(57)【要約】  ヒトがん細胞に結合してそれを殺傷する多重特異性結合タンパク質、ならびにがん治療に有用な医薬組成物及び治療法が記載される。がんは、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）発現がんであることが可能である。本明細書中提供される多重特異性結合タンパク質は、抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体に比べて高い効力及び標的細胞の最大溶解を示す。【選択図】図１Ａ
2021533169.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質であって、以下：
（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む第一抗原結合部位、
（ｂ）Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合する第二抗原結合部位、及び
（ｃ）抗体ＦｃドメインもしくはＣＤ１６に結合するのに十分なその一部分、またはＣＤ１６に結合する第三抗原結合部位
を含む、前記タンパク質。
【請求項２】
さらに、ＢＣＭＡに結合する追加の抗原結合部位を含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
ＢＣＭＡに結合する前記第二抗原結合部位は、Ｆａｂ断片である、請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項４】
ＢＣＭＡに結合する前記第二及び前記追加の抗原結合部位は、Ｆａｂ断片である、請求項１から３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項５】
ＢＣＭＡに結合する前記第二及び前記追加の抗原結合部位は、ｓｃＦｖである、請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項６】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖの重鎖可変ドメインは、前記ｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインのＮ末端またはＣ末端に位置する、請求項１から５のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項７】
前記軽鎖可変ドメインは、ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインのＮ末端に位置する、請求項６に記載のタンパク質。
【請求項８】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖは、前記抗体ＦｃドメインもしくはＣＤ１６に結合するのに十分なその一部分、またはＣＤ１６に結合する第三抗原結合部位と連結されている、請求項１から７のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項９】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖは、前記抗体ＦｃドメインもしくはＣＤ１６に結合するのに十分なその一部分、またはＣＤ１６に結合する第三抗原結合部位と、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介して連結されている、請求項８に記載のタンパク質。
【請求項１０】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖは、前記抗体ＦｃドメインもしくはＣＤ１６に結合するのに十分なその一部分、またはＣＤ１６に結合する第三抗原結合のＣ末端と、配列番号１６８のアミノ酸配列を含むフレキシブルリンカーを介して連結されている、請求項８に記載のタンパク質。
【請求項１１】
前記抗体ＦｃドメインのＣ末端は、ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインのＮ末端と連結されている、請求項１０に記載のタンパク質。
【請求項１２】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖ内で、前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインと前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインの間でジスルフィド架橋が形成されている、請求項１から１１のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１３】
前記ジスルフィド架橋は、前記重鎖可変ドメインのＣ４４と前記軽鎖可変ドメインのＣ１００の間で形成されている、請求項１２に記載のタンパク質。
【請求項１４】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖ内で、前記重鎖可変ドメインは、前記軽鎖可変ドメインと、フレキシブルリンカーを介して連結されている、請求項１から１３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１５】
前記フレキシブルリンカーは、（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）ｎ（Ｇ４Ｓ）ｎ）（配列番号１９８）を含み、ただしｎは、１〜１０の整数である、請求項１４に記載のタンパク質。
【請求項１６】
前記第二及び前記追加の抗原結合部位ｓｃＦｖは、前記抗体ＦｃドメインもしくはＣＤ１６に結合するのに十分なその一部分、またはＣＤ１６に結合する前記第三抗原結合部位と、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介して連結されている、請求項５から１５のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１７】
前記第二及び前記追加の抗原結合部位ｓｃＦｖは、前記抗体Ｆｃドメインと、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介して連結されている、請求項５から１６のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１８】
前記第二抗原結合部位及び／または前記追加の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインと前記軽鎖可変ドメインの間でジスルフィド架橋が形成されている、請求項１６または１７に記載のタンパク質。
【請求項１９】
前記ジスルフィド架橋は、前記重鎖可変ドメインのＣ４４と前記軽鎖可変ドメインのＣ１００の間で形成されている、請求項１８に記載のタンパク質。
【請求項２０】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖは、重鎖可変ドメインのＮ末端に位置する軽鎖可変ドメインを含み、ただし前記軽鎖可変ドメインは、前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインと、配列番号１６７のアミノ酸配列からなるフレキシブルリンカーを介して連結されており、及びＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖは、前記抗体Ｆｃドメインと、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介して連結されている、請求項１から１９のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項２１】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第一抗原結合部位は、以下：
（ａ）配列番号１９０、９６、及び１９１のアミノ酸配列でそれぞれ表される相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、及び相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびに、配列番号９９、１００、及び１０１のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｂ）配列番号１９０、９６、及び１９３のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびに、配列番号９９、１００、及び１０１のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｃ）配列番号９５、９６、及び９７のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびに、配列番号９９、１００、及び１０１のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｄ）配列番号１８８、８８、及び１８９のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびに、配列番号９１、９２、及び９３のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｅ）配列番号１８５、１０４、及び１９２のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびに、配列番号１０７、１０８、及び１０９のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｆ）配列番号１８５、７２、及び１５９のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびに、配列番号７５、７６、及び７７のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｇ）配列番号１８６、８０、及び１８７のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびに、配列番号８３、８４、及び８５のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｈ）配列番号１９０、９６、及び１９４のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびに、配列番号９９、１００、及び１０１のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｉ）配列番号１９０、９６、及び１９５のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびに、配列番号９９、１００、及び１０１のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｊ）配列番号１９０、９６、及び１９６のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびに、配列番号９９、１００、及び１０１のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｋ）配列番号１９０、９６、及び１９７のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびに、配列番号９９、１００、及び１０１のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；または
（ｌ）配列番号１９０、９６、及び１６０のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびに、配列番号９９、１００、及び１０１のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン
を含む、請求項１から２０のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項２２】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第一抗原結合部位は、配列番号９４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメインを含む、請求項１から２１のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項２３】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第一抗原結合部位は、配列番号９４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項１から２１のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項２４】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第一抗原結合部位は、配列番号９４と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項１から２１のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項２５】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第一抗原結合部位は、配列番号９４と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項１から２１のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項２６】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第一抗原結合部位は、配列番号１６９と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項１から２１のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項２７】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第一抗原結合部位は、配列番号１７１と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項１から２１のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項２８】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第一抗原結合部位は、配列番号１７３と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項１から２１のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項２９】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第一抗原結合部位は、配列番号１７５と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項１から２１のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項３０】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第一抗原結合部位は、配列番号１７７と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項１から２１のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項３１】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第一抗原結合部位は、配列番号１７９と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と同一である軽鎖可変ドメインを含む、請求項１から２１のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項３２】
ＢＣＭＡに結合する前記第二及び／または前記追加の抗原結合部位（複数可）は、以下：
（ａ）配列番号１４９、１５０、及び１５１のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１５３、１５４、及び１５５のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｂ）配列番号１１５、１１６、及び１１１７のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１２０、１２１、及び１２３のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｃ）配列番号１２５、１２６、及び１２７のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１２９、１３０、及び１３１のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｄ）配列番号１３３、１３４、及び１３５のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１３７、１３８、及び１３９のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｅ）配列番号１４１、１４２、及び１４３のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１４５、１４６、及び１４７のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；または
（ｆ）配列番号１１５、１１６、及び１１７のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１２０、１２１、及び１２２のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン
を含む、請求項１から３１のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項３３】
ＢＣＭＡに結合する前記第二及び／または前記追加の抗原結合部位（複数可）は、以下：
（ａ）配列番号１４８と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１５２と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン；
（ｂ）配列番号１４８と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１５２と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン；または
（ｃ）配列番号１４８と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１５２と同一である軽鎖可変ドメイン、
を含む、請求項１から３２のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項３４】
ＢＣＭＡに結合する前記第二及び／または前記追加の抗原結合部位（複数可）は、以下：
（ａ）配列番号１１４と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１１９と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン；
（ｂ）配列番号１１４と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１１９と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン；または
（ｃ）配列番号１１４と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１１９と同一である軽鎖可変ドメイン、
を含む、請求項１から３２のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項３５】
ＢＣＭＡに結合する前記第二及び／または前記追加の抗原結合部位（複数可）は、以下：
（ａ）配列番号１２４と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１２８と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン；
（ｂ）配列番号１２４と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１２８と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン；または
（ｃ）配列番号１２４と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１２８と同一である軽鎖可変ドメイン、
を含む、請求項１から３２のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項３６】
ＢＣＭＡに結合する前記第二及び／または前記追加の抗原結合部位（複数可）は、以下：
（ａ）配列番号１３２と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１３６と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン；
（ｂ）配列番号１３２と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１３６と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン；または
（ｃ）配列番号１３２と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１３６と同一である軽鎖可変ドメイン、
を含む、請求項１から３２のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項３７】
ＢＣＭＡに結合する前記第二及び／または前記追加の抗原結合部位（複数可）は、以下：
（ａ）配列番号１４０と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１４４と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン；
（ｂ）配列番号１４０と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１４４と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン；または
（ｃ）配列番号１４０と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１４４と同一である軽鎖可変ドメイン、
を含む、請求項１から３２のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項３８】
ＢＣＭＡに結合する前記第二及び／または前記追加の抗原結合部位（複数可）は、以下：
（ａ）配列番号１１４と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１１８と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン；
（ｂ）配列番号１１４と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１１８と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン；または
（ｃ）配列番号１１４と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１１８と同一である軽鎖可変ドメイン、
を含む、請求項１から３２のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項３９】
前記抗体Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１抗体のヒンジ及びＣＨ２ドメインを含む、請求項１から３８のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項４０】
前記Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１抗体の２３４番〜３３２番アミノ酸と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３９に記載のタンパク質。
【請求項４１】
前記Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ならびにＱ３４７、Ｙ３４９、Ｔ３５０、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１、及びＫ４３９からなる群より選択される１つまたは複数の位置で異なっている、請求項３９または４０に記載のタンパク質。
【請求項４２】
前記Ｆｃドメインは、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔ置換を有するヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである、請求項１から４１のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項４３】
前記置換を有する前記Ｆｃドメインは、ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖと連結されている、請求項４２に記載のタンパク質。
【請求項４４】
前記Ｆｃドメインは、Ｋ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗ置換を有するヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである、請求項１から４３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項４５】
前記置換を有する前記Ｆｃドメインは、前記第二抗原結合部位と連結されている、請求項４４に記載のタンパク質。
【請求項４６】
配列番号１６２のアミノ酸配列を含む、請求項１から３３及び３９から４５のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項４７】
配列番号１６２、配列番号１６３、及び配列番号１６５を含むアミノ酸配列を含む、請求項１から３３及び３９から４５のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項４８】
配列番号１６２のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１から３３及び３９から４５のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項４９】
配列番号１６２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１から３３及び３９から４５のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項５０】
配列番号１６２のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１から３３及び３９から４５のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項５１】
配列番号１６２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み、さらに配列番号１６３及び配列番号１６５を含む、請求項１から３３及び３９から４５のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項５２】
前記タンパク質は、表面プラズモン共鳴により測定した場合、ＮＫＧ２Ｄに２〜１２０ｎＭのＫＤで結合する、請求項１から５０のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項５３】
先行請求項のいずれか１項に記載のタンパク質及び薬学上許容されるキャリアを含む、配合物。
【請求項５４】
請求項１から５２のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸を１つまたは複数含む、細胞。
【請求項５５】
腫瘍細胞死の直接及び／または間接的な増大方法であって、腫瘍及びナチュラルキラー細胞を請求項１から５２のいずれか１項に記載のタンパク質と接触させることを含む、前記方法。
【請求項５６】
がんの治療方法であって、患者に、請求項１から５２のいずれか１項に記載のタンパク質または請求項５３に記載の配合物を投与することを含む、前記方法。
【請求項５７】
前記がんは、多発性骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、及び急性骨髄性白血病からなる群より選択される、請求項５５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１８年８月８日出願の米国特許出願第６２／７１６，２０７号の優先権を主張し、これはそのまま全体が本明細書中参照として援用される。
【０００２】
配列表
本明細書は、配列表のコンピュータ読み取り可能な形式（ＣＲＦ）のコピーとともに出願される。ＣＲＦは、名称が１４２４７−４２５−２２８＿ＳＴ２５．ＴＸＴ、作成日が２０１９年８月８日、ファイルサイズが１３７，００８バイトであり、これはそのまま全体が本明細書中参照として援用される。
【０００３】
発明の分野
本発明は、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６、及びＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合する多重特異性結合タンパク質に関する。このような多重特異性結合タンパク質は、抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体に比べて高い効力及び標的細胞の最大溶解を呈し、ＢＣＭＡを発現するヒトがん細胞の殺傷に有用である。
【背景技術】
【０００４】
がんは、この疾患を治療するための相当の研究努力及び科学的進歩が文献で報告されているにも関わらず、重大な健康上の障害であり続けている。最も頻繁に診断されるがんのいくつかとして、前立腺癌、乳癌、及び肺癌が挙げられる。前立腺癌は、男性のがんで最も一般的な形態である。乳癌は、依然として女性の死亡原因の第１位である。これらのがんの現行の治療選択肢は、全ての患者について有効というわけではなく、及び／または相当の有害な副作用を有する可能性がある。他の型のがんも、既存の治療選択肢を用いて治療するのは、依然として困難である。
【０００５】
