(57)【要約】ＨＢｓＡｇの定量検出のためのキット及びＨＢｓＡｇを含むサンプル中のＨＢｓＡｇ含有量を定量的に検出する方法。該キットは、ＨＢｓＡｇに特異的に結合する第１の抗体及び試薬組成物を含む。試薬組成物は、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）及び尿素を含む。
2021505906.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＢｓＡｇに特異的に結合することができる第１の抗体と試薬組成物とを備えるキットであって、前記試薬組成物がトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）及び尿素を含む、キット。
【請求項２】
前記試薬組成物が、非イオン性界面活性剤、無機塩、及びバッファーからなる群から選択される１つ以上の試薬を更に含む、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記試薬組成物が、以下：
（ｉ）前記非イオン性界面活性剤が、Ｃｈａｐｓ、スルホベタイン型界面活性剤、Ｔｒｉｔｏｎ型洗浄剤、Ｔｗｅｅｎ型洗浄剤、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、好ましくは、前記非イオン性界面活性剤が、ＳＢ１４、ＳＢ１６、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−４０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、及びそれらの任意の組み合わせから選択され、より好ましくは、前記非イオン性界面活性剤が、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び／又はＴｗｅｅｎ−２０である；
（ｉｉ）前記無機塩が、ＮＨ４ＳＯ４及びＮａＣｌから選択される；
（ｉｉｉ）前記バッファーが炭酸バッファーである；
の１つ以上の特徴を有する、請求項２に記載のキット。
【請求項４】
前記試薬組成物が、
（１）ＴＣＥＰ、尿素、及び残部は水、
（２）ＴＣＥＰ、尿素、無機塩（例えば、ＮａＣｌ）、及び残部は水、
（３）ＴＣＥＰ、尿素、無機塩（例えば、ＮａＣｌ）、非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０）、及び残部は水、又は、
（４）ＴＣＥＰ、尿素、無機塩（例えば、ＮａＣｌ）、非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０）、バッファー（例えば、炭酸バッファー）、及び残部は水、
を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５】
ＴＣＥＰが１ｍＭ〜１００ｍＭ（例えば、１ｍＭ〜５０ｍＭ、１０ｍＭ〜５０ｍＭ、２０ｍＭ〜５０ｍＭ、又は３０ｍＭ〜５０ｍＭ、例えば４０ｍＭ）の量で存在し、
尿素が、０．５Ｍ〜８Ｍ（例えば、１Ｍ〜８Ｍ、１Ｍ〜６Ｍ、又は２Ｍ〜６Ｍ、例えば２Ｍ）の量で存在し、
前記非イオン性界面活性剤が、０％〜１０％（体積／体積）（例えば、０．１％〜１％、例えば０．１％）の量で存在し、
前記無機塩が、０．５Ｍ〜８Ｍ（例えば、０．５Ｍ〜１Ｍ、例えば０．６ｍＭ）の量で存在し、
前記バッファーが、０ｍＭ〜２００ｍＭ（例えば、５０ｍＭ〜２００ｍＭ、又は５０ｍＭ〜１５０ｍＭ、例えば１００ｍＭ）の量で存在する、
請求項１〜４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６】
前記試薬組成物が４０ｍＭ  ＴＣＥＰ及び２Ｍ尿素を含み、
好ましくは、前記試薬組成物が以下の成分：４０ｍＭ  ＴＣＥＰ、２Ｍ尿素、６００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ炭酸バッファー（ｐＨ９．６）、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（体積／体積）、及び残部は水（例えば、脱イオン水）からなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７】
前記キットが、ＨＢｓＡｇを認識してそれに結合することができる検出試薬、例えば、ＨＢｓＡｇに特異的に結合することができる第２の抗体を更に備え、
好ましくは、前記検出試薬が、酵素（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）、化学発光試薬（例えば、アクリジニウムエステル化合物）、又は蛍光色素等の検出可能な標識を担持する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項８】
前記キットが、マイクロタイタープレート（例えば、マイクロウェルプレート又はＥＬＩＳＡプレート）又は磁気ビーズ等の固体支持体を更に備え、
好ましくは、前記キットが、表面が前記第１の抗体でコーティングされている固体支持体を備える、請求項１〜７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項９】
前記キットが、標準物質（例えば、異なる既知量のＨＢｓＡｇを含有する一連のサンプル）；陽性対照サンプル（例えば、既知量のＨＢｓＡｇを含有するサンプル）；陰性対照サンプル（例えば、ＨＢｓＡｇを含まないサンプル）；酵素により触媒される基質の呈色反応を停止するための停止溶液（例えば、硫酸、塩酸又は水酸化ナトリウムの溶液）；非特異的結合を阻害するためのブロッキング溶液；及び採血デバイス（例えば、発熱物質を含まない真空採血管）からなる群から選択される１つ以上の試薬又はデバイスを更に備える、請求項１〜８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１０】
ＨＢｓＡｇと、ＨＢｓＡｇに特異的に結合することができる第１の抗体と、試薬組成物とを含む反応システムであって、前記試薬組成物が請求項１〜６のいずれか一項に規定される通りである、反応システム。
【請求項１１】
ＨＢｓＡｇを含有するサンプル中のＨＢｓＡｇの量を定量的に検出する方法であって、
（１）前記サンプルを、試薬組成物中のＨＢｓＡｇに特異的に結合することができる第１の抗体と接触させて、免疫複合体を得る工程と、
（２）工程（１）で得られた前記免疫複合体の量を測定する工程と、
を含み、工程（１）において、前記試薬組成物が請求項１〜６のいずれか一項に規定される通りである、方法。
【請求項１２】
前記方法が、以下：
（ｉ）前記サンプルが、全血、血漿、又は血清等の血液サンプルである；
（ｉｉ）前記血液サンプルが希釈されていない；
（ｉｉｉ）前記第１の抗体が固体支持体の表面にコーティングされ、好ましくは、前記第１の抗体が、マイクロタイタープレート（例えば、マイクロウェルプレート又はＥＬＩＳＡプレート）又は磁気ビーズの表面にコーティングされている；
（ｉｖ）工程（２）の前に、前記免疫複合体を洗浄して未反応物質を除去する工程を更に含む、
の１つ以上の特徴を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（２）において、前記免疫複合体の量が免疫学的検出によって決定され、
好ましくは、前記免疫学的検出が、酵素イムノアッセイ又は化学発光イムノアッセイであり、好ましくは、前記免疫学的検出が、ＣＬＥＩＡ法及びＣＬＩＡ法から選択され、
好ましくは、工程（２）において、前記免疫複合体の量が、ＨＢｓＡｇに特異的に結合することができる第２の抗体を使用して検出され、前記第２の抗体が、酵素（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）、化学発光試薬（例えば、アクリジニウムエステル化合物）又は蛍光色素等の検出可能な標識を担持する、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
被験体の血液サンプル中のＨＢｓＡｇの量を検出するキットの製造における試薬組成物の使用であって、前記試薬組成物が請求項１〜６のいずれか一項に規定される通りである、使用。
【請求項１５】
前記キットが、ＨＢｓＡｇに特異的に結合することができる第１の抗体を更に備える、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記キットが、ＨＢｓＡｇに特異的に結合することができる第２の抗体等の、ＨＢｓＡｇを認識してそれに結合することができる検出試薬を更に備え、
好ましくは、前記検出試薬が、酵素（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）、化学発光試薬（例えば、アクリジニウムエステル化合物）、又は蛍光色素等の検出可能な標識を担持する、請求項１４又は１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記キットが、マイクロタイタープレート（例えば、マイクロウェルプレート又はＥＬＩＳＡプレート）又は磁気ビーズ等の固体支持体を更に備え、
好ましくは、前記第１の抗体が前記固体支持体の表面にコーティングされている、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
前記キットが、
（１）前記血液サンプルを前記試薬組成物中の第１の抗体と接触させて、免疫複合体を得る工程と、
（２）工程（１）で得られた前記免疫複合体の量を測定する工程と、
を含む方法によって、被験体の血液サンプル中のＨＢｓＡｇの量を検出し、工程（１）において、前記血液サンプルが希釈されていない、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１９】
工程（２）において、前記免疫複合体の量が免疫学的検出（例えば、酵素イムノアッセイ又は化学発光イムノアッセイ）によって決定され、
好ましくは、工程（２）において、前記免疫複合体の量が、ＨＢｓＡｇに特異的に結合することができる第２の抗体を使用して検出され、前記第２の抗体が、酵素（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）、化学発光試薬（例えば、アクリジニウムエステル化合物）又は蛍光色素等の検出可能な標識を担持する、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
以下：
（ｉ）工程（２）の前に、前記免疫複合体を洗浄して未反応物質を除去する工程を更に含む；
（ｉｉ）前記被験体がＨＢＶ感染症又はＨＢＶ感染に関連する疾患（例えば、Ｂ型肝炎）を有する；
（ｉｉｉ）前記血液サンプルが、全血、血漿、及び血清からなる群から選択される；
