(57)【要約】  本発明は、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸および４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリン（５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸と４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンのモル比が１：０．３〜１：２．０（モル／モル））を含む結晶塩および／またはその水和物および／またはその溶媒和物、ならびにそれらを製造する方法に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸および４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンを含み、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸と４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンとのモル比が１：０．３〜１：２．０（モル／モル）である結晶塩および／またはその水和物および／またはその溶媒和物。
【請求項２】
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸と４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンのモル比が、１：０．５〜１：１．５（モル／モル）である請求項１に記載の結晶塩および／またはその水和物および／または溶媒和物。
【請求項３】
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸と４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンのモル比が、１：０．７５〜１：１．２５（モル／モル）である請求項１または２に記載の結晶塩および／またはその水和物および／または溶媒和物。
【請求項４】
前記結晶塩が５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸と４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンの比が、約１：１（モル／モル）および／またはその水和物および／または溶媒和物で先行する請求項の少なくとも１項に記載の結晶塩。
【請求項５】
前記結晶塩が５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸および４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンの塩であり、１４．２、１４．８、１９．７、２０．０、および２０．６に位置するピークから選択される少なくとも１つの特徴的なピーク（２θ±０．２°２θ （ＣｕＫα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有することを特徴とする、先行する請求項の少なくとも１つの結晶塩。
【請求項６】
前記結晶塩が５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸および４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンの塩であり、１４．２、１４．８、１９．７、２０．０、および２０．６に位置する以下のピークから選択される少なくとも３つの特徴的なピーク（２θ±０．２°２θ （ＣｕＫα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有することを特徴とする、先行する請求項の少なくとも１項に記載の結晶塩。
【請求項７】
塩が５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸および４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンの塩であり、４．９、１２．２、１４．２、１４．８、１５．１、１５．３、１７．４、１９．７、２０．０、２０．６、２３．６、２４．９および２８．１に位置する以下のピークから選択される少なくとも１つの特徴的なピーク（２θ±０．２°２θ （ＣｕＫα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有することを特徴とする、先行する請求項の少なくとも１項に記載の結晶塩。
【請求項８】
塩が５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸および４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンの塩であり、実質的に図１に示されるようなＰＸＲＤパターンを有することを特徴とする、先行する請求項の少なくとも１項に記載の結晶塩。
【請求項９】
少なくとも９９重量％以上の化学的および／または立体異性的純度を有する、先行する請求項の少なくとも１項に記載の結晶塩。
【請求項１０】
５−メチル−（６Ｓ）テトラヒドロ葉酸および４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンを含む、請求項１〜９の少なくとも１項に記載の結晶塩を製造する方法であって、以下の工程、
ａ)５−メチル（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸と４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンの混合物を、場合により適当な溶媒または溶媒の混合物中で準備する工程、
ｂ)結晶化する工程、
ｃ)必要に応じて、より多くの溶媒または溶媒の混合物を添加する工程、および
ｄ）得られた結晶を単離する工程、
を含む製造方法。
【請求項１１】
工程ａ）における５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸と４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンとのモル比が１：１〜１：３の範囲であることを特徴とする請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
溶媒が水、アルコールおよび／またはケトンであることを特徴とする請求項１０〜１１の少なくとも１項に記載の製造方法。
【請求項１３】
工程ｂ）および／またはｃ）において種結晶が添加されることを特徴とする、請求項１０〜１２の少なくとも１項に記載の製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜９の少なくとも１項に記載の５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸および４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンの結晶塩、ならびに任意選択で１以上の許容可能な賦形剤を含む、医薬組成物、食品添加物および／または調剤。
