(57)【要約】  本発明は、新規なヒト化アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体と、それを使用する治療方法及び診断方法並びに組成物とに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における自己免疫疾患を処置する方法であって、
負荷用量を含む治療上有効量の抗ＣＤ４０抗体を対象に投与することを含む、
方法。
【請求項２】
抗ＣＤ４０抗体が、
ａ）配列番号：９〜配列番号：１１からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：１２〜配列番号：１５からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ２配列及び配列番号：１６〜配列番号：１７からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ３配列と、
ｂ）配列番号：１８〜配列番号：２１からなる群より選択される配列を有する軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：２２〜配列番号：２３の軽鎖ＣＤＲ２配列及び配列番号：２４〜配列番号：２５からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ３配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記抗体が、配列番号：１０の重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：１３の重鎖ＣＤＲ２配列及び配列番号：１６の重鎖ＣＤＲ３配列を含み、ここで、前記抗体が、配列番号：１９の軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：２２の軽鎖ＣＤＲ２配列及び配列番号：２４の軽鎖ＣＤＲ３配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
抗ＣＤ４０抗体が、配列番号：９の重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：１４の重鎖ＣＤＲ２配列及び配列番号：１６の重鎖ＣＤＲ３配列を含み、ここで、前記抗体が、配列番号：２０の軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：２２の軽鎖ＣＤＲ２配列及び配列番号：２４の軽鎖ＣＤＲ３配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
抗ＣＤ４０抗体が、配列番号：１１の重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：１５の重鎖ＣＤＲ２配列及び配列番号：１７の重鎖ＣＤＲ３配列を含み、前記抗体が、配列番号：２１の軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：２３の軽鎖ＣＤＲ２配列及び配列番号：２５の軽鎖ＣＤＲ３配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
抗ＣＤ４０抗体が、
配列番号：４４の重鎖可変領域及び配列番号：４３の軽鎖可変領域、
配列番号：５３の重鎖可変領域及び配列番号：５２の軽鎖可変領域又は
配列番号：５８の重鎖可変領域及び配列番号：５６の軽鎖可変領域を含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
抗ＣＤ４０抗体が、
配列番号：３０の重鎖及び配列番号：２６の軽鎖、
配列番号：３５の重鎖及び配列番号：３１の軽鎖又は
配列番号：４０の重鎖及び配列番号：３６の軽鎖を含む、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般的には、診断及び治療用途のためのヒト化抗ＣＤ４０抗体に関する。より具体的には、ヒト化抗ＣＤ４０抗体及びＣＤ４０を発現する細胞により特徴付けられる種々の疾患又は障害の処置のための使用方法が開示される。ヒト化抗ＣＤ４０抗体を含む医薬組成物及びキットも開示される。
【０００２】
発明の背景
ＣＤ４０は、４８kDaのＩ型内在性膜糖タンパク質であり、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプタースーパーファミリーのメンバーである。ＣＤ４０は、正常及び腫瘍性Ｂ細胞、指状突起細胞、癌腫、上皮細胞（例えば、ケラチノサイト）、線維芽細胞（例えば、滑膜細胞）及び血小板を含む各種の細胞型において発現される。ＣＤ４０は、単球、マクロファージ、一部の内皮細胞及び濾胞樹状細胞にも存在する。ＣＤ４０は、Ｂ細胞の個体発生の初期に発現され、ＣＤ１０及びＣＤ１９の出現に続いてＢ細胞前駆体に現れ、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ２４の発現及び表面免疫グロブリンＭ（ｓＩｇＭ）の出現に先立って現れる（Uckun et al., 1990, Blood 15:2449）。ＣＤ４０は、扁桃及び骨髄由来形質細胞でも検出されている（Pellat-Decounynck et al., 1994, Blood 84:2597）。
【０００３】
ＣＤ４０のリガンドは、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであるＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４、ｇｐ３９及びＴＲＡＰとも呼ばれる）である。ＣＤ４０Ｌは、活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の小さなサブセットにおいて主に発現される膜貫通型タンパク質である（Van Kooten C. and Banchereau, 2000にレビューされている）。
【０００４】
ＣＤ４０とＣＤ４０Ｌとの相互作用は、体液性免疫応答と細胞媒介性免疫応答との両方を誘引する。ＣＤ４０は、このリガンド−レセプターペアをレギュレーションして、Ｂ細胞及び樹状細胞（ＤＣ）を含む他の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を活性化する（Toubi and Shoenfeld, 2004；Kiener, et al., 1995にレビューされている）。Ｂ細胞でのＣＤ４０の機能は広く研究されてきた。Ｂ細胞でのＣＤ４０の活性化は、増殖、抗体分泌細胞への分化及び二次リンパ器官の胚中心におけるアイソタイプスイッチングを誘引する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究では、ＣＤ４０活性化がサイトカイン産生（ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、ＬＴ−α）、接着分子及び共刺激レセプター（ＩＣＡＭ、ＣＤ２３、ＣＤ８０及びＣＤ８６）の発現並びにＢリンパ球によるＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ及びＴＡＰトランスポーターの発現増加に直接影響することが示されている（Liu, et al., 1996）。これらのプロセスのほとんどについて、ＣＤ４０は、サイトカイン又は他のレセプター−リガンド相互作用のいずれかと協調して作用する。
【０００５】
単球及びＤＣでのＣＤ４０シグナル伝達により、生存性の向上及びサイトカイン（ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α及びＭＩＰ−１α）の分泌がもたらされる。また、これらのＡＰＣでのＣＤ４０連結により、共刺激分子、例えば、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３、ＣＤ８０及びＣＤ８６のアップレギュレーションももたらされる。ＣＤ４０レセプターの活性化は、Ｔ細胞活性化を駆動する効率的なＡＰＣへのＤＣの完全な成熟を可能にする重要なシグナルの１つである（Banchereau and Steinman, 1998、Van Kooten C. and Banchereau, 2000）。
【０００６】
マウスモデルでの近年の研究から、樹状細胞でのＣＤ４０シグナル伝達は、関節炎及び多発性硬化症等の疾患における自己免疫のメディエーターと考えられているＴＨ１７細胞の生成にも重要な役割を果たしていることが示された（Iezzi, et al., 2009、Perona-Wright, et al., 2009）。
【０００７】
ＣＤ４０及びＣＤ４０Ｌノックアウトマウス並びにアゴニスト及びアンタゴニスト抗マウス抗体の利用可能性から、幾つかの疾患モデルにおけるＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用の役割を研究する可能性が提供された。遮断性抗ＣＤ４０Ｌの投与は、ＳＮＦ１マウスにおけるループス腎炎又はＮＯＤマウスにおける糖尿病等の自然発症疾患又はコラーゲン誘引関節炎（ＣＩＡ）もしくは実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）等の実験的に誘引された形態の疾患を含む自己免疫の幾つかのモデルにおいて有益であることが実証されている（Toubi and Shoenfeld, 2004）。マウスでのＣＩＡは、抗ＣＤ４０Ｌ  ｍＡｂにより阻害され、このｍＡｂにより、関節の炎症の進行、コラーゲンに対する血清抗体価、軟骨及び骨のびらんに加えて、滑膜下組織への炎症細胞の浸潤が遮断された（Durie, et al., 1993）。ループス腎炎とＥＡＥとの両方について、抗ＣＤ４０Ｌにより、進行中の疾患を軽減することもできることが実証され、疾患のエフェクター相におけるＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌの役割が確認された（Kalled, et al., 1998；Howard, et al., 1999）。
【０００８】
ＥＡＥ発症におけるＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用の役割は、ミエリン塩基性タンパク質に特異的なトランスジェニックＴ細胞レセプターを有するＣＤ４０Ｌ欠損マウスでも研究された。これらのマウスは、抗原によるプライミング後にＥＡＥを発症することができず、ＣＤ４＋Ｔ細胞は静止したままであり、ＩＮＦ−γを産生しなかった（Grewal, et al., 1996）。
【０００９】
さらに、ＣＤ４０に対する阻害抗体は、炎症性疾患モデル、例えば、ＥＡＥにおいて有益な効果を示した。Lamannらにより、アンタゴニストマウス抗ヒトＣＤ４０  ｍｕ５Ｄ１２及びこのｍＡｂのキメラバージョンが非近交系のキヌサルにおける慢性脱髄性ＥＡＥの臨床的発現を効果的に防止することが実証された（Laman, et al., 2002；Boon, et al., 2001）。追跡研究から、キメラ抗ヒトＣＤ４０抗体による治療的処置により、マーモセットＥＡＥモデルにおいて、ＭＲＩで検出可能な炎症が減少し、既存の脳病変の拡大が遅くなることが示された（Hart, et al., 2005）。
【００１０】
アゴニスト活性を有する抗ＣＤ４０抗体が、関節炎のマウスモデルで試験され、幾らか矛盾する結果が得られた。免疫刺激剤について予測されるように、アゴニスト抗マウスＣＤ４０  ｍＡｂ  ＦＧＫ４５は、ＣＩＡのＤＢＡ／１マウスモデルにおいて疾患を悪化させることが示された（Tellander, et al., 2000）。一方、別の慢性ＣＩＡモデルＦＧＫ４５及び別のアゴニスト抗マウスＣＤ４０  ｍＡｂ  ３／２３では、両方とも、ポジティブな治療効果が示された（Mauri, et al., 2000）。この研究グループは、この処置計画におけるアゴニスト抗体がＩＦＮ−γレベルの低下とＩＬ−４及びＩＬ−１０レベルの向上を伴うＴｈ２応答への免疫偏位を誘引することにより有益な効果を有すると仮定した（Mauri, et al., 2000）。
【００１１】
ＣＤ４０／ＣＤ１５４相互作用を遮断することによる移植拒絶反応の予防も立証されている。アカゲザルでの腎同種移植片研究におけるキメラ抗ＣＤ４０アンタゴニストであるｃｈ５Ｄ１２の使用により、ＣＤ４０の拮抗作用が、疾患修飾及び１００日を超える平均生存期間の延長に十分であることが示される。ｃｈ５Ｄ１２を抗ＣＤ８６抗体と併用し、同種移植片研究の開始時にのみ与え、続けて、シクロスポリンによる処置を延長した場合、４年を超える平均生存期間が達成された。このことから、この併用により、寛容性が誘引される可能性があることが示されている（Haanstra, et al., 2005）。
【００１２】
このように、効率的なＴ細胞依存性免疫応答の駆動におけるＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ二分子（ｄｙａｄ）の重要な役割についての証拠を提供する十分な前臨床研究が存在する。したがって、ＣＤ４０シグナル伝達の遮断は、ＲＡ、多発性硬化症又は乾癬等の疾患における病原性自己免疫応答をサプレッションするための適切かつ必要な治療戦略であると認識される。しかしながら、これまでに、開発中の抗ＣＤ４０抗体が重大な副作用を有することが示された知見により、このような疾患の治療的介在のために承認されたＣＤ４０抗体は存在しない。このため、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌの作用に介在し、ＣＤ４０シグナル伝達を遮断するのに使用することができる治療剤に対する重大な必要性が依然として存在する。この必要性には、ＣＤ４０に特異的に結合し、抗原結合特異性、親和性及びＣＤ４０に基づく障害の治療的介在においてその使用が可能となる薬物動態学的及び薬力学的特性を示す、新規なヒト化抗ＣＤ４０抗体により対処することができる。
【００１３】
発明の概要
本発明は、ヒト化モノクローナル抗体であって、前記抗体が１nM未満のアンタゴニスト活性ＩＣ５０を有して、ヒトＣＤ４０に特異的に結合し、Ｂ細胞増殖に１００μg/mlまで受容体活性化作用を有さず、ここで、前記抗体が非ヒト霊長類において少なくとも１０日のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有することをさらに特徴とする、ヒト化モノクローナル抗体を提供する。
【００１４】
該ヒト化モノクローナル抗体は、該抗体が３０mg/kg未満の用量で、カニクイザルにおいて８日を超える半減期を有することをさらに特徴とすることができる。
【００１５】
例示的な実施態様では、本発明の抗体は、配列番号：１〜配列番号：４のいずれかからなる群より選択される重鎖配列と、配列番号：５〜配列番号：８のいずれかからなる群より選択される軽鎖配列とを含む。
【００１６】
他の実施態様では、該抗体は、配列番号：１〜４、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５３、配列番号：５７、配列番号：５８、配列番号：５９、配列番号：６０、配列番号：６１、配列番号：６２、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番号：６５、配列番号：６６、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９、配列番号：７０、配列番号：７１、配列番号：７２又は配列番号：７３のいずれかの重鎖可変領域アミノ酸配列を有する抗体のヒト化抗体又は抗原結合フラグメントである。
【００１７】
他の実施態様では、該抗体は、配列番号：５〜配列番号：８、配列番号：２６、配列番号：３１、配列番号：３６、配列番号：４１、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５０、配列番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５５、配列番号：５６、配列番号：７４、配列番号：７５又は配列番号：７６の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む抗体のヒト化抗体又は抗原結合フラグメントである。
【００１８】
具体的な実施態様では、本明細書で記載されたモノクローナル抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、ここで、重鎖ＣＤＲ１配列が、配列番号：９〜配列番号：１１からなる群より選択され、重鎖ＣＤＲ２配列が、配列番号：１２〜配列番号：１５からなる群より選択され、重鎖ＣＤＲ３配列が、配列番号：１６〜配列番号：１７からなる群より選択され、ここで、軽鎖ＣＤＲ１配列が、配列番号：１８〜配列番号：２１からなる群より選択される配列を有し、軽鎖ＣＤＲ２配列が、配列番号：２２〜配列番号：２３からなる群より選択される配列を有し、軽鎖ＣＤＲ３配列が、配列番号：２４〜配列番号：２５からなる群より選択されることを特徴とする。
【００１９】
具体的な実施態様では、本明細書で記載されたモノクローナル抗体は、該抗体が配列番号：１０の重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：１３の重鎖ＣＤＲ２配列及び配列番号：１６の重鎖ＣＤＲ３配列を含み、ここで、前記抗体が、配列番号：１９の軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：２２の軽鎖ＣＤＲ２配列及び配列番号：２４の軽鎖ＣＤＲ３配列を含むことを特徴とする。
【００２０】
他の具体的な実施態様では、本明細書で記載されたモノクローナル抗体は、該抗体が配列番号：９の重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：１４の重鎖ＣＤＲ２配列及び配列番号：１６の重鎖ＣＤＲ３配列を含み、ここで、前記抗体が、配列番号：２０の軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：２２の軽鎖ＣＤＲ２配列及び配列番号：２４の軽鎖ＣＤＲ３配列を含むことを特徴とする。
【００２１】
別の具体的な実施態様では、本明細書で記載されたモノクローナル抗体は、該抗体が配列番号：９の重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：１４の重鎖ＣＤＲ２配列及び配列番号：１６の重鎖ＣＤＲ３配列を含み、ここで、前記抗体が、配列番号：２０の軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：２２の軽鎖ＣＤＲ２配列及び配列番号：２４の軽鎖ＣＤＲ３配列を含むことを特徴とする。
【００２２】
別の具体的な実施態様では、本明細書で記載されたモノクローナル抗体は、該抗体が配列番号：１１の重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：１５の重鎖ＣＤＲ２配列及び配列番号：１７の重鎖ＣＤＲ３配列を含み、前記抗体が、配列番号：２１の軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号：２３の軽鎖ＣＤＲ２配列及び配列番号：２５の軽鎖ＣＤＲ３配列を含むことを特徴とする。
【００２３】
また、本明細書において、本発明の好ましい抗体の重鎖についての個々の配列も記載される。本発明は、例えば、配列番号：１〜４のいずれか１つの重鎖可変ドメイン配列を含む抗ＣＤ４０抗体に関する。抗ＣＤ４０抗体は、配列番号：５〜配列番号：８のいずれか１つの軽鎖可変ドメイン配列を含むことをさらに特徴とする。
【００２４】
配列番号：２７及び配列番号：２６それぞれ；配列番号：２８及び配列番号：２６それぞれ；配列番号：２９及び配列番号：２６それぞれ；配列番号：３０及び配列番号：２６それぞれ；配列番号：３２及び配列番号：３１それぞれ；配列番号：３３及び配列番号：３１それぞれ；配列番号：３４及び配列番号：３１それぞれ；配列番号：３５及び配列番号：３１それぞれ；配列番号：３７及び配列番号：３６それぞれ；配列番号：３８及び配列番号：３６それぞれ；配列番号：３９及び配列番号：３６それぞれ；配列番号：４０及び配列番号：３６それぞれのアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変領域を有する、ヒト化抗体又は抗体フラグメントも企図される。
【００２５】
別の実施態様では、本発明は、配列番号：２７及び配列番号：２６それぞれのアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変領域を有する、ヒト化抗体又は抗体フラグメントに関する。
【００２６】
別の実施態様では、本発明は、配列番号：２８及び配列番号：２６それぞれのアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変領域を有する、ヒト化抗体又は抗体フラグメントに関する。
【００２７】
別の実施態様では、本発明は、配列番号：２９及び配列番号：２６それぞれのアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変領域を有する、ヒト化抗体又は抗体フラグメントに関する。
【００２８】
別の実施態様では、本発明は、配列番号：３０及び配列番号：２６それぞれのアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変領域を有する、ヒト化抗体又は抗体フラグメントに関する。
【００２９】
別の実施態様では、本発明は、配列番号：３２及び配列番号：３１それぞれのアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変領域を有する、ヒト化抗体又は抗体フラグメントに関する。
【００３０】
別の実施態様では、本発明は、配列番号：３３及び配列番号：３１それぞれのアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変領域を有する、ヒト化抗体又は抗体フラグメントに関する。
【００３１】
別の実施態様では、本発明は、配列番号：３４及び配列番号：３１それぞれのアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変領域を有する、ヒト化抗体又は抗体フラグメントに関する。
【００３２】
別の実施態様では、本発明は、配列番号：３５及び配列番号：３１それぞれのアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変領域を有する、ヒト化抗体又は抗体フラグメントに関する。
【００３３】
別の実施態様では、本発明は、配列番号：３７及び配列番号：３６それぞれのアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変領域を有する、ヒト化抗体又は抗体フラグメントに関する。
【００３４】
別の実施態様では、本発明は、配列番号：３８及び配列番号：３６それぞれのアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変領域を有する、ヒト化抗体又は抗体フラグメントに関する。
【００３５】
別の実施態様では、本発明は、配列番号：３９及び配列番号：３６それぞれのアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変領域を有する、ヒト化抗体又は抗体フラグメントに関する。
【００３６】
別の実施態様では、本発明は、配列番号：４０及び配列番号：３６それぞれのアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変領域を有する、ヒト化抗体又は抗体フラグメントに関する。
【００３７】
別の実施態様は、ヒトＣＤ４０に特異的に結合し、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９又は配列番号：３０のヒト可変ドメイン重鎖アミノ酸配列のフレームワーク領域のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有するフレームワーク領域を含むヒト化重鎖可変ドメインを含み、配列番号：２６の対応する軽鎖可変ドメインと少なくとも９０％同一の軽鎖アミノ酸配列を含む、単離された抗体又は抗原結合フラグメントに関する。
【００３８】
別の実施態様は、ヒトＣＤ４０に特異的に結合し、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４又は配列番号：３５のヒト可変ドメイン重鎖アミノ酸配列のフレームワーク領域のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有するフレームワーク領域を含むヒト化重鎖可変ドメインを含み、配列番号：３１の対応する軽鎖可変ドメインと少なくとも９０％同一の軽鎖アミノ酸配列を含む、単離された抗体又は抗原結合フラグメントに関する。
【００３９】
別の態様では、本発明は、重鎖アミノ酸配列が配列番号：３２であり、別の実施態様では、重鎖アミノ酸配列が配列番号：３３であり、別の実施態様では、重鎖アミノ酸配列が配列番号：３４であり、別の実施態様では、重鎖アミノ酸配列が配列番号：３５である、すぐ上の実施態様で記載された単離された抗体又は抗原結合フラグメントに関する。
【００４０】
ヒトＣＤ４０に特異的に結合し、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９又は配列番号：４０のヒト可変ドメイン重鎖アミノ酸配列のフレームワーク領域のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有するフレームワーク領域を含むヒト化重鎖可変ドメインを含み、配列番号：３６の対応する軽鎖と少なくとも９０％同一の軽鎖アミノ酸配列を含む、単離された抗体又は抗原結合フラグメントも企図される。
【００４１】
別の態様では、本発明は、重鎖アミノ酸配列が配列番号：３７であり、別の実施態様では、重鎖アミノ酸配列が配列番号：３８であり、別の実施態様では、重鎖アミノ酸配列が配列番号：３９であり、別の実施態様では、重鎖アミノ酸配列が配列番号：４０である、すぐ上の実施態様で記載された単離された抗体又は抗原結合フラグメントに関する。
【００４２】
本発明の抗体は、前記抗体がＣＤ４０Ｌの非存在下ではＢ細胞からのサイトカインの産生を刺激しないことをさらに特徴とすることができる。
【００４３】
本発明の抗体は、前記抗体が５０％ ヒト血清の存在下でヒトＣＤ４０に結合し、ｏｎレートが２倍未満に低下することをさらに特徴とすることができる。
【００４４】
本発明の抗体は、さらに、前記抗体が１mg/kgの濃度でほ乳類におけるＩｇＭ及びＩｇＧ産生の阻害を生じさせることを特徴とすることができる。
【００４５】
本発明の抗体は、種々の治療方法、予防方法、診断方法及び他の方法に使用することができる。例えば、本発明は、ほ乳類におけるヒトＣＤ４０の機能を遮断する方法であって、前記ほ乳類に、前記ほ乳類におけるＣＤ４０媒介性免疫応答を遮断するのに十分な量で本発明の抗体を含む組成物を投与することを含む、方法を記載する。
【００４６】
本明細書において、ほ乳類における移植片対宿主病を治療し又は改善する方法であって、前記ほ乳類に、前記ほ乳類における移植片対宿主病の１種以上の症状を減少させるのに十分な量で本発明の抗体を含む組成物を投与することを含む、方法も企図される。
【００４７】
例として、自己免疫疾患又は炎症性疾患は、関節リウマチ、ループス腎炎、多発性硬化症、増殖性ループス糸球体腎炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、乾癬、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、クローン病及び全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、甲状腺中毒症／グレーブス病、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、自己免疫性心臓炎、アジソン病、早発閉経、１型糖尿病、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、特発性白血球減少症、原発性胆汁性肝硬変、活動性慢性肝炎（ＨＢｓ  Ａｇ陰性）、特発性肝硬変、シェーグレン症候群、皮膚筋炎、強皮症、混合性結合組織病、円板状エリテマトーデス及び全身性血管炎を含むことができるが、これらに限定されない。例示的な実施態様では、ほ乳類は、関節リウマチを有する。
【００４８】
本発明の方法は、ＴＮＦアンタゴニスト、疾患修飾抗リウマチ剤、ＣＴＬＡ４アンタゴニスト、抗ＩＬ−６レセプター  ｍＡｂ及び抗ＣＤ２０  ｍＡｂからなる群より選択される第２の治療剤を投与することをさらに含むことができる。
【００４９】
具体的な実施態様では、炎症性疾患又は自己免疫疾患は、ＣＤ４０及びＣＤ２０の両方を発現する細胞と関連する炎症性疾患又は自己免疫疾患である。
【００５０】
具体的な方法では、処置は、抗体組成物を非経口投与経路により投与することを含む。
【００５１】
具体的な方法では、処置は、抗体組成物を静脈内又は皮下に投与することを含む。
【００５２】
本発明の更なる方法は、ヒト患者におけるＢ細胞による抗体産生を阻害することを含み、前記ヒト患者に、有効量の本発明の抗ＣＤ４０抗体を投与することを含む。
【００５３】
より具体的には、ヒト患者は、ＣＤ４０発現細胞と関連する炎症性疾患又は自己免疫疾患を有する。
【００５４】
例示的な実施態様では、ヒト患者は、関節リウマチ、多発性硬化症、増殖性ループス糸球体腎炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、乾癬、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、クローン病及び全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、甲状腺中毒症／グレーブス病、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、自己免疫性心臓炎、アジソン病、早発閉経、１型糖尿病、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、特発性白血球減少症、原発性胆汁性肝硬変、活動性慢性肝炎（ＨＢｓ  Ａｇ陰性）、特発性肝硬変、シェーグレン症候群、皮膚筋炎、強皮症、混合性結合組織病、円板状エリテマトーデス及び全身性血管炎からなる群より選択される自己免疫疾患又は炎症性疾患からなる群より選択される自己免疫疾患を患っている。
【００５５】
本発明の別の方法は、ヒトＣＤ４０抗原を発現している細胞の増殖を阻害することであって、抗体又はその抗原結合フラグメントを該細胞に投与することを含み、この抗体又はその抗原結合フラグメントがヒト細胞表面ＣＤ４０抗原に特異的に結合し、ここで、抗体又はその抗原結合フラグメントのＣＤ４０抗原への結合が細胞の増殖又は分化を阻害する、阻害に関する。
【００５６】
また、ＣＤ４０関連障害を有する対象を処置する方法であって、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントを該対象に投与することを含み、この抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトＣＤ４０に特異的に結合し、ここで、この抗体又はその抗原結合フラグメントのＣＤ４０への結合は、このＣＤ４０関連障害の細胞の増殖又は分化を阻害する、方法も企図される。該細胞は、Ｂリンパ芽球様細胞、膵臓細胞、肺細胞、乳房細胞、卵巣細胞、結腸細胞、前立腺細胞、皮膚細胞、頭頸部細胞、膀胱細胞、骨細胞又は腎臓細胞であることができるが、これらに限定されない。
【００５７】
細胞の増殖又は分化を阻害するための処置方法は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、慢性リンパ球性白血病、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症又はカポジ肉腫の処置に有用であることができる。
【００５８】
また、末梢Ｂ細胞の枯渇を誘引するための方法であって、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントを該細胞に投与することを含み、この抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒト細胞表面ＣＤ４０抗原に特異的に結合し、ここで、この抗体又は抗原結合フラグメントのＣＤ４０抗原への結合は、該細胞の枯渇を誘引する、方法も企図される。
【００５９】
具体的な実施態様では、該抗体又は抗原結合フラグメントは、免疫障害を有する対象に投与される。例えば、免疫疾患は、関節リウマチ又は全身性エリテマトーデスである。
【００６０】
また、対象における関節リウマチを処置する方法であって、本発明の抗体を前記対象に投与することを含み、ここで、前記抗体は、前記対象におけるＣＤ４０の機能を遮断するアンタゴニスト抗体である、方法も企図される。
【００６１】
また、対象における全身性エリテマトーデス又はループス腎炎を処置する方法であって、本発明の抗体を該対象に投与することを含み、ここで、前記抗体は、前記対象におけるＣＤ４０の機能を遮断するアンタゴニスト抗体である、方法も企図される。
【００６２】
好ましくは、該抗体は、前記対象におけるＢ細胞分化及び抗体アイソタイプスイッチングを阻害するのに有効な量で投与される。
【００６３】
他の実施態様では、該抗体は、前記対象のＴ細胞及びマクロファージにおけるサイトカイン及びケモカインの産生並びに接着分子のアップレギュレーションを阻害するのに有効な量で投与される。好ましくは、該抗体は、前記対象における樹状細胞の活性化を阻害するのに有効な量で投与される。
【００６４】
他の実施態様では、該方法は、前記対象における炎症誘発性サイトカイン、ケモカイン、マトリックスメタロプロテイナーゼ、プロスタグランジンの産生を阻害し、非免疫細胞における接着分子をダウンレギュレーションするのに有効な量で投与されることをさらに特徴とする。
【００６５】
具体的な実施態様では、該抗体は、メトトレキサートの投与及び／又はEnbrel/Humiraの投与を含む計画と組み合わせて投与される。
【００６６】
治療を受ける対象は、関節リウマチを有し、メトトレキサート処置単独に非応答性であったものである。
【００６７】
具体的な実施態様では、該方法は、メトトレキサートの投与及び／又はEnbrel/Humiraの投与を含む計画で、前記対象を処置することを含む。
【００６８】
本発明の方法は、前記アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体による前記対象の処置がメトトレキサート単独、Enbrel単独、Enbrel＋メトトレキサートの組み合わせによる処置より優れた効力を有することをさらに特徴とすることができる。
【００６９】
本発明の方法は、前記アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体による前記対象の処置がメトトレキサートに対する不十分な応答を有した患者において、Enbrel＋ＭＴＸによる処置より優れた効力を有することをさらに特徴とすることができる。
【００７０】
具体的な実施態様では、該抗体は、抗ＴＮＦ剤を含む計画と組み合わせて投与される。
【００７１】
具体的な実施態様では、対象は、関節リウマチを有し、抗ＴＮＦ剤単独での治療に応答しなかったものとして特徴付けられる。このような実施態様では、該方法は、前記アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体と組み合わせた抗ＴＮＦ剤による処置を含む計画で前記対象を処置することを含むことができる。
【００７２】
具体的な実施態様では、前記アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体による前記対象の処置は、抗ＴＮＦ剤による処置より優れた効力を有する。
【００７３】
さらに他の実施態様では、該方法は、前記アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体による前記対象の処置が抗ＴＮＦ剤単独に対して不十分な応答を有する患者において、Orencia又はRituxanによる処置より優れた効力を有することを特徴とする。
【００７４】
本発明は、さらに、（ｉ）本明細書で記載された抗体又は抗原結合フラグメントと、（ｉｉ）薬学的に許容し得る賦形剤とを含む、医薬組成物を企図する。このような組成物において、該抗体又はその抗原結合フラグメントは、有利には、第２の薬剤、例えば、細胞傷害剤、ＰＥＧキャリア、酵素又はマーカー等にコンジュゲートさせることができる。
