(57)【要約】  本発明は、一般式（I）の化合物に関する（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は明細書中に規定される）。この化合物、および当該化合物を含む組成物は、高い血清安定性およびγδＴ細胞免疫応答の強力な活性化を示し、免疫療法における使用に好適である。また、本発明は、一般式（Ｉ）の化合物を用いる免疫療法の方法にも関する。【選択図】図13
2021529786.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
全ての互変異性体を含む一般式（Ｉ）の化合物またはその塩： 
2021529786.tif 000009
式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、一般式（ＩＩ）のアミノ酸エステル基または一般式（ＩＩＩ）のアリールオキシ基を表し、
2021529786.tif 000010
式中、Ｒ６は、Ｈ、または、飽和もしくは不飽和の、任意に置換されていてもよい炭化水素鎖を表し；Ｒ７は、飽和または不飽和の、任意に置換されていてもよい炭化水素鎖を表し；Ｒ８は、任意に置換されていてもよいＣ5-25アリールまたは５〜２５員のヘテロアリール基を表し；
Ｒ３は、任意に置換されていてもよいＣ2-20 アルキル基、Ｃ4-20アルケニル基またはＣ2-20アルコール基を表し；Ｒ４およびＲ５の各々は、独立してＨまたはハロを表す。
【請求項２】
前記化合物が一般式（ＩＶ）で表され、
2021529786.tif 000011
式中、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は請求項１に定義されるとおりである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ３が、式（Ｖ）、式（ＶＩ）または式（ＶＩＩ）の基であり、 
2021529786.tif 000012
式中、Ｒ９は、ＯＨ、ＯＲ10、ＳＨ、ＳＲ10、ＮＨ2またはＮＨＲ10から選択され；Ｒ10は、Ｃ1-4 アルキルを表す、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ９がＯＨである、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ４およびＲ５の少なくとも一方、好ましくは両方がハロを表す、請求項１〜４のいずれか１に記載の化合物。
【請求項６】
前記ハロ置換基がフルオロ基である、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ６がＣ1-4アルキル鎖である、請求項１〜６のいずれか１に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ７が非置換Ｃ1-4アルキル鎖または非置換ベンジル基である、請求項１〜７のいずれか１に記載の化合物。
【請求項９】
以下の群から選択される、請求項１に記載の化合物。
2021529786.tif 000013
2021529786.tif 000014
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１に記載の化合物と、薬学的に許容される賦形剤または担体とを含む、医薬組成物。
【請求項１１】
免疫療法に使用するための、請求項１〜９のいずれか１に記載の化合物、または請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
感染症、増殖性疾患または骨粗鬆症の治療に使用するための、請求項１１に記載の化合物または医薬組成物。 
【請求項１３】
前記増殖性疾患が癌である、請求項１２に記載の使用のための化合物または医薬組成物。
【請求項１４】
γδＴ細胞免疫反応を活性化するために、請求項１〜９のいずれか１に記載の化合物または請求項１０に記載の医薬組成物の有効量を患者に投与することを含む、免疫療法の方法。 
【請求項１５】
治療を必要とする個体から取得したサンプルに前記化合物または組成物を生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で投与し、当該サンプルが体内に戻される前にγδＴ細胞の増殖を誘導する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
感染症、増殖性疾患または骨粗鬆症を治療するための、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記増殖性疾患が癌である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
患者においてγδＴ細胞免疫反応を活性化する薬剤の調製における、請求項１〜９のいずれか１に記載の化合物または請求項１０に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１９】
患者における感染、増殖性疾患または骨粗鬆症の治療のための薬剤の調製における、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記増殖性疾患が癌である、請求項１９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高い血清安定性およびγδＴ細胞免疫応答の強力な活性化を示すホスホアンチゲン（ＰＡｇ）プロドラッグ化合物および医薬組成物に関する。化合物および組成物は、免疫療法、特に感染症、癌、骨粗鬆症および他の増殖性疾患の治療に使用するためのものである。また、γδＴ細胞免疫反応を活性化するために、本発明の化合物または組成物を使用することを含む免疫療法も提供される。
【背景技術】
【０００２】
現在、成人末梢血におけるヒトγδＴ細胞の出生から優勢なサブタイプまで、Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞は現在、結核、らい、腸チフス、マラリア、およびトキソプラズマ（非特許文献１）などの多くの疾患との闘いに関与するγδＴ細胞の重要なサブセットとして確立されている。霊長類モデルにおける研究はまた、Mycobacterium tuberculosis（非特許文献２）に対する免疫におけるＶγ９／Ｖδ２Ｔ細胞に関与している。これらの細胞はまた、インビトロで多様なガン細胞を標的化し、溶解することができることを示している（非特許文献１）。合わせて、これらの観察は、Ｖγ９／Ｖδ２サブセットを、γδＴ細胞の治療的利用において主要な焦点とした（非特許文献３）。 
【０００３】
現在までに、Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞の多数の小分子アクチベーターが報告されている。これらの中には、天然に存在するＰＡｇ（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチルブト−２−エニルピロリン酸（ＨＭＢＰＰ）およびイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）、ならびに２つの合成分子、リセドロネートおよびゾレドロネート（図１）があり、これらは現在、骨粗鬆症およびいくつかの型の癌（非特許文献４〜６）を処置するために臨床において使用されている。
【０００４】
今日までに報告された最も強力なＶγ９／Ｖδ２Ｔ細胞活性化因子はＨＭＢＰＰ、ＥＣ50 ＝ ０．０００５１μＭであり、これは、１型膜貫通蛋白質ブチロフィリン３Ａ１を結合することによってこれらのＴ細胞を活性化する。これらのＰＡｇの結合部位はこの膜貫通タンパク質の細胞外ドメインまたは細胞内ドメインと結合するかどうかに関して相反する報告がある中で不明のままであったが、現在ではＨＭＢＰＰがブチロフィリン３Ａ１の細胞内Ｂ３０．２ドメインと結合するという概念を支持する説得力のある証拠がある。
【０００５】
Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞の活性化におけるＨＭＢＰＰの効力によって促進されて、アリールオキシトリエステルホスホラミデートプロドラッグテクノロジーは、近年、その薬物様特性を改善するための手段として、ＨＭＢＰＰのモノホスフェート誘導体、すなわちＨＭＢＰに適用された（非特許文献６）。このプロドラッグアプローチでは、モノホスフェート基はアリール基および／またはアミノ酸エステルによってマスクされ（図２）、これらは両方とも細胞内で酵素的に切断されてモノホスフェートまたはモノホスホネート種を放出する。そのような化合物はＰＡｇのプロドラッグであるので、それらは、ヌクレオチドのプロドラッグであるＰｒｏＴｉｄｅｓからそれらを区別するためにＰｒｏＰＡｇｅｎｓと呼ばれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Morita, C. T.; Jin, C.; Sarikonda, G.; Wang, H. Nonpeptide antigens, presentation mechanisms, and immunological memory of human Vgamma2Vdelta2 T cells: discriminating friend from foe through the recognition of prenyl pyrophosphate antigens. Immunol Rev 2007, 215, 59-76.
【非特許文献２】Shen, Y.; Zhou, D.; Qiu, L.; Lai, X.; Simon, M.; Shen, L.; Kou, Z.; Wang, Q.; Jiang, L.; Estep, J.; Hunt, R.; Clagett, M.; Sehgal, P. K.; Li, Y.; Zeng, X.; Morita, C. T.; Brenner, M. B.; Letvin, N. L.; Chen, Z. W. Adaptive immune response of Vgamma2Vdelta2+ T cells during mycobacterial infections. Science (New York, N.Y.) 2002, 295, 2255-8.
【非特許文献３】Fisher, J. P.; Heuijerjans, J.; Yan, M.; Gustafsson, K.; Anderson, J. gammadelta T cells for cancer immunotherapy: A systematic review of clinical trials. Oncoimmunology 2014, 3, e27572
【非特許文献４】Maraka, S.; Kennel, K. A. Bisphosphonates for the prevention and treatment of osteoporosis. BMJ (Clinical research ed.) 2015, 351, h3783.
【非特許文献５】Roelofs, A. J.; Jauhiainen, M.; Monkkonen, H.; Rogers, M. J.; Monkkonen, J.; Thompson, K. Peripheral blood monocytes are responsible for gammadelta T cell activation induced by zoledronic acid through accumulation of IPP/DMAPP. British journal of haematology 2009, 144, 245-50.
【非特許文献６】Davey, M. S.; Malde, R.; Mykura, R. C.; Baker, A. T.; Taher, T. E.; Le Duff, C. S.; Willcox, B. E.; Mehellou, Y. Synthesis and Biological Evaluation of ( E)-4-Hydroxy-3-methylbut-2-enyl Phosphate (HMBP) Aryloxy Triester Phosphoramidate Prodrugs as Activators of Vgamma9/Vdelta2 T-Cell Immune Responses. J Med Chem 2018, 61, 2111-2117.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これらのHMBP ProPAgensはＶγ９／Ｖδ２Ｔ細胞（ＥＣ50 ＝ ０．４５〜１１ ｎＭ）の強力な活性化を示したが、主にこれらの活性化合物の‐Ｐ‐Ｏ結合の切断のために、それらの血清安定性はかなり低かった（非特許文献６）。従って、本発明の目的は以前に報告されたHMBP ProPAgens活性化合物の貧弱な血清安定性に対処しながら、Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞の強力な活性化を保持する代替のＰｒｏＰＡｇｅｎｓを設計することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第１の態様によれば、その全ての互変異性体を含む一般式（Ｉ）の化合物またはその塩が提供される。
