(57)【要約】本明細書では、細胞傷害性Ｔ細胞、ウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、またはガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞に由来し得、１種または複数種の抗原を標的とする１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み得る、ゲノム編集キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）を開示し、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、１つまたは複数のＣＡＲが特異的に結合する１種または複数種の抗原を欠損している。とりわけ、本開示は、遺伝子改変モノ、デュアル、及びタンデムキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）保有Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）、ならびに、がんの治療用の免疫療法を行うための方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種または複数種の抗原を標的とする１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むＣＡＲ−Ｔ細胞であって、Ｔ細胞受容体複合体のサブユニットを欠損している、及び／または、前記１つまたは複数のＣＡＲが特異的に結合する少なくとも１種または複数種の抗原を欠損している、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項２】
１種または複数種の抗原を標的とする１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むＣＡＲ−Ｔ細胞であって、前記１つまたは複数のＣＡＲが特異的に結合する１種または複数種の抗原を欠損している、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項３】
前記Ｔ細胞受容体複合体の前記サブユニットは、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲδ、ＴＣＲγ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、及びＣＤ３ζ、から選択される、請求項１に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項４】
前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、悪性Ｔ細胞または骨髄腫細胞上に発現した１種または複数種の抗原に特異的に結合する、請求項１から請求項２のいずれか１項に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項５】
前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、または配列番号：３９、から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を示す、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項６】
前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、または配列番号：３９、から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９８％の配列同一性を示す、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項７】
前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、または配列番号：３９、から選択されるアミノ酸配列である、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項８】
前記キメラ抗原受容体（複数可）は、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３７１、ＣＤ１１７、ＣＤ１３５、Ｔｉｍ−３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ５６、及びＣＤ１ａ、から選択される１種または複数種の抗原（複数可）に特異的に結合する、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項９】
前記キメラ抗原受容体（複数可）は、悪性Ｔ細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する、請求項１から請求項５のいずれか１項に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項１０】
悪性Ｔ細胞上に発現した前記抗原は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＴＣＲＡ、及びＴＣＲβ、から選択される、請求項９に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項１１】
前記キメラ抗原受容体は、悪性形質細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する、請求項１から請求項５のいずれか１項に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項１２】
悪性形質細胞上に発現した前記抗原は、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ３８、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１３８、及びＣＤ１９、から選択される、請求項１１に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項１３】
前記キメラ抗原受容体（複数可）は、悪性Ｂ細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する、請求項１から請求項５のいずれか１項に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項１４】
悪性Ｂ細胞上に発現した前記抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３８、及びＣＤ４５、から選択される、請求項１３に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項１５】
悪性Ｂ細胞上に発現した前記抗原は、ＣＤ１９及びＣＤ２０から選択される、請求項１４に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項１６】
自殺遺伝子を更に含む、請求項１から請求項１５のいずれか１項に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項１７】
内在性Ｔ細胞受容体介在性シグナル伝達は、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞内において阻害される、請求項１から請求項１６のいずれか１項に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項１８】
アロ反応性または移植片対宿主病を誘導しない、請求項１から請求項１７のいずれか１項に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項１９】
同胞殺しを誘導しない、請求項１から請求項１８のいずれか１項に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項２０】
請求項１から請求項１９のいずれか１項に記載のデュアルＣＡＲ−Ｔ細胞またはタンデムＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項２１】
前記ＣＡＲ（複数可）は、ＣＤ２×ＣＤ３ε、ＣＤ２×ＣＤ４、ＣＤ２×ＣＤ５、ＣＤ２×ＣＤ７、ＣＤ３ε×ＣＤ４、ＣＤ３ε×ＣＤ５、ＣＤ３ε×ＣＤ７、ＣＤ４×ＣＤ５、ＣＤ４×ＣＤ７、ＣＤ５×ＣＤ７、ＴＲＡＣ×ＣＤ２、ＴＲＡＣ×ＣＤ３ε、ＴＲＡＣ×ＣＤ４、ＴＲＡＣ×ＣＤ５、ＴＲＡＣ×ＣＤ７、ＴＣＲβ×ＣＤ２、ＴＣＲβ×ＣＤ３ε、ＴＣＲβ×ＣＤ４、ＴＣＲβ×ＣＤ７、ＣＤ２×ＣＤ３ε、ＣＤ２×ＣＤ４、ＣＤ２×ＣＤ５、ＣＤ２×ＣＤ７、ＣＤ３ε×ＣＤ４、ＣＤ３ε×ＣＤ５、ＣＤ３ε×ＣＤ７、ＣＤ４×ＣＤ５、ＣＤ４×ＣＤ７、ＣＤ５×ＣＤ７、ＴＲＡＣ×ＣＤ２、ＴＲＡＣ×ＣＤ３ε、ＴＲＡＣ×ＣＤ４、ＴＲＡＣ×ＣＤ５、ＴＲＡＣ×ＣＤ７、ＴＣＲβ×ＣＤ２、ＴＣＲβ×ＣＤ３ε、ＴＣＲβ×ＣＤ４、ＴＣＲβ×ＣＤ５、ＴＣＲβ×ＣＤ７、ＢＣＭＡ×ＣＳ１、ＢＣＭＡ×ＣＤ１９、ＢＣＭＡ×ＣＤ３８、ＣＳ１×ＣＤ１９、ＣＤ１９×ＣＤ３８、ＡＰＲＩＬ×ＣＳ１、ＡＰＲＩＬ×ＢＣＭＡ、ＡＰＲＩＬ×ＣＤ１９、ＡＰＲＩＬ×ＣＤ３８、ＣＳ１×ＣＤ３８、ＣＤ７９Ａ×ＢＣＭＡ、ＣＤ７９Ａ×ＣＳ１、ＣＤ７９Ａ×ＣＤ１９、ＣＤ７９Ａ×ＣＤ３８、ＣＤ７９Ａ×ＣＤ３８、ＣＤ７９Ａ×ＡＰＲＩＬ、ＣＤ７９Ａ×ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ７９Ｂ×ＢＣＭＡ、ＣＤ７９Ｂ×ＣＳ１、ＣＤ７９Ｂ×ＣＤ１９、ＣＤ７９Ｂ×ＣＤ３８、ＣＤ７９Ｂ×ＡＰＲＩＬ、ＣＤ７９Ｂ×ＣＤ７９Ａ、ＣＤ１３８×ＢＣＭＡ、ＣＤ１３８×ＣＳ１、ＣＤ１３８×ＣＤ１９、ＣＤ１３８×ＣＤ３８、ＣＤ１３８×ＡＰＲＩＬ、ＣＤ１３８×ＣＤ７９Ａ、ＣＤ１３８×ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１３８×ＢＣＭＡ、及びＣＤ１３８×ＣＳ１、から選択される２種の異なる標的に特異的に結合する、請求項２０に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項２２】
前記ＣＡＲ（複数可）は、ＣＤ２×ＣＤ３ε、ＣＤ２×ＣＤ４、ＣＤ２×ＣＤ５、ＣＤ２×ＣＤ７、ＣＤ３ε×ＣＤ４、ＣＤ３ε×ＣＤ５、ＣＤ３ε×ＣＤ７、ＣＤ４×ＣＤ５、ＣＤ４×ＣＤ７、ＣＤ５×ＣＤ７、ＴＲＡＣ×ＣＤ２、ＴＲＡＣ×ＣＤ３ε、ＴＲＡＣ×ＣＤ４、ＴＲＡＣ×ＣＤ５、ＴＲＡＣ×ＣＤ７、ＴＣＲβ×ＣＤ２、ＴＣＲβ×ＣＤ３ε、ＴＣＲβ×ＣＤ４、ＴＣＲβ×ＣＤ７、ＣＤ２×ＣＤ３ε、ＣＤ２×ＣＤ４、ＣＤ２×ＣＤ５、ＣＤ２×ＣＤ７、ＣＤ３ε×ＣＤ４、ＣＤ３ε×ＣＤ５、ＣＤ３ε×ＣＤ７、ＣＤ４×ＣＤ５、ＣＤ４×ＣＤ７、ＣＤ５×ＣＤ７、ＴＲＡＣ×ＣＤ２、ＴＲＡＣ×ＣＤ３ε、ＴＲＡＣ×ＣＤ４、ＴＲＡＣ×ＣＤ５、ＴＲＡＣ×ＣＤ７、ＴＣＲβ×ＣＤ２、ＴＣＲβ×ＣＤ３ε、ＴＣＲβ×ＣＤ４、ＴＣＲβ×ＣＤ５、及びＴＣＲβ×ＣＤ７、から選択される２種の異なる標的に特異的に結合する、請求項２１に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項２３】
前記ＣＡＲ（複数可）は、ＢＣＭＡ×ＣＳ１、ＢＣＭＡ×ＣＤ１９、ＢＣＭＡ×ＣＤ３８、ＣＳ１×ＣＤ１９、ＣＤ１９×ＣＤ３８、ＡＰＲＩＬ×ＣＳ１、ＡＰＲＩＬ×ＢＣＭＡ、ＡＰＲＩＬ×ＣＤ１９、ＡＰＲＩＬ×ＣＤ３８、ＣＳ１×ＣＤ３８、ＣＤ７９Ａ×ＢＣＭＡ、ＣＤ７９Ａ×ＣＳ１、ＣＤ７９Ａ×ＣＤ１９、ＣＤ７９Ａ×ＣＤ３８、ＣＤ７９Ａ×ＣＤ３８、ＣＤ７９Ａ×ＡＰＲＩＬ、ＣＤ７９Ａ×ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ７９Ｂ×ＢＣＭＡ、ＣＤ７９Ｂ×ＣＳ１、ＣＤ７９Ｂ×ＣＤ１９、ＣＤ７９Ｂ×ＣＤ３８、ＣＤ７９Ｂ×ＡＰＲＩＬ、ＣＤ７９Ｂ×ＣＤ７９Ａ、ＣＤ１３８×ＢＣＭＡ、ＣＤ１３８×ＣＳ１、ＣＤ１３８×ＣＤ１９、ＣＤ１３８×ＣＤ３８、ＣＤ１３８×ＡＰＲＩＬ、ＣＤ１３８×ＣＤ７９Ａ、ＣＤ１３８×ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１３８×ＢＣＭＡ、及びＣＤ１３８×ＣＳ１、から選択される２種の異なる標的に特異的に結合する、請求項２１に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項２４】
前記ＣＡＲ（複数可）は、ＣＤ１２３×ＣＤ３７１、ＣＤ１２３×ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＤ１２３×ＣＤ１１７、ＣＤ１２３×ＦＬＴ３、ＣＤ１２３×ＣＤ７、ＣＤ１２３×Ｔｉｍ３、ＣＤ３７１×ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＤ３７１×ＣＤ１１７、ＣＤ３７１×ＦＬＴ３、ＣＤ３７１×ＣＤ７、ＣＤ３７１×Ｔｉｍ３、ＣＬＥＣ１２Ａ×ＣＤ１１７、ＣＬＥＣ１２Ａ×ＦＬＴ３、ＣＬＥＣ１２Ａ×ＣＤ７、ＣＬＥＣ１２Ａ×Ｔｉｍ３、ＣＤ１１７×ＦＬＴ３、ＣＤ１１７×ＣＤ７、ＣＤ１１７×Ｔｉｍ３、ＦＬＴ３×ＣＤ７、ＦＬＴ３×Ｔｉｍ３、及びＣＤ７×Ｔｉｍ３、から選択される２種の異なる標的に特異的に結合する、請求項２１に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項２５】
請求項２１から請求項２４のいずれか１項に記載のデュアルＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項２６】
請求項２１から請求項３４のいずれか１項に記載のタンデムＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項２７】
自殺遺伝子を更に含む、請求項１から請求項２６のいずれか１項に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項２８】
内在性Ｔ細胞受容体介在性シグナル伝達は、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞内において阻害される、請求項１から請求項２６のいずれか１項に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項２９】
アロ反応性または移植片対宿主病を誘導しない、請求項１から請求項２６のいずれか１項に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項３０】
同胞殺しを誘導しない、請求項１から請求項２６のいずれか１項に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項３１】
２種またはそれ以上の形質細胞抗原を標的とするデュアルキメラ抗原受容体またはタンデムキメラ抗原受容体（ｄＣＡＲまたはｔＣＡＲ）。
【請求項３２】
前記形質細胞抗原（複数可）は、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ３８、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１３８、及びＣＤ１９、から選択される、請求項３１に記載のＣＡＲ。
【請求項３３】
前記ＣＡＲ（複数可）は、ＢＣＭＡ×ＣＳ１、ＢＣＭＡ×ＣＤ１９、ＢＣＭＡ×ＣＤ３８、ＣＳ１×ＣＤ１９、ＣＤ１９×ＣＤ３８、ＡＰＲＩＬ×ＣＳ１、ＡＰＲＩＬ×ＢＣＭＡ、ＡＰＲＩＬ×ＣＤ１９、ＡＰＲＩＬ×ＣＤ３８、ＣＳ１×ＣＤ３８、ＣＤ７９Ａ×ＢＣＭＡ、ＣＤ７９Ａ×ＣＳ１、ＣＤ７９Ａ×ＣＤ１９、ＣＤ７９Ａ×ＣＤ３８、ＣＤ７９Ａ×ＣＤ３８、ＣＤ７９Ａ×ＡＰＲＩＬ、ＣＤ７９Ａ×ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ７９Ｂ×ＢＣＭＡ、ＣＤ７９Ｂ×ＣＳ１、ＣＤ７９Ｂ×ＣＤ１９、ＣＤ７９Ｂ×ＣＤ３８、ＣＤ７９Ｂ×ＡＰＲＩＬ、ＣＤ７９Ｂ×ＣＤ７９Ａ、ＣＤ１３８×ＢＣＭＡ、ＣＤ１３８×ＣＳ１、ＣＤ１３８×ＣＤ１９、ＣＤ１３８×ＣＤ３８、ＣＤ１３８×ＡＰＲＩＬ、ＣＤ１３８×ＣＤ７９Ａ、ＣＤ１３８×ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１３８×ＢＣＭＡ、及びＣＤ１３８×ＣＳ１、から選択される２種の異なる標的に特異的に結合する、請求項３２に記載のＣＡＲ。
【請求項３４】
ｄＣＡＲである、請求項３１から請求項３３のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項３５】
ｔＣＡＲである、請求項３１から請求項３３のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項３６】
２種またはそれ以上の白血病細胞抗原を標的とするデュアルキメラ抗原受容体またはタンデムキメラ抗原受容体（ｄＣＡＲまたはｔＣＡＲ）。
【請求項３７】
前記形質細胞抗原（複数可）は、ＣＤ１２３、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＤ１１７、ＦＬＴ３、ＣＤ７、及びＴｉｍ３、から選択される、請求項３６に記載のＣＡＲ。
【請求項３８】
前記ＣＡＲ（複数可）は、ＣＤ１２３×ＣＤ３７１、ＣＤ１２３×ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＤ１２３×ＣＤ１１７、ＣＤ１２３×ＦＬＴ３、ＣＤ１２３×ＣＤ７、ＣＤ１２３×Ｔｉｍ３、ＣＤ３７１×ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＤ３７１×ＣＤ１１７、ＣＤ３７１×ＦＬＴ３、ＣＤ３７１×ＣＤ７、ＣＤ３７１×Ｔｉｍ３、ＣＬＥＣ１２Ａ×ＣＤ１１７、ＣＬＥＣ１２Ａ×ＦＬＴ３、ＣＬＥＣ１２Ａ×ＣＤ７、ＣＬＥＣ１２Ａ×Ｔｉｍ３、ＣＤ１１７×ＦＬＴ３、ＣＤ１１７×ＣＤ７、ＣＤ１１７×Ｔｉｍ３、ＦＬＴ３×ＣＤ７、ＦＬＴ３×Ｔｉｍ３、及びＣＤ７×Ｔｉｍ３、から選択される２種の異なる標的に特異的に結合する、請求項３７に記載のＣＡＲ。
【請求項３９】
ｄＣＡＲである、請求項３６から請求項３８のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項４０】
ｔＣＡＲである、請求項３６から請求項３８のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項４１】
２種またはそれ以上のＴ細胞抗原を標的とするタンデムキメラ抗原受容体（ｔＣＡＲ）。
【請求項４２】
前記Ｔ細胞抗原は、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ４、及びＣＤ３、から選択される、請求項４１に記載のｔＣＡＲ。
【請求項４３】
一対（すなわち、２種）の抗原を標的とする、請求項４２に記載のｔＣＡＲ。
【請求項４４】
前記抗原対は、ＣＤ２×ＣＤ３ε、ＣＤ２×ＣＤ４、ＣＤ２×ＣＤ５、ＣＤ２×ＣＤ７、ＣＤ３ε×ＣＤ４、ＣＤ３ε×ＣＤ５、ＣＤ３ε×ＣＤ７、ＣＤ４×ＣＤ５、ＣＤ４×ＣＤ７、ＣＤ５×ＣＤ７、ＴＲＡＣ×ＣＤ２、ＴＲＡＣ×ＣＤ３ε、ＴＲＡＣ×ＣＤ４、ＴＲＡＣ×ＣＤ５、ＴＲＡＣ×ＣＤ７、ＴＣＲβ×ＣＤ２、ＴＣＲβ×ＣＤ４、ＴＣＲβ×ＣＤ７、ＣＤ２×ＣＤ３ε、ＣＤ２×ＣＤ４、ＣＤ２×ＣＤ５、ＣＤ２×ＣＤ７、ＣＤ３ε×ＣＤ４、ＣＤ３ε×ＣＤ５、ＣＤ４×ＣＤ５、ＣＤ４×ＣＤ７、ＣＤ５×ＣＤ７、ＴＲＡＣ×ＣＤ２、ＴＲＡＣ×ＣＤ３ε、ＴＲＡＣ×ＣＤ４、ＴＲＡＣ×ＣＤ５、ＴＲＡＣ×ＣＤ７、ＴＣＲβ×ＣＤ２、ＴＣＲβ×ＣＤ３ε、ＴＣＲβ×ＣＤ４、ＴＣＲβ×ＣＤ５、及びＴＣＲβ×ＣＤ７、から選択される、請求項４３に記載のｔＣＡＲ。
【請求項４５】
前記抗原対は、ＣＤ２×ＣＤ３ε、ＣＤ２×ＣＤ４、ＣＤ２×ＣＤ５、ＣＤ２×ＣＤ７、ＣＤ３ε×ＣＤ４、ＣＤ３ε×ＣＤ５、ＣＤ３ε×ＣＤ７、ＣＤ４×ＣＤ５、ＣＤ４×ＣＤ７、及びＣＤ５×ＣＤ７、から選択される、請求項４３に記載のｔＣＡＲ。
【請求項４６】
前記ＣＡＲ構築物は、直鎖状ｔＣＡＲ構築物である、請求項３５及び請求項４０から請求項４５のいずれか１項に記載のｔＣＡＲ。
【請求項４７】
前記直鎖状ｔＣＡＲ構築物は、ＶＨ１及びＶＬ１と呼ばれる第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント、ならびに、ＶＬ２及びＶＨ２と呼ばれる第２の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント、を含み、前記第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び前記第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）２〜６リンカーにより、前記第２の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び前記第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメントと連結している、請求項４６に記載のｔＣＡＲ。
【請求項４８】
前記直鎖状ｔＣＡＲ構築物は、ＶＨ２及びＶＬ２と呼ばれる第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント、ならびに、ＶＨ１及びＶＬ１と呼ばれる第２の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント、を含み、前記第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び前記第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）２〜６リンカーにより、前記第２の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び前記第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメントと連結している、請求項４６に記載のｔＣＡＲ。
【請求項４９】
前記直鎖状ｔＣＡＲ構築物は、ＶＬ１及びＶＨ１と呼ばれる第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント、ならびに、ＶＨ２及びＶＬ２と呼ばれる第２の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント、を含み、前記第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び前記第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）２〜６リンカーにより、前記第２の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び前記第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメントと連結している、請求項４６に記載のｔＣＡＲ。
【請求項５０】
前記直鎖状ｔＣＡＲ構築物は、ＶＬ２及びＶＨ２と呼ばれる第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント、ならびに、ＶＨ１及びＶＬ１と呼ばれる第２の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント、を含み、前記第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び前記第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）２〜６リンカーにより、前記第２の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び前記第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメントと連結している、請求項４６に記載のｔＣＡＲ。
【請求項５１】
前記直鎖状ｔＣＡＲ構築物は、７−Ｉ〜７−ＸＸＸＩＩから選択される構造物を含む、請求項４６に記載のｔＣＡＲ。
【請求項５２】
前記ＣＡＲ構築物は、ヘアピンｔＣＡＲ構築物である、請求項３５及び請求項４０から請求項４５のいずれか１項に記載のｔＣＡＲ。
【請求項５３】
前記ヘアピンｔＣＡＲ構築物は、ＶＨ１及びＶＨ２と呼ばれる、第１のｓｃＦｖに由来する第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び第２のｓｃＦｖに由来する第２の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント、ならびに、ＶＬ２及びＶ１２と呼ばれる、前記第２のｓｃＦｖに由来する第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び前記第１のｓｃＦｖに由来する第２の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメントを含み、前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の重（ＶＨ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）２〜６リンカーにより、前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第２の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメントと連結している、請求項５２に記載のｔＣＡＲ。
【請求項５４】
前記ヘアピンｔＣＡＲ構築物は、ＶＨ２及びＶＨ１と呼ばれる、第２のｓｃＦｖに由来する第２の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び第１のｓｃＦｖに由来する第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント、ならびに、ＶＬ１及びＶＬ２と呼ばれる、前記第１のｓｃＦｖに由来する第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する第２の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメントを含み、前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）２〜６リンカーにより、前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメントと連結している、請求項５２に記載のｔＣＡＲ。
【請求項５５】
前記ヘアピンｔＣＡＲ構築物は、ＶＬ１及びＶＬ２と呼ばれる、第１のｓｃＦｖに由来する第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び第２のｓｃＦｖに由来する第２の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント、ならびに、ＶＨ２及びＶＨ１と呼ばれる、前記第１のｓｃＦｖに由来する第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する第２の重（ＶＬ）鎖可変フラグメントを含み、前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）２〜６リンカーにより、前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の重（ＶＬ）鎖可変フラグメントと連結している、請求項５２に記載のｔＣＡＲ。
【請求項５６】
前記ヘアピンｔＣＡＲ構築物は、ＶＬ２及びＶＬ１と呼ばれる、第２のｓｃＦｖに由来する第２の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び第１のｓｃＦｖに由来する第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント、ならびに、ＶＨ１及びＶＨ２と呼ばれる、前記第１のｓｃＦｖに由来する第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する第２の軽重（ＶＨ）鎖可変フラグメントを含み、前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）２〜６リンカーにより、前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の軽重（ＶＨ）鎖可変フラグメントと連結している、請求項５２に記載のｔＣＡＲ。
【請求項５７】
前記ヘアピンｔＣＡＲ構築物は、９−Ｉ〜９−ＸＸＸＩＩから選択される構造物を含む、請求項５２に記載のｔＣＡＲ。
【請求項５８】
前記ＣＡＲ構築物は、前記リンカー内に（Ｃｙｓ＝Ｃｙｓ）二本鎖結合（ＤＳＢ）を有するヘアピンＤＳＢｔＣＡＲ構築物である、請求項３５及び請求項４０から請求項４５のいずれか１項に記載のｔＣＡＲ。
【請求項５９】
前記ヘアピンｔＣＡＲ構築物は、ＶＨ１及びＶＨ２と呼ばれる、第１のｓｃＦｖに由来する第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び第２のｓｃＦｖに由来する第２の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント、ならびに、ＶＬ２及びＶ１２と呼ばれる、前記第２のｓｃＦｖに由来する第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び前記第１のｓｃＦｖに由来する第２の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメントを含み、前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の重（ＶＨ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）０〜１−（ＧＧＧＧＣ）１−（ＧＧＧＧＳ）１〜２−（ＧＧＧＧＰ）１−（ＧＧＧＧＳ）２〜３−（ＧＧＧＧＣ）１−（ＧＧＧＧＳ）０〜１リンカーにより、前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第２の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメントと連結している、請求項５８に記載のｔＣＡＲ。
【請求項６０】
前記ヘアピンｔＣＡＲ構築物は、ＶＨ２及びＶＨ１と呼ばれる、第２のｓｃＦｖに由来する第２の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び第１のｓｃＦｖに由来する第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント、ならびに、ＶＬ１及びＶＬ２と呼ばれる、前記第１のｓｃＦｖに由来する第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する第２の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメントを含み、前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）０〜１−（ＧＧＧＧＣ）１−（ＧＧＧＧＳ）１〜２−（ＧＧＧＧＰ）１−（ＧＧＧＧＳ）２〜３−（ＧＧＧＧＣ）１−（ＧＧＧＧＳ）０〜１リンカーにより、前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメントと連結している、請求項５８に記載のｔＣＡＲ。
【請求項６１】
前記ヘアピンｔＣＡＲ構築物は、ＶＬ１及びＶＬ２と呼ばれる、第１のｓｃＦｖに由来する第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び第２のｓｃＦｖに由来する第２の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント、ならびに、ＶＨ２及びＶＨ１と呼ばれる、前記第１のｓｃＦｖに由来する第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する第２の重（ＶＬ）鎖可変フラグメントを含み、前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）０〜１−（ＧＧＧＧＣ）１−（ＧＧＧＧＳ）１〜２−（ＧＧＧＧＰ）１−（ＧＧＧＧＳ）２〜３−（ＧＧＧＧＣ）１−（ＧＧＧＧＳ）０〜１リンカーにより、前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の重（ＶＬ）鎖可変フラグメントと連結している、請求項５８に記載のｔＣＡＲ。
【請求項６２】
前記ヘアピンｔＣＡＲ構築物は、ＶＬ２及びＶＬ１と呼ばれる、第２のｓｃＦｖに由来する第２の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び第１のｓｃＦｖに由来する第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント、ならびに、ＶＨ１及びＶＨ２と呼ばれる、前記第１のｓｃＦｖに由来する第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する第２の軽重（ＶＨ）鎖可変フラグメントを含み、前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）０〜１−（ＧＧＧＧＣ）１−（ＧＧＧＧＳ）１〜２−（ＧＧＧＧＰ）１−（ＧＧＧＧＳ）２〜３−（ＧＧＧＧＣ）１−（ＧＧＧＧＳ）０〜１リンカーにより、前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の軽重（ＶＨ）鎖可変フラグメントと連結している、請求項５８に記載のｔＣＡＲ。