【００７５】
また、本明細書において、配列番号：１〜４、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５３、配列番号：５７、配列番号：５８、配列番号：５９、配列番号：６０、配列番号：６１、配列番号：６２、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番号：６５、配列番号：６６、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９、配列番号：７０、配列番号：７１、配列番号：７２又は配列番号：７３のいずれかの重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする、単離されたポリヌクレオチドも企図される。
【００７６】
また、本明細書において、配列番号：５〜配列番号：８、配列番号：２６、配列番号：３１、配列番号：３６、配列番号：４１、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５０、配列番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５５、配列番号：５６、配列番号：７４、配列番号：７５又は配列番号：７６のいずれかの軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする、単離されたポリヌクレオチドも企図される。
【００７７】
本発明は、さらに、ほ乳類におけるヒトＣＤ４０の機能を遮断するための医薬の製造のためのものであり、ここで、該医薬は、前記ほ乳類におけるＣＤ４０媒介性免疫応答を遮断する、本明細書で記載された抗体の使用に関する。
【００７８】
実施態様において、本発明は、ほ乳類における移植片対宿主病を治療し又は改善するための、医薬の製造に関する。
【００７９】
例示的な実施態様では、該医薬は、関節リウマチ、ループス腎炎、多発性硬化症、増殖性ループス糸球体腎炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、乾癬、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、クローン病及び全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、甲状腺中毒症／グレーブス病、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、自己免疫性心臓炎、アジソン病、早発閉経、１型糖尿病、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、特発性白血球減少症、原発性胆汁性肝硬変、活動性慢性肝炎（ＨＢｓ  Ａｇ陰性）、特発性肝硬変、シェーグレン症候群、皮膚筋炎、強皮症、混合性結合組織病、円板状エリテマトーデス及び全身性血管炎からなる群より選択される自己免疫疾患又は炎症性疾患の処置のために製造される。
【００８０】
一部の実施態様では、該医薬は、ＴＮＦアンタゴニスト、疾患修飾抗リウマチ剤、ＣＴＬＡ４アンタゴニスト、抗ＩＬ−６レセプター  ｍＡｂ及び抗ＣＤ２０  ｍＡｂからなる群より選択される第２の治療剤をさらに含むことができる。
【００８１】
該医薬は、非経口投与経路で使用するために製造することができる。該医薬は、静脈内又は皮下で使用するために製造することができる。
【００８２】
別の実施態様は、ヒト患者におけるＢ細胞による抗体産生の阻害のための医薬の製造のための、本明細書で記載された抗体の使用を企図する。
【００８３】
別の実施態様は、ヒトＣＤ４０抗原を発現する細胞の増殖及び／又は分化を阻害するための医薬の製造のための、本明細書で記載された抗体の使用を企図する。
【００８４】
別の実施態様は、ＣＤ４０関連障害を有する対象の処置のための医薬の製造のためのものであり、ここで、前記医薬中の抗体又は抗原結合フラグメントのＣＤ４０への結合は、ＣＤ４０関連障害の細胞の増殖又は分化を阻害する、本明細書で記載された抗体の使用を企図する。
【００８５】
該医薬は、Ｂリンパ芽球様細胞、膵臓細胞、肺細胞、乳房細胞、卵巣細胞、結腸細胞、前立腺細胞、皮膚細胞、頭頸部細胞、膀胱細胞、骨細胞又は腎臓細胞から選択されるＣＤ４０関連障害の細胞の処置に使用するために製造することができる。
【００８６】
該医薬は、慢性リンパ性白血病、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症又はカポジ肉腫の処置に使用するために製造することができる。
【００８７】
別の実施態様は、末梢Ｂ細胞の枯渇を誘引するための医薬の製造におけるものであり、ここで、該医薬の抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒト細胞表面ＣＤ４０抗原に特異的に結合し、ここで、該抗体又は抗原結合フラグメントのＣＤ４０抗原への結合は、該細胞の枯渇を誘引する、本発明の抗体の使用を企図する。
【００８８】
該医薬は、免疫障害を有する対象の処置における使用のために製造することができる。
【００８９】
該医薬は、関節リウマチ又は全身性エリテマトーデスの処置における使用のために製造することができる。
【００９０】
別の実施態様は、対象における関節リウマチの処置のための医薬の製造における、本発明の抗体の使用を企図する。
【００９１】
別の実施態様は、対象における全身性エリテマトーデス又はループス腎炎の処置のための薬剤の製造における、本発明の抗体の使用を企図する。
【００９２】
該医薬は、前記対象におけるＢ細胞分化及び抗体アイソタイプスイッチングの阻害における使用のために製造することができる。
【００９３】
該医薬は、前記対象におけるサイトカイン及びケモカイン産生の阻害並びにＴ細胞及びマクロファージにおける接着分子のアップレギュレーションにおける使用のために製造することができる。
【００９４】
該医薬は、前記対象における樹状細胞の活性化の阻害に使用するために製造することができる。
【００９５】
該医薬は、前記対象における炎症誘発性サイトカイン、ケモカイン、マトリックスメタロプロテイナーゼ、プロスタグランジンの産生の阻害及び非免疫細胞における接着分子のダウンレギュレーションにおける使用のために製造することができる。
【００９６】
特定の実施態様では、該医薬は、メトトレキサートの投与及び／又はEnbrel/Humiraの投与を含む計画と組み合わせて投与される組み合わせ医薬として製造される。
【００９７】
他の実施態様では、該医薬は、組み合わせ薬剤として製造され、該医薬は、本発明の抗体を含むことに加えて、抗ＴＮＦ剤をさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】図１は、単純な用量漸増設計を示す。Ｓ−ＦＵは、安全性追跡である。＊は、プラセボに無作為に割り振られた２名の対象と本発明の抗体に無作為に割り振られた８名の対象を指す。†は、Ｓ−ＦＵがコホート４について長かったことを指す（４２日に代えて５６日）。
【図２】図２は、８日目、１５日目及び２２日目（Ｃｐｒｅ）の本発明の抗体の前投与濃度並びに２９日目のトラフ濃度を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、異なる用量での処置によるＣＤ４０レセプター占有率の算術平均％を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、異なる用量によるＣＤ５４アップレギュレーションの％  阻害を示す。
【００９９】
発明の詳細な説明
現在では、ＣＤ４０媒介性シグナル伝達は、各種のターゲット疾患に関与していると認識されている。これらの障害への介在が治療上有益であるであろうことを示す各種の前臨床データが利用可能であるにもかかわらず、自己免疫疾患の処置に使用することができるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の必要性が依然として存在する。本発明は、好ましい実施態様では、ＣＤ４０を認識するヒト化抗体に関する。また、これらの抗体は、ＵＳ第８，５９１，９００号及びＷＯ第２０１１／１２３４８９号にも開示されている。これらの文献それぞれの内容は、参照により本明細書に組み入れられる。具体的な実施態様では、これらのヒト化抗体の配列は、特定のリードマウス抗体の配列に基づいて特定されている。
【０１００】
近年の治療法の進歩にもかかわらず、自己免疫疾患、例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス及びループス腎炎のための新たな処置には未だ満たされていない必要性が存在する。細胞表面レセプターＣＤ４０とそのリガンドＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）との相互作用は、体液性免疫及び細胞性免疫のレギュレーション並びにこれらの自己免疫疾患の病因において、中心的役割を果たすことが公知である。したがって、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用は、自己免疫疾患のモデュレーションのための魅力的なターゲットである。
【０１０１】
ＣＤ４０は、細胞表面レセプターであり、腫瘍壊死因子レセプターファミリーに属し、Ｂ細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、腎細胞及び他の非免疫細胞において発現される。ＣＤ４０は、Ｂ細胞並びに樹状細胞及びマクロファージを含む他の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を活性化することにより、抗原駆動性の獲得免疫の発達に関与する重要な共刺激分子であるが、非免疫常在細胞の活性化にも関与している４。ＣＤ４０Ｌは、腫瘍壊死因子スーパーファミリーのメンバーであり、主に、活性化Ｔ細胞並びに活性化Ｂ細胞及び血小板により発現される。ＣＤ４０がＣＤ４０Ｌに結合すると、Ｅ−セレクチン（ＣＤ６２Ｅ）、血管細胞接着分子−１（ＣＤ１０６）、細胞間接着分子−１（ＣＤ５４）のアップレギュレーションが生じ、それにより、白血球の辺縁趨向及び血管外漏出が増加する。
【０１０２】
ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用は、最適なＡＰＣ−Ｔ細胞活性化に必要であると考えられる。ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ経路は、Ｔ細胞応答の増幅に特に重要であると考えられており、幾つかの自己免疫疾患に関与している。ＣＤ４０シグナル伝達経路を遮断すると、ヘルパーＴ１（Ｔｈ１）細胞の分化及び免疫応答の維持が阻害されることが示されている。ＣＤ４０及びＣＤ４０Ｌの発現増加は、関節リウマチ患者における活動性疾患と関連している。Ｂ細胞及びＴ細胞におけるＣＤ４０Ｌレベルの上昇は、全身性エリテマトーデスにおける疾患活動性と関連し、メサンギウム細胞における腎ＣＤ４０発現は、クラスＩＩＩ及びクラスＩＶループス腎炎患者においてアップレギュレートされる。
【０１０３】
血栓塞栓症の偶発症のために、ＣＤ４０Ｌに対するモノクローナル抗体の以前の臨床開発は失敗であったが、この偶発症は、血小板の活性化及び凝集により開始されたものであり、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）血小板レセプターを活性化する抗ＣＤ４０Ｌ抗体のＦｃ領域による可能性がある。近年の研究では、機能的Ｆｃ領域を欠く抗体が、血栓塞栓性イベントを誘引せず、血小板を活性化できず、薬理活性及び臨床活性を保持することが示されている。
【０１０４】
実施態様において、本発明の抗体は、ＣＤ４０に選択的に結合し、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用を遮断するヒト化アンタゴニスト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体であり、アゴニスト活性を有さず、サイトカイン産生の刺激を防止するように設計された。Ｆｃ領域における２つの置換突然変異（Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ）を組み込んで、Ｆｃ媒介性抗体依存性又は補体媒介性細胞傷害性及び血小板活性化を防止した。本発明の抗体では、ヒト（ＥＣ９０＝６．８５±０．７４nM）及びカニクイザルＢ細胞の両方において、強力かつ同等の結合特性並びにアゴニズムを伴わないＣＤ４０Ｌ誘引末梢血単核細胞増殖の強力な阻害が実証された。血小板に結合しても、本発明の抗体は、血小板の活性化、凝集又は機能を変化させないと考えられる。カニクイザルでの前臨床評価において、本発明の抗体５０mg/kgまでを２６週間反復投与することにより、Ｂ細胞レベルの可逆的低下、リンパ器官胚中心の可逆的減少及び血栓塞栓イベント又は関連するサイトカイン放出を伴わない良好な全般的耐用性が実証された（及び未発表データ）。これらの評価における無毒性量は、投与された最高用量である５０mg/kgであった（未発表データ）。
【０１０５】
実施例９に示されたように、健康なボランティアでの単回上昇用量研究において、最大１２０mg 本発明の抗体の静脈内（ＩＶ）及び皮下（ＳＣ）単回用量の増加は十分に耐容性であり、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ経路を遮断する高い可能性を示した。本発明の抗体のＩＶ及びＳＣ投与の両方の後、ＣＤ４０レセプター占有率（ＲＯ）の用量関連増加及びＢ細胞活性化の阻害（ＣＤ５４アップレギュレーションの阻害により測定される）が観察された。
【０１０６】
「ＣＤ４０」及び「ＣＤ４０表面抗原」という用語は、正常及び腫瘍性Ｂ細胞の表面に発現される約４８kD 糖タンパク質を指し、細胞の増殖及び分化に関与するシグナルのレセプターとして作用する（Ledbetter et al., 1987, J. Immunol. 138:788-785）。バーキットリンパ腫細胞系統Ｒａｊｉから調製されたライブラリから、ＣＤ４０をコードするｃＤＮＡ分子が単離されている（Stamenkovic et al., 1989, EMBO J. 8:1403）。
【０１０７】
本明細書で使用する場合、ＣＤ４０を内因的に発現する細胞は、ＣＤ４０の表面発現により特徴付けられる任意の細胞であり、正常及び腫瘍性Ｂ細胞、指状突起細胞、基底上皮細胞、ガン細胞、マクロファージ、内皮細胞、濾胞樹状細胞、扁桃細胞及び骨髄由来形質細胞を含むが、これらに限定されない。一部の実施態様では、ＣＤ４０分子は、ヒトＣＤ４０分子である。
【０１０８】
本発明の抗体は、ヒトリコンビナント及びネイティブＣＤ４０に特異的に結合する。ヒト化モノクローナル抗体は、１nM未満のアゴニスト活性ＩＣ５０を有してヒトＣＤ４０に特異的に結合し、Ｂ細胞増殖において最大１００μg/mlの作動性を有さず、ここで、前記抗体は、非ヒト霊長類において少なくとも１０日のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有することをさらに特徴とする。
【０１０９】
好ましくは、抗体は、１nM未満のＥＣ５０を有してＣＤ４０−ＦｃコンジュゲートにおけるＣＤ４０に特異的に結合し、２．５nM未満のＥＣ５０を有してＣＤ４０発現細胞におけるＣＤ４０に特異的に結合する。抗体のアンタゴニスト特性は、１nM未満のＢ細胞又は樹状細胞アンタゴニスト活性ＩＣ５０を有するという点で定義される。該抗体は、さらに、他の抗ＣＤ４０抗体（例えば、抗ＣＤ４０抗体４Ｄ１１）と比較して、向上したｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有する優れた薬物動態特性を有する。
【０１１０】
本明細書で使用する場合、ＣＤ４０を発現する細胞は、ＣＤ４０の表面発現により特徴付けられる任意の細胞であり、正常及び腫瘍性Ｂ細胞、指状突起細胞、基底上皮細胞、ガン細胞、マクロファージ、内皮細胞、濾胞樹状細胞、扁桃細胞及び骨髄由来形質細胞を含むが、これらに限定されない。一部の実施態様では、ＣＤ４０分子は、ヒトＣＤ４０分子である。
【０１１１】
本発明の抗体は、特異的な「ＣＤ４０抗原エピトープ」及び「ＣＤ４０エピトープ」を認識する。本明細書で使用する場合、これらの用語は、抗ＣＤ４０抗体と免疫反応可能な分子（例えば、ペプチド）又は分子のフラグメントを指し、例えば、軽鎖配列番号：２６と重鎖配列番号：２７、２８、２９もしくは３０のいずれか；又は軽鎖配列番号：３１と重鎖配列番号：３２、３３、３４もしくは３５のいずれか；又は軽鎖配列番号：３６と重鎖配列番号：３７、３８、３９もしくは４０のいずれかとの重鎖／軽鎖配列の組合せを有する抗体のいずれかにより認識されるＣＤ４０抗原決定基を含む。ＣＤ４０抗原エピトープは、タンパク質、タンパク質フラグメント、ペプチド等に含まれることができる。エピトープは、最も一般的には、タンパク質、短いオリゴペプチド、オリゴペプチド模倣物（すなわち、ＣＤ４０抗原の抗体結合特性を模倣する有機化合物）又はそれらの組み合わせである。
【０１１２】
抗体又は免疫グロブリンの一般化された構造は、当業者に周知であり、これらの分子は、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成される、典型的には、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、１つのジスルフィド結合により重鎖に共有結合して、ヘテロ二量体を形成し、ヘテロ四量体分子は、該ヘテロ二量体の２つの同一の重鎖間の共有ジスルフィド結合を介して形成される。軽鎖及び重鎖同士は、１つのジスルフィド結合により結合されるが、２つの重鎖間のジスルフィド連結の数は、免疫グロブリンアイソタイプにより変化する。また、各重鎖及び軽鎖は、規則的に間隔を空けた鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、可変ドメイン（ＶＨ）、続けて、３つ又は４つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４）と、ＣＨ１とＣＨ２との間のヒンジ領域とを有する。各軽鎖は、２つのドメインであるアミノ末端可変ドメイン（ＶＬ）及び刈る簿記氏末端定常ドメイン（ＣＬ）を有する。ＶＬドメインは、ＶＨドメインと非共有的に会合する。一方、ＣＬドメインは、一般的には、ジスルフィド結合を介してＣＨ１ドメインと共有結合する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の界面を形成すると考えられている（Chothia et al., 1985, J. Mol. Biol. 186:651-663.）。
【０１１３】
可変ドメイン内の特定のドメインは、異なる抗体間で大きく異なる、すなわち、「超可変」である。これらの超可変ドメインは、その特異的抗原決定基に対する各特定の抗体の結合及び特異性に直接関与する残基を含有する。軽鎖及び重鎖可変ドメインの両方における過可変性は、相補性決定領域（ＣＤＲ）又は超可変ループ（ＨＶＬ）として公知の３つのセグメントに集中している。ＣＤＲは、Kabat et al., 1991, In: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.において、配列比較により定義される。一方、ＨＶＬは、Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917に記載されているように、可変ドメインの三次元構造に従って、構造的に定義される。これらの２つの方法により、ＣＤＲのわずかに異なる特定をもたらされる場合には、構造的定義が好ましい。Kabatに定義されているように、ＣＤＲ−Ｌ１は、軽鎖可変ドメインにおける約２４〜３４、ＣＤＲ−Ｌ２は、約５０〜５６、ＣＤＲ−Ｌ３は、約８９〜９７の残基に位置し、ＣＤＲ−Ｈ１は、重鎖可変ドメインにおける約３１〜３５、ＣＤＲ−Ｈ２は、約５０〜６５、ＣＤＲ−Ｈ３は、約９５〜１０２の残基に位置する。したがって、重鎖及び軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、所定の抗体に特異的な固有かつ機能的特性を規定する。
【０１１４】
重鎖及び軽鎖それぞれにおける３つのＣＤＲは、それほど可変でない傾向がある配列を含有するフレームワーク領域（ＦＲ）により分離される。重鎖及び軽鎖可変ドメインのアミノ末端からカルボキシ末端にかけて、ＦＲ及びＣＤＲは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４の順序で配置される。ＦＲの大部分のβ−シート構成は、各鎖内のＣＤＲ同士を近接させ、他の鎖からのＣＤＲにも近接させる。全てのＣＤＲ残基が、必ずしも抗原結合に直接関与するわけではないが、結果として生じるコンホメーションは、抗原結合部位に寄与する（Kabat et al., 1991, NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, pages 647-669を参照のこと）。
【０１１５】
ＦＲ残基及びＩｇ定常ドメインは、抗原結合に直接関与しないが、抗原結合に寄与し及び／又は抗体エフェクター機能を媒介する。幾つかのＦＲ残基は、少なくとも３つの方法：エピトープに非共有結合的に直接結合すること、１つ以上のＣＤＲ残基と相互作用すること及び重鎖と軽鎖との間の界面に影響を及ぼすことにより、抗原結合に重要な影響を有すると考えられる。定常ドメインは、抗原結合に直接関与しないが、種々のＩｇエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）における抗体の関与を媒介する。
【０１１６】
脊椎動物の免疫グロブリンの軽鎖は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）との２つの明らかに異なるクラスのうちの一方に割り当てられる。比較すると、ほ乳類の免疫グロブリンの重鎖は、定常ドメインの配列に従って、５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭのうちの１つに割り当てられる。ＩｇＧ及びＩｇＡは、さらに、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に分けられる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれ、α、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。ネイティブな免疫グロブリンのクラスのサブユニット構造及び三次元立体配置は周知である。
【０１１７】
「抗体」、「抗ＣＤ４０抗体」、「ヒト化抗ＣＤ４０抗体」及び「改変ヒト化抗ＣＤ４０抗体」という用語は、本明細書において、最も広い意味で使用され、特に、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）並びに所望の生物学的活性、例えば、ＣＤ４０結合を示す抗体フラグメント、例えば、抗体の可変ドメイン及び他の部分を包含する。
【０１１８】
「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）という用語は、実質的に均質な抗体の集団の抗体を指す。すなわち、その集団中の個々の抗体は、少量で存在する場合がある天然に存在する突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原決定基「エピトープ」に対して向けられる。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、同一のエピトープに対して向けられる抗体の実質的に均質な集団を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。モノクローナル抗体は、当技術分野において公知の任意の技術又は方法論（例えば、ハイブリドーマ法（Kohler et al., 1975, Nature 256:495）又は当技術分野において公知のリコンビナントＤＮＡ法（例えば、ＵＳ第４，８１６，５６７号を参照こと）又はClackson et al., 1991, Nature 352: 624-628及びMarks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581-597に記載された技術を使用するファージ抗体ライブラリーを使用してリコンビナントに産生されたモノクローナルの単離方法により調製することができると理解されるべきである。
【０１１９】
キメラ抗体は、ある種（例えば、非ヒトほ乳類、例えば、マウス）由来の抗体の重鎖及び軽鎖可変領域と、別の種（例えば、ヒト）抗体の重鎖及び軽鎖定常領域とからなり、第１の種（例えば、マウス）由来の抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を第２の種（例えば、ヒト）由来の抗体の定常領域のＤＮＡ配列に連結させ、連結させた配列を含有する発現ベクターでホストをトランスフォーメーションして、キメラ抗体を産生させることにより得ることができる。代替的には、キメラ抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の１つ以上の領域又はドメインが別の免疫グロブリンクラス又はアイソタイプ由来のモノクローナル抗体と同一、相同又は対応する配列の変異体であるか又はコンセンサス配列又は生殖系列配列由来のものであることもできる。キメラ抗体は、このような抗体のフラグメントを含むことができる。ただし、抗体フラグメントは、その親抗体の所望の生物学的活性、例えば、同じエピトープへの結合を示すという条件である（例えば、ＵＳ第４，８１６，５６７号及びMorrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855を参照のこと）。
【０１２０】
「抗体フラグメント」、「抗ＣＤ４０抗体フラグメント」、「ヒト化抗ＣＤ４０抗体フラグメント」、「変異体ヒト化抗ＣＤ４０抗体フラグメント」という用語は、全長抗ＣＤ４０抗体の一部を指し、可変領域又は機能的能力、例えば、特異的ＣＤ４０エピトープ結合が保持される。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ及びｓｃＦｖ−Ｆｃフラグメント、ディアボディ、線状抗体、一本鎖抗体、ミニボディ、抗体フラグメントから形成されるディアボディ及び抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体を含むが、これらに限定されない。
【０１２１】
全長抗体は、有用な抗体フラグメントを生成するために、酵素、例えば、パパイン又はペプシンで処理することができる。パパイン消化は、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合抗体フラグメント（それぞれ、単一の抗原結合部位を有する）と、残りの「Ｆｃ」フラグメントとを生成するのに使用される。また、Ｆａｂフラグメントは、軽鎖の定常領域及び重鎖のＣＨ１領域も含有する。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、それでも抗原と架橋可能なＦ（ａｂ’）２フラグメントが生成される。
【０１２２】
Ｆａｂ’フラグメントは、ＣＨ１ドメインのＣ末端における抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む付加的な残基の存在により、Ｆａｂフラグメントとは異なる。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、ヒンジ領域においてシステイン残基により連結しているＦａｂ’フラグメントのペアである。抗体フラグメントの他の化学結合も公知である。
【０１２３】
「Ｆｖ」フラグメントは、密接な非共有会合の１つの重鎖及び１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる完全な抗原認識及び結合部位を含有する。この構成では、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用し、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面に、抗原結合部位を画定する。まとめると、６個のＣＤＲにより、抗原結合特異性が抗体に付与される。
【０１２４】
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含む一本鎖Ｆｖ変異体であり、ここで、該ドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。一本鎖Ｆｖは、抗原を認識し、結合可能である。また、ｓｃＦｖポリペプチドは、場合により、ｓｃＦｖによる抗原結合のための所望の三次元構造の形成を容易にするために、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に位置するポリペプチドリンカーを含有することもできる（例えば、Pluckthun, 1994, In The Pharmacology of monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315を参照のこと）。
【０１２５】
他の認識された抗体フラグメントには、一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含み、一対の抗原結合領域を形成するものを含む。これらの「線状抗体」は、例えば、Zapata et al. 1995, Protein Eng. 8(10):1057-1062に記載されているように、二重特異性又は単特異性であることができる。
【０１２６】
ヒト化抗体又はヒト化抗体フラグメントは、免疫グロブリンアミノ酸配列変異体又はそのフラグメントを含み、所定の抗原に結合可能であり、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有する１つ以上のＦＲ及び非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有する１つ以上のＣＤＲを含む、特別な種類のキメラ抗体である。多くの場合「インポート」配列と呼ばれるこの非ヒトアミノ酸配列は、典型的には、「インポート」抗体ドメイン、特に、可変ドメインから得られる。一般的には、ヒト化抗体は、ヒト重鎖又は軽鎖可変ドメインのＦＲの間に挿入された非ヒト抗体のＣＤＲ又はＨＶＬを少なくとも含む。本発明は、ヒト生殖系列配列重鎖及び軽鎖可変ドメインのＦＲ間に挿入された、表３及び４に示されたマウスモノクローナル抗体に由来するＣＤＲを含有する特異的ヒト化抗ＣＤ４０抗体を記載する。特定のマウスＦＲ残基は、ヒト化抗体の機能に重要である場合があり、したがって、ヒト生殖系列配列重鎖及び軽鎖可変ドメイン残基の特定のものは、対応するマウス配列のものと同じであるように修飾されると理解されるであろう。
【０１２７】
別の態様では、ヒト化抗ＣＤ４０抗体は、全て又は実質的に全てのＣＤＲが非ヒト免疫グロブリンのものに対応する、少なくとも１つ、典型的には、２つの可変ドメイン（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ及びＦｖフラグメントに含まれるような）の実質的に全てを含み、具体的には、本明細書において、全てのＣＤＲが、本明細書における以下の表１〜４に詳述されるマウス配列であり、全て又は実質的に全てのＦＲが、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列又は生殖系列配列のものである。また、別の態様では、ヒト化抗ＣＤ４０抗体は、免疫グロブリンＦｃ領域の少なくとも一部、典型的には、ヒト免疫グロブリンのものも含む。通常、該抗体は、軽鎖及び重鎖の少なくとも可変ドメインの両方を含有するであろう。また、必要に応じて、該抗体は、重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３及び／又はＣＨ４領域のうちの１つ以上を含むことができる。
【０１２８】
ヒト化抗ＣＤ４０抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥを含む任意のクラスの免疫グロブリン並びにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２を含む任意のアイソタイプから選択することができる。例えば、定常ドメインは、ヒト化抗体が細胞傷害活性を示すことが所望される場合、補体固定定常ドメインであることができ、アイソタイプは、典型的には、ＩｇＧ１である。このような細胞傷害活性が望ましくない場合、定常ドメインは、別のアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ２であることができる。代替的なヒト化抗ＣＤ４０抗体は、２つ以上の免疫グロブリンクラス又はアイソタイプからの配列を含むことができ、所望のエフェクター機能を最適化するために特定の定常ドメインを選択することは、当業者の範囲内である。具体的な実施態様では、本発明は、ＩｇＧ１抗体、とりわけ、エフェクター機能のノックアウトが存在するＩｇＧ１抗体である抗体を提供する。
【０１２９】
ヒト化抗ＣＤ４０抗体のＦＲ及びＣＤＲ又はＨＶＬは、親配列に正確に対応する必要はない。例えば、インポートＣＤＲもしくはＨＶＬ又はコンセンサス配列もしくは生殖系列ＦＲ配列における１つ以上の残基は、置換、挿入又は欠失により改変（例えば、突然変異誘発）させることができ、その結果、得られたアミノ酸残基は、いずれかの親配列における対応する位置にある元の残基とはもはや同一ではないが、それにもかかわらず、該抗体は、ＣＤ４０に結合する機能を保持する。このような改変は、典型的には、広範囲にわたるものではなく、保存的改変であろう。通常、ヒト化抗体残基の少なくとも７５％、より多くの場合、少なくとも９０％、最も多くの場合、９５％超又は９８％超又は９９％超は、親コンセンサス配列又は生殖系列ＦＲ配列及びインポートＣＤＲ配列の残基に対応するであろう。
【０１３０】
重鎖及び軽鎖可変領域間の界面（「ＶＬ−ＶＨ界面」）に影響を及ぼす免疫グロブリン残基は、互いに関係する２つの鎖の近接性又は方向に影響を及ぼすものである。鎖間相互作用に関与する場合がある特定の残基は、ＶＬ残基３４、３６、３８、４４、４６、８７、８９、９１、９６及び９８並びにＶＨ残基３５、３７、３９、４５、４７、９１、９３、９５、１００及び１０３を含む（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987で説明されたナンバリングシステムを利用する）。また、ＵＳ第６，４０７，２１３号にも、ＶＬ残基４３及び８５並びにＶＨ残基４３及び６０等の残基が、この相互作用に関与する場合があることが議論されている。これらの残基は、ヒトＩｇＧについてのみ示されるが、これらは、種を跨って適用可能である。鎖間相互作用に関与すると合理的に予想される重要な抗体残基が、コンセンサス配列への置換に選択される。
【０１３１】
「コンセンサス配列」及び「コンセンサス抗体」という用語は、全ての免疫グロブリンの任意の特定のクラス、アイソタイプ又はサブユニット構造、例えば、ヒト免疫グロブリン可変ドメインにおける各位置に最も頻繁に存在するアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を指す。コンセンサス配列は、特定の種又は多くの種の免疫グロブリンに基づくことができる。「コンセンサス」配列、構造又は抗体は、特定の実施態様に記載されたようなコンセンサスヒト配列を包含し、全てのヒト免疫グロブリンの任意の特定のクラス、アイソタイプ又はサブユニット構造における各位置に最も頻繁に存在するアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を指すと理解される。このため、コンセンサス配列は、１つ以上の公知の免疫グロブリンに存在するが、任意の単一の免疫グロブリンのアミノ酸配列全体を正確には複製することができないアミノ酸を各位置に有するアミノ酸配列を含有する。可変領域コンセンサス配列は、天然に産生される抗体又は免疫グロブリン及びその変異体のいずれからも得られない（Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.）。重鎖及び軽鎖コンセンサス配列のＦＲ並びにその変異体は、ヒト化抗ＣＤ４０抗体の調製に有用な配列を提供する。例えば、ＵＳ第６，０３７，４５４号及び同第６，０５４，２９７号を参照のこと。
【０１３２】
ヒト生殖系列配列は、ヒト集団中に自然に見出される。これらの生殖系列遺伝子の組み合わせは、抗体の多様性を生み出す。抗体の軽鎖のための生殖細胞系抗体配列は、保存されたヒト生殖系列カッパ又はラムダｖ−遺伝子及びｊ−遺伝子に由来する。同様に、重鎖配列は、生殖系列のｖ−、ｄ−及びｊ−遺伝子に由来する（LeFranc, M-P, and LeFranc, G, 「The Immunoglobulin Facts Book」 Academic Press, 2001）。