【０００９】
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式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、一般式（ＩＩ）のアミノ酸エステル基または一般式（ＩＩＩ）のアリールオキシ基を表し、
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式中、Ｒ６は、Ｈ、または、飽和もしくは不飽和の、任意に置換されていてもよい炭化水素鎖を表し；Ｒ７は、飽和または不飽和の、任意に置換されていてもよい炭化水素鎖を表し；Ｒ８は、任意に置換されていてもよいＣ5-25アリールまたは５〜２５員のヘテロアリール基を表し；
Ｒ３は、任意に置換されていてもよいＣ2-20 アルキル基、Ｃ4-20アルケニル基またはＣ2-20アルコール基を表し；Ｒ４およびＲ５の各々は、独立してＨまたはハロゲン原子を表す。
【００１０】
上述した従来のリン酸基含有プロＰＡｇｅｎとは対照的に、一般式（Ｉ）の化合物はアリール基および／またはアミノ酸エステル基によってマスクされるホスホネート基を含み、これは、活性ホスホネート化合物を放出するために細胞内部で酵素的に切断される。不安定な−Ｏ−Ｐ結合を−Ｃ−Ｃ結合で置換すると、活性ホスホネート化合物の安定性が有意に改善されることが示されており、これはＶγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞の強力な活性化因子であることが示された。さらに、この活性はin vitroで膀胱癌細胞の強力な溶解に翻訳された。 
一般式（Ｉ）の化合物は高い特異性でＶγ９／Ｖδ２Ｔ細胞を活性化することが示されているので、それらは免疫療法剤としての開発のための理想的な候補である。特に、一般式（Ｉ）の化合物は、感染症、癌などの増殖性疾患、および／または骨粗鬆症の治療に有用である。
【００１１】
Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞活性化免疫療法による治療に適した感染症には、細菌、ウイルスおよび真菌感染がある。特に適切な感染は、細菌感染、特にＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属および／またはSalmonella enterica種の細菌感染である。したがって、一般式（Ｉ）の化合物は、結核、ハンセン病および腸チフスの１つ以上の治療に特に有用である。
【００１２】
あるいは、感染は寄生虫感染である可能性がある。特に好適な寄生虫感染は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ属および／またはＴｏｘｏｐｌａｓｍａ属のものである。したがって、一般式（Ｉ）の化合物は、マラリアおよびトキソプラズマ症の一方または両方の治療に特に有用である。
【００１３】
一般式（Ｉ）の化合物は、癌、特に膀胱癌、前立腺癌、肺癌、頸癌、皮膚癌および乳癌ならびに中皮腫の治療に特に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、報告されている小分子Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞活性化因子の化学構造である。
【図２】図２は、アリールオキシトリエステルホスホラミデートプロドラッグ技術のＨＭＢＰＰ(ＨＭＢＰ)のモノホスフェート誘導体への適用である。
【図３】図３は、リン酸基および異なるホスホン酸基のｐＫＡ値である。
【図４】図４Ａは、ＨＭＢＰメチルホスホネート（４ａ〜ｄ）のアリールオキシホスファラミデートプロＰＡｇｅｎ；および、図４Ｂは、ＨＭＢＰジフルオロメチルホスホネート（９ａ〜ｄ）の合成である。
【図５】図５は、ヒト血清中のＨＭＢＰホスホネートＰｒｏＰＡｇｅｎ ４ｄの安定性（３７℃、１２時間）を31 P NMRでモニターしたスペクトルである。
【図６】図６は、ヒト血清中のＨＭＢＰホスホン酸プロＰＡｇｅｎ ９ａの３７℃で１２時間の安定性を、31 P NMRでモニターしたスペクトルである。
【図７】図７は、ＨＭＢＰホスホネートＰｒｏＰＡｇｅｎｓ ４ｄおよび９ｄによるヒトＶγ９／Ｖδ２+ Ｔ細胞の活性化。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、示された濃度のＰｒｏＰＡｇｅｎｓ ４ｄ（左）および９ｄ（右）と共に１８時間インキュベートした結果である。
【図８】図８は、ヒトＶγ９／Ｖδ２+ Ｔ細胞がＨＭＢＰホスホネートＰｒｏＰＡｇｅｎ ４ｄによって用量依存的に活性化されることを示すＦＡＣＳデータである。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、示された濃度のＰｒｏＰＡｇｅｎｓ ４ｄと共に１８時間（図８Ａ）または２０時間（図８Ｂおよび８Ｃ）インキュベートした結果。
【図９】図９は、ヒトＶγ９／Ｖδ２+ Ｔ細胞がＨＭＢＰホスホネートＰｒｏＰＡｇｅｎ ９ｄによって用量依存的に活性化されることを示すＦＡＣＳデータ。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、示された濃度のＰｒｏＰＡｇｅｎｓ ９ｄと共に１８時間（図９Ａ）または２０時間（図９Ｂおよび９Ｃ）インキュベートした結果。
【図１０】図１０は、ＨＭＢＰＰによるヒトＶγ９／Ｖδ２+Ｔ細胞の活性化を用量依存的に示した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、示された濃度のＨＭＢＰＰと共に２０時間インキュベートした結果である。データを収集し、２つの別々のドナーから個別に分析した：図１０Ａに示すドナー（１）の結果、図１０Ｂに示すドナー（２）の結果。
【図１１】図１１は、ＨＭＢＰホスホネートＰｒｏＰＡｇｅｎ ４ｄによるヒトＣＤ８+ T細胞の活性化の欠如を示すＦＡＣＳデータである。データを収集し、２つの別々のドナーから個別に分析した：図１１Ａに示すドナー（１）の結果、図１１Ｂに示すドナー（２）の結果。
【図１２】図１２は、ＨＭＢＰホスホネートＰｒｏＰＡｇｅｎ ９ｄによるヒトＣＤ８+ T細胞の活性化の欠如を示すＦＡＣＳデータである。データを収集し、２つの別々のドナーから個別に分析した：図１２Ａに示すドナー（１）の結果、図１２Ｂに示すドナー（２）の結果。
【図１３】図１３は、ＨＭＢＰホスホネートＰｒｏＰＡｇｅｎ ４ｄとのインキュベーション後に膀胱癌細胞の強力な溶解を示す細胞傷害性アッセイの結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書で使用される「ハロ」という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨード、より適切には、フルオロまたはクロロ、および、最も適切には、フルオロを意味する。
【００１６】
本明細書で使用される「Ｃ2-20 アルキル」という語は、２〜２０個の炭素原子を含む直鎖または分枝鎖の飽和炭化水素鎖を指す。例としては、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−オクチルおよびｎ−デシルが挙げられる。
【００１７】
本明細書で使用される「Ｃ4-20アルケニル」という語は、４〜２０個の炭素原子を含む直鎖または分枝鎖不飽和炭化水素鎖を指す。例としては、ブテニル、ペンテニルなどが挙げられる。
【００１８】
本明細書で使用される「Ｃ2-20アルコール」という語は２〜２０個の炭素原子を含み、１つ以上の水酸基（ＯＨ）官能基を含む、直鎖または分枝鎖および飽和または不飽和炭化水素鎖を指す。
【００１９】
本明細書で使用される「飽和または不飽和炭化水素鎖」という用語は、前記鎖内に１つ以上の二重結合または三重結合を含んでも含まなくてもよい脂肪族または芳香族炭化水素基を指す。したがって、この用語は、アルキル、アルケニルアルキニルまたはアリール基をカプセル化する。
【００２０】
本明細書で使用される「Ｃ5-25アリール」という語は５〜２５個の炭素原子を含み、１つ以上の炭素環式芳香族環を含む任意の炭化水素基を指す。より適切には、アリール基はＣ6-14であり、好ましくはＣ6-10アリール基である。
【００２１】
本明細書で使用される「ヘテロアリール」という用語は前記環の一部として１つ以上のヘテロ原子（例えば、Ｎ、ＯまたはＳ）を含む１つ以上の芳香族環を含む任意の炭化水素基を指す。ヘテロアリール基の特に適切な例は、ピリジン、フラン、チオフェンおよびインドール基である。５〜２５員ヘテロアリール基とは、環形成原子（炭素およびヘテロ原子）の総数が５〜２５である基をいう。
【００２２】
他のアルキル基、アルケニル基、アリール基および／またはアルコール基は定義される通りであるが、異なる数の炭素原子を有する。例えば、Ｃ1-4アルキルは、１〜４個の炭素原子を有する。
【００２３】
炭化水素鎖および／またはアリール、ヘテロアリール、アルキル、アルケニルまたはアルコール基は、任意に、１つ以上のヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｓ、またはＮ）含有官能基で置換されていてもよい。適切なヘテロ原子含有基の例としてはニトロ、ニトロン、ハロ、アミノ、アミド、シアノ、カルボキシル、スルホニル、ヒドロキシル、アルコキシ、ケトン、アルデヒド、チオール、チオエーテル、および非芳香族複素環基が挙げられるが、これらに限定されない。炭化水素鎖は飽和または不飽和環状環を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。本明細書中で使用される場合、炭化水素鎖、アルキル、アルケニル、アリールまたはアルコールラジカルの任意の炭素数は、置換基中に存在する任意の炭素原子を含む。好ましい実施形態では炭化水素鎖および／またはアリール、ヘテロアリール、アルキル、アルケニルまたはアルコール基はチオール、チオエーテル、アルコキシおよびアミノ（第一級または第二級アミノ基であってもよい）から選択される１つ以上のヘテロ原子含有官能基で任意に置換される。
【００２４】
一般式（Ｉ）の化合物の塩は、適切には薬学的または獣医学的に許容される塩である。Ｒ1〜Ｒ8の種類に応じて、これらは、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アルミニウム塩、亜鉛塩、マグネシウム塩および他の金属塩、ならびにコリン塩、ジエタノールアミン塩、エタノールアミン塩、エチルジアミン塩、メグルミン塩、およびＰａｕｌｅｋｕｈｎら（２００７)Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５０： ６６６５−６６７２に要約されているような他の周知の塩基性付加塩および／または当業者に公知である塩基性付加塩であってもよい。あるいは、一般式（Ｉ）の化合物がアミノ基を含む場合、これを４級化してハロゲン化物、水酸化物、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、コハク酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩およびｐ−トルエンスルホン酸塩などの対イオンを有する塩を形成することができる。
【００２５】
一般式（Ｉ）による化合物の好ましいサブセットにおいて、ホスホネート基は、アミノ酸エステルおよびアリール基によってマスクされる。このような化合物は一般式（ＩＶ）のものであり、式中、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、上記で定義した通りである：
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一般式（Ｉ）または一般式（ＩＶ）のいくつかの化合物において、Ｒ３は、Ｃ4-16であり、好ましくはＣ4-8、アルキル、アルケニルまたはアルコール基である。より好ましくは、Ｒ３は上記定義のアルコール基である。
【００２６】
特に好ましい化合物において、Ｒ３は、式（Ｖ）、式（ＶＩ）または式（ＶＩＩ）による基であり、式中、Ｒ９はＯＨ、ＯＲ10、ＳＨ、ＳＲ10、ＮＨ2またはＮＨＲ10から選択され、好ましくはＯＨであり、Ｒ10は、Ｃ1-4 アルキルを表す：
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これらのＲ３置換基は、天然に存在するPAgsIPP(式（Ｖ））、ＨＭＢＰＰ(式（ＶＩ））およびＩＰＰ異性体ジメチルアリルジホスフェートＤＭＡＰＰ（式（ＶＩＩ）に見出されるものに類似している。
【００２７】
特に好ましい態様において、Ｒ３は、式（ＶＩ）の基である。
【００２８】