【請求項６３】
前記ヘアピンＤＳＢｔＣＡＲ構築物は、１１−Ｉ〜１１−ＸＸＸＩＩから選択される構造物を含む、請求項５８に記載のｔＣＡＲ。
【請求項６４】
それぞれのＶＨ鎖及びＶＬ鎖は、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ４、及びＣＤ３、から選択される異なる抗原を認識するｓｃＦｖに由来する、請求項４１から請求項６３のいずれか１項に記載のｔＣＡＲ。
【請求項６５】
それぞれのＶＨ鎖及びＶＬ鎖は、異なり、配列番号：１２〜配列番号：３１から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を示す、請求項６４に記載のｔＣＡＲ。
【請求項６６】
それぞれのＶＨ鎖及びＶＬ鎖は、異なり、配列番号：１２〜配列番号：３１から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を示す、請求項６４に記載のｔＣＡＲ。
【請求項６７】
それぞれのＶＨ鎖及びＶＬ鎖は、異なり、配列番号：１２〜配列番号：３１から選択される配列である、請求項６４に記載のｔＣＡＲ。
【請求項６８】
ＣＤ２８及び４−１ＢＢから選択される少なくとも１種の共刺激ドメインを含む、請求項３５、請求項３９、及び請求項４１から請求項６７のいずれか１項に記載のｔＣＡＲ。
【請求項６９】
前記共刺激ドメインはＣＤ２８である、請求項６８に記載のｔＣＡＲ。
【請求項７０】
ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、請求項３５及び請求項４０から請求項６９のいずれか１項に記載のｔＣＡＲ。
【請求項７１】
前記それぞれのＶＨ鎖及びＶＬ鎖は、ＣＤ２を認識するｓｃＦｖまたはＣＤ３を認識するｓｃＦｖに由来する、請求項４１から請求項６３及び請求項６８から請求項７０のいずれか１項に記載のｔＣＡＲ。
【請求項７２】
前記ｔＣＡＲ構築物は、クローン５、クローン６、クローン７、クローン８、クローン１３、クローン１４、クローン１５、及びクローン１６、から選択される、請求項６４に記載のｔＣＡＲ。
【請求項７３】
前記ｔＣＡＲ構築物は、配列番号：４１〜配列番号：４６から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を示す、請求項６４に記載のｔＣＡＲ。
【請求項７４】
請求項３５及び請求項４０から請求項７３のいずれか１項に記載の、２種またはそれ以上のＴ細胞抗原を標的とするｔＣＡＲ、を含む、タンデムキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞（ｔＣＡＲ−Ｔ細胞）。
【請求項７５】
前記細胞は、前記１つまたは複数のＣＡＲが特異的に結合する１種または複数種の抗原を欠損している、請求項７４に記載のｔＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項７６】
Ｔ細胞受容体複合体のサブユニットを欠損している、請求項７４及び請求項７５のいずれか１項に記載のｔＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項７７】
前記Ｔ細胞受容体複合体の前記サブユニットは、ＴＣＲα（ＴＲＡＣ）、ＴＣＲβ、ＴＣＲδ、ＴＣＲγ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、及びＣＤ３ζ、から選択される、請求項７６に記載のｔＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項７８】
前記Ｔ細胞受容体複合体の前記サブユニットは、ＴＣＲα（ＴＲＡＣ）及びＣＤ３εから選択される、請求項７７に記載のｔＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項７９】
前記Ｔ細胞受容体複合体の前記サブユニットはＴＲＡＣである、請求項７８に記載のｔＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項８０】
前記ＣＡＲ−Ｔ細胞は自殺遺伝子を更に含む、請求項３５及び請求項４０から請求項７９のいずれか１項に記載のｔＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項８１】
内在性Ｔ細胞受容体介在性シグナル伝達は、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞内において阻害される、請求項３５及び請求項４０から請求項８０のいずれか１項に記載のｔＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項８２】
前記ＣＡＲ−Ｔ細胞は、アロ反応性または移植片対宿主病を誘導しない、請求項３５及び請求項４０から請求項８１のいずれか１項に記載のｔＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項８３】
前記ＣＡＲ−Ｔ細胞は同胞殺しを誘導しない、請求項３５及び請求項４０から請求項８２のいずれか１項に記載のｔＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項８４】
ＣＤ２及びＣＤ３を標的とするＣＡＲを有するタンデムＣＡＲ−Ｔ細胞であって、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体複合体のサブユニットを欠損しており、ＣＤ２を欠損している、前記タンデムＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項８５】
前記ＣＡＲは、配列番号：４１〜配列番号：４４から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を示す、請求項８５に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項８６】
前記ＣＡＲは、配列番号：４１〜配列番号：４４から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を示す、請求項８５に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項８７】
前記ＣＡＲは、配列番号：４１〜配列番号：４４から選択されるアミノ酸配列である、請求項８５に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項８８】
ＣＤ２及びＣＤ７を標的とするＣＡＲを有するタンデムＣＡＲ−Ｔ細胞であって、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体複合体のサブユニットを欠損しており、ＣＤ２及びＣＤ７を欠損している、前記タンデムＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項８９】
前記ＣＡＲは、配列番号：４５〜配列番号：４６から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を示す、請求項８８に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項９０】
前記ＣＡＲは、配列番号：４５〜配列番号：４６から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を示す、請求項８８に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項９１】
前記ＣＡＲは、配列番号：４５〜配列番号：４６から選択されるアミノ酸配列である、請求項８８に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項９２】
ＣＤ７を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むＣＡＲ−Ｔ細胞であって、ＴＲＡＣを欠損しており、ＣＤ７を欠損しており、ＣＤ２８共刺激ドメイン及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項９３】
前記ＣＡＲは、配列番号：３２〜配列番号：３９から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を示す、請求項９２に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項９４】
前記ＣＡＲは、配列番号：３２〜配列番号：３９から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を示す、請求項９２に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項９５】
前記ＣＡＲは、配列番号：３２〜配列番号：３９から選択されるアミノ酸配列である、請求項９２に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項９６】
請求項１から請求項３０及び請求項７４から請求項９５のいずれか１項に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞の集団、または、請求項３１から請求項７３のいずれか１項に記載のＣＡＲ（複数可）を含むＣＡＲ−Ｔ細胞の集団、を含み、かつ、少なくとも１種の治療的に許容される担体及び／またはアジュバントを含む、治療用組成物。
【請求項９７】
患者におけるがんを治療するための方法であって、請求項１から請求項３０及び請求項７４から請求項９５のいずれか１項に記載のゲノム編集ＣＡＲ−Ｔ細胞、ゲノム編集ＣＡＲ−Ｔ細胞、デュアルＣＡＲ−Ｔ細胞、もしくはタンデムＣＡＲ−Ｔの集団、または、請求項３１から請求項７３のいずれか１項に記載のＣＡＲ（複数可）を含むＣＡＲ−Ｔ細胞の集団を、がんの治療を必要とする前記患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項９８】
前記がんは血液悪性腫瘍である、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記血液悪性腫瘍はＴ細胞悪性腫瘍である、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記Ｔ細胞悪性腫瘍はＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記Ｔ細胞悪性腫瘍は非ホジキンリンパ腫である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０２】
前記Ｔ細胞悪性腫瘍はＴ細胞慢性リンパ性白血病（Ｔ−ＣＬＬ）である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０３】
前記血液悪性腫瘍は多発性骨髄腫である、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０４】
前記血液悪性腫瘍は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項９８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１９年１月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／７９９，５１３号、及び２０１８年５月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／６７８，８７８号の優先権の利益を主張するものであり、その開示はその全体が本明細書に記載されるかのように参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本明細書では、ゲノム編集キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）、及び免疫療法におけるその使用方法を開示する。とりわけ、本開示は、１種または複数種のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝的に修飾可能なＴ細胞、及びがんの治療におけるその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
リンパ球の一種であるＴ細胞は、細胞介在性免疫において中心的な役割を果たしている。Ｔ細胞は、細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在により、その他のリンパ球、例えば、Ｂ細胞及びナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）などとは区別されている。ＣＤ４＋ＴまたはＣＤ４Ｔ細胞とも呼ばれるＴヘルパー細胞（ＴＨ）は、その表面上にＣＤ４糖タンパク質を発現している。ヘルパーＴ細胞は、ＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）クラスＩＩ分子が提示するペプチド抗原に曝露されると活性化する。一度活性化すると、これらの細胞は急速に増殖して、免疫応答を調節するサイトカインを分泌する。ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ８Ｔ細胞としても知られている細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ）は、その細胞表面上にＣＤ８糖タンパク質を発現している。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子が提示するペプチド抗原に曝露されると活性化する。Ｔ細胞の亜型であるメモリーＴ細胞は、長期にわたり持続してその同族抗原に応答することから、過去の感染症及び／または腫瘍細胞に対する「メモリー」を備えた免疫機構をもたらす。ガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞は、「通常とは異なった」Ｔ細胞の典型であり、末梢血における比較的小さな、Ｔ細胞の亜集団の代表例である。ガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞は、γ鎖及びδ鎖で構成されるヘテロ二量体Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の発現により定義されている。ガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞は、この定義により、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞及びＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞とは区別されている。ウイルス特異的細胞傷害性Ｔリンパ球は、ウイルス抗原、とりわけ、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）及びサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に対する反応性を有するＴ細胞である。
【０００４】
抗原認識部分及びＴ細胞活性化ドメインで構成される融合タンパク質であるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように、本明細書に記載のＴ細胞を遺伝的に修飾してもよい。ＣＡＲを発現するＴ細胞は、特定のタンパク質、すなわち、腫瘍細胞上の抗原を認識することができる。ＣＡＲを発現するこれらのＴ細胞を研究室で増殖させてから、患者に注入してもよい。
【０００５】
臨床試験では、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）及びＢ細胞前駆細胞急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を含むＢ細胞悪性腫瘍を有する患者への抗ＣＤ１９  ＣＡＲの注入後に、高い奏効率が示されており、２種のＦＤＡ承認済み治療薬、イエスカルタ（商標）（アキシカブタゲンシロロイセル、Ｋｉｔｅ  Ｐｈａｒｍａ／Ｇｉｌｅａｄ）及びキムリア（商標）（チサゲンレクロイセル、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）につながっている。これらの成功にもかかわらず、Ｔ細胞悪性腫瘍に対するＣＡＲ−Ｔ細胞治療薬の開発には、悪性Ｔ細胞とエフェクターＴ細胞の間における標的抗原の共通発現を一因とする未解決問題があることが判明している。その中の最も一般的な課題は、（１）キメラ抗原受容体（複数可）の抗原標的（複数可）、（２）ＣＡＲ設計、すなわち、モノＣＡＲ、デュアルＣＡＲ、タンデムＣＡＲ、及び（３）腫瘍の不均一性、とりわけ、腫瘍抗原の表面発現における違い、である。その結果、より効果的、安全、かつ効率的にがん（Ｔ細胞関連悪性腫瘍を含む）を標的とするための、ゲノム編集、ならびにモノ、デュアル、及びタンデムＣＡＲの構築物を利用した、改良されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）系免疫療法薬に対する要望は依然として存在している。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】デュアルＣＡＲ−Ｔ細胞（ｄＣＡＲ−Ｔ細胞）の概略図を示す。
【０００７】
【図２】タンデムＣＡＲ−Ｔ細胞（ｔＣＡＲ−Ｔ細胞）の概略図を示す。
【０００８】
【図３】デュアルＣＡＲ構築物及びタンデムＣＡＲ構築物の概略図を示す。
【０００９】
【図４】タンデム標的化ＣＡＲ構築物の概略図を示す。
【００１０】
【図５】ＣＤ３＋ＣＡＲ−Ｔ細胞またはＣＤ２＋ＣＡＲ−Ｔ細胞を物理的に枯渇させていない、ＣＡＲ−Ｔ作製物の純度を示す。ＦＡＣＳ解析により示されるとおり、ＣＤ３＋細胞を磁気で枯渇させる必要のない、高純度のＣＤ３−ＣＡＲ−Ｔ細胞及びＣＤ２−ＣＡＲ−Ｔ細胞が存在している。代表的なＦＡＣＳプロットは、ＣＤ３（ｙ軸）及びＣＤ２（ｘ軸）のＦＩＴＣ染色を示している。クローン５（上部）及びクローン６（下部）を示している。
【００１１】
【図６】ＣＤ３＋ＣＡＲ−Ｔ細胞またはＣＤ２＋ＣＡＲ−Ｔ細胞を物理的に枯渇させていない、ＣＡＲ−Ｔ作製物の純度を示す。ＦＡＣＳ解析により示されるとおり、ＣＤ３＋細胞を磁気で枯渇選択する必要のない、高純度のＣＤ３−ＣＡＲ−Ｔ細胞及びＣＤ２−ＣＡＲ−Ｔ細胞が存在している。代表的なＦＡＣＳプロットは、ＣＤ３（ｙ軸）及びＣＤ２（ｘ軸）のＦＩＴＣ染色を示している。クローン７（上部）及びクローン８（下部）を示している。
【００１２】
【図７】ＣＤ３＋ＣＡＲ−Ｔ細胞またはＣＤ２＋ＣＡＲ−Ｔ細胞を物理的に枯渇させていない、ＣＡＲ−Ｔ作製物の純度を示す。ＦＡＣＳ解析により示されるとおり、ＣＤ３＋細胞を磁気で枯渇選択する必要のない、高純度のＣＤ３−ＣＡＲ−Ｔ細胞及びＣＤ２−ＣＡＲ−Ｔ細胞が存在している。代表的なＦＡＣＳプロットは、ＣＤ３（ｙ軸）及びＣＤ２（ｘ軸）のＦＩＴＣ染色を示している。クローン１３（上部）及びクローン１４（下部）を示している。
【００１３】
【図８】ＣＤ３＋ＣＡＲ−Ｔ細胞またはＣＤ２＋ＣＡＲ−Ｔ細胞を物理的に枯渇させていない、ＣＡＲ−Ｔ作製物の純度を示す。ＦＡＣＳ解析により示されるとおり、ＣＤ３＋細胞を磁気で枯渇選択する必要のない、高純度のＣＤ３−ＣＡＲ−Ｔ細胞及びＣＤ２−ＣＡＲ−Ｔ細胞が存在している。代表的なＦＡＣＳプロットは、ＣＤ３（ｙ軸）及びＣＤ２（ｘ軸）のＦＩＴＣ染色を示している。クローン１５（上部）及びクローン１６（下部）を示している。
【００１４】
【図９Ａ】タンデムＣＤ２−ＣＤ３  ＣＡＲ−Ｔクローン５（上部）及びタンデムＣＤ２−ＣＤ３  ＣＡＲ−Ｔクローン６（下部）の腫瘍細胞殺傷を示し、凡例は、エフェクター対標的細胞の比率（Ｅ：Ｔ比率）を示す。
【００１５】
【図９Ｂ】タンデムＣＤ２−ＣＤ３  ＣＡＲ−Ｔクローン７（上部）及びタンデムＣＤ２−ＣＤ３  ＣＡＲ−Ｔクローン８（下部）の腫瘍細胞殺傷を示し、凡例は、エフェクター対標的細胞の比率（Ｅ：Ｔ比率）を示す。
【００１６】
【図９Ｃ】タンデムＣＤ２−ＣＤ３  ＣＡＲ−Ｔクローン１３（上部）及びタンデムＣＤ２−ＣＤ３  ＣＡＲ−Ｔクローン１４（下部）の腫瘍細胞殺傷を示し、凡例は、エフェクター対標的細胞の比率（Ｅ：Ｔ比率）を示す。
【００１７】
【図９Ｄ】タンデムＣＤ２−ＣＤ３  ＣＡＲ−Ｔクローン１５（上部）及びタンデムＣＤ２−ＣＤ３  ＣＡＲ−Ｔクローン１６（下部）の腫瘍細胞殺傷を示し、凡例は、エフェクター対標的細胞の比率（Ｅ：Ｔ比率）を示す。
【００１８】
【図１０Ａ】ＢＣＭＡを標的とする、Ｔ細胞に形質導入するＢＣＭＡ  ＣＡＲ構築物の概略図を示す。
【００１９】
【図１０Ｂ】５１Ｃｒ放出アッセイにおける、ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞の腫瘍細胞殺傷を示す。複数のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）の比率において、ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞の効率的な殺傷が認められた。非形質導入活性化Ｔ細胞及びＣＤ１９−ＣＡＲ−Ｔ細胞を陰性対照として使用したが、ＭＭ．１Ｓ−ＣＧ細胞の殺傷を誘導しなかった。
【００２０】
【図１０Ｃ】ＢＣＭＡ  ＣＡＲ−Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を示す。５０日目あたりに死亡した対照と比較して、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ−Ｔで治療した７匹全てのマウスは、ほぼ１５０日間またはそれ以上まで生存した。
【００２１】
【図１０Ｄ】光子束を測定した経時的な生物発光イメージング（ＢＬＩ）により、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ−Ｔ細胞による治療を受けたマウスを用いた実験期間中にわたり決して上昇しなかったバックグラウンドレベルに対するシグナルの強力な低下が明らかとなったこと、を示す。
【００２２】
【図１１Ａ】ＣＳ１を標的とする、Ｔ細胞に形質導入するＣＳ１−ＣＡＲ構築物の概略図を示す。
【００２３】
【図１１Ｂ】ＣＳ１−ＣＡＲ−Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を示す。ＣＳ１−ＣＡＲ−Ｔ細胞の特異度を試験するための方法として、マウスに、ＭＭ．１Ｓ−ＣＧ細胞、及びＣＳ１を欠いたＭＭ．１Ｓ−ＣＧ細胞（Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ技術を使用した、ＭＭ．１Ｓ−ＣＧΔＣＳ１）を移植した。ＣＳ１−ＣＡＲ−Ｔ細胞で治療した全てのマウス（ｎ＝１０）が＞９０日間生存した一方で、ＣＤ１９対照マウス（ｎ＝８）の中央生存は４３日間であった。
【００２４】
【図１１Ｃ】経時的な生物発光イメージング（ＢＬＩ）が、ＣＳ１−ＣＡＲ−Ｔ細胞で治療したマウスが、光子束の３対数の低下、及び骨髄腫瘍の排除を示したことを示したこと、を示す（実験１〜実験３）。
【００２５】
【図１２Ａ】モノ（ＣＤ１９、ＣＳ１）構築物及びタンデム（ＢＣＭＡ−ＣＳ１）構築物の概略図を示す。
【００２６】
【図１２Ｂ】ＣＤ１９  ＣＡＲを発現するジャーカット細胞が、ＢＣＭＡタンパク質またはＣＳ１タンパク質のいずれにも結合しなかったＦＡＣＳ解析（それぞれのプロットの下部左側の象限）を示す。ＢＣＭＡ  ＣＡＲタンパク質を発現するジャーカット細胞は、ＢＣＭＡタンパク質に結合した（それぞれのプロットの上部左側の象限）。ＣＳ１  ＣＡＲタンパク質を発現するジャーカット細胞は、ＣＳ１タンパク質に結合した（それぞれのプロットの下部右側の象限）。タンデムＢＣＭＡ−ＣＳ１  ＣＡＲタンパク質を発現するジャーカット細胞は、両方の組換えタンパク質に結合し（それぞれのプロットの上部右側の象限）、両方のｓｃＦｖの発現を示唆した。
【００２７】
【図１２Ｃ】標準的な４時間のクロム放出（５１Ｃｒ）アッセイを用いた、単一ＣＡＲ−Ｔ細胞及びタンデムＣＡＲ−Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効性を示す。ＢＣＭＡ−ＣＳ１  ｔＣＡＲ−Ｔ細胞は、単抗原標的化ＢＣＭＡ  ＣＡＲ−Ｔ細胞と単抗原標的化ＣＳ１  ＣＡＲ−Ｔ細胞の両方と同様の有効性で、ＭＭ．１Ｓ−ＣＧ細胞を殺傷した。
【００２８】
【図１３】Ｔ−ＡＬＬの異種モデルを用いたＣＤ２＊ＣＤ３Δ−ｄＣＡＲＴΔＣＤ２ΔＣＤ３εの有効性試験を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下の開示は、遺伝子改変細胞の詳細な実施形態、選択肢、及び使用、ならびに、例えば、疾患を治療するための、免疫療法及び養子細胞移入におけるこのような細胞の使用である。それゆえ、本明細書では以下の実施形態を提供する。
【００３０】
実施形態１．１種または複数種の抗原を標的とする１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むＣＡＲ−Ｔ細胞であって、Ｔ細胞受容体複合体のサブユニットを欠損している、及び／または、前記１つまたは複数のＣＡＲが特異的に結合する少なくとも１種または複数種の抗原を欠損している、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞。
【００３１】
実施形態２．１種または複数種の抗原を標的とする１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むＣＡＲ−Ｔ細胞であって、前記１つまたは複数のＣＡＲが特異的に結合する１種または複数種の抗原を欠損している、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞。
【００３２】
実施形態３．前記Ｔ細胞受容体複合体の前記サブユニットは、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲδ、ＴＣＲγ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、及びＣＤ３ζ、から選択される、実施形態１に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【００３３】
実施形態４．前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、悪性Ｔ細胞または骨髄腫細胞上に発現した１種または複数種の抗原に特異的に結合する、実施形態１から実施形態２のいずれか１つに記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【００３４】
実施形態５．前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、または配列番号：３９、から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を示す、実施形態１から実施形態４のいずれか１つに記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【００３５】
実施形態６．前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、または配列番号：３９、から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９８％の配列同一性を示す、実施形態１から実施形態４のいずれか１つに記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【００３６】
実施形態７．前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、または配列番号：３９、から選択されるアミノ酸配列である、実施形態１から実施形態４のいずれか１つに記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【００３７】
実施形態８．前記キメラ抗原受容体（複数可）は、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３７１、ＣＤ１１７、ＣＤ１３５、Ｔｉｍ−３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ５６、及びＣＤ１ａ、から選択される１種または複数種の抗原（複数可）に特異的に結合する、実施形態１から実施形態４のいずれか１つに記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【００３８】
実施形態９．前記キメラ抗原受容体（複数可）は、悪性Ｔ細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する、実施形態１から実施形態５のいずれか１つに記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【００３９】
実施形態１０．悪性Ｔ細胞上に発現した前記抗原は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＴＣＲＡ、及びＴＣＲβ、から選択される、実施形態９に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【００４０】
実施形態１１．前記キメラ抗原受容体は、悪性形質細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する、実施形態１から実施形態５のいずれか１つに記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【００４１】
実施形態１２．悪性形質細胞上に発現した前記抗原は、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ３８、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１３８、及びＣＤ１９、から選択される、実施形態１１に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【００４２】
実施形態１３．前記キメラ抗原受容体（複数可）は、悪性Ｂ細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する、実施形態１から実施形態５のいずれか１つに記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【００４３】
実施形態１４．悪性Ｂ細胞上に発現した前記抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３８、及びＣＤ４５、から選択される、実施形態１３に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【００４４】
実施形態１５．悪性Ｂ細胞上に発現した前記抗原は、ＣＤ１９及びＣＤ２０から選択される、実施形態１４に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【００４５】
実施形態１６．自殺遺伝子を更に含む、実施形態１から実施形態１５のいずれか１つに記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【００４６】
実施形態１７．内在性Ｔ細胞受容体介在性シグナル伝達は、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞内において阻害される、実施形態１から実施形態１６のいずれか１つに記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【００４７】
実施形態１８．アロ反応性または移植片対宿主病を誘導しない、実施形態１から実施形態１７のいずれか１つに記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【００４８】
実施形態１９．同胞殺しを誘導しない、実施形態１から実施形態１８のいずれか１つに記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【００４９】
実施形態２０．実施形態１から実施形態１９のいずれか１つに記載のデュアルＣＡＲ−Ｔ細胞またはタンデムＣＡＲ−Ｔ細胞。
【００５０】