【０１３３】
本明細書で使用する場合、「変異体」、「抗ＣＤ４０変異体」、「ヒト化抗ＣＤ４０変異体」又は「変異体ヒト化抗ＣＤ４０」はそれぞれ、配列番号：１〜４の配列のいずれかからの重鎖可変マウスＣＤＲ又は配列番号：５〜配列番号：８のいずれかに示されたマウスモノクローナル抗体に由来する軽鎖マウスＣＤＲ配列及びヒトコンセンサス配列に由来するＦＲ配列を少なくとも有するヒト化抗ＣＤ４０抗体を指す。変異体は、軽鎖又は重鎖可変ドメインの一方又は両方に１つ以上のアミノ酸変化を有するものを含む。ただし、アミノ酸変化が、抗体のＣＤ４０への結合を実質的に損なわないという条件である。本明細書で産生される例示的なヒト化抗体は、抗体Ａ、抗体Ｂ及び抗体Ｃと指定されるものを含み、それらの種々の重鎖及び軽鎖配列は、配列番号：２６〜配列番号：４０に示される。
【０１３４】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から特定され並びに分離され及び／又は回収されたものである。抗体の自然環境の夾雑成分は、抗体の診断的又は治療的使用を妨害する場合があるような物質であり、酵素、ホルモン又は他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質である場合がある。一態様では、該抗体は、抗体の少なくとも９５重量％超の単離まで精製されるであろう。
【０１３５】
単離された抗体は、抗体が産生されるリコンビナント細胞内のｉｎ  ｓｉｔｕでの抗体を含む。抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないであろうためである。ただし、通常、単離された抗体は、リコンビナント細胞材料が除去される少なくとも１つの精製工程により調製される。
【０１３６】
「抗体性能」という用語は、抗原の抗体認識又はｉｎ  ｖｉｖｏでの抗体の効力に寄与する因子を指す。抗体のアミノ酸配列の変化は、抗体特性、例えば、フォールディングに影響を及ぼす場合があり、物理的な因子、例えば、抗原への抗体結合の初速度（ｋａ）、抗原からの抗体の解離定数（ｋｄ）、抗原に対する抗体の親和定数（Ｋｄ）、抗体のコンホメーション、タンパク質安定性及び抗体の半減期に影響を及ぼす場合がある。
【０１３７】
本明細書で使用する場合、「エピトープタグ付けされた」という用語は、「エピトープタグ」に融合された抗ＣＤ４０抗体を指す。「エピトープタグ」は、抗体産生のためのエピトープを提供するのに十分な数のアミノ酸を有するが、ヒト化抗ＣＤ４０抗体の所望の活性を妨害しないように設計されたポリペプチドである。エピトープタグに対して生じた抗体が、他のエピトープと実質的に交差反応しないように、エピトープタグは、通常、十分に独特である。適切なタグポリペプチドは、一般的には、少なくとも６個のアミノ酸残基を含有し、通常、約８〜５０個のアミノ酸残基又は約９〜３０個の残基を含有する。エピトープタグ及びエピトープに結合する抗体の例は、ｆｌｕ  ＨＡタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５（Field et al., 1988 Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165）；ｃ−ｍｙｃタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体（Evan et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5(12):3610-3616）；並びに単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグ及びその抗体（Paborsky et al. 1990, Protein Engineering 3(6): 547-553）を含む。特定の実施態様では、エピトープタグは、「サルベージレセプター結合エピトープ」である。本明細書で使用する場合、「サルベージレセプター結合エピトープ」という用語は、ＩｇＧ分子のｉｎ  ｖｉｖｏ血清半減期を上昇させる原因となるＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを指す。
【０１３８】
一部の実施態様では、本発明の抗体は、細胞傷害剤にコンジュゲートさせることができる。これは、細胞の機能を阻害しもしくは妨げ及び／又は細胞の破壊を引き起こす任意の物質である。該用語は、放射性同位体（例えば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０及びＲｅ１８６）、化学療法剤並びに細菌、真菌、植物又は動物起源の毒素、例えば、酵素活性毒素及びそのフラグメントを含むことが意図される。このような細胞傷害剤は、標準的な手法を使用して、本発明のヒト化抗体にカップリングさせることができ、例えば、抗体による治療を必要とする患者を処置するのに使用することができる。
【０１３９】
「化学療法剤」は、ガンの処置に有用な化合物である。本発明の治療用抗体とコンジュゲートさせることができる化学療法剤の多くの例が存在する。このような化学療法剤の例は、アルキル化剤、例えば、チオテパ及びシクロスピファミド；アルキルスルホナート、例えば、ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン；ベンゾドパ、カルボクオン、アジリジン、例えば、ベンゾドパ、カルボクオン、メツレドパ及びウレドパ；エチレンイミン及びメチルメラミン（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチロールメラミンを含む）；アセトゲニン（特に、ブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体であるトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン、アウリスタチン（類似体であるモノメチル−アウリスタチンＥ及びモノメチル−アウリスタチンＦを含む）；デュオカルマイシン（合成類似体であるＫＷ−２１８９及びＣＢＩ−ＴＭＩを含む）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロマファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、酸化メクロレタミン塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン；トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ランチムスチン；抗生物質、例えば、エンジエン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特に、カリケアマイシンガンマ１Ｉ及びカリケアマイシンｐｈｉＩ１（例えば、Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33:183-186を参照のこと）；ダイネミシン（ダイネミシンＡを含む）；ビスホスホナート、例えば、クロドロナート；エスペラミシン並びにネオカルジノスタチン発色団及び関連する発色タンパク質エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルビシン、ドキソルビシン（Adriamycin（商標））、（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えば、マイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗剤、例えば、メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似物、例えば、デノプテリン、メトトレキサー���、プテノプテリン、トリメトレキサート；プリン類似物、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似物、例えば、アンシタビン、アザウリジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；アンドロゲン、例えば、カルステロン、ドロモスタノロンプロピオナート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗アドラナール、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充剤、例えば、フロリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグルコシド；アミノレブリン酸；エニルラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デホファミン；デモコルシン；ジアジクオン；エルホミチン；エリプチニウムアセタート；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；メイタンシノイド、例えば、メイタンシン及びアンサミトシン；ミトグアゾン、ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルブシン；ロソキサントロン、ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジン；プロカルバジン；PSK（登録商標）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ及びアンギジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミタブロニトール；；ミトラクロール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（TAXOL（登録商標）、Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.）及びドキセタキセル（TAXOTERE（登録商標）、Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロラムブシル；ゲムシタビン（Gemzar（商標））；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；プラチナ類似物、例えば、シスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；メトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン（Navelbine（商標））；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセロダ；イバンドロナート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えば、レチノイン酸；カペシタビン；並びに上記のいずれかの薬学的に許容し得る塩、酸又は誘導体を含む。また、この定義には、腫瘍におけるホルモン作用をレギュレーションし又は阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば、抗エストロゲン剤及び選択的エストロゲンレセプターモデュレーター（ＳＥＲＭ）（例えば、タモキシフェン（Nolvadex（商標）を含む）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン及びトレミフェン（Fareston（商標））を含む）；副腎におけるエストロゲン産生をレギュレーションする酵素であるアロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば、例えば、４（��）−イミダゾール、アミノグルテチミド、メゲストロールアセタート（Megace（商標））、エキセメスタン、ホルメスタン、ファドロゾール、ボロゾール（Rivisor（商標））、レトロゾール（Femara（商標））及びアナストロゾール（Arimidex（商標））；並びに抗アンドロゲン、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリド及びゴセレリン；並びに上記のいずれかの薬学的に許容し得る塩、酸又は誘導体も含まれる。これらの薬剤のいずれか１種以上を、本発明のヒト化抗体にコンジュゲートさせて、種々の障害の処置に有用な治療剤を提供することができる。
【０１４０】
また、該抗体は、プロドラッグにコンジュゲートさせることもできる。「ドラッグ」は、親薬物と比較して、腫瘍細胞に対してより細胞傷害性が低く、酵素的に活性化可能であるか又はより活性な形態に変換可能な、薬学的に活性な物質の前駆体又は誘導体形態である。例えば、Wilman, 1986, 「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」, In Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast及びStella et al., 1985, 「Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, In:」Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Pressを参照のこと。有用なプロドラッグは、ホスファート含有プロドラッグ、チオホスファート含有プロドラッグ、サルファート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、場合により置換されているフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ及び場合により置換されているフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシン及びより活性な細胞毒傷害性のない薬剤に変換することができる他の５−フルオロウリジンプロドラッグを含むが、これらに限定されない。プロドラッグ形態に誘導体化することができる細胞傷害剤の例は、上記されたような化学療法剤を含むが、これらに限定されない。
【０１４１】
また、診断及び治療のモニタリングの目的で、本発明の抗体は、ラベルを、ラベル単独又はラベル及び更なる第２の薬剤（プロドラッグ、化学療法剤など）のいずれかでコンジュゲートさせることもできる。他の第２の薬剤と区別されるラベルは、検出可能な化合物又は組成物であり、本発明のヒト化抗体に直接又は間接的にコンジュゲートさせることもできる作用剤を指す。ラベル自体が検出可能であることができ（例えば、放射性同位体ラベル又は蛍光ラベル）又は酵素ラベルの場合には、検出可能な基質化合物もしくは組成物の化学的変化を触媒することができる。ラベルされたヒト化抗ＣＤ４０抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ診断を含む種々の適用において調製し、使用することができる。
【０１４２】
本発明の抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのその送達に影響を及ぼすために、リポソーム調製物の一部として配合することができる。「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤から構成される小胞である。リポソームは、本明細書で開示されたヒト化抗ＣＤ４０抗体等の化合物又は配合物のほ乳類への送達に有用であり、場合により、１種以上の薬学的に活性な薬剤及び／又はラベルに結合されるか又はこれらと組み合わせられる。リポソームの成分は、通常、生体膜の脂質配置に似た、二層形態で配置される。
【０１４３】
本発明の特定の態様は、本発明のヒト化抗体の１つ以上のドメインをコードする、単離された核酸に関する。「単離された」核酸分子は、通常は抗体核酸の天然ソースに会合する少なくとも１つの夾雑核酸分子から特定され、分離された核酸分子である。単離された核酸分子は、本来の細胞中に存在する場合の核酸分子とは区別される。
【０１４４】
本発明の種々の態様では、ヒト化抗体の１つ以上のドメインは、リコンビナントに発現されるであろう。このようなリコンビナント発現は、１つ以上の制御配列、すなわち、特定のホスト生物における動作可能に連結されたコード配列の発現に必要なポリヌクレオチド配列を利用することができる。原核細胞における使用に適した制御配列は、例えば、プロモーター、オペレーター及びリボソーム結合部位配列を含む。真核生物の制御配列は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを含むが、これらに限定されない。これらの制御配列は、原核及び真核ホスト細胞におけるヒト化抗ＣＤ４０抗体の発現及び産生に利用することができる。
【０１４５】
核酸配列は、別の核酸配列と機能的関係に置かれた場合、「動作可能に連結」される。例えば、核酸プレ配列又は分泌リーダーは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドをコードする核酸に動作可能に連結され、プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に動作可能に連結され又はリボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置される場合、コード配列に動作可能に連結される。一般的には、「動作可能に連結される」は、連結されるＤＮＡ配列が連続しており、分泌リーダーの場合、連続し、読み枠内にあることを意味する。一方、エンハンサーは、場合により連続している。連結は、便宜な制限部位におけるライゲーションにより達成することができる。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを使用することができる。
【０１４６】
本明細書で使用する場合、「細胞」、「細胞系統」及び「細胞培養物」という表現は、互換的に使用され、全てのこのような名称は、その子孫を含む。このため、「トランスフォーマント」及び「トランスフォーメーションされた細胞」は、トランスファーの回数に関係なく、初代対象細胞及びそれに由来する培養物を含む。
【０１４７】
処置の目的での「ほ乳類」という用語は、ヒト、飼育動物及び家畜並びに動物園、スポーツ又はペット動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ等を含む、ほ乳類として分類される任意の動物を指す。好ましくは、ほ乳類は、ヒトである。
【０１４８】
本明細書で使用する場合、「障害」は、本明細で記載されたヒト化抗ＣＤ４０抗体による処置により利益を得るであろう任意の状態である。これは、慢性及び急性の障害又は疾患を含み、当該障害にほ乳類を罹りやすくする病理学的状態を含む。本明細書で処置される障害の非限定的な例は、ガン、血液悪性腫瘍、良性及び悪性腫瘍、白血病及びリンパ性悪性腫瘍並びに炎症性、血管新生、自己免疫及び免疫障害を含む。
【０１４９】
「ガン」及び「ガン性」という用語は、レギュレーションされていない細胞増殖を典型的に特徴とするほ乳類における生理学的状態を指し又は説明する。ガンの例は、ガン腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病を含むが、これらに限定されない。
【０１５０】
本明細書で使用する場合、「ＣＤ４０関連障害」又は「ＣＤ４０関連疾患」という用語は、ＣＤ４０を発現する細胞の改変又は排除が必要な状態を指す。これらは、異常な増殖を示すＣＤ４０発現細胞又はガン性もしくは悪性の増殖と関連するＣＤ４０発現細胞を含む。ＣＤ４０抗原の異常な発現を示すガンのより特定の例は、Ｂリンパ芽球様細胞、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、Ｔ細胞リンパ腫、カポジ肉腫、骨肉腫、表皮及び内皮腫瘍、膵臓、肺、乳房、卵巣、結腸、前立腺、頭頸部、皮膚（メラノーマ）、膀胱及び腎臓のガンを含む。このような障害は、白血病、Ｂ細胞リンパ腫及び非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症；肉腫、例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性メラノーマ、卵巣腺ガンを含む腺ガン、カポジ肉腫／カポジ腫瘍及び扁平上皮ガンを含む固形腫瘍を含むが、これらに限定されない。
【０１５１】
また、ＣＤ４０関連障害は、免疫系の疾患及び障害、例えば、自己免疫障害及び炎症性障害も含む。このような状態は、関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、強皮症、シェーグレン症候群、多発性硬化症、乾癬、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎及びクローン病）、肺炎、喘息及び特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）を含むが、これらに限定されない。
【０１５２】
本明細書で使用する場合、「増殖を停止させる」又は「増殖阻害」という表現は、細胞、特に、ＣＤ４０抗原を発現する新生物細胞種の増殖（ｇｒｏｗｔｈ）又は増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を阻害することを指す。このため、増殖阻害は、例えば、Ｓ期における新生物細胞の割合を顕著に低下させる。
【０１５３】
「静脈内注入」という用語は、約１５分超の期間、一般的には、約３０〜９０分の間にわたる、動物又はヒト患者の静脈への薬剤の導入を指す。
【０１５４】
「静脈内ボーラス」又は「静脈内プッシュ」という用語は、身体に約１５分以内、一般的には、５分以内に薬剤を投与するような、動物又はヒトの静脈への薬剤投与を指す。
【０１５５】
「皮下投与」という用語は、薬剤レセプタクルからの比較的ゆっくりとした持続的送達による、動物又はヒト患者の皮膚下、好ましくは、皮膚と下にある組織との間のポケット内への薬剤の導入を指す。皮膚をつまんだり、引き上げたりして、下にある組織から離すと、ポケットを形成することができる。
【０１５６】
「皮下注入」という用語は、薬物レセプタクルからの比較的ゆっくりとした持続的な送達による、３０分以内又は９０分以内を含むがこれらに限定されない期間での、動物又はヒト患者の皮膚下、好ましくは、皮膚と下にある組織との間のポケット内への薬剤の導入を指す。場合により、該注入は、動物又はヒト患者の皮膚下に埋め込まれた薬剤送達ポンプの皮下埋込みにより行うことができ、ここで、該ポンプは、所定の期間、例えば、３０分、９０分又は処置計画の長さにわたる期間、所定量の薬剤を送達する。
【０１５７】
「皮下ボーラス」という用語は、動物又はヒト患者の皮膚下への薬剤投与を指し、ここで、ボーラス薬剤送達は、約１５分未満；別の態様では、５分未満、さらに別の態様では、６０秒未満である。さらに別の態様では、投与は、皮膚と下にある組織との間のポケット内であり、ここで、ポケットは、皮膚をつまむか又は引き上げ、下にある組織から離すことにより形成することができる。
【０１５８】
「治療上有効量」という用語は、処置される障害の症状の１つ以上を軽減し又は改善する活性薬剤の量を指すのに使用される。そうすることで、治療上有効量は、有益な患者アウトカム、例えば、成長停止効果を有するか又は細胞の除去を引き起こす量である。一態様では、治療上有効量は、アポトーシス活性を有するか又は細胞死を誘引可能である。別の態様では、治療上有効量は、例えば、疾患の進行を遅らせるのに有効であることが示されているターゲット血清濃度を指す。効力は、処置される状態に依存して、従来の方法で測定することができる。例えば、ＣＤ４０を発現する細胞により特徴付けられる腫瘍性疾患又は障害において、効力は、疾患が進行するまでの時間を評価するか又は応答率を決定することにより測定することができる。
【０１５９】
本明細書で使用する場合、「処置」及び「治療」等の用語は、１種以上の症状の緩和又は軽減、退行、疾患又は障害の進行の遅延又は停止を含むが、これらに限定されない、任意の臨床的に望ましい又は有益な効果をもたらす疾患又は障害のための治療的及び予防的又はサプレッション手段を含むことを意味する。このため、例えば、処置という用語は、疾患又は障害の症状の発症前又は発症後に薬剤を投与し、それにより、疾患又は障害の１つ以上の徴候を予防し又は除去することを含む。別の例として、この用語は、疾患の症状に対抗するための、疾患の臨床症状発現後の薬剤の投与を含む。さらに、投与が、疾患又は障害の臨床パラメーター、例えば、組織損傷の程度又は転移の量もしくは程度に影響を及ぼす場合、発症後及び臨床症状が発現した後の薬剤の投与は、処置により疾患の改善がもたらされるか否かにかかわらず、本明細書で使用される「処置」又は「治療」を含む。さらに、本発明の組成物が、単独で又は別の治療剤と組み合わせて、ヒト化ＣＤ４０抗体組成物を使用しない場合の症状と比較して、処置される障害の少なくとも１つの症状を軽減し又は改善する限り、その結果は、障害の全ての症状が軽減されるか否かにかかわらず、基礎疾患の有効な処置であるとみなされるべきである。
【０１６０】
「添付文書」という用語は、このような治療製品の使用に関する適応症、使用法、投与、禁忌及び／又は警告に関する情報を含有する、治療製品の市販パッケージに慣例的に含まれる説明書を指すのに使用される。
【０１６１】
抗体
本明細書において、ヒト化抗ＣＤ４０抗体並びに本発明の１つ以上のヒト化抗ＣＤ４０抗体を含む組成物及び製品が記載され、開示される。また、本発明の抗体は、ＵＳ第８，５９１，９００号及びＷＯ第２０１１／１２３４８９号にも開示されている。これらの文献それぞれの内容は、参照により本明細書に組み入れられる。また、ヒト化抗ＣＤ４０抗体の抗原結合フラグメントを含む結合剤も記載されている。ヒト化抗ＣＤ４０抗体及び結合剤は、細胞の増殖を停止させ、ＣＤ４０を発現する細胞の除去を引き起こし又は何等かの方法で、ターゲット細胞に対する細胞傷害性又は細胞増殖抑制効果を誘引しもしくは引き起こすことができる。ヒト化抗ＣＤ４０抗体及び結合剤は、ＣＤ４０表面抗原を発現する細胞の増殖を特徴とする各種の疾患又は障害の処置に使用することができる。ヒト化抗ＣＤ４０抗体及びＣＤ４０結合剤はそれぞれ、ＣＤ４０エピトープを特異的に認識する少なくとも一部（すなわち、抗原結合フラグメント）を含む。
【０１６２】
最初の特徴決定において、マウス抗体をＣＤ４０結合特徴決定に基づいて選択した。
【０１６３】
これらの最初の研究から、表１に示された下記重鎖可変領域及び表２に示された軽鎖可変領域を有するマウス抗体を選択した。
【０１６４】
【表１】
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【０１６５】
【表２】
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【０１６６】
ヒトフレームワーク配列を、フレームワーク相同性、ＣＤＲ構造、保存された標準残基、保存された界面パッキング残基及び他のパラメーターに基づいて、マウスリードそれぞれについて選択した。
【０１６７】
選択された種々のマウス抗体のマウス重鎖及び軽鎖ＣＤＲを表３及び表４それぞれに示す。
【０１６８】
【表３】
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【０１６９】
上記列記されたＨ−ＣＤＲ１は、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングシステム（Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948）を使用する配列を使用している。該配列についてのＫａｂａｔｓナンバリングは、太字のイタリック体のテキストにより示され、ＩＭＧＴナンバリングは、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２についての上記表中の残基の下線を引いたテキストにより示される。２Ｈ１１、１０Ｆ２及び１９Ｂ１０それぞれについてのＨ−ＣＤＲ３の配列は、TTSYYVGTYGY（配列番号：７７）であり、２０Ｅ２についての配列は、ARQDGYRYAMDY（配列番号：７８）である。
【０１７０】
【表４】
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【０１７１】
再度、表４では、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングシステムを使用し、該配列についてのＫａｂａｔｓナンバリングは、太字のイタリック体のテキストにより示され、ＩＭＧＴナンバリングは、下線を引いたテキストにより示される。
【０１７２】
キメラ親Ｆａｂと比較してより良好又は等しい結合を示したＦａｂをＩｇＧへの変換のために選択した。２０Ｅ２シリーズからのクローンを２つの異なるＩｇＧフォーマットに変換した。ａ）ＩｇＧ４ＤＭ（二重突然変異体）は、Ｆｃ／ヒンジ領域に、半分子形成を減少させるＳｅｒ２２８Ｐｒｏ及びＦｃγＲ結合をさらに減少させるＬｅｕ２３５Ｇｌｕの２つの突然変異を有する。ｂ）ＩｇＧ１ＫＯ（エフェクター機能のノックアウト）は、Ｆｃ領域に、エフェクター機能、例えば、ＦｃγＲ結合及び補体結合を減少させるＬｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａの２つの突然変異を有する。両方のＩｇＧフォーマットは、文献に記載されている。実施例１に、３つの候補のヒト化について、さらに詳細に記載する。このようなヒト化の結果により、以下に示された重鎖及び軽鎖配列を有するヒト化抗体配列がもたらされた。
【０１７３】
【表５】
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【０１７４】
一部の実施態様では、抗原結合フラグメントは、例えば、ＣＤ４０表面抗原を結合することにより、例えば、増殖を遮断しもしくは何等かの方法で、細胞の増殖を停止させ又はその減少、死もしくは何等かの方法で、その除去を引き起こすことができる。例えば、Ｔ細胞及びＢ細胞悪性腫瘍では、悪性細胞が、正常なリンパ球の活性化をもたらす刺激に曝されると、多くの場合、抗腫瘍効果（例えば、細胞除去又はアポトーシスを伴う又は伴わない増殖停止）が生じる。この活性化誘導性の増殖停止は、抗原レセプター又は共刺激レセプターのいずれかを介するシグナルについて観察されている（例えば、Ashwell et al., 1987, Science 237:61；Bridges et al., 1987, J. Immunol. 139:4242；Page and Defranco, 1988, J. Immunol. 140:3717；及びBeckwith et al., 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82:501を参照のこと）。ＣＤ４０刺激により、抗体又は可溶性リガンドのいずれかによる特異的結合の結果として、Ｂ細胞リンパ腫の増殖が阻害される（例えば、Funakoshi et al., 1994, Blood 83:2787-2794を参照のこと）。この方法で悪性細胞の増殖を阻害し、ＣＤ４０表面抗原に向けられる薬剤は、適切な薬剤の例である。
【０１７５】
ＣＤ４０特異的薬剤は、ＣＤ４０（例えば、ヒトＣＤ４０又はその変異体）に結合するヒト化抗ＣＤ４０抗体の抗原結合フラグメントを含む。ＣＤ４０特異的薬剤及び抗体は、場合により、細胞傷害剤又は化学療法剤とコンジュゲートさせるか又はこれらと融合させることができる。ヒト化抗体が、ＣＤ４０表面抗原に結合し、ＣＤ４０発現細胞種の減少を引き起こす態様において、結合は、一般的には、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＣＤ４０表面抗原細胞に向かうことにより特徴付けられる。適切な結合剤は、ＣＤ４０特異的薬剤が抗原を発現する細胞を特異的にターゲットとすることにより治療剤として有用であるように、十分な親和性及び／又は結合力でＣＤ４０抗原に結合する。
【０１７６】
一部の態様では、ヒト化抗体は、ＣＤ４０リガンドのＣＤ４０への結合を、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％又は少なくとも７５％又は少なくとも８０％又は少なくとも９０％又は少なくとも９５％減少させる。
【０１７７】
一部の実施態様では、重鎖及び軽鎖可変ドメイン等のその抗原結合フラグメントを含むヒト化抗ＣＤ４０抗体は、本明細書で上記されたＣＤＲ抗体Ａ（重鎖配列＝配列番号：２７；配列番号：２８；配列番号：２９；又は配列番号：３０；軽鎖配列＝配列番号：２６）、抗体Ｂ（重鎖配列＝配列番号：３２；配列番号：３３；配列番号：３４；又は配列番号：３５；軽鎖配列＝配列番号：３１）及び抗体Ｃ（重鎖配列＝配列番号：３７；配列番号：３８；配列番号：３９；又は配列番号：４０；軽鎖配列＝配列番号：３６）に由来する残基のアミノ酸配列及びヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域に由来するアミノ酸残基を含む。ヒト化抗ＣＤ４０抗体は、場合により、コンセンサス又は生殖系列フレームワーク領域における特定のアミノ酸置換を含む。
【０１７８】
これらのフレームワーク位置におけるアミノ酸残基の特定の置換により、以下の実施例に示されたように、ヒト生殖系列フレームワーク領域へのＣＤＲ又はＨＶＬの「直接スワップ」により形成されるヒト化抗体において実証されるものよりも結合親和性及び／又は安定性を含む抗体性能の種々の態様を改善することができる。
【０１７９】
一部の実施態様では、本発明は、配列番号：１〜配列番号：４の重鎖（ＶＨ）配列及び配列番号：５〜配列番号：８の軽鎖（ＶＬ）配列を有する他のモノクローナル抗体を記載する（上記表１及び２を参照のこと）。これらのマウス抗体のＣＤＲ配列を表３及び４に示し、このようなＣＤＲをヒトコンセンサス重鎖及び軽鎖可変ドメインのＦＲに入れると、本発明の有用なヒト化抗体が生成されるであろう。
【０１８０】
一部の具体的な実施態様では、本明細書で開示されたヒト化抗ＣＤ４０抗体は、上記表１〜４に示されたマウスモノクローナル抗体のＣＤＲ又はＨＶＬを含む重鎖又は軽鎖可変ドメインを含むと、ヒト生殖系列重鎖及び軽鎖可変ドメインのＦＲとを少なくとも含む。例示的な実施態様では、本明細書で作製されたヒト化抗体は、抗体Ａ、抗体Ｂ及び抗体Ｃであり、その種々の重鎖及び軽鎖配列を配列番号：２６〜配列番号：４０に示す。
【０１８１】
具体的な実施態様では、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９又は配列番号：３０のいずれかの重鎖配列を、配列番号：２６の軽鎖配列との組み合わせで有する抗体が企図される。代替的な抗体は、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４又は配列番号：３５の重鎖配列を、配列番号：３１の軽鎖配列との組み合わせで有する抗体を含む。更なる実施態様では、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９又は配列番号：４０の重鎖配列を、配列番号：３６の軽鎖配列との組み合わせで有するヒト化抗体が提供される。
【０１８２】
これらの配列のＣＤＲを表３及び４に示す。具体的な実施態様では、これらの例示的な免疫グロブリンの間で交換されたＣＤＲ領域（すなわち、例えば、抗体Ａの１つ又は２つのＣＤＲを抗体Ｃ由来の類似のＣＤＲで交換する）を有するキメラ抗体が有用な抗体を生成することができることが企図される。
【０１８３】
特定の実施態様では、ヒト化抗ＣＤ４０抗体は、抗体フラグメントである。種々の抗体フラグメントは、一般的に上記で議論されており、抗体フラグメントの産生のために開発された技術が存在する。フラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質分解消化により得ることができる（例えば、Morimoto et al., 1992, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117；及びBrennan et al., 1985, Science 229:81を参照のこと）。代替的には、フラグメントは、リコンビナントホスト細胞中で直接産生することができる。例えば、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントは、E. coliから直接回収することができ、化学的にカップリングさせて、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを形成することができる（例えば、Carter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167を参照のこと）。別のアプローチにより、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントをリコンビナントホスト細胞培養物から直接分離することができる。抗体フラグメントの産生のための他の技術は、熟練した実務家に明白であろう。