上記のように、一般式（Ｉ）または一般式（ＩＶ）の化合物は、−Ｃ（Ｒ４）（Ｒ５）−Ｐｂｏｎｄを含むマスクされたホスホネート基を含み、これは、従来のＰｒｏＰＡｇｅｎｓの−Ｏ−Ｐｂｏｎｄよりも安定であることが示されている。好ましい実施形態では、Ｒ３およびＲ５の少なくとも１つ、より好ましくは両方がハロを表す。
【００２９】
-O-P結合から−ＣＨ2 −Ｐ結合への変化により、活性物質の安定性が向上することが示されているが、ホスホネート基の２回目の脱プロトネーション（pKa＝７．４９）のpKa値はリン酸基のもの（pKa＝６．３１）と大きく異なっている（図３）。この結果、生理的ｐＨ(＜７．４）下での活性化合物の完全なイオン化、したがって標的タンパク質に対する結合親和性に影響を及ぼし、これは、ブチロフィリン３Ａ１細胞内ドメイン上の正に荷電したポケット（アルギニンリッチ）に結合するためにリン酸基の完全なイオン化を必要とする。
【００３０】
しかしながら、ジフルオロメチルホスホネート（−ＣＦ2−Ｐ−）結合を提供することにより、活性化合物は、生理学的環境での優れた安定性と、天然のリン酸化合物自身の２回目の脱プロトン化に非常に近い２回目の脱プロトン化のpKa（６．７）とを結合させることが分かった（図３）。したがって、一般式（Ｉ）または（ＩＶ）の化合物のモノおよび／またはジハロメチルホスホネート誘導体は、優れた安定性をＶγ９／Ｖδ２Ｔ細胞の強力な活性化と組み合わせる。
【００３１】
一般式（Ｉ）または（ＩＶ）の化合物は、モノホスホネート基がアリール基および／またはアミノ酸エステルによってマスクされているプロドラッグであり、これらは両方とも細胞内で酵素的に切断されて活性モノホスホネート種を放出する。
【００３２】
適切なアミノ酸エステルマスキング基には、多種多様なアミノ酸側鎖（Ｒ６）基が含まれる。典型的には、Ｒ６は、タンパク質産生アミノ酸の側鎖、好ましくは非極性側鎖である。特に好ましいＲ６基は、Ｃ1-4アルキル鎖を含む。このようなＲ６群の事例としては、−ＣＨ3 （アラニン）、−ＣＨ（ＣＨ3）2（バリン）、−ＣＨ2 ＣＨ（ＣＨ3）2（ロイシン）、−ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2 ＣＨ3（アイソルーチン）および−ＣＨ2 ＣＨ2 ＳＣＨ3（メソニン）がある。Ｒ６がメチル（ＣＨ3）を表す化合物が特に好適である。
【００３３】
Ｒ７は、飽和または不飽和であり、任意に置換されていてもよい炭化水素鎖であり、脂肪族または芳香族であってもよい。好ましくは、Ｒ７は、Ｃ1-6のアルキルまたはＣ6-14のアリールグループである。特に好ましい実施形態では、Ｒ７は、Ｃ6-10アリール基であり、最も好ましくはベンジル基である。ベンジルエステルを含む一般式（Ｉ）または（ＩＶ）の化合物は、脂肪族エステル系化合物と比較して、より高い分解速度および改善された親油性（したがって、改善された細胞取り込み）を有する。
【００３４】
特に好適な一般式（ＩＶ）の化合物には、以下の化合物が含まれる：
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2021529786.tif 000008
本発明の第１の態様の化合物は一般に、医薬組成物の一部として投与されることが理解されるのであろう。したがって、本発明の第２の態様によれば、本発明の第１の態様の化合物および薬学的に許容される賦形剤または担体を含む医薬が提供される。
【００３５】
適切な医薬賦形剤は、当業者に周知である。医薬組成物は任意の適切な経路、例えば、経口、直腸、経鼻、気管支（吸入）、局所（点眼剤、口腔および舌下を含む）、膣または非経口（皮下、筋肉内、静脈内および皮内を含む）投与によって投与するために製剤化することができ、薬学分野で周知の任意の方法によって調製することができる。
【００３６】
組成物は、本発明の第１の態様の化合物を担体と混合させることによって調製することができる。一般に、製剤は、前記化合物を液体担体または微細に分割された固体担体またはその両方と均一かつ緊密に会合させ、次いで必要に応じて生成物を成形することによって調製される。
【００３７】
本発明における経口投与のための製剤は、それぞれ所定量の化合物を含有するカプセル、小袋または錠剤などの別個の単位として；粉末または顆粒として；水性液体または非水性液体中の化合物の溶液または懸濁液として；または水中油型液体エマルジョンまたは油中水型液体エマルジョンとして；またはボーラスなどとして提供され得る。
【００３８】
経口投与用の組成物（例えば、錠剤およびカプセル剤）については、用語「許容される担体」は一般的な賦形剤などのビヒクルを含み、例えば、結合剤、例えば、シロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、ポリビニルピロリドン（ポビドン）、メチルセルロース、エチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロースおよびデンプン；充填剤および担体、例えば、トウモロコシデンプン、ゼラチン、ラクトース、スクロース、微結晶セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸二カルシウム、塩化ナトリウムおよびアルギン酸；ならびに滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウムおよび他の金属ステアリン酸塩、グリセロールステアリン酸、ステアリン酸、シリコーン流体、タルクワックス、油およびコロイダルシリカを含む。ペパーミント、ウィンターグリーン油、チェリーフレーバーなどのフレーバー剤を使用することもできる。投薬形態を容易に同定可能にするために着色剤を添加することが望ましい場合がある。錠剤はまた、当該分野で周知の方法によってコーティングされ得る。
【００３９】
錠剤は任意選択で１つまたは複数の補助成分と共に、圧縮または成形によって作製することができる。圧縮錠剤は、適当な機械で、化合物を粉末または顆粒のような自由流動形態で、場合により結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、防腐剤、界面活性剤または分散剤と混合して圧縮することによって調製することができる。成形錠剤は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化合物の混合物を適切な機械で成形することによって製造することができる。錠剤は、必要に応じて、コーティングされ得るか、または刻み目が付けられ得、そして活性薬剤の徐放または制御放出を提供するように処方され得る。
【００４０】
経口投与に適した他の製剤には、活性剤を風味付けされた基剤、通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガント中に含むロゼンジ；活性剤を不活性基剤、例えばゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシア中に含むパステル；および活性剤を適当な液状担体中に含むマウスウォッシュが含まれる。
【００４１】
経口製剤は、一般に無菌である。
【００４２】
皮膚への局所適用のために、組成物は、クリーム、軟膏、ゼリー、溶液または懸濁液などに調製され得る。薬物に使用することができるクリームまたは軟膏製剤は例えば、英国薬局方などの薬学の標準的教科書に記載されているような、当技術分野で周知の従来の製剤である。
【００４３】
本発明のこの局面の好ましい実施形態において、組成物は、経口送達のために処方される。
【００４４】
治療的に有効である本明細書に定義される組成物の正確な量、およびそのような化合物が最良に投与される経路は、当業者によって容易に決定される。そのような量は、もちろん、治療される特定の状態、状態の重症度、年齢、身体状態、サイズおよび体重を含む個々の患者のパラメータ、治療の持続時間、同時治療の性質（もしあれば）、特定の投与経路、および医療従事者の知識および専門知識内の同様の因子に依存する。これらの因子は当業者に周知であり、日常的な実験のみで対処することができる。一般に、個々の成分またはそれらの組み合わせの最大用量、すなわち、健全な医学的判断による最高安全用量が使用されることが好ましい。しかし、患者は医学的理由、心理学的理由、または実質的に任意の他の理由のために、より低い用量または許容用量を主張し得ることが、当業者によって理解される。
【００４５】
患者に投与される本発明の化合物または組成物の用量は、異なるパラメータに従って、特に使用される投与様式および被験体の状態に従って選択され得る。他の因子には、所望の治療期間が含まれる。患者における応答が適用される最初の用量で不十分である場合、より高い用量（または異なる、より局所化された送達経路による、事実上より高い用量）が患者の寛容が許容する程度まで使用され得る。
【００４６】
上述のように、本発明の第１の局面の化合物は、Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞の高度に安定な強力なアクチベーターのプロドラッグを表す。したがって、本発明の第３の態様によれば、免疫療法に使用するための、第１の態様の化合物または第２の態様の医薬組成物が提供される。特に、すでに上記に示したように、化合物または組成物は感染、増殖性疾患（例えば、癌および／または骨粗鬆症）の処置における使用のためのものである。
【００４７】
第４の態様によれば、本発明は免疫療法の方法に及ぶものであり、この方法はγδＴ細胞免疫反応を活性化するために、第１の態様による化合物または第２の態様による医薬組成物の有効量を投与することを含む。
【００４８】
好ましい方法において、本発明の化合物または医薬組成物は、任意の適切な手段によって、そのような処置を必要とする患者に投与される。理解されるように、このようにしてγδＴ細胞免疫反応の活性化が生体内で起こり、免疫反応をもたらす。
【００４９】
あるいは、治療を必要とする個体から取得したサンプルに前記化合物または組成物を生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で投与し、当該サンプルが体内に戻される前にγδＴ細胞の増殖を誘導することを含むことができる、ｅｘ  ｖｉｖｏ方法が提供される。例えば、前記サンプルは個体由来の血液サンプル由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のサンプルを含み（これに限定されるものではないが）、ここで、化合物または組成物の投与は前記個体の体内に戻る前にγδＴ細胞の増殖および活性化がもたらされる。
【００５０】
免疫療法の方法は、感染症、増殖性疾患または骨粗鬆症を治療するために実施され得る。特に、本方法は癌、特に膀胱癌の治療、および／または以下の感染症：結核、らい、チフス、マラリア、およびトキソプラズマ症のいずれかの治療に使用され得る。
【００５１】
また、被験体における感染、癌もしくは他の増殖性疾患または骨粗鬆症の治療のための薬剤の調製における、第１の局面に従う化合物または第２の局面に従う医薬組成物の使用が提供される。
【００５２】
本発明のこの局面の好ましい実施形態において、前記患者は哺乳動物である。理想的には、前記哺乳動物はヒトである。
【００５３】
本明細書の説明および特許請求の範囲を通して、用語「含む」および「含む」、ならびに用語の変形、例えば「含む」および「含む」は「含むがこれに限定されない」を意味し、他の部分、添加剤、成分、整数またはステップを排除しない。本明細書の記載および特許請求の範囲を通して、単数形はその状況が他のことを要求していない限り、複数形を含む。特に、不定冠詞が使用される場合は本明細書がその状況が他のことを要求していない限り、単数だけでなく複数も意図していると理解されたい。
【００５４】
本明細書に引用された、任意の特許または特許出願を含む全ての参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。いかなる参考文献も先行技術を構成することは許可されない。さらに、先行技術のいずれも、当該技術分野における一般的な知識の一部を構成することを認めるものではない。
【００５５】
本発明の各局面の好ましい特徴は、他の局面のいずれかに関連して記載されるとおりであり得る。
【００５６】
本発明の他の特徴は、以下の実施例から明らかになるであろう。一般的に言えば、本発明は、本明細書（添付の特許請求の範囲および図面を含む）に開示された特徴の任意の新規なもの、または任意の新規な組み合わせに及ぶ。したがって、本発明の特定の態様、実施形態または例に関連して記載される特徴、整数、特性、化合物または化学部分は、本明細書に記載される任意の他の態様、実施形態または例に適合しない限り適用可能であると理解されるべきである。
【００５７】
さらに、特に断らない限り、本明細書に開示される任意の特徴は、同じまたは同様の目的を果たす代替の特徴によって置き換えられてもよい。
【実施例】
【００５８】
本発明は、以下の実施例および以下の図面を参照して、あくまで例示として記載される：
図１：報告されている小分子Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞活性化因子の化学構造：