がん免疫療法は、特異性が高く、また患者自身の免疫系を利用してがん細胞の破壊を促進することができることから、望ましいものである。二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ｅｎｇａｇｅｒ）などの融合タンパク質は、文献に記載のがん免疫療法であるが、これらは、腫瘍細胞及びＴ細胞に結合して、腫瘍細胞の破壊を促進する。ある種の腫瘍関連抗原及びある種の免疫細胞に結合する抗体が、文献に記載されている。例えば、ＷＯ  ２０１６／１３４３７１及びＷＯ  ２０１５／０９５４１２を参照。
【０００６】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、自然免疫系の構成要素であり、循環リンパ球の約１５％を構成する。ＮＫ細胞は、実質的に全ての組織に浸潤するものであり、もともとは、前感作を必要とせずに有効に腫瘍細胞を殺傷するその能力により特性決定された。活性化ＮＫ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞と同様な手段により、すなわち、パーフォリン及びグランザイムを含有する細胞溶解性顆粒を介して、ならびに細胞死受容体経路を介して、標的細胞を殺傷する。活性化ＮＫ細胞は、ＩＦＮ−γ及びケモカインなどの炎症性サイトカインも分泌し、これらが他の白血球の標的組織への動員を促進する。
【０００７】
ＮＫ細胞は、自身の表面の様々な活性化受容体及び阻害性受容体を通じてシグナルに反応する。例えば、ＮＫ細胞が健康な自己細胞に遭遇した場合、ＮＫ細胞の活性は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）の活性化を通じて阻害される。あるいは、ＮＫ細胞が外来細胞またはがん細胞に遭遇した場合、ＮＫ細胞は、自身の活性化受容体（例えば、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＣＲ、ＤＮＡＭ１）を介して活性化される。ＮＫ細胞は、自身の表面のＣＤ１６受容体を通じて、一部の免疫グロブリンの定常領域によっても活性化される。活性化に対するＮＫ細胞の全体的な感度は、刺激シグナル及び阻害シグナルの合計に左右される。
【０００８】
ＢＣＭＡとは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーに属する膜貫通タンパク質である。ＢＣＭＡは、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリー、メンバー１３ｂ（ＴＮＦＳＦ１３Ｂ／ＴＡＬＬ−１／ＢＡＦＦ）に特異的に結合し、ＮＦ−κＢ及びＭＡＰＫ８／ＪＮＫ活性化を招く。ＢＣＭＡの発現は、Ｂ細胞系譜に限定されており、Ｂ細胞発達及び自己免疫応答に重要であることが示されてきている。ＢＣＭＡは、様々なＴＲＡＦファミリーメンバーにも結合し、したがって、細胞の生存及び増殖のシグナルを伝達している可能性がある。ＢＣＭＡは、様々ながん、例えば、多発性骨髄腫、リンパ腫、及び白血病などと関連づけられている。本発明は、ＢＣＭＡ発現がんの治療を改善するある種の利点を提供する。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、ＢＣＭＡ、例えば、がん細胞のＢＣＭＡなどに、ならびに、例えば、ナチュラルキラー細胞で発現したＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体に結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。当該タンパク質は、１種より多いＮＫ活性化受容体と係合することができ、天然リガンドがＮＫＧ２Ｄに結合するのをブロックする可能性がある。ある特定の実施形態において、本タンパク質は、ヒトにおいてならびに齧歯類及びカニクイザルなどの他の種において、ＮＫ細胞をアゴナイズすることができる。ある特定の実施形態において、本タンパク質は、ヒトにおいてならびに齧歯類及びカニクイザルなどの他の種において、細胞傷害性Ｔ細胞をアゴナイズすることができる。実施形態によっては、本タンパク質は、ヒトＮＫ細胞を刺激する。実施形態によっては、本タンパク質は、ヒト細胞傷害性Ｔ細胞を刺激する。本発明の様々な態様及び実施形態について、さらなる詳細を以下に記載する。
【００１０】
したがって、本発明の１つの態様は、以下を含むタンパク質を提供する：（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む第一抗原結合部位；（ｂ）Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合する第二抗原結合部位；及び（ｃ）抗体ＦｃドメインもしくはＣＤ１６に結合するのに十分なその一部分、またはＣＤ１６に結合する第三抗原結合部位。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、さらに、ＢＣＭＡに結合する追加の抗原結合部位を含む。ある特定の実施形態において、本開示に記載されるタンパク質の第二抗原結合部位は、ＢＣＭＡに結合するＦａｂ断片である。ある特定の実施形態において、本開示に記載されるタンパク質の第二抗原結合部位及び追加の抗原結合部位は、ＢＣＭＡに結合するＦａｂ断片である。
【００１１】
ある特定の実施形態において、本開示に記載されるタンパク質の第二抗原結合部位及び追加の抗原結合部位は、ＢＣＭＡに結合するｓｃＦｖである。ある特定の実施形態において、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖの重鎖可変ドメインは、ｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインのＮ末端またはＣ末端に位置する。ある特定の実施形態において、軽鎖可変ドメインは、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖの重鎖可変ドメインのＮ末端に位置する。
【００１２】
ある特定の実施形態において、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖは、抗体ＦｃドメインもしくはＣＤ１６に結合するのに十分なその一部分、またはＣＤ１６に結合する第三抗原結合部位と連結されている。ある特定の実施形態において、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖは、抗体ＦｃドメインもしくはＣＤ１６に結合するのに十分なその一部分、またはＣＤ１６に結合する第三抗原結合部位と、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介して連結されている。ある特定の実施形態において、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖは、抗体ＦｃドメインもしくはＣＤ１６に結合するのに十分なその一部分、またはＣＤ１６に結合する第三抗原結合部位のＣ末端と、配列番号１６８のアミノ酸配列を含むフレキシブルリンカーを介して連結されている。ある特定の実施形態において、ＦｃドメインのＣ末端とＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖのＶＬドメイン（例えば、配列番号９８）のＮ末端とを連結するフレキシブルリンカーは、配列番号１６８のアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態において、抗体ＦｃドメインのＣ末端は、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインのＮ末端と連結されている。
【００１３】
ある特定の実施形態において、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖ内で、ジスルフィド架橋が、ｓｃＦｖの重鎖可変ドメインとｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインの間で形成される。ある特定の実施形態において、ジスルフィド架橋は、重鎖可変ドメインのＣ４４と軽鎖可変ドメインのＣ１００の間で形成される。
【００１４】
ある特定の実施形態において、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖ内で、重鎖可変ドメインは、軽鎖可変ドメインと、フレキシブルリンカーを介して連結されている。ある特定の実施形態において、フレキシブルリンカーは、（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）ｎ（（Ｇ４Ｓ）ｎ；配列番号１９８）を含み、配列中、ｎは、１〜１０の整数である。ある特定の実施形態において、フレキシブルリンカーは、配列番号１６７のアミノ酸配列を有する。
【００１５】
ある特定の実施形態において、第二抗原結合部位ｓｃＦｖ及び追加の抗原結合部位ｓｃＦｖは、抗体ＦｃドメインもしくはＣＤ１６に結合するのに十分なその一部分、またはＣＤ１６に結合する第三抗原結合部位と、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介して連結されている。ある特定の実施形態において、第二抗原結合部位ｓｃＦｖ及び追加の抗原結合部位ｓｃＦｖは、抗体Ｆｃドメインと、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介して連結されている。
【００１６】
ある特定の実施形態において、第二抗原結合部位及び／または追加の抗原結合部位の重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインの間に、ジスルフィド架橋が形成される。ある特定の実施形態において、ジスルフィド架橋は、重鎖可変ドメインのＣ４４と軽鎖可変ドメインのＣ１００の間に形成される。
【００１７】
ある特定の実施形態において、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖは、重鎖可変ドメインのＮ末端に位置する軽鎖可変ドメインを含み、ただし軽鎖可変ドメインは、ｓｃＦｖの重鎖可変ドメインと、配列番号１６７のアミノ酸配列を含むフレキシブルリンカーを介して連結されており、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖは、抗体Ｆｃドメインと、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介して連結されている。
【００１８】
ある特定の実施形態において、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖを含む第一抗原結合部位を含む本発明のタンパク質は、以下：
（ａ）配列番号１９０、９６、及び１９１のアミノ酸配列でそれぞれ表される相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、及び相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびに、配列番号９９、１００、及び１０１のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｂ）配列番号１９０、９６、及び１９３のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびに、配列番号９９、１００、及び１０１のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｃ）配列番号９５、９６、及び９７のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびに、配列番号９９、１００、及び１０１のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｄ）配列番号１８８、８８、及び１８９のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびに、配列番号９１、９２、及び９３のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｅ）配列番号１８５、１０４、及び１９２のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびに、配列番号１０７、１０８、及び１０９のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｆ）配列番号１８５、７２、及び１５９のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびに、配列番号７５、７６、及び７７のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｇ）配列番号１８６、８０、及び１８７のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびに、配列番号８３、８４、及び８５のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｈ）配列番号１９０、９６、及び１９４のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびに、配列番号９９、１００、及び１０１のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｉ）配列番号１９０、９６、及び１９５のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびに、配列番号９９、１００、及び１０１のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｊ）配列番号１９０、９６、及び１９６のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびに、配列番号９９、１００、及び１０１のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｋ）配列番号１９０、９６、及び１９７のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびに、配列番号９９、１００、及び１０１のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；または
（ｌ）配列番号１９０、９６、及び１６０のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびに、配列番号９９、１００、及び１０１のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；を含み、ならびに
ＢＣＭＡに結合する第二及び／または追加の抗原結合部位（複数可）は、以下：
（ａ）配列番号１４９、１５０、及び１５１のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１５３、１５４、及び１５５のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｂ）配列番号１１５、１１６、及び１１１７のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１２０、１２１、及び１２３のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｃ）配列番号１２５、１２６、及び１２７のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１２９、１３０、及び１３１のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｄ）配列番号１３３、１３４、及び１３５のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１３７、１３８、及び１３９のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｅ）配列番号１４１、１４２、及び１４３のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１４５、１４６、及び１４７のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；または
（ｆ）配列番号１１５、１１６、及び１１７のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１２０、１２１、及び１２２のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン
を含む。
【００１９】
ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、配列番号１６２のアミノ酸配列を含む。
【００２０】
ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、配列番号１６２、配列番号１６３、及び配列番号１６５を含むアミノ酸配列を含む。
【００２１】
ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、配列番号１６２のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００２２】
ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、配列番号１６２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００２３】
ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、配列番号１６２のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００２４】
ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、配列番号１６２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み、さらに、配列番号１６３及び配列番号１６５を含む。
【００２５】
ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第一抗原結合部位を備え、配列番号９４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一）である重鎖可変ドメインを含む。
【００２６】
ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号９４と少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一）である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号９４と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第一抗原結合部位を含み、第一抗原結合部位は、配列番号９４と少なくとも９８％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と少なくとも９８％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第一抗原結合部位を含み、第一抗原結合部位は、配列番号９４と少なくとも９９％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と少なくとも９９％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号９４と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と同一である軽鎖可変ドメインを含む。
【００２７】
ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１６９と少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一）である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１６９と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１６９と少なくとも９８％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と少なくとも９８％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１６９と少なくとも９９％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と少なくとも９９％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１６９と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と同一である軽鎖可変ドメインを含む。
【００２８】
ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１７１と少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一）である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１７１と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１７１と少なくとも９８％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と少なくとも９８％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１７１と少なくとも９９％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と少なくとも９９％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１７１と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と同一である軽鎖可変ドメインを含む。
【００２９】
ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１７３と少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一）である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１７３と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１７３と少なくとも９８％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と少なくとも９８％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１７３と少なくとも９９％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と少なくとも９９％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１７３と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と同一である軽鎖可変ドメインを含む。
【００３０】
ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１７５と少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一）である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１７５と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１７５と少なくとも９８％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と少なくとも９８％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１７５と少なくとも９９％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と少なくとも９９％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１７５と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と同一である軽鎖可変ドメインを含む。
【００３１】
ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１７７と少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一）である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１７７と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１７７と少なくとも９８％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と少なくとも９８％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１７７と少なくとも９９％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と少なくとも９９％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１７７と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と同一である軽鎖可変ドメインを含む。
【００３２】
ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１７９と少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一）である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１７９と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１７９と少なくとも９８％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と少なくとも９８％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１７９と少なくとも９９％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と少なくとも９９％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１７９と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と同一である軽鎖可変ドメインを含む。
【００３３】
ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＢＣＭＡに結合する第二抗原結合部位を備え、第二抗原結合部位は、配列番号１４８と少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一）である重鎖可変ドメイン及び配列番号１５２と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＢＣＭＡに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１４８と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１５２と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＢＣＭＡに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１４８と少なくとも９８％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１５２と少なくとも９８％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＢＣＭＡに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１４８と少なくとも９９％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１５２と少なくとも９９％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＢＣＭＡに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１４８と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１５２と同一である軽鎖可変ドメインを含む。
【００３４】
ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＢＣＭＡに結合する第二抗原結合部位を備え、第二抗原結合部位は、配列番号１１４と少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一）である重鎖可変ドメイン及び配列番号１１９と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＢＣＭＡに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１１４と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１１９と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＢＣＭＡに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１１４と少なくとも９８％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１１９と少なくとも９８％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＢＣＭＡに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１１４と少なくとも９９％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１１９と少なくとも９９％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＢＣＭＡに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１１４と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１１９と同一である軽鎖可変ドメインを含む。
【００３５】
ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＢＣＭＡに結合する第二抗原結合部位を備え、第二抗原結合部位は、配列番号１２４と少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一）である重鎖可変ドメイン及び配列番号１２８と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＢＣＭＡに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１２４と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１２８と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＢＣＭＡに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１２４と少なくとも９８％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１２８と少なくとも９８％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＢＣＭＡに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１２４と少なくとも９９％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１２８と少なくとも９９％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＢＣＭＡに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１２４と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１２８と同一である軽鎖可変ドメインを含む。
【００３６】
ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＢＣＭＡに結合する第二抗原結合部位を備え、第二抗原結合部位は、配列番号１３２と少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一）である重鎖可変ドメイン及び配列番号１３６と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＢＣＭＡに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１３２と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１３６と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＢＣＭＡに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１３２と少なくとも９８％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１３６と少なくとも９８％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＢＣＭＡに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１３２と少なくとも９９％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１３６と少なくとも９９％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＢＣＭＡに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１３２と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１３６と同一である軽鎖可変ドメインを含む。
【００３７】
ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＢＣＭＡに結合する第二抗原結合部位を備え、第二抗原結合部位は、配列番号１４０と少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一）である重鎖可変ドメイン及び配列番号１４４と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＢＣＭＡに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１４０と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１４４と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＢＣＭＡに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１４０と少なくとも９８％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１４４と少なくとも９８％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＢＣＭＡに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１４０と少なくとも９９％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１４４と少なくとも９９％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＢＣＭＡに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１４０と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１４４と同一である軽鎖可変ドメインを含む。
【００３８】
ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＢＣＭＡに結合する第二抗原結合部位を備え、第二抗原結合部位は、配列番号１１４と少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一）である重鎖可変ドメイン及び配列番号１１８と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＢＣＭＡに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１１４と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１１８と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＢＣＭＡに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１１４と少なくとも９８％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１１８と少なくとも９８％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＢＣＭＡに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１１４と少なくとも９９％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１１８と少なくとも９９％同一である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ＢＣＭＡに結合する第一抗原結合部位を備え、第一抗原結合部位は、配列番号１１４と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１１８と同一である軽鎖可変ドメインを含む。
【００３９】
ある特定の実施形態において、本タンパク質は、さらに、ＢＣＭＡに結合する追加の抗原結合部位を含む。ある特定の実施形態において、追加の抗原結合部位は、ＢＣＭＡに結合する第二抗原結合部位の重鎖可変ドメインと同じＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ならびに軽鎖可変ドメインと同じＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態において、追加の抗原結合部位は、ＢＣＭＡに結合する第二抗原結合部位の重鎖可変ドメインと少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一）である重鎖可変ドメイン、及びＢＣＭＡに結合する第二抗原結合部位の軽鎖可変ドメインと少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一）である軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態において、追加の抗原結合部位は、ＢＣＭＡに結合する第二抗原結合部位の重鎖可変ドメインと同一である重鎖可変ドメイン及びＢＣＭＡに結合する第二抗原結合部位の軽鎖可変ドメインと同一である軽鎖可変ドメインを含む。
【００４０】
本明細書中開示されるタンパク質は、抗体ＦｃドメインもしくはＣＤ１６に結合するのに十分なその一部分、またはＣＤ１６に結合する第三抗原結合部位を含む。ある特定の実施形態において、本明細書中開示されるタンパク質は、抗体Ｆｃドメインを含む。抗体Ｆｃドメインは、ＣＤ１６に結合できる。ある特定の実施形態において、本明細書中開示されるタンパク質は、ＣＤ１６に対する抗体Ｆｃドメインの結合親和性を保持している、すなわちＣＤ１６に結合するのに十分である抗体Ｆｃドメインの一部分を含む。ある特定の実施形態において、本明細書中開示されるタンパク質は、ＣＤ１６に結合する第三抗原結合部位を含む。ある特定の実施形態において、ＣＤ１６に結合する第三抗原結合部位は、Ｆａｂ断片を含む。ある特定の実施形態において、ＣＤ１６に結合する第三抗原結合部位は、ｓｃＦＶを含む。
【００４１】
ある特定の実施形態において、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖは、抗体ＦｃドメインもしくはＣＤ１６に結合するのに十分なその一部分、またはＣＤ１６に結合する第三抗原結合部位と連結されている。ある特定の実施形態において、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖは、抗体ＦｃドメインもしくはＣＤ１６に結合するのに十分なその一部分、またはＣＤ１６に結合する第三抗原結合部位と、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介して連結されている。ある特定の実施形態において、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖは、抗体ＦｃドメインもしくはＣＤ１６に結合するのに十分なその一部分、またはＣＤ１６に結合する第三抗原結合部位のＣ末端と、フレキシブルリンカーを介して連結されている。ある特定の実施形態において、フレキシブルリンカーは、配列番号１６８のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗体ＦｃドメインもしくはＣＤ１６に結合するのに十分なその一部分、またはＣＤ１６に結合する第三抗原結合部位のＣ末端は、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインのＮ末端と連結されている。ある特定の実施形態において、抗体ＦｃドメインもしくはＣＤ１６に結合するのに十分なその一部分、またはＣＤ１６に結合する第三抗原結合部位のＣ末端とＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖのＶＬドメイン（例えば、配列番号９８）のＮ末端を連結するフレキシブルリンカーは、配列番号１６８のアミノ酸配列を有する。
【００４２】
ある特定の実施形態において、本明細書中開示されるタンパク質は、抗体Ｆｃドメインを含む。ある特定の実施形態において、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖは、抗体Ｆｃドメインと連結されている。ある特定の実施形態において、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖは、抗体Ｆｃドメインと、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介して連結されている。ある特定の実施形態において、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖは、抗体ＦｃドメインのＣ末端と、フレキシブルリンカーを介して連結されている。ある特定の実施形態において、フレキシブルリンカーは、配列番号１６８のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗体ＦｃドメインのＣ末端は、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインのＮ末端と連結されている。ある特定の実施形態において、ＦｃドメインのＣ末端と、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖのＶＬドメイン（例えば、配列番号９８）のＮ末端を連結するフレキシブルリンカーは、配列番号１６８のアミノ酸配列を有する。
【００４３】
ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ヒトＩｇＧ１抗体のヒンジ及びＣＨ２ドメインを含む抗体Ｆｃドメインを備える。
【００４４】
ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ヒトＩｇＧ１抗体の２３４番〜３３２番アミノ酸と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むＦｃドメインを備える。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ヒトＩｇＧ１抗体の２３４番〜３３２番アミノ酸と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むＦｃドメインを備える。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ヒトＩｇＧ１抗体の２３４番〜３３２番アミノ酸と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むＦｃドメインを備える。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むＦｃドメインを備える。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むＦｃドメインを備える。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインと少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むＦｃドメインを備える。ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むＦｃドメインを備え、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｔ３５０、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１、及びＫ４３９からなる群より選択される１つまたは複数の位置で異なっている。
【００４５】
ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔ置換を有するヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを備える。本開示のタンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖと連結された、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔ置換を有するＦｃドメインを備える。
【００４６】
ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、Ｋ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗ置換を有するヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを備える。
【００４７】
ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、第二抗原結合部位と連結された、Ｋ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗ置換を有するＦｃドメインを備える。
【００４８】
ある特定の実施形態において、第一抗原結合部位は、表面プラズモン共鳴により測定した場合に、２〜１２０ｎＭのＫＤでＮＫＧ２Ｄに結合する。ある特定の実施形態において、タンパク質は、表面プラズモン共鳴により測定した場合に、２〜１２０ｎＭのＫＤでＮＫＧ２Ｄに結合する。
【００４９】
これらのタンパク質の少なくとも１種を含有する配合物、これらのタンパク質を発現する少なくとも１種または複数の核酸を含有する細胞、及びこれらのタンパク質を使用して腫瘍細胞死を増大させる方法も、提供される。
【００５０】
本発明のさらなる態様において、本開示は、がんの治療法を提供し、本方法において、本開示のタンパク質または本開示のタンパク質を含む配合物が、それを必要としている患者に投与される。実施形態によっては、がんは、ＢＣＭＡを発現する。実施形態によっては、がんの細胞の少なくとも２０％が、ＢＣＭＡを発現する。実施形態によっては、がんの細胞の少なくとも５０％が、ＢＣＭＡを発現する。実施形態によっては、がんの細胞の少なくとも８０％が、ＢＣＭＡを発現する。
【００５１】
ある特定の実施形態において、本開示のタンパク質は、多発性骨髄腫、急性骨髄単球性白血病、Ｔ細胞リンパ腫、急性単球性白血病、及び濾胞性リンパ腫から選択されるがんの治療に使用される。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】は、三重特異性抗体（ＴｒｉＮＫＥＴ）の例を図解し、三重特異性抗体は、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖ第一抗原結合部位、ＢＣＭＡに結合する第二抗原結合部位、ＢＣＭＡに結合する追加の腫瘍関連抗原結合部位、及びＣＤ１６に結合するヘテロ二量体化抗体定常領域を含む。こうした抗体様式を、本明細書中、Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴと称する。Ａは、Ｆａｂ様式の２つのＢＣＭＡ結合部位を示す。Ｂは、ｓｃＦｖ様式の２つのＢＣＭＡ結合部位を示す。
【００５３】
【図２】ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖ第一抗原結合部位、ＢＣＭＡに結合する第二抗原結合部位、及びヘテロ二量体化抗体定常領域を含むＴｒｉＮＫＥＴ例を図解する。この抗体様式は、本明細書中、Ｆ３−ＴｒｉＮＫＥＴと称する。
【００５４】
【図３】ＢＣＭＡ標的指向化ＴｒｉＮＫＥＴ（ＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡ（短くは、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡ）が、ＢＣＭＡ陽性ＫＭＳ１２−ＰＥ骨髄腫細胞の溶解を、抗ＢＣＭＡ  ｍＡｂよりも強力に仲介することを示す。
【００５５】
【図４】ＢＣＭＡ標的指向化ＴｒｉＮＫＥＴが、ＢＣＭＡ陽性ＭＭ．１Ｒ骨髄腫細胞の溶解を、抗ＢＣＭＡ  ｍＡｂよりも強力に仲介することを示す。
【００５６】
【図５】ＢＣＭＡ標的指向化抗体及びＴｒｉＮＫＥＴとともにインキュベートすると、ＫＭＳ１２−ＰＥ骨髄腫細胞の表面ＢＣＭＡ発現の合計が継時的に安定して増加することを示す。
【００５７】
【図６】ＢＣＭＡ標的指向化抗体及びＴｒｉＮＫＥＴとともにインキュベートすると、ＭＭ．１Ｒ骨髄腫細胞の表面ＢＣＭＡ発現の合計が継時的に安定して増加することを示す。
【００５８】
【図７】二価ＴｒｉＮＫＥＴを用いたインキュベーション時間を延長すると、ＫＭＳ１２−ＰＥ骨髄腫細胞に結合したＴｒｉＮＫＥＴの量が劇的に増大したことを示す。
【００５９】
【図８】二価ＴｒｉＮＫＥＴを用いたインキュベーション時間を延長すると、ＭＭ．１Ｒ細胞に結合したＴｒｉＮＫＥＴの量が劇的に増大したことを示す。
【００６０】
【図９】長時間の精製ＮＫ殺傷アッセイにおいて、二価ＴｒｉＮＫＥＴ（Ｆ４様式）が二価ＢＣＭＡ標的指向化ｍＡｂ及び一価ＴｒｉＮＫＥＴよりも優れた成績であったことを示す。
【００６１】
【図１０】新鮮なＰＢＭＣエフェクター細胞を用いた長時間細胞毒性アッセイにおいて、ＢＣＭＡ−ＴｒｉＮＫＥＴが、有効性を保持したことを示す。
【００６２】
【図１１】ＢＣＭＡ標的指向化ＴｒｉＮＫＥＴが、ＫＨＹＧ−１細胞で発現したＮＫＧ２Ｄに対し弱く（検出限度未満で）結合することを示す。
【００６３】
【図１２】二価ＢＣＭＡ標的指向化ＴｒｉＮＫＥＴ（Ｆ４様式）が、ＣＤ１６を発現するように形質導入されたＫＨＹＧ−１細胞に対して、ｍＡｂ  Ｆｃ結合を超えるがほとんど結合しないことを示す。
【００６４】
【図１３】全血において、ＮＫ細胞（Ａ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｂ）、及びＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｃ）に対する、ＢＣＭＡ標的指向化ＴｒｉＮＫＥＴ（実線、暗灰色）の結合は、バックグラウンド（破線、白色）を超えるが軽微であることを示す。ＩｇＧ１対照（点線、明灰色）に近接していることを考慮すると、Ｂ細胞（Ｄ）、単球（Ｅ）、及び顆粒球（Ｆ）に対する結合は、大部分がＦｃ受容体の介在による。
【００６５】
【図１４】ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の純度及び標的発現を示す。示すとおり、ＣｏｎＡ刺激で発生させＩＬ−１５とともに培養したＣＤ８＋エフェクターＴ細胞は、高純度のものであり（＞９９％がＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞）、全てＮＫＧ２Ｄを発現したが、ＣＤ１６は発現しなかった。
【００６６】
【図１５】ＤＥＬＦＩＡアッセイでのＫＭＳ１２−ＰＥ細胞の細胞溶解を示す。ＤＥＬＦＩＡ細胞毒性アッセイは、２人の健康なドナーに由来するヒト初代ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞及びＫＭＳ１２−ＰＥ標的細胞を用いて行った。Ａは、ドナー１に由来する細胞での結果を示し、Ｂは、ドナー２に由来する細胞での結果を示す。示すとおり、ＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡは、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養した場合、ＫＭＳ１２−ＰＥ細胞の溶解を増大させたが、エフェクター細胞が存在しない場合は増大させなかった。親抗ＢＣＭＡ  ｍＡｂまたは無関係ＴｒｉＮＫＥＴでは、いずれのドナーに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞による溶解も増大させることができなかった。
【００６７】
【図１６】抗ＢＣＭＡ  ＴｒｉＮＫＥＴまたはモノクローナル抗体の存在化で４時間以内の、ＢＣＭＡ陽性標的細胞株の存在下でのヒトＮＫ細胞活性化を示す。Ａは、標的細胞としてＫＭＳ１２−ＰＥ細胞（低ＢＣＭＡ発現）を用いた結果を示す。Ｂは、標的細胞としてＨ９２９（高ＢＣＭＡ発現）を用いた結果を示す。示すとおり、高及び低ＢＣＭＡ発現細胞の両方に対して、Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴは、サブナノモルのＥＣ５０値で、脱顆粒及びＩＦＮγ産生の上昇を引き起こした。ＢＣＭＡモノクローナル抗体と比較して、Ｆ４ＴｒｉＮＫＥＴは、最大でより高い割合のＮＫ細胞を刺激し、両方の細胞株に対して向上した効力を有した。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
本発明は、ＢＣＭＡ、ＮＫＧ２Ｄ受容体、及びＣＤ１６受容体に結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。多重特異性結合タンパク質は、がん細胞のＢＣＭＡに結合するとともに、ナチュラルキラー細胞のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体に結合してナチュラルキラー細胞を活性化することができる。多重特異性結合タンパク質は、がん細胞のＢＣＭＡに結合するとともに、細胞傷害性Ｔ細胞のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体に結合して細胞傷害性Ｔ細胞を活性化することもできる。同じく本明細書中提供されるのは、当該多重特異性結合タンパク質を含む医薬組成物、ならびにがん治療のための方法を含む当該多重特異性タンパク質及び医薬組成物を使用した治療法である。本発明の様々な態様を以下のセクションに記載するが、特定の１つのセクションに記載される本発明の態様は、どのような特定セクションにも限定されないものとする。
【００６９】
本発明の理解を深めるため、複数の用語及び語句を、以下で定義する。
【００７０】
「ａ」及び「ａｎ」という用語は、本明細書中使用される場合、「１つまたは複数」であることを意味し、文脈が不適切にならない限り、複数を含む。
【００７１】
本明細書中使用される場合、「抗原結合部位」という用語は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の一部分を示す。ヒト抗体では、抗原結合部位は、重（「Ｈ」）鎖及び軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基で形成される。重鎖及び軽鎖のＶ領域内の３つの高度に多岐にわたる区間は、「超可変領域」と称し、超可変領域は、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として知られる、より保存された隣接区間の間に挟まれている。すなわち、「ＦＲ」という用語は、免疫グロブリンの超可変領域の間及び超可変領域に隣接して天然に見つかるアミノ酸配列を示す。ヒト抗体分子では、軽鎖の３つの超可変領域及び重鎖の３つの超可変領域は、抗原結合表面を形成するように三次元空間において互いに相対的に配置されている。抗原結合表面は、結合した抗原の三次元表面に対して相補的であり、重鎖及び軽鎖それぞれの３つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と称する。ある種の動物、例えば、ラクダ及び軟骨魚類などでは、抗原結合部位は、一本の抗体鎖により形成されて、「単一ドメイン抗体」をもたらす。抗原結合部位は、インタクト抗体、抗原結合表面を保持している抗体の抗原結合断片、またはｓｃＦｖなどの組換えポリペプチドに存在することができ、ペプチドリンカーを用いて単一ポリペプチドにおいて重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインを連結する。本明細書中開示される重鎖または軽鎖可変領域中のアミノ酸位置は全て、Ｋａｂａｔの番号付けに従って番号が振られている。
【００７２】
「腫瘍関連抗原」という用語は、本明細書中使用される場合、がんに関連する任意の抗原を意味し、そのような抗原として、タンパク質、糖タンパク質、ガングリオシド、炭水化物、脂質が挙げられるが、これらに限定されない。そのような抗原は、悪性細胞で、または腫瘍微小環境、例えば、腫瘍関連血管、細胞外基質、間葉系間質細胞、もしくは免疫浸潤物などで、発現する可能性がある。
【００７３】
本明細書中使用される場合、「対象」及び「患者」という用語は、本明細書中記載される方法及び組成物により治療される生物を示す。そのような生物として、好ましくは、哺乳類（例えば、マウス、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなど）が挙げられるが、これらに限定されず、より好ましくはヒトが挙げられる。
【００７４】
本明細書中使用される場合、「有効量」という用語は、有益なまたは所望の結果を実現するのに十分な、作用剤（例えば、本発明のタンパク質）の量を示す。この用語は、治療薬に関連して使用される場合、疾患もしくは障害の治療において治療効果をもたらすのに十分な、あるいは疾患もしくは障害に関連した１つまたは複数の症候を遅らせるまたは最小化するのに十分な、当該作用剤の量を示す。有効量は、１回または複数回の投与、適用、または投薬量で投与することができ、特定の配合または投与経路に限定されることを意図しない。本明細書中使用される場合、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、症状、疾患、障害などの改善をもたらす任意の効果、例えば、緩和、低減、調節、寛解、もしくは除去、またはそれらの症候の寛解を含む。
【００７５】
本明細書中使用される場合、「医薬組成物」という用語は、活性作用剤と、不活性もしくは活性であり、組成物をｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの診断用途または治療用途に特に適したものにするキャリアとの組み合わせを示す。
【００７６】
本明細書中使用される場合、「薬学上許容されるキャリア」という用語は、標準的な医薬キャリアのいずれか、例えば、リン酸緩衝食塩水、水、乳濁液（例えば、油／水または水／油乳濁液など）、及び各種湿潤剤を示す。組成物は、安定剤及び保存剤も含むことができる。キャリア、安定剤、及びアジュバントの例として、例えば、Ｍａｒｔｉｎ，  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １５ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌ．  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ  ［１９７５］を参照。
【００７７】
本明細書中使用される場合、「薬学上許容される塩」という用語は、対象への投与に際して、本発明の化合物またはその活性代謝産物もしくは残基をもたらすことができる本発明の化合物の任意の薬学上許容される塩（例えば、酸または塩基）を示す。当業者に既知であるとおり、本発明の化合物「塩」は、無機または有機の酸及び塩基から派生することができる。酸の例として、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン−ｐ−スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などが挙げられるが、これらに限定されない。シュウ酸などの他の酸は、それら自身は薬学上許容されないものの、本発明の化合物及びそれらの薬学上許容される酸付加塩を得る上で、中間体として有用な塩の調製に採用される場合がある。
【００７８】
