(57)【要約】包埋された細胞傷害剤を含むベシクル、ならびにこのベシクルを作製および使用する方法の実施形態が開示される。このベシクルを含む医薬組成物もまた開示される。ベシクルは、空洞を取り囲む二成分脂質二重層を含み、このベシクル二成分脂質二重層は、（ｉ）非二重層形成性脂質（または非二重層形成性脂質の組合せ）およびＰＥＧ化脂質；ならびに（ｉｉ）ベシクル壁内に包埋された細胞傷害剤を含む。二成分脂質二重層および二成分脂質二重層内に包埋された細胞傷害剤を含むベシクル、ならびにベシクルを作製および使用する方法の実施形態が、本明細書に開示される。
2021530492.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルキン含有リン脂質およびＰＥＧ化脂質を含む二成分脂質二重層；ならびに
前記二成分脂質二重層中に包埋された細胞傷害剤
を含むベシクルであって；
前記二成分脂質二重層には、前記アルキン含有リン脂質または前記ＰＥＧ化脂質以外の脂質がないか、または含まれない、ベシクル。
【請求項２】
前記二成分脂質二重層が、６ｍｏｌ％を超え、２０ｍｏｌ％までの前記ＰＥＧ化脂質を含む、請求項１に記載のベシクル。
【請求項３】
前記二成分脂質二重層が、１０ｍｏｌ％〜２０ｍｏｌ％の前記ＰＥＧ化脂質を含む、請求項１または請求項２に記載のベシクル。
【請求項４】
合計した前記アルキン含有リン脂質および前記ＰＥＧ化脂質と、前記細胞傷害剤とが、１：０．０５（総脂質：細胞傷害剤）の比で存在する、請求項１から３のいずれか一項に記載のベシクル。
【請求項５】
前記アルキン含有リン脂質が、アルキン含有ホスホコリン脂質、または前記アルキン含有ホスホコリン脂質とアルキン含有ホスホエタノールアミン脂質との混合物である、請求項１から４のいずれか一項に記載のベシクル。
【請求項６】
前記アルキン含有ホスホコリン脂質が、１，２−ビス（トリコサ−１０，１２−ジイノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＣ８，９ＰＣ）であり、前記アルキン含有ホスホエタノールアミン脂質が、１，２−ビス（１０，１２−トリコサジイノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＣ８，９ＰＥ）である、請求項５に記載のベシクル。
【請求項７】
前記ＰＥＧ化脂質が、５００Ｄａから５０００Ｄａまでの範囲の分子量を有するＰＥＧ基を含むＰＥＧ化１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）脂質である、請求項１から６のいずれか一項に記載のベシクル。
【請求項８】
前記ＰＥＧ化脂質が、１０００Ｄａから３０００Ｄａまでの範囲の分子量を有するＰＥＧ基を含むＰＥＧ化ＤＳＰＥ脂質である、請求項１から７のいずれか一項に記載のベシクル。
【請求項９】
前記ＰＥＧ化脂質が、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）である、請求項１から８のいずれか一項に記載のベシクル。
【請求項１０】
前記細胞傷害剤が、テトラピロール化合物、カンプトテシン化合物、パクリタキセル、ダウノルビシン、メソトレキセート、ビンクリスチン、エトポシド、ソラフェニブ、エルロチニブ、イマチニブ、またはそれらの任意の組合せである、請求項１から９のいずれか一項に記載のベシクル。
【請求項１１】
前記テトラピロール化合物が、２−［１−ヘキシルオキシエチル］−２−デビニルピロフェオホルビド−ａ（ＨＰＰＨ）、（１７Ｓ，１８Ｓ）−１８−（２−カルボキシエチル）−２０−（カルボキシメチル）−１２−エテニル−７−エチル−３，８，１３，１７−テトラメチル−１７，１８，２２，２３−テトラヒドロポルフィリン−２−カルボン酸（Ｃｅ６）、（３Ｓ，４Ｓ）−９−エテニル−１４−エチル−２１−（メトキシカルボニル）−４，８，１３，１８−テトラメチル−２０−オキソ−３−ホルビンプロパン酸（フェオホルビドａ）；３，３’，３’’，３’’’−（２，３−ジヒドロポルフィリン−５，１０，１５，２０−テトライル）テトラフェノール（テモポルフィン）、３−［（２３Ｓ，２４Ｒ）−１４−エテニル−５−（３−メトキシ−３−オキソプロピル）−２２，２３−ビス（メトキシカルボニル）−４，１０，１５，２４−テトラメチル−２５，２６，２７，２８−テトラアザヘキサシクロ［１６．６．１．１３，６．１８，１１．１１３，１６．０１９，２４］オクタコサ−１，３，５，７，９，１１（２７），１２，１４，１６，１８（２５），１９，２１−ドデカエン−９−イル］プロパン酸（ベルテポルフィン）、またはそれらの任意の組合せである、請求項１０に記載のベシクル。
【請求項１２】
前記カンプトテシン化合物が、カンプトテシン、シラテカン７−ｔ−ブチルジメチルシリル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＤＢ−６７）、７−エチル−１０−ヒドロキシ−２０（Ｓ）−カンプトテシン（ＳＮ−３８）、トポテカン、イリノテカン、９−ニトロ−カンプトテシン、ルルトテカン、エキサテカン、ギマテカンまたはカレニテシンである、請求項１０に記載のベシクル。
【請求項１３】
アルキン含有脂質、ＰＥＧ化脂質からなる二成分脂質二重層、および前記二成分脂質二重層内に包埋された細胞傷害剤を含む、請求項１に記載のベシクル。
【請求項１４】
（ｉ）ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、および（ｉｉ）ＤＣ８，９ＰＣ、またはＤＣ８，９ＰＣとＤＣ８，９ＰＥとの組合せを含む二成分脂質二重層；ならびに
前記二成分脂質二重層中に包埋されたＨＰＰＣ、Ｃｅ６および／またはカンプトテシン
を含むベシクルであって；前記二成分脂質二重層には、前記ＤＣ８，９ＰＣ、前記ＤＣ８，９ＰＥおよび前記ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００以外の脂質がないか、または含まれない、ベシクル。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか一項に記載のベシクルを提供するステップ；ならびに
有効期間の間、近赤外範囲中の選択された波長および選択された強度を有する光の標的化印加によって前記ベシクルを照射して、前記細胞傷害剤の少なくとも一部分を活性化するステップ
を含む、方法。
【請求項１６】
光の標的化印加によって前記ベシクルを照射するステップが、６５０〜６７０ｎｍの波長を有する光を生じるレーザーによって前記ベシクルを照射することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記選択された強度が、１ｍＷ〜５００ｍＷである、請求項１５または請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記有効期間が、少なくとも３０秒間である、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
対象を、前記細胞傷害剤で処置され得る状態を有すると識別するステップ；
前記ベシクルを前記対象に投与するステップ
をさらに含み、光の前記標的化印加が、前記対象の標的化された部分に向けられる、請求項１５から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象が、腫瘍を有し、前記対象の前記標的化された部分が、前記腫瘍の場所に近接したエリアを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ベシクルを前記対象に投与するステップが、腫瘍サイズ退縮を誘導するのに有効な量の前記ベシクルを投与することを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
照射するステップが、前記ベシクルを前記対象に投与するステップの４〜６時間後に実施される、請求項１９から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ベシクルを前記対象に投与するステップが、前記ベシクルを前記対象中に静脈内注射することを含む、請求項１９から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ベシクルを前記対象に投与するステップが、前記ベシクルを含む医薬組成物を前記対象に投与することを含む、請求項１９から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
光の前記標的化印加が、前記有効期間の間前記対象の前記標的化された部分に前記光を外部から印加することによって生じ、それによって、前記腫瘍に前記光を経皮的に印加する、請求項１９から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
光の前記標的化印加が、前記有効期間の間前記対象の前記標的化された部分に前記光を内部から印加することによって生じる、請求項１９から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
光が、内視鏡または光ファイバーカテーテルを使用して内部から印加される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
対象における腫瘍の成長を損なうための方法であって、
治療有効量の請求項１から１４のいずれか一項に記載のベシクルを、前記対象に投与するステップ；ならびに
有効期間の間、前記腫瘍の場所に近接した前記対象の標的エリアへの近赤外範囲中の選択された波長および選択された強度を有する光の標的化印加によって前記ベシクルを照射して、前記細胞傷害剤の少なくとも一部分を活性化して反応性酸素種形成を促進し、それによって、前記腫瘍の成長を損なうステップ
を含む、方法。
【請求項２９】
前記有効期間が、少なくとも３０秒間である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
照射するステップが、前記ベシクルを前記対象に投与するステップの４〜６時間後に実施される、請求項２８または請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ベシクルを前記対象に投与するステップが、腫瘍サイズ退縮を誘導するのに有効な量の前記ベシクルを投与することを含む、請求項２８から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ベシクルを前記対象に投与するステップが、前記ベシクルを前記対象中に静脈内注射することを含む、請求項２８から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ベシクルを前記対象に投与するステップが、前記ベシクルを含む医薬組成物を前記対象に投与することを含む、請求項２８から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
光の標的化印加によって前記ベシクルを照射するステップが、前記有効期間の間前記対象の標的化された部分に前記光を外部からまたは内部から印加することを含む、請求項２８から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記光が、内視鏡または光ファイバーカテーテルを使用して内部から印加される、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年７月１２日出願の米国仮特許出願第６２／６９７，２８７号のより早い出願日の利益およびそれに基づく優先権を主張する。
【０００２】
政府支援の確認
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって授与されたプロジェクト番号ＺＩＡ  ＢＣ  ０１１０６１の下で政府支援によりなされた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
二成分脂質二重層および二成分脂質二重層内に包埋された細胞傷害剤を含むベシクル、ならびにベシクルを作製および使用する方法の実施形態が、本明細書に開示される。
【０００４】
共同研究の合意の当事者
Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  ＨｅａｌｔｈおよびＲｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒは、本明細書に開示されるテクノロジーに関する共同研究の合意の当事者である。
【背景技術】
【０００５】
背景
正常な細胞および組織への最小の損傷を伴った、腫瘍組織への抗がん剤の標的化送達は、がん治療における重要な目標である。がんナノテクノロジープラットフォーム、例えば、光線力学的治療（ＰＤＴ）薬物送達プラットフォームは、有望であることが示されている；しかし、従来のＰＤＴプラットフォームは、治療設定におけるそれらの使用を制限し、腫瘍中に効率的に蓄積するそれらの能力もまた制限する構造的特色を有する。優先的な腫瘍取り込み、血漿安定性およびより長い保存可能期間を示すＰＤＴプラットフォームが、当該分野で必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
要旨
アルキン含有リン脂質およびＰＥＧ化脂質を含む二成分脂質二重層；ならびに二成分脂質二重層中に包埋された細胞傷害剤を含むベシクルの実施形態が、本明細書に開示される。特定の開示された実施形態では、二成分脂質二重層には、アルキン含有リン脂質またはＰＥＧ化脂質以外の脂質がないか、または含まれない。一部の実施形態では、アルキン含有リン脂質は、アルキン含有ホスホコリン脂質、アルキン含有ホスホエタノールアミン脂質、またはアルキン含有ホスホコリン脂質とアルキン含有ホスホエタノールアミン脂質との混合物である。開示されたベシクルの例示的な実施形態は、ＤＣ８，９ＰＣおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を含む二成分脂質二重層ならびに二成分脂質二重層中に包埋されたＨＰＰＨを含み；この二成分脂質二重層には、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００およびＤＣ８，９ＰＣ（単独またはＤＣ８，９ＰＥと組み合わせた）以外の脂質がないか、または含まれない。他の例示的な実施形態は、本明細書に記載される。
【０００７】
本開示に従うベシクルを提供するステップ、および有効期間の間、近赤外範囲中の選択された波長および選択された強度を有する光の標的化印加によってベシクルを照射して、細胞傷害剤の少なくとも一部分を活性化するステップを含む方法の実施形態もまた、本明細書に開示される。一部の実施形態では、この方法は、対象を、細胞傷害剤で処置され得る状態を有すると識別するステップ；およびベシクルを対象に投与するステップをさらに含み得；光の標的化印加は、対象の標的化された部分に向けられる。
【０００８】
対象における腫瘍の成長を損なうための方法であって、治療有効量の本開示に従うベシクルを対象に投与するステップ；ならびに有効期間の間、腫瘍の場所に近接した対象の標的エリアへの近赤外範囲中の選択された波長および選択された強度を有する光の標的化印加によってベシクルを照射して、細胞傷害剤の少なくとも一部分を活性化して反応性酸素種形成を促進し、それによって、腫瘍の成長を損なうステップを含む方法の実施形態もまた、開示される。
【０００９】
本開示の上述のおよび他の目的および特色は、添付の図面を参照して進む、以下の詳細な説明からより明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ＰＥＧ化脂質と非二重層形成性アルキン含有ホスホコリン脂質との間で二成分脂質二重層がどのように形成され得るかについての提案されたモデルの概略図である。
【図２】図２は、ベシクルの注射と、その後の、対象の皮膚の外部表面への所望の波長の光の標的化送達とによる、腫瘍を有する対象を処置するために開示されたベシクルを使用するための方法の一実施形態を示す概略図である。
【図３Ａ】図３Ａおよび３Ｂは、２−［１−ヘキシルオキシエチル］−２−デビニルピロフェオホルビド−ａ（ＨＰＰＨ）、（１７Ｓ，１８Ｓ）−１８−（２−カルボキシエチル）−２０−（カルボキシメチル）−１２−エテニル−７−エチル−３，８，１３，１７−テトラメチル−１７，１８，２２，２３−テトラヒドロポルフィリン−２−カルボン酸（または「クロリンｅ６」もしくは「Ｃｅ６」）、１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドトリカルボシアニンヨージド（tetramethylindotricarbocyanine  iodide）（ＤｉＲ）およびカンプトテシン（図３Ａ）；１，２−ビス（トリコサ−１０，１２−ジイノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＣ８，９ＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）および１，２−ビス（１０，１２−トリコサジイノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＣ８，９ＰＥ）（図３Ｂ）の化学構造を提供する。
【図３Ｂ】図３Ａおよび３Ｂは、２−［１−ヘキシルオキシエチル］−２−デビニルピロフェオホルビド−ａ（ＨＰＰＨ）、（１７Ｓ，１８Ｓ）−１８−（２−カルボキシエチル）−２０−（カルボキシメチル）−１２−エテニル−７−エチル−３，８，１３，１７−テトラメチル−１７，１８，２２，２３−テトラヒドロポルフィリン−２−カルボン酸（または「クロリンｅ６」もしくは「Ｃｅ６」）、１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドトリカルボシアニンヨージド（tetramethylindotricarbocyanine  iodide）（ＤｉＲ）およびカンプトテシン（図３Ａ）；１，２−ビス（トリコサ−１０，１２−ジイノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＣ８，９ＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）および１，２−ビス（１０，１２−トリコサジイノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＣ８，９ＰＥ）（図３Ｂ）の化学構造を提供する。