の１つ以上を特徴とする、請求項１８又は１９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、ウイルス学及び免疫学の分野に関する。特に、本出願は、ＨＢｓＡｇを定量的に検出するキットに関する。さらに、本出願はまた、ＨＢｓＡｇを含むサンプル中のＨＢｓＡｇの量を定量的に検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ：Hepatitis B virus）感染症、特に慢性Ｂ型肝炎ウイルス感染症は、世界で最も深刻な公衆衛生問題の１つである。現在、慢性Ｂ型肝炎ウイルスに感染している人は世界中で３億５０００万人を超えている。慢性Ｂ型肝炎ウイルス感染症は、慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ：chronic hepatitis B）、肝硬変（ＬＣ：Liver cirrhosis）、及び原発性肝細胞癌（ＨＣＣ：hepatocellular carcinoma）等の肝疾患を引き起こす場合がある。慢性Ｂ型肝炎ウイルス感染症とそれによって引き起こされる疾患とによる死者は、毎年世界中で１００万人を超えている（非特許文献１）。
【０００３】
Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ：Hepatitis B virus surface antigen）はＨＢＶの外膜タンパク質である。ＨＢｓＡｇは臨床上、ＨＢＶ感染の最も重要な診断マーカーである。ＨＢｓＡｇの長期的な存在は慢性ＨＢＶ感染を示す。近年、ＨＢｓＡｇ定量検出の臨床的重要性が徐々に明らかになり、検出が広く使用されている。
【０００４】
ヌクレオシドアナログによる治療中のＨＢｓＡｇの減少は、ＨＢＶ  ＤＮＡの減少と一致している（非特許文献２）。薬剤耐性株が出現すると、血清ＨＢｓＡｇレベルが上昇し、これは、しばしばＨＢＶ  ＤＮＡのリバウンド及び生化学的ブレークスルー（ＡＬＴレベルの上昇）に先行する（非特許文献２及び非特許文献３）。
【０００５】
インターフェロン療法に対する反応の検出及び予測では、治療の初期段階でのＨＢｓＡｇの量的レベルの著しい低下、又は治療前のより低いＨＢｓＡｇベースラインレベルを伴う急な出現は、持続性ウイルス学的著効（ＳＶＲ：sustained virological response）及びＨＢｅＡｇセロコンバージョン（seroconversion：血清変換）を得るのに役立つ（非特許文献４及び非特許文献５）。ＨＢｅＡｇ陽性患者のＰＥＧ−ＩＦＮによる治療中、ＨＢｓＡｇの定量化が治療１２週目で１５００ＩＵ／ｍＬ未満であることはＨＢｅＡｇセロコンバージョンの重要な予測指標であり、ＨＢｓＡｇ定量化が治療１２週目で２００００ＩＵ／ｍＬ超であることは反応していないことの強力な予測指標である（非特許文献６及び非特許文献７）。ＨＢｅＡｇ陰性患者のＰＥＧ−ＩＦＮによる治療中、ＨＢｓＡｇ濃度の低下がなく、ＨＢＶ  ＤＮＡの低下が２Ｌｏｇ１０ＩＵ／ｍｌ未満であることは、治療に対する反応がないことの強力な予測指標であり、治療を停止して他の薬で置き換えられることを示す（非特許文献８及び非特許文献９）。
【０００６】
現在のＨＢｓＡｇ定量試薬は、「被覆抗体−抗原−標識抗体」の「サンドイッチ」検出法を使用する。異なる試薬間の違いは、主にコーティング媒質及び標識の違いにある。さらに、異なる試薬は定量範囲も或る程度異なる。例えば、Roche試薬はビオチン及びレアメタルである「ルテニウム」を使用して抗原検出用に２つの抗体をそれぞれ標識した後、アビジン標識磁気粒子を介して抗原と抗体との間の反応によって形成された二重抗体サンドイッチ複合体を捕捉して、電気化学的シグナルを検出する（この場合、試薬の検出範囲はサンプルを希釈しない条件下で０ＩＵ／ｍＬ〜１３０ＩＵ／ｍＬである）のに対し、Abbott試薬の場合、一方の抗体は磁気粒子に直接コーティングされ、他方の抗体はアクリジニウムエステルで標識されて、サンプルと反応することにより二重抗体サンドイッチ複合体が形成されて化学発光シグナルが検出される（この場合、試薬の検出範囲は、サンプルを希釈しない条件下で０ＩＵ／ｍＬ〜２５０ＩＵ／ｍＬである）。
【０００７】
しかしながら、現在、慢性Ｂ型肝炎患者のほとんどは、ＨＢｓＡｇの量的レベルが１００ＩＵ／ｍｌを超えている（非特許文献１０及び非特許文献１１）。したがって、ほとんどの臨床サンプルでは、サンプルを検査前に希釈した場合にのみ、既存の市販試薬を使用してサンプルの定量値を検出することができる。しかしながら、希釈倍率が大きいことから、サンプルを希釈するためには、希釈操作を数回繰り返す必要があり、希釈プロセスに時間がかかる。Abbott試薬を例にとると、手作業で５００倍希釈を行う場合、２５μｌのサンプルを最初に４７５μｌの希釈溶液に加えて２０倍希釈液を作製し、次いで２０μｌの１：２０希釈サンプルを４８０μｌの希釈溶液に添加して５００倍希釈を達成するので、手作業による希釈は精度を低下させる。全自動機器による自動希釈でも複数回の希釈操作が必要であり、希釈倍率が大きいほど、機器の検出スループットが低下し、検出精度が低下する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Dienstag JL. Hepatitis B virus infection. N Engl J Med 2008; 359: 1486-1500
【非特許文献２】Chen Xiangsheng, Liao Wenjun. Clinical diagnostic significance of quantitative detection of hepatitis B HBsAg, [J]. Journal of Hubei College of Traditional Chinese Medicine, 2009, 11 (2): 21-23.
【非特許文献３】Chen Ruilie, et al. Relationship between serum HBV DNA level and liver function and immune parameters in patients with severe hepatitis B, [J]. China Journal of Primary Medicine, 2006, 13 (9): 1449-1450.
【非特許文献４】Luo Weimin, Wang Chaohui, Liu Zhongjing. The relationship and significance of HBV DNA and its five detection indexes, [J]. Qilu Journal of Medicine, 2009, 24 (1): 4-5
【非特許文献５】Liu Can, Weng Yirui, Chen Yongdong. Comparative study of HBsAg quantification with HBV-DNA and hepatitis B marker patterns in patients with hepatitis B, [J]. Fujian Journal of Medicine, 2006, 28 (4): 124-125.
【非特許文献６】Piratvisuth T, et al. Hepatol Int. 2013 Jun; 7(2): 429-36.;
【非特許文献７】Sonneveld MJ, et al. Hepatology. 2010; 52: 1251-1257.
【非特許文献８】Rijckborst V, et al. Hepatology 2010, 52: 454-461
【非特許文献９】Rijckborst V, et al. Journal of hepatology 2012, 56: 1006-1011
【非特許文献１０】Jaroszewicz J, et al. Journal of Hepatology, 2010, 52 (4): 514-522
【非特許文献１１】Nguyen T, et al. Journal of Hepatology, 2010 52 (4): 508-513.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、臨床サンプル中のＨＢｓＡｇ含有量のより単純で、より速く、より正確な測定を達成するために、サンプル希釈を必要とせず、検出の上限がより高いＨＢｓＡｇ定量検出方法を開発することが当該技術分野で必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
多くの実験調査の後、本発明者らは、予想外なことに、ＨＢｓＡｇの定量検出中に、特定の試薬組成物を使用することで、試験されるサンプルを希釈しない場合に検出の上限を１０００００ＩＵ／ｍＬに大幅に高めることができ、そのためほとんどの臨床サンプルがこの検出範囲に含まれ得ることを見出した。この知見に基づいて、本発明者らは、新たなＨＢｓＡｇ定量検出キット及び検出方法を開発した。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
キット
したがって、本発明の一態様は、ＨＢｓＡｇに特異的に結合することができる第１の抗体と試薬組成物とを備えるキットであって、前記試薬組成物がトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）及び尿素を含む、キットを提供する。
【００１２】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記試薬組成物は、非イオン性界面活性剤、無機塩、及びバッファーからなる群から選択される１つ以上の試剤を更に含む。
【００１３】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記非イオン性界面活性剤は、Ｃｈａｐｓ、スルホベタイン型界面活性剤、Ｔｒｉｔｏｎ型洗浄剤、Ｔｗｅｅｎ型洗浄剤、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。或る特定の好ましい実施の形態では、前記非イオン性界面活性剤は、ＳＢ１４、ＳＢ１６、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−４０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。或る特定の好ましい実施の形態では、前記非イオン性界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び／又はＴｗｅｅｎ−２０である。
【００１４】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記無機塩は、ＮＨ４ＳＯ４、ＮａＣｌ等から選択される。
【００１５】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記バッファーは炭酸バッファーである。
【００１６】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記試薬組成物は、ＴＣＥＰ、尿素、及び残部は水を含む。
【００１７】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記試薬組成物は、ＴＣＥＰ、尿素、無機塩（例えば、ＮａＣｌ）、及び残部は水を含む。
【００１８】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記試薬組成物は、ＴＣＥＰ、尿素、無機塩（例えば、ＮａＣｌ）、非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０）、及び残部は水を含む。
