解析によって判定された全血中のIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8のバリアントの組み合わせの選択的活性を示す。Y軸：エフェクター細胞の存在下で一晩（o/n）インキュベーションした後の、総リンパ球集団（CD66b陰性）のB細胞画分（CD19陽性/CD3陰性）またはT細胞画分（CD19陰性/CD3陽性）。X軸：異なる処置群。記号は、1ドナー当たり2つの別々のインキュベーションで試験された、5人の異なる健常ドナー由来の細胞を表す。（A）IgG1-11B8-G237A-E430G-S440Kと混合されたIgG1-CAMPATH-1H-G236R-E430G-K439Eの選択的活性。（B）IgG1-11B8-G237A-E430G-S440Kと混合された、追加のG237変異を含有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eバリアントの選択的活性。（C）追加のC1q結合増強E333S変異を含有するIgG1-11B8-G237A-E430G-S440Kと混合された、追加のG236RまたはG237変異を含有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eバリアントの選択的活性。（D）IgG1-11B8-G237A-E430G-S440Kと混合された追加の変異G236R、G237QまたはG237Rを有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eの共依存性抗体組み合わせと比較した、異なるB細胞ターゲティング抗体によるB細胞枯渇の深度。Y軸：上記の通り決定されたB細胞画分の対数スケール表示。
【０３１０】
図20は、抗CD52成分中にC1q結合阻害変異および抗CD20成分中にC1q結合増強変異を有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439EおよびIgG1-11B8-E430G-S440K抗体バリアントの組み合わせによる、CD20およびCD52の異なる発現レベルを有する異なる細胞株に対するCDC活性の選択性を示す。インビトロCDCアッセイを、0.01〜40μg/mLの抗体を用いて、20％NHSの存在下、バーキットリンパ腫細胞株Daudi（A）、Raji（B）およびRamos（C）、ALL細胞株REH（D）、ならびにB細胞リンパ腫細胞株U-698-M（E）を使用して実施した。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして、および最大溶解として提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０３１１】
図21は、C1q結合阻害変異G236Rを有するまたは有さない抗CD37 IgG1-CD37-37.3-E430G-K439E＋C1q結合増強変異E333Sを有するまたは有さない抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。（A）Daudi細胞および（B）WIL2-S細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして、および40μg/mLのIgGでの溶解として提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CD37-37.3-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０３１２】
図22は、（A）FcγR結合阻害変異およびC1q結合調節変異G236R、G237AまたはG237Tのいずれかと組み合わせた、Fc：Fc相互作用増強変異E430GまたはE345R、自己オリゴマー化阻害変異K439Eを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hの抗体バリアントの、ヒトリンパ腫細胞株Wien 133への結合を示す。抗体結合をフローサイトメトリーによって試験し、野生型IgG1-Campath-1HのBmax値（100％）に対して正規化して提示する。結合についての陰性対照として、非結合抗gp120抗体IgG1-b12を使用した。（B）C1q結合調節変異G236R、G237AまたはG237Tのいずれかと組み合わせた変異E430GおよびK439Eを有するIgG1-Campath-1H抗体バリアントによるRaji細胞への最大結合（Bmax）を、野生型IgG1-Campath-1Hの結合に対して正規化して示す。（C）C1q結合調節変異G236R、G237AまたはG237Tのいずれかと組み合わせた変異E430GおよびS440Kを有するIgG1-Campath-1H抗体バリアントのRaji細胞に結合する見かけのKd値。
【０３１３】
図23は、C1q結合調節変異K326AもしくはE333A（A）またはE333S、G237AもしくはG237A-E333S（B）のいずれかと組み合わせた、Fc-Fc相互作用増強変異E430G、自己オリゴマー化阻害変異S440Kを有する抗CD20 IgG1-11B8の抗体バリアントの、ヒトリンパ腫細胞株Rajiへの結合を示す。抗体結合をフローサイトメトリーによって試験し、野生型IgG1-11B8のBmax値（100％）に対して正規化して提示する。結合についての陰性対照として、非結合抗gp120抗体IgG1-b12を使用した。（C、D）C1q結合調節変異K326AもしくはE333A（C）またはE333S、G237AもしくはG237A-E333S（D）のいずれかと組み合わせた、変異E430GおよびS440Kを有するIgG1-11B8抗体バリアントによるRaji細胞への最大結合（Bmax）を、野生型IgG1-11B8の結合に対して正規化して示す。（E、F）C1q結合調節変異K326AもしくはE333A（E）またはE333S、G237AもしくはG237A-E333S（F）のいずれかと組み合わせた変異E430GおよびS440Kを有するIgG1-11B8抗体バリアントのRaji細胞に結合する見かけのKd値。
【０３１４】
図24は、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hおよび抗CD20 IgG1-11B8抗体バリアントのFcRn結合を示す。（A、C）（A）pH 6.0または（C）pH 7.4で40μg/mLの抗体濃度を使用した、Fc-Fc相互作用増強変異E430G、自己オリゴマー化阻害変異K439EおよびC1q結合調節変異G237AまたはG237Tを有する抗CD52抗体IgG1-CAMPATH-1HのバリアントについてのヒトFcRnへの結合を示す。（B、D）（B）pH 6.0または（D）pH 7.4で40μg/mLの抗体濃度を使用した、Fc-Fc相互作用増強変異E430G、自己オリゴマー化阻害変異S440KおよびC1q結合調節変異K326A、E333A、G237AまたはG237A-E333Sを有する抗CD20抗体IgG1-11B8のバリアントによるヒトFcRnへの結合。FcRn ELISAを、2μg/mLのヒトFcRnのコート組換え細胞外ドメイン（FcRnECDHis-B2M-BIO）および抗体希釈系列を用いて実施した。結合した抗体の量をHRPコンジュゲートヤギ抗ヒトIgG1抗体および化学発光基質ABTSを用いて判定した。吸光度を405nmで測定した。
【０３１５】
図25は、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hもしくは抗IgG1-11B8抗体バリアントまたはそれらの混合物を注射したマウスから収集された血液試料中で測定された場合の総ヒトIgG（hIgG）濃度を示す。（A）野生型IgG1-CAMPATH-1H、IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G237QまたはIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G236Rを注射したマウスから収集された血液試料中の総hIgG濃度。（B）野生型IgG1-11B8、IgG1-11B8-E430G-S440K-G237AまたはIgG1-11B8-E430G-S440K-E333Sを注射したマウスから収集された血液試料中の総hIgG濃度。（C）野生型IgG1-CAMPATH-1H＋IgG1-11B8の混合物または（A）および（B）のような変異を保有するIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8抗体バリアントの混合物を注射したマウスから収集された血液試料中の総hIgG濃度。すべての図面で、点線は、SCIDマウスにおける野生型IgG1抗体についての予測された経時的IgG1濃度を表す。（D）抗体の投与後21日目までのクリアランスを、式D*1000/AUC（式中、Dは注射用量であり、AUCは濃度-時間曲線の曲線下面積である）に従って決定した。
【０３１６】
図26は、変異E430G、K439EまたはS440KおよびG236R、G237A、G237QまたはG237Rを保有するIgG1-CAMPATH-1H、IgG1-11B8およびIgG1-b12の抗体バリアントとインキュベートした試料中で検出されたC4dの、抗体を含有しない陰性対照試料中で検出された平均C4d濃度の減算後の濃度（μg/ml単位）を示す。陽性対照試料は、Fc-Fc相互作用増強変異E345R、E430GおよびS440Y（RGY）を保有する抗体バリアントを含む。
【０３１７】
図27は、補体供給源としての正常ヒト血清と氷上でインキュベートしたWien 133細胞へのC1q結合を、変異E430G、K439EまたはS440KおよびG236R、G237T、K326AまたはE333Sを保有する抗体IgG1-CAMPATH-1H、IgG1-11B8およびIgG1-b12のバリアントでのオプソニン化後、フローサイトメトリーによって検出して示す。平均蛍光強度値は、対数アゴニスト応答モデルを適合させることによって推定された抗体なしの対照反応（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物の最高レベル（100％）に対して正規化された。（A）対照反応のC1q結合。（B〜D）非結合対照IgG1-b12または異なるIgG1-11B8バリアントと混合された、（B）IgG1-CAMPATH-E430G-K439E、(C）IgG1-CAMPATH-E430G-K439E-G236R、および（D）IgG1-CAMPATH-E430G-K439E-G237RのC1q結合。
【０３１８】
図28は、自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440KおよびC1q結合調節変異を保有するIgG1-CAMPATH-1H-E430GおよびIgG1-11B8-E430G抗体バリアントによるFcγR結合を示す。（A〜E）（A）高親和性アロタイプFcγRIIA 131H、(B）低親和性アロタイプFcγRIIA 131R、(C）FcγRIIB、(D）高親和性アロタイプFcγRIIIA 158V、または（E）低親和性アロタイプFcγRIIIA 158Fの、ELISAアッセイで試験した場合の二量体Hisタグ化ビオチン化ECDへの固定化抗体バリアントの結合。（F）ELISAで試験した抗体バリアントへの固定化FcγRIaの結合。結合は、20μg/mLの抗体試料について提示され、一次抗体なしでインキュベートしたウェル中のシグナルの減算後、野生型IgG1-CAMPATH-1Hについて観察された平均シグナル（100％）に対して実験毎に正規化された。検出は、ストレプトアビジン-ポリHRPおよびABTSを使用して実施した。
【０３１９】
図29は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を調節する変異の導入による、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H、抗CD20 IgG1-11B8および抗CD52 IgG1-h2E8の混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、3つの独立した実験で測定し、（A）非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して正規化された平均AUC、ならびに（B）40μg/mlの抗体濃度でのヨウ化プロピジウム陽性によって判定された平均溶解率として提示される。
【０３２０】
図30（A、B）は、表示の通りの自己オリゴマー化阻害変異およびC1q結合調節変異を保有する、単剤および組み合わせた抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G、抗CD20 IgG1-11B8-E430G、および非抗原結合IgG1-b12-E430G抗体バリアントのCDC有効性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して正規化されたAUCとして提示される。
【０３２１】
図31は、（A）FcγRIIaまたは（B）FcγRIIIaのいずれかを安定発現するJurkatレポーター細胞株の活性化を、Rajiリンパ腫細胞と異なる濃度のIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8抗体バリアントと共培養した際の発光（RLU）のレベルによって測定して示す。発光値は、IgG1-b12について観察された発光値（0％）および野生型IgG1-Campath-1H＋野生型IgG1-11B8について観察された発光値（100％）に対して実験毎に正規化された後、3つ（FcγRIIa）または2つ（FcγRIIIa）の実験レプリケートで平均された。
【０３２２】
図32は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を調節する変異を保有するIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8抗体バリアントの非等モル比の混合物によって誘導されたWien 133細胞に対する共依存性CDCを示す。（A）等モルおよび非等モル濃度比のIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G236RおよびIgG1-11B8-E430G-S440K-G237Aを含有する混合物によって誘導された共依存性CDC。（B）等モルおよび非等モル濃度比のIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G237QおよびIgG1-11B8-E430G-S440K-G237Aを含有する混合物によって誘導された共依存性CDC。
【０３２３】
図33は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を阻害する変異の導入による、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hの抗体バリアントと抗HLA-DR IgG1-HLA-DR-huL243バリアント（A）または抗HLA-DR IgG1-HLA-DR-1D09C3バリアント（B）のいずれかとの混合物によるCDC活性の選択性を示す。Oci-Ly17細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）および（A）IgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-HLA-DR-huL243-E430Gの混合物（100％）または（B）IgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-HLA-DR-1D09C3-E430Gの混合物（100％）に対して正規化されたAUCとして提示される。
【０３２４】
図34は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を阻害する変異の導入による、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hおよび抗CD20 IgG1-11B8の混合抗体バリアントの選択的共依存性CDC活性を示す。CDC有効性を、変異L234A、L234A-L235A、L234F、L234F-L235E、L235A、L235Q、G236RまたはG237Qのいずれかを有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eのバリアント、およびこれらのバリアントと非結合対照抗体IgG1-b12またはIgG1-11B8-E430G-S440Kのいずれかとの混合物について示す。CDC有効性は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して正規化されたAUCとして提示される。
【０３２５】
図35は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を阻害する変異の導入による、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hおよび抗CD20 IgG1-11B8の混合抗体バリアントの選択的共依存性CDC活性を示す。（A）Fc-Fc相互作用増強変異E430G、E430N、E430T、E430V、E430Y、E345A、E345K、E345Q、E345RまたはE345Y、自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440KおよびC1q結合阻害変異G236RまたはG237Aを保有するIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8の抗体バリアントの単剤またはそれらの混合物としてのCDC有効性。（B）Fc-Fc相互作用増強変異E430G、E430N、E430T、E430V、E430Y、E345A、E345Q、E345VまたはE345Y、自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440KおよびC1q結合阻害変異G236RまたはG237Aを保有するIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8の抗体バリアントの単剤またはそれらの混合物としてのCDC有効性。（C）一致するFc-Fc相互作用増強変異E430G、E430N、E430T、E430V、E430Y、E345A、E345Q、E345VまたはE345Y、自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440KおよびC1q結合阻害変異G236RまたはG237Aを保有するIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8の抗体バリアントの単剤またはそれらの混合物としてのCDC有効性。（D）Fc-Fc相互作用増強変異E430GまたはK248E-T437R、自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440KおよびC1q結合調節変異G236R、G237AまたはE333Sを保有するIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8の抗体バリアントの単剤またはそれらの混合物としてのCDC有効性。CDC有効性は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して正規化されたAUCとして提示される。
【０３２６】
図36は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を調節する変異を保有するIgG1-CD37-37-3およびIgG1-11B8抗体バリアントの混合物によって誘導されたRajiリンパ腫細胞に対する共依存性CDCを示す。（A）表示の抗体バリアントの希釈物またはそれらの混合物によって誘導された細胞溶解の、最小溶解（IgG1-b12で0％）および最大溶解（IgG1-CD37-37-3-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物で100％）に対して正規化された相対曲線下面積（AUC）。（B）表示の抗体バリアントおよびそれらの混合物によって誘導された最大溶解率。
【０３２７】
図37は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を調節する変異の導入による、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hおよび抗CD20 IgG1-11B8の混合抗体バリアントの選択的共依存性CDC活性を示す。患者CLL試料を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、抗体バリアントとインキュベーションした際の生存B細胞のパーセンテージとして提示される。患者1（A）、2（B）および3（C）由来のCLL試料を使用した結果を示す。
【０３２８】
図38は、全血試料と、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を調節する変異を保有するIgG1-CAMPATH-1H、IgG1-huCLB-T3/4およびIgG1-CD5-INSERMの抗体バリアントの混合物とのインキュベーション後のフローサイトメトリーによって検出された、B細胞、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞の画分を示す。表示のIgG1-CAMPATH-1H、IgG1-huCLB-T3/4およびIgG1-b12抗体バリアントとのインキュベーション後の4人のドナーの全血試料中で検出された、（A）B細胞、(B）CD4+ T細胞および（C）CD8+ T細胞のパーセンテージ。表示のIgG1-CAMPATH-1H、IgG1-CD5-INSERMおよびIgG1-b12抗体バリアントとのインキュベーション後の4人のドナーの全血試料中で検出された、（D）B細胞、(E）CD4+ T細胞および（F）CD8+ T細胞のパーセンテージ。分率を［100％×（試料中の細胞数/「抗体なしの試料」中の細胞数）×（「抗体なしの試料」中の顆粒球数/試料中の顆粒球数）］として算出した。
【０３２９】
図39は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を阻害する（G237T）または増強する（K326W-E333S）変異を保有する抗DR4および抗DR5抗体バリアントによる、がん細胞におけるプログラム細胞死の協同的活性化を示す。（A）表示の抗体バリアントと72時間インキュベーションした後のBxPC-3ヒト膵臓がん細胞の生存率。（B）表示の抗体バリアントと72時間インキュベーションした後のCOLO 205ヒト結腸がん細胞の生存率。生存細胞のパーセンテージを、以下の式を使用して算出した：生存細胞％＝［（抗体試料の発光−スタウロスポリン試料の発光）/（抗体なしの試料の発光−スタウロスポリン試料の発光）］＊100。
【０３３０】
図1において100%に設定したAは、P329R変異の導入による抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％のプールした正常ヒト血清（NHS）の存在下、濃度抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、（A）ヨウ化プロピジウム（PI）陽性細胞のパーセンテージによって決定された溶解率および（B）用量応答-応答曲線下面積（AUC）を、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して正規化して提示される。
【０３３１】
図2は、K322E変異の導入による抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、（A）PI陽性細胞のパーセンテージによって決定された溶解率および（B）AUCを、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して正規化して提示される。
【０３３２】
図3は、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋抗CD20-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントへのK322E変異の導入による、異なる細胞株に対するCDC活性の選択性を示す。インビトロCDCアッセイを、30μg/mLの抗体を用いて、20％NHSの存在下、バーキットリンパ腫細胞株Wien 133（A）、Daudi（B）、Raji（C）およびRamos（D）、急性リンパ芽球性リンパ腫（ALL）細胞株REH（E）、骨髄腫細胞株U266B1（F）、ならびにB細胞リンパ腫細胞株 U-698-M（G）を使用して実施した。CDC活性は、PI陽性細胞のパーセンテージによって決定された溶解率を、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）ならびにREH、U266B1およびWien 133についてはIgG1-CAMPATH-1H-E430G（100％）またはDaudi、Raji、RamosおよびU-698-MについてはIgG1-11B8-E430G（100％）に対して細胞株毎に正規化して提示される。
【０３３３】
図4は、C1q結合阻害変異（G236R、K322A、E269K、K322EまたはP329R）を有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして提示される。正規化は、非結合対照抗体ミックスIgG1-b12-K439E＋IgG1-b12-S440K（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０３３４】
図5は、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋C1q結合増強変異（E333S、K326WまたはK326A/E333A）を有する抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして提示される。正規化は、非結合対照抗体ミックスIgG1-b12-K439E＋IgG1-b12-S440K（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０３３５】
図6は、C1q結合阻害変異G236R（A）、K322A（B）、E269K（C）、K322E（D）またはP329R（E）を有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋C1q結合増強変異（E333S、K326WまたはK326A/E333A）を有する抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして提示される。正規化は、非結合対照抗体ミックスIgG1-b12-K439E＋IgG1-b12-S440K（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０３３６】
図7は、C1q結合阻害変異G236RまたはK322Aを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eの抗体バリアント（A、B）およびC1q結合増強変異E333Sを有する抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの抗体バリアント（C、D）の、ヒトリンパ腫細胞株Wien 133（A、C）およびRaji（B、D）への結合を示す。抗体結合をフローサイトメトリーによって試験した。結合は、蛍光強度の幾何平均（MFI）として表される。結合についての陰性対照として、一次抗体なしの試料または非結合抗gp120抗体IgG1-b12を使用した。
【０３３７】
図8は、C1q結合阻害変異G236RまたはK322Aを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eの抗体バリアント（A、C）およびC1q結合増強変異E333Sを有する抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの抗体バリアント（B、D）のADCC能を示す。（A、B）Raji標的細胞を、抗体希釈系列と高親和性FcγRIIIa（V158）およびホタルルシフェラーゼの発現を駆動するNFAT応答エレメントを安定発現するJurkatヒトT細胞と共インキュベートする、ADCCレポーターバイオアッセイを実施した。ルシフェラーゼ産生を発光読み出しによって定量した。（C、D）Wien 133標的細胞を抗体希釈系列とヒトPBMC（E：T 100：1）と共インキュベートする、インビトロユウロピウムTDA（EuTDA）ADCCアッセイを実施した。上清中のEuTDA蛍光キレートのシグナルを測定することによって、細胞溶解を判定した。
【０３３８】
図9は、C1q結合阻害変異G236RまたはK322Aを有するFc-Fc相互作用が増強された抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-K439E＋C1q結合増強変異E333Sを有するまたは有さないFc-Fc相互作用が増強された抗CD20 IgG1-11B8-S440Kのバリアントの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。試験したFc-Fc相互作用増強変異は、E430G、E345K、E345RおよびE345R-E430Gであった。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCおよび最大溶解として提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０３３９】
図10は、G236位（G236RまたはG236K）もしくはG237位（G237A、G237T、G237QまたはG237R）にC1q結合調節変異または二重変異G237A-K322Aを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋C1q結合調節変異E333S、E333A、K326A、K326W-E333S、G237AまたはG237A-E333Sを有するまたは有さない抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCおよび最大溶解として提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０３４０】
図11は、C1q結合阻害変異G236Rを有するまたは有さない抗CD52 CAMPATH-1H-E430G-K439E＋C1q結合増強変異E333Sを有するまたは有さない抗CD20 11B8-E430G-S440Kの混合抗体アイソタイプバリアント（IgG1、IgG2、IgG3およびヒンジ安定化IgG4）によるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０３４１】
図12は、C1q結合阻害変異G236RまたはK322Aを有するまたは有さない抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋C1q結合増強変異E333Sを有するまたは有さない抗CD37 IgG1-CD37-37.3-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによる、（A）Daudi細胞および（B）Wien 133細胞に対するCDC活性の選択性を示す。標的細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-CD37-37.3-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０３４２】
図13は、C1q結合阻害変異G236Rを有するまたは有さない抗DR5 IgG1-DR5-01-G56T-E430G-K439E＋C1q結合増強変異E333Sを有するまたは有さないIgG1-DR5-05-E430G-S440Kの（A）単一抗体バリアントまたは（B）抗体バリアントのアゴニスト混合物の、BxPC-3ヒト膵臓がん細胞に対するDR5媒介細胞傷害性を示す。3日間の生存率アッセイを実施し、CellTiter-Gloキットを使用して細胞生存率を判定した。
【０３４３】
図14は、C1q結合調節変異G237A、G236R、A327K、K322EまたはP329Rを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430Gの抗体バリアントによるCDC活性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12-S440K（0％；示さない）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G（100％）に対して実施された。
【０３４４】
図15は、C1q結合阻害変異G236RまたはK322Aを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eの抗体バリアント（A、B、C）およびC1q結合増強変異E333Sを有する抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの抗体バリアント（D、E、F）のヒトFcRnへの結合を示す。FcRn ELISAを、5μg/mLのヒトFcRnのコート組換え細胞外ドメイン（FcRnhsECDHis-B2M-BIO）および抗体希釈系列を用いて実施した。結合した抗体の量をHRPコンジュゲートヤギ抗ヒトIgG1抗体および化学発光基質ABTSを用いて判定した。吸光度を405nmで測定した。
【０３４５】
図16は、SCIDマウスにおける静脈内投与された抗体500μgのクリアランス率を示す。（A〜C）血漿試料中の総ヒトIgGをELISAによって判定し、（A）IgG1-CAMPATH-1Hバリアント、(B）IgG1-11B8バリアント、および（C）IgG1-CAMPATH-1Hバリアント＋IgG1-11B8バリアントの組み合わせについて濃度対時間曲線にプロットした。各データ点は、トリプリケート試料の平均＋/−標準偏差を表す。（D）抗体の投与後21日目までのクリアランスを、式D*1,000/AUC（式中、Dは注射用量であり、AUCは濃度-時間曲線の曲線下面積である）に従って決定した。
【０３４６】
図17は、C1q結合阻害変異G236RまたはG237Tを有する固定化IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439EバリアントおよびC1q結合増強変異K326AまたはE333Sを有するIgG1-11B8-E430G-S440Kバリアントの、FcγRIIAアロタイプ131H（A）、FcγRIIAアロタイプ131R（B）、FcγRIIB（C）、FcγRIIIAアロタイプ158V（D）およびFcγRIIIAアロタイプ158F（E）の二量体Hisタグ化ビオチン化ECDへの結合をELISAアッセイで試験して示す。結合は、20μg/mLの抗体試料について、抗体なしの対照（バックグラウンド）およびIgG1-11B8-E430G-S440Kへの結合（100％）と相対的に提示される。検出は、ストレプトアビジン-ポリHRPおよびABTSを使用して実施した。
【０３４７】
図18は、C1q結合阻害変異（G236RまたはG237T）を有するまたは有さない抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋C1q結合増強変異E333Sを有するまたは有さないFcγR結合阻害変異G237Aを有する抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして、および40μg/mLのIgGでの溶解として提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０３４８】
図19は、血液細胞のフローサイトメトリー解析によって判定された全血中のIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8のバリアントの組み合わせの選択的活性を示す。Y軸：エフェクター細胞の存在下で一晩（o/n）インキュベーションした後の、総リンパ球集団（CD66b陰性）のB細胞画分（CD19陽性/CD3陰性）またはT細胞画分（CD19陰性/CD3陽性）。X軸：異なる処置群。記号は、1ドナー当たり2つの別々のインキュベーションで試験された、5人の異なる健常ドナー由来の細胞を表す。（A）IgG1-11B8-G237A-E430G-S440Kと混合されたIgG1-CAMPATH-1H-G236R-E430G-K439Eの選択的活性。（B）IgG1-11B8-G237A-E430G-S440Kと混合された、追加のG237変異を含有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eバリアントの選択的活性。（C）追加のC1q結合増強E333S変異を含有するIgG1-11B8-G237A-E430G-S440Kと混合された、追加のG236RまたはG237変異を含有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eバリアントの選択的活性。（D）IgG1-11B8-G237A-E430G-S440Kと混合された追加の変異G236R、G237QまたはG237Rを有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eの共依存性抗体組み合わせと比較した、異なるB細胞ターゲティング抗体によるB細胞枯渇の深度。Y軸：上記の通り決定されたB細胞画分の対数スケール表示。
【０３４９】
図20は、抗CD52成分中にC1q結合阻害変異および抗CD20成分中にC1q結合増強変異を有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439EおよびIgG1-11B8-E430G-S440K抗体バリアントの組み合わせによる、CD20およびCD52の異なる発現レベルを有する異なる細胞株に対するCDC活性の選択性を示す。インビトロCDCアッセイを、0.01〜40μg/mLの抗体を用いて、20％NHSの存在下、バーキットリンパ腫細胞株Daudi（A）、Raji（B）およびRamos（C）、ALL細胞株REH（D）、ならびにB細胞リンパ腫細胞株U-698-M（E）を使用して実施した。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして、および最大溶解として提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０３５０】
図21は、C1q結合阻害変異G236Rを有するまたは有さない抗CD37 IgG1-CD37-37.3-E430G-K439E＋C1q結合増強変異E333Sを有するまたは有さない抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。（A）Daudi細胞および（B）WIL2-S細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして、および40μg/mLのIgGでの溶解として提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CD37-37.3-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０３５１】
図22は、（A）FcγR結合阻害変異およびC1q結合調節変異G236R、G237AまたはG237Tのいずれかと組み合わせた、Fc：Fc相互作用増強変異E430GまたはE345R、自己オリゴマー化阻害変異K439Eを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hの抗体バリアントの、ヒトリンパ腫細胞株Wien 133への結合を示す。抗体結合をフローサイトメトリーによって試験し、野生型IgG1-Campath-1HのBmax値（100％）に対して正規化して提示する。結合についての陰性対照として、非結合抗gp120抗体IgG1-b12を使用した。（B）C1q結合調節変異G236R、G237AまたはG237Tのいずれかと組み合わせた変異E430GおよびK439Eを有するIgG1-Campath-1H抗体バリアントによるRaji細胞への最大結合（Bmax）を、野生型IgG1-Campath-1Hの結合に対して正規化して示す。（C）C1q結合調節変異G236R、G237AまたはG237Tのいずれかと組み合わせた変異E430GおよびS440Kを有するIgG1-Campath-1H抗体バリアントのRaji細胞に結合する見かけのKd値。
【０３５２】
図23は、C1q結合調節変異K326AもしくはE333A（A）またはE333S、G237AもしくはG237A-E333S（B）のいずれかと組み合わせた、Fc-Fc相互作用増強変異E430G、自己オリゴマー化阻害変異S440Kを有する抗CD20 IgG1-11B8の抗体バリアントの、ヒトリンパ腫細胞株Rajiへの結合を示す。抗体結合をフローサイトメトリーによって試験し、野生型IgG1-11B8のBmax値（100％）に対して正規化して提示する。結合についての陰性対照として、非結合抗gp120抗体IgG1-b12を使用した。（C、D）C1q結合調節変異K326AもしくはE333A（C）またはE333S、G237AもしくはG237A-E333S（D）のいずれかと組み合わせた、変異E430GおよびS440Kを有するIgG1-11B8抗体バリアントによるRaji細胞への最大結合（Bmax）を、野生型IgG1-11B8の結合に対して正規化して示す。（E、F）C1q結合調節変異K326AもしくはE333A（E）またはE333S、G237AもしくはG237A-E333S（F）のいずれかと組み合わせた変異E430GおよびS440Kを有するIgG1-11B8抗体バリアントのRaji細胞に結合する見かけのKd値。
【０３５３】
図24は、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hおよび抗CD20 IgG1-11B8抗体バリアントのFcRn結合を示す。（A、C）（A）pH 6.0または（C）pH 7.4で40μg/mLの抗体濃度を使用した、Fc-Fc相互作用増強変異E430G、自己オリゴマー化阻害変異K439EおよびC1q結合調節変異G237AまたはG237Tを有する抗CD52抗体IgG1-CAMPATH-1HのバリアントについてのヒトFcRnへの結合を示す。（B、D）（B）pH 6.0または（D）pH 7.4で40μg/mLの抗体濃度を使用した、Fc-Fc相互作用増強変異E430G、自己オリゴマー化阻害変異S440KおよびC1q結合調節変異K326A、E333A、G237AまたはG237A-E333Sを有する抗CD20抗体IgG1-11B8のバリアントによるヒトFcRnへの結合。FcRn ELISAを、2μg/mLのヒトFcRnのコート組換え細胞外ドメイン（FcRnECDHis-B2M-BIO）および抗体希釈系列を用いて実施した。結合した抗体の量をHRPコンジュゲートヤギ抗ヒトIgG1抗体および化学発光基質ABTSを用いて判定した。吸光度を405nmで測定した。
【０３５４】
図25は、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hもしくは抗IgG1-11B8抗体バリアントまたはそれらの混合物を注射したマウスから収集された血液試料中で測定された場合の総ヒトIgG（hIgG）濃度を示す。（A）野生型IgG1-CAMPATH-1H、IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G237QまたはIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G236Rを注射したマウスから収集された血液試料中の総hIgG濃度。（B）野生型IgG1-11B8、IgG1-11B8-E430G-S440K-G237AまたはIgG1-11B8-E430G-S440K-E333Sを注射したマウスから収集された血液試料中の総hIgG濃度。（C）野生型IgG1-CAMPATH-1H＋IgG1-11B8の混合物または（A）および（B）のような変異を保有するIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8抗体バリアントの混合物を注射したマウスから収集された血液試料中の総hIgG濃度。すべての図面で、点線は、SCIDマウスにおける野生型IgG1抗体についての予測された経時的IgG1濃度を表す。（D）抗体の投与後21日目までのクリアランスを、式D*1000/AUC（式中、Dは注射用量であり、AUCは濃度-時間曲線の曲線下面積である）に従って決定した。
【０３５５】
図26は、変異E430G、K439EまたはS440KおよびG236R、G237A、G237QまたはG237Rを保有するIgG1-CAMPATH-1H、IgG1-11B8およびIgG1-b12の抗体バリアントとインキュベートした試料中で検出されたC4dの、抗体を含有しない陰性対照試料中で検出された平均C4d濃度の減算後の濃度（μg/ml単位）を示す。陽性対照試料は、Fc-Fc相互作用増強変異E345R、E430GおよびS440Y（RGY）を保有する抗体バリアントを含む。
【０３５６】
図27は、補体供給源としての正常ヒト血清と氷上でインキュベートしたWien 133細胞へのC1q結合を、変異E430G、K439EまたはS440KおよびG236R、G237T、K326AまたはE333Sを保有する抗体IgG1-CAMPATH-1H、IgG1-11B8およびIgG1-b12のバリアントでのオプソニン化後、フローサイトメトリーによって検出して示す。平均蛍光強度値は、対数アゴニスト応答モデルを適合させることによって推定された抗体なしの対照反応（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物の最高レベル（100％）に対して正規化された。（A）対照反応のC1q結合。（B〜D）非結合対照IgG1-b12または異なるIgG1-11B8バリアントと混合された、（B）IgG1-CAMPATH-E430G-K439E、(C）IgG1-CAMPATH-E430G-K439E-G236R、および（D）IgG1-CAMPATH-E430G-K439E-G237RのC1q結合。
【０３５７】
図28は、自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440KおよびC1q結合調節変異を保有するIgG1-CAMPATH-1H-E430GおよびIgG1-11B8-E430G抗体バリアントによるFcγR結合を示す。（A〜E）（A）高親和性アロタイプFcγRIIA 131H、(B）低親和性アロタイプFcγRIIA 131R、(C）FcγRIIB、(D）高親和性アロタイプFcγRIIIA 158V、または（E）低親和性アロタイプFcγRIIIA 158Fの、ELISAアッセイで試験した場合の二量体Hisタグ化ビオチン化ECDへの固定化抗体バリアントの結合。（F）ELISAで試験した抗体バリアントへの固定化FcγRIaの結合。結合は、20μg/mLの抗体試料について提示され、一次抗体なしでインキュベートしたウェル中のシグナルの減算後、野生型IgG1-CAMPATH-1Hについて観察された平均シグナル（100％）に対して実験毎に正規化された。検出は、ストレプトアビジン-ポリHRPおよびABTSを使用して実施した。
【０３５８】
図29は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を調節する変異の導入による、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H、抗CD20 IgG1-11B8および抗CD52 IgG1-h2E8の混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、3つの独立した実験で測定し、（A）非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して正規化された平均AUC、ならびに（B）40μg/mlの抗体濃度でのヨウ化プロピジウム陽性によって判定された平均溶解率として提示される。
【０３５９】
図30（A、B）は、表示の通りの自己オリゴマー化阻害変異およびC1q結合調節変異を保有する、単剤および組み合わせた抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G、抗CD20 IgG1-11B8-E430G、および非抗原結合IgG1-b12-E430G抗体バリアントのCDC有効性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して正規化されたAUCとして提示される。