塩基の例として、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）水酸化物、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）水酸化物、アンモニア、及び式ＮＷ４＋の化合物（式中、ＷはＣ１−４アルキルである）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
塩の例として、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、ウンデカン酸塩などが挙げられるが、これらに限定されない。塩の他の例として、本発明の化合物のアニオンが適切なカチオン、例えば、Ｎａ＋、ＮＨ４＋、及びＮＷ４＋（式中、Ｗは、Ｃ１−４アルキル基である）などと化合したものが挙げられる。
【００８０】
治療用途の場合、本発明の化合物の塩は、薬学上許容されるものであることが企図される。しかしながら、薬学上許容されるものではない酸及び塩基の塩も、例えば、薬学上許容される化合物の調製または精製において、用途を見出す場合がある。
【００８１】
説明全体を通じて、組成物が、特定の成分を有する、備える、または含むと記載される場合、あるいはプロセス及び方法が、特定の工程を有する、包含する、または含むと記載される場合、追加で、列挙される成分から本質的になる、またはそれらからなる本発明の組成物が存在すること、及び列挙される処理工程から本質的になる、またはそれらからなる本発明によるプロセス及び方法が存在することが、企図される。
【００８２】
一般的事項として、組成物のパーセンテージが指定される場合、特に記載がない限り、重量による。さらに、変数が定義を伴わない場合、その変数のこれまでの定義が優先される。
【００８３】
Ｉ．タンパク質
本発明は、がん細胞のＢＣＭＡに結合するとともに、ナチュラルキラー細胞のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体に結合してナチュラルキラー細胞を活性化する、多重特異性結合タンパク質を提供する。多重特異性結合タンパク質は、本明細書中記載される医薬組成物及び治療法に有用である。多重特異性結合タンパク質がナチュラルキラー細胞のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体に結合することで、がん細胞の破壊に向かうナチュラルキラー細胞の活性が向上する。多重特異性結合タンパク質ががん細胞のＢＣＭＡに結合することで、がん細胞はナチュラルキラー細胞と近接することになり、このことが、ナチュラルキラー細胞によるがん細胞の破壊を直接及び間接的に促進する。
【００８４】
本明細書中提供される多重特異性結合タンパク質は、がん細胞のＢＣＭＡに結合するとともに、細胞傷害性Ｔ細胞のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体に結合して細胞傷害性Ｔ細胞を活性化する、多重特異性結合タンパク質を提供する。多重特異性結合タンパク質は、本明細書中記載される医薬組成物及び治療法に有用である。多重特異性結合タンパク質が細胞傷害性Ｔ細胞のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体に結合することで、がん細胞の破壊に向かう細胞傷害性Ｔ細胞の活性が向上する。多重特異性結合タンパク質ががん細胞のＢＣＭＡに結合することで、がん細胞は細胞傷害性Ｔ細胞と近接することになり、このことが、細胞傷害性Ｔ細胞によるがん細胞の破壊を直接及び間接的に促進する。
【００８５】
多重特異性結合タンパク質の例について、以下にさらに説明する。
【００８６】
多重特異性結合タンパク質の第一構成要素は、ＮＫＧ２Ｄ受容体発現細胞に結合し、そのような細胞として、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、γδＴ細胞、及びＣＤ８＋αβＴ細胞を挙げることができるが、これらに限定されない。ＮＫＧ２Ｄとの結合に際して、多重特異性結合タンパク質は、ＵＬＢＰ６及びＭＩＣＡなどの天然リガンドが、ＮＫＧ２Ｄに結合してＮＫＧ２Ｄ受容体を活性化するのをブロックする可能性がある。
【００８７】
多重特異性結合タンパク質の第二構成要素は、ＢＣＭＡ発現細胞に結合し、そのような細胞として、多発性骨髄腫及びＢ細胞性腫瘍を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００８８】
多重特異性結合タンパク質の第三構成要素は、白血球の表面でＣＤ１６、すなわちＦｃ受容体を発現する細胞と結合し、そのような細胞として、ナチュラルキラー細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、肥満細胞、及び濾胞樹状細胞が挙げられる。
【００８９】
本明細書中記載される多重特異性結合タンパク質は、様々な様式を取ることができる。図１Ａは、ＢＣＭＡに結合する抗原結合部位を２つ有するＦ４  ＴｒｉＮＫＥＴを図解し、図中、ＢＣＭＡに結合する抗原結合部位は両方ともＦａｂ断片である。Ｆ４  ＴｒｉＮＫＥＴ（Ｆａｂ）は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第一抗原結合部位（この部位はｓｃＦｖを含む）、ＢＣＭＡに結合する第二抗原結合部位、ＢＣＭＡに結合する追加の抗原結合部位、及びＣＤ１６に結合するヘテロ二量体化抗体定常領域を備える。Ｆ４  ＴｒｉＮＫＥＴ（Ｆａｂ）は、４つのペプチド、第一免疫グロブリン重鎖、第二免疫グロブリン重鎖、及び２つの免疫グロブリン軽鎖を備えるヘテロ二量体型多重特異性抗体である（図１Ａ）。第一免疫グロブリン重鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とこれに連結した重鎖定常領域１（ＣＨ１）（これが第一（ＶＨ−ＣＨ１）ドメインを形成する）、及び第一Ｆｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメインを備え、ただし第一（ＶＨ−ＣＨ１）ドメインは、第一軽鎖と対形成して、ＢＣＭＡに結合する第一Ｆａｂを形成し、及びただし（ＶＨ−ＣＨ１）ドメインは、リンカーまたはヒンジを介して第一Ｆｃと連結されている（図１Ａ）。第二免疫グロブリン重鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、第二（ＶＨ−ＣＨ１）ドメイン、第二Ｆｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメイン、ならびに対形成しＮＫＧ２Ｄに結合するＶＨ及びＶＬで構成された一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を備え、ただし第二Ｆｃドメインは、そのＮ末端でリンカーまたはヒンジいずれかを介して第二（ＶＨ−ＣＨ１）ドメインと連結されており、及びそのＣ末端でリンカーまたはヒンジいずれかを介してＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦＶと連結されており、ならびにただし第二（ＶＨ−ＣＨ１）ドメインは、第二軽鎖と対形成して、ＢＣＭＡに結合する第二Ｆａｂを形成する（図１Ａ）。
【００９０】
Ｆ４  ＴｒｉＮＫＥＴ（ｓｃＦｖ）は、２つのペプチド、第一免疫グロブリン重鎖及び第二免疫グロブリン重鎖を備えたヘテロ二量体型多重特異性抗体である（図１Ｂ）。第一免疫グロブリン重鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＢＣＭＡに結合する第一ｓｃＦｖ及び第一Ｆｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメインを備え、ただし、ＢＣＭＡに結合する第一ｓｃＦｖは、リンカーまたはヒンジいずれかを介して第一Ｆｃと連結されている（図１Ｂ）。第二免疫グロブリン重鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＢＣＭＡに結合する第二ｓｃＦｖ、第二Ｆｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメイン、及びＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖを備え、ただし、第二Ｆｃドメインは、そのＮ末端でリンカーまたはヒンジいずれかを介してＢＣＭＡに結合する第二ｓｃＦｖドメインと連結されており、そのＣ末端でリンカーまたはヒンジいずれかを介してＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖと連結されている（図１Ｂ）。
【００９１】
「ＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡ」と呼ばれるＴｒｉＮＫＥＴにより、図１Ａ（ＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ４（Ｆａｂ）−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡ）または図１Ｂ（ＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ４（ｓｃＦｖ）−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡ）に描かれたＴｒｉＮＫＥＴを示すことができる。例えば、「Ａ４９−Ｆ４−ＴＲＩＮＫＥＴ−ＢＣＭＡ」というＴｒｉＮＫＥＴは、「ＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡ」様式を有し、かつＡ４９のＶＨ及びＶＬ（以下の表１を参照）を含むＮＫＧ−２Ｄ結合ドメインを有するＴｒｉＮＫＥＴを示す。
【００９２】
実施形態によっては、上記の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、ヒンジ配列を介して抗体定常ドメインと連結されている。実施形態によっては、ヒンジは、アミノ酸Ａｌａ−Ｓｅｒを含む。いくつかの他の実施形態において、ヒンジは、アミノ酸Ａｌａ−Ｓｅｒ及びＴｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙを含む。ヒンジ配列は、標的抗原と結合する上での柔軟性、ならびに柔軟性と最適形状の間の兼ね合いを提供することができる。
【００９３】
実施形態によっては、上記の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを備える。実施形態によっては、重鎖可変ドメインは、軽鎖可変ドメインとの間にジスルフィド架橋を形成して、ｓｃＦｖの安定性を向上させる。例えば、ジスルフィド架橋は、重鎖可変ドメインのＣ４４残基と軽鎖可変ドメインのＣ１００残基の間で形成される可能性がある。実施形態によっては、重鎖可変ドメインは、フレキシブルリンカーを介して軽鎖可変ドメインと連結されている。任意の適切なリンカー、例えば、（Ｇ４Ｓ）４リンカーが使用可能である。ｓｃＦｖの実施形態によっては、重鎖可変ドメインは、軽鎖可変ドメインのＮ末端に位置する。ｓｃＦｖの実施形態によっては、重鎖可変ドメインは、軽鎖可変ドメインのＣ末端に位置する。
【００９４】
多重特異性結合タンパク質は、ＢＣＭＡの二価または一価の係合を提供することができる。多重特異性タンパク質によるＢＣＭＡの二価係合は、がん細胞表面のＢＣＭＡを安定化させて、がん細胞に向かうＮＫ細胞の細胞傷害性を向上させることができる。多重特異性タンパク質によるＢＣＭＡの二価係合は、多重特異性タンパク質とがん細胞のより強い結合を与えることができ、それによりがん細胞、特にＢＣＭＡの発現レベルが低いがん細胞に向かうＮＫ細胞のより強力な細胞傷害性反応を促進することができる。本明細書中提供される多重特異性タンパク質によるＢＣＭＡの二価係合は、がん細胞に向かう細胞傷害性Ｔ細胞の細胞傷害性も向上させることができる。多重特異性タンパク質によるＢＣＭＡの二価係合は、多重特異性タンパク質とがん細胞のより強い結合を与えることができ、それによりがん細胞に向かう細胞傷害性Ｔ細胞のより強力な細胞傷害性反応を促進することができる。
【００９５】
Ｆｃドメイン内では、ＣＤ１６結合に、ヒンジ領域及びＣＨ２ドメインが介在する。例えば、ヒトＩｇＧ１内で、ＣＤ１６との相互作用は、主に、アミノ酸残基Ａｓｐ２６５−Ｇｌｕ２６９、Ａｓｎ２９７−Ｔｈｒ２９９、Ａｌａ３２７−Ｉｌｅ３３２、Ｌｅｕ２３４−Ｓｅｒ２３９、及びＣＨ２ドメインの炭水化物残基Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを中心としている（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ４０６  （６７９３）：２６７−２７３を参照）。既知のドメインに基づいて、ファージディスプレイライブラリーまたは酵母菌表面ディスプレイｃＤＮＡライブラリーを用いることによるなどして、ＣＤ１６に対する結合親和性を向上または低下させるように変異を選択することができ、あるいは、相互作用の既知の三次元構造に基づいて変異を設計することができる。
【００９６】
実施形態によっては、抗体定常ドメインは、ＩｇＧ抗体、例えば、ヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。実施形態によっては、変異は、抗体定常ドメインに導入されて、別の抗体定常ドメインとのヘテロ二量体化を可能にする。例えば、抗体定常ドメインがヒトＩｇＧ１の定常ドメインに由来する場合、抗体定常ドメインは、ヒトＩｇＧ１抗体の２３４番〜３３２番アミノ酸と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む可能性があり、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１、及びＫ４３９からなる群より選択される１つまたは複数の位置で異なっている。本明細書中開示されるＦｃドメインまたはヒンジ領域のアミノ酸位置は全て、ＥＵ番号付けに従って番号が付されている。
【００９７】
実施形態によっては、抗体定常ドメインは、ヒトＩｇＧ１抗体の２３４番〜３３２番アミノ酸と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む可能性があり、Ｑ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９Ｄ、及びＫ４３９Ｅからなる群より選択される１つまたは複数の置換により異なっている。
【００９８】
以下に列挙するのは、２つのポリペプチド鎖のヘテロ二量体化を可能にする変異も有している抗体定常領域と連結されたｓｃＦｖの例である。ＮＫＧ２Ｄ由来の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含むｓｃＦｖが、本開示の多重特異性タンパク質の調製に使用される。各配列は、ＶＬ−（Ｇ４Ｓ）４−ＶＨ−ヒンジ（ＡＳ）−ヘテロ二量体化変異（下線付）を有するＦｃで表される。ＶＬ及びＶＨは、１００ＶＬ−４４ＶＨのＳ−Ｓ架橋（下線付）を有し、任意の腫瘍標的指向性またはＮＫＧ２Ｄ結合抗体に由来することができる。Ａｌａ−Ｓｅｒ（ＡＳ、太線＆下線付）は、柔軟性と最適形状の兼ね合いを図るようにエルボーヒンジ領域配列に含まれている。ある特定の実施形態において、追加の配列Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−ＧｌｙをヒンジにあるＡＳ配列に加えることができる。（Ｇ４Ｓ）４リンカーは、下の段落で列挙される配列中、下線が付されている。
【００９９】
本開示のＴｒｉＮＫＥＴは、ＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡ、すなわちＡ４９−Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡであり、これは、配列番号１６２の配列を含む第一ポリペプチド（Ｆ４−ＢＣＭＡＦｃ−ＡＪ鎖Ｂ−ＮＫＧ２Ｄ結合ｓｃＦｖ）、配列番号１６３の配列を含む第二ポリペプチド（抗ＢＣＭＡ  ＨＣ−ヒンジ−Ｆｃ）、ならびに配列番号１６５の配列をそれぞれ含む第三及び第四ポリペプチド（抗ＢＣＭＡ−全ＬＣ）を含む。
【０１００】
第一ポリペプチド、すなわち、Ｆ４−ＢＣＭＡＦｃ−ＡＪ鎖Ｂ−ＮＫＧ２Ｄ結合ｓｃＦｖ（配列番号１６２）と第三ポリペプチド、すなわち抗ＢＣＭＡ−全ＬＣは、第一ＢＣＭＡ標的指向性Ｆａｂ断片（重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（配列番号１４８）及びＣＨ１ドメインを含む重鎖部分と、ならびに軽鎖可変ドメイン（配列番号１５２）及び軽鎖定常ドメインを含む軽鎖部分とを備える）を形成する。Ｆ４−ＢＣＭＡＦｃ−ＡＪ鎖Ｂ−ＮＫＧ２Ｄ結合ｓｃＦｖは、Ｆｃドメイン（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）と接続された重鎖部分（ＶＨ−ＣＨ１）を含み、Ｆｃドメインは、ＦｃのＣ末端で、ＮＫＧ２Ｄに結合する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）と連結されている。ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖは、配列番号１６１のアミノ酸配列で表され、（Ｇ４Ｓ）４リンカーを介して重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（配列番号９４）と連結された軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）（配列番号９８）を備える。配列番号１６２に表されるとおり、ＦｃドメインのＣ末端が、短いＳＧＳＧＧＧＧＳリンカー（配列番号１６８）を用いてＶＬ（配列番号９８）ドメインのＮ末端と連結されている。
ＮＫＧ２Ｄ結合ｓｃＦｖ
【化１】
2021533169.tif 000003
Ｆ４−ＢＣＭＡＦｃ−ＡＪ鎖Ｂ−ＮＫＧ２Ｄ結合ｓｃＦｖ
【化２】
2021533169.tif 000004
【０１０１】
ＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡのｓｃＦｖは、（Ｇ４Ｓ）４リンカーで重鎖可変ドメインと接続されたＮＫＧ２Ｄ結合部位の軽鎖可変ドメインを備える（（ＶＬ（Ｇ４Ｓ）４ＶＨ）で表す）。ｓｃＦｖ（配列番号１６２）の軽鎖及び重鎖可変ドメインは、ＶＬ−（Ｇ４Ｓ）４−ＶＨとして接続されており；ＶＬ及びＶＨは、１００ＶＬ−４４ＶＨのＳ−Ｓ架橋を有し（それぞれＧ１００Ｃ及びＧ４４Ｃ置換から生じる）（システイン残基は、太字−斜体−下線付である）。（Ｇ４Ｓ）４は、配列番号１６１及び配列番号１６２中の斜体の配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１６４）である。配列番号１６２中のＦｃドメインは、Ｓ３５４Ｃ置換を有し、この置換は、別のＦｃドメインのＹ３４９Ｃ置換とジスルフィド結合を形成する（配列番号１６３、以下で説明）。配列番号１６２中のＦｃドメインは、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔ置換を有する。
【０１０２】
第二ポリペプチド、すなわち抗ＢＣＭＡ  ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃと、第四ポリペプチド、すなわち抗ＢＣＭＡ−全ＬＣは、第二ＢＣＭＡ結合Ｆａｂ断片を形成する。抗ＢＣＭＡ  ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃは、重鎖可変ドメイン（配列番号１４８）及びＣＨ１ドメインを含む重鎖部分を備え、ただし重鎖可変ドメインはＣＨ１ドメインと接続されており、ＣＨ１ドメインはＦｃドメインと接続されている。抗ＢＣＭＡ−全ＬＣは、軽鎖可変ドメイン（配列番号１５２）及び軽鎖定常ドメインを含む軽鎖部分を備える。
抗ＢＣＭＡＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ
【化３】
2021533169.tif 000005
【０１０３】
配列番号１６３は、第二抗ＢＣＭＡ  Ｆａｂ断片の重鎖部分を表し、重鎖部分は、ＢＣＭＡ結合部位の重鎖可変ドメイン（配列番号１４８）及びＣＨ１ドメインを含み、Ｆｃドメイン（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）と接続されている。配列番号１６３のＦｃドメインは、Ｙ３４９Ｃ置換を有し、この置換は、ＮＫＧ２Ｄ結合ｓｃＦｖ（配列番号１６２）と連結されたＦｃのＣＨ３ドメインのＳ３５４Ｃ置換とジスルフィド結合を形成する。配列番号１６３中、Ｆｃドメインは、Ｋ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗ置換も有する。
【０１０４】
配列番号１６５は、ＢＣＭＡ結合部位の軽鎖可変ドメイン（配列番号１５２）及び軽鎖定常ドメインを含むＦａｂ断片の軽鎖部分を表す。
抗ＢＣＭＡ−全ＬＣ
【化４】
2021533169.tif 000006
【０１０５】
例示の実施形態において、ＮＫＧ２Ｄ結合ｓｃＦｖ断片と連結されているＦｃドメインは、Ｋ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗという変異を有し、ＢＣＭＡ  Ｆａｂ断片と連結されているＦｃドメインは、ヘテロ二量体を形成するために一致する変異Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔを有する。
【０１０６】
例示の実施形態において、ＮＫＧ２Ｄ結合ｓｃＦｖ断片と連結されているＦｃドメインは、ＣＨ３ドメインにＹ３４９Ｃ置換を有し、これは、ＢＣＭＡ結合Ｆａｂ断片と連結されているＦｃのＳ３５４Ｃ置換とジスルフィド結合を形成する。
【０１０７】
Ｆ３  ＴｒｉＮＫＥＴは、３つのペプチド、第一免疫グロブリン重鎖、第二免疫グロブリン重鎖、及び免疫グロブリン軽鎖を備えるヘテロ二量体型多重特異性抗体である（図２）。第一免疫グロブリン重鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖ及び第一Ｆｃ（ＣＨ２−ＣＨ３）ドメインを備え、ただし、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖは、リンカーまたはヒンジいずれかを介して第一Ｆｃと連結されている（図２）。第二免疫グロブリン重鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ＶＨ−ＣＨ１）ドメイン及び第二Ｆｃ（ＣＨ２−ＣＨ３）ドメインを備え、ただし、第二Ｆｃドメインは、そのＮ末端でリンカーまたはヒンジいずれかを介して（ＶＨ−ＣＨ１）ドメインと連結されており、ただし、（ＶＨ−ＣＨ１）ドメインは、軽鎖と対形成してＢＣＭＡに結合するＦａｂを形成する（図２）。「ＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ３−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡ」と呼ばれるＴｒｉＮＫＥＴは、図２に描かれるＴｒｉＮＫＥＴを示すことができる。本開示のＴｒｉＮＫＥＴの別の例は、ＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ３−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡであり、その配列は以下に記載される（ＣＤＲ（Ｋａｂａｔ番号付）は、下線が付してある）。
【０１０８】
ＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ３−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡの例は、重鎖可変ドメイン（配列番号１４８）及びＣＨ１ドメインを含む重鎖部分と、軽鎖可変ドメイン（配列番号１５２）及び軽鎖定常ドメインを含む軽鎖部分とを備えるＢＣＭＡ結合Ｆａｂ断片を備え、ただし、重鎖可変ドメインはＣＨ１ドメインに接続されており、ＣＨ１ドメインはＦｃドメインに接続されている。ＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ３−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡは、Ｆｃドメインと連結したＮＫＧ２Ｄ結合ｓｃＦｖ（配列番号１６６）も含む。配列番号１６３は、図２に描かれるとおりのＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ３−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡの第二免疫グロブリン重鎖の例を表し、この例は、抗ＢＣＭＡＦａｂ断片の重鎖部分を備え、この重鎖部分は、ＢＣＭＡ結合部位の重鎖可変ドメイン（配列番号１４８）及びＣＨ１ドメインを含み、Ｆｃドメインと接続されている。配列番号１６３中のＦｃドメインは、Ｙ３４９Ｃ置換を有し、この置換は、ＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ３−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡを形成するために、ＮＫＧ２Ｄ結合ｓｃＦｖ（配列番号１６６）と連結されたＦｃのＣＨ３ドメインのＳ３５４Ｃ置換とジスルフィド結合を形成する。配列番号１６３中、Ｆｃドメインは、Ｋ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗ置換も有する。
【０１０９】
ＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ３−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡの第一免疫グロブリン重鎖の例において、ＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ３−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡのｓｃＦｖは、（Ｇ４Ｓ）４リンカー（配列番号１６４）で重鎖可変ドメインと接続されたＮＫＧ２Ｄ結合部位の軽鎖可変ドメインを備え（（ＶＬ（Ｇ４Ｓ）４ＶＨ）で表され）、これは、Ｆｃドメインと連結されている。ＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ３−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡ中、ｓｃＦｖ（配列番号１６１）の軽鎖及び重鎖可変ドメインは、ＶＬ−（Ｇ４Ｓ）４−ＶＨとして接続されており；ＶＬ及びＶＨは、１００ＶＬ−４４ＶＨのＳ−Ｓ架橋を有し（それぞれＧ１００Ｃ及びＧ４４Ｃ置換から生じる）（システイン残基は、太字−斜体−下線付）；及びＶＨは、Ａｌａ−Ｓｅｒを介してＦｃドメインと接続されている。
【０１１０】
配列番号１６６は、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインと連結されているＮＫＧ２Ｄ結合ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ−Ｆｃ）の全長配列を表す。ｓｃＦｖと連結されているＦｃドメインは、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔ置換を有する。
Ｆ３−ＮＫＧ２Ｄ結合ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＡＪ鎖Ｂ［ＶＬ（Ｇ４Ｓ）４ＶＨ）］
【化５】
2021533169.tif 000007
【０１１１】
ＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ３−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡの例示の実施形態において、ＮＫＧ２Ｄ結合ｓｃＦｖ断片と連結された第一免疫グロブリン重鎖のＦｃドメインは、Ｋ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗという変異を有し、ＢＣＭＡＦａｂ断片と連結された第二免疫グロブリン重鎖のＦｃドメインは、ヘテロ二量体を形成するために一致する変異Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔを有する。
【０１１２】
ＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ３−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡの例示の実施形態において、ＮＫＧ２Ｄ結合ｓｃＦｖ断片と連結された第一免疫グロブリン重鎖のＦｃドメインは、ＣＨ３ドメインにＹ３４９Ｃ置換を有し、この置換が、ＢＣＭＡ結合Ｆａｂ断片と連結された第二免疫グロブリン重鎖のＦｃドメインのＳ３５４Ｃ置換とジスルフィド結合を形成する。
【０１１３】
多重特異性結合タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄ受容体発現細胞と結合することができ、そのような細胞として、ＮＫ細胞、γδＴ細胞、及びＣＤ８＋αβＴ細胞を挙げることができるが、これらに限定されない。ＮＫＧ２Ｄ結合に際して、多重特異性結合タンパク質は、ＵＬＢＰ６及びＭＩＣＡなどの天然リガンドが、ＮＫＧ２Ｄと結合してＮＫＧ２Ｄ受容体を活性化するのをブロックする可能性がある。
【０１１４】
多重特異性結合タンパク質は、ＣＤ１６、すなわち白血球表面のＦｃ受容体を発現する細胞と結合し、そのような細胞として、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、肥満細胞、濾胞樹状細胞が挙げられる。
【０１１５】
本開示のタンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに、１０ｎＭ以下、例えば、約１０ｎＭ、約９ｎＭ、約８ｎＭ、約７ｎＭ、約６ｎＭ、約５ｎＭ、約４．５ｎＭ、約４ｎＭ、約３．５ｎＭ、約３ｎＭ、約２．５ｎＭ、約２ｎＭ、約１．５ｎＭ、約１ｎＭ、約０．５ｎＭ〜約１ｎＭ、約１ｎＭ〜約２ｎＭ、約２ｎＭ〜３ｎＭ、約３ｎＭ〜４ｎＭ、約４ｎＭ〜約５ｎＭ、約５ｎＭ〜約６ｎＭ、約６ｎＭ〜約７ｎＭ、約７ｎＭ〜約８ｎＭ、約８ｎＭ〜約９ｎＭ、約９ｎＭ〜約１０ｎＭ、約１ｎＭ〜約１０ｎＭ、約２ｎＭ〜約１０ｎＭ、約３ｎＭ〜約１０ｎＭ、約４ｎＭ〜約１０ｎＭ、約５ｎＭ〜約１０ｎＭ、約６ｎＭ〜約１０ｎＭ、約７ｎＭ〜約１０ｎＭ、または約８ｎＭ〜約１０ｎＭのＫＤの親和性で結合する。
【０１１６】
ナチュラルキラー細胞のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体、ならびにがん細胞の腫瘍関連抗原との結合に際して、多重特異性結合タンパク質は、１種より多いＮＫ活性化受容体と係合することができ、天然リガンドがＮＫＧ２Ｄに結合するのをブロックする可能性がある。ある特定の実施形態において、タンパク質は、ヒトにおいてＮＫ細胞をアゴナイズすることができる。実施形態によっては、タンパク質はヒトにおいてならびに他の種、例えば、齧歯類及びカニクイザルにおいて、ＮＫ細胞をアゴナイズすることができる。
【０１１７】