【００１９】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記試薬組成物は、ＴＣＥＰ、尿素、無機塩（例えば、ＮａＣｌ）、非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０）、バッファー（例えば、炭酸バッファー）、及び残部は水を含む。
【００２０】
或る特定の好ましい実施の形態では、試薬組成物には、ＴＣＥＰが１ｍＭ〜１００ｍＭ（例えば、１ｍＭ〜５０ｍＭ、１０ｍＭ〜５０ｍＭ、２０ｍＭ〜５０ｍＭ、又は３０ｍＭ〜５０ｍＭ、例えば４０ｍＭ）の量で存在し、尿素が、０．５Ｍ〜８Ｍ（例えば、１Ｍ〜８Ｍ、１Ｍ〜６Ｍ、又は２Ｍ〜６Ｍ、例えば２Ｍ）の量で存在し、前記非イオン性界面活性剤が、０％〜１０％（体積／体積）（例えば、０．１％〜１％、例えば０．１％）の量で存在し、前記無機塩が、０．５Ｍ〜８Ｍ（例えば、０．５Ｍ〜１Ｍ、例えば０．６ｍＭ）の量で存在し、前記バッファーが、０ｍＭ〜２００ｍＭ（例えば、５０ｍＭ〜２００ｍＭ、又は５０ｍＭ〜１５０ｍＭ、例えば１００ｍＭ）の量で存在する。
【００２１】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記試薬組成物は、４０ｍＭ  ＴＣＥＰ及び２Ｍ尿素を含む。或る特定の例示的な実施の形態では、前記試薬組成物は、以下：４０ｍＭ  ＴＣＥＰ、２Ｍ尿素、６００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ炭酸バッファー（ｐＨ９．６）、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（体積／体積）、及び残部は水（例えば、脱イオン水）の成分からなる。
【００２２】
或る特定の好ましい実施の形態では、第１の抗体はモノクローナル抗体である。或る特定の例示的な実施の形態では、第１の抗体は、いずれもXiamen Wantai Canghai Biotechnology Co., Ltd.製の１５Ｄ１（Ｍ１０５６）、４２Ｂ６（Ｍ１０５８）、６Ｃ１０（Ｍ１０５１０）、２Ｃ１（Ｍ１０５７）、ＳＦ（Ｍ１０５１７）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【００２３】
或る特定の好ましい実施の形態では、キットは、ＨＢｓＡｇを認識してそれに結合することができる検出試薬を更に備える。かかる検出試薬は当該技術分野でよく知られており、ＨＢｓＡｇに特異的に結合することができる、抗体、標的化ポリペプチド、又はアプタマーが挙げられるが、これらに限定されない。或る特定の例示的な実施の形態では、検出試薬は、ＨＢｓＡｇに特異的に結合することができる第２の抗体である。或る特定の例示的な実施の形態では、第２の抗体はポリクローナル抗体である。
【００２４】
或る特定の好ましい実施の形態では、検出試薬は、酵素（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）、化学発光試薬（例えば、アクリジニウムエステル化合物）、又は蛍光色素等の検出可能な標識を担持する。或る特定の例示的な実施の形態では、検出可能な標識が酵素である場合、キットは、セイヨウワサビペルオキシダーゼに対してｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ＡＢＴＳ若しくはルミノール化合物、又はアルカリホスファターゼに対してｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐ−ＮＰＰ）若しくはＡＭＰＰＤ等の着色溶液を更に備えてもよい。
【００２５】
或る特定の好ましい実施の形態では、キットは、固体支持体を更に備え、任意に、第１の抗体を固体支持体上にコーティングするためのコーティングバッファー（例えば、炭酸バッファー、リン酸バッファー、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、又はホウ酸バッファー）等のコーティング試薬を更に備える。或る特定の好ましい実施の形態では、固体支持体は、ポリマー材料（例えば、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリアクリルアミド又はセルロース）で作製されているか、若しくはそれでコーティングされている、陥没したウェルを備えるプレート、チューブ、粒子（例えば、ラテックス粒子）若しくは膜（例えば、ニトロセルロース膜）、又は官能基（例えば、アミノ、カルボキシル、ビオチン又はアビジン）でプレコートされた磁気ビーズを備える。或る特定の例示的な実施の形態では、固体支持体は、マイクロタイタープレート（例えば、マイクロウェルプレート又はＥＬＩＳＡプレート）である。或る特定の例示的な実施の形態では、固体支持体は磁気ビーズである。タンパク質又はポリペプチドを固体支持体上にコーティングする方法は、物理吸着、アミノ基若しくはカルボキシル基を有する表面を介した共有結合、又はアビジン−ビオチン系、ポリリジンプレコート表面、プロテインＡ若しくはプロテインＧのプレコート表面によって達成される媒介結合等、当該技術分野でよく知られている。
【００２６】
或る特定の好ましい実施の形態では、第１の抗体は、固体支持体の表面にコーティングされる。或る特定の例示的な実施の形態では、第１の抗体は、マイクロタイタープレート（例えば、マイクロウェルプレート又はＥＬＩＳＡプレート）の表面にコーティングされる。或る特定の例示的な実施の形態では、第１の抗体は、磁気ビーズの表面にコーティングされる。
【００２７】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記キットは、標準物質（例えば、異なる既知量のＨＢｓＡｇを含有する一連のサンプル）；陽性対照サンプル（例えば、既知量のＨＢｓＡｇを含有するサンプル）；陰性対照サンプル（例えば、ＨＢｓＡｇを含まないサンプル）；酵素により触媒される基質の呈色反応を停止するための停止溶液（例えば、硫酸、塩酸又は水酸化ナトリウムの溶液）；非特異的結合を阻害するためのブロッキング溶液；及び採血デバイス（例えば、発熱物質を含まない真空採血管）からなる群から選択される１つ以上の試薬又はデバイスを更に備える。
【００２８】
反応システム
別の態様では、本発明は、ＨＢｓＡｇと、ＨＢｓＡｇに特異的に結合することができる第１の抗体と、試薬組成物とを備える反応システムであって、前記試薬組成物がトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）及び尿素を含む、反応システムを提供する。
【００２９】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記試薬組成物は、非イオン性界面活性剤、無機塩、及びバッファーからなる群から選択される１つ以上の試剤を更に含む。
【００３０】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記非イオン性界面活性剤は、Ｃｈａｐｓ、スルホベタイン型界面活性剤、Ｔｒｉｔｏｎ型洗浄剤、Ｔｗｅｅｎ型洗浄剤、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。或る特定の好ましい実施の形態では、前記非イオン性界面活性剤は、ＳＢ１４、ＳＢ１６、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−４０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。或る特定の好ましい実施の形態では、前記非イオン性界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び／又はＴｗｅｅｎ−２０である。
【００３１】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記無機塩は、ＮＨ４ＳＯ４、ＮａＣｌ等から選択される。
【００３２】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記バッファーは炭酸バッファーである。
【００３３】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記試薬組成物は、ＴＣＥＰ、尿素、及び残部は水を含む。
【００３４】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記試薬組成物は、ＴＣＥＰ、尿素、無機塩（例えば、ＮａＣｌ）、及び残部は水を含む。
【００３５】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記試薬組成物は、ＴＣＥＰ、尿素、無機塩（例えば、ＮａＣｌ）、非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０）、及び残部は水を含む。
【００３６】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記試薬組成物は、ＴＣＥＰ、尿素、無機塩（例えば、ＮａＣｌ）、非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０）、バッファー（例えば、炭酸バッファー）、及び残部は水を含む。
【００３７】
或る特定の好ましい実施の形態では、試薬組成物には、ＴＣＥＰが１ｍＭ〜１００ｍＭ（例えば、１ｍＭ〜５０ｍＭ、１０ｍＭ〜５０ｍＭ、２０ｍＭ〜５０ｍＭ、又は３０ｍＭ〜５０ｍＭ、例えば４０ｍＭ）の量で存在し、尿素が、０．５Ｍ〜８Ｍ（例えば、１Ｍ〜８Ｍ、１Ｍ〜６Ｍ、又は２Ｍ〜６Ｍ、例えば２Ｍ）の量で存在し、前記非イオン性界面活性剤が、０％〜１０％（体積／体積）（例えば、０．１％〜１％、例えば０．１％）の量で存在し、前記無機塩が、０．５Ｍ〜８Ｍ（例えば、０．５Ｍ〜１Ｍ、例えば０．６ｍＭ）の量で存在し、前記バッファーが、０ｍＭ〜２００ｍＭ（例えば、５０ｍＭ〜２００ｍＭ、又は５０ｍＭ〜１５０ｍＭ、例えば１００ｍＭ）の量で存在する。
【００３８】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記試薬組成物は、４０ｍＭ  ＴＣＥＰ及び２Ｍ尿素を含む。或る特定の例示的な実施の形態では、前記試薬組成物は、以下：４０ｍＭ  ＴＣＥＰ、２Ｍ尿素、６００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ炭酸バッファー（ｐＨ９．６）、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（体積／体積）、及び残部は水（例えば、脱イオン水）の成分からなる。
【００３９】
或る特定の好ましい実施の形態では、第１の抗体はモノクローナル抗体である。或る特定の例示的な実施の形態では、第１の抗体は、いずれもXiamen Wantai Canghai Biotechnology Co., Ltd.製の１５Ｄ１（Ｍ１０５６）、４２Ｂ６（Ｍ１０５８）、６Ｃ１０（Ｍ１０５１０）、２Ｃ１（Ｍ１０５７）、ＳＦ（Ｍ１０５１７）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【００４０】