【０３６０】
図31は、（A）FcγRIIaまたは（B）FcγRIIIaのいずれかを安定発現するJurkatレポーター細胞株の活性化を、Rajiリンパ腫細胞と異なる濃度のIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8抗体バリアントと共培養した際の発光（RLU）のレベルによって測定して示す。発光値は、IgG1-b12について観察された発光値（0％）および野生型IgG1-Campath-1H＋野生型IgG1-11B8について観察された発光値（100％）に対して実験毎に正規化された後、3つ（FcγRIIa）または2つ（FcγRIIIa）の実験レプリケートで平均された。
【０３６１】
図32は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を調節する変異を保有するIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8抗体バリアントの非等モル比の混合物によって誘導されたWien 133細胞に対する共依存性CDCを示す。（A）等モルおよび非等モル濃度比のIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G236RおよびIgG1-11B8-E430G-S440K-G237Aを含有する混合物によって誘導された共依存性CDC。（B）等モルおよび非等モル濃度比のIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G237QおよびIgG1-11B8-E430G-S440K-G237Aを含有する混合物によって誘導された共依存性CDC。
【０３６２】
図33は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を阻害する変異の導入による、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hの抗体バリアントと抗HLA-DR IgG1-HLA-DR-huL243バリアント（A）または抗HLA-DR IgG1-HLA-DR-1D09C3バリアント（B）のいずれかとの混合物によるCDC活性の選択性を示す。Oci-Ly17細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）および（A）IgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-HLA-DR-huL243-E430Gの混合物（100％）または（B）IgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-HLA-DR-1D09C3-E430Gの混合物（100％）に対して正規化されたAUCとして提示される。
【０３６３】
図34は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を阻害する変異の導入による、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hおよび抗CD20 IgG1-11B8の混合抗体バリアントの選択的共依存性CDC活性を示す。CDC有効性を、変異L234A、L234A-L235A、L234F、L234F-L235E、L235A、L235Q、G236RまたはG237Qのいずれかを有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eのバリアント、およびこれらのバリアントと非結合対照抗体IgG1-b12またはIgG1-11B8-E430G-S440Kのいずれかとの混合物について示す。CDC有効性は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して正規化されたAUCとして提示される。
【０３６４】
図35は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を阻害する変異の導入による、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hおよび抗CD20 IgG1-11B8の混合抗体バリアントの選択的共依存性CDC活性を示す。（A）Fc-Fc相互作用増強変異E430G、E430N、E430T、E430V、E430Y、E345A、E345K、E345Q、E345RまたはE345Y、自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440KおよびC1q結合阻害変異G236RまたはG237Aを保有するIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8の抗体バリアントの単剤またはそれらの混合物としてのCDC有効性。（B）Fc-Fc相互作用増強変異E430G、E430N、E430T、E430V、E430Y、E345A、E345Q、E345VまたはE345Y、自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440KおよびC1q結合阻害変異G236RまたはG237Aを保有するIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8の抗体バリアントの単剤またはそれらの混合物としてのCDC有効性。（C）一致するFc-Fc相互作用増強変異E430G、E430N、E430T、E430V、E430Y、E345A、E345Q、E345VまたはE345Y、自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440KおよびC1q結合阻害変異G236RまたはG237Aを保有するIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8の抗体バリアントの単剤またはそれらの混合物としてのCDC有効性。（D）Fc-Fc相互作用増強変異E430GまたはK248E-T437R、自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440KおよびC1q結合調節変異G236R、G237AまたはE333Sを保有するIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8の抗体バリアントの単剤またはそれらの混合物としてのCDC有効性。CDC有効性は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して正規化されたAUCとして提示される。
【０３６５】
図36は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を調節する変異を保有するIgG1-CD37-37-3およびIgG1-11B8抗体バリアントの混合物によって誘導されたRajiリンパ腫細胞に対する共依存性CDCを示す。（A）表示の抗体バリアントの希釈物またはそれらの混合物によって誘導された細胞溶解の、最小溶解（IgG1-b12で0％）および最大溶解（IgG1-CD37-37-3-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物で100％）に対して正規化された相対曲線下面積（AUC）。（B）表示の抗体バリアントおよびそれらの混合物によって誘導された最大溶解率。
【０３６６】
図37は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を調節する変異の導入による、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hおよび抗CD20 IgG1-11B8の混合抗体バリアントの選択的共依存性CDC活性を示す。患者CLL試料を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、抗体バリアントとインキュベーションした際の生存B細胞のパーセンテージとして提示される。患者1（A）、2（B）および3（C）由来のCLL試料を使用した結果を示す。
【０３６７】
図38は、全血試料と、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を調節する変異を保有するIgG1-CAMPATH-1H、IgG1-huCLB-T3/4およびIgG1-CD5-INSERMの抗体バリアントの混合物とのインキュベーション後のフローサイトメトリーによって検出された、B細胞、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞の画分を示す。表示のIgG1-CAMPATH-1H、IgG1-huCLB-T3/4およびIgG1-b12抗体バリアントとのインキュベーション後の4人のドナーの全血試料中で検出された、（A）B細胞、(B）CD4+ T細胞および（C）CD8+ T細胞のパーセンテージ。表示のIgG1-CAMPATH-1H、IgG1-CD5-INSERMおよびIgG1-b12抗体バリアントとのインキュベーション後の4人のドナーの全血試料中で検出された、（D）B細胞、(E）CD4+ T細胞および（F）CD8+ T細胞のパーセンテージ。分率を［100％×（試料中の細胞数/「抗体なしの試料」中の細胞数）×（「抗体なしの試料」中の顆粒球数/試料中の顆粒球数）］として算出した。
【０３６８】
図39は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を阻害する（G237T）または増強する（K326W-E333S）変異を保有する抗DR4および抗DR5抗体バリアントによる、がん細胞におけるプログラム細胞死の協同的活性化を示す。（A）表示の抗体バリアントと72時間インキュベーションした後のBxPC-3ヒト膵臓がん細胞の生存率。（B）表示の抗体バリアントと72時間インキュベーションした後のCOLO 205ヒト結腸がん細胞の生存率。生存細胞のパーセンテージを、以下の式を使用して算出した：生存細胞％＝［（抗体試料の発光−スタウロスポリン試料の発光）/（抗体なしの試料の発光−スタウロスポリン試料の発光）］＊100。
【０３６９】
B) は、別々の単一抗体よりも効率的であることが見いだされた（図1は、P329R変異の導入による抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％のプールした正常ヒト血清（NHS）の存在下、濃度抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、（A）ヨウ化プロピジウム（PI）陽性細胞のパーセンテージによって決定された溶解率および（B）用量応答-応答曲線下面積（AUC）を、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して正規化して提示される。
【０３７０】
図2は、K322E変異の導入による抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、（A）PI陽性細胞のパーセンテージによって決定された溶解率および（B）AUCを、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して正規化して提示される。
【０３７１】
図3は、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋抗CD20-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントへのK322E変異の導入による、異なる細胞株に対するCDC活性の選択性を示す。インビトロCDCアッセイを、30μg/mLの抗体を用いて、20％NHSの存在下、バーキットリンパ腫細胞株Wien 133（A）、Daudi（B）、Raji（C）およびRamos（D）、急性リンパ芽球性リンパ腫（ALL）細胞株REH（E）、骨髄腫細胞株U266B1（F）、ならびにB細胞リンパ腫細胞株 U-698-M（G）を使用して実施した。CDC活性は、PI陽性細胞のパーセンテージによって決定された溶解率を、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）ならびにREH、U266B1およびWien 133についてはIgG1-CAMPATH-1H-E430G（100％）またはDaudi、Raji、RamosおよびU-698-MについてはIgG1-11B8-E430G（100％）に対して細胞株毎に正規化して提示される。
【０３７２】
図4は、C1q結合阻害変異（G236R、K322A、E269K、K322EまたはP329R）を有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして提示される。正規化は、非結合対照抗体ミックスIgG1-b12-K439E＋IgG1-b12-S440K（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０３７３】
図5は、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋C1q結合増強変異（E333S、K326WまたはK326A/E333A）を有する抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして提示される。正規化は、非結合対照抗体ミックスIgG1-b12-K439E＋IgG1-b12-S440K（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０３７４】
図6は、C1q結合阻害変異G236R（A）、K322A（B）、E269K（C）、K322E（D）またはP329R（E）を有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋C1q結合増強変異（E333S、K326WまたはK326A/E333A）を有する抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして提示される。正規化は、非結合対照抗体ミックスIgG1-b12-K439E＋IgG1-b12-S440K（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０３７５】
図7は、C1q結合阻害変異G236RまたはK322Aを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eの抗体バリアント（A、B）およびC1q結合増強変異E333Sを有する抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの抗体バリアント（C、D）の、ヒトリンパ腫細胞株Wien 133（A、C）およびRaji（B、D）への結合を示す。抗体結合をフローサイトメトリーによって試験した。結合は、蛍光強度の幾何平均（MFI）として表される。結合についての陰性対照として、一次抗体なしの試料または非結合抗gp120抗体IgG1-b12を使用した。
【０３７６】
図8は、C1q結合阻害変異G236RまたはK322Aを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eの抗体バリアント（A、C）およびC1q結合増強変異E333Sを有する抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの抗体バリアント（B、D）のADCC能を示す。（A、B）Raji標的細胞を、抗体希釈系列と高親和性FcγRIIIa（V158）およびホタルルシフェラーゼの発現を駆動するNFAT応答エレメントを安定発現するJurkatヒトT細胞と共インキュベートする、ADCCレポーターバイオアッセイを実施した。ルシフェラーゼ産生を発光読み出しによって定量した。（C、D）Wien 133標的細胞を抗体希釈系列とヒトPBMC（E：T 100：1）と共インキュベートする、インビトロユウロピウムTDA（EuTDA）ADCCアッセイを実施した。上清中のEuTDA蛍光キレートのシグナルを測定することによって、細胞溶解を判定した。
【０３７７】
図9は、C1q結合阻害変異G236RまたはK322Aを有するFc-Fc相互作用が増強された抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-K439E＋C1q結合増強変異E333Sを有するまたは有さないFc-Fc相互作用が増強された抗CD20 IgG1-11B8-S440Kのバリアントの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。試験したFc-Fc相互作用増強変異は、E430G、E345K、E345RおよびE345R-E430Gであった。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCおよび最大溶解として提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０３７８】
図10は、G236位（G236RまたはG236K）もしくはG237位（G237A、G237T、G237QまたはG237R）にC1q結合調節変異または二重変異G237A-K322Aを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋C1q結合調節変異E333S、E333A、K326A、K326W-E333S、G237AまたはG237A-E333Sを有するまたは有さない抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCおよび最大溶解として提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０３７９】
図11は、C1q結合阻害変異G236Rを有するまたは有さない抗CD52 CAMPATH-1H-E430G-K439E＋C1q結合増強変異E333Sを有するまたは有さない抗CD20 11B8-E430G-S440Kの混合抗体アイソタイプバリアント（IgG1、IgG2、IgG3およびヒンジ安定化IgG4）によるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０３８０】
図12は、C1q結合阻害変異G236RまたはK322Aを有するまたは有さない抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋C1q結合増強変異E333Sを有するまたは有さない抗CD37 IgG1-CD37-37.3-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによる、（A）Daudi細胞および（B）Wien 133細胞に対するCDC活性の選択性を示す。標的細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-CD37-37.3-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０３８１】
図13は、C1q結合阻害変異G236Rを有するまたは有さない抗DR5 IgG1-DR5-01-G56T-E430G-K439E＋C1q結合増強変異E333Sを有するまたは有さないIgG1-DR5-05-E430G-S440Kの（A）単一抗体バリアントまたは（B）抗体バリアントのアゴニスト混合物の、BxPC-3ヒト膵臓がん細胞に対するDR5媒介細胞傷害性を示す。3日間の生存率アッセイを実施し、CellTiter-Gloキットを使用して細胞生存率を判定した。
【０３８２】
図14は、C1q結合調節変異G237A、G236R、A327K、K322EまたはP329Rを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430Gの抗体バリアントによるCDC活性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12-S440K（0％；示さない）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G（100％）に対して実施された。
【０３８３】
図15は、C1q結合阻害変異G236RまたはK322Aを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eの抗体バリアント（A、B、C）およびC1q結合増強変異E333Sを有する抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの抗体バリアント（D、E、F）のヒトFcRnへの結合を示す。FcRn ELISAを、5μg/mLのヒトFcRnのコート組換え細胞外ドメイン（FcRnhsECDHis-B2M-BIO）および抗体希釈系列を用いて実施した。結合した抗体の量をHRPコンジュゲートヤギ抗ヒトIgG1抗体および化学発光基質ABTSを用いて判定した。吸光度を405nmで測定した。
【０３８４】
図16は、SCIDマウスにおける静脈内投与された抗体500μgのクリアランス率を示す。（A〜C）血漿試料中の総ヒトIgGをELISAによって判定し、（A）IgG1-CAMPATH-1Hバリアント、(B）IgG1-11B8バリアント、および（C）IgG1-CAMPATH-1Hバリアント＋IgG1-11B8バリアントの組み合わせについて濃度対時間曲線にプロットした。各データ点は、トリプリケート試料の平均＋/−標準偏差を表す。（D）抗体の投与後21日目までのクリアランスを、式D*1,000/AUC（式中、Dは注射用量であり、AUCは濃度-時間曲線の曲線下面積である）に従って決定した。
【０３８５】
図17は、C1q結合阻害変異G236RまたはG237Tを有する固定化IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439EバリアントおよびC1q結合増強変異K326AまたはE333Sを有するIgG1-11B8-E430G-S440Kバリアントの、FcγRIIAアロタイプ131H（A）、FcγRIIAアロタイプ131R（B）、FcγRIIB（C）、FcγRIIIAアロタイプ158V（D）およびFcγRIIIAアロタイプ158F（E）の二量体Hisタグ化ビオチン化ECDへの結合をELISAアッセイで試験して示す。結合は、20μg/mLの抗体試料について、抗体なしの対照（バックグラウンド）およびIgG1-11B8-E430G-S440Kへの結合（100％）と相対的に提示される。検出は、ストレプトアビジン-ポリHRPおよびABTSを使用して実施した。
【０３８６】
図18は、C1q結合阻害変異（G236RまたはG237T）を有するまたは有さない抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋C1q結合増強変異E333Sを有するまたは有さないFcγR結合阻害変異G237Aを有する抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして、および40μg/mLのIgGでの溶解として提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０３８７】
図19は、血液細胞のフローサイトメトリー解析によって判定された全血中のIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8のバリアントの組み合わせの選択的活性を示す。Y軸：エフェクター細胞の存在下で一晩（o/n）インキュベーションした後の、総リンパ球集団（CD66b陰性）のB細胞画分（CD19陽性/CD3陰性）またはT細胞画分（CD19陰性/CD3陽性）。X軸：異なる処置群。記号は、1ドナー当たり2つの別々のインキュベーションで試験された、5人の異なる健常ドナー由来の細胞を表す。（A）IgG1-11B8-G237A-E430G-S440Kと混合されたIgG1-CAMPATH-1H-G236R-E430G-K439Eの選択的活性。（B）IgG1-11B8-G237A-E430G-S440Kと混合された、追加のG237変異を含有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eバリアントの選択的活性。（C）追加のC1q結合増強E333S変異を含有するIgG1-11B8-G237A-E430G-S440Kと混合された、追加のG236RまたはG237変異を含有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eバリアントの選択的活性。（D）IgG1-11B8-G237A-E430G-S440Kと混合された追加の変異G236R、G237QまたはG237Rを有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eの共依存性抗体組み合わせと比較した、異なるB細胞ターゲティング抗体によるB細胞枯渇の深度。Y軸：上記の通り決定されたB細胞画分の対数スケール表示。
【０３８８】
図20は、抗CD52成分中にC1q結合阻害変異および抗CD20成分中にC1q結合増強変異を有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439EおよびIgG1-11B8-E430G-S440K抗体バリアントの組み合わせによる、CD20およびCD52の異なる発現レベルを有する異なる細胞株に対するCDC活性の選択性を示す。インビトロCDCアッセイを、0.01〜40μg/mLの抗体を用いて、20％NHSの存在下、バーキットリンパ腫細胞株Daudi（A）、Raji（B）およびRamos（C）、ALL細胞株REH（D）、ならびにB細胞リンパ腫細胞株U-698-M（E）を使用して実施した。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして、および最大溶解として提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０３８９】
図21は、C1q結合阻害変異G236Rを有するまたは有さない抗CD37 IgG1-CD37-37.3-E430G-K439E＋C1q結合増強変異E333Sを有するまたは有さない抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。（A）Daudi細胞および（B）WIL2-S細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして、および40μg/mLのIgGでの溶解として提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CD37-37.3-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０３９０】
図22は、（A）FcγR結合阻害変異およびC1q結合調節変異G236R、G237AまたはG237Tのいずれかと組み合わせた、Fc：Fc相互作用増強変異E430GまたはE345R、自己オリゴマー化阻害変異K439Eを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hの抗体バリアントの、ヒトリンパ腫細胞株Wien 133への結合を示す。抗体結合をフローサイトメトリーによって試験し、野生型IgG1-Campath-1HのBmax値（100％）に対して正規化して提示する。結合についての陰性対照として、非結合抗gp120抗体IgG1-b12を使用した。（B）C1q結合調節変異G236R、G237AまたはG237Tのいずれかと組み合わせた変異E430GおよびK439Eを有するIgG1-Campath-1H抗体バリアントによるRaji細胞への最大結合（Bmax）を、野生型IgG1-Campath-1Hの結合に対して正規化して示す。（C）C1q結合調節変異G236R、G237AまたはG237Tのいずれかと組み合わせた変異E430GおよびS440Kを有するIgG1-Campath-1H抗体バリアントのRaji細胞に結合する見かけのKd値。
【０３９１】
図23は、C1q結合調節変異K326AもしくはE333A（A）またはE333S、G237AもしくはG237A-E333S（B）のいずれかと組み合わせた、Fc-Fc相互作用増強変異E430G、自己オリゴマー化阻害変異S440Kを有する抗CD20 IgG1-11B8の抗体バリアントの、ヒトリンパ腫細胞株Rajiへの結合を示す。抗体結合をフローサイトメトリーによって試験し、野生型IgG1-11B8のBmax値（100％）に対して正規化して提示する。結合についての陰性対照として、非結合抗gp120抗体IgG1-b12を使用した。（C、D）C1q結合調節変異K326AもしくはE333A（C）またはE333S、G237AもしくはG237A-E333S（D）のいずれかと組み合わせた、変異E430GおよびS440Kを有するIgG1-11B8抗体バリアントによるRaji細胞への最大結合（Bmax）を、野生型IgG1-11B8の結合に対して正規化して示す。（E、F）C1q結合調節変異K326AもしくはE333A（E）またはE333S、G237AもしくはG237A-E333S（F）のいずれかと組み合わせた変異E430GおよびS440Kを有するIgG1-11B8抗体バリアントのRaji細胞に結合する見かけのKd値。
【０３９２】
図24は、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hおよび抗CD20 IgG1-11B8抗体バリアントのFcRn結合を示す。（A、C）（A）pH 6.0または（C）pH 7.4で40μg/mLの抗体濃度を使用した、Fc-Fc相互作用増強変異E430G、自己オリゴマー化阻害変異K439EおよびC1q結合調節変異G237AまたはG237Tを有する抗CD52抗体IgG1-CAMPATH-1HのバリアントについてのヒトFcRnへの結合を示す。（B、D）（B）pH 6.0または（D）pH 7.4で40μg/mLの抗体濃度を使用した、Fc-Fc相互作用増強変異E430G、自己オリゴマー化阻害変異S440KおよびC1q結合調節変異K326A、E333A、G237AまたはG237A-E333Sを有する抗CD20抗体IgG1-11B8のバリアントによるヒトFcRnへの結合。FcRn ELISAを、2μg/mLのヒトFcRnのコート組換え細胞外ドメイン（FcRnECDHis-B2M-BIO）および抗体希釈系列を用いて実施した。結合した抗体の量をHRPコンジュゲートヤギ抗ヒトIgG1抗体および化学発光基質ABTSを用いて判定した。吸光度を405nmで測定した。
【０３９３】
図25は、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hもしくは抗IgG1-11B8抗体バリアントまたはそれらの混合物を注射したマウスから収集された血液試料中で測定された場合の総ヒトIgG（hIgG）濃度を示す。（A）野生型IgG1-CAMPATH-1H、IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G237QまたはIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G236Rを注射したマウスから収集された血液試料中の総hIgG濃度。（B）野生型IgG1-11B8、IgG1-11B8-E430G-S440K-G237AまたはIgG1-11B8-E430G-S440K-E333Sを注射したマウスから収集された血液試料中の総hIgG濃度。（C）野生型IgG1-CAMPATH-1H＋IgG1-11B8の混合物または（A）および（B）のような変異を保有するIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8抗体バリアントの混合物を注射したマウスから収集された血液試料中の総hIgG濃度。すべての図面で、点線は、SCIDマウスにおける野生型IgG1抗体についての予測された経時的IgG1濃度を表す。（D）抗体の投与後21日目までのクリアランスを、式D*1000/AUC（式中、Dは注射用量であり、AUCは濃度-時間曲線の曲線下面積である）に従って決定した。
【０３９４】
図26は、変異E430G、K439EまたはS440KおよびG236R、G237A、G237QまたはG237Rを保有するIgG1-CAMPATH-1H、IgG1-11B8およびIgG1-b12の抗体バリアントとインキュベートした試料中で検出されたC4dの、抗体を含有しない陰性対照試料中で検出された平均C4d濃度の減算後の濃度（μg/ml単位）を示す。陽性対照試料は、Fc-Fc相互作用増強変異E345R、E430GおよびS440Y（RGY）を保有する抗体バリアントを含む。
【０３９５】
図27は、補体供給源としての正常ヒト血清と氷上でインキュベートしたWien 133細胞へのC1q結合を、変異E430G、K439EまたはS440KおよびG236R、G237T、K326AまたはE333Sを保有する抗体IgG1-CAMPATH-1H、IgG1-11B8およびIgG1-b12のバリアントでのオプソニン化後、フローサイトメトリーによって検出して示す。平均蛍光強度値は、対数アゴニスト応答モデルを適合させることによって推定された抗体なしの対照反応（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物の最高レベル（100％）に対して正規化された。（A）対照反応のC1q結合。（B〜D）非結合対照IgG1-b12または異なるIgG1-11B8バリアントと混合された、（B）IgG1-CAMPATH-E430G-K439E、(C）IgG1-CAMPATH-E430G-K439E-G236R、および（D）IgG1-CAMPATH-E430G-K439E-G237RのC1q結合。
【０３９６】
図28は、自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440KおよびC1q結合調節変異を保有するIgG1-CAMPATH-1H-E430GおよびIgG1-11B8-E430G抗体バリアントによるFcγR結合を示す。（A〜E）（A）高親和性アロタイプFcγRIIA 131H、(B）低親和性アロタイプFcγRIIA 131R、(C）FcγRIIB、(D）高親和性アロタイプFcγRIIIA 158V、または（E）低親和性アロタイプFcγRIIIA 158Fの、ELISAアッセイで試験した場合の二量体Hisタグ化ビオチン化ECDへの固定化抗体バリアントの結合。（F）ELISAで試験した抗体バリアントへの固定化FcγRIaの結合。結合は、20μg/mLの抗体試料について提示され、一次抗体なしでインキュベートしたウェル中のシグナルの減算後、野生型IgG1-CAMPATH-1Hについて観察された平均シグナル（100％）に対して実験毎に正規化された。検出は、ストレプトアビジン-ポリHRPおよびABTSを使用して実施した。
【０３９７】
図29は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を調節する変異の導入による、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H、抗CD20 IgG1-11B8および抗CD52 IgG1-h2E8の混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、3つの独立した実験で測定し、（A）非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して正規化された平均AUC、ならびに（B）40μg/mlの抗体濃度でのヨウ化プロピジウム陽性によって判定された平均溶解率として提示される。
【０３９８】
図30（A、B）は、表示の通りの自己オリゴマー化阻害変異およびC1q結合調節変異を保有する、単剤および組み合わせた抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G、抗CD20 IgG1-11B8-E430G、および非抗原結合IgG1-b12-E430G抗体バリアントのCDC有効性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して正規化されたAUCとして提示される。
【０３９９】
図31は、（A）FcγRIIaまたは（B）FcγRIIIaのいずれかを安定発現するJurkatレポーター細胞株の活性化を、Rajiリンパ腫細胞と異なる濃度のIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8抗体バリアントと共培養した際の発光（RLU）のレベルによって測定して示す。発光値は、IgG1-b12について観察された発光値（0％）および野生型IgG1-Campath-1H＋野生型IgG1-11B8について観察された発光値（100％）に対して実験毎に正規化された後、3つ（FcγRIIa）または2つ（FcγRIIIa）の実験レプリケートで平均された。
【０４００】
図32は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を調節する変異を保有するIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8抗体バリアントの非等モル比の混合物によって誘導されたWien 133細胞に対する共依存性CDCを示す。（A）等モルおよび非等モル濃度比のIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G236RおよびIgG1-11B8-E430G-S440K-G237Aを含有する混合物によって誘導された共依存性CDC。（B）等モルおよび非等モル濃度比のIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G237QおよびIgG1-11B8-E430G-S440K-G237Aを含有する混合物によって誘導された共依存性CDC。
【０４０１】
図33は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を阻害する変異の導入による、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hの抗体バリアントと抗HLA-DR IgG1-HLA-DR-huL243バリアント（A）または抗HLA-DR IgG1-HLA-DR-1D09C3バリアント（B）のいずれかとの混合物によるCDC活性の選択性を示す。Oci-Ly17細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）および（A）IgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-HLA-DR-huL243-E430Gの混合物（100％）または（B）IgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-HLA-DR-1D09C3-E430Gの混合物（100％）に対して正規化されたAUCとして提示される。
【０４０２】
図34は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を阻害する変異の導入による、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hおよび抗CD20 IgG1-11B8の混合抗体バリアントの選択的共依存性CDC活性を示す。CDC有効性を、変異L234A、L234A-L235A、L234F、L234F-L235E、L235A、L235Q、G236RまたはG237Qのいずれかを有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eのバリアント、およびこれらのバリアントと非結合対照抗体IgG1-b12またはIgG1-11B8-E430G-S440Kのいずれかとの混合物について示す。CDC有効性は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して正規化されたAUCとして提示される。
【０４０３】
図35は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を阻害する変異の導入による、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hおよび抗CD20 IgG1-11B8の混合抗体バリアントの選択的共依存性CDC活性を示す。（A）Fc-Fc相互作用増強変異E430G、E430N、E430T、E430V、E430Y、E345A、E345K、E345Q、E345RまたはE345Y、自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440KおよびC1q結合阻害変異G236RまたはG237Aを保有するIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8の抗体バリアントの単剤またはそれらの混合物としてのCDC有効性。（B）Fc-Fc相互作用増強変異E430G、E430N、E430T、E430V、E430Y、E345A、E345Q、E345VまたはE345Y、自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440KおよびC1q結合阻害変異G236RまたはG237Aを保有するIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8の抗体バリアントの単剤またはそれらの混合物としてのCDC有効性。（C）一致するFc-Fc相互作用増強変異E430G、E430N、E430T、E430V、E430Y、E345A、E345Q、E345VまたはE345Y、自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440KおよびC1q結合阻害変異G236RまたはG237Aを保有するIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8の抗体バリアントの単剤またはそれらの混合物としてのCDC有効性。（D）Fc-Fc相互作用増強変異E430GまたはK248E-T437R、自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440KおよびC1q結合調節変異G236R、G237AまたはE333Sを保有するIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8の抗体バリアントの単剤またはそれらの混合物としてのCDC有効性。CDC有効性は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して正規化されたAUCとして提示される。
【０４０４】
図36は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を調節する変異を保有するIgG1-CD37-37-3およびIgG1-11B8抗体バリアントの混合物によって誘導されたRajiリンパ腫細胞に対する共依存性CDCを示す。（A）表示の抗体バリアントの希釈物またはそれらの混合物によって誘導された細胞溶解の、最小溶解（IgG1-b12で0％）および最大溶解（IgG1-CD37-37-3-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物で100％）に対して正規化された相対曲線下面積（AUC）。（B）表示の抗体バリアントおよびそれらの混合物によって誘導された最大溶解率。
【０４０５】
図37は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を調節する変異の導入による、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hおよび抗CD20 IgG1-11B8の混合抗体バリアントの選択的共依存性CDC活性を示す。患者CLL試料を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、抗体バリアントとインキュベーションした際の生存B細胞のパーセンテージとして提示される。患者1（A）、2（B）および3（C）由来のCLL試料を使用した結果を示す。
【０４０６】
図38は、全血試料と、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を調節する変異を保有するIgG1-CAMPATH-1H、IgG1-huCLB-T3/4およびIgG1-CD5-INSERMの抗体バリアントの混合物とのインキュベーション後のフローサイトメトリーによって検出された、B細胞、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞の画分を示す。表示のIgG1-CAMPATH-1H、IgG1-huCLB-T3/4およびIgG1-b12抗体バリアントとのインキュベーション後の4人のドナーの全血試料中で検出された、（A）B細胞、(B）CD4+ T細胞および（C）CD8+ T細胞のパーセンテージ。表示のIgG1-CAMPATH-1H、IgG1-CD5-INSERMおよびIgG1-b12抗体バリアントとのインキュベーション後の4人のドナーの全血試料中で検出された、（D）B細胞、(E）CD4+ T細胞および（F）CD8+ T細胞のパーセンテージ。分率を［100％×（試料中の細胞数/「抗体なしの試料」中の細胞数）×（「抗体なしの試料」中の顆粒球数/試料中の顆粒球数）］として算出した。
【０４０７】
図39は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を阻害する（G237T）または増強する（K326W-E333S）変異を保有する抗DR4および抗DR5抗体バリアントによる、がん細胞におけるプログラム細胞死の協同的活性化を示す。（A）表示の抗体バリアントと72時間インキュベーションした後のBxPC-3ヒト膵臓がん細胞の生存率。（B）表示の抗体バリアントと72時間インキュベーションした後のCOLO 205ヒト結腸がん細胞の生存率。生存細胞のパーセンテージを、以下の式を使用して算出した：生存細胞％＝［（抗体試料の発光−スタウロスポリン試料の発光）/（抗体なしの試料の発光−スタウロスポリン試料の発光）］＊100。
【０４０８】
B) IgG1-CAMPATH-1H-E430Gを単剤として試験した場合、K439E変異の導入(SEQ ID NO 80)によりCDC有効性が減少し、K439E-P329R(SEQ ID NO 100)によりCDC活性が完全に喪失した（図1は、P329R変異の導入による抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％のプールした正常ヒト血清（NHS）の存在下、濃度抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、（A）ヨウ化プロピジウム（PI）陽性細胞のパーセンテージによって決定された溶解率および（B）用量応答-応答曲線下面積（AUC）を、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して正規化して提示される。
【０４０９】
図2は、K322E変異の導入による抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、（A）PI陽性細胞のパーセンテージによって決定された溶解率および（B）AUCを、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して正規化して提示される。
【０４１０】
図3は、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋抗CD20-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントへのK322E変異の導入による、異なる細胞株に対するCDC活性の選択性を示す。インビトロCDCアッセイを、30μg/mLの抗体を用いて、20％NHSの存在下、バーキットリンパ腫細胞株Wien 133（A）、Daudi（B）、Raji（C）およびRamos（D）、急性リンパ芽球性リンパ腫（ALL）細胞株REH（E）、骨髄腫細胞株U266B1（F）、ならびにB細胞リンパ腫細胞株 U-698-M（G）を使用して実施した。CDC活性は、PI陽性細胞のパーセンテージによって決定された溶解率を、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）ならびにREH、U266B1およびWien 133についてはIgG1-CAMPATH-1H-E430G（100％）またはDaudi、Raji、RamosおよびU-698-MについてはIgG1-11B8-E430G（100％）に対して細胞株毎に正規化して提示される。
【０４１１】
