(57)【要約】本発明は、医薬化合物およびファインケミカル化合物の生成のための工業プロセス条件下で有用な操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドを提供する。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）と表されるレトロウイルスは、罹患した個体の免疫系の進行性の破壊、ならびに中枢および末梢神経系の変性を含む複雑な疾患である後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病原因子である。レトロウイルスの複製の一般的な特徴（common  feacture）は、ウイルスの複製のために必要なＨＩＶ配列のＤＮＡコピーを生じる、ウイルスにコードされる逆転写酵素によるウイルスのＲＮＡゲノムの逆転写である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、６および／もしくは４６６またはそれらの機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼであって、前記操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼが、前記ポリペプチド配列中に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号２、６および／または４６６を参照して番号付けされる、操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼ。
【請求項２】
前記ポリペプチド配列が、配列番号２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有し、前記操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼが、前記ポリペプチド配列中の１０／４７／６６／１４１／１４５／１５６、２、６、９、１０／４７／８８／１５６、１３、３１、４６、４７、４７／１３４／１４１／２１２、６６、６６／８８／１１２／１３４／１４１／１４３／１４５／２１２、７１、７２、８８、９４、１０２、１０４、１１２、１１６、１３３、１３３／１７３／２０４／２３５／２３６、１３４、１４５、１４５／１７３、１４７、１７３、１８４、１８９、１９７、２０３、２０４、２０７、２２６、２３５、２３５／２３６、および２３６から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号２を参照して番号付けされる、請求項１に記載の操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼ。
【請求項３】
前記ポリペプチド配列が、配列番号６と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有し、前記操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼが、前記ポリペプチド配列中の２、２／６／１０／６６／８８／１０２／１８４／２３５／２３６、２／６／１０２／１４１／２０３／２３５、２／１０／１０２／２３５／２３６、２／４７／６６／７１／１４１／１８４／２０３／２３５／２３６、２／４７／７１／８８／２０３／２３５／２３６、２／４７／７１／１４１／１９７／２３５／２３６、２／８８／１４１／２３５／２３６、２／２０３／２３５／２３６、５、６／２０３／２３５／２３６、９、１０／４７／６６／１８４／１９７／２３６、１０／４７／６６／２３５／２３６、１０／４７／７１／１８４／２０３／２３５／２３６、１３、１３／４６、１３／４６／６６／９４、１３／４６／６６／９４／１８４／２０４、１３／４６／６６／１３３／１３４／１８４、１３／４６／６６／１８４、１３／４６／１１２／１３４／１８４、１３／４６／１３３／１８４、１３／６６／９４、１３／６６／９４／１８４、１３／６６／１１２／１３３／１３４／１８４／２０４、１３／６６／１１２／１３３／１３４／２０４、１３／６６／１１２／１８４、１３／６６／１３３／１３４／１８４／２０４、１３／６６／１８４／２０４、１３／９４／１３３／１８４、１３／９４／１８４、１３／９４／１８４／２０４、１３／１３３／１３４／１８４、１３／１３３／１３４／２０４、１３／１３４／２０４、１３／１８４、２７、４０、４６／６６／９４／１１２、４６／６６／１１２／１３３／１３４／１８４、４６／６６／１３３／１３４、４６／６６／１３３／１８４／１９７、４６／６６／１３３／１９７、４６／６６／１３４／１８４／１９７／２０４、４６／６６／１８４、４６／１１２／１３３、４６／１１２／１３３／１３４／２０４、４６／１３３／２０４、４６／１９７／２０４、４７／６６／７１／８８／２０３／２３５／２３６、４７／６６／７１／１４１／１８４、４７／６６／８８／１８４／２３５、４７／６６／８８／２０３／２３５／２３６、４７／６６／１４１／２３５／２３６、４７／６６／１８４／１９７／２０３／２３５／２３６、４７／６６／１８４／１９７／２３６、４７／７１／８８／１８４／２０３／２３５、４７／７１／８８／１８４／２０３／２３６、４７／７１／１４１／１８４／２０３／２３５、４７／７１／１８４、４７／７１／１８４／１９７／２３６、４７／７１／１８４／２３５、４７／７１／１８４／２３６、４７／８８／１０２／１４１／２３５／２３６、４７／８８／２０３／２３５／２３６、４７／８８／２３５／２３６、４７／１０２／１８４／１９７／２３５／２３６、４７／１０２／２０３／２３５／２３６、４７／１４１／１８４、４７／１４１／１８４／２３６、４７／１８４／２３６、４７／２０３／２３５、４７／２０３／２３５／２３６、４７／２０３／２３６、４７／２３５／２３６、６２、６６、６６／８８／１０２／１８４／１９７／２０３／２３５／２３６、６６／８８／１９７、６６／８８／２３５、６６／８８／２３５／２３６、６６／９４、６６／９４／１１２／１３３／１８４、６６／９４／１１２／１８４／２０４、６６／１０２／１８４／２３５／２３６、６６／１１２／１３３／１３４／１９７、６６／１１２／１３３／１９７、６６／１１２／１３４／１９７、６６／１１２／１８４、６６／１３３／１８４、６６／１３３／１９７、６６／１８４、６６／１９７／２０３／２３５、８４、８８、８８／１０２／１４１／１８４／２３５／２３６、８８／１８４、８８／１８４／１９７／２０３／２３５／２３６、８８／１８４／１９７／２３５／２３６、８８／１８４／２０３／２３５、８８／１８４／２３６、８８／１９７／２３５／２３６、８８／２３６、９４／１１２／１８４／１９７、９４／１３３／１８４、９６、１０２／１４１／２０３、１０２／１８４／２０３／２３６、１０２／１８４／２３６、１０２／１９７／２３５、１１２、１１２／１３３／１３４、１１２／１３３／１８４／２０４、１１２／１３４／１９７、１１４、１１５、１２０、１２７、１３２、１３３、１３３／１３４／１８４、１４１／１８４／２０３／２３５／２３６、１４１／１８４／２３５、１４１／１９７、１４１／２０３／２３５／２３６、１４１／２３６、１４６、１４８、１８４、１８４／２０３、１８４／２０３／２３５、１８４／２０３／２３６、１８４／２３５／２３６、１８４／２３６、１９７／２３５、２０３／２３５／２３６、２０３／２３６、２０４、２１８、２３５、２３５／２３６、および２３６から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号６を参照して番号付けされる、請求項１に記載の操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼ。
【請求項４】
前記ポリペプチド配列が、配列番号４６６と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有し、前記操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼが、前記ポリペプチド配列中の７１／８８／９４／１３３、７１／１３３および１３３から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号４６６を参照して番号付けされる、請求項１に記載の操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼ。
【請求項５】
表３．１、４．１および／または６．１に示される少なくとも１つの操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼバリアントの配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高く同一であるポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼ。
【請求項６】
表３．１、４．１および／または６．１に提供されるバリアントの操作されたポリペプチドを含む、請求項１に記載の操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼ。
【請求項７】
配列番号２、６および／または４６６に示される少なくとも１つの操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼバリアントの配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高く同一であるポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼ。
【請求項８】
配列番号６および／または４６６に示されるバリアントの操作されたポリペプチドである、請求項６に記載の操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼ。
【請求項９】
配列番号２〜４７８の偶数配列に示される少なくとも１つの操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼバリアントの配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高く同一であるポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼ。
【請求項１０】
配列番号２〜４７８の偶数配列に示されるポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼ。
【請求項１１】
野生型Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｈａｌｉｆａｘｅｎｓｉｓのデオキシリボースリン酸アルドラーゼと比較して少なくとも１つの改善された性質を示す、請求項１〜１０のいずれかに記載の操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼ。
【請求項１２】
前記改善された性質が、基質に対する改善された活性を含む、請求項１１に記載の操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼ。
【請求項１３】
前記基質が、Ｒ−２−エチニル−グリセルアルデヒドを含む、請求項１２に記載の操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼ。
【請求項１４】
前記改善された性質が、改善された熱安定性を含む、請求項１１に記載の操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼ。
【請求項１５】
精製されている、請求項１〜１４のいずれかに記載の操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼ。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかに提供される少なくとも１つの操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼを含む組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれかに記載の少なくとも１つの操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼをコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項１８】
少なくとも１つの操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼをコードする操作されたポリヌクレオチド配列であって、前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号１、５および／または４６５と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を含み、前記操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼの前記ポリヌクレオチド配列が、１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換を含む、操作されたポリヌクレオチド配列。
【請求項１９】
配列番号１、５および／もしくは４６５またはそれらの機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を含む少なくとも１つの操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼをコードする操作されたポリヌクレオチド配列。
【請求項２０】
配列番号１〜４７７の奇数配列に示される配列を含む、請求項１７〜１９のいずれかに記載の操作されたポリヌクレオチド配列。
【請求項２１】
前記ポリヌクレオチド配列が、制御配列に作動可能に連結されている、請求項１７〜２０のいずれかに記載の操作されたポリヌクレオチド配列。
【請求項２２】
コドン最適化されている、請求項１７〜２１のいずれかに記載の操作されたポリヌクレオチド配列。
【請求項２３】
請求項１７〜２２のいずれかに記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項２４】
請求項２３に記載の少なくとも１つの発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２５】
請求項１７〜２２のいずれかに記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞。
【請求項２６】
宿主細胞において操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼを産生させる方法であって、少なくとも１つの操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼが産生するように、適切な条件下で、培養培地中で請求項２４および／または２５に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
【請求項２７】
培養培地および／または宿主細胞から少なくとも１つの操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼを回収することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記少なくとも１つの操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼを精製するステップをさらに含む、請求項２６および／または２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１８年７月９日に出願された米国仮特許出願第６２／６９５，５２０号、および２０１９年３月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／８２２，２７３号に対する優先権を主張し、この両方とも、すべての目的のために、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本発明は、医薬化合物およびファインケミカル化合物の生成のための工業プロセス条件下で有用な操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドを提供する。
【０００２】
配列表、表またはコンピュータープログラムに対する参照
配列表の公式の写しを、作成日２０１９年６月２７日およびサイズ８３２キロバイトのファイル名「ＣＸ２−１７３ＷＯ２＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」のＡＳＣＩＩフォーマットのテキストファイルとして本明細書と共に、ここに、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出する。ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）と表されるレトロウイルスは、罹患した個体の免疫系の進行性の破壊、ならびに中枢および末梢神経系の変性を含む複雑な疾患である後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病原因子である。レトロウイルスの複製の一般的な特徴（common  feacture）は、ウイルスの複製のために必要なＨＩＶ配列のＤＮＡコピーを生じる、ウイルスにコードされる逆転写酵素によるウイルスのＲＮＡゲノムの逆転写である。アジドチミジン（ＡＺＴ）などのいくつかの化合物は、公知の逆転写酵素阻害剤であり、ＡＩＤＳおよび類似の疾患の処置において使用されている。ＨＩＶ逆転写酵素を阻害することが公知のいくつかの化合物があるが、この酵素の阻害においてより有効で、それによってＡＩＤＳの作用を寛解させるさらなる化合物についての当技術分野における必要性が残されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、医薬化合物およびファインケミカル化合物の生成のための工業プロセス条件下で有用な操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドを提供する。
【０００５】
本発明は、配列番号２、６および／もしくは４６６またはそれらの機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼであって、操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼが、ポリペプチド配列中に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号２または６を参照して番号付けされる、操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼを提供する。一部の実施形態では、操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼのポリペプチド配列は、配列番号２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有し、操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼは、ポリペプチド配列中の２、６、９、１０／４７／６６／１４１／１４５／１５６、１０／４７／８８／１５６、１３、３１、４６、４７、４７／１３４／１４１／２１２、６６、６６／８８／１１２／１３４／１４１／１４３／１４５／２１２、７１、７２、８８、９４、１０２、１０４、１１２、１１６、１３３、１３３／１７３／２０４／２３５／２３６、１３４、１４５、１４５／１７３、１４７、１７３、１８４、１８９、１９７、２０３、２０４、２０７、２２６、２３５、２３５／２３６、および２３６から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼのポリペプチド配列は、配列番号２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有し、操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼは、２Ｃ、２Ｒ、２Ｗ、６Ｈ、６Ｗ、６Ｙ、９Ｒ、１０Ｒ／４７Ｍ／６６Ｐ／１４１Ｔ／１４５Ｋ／１５６Ｉ、１０Ｒ／４７Ｍ／８８Ａ／１５６Ｉ、１３Ｉ、１３Ｌ、１３Ｑ、１３Ｒ、３１Ｌ、４６Ｖ、４７Ｍ、４７Ｍ／１３４Ｌ／１４１Ｔ／２１２Ｙ、４７Ｖ、６６Ｉ、６６Ｌ、６６Ｐ、６６Ｐ／８８Ａ／１１２Ａ／１３４Ｌ／１４１Ｔ／１４３Ｅ／１４５Ｋ／２１２Ｙ、６６Ｓ、６６Ｔ、７１Ｖ、７２Ｃ、８８Ｒ、８８Ｔ、９４Ｋ、９４Ｌ、９４Ｍ、１０２Ｅ、１０４Ｔ、１１２Ｈ、１１２Ｋ、１１２Ｌ、１１２Ｍ、１１２Ｒ、１１６Ｇ、１１６Ｐ、１３３Ｉ／１７３Ｖ／２０４Ｔ／２３５Ｄ／２３６Ｈ、１３３Ｌ、１３３Ｍ、１３４Ｌ、１３４Ｖ、１４５Ｃ、１４５Ｒ、１４５Ｖ／１７３Ｒ、１４７Ａ、１４７Ｋ、１４７Ｓ、１７３Ｐ、１７３Ｔ、１８４Ｉ、１８４Ｖ、１８９Ａ、１８９Ｒ、１９７Ｃ、１９７Ｍ、２０３Ｉ、２０４Ｔ、２０７Ｇ、２２６Ｓ、２３５Ｄ、２３５Ｄ／２３６Ｒ、２３５Ｔ、２３６Ｃ、および２３６Ｄから選択されるポリペプチド中の少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼのポリペプチド配列は、配列番号２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有し、操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼは、ポリペプチド中にＳ２Ｃ、Ｓ２Ｒ、Ｓ２Ｗ、Ｋ６Ｈ、Ｋ６Ｗ、Ｋ６Ｙ、Ｑ９Ｒ、Ｑ１０Ｒ／Ｃ４７Ｍ／Ｄ６６Ｐ／Ｓ１４１Ｔ／Ａ１４５Ｋ／Ｌ１５６Ｉ、Ｑ１０Ｒ／Ｃ４７Ｍ／Ｌ８８Ａ／Ｌ１５６Ｉ、Ｓ１３Ｉ、Ｓ１３Ｌ、Ｓ１３Ｑ、Ｓ１３Ｒ、Ｅ３１Ｌ、Ｉ４６Ｖ、Ｃ４７Ｍ、Ｃ４７Ｍ／Ｉ１３４Ｌ／Ｓ１４１Ｔ／Ｆ２１２Ｙ、Ｃ４７Ｖ、Ｄ６６Ｉ、Ｄ６６Ｌ、Ｄ６６Ｐ、Ｄ６６Ｐ／Ｌ８８Ａ／Ｅ１１２Ａ／Ｉ１３４Ｌ／Ｓ１４１Ｔ／Ｖ１４３Ｅ／Ａ１４５Ｋ／Ｆ２１２Ｙ、Ｄ６６Ｓ、Ｄ６６Ｔ、Ａ７１Ｖ、Ｔ７２Ｃ、Ｌ８８Ｒ、Ｌ８８Ｔ、Ｖ９４Ｋ、Ｖ９４Ｌ、Ｖ９４Ｍ、Ｄ１０２Ｅ、Ｖ１０４Ｔ、Ｅ１１２Ｈ、Ｅ１１２Ｋ、Ｅ１１２Ｌ、Ｅ１１２Ｍ、Ｅ１１２Ｒ、Ｔ１１６Ｇ、Ｔ１１６Ｐ、Ｔ１３３Ｉ／Ａ１７３Ｖ／Ｋ２０４Ｔ／Ｓ２３５Ｄ／Ｓ２３６Ｈ、Ｔ１３３Ｌ、Ｔ１３３Ｍ、Ｉ１３４Ｌ、Ｉ１３４Ｖ、Ａ１４５Ｃ、Ａ１４５Ｒ、Ａ１４５Ｖ／Ａ１７３Ｒ、Ｐ１４７Ａ、Ｐ１４７Ｋ、Ｐ１４７Ｓ、Ａ１７３Ｐ、Ａ１７３Ｔ、Ｍ１８４Ｉ、Ｍ１８４Ｖ、Ｓ１８９Ａ、Ｓ１８９Ｒ、Ｆ１９７Ｃ、Ｆ１９７Ｍ、Ｖ２０３Ｉ、Ｋ２０４Ｔ、Ａ２０７Ｇ、Ｔ２２６Ｓ、Ｓ２３５Ｄ、Ｓ２３５Ｄ／Ｓ２３６Ｒ、Ｓ２３５Ｔ、Ｓ２３６Ｃ、およびＳ２３６Ｄから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２を参照して番号付けされる。
【０００６】
一部の実施形態では、操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼは、配列番号６と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼは、ポリペプチド配列中の２、２／６／１０／６６／８８／１０２／１８４／２３５／２３６、２／６／１０２／１４１／２０３／２３５、２／１０／１０２／２３５／２３６、２／４７／６６／７１／１４１／１８４／２０３／２３５／２３６、２／４７／７１／８８／２０３／２３５／２３６、２／４７／７１／１４１／１９７／２３５／２３６、２／８８／１４１／２３５／２３６、２／２０３／２３５／２３６、５、６／２０３／２３５／２３６、９、１０／４７／６６／１８４／１９７／２３６、１０／４７／６６／２３５／２３６、１０／４７／７１／１８４／２０３／２３５／２３６、１３、１３／４６、１３／４６／６６／９４、１３／４６／６６／９４／１８４／２０４、１３／４６／６６／１３３／１３４／１８４、１３／４６／６６／１８４、１３／４６／１１２／１３４／１８４、１３／４６／１３３／１８４、１３／６６／９４、１３／６６／９４／１８４、１３／６６／１１２／１３３／１３４／１８４／２０４、１３／６６／１１２／１３３／１３４／２０４、１３／６６／１１２／１８４、１３／６６／１３３／１３４／１８４／２０４、１３／６６／１８４／２０４、１３／９４／１３３／１８４、１３／９４／１８４、１３／９４／１８４／２０４、１３／１３３／１３４／１８４、１３／１３３／１３４／２０４、１３／１３４／２０４、１３／１８４、２７、４０、４６／６６／９４／１１２、４６／６６／１１２／１３３／１３４／１８４、４６／６６／１３３／１３４、４６／６６／１３３／１８４／１９７、４６／６６／１３３／１９７、４６／６６／１３４／１８４／１９７／２０４、４６／６６／１８４、４６／１１２／１３３、４６／１１２／１３３／１３４／２０４、４６／１３３／２０４、４６／１９７／２０４、４７／６６／７１／８８／２０３／２３５／２３６、４７／６６／７１／１４１／１８４、４７／６６／８８／１８４／２３５、４７／６６／８８／２０３／２３５／２３６、４７／６６／１４１／２３５／２３６、４７／６６／１８４／１９７／２０３／２３５／２３６、４７／６６／１８４／１９７／２３６、４７／７１／８８／１８４／２０３／２３５、４７／７１／８８／１８４／２０３／２３６、４７／７１／１４１／１８４／２０３／２３５、４７／７１／１８４、４７／７１／１８４／１９７／２３６、４７／７１／１８４／２３５、４７／７１／１８４／２３６、４７／８８／１０２／１４１／２３５／２３６、４７／８８／２０３／２３５／２３６、４７／８８／２３５／２３６、４７／１０２／１８４／１９７／２３５／２３６、４７／１０２／２０３／２３５／２３６、４７／１４１／１８４、４７／１４１／１８４／２３６、４７／１８４／２３６、４７／２０３／２３５、４７／２０３／２３５／２３６、４７／２０３／２３６、４７／２３５／２３６、６２、６６、６６／８８／１０２／１８４／１９７／２０３／２３５／２３６、６６／８８／１９７、６６／８８／２３５、６６／８８／２３５／２３６、６６／９４、６６／９４／１１２／１３３／１８４、６６／９４／１１２／１８４／２０４、６６／１０２／１８４／２３５／２３６、６６／１１２／１３３／１３４／１９７、６６／１１２／１３３／１９７、６６／１１２／１３４／１９７、６６／１１２／１８４、６６／１３３／１８４、６６／１３３／１９７、６６／１８４、６６／１９７／２０３／２３５、８４、８８、８８／１０２／１４１／１８４／２３５／２３６、８８／１８４、８８／１８４／１９７／２０３／２３５／２３６、８８／１８４／１９７／２３５／２３６、８８／１８４／２０３／２３５、８８／１８４／２３６、８８／１９７／２３５／２３６、８８／２３６、９４／１１２／１８４／１９７、９４／１３３／１８４、９６、１０２／１４１／２０３、１０２／１８４／２０３／２３６、１０２／１８４／２３６、１０２／１９７／２３５、１１２、１１２／１３３／１３４、１１２／１３３／１８４／２０４、１１２／１３４／１９７、１１４、１１５、１２０、１２７、１３２、１３３、１３３／１３４／１８４、１４１／１８４／２０３／２３５／２３６、１４１／１８４／２３５、１４１／１９７、１４１／２０３／２３５／２３６、１４１／２３６、１４６、１４８、１８４、１８４／２０３、１８４／２０３／２３５、１８４／２０３／２３６、１８４／２３５／２３６、１８４／２３６、１９７／２３５、２０３／２３５／２３６、２０３／２３６、２０４、２１８、２３５、２３５／２３６、および２３６から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号６を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼのポリペプチド配列は、配列番号６と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有し、操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼは、ポリペプチド中に２Ｃ／４７Ｖ／６６Ｌ／７１Ｖ／１４１Ｓ／１８４Ｉ／２０３Ｉ／２３５Ｔ／２３６Ｄ、２Ｃ／４７Ｖ／７１Ｖ／８８Ａ／２０３Ｉ／２３５Ｔ／２３６Ｄ、２Ｃ／４７Ｖ／７１Ｖ／１４１Ｓ／１９７Ｍ／２３５Ｔ／２３６Ｄ、２Ｎ、２Ｒ／６Ｈ／１０Ｑ／６６Ｌ／８８Ａ／１０２Ｅ／１８４Ｉ／２３５Ｔ／２３６Ｄ、２Ｒ／６Ｈ／１０２Ｅ／１４１Ｓ／２０３Ｉ／２３５Ｔ、２Ｒ／１０Ｑ／１０２Ｅ／２３５Ｔ／２３６Ｄ、２Ｒ／８８Ａ／１４１Ｓ／２３５Ｄ／２３６Ｄ、２Ｒ／２０３Ｉ／２３５Ｔ／２３６Ｄ、５Ｒ、６Ｈ／２０３Ｉ／２３５Ｔ／２３６Ｄ、９Ｋ、９Ｌ、１０Ｑ／４７Ｖ／６６Ｌ／１８４Ｉ／１９７Ｍ／２３６Ｄ、１０Ｑ／４７Ｖ／６６Ｌ／２３５Ｔ／２３６Ｄ、１０Ｑ／４７Ｖ／７１Ｖ／１８４Ｉ／２０３Ｉ／２３５Ｔ／２３６Ｄ、１３Ｉ、１３Ｉ／４６Ｖ、１３Ｉ／４６Ｖ／６６Ｓ／９４Ｌ、１３Ｉ／４６Ｖ／６６Ｓ／９４Ｌ／１８４Ｖ／２０４Ｔ、１３Ｉ／４６Ｖ／６６Ｓ／１３３Ｌ／１３４Ｌ／１８４Ｖ、１３Ｉ／４６Ｖ／６６Ｓ／１８４Ｖ、１３Ｉ／４６Ｖ／１１２Ｋ／１３４Ｌ／１８４Ｖ、１３Ｉ／４６Ｖ／１３３Ｌ／１８４Ｖ、１３Ｉ／４６Ｖ／１３３Ｍ／１８４Ｖ、１３Ｉ／６６Ｓ／９４Ｌ、１３Ｉ／６６Ｓ／９４Ｌ／１８４Ｖ、１３Ｉ／６６Ｓ／１１２Ｋ／１３３Ｍ／１３４Ｌ／１８４Ｖ／２０４Ｔ、１３Ｉ／６６Ｓ／１１２Ｋ／１３３Ｍ／１３４Ｌ／２０４Ｔ、１３Ｉ／６６Ｓ／１１２Ｍ／１８４Ｖ、１３Ｉ／６６Ｓ／１３３Ｍ／１３４Ｌ／１８４Ｖ／２０４Ｔ、１３Ｉ／６６Ｓ／１８４Ｖ／２０４Ｔ、１３Ｉ／９４Ｌ／１３３Ｍ／１８４Ｖ、１３Ｉ／９４Ｌ／１８４Ｖ、１３Ｉ／９４Ｌ／１８４Ｖ／２０４Ｔ、１３Ｉ／１３３Ｍ／１３４Ｌ／１８４Ｖ、１３Ｉ／１３３Ｍ／１３４Ｌ／２０４Ｔ、１３Ｉ／１３４Ｌ／２０４Ｔ、１３Ｉ／１８４Ｖ、１３Ｌ、１３Ｔ、２７Ｒ、４０Ｗ、４６Ｖ／６６Ｓ／９４Ｌ／１１２Ｋ、４６Ｖ／６６Ｓ／１１２Ｋ／１３３Ｌ／１３４Ｌ／１８４Ｖ、４６Ｖ／６６Ｓ／１３３Ｌ／１３４Ｌ、４６Ｖ／６６Ｓ／１３３Ｌ／１８４Ｖ／１９７Ｃ、４６Ｖ／６６Ｓ／１３３Ｍ／１９７Ｃ、４６Ｖ／６６Ｓ／１３４Ｌ／１８４Ｖ／１９７Ｃ／２０４Ｔ、４６Ｖ／６６Ｓ／１８４Ｖ、４６Ｖ／１１２Ｋ／１３３Ｌ／１３４Ｌ／２０４Ｔ、４６Ｖ／１１２Ｍ／１３３Ｌ、４６Ｖ／１３３Ｍ／２０４Ｔ、４６Ｖ／１９７Ｃ／２０４Ｔ、４７Ｖ／６６Ｌ／７１Ｖ／８８Ａ／２０３Ｉ／２３５Ｔ／２３６Ｄ、４７Ｖ／６６Ｌ／７１Ｖ／１４１Ｓ／１８４Ｉ、４７Ｖ／６６Ｌ／８８Ａ／１８４Ｉ／２３５Ｔ、４７Ｖ／６６Ｌ／８８Ａ／２０３Ｉ／２３５Ｔ／２３６Ｄ、４７Ｖ／６６Ｌ／１４１Ｓ／２３５Ｔ／２３６Ｄ、４７Ｖ／６６Ｌ／１８４Ｉ／１９７Ｍ／２０３Ｉ／２３５Ｔ／２３６Ｄ、４７Ｖ／６６Ｌ／１８４Ｉ／１９７Ｍ／２３６Ｄ、４７Ｖ／７１Ｖ／８８Ａ／１８４Ｉ／２０３Ｉ／２３５Ｄ、４７Ｖ／７１Ｖ／８８Ａ／１８４Ｉ／２０３Ｉ／２３６Ｄ、４７Ｖ／７１Ｖ／１４１Ｓ／１８４Ｉ／２０３Ｉ／２３５Ｄ、４７Ｖ／７１Ｖ／１８４Ｉ、４７Ｖ／７１Ｖ／１８４Ｉ／１９７Ｍ／２３６Ｄ、４７Ｖ／７１Ｖ／１８４Ｉ／２３５Ｔ、４７Ｖ／７１Ｖ／１８４Ｉ／２３６Ｄ、４７Ｖ／８８Ａ／１０２Ｅ／１４１Ｓ／２３５Ｔ／２３６Ｄ、４７Ｖ／８８Ａ／２０３Ｉ／２３５Ｄ／２３６Ｄ、４７Ｖ／８８Ａ／２３５Ｔ／２３６Ｄ、４７Ｖ／１０２Ｅ／１８４Ｉ／１９７Ｍ／２３５Ｔ／２３６Ｄ、４７Ｖ／１０２Ｅ／２０３Ｉ／２３５Ｔ／２３６Ｄ、４７Ｖ／１４１Ｓ／１８４Ｉ、４７Ｖ／１４１Ｓ／１８４Ｉ／２３６Ｄ、４７Ｖ／１８４Ｉ／２３６Ｄ、４７Ｖ／２０３Ｉ／２３５Ｄ、４７Ｖ／２０３Ｉ／２３５Ｔ／２３６Ｄ、４７Ｖ／２０３Ｉ／２３６Ｄ、４７Ｖ／２３５Ｔ／２３６Ｄ、６２Ｌ、６６Ａ、６６Ｃ、６６Ｈ、６６Ｌ／８８Ａ／１０２Ｅ／１８４Ｉ／１９７Ｍ／２０３Ｉ／２３５Ｔ／２３６Ｄ、６６Ｌ／８８Ａ／１９７Ｍ、６６Ｌ／８８Ａ／２３５Ｄ、６６Ｌ／８８Ａ／２３５Ｔ／２３６Ｄ、６６Ｌ／１０２Ｅ／１８４Ｉ／２３５Ｄ／２３６Ｄ、６６Ｌ／１８４Ｉ、６６Ｌ／１９７Ｍ／２０３Ｉ／２３５Ｄ、６６Ｓ／９４Ｌ、６６Ｓ／９４Ｌ／１１２Ｋ／１３３Ｌ／１８４Ｖ、６６Ｓ／９４Ｌ／１１２Ｋ／１８４Ｖ／２０４Ｔ、６６Ｓ／９４Ｌ／１１２Ｍ／１３３Ｍ／１８４Ｖ、６６Ｓ／１１２Ｋ／１３３Ｌ／１３４Ｌ／１９７Ｃ、６６Ｓ／１１２Ｋ／１３４Ｌ／１９７Ｃ、６６Ｓ／１１２Ｋ／１８４Ｖ、６６Ｓ／１１２Ｍ／１３３Ｌ／１９７Ｃ、６６Ｓ／１３３Ｌ／１９７Ｃ、６６Ｓ／１３３Ｍ／１８４Ｖ、６６Ｓ／１８４Ｖ、８４Ｃ、８４Ｌ、８８Ａ／１０２Ｅ／１４１Ｓ／１８４Ｉ／２３５Ｔ／２３６Ｄ、８８Ａ／１８４Ｉ、８８Ａ／１８４Ｉ／１９７Ｍ／２０３Ｉ／２３５Ｔ／２３６Ｄ、８８Ａ／１８４Ｉ／１９７Ｍ／２３５Ｄ／２３６Ｄ、８８Ａ／１８４Ｉ／２０３Ｉ／２３５Ｄ、８８Ａ／１８４Ｉ／２３６Ｄ、８８Ａ／１９７Ｍ／２３５Ｔ／２３６Ｄ、８８Ａ／２３６Ｄ、８８Ｈ、８８Ｖ、９４Ｌ／１１２Ｍ／１８４Ｖ／１９７Ｃ、９４Ｌ／１３３Ｌ／１８４Ｖ、９６Ｌ、１０２Ｅ／１４１Ｓ／２０３Ｉ、１０２Ｅ／１８４Ｉ／２０３Ｉ／２３６Ｄ、１０２Ｅ／１８４Ｉ／２３６Ｄ、１０２Ｅ／１９７Ｍ／２３５Ｄ、１１２Ｃ、１１２Ｋ／１３３Ｌ／１８４Ｖ／２０４Ｔ、１１２Ｋ／１３３Ｍ／１３４Ｌ、１１２Ｋ／１３４Ｌ／１９７Ｃ、１１２Ｎ、１１４Ｒ、１１５Ｄ、１１５Ｖ、１２０Ｍ、１２０Ｒ、１２７Ｇ、１２７Ｈ、１２７Ｌ、１２７Ｒ、１２７Ｔ、１２７Ｖ、１３２Ｌ、１３３Ｇ、１３３Ｈ、１３３Ｌ、１３３Ｍ／１３４Ｌ／１８４Ｖ、１３３Ｒ、１４１Ｓ／１８４Ｉ／２０３Ｉ／２３５Ｔ／２３６Ｄ、１４１Ｓ／１８４Ｉ／２３５Ｄ、１４１Ｓ／１９７Ｍ、１４１Ｓ／２０３Ｉ／２３５Ｄ／２３６Ｄ、１４１Ｓ／２３６Ｄ、１４６Ｑ、１４８Ｇ、１４８Ｌ、１８４Ｉ／２０３Ｉ、１８４Ｉ／２０３Ｉ／２３５Ｄ、１８４Ｉ／２０３Ｉ／２３６Ｄ、１８４Ｉ／２３５Ｔ／２３６Ｄ、１８４Ｉ／２３６Ｄ、１８４Ｖ、１９７Ｍ／２３５Ｄ、２０３Ｉ／２３５Ｔ／２３６Ｄ、２０３Ｉ／２３６Ｄ、２０４Ｔ、２１８Ｓ、２３５Ｄ／２３６Ｄ、２３５Ｔ、２３５Ｔ／２３６Ｄ、および２３６Ｄから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号６を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼのポリペプチド配列は、配列番号６と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を含み、操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼは、ポリペプチド中にＳ２Ｃ／Ｍ４７Ｖ／Ｐ６６Ｌ／Ａ７１Ｖ／Ｔ１４１Ｓ／Ｍ１８４Ｉ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ
２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｓ２Ｃ／Ｍ４７Ｖ／Ａ７１Ｖ／Ｌ８８Ａ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｓ２Ｃ／Ｍ４７Ｖ／Ａ７１Ｖ／Ｔ１４１Ｓ／Ｆ１９７Ｍ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｓ２Ｎ、Ｓ２Ｒ／Ｋ６Ｈ／Ｒ１０Ｑ／Ｐ６６Ｌ／Ｌ８８Ａ／Ｄ１０２Ｅ／Ｍ１８４Ｉ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｓ２Ｒ／Ｋ６Ｈ／Ｄ１０２Ｅ／Ｔ１４１Ｓ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｔ、Ｓ２Ｒ／Ｒ１０Ｑ／Ｄ１０２Ｅ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｓ２Ｒ／Ｌ８８Ａ／Ｔ１４１Ｓ／Ｓ２３５Ｄ／Ｓ２３６Ｄ、Ｓ２Ｒ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｋ５Ｒ、Ｋ６Ｈ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｑ９Ｋ、Ｑ９Ｌ、Ｒ１０Ｑ／Ｍ４７Ｖ／Ｐ６６Ｌ／Ｍ１８４Ｉ／Ｆ１９７Ｍ／Ｓ２３６Ｄ、Ｒ１０Ｑ／Ｍ４７Ｖ／Ｐ６６Ｌ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｒ１０Ｑ／Ｍ４７Ｖ／Ａ７１Ｖ／Ｍ１８４Ｉ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｓ１３Ｉ、Ｓ１３Ｉ／Ｉ４６Ｖ、Ｓ１３Ｉ／Ｉ４６Ｖ／Ｐ６６Ｓ／Ｖ９４Ｌ、Ｓ１３Ｉ／Ｉ４６Ｖ／Ｐ６６Ｓ／Ｖ９４Ｌ／Ｍ１８４Ｖ／Ｋ２０４Ｔ、Ｓ１３Ｉ／Ｉ４６Ｖ／Ｐ６６Ｓ／Ｔ１３３Ｌ／Ｉ１３４Ｌ／Ｍ１８４Ｖ、Ｓ１３Ｉ／Ｉ４６Ｖ／Ｐ６６Ｓ／Ｍ１８４Ｖ、Ｓ１３Ｉ／Ｉ４６Ｖ／Ｅ１１２Ｋ／Ｉ１３４Ｌ／Ｍ１８４Ｖ、Ｓ１３Ｉ／Ｉ４６Ｖ／Ｔ１３３Ｌ／Ｍ１８４Ｖ、Ｓ１３Ｉ／Ｉ４６Ｖ／Ｔ１３３Ｍ／Ｍ１８４Ｖ、Ｓ１３Ｉ／Ｐ６６Ｓ／Ｖ９４Ｌ、Ｓ１３Ｉ／Ｐ６６Ｓ／Ｖ９４Ｌ／Ｍ１８４Ｖ、Ｓ１３Ｉ／Ｐ６６Ｓ／Ｅ１１２Ｋ／Ｔ１３３Ｍ／Ｉ１３４Ｌ／Ｍ１８４Ｖ／Ｋ２０４Ｔ、Ｓ１３Ｉ／Ｐ６６Ｓ／Ｅ１１２Ｋ／Ｔ１３３Ｍ／Ｉ１３４Ｌ／Ｋ２０４Ｔ、Ｓ１３Ｉ／Ｐ６６Ｓ／Ｅ１１２Ｍ／Ｍ１８４Ｖ、Ｓ１３Ｉ／Ｐ６６Ｓ／Ｔ１３３Ｍ／Ｉ１３４Ｌ／Ｍ１８４Ｖ／Ｋ２０４Ｔ、Ｓ１３Ｉ／Ｐ６６Ｓ／Ｍ１８４Ｖ／Ｋ２０４Ｔ、Ｓ１３Ｉ／Ｖ９４Ｌ／Ｔ１３３Ｍ／Ｍ１８４Ｖ、Ｓ１３Ｉ／Ｖ９４Ｌ／Ｍ１８４Ｖ、Ｓ１３Ｉ／Ｖ９４Ｌ／Ｍ１８４Ｖ／Ｋ２０４Ｔ、Ｓ１３Ｉ／Ｔ１３３Ｍ／Ｉ１３４Ｌ／Ｍ１８４Ｖ、Ｓ１３Ｉ／Ｔ１３３Ｍ／Ｉ１３４Ｌ／Ｋ２０４Ｔ、Ｓ１３Ｉ／Ｉ１３４Ｌ／Ｋ２０４Ｔ、Ｓ１３Ｉ／Ｍ１８４Ｖ、Ｓ１３Ｌ、Ｓ１３Ｔ、Ｑ２７Ｒ、Ａ４０Ｗ、Ｉ４６Ｖ／Ｐ６６Ｓ／Ｖ９４Ｌ／Ｅ１１２Ｋ、Ｉ４６Ｖ／Ｐ６６Ｓ／Ｅ１１２Ｋ／Ｔ１３３Ｌ／Ｉ１３４Ｌ／Ｍ１８４Ｖ、Ｉ４６Ｖ／Ｐ６６Ｓ／Ｔ１３３Ｌ／Ｉ１３４Ｌ、Ｉ４６Ｖ／Ｐ６６Ｓ／Ｔ１３３Ｌ／Ｍ１８４Ｖ／Ｆ１９７Ｃ、Ｉ４６Ｖ／Ｐ６６Ｓ／Ｔ１３３Ｍ／Ｆ１９７Ｃ、Ｉ４６Ｖ／Ｐ６６Ｓ／Ｉ１３４Ｌ／Ｍ１８４Ｖ／Ｆ１９７Ｃ／Ｋ２０４Ｔ、Ｉ４６Ｖ／Ｐ６６Ｓ／Ｍ１８４Ｖ、Ｉ４６Ｖ／Ｅ１１２Ｋ／Ｔ１３３Ｌ／Ｉ１３４Ｌ／Ｋ２０４Ｔ、Ｉ４６Ｖ／Ｅ１１２Ｍ／Ｔ１３３Ｌ、Ｉ４６Ｖ／Ｔ１３３Ｍ／Ｋ２０４Ｔ、Ｉ４６Ｖ／Ｆ１９７Ｃ／Ｋ２０４Ｔ、Ｍ４７Ｖ／Ｐ６６Ｌ／Ａ７１Ｖ／Ｌ８８Ａ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｍ４７Ｖ／Ｐ６６Ｌ／Ａ７１Ｖ／Ｔ１４１Ｓ／Ｍ１８４Ｉ、Ｍ４７Ｖ／Ｐ６６Ｌ／Ｌ８８Ａ／Ｍ１８４Ｉ／Ｓ２３５Ｔ、Ｍ４７Ｖ／Ｐ６６Ｌ／Ｌ８８Ａ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｍ４７Ｖ／Ｐ６６Ｌ／Ｔ１４１Ｓ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｍ４７Ｖ／Ｐ６６Ｌ／Ｍ１８４Ｉ／Ｆ１９７Ｍ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｍ４７Ｖ／Ｐ６６Ｌ／Ｍ１８４Ｉ／Ｆ１９７Ｍ／Ｓ２３６Ｄ、Ｍ４７Ｖ／Ａ７１Ｖ／Ｌ８８Ａ／Ｍ１８４Ｉ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｄ、Ｍ４７Ｖ／Ａ７１Ｖ／Ｌ８８Ａ／Ｍ１８４Ｉ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３６Ｄ、Ｍ４７Ｖ／Ａ７１Ｖ／Ｔ１４１Ｓ／Ｍ１８４Ｉ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｄ、Ｍ４７Ｖ／Ａ７１Ｖ／Ｍ１８４Ｉ、Ｍ４７Ｖ／Ａ７１Ｖ／Ｍ１８４Ｉ／Ｆ１９７Ｍ／Ｓ２３６Ｄ、Ｍ４７Ｖ／Ａ７１Ｖ／Ｍ１８４Ｉ／Ｓ２３５Ｔ、Ｍ４７Ｖ／Ａ７１Ｖ／Ｍ１８４Ｉ／Ｓ２３６Ｄ、Ｍ４７Ｖ／Ｌ８８Ａ／Ｄ１０２Ｅ／Ｔ１４１Ｓ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｍ４７Ｖ／Ｌ８８Ａ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｄ／Ｓ２３６Ｄ、Ｍ４７Ｖ／Ｌ８８Ａ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｍ４７Ｖ／Ｄ１０２Ｅ／Ｍ１８４Ｉ／Ｆ１９７Ｍ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｍ４７Ｖ／Ｄ１０２Ｅ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｍ４７Ｖ／Ｔ１４１Ｓ／Ｍ１８４Ｉ、Ｍ４７Ｖ／Ｔ１４１Ｓ／Ｍ１８４Ｉ／Ｓ２３６Ｄ、Ｍ４７Ｖ／Ｍ１８４Ｉ／Ｓ２３６Ｄ、Ｍ４７Ｖ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｄ、Ｍ４７Ｖ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｍ４７Ｖ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３６Ｄ、Ｍ４７Ｖ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｅ６２Ｌ、Ｐ６６Ａ、Ｐ６６Ｃ、Ｐ６６Ｈ、Ｐ６６Ｌ／Ｌ８８Ａ／Ｄ１０２Ｅ／Ｍ１８４Ｉ／Ｆ１９７Ｍ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｐ６６Ｌ／Ｌ８８Ａ／Ｆ１９７Ｍ、Ｐ６６Ｌ／Ｌ８８Ａ／Ｓ２３５Ｄ、Ｐ６６Ｌ／Ｌ８８Ａ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｐ６６Ｌ／Ｄ１０２Ｅ／Ｍ１８４Ｉ／Ｓ２３５Ｄ／Ｓ２３６Ｄ、Ｐ６６Ｌ／Ｍ１８４Ｉ、Ｐ６６Ｌ／Ｆ１９７Ｍ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｄ、Ｐ６６Ｓ／Ｖ９４Ｌ、Ｐ６６Ｓ／Ｖ９４Ｌ／Ｅ１１２Ｋ／Ｔ１３３Ｌ／Ｍ１８４Ｖ、Ｐ６６Ｓ／Ｖ９４Ｌ／Ｅ１１２Ｋ／Ｍ１８４Ｖ／Ｋ２０４Ｔ、Ｐ６６Ｓ／Ｖ９４Ｌ／Ｅ１１２Ｍ／Ｔ１３３Ｍ／Ｍ１８４Ｖ、Ｐ６６Ｓ／Ｅ１１２Ｋ／Ｔ１３３Ｌ／Ｉ１３４Ｌ／Ｆ１９７Ｃ、Ｐ６６Ｓ／Ｅ１１２Ｋ／Ｉ１３４Ｌ／Ｆ１９７Ｃ、Ｐ６６Ｓ／Ｅ１１２Ｋ／Ｍ１８４Ｖ、Ｐ６６Ｓ／Ｅ１１２Ｍ／Ｔ１３３Ｌ／Ｆ１９７Ｃ、Ｐ６６Ｓ／Ｔ１３３Ｌ／Ｆ１９７Ｃ、Ｐ６６Ｓ／Ｔ１３３Ｍ／Ｍ１８４Ｖ、Ｐ６６Ｓ／Ｍ１８４Ｖ、Ａ８４Ｃ、Ａ８４Ｌ、Ｌ８８Ａ／Ｄ１０２Ｅ／Ｔ１４１Ｓ／Ｍ１８４Ｉ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｌ８８Ａ／Ｍ１８４Ｉ、Ｌ８８Ａ／Ｍ１８４Ｉ／Ｆ１９７Ｍ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｌ８８Ａ／Ｍ１８４Ｉ／Ｆ１９７Ｍ／Ｓ２３５Ｄ／Ｓ２３６Ｄ、Ｌ８８Ａ／Ｍ１８４Ｉ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｄ、Ｌ８８Ａ／Ｍ１８４Ｉ／Ｓ２３６Ｄ、Ｌ８８Ａ／Ｆ１９７Ｍ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｌ８８Ａ／Ｓ２３６Ｄ、Ｌ８８Ｈ、Ｌ８８Ｖ、Ｖ９４Ｌ／Ｅ１１２Ｍ／Ｍ１８４Ｖ／Ｆ１９７Ｃ、Ｖ９４Ｌ／Ｔ１３３Ｌ／Ｍ１８４Ｖ、Ｙ９６Ｌ、Ｄ１０２Ｅ／Ｔ１４１Ｓ／Ｖ２０３Ｉ、Ｄ１０２Ｅ／Ｍ１８４Ｉ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３６Ｄ、Ｄ１０２Ｅ／Ｍ１８４Ｉ／Ｓ２３６Ｄ、Ｄ１０２Ｅ／Ｆ１９７Ｍ／Ｓ２３５Ｄ、Ｅ１１２Ｃ、Ｅ１１２Ｋ／Ｔ１３３Ｌ／Ｍ１８４Ｖ／Ｋ２０４Ｔ、Ｅ１１２Ｋ／Ｔ１３３Ｍ／Ｉ１３４Ｌ、Ｅ１１２Ｋ／Ｉ１３４Ｌ／Ｆ１９７Ｃ、Ｅ１１２Ｎ、Ｎ１１４Ｒ、Ｅ１１５Ｄ、Ｅ１１５Ｖ、Ｅ１２０Ｍ、Ｅ１２０Ｒ、Ｅ１２７Ｇ、Ｅ１２７Ｈ、Ｅ１２７Ｌ、Ｅ１２７Ｒ、Ｅ１２７Ｔ、Ｅ１２７Ｖ、Ｄ１３２Ｌ、Ｔ１３３Ｇ、Ｔ１３３Ｈ、Ｔ１３３Ｌ、Ｔ１３３Ｍ／Ｉ１３４Ｌ／Ｍ１８４Ｖ、Ｔ１３３Ｒ、Ｔ１４１Ｓ／Ｍ１８４Ｉ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｔ１４１Ｓ／Ｍ１８４Ｉ／Ｓ２３５Ｄ、Ｔ１４１Ｓ／Ｆ１９７Ｍ、Ｔ１４１Ｓ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｄ／Ｓ２３６Ｄ、Ｔ１４１Ｓ／Ｓ２３６Ｄ、Ｄ１４６Ｑ、Ａ１４８Ｇ、Ａ１４８Ｌ、Ｍ１８４Ｉ／Ｖ２０３Ｉ、Ｍ１８４Ｉ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｄ、Ｍ１８４Ｉ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３６Ｄ、Ｍ１８４Ｉ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｍ１８４Ｉ／Ｓ２３６Ｄ、Ｍ１８４Ｖ、Ｆ１９７Ｍ／Ｓ２３５Ｄ、Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３６Ｄ、Ｋ２０４Ｔ、Ｒ２１８Ｓ、Ｓ２３５Ｄ／Ｓ２３６Ｄ、Ｓ２３５Ｔ、Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、およびＳ２３６Ｄから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号６を参照して番号付けされる。
【０００７】
一部の実施形態では、操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼのポリペプチド配列は、配列番号４６６と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有し、操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼは、ポリペプチド配列中の７１／８８／９４／１３３、７１／１３３および１３３から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号４６６を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼのポリペプチド配列は、配列番号４６６と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有し、操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼは、ポリペプチド中に７１Ａ／８８Ａ／９４Ｌ／１３３Ｈ、７１Ａ／１３３Ｈおよび１３３Ｈから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号４６６を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼのポリペプチド配列は、配列番号４６６と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有し、操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼは、ポリペプチド中にＶ７１Ａ／Ｌ８８Ａ／Ｖ９４Ｌ／Ｔ１３３Ｈ、Ｖ７１Ａ／Ｔ１３３ＨおよびＴ１３３Ｈから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号４６６を参照して番号付けされる。
【０００８】
本発明は、表３．１、４．１および／または６．１に示される少なくとも１つの操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼバリアントの配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高く同一であるポリペプチド配列を含む操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼも提供する。一部の実施形態では、操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼは、表３．１、４．１および／または６．１に提供されるバリアントの操作されたポリペプチドである。一部の実施形態では、操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼは、配列番号２、６および／または４６６に示される少なくとも１つの操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼバリアントの配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高く同一であるポリペプチド配列を含む。一部の追加の実施形態では、操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼは、配列番号２、６および／または４６６に示されるバリアントの操作されたポリペプチドである。一部のさらなる実施形態では、操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼは、配列番号２〜４７８の偶数配列に示される少なくとも１つの操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼバリアントの配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高く同一であるポリペプチド配列を含む。さらに一部の追加の実施形態では、操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼは、配列番号２〜４７８の偶数配列に示される（forth  in）ポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼは、野生型Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｈａｌｉｆａｘｅｎｓｉｓのデオキシリボースリン酸アルドラーゼと比較して少なくとも１つの改善された性質を含む。一部の追加の実施形態では、改善された性質は、基質に対する改善された活性を含む。一部のさらなる実施形態では、基質は、Ｒ−２−エチニル−グリセルアルデヒドを含む。さらに一部のさらなる実施形態では、改善された性質は、改善された熱安定性を含む。なお一部の追加の実施形態では、操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼは、精製されている。本発明は、本明細書に提供される少なくとも１つの操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼを含む組成物も提供する。
【０００９】
本発明は、本明細書に提供される少なくとも１つの操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼをコードするポリヌクレオチド配列も提供する。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチド配列は、少なくとも１つの操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼをコードし、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１、５および／または４６５と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を含む。本発明は、本明細書に提供される少なくとも１つの操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼをコードするポリヌクレオチド配列も提供する。一部の追加の実施形態では、操作されたポリヌクレオチド配列は、少なくとも１つの操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼをコードし、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１、５および／または４６５と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を含み、操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼのポリヌクレオチド配列は、１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換を含む。一部のさらなる実施形態では、少なくとも１つの操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼをコードする操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号２、６および／もしくは４６６またはそれらの機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を含む。さらに一部の追加の実施形態では、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号１〜４７７の奇数配列に示される配列を含む。一部のさらなる実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、制御配列に作動可能に連結されている。さらに一部の追加の実施形態では、操作されたポリヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。本発明は、本明細書に提供される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターも提供する。本発明は、本明細書に提供される少なくとも１つの発現ベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。一部の実施形態では、宿主細胞は、本明細書に提供される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む。
【００１０】
本発明は、宿主細胞において操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼを産生させる方法であって、少なくとも１つの操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼが産生するように、適切な条件下で、培養培地中で本明細書に提供される宿主細胞を培養することを含む、方法も提供する。一部の実施形態では、方法は、培養培地および／または宿主細胞から少なくとも１つの操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼを回収することをさらに含む。一部の追加の実施形態では、方法は、少なくとも１つの操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼを精製するステップをさらに含む。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、医薬化合物およびファインケミカル化合物の生成のための工業プロセス条件下で有用な操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドを提供する。
【００１２】
デオキシリボースリン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ；ＥＣ  ４．１．２．４）は、アセトアルデヒドおよびＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸の可逆的アルドール反応を触媒して、２−デオキシリボース−５−リン酸を生成する（例えば、Barbas  et  al.,  J.  Am.  Chem.  Soc.,  112:  2013-2014  [1990]を参照のこと（Se））。同義語としては、ホスホデオキシリボアルドース（phosphodeoxyriboaldose）、デオキシリボアルドラーゼ、デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼおよび２−デオキシ−Ｄ−リボース−５−リン酸アセトアルデヒド−リアーゼが挙げられる。これは、ペントースリン酸経路に関与し、微生物および動物組織中に広く分布している（Racker,  J.  Biol.  Chem.,  196:347-365  [1952]を参照のこと）。これは、クラスＩアルドラーゼであるので、これは、補因子には依存せず、厳密に保存された活性部位のリシンを有するシッフ塩基の形成によってその供与体基質を活性化する（米国特許出願公開第２０１７／０１９１０９５号；およびDean  et  al.,  Adv.  Synth.  Catal.,  349:  1308-1320  [2007]を参照のこと）。本発明では、エナンチオピュアな（Ｒ）−２−エチニル−グリセルアルデヒド（化合物Ｘ）は、アセトアルデヒドの存在下で、デオキシリボースリン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ）によって、（４Ｓ，５Ｒ）−５−エチニル−デオキシリボース（化合物Ｙ）に選択的に変換される（下記の反応を参照のこと）。
【化１】
2021530980.tif 000002
【００１３】
一部の実施形態では、化合物Ｙは、次いで、ＨＩＶの処置および予防のために適切なヌクレオシド逆転写酵素転座阻害剤（ＮＲＴＴＩ）を生成するために必要であるなど、追加の反応における利用のために、ホスファターゼによるリン酸化を介して５−ホスホ−デオキシリボース−アルキンに変換される。５−ホスホ−デオキシリボース−アルキン（５−Ｐ）の化学合成は非常に困難である。したがって、本発明は、当技術分野において非常に望まれる代替の生体触媒経路を提供する。
【００１４】
本明細書に提供される記載について、単数形の使用は、特に他に明記されていない限り、複数形を含む（逆もまた同様）。例えば、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数の指示対象を含む。同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、互換可能であり、限定することを意図しない。
【００１５】
さまざまな実施形態の記載が「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語を使用する場合、一部の特定の例では、実施形態が、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という語を使用して代わりに記載することができることを当業者であれば理解するはずであることがさらに理解されるべきである。
【００１６】
図を含む前述の一般的な記載および以下の詳細な記載の両方とも、例示的かつ説明的なものにすぎず、本発明を制限するものではない。また、本明細書において使用される節の見出しは、構成の目的のためにすぎず、記載される主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００１７】
定義
本明細書で使用される場合、以下の用語は、以下の意味を有することが意図される。本発明に関して、本明細書における記載において使用される技術用語および科学用語は、特に他に定義されない限り、当業者によって通常理解される意味を有する。したがって、以下の用語は、以下の意味を有することが意図される。加えて、本明細書において参照される、すべての特許および刊行物は、そのような特許および刊行物に開示されるすべての配列を含んで、参照によって明示的に組み込まれる。
【００１８】
他に指示されない限り、本発明の実施は、分子生物学、発酵、微生物学および関連する分野において通常使用される従来の技法を含み、これらは、当業者に公知である。本明細書において他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものに類似または同等の任意の方法および材料は、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料を記載する。実際に、本発明が、それらが使用される状況に応じて変わり得るので、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコールおよび試薬に限定されないことが意図される。本明細書に提供される見出しは、全体として本明細書への参照によって有することができる、本発明のさまざまな態様または実施形態の限定ではない。したがって、下記で定義される用語は、全体として本明細書への参照によって、より完全に定義される。
【００１９】
それにもかかわらず、本発明の理解を容易にするために、多くの用語を下記で定義する。数値範囲は、その範囲を定義する数字を包含する。したがって、本明細書に開示されるすべての数値範囲は、より狭い数値範囲が本明細書においてすべて明示的に記載されているかのように、より広い数値範囲内に入るそのようなすべてのより狭い数値範囲を包含することが意図される。本明細書に開示されるすべての最大の（または最小の）数値限定は、より低い（またはより高い）数値限定が本明細書において明示的に書かれているかのように、そのようなすべてのより低い（またはより高い）数値限定を含むことも意図される。
【００２０】
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語およびその同語源語は、それらの包括的な意味で使用される（すなわち、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語およびその対応する同語源語と同等である）。
【００２１】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「宿主細胞」への言及は、複数のそのような宿主細胞を含む。
【００２２】
他に指示されない限り、それぞれ、核酸は、左から右に５’から３’の方向で記載され、アミノ酸配列は、左から右にアミノからカルボキシの方向で記載される。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化、脂質化、ミリスチル化（myristilation）、ユビキチン化など）に関わらず、アミド結合によって共有結合で連結された少なくとも２つのアミノ酸のポリマーを示すために、本明細書で互換可能に使用される。Ｄ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸ならびにＤ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸の混合物は、この定義内に含まれる。
【００２４】
「アミノ酸」は、本明細書において、それらの通常公知の三文字記号によって、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会によって推奨される一文字記号によってのいずれかで言及される。同様に、ヌクレオチドは、それらの通常許容される一文字表記によって言及され得る。遺伝子によってコードされるアミノ酸について使用される略語は、従来のものであり、以下の通りである：アラニン（ＡｌａまたはＡ）、アルギニン（ＡｒｅまたはＲ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、リシン（ＬｙｓまたはＫ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、およびバリン（ＶａｌまたはＶ）。
【００２５】
三文字略語が使用される場合、「Ｌ」もしくは「Ｄ」が具体的に先行しない限り、または略語が使用される文脈から明らかでない限り、アミノ酸は、α炭素（Ｃα）についてＬ配置またはＤ配置のいずれかであり得る。例えば、「Ａｌａ」は、α炭素についての立体配置を特定することなくアラニンを指すが、「Ｄ−Ａｌａ」および「Ｌ−Ａｌａ」は、それぞれ、Ｄ−アラニンおよびＬ−アラニンを指す。一文字略語が使用される場合、大文字は、α炭素についてＬ配置にあるアミノ酸を指し、小文字は、α炭素についてＤ配置にあるアミノ酸を指す。例えば、「Ａ」は、Ｌ−アラニンを指し、「ａ」は、Ｄ−アラニンを指す。ポリペプチド配列が、一連の一文字または三文字の略語（またはこれらの混合）として表される場合、配列は、一般的な慣例に従って、アミノ（Ｎ）からカルボキシ（Ｃ）の方向で表される。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「親水性アミノ酸または残基」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら（Eisenberg  et  al.,  J.  Mol.  Biol.,  179:125-142  [1984]）の正規化コンセンサス疎水性尺度に従って、ゼロ未満の疎水性を示す側鎖を有するアミノ酸または残基を指す。遺伝子によってコードされる親水性アミノとしては、Ｌ−Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ−Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｌ−Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｌ−Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ−Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｌ−Ａｓｐ（Ｄ）、Ｌ−Ｌｙｓ（Ｋ）およびＬ−Ａｒｇ（Ｒ）が挙げられる。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「酸性アミノ酸または残基」は、アミノ酸がペプチドまたはポリペプチドに含まれる場合、約６未満のｐＫ値を示す側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を指す。酸性アミノ酸は、典型的には、水素イオンの喪失に起因して、生理学的なｐＨで負に荷電した側鎖を有する。遺伝子によってコードされる酸性アミノ酸としては、Ｌ−Ｇｌｕ（Ｅ）およびＬ−Ａｓｐ（Ｄ）が挙げられる。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「塩基性アミノ酸または残基」は、アミノ酸がペプチドまたはポリペプチドに含まれる場合、約６よりも大きいｐＫ値を示す側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を指す。塩基性アミノ酸は、典型的には、ヒドロニウムイオンとの会合に起因して、生理学的なｐＨで正に荷電した側鎖を有する。遺伝子によってコードされる塩基性アミノ酸としては、Ｌ−Ａｒｇ（Ｒ）およびＬ−Ｌｙｓ（Ｋ）が挙げられる。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「極性アミノ酸または残基」は、生理学的ｐＨで非荷電であるが、２つの原子によって共有される電子対が、原子の１つによってより密接に保持される少なくとも１つの結合を有する側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を指す。遺伝子によってコードされる極性アミノ酸としては、Ｌ−Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ−Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）およびＬ−Ｔｈｒ（Ｔ）が挙げられる。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「疎水性アミノ酸または残基」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら（Eisenberg  et  al.,  J.  Mol.  Biol.,  179:125-142  [1984]）の正規化コンセンサス疎水性尺度に従って、ゼロを超える疎水性を示す側鎖を有するアミノ酸または残基を指す。遺伝子によってコードされる疎水性アミノ酸としては、Ｌ−Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｌ−Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌ−Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌ−Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｌ−Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｌ−Ａｌａ（Ａ）およびＬ−Ｔｙｒ（Ｙ）が挙げられる。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「芳香族アミノ酸または残基」は、少なくとも１つの芳香族環もしくは芳香族複素環を含む側鎖を有する親水性または疎水性のアミノ酸または残基を指す。遺伝子によってコードされる芳香族アミノ酸としては、Ｌ−Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｌ−Ｔｙｒ（Ｙ）およびＬ−Ｔｒｐ（Ｗ）が挙げられる。Ｌ−Ｈｉｓ（Ｈ）は、その芳香族複素環の窒素原子のｐＫａに基づいて塩基性残基として分類される場合があり、または、その側鎖として芳香族複素環を含むので芳香族残基として分類される場合があるが、本明細書において、ヒスチジンは、親水性残基として、または「拘束残基」（以下を参照のこと）として分類される。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「拘束アミノ酸または残基」は、拘束配置を有するアミノ酸または残基を指す。本明細書において、拘束残基としては、Ｌ−Ｐｒｏ（Ｐ）およびＬ−Ｈｉｓ（Ｈ）が挙げられる。ヒスチジンは、比較的小さなイミダゾール環を有するので、拘束配置を有する。プロリンは、これも５員環を有するので、拘束配置を有する。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「非極性アミノ酸または残基」は、生理学的ｐＨで非荷電であり、２つの原子によって共有される電子対が、一般に、２つの原子のそれぞれによって同等に保持される結合を有する側鎖を有する（すなわち、側鎖は極性でない）疎水性アミノ酸または残基を指す。遺伝子によってコードされる非極性アミノ酸としては、Ｌ−Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｌ−Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌ−Ｍｅｔ（Ｍ）およびＬ−Ａｌａ（Ａ）が挙げられる。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「脂肪族アミノ酸または残基」は、脂肪族炭化水素側鎖を有する疎水性アミノ酸または残基を指す。遺伝子によってコードされる脂肪族アミノ酸としては、Ｌ−Ａｌａ（Ａ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｌｅｕ（Ｌ）およびＬ−Ｉｌｅ（Ｉ）が挙げられる。システイン（または「Ｌ−Ｃｙｓ」もしくは「［Ｃ］」）は、他のＬ−Ｃｙｓ（Ｃ）アミノ酸、または他のスルファニルもしくはスルフヒドリル含有アミノ酸とジスルフィド架橋を形成することができるという点で、普通ではないことに留意する。「システイン様残基」としては、システイン、およびジスルフィド架橋の形成のために利用可能なスルフヒドリル部分を含有する他のアミノ酸が挙げられる。還元型遊離−ＳＨまたは酸化型ジスルフィド架橋形態のいずれかでペプチド中に存在するＬ−Ｃｙｓ（Ｃ）（および−ＳＨを含有する側鎖を有する他のアミノ酸）の能力は、Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）がペプチドへの正味の疎水性または親水性の特性に寄与するか否かに影響を及ぼす。Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ（Eisenberg  et  al.,  1984、上記）の正規化コンセンサススケールに従って、０．２９の疎水性を示すが、本発明の目的のためには、Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）は、それ自身独自の群に分類されることが理解されるべきである。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「小型アミノ酸または残基」は、全部で３つまたはそれよりも少ない炭素および／またはヘテロ原子（α−炭素および水素を除く）で構成される側鎖を有するアミノ酸または残基を指す。小型アミノ酸または残基は、上記の定義に従って、脂肪族、非極性、極性もしくは酸性の小型アミノ酸または残基として、さらに分類されてもよい。遺伝子によってコードされる小型アミノ酸としては、Ｌ−Ａｌａ（Ａ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｌ−Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ−Ｔｈｒ（Ｔ）およびＬ−Ａｓｐ（Ｄ）が挙げられる。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「ヒドロキシル含有アミノ酸または残基」は、ヒドロキシル（−ＯＨ）部分を含有するアミノ酸を指す。遺伝子によってコードされるヒドロキシルを含有するアミノ酸としては、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ−Ｔｈｒ（Ｔ）およびＬ−Ｔｙｒ（Ｙ）が挙げられる。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸の相違」および「残基の相違」は、参照配列における対応する位置でのアミノ酸残基と比べて、ポリペプチド配列の位置でのアミノ酸残基の相違を指す。アミノ酸の相違の位置は、一般に、本明細書において、「Ｘｎ」と称し、ここで、ｎは、残基の相違がそれに基づく参照配列中の対応する位置を指す。例えば、「配列番号２と比較したＸ４０位での残基の相違」は、配列番号２の４０位に対応するポリペプチド位置でのアミノ酸残基の相違を指す。したがって、配列番号２の参照ポリペプチドが４０位にヒスチジンを有する場合、「配列番号２と比較したＸ４０位での残基の相違」は、配列番号２の４０位に対応するポリペプチドの位置でのヒスチジン以外の任意の残基のアミノ酸置換を指す。本明細書におけるほとんどの例では、ある位置での特定のアミノ酸残基の相違は、「ＸｎＹ」として示され、ここで、「Ｘｎ」は、上記に記載の対応する位置を特定し、「Ｙ」は、操作されたポリペプチドにおいて見出されるアミノ酸の一文字識別子（すなわち、参照ポリペプチドとは異なる残基）である。一部の例では、本発明は、従来の表記「ＡｎＢ」によって表される特定のアミノ酸の相違も提供し、ここで、Ａは、参照配列における残基の一文字識別子であり、「ｎ」は、参照配列における残基位置の番号であり、Ｂは、操作されたポリペプチドの配列における残基置換の一文字識別子である。一部の例では、本発明のポリペプチドは、参照配列と比べて残基の相違が存在する特定された位置のリストによって表される、参照配列と比べて１つまたは複数のアミノ酸残基の相違を含むことができる。一部の実施形態では、２つ以上のアミノ酸をポリペプチドの特定の残基位置で使用することができる場合、使用することができるさまざまなアミノ酸残基は、「／」（例えば、Ｘ１９２Ａ／Ｇ）によって分離される。複数の置換を有するバリアントが存在する、一部の実施形態では、置換は、セミコロン（；）またはスラッシュ（／）（例えば、Ｙ１７Ｖ；Ｉ２５９Ｔ；Ｅ３４７ＫまたはＹ１７Ｖ／Ｉ２５９Ｔ／Ｅ３４７Ｋ）のいずれかによって、分離される。