検出方法及び使用
別の態様では、本発明は、ＨＢｓＡｇを含有するサンプル中のＨＢｓＡｇの量を定量的に検出する方法であって、
（１）前記サンプルを、試薬組成物中のＨＢｓＡｇに特異的に結合することができる第１の抗体と接触させて、免疫複合体を得る工程と、
（２）工程（１）で得られた前記免疫複合体の量を測定する工程と、
を含み、工程（１）において、前記試薬組成物がＴＣＥＰ及び尿素を含む、方法を提供する。
【００４１】
或る特定の好ましい実施の形態では、本発明の方法は、非診断目的で使用される。かかる実施の形態では、試験されるサンプルはＨＢｓＡｇを含むことが分かっている、すなわち、本発明の方法を検査に使用する前にサンプルの被験体が既に診断結果を得ているため、本発明の方法はサンプルの診断段階では役に立たない。本発明の方法の直接的な目的は、サンプルの被験体の診断結果を得ることではなく、既知の診断情報を用いてサンプルに対して更に正確な定量検出を行うことであることが分かる。
【００４２】
或る特定の好ましい実施の形態では、サンプルは、全血、血漿又は血清等の血液サンプルである。或る特定の好ましい実施の形態では、血液サンプルは希釈されていない。
【００４３】
或る特定の好ましい実施の形態では、工程（１）において、前記試薬組成物は、非イオン性界面活性剤、無機塩、及びバッファーからなる群から選択される１つ以上の試薬を更に含む。
【００４４】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記非イオン性界面活性剤は、Ｃｈａｐｓ、スルホベタイン型界面活性剤、Ｔｒｉｔｏｎ型洗浄剤、Ｔｗｅｅｎ型洗浄剤、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。或る特定の好ましい実施の形態では、前記非イオン性界面活性剤は、ＳＢ１４、ＳＢ１６、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−４０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。或る特定の好ましい実施の形態では、前記非イオン性界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び／又はＴｗｅｅｎ−２０である。
【００４５】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記無機塩は、ＮＨ４ＳＯ４、ＮａＣｌ等から選択される。
【００４６】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記バッファーは炭酸バッファーである。
【００４７】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記試薬組成物は、ＴＣＥＰ、尿素、及び残部は水を含む。
【００４８】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記試薬組成物は、ＴＣＥＰ、尿素、無機塩（例えば、ＮａＣｌ）、及び残部は水を含む。
【００４９】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記試薬組成物は、ＴＣＥＰ、尿素、無機塩（例えば、ＮａＣｌ）、非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０）、及び残部は水を含む。
【００５０】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記試薬組成物は、ＴＣＥＰ、尿素、無機塩（例えば、ＮａＣｌ）、非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０）、バッファー（例えば、炭酸バッファー）、及び残部は水を含む。
【００５１】
或る特定の好ましい実施の形態では、試薬組成物には、ＴＣＥＰが１ｍＭ〜１００ｍＭ（例えば、１ｍＭ〜５０ｍＭ、１０ｍＭ〜５０ｍＭ、２０ｍＭ〜５０ｍＭ、又は３０ｍＭ〜５０ｍＭ、例えば４０ｍＭ）の量で存在し、尿素が、０．５Ｍ〜８Ｍ（例えば、１Ｍ〜８Ｍ、１Ｍ〜６Ｍ、又は２Ｍ〜６Ｍ、例えば２Ｍ）の量で存在し、前記非イオン性界面活性剤が、０％〜１０％（体積／体積）（例えば、０．１％〜１％、例えば０．１％）の量で存在し、前記無機塩が、０．５Ｍ〜８Ｍ（例えば、０．５Ｍ〜１Ｍ、例えば０．６ｍＭ）の量で存在し、前記バッファーが、０ｍＭ〜２００ｍＭ（例えば、５０ｍＭ〜２００ｍＭ、又は５０ｍＭ〜１５０ｍＭ、例えば１００ｍＭ）の量で存在する。
【００５２】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記試薬組成物は、４０ｍＭ  ＴＣＥＰ及び２Ｍ尿素を含む。或る特定の例示的な実施の形態では、前記試薬組成物は、以下：４０ｍＭ  ＴＣＥＰ、２Ｍ尿素、６００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ炭酸バッファー（ｐＨ９．６）、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（体積／体積）、及び残部は水（例えば、脱イオン水）の成分からなる。
【００５３】
或る特定の好ましい実施の形態では、工程（２）において、免疫複合体の量を免疫学的検出によって測定する。或る特定の好ましい実施の形態では、免疫学的検出は、酵素イムノアッセイ又は化学発光イムノアッセイである。或る特定の例示的な実施の形態では、免疫学的検出は、ＣＬＥＩＡ及びＣＬＩＡから選択される。或る特定の例示的な実施の形態では、工程（２）において、免疫複合体の量を、ＨＢｓＡｇに特異的に結合することができる第２の抗体を使用して検出し、第２の抗体は、酵素（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）、化学発光試薬（例えば、アクリジニウムエステル化合物）、又は蛍光色素等の検出可能な標識を担持する。かかる実施の形態では、第２の抗体及び工程（１）で得られる免疫複合体は、「抗体−抗原−抗体」サンドイッチ複合体を形成することができる。
【００５４】
幾つかの好ましい実施の形態では、工程（２）の前に、免疫複合体を洗浄して未反応物質を除去する工程を更に含む。
【００５５】
或る特定の好ましい実施の形態では、第１の抗体は、固体支持体の表面にコーティングされる。或る特定の好ましい実施の形態では、固体支持体は、ポリマー材料（例えば、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリアクリルアミド又はセルロース）で作製されているか、若しくはそれでコーティングされている、陥没したウェルを備えるプレート、チューブ、粒子（例えば、ラテックス粒子）若しくは膜（例えば、ニトロセルロース膜）、又は官能基（例えば、アミノ、カルボキシル、ビオチン又はアビジン）でプレコートされた磁気ビーズを備える。或る特定の例示的な実施の形態では、第１の抗体は、マイクロタイタープレート（例えば、マイクロウェルプレート又はＥＬＩＳＡプレート）の表面にコーティングされる。或る特定の例示的な実施の形態では、第１の抗体は、磁気ビーズの表面にコーティングされる。
【００５６】
別の態様では、本発明は、被験体の血液サンプル中のＨＢｓＡｇの量を検出するキットの製造における試薬組成物の使用に関し、試薬組成物はトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）及び尿素を含む。
【００５７】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記試薬組成物は、非イオン性界面活性剤、無機塩、及びバッファーからなる群から選択される１つ以上の試剤を更に含む。
【００５８】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記非イオン性界面活性剤は、Ｃｈａｐｓ、スルホベタイン型界面活性剤、Ｔｒｉｔｏｎ型洗浄剤、Ｔｗｅｅｎ型洗浄剤、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。或る特定の好ましい実施の形態では、前記非イオン性界面活性剤は、ＳＢ１４、ＳＢ１６、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−４０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。或る特定の好ましい実施の形態では、前記非イオン性界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び／又はＴｗｅｅｎ−２０である。
【００５９】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記無機塩は、ＮＨ４ＳＯ４、ＮａＣｌ等から選択される。
【００６０】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記バッファーは炭酸バッファーである。
【００６１】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記試薬組成物は、ＴＣＥＰ、尿素、及び残部は水を含む。
【００６２】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記試薬組成物は、ＴＣＥＰ、尿素、無機塩（例えば、ＮａＣｌ）、及び残部は水を含む。
【００６３】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記試薬組成物は、ＴＣＥＰ、尿素、無機塩（例えば、ＮａＣｌ）、非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０）、及び残部は水を含む。
【００６４】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記試薬組成物は、ＴＣＥＰ、尿素、無機塩（例えば、ＮａＣｌ）、非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０）、バッファー（例えば、炭酸バッファー）、及び残部は水を含む。
【００６５】
或る特定の好ましい実施の形態では、試薬組成物には、ＴＣＥＰが１ｍＭ〜１００ｍＭ（例えば、１ｍＭ〜５０ｍＭ、１０ｍＭ〜５０ｍＭ、２０ｍＭ〜５０ｍＭ、又は３０ｍＭ〜５０ｍＭ、例えば４０ｍＭ）の量で存在し、尿素が、０．５Ｍ〜８Ｍ（例えば、１Ｍ〜８Ｍ、１Ｍ〜６Ｍ、又は２Ｍ〜６Ｍ、例えば２Ｍ）の量で存在し、前記非イオン性界面活性剤が、０％〜１０％（体積／体積）（例えば、０．１％〜１％、例えば０．１％）の量で存在し、前記無機塩が、０．５Ｍ〜８Ｍ（例えば、０．５Ｍ〜１Ｍ、例えば０．６ｍＭ）の量で存在し、前記バッファーが、０ｍＭ〜２００ｍＭ（例えば、５０ｍＭ〜２００ｍＭ、又は５０ｍＭ〜１５０ｍＭ、例えば１００ｍＭ）の量で存在する。