細胞傷害性Ｔ細胞のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体、ならびにがん細胞の腫瘍関連抗原との結合に際して、多重特異性結合タンパク質は、１種より多い活性化受容体と係合することができ、天然リガンドがＮＫＧ２Ｄに結合するのをブロックする可能性がある。ある特定の実施形態において、タンパク質は、ヒトにおいて細胞傷害性Ｔ細胞をアゴナイズすることができる。実施形態によっては、タンパク質はヒトにおいてならびに他の種、例えば、齧歯類及びカニクイザルにおいて、細胞傷害性Ｔ細胞をアゴナイズすることができる。
【０１１８】
ＮＫＧ２Ｄ結合部位
表１は、組み合わせることで、ＮＫＧ２Ｄと結合することができる重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインのペプチド配列を列挙する。実施形態によっては、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、Ｆａｂ様式で配列される。実施形態によっては、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、互いに融合してｓｃＦｖを形成する。
【０１１９】
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは、ＮＫＧ２Ｄに対する結合親和性が様々に異なる可能性があるが、それにかかわらず、これらのドメインは、ＮＫＧ２Ｄ発現細胞、例えば、ＮＫ細胞及び細胞傷害性Ｔ細胞を活性化することができる。
【０１２０】
特に記載がない限り、表１に提示されるＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔ式で特定されている。
【表１】
2021533169.tif 000008
2021533169.tif 000009
2021533169.tif 000010
2021533169.tif 000011
2021533169.tif 000012
2021533169.tif 000013
2021533169.tif 000014
2021533169.tif 000015
2021533169.tif 000016
2021533169.tif 000017
2021533169.tif 000018
2021533169.tif 000019
2021533169.tif 000020
【０１２１】
あるいは、ＵＳ９，２７３，１３６で解説されるとおり、配列番号１１０で表される重鎖可変ドメインは、配列番号１１１で表される軽鎖可変ドメインと対形成して、ＮＫＧ２Ｄに結合することができる抗原結合部位を形成することができる。
配列番号１１０
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＦＩＲＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＤＲＧＬＧＤＧＴＹＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号１１１
ＱＳＡＬＴＱＰＡＳＶＳＧＳＰＧＱＳＩＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＡＶＮＷＹＱＱＬＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＤＤＬＬＰＳＧＶＳＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＦＬＡＩＳＧＬＱＳＥＤＥＡＤＹＹＣＡＡＷＤＤＳＬＮＧＰＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
【０１２２】
あるいは、ＵＳ７，８７９，９８５で解説されるとおり、配列番号１１２で表される重鎖可変ドメインは、配列番号１１３で表される軽鎖可変ドメインと対形成して、ＮＫＧ２Ｄに結合することができる抗原結合部位を形成することができる。
配列番号１１２
ＱＶＨＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＤＤＳＩＳＳＹＹＷＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＨＩＳＹＳＧＳＡＮＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＮＷＤＤＡＦＮＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
配列番号１１３
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
【０１２３】
腫瘍関連抗原結合部位
本開示は、ＢＣＭＡ結合部位を提供し、部位中、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン。実施形態によっては、ＢＣＭＡ結合部位は、ヒンジを介して、抗体ＦｃドメインもしくはＣＤ１６に結合するのに十分なその一部分、または本明細書中開示されるタンパク質のＣＤ１６に結合する抗原結合部位と連結されている。本明細書中開示されるタンパク質は、ＢＣＭＡの一価または二価の係合を提供することができ、１つまたは２つのＢＣＭＡ結合部位を有することができる。実施形態によっては、本明細書中開示されるタンパク質は、２つのＢＣＭＡ結合部位を有し、それぞれが、ヒンジを介して、抗体ＦｃドメインもしくはＣＤ１６に結合するのに十分なその一部分、または本明細書中開示されるタンパク質のＣＤ１６に結合する抗原結合部位と連結されている。
【０１２４】
表２に、組み合わせることで、ＢＣＭＡに結合することができる重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインのペプチド配列をまとめる。
【表２】
2021533169.tif 000021
2021533169.tif 000022
2021533169.tif 000023
【０１２５】
あるいは、ＢＣＭＡ結合ドメインは、以下で８３Ａ１０及びＭＡＢ４２に列挙されるとおり重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを備えていることができる。
８３Ａ１０重鎖可変ドメイン（配列番号１５７）：
【化６】
2021533169.tif 000024
８３Ａ１０軽鎖可変ドメイン（配列番号１５８）：
【化７】
2021533169.tif 000025
【０１２６】
あるいは、配列番号１５６により定義されるアミノ酸配列との結合についてスクリーニングすることにより、ＢＣＭＡに結合することができる新規抗原結合部位を同定することができる。
配列番号１５６
ＭＬＱＭＡＧＱＣＳＱＮＥＹＦＤＳＬＬＨＡＣＩＰＣＱＬＲＣＳＳＮＴＰＰＬＴＣＱＲＹＣＮＡＳＶＴＮＳＶＫＧＴＮＡＩＬＷＴＣＬＧＬＳＬＩＩＳＬＡＶＦＶＬＭＦＬＬＲＫＩＮＳＥＰＬＫＤＥＦＫＮＴＧＳＧＬＬＧＭＡＮＩＤＬＥＫＳＲＴＧＤＥＩＩＬＰＲＧＬＥＹＴＶＥＥＣＴＣＥＤＣＩＫＳＫＰＫＶＤＳＤＨＣＦＰＬＰＡＭＥＥＧＡＴＩＬＶＴＴＫＴＮＤＹＣＫＳＬＰＡＡＬＳＡＴＥＩＥＫＳＩＳＡＲ
【０１２７】
Ｆｃドメイン内で、ＣＤ１６結合は、ヒンジ領域及びＣＨ２ドメインを介して行われる。例えば、ヒトＩｇＧ１内では、ＣＤ１６との相互作用は、主に、アミノ酸残基Ａｓｐ２６５−Ｇｌｕ２６９、Ａｓｎ２９７−Ｔｈｒ２９９、Ａｌａ３２７−Ｉｌｅ３３２、Ｌｅｕ２３４−Ｓｅｒ２３９、及びＣＨ２ドメインの炭水化物残基Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを中心としている（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ４０６  （６７９３）：２６７−２７３を参照）。既知のドメインに基づいて、ファージディスプレイライブラリーまたは酵母菌表面ディスプレイｃＤＮＡライブラリーを用いることによるなどして、ＣＤ１６に対する結合親和性を向上または低下させるように変異を選択することができ、あるいは、相互作用の既知の三次元構造に基づいて変異を設計することができる。
【０１２８】
ヘテロ二量体型抗体重鎖のアセンブリは、同一細胞中で２種の異なる抗体重鎖配列を発現させることにより達成することができる。２種の異なる抗体重鎖配列は、ヘテロ二量体のアセンブリだけでなく、各抗体重鎖のホモ二量体のアセンブリも招く可能性がある。ヘテロ二量体の優先的なアセンブリは、ＵＳ１３／４９４８７０、ＵＳ１６／０２８８５０、ＵＳ１１／５３３７０９、ＵＳ１２／８７５０１５、ＵＳ１３／２８９９３４、ＵＳ１４／７７３４１８、ＵＳ１２／８１１２０７、ＵＳ１３／８６６７５６、ＵＳ１４／６４７４８０、及びＵＳ１４／８３０３３６に示されるとおり、各抗体重鎖定常領域のＣＨ３ドメインに異なる変異を組み込むことにより促進することができる。例えば、ヒトＩｇＧ１に基づいてＣＨ３ドメインに変異を生じさせ、第一ポリペプチド及び第二ポリペプチド内に、明確に異なる対のアミノ酸置換を組み込むことで、それら２本の鎖が互いに選択的にヘテロ二量体化するようになることが可能である。以下に例示するアミノ酸置換の位置は全て、Ｋａｂａｔ式と同様にＥＵインデックスに従って番号付した。
【０１２９】
１つの筋書きにおいて、第一ポリペプチドのアミノ酸置換は、元来のアミノ酸を、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、またはトリプトファン（Ｗ）から選択されるそれより大きなアミノ酸で置き換え、及び第二ポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸置換は、元来のアミノ酸（複数可）を、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、またはバリン（Ｖ）から選択されるそれより小さなアミノ酸（複数可）で置き換えて、より大きなアミノ酸置換（隆起）がより小さなアミノ酸置換（空洞）の表面に一致するようにする。例えば、一方のポリペプチドは、Ｔ３６６Ｗ置換を組み込むことができ、他方は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含む置換を組み込むことができる。
【０１３０】
本発明の抗体重鎖可変ドメインは、任意選択で、抗体定常領域、例えば、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを備えＣＨ１ドメインは含むまたは含まないＩｇＧ定常領域と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列とカップリングさせることができる。実施形態によっては、定常領域のアミノ酸配列は、ヒト抗体定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ１定常領域、ＩｇＧ２定常領域、ＩｇＧ３定常領域、またはＩｇＧ４定常領域と少なくとも９０％同一である。いくつかの他の実施形態において、定常領域のアミノ酸配列は、別の哺乳類、例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、またはウマ由来の抗体定常領域と少なくとも９０％同一である。１つまたは複数の変異を、ヒトＩｇＧ１定常領域と比較として、例えば、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１、及び／またはＫ４３９において、定常領域に組み込むことができる。置換の例として、例えば、Ｑ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｔ３９４Ｗ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９Ｄ、及びＫ４３９Ｅが挙げられる。
【０１３１】
ある特定の実施形態において、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣＨ１に組み込み可能な変異は、アミノ酸Ｖ１２５、Ｆ１２６、Ｐ１２７、Ｔ１３５、Ｔ１３９、Ａ１４０、Ｆ１７０、Ｐ１７１、及び／またはＶ１７３における変異である場合がある。ある特定の実施形態において、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣκに組み込み可能な変異は、アミノ酸Ｅ１２３、Ｆ１１６、Ｓ１７６、Ｖ１６３、Ｓ１７４、及び／またはＴ１６４における変異である場合がある。
【０１３２】
アミノ酸置換は、表３に示す以下の置換セットから選択することができる。
【表３】
2021533169.tif 000026
【０１３３】
あるいは、アミノ酸置換は、表４に示す以下の置換セットから選択することができる。
【表４】
2021533169.tif 000027
【０１３４】
あるいは、アミノ酸置換は、表５に示す以下の置換セットから選択することができる。
【表５】
2021533169.tif 000028
【０１３５】
あるいは、各ポリペプチド鎖の少なくとも１つのアミノ酸置換は、表６から選択することができる。
【表６】
2021533169.tif 000029
【０１３６】
あるいは、少なくとも１つのアミノ酸置換は、表７の以下の置換セットから選択することができ、ただし、第一ポリペプチド欄に示される位置（複数可）は、任意の既知の負に荷電したアミノ酸で置き換えられ、第二ポリペプチド欄に示される位置（複数可）は、任意の既知の正に荷電したアミノ酸で置き換えられる。
【表７】
2021533169.tif 000030
【０１３７】
あるいは、少なくとも１つのアミノ酸置換は、表８の以下のセットから選択することができ、ただし、第一ポリペプチド欄に示される位置（複数可）は、任意の既知の正に荷電したアミノ酸で置き換えられ、第二ポリペプチド欄に示される位置（複数可）は、任意の既知の負に荷電したアミノ酸で置き換えられる。
【表８】
2021533169.tif 000031
【０１３８】
あるいは、アミノ酸置換は、表９の以下のセットから選択することができる。
【表９】
2021533169.tif 000032
【０１３９】
あるいは、またはそれに加えて、ヘテロ多量体型タンパク質の構造安定性は、第一ポリペプチド鎖または第二ポリペプチド鎖いずれかにＳ３５４Ｃを導入し、及び反対のポリペプチド鎖にＹ３４９Ｃを導入することにより上昇させることができ、これらの置換は、２つのポリペプチドの界面間に人為的ジスルフィド架橋を形成する。
【０１４０】
実施形態によっては、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、位置Ｔ３６６で異なっており、その場合、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３６６、Ｌ３６８、及びＹ４０７からなる群より選択される１つまたは複数の位置で異なっている。
【０１４１】
実施形態によっては、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３６６、Ｌ３６８、及びＹ４０７からなる群より選択される１つまたは複数の位置で異なっており、その場合、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、位置Ｔ３６６で異なっている。
【０１４２】
実施形態によっては、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５、及びＴ４１１からなる群より選択される１つまたは複数の位置で異なっており、その場合、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｙ３４９、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５、及びＴ４１１からなる群より選択される１つまたは複数の位置で異なっている。
【０１４３】
実施形態によっては、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｙ３４９、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５、及びＴ４１１からなる群より選択される１つまたは複数の位置で異なっており、その場合、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５、及びＴ４１１からなる群より選択される１つまたは複数の位置で異なっている。
【０１４４】
実施形態によっては、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｌ３５１、Ｄ３９９、Ｓ４００、及びＹ４０７からなる群より選択される１つまたは複数の位置で異なっており、その場合、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３６６、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｋ４０９、及びＴ４１１からなる群より選択される１つまたは複数の位置で異なっている。
【０１４５】
実施形態によっては、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３６６、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｋ４０９、及びＴ４１１からなる群より選択される１つまたは複数の位置で異なっており、その場合、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｌ３５１、Ｄ３９９、Ｓ４００、及びＹ４０７からなる群より選択される１つまたは複数の位置で異なっている。
【０１４６】
実施形態によっては、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｋ３６０、及びＫ４０９からなる群より選択される１つまたは複数の位置で異なっており、その場合、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｑ３４７、Ｅ３５７、Ｄ３９９、及びＦ４０５からなる群より選択される１つまたは複数の位置で異なっている。
【０１４７】
実施形態によっては、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｑ３４７、Ｅ３５７、Ｄ３９９、及びＦ４０５からなる群より選択される１つまたは複数の位置で異なっており、その場合、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｙ３４９、Ｋ３６０、Ｑ３４７、及びＫ４０９からなる群より選択される１つまたは複数の位置で異なっている。
【０１４８】
実施形態によっては、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｋ４０９、及びＫ４３９からなる群より選択される１つまたは複数の位置で異なっており、その場合、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｄ３５６、Ｅ３５７、及びＤ３９９からなる群より選択される１つまたは複数の位置で異なっている。
【０１４９】
実施形態によっては、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｄ３５６、Ｅ３５７、及びＤ３９９からなる群より選択される１つまたは複数の位置で異なっており、その場合、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｋ４０９、及びＫ４３９からなる群より選択される１つまたは複数の位置で異なっている。
【０１５０】
実施形態によっては、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｌ３５１、Ｅ３５６、Ｔ３６６、及びＤ３９９からなる群より選択される１つまたは複数の位置で異なっており、その場合、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｌ３６８、Ｋ３９２、及びＫ４０９からなる群より選択される１つまたは複数の位置で異なっている。
【０１５１】
実施形態によっては、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｌ３６８、Ｋ３９２、及びＫ４０９からなる群より選択される１つまたは複数の位置で異なっており、その場合、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｌ３５１、Ｅ３５６、Ｔ３６６、及びＤ３９９からなる群より選択される１つまたは複数の位置で異なっている。
【０１５２】
実施形態によっては、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｓ３５４Ｃ置換により異なっており、その場合、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｙ３４９Ｃ置換により異なっている。
【０１５３】
実施形態によっては、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｙ３４９Ｃ置換により異なっており、その場合、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｓ３５４Ｃ置換により異なっている。
【０１５４】
実施形態によっては、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｋ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗ置換により異なっており、その場合、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｏ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔ置換により異なっている。
【０１５５】
実施形態によっては、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｏ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔ置換により異なっており、その場合、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｋ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗ置換により異なっている。
【０１５６】
実施形態によっては、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３６６Ｗ置換により異なっており、その場合、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換により異なっている。
【０１５７】
実施形態によっては、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換により異なっており、その場合、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３６６Ｗ置換により異なっている。
【０１５８】
実施形態によっては、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換により異なっており、その場合、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、及びＴ３９４Ｗ置換により異なっている。
【０１５９】
実施形態によっては、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、及びＴ３９４Ｗ置換により異なっており、その場合、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換により異なっている。
【０１６０】
上記の多重特異性タンパク質は、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術を用いて作製可能である。例えば、第一免疫グロブリン重鎖をコードする第一核酸配列を、第一発現ベクターにクローン導入することができ、第二免疫グロブリン重鎖をコードする第二核酸配列を、第二発現ベクターにクローン導入することができ、免疫グロブリン軽鎖をコードする第三核酸配列を、第三発現ベクターにクローン導入することができ、第一、第二、及び第三発現ベクターを、まとめて宿主細胞に安定的に遺伝子導入して多量体タンパク質を産生させることができる。
【０１６１】
多重特異性タンパク質の最高収率を達成するため、様々な比率の第一、第二、及び第三発現ベクターを調査して、宿主細胞への遺伝子導入に最適な比を特定することができる。遺伝子導入後、当該分野で既知である方法、例えば、限界希釈、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、顕微鏡、またはＣｌｏｎｅｐｉｘなどを用いて、細胞バンク生成用に単一クローンを単離することができる。
【０１６２】
クローンは、バイオリアクターの規模拡大に適切な条件下で培養することができ、多重特異性タンパク質の発現を維持させることができる。多重特異性タンパク質は、当該分野で既知である方法を用いて、単離精製することができ、そのような方法として、遠心、デプス濾過、細胞溶解、均質化、凍結融解、親和性精製、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水的相互作用交換クロマトグラフィー、及びミックスモードクロマトグラフィーが挙げられる。
【０１６３】
ＩＩ．多重特異性タンパク質の特性決定
本開示の多重特異性結合タンパク質（例えば、ＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡまたはＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ３−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡ）は、ＮＫＧ２Ｄ結合ｓｃＦＶ及びＢＣＭＡ結合ドメインを備えるものであるが、これらは腫瘍成長の低下及びがん細胞の殺傷により有効である。例えば、ＢＣＭＡ発現腫瘍／がん細胞を標的とする本開示の多重特異性結合タンパク質は、抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体ＭＡＢ４２よりも有効である。本開示のＴｒｉＮＫＥＴ、ＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡは、ＢＣＭＡを発現するヒトがん細胞株のＮＫ介在細胞溶解を促進するのに、抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体ＭＡＢ４２よりも有効である。
【０１６４】
ＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡは、ＮＫＧ２Ｄを発現する細胞に対して弱い結合を示す。しかしながら、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを備える本明細書中記載される多重特異性結合タンパク質（例えば、ＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡまたはＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ３−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡ）は、ＭＡＢ４２抗ＢＣＭＡ  ｍＡｂに比べて、効力及び標的細胞の最大溶解において顕著な有利性を示す。
【０１６５】
したがって、モノクローナル抗体に比べて、本明細書中記載される多重特異性結合タンパク質（例えば、ＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡまたはＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ３−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡ）は、ＢＣＭＡ発現がんの治療に有利である。
【０１６６】
ＩＩＩ．治療用途
本明細書中開示されるタンパク質は、細胞傷害性Ｔ細胞またはナチュラルキラー細胞を活性化するのに使用することができる。実施形態によっては、本明細書中提供されるのは、細胞傷害性Ｔ細胞を、本明細書中開示されるタンパク質と接触させることによる、細胞傷害性Ｔ細胞の活性化法である。実施形態によっては、本明細書中提供されるのは、ナチュラルキラー細胞を、本明細書中開示されるタンパク質と接触させることによる、ナチュラルキラー細胞の活性化法である。
【０１６７】
したがって、本明細書中提供されるのは、細胞傷害性Ｔ細胞またはナチュラルキラー細胞の存在下、腫瘍細胞を、本明細書中開示されるタンパク質と接触させることによる、腫瘍細胞死の増大法である。実施形態によっては、本明細書中提供されるのは、細胞傷害性Ｔ細胞の存在下、腫瘍細胞を、本明細書中開示されるタンパク質と接触させることによる、腫瘍細胞死の増大法である。実施形態によっては、本明細書中提供されるのは、ナチュラルキラー細胞の存在下、腫瘍細胞を、本明細書中開示されるタンパク質と接触させることによる、腫瘍細胞死の増大法である。
【０１６８】
同じく本明細書中提供されるのは、対象に、本明細書中開示されるタンパク質または本明細書中開示される配合物を投与することによる、対象におけるＢＣＭＡ発現がん細胞に対する免疫応答の増大法である。
【０１６９】
本発明は、本明細書中記載される多重特異性結合タンパク質及び／または本明細書中記載される医薬組成物を用いたがんの治療法を提供する。本方法は、治療を必要としている患者に、本明細書中記載される多重特異性結合タンパク質を治療上有効量で投与することにより、様々ながんの治療に使用可能である。実施形態によっては、本明細書中開示されるタンパク質により治療可能ながんは、ＢＣＭＡを発現する。
【０１７０】
治療法は、治療しようとするがんに応じた特徴を有することができる。例えば、ある特定の実施形態において、がんは、乳癌、卵巣癌、食道癌、膀胱癌、または胃癌、唾液管癌、唾液管癌（複数）、肺腺癌、または侵襲型の子宮癌、例えば、子宮漿液性子宮内膜癌などである。
【０１７１】