【０１８４】
特定の実施態様は、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９又は配列番号：３０のいずれかの重鎖配列を、配列番号：２６の軽鎖配列との組み合わせで有する、ヒト化抗ＣＤ４０抗体のＦ（ａｂ’）２フラグメントを含む。代替的な抗体は、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４又は配列番号：３５の重鎖配列を、配列番号：３１の軽鎖配列との組み合わせで有する抗体を含む。更なる実施態様では、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９又は配列番号：４０の重鎖配列を、配列番号：３６の軽鎖配列との組み合わせで有するヒト化抗体が提供される。このような実施態様は、このようなＦ（ａｂ’）２を含むインタクトな抗体を含むことができる。
【０１８５】
一部の実施態様では、該抗体又は抗体フラグメントは、エフェクター機能を媒介する定常領域を含む。定常領域は、ＣＤ４０発現ターゲット細胞に対する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）応答を提供することができる。エフェクタードメインは、例えば、Ｉｇ分子のＦｃ領域であることができる。典型的には、ＣＤ４０結合剤は、細胞傷害性白血球（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、貪食細胞（例えば、マクロファージ）及び／又は血清補体成分をリクルートし及び／又は活性化する。
【０１８６】
抗体のエフェクタードメインは、任意の適切な脊椎動物種及びアイソタイプから得ることができる。異なる動物種のイソタイプは、エフェクター機能を媒介する能力が異なる。例えば、ＣＤＣ及びＡＤＣＣ／ＡＤＣＰを媒介するヒト免疫グロブリン能力は、一般的には、ＩｇＭ≒ＩｇＧ１≒ＩｇＧ３＞ＩｇＧ２＞ＩｇＧ４及びＩｇＧ１≒ＩｇＧ３＞ＩｇＧ２／ＩｇＭ／ＩｇＧ４それぞれの順序である。マウスの免疫グロビンは、ＣＤＣ及びＡＤＣＣ／ＡＤＣＰを、一般的には、マウスＩｇＭ≒ＩｇＧ３＞＞ＩｇＧ２ｂ＞ＩｇＧ２ａ＞＞ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ｂ＞ＩｇＧ２ａ＞＞ＩｇＧ１＞＞ＩｇＧ３それぞれの順序で媒介する。別の例では、マウスＩｇＧ２ａは、ＡＤＣＣを媒介するが、マウスＩｇＧ２ａ及びＩｇＭは両方とも、ＣＤＣを媒介する。
【０１８７】
抗体修飾
ヒト化抗ＣＤ４０抗体及び薬剤は、ヒト化抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合フラグメントの修飾を含むことができる。例えば、ガンの処置における抗体の有効性を増強するために、エフェクター機能に関して抗体を修飾することが望ましい場合がある。このような修飾の１つは、Ｆｃ領域へのシステイン残基の導入であり、それにより、この領域における鎖間ジスルフィド結合形成が可能となる。このようにして生成されたホモ二量体抗体は、内在化能力が改善しかつ／又は補体媒介性細胞殺傷及び／もしくは抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を向上させることができる。例えば、Caron et al., 1992, J. Exp Med. 176:1191-1195；及びShopes, 1992, J. Immunol. 148:2918-2922を参照のこと。また、増強された抗腫瘍活性を有するホモ二量体抗体は、Wolff et al., 1993, Cancer Research 53: 2560-2565に記載されるように、ヘテロ二官能性架橋剤を使用しても調製することができる。代替的には、抗体は、二重Ｆｃ領域を含有するように操作することができ、これにより、抗体の補体溶解及びＡＤＣＣ能力が増強される。Stevenson et al., 1989, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230を参照のこと。
【０１８８】
ＡＤＣＣを支持する改善された能力を有する抗体は、それらのＦｃ領域のグリコシル化パターンを修飾することにより生成された。これは、ＣＨ２ドメインのアスパラギン残基Ｎ２９７における抗体グリコシル化がＡＤＣＣに必要なＩｇＧとＦｃγレセプターとの間の相互作用に関与しているために起こり得る。ホスト細胞系統は、改変されたグリコシル化、例えば、増強された二分割Ｎ−アセチルグルコサミン又は還元されたフコースを有する抗体を発現するように操作されてきた。フコースの還元により、二分割Ｎ−アセチルグルコサミンの存在を増加させるより高いＡＤＣＣ活性の増強が提供される。さらに、低フコース抗体によるＡＤＣＣの増強は、ＦｃγＲＩＩＩａ  Ｖ／Ｆ多形とは無関係である。
【０１８９】
抗体のＦｃ領域のアミノ酸配列を修飾することは、ＡＤＣＣを増強するためのグリコシル化操作の代替手段である。Ｆｃγレセプターに対するヒトＩｇＧ１における結合部位は、広範な突然変異解析により決定されている。これにより、ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合親和性を向上させ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＡＤＣＣを増強する、Ｆｃ突然変異を有するヒト化ＩｇＧ１抗体の生成がもたらされた。加えて、Ｆｃ変異体は、結合特性、例えば、他のＦｃγＲレセプターへの結合が変化していないか又は低下した特異的ＦｃγＲレセプターへの改善された結合の多くの異なる順列により得られている。
【０１９０】
別の態様は、細胞傷害剤、例えば、化学療法剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素活性毒素又はそれらのフラグメント）又は放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）にコンジュゲートさせたヒト化抗体又はそのフラグメントを含む、免疫コンジュゲートを含む。
【０１９１】
このような免疫コンジュゲートの生成に有用な化学療法剤は上記されている。有用な免疫コンジュゲートを形成するのに使用することができる酵素活性毒素及びそのフラグメントは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、エキソトキシンＡ鎖（Pseudomonas aeruginosa由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Aleurites fordiiタンパク質、ジアンチンタンパク質、Phytolaca americanaタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ）、Momordica charantia阻害剤、クルシン、クロチン、Sapaonaria officinalis阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、トリコテセン等を含む。種々の放射性核種が、放射性コンジュゲートヒト化抗ＣＤ４０抗体の産生に利用可能である。例は、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅを含む。
【０１９２】
ヒト化抗ＣＤ４０抗体と細胞傷害剤又は化学療法剤とのコンジュゲートは、公知の方法により、各種の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミダートＨＣＬ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベラート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（例えば、トルエン  ２，６−ジイソシアナート）及びビス活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して調製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta et al., 1987, Science 238:1098に記載されるように調製することができる。炭素−１４ラベル１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドを抗体にコンジュゲートさせるための例示的なキレート剤である。また、コンジュゲートは、開裂可能なリンカーによっても形成することができる。
【０１９３】
別の実施態様では、該抗体は、腫瘍プレターゲティングに利用するために「レセプター」（例えば、ストレプトアビジン）にコンジュゲートさせることができる。この手法において、抗体−レセプターコンジュゲートが、患者に投与され、続けて、清澄剤を使用して循環から非結合コンジュゲートを除去し、ついで、レセプター（例えば、アビジン）に選択的に結合する「リガンド」を投与し、リガンドが、細胞傷害剤（例えば、放射性核種）にコンジュゲートする。
【０１９４】
また、本明細書で開示されたヒト化抗ＣＤ４０抗体は、免疫リポソームとして配合することもできる。抗体を含有するリポソームは、当技術分野において公知の方法、例えば、Epstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688；Hwang et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030並びにＵＳ第４，４８５，０４５号及び同第４，５４４，５４５号に記載されている方法により調製される。長い循環時間を有するリポソームは、例えば、ＵＳ第５，０１３，５５６号に開示されている。
【０１９５】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を使用して、逆相蒸発法により生成することができる。リポソームは、規定された孔サイズのフィルターを通して押し出され、所望の直径を有するリポソームを生成する。本明細書で開示された抗体のＦａｂ’フラグメントは、ジスルフィド交換反応を介して、Martin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:286-288記載されているように、リポソームにコンジュゲートさせることができる。化学療法剤（例えば、ドキソルビシン）を、場合により、リポソーム内に含有させる。例えば、Gabizon et al., 1989, J. National Cancer Inst. 81(19):1484を参照のこと。
【０１９６】
また、本明細書で記載され、開示された抗体は、プロドラッグ（例えば、ペプチジル化学療法剤）を活性抗ガン剤に変換するプロドラッグ活性化酵素に抗体をコンジュゲートさせることにより、ＡＤＥＰＴ（抗体−指向酵素プロドラッグ療法）手法において使用することができる。例えば、ＷＯ第８１／０１１４５号、同第８８／０７３７８号及びＵＳ第４，９７５，２７８号を参照のこと。ＡＤＥＰＴに有用な免疫コンジュゲートの酵素成分は、プロドラッグをそのより活性な細胞傷害性形態に変換するような方法でプロドラッグに作用可能な酵素である。ＡＤＥＰＴに有用な具体的な酵素は、ホスファート含有プロドラッグを遊離剤に変換するためのアルカリホスファターゼ；スルファート含有プロドラッグを遊離薬剤に変換するためのアリールスルファターゼ；非毒性５−フルオロシトシンを抗ガン剤である５−フルオロウラシルに変換するためのシトシンデアミナーゼ；ペプチド含有プロドラッグを遊離薬剤に変換するためのプロテアーゼ、例えば、セラチアプロテアーゼ、サーモリシン、スブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン（例えば、カテプシンＢ及びＬ）；Ｄ−アミノ酸置換基を含有するプロドラッグを変換するためのＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化プロドラッグを遊離薬剤に変換するための炭水化物開裂酵素、例えば、β−ガラクトシダーゼ及びノイラミニダーゼ；β−ラクタムにより誘導体化された薬剤を遊離薬剤に変換するためのβ−ラクタマーゼ；並びにフェノキシアセチル又はフェニルアセチル基それぞれによりそのアミン窒素において誘導体化された薬剤を遊離薬剤に変換するためのペニシリンアミダーゼ、例えば、ペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼを含むが、これらに限定されない。代替的には、酵素活性を有する抗体（「アブザイム」）を使用して、プロドラッグを遊離活性薬剤に変換することができる（例えば、Massey, 1987, Nature 328: 457-458を参照のこと）。抗体−アブザイムコンジュゲートは、腫瘍細胞集団へのアブザイムの送達のための公知の方法により、例えば、上記議論されるヒト化抗ＣＤ４０抗体／ヘテロ二官能性架橋試薬に酵素を共有結合することにより調製することができる。代替的には、上記された酵素の少なくとも機能的に活性な部分に連結された、本明細書で開示された抗体の抗原結合領域を少なくとも含む融合タンパク質は、リコンビナントＤＮＡ技術を使用して構築することができる（例えば、Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608を参照のこと）。
【０１９７】
特定の実施態様では、例えば、腫瘍浸透を向上させるために、インタクトな抗体ではなく、ヒト化抗ＣＤ４０抗体フラグメントを使用するのが望ましい場合がある。血清半減期を長くするために、抗体フラグメントを修飾するのが望ましい場合がある。これは、例えば、サルベージレセプター結合エピトープを抗体フラグメントに組み込むことにより達成することができる。１つの方法では、抗体フラグメントの適切な領域を変化させる（例えば、突然変異させる）ことができ又はエピトープをペプチドタグに組み込み、ついで、例えば、ＤＮＡもしくはペプチド合成により、抗体フラグメントのいずれかの末端もしくは中央に融合させることができる。例えば、ＷＯ第９６／３２４７８号を参照のこと。
【０１９８】
他の実施態様では、ヒト化抗ＣＤ４０抗体の共有結合修飾も含まれる。共有結合修飾は、システイニル残基、ヒスチジル残基、リシニル及びアミノ末端残基、アルギニル残基、チロシル残基、カルボキシル側鎖基（アスパルチル又はグルタミル）、グルタミニル及びアスパラギニル残基又はセリルもしくはスレオニル残基の修飾を含む。別の種類の共有結合修飾は、グリコシドを抗体に化学的又は酵素的にカップリングすることを含む。このような修飾は、必要に応じて、化学合成により、又は抗体の酵素的もしくは化学的開裂により行うことができる。抗体の他の種類の共有結合修飾は、抗体のターゲットアミノ酸残基を、選択された側鎖又はアミノ末端もしくはカルボキシ末端残基と反応可能な有機誘導体化剤と反応させることにより、分子内に導入することができる。
【０１９９】
抗体に存在する任意の炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に達成することができる。化学的脱グリコシル化は、Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52及びEdge et al., 1981, Anal. Biochem., 118:131に記載されている。抗体における炭水化物部分の酵素的開裂は、Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol 138:350に記載されるように、各種のエンドグリコシダーゼ及びエキソグリコシダーゼの使用により達成することができる。
【０２００】
別の種類の有用な共有結合修飾は、抗体を、ＵＳ第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号及び同第４，１７９，３３７号の１つ以上で説明されている様式で、各種の非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール又はポリオキシアルキレンのうちの１つに連結させることを含む。
【０２０１】
ヒト化及びアミノ酸配列変異体
抗ＣＤ４０抗体のアミノ酸配列変異体は、抗ＣＤ４０抗体ＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入することにより又はペプチド合成により調製することができる。このような変異体は、例えば、本明細書における実施例の抗ＣＤ４０抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失及び／又は同配列への挿入及び／又は同残基の置換を含む。最終構築物に到達するために、欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせを行う。ただし、最終構築物が所望の特徴を有するという条件である。また、アミノ酸変化は、ヒト化又は変異体抗ＣＤ４０抗体の翻訳後プロセスを変化させる（例えば、グリコシル化部位の数又は位置を変化させる）ことができる。
【０２０２】
突然変異誘発に好ましい位置である抗ＣＤ４０抗体の特定の残基又は領域を特定するのに有用な方法は、Cunningham and Wells（Science, 244:1081-1085 (1989)）に記載されているように、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、ターゲット残基の残基又は基が特定され（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕ等の荷電残基）、アミノ酸とＣＤ４０抗原との相互作用に影響を及ぼすために、中性又は負に荷電したアミノ酸（典型的には、アラニン）により置き換えられる。ついで、置換に対する機能的感受性を示すそれらのアミノ酸位置は、さらなる又は他の変異を、置換の部位に又は同部位のために導入することにより精錬される。このようにして、アミノ酸配列変動を導入するための部位が予め決定されるが、突然変異自体の性質は予め決定する必要がない。例えば、所定の部位での突然変異の性能を分析するために、アラニンスキャニング又はランダム突然変異誘発をターゲットコドン又は領域で行い、発現された抗ＣＤ４０抗体変異体を所望の活性についてスクリーニングする。
【０２０３】
アミノ酸配列の挿入は、１つの残基から１００個以上の残基を含有するポリペプチドまでの長さ範囲で、アミノ末端及び／又はカルボキシル末端の融合並びに単一もしくは複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例は、エピトープタグに融合した抗ＣＤ４０抗体を含む。抗ＣＤ４０抗体分子の他の挿入変異体は、抗体の血清半減期を長くする酵素又はポリペプチドの抗ＣＤ４０抗体のＮ末端又はＣ末端への融合を含む。
【０２０４】
別の種類の変異体は、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗ＣＤ４０抗体分子中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、異なる残基がその位置に挿入されている。置換突然変異誘発のための最も興味のある部位は、超可変領域を含むが、ＦＲ改変も企図される。保存的置換を表５の「好ましい置換」の見出しの下に示し、このような置換により、生物学的活性の変化が生じる場合には、「例示的置換」と命名されるか又はアミノ酸クラスに関して以下にさらに記載されるようなより実質的な変化を導入し、産物をスクリーニングすることができる。
【０２０５】
【表６】
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【０２０６】
タンパク質化学では、抗体の生物学的特性は、（ａ）置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造、例えば、シート又はらせん構造、（ｂ）ターゲット部位における分子の電荷もしくは疎水性又は（ｃ）側鎖の嵩を維持することに対するその効果が明らかに異なる置換を選択することにより達成することができることが一般に認められている。天然残基は、共通の側鎖特性に基づいてグループに分けられる。
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｉｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：  ｇｌｙ、ｐｒｏ；及び
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ
【０２０７】
非保存的置換は、これらのクラスのメンバーの１つを別のクラスに交換することを含むであろう。
【０２０８】
また、ヒト化又は変に抗ＣＤ４０抗体の適切なコンホメーションの維持に関与しない任意のシステイン残基を、分子の酸化安定性を改善するために、異常な架橋を防ぐために又は細胞傷害性もしくは細胞増殖抑制性化合物へのコンジュゲーションの確立された点を提供するために、一般的には、セリンで置換することもできる。逆に、システイン結合を抗体に付加して、（特に、抗体が、抗体フラグメント、例えば、Ｆｖフラグメントである場合）その安定性を改善することができる。
【０２０９】
ある種の置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することを含む。一般的には、更なる開発のために選択して得られた変異体は、それらが生じた親抗体に対して改善された生物学的特性を有するであろう。このような置換変異体を生成するための便宜な方法は、ファージディスプレイを使用する親和性成熟である。簡潔に、幾つかの超可変領域部位（例えば、６〜７部位）を、各部位における全ての可能性のあるアミノ置換を生じさせるために突然変異させる。このようにして生成された抗体変異体を、各粒子内にパッケージされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物に対する融合としてのフィラメント状ファージ粒子からの一価様式で提示される。ついで、ファージ提示変異体をそれらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。修飾のための候補超可変領域部位を特定するために、アラニンスキャニング突然変異誘発を行って、抗原結合に顕著に寄与する超可変領域残基を特定することができる。代替的に又は加えて、抗体とヒトＣＤ４０との間の接触点を特定するために、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析することが有益であることができる。このような接触残基及び隣接残基は、本明細書において詳述された技術に従った置換のための候補である。このような変種が生じると、変異体のパネルを本明細書で記載されたスクリーニングに供し、１種以上の関連アッセイにおいて、優れた特性を有する抗体を更なる開発のために選択することができる。
【０２１０】
抗体の別の種類のアミノ酸変異体は、抗体の元のグリコシル化パターンを改変する。「改変する」は、抗体に見出される１つ以上の炭水化物部分を欠失させること及び／又は抗体に存在しない１つ以上のグリコシル化部位を付加することを意味する。
【０２１１】
一部の実施態様では、本発明の抗体を修飾して、グリコシル化部位を付加するのが望ましい場合がある。抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ−結合又はＯ−結合のいずれかである。Ｎ−結合は、炭水化物部位のアスパラギン残基の側鎖への付着を指す。ポリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−スレオニン（ここで、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部位の酵素付着のための認識配列である。このため、これらのトリペプチド配列のいずれかがポリペプチド中に存在すると、潜在的なグリコシル化部位が形成される。Ｏ結合グリコシル化は、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース又はキシロースのうちの１つのヒドロキシアミノ酸、最も一般的には、セリン又はスレオニンへの付着を指すが、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリシンを使用することもできる。このため、所定のタンパク質、例えば、抗体をグリコシル化するために、タンパク質のアミノ酸配列は、（Ｎ結合グリコシル化部位のために）上記された１つ以上のトリペプチド配列を含有するように操作される。改変は、（Ｏ−結合グリコシル化部位のために）１つ以上のセリン又はスレオニン残基の元の抗体の配列への付加又はこれらの残基による置換によっても行うことができる。
【０２１２】
抗ＣＤ４０抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当技術分野において公知の各種の方法により調製される。これらの方法は、天然ソース（天然のアミノ酸配列変異体の場合）からの単離又はオリゴヌクレオチド媒介性（又は部位特異的）突然変異誘発による調製、ＰＣＲ突然変異誘発及び抗ＣＤ４０抗体の予め調製された変異体又は非変異体バージョンのカセット突然変異誘発を含むが、これらに限定されない。
【０２１３】
ポリヌクレオチド、ベクター、ホスト細胞及びリコンビナント法
他の実施態様は、ヒト化抗ＣＤ４０抗体をコードする配列を含む、単離されたポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター及びホスト細胞並びにヒト化抗体の製造のためのリコンビナント技術を包含する。単離されたポリヌクレオチドは、例えば、全長モノクローナル抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖフラグメント、ディアボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子並びに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体を含む、任意の所望の形態の抗ＣＤ４０抗体をコードすることができる。
【０２１４】
一部の実施態様は、配列番号：１〜４、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９又は配列番号：４０のいずれかの重鎖可変領域アミノ酸配列を有する抗体又は抗体フラグメントをコードする配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを含む。一部の実施態様は、配列番号：２６、配列番号：３１又は配列番号：３６の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を有する抗体又は抗体フラグメントをコードする配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを含む。
【０２１５】
一態様では、単離されたポリヌクレオチド配列は、配列番号：２７及び配列番号：２６それぞれ；配列番号：２８及び配列番号：２６それぞれ；配列番号：２９及び配列番号：２６それぞれ；配列番号：３０及び配列番号：２６それぞれ；配列番号：３２及び配列番号：３１それぞれ；配列番号：３３及び配列番号：３１それぞれ；配列番号：３４及び配列番号：３１それぞれ；配列番号：３５及び配列番号：３１それぞれ；配列番号：３７及び配列番号：３６それぞれ；配列番号：３８及び配列番号：３６それぞれ；配列番号：３９及び配列番号：３６それぞれ；配列番号：４０及び配列番号：３６それぞれのアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを有する抗体又は抗体フラグメントをコードする。
【０２１６】
ヒト化抗ＣＤ４０抗体又はそのフラグメントもしくは鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドは、当技術分野において公知のように、１つ以上のレギュラトリー配列又は制御配列に融合させることができ、当技術分野において公知のように、適切な発現ベクター又はホスト細胞に含ませることができる。重鎖又は軽鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチド分子はそれぞれ、定常ドメイン、例えば、ヒト定常ドメインをコードするポリヌクレオチド配列に独立して融合させることができ、これにより、インタクトな抗体の産生が可能となる。代替的には、一本鎖抗体の産生のためのテンプレートを提供するポリヌクレオチド又はその一部同士を融合させることができる。
【０２１７】
リコンビナント産生のために、抗体をコードするポリヌクレオチドは、クローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のために、複製可能なベクターに挿入される。リコンビナント抗体を発現するための多くの適切なベクターが利用可能である。ベクター成分は、一般的には、下記：シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター及び転写終結配列の１つ以上を含むが、これらに限定されない。
【０２１８】
また、ヒト化抗ＣＤ４０抗体は、融合ポリペプチドとして産生することもでき、ここで、該抗体は、異種ポリペプチド、例えば、シグナル配列又は成熟タンパク質もしくはポリペプチドのアミノ末端に特異的開裂部位を有する他のポリペプチドと融合される。選択される異種シグナル配列は、典型的には、ホスト細胞により認識され、プロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼにより開裂される）ものである。ヒト化抗ＣＤ４０抗体シグナル配列を認識せず、プロセシングしない原核生物ホスト細胞については、シグナル配列は、原核生物シグナル配列により置換することができる。シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、リポタンパク質、熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダー等であることができる。酵母分泌のために、ネイティブなシグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼα因子（Saccharomyces及びKluyveromycesのα因子リーダーを含む）、酸性ホスファターゼ、C. albicansグルコアミラーゼ又はＷＯ第９０／１３６４６号に記載されているシグナルから得られるリーダー配列により置換することができる。ほ乳類細胞において、ほ乳類シグナル配列及びウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルを使用することができる。このような前駆体領域のためのＤＮＡは、リーディングフレームにおいて、ヒト化抗ＣＤ４０抗体をコードするＤＮＡにライゲーションされる。
【０２１９】
発現ベクター及びクローニングベクターは、ベクターが１つ以上の選択されたホスト細胞において複製することを可能にする核酸配列を含有する。一般的には、クローニングベクターにおいて、この配列は、ベクターがホスト染色体ＤＮＡとは無関係に複製することを可能にするものであり、複製起点又は自律的に複製する配列を含む。このような配列は、各種の細菌、酵母及びウイルスについて周知である。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点は、ほとんどのグラム陰性菌に適しており、２−νプラスミド起点は、酵母に適しており、種々のウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ及びＢＰＶ）は、哺乳類細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般的には、哺乳類の発現ベクターには、複製起点コンポーネントは必要ない（ＳＶ４０起点のみを、典型的に使用することができる。初期プロモーターを含有するためである）。
【０２２０】
発現ベクター及びクローニングベクターは、発現の特定を容易にするために選択マーカーをコードする遺伝子を含有することができる。典型的な選択マーカー遺伝子は、抗生物質又は他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート又はテトラサイクリンに対する耐性を付与するタンパク質をコードするか又は代替的に、補体栄養要求性欠損であるか又は他の代替手段において、複雑な培地に存在しない特定の栄養素を供給する（例えば、Bacilliに対するＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）。
【０２２１】
選択スキームの一例は、ホスト細胞の増殖を停止させる薬剤を利用する。異種遺伝子により成功裏にトランスフォーメーションされるこれらの細胞は、薬剤耐性を付与するタンパク質を産生し、これにより、選択計画を生き延びる。このような優性選択の例は、薬剤であるネオマイシン、ミコフェノール酸及びヒグロマイシンを使用する。ほ乳類細胞のための一般的な選択マーカーは、ヒト化抗ＣＤ４０抗体をコードする核酸を取り込んだコンピテント細胞の特定を可能にするもの、例えば、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉ及びＩＩ（例えば、霊長類メタロチオネイン遺伝子）、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等である。ＤＨＦＲ選択遺伝子によりトランスフォーメーションされた細胞は、最初に、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含有する培養培地中で全てのトランスフォーマントを培養することにより特定される。野生型ＤＨＦＲを利用する場合の適切なホスト細胞は、ＤＨＦＲ活性を欠いたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系統（例えば、ＤＧ４４）である。
【０２２２】
代替的には、抗ＣＤ４０抗体、野生型ＤＨＦＲタンパク質及び別の選択マーカー、例えば、アミノグリコシド  ３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）をコードするＤＮＡ配列によりトランスフォーメーションされ又は共トランスフォーメーションされたホスト細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含有する野生型ホスト）は、選択マーカー、例えば、アミノグリコシド抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシン又はＧ４１８のための選択剤を含有する培地中での細胞増殖により選択することができる。例えば、ＵＳ第４，９６５，１９９号を参照のこと。
【０２２３】
リコンビナント産生をホスト細胞として酵母細胞で行う場合、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するＴＲＰ１遺伝子（Stinchcomb et al., 1979, Nature 282: 39）を選択マーカーとして使用することができる。ＴＲＰ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母の突然変異株に対する選択マーカー、例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４４０７６又はＰＥＰ４−１を提供する（Jones, 1977, Genetics 85:12）。ついで、酵母ホスト細胞ゲノムにおけるｔｒｐ１損傷の存在は、トリプトファンの不存在下での増殖によりトランスフォーメーションを検出するのに有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２ｐ欠損酵母株、例えば、ＡＴＣＣ  ２０，６２２及び３８，６２６は、ＬＥＵ２遺伝子を有する公知のプラスミドにより補完される。
【０２２４】
加えて、１．６μmの環状プラスミドｐＫＤ１に由来するベクターをKluyveromyces酵母のトランスフォーメーションに使用することができる。代替的には、リコンビナント子ウシキモシンの大規模製造のための発現系が、K. lactisについて報告された（Van den Berg, 1990, Bio/Technology 8:135）。Kluyveromycesの工業株によるリコンビナントヒト成熟血清アルブミンの分泌に安定な多重コピー発現ベクターも開示された（Fleer et al., 1991, Bio/Technology 9:968-975）。