【請求項１５】
錠剤、カプセル、経口液体製剤、粉末、凍結乾燥物、顆粒、ロゼンジ、再構成可能な粉末、注射または注入可能な溶液または懸濁液または坐剤の形態である請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
少なくとも１つの追加の治療薬をさらに含む、請求項１４または１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
経口、非経口、筋肉内、脊髄内、髄腔内、髄腔内、歯周、局所または直腸投与のための医薬組成物である請求項１４〜１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸および４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンを含む、請求項１〜９の少なくとも１項に記載の結晶性塩の、薬物の製造のための成分としてのおよび／または食品添加物としての使用。
【請求項１９】
貧血、神経管欠損、心血管疾患、うつ病、認知障害、アルツハイマー病および骨粗鬆症、ならびに／または低血漿および／もしくは低赤血球および／もしくは低脳脊髄液および／もしくは低末梢もしくは中枢神経系葉酸塩の食事管理のホモシステイン低下、貧血、神経管欠損、心血管疾患、うつ病、認知障害、および／もしくは骨粗鬆症の治療における使用のための、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸および４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンを含む請求項１〜９の少なくとも１項に記載の結晶塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５−メチル（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸（Ｎ−［４−［［（２−アミノ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−５−メチル４−オキソ−（６Ｓ）−プテリジニル）メチル］アミノ］ベンゾイル］−Ｌ−グルタミン酸）及び４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンを含む結晶塩及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
テトラヒドロ葉酸塩は、主に５−ホルミルテトラヒドロ葉酸（ロイコボリンおよびロボロイコボリン）のカルシウム塩として、５−メチルテトラヒドロ葉酸（メタフォリン（登録商標））のカルシウム塩として、または５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸（モデュフォリン（登録商標））の硫酸塩として使用される。最も突出した使用分野は、巨赤芽球性葉酸貧血の治療のために、葉酸アンタゴニスト、特に癌治療におけるアミノプテリンおよびメトトレキセートの適合性を増加させるための解毒剤として（「葉酸拮抗剤レスキュー」）、フッ化ピリミジンの治療効果を増加させるために、および乾癬および関節リウマチのような自己免疫疾患の治療のために、例えばトリメトプリム−スルファメトキサゾールのような突然変異に対するある種の駆虫剤の適合性を増加させるために、および化学療法におけるジデアザテトラヒドロ葉酸の毒性を減少させるために、使用される。
【０００３】
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩は特に、薬物として、および食品添加物として、ビタミン調剤として、神経管欠損の予防のために、うつ病の治療のために、およびホモシステインレベルに影響を及ぼすために使用される。
【０００４】
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびその塩は、極めて不安定であることが知られている。特に、それらは、酸化に対して非常に敏感であり（この点に関して、Ａ．LFitzhugh、Pteridines 4（4），187-191(1993）も参照のこと）、したがって、医薬活性成分または食品添加物に許容される純度レベルで製造することが困難である。
【０００５】
５−メチルテトラヒドロ葉酸およびその塩の不安定性を克服するために、酸素をできるだけ完全に排除する、またはアスコルビン酸もしくは還元Ｌ−グルタチオンなどの酸化防止剤を添加するなどの様々な方法が使用されてきた。
【０００６】
米国特許第６，４４１，１６８号は、５−メチルテトラヒドロ葉酸のアルカリ土類塩、特にカルシウム塩、その結晶化およびその使用を開示している。５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸のこのような結晶性カルシウム塩の欠点は、それが４つまでの多形変異の結晶形態で存在することである。従って、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性カルシウム塩の製造方法は、非常に正確に制御されなければならない。さらに、米国特許第６，４４１，１６８号の５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性カルシウム塩は、典型的には結晶格子中に、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸１当量当たり少なくとも１当量であるが４当量までの水をそのすべての多形形態で含有する。
【０００７】
薬学的に有用な化合物の新しい結晶形態は、薬学的および／またはビタミン／医学的食品の性能プロフィールを改善する機会を提供する。それは、製剤科学者が改善された特性を有する新しい投薬形態を設計するために利用可能な材料の蓄積を広げる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の根底にある技術的課題は、当該技術分野で知られている５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶性カルシウム塩の欠点を克服する、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸を含む結晶形態の提供である。
【０００９】
さらに、新しい結晶形態はしばしば、所望の異なる物理的性質および／または生物学的特性を示し、これは、規制の承認に必要とされる純度レベルおよび均一性まで、活性化合物の製造または処方を補助し得る。
【００１０】