【００６６】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記試薬組成物は、４０ｍＭ  ＴＣＥＰ及び２Ｍ尿素を含む。或る特定の例示的な実施の形態では、前記試薬組成物は、以下：４０ｍＭ  ＴＣＥＰ、２Ｍ尿素、６００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ炭酸バッファー（ｐＨ９．６）、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（体積／体積）、及び残部は水（例えば、脱イオン水）の成分からなる。
【００６７】
或る特定の好ましい実施の形態では、キットは、ＨＢｓＡｇに特異的に結合する第１の抗体を更に備える。或る特定の好ましい実施の形態では、第１の抗体はモノクローナル抗体である。或る特定の例示的な実施の形態では、第１の抗体は、いずれもXiamen Wantai Canghai Biotechnology Co., Ltd.製の１５Ｄ１（Ｍ１０５６）、４２Ｂ６（Ｍ１０５８）、６Ｃ１０（Ｍ１０５１０）、２Ｃ１（Ｍ１０５７）、ＳＦ（Ｍ１０５１７）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【００６８】
或る特定の好ましい実施の形態では、本発明は、被験体の血液サンプル中のＨＢｓＡｇの量を検出するキットの製造における試薬組成物及び第１の抗体の使用に関する。
【００６９】
或る特定の好ましい実施の形態では、キットは、ＨＢｓＡｇを認識してそれに結合することができる検出試薬を更に備える。かかる検出試薬は当該技術分野でよく知られており、ＨＢｓＡｇに特異的に結合することができる、抗体、標的化ポリペプチド、又はアプタマーが挙げられるが、これらに限定されない。或る特定の例示的な実施の形態では、検出試薬は、ＨＢｓＡｇに特異的に結合することができる第２の抗体である。或る特定の例示的な実施の形態では、第２の抗体はポリクローナル抗体である。
【００７０】
或る特定の好ましい実施の形態では、検出試薬は、酵素（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）、化学発光試薬（例えば、アクリジニウムエステル化合物）、又は蛍光色素等の検出可能な標識を担持する。或る特定の例示的な実施の形態では、検出可能な標識が酵素である場合、キットは、セイヨウワサビペルオキシダーゼに対してｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ＡＢＴＳ若しくはルミノール化合物、又はアルカリホスファターゼに対してｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐ−ＮＰＰ）若しくはＡＭＰＰＤ等の着色溶液を更に備えてもよい。
【００７１】
或る特定の好ましい実施の形態では、キットは、固体支持体を更に備え、任意に、第１の抗体を固体支持体上にコーティングするためのコーティングバッファー（例えば、炭酸バッファー、リン酸バッファー、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、又はホウ酸バッファー）等のコーティング試薬を更に備える。或る特定の好ましい実施の形態では、固体支持体は、ポリマー材料（例えば、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリアクリルアミド又はセルロース）で作製されているか、若しくはそれでコーティングされている、陥没したウェルを備えるプレート、チューブ、粒子（例えば、ラテックス粒子）若しくは膜（例えば、ニトロセルロース膜）、又は官能基（例えば、アミノ、カルボキシル、ビオチン又はアビジン）でプレコートされた磁気ビーズを備える。或る特定の例示的な実施の形態では、固体支持体は、マイクロタイタープレート（例えば、マイクロウェルプレート又はＥＬＩＳＡプレート）である。或る特定の例示的な実施の形態では、固相支持体は磁気ビーズである。タンパク質又はポリペプチドを固体支持体上にコーティングする方法は、物理吸着、アミノ基若しくはカルボキシル基を有する表面を介した共有結合、又はアビジン−ビオチン系、ポリリジンプレコート表面、プロテインＡ若しくはプロテインＧのプレコート表面によって達成される媒介結合等、当該技術分野でよく知られている。
【００７２】
或る特定の好ましい実施の形態では、第１の抗体は、固体支持体の表面にコーティングされる。或る特定の例示的な実施の形態では、第１の抗体は、マイクロタイタープレート（例えば、マイクロウェルプレート又はＥＬＩＳＡプレート）の表面にコーティングされる。或る特定の例示的な実施の形態では、第１の抗体は、磁気ビーズの表面にコーティングされる。
【００７３】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記キットは、標準物質（例えば、異なる既知量のＨＢｓＡｇを含有する一連のサンプル）；陽性対照サンプル（例えば、既知量のＨＢｓＡｇを含有するサンプル）；陰性対照サンプル（例えば、ＨＢｓＡｇを含まないサンプル）；酵素により触媒される基質の呈色反応を停止するための停止溶液（例えば、硫酸、塩酸又は水酸化ナトリウムの溶液）；非特異的結合を阻害するためのブロッキング溶液；及び採血デバイス（例えば、発熱物質を含まない真空採血管）からなる群から選択される１つ以上の試薬又はデバイスを更に備える。
【００７４】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記キットは、
（１）前記血液サンプルを前記試薬組成物中の第１の抗体と接触させて、免疫複合体を得る工程と、
（２）工程（１）で得られた前記免疫複合体の量を測定する工程と、
を含む方法によって、被験体の血液サンプル中のＨＢｓＡｇの量を検出し、工程（１）において、前記血液サンプルが希釈されていない。
【００７５】
或る特定の好ましい実施の形態では、工程（２）において、免疫複合体の量を免疫学的検出によって測定する。或る特定の好ましい実施の形態では、免疫学的検出は、酵素イムノアッセイ又は化学発光イムノアッセイである。或る特定の例示的な実施の形態では、免疫学的検出は、ＣＬＥＩＡ及びＣＬＩＡから選択される。或る特定の例示的な実施の形態では、工程（２）において、免疫複合体の量を、ＨＢｓＡｇに特異的に結合することができる第２の抗体を使用して検出し、第２の抗体は、酵素（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）、化学発光試薬（例えば、アクリジニウムエステル化合物）、又は蛍光色素等の検出可能な標識を担持する。かかる実施の形態では、第２の抗体及び工程（１）で得られる免疫複合体は、「抗体−抗原−抗体」サンドイッチ複合体を形成することができる。
【００７６】
幾つかの好ましい実施の形態では、工程（２）の前に、前記免疫複合体を洗浄して未反応物質を除去する工程を更に含む。
【００７７】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記被験体は、ＨＢＶ感染症又はＨＢＶ感染に関連する疾患（例えば、Ｂ型肝炎）を有する。
【００７８】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記血液サンプルは、全血、血漿、及び血清からなる群から選択される。
【００７９】
用語の定義
本発明において、特に明記しない限り、本明細書で使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有する。さらに、本明細書で使用されるウイルス学的、生化学的、及び免疫学的な実験手順は、いずれも対応する分野で広く使用されている日常的な手順である。一方、本発明をよりよく理解するために、関連する用語の定義及び説明を以下に提示する。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「ＨＢｓＡｇ」という用語は、当業者によく知られているＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の表面抗原主要タンパク質を指す（例えば、ＮＣＢＩ  ＧＥＮＢＡＮＫデータベースアクセッション番号：ＡＡＦ２４７２９．１を参照されたい）。
【００８１】
本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」又は「特異的結合」という用語は、抗体と、該抗体が向けられている抗原との間の反応等の２つの分子（すなわち、結合分子と標的分子との）間の非ランダム結合反応を指す。２つの分子間の結合親和性をＫＤ値で説明することができる。ＫＤ値は、ｋｄ（ｋｏｆｆとしても知られている、特異的結合分子−標的分子の相互作用の解離速度）のｋａ（ｋｏｎとしても知られている、特異的結合分子−標的分子の相互作用の会合速度）に対する比から得られる解離定数又はモル濃度（Ｍ）として表されるｋｄ／ｋａを指す。ＫＤ値が小さいほど、２つの分子がより密接に結合し、親和性が高くなる。幾つかの実施の形態では、抗原に特異的に結合する抗体（すなわち、抗原に特異的な抗体）は、抗体が約１０−５Ｍ未満、例えば約１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満若しくは１０−１０Ｍ未満、又はそれより低い値未満の親和性（ＫＤ）で抗原に結合することを意味する。ＫＤ値は、当該技術分野でよく知られている方法、例えばＢＩＡＣＯＲＥ機器での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定され得る。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「免疫学的検出」という用語は、抗原−抗体間の特異的相互作用／結合親和性を使用するアッセイを指し、これは一般にサンプル中の特定の抗原又は抗体の存在又はレベルを検出するのに役立つ。かかる免疫学的検出は当業者によく知られており、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、ウエスタンブロッティング、免疫比濁法、表面プラズモン共鳴等が挙げられるが、これらに限定されない。或る特定の実施の形態では、免疫学的検出は、ＥＬＩＳＡ、Ｅｌｉｓｐｏｔ、又はＣＬＥＩＡ等のエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）である。免疫学的検出の詳細な説明については、例えば、Fundamental Immunology, Ch. 7 Paul, W., ed., 2nd edition, Raven Press, N.Y. (1989)を参照されたい。
【００８３】