【０２２５】
発現ベクター及びクローニングベクターは、通常、ホスト生物により認識され、抗ＣＤ４０抗体又はそのポリペプチド鎖をコードする核酸分子に動作可能に連結されるプロモーターを含有する。原核生物ホストでの使用に適したプロモーターは、ｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系並びにハイブリッドプロモーター、例えば、ｔａｃプロモーターを含む。また、他の公知の細菌プロモーターも適切である。また、細菌系における使用のためのプロモーターは、ヒト化抗ＣＤ４０抗体をコードするＤＮＡに動作可能に連結されたＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｍｏ（Ｓ．Ｄ．）配列も含有するであろう。
【０２２６】
多くの真核生物のプロモーター配列が公知である。実質的に全ての真核生物遺伝子は、転写が開始される部位から約２５〜３０塩基上流に、ＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始点から７０〜８０塩基上流に見いだされる別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域（ここで、Ｎは、任意のヌクレオチドであることができる）である。ほどんどの真核生物遺伝子の３’末端には、コーディング配列の３’末端にポリＡテイルを付加するためのシグナルとなることができるＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は全て、真核生物発現ベクター内に適切に挿入される。
【０２２７】
酵母ホストと共に使用するのに適したプロモーター配列の例は、３−ホスホグリセラートキナーゼ又は他の解糖酵素、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセラートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼのためのプロモーターを含む。
【０２２８】
誘引性プロモーターは、増殖条件により制御される転写という更なる利点を有する。これらは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する誘導体酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ並びにマルトース及びガラクトース利用に関与する酵素のための酵母プロモーター領域を含む。酵母発現での使用に適したベクター及びプロモーターは、ＥＰ第７３，６５７号にさらに記載されている。また、酵母エンハンサーは、酵母プロモーターと共に有利に使用される。
【０２２９】
ほ乳類ホスト細胞中のベクターからのヒト化抗ＣＤ４０抗体転写は、例えば、ウイルス、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のゲノムから、異種ほ乳類プロモーター、例えば、アクチンプロモーターもしくは免疫グロブリンプロモーターから又は熱ショックプロモーターから得られるプロモーターにより制御される。ただし、このようなプロモーターは、ホスト細胞系に適合性であるという条件である。
【０２３０】
ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含有するＳＶ４０制限フラグメントとして便宜に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの即時型初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限フラグメントとして便宜に得られる。ウシパピローマウイルスをベクターとしてほ乳類ホストにおいてＤＮＡを発現させる系が、ＵＳ第４，４１９，４４６号に開示されている。この系の改変が、ＵＳ第４，６０１，９７８号に記載されている。Reyes et al., 1982, Nature 297:598-601も参照のこと。同文献には、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのマウス細胞におけるヒトｐ−インターフェロンｃＤＮＡの発現が開されている。代替的には、ラウス肉腫ウイルス長末端反復配列をプロモーターとして使用することができる。
【０２３１】
リコンビナント発現ベクターに使用することができる別の有用なエレメントは、エンハンサー配列である。同配列は、高等真核生物によるヒト化抗ＣＤ４０抗体をコードするＤＮＡの転写を増加させるのに使用される。現在、多くのエンハンサー配列が、ほ乳類の遺伝子（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン及びインシュリン）から公知である。ただし、典型的には、真核生物細胞ウイルス由来のエンハンサーが使用される。例は、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーを含む。真核生物プロモーターを活性化するための増強エレメントの説明については、Yaniv, 1982, Nature 297:17-18も参照のこと。エンハンサーは、ヒト化抗ＣＤ４０抗体をコードする配列に対して５’又は３’の位置でベクターにスプライシングさせることができるが、好ましくは、プロモーターから５’の部位に位置する。
【０２３２】
また、真核生物ホスト細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト又は他の多細胞生物由来の有核細胞）で使用される発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含有することができる。このような配列は、一般的には、真核生物又はウイルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５’及び場合により、３’非翻訳領域から入手できる。これらの領域は、抗ＣＤ４０抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。１つの有用な転写終結コンポーネントは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ第９４／１１０２６号及び同文献に開示されている発現ベクターを参照のこと。一部の態様では、ヒト化抗ＣＤ４０抗体は、ＣＨＥＦ系を使用して発現させることができる。例えば、ＵＳ第５，８８８，８０９号を参照のこと。同文献の開示は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０２３３】
本明細書におけるベクター中でＤＮＡをクローニングし又は発現させるのに適したホスト細胞は、上記された原核生物、酵母又は高等真核生物細胞である。この目的に適した原核生物は、eubacteria、例えば、グラム陰性又はグラム陽性生物、例えば、Enterobacteriaceae、例えば、Escherichia、例えば、E. coli、Enterobacter、Erwinia、Klebsiella、Proteus、Salmonella、例えば、Salmonella typhimurium、Serratia、例えば、Serratia marcescans及びShigella並びにBacilli、例えば、B. subtilis及びB. licheniformis（例えば、DD 266,710 published Apr. 12, 1989に開示されているB. licheniformis 41 P）、Pseudomonas、例えば、P. aeruginosa及びStreptomycesを含む。１つの好ましいE. coliクローニングホストは、E. coli 294（ATCC 31,446）であるが、他の株、例えば、E. coli B、E. coli X1776（ATCC 31,537）及びE. coli W3110（ATCC 27,325）が適している。これらの例は、限定ではなく例示である。
【０２３４】
原核生物に加えて、真核微生物、例えば、糸状菌又は酵母は、ヒト化抗ＣＤ４０抗体をコードするベクターに適したクローニング又は発現ホストである。Saccharomyces cerevisiae又は一般的なパン酵母は、下等真核生物のホスト微生物の中で最も一般的に使用される。ただし、数多くの他の属、種及び株が一般に入手可能であり、本明細書において有用であり、例えば、Schizosaccharomyces pombe；Kluyveromycesホスト、例えば、K. lactis、K. fragilis（ATCC 12,424）、K. bulgaricus（ATCC 16,045）、K. wickeramii（ATCC 24,178）、K. waltii（ATCC 56,500）、K. drosophilarum（ATCC 36,906）、K. thermotolerans及びK. marxianus；yarrowia（ＥＰ第４０２，２２６号)等；Pichia pastors（ＥＰ第１８３，０７０号)；Candida；Trichoderma reesia（ＥＰ第２４４，２３４号); Neurospora crassa；Schwanniomyces、例えば、Schwanniomyces occidentalis；並びに糸状菌、例えば、Neurospora、Penicillium、Tolypocladium及びAspergillusホスト、例えば、A. nidulans及びA. niger等である。
【０２３５】
グリコシル化ヒト化抗ＣＤ４０抗体の発現に適したホスト細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例は、例えば、多数のバキュロウイルス株及び変異体並びにSpodoptera frugiperda（毛虫）、Aedes aegypti（蚊）、Aedes albopictus（蚊）、Drosophila melanogaster（ショウジョウバエ）及びBombyx mori（カイコ）等のホスト由来の対応する許容昆虫ホスト細胞を含む、植物及び昆虫細胞を含む。トランスフェクションのための各種のウイルス株、例えば、Autographa californica NPVのＬ−１変異体及びBombyx mori NPVのＢｍ−５株が公衆に利用可能である。このようなウイルスは、特に、Spodoptera frugiperda細胞のトランスフェクションに使用することができる。
【０２３６】
綿花、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト及びタバコの植物細胞培養物もホストとして利用することができる。
【０２３７】
別の態様では、ヒト化抗ＣＤ４０の発現は、脊椎動物細胞において行われる。培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖は、ルーチンな手法になっており、技術は広く利用可能である。有用なほ乳類ホスト細胞系統の例は、ＳＶ４０によりトランスフェクションされたサル腎臓ＣＶ１系統（ＣＯＳ−７、ATCC CRL 1651）、ヒト胚性腎臓系統、（懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３又は２９３細胞）（Graham et al., 1977, J. Gen Virol. 36: 59）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ATCC CCL 10）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ１（ＣＨＯ、Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216；例えば、ＤＧ４４）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather, 1980, Biol. Reprod. 23:243-251）、サル腎臓細胞（ＣＶ１、ATCC CCL 70）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ATCC CRL-1587）、ヒト子宮頸ガン細胞（ＨＥＬＡ、ATCC CCL 2）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ATCC CCL 34）、バッファーローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ATCC CRL 1442）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ATCC CCL 75）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ATCC CCL51）、ＴＲ１細胞（Mather et al., 1982, Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68）、ＭＲＣ  ５細胞、ＦＳ４細胞及びヒト肝ガン系統（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【０２３８】
ホスト細胞を、ヒト化抗ＣＤ４０抗体産生のための上記された発現ベクター又はクローニングベクターによりトランスフォーメーションし、プロモーターの誘引、トランスフォーマントの選択又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適切に修飾された従来の栄養培地中で培養する。
【０２３９】
本明細書で記載されたヒト化抗ＣＤ４０抗体を産生するのに使用されるホスト細胞は、各種の培地中で培養することができる。市販の培地、例えば、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Mo)、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Sigma-Aldrich Co.）、ＲＰＭＩ−１６４０（Sigma-Aldrich Co.）及びダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Sigma-Aldrich Co.）は、ホスト細胞の培養に適している。加えて、ホスト細胞のための培養培地として、Ham et al., 1979, Meth. Enz. 58: 44、Barnes et al., 1980, Anal. Biochem. 102: 255、ＵＳ第４，７６７，７０４号、同第４，６５７，８６６号、同第４，９２７，７６２号、同第４，５６０，６５５号、同第５，１２２，４６９号、ＷＯ第９０／１０３４３０号及び同第８７／００１９５号の１つ以上に記載されている培地のいずれかを使用することができる。これらの培地はいずれも、必要に応じて、ホルモン及び／又は他の増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリン又は上皮成長因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びホスファート）、バッファー（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えば、アデノシン及びチミジン）、抗生物質（例えば、ゲンタマイシン）、微量元素（通常、マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）並びにグルコース又は同等のエネルギー源を補充することができる。また、他のサプリメントも、当業者に公知であろう適切な濃度で含ませることができる。培養条件、例えば、温度、ｐＨ等は、発現のために選択されたホスト細胞で以前から使用されているものであり、当業者に明らかであろう。
【０２４０】
リコンビナント技術を使用する場合、抗体は、細胞内、ペリプラズム空間内で産生することができ又は培地中に直接分泌させることができる。抗体が細胞内で産生される場合、細胞は、第１の工程として、タンパク質を放出するために破壊される場合がある。ホスト細胞又は溶解断片のいずれかである粒子状デブリを、例えば、遠心分離又は限外ろ過により除去することができる。Carter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167には、E. coliのペリプラズム空間に分泌される抗体を単離するための手法が記載されている。簡潔に、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ及びフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分かけて解凍する。細胞デブリを遠心分離により除去することができる。抗体が、培地中に分泌される場合、このような発現系からの上清は、一般的には、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、Amicon又はMillipore Pellicon限外ろ過ユニット）を使用して、最初に濃縮される。プロテアーゼ阻害剤、例えば、ＰＭＳＦを、タンパク質分解を阻害するために、前述の工程のいずれかに含ませることができ、抗生物質を、外来性の夾雑物の増殖を防止するために含ませることができる。ホスト細胞から抗体を単離するための各種の方法を使用することができる。
【０２４１】
細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析及び親和性クロマトグラフィーを使用して精製することができる。ここで、親和性クロマトグラフィーが、典型的な精製技術である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適切さは、抗体に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種類及びアイソタイプにより決まる。プロテインＡは、ヒトガンマ１、ガンマ２又はガンマ４重鎖に基づく抗体を精製するのに使用することができる（例えば、Lindmark et al., 1983 J. Immunol. Meth. 62:1-13を参照のこと）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトガンマ３に推奨される（例えば、Guss et al., 1986 EMBO J. 5:1567-1575を参照のこと）。親和性リガンドが付着するマトリックスは、ほとんどの場合アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。機械的に安定なマトリックス、例えば、孔制御ガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンにより、アガロースで達成することができるよりも、早い流速及び短い処理時間が可能となる。抗体が、ＣＨ３ドメインを含む場合、Bakerbond ABX（商標）樹脂（J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.）が、精製に有用である。タンパク質精製のための他の技術、多と負えば、イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）でのヘパリンSEPHAROSE（商標）クロマトグラフィーでのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び硫酸アンモニウム沈殿も、回収される抗体に応じて利用可能である。
【０２４２】
任意の予備精製工程後に、目的の抗体及び夾雑物を含む混合物を、約２．５〜４．５の間のｐＨで溶出バッファーを使用する低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供することができ、典型的には、低塩濃度（例えば、約０〜０．２５M 塩）で行うことができる。
【０２４３】
また、本明細書で定義されたように、低、中及び高ストリンジェンシー条件下で、配列番号：２７及び配列番号：２６それぞれ；配列番号：２８及び配列番号：２６それぞれ；配列番号：２９及び配列番号：２６それぞれ；配列番号：３０及び配列番号：２６それぞれ；配列番号：３２及び配列番号：３１それぞれ；配列番号：３３及び配列番号：３１それぞれ；配列番号：３４及び配列番号：３１それぞれ；配列番号：３５及び配列番号：３１それぞれ；配列番号：３７及び配列番号：３６それぞれ；配列番号：３８及び配列番号：３６それぞれ；配列番号：３９及び配列番号：３６それぞれ；配列番号：４０及び配列番号：３６それぞれのアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変領域を有する抗体又は抗体フラグメントをコードする、単離されたポリヌクレオチド配列により表されるヌクレオチド配列の全部又は一部（例えば、可変領域をコードする部分）にハイブリダイズする核酸も含まれる。ハイブリダイズする核酸のハイブリダイズ部分は、典型的には、少なくとも１５（例えば、２０、２５、３０又は５０）ヌクレオチド長である。ハイブリダイズする核酸のハイブリダイズ部分は、抗ＣＤ４０ポリペプチド（例えば、重鎖又は軽鎖可変領域）又はその相補体をコードする核酸の一部又は全ての配列と、少なくとも８０％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９８％同一である。本明細書で記載された種類のハイブリダイズする核酸は、例えば、クローニングプローブ、プライマー、例えば、ＰＣＲプライマー又は診断プローブとして使用することができる。
【０２４４】
一部の実施態様は、配列番号：１〜４、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９又は配列番号：４０のいずれかのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である重鎖可変領域アミノ酸配列を有する抗体又は抗体フラグメントをコードする配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを含む。一部の実施態様は、配列番号：５〜８、配列番号：２６、配列番号：３１又は配列番号：３６のいずれかのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を有する抗体又は抗体フラグメントをコードする配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを含む。
【０２４５】
一態様では、単離されたポリヌクレオチド配列は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変領域を有する抗体又は抗体フラグメントをコードする。重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変領域はそれぞれ、配列番号：２７及び配列番号：２６それぞれ；配列番号：２８及び配列番号：２６それぞれ；配列番号：２９及び配列番号：２６それぞれ；配列番号：３０及び配列番号：２６それぞれ；配列番号：３２及び配列番号：３１それぞれ；配列番号：３３及び配列番号：３１それぞれ；配列番号：３４及び配列番号：３１それぞれ；配列番号：３５及び配列番号：３１それぞれ；配列番号：３７及び配列番号：３６それぞれ；配列番号：３８及び配列番号：３６それぞれ；配列番号：３９及び配列番号：３６それぞれ；配列番号：４０及び配列番号：３６それぞれのアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変領域を有する抗体又は抗体フラグメントのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０２４６】
別の態様では、本発明は、コードされた抗体又は抗体フラグメントの重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変領域が一実施態様では、配列番号：２７及び配列番号：２６それぞれ；別の実施態様では、配列番号：２８及び配列番号：２６それぞれ；別の実施態様では、配列番号：２９及び配列番号：２６それぞれ；別の実施態様では、配列番号：３０及び配列番号：２６それぞれ；別の実施態様では、配列番号：３２及び配列番号：３１それぞれ；別の実施態様では、配列番号：３３及び配列番号：３１それぞれ；別の実施態様では、配列番号：３４及び配列番号：３１それぞれ；別の実施態様では、配列番号：３５及び配列番号：３１それぞれ；別の実施態様では、配列番号：３７及び配列番号：３６それぞれ；別の実施態様では、配列番号：３８及び配列番号：３６それぞれ；別の実施態様では、配列番号：３９及び配列番号：３６それぞれ；並びに、別の実施態様では、配列番号：４０及び配列番号：３６それぞれのアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変領域を有する抗体又は抗体フラグメントのアミノ酸配列と、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、すぐ上で記載された実施態様におけるポリヌクレオチドに関する。
【０２４７】
本明細書で使用する場合、「同一」又は「％  同一性」という用語は、２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈において、最大の対応のために比較し、アライメントさせた場合、同じであるか又は同じであるヌクレオチドもしくはアミノ酸残基の特定の割合を有する、２つ以上の配列又はサブ配列を指す。％  同一性を決定するために、配列を最適な比較目的のためにアライメントさせる（例えば、ギャップを第２のアミノ又は核酸配列との最適なアライメントのために、第１のアミノ酸又は核酸配列の配列に導入することができる）。ついで、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドにより使用される場合には、分子はその位置で同一である。２つの配列間の％  同一性は、配列により共有される同一位置の数の関数である（すなわち、％  同一性＝同一位置の数／位置の合計数（例えば、重複位置）×１００）。一部の実施態様では、比較される２つの配列は、ギャップが配列内に導入された後、適切な場合（例えば、比較される配列を超えて伸長するさらなる配列を除く）、同じ長さである。例えば、可変領域配列が比較される場合、リーダー及び／又は定常ドメイン配列は考慮されない。２つの配列間の配列比較について、「対応する」ＣＤＲは、両方の配列中の同じ位置にあるＣＤＲ（例えば、各配列のＣＤＲ−Ｈ１）を指す。
【０２４８】
２つの配列間の％  同一性又は％  類似性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。２つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268（Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877において改良）のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝１００、ワード長＝１２）により行い、目的のタンパク質をコードする核酸に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝５０、ワード長＝３）により行い、目的のタンパク質に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためのギャップアライメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを、Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載されているように利用することができる。代替的には、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを使用して、分子間の遠い関係を検出する反復検索を行うことができる（同上）。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ、ＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例は、Myers and Miller, CABIOS(1989)のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重み残基表、１２のギャップ長ペナルティー及び４のギャップペナルティーを使用することができる。配列分析のための更なるアルゴリズムは、当技術分野において公知であり、Torellis and Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5に記載されているＡＤＶＡＮＣＥ及びＡＤＡＭ並びにPearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-8に記載されているＦＡＳＴＡを含む。ＦＡＳＴＡ内では、ｋｔｕｐが検索の感度及び速度を設定する制御オプションである。ｋｔｕｐ＝２の場合、比較される２つの配列における類似の領域が、アライメントされた残基のペアを見ることにより見出される。ｋｔｕｐ＝１の場合、単一のアライメントされたアミノ酸が試験される。ｋｔｕｐは、タンパク質配列については、２もしくは１又はＤＮＡ配列については、１〜６に設定することができる。ｋｔｕｐが指定されていない場合のデフォルトは、タンパク質については２であり、ＤＮＡについては６である。代替的には、タンパク質配列アライメントは、Higgins et al., 1996, Methods Enzymol. 266:383-402に記載されているように、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアルゴリズムを使用して行うことができる。
【０２４９】
治療以外の用途
本明細書で記載された抗体は、親和性精製剤として有用である。この方法では、該抗体は、当技術分野で周知の方法を使用して、固相、例えば、プロテインＡ樹脂に固定化される。固定化された抗体は、精製されるＣＤ４０タンパク質（又はそのフラグメント）を含有するサンプルと接触し、その後、支持体を、固定化された抗体に結合しているＣＤ４０タンパク質を除くサンプル中の実質的に全ての物質を除去するであろう適切な溶媒により洗浄する。最後に、支持体を、抗体からＣＤ４０タンパク質を放出するであろう別の適切な溶媒により洗浄する。
【０２５０】
また、ヒト化抗ＣＤ４０抗体は、ＣＤ４０タンパク質を検出し及び／又は定量するための診断アッセイ（例えば、特定の細胞、組織又は血清におけるＣＤ４０発現を検出すること）にも有用である。
【０２５１】
一部の実施態様では、例えば、診断目的で、検出可能な部分で抗体をラベルするのが有利であろう。放射性同位体、蛍光ラベル、酵素基質ラベル等を含む多数の検出可能なラベルが利用可能である。ラベルは、種々の公知の技術を使用して、抗体と間接的にコンジュゲートさせることができる。例えば、抗体は、ビオチンとコンジュゲートさせることができ、上記言及された３つの広範なカテゴリーのラベルのいずれかは、アビジンとコンジュゲートさせることができ又はその逆も可能である。ビオチンは、アビジンに選択的に結合し、このため、ラベルをこの間接的な様式で抗体とコンジュゲートさせることができる。代替的には、ラベルと抗体との間接的なコンジュゲーションを達成するために、抗体を小ハプテン（例えば、ジゴキシン）とコンジュゲートさせることができ、上記言及された異なる種類のラベルの１つを抗ハプテン抗体（例えば、抗ジゴキシン抗体）とコンジュゲートさせる。このようにして、ラベルと抗体との間接的なコンジュゲーションを達成することができる。
【０２５２】
例示的な放射性同位体ラベルは、３５Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ及び１３１Ｉを含む。抗体は、放射性同位体により、例えば、Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, 1991, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubsに記載されている技術を使用してラベルすることができる。放射能は、例えば、シンチレーション計数により測定することができる。
【０２５３】
例示的な蛍光ラベルは、希土類キレート（ユーロピウムキレート）に由来するラベル又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリスリン並びにＴｅｘａｓ  Ｒｅｄを含み、利用可能である。蛍光ラベルは、例えば、上記Current Protocols in Immunologyに開示されているような公知の技術を介して、抗体にコンジュゲートさせることができる。蛍光を、蛍光計を使用して定量化することができる。
【０２５４】
当技術分野において公知の種々のよく特徴付けられた酵素−基質ラベルが存在する（例えば、レビューについては、ＵＳ第４，２７５，１４９号を参照のこと）。該酵素は、一般的には、種々の技術を使用して測定することができる発色基質の化学的変化を触媒する。例えば、変化は、分光光度的に測定することができる基質の色の変化であることができる。代替的には、該酵素は、基質の蛍光又は化学発光を変化させる場合がある。蛍光の変化を定量化する技術は上記されている。化学発光基質は、化学反応により電子的に励起され、ついで、例えば、化学ルミノメーターを使用して測定することができる光を発するか又は蛍光アクセプターにエネルギーを供与することができる。
【０２５５】
酵素ラベルの例は、ルシフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（ＵＳ第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環オキシダーゼ（例えば、ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ等を含む。酵素を抗体にコンジュゲートさせるための技術は、例えば、O'Sullivan et al., 1981, Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (J. Langone & H. Van Vunakis, eds.), Academic press, N.Y., 73: 147-166に記載されている。
【０２５６】
酵素−基質の組み合わせの例は、例えば、過酸化水素を基質とする西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）（ここで、過酸化水素は、色素前駆体、例えば、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）又は３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン塩酸塩（ＴＭＢ）を酸化する）；パラ−ニトロフェニルホスファートを発色基質とするアルカリホスファターゼ（ＡＰ）；及びｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等を発色基質とする又は４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼを蛍光基質とするβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−Ｇａｌ）を含む。
【０２５７】
多数の他の酵素−基質の組み合わせが、当業者に利用可能である。これらの一般的なレビューについては、ＵＳ第４，２７５，１４９号及び同第４，３１８，９８０号を参照のこと。
【０２５８】
別の実施態様では、ヒト化抗ＣＤ４０抗体は、ラベルされずに使用され、ヒト化抗ＣＤ４０抗体に結合するラベル抗体で検出される。
【０２５９】
本明細書で記載された抗体は、任意の公知のアッセイ法、例えば、競合的結合アッセイ、直接及び間接サンドイッチアッセイ及び免疫沈降アッセイにおいて利用することができる。例えば、Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987)を参照のこと。
【０２６０】
診断キット
ヒト化抗ＣＤ４０抗体は、診断キット、すなわち、診断アッセイを行うための説明書と共に、所定量の試薬のパッケージされた組み合わせにおいて使用することができる。抗体が、酵素によりラベルされている場合、該キットは、酵素により必要とされる基質及び補因子、例えば、検出可能な発色団又はフルオロフォアを提供する基質前駆体を含むことができる。加えて、他の添加剤、例えば、安定剤、バッファー（例えば、ブロックバッファー又は溶解バッファー）等を含ませることができる。種々の試薬の相対量は、アッセイの感度を実質的に最適化する試薬の溶液中の濃度を提供するために、広く変化させることができる。試薬は、溶解時に適切な濃度を有する試薬溶液を提供するであろう賦形剤を含む、通常は凍結乾燥された乾燥粉末として提供することができる。