【００３８】
本発明は、保存的および非保存的アミノ酸置換のいずれかまたは両方を含む１つまたは複数のアミノ酸の相違を含む操作されたポリペプチド配列を含む。本発明の配列表に含まれる特定の組換え炭酸脱水酵素ポリペプチドのアミノ酸配列は、開始メチオニン（Ｍ）残基を含む（すなわち、Ｍは、残基の１位を表す）。しかしながら、当業者は、この開始メチオニン残基が、開始メチオニン残基を欠くがその他の点では酵素の性質を保持する成熟タンパク質を生成するための、宿主細胞またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系においてなどの生物学的プロセシング機構によって除去され得ることを理解する。その結果、「Ｘｎ位で配列番号２と比べたアミノ酸残基の相違」という用語は、本明細書で使用される場合、開始メチオニンを欠くようにプロセシングされた参照配列中の「Ｘｎ」位または対応する位置（例えば、（Ｘ−１）ｎ位）を指し得る。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」という語句は、類似の側鎖を有する残基の互換性を指し、したがって、典型的には、同じまたは類似の定義されたアミノ酸のクラス内のアミノ酸によるポリペプチド中のアミノ酸の置換を含む。限定ではなく例として、一部の実施形態では、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は、別の脂肪族アミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン）で置換され；ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸は、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、セリンおよびトレオニン）で置換され；芳香族側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびヒスチジン）で置換され；塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性側鎖（basis  side  chain）を有する別のアミノ酸（例えば、リシンおよびアルギニン）で置換され；酸性側鎖を有するアミノ酸は、酸性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）で置換され；および／または疎水性もしくは親水性アミノ酸は、それぞれ、別の疎水性もしくは親水性アミノ酸で置き換えられる。例示的な保存的置換を表１に提供する。
【表１】
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【００４０】
本明細書で使用される場合、「非保存的置換」という語句は、著しく異なる側鎖の性質を有するアミノ酸によるポリペプチド中のアミノ酸の置換を指す。非保存的置換は、定義された群内ではなく、群の間のアミノ酸を使用してもよく、（ａ）置換（例えば、グリシンについてプロリン）の領域におけるペプチド主鎖の構造、（ｂ）電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩に影響を及ぼす。限定ではなく例として、例示的な非保存的置換は、塩基性アミノ酸または脂肪族アミノ酸で置換された酸性アミノ酸、小型アミノ酸で置換された芳香族アミノ酸、および疎水性アミノ酸で置換された親水性アミノ酸であり得る。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「欠失」は、参照ポリペプチドからの１つまたは複数のアミノ酸の除去によるポリペプチドの改変を指す。欠失は、操作された酵素の酵素活性を保持し、および／または改善された性質を保持しながら、１もしくはそれより多くのアミノ酸、２もしくはそれより多くのアミノ酸、５つもしくはそれより多くのアミノ酸、１０もしくはそれより多くのアミノ酸、１５もしくはそれより多くのアミノ酸、または２０もしくはそれより多くのアミノ酸、ポリペプチドを構成するアミノ酸の総数の最大１０％、またはアミノ酸の総数の最大２０％の除去を含み得る。欠失は、ポリペプチドの内部部分および／または末端部分を対象とすることができる。さまざまな実施形態では、欠失は、連続するセグメントを含み得るか、または不連続であり得る。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「挿入」は、参照ポリペプチドへの１つまたは複数のアミノ酸の付加によるポリペプチドの改変を指す。一部の実施形態では、改善された操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼ酵素は、天然に存在するデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドへの１つまたは複数のアミノ酸の挿入、ならびに操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドへの１つまたは複数のアミノ酸の挿入を含む。挿入は、ポリペプチドの内部部分にあり得るか、またはカルボキシ末端もしくはアミノ末端にあり得る。本明細書で使用される挿入は、当技術分野において公知の融合タンパク質を含む。挿入は、アミノ酸の連続するセグメントであり得るか、または天然に存在するポリペプチドにおいて１つまたは複数のアミノ酸によって分離され得る。
【００４３】
「アミノ酸置換セット」または「置換セット」という用語は、参照配列と比較して、ポリペプチド配列中のアミノ酸置換の群を指す。置換セットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれよりも多くのアミノ酸置換を有することができる。一部の実施形態では、置換セットは、実施例において提供される表に列挙されたバリアントデオキシリボースリン酸アルドラーゼのいずれかに存在するアミノ酸置換のセットを指す。「置換セット」という用語はまた、参照配列と比較して、ポリヌクレオチド配列中のヌクレオチド置換の群に関して使用される。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「断片」は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を有するが、残りのアミノ酸配列は、配列中の対応する位置と同一であるポリペプチドを指す。断片は、典型的には、全長デオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチド、例えば、配列番号２のポリペプチドの約８０％、約９０％、約９５％、約９８％または約９９％を有することができる。一部の実施形態では、断片は、「生物学的に活性」である（すなわち、それは全長配列と同じ酵素活性を示す）。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「単離されたポリペプチド」は、天然で付随する他の夾雑物（例えば、タンパク質、脂質およびポリヌクレオチド）から実質的に分離されているポリペプチドを指す。この用語は、それらの天然に存在する環境または発現系（例えば、宿主細胞またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成）から取り出されているか、または精製されているポリペプチドを包含する。改善されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼ酵素は、細胞内に存在していてもよく、細胞培地に存在していてもよく、または溶解物もしくは単離された調製物などのさまざまな形態で調製されてもよい。このように、一部の実施形態では、本発明の操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドは、単離されたポリペプチドであり得る。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「実質的に純粋なポリペプチド」は、ポリペプチド種が存在する主要な種である組成物を指し（すなわち、モルまたは重量基準で、それが組成物において任意の他の個々の高分子種より豊富である）、一般に、目的の種がモルまたは重量％で、存在する高分子種の少なくとも約５０パーセントを占める場合、実質的に精製された組成物である。一般に、実質的に純粋な操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチド組成物は、モルまたは重量％で、組成物中に存在するすべての高分子種の約６０％もしくはそれよりも多く、約７０％もしくはそれよりも多く、約８０％もしくはそれよりも多く、約９０％もしくはそれよりも多く、約９１％もしくはそれよりも多く、約９２％もしくはそれよりも多く、約９３％もしくはそれよりも多く、約９４％もしくはそれよりも多く、約９５％もしくはそれよりも多く、約９６％もしくはそれよりも多く、約９７％もしくはそれよりも多く、約９８％もしくはそれよりも多く、または約９９％を占める。溶媒種、小型分子（＜５００ダルトン）および元素イオン種は、高分子種とは見なさない。一部の実施形態では、単離された改善されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「実質的に純粋なポリヌクレオチド」は、ポリヌクレオチド種が存在する主たる種である組成物を指し（すなわち、モルまたは重量基準で、それが組成物において任意の他の個々の高分子種より豊富である）、一般に、目的の種がモルまたは重量％で、存在する高分子種の少なくとも約５０パーセントを占める場合、実質的に精製された組成物である。一般に、実質的に純粋な操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリヌクレオチド組成物は、モルまたは重量％で、組成物中に存在するすべての高分子種の約６０％もしくはそれよりも多く、約７０％もしくはそれよりも多く、約８０％もしくはそれよりも多く、約９０％もしくはそれよりも多く、約９１％もしくはそれよりも多く、約９２％もしくはそれよりも多く、約９３％もしくはそれよりも多く、約９４％もしくはそれよりも多く、約９５％もしくはそれよりも多く、約９６％もしくはそれよりも多く、約９７％もしくはそれよりも多く、約９８％もしくはそれよりも多く、または約９９％を占める。一部の実施形態では、単離された改善されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリヌクレオチド組成物である。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、共有結合で一緒に連結された２つまたはそれよりも多くのヌクレオシドを指す。ポリヌクレオチドは、リボヌクレオシドから全体的に構成されてもよく（すなわち、ＲＮＡ）、２’デオキシリボヌクレオチドから全体的に構成されてもよく（すなわち、ＤＮＡ）、またはリボヌクレオシドおよび２’デオキシリボヌクレオシドの混合物で構成されてもよい。ヌクレオシドは、典型的には、標準的なホスホジエステル結合を介して一緒に連結されるが、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の非標準的な連結を含んでいてもよい。ポリヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖であってもよく、または一本鎖領域および二本鎖領域の両方を含んでいてもよい。また、ポリヌクレオチドは、典型的には、天然に存在するコード核酸塩基（すなわち、アデニン、グアニン、ウラシル、チミンおよびシトシン）から構成されるが、これは、１つまたは複数の修飾核酸塩基および／または合成核酸塩基（例えば、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチンなど）を含んでいてもよい。好ましくは、このような修飾核酸塩基または合成核酸塩基は、コード核酸塩基である。
【００４９】
遺伝子コードヌクレオシド（genetically  encoding  nucleoside）のために使用される略語は、従来のものであり、以下の通りである：アデノシン（Ａ）；グアノシン（Ｇ）；シチジン（Ｃ）；チミジン（Ｔ）；およびウリジン（Ｕ）。具体的に詳述されない限り、略されたヌクレオチドは、リボヌクレオシドまたは２’−デオキシリボヌクレオシドのいずれかであり得る。ヌクレオシドは、個別基準でまたは集合基準で、リボヌクレオシドまたは２’−デオキシリボヌクレオシドのいずれかであると特定され得る。核酸配列が、一連の一文字略語として表される場合、配列は、一般的な慣例に従って、５’から３’の方向で表され、そのリン酸は示さない。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー」は、核酸のハイブリダイゼーションにおける洗浄条件などのハイブリダイゼーション条件に関する。一般に、ハイブリダイゼーション反応は、より低いストリンジェンシーの条件下で行われ、続いて、多様であるが、より高いストリンジェンシーの洗浄を行う。「中ストリンジェントなハイブリダイゼーション」という用語は、標的ＤＮＡが、標的ポリヌクレオチドに対して約９０％よりも高い同一性で、標的ＤＮＡに対して約６０％の同一性、好ましくは、約７５％の同一性、約８５％の同一性を有する相補的核酸に結合することを可能にする条件を指す。例示的な中ストリンジェントな条件は、５０％のホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％のＳＤＳ中、４２℃でのハイブリダイゼーション、続いて、０．２×ＳＳＰＥ、０．２％のＳＤＳ中、４２℃での洗浄と同等の条件である。「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」は、一般に、定義されたポリヌクレオチド配列のための溶液条件下で決定された熱融解温度Ｔｍから約１０℃またはそれより低い条件を指す。一部の実施形態では、高ストリンジェンシー条件は、０．０１８ＭのＮａＣｌ中、６５℃で安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す（すなわち、ハイブリッドが、０．０１８ＭのＮａＣｌ中、６５℃で安定ではない場合、これは、本明細書において企図されるように、高ストリンジェンシー条件下で安定ではない）。高ストリンジェンシー条件は、例えば、５０％のホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％のＳＤＳ、４２℃と同等の条件でのハイブリダイゼーション、続いて、０．１×ＳＳＰＥ、および０．１％のＳＤＳ中、６５℃での洗浄によって提供され得る。別の高ストリンジェンシー条件は、０．１％（ｗ：ｖ）のＳＤＳを含有する５×ＳＳＣ中、６５℃でのハイブリダイズと同等の条件でハイブリダイズさせること、および０．１％のＳＤＳを含有する０．１×ＳＳＣ中、６５℃で洗浄することである。他の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件および中ストリンジェントな条件は、当業者に公知である。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「コード配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸（例えば、遺伝子）の部分を指す。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「コドン最適化」は、コードされるタンパク質が目的の生物において効率的に発現されるように、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンの、特定の生物において優先的に使用されるコドンへの変化を指す。一部の実施形態では、デオキシリボースリン酸アルドラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドは、発現のために選択される宿主生物からの最適な産生のためにコドン最適化されてもよい。遺伝コードは、ほとんどのアミノ酸が、「同義」または「同義の」コドンと呼ばれるいくつかのコドンによって表されるという点において縮重しているが、特定の生物によるコドン使用頻度は、ランダムではなく、特定のコドントリプレットの方に偏っていることは周知である。このコドン使用頻度バイアスは、所与の遺伝子、共通の機能または先祖起源の遺伝子、低コピー数タンパク質に対する高度に発現されるタンパク質、および生物のゲノムの凝集タンパク質コード領域（aggregate  protein  coding  region）に関してより高くてもよい。一部の実施形態では、デオキシリボースリン酸アルドラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドは、発現のために選択される宿主生物からの最適な産生のためにコドン最適化されてもよい。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「好ましく、最適な高いコドン使用頻度バイアスコドン」は、同じアミノ酸をコードする他のコドンより高い頻度でタンパク質コード領域において使用されるコドンを互換可能に指す。好ましいコドンは、単一の遺伝子、共通の機能もしくは起源の遺伝子のセット、高度に発現された遺伝子におけるコドン使用頻度、生物全体の凝集タンパク質コード領域におけるコドン頻度、関連する生物の凝集タンパク質コード領域におけるコドン頻度、またはそれらの組合せに関して決定され得る。その頻度が遺伝子発現のレベルと共に増加するコドンは、典型的には、発現のために最適なコドンである。例えば、クラスター分析または対応分析、および遺伝子において使用されるコドンの有効数を使用する多変量分析を含む種々の方法が、コドン頻度（例えば、コドン使用頻度、相対的に同義のコドン使用頻度）および特定の生物におけるコドン優先選択を決定するために、公知である（例えば、GCG  CodonPreference,  Genetics  Computer  Group  Wisconsin  Package；CodonW,  John  Peden,  University  of  Nottingham;  McInerney,  Bioinform.,  14:372-73  [1998]；Stenico  et  al.,  Nucleic  Acids  Res.,  222:437-46  [1994]；およびWright,  Gene  87:23-29  [1990]を参照のこと）。コドン使用頻度の表は、増え続ける生物のリストについて利用可能である（例えば、Wada  et  al.,  Nucleic  Acids  Res.,  20:2111-2118  [1992]；Nakamura  et  al.,  Nucl.  Acids  Res.,  28:292  [2000]；  Duret,  et  al.、上記;  Henaut  and  Danchin,  "Escherichia  coli  and  Salmonella,"  Neidhardt,  et  al.  (eds.),  ASM  Press,  Washington  D.C.,  [1996],  p.  2047-2066を参照のこと）。コドン使用頻度を得るためのデータソースは、タンパク質についてコードする能力を有する任意の利用可能なヌクレオチド配列に依拠し得る。これらのデータセットは、発現されるタンパク質をコードすることが実際に公知である核酸配列（例えば、完全なタンパク質コード配列−ＣＤＳ）、発現される配列タグ（ＥＳＴＳ）、またはゲノム配列の予想されるコード領域を含む（例えば、Uberbacher,  Meth.  Enzymol.,  266:259-281  [1996]；Tiwari  et  al.,  Comput.  Appl.  Biosci.,  13:263-270  [1997]を参照のこと）。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「制御配列」は、本明細書において、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現のために必要であるか、または有利であるすべての構成要素を含むように定義される。それぞれの制御配列は、目的のポリヌクレオチドに対して、ネイティブまたは外来性であり得る。そのような制御配列としては、限定されるものではないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列および転写ターミネーターが挙げられる。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」は、本明細書において、制御配列が、目的のポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチドの発現を指示または調節するように、制御配列が、目的のポリヌクレオチドに対する位置で適切に（すなわち、機能的な関係で）配置される配置（configuration）として定義される。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「プロモーター配列」は、コード配列などの目的のポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識される核酸配列を指す。制御配列は、適切なプロモーター配列を含んでいてもよい。プロモーター配列は、目的のポリヌクレオチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、変異体、トランケート型およびハイブリッドプロモーターを含む、選択される宿主細胞において転写活性を示す任意の核酸配列であってもよく、宿主細胞に対して同種もしくは異種のいずれかである細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られ得る。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「天然に存在する」および「野生型」は、天然に見出される形態を指す。例えば、天然に存在するか、もしくは野生型のポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然の供給源から単離することができ、ヒトの操作（manipulation）によって意図的に改変されていない、生物中に存在する配列である。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「天然に存在しない」、「操作された」、「バリアント」および「組換え」は、（例えば、細胞、核酸またはポリペプチド）に関して本発明において使用される場合、そうでなければ天然に存在しないはずである様式で改変されている材料、または材料の天然もしくはネイティブ形態に対応する材料を指す。一部の実施形態では、材料は、天然に存在する材料と同一であるが、合成材料からおよび／もしくは組換え技法を使用する操作によって、生成または誘導される。非限定的な例としては、中でも、細胞のネイティブ（非組換え）形態内では見出されない遺伝子を発現するか、またはそうでなければ異なるレベルで発現されるネイティブ遺伝子を発現する、組換え細胞が挙げられる。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「配列同一性のパーセンテージ」、「同一性パーセント」および「同一パーセント」は、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の間の比較を指し、２つの最適に整列させた配列を比較ウィンドウに対して比較することによって決定され、ここで、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適なアライメントのために参照配列と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでいてもよい。パーセンテージは、同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基のいずれかが両方の配列に存在する位置の数を決定するか、または核酸塩基もしくはアミノ酸残基をギャップと共に整列させてマッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を比較ウィンドウにおける位置の総数で除算し、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。最適なアライメントおよび配列同一性パーセントの決定は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズム（例えば、Altschul  et  al.,  J.  Mol.  Biol.  215:  403-410  [1990]；およびAltschul  et  al.,  Nucl.  Acids  Res.,  25:  3389-3402  [1977]）を使用して行われる。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、アメリカ国立生物工学情報センターのウェブサイトを通して公開されている。
【００６０】
簡潔には、ＢＬＡＳＴ分析は、最初に、データベース配列における同じ長さのワードと整列させた場合に、いくつかの正の値の閾値スコアＴとマッチするか、または満たすクエリ配列における短いワード長Ｗを特定することによって、高スコアリングの配列ペア（ＨＳＰ）を特定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と称される（Altschul  et  al.、上記）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見出す検索を開始するためのシードとしての役割を果たす。次いで、ワードヒットを、累積アライメントスコアを増加させることができる範囲まで、それぞれの配列に沿って両方の方向に伸長させる。累積スコアは、ヌクレオチド配列のために、パラメータＭ（マッチする残基の対についての報酬スコア：常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を使用して計算する。アミノ酸配列のためには、スコアリング行列を使用して累積スコアを計算する。それぞれの方向におけるワードヒットの伸長は、以下の場合に停止する：累積アライメントスコアがその最大達成値から量Ｘ低下する；累積スコアが、１つもしくは複数の負のスコアリング残基アライメントの蓄積に起因して、ゼロもしくはそれよりも低くなる；またはいずれかの配列の末端に達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータのＷ、Ｔ、およびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列のため）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列のためには、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列を使用する（例えば、Henikoff  and  Henikoff,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  89:10915  [1989]を参照のこと）。
【００６１】