図4は、C1q結合阻害変異（G236R、K322A、E269K、K322EまたはP329R）を有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして提示される。正規化は、非結合対照抗体ミックスIgG1-b12-K439E＋IgG1-b12-S440K（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０４１２】
図5は、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋C1q結合増強変異（E333S、K326WまたはK326A/E333A）を有する抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして提示される。正規化は、非結合対照抗体ミックスIgG1-b12-K439E＋IgG1-b12-S440K（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０４１３】
図6は、C1q結合阻害変異G236R（A）、K322A（B）、E269K（C）、K322E（D）またはP329R（E）を有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋C1q結合増強変異（E333S、K326WまたはK326A/E333A）を有する抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして提示される。正規化は、非結合対照抗体ミックスIgG1-b12-K439E＋IgG1-b12-S440K（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０４１４】
図7は、C1q結合阻害変異G236RまたはK322Aを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eの抗体バリアント（A、B）およびC1q結合増強変異E333Sを有する抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの抗体バリアント（C、D）の、ヒトリンパ腫細胞株Wien 133（A、C）およびRaji（B、D）への結合を示す。抗体結合をフローサイトメトリーによって試験した。結合は、蛍光強度の幾何平均（MFI）として表される。結合についての陰性対照として、一次抗体なしの試料または非結合抗gp120抗体IgG1-b12を使用した。
【０４１５】
図8は、C1q結合阻害変異G236RまたはK322Aを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eの抗体バリアント（A、C）およびC1q結合増強変異E333Sを有する抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの抗体バリアント（B、D）のADCC能を示す。（A、B）Raji標的細胞を、抗体希釈系列と高親和性FcγRIIIa（V158）およびホタルルシフェラーゼの発現を駆動するNFAT応答エレメントを安定発現するJurkatヒトT細胞と共インキュベートする、ADCCレポーターバイオアッセイを実施した。ルシフェラーゼ産生を発光読み出しによって定量した。（C、D）Wien 133標的細胞を抗体希釈系列とヒトPBMC（E：T 100：1）と共インキュベートする、インビトロユウロピウムTDA（EuTDA）ADCCアッセイを実施した。上清中のEuTDA蛍光キレートのシグナルを測定することによって、細胞溶解を判定した。
【０４１６】
図9は、C1q結合阻害変異G236RまたはK322Aを有するFc-Fc相互作用が増強された抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-K439E＋C1q結合増強変異E333Sを有するまたは有さないFc-Fc相互作用が増強された抗CD20 IgG1-11B8-S440Kのバリアントの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。試験したFc-Fc相互作用増強変異は、E430G、E345K、E345RおよびE345R-E430Gであった。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCおよび最大溶解として提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０４１７】
図10は、G236位（G236RまたはG236K）もしくはG237位（G237A、G237T、G237QまたはG237R）にC1q結合調節変異または二重変異G237A-K322Aを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋C1q結合調節変異E333S、E333A、K326A、K326W-E333S、G237AまたはG237A-E333Sを有するまたは有さない抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCおよび最大溶解として提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０４１８】
図11は、C1q結合阻害変異G236Rを有するまたは有さない抗CD52 CAMPATH-1H-E430G-K439E＋C1q結合増強変異E333Sを有するまたは有さない抗CD20 11B8-E430G-S440Kの混合抗体アイソタイプバリアント（IgG1、IgG2、IgG3およびヒンジ安定化IgG4）によるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０４１９】
図12は、C1q結合阻害変異G236RまたはK322Aを有するまたは有さない抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋C1q結合増強変異E333Sを有するまたは有さない抗CD37 IgG1-CD37-37.3-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによる、（A）Daudi細胞および（B）Wien 133細胞に対するCDC活性の選択性を示す。標的細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-CD37-37.3-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０４２０】
図13は、C1q結合阻害変異G236Rを有するまたは有さない抗DR5 IgG1-DR5-01-G56T-E430G-K439E＋C1q結合増強変異E333Sを有するまたは有さないIgG1-DR5-05-E430G-S440Kの（A）単一抗体バリアントまたは（B）抗体バリアントのアゴニスト混合物の、BxPC-3ヒト膵臓がん細胞に対するDR5媒介細胞傷害性を示す。3日間の生存率アッセイを実施し、CellTiter-Gloキットを使用して細胞生存率を判定した。
【０４２１】
図14は、C1q結合調節変異G237A、G236R、A327K、K322EまたはP329Rを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430Gの抗体バリアントによるCDC活性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12-S440K（0％；示さない）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G（100％）に対して実施された。
【０４２２】
図15は、C1q結合阻害変異G236RまたはK322Aを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eの抗体バリアント（A、B、C）およびC1q結合増強変異E333Sを有する抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの抗体バリアント（D、E、F）のヒトFcRnへの結合を示す。FcRn ELISAを、5μg/mLのヒトFcRnのコート組換え細胞外ドメイン（FcRnhsECDHis-B2M-BIO）および抗体希釈系列を用いて実施した。結合した抗体の量をHRPコンジュゲートヤギ抗ヒトIgG1抗体および化学発光基質ABTSを用いて判定した。吸光度を405nmで測定した。
【０４２３】
図16は、SCIDマウスにおける静脈内投与された抗体500μgのクリアランス率を示す。（A〜C）血漿試料中の総ヒトIgGをELISAによって判定し、（A）IgG1-CAMPATH-1Hバリアント、(B）IgG1-11B8バリアント、および（C）IgG1-CAMPATH-1Hバリアント＋IgG1-11B8バリアントの組み合わせについて濃度対時間曲線にプロットした。各データ点は、トリプリケート試料の平均＋/−標準偏差を表す。（D）抗体の投与後21日目までのクリアランスを、式D*1,000/AUC（式中、Dは注射用量であり、AUCは濃度-時間曲線の曲線下面積である）に従って決定した。
【０４２４】
図17は、C1q結合阻害変異G236RまたはG237Tを有する固定化IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439EバリアントおよびC1q結合増強変異K326AまたはE333Sを有するIgG1-11B8-E430G-S440Kバリアントの、FcγRIIAアロタイプ131H（A）、FcγRIIAアロタイプ131R（B）、FcγRIIB（C）、FcγRIIIAアロタイプ158V（D）およびFcγRIIIAアロタイプ158F（E）の二量体Hisタグ化ビオチン化ECDへの結合をELISAアッセイで試験して示す。結合は、20μg/mLの抗体試料について、抗体なしの対照（バックグラウンド）およびIgG1-11B8-E430G-S440Kへの結合（100％）と相対的に提示される。検出は、ストレプトアビジン-ポリHRPおよびABTSを使用して実施した。
【０４２５】
図18は、C1q結合阻害変異（G236RまたはG237T）を有するまたは有さない抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋C1q結合増強変異E333Sを有するまたは有さないFcγR結合阻害変異G237Aを有する抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして、および40μg/mLのIgGでの溶解として提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０４２６】
図19は、血液細胞のフローサイトメトリー解析によって判定された全血中のIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8のバリアントの組み合わせの選択的活性を示す。Y軸：エフェクター細胞の存在下で一晩（o/n）インキュベーションした後の、総リンパ球集団（CD66b陰性）のB細胞画分（CD19陽性/CD3陰性）またはT細胞画分（CD19陰性/CD3陽性）。X軸：異なる処置群。記号は、1ドナー当たり2つの別々のインキュベーションで試験された、5人の異なる健常ドナー由来の細胞を表す。（A）IgG1-11B8-G237A-E430G-S440Kと混合されたIgG1-CAMPATH-1H-G236R-E430G-K439Eの選択的活性。（B）IgG1-11B8-G237A-E430G-S440Kと混合された、追加のG237変異を含有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eバリアントの選択的活性。（C）追加のC1q結合増強E333S変異を含有するIgG1-11B8-G237A-E430G-S440Kと混合された、追加のG236RまたはG237変異を含有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eバリアントの選択的活性。（D）IgG1-11B8-G237A-E430G-S440Kと混合された追加の変異G236R、G237QまたはG237Rを有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eの共依存性抗体組み合わせと比較した、異なるB細胞ターゲティング抗体によるB細胞枯渇の深度。Y軸：上記の通り決定されたB細胞画分の対数スケール表示。
【０４２７】
図20は、抗CD52成分中にC1q結合阻害変異および抗CD20成分中にC1q結合増強変異を有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439EおよびIgG1-11B8-E430G-S440K抗体バリアントの組み合わせによる、CD20およびCD52の異なる発現レベルを有する異なる細胞株に対するCDC活性の選択性を示す。インビトロCDCアッセイを、0.01〜40μg/mLの抗体を用いて、20％NHSの存在下、バーキットリンパ腫細胞株Daudi（A）、Raji（B）およびRamos（C）、ALL細胞株REH（D）、ならびにB細胞リンパ腫細胞株U-698-M（E）を使用して実施した。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして、および最大溶解として提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０４２８】
図21は、C1q結合阻害変異G236Rを有するまたは有さない抗CD37 IgG1-CD37-37.3-E430G-K439E＋C1q結合増強変異E333Sを有するまたは有さない抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。（A）Daudi細胞および（B）WIL2-S細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして、および40μg/mLのIgGでの溶解として提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CD37-37.3-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０４２９】
図22は、（A）FcγR結合阻害変異およびC1q結合調節変異G236R、G237AまたはG237Tのいずれかと組み合わせた、Fc：Fc相互作用増強変異E430GまたはE345R、自己オリゴマー化阻害変異K439Eを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hの抗体バリアントの、ヒトリンパ腫細胞株Wien 133への結合を示す。抗体結合をフローサイトメトリーによって試験し、野生型IgG1-Campath-1HのBmax値（100％）に対して正規化して提示する。結合についての陰性対照として、非結合抗gp120抗体IgG1-b12を使用した。（B）C1q結合調節変異G236R、G237AまたはG237Tのいずれかと組み合わせた変異E430GおよびK439Eを有するIgG1-Campath-1H抗体バリアントによるRaji細胞への最大結合（Bmax）を、野生型IgG1-Campath-1Hの結合に対して正規化して示す。（C）C1q結合調節変異G236R、G237AまたはG237Tのいずれかと組み合わせた変異E430GおよびS440Kを有するIgG1-Campath-1H抗体バリアントのRaji細胞に結合する見かけのKd値。
【０４３０】
図23は、C1q結合調節変異K326AもしくはE333A（A）またはE333S、G237AもしくはG237A-E333S（B）のいずれかと組み合わせた、Fc-Fc相互作用増強変異E430G、自己オリゴマー化阻害変異S440Kを有する抗CD20 IgG1-11B8の抗体バリアントの、ヒトリンパ腫細胞株Rajiへの結合を示す。抗体結合をフローサイトメトリーによって試験し、野生型IgG1-11B8のBmax値（100％）に対して正規化して提示する。結合についての陰性対照として、非結合抗gp120抗体IgG1-b12を使用した。（C、D）C1q結合調節変異K326AもしくはE333A（C）またはE333S、G237AもしくはG237A-E333S（D）のいずれかと組み合わせた、変異E430GおよびS440Kを有するIgG1-11B8抗体バリアントによるRaji細胞への最大結合（Bmax）を、野生型IgG1-11B8の結合に対して正規化して示す。（E、F）C1q結合調節変異K326AもしくはE333A（E）またはE333S、G237AもしくはG237A-E333S（F）のいずれかと組み合わせた変異E430GおよびS440Kを有するIgG1-11B8抗体バリアントのRaji細胞に結合する見かけのKd値。
【０４３１】
図24は、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hおよび抗CD20 IgG1-11B8抗体バリアントのFcRn結合を示す。（A、C）（A）pH 6.0または（C）pH 7.4で40μg/mLの抗体濃度を使用した、Fc-Fc相互作用増強変異E430G、自己オリゴマー化阻害変異K439EおよびC1q結合調節変異G237AまたはG237Tを有する抗CD52抗体IgG1-CAMPATH-1HのバリアントについてのヒトFcRnへの結合を示す。（B、D）（B）pH 6.0または（D）pH 7.4で40μg/mLの抗体濃度を使用した、Fc-Fc相互作用増強変異E430G、自己オリゴマー化阻害変異S440KおよびC1q結合調節変異K326A、E333A、G237AまたはG237A-E333Sを有する抗CD20抗体IgG1-11B8のバリアントによるヒトFcRnへの結合。FcRn ELISAを、2μg/mLのヒトFcRnのコート組換え細胞外ドメイン（FcRnECDHis-B2M-BIO）および抗体希釈系列を用いて実施した。結合した抗体の量をHRPコンジュゲートヤギ抗ヒトIgG1抗体および化学発光基質ABTSを用いて判定した。吸光度を405nmで測定した。
【０４３２】
図25は、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hもしくは抗IgG1-11B8抗体バリアントまたはそれらの混合物を注射したマウスから収集された血液試料中で測定された場合の総ヒトIgG（hIgG）濃度を示す。（A）野生型IgG1-CAMPATH-1H、IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G237QまたはIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G236Rを注射したマウスから収集された血液試料中の総hIgG濃度。（B）野生型IgG1-11B8、IgG1-11B8-E430G-S440K-G237AまたはIgG1-11B8-E430G-S440K-E333Sを注射したマウスから収集された血液試料中の総hIgG濃度。（C）野生型IgG1-CAMPATH-1H＋IgG1-11B8の混合物または（A）および（B）のような変異を保有するIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8抗体バリアントの混合物を注射したマウスから収集された血液試料中の総hIgG濃度。すべての図面で、点線は、SCIDマウスにおける野生型IgG1抗体についての予測された経時的IgG1濃度を表す。（D）抗体の投与後21日目までのクリアランスを、式D*1000/AUC（式中、Dは注射用量であり、AUCは濃度-時間曲線の曲線下面積である）に従って決定した。
【０４３３】
図26は、変異E430G、K439EまたはS440KおよびG236R、G237A、G237QまたはG237Rを保有するIgG1-CAMPATH-1H、IgG1-11B8およびIgG1-b12の抗体バリアントとインキュベートした試料中で検出されたC4dの、抗体を含有しない陰性対照試料中で検出された平均C4d濃度の減算後の濃度（μg/ml単位）を示す。陽性対照試料は、Fc-Fc相互作用増強変異E345R、E430GおよびS440Y（RGY）を保有する抗体バリアントを含む。
【０４３４】
図27は、補体供給源としての正常ヒト血清と氷上でインキュベートしたWien 133細胞へのC1q結合を、変異E430G、K439EまたはS440KおよびG236R、G237T、K326AまたはE333Sを保有する抗体IgG1-CAMPATH-1H、IgG1-11B8およびIgG1-b12のバリアントでのオプソニン化後、フローサイトメトリーによって検出して示す。平均蛍光強度値は、対数アゴニスト応答モデルを適合させることによって推定された抗体なしの対照反応（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物の最高レベル（100％）に対して正規化された。（A）対照反応のC1q結合。（B〜D）非結合対照IgG1-b12または異なるIgG1-11B8バリアントと混合された、（B）IgG1-CAMPATH-E430G-K439E、(C）IgG1-CAMPATH-E430G-K439E-G236R、および（D）IgG1-CAMPATH-E430G-K439E-G237RのC1q結合。
【０４３５】
図28は、自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440KおよびC1q結合調節変異を保有するIgG1-CAMPATH-1H-E430GおよびIgG1-11B8-E430G抗体バリアントによるFcγR結合を示す。（A〜E）（A）高親和性アロタイプFcγRIIA 131H、(B）低親和性アロタイプFcγRIIA 131R、(C）FcγRIIB、(D）高親和性アロタイプFcγRIIIA 158V、または（E）低親和性アロタイプFcγRIIIA 158Fの、ELISAアッセイで試験した場合の二量体Hisタグ化ビオチン化ECDへの固定化抗体バリアントの結合。（F）ELISAで試験した抗体バリアントへの固定化FcγRIaの結合。結合は、20μg/mLの抗体試料について提示され、一次抗体なしでインキュベートしたウェル中のシグナルの減算後、野生型IgG1-CAMPATH-1Hについて観察された平均シグナル（100％）に対して実験毎に正規化された。検出は、ストレプトアビジン-ポリHRPおよびABTSを使用して実施した。
【０４３６】
図29は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を調節する変異の導入による、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H、抗CD20 IgG1-11B8および抗CD52 IgG1-h2E8の混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、3つの独立した実験で測定し、（A）非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して正規化された平均AUC、ならびに（B）40μg/mlの抗体濃度でのヨウ化プロピジウム陽性によって判定された平均溶解率として提示される。
【０４３７】
図30（A、B）は、表示の通りの自己オリゴマー化阻害変異およびC1q結合調節変異を保有する、単剤および組み合わせた抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G、抗CD20 IgG1-11B8-E430G、および非抗原結合IgG1-b12-E430G抗体バリアントのCDC有効性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して正規化されたAUCとして提示される。
【０４３８】
図31は、（A）FcγRIIaまたは（B）FcγRIIIaのいずれかを安定発現するJurkatレポーター細胞株の活性化を、Rajiリンパ腫細胞と異なる濃度のIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8抗体バリアントと共培養した際の発光（RLU）のレベルによって測定して示す。発光値は、IgG1-b12について観察された発光値（0％）および野生型IgG1-Campath-1H＋野生型IgG1-11B8について観察された発光値（100％）に対して実験毎に正規化された後、3つ（FcγRIIa）または2つ（FcγRIIIa）の実験レプリケートで平均された。
【０４３９】
図32は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を調節する変異を保有するIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8抗体バリアントの非等モル比の混合物によって誘導されたWien 133細胞に対する共依存性CDCを示す。（A）等モルおよび非等モル濃度比のIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G236RおよびIgG1-11B8-E430G-S440K-G237Aを含有する混合物によって誘導された共依存性CDC。（B）等モルおよび非等モル濃度比のIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G237QおよびIgG1-11B8-E430G-S440K-G237Aを含有する混合物によって誘導された共依存性CDC。
【０４４０】
図33は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を阻害する変異の導入による、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hの抗体バリアントと抗HLA-DR IgG1-HLA-DR-huL243バリアント（A）または抗HLA-DR IgG1-HLA-DR-1D09C3バリアント（B）のいずれかとの混合物によるCDC活性の選択性を示す。Oci-Ly17細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）および（A）IgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-HLA-DR-huL243-E430Gの混合物（100％）または（B）IgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-HLA-DR-1D09C3-E430Gの混合物（100％）に対して正規化されたAUCとして提示される。
【０４４１】
図34は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を阻害する変異の導入による、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hおよび抗CD20 IgG1-11B8の混合抗体バリアントの選択的共依存性CDC活性を示す。CDC有効性を、変異L234A、L234A-L235A、L234F、L234F-L235E、L235A、L235Q、G236RまたはG237Qのいずれかを有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eのバリアント、およびこれらのバリアントと非結合対照抗体IgG1-b12またはIgG1-11B8-E430G-S440Kのいずれかとの混合物について示す。CDC有効性は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して正規化されたAUCとして提示される。
【０４４２】
図35は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を阻害する変異の導入による、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hおよび抗CD20 IgG1-11B8の混合抗体バリアントの選択的共依存性CDC活性を示す。（A）Fc-Fc相互作用増強変異E430G、E430N、E430T、E430V、E430Y、E345A、E345K、E345Q、E345RまたはE345Y、自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440KおよびC1q結合阻害変異G236RまたはG237Aを保有するIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8の抗体バリアントの単剤またはそれらの混合物としてのCDC有効性。（B）Fc-Fc相互作用増強変異E430G、E430N、E430T、E430V、E430Y、E345A、E345Q、E345VまたはE345Y、自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440KおよびC1q結合阻害変異G236RまたはG237Aを保有するIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8の抗体バリアントの単剤またはそれらの混合物としてのCDC有効性。（C）一致するFc-Fc相互作用増強変異E430G、E430N、E430T、E430V、E430Y、E345A、E345Q、E345VまたはE345Y、自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440KおよびC1q結合阻害変異G236RまたはG237Aを保有するIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8の抗体バリアントの単剤またはそれらの混合物としてのCDC有効性。（D）Fc-Fc相互作用増強変異E430GまたはK248E-T437R、自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440KおよびC1q結合調節変異G236R、G237AまたはE333Sを保有するIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8の抗体バリアントの単剤またはそれらの混合物としてのCDC有効性。CDC有効性は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して正規化されたAUCとして提示される。
【０４４３】
図36は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を調節する変異を保有するIgG1-CD37-37-3およびIgG1-11B8抗体バリアントの混合物によって誘導されたRajiリンパ腫細胞に対する共依存性CDCを示す。（A）表示の抗体バリアントの希釈物またはそれらの混合物によって誘導された細胞溶解の、最小溶解（IgG1-b12で0％）および最大溶解（IgG1-CD37-37-3-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物で100％）に対して正規化された相対曲線下面積（AUC）。（B）表示の抗体バリアントおよびそれらの混合物によって誘導された最大溶解率。
【０４４４】
図37は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を調節する変異の導入による、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hおよび抗CD20 IgG1-11B8の混合抗体バリアントの選択的共依存性CDC活性を示す。患者CLL試料を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、抗体バリアントとインキュベーションした際の生存B細胞のパーセンテージとして提示される。患者1（A）、2（B）および3（C）由来のCLL試料を使用した結果を示す。
【０４４５】
図38は、全血試料と、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を調節する変異を保有するIgG1-CAMPATH-1H、IgG1-huCLB-T3/4およびIgG1-CD5-INSERMの抗体バリアントの混合物とのインキュベーション後のフローサイトメトリーによって検出された、B細胞、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞の画分を示す。表示のIgG1-CAMPATH-1H、IgG1-huCLB-T3/4およびIgG1-b12抗体バリアントとのインキュベーション後の4人のドナーの全血試料中で検出された、（A）B細胞、(B）CD4+ T細胞および（C）CD8+ T細胞のパーセンテージ。表示のIgG1-CAMPATH-1H、IgG1-CD5-INSERMおよびIgG1-b12抗体バリアントとのインキュベーション後の4人のドナーの全血試料中で検出された、（D）B細胞、(E）CD4+ T細胞および（F）CD8+ T細胞のパーセンテージ。分率を［100％×（試料中の細胞数/「抗体なしの試料」中の細胞数）×（「抗体なしの試料」中の顆粒球数/試料中の顆粒球数）］として算出した。
【０４４６】
図39は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を阻害する（G237T）または増強する（K326W-E333S）変異を保有する抗DR4および抗DR5抗体バリアントによる、がん細胞におけるプログラム細胞死の協同的活性化を示す。（A）表示の抗体バリアントと72時間インキュベーションした後のBxPC-3ヒト膵臓がん細胞の生存率。（B）表示の抗体バリアントと72時間インキュベーションした後のCOLO 205ヒト結腸がん細胞の生存率。生存細胞のパーセンテージを、以下の式を使用して算出した：生存細胞％＝［（抗体試料の発光−スタウロスポリン試料の発光）/（抗体なしの試料の発光−スタウロスポリン試料の発光）］＊100。
【０４４７】
A-B) IgG1-11B8-E430Gについて、S440K変異(SEQ ID NO 101)またはS440K-P329R(SEQ ID NO 114)のいずれかの導入により、CDC有効性が喪失した（図1は、P329R変異の導入による抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％のプールした正常ヒト血清（NHS）の存在下、濃度抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、（A）ヨウ化プロピジウム（PI）陽性細胞のパーセンテージによって決定された溶解率および（B）用量応答-応答曲線下面積（AUC）を、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して正規化して提示される。
【０４４８】
図2は、K322E変異の導入による抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、（A）PI陽性細胞のパーセンテージによって決定された溶解率および（B）AUCを、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して正規化して提示される。
【０４４９】
図3は、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋抗CD20-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントへのK322E変異の導入による、異なる細胞株に対するCDC活性の選択性を示す。インビトロCDCアッセイを、30μg/mLの抗体を用いて、20％NHSの存在下、バーキットリンパ腫細胞株Wien 133（A）、Daudi（B）、Raji（C）およびRamos（D）、急性リンパ芽球性リンパ腫（ALL）細胞株REH（E）、骨髄腫細胞株U266B1（F）、ならびにB細胞リンパ腫細胞株 U-698-M（G）を使用して実施した。CDC活性は、PI陽性細胞のパーセンテージによって決定された溶解率を、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）ならびにREH、U266B1およびWien 133についてはIgG1-CAMPATH-1H-E430G（100％）またはDaudi、Raji、RamosおよびU-698-MについてはIgG1-11B8-E430G（100％）に対して細胞株毎に正規化して提示される。
【０４５０】
図4は、C1q結合阻害変異（G236R、K322A、E269K、K322EまたはP329R）を有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして提示される。正規化は、非結合対照抗体ミックスIgG1-b12-K439E＋IgG1-b12-S440K（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０４５１】
図5は、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋C1q結合増強変異（E333S、K326WまたはK326A/E333A）を有する抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして提示される。正規化は、非結合対照抗体ミックスIgG1-b12-K439E＋IgG1-b12-S440K（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０４５２】
図6は、C1q結合阻害変異G236R（A）、K322A（B）、E269K（C）、K322E（D）またはP329R（E）を有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋C1q結合増強変異（E333S、K326WまたはK326A/E333A）を有する抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして提示される。正規化は、非結合対照抗体ミックスIgG1-b12-K439E＋IgG1-b12-S440K（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０４５３】
図7は、C1q結合阻害変異G236RまたはK322Aを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eの抗体バリアント（A、B）およびC1q結合増強変異E333Sを有する抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの抗体バリアント（C、D）の、ヒトリンパ腫細胞株Wien 133（A、C）およびRaji（B、D）への結合を示す。抗体結合をフローサイトメトリーによって試験した。結合は、蛍光強度の幾何平均（MFI）として表される。結合についての陰性対照として、一次抗体なしの試料または非結合抗gp120抗体IgG1-b12を使用した。
【０４５４】
図8は、C1q結合阻害変異G236RまたはK322Aを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eの抗体バリアント（A、C）およびC1q結合増強変異E333Sを有する抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの抗体バリアント（B、D）のADCC能を示す。（A、B）Raji標的細胞を、抗体希釈系列と高親和性FcγRIIIa（V158）およびホタルルシフェラーゼの発現を駆動するNFAT応答エレメントを安定発現するJurkatヒトT細胞と共インキュベートする、ADCCレポーターバイオアッセイを実施した。ルシフェラーゼ産生を発光読み出しによって定量した。（C、D）Wien 133標的細胞を抗体希釈系列とヒトPBMC（E：T 100：1）と共インキュベートする、インビトロユウロピウムTDA（EuTDA）ADCCアッセイを実施した。上清中のEuTDA蛍光キレートのシグナルを測定することによって、細胞溶解を判定した。
【０４５５】
図9は、C1q結合阻害変異G236RまたはK322Aを有するFc-Fc相互作用が増強された抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-K439E＋C1q結合増強変異E333Sを有するまたは有さないFc-Fc相互作用が増強された抗CD20 IgG1-11B8-S440Kのバリアントの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。試験したFc-Fc相互作用増強変異は、E430G、E345K、E345RおよびE345R-E430Gであった。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCおよび最大溶解として提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０４５６】
図10は、G236位（G236RまたはG236K）もしくはG237位（G237A、G237T、G237QまたはG237R）にC1q結合調節変異または二重変異G237A-K322Aを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋C1q結合調節変異E333S、E333A、K326A、K326W-E333S、G237AまたはG237A-E333Sを有するまたは有さない抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCおよび最大溶解として提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０４５７】
図11は、C1q結合阻害変異G236Rを有するまたは有さない抗CD52 CAMPATH-1H-E430G-K439E＋C1q結合増強変異E333Sを有するまたは有さない抗CD20 11B8-E430G-S440Kの混合抗体アイソタイプバリアント（IgG1、IgG2、IgG3およびヒンジ安定化IgG4）によるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０４５８】
図12は、C1q結合阻害変異G236RまたはK322Aを有するまたは有さない抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋C1q結合増強変異E333Sを有するまたは有さない抗CD37 IgG1-CD37-37.3-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによる、（A）Daudi細胞および（B）Wien 133細胞に対するCDC活性の選択性を示す。標的細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-CD37-37.3-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０４５９】
図13は、C1q結合阻害変異G236Rを有するまたは有さない抗DR5 IgG1-DR5-01-G56T-E430G-K439E＋C1q結合増強変異E333Sを有するまたは有さないIgG1-DR5-05-E430G-S440Kの（A）単一抗体バリアントまたは（B）抗体バリアントのアゴニスト混合物の、BxPC-3ヒト膵臓がん細胞に対するDR5媒介細胞傷害性を示す。3日間の生存率アッセイを実施し、CellTiter-Gloキットを使用して細胞生存率を判定した。
【０４６０】
図14は、C1q結合調節変異G237A、G236R、A327K、K322EまたはP329Rを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430Gの抗体バリアントによるCDC活性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12-S440K（0％；示さない）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G（100％）に対して実施された。
【０４６１】
図15は、C1q結合阻害変異G236RまたはK322Aを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eの抗体バリアント（A、B、C）およびC1q結合増強変異E333Sを有する抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの抗体バリアント（D、E、F）のヒトFcRnへの結合を示す。FcRn ELISAを、5μg/mLのヒトFcRnのコート組換え細胞外ドメイン（FcRnhsECDHis-B2M-BIO）および抗体希釈系列を用いて実施した。結合した抗体の量をHRPコンジュゲートヤギ抗ヒトIgG1抗体および化学発光基質ABTSを用いて判定した。吸光度を405nmで測定した。
【０４６２】
図16は、SCIDマウスにおける静脈内投与された抗体500μgのクリアランス率を示す。（A〜C）血漿試料中の総ヒトIgGをELISAによって判定し、（A）IgG1-CAMPATH-1Hバリアント、(B）IgG1-11B8バリアント、および（C）IgG1-CAMPATH-1Hバリアント＋IgG1-11B8バリアントの組み合わせについて濃度対時間曲線にプロットした。各データ点は、トリプリケート試料の平均＋/−標準偏差を表す。（D）抗体の投与後21日目までのクリアランスを、式D*1,000/AUC（式中、Dは注射用量であり、AUCは濃度-時間曲線の曲線下面積である）に従って決定した。
【０４６３】
図17は、C1q結合阻害変異G236RまたはG237Tを有する固定化IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439EバリアントおよびC1q結合増強変異K326AまたはE333Sを有するIgG1-11B8-E430G-S440Kバリアントの、FcγRIIAアロタイプ131H（A）、FcγRIIAアロタイプ131R（B）、FcγRIIB（C）、FcγRIIIAアロタイプ158V（D）およびFcγRIIIAアロタイプ158F（E）の二量体Hisタグ化ビオチン化ECDへの結合をELISAアッセイで試験して示す。結合は、20μg/mLの抗体試料について、抗体なしの対照（バックグラウンド）およびIgG1-11B8-E430G-S440Kへの結合（100％）と相対的に提示される。検出は、ストレプトアビジン-ポリHRPおよびABTSを使用して実施した。
【０４６４】
図18は、C1q結合阻害変異（G236RまたはG237T）を有するまたは有さない抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋C1q結合増強変異E333Sを有するまたは有さないFcγR結合阻害変異G237Aを有する抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして、および40μg/mLのIgGでの溶解として提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０４６５】
図19は、血液細胞のフローサイトメトリー解析によって判定された全血中のIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8のバリアントの組み合わせの選択的活性を示す。Y軸：エフェクター細胞の存在下で一晩（o/n）インキュベーションした後の、総リンパ球集団（CD66b陰性）のB細胞画分（CD19陽性/CD3陰性）またはT細胞画分（CD19陰性/CD3陽性）。X軸：異なる処置群。記号は、1ドナー当たり2つの別々のインキュベーションで試験された、5人の異なる健常ドナー由来の細胞を表す。（A）IgG1-11B8-G237A-E430G-S440Kと混合されたIgG1-CAMPATH-1H-G236R-E430G-K439Eの選択的活性。（B）IgG1-11B8-G237A-E430G-S440Kと混合された、追加のG237変異を含有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eバリアントの選択的活性。（C）追加のC1q結合増強E333S変異を含有するIgG1-11B8-G237A-E430G-S440Kと混合された、追加のG236RまたはG237変異を含有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eバリアントの選択的活性。（D）IgG1-11B8-G237A-E430G-S440Kと混合された追加の変異G236R、G237QまたはG237Rを有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eの共依存性抗体組み合わせと比較した、異なるB細胞ターゲティング抗体によるB細胞枯渇の深度。Y軸：上記の通り決定されたB細胞画分の対数スケール表示。
【０４６６】