天然に存在するＰＡｇｓ(Ｅ)‐４‐ヒドロキシ‐３‐メチルブト‐２‐エニルピロリン酸（ＨＭＢＰＰ）およびイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）；合成分子リセドロネートおよびゾレドロネート。
【００５９】
図２：アリールオキシトリエステルホスホラミデートプロドラッグ技術のＨＭＢＰＰ(ＨＭＢＰ)のモノホスフェート誘導体への適用：
モノホスフェート基はアリール基およびアミノ酸エステルによってマスクされ、これらは両方とも細胞内で酵素的に切断されて活性モノホスフェート種を放出する。不安定性は、これらの化合物の−Ｐ−Ｏｂｏｎｄの切断に起因して観察された（陰影）。 
図３：リン酸基および異なるホスホン酸基のｐＫＡ値。
【００６０】
図４：（Ａ）ＨＭＢＰメチルホスホネート（４ａ〜ｄ）のアリールオキシホスファラミデートプロＰＡｇｅｎ；および(Ｂ)ＨＭＢＰジフルオロメチルホスホネート（９ａ〜ｄ）の合成：
試薬および条件下:(ｉ)ＴＭＳＢｒ、ＤＣＭ、ｒｔ、２時間、次いで（ＣＯＣｌ）2、ＤＭＦカタログ、ＤＣＭ、ｒｔ、１８時間; ii) ａ．フェノール、Ｅｔ3 Ｎ、ＤＣＭ、−７８℃、３０分間、次いでｒｔ、３時間；ｂ．置換Ｌ−アラニンエステル塩酸塩、Ｅｔ3 Ｎ、ＤＣＭ、ｒｔ、１２時間、収率：３８〜６１％；（ｉｉ）２−メチル−２−プロペノール、１，４−ベンゾキノン、ホベイダ−グラブス触媒２生成、ＤＣＭ、ｒｔ、収率：５７〜６４%;(ｉｖ)ジエチル（ブロモジフルオロメチル）ホスホネート、ＤＭＦ、亜鉛粉末、ｒｔ、Ｎ2、３時間、次いでＣｕＢｒ、臭化アリル、ｒｔ、４０時間;(ｖ)(ｉ)ＴＭＳＢｒ、ＤＣＭ、ｒｔ、２時間、次いで（ＣＯＣｌ）2、ＤＭＦネコ、ＤＣＭ、ｒｔ、１８時間; ii)ａ．フェノール、Ｅｔ3 Ｎ、ＤＣＭ、−７８℃、３０分、ｒｔ、３時間；ｂ．置換Ｌ−アラニンエステル塩酸塩、Ｅｔ3 Ｎ、ＤＣＭ、ｒｔ、１２時間収率：２４〜４６%;(ｉｉｉ)２−メチル−２−プロペノール、１，４−ベンゾキノン、Ｈｏｖｅｙｄａ−Ｇｒｕｂｂｓ触媒第２世代、ＤＣＭ、ｒｔ、収率：５８〜６９％。 
図５：ヒト血清中のＨＭＢＰホスホネートＰｒｏＰＡｇｅｎ ４ｄの安定性（３７℃、１２時間）を31 P NMRでモニターした：
プロドラッグ４ｄ（５．０ｍｇ）をＤＭＳＯ−ｄ6（０．１０ｍＬ）およびＤ2 Ｏ（０．１５ｍＬ）に溶解した。全ての31 P NMRスペクトルを３７℃で記録した。最初に、ＤＭＳＯ−ｄ6（０．１０ｍＬ）およびＤ2 Ｏ（０．１５ｍＬ）中のプロドラッグ４ｄ（５．０ｍｇ）の31 P NMR走査を記録した（化合物４ｄ単独として図示）。これに続いて、予め解凍したヒト血清（０．３０ｍＬ）をＮＭＲチューブに添加し、直ちにスペクトルを測定した。スペクトルは、添加後３０分で、次いで１２時間にわたる均等な時間隔で記録した。
【００６１】
図６：ヒト血清中のＨＭＢＰホスホン酸プロＰＡｇｅｎ ９ａの３７℃で１２時間の安定性を、31 P NMRでモニターした：
上記化合物４ｄと同じである。プロドラッグ９ａの31 P NMRは、フッ素−リン間の結合のために６つのリンピークを示す。実際、これらは、予測されるような８つのピークであり、これらのピークにズームして、このような化合物の予測される８つのリンピークを作ると、２つの余分なピークが見られる。
【００６２】
図７.ＨＭＢＰホスホネートＰｒｏＰＡｇｅｎｓ ４ｄおよび９ｄによるヒトＶγ９／Ｖδ２+ Ｔ細胞の活性化：
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、示された濃度のＰｒｏＰＡｇｅｎｓ ４ｄ（左）および９ｄ（右）と共に１８時間インキュベートした。次いで、Ｖγ９／Ｖδ２+ Ｔ細胞の活性化の読み出しとして、TCR Vγ９／Ｖδ２+ Ｔ細胞を、細胞表面マーカー、ＣＤ６９およびＣＤ２５のアップレギュレーションについて評価した。両ＰｒｏＰＡｇｅｎｓのＥＣ50は約８ ｐＭ(ピコモル）である。
【００６３】
図８.ヒトＶγ９／Ｖδ２+ Ｔ細胞がＨＭＢＰホスホネートＰｒｏＰＡｇｅｎ ４ｄによって用量依存的に活性化されることを示すＦＡＣＳデータ：
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、示された濃度のＰｒｏＰＡｇｅｎｓ ４ｄと共に１８時間（図８Ａ）または２０時間（図８Ｂおよび８Ｃ）インキュベートした。２０時間のインキュベーションの間、データを収集し、２つの別々のドナーから個別に分析した：図８Ｂに示すドナー（１）の結果、図８Ｃに示すドナー（２）の結果。次いで、Ｖγ９／Ｖδ２+ Ｔ細胞の活性化の読み出しとして、TCR Vγ９／Ｖδ２+ Ｔ細胞を、細胞表面マーカー、ＣＤ６９およびＣＤ２５のアップレギュレーションについて評価した。これの定量化を図７に示す。
【００６４】
図９.ヒトＶγ９／Ｖδ２+ Ｔ細胞がＨＭＢＰホスホネートＰｒｏＰＡｇｅｎ ９ｄによって用量依存的に活性化されることを示すＦＡＣＳデーター：
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、示された濃度のＰｒｏＰＡｇｅｎｓ ９ｄと共に１８時間（図９Ａ）または２０時間（図９Ｂおよび９Ｃ）インキュベートした。２０時間のインキュベーションの間、データを収集し、２つの別々のドナーから個別に分析した：図９Ｂに示すドナー（１）の結果、図９Ｃに示すドナー（２）の結果。次いで、Ｖγ９／Ｖδ２+ Ｔ細胞の活性化の読み出しとして、TCR Vγ９／Ｖδ２+ Ｔ細胞を、細胞表面マーカー、ＣＤ６９およびＣＤ２５のアップレギュレーションについて評価した。これの定量化を図７に示す。
【００６５】
図１０.ＨＭＢＰＰによるヒトＶγ９／Ｖδ２+Ｔ細胞の活性化を用量依存的に示した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、示された濃度のＨＭＢＰＰと共に２０時間インキュベートした：
データを収集し、２つの別々のドナーから個別に分析した：図１０Ａに示すドナー（１）の結果、図１０Ｂに示すドナー（２）の結果。次いで、Ｖγ９／Ｖδ２+ Ｔ細胞の活性化の読み出しとして、TCR Vγ９／Ｖδ２+ Ｔ細胞を、細胞表面マーカー、ＣＤ６９およびＣＤ２５のアップレギュレーションについて評価した。
【００６６】
図１１.ＨＭＢＰホスホネートＰｒｏＰＡｇｅｎ ４ｄによるヒトＣＤ８+ T細胞の活性化の欠如を示すＦＡＣＳデータ：
ヒトＰＢＭＣを、示された濃度のＰｒｏＰＡｇｅｎ ４ｄと共に２０時間インキュベートした。次いで、TCR CD８+ Ｔ細胞を、ＣＤ８+ Ｔ細胞の活性化の読み出しとして、細胞表面マーカー、ＣＤ６９およびＣＤ２５のアップレギュレーションについて評価した。データを収集し、２つの別々のドナーから個別に分析した：図１１Ａに示すドナー（１）の結果、図１１Ｂに示すドナー（２）の結果。
【００６７】
図１２.ＨＭＢＰホスホネートＰｒｏＰＡｇｅｎ ９ｄによるヒトＣＤ８+ T細胞の活性化の欠如を示すＦＡＣＳデータ：
ヒトＰＢＭＣを、示された濃度のＰｒｏＰＡｇｅｎ ９ｄと共に２０時間インキュベートした。次いで、TCR CD８+ Ｔ細胞を、ＣＤ８+ Ｔ細胞の活性化の読み出しとして、細胞表面マーカー、ＣＤ６９およびＣＤ２５のアップレギュレーションについて評価した。データを収集し、２つの別々のドナーから個別に分析した：図１２Ａに示すドナー（１）の結果、図１２Ｂに示すドナー（２）の結果。
【００６８】
図１３.ＨＭＢＰホスホネートＰｒｏＰＡｇｅｎ ４ｄとのインキュベーション後に膀胱癌細胞の強力な溶解を示す細胞傷害性アッセイ
ＰｒｏＰＡｇｅｎ ４ｄはＶγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞によるＴ２４膀胱癌細胞の特異的溶解を媒介する。ヒトＴ２４膀胱癌細胞株（標的）を、１０μＭのゾレドロネート、１００ ｐＭのＨＭＢＰＰまたは１００ ｐＭのＰｒｏＰＡｇｅｎ ４ｄと共に４時間インキュベートした後、培地中で５回洗浄し、予め増殖させたＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞と１０：１のエフェクター標的比で１８時間共培養した。
【００６９】
材料及び方法：
全ての試薬および溶媒は汎用または分析グレードのものであり、Sigma-Aldrich Ltd、Fisher Scientific、ＦｌｕｏｒｏｃｈｅｍまたはＡｃｒｏｓから購入した。31 Ｐ、1 Ｈおよび13 C NMRデータを、２０２、５００および１２５ＭＨｚで作動するブルーカーアバンスＤＰＸ５００分光計に記録した。化学シフト（δ）はｐｐｍで示され、Ｊ値はＨｚで示される。スペクトルデータを報告する際に、以下の略語を使用した: s(一重項）、ｄ（二重項）、ｔ（三重項）、ｑ（四重項）、ｄｄ(二重項の二重項）、ｔｄ(二重項の三重項）、およびｍ（多重項）。全ての反応を窒素雰囲気下で実施し、プレコートシリカプレート（キーゼルゲル６０ Ｆ２５４、ＢＤＨ）上の分析薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）でモニターした。化合物は紫外線（２５４ナノメートル）で照射することにより、またはＫＭｎＯＯＯＡ染色を使用し、続いて加熱することにより可視化した。フラッシュカラムクロマトグラフィーを、シリカゲル６０（２３０−４００網）（メルク）を用いて行った。質量スペクトル（ＨＲＭＳ）は、Cardiff UniversityのSchool of Chemistryによってサービスとして決定された。
【００７０】
実施例１：ＨＭＢＰメチルホスホネートのアリールオキシホスファラミデートＰｒｏＰＡｇｅｎｓの合成
Ｒ４およびＲ５がそれぞれＨを表す一般式（ＶＩ）の化合物を、グラブスオレフィンメタセシス（非特許文献７）を用いた合成法によって調製した。図４（Ａ）に概略的に要約されているＰｒｏＰＡｇｅｎｓ４Ａ〜ｄの合成は、市販のジエチル３−ブテニルホスホネート（１）をブロモトリメチルシラン（ＴＭＳＢｒ）で室温で処理してエトキシ基を除去することによって達成された（非特許文献８）。これに続いて、触媒量のＤＭＦの存在下で塩化オキサリルを用いて塩素化反応を行った。次に、この反応の生成物２を、トリエチルアミンの存在下で、次いで適切なアミノ酸エステルでフェノール処理して、中程度の収率（３８〜６１％）でホスホンアミデート３ａ〜ｄを得た。その後、これらの化合物は、１，４‐ベンゾキノンの存在下でＨｏｖｅｙｄａ‐Ｇｒｕｂｂｓ第二世代触媒を用いて２‐メチル‐２‐プロペノールによるＧｒｕｂｂｓオレフィンメタセシスを受けた。これにより、ＰｒｏＰＡｇｅｎｓ ４ａ〜ｄは良好な収率（５７〜６４％）のを得た（非特許文献９）。
【００７１】
ＰｒｏＰＡｇｅｎｓ ４ａ−ｄの合成において選択されるアミノ酸としてＬ−アラニンを使用したが、これは歴史的に最適な生物学的活性を示したためであり、一方、フェノールモチーフは２つのＦＤＡ認可薬物、ソホスブビルおよびテノホビルアラフェナミドの発見において首尾よく使用されたため、アリールオキシマスキング基について選択された。４つの異なったエステルモチーフをＰｒｏＰＡｇｅｎｓ‐４ａ：メチル（Ｍｅ）；４ｂ：イソプロピル（ｉＰｒ）；４c: tert‐ブチル（ｔＢｕ）；および４ｄ：ベンジル（Ｂｎ）の合成において選択したが、それはこれらが最低活性（ｔＢｕ）から最高活性（Ｂｎ）まで変化する様々な生物学的活性を示すからである（非特許文献６）。
【００７２】
上記の合成のさらなる詳細は、付録（Appendix）に見出すことができる。
【００７３】
実施例２：ＨＭＢＰジフルオロメチルホスホネートのアリールオキシホスファラミデートプロパンの合成
Ｒ４およびＲ５がそれぞれＦを表す一般式（ＶＩ）の化合物も、Ｇｒｕｂｂｓオレフィンメタセシス7を用いた合成法を用いて調製した。図４（Ｂ）に概略的に要約されているＰｒｏＰＡｇｅｎｓ ９ａ−ｄの合成は最初に、既報に従いＤＭＦ中の亜鉛および臭化銅の存在下で、市販のジエチル（ブロモジフルオロメチル）ホスホネート（５）を臭化アリルと反応させることによって達成された(非特許文献１０)。生成した化合物６を続いて塩素化し、次いでフェノールおよび適切なアミノ酸エステルで処理して、化合物３ａ〜ｄの合成について記載したように、ホスホラミデート８ａ〜ｄを良好な収率（２４〜４６％）で得た。続いて、これらのホスホンアミデートを１，４‐ベンゾキノンおよびＨｏｖｅｙｄａ‐Ｇｒｕｂｂｓ第二世代触媒の存在下で２‐メチル‐２‐プロペノールで処理した(非特許文献９)。最終ＰｒｏＰＡｇｅｎｓ ９ａ−ｄは良好な収率（５８−６９％）で生成した。Ｌ−アラニンは歴史的に最適な生物学的活性を示したので、これらのプロドラッグの合成において選択されるアミノ酸として使用され、一方、フェノールモチーフは２つのＦＤＡ認可薬物、ソホスブビルおよびテノホビルアラフェナミドの発見において首尾よく使用されたので選択された。
【００７４】
ＰｒｏＰＡｇｅｎｓ ４ａ−ｄに関しては、ＰｒｏＰＡｇｅｎｓ ９ａ−ｄの合成において選択されるアミノ酸としてＬ−アラニンを使用し、アリールオキシマスキング基についてフェノールモチーフを選択した。再び、４つの異なるエステルモチーフを、ＰｒｏＰＡｇｅｎｓ−９ａの合成において選択した：メチル（Ｍｅ）；９ｂ：イソプロピル（ｉＰｒ）；９c: tert−ブチル（ｔＢｕ）；および４ｄ：ベンジル（Ｂｎ）。
