(57)【要約】  本開示はＣＤＫ９阻害薬の局所送達のための新規徐放製剤を記載する。
2021522343.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイクリン依存性キナーゼ９（ＣＤＫ９）阻害薬及び乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）を含むマイクロパーティクルであって、ＣＤＫ９阻害薬がＰＬＧＡによってカプセル化され、マイクロパーティクルがＣＤＫ９阻害薬の徐放を担う、ＣＤＫ９阻害薬。
【請求項２】
前記ＣＤＫ９阻害薬がフラボピリドール、ＳＮＳ−０３２、ボルシクリブ（ｖｏｒｕｃｉｃｌｉｂ）及びそれらの誘導体からなる群、又はそれらの医薬的に許容可能な塩から選択される請求項１のマイクロパーティクル。
【請求項３】
前記ＣＤＫ９阻害薬がフラボピリドール、ＳＮＳ−０３２、ボルシクリブ（ｖｏｒｕｃｉｃｌｉｂ）、又はそれらの医薬的に許容可能な塩である請求項１のマイクロパーティクル。
【請求項４】
前記ＣＤＫ９阻害薬がフラボピリドールである請求項１〜３のいずれか一項のマイクロパーティクル。
【請求項５】
前記ＰＬＧＡが約５０：５０から約７５：２５の乳酸とグリコール酸との（Ｌ：Ｇ）比を有する請求項１〜４のいずれか一項のマイクロパーティクル。
【請求項６】
前記ＰＬＧＡが約０．４から約０．９までのインヘレント粘度（ＩＶ）を有する請求項１〜５のいずれか一項のマイクロパーティクル。
【請求項７】
前記ＰＬＧＡが約０．４、約０．５５から約０．７５までの、又は約０．７から０．９までのインヘレント粘度（ＩＶ）を有する請求項６のマイクロパーティクル。
【請求項８】
前記ＰＬＧＡがＬａｃｔｅｌ（登録商標）Ｂ６０１３−２、Ｐｕｒａｓｏｒｂ（登録商標）５００４Ａ、又はＬａｃｔｅｌ（登録商標）Ｂ６０１２−４である請求項１〜７のいずれか一項のマイクロパーティクル。
【請求項９】
前記マイクロパーティクルが約３から約５０ミクロンの直径を有する請求項１〜８のいずれか一項のマイクロパーティクル。
【請求項１０】
前記マイクロパーティクルが約２４時間、約２日、約５日、約１０日、約１４日、約２１日、約３０日、約４５日、及び約６０日からなる群より選択される期間にわたってＣＤＫ９を放出する請求項１〜９のいずれか一項のマイクロパーティクル。
【請求項１１】
前記マイクロパーティクルが投与後２４時間にわたりＣＤＫ９阻害薬の約３％から約３０％、約３％から約２０％、約３％から約１０％、約５％から約３０％、約５％から約２０％、又は約５％から約１０％を放出する請求項１〜１０のいずれか一項のマイクロパーティクル。
【請求項１２】
前記マイクロパーティクルが投与後２日にわたりＣＤＫ９阻害薬の約５％から約４０％、約５％から約３０％、約５％から約２０％、約１０％から約４０％、約１０％から約３０％、約１０％から約２０％、又は約１０％から約１５％を放出する請求項１〜１１のいずれか一項のマイクロパーティクル。
【請求項１３】
前記マイクロパーティクルが投与後５日にわたりＣＤＫ９阻害薬の約１０％から約５０％、約１０％から約４０％、約１０％から約３０％、約１５％から約４０％、約１５％から約３０％、又は約１５％から約２５％を放出する請求項１〜１２のいずれか一項のマイクロパーティクル。
【請求項１４】
前記マイクロパーティクルが投与後８日にわたりＣＤＫ９阻害薬の約２０％から約７０％、約２０％から約６０％、約２０％から約５０％、約２０％から約４０％、又は約２５％から約３５％を放出する請求項１〜１３のいずれか一項のマイクロパーティクル。
【請求項１５】
前記マイクロパーティクルが投与後１２日にわたりＣＤＫ阻害薬の約３０％から約７０％、約３０％から約６０％、約３０％から約５０％、約４０％から約７０％、約４０％から約６０％、又は約４０％から約５０％を放出する請求項１〜１４のいずれか一項のマイクロパーティクル。
【請求項１６】
前記マイクロパーティクルが投与後１５日にわたりＣＤＫ阻害薬の約４０％から約８０％、約４０％から約７０％、約５０％から約７０％、又は約５５％から約６５％を放出する請求項１〜１５のいずれか一項のマイクロパーティクル。
【請求項１７】
前記マイクロパーティクルが投与後１９日にわたりＣＤＫ阻害薬の約４０％から約８０％、５０％から約８０％、６０％から約８０％、又は６５％から約７５％を放出する請求項１〜１６のいずれか一項のマイクロパーティクル。
【請求項１８】
前記マイクロパーティクルが投与後２２日にわたりＣＤＫ阻害薬の約４０％から約９０％、約５０％から約９０％、約６０％から約９０％、約７０％から約９０％、又は約７５％から約８５％を放出する請求項１〜１７のいずれか一項のマイクロパーティクル。
【請求項１９】
前記マイクロパーティクルが投与後２６日にわたりＣＤＫ阻害薬の約５０％から約９０％、約６０％から約９０％、約７０％から約９０％、又は約８０％から約９０％を放出する請求項１〜１８のいずれか一項のマイクロパーティクル。
【請求項２０】
前記マイクロパーティクルが投与後３０日にわたりＣＤＫ阻害薬の約６０％から約９５％、約７０％から約９５％、約８０％から約９５％、又は約８５％から約９５％を放出する請求項１〜１９のいずれか一項のマイクロパーティクル。
【請求項２１】
複数のマイクロパーティクル及び医薬的に許容可能な担体を含む請求項１〜２０のいずれか一項の医薬組成物。
【請求項２２】
前記複数のマイクロパーティクルが約５から約２０、又は約１０から約２０ミクロン、又は約２０から約５０ミクロンの平均の直径を有する請求項２１の医薬組成物。
【請求項２３】
前記複数のマイクロパーティクルの質量の１０％（Ｄ１０）が約９又は約１０ミクロンより小さい直径を有する請求項２１の医薬組成物。
【請求項２４】
前記複数のマイクロパーティクルの質量の５０％（Ｄ５０）が約１８より小さい、約１９より小さい、又は約２０ミクロンより小さい直径を有する請求項２１の医薬組成物。
【請求項２５】
前記複数のマイクロパーティクルの質量の９０％（Ｄ９０）が約２６、約２７、約２８、約２９、又は約３０ミクロンより小さい直径を有する請求項２１の医薬組成物。
【請求項２６】
前記複数のマイクロパーティクルがＣＤＫ９阻害薬の質量に基づいて約０．５％から約５％、約０．５％から約４％、約０．５％から約３％、又は約０．５％から約２％を有する請求項２１の医薬組成物。
【請求項２７】
ＣＤＫ９阻害薬及び乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）を含むマイクロパーティクルであって、ここで前記マイクロパーティクルが、PLGAによってカプセル化され、この中で前記マイクロパーティクルがCDK9阻害薬の徐放を提供する、治療有効量の複数のマイクロパーティクルを投与することを含むそれを必要とする対象を治療する方法。
【請求項２８】
前記マイクロパーティクルが医薬的に許容可能な担体において投与される請求項２７の方法。
【請求項２９】
前記ＣＤＫ９阻害薬がフラボピリドール、ＳＮＳ−０３２、ボルシクリブ（ｖｏｒｕｃｉｃｌｉｂ）及びそれらの誘導体からなる群、又はそれらの医薬的に許容可能な塩から選択される請求項２７又は２８の方法。
【請求項３０】
前記ＣＤＫ９阻害薬がフラボピリドール、ＳＮＳ−０３２、又はボルシクリブ（ｖｏｒｕｃｉｃｌｉｂ）、又はそれらの医薬的に許容可能な担体である請求項２９の方法。
【請求項３１】
前記ＣＤＫ９阻害薬がフラボピリドールである請求項３０の方法。
【請求項３２】
前記治療される対象がヒトである請求項２７〜３１のいずれか一項の方法。
【請求項３３】
前記治療される対象がウマである請求項２７〜３１のいずれか一項の方法。
【請求項３４】
ＣＤＫ９阻害薬の治療有効量が１〜４２日間にわたり放出される請求項２７〜３３のいずれか一項の方法。
【請求項３５】
請求項１〜２６のいずれか一項の複数のマイクロパーティクルを含む医薬組成物を投与することを含む、それを必要とする対象を治療する方法。
【請求項３６】
前記対象が関節炎、変形性関節症、外傷性の変形性関節症、及び外傷性疾患より選択される疾病又は状態を有する請求項２７〜３５のいずれか一項の方法。
【請求項３７】
前記疾病又は状態が関節に影響する請求項３６の方法。
【請求項３８】
前記関節が膝関節である請求項３７の方法。
【請求項３９】
前記医薬組成物が注射によって投与される請求項２７〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記マイクロパーティクルが少なくとも２４時間部位でＣＤＫ９阻害薬の徐放を提供し、そしてそれによってその部位の炎症がそこで減少又は回復される、複数のマイクロパーティクルに製剤化されたＣＤＫ９阻害薬を含む組成物を部位に投与することを含む炎症部位を治療する方法。
【請求項４１】
前記炎症部位が関節、軟骨、又は外傷の部位である請求項４０の方法。
【請求項４２】
前記マイクロパーティクルがＰＬＧＡを含み、そしてここで前記ＣＤＫ９阻害薬がフラボピリドール、ＳＮＳ−０３２、ボルシクリブ（ｖｏｒｕｃｉｃｌｉｂ）及びそれらの誘導体からなる群、又はそれらの医薬的に許容可能な塩から選択される請求項４０又は４１の方法。
【請求項４３】
前記マイクロパーティクルが約２０から約５０ミクロンの間の平均の直径を有する請求項２７〜４２のいずれか一項の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は２０１８年４月２３日に出願された米国特許出願第６２／６６１，５９９の利益を請求し、その内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
［連邦政府が後援する研究又は開発下で行われた発明に対する権利に関する声明］
【０００２】
本発明はアメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）の助成金番号Ｒ２１ＡＲ０６３３４８及びＡＲＭＹ／ＭＲＭＣ助成金番号Ｗ８１ＸＷＨ−１２−１−０３１１下で政府の支援を受けて作製された。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