図20は、抗CD52成分中にC1q結合阻害変異および抗CD20成分中にC1q結合増強変異を有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439EおよびIgG1-11B8-E430G-S440K抗体バリアントの組み合わせによる、CD20およびCD52の異なる発現レベルを有する異なる細胞株に対するCDC活性の選択性を示す。インビトロCDCアッセイを、0.01〜40μg/mLの抗体を用いて、20％NHSの存在下、バーキットリンパ腫細胞株Daudi（A）、Raji（B）およびRamos（C）、ALL細胞株REH（D）、ならびにB細胞リンパ腫細胞株U-698-M（E）を使用して実施した。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして、および最大溶解として提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０４６７】
図21は、C1q結合阻害変異G236Rを有するまたは有さない抗CD37 IgG1-CD37-37.3-E430G-K439E＋C1q結合増強変異E333Sを有するまたは有さない抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。（A）Daudi細胞および（B）WIL2-S細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、PI陽性細胞のパーセンテージの正規化されたAUCとして、および40μg/mLのIgGでの溶解として提示される。正規化は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CD37-37.3-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して実施された。
【０４６８】
図22は、（A）FcγR結合阻害変異およびC1q結合調節変異G236R、G237AまたはG237Tのいずれかと組み合わせた、Fc：Fc相互作用増強変異E430GまたはE345R、自己オリゴマー化阻害変異K439Eを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hの抗体バリアントの、ヒトリンパ腫細胞株Wien 133への結合を示す。抗体結合をフローサイトメトリーによって試験し、野生型IgG1-Campath-1HのBmax値（100％）に対して正規化して提示する。結合についての陰性対照として、非結合抗gp120抗体IgG1-b12を使用した。（B）C1q結合調節変異G236R、G237AまたはG237Tのいずれかと組み合わせた変異E430GおよびK439Eを有するIgG1-Campath-1H抗体バリアントによるRaji細胞への最大結合（Bmax）を、野生型IgG1-Campath-1Hの結合に対して正規化して示す。（C）C1q結合調節変異G236R、G237AまたはG237Tのいずれかと組み合わせた変異E430GおよびS440Kを有するIgG1-Campath-1H抗体バリアントのRaji細胞に結合する見かけのKd値。
【０４６９】
図23は、C1q結合調節変異K326AもしくはE333A（A）またはE333S、G237AもしくはG237A-E333S（B）のいずれかと組み合わせた、Fc-Fc相互作用増強変異E430G、自己オリゴマー化阻害変異S440Kを有する抗CD20 IgG1-11B8の抗体バリアントの、ヒトリンパ腫細胞株Rajiへの結合を示す。抗体結合をフローサイトメトリーによって試験し、野生型IgG1-11B8のBmax値（100％）に対して正規化して提示する。結合についての陰性対照として、非結合抗gp120抗体IgG1-b12を使用した。（C、D）C1q結合調節変異K326AもしくはE333A（C）またはE333S、G237AもしくはG237A-E333S（D）のいずれかと組み合わせた、変異E430GおよびS440Kを有するIgG1-11B8抗体バリアントによるRaji細胞への最大結合（Bmax）を、野生型IgG1-11B8の結合に対して正規化して示す。（E、F）C1q結合調節変異K326AもしくはE333A（E）またはE333S、G237AもしくはG237A-E333S（F）のいずれかと組み合わせた変異E430GおよびS440Kを有するIgG1-11B8抗体バリアントのRaji細胞に結合する見かけのKd値。
【０４７０】
図24は、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hおよび抗CD20 IgG1-11B8抗体バリアントのFcRn結合を示す。（A、C）（A）pH 6.0または（C）pH 7.4で40μg/mLの抗体濃度を使用した、Fc-Fc相互作用増強変異E430G、自己オリゴマー化阻害変異K439EおよびC1q結合調節変異G237AまたはG237Tを有する抗CD52抗体IgG1-CAMPATH-1HのバリアントについてのヒトFcRnへの結合を示す。（B、D）（B）pH 6.0または（D）pH 7.4で40μg/mLの抗体濃度を使用した、Fc-Fc相互作用増強変異E430G、自己オリゴマー化阻害変異S440KおよびC1q結合調節変異K326A、E333A、G237AまたはG237A-E333Sを有する抗CD20抗体IgG1-11B8のバリアントによるヒトFcRnへの結合。FcRn ELISAを、2μg/mLのヒトFcRnのコート組換え細胞外ドメイン（FcRnECDHis-B2M-BIO）および抗体希釈系列を用いて実施した。結合した抗体の量をHRPコンジュゲートヤギ抗ヒトIgG1抗体および化学発光基質ABTSを用いて判定した。吸光度を405nmで測定した。
【０４７１】
図25は、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hもしくは抗IgG1-11B8抗体バリアントまたはそれらの混合物を注射したマウスから収集された血液試料中で測定された場合の総ヒトIgG（hIgG）濃度を示す。（A）野生型IgG1-CAMPATH-1H、IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G237QまたはIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G236Rを注射したマウスから収集された血液試料中の総hIgG濃度。（B）野生型IgG1-11B8、IgG1-11B8-E430G-S440K-G237AまたはIgG1-11B8-E430G-S440K-E333Sを注射したマウスから収集された血液試料中の総hIgG濃度。（C）野生型IgG1-CAMPATH-1H＋IgG1-11B8の混合物または（A）および（B）のような変異を保有するIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8抗体バリアントの混合物を注射したマウスから収集された血液試料中の総hIgG濃度。すべての図面で、点線は、SCIDマウスにおける野生型IgG1抗体についての予測された経時的IgG1濃度を表す。（D）抗体の投与後21日目までのクリアランスを、式D*1000/AUC（式中、Dは注射用量であり、AUCは濃度-時間曲線の曲線下面積である）に従って決定した。
【０４７２】
図26は、変異E430G、K439EまたはS440KおよびG236R、G237A、G237QまたはG237Rを保有するIgG1-CAMPATH-1H、IgG1-11B8およびIgG1-b12の抗体バリアントとインキュベートした試料中で検出されたC4dの、抗体を含有しない陰性対照試料中で検出された平均C4d濃度の減算後の濃度（μg/ml単位）を示す。陽性対照試料は、Fc-Fc相互作用増強変異E345R、E430GおよびS440Y（RGY）を保有する抗体バリアントを含む。
【０４７３】
図27は、補体供給源としての正常ヒト血清と氷上でインキュベートしたWien 133細胞へのC1q結合を、変異E430G、K439EまたはS440KおよびG236R、G237T、K326AまたはE333Sを保有する抗体IgG1-CAMPATH-1H、IgG1-11B8およびIgG1-b12のバリアントでのオプソニン化後、フローサイトメトリーによって検出して示す。平均蛍光強度値は、対数アゴニスト応答モデルを適合させることによって推定された抗体なしの対照反応（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物の最高レベル（100％）に対して正規化された。（A）対照反応のC1q結合。（B〜D）非結合対照IgG1-b12または異なるIgG1-11B8バリアントと混合された、（B）IgG1-CAMPATH-E430G-K439E、(C）IgG1-CAMPATH-E430G-K439E-G236R、および（D）IgG1-CAMPATH-E430G-K439E-G237RのC1q結合。
【０４７４】
図28は、自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440KおよびC1q結合調節変異を保有するIgG1-CAMPATH-1H-E430GおよびIgG1-11B8-E430G抗体バリアントによるFcγR結合を示す。（A〜E）（A）高親和性アロタイプFcγRIIA 131H、(B）低親和性アロタイプFcγRIIA 131R、(C）FcγRIIB、(D）高親和性アロタイプFcγRIIIA 158V、または（E）低親和性アロタイプFcγRIIIA 158Fの、ELISAアッセイで試験した場合の二量体Hisタグ化ビオチン化ECDへの固定化抗体バリアントの結合。（F）ELISAで試験した抗体バリアントへの固定化FcγRIaの結合。結合は、20μg/mLの抗体試料について提示され、一次抗体なしでインキュベートしたウェル中のシグナルの減算後、野生型IgG1-CAMPATH-1Hについて観察された平均シグナル（100％）に対して実験毎に正規化された。検出は、ストレプトアビジン-ポリHRPおよびABTSを使用して実施した。
【０４７５】
図29は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を調節する変異の導入による、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H、抗CD20 IgG1-11B8および抗CD52 IgG1-h2E8の混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、3つの独立した実験で測定し、（A）非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して正規化された平均AUC、ならびに（B）40μg/mlの抗体濃度でのヨウ化プロピジウム陽性によって判定された平均溶解率として提示される。
【０４７６】
図30（A、B）は、表示の通りの自己オリゴマー化阻害変異およびC1q結合調節変異を保有する、単剤および組み合わせた抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G、抗CD20 IgG1-11B8-E430G、および非抗原結合IgG1-b12-E430G抗体バリアントのCDC有効性を示す。Wien 133細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して正規化されたAUCとして提示される。
【０４７７】
図31は、（A）FcγRIIaまたは（B）FcγRIIIaのいずれかを安定発現するJurkatレポーター細胞株の活性化を、Rajiリンパ腫細胞と異なる濃度のIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8抗体バリアントと共培養した際の発光（RLU）のレベルによって測定して示す。発光値は、IgG1-b12について観察された発光値（0％）および野生型IgG1-Campath-1H＋野生型IgG1-11B8について観察された発光値（100％）に対して実験毎に正規化された後、3つ（FcγRIIa）または2つ（FcγRIIIa）の実験レプリケートで平均された。
【０４７８】
図32は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を調節する変異を保有するIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8抗体バリアントの非等モル比の混合物によって誘導されたWien 133細胞に対する共依存性CDCを示す。（A）等モルおよび非等モル濃度比のIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G236RおよびIgG1-11B8-E430G-S440K-G237Aを含有する混合物によって誘導された共依存性CDC。（B）等モルおよび非等モル濃度比のIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G237QおよびIgG1-11B8-E430G-S440K-G237Aを含有する混合物によって誘導された共依存性CDC。
【０４７９】
図33は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を阻害する変異の導入による、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hの抗体バリアントと抗HLA-DR IgG1-HLA-DR-huL243バリアント（A）または抗HLA-DR IgG1-HLA-DR-1D09C3バリアント（B）のいずれかとの混合物によるCDC活性の選択性を示す。Oci-Ly17細胞を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）および（A）IgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-HLA-DR-huL243-E430Gの混合物（100％）または（B）IgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-HLA-DR-1D09C3-E430Gの混合物（100％）に対して正規化されたAUCとして提示される。
【０４８０】
図34は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を阻害する変異の導入による、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hおよび抗CD20 IgG1-11B8の混合抗体バリアントの選択的共依存性CDC活性を示す。CDC有効性を、変異L234A、L234A-L235A、L234F、L234F-L235E、L235A、L235Q、G236RまたはG237Qのいずれかを有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eのバリアント、およびこれらのバリアントと非結合対照抗体IgG1-b12またはIgG1-11B8-E430G-S440Kのいずれかとの混合物について示す。CDC有効性は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して正規化されたAUCとして提示される。
【０４８１】
図35は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を阻害する変異の導入による、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hおよび抗CD20 IgG1-11B8の混合抗体バリアントの選択的共依存性CDC活性を示す。（A）Fc-Fc相互作用増強変異E430G、E430N、E430T、E430V、E430Y、E345A、E345K、E345Q、E345RまたはE345Y、自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440KおよびC1q結合阻害変異G236RまたはG237Aを保有するIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8の抗体バリアントの単剤またはそれらの混合物としてのCDC有効性。（B）Fc-Fc相互作用増強変異E430G、E430N、E430T、E430V、E430Y、E345A、E345Q、E345VまたはE345Y、自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440KおよびC1q結合阻害変異G236RまたはG237Aを保有するIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8の抗体バリアントの単剤またはそれらの混合物としてのCDC有効性。（C）一致するFc-Fc相互作用増強変異E430G、E430N、E430T、E430V、E430Y、E345A、E345Q、E345VまたはE345Y、自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440KおよびC1q結合阻害変異G236RまたはG237Aを保有するIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8の抗体バリアントの単剤またはそれらの混合物としてのCDC有効性。（D）Fc-Fc相互作用増強変異E430GまたはK248E-T437R、自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440KおよびC1q結合調節変異G236R、G237AまたはE333Sを保有するIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8の抗体バリアントの単剤またはそれらの混合物としてのCDC有効性。CDC有効性は、非結合対照抗体IgG1-b12（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物（100％）に対して正規化されたAUCとして提示される。
【０４８２】
図36は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を調節する変異を保有するIgG1-CD37-37-3およびIgG1-11B8抗体バリアントの混合物によって誘導されたRajiリンパ腫細胞に対する共依存性CDCを示す。（A）表示の抗体バリアントの希釈物またはそれらの混合物によって誘導された細胞溶解の、最小溶解（IgG1-b12で0％）および最大溶解（IgG1-CD37-37-3-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物で100％）に対して正規化された相対曲線下面積（AUC）。（B）表示の抗体バリアントおよびそれらの混合物によって誘導された最大溶解率。
【０４８３】
図37は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を調節する変異の導入による、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hおよび抗CD20 IgG1-11B8の混合抗体バリアントの選択的共依存性CDC活性を示す。患者CLL試料を、20％NHSの存在下、抗体濃度系列とインキュベートした。CDC有効性は、抗体バリアントとインキュベーションした際の生存B細胞のパーセンテージとして提示される。患者1（A）、2（B）および3（C）由来のCLL試料を使用した結果を示す。
【０４８４】
図38は、全血試料と、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を調節する変異を保有するIgG1-CAMPATH-1H、IgG1-huCLB-T3/4およびIgG1-CD5-INSERMの抗体バリアントの混合物とのインキュベーション後のフローサイトメトリーによって検出された、B細胞、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞の画分を示す。表示のIgG1-CAMPATH-1H、IgG1-huCLB-T3/4およびIgG1-b12抗体バリアントとのインキュベーション後の4人のドナーの全血試料中で検出された、（A）B細胞、(B）CD4+ T細胞および（C）CD8+ T細胞のパーセンテージ。表示のIgG1-CAMPATH-1H、IgG1-CD5-INSERMおよびIgG1-b12抗体バリアントとのインキュベーション後の4人のドナーの全血試料中で検出された、（D）B細胞、(E）CD4+ T細胞および（F）CD8+ T細胞のパーセンテージ。分率を［100％×（試料中の細胞数/「抗体なしの試料」中の細胞数）×（「抗体なしの試料」中の顆粒球数/試料中の顆粒球数）］として算出した。
【０４８５】
図39は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を阻害する（G237T）または増強する（K326W-E333S）変異を保有する抗DR4および抗DR5抗体バリアントによる、がん細胞におけるプログラム細胞死の協同的活性化を示す。（A）表示の抗体バリアントと72時間インキュベーションした後のBxPC-3ヒト膵臓がん細胞の生存率。（B）表示の抗体バリアントと72時間インキュベーションした後のCOLO 205ヒト結腸がん細胞の生存率。生存細胞のパーセンテージを、以下の式を使用して算出した：生存細胞％＝［（抗体試料の発光−スタウロスポリン試料の発光）/（抗体なしの試料の発光−スタウロスポリン試料の発光）］＊100。
【０４８６】
A-B)
抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440K（単剤CDC活性なし）＋抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E（部分的な単剤CDC活性）の混合物は、Wien 133に対する最大CDC活性を、CD20およびCD52を標的とする混合物IgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gのレベルと同様に完全に復元した（図1Aにおける同様の用量応答；図1Bにおける100％）。抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440K（単剤CDC活性なし）を抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-P329R-E430G-K439E（単剤CDC活性なし）に加えると、Wien 133に対する細胞溶解を部分的に回復した（図1Aにおける飽和標的結合で56％；図1Bにおける28％）。
【０４８７】
抗CD20 IgG1-11B8-P329R-E430G-S440K（単剤CDC活性なし）を抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E（部分的な単剤CDC活性）に加えると、Wien 133に対するCDC活性を、混合物IgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gよりも低いレベル（図1Aにおけるより高いEC50およびより低い最大死滅；図1Bにおける47％）まで部分的に復元したが、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋対照抗体（IgG1-b12）の混合物よりも中程度に高いレベルまで部分的に復元した（同様の最大死滅であるがより高いEC50（図1A）およびより低い相対AUC（図1Bにおける36％）を有する）。対照的に、抗CD20 IgG1-11B8-P329R-E430G-S440K（単剤CDC活性なし）を抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-P329R-E430G-K439E（単剤CDC活性なし）に加えると、CDC活性を全く復元しなかった（図1A〜B)。
【０４８８】
これらのデータは、直接C1q結合を阻害する変異P329Rの導入が、増強されたFc-Fc相互作用（E430G）を有するK439E＋S440K抗体混合物において個々の成分のCDC活性をさらに抑制し得ることを例証する。驚くべきことに、単剤として検出可能なCDC活性を共に示さなかった2つの異なる標的に対する2つの抗体について、2つの抗体のうち一方だけがC1q結合阻害変異P329Rを含有した混合物でCDC活性を部分的に復元できることが観察された。これらのデータは、単剤活性を減少または阻害するC1q結合阻害変異P329Rの導入によって、抗CD20 IgG-E430G-S440K＋抗CD52 IgG-E430G-K439E抗体の混合物を適用して、2つの異なる標的を同時に発現する細胞に対してCDC活性の選択性を生み出すことができることを示す。理論に制限されるものではないが、ヘテロ六量体IgGアセンブリ中の3つの抗体中のC1q結合部位に対するC1qのアビディティは、部分的CDC活性を回復させるのに十分高い可能性がある。対照的に、例えばP329R変異を共に含有する2つの抗体の混合物における、6つの抗体すべての6つのC1q結合部位すべての喪失は、CDC活性の喪失をもたらした。
【０４８９】
実施例3：Fc-Fc相互作用増強変異E430Gを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-K439E＋抗CD20 IgG1-11B8-S440KへのK322E変異の導入による混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性
インビトロCDC有効性に対する変異K322Eの効果を、抗CD20抗体IgG1-11B8および抗CD52抗体IgG1-CAMPATH-1Hのバリアントの混合物を使用して試験した。異なる濃度の精製抗体（終濃度範囲0.001〜30.0μg/mL）を、基本的には実施例2に記載のように、20％NHSを用いたWien 133細胞に対するインビトロCDCアッセイで試験した。抗体IgG1-11B8およびIgG1-CAMPATH-1Hに異なる変異を導入した：E430G（これは、増強されたFc-Fc相互作用を誘導する）；K322E（これは、抗体への直接C1q結合を阻害する）；および変異K439EまたはS440Kのいずれか（これは、分子間Fc-Fc相互作用の阻害を通じてホモ六量体抗体複合体の形成を阻害し、かつ、交差補体Fc-Fc相互作用を通じてヘテロ六量体抗体複合体の形成を促進する）。溶解率をPI陽性細胞の数から算出した。対数変換濃度を使用した非線形用量応答適合の最良適合値を使用してデータを解析し、3つの実験レプリケートの用量応答曲線下面積を算出した。相対曲線下面積（AUC）値は、最小溶解（IgG1-b12で0％）および最大溶解（IgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物で100％）に対する正規化を表す。
【０４９０】
抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G＋抗CD20 IgG1-11B8-E430Gの1：1混合物は、Wien 133細胞の効率的な細胞溶解を誘導した（Error! Reference source not found.A；Error! Reference source not found.Bで100％に設定）。IgG1-CAMPATH-1H-E430Gを単剤として試験したとき、K439E変異の導入は、減少したCDC有効性をもたらし、K439E-K322E（SEQ ID NO 91）の導入は、CDC活性の完全な喪失をもたらした（Error! Reference source not found.A〜B）。IgG1-11B8-E430Gについて、S440K変異またはS440K-K322E（SEQ ID NO 109）のいずれかの導入は、CDC有効性の喪失をもたらした（Error! Reference source not found.A〜B）。
【０４９１】
抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440K（単剤CDC活性なし）＋抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E（部分的な単剤CDC活性）の混合物は、Wien 133細胞に対する高いCDC活性を、CD20およびCD52を標的とする混合物IgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gのレベルと同等に復元した（図2Aにおける同等の用量応答；図2Bにおける87％）。抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440K（単剤CDC活性なし）を抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-K322E-E430G-K439E（単剤CDC活性なし）に加えると、Wien 133に対する細胞溶解を部分的に回復した（図2Aにおける混合物IgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gよりも高いEC50；図2Bにおける60％）。
【０４９２】
抗CD20 IgG1-11B8-K322E-E430G-S440K（単剤CDC活性なし）を抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E（部分的な単剤CDC活性）に加えると、Wien 133に対するCDC活性を部分的に復元した（図2Aにおける混合物IgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gよりも高いEC50； 図2Bにおける66％）。対照的に、抗CD20 IgG1-11B8-K322E-E430G-S440K（単剤CDC活性なし）を抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-K322E-E430G-K439E（単剤CDC活性なし）に加えると、最小CDC活性を復元しただけであった（図2Aにおける高いEC50およびおよそ31％の最大死滅；図2Bにおける10％）。
【０４９３】
これらのデータは、直接C1q結合を阻害する変異K322Eの導入が、増強されたFc-Fc相互作用（E430G）を有するK439E＋S440K抗体混合物において個々の成分のCDC活性をさらに抑制し得ることを例証する。驚くべきことに、単剤として検出可能なCDC活性を共に示さなかった2つの異なる標的に対する2つの抗体について、2つの抗体のうち一方だけがC1q結合阻害変異K322Eを含有した混合物でCDC活性をほぼ最大の細胞溶解まで復元できることが観察された。これらのデータは、単剤活性を減少または阻害するC1q結合阻害変異K322Eの導入によって、抗CD20 IgG-E430G-S440K＋抗CD52 IgG-E430G-K439E抗体の混合物を適用して、2つの異なる標的を同時に発現する細胞に対してCDC活性の選択性を生み出すことができることを示す。
【０４９４】
実施例4：Fc-Fc相互作用増強変異E430Gを有する抗CD20＋抗CD52抗体へのK322E変異の導入による混合抗体バリアントによる異なる細胞株に対するCDC活性の選択性
実施例2および実施例3は、Fc-Fc相互作用が増強された抗CD20および抗CD52抗体の特定の組み合わせが、Fc-Fc相互作用を介してホモオリゴマー化を遮断するK439EまたはS440Kのいずれかの変異を抗体の各々が含有するという条件で、両方の成分が同時に存在した場合に、Wien 133細胞に対して最も効率的なCDC活性を示すことを説明している。その個々の成分と比較した混合物の選択的活性は、抗CD52抗体IgG1-CAPMATH-1H-E430G-S440KへのC1q結合阻害変異P329R（実施例2）またはK322E（実施例3）の導入によって改善され、単一成分としてのその残留CDC活性を抑制した。ここで、K322E変異を有する抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440K＋抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E抗体バリアントの混合物による、細胞表面でCD20とCD52の両方を十分なレベルで発現する細胞に対するCDC活性の選択性を、7つの異なるヒト細胞株で試験した：バーキットリンパ腫細胞株Wien 133、Daudi（ATCC, Cat No. CCL-213）、Raji（ATCC, Cat No. CCL-86）およびRamos（ATCC, Cat No. CRL-1596）、急性リンパ芽球性リンパ腫（ALL）細胞株REH（DSMZ, Cat No. ACC-22）、骨髄腫細胞株U266B1（ATCC, Cat No. TIB-196）、ならびにB細胞リンパ腫細胞株U-698-M（DSMZ, Cat No. ACC-4）。インビトロCDCアッセイを、基本的には実施例2に記載のように、20％NHSおよび抗体終濃度30.0μg/mLを用いて実施した。PI陽性細胞の数から細胞溶解を算出し、3つの実験レプリケートから平均化し、そして、陰性対照抗体IgG1-b12について測定された細胞溶解（0％）およびどの抗体が最も高い溶解を誘導したかに応じてIgG1-CAMPATH-1H-E430G（100％、REH、U266B1およびWien 133について）またはIgG1-11B8-E430G（100％、Daudi、Raji、RamosおよびU-698-Mについて）について測定された細胞溶解に対して細胞株毎に正規化された。
【０４９５】
CD52およびCD20の細胞表面発現レベルを、Human IgG Calibrator Kit（Biocytex, Cat No. CP010）を使用した間接的免疫蛍光によって判定した。1ウェル当たり100,000個の細胞をポリスチレン96ウェル丸底プレート（Greiner Bio-One, Cat No. 650101）に播種した。次の工程を4℃で実施した。細胞を、300xgで3分間の遠心分離によってペレット化し、飽和濃度の10μg/mLのIgG1-CAMPATH-1H（抗CD52）またはIgG1-11B8（抗CD20）を含有するPBS（B Braun, Cat No. 3623140）50μLに再懸濁した。4℃で30分間のインキュベーション後、細胞を、300xgで3分間の遠心分離によってペレット化し、FACS緩衝液（PBS＋0.1％（w/v）ウシ血清アルブミン（BSA）＋0.02％（w/v）アジ化ナトリウム）150μLに再懸濁した。セットアップビーズおよびキャリブレーションビーズを製造元の指示に従ってプレートに加えた。細胞およびビーズを並行して、FACS緩衝液150μLでさらに2回洗浄し、FITCコンジュゲートマウス-IgG吸収ヤギ抗ヒトIgG（BioCytex）50μLに再懸濁し、4℃で30分間インキュベートした。細胞およびビーズを2回洗浄し、FACS緩衝液150μLに再懸濁した。細胞をFixative（BioCytex）に再懸濁し、光から保護して4℃で5〜60分間インキュベートした。FACS Canto II（BD Biosciences）でのフローサイトメトリーによって、生存細胞の集団内の10,000のイベントを記録することによって免疫蛍光を測定した。キャリブレーションビーズの蛍光強度の幾何平均を使用し、GraphPad Prismソフトウェアを使用してゼロ強度およびゼロ濃度を通過するようにさせたキャリブレーション曲線を算出した。各細胞株について、CD52およびCD20の細胞表面発現をそれぞれ表すIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8の抗体結合能（ABC）を、GraphPadソフトウェアを使用したキャリブレーション曲線の方程式（標準曲線からの未知のものの内挿）に基づき、幾何平均蛍光強度を使用して算出し、続いて、一次抗体なしでインキュベートしたウェルについて決定されたバックグラウンドを減算した。ABC値を2つの独立した実験から平均化し、表2にまとめる。
【０４９６】
図3は、IgG1-CAMPATH-1H-E430GおよびIgG1-11B8-E430Gの標的飽和でのCDC活性が、標的発現レベルと共に変動したことを示す：U266B1細胞（CD20 ABC＜20,000；CD52 ABC＞1×106）およびREH細胞（CD20 ABC＜20,000；CD52 ABC＞100,000）は、抗CD20抗体IgG1-11B8-E430Gによる溶解に強靭性であったが、抗CD52抗体IgG1-CAMPATH-1H-E430Gに感受性であった。反対に、Daudi細胞（CD52 ABC＜75,000；CD20 ABC＞100,000）は、IgG1-CAMPATH-1H-E430Gに強靭性であったが、IgG1-11B8-E430Gに感受性であった。他の4つの試験した細胞株は、IgG1-CAMPATH-1H-E430GとIgG1-11B8-E430Gの両方に感受性であった：Wien 133（CD20 ABC＞100,000；CD52 ABC＞300,000）、Raji（CD20 ABC＞100,000；CD52 ABC＞85,000）、U-698-M（CD20 ABC＞70,000；CD52: ABC＞90,000）およびRamos（CD20 ABC＞80,000；CD52 ABC＞175,000）。
【０４９７】
IgG1-CAMPATH-1H-E430Gについて、K439E変異の導入は、U-698-MおよびRaji細胞（CD52 ABC＜100,000）に対して低減された単剤CDC活性をもたらしたが、細胞株U266B1（CD52 ABC＞1×106）細胞、Wien 133（CD52 ABC＞300,000）、Ramos（CD52 ABC＞175,000）、およびREH細胞（CD52 ABC＞135,000）に対して有意な効果を有していなかった。IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439EへのK322Eの導入によるC1q結合阻害はさらに、IgG1-CAMPATH-1H-E430Gに応答したすべての試験した細胞株に対して単剤CDC活性を排除した。IgG1-11B8-E430Gについて、S440K変異だけの導入またはS440K変異とK322E変異の両方の導入は、IgG1-11B8-E430Gに感受性であったすべての試験した細胞株に対して単剤CDC活性の完全な阻害をもたらした：Daudi（CD20 ABC＜115,000）、Wien 133（CD20 ABC＜110,000）、Raji（CD20 ABC＜120,000）、U-698-M（CD20 ABC＜75,000）およびRamos（CD20 ABC＜85,000）。
【０４９８】
IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合物は、CD20およびCD52の表面発現レベルに関わらず、すべての試験した細胞株に対してCDC活性を示した（図3）。全く対照的に、IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-K322E＋IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合物は、CD20とCD52の両方の十分な表面発現レベルを呈した細胞株にのみ選択的溶解を示した：Wien 133（CD20 ABC＞100,000；CD52 ABC＞300,000）、Ramos（CD20 ABC＞80,000；CD52 ABC＞175,000）、U-698-M（CD20 ABC＞70,000；CD52 ABC＞90,000）、およびRaji（CD20 ABC＞100,000；CD52 ABC＞85,000）。
【０４９９】
CD20またはCD52が非常に低レベルで発現されたときにのみ、IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-K322E＋IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合物によるCDC活性は観察されなかった：Daudi（CD52 ABC＜75,000）、U266B1 U266B1（CD20 ABC＜20,000）およびREH（CD20 ABC＜20,000）。C1q結合阻害変異K322Eが両方の抗体（IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-K322E＋IgG1-11B8-E430G-S440K-K322E）に導入されたとき、CDC活性は観察されなかった。まとめると、これらのデータは、IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-K322EによるC1qの動員およびCDC有効性が、IgG1-11B8-E430G-S440Kとのそのヘテロオリゴマー化に依存することを示唆している。
【０５００】
結論として、十分なレベルのCD20とCD52の両方を発現する細胞の選択的死滅を、IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-K322E＋IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合物を使用して達成することができた；対照的に、この混合物は、非常に低い発現レベルのCD20またはCD52のいずれかを発現した細胞株に対してはバックグラウンド溶解レベルを呈し、これらの細胞株は、IgG1-11B8-E430G-S440KおよびIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-K322Eそれぞれの単剤CDC活性によって死滅できなかった。
【０５０１】
（表2）血液がん細胞株に対するCD52およびCD20の細胞表面発現
2021522303.tif 000059
1細胞表面発現は、Human IgG Calibrator Kit（Biocytex）を使用して判定された、1細胞当たりの特異的抗体結合能（ABC）の数として表される。
【０５０２】
実施例5：抗CD20抗体IgG1-11B8-E430G-S440Kとの抗体混合物の選択的CDC活性に対する、抗CD52抗体IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eにおける異なるC1q結合阻害変異の効果の分析
C1q結合阻害変異P329R（Error! Reference source not found.）またはK322E（Error! Reference source not found.）の導入は、Wien 133細胞に対してIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eの残留CDC活性の阻害をもたらした一方で、IgG1-11B8-E430G-S440Kと混合したとき、試験された細胞株に応じて、CDC活性が完全に回復したか、部分的に回復したかまたはまったく回復しなかったかのいずれかであったことを上述した（Error! Reference source not found.）。ここで、異なるC1q結合阻害変異の効果を、Wien 133細胞を使用したインビトロCDCアッセイで、C1q結合阻害変異G236R（SEQ ID NO 84）、K322A（SEQ ID NO 90）、E269K（SEQ ID NO 81）、K322EまたはP329R（予想されるC1q結合親和性の漸減によってここに列記）を含有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439EバリアントをIgG1-11B8-E430G-S440Kとの混合物で用いて比較した。Wien 33細胞を使用したインビトロCDCアッセイを、基本的にはError! Reference source not found.に記載のように、20％NHSおよび段階希釈抗体濃度（4倍希釈で終濃度範囲0.002〜40.0μg/mL）を用いて実施した。Intellicyt iQueTMスクリーナーでのフローサイトメトリーによる測定でPI陽性細胞の数から細胞溶解を算出し、3つの実験レプリケートから平均化した。相対曲線下面積（AUC）値は、最小溶解（陰性対照IgG1-b12-K439E＋IgG1-b12-S440Kで0％）および最大溶解（IgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物で100％）に対する正規化を表す。Error! Reference source not found.は、Wien 133細胞に対する用量応答CDC活性曲線のAUC値についての棒グラフを示す。C1q結合阻害変異（G236R、K322A、E269K、K322EまたはP329R）のいずれか1つの導入は、Wien 133に対してIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eによる残留単剤CDC活性の完全な阻害をもたらした。IgG1-11B8-E430G-S440Kとの混合物では、単一のC1q結合阻害変異P329R、K322E、E269K、K322AまたはG236Rを含有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eバリアントを用いて増加レベルのCDC活性の回復が観察された。これらのデータは、IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eバリアント（P329R、K322E、E269K、K322AまたはG236R）のC1q結合親和性と、IgG1-11B8-E430G-S440Kとの混合物についてのCDC活性の回復との間に直接的な相関関係があったことを示唆している。
【０５０３】
実施例6：抗CD52抗体IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eとの抗体混合物の選択的CDC活性に対する、抗CD20抗体IgG1-11B8-E430G-S440Kにおける異なるC1q結合増強変異の効果の分析
異なるC1q結合増強変異の効果を、Wien 133細胞を使用したインビトロCDCアッセイで、C1q結合増強変異E333S（SEQ ID NO 103）、K326W（SEQ ID NO 112）またはK326A/E333A（SEQ ID NO 111；予想されるC1q結合親和性の漸増によってここに列記）を含有するIgG1-11B8-E430G-S440KバリアントをIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eとの混合物で用いて比較した。Wien 133細胞を使用したインビトロCDCアッセイを、基本的にはError! Reference source not found.に記載のように、20％NHSおよび段階希釈抗体濃度（4倍希釈で終濃度範囲0.002〜40.0μg/mL）を用いて実施した。Intellicyt iQueTMスクリーナーでのフローサイトメトリーによる測定でPI陽性細胞の数から細胞溶解を算出し、3つの実験レプリケートから平均化した。相対曲線下面積（AUC）値は、最小溶解（陰性対照IgG1-b12-K439E＋IgG1-b12-S440Kで0％）および最大溶解（IgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物で100％）に対する正規化を表す。Error! Reference source not found.は、Wien 133細胞に対する用量応答CDC活性曲線のAUC値についての棒グラフを示す。C1q結合増強変異E333S、K326WまたはK326A/E333Aの導入は、Wien 133に対してIgG1-11B8-E430G-S440Kによる漸増単剤CDC活性をもたらした（E333Sについて7％；K326Wについて18％；K326A/E333Aについて25％、C1q結合増強変異なしの1％との比較）。IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eとの混合物では、C1q結合増強変異K326A/E333A、K326WまたはE333Sを含有するIgG1-11B8-E430G-S440Kバリアントを用いて増加レベルのCDC活性が観察された。これらのデータは、IgG1-11B8-E430G-S440Kバリアント（K326A/E333A、K326WまたはE333S）のC1q結合親和性と、IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eとの混合物についてのCDC活性との間に直接的な相関関係があったことを示唆している。
【０５０４】
実施例7：抗CD52および抗CD20抗体バリアントの抗体混合物の選択的CDC活性に対する、抗CD52抗体IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eにおける異なるC1q結合阻害変異および抗CD20抗体IgG1-11B8-E430G-S440KにおけるC1q結合増強変異の効果の分析