【図４】図４は、脂質製剤中にＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を含めることによる、ＤＣ８，９ＰＣのＵＶ誘発される光架橋に対する影響を示す棒グラフであり、このとき、種々のベシクル実施形態（表１を参照のこと）を、９６ウェルプレート中に配置し、室温で示された期間にわたってＵＶ光（２５４ｎｍ）に曝露させ、各インキュベーションの最後に、吸光度を５２０ｎｍで測定して、光架橋を評価した。
【図５】図５は、取り込まれなかったＨＰＰＨをＨＰＰＨ包埋されたベシクルから除去するために本明細書に開示される遠心分離技術を使用したことから得られた結果を示し、このとき、ＨＰＰＨを担持したベシクルを、微小遠心管中に配置し、遠心分離を、固定角ローター遠心分離機を使用して、６，０００ｒｐｍ（約３０００ＲＣＦ）で２０〜２５℃で３０分間実施し、ベシクルに取り込まれたＨＰＰＨを含む上清を収集し、全ての取り込まれなかったＨＰＰＨを、ペレット画分中に沈降させた。
【図６】図６は、図５によって示されるデータを生成するために使用した遠心分離技術の概略図である。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、例示的なベシクル実施形態におけるＨＰＰＨ濃度を分析したことからの結果を示し、このとき、ＨＰＰＨを、既知の脂質濃度（典型的には、５または１０ｍｇの脂質を使用した）について種々の重量比において含め、ベシクルを、超音波処理によって調製し、取り込まれなかったＨＰＰＨを、遠心分離によって除去した；図７Ａは、試験した脂質：ＨＰＰＨ比についてのベシクル会合ＨＰＰＨの量の結果を示し、図７Ｂは、試験した異なる脂質：ＨＰＰＨ比についてのＨＰＰＨ封入ベシクルのパーセントを示す。
【図８】図８は、本明細書に開示されるベシクル実施形態におけるＨＰＰＨ取り込みを分析したことから得られた結果を示し、ベシクルの二成分脂質二重層中に取り込まれた場合に、ＨＰＰＨのＰＤＴ効率が損なわれないことをさらに示す；これらの結果を生成するために、ベシクル製剤化ＨＰＰＨ実施形態および緩衝液中に懸濁された等価な量のＨＰＰＨを、６６１ｎｍレーザーで５分間処理し、レーザー処理後の残存するＨＰＰＨの蛍光を、未処理試料の蛍光を１００％として評価した。
【図９】図９Ａ〜９Ｃは、腫瘍保有マウスの肝臓、腫瘍および皮膚におけるベシクル製剤化ＨＰＰＨのｉｎ  ｖｉｖｏ組織分布を分析したことから得られた光学イメージング結果を示す；ＣＴ−２６腫瘍保有ＢＡＬＢ／ｃマウスに、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ８０−ＨＰＰＨ（図９Ｂ）またはベシクル２０−ＨＰＰＨ（図９Ａ）のいずれかを使用して静脈内注射した（５匹の群）；ＨＰＰＨなしのベシクル２０製剤（図９Ｃ）を使用してバックグラウンドシグナルを得、種々の時間間隔において画像を収集し、腫瘍、肝臓および皮膚におけるＨＰＰＨの平均放射効率を決定した。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｆは、二成分脂質二重層中に異なる濃度のＰＥＧ化脂質を有する本明細書に開示されるベシクル実施形態の平均直径および多分散指数を示す、直径（ｎｍ）の関数としての強度（％）のグラフである；ＤＣ８，９ＰＣと共に種々のＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００量を含むベシクルを、プローブ超音波処理によって調製し、１：２０または１：４０のいずれかの比（ｖ／ｖ）でＨＢＳ中に希釈し、動的光散乱測定値を得た。
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、包埋された細胞傷害剤を含まないベシクル（ベシクル２０；図１１Ａ）および包埋された細胞傷害剤を含むベシクル（ベシクル２０−ＨＰＰＨ；図１１Ｂ）のクライオ電子顕微鏡写真である。
【図１２】図１２Ａおよび１２Ｂは、２つの代表的なベシクル実施形態であるベシクル１０−ＨＰＰＨ（図１２Ａ）およびベシクル２０−ＨＰＰＨ（図１２Ｂ）の流体力学的サイズ（動的光散乱を使用して時間の関数としてモニタリングされる）の進化を示す、直径（ｎｍ）の関数としての強度（％）のグラフである。
【図１３】図１３は、胎仔ウシ血清とのインキュベーションの際のＨＰＰＨを含むベシクルの相対的分布を示し、検出可能なＨＰＰＨのほとんどが二成分脂質二重層内に包埋されたままであり、ベシクル画分における脂質：ＨＰＰＨ比が影響を受けないままであるので、本明細書に記載されるベシクル実施形態が高い血清安定性を有することを示すグラフである；ベシクル２０−ＨＰＰＨベシクルを、１：０．１の脂質：ＨＰＰＨ比（ｗ／ｗ）で調製し、３７℃で２時間ＦＢＳと共にインキュベートし、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂ上で分画し、画分を収集し、その後、各画分中の脂質Ｐｉ、ＨＰＰＨおよびタンパク質を決定した；差し込み図は、ベシクル画分（１０〜１８ｍｌの画分）中の脂質およびＨＰＰＨ（ｍｇ／ｍｌ）についての拡大バージョンを示す。
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂは、４時間（図１４Ａ）および２４時間（図１４Ｂ）のインキュベーション後の、ベシクル実施形態ベシクル２０−ＨＰＰＨによるＣＴ−２６細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を評価したことからの結果を示すグラフである；９６ウェルクラスター上の細胞を、種々の用量のベシクル２０−ＨＰＰＨと共にインキュベートし、レーザー処理を、インキュベーションの４時間後または２４時間後のいずれかの時点で実施した；使用したレーザー処理線量は、０、１、２または４Ｊ／ｃｍ２のいずれかであり、細胞生存度を、ＭＴＴアッセイを使用して実施した；結果は、未処理の対照細胞を１００％生存とした生存度として示される。
【図１５】図１５は、ＤｉＲおよびＨＰＰＨを含むベシクル実施形態を注射したマウスのｉｎ  ｖｉｖｏ画像（全身ＤｉＲ背側２Ｄ−マルチスペクトル蛍光イメージングを使用してイメージングした）を提供し、開示されたベシクル実施形態が、ＤＰＰＣおよびＤＣ８，９ＰＣ脂質ならびに低い量のＰＥＧ化脂質を含むリポソームと比較して、腫瘍において増強された蓄積を示すことを確立する；結果を生成するために、胸腺欠損ｎｕ／ｎｕマウスに、ＨＴ２９細胞を脇腹に注射し、腫瘍が約１００ｍｍ３に達した時点で、０．２ｍｌのベシクル（１ｍｇの総脂質を含む）を静脈内注射し、ＤｉＲイメージングを注射の４時間後に実施した；「Ｌ」＝肝臓；「Ｔ」＝腫瘍。
【図１６】図１６Ａおよび１６Ｂは、本明細書に開示される異なるベシクル実施形態（ならびにＤＰＰＣおよびＤＣ８，９ＰＣ脂質ならびに低い量のＰＥＧ化脂質を含む比較リポソーム）の腫瘍蓄積の結果および腫瘍対肝臓におけるベシクル実施形態の相対的蓄積の結果を示すグラフである；腫瘍または肝臓におけるＤｉＲ蛍光の定量化を、１群当たり４匹のマウスについての平均をとって実施した；図１６Ａは、腫瘍におけるＤｉＲの総放射効率（±Ｓ．Ｄ．  ４匹の動物）を示し、図１６Ｂは、各群についての腫瘍対肝臓におけるＤｉＲの相対比率を示す；４ｍｏｌ％のＰＥＧ−脂質を含むベシクルについて得られた腫瘍の肝臓に対する比を１００とし、値を、４匹の動物からの平均（±Ｓ．Ｄ．）として表す。
【図１７】図１７Ａ〜１７Ｃは、ＣＴ−２６保有ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける本明細書に記載されるベシクル実施形態ベシクル２０−ＨＰＰＨのｉｎ  ｖｉｖｏ  ＰＤＴ応答および抗腫瘍活性を分析したことから得られた結果を示す；これらの結果を生成するために、比較例Ｔｗｅｅｎ  ８０−ＨＰＰＨ（図１７Ａ）および例示的なベシクル実施形態ベシクル２０−ＨＰＰＨ（図１７Ｂおよび１７Ｃ）を、０．４７μｍｏｌ  ＨＰＰＨ／ｋｇ体重で腫瘍保有マウス中に静脈内注射した；レーザー処理を、ベシクル２０−ＨＰＰＨ注射動物について４時間後に実施し、Ｔｗｅｅｎ  ８０−ＨＰＰＨの注射の２４時間後に実施し、腫瘍体積を示された日に測定した。
【図１８】図１８は、ベシクル２０−ＨＰＰＨ（２回の独立した実験）およびＴｗｅｅｎ  ８０−ＨＰＰＨについて得られた動物生存データを比較するカプラン・マイヤーグラフである。
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｈは、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００およびＤＣ８，９ＰＣを含むある特定の製剤の平均直径および多分散指数を示す、直径（ｎｍ）の関数としての強度（％）のグラフである。
【図２０】図２０Ａおよび２０Ｂは、１日後（図２０Ａ）および７日後（図２０Ｂ）の、二重層中に包埋されたカンプトテシンを含むある特定のベシクル実施形態の平均直径および多分散指数を示す、直径（ｎｍ）の関数としての強度（％）のグラフである。
【図２１】図２１Ａおよび２１Ｂは、遊離カンプトテシン用量（図２１Ｂ）と比較した、カンプトテシン製剤化ベシクル（図２１Ａ）のヒト乳がん細胞におけるカンプトテシン誘導された細胞傷害性を分析したことからの結果を示す、カンプトテシン濃度（ｕＭ）の関数としての蛍光のグラフである。
【図２２】図２２Ａおよび２２Ｂは、Ａ５４９細胞を皮下に埋め込み、細胞傷害剤なしの二成分脂質二重層および微量のＤｉＲを含むベシクル実施形態を次いで注射した２匹の異なるＡ５４９腫瘍保有マウスのｉｎ  ｖｉｖｏ画像を提供する；これらの図面は、開示されたベシクル実施形態が腫瘍中に蓄積することができ、長期肝臓毒性を示さないことを示している；結果を生成するために、マウスにＡ５４９細胞を注射し、腫瘍が１００ｍｍ３〜２００ｍｍ３に達した時点で、０．１ｍｌのベシクル（１ｍｇの総脂質を含む）を静脈内注射し、ＤｉＲイメージングを実施した。
【図２３】図２３は、マウスにベシクル実施形態を注射した１週間後の、図２２Ａおよび２２Ｂ中に示されるマウスの種々の組織の画像を提供し、ベシクルのクリアランスを示す、肝臓中の蛍光シグナルにおける低減が存在した；しかし、シグナルは、腫瘍において比較的持続し、心臓または肺においては蛍光はほとんど〜全く存在せず、このことは、ベシクルが、腫瘍における臓器特異的蓄積を示すが、心臓にも肺にも蓄積せず、したがって、これらの臓器における毒性に寄与しないことを確立している。
【図２４】図２４Ａ〜２４Ｃは、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００およびＤＣ８，９ＰＣならびにＣｅ６を含むベシクル実施形態を分析したことから得られた結果を提供する；図２４Ａおよび２４Ｂは、１日後（図２４Ａ）および７日後（図２４Ｂ）の、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００およびＤＣ８，９ＰＣならびにＣｅ６を含むある特定の製剤の平均直径および多分散指数を示す、直径（ｎｍ）の関数としての強度（％）のグラフであり、図２４Ｃは、Ｃｅ６がベシクル中に取り込まれ得ることを示している。
【図２５】図２５Ａおよび２５Ｂは、１日後（図２５Ａおよび２５Ｂの上のグラフ）および４ヶ月後（図２５Ａおよび２５Ｂの下のグラフ）の、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３５０およびＤＣ８，９ＰＣを含むある特定の製剤（図２５Ａ）ならびにＤＳＰＥ−ＰＥＧ１０００およびＤＣ８，９ＰＣを含むある特定の製剤（図２５Ｂ）の平均直径および多分散指数を示す、直径（ｎｍ）の関数としての強度（％）のグラフである。
【図２６】図２６Ａ〜２６Ｄは、様々な比でＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００およびＤＣ８，９ＰＣを含むある特定の製剤の、異なる期間についての平均直径および多分散指数を示す、直径（ｎｍ）の関数としての強度（％）のグラフである；図２６Ａおよび２６Ｂは、１日後（図２６Ａ）および４ヶ月後（図２６Ｂ）の、９０：１０のＤＣ８，９ＰＣ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００比におけるＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００およびＤＣ８，９ＰＣの結果を示し、図２６Ｃおよび２６Ｄは、１日後（図２６Ｃ）および４ヶ月後（図２６Ｄ）の、９９：１のＤＣ８，９ＰＣ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００比におけるＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００およびＤＣ８，９ＰＣの結果を示す。
【図２７】図２７Ａ〜２７Ｃは、（ｉ）ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、ＤＣ８，９ＰＣおよびＤＣ８，９ＰＥを含むベシクル実施形態（図２７Ａおよび２７Ｂ）、ならびに（ｉｉ）ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００およびＤＣ８，９ＰＥを含み、ＨＰＰＨをさらに含むベシクル実施形態（図２７Ｃ）を分析したことから得られた結果を提供する；図２７Ａおよび２７Ｂは、異なる脂質：ＨＰＰＨ比でＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、ＤＣ８，９ＰＣおよびＤＣ８，９ＰＥを含み、ＨＰＰＨをさらに含むある特定の製剤の平均直径および多分散指数を示す、直径（ｎｍ）の関数としての強度（％）のグラフである；図２７Ａは、２０：１の（総）脂質のＨＰＰＨに対する比を含む実施形態についての結果を示し、図２７Ｂは、１００：１の（総）脂質のＨＰＰＨに対する比を含む実施形態についての結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
詳細な説明
Ｉ．用語および略語の概説
用語および略語の以下の説明は、本開示をよりよく記載するため、および本開示の実施において当業者をガイドするために提供される。本明細書で使用される場合、「含む（comprising）」は、「含む（including）」を意味し、単数形「１つの（a）」または「１つの（an）」または「この（the）」は、文脈が明確に他を示さない限り、複数形の言及を含む。用語「または」は、文脈が明確に他を示さない限り、述べられた選択肢の要素のうちの単一の要素、または２つもしくはそれよりも多くの要素の組合せを指す。
【００１２】
他のように説明しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または等価な方法および材料が、本開示の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および材料は以下に記載される。材料、方法および例は、例示に過ぎず、限定を意図しない。本開示の他の特色は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
【００１３】
他のように示さない限り、本明細書または特許請求の範囲において使用される、構成要素、分子量、パーセンテージ、温度、時間などの量を表す全ての数字は、用語「約」によって修飾されると理解されるべきである。したがって、黙示的または明示的に他のように示さない限り、示される数的パラメーターは、求められる所望の特性および／または標準的な試験条件／方法の下での検出限界に依存し得る近似値である。議論された先行技術から実施形態を直接的かつ明示的に識別する場合、実施形態の数字は、単語「約」が示されない限り、近似ではない。
【００１４】
全ての化学化合物は、（＋）および（−）立体異性体のいずれかまたは両方、ならびに任意の幾何異性体、例えば、ＺおよびＥ異性体ならびにシスおよびトランス異性体を含む。本明細書の他の化学用語は、Hawley's  Condensed  Chemical  Dictionary,  Richard  J.  Lewis,  Sr.  (ed.),  John  Wiley  &  Sons,  Inc.刊,  1997  (ISBN  0-471-29205-2)によって例示されるように、当該分野の従来の用法に従って使用される。
【００１５】
Ａ．用語の説明
用語の以下の説明は、本開示の主題をよりよく説明するため、およびそれを実施する当業者をガイドするために提供される。
【００１６】
投与する：任意の経路による投与、例えば、経口、外用、静脈内、腹腔内、筋肉内、病巣内、鼻腔内もしくは皮下投与、坐剤からの放出、または対象への緩徐放出デバイス（例えば、ミニ浸透圧ポンプ）の埋め込み。「非経口」投与は、消化管を介したもの以外の任意の経路によるものであり、これには、例えば、静脈内または動脈内投与による、血管中への直接的な血管内投与が含まれる。
【００１７】
アルキン含有ホスホコリン脂質：ホスホコリン基（即ち、（ＣＨ３）３Ｎ＋（ＣＨ２）２−ＯＰＯ３−−）および脂質の炭素鎖内の少なくとも１つのアルキン部分を含む脂質であり、一部の実施形態は、脂質の同じ炭素鎖または異なる炭素鎖中にあり得る１つよりも多くのアルキン部分を含む。一部の実施形態では、アルキン含有ホスホコリン脂質は、少なくとも１つのジイン部分を含み得る。例示的なアルキン含有ホスホコリン脂質は、ＤＣ８，９ＰＣである。