最近の前進により、サイクリン依存性キナーゼ９（ＣＤＫ９）及びサイクリンＴを含む一般的な転写因子Ｐ−ＴＥＦｂが全ての初期応答遺伝子の活性化の律速段階を制御することを決定的に示した。前記初期応答遺伝子（ＰＲＧｓ）は、環境中の急な変化への対応において転写レベルで即座に活性化される必要がある遺伝子である。ＰＲＧｓは典型的な炎症性遺伝子（ＩＬ−１、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ｉＮＯＳ等）、及び他の細胞型特異的遺伝子を含む。細胞環境中の急性の変化の事象（例えば関節の怪我）において、ＰＲＧｓの転写ではＣＤＫ９の活性を必要とする。それゆえ、ＣＤＫ９は急性の事象、例えば怪我に対する細胞応答を制限するために設計された治療についての新規標的である。小分子のＣＤＫ９阻害薬は存在するが、しかしながらそれらは迅速に拡散し、一般的にｉｎ  ｖｉｖｏで半減期が短く、そして全身投与は所望されない的外れの影響をもたらしうる。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書で提供されるものは、局所的に病変組織への阻害薬の徐放を提供し、一方で所望されない全身への影響を避けるＣＤＫ９阻害薬のマイクロパーティクル製剤である。本発明の製剤は乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）のマイクロパーティクル内にカプセル化されたＣＤＫ９阻害薬を含む。驚くべきことに、我々はマイクロパーティクルの成分の多くの組み合わせが十分な徐放を提供することに失敗し、許容されないより大きい平均サイズのマイクロパーティクルをもたらし、カプセル化された薬物の少なくとも約８０％で放出することを失敗し、及び／又はＣＤＫ９阻害薬の不適切な量がカプセル化されることを発見した。
【０００５】
本明細書のマイクロパーティクル製剤は約４〜６週の期間にわたりＣＤＫ９阻害薬の徐放を提供し、ここで投与後最初の２４時間以内に制限された量を放出した。
【０００６】
本発明のマイクロパーティクルはＣＤＫ９阻害薬及びＰＬＧＡポリマーを含み、約２ミクロンから約１５０ミクロンの平均サイズに及ぶ。
【０００７】
さらに本明細書で提供されるものは、開示の複数のマイクロパーティクルを含む医薬組成物、及び医薬的に許容可能な担体である。
【０００８】
また本明細書で提供されるものは、関節における疾病又は障害に苦しむ対象例えばヒト又は動物の対象を治療する方法であり、関節に注射することを含む方法は医薬組成物の治療有効量を含む。
【０００９】
本発明の一つの側面はサイクリン依存性キナーゼ９（ＣＤＫ９）阻害薬及び乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）を含むマイクロパーティクルであって、ここでそのＣＤＫ９阻害薬はＰＬＧＡによってカプセル化され、そしてこの中でそのマイクロパーティクルはＣＤＫ９阻害薬の徐放を提供する。
【００１０】
本発明の別の側面は本発明の複数のマイクロパーティクル、及び医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物である。
【００１１】
本発明の別の側面は、複数のマイクロパーティクルの治療有効量を投与することを含む、それを必要とする対象を治療する方法であって、そのマイクロパーティクルはＣＤＫ９阻害薬及び乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）を含み、ここでそのＣＤＫ９阻害薬はＰＬＧＡによってカプセル化され、そしてこの中でそのマイクロパーティクルはＣＤＫ９阻害薬の徐放を提供する。
【００１２】
本発明の別の側面は、本発明の複数のマイクロパーティクル及び医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物を投与することを含む、それを必要とする患者を治療する方法である。
【００１３】
本発明の別の側面は、複数のマイクロパーティクル内に製剤化したＣＤＫ９阻害薬を含む組成物を部位に投与することを含む炎症部位を治療する方法であって、ここでそのマイクロパーティクルは少なくとも２４時間その部位でＣＤＫ９の徐放を提供し、そしてこれによってその部位の炎症はそれゆえ減少又は回復する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、３００ｎＭフラボピリドールの有無、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１βによって５時間処理した単層培養における初期ヒト軟骨細胞の遺伝子発現の効果を示す。ＣＤＫ９阻害薬は初期炎症応答遺伝子の転写を効果的に抑制する。
【００１５】
【図２Ａ】図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ及び２Ｄはフラボピリドールの全身投与によるＣＤＫ９阻害がマウスにおける前十字靭帯損傷の初期応答遺伝子の転写を効果的に抑制することを示す。図２Ａはフラボピリドールの有無によるＩＬ−１β  ｍＲＮＡ発現の増加を示す。
【図２Ｂ】図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ及び２Ｄはフラボピリドールの全身投与によるＣＤＫ９阻害がマウスにおける前十字靭帯損傷の初期応答遺伝子の転写を効果的に抑制することを示す。図２Ｂはフラボピリドールの有無によるＩＬ−６  ｍＲＮＡ発現の増加を示す。
【図２Ｃ】図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ及び２Ｄはフラボピリドールの全身投与によるＣＤＫ９阻害がマウスにおける前十字靭帯損傷の初期応答遺伝子の転写を効果的に抑制することを示す。図２Ｃはフラボピリドールの有無によるＭＭＰ−１３  ｍＲＮＡ発現の増加を示す。
【図２Ｄ】図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ及び２Ｄはフラボピリドールの全身投与によるＣＤＫ９阻害がマウスにおける前十字靭帯損傷の初期応答遺伝子の転写を効果的に抑制することを示す。図２Ｄはフラボピリドールの有無によるＡＤＡＭＴＳ４  ｍＲＮＡ発現の増加を示す。
【００１６】
【図３Ａ】フラボピリドールの反復した全身投与によるＣＤＫ９阻害はマウスにおいて前十字靭帯損傷の初期応答遺伝子の転写を効果的に抑制する。損傷後、少なくとも３時間の空白時間が存在し、その間に、フラボピリドールによるＣＤＫ阻害が初期応答遺伝子の転写を阻害することで効果的である。図３Ａはフラボピリドールの０、１、又は２回の投与後のＩＬ−１β遺伝子発現の増加を示す。
【図３Ｂ】フラボピリドールの反復した全身投与によるＣＤＫ９阻害はマウスにおいて前十字靭帯損傷の初期応答遺伝子の転写を効果的に抑制する。損傷後、少なくとも３時間の空白時間が存在し、その間に、フラボピリドールによるＣＤＫ阻害が初期応答遺伝子の転写を阻害することで効果的である。図３Ｂはフラボピリドールの０、１、又は２回の投与後のＩＬ−６遺伝子発現の増加を示す。
【図３Ｃ】フラボピリドールの反復した全身投与によるＣＤＫ９阻害はマウスにおいて前十字靭帯損傷の初期応答遺伝子の転写を効果的に抑制する。損傷後、少なくとも３時間の空白時間が存在し、その間に、フラボピリドールによるＣＤＫ阻害が初期応答遺伝子の転写を阻害することで効果的である。図３Ｃはフラボピリドール投与前に０、１、２、又は３時間の遅延後のＩＬ−１β遺伝子発現の増加を示す（一番左側のバーはフラボピリドールの治療のない発現を示す）。
【図３Ｄ】フラボピリドールの反復した全身投与によるＣＤＫ９阻害はマウスにおいて前十字靭帯損傷の初期応答遺伝子の転写を効果的に抑制する。損傷後、少なくとも３時間の空白時間が存在し、その間に、フラボピリドールによるＣＤＫ阻害が初期応答遺伝子の転写を阻害することで効果的である。図３Ｄはフラボピリドールの投与前に０、１、２、又は３時間の遅延後のＩＬ−６遺伝子発現の増加を示す（一番左側のバーはフラボピリドールの治療のない発現を示す）。
【００１７】
【図４Ａ】図４は実施例１において調製されたフラボピリドールを含むＰＬＧＡマイクロパーティクルの典型的なサイズ分布である。図４Ａは、測定の表とともに、ロット５３０２４のＰＬＧＡマイクロパーティクルのサイズ分布を図示する。
【図４Ｂ】図４は実施例１において調製されたフラボピリドールを含むＰＬＧＡマイクロパーティクルの典型的なサイズ分布である。図４Ｂは本発明のマイクロパーティクルの光学顕微鏡像である。
【図４Ｃ】図４は実施例１において調製されたフラボピリドールを含むＰＬＧＡマイクロパーティクルの典型的なサイズ分布である。図４Ｃは異なる製剤における本発明のマイクロパーティクルの光学顕微鏡像である。
【図４Ｄ】図４は実施例１において調製されたフラボピリドールを含むＰＬＧＡマイクロパーティクルの典型的なサイズ分布である。図４Ｄはさらに別の製剤における本発明のマイクロパーティクルの光学顕微鏡像である。
【００１８】
【図５】１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含む１×ＰＢＳにおけるバッチのＰＬＧＡマイクロパーティクル由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのフラボピリドールの放出特性が、約９０％の放出された薬剤によって、３０日までマイクロパーティクルのほぼ線形のフラボピリドールの放出動態を示す。
【００１９】
【図６Ａ】２０％ｗ／ｖ比の塩化メチレンにおけるＰｕｒａｓｏｒｂ（登録商標）ＰＤＬＧ５００４Ａ（Ｃｏｒｂｉｏｎ）を用いて合成したＰＬＧＡマイクロパーティクル（ＭＰｓ）においてフラボピリドールを１％ｗ／ｖ比でカプセル化し、２：１の比でポリビニルアルコール（１０％）の添加後３０秒間激しくボルテックスした。続いてその溶液を液滴で１％ＰＶＡに添加し、一晩撹拌し、翌日３回洗浄し、一晩凍結乾燥した。ＤＭＦにフラボピリドールＰＬＧＡ  ＭＰｓを溶解することによって、５１．５％の平均積載効率を決定し、標準曲線よりフラボピリドール濃度を測定し、そして出発量と比較した（全ての測定点についてｎ＝３）。図６Ａ：ＡｃｃｕＳｉｚｅｒ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ７７０を用いて、フラボピリドールＭＰｓのサイズを決定し、６．８７μｍの平均の直径を有した（ブランクＭＰｓは１０．７７μｍの平均の直径を有した）。
【図６Ｂ】２０％ｗ／ｖ比の塩化メチレンにおけるＰｕｒａｓｏｒｂ（登録商標）ＰＤＬＧ５００４Ａ（Ｃｏｒｂｉｏｎ）を用いて合成したＰＬＧＡマイクロパーティクル（ＭＰｓ）においてフラボピリドールを１％ｗ／ｖ比でカプセル化し、２：１の比でポリビニルアルコール（１０％）の添加後３０秒間激しくボルテックスした。続いてその溶液を液滴で１％ＰＶＡに添加し、一晩撹拌し、翌日３回洗浄し、一晩凍結乾燥した。ＤＭＦにフラボピリドールＰＬＧＡ  ＭＰｓを溶解することによって、５１．５％の平均積載効率を決定し、標準曲線よりフラボピリドール濃度を測定し、そして出発量と比較した（全ての測定点についてｎ＝３）。図６Ｂ：Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ２０００  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒで２７４ｎｍで取得された、ＤＭＳＯに溶解したＰＬＧＡの溶液内のフラボピリドールの異なる濃度の線形標準曲線。