C1q結合親和性に影響を及ぼす異なる変異の効果を、Wien 133細胞を使用したインビトロCDCアッセイで、C1q結合阻害変異G236R、K322A、E269K、K322EまたはP329Rを含有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eバリアント（実施例5に記載）をC1q結合増強変異E333S、K326WまたはK326A/E333Aを含有するIgG1-11B8-E430G-S440Kバリアント（実施例6に記載）との混合物で用いて比較した。Wien 133細胞を使用したインビトロCDCアッセイを、基本的には実施例2に記載のように、20％NHSおよび段階希釈抗体濃度（4倍希釈で終濃度範囲0.002〜40.0μg/mL）を用いて実施した。Intellicyt iQueTMスクリーナーでのフローサイトメトリーによる測定でPI陽性細胞の数から細胞溶解を算出し、3つの実験レプリケートから平均化した。相対曲線下面積（AUC）値は、最小溶解（陰性対照IgG1-b12-K439E＋IgG1-b12-S440Kで0％）および最大溶解（IgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物で100％）に対する正規化を表す。図6は、Wien 133細胞に対する用量応答CDC活性曲線のAUC値についての棒グラフを示す。C1q結合増強変異を有する抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440KがC1q結合阻害変異G236RまたはK322Aを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E抗体バリアントと混合された混合物は、C1q結合増強変異なしのIgG1-11B8-E430G-S440Kとの混合物と比較して、Wien 133細胞に対するCDC活性の回復改善を示した。C1q結合阻害変異を含有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eバリアントと混合したとき、IgG1-11B8-E430G-S440KバリアントにおけるC1q結合親和性の予想強度（K326A/E333A＞K326W＞E333S）とCDC活性回復のレベルとの間に相関関係があり、G236Rについてわずかに増強された最大溶解回復（図6A；表3）、K322A（図6B；表3）、E269K（図6C；表3）、K322E（図6D；表3）についてEC50値が増加した最大溶解回復、またはP329RについてEC50値が増加した低減されたままの最大溶解（図6E；表3）があった。
【０５０５】
（表3）
2021522303.tif 000060
【０５０６】
実施例8：抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H抗体バリアントおよび抗CD20 IgG1-11B8抗体バリアントの細胞に対する標的結合
E430G、K439EおよびC1q結合阻害変異G236RまたはK322Aを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1HならびにE430G、S440KおよびC1q結合増強変異E333Sを有する抗CD20 IgG1-11B8について、Wien 133およびRajiリンパ腫細胞への結合をフローサイトメトリーによって解析した。細胞懸濁液をFACS緩衝液で洗浄し、FACS緩衝液［PBS＋0.1％（w/v）ウシ血清アルブミン（BSA）＋0.02％（w/v）アジ化ナトリウム］に2.5×106個の細胞/mLの濃度で再懸濁した。細胞懸濁液試料（1ウェル当たり100,000個の細胞）40μLをポリスチレン96ウェル丸底プレート（Greiner Bio-One；Cat nr 650101）に播種し、抗体試料（3倍希釈で終濃度0.001〜30μg/mL）40μLと4℃で30分間インキュベートした。細胞を、4℃の300xgで3分間の遠心分離によってペレット化し、FACS緩衝液150μLで2回洗浄した。細胞を、光から保護して二次抗体R-フィコエリスリン（R-PE）コンジュゲートヤギ-抗ヒトIgG F(ab’)2（Jackson ImmunoResearch, Cat No. 109-116-098, 1:100）50μLと4℃で30分間インキュベートした。細胞をFACS緩衝液150μLで2回洗浄し、FACS緩衝液150μLに再懸濁し、抗体結合をIntellicyt iQueスクリーナーでのフローサイトメトリーによって解析した。結合曲線を、GraphPad Prismソフトウェアを使用した非線形回帰分析（可変傾斜を有するシグモイド用量応答）を使用して分析した。
【０５０７】
図7は、IgG1-CAMPATH-1Hについて、すべての試験した抗体バリアントが、Wien 133細胞（図7A）とRaji細胞（図7B）の両方へ類似の用量依存的結合を示したことを示す。これらのデータは、単一変異E430GおよびK439E、ならびに二重変異E430G-K439Eの導入が、細胞表面への標的結合に対して効果を有していなかったことを示す。また、追加の変異G236RまたはK322Aの導入も細胞表面へのCD52標的結合に対して効果を有していなかった。
【０５０８】
図7は、IgG1-11B8について、すべての試験した抗体バリアントが、Wien 133細胞（図7C）とRaji細胞（図7D）の両方へ類似の用量依存的結合を示したことを示す。これらのデータは、単一変異E430GおよびS440K、ならびに二重変異E430G-S440Kの導入が、細胞表面への標的結合に対して効果を有していなかったことを示す。また、追加の変異E333Sの導入も細胞表面へのCD20標的結合に対して効果を有していなかった。
【０５０９】
実施例9：抗CD52および抗CD20抗体バリアントの混合物を使用した、FcγR媒介エフェクター機能に対する、抗CD52抗体IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439EにおけるC1q結合阻害変異および抗CD20抗体IgG1-11B8-E430G-S440KにおけるC1q結合増強変異の効果の分析
抗体依存的細胞傷害性（ADCC）に対する、IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439EバリアントへのC1q結合阻害変異G236RまたはK322AおよびIgG1-11B-E430G-S440KへのC1q結合増強変異E333Sの導入の効果を、Raji細胞に対してはADCCレポーターバイオアッセイで、Wien 133細胞に対してはヒト末梢血単核細胞（PBMC）を用いたインビトロユウロピウムTDA（EuTDA）ADCCアッセイで試験した。
【０５１０】
ADCCレポーターバイオアッセイについて、IgG1-CAMPATH-1H（WT、E430G、K439E（SEQ ID NO 29）、E430G-K439E、E430G-K439E-G236RおよびE430G-K439E-K322A）およびIgG1-11B8（WT、E430G. S440K（SEQ ID NO 30）、E430G-S440K、E430G-S440K-E333S）のバリアントを、Raji細胞に対してBio-Glo Luciferase Assay System（Promega, Cat No. G7940）を使用して試験した。エフェクター細胞として、キットは、高親和性FcγRIIIa（V158）およびホタルルシフェラーゼの発現を駆動する活性化T細胞核内因子（NFAT）応答エレメントを安定発現するように操作されたJurkatヒトT細胞を含有する。簡潔に述べると、Raji細胞（5.000個の細胞/ウェル）を、384ウェルの白色OptiPlates（Perkin Elmer Cat No. 6007290）内、ADCC Assay Buffer［4％ Low IgG Serum（Promega, Cat No. G711A）を補充したRPMI-1640培地（Lonza, Cat No. BE12-115F）］中に播種し、37℃/5％CO2で6時間、抗体濃度系列（3.5倍希釈で終濃度0.4〜10,000ng/mL）および融解させたADCC Bioassay Effector Cells（Promega, Cat No. G701A）を含有する30μLの総容量でインキュベートした。プレートを室温（RT）で15分間インキュベートした後、Bio Glo Assay Luciferase Reagent［Bio-Glo Luciferase Assay Buffer（Promega, Cat No. G719A）中のBio-Glo Luciferase Assay Substrate（Promega Cat No. G720A）］30μLを加え、RTで5分間インキュベートした。ルシフェラーゼ産生を、EnVision Multilabel Reader（Perkin Elmer）での発光読み出しによって定量した。
【０５１１】
IgG1-CAMPATH-E430G-K439EへのC1q結合阻害変異G236Rの導入は、Raji細胞上への単一抗CD52抗体の結合後にエフェクター細胞においてFcγRIIIa活性化の完全な阻害をもたらしたが、C1q結合阻害変異K322Aは、ADCCレポーターバイオアッセイにおいてFcγRIIIa活性化の部分的阻害をもたらした（図8A）。すべての試験したIgG1-11B8抗体バリアントは、Raji細胞上への単一抗CD20抗体の結合後にエフェクター細胞において大幅なFcγRIIIa活性化を示し、S440Kおよび/またはE430Gおよび/またはE333S変異を含有するIgG1-11B8バリアント間で有意差はなかった（図8B）。
【０５１２】
3人の異なる健常ドナー由来の新たに単離したPBMCをエフェクター細胞として用いて、Wien 133細胞に対してインビトロEuTDA ADCCアッセイ（DELFIA EuTDA Cytotoxicity Assay, Perkin Elmer, Cat No. AD0116）を実施し、IgG1-CAMPATH-1H抗体バリアント（WT、K439E、E430G-K439E、G236R-E430G-K439EおよびK322A-E430G-K439E）およびIgG1-11B8抗体バリアント（WT、S440K、E430G-S440KおよびE333S-E430G-S440K）の単剤としてのまたは組み合わせ（IgG1-CAMPATH-1H-G236R-E430G-K439Eまたは-K322A-E430G-K439EとIgG1-11B8-E333S-E430G-S440Kとの）としてのADCC活性を試験した。標準的なFicoll密度遠心分離用のLymphocyte Separation Medium（Lonza, Cat No. 17-829E）を製造元の指示に従って使用して、バフィーコート（Sanquin, Amsterdam, The Netherlands）からPBMCを単離した。10％の鉄含有ドナーウシ血清（DBSI, ThermoFischer, Cat No. 10371029）およびペニシリン/ストレプトマイシン（Pen/Strep, Lonza, Cat No. DE17-603E）を補充したRPMI-1640培地（Lonza, Cat No. BE12-115F）中に細胞を再懸濁した後、細胞をトリパンブルー（Sigma Aldrich, Cat No. T8154）色素排除によって計数し、2×107個の細胞/mLまで濃縮した。
【０５１３】
Wien 133細胞を採取し、洗浄し（PBS中で2回、1,200rpm、5分）、10％DBSIおよびPen/Strepを補充したRPMI-1640培地中に1×106個の細胞/mLの濃度で収集し、それに対してDELFIA BATDA Reagent（Perkin Elmer, Cat No. C136-100、5μL/3×106個の細胞）15μLを加えた。混合物を水浴中37℃で20分間インキュベートした。細胞の洗浄（PBS 50mL中で5回、1,200rpm、5分）後、細胞を10％DBSIおよびPen/Strepを補充したRPMI-1640培地に再懸濁し、トリパンブルー色素排除によって計数し、2×105個の細胞/mLの濃度に希釈した。
【０５１４】
ADCC実験のために、BATDAで標識したWien 133細胞（10,000個の細胞/ウェル）50μLを、濃度系列（10倍希釈で終濃度0.01〜10,000ng/mL）のIgG1-CAMPATH-1Hおよび/またはIgG1-11B8抗体バリアントと、96ウェルV底マイクロタイタープレート（Greiner Bio-One；Cat No. 651101）内、10％DBSIおよびPen/Strepを補充したRPMI-1640培地150μLの総容量でプレインキュベートした。RTで15分後、PBMC（1×106個の細胞）50μLを加えて、エフェクター対標的比（E：T）100：1とし、37℃/5％CO2で2時間インキュベートした。細胞溶解の最大量を判定するために、BATDAで標識したWien 133細胞（10,000個の細胞/ウェル）50μLを、10％DBSI、Pen/StrepおよびDELFIA Lysis Buffer（0.03％ジギトニンおよび19％DMSO、Perkin Elmer, Cat No. AD0116-A）を補充したRPMI-1640培地150μLと製造元の推奨に従ってインキュベートした。自然溶解の量を判定するために、BATDAで標識したWien 133細胞（10,000個の細胞/ウェル）50μLを、いかなる抗体もエフェクター細胞も含まない培地150μL中でインキュベートした。
【０５１５】
放出されたBATDA Reagentの量を測定するために、プレートを遠心分離し（500xg、10分）、上清20μLをDELFIA Micotitrationプレートに移し、DELFIA Europium Solution（Perkin Elmer, Cat No. AD0116-B）200μLを加えた。その後、プレートを振盪しながらRTで15分間インキュベートした。ユウロピウム-BATDA（EuTDA）を時間分解蛍光光度計（Perkin Elmer EnVision 2104 Multi Detection Microplate Reader）で測定し、これを使用して、以下のように抗体媒介溶解率を算出した：（試料放出−自然放出）/（最大放出−自然放出）×100％。
【０５１６】
WT IgG1-CAMPATH-1HへのE430Gおよび/またはK439E変異の導入は、単剤として試験したとき、Wien 133細胞の用量応答性ADCC媒介死滅に対して効果を有していなかった（図8C）。IgG1-CAMPATH-E430G-K439EへのC1q結合阻害変異G236Rの導入は、単剤のADCC活性の完全な阻害をもたらしたが、C1q結合阻害変異K322Aは、Wien 133細胞に対する単剤IgG1-CAMPATH-E430G-K439EのADCC活性に効果を有していなかった（図8C）。すべての試験したIgG1-11B8抗体バリアントは、単剤として試験したとき、Wien 133細胞に対して大幅なADCC有効性を示し、S440Kおよび/またはE430Gおよび/またはE333S変異を含有するIgG1-11B8バリアント間で有意差はなかった（図8D）。IgG1-11B8-E333S-E430G-S440KとIgG1-CAMPATH-1H-G236R-E430G-K439EまたはIgG1-CAMPATH-1H-K322A-E430G-K439Eとの混合物は共に、Wien 133細胞に対して大幅なADCC有効性を示した（図8D）。
【０５１７】
結論として、変異G236Rは、発光ADCCレポーターバイオアッセイおよびインビトロEuTDA ADCCアッセイの両方でIgG-CAMPATH-E430G-K439EのADCC活性を強く阻害した。K322A変異を有するIgG-CAMPATH-E430G-K439Eは、発光ADCCレポーターバイオアッセイにおいて活性の低減を示したが、インビトロEuTDA ADCCアッセイにおいて実質的なADCC活性の保持を示した。
【０５１８】
実施例10：C1q結合阻害変異を有するIgG1-CAMPATH-K439EバリアントおよびC1q結合増強変異を有するまたは有さないIgG1-11B8-S440Kバリアントの混合物のWien 133細胞に対する選択的CDC活性についての異なるFc-Fc相互作用増強変異の分析
実施例5において、IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439EへのC1q結合阻害変異（G236R、K322A、E269K、K322EまたはP329R）の導入は、Wien 133に対する単剤CDC活性の完全な阻害を、そして、IgG1-11B8-E430G-S440Kとの混合物の場合にはCDC活性の回復をもたらしたことを説明した。実施例6において、E333SなどのC1q結合増強変異を含有するIgG1-11B8-E430G-S440Kが、Wien 133細胞を使用したインビトロCDCアッセイにおいて単剤として試験したとき、非常に限定されたCDC活性を示したが、IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eとの混合物ではCDC活性の回復を示したことを説明した。実施例7において、C1q結合阻害変異G236RまたはK322Aを含有する抗CD52抗体IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439EとC1q結合増強変異E333Sを含有する抗CD20抗体IgG1-11B8-E430G-S440Kの組み合わせが、Wien 133細胞に対して選択的CDC活性を示した一方で、単剤についてCDC活性は観察されなかったことを説明した。ここで、Fc-Fc増強変異（E430Gなど）、K439E変異およびC1q結合増強変異（G236RまたはK322Aなど）を有するIgG1-CAMPATH-1HバリアントとFc-Fc増強変異（E430Gなど）、S440K変異および任意でC1q結合増強変異（E333Sなど）を有するIgG1-11B8抗体バリアントとの混合物によるこのCDC活性の選択的誘導の原理を、E345K、E345RおよびE345R-E430Gなどの他のFc-Fc増強変異について、Wien 133細胞に対するインビトロCDCアッセイで分析した。Wien 133細胞を使用したインビトロCDCアッセイを、基本的には実施例2に記載のように、20％NHSおよび抗体濃度系列（3倍希釈で終濃度範囲0.003〜10.0μg/mL）を用いて実施した。細胞溶解および相対曲線下面積（AUC）値を、2つの実験レプリケートから、実施例2に記載するようにPI陽性細胞の数から算出した。AUCは、陰性対照抗体IgG1-b12についての値（0％）および陽性対照IgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gについての値（100％）に対して正規化された一方で、提示される最大溶解データは、10μg/mLのIgGでの正規化されていない細胞溶解を反映する。
【０５１９】
Error! Reference source not found.は、Wien 133細胞に対する用量応答CDC活性曲線のAUC値および最大溶解についての棒グラフを示す。Fc-Fc相互作用増強変異E430G、E345K（それぞれ、SEQ ID NO：66または67）またはE345R（それぞれ、SEQ ID NO：74または73）のいずれか1つを有するIgG1-CAMPATH-1H-K439EへのC1q結合阻害変異G236R（Error! Reference source not found.A）またはK322A（Error! Reference source not found.B）の導入は、Wien 133細胞に対して単一のターゲティング剤として試験したとき、CDC活性の喪失をもたらした。対照的に、2つのFc-Fc相互作用増強変異E345R-E430GおよびC1q結合阻害変異G236R（SEQ ID NO：71）を有するIgG1-CAMPATH-1H-K439Eバリアントは、Wien 133細胞に対して残留単剤CDC活性を示した（Error! Reference source not found.A）。E430G、E345KまたはE345RのいずれかのFc-Fc相互作用増強変異を含有するIgG1-CAMPATH-1H-K439E-G236R（Error! Reference source not found.A）またはIgG1-CAMPATH-1H-K439E-K322A（Error! Reference source not found.B）とIgG1-11B8-E430G-S440KまたはIgG1-11B8-E430G-S440K-E333Sとの混合物は、Wien 133細胞に対してCDC活性の回復を示したが、これらのバリアントはすべて、単剤としていかなるCDCも誘導しなかった。E430GまたはE345K（SEQ ID NO：68）のいずれかのFc-Fc相互作用増強変異を含有するIgG1-11B8-S440K-E333S抗体バリアントは、Wien 133細胞を使用したインビトロCDCアッセイにおいて単剤として試験したとき、有意なCDC活性を誘導しなかったが、2つのFc-Fc相互作用増強変異E345R-E430Gを含有するIgG1-11B8-E345R-E430G-S440K-E333S（SEQ ID NO：72）を用いて単剤活性が観察された（Error! Reference source not found.C）。E345KまたはE430GのいずれかのFc-Fc相互作用増強変異を含有するIgG1-11B8-S440K-E333SとIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G236Rとの混合物は、Wien 133細胞に対してCDC活性の回復を示したが、これらのバリアントはすべて、単剤としていかなるCDCも誘導しなかった（Error! Reference source not found.C）。同様に、すべてがFc-Fc相互作用増強変異E345Kを含有する、IgG1-11B8-E345K-S440K-E333SとIgG1-CAMPATH-1H-E345K-K439E-G236RまたはIgG1-CAMPATH-1H-E345K-K439E-K322Aとの混合物は、Wien 133細胞に対してCDC活性の回復を示したが、単剤はCDCを誘導しなかった（Error! Reference source not found.C）。
【０５２０】
まとめると、これらのデータは、E430G、E345KまたはE345RなどのFc-Fc相互作用増強変異の1つおよびC1q結合阻害変異G236RまたはK322Aを含有するIgG1-CAMPATH-1H-K439EバリアントをE333SなどのC1q結合増強変異を有するまたは有さずにFc-Fc相互作用増強変異の1つを含有するIgG1-11B8-S440Kバリアントと混合した組成物によって、CD52陽性/CD20陽性Wien 133細胞に対する選択的CDC活性を達成することができることを示す。結論として、異なるFc-Fc相互作用増強変異を有する個々の抗体のCDC活性は、C1q結合強度の調節と組み合わせた自己オリゴマー化阻害変異の導入によって制御することができる。補体活性は、両方の抗体が同時に結合した細胞に対する選択的ヘテロオリゴマー化を可能にする補体自己オリゴマー化阻害変異を有する2つのそのような抗体を混合した後に復元される。
【０５２１】
実施例11：抗CD52 IgG1-CAMPATH-E430G-K439Eおよび抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440K抗体バリアントの混合物のWien 133細胞に対する選択的CDC活性についての異なるC1q結合調節変異の分析
実施例7において、G236RまたはK322AなどのC1q結合阻害変異を含有する抗CD52抗体IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439EとE333S、K326WまたはK326A-E333AなどのC1q結合増強変異を含有する抗CD20抗体IgG1-11B8-E430G-S440Kの組み合わせが、Wien 133細胞に対して選択的CDC活性を示した一方で、単剤についてCDC活性がほとんど観察されなかったか全く観察されなかったことを説明した。ここで、単剤のCDC活性を抑制し、抗CD52および抗CD20抗体バリアントの混合物による選択的CDC活性の最大回復を可能にする目的で、代わりのC1q結合調節変異を、IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439EおよびIgG1-11B8-E430G-S440K抗体バリアントの異なる組み合わせで試験した。Wien 133細胞を使用したインビトロCDCアッセイを、基本的には実施例2に記載のように、20％NHSおよび抗体濃度系列（3倍希釈で終濃度範囲0.003〜10.0μg/mL）を用いて実施した。細胞溶解および相対AUC値を、2つの実験レプリケートから、実施例2に記載するようにPI陽性細胞の数から算出した。AUCは、陰性対照抗体IgG1-b12についての値（0％）および陽性対照IgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gについての値（100％）に対して正規化された一方で、提示される最大溶解データは、10μg/mLのIgGでの正規化されていない細胞溶解を反映する。
【０５２２】
最初に、アミノ酸G236位（G236RまたはG236K（SEQ ID NO 83））もしくはG237位（G237A（SEQ ID NO 85）、G237T（SEQ ID NO 89）、G237Q（SEQ ID NO 87）もしくはG237R（SEQ ID NO 88））に置換または二重変異G237A-K322A（SEQ ID NO 86）を含有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E抗体バリアントを、C1q結合増強変異E333Sを有するまたは有さないIgG1-11B8-E430G-S440Kと組み合わせた。Error! Reference source not found.Aに示すように、IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E中のG236位またはG237位にあるすべての試験したC1q結合調節変異は、C1q結合増強変異E333Sを有するまたは有さないIgG1-11B8-E430G-S440Kとの混合物で選択的CDC活性をもたらした一方で、単剤としてWien 133細胞に対してCDC活性をほとんど示さないか全く示さなかった。対照的に、二重変異G237A-K322Aを含有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eバリアントの混合物は、C1q結合増強変異E333Sを有するまたは有さないIgG1-11B8-E430G-S440Kと組み合わせたとき、CDC活性の回復を示さなかった。
【０５２３】
次に、C1q結合増強変異K326A（SEQ ID NO 110）、E333A（SEQ ID NO 102）、E333SまたはK236W-E333S（SEQ ID NO 157）を含有するIgG1-11B8-E430G-S440K抗体バリアントを、C1q結合阻害変異G236RまたはK322Aを含有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eと組み合わせた。Error! Reference source not found.Bに示すように、単一のC1q結合増強変異K326A、E333AまたはE333Sを含有するIgG1-11B8-E430G-S440K抗体バリアントは、単剤としてWien 133細胞に対するCDC活性の欠如を保持したが、二重変異K236W-E333Sを含有するIgG1-11B8-E430G-S440Kバリアントは、単剤として有意に高いCDC活性を示した。単一のC1q結合増強変異K326A、E333AまたはE333Sを含有するIgG1-11B8-E430G-S440K抗体バリアントとC1q結合阻害変異G236RまたはK322Aを含有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eバリアントのすべての試験した組み合わせは、CDC活性の回復を示した一方で、単剤としてWien 133細胞に対してCDC活性をほとんど示さないか全く示さなかった。
【０５２４】
また、C1q結合増強変異K326AまたはE333Aを含有するIgG1-11B8-E430G-S440K抗体バリアントを、G237位にC1q結合調節変異（G237A、G237T、G237QまたはG237R）を含有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eと組み合わせた。図10Bに示すように、IgG1-11B8-E430G-S440K-K326AまたはIgG1-11B8-E430G-S440K-E333AとG237位に試験した変異の1つを含有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E抗体バリアントのすべての試験した組み合わせは、選択的CDC活性をもたらした一方で、単剤はすべて、Wien 133細胞に対してCDC活性をほとんど示さないか全く示さなかった。
【０５２５】
S440K成分（SEQ ID NO 105）におけるFcγR媒介エフェクター機能を抑制するために、IgG1-11B8-E430G-S440K抗体バリアントに変異G237Aを導入した。潜在的に減少したC1q結合を補うために、G237Aを、C1q結合増強変異E333S（SEQ ID NO 106）と組み合わせて試験した。IgG1-11B8バリアントをIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G236Rと組み合わせた。Error! Reference source not found.Bに示すように、これらの組み合わせも選択的CDC活性を示した一方で、単剤は、Wien 133細胞に対してCDC活性をほとんど示さないか全く示さなかった。
【０５２６】
結論として、Fc-Fc相互作用増強変異E430Gを有する個々の抗体のCDC活性は、C1q結合を阻害する異なる変異と組み合わせた自己オリゴマー化阻害変異の導入によって制御することができた。そのような抗体を使用した補体活性の最大回復は、異なるC1q結合増強変異および両方の抗体が同時に結合した細胞に対する選択的ヘテロオリゴマー化を可能にする補体自己オリゴマー化阻害変異を含有する抗体と混合することによって達成された。
【０５２７】
実施例12：異なるヒトIgGアイソタイプ骨格における抗CD52抗体および抗CD20抗体バリアントの混合物についてのWien 133細胞に対する選択的CDC活性の分析
抗CD52 CAMPATH-1HのVH配列を、E430G-K439E-G236R変異を含有するヒトIgG1、IgG2、IgG3およびヒンジ安定化IgG4（S228P）Fc骨格にクローニングし、抗CD20 11B8のVH配列を、E430G-S440K-E333S変異を含有するヒトIgG1、IgG2、IgG3およびヒンジ安定化IgG4（S228P）Fc骨格にクローニングした。これらの抗CD52および抗CD20アイソタイプバリアントの異なる組み合わせを選択的CDC活性について試験した。Wien 133細胞を使用したインビトロCDCアッセイを、基本的には実施例2に記載のように、20％NHSおよび抗体濃度系列（3倍希釈で終濃度範囲0.003〜10.0μg/mL）を用いて実施した。細胞溶解および相対AUC値を、2つの実験レプリケートから、実施例2に記載するようにPI陽性細胞の数から算出した。AUCは、陰性対照抗体IgG1-b12についての値（0％）および陽性対照IgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gについての値（100％）に対して正規化された一方で、提示される最大溶解データは、10μg/mLのIgGでの正規化されていない細胞溶解を反映する。
【０５２８】
IgG2-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G236RおよびIgG2-11B8-E430G-S440KまたはIgG2-11B8-E430G-S440K-E333Sの混合物は、CDC活性の回復を示したが、対応するIgG1抗体バリアントの混合物と比較してCDC効力（AUC）が低減されていた（図11）。IgG2-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G236RおよびIgG2-11B8-E430G-S440Kは、単剤CDC活性を示さなかった一方で、IgG2-11B8-E430G-S440K-E333SへのC1q結合増強変異E333Sの導入は、Wien 133細胞に対して単剤によるいくらかのCDC活性の誘導をもたらした（図11）。
【０５２９】
試験したIgG3アイソタイプバリアントの単剤または混合物のいずれについても、CDC活性は観察されなかった（図11）。また、試験したIgG4アイソタイプバリアントの単剤または混合物についても、CDC活性は観察されなかった（図11）。
【０５３０】
驚くべきことに、IgG2-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G236RとIgG1-11B8-E430G-S440K-E333Sとの混合物およびヒンジ安定化IgG4-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G236R（SEQ ID NO 146）とIgG1-11B8-E430G-S440K-E333Sとの混合物は、CDC効力の部分的回復を示した一方で、それぞれの単剤は、Wien 133細胞に対してCDCを誘導しなかった（図11）。
【０５３１】
結論として、Fc-Fc相互作用増強変異E430Gを含有する異なるIgG骨格を有する個々の抗体のCDC活性は、C1q結合を調節する変異と組み合わせた自己オリゴマー化阻害変異の導入によって制御することができた。補体自己オリゴマー化阻害変異を含有するそのような抗体を混合することによって、そのような抗体のCDC活性を、両方の抗体が同時に結合した細胞に対する選択的ヘテロオリゴマー化によって復元することができた。
【０５３２】
実施例13：抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H抗体バリアントおよび抗CD37 IgG1-CD37-37.3抗体バリアントの混合物による異なる標的発現レベルを有する細胞株に対するCDC活性の選択性
実施例4において説明したように、IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-K322E＋IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合物による選択的CDC活性は、十分なレベルの両標的、すなわち、CD20およびCD52を発現する細胞に対してのみ達成することができた。さらに、実施例7において、抗体組み合わせに対する選択性が保存されたWien 133細胞の最大死滅が、G236RまたはK322AなどのC1q結合阻害変異を含有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E、およびE333SなどのC1q結合増強変異を含有するIgG1-11B8-E430G-S440Kを使用して達成されたことを説明している。ここで、抗CD52抗体バリアントおよび抗CD37抗体バリアントの組み合わせについて、Daudi細胞およびWien 133細胞を使用したインビトロCDCアッセイで選択的CDC活性を試験した。Daudi細胞およびWien 133細胞を使用したインビトロCDCアッセイを、基本的には実施例2に記載のように、20％NHSおよび抗体濃度系列（3倍希釈で終濃度範囲0.003〜10.0μg/mL）を用いて実施した。細胞溶解および相対AUC値を、2つの実験レプリケート（Daudi）および1つの実験レプリケート（Wien 133）から、実施例2に記載するようにPI陽性細胞の数から算出した。AUCは、陰性対照抗体IgG1-b12についての値（0％）および陽性対照IgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gについての値（100％）に対して正規化された。
【０５３３】
低いCD52レベルを発現する（表2）Daudi細胞は、単剤として試験したときのすべてのIgG1-CAMPATH-1Hバリアント（WT、E430G、E430G-K439E、E430G-K439E-G236RおよびE430G-K439E-K322A）によるCDC誘導に強靭性であることが判明した（図12A）。Daudi細胞（高いCD37レベルを発現する、データは示さない）に対するIgG1-CD37-37.3-E430GによるCDC活性は、S440K変異の導入によって阻害され、C1q結合増強変異E333Sの追加の導入によって部分的に回復した。WT IgG1-CD37-37.3は、Daudi細胞に対してCDC活性を誘導しなかった。IgG1-CD37-37.3-E430G-S440KとG236RまたはK322Aを含有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eバリアントとの混合物について、観察されたCDC活性は、単剤IgG1-CD37-37.3-E430G-S440Kのものと類似しており、このことは、低いCD52発現でのIgG1-CAMPATH-1Hバリアントとの協同性の欠如を実証している。低い協同性は、IgG1-CD37-37.3-E430G-S440K-E333SとC1q阻害変異G236RまたはK322Aを含有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eバリアントのバリアントとの混合物について観察された。これらのデータは、IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439EにおけるC1q結合阻害変異G236Rが、低レベルのCD52を発現する細胞で偽の同時活性化を抑制したことを実証した。
【０５３４】
中程度のCD37レベルを発現する（データは示さない）Wien 133細胞は、単剤として試験したときのすべてのIgG1-CD37-37.3バリアント（WT、E430G、E430G-S440K、E430G-S440K-E333S）によるCDC誘導に強靭性であることが判明した（図12B）。高いCD52レベルを発現する（ABC＞300,000；表2）Wien 133細胞に対するIgG1-CAMPATH-1H-E430GによるCDC活性は、K439E変異の導入によってWT IgG1-CAMPATH-1Hのレベルまで低減された。C1q結合阻害変異のさらなる導入（IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G236RおよびIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-K322A）は、単剤についてWien 133細胞に対するCDC活性の完全な阻害をもたらした。IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G236RまたはIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-K322AとIgG1-CD37-37.3-E430G-S440KまたはIgG1-CD37-37.3-E430G-S440K-E333Sとの混合物について、CDC活性の回復がWT IgG1-CAMPATH-1Hのものより優れたレベルまで観察された一方で、これらのバリアントはすべて、単剤としてWien 133細胞に対してCDC活性を示さなかった。
【０５３５】
結論として、IgG1-CAMPATH-1H-E430GおよびIgG1-CD37-37.3-E430G抗体バリアントの混合物についてのCDC有効性の選択的回復は、CD37とCD52の両方をかなりのレベルで発現するWien 133細胞に対して確立することができた一方で、低レベルのCD52を発現するDaudi細胞は、自己オリゴマー化阻害変異とC1q結合阻害変異G236RまたはK322Aの両方を含有するIgG1-CAMPATH-1H-E430Gバリアントの存在から保護され得た。
【０５３６】
実施例14：2つの非交差遮断抗DR5抗体の混合物のBxPC-3細胞に対する選択的DR5アゴニスト活性
2つの非交差遮断抗細胞死受容体5（DR5）抗体IgG1-DR5-01-G56T-E430G＋IgG1-DR5-05-E430Gの混合物は、DR5アゴニストとして作用して、DR5陽性がん細胞の死滅を誘導する（WO17093447）。ここで、生存率アッセイを実施して、IgG1-DR5-01-G56T-E430G抗体バリアント（K439E、K439E-G236R）とIgG1-DR5-05-E430G抗体バリアント（S440K、S440K-E333S）の組み合わせの、低レベルのDR5を発現する（データは示さない）ヒトBxPC-3膵臓がん細胞（ATCC, Cat No. CRL-1687）の死滅を誘導する能力を研究した。BxPC-3細胞をトリプシン処理によって採取し、セルストレーナーに通した。細胞を、1,200rpmで5分間の遠心分離によってペレット化し、培養培地（25mM HepesおよびL-グルタミン（Lonza）＋10％DBSI（Life Technologies Cat No. 10371-029）＋Pen/Strepを含有するRPMI 1640）に0.5×105個の細胞/mLの濃度で再懸濁した。単一細胞懸濁液（5,000個の細胞/ウェル）100μLをポリスチレン96ウェル平底プレート（Greiner Bio-One, Cat No. 655182）に播種し、37℃で一晩付着させた。翌日、抗体希釈系列（3倍希釈で終濃度範囲0.003〜20μg/mL）の試料50μLおよび精製ヒトC1qストック溶液（Quidel, Cat No. A400、終濃度2.5μg/mL）10μLを加え、37℃で3日間インキュベートした。陽性対照として、細胞を5μMのスタウロスポリン（Sigma Aldrich, Cat No. S6942）とインキュベートした。細胞培養物の生存率を、代謝的に活性な細胞の指標となるATPの存在を定量するCellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイ（Promega, Cat No. G7571）で判定した。キットから、Luciferin Solution Reagentを1ウェル当たり15μL加え、プレートを500rpmで2分間振盪させることによって混合した。次に、プレートを37℃で1.5時間インキュベートした。上清100μLを白色OptiPlate-96（Perkin Elmer, Cat No. 6005299）に移し、発光をEnVision Multilabel Reader（PerkinElmer）で測定した。GraphPad Prismソフトウェアを使用した非線形回帰（可変傾斜を有するシグモイド用量応答）を使用してデータを解析し、プロットした。生存細胞のパーセンテージを、以下の式を使用して算出した：生存細胞％＝［（抗体試料の発光−スタウロスポリン試料の発光）/（抗体なしの試料の発光−スタウロスポリン試料の発光）］*100。
【０５３７】
試験した単剤はいずれもBxPC-3細胞の死滅を誘導しなかったが（図13A）、IgG1-DR5-01-G56T-E430G＋IgG1-DR5-05-E430Gの組み合わせは、BxPC-3細胞の用量依存的死滅を誘導した（図13B）。この選択的死滅は、IgG1-DR5-01-G56T-E430G-K439E＋IgG1-DR5-05-E430G-S440Kの組み合わせにおいて保持され、このことは、両方の抗体がヘテロ六量体を形成することを示している。C1q結合部位を調節することによって、DR5アゴニスト活性によるBxPc-3細胞の死滅の誘導が、IgG1-DR5-01-G56T-E430G-K439E（C1q結合阻害変異なし）＋IgG1-DR5-05-E430G-S440K-E333S（C1q結合増強変異E333Sを有する）の組み合わせで最も効率的であり、IgG1-DR5-01-G56T-E430G-K439E-G236R（C1q結合阻害変異G236Rを有する）＋IgG1-DR5-05-E430G+S440K（C1q結合増強変異なし）の組み合わせでは若干低減されたことが観察された。他の試験したIgG1-DR5-01-G56T-E430G-K439E-E333S（C1q結合阻害変異を有する）＋IgG1-DR5-05-E430G-S440K-E333S（C1q結合増強変異E333Sを有する）の組み合わせは、IgG1-DR5-01-G56T-E430G＋IgG1-DR5-05-E430Gと同様の有効性を示した。
【０５３８】
結論として、C1q調節変異の導入は、抗DR5抗体のヘテロオリゴマー化混合物によるBxPC-3細胞の選択的死滅を損なうことはなかった。むしろ、混合物の効力は、DR5結合後にBxPC-3細胞で形成されるヘテロオリゴマー抗体構造の予想される総C1q結合アビディティの効力に比例していた。
【０５３９】
実施例15：抗CD52抗体IgG1-CAMPATH-1H-E430Gにおける異なるC1q結合阻害変異のCDC活性に対する効果の分析
IgG1-CAMPATH-1H-E430G（G237A、G236R、A327K、K322EまたはP329R）へ異なるC1q結合阻害変異を導入することの効果を、Wien 133細胞を使用したインビトロCDCアッセイにおいて比較した。Wien 133細胞を使用したインビトロCDCアッセイを、基本的にはError! Reference source not found.に記載のように、20％NHSおよび段階希釈抗体濃度（4倍希釈で終濃度範囲0.002〜40.0μg/mL）を用いて実施した。Intellicyt iQueTMスクリーナーでのフローサイトメトリーによる測定でPI陽性細胞の数から細胞溶解を算出し、3つの実験レプリケートから平均化した。相対曲線下面積（AUC）値は、最小溶解（陰性対照IgG1-b12-K439E＋IgG1-b12-S440Kで0％（示さない））および最大溶解（IgG1-CAMPATH-1H-E430Gで100％）に対する正規化を表す。Error! Reference source not found.は、G237A変異（SEQ ID NO：124）が、Wien 133細胞に対するIgG1-CAMPATH-1H-E430GのCDC効力に効果を有していなかったことを示す。G236R（SEQ ID NO：123）またはA327K（SEQ ID NO：63）変異の導入は、部分的に減少したCDC活性をもたらした一方で、K322E（SEQ ID NO：132）変異の導入は、WT IgG1-CAMPATH-1HについてのCDC活性を下回る残留レベルまで減少したCDC活性をもたらした。P329R変異（SEQ ID NO：133）だけが、Wien 133細胞に対するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-P329RによるCDC活性の完全な阻害をもたらした。
【０５４０】
実施例16：抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H抗体バリアントおよび抗CD20 IgG1-11B8抗体バリアントのFcRn結合
胎児性Fc受容体（FcRn）は、IgGを分解から保護することによってIgGの長期血漿半減期に関与している。抗体の内部移行後、FcRnは、エンドソーム内で抗体Fc領域に結合する（ここでは、相互作用が弱酸性環境（pH 6.0）で安定である）。環境が中性（pH 7.4）である原形質膜までリサイクルされると、相互作用が失われ、抗体は循環血液中にもう一度放出される。これがIgGの血漿半減期に影響を及ぼす。
【０５４１】
FcRn結合酵素連結免疫吸着アッセイ（ELISA）を実施して、E430G、K439EおよびC1q結合阻害変異G236RまたはK322Aを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1HならびにE430G、S440KおよびC1q結合増強変異E333Sを有する抗CD20 IgG1-11B8へのヒトFcRnの結合を評価した。Streptawell 96ウェルプレート（Roche, Cat No. 1734776001）を、0.05％Tween 20（PBST）＋0.2％BSAを補充したPBS中で希釈した5μg/mL（100μL/ウェル）のヒトFcRnの組換え産生されたビオチン化細胞外ドメイン［FcRnhsECDHis-B2M-BIO、すなわち、C末端Hisタグを有するヒトFcRnの細胞外ドメイン（FcRnhsECDHis；SEQ ID NO 155）、ベータ2ミクログロブリン（B2M；SEQ ID NO 156）との二量体として］で振盪しながら室温（RT）で2時間コーティングした。プレートをPBSTで3回洗浄した。段階希釈した抗体試料（PBST/0.2％BSA（pH 6.0またはpH 7.4）中、5倍希釈で終濃度範囲0.0005〜40μg/mL）を加え、振盪しながらRTで1時間インキュベートした。プレートをPBST/0.2％BSA（pH 6.0またはpH 7.4）で洗浄した。PBST/0.2％BSA（pH 6.0またはpH 7.4）中で希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP)コンジュゲートポリクローナルヤギ-抗ヒトカッパ軽鎖（1:5,000；Sigma, Cat No. A-7164）を加え、プレートを振盪しながらRTで1時間インキュベートした。PBST/0.2％BSA（pH 6.0またはpH 7.4）で洗浄した後、2,2’-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)（ABTS；1mg/mL；Roche Cat No. 11112422001および11112597001）100μLを基質として加え、プレートを光から保護してRTで10分間インキュベートした。2％シュウ酸（Riedel de Haen, Cat No. 33506）100μLを使用して反応を停止し、RTで10分間インキュベートし、ELISAリーダーを使用して405nmで吸光度を測定した。対数変換データを、GraphPad Prismソフトウェアを使用して、可変傾斜を有するシグモイド用量応答曲線に適合させることによって解析した。