テトラヒドロ葉酸塩の安定性のために、貯蔵時に低い吸水性を有し、製造中に十分に乾燥させることができる化合物を提供することが常に目標である。加えて、周囲条件下で多量の水を吸収しない薬剤物質が非常に望まれている。特に、環境の相対湿度の変化による含水量の大きな変化が剤形に関して高い精度を達成することをより困難にするため、環境の相対湿度が変化したときに含水量を変化させない物質が望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の根底にある技術的課題は、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸および４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンを含み、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸と４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンのモル比が１：０．３〜１：２．０（モル／モル）である結晶塩および／またはその水和物および／またはその溶媒和物によって解決される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】５−メチル（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸塩および４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンを含む結晶塩の粉末Ｘ線回折パターンを示す図である。
【図２】５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸塩および４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンを含む結晶塩のＤＶＳ測定結果を示す図である。ｙ軸は、試料の含水量を示し、垂直矢印は、約２％である２０〜８０％の相対湿度範囲における水分含量の変化を示す。
【図３】カルシウム塩を５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸ともにＤＶＳ測定結果を示す図である。ｙ軸は、試料の含水量を示し。垂直の矢印は、約４％である２０〜８０％の相対湿度の範囲における水分含量の変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の固体形態は、改善された薬理学的特徴を有し、したがって、改善された薬物生成物を調節および設計するための強化された可能性を提供する。当該技術分野で知られている５−メチル（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩の結晶性多形形態と比較して、５−メチル（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸および４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンの結晶性塩の水吸着は、有意に低く、変化する相対湿度条件下での吸着水の量の変化が有意にそれほど顕著ではないため、製剤中の標的剤形レベルに対する実質的に改善された制御をもたらす。５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸および４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンの結晶塩の別の有利な側面は、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の高い化学的および光学的純度が１回の結晶化工程で達成され得ることである。さらに、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸および４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンを含む結晶塩は、１つの明確に定義された多形変異においてその結晶形態で存在する。したがって、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸および４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンを含む結晶塩の製造方法は、結晶化条件の非常に正確な制御を必要としない。
【００１４】
好ましくは、結晶性塩が５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸と４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンのモル比が１：０．５〜１：１．５（モル／モル）である。
【００１５】
さらにより好ましくは、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸と４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンのモル比が１：０．７５〜１：１．２５（モル／モル）である。
【００１６】
最も好ましくは、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸と４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンの比が約１：１（モル／モル）である。
【００１７】
好ましくは、本発明の塩が５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸および４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンの結晶塩であり、１４．２、１４．８、１９．７、２０．０、および２０．６に位置するピークから選択される少なくとも１つの特徴的なピーク（２θ±０．２°２θ （ＣｕＫα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有する。
【００１８】
より好ましくは、本発明の塩が５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸および４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンの結晶塩であり、１４．２、１４．８、１９．７、２０．０、および２０．６に位置するピークから選択される少なくとも３つの特徴的なピーク（２θ±０．２°２θ （ＣｕＫα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有する。
【００１９】
さらにより好ましくは、本発明の塩が５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸および４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンの結晶塩であり、１４．２、１４．８、１９．７、２０．０、および２０．６に位置するピークから選択されるピーク（２θ±０．２°２θ （ＣｕＫα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有する。