ある特定の他の実施形態において、本明細書中記載される多重特異性結合タンパク質及び／または本明細書中記載される医薬組成物により治療されるがんは、脳癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、白血病、肺癌、肝臓癌、黒色腫、卵巣癌、膵癌、直腸癌、腎癌、胃癌、精巣癌、または子宮癌である。さらに他の実施形態において、がんは、扁平上皮癌、腺癌、小細胞癌、黒色腫、神経芽細胞腫、肉腫（例えば、血管肉腫または軟骨肉腫）、咽頭癌、耳下腺癌、胆道癌、甲状腺癌、末端黒子型黒色腫、光線角化症、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、腺様嚢胞癌、腺腫、腺肉腫、腺扁平上皮癌、肛門管癌、肛門癌、肛門直腸癌、星細胞腫瘍、バルトリン腺癌、基底細胞癌、胆道癌、骨癌、骨髄癌、気管支癌、気管支腺癌、カルチノイド、胆管細胞癌、軟骨肉腫、脈絡叢乳頭腫／脈略叢癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、（腎）明細胞癌、結合組織癌、嚢胞腺腫、消化器系癌、十二指腸癌、内分泌系癌、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮内膜間質肉腫、類内膜腺癌、内皮細胞癌、脳室上衣癌（ｅｐｅｎｄｙｍａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、上皮細胞癌、ユーイング肉腫、目及び眼窩の癌、女性性器癌、限局性結節性過形成、胆嚢癌、胃噴門癌、胃底癌、ガストリノーマ、神経膠芽細胞腫、グルカゴノーマ、心臓癌、血管芽細胞腫、血管内皮腫、血管腫、肝腺腫、多発性肝腺腫（ｈｅｐａｔｉｃ  ａｄｅｎｏｍａｔｏｓｉｓ）、肝胆道癌、肝細胞癌、ホジキン病、回腸癌、インスリノーマ、上皮内腫瘍、上皮細胞間扁平細胞腫瘍（ｉｎｔｅｒｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ）、肝内胆管癌、浸潤扁平上皮癌、空腸癌、関節癌、カポジ肉腫、骨盤癌、大細胞癌、大腸癌、平滑筋肉腫、悪性黒子由来黒色腫、リンパ腫、男性性器癌、悪性黒色腫、悪性中皮腫、髄芽細胞腫、髄上皮腫、髄膜癌、中皮癌、転移性癌、口腔癌、粘表皮癌、多発性骨髄腫、筋肉癌、鼻腔癌、神経系癌、神経上皮腺癌（ｎｅｕｒｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、結節性黒色腫、非上皮性皮膚癌、非ホジキンリンパ腫、燕麦細胞癌、乏突起膠細胞癌、口腔癌、骨肉腫、乳頭漿液性腺癌、陰茎癌、咽頭癌、下垂体腫瘍、形質細胞種、偽肉腫、肺芽腫、直腸癌、腎細胞癌、呼吸器系癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、漿液性癌、副鼻腔癌、皮膚癌、小細胞癌、小腸癌、平滑筋癌、軟部組織癌、ソマトスタチン分泌腫瘍、脊椎癌、扁平上皮癌、横紋筋癌、中皮下癌（ｓｕｂｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、表在拡大型黒色腫、Ｔ細胞白血病、舌癌、未分化癌、尿管癌、尿道癌、膀胱癌、泌尿器系癌、子宮頚癌、子宮体癌、ぶどう膜黒色腫、膣癌、いぼ状癌、ビポーマ、外陰癌、高分化癌、またはウィルムス腫瘍である。
【０１７２】
ある特定の他の実施形態において、本明細書中記載される多重特異性結合タンパク質及び／または本明細書中記載される医薬組成物により治療されるがんは、非ホジキンリンパ腫、例えば、Ｂ細胞リンパ腫またはＴ細胞リンパ腫である。ある特定の実施形態において、非ホジキンリンパ腫は、Ｂ細胞リンパ腫、例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、または原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫である。ある特定の他の実施形態において、非ホジキンリンパ腫は、Ｔ細胞リンパ腫、例えば、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、節外性ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫、腸管症型Ｔ細胞リンパ腫、皮下脂肪組織炎様Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、または末梢性Ｔ細胞リンパ腫である。
【０１７３】
ある特定の実施形態において、本明細書中記載される多重特異性結合タンパク質及び／または本明細書中記載される医薬組成物により治療されるがんは、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）である。ある特定の実施形態において、ＤＬＢＣＬは、胚中心Ｂ細胞（ＧＣＢ）ＤＬＢＣＬである。ある特定の実施形態において、ＤＬＢＣＬは、活性化Ｂ細胞（ＡＢＣ）ＤＬＢＣＬである。
【０１７４】
ある特定の実施形態において、本明細書中記載される多重特異性結合タンパク質及び／または本明細書中記載される医薬組成物により治療されるがんは、多発性骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、または急性骨髄性白血病である。ある特定の実施形態において、がんは、多発性骨髄腫である。ある特定の実施形態において、がんは、慢性リンパ性白血病である。ある特定の実施形態において、がんは、急性骨髄性白血病である。
【０１７５】
治療されるがんは、がん細胞の表面で発現する特定抗原の存在により特性決定可能である。ある特定の実施形態において、がん細胞は、ＢＣＭＡの他に、以下のうち１種または複数を発現する可能性がある：ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＥＧＦＲ／ＥＲＢＢ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＨＥＲ３／ＥＲＢＢ３、ＨＥＲ４／ＥＲＢＢ４、ＭＵＣ１、ｃＭＥＴ、ＳＬＡＭＦ７、ＰＳＣＡ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＣＴＬＡ４、及びＰＤ１。
【０１７６】
ＩＶ．併用療法
本発明の別の態様は、併用療法を提供する。本明細書中記載される多重特異性結合タンパク質は、がんを治療する追加治療薬と併用することができる。
【０１７７】
がん治療の併用療法の一部として使用可能な治療薬の例として、例えば、放射線照射、マイトマイシン、トレチノイン、リボムスチン（ｒｉｂｏｍｕｓｔｉｎ）、ゲムシタビン、ビンクリスチン、エトポシド、クラドリビン、ミトブロニトール、メトトレキサート、ドキソルビシン、カルボコン、ペントスタチン、ニトラクリン、ジノスタチン、セトロレリクス、レトロゾール、ラルチトレキセド、ダウノルビシン、ファドロゾール、ホテムスチン、サイマルファシン、ソブゾキサン、ネダプラチン、シタラビン、ビカルタミド、ビノレルビン、ベスナリノン、アミノグルテチミド、アムサクリン、プログルミド、エリプチニウム酢酸塩、ケタンセリン、ドキシフルリジン、エトレチナート、イソトレチノイン、ストレプトゾシン、ニムスチン、ビンデシン、フルタミド、ドロゲニル、ブトシン（ｂｕｔｏｃｉｎ）、カルモフル、ラゾキサン、シゾフィラン、カルボプラチン、ミトラクトール、テガフール、イホスファミド、プレドニムスチン、ピシバニール、レバミソール、テニポシド、インプロスルファン、エノシタビン、リスリド、オキシメトロン、タモキシフェン、プロゲステロン、メピチオスタン、エピチオスタノール、ホルメスタン、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−２アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）、コロニー刺激因子１、コロニー刺激因子２、デニロイキンジフチトクス、インターロイキン２、黄体形成ホルモン放出因子、及び同族受容体に対する結合に差を示す、または血清半減期の増加もしくは減少を示す可能性がある上記作用剤の変種が挙げられる。
【０１７８】
ある種のがん、例えば、多発性骨髄腫の場合、追加治療薬として、レナリドミド、ポマリドミド、サリドマイド、ボルテゾミブ、デキサメタゾン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、カルフィルゾミブ、イキサゾミブ、シスプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、抗ＣＤ３８抗体、例えば、ダラツムマブ、パノビノスタット、及びエロツズマブのうち１種または複数が可能であり、これらは単独で、上記の組み合わせのうちの１つにおいて、または任意の他の組み合わせで、追加される。
【０１７９】
がん治療の併用療法の一部として使用可能な作用剤のさらなるクラスは、免疫チェックポイント阻害剤である。免疫チェックポイント阻害剤の例として、（ｉ）細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）、（ｉｉ）プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）、（ｉｉｉ）ＰＤＬ１、（ｉｖ）ＬＡＧ３、（ｖ）Ｂ７−Ｈ３、（ｖｉ）Ｂ７−Ｈ４、及び（ｖｉｉ）ＴＩＭ３のうち１種または複数を阻害する作用剤が挙げられる。ＣＴＬＡ４阻害剤イピリムマブは、米国食品医薬品局により、黒色腫の治療用に承認されている。
【０１８０】
がん治療の併用療法の一部として使用可能なさらに他の作用剤は、非チェックポイント標的を標的とするモノクローナル抗体作用剤（例えば、ハーセプチン）、及び非細胞傷害性剤（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤）である。
【０１８１】
抗がん剤のさらに他のカテゴリとして、例えば、（ｉ）ＡＬＫ阻害剤、ＡＴＲ阻害剤、Ａ２Ａアンタゴニスト、塩基除去修復阻害剤、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害剤、ブルトンチロシンキナーゼ阻害剤、ＣＤＣ７阻害剤、ＣＨＫ１阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤、ＤＮＡ−ＰＫ及びｍＴＯＲ両方の阻害剤、ＤＮＭＴ１阻害剤、ＤＮＭＴ１阻害剤＋２−クロロ−デオキシアデノシン、ＨＤＡＣ阻害剤、ヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤、ＩＤＯ阻害剤、ＪＡＫ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＭＥＬＫ阻害剤、ＭＴＨ１阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、ホスホイノシチド３−キナーゼ阻害剤、ＰＡＲＰ１及びＤＨＯＤＨ両方の阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、及びＷＥＥ１阻害剤から選択される阻害剤；（ｉｉ）ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＴＮＦＲＳＦ２５、またはＩＣＯＳのアゴニスト；ならびに（ｉｉｉ）ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＧ−ＣＳＦから選択されるサイトカイン、が挙げられる。
【０１８２】
本発明のタンパク質は、原発巣の外科的除去に対する補助としても使用可能である。
【０１８３】
多重特異性結合タンパク質及び追加治療薬の量及び投与の相対的なタイミングは、所望の併用治療効果を達成する目的で選択することができる。例えば、併用療法の投与を必要としている患者に併用療法を投与する場合、併用に含まれる治療薬、または治療薬を含む医薬組成物単数もしくは複数は、任意の順序で、例えば、順次、同時発生的に、一緒に、同時になどで投与することができる。さらに、例えば、多重特異性結合タンパク質を、追加の治療薬（複数可）がその予防効果もしくは治療効果を発揮している時間中に投与することができ、その逆もまたしかりである。
【０１８４】
Ｖ．医薬組成物
本開示は、本明細書中記載されるタンパク質を治療上有効量で含有する医薬組成物も特長とする。組成物は、様々な薬物送達系で使用されるように配合することができる。適切な配合物にするため、１種または複数の生理学的に許容される賦形剤またはキャリアも、組成物に含めることができる。本開示での使用に適切な配合物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  Ｐａ．，  １７ｔｈ  ｅｄ．，  １９８５で見られる。薬物送達法の簡単な総説については、例えば、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３，  １９９０）を参照。
【０１８５】
本開示の静脈内薬物送達配合物は、バッグ、ペン、またはシリンジに入れられている場合がある。ある特定の実施形態において、バッグには、管及び／または針を備えた導管が接続されている場合がある。ある特定の実施形態において、配合物は、凍結乾燥配合物または液状配合物である場合がある。ある特定の実施形態において、配合物は、凍結乾燥（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ））されていて、約１２〜６０本のバイアルに入れられている場合がある。ある特定の実施形態において、配合物は、凍結乾燥されている場合があり、凍結乾燥された配合物４５ｍｇが、１本のバイアルに入れられている場合がある。ある特定の実施形態において、凍結乾燥された配合物約４０ｍｇ〜約１００ｍｇが、１本のバイアルに入れられている場合がある。ある特定の実施形態において、凍結乾燥された配合物を、１２、２７、または４５本のバイアルから集約し、静脈内薬物配合物中に治療用量のタンパク質が含まれるようにする。ある特定の実施形態において、配合物は、液状配合物である場合があり、約２５０ｍｇ／バイアル〜約１０００ｍｇ／バイアルで貯蔵される場合がある。ある特定の実施形態において、配合物は、液状配合物であり、約６００ｍｇ／バイアルで貯蔵される場合がある。ある特定の実施形態において、配合物は、液状配合物であり、約２５０ｍｇ／バイアルで貯蔵される場合がある。
【０１８６】
タンパク質は、配合物を形成する緩衝液中に治療上有効量のタンパク質を含む水性液状医薬配合物として存在可能である。
【０１８７】
こうした組成物は、従来の滅菌技法により滅菌される場合もあれば、滅菌濾過される場合もある。得られる水溶液は、そのまま使用できるようにパッケージ化される場合もあれば、凍結乾燥される場合もあり、凍結乾燥製剤は、投与前に滅菌水性キャリアと混合される。製剤のｐＨは、典型的には、３〜１１、より好ましくは５〜９または６〜８、特に好ましくは７〜８、例えば７〜７．５となる。固形で得られる組成物は、複数の単回投薬単位でパッケージ化される場合があり、各単位は、上記作用剤単数または複数を固定された量で含有する。固形の組成物は、量に柔軟性を持たせるために容器に入れてパッケージ化することもできる。
【０１８８】
ある特定の実施形態において、本開示は、本開示のタンパク質を、マンニトール、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、リン酸二水素ナトリウム二水和物、塩化ナトリウム、ポリソルベート８０、水、及び水酸化ナトリウムと合わせて含む、保存可能期間の延長された配合物を提供する。
【０１８９】
ある特定の実施形態において、ｐＨ緩衝液中に本開示のタンパク質を含む水性配合物が調製される。本発明の緩衝剤は、約４〜約８、例えば、約４．５〜約６．０、または約４．８〜約５．５の範囲のｐＨを有する場合があり、あるいは約５．０〜約５．２のｐＨを有する場合がある。上記に列挙されるｐＨの中間範囲も、本開示の一部であることが意図される。例えば、上限及び／または下限として上記に列挙される値のいずれかの組み合わせを用いる値の範囲も、含まれることが意図される。この範囲内にｐＨを制御する緩衝剤の例として、酢酸塩（例えば、酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（例えば、コハク酸ナトリウム）、グルコン酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩、及び他の有機酸緩衝剤が挙げられる。
【０１９０】
ある特定の実施形態において、配合物は、ｐＨを約４〜約８の範囲に維持するためにクエン酸塩及びリン酸塩を含む緩衝剤系を含む。ある特定の実施形態において、ｐＨ範囲は、約４．５〜約６．０、または約ｐＨ４．８〜約５．５、または約５．０〜約５．２のｐＨ範囲である場合がある。ある特定の実施形態において、緩衝剤系は、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、及び／またはリン酸二水素ナトリウム二水和物を含む。ある特定の実施形態において、緩衝剤系は、クエン酸約１．３ｍｇ／ｍＬ（例えば、１．３０５ｍｇ／ｍＬ）、クエン酸ナトリウム約０．３ｍｇ／ｍＬ（例えば、０．３０５ｍｇ／ｍＬ）、リン酸二ナトリウム二水和物約１．５ｍｇ／ｍＬ（例えば、１．５３ｍｇ／ｍＬ）、リン酸二水素ナトリウム二水和物約０．９ｍｇ／ｍＬ（例えば、０．８６）、及び塩化ナトリウム約６．２ｍｇ／ｍＬ（例えば、６．１６５ｍｇ／ｍＬ）を含む。ある特定の実施形態において、緩衝剤系は、クエン酸１〜１．５ｍｇ／ｍＬ、クエン酸ナトリウム０．２５〜０．５ｍｇ／ｍＬ、リン酸二ナトリウム二水和物１．２５〜１．７５ｍｇ／ｍＬ、リン酸二水素ナトリウム二水和物、０．７〜１．１ｍｇ／ｍＬ、及び塩化ナトリウム６．０〜６．４ｍｇ／ｍＬを含む。ある特定の実施形態において、配合物のｐＨは、水酸化ナトリウムで調整される。
【０１９１】
ポリオールは、浸透圧調節剤（ｔｏｎｉｃｉｆｉｅｒ）として作用し、抗体を安定化させる可能性があるが、これもまた、配合物に含まれる場合がある。ポリオールは、配合物に望まれる等張性に関連して変化する可能性がある量で配合物に加えられる。ある特定の実施形態において、水性配合物は、等張性である場合がある。ポリオールの添加量は、ポリオールの分子量に関連して変更される場合もある。例えば、単糖類（例えば、マンニトール）は、二糖類（例えば、トレハロース）に比べて少ない量で加えられる可能性がある。ある特定の実施形態において、浸透圧調節剤として配合物に使用される可能性があるポリオールは、マンニトールである。ある特定の実施形態において、マンニトール濃度は、約５〜約２０ｍｇ／ｍＬの場合がある。ある特定の実施形態において、マンニトール濃度は、約７．５〜１５ｍｇ／ｍＬの場合がある。ある特定の実施形態において、マンニトール濃度は、約１０〜１４ｍｇ／ｍＬの場合がある。ある特定の実施形態において、マンニトール濃度は、約１２ｍｇ／ｍＬの場合がある。ある特定の実施形態において、ポリオールとしてソルビトールが配合物に含まれる場合がある。
【０１９２】
洗剤または界面活性剤も、配合物に添加される場合がある。洗剤の例として、非イオン性洗剤、例えば、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０など）またはポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）が挙げられる。洗剤の添加量は、配合された抗体の凝集を減少させる、及び／または配合物中の粒子形成を最小限にする、及び／または吸着を減少させるような量である。ある特定の実施形態において、配合物は、界面活性剤を含む場合があり、界面活性剤はポリソルベートである。ある特定の実施形態において、配合物は、洗剤としてポリソルベート８０またはＴｗｅｅｎ８０を含有する場合がある。Ｔｗｅｅｎ８０は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレアートを記載するのに使用される用語である（Ｆｉｅｄｌｅｒ，  Ｌｅｘｉｋｏｎ  ｄｅｒ  Ｈｉｆｓｓｔｏｆｆｅ，  Ｅｄｉｔｉｏ  Ｃａｎｔｏｒ  Ｖｅｒｌａｇ  Ａｕｌｅｎｄｏｒｆ，  ４ｔｈ  ｅｄ．，  １９９６を参照）。ある特定の実施形態において、配合物は、ポリソルベート８０を約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、または約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬで、含有する場合がある。ある特定の実施形態において、約０．１％のポリソルベート８０が、配合物に添加される場合がある。
【０１９３】
複数の実施形態において、本開示のタンパク質製品は、液状配合物として配合される。液状配合物は、ゴム栓でキャップされアルミニウム圧着シールで密閉されたＵＳＰ／Ｐｈ  ＥｕｒいずれかのＩ型５０Ｒバイアル中に１０ｍｇ／ｍＬ濃度で提供される場合がある。ゴム栓は、ＵＳＰ及びＰｈ  Ｅｕｒに準拠したエラストマー製である場合がある。ある特定の実施形態において、バイアルには、抽出可能な体積が６０ｍＬであるようにする目的で、タンパク質製品溶液が６１．２ｍＬ入れられている場合がある。ある特定の実施形態において、液状配合物は、０．９％生理食塩水で希釈されている場合がある。
【０１９４】
ある特定の実施形態において、本開示の液状配合物は、糖を安定化レベルで組み合わせて１０ｍｇ／ｍＬ濃度溶液として調製される場合がある。ある特定の実施形態において、液状配合物は、水性キャリア中に調製される。ある特定の実施形態において、安定剤が、静脈内投与に望ましくないまたは適切でない粘度をもたらす可能性がある量を超えない量で添加される場合がある。ある特定の実施形態において、糖は、二糖類、例えば、スクロースである場合がある。ある特定の実施形態において、液状配合物は、緩衝剤、界面活性剤、及び保存料のうち１種または複数も含む場合がある。
【０１９５】
ある特定の実施形態において、液状配合物のｐＨは、薬学上許容される酸及び／または塩基の添加により設定される場合がある。ある特定の実施形態において、薬学上許容される酸は、塩酸である場合がある。ある特定の実施形態において、塩基は、水酸化ナトリウムである場合がある。
【０１９６】
凝集の他に、脱アミド化も、ペプチド及びタンパク質に共通する産物変種であり、これは発酵、収穫／細胞清澄、精製、薬物質／薬産物貯蔵中に、及び試料分析中に生じる可能性がある。脱アミド化とは、タンパク質がＮＨ３を失ってスクシンイミド中間体を形成することであり、この中間体が加水分解を受ける可能性がある。スクシンイミド中間体は、親ペプチドから１７ダルトンの質量減少をもたらす。続く加水分解により、１８ダルトンの質量増加がもたらされる。スクシンイミド中間体は、水性条件下で不安定なため、単離することが困難である。そのため、脱アミド化は、典型的には、１ダルトンの質量増加として検出可能である。アスパラギンの脱アミド化は、アスパラギン酸またはイソアスパラギン酸いずれかをもたらす。脱アミド化速度に影響するパラメーターとして、ｐＨ、温度、溶媒、比誘電率、イオン強度、一次配列、局所ポリペプチド立体配座、及び立体構造が挙げられる。ペプチド鎖中のＡｓｎに隣接するアミノ酸残基は、脱アミド化速度に影響する。タンパク質配列中のＡｓｎに続くＧｌｙ及びＳｅｒは、脱アミド化の受けやすさを高める結果となる。
【０１９７】
ある特定の実施形態において、本開示の液状配合物は、タンパク質製品の脱アミノ化を防ぐｐＨ及び湿度条件下で保存される場合がある。
【０１９８】
本明細書中関心対象である水性キャリアとは、薬学上許容される（ヒトへの投与に関して安全かつ無毒）ものであり、かつ液状配合物の調製に有用であるものである。例示のキャリアとして、滅菌注射用水（ＳＷＦＩ）、静菌注射用水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝液（例えば、リン酸緩衝食塩水）、滅菌生理食塩水、リンガー液、またはブドウ糖液が挙げられる。
【０１９９】
保存料は、任意選択で、細菌作用を低減するために本明細書中の配合物に添加される場合がある。保存料の添加は、例えば、複数回使用（複数回用量）配合物の製造を促進する場合がある。
【０２００】
静脈内（ＩＶ）配合物は、特定の場合において、例えば、患者が入院しており移植後に全ての薬物をＩＶ経路で投与されている場合などにおいて好適な投与経路である場合がある。ある特定の実施形態において、液状配合物は、投与前に、０．９％塩化ナトリウム溶液で希釈される。ある特定の実施形態において、希釈された注射用製剤は、等張性であり静脈内注入による投与に適している。
【０２０１】
ある特定の実施形態において、塩または緩衝剤成分が、１０ｍＭ〜２００ｍＭの量で添加される場合がある。塩及び／または緩衝剤は、薬学上許容されるものであり、様々な既知の酸（無機及び有機）及び「塩基形成」金属またはアミンから派生する。ある特定の実施形態において、緩衝剤は、リン酸塩緩衝剤である場合がある。ある特定の実施形態において、緩衝剤は、グリシン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩緩衝剤である場合があり、その場合、ナトリウム、カリウム、またはアンモニウムイオンが、カウンターイオンとして機能することができる。
【０２０２】
保存料は、任意選択で、細菌作用を低減するために本明細書中の配合物に添加される場合がある。保存料の添加は、例えば、複数回使用（複数回用量）配合物の製造を促進する場合がある。
【０２０３】
本明細書中関心対象である水性キャリアとは、薬学上許容される（ヒトへの投与に関して安全かつ無毒）ものであり、かつ液状配合物の調製に有用であるものである。例示のキャリアとして、滅菌注射用水（ＳＷＦＩ）、静菌注射用水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝液（例えば、リン酸緩衝食塩水）、滅菌生理食塩水、リンガー液、またはブドウ糖液が挙げられる。
【０２０４】
本開示のタンパク質は、タンパク質及び凍結乾燥保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）を含む凍結乾燥配合物中に存在することができる。凍結乾燥保護剤は、糖、例えば、二糖類である場合がある。ある特定の実施形態において、凍結乾燥保護剤は、スクロースまたはマルトースである場合がある。凍結乾燥配合物は、緩衝剤、界面活性剤、増量剤、及び／または保存料のうち１種または複数も含む場合がある。
【０２０５】
凍結乾燥製剤の安定化に有用なスクロースまたはマルトースの量は、重量比で少なくとも１：２のタンパク質対スクロースまたはマルトースである場合がある。ある特定の実施形態において、タンパク質対スクロースまたはマルトースの重量比は、１：２〜１：５である場合がある。
【０２０６】
ある特定の実施形態において、配合物のｐＨは、凍結前に、薬学上許容される酸及び／または塩基の添加により設定される場合がある。ある特定の実施形態において、薬学上許容される酸は、塩酸である場合がある。ある特定の実施形態において、薬学上許容される塩基は、水酸化ナトリウムである場合がある。
【０２０７】
凍結乾燥前に、本開示のタンパク質を含有する溶液のｐＨは、６〜８に調整される場合がある。ある特定の実施形態において、凍結乾燥製剤のｐＨ範囲は、７〜８である場合がある。
【０２０８】
ある特定の実施形態において、塩または緩衝剤成分が、１０ｍＭ〜２００ｍＭの量で添加される場合がある。塩及び／または緩衝剤は、薬学上許容されるものであり、様々な既知の酸（無機及び有機）及び「塩基形成」金属またはアミンから派生する。ある特定の実施形態において、緩衝剤は、リン酸塩緩衝剤である場合がある。ある特定の実施形態において、緩衝剤は、グリシン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩緩衝剤である場合があり、その場合、ナトリウム、カリウム、またはアンモニウムイオンが、カウンターイオンとして機能することができる。
【０２０９】
ある特定の実施形態において、「増量剤」が添加される場合がある。「増量剤」とは、凍結乾燥混合物に質量を与え、凍結乾燥ケーキの物理的構造に寄与する（例えば、貫通細孔構造を維持した本質的に均一な凍結乾燥ケーキの生成を促進する）化合物である。例示の増量剤として、マンニトール、グリシン、ポリエチレングリコール、及びソルビトールが挙げられる。本発明の凍結乾燥配合物は、そのような増量剤を含有する場合がある。
【０２１０】
保存料は、任意選択で、細菌作用を低減するために本明細書中の配合物に添加される場合がある。保存料の添加は、例えば、複数回使用（複数回用量）配合物の製造を促進する場合がある。
【０２１１】
ある特定の実施形態において、凍結乾燥製剤は、水性キャリアで構築される場合がある。本明細書中関心対象である水性キャリアとは、薬学上許容される（ヒトへの投与に関して安全かつ無毒）ものであり、かつ凍結乾燥後、液状配合物の調製に有用であるものである。例示のキャリアとして、滅菌注射用水（ＳＷＦＩ）、静菌注射用水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝液（例えば、リン酸緩衝食塩水）、滅菌生理食塩水、リンガー液、またはブドウ糖液が挙げられる。
【０２１２】
ある特定の実施形態において、本開示の凍結乾燥製剤は、滅菌注射用水、ＵＳＰ（ＳＷＦＩ）または０．９％塩化ナトリウム注射液、ＵＳＰいずれかを用いて再構築される。再構築中、凍結乾燥粉末は溶解して溶液になる。
【０２１３】
ある特定の実施形態において、本開示の凍結乾燥タンパク質製品は、約４．５ｍＬの注射用水で構築され、０．９％生理食塩水（塩化ナトリウム溶液）で希釈される。
【０２１４】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬レベルは、患者にとって毒性となることがなく、特定の患者、組成、及び投与様式に関して所望の治療反応を達成するのに有効な活性成分の量を得られるように、変化する場合がある。
【０２１５】
具体的な用量は、各患者に関して均一用量、例えば、５０〜５０００ｍｇのタンパク質であることが可能である。あるいは、ある患者の用量は、その患者の体重または表面積の概算に合わせて調節することができる。適切な投薬量を決定する他の要因として、治療もしくは予防しようとする疾患または症状、疾患の重篤度、投与経路、ならびに患者の年齢、性別、及び医学的状態を挙げることができる。治療に適切な投薬量を決定するのに必要な計算のさらなる微調整は、特に本明細書中開示される投薬量の情報及びアッセイに照らして、当業者により常套的に行なわれる。投薬量は、適切な用量反応データと合わせて、使用される既知の投薬量決定アッセイの使用を通じても決定することができる。個々の患者の投薬量は、疾患の進行のモニタリングに合わせて調節することができる。患者中の標的設定可能な構築物または複合体の血中レベルを測定して、投薬量が、有効濃度に達するまたはそれを維持するための調節を必要としているのかどうかを知ることができる。ゲノム薬理学を用いて、どの標的設定可能な構築物及び／または複合体、及びそれらの投薬量が、所定の個体について最も有効であるように思われるかを決定することができる（Ｓｃｈｍｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ３０８：  ４３−５３，  ２００１；Ｓｔｅｉｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ３０８：  ３３−４１，  ２００１）。
【０２１６】
一般に、体重に基づく投薬量は、体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ〜約１００ｍｇ、例えば、約０．０１μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約５０μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１０μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約０．１μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１０μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約５０μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１０μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約５０μｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０２１７】
用量は、毎日、毎週、毎月、または毎年１回もしくは複数回、あるいはさらには２〜２０年ごとに１回、投与される場合がある。当業者なら、体液または組織中の標的設定可能な構築物または複合体について測定された滞留時間及び濃度に基づき、投与の繰り返し率を容易に推定することができる。本発明の投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、くも膜下腔内、腔内、カテーテルを通じた灌流による、または直接の病巣内注入によるものが可能である。これは、毎日１回または複数回、毎週１回または複数回、毎月１回または複数回、あるいは毎年１回または複数回投与される場合がある。
【０２１８】
上記の説明は、本発明の複数の態様及び実施形態を説明するものである。特許出願は、具体的に、態様及び実施形態の全ての組み合わせ及び並び替えを企図している。