【０５４２】
すべての試験したIgG1-CAMPATH-1H抗体バリアントは、pH 7.4でヒトFcRnへの結合を示さず（図15A）、pH 6.0で効率的なFcRn結合を示した（図15B）。IgG1-CAMPATH-1HのバリアントK439E（見かけ上一番下）とバリアントE430G-K439E（見かけ上一番上）の結合曲線間の幅およびIgG1-b12とFcRn結合部位を保有する野生型Fcドメインを有するIgG1-CAMPATH-1Hとの最大FcRn結合間の幅を考慮すると、試験したIgG1-CAMPATH-1Hバリアント間の結合の見かけ上の差は有意でないと解釈された（図15B、C）。すべての試験したIgG1-11B8抗体バリアントは、pH 7.4でヒトFcRnへの結合を示さず（図15D）、pH 6.0で効率的なFcRn結合を示した（図15E）。IgG1-11B8-E430G-S440KへのC1q結合増強変異E333Sの導入は、ヒトFcRnへの結合に対して効果を有していなかった（図15E,F）。まとめると、これらのデータは、E430G、K439EおよびC1q結合阻害変異G236RまたはK322Aを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1HならびにE430G、S440KおよびC1q結合増強変異E333Sを有する抗CD20 IgG1-11B8は、ヒトFcRnへの正常な結合を示したことを示した。
【０５４３】
実施例17：E430G、K439E、S440Kおよび/またはK322E変異ならびにそれらの組み合わせを含有するIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8抗体バリアントの薬物動態（PK）分析
IgG1-CAMPATH-1Hおよび/またはIgG1-11B8のクリアランス率に対するK439E、S440K、E430GおよびK322E変異の効果を、SCIDマウスにおけるPK実験で研究した。
【０５４４】
IgG1-CAMPATH-1H-E430G、-K439E、-E430G-K439Eおよび-K322-E430G-K439Eのクリアランス率をWT IgG1-CAMPATH-1Hのクリアランス率と比較し、IgG1-11B8-E430G、-S440K、-E430G-S440Kおよび-K322-E430G-S440Kのクリアランス率をWT IgG1-11B8のクリアランス率と比較した。さらに、図16Cおよび図16Dに表示した通りのIgG1-CAMPATH-1H抗体バリアントとIgG1-11B8抗体バリアントの組み合わせのクリアランス率も判定し、WT IgG1-CAMPATH-1HとWT IgG1-11B8の組み合わせのクリアランスと比較した。
【０５４５】
この研究におけるマウスは、Central Laboratory Animal Facility（Utrecht, The Netherlands）で飼育され、AAALACおよびISO 9001:2000公認の動物施設（GDL）においてFELASAによって規定される動物管理基準（good animal practice）に従って取り扱われた。実験はすべて、欧州指令（2010/63/EU）から移行されたDutch動物保護法（WoD）に準拠して実施され、Dutch動物倫理委員会（CCD）および地方の動物福祉団体（Animal Welfare Body）によって承認された。11〜12週齢の雌のSCID（C.B-17/IcrHan（登録商標）Hsd-Prkdcscid, Envigo）マウス（1群当たりマウス3匹）に対して、500μgの抗体（単剤については500μg；抗体混合物については250μg＋250μg)（25mg/kg）を注射容量200μLで静脈内注射した。抗体投与の10分後、4時間後、1日後、2日後、7日後、14日後および21日後に伏在静脈と頬静脈穿刺とから交互に血液試料50μLを収集した。血液をヘパリン含有バイアルに収集し、14,000xgで10分間遠心分離した。血漿試料20μLをPBS 380μLで希釈し、抗体濃度の決定まで-20℃で貯蔵した。サンドイッチELISAを使用して総ヒトIgG濃度を決定した。マウス抗ヒトIgG-カッパmAbクローンMH16（CLB Sanquin, Cat No. M1268）を捕捉抗体として使用し、100μLで、4℃で一晩、96ウェルELISAマイクロプレート（Greiner, Cat No. 655092）にPBS中2μg/mLの濃度でコーティングした。プレートシェーカー上で0.2％BSAを補充したPBSとRTで1時間インキュベートすることによって、プレートをブロッキングした。洗浄後、希釈した血漿試料100μLを加え、プレートシェーカー上にてRTで1時間インキュベートした。プレートをPBST 300μLで3回洗浄し、その後、プレートシェーカー上でペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIgG免疫グロブリン（Jackson, Cat No. 109-035-098；0.2％BSAを補充したPBST中1：10.000）100μLとRTで1時間インキュベートした。プレートをPBST 300μLで再度3回洗浄した後、光から保護して基質ABTS 100μLとRTで15分間インキュベートした。2％シュウ酸100μLを加えることによって反応を停止し、RTで10分間インキュベートした。マイクロプレートリーダー（Biotek, Winooski, VT）にて405nmで吸光度を測定した。注射した材料を参照曲線として使用することによって、濃度を算出した。プレート対照として、IgG1カッパを含有するヒト骨髄腫タンパク質（The Binding Site, Cat No. BP078）を含めた。ヒトIgG濃度（μg/ml単位）をプロットし（IgG1-CAMPATH-1Hバリアントについて図16A、IgG1-11B8バリアントについて図16B、組み合わせについて図16C）、Graphpad Prismソフトウェアを使用して曲線下面積（AUC）を算出した。血液採取の最終日（21日目）までのクリアランス率を、式D*1,000/AUC（式中、Dは、注射の用量（25mg/kg）である）によって決定した（図16D）。
【０５４６】
WTを含めたすべてのIgG1-CAMPATH-1バリアントのクリアランス率は、IgG1-11B8バリアントのクリアランスおよび予測されたIgG1曲線（2コンパートメントモデルに基づく）よりも少し速かった。
【０５４７】
IgG1-CAMPATH-1HとIgG1-11B8の両方へのE430G変異の導入は、これらの抗体のクリアランス率の小さな増加をもたらした。IgG1-CAMPATH-1H-E430GおよびIgG1-11B8-E430GへのK439EまたはS440Kおよび/またはK322E変異の導入は、それぞれ、WT IgG1-CAMPATH-1HおよびWT IgG1-11B8のクリアランス率と同程度のクリアランス率を導いた（図16D）。IgG1-CAMPATH-1HバリアントとIgG1-11B8-バリアントのすべての試験した組み合わせは、WT IgG1-CAMPATH-1H＋IgG1-11B8抗体の組み合わせのクリアランス率と同程度のクリアランス率を示した。
【０５４８】
まとめると、これらのデータは、E430G、K439E、E430G-K439EまたはE430G-K439E-K322E変異を有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H、およびE430G、S440K、E430G-S440KまたはE430G-S440K-K322E変異を有する抗CD20 IgG1-11B8、およびそれらの混合物が、WT IgG1抗体のクリアランス率と類似したクリアランス率を示したことを示した。
【０５４９】
実施例18：六量体化増強変異およびK439EまたはS440Kを有する抗CD52または抗CD20抗体のインビトロFcγR結合に対するG236R、G237T、K326AまたはE333S変異の効果
精製抗体を使用して、FcγRIIAアロタイプ131H、FcγRIIAアロタイプ131R、FcγRIIB、FcγRIIIAアロタイプ158FおよびFcγRIIIAアロタイプ158Vの二量体ECDへのIgG1-CAMPATH-1HまたはIgG1-11B8抗体バリアントの結合をELISAアッセイで試験した。二量体FcγRバリアントへの結合を検出するために、96ウェルMicrolon ELISAプレート（Greiner, Germany）を、4℃で一晩、PBS中のヤギF(ab’)2-抗ヒト-IgG-F(ab’)2（Jackson Laboratory, 109-006-097, 1μg/mL）でコーティングし、200μL/ウェルのPBS/0.2％BSAにより室温（RT）で1時間洗浄およびブロッキングした。インキュベーションの間に洗浄を行いながら、プレートを、PBST/0.2％BSA中の希釈系列のIgG1-CAMPATH-1HまたはIgG1-11B8抗体バリアント（5倍段階で0.0013〜20μg/mL）100μL/ウェルとRTで1時間、PBST/0.2％BSA中の二量体のHisタグ化されたC末端ビオチン化FcγR ECDバリアント（1μg/mL）100μL/ウェルとRTで1時間、そして、検出抗体としてのPBST/0.2％BSA中のストレプトアビジン-ポリHRP（CLB, M2032, 1:10.000）100μL/ウェルとRTで30分間、逐次的にインキュベートした。およそ20分間（IIA-131H）または30分間（IIA-131R、IIB、IIIA-158V、IIIA-158F）、1mg/mLのABTS（Roche, Mannheim, Germany）を用いて現像を実施した。反応を停止させるために、2％シュウ酸100μLを加えた。マイクロプレートリーダー（BioTek, Winooski, VT）にて405nmで吸光度を測定した。20μg/mLの抗体濃度でのFcγR結合をプロットした。データは、ELISAにおけるバックグラウンドシグナル（抗体なしの対照、0％）および100％に設定された内部標準IgG1-11B8-E430G-S440Kに対して実験毎に正規化された3つの独立したレプリケートに基づく。
【０５５０】
FcγR媒介エフェクター機能は、IgG六量体化によるレギュレーションに対してCDCよりも感受性が小さい可能性があるので、六量体化によってレギュレーションされる共依存性混合物についての細胞傷害性の完全選択性は、特にFcγR受容体を発現するエフェクター細胞の存在下で、混合物中の個々の抗体それぞれへのFcγR結合の抑制を必要とする可能性がある。C1q結合を阻害する変異G236RまたはG237Tを抗体IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eに導入したとき、FcγRバリアントIIA、IIBおよびIIIAへの結合は、ELISAによって検出したところ強く阻害された（図17）。C1q結合を増強する変異K326AまたはE333SをIgG1-11B8-E430G-S440Kに導入したとき、変異K326Aは、試験したすべてのFcγRバリアントへの結合増加をもたらした一方で、変異E333Sは、FcγRバリアントIIA/BおよびIIIAへの結合をそれぞれ約50および約20％低下させた（図17）。IgG1-11B8-E430G-S440K、IgG1-11B8-K326A-E430G-S440K、またはIgG1-11B8-E333S-E430G-S440KへのFcγR結合のさらなる抑制は、実施例19で試験された変異G237Aなどの追加の変異を必要とする可能性がある。
【０５５１】
結論として、K326AまたはE333S変異を有するIgG1-11B8-E430G-S440KバリアントはFcγR結合を保持するが、G236RまたはG237T変異を含有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eバリアントは、FcγRバリアントIIA、IIBおよびIIIAへの検出可能な結合を示さなかった。
【０５５２】
実施例19：抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eおよび抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440K-G237A抗体バリアントの混合物のWien 133細胞に対する選択的CDC活性についての異なるC1q結合調節変異の分析
実施例11において、C1q結合増強変異E333Sを有するまたは有さないIgG1-11B8-E430G-S440KバリアントへのFcγR結合阻害変異G237Aの導入は、C1q結合阻害変異G236Rを含有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eバリアントと組み合わせたとき、10μg/mLのIgGでのCDC活性を損なうことはなかったことが示された。ここで、別のC1q結合阻害変異（G237T）をIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eに導入し、IgG1-11B8-E430G-S440K-G237AおよびIgG1-11B8-E430G-S440K-G237A-E333Sと組み合わせて試験した。Wien 133細胞を使用したインビトロCDCアッセイを、基本的には実施例2に記載のように、20％NHSおよび抗体濃度系列（3.3倍希釈で終濃度範囲0.01〜40.0μg/mL）を用いて実施した。細胞溶解および相対AUC値を、3つの実験レプリケートから、実施例2に記載するようにPI陽性細胞の数から算出した。AUCは、陰性対照抗体IgG1-b12についての値（0％）および陽性対照IgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gについての値（100％）に対して正規化された一方で、提示される最大溶解データは、40μg/mLのIgGでの正規化されていない細胞溶解を反映する。
【０５５３】
FcγR媒介エフェクター機能は、IgG六量体化によるレギュレーションに対してCDCよりも感受性が小さい可能性があるので、六量体化によってレギュレーションされる共依存性混合物についての細胞傷害性の完全選択性は、特にFcγR受容体を発現するエフェクター細胞の存在下で、混合物中の個々の抗体それぞれへのFcγR結合の抑制を必要とする可能性がある。IgG1-Campath-E430G-K439Eへの変異G236RおよびG237Tの導入は、FcγR結合を強く抑制したが（実施例18）、IgG1-11B8-E430G-S440Kは、通常のFcγR結合を示した。試験した混合物中の11B8成分のFcγR結合を抑制するために、追加のE333S変異を有するまたは有さない抗体IgG1-11B8-E430G-S440Kに変異G237Aを導入した。図18に示すように、C1q結合阻害変異G237RまたはG237Tの導入は、IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E成分の単剤活性を効率的に低減させた一方で、IgG1-11B8-E430G-S440K-G237AまたはIgG1-11B8-E430G-S440K-G237A-E333Sとの組み合わせでWien 133細胞に対する完全CDC活性を保持した。
【０５５４】
結論として、Fc-Fc相互作用増強変異E430Gおよび自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440Kをそれぞれ有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H＋抗CD20 IgG1-11B8-G237A抗体バリアントのCDC活性の選択性は、抗CD52 K439E成分へのC1q結合阻害変異G236RまたはG237Tの導入によって増加した。IgG1-11B8-E430G-S440K-G237A（FcγR結合阻害のためのG237Aを有する）で補体活性の最大回復がすでに達成されている通り、11B8バリアントへのC1q結合増強変異E333Sの導入は、その組み合わせでCDC活性の回復を増加させることはなかった。
【０５５５】
実施例20：共依存性抗体組み合わせによる血液細胞のサブセットの枯渇
実施例19において、共依存的様式で働くように設計された抗CD52および抗CD20抗体バリアントの混合物について、Wien 133細胞に対するCDC活性が示された。共依存性抗体混合物の特異性を、全血細胞傷害性アッセイで試験した。CD52は、T細胞とB細胞の両方に発現され、一方で、CD20は、B細胞上に発現されるが、T細胞上にはほとんど発現されない。独立に作用するCD52ターゲティング抗体とCD20ターゲティング抗体の混合物は、それゆえ、T細胞とB細胞の両方を排除すると予想されるが、厳密に共依存性のAb混合物は、B細胞を独占的に枯渇すると予想される（B細胞はCD52とCD20の両方を発現するため）。実験の目的は、それゆえ、抗CD52抗体バリアントと抗CD20抗体バリアントのどの混合物が、T細胞集団に影響を及ぼすことなくB細胞を枯渇させることができるかを試験することであった。
【０５５６】
匿名のヒルジン処理血液試料を、University Medical Center Utrechtにて入手した。1日目の間に、CD52、CD20およびgp120に指向される抗体の混合物を、0.2％BSAを補充したRPMI 1640培地中で調製した。抗体を、ヒルジンで処理した血液30μLをRPMI/0.2％BSA中に最終容量100μLで含有するプレートに抗体終濃度10μg/mLで移し、37℃および5％CO2で18時間インキュベートした。2日目に、等容量の赤血球（RBC）溶解緩衝液を混合物に加え、その後、細胞を遠心分離（300rcfで3分間）によって収集した。混合物の透明度による測定ですべての赤血球が溶解するまで、この工程を繰り返した。
【０５５７】
その後、蛍光色素で標識された異なる血液学的サブセットに対して指向される検出抗体の混合物を加え、混合物を4℃で30分間インキュベートした。FACS緩衝液を用いて実施した3回の洗浄工程後、細胞をFACS緩衝液に再懸濁し、LSR Fortessa X20 FACS（BD）を使用したフローサイトメトリーによって残りの細胞集団の相対存在量を判定した。並行して、個々の免疫検出試薬または固定可能生細胞染色剤（fixable viability stain）（FVS）を使用した補正制御ビーズ（UltraComp eBeads, Thermo Scientific cat. nr. 01-2222）の染色手順を実施し、フローサイトメトリーによって検出した。すべての工程を氷上で実施した。使用する検出試薬は、efluor 450で標識された抗CD3（e-biosciences cat. nr. 48-0037）、BV711で標識されたCD19（Biolegend cat. nr. 302245）、PE-Cy7で標識されたCD66b（Biolegend cat. nr. 305115）、およびFVS生細胞染色剤BV510（BD cat. nr. 564406）であった。簡潔に述べると、FVS陽性細胞およびダブレットの排除によって生存細胞をゲーティングした。生存細胞集団内で、骨髄細胞をCD66bhigh発現によってゲーティングした一方で、リンパ系細胞をCD3high/CD19low/CD66blow発現によってT細胞に、CD3low/CD19high/CD66blow発現によってB細胞に分離した；残りのCD3low/CD19low/CD66blowリンパ系細胞は、NK細胞を含有する可能性があるが、これらの実験においてさらに特徴付けることはなかった。5人の異なる健常ドナーの血液試料を3つの独立した実験で試験した。
【０５５８】
腫瘍細胞株に対するCDCアッセイとは対照的に、全血アッセイは、ADCCおよびADCPを媒介することができるFcγR発現エフェクター細胞の存在下で実施されるため、血液細胞の枯渇をCDC以外の異なるエフェクター機序によって媒介することができる。FcγR媒介エフェクター機能は、IgG六量体化に対してCDCよりも感受性が小さい可能性があるので、極めて接近した2つのヘテロ六量体形成抗体試薬の結合に共依存性の細胞傷害性を生み出すために、FcγR媒介エフェクター機能の追加の抑制が必要となる可能性がある。リンパ球集団内のB細胞およびT細胞の相対存在量は、異なるドナーにおいてそれぞれおよそ1.5〜6％および20〜40％の範囲であった（図19A）。実際に、CD52指向性IgG1-Campath-1H-E430GおよびCD20指向性IgG1-11B8-E430Gの混合物は、すべてのT細胞（CD52を発現する）およびB細胞（CD52およびCD20を発現する）を枯渇させた。WO2013004842に開示されている変異に基づくIgG1-Campath-1H-E430G-K439E＋IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合物は、このアッセイ設定において共依存性ではなかった（図19A）。IgG1-Campath-1H-E430G-K439Eは、B細胞とT細胞の両方に対してかなりの単剤活性を呈し、それは、高いIgG濃度で腫瘍細胞株に対して観察されたように、FcγR媒介活性と残留CDC活性の両方によって説明され得る（実施例4）。IgG1-11B8-E430G-S440Kは、B細胞に対して単剤活性を呈したが、これはFcγR媒介活性によって説明される可能性が高い。実際に、IgG1-Campath-1H-E430G-K439E＋IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合物は、B細胞とT細胞の両方のかなりの枯渇を引き起こした。全く対照的に、IgG1-Campath-1H-G236R-E430G-K439E＋IgG1-11B8-G237A-E430G-S440Kの混合物は、厳密に共依存的な様式でT細胞ではなくB細胞のみの選択的枯渇を示した（図19A）。実際に、IgG1-Campath-1H-G236R-E430G-K439Eは、B細胞またはT細胞のいずれに対しても単剤活性をほとんど示さず、このことは、変異G236Rの導入が、例えば先の実施例5、7および19において観察されたような単剤CDC活性を抑制することに加えて、実施例18から予想されるようなFcγR媒介活性を排除したことを実証している。IgG1-11B8-G237A-E430G-S440Kに存在する変異G237Aの導入は、B細胞に対する残留単剤活性を排除したが、これは残留FcγR媒介活性の抑制による可能性が最も高い。
【０５５９】
G237位に追加の変異、すなわち、G237A、G237T、G237QまたはG237Rを含有するIgG1-CD52-Campath-E430G-K439Eのバリアントは、様々なレベルの単剤活性を呈した（図19B）。バリアントIgG1-CD52-Campath-G237A-E430G-K439EおよびIgG1-CD52-Campath-G237T-E430G-K439Eは、単剤としてT細胞の数の低下を誘導した。対照的に、バリアントIgG1-CD52-Campath-G237Q-E430G-K439EおよびIgG1-CD52-Campath-G237R-E430G-K439Eは、B細胞に対してもT細胞に対してもほとんど単剤活性を示さなかった。単剤活性を欠いているIgG1-11B8-G237A-E430G-S440KをIgG1-CD52-Campath-G237Q-E430G-K439EまたはIgG1-CD52-Campath-G237R-E430G-K439Eと混合したとき、T細胞ではなくB細胞の強力かつ選択的な枯渇が観察された（図19B）。
【０５６０】
C1q親和性を増強する変異E333Sを含有するIgG1-11B8-G237A-E333S-E430G-S440Kの存在下で同様の結果が得られた：この成分は、B細胞に対してもT細胞に対してもほとんど単剤活性を示さなかった一方で、IgG1-CD52-Campath-G236R-E430G-K439E、IgG1-CD52-Campath-G237Q-E430G-K439E、またはIgG1-CD52-Campath-G237R-E430G-K439Eとの混合は、T細胞ではなくB細胞の強力かつ選択的な枯渇をもたらした（図19C）。対照的に、IgG1-11B8-G237A-E333S-E430G-S440KをIgG1-CD52-Campath-G237A-E430G-K439EまたはIgG1-CD52-Campath-G237T-E430G-K439Eと混合したとき、検出可能なT細胞枯渇が観察され（図19C）、このことは、図19Bにおける結果と一致する。
【０５６１】
また、CD52とCD20の両方を発現するB細胞を標的とする共依存性抗体混合物の効力を、独立してB細胞を標的とする抗体リツキシマブ、オビヌツズマブ、IgG1-11B8およびIgG1-11B8-E430Gと比較した。興味深いことに、CD52とCD20の両方を標的とする厳密に共依存性の抗体混合物のB細胞枯渇の深度は、リツキシマブ、オビヌツズマブ、IgG1-11B8およびIgG1-11B8-E430Gによる深度を超えた（図19D）。これは、IgG1-11B8-G237A-E430G-S440KとIgG1-CD52-Campath-G236R-E430G-K439E、IgG1-CD52-Campath-G237Q-E430G-K439E、またはIgG1-CD52-Campath-G237R-E430G-K439Eとの混合物にも当てはまり、そのすべてが、T細胞ではなくB細胞の選択的枯渇を示した（図19A/B）。
【０５６２】
結論として、これらのデータは、2つの異なる細胞表面標的を標的とする2つの抗体の組み合わせが、厳密に共依存的な様式で働くことを強いられ得ることを実証した。結果として、血液学的サブセット、ここではCD20を発現するB細胞の選択的枯渇は、CD52を発現する細胞の総集団から達成された。これらの厳密に共依存性の抗体組み合わせは、G236R、G237QまたはG237Tの変異に加えてFc-ドメイン変異E430GおよびK439Eを有する1つの抗体と、任意の追加の変異E333Sと共にFc-ドメイン変異G237A、E430GおよびS440Kを有する1つの抗体とから構成された。
【０５６３】
実施例21：抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440Kバリアントと組み合わせたときの、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G K439EへのC1q結合阻害変異G236RまたはG237Tの導入による混合抗体バリアントによる複数の細胞株に対するCDC活性の増強された選択性
先の実施例において、C1q結合増強変異E333Sおよび/またはFcγR結合阻害変異G237Aを有するまたは有さないIgG1-11B8-E430G-S440K抗体バリアントと組み合わせた、IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439EへのC1q結合阻害変異（実施例3ではK322E、実施例19ではG236RまたはG237T）の導入によって、CDC活性の増強された選択性が示された。ここで、IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439EへのC1q結合阻害変異G236RまたはG237Tの導入後のCD20/CD52二重陽性細胞に対するCDC活性の選択性を、CD52およびCD20の異なる発現レベルを有するヒト腫瘍細胞株に対して試験した（以下の表4を参照のこと）。Daudi、Raji、Ramos、REHおよびU-698-M細胞株を使用したインビトロCDCアッセイを、基本的には実施例2に記載のように、20％NHSおよび抗体濃度系列（3.3倍希釈で終濃度範囲0.01〜40.0μg/mL）を用いて実施した。細胞溶解および相対AUC値を、3つの実験レプリケートから、実施例2に記載するようにPI陽性細胞の数から算出した。AUCは、陰性対照抗体IgG1-b12についての値（0％）および陽性対照IgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gについての値（100％）に対して正規化された一方で、提示される最大溶解データは、40μg/mLのIgGでの正規化されていない細胞溶解を反映する。
【０５６４】
（表4）異なる細胞株上でのCD20およびCD52発現レベル
2021522303.tif 000061
*ABC  QIFIKIT分析によって判定した場合の抗体結合能（データは示さない）
【０５６５】
C1q結合阻害変異G237RまたはG237Tを有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eバリアントは、異なるCD52発現レベルを有するすべての試験した細胞株に対して単剤活性を示さなかった（バックグラウンドレベルと同程度）：Daudi（図20A）、Raji（図20B）、Ramos（図20C）、REH（図20D）およびU-698-M（図20E）。細胞株Daudi、Ramos、Raji、およびU-698-Mについて、試験したC1q結合増強変異E333S（FcγR阻害変異G237Aを有するまたは有さない）またはK326Aを有するIgG1-11B8-E430G-S440K抗体バリアントと組み合わせたとき、CDC活性の回復の増加が観察された。CD20標的指向型11B8におけるC1q増強変異K326AまたはE333Sの効果は、CD20発現レベルがより低かったときにはそれほど顕著ではなかった（REH：19,000 ABC CD20）。標的発現レベルと一致して、低いCD20発現細胞株REHのCDCは、CD52ターゲティング剤の存在に高度に依存性であった一方で、低いCD52発現細胞株DaudiのCDCは、CD20ターゲティング剤の存在に高度に依存性であった。実際に、細胞株REHおよびDaudiに対するIgG1-G236R-E430G-K439E＋IgG1-11B8-E430G-S440Kによって誘導されたCDC AUCおよび最大溶解は、IgG1-Campath-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの組み合わせによって誘導されたものよりも実質的に低く、このことは、CD20/CD52二重陽性細胞株Ramos、RajiおよびU-698-Mに対するこの混合物の相対的選択性を例証している。低いCD52発現Daudi細胞のCDC感受性は、CD20ターゲティング剤に導入されたC1q増強変異K326A、E333SまたはG237A-E333Sの存在によって調節された。
【０５６６】
結論として、IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439EおよびIgG1-11B8-E430G-S440Kの組み合わせについてのCDC活性の選択性は、抗CD52 E430G-K439E成分へのG236RまたはG237TなどのC1q結合阻害変異の導入によって、異なる細胞株において標的発現レベルに関係なく確立することができた；混合物の効力は、抗CD20 E430G-S440K成分へのE333SまたはK326AなどのC1q結合増強変異の導入によって調節された。
【０５６７】
実施例22：実施例15：抗CD37 IgG1-CD37-37.3抗体バリアントおよび抗CD20 IgG1-11B8抗体バリアントの混合物による異なる標的発現レベルを有する細胞株に対するCDC活性の選択性
先の実施例において、抗CD52と抗CD20の抗体バリアントの組み合わせ（Error! Reference source not found.、Error! Reference source not found.、Error! Reference source not found.）および抗CD52と抗CD37の抗体バリアントの組み合わせ（Error! Reference source not found.）について選択的CDC活性が示された。ここで、選択的CDC活性を、抗CD37抗体バリアントと抗CD20抗体バリアントの組み合わせについて、Daudi細胞およびWIL2-S細胞を使用したインビトロCDCアッセイで試験した。Daudi細胞およびBリンパ芽球WIL2-S細胞（ATCC, CRL-8885）を使用したインビトロCDCアッセイを、基本的にはError! Reference source not found.に記載のように、20％NHSおよび抗体濃度系列（3倍希釈で終濃度範囲0.005〜10.0μg/mL）を用いて実施した。WIL2-S細胞用の培養培地は、10％熱不活化DBSI、1mMピルビン酸ナトリウム（Lonza, Cat No. BE13-115E）および50U/mL Pen/Strepを補充した、25mM HepesおよびL-グルタミン（Lonza, Cat No BE12-115F）を含むRPMI 1640から構成した。PI陽性細胞の数から細胞溶解を算出し、3つの実験レプリケートから平均化し、陰性対照抗体IgG1-b12について測定された細胞溶解（0％）および10μg/mLのIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gについて測定された細胞溶解（100％）に対して正規化された。
【０５６８】
Daudi細胞は、単剤として試験したときのWT抗CD37抗体IgG1-CD37-37.3およびWT II型抗CD20抗体IgG1-11B8によるCDC誘導に強靭性であった一方で、2つのWT抗体の混合物についていくらかのCDC活性が観察された（図21A）。Fc-Fc相互作用増強変異の導入は、単剤として試験したときには両抗体についてCDC活性の誘導を、混合物として試験したときには強いCDC活性をもたらした。IgG1-CD37-37.3-E430Gによる単剤CDC活性は、K439E変異の導入によって強く阻害され、C1q結合阻害変異G236Rの追加の導入によって完全に阻害された。IgG1-11B8-E430Gによる単剤CDC活性は、また追加のC1q結合増強変異E333Sの存在下でも、S440K変異の導入によって阻害された。IgG1-CD37-37.3抗体変異体（E430G、E430G-K439EまたはE430G-K439E-G326Rを含有する）とIgG1-11B8抗体変異体（E430G、E430G-S440KまたはE430G-S440K-E333Sを含有する）とのすべての試験した混合物について、強いCDC活性がDaudi細胞に対して観察された。
【０５６９】
WIL2-S細胞に対して、CDC活性は、単剤として試験したときのすべてのIgG1-CD37-37.3抗体バリアント（WT、E430G、E430G-K439EおよびE430G-K439E-E333S）について非常に低かった（図21B）。II型抗CD20抗体IgG1-11B8へのE430G変異の導入は、WIL2-S細胞に対してCDC活性の誘導をもたらした。IgG1-11B8-E430Gによる単剤CDC活性は、S440K変異の導入によって強く阻害された一方で、追加のC1q結合増強変異E333Sの導入は、IgG1-11B8-E430G-S440K-E333Sによる低いCDC活性をもたらした（図21B）。IgG1-CD37-37.3抗体変異体（E430G、E430G-K439EまたはE430G-K439E-G326Rを含有する）とIgG1-11B8抗体変異体（E430G、E430G-S440KまたはE430G-S440K-E333Sを含有する）とのすべての試験した混合物について、強いCDC活性がWIL2-S細胞に対して観察された。
【０５７０】
結論として、これらのデータは、試験したIgG1-CD37-37.3-E430G抗体バリアント（K439EおよびK439E-G236R）とIgG1-11B8-E430G抗体バリアント（S440KおよびS440K-E333S）との混合物によるDaudi細胞およびWIL2-S細胞に対する選択的CDC活性を実証した一方で、単剤として試験したとき個々の抗体によってCDC活性はほとんど観察されなかったか全く観察されなかった。
【０５７１】
実施例23：抗CD37 IgG1-CD37-37.3抗体バリアントと抗CD20 IgG1-11B8抗体バリアントの異なる比で混合された組成物によるDaudi細胞に対するCDC活性
実施例22において、抗CD20抗体バリアントと1：1の比で混合された抗CD37抗体バリアントについて、Daudi細胞を使用したインビトロCDCアッセイで選択的CDC活性が示された。ここで、混合物中に存在する2つの共依存性抗体成分間の比を変動させることの効果を調べた。0.0005〜10μg/mLの範囲の濃度のIgG1-CD37-37.3-G236R-E430G-K439Eおよび0.013〜10μg/mLの範囲の濃度のIgG1-11B8-E430G-S440Kを含有する組成物を完全実施要因計画で作製し、インビトロCDCアッセイで試験した。Daudi細胞を使用したインビトロCDCアッセイを、基本的には実施例2に記載のように、20％NHSを用いて実施した。PI陽性細胞の数から細胞溶解を算出した。
【０５７２】
Daudi細胞は、IgG1-CD37-37.3-G236R-E430G-K439EおよびIgG1-11B8-E430G-S440Kの混合物によって共依存的様式で溶解した。単剤は、限定された活性を示した：非結合対照抗体IgG1-b12と混合された10μg/mLまでのIgG1-CD37-37.3-G236R-E430G-K439Eによって最大で8％の溶解が誘導され、IgG1-b12と混合された10μg/mLまでのIgG1-11B8-E430G-S440Kによって最大で7％の溶解が誘導された。対照的に、IgG1-CD37-37.3-G236R-E430G-K439EおよびIgG1-11B8-E430G-S440Kの混合物は、広範な異なる抗体比を表す組成物について、Daudi細胞の効率的な溶解を誘導した（表5）。
【０５７３】
注目すべきことに、IgG1-11B8-E430G-S440Kを10μg/mLで提供することによってCD20結合が飽和されたとき、≧0.12μg/mLのIgG1-CD37-37.3-G236R-E430G-K439Eの添加は、Daudi細胞の≧70％の溶解をもたらした。10μg/mLのIgG1-11B8-E430G-S440Kおよび≧0.013μg/mLのIgG1-CD37-37.3-G236R-E430G-K439Eを含有する組成物について検出可能な溶解が観察された。同様に、10μg/mLのIgG1-CD37-37.3-G236R-E430G-K439Eを使用してCD37結合が飽和されたとき、≧1.1μg/mLのIgG1-11B8-E430G-S440Kは、Daudi細胞の≧69％の溶解を誘導した。10μg/mLのIgG1-CD37-37.3-G236R-E430G-K439Eおよび≧0.12μg/mLのIgG1-11B8-E430G-S440Kを含有する組成物について検出可能な溶解が観察された。
【０５７４】
このことは、IgG1-CD37-37.3-G236R-E430G-K439EおよびIgG1-11B8-E430G-S440Kをおよそ1：1000〜1：1または1：1〜1：100の範囲の比で含有する抗体組成物が、2つの標的CD37およびCD20の少なくとも1つの結合が飽和されたという条件で、Daudi細胞の検出可能な溶解をもたらしたことを暗示した。IgG1-CD37-37.3-G236R-E430G-K439EおよびIgG1-11B8-E430G-S440Kをおよそ1：100〜1：1または1：1〜1：10の範囲の比で含有する抗体組成物は、2つの標的の少なくとも1つの結合が飽和されたという条件で、Daudi細胞の＞69％の溶解をもたらした。
【０５７５】
結論として、これらのデータは、広範に異なる比を有する抗体組成物が、とりわけ2つの標的の少なくとも1つの結合が飽和されたときに、CDCによるDaudi細胞の検出可能〜効率的な溶解をもたらした一方で、第2の成分が存在しないかまたは低い存在量で存在したときに検出可能な溶解が観察されなかったことを実証した。
【０５７６】
表5は、完全実施要因計画で混合された0.0005〜10μg/mLの範囲の濃度のIgG1-CD37-37.3-G236R-E430G-K439Eおよび0.013〜10μg/mLの範囲の濃度のIgG1-11B8-E430G-S440Kを含有する組成物についてのCDC活性を示す。Daudi細胞を20％NHSの存在下で抗体混合物とインキュベートした。PI陽性細胞の画分からDaudi細胞の溶解を算出した。
2021522303.tif 000062
【０５７７】
実施例24：抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H抗体バリアントのWien 133細胞に対する標的結合
Fc-Fc相互作用増強変異E430GまたはE345R、自己オリゴマー化阻害変異K439EならびにFcγR結合阻害変異およびC1q結合調節変異G236R、G237AまたはG237Tのいずれかを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H抗体バリアントについて、Wien 133リンパ腫細胞への結合をフローサイトメトリーによって解析した。細胞懸濁液をPBSで洗浄し、FACS緩衝液［PBS＋0.1％（w/v）ウシ血清アルブミン（BSA）＋0.02％（w/v）アジ化ナトリウム］に2×106個の細胞/mLの濃度で再懸濁した。細胞懸濁液試料（1ウェル当たり100,000個の細胞）50μLを、ポリスチレン96ウェル丸底プレート（Greiner Bio-One；Cat nr 650261）に播種し、抗体試料（3倍希釈で終濃度0.0002〜10μg/mL）50μLと4℃で30分間インキュベートした。細胞を、4℃の300xgで3分間の遠心分離によってペレット化し、FACS緩衝液150μLで3回洗浄した。細胞を、光から保護して二次抗体R-フィコエリスリン（R-PE）コンジュゲートヤギ-抗ヒトIgG F(ab’)2（Jackson ImmunoResearch, Cat No. 109-116-098, 1：200）50μLと4℃で30分間インキュベートした。細胞をFACS緩衝液150μLで2回洗浄し、FACS緩衝液30μLに再懸濁し、抗体結合をIntellicyt iQueスクリーナーでのフローサイトメトリーによって解析した。最大結合レベル（Bmax）および見かけのKdは、GraphPad Prismソフトウェアバージョン8にて供給されるHill傾斜モデルを用いた特異的結合の結合曲線の非線形回帰分析によって、二次抗体とインキュベートしただけの細胞について観察されたバックグラウンドシグナルを減算した後に判定された。結合データは、野生型IgG1-11B8について算出された最大結合レベル（Bmax）に対して実験毎に正規化された。
【０５７８】
図22Aは、代表実験におけるIgG1-CAMPATH-1Hバリアントについて観察された結合を示しており、その中で、すべての試験した抗体バリアントがWien 133細胞への類似の用量依存的結合を示した。これらのデータは、変異E430GおよびK439Eの導入が、細胞表面への標的結合に対して効果を有していなかったことを示す。変異E345Rを変異E430Gの代わりに導入したとき、同程度の標的結合が観察された。また、IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eへの追加の変異G236R、G237AまたはG237Tのいずれかの導入は、細胞表面へのCD52標的結合に対して効果を有していなかった。3つの独立した実験から収集されたデータを比較したとき、野生型抗体との比較で抗体バリアントについて平均化された最大結合（Bmax；図22B）で差は観察されず、平均化された見かけのKd（図22C）で差は観察されなかった。
【０５７９】
実施例25：E430G-S440K変異を含有する抗CD20 IgG1-11B8抗体バリアントのRaji細胞に対する標的結合
Fc：Fc相互作用増強変異E430G、自己オリゴマー化阻害変異S440KおよびC1q結合調節変異を有する抗CD20 IgG1-11B8抗体バリアントのRajiリンパ腫細胞への結合をフローサイトメトリーによって解析した。Raji細胞を使用したインビトロ結合アッセイを、基本的には実施例24に記載のように、段階希釈抗体濃度（3倍希釈で終濃度範囲0.0007〜40μg/ml）を用いて実施した。抗体結合をIntellicyt iQueスクリーナーでのフローサイトメトリーによって解析した。最大結合レベル（Bmax）および見かけのKdは、GraphPad Prismソフトウェアバージョン8にて供給されるHill傾斜モデルを用いた特異的結合の結合曲線の非線形回帰分析によって、二次抗体とインキュベートしただけの細胞について観察されたバックグラウンドシグナルを減算した後に判定された。結合データは、野生型IgG1-11B8について算出された最大結合レベル（Bmax）に対して実験毎に正規化された。
【０５８０】
図23AおよびBは、すべての試験したIgG1-11B8抗体バリアントがRaji細胞への類似の用量依存的結合を示した、代表的な結合実験を示す。3つの独立した実験で平均化したとき、上述した変異のいずれかを保有するIgG1-11B8抗体バリアントの最大結合（Bmax）値および平均化された見かけのKd値は、野生型IgG1-11B8のものと類似していた（図23C〜F）。これらのデータは、単一または組み合わされた変異E430GおよびS440Kの導入が、細胞表面への標的結合に対して効果を有していなかったことを示す。IgG1-11B8-E430G-S440Kへの追加のC1q結合増強変異K326A、E333AまたはE333Sのいずれか、C1q結合阻害変異G237A、またはC1q結合調節変異G237A-E333Sの組み合わせの導入は、細胞表面へのCD20標的結合に対して効果を有していなかった。
【０５８１】
実施例26：E430GおよびK439EまたはS440K変異を含有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hおよび抗CD20 IgG1-11B8抗体バリアントのFcRn結合
胎児性Fc受容体（FcRn）は、IgGを分解から保護することによってIgGの長期血漿半減期に関与している。抗体の内部移行後、FcRnは、エンドソーム内で抗体Fc領域に結合する（ここでは、相互作用が弱酸性環境（pH 6.0）で安定である）。環境が中性（pH 7.4）である原形質膜までリサイクルされると、相互作用が失われ、抗体は循環血液中にもう一度放出される。これがIgGの血漿半減期に影響を及ぼす。
【０５８２】
FcRn結合酵素連結免疫吸着アッセイ（ELISA）を実施して、Fc-Fc相互作用増強変異E430G、自己オリゴマー化阻害変異K439E（IgG1-CAMPATH-1Hの場合）またはS440K（IgG1-11B8の場合）およびC1q結合調節変異G237A、G237T、K326A、E333AまたはG237A-E333Sのいずれかを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hまたは抗CD20 IgG1-11B8へのヒトFcRnの結合を評価した。Streptawell 96ウェルプレート（Roche, Cat No. 1734776001）を、PBS中で希釈した2μg/mL（100μL/ウェル）のヒトFcRnの組換え産生されたビオチン化細胞外ドメイン［FcRnECDHis-B2M-BIO、すなわち、C末端Hisタグを有するヒトFcRnの細胞外ドメイン（FcRnECDHis；SEQ ID 155）、ベータ2ミクログロブリン（B2M；SEQ ID 156）との二量体として］で振盪しながら室温（RT）で2時間コーティングした。プレートをPBSTで3回洗浄した。抗体試料をPBST/0.2％BSA（pH 6.0またはpH 7.4）中に終濃度40μg/mLで加え、振盪しながらRTで1時間インキュベートした。プレートをPBST/0.2％BSA（pH 6.0またはpH 7.4）で3回洗浄した。PBST/0.2％BSA（pH 6.0またはpH 7.4）中で希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP)コンジュゲートポリクローナルヤギ-抗ヒトカッパ軽鎖（1:5,000；Sigma, Cat No. A-7164）を加え、プレートを振盪しながらRTで1時間インキュベートした。PBST/0.2％BSA（pH 6.0またはpH 7.4）で3回洗浄した後、2,2’-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)（ABTS；1mg/mL；Roche Cat No. 11112422001）100μLを基質として加え、プレートを光から保護してRTで10分間インキュベートした。2％シュウ酸（Riedel de Haen, Cat No. 33506）100μLを使用して反応を停止し、RTで10分間インキュベートし、ELISAリーダーを使用して405nmで吸光度を測定した。
【０５８３】