２つの配列についての同一性パーセントの提供においてＢＬＡＳＴと同様に機能する多数の他のアルゴリズムが利用可能であり、当技術分野において公知である。比較のための配列の最適なアライメントは、当技術分野において公知の任意の適切な方法を使用して（例えば、Smith  and  Waterman,  Adv.  Appl.  Math.,  2:482  [1981]の局所相同性アルゴリズムによって；Needleman  and  Wunsch,  J.  Mol.  Biol.,  48:443  [1970]の相同性アライメントアルゴリズムによって；Pearson  and  Lipman,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  85:2444  [1988]の類似性についての検索方法によって；および／またはこれらのアルゴリズム［ＧＣＧ  ＷｉｓｃｏｎｓｉｎソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ］のコンピューターによる実行によって）、または当技術分野において一般に公知の方法を使用する目視検査によって、実施することができる。加えて、配列アライメントおよび配列同一性パーセントの決定は、提供されたデフォルトパラメータを使用して、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎソフトウェアパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）におけるＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプログラムを用いることができる。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「実質的な同一性」は、少なくとも２０残基位置の比較ウィンドウに対して、しばしば少なくとも３０〜５０残基のウィンドウに対して、参照配列と比較して、少なくとも８０パーセントの配列同一性、少なくとも８５パーセントの同一性、および少なくとも８９〜９５パーセントの配列同一性、より通常は少なくとも９９パーセントの配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を指し、ここで、配列同一性のパーセンテージは、比較ウィンドウに対して、参照配列の合計で２０パーセントまたはそれよりも少ない欠失または付加を含む配列に対して参照配列を比較することによって計算される。ポリペプチドに適用される特定の実施形態では、「実質的な同一性」という用語は、デフォルトのギャップ重さを使用して、プログラムのＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによってなど、最適に整列させた場合に、２つのポリペプチド配列が、少なくとも８０パーセントの配列同一性、好ましくは、少なくとも８９パーセントの配列同一性、少なくとも９５パーセントの配列同一性またはそれより高い配列同一性（例えば、９９パーセントの配列同一性）を共有することを意味する。一部の好ましい実施形態では、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「参照配列」は、別の配列と比較される定義された配列を指す。参照配列は、より大きな配列のサブセット、例えば、全長の遺伝子またはポリペプチド配列のセグメントであってもよい。一般に、参照配列は、少なくとも２０ヌクレオチド長またはアミノ酸残基長、少なくとも２５残基長、少なくとも５０残基長、または全長の核酸もしくはポリペプチドである。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それぞれ、（１）２つの配列間で類似である配列（すなわち、完全な配列の一部）を含んでいてもよく、（２）２つの配列間で相違する配列をさらに含んでいてもよいので、２つの（またはそれより多くの）ポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列比較は、典型的には、比較ウィンドウに対して２つのポリヌクレオチドの配列を比較して、局所領域の配列類似性を同定および比較することによって行われる。「参照配列」という用語は、野生型配列に限定されることを意図するものではなく、操作された配列または変更された配列を含むことができる。例えば、一部の実施形態では、「参照配列」は、あらかじめ操作されたアミノ酸配列または変更されたアミノ酸配列であり得る。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「比較ウィンドウ」は、少なくとも約２０の連続するヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念的セグメントを指し、ここで、配列は、少なくとも２０の連続するヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較されてもよく、比較ウィンドウにおける配列の部分は、２つの配列の最適なアライメントのために参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して２０パーセントまたはそれよりも低い付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでいてもよい。比較ウィンドウは、２０の連続する残基より長くてよく、必要に応じて、３０、４０、５０、１００、またはそれよりも長いウィンドウを含む。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「対応する」、「参照して」および「比べて」は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の番号付けの文脈において使用される場合、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列を参照配列と比較した場合の特定された参照配列の残基の番号付けを指す。言い換えれば、所与のポリマーの残基番号または残基位置は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の数的な位置によってではなく参照配列に関して指定される。例えば、操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼのアミノ酸配列などの所与のアミノ酸配列は、２つの配列間の残基のマッチを最適化するためにギャップを導入することによって、参照配列と整列させることができる。これらの場合では、ギャップは存在するが、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列中の残基の番号付けは、それを整列させた参照配列に関して行われる。本明細書で使用される場合、下記にさらに記載の「Ｘｎ」などの残基位置への言及は、特に他に指示されない限り、「に対応する残基」への言及として解釈されるべきである。したがって、例えば、「Ｘ９４」は、ポリペプチド配列の９４位の任意のアミノ酸を指す。
【００６６】
本明細書で使用される場合、核酸またはポリペプチドに関して使用される場合、「異種」という用語は、通常、生物（例えば、野生型生物）によって発現および分泌されない配列を指す。一部の実施形態では、この用語は、通常天然に見出されるものと同じ互いとの関係において見出されないか、あるいはその発現のレベル、または細胞中における他の核酸もしくは他の分子との物理的関係、または構造が通常天然に見出されるものではないような、組換え操作された、２つまたはそれよりも多くの部分配列を含む配列を包含する。例えば、異種核酸は、典型的には、組換えによって生成され、天然に見出されない様式で配置された無関係の遺伝子由来の２つまたはそれよりも多くの配列を有する（例えば、ベクターなどの発現カセットに挿入されたプロモーター配列に作動可能に連結された本発明の核酸オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ））。一部の実施形態では、「異種ポリヌクレオチド」は、実験技法によって宿主細胞に導入される任意のポリヌクレオチドを指し、宿主細胞から取り出され、実験操作に付され、次いで、宿主細胞に再導入されるポリヌクレオチドを含む。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「改善された酵素の性質」は、参照デオキシリボースリン酸アルドラーゼと比較して、任意の酵素の性質における改善を示すデオキシリボースリン酸アルドラーゼを指す。本明細書に記載の操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドについて、比較は、一般に、野生型デオキシリボースリン酸アルドラーゼ酵素に対して行われるが、一部の実施形態では、参照デオキシリボースリン酸アルドラーゼは、別の改善された操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼであり得る。改善が望まれる酵素の性質としては、限定されるものではないが、酵素活性（指定量のデオキシリボースリン酸アルドラーゼを使用して指定の反応時間での基質の変換パーセントの観点で表すことができる）、化学選択性、熱安定性、溶媒安定性、ｐＨ活性プロファイル、阻害剤に対する不応性（例えば、生成物阻害）、立体特異性、および立体選択性（エナンチオ選択性を含む）が挙げられる。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「酵素活性の増加」は、操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドの改善された性質を指し、これは、参照デオキシリボースリン酸アルドラーゼ酵素と比較して、比活性（例えば、生成した生成物／時間／重量タンパク質）の増加、または基質の生成物への変換パーセント（例えば、指定量のデオキシリボースリン酸アルドラーゼを使用して指定の期間での開始量の基質の生成物への変換パーセント）の増加によって表すことができる。酵素活性を決定するための例示的な方法は、実施例において提供される。Ｋｍ、Ｖｍａｘまたはｋｃａｔの古典的な酵素の性質を含む、酵素活性に関する任意の性質は影響を受け得、その変化が酵素活性の増加をもたらし得る。酵素活性の改善は、対応する野生型デオキシリボースリン酸アルドラーゼ酵素の酵素活性の約１．５倍から、天然に存在するデオキシリボースリン酸アルドラーゼまたはデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドが由来する別の操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼよりも２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、またはそれより高い酵素活性であり得る。一部の実施形態では、操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼ酵素は、親のデオキシリボースリン酸アルドラーゼ酵素のものよりも１．５〜５０倍、１．５〜１００倍高い範囲の改善された酵素活性を示す。任意の酵素の活性が、触媒ターンオーバー速度が、基質の拡散速度を超えることはできないような、拡散限界性であることが当業者に理解される。拡散限界またはｋｃａｔ／Ｋｍの理論的最大値は、一般に、約１０８〜１０９（Ｍ−１  ｓ−１）である。そのため、デオキシリボースリン酸アルドラーゼの酵素活性の任意の改善は、デオキシリボースリン酸アルドラーゼ酵素によって影響を受ける基質の拡散速度に関連する上限がある。酵素活性の比較は、本明細書においてさらに詳細に記載されるように、酵素の規定の調製、設定条件下での規定のアッセイ、および１つまたは複数の規定の基質を使用して行われる。一般に、溶解物が比較される場合、細胞の数およびアッセイされたタンパク質の量が決定されるだけでなく、宿主細胞によって産生され、溶解物中に存在する酵素の量の変動を最小限にするために、同一の発現系および同一の宿主細胞が使用される。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「酵素活性の増加」および「活性の増加」は、操作された酵素の改善された性質を指し、これは、本明細書に記載の参照酵素と比較して、比活性（例えば、生成した生成物／時間／重量タンパク質）の増加、または基質の生成物への変換パーセント（例えば、指定量のデオキシリボースリン酸アルドラーゼを使用して指定の期間での開始量の基質の生成物への変換パーセント）の増加によって表すことができる。Ｋｍ、Ｖｍａｘまたはｋｃａｔの古典的な酵素の性質を含む、酵素活性に関する任意の性質は影響を受け得、その変化が酵素活性の増加をもたらし得る。酵素活性の比較は、本明細書においてさらに詳細に記載されるように、酵素の規定の調製、設定条件下での規定のアッセイ、および１つまたは複数の規定の基質を使用して行われる。一般に、細胞溶解物中の酵素が比較される場合、細胞の数およびアッセイされたタンパク質の量が決定されるだけでなく、宿主細胞によって産生され、溶解物中に存在する酵素の量の変動を最小限にするために、同一の発現系および同一の宿主細胞が使用される。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「変換」は、基質の対応する生成物への酵素的変換を指す。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「変換パーセント」は、指定の条件下で一定の期間内に生成物に変換される基質のパーセントを指す。したがって、例えば、デオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドの「酵素活性」または「活性」は、基質の生成物への「変換パーセント」として表すことができる。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「化学選択性」は、別の生成物に対して１つの生成物の化学反応または酵素反応における優先的な形成を指す。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「熱安定の」および「熱的安定な」とは、未処理の酵素と比較して、設定の温度条件（例えば、４０〜８０℃）に一定期間（例えば、０．５〜２４時間）曝露された場合、不活化に対して耐性であり、したがって、上昇した温度に曝露後に、ある特定のレベルの残留活性（例えば、６０％〜８０％より高い）を保持するポリペプチドを指すために互換可能に使用される。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「溶媒安定な」とは、未処理の酵素と比較して、異なる濃度（例えば、５〜９９％）の溶媒（イソプロピルアルコール、テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフラン、アセトン、トルエン、酢酸ブチル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルなど）に一定期間（例えば、０．５〜２４時間）曝露後に、類似の活性（例えば、６０％〜８０％より高い）を維持するポリペプチドの能力を指す。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「ｐＨ安定な」とは、未処理の酵素と比較して、高いまたは低いｐＨ（例えば、４．５〜６、または８〜１２）に一定期間（例えば、０．５〜２４時間）曝露後に、類似の活性（例えば、６０％〜８０％より高い）を維持するデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドを指す。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「熱および溶媒安定な」とは、熱安定および溶媒安定の両方であるデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドを指す。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「適切な反応条件」は、その条件の下で本発明のデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドが作用する能力を有する生体触媒反応溶液の条件（例えば、酵素添加量、基質添加量、温度、ｐＨ、緩衝液、共溶媒などの範囲）を指す。例示的な「適切な反応条件」は、本発明において提供され、実施例によって説明される。
【００７８】
本明細書で使用される場合、「化合物添加量」および「酵素添加量」などにおける「添加量」は、反応の開始時の反応混合物中の成分の濃度または量を指す。
【００７９】
本明細書で使用される場合、生体触媒媒介プロセスの文脈における「基質」は、生体触媒が作用する化合物または分子を指す。
【００８０】
本明細書で使用される場合、生体触媒媒介プロセスの文脈における「生成物」は、生体触媒の作用から生じる化合物または分子を指す。
【００８１】
本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「平衡」は、化学反応または酵素反応の順方向速度定数および逆方向速度定数によって決定される、立体異性体の相互変換を含む、化学反応または酵素反応（例えば、ＡおよびＢの２つの種の相互変換）において化学種の定常状態の濃度をもたらすプロセスを指す。
【００８２】
「デオキシリボース（Dexyribose）リン酸アルドラーゼ」および「ＤＥＲＡ」は、本明細書において、炭素−炭素結合を可逆的に切断または生じさせ、溶解物のファミリー中のポリペプチドを指すために互換可能に使用される。本明細書で使用されるデオキシリボースリン酸アルドラーゼとしては、天然に存在する（野生型）デオキシリボースリン酸アルドラーゼ、およびヒトの操作によって作成された天然に存在しない操作されたポリペプチドが挙げられる。野生型デオキシリボースリン酸アルドラーゼは、２−デオキシ−Ｄ−リボース（rbiose）５−リン酸のＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸およびアセトアルデヒドへの可逆反応を触媒する。
【００８３】
「Ｒ−２−エチニル−グリセルアルデヒド」および「ＥＧＡ」は、本明細書において、アルドラーゼの反応のための基質を指すために互換可能に使用される。
【００８４】
「（４Ｓ，５Ｒ）−５−エチニル−デオキシリボース」および「ＥＤＲ」は、本明細書において、所望の立体化学を有する生成物を指すために互換可能に使用される。
【００８５】
「補因子」は、本明細書で使用される場合、反応を触媒する際に、酵素と組み合わせて動作する非タンパク質化合物を指す。
【００８６】
「必要に応じた」または「必要に応じて」は、続いて記載される事象もしくは状況が起こってもよく、または起こらなくてもよいこと、ならびに記載が、前記事象または状況が起こる例、および起こらない例を含むことを意味する。当業者は、１つまたは複数の必要に応じた置換基を含有すると記載された任意の分子に関して、立体的に実際的におよび／または合成的に実現可能な化合物のみが含まれることを意味すると理解するはずである。「必要に応じて置換された」とは、１つの用語または一連の化学基におけるすべてのその後の修飾を指す。例えば、「必要に応じて置換されたアリールアルキル」という用語において、分子の「アルキル」部分および「アリール」部分が、置換されていてもよく、または置換されていなくてもよく、一連の「必要に応じて置換されたアルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリール」について、アルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリール基は、他と独立して、置換されていてもよく、または置換されていなくてもよい。
【００８７】
「保護基」は、分子中の反応性官能基に結合したときに、官能基の反応性を、遮蔽、低減または防止する原子の基を指す。典型的には、保護基は、合成の過程の間に、所望により選択的に除去され得る。保護基の例は、当技術分野において公知である（例えば、Wuts  and  Greene,  "Greene's  Protective  Groups  in  Organic  Synthesis,"  4th  Ed.,  Wiley  Interscience  [2006]およびHarrison  et  al.,  Compendium  of  Synthetic  Organic  Methods,  Vols.  1-8,  John  Wiley  &  Sons,  NY  [1971-1976]）。保護基を有し得る官能基としては、限定されるものではないが、ヒドロキシ基、アミノ基およびカルボキシ基が挙げられる。代表的なアミノ保護基としては、限定されるものではないが、ホルミル、アセチル、トリフルオロアセチル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニル（「ＣＢＺ」）、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（「Ｂｏｃ」）、トリメチルシリル（「ＴＭＳ」）、２−トリメチルシリル−エタンスルホニル（「ＳＥＳ」）、トリチルおよび置換トリチル基、アリルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（「ＦＭＯＣ」）、ニトロ−ベラトリルオキシカルボニル（「ＮＶＯＣ」）などが挙げられる。代表的なヒドロキシル保護基としては、限定されるものではないが、ヒドロキシル基が、アシル化（例えば、メチルおよびエチルエステル、酢酸基もしくはプロピオン酸基、またはグリコールエステル）、またはベンジルおよびトリチルエーテルなどのアルキル化されるかのいずれかである基、ならびにアルキルエーテル、テトラヒドロピラニルエーテル、トリアルキルシリルエーテル（例えば、ＴＭＳ基またはＴＩＰＰＳ基）およびアリルエーテルが挙げられる。他の保護基は、本明細書に言及される参照文献中で見出すことができる。
【００８８】
「脱離基」は、一般に、化学反応において、別の原子または部分によって置き換えられる能力を有する任意の原子または部分を指す。より詳細には、脱離基は、求核剤（例えば、アミン、チオール、アルコールまたはシアン化物）によって、容易に置き換えられ、置換される原子または部分を指す。そのような脱離基は、周知であり、カルボキシレート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（「ＮＨＳ」）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素またはヨウ素）およびアルキルオキシ基が挙げられる。脱離基の非限定的な特性および例は、当技術分野において公知であり、さまざまな化学テキストに記載されている。
【００８９】
操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチド
本発明は、デオキシリボースリン酸アルドラーゼ活性を有する操作されたポリペプチド（本明細書において「操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチド」とも称する）を提供する。さらに、本発明は、操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含む関連するベクターおよび宿主細胞、操作されたポリペプチドを作製するための方法、および適切な反応条件を含む操作されたポリペプチドを使用するための方法を提供する。
【００９０】
本発明の操作されたポリペプチドは、本発明の操作されたポリペプチドの指向進化のための出発の主鎖配列として使用される、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｈａｌｉｆａｘｅｎｓｉｓ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｂ０ＴＱ９１；配列番号２）の野生型デオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドと比較して改善された酵素の性質（増加した立体選択性など）を有するように操作された天然に存在しないデオキシリボースリン酸アルドラーゼである。
【００９１】
本発明の操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドは、ＥＧＡおよびアセトアルデヒドの（４Ｓ，５Ｒ）−５−エチニル−デオキシリボース（ＥＤＲ）への効率的な変換のために、配列番号２の指向進化によって生成した。一部の実施形態では、ＥＤＲは、ジアステレオピュア（すなわち、≧９９％ＤＥ）である。一部の実施形態では、変換は、エナンチオピュアなＥＧＡまたはジアステレオピュア（≧９９％ＤＥ）で実施される。一部の追加の実施形態では、変換は、ラセミＥＧＡからのエナンチオピュア（enatiopure）（≧９９％ＥＥ）なＥＤＲで実施される。一部のさらなる実施形態では、これらの性質は、１つまたは複数の組合せで使用され、これは、本発明を任意の特定の試薬の純度レベルに限定することを意図しない。
【００９２】
本発明は、配列番号２〜４７８の偶数配列の識別子のアミノ酸配列を含む、多数の例示的な操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドを提供する。これらの例示的な操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドは、参照配列（例えば、配列番号２、６および／または４６６）と比較して、１つまたは複数の以下の残基の相違を含むアミノ酸配列を含む。
【００９３】
一部の場合では、例示的な操作されたポリペプチドは、参照配列（例えば、配列番号２、６および／または４６６）と比較して、１つまたは複数の残基の相違をさらに含むアミノ酸配列を有する。一部の場合では、例示的な操作されたポリペプチドは、参照配列（例えば、配列番号２、６および／または４６６）と比較して、１つまたは複数の残基の相違をさらに含むアミノ酸配列を有する。
【００９４】
一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号２、６および／または４６６から選択される参照配列と少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高く同一であるアミノ酸配列を含み、ポリペプチドは、デオキシリボースリン酸アルドラーゼ活性、および本明細書に記載の１つまたは複数の改善された性質、例えば、参照配列（例えば、配列番号２、６および／または４６６のポリペプチド）と比較して増加した活性で、ＥＧＡおよびアセトアルデヒドをＥＤＲに変換する能力を有する。一部の実施形態では、参照配列は、配列番号２である。一部の実施形態では、参照配列は、配列番号６である。一部の実施形態では、参照配列は、配列番号４６６である。
【００９５】
一部の実施形態では、アミノ酸配列を含む操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドは、配列番号２、６および／または４６６と比較して、１つまたは複数のアミノ酸残基の相違を有する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号２、６および／または４６６の参照配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、および（ａ）本明細書に提供されるそれらの置換から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基の相違（例えば、表３．１、４．１および６．１を参照のこと）を含む、デオキシリボースリン酸アルドラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。
【００９６】
一部の実施形態では、本発明は、Ｓ２Ｃ、Ｓ２Ｒ、Ｓ２Ｗ、Ｋ６Ｈ、Ｋ６Ｗ、Ｋ６Ｙ、Ｑ９Ｒ、Ｑ１０Ｒ／Ｃ４７Ｍ／Ｄ６６Ｐ／Ｓ１４１Ｔ／Ａ１４５Ｋ／Ｌ１５６Ｉ、Ｑ１０Ｒ／Ｃ４７Ｍ／Ｌ８８Ａ／Ｌ１５６Ｉ、Ｓ１３Ｉ、Ｓ１３Ｌ、Ｓ１３Ｑ、Ｓ１３Ｒ、Ｅ３１Ｌ、Ｉ４６Ｖ、Ｃ４７Ｍ、Ｃ４７Ｍ／Ｉ１３４Ｌ／Ｓ１４１Ｔ／Ｆ２１２Ｙ、Ｃ４７Ｖ、Ｄ６６Ｉ、Ｄ６６Ｌ、Ｄ６６Ｐ、Ｄ６６Ｐ／Ｌ８８Ａ／Ｅ１１２Ａ／Ｉ１３４Ｌ／Ｓ１４１Ｔ／Ｖ１４３Ｅ／Ａ１４５Ｋ／Ｆ２１２Ｙ、Ｄ６６Ｓ、Ｄ６６Ｔ、Ａ７１Ｖ、Ｔ７２Ｃ、Ｌ８８Ｒ、Ｌ８８Ｔ、Ｖ９４Ｋ、Ｖ９４Ｌ、Ｖ９４Ｍ、Ｄ１０２Ｅ、Ｖ１０４Ｔ、Ｅ１１２Ｈ、Ｅ１１２Ｋ、Ｅ１１２Ｌ、Ｅ１１２Ｍ、Ｅ１１２Ｒ、Ｔ１１６Ｇ、Ｔ１１６Ｐ、Ｔ１３３Ｉ／Ａ１７３Ｖ／Ｋ２０４Ｔ／Ｓ２３５Ｄ／Ｓ２３６Ｈ、Ｔ１３３Ｌ、Ｔ１３３Ｍ、Ｉ１３４Ｌ、Ｉ１３４Ｖ、Ａ１４５Ｃ、Ａ１４５Ｒ、Ａ１４５Ｖ／Ａ１７３Ｒ、Ｐ１４７Ａ、Ｐ１４７Ｋ、Ｐ１４７Ｓ、Ａ１７３Ｐ、Ａ１７３Ｔ、Ｍ１８４Ｉ、Ｍ１８４Ｖ、Ｓ１８９Ａ、Ｓ１８９Ｒ、Ｆ１９７Ｃ、Ｆ１９７Ｍ、Ｖ２０３Ｉ、Ｋ２０４Ｔ、Ａ２０７Ｇ、Ｔ２２６Ｓ、Ｓ２３５Ｄ、Ｓ２３５Ｄ／Ｓ２３６Ｒ、Ｓ２３５Ｔ、Ｓ２３６Ｃ、およびＳ２３６Ｄから選択される位置に配列番号２と比較して１つまたは複数のアミノ酸残基の相違を有するアミノ酸配列を含む操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドであって、位置が、配列番号２を参照して番号付けされる、操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、アミノ酸の相違は、Ｓ２Ｃ、Ｓ２Ｒ、Ｓ２Ｗ、Ｋ６Ｈ、Ｋ６Ｗ、Ｋ６Ｙ、Ｑ９Ｒ、Ｑ１０Ｒ／Ｃ４７Ｍ／Ｄ６６Ｐ／Ｓ１４１Ｔ／Ａ１４５Ｋ／Ｌ１５６Ｉ、Ｑ１０Ｒ／Ｃ４７Ｍ／Ｌ８８Ａ／Ｌ１５６Ｉ、Ｓ１３Ｉ、Ｓ１３Ｌ、Ｓ１３Ｑ、Ｓ１３Ｒ、Ｅ３１Ｌ、Ｉ４６Ｖ、Ｃ４７Ｍ、Ｃ４７Ｍ／Ｉ１３４Ｌ／Ｓ１４１Ｔ／Ｆ２１２Ｙ、Ｃ４７Ｖ、Ｄ６６Ｉ、Ｄ６６Ｌ、Ｄ６６Ｐ、Ｄ６６Ｐ／Ｌ８８Ａ／Ｅ１１２Ａ／Ｉ１３４Ｌ／Ｓ１４１Ｔ／Ｖ１４３Ｅ／Ａ１４５Ｋ／Ｆ２１２Ｙ、Ｄ６６Ｓ、Ｄ６６Ｔ、Ａ７１Ｖ、Ｔ７２Ｃ、Ｌ８８Ｒ、Ｌ８８Ｔ、Ｖ９４Ｋ、Ｖ９４Ｌ、Ｖ９４Ｍ、Ｄ１０２Ｅ、Ｖ１０４Ｔ、Ｅ１１２Ｈ、Ｅ１１２Ｋ、Ｅ１１２Ｌ、Ｅ１１２Ｍ、Ｅ１１２Ｒ、Ｔ１１６Ｇ、Ｔ１１６Ｐ、Ｔ１３３Ｉ／Ａ１７３Ｖ／Ｋ２０４Ｔ／Ｓ２３５Ｄ／Ｓ２３６Ｈ、Ｔ１３３Ｌ、Ｔ１３３Ｍ、Ｉ１３４Ｌ、Ｉ１３４Ｖ、Ａ１４５Ｃ、Ａ１４５Ｒ、Ａ１４５Ｖ／Ａ１７３Ｒ、Ｐ１４７Ａ、Ｐ１４７Ｋ、Ｐ１４７Ｓ、Ａ１７３Ｐ、Ａ１７３Ｔ、Ｍ１８４Ｉ、Ｍ１８４Ｖ、Ｓ１８９Ａ、Ｓ１８９Ｒ、Ｆ１９７Ｃ、Ｆ１９７Ｍ、Ｖ２０３Ｉ、Ｋ２０４Ｔ、Ａ２０７Ｇ、Ｔ２２６Ｓ、Ｓ２３５Ｄ、Ｓ２３５Ｄ／Ｓ２３６Ｒ、Ｓ２３５Ｔ、Ｓ２３６ＣおよびＳ２３６Ｄの置換（複数可）を含み、位置は、配列番号２を参照して番号付けされる。
【００９７】
一部の実施形態では、本発明は、２、２／６／１０／６６／８８／１０２／１８４／２３５／２３６、２／６／１０２／１４１／２０３／２３５、２／１０／１０２／２３５／２３６、２／４７／６６／７１／１４１／１８４／２０３／２３５／２３６、２／４７／７１／８８／２０３／２３５／２３６、２／４７／７１／１４１／１９７／２３５／２３６、２／８８／１４１／２３５／２３６、２／２０３／２３５／２３６、５、６／２０３／２３５／２３６、９、１０／４７／６６／１８４／１９７／２３６、１０／４７／６６／２３５／２３６、１０／４７／７１／１８４／２０３／２３５／２３６、１３、１３／４６、１３／４６／６６／９４、１３／４６／６６／９４／１８４／２０４、１３／４６／６６／１３３／１３４／１８４、１３／４６／６６／１８４、１３／４６／１１２／１３４／１８４、１３／４６／１３３／１８４、１３／６６／９４、１３／６６／９４／１８４、１３／６６／１１２／１３３／１３４／１８４／２０４、１３／６６／１１２／１３３／１３４／２０４、１３／６６／１１２／１８４、１３／６６／１３３／１３４／１８４／２０４、１３／６６／１８４／２０４、１３／９４／１３３／１８４、１３／９４／１８４、１３／９４／１８４／２０４、１３／１３３／１３４／１８４、１３／１３３／１３４／２０４、１３／１３４／２０４、１３／１８４、２７、４０、４６／６６／９４／１１２、４６／６６／１１２／１３３／１３４／１８４、４６／６６／１３３／１３４、４６／６６／１３３／１８４／１９７、４６／６６／１３３／１９７、４６／６６／１３４／１８４／１９７／２０４、４６／６６／１８４、４６／１１２／１３３、４６／１１２／１３３／１３４／２０４、４６／１３３／２０４、４６／１９７／２０４、４７／６６／７１／８８／２０３／２３５／２３６、４７／６６／７１／１４１／１８４、４７／６６／８８／１８４／２３５、４７／６６／８８／２０３／２３５／２３６、４７／６６／１４１／２３５／２３６、４７／６６／１８４／１９７／２０３／２３５／２３６、４７／６６／１８４／１９７／２３６、４７／７１／８８／１８４／２０３／２３５、４７／７１／８８／１８４／２０３／２３６、４７／７１／１４１／１８４／２０３／２３５、４７／７１／１８４、４７／７１／１８４／１９７／２３６、４７／７１／１８４／２３５、４７／７１／１８４／２３６、４７／８８／１０２／１４１／２３５／２３６、４７／８８／２０３／２３５／２３６、４７／８８／２３５／２３６、４７／１０２／１８４／１９７／２３５／２３６、４７／１０２／２０３／２３５／２３６、４７／１４１／１８４、４７／１４１／１８４／２３６、４７／１８４／２３６、４７／２０３／２３５、４７／２０３／２３５／２３６、４７／２０３／２３６、４７／２３５／２３６、６２、６６、６６／８８／１０２／１８４／１９７／２０３／２３５／２３６、６６／８８／１９７、６６／８８／２３５、６６／８８／２３５／２３６、６６／９４、６６／９４／１１２／１３３／１８４、６６／９４／１１２／１８４／２０４、６６／１０２／１８４／２３５／２３６、６６／１１２／１３３／１３４／１９７、６６／１１２／１３３／１９７、６６／１１２／１３４／１９７、６６／１１２／１８４、６６／１３３／１８４、６６／１３３／１９７、６６／１８４、６６／１９７／２０３／２３５、８４、８８、８８／１０２／１４１／１８４／２３５／２３６、８８／１８４、８８／１８４／１９７／２０３／２３５／２３６、８８／１８４／１９７／２３５／２３６、８８／１８４／２０３／２３５、８８／１８４／２３６、８８／１９７／２３５／２３６、８８／２３６、９４／１１２／１８４／１９７、９４／１３３／１８４、９６、１０２／１４１／２０３、１０２／１８４／２０３／２３６、１０２／１８４／２３６、１０２／１９７／２３５、１１２、１１２／１３３／１３４、１１２／１３３／１８４／２０４、１１２／１３４／１９７、１１４、１１５、１２０、１２７、１３２、１３３、１３３／１３４／１８４、１４１／１８４／２０３／２３５／２３６、１４１／１８４／２３５、１４１／１９７、１４１／２０３／２３５／２３６、１４１／２３６、１４６、１４８、１８４、１８４／２０３、１８４／２０３／２３５、１８４／２０３／２３６、１８４／２３５／２３６、１８４／２３６、１９７／２３５、２０３／２３５／２３６、２０３／２３６、２０４、２１８、２３５、２３５／２３６、および２３６から選択される位置に配列番号６と比較して１つまたは複数のアミノ酸残基の相違を有するアミノ酸配列を含む操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドであって、位置が、配列番号６を参照して番号付けされる、操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、アミノ酸の相違は、Ｓ２Ｃ／Ｍ４７Ｖ／Ｐ６６Ｌ／Ａ７１Ｖ／Ｔ１４１Ｓ／Ｍ１８４Ｉ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｓ２Ｃ／Ｍ４７Ｖ／Ａ７１Ｖ／Ｌ８８Ａ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｓ２Ｃ／Ｍ４７Ｖ／Ａ７１Ｖ／Ｔ１４１Ｓ／Ｆ１９７Ｍ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｓ２Ｎ、Ｓ２Ｒ／Ｋ６Ｈ／Ｒ１０Ｑ／Ｐ６６Ｌ／Ｌ８８Ａ／Ｄ１０２Ｅ／Ｍ１８４Ｉ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｓ２Ｒ／Ｋ６Ｈ／Ｄ１０２Ｅ／Ｔ１４１Ｓ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｔ、Ｓ２Ｒ／Ｒ１０Ｑ／Ｄ１０２Ｅ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｓ２Ｒ／Ｌ８８Ａ／Ｔ１４１Ｓ／Ｓ２３５Ｄ／Ｓ２３６Ｄ、Ｓ２Ｒ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｋ５Ｒ、Ｋ６Ｈ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｑ９Ｋ、Ｑ９Ｌ、Ｒ１０Ｑ／Ｍ４７Ｖ／Ｐ６６Ｌ／Ｍ１８４Ｉ／Ｆ１９７Ｍ／Ｓ２３６Ｄ、Ｒ１０Ｑ／Ｍ４７Ｖ／Ｐ６６Ｌ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｒ１０Ｑ／Ｍ４７Ｖ／Ａ７１Ｖ／Ｍ１８４Ｉ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｓ１３Ｉ、Ｓ１３Ｉ／Ｉ４６Ｖ、Ｓ１３Ｉ／Ｉ４６Ｖ／Ｐ６６Ｓ／Ｖ９４Ｌ、Ｓ１３Ｉ／Ｉ４６Ｖ／Ｐ６６Ｓ／Ｖ９４Ｌ／Ｍ１８４Ｖ／Ｋ２０４Ｔ、Ｓ１３Ｉ／Ｉ４６Ｖ／Ｐ６６Ｓ／Ｔ１３３Ｌ／Ｉ１３４Ｌ／Ｍ１８４Ｖ、Ｓ１３Ｉ／Ｉ４６Ｖ／Ｐ６６Ｓ／Ｍ１８４Ｖ、Ｓ１３Ｉ／Ｉ４６Ｖ／Ｅ１１２Ｋ／Ｉ１３４Ｌ／Ｍ１８４Ｖ、Ｓ１３Ｉ／Ｉ４６Ｖ／Ｔ１３３Ｌ／Ｍ１８４Ｖ、Ｓ１３Ｉ／Ｉ４６Ｖ／Ｔ１３３Ｍ／Ｍ１８４Ｖ、Ｓ１３Ｉ／Ｐ６６Ｓ／Ｖ９４Ｌ、Ｓ１３Ｉ／Ｐ６６Ｓ／Ｖ９４Ｌ／Ｍ１８４Ｖ、Ｓ１３Ｉ／Ｐ６６Ｓ／Ｅ１１２Ｋ／Ｔ１３３Ｍ／Ｉ１３４Ｌ／Ｍ１８４Ｖ／Ｋ２０４Ｔ、Ｓ１３Ｉ／Ｐ６６Ｓ／Ｅ１１２Ｋ／Ｔ１３３Ｍ／Ｉ１３４Ｌ／Ｋ２０４Ｔ、Ｓ１３Ｉ／Ｐ６６Ｓ／Ｅ１１２Ｍ／Ｍ１８４Ｖ、Ｓ１３Ｉ／Ｐ６６Ｓ／Ｔ１３３Ｍ／Ｉ１３４Ｌ／Ｍ１８４Ｖ／Ｋ２０４Ｔ、Ｓ１３Ｉ／Ｐ６６Ｓ／Ｍ１８４Ｖ／Ｋ２０４Ｔ、Ｓ１３Ｉ／Ｖ９４Ｌ／Ｔ１３３Ｍ／Ｍ１８４Ｖ、Ｓ１３Ｉ／Ｖ９４Ｌ／Ｍ１８４Ｖ、Ｓ１３Ｉ／Ｖ９４Ｌ／Ｍ１８４Ｖ／Ｋ２０４Ｔ、Ｓ１３Ｉ／Ｔ１３３Ｍ／Ｉ１３４Ｌ／Ｍ１８４Ｖ、Ｓ１３Ｉ／Ｔ１３３Ｍ／Ｉ１