実施形態２１．前記ＣＡＲ（複数可）は、ＣＤ２×ＣＤ３ε、ＣＤ２×ＣＤ４、ＣＤ２×ＣＤ５、ＣＤ２×ＣＤ７、ＣＤ３ε×ＣＤ４、ＣＤ３ε×ＣＤ５、ＣＤ３ε×ＣＤ７、ＣＤ４×ＣＤ５、ＣＤ４×ＣＤ７、ＣＤ５×ＣＤ７、ＴＲＡＣ×ＣＤ２、ＴＲＡＣ×ＣＤ３ε、ＴＲＡＣ×ＣＤ４、ＴＲＡＣ×ＣＤ５、ＴＲＡＣ×ＣＤ７、ＴＣＲβ×ＣＤ２、ＴＣＲβ×ＣＤ３ε、ＴＣＲβ×ＣＤ４、ＴＣＲβ×ＣＤ７、ＣＤ２×ＣＤ３ε、ＣＤ２×ＣＤ４、ＣＤ２×ＣＤ５、ＣＤ２×ＣＤ７、ＣＤ３ε×ＣＤ４、ＣＤ３ε×ＣＤ５、ＣＤ３ε×ＣＤ７、ＣＤ４×ＣＤ５、ＣＤ４×ＣＤ７、ＣＤ５×ＣＤ７、ＴＲＡＣ×ＣＤ２、ＴＲＡＣ×ＣＤ３ε、ＴＲＡＣ×ＣＤ４、ＴＲＡＣ×ＣＤ５、ＴＲＡＣ×ＣＤ７、ＴＣＲβ×ＣＤ２、ＴＣＲβ×ＣＤ３ε、ＴＣＲβ×ＣＤ４、ＴＣＲβ×ＣＤ５、ＴＣＲβ×ＣＤ７、ＢＣＭＡ×ＣＳ１、ＢＣＭＡ×ＣＤ１９、ＢＣＭＡ×ＣＤ３８、ＣＳ１×ＣＤ１９、ＣＤ１９×ＣＤ３８、ＡＰＲＩＬ×ＣＳ１、ＡＰＲＩＬ×ＢＣＭＡ、ＡＰＲＩＬ×ＣＤ１９、ＡＰＲＩＬ×ＣＤ３８、ＣＳ１×ＣＤ３８、ＣＤ７９Ａ×ＢＣＭＡ、ＣＤ７９Ａ×ＣＳ１、ＣＤ７９Ａ×ＣＤ１９、ＣＤ７９Ａ×ＣＤ３８、ＣＤ７９Ａ×ＣＤ３８、ＣＤ７９Ａ×ＡＰＲＩＬ、ＣＤ７９Ａ×ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ７９Ｂ×ＢＣＭＡ、ＣＤ７９Ｂ×ＣＳ１、ＣＤ７９Ｂ×ＣＤ１９、ＣＤ７９Ｂ×ＣＤ３８、ＣＤ７９Ｂ×ＡＰＲＩＬ、ＣＤ７９Ｂ×ＣＤ７９Ａ、ＣＤ１３８×ＢＣＭＡ、ＣＤ１３８×ＣＳ１、ＣＤ１３８×ＣＤ１９、ＣＤ１３８×ＣＤ３８、ＣＤ１３８×ＡＰＲＩＬ、ＣＤ１３８×ＣＤ７９Ａ、ＣＤ１３８×ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１３８×ＢＣＭＡ、及びＣＤ１３８×ＣＳ１、から選択される２種の異なる標的に特異的に結合する、実施形態２０に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【００５１】
実施形態２２．前記ＣＡＲ（複数可）は、ＣＤ２×ＣＤ３ε、ＣＤ２×ＣＤ４、ＣＤ２×ＣＤ５、ＣＤ２×ＣＤ７、ＣＤ３ε×ＣＤ４、ＣＤ３ε×ＣＤ５、ＣＤ３ε×ＣＤ７、ＣＤ４×ＣＤ５、ＣＤ４×ＣＤ７、ＣＤ５×ＣＤ７、ＴＲＡＣ×ＣＤ２、ＴＲＡＣ×ＣＤ３ε、ＴＲＡＣ×ＣＤ４、ＴＲＡＣ×ＣＤ５、ＴＲＡＣ×ＣＤ７、ＴＣＲβ×ＣＤ２、ＴＣＲβ×ＣＤ３ε、ＴＣＲβ×ＣＤ４、ＴＣＲβ×ＣＤ７、ＣＤ２×ＣＤ３ε、ＣＤ２×ＣＤ４、ＣＤ２×ＣＤ５、ＣＤ２×ＣＤ７、ＣＤ３ε×ＣＤ４、ＣＤ３ε×ＣＤ５、ＣＤ３ε×ＣＤ７、ＣＤ４×ＣＤ５、ＣＤ４×ＣＤ７、ＣＤ５×ＣＤ７、ＴＲＡＣ×ＣＤ２、ＴＲＡＣ×ＣＤ３ε、ＴＲＡＣ×ＣＤ４、ＴＲＡＣ×ＣＤ５、ＴＲＡＣ×ＣＤ７、ＴＣＲβ×ＣＤ２、ＴＣＲβ×ＣＤ３ε、ＴＣＲβ×ＣＤ４、ＴＣＲβ×ＣＤ５、及びＴＣＲβ×ＣＤ７、から選択される２種の異なる標的に特異的に結合する、実施形態２１に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【００５２】
実施形態２３．前記ＣＡＲ（複数可）は、ＢＣＭＡ×ＣＳ１、ＢＣＭＡ×ＣＤ１９、ＢＣＭＡ×ＣＤ３８、ＣＳ１×ＣＤ１９、ＣＤ１９×ＣＤ３８、ＡＰＲＩＬ×ＣＳ１、ＡＰＲＩＬ×ＢＣＭＡ、ＡＰＲＩＬ×ＣＤ１９、ＡＰＲＩＬ×ＣＤ３８、ＣＳ１×ＣＤ３８、ＣＤ７９Ａ×ＢＣＭＡ、ＣＤ７９Ａ×ＣＳ１、ＣＤ７９Ａ×ＣＤ１９、ＣＤ７９Ａ×ＣＤ３８、ＣＤ７９Ａ×ＣＤ３８、ＣＤ７９Ａ×ＡＰＲＩＬ、ＣＤ７９Ａ×ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ７９Ｂ×ＢＣＭＡ、ＣＤ７９Ｂ×ＣＳ１、ＣＤ７９Ｂ×ＣＤ１９、ＣＤ７９Ｂ×ＣＤ３８、ＣＤ７９Ｂ×ＡＰＲＩＬ、ＣＤ７９Ｂ×ＣＤ７９Ａ、ＣＤ１３８×ＢＣＭＡ、ＣＤ１３８×ＣＳ１、ＣＤ１３８×ＣＤ１９、ＣＤ１３８×ＣＤ３８、ＣＤ１３８×ＡＰＲＩＬ、ＣＤ１３８×ＣＤ７９Ａ、ＣＤ１３８×ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１３８×ＢＣＭＡ、及びＣＤ１３８×ＣＳ１、から選択される２種の異なる標的に特異的に結合する、実施形態２１に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【００５３】
実施形態２４．前記ＣＡＲ（複数可）は、ＣＤ１２３×ＣＤ３７１、ＣＤ１２３×ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＤ１２３×ＣＤ１１７、ＣＤ１２３×ＦＬＴ３、ＣＤ１２３×ＣＤ７、ＣＤ１２３×Ｔｉｍ３、ＣＤ３７１×ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＤ３７１×ＣＤ１１７、ＣＤ３７１×ＦＬＴ３、ＣＤ３７１×ＣＤ７、ＣＤ３７１×Ｔｉｍ３、ＣＬＥＣ１２Ａ×ＣＤ１１７、ＣＬＥＣ１２Ａ×ＦＬＴ３、ＣＬＥＣ１２Ａ×ＣＤ７、ＣＬＥＣ１２Ａ×Ｔｉｍ３、ＣＤ１１７×ＦＬＴ３、ＣＤ１１７×ＣＤ７、ＣＤ１１７×Ｔｉｍ３、ＦＬＴ３×ＣＤ７、ＦＬＴ３×Ｔｉｍ３、及びＣＤ７×Ｔｉｍ３、から選択される２種の異なる標的に特異的に結合する、実施形態２１に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【００５４】
実施形態２５．実施形態２１から実施形態２４のいずれか１つに記載のデュアルＣＡＲ−Ｔ細胞。
【００５５】
実施形態２６．実施形態２１から実施形態３４のいずれか１つに記載のタンデムＣＡＲ−Ｔ細胞。
【００５６】
実施形態２７．自殺遺伝子を更に含む、実施形態１から実施形態２６のいずれか１つに記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【００５７】
実施形態２８．内在性Ｔ細胞受容体介在性シグナル伝達は、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞内において阻害される、実施形態１から実施形態２６のいずれか１つに記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【００５８】
実施形態２９．アロ反応性または移植片対宿主病を誘導しない、実施形態１から実施形態２６のいずれか１つに記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【００５９】
実施形態３０．同胞殺しを誘導しない、実施形態１から実施形態２６のいずれか１つに記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【００６０】
実施形態３１．２種またはそれ以上の形質細胞抗原を標的とするデュアルキメラ抗原受容体またはタンデムキメラ抗原受容体（ｄＣＡＲまたはｔＣＡＲ）。
【００６１】
実施形態３２．前記形質細胞抗原（複数可）は、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ３８、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１３８、及びＣＤ１９、から選択される、実施形態３１に記載のＣＡＲ。
【００６２】
実施形態３３．前記ＣＡＲ（複数可）は、ＢＣＭＡ×ＣＳ１、ＢＣＭＡ×ＣＤ１９、ＢＣＭＡ×ＣＤ３８、ＣＳ１×ＣＤ１９、ＣＤ１９×ＣＤ３８、ＡＰＲＩＬ×ＣＳ１、ＡＰＲＩＬ×ＢＣＭＡ、ＡＰＲＩＬ×ＣＤ１９、ＡＰＲＩＬ×ＣＤ３８、ＣＳ１×ＣＤ３８、ＣＤ７９Ａ×ＢＣＭＡ、ＣＤ７９Ａ×ＣＳ１、ＣＤ７９Ａ×ＣＤ１９、ＣＤ７９Ａ×ＣＤ３８、ＣＤ７９Ａ×ＣＤ３８、ＣＤ７９Ａ×ＡＰＲＩＬ、ＣＤ７９Ａ×ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ７９Ｂ×ＢＣＭＡ、ＣＤ７９Ｂ×ＣＳ１、ＣＤ７９Ｂ×ＣＤ１９、ＣＤ７９Ｂ×ＣＤ３８、ＣＤ７９Ｂ×ＡＰＲＩＬ、ＣＤ７９Ｂ×ＣＤ７９Ａ、ＣＤ１３８×ＢＣＭＡ、ＣＤ１３８×ＣＳ１、ＣＤ１３８×ＣＤ１９、ＣＤ１３８×ＣＤ３８、ＣＤ１３８×ＡＰＲＩＬ、ＣＤ１３８×ＣＤ７９Ａ、ＣＤ１３８×ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１３８×ＢＣＭＡ、及びＣＤ１３８×ＣＳ１、から選択される２種の異なる標的に特異的に結合する、実施形態３２に記載のＣＡＲ。
【００６３】
実施形態３４．ｄＣＡＲである、実施形態３１から実施形態３３のいずれか１つに記載のＣＡＲ。
【００６４】
実施形態３５．ｔＣＡＲである、実施形態３１から実施形態３３のいずれか１つに記載のＣＡＲ。
【００６５】
実施形態３６．２種またはそれ以上の白血病細胞抗原を標的とするデュアルキメラ抗原受容体またはタンデムキメラ抗原受容体（ｄＣＡＲまたはｔＣＡＲ）。
【００６６】
実施形態３７．前記形質細胞抗原（複数可）は、ＣＤ１２３、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＤ１１７、ＦＬＴ３、ＣＤ７、及びＴｉｍ３、から選択される、実施形態３６に記載のＣＡＲ。
【００６７】
実施形態３８．前記ＣＡＲ（複数可）は、ＣＤ１２３×ＣＤ３７１、ＣＤ１２３×ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＤ１２３×ＣＤ１１７、ＣＤ１２３×ＦＬＴ３、ＣＤ１２３×ＣＤ７、ＣＤ１２３×Ｔｉｍ３、ＣＤ３７１×ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＤ３７１×ＣＤ１１７、ＣＤ３７１×ＦＬＴ３、ＣＤ３７１×ＣＤ７、ＣＤ３７１×Ｔｉｍ３、ＣＬＥＣ１２Ａ×ＣＤ１１７、ＣＬＥＣ１２Ａ×ＦＬＴ３、ＣＬＥＣ１２Ａ×ＣＤ７、ＣＬＥＣ１２Ａ×Ｔｉｍ３、ＣＤ１１７×ＦＬＴ３、ＣＤ１１７×ＣＤ７、ＣＤ１１７×Ｔｉｍ３、ＦＬＴ３×ＣＤ７、ＦＬＴ３×Ｔｉｍ３、及びＣＤ７×Ｔｉｍ３、から選択される２種の異なる標的に特異的に結合する、実施形態３７に記載のＣＡＲ。
【００６８】
実施形態３９．ｄＣＡＲである、実施形態３６から実施形態３８のいずれか１つに記載のＣＡＲ。
【００６９】
実施形態４０．ｔＣＡＲである、実施形態３６から実施形態３８のいずれか１つに記載のＣＡＲ。
【００７０】
実施形態４１．２種またはそれ以上のＴ細胞抗原を標的とするタンデムキメラ抗原受容体（ｔＣＡＲ）。
【００７１】
実施形態４２．前記Ｔ細胞抗原は、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ４、及びＣＤ３、から選択される、実施形態４１に記載のｔＣＡＲ。
【００７２】
実施形態４３．一対（すなわち、２種）の抗原を標的とする、実施形態４２に記載のｔＣＡＲ。
【００７３】
実施形態４４．前記抗原対は、ＣＤ２×ＣＤ３ε、ＣＤ２×ＣＤ４、ＣＤ２×ＣＤ５、ＣＤ２×ＣＤ７、ＣＤ３ε×ＣＤ４、ＣＤ３ε×ＣＤ５、ＣＤ３ε×ＣＤ７、ＣＤ４×ＣＤ５、ＣＤ４×ＣＤ７、ＣＤ５×ＣＤ７、ＴＲＡＣ×ＣＤ２、ＴＲＡＣ×ＣＤ３ε、ＴＲＡＣ×ＣＤ４、ＴＲＡＣ×ＣＤ５、ＴＲＡＣ×ＣＤ７、ＴＣＲβ×ＣＤ２、ＴＣＲβ×ＣＤ４、ＴＣＲβ×ＣＤ７、ＣＤ２×ＣＤ３ε、ＣＤ２×ＣＤ４、ＣＤ２×ＣＤ５、ＣＤ２×ＣＤ７、ＣＤ３ε×ＣＤ４、ＣＤ３ε×ＣＤ５、ＣＤ４×ＣＤ５、ＣＤ４×ＣＤ７、ＣＤ５×ＣＤ７、ＴＲＡＣ×ＣＤ２、ＴＲＡＣ×ＣＤ３ε、ＴＲＡＣ×ＣＤ４、ＴＲＡＣ×ＣＤ５、ＴＲＡＣ×ＣＤ７、ＴＣＲβ×ＣＤ２、ＴＣＲβ×ＣＤ３ε、ＴＣＲβ×ＣＤ４、ＴＣＲβ×ＣＤ５、及びＴＣＲβ×ＣＤ７、から選択される、実施形態４３に記載のｔＣＡＲ。
【００７４】
実施形態４５．前記抗原対は、ＣＤ２×ＣＤ３ε、ＣＤ２×ＣＤ４、ＣＤ２×ＣＤ５、ＣＤ２×ＣＤ７、ＣＤ３ε×ＣＤ４、ＣＤ３ε×ＣＤ５、ＣＤ３ε×ＣＤ７、ＣＤ４×ＣＤ５、ＣＤ４×ＣＤ７、及びＣＤ５×ＣＤ７、から選択される、実施形態４３に記載のｔＣＡＲ。
【００７５】
実施形態４６．前記ＣＡＲ構築物は、直鎖状ｔＣＡＲ構築物である、実施形態３５及び実施形態４０から実施形態４５のいずれか１つに記載のｔＣＡＲ。
【００７６】
実施形態４７．前記直鎖状ｔＣＡＲ構築物は、ＶＨ１及びＶＬ１と呼ばれる第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント、ならびに、ＶＬ２及びＶＨ２と呼ばれる第２の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント、を含み、前記第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び前記第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）２〜６リンカーにより、前記第２の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び前記第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメントと連結している、実施形態４６に記載のｔＣＡＲ。
【００７７】
実施形態４８．前記直鎖状ｔＣＡＲ構築物は、ＶＨ２及びＶＬ２と呼ばれる第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント、ならびに、ＶＨ１及びＶＬ１と呼ばれる第２の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント、を含み、前記第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び前記第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）２〜６リンカーにより、前記第２の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び前記第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメントと連結している、実施形態４６に記載のｔＣＡＲ。
【００７８】
実施形態４９．前記直鎖状ｔＣＡＲ構築物は、ＶＬ１及びＶＨ１と呼ばれる第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント、ならびに、ＶＨ２及びＶＬ２と呼ばれる第２の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント、を含み、前記第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び前記第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）２〜６リンカーにより、前記第２の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び前記第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメントと連結している、実施形態４６に記載のｔＣＡＲ。
【００７９】
実施形態５０．前記直鎖状ｔＣＡＲ構築物は、ＶＬ２及びＶＨ２と呼ばれる第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント、ならびに、ＶＨ１及びＶＬ１と呼ばれる第２の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント、を含み、前記第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び前記第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）２〜６リンカーにより、前記第２の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び前記第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメントと連結している、実施形態４６に記載のｔＣＡＲ。
【００８０】
実施形態５１．前記直鎖状ｔＣＡＲ構築物は、７−Ｉ〜７−ＸＸＸＩＩから選択される構造物を含む、実施形態４６に記載のｔＣＡＲ。
【００８１】
実施形態５２．前記ＣＡＲ構築物は、ヘアピンｔＣＡＲ構築物である、実施形態３５及び実施形態４０から実施形態４５のいずれか１つに記載のｔＣＡＲ。
【００８２】
実施形態５３．前記ヘアピンｔＣＡＲ構築物は、ＶＨ１及びＶＨ２と呼ばれる、第１のｓｃＦｖに由来する第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び第２のｓｃＦｖに由来する第２の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント、ならびに、ＶＬ２及びＶ１２と呼ばれる、前記第２のｓｃＦｖに由来する第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び前記第１のｓｃＦｖに由来する第２の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメントを含み、前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の重（ＶＨ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）２〜６リンカーにより、前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第２の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメントと連結している、実施形態５２に記載のｔＣＡＲ。
【００８３】
実施形態５４．前記ヘアピンｔＣＡＲ構築物は、ＶＨ２及びＶＨ１と呼ばれる、第２のｓｃＦｖに由来する第２の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び第１のｓｃＦｖに由来する第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント、ならびに、ＶＬ１及びＶＬ２と呼ばれる、前記第１のｓｃＦｖに由来する第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する第２の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメントを含み、前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）２〜６リンカーにより、前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメントと連結している、実施形態５２に記載のｔＣＡＲ。
【００８４】
実施形態５５．前記ヘアピンｔＣＡＲ構築物は、ＶＬ１及びＶＬ２と呼ばれる、第１のｓｃＦｖに由来する第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び第２のｓｃＦｖに由来する第２の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント、ならびに、ＶＨ２及びＶＨ１と呼ばれる、前記第１のｓｃＦｖに由来する第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する第２の重（ＶＬ）鎖可変フラグメントを含み、前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）２〜６リンカーにより、前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の重（ＶＬ）鎖可変フラグメントと連結している、実施形態５２に記載のｔＣＡＲ。
【００８５】
実施形態５６．前記ヘアピンｔＣＡＲ構築物は、ＶＬ２及びＶＬ１と呼ばれる、第２のｓｃＦｖに由来する第２の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び第１のｓｃＦｖに由来する第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント、ならびに、ＶＨ１及びＶＨ２と呼ばれる、前記第１のｓｃＦｖに由来する第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する第２の軽重（ＶＨ）鎖可変フラグメントを含み、前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）２〜６リンカーにより、前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の軽重（ＶＨ）鎖可変フラグメントと連結している、実施形態５２に記載のｔＣＡＲ。
【００８６】
実施形態５７．前記ヘアピンｔＣＡＲ構築物は、９−Ｉ〜９−ＸＸＸＩＩから選択される構造物を含む、実施形態５２に記載のｔＣＡＲ。
【００８７】
実施形態５８．前記ＣＡＲ構築物は、前記リンカー内に（Ｃｙｓ＝Ｃｙｓ）二本鎖結合（ＤＳＢ）を有するヘアピンＤＳＢｔＣＡＲ構築物である、実施形態３５及び実施形態４０から実施形態４５のいずれか１つに記載のｔＣＡＲ。
【００８８】
実施形態５９．前記ヘアピンｔＣＡＲ構築物は、ＶＨ１及びＶＨ２と呼ばれる、第１のｓｃＦｖに由来する第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び第２のｓｃＦｖに由来する第２の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント、ならびに、ＶＬ２及びＶ１２と呼ばれる、前記第２のｓｃＦｖに由来する第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び前記第１のｓｃＦｖに由来する第２の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメントを含み、前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の重（ＶＨ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）０〜１−（ＧＧＧＧＣ）１−（ＧＧＧＧＳ）１〜２−（ＧＧＧＧＰ）１−（ＧＧＧＧＳ）２〜３−（ＧＧＧＧＣ）１−（ＧＧＧＧＳ）０〜１リンカーにより、前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第２の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメントと連結している、実施形態５８に記載のｔＣＡＲ。
【００８９】
実施形態６０．前記ヘアピンｔＣＡＲ構築物は、ＶＨ２及びＶＨ１と呼ばれる、第２のｓｃＦｖに由来する第２の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び第１のｓｃＦｖに由来する第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント、ならびに、ＶＬ１及びＶＬ２と呼ばれる、前記第１のｓｃＦｖに由来する第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する第２の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメントを含み、前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）０〜１−（ＧＧＧＧＣ）１−（ＧＧＧＧＳ）１〜２−（ＧＧＧＧＰ）１−（ＧＧＧＧＳ）２〜３−（ＧＧＧＧＣ）１−（ＧＧＧＧＳ）０〜１リンカーにより、前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメントと連結している、実施形態５８に記載のｔＣＡＲ。
【００９０】
実施形態６１．前記ヘアピンｔＣＡＲ構築物は、ＶＬ１及びＶＬ２と呼ばれる、第１のｓｃＦｖに由来する第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び第２のｓｃＦｖに由来する第２の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント、ならびに、ＶＨ２及びＶＨ１と呼ばれる、前記第１のｓｃＦｖに由来する第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する第２の重（ＶＬ）鎖可変フラグメントを含み、前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）０〜１−（ＧＧＧＧＣ）１−（ＧＧＧＧＳ）１〜２−（ＧＧＧＧＰ）１−（ＧＧＧＧＳ）２〜３−（ＧＧＧＧＣ）１−（ＧＧＧＧＳ）０〜１リンカーにより、前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の重（ＶＬ）鎖可変フラグメントと連結している、実施形態５８に記載のｔＣＡＲ。
【００９１】
実施形態６２．前記ヘアピンｔＣＡＲ構築物は、ＶＬ２及びＶＬ１と呼ばれる、第２のｓｃＦｖに由来する第２の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び第１のｓｃＦｖに由来する第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント、ならびに、ＶＨ１及びＶＨ２と呼ばれる、前記第１のｓｃＦｖに由来する第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する第２の軽重（ＶＨ）鎖可変フラグメントを含み、前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の軽（ＶＬ）鎖可変フラグメントは、（ＧＧＧＧＳ）０〜１−（ＧＧＧＧＣ）１−（ＧＧＧＧＳ）１〜２−（ＧＧＧＧＰ）１−（ＧＧＧＧＳ）２〜３−（ＧＧＧＧＣ）１−（ＧＧＧＧＳ）０〜１リンカーにより、前記第１のｓｃＦｖに由来する前記第１の重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び前記第２のｓｃＦｖに由来する前記第２の軽重（ＶＨ）鎖可変フラグメントと連結している、実施形態５８に記載のｔＣＡＲ。
【００９２】
実施形態６３．前記ヘアピンＤＳＢｔＣＡＲ構築物は、１１−Ｉ〜１１−ＸＸＸＩＩから選択される構造物を含む、実施形態５８に記載のｔＣＡＲ。
【００９３】
実施形態６４．それぞれのＶＨ鎖及びＶＬ鎖は、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ４、及びＣＤ３、から選択される異なる抗原を認識するｓｃＦｖに由来する、実施形態４１から実施形態６３のいずれか１つに記載のｔＣＡＲ。
【００９４】
実施形態６５．それぞれのＶＨ鎖及びＶＬ鎖は、異なり、配列番号：１２〜配列番号：３１から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を示す、実施形態６４に記載のｔＣＡＲ。
【００９５】
実施形態６６．それぞれのＶＨ鎖及びＶＬ鎖は、異なり、配列番号：１２〜配列番号：３１から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を示す、実施形態６４に記載のｔＣＡＲ。
【００９６】
実施形態６７．それぞれのＶＨ鎖及びＶＬ鎖は、異なり、配列番号：１２〜配列番号：３１から選択される配列である、実施形態６４に記載のｔＣＡＲ。
【００９７】
実施形態６８．ＣＤ２８及び４−１ＢＢから選択される少なくとも１種の共刺激ドメインを含む、実施形態３５、実施形態３９、及び実施形態４１から実施形態６７のいずれか１つに記載のｔＣＡＲ。
【００９８】
実施形態６９．前記共刺激ドメインはＣＤ２８である、実施形態６８に記載のｔＣＡＲ。
【００９９】
実施形態７０．ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、実施形態３５及び実施形態４０から実施形態６９のいずれか１つに記載のｔＣＡＲ。
【０１００】
実施形態７１．前記それぞれのＶＨ鎖及びＶＬ鎖は、ＣＤ２を認識するｓｃＦｖまたはＣＤ３を認識するｓｃＦｖに由来する、実施形態４１から実施形態６３及び実施形態６８から実施形態７０のいずれか１つに記載のｔＣＡＲ。
【０１０１】
実施形態７２．前記ｔＣＡＲ構築物は、クローン５、クローン６、クローン７、クローン８、クローン１３、クローン１４、クローン１５、及びクローン１６、から選択される、実施形態６４に記載のｔＣＡＲ。
【０１０２】
実施形態７３．前記ｔＣＡＲ構築物は、配列番号：４１〜配列番号：４６から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を示す、実施形態６４に記載のｔＣＡＲ。
【０１０３】
実施形態７４．実施形態３５及び実施形態４０から実施形態７３のいずれか１つに記載の、２種またはそれ以上のＴ細胞抗原を標的とするｔＣＡＲ、を含む、タンデムキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞（ｔＣＡＲ−Ｔ細胞）。
【０１０４】
実施形態７５．前記細胞は、前記１つまたは複数のＣＡＲが特異的に結合する１種または複数種の抗原を欠損している、実施形態７４に記載のｔＣＡＲ−Ｔ細胞。
【０１０５】
実施形態７６．Ｔ細胞受容体複合体のサブユニットを欠損している、実施形態７４及び実施形態７５のいずれか１つに記載のｔＣＡＲ−Ｔ細胞。
【０１０６】
実施形態７７．前記Ｔ細胞受容体複合体の前記サブユニットは、ＴＣＲα（ＴＲＡＣ）、ＴＣＲβ、ＴＣＲδ、ＴＣＲγ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、及びＣＤ３ζ、から選択される、実施形態７６に記載のｔＣＡＲ−Ｔ細胞。
【０１０７】
実施形態７８．前記Ｔ細胞受容体複合体の前記サブユニットは、ＴＣＲα（ＴＲＡＣ）及びＣＤ３εから選択される、実施形態７７に記載のｔＣＡＲ−Ｔ細胞。
【０１０８】
実施形態７９．前記Ｔ細胞受容体複合体の前記サブユニットはＴＲＡＣである、実施形態７８に記載のｔＣＡＲ−Ｔ細胞。
【０１０９】
実施形態８０．前記ＣＡＲ−Ｔ細胞は自殺遺伝子を更に含む、実施形態３５及び実施形態４０から実施形態７９のいずれか１つに記載のｔＣＡＲ−Ｔ細胞。
【０１１０】
実施形態８１．内在性Ｔ細胞受容体介在性シグナル伝達は、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞内において阻害される、実施形態３５及び実施形態４０から実施形態８０のいずれか１つに記載のｔＣＡＲ−Ｔ細胞。
【０１１１】
実施形態８２．前記ＣＡＲ−Ｔ細胞は、アロ反応性または移植片対宿主病を誘導しない、実施形態３５及び実施形態４０から実施形態８１のいずれか１つに記載のｔＣＡＲ−Ｔ細胞。
【０１１２】
実施形態８３．前記ＣＡＲ−Ｔ細胞は同胞殺しを誘導しない、実施形態３５及び実施形態４０から実施形態８２のいずれか１つに記載のｔＣＡＲ−Ｔ細胞。
【０１１３】
実施形態８４．ＣＤ２及びＣＤ３を標的とするＣＡＲを有するタンデムＣＡＲ−Ｔ細胞であって、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体複合体のサブユニットを欠損しており、ＣＤ２を欠損している、前記タンデムＣＡＲ−Ｔ細胞。
【０１１４】
実施形態８５．前記ＣＡＲは、配列番号：４１〜配列番号：４４から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を示す、実施形態８５に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【０１１５】
実施形態８６．前記ＣＡＲは、配列番号：４１〜配列番号：４４から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を示す、実施形態８５に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【０１１６】
実施形態８７．前記ＣＡＲは、配列番号：４１〜配列番号：４４から選択されるアミノ酸配列である、実施形態８５に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【０１１７】
実施形態８８．ＣＤ２及びＣＤ７を標的とするＣＡＲを有するタンデムＣＡＲ−Ｔ細胞であって、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体複合体のサブユニットを欠損しており、ＣＤ２及びＣＤ７を欠損している、前記タンデムＣＡＲ−Ｔ細胞。
【０１１８】
実施形態８９．前記ＣＡＲは、配列番号：４５〜配列番号：４６から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を示す、実施形態８８に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【０１１９】
実施形態９０．前記ＣＡＲは、配列番号：４５〜配列番号：４６から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を示す、実施形態８８に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【０１２０】
実施形態９１．前記ＣＡＲは、配列番号：４５〜配列番号：４６から選択されるアミノ酸配列である、実施形態８８に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【０１２１】
実施形態９２．ＣＤ７を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むＣＡＲ−Ｔ細胞であって、ＴＲＡＣを欠損しており、ＣＤ７を欠損しており、ＣＤ２８共刺激ドメイン及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞。
【０１２２】
実施形態９３．前記ＣＡＲは、配列番号：３２〜配列番号：３９から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を示す、実施形態９２に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【０１２３】