【００７５】
上記の合成のさらなる詳細は、付録（Appendix）に見出すことができる。
【００７６】
実施例３：ＨＭＢＰメチルホスホネートおよびＨＭＢＰジフルオロメチルホスホネートの安定性試験
ＨＭＢＰリン酸プロパジェンスの安定性試験で以前に見られた不安定さ(非特許文献６)に対処するための主要な目的であったため、例１および例２における新規化合物の合成が完了した時点で実施した。
【００７７】
３７℃で１２時間、ヒト血清を用いてＰｒｏＰＡｇｅｎ ４ｄを行い、事前に報告されたように、31Ｐ−ＮＭＲによって試料をモニターした。図５に示すように、ＰｒｏＰＡｇｅｎ ４ｄは、これらのプロドラッグに典型的なキラルリン中心から生じる２つのジアステレオ異性体に対応する31Ｐ−ＮＭＲ上で、dP = ３３．６０および３４．０５ｐｐｍに２つの一重項を有していた。ヒト血清を加え、試料を31Ｐ−ＮＭＲでモニターした後、試験した時間（１２時間）の間、新たなリンピークは検出されなかったので、分解は観察されなかった。
【００７８】
ジフルオロメチルホスホネートＰｒｏＰＡｇｅｎ ９ａについても同様の安定性プロフィールが観察された（図６）。まとめると、これらのデータは、著者らが以前に.開示したＨＭＢＰリン酸プロＰＡゲン(非特許文献６)に比べて、これらのプロドラッグの優れた安定性を示すものである。
【００７９】
実施例４：ＰｒｏＰＡｇｅｎｓ ４ａ−ｄおよび９ａ−ｄによるヒトＶγ９／Ｖδ２+ Ｔ細胞の活性化
実施例１および２のＰｒｏＰＡｇｅｎがＶγ９／Ｖδ２Ｔ細胞の強力な活性化を保持したことを実証するために、健康なドナーに由来するＶγ９／Ｖδ２Ｔ細胞を含有する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、漸増する濃度のＰｒｏＰＡｇｅｎ４ｄおよび９ｄと共にインキュベートした（図７、８および９）。
【００８０】
末梢血γδ Ｔ細胞は定常状態条件下ではかなりのレベルの表面ＣＤ６９またはＣＤ２５を欠いているが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）刺激により、７２時間以内に両Ｔ細胞活性化マーカーがアップレギュレートされる。次いで、ＰＡｇ応答性Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞を、TCR Vγ９およびＶδ２発現によって識別し、アップレギュレーションＣＤ６９およびＣＤ２５について評価した。
【００８１】
図７、８および９に示されるように、ＨＭＢＰホスホネートプロＰＡｇｅｎｓ４ｄおよび９ｄは、これらのクラスのプロドラッグの代表として、ＨＭＢＰホスフェートプロＰＡｇｅｎｓＯＯＢについて報告されたものよりはるかに優れた強力なＶγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞活性化を示した。
【００８２】
実施例５（比較）：ＨＭＢＰＰによるヒトＶγ９／Ｖδ２+Ｔ細胞の活性化
実施例１および２のＰｒｏＰＡｇｅｎの増強されたＶγ９／Ｖδ２Ｔ細胞活性化効力を実証するために、健康なドナーに由来するＶγ９／Ｖδ２Ｔ細胞を含有する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、比較目的のために、増加する濃度のＨＭＢＰＰと共にインキュベートした（図１０）。
【００８３】
図８および図９と図１０との比較で明らかなように、ＨＭＢＰＰのＴ細胞活性化能は、ＰｒｏＰＡｇｅｎｓ ４ｄおよび９ｄの活性化能よりも劣っている。
【００８４】
実施例６：ＰｒｏＰＡｇｅｎ４ａ−ｄおよび９ａ−ｄによるヒトＣＤ８+ T細胞の活性化の欠如
実施例１および２のプロジェンがＶγ９／Ｖδ２Ｔ細胞特異的活性化因子であることを実証するために、ドナー由来のＣＤ８+ T細胞を含むＰＢＭＣを、プロジェン４ｄおよび９ｄの濃度を増加させてインキュベートした（図１１および１２）。
【００８５】
末梢血γδ Ｔ細胞と同様に、末梢血ＣＤ８+ T細胞は定常状態条件下ではかなりのレベルの表面ＣＤ６９またはＣＤ２５を欠いているが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）刺激により、７２時間以内に両Ｔ細胞活性化マーカーがアップレギュレートされる。次いで、ＰＡｇ応答性ＣＤ８ Ｔ細胞をTCR CD８発現によって区別し、アップレギュレーションＣＤ６９およびＣＤ２５について評価した。
【００８６】
図１１および１２に示すように、ＨＭＢＰホスホネートＰｒｏｐＡｇｅｎｓ ４ｄおよび９ｄはこれらのクラスのプロドラッグの代表として、１μＭ、すなわち、両方のＰｒｏＰＡｇｅｎｓについて計算されたＶγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞活性化ＥＣ50値より約１００，０００倍大きい濃度でインキュベートした場合でさえ、ＣＤ８+ T細胞の活性化を示さなかった。
【００８７】
実施例７：Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ−細胞によるＴ２４膀胱癌細胞の溶解はＰｒｏＰＡｇｅｎ ４ａ−ｄおよび９ａ−ｄによって媒介され、増強される
上記原理のさらなる証拠として、そして上記に示される実施例１および２のＰｒｏＰＡｇｅｎの優れたＶγ９／Ｖδ２+ Ｔ細胞活性化効力が有益な治療効果に翻訳されることを実証するために、ヒトＴ２４膀胱癌細胞株を１０μＭゾレドロネート、１００ ｐＭのＨＭＢＰＰまたは１００ ｐＭのＰｒｏＰＡｇｅｎ ４ｄと４時間インキュベートした後、Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞による癌細胞の特異的溶解を比較した。
【００８８】
このin vitro細胞毒性アッセイのさらなる詳細は、付録（Appendix）に見出すことができる。
【００８９】
図１３に示すように、ＨＭＢＰホスホネートＰｒｏｐＡｇｅｎ ４ｄとのインキュベーションはゾレドロネートとのインキュベーションで観察されたものと比較して、また驚くべきことに、ＨＭＢＰＰとのインキュベーションで観察されたものと比較して、Ｔ２４膀胱癌溶解の有意な増強をもたらした。
【００９０】
まとめ：
新規メチルおよびジフルオロメチルホスホネートＰｒｏＰＡｇｅｎｓの合成について報告する。これらのＰｒｏＰＡｇｅｎｓは、これまで報告されていたリン酸ＰｒｏＰＡｇｅｎｓ誘導体（非特許文献６）に比べて優れた血清安定性を示した。これらのプロドラッグは、Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞の特異的アクチベーターであるだけでなく、過去に報告されたＨＭＢＰリン酸プロＰＡｇｅｎｓよりもはるかに強力なＶγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞のアクチベーターであることが示された。このＶγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞活性化効果の増加は、in vitroでの癌細胞の非常に強力な溶解に翻訳されることも示された。
【００９１】
これらの新しいホスホネートＰｒｏｇｅｎの高い、特異性、血清安定性および効力プロフィールの組合せは、癌、骨粗鬆症および／または結核、らい、チフス、マラリア、およびトキソプラズマ症などの種々の感染症などの増殖性疾患を含む種々の状態を治療するための新しい免疫療法薬としての開発に適している。
【００９２】
付録（Appendix）：ＰｒｏＰＡｇｅｎ化合物４ａ−ｄおよび９ａ−ｄの合成および評価
Ｂｕｔ−３−ｅｎ−１−イルホスホン酸二塩化物（２）
臭化トリメチルシリル（１３．７２ｍＬ、１０４．０６ｍｍｏｌ、１０当量）を、窒素下、室温で、ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）中のジエチルｂｕｔ−３−ｅｎ−１−イルホスホネート１（２ｇ、１０．４０ｍｍｏｌ、１当量）に３０分間かけてゆっくりと添加した。混合物を２時間撹拌し、次いで減圧下で揮発性物質を除去し、黄色液δPＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）：２４．７０を得た。次いで、これを５０ｍｌのＣＨ2 Ｃｌ2に溶解し、２滴の乾燥ＤＭＦを添加し、混合物を０℃に冷却した。次に、塩化オキサリル（２．６８ｍＬ、３１．２０ｍｍｏｌ、３当量）を滴下して加え、反応混合物を室温まで温め、１８時間撹拌した。揮発性物質を蒸発させ、追加のＣＨ2 Ｃｌ2（１０ｍＬ）をさらに３回蒸発させて、粗生成物（１．７９ｇ、１００％）を茶色の液として得、これをさらに精製することなく次工程で使用した。δP ＮＭＲ(２０２ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）： ４９．６６．
【００９３】
一般手順１：アリルホスホノアミデート３ａ−ｄの合成
粗生成物であるが−３−エン−１−イルホスホンジクロリド（２）を５ｍＬのＣＨ2 Ｃｌ2に溶解し、フェノール（１当量）、乾燥Ｅｔ3 Ｎ（２当量）およびＣＨ2 Ｃｌ2（１０ｍＬ）の水溶液に−７８℃で滴下した。−７８℃で３０分間撹拌した後、反応混合物を室温に温め、撹拌をさらに３時間続けた。31P NMR[δP ＮＭＲ(２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）：〜３９．９３］により示されるように反応が完了したら、混合物を濾過し、揮発性物質を減圧下で除去し、Ｅｔ2 Ｏで２回洗浄し、続いて減圧下で除去して、粗油状物を得た。次に、この生成物をＣＨ2 Ｃｌ2（１０ｍＬ）に溶解し、Ｌ−アラニンエステル塩化水素（１当量）と乾燥Ｅｔ3 Ｎ（２当量）の乾燥ＣＨ2 Ｃｌ2（１０ｍＬ）中の攪拌混合物に−７８℃で１５分かけて滴下した。−７８℃で３０分間撹拌した後、反応物を室温に温め、一晩撹拌したままにした。溶媒を減圧下で除去し、濾過し、Ｅｔ2 Ｏで洗浄した後、減圧下で除去し、粗油状物を得た。次いで、最終生成物をカラムクロマトグラフィー（６：４ Hex/ EtOAc)により無色油として精製した。
【００９４】
メチル（but−３−エン−１−イル（フェノキシ）ホスホリル）−Ｌ−アラニン酸（３ａ）
フェノール（０．２１０ｇ、２．２３ｍｍｏｌ、１当量）およびＬ−アラニンメチルエステル塩化水素（０．３７３ｇ、２．２３ｍｍｏｌ、１当量）を使用して一般手順１に従って合成し、生成物３ａ（０．２４８ｇ、３８％）を無色油として得た。
【００９５】
δP ＮＭＲ(２０２ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）： ３０．８８、３１．２２．
δH ＮＭＲ(５００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）： ７．３０ （ｍ、２Ｈ、Ａｒ）、７．１０ （ｍ、３Ｈ、Ａｒ），５．８２ （ｍ、１Ｈ、ＣＨ2 ＝ＣＨ）、５．００ （ｍ、２Ｈ、ＣＨ2 ＝ＣＨ）、４．１１−３．８６ （ｍ、１Ｈ，ＣＨ−ＮＨ）、３．６０ （ｄ、J = ６．６ Ｈｚ、３Ｈ、ＯＣＨ3）、３．１８ （ｍ、１Ｈ，ＮＨ）、２．４８−２．２７ （ｍ、２Ｈ，＝ＣＨ−ＣＨ2）、１．９２ （ｍ、２Ｈ、ＣＨ2 −Ｐ）、１．２１ （２ｄ、J = ７．１ Ｈｚ、３Ｈ、ＣＨ−ＣＨ3）．
δC ＮＭＲ(１２６ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）： １７４．６８ （ｄ、J = ６．３ Ｈｚ、Ｃ＝Ｏ）、１７４．３８ （ｄ、J = ５．１ Ｈｚ、Ｃ＝Ｏ）、１５０．７２ （ｄ、J = ９．１ Ｈｚ）、１５０．５１ （ｄ、J = ９．４ Ｈｚ）、１２９．７８、１２４．７８ （ｄ、J = ５．５ Ｈｚ、ＣＨ＝ＣＨ2）、１２０．８６ （ｄ、J = ４．６ Ｈｚ、Ｃ−Ａｒ）、１２０．７１ （ｄ、J = ４．７ Ｈｚ）、１１５．５６、５２．５２ （ｄ、J = ３．１ Ｈｚ、ＣＨ3 −Ｏ）、４９．５８ （ｄ、J = １４．７ Ｈｚ、ＣＨ−ＮＨ）、２７．８８ （ｄ、J = １３０．９ Ｈｚ、ＣＨ2 −Ｐ） ２７．６０ （ｄ、J = １３１．６ Ｈｚ、ＣＨ2 −Ｐ）、２６．５９ （ｄ、J = ４．１ Ｈｚ、ＣＨ2 −ＣＨ2 −Ｐ）、２１．６８ （２ｄ、J = ４．３ Ｈｚ、ＣＨＣＨ3）．
【００９６】
イソプロピル（but−３−エン−１−イル（フェノキシ）ホスホリル）−Ｌ−アラニン酸（３ｂ）
フェノール（０．２１０ｇ、２．２３ｍｍｏｌ、１当量）およびＬ−アラニンイソプロピルエステル塩化水素（０．３７３ｇ、２．２３ｍｍｏｌ、１当量）を使用して一般手順１に従って合成し、生成物３ｂ（０．３４８ｇ、４８％）を無色油として得た。
【００９７】
δP ＮＭＲ(２０２ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）： ３０．９３、３１．２４．