【０２６１】
治療的用途
別の実施態様では、本明細書で開示されたヒト化抗ＣＤ４０抗体は、本明細書で記載されたＣＤ４０の発現に関連する種々の障害の処置に有用である。
【０２６２】
ヒト化抗ＣＤ４０抗体又は薬剤は、非経口、皮下、腹腔内、肺内及び鼻腔内を含む任意の適切な手段により投与され、必要に応じて、局所免疫サプレッション処置、病変内投与（移植前に移植片を潅流するか又は何等かの方法で抗体と接触させることを含む）により投与される。ヒト化抗ＣＤ４０抗体又は薬剤は、例えば、注入又はボーラスとして投与することができる。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与を含む。加えて、ヒト化抗ＣＤ４０抗体は、パルス注入により、特に、抗体の用量を減少させながら、適切に投与される。一態様では、投与は、投与が短期間であるか又は慢性であるかに一部依存して、注射、最も好ましくは、静脈内注射又は皮下注射により与えられる。
【０２６３】
疾患の予防又は治療のために、抗体の適切な投与量は、上記定義されたように、処置される疾患の種類、疾患の重症度及び経過、抗体が予防目的又は治療目的で投与されるかどうか、以前の治療、患者の臨床歴及び抗体に対する応答並びに主治医の裁量等の各種の要因により決まるであろう。抗体は、一度に又は一連の処置にわたって患者に適切に投与される。
【０２６４】
疾患の種類及び重症度に応じて、約１μg/kg〜２０mg/kg（例えば、０．１〜１５mg/kg） 抗体が、例えば、１回以上の別々の投与によるか又は連続注入によるかにかかわらず、患者への投与のための最初の候補用量である。典型的な一日量は、上記言及された要因に応じて、約１μg/kg〜１００mg/kg以上の範囲であることができる。数日以上にわたる反復投与については、状態に応じて、疾患症状の所望のサプレッションが生じるまで、処置が持続される。ただし、他の投与計画も有用であることができる。この治療の進展は、従来からの技術及びアッセイにより容易にモニターされる。例示的な投与計画は、ＷＯ第９４／０４１８８号に開示されているものである。
【０２６５】
「サプレッション」という用語は、本明細書において、「改善」及び「緩和」と同じ文脈で使用され、疾患の１つ以上の特徴を減少させることを意味する。
【０２６６】
抗体組成物は、高い医療水準（ｇｏｏｄ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）と一致する様式で配合され、投薬され、投与されるであろう。この文脈において考慮される要因は、処置される特定の障害、処置される特定のほ乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与のスケジューリング及び医師に公知の他の要因を含む。投与される抗体の「治療上有効量」は、このような考慮事項により管理されるであろうし、ＣＤ４０発現に関連する障害を予防し、改善し又は治療するのに必要な最少量である。
【０２６７】
抗体は、必ずしも必要ではないが、場合により、当該障害を予防し又は治療するのに現在使用されている１種以上の薬剤と共に配合される。このような他の薬剤の有効量は、配合物中に存在するヒト化抗ＣＤ４０抗体の量、障害又は処置の種類及び上記議論された他の因子により決まる。これらは、一般的には、これまで使用されてきたのと同じ用量及び投与経路で又はこれまで利用されてきた用量の約１〜９９％で使用される。
【０２６８】
ＣＤ４０関連疾患
抗ＣＤ４０抗体又は薬剤は、ＣＤ４０発現ガン又はＣＤ４０の発現、例えば、免疫細胞（例えば、リンパ球又は樹状細胞）の不適切な活性化により特徴付けられる免疫学的障害を治療し又は予防するのに有用である。ＣＤ４０のこのような発現は、例えば、細胞表面でのＣＤ４０タンパク質レベルの向上及び／又は発現されたＣＤ４０の抗原性の変化に起因する場合がある。免疫学的障害の治療又は予防は、本明細書で記載された方法に従って、このような治療又は予防を必要とする対象に、有効量の抗ＣＤ４０抗体又は薬剤を投与することにより、該抗体が（ｉ）ＣＤ４０を発現し、疾患状態に関連する活性化免疫細胞に結合し、（ｉｉ）活性化免疫細胞に対して細胞傷害性、細胞増殖抑制性又は免疫サプレッション効果を発揮することにより達成される。
【０２６９】
免疫細胞の不適切な活性化により特徴付けられ、本明細書で記載された方法により治療し又は予防することができる免疫学的疾患は、例えば、障害の基礎をなす過敏反応のタイプにより分類することができる。これらの反応は、典型的には、４つのタイプ：アナフィラキシー反応、細胞傷害性（細胞溶解）反応、免疫複合体反応又は細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）反応（遅延型過敏症（ＤＴＨ）反応とも呼ばれる）に分類される（例えば、Fundamental Immunology（William E. Paul ed., Raven Press, N.Y., 3rd ed. 1993)を参照のこと）。
【０２７０】
このような免疫学的疾患の具体的な例は、下記：関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、自己免疫性脱髄疾患（例えば、多発性硬化症、アレルギー性脳脊髄炎）、内分泌性眼障害、網膜ブドウ膜炎、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、グレーブス病、糸球体腎炎、自己免疫性肝障害、炎症性腸疾患（例えば、クローン病又は潰瘍性大腸炎）、アナフィラキシー、アレルギー反応、シェーグレン症候群、Ｉ型糖尿病、原発性胆汁性肝硬変、ウェゲナー肉芽腫症、線維筋炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、炎症性筋炎、多発性内分泌不全、シュミット症候群、自己免疫性ブドウ膜炎、アジソン病、副腎炎、甲状腺炎、橋本甲状腺炎、自己免疫性甲状腺疾患、悪性貧血、胃萎縮、慢性肝炎、ルポイド肝炎、アテローム性動脈硬化症、亜急性皮膚エリテマトーデス、副甲状腺機能低下症、ドレスラー症候群、自己免疫性血小板減少症、特発性血小板減少性紫斑病、溶血性貧血、尋常性天疱瘡、天疱瘡、疱疹状皮膚炎、弓状脱毛症、類天疱瘡、強皮症、進行性全身性硬化症、ＣＲＥＳＴ症候群（石灰沈着症、レイノー現象、食道蠕動低下、強指症及び毛細血管拡張）、雌雄の自己免疫性不妊症、強直性脊椎炎、潰瘍性大腸炎、混合性結合組織病、結節性多発動脈炎、全身性壊死性血管炎、アトピー性皮膚炎、アトピー性鼻炎、グッドパスチャー症候群、シャーガス病、サルコイドーシス、リウマチ熱、喘息、再発性流産、抗リン脂質症候群、農夫肺、多形紅斑、開心術後症候群、クッシング症候群、自己免疫性慢性活動性肝炎、鳥飼病、中毒性表皮壊死症、アルポート症候群、肺胞炎、アレルギー性肺胞炎、線維化肺胞炎、間質性肺疾患、結節性紅斑、壊疽性膿皮症、輸血反応、高安動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、側頭動脈炎、住血吸虫症、巨細胞性動脈炎、回虫症、アスペルギルス症、サンプター症候群、湿疹、リンパ腫様肉芽腫症、ベーチェット病、カプラン症候群、川崎病、デング熱、脳脊髄炎、心内膜炎、心内膜心筋線維症、眼内炎、隆起性紅斑、乾癬、胎児赤芽球症、好酸球性顔面炎、シャルマン症候群、フェルティ症候群、フィラリア症、毛様体炎、慢性毛様体炎、異時性毛様体炎、フッホ毛様体炎、ＩｇＡ腎症、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、移植片対宿主病、移植拒絶反応、心筋症、イートン−ランバート症候群、再発性多発軟骨炎、クリオグロブリン血症、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、エバン症候群、急性呼吸窮迫症候群、肺の炎症、骨粗鬆症、遅延型過敏症及び自己免疫性腺不全を含む。
【０２７１】
したがって、本明細書で記載された方法は、Ｂリンパ球の障害（例えば、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、関節リウマチ及びＩ型糖尿病）、Ｔｈ１リンパ球の障害（例えば、関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、グレーブ病、原発性胆汁性肝硬変、ヴェゲナー肉芽腫症、結核又は移植片対宿主病）又はＴｈ２リンパ球の障害（例えば、アトピー性皮膚炎、全身性エリテマトーデス、アトピー性喘息、鼻結膜炎、アレルギー性鼻炎、オメン症候群、全身性硬化症又は慢性移植片対宿主病）の処置を包含する。一般的には、樹状細胞に関連する障害は、Ｔｈ１リンパ球又はＴｈ２リンパ球の障害を含む。
【０２７２】
関節リウマチ（ＲＡ）は、人口の約１％が罹患する最も一般的な炎症性自己免疫疾患の１つである。有効な治療（例えば、ＭＴＸ及び抗ＴＮＦ薬）が利用可能であるが、特に、抗ＴＮＦ療法に十分な反応を示さない患者（患者の約３０％）には、大きなアンメット・メディカル・ニーズが存在する。加えて、最大５０％ 患者は、主に有害事象のために、５年以内にＴＮＦアンタゴニスト治療を中止する。ますます多くの患者が、治療上の利益を失うためでもある。このため、ＲＡにおける炎症及び関節破壊をターゲットとするが、ＴＮＦの直接的阻害のみに頼らない有効な治療法を確立することが重要である。非常に魅力的なアプローチは、共刺激細胞経路をターゲットとすることである。共刺激における重要なレセプター−リガンドペアの１つは、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌである。この系により、免疫細胞間及び免疫細胞と非免疫細胞との間の相互作用が可能となり、その全てが、ＲＡの病因に重要である。本発明のアンタゴニスト抗体によるＣＤ４０の遮断は、ＲＡにおいて下記効果のうちの１つ以上を有する場合がある。
１）Ｂ細胞分化及び抗体アイソタイプスイッチングを阻害する
２）Ｔ細胞及びマクロファージにおけるサイトカイン及びケモカインの産生並びに接着分子のアップレギュレーションを阻害する
３）樹状細胞の活性化を阻害する
４）炎症誘発性サイトカイン、ケモカイン、マトリックスメタロプロテイナーゼ、プロスタグランジンの産生を阻害し、非免疫細胞（例えば、上皮細胞、内皮細胞及び間葉細胞）における接着分子をダウンレギュレーションする
【０２７３】
１つ以上の上記効果を達成する方法は、本明細書で明確に企図されている。ＲＡに加えて、本発明の組成物は、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、多発性硬化症、乾癬（乾癬性関節炎を含む）、若年性関節リウマチ、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス及び固形臓器移植の処置方法に特に有用であろう。
【０２７４】
関節リウマチ（ＲＡ）は、成人における有病率が約１％の慢性、全身性の自己免疫疾患である。該疾患は、重大な病的状態及び早期死亡を引き起こし続けている（死亡は、主に、心血管疾患の加速による）。現在では、関節損傷が、疾患の経過のごく早期に起こり、最大３０％の患者が、診断時に骨びらんのＸ線像上の証拠を示し、１年後には６０％に増加することが特定されている。現在のガイドラインでは、確定診断が確定してから３か月以内に伝統的な疾患修飾性抗リウマチ剤（ＤＭＡＲＤ）による治療を開始することが推奨されている。ＤＭＡＲＤは、関節損傷を低減し又は予防し、関節機能を維持する可能性を有する。現在、リウマチ専門医は、ほとんどの患者に対する初期ＤＭＡＲＤ療法としてメトトレキサート（ＭＴＸ）を選択している。
【０２７５】
ＴＮＦアンタゴニストであるエタネルセプト（Enbrel（登録商標））、インフリキシマブ（Remicade（登録商標））、アダリムマブ（Humira（登録商標））、ＣＴＬＡ４アンタゴニストであるアバタセプト（Orencia（登録商標））、抗ＩＬ−６レセプター  ｍＡｂであるトシリズマブ及び抗ＣＤ２０  ｍＡｂであるリツキシマブ（Rituxan（登録商標））は、ＲＡの処置に有効である。現行のガイドラインでは、一般的には、伝統的なＤＭＡＲＤでは応答が不十分な後の活動型ＲＡの処置には、生物学的ＤＭＡＲＤの使用が推奨されている。
【０２７６】
先にＭＴＸ処置が行われていない早期侵襲性ＲＡ患者での近年の研究では、ＭＴＸとＴＮＦアンタゴニストとの組み合わせが、それぞれを単剤療法として使用した場合より優れていることが示された。最も顕著な結果は、併用療法の顕著な放射線学的利益であった。このため、ＭＴＸとＴＮＦ阻害剤との組み合わせは、侵襲性疾患及び侵襲性表現型（例えば、高い活動性スコア、機能障害、リウマチ因子（ＲＦ）又は抗環状シトルリン化ペプチド抗体（ＣＣＰ）の血清陽性、ＣＲＰ上昇、Ｘ線上のびらん）のリスクが最も高い患者に使用されるべきである。一方、臨床現場では、ＴＮＦアンタゴニストが、第一選択薬として使用されるであろうことはまれであろうと予想される。２００５年４月に行われた米国のリウマチ専門医を対象とした調査では、ＴＮＦアンタゴニストの使用決定に最も影響を及ぼす要因は、ＭＴＸ又は複数のＤＭＡＲＤの失敗、医師による全般的評価、機能障害、Ｘ線像上の悪化又はびらんであった。現在、米国では、ＲＡ患者の２０％が、ＴＮＦ阻害剤治療を受けていると推定されている。
【０２７７】
ＲＡ患者のかなりの割合が、薬剤不耐性及び毒性のため又は応答が得られないためのいずれかにより、生物学的療法を含む現在の治療では十分な助けが得られない。主に有害イベントのために、最大５０％の患者が、５年以内にＴＮＦアンタゴニスト処置を中止する。応答が得られないと認識された患者数が増えているためである。
【０２７８】
一部の実施態様では、免疫学的障害は、Ｔ細胞媒介性免疫学的障害、例えば、障害に関連する活性化Ｔ細胞がＣＤ４０を発現するＴ細胞障害である。抗ＣＤ４０抗体又は薬剤は、このようなＣＤ４０発現活性化Ｔ細胞を枯渇させるのに投与することができる。具体的な実施態様では、抗ＣＤ４０抗体又は薬剤の投与により、ＣＤ４０発現活性化Ｔ細胞を枯渇させることができるが、休止Ｔ細胞は、抗ＣＤ４０又は薬剤により実質的に枯渇されない。この文脈において、「実質的に枯渇されない」は、約６０％未満又は約７０％未満又は約８０％未満 休止Ｔ細胞が枯渇されないことを意味する。
【０２７９】
また、本明細書で記載された抗ＣＤ４０抗体及び薬剤は、ＣＤ４０発現ガンを治療し又は予防するのにも有用である。本明細書で記載された方法に従って、ＣＤ４０発現ガンの治療又は予防は、このような治療又は予防を必要とする対象に、有効量の抗ＣＤ４０抗体又は薬剤を投与することにより、該抗体又は薬剤が（ｉ）ＣＤ４０発現ガン細胞に結合し、（ｉｉ）細胞傷害性又は細胞増殖抑制効果を発揮して、ＣＤ４０発現ガン細胞を枯渇させるか又は同細胞の増殖を阻害するにより達成される。
【０２８０】
本明細書で記載された方法により治療し又は予防することができるＣＤ４０発現ガンは、例えば、白血病、例えば、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（例えば、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性又は赤白血病）、慢性白血病、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病又は慢性リンパ性白血病；真性赤血球増加症；リンパ腫（例えば、ホジキン病又は非ホジキン病）；多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；重鎖病；固形腫瘍、例えば、肉腫及びガン腫（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸ガン、結腸直腸ガン、膵臓ガン、乳ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、扁平上皮ガン、基底細胞ガン、腺ガン、汗腺ガン、脂腺ガン、乳頭ガン、乳頭腺ガン、嚢胞腺ガン、髄様ガン、気管支原性ガン、腎細胞ガン、肝細胞ガン、胆管ガン、絨毛ガン、セミノーマ、胎児性ガン、ウィルムス腫瘍、子宮頸ガン、子宮ガン、精巣腫瘍、肺ガン、小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、膀胱ガン、上皮ガン、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経膠腫、乏突起膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽腫、網膜芽細胞腫、鼻咽頭ガン又は食道ガンを含む。
【０２８１】
医薬組成物及びその投与
ＣＤ４０結合剤（例えば、抗ＣＤ４０抗体）を含む組成物は、免疫学的障害又はＣＤ４０発現ガンを有するか又は有するリスクがある対象に投与することができる。本発明は、さらに、ＣＤ４０発現ガン又は免疫学的障害の予防又は治療のための医薬の製造における、ＣＤ４０結合剤（例えば、抗ＣＤ４０抗体）の使用を提供する。本明細書で使用する場合、「対象」という用語は、ＣＤ４０結合剤を投与することができる任意のほ乳類患者を意味し、例えば、ヒト及び非ヒトほ乳類、例えば、霊長類、げっ歯類及びイヌを含む。本明細書で記載された方法を使用する処置に特に意図される対象は、ヒトを含む。該抗体又は薬剤は、免疫学的障害又はＣＤ４０発現ガンの予防又は治療において、単独で又は他の組成物と組み合わせて投与することができる。
【０２８２】
このような医薬組成物に使用するのに好ましい抗体は、配列番号：１〜４、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９又は配列番号：４０のいずれかの重鎖可変領域アミノ酸配列を有するヒト化抗体又は抗体フラグメントを含む抗体である。
【０２８３】
一部の実施態様は、配列番号：２６、配列番号：３１又は配列番号：３６の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を有する抗体又は抗体フラグメントをコードする配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを含む。特に好ましいヒト化抗体組成物は、配列番号：２７及び配列番号：２６それぞれ；配列番号：２８及び配列番号：２６それぞれ；配列番号：２９及び配列番号：２６それぞれ；配列番号：３０及び配列番号：２６それぞれ；配列番号：３２及び配列番号：３１それぞれ；配列番号：３３及び配列番号：３１それぞれ；配列番号：３４及び配列番号：３１それぞれ；配列番号：３５及び配列番号：３１それぞれ；配列番号：３７及び配列番号：３６それぞれ；配列番号：３８及び配列番号：３６それぞれ；配列番号：３９及び配列番号：３６それぞれ；配列番号：４０及び配列番号：３６それぞれのアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変領域を有する、抗体又は抗体フラグメントを含む。配列番号：１〜４、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５３、配列番号：５７、配列番号：５８、配列番号：５９、配列番号：６０、配列番号：６１、配列番号：６２、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番号：６５、配列番号：６６、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９、配列番号：７０、配列番号：７１、配列番号：７２又は配列番号：７３の重鎖配列のいずれかをコードする、単離されたポリヌクレオチドは、本発明の範囲内であることが企図される。他の実施態様は、配列番号：５〜配列番号：８、配列番号：２６、配列番号：３１、配列番号：３６、配列番号：４１、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５０、配列番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５５、配列番号：５６、配列番号：７４、配列番号：７５又は配列番号：７６の配列のいずれかの軽鎖配列をコードする、単離された核酸を対象とする。
【０２８４】
特定の実施態様では、ＲＡの処置が企図される場合、本発明の組成物は、ＭＴＸ単独に対して十分に応答しない中等度から重度に活性なＲＡを有する患者において、徴候及び症状を減少させ、主要な臨床応答（ｍａｊｏｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を誘引し、構造的損傷の進行を減少させるための方法に使用することができる。現在の例示的なこのような治療は、Enbrel/Humiraである（Humira及びEnbrelによるデータが、２つの異なる患者集団において得られた）。本発明の組成物は、ＭＴＸ単独に対して応答しない対象について、Enbrel/Humira療法に代えて又はEnbrel/Humira療法と組み合わせて使用することができる。好ましくは、このような実施態様では、本発明の組成物は、例えば、化合物＋ＭＴＸについて６か月＞８５％のＡＣＲ２０（ＧＳ：Enbrel＋ＭＴＸ  ７１％対プラセボ＋ＭＴＸ  ２７％、１２ヶ月でのHumira＋ＭＴＸ  ５９％対プラセボ＋ＭＴＸ  ２４％）＊で決定されたように、メトトレキサートに対して不十分な応答を示した患者において、Enbrel＋ＭＴＸより優れた効力を有するであろう。本発明の組成物の優れた効力についてのさらなる基準は、Enbrelと同様の１年間にわたる構造的損傷の進行の阻害を含むことができる(５２週間後の平均修飾Ｓｈａｒｐスコア  Humira＋ＭＴＸ  ０．１対プラセボ＋ＭＴＸ  ２．７）＊。さらに他の実施態様では、該組成物は、ＡＣＲ７０により測定されたように、メトトレキサートに対して不十分な応答を示した患者において、Enbrelより優れた「主要な臨床応答」を生じさせる（Humira＋ＭＴＸでは２０％、プラセボ＋ＭＴＸでは４％）＊。
【０２８５】
他の実施態様では、本発明の組成物は、抗ＴＮＦ剤に対して不十分な応答を示した中等度から重度に活性なＲＡを有する患者において、徴候及び症状を減少させ、主要な臨床応答を誘引し、構造的損傷の進行を減少させるのに必要とされる場合がある。現在のＧｏｌｄ標準：非抗ＴＮＦ生物学的療法。好ましくは、このような対象において、本発明の組成物は、抗ＴＮＦ剤に対して不十分な応答を示した患者における既往歴比較により、非抗ＴＮＦ生物学的製剤（例えば、Orencia、Rituxan）と比較して、優れた効力を有する。化合物＋ＤＭＡＲＤについて６か月＞５０％のＡＣＲ２０（ＧＳ：Orencia＋ＤＭＡＲＤ  ５０％対プラセボ＋ＤＭＡＲＤ  ２０％）。さらに他の実施態様では、本発明の組成物は、Rituxanと同様に、関節びらん及び関節腔狭窄のための許容されたＸ線スコアリング法により評価される１年間にわたる構造損傷の進行を阻害する（５２週間後の平均修正Ｓｈａｒｐスコア  Rituxan＋ＭＴＸ  １．０対プラセボ＋ＭＴＸ  ２．３１）。
【０２８６】
種々の送達システムが公知であり、ＣＤ４０結合剤を投与するのに使用することができる。導入方法は、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外及び経口経路を含むが、これらに限定されない。ＣＤ４０結合剤は、例えば、注入、ボーラス又は注射により投与することができ、他の生物学的に活性な薬剤、例えば、化学療法剤と共に投与することができる。投与は、全身又は局所であることができる。好ましい態様では、投与は、皮下注射による。このような注射のための製剤は、例えば、１週間おきに１回投与することができる、予め充填されたシリンジで調製することができる。
【０２８７】
本発明の抗体の安全性の特徴が決定されるであろうし、好ましくは、１つ以上の特徴、例えば、関節リウマチを処置するのに一般的に使用される他の医薬品（例えば、ＤＭＡＲＤ、ステロイド、ＮＳＡＩＤ）との臨床的に重大で有害な相互作用がないこと；Enbrelと比較して安全性又は許容性の問題による中止率が高くないこと；抗ＴＮＦ剤又は他の一般的に使用される生物学的製剤より重篤な感染症の割合が大きくないこと；Enbrelと同様の注射部位反応又は注入反応の頻度及び／又は重症度；治療の反復サイクルにおける薬剤耐性の発生がないか又は最小限（５％未満）であること；中和抗体がないか又は最小限であること；ｉｎ  ｖｉｖｏでの血栓塞栓イベント又は出血につながる場合がある血小板／内皮機能障害につながる場合がある血小板凝集／活性化が増強されたという証拠がないことを含むであろう。
【０２８８】
具体的な実施態様では、ＣＤ４０結合剤組成物は、注射により、カテーテルにより、坐剤により又はインプラントにより投与される。インプラントは、シラスティック膜等の膜又は繊維を含む、多孔質、非多孔質又はゼラチン状材料のものである。典型的には、該組成物を投与する場合、抗ＣＤ４０抗体又は薬剤が吸収しない材料が使用される。
【０２８９】
他の実施態様では、抗ＣＤ４０抗体又は薬剤は、制御放出系で送達される。一実施態様では、ポンプを使用することができる（例えば、Langer, 1990, Science 249:1527-1533；Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201；Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507；Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574を参照のこと）。別の実施態様では、ポリマー材料を使用することができる（例えば、Medical Applications of Controlled Release（Langer and Wise eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1974）；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance（Smolen and Ball eds., Wiley, New York, 1984）；Ranger and Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61）。Levy et al., 1985, Science 228:190；During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351；Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105.も参照のこと。他の制御放出系は、例えば、上記Langerにおいて議論されている。
【０２９０】
ＣＤ４０結合剤（例えば、抗ＣＤ４０抗体）は、治療上有効量の結合剤及び１種以上の薬学的に適合性の成分を含む医薬組成物として投与することができる。
【０２９１】
典型的な実施態様では、該医薬組成物は、ヒトへの静脈内又は皮下投与に適合した医薬組成物として、ルーチンな手法に従って配合される。典型的には、注射による投与のための組成物は、滅菌等張水性バッファーの溶液である。必要に応じて、医薬品は、可溶化剤及び局所麻酔剤、例えば、リグノカインを含ませて、注射部位での疼痛を緩和することもできる。一般的には、成分は、別個に又は同成分同士を単一剤形に混合させて（例えば、活性剤の量を示す気密封入容器、例えば、アンプル又は小袋に入った凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として）のいずれかで供給される。医薬品が、注入により投与される場合、該医薬品は、無菌医薬品グレードの水又は生理食塩水を含有する注入ボトルにより分注することができる。医薬品が、注射により投与される場合、注射用の滅菌水又は生理食塩水のアンプルを提供して、成分を投与前に混合することができる。
【０２９２】
さらに、医薬組成物は、（ａ）凍結乾燥形態にあるＣＤ４０結合剤（例えば、抗ＣＤ４０抗体）を含有する容器及び（ｂ）注射用の薬学的に許容し得る希釈剤（例えば、滅菌水）を含有する第２の容器を含む、医薬キットとして提供することができる。薬学的に許容し得る希釈剤は、凍結乾燥された抗ＣＤ４０抗体又は薬剤の再構成又は希釈に使用することができる。場合により、このような容器には、医薬品又は生物学的製品の製造、使用又は販売を監督する政府当局により指示された形式での注意書きが添付される。同注意書きは、ヒトへの投与のための製造、使用又は販売の該当局による認可を反映する。
【０２９３】
免疫学的障害又はＣＤ４０発現ガンの治療又は予防に有効なＣＤ４０結合剤（例えば、抗ＣＤ４０抗体）の量は、標準的な臨床技術により決定することができる。加えて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを、場合により、最適な用量範囲を特定するのに役立てるために利用することができる。製剤に利用される正確な用量は、投与経路及び免疫学的障害又はＣＤ４０発現ガンの段階によっても決まるであろうし、実務者の判断及び各患者の状況に応じて決定されるべきである。有効用量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又は動物モデル試験システムから導かれる用量応答曲線から外挿することができる。
【０２９４】
例えば、抗ＣＤ４０抗体又は薬剤の毒性及び治療効力は、ＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するための標準的な医薬手順により、細胞培養物又は実験動物において決定することができる。大きな治療指数を示すＣＤ４０結合剤（例えば、抗ＣＤ４０抗体）が好ましい。ＣＤ４０結合剤が、毒性副作用を示す場合、ＣＤ４０結合剤を患部組織の部位にターゲット化する送達系を使用して、非ＣＤ４０発現細胞の潜在的損傷を最少限に抑え、それにより、副作用を減少させることができる。
【０２９５】
細胞培養アッセイ及び動物研究から得られるデータは、ヒトにおける使用のための用量の範囲を策定するのに使用することができる。ＣＤ４０結合剤の用量は、典型的には、毒性がほとんど又は全くなく、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。用量は、利用される剤形及び利用される投与経路に応じて、この範囲内で変化させることができる。本方法において使用される任意のＣＤ４０結合剤について、治療上有効な用量は、細胞培養アッセイから最初に推定することができる。用量は、細胞培養物において決定されるようなＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量の阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて配合することができる。このような情報を、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するのに使用することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィー、ＥＬＩＳＡ等により測定することができる。
【０２９６】
一般的には、免疫学的障害又はＣＤ４０発現ガンを有する患者に投与される抗ＣＤ４０抗体又はＣＤ４０結合剤の用量は、典型的には、約０．１mg/kg〜約１００mg/kg 対象の体重である。対象に投与される用量は、約０．１mg/kg〜約５０mg/kg、約１mg/kg〜約３０mg/kg、約１mg/kg〜約２０mg/kg、約１mg/kg〜約１５mg/kg又は約１mg/kg〜約１０mg/kg 対象の体重である。
【０２９７】
例示的な用量は、１ng/kg〜１００mg/kgを含むが、これらに限定されない。一部の実施態様では、用量は、約０．５mg/kg、約１mg/kg、約２mg/kg、約３mg/kg、約４mg/kg、約５mg/kg、約６mg/kg、約７mg/kg、約８mg/kg、約９mg/kg、約１０mg/kg、約１１mg/kg、約１２mg/kg、約１３mg/kg、約１４mg/kg、約１５mg/kg又は約１６mg/kgである。用量は、例えば、毎日、週１回（毎週）、週２回、週３回、週４回、週５回、週６回、隔週又は月１回、２か月毎又は３か月毎に投与することができる。具体的な実施態様では、用量は、約０．５mg/kg/週、約１mg/kg/週、約２mg/kg/週、約３mg/kg/週、約４mg/kg/週、約５mg/kg/週、約６mg/kg/週、約７mg/kg/週、約８mg/kg/週、約９mg/kg/週、約１０mg/kg/週、約１１mg/kg/週、約１２mg/kg/週、約１３mg/kg/週、約１４mg/kg/週、約１５mg/kg/週又は約１６mg/kg/週である。一部の実施態様では、用量は、約１mg/kg/週〜約１５mg/kg/週の範囲にある。
【０２９８】
一部の実施態様では、ＣＤ４０結合剤を含む医薬組成物は、該結合剤にコンジュゲートしているか又はコンジュゲートしていないかのいずれかの治療剤をさらに含むことができる。抗ＣＤ４０抗体又はＣＤ４０結合剤は、免疫学的障害又はＣＤ４０発現ガンの治療又は予防のための１種以上の治療剤と組み合わせて同時投与することができる。例えば、併用療法は、細胞増殖抑制剤、細胞傷害剤又は免疫サプレッション剤を含むことができる。また、併用療法は、例えば、活性化リンパ球、樹状細胞又はＣＤ４０発現ガン細胞表面のＣＤ４０以外のレセプター又はレセプター複合体をターゲットとする薬剤の投与を含むこともできる。このような薬剤の例は、活性化リンパ球、樹状細胞又はＣＤ４０発現ガン細胞表面にある分子に結合する第２の非ＣＤ４０抗体を含む。別の例は、このようなレセプター又はレセプター複合体をターゲットとするリガンドを含む。典型的には、このような抗体又はリガンドは、活性化リンパ球、樹状細胞又はＣＤ４０発現ガン細胞の細胞表面レセプターに結合し、活性化リンパ球、樹状細胞又はＣＤ４０発現ガン細胞に細胞増殖抑制性又は細胞傷害性シグナルを送ることにより、抗ＣＤ４０抗体の細胞傷害性又は細胞増殖抑制効果を増強する。
【０２９９】
このような併用療法投与は、疾患パラメーター（例えば、症状の重症度、症状の数又は再発の頻度）に対して相加的又は相乗的効果を有することができる。
【０３００】
併用投与のための治療計画に関して、具体的な実施態様では、抗ＣＤ４０抗体又はＣＤ４０結合剤は、治療剤と同時に投与される。別の具体的な実施態様では、治療剤が、抗ＣＤ４０抗体又はＣＤ４０結合剤の投与の前又は後に、抗ＣＤ４０抗体又はＣＤ４０結合剤の投与の前又は後の少なくとも１時間かつ数か月まで、例えば、少なくとも１時間、５時間、１２時間、１日、１週間、１か月又は３か月までに投与される。
【０３０１】
有用なクラスの細胞傷害剤又は免疫サプレッション剤は、例えば、抗チューブリン剤、オーリスタチン（例えば、ＭＭＡＥ又はＭＭＡＦ）、ＤＮＡ副溝バインダー、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化剤（例えば、白金錯体、例えば、シスプラチン、モノ（白金）、ビス（白金）及び三核白金錯体及びカルボプラチン）、アントラサイクリン、抗生物質、抗葉酸塩、代謝拮抗剤、化学療法増感剤、デュオカルマイシン、エトポシド、フッ素化ピリミジン、イオノフォア、レキシトロプシン、ニトロソウレア、プラチノール、予備成形コンパウンド（ｐｒｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）、プリン代謝拮抗剤、ピューロマイシン、放射線増感剤、ステロイド、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイド等を含む。
【０３０２】
個々の細胞傷害剤又は免疫サプレッション剤は、例えば、アンドロゲン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、アスパラギナーゼ、５−アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ブスルファン、ブチオニン、スルホキシミン、カンプトテカン、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ＣＣ−１０６５、クロラムブシル、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、シタラビン、シチジンアラビノシド、サイトカラシンＢ、ダカルバジン、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ダウノルビシン、デカルバジン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エストロゲン、５−フルオロデオキシウリジン、５−フルオロウラシル、グラミシジンＤ、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミン、メルファラン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ニトロイミダゾール、パクリタキセル、プリカマイシン、プロカルビジン、ストレプトゾトシン、テノポシド、６−チオグアニン、チオＴＥＰＡ、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ＶＰ−１６及びＶＭ−２６を含む。