【００１８】
アルキン含有ホスホエタノールアミン脂質：ホスホエタノールアミン基（即ち、Ｈ３Ｎ＋（ＣＨ２）２−ＯＰＯ３−−）および脂質の炭素鎖内の少なくとも１つのアルキン部分を含む脂質であり、一部の実施形態は、脂質の同じ炭素鎖または異なる炭素鎖中にあり得る１つよりも多くのアルキン部分を含む。一部の実施形態では、アルキン含有ホスホエタノールアミン脂質は、少なくとも１つのジイン部分を含み得る。例示的なアルキン含有ホスホコリン脂質は、ＤＣ８，９ＰＥである。
【００１９】
アルキン含有リン脂質：リン酸基（例えば、ホスホコリンまたはホスホエタノールアミン）および脂質の炭素鎖内の少なくとも１つのアルキン部分を含む脂質であり、一部の実施形態は、脂質の同じ炭素鎖または異なる炭素鎖中にあり得る１つよりも多くのアルキン部分を含む。一部の実施形態では、アルキン含有リン脂質は、少なくとも１つのジイン部分を含み得る。例示的なアルキン含有リン脂質には、アルキン含有ホスホコリン脂質およびアルキン含有ホスホエタノールアミン脂質が含まれる。
【００２０】
二重層：ベシクルのコアを規定し、少なくとも２つの脂質層を含むベシクルの構成要素であり、各層は、少なくとも１つの非二重層形成性脂質（例えば、アルキン含有リン脂質（またはアルキン含有リン脂質の組合せ））およびＰＥＧ化脂質を含む。
【００２１】
担体：本明細書に記載される化合物を送達することが可能な構成要素として機能する賦形剤。一部の実施形態では、担体は、懸濁助剤、可溶化助剤またはエアロゾル化助剤であり得る。一般に、担体の性質は、使用される投与の特定の様式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、薬学的および生理的に許容される流体、例えば、水、生理的食塩水、平衡塩溶液、水性デキストロース、グリセロールなどをビヒクルとして含む注射可能な流体を含む。一部の例では、薬学的に許容される担体は、対象への（例えば、非経口、筋肉内または皮下注射による）投与に適切なように、無菌であり得る。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬製剤は、少量の非毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、防腐剤およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはモノラウリン酸ソルビタンを含み得る。
【００２２】
脂質：脂肪および脂肪由来材料についての用語。一部の実施形態では、脂質には、脂肪酸のエステル（単純脂質、例えば、脂肪、ステロール、ワックスおよびトリグリセリド）または密接に関連した物質（複合脂質、例えば、リン脂質）が含まれる。脂質は、一般に、水中で不溶性であるが、有機溶媒中では可溶性である。
【００２３】
近赤外（ＮＩＲ）：可視領域と赤外領域との間の電磁スペクトルの領域。近赤外領域の境界について確定した定義は存在しないが、定義には、６５０〜２５００ｎｍ、７５０〜２５００ｎｍ、７８０〜２５００ｎｍ、８００〜２５００ｎｍ、７００〜１４００ｎｍまたは７８０〜３０００ｎｍの波長範囲が含まれる。本明細書で使用される場合、ＮＩＲは、６５０〜２５００ｎｍの波長領域を指す。
【００２４】
非二重層形成性脂質：構造的改変もＰＥＧ化脂質との組合せもない場合には、それ自体で凝集することが可能でなく、二重層を形成することが可能でない脂質。非二重層形成性脂質の例には、アルキン含有リン脂質、例えば、アルキン含有ホスホコリン脂質（例えば、ＤＣ８，９ＰＣ）、アルキン含有ホスホエタノールアミン脂質（例えば、ＤＣ８，９ＰＥ）、およびそれらの組合せが含まれる。
【００２５】
核酸分子：ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。ＤＮＡは、プロモーターに作動可能に連結され得る、および／またはプラスミドなどの発現ベクター内に含まれ得る。ＤＮＡは、ゲノム（イントロンあり）であり得る、またはイントロンなしｃＤＮＡコード配列のみからなり得る。一部の例では、ＤＮＡ配列は、治療タンパク質、例えば、抗腫瘍タンパク質をコードし得る。他の例では、ＲＮＡ配列は、遺伝子発現を阻害する阻害性ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）であり得る。例には、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が含まれる。
【００２６】
ＰＥＧ化：ベシクルに関して、ＰＥＧ化は、細網内皮系による検出からベシクルを保護するため、およびベシクルの血液循環時間を増加させるために、表面結合したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を取り込むことを指す。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、化学的に活性化され得る２つの末端ヒドロキシル基を有する、反復酸化エチレンサブユニットから構成される親水性ポリマーである。ＰＥＧの一般構造は、ＨＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨであり、式中、ｎは、０またはそれよりも大きい、例えば、０〜１０，０００（もしくはそれよりも大きい）、または１〜７，５００、または１〜５，０００、または１〜３，０００、または１〜２，０００、または１〜１，０００であり得る。一部の実施形態では、ｎは、３５０〜１０，０００、例えば、３５０〜５，０００、または３５０〜２，０００、または３５０〜１，０００である。ＰＥＧ鎖は、直鎖または分岐鎖であり得る。薬学的にまたは生物学的に有用な薬剤へのＰＥＧコンジュゲーションは、典型的には、官能基を有するＰＥＧ誘導体を調製することによってＰＥＧを活性化することを含む。ＰＥＧ上の官能基は、コンジュゲートされる分子の反応性基に基づいて選択される。ＰＥＧの分子量は、肝臓による迅速なクリアランスだけでなく、いずれの毒性効果も回避するように選択される。
【００２７】
ＰＥＧ化脂質：脂質に共有結合したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基を含む脂質であり、ＰＥＧ基は、脂質の官能基に直接的に、またはリンカーもしくは他の官能基を介して脂質に間接的に、結合される。
【００２８】
医薬品剤または生理活性剤：治療効果（診断効果を含む）を提供することが可能な分子。生理活性剤は、生きた組織に対して効果を有する。例には、抗がん剤、イメージング剤、抗炎症剤および低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子が含まれる。
【００２９】
薬学的に許容される：用語「薬学的に許容される」は、対象に対する顕著な有害な毒物学的効果なしに対象中に取り込まれ得る物質を指す。
【００３０】
薬学的に許容される賦形剤：活性化合物の製剤中に含められる、活性化合物（例えば、本明細書に記載される化合物）以外の物質。本明細書で使用される場合、賦形剤は、医薬製剤の粒子内に取り込まれ得る、または医薬製剤の粒子と物理的に混合され得る。賦形剤はまた、溶液、懸濁物、エマルジョンなどの形態であり得る。賦形剤は、例えば、活性薬剤を希釈するため、および／または医薬製剤の特性を改変するために、使用され得る。賦形剤には、付着防止剤（antiadherent）、バインダー、コーティング、腸溶性コーティング、崩壊剤、香味料、甘味料、着色料、滑沢剤、流動促進剤、吸着剤、防腐剤、アジュバント、担体またはビヒクルが含まれ得るがこれらに限定されない。賦形剤は、デンプンおよび加工デンプン、セルロースおよびセルロース誘導体、糖類およびそれらの誘導体、例えば、二糖、多糖および糖アルコール、タンパク質、合成ポリマー、架橋ポリマー、抗酸化剤、アミノ酸または防腐剤であり得る。例示的な賦形剤には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、植物ステアリン、スクロース、ラクトース、デンプン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、キシリトール、ソルビトール、マルチトール、ゼラチン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、トコフェリルポリエチレングリコール１０００サクシネート（ビタミンＥ  ＴＰＧＳまたはＴＰＧＳとしても公知）、カルボキシメチルセルロース、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、パルミチン酸レチニル、セレン、システイン、メチオニン、クエン酸、クエン酸ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン、糖、シリカ、タルク、炭酸マグネシウム、デンプングリコール酸ナトリウム、タートラジン、アスパルテーム、塩化ベンザルコニウム、ゴマ油、没食子酸プロピル、メタ重亜硫酸ナトリウムまたはラノリンが含まれるがこれらに限定されない。
【００３１】
リン脂質：リン酸基を含む脂質。リン脂質は、リン酸基および２つの脂肪酸鎖に結合したグリセロールを含む。
【００３２】
光活性化可能な／光誘発可能な：光エネルギーによって活性化される（例えば、不活性形態から活性形態に変換される）ことが可能であること。
【００３３】
光活性化／光誘発：光エネルギーを使用してベシクルを活性化すること。本明細書で使用される場合、活性化は、本明細書に開示される細胞傷害剤からの反応性酸素種形成を促進すること、および／またはベシクルの二成分脂質二重層内に包埋された細胞傷害剤の少なくとも一部分が放出されるように、ベシクルの二成分脂質二重層壁を不安定化することを含み得る。一部の実施形態では、光活性化は、例えば、予め選択された標的エリアへの選択された波長、強度および／または表面積の光の標的化印加へのベシクルの曝露によって生じる。
【００３４】
光増感剤：光化学的反応を開始させる分子または原子種。用語「光増感剤」は、生物、細胞または組織を光に対して増感させる物質も指す。光増感剤は、例えば、がんの処置のための光線力学的治療において使用され得る。光増感剤は、特定の波長または波長範囲の光を吸収し、励起される。励起された光増感剤は、近傍の分子にエネルギーを移動させる。光線力学的治療では、光増感剤は、がん細胞によって取り込まれ得る。光吸収により、光増感剤は、細胞内に存在する酸素にエネルギーを移動させ、それによって、がん細胞にとって毒性である反応性酸素種（ＲＯＳ）を産生する。
【００３５】
対象：哺乳動物および／または他の動物、例えば、ヒト、コンパニオン動物（例えば、イヌ、ネコ、ウサギなど）、有用動物（utility  animal）、餌動物（feed  animal）など；したがって、開示された方法は、ヒト治療および獣医学適用の両方に適用可能である。
【００３６】
治療有効量：処置されている対象において所望の効果を達成するのに十分な、特定の化合物または組成物の量または濃度。例えば、これは、腫瘍細胞死または阻害を引き起こし、それによって、腫瘍を排除し、腫瘍のサイズを低減させ、および／または対象における腫瘍成長を阻害するのに必要な、本明細書に開示されるベシクル、またはベシクルを含む医薬組成物の量であり得る。理想的には、化合物または組成物の治療有効量は、非腫瘍細胞に対する大きな細胞傷害効果なしに所望の効果を低減させるのに十分な量である。しかし、ベシクルまたは組成物の治療有効量は、処置されている対象、腫瘍のサイズおよび特徴、ならびに治療的組成物の投与の様式に依存する。
【００３７】
処置する／処置：対象、特に、目的の疾患もしくは状態を有する、または疾患もしくは状態を発達させる傾向があってもなくてもよいヒトまたは哺乳動物における、目的の疾患または状態の処置であり、これには、限定なしに例として以下が含まれる：
（ｉ）特に、かかる対象がその状態になりやすいが、その状態を有すると未だ診断されていない場合に、対象において疾患もしくは状態が生じるのを予防するため、または必要に応じて、その状態と関連する症状を好転させるための、予防的投与；
（ｉｉ）疾患または状態を阻害すること、例えば、その発達を停止または緩徐化すること；
（ｉｉｉ）疾患または状態を軽減すること、例えば、疾患もしくは状態またはその症状の退縮を引き起こすこと；あるいは
（ｉｖ）疾患または状態を安定化すること。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語「疾患」および「状態」は、相互交換可能に使用され得、または特定の病弊もしくは状態が、既知の原因因子を有していない場合があり（その結果、病因がいまだ決定されていない）、したがって、疾患としてはいまだ認識されておらず、望ましくない状態もしくは症候群としてのみ認識されているという点で異なり得、このとき、症状のより具体的なまたはあまり具体的でないセットは、臨床医によって識別されている。
【００３９】
ベシクル：空洞を形成し包囲する脂質二重層を含む構造的構成要素であって、空洞は、コア材料、例えば、ナノ粒子中に見出されるコア材料（例えば、ＣａＰコア、液体金属コアなど）を含まない。その代わり、ベシクル内の空洞は、閉鎖内部空間である。ベシクルは、膜の型によって特徴付けられ得る。単層ベシクルは、単一の膜を有する。オリゴラメラ（oligolamellar）ベシクルおよび多重層ベシクルは、複数の、通常は同心の膜層を有し、典型的には、０．１μｍよりも大きい。いくつかの非同心膜を有するベシクル、即ち、より大きいベシクル内に含まれるいくつかの小さいベシクルは、多胞性ベシクルと呼ばれる。特定の開示された実施形態では、本開示のベシクル実施形態は、「単層」であり、したがって、単一の二成分脂質二重層膜を有する。
【００４０】
Ｚ平均サイズ：キュムラントの技術を使用して動的光散乱データを分析することによって決定される平均サイズ；「キュムラント平均」または「調和強度平均粒子直径（harmonic  intensity  averaged  particle  diameter）」（ＩＳＯ  ２２４１２）とも呼ばれる。
Ｂ．略語
ＤＣ８，９ＰＣ：１，２ビス（トリコサ−１０，１２−ジイノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン
ＤＣ８，９ＰＥ：１，２−ビス（１０，１２−トリコサジイノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン
ＤｉＲ：１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドトリカルボシアニンヨージド
ＤＭＥＭ：ダルベッコ改変イーグル培地（１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ＦＢＳ（胎仔ウシ血清）、１００ｉ．ｕ．／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充した）
ＤＰＰＣ：１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（１８：０  ＰＥＧ２  ＰＥ）：１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）
ＨＢＳ：ＨＥＰＥＳ緩衝液、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２〜７．５）
ＨＰＰＨ：２−［１−ヘキシルオキシエチル］−２−デビニルピロフェオホルビド−ａ
ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水（２．６６ｍＭ  ＫＣｌ、１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３８ｍＭ  ＮａＣｌ、８．０６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ（ｐＨ７．１））
ＰＤＴ：光線力学的治療
ＰＩ：多分散指数
【００４１】
ＩＩ．導入
抗がん薬物の臨床的有用性は、その不十分な溶解性、低減されたバイオアベイラビリティおよび非特異的毒性に起因して限定的である場合が多い。これらの制限は、これらの薬物の所望の部位（複数可）への輸送のために適切な担体を開発することによって軽減され得る。がんナノ薬における一部の以前に調査されたプラットフォームには、脂質ベースのナノ担体が含まれる；しかし、従来のリポソームは、腫瘍中に特異的に蓄積し、単核食細胞系（ＭＰＳ）による取り込みを回避する能力が限定されている。
【００４２】
ＰＥＧ化脂質をリポソーム中に導入することによって、ＭＰＳ取り込みを部分的に低減させることができる「ステルス」リポソームを創出することが可能である；しかし、かかるリポソームの大きい割合は、ＭＰＳによってなおも取り込まれる。さらに、リポソーム中へのＰＥＧ化脂質取り込みの度合いおよび程度は、それらの構造的制約に起因して限定的である場合が多い。典型的には、リポソーム中に効率的に取り込むことができるＰＥＧ脂質濃度は、かかる構造的制約によって制限され、かかるリポソームは、典型的には、二重層形成性脂質、例えば、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（またはジオレオイルホスファチジルコリン、「ＤＯＰＣ」）を使用することを必要とする。
【００４３】
本開示は、アルキン含有リン脂質およびＰＥＧ化脂質を含む二成分脂質二重層を含み、脂質層中に包埋された細胞傷害剤をさらに含む新規ベシクルの実施形態を記載する。一部の実施形態では、アルキン含有リン脂質は、アルキン含有ホスホコリン脂質、アルキン含有ホスホエタノールアミン脂質、またはアルキン含有ホスホコリン脂質とアルキン含有ホスホエタノールアミン脂質との混合物（両方の型のリン脂質が二成分脂質二重層中に含まれるように）である。開示されたベシクル実施形態は、リポソーム送達系において典型的に使用される従来のリン脂質、例えば、ホスファチジルコリン脂質を使用することを必要とせず、その代わり、２つの異なる脂質のみを使用して、ベシクルを作製することに関連する複雑性およびコストを低減させる。開示されたベシクル実施形態は、驚くほど高い量のＰＥＧ化脂質を収容することができるが、二成分脂質膜内の高い濃度での細胞傷害剤の担持もまた可能にする。開示されたベシクル実施形態はまた、周囲温度における貯蔵の際にそれらの安定性を維持し、高い効率で腫瘍中にさらに蓄積し、再発を伴わない際立って高い腫瘍治療を示す。