実施形態９４．前記ＣＡＲは、配列番号：３２〜配列番号：３９から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を示す、実施形態９２に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【０１２４】
実施形態９５．前記ＣＡＲは、配列番号：３２〜配列番号：３９から選択されるアミノ酸配列である、実施形態９２に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【０１２５】
実施形態１から実施形態３０及び実施形態７４から実施形態９５のいずれか１つに記載のＣＡＲ−Ｔ細胞の集団、または、実施形態３１から実施形態７３のいずれか１つに記載のＣＡＲ（複数可）を含むＣＡＲ−Ｔ細胞の集団、を含み、かつ、少なくとも１種の治療的に許容される担体及び／またはアジュバントを含む、治療用組成物。
【０１２６】
実施形態９６．患者におけるがんを治療するための方法であって、実施形態１から実施形態３０及び実施形態７４から実施形態９５のいずれか１つに記載のゲノム編集ＣＡＲ−Ｔ細胞、ゲノム編集ＣＡＲ−Ｔ細胞、デュアルＣＡＲ−Ｔ細胞、もしくはタンデムＣＡＲ−Ｔの集団、または、実施形態３１から実施形態７３のいずれか１つに記載のＣＡＲ（複数可）を含むＣＡＲ−Ｔ細胞の集団を、がんの治療を必要とする前記患者に投与することを含む、前記方法。
【０１２７】
実施形態９７．前記がんは血液悪性腫瘍である、実施形態９７に記載の方法。
【０１２８】
実施形態９８．前記血液悪性腫瘍はＴ細胞悪性腫瘍である、実施形態９８に記載の方法。
【０１２９】
実施形態９９．前記Ｔ細胞悪性腫瘍はＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）である、実施形態９９に記載の方法。
【０１３０】
実施形態１００．前記Ｔ細胞悪性腫瘍は非ホジキンリンパ腫である、実施形態９９に記載の方法。
【０１３１】
実施形態１０１．前記Ｔ細胞悪性腫瘍はＴ細胞慢性リンパ性白血病（Ｔ−ＣＬＬ）である、実施形態９９に記載の方法。
【０１３２】
実施形態１０２．前記血液悪性腫瘍は多発性骨髄腫である、実施形態９８に記載の方法。
【０１３３】
実施形態１０３．前記血液悪性腫瘍は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、実施形態９８に記載の方法。
【０１３４】
実施形態１０４．Ｃａｓ９−ＣＲＩＳＰＲ、及び本明細書で開示するｇＲＮＡから選択されるｇＲＮＡを使用して、上記の任意の実施形態または本明細書に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞を作製するための方法。
【０１３５】
実施形態１０５．Ｃａｓ９−ＣＲＩＳＰＲ、ならびに、表１２及び表１５〜表４７で開示するｇＲＮＡから選択されるｇＲＮＡを使用して、上記の任意の実施形態または本明細書に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞を作製するための方法。
【０１３６】
実施形態１０６．Ｃａｓ９−ＣＲＩＳＰＲ、ならびに、表１２で開示するｇＲＮＡ及び表１５〜表４７において太字体で示すｇＲＮＡから選択されるｇＲＮＡを使用して、上記の任意の実施形態または本明細書に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞を作製するための方法。
【０１３７】
実施形態１０７．Ｃａｓ９−ＣＲＩＳＰＲ、及び表１２で開示するｇＲＮＡから選択されるｇＲＮＡを使用して、上記の任意の実施形態または本明細書に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞を作製するための方法。
【０１３８】
Ｍ
【０１３９】
本明細書では、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、またはガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞に由来し、１種または複数種の抗原を標的とする１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、ゲノム編集ＣＡＲ−Ｔ細胞を開示し、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、１つまたは複数のＣＡＲが特異的に結合する１種または複数種の抗原を欠損している。
【０１４０】
ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、またはガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞に由来し、１種または複数種の抗原を標的とする１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、ゲノム編集ＣＡＲ−Ｔ細胞もまた提供し、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体複合体のサブユニット、及び１つまたは複数のＣＡＲが特異的に結合する１種または複数種の抗原を欠損している。
【０１４１】
ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、またはガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞、に由来するＣＡＲ−Ｔ細胞もまた提供し、Ｔ細胞受容体複合体の欠損したサブユニットは、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲδ、ＴＣＲγ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、及びＣＤ３ζ、から選択される。
【０１４２】
特定の実施形態では、キメラ抗原受容体は、悪性Ｔ細胞上に発現した少なくとも１種の抗原に特異的に結合する。
【０１４３】
特定の実施形態では、１種または複数種の抗原は、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３７１、ＣＤ１１７、ＣＤ１３５、Ｔｉｍ−３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ５６、及びＣＤ１ａ、から選択される。
【０１４４】
特定の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、自殺遺伝子療法システムを更に含む。
【０１４５】
特定の実施形態では、内在性Ｔ細胞受容体介在性シグナル伝達は、ＣＡＲ−Ｔ細胞内において阻害される。
【０１４６】
特定の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、アロ反応性または移植片対宿主病を誘導しない。
【０１４７】
特定の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は同胞殺しを誘導しない。
【０１４８】
デュアルＣＡＲ−Ｔ細胞またはタンデムＣＡＲ−Ｔ細胞もまた提供する。
【０１４９】
本明細書で開示するＣＡＲ−Ｔ細胞の集団、ならびに、少なくとも１種の治療的に許容される担体及び／またはアジュバントを含む、医薬組成物もまた提供する。
【０１５０】
血液悪性腫瘍の治療を必要とする患者に、ゲノム編集ＣＡＲ−Ｔ細胞、ゲノム編集ＣＡＲ−Ｔ細胞の集団を投与することを含む、血液悪性腫瘍を治療するための方法もまた提供し、ゲノム編集ＣＡＲ−Ｔ細胞の集団は、本明細書で開示するモノＣＡＲ−Ｔ細胞、デュアルＣＡＲ−Ｔ細胞、もしくはタンデムＣＡＲ−Ｔ細胞、または、本明細書で開示するモノＣＡＲ−Ｔ細胞、デュアルＣＡＲ−Ｔ細胞、もしくはタンデムＣＡＲ−Ｔ細胞を含む医薬組成物である。
【０１５１】
特定の実施形態では、血液悪性腫瘍はＴ細胞悪性腫瘍である。
【０１５２】
特定の実施形態では、Ｔ細胞悪性腫瘍はＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）である。
【０１５３】
特定の実施形態では、Ｔ細胞悪性腫瘍は非ホジキンリンパ腫である。
【０１５４】
特定の実施形態では、Ｔ細胞悪性腫瘍はＴ細胞慢性リンパ性白血病（Ｔ−ＣＬＬ）である。
【０１５５】
特定の実施形態では、血液悪性腫瘍は多発性骨髄腫である。
【０１５６】
特定の実施形態では、血液悪性腫瘍は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。
【０１５７】
ＣＡＲ−Ｔ細胞
本開示は、キメラ抗原受容体保有Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）、キメラ抗原受容体保有Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）を含む医薬組成物、及び、がん、とりわけ、血液悪性腫瘍の治療用の免疫療法を行うための方法を提供する。
【０１５８】
ＣＡＲ−Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞である。ＣＡＲ分子を発現するＴ細胞は、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、またはガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞、であってもよい。
【０１５９】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、１）細胞外リガンド結合ドメイン、すなわち、抗原認識ドメイン、２）膜貫通ドメイン、及び３）シグナル伝達ドメイン、を含む、組換え融合タンパク質である。
【０１６０】
細胞外リガンド結合ドメインは、リガンドに結合可能なオリゴペプチドまたはポリペプチドである。細胞外リガンド結合ドメインは、標的の抗原、受容体、ペプチドリガンド、タンパク質リガンド、または標的のポリペプチドであってもよい、細胞表面分子と相互作用可能であることが好ましい。細胞外リガンド結合ドメインは、約０．１ｐＭ〜約１０ｐＭ、約０．１ｐＭ〜約１ｐＭ、または、より好ましくは、約０．１ｐＭ〜約１００ｎＭの親和性定数または相互作用（ＫＤ）の親和性で、抗原に特異的に結合することができる。親和性定数または相互作用（ＫＤ）の親和性を測定するための方法は、当該技術分野において周知である。一部の例では、細胞外リガンド結合ドメインは、特定の疾患状態に関連する標的細胞上における細胞表面マーカーとして機能するリガンドを認識するように選択される。
【０１６１】
一実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ（２〜６））により連結された軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び重（ＶＨ）鎖可変フラグメントを含む、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含み、Ｔ細胞抗原またはＴ細胞に特異的ではない抗原のいずれかに対する特異性を付与する。一実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞のキメラ抗原受容体は、ＣＡＲ−Ｔ細胞（例えば、ゲノム編集ＣＡＲ−Ｔ細胞）が欠損している抗原である、悪性Ｔ細胞上に発現または過剰発現したＴ細胞特異的抗原に結合し得る。
【０１６２】
悪性Ｔ細胞上に発現した、ＣＡＲが標的とする抗原の非限定例としては、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ４、及びＣＤ３、が挙げられる。一実施形態では、本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ５に特異的に結合する細胞外リガンド結合ドメインを有するキメラ抗原受容体を含む。
【０１６３】
別の実施形態では、本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ７に特異的に結合する細胞外リガンド結合ドメインを有するキメラ抗原受容体を含む。言い換えると、ＣＤ７に特異的に結合するＣＡＲは、配列番号：２０及び配列番号：２１から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％、または９９％の同一性を示すポリペプチド配列を含み、配列（ＧＧＧＧＳ）３〜４を含むフレキシブルリンカーにより互いに連結している、細胞外リガンド結合ドメインを含む。
【０１６４】
別の実施形態では、本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ２に特異的に結合する細胞外リガンド結合ドメインを有するキメラ抗原受容体を含む。言い換えると、ＣＤ２に特異的に結合するＣＡＲは、配列番号：１２、及び配列番号：１３または配列番号：１４、ならびに配列番号：１５、から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％、または９９％の同一性を示すポリペプチド配列を含み、配列（ＧＧＧＧＳ）３〜４を含むフレキシブルリンカーにより互いに連結している、細胞外リガンド結合ドメインを含む。
【０１６５】
なおも別の実施形態では、本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ４に特異的に結合する細胞外リガンド結合ドメインを有するキメラ抗原受容体を含む。
【０１６６】
更に別の実施形態では、本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ３に特異的に結合するキメラ抗原受容体の細胞外リガンド結合ドメインを含む。言い換えると、ＣＤ３に特異的に結合するＣＡＲは、配列番号：１６、及び配列番号：１７または配列番号：１８、ならびに配列番号：１９、から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％、または９９％の同一性を示すポリペプチド配列を含み、配列（ＧＧＧＧＳ）３〜４を含むフレキシブルリンカーにより互いに連結している、細胞外リガンド結合ドメインを含む。
【０１６７】
白血病細胞（例えば、異常な骨髄芽球、赤血球、または血小板）の表面上に発現した、ＣＡＲが標的とする抗原の非限定例としては、ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ）、ＣＤ３７１（ＣＬＬ−１、ＣＬＥＣ１２Ａ）、ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）、及びＣＤ１３５（ＦＬＴ３）、ＣＤ７、ならびにＴｉｍ３、が挙げられる。白血病、すなわち、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を治療するために、これらの抗原を標的とする細胞外リガンド結合ドメインを有するＣＡＲを構築してもよい。
【０１６８】
多発性骨髄腫細胞（例えば、悪性形質細胞）の表面上に発現した、ＣＡＲが標的とする抗原の非限定例としては、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ３８、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１３８、及びＣＤ１９、が挙げられる。多発性骨髄腫を治療するために、これらの抗原を標的とする細胞外リガンド結合ドメインを有するＣＡＲを構築してもよい。別の実施形態では、多発性骨髄腫を治療するために、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）ならびに膜貫通型活性化因子及びＣＡＭＬ相互作用因子（ＴＡＣＩ）のリガンドを標的とし、ＢＣＭＡとＴＡＣＩの両方を効果的に共標的とする、ＡＰＲＩＬタンパク質の一部を有するＣＡＲを構築してもよい。シグナルペプチドは、分泌されたタンパク質または膜貫通タンパク質の、細胞膜及び／または細胞表面への輸送を誘導し、ポリペプチドの適切な局在化を可能とする。とりわけ、本開示のシグナルペプチドは、付加ポリペプチド、すなわち、ＣＡＲ受容体を、細胞膜へと誘導するが、付加ポリペプチドの細胞外リガンド結合ドメインは細胞表面上に提示されており、付加ポリペプチドの膜貫通ドメインは細胞膜にまたがっており、付加ポリペプチドのシグナル伝達ドメインは細胞の細胞質部分内にある。一実施形態では、シグナルペプチドは、ヒトＣＤ８αに由来するシグナルペプチド（配列番号：１）である。一実施形態では、シグナルペプチドは、ＣＤ８αシグナルペプチドの機能性フラグメントである。機能性フラグメントは、付加ポリペプチドを細胞膜及び／または細胞表面へと誘導するＣＤ８αシグナルペプチドの少なくとも１０アミノ酸のフラグメントとして定義される。ヒトＣＤ８αシグナルペプチドの機能性フラグメントの例としては、アミノ酸配列ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡ、ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰ、ＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬ、及びＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ、が挙げられる。
【０１６９】
通常、細胞外リガンド結合ドメインは、膜貫通ドメイン（Ｔｍ）により、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のシグナル伝達ドメインに連結している。膜貫通ドメインは細胞膜を貫通し、ＣＡＲをＴ細胞表面に固定し、細胞外リガンド結合ドメインをシグナル伝達ドメインに連結させて、Ｔ細胞表面上におけるＣＡＲの発現に影響を及ぼす。
【０１７０】
本開示における膜貫通ドメインの極めて特徴的な特性は、免疫細胞の表面に発現して、所定の標的細胞に対する免疫細胞応答を誘導する能力である。膜貫通ドメインは、天然または合成の供給源に由来していてもよい。代替的に、本開示の膜貫通ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来していてもよい。
【０１７１】
本開示の膜貫通ポリペプチドの非限定例は、Ｔ細胞受容体のα鎖、β鎖、またはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤＳ、ＣＤＳ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤＳ０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及びＣＤ１５４、である。代替的に、膜貫通ドメインは、合成であってもよく、主に疎水性アミノ酸残基（例えば、ロイシン及びバリン）を含んでいてもよい。一実施形態では、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８α鎖Ｉ型アイソフォーム前駆体（ＮＰ＿００１１３９３４５．１）（配列番号：４）、より好ましくは、ＣＤ２８（配列番号：３）に由来する。膜貫通ドメインは、細胞外リガンド結合ドメインと上記膜貫通ドメインの間のヒンジ領域を更に含んでいてもよい。用語「ヒンジ領域」とは一般的に、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに連結させるように機能する、任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドのことを意味する。とりわけ、ヒンジ領域は、細胞外リガンド結合ドメインに更なるフレキシビリティ及びアクセシビリティをもたらすために使用される。ヒンジ領域は、最大３００アミノ酸、好ましくは、１０〜１００アミノ酸、最も好ましくは、２５〜５０アミノ酸、を含んでいてもよい。ヒンジ領域は、天然分子、例えば、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ−４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ３ζ、Ｔ細胞受容体のα鎖もしくはβ鎖、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４などの全てもしくは一部、または、抗体定常領域の全てもしくは一部、に由来していてもよい。代替的に、ヒンジ領域は、天然ヒンジ配列に相当する合成配列であってもよく、または、ヒンジ領域は、完全な合成ヒンジ配列であってもよい。一実施形態では、ヒンジドメインは、ヒトＣＤ８α（配列番号：２）、ＦｃγＲＩＩＩα、またはＩｇＧ１の一部を含み、それらに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有する。
【０１７２】
本開示のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、細胞外リガンド結合ドメインが標的に結合した後に、細胞内シグナル伝達に影響を及ぼし、免疫細胞及び免疫応答の活性化をもたらす、ＣＡＲのシグナル伝達ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインを含む。言い換えると、シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲを発現する免疫細胞における少なくとも１種の正常エフェクター機能の活性化に影響を及ぼす。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、サイトカインの分泌を含む、細胞溶解活性またはヘルパーＴ細胞活性であってもよい。それゆえ、用語「シグナル伝達ドメイン」とは、エフェクター機能シグナルを伝達して細胞に特殊機能を実行させる、タンパク質の部分のことを意味する。
【０１７３】
ＣＡＲに用いるシグナル伝達ドメインの例は、抗原受容体の結合後にシグナル伝達を開始するために協同で作用するＴ細胞受容体及び共受容体の細胞質配列、ならびに、これら配列の任意の誘導体またはバリアント、及び同一の機能的性能を有する任意の合成配列であってもよい。シグナル伝達ドメインは、２種の異なる部類の細胞質シグナル伝達配列を含み、一方の部類は抗原依存的な一次活性化を開始し、もう一方の部類は抗原非依存的に作用して二次または共刺激シグナルをもたらす。一次細胞質シグナル伝達配列は、ＩＴＡＭの免疫受容体チロシンベース活性化モチーフとして知られているシグナル伝達モチーフを含んでいてもよい。ＩＴＡＭは、ｓｙｋ／ｚａｐ７０クラスのチロシンキナーゼ用の結合部位として機能する様々な受容体の細胞質内尾部に存在する、明確なシグナル伝達モチーフである。本開示において使用可能なＩＴＡＭの非限定例としては、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＦｃＲε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤＳ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄ、に由来するＩＴＡＭを挙げることができる。一実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、それらＩＴＡＭに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性のアミノ酸配列を有するＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。
【０１７４】
加えて、本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞は、１種または複数種の自殺遺伝子療法システムを更に含んでいてもよい。当該技術分野において周知の好適な自殺遺伝子療法システムとしては、いくつかの単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）／ガンシクロビル（ＧＣＶ）、または誘導性カスパーゼ９タンパク質、が挙げられるがこれらに限定されない。一実施形態では、自殺遺伝子はキメラＣＤ３４／チミジンキナーゼである。
【０１７５】
本明細書で開示するＴ細胞は、キメラ抗原受容体が特異的に結合する抗原を欠損していることにより、同胞殺し抵抗性であってもよい。一部の実施形態では、Ｔ細胞の抗原は、キメラ抗原受容体が修飾抗原にもはや特異的に結合しないように、修飾されている。例えば、キメラ抗原受容体が認識する抗原のエピトープは、１つもしくは複数のアミノ酸変異（例えば、置換または欠失）によって修飾されていてもよく、または、エピトープは、抗原から欠失されていてもよい。その他の実施形態では、抗原の発現は、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれ以上低下する。タンパク質の発現を低下させるための方法は当技術分野において周知であり、タンパク質をコードする核酸配列に機能的に連結するプロモーターを修飾または置換することが挙げられるがこれらに限定されない。更にその他の実施形態では、Ｔ細胞は、例えば、抗原をコードする遺伝子を欠失または破壊することにより、抗原が発現しないように修飾される。上記の実施形態のそれぞれでは、Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体が特異的に結合する１種または好ましくは全ての抗原を欠損していてもよい。抗原を欠損させるＴ細胞を遺伝的に修飾するための方法は、当該技術分野において十分周知されており、非限定的な例については上に記載している。例示的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を用いて、抗原、例えば、以下に記載する抗原を欠損させるＴ細胞を修飾してもよい。代替的に、ＴＡＬＥＮを用いて遺伝子を編集してもよい。
【０１７６】
上記方法の変化形態では、編集工程もしくは編集工程の一部、または、ＣＡＲ形質導入の一部のいずれかとして、１種または複数種のタンパク質発現ブロッカー（ＰＥＢＬ）をコードする構築物を、細胞に形質導入してもよい。例えば、ＣＤ３εに特異的な抗体由来単鎖可変フラグメントをコードする構築物を、例えば、レンチウイルスベクターにより、形質導入してもよい。一旦発現すると、ＰＥＢＬはＣＤ３εと細胞内で共局在化し、表面ＣＤ３及びＴＣＲαβの発現を阻害する。それゆえ、ＰＥＢＬによる表面ＣＤ３／ＴＣＲαβ発現の阻害は、同種異系ＣＡＲ−Ｔ細胞を調製するための代替法である。更に、ＰＥＢＬ及びＣＡＲの発現を、単一の構築物内で組み合わせてもよい。本明細書で開示する方法を用いてこれらの方法のいずれかを実施してもよく、本明細書で開示する遺伝子抑制標的のいずれかを阻害するためのＰＥＢＬを作製してもよい。
【０１７７】
上記の方法を適応させて、抗原、細胞表面タンパク質、または分泌可能なタンパク質、例えば、サイトカインなど、をコードする遺伝子用の遺伝子座に、ＣＡＲを挿入してもよい。この方法では、ゲノムの編集は、ＣＡＲのトランスフェクションによりもたらされる。その後、本明細書に記載するとおりに細胞を活性化させて、特定の実施形態における独立したゲノム編集工程を取り除いてもよい。理論上、このような工程は、細胞が活発に分裂している間に実施する必要がある。このような方法はまた、遺伝子改変細胞の強力な増殖をもたらすと予想されている。
【０１７８】
特定の状況では、キメラ抗原受容体が特異的に結合する抗原の欠損で、Ｔ細胞を選択してもよい。ある特定のＴ細胞は、より少ない任意の表面タンパク質を産生及び提示するが、その代わりに、Ｔ−ＣＡＲの標的となる抗原を欠失または非機能化する場合には、Ｔ細胞を、抗原の欠損で選択して、抗原欠損細胞の集団をＣＡＲの形質導入用に増殖させてもよい。このような細胞はまた、同胞殺し抵抗性であり得る。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表２−１】
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【表２−２】
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【０１７９】
モノＣＡＲ−Ｔ細胞（ｍＣＡＲ−Ｔ）
本開示が包含するＣＡＲ−Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体が特異的に結合する１種または複数種の抗原を欠損しており、その結果、同胞殺し抵抗性である。一部の実施形態では、Ｔ細胞の１種または複数種の抗原は、キメラ抗原受容体が１種または複数種の修飾抗原にもはや特異的に結合しないように、修飾されている。例えば、キメラ抗原受容体が認識する１種もしくは複数種の抗原のエピトープは、１つもしくは複数のアミノ酸変異（例えば、置換または欠失）によって修飾されていてもよく、または、エピトープは、抗原から欠失されていてもよい。その他の実施形態では、１種または複数種の抗原の発現は、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれ以上低下する。タンパク質の発現を低下させるための方法は当技術分野において周知であり、タンパク質をコードする核酸配列に機能的に連結するプロモーターを修飾または置換することが挙げられるがこれらに限定されない。更にその他の実施形態では、Ｔ細胞は、例えば、１種または複数種の抗原をコードする遺伝子を欠失または破壊することにより、１種または複数種の抗原が発現しないように修飾される。上記の実施形態のそれぞれでは、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体が特異的に結合する１種または好ましくは全ての抗原を欠損していてもよい。１種または複数種の抗原を欠損させるＴ細胞を遺伝的に修飾するための方法は、当該技術分野において十分周知されており、非限定的な例については本明細書に記載している。実施例１〜６に記載する実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを用いて、１種または複数種の抗原を欠損させるＴ細胞を修飾する。
【０１８０】
本開示が包含するＣＡＲ−Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）−ＣＤ３複合体の一部を欠失させた結果として、内在性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達を更に欠損していてもよい。様々な実施形態では、本明細書で開示するＣＡＲ−Ｔ細胞を用いて、内在性ＴＣＲシグナル伝達を除去または抑制することが望ましい場合がある。例えば、同種異系Ｔ細胞を用いてＣＡＲ−Ｔ細胞を作製する場合に、ＣＡＲ−Ｔ細胞における内在性ＴＣＲシグナル伝達を抑制または除去することにより、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を予防または抑制してもよい。内在性ＴＣＲシグナル伝達を除去または抑制するための方法は当該技術分野において周知であり、ＴＣＲ−ＣＤ３受容体複合体の一部、例えば、ＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）、ＴＣＲ受容体β鎖（ＴＣＲβ）、ＴＣＲδ、ＴＣＲγ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、及び／またはＣＤ３δ、を欠失させること、が挙げられるがこれらに限定されない。ＴＣＲ受容体複合体の一部を欠失させることにより、ＴＣＲ介在性シグナル伝達を阻害することができ、それにより、生命を脅かすＧｖＨＤを誘導することなく、ＣＡＲ−Ｔ細胞の供給源として同種異系Ｔ細胞を安全に使用することを可能としてもよい。
【０１８１】
加えて、本開示が包含するＣＡＲ−Ｔ細胞は、本明細書に記載の１種または複数種の自殺遺伝子を更に含んでいてもよい。
【０１８２】
一実施形態では、本開示は、ＣＤ５に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含むＴ細胞を提供し、Ｔ細胞は、ＣＤ５を欠損しており、例えば、ＣＤ５ΔＣＡＲＴ５細胞である。非限定的な例では、ＣＤ５の欠損は、（ａ）キメラ抗原受容体が、修飾されたＣＤ５にもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現するＣＤ５を修飾すること、（ｂ）抗原の発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）ＣＤ５が発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、ＣＤ５をコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。更なる実施形態では、Ｔ細胞は、自殺遺伝子、及び／または、内在性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）介在性シグナル伝達がＴ細胞内において阻害されるような修飾を含む。非限定的な例では、ヒトＣＤ３４  ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合した修飾ヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のタンパク質コード配列は、ＣＤ５ΔＣＡＲＴ５細胞内で発現している。
【０１８３】