pH 6.0で、野生型IgG1-CAMPATH-1Hおよび変異E430GまたはE430G-K439Eを保有するIgG1-CAMPATH-1H抗体バリアントによっても、C1q結合調節変異G237AまたはG237Tを保有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E抗体バリアントによっても、高度に類似したFcRn結合が観察された（図24A）。また、野生型IgG1-11B8、変異E430GまたはE430G-S440Kを保有するIgG1-11B8抗体バリアント、およびC1q結合調節変異K326A、E333A、G237AまたはG237A-E333Sを保有するIgG1-11B8-E430G-S440K抗体バリアントも、pH 6.0で類似のFcRn結合を示した（図24B）。IgG1-b12は、試験した他の抗体（すべて、抗体なしでインキュベートしたウェルについて記録されたバックグラウンドシグナルに本質的に類似した結合を示した）とは対照的に、pH 7.4でFcRnへの低い残留結合を示した（図24C、D）。総合すれば、これらの結果は、六量体化増強変異E430G、自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440K、およびC1q結合調節変異K326A、G237A、G237T、E333AまたはG237A-E333Sを有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hおよび抗CD20 IgG1-11B8が、ヒトFcRnへの正常な結合を示したことを示す。
【０５８４】
実施例27：Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を調節する変異を保有する抗体バリアントの薬物動態（PK）分析
Fc-Fc相互作用増強変異、自己オリゴマー化阻害変異およびC1q結合調節変異を保有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hおよび抗CD20 IgG1-11B8抗体バリアントの薬物動態特性をマウス研究で分析した。抗体バリアントを単一抗体および混合物の両方で試験した。
【０５８５】
この研究におけるマウスは、Central Laboratory Animal Facility（Utrecht, The Netherlands）で飼育され、水および食餌が自由に提供される個別に換気されたケージ内で維持された。実験はすべて、欧州指令（2010/63/EU）から移行されたDutch動物保護法（WoD）に準拠し、動物実験のためのDutch Central Commissionおよび地方倫理委員会によって承認された。SCIDマウス（C.B-17/IcrHan@Hsd-Prkdc<scid, Envigo）に対して、1群当たりマウス3匹を使用して、500μgの抗体（野生型IgG1-CAMPATH-1H、E430GおよびK439E変異ならびにG237QもしくはG236R変異のいずれかを保有するそのバリアント、野生型IgG1-11B8、E430GおよびS440K変異ならびにG237AもしくはE333S変異のいずれかを保有するそのバリアント、またはIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8抗体バリアントの組み合わせ）を静脈内注射した。抗体投与の10分後、4時間後、1日後、2日後、7日後、14日後および21日後に顔面静脈から血液試料50μLを収集した。血液をヘパリン含有バイアルに収集し、10,000gで5分間遠心分離した。抗体濃度の決定まで血漿を-20℃で貯蔵した。
【０５８６】
総hIgG ELISAを使用して特定のヒトIgG濃度を決定した。96ウェルMicrolon ELISAプレート（Greiner, Germany）に2μg/mLの濃度でコーティングしたマウス抗ヒトIgG IgG2amm-1015-6A05-Fab（社内で作製した抗体、バッチ3233-025-EP, Genmab, The Netherlands）を捕捉抗体として使用した。0.2％ウシ血清アルブミンを補充したPBSでプレートをブロッキングした後、試料を加え、ELISA緩衝液（0.05％Tween 20および0.2％ウシ血清アルブミンを補充したPBS）中で段階希釈し、プレートシェーカー上にて室温（RT）で1時間インキュベートした。その後、プレートをヤギ抗ヒトIgG免疫グロブリン（#109-035-098, Jackson, West Grace, PA）とインキュベートし、2,2’-アジノ-ビス（3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)（ABTS；Roche, Mannheim, Germany）で現像した。注射に使用するそれぞれの材料を参照曲線として使用した。マイクロプレートリーダー（Biotek, Winooski, VT）にて405nmで吸光度を測定した。
【０５８７】
野生型抗体IgG1-CAMPATH-1Hならびに抗体バリアントIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G236RおよびIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G237Qのクリアランスは同程度であったが、マウスに注射したすべてのIgG1-CAMPATH-1H抗体バリアントの観察されたIgG濃度は、SCIDマウスにおける野生型IgG1抗体について予想される濃度曲線（2コンパートメントモデルに基づく）よりも低かった（図25A）。野生型抗体IgG1-11B8ならびにそのバリアントIgG1-11B8-E430G-S440K-G237AおよびIgG1-11B8-E430G-S440K-E333Sのクリアランスは、互いに同程度であった（図25B）。IgG1-11B8およびそのバリアントの場合、総IgG1濃度曲線は、SCIDマウスにおける野生型IgG1についての予測された濃度曲線と類似していた。単一抗体についての観察と一致して、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するまたはC1q結合を調節する変異の導入は、IgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8抗体の混合物の薬物動態に影響を及ぼさなかった（図25C）。混合物の総IgG濃度曲線は、SCIDマウスにおける野生型IgG1についての予測された濃度曲線と類似していたが、それよりもわずかに低かった。
【０５８８】
変異E430G-S440K-G237Aを有するIgG1-11B8のバリアントは、野生型IgG1-11B8と類似したクリアランス率を示した（図25D）。変異E430G-K439E-G236RまたはE430G-K439E-G237Qを有するIgG1-CAMPATH-1Hのバリアントは、野生型IgG1-CAMPATH-1Hのクリアランス率と類似したクリアランス率を呈したが（図25D）、一方で、試験したすべてのIgG1-CAMPATH-1Hバリアントのクリアランスは、試験したIgG1-11B8バリアントのクリアランスよりも高かった。IgG1-CAMPATH-1HバリアントとIgG1-11B8バリアントのすべての試験した組み合わせは、WT IgG1-CAMPATH-1H＋IgG1-11B8抗体の組み合わせのクリアランス率と同程度のクリアランス率を示した。結論として、Fc-Fc相互作用、自己オリゴマー化およびC1q結合を調節する変異の導入は、マウスにおけるIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8抗体またはそれらの混合物の薬物動態プロファイルに影響を及ぼさなかった。
【０５８９】
実施例28：Fc-Fc相互作用増強変異、自己オリゴマー化阻害変異およびC1q結合調節変異を保有するIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8の抗体バリアントによる液相補体活性化
抗体のオリゴマー化時に、補体因子C1は、補体カスケードのさらなる活性化を開始する抗体多量体に結合することができる。古典的補体経路の活性化後、活性化されたC1は、C4を断片C4aおよびC4bに開裂し、それは因子IによってC4dにさらにプロセシングされる。それゆえ、C4dの血清濃度を、古典的補体経路活性化の尺度として使用することができる。ここで、ヒト血清中の抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hおよび抗CD20 IgG1-11B8抗体バリアントと無傷の補体（熱不活化されていない）とのインキュベーション後にC4d血清濃度を測定し、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を調節する変異の導入が、標的結合とは関係なく古典的補体経路活性化を誘導するかどうかを判定した。
【０５９０】
単一抗体を90％正常ヒトAB血清（NHS）と最終総組換えIgG濃度100μg/mlで混合した。次いで、抗体を37℃で60分間インキュベートし、その後、氷上で維持した。次に、検体希釈液（Quidel, MicroVue Complement C4d Fragment EIA kitから）を使用して試料を100倍希釈した。製造元の指示に従って、試料およびキット付属標準品を、洗浄緩衝液250〜300μlを使用した3回のプレート洗浄工程および各工程後のブロッティング乾燥で事前処理した96ウェルマイクロタイタープレートにアプライした。プレートを、シェーカー上にてRTで30分間インキュベートした。次に、マイクロタイタープレートを空にし、洗浄緩衝液を使用して5回洗浄し、各工程後にブロッティング乾燥した。1ウェル当たりキット付属C4dコンジュゲート50μlを加え、RTで30分間インキュベートした。再度、すべてのウェルを、洗浄緩衝液を使用して5回洗浄し、各工程後にブロッティング乾燥した。次いで、1ウェル当たりキット付属基質100μlを加え、RTで30分間インキュベートした。酵素反応を停止させるために、キット付属停止溶液50μlをすべてのウェルに加え、ELISAリーダー（Biotek, Winooski, VT）を使用して405nmの波長で吸光度を判定した。これらのアッセイに使用された血清中でバックグラウンドC4dレベルおよそ11〜13μg/mlが検出された。それゆえ、抗体を含有しない2つの試料を陰性対照として使用し、これらの試料において測定されたC4dの平均濃度を、抗体バリアントとインキュベートした試料で測定されたC4d濃度から減算した。試料の平均および標準偏差を、3つの独立した実験において記録されたすべての値で算出した。
【０５９１】
血清中のC4d濃度によって判定された場合の補体活性化は、E345R、E430G、S440Y（RGY）変異を含有する抗体バリアントについて検出された（図26）。最も強い補体活性化が、組換えHer2ECDHis（SEQ ID NO：159）およびHer2特異的抗体バリアントIgG1-1014-005-E345R-E430G-S440Y（IgG1-1014-005-RGY；SEQ ID NO：158）のインキュベーション時に検出された一方で、組換えHer2ECDHisは、補体活性化を誘導しなかった。バックグラウンドC4dレベルと有意に異なるC4dの濃度は、IgG1-CAMPATH-1H、IgG1-11B8もしくはIgG1-b12抗体バリアント、またはそれらの混合物のいずれについても検出されなかった。
【０５９２】
結論として、IgG1-CAMPATH-1H、IgG1-11B8またはIgG1-b12の抗体バリアントへのFc-Fc相互作用増強変異E430G、自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440KおよびC1q結合調節変異G236R、G237A、G237QまたはG237Rの導入は、溶液中での補体活性化をもたらさなかった。
【０５９３】
実施例29：E430GおよびK439EまたはS440K変異を含有する抗体バリアントによる細胞上へのC1q結合
フローサイトメトリー解析を実施して、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するまたはC1q結合を調節する変異を保有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hおよび抗CD20 IgG1-11B8抗体バリアントとインキュベートしたWien 133細胞へのC1q結合を解析した。1試料当たり、0.1×106個のWien 133細胞を、2.5倍希釈段階で20〜0.033μg/mlの濃度範囲の抗体バリアントの希釈物と37℃で15分間インキュベートした。次に、プレートを氷上で0℃まで30分間冷却した。冷却した正常ヒトAB血清（NHS）を終濃度20％まで加え、プレートを氷上にて0℃で10〜20分間インキュベートした。細胞を氷冷FACS緩衝液（PBS＋0.1％BSA＋0.02％NaN3）で2回洗浄し、その後、20μg/mlウサギ抗ヒトC1q-FITC（Dako；cat nr F0254）と4℃で30分間インキュベートした。細胞をFACS緩衝液中で2回洗浄した後、細胞をFACS緩衝液30μlに懸濁し、iQueフローサイトメーター（Intellicyt）で解析した。平均蛍光強度値として測定したC1q結合を、濃度軸の対数変換後に対数アゴニスト応答モデルに適合させ、GraphPad Prismバージョン8を使用して抗体なしでインキュベートしたウェルの平均MFI（0％）、および陽性対照IgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの用量応答曲線の適合した最高値（100％）に対して正規化した。
【０５９４】
Wien 133細胞をIgG1-CAMPATH-1H-E430GおよびIgG1-11B8-E430Gの混合物とインキュベート後に、効率的なC1q結合が観察された（図27A）。IgG1-CAMPATH-1H-E430Gの単剤C1q結合活性は、陽性対照混合物によって誘導されたレベルに近い一方で、IgG1-11B8-E430Gは低い単剤C1q結合活性を実証した。
【０５９５】
IgG1-CAMPATH-1H-E430Gへの自己オリゴマー化阻害変異K439Eの導入は、C1q結合効率の部分的な抑止をもたらした一方で、IgG1-11B8-E430Gへの自己オリゴマー化阻害変異S440Kの導入は、C1q結合の完全な喪失をもたらした（図27B）。C1qに結合する能力は、IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439EおよびIgG1-11B8-E430G-S440Kを混合することによって、陽性対照混合物との比較で中間レベルまで復元した。IgG1-11B8-E430G-S440KへのC1q結合増強変異K326AまたはE333Sの導入によって、単剤C1q結合の穏やかな回復が達成された。後者の2つの抗体バリアントのいずれかとIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eとの混合は、IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E＋IgG1-11B8-E430G-S440Kの混合物のレベルと同様のC1q結合の復元をもたらした。
【０５９６】
C1q結合は、IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439EへのC1q結合阻害変異G236R（図27C）またはG237T（図27D）のいずれかの導入によって完全に抑止された。IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G236RとS440K、S440K-K326AまたはS440K-E333S変異のいずれかを保有するIgG1-11B8-E430G抗体バリアントとの混合後に、C1q結合の部分的復元が観察された（図27C）。同じように、IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G237TとS440K、S440K-K326AまたはS440K-E333S変異のいずれかを保有するIgG1-11B8-E430G抗体バリアントとの混合後に、C1q結合の部分的復元が観察された（図27D）。
【０５９７】
結論として、自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440Kの導入は、Fc-Fc増強変異E430Gを保有する抗体のC1q結合能を部分的に抑止した一方で、C1q結合の完全な抑止は、追加のC1q結合阻害変異の導入によって達成することができた。C1q結合は、相補的変異K439EおよびS440Kを有する抗体を混合することによって、個々の抗体に導入されたC1q調節変異に応じて様々なレベルに回復した。
【０５９８】
実施例30：六量体化増強変異および自己オリゴマー化阻害変異を有する抗CD52および抗CD20抗体のインビトロFcγR結合に対するC1q結合調節変異の効果
精製抗体を使用して、IgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8抗体バリアントのFcγRIAの単量体細胞外ドメイン（ECD）（FCGR1AECDHis；SEQ ID NO 149）への、ならびにFcγRIIAアロタイプ131H（diFCGR2AH-HisBAP；SEQ ID NO 150）、FcγRIIAアロタイプ131R（diFCGR2AR-HisBAP；SEQ ID NO 151）、FcγRIIB（diFCGR2B-HisBAP；SEQ ID NO 152）、FcγRIIIAアロタイプ158F（diFCGR3AF-HisBAP；SEQ ID NO 153）、およびFcγRIIIAアロタイプ158V（diFCGR3AV-HisBAP；SEQ ID NO 154）の二量体細胞外ドメインへの結合をELISAアッセイで試験した。二量体FcγRバリアントへの結合を検出するために、96ウェルMicrolon ELISAプレート（Greiner, Germany）を、4℃で一晩、PBS中ヤギF(ab’)2-抗ヒト-IgG-F(ab’)2（Jackson Laboratory, 109-006-097, 1μg/mL）でコーティングし、PBS/0.2％BSA 200μL/ウェルを用いて室温（RT）で1時間洗浄およびブロッキングした。インキュベーションの間に洗浄を行いながら、プレートを、PBST/0.2％BSA中20μg/mlのIgG1-CAMPATH-1H抗体バリアント100μL/ウェルと振盪しながらRTで1時間、PBST/0.2％BSA中の二量体のHisタグ化されたC末端ビオチン化FcγR ECDバリアント（1μg/mL）100μL/ウェルと振盪しながらRTで1時間、および検出抗体としてのPBST/0.2％BSA中のストレプトアビジン-ポリHRP（CLB, M2032, 1:10.000）100μL/ウェルと振盪しながらRTで30分間、逐次的にインキュベートした。およそ10分間（IIAH、IIAR、IIIAV）、20分間（IIIAF）、または30分間（IIB）、1mg/mLのABTS（Roche, Mannheim, Germany）を用いて現像を実施した。反応を停止させるために、2％シュウ酸100μL/ウェルを加えた。マイクロプレートリーダー（BioTek, Winooski, VT）にて405nmで吸光度を測定した。FcγRIaへの結合を検出するために、96ウェルMicrolon ELISAプレート（Greiner, Germany）を、4℃で一晩、PBS中FCGR1AECD-His（1μg/mL）でコーティングし、PBS/0.2％BSA 200μL/ウェルを用いて室温（RT）で1時間洗浄およびブロッキングした。インキュベーションの間に洗浄を行いながら、プレートを、PBST/0.2％BSA中20μg/mlのIgG1-CAMPATH-1H抗体バリアント100μL/ウェルと振盪しながらRTで1時間、およびPBST/0.2％BSA中のヤギ抗ヒト-カッパLC-HRP（1：5000）100μL/ウェルと振盪しながらRTで30分間、逐次的にインキュベートした。およそ10分間、1mg/mLのABTS（Roche, Mannheim, Germany）を用いて現像を実施した。反応を停止させるために、2％シュウ酸100μL/ウェルを加えた。マイクロプレートリーダー（BioTek, Winooski, VT）にて405nmで吸光度を測定した。
【０５９９】
3つ（FcγRI、FcγRIIB、FcγRIIIA）または2つ（FcγRIIA）の独立したレプリケートのデータを、ELISAにおけるバックグラウンドシグナル（抗体なしの対照、0％）および100％に設定された内部標準IgG1-CAMPATH-1Hに対してプレート毎に正規化することによって組み合わせ、次いで、すべての実験で平均化した。また、抗体バリアントへのC1q結合を調節するために導入された変異もFcγR結合に影響を及ぼすと予想された。Fc-Fc相互作用増強変異E430G、自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440KおよびC1q結合調節変異G236R、G237A、K322A、G237T、G237Q、G237RまたはG237A-E333Sのいずれかを有するIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8抗体バリアントのFcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIaおよびFcγRIaへの結合のELISAによる評価は、IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eへの変異G236R、G237A、G237T、G237QまたはG237Rの導入が、すべての試験したFcγRバリアントへの結合を強く抑制したことを明らかにした（図28A〜F）。IgG1-CAMPATH-1H-E430G-G237Aについて、FcγRIIbならびに低親和性FcγRIIaおよびFcγRIIIa受容体への低い残留結合が観察された。また、FcγRIaへの低い残留結合が変異G236R、G237T、G237QおよびG237Rを有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eバリアントについて観察された。野生型IgG1-11B8およびIgG1-11B8-E430G-S440Kは、すべての試験したFcγRへの類似した強い結合を示し、それは、IgG1-11B8-E430G-S440KへのG237AまたはG237A-E333Sの導入によって抑制された。後者の2つの抗体バリアントは、FcγRIa、FcγRIIbおよび低親和性FcγRIIa受容体への低い残留結合を示した。変異K322Aの導入は、すべての試験したFcγRへのIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eの結合を穏やかに抑制した。
【０６００】
結論として、FcγR結合は、IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439EへのC1q結合調節変異G236R、G237A、G237T、G237QおよびG237Rの導入によって強く阻害された。同様に、IgG1-11B8-E430G-S440Kへの変異G237AまたはG237A-E333Sの導入は、FcγR結合を強く抑制した。
【０６０１】
実施例31：Fc-Fc相互作用増強変異E430Gを有する抗CD52 IgG1-h2E8、IgG1-CAMPATH-1Hおよび抗CD20 IgG1-11B8抗体バリアントへのC1q結合調節変異の導入による混合抗体バリアントによるCDC活性の選択性
IgG1-CAMPATH-1Hと同じく、ヒト化抗体IgG1-h2E8は、ヒトCD52を標的とする。ここで、Fc-Fc相互作用増強変異および自己オリゴマー化阻害変異を保有するIgG1-CAMPATH-1H、IgG1-h2E8、IgG1-11B8抗体バリアントへのC1q結合調節変異の導入のCDC有効性に対する効果を、Wien 133リンパ腫細胞を使用して研究した。
【０６０２】
抗体IgG1-CAMPATH-1H、IgG1-h2E8、IgG1-11B8およびIgG1-b12に異なる変異を導入した：E430G（これは、増強されたFc-Fc相互作用を誘導する）；変異K439EまたはS440Kのいずれか（これは、分子間Fc-Fc相互作用の阻害を通じてホモ六量体抗体複合体の形成を阻害し、かつ、交差補体Fc-Fc相互作用を通じてヘテロ六量体抗体複合体の形成を促進する）；G236R、G237A、G237R、G237TまたはG237Q（これは、ヘテロ六量体抗体複合体へのC1qの結合を抑制し、かつ、Fcγ受容体への結合を抑制する）。対照として、個々の成分とそれからなる混合物の濃度の直接比較が可能となるように、単一抗体も非結合アイソタイプ対照抗体IgG1-b12またはIgG1-b12-E430G-S440Kと1：1で混合した。ある濃度範囲の精製抗体（終濃度範囲0.009〜40.0μg/mL；3.3倍希釈）を、基本的には実施例2に記載のように、20％NHSを用いたWien 133細胞に対するインビトロCDCアッセイで試験した。細胞溶解率を（PI陽性細胞の数/細胞の総数）×100％として算出した。GraphPad PRISMで対数変換濃度を使用した非線形アゴニスト応答モデルの最良適合値を使用してデータを解析し、3つの実験レプリケートの用量応答曲線下面積を算出した。相対曲線下面積（AUC）値は、最小溶解（IgG1-b12で0％）および最大溶解（IgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物で100％）に対する正規化を表す。
【０６０３】
IgG1-11B8-E430Gによって誘導された中間の単剤CDC有効性は、変異S440Kまたは二重変異S440K-G237Aの導入によって抑止された（図29A）。IgG1-11B8-E430Gと比較して、より強い単剤CDC有効性がIgG1-CAMPATH-1H-E430Gによって誘導され、それは、変異K439E-G236Rの導入によって完全に抑止され得た。CDC有効性は、IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G236RをIgG1-11B8-E430G-S440Kと混合することによって、陽性対照混合物IgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの効力（相対AUC）のおよそ80％まで部分的に復元することができた。
【０６０４】
野生型IgG1-CAMPATH-1Hと同様に、野生型IgG1-h2E8は、Wien 133細胞において中間の有効性でCDCを誘導し、それは、Fc-Fc相互作用増強変異E430Gの導入によって、IgG1-CAMPATH-1H-E430Gによって誘導された同じレベルまで増強することができた。IgG1-h2E8-E430GとIgG1-11B8-E430Gとの混合は、IgG1-CAMPATH-1H-E430GおよびIgG1-11B8-E430Gの混合物と同程度の効率でCDCを誘導した。IgG1-h2E8-E430Gの単剤CDC活性は、自己オリゴマー化阻害変異K439Eの導入によって部分的に抑制することができた。40μg/mlの単剤IgG1-h2E8-E430G-K439Eによって誘導された最大溶解は、IgG1-h2E8-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物のレベルに近かった（図29B）。CDC有効性は、IgG1-h2E8-E430G-K439EをIgG1-11B8-E430G-S440Kと混合することによって復元したが（陽性対照混合物IgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの効力のおよそ90％を回復）、非抗原結合IgG1-b12-E430G-S440Kとの混合では復元しなかった。後者の混合物におけるIgG1-11B8-E430G-S440Kへの変異G237Aの導入は、混合物のCDC有効性（AUCとしてまたは40μg/mlでの最大溶解としてのいずれで測定された）に影響を及ぼさなかった（図29B）。
【０６０５】
IgG1-h2E8-E430G-K439Eへの変異G236Rの導入は、残留単剤CDC活性を完全に抑止した一方で、対照混合物と比較してCDC効力のおよそ79％がIgG1-11B8-E430G-S440Kとの混合によって回復することができた。IgG1-11B8-E430G-S440Kへの変異G237Aの導入は、IgG1-h2E8-E430G-K439E-G236Rとの混合後に回復したCDC有効性を穏やかに抑制した。IgG1-h2E8-E430G-K439Eへの変異G237Tの導入は、単剤CDC有効性を抑制したが、完全には抑止することはなかった。IgG1-h2E8-E430G-K439E-G236RおよびIgG1-11B8-E430G-S440K抗体バリアントの混合物と同様に、IgG1-h2E8-E430G-K439E-G237TのCDC有効性は、IgG1-11B8-E430G-S440Kとの混合によって、対照混合物の効力のおよそ88％まで、またはIgG1-11B8-E430G-S440K-G237Aとの混合によって（そのおよそ79％まで）復元することができた。変異G236Rの導入と同じく、IgG1-h2E8-E430G-K439EへのG237Qの導入は、残留単剤CDC活性を完全に抑止した。CDC有効性は、IgG1-11B8-E430G-S440Kとの混合によって、対照混合物の効力のおよそ84％まで復元することができた。後者の混合物におけるIgG1-11B8-E430G-S440Kへの変異G237Aの導入は、対照混合物の効力のおよそ74％までのCDC有効性の穏やかな抑制を誘導した。C1q結合調節変異G236R、G237TまたはG237Qのいずれかを有するIgG1-h2E8-E430G-K439E抗体バリアントとIgG1-11B8-E430G-S440KまたはIgG1-11B8-E430G-S440K-G237Aのいずれかとのすべての抗体混合物によって40μg/mlで誘導された最大溶解は、IgG1-h2E8-E430G-K439EおよびIgG1-11B8-E430G-S440Kの混合物によって誘導された最大溶解と同程度であった（図29B）。
【０６０６】
結論として、E430G変異、自己オリゴマー化阻害変異K439EおよびC1q結合調節変異を保有する抗CD52抗体IgG1-h2E8のバリアントは、抗CD20 IgG1-11B8抗体バリアントと混合したとき、Wien 133細胞において同じ変異を保有するIgG1-CAMPATH-1H抗体バリアントと同程度の選択的共依存性CDC有効性を示し、このことは、観察された変異によって誘導された効果がIgG1-CAMPATH-1Hに特異的ではなく、他のCD52標的指向型抗体にも適用可能であったことを示している。
【０６０７】
実施例32：Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を調節する変異を含有する抗体バリアントの標的結合非依存性動員
先の実施例において、Fc-Fc相互作用増強変異および自己オリゴマー化阻害変異を保有する抗原結合抗体バリアントの単剤CDC活性が、C1q結合阻害変異を導入することによってさらに低減され得ることが実証された。低減された単剤活性を有する抗体バリアントとC1q結合調節変異を保有する補体抗原結合抗体バリアントとを混合した後に、CDC有効性の回復が観察された。ここで、本発明者等は、共依存性六量体化およびCDCが、抗原結合抗体バリアントと前記変異を保有する非結合抗体バリアントとを混合することによっても誘導され得るかどうかを試験した。
【０６０８】
抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H抗体、抗CD20 IgG1-11B8抗体および非結合対照抗体IgG1-b12に異なる変異を導入した：E430G（これは、増強されたFc-Fc相互作用を誘導する）；変異K439EまたはS440Kのいずれか（これは、分子間Fc-Fc相互作用の阻害を通じてホモ六量体抗体複合体の形成を阻害し、かつ、交差補体Fc-Fc相互作用を通じてヘテロ六量体抗体複合体の形成を促進する）；G236RまたはG237A（これは、ヘテロ六量体抗体複合体へのC1qの結合を抑制する）。ある濃度範囲の精製抗体（終濃度範囲0.009〜40.0μg/mL；3.3倍希釈）を、基本的には実施例2に記載のように、20％NHSを用いたWien 133細胞に対するインビトロCDCアッセイで試験した。細胞溶解率を（PI陽性細胞の数/細胞の総数）×100％として算出した。GraphPad PRISMで対数変換濃度を使用した非線形アゴニスト用量応答モデルの最良適合値を使用してデータを解析し、3つの実験レプリケートの用量応答曲線下面積を算出した。相対曲線下面積（AUC）値は、アイソタイプ対照抗体IgG1-b12について観察されたAUC値（0％）およびIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物のAUC値（100％）に対して正規化された値を表す。
【０６０９】
図30A、Bは、変異K439EまたはS440Kのいずれかと組み合わせたE430G変異を保有する非結合対照抗体IgG1-b12の抗体バリアントの混合物について単剤活性が観察されなかったことを示す。加えて、先の実施例において説明したように、抗体IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G236R、IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G237Q、IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G237R、またはIgG1-11B8-E430G-S440Kについて単剤活性は観察されなかった。IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G237Tを非抗原結合IgG1-b12-E430G-S440Kと混合したとき、陽性対照混合物（IgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430G）の効力の9％のCDCが検出された。IgG1-11B8-E430G-S440Kを非結合IgG1-b12-E430G-K439Eとインキュベートしたとき、適度なCDCを検出することができた。対照的に、試験した4つのCAMPATHバリアントすべてが、CD20抗原結合IgG1-11B8-E430G-S440Kと混合した際にCDCを強く回復することができた。
【０６１０】
CD20指向性IgG1-11B8バリアントによる非細胞結合抗体の潜在的な動員を、別々の実験で、共にE430G、K439EおよびG236R変異を含有するCD52結合抗体IgG1-CAMPATH-1Hまたは非結合対照抗体IgG1-b12のバリアントと混合した後のCDC有効性を比較することによって、より詳細に分析した（図30C、D）。変異K439EまたはS440KのいずれかおよびG236RまたはG237A変異のいずれかと組み合わせたE430G変異を保有する非結合対照抗体IgG1-b12の抗体バリアントについて単剤活性は観察されなかった。共にE430G変異、K439EまたはS440K変異のいずれかおよびG236RまたはG237A変異のいずれかを保有する2つの非抗原結合IgG1-b12抗体バリアントと混合した際に、CDC有効性は観察されなかった。非抗原結合抗体IgG1-b12-E430G-K439E-G236RをIgG1-11B8-E430G-S440KまたはIgG1-11B8-E430G-S440K-G237Aのいずれかと混合した後に、それぞれ、陽性対照混合物のCDC効力のおよそ15％および19％までのCDC有効性の部分的回復が観察された。CDC活性は、IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G236RをIgG1-11B8-E430G-S440KまたはIgG1-11B8-E430G-S440K-G237Aのいずれかと混合することによって、それぞれ、陽性対照混合物によって誘導されたレベルのおよそ65％および71％まで回復することができた。この回復は、IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G236Rを非標的結合抗体IgG1-b12-E430G-S440KまたはIgG1-b12-E430G-S440K-G237Aのいずれかと混合した際には誘導されなかった。
【０６１１】
これらのデータは、Fc-Fc相互作用増強変異E430G、自己オリゴマー化阻害変異S440Kおよび任意でC1q結合阻害変異G237Aを保有する抗原結合抗体バリアントが、相補的変異E430G、K439EおよびG236Rを保有する非抗原結合抗体バリアントを動員することができ、最終的にCDCの誘導をもたらすことを示す。補体抗体E430G-S440Kの抗原結合非依存性動員は、抗原結合抗体がE430G-K439Eに加えてC1q結合阻害変異G236R、G237QまたはG237Rのいずれかも含有した場合に強く抑制されたが、G237Tは、補体抗体の抗原結合非依存性動員を遮断することに失敗した。
【０６１２】
実施例33：Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を調節する変異を保有する抗体バリアントによるFcγRIIaおよびFcγRIIIaの活性化能
実施例31において、Fc-Fc相互作用増強変異E430G、自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440KのいずれかおよびC1q結合調節変異G236R、G237A、G237T、G237Q、G237RまたはK322Aのいずれかを保有する抗体バリアントのFcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIbおよびFcγRIIIaへの結合を研究した。G236位またはG237位でのC1q結合調節変異の導入は、FcγR結合の抑制をもたらした。ここで、本発明者等は、標的を発現するRaji細胞およびヒトFcγRIIaまたはヒトFcγRIIIaの高親和性アロタイプバリアントを発現するJurkatレポーター細胞株を使用したPromegaレポーターアッセイにおいてFcγRIIaおよびFcγRIIIa媒介活性化を判定することによって、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eおよび抗CD20 IgG1-11B8-E430G-S440KへのC1q結合調節変異G236R、G237A、G237A-E333SまたはG237Qの導入がADCCの誘導に影響を及ぼしたかどうか研究した。
【０６１３】
ADCCレポーターバイオアッセイ（Promega, FcγRIIa: Cat # G9995；FcγRIIIa: Cat # G7018）を製造元の推奨に従ってRaji細胞に対して使用して、上述したIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8抗体バリアントによるFcγR媒介シグナル伝達の活性化を定量した。エフェクター細胞として、キットは、高親和性FcγRIIa（FcγRII-H）またはFcγRIIIa（V158）およびホタルルシフェラーゼの発現を駆動する活性化T細胞核内因子（NFAT）応答エレメントを安定発現するように操作されたJurkatヒトT細胞を含有する。簡潔に述べると、Raji細胞（5.000個の細胞/ウェル）を、384ウェルの白色OptiPlates（Perkin Elmer Cat # 6007290）内、12％ Low IgG Serum（Promega；Cat # G711A）を補充したADCC Assay Buffer（Promega, Cat # G719A）中に播種し、37℃/5％CO2で6時間、抗体濃度系列（4倍希釈で終濃度0.0002〜40μg/mL）および融解させたADCC Bioassay Effector Cellsを含有する30μLの総容量でインキュベートした。プレートを室温（RT）で15分間インキュベートした後、Bio Glo Assay Luciferase Reagent 30μLを加え、RTで5分間インキュベートした。ルシフェラーゼ産生を、EnVision Multilabel Reader（Perkin Elmer）での発光読み出しによって定量した。発光シグナルは、培地のみの試料（Raji細胞なし、抗体なし、エフェクター細胞なし）から決定されたバックグラウンド発光シグナルを減算することによって正規化された。GraphPad PRISMで対数変換濃度を使用した非線形アゴニスト用量応答モデルの最良適合値を使用してデータを解析し、3つ（FcγRIIa）または2つ（FcγRIIIa）の実験レプリケートの用量応答曲線下面積を算出した。AUC値は、非結合対照IgG1-b12とインキュベートした細胞について観察されたレポーター活性（0％）および野生型IgG1-Campath-1H＋野生型IgG1-11B8の混合物の活性（100％）に対して実験毎に正規化され、その後、実験レプリケートで平均化された。
【０６１４】
単剤として、抗体バリアントIgG1-11B8-E430G-S440Kは、FcγRIIa媒介活性化を誘導し（図31A）、これは、このバリアントによるFcγRIIa結合を示している実施例31の結果と一致する。対照的に、IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439EへのC1q結合調節変異G236RもしくはG237Q、またはIgG1-11B8-E430G-S440Kへの変異G237AもしくはG237A-E333Sの導入の際に、単剤抗体バリアントによるFcγRIIa媒介活性化は観察されなかった。また、変異G236RまたはG237Qを保有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eバリアントおよび変異G237AまたはG237A-E333Sを保有するIgG1-11B8-E430G-S440Kバリアントの混合物は、FcγRIIa媒介活性化を誘導しなかった。しかしながら、IgG1-11B8-E430G-S440KおよびIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G236RまたはIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G237Qのいずれかの混合物は、FcγRIIa媒介活性化を誘導した。同じ抗体バリアントを、FcγRIIIa媒介活性化を誘導する能力について試験した（図31B）。ここで、IgG1-11B8-E430G-S440K単独によって、またはG236RもしくはG237Q変異のいずれかを保有するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eバリアントと混合したときに、FcγRIIIa媒介活性化が観察された。変異G236Rを有するまたは有さないIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eは、それぞれ、低いまたは中間のFcγRIIIa媒介活性化を誘導した。IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G236RまたはIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G237QをIgG1-11B8-E430G-S440KバリアントG237AまたはG237A-E333Sのいずれかと混合したとき、FcγRIIIa媒介活性化を検出することはできなかった。
【０６１５】
結論として、Fc-Fc相互作用増強変異および自己オリゴマー化阻害変異を保有するIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8抗体バリアントによるFcγRIIaまたはFcγRIIIa媒介活性化を誘導する能力（ADCCについての代理尺度として使用される）は、C1q結合調節変異G236R、G237A、G237A-E333SまたはG237Qの導入によって効率的に抑止された。
【０６１６】
実施例34：Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を調節する変異を有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hおよび抗CD20 IgG1-11B8の抗体バリアントの混合物の成分を滴定した後のWien 133細胞に対するCDC活性の選択性
先の実施例において、自己オリゴマー化を阻害する変異およびC1q結合を調節する変異だけでなくFc-Fc相互作用を増強する変異も保有する抗体バリアントを1：1比で混合した。ここで、本発明者等は、選択的共依存性CDC活性が2つの抗体バリアントを非等モル比で混合することによっても達成されるかどうかを試験した。
【０６１７】
Wien 133細胞を使用したインビトロCDCアッセイを、基本的には実施例2に記載のように20％NHSを用いて実施した。単一抗体を3.3倍希釈（終濃度範囲0.005〜20.0μg/mL）で滴定した。抗体混合物を適用したとき、一方の成分を滴定し（5倍希釈で終濃度範囲0.0003〜20.0μg/mL）、他方の成分を20μg/mLの固定濃度で使用した。細胞溶解を実施例2に記載するようにPI陽性細胞の数から算出した。
【０６１８】
Wien 133細胞に対する効率的なCDC活性が、滴定したIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G236RおよびIgG1-11B8-E430G-S440K-G237Aの混合物（1：1比）によって誘導された（図32A）。一方の抗体バリアントを滴定して他方の抗体バリアントを20μg/mLの固定濃度で適用した抗体バリアント混合物とWien 133細胞をインキュベートした際に、CDCがさらにより効率的に誘導された。滴定したIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G236Rを20μg/mLの非標的結合抗体IgG1-b12またはE430G-S440K-G237A変異を保有するそのバリアントと混合した際に、CDC活性は検出されず、このことは、CD20結合を飽和するIgG濃度であってもヘテロ六量体化が標的結合依存性のままであったことを示している。また、IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G236RおよびIgG1-11B8-E430G-S440K-G237Aを血清の非存在下で混合した際にもCDCは観察されず、このことは、六量体複合体の安定化にC1qが必要であることを示している。IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G237QおよびIgG1-11B8-E430G-S440K-G237Aの混合物について極めて類似した結果が得られた（図32B）。CDCは、IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G237QおよびIgG1-11B8-E430G-S440K-G237Aの混合物によって、両方の抗体バリアントが滴定された混合物でまたは一方の抗体バリアントが滴定されて他の抗体バリアントが20μg/mLの固定濃度で適用された混合物でのみ誘導された。IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G237Qおよび非標的結合抗体IgG1-b12またはE430G-S440K-G237A変異を保有するそのバリアントの混合物は、CDCを誘導しなかった。
【０６１９】
結論として、Wien 133細胞に対する効率的なCDCは、Fc-Fc相互作用増強変異E430G、自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440KのいずれかおよびC1q結合調節変異G236R、G237AまたはG237Qのいずれかを保有するIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8の抗体バリアントによって、広範な非等モル比にわたって共依存的に誘導することができた：2つの標的の少なくとも1つへの結合が飽和されたという条件で、CAMPATH：11B8比が100：3から1：100まで減少する範囲で＞50％の溶解が観察された。
【０６２０】
実施例35：Fc-Fc相互作用増強変異E430G、自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440KのいずれかおよびC1q結合調節変異P329RまたはG236Rを保有する抗CD52および抗HLA-DR抗体バリアントの選択性
ここで、Fc-Fc相互作用増強変異、自己オリゴマー化阻害変異およびC1q結合調節変異を保有する抗CD52および抗HLA-DR抗体バリアントによる選択的共依存性CDC有効性をOci-Ly17リンパ腫細胞に対して研究した。
【０６２１】