本明細書で使用される場合、「検出可能な標識」という用語は、蛍光、分光学的、光化学的、生化学的、免疫学的、電気的、光学的、又は化学的手段によって検出され得る任意の組成物を指す。本発明では、かかる標識が免疫学的検出（例えば、酵素結合イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、化学発光イムノアッセイ等）に適したものとなり得ることが特に好ましい。かかる標識は当該技術分野においてよく知られており、酵素（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ等）、放射性核種（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、又は３２Ｐ）、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フルオレセイン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、テキサスレッド、ローダミン、量子ドット又はシアニン色素誘導体（例えば、Ｃｙ７、Ａｌｅｘａ７５０））、アクリジニウムエステル化合物、磁気ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標））、金コロイド、又は着色ガラス若しくはプラスチックビーズ（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）等の熱量測定用標識、及び上記の標識で修飾されたアビジン（例えば、ストレプトアビジン）を結合するために使用されるビオチンが挙げられるが、これらに限定されない。かかる標識の使用を教示する特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号、同第３，８５０，７５２号、同第３，９３９，３５０号、同第３，９９６，３４５号、同第４，２７７，４３７号、同第４，２７５，１４９号、及び同第４，３６６，２４１号（いずれも引用することで本明細書の一部をなす）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明に包含される標識は、当該技術分野で知られている方法により検出され得る。例えば、放射性標識は、写真フィルム又はシンチレーションカウンターを使用して検出することができ、蛍光標識は、放出された光を検出する光検出器を使用して検出することができる。酵素標識は、一般に、酵素に基質を与え、酵素が基質に及ぼす影響により生じる反応生成物を検出することにより検出され、比色標識は、着色された標識を視覚化するだけで検出される。
【００８４】
本明細書で使用される場合、「ＨＢｓＡｇを認識してそれに結合することができる検出試薬」という表現は、ＨＢｓＡｇに特異的に結合することができる物質を指す。かかる物質は、当該技術分野でよく知られているか、又は例えば抗体、標的化ポリペプチド若しくはアプタマーを含む、当該技術分野で知られている方法によって調製され得る。概して、かかる試薬は、免疫学的検出によってサンプル中のＨＢｓＡｇの量を測定することができることが特に好ましい。免疫学的検出の使用は、抗原−抗体間の特異的相互作用／結合親和性を利用するため、特に有利である。したがって、試薬がＨＢｓＡｇに特異的に結合する反応性を保持している限り、該試薬を使用して、免疫学的検出によってサンプル中のＨＢｓＡｇの量を測定することができる（すなわち、該試薬を、ＨＢｓＡｇを認識してそれに結合することが可能な検出試薬として使用することができる）。ＨＢｓＡｇへの特異的結合の反応性を保持する様々な試薬は、当業者が容易に想到することができて入手可能であり、抗ＨＢｓＡｇのポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体等の抗ＨＢｓＡｇ抗体又はその抗原結合フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８５】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、典型的には各対が１つの「軽」（Ｌ）鎖及び１つの「重」（Ｈ）鎖を有する２対のポリペプチド鎖からなる免疫グロブリン分子を指す。抗体軽鎖はκ軽鎖及びλ軽鎖に分類することができる。重鎖はμ、δ、γ、α、又はεに分類することができ、抗体のアイソタイプはそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥとして定義される。軽鎖及び重鎖の中で、可変領域及び定常領域は約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結されており、重鎖は約３個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含んでいる。重鎖はそれぞれ、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）で構成されている。重鎖定常領域は３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）からなる。軽鎖はそれぞれ、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成されている。軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬからなる。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主の組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。ＶＨ領域及びＶＬ領域を、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的保存的な領域の間にある、高変性の領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる）に細分することもできる。ＶＨ及びＶＬはそれぞれ、次の順序：アミノ末端からカルボキシ末端へ、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４に配列された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成されている。各重鎖／軽鎖ペアの可変領域（ＶＨ及びＶＬ）は、それぞれ抗体結合部位を形成する。アミノ酸の領域又はドメインへの割り当ては、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest（National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))、又はChothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917、Chothia et al. (1989) Nature 342: 878-883の定義に従う。「抗体」という用語は、抗体を産生するためのいかなる特定の方法によっても限定されない。例えば、抗体には、特に、組換え抗体、モノクローナル抗体、及びポリクローナル抗体が含まれる。抗体は、異なるアイソタイプの抗体、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のサブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭの抗体であってもよい。
【００８６】
本明細書で使用される場合、「アプタマー」という用語は、目的の標的タンパク質（例えば、ＨＢｓＡｇ）又は他の生物学的標的分子に高い親和性及び高い特異性で結合することができる一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。アプタマーは折りたたまれてステムループ、ヘアピン、シュードノット、Ｇテトラマー等の熱力学的に安定した３次元空間構造を形成することができ、構造的相補性、塩基スタッキング力、ファンデルワールス力、水素結合、又は静電気的相互作用を介して目的の標的タンパク質又は他の生物学的標的分子に特異的に結合する。アプタマーは、ＤＮＡ又はＲＮＡであってもよく、また核酸アナログ（例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）又はトレオース核酸（ＴＮＡ））を含んでもよい。特定の標的タンパク質に結合するアプタマーを得る方法は、ＳＥＬＥＸ（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment：試験管内進化法）スクリーニング技術等、当該技術分野においてよく知られている。
【００８７】
本明細書で使用される場合、「標的化ポリペプチド」という用語は、目的の標的タンパク質（例えば、ＨＢｓＡｇ）に特異的に結合することができるポリペプチド分子を指す。本発明では、標的化ポリペプチドは、天然アミノ酸、合成アミノ酸、又は天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸模倣物を含み得る。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされたアミノ酸、及び後で修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−ヒドロキシグルタメート、Ｏ−ホスホセリン、ホスホスレオニン、又はホスホチロシンである。本発明では、標的化ポリペプチドと目的の標的タンパク質との間の「特異性」は、親和性に基づいて決定することができ、親和性は、標的化ポリペプチド及び該標的化ポリペプチドが結合する目的の標的タンパク質の解離平衡定数（すなわち、ＫＤ値）によって説明することができる。ＫＤ値が低いほど、標的化ポリペプチドと該標的化ポリペプチドが結合する目的の標的タンパク質との間の結合強度が強くなる。約１０−３Ｍより大きいＫＤ値が一般に非結合又は非特異的結合を示すとされていることは、当該技術分野で一般的に知られている。目的の特定の標的タンパク質に応じて、標的タンパク質に特異的に結合する標的化ポリペプチドは、ファージディスプレイ技術又はタンパク質マイクロアレイ技術によるスクリーニング等の当業者に知られている方法によって得ることができる。
【００８８】
本明細書で使用される場合、「血液サンプルが希釈されていない」という表現は、血液サンプルが被験体から得られた後、どのような希釈処理も受けていないことを意味する。
【００８９】
本明細書で使用される場合、「被験体」という用語には、様々な動物、特にウシ、ウマ、仔ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス又はラット）、非ヒト霊長類（例えば、マカク又はカニクイザル）、又はヒト等の哺乳動物が含まれるが、これらに限定されない。
【００９０】
臨床診療では、ほとんどのＨＢＶ感染症又はＢ型肝炎の患者のＨＢｓＡｇレベルは既存の市販されているＨＢｓＡｇ定量試薬の検出上限よりもはるかに高いため、試験サンプルに対してしばしば希釈操作を繰り返す必要がある。しかしながら、希釈プロセスは時間がかかるだけでなく、手作業による希釈であるか、全自動機器による自動希釈であるかに関わらず、検出の精度を低下させやすい。
【００９１】
本発明は、特定の試薬組成物を備えるＨＢｓＡｇ定量検出キット、及び該試薬組成物に基づくＨＢｓＡｇ定量検出方法を提供する。従来技術と比較して、本発明の技術的解決策は、検出の精度を保証することができ、その検出範囲は、ほとんどの臨床サンプルの血清／血漿ＨＢｓＡｇ濃度の分布範囲をカバーすることができることから、試験サンプルを希釈せずに直接検出することができ、操作手順が大幅に簡素化される。
【００９２】