３４Ｌ／Ｋ２０４Ｔ、Ｓ１３Ｉ／Ｉ１３４Ｌ／Ｋ２０４Ｔ、Ｓ１３Ｉ／Ｍ１８４Ｖ、Ｓ１３Ｌ、Ｓ１３Ｔ、Ｑ２７Ｒ、Ａ４０Ｗ、Ｉ４６Ｖ／Ｐ６６Ｓ／Ｖ９４Ｌ／Ｅ１１２Ｋ、Ｉ４６Ｖ／Ｐ６６Ｓ／Ｅ１１２Ｋ／Ｔ１３３Ｌ／Ｉ１３４Ｌ／Ｍ１８４Ｖ、Ｉ４６Ｖ／Ｐ６６Ｓ／Ｔ１３３Ｌ／Ｉ１３４Ｌ、Ｉ４６Ｖ／Ｐ６６Ｓ／Ｔ１３３Ｌ／Ｍ１８４Ｖ／Ｆ１９７Ｃ、Ｉ４６Ｖ／Ｐ６６Ｓ／Ｔ１３３Ｍ／Ｆ１９７Ｃ、Ｉ４６Ｖ／Ｐ６６Ｓ／Ｉ１３４Ｌ／Ｍ１８４Ｖ／Ｆ１９７Ｃ／Ｋ２０４Ｔ、Ｉ４６Ｖ／Ｐ６６Ｓ／Ｍ１８４Ｖ、Ｉ４６Ｖ／Ｅ１１２Ｋ／Ｔ１３３Ｌ／Ｉ１３４Ｌ／Ｋ２０４Ｔ、Ｉ４６Ｖ／Ｅ１１２Ｍ／Ｔ１３３Ｌ、Ｉ４６Ｖ／Ｔ１３３Ｍ／Ｋ２０４Ｔ、Ｉ４６Ｖ／Ｆ１９７Ｃ／Ｋ２０４Ｔ、Ｍ４７Ｖ／Ｐ６６Ｌ／Ａ７１Ｖ／Ｌ８８Ａ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｍ４７Ｖ／Ｐ６６Ｌ／Ａ７１Ｖ／Ｔ１４１Ｓ／Ｍ１８４Ｉ、Ｍ４７Ｖ／Ｐ６６Ｌ／Ｌ８８Ａ／Ｍ１８４Ｉ／Ｓ２３５Ｔ、Ｍ４７Ｖ／Ｐ６６Ｌ／Ｌ８８Ａ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｍ４７Ｖ／Ｐ６６Ｌ／Ｔ１４１Ｓ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｍ４７Ｖ／Ｐ６６Ｌ／Ｍ１８４Ｉ／Ｆ１９７Ｍ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｍ４７Ｖ／Ｐ６６Ｌ／Ｍ１８４Ｉ／Ｆ１９７Ｍ／Ｓ２３６Ｄ、Ｍ４７Ｖ／Ａ７１Ｖ／Ｌ８８Ａ／Ｍ１８４Ｉ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｄ、Ｍ４７Ｖ／Ａ７１Ｖ／Ｌ８８Ａ／Ｍ１８４Ｉ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３６Ｄ、Ｍ４７Ｖ／Ａ７１Ｖ／Ｔ１４１Ｓ／Ｍ１８４Ｉ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｄ、Ｍ４７Ｖ／Ａ７１Ｖ／Ｍ１８４Ｉ、Ｍ４７Ｖ／Ａ７１Ｖ／Ｍ１８４Ｉ／Ｆ１９７Ｍ／Ｓ２３６Ｄ、Ｍ４７Ｖ／Ａ７１Ｖ／Ｍ１８４Ｉ／Ｓ２３５Ｔ、Ｍ４７Ｖ／Ａ７１Ｖ／Ｍ１８４Ｉ／Ｓ２３６Ｄ、Ｍ４７Ｖ／Ｌ８８Ａ／Ｄ１０２Ｅ／Ｔ１４１Ｓ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｍ４７Ｖ／Ｌ８８Ａ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｄ／Ｓ２３６Ｄ、Ｍ４７Ｖ／Ｌ８８Ａ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｍ４７Ｖ／Ｄ１０２Ｅ／Ｍ１８４Ｉ／Ｆ１９７Ｍ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｍ４７Ｖ／Ｄ１０２Ｅ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｍ４７Ｖ／Ｔ１４１Ｓ／Ｍ１８４Ｉ、Ｍ４７Ｖ／Ｔ１４１Ｓ／Ｍ１８４Ｉ／Ｓ２３６Ｄ、Ｍ４７Ｖ／Ｍ１８４Ｉ／Ｓ２３６Ｄ、Ｍ４７Ｖ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｄ、Ｍ４７Ｖ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｍ４７Ｖ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３６Ｄ、Ｍ４７Ｖ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｅ６２Ｌ、Ｐ６６Ａ、Ｐ６６Ｃ、Ｐ６６Ｈ、Ｐ６６Ｌ／Ｌ８８Ａ／Ｄ１０２Ｅ／Ｍ１８４Ｉ／Ｆ１９７Ｍ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｐ６６Ｌ／Ｌ８８Ａ／Ｆ１９７Ｍ、Ｐ６６Ｌ／Ｌ８８Ａ／Ｓ２３５Ｄ、Ｐ６６Ｌ／Ｌ８８Ａ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｐ６６Ｌ／Ｄ１０２Ｅ／Ｍ１８４Ｉ／Ｓ２３５Ｄ／Ｓ２３６Ｄ、Ｐ６６Ｌ／Ｍ１８４Ｉ、Ｐ６６Ｌ／Ｆ１９７Ｍ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｄ、Ｐ６６Ｓ／Ｖ９４Ｌ、Ｐ６６Ｓ／Ｖ９４Ｌ／Ｅ１１２Ｋ／Ｔ１３３Ｌ／Ｍ１８４Ｖ、Ｐ６６Ｓ／Ｖ９４Ｌ／Ｅ１１２Ｋ／Ｍ１８４Ｖ／Ｋ２０４Ｔ、Ｐ６６Ｓ／Ｖ９４Ｌ／Ｅ１１２Ｍ／Ｔ１３３Ｍ／Ｍ１８４Ｖ、Ｐ６６Ｓ／Ｅ１１２Ｋ／Ｔ１３３Ｌ／Ｉ１３４Ｌ／Ｆ１９７Ｃ、Ｐ６６Ｓ／Ｅ１１２Ｋ／Ｉ１３４Ｌ／Ｆ１９７Ｃ、Ｐ６６Ｓ／Ｅ１１２Ｋ／Ｍ１８４Ｖ、Ｐ６６Ｓ／Ｅ１１２Ｍ／Ｔ１３３Ｌ／Ｆ１９７Ｃ、Ｐ６６Ｓ／Ｔ１３３Ｌ／Ｆ１９７Ｃ、Ｐ６６Ｓ／Ｔ１３３Ｍ／Ｍ１８４Ｖ、Ｐ６６Ｓ／Ｍ１８４Ｖ、Ａ８４Ｃ、Ａ８４Ｌ、Ｌ８８Ａ／Ｄ１０２Ｅ／Ｔ１４１Ｓ／Ｍ１８４Ｉ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｌ８８Ａ／Ｍ１８４Ｉ、Ｌ８８Ａ／Ｍ１８４Ｉ／Ｆ１９７Ｍ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｌ８８Ａ／Ｍ１８４Ｉ／Ｆ１９７Ｍ／Ｓ２３５Ｄ／Ｓ２３６Ｄ、Ｌ８８Ａ／Ｍ１８４Ｉ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｄ、Ｌ８８Ａ／Ｍ１８４Ｉ／Ｓ２３６Ｄ、Ｌ８８Ａ／Ｆ１９７Ｍ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｌ８８Ａ／Ｓ２３６Ｄ、Ｌ８８Ｈ、Ｌ８８Ｖ、Ｖ９４Ｌ／Ｅ１１２Ｍ／Ｍ１８４Ｖ／Ｆ１９７Ｃ、Ｖ９４Ｌ／Ｔ１３３Ｌ／Ｍ１８４Ｖ、Ｙ９６Ｌ、Ｄ１０２Ｅ／Ｔ１４１Ｓ／Ｖ２０３Ｉ、Ｄ１０２Ｅ／Ｍ１８４Ｉ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３６Ｄ、Ｄ１０２Ｅ／Ｍ１８４Ｉ／Ｓ２３６Ｄ、Ｄ１０２Ｅ／Ｆ１９７Ｍ／Ｓ２３５Ｄ、Ｅ１１２Ｃ、Ｅ１１２Ｋ／Ｔ１３３Ｌ／Ｍ１８４Ｖ／Ｋ２０４Ｔ、Ｅ１１２Ｋ／Ｔ１３３Ｍ／Ｉ１３４Ｌ、Ｅ１１２Ｋ／Ｉ１３４Ｌ／Ｆ１９７Ｃ、Ｅ１１２Ｎ、Ｎ１１４Ｒ、Ｅ１１５Ｄ、Ｅ１１５Ｖ、Ｅ１２０Ｍ、Ｅ１２０Ｒ、Ｅ１２７Ｇ、Ｅ１２７Ｈ、Ｅ１２７Ｌ、Ｅ１２７Ｒ、Ｅ１２７Ｔ、Ｅ１２７Ｖ、Ｄ１３２Ｌ、Ｔ１３３Ｇ、Ｔ１３３Ｈ、Ｔ１３３Ｌ、Ｔ１３３Ｍ／Ｉ１３４Ｌ／Ｍ１８４Ｖ、Ｔ１３３Ｒ、Ｔ１４１Ｓ／Ｍ１８４Ｉ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｔ１４１Ｓ／Ｍ１８４Ｉ／Ｓ２３５Ｄ、Ｔ１４１Ｓ／Ｆ１９７Ｍ、Ｔ１４１Ｓ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｄ／Ｓ２３６Ｄ、Ｔ１４１Ｓ／Ｓ２３６Ｄ、Ｄ１４６Ｑ、Ａ１４８Ｇ、Ａ１４８Ｌ、Ｍ１８４Ｉ／Ｖ２０３Ｉ、Ｍ１８４Ｉ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｄ、Ｍ１８４Ｉ／Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３６Ｄ、Ｍ１８４Ｉ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｍ１８４Ｉ／Ｓ２３６Ｄ、Ｍ１８４Ｖ、Ｆ１９７Ｍ／Ｓ２３５Ｄ、Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６Ｄ、Ｖ２０３Ｉ／Ｓ２
３６Ｄ、Ｋ２０４Ｔ、Ｒ２１８Ｓ、Ｓ２３５Ｄ／Ｓ２３６Ｄ、Ｓ２３５Ｔ、Ｓ２３５Ｔ／Ｓ２３６ＤおよびＳ２３６Ｄの置換（複数可）を含み、位置は、配列番号６を参照して番号付けされる。
【００９８】
一部の実施形態では、デオキシリボースリン酸アルドラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、適切な反応条件下、参照ポリペプチド（例えば、配列番号２、６および／または４６６）の基質許容性と比べて基質（例えば、アセトアルデヒド）の存在に対する許容性の増加を有して、ＥＧＡおよびアセトアルデヒドをＥＤＲに変換する能力を有する。したがって、一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、適切な反応条件下、約７２時間、約４８時間、約３６時間、約２４時間またはさらにより短い時間の反応時間において、少なくとも約１ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、約３０ｇ／Ｌ、約４０ｇ／Ｌ、約５０ｇ／Ｌ、約７０ｇ／Ｌ、約７５ｇ／Ｌ、約１００ｇ／Ｌの基質添加量の濃度で、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の変換パーセントで、ＥＧＡおよびアセトアルデヒドをＥＤＲに変換する能力を有する。
【００９９】
一部の適切な反応条件であって、その下で、操作されたポリペプチドの上記に記載の改善された性質が、ポリペプチドの濃度もしくは量、基質、緩衝液、ｐＨ、ならびに／または温度および反応時間を含む条件に関して決定することができる、一部の適切な反応条件を本明細書に提供する。一部の実施形態では、適切な反応条件は、下記および実施例に記載のアッセイ条件を含む。
【０１００】
当業者に明らかであるように、前述の残基の位置、およびそれぞれの残基位置についての特定のアミノ酸残基は、中でも、酵素活性、基質／生成物の好ましさ、立体選択性、基質／生成物の許容性、ならびに温度の上昇、溶媒および／またはｐＨなどのさまざまな条件下での安定性を含む所望の改善された性質を有するデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドを合成するために、個々に、またはさまざまな組合せで使用することができる。
【０１０１】
一部の実施形態では、本発明は、機能的デオキシリボースリン酸アルドラーゼ活性および／または操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドの改善された性質を保持した、本明細書に記載の操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドのいずれかの断片を含む操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドも提供する。したがって、一部の実施形態では、本発明は、デオキシリボースリン酸アルドラーゼ活性を有する（例えば、適切な反応条件下で、ＥＧＡおよびアセトアルデヒドをＥＤＲに変換する能力を有する）ポリペプチド断片を提供し、断片は、配列番号２〜４７８の偶数配列の識別子を有する例示的な操作されたポリペプチドなどの本発明の操作されたポリペプチドの全長アミノ酸配列の少なくとも約８０％、９０％、９５％、９８％または９９％を含む。
【０１０２】
一部の実施形態では、本発明の操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドは、配列番号２〜４７８の偶数配列の識別子を有する例示的な操作されたポリペプチド配列などの本明細書に記載の操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチド配列のいずれか１つと比較して、欠失を含むアミノ酸配列を含む。したがって、本発明の操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドのそれぞれおよびすべての実施形態について、アミノ酸配列は、１つもしくはそれより多くのアミノ酸、２つもしくはそれより多くのアミノ酸、３つもしくはそれより多くのアミノ酸、４つもしくはそれより多くのアミノ酸、５つもしくはそれより多くのアミノ酸、６つもしくはそれより多くのアミノ酸、８つもしくはそれより多くのアミノ酸、１０もしくはそれより多くのアミノ酸、１５もしくはそれより多くのアミノ酸、または２０もしくはそれより多くのアミノ酸、デオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドのアミノ酸の総数の最大で１０％、アミノ酸の総数の最大で１０％、アミノ酸の総数の最大で２０％、またはアミノ酸の総数の最大で３０％の欠失を含むことができ、本明細書に記載の操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼの関連する機能活性および／または改善された性質は維持される。一部の実施形態では、欠失は、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２１、１〜２２、１〜２３、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜４５、１〜５０、１〜５５または１〜６０アミノ酸残基を含むことができる。一部の実施形態では、欠失の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３０、３５、４０、４５、５０、５５または６０アミノ酸残基であり得る。一部の実施形態では、欠失は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５または３０アミノ酸残基の欠失を含むことができる。
【０１０３】
一部の実施形態では、本発明は、配列番号２〜４７８の偶数配列の識別子を有する例示的な操作されたポリペプチド配列などの本明細書に記載の操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチド配列のいずれか１つと比較して、挿入を含むアミノ酸配列を有する操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドを提供する。したがって、本発明のデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドのそれぞれおよびすべての実施形態について、挿入は、１つもしくはそれより多くのアミノ酸、２つもしくはそれより多くのアミノ酸、３つもしくはそれより多くのアミノ酸、４つもしくはそれより多くのアミノ酸、５つもしくはそれより多くのアミノ酸、６つもしくはそれより多くのアミノ酸、８つもしくはそれより多くのアミノ酸、１０もしくはそれより多くのアミノ酸、１５もしくはそれより多くのアミノ酸、または２０もしくはそれより多くのアミノ酸を含むことができ、本明細書に記載の操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼの関連する機能活性および／または改善された性質は維持される。挿入は、デオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドのアミノ末端もしくはカルボキシ末端、または内部部分にあってよい。
【０１０４】
一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは、操作されたポリペプチドが、限定ではなく例として、抗体タグ（例えば、ｍｙｃエピトープ）、精製配列（例えば、金属への結合のためのＨｉｓタグ）および細胞局在化シグナル（例えば、分泌シグナル）などの他のポリペプチドと融合された、融合ポリペプチドの形態である。したがって、本明細書に記載の操作されたポリペプチドは、他のポリペプチドへの融合が有りまたは無しで使用することができる。
【０１０５】
本明細書に記載の操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドは、遺伝子によってコードされるアミノ酸に限らない。したがって、遺伝子によってコードされるアミノ酸に加えて、本明細書に記載のポリペプチドは、全体的または部分的に、天然に存在するおよび／または合成の非コードアミノ酸で構成され得る。本明細書に記載のポリペプチドを構成し得るある特定の一般的に遭遇する非コードアミノ酸としては、限定されるものではないが、遺伝子によってコードされるアミノ酸のＤ−立体異性体；２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）；α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；ε−アミノヘキサン酸（Ａｈａ）；δ−アミノ吉草酸（Ａｖａ）；Ｎ−メチルグリシンまたはサルコシン（ＭｅＧｌｙまたはＳａｒ）；オルニチン（Ｏｒｎ）；シトルリン（Ｃｉｔ）；ｔ−ブチルアラニン（Ｂｕａ）；ｔ−ブチルグリシン（Ｂｕｇ）；Ｎ−メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）；フェニルグリシン（Ｐｈｇ）；シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；ノルロイシン（Ｎｌｅ）；ナフチルアラニン（Ｎａｌ）；２−クロロフェニルアラニン（Ｏｃｆ）；３−クロロフェニルアラニン（Ｍｃｆ）；４−クロロフェニルアラニン（Ｐｃｆ）；２−フルオロフェニルアラニン（Ｏｆｆ）；３−フルオロフェニルアラニン（Ｍｆｆ）；４−フルオロフェニルアラニン（Ｐｆｆ）；２−ブロモフェニルアラニン（Ｏｂｆ）；３−ブロモフェニルアラニン（Ｍｂｆ）；４−ブロモフェニルアラニン（Ｐｂｆ）；２−メチルフェニルアラニン（Ｏｍｆ）；３−メチルフェニルアラニン（Ｍｍｆ）；４−メチルフェニルアラニン（Ｐｍｆ）；２−ニトロフェニルアラニン（Ｏｎｆ）；３−ニトロフェニルアラニン（Ｍｎｆ）；４−ニトロフェニルアラニン（Ｐｎｆ）；２−シアノフェニルアラニン（Ｏｃｆ）；３−シアノフェニルアラニン（Ｍｃｆ）；４−シアノフェニルアラニン（Ｐｃｆ）；２−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｏｔｆ）；３−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｍｔｆ）；４−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｐｔｆ）；４−アミノフェニルアラニン（Ｐａｆ）；４−ヨードフェニルアラニン（Ｐｉｆ）；４−アミノメチルフェニルアラニン（Ｐａｍｆ）；２，４−ジクロロフェニルアラニン（Ｏｐｅｆ）；３，４−ジクロロフェニルアラニン（Ｍｐｃｆ）；２，４−ジフルオロフェニルアラニン（Ｏｐｆｆ）；３，４−ジフルオロフェニルアラニン（Ｍｐｆｆ）；ピリド−２−イルアラニン（２ｐＡｌａ）；ピリド−３−イルアラニン（３ｐＡｌａ）；ピリド−４−イルアラニン（４ｐＡｌａ）；ナフタ−１−イルアラニン（１ｎＡｌａ）；ナフタ−２−イルアラニン（２ｎＡｌａ）；チアゾリルアラニン（ｔａＡｌａ）；ベンゾチエニルアラニン（ｂＡｌａ）；チエニルアラニン（ｔＡｌａ）；フリルアラニン（ｆＡｌａ）；ホモフェニルアラニン（ｈＰｈｅ）；ホモチロシン（ｈＴｙｒ）；ホモトリプトファン（ｈＴｒｐ）；ペンタフルオロフェニルアラニン（５ｆｆ）；スチリルアラニン（styrylkalanine）（ｓＡｌａ）；アントリルアラニン（authrylalanine）（ａＡｌａ）；３，３−ジフェニルアラニン（Ｄｆａ）；３−アミノ−５−フェニルペンタン酸（phenypentanoic  acid）（Ａｆｐ）；ペニシラミン（Ｐｅｎ）；１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）；β−２−チエニルアラニン（Ｔｈｉ）；メチオニンスルホキシド（Ｍｓｏ）；Ｎ（ｗ）−ニトロアルギニン（ｎＡｒｇ）；ホモリシン（ｈＬｙｓ）；ホスホノメチルフェニルアラニン（ｐｍＰｈｅ）；ホスホセリン（ｐＳｅｒ）；ホスホトレオニン（ｐＴｈｒ）；ホモアスパラギン酸（ｈＡｓｐ）；ホモグルタミン酸（ｈＧｌｕ）；１−アミノシクロペンタ−（２または３）−エン−４カルボン酸；ピペコリン酸（ＰＡ）、アゼチジン−３−カルボン酸（ＡＣＡ）；１−アミノシクロペンタン−３−カルボン酸；アリルグリシン（ａＯｌｙ）；プロパルギルグリシン（ｐｇＧｌｙ）；ホモアラニン（ｈＡｌａ）；ノルバリン（ｎＶａｌ）；ホモロイシン（ｈＬｅｕ）、ホモバリン（ｈＶａｌ）；ホモイソロイシン（ｈＩｌｅ）；ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）；Ｎ−アセチルリシン（ＡｃＬｙｓ）；２，４−ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）；２，３−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）；Ｎ−メチルバリン（ＭｅＶａｌ）；ホモシステイン（ｈＣｙｓ）；ホモセリン（ｈＳｅｒ）；ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）およびホモプロリン（ｈＰｒｏ）が挙げられる。本明細書に記載のポリペプチドを構成し得る追加の非コードアミノ酸は、当業者に明らかである。これらのアミノ酸は、Ｌ配置またはＤ配置のいずれかであり得る。
【０１０６】
当業者は、側鎖保護基を有するアミノ酸または残基が本明細書に記載のポリペプチドも含み得ることを認識する。この場合では、芳香族のカテゴリーに属するそのような保護されたアミノ酸の非限定的な例としては、限定されるものではないが、Ａｒｇ（ｔｏｓ）、Ｃｙｓ（メチルベンジル）、Ｃｙｓ（ニトロピリジンスルフェニル）、Ｇｌｕ（δ−ベンジルエステル）、Ｇｌｎ（キサンチル）、Ａｓｎ（Ｎ−δ−キサンチル）、Ｈｉｓ（ｂｏｍ）、Ｈｉｓ（ベンジル）、Ｈｉｓ（ｔｏｓ）、Ｌｙｓ（ｆｍｏｃ）、Ｌｙｓ（ｔｏｓ）、Ｓｅｒ（Ｏ−ベンジル）、Ｔｈｒ（Ｏ−ベンジル）およびＴｙｒ（Ｏ−ベンジル）が挙げられる（保護基を丸括弧内に列挙する）。
【０１０７】
本明細書に記載のポリペプチドを構成し得る立体構造的に制約される非コードアミノ酸としては、限定されるものではないが、Ｎ−メチルアミノ酸（Ｌ−配置）；１−アミノシクロペンタ−（２または３）−エン−４−カルボン酸；ピペコリン酸；アゼチジン−３−カルボン酸；ホモプロリン（ｈＰｒｏ）；および１−アミノシクロペンタン−３−カルボン酸が挙げられる。
【０１０８】
一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、膜、樹脂、固体担体または他の固相材料などの固体支持体上に提供され得る。固体支持体は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシおよびポリアクリルアミド、ならびにそれらのコポリマーおよびグラフトなどの有機ポリマーで構成され得る。固体支持体はまた、ガラス、シリカ、制御細孔ガラス（ＣＰＧ）、逆相シリカ、または金もしくは白金などの金属などの無機物であり得る。固体支持体の形状は、ビーズ、球、粒子、顆粒、ゲル、膜または面の形態であり得る。面は、平面、実質的に平面、または非平面であり得る。固体支持体は、多孔性または非多孔性であり得、膨潤特性または非膨潤特性を有し得る。固体支持体は、ウェル、窪みまたは他の容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）、容器（ｖｅｓｓｅｌ）、フィーチャまたは場所（location）の形態で配置され得る。
【０１０９】
一部の実施形態では、デオキシリボースリン酸アルドラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、それらが、参照ポリペプチド（例えば、配列番号２、６および／または４６６）と比べて、それらの改善された活性、エナンチオ選択性、立体選択性および／または他の改善された性質を保持するように、固体支持体上に結合または固定される。そのような実施形態では、固定されたポリペプチドは、基質化合物の所望の生成物への生体触媒変換を促進することができ、その反応が完了した後、容易に保持され（例えば、ポリペプチドが固定されているビーズを保持することによって）、次いで、その後の反応において再使用または再利用される。そのような固定された酵素プロセスは、さらなる効率およびコスト低減を可能にする。したがって、本発明の操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドを使用する任意の方法を、固体支持体上に結合または固定された同じデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドを使用して行うことができることがさらに企図される。
【０１１０】
操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドは、非共有結合で、または共有結合で結合され得る。酵素の固体支持体（例えば、樹脂、膜、ビーズ、ガラスなど）へのコンジュゲーションおよび固定のためのさまざまな方法は、当技術分野において周知である。特に、ＰＣＴ公開の国際公開第２０１２／１７７５２７Ａ１号は、固定されたポリペプチドを調製する方法を開示しており、ここで、ポリペプチドは、疎水性相互作用または共有結合のいずれかによって樹脂に物理的に付着され、少なくとも最大で１００％の有機溶媒を含む溶媒系中で安定である。固体支持体（例えば、樹脂、膜、ビーズ、ガラスなど）への酵素のコンジュゲーションおよび固定のための他の方法は、当技術分野において周知である（例えば、Yi  et  al.,  Proc.  Biochem.,  42:  895-898  [2007]；Martin  et  al.,  Appl.  Microbiol.  Biotechnol.,  76:  843-851  [2007]；Koszelewski  et  al.,  J.  Mol.  Cat.  B:  Enz.,  63:  39-44  [2010]；Truppo  et  al.,  Org.  Proc.  Res.  Develop.,オンライン：dx.doi.org/10.1021/op200157cで公開；およびMateo  et  al.,  Biotechnol.  Prog.,  18:629-34  [2002]などを参照のこと）。
【０１１１】
本発明の操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドを固定するために有用な固体支持体としては、限定されるものではないが、エポキシド官能基を有するポリメタクリレート、アミノエポキシド官能基を有するポリメタクリレート、オクタデシル官能基を有するスチレン／ＤＶＢコポリマーもしくはポリメタクリレートを含む、ビーズまたは樹脂が挙げられる。本発明の操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼを固定するために有用な例示的な固体支持体としては、限定されるものではないが、キトサンビーズ、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ  Ｃ、ならびに以下の異なるタイプ：ＳＥＰＡＢＥＡＤ：ＥＣ−ＥＰ、ＥＣ−ＨＦＡ／Ｓ、ＥＸＡ２５２、ＥＸＥ１１９およびＥＸＥ１２０を含むＳＥＰＡＢＥＡＤ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）が挙げられる。
【０１１２】
一部の実施形態では、操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドは、ポリペプチドが位置的に区別される場所に配置されたアレイの形態で提供される。一部の実施形態では、位置的に区別される場所は、９６ウェルプレートなどの固体支持体中のウェルである。複数の支持体は、試薬のロボット送達のため、または検出方法および／もしくは装置によって対処可能なさまざまな場所で、アレイ上に配置され得る。そのようなアレイは、ポリペプチドによる変換について種々の基質化合物を試験するために使用することができる。
【０１１３】
一部の実施形態では、本明細書に記載の操作されたポリペプチドは、キットの形態で提供される。キット中のポリペプチドは、個々または複数のポリペプチドとして存在していてもよい。キットは、酵素反応を行うための試薬、ポリペプチドの活性を評価するための基質、および生成物を検出するための試薬をさらに含むことができる。キットは、試薬ディスペンサーおよびキットの使用のための指示を含むこともできる。一部の実施形態では、本発明のキットは、複数の異なる操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドを対処可能な異なる位置に含むアレイを含み、ここで、異なるポリペプチドは、少なくとも１つの異なる改善された酵素の性質をそれぞれ有する参照配列の異なるバリアントである。複数の操作されたポリペプチドを含むそのようなアレイおよびそれらの使用方法は、公知である（例えば、国際公開第２００９／００８９０８Ａ２号を参照のこと）。
【０１１４】
操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドを調製するために有用なポリヌクレオチド、制御配列、発現ベクターおよび宿主細胞
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のデオキシリボースリン酸アルドラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、遺伝子発現を制御する１つまたは複数の異種調節配列に作動可能に連結させて、ポリペプチドを発現する能力を有する組換えポリヌクレオチドを生じさせ得る。操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含有する発現構築物を、適切な宿主細胞に導入して、対応する操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドを発現させることができる。
【０１１５】
一部の実施形態では、改善されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドは、ポリペプチドの改善された活性および／または発現を提供する種々の方法で操作される。単離されたポリヌクレオチドのベクターへの挿入前の操作は、発現ベクターに応じて、望まししいか、または必要であり得る。組換えＤＮＡ法を利用するポリヌクレオチドおよび核酸配列を改変するための技法は、当技術分野において周知である。
【０１１６】
当業者は、遺伝コードの縮重に起因して、本発明のバリアントデオキシリボースリン酸アルドラーゼのアシラーゼポリペプチドをコードする多数のヌクレオチド配列が存在することを理解する。例えば、コドンＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧおよびＣＧＵは、すべて、アミノ酸のアルギニンをコードする。したがって、コドンによってアルギニンが特定される本発明の核酸におけるすべての位置にて、コドンは、コードされるポリペプチドを変更することなく、上記に記載の対応するコドンのいずれかに変更され得る。ＲＮＡ配列における「Ｕ」は、ＤＮＡ配列における「Ｔ」に対応することが理解される。本発明は、可能性があるコドン選択に基づいて組合せを選択することによって作製され得る、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列のそれぞれおよびすべての可能性があるバリエーションを企図し、提供する。
【０１１７】
上記に示したように、デオキシリボースリン酸アルドラーゼをコードするＤＮＡ配列はまた、高いコドン使用頻度バイアスコドン（同じアミノ酸についてコードする他のコドンよりも、タンパク質のコード領域においてより高い頻度で使用されるコドン）のために設計され得る。好ましいコドンは、単一の遺伝子、共通の機能もしくは起源の遺伝子のセット、高度に発現された遺伝子におけるコドン使用頻度、生物全体の凝集タンパク質コード領域におけるコドン頻度、関連する生物の凝集タンパク質コード領域におけるコドン頻度、またはそれらの組合せに関して決定され得る。その頻度が遺伝子発現のレベルと共に増加するコドンは、典型的には、発現のために最適なコドンである。特に、ＤＮＡ配列は、特定の宿主生物における発現のために最適化することができる。コドン頻度（例えば、コドン使用頻度、相対的同義コドン使用頻度）、および多変量分析（例えば、クラスター分析または対応分析を使用する）を含む特定の生物におけるコドン優先選択、および遺伝子中で使用されるコドンの有効な数を決定するための種々の方法が当技術分野において周知である。コドン使用頻度を得るためのデータソースは、タンパク質についてコードする能力を有する任意の利用可能なヌクレオチド配列に依拠し得る。これらのデータセットとしては、当技術分野において周知であるように、発現されるタンパク質をコードすることが実際に公知の核酸配列（例えば、完全なタンパク質コード配列−ＣＤＳ）、発現される配列タグ（ＥＳＴ）、またはゲノム配列の予測されるコード領域が挙げられる。バリアントデオキシリボースリン酸アルドラーゼをコードするポリヌクレオチドは、当技術分野において公知の任意の適切な方法を使用して調製することができる。典型的には、オリゴヌクレオチドは、個々に合成され、次いで、結合して（例えば、酵素的もしくは化学的連結法、またはポリメラーゼ媒介法によって）、本質的に任意の所望の連続的な配列を形成する。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、限定されるものではないが自動合成法を含む、当技術分野において公知の任意の適切な方法を使用する化学合成によって調製される。例えば、ホスホルアミダイト法では、オリゴヌクレオチドを、合成し（例えば、自動ＤＮＡ合成機において）、精製し、アニーリングし、ライゲーションし、適切なベクターにクローニングする。一部の実施形態では、二本鎖ＤＮＡ断片は、次いで、相補鎖を合成すること、および適切な条件下で、その鎖を一緒にアニーリングすることによって、または適切なプライマー配列を有するＤＮＡポリメラーゼを使用して相補鎖を付加することによってのいずれかで得る。本発明において有用な方法を提供する多数の一般的で標準的なテキストが当業者に周知である。
【０１１８】