【実施例】
【０２１９】
ここまで本発明を全般的に説明してきたが、本発明は、以下の実施例を参照することでさらに容易に理解されるだろう。実施例は、本発明のある特定の態様及び実施形態を解説する目的で含まれているに過ぎず、本発明を制限することを意図しない。
【０２２０】
実施例１−初代ヒトＮＫ細胞細胞毒性アッセイ：
密度勾配遠心を用いて、ヒト末梢血バフィーコートから末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離した。ＮＫ細胞を単離するため、単離したＰＢＭＣを洗い、調製した。磁気ビーズを用い負の選択技法によりＮＫ細胞を単離した。単離したＮＫ細胞の純度は、典型的には＞９０％のＣＤ３−ＣＤ５６＋であった。単離したＮＫ細胞を一晩静置し、静置したＮＫ細胞を、翌日、細胞毒性アッセイに使用した。
【０２２１】
ＤＥＬＦＩＡ細胞毒性アッセイ：
ＢＣＭＡを発現するヒトがん細胞株を、培養物から収穫し、細胞をＨＢＳで洗い、ＢＡＴＤＡ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＡＤ０１１６）で標識化するため、１０６／ｍＬで増殖培地に再懸濁させた。標的細胞を標識化するため使用説明書に従った。標識化した後、細胞をＨＢＳで３回洗い、培養培地に０．５〜１．０×１０５／ｍＬで再懸濁させた。バックグラウンドウェルを調製するため、等分した標識化細胞の１分量を取り分け、細胞を回転させて培地から分離させた。ペレット化細胞を撹乱しないように、３つ組のウェルに培地１００μｌを慎重に加えた。９６ウェルプレートの各ウェルに、ＢＡＴＤＡ標識化細胞１００μｌを加えた。複数のウェルを、標的細胞からの自発的放出用にとっておき、また複数のウェルを、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘの添加による標的細胞の最大溶解用に調製した。モノクローナル抗体またはＢＣＭＡに対するＴｒｉＮＫＥＴ（ＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡ）を培地に希釈し、希釈したｍＡｂまたはＴｒｉＮＫＥＴを５０μｌ、各ウェルに加えた。静置したＮＫ細胞を培養物から収穫し、細胞を洗い、所望のＥ：Ｔ比に応じて１０５〜２．０×１０６／ｍＬで、培養培地に再懸濁させた。ＮＫ細胞５０μｌをプレートの各ウェルに加え、培養体積を合計で２００μｌにした。プレートを３７℃及び５％ＣＯ２で２〜３時間インキュベートしてから、アッセイを展開した。
【０２２２】
２〜３時間培養後、プレートをインキュベーターから取り出し、細胞を２００ｇで５分間遠心してペレット化した。培養上清２０μｌを、製造元から提供された清浄なマイクロプレートに移し、室温のユーロピウム溶液２００μｌを、各ウェルに加えた。プレートを遮光し、プレートシェーカーに乗せて２５０ｒｐｍで１５分間インキュベートした。プレートを、Ｖｉｃｔｏｒ３またはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉ３Ｘいずれかの装置を用いて読んだ。特異的溶解％は、以下のとおり計算した：特異的溶解％＝（（実験による放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出））＊１００％。
【０２２３】
ＦＡＣＳに基づく長時間細胞毒性アッセイ：
ＢＣＭＡ発現ヒトがん細胞株に、ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｇｒｅｅｎ（Ｅｓｓｅｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ  ４４７５）を安定的に発現するように形質導入し、ピューロマイシン選別した後、細胞株を、培養物から回転分離により収穫し、培養培地に１０５／ｍＬで再懸濁させた。標的細胞１００μｌを、９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。ＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡというＴｒｉＮＫＥＴを培養培地に希釈し、５０μｌずつ、２つ組のウェルに加えた。一晩静置した精製ヒトＮＫを、培養物から収穫し、洗い、培養培地に４×１０５／ｍＬで再懸濁させた。１：１のエフェクター細胞：標的細胞（Ｅ：Ｔ）比の場合、ＮＫ細胞５０μｌを、標的のみの対照を除く全てのウェルに加え、対照には、培養培地１００μｌを加えた。エフェクターとして新たに処理されたＰＢＭＣを使用する場合、１０：１のＥ：Ｔ比を代わりに用いた。プレートを３７℃及び５％ＣＯ２で３０時間インキュベートした。
【０２２４】
共培養後、細胞を染色し、固定し、フローサイトメトリーで分析した。残存する標的細胞を、ＦＩＴＣチャネルの強いシフトで検出し、死細胞は、生死判定染色で排除した。緑色事象数をエクスポートし、殺傷％を、標的のみ対照試料との比較により計算した。ビーズの計測数を含めることで、記録された量が同等であることを確実にした。
【０２２５】
実施例２−ＮＫＧ２Ｄ陽性細胞に対するＴｒｉＮＫＥＴ結合の評価
ヒト全血におけるＴｒｉＮＫＥＴ結合
ヘパリン処置したヒト全血１００μｌを、各試験管／ウェルに加えた。直接標識化ＴｒｉＮＫＥＴ（ＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡ）またはｍＡｂを、全血に直接加え、直接複合体化ｍＡｂ混合物も免疫表現型検査のために加え、試料を室温で２０分間インキュベートした。直接標識化ＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡまたはｍＡｂについて、インキュベーション後、１×ＲＢＣ溶解／固定緩衝液２ｍＬを各試料に加えた。試料を室温で１５分間インキュベートした。溶解後、試料を１回洗い、それから分析用に調製した。
【０２２６】
図３及び図４は、抗ＢＣＭＡ  ＴｒｉＮＫＥＴ（ＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡ）または抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体の存在下、２時間以内でのＢＣＭＡ陽性標的細胞株のヒトＮＫ細胞による溶解を示す。ＫＭＳ１２−ＰＥ細胞（図３）及びＭＭ．１Ｒ細胞（図４）は、それぞれＢＣＭＡを低発現及び高発現するが、これらを標的細胞として使用した。ＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡは、ＫＭＳ１２−ＰＥ細胞及びＭＭ．１Ｒ細胞の両方に対してナノモル以下のＥＣ５０値を実証した。ＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡは、両細胞株（ＫＭＳ１２−ＰＥ細胞（図３）及びＭＭ．１Ｒ細胞（図４））に対して、抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体（ＭＡＢ４２）より高い最大特異性溶解及び効力をもたらした。
【０２２７】
ＴｒｉＮＫＥＴによるＢＣＭＡ表面安定化
ＫＭＳ１２−ＰＥ細胞またはＭＭ．１Ｒ細胞を、抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体（ＭＡＢ４２）、二価ＴｒｉＮＫＥＴ（ＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡ）、または一価ＴｒｉＮＫＥＴ（Ａ４９−ＤＢ−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡ）とともにインキュベートした。Ａ４９−ＤＢ−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡは、第一抗原結合部位にＮＫＧ２Ｄと結合するＦａｂを含み、かつ第二抗原結合部位にＢＣＭＡと結合するＦａｂを含み、それぞれがＦｃドメインに接続されていて、二価抗体を形成しているＴｒｉＮＫＥＴである（ＷＯ２０１８／１４８５６６）。
【０２２８】
合計表面ＢＣＭＡを評価するため、飽和する濃度である１００μｇ／ｍＬを用い、一方で未飽和表面安定化を調べるために１００ｎｇ／ｍＬを選択した。各試料を１／３ずつに分割し、分量それぞれを、氷上に２０分間、３７℃で２時間、または３７℃で２４時間放置した。インキュベーション期間後、細胞を洗い、結合したＴｒｉＮＫＥＴを抗ヒトＩｇＧ二次抗体を用いて検出した。染色後、細胞を固定して４℃で貯蔵し、全ての試料を試験終了時に分析した。
【０２２９】
ＴｒｉＮＫＥＴは、表面ＢＣＭＡを安定化する
図５は、Ａ４９−ＤＢ−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡまたはＢＣＭＡモノクローナル抗体（ＭＡＢ４２）とともに所定時間インキュベートした後の、ＫＭＳ１２−ＰＥ細胞の表面ＢＣＭＡの染色を示す。ＢＣＭＡ  ｍＡｂ及びＴｒｉＮＫＥＴは両方とも、インキュベーション後直ちに表面ＢＣＭＡを安定化することができ、２４時間の期間にわたり発現の増加を維持することができた。図６は、ＢＣＭＡ発現が本質的により高い細胞株ＭＭ．１Ｒでも、同じ効果が観察されたことを示す。
【０２３０】
より長いインキュベーション時間を用いたＢＣＭＡ標的細胞結合における目立った改善が、未飽和濃度のＡ４９−ＤＢ−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡ及び抗ＢＣＭＡ  ｍＡｂ（ＭＡＢ４２）でも観察された。図７は、抗ＢＣＭＡ  ｍＡｂ（ＭＡＢ４２）及び二価ＴｒｉＮＫＥＴ（ＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡ）によりもたらされる貪欲な結合が、ＫＭＳ１２−ＰＥ細胞のＢＣＭＡとの結合の迅速かつ持続した増加を促進するのに対して、一価ＴｒｉＮＫＥＴ（Ａ４９−ＤＢ−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡ）では、結合の限定的な改善のみが観察されたことを示す。図８は、ＭＭ．１Ｒ細胞での同様なパターンを示す。
【０２３１】
実施例３−二価ＴｒｉＮＫＥＴは、優れた長期細胞傷害性を仲介する
二価ＴｒｉＮＫＥＴ（ＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡ）の存在下で精製ヒトＮＫがＢＣＭＡ発現ＫＭＳ１２−ＰＥ細胞を枯渇させる能力を、抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体ＭＡＢ４２の場合のものと比較した。図９は、２０時間後にフローサイトメトリーで検出した場合の、精製ヒトＮＫ細胞によるＫＭＳ１２−ＰＥ細胞の静置ＮＫ介在型枯渇（Ｅ：Ｔ比は１：１）を示す。二価ＢＣＭＡ  ＴｒｉＮＫＥＴ（ＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡ）は、モノクローナル抗体または一価ＴｒｉＮＫＥＴ（Ａ４９−ＤＢ−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡ）いずれよりも強力な殺傷をもたらした。精製ＮＫではなくＰＢＭＣを１０：１のＥ：Ｔ比で用いた場合、同様な結果が得られた（図１０）。いずれのＴｒｉＮＫＥＴ様式と比較しても、抗ＢＣＭＡ  ｍＡｂは、両エフェクター細胞型で低下した最大殺傷及び効力をもたらした。
【０２３２】
ＢＣＭＡ  ＴｒｉＮＫＥＴは、細胞のＮＫＧ２Ｄと極度に弱い結合相互作用を持つ
ＫＨＹＧ−１ヒトＮＫ細胞株を用いて、ＮＫＧ２ＤとＴｒｉＮＫＥＴであるＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡとの結合を評価した。ＣＤ１６−Ｆ１５８Ｖを発現するように形質導入されたＫＨＹＧ−１細胞を用いて、Ｆｃ  ＣＤ１６結合の寄与を調べた。ＴｒｉＮＫＥＴを希釈し、ＫＨＹＧ−１細胞とともにインキュベートした。ＴｒｉＮＫＥＴの結合は、フルオロフォア複合化抗ヒトＩｇＧ二次抗体を用いて検出した。細胞をフローサイトメトリーにより分析し、蛍光強度中央値（「ＭＦＩ」）を記録した。
【０２３３】
ＴｒｉＮＫＥＴがＮＫＧ２Ｄ発現細胞に結合する能力を調べた。図１１に示すとおり、ＴｒｉＮＫＥＴ（ＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡ及びＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ３−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡ）の結合が実質的にないことが、ＮＫＧ２Ｄを発現するがＣＤ１６は発現しないＫＨＹＧ−１細胞に対して観察された。対照的に、ＫＨＹＧ−１細胞がＣＤ１６の高親和性バリアントを発現するように形質導入された状況の場合、ＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡは、抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体ＭＡＢ４２よりもかろうじて高いにすぎないレベルでその細胞に結合することができた（図１２）。しかしながら、ＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ３−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡは、ＣＤ１６発現ＫＨＹＧ−１細胞に、より高いＭＦＩで結合することができた（図１２）。ＴｒｉＮＫＥＴがＮＫＧ２Ｄ発現細胞に結合しなかったということは、ＴｒｉＮＫＥＴが全血中のＮＫＧ２Ｄ陽性ＮＫ細胞（図１３Ａ）にもＣＤ８＋Ｔ細胞（図１３Ｂ）にも結合することができないことにより、さらに裏付けられた。ＴｒｉＮＫＥＴは、全血中のＢ細胞（図１３Ｄ）、単球（図１３Ｅ）、及び顆粒球（図１３Ｆ）に、ＩｇＧ１対照結合に匹敵するレベルで結合することができた。
【０２３４】
実施例４−ＴｒｉＮＫＥＴは、ＢＣＭＡ＋腫瘍細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞溶解を引き起こす
初代ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞細胞毒性アッセイ：
初代ヒトＣＤ８＋エフェクターＴ細胞発生：密度勾配遠心を用いて、ヒト末梢血バフィーコートからヒトＰＢＭＣを単離した。単離したＰＢＭＣを、１μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を用いて３７℃で１８時間刺激した。次いで、ＣｏｎＡを除去し、細胞を、２５単位／ｍｌのＩＬ−２を用いて３７℃で４日間培養した。磁気ビーズを用い負の選択技法によりＣＤ８＋Ｔ細胞を精製し、次いで１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５を含有する培地中３７℃で６〜１３日間培養した。
【０２３５】
初代ヒトＣＤ８＋エフェクターＴ細胞特性決定：上記で発生した初代ヒトＣＤ８＋エフェクターＴ細胞を、ＣＤ８＋Ｔ細胞純度、ならびにＮＫＧ２Ｄ及びＣＤ１６発現について、フローサイトメトリーにより分析した。細胞を、ＣＤ３、ＣＤ８、ＮＫＧ２Ｄ、及びＣＤ１６に対するフルオロフォア複合化抗体で染色し、次いでフローサイトメトリーにより分析した。
【０２３６】
短期間ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞ＤＥＬＦＩＡ細胞毒性アッセイ：目的の標的であるＢＣＭＡを発現するヒト多発性骨髄腫ＫＭＳ１２−ＰＥ細胞を、培養物から収穫した。細胞を洗い、ＢＡＴＤＡ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＡＤ０１１６）で標識するために増殖培地に１０６／ｍＬで再懸濁させた。標的細胞を標識するために使用説明書に従った。標識後、細胞をＨＢＳで３回洗い、培養培地に０．５×１０５／ｍＬで再懸濁させた。ＢＡＴＤＡ標識化細胞１００μｌを、９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。複数のウェルを、標的細胞からの自発的放出用にとっておき、また複数のウェルを、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘの添加による標的細胞の最大溶解用に調製した。ＴｒｉＮＫＥＴ及びｍＡｂを培養培地で希釈し、５０μＬ／ウェルでプレートに加えた。ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞を培養物から収穫し、洗い、培養培地に０．５×１０６／ｍＬで再懸濁させた（Ｅ：Ｔ比＝５０：１）。次いで、ＣＤ８＋Ｔ細胞５０μｌをプレートの各ウェルに加え、培養体積を合計２００μｌにした。プレートを３７℃及び５％ＣＯ２で３．５時間インキュベートしてから、アッセイを展開した。インキュベーション後、プレートをインキュベーターから取り出し、細胞を５００ｇで５分間遠心してペレット化した。培養上清２０μｌを、製造元から提供された清浄なマイクロプレートに移し、室温のユーロピウム溶液２００μｌを、各ウェルに加えた。プレートを遮光し、プレートシェーカーに乗せて２５０ｒｐｍで１５分間インキュベートした。プレートを、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉ３Ｘ装置を用いて読んだ。
【０２３７】
特異的溶解％は、以下のとおり計算した：特異的溶解％＝（（実験による放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出））＊１００％。
【０２３８】
細胞毒性アッセイに使用したＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の特性決定
図１４に示すとおり、ＣｏｎＡ刺激を用いて発生させ、ＩＬ−１５を用いて培養したＣＤ８＋エフェクターＴ細胞は、高純度（＞９９％のＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞）のものであり、全てがＮＫＧ２Ｄを発現したがＣＤ１６は発現しなかった。
【０２３９】
ＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡは、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養された場合に、ＫＭＳ１２−ＰＥ細胞の溶解を増大させた。
ＤＥＬＦＩＡアッセイにおけるＫＭＳ１２−ＰＥ細胞の細胞溶解：ドナー１（図１５Ａ）及びドナー２（図１５Ｂ）由来のＩＬ−１５刺激されたＣＤ８＋Ｔ細胞の存在下または不在下、６０ｎＭのＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡ、抗ＢＣＭＡ  ｍＡｂ、または無関係のＴｒｉＮＫＥＴを、ＫＭＳ１２−ＰＥ標的細胞の培養物に加えた。ＴｒｉＮＫＥＴ／ｍＡｂの不在下、ＫＭＳ１２−ＰＥ細胞と共培養された活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞を、バックグラウンドＴ細胞殺傷として含めた。
【０２４０】
図１５Ａ〜図１５Ｂは、２人の健康なドナーに由来するヒト初代ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞及びＫＭＳ１２−ＰＥ標的細胞を用いたＤＥＬＦＩＡ細胞毒性アッセイの結果を示す。示すとおり、ＮＫＧ２Ｄ結合−Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡは、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養した場合にＫＭＳ１２−ＰＥ細胞の溶解を増大させたが、エフェクター細胞の不在下では増大させなかった。親抗ＢＣＭＡ  ｍＡｂまたは無関係のＴｒｉＮＫＥＴは、いずれのドナーに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞でも細胞による溶解を増大させることができなかった。
【０２４１】
実施例５−ＴｒｉＮＫＥＴは、ＮＫ細胞活性化を刺激する
ヒト精製ＮＫ細胞の共培養：ＢＣＭＡを発現するヒトがん細胞株を培養物から収穫し、細胞を１×１０６細胞／ｍＬに調整した。ＴｒｉＮＫＥＴ／ｍＡｂを培養培地に希釈した。静置したＮＫ細胞を培養物から収穫し、洗った。精製ＮＫ細胞を、１：１のＥ：Ｔ用に１×１０６細胞／ｍＬで再懸濁させた。全ての共培養物に、ｈＩＬ−２、ブレフェルジンＡ、モネンシン、及びフルオロフォア複合化抗ＣＤ１０７ａを補充し、４時間インキュベートした。透過処理／洗浄緩衝剤及びフルオロフォア複合化抗ＩＦＮγを用いた固定後に生ＮＫ細胞の細胞内染色を行なった。
【０２４２】
図１６Ａ〜図１６Ｂは、抗ＢＣＭＡ  ＴｒｉＮＫＥＴまたはモノクローナル抗体の存在下、４時間以内の、ＢＣＭＡ陽性標的細胞株の存在下でのヒトＮＫ細胞活性化を示す。図１６Ａでは、ＫＭＳ１２−ＰＥ細胞（ＢＣＭＡ低発現）を標的細胞として用いた。示すとおり、ＢＣＭＡ標的指向化ＴｒｉＮＫＥＴは、ＢＣＭＡ陽性ＫＭＳ１２−ＰＥ骨髄腫細胞との共培養物において、抗ＢＣＭＡ  ｍＡｂよりも大幅にヒトＮＫ細胞活性化を仲介した。図１６Ｂでは、Ｈ９２９（ＢＣＭＡ高発現）を標的細胞として用いた。示すとおり、ＢＣＭＡ標的指向化ＴｒｉＮＫＥＴは、ＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９骨髄腫細胞との共培養物において、抗ＢＣＭＡ  ｍＡｂよりも大幅にヒトＮＫ細胞活性化を仲介した。すなわち、ＢＣＭＡ低発現及び高発現細胞の両方に対して、Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴは、ナノモル以下のＥＣ５０値で脱顆粒及びＩＦＮγ産生の上昇を引き起こした。ＢＣＭＡモノクローナル抗体に比べて、Ｆ４ＴｒｉＮＫＥＴは、最大でＮＫ細胞をより高い割合で刺激し、両細胞株に対する効力が向上していた。
【０２４３】
例示の実施形態
実施形態１：タンパク質であって、以下：（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む第一抗原結合部位、ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖは、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む；（ｂ）Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合する第二抗原結合部位；ならびに（ｃ）抗体ＦｃドメインもしくはＣＤ１６に結合するのに十分なその一部分、またはＣＤ１６に結合する第三抗原結合部位
を含む、前記タンパク質。
【０２４４】
実施形態２：さらに、ＢＣＭＡに結合する追加の抗原結合部位を含む、実施形態１に記載のタンパク質。
【０２４５】
実施形態３：ＢＣＭＡに結合する前記第二抗原結合部位は、Ｆａｂ断片である、実施形態１または２に記載のタンパク質。
【０２４６】
実施形態４：ＢＣＭＡに結合する前記第二及び前記追加の抗原結合部位は、Ｆａｂ断片である、実施形態１から３のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０２４７】
実施形態５：ＢＣＭＡに結合する前記第二及び前記追加の抗原結合部位は、ｓｃＦｖであり、それぞれが、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む、実施形態１または２に記載のタンパク質。
【０２４８】
実施形態６：ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインは、ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインのＮ末端またはＣ末端に位置する、実施形態１から５のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０２４９】
実施形態７：ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインは、ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインのＮ末端に位置する、実施形態６に記載のタンパク質。
【０２５０】
実施形態８：ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖは、前記抗体ＦｃドメインもしくはＣＤ１６に結合するのに十分な前記その一部分、またはＣＤ１６に結合する前記第三抗原結合部位と連結されている、実施形態１から７のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０２５１】
実施形態９：ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖは、前記抗体ＦｃドメインもしくはＣＤ１６に結合するのに十分な前記その一部分、またはＣＤ１６に結合する前記第三抗原結合部位と、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介して連結されている、実施形態８に記載のタンパク質。
【０２５２】
実施形態１０：ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖは、前記抗体ＦｃドメインもしくはＣＤ１６に結合するのに十分な前記その一部分、またはＣＤ１６に結合する前記第三抗原結合部位と、配列番号１６８のアミノ酸配列を含むフレキシブルリンカーを介して連結されている、実施形態８に記載のタンパク質。
【０２５３】
実施形態１１：前記抗体ＦｃドメインのＣ末端は、ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインのＮ末端と連結されている、実施形態１０に記載のタンパク質。
【０２５４】
実施形態１２：ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖ内で、ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインと前記軽鎖可変ドメインの間でジスルフィド架橋が形成されている、実施形態１から１１のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０２５５】
実施形態１３：前記ジスルフィド架橋は、前記重鎖可変ドメインのＣ４４と前記軽鎖可変ドメインのＣ１００の間で形成されている、実施形態１２に記載のタンパク質。
【０２５６】
実施形態１４：ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖ内で、前記重鎖可変ドメインは、前記軽鎖可変ドメインと、フレキシブルリンカーを介して連結されている、実施形態１から１３のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０２５７】
実施形態１５：前記フレキシブルリンカーは、（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）ｎ（配列番号１９８）を含み、ただしｎは、１〜１０の整数である、実施形態１４に記載のタンパク質。
【０２５８】
実施形態１６：前記第二及び前記追加の抗原結合部位ｓｃＦｖは、それぞれが、前記抗体ＦｃドメインもしくはＣＤ１６に結合するのに十分な前記その一部分、またはＣＤ１６に結合する前記第三抗原結合部位と、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介して連結されている、実施形態５から１５のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０２５９】
実施形態１７：前記第二及び前記追加の抗原結合部位ｓｃＦｖは、前記抗体Ｆｃドメインと、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介して連結されている、実施形態５から１６のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０２６０】
実施形態１８：前記第二抗原結合部位、前記追加の抗原結合部位、またはその両方の前記重鎖可変ドメインと前記軽鎖可変ドメインの間でジスルフィド架橋が形成されている、実施形態１６または１７に記載のタンパク質。
【０２６１】
実施形態１９：前記ジスルフィド架橋は、前記第二抗原結合部位、前記追加の抗原結合部位、またはその両方の前記重鎖可変ドメインのＣ４４と前記軽鎖可変ドメインのＣ１００の間で形成されている、実施形態１８に記載のタンパク質。
【０２６２】
実施形態２０：ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインは、ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖの重鎖可変ドメインのＮ末端に位置しており、ただしＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインは、ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインと、配列番号１６７のアミノ酸配列からなるフレキシブルリンカーを介して連結されており、及びＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖは、前記抗体Ｆｃドメインと、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介して連結されている、実施形態１から１９のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０２６３】