抗CD52抗体IgG1-CAMPATH-1Hならびに抗HLA-DR抗体IgG1-HLA-DR-huL243およびIgG1-HLA-DR-1D09C3に異なる変異を導入した：E430G（これは、増強されたFc-Fc相互作用を誘導する）、自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440Kのいずれか、および変異G236またはP329Rのいずれか（これは、C1qの結合を抑制する）。対照として、個々の成分とそれからなる混合物の濃度の直接比較が可能となるように、単一抗体も非結合アイソタイプ対照抗体IgG1-b12またはIgG1-b12-E430G-S440Kと1：1で混合した。ある濃度範囲の精製抗体（終濃度範囲0.009〜40.0μg/mL；3.3倍希釈）を、基本的には実施例2にさらに記載のように、20％NHSを用いた1条件当たり30,000個のOci-Ly17リンパ腫細胞に対するインビトロCDCアッセイで試験した。細胞溶解率を（PI陽性細胞の数/細胞の総数）×100％として算出した。GraphPad PRISMで対数変換濃度を使用した非線形アゴニスト用量応答モデルの最良適合値を使用してデータを解析し、3つの実験レプリケートの用量応答曲線下面積を算出した。相対曲線下面積（AUC）値は、最小溶解（IgG1-b12で0％）および最大溶解（図33AにおけるIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-HLA-DR-huL243-E430Gの混合物で100％;または図33BにおけるIgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-HLA-DR-1D09C3-E430Gの混合物で100％）に対する正規化を表す。
【０６２２】
IgG1-CAMPATH-1H-E430GおよびIgG1-HLA-DR-huL243-E430Gの混合物は、Oci-Ly17細胞の効率的なCDCを誘導した（陽性対照混合物；100％に設定、図33A）。後者の混合物の単剤は、CDCを、陽性対照混合物の効力のおよそ83％（IgG1-CAMPATH-1H-E430G）および80％（IgG1-HLA-DR-huL243-E430G）まで誘導した。IgG1-CAMPATH-1H-E430Gへの変異S440Kの導入 は、CDCを誘導する能力を対照混合物の効力のおよそ24％まで低減させた一方で、IgG1-HLA-DR-huL243-E430Gへの二重変異K439E-P329Rの導入は、CDCを誘導する能力を対照混合物の効力のおよそ8.5％まで低減させた。IgG1-HLA-DR-huL243-E430G-K439E-P329RおよびIgG1-CAMPATH-1H-E430G-S440Kを混合することによって、CDCを誘導する能力は対照混合物の効力のおよそ38％まで復元した。IgG1-HLA-DR-huL243-E430Gの単剤CDC有効性は、二重変異K439E-G236Rの導入によって抑止された。CDC有効性の復元は、IgG1-HLA-DR-huL243-E430G-K439E-G236RをIgG1-CAMPATH-1H-E430G-S440Kと混合することによって対照混合物の効力のおよそ75％まで達成することができたが、非標的結合抗体バリアントIgG1-b12-E430G-S440Kとの混合では達成することができなかった。
【０６２３】
IgG1-HLA-DR-huL243の代わりに抗HLA-DR抗体IgG1-HLA-DR-1D09C3のバリアントを試験したときに同程度の結果が観察された（図33B）。IgG1-CAMPATH-1H-E430GおよびIgG1-HLA-DR-1D09C3-E430Gの混合物は、Oci-Ly17細胞の効率的なCDCを誘導した（陽性対照混合物；100％に設定、図33B）。後者の混合物の単剤は、CDCを、対照混合物の効力のおよそ70％（IgG1-CAMPATH-1H-E430G）および95％（IgG1-HLA-DR-1D09C3-E430G）まで誘導した。IgG1-CAMPATH-1H-E430Gへの変異S440Kの導入は、CDCを誘導する能力を対照混合物の効力のおよそ20％まで低減させた一方で、IgG1-HLA-DR-1D09C3-E430Gへの二重変異K439E-P329Rの導入は、CDCを誘導する能力を対照混合物の効力のおよそ7％まで低減させた。IgG1-HLA-DR-huL243-E430G-K439E-P329RおよびIgG1-CAMPATH-1H-E430G-S440Kを混合することによって、CDCを誘導する能力は、対照混合物の効力によって誘導されたレベルのおよそ35％まで復元した。IgG1-HLA-DR-1D09C3-E430Gの単剤CDC有効性は、二重変異K439E-G236Rの導入によって抑止された。CDC有効性の復元は、IgG1-HLA-DR-1D09C3-E430G-K439E-G236RをIgG1-CAMPATH-1H-E430G-S440Kと混合することによって対照混合物の効力のおよそ50％まで達成することができたが、非標的結合抗体バリアントIgG1-b12-E430G-S440Kとの混合では達成することができなかった。
【０６２４】
結論として、これらのデータは、Fc-Fc相互作用増強変異E430G、自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440K、およびC1q結合阻害変異P329RまたはG236Rを導入することによって、抗CD52 IgG1-CAMPATH-1Hの抗体バリアントと抗HLA-DR IgG1-HLA-DR-huL243またはIgG1-HLA-DR-1D09C3のいずれかの抗体バリアントとの混合によって、Oci-Ly17リンパ腫細胞の選択的な共依存性CDCを誘導することができたことを示す。
【０６２５】
実施例36：FcγR結合およびC1q結合を抑制するL234位およびL235位での変異を含有する抗体バリアントの選択性
実施例5および12において、抗体バリアントへのC1q結合を調節する変異の導入の際のCDC有効性に対する効果を説明した。IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eへの変異G236RおよびG237Qの導入は、Wien 133細胞に対して単剤CDC活性の抑止をもたらした。ここで、Wien 133細胞に対するCDC有効性への効果を、L234位およびL235位でC1q結合調節変異を導入した際のIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439EおよびIgG1-11B8-E430G-S440K抗体バリアントについて研究した。
【０６２６】
抗体IgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8に異なる変異を導入した：E430G（これは、増強されたFc-Fc相互作用を誘導する）；自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440Kのいずれか；およびL234A、L234A-L235A、L234F、L234F-L235E、L235A、L235Q、G236RまたはG237Q（これは、ヘテロ六量体抗体複合体へのC1qの結合を抑制する）。対照として、個々の成分とそれからなる混合物の濃度の直接比較が可能となるように、単一抗体も非結合アイソタイプ対照抗体IgG1-b12と1：1で混合した。ここで、一過性にトランスフェクトされたEXPI293上清由来の未精製上清を、L234、L235またはそれらの組み合わせに置換を含有するIgG1-CAMPATH-1HバリアントのためのIgG供給源として使用した。ある濃度範囲の抗体（終濃度範囲0.009〜40.0μg/mL；3.3倍希釈）を、基本的には実施例2に記載のように、20％NHSを用いたWien 133細胞に対するインビトロCDCアッセイで試験した。細胞溶解率を（PI陽性細胞の数/細胞の総数）×100％として算出した。GraphPad PRISMで対数変換濃度を使用した非線形アゴニスト用量応答モデルの最良適合値を使用してデータを解析し、3つの実験レプリケートの用量応答曲線下面積を算出した。相対曲線下面積（AUC）値は、最小溶解（IgG1-b12で0％）および最大溶解（IgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物で100％）に対する正規化を表す。
【０６２７】
モックトランスフェクトされたEXPI293上清は、Wien 133細胞の溶解を誘導しなかったが、このことは、使用した未精製上清中の物質による寄与を排除している。Wien 133細胞に対するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eの単剤CDC有効性は、変異L234A、L234A-L235A、L234F-L235E、L235A、L235Q、G236RまたはG237Qのいずれかの導入の際に完全に抑止された一方で、IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-L234Fについて低い残留CDC活性が観察された（図34）。これらの抗体バリアントすべてで、IgG1-11B8-E430G-S440Kと混合した際にCDC有効性を部分的に復元することができた。CDC回復の効率は、陽性対照混合物IgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430GのAUCによって規定された効力のおよそ70％（IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G236R＋IgG1-11B8-E430G-S440K）〜およそ84％（IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-L234F＋IgG1-11B8-E430G-S440K）の範囲であった。
【０６２８】
結論として、Wien 133細胞に対するIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439Eの単剤活性は、C1q結合阻害変異L234A、L234A-L235A、L234F、L234F-L235E、L235AおよびL235Qの導入によって、変異G236RまたはG237Qの導入の効果と同程度に抑止することができた。CDC有効性の回復は、これらの抗体バリアントをIgG1-11B8-E430G-S440Kと混合することによって達成することができた。それで、先の実施例およびこの実施例において試験したC1q結合阻害置換のいずれかが、本発明の共依存的に作用する抗体の選択性を改善することができたことが観察された。この大きな群内で、G236K/R、G237、L234およびL235置換は、FcγR媒介エフェクター機能を同時に阻害しながらC1q結合を比較的穏やかに調節するため、好ましい置換である。理論に制限されるものではないが、これによって、本発明の2つの抗体が結合した細胞上の両抗体間で形成されるヘテロ六量体複合体が十分なC1q結合アビディティを有する場合に、CDCなどの強力なオリゴマー化依存的活性を回復させることが可能になり、それによって、両方の抗体が結合した細胞に対して最大活性を選択的に呈する。
【０６２９】
実施例37：自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を調節する変異に加えてE345位およびE430位に代わりのFc-Fc相互作用増強変異を有する抗体バリアントの選択性
先の実施例において、Fc-Fc相互作用増強変異E345K、E345RおよびE430Gを共依存性抗体バリアントに導入した。ここで、本発明者等は、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を調節する変異を保有するIgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8の抗体バリアント中のE430位およびE345位における代わりの置換の導入が、Wien 133細胞に対するCDCの共依存的誘導をもたらしたかどうか研究した。
【０６３０】
抗体IgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8に異なる変異を導入した。小さい、親水性、疎水性および大きい/芳香族の変異などの広範に異なる置換の代表として、E430置換のE430G、E430N、E430T、E430VおよびE430Yを選んだ。同じように、小さい、塩基性/電荷、親水性、疎水性および大きい/芳香族の変異の代表として、E345に導入される変異E345A、E345K、E345Q、E345R、E345V、E345Yを選んだ。変異組み合わせK248E-T437Rは、Fc-Fc相互作用を介してIgGオリゴマー化を調節すると過去に示唆された（WO2018031258）。さらに、抗体は、自己オリゴマー化阻害変異K439EもしくはS440K、および/またはC1q調節変異G236R、G237AもしくはE333Sのいずれかを含有した。対照として、個々の成分とそれからなる混合物の濃度の直接比較が可能となるように、単一抗体も非結合アイソタイプ対照抗体IgG1-b12と1：1で混合した。ここで、一過性にトランスフェクトされたEXPI293上清由来の未精製上清を、E430G、E345KまたはE345R置換を含有しなかった抗体バリアントのためのIgG供給源として使用した。ある濃度範囲の抗体（終濃度範囲0.009〜40.0μg/mL；3.3倍希釈）を、基本的には実施例2に記載のように、20％NHSを用いたWien 133細胞に対するインビトロCDCアッセイで試験した。細胞溶解率を（PI陽性細胞の数/細胞の総数）×100％として算出した。GraphPad PRISMで対数変換濃度を使用した非線形アゴニスト用量応答モデルの最良適合値を使用してデータを解析し、2つの実験レプリケートの用量応答曲線下面積を算出した。相対曲線下面積（AUC）値として提示されるCDC効力/効率は、最小溶解（IgG1-b12で0％）および最大溶解（IgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物で100％）に対してプレート毎に正規化された値に相当し、これは、その後、2つの独立した実験レプリケートで平均化された。
【０６３１】
モックトランスフェクトされたEXPI293上清は、Wien 133細胞の溶解を誘導しなかったが、このことは、使用した未精製上清中の物質による寄与を排除している。先の実施例において説明したように、IgG1-11B8への変異E430G-S440KまたはE430G-S440K-G237Aの導入は単剤CDC有効性を抑止し（図35A）、一方で、IgG1-CAMPATH-1Hの単剤CDC活性は、変異E430G-K439E-G236Rの導入によって抑止することができた。CDC有効性は、IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G236RをE430G-S440KまたはE430G-S440K-G237A変異のいずれかを有するIgG1-11B8抗体バリアントと混合することによって、それぞれ、陽性対照混合物IgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gについて測定された効力のおよそ82％および91％まで復元した。
【０６３２】
変異E430N（SEQ ID NO 115をもたらす）、E430T（SEQ ID NO 117をもたらす）、E430V（SEQ ID NO 119をもたらす）、E345A（SEQ ID NO 64をもたらす）、E345K（SEQ ID NO 66をもたらす）、E345Q（SEQ ID NO 69をもたらす）、E345R（SEQ ID NO 73をもたらす）またはE345Y（SEQ ID NO 77をもたらす）のいずれかをE430Gの代わりにIgG1-CAMPATH-1H-K439E-G236Rに導入したとき、E430Gについて観察された結果と同程度の結果が達成された：言及したE430置換のいずれかを保有するIgG1-CAMPATH-1H抗体バリアントの単剤CDC活性はバックグラウンドレベルであった一方で、IgG1-CAMPATH-1HバリアントをIgG1-11B8-E430G-S440KまたはIgG1-11B8-E430G-S440K-G237Aと混合することによってCDC活性の回復が達成された。混合物によるCDC有効性の回復は、対照混合物の効力のおよそ78％（IgG1-CAMPATH-1H-E345Q-K439E-G236R＋IgG1-11B8-E430G-S440K）〜およそ92％（IgG1-CAMPATH-1H-E345R-K439E-G236R＋IgG1-11B8-E430G-S440K-G237A）の範囲であった。抗体バリアントIgG1-CAMPATH-1H-E430Y-K439E-G236R（SEQ ID NO 121）は、対照混合物の効力のおよそ44％の残留単剤CDC活性を誘導した。IgG1-CAMPATH-1H-E430Y-K439E-G236RをIgG1-11B8-S440K-G237Aと混合することによって、CDC有効性は陽性対照混合物によって誘導されたレベルのおよそ94％まで復元した。
【０６３３】
IgG1-11B8-E430G-S440K-G237A中のE430G変異を、変異E430N（SEQ ID NO 116をもたらす）、E430T（SEQ ID NO 118をもたらす）、E430V（SEQ ID NO 120をもたらす）、E345A（SEQ ID NO 65をもたらす）、E345Q（SEQ ID NO 70をもたらす）、E345V（SEQ ID NO 76をもたらす）またはE345Y（SEQ ID NO 78をもたらす）のいずれかで置換した際に、E430Gについて観察された結果と同程度の結果が達成された：言及したE430置換のいずれかを保有するIgG1-11B8抗体バリアントの単剤CDC活性はバックグラウンドレベルであった一方で、IgG1-11B8バリアントをIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G236Rと混合することによってCDC活性の回復が達成された（図35B）。混合物によるCDC有効性の回復は、対照混合物の効力のおよそ80％（IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G236R＋IgG1-11B8-E430V-S440K-G237A）〜およそ86％（IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G236R＋IgG1-11B8-E345Q-S440K-G237A）の範囲であった。陽性対照混合物によって誘導されたレベルのおよそ21％の残留単剤CDC活性が抗体バリアントIgG1-11B8-E430Y-S440K-G237A（SEQ ID NO 122）について観察された一方で、CDC有効性は、IgG1-11B8-E430Y-S440K-G237AをIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G236Rと混合することによって、陽性対照混合物によって誘導されたレベルのおよそ91％まで復元することができた。
【０６３４】
また、以下の変異：E430N、E430T、E430V、E345A、E345Q、E345V、E345Yから選択される同一のFc-Fc相互作用調節変異が両抗体に導入されたIgG1-CAMPATH-1H-K439E-G236RおよびIgG1-11B8-S440K-G237A抗体バリアントを混合した際にも、CDC有効性の強力な回復が観察された（図35C）。図35AおよびBに示すように、これらの抗体バリアントの単剤活性は、バックグラウンドレベルであった。CDC有効性の回復は、陽性対照混合物によって誘導されたレベルのおよそ70％（IgG1-CAMPATH-1H-E430V-K439E-G236R＋IgG1-11B8-E430V-S440K-G237A）〜およそ89％（IgG1-CAMPATH-1H-E430T-K439E-G236R＋IgG1-11B8-E430T-S440-G237A）の範囲であった。E430Y変異が導入されたIgG1-CAMPATH-1H-K439E-G236RおよびIgG1-11B8-S440K-G237A抗体バリアントの混合物によって最も高いCDC有効性の回復が達成され（陽性対照混合物によって誘導されたレベルのおよそ97％）、一方で、両方の抗体バリアントは、上記のように残留単剤CDC活性を誘導した。
【０６３５】
抗体バリアントへの二重変異K248E-T437Rの導入は、Fc-Fc相互作用を促進すると説明されてきた。図35Dに示すように、IgG1-11B8-K248E-T437Rへの変異S440K-G237A（SEQ ID NO 131をもたらす）の導入は、Wien 133細胞に対する単剤CDC有効性を抑止した。IgG1-11B8-K248E-T437Rへの変異S440K-E333S（SEQ ID NO 130をもたらす）の導入の際に単剤CDC活性の部分的阻害が観察された。IgG1-11B8-K248E-T437R-S440K-G237AをIgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G236Rと混合したときに、対照混合物の効力のおよそ87％までのCDC有効性の強力な回復が観察された。さらに、K439E-G236R変異（SEQ ID NO 128をもたらす）も保有するIgG1-CAMPATH-1H抗体バリアントへの変異K248E-T437Rの導入は、あらゆる単剤CDC活性を欠いた抗体バリアントをもたらした。CDC有効性は、IgG1-CAMPATH-1H-K248E-T437R-K439E-G236RをE430G-S440K-G237A、K248E-T437R-S440K-G237AまたはK248E-T437R-S440K-E333S変異を保有するIgG1-11B8抗体バリアントのいずれかと混合することによって、それぞれ、対照混合物の効力のおよそ87％、84％および97％まで強力に復元することができた。同じように、K439E-G237Q変異（SEQ ID NO 129をもたらす）も保有するIgG1-CAMPATH-1H抗体バリアントへの変異K248E-T437Rの導入は、あらゆる単剤CDC活性を欠いた抗体バリアントをもたらした。CDC有効性の回復は、IgG1-CAMPATH-1H-K248E-T437R-K439E-G237QをK248E-T437R-S440K-G237AまたはK248E-T437R-S440K-E333S変異を保有するIgG1-11B8抗体バリアントと混合することによって、それぞれ、対照混合物の効力のおよそ86％および98％まで達成することができた。
【０６３６】
結論として、Wien 133細胞に対する選択的共依存性CDC有効性は、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を調節する変異に加えてすべての試験したE430置換（E430G、E430N、E430T、E430V、E430Y）、すべての試験したE345置換（E345A、E345K、E345Q、E345R、E345V、E345Y）およびK248E-T437Rを含む異なるFc-Fc相互作用調節変異を保有する、IgG1-CAMPATH-1HおよびIgG1-11B8抗体バリアントを混合することによって達成することができた。さらに、混合された抗体が同一でないFc-Fc相互作用増強変異を含有したとき、共依存的活性が観察された。
【０６３７】
それで、本発明の共依存的に作用する抗体がまた自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440Kも含有するという条件で、かつ、1つの抗体がまたG236R、G237QまたはG237Aによって例示されるC1q結合調節変異も含有するという条件で、任意のE430または任意のE345置換をこれらの抗体に適用することができると予想することができる。Fc-Fc相互作用増強性置換E430YおよびE430Fは、その残留単剤活性に起因して、本発明の抗体にとってそれほど好ましい置換ではない可能性がある。
【０６３８】
実施例38：E430G-S440K変異およびC1q結合阻害変異を保有する抗体バリアントとE430G-K439E変異およびC1q結合増強変異を保有する抗体バリアントとからなる混合物によるRajiリンパ腫細胞に対するCDC活性の選択性
先の実施例において、CDCを誘導する能力を、2つの抗体バリアント（一方が、C1q結合阻害変異と組み合せたFc-Fc相互作用増強変異および自己オリゴマー化阻害変異K439Eを保有する抗体バリアントであり、他方が、場合によりC1q結合増強変異と組み合せたFc-Fc相互作用増強変異および自己オリゴマー化阻害変異S440Kを保有する抗体バリアントである）を含有する共依存性混合物について測定した。ここで、本発明者等は、Raji細胞に対する選択的共依存性CDC誘導を、逆に、すなわち、穏やかにC1q結合を阻害するまたは増強する変異を保有するIgG1-CD37-37-3-E430G-K439E抗体バリアントとC1q結合阻害変異を保有するIgG1-11B8-E430G-S440K抗体バリアントとを混合することによっても、誘導することができるかどうかを試験した。
【０６３９】
抗体IgG1-CD37-37-3およびIgG1-11B8に異なる変異を導入した：E430G（これは、増強されたFc-Fc相互作用を誘導する）；自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440Kのいずれか；G236R、G237A、G237Q（これは、ヘテロ六量体抗体複合体へのC1qの結合を抑制する）；E333S（これは、ヘテロ六量体抗体複合体へのC1qの結合を増強する）。対照として、個々の成分とそれからなる混合物の濃度の直接比較が可能となるように、単一抗体も非結合アイソタイプ対照抗体IgG1-b12と1：1で混合した。ここで、また、一過性にトランスフェクトされたEXPI293上清由来の未精製上清をIgG供給源として使用した。ある濃度範囲の精製抗体（終濃度範囲0.009〜40.0μg/mL；3.3倍希釈）を、基本的には実施例2に記載のように、20％NHSを用いてRaji細胞に対するインビトロCDCアッセイで試験した。細胞溶解率を（PI陽性細胞の数/細胞の総数）×100％として算出した。GraphPad PRISMで対数変換濃度を使用した非線形用量応答適合の最良適合値を使用してデータを解析し、3つの実験レプリケートの用量応答曲線下面積を算出した。相対曲線下面積（AUC）値として提示されるCDC有効性は、最小溶解（IgG1-b12で0％）および最大溶解（IgG1-CD37-37-3-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物で100％）に対してプレート毎に正規化された値に相当し、これは、その後、2つの独立した実験レプリケートで平均化された。IgG1-CD37-37-3-E430GおよびIgG1-11B8-E430Gの陽性対照混合物は、Raji細胞に対して効率的なCDCを誘導した（図36A）。IgG1-11B8-E430Gの抗体バリアントの単剤活性は、変異K439Eの導入によって強く抑制することができ、それは、C1q結合阻害変異（G237A）またはC1q結合増強変異（E333S）の追加の導入によってさらに影響を受けることはなかった。CDC有効性はまた、C1q結合阻害変異G237Aの有無に関わらず変異S440Kの導入によって強く抑制することができた。IgG1-CD37-37-3-E430Gへの変異K439E-G236Rの導入もまた単剤CDC有効性を抑止したが、CDC有効性は、IgG1-CD37-37-3-E430G-K439E-G236RをIgG1-11B8-E430G-S440KまたはIgG1-11B8-E430G-S440K-G237Aのいずれかと混合することによって、それぞれ、陽性対照混合物によって誘導されたレベルのおよそ72％および62％まで復元することができた。同じように、IgG1-CD37-37-3-E430Gへの変異K439E-G237A、K439E-E333S（SEQ ID NO:82）、S440K-G236R（SEQ ID NO：104）、S440K-G237A、またはS440K-G237Q（SEQ ID NO：107）の導入は、単剤活性をもたらさなかった一方で、これらの抗体と補体自己オリゴマー化阻害変異およびC1q結合阻害変異（G237A）または増強変異（E333S）のいずれかを保有するIgG1-11B8抗体バリアントとの混合物は、CDC有効性を部分的に復元した（対照混合物の効力のおよそ43％〜94％の範囲）。IgG1-CD37-37-3およびIgG1-11B8抗体バリアントの共依存性混合物によって誘導された40μg/mLの濃度での最大溶解は強く、対照混合物の効力の76％〜93％の範囲であった（図36B）。
【０６４０】
結論として、E430G変異を保有するIgG1-C37-37-3およびIgG1-11B8抗体バリアントの単剤CDC活性は、K439EまたはS440K変異のいずれかおよびC1q結合調節変異G236R、G237A、G237Q、E333Sのいずれかの導入によって抑止することができた一方で、そのような抗体バリアントの混合物は、2つの抗体のいずれかに自己オリゴマー化阻害変異およびC1q結合阻害変異または増強変異のどの組み合わせが導入されたかに関わらず、CDC有効性を復元した。
【０６４１】
実施例39：Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を調節する変異を保有する抗CD52および抗CD20抗体バリアントの共依存的組み合わせによる患者CLL細胞の選択的補体依存的細胞傷害性
先の実施例において、抗体バリアント組み合わせのCDC有効性を、インビトロで培養した腫瘍細胞株を使用して試験した。ここで、CDCの選択的共依存性誘導を、慢性リンパ性白血病（CLL）患者由来の腫瘍細胞を使用して、Fc-Fc相互作用増強変異E430G、自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440KのいずれかおよびC1q結合調節変異G236RまたはE333Sのいずれかを保有する抗CD20 IgG1-11B8および抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H抗体バリアントを混合することによって研究した。対照として、個々の成分とそれからなる混合物の濃度の直接比較が可能となるように、単一抗体も非結合アイソタイプ対照抗体IgG1-b12と1：1で混合した。ある濃度範囲の精製抗体（終濃度範囲0.003〜10.0μg/mL；3.3倍希釈）を、20％NHSを用いた3人のCLL患者に由来する腫瘍細胞に対するインビトロCDCアッセイで試験した。3人のCLL患者由来の末梢血単核細胞（PBMC；ConversantBio）を37℃で融解し、10％の鉄含有ドナーウシ血清（DBSI；Life Technologies, cat. no. 20371）を補充したRPMI 1640（Life technologies）中で洗浄し、RPMI＋0.2％BSA中3.33×106個のPBMC/mLの濃度にした。96ウェルプレートの各ウェルに、30μL（100,000個の細胞/ウェルに対応する）を加え、2×濃度の抗体希釈系列50μLも加えた。シェーカー上にてRTで15分間のインキュベーション後、非ヒト血清20μLを各ウェルに加え、37℃で45分間インキュベートした。次いで、細胞を遠心分離し、FACS緩衝液（PBS＋0.1％BSA＋0.02％アジ化ナトリウム）で洗浄した。染色ミックス（staining mix）50μLを各ウェルに加え、4℃で30分間インキュベートした。FACS緩衝液を使用してプレートを2回洗浄した後、生存細胞のパーセンテージをFortessaフローサイトメーター（BD）にて測定した。
【０６４２】
CD20およびCD52の標的発現レベルを、QIFIキット（DAKO；cat. nr. K0078）を使用した定量フローサイトメトリー手順によって判定した。3人の患者のCLL患者PBMCを、96ウェル丸底プレートに100,000個の細胞/ウェルで播種し、遠心分離して細胞をペレット化した。上清を廃棄した後、一次マウス抗ヒト-CD20（IgG1-mm-IgG1-7D8-K409R）および-CD52（Tebu Bio；cat. nr. MAB0944）抗体またはアイソタイプ対照抗体を各ウェルに加え、4℃で30〜45分間インキュベートした。別々のウェルで、50μLのキット付属セットアップビーズおよびキャリブレーションビーズを加えた。細胞を遠心分離して上清を廃棄した後、細胞をFACS緩衝液中で2回洗浄した。次いで、細胞を50μL/ウェルの二次ヤギ抗マウスIgG-FITCコンジュゲート（DAKO；cat. nr. F0479）に再懸濁し、暗所にて4℃で30〜45分間インキュベートした。細胞をFACS緩衝液中で2回洗浄し、最終的に、Fortessaフローサイトメーターでの解析のためにFACS緩衝液に再懸濁した。製造元のガイドラインに従って、抗体結合能をキャリブレーション曲線に基づいて算出することによって抗原量を判定した。
【０６４３】
3つすべてのCLL患者試料における最も強いCDC有効性は、IgG1-CAMPATH-1H-E430GおよびIgG1-11B8-E430Gの混合物によって誘導された（図37A〜C）。IgG1-CAMPATH-1H-E430Gの単剤CDC活性は、IgG1-CAMPATH-1H-E430G＋IgG1-11B8-E430Gの混合物によって誘導されたレベルに近い（患者1、2）または同等であった（患者3）。単剤としてのIgG1-11B8-E430GによるCDCを誘導する能力は患者毎に変動し、CDC活性なし（患者3）および中間の有効性（患者1）〜単剤IgG1-CAMPATH-1H-E430Gによって誘導されたレベルに近いCDC効率（患者2）の範囲であった。IgG1-11B8抗体バリアントの単剤活性は、異なる試料のCD20発現レベルと相関関係にあった（患者1：48E+03；患者2：172E+03；患者3：39E+03）。単剤活性は、IgG1-CAMPATH-1H-E430Gへの変異K439E-G236RおよびIgG1-11B8-E430Gへの変異S440KまたはS440K-E333Sの導入の際に完全に抑止された。しかしながら、CDC有効性は、IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G236RをIgG1-11B8-E430G-S440KまたはIgG1-11B8-E430G-S440K-E333Sと混合することによって復元することができた。CDC有効性の復元の程度は、患者試料毎に変動した。
【０６４４】
結論として、変異E430G、K439EまたはS440KおよびG236RまたはE333Sを保有する抗CD20および抗CD52抗体バリアントの混合物は、患者CLL試料において共依存的様式でCDCを誘導することができた。
【０６４５】
実施例40：末梢血単核細胞試料内でのT細胞集団の選択的枯渇
共依存性抗体混合物の作製は、B細胞について実施例20で実証されたように、T細胞をそのままの状態にしたまま、全血試料からの特定の血液学的サブセットの選択的枯渇を可能にする。ここで、本発明者等は、Fc-Fc相互作用増強変異、自己オリゴマー化阻害変異およびC1q結合調節変異を保有する共依存性抗体バリアントの混合物が、B細胞画分をそのままの状態にしたまま、全血試料からT細胞を選択的に枯渇させることができるかどうかを試験した。
【０６４６】
凝固を防止するようにヒルジンと共に保存された4人の健常なヒトドナーに由来する全血の試料（UMC Utrecht）30μLを、96ウェル丸底プレート（Greiner Bio-One；Cat # 650101）内に分割し、RPMI＋0/2％BSA（Lonza；Cat # BE12-115F/U1）50μLを補充した。各ウェルに、以下の変異を有するIgG1-CAMPATH-1H、IgG1-huCLB-T3/4およびIgG1-CD5-INSERM抗体の2つの抗体バリアントの混合物（終濃度10μg/mL）20μLを加えた：E430G（増強されたFc-Fc相互作用を誘導する）；自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440Kのいずれか；およびC1q調節変異G236R、G237AまたはK326A。対照として、個々の成分とそれからなる混合物の濃度の直接比較が可能となるように、単一抗体を、E430G、K439E、S440K、G236RまたはG237A変異を保有する非結合アイソタイプ対照抗体IgG1-b12のバリアントと1：1で混合した。37℃および5％CO2で一晩インキュベーションした後、プレートを遠心分離し、細胞をPBS（B. Braun；Cat # A220/12257874/1110）150μLで1回洗浄した。次に、細胞をアミン反応性生存率色素（Invitrogen；Cat # A10346A）80uLに再懸濁し、PBS中で1：1000希釈し、暗所にて4℃で30分間インキュベートした。次いで、細胞を遠心分離し、Fixable Viability Stain 510（FVS510, BD；Cat # 564406）の他にCD3に対して指向される蛍光標識抗体（eBioscience；Cat # 48-0037）、CD4に対して指向される蛍光標識抗体（eBioscience；Cat # 47-0048）、CD8に対して指向される蛍光標識抗体（BioLegend；Cat # 301028）、CD19に対して指向される蛍光標識抗体（BioLegend, Cat # 302245）、CD45に対して指向される蛍光標識抗体（BioLegend；Cat # 368505）、CD56に対して指向される蛍光標識抗体（BD；Cat # 564849）およびCD66bに対して指向される蛍光標識抗体（BioLegend；Cat # 305115）のミックス80μLにそのペレットを再懸濁した。細胞を、暗所にて4℃で30分間インキュベートし、その後、遠心分離した後、冷RBC溶解緩衝液を使用して赤血球を溶解した。細胞をFACS緩衝液（PBS＋0.1％BSA＋0.02％NaN3）中で洗浄および採集した後、試料75μLの固定容量でフローサイトメーター（BD Fortessa）にて解析した。B細胞、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞の画分を、以下の式を使用して算出した：回収された画分（標的集団、％）＝100％*（標的細胞数（試料）/標的細胞数（抗体なしの対照））*（顆粒球数（抗体なしの対照）/顆粒球数（試料）。ここで、本発明者等は、方法によって誘導される試料間変動を内部対照として顆粒球集団を使用して（顆粒球集団は、溶解誘導抗体によって標的とされないので）補正した、溶解誘導抗体なしでインキュベートした対照試料中の細胞数と比較することによって、標的とされた細胞の相対回収率を測定する。
【０６４７】
抗CD52抗体IgG1-CAMPATH-1Hおよび抗CD3抗体IgG1-huCLB-T3/4のバリアントを使用して、B細胞に影響を及ぼすことなく全血試料からT細胞を選択的に枯渇させた。単剤として適用したとき、IgG1-CAMPATH-1H-E430Gは、B細胞、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞を強く枯渇させた一方で、単剤IgG1-huCLB-T3/4-E430Gは、CD4+ T細胞を部分的に枯渇させた（図38A、B、C）。非標的結合抗体バリアントIgG1-b12-E430G-K439E-G236RおよびIgG1-b12-E430G-S440K-G237Aの混合物によって、リンパ球サブセットの枯渇は観察されなかった。また、後者の抗体バリアントのいずれかを補体IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G236RまたはIgG1-huCLB-T3/4-E430G-S440K-K326Aと混合したときにも枯渇は観察されなかった。対照的に、IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G236RおよびIgG1-huCLB-T3/4-E430G-S440K-K326Aの混合物は、これらの試料において計数されたB細胞に影響を及ぼすことなく、CD4+ T細胞を、そして、比較的規模は小さいがCD8+ T細胞を共依存的様式で強く枯渇させた。
【０６４８】
加えて、抗CD52抗体IgG1-CAMPATH-1Hおよび抗CD5抗体IgG1-CD5-INSERMのバリアントを使用して、B細胞に影響を及ぼすことなく全血試料からT細胞を選択的に枯渇させた。この場合も同じく、B細胞、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞の強い枯渇が単剤IgG1-CAMPATH-1H-E430Gによって誘導された一方で、単剤IgG1-CD5-INSERM-E430Gは、分析されたリンパ球集団のいずれも枯渇させなかった（図38D、E、F）。非標的結合抗体バリアントIgG1-b12-E430G-K439E-G236RおよびIgG1-b12-E430G-S440K-G237Aの混合物によって、リンパ球サブセットの枯渇は観察されなかった。また、後者の抗体バリアントのいずれかを補体IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G236RまたはIgG1-CD5-INSERM-E430G-S440K-K326Aと混合したときにも枯渇は観察されなかった。対照的に、IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-G236RおよびIgG1-CD5-INSERM-E430G-S440K-K326Aの混合物は、B細胞ではなくCD4+ T細胞を強くかつ選択的に共依存的様式で枯渇させた。IgG1-CAMPATH-1H-E430G-K439E-K326AおよびIgG1-CD5-INSERM-E430G-S440K-G237Aの混合物によるCD8+ T細胞に対する効果は、ドナー毎に変動した。
【０６４９】
結論として、Fc-Fc相互作用増強変異E430G、自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440KおよびC1q結合調節変異G236RまたはG237Aを保有する抗CD52 IgG1-CAMPATH-1H、IgG1-huCLB-T3/4およびIgG1-CD5-INSERMの抗体バリアントの混合物を適用して、B細胞集団を無傷の状態にしたままで健常ドナー全血試料からT細胞集団を選択的かつ共依存的に枯渇させることができた。
【０６５０】
実施例20における結果との組み合わせで、このことは、本発明に開示される変異を保有するFc-ドメインを含有する抗体組み合わせを使用し、その同時発現が標的血液学的サブセットの選択の特徴となる標的組み合わせを使用して、B細胞、CD8+ T細胞またはCD4+ T細胞の域を超えて異なる血液学的サブセットを選択的に枯渇させることができることを主張する。
【０６５１】
実施例41：Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を調節する変異を保有する抗DR4および抗DR5抗体バリアントの混合物によるプログラム細胞死の共依存的誘導
生存率アッセイを実施して、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を調節する変異を保有する抗DR4および抗DR5抗体バリアントの混合物が、BxPC-3ヒト膵臓がん細胞およびCOLO 205結腸がん細胞のプログラム細胞死（PCD）を共依存的に誘導することができるかどうかを研究した。
【０６５２】
抗DR4抗体IgG1-DR4-chCTB007および抗DR5抗体IgG1-DR5-01に異なる変異を導入した：E430G（これは、増強されたFc-Fc相互作用を誘導する）；自己オリゴマー化阻害変異K439EまたはS440Kのいずれか；C1q結合調節変異G237T、K326WまたはE333S（これは、C1qの結合を抑制（G237T）または増強（K326W、E333S）する）。対照として、個々の成分とそれからなる混合物の濃度の直接比較が可能となるように、単一抗体もE430G-K439EまたはE430G-S440K変異を保有する非結合アイソタイプ対照抗体IgG1-b12のバリアントと1：1で混合した。生存率アッセイを基本的には実施例14に記載のように実施した。手短に言えば、単一細胞懸濁液（1ウェル当たり5,000細胞）90μLをポリスチレン96ウェル平底プレート（Greiner Bio-One, Cat nr 655182）に播種し、37℃で一晩インキュベートした。段階希釈系列の抗体混合物（5倍希釈で終濃度範囲0.0003〜20μg/mL）20μLおよびC1q（Quidel；終濃度2.5μg/mL）10μLを加え、37℃で3日間インキュベートした。細胞死の誘導に対する陰性対照および陽性対照として、それぞれ、細胞を抗体なしでまたは5μMのスタウロスポリンとインキュベートした。培養した細胞の生存率を、実施例14において説明したようにCellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイで判定した。GraphPad Prismソフトウェアを使用した非線形回帰（可変傾斜を有するシグモイド用量応答）を使用してデータを解析し、プロットした。生存細胞のパーセンテージを、以下の式を使用して算出した：生存細胞％＝［（抗体試料の発光−スタウロスポリン試料の発光）/（抗体試料なしの発光−スタウロスポリン試料の発光)］*100。
【０６５３】
BxPC-3またはCOLO 205細胞において単剤として適用したときIgG1-DR5-01-E430G-K439E-G237Tによってプログラム細胞死は観察されなかった（図39A、B）。IgG1-DR4-chCTB007-E430G-S440K-K326W-E333Sは、単剤として適用したとき、BxPC-3およびCOLO 205アッセイにおいて使用した最も高い濃度でそれぞれおよそ67％および60％の生存細胞が残ったことから反映される通り、プログラム細胞死を誘導した。プログラム細胞死を誘導するIgG1-DR4-chCTB007-E430G-S440K-K326W-E333Sの能力は、これをIgG1-DR5-01-E430G-K439E-G237Tと混合することによって増強することができ、これは、両方の細胞株を使用して観察された効果であった。
【０６５４】
総合すれば、BxPC-3およびCOLO 205がん細胞におけるプログラム細胞死の共依存的活性化は、Fc-Fc相互作用を増強する、自己オリゴマー化を阻害するおよびC1q結合を阻害する（G237T）または増強する（K326W-E333S）変異を保有する抗DR4および抗DR5抗体バリアントの混合物によって達成することができた。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１５Ｆ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２０−４】
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【図２０−５】
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【図２０−６】
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【図２０−７】
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【図２０−８】
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【図２０−９】
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【図２０−１０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２３Ｆ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２８Ｄ】
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【図２８Ｅ】
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【図２８Ｆ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３０Ｄ】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３５Ｄ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３７Ｃ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３８Ｄ】
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【図３８Ｅ】
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【図３８Ｆ】
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【図３９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021522303.tif 000184
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