例えば、変異誘発および指向進化法を、ポリヌクレオチドに容易に適用して、発現させ、スクリーニングし、アッセイすることができるバリアントライブラリーを作成することができる。変異誘発および指向進化法は、当技術分野において周知である（例えば、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号、同第５，８３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号、同第５，８３７，４５８号、同第５，９２８，９０５号、同第６，０９６，５４８号、同第６，１１７，６７９号、同第６，１３２，９７０号、同第６，１６５，７９３号、同第６，１８０，４０６号、同第６，２５１，６７４号、同第６，２６５，２０１号、同第６，２７７，６３８号、同第６，２８７，８６１号、同第６，２８７，８６２号、同第６，２９１，２４２号、同第６，２９７，０５３号、同第６，３０３，３４４号、同第６，３０９，８８３号、同第６，３１９，７１３号、同第６，３１９，７１４号、同第６，３２３，０３０号、同第６，３２６，２０４号、同第６，３３５，１６０号、同第６，３３５，１９８号、同第６，３４４，３５６号、同第６，３５２，８５９号、同第６，３５５，４８４号、同第６，３５８，７４０号、同第６，３５８，７４２号、同第６，３６５，３７７号、同第６，３６５，４０８号、同第６，３６８，８６１号、同第６，３７２，４９７号、同第６，３３７，１８６号、同第６，３７６，２４６号、同第６，３７９，９６４号、同第６，３８７，７０２号、同第６，３９１，５５２号、同第６，３９１，６４０号、同第６，３９５，５４７号、同第６，４０６，８５５号、同第６，４０６，９１０号、同第６，４１３，７４５号、同第６，４１３，７７４号、同第６，４２０，１７５号、同第６，４２３，５４２号、同第６，４２６，２２４号、同第６，４３６，６７５号、同第６，４４４，４６８号、同第６，４５５，２５３号、同第６，４７９，６５２号、同第６，４８２，６４７号、同第６，４８３，０１１号、同第６，４８４，１０５号、同第６，４８９，１４６号、同第６，５００，６１７号、同第６，５００，６３９号、同第６，５０６，６０２号、同第６，５０６，６０３号、同第６，５１８，０６５号、同第６，５１９，０６５号、同第６，５２１，４５３号、同第６，５２８，３１１号、同第６，５３７，７４６号、同第６，５７３，０９８号、同第６，５７６，４６７号、同第６，５７９，６７８号、同第６，５８６，１８２号、同第６，６０２，９８６号、同第６，６０５，４３０号、同第６，６１３，５１４号、同第６，６５３，０７２号、同第６，６８６，５１５号、同第６，７０３，２４０号、同第６，７１６，６３１号、同第６，８２５，００１号、同第６，９０２，９２２号、同第６，９１７，８８２号、同第６，９４６，２９６号、同第６，９６１，６６４号、同第６，９９５，０１７号、同第７，０２４，３１２号、同第７，０５８，５１５号、同第７，１０５，２９７号、同第７，１４８，０５４号、同第７，２２０，５６６号、同第７，２８８，３７５号、同第７，３８４，３８７号、同第７，４２１，３４７号、同第７，４３０，４７７号、同第７，４６２，４６９号、同第７，５３４，５６４号、同第７，６２０，５００号、同第７，６２０，５０２号、同第７，６２９，１７０号、同第７，７０２，４６４号、同第７，７４７，３９１号、同第７，７４７，３９３号、同第７，７５１，９８６号、同第７，７７６，５９８号、同第７，７８３，４２８号、同第７，７９５，０３０号、同第７，８５３，４１０号、同第７，８６８，１３８号、同第７，７８３，４２８号、同第７，８７３，４７７号、同第７，８７３，４９９号、同第７，９０４，２４９号、同第７，９５７，９１２号、同第７，９８１，６１４号、同第８，０１４，９６１号、同第８，０２９，９８８号、同第８，０４８，６７４号、同第８，０５８，００１号、同第８，０７６，１３８号、同第８，１０８，１５０号、同第８，１７０，８０６号、同第８，２２４，５８０号、同第８，３７７，６８１号、同第８，３８３，３４６号、同第８，４５７，９０３号、同第８，５０４，４９８号、同第８，５８９，０８５号、同第８，７６２，０６６号、同第８，７６８，８７１号、同第９，５９３，３２６号、およびすべての関連する米国以外の対応特許；Ling  et  al.,  Anal.  Biochem.,  254(2):157-78  [1997]；Dale  et  al.,  Meth.  Mol.  Biol.,  57:369-74  [1996]；Smith,  Ann.  Rev.  Genet.,  19:423-462  [1985]；Botstein  et  al.,  Science,  229:1193-1201  [1985]；Carter,  Biochem.  J.,  237:1-7  [1986]；Kramer  et  al.,  Cell,  38:879-887  [1984]；Wells  et  al.,  Gene,  34:315-323  [1985]；Minshull  et  al.,  Curr.  Op.  Chem.  Biol.,  3:284-290  [1999]；Christians  et  al.,  Nat.  Biotechnol.,  17:259-264  [1999]；Crameri  et  al.,  Nature,  391:288-291  [1998]；Crameri,  et  al.,  Nat.  Biotechnol.,  15:436-438  [1997]；Zhang  et  al.,  Proc.  Nat.  Acad.  Sci.  U.S.A.,  94:4504-4509  [1997]；Crameri  et  al.,  Nat.  Biotechnol.,  14:315-319  [1996]；Stemmer,  Nature,  370:389-391  [1994]；Stemmer,  Proc.  Nat.  Acad.  Sci.  USA,  91:10747-10751  [1994]；国際公開第９５／２２６２５号；国際公開第９７／００７８号；国際公開第９７／３５９６６号；国際公開第９８／２７２３０号；国際公開第００／４２６５１号；国際公開第０１／７５７６７号；および国際公開第２００９／１５２３３６号を参照のこと、これらのすべては参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０１１９】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２〜４７８の偶数配列の識別子から選択される参照配列と少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高く同一であるアミノ酸配列を含むデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドをコードし、ポリペプチドは、デオキシリボースリン酸アルドラーゼ活性、および本明細書に記載の１つまたは複数の改善された性質、例えば、参照配列（例えば、配列番号２、６および／または４６６のポリペプチド）と比較して活性の増加を有して、ＥＧＡおよびアセトアルデヒドをＥＤＲに変換する能力を有する。一部の実施形態では、参照配列は、配列番号２、６および／または４６６から選択される。一部の実施形態では、参照配列は、配列番号２である。一部の実施形態では、参照配列は、配列番号６である。一部の実施形態では、参照配列は、配列番号４６６である。
【０１２０】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、上記に記載の同一性パーセントを有するアミノ酸配列を含む操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドをコードし、（ａ）配列番号２、６および／または４６６と比較して、１つまたは複数のアミノ酸残基の相違を有する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号２、６および／または４６６の参照配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列、および（ａ）本明細書に提供されるそれらの置換から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基の相違（例えば、表３．１、４．１および６．１を参照のこと）を含む、デオキシリボースリン酸アルドラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。
【０１２１】
一部の実施形態では、操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１〜４７７の奇数配列の識別子から選択される配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１および５から選択される。一部の実施形態では、本発明は、デオキシリボースリン酸アルドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチドであって、操作されたポリペプチドが、配列番号２および６から選択される少なくとも１つの参照配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有する、操作されたポリヌクレオチドを提供する。
【０１２２】
一部の実施形態では、本発明は、中ストリンジェントまたは高ストリンジェントな条件下などの定義された条件下で、本発明の操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼをコードするポリヌクレオチド配列（またはその相補体）とハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１〜４７７の奇数配列の識別子を有する配列から選択されるポリヌクレオチド、またはその相補体と、高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする能力を有し、本明細書に記載の１つまたは複数の改善された性質を有するデオキシリボースリン酸アルドラーゼを有するポリペプチドをコードする。
【０１２３】
一部の実施形態では、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする能力を有するポリヌクレオチドは、本明細書に提供されるように、配列番号２または配列番号６と比較して、１つまたは複数のアミノ酸残基の相違を有するアミノ酸配列を含む操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドをコードする。
【０１２４】
一部の実施形態では、本発明のバリアントデオキシリボースリン酸アルドラーゼは、酵素のコードされる活性を変更しない追加の配列をさらに含む。例えば、一部の実施形態では、バリアントデオキシリボースリン酸アルドラーゼは、エピトープタグ、または精製において有用な別の配列に連結される。
【０１２５】
一部の実施形態では、本発明のバリアントデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドは、それらを発現する宿主細胞（例えば、酵母または糸状菌宿主細胞）から分泌され、シグナルペプチド（すなわち、ポリペプチドのアミノ末端に連結され、コードされるポリペプチドを細胞の分泌経路に向けるアミノ酸配列）を含むプレタンパク質として発現される。
【０１２６】
操作されたポリペプチドの配列が公知である場合、酵素をコードするポリヌクレオチドは、公知の合成法に従って、標準的な固相法によって調製することができる。一部の実施形態では、約１００塩基までの断片を個々に合成し、次いで結合して（例えば、酵素的もしくは化学的ライゲーション法、またはポリメラーゼ媒介法によって）、任意の所望の連続的な配列を形成することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、化学合成（典型的には、自動化された合成法で実施されるので、例えば、Beaucage  et  al.,  Tet.  Lett.,  22:1859-69  [1981]によって記載された古典的なホスホルアミダイト法、またはMatthes  et  al.,  EMBO  J.,  3:801-05  [1984]によって記載された方法を使用する）によって調製され得る。ホスホルアミダイト法に従って、オリゴヌクレオチドを合成し（例えば、自動ＤＮＡ合成機において）、精製し、アニーリングし、ライゲーションし、適切なベクターにクローニングする。加えて、本質的に任意の核酸は、任意の種々の商業的供給業者（例えば、Ｔｈｅ  Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｍｉｄｌａｎｄ、ＴＸ、Ｔｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒａｍｏｎａ、ＣＡ、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ  Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ、および多くの他の供給業者）から入手することができる。
【０１２７】
本発明は、本明細書に提供される少なくとも１つのバリアントデオキシリボースリン酸アルドラーゼをコードする配列を含む組換え構築物も提供する。一部の実施形態では、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結されたバリアントデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。一部の実施形態では、本発明の発現ベクターを使用して、適切な宿主細胞を形質転換して、宿主細胞がバリアントデオキシリボースリン酸アルドラーゼタンパク質を発現することを可能にする。真菌および他の生物におけるタンパク質の組換え発現のための方法は、当技術分野において周知であり、多くの発現ベクターが、利用可能であるか、または慣例の方法を使用して構築することができる。一部の実施形態では、本発明の核酸構築物は、本発明の核酸配列が挿入された、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）などのベクターを含む。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、バリアントデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチド（複数可）を発現するために適切な種々の発現ベクターのいずれか１つに組み込まれる。適切なベクターとしては、限定されるものではないが、染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列および合成ＤＮＡ配列（例えば、ＳＶ４０の誘導体）、ならびに細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドおよびファージＤＮＡの組合せに由来するベクター、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、および多くの他のものなどのウイルスＤＮＡが挙げられる。遺伝子材料を細胞に形質導入し、複製が望ましい場合には、関連する宿主において複製可能および生存可能である任意の適切なベクターが、本発明において使用される。
【０１２８】
一部の実施形態では、構築物は、タンパク質をコードする配列に作動可能に連結された、限定されるものではないが、プロモーターを含む調節配列をさらに含む。多数の適切なベクターおよびプロモーターは、当業者に公知である。実際に、一部の実施形態では、特定の宿主において高い発現のレベルを得るために、多くの場合、異種プロモーターの制御下、本発明のバリアントデオキシリボースリン酸アルドラーゼを発現させることが有用である。一部の実施形態では、プロモーター配列は、当技術分野において公知の任意の適切な方法を使用して、バリアントデオキシリボースリン酸アルドラーゼコード配列の５’領域に作動可能に連結される。バリアントデオキシリボースリン酸アルドラーゼの発現のために有用なプロモーターの例としては、限定されるものではないが、真菌由来のプロモーターが挙げられる。一部の実施形態では、真菌株においてデオキシリボースリン酸アルドラーゼ遺伝子以外の遺伝子の発現を駆動するプロモーター配列が使用される。非限定的な例として、エンドグルカナーゼをコードする遺伝子由来の真菌プロモーターを使用してもよい。一部の実施形態では、デオキシリボースリン酸アルドラーゼが由来する真菌株以外の真菌株においてデオキシリボースリン酸アルドラーゼ遺伝子の発現を駆動するプロモーター配列が使用される。糸状菌宿主細胞において本発明のヌクレオチド構築物の転写を指示するために有用な他の適切なプロモーターの例としては、限定されるものではないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性アルファ−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ酸安定アルファ−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ（例えば、国際公開第９６／００７８７号を参照のこと、参照によって本明細書に組み込まれる）の遺伝子から得られるプロモーター、ならびにＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性アルファ−アミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子由来のプロモーターのハイブリッド）、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、ｐｅｐＡ、ｈｆｂ１、ｈｆｂ２、ｘｙｎ１、ａｍｙおよびｇｌａＡなどのプロモーター（例えば、Nunberg  et  al.,  Mol.  Cell  Biol.,  4:2306  -2315  [1984]；Boel  et  al.,  EMBO  J.,  3:1581-85  [1984]；および欧州特許出願第１３７２８０号を参照のこと、これらのすべては参照によって本明細書に組み込まれる）、ならびにそれらの変異体、トランケート型、およびハイブリッドプロモーターが挙げられる。
【０１２９】
酵母宿主細胞では、有用なプロモーターとしては、限定されるものではないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ｅｎｏ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅガラクトキナーゼ（ｇａｌ１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３−ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子由来のプロモーターが挙げられる。酵母宿主細胞のために有用な追加の有用なプロモーターは、当技術分野において公知である（例えば、Romanos  et  al.,  Yeast  8:423-488  [1992]を参照のこと、参照によって本明細書に組み込まれる）。加えて、真菌におけるキチナーゼ産生に関連するプロモーターが本発明において使用される（例えば、Blaiseau  and  Lafay,  Gene  120243-248  [1992]；およびLimon  et  al.,  Curr.  Genet.,  28:478-83  [1995]、これらは両方とも参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０１３０】
細菌宿主細胞のためには、本開示の核酸構築物の転写を指示するために適切なプロモーターとしては、限定されるものではないが、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃオペロン、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｔｒｐオペロン、バクテリオファージラムダ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓマルトジェニックアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓアルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、および原核生物のベータ−ラクタマーゼ遺伝子（例えば、Villa-Kamaroff  et  al.,  Proc.  Natl  Acad.  Sci.  USA  75:  3727-3731  [1978]を参照のこと）、ならびにｔａｃプロモーター（例えば、DeBoer  et  al.,  Proc.  Natl  Acad.  Sci.  USA  80:  21-25  [1983]を参照のこと）から得られるプロモーターが挙げられる。
【０１３１】
一部の実施形態では、クローニングされた本発明のバリアントデオキシリボースリン酸アルドラーゼは、宿主細胞によって認識されて転写を終結させる配列である、適切な転写ターミネーター配列も有する。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結される。選択される宿主細胞において機能する任意のターミネーターが、本発明において使用される。糸状菌宿主細胞のための例示的な転写ターミネーターとしては、限定されるものではないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒアルファ−グルコシダーゼおよびＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ（例えば、米国特許第７，３９９，６２７号を参照のこと、参照によって本明細書に組み込まれる）の遺伝子から得られる転写ターミネーターが挙げられる。一部の実施形態では、酵母宿主細胞のための例示的なターミネーターとしては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅチトクロムＣ（ＣＹＣ１）およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から得られるターミネーターが挙げられる。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネーターは、当業者に周知である（例えば、Romanos  et  al.,  Yeast  8:423-88  [1992]を参照のこと）。
【０１３２】
一部の実施形態では、適切なリーダー配列は、クローニングされたバリアントデオキシリボースリン酸アルドラーゼ配列の一部であり、これは、宿主細胞による翻訳のために重要であるｍＲＮＡの非翻訳領域である。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動可能に連結される。選択される宿主細胞において機能する任意のリーダー配列が、本発明において使用される。糸状菌宿主細胞のための例示的なリーダーとしては、限定されるものではないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られるリーダーが挙げられる。酵母宿主細胞のための適切なリーダーとしては、限定されるものではないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ−因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られるリーダーが挙げられる。
【０１３３】
一部の実施形態では、本発明の配列は、核酸配列の３’末端に作動可能に連結され、転写されると、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するシグナルとして宿主細胞によって認識される、ポリアデニル化配列も含む。選択される宿主細胞において機能する任意のポリアデニル化配列が、本発明において使用される。糸状菌宿主細胞のための例示的なポリアデニル化配列としては、限定されるものではないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒアルファ−グルコシダーゼの遺伝子から得られるポリアデニル化配列が挙げられる。酵母宿主細胞のために有用なポリアデニル化配列は、当技術分野において公知である（例えば、Guo  and  Sherman,  Mol.  Cell.  Biol.,  15:5983-5990  [1995]を参照のこと）。
【０１３４】
一部の実施形態では、制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードするシグナルペプチドコード領域を含み、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に向ける。核酸配列のコード配列の５’末端は、本質的に、翻訳リーディングフレームにおいて、分泌されたポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと天然に連結されたシグナルペプチドコード領域とを含有していてもよい。あるいは、コード配列の５’末端は、コード配列に対して外来であるシグナルペプチドコード領域を含有していてもよい。外来シグナルペプチドコード領域は、コード配列がシグナルペプチドコード領域を天然に含有しない場合に必要であり得る。
【０１３５】
あるいは、外来シグナルペプチドコード領域は、ポリペプチドの分泌を増強するために、天然のシグナルペプチドコード領域を単に置き換え得る。しかしながら、発現されるポリペプチドを選択される宿主細胞の分泌経路に向ける任意のシグナルペプチドコード領域を本発明において使用してもよい。
【０１３６】
一部の実施形態では、シグナルペプチドは、内在性Ｖ．ｆｌｕｖｉａｌｉｓのデオキシリボースリン酸アルドラーゼシグナルペプチドである。一部の追加の実施形態では、他のＶ．ｆｌｕｖｉａｌｉｓ分泌タンパク質由来のシグナルペプチドが使用される。一部の実施形態では、他のシグナルペプチドは、宿主細胞および他の要因に応じて、使用される。
【０１３７】
細菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域としては、限定されるものではないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ＮＣｌＢ  １１８３７マルトジェニックアミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓアルファ−アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓサブチリシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓベータ−ラクタマーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｐｒｓＡの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域が挙げられる。さらなるシグナルペプチドは、当技術分野において公知である（例えば、Simonen  and  Palva,  Microbiol.  Rev.,  57:109-137  [1993]を参照のこと）。
【０１３８】
糸状菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域としては、限定されるものではないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓセルラーゼおよびＨｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域が挙げられる。
【０１３９】
酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドとしては、限定されるものではないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ−因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼの遺伝子が挙げられる。他の有用なシグナルペプチドコード領域は、当技術分野において公知である（例えば、Romanos  et  al.,  [1992]、上記を参照のこと）。
【０１４０】
一部の実施形態では、制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域を含む。得られるポリペプチドは、プロ酵素またはプロポリペプチド（または一部の場合では、酵素原）として公知である。プロポリペプチドは、一般に、不活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的または自己触媒的切断によって、成熟活性デオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドに変換することができる。プロペプチドコード領域としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ−因子、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼおよびＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａラクターゼ（例えば、国際公開第９５／３３８３６号を参照のこと）の遺伝子から得られ得る。
【０１４１】
シグナルペプチドおよびプロペプチド領域の両方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端の隣に位置し、シグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のアミノ末端の隣に位置する。
【０１４２】
一部の実施形態では、調節配列はまた、宿主細胞の成長に関連して、ポリペプチドの発現の調節を可能にするために使用される。調節系の例は、調節化合物の存在を含む、化学的もしくは物理的刺激に応答してオンまたはオフされる遺伝子の発現を引き起こす系である。原核宿主細胞では、適切な調節配列としては、限定されるものではないが、ｌａｃ、ｔａｃおよびｔｒｐオペレーター系が挙げられる。酵母宿主細胞では、適切な調節系としては、例として、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系が挙げられる。糸状菌では、適切な調節配列としては、ＴＡＫＡアルファ−アミラーゼプロモーター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼプロモーターおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅグルコアミラーゼプロモーターが挙げられる。
【０１４３】
調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にするものである。真核生物の系では、これらとしては、メトトレキサートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、および重金属で増幅されるメタロチオネイン遺伝子が挙げられる。これらの場合では、本発明のデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドをコードする核酸配列は、調節配列に作動可能に連結されるはずである。
【０１４４】
したがって、一部の追加の実施形態では、本発明は、操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドまたはそのバリアントをコードするポリヌクレオチド、ならびにそれらが導入される宿主の種類に応じて、プロモーターおよびターミネーター、複製起点などのような１つまたは複数の発現調節領域を含む、組換え発現ベクターを提供する。一部の実施形態では、上記に記載のさまざまな核酸および制御配列を一緒に結合して、そのような部位でポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換を可能にするために１つまたは複数の好都合な制限部位を含んでいてもよい、組換え発現ベクターを生成する。あるいは、一部の実施形態では、核酸配列は、核酸配列またはその配列を含む核酸構築物を、発現のための適切なベクターに挿入することによって発現される。発現ベクターの作製において、コード配列は、コード配列が発現のための適切な制御配列に作動可能に連結されるように、ベクターに位置する。
【０１４５】
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に好都合に付すことができ、ポリヌクレオチド配列の発現をもたらすことができる、任意の適切なベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）を含む。ベクターの選択は、典型的には、ベクターと、ベクターが導入される宿主細胞との適合性に依存する。一部の実施形態では、ベクターは、線形または閉環状のプラスミドである。
【０１４６】
一部の実施形態では、発現ベクターは、自己複製ベクター（すなわち、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体または人工染色体などの、その複製が染色体の複製とは無関係である染色体外実体として存在するベクター）である。一部の実施形態では、ベクターは、自己複製を確実にするための任意の手段を含有する。あるいは、一部の他の実施形態では、宿主細胞に導入される際に、ベクターは、ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体（複数可）と一緒に複製される。さらにまた、追加の実施形態では、宿主細胞のゲノムに導入される総ＤＮＡを一緒に含有する、単一のベクターもしくはプラスミド、または２つもしくはそれよりも多くのベクターもしくはプラスミド、あるいはトランスポゾンが利用される。
【０１４７】
一部の実施形態では、本発明の発現ベクターは、形質転換細胞の容易な選択を可能にする１つまたは複数の選択マーカーを含有する。「選択マーカー」は、その生成物が、殺生物剤もしくはウイルスに対する耐性、抗菌剤または重金属に対する耐性、栄養要求株に対する原栄養性などを提供する遺伝子である。限定されるものではないが、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸還元酵素）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびにそれらの同等物を含む、糸状菌宿主細胞における使用のための任意の適切な選択マーカーが本発明において使用される。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓなどの宿主細胞において有用な追加のマーカーとしては、限定されるものではないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのａｍｄＳ遺伝子およびｐｙｒＧ遺伝子、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓのｂａｒ遺伝子が挙げられる。酵母宿主細胞のための適切なマーカーとしては、限定されるものではないが、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１およびＵＲＡ３が挙げられる。細菌の選択マーカーの例としては、限定されるものではないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のｄａｌ遺伝子、またはアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールおよび／もしくはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を付与するマーカーが挙げられる。
【０１４８】
一部の実施形態では、本発明の発現ベクターは、ベクターの宿主細胞のゲノムへの組込み、またはゲノムとは無関係の細胞におけるベクターの自己複製を可能にするエレメント（複数可）を含有する。宿主細胞ゲノムへの統合を含む一部の実施形態では、ベクターは、ポリペプチドをコードする核酸配列、または相同もしくは非相同組換えによるベクターのゲノムへの組込みのためのベクターの任意の他のエレメントに依拠する。
【０１４９】