【０３０３】
一部の典型的な実施態様では、治療剤は、細胞傷害剤である。適切な細胞傷害剤は、例えば、ドラスタチン（例えば、オーリスタチンＥ、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、ＡＥＢ又はＡＥＶＢ）、ＤＮＡ副溝バインダー（例えば、エンジイン及びレキシトロプシン）、デュオカルマイシン、タキサン（例えば、パクリタキセル及びドセタキセル）、ピューロマイシン、ビンカアルカロイド、ＣＣ−１０６５、ＳＮ−３８、トポテカン、モルホリノ−ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、エキノマイシン、コンブレタスタチン、ネトロプシン、エポチロンＡ及びＢ、エストラムスチン、クリプトフィジン、セマドチン、メイタンシノイド、ディスコデルモリド、エリュテロビン又はミトキサントロンを含む。
【０３０４】
一部の実施態様では、細胞傷害剤は、例えば、従来の化学療法剤、例えば、ドキソルビシン、パクリタキセル、メルファラン、ビンカアルカロイド、メトトレキサート、マイトマイシンＣ又はエトポシド等である。加えて、強力な薬剤、例えば、ＣＣ−１０６５類似体、カリケアマイシン、メイタンシン、ドラスタチン１０の類似体、リゾキシン及びパリトキシンを抗ＣＤ４０抗体又はその薬剤に連結させることができる。
【０３０５】
具体的な実施態様では、細胞傷害剤又は細胞増殖抑制剤は、オーリスタチンＥ（当技術分野において、ドラスタチン−１０としても公知である）又はその誘導体である。典型的には、オーリスタチンＥ誘導体は、例えば、オーリスタチンＥとケト酸との間で形成されるエステルである。例えば、オーリスタチンＥをパラアセチル安息香酸又はベンゾイル吉草酸と反応させて、それぞれＡＥＢ及びＡＥＶＢを生成することができる。他の典型的なオーリスタチン誘導体は、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ及びＭＭＡＥを含む。オーリスタチンＥ及びその誘導体の合成及び構造は、例えば、ＵＳ第２００４−０１５７７８２号及び同第２００５−０２３８６４９号；ＰＣＴ／ＵＳ第０３／２４２０９号、ＰＣＴ／ＵＳ第０２／１３４３５号並びにＵＳ第６，８８４，８６９号；同第６，３２３，３１５号；同第６，２３９，１０４号；同第６，０３４，０６５号；同第５，７８０，５８８号；同第５，６６５，８６０号；同第５，６６３，１４９号；同第５，６３５，４８３号；同第５，５９９，９０２号；同第５，５５４，７２５号；同第５，５３０，０９７号；同第５，５２１，２８４号；同第５，５０４，１９１号；同第５，４１０，０２４号；同第５，１３８，０３６号；同第５，０７６，９７３号；同第４，９８６，９８８号；同第４，９７８，７４４号；同第４，８７９，２７８号；同第４，８１６，４４４号；及び同第４，４８６，４１４号に記載されている。これらの文献の開示は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０３０６】
具体的な実施態様では、細胞傷害剤は、ＤＮＡ副溝結合剤である（例えば、ＵＳ第６，１３０，２３７号を参照のこと）。例えば、一部の実施態様では、副溝結合剤は、ＣＢＩ化合物である。他の実施態様では、副溝結合剤は、エネジイン（例えば、カリケアマイシン）である。
【０３０７】
抗チューブリン剤の例は、タキサン（例えば、Taxol（登録商標）（パクリタキセル）、Taxotere（登録商標）（ドセタキセル））、Ｔ６７（Tularik）、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン及びビノレルビン）及びドラスタチン（例えば、オーリスタチンＥ、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ）を含むが、これらに限定されない。他の抗チューブリン剤は、例えば、バカチン誘導体、タキサン類似体（例えば、エポチロンＡ及びＢ）、ノコダゾール、コルヒチン及びコルシミド、エストラムスチン、クリプトフィジン、セマドチン、メイタンシノイド、コンブレタスタチン、ディスコデルモリド及びエリュテロビンを含む。
【０３０８】
一部の実施態様では、細胞傷害剤は、抗チューブリン剤の別のグループであるメイタンシノイドである。例えば、具体的な実施態様では、メイタンシノイドは、メイタンシン又はＤＭ−１（ImmunoGen, Inc.；Chari et al., 1992, Cancer Res. 52:127-131も参照のこと）である。
【０３０９】
一部の実施態様では、治療剤は、放射性同位体ではない。
【０３１０】
一部の実施態様では、細胞傷害剤又は免疫サプレッション剤は、代謝拮抗剤である。代謝拮抗剤は、例えば、プリンアンタゴニスト（例えば、アゾチオプリン又はミコフェノラートモフェチル）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤（例えば、メトトレキサート）、アシクロビル、ガングシクロビル、ジドブジン、ビダラビン、リババリン、アジドチミジン、シチジンアラビノシド、アマンタジン、ジデオキシウリジン、ヨードデオキシウリジン、ポスカメット又はトリフルリジンであることができる。
【０３１１】
他の実施態様では、細胞傷害剤又は免疫サプレッション剤は、タクロリムス、シクロスポリン又はラパマイシンである。更なる実施態様では、細胞傷害剤は、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリトレチノイン、アロプリノール、アルトレタミン、アミホスチン、アナストロゾール、三酸化ヒ素、ベキサロテン、ベキサロテン、カルステロン、カペシタビン、セレコキシブ、カルドリビン、ダルベポエチンアルファ、デニロイキンジフチトクス、デクスラゾキサン、ドロモスタノロンプロピオナート、エピルビシン、エポエチンアルファ、エストラムスチン、エキセメスタン、フィルグラスチム、フロクスウリジン、フルダラビン、フルベストラント、ゲムシタビン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゴセレリン、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブメシラート、インターフェロンアルファ−２ａ、イリノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、レバミソール、メクロレタミン又はナイトロジェンマスタード、メゲストロール、メスナ、メトトレキサート、メトキサレン、ミトマイシンＣ、ミトタン、ナンドロロンフェンプロピオナート、オプレルベキン、オキサリプラチン、パミドロナート、ペガデマーゼ、ペガスパルガーゼ、ペグフィルグラスチム、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ポルフィマーナトリウム、プロカルバジン、キナクリン、ラスブリカーゼ、レブリミド、サルグラモスチム、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノイン、ウラシルマスタード、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン及びゾレドロナートである。
【０３１２】
更なる実施態様では、該薬剤は、ヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体；RITUXAN（リツキシマブ；Genentech, Inc., South San Francisco, Calif）；キメラ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体；OVAREX（AltaRex Corporation, MA）；PANOREX（Glaxo Wellcome, NC；マウスＩｇＧ２ａ抗体）；Cetuximab Erbitux（Imclone Systems Inc., NY；抗ＥＧＦＲ  ＩｇＧキメラ抗体）；Vitaxin（MedImmune, Inc., MD）；Campath I/H（Leukosite, MA；ヒト化ＩｇＧ１抗体）；Smart MI95（Protein Design Labs, Inc., CA；ヒト化抗ＣＤ３３  ＩｇＧ抗体）；LymphoCide（Immunomedics Inc., NJ；ヒト化抗ＣＤ２２  ＩｇＧ抗体）；Smart ID10（Protein Design Labs, Inc., CA；ヒト化抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体）；Oncolym（Techniclone, Inc., CA；放射線ラベルマウス抗ＨＬＡ−Ｄｒ１０抗体）；Allomune（BioTransplant, CA；ヒト化抗ＣＤ２  ｍＡｂ）；Avastin（Genentech, Inc., CA；抗ＶＥＧＦヒト化抗体）；Epratuzamab（Immunomedics, Inc., NJ及びAmgen, CA；抗ＣＤ２２抗体）；及びCEAcide（Immunomedics, NJ；ヒト化抗ＣＥＡ抗体）である。
【０３１３】
他の適切な抗体は、下記抗原：ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、Ｌ６、ルイスＹ、ルイスＸ、アルファフェトプロテイン、ＣＡ  ２４２、胎盤アルカリホスファターゼ、前立腺特異的抗原、前立腺酸性ホスファターゼ、上皮成長因子、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、抗トランスフェリンレセプター、ｐ９７、ＭＵＣ１−ＫＬＨ、ＣＥＡ、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ１、前立腺特異的抗原、ＩＬ−２レセプター、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ３３、ＣＤ２２、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ＣＤ３８、ムチン、Ｐ２１、ＭＰＧ、及びＮｅｕガン遺伝子産物に対する抗体を含むが、これらに限定されない。
【０３１４】
一部の実施態様では、該治療剤は、免疫サプレッション剤である。免疫サプレッション剤は、例えば、ガンシクロビル、エタネルセプト、タクロリムス、シクロスポリン、ラパマイシン、シクロホスファミド、アザチオプリン、ミコフェノラートモフェチル又はメトトレキセートであることができる。代替的には、免疫サプレッション剤は、例えば、グルココルチコイド（例えば、コルチゾール又はアルドステロン）又はグルココルチコイド類似体（例えば、プレドニゾン又はデキサメタゾン）であることができる。
【０３１５】
適切なシクロオキシゲナーゼ阻害剤は、メクロフェナム酸、メフェナム酸、カルプロフェン、ジクロフェナク、ジフルニサール、フェンブフェン、フェノプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ナブメトン、ナプロキセン、スリンダク、テノキシカム、トルメチン及びアセチルサリチル酸を含む。
【０３１６】
適切なリポキシゲナーゼ阻害剤は、酸化還元阻害剤（例えば、カテコールブタン誘導体、ノルジヒドログアレチン酸（ＮＤＧＡ）、マソプロコール、フェニドン、イアノパレン、インダゾリノン、ナファザトロム、ベンゾフラノール、アルキルヒドロキシルアミン）及び非酸化還元阻害剤（例えば、ヒドロキシチアゾール、メトキシアルキルチアゾール、ベンゾピラン及びその誘導体、メトキシテトラヒドロピラン、ボスウェリン酸及びボスウェリン酸のアセチル化誘導体並びにシクロアルキル基により置換されているキノリンメトキシフェニル酢酸）並びに酸化還元阻害剤の前駆体を含む。
【０３１７】
他の適切なリポキシゲナーゼ阻害剤は、抗酸化剤（例えば、フェノール、プロピルガラート、フラボノイド及び／又はフラボノイドを含有する天然基質、フラボンのヒドロキシル化誘導体、フラボノール、ジヒドロケルセチン、ルテオリン、ガランギン、オロボール、カルコンの誘導体、４，２’，４’−トリヒドロキシカルコン、オルト−アミノフェノール、Ｎ−ヒドロキシウレア、ベンゾフラノール、エブセレン及び還元セレノ酵素の活性を向上させる種）、鉄キレート剤（例えば、ヒドロキサム酸及びその誘導体、Ｎ−ヒドロキシウレア、２−ベンジル−１−ナフトール、カテコール、ヒドロキシルアミン、カルノゾールトロックスＣ、カテコール、ナフトール、スルファサラジン、ジロートン、５−ヒドロキシアントラニル酸及び４−（オメガ−アリールアルキル）フェニルアルカン酸）、イミダゾール含有化合物（例えば、ケトコナゾール及びイトラコナゾール）、フェノチアジン及びベンゾピラン誘導体を含む。
【０３１８】
さらに他の適切なリポキシゲナーゼ阻害剤は、エイコサノイド（例えば、オクタデカテトラエン酸、エイコサテトラエン酸、ドコサペンタエン酸、エイコサヘキサエン酸及びドコサヘキサエン酸並びにそのエステル）、ＰＧＥ１（プロスタグランジンＥ１）、ＰＧＡ２（プロスタグランジンＡ２）、ビプロストール、１５−モノヒドロキシエイコサテトラエン酸、１５−モノヒドロキシエイコサトリエン酸及び１５−モノヒドロキシエイコサペンタエン酸並びにロイコトリエンＢ５、Ｃ５及びＤ５）、カルシウム流を妨害する化合物、フェノチアジン、ジフェニルブチルアミン、ベラパミル、フスコシド、クルクミン、クロロゲン酸、カフェン酸、５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸（ＥＴＹＡ）、ヒドロキシフェニルレチナミド、ロナパレン、エスクリン、ジエチルカルバマジン、フェナントロリン、バイカレイン、プロキシクロミル、チオエーテル、ジアリルスルフィド及びジ−（１−プロペニル）スルフィドを含む。
【０３１９】
ロイコトリエンレセプターアンタゴニストは、カルシトリオール、Bayer-x-1005、Ciba-Geigy CGS-25019C、エブセレン、Leo DenMark ETH-615、Lilly LY-293111、Ono ONO-4057、Terumo TMK-688、Boehringer Ingleheim BI-RM-270、Lilly LY 213024、Lilly LY 26086、Lilly LY 292728、Ono ONO LB457、Pfizer 105696、Perdue Frederick PF 10042、Rhone-Poulenc Rorer RP 66153、SmithKline Beecham SB-20146、SmithKline Beecham SB-201993、SmithKline Beecham SB-209247、Searle SC-53228、Sumitomo SM 15178、American Home Products WAY 121006、Bayer Bay-o-8276、Warner-Lambert CI-987、Warner-Lambert CI-987BPC-15LY 223982、Lilly LY 233569、Lilly LY-255283, MacroNex MNX-160, Merck and Co. MK-591、Merck and Co. MK-886、Ono ONO-LB-448、Purdue Frederick PF-5901、Rhone-Poulenc Rorer RG 14893、Rhone-Poulenc Rorer RP 66364、Rhone- Poulenc Rorer RP 69698、Shionoogi S-2474、Searle SC-41930、Searle SC-50505、Searle SC-51146、Searle SC-52798、SmithKline Beecham SK及びF-104493、Leo Denmark SR-2566、Tanabe T-757及びTeijin TEI-1338を含む。
【０３２０】
製品
別の態様では、上記された障害の処置に有用な物質を含有する製品が含まれる。該製品は、容器及びラベルを含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ及び試験管を含む。容器は、各種の材料、例えば、ガラス又はプラスチックで形成することができる。容器は、状態を処置するのに有効な組成物を保持し、無菌アクセスポートを有することができる。例えば、容器は、皮下注射針により穿孔可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであることができる。該組成物中の活性剤は、ヒト化抗ＣＤ４０抗体である。容器上又は容器に付随するラベルは、該組成物が選択された状態を処置するのに使用されることを示す。該製品は、薬学的に許容し得るバッファー、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液を含む第２の容器をさらに含むことができる。該製品は、さらに、商業的及びユーザーの観点から望ましい他の材料（他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ及び使用説明を伴う添付文書を含む）を含むことができる。
【０３２１】
本発明を下記実施例においてさらに説明する。下記実施例は、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【０３２２】
実施例
実施例１：ヒト化抗ＣＤ４０抗体の産生
マウス抗体２０Ｅ２及び２Ｈ１１を本明細書で上記された表１及び２に示す。２０Ｅ２及び２Ｈ１１クローンのヒト化は完了している。ヒト及びマウスの残基を任意の所定の位置で、ヒト又はマウスのいずれかの残基が存在することができるように変化させたライブラリを作製した。このようなライブラリをヒト生殖系列とマウス抗体との間で異なるアミノ酸について作製した。親マウス抗体の機能を保持するクローンのみを選択した。
【０３２３】
このようにして、抗体Ａ、抗体Ｂ及び抗体Ｃは、ヒトＩｇＧ１−ＫＯ（ＫＯ＝ノックアウト）／κ骨格にクローニングされたマウス抗体２０Ｅ２（抗体Ａ及び抗体Ｂ）又は２Ｈ１１（抗体Ｃ）に由来するヒト化抗体であった。ＩｇＧ１−ＫＯは、Ｆｃ領域にＬｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａという２つの突然変異を有し、ＦｃγＲ及び補体結合が低下している。
【０３２４】
このようなヒト化の結果、以下に示された種々のヒト化重鎖及び軽鎖可変配列がもたらされた。
【０３２５】
配列番号：４１（可変軽鎖配列）
【表７】
2021529754.tif 000011
【０３２６】
配列番号：４２（可変重鎖配列）
【表８】
2021529754.tif 000012
【０３２７】
配列番号：４３（可変軽鎖配列）
【表９】
2021529754.tif 000013
【０３２８】
配列番号：４４（可変重鎖配列）
【表１０】
2021529754.tif 000014
【０３２９】
配列番号：４５（可変軽鎖配列）
【表１１】
2021529754.tif 000015
【０３３０】
配列番号：４６（可変重鎖配列）
【表１２】
2021529754.tif 000016
【０３３１】
配列番号：４７（可変軽鎖配列）
【表１３】
2021529754.tif 000017
【０３３２】
配列番号：４８（可変重鎖配列）
【表１４】
2021529754.tif 000018
【０３３３】
配列番号：４９（可変軽鎖配列）
【表１５】
2021529754.tif 000019
【０３３４】
配列番号：５０（可変軽鎖配列）
【表１６】
2021529754.tif 000020
【０３３５】
配列番号：５１（可変軽鎖配列）
【表１７】
2021529754.tif 000021
【０３３６】
配列番号：５２（可変軽鎖配列）
【表１８】
2021529754.tif 000022
【０３３７】
配列番号：５３（可変重鎖配列）
【表１９】
2021529754.tif 000023
【０３３８】
配列番号：５４（可変軽鎖配列）
【表２０】
2021529754.tif 000024
【０３３９】
配列番号：５５（可変軽鎖配列）
【表２１】
2021529754.tif 000025
【０３４０】
配列番号：５６（可変軽鎖配列）
【表２２】
2021529754.tif 000026
【０３４１】
配列番号：５７（可変重鎖配列）
【表２３】
2021529754.tif 000027
【０３４２】
配列番号：５８（可変重鎖配列）
【表２４】
2021529754.tif 000028
【０３４３】
配列番号：５９（可変重鎖配列）
【表２５】
2021529754.tif 000029
【０３４４】
配列番号：６０（可変重鎖配列）
【表２６】
2021529754.tif 000030
【０３４５】
配列番号：６１（可変重鎖配列）
【表２７】
2021529754.tif 000031
【０３４６】
配列番号：６２（可変重鎖配列）
【表２８】
2021529754.tif 000032
【０３４７】
配列番号：６３（可変重鎖配列）
【表２９】
2021529754.tif 000033
【０３４８】
配列番号：６４（可変重鎖配列）
【表３０】
2021529754.tif 000034
【０３４９】
配列番号：６５（可変重鎖配列）
【表３１】
2021529754.tif 000035
【０３５０】
配列番号：６６（可変重鎖配列）
【表３２】
2021529754.tif 000036
【０３５１】
配列番号：６７（可変重鎖配列）
【表３３】
2021529754.tif 000037
【０３５２】
配列番号：６８（可変重鎖配列）
【表３４】
2021529754.tif 000038
【０３５３】
配列番号：６９（可変重鎖配列）
【表３５】
2021529754.tif 000039
【０３５４】
配列番号：７０（可変重鎖配列）
【表３６】
2021529754.tif 000040
【０３５５】
配列番号：７１（可変重鎖配列）
【表３７】
2021529754.tif 000041
【０３５６】
配列番号：７２（可変重鎖配列）
【表３８】
2021529754.tif 000042
【０３５７】
配列番号：７３（可変重鎖配列）
【表３９】
2021529754.tif 000043
【０３５８】
配列番号：７４（可変軽鎖配列）１  抗体１０Ｆ２Ｈｕｍ由来
【表４０】
2021529754.tif 000044
【０３５９】
配列番号：７５（可変軽鎖配列）２  抗体１０Ｆ２Ｈｕｍ由来
【表４１】
2021529754.tif 000045
【０３６０】
配列番号：７６（可変軽鎖配列）
【表４２】
2021529754.tif 000046
【０３６１】
本発明の例示的なヒト化抗体は、下記表で説明された重鎖配列及び軽鎖配列を有する抗体である。下記表中の太字の下線を引いた配列は、可変ドメインであり、一方、通常の下線を引いていない配列は、定常ドメインである。
【０３６２】
【表４３】
2021529754.tif 000047
2021529754.tif 000048
2021529754.tif 000049
2021529754.tif 000050
【０３６３】
可変領域を１つ又は２つの異なる適切なＩｇＧ発現ベクターにサブクローニングした
Ａ）ヒトＩｇＧ１−ＫＯ（ノックアウト）／カッパフォーマット（Ｆｃ領域にＬｅｕ２３４Ａｌａ、Ｌｅｕ２３５Ａｌａの二重突然変異を有し、エフェクター機能、例えば、ＦｃγＲ結合及び補体結合が低下している）
Ｂ）ヒトＩｇＧ４−ＤＭ（二重突然変異体）／カッパフォーマット（ヒンジ領域にＳｅｒ２２８Ｐｒｏ突然変異を有し、ＩｇＧ４半分子及びＬｅｕ２３５Ｇｌｕ突然変異の発生を低減し、さらに、ＦｃγＲ結合が低下している）
【０３６４】
２つの候補抗体Ａ及び抗体Ｂを精製し、下記基準により評価した。
−ＣＣＦの外観（濁度）
−ＣＣＦのろ過特性
−ｒプロテインＡの収率
−溶出及び中和時の濁度
−可溶性凝集体（ＳＥＣ）
−純度／夾雑パターン（ＳＤＳ）
−電荷パターン（ＩＥＦ）
【０３６５】
実施例２：ｉｎ  ｖｉｔｒｏデータ
抗体Ａ、抗体Ｂ及び抗体Ｃを、公表されている配列に基づいて産生された抗体４Ｄ１１（Kirin/Astellas）及びＰＧ−１０２（PanGenetics）と共に特徴決定した。抗体Ａ、抗体Ｂ、抗体Ｃ及び４Ｄ１１についてのデータを以下に示す。ＰＧ−１０２は、アゴニスト活性を示し、Ｂ細胞増殖の阻害のみが不完全であった（図示せず）。表２．２に、得られたデータをまとめる。データのより詳細な説明は表２．２に従う。
【０３６６】
【表４４】
2021529754.tif 000051
【０３６７】
Ａ．ヒト化抗体の細胞ＣＤ４０及びリコンビナントＣＤ４０タンパク質への結合
ヒト化抗体の細胞ＣＤ４０への特異的結合を、ヒトＣＤ４０でトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞を使用するフローサイトメトリーにより分析した。抗体Ａ、抗体Ｂ、及び抗体Ｃの濃度依存的結合が観察された。該抗体は、同様の結合プロファイルを示した。本発明の抗体及びKirinの抗体４Ｄ１１のＥＣ５０値は全て、約１nMの同じ範囲にある。同範囲は、トランスフェクションされた細胞においてＣＤ４０が高レベルであるため、アッセイの感度限界で最も可能性がある。また、ヒト化抗体のヒトＲａｍｏｓ細胞の細胞ＣＤ４０への特異的結合からも、濃度依存性結合が示された。該抗体は、わずかに異なる結合プロファイル及び０．２１〜１．２２nM ＥＣ５０値を示した。ＣＤ４０陰性細胞、例えば、トランスフェクションされていないＨＥＫ２９３細胞又はＴ細胞系統ＨＳＢ−２への結合は検出されなかったため、ＣＤ４０への選択的結合が確認された（データを示さず）。
【０３６８】
ヒトＣＤ４０−Ｆｃタンパク質に対する抗体Ａ、抗体Ｂ及び抗体Ｃ結合の親和性を、ForteBio Octetにより測定し、＜１００pMの解離定数（ＫＤ）が明らかとなった。抗体及びＣＤ４０−Ｆｃのために、二価結合活性効果により、１００pM未満のＫｄが正確に決定されるのが妨げられる。加えて、ＣＤ４０−Ｆｃへの結合を５０％ ヒト血清の非存在下及び存在下で分析した。結合に対する血清の顕著な影響は観察されなかった（データを示さず）。
【０３６９】
Ｂ．Ｂ細胞活性化／増殖アッセイにおけるヒト化抗体の活性
ヒト化抗体の活性をＩＬ−２及びＩＬ−４の存在下で、末梢血由来のヒトＢ細胞をリコンビナントＣＤ４０Ｌにより刺激するＢ細胞増殖アッセイにおいて試験した。抗体Ａ、抗体Ｂ及び抗体Ｃは、Ｂ細胞の増殖の強力な阻害を示した。BIの抗体及びKirinの抗体４Ｄ１１の阻害曲線及びＩＣ５０値との比較から、４Ｄ１１抗体が複数のドナーにわたって試験された場合、より高い効力を有することが示される。ＣＤ４０Ｌの非存在下でアゴニスト活性について試験した場合、抗体Ｂ、抗体Ａ及び抗体Ｃの抗体は、４Ｄ１１抗体と同様に、１０μg/m l(６７nM）までの濃度で、バックグラウンドレベルを超えるＢ細胞増殖を誘引しなかった。
【０３７０】
競合抗体４Ｄ１１は、わずかに強力であり、平均ＩＣ５０は、約０．０２nMであり、アゴニスト効果を有さなかった。３つのBI抗体及び４Ｄ１１についてのデータを、上記表２．２にまとめる。このアッセイにおいて、別の競合抗体であるＰＧ−１０２（クローン５Ｄ１２由来）も試験し、ＣＤ４０Ｌの非存在下でＢ細胞増殖を刺激する顕著なアゴニスト効果が示された。したがって、本発明者らのリード候補のアゴニスト活性の欠如により、それらは、ＰＧ−１０２と明確に区別される。
【０３７１】
第２のアッセイにおいて、該抗体をヒトＢ細胞におけるＣＤ８６アップレギュレーションの阻害について評価した。この場合、アッセイを外因性ＣＤ４０Ｌの存在下で、ヒト全血又は精製Ｂ細胞の両方により行うことができる。Ｂ細胞増殖データと一致して、ヒト全血で試験した抗体Ｂ、抗体Ａ及び抗体Ｃは、フローサイトメトリーにより測定された場合、ＣＤ４０媒介性ＣＤ８６アップレギュレーションの強力な阻害を示した。抗体Ｃは、このアッセイにおいて、４Ｄ１１と同様の効力を示したが、抗体Ｂ及び抗体Ａの効力はいくらか弱かった。精製Ｂ細胞又は全血について抗体Ｂと４Ｄ１１とを比較すると、抗体Ｂの効力（ＩＣ５０及びＩＣ９０値）は、他のＣＤ４０を有する細胞又は血清の存在下で、Ｂ細胞と比較して精製Ｂ細胞では比較的変化しないが、４Ｄ１１は、全血条件下で効力の劇的な変化を受けることが示される。
【０３７２】
同様のデータは、全血サンプルにより行われた場合、抗体Ｂ、抗体Ａ及び抗体Ｃが、カニクイザルＢ細胞でのＣＤ８６アップレギュレーションの阻害について評価された場合に得られている。カニクイザル全血で試験された抗体Ｂ、抗体Ａ及び抗体Ｃは、フローサイトメトリーで測定された場合、ＣＤ４０媒介性ＣＤ８６アップレギュレーションの強力な阻害を示した。したがって、これらの抗体は全て、ヒトＣＤ４０と同様の効力で、カニクイザルＣＤ４０に対して機能的交叉反応性を示す。
【０３７３】
抗体Ｂ  ＩｇＧ１ＫＯｂ及び抗体Ｂ  ＩｇＧ１ＷＴの活性を、抗体依存性細胞傷害性を媒介する能力について評価した。このアッセイにおいて、ＲＡＭＯＳ細胞をヒトＰＢＭＣと共にエフェクター対ターゲット細胞比５０：１でインキュベーションした。抗体Ｂ  ＩｇＧ１ＫＯｂ及び抗体Ｂ  ＩｇＧ１ＷＴを２０ug/mlから滴定し、細胞死の程度をＬＤＨの放出によりモニターする。示されたデータは、１つの代表的な実験からのものである。このデータから、抗体Ａ  ＩｇＧ１Ｗｔ  ２０Ｅ２−１２−ＲＩｇＧ１ＷＴが、ＡＤＣＣの有効なメディエーターであり、エフェクター機能を排除する突然変異を含有する抗体Ｂ  ＩｇＧ１ＫＯｂが、ＡＤＣＣ活性を有さないことが示される。
【０３７４】
実施例３：薬物動態／薬力学研究
Ａ．カニクイザルへの抗体Ａ及び抗体Ｂの１又は１０mg/kgでの単回ＩＶ投与
抗体Ａ及び抗体Ｂそれぞれを、１及び１０mg/kg  ＩＶで、オスのカニクイザル（Ｎ＝３）／投与に投与した。血液サンプルを０〜５０４時間（３週間）で収集し、血清を回収し、サンプルを分析まで−２０℃で保存した。サンプルを上記されたサンドイッチＥＬＩＳＡにより分析した。両ＩＶ投与後のサルにおける両抗体の血清濃度−時間プロファイル及び薬物動態パラメーターを以下に示された表２．７．１（抗体Ａ）及び表２．７．２（抗体Ｂ）にまとめる。両抗体とも、用量依存的薬物動態を示した。このことから、低用量では、クリアランスは、主にターゲット媒介性処分に一致して生じ、一方、高用量では、該抗体は、主に異化により除去されることが示唆された。同様の用量依存的薬物動態プロファイルが、膜関連ターゲット（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＥＧＦＲ、ＣＤ１４６及びＨＥＲ２）をターゲットとする他のＭＡｂについて観察されている。抗体Ａについてのクリアランスは、１及び１０mg/kg用量についてそれぞれ、０．８及び０．１mL/h/kgであった。抗体Ｂについてのクリアランスは、１及び１０mg/kg用量についてそれぞれ、０．７及び０．１mL/hr/kgであった。同様に、抗体Ａ半減期は、１及び１０mg/kg用量についてそれぞれ、１日及び１３日であり、抗体Ｂ半減期は、同じ各用量について２日及び１３日であった。抗体Ｂは、抗体Ａの同じ投与量に対して、より低い用量で半減期がわずかに長かったが、この差は、慢性投与時のより持続的な曝露にはつながらないと予想されるであろう。両化合物についてのＡＵＣは、両化合物についての分布の上比例（ｓｕｐｒａｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ）及び体積（Ｖｓｓ）であり、血漿体積（約４０mL/kg）のものに近似した。このことは、大型の極性タンパク質治療剤について典型的に見られる限定された組織分布を示す。全体として、２つの抗体間の薬物動態パラメーターに明らかな差は存在しない。
【０３７５】
【表４５】
2021529754.tif 000052
【０３７６】
【表４６】
2021529754.tif 000053
【０３７７】
Ｂ．ｅｘ  ｖｉｖｏ薬力学研究
上記されたＰＫ研究の一環として、抗ＣＤ４０抗体の薬力学的効果を分析した。この目的のために、全血サンプルをリコンビナントＣＤ４０Ｌと共に一晩インキュベーションし、Ｂ細胞でのＣＤ８６発現の増加をフローサイトメトリーにより決定した。サンプルを０日目（処置前）、投与後２、７及び１４日目に分析した。ＣＤ８６発現の増加は比較的小さい（約５〜２０％）が、用量依存的効果が観察された。１０mg/kg 抗体Ａ及び抗体Ｂを投与された動物の群において、ＣＤ８６誘引は、２、７及び１４日目に完全に阻害され、この用量での持続的曝露と一致した。１mg/kgを投与された動物は、２日目に完全な阻害を示し、７日目に部分的な阻害を示し、１４日目には阻害を示さなかった。薬力学的効果の経時的な消失は、低い投与群において抗体のクリアランスがより速いことと相関する。
【０３７８】
実施例４：毒性関連研究：血小板のＣＤ４０
ＣＤ４０は、ヒト血小板において構成的に発現している（Henn, et al., 2001及びInwald, et al., 2003）が、ＣＤ４０Ｌは、活性化血小板の細胞表面に迅速かつ一過性に発現している（Henn, et al., 2001）。ＦｃγＲ結合性を有さない抗ＣＤ４０抗体は、血小板に対する効果を有するとは予想されないであろうが、これが事実であることを直接実証することが重要である。フローサイトメトリー研究を行い、抗ＣＤ４０リード候補のヒト及びカニクイザル血小板への結合を実証した。
【０３７９】
以前、フローサイトメトリーにより、Ｇ２８．５及びｍＡｂ  ８９抗ＣＤ４０  ｍＡｂが、休止中のヒト血小板に結合することが実証されている（Henn, et al., 2001）。これは、ＦＩＴＣラベルＧ２８．５抗体を使用して確認された。Ｇ２８．５の５倍系列希釈を調製し、０．５μg/ml〜０．３２ng/mlの範囲をヒト（２名のドナー）又はカニクイザル（３匹のドナー）から得られた血小板 １００μl中において、室温で３０分間インキュベーションした。加えて、ＡＰＣラベル抗ＣＤ４５  ｍＡｂを使用して、他のＣＤ４０＋細胞種に結合した血小板を特定し、これらの細胞を分析から除外した。抗体染色後、血小板を洗浄し、Optilyse Cで固定し、フローサイトメトリーを行った。平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＣＤ４５−血小板に結合する抗体の尺度として測定した。
【０３８０】
市販の５ｃ３及び本発明の選択された抗体である抗ＣＤ４０マウスｍＡｂをＦＩＴＣラベルした。Ｒａｍｏｓ細胞への結合を確認した。抗体分子当たりのＦＩＴＣ分子の数は、抗体分子あたりに２〜４個 ＦＩＴＣの範囲であった。市販及び候補抗ＣＤ４０  ｍＡｂの５倍系列希釈を、０．５μg/ml〜０．３２ng/mlの範囲で調製し、ヒト（３名のドナー）及びカニクイザル（２匹のドナー）血小板と共に室温で３０分間インキュベーションした。
【０３８１】
マウス候補抗ＣＤ４０  ｍＡｂのヒト血小板への結合を実証する代表的なグラフは、以前に、ＵＳ第８，５９１，９００号に示された。４つの候補モノクローナル抗体が、ＦＩＴＣラベルアイソタイプ対照抗体と比較して、ヒト血小板への特異的結合を示した。１０Ｆ２、２Ｈ１１、１９Ｂ１０及び２０Ｅ２は、血小板への同等の結合を示した。カニクイザルの血小板についても同様の傾向が観察された（データを示さず）。
【０３８２】
これらの研究に加えて、直接ラベルされた抗体Ｂ及び４Ｄ１１について、ヒト及びカニクイザルの全血サンプルにおける血小板及びＢ細胞への結合能を比較した。４Ｄ１１は、ヒト及びカニクイザル血液サンプルにおけるＢ細胞及び血小板の両方に対して（ＥＣ５０により例示された）類似の結合を示した。Ｂ抗体は、同様のパターンを示したが、結合能は、はるかに弱かった。
【０３８３】
実施例５：ＮＳＧマウスモデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ薬理研究
ヒト化抗体である抗体Ａの効力を、移植片対宿主応答を生じさせるために、ヒトＰＢＭＣを免疫不全ＮＳＧマウスに注射した抗体産生モデルにおいて評価した。ヒトＩｇＭ（ｈＩｇＭ）及びＩｇＧ（ｈＩｇＧ）の顕著な産生を生着後２週間から検出することができる。抗体Ａを５及び１mg/kgの用量で処置すると、生着後２週目及び３週目において、ｈＩｇＧ及びｈＩｇＭ応答が顕著に阻害された。対照抗体（４Ｄ１１）を５mg/kg単回投与で評価し、該応答の消失も示された。第２の研究では、全ての抗体である抗体Ａ、抗体Ｂ及び抗体Ｃを１mg/kgの単回用量で試験し、２週目にＩｇＭ及びＩｇＧ応答の完全な阻害が示された。
【０３８４】
実施例６：バイオマーカー分析
レセプターのアップレギュレーション：レセプターのＣＤ４０Ｌ誘引アップレギュレーションは、フローサイトメトリーにより測定することができる。ヒト全血を可溶性ＣＤ４０Ｌの最適化された濃度により刺激することができ、ＣＤ２０＋レセプター＋細胞の完全な割合をフローサイトメトリーにより測定することができる。ＣＤ２０陽性細胞におけるＣＤ８６発現の割合の変化を、抗体Ａ及びＢを評価するカニクイザルｐｋ研究と並行して測定した。データから、抗体の曝露と一致する時点でのＣＤ８６アップレギュレーションの阻害が示される。