別の実施形態では、本開示は、ＣＤ７に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含むＴ細胞を提供し、Ｔ細胞は、ＣＤ７を欠損しており、例えば、ＣＤ７ΔＣＡＲＴ７細胞である。非限定的な例では、ＣＤ７の欠損は、（ａ）キメラ抗原受容体が、修飾されたＣＤ７にもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現するＣＤ７を修飾すること、（ｂ）抗原の発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）ＣＤ７が発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、ＣＤ７をコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。更なる実施形態では、Ｔ細胞は、自殺遺伝子、及び／または、内在性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）介在性シグナル伝達がＴ細胞内において阻害されるような修飾を含む。非限定的な例では、ヒトＣＤ３４  ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合した修飾ヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のタンパク質コード配列は、ＣＤ７ΔＣＡＲＴ７細胞内で発現している。
【０１８４】
別の実施形態では、本開示は、ＣＤ２に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含むＴ細胞を提供し、Ｔ細胞は、ＣＤ２を欠損しており、例えば、ＣＤ２ΔＣＡＲＴ２細胞である。非限定的な例では、ＣＤ２の欠損は、（ａ）キメラ抗原受容体が、修飾されたＣＤ２にもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現するＣＤ２を修飾すること、（ｂ）抗原の発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）ＣＤ２が発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、ＣＤ２をコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。更なる実施形態では、Ｔ細胞は、自殺遺伝子、及び／または、内在性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）介在性シグナル伝達がＴ細胞内において阻害されるような修飾を含む。非限定的な例では、ヒトＣＤ３４  ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合した修飾ヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のタンパク質コード配列は、ＣＤ２ΔＣＡＲＴ２細胞内で発現している。
【０１８５】
別の実施形態では、本開示は、ＣＤ４に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含むＴ細胞を提供し、Ｔ細胞は、ＣＤ４を欠損しており、例えば、ＣＤ４ΔＣＡＲＴ４細胞である。非限定的な例では、ＣＤ４の欠損は、（ａ）キメラ抗原受容体が、修飾されたＣＤ４にもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現するＣＤ４を修飾すること、（ｂ）抗原の発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）ＣＤ４が発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、ＣＤ４をコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。更なる実施形態では、Ｔ細胞は、自殺遺伝子、及び／または、内在性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）介在性シグナル伝達がＴ細胞内において阻害されるような修飾を含む。非限定的な例では、ヒトＣＤ３４  ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合した修飾ヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のタンパク質コード配列は、ＣＤ４ΔＣＡＲＴ４細胞内で発現している。
【０１８６】
別の実施形態では、本開示は、ＣＤ３に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含むＴ細胞を提供し、Ｔ細胞は、ＣＤ３εを欠損しており、例えば、ＣＤ３ΔＣＡＲＴ３ｅ細胞である。非限定的な例では、ＣＤ３の欠損は、（ａ）キメラ抗原受容体が、修飾されたＣＤ３にもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現するＣＤ３を修飾すること、（ｂ）抗原の発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）ＣＤ３が発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、ＣＤ３εをコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。更なる実施形態では、Ｔ細胞は、自殺遺伝子、及び／または、内在性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）介在性シグナル伝達がＴ細胞内において阻害されるような修飾を含む。非限定的な例では、ヒトＣＤ３４  ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合した修飾ヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のタンパク質コード配列は、ＣＤ３ΔＣＡＲＴ３ε細胞内で発現している。
【０１８７】
細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、またはガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞に由来する、ゲノム編集されたＣＡＲ−Ｔ細胞の表面上に発現させることのできるＣＡＲアミノ酸配列の実施形態について開示する。
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【０１８８】
類似の方法を用いて、その他のモノＣＡＲ−Ｔ細胞を構築してもよく、それらについては以下の表４に記載する。
【表４−１】
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【表４−２】
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【０１８９】
デュアルＣＡＲ−Ｔ細胞（ｄＣＡＲ−Ｔ）
第１の細胞外リガンド結合ドメインのタンパク質コード配列を、１種または複数種の共刺激ドメイン及びシグナル伝達ドメインを含有するレンチウイルスベクターにクローニングしてから、第２の細胞外リガンド結合ドメインの第２のタンパク質コード配列を、別の１種または複数種の共刺激ドメイン及びシグナル伝達ドメインを含有する同一レンチウイルスベクターにクローニングして、２種のＣＡＲ構築物が同一ベクターから発現するプラスミドを生じさせることにより、デュアルＣＡＲ−Ｔ細胞（ｄＣＡＲ−Ｔ）を作製してもよい。
【０１９０】
一実施形態では、本開示は、ＣＤ５及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）に特異的に結合する、デュアルキメラ抗原受容体
【化１】
2021525524.tif 000014
（ｄＣＡＲ）、すなわち、単一のレンチウイルス構築物から発現する２種のＣＡＲのタンパク質コード配列、を含む遺伝子改変Ｔ細胞を提供し、Ｔ細胞は、ＣＤ５及びＴＲＡＣを欠損している（例えば、ＣＤ５＊ＴＲＡＣ−ｄＣＡＲＴΔＣＤ５ΔＴＲＡＣ細胞）。非限定的な例では、ＣＤ５及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）の欠損は、（ａ）キメラ抗原受容体が、修飾されたＣＤ５及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）にもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現するＣＤ５及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）を修飾すること、（ｂ）ＣＤ５及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）の発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）ＣＤ５及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）が発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、ＣＤ５及び／またはＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）をコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。更なる実施形態では、Ｔ細胞は自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、修飾ヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のタンパク質コード配列は、ヒトＣＤ３４  ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合しており、ＣＤ５＊ＴＲＡＣ−ＣＡＲＴΔＣＤ５ΔＴＲＡＣ細胞内で発現している。
【０１９１】
第２の実施形態では、本開示は、ＣＤ７及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）に特異的に結合するｄＣＡＲを含む遺伝子改変Ｔ細胞を提供し、Ｔ細胞は、ＣＤ７及びＴＲＡＣを欠損しており、例えば、ＣＤ７＊ＴＲＡＣ−ｄＣＡＲＴΔＣＤ７ΔＴＲＡＣ細胞である。非限定的な例では、ＣＤ７及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）の欠損は、（ａ）キメラ抗原受容体が、修飾されたＣＤ７及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）にもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現するＣＤ５及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）を修飾すること、（ｂ）ＣＤ７及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）の発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）ＣＤ７及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）が発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、ＣＤ７及び／またはＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）をコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。更なる実施形態では、Ｔ細胞は自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、修飾ヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のタンパク質コード配列は、ヒトＣＤ３４  ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合しており、ＣＤ７＊ＴＲＡＣ−ｄＣＡＲＴΔＣＤ７ΔＴＲＡＣ細胞内で発現している。
【０１９２】
第３の実施形態では、本開示は、ＣＤ２及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）に特異的に結合するｄＣＡＲを含む遺伝子改変Ｔ細胞を提供し、Ｔ細胞は、ＣＤ２及びＴＲＡＣを欠損しており、例えば、ＣＤ２＊ＴＲＡＣ−ｄＣＡＲＴΔＣＤ２ΔＴＲＡＣ細胞である。非限定的な例では、ＣＤ２及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）の欠損は、（ａ）キメラ抗原受容体が、修飾されたＣＤ２及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）にもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現するＣＤ２及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）を修飾すること、（ｂ）ＣＤ７及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）の発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）ＣＤ２及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）が発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、ＣＤ２及び／またはＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）をコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。更なる実施形態では、Ｔ細胞は自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、修飾ヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のタンパク質コード配列は、ヒトＣＤ３４  ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合しており、ＣＤ２＊ＴＲＡＣ−ｄＣＡＲＴΔＣＤ２ΔＴＲＡＣ細胞内で発現している。
【０１９３】
別の実施形態では、本開示は、ＣＤ４及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）に特異的に結合するｄＣＡＲを含む遺伝子改変Ｔ細胞を提供し、Ｔ細胞は、ＣＤ４及びＴＲＡＣを欠損しており、例えば、ＣＤ４＊ＴＲＡＣ−ｄＣＡＲＴΔＣＤ４ΔＴＲＡＣ細胞である。非限定的な例では、ＣＤ４及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）の欠損は、（ａ）キメラ抗原受容体が、修飾されたＣＤ４及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）にもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現するＣＤ４及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）を修飾すること、（ｂ）ＣＤ７及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）の発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）ＣＤ４及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）が発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、ＣＤ４及び／またはＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）をコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。更なる実施形態では、Ｔ細胞は自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、修飾ヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のタンパク質コード配列は、ヒトＣＤ３４  ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合しており、ＣＤ４＊ＴＲＡＣ−ｄＣＡＲＴΔＣＤ４ΔＴＲＡＣ細胞内で発現している。
【０１９４】
別の実施形態では、本開示は、ＣＤ３及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）に特異的に結合するｄＣＡＲを含む遺伝子改変Ｔ細胞を提供し、Ｔ細胞は、ＣＤ３及びＴＲＡＣを欠損しており、例えば、ＣＤ３＊ＴＲＡＣ−ｄＣＡＲＴΔＣＤ３ＴＲＡＣ細胞である。非限定的な例では、ＣＤ３及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）の欠損は、（ａ）キメラ抗原受容体が、修飾されたＣＤ３及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）にもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現するＣＤ３及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）を修飾すること、（ｂ）ＣＤ３及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）の発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）ＣＤ３及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）が発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、ＣＤ３及び／またはＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）をコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。更なる実施形態では、Ｔ細胞は自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、修飾ヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のタンパク質コード配列は、ヒトＣＤ３４  ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合しており、ＣＤ３＊ＴＲＡＣ−ｄＣＡＲＴΔＣＤ３ΔＴＲＡＣ細胞内で発現している。
【０１９５】
別の実施形態では、本開示は、ＣＤ２及びＣＤ３イプシロン（ε）鎖に特異的に結合するｄＣＡＲを含む遺伝子改変Ｔ細胞を提供し、Ｔ細胞は、ＣＤ２及びＣＤ３イプシロンを欠損しており、例えば、ＣＤ２＊ＣＤ３ε−ｄＣＡＲＴΔＣＤ２ΔＣＤ３ε細胞である。非限定的な例では、ＣＤ２及びＣＤ３イプシロン（ε）鎖の欠損は、（ａ）キメラ抗原受容体が、修飾されたＣＤ２及びＣＤ３イプシロンにもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現するＣＤ３イプシロンを修飾すること、（ｂ）ＣＤ２及びＣＤ３イプシロンの発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）ＣＤ２及びＣＤ３イプシロンが発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、ＣＤ２及び／またはＣＤ３イプシロンをコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。更なる実施形態では、Ｔ細胞は自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、修飾ヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のタンパク質コード配列は、ヒトＣＤ３４  ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合しており、ＣＤ２＊ＣＤ３ε−ｄＣＡＲＴΔＣＤ２ΔＣＤ３ε細胞内で発現している。
【０１９６】
別の実施形態では、本開示は、ＣＤ４及びＣＤ３イプシロン（ε）鎖に特異的に結合するｄＣＡＲを含む遺伝子改変Ｔ細胞を提供し、Ｔ細胞は、ＣＤ２及びＣＤ３εを欠損しており、例えば、ＣＤ４＊ＣＤ３ε−ｄＣＡＲＴΔＣＤ４ΔＣＤ３ε細胞である。非限定的な例では、ＣＤ４及びＣＤ３ε鎖の欠損は、（ａ）キメラ抗原受容体が、修飾されたＣＤ４及びＣＤ３εにもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現するＣＤ４及びＣＤ３イプシロンを修飾すること、（ｂ）ＣＤ４及びＣＤ３εの発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）ＣＤ４及びＣＤ３εが発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、ＣＤ４及び／またはＣＤ３εをコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。更なる実施形態では、Ｔ細胞は自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、修飾ヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のタンパク質コード配列は、ヒトＣＤ３４  ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合しており、ＣＤ４＊ＣＤ３ε−ｄＣＡＲＴΔＣＤ４ΔＣＤ３ε細胞内で発現している。
【０１９７】
別の実施形態では、本開示は、ＣＤ５及びＴＣＲベータ（β）鎖に特異的に結合するｄＣＡＲを含む遺伝子改変Ｔ細胞を提供し、Ｔ細胞は、ＣＤ５及びＴＣＲβを欠損しており、例えば、ＣＤ５＊ＴＣＲβ−ｄＣＡＲＴΔＣＤ５ΔＴＣＲβ細胞である。非限定的な例では、ＣＤ５及びＴＣＲβ鎖の欠損は、（ａ）キメラ抗原受容体が、修飾されたＣＤ５及びＴＣＲβにもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現するＣＤ５及びＴＣＲβを修飾すること、（ｂ）ＣＤ５及びＴＣＲβの発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）ＣＤ５及びＴＣＲβが発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、ＣＤ５及び／またはＴＣＲβをコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。更なる実施形態では、Ｔ細胞は自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、修飾ヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のタンパク質コード配列は、ヒトＣＤ３４  ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合しており、ＣＤ５＊ＴＣＲβ−ｄＣＡＲＴΔＣＤ５ΔＴＣＲβ細胞内で発現している。
【０１９８】
別の実施形態では、本開示は、ＣＤ７及びＴＣＲベータ（β）鎖に特異的に結合するｄＣＡＲを含む遺伝子改変Ｔ細胞を提供し、Ｔ細胞は、ＣＤ５及びＴＣＲベータを欠損しており、例えば、ＣＤ７＊ＴＣＲβ−ｄＣＡＲＴΔＣＤ７ΔＴＣＲβ細胞である。非限定的な例では、ＣＤ７及びＴＣＲβ鎖の欠損は、（ａ）キメラ抗原受容体が、修飾されたＣＤ７及びＴＣＲβにもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現するＣＤ７及びＴＣＲβを修飾すること、（ｂ）ＣＤ７及びＴＣＲβの発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）ＣＤ７及びＴＣＲβが発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、ＣＤ７及び／またはＴＣＲβをコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。更なる実施形態では、Ｔ細胞は自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、修飾ヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のタンパク質コード配列は、ヒトＣＤ３４  ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合しており、ＣＤ７＊ＴＣＲβ−ｄＣＡＲＴΔＣＤ７ΔＴＣＲβ細胞内で発現している。
【０１９９】
別の実施形態では、本開示は、ＣＤ２及びＴＣＲベータ（β）鎖に特異的に結合するｄＣＡＲを含む遺伝子改変Ｔ細胞を提供し、Ｔ細胞は、ＣＤ２及びＴＣＲβを欠損しており、例えば、ＣＤ２＊ＴＣＲβ−ｄＣＡＲＴΔＣＤ７ΔＴＣＲβ細胞である。非限定的な例では、ＣＤ２及びＴＣＲβ鎖の欠損は、（ａ）キメラ抗原受容体が、修飾されたＣＤ２及びＴＣＲβにもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現するＣＤ２及びＴＣＲβを修飾すること、（ｂ）ＣＤ２及びＴＣＲβの発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）ＣＤ２及びＴＣＲβが発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、ＣＤ２及び／またはＴＣＲβをコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。更なる実施形態では、Ｔ細胞は自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、修飾ヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のタンパク質コード配列は、ヒトＣＤ３４  ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合しており、ＣＤ２＊ＴＣＲβ−ｄＣＡＲＴΔＣＤ２ΔＴＣＲβ細胞内で発現している。
【０２００】
別の実施形態では、本開示は、ＣＤ４及びＴＣＲベータ（β）鎖に特異的に結合するｄＣＡＲを含む遺伝子改変Ｔ細胞を提供し、Ｔ細胞は、ＣＤ４及びＴＣＲβを欠損しており、例えば、ＣＤ４＊ＴＣＲβ−ｄＣＡＲＴΔＣＤ４ΔＴＣＲβ細胞である。非限定的な例では、ＣＤ４及びＴＣＲβ鎖の欠損は、（ａ）キメラ抗原受容体が、修飾されたＣＤ４及びＴＣＲβにもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現するＣＤ４及びＴＣＲβを修飾すること、（ｂ）ＣＤ４及びＴＣＲＢの発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）ＣＤ４及びＴＣＲβが発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、ＣＤ４及び／またはＴＣＲβをコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。更なる実施形態では、Ｔ細胞は自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、修飾ヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のタンパク質コード配列は、ヒトＣＤ３４  ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合しており、ＣＤ４＊ＴＣＲβ−ｄＣＡＲＴΔＣＤ４ΔＴＣＲβ細胞内で発現している。
【０２０１】
別の実施形態では、本開示は、ＣＤ７及びＣＤ２に特異的に結合するｄＣＡＲを含む遺伝子改変Ｔ細胞を提供し、Ｔ細胞は、ＣＤ７及びＣＤ２を欠損しており、例えば、ＣＤ７＊ＣＤ２−ｄＣＡＲＴΔＣＤ７ΔＣＤ２細胞である。非限定的な例では、ＣＤ７及びＣＤ２の欠損は、（ａ）キメラ抗原受容体が、修飾されたＣＤ７及びＣＤ２にもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現するＣＤ７及びＣＤ２を修飾すること、（ｂ）ＣＤ７及びＣＤ２の発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）ＣＤ７及びＣＤ２が発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、ＣＤ７及び／またはＣＤ２をコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。更なる実施形態では、Ｔ細胞は自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、修飾ヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のタンパク質コード配列は、ヒトＣＤ３４  ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合しており、ＣＤ７＊ＣＤ２−ｄＣＡＲＴΔＣＤ７ΔＣＤ２細胞内で発現している。
【０２０２】
別の実施形態では、本開示は、ＣＤ７及びＣＤ５に特異的に結合するｄＣＡＲを含む遺伝子改変Ｔ細胞を提供し、Ｔ細胞は、ＣＤ７及びＣＤ５を欠損しており、例えば、ＣＤ７＊ＣＤ５−ｄＣＡＲＴΔＣＤ７ΔＣＤ５細胞である。非限定的な例では、ＣＤ７及びＣＤ５の欠損は、（ａ）キメラ抗原受容体が、修飾されたＣＤ７及びＣＤ５にもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現するＣＤ７及びＣＤ５を修飾すること、（ｂ）ＣＤ７及びＣＤ５の発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）ＣＤ７及びＣＤ５が発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、ＣＤ７及び／またはＣＤ５をコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。更なる実施形態では、Ｔ細胞は自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、修飾ヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のタンパク質コード配列は、ヒトＣＤ３４  ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合しており、ＣＤ７＊ＣＤ５−ｄＣＡＲＴΔＣＤ７ΔＣＤ５細胞内で発現している。
【０２０３】
別の実施形態では、本開示は、ＣＤ７及びＣＤ４に特異的に結合するｄＣＡＲを含む遺伝子改変Ｔ細胞を提供し、Ｔ細胞は、ＣＤ７及びＣＤ４を欠損している（例えば、ＣＤ７＊ＣＤ４−ｄＣＡＲＴΔＣＤ７ΔＣＤ４細胞である）。非限定的な例では、ＣＤ７及びＣＤ４の欠損は、（ａ）キメラ抗原受容体が、修飾されたＣＤ７及びＣＤ４にもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現するＣＤ７及びＣＤ４を修飾すること、（ｂ）ＣＤ７及びＣＤ４の発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）ＣＤ７及びＣＤ４が発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、ＣＤ７及び／またはＣＤ４をコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。更なる実施形態では、Ｔ細胞は自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、修飾ヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子をコードする、ＣＤ７＊ＣＤ４−ｄＣＡＲＴΔＣＤ７ΔＣＤ４細胞内で発現している自殺遺伝子は、ヒトＣＤ３４  ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合しており、ＣＤ７＊ＣＤ４−ｄＣＡＲＴΔＣＤ７ΔＣＤ４細胞内で発現している。
【０２０４】