【００４４】
ＩＩＩ．ベシクルおよび組成物の実施形態
アルキン含有リン脂質およびＰＥＧ化脂質を含む二成分脂質二重層ならびに脂質層中に包埋された細胞傷害剤を含むベシクルの実施形態が、本明細書に開示される。一部の実施形態では、アルキン含有リン脂質は、アルキン含有ホスホコリン脂質、アルキン含有ホスホエタノールアミン脂質、またはアルキン含有ホスホコリン脂質とアルキン含有ホスホエタノールアミン脂質との混合物である。特定の実施形態では、アルキン含有リン脂質は、アルキン含有ホスホコリン脂質である、またはアルキン含有ホスホコリン脂質とアルキン含有ホスホエタノールアミン脂質との混合物である。一部の実施形態では、二成分脂質二重層は、複数（例えば、２つまたはそれよりも多く）の細胞傷害剤を含み得る。
【００４５】
特定の開示された実施形態では、ベシクルは、（ｉ）アルキン含有リン脂質およびＰＥＧ化脂質を含む二成分脂質二重層；ならびに（ｉｉ）二成分脂質二重層中に包埋された細胞傷害剤を含み得、この二成分脂質二重層には、アルキン含有リン脂質またはＰＥＧ化脂質以外の脂質がないか、または含まれない。独立した実施形態では、アルキン含有ホスホエタノールアミン脂質は、本明細書で「アルキン含有リン脂質またはＰＥＧ化脂質以外の脂質」と呼ばれるものではない。
【００４６】
一部の実施形態では、ベシクルは、（ｉ）アルキン含有ホスホコリン脂質およびＰＥＧ化脂質を含む二成分脂質二重層；ならびに（ｉｉ）二成分脂質二重層中に包埋された細胞傷害剤を含み得、この二成分脂質二重層には、アルキン含有ホスホコリン脂質またはＰＥＧ化脂質以外の脂質がないか、または含まれない。なおさらなる実施形態では、ベシクルは、（ｉ）アルキン含有ホスホコリン脂質、アルキン含有ホスホエタノールアミン脂質およびＰＥＧ化脂質を含む二成分脂質二重層；ならびに（ｉｉ）二成分脂質二重層中に包埋された細胞傷害剤を含み得、この二成分脂質二重層には、アルキン含有ホスホコリン脂質、アルキン含有ホスホエタノールアミン脂質またはＰＥＧ化脂質以外の脂質がないか、または含まれない。アルキン含有ホスホコリン脂質、アルキン含有ホスホエタノールアミン脂質またはＰＥＧ化脂質以外の脂質には、ホスファチジルコリン脂質（例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン、または「ＤＰＰＣ」）、非ＰＥＧ化ＤＳＰＥ、コレステロール、プラスマローゲン、ＤＰＰＥ−ＤＶＢＡ、ビス−アゾＰＣ、ビス−ソルビルホスファチジルコリン（または「ビス−ＳｏｒｂＰＣ」）などが含まれ得る。一部の実施形態では、ベシクルは、（ｉ）アルキン含有リン脂質（例えば、アルキン含有ホスホコリン脂質および／またはアルキン含有ホスホエタノールアミン脂質）およびＰＥＧ化脂質でできた二成分脂質二重層；ならびに（ｉｉ）二成分脂質二重層中に包埋された細胞傷害剤から本質的になり得る。かかる実施形態では、ベシクルには、アルキン含有リン脂質またはＰＥＧ化脂質以外の脂質、ならびにその所望の機能を果たすベシクルの能力に有害な影響を与える任意の構成要素、例えば、ベシクルの形状および／または安定性を破壊する薬剤または化合物がない。なおさらなる実施形態では、ベシクルは、アルキン含有リン脂質（例えば、アルキン含有ホスホコリン脂質および／またはアルキン含有ホスホエタノールアミン脂質）、ＰＥＧ化脂質および細胞傷害剤からなり得る。なおさらなる実施形態では、ベシクルは、（ｉ）アルキン含有リン脂質（例えば、アルキン含有ホスホコリン脂質および／またはアルキン含有ホスホエタノールアミン脂質）およびＰＥＧ化脂質からなる二成分脂質二重層；ならびに（ｉｉ）細胞傷害剤を含み得る。ある特定のイメージング目的、例えば、体内分布研究のために、微量の脂質プローブ（例えば、１，１’−ジオクタデシルテトラメチルインドトリカルボシアニンヨージド（ＤｉＲ））が、ベシクル中に含められ得る。この構成要素は、ベシクルの性能に有害な影響を与えず、ベシクル実施形態の必要な構成要素ではない。
【００４７】
特定の開示された実施形態では、アルキン含有リン脂質は、薬物送達に適切な水溶液中でそれ自体ではナノ構造を形成しない、非二重層形成性脂質である。一部の実施形態では、非二重層形成性脂質は、単独では、小管様形態を形成する。例えば、例示的なアルキン含有ホスホコリン脂質ＤＣ８，９ＰＣの小管様構造を示す図１を参照のこと。他の例示的なアルキン含有リン脂質には、アルキン含有ホスホエタノールアミン脂質、例えば、ＤＣ８，９ＰＥなどが含まれるがこれらに限定されない。
【００４８】
二成分脂質二重層は、８０ｍｏｌ％（またはそれ未満、例えば、７５ｍｏｌ％）〜９７ｍｏｌ％、例えば、８５ｍｏｌ％〜９５ｍｏｌ％、または８５ｍｏｌ％〜９０ｍｏｌ％のアルキン含有リン脂質（またはかかるリン脂質の組合せ）を含み得る。特定の開示された実施形態では、アルキン含有リン脂質（またはかかるリン脂質の組合せ）は、８０ｍｏｌ％、８５ｍｏｌ％または９０ｍｏｌ％で存在する。アルキン含有ホスホコリン脂質とアルキン含有ホスホエタノールアミン脂質との混合物をアルキン含有リン脂質として含む実施形態では、アルキン含有ホスホコリン脂質は、４５ｍｏｌ％〜８５ｍｏｌ％、例えば、５０ｍｏｌ％〜８０ｍｏｌ％、または５０ｍｏｌ％〜７５ｍｏｌ％、または５０ｍｏｌ％〜７０ｍｏｌ％、または５０ｍｏｌ％〜６５ｍｏｌ％で存在し得；アルキン含有ホスホエタノールアミン脂質は、５ｍｏｌ％〜４５ｍｏｌ％、例えば、５ｍｏｌ％〜４０ｍｏｌ％、または５ｍｏｌ％〜３５ｍｏｌ％、または５ｍｏｌ％〜３０ｍｏｌ％、または５ｍｏｌ％〜２５ｍｏｌ％、または５ｍｏｌ％〜２０ｍｏｌ％、または５ｍｏｌ％〜１５ｍｏｌ％、または５ｍｏｌ％〜１０ｍｏｌ％で存在し得る。かかる混合物の代表的な実施形態では、アルキン含有ホスホコリン脂質は、６５ｍｏｌ％で存在し得、アルキン含有ホスホエタノールアミン脂質は、２５ｍｏｌ％で存在し得る。なおさらなる実施形態では、アルキン含有ホスホコリン脂質は、４５ｍｏｌ％で存在し得、アルキン含有ホスホエタノールアミン脂質は、４５ｍｏｌ％で存在し得る。
【００４９】
非二重層形成性脂質は、図１に概略で示されるように、ベシクル構造を形成するように、ＰＥＧ化脂質と組み合わされる。ＰＥＧ化脂質は、対象への投与を含む治療方法に適切であり、また、所望により、細胞中に蓄積しないように、高すぎる親水性を有さない、任意のＰＥＧ化脂質から選択され得る。特定の開示された実施形態では、ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ基で改変されたホスホエタノールアミン脂質を含む。かかる脂質には、３５０Ｄａを超え、１０，０００Ｄａまでの範囲、例えば、３５０Ｄａから５，０００Ｄａ（もしくはそれよりも大きい）まで、または５００Ｄａから５，０００Ｄａまでの範囲の分子量を有するＰＥＧ基を含む１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＳＥ）脂質が含まれ得るがこれらに限定されない。一部の実施形態では、ＰＥＧ基は、１，０００Ｄａから５，０００Ｄａまで、または１，０００Ｄａから４，０００Ｄａまで、または１，０００Ｄａから３，０００Ｄａまで、または１，０００Ｄａから２，０００Ｄａまでの範囲の分子量を有し得る。代表的な実施形態では、ＤＰＳＥ−ＰＥＧ２０００が、ＰＥＧ化脂質として使用される。他の例示的なＰＥＧ化脂質には、コレステロール−ＰＥＧ６００、ＤＰＳＥ−ＰＥＧ１０００、ＤＰＳＥ−ＰＥＧ５０００などが含まれるがこれらに限定されない。
【００５０】
二成分脂質二重層は、３ｍｏｌ％〜２０ｍｏｌ％またはそれよりも高い（例えば、２５ｍｏｌ％）ＰＥＧ化脂質を含み得、特定の実施形態では、６ｍｏｌ％を超え、２０ｍｏｌ％まで、例えば、８ｍｏｌ％〜１５ｍｏｌ％、または１０ｍｏｌ％〜１５ｍｏｌ％のＰＥＧ化脂質を含み得る。特定の開示された実施形態では、ＰＥＧ化脂質は、１０ｍｏｌ％、１５ｍｏｌ％または２０ｍｏｌ％の量で存在し得る。ＰＥＧ化脂質がＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００である独立した実施形態では、ＰＥＧ化脂質は、６ｍｏｌ％よりも高い量で使用される。
【００５１】
開示されたアルキン含有リン脂質およびＰＥＧ化脂質は、内部空洞を規定するベシクル構造を形成するように相互作用する（図１）。開示されたベシクルの実施形態は、５０ｎｍから２００ｎｍまでの範囲、例えば、６０ｎｍから１５０ｎｍまで、または６５ｎｍから１００ｎｍまでの範囲の直径を有する。一部の実施形態では、開示されたベシクルは、０．２から０．３までの範囲のＰＩを有し得る。
【００５２】
１つまたは複数の細胞傷害剤は、アルキン含有リン脂質およびＰＥＧ化脂質によって形成される二重層内に包埋され得る。一部の実施形態では、細胞傷害剤は、疎水性化合物、例えば、テトラピロール（tetrapyrrollic）化合物またはカンプトテシンである。例示的なテトラピロール化合物には、ＨＰＰＨまたはそのテトラピロールアナログ、例えば、アミノジエチルアナログ、アミノヘキサンアナログ、およびその関連部分が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１２／００６００９によって開示されるような他のかかるアナログ；クロリンｅ６（または「Ｃｅ６」）；（３Ｓ，４Ｓ）−９−エテニル−１４−エチル−２１−（メトキシカルボニル）−４，８，１３，１８−テトラメチル−２０−オキソ−３−ホルビン（phorbine）プロパン酸（「フェオホルビドａ」）；３，３’，３’’，３’’’−（２，３−ジヒドロポルフィリン−５，１０，１５，２０−テトライル）テトラフェノール（または「テモポルフィン（Temoporfn）」）および３−［（２３Ｓ，２４Ｒ）−１４−エテニル−５−（３−メトキシ−３−オキソプロピル）−２２，２３−ビス（メトキシカルボニル）−４，１０，１５，２４−テトラメチル−２５，２６，２７，２８−テトラアザヘキサシクロ［１６．６．１．１３，６．１８，１１．１１３，１６．０１９，２４］オクタコサ−１，３，５，７，９，１１（２７），１２，１４，１６，１８（２５），１９，２１−ドデカエン−９−イル］プロパン酸（または「ベルテポルフィン」）が含まれるがこれらに限定されない。ＨＰＰＨは、生理的ｐＨで５．６のｌｏｇ  Ｐ、近赤外領域における大きいモル吸光、即ち、６６５ｎｍにおけるε＝４７，５００Ｍ−１ｃｍ−１、および０．４８の一重項酸素収率を有する親油性化合物である。ＨＰＰＨは、抗がん特性も有し、例えば、食道がんおよび非小細胞肺がんの処置のために、ＰＤＴにおいて使用されてきた。一部の実施形態では、活性化されたＨＰＰＨは、光活性化の際に反応性酸素種（例えば、一重項酸素）を生成することを介して、その治療効果を発揮する。クロリンｅ６は、本明細書に開示される実施形態において使用され得る別の例示的なＰＤＴ化合物であり、ＨＰＰＨと同様、治療効果を発揮するために活性化され得る。一部の実施形態では、ベシクルは、カンプトテシンを含み得る。カンプトテシンは、化学療法活性を示す疎水性ラクトン薬物である。例示的なカンプトテシンには、カンプトテシン、シラテカン（silatecan）７−ｔ−ブチルジメチルシリル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＤＢ−６７）、７−エチル−１０−ヒドロキシ−２０（Ｓ）−カンプトテシン（ＳＮ−３８）、トポテカン、イリノテカン、９−ニトロ−カンプトテシン、ルルトテカン（lurtotecan）、エキサテカン、ギマテカン（gimatecan）およびカレニテシン（karenitecin）が含まれるがこれらに限定されない。さらなる実施形態では、細胞傷害剤は、パクリタキセル、ダウノルビシン、メソトレキセート、ビンクリスチン、エトポシド、ソラフェニブ、エルロチニブ、イマチニブ、またはそれらの任意の組合せから選択され得る。任意の組合せおよび任意の数の細胞傷害剤が、ベシクルにおいて使用され得る。
【００５３】
細胞傷害剤（または細胞傷害剤の組合せ）は、高い濃度、例えば、０．０５ｍｇ細胞傷害剤／ｍｇ脂質から０．５ｍｇ細胞傷害剤／ｍｇ脂質までの範囲、例えば、０．０７５ｍｇ細胞傷害剤／ｍｇ脂質から０．５ｍｇ細胞傷害剤／ｍｇ脂質まで、または０．１ｍｇ細胞傷害剤／ｍｇ脂質から０．５ｍｇ細胞傷害剤／ｍｇ脂質まで、または０．２５ｍｇ細胞傷害剤／ｍｇ脂質から０．５ｍｇ細胞傷害剤／ｍｇ脂質までの範囲の量で、二成分脂質二重層中に包埋され得る。複数の細胞傷害剤を含む実施形態では、存在する細胞傷害剤の総量は、０．０５ｍｇ細胞傷害剤／ｍｇ脂質から０．５ｍｇ細胞傷害剤／ｍｇ脂質までの範囲、例えば、０．０７５ｍｇ細胞傷害剤／ｍｇ脂質から０．５ｍｇ細胞傷害剤／ｍｇ脂質まで、または０．１ｍｇ細胞傷害剤／ｍｇ脂質から０．５ｍｇ細胞傷害剤／ｍｇ脂質まで、または０．２５ｍｇ細胞傷害剤／ｍｇ脂質から０．５ｍｇ細胞傷害剤／ｍｇ脂質までの範囲であり得る。一部の実施形態では、細胞傷害剤は、５：１の脂質：細胞傷害剤から１００：１の脂質：細胞傷害剤までの範囲、例えば、５：１の脂質：細胞傷害剤から２０：１の脂質：細胞傷害剤までの範囲の、総脂質含量の細胞傷害剤に対する比（「脂質：細胞傷害剤」）を提供する量で存在し得る。一部の実施形態では、５：１の脂質：細胞傷害剤、１０：１の脂質：細胞傷害剤または２０：１の脂質：細胞傷害剤の比が使用される。
【００５４】
本開示は、少なくとも１つの本明細書に記載されるベシクルを含む医薬組成物を含む。開示された医薬組成物の一部の実施形態は、近赤外エネルギーによって照射された場合、腫瘍細胞を死滅させることまたは阻害することが可能であり、それによって、腫瘍を排除し、腫瘍サイズを低減させ、および／または腫瘍成長を阻害する。医薬組成物は、腫瘍細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで付与され得、または医薬組成物は、ヒトおよび／もしくは獣医学の薬における使用のために製剤化され得、治療有効量または診断有効量の医薬組成物を対象に投与することによって、腫瘍細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで付与され得る。
【００５５】
医薬組成物の一部の実施形態は、薬学的に許容される担体および少なくとも１つの活性成分を含む。有用な薬学的に許容される担体および賦形剤は、当該分野で公知である。活性成分は、例えば、少なくとも１つの本明細書に記載されるベシクル実施形態、または本明細書に記載されるベシクルの任意の組合せ（例えば、１つの特定の型の細胞傷害剤を含むベシクルと異なる型の細胞傷害剤を含むベシクルとの組合せ）を含み得る。さらに、例えば、処置されている苦痛に対して、類似の、関連のまたは補完的な効果を有する他の薬用剤または医薬品剤が、医薬組成物中に活性成分として含められ得る。これらの薬剤には、医薬品化合物、化学療法剤、サイトカインおよび抗血管新生剤が含まれるがこれらに限定されない。
【００５６】
１つまたは複数のベシクルを含む医薬組成物は、例えば、投与の様式ならびに／または処置される疾患の場所および型に依存して、種々の方法で製剤化され得る。例えば、非経口製剤は、薬学的および生理的に許容される流体ビヒクル、例えば、水、生理的食塩水、他の平衡塩溶液、水性デキストロース、グリセロールなどである注射可能な流体を含み得る。賦形剤には、例えば、非イオン性可溶化剤、例えば、ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ、またはタンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンもしくは血漿調製物が含まれ得る。所望により、投与される医薬組成物は、非毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、防腐剤およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはモノラウリン酸ソルビタンもまた含み得る。
【００５７】
医薬組成物の投薬形態は、選択された投与の様式によって決定される。開示された医薬組成物の実施形態は、例えば、外用、眼、経口、頬側、全身、経鼻、注射、経皮、直腸、腟などを含む事実上任意の様式の投与に適切な形態、または吸入もしくは送気による投与に適切な形態を取り得る。
【００５８】
外用調製物には、当該分野で周知の、点眼、ゲル、軟膏、クリーム、懸濁物、スプレーなどが含まれ得る。
【００５９】
有用な注射可能な調製物には、水性または油性ビヒクル中の活性化合物（複数可）の、無菌の懸濁物、溶液またはエマルジョンが含まれる。組成物は、製剤化剤、例えば、懸濁化剤、安定剤および／または分散剤もまた含み得る。注射のための製剤は、単位投薬形態中で、例えば、アンプル中または多用量コンテナ中で提示され得、添加された防腐剤を含み得る。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁物、溶液またはエマルジョンなどの形態を取り得、懸濁化剤、安定剤および／または分散剤などの製剤的薬剤（formulatory  agent）を含み得る。例えば、非経口投与は、ボーラス注射または継続注入によって実施され得る。あるいは、活性成分は、使用前に、無菌水などの適切なビヒクルによる復元のための粉末形態であり得る。
【００６０】
全身製剤には、注射、例えば、皮下、静脈内、筋肉内、くも膜下腔内または腹腔内注射による投与のために設計されたもの、ならびに経皮、経粘膜、経口または肺投与のために設計されたものが含まれる。
【００６１】