一部の代替の実施形態では、発現ベクターは、宿主細胞のゲノムへの相同組換えによる組込みを指示するための追加の核酸配列を含有する。追加の核酸配列は、ベクターが、染色体（複数可）の正確な場所（複数可）で宿主細胞のゲノムに組み込まれることを可能にする。正確な場所での組込みの可能性を増加させるために、組込みエレメントは、好ましくは、相同組換えの確率を増強するために対応する標的配列と高度に相同である、１００〜１０，０００塩基対、好ましくは、４００〜１０，０００塩基対、最も好ましくは、８００〜１０，０００塩基対などの十分な数のヌクレオチドを含有する。組込みエレメントは、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同である任意の配列であり得る。さらにまた、組込みエレメントは、非コード核酸配列またはコード核酸配列であり得る。他方では、ベクターは、非相同組換えによって宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよい。
【０１５０】
自己複製のために、ベクターは、ベクターが問題の宿主細胞において自己複製することを可能にする複製起点をさらに含んでいてもよい。細菌の複製起点の例は、Ｐ１５Ａ  ｏｒｉもしくはプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣｌ７７（このプラスミドはＰ１５Ａ  ｏｒｉを有する）の複製起点、またはＥ．ｃｏｌｉにおける複製を可能にするｐＡＣＹＣ１８４、およびＢａｃｉｌｌｕｓにおける複製を可能にするｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０もしくはｐＡＭβ１である。酵母宿主細胞における使用のための複製起点の例は、２ミクロンの複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１およびＣＥＮ３の組合せ、ならびにＡＲＳ４およびＣＥＮ６の組合せである。複製起点は、宿主細胞において温度感受性で機能するようにする変異を有するものであってもよい（例えば、Ehrlich,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  75:1433  [1978]を参照のこと）。
【０１５１】
一部の実施形態では、本発明の核酸配列の２つ以上のコピーは、遺伝子産物の産生を増加させるために、宿主細胞に挿入される。選択マーカー遺伝子の増幅されたコピー、およびそれにより、核酸配列の追加のコピーを含有する細胞を、細胞を適切な選択剤の存在下で培養することによって選択することができる場合、核酸配列のコピー数の増加は、配列の少なくとも１つの追加のコピーを宿主細胞のゲノム中に組み込むことによって、または、増幅可能な選択マーカー遺伝子を核酸配列と共に含めることによって得ることができる。
【０１５２】
本発明における使用のための多くの発現ベクターが市販されている。適切な市販の発現ベクターとしては、限定されるものではないが、ｐ３ｘＦＬＡＧＴＭ（商標）発現ベクター（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）が挙げられ、これは、ＣＭＶプロモーター、および哺乳動物宿主細胞における発現のためのｈＧＨポリアデニル化部位、およびｐＢＲ３２２複製開始点、およびＥ．ｃｏｌｉにおける増幅のためのアンピシリン耐性マーカーを含む。他の適切な発現ベクターとしては、限定されるものではないが、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）およびｐＢＫ−ＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ならびにｐＢＲ３２２（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ｐＵＣ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＰｏｌｙ（例えば、Lathe  et  al.,  Gene  57:193-201  [1987]を参照のこと）に由来するプラスミドが挙げられる。
【０１５３】
したがって、一部の実施形態では、少なくとも１つのバリアントデオキシリボースリン酸アルドラーゼをコードする配列を含むベクターは、ベクターの増殖（propagation）およびバリアントデオキシリボースリン酸アルドラーゼ（複数可）の発現を可能にするために、宿主細胞に形質転換される。一部の実施形態では、バリアントデオキシリボースリン酸アルドラーゼを翻訳後修飾して、シグナルペプチドを除去し、一部の場合では、分泌後に切断してもよい。一部の実施形態では、上記に記載の形質転換された宿主細胞は、バリアントデオキシリボースリン酸アルドラーゼ（複数可）の発現を可能にする条件下で、適切な栄養培地中で培養される。限定されるものではないが、適切な補充物を含有する最小培地または複合培地を含む、宿主細胞を培養するために有用な任意の適切な培地が本発明において使用される。一部の実施形態では、宿主細胞は、ＨＴＰ培地中で成長させる。適切な培地は、さまざまな商業的供給業者から入手可能であるか、または公開されたレシピ（例えば、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関のカタログ中）に従って調製されてもよい。
【０１５４】
別の態様では、本発明は、本明細書に提供される改善されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供し、ポリヌクレオチドは、宿主細胞においてデオキシリボースリン酸アルドラーゼ酵素の発現のための１つまたは複数の制御配列に作動可能に連結されている。本発明の発現ベクターによってコードされるデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドの発現における使用のための宿主細胞は、当技術分野において周知であり、限定されるものではないが、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞などの細菌細胞；酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣアクセッション番号２０１１７８））などの真菌細胞；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、２９３およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞などの動物細胞；ならびに植物細胞が挙げられる。上記に記載の宿主細胞のための適切な培養培地および成長条件は、当技術分野において周知である。
【０１５５】
デオキシリボースリン酸アルドラーゼの発現のためのポリヌクレオチドは、当技術分野において公知のさまざまな方法によって細胞に導入され得る。技法としては、中でも、電気穿孔、微粒子銃、リポソーム媒介トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクションおよびプロトプラスト融合が挙げられる。ポリヌクレオチドを細胞に導入するためのさまざまな方法は、当業者に公知である。
【０１５６】
一部の実施形態では、宿主細胞は、真核細胞である。適切な真核生物宿主細胞としては、限定されるものではないが、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞および植物細胞が挙げられる。適切な真菌宿主細胞としては、限定されるものではないが、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ、Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ、Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔａ、Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ、Ｆｕｎｇｉ  ｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉが挙げられる。一部の実施形態では、真菌宿主細胞は、酵母細胞および糸状菌細胞である。本発明の糸状菌宿主細胞は、Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ亜門およびＯｏｍｙｃｏｔａ亜門のすべての糸状形態を含む。糸状菌は、キチン、セルロースおよび他の複合多糖で構成される細胞壁を有する栄養菌糸によって特徴付けられる。本発明の糸状菌宿主細胞は、酵母とは形態学的に区別される。
【０１５７】
本発明の一部の実施形態では、糸状菌宿主細胞は、限定されるものではないが、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍｅｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍおよび／もしくはＶｏｌｖａｒｉｅｌｌａ、ならびに／またはそれらの完全世代もしくは無性世代、ならびに異名、バシオニムもしくは分類学的等価物を含む、任意の適切な属および種のものである。
【０１５８】
本発明の一部の実施形態では、宿主細胞は、限定されるものではないが、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、ＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓまたはＹａｒｒｏｗｉａ種の細胞を含む、酵母細胞である。本発明の一部の実施形態では、酵母細胞は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｄａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｑｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓまたはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａである。
【０１５９】
本発明の一部の実施形態では、宿主細胞は、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）およびＰｈｏｒｍｉｄｉｕｍ（例えば、Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ  ｓｐ．ＡＴＣＣ２９４０９）などの藻類細胞である。
【０１６０】
一部の他の実施形態では、宿主細胞は、原核細胞である。適切な原核細胞としては、限定されるものではないが、グラム陽性、グラム陰性およびグラム不定性の細菌細胞が挙げられる。限定されるものではないが、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｂｕｃｈｎｅｒａ、Ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ｃａｍｐｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ、Ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｘｙｌｅｌｌａ、ＹｅｒｓｉｎｉａおよびＺｙｍｏｍｏｎａｓを含む、任意の適切な細菌生物が本発明において使用される。一部の実施形態では、宿主細胞は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｃｈｎｅｒａ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓまたはＺｙｍｏｍｏｎａｓの種である。一部の実施形態では、細菌宿主株は、ヒトに対して非病原性である。一部の実施形態では、細菌宿主株は、工業用株である。多数の細菌工業用株が公知であり、本発明において適切である。本発明の一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（例えば、Ａ．ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ、Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓおよびＡ．ｒｕｂｉ）である。本発明の一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ種（例えば、Ａ．ａｕｒｅｓｃｅｎｓ、Ａ．ｃｉｔｒｅｕｓ、Ａ．ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ、Ａ．ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ、Ａ．ｍｙｓｏｒｅｎｓ、Ａ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ、Ａ．ｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ、Ａ．ｐｒｏｔｏｐｈｏｎｎｉａｅ、Ａ．ｒｏｓｅｏｐａｒｑｆｆｉｎｕｓ、Ａ．ｓｕｌｆｕｒｅｕｓおよびＡ．ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）である。本発明の一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種（例えば、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｅｎｓｉｓ、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ、Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｌａｕｔｕｓ、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｂ．ｆｉｒｍｕｓ、Ｂ．ａｌｋａｏｐｈｉｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓおよびＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、限定されるものではないが、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓまたはＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓを含む、工業用Ｂａｃｉｌｌｕｓ株である。一部の実施形態では、Ｂａｃｉｌｌｕｓ宿主細胞は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよび／またはＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓである。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種（例えば、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ  Ｅ８８、Ｃ．ｌｉｔｕｓｅｂｕｒｅｎｓｅ、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓおよびＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍおよびＣ．ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｅｒｗｉｎｉａ種（例えば、Ｅ．ｕｒｅｄｏｖｏｒａ、Ｅ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、Ｅ．ａｎａｎａｓ、Ｅ．ｈｅｒｂｉｃｏｌａ、Ｅ．ｐｕｎｃｔａｔａおよびＥ．ｔｅｒｒｅｕｓ）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｐａｎｔｏｅａ種（例えば、Ｐ．ｃｉｔｒｅａおよびＰ．ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉおよびＰ．ｓｐ．Ｄ−０ｌ  １０）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種（例えば、Ｓ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｅｓ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓおよびＳ．ｕｂｅｒｉｓ）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種（例えば、Ｓ．ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ、Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓおよびＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓおよびＺ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である。
【０１６１】
本発明において使用される多くの原核生物株および真核生物株は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）、ドイツ微生物培養細胞系統保存機関（ＤＳＭ）、オランダ微生物株保存センター（ＣＢＳ）、および農業研究局特許培養株保存機関、北部地域研究センター（ＮＲＲＬ）などの多くの菌株保存機関から、公的に容易に入手可能である。
【０１６２】
一部の実施形態では、宿主細胞は、タンパク質分泌、タンパク質安定性ならびに／またはタンパク質の発現および／もしくは分泌のために望ましい他の性質を改善する特性を有するように遺伝子改変される。遺伝子改変は、遺伝子操作技法および／または古典的な微生物学的技法（例えば、化学的またはＵＶ変異誘発、およびその後の選択）によって達成することができる。実際に、一部の実施形態では、組換え改変技法および古典的な選択技法の組合せを使用して、宿主細胞を生成させる。組換え技術を使用して、核酸分子を、宿主細胞内および／または培養培地中、デオキシリボースリン酸アルドラーゼバリアント（複数可）の収量の増加をもたらす様式で、導入、欠失、阻害または改変することができる。例えば、Ａｌｐ１機能のノックアウトは、プロテアーゼが欠損した細胞をもたらし、ｐｙｒ５機能のノックアウトは、ピリミジン欠損表現型を有する細胞をもたらす。１つの遺伝子工学アプローチでは、相同組換えを使用して、コードされるタンパク質の発現を抑制するためにｉｎ  ｖｉｖｏで遺伝子を特異的に標的化することによって、標的とする遺伝子改変を誘導する。代替のアプローチでは、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスおよび／またはリボザイム技術は、遺伝子発現の阻害において使用される。限定されるものではないが、タンパク質をコードする遺伝子の全部または一部の欠失、および遺伝子産物の発現または活性を破壊する部位特異的変異誘発を含む、細胞におけるタンパク質の発現を低減するための種々の方法が当技術分野において公知である（例えば、Chaveroche  et  al.,  Nucl.  Acids  Res.,  28:22  e97  [2000];  Cho  et  al.,  Mol.  Plant  Mic.  Interact.,  19:7-15  [2006]；  Maruyama  and  Kitamoto,  Biotechnol  Lett.,  30:1811-1817  [2008]；Takahashi  et  al.,  Mol.  Gen.  Genom.,  272:  344-352  [2004]；およびYou  et  al.  ,  Arch.  Microbiol.,  191:615-622  [2009]を参照のこと、これらのすべては参照によって本明細書に組み込まれる）。ランダム変異誘発、続く所望の変異についてのスクリーニングも使用される（例えば、Combier  et  al.,  FEMS  Microbiol.  Lett.,  220:141-8  [2003]；およびFiron  et  al.,  Eukary.  Cell  2:247-55  [2003]を参照のこと、これらは両方とも参照によって組み込まれる）。
【０１６３】
宿主細胞へのベクターまたはＤＮＡ構築物の導入は、限定されるものではないが、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、ＰＥＧ媒介形質転換、電気穿孔、または当技術分野において公知の他の一般的な技法を含む、当技術分野において公知の任意の適切な方法を使用して達成することができる。一部の実施形態では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ発現ベクターｐＣＫ１００９００ｉ（米国特許第７，６２９，１５７号を参照のこと、これは、参照によって本明細書に組み込まれる）が使用される。
【０１６４】
一部の実施形態では、本発明の操作された宿主細胞（すなわち、「組換え宿主細胞」）は、プロモーターを活性化するため、形質転換体を選択するため、またはデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリヌクレオチドを増幅するために、必要により、改変された従来の栄養培地中で培養される。温度、ｐＨなどのような培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で以前使用したものであり、当業者に周知である。述べたように、多くの標準的な参照文献およびテキストは、細菌、植物、動物（特に、哺乳動物）および古細菌が起源の細胞を含む、多くの細胞の培養および生成のために利用可能である。
【０１６５】
一部の実施形態では、本発明のバリアントデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドを発現する細胞は、バッチまたは連続発酵条件下で成長させる。古典的な「バッチ発酵」は、閉鎖系であり、ここで、培地の組成は、発酵の開始時に設定され、発酵の間に人為的な変更に付されない。バッチ系のバリエーションは、「フェドバッチ発酵」であり、これも本発明において使用される。このバリエーションでは、基質を、発酵が進行するにつれて増加させて添加する。フェドバッチ系は、異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害する可能性がある場合、および培地中の基質の量を制限することが望ましい場合、有用である。バッチおよびフェドバッチ発酵は、一般的であり、当技術分野において周知である。「連続発酵」は、開放系であり、ここで、規定の発酵培地を、バイオリアクターに連続的に添加し、等量の条件培地を処理のために同時に除去する。連続発酵は、一般に、培養物を細胞が主に対数期成長にある一定の高密度で維持する。連続発酵系は、定常状態の成長条件を維持することを目指す。連続発酵プロセスのために栄養分および成長因子を調節するための方法、ならびに生成物形成の速度を最大化するための技法は、工業微生物学の技術分野において周知である。
【０１６６】
本発明の一部の実施形態では、無細胞転写／翻訳系は、バリアントデオキシリボースリン酸アルドラーゼ（複数可）の産生において使用される。いくつかの系が市販されており、方法は、当業者に周知である。
【０１６７】
本発明は、バリアントデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドまたは生物学的に活性なその断片を作製する方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、配列番号２、６および／または４６６と少なくとも約７０％（または少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％）の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードし、本明細書に提供される少なくとも１つの変異を含むポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞を提供すること；宿主細胞がコードされたバリアントデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドを発現する条件下で、培養培地中で形質転換された宿主細胞を培養すること；ならびに必要に応じて、発現したバリアントデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドを回収もしくは単離すること、および／または、発現したバリアントデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドを含有する培養培地を回収もしくは単離することを含む。一部の実施形態では、方法は、必要に応じて、コードされるデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドが発現した後に形質転換された宿主細胞を溶解すること、ならびに必要に応じて、発現したバリアントデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドを細胞溶解物から回収および／または単離することをさらに提供する。本発明は、バリアントデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドで形質転換された宿主細胞を、バリアントデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドの産生のために適切な条件下で培養すること、およびバリアントデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドを回収することを含む、バリアントデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドを作製する方法をさらに提供する。典型的には、デオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドの回収または単離は、宿主細胞の培養培地、宿主細胞、またはその両方からであって、本明細書に記載されるものを含む当技術分野において周知のタンパク質回収技法を使用する。一部の実施形態では、宿主細胞を、遠心分離によって採取し、物理的または化学的手段によって破壊し、得られた粗抽出物をさらなる精製のために保持する。タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、限定されるものではないが、凍結解凍サイクル、超音波処理、機械的破壊および／または細胞溶解剤の使用、ならびに当業者に周知の多くの他の適切な方法を含む任意の好都合な方法によって、破壊することができる。
【０１６８】
宿主細胞によって生成された操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼ酵素は、中でも、リゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、超遠心分離およびクロマトグラフィーを含むタンパク質精製のための当術分野において公知の任意の１つまたは複数の技法を使用して、細胞および／または培養培地から回収することができる。Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌由来のタンパク質の溶解および高効率の抽出のために適切な溶液は、商品名ＣｅｌＬｙｔｉｃ  Ｂ（商標）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で市販されている。したがって、一部の実施形態では、得られたポリペプチドを、回収／単離し、必要に応じて当技術分野において公知の多くの方法のいずれかによって精製する。例えば、一部の実施形態では、ポリペプチドを、限定されるものではないが、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水性相互作用、クロマトフォーカシングおよびサイズ排除）、または沈殿を含む従来の手順によって、栄養培地から単離する。一部の実施形態では、タンパク質の再フォールディングステップを、所望により、成熟タンパク質の立体配置の完成において使用する。加えて、一部の実施形態では、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製ステップにおいて用いる。例えば、一部の実施形態では、当技術分野において公知の方法を、本発明において使用する（例えば、Parry  et  al.,  Biochem.  J.,  353:117  [2001]；およびHong  et  al.,  Appl.  Microbiol.  Biotechnol.,  73:1331  [2007]を参照のこと、これらは両方とも参照によって本明細書に組み込まれる）。実際に、当技術分野において公知の任意の適切な精製方法を、本発明において使用する。
【０１６９】
デオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドの単離のためのクロマトグラフィー技法としては、限定されるものではないが、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動およびアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。特定の酵素を精製するための条件は、正味電荷、疎水性、親水性、分子量、分子形状などのような要因に部分的に依存し、当業者に公知である。
【０１７０】
一部の実施形態では、アフィニティー技法が、改善されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼ酵素の単離において使用される。アフィニティークロマトグラフィー精製のために、デオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドに特異的に結合する任意の抗体を使用してもよい。抗体の産生のために、限定されるものではないが、ウサギ、マウス、ラットなどを含むさまざまな宿主動物を、デオキシリボースリン酸アルドラーゼによる注射によって免疫してもよい。デオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドは、側鎖官能基、または側鎖官能基に結合させたリンカーによって、ＢＳＡなどの適切な担体に結合させてもよい。限定されるものではないが、フロイント（完全および不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムなどの無機ゲル、リゾレシチンなどの表面活性物質、プルロニック（登録商標）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍなどの潜在的に有用なヒトアジュバントを含むさまざまなアジュバントを、宿主種に応じて、免疫学的応答を増加させるために使用してもよい。
【０１７１】
一部の実施形態では、デオキシリボースリン酸アルドラーゼバリアントを調製し、酵素を発現する細胞の形態で、粗抽出物として、または単離もしくは精製された調製物として使用する。一部の実施形態では、デオキシリボースリン酸アルドラーゼバリアントは、凍結乾燥物として、粉末形態（例えば、アセトン粉末）で調製され、または酵素溶液として調製される。一部の実施形態では、デオキシリボースリン酸アルドラーゼバリアントは、実質的に純粋な調製物の形態である。
【０１７２】
一部の実施形態では、デオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドは、任意の適切な固体基材に付着させる。固体基材としては、限定されるものではないが、固相、表面および／または膜が挙げられる。固体支持体としては、限定されるものではないが、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシおよびポリアクリルアミド、ならびにそれらのコポリマーおよびグラフトなどの有機ポリマーが挙げられる。固体支持体はまた、ガラス、シリカ、制御細孔ガラス（ＣＰＧ）、逆相シリカ、または金もしくは白金などの金属などの無機物であり得る。基材の形状は、ビーズ、球、粒子、顆粒、ゲル、膜または面の形態であり得る。面は、平面、実質的に平面、または非平面であり得る。固体支持体は、多孔性または非多孔性であり得、膨潤特性または非膨潤特性を有し得る。固体支持体は、ウェル、窪みまたは他の容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）、容器（ｖｅｓｓｅｌ）、フィーチャまたは場所の形態で配置され得る。複数の支持体は、試薬のロボット送達のため、または検出方法および／もしくは装置によって対処可能なさまざまな場所で、アレイ上に配置され得る。
【０１７３】
一部の実施形態では、免疫学的方法を使用して、デオキシリボースリン酸アルドラーゼバリアントを精製する。１つのアプローチでは、従来の方法を使用してバリアントデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドに対して（例えば、限定されるものではないが、配列番号２、６および／もしくは４６６を含む本明細書に提供される操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼバリアントを含むポリペプチド、およびそれらのバリアント、ならびに／またはそれらの免疫原性断片に対して）生じさせた抗体を、ビーズ上に固定し、バリアントデオキシリボースリン酸アルドラーゼが結合する条件下で、細胞培養培地と混合し、沈殿させる。関連するアプローチでは、免疫クロマトグラフィーが使用される。
【０１７４】
一部の実施形態では、バリアントデオキシリボースリン酸アルドラーゼは、非酵素部分を含む融合タンパク質として発現される。一部の実施形態では、バリアントデオキシリボースリン酸アルドラーゼ配列は、精製を容易にするドメインと融合されている。本明細書で使用される場合、「精製を容易にするドメイン」という用語は、それが融合しているポリペプチドの精製を媒介するドメインを指す。適切な精製ドメインとしては、限定されるものではないが、金属キレート化ペプチド、固定された金属上での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュール、グルタチオンに結合する配列（例えば、ＧＳＴ）、赤血球凝集素（ＨＡ）タグ（インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する；例えば、Wilson  et  al.,  Cell  37:767  [1984]を参照のこと）、マルトース結合性タンパク質配列、ＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティー精製システムにおいて利用されるＦＬＡＧエピトープ（例えば、Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐから入手可能なシステム）などが挙げられる。本明細書に記載の組成物および方法における使用について意図される１つの発現ベクターを、エンテロキナーゼ切断部位によって分離されるポリヒスチジン領域と融合した本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質の発現のために提供する。ヒスチジン残基は、ＩＭＩＡＣ（固定された金属イオンアフィニティークロマトグラフィー；例えば、Porath  et  al.,  Prot.  Exp.  Purif.,  3:263-281  [1992]を参照のこと）での精製を容易にするが、エンテロキナーゼ切断部位は、バリアントデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドを融合タンパク質から分離するための手段を提供する。ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）はまた、外来ポリペプチドをグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させるために使用され得る。一般に、そのような融合タンパク質は、可溶性であり、溶解細胞から、リガンド−アガロースビーズ（例えば、ＧＳＴ融合物の場合では、グルタチオン−アガロース）への吸着、続く遊離リガンドの存在下での溶出によって、容易に精製することができる。