【図６Ｃ】２０％ｗ／ｖ比の塩化メチレンにおけるＰｕｒａｓｏｒｂ（登録商標）ＰＤＬＧ５００４Ａ（Ｃｏｒｂｉｏｎ）を用いて合成したＰＬＧＡマイクロパーティクル（ＭＰｓ）においてフラボピリドールを１％ｗ／ｖ比でカプセル化し、２：１の比でポリビニルアルコール（１０％）の添加後３０秒間激しくボルテックスした。続いてその溶液を液滴で１％ＰＶＡに添加し、一晩撹拌し、翌日３回洗浄し、一晩凍結乾燥した。ＤＭＦにフラボピリドールＰＬＧＡ  ＭＰｓを溶解することによって、５１．５％の平均積載効率を決定し、標準曲線よりフラボピリドール濃度を測定し、そして出発量と比較した（全ての測定点についてｎ＝３）。図６Ｃ：ほぼ線形の放出を示す１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）ＰＢＳ溶液における４２日間にわたるＭＰｓを積載したフラボピリドールの放出動態。
【図６Ｄ】２０％ｗ／ｖ比の塩化メチレンにおけるＰｕｒａｓｏｒｂ（登録商標）ＰＤＬＧ５００４Ａ（Ｃｏｒｂｉｏｎ）を用いて合成したＰＬＧＡマイクロパーティクル（ＭＰｓ）においてフラボピリドールを１％ｗ／ｖ比でカプセル化し、２：１の比でポリビニルアルコール（１０％）の添加後３０秒間激しくボルテックスした。続いてその溶液を液滴で１％ＰＶＡに添加し、一晩撹拌し、翌日３回洗浄し、一晩凍結乾燥した。ＤＭＦにフラボピリドールＰＬＧＡ  ＭＰｓを溶解することによって、５１．５％の平均積載効率を決定し、標準曲線よりフラボピリドール濃度を測定し、そして出発量と比較した（全ての測定点についてｎ＝３）。図６Ｄ：Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＸＬ３０  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅを用いるフラボピリドールＭＰｓのＳＥＭ画像。
【００２０】
【図７Ａ】徐放ＰＬＧＡ−フラボピリドールの関節内注射は前十字靭帯損傷ＰＴＯＡラットモデルにおいて少なくとも３週間ＯＡから膝関節を保護した。図７Ａは、治療した及びコントロールの膝と比較するために、未治療の損傷した膝における局在化したＭＭＰ発現を示す。
【図７Ｂ】徐放ＰＬＧＡ−フラボピリドールの関節内注射は前十字靭帯損傷ＰＴＯＡラットモデルにおいて少なくとも３週間ＯＡから膝関節を保護した。図７Ｂ：フラボピリドール−ＰＬＧＡマイクロパーティクルを前十字靭帯損傷を有するラット（三角）の関節内注射によって投与し、そして薬物を有さない空のＰＬＧＡマイクロパーティクルはコントロール（四角）である。関節のＭＭＰＳｅｎｓｅ活性をＭＭＰＳｅｎｓｅ７５０試薬を用いて反復して測定し、そして損傷した脚における活性を同じ動物の損傷していない反対側の脚の活性により標準化した。１．０の比は損傷の影響がないことを示す。これらの結果はフラボピリドールを放出するマイクロパーティクルが少なくとも３週間、軟骨を分解するＭＭＰ酵素の活性に対して保護されることを示す。
【００２１】
【図８Ａ】図８は細胞に基づく試験を用いて、ＰＬＧＡマイクロパーティクルから放出されたフラボピリドールがその効力を保持することを示す。図８Ａ：図の３〜５レーンに示すように、フラボピリドールはルシフェラーゼレポーター遺伝子による測定として、ＩＬ−１刺激（レーン２）によって見られるＩＬ−１β応答の９９％以上を保護し、そしてこれはＰＬＧＡカプセル化前（レーン５）と後（レーン３，４）との間のフラボピリドールで一貫していた。その刺激はＩＬ−１β処理であり、多くの初期応答遺伝子の転写活性をもたらす。ルシフェラーゼ活性の読み取りはＮＦκＢ−応答性のプロモーターによって駆動され、それは容易に定量化されうる初期応答遺伝子として寄与する。コントロールのベースライン値は低く、＜５０００である。このＩＬ−１β誘導した増加はフラボピリドールが存在する場合に観察されず、そして重要なことに、二つの異なるＰＬＧＡ製剤（５３０１０及び５３０１２）から放出されるフラボピリドールは、カプセル化前のフラボピリドール（Ｆｌａｖｏ）と同様の活性がある。図８Ａ、図８ＢのＹ軸の対数目盛に注意：下図は線形のＹ軸であり、フラボピリドールがＩＬ−１β反応の９９．６％と９９．８％との間で保護されており、そしてＰＬＧＡカプセル化したフラボピリドールがその効力を保持していることを示す。
【図８Ｂ】図８は細胞に基づく試験を用いて、ＰＬＧＡマイクロパーティクルから放出されたフラボピリドールがその効力を保持することを示す。図８Ａ：図の３〜５レーンに示すように、フラボピリドールはルシフェラーゼレポーター遺伝子による測定として、ＩＬ−１刺激（レーン２）によって見られるＩＬ−１β応答の９９％以上を保護し、そしてこれはＰＬＧＡカプセル化前（レーン５）と後（レーン３，４）との間のフラボピリドールで一貫していた。その刺激はＩＬ−１β処理であり、多くの初期応答遺伝子の転写活性をもたらす。ルシフェラーゼ活性の読み取りはＮＦκＢ−応答性のプロモーターによって駆動され、それは容易に定量化されうる初期応答遺伝子として寄与する。コントロールのベースライン値は低く、＜５０００である。このＩＬ−１β誘導した増加はフラボピリドールが存在する場合に観察されず、そして重要なことに、二つの異なるＰＬＧＡ製剤（５３０１０及び５３０１２）から放出されるフラボピリドールは、カプセル化前のフラボピリドール（Ｆｌａｖｏ）と同様の活性がある。図８Ａ、図８ＢのＹ軸の対数目盛に注意：下図は線形のＹ軸であり、フラボピリドールがＩＬ−１β反応の９９．６％と９９．８％との間で保護されており、そしてＰＬＧＡカプセル化したフラボピリドールがその効力を保持していることを示す。
【００２２】
【図９】図９はマイクロパーティクルが大きい凝集物を形成したために規格に適合しないＰＬＧＡ−フラボピリドール製剤を示す。この場合において、分布図により示されるように、ＰＬＧＡカプセル化したフラボピリドールを有するマイクロパーティクルは１００〜２００ミクロンの凝集物を形成した。これらの粒子は凝集塊を示す（実施例６表３（Ｅ及びＨ製剤）参照）。
【００２３】
【図１０】図１０は不完全なフラボピリドールを放出するため、規格に適合しないＰＬＧＡ−フラボピリドール製剤を示す。この図はそれらが＜８０％の不完全なフラボピリドールの放出を示すために規格に適合しないＰＬＧＡ−フラボピリドールの二つの異なる製剤を示す。これらの製剤は、滅菌のための場合によっては用いられうる処理方法である、ガンマ線照射処理後の製剤Ｊ及びＬ（実施例６表３参照）に対応するが、本明細書ではフラボピリドールの放出特性に好ましくない影響を与える。
【００２４】
【図１１】図１１は、非線形のフラボピリドールの放出（最初に勢いよく放出され、続く追加の放出はほとんどない）により規格に適合しないＰＬＧＡ−フラボピリドール製剤を示す。図はＰＬＧＡ−フラボピリドールの二つの製剤が；（ａ）最初の勢いよいフラボピリドールの放出；（ｂ）最初の勢いのよい放出の後のとても遅い放出（実施例表３製剤Ｍ及びＮ参照）を有するので、規格に適合しないことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
Ｉ．概要
ある態様において、本発明はＣＤＫ９阻害薬の局所送達について新規の徐放製剤を記載し、ここでその阻害薬は生体吸収性ポリマーにカプセル化され、そしてポリマーが分解される時間にわたり放出される。その阻害薬は、全体的な全身投与量を最小限に抑えながら、長期間にわたり治療レベルで局所的に利用可能である。
ＩＩ．定義
【００２６】
「ＰＬＧＡ」は乳酸・グリコール酸共重合体である。
【００２７】
「ＣＤＫ」はサイクリン依存性キナーゼを意味する。ＣＤＫ９はサイクリン依存性キナーゼ９である。
【００２８】
「ＩＬ」はインターロイキンである。
【００２９】
「ＴＮＦ」は腫瘍壊死因子である。
【００３０】
「ＭＭＰ」はマトリックスメタロプロテアーゼである。
【００３１】
「ＡＣＬ」は前十字靭帯である。
【００３２】
「ＰＴＯＡ」は外傷後の変形性関節症である。
【００３３】
ＣＤＫ９阻害薬の「誘導体」はＣＤＫ９阻害薬のエステル、アミド又はプロドラッグであり、ここでそのエステル、アミド、又はプロドラッグ置換基は対象へ投与後切断又は加水分解される。
【００３４】
「マイクロパーティクル」という用語は約０．５μｍと約１００μｍとの間の直径を有するＰＬＧＡ粒子を意味する。
【００３５】
「徐放」という用語は、投与後の延長された期間にわたるＣＤＫ阻害薬の放出を意味し、一般的に約１時間と約３０〜６０日間との間である。
【００３６】
「インヘレント粘度」（本明細書では「ＩＶ」として略される）という用語は本発明に用いられるポリマーの特性を意味する。インヘレント粘度、ηiはηi＝（ｌｎ  ηr）／ｃ式より計算され、式中「ｃ」は溶液中のポリマー濃度であり、そしてηrは相対粘度である。次に前記相対粘度は、ηr＝η／η0によって与えられ、ここでηは測定される粘度であり、η0は溶媒の粘度である。前記ＩＶは濃度を０に外挿されうり、その結果は「極限粘度」（「［η］」）と称され、それはポリマーの分子量と相関する。それゆえ、ＩＶはポリマーの分子量の指標である。ＩＶはグラム当たりのデシリットル、ｄＬ／ｇの単位で示される。粘度は一般に粘度計、例えば回転式粘度計、音叉振動式粘度計、ガラス毛細管粘度計、落球粘度計等を用いて測定される。本発明で使用されるポリマーに対するＩＶは、クロロホルム又はヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）に溶解したポリマーによってガラス毛細管粘度計を用いて決定されうる。
【００３７】
本明細書で用いられる「対象」という用語は、哺乳類を意味し、それはヒト又はヒトではない哺乳類、例えば伴侶動物、例えばイヌ、ネコ、ラット等、又は家畜例えばウマ、ロバ、ラバ、ヤギ、ヒツジ、ブタ若しくはウシ等でありうる。
【００３８】