経口製剤は、液体（例えば、シロップ、溶液または懸濁物）または固体（例えば、粉末、錠剤またはカプセル）であり得る。経口製剤は、内皮バリアを横断するために、標的化リガンドとカップリングされ得る。一部のベシクル製剤は、リポソーム粉末を形成するために、例えば、二糖を用いたスプレー乾燥によって乾燥され得る。固体組成物は、薬学的に許容される賦形剤、例えば、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；フィラー（例えば、ラクトース、マンニトール、結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）を用いて、従来の手段によって調製され得る。錠剤は、例えば、ベシクルの二成分脂質二重層の酸変性を和らげる、糖、フィルムまたは腸溶性コーティングを用いて、当該分野で周知の方法によってコーティングされ得る。かかる投薬形態を調製するための実際の方法は、当業者に公知である、または当業者に明らかとなる。
【００６２】
経口投与のための液体調製物は、例えば、エリキシル剤、溶液、シロップまたは懸濁物の形態を取り得る。かかる液体調製物は、薬学的に許容される添加剤、例えば、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、ｃｒｅｍｏｐｈｏｒｅ（商標）または分留植物油）；および防腐剤（例えば、メチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸）を用いて、従来の手段によって調製され得る。調製物は、必要に応じて、緩衝塩、防腐剤、香味剤、着色剤および甘味剤もまた含み得る。経口投与のための調製物は、周知のように、活性化合物の制御放出を与えるために、適切に製剤化され得る。
【００６３】
頬側投与のために、組成物は、従来の様式で製剤化された錠剤またはロゼンジ剤の形態を取り得る。
【００６４】
直腸および腟経路の投与のために、活性化合物（複数可）は、従来の坐剤基剤、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドを含む溶液（停留浣腸のため）、坐剤または軟膏として製剤化され得る。
【００６５】
経鼻投与または吸入もしくは送気による投与のために、活性化合物（複数可）は、適切な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、フッ化炭素、二酸化炭素または他の適切なガスの使用によって、加圧されたパックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレーまたはミストの形態で、簡便に送達され得る。加圧されたエアロゾルの場合、投薬単位は、計量された量を送達するための弁を提供することによって決定され得る。
【００６６】
長期送達のために、ベシクルは、埋め込みまたは筋肉内注射による投与のためのデポー調製物として製剤化され得る。あるいは、経皮吸収のためにベシクルを緩徐に放出する粘着性のディスクまたはパッチとして製造された経皮送達系が使用され得る。この目的のために、浸透増強剤が、活性化合物（複数可）の経皮透過を促進するために使用され得る。
【００６７】
本明細書に記載されるベシクルを含む医薬組成物のある特定の実施形態は、正確な投薬量の個々の投与に適切な単位投薬形態で製剤化され得る。医薬組成物は、所望により、ベシクルを含む１つまたは複数の単位投薬形態を含み得るパックまたはディスペンサーデバイス中で提示され得る。パックは、例えば、金属またはプラスチックホイル、例えば、ブリスターパックを含み得る。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための使用説明書が付属し得る。投与されるベシクルの量は、処置されている対象、苦痛の重症度（例えば、腫瘍のサイズ、場所および特徴）、および投与の様式に依存し、当業者に公知である。これらの範囲内で、投与される製剤は、処置されている対象において所望の効果を達成するのに有効な量の、本明細書に開示されるベシクルの量を含む。
【００６８】
開示されたベシクルの実施形態は、一般に、意図した結果を達成するのに有効な量で、例えば、腫瘍を処置またはイメージングするのに有効な量で使用される。ベシクルは、治療利益を達成するために、治療的に投与され得る。治療利益とは、処置されている根底にある障害の根絶もしくは好転、および／または患者が根底にある障害になおも苦しんでいるにしても、その患者が、感覚または状態における改善を報告するような、根底にある障害と関連する症状のうち１つもしくは複数の根絶もしくは好転を意味する。治療利益には、改善が自覚されているかどうかにかかわらず、疾患の進行を停止または緩徐化することもまた含まれる。一部の実施形態では、ベシクルは、診断的利益を達成するために投与される。診断的利益には、例えば、腫瘍組織などの標的組織をイメージングする能力が含まれる。
【００６９】
投与される量は、例えば、処置されている特定の適応症、投与の様式、処置されている適応症の重症度、患者の年齢および体重、ベシクルの空洞内に含められる特定の生理活性剤のバイオアベイラビリティなどが含まれる種々の因子に依存する。有効投薬量の決定は、十分に、当業者の能力の範囲内である。
【００７０】
有効投薬量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイから最初に推定され得る。例えば、初回投薬量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて決定されるように、腫瘍細胞壊死を引き起こすのに十分な、ベシクルの二重層内に包埋された細胞傷害剤によって産生される反応性酸素種の腫瘍組織濃度を達成するように製剤化され得る。さらなる実施形態では、初回投薬量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて決定されるように、腫瘍細胞壊死を引き起こすのに十分な、ベシクル破壊後に、放出された細胞傷害剤の腫瘍組織濃度を達成するように製剤化され得る。かかる濃度を達成するための投薬量の計算は、十分に、当業者の能力の範囲内である。ガイダンスとして、読者には、Fingl  &  Woodbury,  "General  Principles,"  In:  Goodman  and  Gilman's  The  Pharmaceutical  Basis  of  Therapeutics,  Chapter  1,  pp.  1  46,  latest  edition,  Pagamonon  Pressおよびその中で引用された参考文献を参照されたい。
【００７１】
初回投薬量は、動物モデルなど、ｉｎ  ｖｉｖｏデータからも推定され得る。腫瘍を処置するための化合物の有効性を試験するのに有用な動物モデルは、当該分野で周知である。当業者は、本開示の利益と共に、ヒト投与に適切な投薬量を決定するためにかかる情報を適応させることができる。
【００７２】
好ましくは、ベシクルは、大きな毒性を引き起こすことなく、治療利益または予防利益を提供する。ベシクルの毒性は、標準的な製薬手順を使用して決定され得る。毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療指数である。高い治療指数を示すベシクルが好ましい。
【００７３】
製薬方法および医薬組成物のある特定の実施形態は、本明細書に記載されるベシクルと、ベシクル以外の第２の薬剤の治療有効量との共投与を含む。ベシクルおよび第２の薬剤は、別々に、または単一の組成物中で一緒に投与され得る。第２の薬剤は、例えば、抗腫瘍剤または血管新生阻害剤であり得る。
【００７４】
ＩＶ．ベシクル実施形態を作製する方法
本開示のベシクル実施形態を作製する方法の実施形態が、本明細書に開示される。この方法は、ベシクルを産生するために、プローブ超音波処理法を使用することを含み得る。一部の実施形態では、アルキン含有リン脂質が、クロロホルム中のＰＥＧ化脂質と組み合わされ、これらは混合される。様々な比の脂質が上記のように使用され得、例示的な比は、本開示の実施例のセクションにおいて、表１および２によって提供される。
【００７５】
所望の量の細胞傷害剤が、脂質フィルムを作製する前に、脂質混合物に溶液（例えば、ＤＭＳＯ溶液）として添加される。全ての溶媒が（例えば、窒素ガス下で）除去され、得られた脂質フィルムは、貯蔵され得、および／または不活性雰囲気下でさらに乾燥され得る。乾燥された脂質フィルムは、緩衝液（例えば、１ｍｌ  ＨＢＳ、ｐＨ＝７．４）を使用して再懸濁される。脂質混合物は、ボルテックスされ、加熱され、次いで、氷浴中でプローブソニケーターを使用して超音波処理される。特定の開示された実施形態では、脂質混合物は、ボルテックスされ、４５〜５０℃で１５〜２０分間加熱され、少なくとも５回の凍結−解凍サイクルに供される。かかる実施形態では、プローブソニケーターが使用され得、特定の実施形態は、１サイクル当たり１分間での５〜１０サイクルと、その後の１分間の休止を使用する。本明細書に開示される例示的なベシクルの作製の具体的な例は、本開示の実施例のセクションに詳細に記載される。
【００７６】
Ｖ．ベシクル実施形態を使用する方法
Ａ．光活性化
開示されたベシクルの実施形態は、有効期間の間、予め選択された標的エリアへの所望の波長、強度および／または表面積を有する光の標的化印加によって、光活性化される（例えば、細胞傷害剤が活性化される、および／または二重層中の脂質コンフォメーションが、細胞傷害剤放出を促進するように改変される）。波長は、近赤外範囲内、例えば、６５０ｎｍ〜２５００ｎｍから選択される。光活性化可能な細胞傷害剤、例えばＨＰＰＨが使用される場合、波長は、６５０〜６７０ｎｍから選択される。適切な光強度は、標的部位および印加の方法に依存して、１ｍＷから５００ｍＷまでの範囲であり得る。一部の例では、９０ｍＷ、６６０ｎｍのレーザーを使用した。近赤外光源は、Ｔｈｏｒｌａｂｓ（Ｎｅｗｔｏｎ、ＮＪ）、Ｌａｓｅｒ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ、ＵＳＡ（Ｈｕｄｓｏｎ、ＮＨ）、ＰｒｏＰｈｏｔｏｎｉｘ（Ｓａｌｅｍ、ＮＨ）などを含む商業的供給源から得ることができる。
【００７７】
一部の実施形態では、光活性化は、標的化されたエリアに光を外部から印加することによって実施される。ＮＩＲ光は、数センチメートルの深さまで、組織中に経皮的に透過することが可能である。他の実施形態では、光活性化は、例えば、内視鏡または光ファイバーカテーテルを使用することによって、光を内部から印加することによって実施され得る。内部印加は、腫瘍などの標的組織が、外部光印加に不適切な深さに位置する場合に使用され得る。例えば、内視鏡は、肺、胃または膀胱中への光送達のために使用され得る。
【００７８】
光印加のための表面積は、一般に、標的組織、例えば、腫瘍もしくは腫瘍の部分、または標的組織に対して外部の皮膚のエリアを含むように選択される。標的化された外部から印加される光が所望される場合、表面積は、適切な光アプリケーター、例えば、マイクロレンズ、フレネルレンズまたはディフューザー配置を使用することによって制御され得る。標的化された内部から印加される光のために、所望の内視鏡または光ファイバーカテーテル直径が使用され得る。一部の適用では、光散乱性溶液を満たした留置カテーテルが、標的組織に近接して内部から配置され得、光ファイバー光源が、カテーテル中に挿入され得る（例えば、Madsen  et  al.,  Lasers  in  Surgery  and  Medicine  2001,  29,  406-412を参照のこと）。
【００７９】
一部の実施形態では、光活性化は、ベシクルの二成分脂質二重層壁内の細胞傷害剤、例えば、ＨＰＰＨまたは他のかかる光活性化可能な化合物の少なくとも一部分を活性化するのに有効な期間にわたって実施され、それによって、腫瘍細胞に対して作用し得る反応性酸素種を放出する。なおさらなる実施形態では、光活性化は、二成分脂質二重層壁が不安定化されるように、二成分脂質二重層の脂質におけるコンフォメーション変化および／または酸化的変化を活性化するのに有効な期間にわたって実施され得る。この不安定化は、包埋された細胞傷害剤、例えば、カンプトテシンの少なくとも一部分の放出を生じ得る。一部の実施形態では、有効期間は、数秒間から数分間までの範囲、例えば、３０秒間から１５分間までの範囲である。ある特定の例では、光活性化は、５〜１０分間実施した。
【００８０】
特定の実施形態では、ＨＰＰＨが、細胞傷害剤として使用される。ＨＰＰＨは、近赤外光エネルギー、例えば、６５０ｎｍ〜６８０ｎｍの波長を有するＮＩＲ光で活性化される。例えば、ＨＰＰＨは、６５５ｎｍ〜６７５ｎｍの波長を有する光を生じるレーザー、例えば、６６０ｎｍレーザーによって有効期間の間照射された場合に、活性化され得る。ある特定の実施形態では、ＨＰＰＨは、数秒間〜数分間にわたって連続波（ｃｗ）−ダイオード６００ｎｍレーザー源（９０ｍＶ）によって照射された場合に、活性化される。
【００８１】
Ｂ．適用
開示されたベシクルの実施形態は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用および／または対象へのｉｎ  ｖｉｖｏ投与のために適切である。上記のように、包埋された細胞傷害剤の少なくとも一部分は、有効期間の間、光（例えば、近赤外光エネルギー）によって照射された際に、反応性酸素種形成を促進するため、および／または別の包埋された細胞傷害剤が放出され得るようにベシクルの形態における変化を促進するために、活性化される。
【００８２】
特定の開示された実施形態では、開示されたベシクルは、細胞傷害剤、例えば、ＨＰＰＨ（または他のテトラピロール化合物、例えば、クロリンｅ６）またはカンプトテシン化合物で処置され得る状態を有すると識別された対象に投与され得る。例えば、図２を参照すると、腫瘍を有する対象２００は、空洞中に包埋されたＨＰＰＨを含むベシクル実施形態で処置され得る。対象への開示されたベシクルの投与は、腫瘍の成長を損ない得るおよび／または腫瘍退縮を引き起こし得る。開示されたベシクルは、高い量のＰＥＧ化脂質を有するので、これらのベシクルは、腫瘍２１０によって優先的に取り込まれ、腫瘍２１０中に蓄積する。治療有効量のベシクル、またはベシクルを含む医薬組成物が、非経口、静脈内、皮下、経口、直腸、腟または外用投与が含まれるがこれらに限定されない任意の適切な手段によって、対象に投与される。図２に示される例では、ベシクル２２０は、静脈内注射を介して投与される。対象の標的部分には、引き続いて、有効期間、例えば、１〜１５分間にわたって、外部光アプリケーター２３０を使用して所望の波長のＮＩＲ光エネルギーが選択的に照射される。光アプリケーター２３０は、腫瘍２１０の領域に限定された標的エリアに光活性化エネルギーを適用し、それによって、腫瘍２１０中およびその周囲においてベシクルを選択的に光活性化し、ＨＰＰＨから生成される反応性酸素種の送達を標的化する。
【００８３】
包埋された細胞傷害剤は、腫瘍細胞成長を阻害し得、および／または腫瘍細胞を死滅させ得、それによって、組合せ化学療法を腫瘍部位に提供する。適切な腫瘍部位には、頭部、頸部、皮膚、膀胱、前立腺、結腸および肺が含まれるがこれらに限定されない。細胞傷害剤および／または細胞傷害剤によって生成される反応性酸素種は、腫瘍部位において直接放出されるので、非標的化投与の他の方法と比較して、細胞傷害剤の有効性は増加され得、および／または細胞傷害剤の副作用は低減され得る。
【００８４】
特定の開示された実施形態では、ベシクル２０−ＨＰＰＨを静脈内注射したｃｏｌｏｎ−２６保有ＢＡＬＢ／ｃマウスは、臨床試験において現在使用されている製剤、即ち、Ｔｗｅｅｎ  ８０−ＨＰＰＨと比較して、優れたＰＤＴ有効性および動物生存（最大で１００日間腫瘍再発なし）を示した。さらにかつ有利には、ベシクルは、室温での貯蔵の際に６０日間にわたって安定性を示し、ＨＴ２９腫瘍保有胸腺欠損マウス中の腫瘍異種移植片において優先的に蓄積することも示された。類似の蓄積の確認が、Ａ５４９腫瘍保有マウスにおいて観察された。さらなる詳細は、本開示の実施例のセクションで議論される。
【００８５】
開示されたベシクルの実施形態は、ナノイメージングツール、病原体診断薬、経口ワクチンおよびバイオミメティクスとしても有用であり得る。
【００８６】
ＶＩ．いくつかの実施形態の概説
治療的使用のためのベシクルの実施形態が、本明細書に開示される。一部の実施形態では、ベシクルは、アルキン含有リン脂質およびＰＥＧ化脂質を含む二成分脂質二重層；ならびに二成分脂質二重層中に包埋された細胞傷害剤を含み；この二成分脂質二重層には、アルキン含有リン脂質またはＰＥＧ化脂質以外の脂質がないか、または含まれない。
【００８７】
上記実施形態のいずれかまたは全てでは、二成分脂質二重層は、６ｍｏｌ％を超え、２０ｍｏｌ％までのＰＥＧ化脂質を含む。
【００８８】
上記実施形態のいずれかまたは全てでは、二成分脂質二重層は、１０ｍｏｌ％〜２０ｍｏｌ％のＰＥＧ化脂質を含む。
【００８９】
上記実施形態のいずれかまたは全てでは、合計したアルキン含有リン脂質およびＰＥＧ化脂質と、細胞傷害剤とは、１：０．０５（総脂質：細胞傷害剤）の比で存在する。
【００９０】
上記実施形態のいずれかまたは全てでは、アルキン含有リン脂質は、アルキン含有ホスホコリン脂質、またはアルキン含有ホスホコリン脂質とアルキン含有ホスホエタノールアミン脂質との混合物である。
【００９１】
上記実施形態のいずれかまたは全てでは、アルキン含有ホスホコリン脂質は、１，２−ビス（トリコサ−１０，１２−ジイノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＣ８，９ＰＣ）であり、アルキン含有ホスホエタノールアミン脂質は、１，２−ビス（１０，１２−トリコサジイノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＣ８，９ＰＥ）である。
【００９２】
上記実施形態のいずれかまたは全てでは、ＰＥＧ化脂質は、５００Ｄａから５０００Ｄａまでの範囲の分子量を有するＰＥＧ基を含むＰＥＧ化１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）脂質である。