別の実施形態では、本開示は、ＣＤ２及びＣＤ５に特異的に結合するｄＣＡＲを含む遺伝子改変Ｔ細胞を提供し、Ｔ細胞は、ＣＤ２、ＣＤ５、及びＴＲＡＣを欠損しており、例えば、ＣＤ２＊ＣＤ５−ｄＣＡＲＴΔＣＤ２ΔＣＤ５ΔＴＲＡＣ細胞である。非限定的な例では、ＣＤ２及びＣＤ５の欠損は、（ａ）キメラ抗原受容体が、修飾されたＣＤ２及びＣＤ５にもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現するＣＤ２及びＣＤ５を修飾すること、（ｂ）ＣＤ２及びＣＤ５の発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）ＣＤ２及びＣＤ５が発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、ＣＤ２及び／またはＣＤ５をコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。更なる実施形態では、Ｔ細胞は自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、修飾ヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のタンパク質コード配列は、ヒトＣＤ３４  ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合しており、ＣＤ２＊ＣＤ５−ｄＣＡＲＴΔＣＤ２ΔＣＤ５細胞内で発現している。
【０２０５】
別の実施形態では、本開示は、ＣＤ２及びＣＤ４に特異的に結合するｄＣＡＲを含む遺伝子改変Ｔ細胞を提供し、Ｔ細胞は、ＣＤ２、ＣＤ４、及びＴＲＡＣを欠損しており、例えば、ＣＤ２＊ＣＤ４−ｄＣＡＲＴΔＣＤ２ΔＣＤ４ΔＴＲＡＣ細胞である。非限定的な例では、ＣＤ２及びＣＤ４の欠損は、（ａ）キメラ抗原受容体が、修飾されたＣＤ２及びＣＤ４にもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現するＣＤ２及びＣＤ４を修飾すること、（ｂ）ＣＤ２及びＣＤ４の発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）ＣＤ２及びＣＤ４が発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、ＣＤ２及び／またはＣＤ４をコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。更なる実施形態では、Ｔ細胞は自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、修飾ヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のタンパク質コード配列は、ヒトＣＤ３４  ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合しており、ＣＤ２＊ＣＤ４−ｄＣＡＲＴΔＣＤ２ΔＣＤ４細胞内で発現している。
【０２０６】
別の実施形態では、本開示は、ＣＤ５及びＣＤ４に特異的に結合するｄＣＡＲを含む遺伝子改変Ｔ細胞を提供し、Ｔ細胞は、ＣＤ５及びＣＤ４を欠損しており、例えば、ＣＤ５＊ＣＤ４−ｄＣＡＲＴΔＣＤ５ΔＣＤ４細胞である。非限定的な例では、ＣＤ５及びＣＤ４の欠損は、（ａ）キメラ抗原受容体が、修飾されたＣＤ５及びＣＤ４にもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現するＣＤ５及びＣＤ４を修飾すること、（ｂ）ＣＤ５及びＣＤ４の発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）ＣＤ５及びＣＤ４が発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、ＣＤ５及び／またはＣＤ４をコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。更なる実施形態では、Ｔ細胞は自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、修飾ヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のタンパク質コード配列は、ヒトＣＤ３４  ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合しており、ＣＤ５＊ＣＤ４−ｄＣＡＲＴΔＣＤ５ΔＣＤ４細胞内で発現している。
【０２０７】
一実施形態では、デュアルＣＡＲ−Ｔ細胞は、（ｉ）第１のシグナルペプチド、第１の細胞外リガンド結合ドメイン、第１のヒンジ領域、第１の膜貫通ドメイン、１種または複数種の共刺激ドメイン、及び第１のシグナル伝達ドメイン、を含む、第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチド、ならびに、（ｉｉ）第２のシグナル伝達ペプチド、第２の細胞外リガンド結合ドメイン、第２のヒンジ領域、第２の膜貫通ドメイン、１種または複数種の共刺激ドメイン、及び第２のシグナル伝達ドメイン、を含む、第２のキメラ抗原受容体ポリペプチド、を含み、第１の細胞外リガンド結合ドメイン及び第２の細胞外リガンド結合ドメインは、異なる細胞表面分子に対する親和性を有し、デュアルＣＡＲ−Ｔ細胞は、デュアルＣＡＲ−Ｔ細胞における細胞表面分子の発現低下をもたらす、１つまたは複数の遺伝子破壊を有する。
【０２０８】
第２の実施形態では、第１のシグナルペプチドはＣＤ８αシグナル配列である。
【０２０９】
第３の実施形態では、第１の細胞外リガンド結合ドメインは、ＶＨ１及びＶＬ１と呼ばれ、５アミノ酸（ＧＧＧＧＳ）の短いリンカーペプチドにより連結された、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の可変領域の融合タンパク質である。一部の実施形態では、このリンカーペプチドは、３または４回繰り返されている。一部の実施形態では、第１の抗原認識ドメインは、ＶＨ１−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＬ１、またはＶＬ１−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＨ１から選択することができる。
【０２１０】
別の実施形態では、第１のヒンジ領域はＣＤ８αを含む。
【０２１１】
別の実施形態では、第１の膜貫通ドメインはＣＤ８またはＣＤ２８である。
【０２１２】
一部の実施形態では、第１の共刺激ドメインは、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、またはいずれかの順番の両方の組み合わせ、すなわち、４−１ＢＢ−ＣＤ２８、もしくはＣＤ２８−４−１ＢＢを含む。
【０２１３】
一部の実施形態では、第１のシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、またはＣＤ３ζバイペプチド、すなわち、ＣＤ３ζ−ＣＤ３ζである。
【０２１４】
一部の実施形態では、第２のシグナルペプチドは、配列番号：１のＣＤ８αシグナル配列である。
【０２１５】
一部の実施形態では、第２の細胞外リガンド結合ドメインは、ＶＨ２及びＶＬ２と呼ばれ、５アミノ酸（ＧＧＧＧＳ）の短いリンカーペプチドにより連結された、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の可変領域の融合タンパク質である。一部の実施形態では、このリンカーペプチドは、３または４回繰り返されている。一部の実施形態では、第２の抗原認識ドメインは、ＶＨ２−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＬ２、またはＶＬ２−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＨ２から選択することができる。
【０２１６】
別の実施形態では、第２のヒンジ領域はＣＤ８αを含む。
【０２１７】
別の実施形態では、第２の膜貫通ドメインはＣＤ８またはＣＤ２８である。
【０２１８】
一部の実施形態では、第２の共刺激ドメインは、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、またはいずれかの順番の両方の組み合わせ、すなわち、４−１ＢＢ−ＣＤ２８、もしくはＣＤ２８−４−１ＢＢを含む。
【０２１９】
一部の実施形態では、第２のシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、またはＣＤ３ζバイペプチド、すなわち、ＣＤ３ζ−ＣＤ３ζである。
【０２２０】
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＶＨ１−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＬ１の第１の細胞外リガンド結合ドメイン融合タンパク質、及びＶＨ２−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＬ２の第２の細胞外リガンド結合ドメイン融合タンパク質、を含む。
【０２２１】
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＶＬ１−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＨ１の第１の細胞外リガンド結合ドメイン融合タンパク質、及びＶＬ２−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＨ２の第２の細胞外リガンド結合ドメイン融合タンパク質、を含む。
【０２２２】
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＶＨ２−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＬ２の第１の細胞外リガンド結合ドメイン融合タンパク質、及びＶＨ１−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＬ１の第２の細胞外リガンド結合ドメイン融合タンパク質、を含む。
【０２２３】
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＶＬ２−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＨ２の第１の細胞外リガンド結合ドメイン融合タンパク質、及びＶＬ１−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＨ１の第２の細胞外リガンド結合ドメイン融合タンパク質、を含む。
【０２２４】
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＶＨ１−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＬ１の第１の細胞外リガンド結合ドメイン融合タンパク質、及びＶＬ２−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＨ２の第２の細胞外リガンド結合ドメイン融合タンパク質、を含む。
【０２２５】
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＶＬ１−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＨ１の第１の細胞外リガンド結合ドメイン融合タンパク質、及びＶＨ２−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＬ２の第２の細胞外リガンド結合ドメイン融合タンパク質、を含む。
【０２２６】
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＶＨ２−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＬ２の第１の細胞外リガンド結合ドメイン融合タンパク質、及びＶＬ１−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＨ１の第２の細胞外リガンド結合ドメイン融合タンパク質、を含む。
【０２２７】
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＶＬ２−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＨ２の第１の細胞外リガンド結合ドメイン融合タンパク質、及びＶＨ１−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＬ１の第２の細胞外リガンド結合ドメイン融合タンパク質、を含む。
【０２２８】
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、少なくとも１つの高効率開裂部位を含み、その高効率開裂部位は、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、及びＦ２Ａから選択される。
【０２２９】
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは自殺遺伝子を含む。
【０２３０】
一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは変異サイトカイン受容体を含む。
【０２３１】
一部の実施形態では、デュアルＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ３３、ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ）、ＣＤ３７１（ＣＬＬ−１、ＣＬＥＣ１２Ａ）、ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）、ＣＤ１３５（ＦＬＴ３）、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ３８、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１３８、及びＣＤ１９、ＡＰＲＩＬ、ならびにＴＡＣＩ、から選択される２種の抗原を標的とする。
【０２３２】
デュアルＣＡＲの別の例については、以下の表５に記載する。
【表５−１】
2021525524.tif 000015
【表５−２】
2021525524.tif 000016
【表５−３】
2021525524.tif 000017
【表５−４】
2021525524.tif 000018
【０２３３】
タンデムＣＡＲ−Ｔ細胞（ｔＣＡＲ−Ｔ）
タンデムＣＡＲ−Ｔ細胞（ｔＣＡＲ−Ｔ）は、２つの異なる細胞表面分子と相互作用可能な２つの異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む単一キメラ抗原ポリペプチドを有するＴ細胞であり、細胞外リガンド結合ドメインは、フレキシブルリンカーによって互いに連結し、１種または複数種の共刺激ドメインを共有しており、第１または第２の細胞外リガンド結合ドメインの結合により、１種または複数種の共刺激ドメイン、及びシグナル伝達ドメインにわたり、シグナルが伝達される。
【０２３４】
一実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞は、タンデムキメラ抗原受容体
【化２】
2021525524.tif 000019
（ｔＣＡＲ）を含み、一方の細胞外リガンド結合ドメインはＣＤ５に特異的に結合し、第２の細胞外リガンド結合ドメインはＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）に結合し、Ｔ細胞は、ＣＤ５及びＴＲＡＣを欠損しており、例えば、ＣＤ５＊ＴＲＡＣ−ｔＣＡＲＴΔＣＤ５ΔＴＲＡＣ細胞である。非限定的な例では、ＣＤ５及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）の欠損は、（ａ）ｔＣＡＲが、修飾されたＣＤ５及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）にもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現するＣＤ５及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）を修飾すること、（ｂ）ＣＤ５及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）の発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）ＣＤ５及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）が発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、ＣＤ５及び／またはＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）をコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。更なる実施形態では、Ｔ細胞は自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、修飾ヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のタンパク質コード配列は、ヒトＣＤ３４  ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合しており、ＣＤ５＊ＴＲＡＣ−ｔＣＡＲＴΔＣＤ５ΔＴＲＡＣ細胞内で発現している。
【０２３５】
第２の実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞は、タンデムキメラ抗原受容体（ｔＣＡＲ）を含み、一方の細胞外リガンド結合ドメインはＣＤ７に特異的に結合し、第２の細胞外リガンド結合ドメインはＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）に結合し、Ｔ細胞は、ＣＤ７及びＴＲＡＣを欠損しており、例えば、ＣＤ７＊ＴＲＡＣ−ｔＣＡＲＴΔＣＤ７ΔＴＲＡＣ細胞である。非限定的な例では、ＣＤ７及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）の欠損は、（ａ）ｔＣＡＲが、修飾されたＣＤ７及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）にもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現するＣＤ７及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）を修飾すること、（ｂ）ＣＤ７及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）の発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）ＣＤ７及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）が発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、ＣＤ７及び／またはＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）をコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。更なる実施形態では、Ｔ細胞は自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、修飾ヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のタンパク質コード配列は、ヒトＣＤ３４  ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合しており、ＣＤ７＊ＴＲＡＣ−ｔＣＡＲＴΔＣＤ７ΔＴＲＡＣ細胞内で発現している。
【０２３６】
第３の実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞は、タンデムキメラ抗原受容体（ｔＣＡＲ）を含み、一方の細胞外リガンド結合ドメインはＣＤ２に特異的に結合し、第２の細胞外リガンド結合ドメインはＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）に結合し、Ｔ細胞は、ＣＤ２及びＴＲＡＣを欠損しており、例えば、ＣＤ２＊ＴＲＡＣ−ｔＣＡＲＴΔＣＤ２ΔＴＲＡＣ細胞である。非限定的な例では、ＣＤ２及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）の欠損は、（ａ）ｔＣＡＲが、修飾されたＣＤ２及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）にもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現するＣＤ２及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）を修飾すること、（ｂ）ＣＤ２及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）の発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）ＣＤ２及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）が発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、ＣＤ２及び／またはＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）をコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。更なる実施形態では、Ｔ細胞は自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、修飾ヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のタンパク質コード配列は、ヒトＣＤ３４  ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合しており、ＣＤ２＊ＴＲＡＣ−ｔＣＡＲＴΔＣＤ２ΔＴＲＡＣ細胞内で発現している。
【０２３７】
別の実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞は、タンデムキメラ抗原受容体（ｔＣＡＲ）を含み、一方の細胞外リガンド結合ドメインはＣＤ４に特異的に結合し、第２の細胞外リガンド結合ドメインはＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）に結合し、Ｔ細胞は、ＣＤ４及びＴＲＡＣを欠損しており、例えば、ＣＤ４＊ＴＲＡＣ−ｔＣＡＲＴΔＣＤ４ΔＴＲＡＣ細胞である。非限定的な例では、ＣＤ４及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）の欠損は、（ａ）ｔＣＡＲが、修飾されたＣＤ４及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）にもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現するＣＤ４及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）を修飾すること、（ｂ）ＣＤ４及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）の発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）ＣＤ４及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）が発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、ＣＤ４及び／またはＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）をコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。更なる実施形態では、Ｔ細胞は自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、修飾ヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のタンパク質コード配列は、ヒトＣＤ３４  ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合しており、ＣＤ４＊ＴＲＡＣ−ｔＣＡＲＴΔＣＤ４ΔＴＲＡＣ細胞内で発現している。
【０２３８】
別の実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞は、タンデムキメラ抗原受容体（ｔＣＡＲ）を含み、一方の細胞外リガンド結合ドメインはＣＤ３イプシロン（ε）鎖に特異的に結合し、第２の細胞外リガンド結合ドメインはＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）に結合し、Ｔ細胞は、ＣＤ３ε及びＴＲＡＣを欠損しており、例えば、ＣＤ３ε＊ＴＲＡＣ−ｔＣＡＲＴΔＣＤ３εΔＴＲＡＣ細胞である。非限定的な例では、ＣＤ３ε及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）の欠損は、（ａ）ｔＣＡＲが、修飾されたＣＤ３ε及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）にもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現するＣＤ３ε及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）を修飾すること、（ｂ）ＣＤ３ε及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）の発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）ＣＤ３ε及びＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）が発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、ＣＤ３ε及び／またはＴＣＲ受容体α鎖（ＴＲＡＣ）をコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。更なる実施形態では、Ｔ細胞は自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、修飾ヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のタンパク質コード配列は、ヒトＣＤ３４  ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合しており、ＣＤ３ε＊ＴＲＡＣ−ｔＣＡＲＴΔＣＤ３εΔＴＲＡＣ細胞内で発現している。
【０２３９】
別の実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞は、タンデムキメラ抗原受容体（ｔＣＡＲ）を含み、一方の細胞外リガンド結合ドメインはＣＤ２に特異的に結合し、第２の細胞外リガンド結合ドメインはＣＤ３イプシロン（ε）鎖に結合し、Ｔ細胞は、ＣＤ２及びＣＤ３εを欠損しており、例えば、ＣＤ２＊ＣＤ３ε−ｔＣＡＲＴΔＣＤ２ΔＣＤ３ε細胞である。非限定的な例では、ＣＤ２及びＣＤ３εの欠損は、（ａ）ｔＣＡＲが、修飾されたＣＤ２及びＣＤ３εにもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現するＣＤ２及びＣＤ３εを修飾すること、（ｂ）ＣＤ２及びＣＤ３εの発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）ＣＤ２及びＣＤ３εが発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、ＣＤ２及び／またはＣＤ３εをコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。更なる実施形態では、Ｔ細胞は自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、修飾ヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のタンパク質コード配列は、ヒトＣＤ３４  ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合しており、ＣＤ２＊ＣＤ３ε−ｔＣＡＲＴΔＣＤ２ΔＣＤ３ε細胞内で発現している。
【０２４０】
別の実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞は、タンデムキメラ抗原受容体（ｔＣＡＲ）を含み、一方の細胞外リガンド結合ドメインはＣＤ４に特異的に結合し、第２の細胞外リガンド結合ドメインはＣＤ３イプシロン（ε）鎖に結合し、Ｔ細胞は、ＣＤ４及びＣＤ３εを欠損しており、例えば、ＣＤ４＊ＣＤ３ε−ｔＣＡＲＴΔＣＤ４ΔＣＤ３ε細胞である。非限定的な例では、ＣＤ４及びＣＤ３εの欠損は、（ａ）ｔＣＡＲが、修飾されたＣＤ４及びＣＤ３εにもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現するＣＤ４及びＣＤ３εを修飾すること、（ｂ）ＣＤ４及びＣＤ３εの発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）ＣＤ４及びＣＤ３εが発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、ＣＤ４及び／またはＣＤ３εをコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。更なる実施形態では、Ｔ細胞は自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、修飾ヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のタンパク質コード配列は、ヒトＣＤ３４  ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合しており、ＣＤ４＊ＣＤ３ε−ｔＣＡＲＴΔＣＤ４ΔＣＤ３ε細胞内で発現している。
【０２４１】
別の実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞は、タンデムキメラ抗原受容体（ｔＣＡＲ）を含み、一方の細胞外リガンド結合ドメインはＣＤ５に特異的に結合し、第２の細胞外リガンド結合ドメインはＴＣＲβ鎖に結合し、Ｔ細胞は、ＣＤ５及びＴＣＲβ鎖を欠損しており、例えば、ＣＤ５＊ＴＣＲβ−ｔＣＡＲＴΔＣＤ５ΔＴＣＲβ細胞である。非限定的な例では、ＣＤ５及びＴＣＲβ鎖の欠損は、（ａ）ｔＣＡＲが、修飾されたＣＤ５及びＴＣＲβにもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現するＣＤ５及びＴＣＲβを修飾すること、（ｂ）ＣＤ５及びＴＣＲβの発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）ＣＤ５及びＴＣＲβが発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、ＣＤ５及び／またはＴＣＲβをコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。更なる実施形態では、Ｔ細胞は自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、修飾ヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のタンパク質コード配列は、ヒトＣＤ３４  ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合しており、ＣＤ５＊ＴＣＲβ−ｔＣＡＲＴΔＣＤ５ΔＴＣＲβ細胞内で発現している。
【０２４２】
別の実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞は、タンデムキメラ抗原受容体（ｔＣＡＲ）を含み、一方の細胞外リガンド結合ドメインはＣＤ７に特異的に結合し、第２の細胞外リガンド結合ドメインはＴＣＲβ鎖に結合し、Ｔ細胞は、ＣＤ７及びＴＣＲβ鎖を欠損しており、例えば、ＣＤ７＊ＴＣＲβ−ｔＣＡＲＴΔＣＤ７ΔＴＣＲβ細胞である。非限定的な例では、ＣＤ７及びＴＣＲβ鎖の欠損は、（ａ）ｔＣＡＲが、修飾されたＣＤ７及びＴＣＲβにもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現するＣＤ７及びＴＣＲβを修飾すること、（ｂ）ＣＤ７及びＴＣＲβの発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）ＣＤ７及びＴＣＲβが発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、ＣＤ７及び／またはＴＣＲβをコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。更なる実施形態では、Ｔ細胞は自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、修飾ヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のタンパク質コード配列は、ヒトＣＤ３４  ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合しており、ＣＤ７＊ＴＣＲβ−ｔＣＡＲＴΔＣＤ７ΔＴＣＲβ細胞内で発現している。