「治療有効量」という用語は、所望されない炎症を抑制すること及び症状及び／又は合併症を排除又は少なくとも部分的に停止するための十分な本発明のマイクロパーティクルの量を意味する。具体的に、治療有効量は初期応答遺伝子、例えばＩＬ−１β及びＩＬ−６の発現を、他の予期された遺伝子活性の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、又は１％以下に抑制する十分量である。本使用における効果的な量は例えば、阻害薬の組成物、投与方法、治療中の疾病のステージ及び重篤性、体重及び患者の一般的な健康状態、並びに医師の処方の判断に依存するだろう。実際のところは、本発明の方法における治療効果のための必要とされるＣＤＫ９阻害薬の量は、マイクロパーティクルの薬剤放出の局所的な性質により、全身投与に必要とされる量よりも少ないだろう。本発明のマイクロパーティクルは慢性的に又は急性的に投与されうり、炎症、軟骨退化、及び外傷後の変形性関節症を減少、阻害又は防止する。
【００３９】
「炎症部位」は炎症を示す対象の体内の特定の組織又は領域を意味する。炎症は多くの因子によりもたらされうり、身体外傷（例えば、火傷、凍傷、異物、使用又は乱用による変性等）、感染、癌、（喫煙に晒されるような）化学物質への曝露、被爆、虚血、自己免疫疾患、ぜんそく等を含む。同様に、「外傷部位」は外傷を認めた対象の体の部分を意味する。外傷部位は、軟組織又は硬組織（例えば、骨、軟骨、及び関節）でありうる。
ＩＩＩ．組成物及び方法
【００４０】
本明細書の方法及び組成物は局所送達のためのＣＤＫ９阻害薬の徐放製剤を提供する。徐放製剤に活性な薬物をカプセル化する一つの重要な利点は、その薬物が長期間にわたって治療有効濃度で局所的に利用可能なままであることである。放出の期間は、パラメータ、例えばポリマーのインヘレント粘度、Ｌ：Ｇ比、ポリマーの末端基及び粒子サイズによって調節される。本明細書で示されるように、これらのパラメータは、急性の損傷事象後数日から数週間に及びうる典型的な炎症応答の期間に対応して設計されうる。素早く代謝され、不活化されると考えられるので（例えば、フラボピリドールはｉｎ  ｖｉｖｏで約５〜６時間の半減期を有する）、これは薬物の慣習の全身投与に対する改善である。本発明の製剤化の第二の重要な利点は薬物の局所送達である。例えば、カプセル化したフラボピリドールを有するマイクロパーティクルが関節内に注射された場合に、それらは関節包内に留まる。これは時間経過で関節腔内に薬剤の治療に有効な局所濃度を提供し、一方で全身の薬物負担を大幅に軽減する。
Ａ．化合物
【００４１】
本明細書で提供されるものは、ＣＤＫ９の存在する小分子阻害薬を用いるＣｄｋ−９キナーゼ活性を標的にする治療薬の製剤である。本明細書で提供される製剤は、フラボピリドール、ボルシクリブ（Ｖｏｒｕｃｉｃｌｉｂ）並びにフラボピリドール及びボルシクリブ（Ｖｏｒｕｃｉｃｌｉｂ）と構造的に関連するＣＤＫ９阻害薬のクラスに適当であり、かくして阻害薬は、対象の患部、例えば損傷組織又は細胞型へ適当な全体的な放出能及び放出動態によって送達される。
【００４２】
ある態様において、前記ＣＤＫ９阻害薬はフラボピリドール、又はエステル、プロドラッグ、又はそれらの医薬的に許容可能な塩である。ある態様において、前記ＣＤＫ９阻害薬はフラボピリドール、又はその誘導体又は塩である。ある態様において、前記ＣＤＫ９阻害薬はフラボピリドール、ＳＮＳ−０３２、又はボルシクリブ（Ｖｏｒｕｃｉｃｌｉｂ）である。
【００４３】
ある態様において、前記ＣＤＫ９阻害薬はフラボピリドール、又はエステル、プロドラッグ、又はそれらの医薬的に許容可能な塩である。ある態様において、前記ＣＤＫ９阻害薬はフラボピリドール、又はその誘導体又は塩である。ある態様において、前記ＣＤＫ９阻害薬はフラボピリドール（ＩＵＰＡＣ名：２−（２−クロロフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−［（３Ｓ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−１−メチル−４−ピペリジニル］−４−クロメノン；（ＣＡＳ＃１４６４２６−４０−６）であり、以下の構造を有する：
【化１】
2021522343.tif 000003
【００４４】
フラボピリドールのようなＣＤＫ９阻害薬は広く及び効果的に初期応答遺伝子の転写活性を抑制し、それは炎症性遺伝子（例えばＩＬ−１、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ｉＮＯＳ等）及びマトリックス分解酵素（ＭＭＰｓ、ＡＤＡＭＴＳ等）を含む。しかしながら、フラボピリドールは迅速に代謝され、そして分解され、そしてｉｎ  ｖｉｖｏで６時間未満の短い半減期を有する。低分子（〜４００Ｄａ）として、投与部位から急速に拡散し、そしてそれゆえ一般的に全身投与として与えられる。本明細書で提供されるものは、ＣＤＫ９阻害薬及びＰＬＧＡポリマーの製剤であり、ここでそのＣＤＫ９阻害薬は適当なサイズの粒子にカプセル化され、そして適当な放出能及び放出動態を有し、かくしてＣＤＫ９阻害薬は一定期間にわたり治療有効量を提供され、対象の損傷組織に対して障害を治療し、炎症を減少し、症状を回復し及び／又はさらなる損傷を防ぐ。
【００４５】
ある態様において、前記ＣＤＫ９阻害薬はＳＮＳ−０３２、又はプロドラッグ、又はそれらの医薬的に許容可能な塩である。ある態様において、前記ＣＤＫ９阻害薬はＳＮＳ−０３２、又はその塩である。ある態様において、前記ＣＤＫ９阻害薬はＳＮＳ−０３２であり、以下の構造を有する：
【化２】
2021522343.tif 000004
【００４６】
ある態様において、前記ＣＤＫ９阻害薬はボルシクリブ（Ｖｏｒｕｃｉｃｌｉｂ）、又はエステル、プロドラッグ、又はそれらの医薬的に許容可能な塩である。ある態様において、そのＣＤＫ９阻害薬はボルシクリブ（Ｖｏｒｕｃｉｃｌｉｂ）又はその誘導体又はその塩である。ある態様において、そのＣＤＫ９阻害薬はボルシクリブ（Ｖｏｒｕｃｉｃｌｉｂ）であり、以下の構造を有する：
【化３】
2021522343.tif 000005
【００４７】
別のＣＤＫ９阻害薬はディナシクリブである。ディナシクリブは効果的にカプセル化されず、又は本発明のマイクロパーティクルにおいて適切に放出されない：
【化４】
2021522343.tif 000006
【００４８】
本明細書に提供されるものはＣＤＫ９阻害薬がＳＮＳ−３２、ボルシクリブ（Ｖｏｒｕｃｉｃｌｉｂ）、又はフラボピリドール、及びＰＬＧＡポリマーであるＣＤＫ９阻害薬の製剤であり、かくしてＣＤＫ９阻害薬が適当なサイズのマイクロパーティクルにカプセル化され、そして適当な放出能及び放出動態を有し、かくしてＣＤＫ９阻害薬は一定期間にわたり治療有効量を提供され、対象の損傷組織に対して損傷を治療し、炎症を減少し、症状を回復し及び／又はさらなる損傷を防止する。
【００４９】
また、本明細書に記載され提供されるものは、ＣＤＫ９阻害薬の医薬的に許容可能な塩、水和物、溶媒、互変異性の形態、多形、プロドラッグである。「医薬的に許容可能な」又は「生理学的に許容可能な」は動物又はヒトの医薬使用について適当である医薬組成物を調製することにおいて有用である化合物、塩、組成物、剤形及び他の材料を意味する。
【００５０】
本明細書で記載される化合物は、医薬的に許容可能な塩として、又は遊離した塩基として適当な場合に調製及び／又は製剤化されうる。「医薬的に許容可能な塩」は遊離した塩基の所望される薬理学的な活性を保持する化合物の遊離した塩基の形状の無毒の塩である。これらの塩は無機又は有機の酸又は塩基に由来しうる。例えば、塩基性窒素を含む化合物は無機酸又は有機酸を有する化合物と接触することによって医薬的に許容可能な塩として調製されうる。医薬的に許容可能な塩の制限されない例として、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、ホスフェート、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソ酪酸エステル、カプロン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオ―ル酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバジン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン−１，４−ジカルボン酸塩（ｂｕｔｙｎｅ−１，４−ｄｉｏａｔｅｓ）、ヘキシン−１，６−ジカルボン酸塩（ｈｅｘｙｎｅ−１，６−ｄｉｏａｔｅｓ）、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、安息香酸メチル、ジニトロベンゾアート、ヒドロキシベンゾエート、メトキシ安息香酸塩（ｍｅｔｈｏｘｙ  ｂｅｎｚｏａｔｅｓ）、フタル酸塩、スルホン酸塩、メタンスルホン酸、プロピルスルホナート、ベシル酸塩、キシレンスルホン酸塩、ナフタレン−１−スルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩、酢酸フェニル、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、γ−ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、酒石酸塩、及びマンデル酸塩を含む。他の適当な医薬的に許容可能な塩はＲｅｍｉｎｇｔｏｎによって発見された：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１th  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，２００６。
【００５１】
また、本明細書に開示した化合物の医薬的に許容可能な塩の例は、適当な塩基、例えばアルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウム）、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）、アンモニウム及びＮＸ４+（ここでＸはＣ1−Ｃ4アルキルである）に由来する塩を含む。また、含まれるものは塩基付加塩、例えばナトリウム又はカリウム塩である。
Ｂ．組成物
【００５２】