δH ＮＭＲ(５００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）： ７．３０ （ｍ、２Ｈ、Ａｒ）、７．２１ （ｍ、３Ｈ、Ａｒ）、５．８１ （ｍ、１Ｈ、ＣＨ2 ＝ＣＨ）、５．１１ （ｍ、２Ｈ、ＣＨ2 ＝ＣＨ）、４．９６ （ｍ、１Ｈ、ＣＨ−ｉＰｒ，）、４．０４− ３．９４ （ｍ、１Ｈ、ＣＨ−ＮＨ）、３．２１ （ｍ、１Ｈ、ＮＨ）、２．４５ （ｍ、２Ｈ、＝ＣＨ−ＣＨ2）、２．０２−１．８８ （ｍ、２Ｈ、ＣＨ2 −Ｐ）、１．２９−１．１８ （ｍ、９Ｈ、ＣＨ3 −ＣＨ−ＮＨ、ＣＨ−ｉＰｒ）．
δC ＮＭＲ(１２６ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）： １７３．６７ （ｄ、J = ６．３ Ｈｚ、Ｃ＝Ｏ）、１５０．７４ （ｄ、J = ９．１ Ｈｚ）、１２９．７６ （ｄ、J = ６．７ Ｈｚ）、１２４．７３ （ｄ、J = ５．０ Ｈｚ）、１２０．８６ （ｄ、J = ４．６ Ｈｚ）、１２０．６９ （ｄ、J = ４．６ Ｈｚ）、１１５．５０、６９．２３ （ｄ、J = ５．６ Ｈｚ、ＣＨｉＰｒ）、４９．７５ （ｄ、J = ９．５ Ｈｚ、ＣＨ−ＮＨ）、２７．８９ （ｄ、J = １３０．９ Ｈｚ、ＣＨ2 −Ｐ）、２７．５４ （ｄ、J = １３１．４ Ｈｚ、ＣＨ2 −Ｐ）、２６．７４ （ｄ、J = ４．３ Ｈｚ、ＣＨ2 −ＣＨ2 −Ｐ）、２６．５７ （ｄ、J = ４．０ Ｈｚ 、ＣＨ2 −ＣＨ2 −Ｐ）、２１．５８ （２ｄ、J = ４．４ Ｈｚ、ＣＨＣＨ3）．
【００９８】
ｔｅｒｔ−ブチル（but−３−エン−１−イル（フェノキシ）ホスホリル）−Ｌ−アラニン酸（３ｃ）
フェノール（０．２１０ｇ、２．２３ｍｍｏｌ、１当量）およびＬ−アラニンｔｅｒｔ−ブチルエステル塩化水素（０．４０５ｇ、２．２３ｍｍｏｌ、１当量）を使用して一般手順１に従って合成し、生成物３ｃ（０．４６１ｇ、６１％）を無色油として得た。
【００９９】
δP ＮＭＲ(２０２ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）： ３０．９５、３１．２１．
δH ＮＭＲ(５００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）： ７．３２ （ｍ、２Ｈ、Ａｒ）、７．２０ （ｍ、３Ｈ、Ａｒ）、５．８７ （ｍ、１Ｈ、ＣＨ2 ＝ＣＨ）、５．１２（ｍ、２Ｈ、ＣＨ2 ＝ＣＨ）、４．００−３．８６ （ｍ、１Ｈ、ＣＨ−ＮＨ）、３．２６ （ｍ、１Ｈ、ＮＨ）、２．４５ （ｍ、２Ｈ，＝ＣＨ−ＣＨ2）、２．０４−１．８５ （ｍ、２Ｈ、Ｐ−ＣＨ2）、１．４２ （ｓ、９Ｈ、ｔＢｕ−Ｈ）、１．２２ （２ｄ、J = ７．２ Ｈｚ、３Ｈ、ＣＨ−ＣＨ3）．
δC ＮＭＲ(１２６ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）： １７３．１３ （ｄ、J = ５．５ Ｈｚ、Ｃ＝Ｏ）、１５０．７７ （ｄ、J = ９．２ Ｈｚ）、１３７．４３ （ｄ、J = ７．１ Ｈｚ）、１３７．３２ （ｄ、J = ７．６ Ｈｚ）、１２９．７６ （ｄ、J = ６．２ Ｈｚ）、１２４．７１ （ｄ、J = ４．０ Ｈｚ）、１２０．８８ （ｄ、J = ４．６ Ｈｚ）、１２０．７２ （ｄ、J = ４．７ Ｈｚ）、１１５．４７、８１．９９ （ｄ、J = ８．２ Ｈｚ）、６０．５４、５０．１８ （ｄ、J = ４．０ Ｈｚ、ＣＨ−ＮＨ）、２８．０５、２７．９１ （ｄ、J = １３１．６ Ｈｚ、ＣＨ2 −Ｐ）、２７．２０ （ｄ、J = １３０．２ Ｈｚ、ＣＨ2 -Ｐ)、２１．８２ （２ｄ、J = ４．２ Ｈｚ、ＣＨＣＨ3）．
【０１００】
ベンジル（but−３−エン−１−イル（フェノキシ）ホスホリル）−Ｌ−アラニン酸（３ｄ）
フェノール（０．２１０ｇ、２．２３ｍｍｏｌ、１当量）およびＬ−アラニンベンジルエステル塩化水素（０．４０５ｇ、２．２３ｍｍｏｌ、１当量）を使用して一般手順１に従って合成し、生成物３ｄ（０．４６１ｇ、５５％）を無色油として得た。
【０１０１】
δP ＮＭＲ(２０２ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）： ３０．８５、３１．２１．
δH ＮＭＲ(５００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）： ７．３８−７．２７ （ｍ、７Ｈ、Ａｒ）、７．２１−７．１８ （ｍ、２Ｈ、Ａｒ）、７．１６−７．０９ （ｍ、１Ｈ、Ａｒ）、５．８５ （ｍ、１Ｈ、ＣＨ2 ＝ＣＨ）、５．０４ （ｍ、４Ｈ、ＣＨ2 ＝ＣＨ、−ＯＣＨ2）、４．２８−４．０３ （ｍ、１Ｈ、ＣＨ−ＮＨ）、３．２４ （ｍ、１Ｈ、ＮＨ）、２．５６−２．３４ （ｍ、２Ｈ、，＝ＣＨ−ＣＨ2）、２．０８−１．８２ （ｍ、２Ｈ、Ｐ−ＣＨ2）、１．２４ （２ｄ、J = ７．１ Ｈｚ、３Ｈ、ＣＨ−ＣＨ3）．
δC ＮＭＲ(１２６ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）： １７３．７４ （ｄ、J = ５．２ Ｈｚ、Ｃ＝Ｏ）、１５０．７０ （ｄ、J = ９．１ Ｈｚ）、１３７．３５、１３５．４０ （ｄ、J = ６．７ Ｈｚ）、１２９．７９ （ｄ、J = ６．１ Ｈｚ）、１２８．７９ （ｄ、J = ２．８ Ｈｚ）、１２８．６４ （ｄ、J = ６．４ Ｈｚ）、１２８．３３、１２０．８６ （ｄ、J = ４．６ Ｈｚ）、１２０．６８ （ｄ、J = ４．７ Ｈｚ）、１１５．５５、６７．３１ （ｄ、J = ３．０ Ｈｚ、ＣＨ2 −Ｏ）、４９．７２ （ｄ、J = １１．１ Ｈｚ、ＣＨ−ＮＨ）、２７．８８ （ｄ、J = １３０．７ Ｈｚ、ＣＨ2 −Ｐ）、２７．５７（ｄ、J = １３１．３ Ｈｚ 、ＣＨ2 −Ｐ）、２６．７４ （ｄ、J = ４．３ Ｈｚ、ＣＨ2 −ＣＨ2 −Ｐ）、２６．５７ （ｄ、J = ４．１ Ｈｚ、ＣＨ2 −ＣＨ2 −Ｐ）、２１．７０ （２ｄ、J = ４．４ Ｈｚ、ＣＨＣＨ3）．
【０１０２】
一般手順２：Ｈｏｖｅｙｄａ−Ｇｒｕｂｂｓ交差複分解によるホスホノアミデート４ａ−ｄの合成
アリルホスホノアミデート３ａ-ｄ(１当量）および２−メチル−２プロペン−１−オール（８５μＬ、１ｍｍｏｌ、２当量）、１，４−ベンゾキノン（５．４０ｍｇ、１０ｍｏｌ％）の乾燥ＤＣＭ(１０ｍＬ）溶液に、Ｈｏｖｅｙｄａ−Ｇｒｕｂｂｓ触媒第２世代（２３．５ｍｇ、０．０３８ｍｍｏｌ、７．５ｍｏｌ％）を加えた。触媒を、２．５ｍｏｌ%(７．８ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）の３等量ずつ、t = ０、２および４時間、反応の過程にわたって添加した。次いで、この溶液を、窒素雰囲気下、４５℃で１８時間加熱還流した。室温に冷却した後、活性炭のスクープを添加し、混合物をさらに２時間撹拌し、次いでセライトパッドを通して濾過した。揮発性物質を蒸発させ、残渣を広範なシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、７：３〜０：１０）によって精製して、４ａ〜ｄを無色の油として得た。
【０１０３】
メチル（（（Ｅ）−５−ヒドロキシ−４−メチルペント−３−エン−１−イル）（フェノキシ）ホスホリル）−Ｌ−アラニン酸塩（４ａ）
３ａ（１５０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ、１当量）を用いて一般手順２に従って合成し、４ａ（９１ｍｇ、５７％）を無色油状物として得た。
【０１０４】
δP ＮＭＲ(２０２ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）： ３０．８９、３１．３１．
δH ＮＭＲ(５００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）： ７．３１ （ｍ、２Ｈ、Ａｒ）、７．１８ （ｍ、３Ｈ、Ａｒ）、５．４８ （ｍ，１Ｈ、＝ＣＨ）、４．２４ − ３．９８ （ｍ、３Ｈ、ＣＨ2 ＯＨ、ＣＨ−ＮＨ）、３．６８ （ｄ、J = ７．９ Ｈｚ、３Ｈ、ＯＣＨ3）、３．３９−３．１８ （ｍ、１Ｈ、ＮＨ）、２．５５−２．４１ （ｍ、２Ｈ、＝ＣＨ−ＣＨ2）、２．１２−１．８７ （ｍ、２Ｈ、ＣＨ2 −Ｐ）、１．７１ （ｄ、J = ６．６ Ｈｚ、３Ｈ、ＣＨ3 （ＣＨ2）Ｃ＝）、１．２７ （２x d、J = ７．１ Ｈｚ、３Ｈ、ＣＨ−ＣＨ3）．
δC ＮＭＲ(１２６ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）： １７６．７１ （ｄ、J = ５．９ Ｈｚ、Ｃ＝Ｏ）、１５０．７２、１２９．８１ （ｄ、J = ６．９ Ｈｚ）、１２４．８１ （ｄ、J = ８．６ Ｈｚ、ＣＨ＝ＣＨ2）、１２４．１７、１２４．０４、１２０．９４、１２０．６９ （ｄ、J = ４．６ Ｈｚ）、６８．５６ （ｄ、J = ９．１ Ｈｚ、ＣＨ2 −ＯＨ）、５２．６４ （ｄ、J = ３．５ Ｈｚ、ＣＨ3 −Ｏ）、４９．５１ （ｄ、J = ４．１ Ｈｚ、ＣＨ−ＮＨ）、２８．３３ （ｄ、J = １２９．６ Hz CH2 −Ｐ）、２８．０６ （ｄ、J = １３０．２ Ｈｚ、ＣＨ2 −Ｐ）、２１．８６ （２ｄ、J = ４．９ Ｈｚ、ＣＨＣＨ3）、２１．００ （ｄ、J = ４ ．８ Ｈｚ、ＣＨ2 −ＣＨ2 −Ｐ）、２０．８９ （ｄ、J = ４．４ Ｈｚ、ＣＨ2 −ＣＨ2 −Ｐ），１３．８７．
HRMS (ES+、ｍ／ｚ）計算：(M+Na)+ C16 Ｈ24 ＮＯ5 ＮａＰ： ３６４．１２９０； 検出： ３６４．１２９３
【０１０５】
イソプロピル（（（Ｅ）−５−ヒドロキシ−４−メチルペント−３−エン−１−イル）（フェノキシ）ホスホリル）−Ｌ−アラニン酸（４ｂ）
化合物３ｂ（０．１５０ｇ、０．４６ｍｍｏｌ、１当量）を用いて一般手順２に従って合成し、生成物４ｂ（９７ｍｇ、５９％）を無色油として得た。
【０１０６】
δP ＮＭＲ(２０２ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）： ３１．１１、３１．４９．
δH ＮＭＲ(５００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）： ７．２８ （ｍ、２Ｈ、Ａｒ）、７．２０ （ｍ、３Ｈ、Ａｒ）、５．４６ （ｍ、１Ｈ、＝ＣＨ）、４．９５ （ｍ、１Ｈ、ＣＨ−ｉＰｒ）、４．０８ − ３．７９ （ｍ、３Ｈ、ＣＨ2 ＯＨ、ＣＨ−ＮＨ）、３．４７−３．２５ （ｍ、１Ｈ、ＮＨ）、２．５１−２．３５ （ｍ、２Ｈ，＝ＣＨ−ＣＨ2）、２．０２−１．８５ （ｍ、２Ｈ、ＣＨ2 −Ｐ）、１．７３−１．５６ （ｄ、J = ６．０ Ｈｚ、３Ｈ、ＣＨ3 （ＣＨ2）Ｃ＝）、１．３５−１．０８ （ｍ、９Ｈ、ＣＨ3 −ＣＨ−ＮＨ、ＣＨ−ｉＰｒ）．
δC ＮＭＲ(１２６ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）： １７３．６２ （ｄ、J = ５．８ Ｈｚ、Ｃ＝Ｏ）、１５０．７４ （ｄ、J = ９．０ Ｈｚ），１３６．７６、１２４．７５、１２３．９５ （ｄ、J = ５．４ Ｈｚ）、１２３．８４ （ｄ、J = ６．９ Ｈｚ）、１２０．９０ （ｄ、J = ４．５ Ｈｚ）、１２０．６７ （ｄ、J = ４．６ Ｈｚ），１１９．８３、１１５．５８、６９．４１ （ｄ、J = ４．７ Ｈｚ、ＣＨｉＰｒ） ６８．３９ （ｄ、J = ７．０ Ｈｚ、ＣＨ2 −ＯＨ）、４９．６５、２８．３６ （ｄ、J = １２９．７ Ｈｚ、ＣＨ2 −Ｐ）、２７．９２ （ｄ、J = １３１．１ Ｈｚ、ＣＨ2 −Ｐ）、２１．８３ （２ｄ、J = ６．２ Ｈｚ、ＣＨＣＨ3）、２０。９０ （ｄ、J = ４．４ Ｈｚ、ＣＨ2 −ＣＨ2 −Ｐ）、２０．８４ （ｄ、J = ４．４ Ｈｚ、ＣＨ2 −ＣＨ2 −Ｐ），１３．８４．
ＨＲＭＳ （ＥＳ＋、ｍ／ｚ）計算値：(M+Na)+ C18 Ｈ28 ＮＯ5 ＮａＰ： ３９２．１６０３； 検出： ３９２．１６１３
【０１０７】
ｔｅｒｔ−ブチル（（（Ｅ）−５−ヒドロキシ−４−メチルペント−３−エン−１−イル）（フェノキシ）ホスホリル）−Ｌ−アラニン酸（４ｃ）
化合物３ｃ（０．１５０ｇ、０．４４ｍｍｏｌ、１当量）を用いて一般手順２に従って合成し、生成物４ｃ（１０８ｍｇ、６４％）を無色油として得た。
【０１０８】
δP ＮＭＲ(２０２ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）： ３１．０５、３１．４２．
δH ＮＭＲ(５００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）： ７．３０ （ｍ、２Ｈ、Ａｒ）、７．１７ （ｍ、３Ｈ，Ａｒ）、５．４６ （ｍ、１Ｈ、＝ＣＨ）、４．１７−３．７８ （ｍ、３Ｈ、ＣＨ2 ＯＨ、ＣＨ−ＮＨ）、３．４１−３．１８ （ｍ、１Ｈ、ＮＨ）、２．６０−２．３０ （ｍ、２Ｈ、＝ＣＨ−ＣＨ2）、２．０１−１．８７ （ｍ、２Ｈ、ＣＨ2 −Ｐ）、１．６９ （ｄ、J = ６．８ Ｈｚ、３Ｈ、ＣＨ3 （ＣＨ2）Ｃ＝）、１．４２ （ｓ、９Ｈ、ｔＢｕ）、１．２７ （２ｄ、J = ７．９ Ｈｚ、３Ｈ、ＣＨ−ＣＨ3）．