【０２４３】
別の実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞は、タンデムキメラ抗原受容体（ｔＣＡＲ）を含み、一方の細胞外リガンド結合ドメインはＣＤ２に特異的に結合し、第２の細胞外リガンド結合ドメインはＴＣＲβ鎖に結合し、Ｔ細胞は、ＣＤ２及びＴＣＲβ鎖を欠損しており、例えば、ＣＤ２＊ＴＣＲβ−ｔＣＡＲＴΔＣＤ７ΔＴＣＲβ細胞である。非限定的な例では、ＣＤ２及びＴＣＲβ鎖の欠損は、（ａ）ｔＣＡＲが、修飾されたＣＤ２及びＴＣＲβにもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現するＣＤ２及びＴＣＲβを修飾すること、（ｂ）ＣＤ２及びＴＣＲβの発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）ＣＤ２及びＴＣＲβが発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、ＣＤ２及び／またはＴＣＲβをコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。更なる実施形態では、Ｔ細胞は自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、修飾ヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のタンパク質コード配列は、ヒトＣＤ３４  ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合しており、ＣＤ２＊ＴＣＲβ−ｔＣＡＲＴΔＣＤ２ΔＴＣＲβ細胞内で発現している。
【０２４４】
別の実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞は、タンデムキメラ抗原受容体（ｔＣＡＲ）を含み、一方の細胞外リガンド結合ドメインはＣＤ４に特異的に結合し、第２の細胞外リガンド結合ドメインはＴＣＲβ鎖に結合し、Ｔ細胞は、ＣＤ４及びＴＣＲβ鎖を欠損しており、例えば、ＣＤ４＊ＴＣＲβ−ｔＣＡＲＴΔＣＤ４ΔＴＣＲβ細胞である。非限定的な例では、ＣＤ４及びＴＣＲβ鎖の欠損は、（ａ）ｔＣＡＲが、修飾されたＣＤ４及びＴＣＲβにもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現するＣＤ４及びＴＣＲβを修飾すること、（ｂ）ＣＤ４及びＴＣＲβの発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）ＣＤ４及びＴＣＲβが発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、ＣＤ４及び／またはＴＣＲβをコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。更なる実施形態では、Ｔ細胞は自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、修飾ヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のタンパク質コード配列は、ヒトＣＤ３４  ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合しており、ＣＤ４＊ＴＣＲβ−ｔＣＡＲＴΔＣＤ４ΔＴＣＲβ細胞内で発現している。
【０２４５】
別の実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞は、タンデムキメラ抗原受容体（ｔＣＡＲ）を含み、一方の細胞外リガンド結合ドメインはＣＤ７に特異的に結合し、第２の細胞外リガンド結合ドメインはＣＤ２に結合し、Ｔ細胞は、ＣＤ７及びＣＤ２を欠損しており、例えば、ＣＤ７＊ＣＤ２−ｔＣＡＲＴΔＣＤ７ΔＣＤ２細胞である。非限定的な例では、ＣＤ７及びＣＤ２の欠損は、（ａ）ｔＣＡＲが、修飾されたＣＤ７及びＣＤ２にもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現するＣＤ７及びＣＤ２を修飾すること、（ｂ）ＣＤ７及びＣＤ２の発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）ＣＤ７及びＣＤ２が発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、ＣＤ７及び／またはＣＤ２をコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。更なる実施形態では、Ｔ細胞は自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、修飾ヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のタンパク質コード配列は、ヒトＣＤ３４  ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合しており、ＣＤ７＊ＣＤ２−ｔＣＡＲＴΔＣＤ７ΔＣＤ２細胞内で発現している。
【０２４６】
別の実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞は、タンデムキメラ抗原受容体（ｔＣＡＲ）を含み、一方の細胞外リガンド結合ドメインはＣＤ７に特異的に結合し、第２の細胞外リガンド結合ドメインはＣＤ５に結合し、Ｔ細胞は、ＣＤ７及びＣＤ５を欠損しており、例えば、ＣＤ７＊ＣＤ５−ｔＣＡＲＴΔＣＤ７ΔＣＤ５細胞である。非限定的な例では、ＣＤ７及びＣＤ５の欠損は、（ａ）ｔＣＡＲが、修飾されたＣＤ７及びＣＤ５にもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現するＣＤ７及びＣＤ５を修飾すること、（ｂ）ＣＤ７及びＣＤ５の発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）ＣＤ７及びＣＤ５が発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、ＣＤ７及び／またはＣＤ５をコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。更なる実施形態では、Ｔ細胞は自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、修飾ヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のタンパク質コード配列は、ヒトＣＤ３４  ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合しており、ＣＤ７＊ＣＤ５−ｔＣＡＲＴΔＣＤ７ΔＣＤ５細胞内で発現している。
【０２４７】
別の実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞は、タンデムキメラ抗原受容体（ｔＣＡＲ）を含み、一方の細胞外リガンド結合ドメインはＣＤ７に特異的に結合し、第２の細胞外リガンド結合ドメインはＣＤ４に結合し、Ｔ細胞は、ＣＤ７及びＣＤ４を欠損しており、例えば、ＣＤ７＊ＣＤ４−ｔＣＡＲＴΔＣＤ７ΔＣＤ４細胞である。非限定的な例では、ＣＤ７及びＣＤ４の欠損は、（ａ）ｔＣＡＲが、修飾されたＣＤ７及びＣＤ４にもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現するＣＤ７及びＣＤ４を修飾すること、（ｂ）ＣＤ７及びＣＤ４の発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）ＣＤ７及びＣＤ４が発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、ＣＤ７及び／またはＣＤ４をコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。更なる実施形態では、Ｔ細胞は自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、修飾ヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のタンパク質コード配列は、ヒトＣＤ３４  ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合しており、ＣＤ７＊ＣＤ４−ｔＣＡＲＴΔＣＤ７ΔＣＤ４細胞内で発現している。
【０２４８】
別の実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞は、タンデムキメラ抗原受容体（ｔＣＡＲ）を含み、一方の細胞外リガンド結合ドメインはＣＤ２に特異的に結合し、第２の細胞外リガンド結合ドメインはＣＤ５に結合し、Ｔ細胞は、ＣＤ２及びＣＤ５を欠損しており、例えば、ＣＤ２＊ＣＤ５−ｔＣＡＲＴΔＣＤ２ΔＣＤ５細胞である。非限定的な例では、ＣＤ２及びＣＤ５の欠損は、（ａ）ｔＣＡＲが、修飾されたＣＤ２及びＣＤ５にもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現するＣＤ２及びＣＤ５を修飾すること、（ｂ）ＣＤ２及びＣＤ５の発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）ＣＤ２及びＣＤ５が発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、ＣＤ２及び／またはＣＤ５をコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。更なる実施形態では、Ｔ細胞は自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、修飾ヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のタンパク質コード配列は、ヒトＣＤ３４  ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合しており、ＣＤ２＊ＣＤ５−ｔＣＡＲＴΔＣＤ２ΔＣＤ５細胞内で発現している。
【０２４９】
別の実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞は、タンデムキメラ抗原受容体（ｔＣＡＲ）を含み、一方の細胞外リガンド結合ドメインはＣＤ２に特異的に結合し、第２の細胞外リガンド結合ドメインはＣＤ４に結合し、Ｔ細胞は、ＣＤ２及びＣＤ４を欠損しており、例えば、ＣＤ２＊ＣＤ４−ｔＣＡＲＴΔＣＤ２ΔＣＤ４細胞である。非限定的な例では、ＣＤ２及びＣＤ４の欠損は、（ａ）ｔＣＡＲが、修飾されたＣＤ２及びＣＤ４にもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現するＣＤ２及びＣＤ４を修飾すること、（ｂ）ＣＤ２及びＣＤ４の発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）ＣＤ２及びＣＤ４が発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、ＣＤ２及び／またはＣＤ４をコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。更なる実施形態では、Ｔ細胞は自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、修飾ヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のタンパク質コード配列は、ヒトＣＤ３４  ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合しており、ＣＤ２＊ＣＤ４−ｔＣＡＲＴΔＣＤ２ΔＣＤ４細胞内で発現している。
【０２５０】
別の実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞は、タンデムキメラ抗原受容体（ｔＣＡＲ）を含み、一方の細胞外リガンド結合ドメインはＣＤ５に特異的に結合し、第２の細胞外リガンド結合ドメインはＣＤ４に結合し、Ｔ細胞は、ＣＤ５及びＣＤ４を欠損しており、例えば、ＣＤ５＊ＣＤ４−ｔＣＡＲＴΔＣＤ５ΔＣＤ４細胞である。非限定的な例では、ＣＤ５及びＣＤ４の欠損は、（ａ）キメラ抗原受容体が、修飾されたＣＤ５及びＣＤ４にもはや特異的に結合しないように、Ｔ細胞が発現するＣＤ５及びＣＤ４を修飾すること、（ｂ）ＣＤ５及びＣＤ４の発現が、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれ以上低下するように、Ｔ細胞を修飾すること、または（ｃ）ＣＤ５及びＣＤ４が発現しないように、Ｔ細胞を修飾すること（例えば、ＣＤ５及び／またはＣＤ４をコードする遺伝子の欠失または破壊により）、によるものである。更なる実施形態では、Ｔ細胞は自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、ヒトＣＤ３４  ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合した修飾ヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のタンパク質コード配列は、ＣＤ５＊ＣＤ４−ｔＣＡＲＴΔＣＤ５ΔＣＤ４細胞内で発現している。
【０２５１】
別の実施形態では、直鎖状タンデムＣＡＲ−Ｔ細胞は、第１のシグナルペプチド、第１の細胞外リガンド結合ドメイン、第２の細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、１種または複数種の共刺激ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドを含み、第１の細胞外リガンド結合抗原認識ドメイン及び第２の細胞外リガンド結合抗原認識ドメインは、異なる細胞表面分子、すなわち、がん細胞、例えば、悪性Ｔ細胞、悪性Ｂ細胞、または悪性形質細胞上の抗原に対する親和性を有し、直鎖状タンデムＣＡＲ−Ｔ細胞は、直鎖状タンデムＣＡＲ−Ｔ細胞における細胞表面分子の発現低下をもたらす、１つまたは複数の遺伝子修飾、欠失、または破壊を有する。
【０２５２】
別の実施形態では、シグナルペプチドは、ヒトＣＤ８αに由来するシグナルペプチド（配列番号：１）である。
【０２５３】
第３の実施形態では、第１の細胞外リガンド結合ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ）により連結されたＶＨ１及びＶＬ１と呼ばれる重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント、を含む、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。一部の実施形態では、このリンカーペプチドは、２、３、４、５、または６回繰り返されている。一部の実施形態では、第１の抗原認識ドメインは、１）ＶＨ１−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＬ１、または２）ＶＬ１−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＨ１から選択することができる。
【０２５４】
一部の実施形態では、第２の細胞外リガンド結合ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ）により連結されたＶＨ２及びＶＬ２と呼ばれる重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント、を含む、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。一部の実施形態では、このリンカーペプチドは、２、３、４、５、または６回繰り返されている。一部の実施形態では、第１の抗原認識ドメインは、１）ＶＨ２−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＬ２、または２）ＶＬ２−（ＧＧＧＧＳ）３〜４−ＶＨ２から選択することができる。
【０２５５】
更なる実施形態では、第１の抗原認識ドメイン及び第２の抗原認識ドメインは、５アミノ酸（ＧＧＧＧＳ）の短いリンカーペプチドにより連結されている。一部の実施形態では、このリンカーペプチドは、２、３、４、５、または６回繰り返されている。
【０２５６】
直鎖状タンデムＣＡＲ構築物
直鎖状タンデムＣＡＲ構築物の一実施形態では、第１の細胞外リガンド結合ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ）２〜６により連結されたＶＨ１及びＶＬ１と呼ばれる重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント、を含む、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。第２の細胞外リガンド結合抗原認識ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ）２〜６により連結されたＶＬ２及びＶＨ２と呼ばれる軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び重（ＶＨ）鎖可変フラグメント、を含む、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。
【０２５７】
直鎖状タンデムＣＡＲ構築物の第２の実施形態では、第１の細胞外リガンド結合ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ）２〜６により連結されたＶＨ２及びＶＬ２と呼ばれる重（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント、を含む、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。第２の細胞外リガンド結合抗原認識ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ）２〜６により連結されたＶＬ１及びＶＨ１と呼ばれる軽（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び重（ＶＨ）鎖可変フラグメント、を含む、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。
【０２５８】
直鎖状タンデムＣＡＲ構築物の第３の実施形態では、第１の細胞外リガンド結合ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ）２〜６により連結されたＶＬ１及びＶＨ１と呼ばれる重（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び軽（ＶＨ）鎖可変フラグメント、を含む、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。第２の細胞外リガンド結合抗原認識ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ）２〜６により連結されたＶＨ２及びＶＬ２と呼ばれる軽（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び重（ＶＬ）鎖可変フラグメント、を含む、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。
【０２５９】
直鎖状タンデムＣＡＲ構築物の第４の実施形態では、第１の細胞外リガンド結合ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ）２〜６により連結されたＶＬ２及びＶＨ２と呼ばれる重（ＶＬ）鎖可変フラグメント及び軽（ＶＨ）鎖可変フラグメント、を含む、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。第２の細胞外リガンド結合抗原認識ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ）２〜６により連結されたＶＨ１及びＶＬ１と呼ばれる軽（ＶＨ）鎖可変フラグメント及び重（ＶＬ）鎖可変フラグメント、を含む、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。
【０２６０】
直鎖状タンデムＣＡＲ構築物の実施形態のそれぞれにおいて、第１及び第２の細胞外リガンド結合ドメインは、表面分子、すなわち、限定するわけではないが、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３７１、ＣＤ１１７、ＣＤ１３５、Ｔｉｍ−３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ５６、及びＣＤ１ａ、から選択される、悪性Ｔ細胞上に発現した抗原を標的とする。
【０２６１】
直鎖状タンデムＣＡＲの更なる例については、以下の表６に記載する。
【表６−１】
2021525524.tif 000020
【表６−２】
2021525524.tif 000021
【表６−３】
2021525524.tif 000022
【表６−４】
2021525524.tif 000023
【０２６２】
例えば、本明細書では、上の表６に記載の抗原対のいずれかを標的とする、ｓｃＦｖのＶＨドメイン及びＶＬドメインを組み込まれていてもよい直鎖状タンデムＣＡＲ構築物を提供する。
【表７−１】
2021525524.tif 000024
【表７−２】
2021525524.tif 000025
【０２６３】
ヘアピンタンデムＣＡＲ構築物
ヘアピンタンデムＣＡＲ構築物の一実施形態では、第１の細胞外リガンド結合ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ）２〜６により連結されたＶＨ１及びＶＨ２と呼ばれる２つの重鎖可変フラグメント、を含む、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。第２の細胞外リガンド結合抗原認識ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ）２〜６により連結されたＶＬ２及びＶＬ１と呼ばれる２つの軽鎖可変フラグメント、を含む、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。
【０２６４】
ヘアピンタンデムＣＡＲ構築物の第２の実施形態では、第１の細胞外リガンド結合ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ）２〜６により連結されたＶＨ２及びＶＨ１と呼ばれる２つの重鎖可変フラグメント、を含む、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。第２の細胞外リガンド結合抗原認識ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ）２〜６により連結されたＶＬ１及びＶＬ２と呼ばれる２つの軽鎖可変フラグメント、を含む、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。
【０２６５】
ヘアピンタンデムＣＡＲ構築物の第３の実施形態では、第１の細胞外リガンド結合ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ）２〜６により連結されたＶＬ１及びＶＬ２と呼ばれる２つの軽鎖可変フラグメント、を含む、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。第２の細胞外リガンド結合抗原認識ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ）２〜６により連結されたＶＨ２及びＶＨ１と呼ばれる２つの重鎖可変フラグメント、を含む、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。
【０２６６】
ヘアピンタンデムＣＡＲ構築物の第４の実施形態では、第１の細胞外リガンド結合ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ）２〜６により連結されたＶＬ２及びＶＬ１と呼ばれる２つの軽鎖可変フラグメント、を含む、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。第２の細胞外リガンド結合抗原認識ドメインは、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳ）２〜６により連結されたＶＨ１及びＶＨ２と呼ばれる２つの重鎖可変フラグメント、を含む、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。
【０２６７】
ヘアピンタンデムＣＡＲ構築物の実施形態のそれぞれにおいて、第１及び第２の細胞外リガンド結合ドメインは、表面分子、すなわち、限定するわけではないが、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３７１、ＣＤ１１７、ＣＤ１３５、Ｔｉｍ−３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ５６、及びＣＤ１ａ、から選択される、悪性Ｔ細胞上に発現した抗原を標的とする。
【０２６８】
ヘアピンタンデムＣＡＲの別の例については、上の表６に記載する。
【０２６９】
更に、本明細書では、（１）ＣＤ２及びＣＤ３、ならびに（２）ＣＤ２及びＣＤ７を標的とする、ｓｃＦｖのＶＨドメイン及びＶＬドメインを組み込まれていてもよいＣＡＲ構築物及びＣＡＲ−Ｔ細胞を提供し、以下の表８に記載する。
【表８−１】
2021525524.tif 000026
【表８−２】
2021525524.tif 000027
【表８−３】
2021525524.tif 000028
【表８−４】
2021525524.tif 000029
【０２７０】
加えて、本明細書では、表６に記載の抗原対のいずれかを標的とする、ｓｃＦｖのＶＨドメイン及びＶＬドメインを組み込まれていてもよいヘアピンタンデムＣＡＲ構築物を提供する。
【表９−１】
2021525524.tif 000030
【表９−２】
2021525524.tif 000031
【０２７１】
例えば、本明細書の表１０では、ＣＤ２  ｓｃＦｖ及びＣＤ３  ｓｃＦｖのＶＨドメイン及びＶＬドメインを組み込んだヘアピンタンデムＣＡＲ構築物を提供する。
【表１０】
2021525524.tif 000032
【０２７２】
本明細書の表１１ではまた、表６に記載の抗原対のいずれかを標的とする、ｓｃＦｖのＶＨドメイン及びＶＬドメインを組み込まれていてもよい（Ｃｙｓ＝Ｃｙｓ）二本鎖結合（ＤＳＢ）を有するヘアピンタンデムＣＡＲ構築物を提供する。
【表１１−１】
2021525524.tif 000033
【表１１−２】
2021525524.tif 000034
【表１１−３】
2021525524.tif 000035
【表１１−４】
2021525524.tif 000036
【０２７３】
遺伝子編集を用いてデュアル構築物またはタンデム構築物におけるＣＡＲを遺伝子改変するための方法
更なる態様では、ＣＡＲ−Ｔ細胞対照を作製してもよい。例えば、対照ＣＡＲ−Ｔ細胞は、悪性Ｔ細胞上に発現していない抗原に結合する細胞外ドメインを含んでいてもよい。例えば、治療用ＣＡＲ−Ｔ細胞が、ＣＤ７などのＴ細胞抗原、または、ＣＤ２及びＣＤ３などの複数のＴ細胞抗原を標的とする場合、対照ＣＡＲ−Ｔ細胞が結合する抗原は、ＣＤ１９であってもよい。ＣＤ１９はＴ細胞上ではなくＢ細胞上に発現する抗原であることから、ＣＤ１９に結合するように適合させた細胞外ドメインを有するＣＡＲ−Ｔ細胞は、Ｔ細胞に結合しない。これらのＣＡＲ−Ｔ細胞を対照として用いて、目的のがんを標的とする及び／または目的の抗原を認識するＣＡＲ−Ｔ細胞の、結合効率及び非特異的結合を解析してもよい。
【０２７４】
当業者に周知の変化形態を任意選択的に採用して、ＷＯ２０１８０２７０３６Ａ１に開示されるように、ＣＡＲを更に設計してもよい。ＷＯ２０１８０２７０３６Ａ１に開示されるように、加えて、当該技術分野において周知の方法を用いて、また市販の供給元から、レンチウイルスベクター及び細胞株を得てもよく、ガイドＲＮＡを設計、検証及び合成してもよい。
【０２７５】
レトロウイルスを用いて遺伝子改変ＣＡＲをＴ細胞内に導入してもよく、それにより、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を標的細胞ゲノム内に効率的かつ安定的に組み込むことが可能となる。当該技術分野において周知のその他の方法としては、レンチウイルス形質導入、トランスポゾンベースのシステム、直接的なＲＮＡトランスフェクション、及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（例えば、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（すなわちＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（すなわちＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（すなわちＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（すなわちＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（すなわちＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｚ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、及びＣｕ１９６６などの好適なＣａｓタンパク質を用いたＩ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型のシステム）、が挙げられるがこれらに限定されない。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）もまた使用してもよい。例えば、Ｓｈｅａｒｅｒ  ＲＦ  ａｎｄ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ  ＤＮ，“Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｆｏｒ  ｓｔａｂｌｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ：  ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ，”Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ２０１５  Ｊａｎ；２０（１）：１−１０を参照されたい。
【０２７６】
ＰＩ３Ｋシグナル伝達の操作を使用して、構成的なＣＡＲの自己シグナル伝達による変異ＣＡＲ−Ｔ細胞の分化を防止してもよく、長命メモリーＴ細胞の発現を促進させてもよい。ＣＡＲ−Ｔの製造中及びｅｘ  ｖｉｖｏ増殖中にＰＩ３Ｋを薬理学的に阻害することにより、優先的なエフェクターＴ細胞の発現を阻害して、ＣＡＲ−Ｔのエフェクター／メモリー比率を、空のベクターを形質導入したＴ細胞に認められる比率にまで回復させることができ、それにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＴ細胞の持続性及び治療活性を向上させることができる。ｐ１１０δ  ＰＩ３Ｋを阻害することにより腫瘍特異的治療用ＣＤ８Ｔ細胞の有効性及び記憶を向上させることができる一方で、ｐ１１０α  ＰＩ３Ｋを阻害することによりサイトカイン産生及び抗腫瘍効果を向上させることができる。Ｔ細胞の表面上にＣＡＲが存在することにより、リガンドがない場合であってもＴ細胞の活性化及び分化に変化が生じ得ることから、このＰＩ３Ｋの阻害が提案されている。ｓｃＦｖフレームワークとシグナル伝達ドメインの両方に関連する、ＣＡＲによる構成的な自己シグナル伝達により、分化の変異及び生存率の低下を含む、異所性のＴ細胞挙動がもたらされ得る。この異所性のＴ細胞挙動は、患者におけるＣＡＲ−Ｔ細胞の有効性がそれらＣＡＲ−Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ寿命と直接関係している場合に重要である。ＣＤ２８共刺激ドメインが存在すると、持続的なＣＡＲの自己シグナル伝達が引き起こすＣＡＲ−Ｔ細胞の消耗が増加し、４−１ＢＢ共刺激ドメインの効果はより少ない。更に、ＣＤ３−ｚｅｔａは、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ｍＴＯＲ及び解糖経路の構成的活性化を有意に向上させ、セントラル／ステムメモリー細胞よりも短命エフェクター細胞の形成を促進させる。例えば、Ｚｈａｎｇ  Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＩ３Ｋ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ＣＡＲ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，”Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，２０１８  Ｎｏｖ  ９；９（８８）：３５８０７−３５８０８を参照されたい。