本明細書で提供されるものは、阻害薬が生体吸収性ポリマーにカプセル化されたＣＤＫ９阻害薬の新規の徐放製剤である。その阻害薬はポリマーの分解としての時間にわたり連続して放出される。そのポリマーは投与部位で保持されるマイクロパーティクルの形状である（例えば、関節への関節内注射）。ある態様において、そのマイクロパーティクルは、直径４ミクロンから５０ミクロンに及び、直径約１５ミクロンの標的サイズを有する。ある態様において、マイクロパーティクルの平均直径は、直径４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００ミクロンである。ある態様において、マイクロパーティクルの平均直径は１００ミクロン以下、７０ミクロン以下、５０ミクロン以下、４５ミクロン以下、４０ミクロン以下、３５ミクロン以下、３０ミクロン以下、２５ミクロン以下、２０ミクロン以下、１５ミクロン以下、１０ミクロン以下、５ミクロン以下である。ある態様において、そのマイクロパーティクルの平均直径は、約２０ミクロンから約５０ミクロンの間、約２０ミクロンから約３０ミクロンの間又は約１０ミクロンから約２０ミクロンの間である。ある態様において、マイクロパーティクルの平均直径は約１２ミクロンから約１８ミクロンの間である。ある態様において、そのマイクロパーティクルの平均直径は約１５ミクロン、約２０ミクロン、約２５ミクロン、約３０ミクロン、約３５ミクロン、約４０ミクロン、約４５ミクロン又は約５０ミクロンである。ある態様において、その生体吸収性のポリマーはＰＬＧＡである。そのマイクロパーティクルは投与部位で保持される（例えば、損傷関節への関節内注射）。マイクロパーティクル−カプセル化した剤形の利点は、マイクロパーティクルが注射した箇所に局所的にとどまることであり、それゆえ、その阻害薬は延長された期間にわたって治療有効濃度で局所的に利用可能であり、正確に設計されうる。例えば、そのタイミングは、損傷応答の異化期の炎症フェーズの期間において、数日から数カ月間薬物を放出するために設計されうる。
【００５３】
本発明の態様は、サイクリン依存性キナーゼ９（ＣＤＫ９）阻害薬及び乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）を含むマイクロパーティクルであり、ここでＣＤＫ９阻害薬はＰＬＧＡによってカプセル化され、そしてこの中でそのマイクロパーティクルはＣＤＫ９阻害薬の徐放を提供する。
【００５４】
ある態様において、その生体吸収性ポリマーはＰＬＧＡ共重合体である。開示のＣＤＫ９阻害薬の徐放に有用であるＰＬＧＡ共重合体は、ＣＤＫ９阻害薬が実質的に約３０日の経過にわたって放出される速度で分解するそれらを含む。ある態様において、ＰＬＧＡ共重合体は乳酸とグリコール酸との単量体の比（Ｌ：Ｇ比）を約１０：９０から約９０：１０を含むそれらを含む。ある態様においては、ＰＬＧＡ共重合体は乳酸とグリコール酸の単量体の比（Ｌ：Ｇ比）を約５０：５０から約７５：２５を含むそれらを含み、約５０：５０から約７５：２５までを有する共重合体を含む。ある態様において、ＰＬＧＡ共重合体は約７０：３０、約６５：３５、約６０：４０、約６０：５０、又は約５５：４５のＬ：Ｇ比を含むそれらを含む。本明細書のある態様において、開示のＰＬＧＡ共重合体は酸末端である。本発明の態様において、そのＰＬＧＡは酸末端化された５０：５０のポリ（ＤＬラクタイドＣＯグリコライド）である。本発明の態様において、そのＰＬＧＡは酸末端化されたＬａｃｔｅｌ（登録商標）ポリマー（Ｄｕｒｅｃｔ  Ｃｏｒｐ．）である。本発明の態様において、そのＰＬＧＡはＬａｃｔｅｌ（登録商標）Ｂ６０１３−１、Ｂ６０１３−２、又はＢ６０１２−４ポリマーである。本発明の態様において、そのＰＬＧＡはＰｕｒａｓｏｒｂ（登録商標）ポリマー（Ｃｏｒｂｉｏｎ）である。本発明の態様において、そのＰＬＧＡはＰｕｒａｓｏｒｂ（登録商標）５００４Ａの５０：５０のポリ（ＤＬラクタイドＣＯグリコライド）である。
【００５５】
ある態様において、そのＰＬＧＡ−カプセル化されたＣＤＫ９阻害薬のマイクロパーティクルは、直径約１から約５０ミクロン、例えば直径約１から約５０、約１から約４０、約２から約５０、約２から約４０、約３から約５０、約３から約４０ミクロンである。ミクロンサイズの粒子の均一な産生が本発明の方法における使用に所望され、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０又は約１００ミクロン未満の直径を有する医薬品製剤における使用について粒子の質量の少なくとも９０％、９５％、９６％、９８％又は少なくとも９９％を有する。
【００５６】
本発明のある態様において、前記マイクロパーティクルは治療期間にわたりおおよそ一定の割合でＣＤＫ９阻害薬を放出する。ある態様において、そのマイクロパーティクルは、カプセル化したＣＤＫ９阻害薬の約３％から約１０％の最初の放出後、一定の割合で放出する。ある態様において、その最初の放出は約２４時間以内に起こる。ある態様において、その最初の放出は約１２時間以内に起こる。ある態様において、その最初の放出は約８時間以内に起こる。ある態様において、その最初の放出は約１時間以内に起こる。ある態様において、そのマイクロパーティクルは２４時間にわたり、ＣＤＫ９阻害薬の約３％から約３０％、約３％から約２０％、約３％から約１０％、約５％から約３０％、約５％から約２０％、又は約５％から約１０％を放出する。ある態様において、そのマイクロパーティクルは、２日間にわたりＣＤＫ９阻害薬の約５％から約４０％、約５％から３０％、約５％から約２０％、約１０％から約４０％、約１０％から約３０％、約１０％から約２０％、又は約１０％から約１５％を放出する。ある態様において、そのマイクロパーティクルは５日間にわたってＣＤＫ９阻害薬の約１０％から約５０％、約１０％から約４０％、約１０％から約３０％、約１５％から約４０％、約１５％から約３０％、又は約１５％から約２５％を放出する。ある態様において、そのマイクロパーティクルは８日間にわたってＣＤＫ９阻害薬の約２０％から約７０％、約２０％から約６０％、約２０％から約５０％、約２０％から約４０％、約２５％から約３５％を放出する。ある態様において、そのマイクロパーティクルは１２日間にわたりＣＤＫ９阻害薬の約３０％から約７０％、約３０％から約６０％、約３０％から約５０％、約４０％から約７０％、約４０％から約６０％、又は約４０％から約５０％を放出する。ある態様において、そのマイクロパーティクルは１５日間にわたりＣＤＫ９の約４０％から約８０％、約４０％から約７０％、約５０％から約７０％、又は約５５％から約６５％を放出する。ある態様において、そのマイクロパーティクルは１９日間にわたりＣＤＫ９阻害薬の約４０％から約８０％、約５０％から約８０％、約６０％から約８０％、又は約６５％から約７５％を放出する。ある態様において、そのマイクロパーティクルは２２日間にわたりＣＤＫ９阻害薬を約４０％から約９０％、約５０％から約９０％、約６０％から約９０％、約７０％から約９０％、又は約７５から約８５％を放出する。ある態様において、そのマイクロパーティクルは２６日間にわたりＣＤＫ阻害薬を約５０％から約９０％、約６０％から約９０％、約７０％から約９０％、又は約８０％から約９０％を放出する。ある態様において、そのマイクロパーティクルは３０日間にわたり約６０％から約９５％、約７０％から約９５％、約８０％から約９５％、又は約８５％から約９５％を放出する。
【００５７】
本発明の態様において、治療期間の終了までに、少なくとも約８０％のカプセル化したＣＤＫ９阻害薬が放出される。ある態様において、放出されるカプセル化したＣＤＫ９阻害薬の量は少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．５％である。本発明の態様において、治療期間は少なくとも約２４時間、少なくとも約２日間、少なくとも約５日間、少なくとも７日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約２０日間、少なくとも約２１日間、少なくとも約２８日間、少なくとも約３０日間、少なくとも約３１日間、少なくとも約４０日間、少なくとも約４２日間、少なくとも約４５日間、少なくとも約４８日間、少なくとも約５０日間又は少なくとも約６０日間である。本発明の態様において、治療期間は約６０日未満、約５５日未満、約５０日未満、約４５日未満、約４０日未満、約３０日未満、約２８日未満、約２５日未満、約２１日未満、約２０日未満、約１４日未満、約１０日未満、約７日未満、約５日未満、又は約２日未満である。
【００５８】
ある態様において、そのマイクロパーティクルは約２４時間にわたりＣＤＫ９阻害薬の約３％から約１０％を放出し；約２日間にわたりＣＤＫ９阻害薬の約１０％から約２０％を；約５日間にわたりＣＤＫ９阻害薬の約１５％から約２５％を；約８日間にわたりＣＤＫ９阻害薬の約２５％から約３５％を；約１２日間にわたりＣＤＫ９阻害薬の約４０％から約５０％を；約１５日間にわたりＣＤＫ９阻害薬の約５５％から約６５％を、約１９日間にわたりＣＤＫ９阻害薬の約６５％から約７５％を；約２２日間にわたりＣＤＫ９阻害薬の約７５％から約８５％を；約２６日間にわたりＣＤＫ９阻害薬の約８０％から約９０％を；及び／又は約３０日間にわたりＣＤＫ９阻害薬の約８５％から約９５％を放出する。
【００５９】
本発明の態様は、そのＣＤＫ９阻害薬がフラボピリドール、ＳＮＳ−０３２、ボルシクリブ（Ｖｏｒｕｃｉｃｌｉｂ）、又はそれらの医薬的に許容可能な塩であるマイクロパーティクルである。本発明の態様はそのＣＤＫ９阻害薬がフラボピリドールであるマイクロパーティクルである。本発明の態様はＰＬＧＡが約５０：５０から約７５：２５の乳酸とグリコール酸との比（Ｌ：Ｇ）を有するマイクロパーティクルである。本発明の態様は、ＰＬＧＡが約０．４から約０．９のインヘレント粘度（ＩＶ）を有するマイクロパーティクルである。本発明の態様はＰＬＧＡが約０．４、約０．５５、約０．７５、又は約０．７から０．９のインヘレント粘度（ＩＶ）を有するマイクロパーティクルである。本発明の態様はＰＬＧＡがＬａｃｔｅｌ（登録商標）Ｂ６０１３−２、Ｐｕｒａｓｏｒｂ（登録商標）５００４Ａ、又はＬａｃｔｅｌ（登録商標）Ｂ６０１２−４であるマイクロパーティクルである。本発明の態様はマイクロパーティクルが約３から約５０ミクロンの直径を有するマイクロパーティクルである。
【００６０】