本発明の実施形態を以下で図面及び実施例を参照して詳細に説明するが、当業者であれば、以下の図面及び実施例は、本発明の範囲を限定するのではなく、本発明を例示するためにのみ使用されることを理解するであろう。本発明の様々な対象及び有利な態様は、当業者には添付の図面及び以下の好ましい実施形態の詳細な説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】調製例２のキットを用いて実施例１で得られたＨＢｓＡｇ定量の標準曲線を示す図である。
【図２】調製例２のキットを用いて実施例１で得られたＨＢｓＡｇの定量検出結果と市販試薬（Roche）の検出結果との間の相関分析を示す図である。
【図３】調製例２のキットを用いて実施例１で得られたＨＢｓＡｇの定量検出結果と市販試薬（Abbott）の検出結果との間の相関分析を示す図である。
【図４】比較例１における異なる処方の解離溶液を使用したＨＢｓＡｇの定量検出の曲線を示す図である。
【実施例】
【００９４】
ここで、以下の実施例を参照して本発明を説明するが、これらの実施例は、本発明を例示することを意図するものであり、これらに限定されない。
【００９５】
特に明記しない限り、本発明で使用される分子生物学実験方法及びイムノアッセイは、基本的には、J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989、及びFM Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., 1995を参照し、制限酵素の使用は、製品の製造業者が推奨する条件に従った。当業者は、実施形態が例として本発明を説明するものであり、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことを理解する。
【００９６】
調製例１：解離溶液の調製
処方：４０ｍＭ  ＴＣＥＰ＋２Ｍ尿素＋６００ｍＭ  ＮａＣｌ＋１００ｍＭ  ＣＢ９．６＋０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０。
【００９７】
試薬：ＴＣＥＰ（カタログ番号６８９５７）、Ｔｗｅｅｎ−２０（カタログ番号Ｐ１３７９）、ＮａＣｌ（カタログ番号Ｖ９０００５８）、重炭酸ナトリウム（カタログ番号Ｓ５７６１−５００ｇ）、尿素（Ｖ８００４４１）、及び炭酸ナトリウム（Ｖ８００３７１）をSigma-Aldrichから購入した。
【００９８】
調製手順：
１．炭酸ナトリウム３１．８ｇ及び重炭酸ナトリウム５８．６ｇを秤量し、脱イオン水に溶解して１０００ｍＬの容量にし、ｐＨ値が９．６の１Ｍ炭酸バッファー（ＣＢ）を調製した。
２．ＮａＣｌ８７．６６ｇを秤量し、脱イオン水に溶解して５００ｍＬの容量にし、３Ｍ  ＮａＣｌ溶液を調製した。
３．尿素２４０．２４ｇを秤量し、脱イオン水に溶解して５００ｍＬの容量にし、８Ｍ尿素溶液を調製した。
４．ＴＣＥＰ５．７３３ｇを秤量して１００ｍＬの脱イオン水に溶解し、次いで１Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．６）５０ｍＬ、８Ｍ尿素１２５ｍＬ、３Ｍ  ＮａＣｌ溶液１００ｍＬ、及びＴｗｅｅｎ−２０  ０．５ｍＬを加えてよく混合し、脱イオン水を加えて５００ｍＬの容量にした。
【００９９】
調製例２：化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）用のＨＢｓＡｇ検出キットの調製
１．固定化抗体の調製
（１−１）マウス抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体（Xiamen Wantai Canghai Biotechnology Co., Ltd.から購入）をｐＨ９．６の５０ｍＭ  ＣＢバッファー（ＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３バッファー、最終濃度５０ｍＭ、ｐＨ９．６）で希釈して最終濃度を４μｇ／ｍｌとし、コーティング溶液を調製した。
（１−２）化学発光反応用９６穴プレートの各ウェルに先の工程（１）で調製したコーティング溶液１００μＬを加え、２℃〜８℃で１６時間〜２４時間コーティングを行った。
（１−３）ＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ  ＰＢ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で１回洗浄し、コーティングされていないマウス抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体を除去した。次いで、２００μｌのブロッキング溶液（ｐＨ７．４であり、２０％仔ウシ血清、１％ＢＳＡ及び１％カゼインを含む２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４バッファー溶液）を各ウェルに加え、３７℃で２時間ブロッキングを行った後、ブロッキング溶液を廃棄した。乾燥後、プレートをアルミホイルの袋に入れ、後で使用するため２℃〜８℃で保存した。
【０１００】
２．標識抗体の調製
抗ＨＢｓＡｇポリクローナル抗体のＨＲＰ標識を、改良された過ヨウ素酸ナトリウム法を使用して行った。以下の実施例を、１０ｍｇの抗ＨＢｓＡｇポリクローナル抗体を標識するために行った。
（２−１）ヤギ抗ＨＢｓＡｇポリクローナル抗体（５ｍＬ）（Xiamen Wantai Canghai Biotechnology Co., Ltd．から購入、カタログ番号Ｇ１０５１）を２ｍｇ／ｍＬの濃度で透析バッグに入れ、２０ｍＭ  ＣＢバッファーに対して４℃で４時間透析し、透析バッファーを２時間ごとに交換した。
（２−２）セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Sigma-Aldrich／７７３３２）４０ｍｇを正確に秤量し、２ｍＬのｄｄＨ２Ｏに溶解した後、２０ｍｇ／ｍＬのＮａＩＯ４  ２ｍｌを加え、室温で３０分間反応させた。エチレングリコール４０μＬを加え、４℃で３０分間反応させて、ＨＲＰ活性化溶液（１０ｍｇ／ｍＬ、４ｍＬ）を調製した。
（２−３）工程（２−２）で調製したＨＲＰ活性化溶液を、ヤギ抗ＨＢｓＡｇポリクローナル抗体が入っている透析バッグに加え、よく混合し、２０ｍＭ  ＣＢバッファーに対する透析を暗所にて４℃で６時間〜８時間継続し、透析バッファーをプロセス中２時間ごとに交換した。
（２−４）ＮａＢＨ４溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）０．５ｍＬを調製し、工程（２−３）で調製した標識反応溶液を加え、よく混合した。混合物を暗所にて４℃で２時間反応させ、３０分ごとによく混合した。
（２−５）工程（２−４）が完了した後、標識反応溶液を新しい透析バッグに再び充填し、ＰＢＳバッファーに対して４℃で４時間透析した。
（２−６）工程（２−５）が完了した後、５０％飽和硫酸アンモニウム（５０％は透析バッグ内の硫酸アンモニウムの濃度を指し、主な目的はヤギポリクローナル抗体−ＨＲＰ標識生成物を沈殿させることであった）を加えた。１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上清を廃棄し、沈殿物を上下にピペッティングして５０％グリセロール＋１０％ＮＢＳ（最終濃度）（ＮＢＳは新生仔ウシ血清の略称）に溶解し、よく混合して、後で使用するために−２０℃で保管した。
（２−７）工程（２−６）で得られたヤギポリクローナル抗体−ＨＲＰ標識生成物を、酵素標識希釈バッファー（ｐＨ７．４であり、２０％ウシ胎児血清、１％カゼイン、１０％スクロース、及び０．０５％アミノピリンを含む２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４バッファー溶液）に体積基準で１／４０００の希釈率で希釈し、酵素標識反応液を調製し、混合後、後で使用するために２℃〜８℃で保管した。
【０１０１】
３．定量標準物質
中濃度及び高濃度のＨＢｓＡｇサンプルの定量検出のための定量標準物質は、種々の濃度のＢ型肝炎ウイルス表面抗原を含む一連のサンプルであった。合計８種類の標準物質が含まれ、その濃度は、それぞれチューブ１本当たり５００μｌ容量で１０００００ＩＵ／ｍＬ、５００００ＩＵ／ｍＬ、１００００ＩＵ／ｍＬ、５０００ＩＵ／ｍＬ、１０００ＩＵ／ｍＬ、５００ＩＵ／ｍＬ、１００ＩＵ／ｍＬ、２０ＩＵ／ｍＬであった。表面抗原は、Xiamen Wantai Kairui Biotechnology Co., Ltd.によって提供され、ＮＩＢＳＣによって公開されたＷＨＯ標準物質（コード：００／５８８）まで遡ることができた。標準物質の希釈に使用する溶液は、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｓＡｂ陰性の健康な献血者の血漿若しくは血清でもよく、又は２０％の新生仔ウシ血清を含むＰＢＳ溶液でもよかった。
【０１０２】
４．解離溶液
調製例１で調製した。
【０１０３】
調製例３：チューブ内の微粒子に基づく化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）用のＨＢｓＡｇ検出キットの調製
１．抗体標識磁気粒子の調製
（１−１）磁気ビーズ（日本のJSR株式会社のＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ  ＭＳ３００／カルボキシル、粒子径は３μｍであった）４ｍｇを活性化バッファー系（５０ｍＭ  ＭＥＳ５．０）１ｍＬで２回洗浄し、上清を廃棄した。ＥＤＣ試薬４ｍｇ及びＮＨＳ試薬４ｍｇ（いずれも５０ｍＭ  ＭＥＳ５．０で１０ｍｇ／ｍＬに調合）を加え、よく混合した後、室温で２０分間振盪しながら活性化した。
（１−２）活性化された磁気ビーズを活性化バッファー系（５０ｍＭ  ＭＥＳ５．０）１ｍＬで３回洗浄して、過剰なＥＤＣ及びＮＨＳを除去し、上清を廃棄した。ｐＨ６．０の５０ｍＭリン酸バッファー１ｍＬ及びマウス抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体１６０μｇを加え、よく混合した後、室温で３時間振盪しながら反応させた。
（１−３）（１−２）で得られた磁気ビーズをＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ  ＰＢ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）１ｍｌで３回洗浄した後、ブロッキングバッファー（２０ｍＭ  ＰＢ７．４、１％グリシン、０．１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）１ｍｌを加え、よく混合した後、室温で３時間振盪しながら反応させた。
（１−４）工程（１−３）で得られたブロッキングされた磁気粒子をＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ  ＰＢ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した後、貯蔵バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）、０．５％ＢＳＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％カゼイン、０．１％防腐剤）１ｍｌを加え、後で使用するために２℃〜８℃で保管した。