【００９３】
上記実施形態のいずれかまたは全てでは、ＰＥＧ化脂質は、１０００Ｄａから３０００Ｄａまでの範囲の分子量を有するＰＥＧ基を含むＰＥＧ化ＤＳＰＥ脂質である。
【００９４】
上記実施形態のいずれかまたは全てでは、ＰＥＧ化脂質は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）である。
【００９５】
上記実施形態のいずれかまたは全てでは、細胞傷害剤は、テトラピロール化合物、カンプトテシン化合物、パクリタキセル、ダウノルビシン、メソトレキセート、ビンクリスチン、エトポシド、ソラフェニブ、エルロチニブ、イマチニブ、またはそれらの任意の組合せである。
【００９６】
上記実施形態のいずれかまたは全てでは、テトラピロール化合物は、２−［１−ヘキシルオキシエチル］−２−デビニルピロフェオホルビド−ａ（ＨＰＰＨ）、（１７Ｓ，１８Ｓ）−１８−（２−カルボキシエチル）−２０−（カルボキシメチル）−１２−エテニル−７−エチル−３，８，１３，１７−テトラメチル−１７，１８，２２，２３−テトラヒドロポルフィリン−２−カルボン酸（Ｃｅ６）、（３Ｓ，４Ｓ）−９−エテニル−１４−エチル−２１−（メトキシカルボニル）−４，８，１３，１８−テトラメチル−２０−オキソ−３−ホルビンプロパン酸（フェオホルビドａ）；３，３’，３’’，３’’’−（２，３−ジヒドロポルフィリン−５，１０，１５，２０−テトライル）テトラフェノール（テモポルフィン）、３−［（２３Ｓ，２４Ｒ）−１４−エテニル−５−（３−メトキシ−３−オキソプロピル）−２２，２３−ビス（メトキシカルボニル）−４，１０，１５，２４−テトラメチル−２５，２６，２７，２８−テトラアザヘキサシクロ［１６．６．１．１３，６．１８，１１．１１３，１６．０１９，２４］オクタコサ−１，３，５，７，９，１１（２７），１２，１４，１６，１８（２５），１９，２１−ドデカエン−９−イル］プロパン酸（ベルテポルフィン）、またはそれらの任意の組合せである。
【００９７】
上記実施形態のいずれかまたは全てでは、カンプトテシン化合物は、カンプトテシン、シラテカン７−ｔ−ブチルジメチルシリル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＤＢ−６７）、７−エチル−１０−ヒドロキシ−２０（Ｓ）−カンプトテシン（ＳＮ−３８）、トポテカン、イリノテカン、９−ニトロ−カンプトテシン、ルルトテカン、エキサテカン、ギマテカンまたはカレニテシンである。
【００９８】
上記実施形態のいずれかまたは全てでは、ベシクルは、アルキン含有脂質、ＰＥＧ化脂質からなる二成分脂質二重層、および二成分脂質二重層内に包埋された細胞傷害剤を含む。
【００９９】
（ｉ）ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、および（ｉｉ）ＤＣ８，９ＰＣ、またはＤＣ８，９ＰＣとＤＣ８，９ＰＥとの組合せを含む二成分脂質二重層；ならびに二成分脂質二重層中に包埋されたＨＰＰＣ、Ｃｅ６および／またはカンプトテシンを含むベシクルであって；二成分脂質二重層には、ＤＣ８，９ＰＣ、ＤＣ８，９ＰＥおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００以外の脂質がないか、または含まれない、ベシクルの実施形態もまた、本明細書に開示される。
【０１００】
本明細書に開示されるベシクル実施形態のいずれかを使用する方法もまた、本明細書に開示される。一部の実施形態では、この方法は、上記ベシクル実施形態のいずれか１つまたは全てに従うベシクルを提供するステップ；ならびに有効期間の間、近赤外範囲中の選択された波長および選択された強度を有する光の標的化印加によってベシクルを照射して、細胞傷害剤の少なくとも一部分を活性化するステップを含む。
【０１０１】
上記実施形態のいずれかまたは全てでは、光の標的化印加によってベシクルを照射するステップは、６５０〜６７０ｎｍの波長を有する光を生じるレーザーによってベシクルを照射することを含む。
【０１０２】
上記実施形態のいずれかまたは全てでは、選択された強度は、１ｍＷ〜５００ｍＷである。
【０１０３】
上記実施形態のいずれかまたは全てでは、有効期間は、少なくとも３０秒間である。
【０１０４】
上記実施形態のいずれかまたは全てでは、この方法は、対象を、細胞傷害剤で処置され得る状態を有すると識別するステップ；ベシクルを対象に投与するステップをさらに含み、光の標的化印加は、対象の標的化された部分に向けられる。
【０１０５】
上記実施形態のいずれかまたは全てでは、対象は、腫瘍を有し、対象の標的化された部分は、腫瘍の場所に近接したエリアを含む。
【０１０６】
上記実施形態のいずれかまたは全てでは、ベシクルを対象に投与するステップは、腫瘍サイズ退縮を誘導するのに有効な量のベシクルを投与することを含む。
【０１０７】
上記実施形態のいずれかまたは全てでは、照射するステップは、ベシクルを対象に投与するステップの４〜６時間後に実施される。
【０１０８】
上記実施形態のいずれかまたは全てでは、ベシクルを対象に投与するステップは、ベシクルを対象中に静脈内注射することを含む。
【０１０９】
上記実施形態のいずれかまたは全てでは、ベシクルを対象に投与するステップは、ベシクルを含む医薬組成物を対象に投与することを含む。
【０１１０】
上記実施形態のいずれかまたは全てでは、光の標的化印加は、有効期間の間対象の標的化された部分に光を外部から適用することによって生じ、それによって、腫瘍に光を経皮的に印加する。
【０１１１】
上記実施形態のいずれかまたは全てでは、光の標的化印加は、有効期間の間対象の標的化された部分に光を内部から印加することによって生じる。
【０１１２】
上記実施形態のいずれかまたは全てでは、光は、内視鏡または光ファイバーカテーテルを使用して内部から印加される。
【０１１３】
対象における腫瘍の成長を損なうための方法の実施形態もまた、本明細書に開示される。一部の実施形態では、この方法は、治療有効量の上記ベシクル実施形態のいずれかまたは全てに従うベシクルを、対象に投与するステップ；ならびに有効期間の間、腫瘍の場所に近接した対象の標的エリアへの近赤外範囲中の選択された波長および選択された強度を有する光の標的化印加によってベシクルを照射して、細胞傷害剤の少なくとも一部分を活性化して反応性酸素種形成を促進し、それによって、腫瘍の成長を損なうステップを含む。
【０１１４】
上記実施形態のいずれかまたは全てでは、有効期間は、少なくとも３０秒間である。
【０１１５】
上記実施形態のいずれかまたは全てでは、照射するステップは、ベシクルを対象に投与するステップの４〜６時間後に実施される。
【０１１６】
上記実施形態のいずれかまたは全てでは、ベシクルを対象に投与するステップは、腫瘍サイズ退縮を誘導するのに有効な量のベシクルを投与することを含む。
【０１１７】
上記実施形態のいずれかまたは全てでは、ベシクルを対象に投与するステップは、ベシクルを対象中に静脈内注射することを含む。
【０１１８】
上記実施形態のいずれかまたは全てでは、ベシクルを対象に投与するステップは、ベシクルを含む医薬組成物を対象に投与することを含む。
【０１１９】
上記実施形態のいずれかまたは全てでは、光の標的化印加によってベシクルを照射するステップは、有効期間の間対象の標的化された部分に光を外部からまたは内部から印加することを含む。
【０１２０】
上記実施形態のいずれかまたは全てでは、光は、内視鏡または光ファイバーカテーテルを使用して内部から印加される。
【実施例】
【０１２１】
ＶＩＩ．実施例
脂質は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ、ＵＳＡ）からであった。ＰＤ１０およびＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂは、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ、ＵＳＡ）からであった。ＤｉＲ（ＤｉＩＣ１８）（７）は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）からであった。全ての他の材料は、試薬グレードのものであった。２−［１−ヘキシルオキシエチル］−２−デビニルピロフェオホルビド−ａ（ＨＰＰＨ）は、Ｇａｒｙ  Ｐａｕｌｙ博士（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｃｏｒｅ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＣＣＲ）が合成した。
【０１２２】
細胞  −  ＨＴ２９（ヒト結腸直腸腺癌）細胞は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ６０細胞系リポジトリから得た。マウスＣＴ−２６結腸癌細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入した。細胞を、１０％ＦＢＳ、１００ｉ．ｕ．／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中で、５％ＣＯ２中で３７℃で維持した。
【０１２３】
ベシクルの調製  −  種々の分子の化学構造（図３Ａおよび３Ｂを参照のこと）、ベシクル調製物の詳細（図４）、それらの精製プロトコール（図５および６）、および特徴付け（例えば、図４、７Ａ、７Ｂ、８、２４）が、本明細書に記載される。以下のセットのベシクルを調製した：
【０１２４】
（ａ）ＰＥＧ化脂質−ＤＣ８，９ＰＣベシクル：種々のモル比（０〜５０ｍｏｌ％のＰＥＧ化脂質）でＤＣ８，９ＰＣおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を含むベシクルを、プローブ超音波処理によって調製した。この研究で試験した種々の製剤は、表１中に示される（ベシクル０〜ベシクル５０）。
【０１２５】
（ｂ）ＨＰＰＨ−ベシクル：１０または２０ｍｏｌ％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を含むベシクル（ベシクル１０およびベシクル２０）（表１）を使用して、ＨＰＰＨを担持した（表２）。ＨＰＰＨを、脂質フィルムの形成の間に含めた。種々の量のＨＰＰＨ（０〜０．５ｍｇ  ＨＰＰＨ／ｍｇ脂質の範囲）を試験して、ベシクルにおける薬物取り込みの効率を最適化した（図７Ａおよび７Ｂ）。低速遠心分離に基づく、取り込まれなかったＨＰＰＨを分離するための単純かつ新たな方法（図６）もまた使用した。さらなる例では、２０：１（ｗ／ｗ）または１００：１（ｗ／ｗ）の脂質：ＨＰＰＨを含むＰＥＧ化脂質−ＤＣ８，９ＰＣ−ＤＣ８，９ＰＥベシクルを作製した。さらなる例では、ＨＰＰＨおよび異なるＰＥＧ基を有するＰＥＧ化脂質を含むベシクルを、プローブ超音波処理によって調製した：（ａ）ＤＣ８，９ＰＣおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧ３５０（１０ｍｏｌ％のＰＥＧ化脂質、２０：１  ｗ／ｗ脂質：ＨＰＰＨ）；（ｂ）ＤＣ８，９ＰＣおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧ１０００（１０ｍｏｌ％のＰＥＧ化脂質、２０：１  ｗ／ｗ脂質：ＨＰＰＨ）；または（ｃ）種々のモル比（１、５および１０ｍｏｌ％のＰＥＧ化脂質、２０：１  ｗ／ｗ脂質：ＨＰＰＨ）のＤＣ８，９ＰＣおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００。これらの種々の製剤は、表４および５に要約される。
【０１２６】
（ｃ）ＨＰＰＨ−ＤｉＲ−ベシクル：マウスイメージング研究のために、０．５ｍｏｌ％の近ＩＲマウスイメージング脂質ＤｉＲ（Ｅｘ／Ｅｍ  ７５０／７８０ｎｍ）を、ベシクル１０およびベシクル２０中に含めた。ＨＰＰＨを、０．０５ｍｇ  ＨＰＰＨ／ｍｇ総脂質で取り込んだ（表２、ベシクル１０−ＨＰＰＨ／ＤｉＲおよびベシクル２０−ＨＰＰＨ／ＤｉＲ）。４ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む製剤（ＤＰＰＣ：ＤＣ８，９ＰＣ／ＤｉＲベシクル、表２）を、比較のために使用した。
【０１２７】
（ｄ）ＰＥＧ化脂質−ＤＣ８，９ＰＣ−ＤＣ８，９ＰＥベシクル：６５：２５：１０のモル比（ＤＣ８，９ＰＣ：ＤＣ８，９ＰＥ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）でＤＣ８，９ＰＣ、ＤＣ８，９ＰＥおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を含むベシクルを、プローブ超音波処理によって調製した。例示的な実施形態は、表３に要約される。
【０１２８】
（ｂ）Ｃｅ６−ベシクル：ＤＣ８，９ＰＣ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００のモル比でＤＣ８，９ＰＣ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を含むベシクルを使用して、５：１（ｗ／ｗ）、１０：１（ｗ／ｗ）および２０：１（ｗ／ｗ）の脂質：Ｃｅ６の範囲の量で、Ｃｅ６を担持した。これらの実施形態は、表６に要約される。
【表１】
2021530492.tif 000003
【表２】
2021530492.tif 000004
【表３】
2021530492.tif 000005
【表４】
2021530492.tif 000006
【表５】
2021530492.tif 000007
【表６】
2021530492.tif 000008
【０１２９】
簡潔に述べると、脂質（クロロホルム中）を、ガラス管中で混合した。ＨＰＰＨを含むベシクルについて、ＤＭＳＯストックからの所望の量のＨＰＰＨ（１０〜１００ｍｇ／ｍｌ）を、脂質混合物に添加し、その後、脂質フィルムを作製した。溶媒を窒素ガス下で除去し、脂質フィルムを、デシケーター中で室温で一晩維持して、微量の溶媒を除去した。典型的には、ベシクルを、１試料当たり５〜１０ｍｇの総脂質で調製した。次いで、乾燥させたフィルムを、１ｍｌのＨＢＳ（ｐＨ＝７．４）を使用して再懸濁した。脂質混合物をボルテックスし、４５〜５０℃で１５〜２０分間加熱し、少なくとも５回の凍結−解凍サイクルに供した。脂質懸濁物を、氷浴中でプローブソニケーター（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ、Ｍｉｃｒｏｔｉｐ  ｐｒｏｂｅ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；１サイクル当たり１分間での５〜１０サイクルと、その後の１分間の休止）を使用して超音波処理した。
【０１３０】
ＨＰＰＨを担持したベシクルを、微小遠心管中に配置し、遠心分離を、固定角ローター遠心分離を使用して、６，０００ｒｐｍ（約３０００ＲＣＦ）で２０〜２５℃で３０分間実施した。ベシクルに取り込まれたＨＰＰＨを含む上清を収集し、水性環境中で凝集する全ての取り込まれなかったＨＰＰＨを、ペレット画分中に沈降させた。等価な量の遊離ＨＰＰＨの試料を、ＨＢＳ中に懸濁し（脂質なし）、ボルテックスすることによって混合した。遊離ＨＰＰＨは、緩衝液中で凝集し、これは、上記のような低速での遠心分離によって、ペレット化された画分中に沈降させることができた。このプロトコールは、取り込まれなかったＨＰＰＨをベシクル会合ＨＰＰＨから除去するための単純な手順を提示した。
【０１３１】
ベシクルの特徴付け
総リン脂質分析：ベシクルにおけるリン脂質回収を、Ａｍｅｓ＆Ｄｕｂｉｎに従う無機リン（Ｐｉ）の分析によって決定した。典型的には、＞９０％の脂質が、種々の製剤において回収された。
【０１３２】
ベシクル会合ＨＰＰＨの定量化：ベシクルにおけるＨＰＰＨ取り込みを、吸光度の測定によって決定した。試料中のＨＰＰＨの初期インプットを定量化するために、測定を、遠心分離ステップの前および後に、超音波処理した試料において実施した。典型的には、５０μｌの試料を、９６ウェルプレート中に配置し、等体積のメタノールおよび１％ＴＸ１００と混合した。試料を、ピペットを使用して穏やかに混合し、吸光度を、マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ  ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して６６５ｎｍで測定した。
【０１３３】
ベシクルのサイズ分析：ベシクルのサイズおよび母分布を、Ｍａｌｖｅｒｎ機器（ＮＡＮＯ  ＺＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して動的光散乱（ＤＬＳ）測定によって決定した。典型的なサイジング実験のために、５〜１０μｌのベシクルを、０．４ｍｌの最終体積になるようにＨＢＳ中に希釈し、測定を、マイクロキュベットを使用して実施した。各実行は、試料１つ当たり１２〜２４回の獲得の、少なくとも３回の測定からなった。ＨＰＰＨを担持したベシクルを、室温で貯蔵したところ、最大で少なくとも６０日間にわたって、安定（ＤＬＳ測定によるサイズ分析において変化なし）のままであった。ベシクルの形態を、クライオ電子顕微鏡によってさらに試験した。
【０１３４】
ベシクルの光処理  −  ベシクルの光処理を、２つの独立した規定された方針を用いて実施した。最初に、ＨＰＰＨなしで調製したベシクルを使用して、ＤＣ８，９ＰＣの分子間パッキングに対するＰＥＧ化脂質の影響を評価した。この影響を、２５４ｎｍ（ＵＶ）誘導されたＤＣ８，９ＰＣ光架橋によってモニタリングした。第２に、ＨＰＰＨを担持したベシクルを、ベシクル会合ＨＰＰＨの光活性化について試験した。この影響を、６６１ｎｍダイオードレーザーを使用してモニタリングして、ＨＰＰＨ光損傷を評価した。ベシクルにおけるＨＰＰＨ担持を、いずれのＵＶ処理もなしに実施し、これらのベシクルを、本明細書に開示されるある特定の実施例において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ試験のために使用した。光処理条件の細目は、以下に記載される：