δC ＮＭＲ(１２６ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）： １７３．３４ （ｄ、J = ６．０ Ｈｚ、Ｃ＝Ｏ）、１５０．７９ （ｄ、J = ９．０ Ｈｚ）、１３６．８１ （ｄ、J = ９．６ Ｈｚ）、１１５．５９、８２．２２ （ｄ、J = ５．６ Ｈｚ）、６８．４５ （ｄ、J = １０．４ Ｈｚ、ＣＨ2 −ＯＨ）、５０．０７ （ｄ、J = ４．５ Ｈｚ、ＣＨ−ＮＨ）、２８．０１ （ｄ、J = １２９．７ Ｈｚ、ＣＨ2 −Ｐ）、２７．２６ （ｄ、J = １３０．４ Ｈｚ、ＣＨ2 −Ｐ）、２１．９８ （ｄ、J = ３．８ Ｈｚ、ＣＨＣＨ３）、２０．９７ （ｄ、J = ４．７ Ｈｚ、ＣＨ2 −ＣＨ2 −Ｐ）、２０．８８ （ｄ、J = ４．４ Ｈｚ、ＣＨ2 −ＣＨ2 −Ｐ）、１３．８６(ＣＨ3）．
HRMS (ES+、ｍ／ｚ）計算：(M+Na)+ C19 Ｈ30 ＮＯ5 ＮａＰ： ４０６．１７５９； 検出： ４０６．１７６２
【０１０９】
ベンジル（（（Ｅ）−５−ヒドロキシ−４−メチルペント−３−エン−１−イル）（フェノキシ）ホスホリル）−Ｌ−アラニン酸（４ｄ）
一般手順２に従って、３日間（０．１５０ｇ、０．４ｍｍｏｌ、１当量）を用いて合成し、生成物４日間（１００ｍｇ、５９％）を無色油状物として得た。
【０１１０】
δP ＮＭＲ(２０２ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）： ３０．９０、３１．３２
δH ＮＭＲ(５００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）： ７．３９−７．２８ （ｍ、７Ｈ、Ａｒ）、７．２２−７．１７ （ｍ、２Ｈ，Ａｒ）、７．１２ （ｍ、１Ｈ、Ａｒ）、５．４４ （ｍ、１Ｈ、＝ＣＨ）、５．０９ （ｍ、２Ｈ、ＯＣＨ2）、４．２２−３．８６ （ｍ、３Ｈ、ｍ、３Ｈ、ＣＨ2 ＯＨ、ＣＨ−ＮＨ）、３．４９−３．１７ （ｍ、１Ｈ、ＮＨ）、２．６４ −２．３６ （ｍ、２Ｈ、＝ＣＨ−ＣＨ2）、２．０４−１．８０ （ｍ、２Ｈ、ＣＨ2 −Ｐ）、１．６９ （ｄ、J = ６．８ Ｈｚ、３Ｈ、ＣＨ3 （ＣＨ2）Ｃ＝）、１．３３ （２ｄ、J = ７．０ Ｈｚ、３Ｈ、ＣＨ−ＣＨ3）
δC ＮＭＲ(１２６ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）： １７６．７６、１２９．８１ （ｄ、J = ７．４ Ｈｚ）、１２８．７５ （ｄ、J = １４．９ Ｈｚ）、１２８．３９、１２４．７７、１２４．１５ （ｄ、J = １５．０ Ｈｚ）、１２０．９３−１２０．８４、１２０．６７ （ｄ、J = ４．７ Ｈｚ）、６８．５７ （ｄ、J = ９．６ Ｈｚ）、６７．４２ （ｄ、J = ２．９ Ｈｚ）、４９．６５、２８．０５ （ｄ、J = １２９．９ Ｈｚ）、２１．７７ （ｄ、J = ４．１ Ｈｚ）、２０．８７ （ｄ、J = ４．４ Ｈｚ）、１３．８７．
HRMS (ES+、ｍ／ｚ）計算：(M+Na)+ C22 Ｈ28 ＮＯ5 ＮａＰ： ４４０．１６０３； 検出： ４４０．１６０９
【０１１１】
ジエチル（１，１−ジフルオロブト−３−エン−１−イル）ホスホネート（６）（非特許文献１０）
活性亜鉛粉末（２．５０ｇ、３８．２３ミリモル、１当量）を含む２５０ｍＬ丸底フラスコに、無水ＤＭＦ(２０ｍＬ）を窒素下で加えた。これに続いて、ジエチル（ブロモジフルオロメチル）ホスホネート（６．８０ｍＬ、３８．２３ｍｍｏｌ、１当量）をゆっくりと滴下し、混合物を室温で３時間撹拌した。CuBr (５．４８ｇ、３８．２３ｍｍｏｌ、１当量）を添加し、続いて発熱反応を防ぐために臭化アリル（３．９６ｍＬ、４５．８７ｍｍｏｌ、１．２当量）をゆっくりと滴下した。４０時間攪拌した後、濾過し、次いで、ＤＣＭと１０％ＮＨ4Ｃｌ水溶液との間で分配した。水相をＤＣＭで３回抽出した。合わせた有機相を無水ＭｇＳＯＯＯＡで乾燥させ、減圧濃縮し、得られた残渣を、ヘキサン中２０% EtOAcを使用するカラムクロマトグラフィーによって精製して、６（５．４１ｇ、６２％）を淡黄色油状物として得た。
【０１１２】
δP ＮＭＲ(２０２ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）： ６．９３ （ｔ、J = １０７．４ Ｈｚ）．
δHＮＭＲ(５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ 3）： ５．８４ （ｍ、１Ｈ、＝ＣＨ）、５．２６ （ｍ、２Ｈ、ＣＨ2 ＝）、４．３２−４．２１ （ｍ、４Ｈ、２x OCH2 ＣＨ3）、２．８２ （ｍ、２Ｈ、＝ＣＨ−ＣＨ2）、１．３７ （ｔ、J = ７．１Ｈｚ、６Ｈ、２ X OCH2 ＣＨ3）
【０１１３】
（１，１−ジフルオロブト−３−エン−１−イル）ホスホン酸二塩化物（７）
化合物６（２．５ｇ、１０．９５ｍｍｏｌ、１当量）を使用して２について記載したように合成して、粗生成物７（２．２８ｇ、１００％）を褐色液体として得、これをさらに精製することなく次の工程で使用した。
【０１１４】
δP ＮＭＲ(２０２ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）： ３１．５６ （ｔ、J = １３８．８ Ｈｚ）．
【０１１５】
メチル（（１，１−ジフルオロブト−３−エン−１−イル）（フェノキシ）ホスホリル）−Ｌ−アラニン酸（８ａ）
フェノール（０．２１０ｇ、２．２３ｍｍｏｌ、１当量）およびＬ−アラニンメチルエステル塩化水素（０．２６１ｇ、１．８７ｍｍｏｌ、１当量）を用いて一般手順１に従って合成し、製品８ａ（０．１５０ｇ、２４％）を無色油として得た。
【０１１６】
δP ＮＭＲ(２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ 3）： ９．０５ （ｄｄ、J = １０１．１、４９．９）、８．４１ （ｄｄ、J = １００．０、５１．１Ｈｚ）
δH ＮＭＲ(５００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）： ７．３５ （ｍ、２Ｈ、Ａｒ）、７．２１ （ｍ、３Ｈ、Ａｒ）、５．８９ （ｍ、１Ｈ、ＣＨ2 ＝ＣＨ）、５．２９ （ｍ、ＣＨ２＝ＣＨ）、４．１４ （ｍ、１Ｈ、ＣＨ−ＮＨ）、３．６９ （ｄ、J = ６．６ Ｈｚ、３Ｈ、ＯＣＨ3），３．６４ （ｍ、１Ｈ、ＮＨ）、３．１３−２．８４ （ｍ、２Ｈ、＝ＣＨ−ＣＨ2）、１．３８ （２x d、７．１ Ｈｚ、３Ｈ、ＣＨ-ＣＨ)
δC ＮＭＲ(１２６ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）： １７３．７６ （ｄ、J = ４．１ Ｈｚ、Ｃ＝Ｏ）、１３０．０２ （ｄ、J = ４．１ Ｈｚ）、１２７．４０−１２７．０７ （ｍ）、１２５．６４、１２１．５４ （ｄ、J = ９．３ Ｈｚ）、１２０．５４ （ｔ、J = ４．８ Ｈｚ）、５２．６９、５０．０９ （ｄ、J = ６．６ Ｈｚ）、３９．３９−３７．２２ （ｍ）、２１．７４（２ｄ、J = ３．５ Ｈｚ、ＣＨ３）．
【０１１７】
イソプロピル（（１，１−ジフルオロブト−３−エン−１−イル）（フェノキシ）ホスホリル）−Ｌ−アラニン酸（８ｂ）
フェノール（０．２１０ｇ、２．２３ｍｍｏｌ、１当量）およびＬ−アラニンイソプロピルエステル塩化水素（０．３１４ｇ、１．８７ｍｍｏｌ、１当量）を使用して一般手順１に従って合成し、生成物８ｂ（０．１６５ｇ、２５％）を無色油として得た。
【０１１８】
δP ＮＭＲ(２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ 3）： ９．１７ （ｄｄ、J = １０１．１、３０．３Ｈｚ）、８．４６ （ｄｄ、J = ９９．９、３８．０Ｈｚ）
δHＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）。７．３４ （ｍ、２Ｈ、Ａｒ）、７．２０（ｍ、３Ｈ、Ａｒ）、５．８９ （ｍ、１Ｈ、ＣＨ2 ＝ＣＨ）、５．２９ （ｍ、２Ｈ、ＣＨ2 ＝ＣＨ）、４．９９ （ｍ、１Ｈ、ＣＨ−ｉＰｒ）、４．１４−３．９９ （ｍ、１Ｈ、ＣＨ−ＮＨ）、３．６８ （ｍ、１Ｈ、ＮＨ）、３．００−２．８９ （ｍ、２Ｈ、＝ＣＨ−ＣＨ2）、１．３５−１．１７ （ｍ、９Ｈ、ＣＨ３−ＣＨ−ＮＨ、ＣＨ−ｉＰｒ）．
δC ＮＭＲ(１２６ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）： １７２．６８ （ｄ、J = ５．９ Ｈｚ、Ｃ＝Ｏ）、１４９．４６、１２９．８８ （ｄ、J = ４．２ Ｈｚ）、１２７．１１ （ｄ、J = ５．４ Ｈｚ）、１２５．４６、１２１．３６ （ｄ、J = ８．９ Ｈｚ）、１２０．４０ （ｔ、J = ４．９ Ｈｚ）、６９．３９ （ｄ、J = ２．８ Ｈｚ、ＣＨｉＰｒ）、５０．１５、３８．６３−３７．９９ （ｍ）、２１．５８ （ｄ、J = １．６ Ｈｚ）、２１．４４ （２ｄ、J = ３．２ Ｈｚ、ＣＨＣＨ3）．
【０１１９】
ｔｅｒｔ‐Ｂｕｔｙｌ((１，１‐ジフルオロバスト‐３‐ｅｎ‐１‐ｙｌ）（フェノキシ）ホスホリル）‐Ｌ‐アラニン酸（８ｃ）
フェノール（０．２１０ｇ、２．２３ｍｍｏｌ、１当量）およびＬ−アラニンｔｅｒｔブチルエステル塩化水素（０．３４０ｇ、１．８７ｍｍｏｌ、１当量）を使用して一般手順１に従って合成し、生成物８ｃ（０．３２０ｇ、４６％）を無色油として得た。
【０１２０】
δP ＮＭＲ(２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ 3）： ９．２３ （ｄｄ、J = １０１．０、３４．４Ｈｚ）、８．５２ （ｄｄ、J = ９９．６、３６．０Ｈｚ）
δH ＮＭＲ(５００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）： ７．３４ （ｍ、２Ｈ、Ａｒ），７．２１ （ｍ、３Ｈ、Ａｒ）、５．８９ （ｍ、１Ｈ、ＣＨ2 ＝ＣＨ）、５．２８ （ｍ、２Ｈ、ＣＨ2 ＝ＣＨ）、４．０８ − ３．９８ （ｍ、１Ｈ、ＣＨ−ＮＨ）、３．６７ （ｍ、１Ｈ、ＮＨ）、３．０１−２．８４ （ｍ、２Ｈ、＝ＣＨ−ＣＨ2）、１．４２ （ｄ、J = ５．２ Ｈｚ，９Ｈ、ｔＢｕ）、１．３０ （ｄ、J = ７．２ Ｈｚ、３Ｈ、ＣＨ−ＣＨ3）．
δC ＮＭＲ(１２６ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）： １７２．４８ （ｄ、J = ４．５ Ｈｚ、Ｃ＝Ｏ）、１４９．７２、１２９．９９ （ｄ、J = ２．１ Ｈｚ）、１２８．５９−１２６．９５ （ｍ）、１２５．５４、１２１．４６ （ｄ、J = ９．２ Ｈｚ）、１２０．５４ （ｔ、J = ４．８ Ｈｚ）、８２．３２ （ｄ、J = ５．８ Ｈｚ）、５０．６９ （ｄ、J = ２．８ Ｈｚ、ＣＨ−ＮＨ）、３８．８０−３８．１２ （ｍ）、２７．９９、２１．８５ （２ｄ、J = ３．１ Ｈｚ、ＣＨＣＨ３）．
【０１２１】
ベンジル（（１，１−ジフルオロブト−３−エン−１−イル）（フェノキシ）ホスホリル）−Ｌ−アラニン酸（８ｄ）
フェノール（０．２１０ｇ、２．２３ｍｍｏｌ、１当量）およびＬ−アラニンベンジルエステル塩化水素（０．４０３ｇ、１．８７ｍｍｏｌ、１当量）を使用して一般手順１に従って合成し、生成物８ｄ（０．３５０ｇ、４５ ％収率）を無色油として得た。
【０１２２】
δP ＮＭＲ(２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ 3）： ９．０８ （ｄｄ、J = １０１．２、４５．４Ｈｚ）、８．３９ （ｄｄ、J = １００．１、４６．５Ｈｚ）
δH ＮＭＲ(５００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）： ７．４１−７．２９ （ｍ、７Ｈ、Ａｒ）、７．２５−７．１７ （ｍ、３Ｈ、Ａｒ）、５．８７ （ｍ、１Ｈ、ＣＨ2 ＝ＣＨ）、５．２７ （ｍ、２Ｈ、ＣＨ2 ＝ＣＨ）、５．１１ （ｍ、２Ｈ、−ＯＣＨ2）、４．３３４．０９ （ｍ、１Ｈ、ＣＨ-ＮＨ)、３．６８ （ｍ、１Ｈ、ＮＨ）、２．９３ （ｍ、２Ｈ、Ｐ−ＣＨ2）、１．３６ （ｄ、J = ７．２ Ｈｚ、３Ｈ、ＣＨ−ＣＨ3）．
δC ＮＭＲ(１２６ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）： １７３．１５ （ｄ、J = ３．２ Ｈｚ、Ｃ＝Ｏ）、１４９．６８、１３５．２６ （ｄ、J = ６．４ Ｈｚ）、１３０．０１ （ｄ、J = ４．１ Ｈｚ）、１２８．８７−１２８．５２ （ｍ）、１２８．３５ （ｄ、J = １．１ Ｈｚ）、１２７．３８−１２７．０３ （ｍ）、１２５．６２、１２２．２４−１２０．３８ （ｍ）、１２０．５１、６７．４９、５０．２０、３８．７４−３８．０７ （ｍ）、２１．９６ （２ｄ、J = ３．５ Ｈｚ、ＣＨＣＨ3）．
【０１２３】
メチル（（（Ｅ）−１，１−ジフルオロ−５−ヒドロキシ−４−メチルペント−３−エン−１−イル）（フェノキシ）ホスホリル）−Ｌ−アラニン酸塩（９ａ）
化合物８ａ（０．１５０ｇ、０．４５ｍｍｏｌ、１当量）を用いて一般手順２に従って合成し、生成物９ａ（９７ｍｇ、５８％）を無色油として得た。
【０１２４】