【０３８５】
ターゲット化プロテオミクス：全血中でのＣＤ４０刺激時のタンパク質の分泌増加を潜在的バイオマーカーとして使用することができる。溶性ＣＤ４０Ｌの最適濃度及び刺激時間を、ＭＤＣ／ＣＣＬ２２及び幾つかの他の分泌タンパク質を検出するLuminex多重ビーズプラットフォームを使用して確立した。臨床サンプルを抗ＣＤ４０  ｍＡｂの全用量範囲でヒト全血から評価するものとする。
【０３８６】
レセプター占有率：ＣＤ４０レセプター占有率をヒト全血中のＢ細胞のフローサイトメトリー分析に基づいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏアッセイで決定することができる。本発明の現在の候補抗体及び非競合抗ＣＤ４０抗体５Ｃ３を、レセプター占有率アッセイを定量するのに使用するものとする。
【０３８７】
実施例７：ヒト化抗ＣＤ４０抗体の抗腫瘍活性
一部の例では、本発明の抗体の抗腫瘍特性を決定するのが望ましい場合がある。このような決定は、ＳＣＩＤマウスリンパ腫異種移植モデルにおいてヒト化抗ＣＤ４０抗体の抗腫瘍活性をアッセイすることにより行うことができる。このようなＳＣＩＤモデルは腫瘍を提示するためにガン細胞を注射することができ、例えば、薬剤処置を開始する１３日前に、５×１０６百万個 腫瘍細胞をＳＣＩＤマウス（１０匹／群）に皮下注射することができる。本発明のマウス抗ＣＤ４０抗体又は比較（例えば、対照又は他のヒト化抗体）を週３回（４mg/kg／投与）腹腔内に与える。８又は５回投与した。腫瘍の発生及び成長をマウスにおいてモニターし、腫瘍容積を選択された研究期間、例えば、１４日間の研究期間中に毎週測定することができる。好ましくは、結果から、本発明の抗体により処置されたマウスと比較して、対照マウスにおける腫瘍の増殖の２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上の増加を示すであろう。好ましくは、処置期間にわたって、本発明の抗体で処置されたマウスにおける腫瘍増殖は無視できるであろう。このようなデータは、試験されるヒト化抗体がこのＢリンパ腫異種移植モデルにおける腫瘍増殖をサプレッションするのに有効であることを裏付けることができる。
【０３８８】
実施例８：ヒト化抗ＣＤ４０抗体による生存期間の延長
腫瘍を有するマウス、例えば、上記されたマウスの生存に対するヒト化抗ＣＤ４０抗体の効力をＳＣＩＤマウスリンパ腫異種移植モデルにおいてアッセイすることができる。ＳＣＩＤマウス（１０匹／群）に、抗体処置の３日前に１×１０６百万個 腫瘍細胞を静脈内接種させた。ついで、マウスを本発明のマウスもしくはヒト化抗ＣＤ４０抗体又はＩｇ対照により処置し、週２回（４mg/kg/投与）腹腔内に投与する。合計５回投与する。ついで、ガンを有する対象の生存延長における抗体の効力のレベルを決定するために、死亡率についてマウスケージを毎日調べることができる。
【０３８９】
特許出願、特許及び科学刊行物を含む種々の参考文献が本明細書に引用され、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書における任意の参考文献の引用又は特定は、このような参考文献が本発明の先行技術として利用可能であることを容認するものとして解釈されるべきではない。
【０３９０】
実施例９：健常な対象における本発明の抗体、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の反復漸増投与の安全性、薬物動態及び薬力学：自己免疫疾患の新規処置の可能性
この無作為化プラセボ対照二重盲検研究の目的は、健常な対象において、８０、１２０、１８０又は２４０mg 本発明の抗体を週１回ＳＣ投与する４週間反復投与の安全性、許容性、薬物動態（ＰＫ）及び薬力学（ＰＤ）を決定することであった。
【０３９１】
方法
研究設計
この第１相研究について、参加施設及びニュージーランド保健当局の独立倫理委員会の承認を受け、参加対象全員からインフォームド・コンセントを得た。該研究は、Boehringer Ingelheimの後援で行われ、Auckland, New Zealandにある１か所の試験施設において、Auckland Clinical Studies Ltdにより行われた。
【０３９２】
該研究を無作為化プラセボ対照二重盲検用量内群研究とした。８０〜２４０mg 本発明の抗体の反復漸増ＳＣ投与を４週間の処置期間にわたって、健常な対象において週１回試験した。
【０３９３】
用量を単回用量漸増研究からの安全性、ＰＫ及びＰＤデータに基づいて選択した。その研究では、試験した最大ＩＶ用量（１２０mg）は十分許容され、試験した１２０mg ＳＣ用量より、最大観察濃度（Ｃｍａｘ）が７倍高く、濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）が３倍高かった。これらのＰＫデータに基づいて、単回用量漸増研究における１２０mg ＩＶ投与での曝露は、２４０mg ＳＣ投与で予測される曝露をカバーすると計算された。
【０３９４】
適格な対象を、４つの連続ＳＣ投与群（８０、１２０、１８０及び２４０mg）において、４：１の比率の本発明の抗体又はプラセボを、Interactive Response Technologyツールにより、少なくとも７日間分離された投与群で受けるように無作為化した。各投与群に、１０名（実薬８名、プラセボ２名）を含ませた（図１）。次の用量レベルへの漸増は、安全性、許容性、ＰＫ及びＰＤデータの評価に基づいて、独立データモニタリング委員会が決定した。
【０３９５】
全ての対象に、２２日目に最終投与の処置を受けさせた。８０、１２０及び１８０mg ＳＣ投与群の対象を最終投与後４２日間追跡し、総研究期間を６４日間とした。２４０mg ＳＣ投与群の対象を５６日間追跡し、総研究期間を７８日間とした。
【０３９６】
対象、研究員及び後援スタッフは、研究処置について盲検のままとした。８０〜１８０mg ＳＣ投与群の患者が研究を完了した後に、初期データベースロックを行い、２４０mg ＳＣ投与群の完了後に、全てのデータを盲検解除した。
【０３９７】
ＰＫ分析用の血液サンプル（２．７mL）を、留置カテーテルを使用して、前腕静脈からエチレンジアミン四酢酸三カリウム抗凝固管に採取した。サンプルを投与前並びに初回投与の投与後、１、８及び１２時間並びに１、２、３日目（ＡＭ及びＰＭ、１２時間隔）、４日目（ＡＭ及びＰＭ、１２時間隔）、５、６、７日目（２回目の投与前）、１４日目（３回目の投与前）、２１日目（４回目の投与前及び４回目の投与後１及び１２時間）、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３１、３４、３８、４２、４９、５６、６３日目（８０〜１８０mg 投与群のみ）及び７７日目（２４０mg 投与群のみ）で採取した。
【０３９８】
本発明の抗体に対する抗体（ＡＤＡ）の評価用の血液サンプルを、投与前並びに初回投与後２１日目（４回目の投与前）、３８、６３日目（８０〜１８０mg 投与群のみ）及び初回投与後７７日目（２４０mg 投与群のみ）に採取した。
【０３９９】
血液サンプルを採取後直ちに氷上に置き、サンプル採取後３０分以内に４℃で１０分間遠心分離した。血漿を２つのポリプロピレンサンプルバイアルに移し（それぞれ０．５mL）、分析実験室に送る前に−２０℃で保存した。
【０４００】
ＰＤ分析用の血液サンプル（４．９mL）を、留置カテーテルを使用して、前腕静脈からヘパリン−抗凝固剤血液チューブに、投与前並びに初回投与後３、７日目（２回目の投与前）、２１日目（４回目の投与前）、２４、２８、３８、６３日目（８０〜１８０mg 投与群のみ）及び７７日目（２４０mg 投与群のみ）に採取し、分析のために直ちに実験室に送った。ＣＤ４０  ＲＯ及びＣＤ５４アップレギュレーションアッセイについてのアッセイ検証から、全血を分析前２４時間及び６時間それぞれまで室温で放置できることが示された。
【０４０１】
研究参加者
ボディマスインデックスが１８．５〜２９．９kg/m2の１８〜６０歳の適格な対象を登録した。女性参加者は、閉経後、不妊手術を受けた、性交渉を禁じている、精管切除された性交渉のパートナーを有する又は研究薬剤投与前３０日以上かつ研究終了後３０日までは受けている避妊法を行っている、研究前及び研究期間中に妊娠検査が陰性である必要があった。
【０４０２】
対象は、診察又は研究室検査により特定された臨床的に重大な異常の何等かの証拠；随伴疾患；消化管、肝臓、腎臓、呼吸器、心血管、代謝、免疫又はホルモン障害のいずれか；中枢神経系の疾患；起立性低血圧、失神発作もしくはブラックアウト；又はアレルギーもしくは薬剤過敏反応を有した場合は除外した。また、対象は、無作為化前の半減期が３０日以内（又は１０回未満の半減期）という長い任意の他の薬剤（ｔ１／２；２４時間超）を服用していた場合、研究の初回投与日前１０日以内に研究結果に影響を及ぼした可能性のある薬剤を服用していた場合、研究の初回投与日前６０日以内に任意の治験剤を受けていた場合、研究の初回投与日前３０日以内に献血していた場合、薬物乱用又は過度の飲酒又は喫煙の証拠があった場合、ヒト免疫不全ウイルス、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、結核又は関連する慢性もしくは急性感染の検査結果が陽性であった場合、研究の初回投与日前１週間以内に新たな運動計画を開始することを意図した場合も除外した。授乳中であった女性又は研究終了後３０日以内に妊娠を計画していた女性も除外した。
【０４０３】
分析方法
本発明の抗体の血漿濃度を、３０ng/mlの定量下限を有する有効なサンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して分析した。９６ウェルマイクロタイタープレートを、最初に、本発明の抗体に対する抗体で被覆し、ブロッキングし、洗浄した。ついで、このプレートを、研究サンプル、キャリブレーター又は品質管理サンプルと共にインキュベーションし、再度洗浄した。本発明の抗体の結合を、本発明の抗体に対するビオチン化抗体、続けて、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートさせたストレプトアビジン、最後に、ペルオキシダーゼ基質であるテトラメチルベンジジンにより検出された。プレートを比色法で読み取り、データを５パラメーターロジスティックフィットにより分析した。定量範囲は、３０〜８００ng/mLであった。十分な正確さ及び精度を３つの濃度−低濃度（５０又は１００ng/mL）、中濃度（１２６又は２００ng/mL）及び高濃度（５００又は５９０ng/mL）での品質管理サンプルによるルーチンな分析中に評価した。ＥＬＩＳＡの再現性を、９３％ サンプルが許容基準（平均値から３０％以下の差）に合格した、重複したサンプルの再分析により試験した。
【０４０４】
本発明の抗体を、有効なブリッジング電気化学ルミネセンス法を使用して、血漿サンプル中で分析した。報告された全てのサンプルデータは、アッセイ特異的な許容基準を満たした。ＡＤＡアッセイの検証から、２５０ng/mL 陽性対照抗体ＡＤＡを５０μg/mLの血漿濃度の本発明の抗体の存在下で検出することができることを実証した。対象における真の陽性応答を更なる力価アッセイによりさらに特徴付けた。力価をサンプルの系列２倍希釈の分析により決定した。報告された力価は、プレート特異的カットポイント以上の平均電気化学ルミネセンス値を生じた最高倍率希釈とした。
【０４０５】
本発明の抗体濃度の測定及びＡＤＡ評価は両方とも、Covance Laboratories, Inc.（Chantilly, VA, USA）により行った。
【０４０６】
ＣＤ４０  ＲＯの測定のために、全血サンプルを、過剰の本発明のフルオレセイン−イソチオシアナート（ＦＩＴＣ）ラベル抗体及び抗ＣＤ１９−アロフィコシアニン（ＡＰＣ；Ｂ細胞上でゲートするため）と共に、暗所、室温で２０分間インキュベーションした。蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）溶解溶液を加え、チューブを暗所、室温で１５分間インキュベーションし、続けて、４℃で６分間遠心分離（１３００rpm）し、上清を除去した。CellFixを加え、チューブをボルテックスし、ＦＡＣＳ分析まで暗所で４℃において保存した。ＦＡＣＳ分析を、CellFixを加えてから２４時間以内に行った。全てのサンプルを測定中は氷上に保持した。
【０４０７】
ＣＤ５４アップレギュレーションの阻害の測定のために、全血をインターロイキン−４（ＩＬ−４）単独−「非刺激ＦＡＣＳチューブ」−又はＭｅｇａＣＤ４０Ｌ＋ＩＬ−４−「刺激ＦＡＣＳチューブ」−のいずれかと共にインキュベーションした。チューブをボルテックスし、暗所で３７℃、加湿インキュベーター中で２３〜２６時間インキュベーションした。抗ＣＤ１９−ＡＰＣ及び抗ＣＤ５４−フィコエリスリン（ＰＥ）を各チューブに加え、チューブをボルテックスし、暗所、室温で２０分間インキュベーションした。ＦＡＣＳ溶解溶液を加え、チューブを暗所、室温で１５分間インキュベーションし、続けて、４℃で６分間遠心分離（１３００rpm）し、上清を除去した。CellFixを加え、チューブをボルテックスし、ＦＡＣＳ分析まで暗所で４℃において保存した。ＦＡＣＳ分析を、CellFixを加えてから２時間以内に行った。全てのサンプルを測定中は氷上に保持した。
【０４０８】
ＣＤ４０  ＲＯ及びＣＤ５４のアップレギュレーションアッセイは両方とも準定量的であった。アッセイ結果は、％  変化に基づいた（すなわち、処置時サンプルは、投与前サンプルに関連した）。
【０４０９】
血小板イベントの可能性を検討するために、下記評価を行った：プロトロンビン時間国際標準比（ＰＴ−ＩＮＲ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）、アンチトロンビンＩＩＩ、フィブリノーゲン、プロテインＳ及びＣ、血小板数、出血時間（デューク法で測定）並びにＤ−二量体。
【０４１０】
薬物動態評価
本発明の抗体についての血漿濃度−時間データを、WinNonlin（商標）（バージョン５．０２、Gary, NC, USA)を使用する非コンパートメントアプローチにより分析した。決定されたパラメーターは、標準的なWinNonlin（商標）手法を使用する、Ｃｍａｘ、Ｃｍａｘを達成するための時間（ｔｍａｘ）、最終排除定数（λｚ）及び終末ｔ１／２を含んだ。最後の（４回目の）投与後の均一な投与間隔τにわたる濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ０−τ）を、WinNonlin（商標）の線形アップログダウンアルゴリズムを使用して計算した。蓄積比（ＲＡ、Ｃｍａｘに基づくＣｍａｘ；ＲＡ、ＡＵＣ０−τに基づくＡＵＣ）を初回投与後の値に対する４回目投与後の値の比として計算した。
【０４１１】
薬力学評価
薬力学評価には、本発明の抗体によるＣＤ４０  ＲＯの評価と、前述の有効なＦＡＣＳアッセイを使用して全血中のＣＤ５４のｍｅｇａＣＤ４０Ｌ誘引アップレギュレーションにより測定されたＢ細胞活性化の阻害とを含ませた。本発明の抗体の用量とＣＤ４０  ＲＯ及びＣＤ５４アップレギュレーションの阻害との間の関係は、標準的なＳ字状Ｅｍａｘモデルを使用して以前に調査され、Albach et al. Eur J Clin Pharmacol. 2018;74(2):161-169に報告されている。
【０４１２】
安全性及び許容性
本発明の抗体の安全性及び一般的な許容性を、処置−出現有害イベント（ＡＥ）、身体検査、バイタルサイン（血圧及び脈拍）、１２誘導心電図（ＥＣＧ）及び臨床検査（血液学、臨床化学及び尿検査）をモニターすることにより評価した。
【０４１３】
統計分析
正式なサンプル数の決定は行っておらず、ＰＫ及び安全性の分析には、投与群あたりに８名の対象で十分であると考えられた。安全性、ＰＫ及びＰＤについて、研究結果を、記述統計量を使用して分析した。安全性集団には、治験薬（本発明の抗体又はプラセボ）が投与された全ての対象を含ませた。ＰＫ集団及びＰＤ集団には、治験薬が投与され、ＰＫ分析及びＰＤ分析それぞれのための評価可能なデータが得られた全ての対象を含ませた。４回目投与後のＡＵＣ０−τ及びＣｍａｘの用量比例性を、パワーモデルを使用して評価した。傾きの９５％信頼区間（ＣＩ）を計算した。完全な用量比例性は、１の傾きパラメータ（β）により定義された。濃度データのグラフ表示を含む記述分析を行って、定常状態が達成されたかどうかを評価した。
【０４１４】
結果
対象
合計４０名の健常な対象を無作為化し、本研究において処置した。対象に、プラセボ（ｎ＝８）、８０mg 本発明の抗体（ｎ＝８）、１２０mg 本発明の抗体（ｎ＝８）、１８０mg 本発明の抗体（ｎ＝８）又は２４０mg 本発明の抗体（ｎ＝８）を４週間にわたって週１回の反復ＳＣ処置を受けさせた。４０名全ての対象が予定観察期間を完了し、早期中止例はなかった。対象の大半は、男性（８３％）及び白人（７３％）であり、平均（標準偏差［ＳＤ］）年齢は、３０（１０．８）であり、平均（ＳＤ）ボディマスインデックスは、２５（３．１）kg/m2であった。処置群間に関連性のある人口統計学的差異は存在しなかった。
【０４１５】
薬物動態
幾何平均（ｇＭｅａｎ）である、  初回ＳＣ投与（１日目）及び最後のＳＣ投与（４日目）投与後の本発明の抗体について選択されたＰＫパラメーターを表９．２に示す。初回投与後、ｔｍａｘの中央値は、週１回の投与ごとに向上したが、ｔｍａｘは、４回目の投与後（ｔｍａｘ，４）に明確な用量相関性を何ら示さなかった。投与用量について正規化された最大血漿濃度及びＡＵＣ（それぞれ、Ｃｍａｘ，ｎｏｒｍ，４及びＡＵＣτ，ｎｏｒｍ，４）は、本発明の抗体の８０mg投与群についてより低く、３つのより高い投与群について同様であった。このことから、８０mgから１２０mgへの曝露の比例的増加より大きいが、１２０mgを超える用量については用量比例動態に近いことが示唆された。Ｃｍａｘ又はＡＵＣに基づく幾何平均蓄積比（それぞれ、ＲＡ，Ｃｍａｘ，４及びＲＡ，ＡＵＣ，４）を決定して、４回の反復投与後の本発明の抗体の蓄積を評価した。８０mgでの４回の週１回のＳＣ投与後、ＲＡ，Ｃｍａｘ，４及びＲＡ，ＡＵＣ，４値は、単回投与後よりそれぞれ８．３倍及び１１．６倍高かった。このことは、本発明の抗体の蓄積を示した。ｇＭｅａｎ蓄積は、３つの高用についてより低かった（範囲：ＲＡ，Ｃｍａｘ，４について３．７及びＲＡ，ＡＵＣ，４について４．９〜５．８）。本発明の抗体の終末ｔ１／２は、１５６〜１９９時間（６〜８日）の範囲であった。トラフ濃度の目視検査から、定常状態には、いずれの用量でも達しないことが示唆された。全ての投与群についての血漿中トラフ濃度が、その後の投与毎に上昇し続けた（図２）。
【０４１６】
表９．２．初回投与（１日目）及び最後の投与（４回の週１回皮下投与後）後の本発明の抗体の選択されたＰＫパラメーター
【表４７】
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【０４１７】
ＳＣ用量範囲８０〜２４０mgにわたる用量比例性の分析から、Ｃｍａｘ及びＡＵＣ０−τの傾きは、１とは明らかに異なっていたことが示された。このことから、本発明の抗体の曝露は、用量に比例しないことが示される（Ｃｍａｘ：初回投与後のパワーモデルの傾きβ＝２．１［９５％ ＣＩ  １．２〜２．９］；最後の投与後の傾きβ＝１．４［９５％ ＣＩ  １．１〜１．８］；ｎ＝３２；ＡＵＣ０−τ：最後の投与後の傾きβ＝１．４［９５％ ＣＩ  １．１〜１．８］；ｎ＝３２）。一方、より高い用量（１２０〜２４０mg）については、用量比例性に向かう傾向が観察された。
【０４１８】
薬力学
本発明の抗体の投与により、用量依存性ＣＤ４０  ＲＯ及びＣＤ５４アップレギュレーションの阻害がもたらされた（図３）。
【０４１９】
本発明の抗体の単回ＳＣ投与後、算術平均ＣＤ４０  ＲＯは、初回投与後測定（７２時間）で、各用量レベルについてほぼ最大値に既に達していた（図３Ａ）。この時点で、８０mg 投与により、約８９％ ＣＤ４０  ＲＯがもたらされた。１２０〜２４０mg 投与群では、ＣＤ４０  ＲＯは、９４〜９５％でプラトーに達した。これは、アッセイについての検出限界であったためであり、より高い占有レベルが達成可能かどうかを確認することはできなかった。ＣＤ４０  ＲＯのこれらのレベルを残りの研究のために維持した。
【０４２０】
本発明の抗体の最後の（第４の）週１回ＳＣ投与後、ＣＤ４０  ＲＯは、全ての用量（８０〜２４０mg）について、３９日目（最後の投与後１７日目）までの全ての測定時点で＞９０％であった。１８０mg 投与群については、７９％（幾何変動係数［ｇＣＶ］  ２３％） ＣＤ４０  ＲＯが、６４日目でも検出可能であり、２４０mg 投与群については、６８％（ｇＣＶ  ２９％） ＣＤ４０  ＲＯが、７８日目に検出可能であった。このことから、これらの後期の時点で変動性がより高かったが、レセプターへの長期持続的な結合が示された。特記すべきＣＤ４０  ＲＯは、プラセボ群では観察されなかった。
【０４２１】
本発明の抗体の単回用量投与後のＣＤ５４アップレギュレーションの阻害は、ＣＤ４０  ＲＯについて観察されたものと同様のパターンに従った。８０mg 用量は、初回投与後測定（７２時間）で８７％ 阻害を与え、この時点でより高い用量について、＞９０％ 阻害が観察された（全ての投与群；図３Ｂ）。８０mg 投与群については、投与後７日目に、阻害がさらに９５％まで向上した。一方、全ての他の用量については、７２時間後の先から９５％ 抑制が観察された。プラセボ群については、ＣＤ５４アップレギュレーションの阻害は、−２０〜３０％で変動した。本発明の抗体の最後の（４回目の）週１回ＳＣ投与後、ＣＤ５４アップレギュレーションの阻害は、３９日目（最後の投与後１７日目）まで、全ての用量について＞９０％であった。阻害効果は、１８０mg 群（６４日目で８９％）及び２４０mg 群（７８日目で５１％）で依然として検出可能であった。
【０４２２】
安全性
ＡＥの全体的な頻度及び強度は、本発明の抗体処置群において類似していた（全ての本発明の抗体投与［７８％］及びプラセボ群［８８％］）。重篤なＡＥ、重度のＡＥ又は投与中止もしくは死亡に至ったＡＥは報告されなかった。対象数は少なかったが、本発明の抗体投与、処置関連ＡＥ又はＡＥの頻度及び強度の間に何らの関係もないようであった。感染が、本発明の抗体を受けた８名の対象（２５％）及びプラセボを受けた５名の対象（６３％）において報告された。血栓塞栓性イベントはなかった。最も頻繁に報告された処置関連ＡＥは、頭痛であり、本発明の抗体を受けた４名（１３％）及びプラセボを受けた２名（２５％）において報告された。全てのＡＥは、軽度又は中等度であり、全て回復した。
【０４２３】
８０mg及び１２０mg 処置群の個々の対象について、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）の実質的な上昇が、ベースライン及び本発明の抗体又はプラセボのいずれかでの処置後の両方で観察された（正常［ＵＬＮ］の上限の１．１〜８８倍の範囲）。全体として、ＣＫのこれらの上昇は、一般的には、広範な運動に起因すると決定された。より高い投与群（１８０〜２４０mg）についてのより厳しい運動制限の実行により、ＣＫレベルの低下（最大３倍ＵＬＮ）がもたらされた。
【０４２４】
本発明の抗体で処置された全ての対象のうち、軽度で一過性の白血球減少症及び好中球減少症がそれぞれ、１２名（３７．５％）及び１４名（４３．８％）の対象において観察された。プラセボを受けた１名の対象のみが、軽度で一過性の好中球減少症を有した。基準値下限（ＬＬＮ）を下回る値が、投与処置前に軽度で一過性の白血球減少症を有する１２名の対象のうちの４名（３３．３％）及び軽度で一過性の好中球減少症を有する１４名の対象のうちの５名（３５．７％）において観察された。全ての対象において、白血球数（ＷＢＣ）及び好中球絶対数は、研究終了の来院時に白血球数が３．７７×１０９個/Lであった１名の対象と、試験終了の来院時に少ないＷＢＳ数及び好中球絶対数（それぞれ、３．５８×１０９/L及び１．６９×１０９/L）を有した更なる対象を除き、正常値内（ＷＢＣ正常範囲：４〜１１×１０９個/L及び好中球絶対数正常範囲：１．９〜７．５×１０９個/L）に回復したか又は研究終了時までに処置前のレベルに達した。さらに、本発明の抗体の用量を増加させても、白血球減少症又は好中球減少症を有する対象の数は増えなかった。
【０４２５】
出血時間、血小板数又はＤ−二量体、アンチトロンビンＩＩＩ、フィブリノーゲン並びにプロテインＳ及びＣを含む凝固パラメーターに臨床的に明らかな変化はなかった。
【０４２６】
バイタルサイン、ＥＣＧ及び身体検査に関して、臨床的に問題となる所見及び処置群間差はなかった。局所許容性の評価から、本発明の抗体の全ての用量は、十分に許容され、プラセボ群と比較して差異がなかったことが示された。
【０４２７】
既存のＡＤＡ応答が、４名の対象（１０％）において観察され、そのうちの３名は、その後に、本発明の抗体を受け、１名は、プラセボを受けた。ＡＤＡ力価は、２４０mg 本発明の抗体を投与されたこれらの対象のうち１名のみにおいて上昇した（処置追加免疫ＡＤＡ［生物学的製剤投与後により高いレベルに追加免疫された既存のＡＤＡ］）。
【０４２８】
血清転換が、本発明の抗体処置後に１６名の対象（５０％）において観察され、発症は、主に、研究終了サンプル（１５名の対象［４７％］）であった。その時点で、本発明の抗体レベルは、既に非常に低かった（本発明の抗体のｇＭｅａｎ血漿濃度は、８０〜２４０mg 投与群について、０．１８２〜１０．５μg/mLの範囲であった）。
【０４２９】
処置誘引ＡＤＡ（生物学的製剤投与後にｄｅ  ｎｏｖｏで発症したＡＤＡ）又は処置追加免疫ＡＤＡ応答が、８０mg 投与群における５名の対象（６２．５％）及び１２０mg 投与群の６名の対象（７５％）で観察された。８０mg 投与群及び１２０mg 投与群の全体的な力価中央値はそれぞれ２０及び８であった。処置誘引ＡＤＡ又は処置追加免疫ＡＤＡ応答が、より高い投与群では少数の対象で観察され、１８０mg及び２４０mg 投与群それぞれで２名（２５％）及び４名（５０％）の対象で観察された。全体的な力価中央値はそれぞれ、４及び８であった。個々の対象における最大力価は、６４０であり、１２０mg 投与群で観察された。
【０４３０】
議論
この研究の目的は、健常な対象において、本発明の抗体（８０〜２４０mg/週）の４週間の上昇ＳＣ投与の効果を調査することであった。ＰＫパラメーターの評価から、本発明の抗体の１２０〜２４０mgＳＣ投与は動力学がほぼ比例することが示されたが、本発明の抗体の単回ＩＶ投与後に、以前の研究で観察されたように、ターゲット媒介性薬剤クリアランスによる８０〜１２０mgのＳＣ用量は動力学が超比例することが示された。その効果は、ＣＤ４０レセプターの広い分布により増強され（特に、その短いｔ１／２を有する血小板）、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体による他の研究で以前に報告されている。Ｃｍａｘ（初回及び最後の投与後）及びＡＵＣ０−τ（最後の投与後）について、本発明の抗体のＳＣ用量範囲１２０〜２４０mgにわたって、ほぼ比例した用量−暴露関係が観察された。ここで、両パラメーターについての傾きβ＝１．２であった。このことは、おそらく、ＣＤ４０  ＲＯがこれらの用量で飽和に近いことを示している。８０mg及び１２０mg 本発明の抗体の初回ＳＣ投与後に達成された血漿曝露は、健常なボランティアにおける以前の単一上昇用量研究で観察されたものと同様であった。ここで、ｇＭｅａｎ  ＡＵＣ値１２０μg・h/mL及び８８８μg・h/mLがそれぞれ、８０mg及び１２０mg 本発明の抗体の単一ＳＣ投与により得られた。本発明の抗体の蓄積が、単回投与（初回投与）の投与と比較して、反復投与後の全ての用量レベルで観察された。一方、１２０〜２４０mg 用量では、より低い蓄積が観察され、比較的一定のｇＭｅａｎ  ＲＡ，Ｃｍａｘ値３．７〜４及びｇＭｅａｎ  ＲＡ，ＡＵＣ値４．９〜６が得られた。投与されたいずれの用量についても、４週間以内に定常状態に達しなかった。モデリングから、１２０mg 本発明の抗体を週１回投与する場合、定常状態に達するのに１２週間かかることが示された（論文準備中）。約１２週間以内に定常状態に達するという予測は、１２０mg 本発明の抗体を週１回１２週間ＳＣでの関節リウマチ患者の処置により確認されている。このことは、ＰＫ定常状態が約１０〜１２週間以内に達することが示している２６。したがって、これにより、今後の臨床研究で定常状態をより迅速に達成するための負荷用量の使用が支持される。曝露パラメーターであるＡＵＣ及びＣｍａｘについて、個体間変動は８０mg 投与でより高く（ｇＣＶ：５６．４〜５９．１％）、１２０mg及び１８０mg 投与で中等度であり（ｇＣＶ：３５．４〜３７．４％）、２４０mg 投与でより低かった（ｇＣＶ：２１．９〜２２．４％）。本発明の抗体は、ＳＣ注射部位からゆっくり吸収され、ｔｍａｘの中央値は、初回投与後に用量と共に増加した。４回目の投与後に、ｔｍａｘ，４との用量関係はなかった。本発明の抗体の反復投与後、推定終末ｔ１／２は、６〜８日の範囲にあり、用量間に明らかな差はなかった。
【０４３１】
ＣＤ４０  ＲＯの評価及びＣＤ５４アップレギュレーションの阻害から、１２０〜２４０mg 本発明の抗体の単回ＳＣ投与により、投与後７２時間から＞９０％ ＣＤ４０  ＲＯ及び＞９０％ ＣＤ５４アップレギュレーションの阻害がもたらされたことが示された。本発明の抗体の最後の（４回目の）投与により、＞９０％ ＣＤ４０  ＲＯ及びＣＤ５４アップレギュレーションの阻害が、ＳＣ用量範囲８０〜２４０mgにわたって投与後少なくとも４０８時間（１７日間）維持された。これらの結果から、本発明の抗体の２週間毎のＳＣ投与によるアゴニストＣＤ４０結合の連続的で完全な阻害の可能性が示唆される。モデリングから、１２０mg 本発明の抗体のＳＣでの３週間にわたる１週間毎の投与、続けて、２週間毎の１回の投与により、連続的に＞９０％ ＣＤ４０  ＲＯがもたらされることが示された。炎症性疾患、例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス又はループス腎炎を有する患者において、ＣＤ４０レセプターは、各種の免疫細胞及び常在細胞（例えば、ループス腎炎におけるメサンギウム細胞）で高度に発現され、アップレギュレートされるであろうことが予測され、このため、健常な対象においてＢ細胞での９０％ レセプター占有率をもたらした抗体より、高い用量の本発明の抗体が、自己免疫疾患患者におけるＣＤ４０レセプターを完全にブロックするのに必要である場合がある。これらの患者における本発明の抗体の臨床研究は、より長い投与間隔により臨床的効力を達成することができるかどうか又は週１回の投与が必要であるかどうかを評価する必要があるであろう。
【０４３２】
本発明の抗体の反復上昇ＳＣ投与は、安全であると考えられ、健常な対象において良好な全体的な許容性を示した。全てのＡＥは、軽度又は中等度であり、研究中止に至った有害事象は報告されなかった。ＵＬＮを超えて上昇した血清ＣＫ値が、一部の対象で、ベースライン時並びに本発明の抗体群及びプラセボ群の両方での処置後に報告されたが、これらは、過剰な運動によるものであり、文献で以前に報告されたものと同様であった。１８０mg及び２４０mg 投与群についてのより厳しい運動制限の実施により、ＣＫ濃度は低下した。複数の対象は、本発明の抗体による処置後に、軽度で一過性の白血球減少及び好中球減少を示した。ただし、ＬＬＮ未満の値は、それぞれ、白血球減少症の対象の３３．３％、好中球減少症の対象の３５．７％で、処置前に既に観察されていた。一過性の好中球減少症は、健常な対象では非常に一般的であり、場合によっては、ウイルス感染の併発と関連している。好中球減少症は、以前に高強度のスポーツを行った対象において報告されており、この研究に登録された対象の大半は、観察された血清ＣＫ値の大幅な上昇により裏付けられるように、激しい身体活動を行っていた。加えて、最近では、運動誘引筋損傷が、急速な局所炎症応答を開始させ、白血球の局所的な蓄積が筋力低下と関連していることが示されている。この研究において観察されたＣＫ値の上昇は、これらの対象に何らかの筋損傷があったことを示している。したがって、循環血中から筋肉に向かう白血球の再分布が、観察された一過性の白血球減少症及び好中球減少症の一因となった可能性がある。まとめると、観察された好中球減少症と本発明の抗体による処置との間には明確な関係はない。ただし、ＷＢＣ及び好中球の変化は、本発明の抗体によるその後の臨床研究において注意深くモニターされるであろう。
【０４３３】
臨床的に関連するバイタルサイン、ＥＣＧ評価又は身体検査の所見は報告されなかった。本発明の抗体の単回ＩＶ及びＳＣ用量の投与後の観察と一致して、反復投与の間に血栓塞栓イベントは報告されず、血小板又は凝固パラメーターに臨床的に関連する変化はなかった。以前に、血小板凝集測定法の調査及びヒト血小板との結合研究では、ＣＤ４０の遮断が、血小板機能に明らかな影響を及ぼさないことが示された（未発表データ）。毒性研究では、本発明の抗体がカニクイザルの血小板に結合しても、血小板の数又は機能に影響を及ぼさないことが実証された。まとめると、これらの知見から、血小板に結合した場合、本発明の抗体は、血小板の活性化、凝集又は機能を変化させないようであることが示される。これらのデータ及び機能的Ｆｃ領域、１７、１９、２０を欠く他の抗ＣＤ４０抗体又は抗ＣＤ４０Ｌ抗体からのデータにより、以前の抗ＣＤ４０Ｌ抗体１６により観察されたように１６、血栓塞栓イベントのリスクを抗体のＦｃ機能を排除することにより回避することができるという解釈が支持される。
【０４３４】
本発明の抗体を投与された対象の５０％での処置誘引又は処置追加免疫ＡＤＡ応答により、何ら臨床症状は引き起こされず（有害イベントとは関係せず又は暴露の変化もない）又は反復投与後にＰＫの観察可能な変化はもたらさなかった。白血球数及び好中球数は影響を受けず、２名の対象（これら２名の対象は、ＡＤＡについて陰性であった）を除き、正常範囲内又は処置前のレベルに達していた。高用量群（１８０mg及び２４０mg）より８０mg及び１２０mg 用量群でＡＤＡの発生率が高かった。本発明の抗体の血漿濃度は、ＡＤＡ応答開始時（研究終了来院時）に、アッセイ定量の下限付近であり、本発明の抗体は、大部分が排除され、本発明の抗体の循環レベルは、ＡＤＡアッセイの薬物許容性未満であった。さらに、この研究における対象数が少ないため、本発明の抗体の用量又はＡＤＡの発生もしくは力価を明確に評価することができなかった。本発明の抗体がＣＤ４０レセプターを阻害し、これにより、抗体産生を遮断するメカニズムに基づいて、本発明の抗体投与及び抗体同位体スイッチング後のＡＤＡの発生は予想されないであろう。１５１２時間（６３日）時点（８０〜１８０mg 用量群）又は１８４８時間（７７日）時点（２４０mg 用量群）において、ＣＤ４０  ＲＯは、既に９０％未満に低下していた。さらに、本発明の抗体レベルは、胚中心においてさらに低いことが予想される。このため、本発明の抗体の濃度は、ＡＤＡの形成を遮断するには低すぎた場合がある。この仮説は、カニクイザルにおける本発明の抗体による前臨床評価によっても支持される。カニクイザルでは、全ての用量で、末梢Ｂ細胞について、＞９０％ ＣＤ４０  ＲＯが示されたが、最も低い群（１mg/kg）では、胚中心に対する完全な薬理作用が示されず、ＡＤＡが発症した（２１及び未発表データ）。
【０４３５】
結論
健常な対象における４週間にわたる本発明の抗体の週１回の反復上昇ＳＣ投与後に、ＰＫは、８０mg〜１２０mgの用量についてのターゲット媒性介クリアランスのために、超比例的に増加したが、＞１２０mg 用量についてはほぼ比例した。本発明の抗体の用量依存的蓄積により、今後の臨床研究においてより早く定常状態を達成するための負荷用量の使用が支持される。本発明の抗体は、ＣＤ４０Ｌ誘引ＣＤ５４アップレギュレーションの持続的な阻害を伴って、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ経路を遮断する可能性が高いことを示した。このため、更なる研究が、より長い投与間隔が自己免疫疾患、例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス又はループス腎炎に罹患している患者において臨床的に効率的であることができるかどうかを評価する必要があるであろう。８０〜２４０mgの範囲にわたる本発明の抗体の反復上昇ＳＣ投与は、一般的には十分に許容され、急性免疫反応の関連する徴候は観察されなかった。
【０４３６】
本明細書で開示される教示の適用は、本明細書で記載された具体的な実施態様により範囲が限定されるべきではない。実際に、本明細書に含まれる教示及び付随する実施例に照らして、種々の修飾が、当業者の能力の範囲内にある。このような修飾は、添付の特許請求の範囲の範囲内にあるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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