【００２０】
さらにより好ましくは、本発明の塩が５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸および４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンの結晶塩であり、４．９、１２．２、１４．２、１４．８、１５．１、１５．３、１７．４、１９．７、２０．０、２０．６、２３．６、２４．９および２８．１に位置するピークから選択される少なくとも１つの特徴的なピーク（２θ±０．２°２θ （ＣｕＫα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有する。
【００２１】
最も好ましくは、本発明の塩が５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸および４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンの結晶塩であり、実質的に図１に示すようなＰＸＲＤパターンを有する。
【００２２】
前述の５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸および４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンの塩は、少なくとも９９重量％以上の化学的および／または立体異性的純度を有し得る。
【００２３】
５−メチル（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸と４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンの塩を５−メチル（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩と比較すると、５−メチル（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸と４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンの塩の水分含量は、２０％〜８０％の間の最も適切な範囲内で２％未満しか変化しないが（実施例２、図２）、５−メチル（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩の水分含量は４％を超えて変化することが示される（参考例２、図３）。この結果は当業者にとって非常に驚くべきものであり、米国特許第６，４４１，１６８号の教示を考慮すると予想することができなかった。さらに、本発明の５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸および４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンの塩は、本発明の根底にある技術的課題を明らかに解決する。
【００２４】
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸を含み、水分含量が非常に低く、特に水を吸収／脱着する傾向が低い塩を有することは、例えば、温度／湿度が制御された環境または相対湿度が一般に非常に高い熱帯諸国で、配合するために物質を取り扱う場合に有利である。
【００２５】
従って、本発明の塩は、これらの条件下でも改善された貯蔵安定性を示す。これらの改善された特性は、米国特許第６，４４１，１６８号の教示を念頭に置いて導き出すことはできなかった。
【００２６】
５−メチル（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸は、水にほとんど溶けない。カルシウム塩（形態ＩＩＩ）の熱力学的に安定な形態は約２．５ｍｇ／ｍｌの水溶解度を示すことが知られており、準安定形態Ｉの溶解度は、室温で約１０ｍｇ／ｍｌである。特定のｐＨ条件下、特に環境のｐＨが所与の塩の平衡ｐＨより低い場合、塩は潜在的に遊離酸に不均化し、その結果、溶解度は実質的に低下する。したがって、中性〜低いｐＨ値でのクレームの塩の熱力学的溶解度は塩の不均化が遅い（難溶性遊離酸の形成）ために、アクセスできない。しかしながら、バイオアベイラビリティは、動力学的効果によって支配される。固形の製剤を投与した後、溶解し、最初の溶解工程の後、薬物を体液で希釈し、分配する。したがって、最初に溶解した原薬は容易に希釈され輸送されるため、動力学的溶解度はバイオアベイラビリティに影響を及ぼす重要なパラメータである。５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸および４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンの塩については、驚くべきことに、カルシウム塩の既知の（準安定形態Ｉ）に対して約３倍の動力学的溶解度が改善されることが見出された。カルシウム塩の熱力学的に安定な形態（形態ＩＩＩ）に対する本発明の塩の動力学的溶解度の差は、おそらく、さらに大きいであろう。したがって、一時的に、はるかに高い薬剤物質濃度を達成することができる。
【００２７】
本発明のさらなる側面は、５−メチル−（６Ｓ）テトラヒドロ葉酸および４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンを含む結晶性塩を得るための方法であり、
ａ）５−メチル（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸と４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンの混合物を、任意選択で適当な溶媒または溶媒の混合物中で、準備する工程、
ｂ)結晶化する工程、
ｃ) 任意選択で、より多くの溶媒または溶媒の混合物を添加する工程、および
ｄ）得られた結晶を単離する工程、
を含む方法である。
【００２８】
好ましくは、工程ａ）における５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸および４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンのモル比が１：１〜１：３の範囲である。
【００２９】
さらに好ましくは、溶媒が水、アルコールおよび／またはケトンである。
【００３０】
工程ｂ）および／またはｃ）において、種結晶を添加することができる。
【００３１】
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸および４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンを含む結晶塩は１つの明確に定義された多形変異においてのみその結晶形態で存在するので、本結晶塩を製造する方法は結晶化条件の非常に正確な制御を必要としない。