【０１３５】
ベシクル（ＨＰＰＨなし）の２５４ｎｍ（ＵＶ）処理：ＨＰＰＨを担持する前のベシクルを、ＵＶ処理のために使用した（表１Ａ）。ベシクル（０．１ｍｌ）に、９６ウェルクラスター中に配置し、室温で種々の期間（０〜４０分間）にわたり、０．５〜１インチの距離でＵＶランプ（ＵＶＰ、Ｓｈｏｒｔ  Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  １１５Ｖ、６０Ｈｚ、２５４ｎｍ）によって照射を行った。架橋されたＤＣ８，９ＰＣの出現を、５２０ｎｍでの測定によってモニタリングした（３）。
【０１３６】
ベシクル２０−ＨＰＰＨの６６１ｎｍレーザー処理：ベシクル２０−ＨＰＰＨ（５０〜１００μｇの脂質および２．５〜５μｇのＨＰＰＨを含む）を微小遠心管中に配置し、ダイオードレーザーキューブを装着した箱中で室温で水平に照射を行った。照射を、６６１ｎｍレーザー（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ  Ｃｕｂｅ  Ｐａｒｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  １１３００６１）を９０ｍＷ（Ｓ１２１Ｃ  Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ  Ｐｏｗｅｒ  Ｓｅｎｓｏｒを備えたＴｈｏｒｌａｂｓ  ＰＭ２００  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｍｅｔｅｒによって測定した場合、１２５ｍＷ／ｃｍ２）の出力で使用して、５分間実施した。Ｔｗｅｅｎ  ８０（Ｔｗｅｅｎ  ８０−ＨＰＰＨ）（４）およびＤＰＰＣ：ＤＣ８，９ＰＣ：ＤＳＰＥＧ２０００ベシクル（表１Ｂ）中に分散させた遊離ＨＰＰＨを対照として使用して、光損傷の程度を比較した。
【０１３７】
動物組織におけるベシクルおよびベシクル会合ＨＰＰＨの定量化
組織におけるＤｉＲ定量化：定量化のために、ＤｉＲのスペクトルプロファイル（Ｅｘ／Ｅｍ  ７５０／７８０ｎｍ）を取得して、自己蛍光からシグナルを分離した。色素の分離された構成要素画像を、定量的分析のために使用した。目的の２Ｄ領域（ＲＯＩ）を、異なる臓器を囲むように手動で画定して、それらの内側の総放射効率を測定した。バックグラウンドを、いずれの取り込みの証拠も示さなかったエリアにおいて、典型的には頸部エリアの周囲で、測定した。シグナルを、ＲＯＩの面積によって正規化し、バックグラウンドを補正した。全ての分析を、Ｍａｅｓｔｒｏソフトウェアバージョン２．１０．０（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて実施した。
【０１３８】
組織におけるＨＰＰＨの定量化：マルチスペクトルイメージングシステムＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）をＬｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ（画像獲得および分析ソフトウェア）と共に使用して、ＨＰＰＨをアッセイした（Ｅｘ／Ｅｍ  ４１０／６７０ｎｍ；Ｑ帯吸光度ｍａｘ＝６６５ｎｍ）。ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍは、透過照明法（下から）または落射照明法（上から）のいずれかを使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光光源で照明を当てる能力を有する。この機器は、フィルターのスペクトルスキャニングおよびスペクトル分離アルゴリズムの使用によって自己蛍光を有意に低減させることを助ける１０個の狭帯域励起フィルター（３０ｎｍ帯域幅）および１８個の狭帯域発光フィルター（２０ｎｍ帯域幅）を備える。ＲＯＩを、化合物蓄積のエリア（腫瘍、肝臓、皮膚）について定義し、この領域内の総シグナルおよび平均シグナルを記録する。蛍光強度を、総放射効率（［ｐ／ｓ］／［μＷ／ｃｍ２］）として表す。結果を、３匹のマウスの平均総放射効率±ＳＤとして表す。
【０１３９】
血清安定性アッセイ  −  ベシクル２０−ＨＰＰＨを、５０％ＦＢＳ中で３７℃で２時間インキュベートした。ベシクルと血清タンパク質との間でのＨＰＰＨの相対的分配を評価するために、試料を、２０ｍｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂカラム上にロードし、ＨＢＳ中に溶出させた。画分（０．５ｍｌ）を収集し、脂質、ＨＰＰＨおよびタンパク質の存在について分析した。タンパク質を、製造業者の推奨に従って、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ  ＣＡ）を介して決定した。
【０１４０】
細胞傷害性アッセイ  −  ベシクル製剤化ＨＰＰＨによる細胞毒性（光活性化による）を、ＣＴ−２６細胞を使用して決定した。簡潔に述べると、９６ウェルプレート中にプレートした細胞を、光処理の前に、示された時間において種々の濃度の試料と共にインキュベートした。ＰＤＴ処理を、アルゴンイオンレーザー（１７１または２０８０のいずれか；Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ）によって駆動される色素レーザー（３７５；Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ、Ｍｔ．Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して実施した。総光線量は、３．４ｍＷ／ｃｍ２のフルエンス率で、１．０から４．０Ｊ／ｃｍ２までの範囲であった。ＰＤＴ処理の４８時間後、細胞生存度を、ＭＴＴアッセイ（詳細は本明細書で提供される）を使用して決定した。
【０１４１】
動物研究  −  最初に、胸腺欠損ｎｕ／ｎｕマウスをｉｎ  ｖｉｖｏ研究に使用して、開示されたベシクルによる腫瘍取り込みの相対的な増強を確立した。引き続いて、免疫適格性ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用して、ベシクル会合ＨＰＰＨを定量化し、製剤化ＨＰＰＨのｉｎ  ｖｉｖｏ  ＰＤＴ有効性／腫瘍治療を決定した。
【０１４２】
種々のベシクルの腫瘍取り込みを評価するために、ＨＴ２９腫瘍保有胸腺欠損マウスにおいてＤｉＲ蛍光をモニタリングした。マウスイメージング研究を、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）のＡｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅガイドラインに従って実施した。
【０１４３】
ＨＰＰＨ、ＰＤＴ有効性および腫瘍退縮の定量化のために、マウス結腸癌（ＣＴ−２６）保有ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用した。これらの研究を、以下に記載される、ＲＰＣＩ  ＩＡＣＵＣ委員会が承認した動物プロトコールに従って実施した。さらなる例では、Ａ５４９腫瘍保有マウスを使用した。
【０１４４】
腫瘍埋め込み
ＨＴ２９腫瘍：ＡＩＮ９３Ｇ食（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）で飼育した６週齢の胸腺欠損ｎｕ／ｎｕマウスに、ＤｉＲベースのベシクル体内分布の評価のために、ＨＴ２９腫瘍を埋め込んだ。ＨＴ２９細胞（埋め込み物１つ当たり、０．１ｍｌ  ＰＢＳ中５×１０６細胞）の腫瘍埋め込みを、動物の下脇腹に皮下で実施した。
【０１４５】
ＣＴ−２６腫瘍：ＣＴ−２６がん細胞を、無血清培地中に２０×１０６／ｍｌの密度で懸濁した。５０μｌ（１×１０６細胞）を、腫瘍移植のために皮下注射した。処置を、６〜７日後に、腫瘍サイズが、直径およそ４〜５ｍｍ、または長さ×幅×１／２幅によって測定して３２〜６２．５ｍｍ３に達したときに開始した。
【０１４６】
Ａ５４９腫瘍：Ａ５４９腫瘍細胞を、腫瘍移植のために皮下注射した。処置を、腫瘍サイズが、長さ×幅×１／２幅によって測定しておよそ１００〜２００ｍｍ３に達したときに開始した。
【０１４７】
ベシクルおよびベシクル会合ＨＰＰＨの組織取り込み
ＨＴ２９腫瘍保有胸腺欠損マウスにおけるベシクルの腫瘍取り込み：ベシクル１０−ＨＰＰＨ／ＤｉＲ、ベシクル２０−ＨＰＰＨ／ＤｉＲおよびＤＰＰＣ：ＤＣ８，９ＰＣ−ＨＰＰＨ／ＤｉＲ（表２）を、４匹の動物の群において静脈内注射した（１ｍｇの総脂質を含む０．２ｍｌ）。さらに、２匹の動物に、０．２ｍｌ  ＨＢＳのみを注射して、バックグラウンドシグナルを得た。全身２Ｄ−マルチスペクトル蛍光イメージング（背側＋腹側）を、７３５±２５ｎｍ励起フィルターおよび８００ｎｍロングパスＬＣＴＦ（液晶チューナブルフィルター）発光フィルターを備えたＭａｅｓｔｒｏ蛍光イメージャー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して、ベシクル注射の４時間後に実施した。画像を、１０ｎｍの刻み幅で、各波長について５秒間の曝露時間で、７８０から９５０ｎｍまで獲得した。組織におけるＤｉＲの定量化の詳細は、本明細書で提供される。
【０１４８】
ＣＴ−２６腫瘍保有ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるベシクル会合ＨＰＰＨの組織取り込み：ベシクル２０−ＨＰＰＨ（表２）製剤を、ＣＴ−２６腫瘍保有ＢＡＬＢ／ｃマウスによるベシクル会合ＨＰＰＨの組織取り込みのために使用した。Ｔｗｅｅｎ  ８０−ＨＰＰＨ製剤（現在臨床試験中、識別子：ＮＣＴ０１１４０１７８）を、比較のために使用した。０．４７μｍｏｌ  ＨＰＰＨ／ｋｇ体重の用量を達成するように水中５％のデキストロース溶液で希釈した製剤を、静脈内注射した（０．２ｍｌ）。近赤外光学イメージングを、注射後種々の期間で実施した。組織会合ＨＰＰＨの定量化のための詳細な手順は、本明細書に記載される。
【０１４９】
Ａ５４９腫瘍保有マウスにおけるベシクル実施形態の組織取り込み：ＤＣ８，９ＰＣ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（９０：１０のモル比）を含むベシクルを使用した。１ｍｇの脂質含量および微量のＤｉＲを含む製剤０．１ｍｌを、静脈内注射した。イメージングを、注射後種々の期間で実施した。
【０１５０】
ＣＴ−２６腫瘍保有ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ  ＰＤＴ有効性および腫瘍退縮：
ＣＴ−２６腫瘍保有ＢＡＬＢ／ｃマウスに注射したベシクル２０−ＨＰＰＨ（表２）およびＴｗｅｅｎ  ８０−ＨＰＰＨ（セクション２．５．２ｉｉ）を、長期ＰＤＴ有効性（腫瘍治癒）について調査した。ＨＰＰＨの腫瘍取り込み（図９Ａ〜９Ｃ）に基づいて、レーザー処理を、それぞれ、ベシクル２０−ＨＰＰＨおよびＴｗｅｅｎ−８０−ＨＰＰＨについて、注射の４時間後および２４時間後の時点で実施した。アクリルのホルダーに拘束したマウスを、６６５ｎｍに調整した、アルゴンイオンレーザー（１７１または２０８０のいずれか；Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ）によって駆動される６６５ｎｍレーザー（３７５；Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ、Ｍｔ．Ｖｉｅｗ、ＣＡ）で処理した。ファイバーからの出力は、１．１ｃｍのスポットにおいて７１ｍＷであった。総光線量は、３０分間の期間にわたって１３５Ｊ／ｃｍ２であり、７５ｍＷ／ｃｍ２のフルエンス率を得た。
【０１５１】
腫瘍再成長を、ＰＤＴ処理後最大で１００日間モニタリングした。処理後に再成長した腫瘍を、１日おきに測定し、腫瘍体積を、長さ×幅×１／２幅＝体積として記録した。腫瘍が≧４００ｍｍ３に達した時点で、マウスを安楽死させ、４００ｍｍ３までの腫瘍再成長の時間を計算した。部分奏効（ＰＲ）として特徴付けられた腫瘍応答は、未処理の対照と比較して、少なくとも５０％の腫瘍成長阻害を示した。完全奏効（ＣＲ）を、腫瘍出現の最初の部位において、治療後最大で１００日間にわたり触診によって腫瘍を検出できないこととして定義し、治癒とみなした。ＣＲ発生後の腫瘍再成長は、マウスの５％未満において観察された。通常、処理群１つ当たり５匹のマウスを、実験に含めた。
【０１５２】
（実施例１）
ＤＣ８，９ＰＣ単独は、水性分散物中で小管様形態を取るが、これは、意図した薬物送達適用に好ましいナノ構造ではない。大きい親水性表面を有する脂質分子（例えば、ＰＥＧ化脂質）は、ＤＣ８，９ＰＣと会合することができ、ベシクル形態を誘導することができることが決定された（図１）。ＨＰＰＨの取り込み前の、ＤＣ８，９ＰＣがベシクルへと遷移する能力に対する、様々な濃度のＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００の影響を評価した（表１）。ベシクル形成を、超音波処理した試料の流体力学的サイズ決定（図１０Ａ〜１０Ｆ）およびクライオ電子顕微鏡法による可視化（図１１Ａおよび１１Ｂ）によってモニタリングした。流体力学的サイズ決定のさらなる結果は、図１９Ａ〜１９Ｈによって提供される。また、Ｃｅ６を含むベシクルについての流体力学的サイズ決定の結果は、図２４Ａ〜２４Ｃによって提供される。図２４Ｃから理解できるように、ベシクル実施形態は、Ｃｅ６を担持することができ、図２４Ａおよび２４Ｂによって示されるように、良好な安定性を示す。評価した製剤に関する詳細は、本明細書の表６中に提供される。
【０１５３】
一部の実施形態では、このデータは、１０〜２０ｍｏｌ％の範囲でＰＥＧ−脂質を含めること（ベシクル１０およびベシクル２０）が、０．２〜０．３の間の範囲の多分散指数（ＰｄＩ）を伴って、６５〜１００ｎｍの流体力学的直径を有する均一なベシクルの形成を生じたことを実証している（それぞれ、図１０Ｂおよび１０Ｃ）。予想通り、ＰＥＧ−脂質の非存在下でのＤＣ８，９ＰＣは、多分散であった（表１および図１０Ａ中のベシクル０のデータを参照のこと）。２０ｍｏｌ％を超えるＰＥＧ−脂質濃度（ベシクル３０、ベシクル４０およびベシクル５０）は、非常に高いＰｄＩ（０．４〜０．５）を伴って、不均一な複数のピークを生じた（平均直径７０〜３７０ｎｍ、図１０Ｄ〜１０Ｆ）。二成分脂質二重層中のＤＣ８，９ＰＣの分子間パッキングに対する、様々な濃度のＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００の影響もまた、ＵＶ媒介性の光架橋を定量化することによって試験した（図４）。
【０１５４】
（実施例２）
ベシクル形成に必要なＰＥＧ−脂質のＤＣ８，９ＰＣに対する所望の比を最適化した後で、ベシクル１０およびベシクル２０を、ＨＰＰＨを取り込む能力について試験した（ベシクル１０−ＨＰＰＨまたはベシクル２０−ＨＰＰＨと命名した）。
【０１５５】
０．０５から０．５ｍｇ／ｍｇ脂質までの範囲の種々の濃度のＨＰＰＨを、脂質混合物に添加し、ＨＰＰＨを担持したベシクルを調製した。ベシクル２０におけるＨＰＰＨ取り込みの効率についての用量応答曲線は、例えば、図７Ａおよび７Ｂに示される。著しい用量のＨＰＰＨ（最大で０．５ｍｇ  ＨＰＰＨ／ｍｇ脂質）を、これらのベシクル中に含めることができた（図７Ａおよび７Ｂ）。取り込まれなかったＨＰＰＨをベシクル捕捉されたＨＰＰＨから分離するために、本発明者らは、単純かつ新規の低速遠心分離プロトコールを使用した。脂質の非存在下でのＨＰＰＨは、水性媒体中に分散させた場合、凝集し、低速遠心分離によって、ペレット化された画分として沈降させることができる。ＨＰＰＨを担持したベシクルのために使用した精製手順の技術的詳細は、本明細書に記載されて提供される（図６もまた参照のこと）。
【０１５６】
０．０５ｍｇ  ＨＰＰＨ／ｍｇ脂質で担持したベシクル２０−ＨＰＰＨを、クライオ−ＥＭ、血清安定性、細胞毒性に対するＰＤＴの効果、腫瘍取り込み、および腫瘍退縮研究によって、さらに調査した。
【０１５７】
（実施例３）
ベシクル２０−ＨＰＰＨベシクル（０．０５ｍｇ  ＨＰＰＨ／ｍｇ脂質を担持した）は、クライオ−ＥＭによって可視化したとき、球状形態を示した。ベシクル２０中にＨＰＰＨを含めることは、これらのベシクルの全体的形態に対してもサイズに対しても、見かけの影響を有さなかった（図１１Ａおよび１１Ｂ）。ＤＬＳ分析により、ベシクル２０およびベシクル２０−ＨＰＰＨの平均サイズが類似であった（それぞれ、６８ｎｍおよび７８ｎｍ）ことがさらに確認された（図１２Ａおよび１２Ｂ）。単一の動作理論に限定されることなく、現在、ベシクル２０−ＨＰＰＨベシクルの平均サイズにおける僅かな増加は、ベシクル中にＨＰＰＨを含めたことに起因すると考えられている。
【０１５８】
貯蔵の際のこれらのベシクルの安定性を評価するために、ＤＬＳ分析を、最大で少なくとも６０日間定期的に実施した。図１２Ａおよび１２Ｂに示されるデータは、最大で４２日間の結果を示す。これらのベシクルは、試験した時間の間、その元のサイズ分布を保持する。この特性は、将来のｉｎ  ｖｉｖｏ適用にとって有利である可能性が高い。
【０１５９】
（実施例４）