【０１７５】
操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼ酵素を使用する方法
別の態様では、本明細書に開示される操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドは、ＥＧＡおよびアセトアルデヒドのＥＤＲへの変換のためのプロセスにおいて使用することができる。
【０１７６】
本明細書に記載され、実施例において説明されるように、本発明は、限定されるものではないが、ｐＨ、温度、緩衝液、溶媒系、基質添加量、基質化合物の立体異性体の混合物、ポリペプチド添加量、圧力および反応時間の範囲を含む、本明細書におけるプロセスにおいて使用することができる適切な反応条件の範囲を企図する。本明細書に記載の操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドを使用する基質化合物の生成物化合物への生体触媒変換のためのプロセスを行うためのさらなる適切な反応条件は、限定されるものではないが、濃度、ｐＨ、温度、溶媒条件の実験的反応条件下で、操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドおよび基質化合物を接触させること、ならびに例えば、本明細書に提供される実施例において記載される方法を使用して、生成物化合物を検出することを含む、慣例の実験によって容易に最適化することができる。
【０１７７】
上記に記載されるように、本発明のプロセスにおける使用のためのデオキシリボースリン酸アルドラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、一般に、配列番号２〜４７８の偶数配列のいずれか１つから選択される参照アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、ならびに参照配列（例えば、配列番号２、６および／または４６６）と比較して、１つまたは複数のアミノ酸残基の相違を有する（has  (a)  has）アミノ酸配列を含む操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドを含む。一部の実施形態では、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする能力を有するポリヌクレオチドは、上記に記載の同一性パーセント、および参照配列（例えば、配列番号２、６および／または４６６）と比較して、１つまたは複数の残基の相違を有するデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドをコードする。
【０１７８】
反応混合物中の基質化合物は、例えば、生成物化合物の所望の量、酵素活性に対する基質濃度の効果、反応条件下での酵素の安定性、および基質の生成物への変換パーセントを考慮して、変えることができる。方法の一部の実施形態では、適切な反応条件は、少なくとも約０．５〜約２００ｇ／Ｌ、１〜約２００ｇ／Ｌ、５〜約１５０ｇ／Ｌ、約１０〜約１００ｇ／Ｌ、または約５０〜約１００ｇ／Ｌの基質化合物添加量を含む。一部の実施形態では、適切な反応条件は、少なくとも約０．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１ｇ／Ｌ、少なくとも約５ｇ／Ｌ、少なくとも約１０ｇ／Ｌ、少なくとも約１５ｇ／Ｌ、少なくとも約２０ｇ／Ｌ、少なくとも約３０ｇ／Ｌ、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、少なくとも約７５ｇ／Ｌ、少なくとも約１００ｇ／Ｌ、少なくとも約１５０ｇ／Ｌもしくは少なくとも約２００ｇ／Ｌ、またはさらにそれより多い基質化合物添加量を含む。本明細書に提供される基質添加量についての値は、化合物（Ｙ）の分子量に基づくが、しかしながら、等モル量のＥＤＲのさまざまな水和物および塩も、プロセスにおいて使用することができることも企図される。
【０１７９】
反応の過程の間に、反応混合物のｐＨは変化してもよい。反応混合物のｐＨは、所望のｐＨ、または所望のｐＨ範囲内で、維持されてもよい。これは、反応の前および／または反応の過程の間に、酸または塩基の添加によって行ってもよい。あるいは、ｐＨは、緩衝液を使用することによって制御され得る。したがって、一部の実施形態では、反応条件は、緩衝液を含む。所望のｐＨ範囲を維持する適切な緩衝液は、当技術分野において公知であり、限定ではなく例として、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリエタノールアミン（ＴＥＡ）緩衝液などが挙げられる。一部の実施形態では、緩衝液は、ＴＥＡである。プロセスの一部の実施形態では、適切な反応条件は、約０．０１Ｍ〜０．５Ｍの濃度で、ＭＯＰＳ（−３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸、ｐＨ７）の緩衝液を含む。一部の実施形態では、反応条件は、緩衝液が存在しない適切な溶媒として、水を含む。
【０１８０】
プロセスの一部の実施形態では、反応条件は、適切なｐＨを含むことができる。上記で述べたように、所望のｐＨまたは所望のｐＨ範囲は、酸もしくは塩基、適切な緩衝液、または緩衝剤（buffering）および酸もしくは塩基の添加の組合せの使用によって、維持することができる。反応混合物のｐＨは、反応の前および／または反応の過程の間に、制御することができる。一部の実施形態では、適切な反応条件は、約５〜１０、約６〜９、約７〜１１、約８〜約１２．５のｐＨ、約８〜約１２のｐＨ、約９．０〜約１１．５のｐＨまたは約９．５〜約１１．０のｐＨの溶液を含む。一部の実施形態では、反応条件は、約８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２または１２．５のｐＨの溶液を含む。一部の代替の実施形態では、反応条件は、約６．５〜約７．５のｐＨの溶液を含む。一部の実施形態では、ｐＨは、約５、５．５、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２または１２．５である。さらに一部の追加の実施形態では、反応条件は、約５〜約１０のｐＨの溶液を含む。一部の実施形態では、ｐＨは、約５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５または１０である。
【０１８１】
本明細書におけるプロセスの一部の実施形態では、適切な温度は、例えば、より高い温度での反応速度の増加、反応の十分な期間のための酵素の活性、およびさらに下記に記載のものを考慮して、反応条件のために使用することができる。例えば、本発明の操作されたポリペプチドは、天然に存在するデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドと比べて安定性が増加しており、これが、本発明の操作されたポリペプチドを、反応のための変換率の増加および基質溶解度の改善という特性のために、より高い温度で使用することを可能にする。したがって、一部の実施形態では、適切な反応条件は、約１０℃〜約７０℃、約１０℃〜約６５℃、約１５℃〜約６０℃、約２０℃〜約６０℃、約２０℃〜約５５℃、約３０℃〜約５５℃または約４０℃〜約５０℃の温度を含む。一部の実施形態では、適切な反応条件は、約１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃または７０℃の温度を含む。一部の実施形態では、酵素反応の間の温度は、反応の過程の間中、ある温度で維持することができる。一部の実施形態では、酵素反応の間の温度は、反応の過程の間、温度プロファイルに対して調整することができる。
【０１８２】
操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼを使用するプロセスは、一般に、溶媒中で行われる。適切な溶媒としては、水、水性緩衝溶液、有機溶媒、および／または通常、水性溶媒および有機溶媒を含む共溶媒系が挙げられる。水性溶媒（水または水性共溶媒系）は、ｐＨ緩衝化されていてもよく、または緩衝化されていなくてもよい。
【０１８３】
適切な反応条件は、基質化合物のその対応する生成物化合物への生体触媒変換を提供する反応パラメータの組合せを含むことができる。したがって、プロセスの一部の実施形態では、反応パラメータの組合せは、（ａ）約０．０１〜５０ｇ／Ｌの基質化合物の基質添加量；（ｂ）約１ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌの操作されたポリペプチドの濃度；（ｃ）約７のｐＨ；および（ｅ）約２２〜５５３０の温度を含む。
【０１８４】
一部の実施形態では、反応パラメータの組合せは、（ａ）約２．５ｇ／Ｌの基質化合物（例えば、５０ｇ／ＬのＥＧＡおよび３モル当量のアセトアルデヒド）；（ｂ）約２．５ｇ／Ｌの操作されたポリペプチド；（ｃ）約ｐＨ７；および（ｄ）約３０℃を含む。
【０１８５】
さらなる例示的な反応条件としては、実施例に提供されるアッセイ条件が挙げられる。本明細書に記載の反応を行うことにおいて、操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドは、部分的に精製または精製された酵素、酵素をコードする遺伝子（複数可）で形質転換された細胞全体、ならびに／またはそのような細胞の細胞抽出物および／もしくは溶解物で、反応混合物に添加されてもよい。操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼ酵素をコードする遺伝子（複数可）で形質転換された細胞全体、またはその細胞抽出物、その溶解物、および単離された酵素は、固体（例えば、凍結乾燥されたもの、噴霧乾燥されたものなど）または半固体（例えば、粗ペースト）を含む種々の異なる形態で利用されてもよい。細胞抽出物または細胞溶解物は、沈殿（例えば、硫酸アンモニウム、ポリエチレンイミン、熱処理など）、続く脱塩手順（例えば、限外濾過、透析など）の後の凍結乾燥によって、部分的に精製されてもよい。いずれかの酵素調製物は、例えば、グルタルアルデヒドなどの公知の架橋剤を使用する架橋によって安定化されていてもよく、または固相材料（例えば、樹脂、キトサン、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ  ＣおよびＳＥＰＡＢＥＡＤなどのビーズ）に固定されていてもよい。
【０１８６】
本明細書に記載の反応の一部の実施形態では、反応は、本明細書に記載の適切な反応条件下で行われ、操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼポリペプチドは、固体支持体に固定されている。反応を行うための操作されたデオキシリボースリン酸アルドラーゼを固定するために有用な固体支持体としては、限定されるものではないが、エポキシド官能基を有するポリメタクリレート、アミノエポキシド官能基を有するポリメタクリレート、オクタデシル官能基を有するスチレン／ＤＶＢコポリマーもしくはポリメタクリレートを含む、ビーズまたは樹脂が挙げられる。例示的な固体支持体としては、限定されるものではないが、キトサンビーズ、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ  Ｃ、ならびに以下の異なるタイプ：ＳＥＰＡＢＥＡＤ：ＥＣ−ＥＰ、ＥＣ−ＨＦＡ／Ｓ、ＥＸＡ２５２、ＥＸＥ１１９およびＥＸＥ１２０を含むＳＥＰＡＢＥＡＤ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）が挙げられる。
【０１８７】
一部の実施形態では、操作されたポリペプチドが、分泌されたポリペプチドの形態で発現され得る場合、分泌されたポリペプチドを含有する培養培地を、本明細書におけるプロセスにおいて使用することができる。
【０１８８】
一部の実施形態では、固体反応物（例えば、酵素、塩など）は、粉末（例えば、凍結乾燥されたもの、噴霧乾燥されたものなど）、溶液、乳液、懸濁液などを含む種々の異なる形態で、反応に提供されてもよい。反応物は、当業者に公知の方法および機器を使用して、容易に凍結乾燥または噴霧乾燥することができる。例えば、タンパク質溶液は、少量のアリコートで−８０℃で凍結され、次いで、あらかじめ冷やされた凍結乾燥チャンバーに加えられ、続いて真空が適用され得る。
【０１８９】
一部の実施形態では、反応物の添加の順序は重要ではない。反応物は、同時に一緒に溶媒（例えば、単相の溶媒、二相の水性共溶媒系など）に添加されてもよく、あるいは、反応物の一部は、別々に添加され、一部が、異なる時点で一緒に添加されてもよい。例えば、デオキシリボースリン酸アルドラーゼおよびデオキシリボースリン酸アルドラーゼ基質が、最初に溶媒に添加されてもよい。水性共溶媒系が使用される場合の混合効率を改善するために、デオキシリボースリン酸アルドラーゼは、最初に水相に添加および混合することができる。次いで、有機相が添加および混合され、続いてデオキシリボースリン酸アルドラーゼ基質が添加されてもよい。あるいは、デオキシリボースリン酸アルドラーゼ基質は、有機相中であらかじめ混合された後、水相に添加されてもよい。
【０１９０】
上記に開示されたプロセスによって生成した生体触媒反応混合物から生成物化合物を抽出、単離、塩の形成、精製および／または結晶化するための方法、技法、ならびにプロトコールは、当業者に公知であるか、および／または慣例の実験を通して利用可能である。加えて、例示的な方法を下記の実施例において提供する。
【０１９１】
本発明のさまざまなフィーチャおよび実施形態を以下の代表的な実施例において説明し、これらは例示的なものであって、限定するものではないことを意図する。
【実施例】
【０１９２】
実験
本発明のさまざまなフィーチャおよび実施形態を以下の代表的な実施例において説明し、これらは例示的なものであって、限定するものではないことを意図する。
【０１９３】
下記の実験の発明では、以下の略記が適用される：ｐｐｍ（百万分率）；Ｍ（モル濃度）；ｍＭ（ミリモル濃度）、ｕＭおよびμΜ（マイクロモル濃度）；ｎＭ（ナノモル濃度）；ｍｏｌ（モル）；ｇｍおよびｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｕｇおよびμｇ（マイクログラム）；Ｌおよびｌ（リットル）；ｍｌおよびｍＬ（ミリリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；ｕｍおよびμｍ（マイクロメートル）；ｓｅｃ．（秒）；ｍｉｎ（分）；ｈおよびｈｒ（時間）；Ｕ（単位）；ＭＷ（分子量）；ｒｐｍ（毎分回転数）；℃（摂氏温度）；ＲＴ（室温）；ＣＤＳ（コード配列）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ＲＮＡ（リボ核酸）；ａａ（アミノ酸）；ＴＢ（テリフィックブロス；１２ｇ／Ｌのバクト−トリプトン、２４ｇ／Ｌの酵母抽出物、４ｍＬ／Ｌのグリセロール、６５ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．０、１ｍＭのＭｇＳＯ４）；ＬＢ（ルリアブロス）；ＣＡＭ（クロラムフェニコール）；ＰＭＢＳ（硫酸ポリミキシンＢ）；ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）；ＤＥＲＡ（デオキシリボースリン酸アルドラーゼ）；ＤＮＰＨ．ＨＣｌ（２，４−ジニトロフェニルヒドラジン塩酸塩）；ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）；ＴＥｏＡ（トリエタノールアミン）；ホウ酸塩（四ホウ酸ナトリウム十水和物）；アセトニトリル（ＭｅＣＮ）；ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）；ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）；ＦＩＯＰ（陽性対照に対する倍数改善）；ＨＴＰ（ハイスループット）；ＭＷＤ（多波長検出器）；ＵＶ（紫外線）；Ｃｏｄｅｘｉｓ（Ｃｏｄｅｘｉｓ，Ｉｎｃ．、Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃｏｒｐ．、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ  ＭＡ）；Ｄｉｆｃｏ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）；Ｄａｉｃｅｌ（Ｄａｉｃｅｌ、Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）；Ｇｅｎｅｔｉｘ（Ｇｅｎｅｔｉｘ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．、Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ、ＯＲ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒｐ．の一員、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、Ａｇｉｌｅｎｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの一員、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）；Ｉｎｆｏｒｓ（Ｉｎｆｏｒｓ−ＨＴ、Ｂｏｔｔｍｉｎｇｅｎ／Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）；Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）；およびＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）；Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）；ならびにＷａｔｅｒｓ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）。
【０１９４】
（実施例１）
ＨＴＰ  ＤＥＲＡ含有湿細胞ペレットの調製
本発明のバリアントを産生するために使用されるＤＥＲＡ（配列番号２）酵素のための親遺伝子を、合成し、ｐＣＫ１１０９００ベクターにクローニングした（例えば、特許第７，６２９，１５７号および米国特許出願公開第２０１６／０２４４７８７号を参照のこと、これらは両方とも、それらの全体がすべての目的のために、参照によって本明細書に組み込まれる）。ｐＣＫ１１０９００にクローニングする場合、６−ヒスチジンタグを、親のＮ末端に付加した。Ｗ３１１０  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、ＤＥＲＡをコードする遺伝子を含有するそれぞれのプラスミドで形質転換し、１％のグルコースおよび３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（ＣＡＭ）を含有するルリアブロス（ＬＢ）寒天プレートに蒔き、３７℃で終夜成長させた。モノクローナルコロニーを採集し、９６ウェルシャローウェルマイクロタイタープレートの１％のグルコースおよび３０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含有する１８０μｌのＬＢに接種した。プレートをＯ２透過性シールでシールし、培養物を、３０℃、２００ｒｐｍおよび８５％湿度で終夜成長させた。次いで、１０μｌのそれぞれの細胞培養物を、３９０μｌのＴＢおよび３０μｇ／ｍＬのＣＡＭを含有する９６ウェルのディープウェルプレートのウェルに移した。ディープウェルプレートを、Ｏ２透過性シールでシールし、０．６〜０．８のＯＤ６００に達するまで、３０℃、２５０ｒｐｍおよび８５％湿度でインキュベートした。次いで、細胞培養物を、イソプロピルチオグリコシド（ＩＰＴＧ）によって１ｍＭの最終濃度に誘導し、３０℃、２５０ｒｐｍで１８〜２０時間終夜インキュベートした。次いで、細胞を、４０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を使用してペレット化した。上清を廃棄し、ペレットを溶解前に−８０℃で凍結させた。
【０１９５】
（実施例２）
ＤＥＲＡ含有細胞溶解物の調製
実施例１に記載のようにして調製された凍結ＤＥＲＡ含有細胞ペレットを、５０ｍＭの３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液、ｐＨ７．０、１ｍｇ／ｍＬのリゾチームおよび０．５ｍｇ／ｍＬのＰＭＢＳを含有する４００μｌの溶解緩衝液を用いて溶解した。溶解混合物を、室温で２時間、振とうした。次いで、プレートを４０００ｒｐｍおよび４℃で１５分間遠心分離した。次いで、上清を、以下の実施例に記載するように、活性レベルを決定するために、清澄にした溶解物として生体触媒反応において使用した。
【０１９６】
（実施例３）
デオキシリボースリン酸アルドラーゼバリアントによる化合物Ｙ（ＥＤＲ）の生成  
配列番号２を、これらの実験のために、親酵素として選択した。操作された遺伝子のライブラリーを、十分に確立された技法（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して、生成した。それぞれの遺伝子によってコードされるポリペプチドを、実施例１に記載されるようにして、ＨＴＰ中で産生させ、清澄にした溶解物を、実施例２に記載されるようにして、生成した。
【０１９７】
それぞれ６０μＬの反応を、５０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ７中の１０μＬのＨＴＰ溶解物、２４ｇ／Ｌの化合物Ｘ（エナンチオピュアな（Ｒ）−２−エチニル−グリセルアルデヒド）、２４ｇ／Ｌ（３モル当量）のアセトアルデヒドを有する９６ウェルシャローウェルマイクロタイタープレートにおいて行った。プレートを、ヒートシールし、３０℃でインキュベートし、Ｉｎｆｏｒｓ  Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎ（登録商標）シェーカー中、６００ＲＰＭで３時間撹拌した。アキラル変換分析のために、１０μＬの反応混合物を、１ｍＬのＡｘｙｇｅｎ９６ウェルプレート中の１９０μＬの新たに作製したＤＮＰＨ．ＨＣｌ（ＤＭＳＯ中４２．６ｇ／Ｌ）に移し、誘導体化反応を、６００ｒｐｍで振とうして、４０℃で１時間インキュベートした。次いで、１０μＬの誘導体化混合物を、１９０μＬのＭｅＣＮ／ＮａＯＨ（１ｍＬのＭｅＣＮあたり４．７μＬのＮａＯＨ）であらかじめ満たされた９６ウェルのＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルタープレート（０．４５μｍの細孔サイズ）に移し、混合し、次いで、実施例５に記載のようにして、アキラルＬＣ−ＭＳ分析のために遠心分離した。
【表３−１】
2021530980.tif 000004
【表３−２】
2021530980.tif 000005
【０１９８】
配列番号２に対する活性を、配列番号２によって形成された生成物の変換パーセントと比べて、バリアントによって形成された生成物の変換％として計算した。変換パーセントを、実施例５に記載のＬＣ−ＭＳ分析によって決定されるように、生成物のピークの面積を基質の面積の合計によって除算することによって定量した。
【０１９９】
（実施例４）
デオキシリボースリン酸アルドラーゼバリアントによる化合物Ｙ（ＥＤＲ）の生成
配列番号６を、これらの実験のために、親酵素として選択した。操作された遺伝子のライブラリーを、十分に確立された技法（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して、生成した。それぞれの遺伝子によってコードされるポリペプチドを、実施例１に記載されるようにして、ＨＴＰ中で産生させ、清澄にした溶解物を、実施例２に記載されるようにして、生成した。
【０２００】
それぞれ６０μＬの反応を、５０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ７中の５μＬのＨＴＰ溶解物、２４ｇ／Ｌの化合物Ｘ（エナンチオピュアな（Ｒ）−２−エチニル−グリセルアルデヒド）、２４ｇ／Ｌ（３モル当量）のアセトアルデヒドを有する９６ウェルシャローウェルマイクロタイタープレートにおいて行った。プレートを、ヒートシールし、３０℃でインキュベートし、Ｉｎｆｏｒｓ  Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎ（登録商標）シェーカー中、６００ＲＰＭで３時間撹拌した。アキラル変換分析のために、１０μＬの反応混合物を、１ｍＬのＡｘｙｇｅｎ９６ウェルプレート中の１９０μＬの新たに作製したＤＮＰＨ．ＨＣｌ（ＤＭＳＯ中４２．６ｇ／Ｌ）に移し、誘導体化反応を、６００ｒｐｍで振とうして、４０℃で１時間インキュベートした。次いで、１０μＬの誘導体化混合物を、１９０μＬのＭｅＣＮ／ＮａＯＨ（１ｍＬのＭｅＣＮあたり４．７μＬのＮａＯＨ）であらかじめ満たされた９６ウェルのＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルタープレート（０．４５μｍの細孔サイズ）に移し、混合し、次いで、実施例５に記載のようにして、アキラルＬＣ−ＭＳ分析のために遠心分離した。
【表４−１】
2021530980.tif 000006
【表４−２】
2021530980.tif 000007
【表４−３】
2021530980.tif 000008
【表４−４】
2021530980.tif 000009
【表４−５】
2021530980.tif 000010
【０２０１】
配列番号６に対する活性を、配列番号６によって形成された生成物の変換パーセントと比べて、バリアントによって形成された生成物の変換％として計算した。変換パーセントを、実施例５に記載のＬＣ−ＭＳ分析によって決定されるように、生成物のピークの面積を基質の面積の合計によって除算することによって定量した。
【０２０２】
（実施例５）
化合物Ｙ（ＥＤＲ）の分析的検出
実施例３および４に記載のデータは、表５．１における分析方法を使用して収集した。本明細書において提供される方法は、本発明を使用して生成するバリアントの分析において使用される。しかしながら、他の適切な方法が本発明において使用されるので、本明細書に記載の方法は、本明細書に提供されるバリアント、および／または本明細書に提供される方法を使用して生成するバリアントの分析に適用可能な唯一の方法であることは意図しない。
【表５】
2021530980.tif 000011
【０２０３】
（実施例６）
改善されたアルドラーゼ活性についての配列番号４６６に由来する操作されたポリペプチドの進化およびスクリーニング
配列番号４６６のデオキシリボースリン酸アルドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド（配列番号４６５）を使用して、表６．１の操作されたポリペプチドを生成した。これらのポリペプチドは、出発ポリペプチドと比較して、所望の条件下で（例えば、スキーム１に示されるように、ＳＰおよび操作されたＰＰＭおよびＰＮＰ酵素の存在下で化合物１の生成を介して測定された化合物４を生成する能力）、デオキシリボースリン酸アルドラーゼ活性の改善を示した。
【化２】
2021530980.tif 000012
【０２０４】
偶数配列の識別子のアミノ酸配列を有する操作されたポリペプチドを、下記に記載されるようにして、配列番号４６６の「主鎖」アミノ酸配列から作成した。指向進化を、配列番号４６５に示されるポリヌクレオチドで開始した。操作されたポリペプチドのライブラリーを、さまざまな周知の技法（例えば、飽和変異誘発、以前に同定された有益なアミノ酸の相違の組換え）を使用して作成し、ポリペプチドのアルドラーゼ活性を測定するＨＴＰアッセイおよび分析方法を使用して、スクリーニングした。この場合では、活性は、スキーム１に示されるように、表６．２の分析方法を使用して、スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）および操作されたホスホペントースムターゼ（ＰＰＭ）およびプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）酵素の存在下で、化合物１の生成を介して、測定した。本明細書において提供される方法は、本発明を使用して生成するバリアントの分析において使用される。しかしながら、他の適切な方法が本発明において使用されるので、本明細書に記載の方法は、本明細書に提供されるバリアント、および／または本明細書に提供される方法を使用して生成するバリアントの分析に適用可能な唯一の方法であることは意図しない。
【０２０５】
ハイスループット溶解物を、以下の通り調製した。クローンのＤＥＲＡバリアントからの凍結ペレットを、実施例１に記載のようにして調製し、１００ｍＭのトリエタノールアミン緩衝液、ｐＨ７．５、１ｍｇ／ｍＬのリゾチームおよび０．５ｍｇ／ｍＬのＰＭＢＳを含有する４００μｌの溶解緩衝液を用いて溶解した。溶解混合物を、室温で２時間、振とうした。次いで、プレートを４０００ｒｐｍおよび４℃で１５分間遠心分離した。
【０２０６】
振とうフラスコ粉末（振とうフラスコ培養物由来の凍結乾燥溶解物）を、以下の通り調製した。所望のバリアントの細胞培養物を、１％のグルコースおよび３０μｇ／ｍｌのＣＡＭを含むＬＢ寒天プレートに蒔き、３７℃で終夜成長させた。それぞれの培養物からの単一コロニーを、１％のグルコースおよび３０μｇ／ｍｌのＣＡＭを含む６ｍｌのＬＢに移した。培養物を、３０℃、２５０ｒｐｍで１８時間成長させ、０．０５の最終ＯＤ６００まで、３０μｇ／ｍｌのＣＡＭを含有する２５０ｍｌのＴＢにおよそ１：５０で継代培養した。培養物を、０．６〜０．８の間のＯＤ６００まで、３０℃、２５０ｒｐｍでおよそ１９５分間成長させ、１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて誘導した。次いで、培養物を３０℃、２５０ｒｐｍで２０時間成長させた。培養物を、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを、３０ｍｌの２０ｍＭのトリエタノールアミン、ｐＨ７．５に再懸濁させ、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（登録商標）プロセッサーシステム（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を１８，０００ｐｓｉで使用して溶解させた。溶解物をペレット化し（１０，０００ｒｐｍで６０分間）、上清を、凍結し、凍結乾燥した。
【０２０７】
反応を、２ｍＬのディープウェルプレートの９６ウェル様式において、１００μＬの総体積で、ＤＥＲＡ／ＰＰＭ／ＰＮＰ／ＳＰ酵素を含むタンデム４酵素カスケードの設定で行った。反応は、振とうフラスコ粉末としてＰＮＰ、ＰＰＭおよびＳＰ（３０重量％のＰＰＭ、配列番号４８０、０．５重量％のＰＮＰ、配列番号４８２、４重量％の野生型ＳＰ、配列番号４８４）、２６ｇ／Ｌまたは１２４ｍＭのエナンチオピュアな（Ｒ）−２−エチニル−グリセルアルデヒド基質、９９ｍＭのＦ−アデニン（０．８当量）、１８６ｍＭのアセトアルデヒド（イソプロパノール中４０重量％、１．５当量）、３７２ｍＭのスクロース（３．０当量）、５ｍＭのＭｎＣｌ２および５０ｍＭのＴＥｏＡ、ｐＨ７．５を含んでいた。反応を、以下の通り設定した：（ｉ）ＤＥＲＡを除くすべての反応成分を単一溶液にあらかじめ混合し、次いで、９０μＬのこの溶液を、９６ウェルプレートのそれぞれのウェルにアリコートした、（ｉｉ）次いで、５０ｍＭのＴＥｏＡ緩衝液を使用して１００倍にあらかじめ希釈した１０μＬのＤＥＲＡ溶解物を、ウェルに添加して、反応を開始した。反応プレートを、ヒートシールし、３５℃、６００ｒｐｍの振とうで、１８〜２０時間インキュベートした。
【０２０８】
反応を、３００μＬの１ＭのＫＯＨおよびＤＭＳＯの１：１混合物でクエンチした。クエンチした反応物を、卓上シェーカーで１０分間振とうし、続いて、４０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し、任意の沈殿物にペレット化した。次いで、１０マイクロリットルの上清を、１９０μＬの０．１ＭのＴＥｏＡ、ｐＨ７．５の緩衝液中の２５％のＭｅＣＮであらかじめ満たされた９６ウェルの丸底プレートに移した。試料を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｕ３０００  ＵＰＬＣシステムに注入し、実施例６−２に記載するように、Ａｔｌａｎｔｉｓ  Ｔ３  Ｃ１８、３μｍ、２．１×１００ｍｍのカラムを使用して、７５：２５の水：０．１％のＴＦＡが補充されたアセトニトリルを含有する移動相で、アイソクラチックで分離した。配列番号４６６に対する活性を、特定の反応条件下、配列番号４６６によって形成された化合物１のピーク面積と比較して、バリアント酵素によって形成された化合物１のピーク面積として計算した。
【０２０９】
選択バリアントを、２５０ｍＬの振とうフラスコおよび上記に記載のようにして作成された酵素粉末中で成長させた。酵素粉末の活性を、上記に記載の類似のアッセイを使用して、０．００４〜８重量％の振とうフラスコ粉末で評価した。表６．１に示されるデータは、配列番号４６６と０．０４重量％のＤＥＲＡバリアントの振とうフラスコ粉末によって形成された化合物１のピーク面積と比較して、バリアント酵素によって形成された化合物１のピーク面積として計算された配列番号４６６に対する活性を反映する。
【表６−１】
2021530980.tif 000013
【表６−２】
2021530980.tif 000014
【０２１０】
本出願において引用されたすべての刊行物、特許、特許出願および他の文書は、個々の刊行物、特許、特許出願または他の文書のそれぞれがすべての目的のために参照によって組み込まれることが個々に示されたものと同じ程度に、すべての目的のために、それらの全体がこれにより参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２１１】
さまざまな特定の実施形態を説明し、記載してきたが、本発明（複数可）の趣旨および範囲から逸脱することなく、さまざまな変更を行うことができることが理解される。
【配列表】
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【国際調査報告】
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