δPＮＭＲ(２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ 3） δ９．２７ （ｄｄ、J = １１２．１、１８．４Ｈｚ）、８．４４ （ｄｄ、J = １２６．４、２０．２Ｈｚ）
δH ＮＭＲ(５００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）： ７．３５ （ｍ、２Ｈ、Ａｒ）、７．２１ （ｍ、３Ｈ、Ａｒ）、５．５６ （ｍ、１Ｈ、＝ＣＨ）、４．１８ （ｍ、１Ｈ、ＣＨ−ＮＨ）、４．０７ （ｍ、２Ｈ、＝ＣＨ−ＣＨ2）、３．７５−３．４６ （ｍ、４Ｈ、ＮＨ、ＯＣＨ3）、３．１０−２．７９ （ｍ、２Ｈ、＝ＣＨ−ＣＨ2）、１．８３ （ｍ，１Ｈ、ＯＨ）、１．７６ （ｓ、３Ｈ、ＣＨ3 （ＣＨ2）Ｃ＝ＣＨ），１．３７ （２x d、J = ７．１ Ｈｚ、３Ｈ、ＣＨ−ＣＨ3）．
δC ＮＭＲ(１２６ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）： １７６．７６、１４１．３８ （ｄ、J = ７．６ Ｈｚ）、１３０．０４ （ｄ、J = ３．２ Ｈｚ）、１２５．６５ （ｄ、J = ４．０ Ｈｚ）、１２０．５６ （ｄ、J = ４．６ Ｈｚ）、１２０．４７ （ｄ、J = ４．７ Ｈｚ）、６８．２５ （ｄ、J = １．９ Ｈｚ）、５２．８０ （ＣＨ3 −Ｏ）、５０．０９ （ｄ、J = ４．１ Ｈｚ、ＣＨ−ＮＨ）、３２．８２、２１．８２ （２ｄ、J = ２．６ Ｈｚ、ＣＨＣＨ3）、１４．１５ （ＣＨ3）．
HRMS (ES+、ｍ／ｚ）計算：(M+Na)+ C16 Ｈ22 Ｆ2 ＮＯ5 ＮａＰ： ４００．１１０１； 検出： ４００．１１０９
【０１２５】
イソプロピル（（（Ｅ）−１，１−ジフルオロ−５−ヒドロキシ−４−メチルペント−３−エン−１−イル）（フェノキシ）ホスホリル）−Ｌ−アラニン酸（９ｂ）
化合物８ｂ（０．１５０ｇ、０．４１ｍｍｏｌ、１当量）を用いて一般手順２に従って合成し、生成物９ｂ（１１７ｍｇ、６９％）を無色油として得た。
【０１２６】
δP ＮＭＲ(２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ 3）： ９．３０ （ｄｄ、J = １０９．１、３４．４Ｈｚ）、８．４２ （ｄｄ、J = １１１．１、３８．４Ｈｚ）
δH ＮＭＲ(５００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）： ７．３５ （ｍ、２Ｈ、Ａｒ）、７．２１ （ｍ、３Ｈ、Ａｒ）、５．５６ （ｍ、１Ｈ、＝ＣＨ）、５．００（ｍ、１Ｈ、ＣＨ−ｉＰｒ）、４．１７−３．９１ （ｍ、３Ｈ、ＣＨ−ＮＨ、＝ＣＨ−ＣＨ2）、３．６７ （ｍ、１Ｈ、ＮＨ）、３．０８−２．７５ （ｍ、２Ｈ、＝ＣＨ−ＣＨ2）、１．８６ （ｍ、１Ｈ、ＯＨ）、１．７０ （ｓ、３Ｈ、ＣＨ3 （ＣＨ2）Ｃ＝ＣＨ）、１．３４−１．１９ （ｍ、９Ｈ、ＣＨ3 −ＣＨ−ＮＨ、ＣＨ−ｉＰｒ）．
δC ＮＭＲ(１２６ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）： １７３．０９ （ｄ、J = ６．８ Ｈｚ、Ｃ＝Ｏ）、１４１．３７ （ｄ、J = ７．９ Ｈｚ）、１３０．０３ （ｄ、J = ２．６ Ｈｚ）、１２５．６０ （ｄ、J = ４．４ Ｈｚ）、１２０．５０ （ｄｄ、J = １０．６、４．７ Ｈｚ）、１１３．７９ − １１３．４３ （ｍ）、６９．７１ （ｄ、J = ４．５ Ｈｚ）、６８．２５、５０．２９ （ｄ、J = ９．６ Ｈｚ）、３０．８８−２８．７２ （ｍ）、２１．７３ （ｄ、J = ８．２ Ｈｚ）、２１．８４ （２ｄ、J = ４．１ Ｈｚ、ＣＨＣＨ3）、１４．１８ （ＣＨ3）．
HRMS (ES+、ｍ／ｚ）計算：(M+Na)+ C18 Ｈ26 Ｆ2 ＮＯ5 ＮａＰ： ４２８．１４１４； 検出： ４２８．１４１４
【０１２７】
ｔｅｒｔ−ブチル（（（Ｅ）−１，１−ジフルオロ−５−ヒドロキシ−４−メチルペント−３−エン−１−イル）（フェノキシ）ホスホリル）−Ｌ−アラニン酸（９ｃ）
化合物８ｃ（０．１５０ｇ、０．３９ｍｍｏｌ、１当量）を用いて一般手順２に従って合成し、生成物９ｃ（１０５ｍｇ、６３％）を無色油状物として得た。
【０１２８】
δP ＮＭＲ(２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ 3）： ９．３６ （ｄｄ、J = １０９．１、３４．４Ｈｚ）、８．４８ （ｄｄ、J = １１１．１、３６．４Ｈｚ）
δH ＮＭＲ(５００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）： ７．３６ （ｍ、２Ｈ、Ａｒ）、７．２２ （ｍ、３Ｈ、Ａｒ）、５．５６ （ｍ、１Ｈ、＝ＣＨ）、４．１６−３．９３ （ｍ、３Ｈ、ＣＨ−ＮＨ、＝ＣＨ−ＣＨ2）、３．６３ （ｍ、１Ｈ、ＮＨ）、３．０８−２．７７ （ｍ、２Ｈ、＝ＣＨ−ＣＨ2）、１．９０ （ｍ、１Ｈ、ＯＨ）、１．７１ （ｓ、３Ｈ、ＣＨ3 （ＣＨ2）Ｃ＝ＣＨ）、１．４３ （ｄ、J = ５．２ Ｈｚ，９Ｈ、t Bu)、１．３０ （２x d、J = ７．１ Ｈｚ、３Ｈ、ＣＨ−ＣＨ3）．
δC ＮＭＲ(１２６ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）： １７２．７９ （ｄ、J = ６．８ Ｈｚ、Ｃ＝Ｏ）、１３０．０２、１２５．５６ （ｄ、J = ５．８ Ｈｚ）、１２０．５５ （ｄ、J = ４．６ Ｈｚ）、１２０．４７ （ｄ、J = ４．４ Ｈｚ）、８２．５９、６８．２６、５０．７２ （ｄ、J = ７．４ Ｈｚ、ＣＨ−ＮＨ）、３２．９７−３２．８０ （ｍ）、２８．０２ （ｄ、J = １．１ Ｈｚ、３x CH３）、２１．９８ （２ｄ、J = ３．８ Ｈｚ、ＣＨＣＨ3）、１４．１６．
HRMS (ES+、ｍ／ｚ）計算：(M+Na)+ C19 Ｈ28 Ｆ2 ＮＯ5 ＮａＰ： ４４２．１５７１； 検出： ４４２．１５７８
【０１２９】
ベンジル（（（Ｅ）−１，１−ジフルオロ−５−ヒドロキシ−４−メチルペント−３−エン−１−イル）（フェノキシ）ホスホリル）−Ｌ−アラニン酸（９ｄ）
化合物８ｄ（０．１５０ｇ、０．３６ｍｍｏｌ、１当量）を用いて一般手順２に従って合成し、生成物９ｄ（１０１ｍｇ、６１％）を無色油状物として得た。
【０１３０】
δP ＮＭＲ(２０２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ 3）： ９．２１ （ｄｄ、J = １１３．２、２２．３Ｈｚ）、８．３７ （ｄｄ、J = １１１．１、２４．３Ｈｚ）
δH ＮＭＲ(５００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）： ７．３９−７．２８ （ｍ、７Ｈ、Ａｒ）、７．２４−７．１６ （ｍ、３Ｈ、Ａｒ）、５．５５ （ｍ，１Ｈ、＝ＣＨ）、５．１３ （ｍ、２Ｈ、ＯＣＨ2）、４．２７−４．１４ （ｍ、１Ｈ、ＣＨ−ＮＨ）、４．０６ （ｍ、２Ｈ、＝ＣＨ−ＣＨ2）、３．６８ （ｍ、１Ｈ、ＮＨ）、３．０５ −２．７３ （ｍ、２Ｈ、＝ＣＨ−ＣＨ2）、１．８０ （ｍ、１Ｈ、ＯＨ）、１．６９ （ｓ、３Ｈ、ＣＨ3 （ＣＨ2）Ｃ＝ＣＨ）、１．３５ （２x d、J = ７．１ Ｈｚ、３Ｈ、ＣＨ−ＣＨ3）．
δC （１２６ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）： １７３．３８ （ｄ、J = ７．９ Ｈｚ、Ｃ＝Ｏ）、１４９．７１、１４１．３７ （ｄ、J = ８．３ Ｈｚ）、１３０．０４ （ｄ、J = ３．１ Ｈｚ）、１２８．７６ （ｄ、J = １２．８ Ｈｚ）、１２８．３５ （ｓ）、１２５．６３ （ｄ、J = ５．５ Ｈｚ）、１２０．４９ （ｄｄ、J = １３．７、４．６ Ｈｚ）、１１３．７５−１１３．３４ （ｍ）、６８．２５ （ｄ、J = ２．４ Ｈｚ）、６７．６１、５０．２２ （ｄ、J = ８．０ Ｈｚ）、３４．３２−３１．１８ （ｍ）、２１．８４ （ｄ、J = ３．８ Ｈｚ、ＣＨＣＨ3）、１４．１５ （ＣＨ3）．
HRMS (ES+, m/z)計算：(M+Na)+ C22 Ｈ26 Ｆ2 ＮＯ5 ＮａＰ： ４７６．１４１４； 検出： ４７６．１４２１
【０１３１】
細胞単離
血液を、抗凝固剤としてのヘパリンおよびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の混合物（２Ｕ／ｍｌヘパリン、１．５mM EDTA)の存在下で、同意された健康なドナー(NRES Committee West Midlands倫理委員会によって承認された; REC参考文献１４／ＷＭ／１２５４）から得た。次いで、血液を密度勾配培地上に重層し、リンホプレップ(Stem Cell Technologies)および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を勾配遠心分離によって精製した。細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、次いで、２mM L−グルタミン、２５mM HEPES、１％ピルビン酸ナトリウム、５０μｇ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地に再懸濁した。
【０１３２】
フローサイトメトリー解析
未処理および処理ＰＢＭＣをZombie aqua生存染料（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で標識し、続いてＢＶ４２１結合抗ＣＤ３（ＵＣＨＴ１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＢＶ６５０結合抗ＣＤ８（ＳＫ１; BD Bioscience)、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ２５（Ｍ−Ａ２５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰＥ結合抗ＣＤ６９（ＴＰ１．５５．３; Beckman Coulter)およびPE Cy５結合抗Ｖγ９ ＴＣＲ(ＩＭＭＵ３６０、Beckman Coulter)およびＡＰＣ結合抗Ｖδ２ ＴＣＲ(１２３Ｒ３、Miltenyi Biotech)抗体の混合物で染色した。ＣＤ８+ Ｔ細胞サブセットまたはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞集団内のＣＤ６９+ ＣＤ２５+のパーセンテージを、フローサイトメーターを使用して測定した。データは、FlowJo V１０ソフトウェアを用いて分析した。
【０１３３】
細胞毒性アッセイ
Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞を、５μＭゾレドロネートの存在下でＰＢＭＣから１４日間増殖させ、１００ Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を２〜３日毎に培地に添加し、約８５％のＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を得た。膀胱癌細胞株Ｔ２４(ATCC HTB４）を０．１μＭのＣＦＳＥで標識し、１０μＭのゾレドロネート、１００ ｐＭのＨＭＢＰＰまたは１００ ｐＭの示されたプロドラッグと共に４時間インキュベートした後、培地中で５回洗浄し、予め増殖させたＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞と１０：１のエフェクター標的比で１８時間共培養した。次いで、全ての細胞をｅＦｌｕｏｒ７８０生存色素で標識し、ＣＦＳＥ+  ｅＦｌｕｏｒ７８０生存色素+細胞をフローサイトメトリーを用いて測定した。データは、FlowJo V１０を用いて分析した。
【０１３４】
参考文献（非特許文献）
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【図１】
2021529786.tif 000015
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
2021529786.tif 000024
【図８Ｃ】
2021529786.tif 000025
【図９Ａ】
2021529786.tif 000026
【図９Ｂ】
2021529786.tif 000027
【図９Ｃ】
2021529786.tif 000028
【図１０Ａ】
2021529786.tif 000029
【図１０Ｂ】
2021529786.tif 000030
【図１１Ａ】
2021529786.tif 000031
【図１１Ｂ】
2021529786.tif 000032
【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
2021529786.tif 000034
【図１３】
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【国際調査報告】
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