脂質ベースのベシクルのｉｎ  ｖｉｖｏ有用性は、封入された薬物の時期を逸したオフターゲット放出を生じるそれらと血漿構成要素との相互作用に起因して、限定的である場合が多い。開示されたベシクルは、顕著により高い量のＰＥＧ−脂質を有するので、このベシクルは、血清タンパク質の存在下で安定であり得る。血清の非存在下での３７℃で２時間にわたってベシクル２０−ＨＰＰＨ（０．１ｍｇ  ＨＰＰＨ／ｍｇ脂質を担持した）の安定性を評価した。ベシクルから血清タンパク質へのＨＰＰＨの可能な交換を、１×１０４〜４×１０６分子量の分画範囲を有するサイズ排除カラム（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ６Ｂ、方法のセクション）上での分画によって決定した。この方法は、ベシクル注射動物の血清ならびに血漿タンパク質からベシクルを分離することが以前に実証されている。カラム画分を、脂質、タンパク質およびＨＰＰＨについて分析した（図１３）。予想通り、ベシクルは画分１２〜１５中に溶出し、主要な血清タンパク質（例えば、アルブミン）は、タンパク質アッセイによって決定されるように、後期の画分（画分２０の後）中に溶出した。ＨＰＰＨ分析により、検出可能なＨＰＰＨのほとんどが、ベシクルと会合したままであり、脂質／ＨＰＰＨ比が、ベシクル画分において影響を受けないままであることが明らかになり、これは、ＨＰＰＨが、少なくともバルク血清タンパク質とは交換しなかったことを実証している。
【０１６０】
（実施例５）
これらの製剤におけるＨＰＰＨのＰＤＴ有効性を決定するために、レーザー処理の際のＣＴ−２６細胞におけるそれらの細胞傷害性を評価した。細胞を、０から１μＭまでの範囲の種々のＨＰＰＨ用量のベシクル２０−ＨＰＰＨと共に、３７℃で４または２４時間インキュベートした（それぞれ、図１４Ａおよび１４Ｂ）。引き続いて、細胞をレーザーで処理し、細胞生存度を、処理の４８時間後に決定した。予想通り、細胞傷害性は、レーザー処理の際にのみ観察された（図１４Ａおよび１４Ｂ）。４時間および２４時間のインキュベーションにおけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性データは、ベシクル２０−ＨＰＰＨが、より長いインキュベーション時間においてわずかにより有効であることを示している。４．０ジュール／ｃｍ２におけるＩＣ５０は、４時間では約０．０３マイクロモル濃度であり、２４時間では約０．０１マイクロモル濃度である（図１４Ｂ）。
【０１６１】
（実施例６）
これらの製剤中の高いＰＥＧ−脂質の、腫瘍蓄積に対する潜在的な利益をモニタリングするために、近ＩＲ脂質プローブＤｉＲを、ベシクル中に取り込んだ。ＤｉＲは、近ＩＲ領域におけるその吸光度（Ｅｘ／Ｅｍ  ７４５／８４５ｎｍ）に起因して、マウスイメージング研究のために広く使用される分子である。ベシクル１０−ＨＰＰＨ／ＤｉＲおよびベシクル２０−ＨＰＰＨ／ＤｉＲ（表２）を試験し、４ｍｏｌ％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を含む製剤と比較した。静脈内注射したマウスを、注射の４時間後にイメージングし、データを分析した（図１５を参照のこと）。図１５は、４、１０または２０ｍｏｌ％のいずれかのＰＥＧ−脂質を含むベシクルの相対的取り込みを示す。ベシクルの腫瘍蓄積は、ＰＥＧ−脂質含量における増加の関数として明らかに増強され、本発明者らの仮説と一致して、ベシクル中のより高いＰＥＧ−脂質が腫瘍蓄積に有利に働くことが確認される。ＤｉＲ蛍光の定量化は、それぞれ、ベシクル１０およびベシクル２０において２．２および２．６倍の増加を示した（図１６Ａを参照のこと）。腫瘍／肝臓におけるＤｉＲ蛍光の平均の比（Ｔ／Ｌ）を決定し、データを図１６Ｂ中に示す。ＤＰＰＣ：ＤＣ８，９ＰＣ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（８６：１０：０４のモル比）について得られたＴ／Ｌ比を、比較のために１００とした。腫瘍／肝臓比における増加が、図１６Ａに示されるベシクルの増強された腫瘍蓄積と一致して、４ｍｏｌ％のＰＥＧ−脂質を含むベシクルと比較して、ベシクル１０およびベシクル２０注射動物において見られた。増強されたＰＥＧ化が腫瘍における増加したＮＰ蓄積を生じたことが確立されたので、ベシクル２０（２０ｍｏｌ％のＰＥＧ化脂質を含む）を、治療有効性研究に使用した；これらの実施例では、ＨＰＰＨを測定して、腫瘍を含む種々の臓器における相対的蓄積をモニタリングした（以下の次のセクション）。
【０１６２】
（実施例７）
ＤｉＲイメージングによってベシクル２０−ＨＰＰＨの腫瘍取り込みを確立した後、本発明者らの次の実験を、ＣＴ−２６腫瘍保有マウスにおける時間依存的組織分布を定量化するために設計した。結果をＴｗｅｅｎ  ８０−ＨＰＰＨ製剤と比較した。ＣＴ−２６腫瘍保有ＢＡＬＢ／ｃマウスに、等価なＨＰＰＨ用量で、ベシクル２０−ＨＰＰＨまたはＴｗｅｅｎ  ８０−ＨＰＰＨを静脈内注射した。動物を、注射後の種々の時間間隔において、腫瘍、肝臓および皮膚におけるＨＰＰＨ蛍光についてイメージングした（図９Ａ〜９Ｃ）。興味深いことに、ベシクル２０−ＨＰＰＨは、注射の８時間後の最大蓄積を伴って、蓄積のより速い速度論を示した（図９Ａ）。他方、Ｔｗｅｅｎ  ８０−ＨＰＰＨ製剤は、２４時間の時点でピークに達した（図９Ｂ）。ベシクル２０−製剤による腫瘍取り込みのより速い速度論は、そのナノ粒子アセンブリ／ＥＰＲ効果に起因する可能性が高い。肝臓および皮膚におけるＨＰＰＨの相対的分布は、類似であることが見出された（図９Ａ〜９Ｃ）。等価な脂質用量を含むＨＰＰＨなしのベシクル２０を使用して、バックグラウンド蛍光を得た（図９Ｃ）。バックグラウンドレベルを上回る蛍光は、これらの動物では検出されず、ベシクル２０−ＨＰＰＨ注射マウスにおいて観察された蛍光が、種々の臓器におけるＨＰＰＨの存在に実際に起因したことが確認された。
【０１６３】
（実施例８）
腫瘍におけるＨＰＰＨの蓄積は、Ｔｗｅｅｎ  ８０−ＨＰＰＨまたはベシクル２０−ＨＰＰＨのいずれかを注射した動物によって、比較的類似の効率で生じた（前述のセクション）。しかし、興味深いことに、ベシクル２０−ＨＰＰＨの最大取り込みは、Ｔｗｅｅｎ  ８０−ＨＰＰＨと比較して、より早期の時点で生じた。したがって、注射の４時間後および注射の２４時間後のベシクル２０−ＨＰＰＨについてのＰＤＴ有効性を、Ｔｗｅｅｎ  ８０−ＨＰＰＨに対して評価した。
【０１６４】
ＰＤＴ有効性を、３０分間にわたって、１３５Ｊ／ｃｍ２および７５ｍＷ／ｃｍ２の線量のレーザー光（６６５ｎｍ）に腫瘍を曝露することによって評価した。引き続いて、腫瘍成長を、処理後最大で１００日間、毎日測定した。腫瘍表面に対するＰＤＴの効果が、ＰＤＴ処理後に痂皮形成を示したＨＰＰＨ単独と比較して、痂皮形成の欠如によって明らかになった（図１７Ａ〜１７Ｃ）。本発明者らの第１のセットの実験では、Ｔｗｅｅｎ  ８０−ＨＰＰＨ（図１７Ａ）またはベシクル２０−ＨＰＰＨ（図１７Ｂ）のいずれかを静脈内注射した５匹のマウスの群において腫瘍退縮を試験した。ベシクル２０−ＨＰＰＨ注射マウスは、Ｔｗｅｅｎ  ８０−ＨＰＰＨ注射動物と比較して、優れた動物生存（ＣＲ＝６０％）および腫瘍応答（ＣＲ＝４０％）を示した。これらの結果は、がん化学療法のためのベシクル製剤化ＨＰＰＨの明らかな利点を示した。
【０１６５】
ベシクル２０−ＨＰＰＨによる観察された増強された抗がん活性をさらに検証するために、第２のセットの動物研究を設計した（１０匹の動物）。ベシクル２０−ＨＰＰＨを、同一の条件下で腫瘍保有マウスに注射し、レーザーで処理し、腫瘍治癒を最大で１００日間モニタリングした。動物による個々の腫瘍応答についての組み合わされた結果は、図１７Ｃに示される。優れた腫瘍応答が観察され、９／１５匹のマウス（ＣＲ＝６０％）は、最大で１００日間にわたって無腫瘍であることが見出された（図１７Ｃ）。カプラン・マイヤーグラフは、ベシクル２０−ＨＰＰＨによる無腫瘍生存で、統計的に有意な（Ｐ値＜０．０００１）応答を示した（図１８）。したがって、ベシクル製剤化ＨＰＰＨは、この薬物についての新たな効率的なナノ送達プラットフォームを提示する。本明細書に記載されるベシクル実施形態は、他のＰＤＴ薬物、特に、ＨＰＰＨと類似の化学的および物理的特性を保有する薬物と共に使用され得る。
【０１６６】
（実施例９）
ＤＣ８，９ＰＣ／ＰＥＧ−脂質ナノアセンブリの性質を理解するために、超音波処理した試料を、種々の期間にわたって室温でＵＶ（２５４ｎｍ）で処理した（方法のセクション、補遺）。ＵＶ処理を、ＰＥＧ化脂質によるＤＣ８，９ＰＣパッキング特性における任意の潜在的妨害を評価することのみを目的として、ＨＰＰＨを含まないベシクルにおいて実施した。光架橋の程度を、示された曝露時間の関数としての、試料の発色特性におけるシフト（５２０ｎｍにおけるスペクトルピークの出現）によってモニタリングした。結果は図４に示され、少なくとも２回の独立した実験を代表している。１０および２０ｍｏｌ％のＰＥＧ−脂質を含む製剤（ベシクル１０およびベシクル２０、表１）は、５２０ｎｍでの吸光度における時間依存的増加によって実証されるように、ＤＣ８，９ＰＣパッキング特性に対して影響を有さなかった。対照試料（ベシクル０、ＰＥＧ−脂質なし）は、類似の光架橋を示した。他方、一部の実施形態では、２０ｍｏｌ％よりも高い濃度のＰＥＧ−脂質（ベシクル３０、ベシクル４０およびベシクル５０、表１）は、光架橋を妨害し、これは、ＤＣ８，９ＰＣモノマーの整列が、２０モル％を超える濃度のＰＥＧ−脂質において破壊されたことを示している（図４）。ベシクル１０およびベシクル２０における光架橋の程度は、所与の時点におけるベシクル０の光架橋の程度と比較して増加したこともまた決定された（図４）。このデータは、所望のモル比におけるＰＥＧ−脂質が、二成分脂質二重層中の分離されたパッチとしての、ベシクル中のＤＣ８，９ＰＣの増強された隔離および整列を補助することを確認する。
【０１６７】
（実施例１０）
レーザー曝露の際のＨＰＰＨによる光活性化の効率は、その環境および凝集状態に依存する。ＨＰＰＨのレーザー処理は、光損傷を生じ、その活性の指標として機能する。したがって、ベシクル製剤化ＨＰＰＨの光損傷を、Ｔｗｅｅｎ  ８０−ＨＰＰＨ、ならびにＤＰＰＣおよびより低い濃度のＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を含む製剤と比較した（表２を参照のこと）。光損傷の程度を、５分間にわたる６６１ｎｍレーザーによる処理により、１：０．０５の脂質：ＨＰＰＨ比を含むベシクル１０−ＨＰＰＨ（表２）を使用して試験した。図８中のデータは、未処理試料の蛍光を１００％とした、レーザー処理した試料において残存するＨＰＰＨ蛍光を示している。図８から理解できるように、ベシクル２０についての光損傷の程度は、ＤＰＰＣ含有製剤またはＴｗｅｅｎ  ８０−ＨＰＰＨと類似であった。緩衝液中に懸濁されたＨＰＰＨのレーザー曝露は、その不溶性およびおそらくはその凝集状態に起因して、同一条件下でのレーザー処理の際に、蛍光における減少を生じなかった。図７Ａおよび７Ｂに示される結果は、ベシクル会合ＨＰＰＨがその光活性化潜在力を保持していることを実証している。
【０１６８】
（実施例１１）
遊離の取り込まれなかったＨＰＰＨは、その不溶性に起因して、水性緩衝液中で凝集し、低速遠心分離による沈降によってペレット化することができる。サイズ排除クロマトグラフィー（ＰＤ１０カラム、ＧＥ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、取り込まれなかったＨＰＰＨをベシクルから分離した；しかし、これらの実施形態では、ＨＢＳ中のＨＰＰＨ分散物（脂質の非存在下）の超音波処理が、ＰＤ１０カラム上でベシクル会合ＨＰＰＨと共に（一部）共溶出したより小さいＨＰＰＨ凝集体を生成したことが観察された。これは、取り込まれなかったＨＰＰＨからのリポソームＨＰＰＨの分離を妨害した。したがって、新たな単純な遠心分離法を開発して、取り込まれなかったＨＰＰＨをベシクル会合ＨＰＰＨから分離した。最も高い濃度のＨＰＰＨ（０．５ｍｇ  ＨＰＰＨ／ｍｇ脂質）を担持したベシクル２０−ＨＰＰＨを使用したデータが、図５に示される。ＨＰＰＨを担持したベシクルの６，０００ｒｐｍで２０〜３０分間の遠心分離は、ベシクル会合ＨＰＰＨからの、取り込まれなかったＨＰＰＨの効果的な分離を生じた（図６）。ＨＢＳ中に懸濁されたＨＰＰＨ（脂質の非存在下）は、吸光度測定によって決定されるように、遠心分離前には懸濁物中に残存した。遠心分離ステップは、ペレット化された画分中へのＨＰＰＨのほぼ完全な沈降を生じた（図６）。対照的に、ＨＰＰＨを担持したベシクルを同一の条件下で遠心分離した場合、ＨＰＰＨの非常に小さい画分のみがペレット化された（図５）。したがって、この遠心分離プロトコールは、全ての取り込まれなかったＨＰＰＨをベシクル会合ＨＰＰＨから除去するための単純かつ効率的な方法を提供する。
【０１６９】
（実施例１２）
この実施例では、カンプトテシンを含むベシクル実施形態を作製し、評価した。ベシクルの形成および多分散性を、動的光散乱を使用して評価した（図２０Ａおよび２０Ｂ）。ベシクルを、ＨＰＰＨ含有実施形態に関して上で開示した方法と類似の方法を使用して作製した。ベシクルを、ＤＣ８，９ＰＣのＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００に対する比９０：１０を含むように作製し、２０：１の脂質：カンプトテシンの重量／重量比で、カンプトテシンを担持した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ヒト乳がん）細胞を、細胞生存度アッセイのために、１ウェル当たり５×１０３の密度で９６ウェルクラスター上にプレートした。カンプトテシンを担持したベシクルまたは遊離カンプトテシンを、細胞培養培地中で所望の濃度に希釈した。１ウェル当たり０．１ｍｌの希釈試料を、三連で添加し、インキュベーションを３７℃で７２時間継続した。細胞生存度を、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｂｌｕｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ｃｏｒｐ．Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して決定した。結果は、図２１Ａ（カンプトテシン製剤化ベシクルについての結果）および２１Ｂ（遊離カンプトテシンについての結果）によって提供される。
【０１７０】
（実施例１３）
この実施例では、２匹のＡ５４９腫瘍保有マウスに、９０：１０のモル比（ＤＣ８，９ＰＣ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）のＤＣ８，９ＰＣおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を含むベシクルを含む製剤を注射し、その後評価した。特に、１ｍｇの脂質含量および微量のＤｉＲを含むベシクル製剤０．１ｍｌを、各マウスに注射した。結果は、図２２Ａ、２２Ｂおよび２３に示される。図２２Ａおよび２２Ｂから理解できるように、高い強度シグナルが、各マウスの腫瘍中に局在化されることが観察された。また、肝臓シグナルの迅速な減少が観察され、したがって、ベシクルが肝臓毒性を示さないはずであることが確立された。図２３は、臓器特異的蓄積が注射の１週間後にこのベシクルで達成され得ることもまた確立している。
【０１７１】
（実施例１４）
この実施例では、ベシクル形成に対するＰＥＧ鎖の長さのバリエーションの影響を評価した。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３５０を含むベシクル実施形態を、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ１０００を含むベシクル実施形態と比較した。具体的な製剤に関する詳細は、表５中に提供される。図２５Ａおよび２５Ｂ中に示される流体力学的サイズおよび安定性の結果を比較することによって理解できるように、より短いＰＥＧ鎖を有する脂質（例えば、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３５０）を含むベシクル（図２５Ａを参照のこと）は、より長いＰＥＧ鎖を有する脂質（例えば、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ１０００）を含むベシクル（図２５Ｂを参照のこと）よりも、４ヶ月後により低い安定性を示した。
【０１７２】
（実施例１５）
この実施例では、ＤＣ８，９ＰＣ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００二成分脂質二重層を含むベシクル実施形態の流体力学的サイズ、安定性およびＨＰＰＨ担持効率を評価した。具体的な製剤に関する詳細は、表４中に提供される。図２６Ａおよび２６Ｂを図２６Ｃおよび２６Ｄと比較することによって理解できるように、ＤＣ８，９ＰＣ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００二成分脂質二重層を含むベシクルは、特に、９０：１０の比のＤＣ８，９ＰＣ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００を含む実施形態について、延長された期間にわたって良好な安定性を示した。
【０１７３】
（実施例１６）
この実施例では、ベシクル中に（アルキン含有リン脂質およびＰＥＧ化脂質と一緒に）アルキン含有ホスホエタノールアミン脂質を含めることの影響を評価した。具体的な製剤に関する詳細は、表３中に提供される。図２７Ａ〜２７Ｃから理解できるように、アルキン含有ホスホエタノールアミン脂質を含むベシクル実施形態は、総脂質含量のＨＰＰＨ含量に対する様々な比で、良好な安定性を示した。
【０１７４】
開示された発明の原理が適用され得る多くの可能な実施形態を考えると、例示された実施形態は、本発明の好ましい例に過ぎず、本発明の範囲を限定すると解釈すべきでないことを認識すべきである。むしろ、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって定義される。したがって、本発明者らは、これらの特許請求の範囲の範囲および精神内に入る全てを本発明者らの発明として特許請求する。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際調査報告】
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