本発明の態様はマイクロパーティクルが約２４時間、約２日間、約５日間、約１０日間、約１４日間、約２１日間、約３０日間、約４５日間、及び約６０日間からなる群より選択される期間にわたりＣＤＫ９阻害薬を放出するマイクロパーティクルである。本発明の態様はマイクロパーティクルが投与後２日間にわたりＣＤＫ９阻害薬の約５％から約４０％、約５％から約３０％、約５％から約２０％、約１０％から約４０％、約１０％から約３０％、約１０％から約２０％、約１０％から約１５％を放出するマイクロパーティクルである。本発明の態様はマイクロパーティクルが投与後５日間にわたりＣＤＫ９阻害薬の約１０％から約５０％、約１０％から約４０％、約１０％から約３０％、約１５％から約４０％、約１５％から約３０％、又は約１５％から約２５％を放出するマイクロパーティクルである。本発明の態様はマイクロパーティクルが投与後８日間にわたりＣＤＫ９阻害薬の約２０％から約７０％、約２０％から約６０％、約２０％から約５０％、約２０％から約４０％、約２５％から約３５％を放出するマイクロパーティクルである。本発明の態様はマイクロパーティクルが投与後１２日間にわたりＣＤＫ９阻害薬の約３０％から約７０％、約３０％から約６０％、約３０％から約５０％、約４０％から約７０％、約４０％から約６０％、又は約４０％から約５０％を放出するマイクロパーティクルである。本発明の態様はマイクロパーティクルが投与後１５日間にわたりＣＤＫ９阻害薬の約４０％から約８０％、約４０％から約７０％、約５０％から約７０％、又は約５５％から約６５％を放出するマイクロパーティクルである。本発明の態様はマイクロパーティクルが投与後１９日間にわたりＣＤＫ９阻害薬の約４０％から約８０％、約５０％から約８０％、約６０％から約８０％、又は約６５％から約７５％を放出するマイクロパーティクルである。本発明の態様はマイクロパーティクルが投与後２２日間にわたりＣＤＫ９阻害薬の約４０％から約９０％、約５０％から約９０％、約６０％から約９０％、約７０％から約９０％、又は約７５％から約８５％を放出するマイクロパーティクルである。本発明の態様はマイクロパーティクルが投与後２６日間にわたりＣＤＫ９阻害薬の約５０％から約９０％、約６０％から約９０％、約７０％から約９０％、又は約８０％から約９０％を放出するマイクロパーティクルである。本発明の態様はマイクロパーティクルが投与後３０日間にわたりＣＤＫ９阻害薬の約６０％から約９５％、約７０％から約９５％、約８０％から約９５％、又は約８５％から約９５％を放出するマイクロパーティクルである。
【００６１】
本発明の別の態様は、本発明の複数のマイクロパーティクル及び医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物である。本発明の態様は、複数のマイクロパーティクルが約５から約２０の、又は約１０から約２０ミクロンの、又は約２０から約５０ミクロンの平均の直径を有する組成物である。本発明の態様は、複数のマイクロパーティクルの１０％量（Ｄ１０）が約９又は約１０ミクロン未満を有する組成物である。本発明の態様は、複数のマイクロパーティクルの５０％量（Ｄ５０）が約１８未満、約１９未満、約２０ミクロン未満の直径を有する組成物である。本発明の態様は複数のマイクロパーティクルの９０％量（Ｄ９０）が約２６、約２７、約２８、約２９、又は約３０ミクロン未満の直径を有する組成物である。本発明の態様は、複数のマイクロパーティクルがＣＤＫ９阻害薬の質量比で約０．５％から約５％、約０．５％から約４％、約０．５％から約３％、又は約０．５％から約２％を有する組成物である。
【００６２】
本発明の医薬組成物は、医薬的に許容可能な担体において分散された又は懸濁された本発明のマイクロパーティクルを含む。本明細書で用いられるように、「医薬的に許容可能な担体」は、当業者に既知である任意の及び全ての溶媒、分散剤、コーティング剤、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば、抗細菌薬、抗真菌薬）、等張剤、吸着遅延剤（ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｄｅｌａｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）、塩、保存料、安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、染色剤、それらの類似物質及び組み合わせ（例えば、参照によって本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０，ｐｐ．１２８９−１３２９参照）。任意の慣習の担体が、本発明のマイクロパーティクルと適合しない場合である限りを除いて、医薬組成物のその使用は熟考された。本発明の組成物は第一に注射又は他の非経口の方法によって投与がなされるであろうことが予期され、また、しかしながら、例えば、ゲル及びエアロゾルの組成物は、外科手術の間の処理に用いられうる。適当な担体は水、注射用水、食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、等を含む。本発明の組成物はさらに推進剤、抗凝集剤、及び上記に挙げられた添加剤でありうる。
【００６３】
本発明の態様は、マイクロパーティクルが医薬的に許容可能な担体に投与される方法である。本発明の態様は、フラボピリドール、ＳＮＳ−０３２、ボルシクリブ（Ｖｏｒｕｃｉｃｌｉｂ）、及びそれらの誘導体、又はそれらの医薬的に許容可能な塩より選択される方法である。本発明の態様は、そのＣＤＫ９阻害薬がフラボピリドール、ＳＮＳ−０３２、ボルシクリブ（Ｖｏｒｕｃｉｃｌｉｂ）、及びそれらの誘導体である方法である。本発明の態様は、そのＣＤＫ９阻害薬がフラボピリドールである方法である。本発明の態様は、治療される対象がヒトである方法である。本発明の態様は、治療される対象がウマである方法である。本発明の態様は、ＣＤＫ９阻害薬の治療有効量が１から４２日間にわたり放出される方法である。
【００６４】
本発明の態様において、その組成物は水及びポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を含む担体を含む。本発明の態様において、その担体はエタノール、ポリオール（すなわち、グリセロール、プロピレングリコール、又は液体のポリエチレングリコール、等）、又はそれらの適当な混合物を含む。本発明の態様において、その担体はゲル化剤を含む。投与前に即座に水和した又は懸濁した本発明の組成物において、その担体は本発明のマイクロパーティクル、例えばマンニトール、スクロース等を懸濁すること及び離散することに適当な乾燥した粒子状固体でありうる。
Ｃ．方法
【００６５】
本発明の別の態様はそれを必要とする対象を治療する方法であり、複数のマイクロパーティクルの治療有効量を投与することを含み、そのマイクロパーティクルはＣＤＫ９阻害薬及び乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）を含み、ここでそのＣＤＫ９阻害薬はＰＬＧＡによってカプセル化され、そしてこの中でそのマイクロパーティクルはＣＤＫ９阻害薬の徐放を提供する。
【００６６】
本明細書の方法は製剤化した徐放のＣＤＫ９阻害薬を提供し、局所送達について、かくして薬剤は延長された期間にわたり治療有効量で局所的に利用可能なままである。マイクロパーティクルに製剤化する試薬を添加することによって製剤化したＣＤＫ９阻害薬は、炎症反応の期間にわたり、ＣＤＫ９阻害薬の放出を提供し、それは急性の損傷事象後数日から数週間に及びうる。また、本明細書で提供されるものは、薬物の局所送達について製剤化したＣＤＫ９阻害薬を投与する方法である。例えば、カプセル化したＣＤＫ９阻害薬を有するマイクロパーティクルは、関節内に注射して徐々に組織内に薬剤の治療有効濃度を提供する場合に、関節包のような関連組織内で保持され、一方で大きく全身の薬物負荷を減少する。
【００６７】
本開示の方法により治療されうる対象は、ヒト又はヒトではない哺乳類、例えば、伴侶動物、例えばイヌ、ネコ、ラット等、又は家畜、例えばウマ、ロバ、ラバ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、又はウシ等である。
【００６８】
全身的な薬物の負荷は、治療量は部分的に投与されるので、本発明の方法において著しく減少し、そしてそれゆえより低用量が用いられうる。例えば、単回の膝関節の関節内注射によって本発明の組成物を投与する場合に、フラボピリドールのようなＣＤＫ９阻害薬の局所有効量はヒトにおける全身投与よりも約８０〜１００倍少ない薬剤によって、そして損傷したウマの関節の場合でさえもより大きな減少が成し遂げられうる。徐放される方法は外傷後の全身及び局所の過炎症と関連のある合併症を著しく減少するために有用である。
【００６９】
避けられるこれらの合併症は、急性肺損傷、脂肪再栓症、多臓器不全、回復の遅れ、重篤な傷害後の免疫抑制等を含む。本発明は、炎症性の腫脹を減少するために、脳／脊髄損傷における組織の損傷を制限するために、交通事故において受けるような重篤な多損傷の場合における全身の炎症を防止するために、心筋梗塞後の筋損傷を制限するために、及び急性炎症反応が所望されていない他の状態に用いられうる。本発明は特に二次免疫応答が所望されない効果を生じる状況に適合する。特定の例は：（ａ）免疫応答が軟骨のマトリックス分解酵素を活性化し、さらに関節を変形性関節症にかかりやすくする、半月板断裂又は前十字靭帯断裂のような関節損傷、（ｂ）免疫応答がけいれん誘発でありうる毒（神経ガス、有機リン酸系等）からの神経学的な損傷、（ｃ）局所的な免疫応答又は異物反応が所望されない医療移植を含む。
【００７０】
ＣＤＫ９阻害薬は炎症反応経路において効果を発揮する。例えば、その薬理学的なＣＤＫ９阻害薬のフラボピリドールは、ＩＬ−１βによって５時間処理したヒトの細胞培養において、初期炎症応答遺伝子の幅広い範囲の活性化を効果的に抑制する（図１参照）。ＩＬ−１βによって誘導された（８４の総ＮＦκＢ標的の中から）６７の異なる遺伝子の間で、フラボピリドールの共処理によって５９を発現した（ＩＬ−１β、ＩＬ−６、及びＴＮＦのような最も特徴づけられる炎症性サイトカインを含む）。その抑制の平均的な規模は、最大の誘導の＞８６％である。これらのデータはＣＤＫ９阻害が初期炎症性遺伝子の幅広い範囲の誘導を抑制することにおいて高い効率であることを実証する。重要なことに、ハウスキーピング遺伝子及び誘導できない遺伝子は短期間のＣＤＫ９阻害によって影響をうけず、副作用において潜在的な減少を示している。
【００７１】