（１−５）コーティングされた磁気粒子を貯蔵バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）、０．５％ＢＳＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％カゼイン、０．１％防腐剤）で１０倍に希釈し、後で使用するために２℃〜８℃で保管した。
【０１０４】
２．ヤギ抗ＨＢｓＡｇポリクローナル抗体のアクリジニウムエステル標識
（２−１）ヤギ抗ＨＢｓＡｇポリクローナル抗体１００μｇを標識バッファー系（５０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ８．０）３００μｌに加え、アクリジニウムエステル（５ｍＭ  ＮＨＳ−ＳＡＥ）１２μＬを加えて、暗所にて室温で３０分間反応させた。
（２−２）工程（２−１）で調製した標識生成物を停止バッファー（１００ｍＭグリシンを含むリン酸バッファー、ｐＨ８．０）２００μＬに加え、暗所にて室温で３０分間反応させた。
（２−３）工程（２−２）による標識生成物を透析バッグに入れ、透析バッファー（２０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．４）に対して暗所にて４℃で６時間〜８時間透析し、２時間ごとに透析バッファーを交換した。
（２−４）工程（２−３）で得られた標識生成物を保管チューブに移し、２％ＢＳＡ及び５０％グリセロールを加え、後で使用するために−２０℃で保管した。
（２−５）工程（２−４）で調製したアクリジニウムエステル標識生成物を体積比１／３０００でアクリジニウムエステル標識希釈バッファー（ｐＨ値７．４であり、０．５％ＢＳＡ、０．５％カゼイン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０及び０．１％防腐剤を含む、２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４バッファー溶液）への希釈に供して発光標識反応溶液を調製した後、後で使用するため混合してから２℃〜８℃で保管した。
【０１０５】
３．定量標準物質
この調製例のキットの定量標準物質は、調製例２の工程３と同じであった。
【０１０６】
４．解離溶液
調製例１のように調製した。
【０１０７】
実施例１：臨床サンプル中のＨＢｓＡｇの定量検出
１．実験試薬／キット
調製例２のキット
【０１０８】
２．実験方法
慢性Ｂ型肝炎の患者に由来する３８例の血清サンプル（番号Ｐ１〜Ｐ３８）を次の工程に従ってＨＢｓＡｇ定量検出に供した。
【０１０９】
（１）サンプル反応：コーティングされた化学発光反応プレートの各ウェルに、解離溶液９０μＬ、次いでサンプル又は標準物質１０μＬを加えた後、振盪混合し、３７℃のインキュベーターで３０分間反応させた。
（２）酵素標識反応：工程（１）が完了した後、化学発光反応プレートをＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ  ＰＢ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で５回洗浄し、反応解離溶液及び未反応のサンプルを除去した。調製例２の工程（２−７）で調製した酵素標識反応溶液１００μＬを各ウェルに加え、３７℃のインキュベーターで３０分間反応させた。
（３）発光反応及び測定：工程（２）が完了した後、化学発光反応プレートをＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ  ＰＢ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で５回洗浄して、過剰な酵素標識反応溶液を除去した。Pierce Company製のＰＩＣＯ化学発光基質１００μＬを各ウェルに加え、各反応ウェルの発光値（ＲＬＵ：luminescence value）をＯｒｉｎ  ＩＩ化学発光検出器で直ちに読み取った。
（４）定量のための標準曲線の作成：工程（３）が完了した後、８種類の定量標準物質の測定値及びそれらの対応する濃度に対して線形回帰を行い、標準曲線を得た。結果を図１に示した。結果は、上記検出方法の精度での定量の上限は１０００００ＩＵ／ｍＬ、下限は２０ＩＵ／ｍＬ、その線形ダイナミックレンジは３．５桁であることを示した。ＲＬＵ測定値からＨＢｓＡｇ濃度を計算する式は次の通りである：濃度ＨＢｓＡｇ（ＩＵ／ｍＬ）＝１０（Ｌｏｇ１０（ＲＬＵ）−２．７２５２）／×０．８６６８
（５）試験するサンプルのＨＢｓＡｇ濃度の取得：工程（１）〜工程（４）を通してサンプルＰ１〜サンプルＰ３８を測定した後、サンプルの対応するＲＬＵ値を得た。測定値を、工程（４）で得られたＨＢｓＡｇ濃度の計算式に代入し、サンプル中のＢ型肝炎ウイルス表面抗原の濃度を算出した。
【０１１０】
同時に、RocheのＢ型肝炎ウイルス表面抗原用定量検出キット（１箱当たり１００回分の検査、カタログ番号０７１４３７３７１９０）及びAbbottのＢ型肝炎ウイルス表面抗原用定量検出キット（１箱当たり１００回分の検査、カタログ番号６Ｃ３６）を使用して同じバッチに由来するサンプルを検出し、ここでは、キットの使用説明書に従って操作を行い、Roche及びAbbottのキットをそれぞれの会社の全自動化学発光機器とともに使用し、サンプルの希釈及び検出をこれらの機器により自動で行った。
【０１１１】
３．実験結果
調製例２のキット、Rocheキット（１箱当たり１００回分の検査、カタログ番号０７１４３７３７１９０）及びAbbottキットを用いた、同じバッチに由来するサンプルの検出結果を表１に示した。
【０１１２】
【表１】
2021505906.tif 000003
【０１１３】
表１の検出結果について、定量相関分析を行い、結果をそれぞれ図２及び図３に示した。図２は、３８例の臨床サンプルについて、調製例２のキット及びRoche試薬の検出結果の間の相関分析の結果を示し、結果は、両者の相関係数Ｒ２が０．９４４８であることを示した。図３は、調製例２のキット及びAbbott試薬の検出結果の間の相関分析の結果を示し、結果は、両者の相関係数Ｒ２が０．９５であることを示した。上記の結果は、本発明のキットが良好な検出精度を有することを実証した。
【０１１４】
さらに、本発明者らは、調製例２のキットを用いて、７４７例の臨床ＨＢｓＡｇ陽性サンプルを検出し、サンプルの濃度分布範囲を算出した。結果は表２に示されており、臨床サンプルの９２．１％が本発明のキットの検出範囲２０ＩＵ／ｍＬ〜１０００００ＩＵ／ｍＬに含まれる濃度を有していたのに対し、従来のＨＢｓＡｇ定量検出試薬の検出範囲（０．０５ＩＵ／ｍＬ〜２５０ＩＵ／ｍＬ）に含まれる濃度を有するサンプルは２５．９７％しかなかった。
【０１１５】
【表２】
2021505906.tif 000004
【０１１６】
比較例１：異なる処方の解離溶液が検出上限に及ぼす影響
１．実験試薬：Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原アッセイキット（化学発光微粒子免疫測定法）（Xiamen Wantai Kairui Biotechnology Co., Ltd.から購入）、調製例１の解離溶液、４０ｍＭ  ＴＣＥＰ溶液、６００ｍＭ  ＮａＣｌ溶液、２Ｍ尿素溶液及び６Ｍ尿素。
【０１１７】
２．実験サンプル：ＨＢｓＡｇ濃度が１０００００ＩＵ／ｍＬのサンプルを、ＨＢｓＡｇとＨＢｓＡｂとの両方に陰性のサンプルで０．０３ＩＵ／ｍＬになるまで３倍連続希釈した。
【０１１８】
３．実験工程：
（１）サンプル反応：サンプル２０μＬを反応チューブに加えた後、１００μＬの調製例１で調製した解離溶液、２Ｍ尿素、６Ｍ尿素、６００ｍＭ  ＮａＣｌ、４０ｍＭ  ＴＣＥＰの溶液をそれぞれ加えた。Xiamen Wantai Kairui Biotechnology Co., Ltd.製のＢ型肝炎ウイルス表面抗原測定キット（化学発光微粒子免疫測定法）の磁気粒子試薬５０μｌを加え、よく振盪混合した後、３７℃のインキュベーターで１５分間反応させた。
（２）発光標識反応：工程（１）が完了した後、化学発光反応チューブをＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ  ＰＢ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で２回洗浄し、Xiamen Wantai Kairui Biotechnology Co., Ltd.製のＢ型肝炎ウイルス表面抗原アッセイキット（化学発光微粒子免疫測定法）のアクリジニウムエステル標識試薬５０μＬを各ウェルに加え、３７℃のインキュベーターで１０分間反応させた。
（３）発光反応の測定：工程（２）が完了した後、化学発光反応チューブをＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ  ＰＢ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で４回洗浄した。Ｓｉｒｉｕｓ−Ｌ  ｓｉｎｇｌｅ−ｔｕｂｅ化学発光検出器を使用し、励起溶液をｉｎ−ｓｉｔｕ注入によって加え、同時に光強度の検出を行った。
（４）定量のための標準曲線の作成：工程（３）が完了した後、１０００００ＩＵ／ｍＬのＨＢｓＡｇサンプルの３倍勾配希釈によって得られた一連のサンプルの測定値及び対応する濃度に対して線形回帰を行い、定量用の標準曲線を得た。
【０１１９】
結果を図４に示した。解離溶液として４０ｍＭ  ＴＣＥＰ又は２Ｍ尿素を用いた場合、それらの検出結果は近似し、検出上限は約３７００ＩＵ／ｍＬであり、従来のＨＢｓＡｇ検出方法の１０倍高かった。これに対して、調製例１の解離溶液を用いた場合、検出上限は１０００００ＩＵ／ｍＬに達することができ、従来のＨＢｓＡｇ検出方法より４００倍高かった。上記の結果は、本発明の解離溶液が検出精度を確保しながら検出の上限を大幅に高めることができ、単一の検出によって正確に定量することができる線形ダイナミックレンジが３．５桁に達し得ることから、ほとんどの臨床サンプルで面倒な希釈処理が不要になり、検出効率が向上したことを示した。
【０１２０】
本発明の具体的な実施形態を詳細に説明したが、当業者は、開示されているあらゆる教示に従って、その詳細に対して様々な変更及び変化を加えることができ、これらの変化が全て本発明の保護範囲内であることを理解するであろう。本発明の全範囲は、添付の特許請求の範囲及びそれらのあらゆる均等物によって与えられる。
【図１】
2021505906.tif 000005
【図２】
2021505906.tif 000006
【図３】
2021505906.tif 000007
【図４】
2021505906.tif 000008
【国際調査報告】
2021505906.tif 000009
2021505906.tif 000010
2021505906.tif 000011
2021505906.tif 000012
2021505906.tif 000013
2021505906.tif 000014