【００３２】
本発明のさらなる側面は、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸および４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンの結晶性塩および任意選択で１以上の許容可能な賦形剤を含む医薬組成物、食品添加物および／または調剤であり、これらもまた本発明の一部である。医薬組成物は、錠剤、カプセル、経口液体調剤、粉末、凍結乾燥物、顆粒、ロゼンジ、再構成可能な粉末、注射可能または注入可能な溶液または懸濁液または坐剤の形態を有し得る。また、医薬組成物は、少なくとも１つの追加の治療薬をさらに含み得る。本発明による医薬組成物は、すべての投与様式、好ましくは経口、非経口、筋肉内、脊髄内、髄腔内、歯周、局所または直腸投与に適している。
【００３３】
本発明のさらなる態様は、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸および４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンを含む結晶塩を、薬物の製造のための成分としておよび／または食品添加物として使用することである。
【００３４】
好ましくは、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸および４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンを含む結晶塩が、貧血、神経管欠損、心血管疾患、うつ病、アルツハイマー病、認知障害および骨粗鬆症、ならびに／または低血漿および／もしくは低赤血球および／もしくは低脳脊髄液および／もしくは低末梢もしくは中枢神経系葉酸塩の食事管理のホモシステイン低下、貧血、神経管欠損、心血管疾患、うつ病、アルツハイマー病の治療において使用される。
【００３５】
要約すると、本発明の５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸および４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンの塩によって提供される特性のプロフィールは、薬剤または食品添加物としての使用に有利である。特に、２０％〜８０％の相対湿度環境における水分含量の低い変化および高い動力学的溶解度は、当業者によって予見され得なかった。
【実施例】
【００３６】
粉末Ｘ線回折
Ｍｙｔｈｅｎ１Ｋ検出器を備えたStoe Stadi P；Cu−Ｋα１放射線；標準測定条件：伝送； ４０ ｋＶおよび４０ｍＡ管出力；湾曲Ｇｅモノクロメーター；０．０２°２θステップサイズ、４８秒ステップ時間、１．５〜５０．５°２θ走査範囲；検出器モード：ステップ走査；１°２θ検出器ステップ；標準試料調製：１０〜２０ｍｇ試料を２つのアセテートフォイルの間に置く；試料ホルダー： Stoe透過試料ホルダー；測定中に試料を回転させた。全ての試料の調製および測定は、周囲空気雰囲気中で行った。
【００３７】
ＴＧ−ＦＴＩＲ
熱重量測定は、Bruker FTIR分光計ベクター２２（ピンホールを有する試料パン、Ｎ２大気、熱速度１０ Ｋ／分）に連結したNetzsch Thermo-Microbalance TG ２０９を用いて行った。
ＤＶＳ
ＤＶＳ測定は、代表的には、ＳＰＳ１１−１００n "Sorptions Prufsystem" をProUmid(以前の"Projekt Messtechnik")、August-Nagel-Str.23, 89079 Ulm (ドイツ）、から取得して実施する。
ＤＶＳ測定は、以下のようにして行った：試料を微量天秤の上のアルミニウムホルダー上に置き、下記所定の湿度プログラムを開始する前に５０％ RHで平衡化させた：
(1)      ５０％一定相対湿度（ＲＨ）に２時間保ち、次いで、
(2)      毎時５％の割合でＲＨを９５％に上げ、
(3)      ＲＨを９５％に５時間維持し、
(4)      毎時５％の割合で０％RHに低減し、
(5)      ＲＨを０％に５時間維持し、
(6)      毎時５％の割合でＲＨを９５％に上げ、
(7)      ＲＨを９５％に５時間維持し、
(8)      毎時５％の割合で０％RHに低減し、
(9)      ＲＨを０％に５時間維持し、
(10)     毎時５％の割合で５０％RHまで上げ、
(11)     ＲＨを５０％に約１時間維持した。
【００３８】
実施例１：４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンを用いた５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶塩の調製
４．７６３グラムの５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸一水和物（アッセイ５−メチルテトラヒドロ葉酸９７．６５ ％ｗ／ｗ）を、マグネチックスターラーバーを備えたガラスフラスコ中に秤量した。９．５ｍＬの水および４．７６ｍＬの４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリン(Aldrich #H２８２０３）を添加した。室温で約２分間撹拌した後、茶色の透明な溶液が形成された。溶液を室温で撹拌しながら、９５ｍＬのアセトンを約２．５時間以内にゆっくりと添加した。形成された懸濁液を室温で約２３時間撹拌した。次いで、懸濁液をフリットガラスフィルター（多孔率Ｐ４）で濾過し、フィルターケーキを周囲温度で風乾した。１００ｍＬのエタノールを濾過ケーキに添加し、洗浄溶液を真空吸引により濾過に通した。洗浄工程を別の１００ｍＬのエタノールで繰り返した。次いで、濾過ケーキを約０．５時間風乾した（空気をフリットガラス濾過に通した）。約５．６グラムの固体生成物が得られ、ＨＰＬＣ、粉末Ｘ線回折、Ｈ-ＮＭＲ分光法およびＴＧ-ＦＴＩＲによって特性を決定した。粉末Ｘ線回折は、表１に示されるようなピーク位置を有する図１に示されるようなＰＸＲＤパターンを有する材料が結晶であることを示した。
【００３９】
【表１−１】
2021529206.tif 000002
【００４０】
【表１−２】
2021529206.tif 000003
【００４１】
Vs ＝非常に強い、ｓ＝強い、ｍ＝中程度、ｗ＝弱い、vw =強度が非常に弱い。強度値は、好ましい配向効果のために実質的に変化し得ることに留意されたい。
【００４２】
実施例２：４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンを用いた５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の結晶塩の調製