現在の抗炎症薬は、上流の炎症性シグナル経路の標的の様々な成分、又は下流のエフェクター遺伝子のいずれかを標的にする（ＩＬ−１拮抗薬、ＴＮＦ拮抗薬、抗酸化剤等）。対応の遺伝子の転写が起こらないように特定の経路の阻害、又は個々の下流のエフェクター遺伝子の働きの阻害に焦点を当ててきた。これらの現存の研究はいずれもＣＤＫ９によって制御される転写伸長の律速工程を解消するものではない。現存の薬物は多様な生理学的な炎症誘発性の問題の取り扱いにおいての効果は低く、そして広範囲の多種多様な下流の炎症応答遺伝子の活性化を防止できないかもしれない。それゆえ、全ての炎症応答遺伝子の活性化における律速段階を制御するＣＤＫ９を標的にすることは、より効果的及び効率的である。ＣＤＫ９による転写伸長の阻害は初期応答炎症性遺伝子によって制限され、そしてＣＤＫ９阻害は、試験される急性の炎症局面内でハウスキーピング遺伝子及び誘導されない遺伝子の転写に影響を与えず、それゆえ、短期間において細胞又は組織に有害でない。ＣＤＫ９阻害の一つの利点は、非常に多くの炎症性の刺激から炎症性遺伝子の転写伸長を減少することである。ＣＤＫ９はフラボピリドール及び本明細書に他に開示されたもの、例えばＳＮＳ−０３２、ボルシクリブ（Ｖｏｒｕｃｉｃｌｉｂ）、及びフラボピリドールのような小分子薬によって特異的に及び可逆的に阻害されうる。本明細書の製剤及び方法と組み合わせて、ＣＤＫ９阻害薬は炎症部位に局所的に送達され、それによってその炎症反応及び症状を、減少、回復、防止又は減少させる。
【００７２】
ある態様において、本明細書の方法は、本明細書で記載されるマイクロパーティクルの形態において、少なくとも一つのＣＤＫ９阻害薬及びＰＬＧＡポリマーを投与することを含み、ここでＣＤＫ９阻害薬は、フラボピリドール、ＳＮＳ−０３２、及びボルシクリブ（Ｖｏｒｕｃｉｃｌｉｂ）、又はそれらのエステル、プロドラッグ、又は医薬的に許容可能な塩からなる群より選択される。
【００７３】
ある態様において、その製剤化したＣＤＫ９阻害薬は、対象の体内の標的組織、細胞型又は領域に投与され、それらに限定されないが、損傷部位、炎症又は潜在的に炎症の領域、関節、軟骨、外科手術を経験した組織、スポーツ損傷によって損傷した組織又は領域、外植片、例えば骨軟骨外植片、それらに限定されないが、軟骨の同種移植、軟骨領域の分解及び／又は軟骨細胞の死を含む。
【００７４】
ある態様において、その製剤化したＣＤＫ９阻害薬は外傷又は炎症反応の１０日以内に投与される。ある態様において、その製剤化したＣＤＫ９阻害薬は、損傷又は炎症反応後１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１日以内に投与される。ある態様において、その製剤化したＣＤＫ９阻害薬は外傷又は炎症反応後、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５時間又は０．５時間未満で投与される。ある態様において、その製剤化したＣＤＫ９阻害薬は損傷又は炎症反応後１回、２回、３回、又はそれ以上投与される。
【００７５】
ある態様において、その製剤化したＣＤＫ９阻害薬は、滑膜炎又は関節炎のような前から存在する状態又は病気を有する対象に投与される。ある態様において、その製剤化したＣＤＫ９阻害薬はそのような長期的に前から存在する状態に対して投与され、例えば、毎週、２週間ごと、３週間ごと、毎月（例えば４週間ごと）、５、６、７、８、９又は１０週ごとに投与される。ある態様において、その製剤化したＣＤＫ９阻害薬は、症状、炎症又は状態若しくは他の兆候又疾病が減少、回復、減弱される、又は他のものが治療によって影響されるまで、そのような長期的に前から存在する状態に対して投与される。ある態様において、その製剤化したＣＤＫ９阻害薬は、対象の寿命についてそのような長期的に前から存在する状態に対して、又は病気若しくは状態の診断又は再発の時間から投与される。
【００７６】
本発明の別の態様はそれを必要とする対象を治療する方法であって、本発明の複数のマイクロパーティクルを含む医薬組成物を投与することを含む。
【００７７】
本発明の態様は、その対象が関節炎、変形性関節症、外傷後の変形関節症、及び損傷より選択される病気又は状態を有する方法である。本発明の態様はその病気又は状態を関節にもたらす方法である。本発明の態様は関節が膝関節である方法である。本発明の態様は、医薬組成物が注射によって投与される方法である。
【００７８】
本発明の別の態様は、複数のマイクロパーティクル内にＣＤＫ９阻害薬を含む組成物を部位へ投与することを含む炎症部位を治療する方法であって、ここでそのマイクロパーティクルは、少なくとも２４時間その部位でＣＤＫ９阻害薬の徐放を提供し、そしてそれによってその部位の炎症が減少又は回復される。
【００７９】
本発明の態様は炎症部位が関節、軟骨、又は損傷部位である方法である。その発明の態様は、そのマイクロパーティクルがＰＬＧＡを含む方法であって、そしてここでそのＣＤＫ９がフラボピリドール、ＳＮＳ−０３２、ボルシクリブ（Ｖｏｒｕｃｉｃｌｉｂ）、及びそれらの誘導体、又はそれらの医薬的に許容可能な塩から選択される。その発明の態様はそのマイクロパーティクルが約２０から約５０ミクロンの間の平均直径を有する方法である。
【００８０】
ＩＶ．実施例
実施例１．乳酸・グリコール酸共重合体及びフラボピリドールを含む粒子の合成
フラボピリドール−乳酸グリコール酸共重合体粒子の調製方法は同一の乳化溶媒蒸発法を用いて実施された。簡潔に、ＰＬＧＡを塩化メチレン（５％ｗ／ｖ）において溶解し、フラボピリドールを添加し、そしてその溶液を滅菌水中のバルク量のポリビニルアルコールに加えて、さらにホモジナイズし（２分間、３５，０００ｒｐｍ）エマルジョンを形成した。それゆえ形成された粒子を２４時間撹拌し、残存した塩化メチレンを蒸発させた。ＭＰｓを洗浄し、凍結乾燥し、そして−２０℃で保存した。サイズ分布をＭｉｃｒｏｔｒａｃ  Ｎａｎｏｔｒａｃ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒによって測定し、そして走査型電子顕微鏡によって確認した。
【００８１】
我々は、フラボピリドールの徐放を示す異なる型のＣＤＫ９阻害薬放出マイクロパーティクルを産生した。実施例を表１及び図４Ａ−Ｄ及び図５に示す。これらの製剤の差異は、（この場合はフラボピリドールにおいて）ＣＤＫ９阻害薬をカプセル化するＰＬＧＡの特徴より起因し、それは次にフラボピリドールの放出の動態に影響する。これらのポリマーを物理学的な特性、例えばインヘレント粘度又は平均分子量、フラボピリドールのようなＣＤＫ９阻害薬とのそれらの適合性、それらのＬ／Ｇ比、及びそれらの予期された放出動態に基づいて選択した。本例において、そのポリマーはＬａｃｔｅｌ（登録商標）Ｂ６０１３−２、Ｐｕｒａｓｏｒｂ（登録商標）５００４Ａ（Ｃｏｒｂｉｏｎ）、及びＬａｃｔｅｌ（登録商標）Ｂ６０１２−４だった。
【００８２】
これらのポリマーの特徴を表１に示す。そのマイクロパーティクルは約１５ミクロン（４〜５０ミクロンに及ぶ）の中央値のサイズであり、質量比で約０．５％〜１．５％のフラボピリドールを有する（図４）。
表１：与えられた特性（Ｌ／Ｇ比、インヘレント粘度、末端基）を有するＰＬＧＡカプセル化したフラボピリドールの製剤。製剤１：Ｌａｃｔｅｌ（登録商標）Ｂ６０１３−２、ＬＧ比５０：５０、ＩＶ：０．５５〜０．７５  ｄＬ／ｇ、酸末端；製剤２：Ｐｕｒａｓｏｒｂ（登録商標）５００４Ａ、ＬＧ比５０：５０、ＩＶ０．４ｄＬ／ｇ、酸末端；製剤３：Ｌａｃｔｅｌ（登録商標）Ｂ６０１２−４、ＬＧ比７５：２５、ＩＶ０．７〜０．９ｄＬ／ｇ、酸末端。
【表１】
2021522343.tif 000007
実施例２．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＰＬＧＡ／フラボピリドール粒子の評価
【００８３】
粒子からのフラボピリドール放出を、２４７ｎｍの吸光度によってＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（登録商標）において４２日間にわたって定量した。図５では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで３０日までマイクロパーティクルより放出された約９０％のフラボピリドールによって、一つのポリマーからの３０日までの近似的な線形の放出動態を示す。
実施例３．ＰＬＧＡ／フラボピリドール粒子はラットの変形性関節症モデルにおいて活性である。
【００８４】
ラット（ＩＡＣＵＣ承認）における損傷後の変形性関節症（ＰＴＯＡ）を誘導するために、４匹のラット（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）を麻酔し、そして同一の機械の過負荷を膝関節に適用することで、ＡＣＬを破壊した。フラボピリドール−ＰＬＧＡを受けた２匹のラット及びブランクのＰＬＧＡを受けた２匹のラットによって、５ｍｇの粒子を５０μＬの生理食塩水で懸濁し、２３ゲージの針を用いて関節内腔に投与した。変形性関節症の発生及び関節の分解を評価するために、我々はＩＶＩＳ−２００上のＭＭＰＳｅｎｓｅ７５０−ＦＡＳＴの関節内注射を用いて、（３週間までの）長期的なＭＭＰ活性のｉｎ  ｖｉｖｏイメージングを実施した。
【００８５】
ラットのＰＴＯＡモデルにおいて、我々は損傷３日後のｉｎ  ｖｉｖｏのＭＭＰ活性において強い増加を観察した。しかしながら、フラボピリドール−ＰＬＧＡマイクロパーティクルの関節内注射は試験された全ての時点で著しくｉｎ  ｖｉｖｏのＭＭＰ活性を減少した。
【００８６】
さらに、関節損傷の背景におけるｉｎ  ｖｉｖｏのデータでは、フラボピリドール注射は、我々が損傷後の変形性関節症を研究することにおいて発展させた非浸潤性の膝の損傷モデルによって評価し、損傷後４〜８時間の損傷部位で効果的に及び選択的に炎症性サイトカインＩＬ−１β及びＩＬ−６のｍＲＮＡ発現を抑制したことを示した（図２Ａ〜２Ｄ、図３Ａ〜３Ｄ参照）（Ｂ．Ａ．Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ（２０１２）２０（７）：７７３〜８２）。加えて、そのハウスキーピング遺伝子の１８ＳｒＲＮＡ及びマトリックス遺伝子のコラーゲン２型及びアグリカンは損傷又はフラボピリドール処理のいずれによっても影響はなかった。これらのデータは、ＣＤＫ９阻害が、フラボピリドールが腹腔内注射を通じて末端及び全身に投与されるが、ｉｎ  ｖｉｖｏで損傷部位で主要な炎症性サイトカインＩＬ−１β及びＩＬ−６の産生を抑制することにおいて効果的であることを示す。図３Ａ及び図３Ｂにおけるデータはフラボピリドールの反復投与が単回投与よりもより効果的であることを示す。
【００８７】
追加のｉｎ  ｖｉｖｏのデータはＰＴＯＡが上記に参照されたマウスの研究に類似した前十字靭帯損傷によって開始されたラットモデルにおいて作り出された。本実施例において、ＰＬＧＡカプセル化したＣＤＫ９阻害薬のフラボピリドールを、損傷した膝関節へ関節内注射によって送達した。製剤に対する明らかな毒性又は他の負の反応は無かった。その製剤は、前十字靭帯損傷におけるＭＭＰ活性を減少することにおいて潜在的な効果を有した。異化酵素的な関節分解の損傷誘導活性はＭＭＰＳｅｎｓｅ７５０試薬を用いてｉｎ  ｖｉｖｏで監視した。
【００８８】