実施形態２１：ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖは、以下：（ａ）配列番号１９０、９６、及び１９１のアミノ酸配列でそれぞれ表される相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、及び相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびに、配列番号９９、１００、及び１０１のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；（ｂ）配列番号１９０、９６、及び１９３のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびに、配列番号９９、１００、及び１０１のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；（ｃ）配列番号９５、９６、及び９７のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびに、配列番号９９、１００、及び１０１のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；（ｄ）配列番号１８８、８８、及び１８９のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびに、配列番号９１、９２、及び９３のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；（ｅ）配列番号１８５、１０４、及び１９２のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびに、配列番号１０７、１０８、及び１０９のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；（ｆ）配列番号１８５、７２、及び１５９のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびに、配列番号７５、７６、及び７７のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；（ｇ）配列番号１８６、８０、及び１８７のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびに、配列番号８３、８４、及び８５のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；（ｈ）配列番号１９０、９６、及び１９４のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびに、配列番号９９、１００、及び１０１のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；（ｉ）配列番号１９０、９６、及び１９５のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびに、配列番号９９、１００、及び１０１のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；（ｊ）配列番号１９０、９６、及び１９６のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびに、配列番号９９、１００、及び１０１のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；（ｋ）配列番号１９０、９６、及び１９７のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびに、配列番号９９、１００、及び１０１のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；または（ｌ）配列番号１９０、９６、及び１６０のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびに、配列番号９９、１００、及び１０１のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン
を含む、実施形態１から２０のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０２６４】
実施形態２２：ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖは、配列番号９４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメインを含む、実施形態１から２１のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０２６５】
実施形態２３：ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖは、配列番号９４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、実施形態１から２１のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０２６６】
実施形態２４：ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖは、配列番号９４のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメインを含む、実施形態１から２１のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０２６７】
実施形態２５：ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖは、配列番号９４と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と同一である軽鎖可変ドメインを含む、実施形態１から２１のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０２６８】
実施形態２６：ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖは、配列番号１６９と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と同一である軽鎖可変ドメインを含む、実施形態１から２１のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０２６９】
実施形態２７：ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖは、配列番号１７１と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と同一である軽鎖可変ドメインを含む、実施形態１から２１のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０２７０】
実施形態２８：ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖは、配列番号１７３と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と同一である軽鎖可変ドメインを含む、実施形態１から２１のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０２７１】
実施形態２９：ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖは、配列番号１７５と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と同一である軽鎖可変ドメインを含む、実施形態１から２１のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０２７２】
実施形態３０：ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖは、配列番号１７７と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と同一である軽鎖可変ドメインを含む、実施形態１から２１のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０２７３】
実施形態３１：ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖは、配列番号１７９と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号９８と同一である軽鎖可変ドメインを含む、実施形態１から２１のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０２７４】
実施形態３２：ＢＣＭＡに結合する前記第二抗原結合部位は、以下：（ａ）配列番号１４９、１５０、及び１５１のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１５３、１５４、及び１５５のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；（ｂ）配列番号１１５、１１６、及び１１１７のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１２０、１２１、及び１２３のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；（ｃ）配列番号１２５、１２６、及び１２７のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１２９、１３０、及び１３１のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；（ｄ）配列番号１３３、１３４、及び１３５のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１３７、１３８、及び１３９のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；（ｅ）配列番号１４１、１４２、及び１４３のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１４５、１４６、及び１４７のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；または（ｆ）配列番号１１５、１１６、及び１１７のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１２０、１２１、及び１２２のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン
を含む、実施形態１から３１のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０２７５】
実施形態３３：ＢＣＭＡに結合する前記第二抗原結合部位は、以下：（ａ）配列番号１４８と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１５２と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン；（ｂ）配列番号１４８と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１５２と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン；または（ｃ）配列番号１４８と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１５２と同一である軽鎖可変ドメイン、
を含む、実施形態１から３２のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０２７６】
実施形態３４：ＢＣＭＡに結合する前記第二抗原結合部位は、以下：（ａ）配列番号１１４と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１１９と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン；（ｂ）配列番号１１４と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１１９と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン；または（ｃ）配列番号１１４と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１１９と同一である軽鎖可変ドメイン、
を含む、実施形態１から３２のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０２７７】
実施形態３５：ＢＣＭＡに結合する前記第二抗原結合部位は、以下：（ａ）配列番号１２４と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１２８と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン；（ｂ）配列番号１２４と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１２８と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン；または（ｃ）配列番号１２４と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１２８と同一である軽鎖可変ドメイン、
を含む、実施形態１から３２のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０２７８】
実施形態３６：ＢＣＭＡに結合する前記第二抗原結合部位は、以下：（ａ）配列番号１３２と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１３６と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン；（ｂ）配列番号１３２と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１３６と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン；または（ｃ）配列番号１３２と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１３６と同一である軽鎖可変ドメイン、
を含む、実施形態１から３２のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０２７９】
実施形態３７：ＢＣＭＡに結合する前記第二抗原結合部位は、以下：（ａ）配列番号１４０と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１４４と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン；（ｂ）配列番号１４０と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１４４と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン；または（ｃ）配列番号１４０と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１４４と同一である軽鎖可変ドメイン、
を含む、実施形態１から３２のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０２８０】
実施形態３８：ＢＣＭＡに結合する前記第二抗原結合部位は、以下：（ａ）配列番号１１４と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１１８と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン；（ｂ）配列番号１１４と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１１８と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン；または（ｃ）配列番号１１４と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１１８と同一である軽鎖可変ドメイン、
を含む、実施形態１から３２のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０２８１】
実施形態３９：ＢＣＭＡに結合する前記追加の抗原結合部位は、以下：（ａ）配列番号１４９、１５０、及び１５１のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１５３、１５４、及び１５５のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；（ｂ）配列番号１１５、１１６、及び１１１７のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１２０、１２１、及び１２３のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；（ｃ）配列番号１２５、１２６、及び１２７のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１２９、１３０、及び１３１のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；（ｄ）配列番号１３３、１３４、及び１３５のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１３７、１３８、及び１３９のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；（ｅ）配列番号１４１、１４２、及び１４３のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１４５、１４６、及び１４７のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；または（ｆ）配列番号１１５、１１６、及び１１７のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１２０、１２１、及び１２２のアミノ酸配列でそれぞれ表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン、
を含む、実施形態２から３８のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０２８２】
実施形態４０：ＢＣＭＡに結合する前記追加の抗原結合部位は、以下：（ａ）配列番号１４８と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１５２と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン；（ｂ）配列番号１４８と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１５２と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン；または（ｃ）配列番号１４８と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１５２と同一である軽鎖可変ドメイン、
を含む、実施形態２から３８のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０２８３】
実施形態４１：ＢＣＭＡに結合する前記追加の抗原結合部位は、以下：（ａ）配列番号１１４と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１１９と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン；（ｂ）配列番号１１４と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１１９と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン；または（ｃ）配列番号１１４と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１１９と同一である軽鎖可変ドメイン、
を含む、実施形態２から３８のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０２８４】
実施形態４２：ＢＣＭＡに結合する前記追加の抗原結合部位は、以下：（ａ）配列番号１２４と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１２８と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン；（ｂ）配列番号１２４と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１２８と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン；または（ｃ）配列番号１２４と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１２８と同一である軽鎖可変ドメイン、
を含む、実施形態２から３８のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０２８５】
実施形態４３：ＢＣＭＡに結合する前記追加の抗原結合部位は、以下：（ａ）配列番号１３２と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１３６と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン；（ｂ）配列番号１３２と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１３６と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン；または（ｃ）配列番号１３２と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１３６と同一である軽鎖可変ドメイン、
を含む、実施形態２から３８のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０２８６】
実施形態４４：ＢＣＭＡに結合する前記追加の抗原結合部位は、以下：（ａ）配列番号１４０と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１４４と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン；（ｂ）配列番号１４０と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１４４と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン；または（ｃ）配列番号１４０と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１４４と同一である軽鎖可変ドメイン、
を含む、実施形態２から３８のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０２８７】
実施形態４５：ＢＣＭＡに結合する前記追加の抗原結合部位は、以下：（ａ）配列番号１１４と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１１８と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン；（ｂ）配列番号１１４と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１１８と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン；または（ｃ）配列番号１１４と同一である重鎖可変ドメイン及び配列番号１１８と同一である軽鎖可変ドメイン、
を含む、実施形態２から３８のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０２８８】
実施形態４６：前記抗体ＦｃドメインもしくはＣＤ１６に結合するのに十分な前記その一部分、またはＣＤ１６に結合する前記第三抗原結合部位は、ヒトＩｇＧ１抗体のヒンジ及びＣＨ２ドメインを含む抗体Ｆｃドメインである、実施形態１から４５のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０２８９】
実施形態４７：前記抗体ＦｃドメインもしくはＣＤ１６に結合するのに十分な前記その一部分、またはＣＤ１６に結合する前記第三抗原結合部位は、ヒトＩｇＧ１抗体の２３４番〜３３２番アミノ酸と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む抗体Ｆｃドメインである、実施形態１から４５のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０２９０】
実施形態４８：前記抗体Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｔ３５０、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１、及びＫ４３９からなる群より選択される１つまたは複数の位置で異なっている、実施形態４６または４７に記載のタンパク質。
【０２９１】
実施形態４９：前記抗体Ｆｃドメインは、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔ置換を有するヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである、実施形態４８に記載のタンパク質。
【０２９２】
実施形態５０：前記抗体Ｆｃドメインは、ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖと連結されている、実施形態４９に記載のタンパク質。
【０２９３】
実施形態５１：前記Ｆｃドメインは、Ｋ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗ置換を有するヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである、実施形態４８に記載のタンパク質。
【０２９４】
実施形態５２：前記Ｆｃドメインは、前記第二抗原結合部位と連結されている、実施形態５１に記載のタンパク質。
【０２９５】
実施形態５３：配列番号１６２のアミノ酸配列を含む、実施形態１から３３及び４６から５２のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０２９６】
実施形態５４：配列番号１６２、配列番号１６３、及び配列番号１６５のアミノ酸配列を含む、実施形態１から３３及び４６から５２のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０２９７】
実施形態５５：配列番号１６２のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１から３３及び４６から５２のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０２９８】
実施形態５６：配列番号１６２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１から３３及び４６から５２のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０２９９】
実施形態５７：配列番号１６２のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１から３３及び４６から５２のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０３００】
実施形態５８：配列番号１６２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み、さらに配列番号１６３及び配列番号１６５を含む、実施形態１から３３及び４６から５２のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０３０１】
実施形態５９：前記タンパク質は、表面プラズモン共鳴により測定した場合、ＮＫＧ２Ｄに２〜１２０ｎＭのＫＤで結合する、実施形態１から５８のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０３０２】
実施形態６０：前記タンパク質は、結合に際して、ナチュラルキラー細胞または細胞傷害性Ｔ細胞を活性化する、実施形態１から５９のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０３０３】
実施形態６１：先行する実施形態のいずれか１つに記載のタンパク質及び薬学上許容されるキャリアを含む、配合物。
【０３０４】
実施形態６２：実施形態１から６０のいずれか１つに記載のタンパク質をコードする核酸を１つまたは複数含む、細胞。
【０３０５】
実施形態６３：腫瘍における細胞死の増大方法であって、ナチュラルキラー細胞または細胞傷害性Ｔ細胞の存在下、前記腫瘍を実施形態１から６０のいずれか１つに記載のタンパク質と接触させることを含む、前記方法。
【０３０６】
実施形態６４：対象におけるがんの治療方法であって、前記対象に、実施形態１から６０のいずれか１つに記載のタンパク質または実施形態６１に記載の配合物を投与することを含む、前記方法。
【０３０７】
実施形態６５：前記がんは、多発性骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、及び急性骨髄性白血病からなる群より選択される、実施形態６４に記載の方法。
【０３０８】
実施形態６６：前記がんは、ＢＣＭＡを発現する、実施形態６４または６５に記載の方法。
【０３０９】
実施形態６７：細胞傷害性Ｔ細胞の刺激法であって、前記細胞傷害性Ｔ細胞を実施形態１から６０のいずれか１つに記載のタンパク質と接触させることを含む、前記方法。
実施形態６８：ナチュラルキラー細胞の刺激法であって、前記ナチュラルキラー細胞を実施形態１から６０のいずれか１つに記載のタンパク質と接触させることを含む、前記方法。
【０３１０】
参照による援用
本明細書中言及される特許文書及び科学論文はそれぞれの全開示が、あらゆる目的で参照として援用される。
【０３１１】
等価物
本発明は、その趣旨または本質的特徴から逸脱することなく、他の具体的な形態で実現される可能性がある。したがって、上記の実施形態は、全ての側面において、本明細書中記載される本発明を限定するのではなく例示であると見なされるべきである。すなわち、本発明の範囲は、上記の説明によってではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と等価である意義及び範囲内に含まれる全ての変更は、特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図１】
2021533169.tif 000033
【図２】
2021533169.tif 000034
【図３】
2021533169.tif 000035
【図４】
2021533169.tif 000036
【図５】
2021533169.tif 000037
【図６】
2021533169.tif 000038
【図７】
2021533169.tif 000039
【図８】
2021533169.tif 000040
【図９】
2021533169.tif 000041
【図１０】
2021533169.tif 000042
【図１１】
2021533169.tif 000043
【図１２】
2021533169.tif 000044
【図１３Ａ】
2021533169.tif 000045
【図１３Ｂ】
2021533169.tif 000046
【図１３Ｃ】
2021533169.tif 000047
【図１３Ｄ】
2021533169.tif 000048
【図１３Ｅ】
2021533169.tif 000049
【図１３Ｆ】
2021533169.tif 000050
【図１４】
2021533169.tif 000051
【図１５】
2021533169.tif 000052
【図１６】
2021533169.tif 000053
【手続補正書】
【提出日】令和3年4月30日(2021.4.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021533169000001.app
【国際調査報告】
2021533169.tif 000054
2021533169.tif 000055