４７．６３ｇの５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸一水和物（分析：５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸９７．９９ ％ｗ／ｗ、６Ｓ−ジアステレオ異性体： ９８．０％）を室温で９５ｍＬの水に懸濁した。４７．６ｍＬの４（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンを、温度を冷却せずに、約５０℃に上昇させながら添加した。混合物を室温まで冷却した。暗褐色透明溶液に９５０ｍＬのアセトンを約２．５時間以内にゆっくりと加えた。形成された懸濁液を室温で約２３時間撹拌した。次いで、懸濁液をフリットガラスフィルター（多孔率Ｇ３）で濾過し、フィルターケーキを１０００ｍＬのエタノールで洗浄した。そのようにして得られた軽いベージュ色の固体を４０℃／１０ ｍｂａｒで一晩乾燥した。約５２．４ｇの固体生成物が得られ、高速液体クロマトグラフィー、粉末Ｘ線回析および１Ｈ-ＮＭＲ分光法によって特性決定した。ＨＰＬＣ分析は９８．７％面積の純度、６Ｓ−ジアステレオ異性体を示した： ９８．７％粉末のＸ線回折は、生成物が表１に示されるようなピーク位置を有する図１に示されるようなＰＸＲＤパターンを有する結晶であることを示した。
【００４３】
実施例３：吸湿性および含水量（ＤＶＳ実験）
実施例１による５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸および４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンの塩の試料のＴＧ-ＦＴＩＲ分析は、試料が約８．９％ｗ／ｗの水を含有することを示した。この値は、約３５％の相対湿度でＴＧ−ＦＴＩＲによって決定された。この試料を、０〜９５％r.h.の相対湿度範囲内で動的水蒸気吸着分析（ＤＶＳ）によって試験した。ＤＶＳ測定は、上記のように行った。
【００４４】
５−メチル（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸と４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンの塩の結果を５−メチル（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩の結果と比較すると、５−メチル（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸と４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンの塩の水分含量は相対湿度２０％から８０％の範囲内で約２％変化し、５−メチル（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩の変化は約４％であることがわかる（参考例２）。さらに、実施例は相対湿度５０％での５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸および４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンの塩の水分含量が約１０％であり、相対湿度が５０％から９５％に増加した場合に化合物が約２％の追加の水を吸収することを示す。５０％ r.h.は中央ヨーロッパの夏の日の典型的な周囲相対湿度条件であるが、生成物が浴室に貯蔵される場合、相対湿度は一時的に少なくとも９５％に達する。
【００４５】
実施例４：５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸および４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンの塩の動力学的溶解度
実施例１に従って調製した５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸および４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリンの塩２７．１ｍｇを、スクリューキャップ付きの７ｍＬガラスバイアルに秤量し、調整可能な容量ピペットを使用して、精製／脱イオン水０．５ｍＬを固体に添加した。混合物を室温で激しく撹拌し、数秒後に全ての固体が溶解し、透明な溶液が得られた。このことは、５−酸メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸と４−（２‐ヒドロキシエチル）−モルホリンの塩について、５４ｍｇ／ｍＬ以上の水を容易に溶解できるということを意味する。これは、水１ｍＬ当たり３７ｍｇより多い５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸の即時動力学的溶解度に相当する。
【００４６】
参考例１：５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩の動力学的溶解度
無水形態の結晶性５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸カルシウム塩４２．５ｍｇを、スクリューキャップ付きの７ｍＬガラスバイアル中に秤量した。２．００ｍＬの精製／脱イオン水を、調整可能な容量ピペットを用いて固体に添加した。混合物を室温で１分間激しく撹拌した。１分後、懸濁液が観察された。懸濁液を遠心濾過によって濾過し、１．５０ｍＬの水溶液を風袋を量ったガラスバイアル（約１０ｍＬ容量）に移した。水を空気乾燥機中で４０℃で約１５時間、次いで５０℃で約８時間蒸発させた。その後、真空下（１０〜２０ｍｂａｒ）、５０℃で約１３時間乾燥を完了させた。溶解度は、固体残渣の重量評価によって決定した。溶解度は、水１ｍＬ当たり５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸９．０ｍｇであった。
【００４７】
参考例２：５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩の吸湿性及び含水率
５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸カルシウム塩の試料のＴＧ−ＦＴＩＲ分析は、試料が約１２．４％の水を含有することを示した。この試料を、０〜９５% r.h.の相対湿度範囲内で動的水蒸気吸着分析（ＤＶＳ）によって試験した。ＤＶＳ測定は、上記のように行った。
【００４８】
結果を図３に示し、２０％〜８０％の最も適切な範囲内で、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩の水分含量が約４％変化することを示した。さらに、参考例は相対湿度５０％での５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩の水分含量が約１２．４％であり、相対湿度が５０％から９５％に増加した場合に化合物が１０％を超える追加の水を吸収することを示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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