ＭＭＰＳｅｎｓｅ７５０は局所的なＭＭＰ活性の存在下で蛍光になり、そして前十字靭帯損傷は未処理の膝及び空のＰＬＧＡマイクロパーティクルによる膝において頑強な蛍光の増加をもたらす。この損傷誘導したＭＭＰ活性は損傷の数日以内に検出可能になり、そして少なくとも３週間、損傷した関節内で上昇したままである。しかしながら、ＰＬＧＡカプセル化したフラボピリドールによる膝において、そのＭＭＰＳｅｎｓｅ７５０シグナルは損傷後に増加しなかった。これはＰＬＧＡマイクロパーティクルを放出するフラボピリドールの単回の関節内注射が、注射した関節においてＭＭＰ活性を効果的に妨げたこと、そして少なくとも３週間継続する単回注射の利点を示す（図７Ａ参照）。これは、我々が本モデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏのＭＭＰ活性が初期応答遺伝子の転写活性に依存し、フラボピリドールの反復した全身投与によって阻害されうることを以前に示したように、ＣＤＫ９活性の長時間続く阻害と一貫している。
実施例４．変化した放出特性によるＰＬＧＡ−フラボピリドール粒子の合成の比較
【００８９】
（Ａ）２ロットのＰＬＧＡ−フラボピリドールのマイクロパーティクルを高粘度のエステル末端化したポリマー（Ｐｕｒａｓｏｒｂ（登録商標）５０１０、ＬＧ比５０：５０、ＩＶ＝１．０）を作製した。酸末端化したＰＬＧＡマイクロパーティクルと比較して（例えば、表１参照）、エステル末端化した形態は、マイクロパーティクルにより少ないＣＤＫ９阻害薬を組み込む。表２に示すように、積載割合は容認し難いほど低く（０．１４％〜０．１７％）、そしてそれゆえ商業化には通用しない。
表２：エステル末端化したＰＬＧＡからの積載及び粒子サイズ
【表２】
2021522343.tif 000008
【００９０】
図８〜１０は変化した積載及び放出の特性によるＰＬＧＡ／フラボピリドールの比較の粒子を示す。図８はフラボピリドールのより低い積載及び放出の水準を有するマイクロパーティクルの集団を示す。これらのマイクロパーティクルをエステル末端化したＰＬＧＡによって作製し、そして約０．７５ｄＬ／ｇ以下のインヘレント粘度を一般的に有する酸末端化したＰＬＧＡによって製剤化したマイクロパーティクルと比較して、より高いインヘレント粘度（１．０ｄＬ／ｇ）を有した。
【００９１】
図９は、ＣＤＫ９阻害薬の放出がＣＤＫ９阻害薬の約６０〜７５％に制限されるマイクロパーティクル製剤を示し、ここでそのマイクロパーティクルは８０％放出に到達しない。これらのマイクロパーティクルをエステル末端化したＰＬＧＡによって製剤化され、１．０ｄＬ／ｇのインヘレント粘度及びさらなる凝集を示した。
【００９２】
図１０は０．７〜０．９ｄＬ／ｇの間のインヘレント粘度を有する酸末端化したＰＬＧＡの２つのマイクロパーティクル製剤を示す。これらのマイクロパーティクルがフラボピリドールの積載を示したが、約２０％のＣＤＫ９阻害薬を初期に勢いよく放出したが、示された期間にさらなる阻害薬の放出はなかった。様々なＰＬＧＡ製剤におけるフラボピリドールの積載及び放出効率を比較した概要を表３に示す。
表３：製剤特徴
【表３】
2021522343.tif 000009
実施例５．ウマの対象への製剤化したフラボピリドールの投与
【００９３】
薬剤調製：フラボピリドールの用量（０．１２２ｍｇ）を１０．２６ｍｇのＰＬＧＡマイクロパーティクルに埋め込んだ。そのマイクロパーティクルを２ｍＬの注射用の無菌生理食塩水に再懸濁した。
【００９４】
（Ａ）手術症例：顆部骨折を有する５２頭、及び第１指骨（Ｐ１）骨折を有する８頭の総数６０頭のウマを研究に用いた。そのウマを治療した３６頭とコントロールの２４頭（生理食塩水のみ）との２群に分けた。手術症例を手術の間、治療群とコントロール群にランダム化した。その執刀医は調製されたシリンジを提供され、そして病気のウマを関節内に生じる骨折のラグスクリューの圧縮後すぐに治療した。全てのウマを同一の抗生物質及びＮＳＡＩＤｓによって術後に治療し、そして毎日ハンドウォークにより快適さのレベルを評価した。包帯の交換で、関節内の滲出液、浮腫、切開排膿、及び屈曲時の痛みについてその脚を評価した。その手術部位を月に一度Ｘ線写真を撮り、骨折の治癒を評価した。
【００９５】
快適スコアは顆部骨折における治療群及びコントロール群で類似していたが、Ｐ１の骨折において有意に改善した。両群とも、術後２４時間で開始する治療群において滲出スコアは著しく改善した。ウマの本群内においてスクリュー挿入について切開を刺した周辺に浮腫が主に位置していたが、浮腫スコアにおいて有意差は見られなかった。
【００９６】
術後９０日以後の時点で治療したウマでは動作の範囲、滲出スコア、及び快適さにおいて著しい改善を実証した。Ｘ線写真上、治療と未治療のコントロールとの間の治癒の割合において有意差は見られず、炎症反応の阻害が治癒に負の影響を与えないことを示した。
【００９７】
（Ｂ）トレーニングケース（競走馬）：中手指節関節及び中足指節関節及び手根関節に関係する行動を制限する跛行の問題を有するウマを上記のマイクロパーティクルによって治療した。
【００９８】
ケースでは注射前にＸ線写真、ＣＴスキャン、及び超音波検査法によって評価され、既に存在する病気の存在を見つけ出した。ケースでは前から存在する骨軟骨の断片（ｎ＝１８）、骨増殖症（ｎ＝６５）、関節の部分的な崩壊（ｎ＝３），広範な軟骨下嚢胞性病変（ｎ＝１）、そして軟骨下のリモデリング（ｎ＝１５）を有すると分類した。ウマ跛行グレード、滲出及び屈曲への反応について毎日試験した。総数２０６注射を投与した。有害事象は見られなかった。
【００９９】
滑膜炎を有する症例において、滑液滲出が最初の２４時間以内に平均２５％減少し、４８時間で７５％減少し、そして６０〜７２時間まで通常であった。快適スコアは注射の３６時間以内に改善した。平均で、前から存在する関節炎の兆候を有するウマは注射から３〜４週間に対する臨床スコアにおいて改善を実証した。
【０１００】
数頭のウマにおける本試験の開始から３０日間ごとに反復して注射した。滑液の臨床試験は全ての症例において改善された粘度及び総タンパク質スコアの減少を明らかにした。Ｘ線写真の又はトモグラフィーの異常の上代性の増大は繰り返された治療によるこれらの症例において見られなかった。
実施例６．ＳＮＳ−３２、ボルシクリブ（Ｖｏｒｕｃｉｃｌｉｂ）、及びディナシクリブの製剤化
【０１０１】
（Ａ）調製：ＰＬＧＡ又はポリカプロラクトン（ＰＣＬ）におけるＣＤＫ−９阻害薬のＳＮＳ−０３２（非フラボノイド）、ボルシクリブ（Ｖｏｒｕｃｉｃｌｉｂ）（フラボノイド）、及びディナシクリブ（非フラボノイド）のカプセル化を以下のように実施した。ＣＤＫ９阻害薬を有する乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）又はポリカプロラクトン（ＰＣＬ）粒子の調製は同一の乳化溶媒蒸発法を用いて実施された。簡潔に、５００ｍｇのＰＧＬＡ又はＰＣＬを２．５ｍＬの（ＰＬＧＡについて）塩化メチレン又は（ＰＬＣについて）２％ｖ／ｖのジメチルスルホキシドを含むクロロホルム内に溶解した。ＣＤＫ９阻害薬（２％ｇ／ｇポリマー、ディナシクリブ、ＳＮＳ−０３２、及びボルシクリブ（Ｖｏｒｕｃｉｃｌｉｂ））をポリマー溶液に添加し、そして続いて５ｍＬの１０％の水性のポリビニルアルコールに添加した。その溶液をフルスピード（ＰＬＧＡについて３０秒又はＰＣＬについて４５秒）でボルテックスし、マイクロパーティクルを形成した。そのマイクロパーティクル懸濁液を１５０ｍＬの１％ポリビニルアルコールに移し、そして２４時間撹拌した。その粒子をペレット化し、水で洗浄し、凍結乾燥し、そしてさらなる使用のために−２０℃で貯蔵した。サイズ分布をＡｃｃｕＳｉｚｅｒ  ｍｏｄｅｌ７７０  ｏｐｔｉｃａｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｉｚｅｒ（Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定した。結果を以下の表４に示す。
【表４】
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表４はＰＬＧＡ又はＰＣＬのいずれかを有する各ＣＤＫ９阻害薬を用いるマイクロパーティクルに積載されたＣＤＫ９阻害薬の割合（すなわち２ｇの割合）を示す。例えば、ＳＮＳ−０３２は３０．７％の積載効率を有し、かくして開始時２ｇの開始時のＳＮＳ−０３２のうち、約０．６１ｇをＰＬＧＡマイクロパーティクルにカプセル化した。低薬物量のカプセル化は、マイクロパーティクルについてより少ない阻害薬をもたらす。積載効率がある閾値を下回るまで減少するならば、ＣＤＫ９阻害薬の治療容量を送達するために必要とされるマイクロパーティクルの量は、（費用、効率、注射量、及び潜在的に、投与されるマイクロパーティクルへの治療される対象への副作用において）禁止されるようになりうる。ＰＬＣがＣＤＫ９阻害薬の十分量を包含することに失敗したこと、及びＰＬＧＡが非フラボノイドの阻害薬ディナシクリブの十分量を包含することに失敗した結果を示す。
【０１０２】
（Ｂ）放出：上記に調製したマイクロパーティクルの放出特性を実施例２に記載されている手順を用いて決定した。その結果を以下の表５に示す。
【表５】
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【０１０３】
ディナシクリブを含むマイクロパーティクルが治療における十分量で化合物を放出することに失敗したこと、及びＰＬＣを用いるマイクロパーティクルが治療における十分な割合で試験された任意のＣＤＫ９阻害薬を放出することを失敗することをその結果は実証した。
【０１０４】
以下の表６はＣＤＫ９阻害薬並びにＰＬＧＡ及びＰＣＬにおける製剤化剤の積載及び放出を比較した。
【表６】
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【０１０５】
上述の発明は理解の明確化の目的のために図及び実施例としていくらか詳細に説明されてきたが、当業者がある変化及び改変が請求の範囲において実行されうると理解するだろう。加えて、本明細書で提供される各参考文献は、各参考文献が個別に参照によって取り込まれた場合と同程度に、その全体を参照によって取り込まれる。本出願と本明細書で提供される参照との間に矛盾が存在する場合、本出願がより有意に立つものとする。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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