【０２７７】
サイトカイン遺伝子の欠失または抑制
ＴＣＲならびに細胞表面タンパク質及び抗原を遺伝子編集することに加えて、分泌可能なタンパク質、例えば、サイトカイン及びケモカインなどの遺伝子を編集してもよい。このような編集を行って、例えば、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）の発症または維持を抑制または予防してもよい。ＣＲＳは、免疫治療薬（またはその他の免疫学的刺激物）に応答した免疫細胞からの、大規模で急速なサイトカインの放出によって引き起こされる。当該技術分野において周知の方法、例えば、遺伝子の配列情報を変化または欠失させることにより遺伝子発現をなくす、遺伝子の除去（遺伝子サイレンシング）などを用いて、１つまたは複数のサイトカインまたはケモカインの遺伝子の修飾、破壊、または欠失を達成してもよい。これは、当該技術分野において周知の遺伝子操作ツール、例えば、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＣＲＩＳＰＲなどを用いることにより、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の形質導入により、サイトカインの遺伝子配列にＣＡＲを標的形質導入することなどにより、達成することができる。
【０２７８】
例えば、Ｃａｓ９−ＣＲＩＳＰＲを用いることにより、または、サイトカインの遺伝子配列にＣＡＲを標的形質導入することにより、本明細書で開示する免疫エフェクター細胞から欠失させることができるサイトカインまたはケモカインとしては、以下、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸ３ＣＬ１、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−１８、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＩＬ−１０、ＩＬ−２０、ＩＬ−１４、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＣＤ１５４、ＬＴ−β、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、４−１ＢＢＬ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ７０、ＣＤ１５３、ＣＤ１７８、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＡＬＬ−１、ＴＲＡＩＬ、ＴＷＥＡＫ、ＴＲＡＮＣＥ、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、Ｅｐｏ、Ｔｐｏ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＳＣＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＳＰ、Ａ２Ｍ、ＡＣＫＲ１、ＡＣＫＲ２、ＡＣＫＲ３、ＡＣＶＲ１、ＡＣＶＲ２Ｂ、ＡＣＶＲＬ１、ＡＤＩＰＯＱ、ＡＧＥＲ、ＡＧＲＮ、ＡＩＭＰ１、ＡＲＥＧ、ＢＭＰ１、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８Ａ、ＢＭＰ８Ｂ、ＢＭＰＲ２、Ｃ１０ｏｒｆ９９、Ｃ１ＱＴＮＦ４、Ｃ５、ＣＣＬ２８、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＤ１０９、ＣＤ３６、ＣＤ４、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＤ７４、ＣＥＲ１、ＣＨＲＤ、ＣＫＬＦ、ＣＬＣＦ１、ＣＭＴＭ１、ＣＭＴＭ２、ＣＭＴＭ３、ＣＭＴＭ４、ＣＭＴＭ５、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ７、ＣＭＴＭ８、ＣＮＴＦ、ＣＮＴＦＲ、ＣＯＰＳ５、ＣＲＬＦ１、ＣＳＦ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＳＦ２、ＣＳＦ３、ＣＳＦ３Ｒ、ＣＴＦ１、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ６、ＥＢＩ３、ＥＤＮ１、ＥＬＡＮＥ、ＥＮＧ、ＦＡＭ３Ｂ、ＦＡＭ３Ｃ、ＦＡＭ３Ｄ、ＦＡＳ、ＦＡＳＬＧ、ＦＧＦ２、ＦＬＴ３ＬＧ、ＦＺＤ４、ＧＢＰ１、ＧＤＦ１、ＧＤＦ１０、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ１５、ＧＤＦ２、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＧＤＦ９、ＧＰＩ、ＧＲＥＭ１、ＧＲＥＭ２、ＧＲＮ、ＨＡＸ１、ＨＦＥ２、ＨＭＧＢ１、ＨＹＡＬ２、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＢ１、ＩＦＮＥ、ＩＦＮＧ、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＫ、ＩＦＮＬ１、ＩＦＮＬ３、ＩＦＮＷ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１１ＲＡ、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１７Ｂ、ＩＬ１７Ｃ、ＩＬ��７Ｄ、ＩＬ１７Ｆ、ＩＬ１８ＢＰ、ＩＬ−１９、ＩＬ１Ｆ１０、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬ１ＲＡＰＬ１、ＩＬ１ＲＬ１、ＩＬ１ＲＮ、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２０ＲＢ、ＩＬ２１、ＩＬ２２、ＩＬ２２ＲＡ１、ＩＬ２２ＲＡ２、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ２３Ｒ、ＩＬ２４、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３１、ＩＬ３１ＲＡ、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＩＬ３４、ＩＬ３６Ａ、ＩＬ３６Ｂ、ＩＬ３６Ｇ、ＩＬ３６ＲＮ、ＩＬ３７、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＮＨＡ、ＩＮＨＢＡ、ＩＮＨＢＢ、ＩＮＨＢＣ、ＩＮＨＢＥ、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＢ３、ＫＩＴ、ＫＩＴＬＧ、ＫＬＨＬ２０、ＬＥＦＴＹ１、ＬＥＦＴＹ２、ＬＩＦＲ、ＬＴＡ、ＬＴＢ、ＬＴＢＰ１、ＬＴＢＰ３、ＬＴＢＰ４、ＭＩＦ、ＭＩＮＯＳ１−、ＭＳＴＮ、ＮＡＭＰＴ、ＮＢＬ１、ＮＤＰ、ＮＬＲＰ７、ＮＯＤＡＬ、ＮＯＧ、ＮＲＧ１、ＮＲＰ１、ＮＲＰ２、ＯＳＭＲ、ＰＡＲＫ７、ＰＤＰＮ、ＰＦ４、ＰＦ４Ｖ１、ＰＧＬＹＲＰ１、ＰＬＰ２、ＰＰＢＰ、ＰＸＤＮ、ＳＣＧ２、ＳＣＧＢ３Ａ１、ＳＥＣＴＭ１、ＳＬＵＲＰ１、ＳＯＳＴＤＣ１、ＳＰ１００、ＳＰＰ１、ＴＣＡＰ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ３、ＴＨＢＳ１、ＴＨＮＳＬ２、ＴＨＰＯ、ＴＩＭＰ１、ＴＮＦ、ＴＮＦＲＳＦ１１、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＲＳＦ１０、ＴＮＦＳＦ１１、ＴＮＦＳＦ１２、ＴＮＦＳＦ１２−、ＴＮＦＳＦ１３、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４、ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦＳＦ１８、ＴＮＦＳＦ４、ＴＮＦＳＦ８、ＴＮＦＳＦ９、ＴＲＩＭ１６、ＴＳＬＰ、ＴＷＳＧ１、ＴＸＬＮＡ、ＶＡＳＮ、ＶＥＧＦＡ、ＶＳＴＭ１、ＷＦＩＫＫＮ１、ＷＦＩＫＫＮ２、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ７Ａ、及びＺＦＰ３６、が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２７９】
これらの遺伝子の配列は当該技術分野において周知かつ入手可能である。
【０２８０】
適応症、及び実際の（ＣＡＲ−Ｔ）療法における標準治療
一部の実施形態では、本明細書で開示する及び／または本明細書で開示する方法を用いて作製されるゲノム編集免疫エフェクター細胞は、１種または複数種のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現し、医薬品として、すなわち、疾患の治療用に使用され得る。多くの実施形態では、細胞はＣＡＲ−Ｔ細胞である。
【０２８１】
本明細書で開示する及び／または本明細書で開示する方法を用いて作製される細胞は、がん、自己免疫疾患、感染症、及びその他の症状を治療するために、または、がん、自己免疫疾患、感染症、及びその他の症状を治療するための医薬品を製造するために、免疫療法及び養子細胞移入に使用され得る。
【０２８２】
がんは、血液悪性腫瘍または固形腫瘍であってもよい。血液悪性腫瘍としては、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、及びそれらの亜型、が挙げられる。リンパ腫は、様々な方法、多くの場合、悪性細胞の基本的なタイプに基づいて分類することができ、ホジキンリンパ腫（リードスタンバーグ細胞のがんであることが多いが、時としてＢ細胞から発生することもあり、全てのその他のリンパ腫は非ホジキンリンパ腫である）、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、ならびに、本明細書で定義する及び当該技術分野において周知のその他のリンパ腫、が挙げられる。
【０２８３】
Ｂ細胞リンパ腫としては、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、ならびに、本明細書で定義する及び当該技術分野において周知のその他のＢ細胞リンパ腫、が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２８４】
Ｔ細胞リンパ腫としては、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫（Ｔ−ＡＬＬ）、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、Ｔ細胞慢性リンパ性白血病（Ｔ−ＣＬＬ）、セザリー症候群、ならびに、本明細書で定義する及び当該技術分野において周知のその他のＴ細胞リンパ腫、が挙げられる。
【０２８５】
白血病としては、急性骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ）（または骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ））白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性（または骨髄性）白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性（またはリンパ芽球性）白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、毛様細胞性白血病（時として、リンパ腫に分類される）、ならびに、本明細書で定義する及び当該技術分野において周知のその他の白血病、が挙げられる。
【０２８６】
形質細胞性悪性腫瘍としては、リンパ形質細胞性リンパ腫、形質細胞腫、及び多発性骨髄腫、が挙げられる。
【０２８７】
一部の実施形態では、患者におけるがんを治療するために、とりわけ、固形腫瘍、例えば、黒色腫、神経芽細胞腫、神経膠腫など、または、がん、例えば、脳、頭頸部、乳房、肺（例えば、非小細胞肺癌、ＮＳＣＬＣ）、生殖系（例えば、卵巣）、上部消化管、膵臓、肝臓、腎臓（ｒｅｎａｌ）系（例えば、腎臓（ｋｉｄｎｅｙ））、膀胱、前立腺、及び結腸直腸の腫瘍など、を治療するために、医薬品を使用してもよい。
【０２８８】
別の実施形態では、患者におけるがんを治療するために、とりわけ、多発性骨髄腫及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）から選択される血液悪性腫瘍、ならびに、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫、及びＴ細胞慢性リンパ性白血病（Ｔ−ＣＬＬ）から選択されるＴ細胞悪性腫瘍、を治療するために、医薬品を使用してもよい。
【０２８９】
一部の実施形態では、自己免疫疾患、例えば、狼瘡、自己免疫（関節）リウマチ、多発性硬化症、移植拒絶反応、クローン病、潰瘍性大腸炎、皮膚炎などの治療に、細胞を使用してもよい。一部の実施形態では、細胞は、抗体フラグメントの代わりに抗原またはそのフラグメントを提示するキメラ自己抗体受容体Ｔ細胞、すなわちＣＡＲ−Ｔであり、このタイプの養子細胞移入では、自己免疫疾患を引き起こすＢ細胞は、遺伝子改変Ｔ細胞を攻撃しようとし、遺伝子改変Ｔ細胞を殺傷することで反応する。
【０２９０】
一部の実施形態では、ＨＩＶ及び結核などの感染症の治療に、細胞を使用してもよい。
【０２９１】
別の実施形態では、本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞は、強力なｉｎ  ｖｉｖｏＴ細胞増殖を受けてもよく、長時間にわたり持続し得る。
【０２９２】
一部の実施形態では、本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞を用いた患者の治療は、緩和、治癒的または予防的となり得る。その治療は、自家免疫療法治療の一部、または同種異系免疫療法治療の一部のいずれかであってもよい。自家とは、患者の治療に用いる細胞、細胞株、または細胞集団が、上記患者またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合ドナーに由来するということを意味する。同種異系とは、患者の治療に用いる細胞または細胞集団が、その患者ではなくドナーに由来するということを意味する。
【０２９３】
本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞を用いたがんの治療は、抗体療法、化学療法、サイトカイン療法、樹状細胞療法、遺伝子療法、ホルモン療法、放射線療法、レーザー光線療法、及び放射線療法、から選択される１種または複数種の治療法と組み合わされてもよい。
【０２９４】
本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞の集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸注、埋め込み、または移植、により実施される。本明細書に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞組成物、すなわち、モノＣＡＲ、デュアルＣＡＲ、タンデムＣＡＲは、皮下、皮膚内、腫瘍内、節内、髄内、筋肉内、静脈内もしくはリンパ管内注射、または腹腔内で、患者に投与され得る。一実施形態では、本開示の細胞組成物は、静脈注射で投与されることが好ましい。
【０２９５】
ＣＡＲ−Ｔ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞の集団の投与は、体重１ｋｇあたり１０４〜１０９の細胞、好ましくは、１０５〜１０６の細胞／ｋｇ（体重）（これらの範囲内の細胞数の全ての整数値を含む）、の投与で構成され得る。ＣＡＲ−Ｔ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞の集団は、１回または複数回の投与で投与されてもよい。別の実施形態では、有効量のＣＡＲ−Ｔ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞の集団は、単回投与で投与される。別の実施形態では、有効量の細胞は、ある期間にわたり２回以上の投与で投与される。投与のタイミングは健康管理提供者の良識の範囲内であり、患者の臨床症状によって決まる。ＣＡＲ−Ｔ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞の集団は、任意の供給源、例えば、血液銀行またはドナーなどから得てもよい。患者の要望は様々ではあるが、個々の疾患または症状のための、任意のＣＡＲ−Ｔ細胞集団（複数可）の有効量の至適範囲の算出は当業者の知るところである。有効量とは、治療効果または予防効果をもたらす量のことを意味する。投与量は、患者レシピエントの年齢、健康及び体重、併用治療の種類（ある場合、治療の頻度）、ならびに、望まれる効果の性質によって決まる。
【０２９６】
別の実施形態では、有効量の、ＣＡＲ−Ｔ細胞もしくはＣＡＲ−Ｔ細胞の集団、またはそれらＣＡＲ−Ｔ細胞を含む組成物は、非経口で投与される。投与は、静脈内投与であってもよい。ＣＡＲ−Ｔ細胞もしくはＣＡＲ−Ｔ細胞の集団、またはそれらＣＡＲ−Ｔ細胞を含む組成物の投与は、腫瘍内への注射によって直接実施されてもよい。
【０２９７】
本開示の一実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞の増殖及び持続性を向上させる、サイトカイン、もしくはＣＡＲ−Ｔ内のサイトカインの発現を用いた治療、ならびに、ＩＬ−２、ＩＬ−７、及びＩＬ−１５、またはそのアナログを用いることを含むがこれらに限定されない治療、を含むがこれらに限定されない多くの関連治療モダリティと共に、例えば、その前に、それと同時に、またはその後に、患者に投与される。
【０２９８】
一部の実施形態では、本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞の集団は、ＴＧＦβ、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、アデノシン、ＶＥＧＦ、インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ１）、インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ２（ＩＤＯ２）、トリプトファン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）、乳酸、低酸素症、アルギナーゼ、及びプロスタグランジンＥ２の阻害剤、を含むがこれらに限定されない、免疫抑制経路を阻害する薬剤と組み合わせて使用してもよい。
【０２９９】
別の実施形態では、本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞の集団は、抗ＣＴＬＡ４（イピリムマブ）、抗ＰＤ１（ペンブロリズマブ、ニボルマブ、セミプリマブ）、抗ＰＤＬ１（アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ）、抗ＰＤＬ２、抗ＢＴＬＡ、抗ＬＡＧ３、抗ＴＩＭ３、抗ＶＩＳＴＡ、抗ＴＩＧＩＴ、及び抗ＫＩＲ、を含むがこれらに限定されないＴ細胞チェックポイント阻害薬、と組み合わせて使用してもよい。
【０３００】
別の実施形態では、本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞の集団は、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＯＸ−４０、ＣＤ２７、４−１ＢＢ、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、及びＨＶＥＭを刺激する抗体を含むがこれらに限定されないＴ細胞アゴニストと組み合わせて使用してもよい。
【０３０１】
別の実施形態では、本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞の集団は、レトロウイルス、ピコルナウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、レオウイルス、パルボウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、及びポックスウイルス、を含むがこれらに限定されない治療用腫瘍崩壊ウイルス、と組み合わせて使用してもよい。
【０３０２】
別の実施形態では、本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞の集団は、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、及びＴＬＲ９アゴニスト、を含むがこれらに限定されない、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニストなどの免疫活性化治療薬、と組み合わせて使用してもよい。
【０３０３】
別の実施形態では、本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞の集団は、環状ＧＭＰ−ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）などのインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）アゴニストと組み合わせて使用してもよい。
【０３０４】
免疫エフェクター細胞無形成症、とりわけ、Ｔ細胞無形成症はまた、養子細胞移入療法後の懸念事である。治療する悪性腫瘍がＴ細胞悪性腫瘍でありＣＡＲ−Ｔ細胞がＴ細胞抗原を標的とする場合、抗原を発現する正常なＴ細胞及びその前駆細胞が枯渇し、免疫機構が損なわれる。それゆえ、これらの副作用を管理するための方法は、治療の案内係である。このような方法としては、後ほど、ＣＡＲ−Ｔ細胞が枯渇または不活性化した後に、増殖させて患者に再注入するために、自家または同種異系（任意選択的に、拒絶反応を引き起こさないまたは拒絶されないように遺伝子改変された）のいずれかの、非悪性のＴ細胞または前駆細胞を選択及び保持することが挙げられる。代替的に、ＴＣＲ保有細胞の亜型、例えば、正常及び悪性のＴＲＢＣ１＋（しかし、ＴＲＢＣ２＋細胞ではない）、または代替的に、ＴＲＢＣ２＋（しかし、ＴＲＢＣ１＋細胞ではない）などを認識して殺傷するＣＡＲ−Ｔ細胞を使用して、十分な正常Ｔ細胞を保持して正常な免疫機構の機能を維持しつつ、Ｔ細胞悪性腫瘍を根絶してもよい。
【０３０５】
定義
本明細書において特に定義しない限り、使用する全ての技術用語及び科学用語は、遺伝子療法、生化学、遺伝学、及び分子生物学の分野の当業者が一般に理解する意味と同一の意味を有する。本明細書に記載の組成物及び方法と同様または同等の全ての開示される組成物及び方法を、本開示の実施または試験に使用することができる。
【０３０６】
本明細書で使用する場合、以下の用語は、示された意味を有する。数値の範囲を開示する場合、また表記「ｎ１…〜ｎ２」または「ｎ１…〜ｎ２の間」を使用する場合、ｎ１及びｎ２は数字であり、そのため、特に明記しない限り、この表記は、数字自体及びそれらの間の範囲を含むことを意図している。この範囲は、数字間における整数または連続であってもよく、末端の数値を含む。例えば、「２〜６個の炭素」の範囲は、炭素が整数単位で存在することから、２、３、４、５、及び６個の炭素を含むことを意図している。対照的に、例えば、「１〜３μＭ（マイクロモル）」の範囲は、１μＭ、３μＭ、及び、数字間における任意数の有効数字（例えば、１．２５５μＭ、２．１μＭ、２．９９９９μＭなど）の全てを含むことを意図している。
【０３０７】
用語「約」は、本明細書で使用する場合、その用語が修飾する数値を、このような数値が誤差の範囲内で変動することを表すように、限定することを意図している。誤差の範囲が特にない場合、例えば、データのグラフまたは表に記載された平均値に対する標準偏差が列挙されている場合などにおいて、用語「約」は、列挙された数値を包含し得る範囲、及び、同様に、有効数字を考慮して、その数値にまで切り上げるまたは切り下げることにより含まれ得る範囲を意味するものと理解すべきである。
【０３０８】
細胞に関する用語「活性化」（及びその別の活用型）は通常、「刺激すること」と同義であると理解すべきであり、本明細書で使用する場合、細胞集団の増殖をもたらす細胞の処理のことを意味する。Ｔ細胞において、活性化は、ＣＤ２及びＣＤ２８（及び同様に、ＣＤ２の場合もある）アゴニスト、一般的には、任意選択的に、磁性ビーズ上にコーティングしたまたはコロイド状のポリマーマトリックスにコンジュゲートした、抗体、に曝露することによって達成されることが多い。
【０３０９】
用語「抗原」は、本明細書で使用する場合、Ｔ細胞受容体またはキメラ抗原受容体が認識する（すなわち、Ｔ細胞受容体またはキメラ抗原受容体の標的である）細胞表面タンパク質である。古典的な意味において、抗原は、抗体が認識する物質、典型的にはタンパク質であるが、ＣＡＲが、１種または複数種の抗原（複数可）を認識する軽（ＶＬ）鎖及び重（ＶＨ）鎖などの抗体由来ドメインを含む限りにおいて、定義は重複するものである。
【０３１０】
用語「がん」とは、体内における悪性腫瘍、または細胞の異常増殖のことを意味する。多くの異なるがんが、特定の細胞表面タンパク質または分子によって特性決定または同定され得る。それゆえ、一般的な用語において、本開示によるがんは、本明細書に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞を用いて治療可能なあらゆる悪性腫瘍のことを意味し得、免疫エフェクター細胞は、がん細胞上の細胞表面タンパク質を認識してそれに結合する。本明細書で使用する場合、がんとは、血液悪性腫瘍、例えば、多発性骨髄腫、Ｔ細胞悪性腫瘍、またはＢ細胞悪性腫瘍などのことを意味し得る。Ｔ細胞悪性腫瘍としては、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）または非ホジキンリンパ腫を挙げることができるがこれらに限定されない。がんはまた、子宮頸癌、膵臓癌、卵巣癌、中皮腫、及び肺癌、を含むがこれらに限定されない固形腫瘍のことを意味し得る。
【０３１１】
「細胞表面タンパク質」は、本明細書で使用する場合、細胞の表面上で少なくとも部分的に、細胞が発現するタンパク質（またはタンパク質複合体）である。細胞表面タンパク質の例としては、ＴＣＲ（及びそのサブユニット）及びＣＤ７が挙げられる。
【０３１２】
「キメラ抗原受容体」すなわち「ＣＡＲ」とは、本明細書で使用する場合、及び当該技術分野において一般的に使用する場合、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び、細胞外リガンド結合ドメインが標的細胞上に存在する構成要素に結合すると、細胞に特殊機能を実行させるシグナル伝達ドメイン、を有する、組換え融合タンパク質のことを意味する。例えば、ＣＡＲは、特定の抗標的細胞免疫活性を示すキメラタンパク質を産生するための、Ｔ細胞受容体を活性化させる細胞内ドメインを有し、所望の抗原（例えば、腫瘍抗原）に対する、抗体に基づいた特異性を有していてもよい。第１世代のＣＡＲは、細胞外リガンド結合ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン（一般的には、ＣＤ３ζまたはＦｃεＲＩγ）を含む。第２世代のＣＡＲは、細胞内共刺激ドメイン（一般的には、４−１ＢＢまたはＣＤ２８）を含ませることにより、第１世代のＣＡＲ構築物を土台に構築されている。これらの共刺激ドメインは、第１世代のＣＡＲと比較して、ＣＡＲ−Ｔ細胞の傷害性及び増殖を向上させるのに役立つ。第３世代のＣＡＲは、主として、ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖及び持続性を向上させるための、複数の共刺激ドメインを含む。キメラ抗原受容体は、ＭＨＣ非依存性抗原に結合するその能力と、その細胞内ドメインを介して活性化シグナルを変換するその能力の両方により、その他の抗原結合因子とは区別される。
【０３１３】
「ＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞」は、少なくとも１種のＣＡＲを形質導入された免疫エフェクター細胞である。「ＣＡＲ−Ｔ細胞」は、少なくとも１種のＣＡＲを形質導入されたＴ細胞であり、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、モノ、デュアル、またはタンデムＣＡＲ−Ｔ細胞であってもよい。ＣＡＲ−Ｔ細胞は、自家（対象自身の細胞から遺伝子改変されたことを意味する）であってもよく、または、同種異系（細胞が健康なドナーを供給源としていることを意味する）であってもよく、多くの場合、宿主対移植片反応、または移植片対宿主反応を引き起こさないように遺伝子改変されている。ドナー細胞はまた、臍帯血に由来していてもよく、または、人工多能性幹細胞から作製してもよい。
【０３１４】
デュアルＣＡＲ−Ｔ細胞（ｄＣＡＲ−Ｔ）を、同一エフェクター細胞内に発現した異なる標的抗原に対する親和性を有する、２つの異なるキメラ抗原受容体ポリペプチドを有するＴ細胞と定義してもよく、それぞれのＣＡＲ機能は独立している。ＣＡＲは、単一または複数のポリヌクレオチド配列から発現してもよい。
【０３１５】
タンデムＣＡＲ−Ｔ細胞（ｔＣＡＲ−Ｔ）を、異なる標的に対する親和性を有する、２つの異なる細胞外リガンド結合ドメインを含有する単一キメラ抗原ポリペプチドを有するＴ細胞と定義してもよく、細胞外リガンド結合ドメインは、ペプチドリンカーによって連結し、１種または複数種の共通の共刺激ドメインを共有しており、いずれかの細胞外リガンド結合ドメインの結合により、１種または複数種の共通の共刺激ドメイン、及びシグナル伝達ドメインにわたり、シグナルが伝達される。
【０３１６】
用語「組み合わせ治療」とは、本開示に記載の治療症状または障害を治療するための、２種またはそれ以上の治療薬の投与のことを意味する。このような投与は、固定比率の活性成分を有する単一のカプセル剤、または、それぞれの活性成分用の複数の別々のカプセル剤などによる、これらの治療薬のほぼ同時の共投与を包含する。加えて、このような投与はまた、それぞれの種類の治療薬の連続的な使用を包含する。いずれの場合も、治療レジメンは、本明細書に記載の症状または障害の治療において、薬剤組み合わせの有益な効果をもたらす。
【０３１７】
用語「組成物」とは、本明細書で使用する場合、１種または複数種の治療的に許容される担体と組み合わせた、免疫療法用の細胞集団のことを意味する。
【０３１８】
用語「疾患」は、本明細書で使用する場合、全てが、正常な機能を損なっているヒトもしくは動物の体またはその部位の１つにおける、異常な状態を反映し、典型的には、徴候及び症状が際立つことにより顕在化し、またヒトまたは動物の寿命または生活の質を低下させるという点で、一般的に、用語「障害」、「症候群」及び「症状」（医学的症状と同様）と同義であり、それらと同じ意味で用いられることを意図している。
【０３１９】
用語「同胞殺し」とは、本明細書で使用する場合、標的とされる細胞が、両方の細胞上のキメラ抗原受容体が特異的に認識する抗原を発現していることから、ＣＡＲ−Ｔ細胞が、そのＣＡＲ−Ｔ細胞の標的と同一のキメラ抗原受容体を含む別のＣＡＲ−Ｔ細胞の標的となる際、または別のＣＡＲ−Ｔ細胞によって殺傷される際に生じるプロセスのことを意味する。キメラ抗原受容体が特異的に結合する抗原を欠損したキメラ抗原受容体を含むＣＡＲ−Ｔ細胞は、「同胞殺し抵抗性」である。
【０３２０】
用語「ゲノム編集」とは、本明細書で使用する場合、遺伝子が、非機能的となるように付加、欠失、または修飾されているということを意味する。それゆえ、特定の実施形態では、「遺伝子編集ＣＡＲ−Ｔ細胞」は、少なくとも１種の抗原を認識するＣＡＲなどの遺伝子を付加された、及び／または、ＣＡＲが認識する抗原（複数可）の遺伝子（複数可）などの遺伝子を欠失された、及び／または、ＴＣＲもしくはそのサブユニット（例えば、α鎖またはβ鎖）などの遺伝子が、非機能的となるように欠失もしくは修飾された、または、関連ＣＤ３シグナル伝達複合体のサブユニットもしくはそのサブユニット（例えば、γ鎖、δ鎖、ε鎖、またはζ鎖）が、非機能的となるように欠失もしくは修飾された、ＣＡＲ−Ｔ細胞である。
【０３２１】
本明細書で使用する場合、「自殺遺伝子」とは、活性化した場合にＣＡＲ−Ｔ細胞の死をもたらす、当該技術分野において周知の標準的な方法を用いてＣＡＲ−Ｔ細胞に導入された核酸配列のことを意味する。必要に応じ、自殺遺伝子は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣＡＲ−Ｔ細胞の追跡及び除去、すなわち、殺傷を促進し得る。自殺遺伝子を活性化することによりＣＡＲ−Ｔ細胞の殺傷を促進することは、当該技術分野において周知の標準的な方法を用いて実施することができる。当該技術分野において周知の自殺遺伝子システムとしては、（ａ）非毒性プロドラッグのガンシクロビル（ＧＣＶ）をＧＣＶ−三リン酸に変換して、ＤＮＡ複製を停止させることにより細胞死をもたらす、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）−ｔｋ、（ｂ）ｉＣａｓｐ９が低分子ＡＰ１９０３に結合することにより二量体化が可能となり、内因性アポトーシス経路が活性化されること、及び、（ｃ）関連モノクローナル抗体の投与後、補体／抗体依存性細胞傷害（ＣＤＣ／ＡＤＣＣ）により、修飾細胞の効率的な除去を可能とする、形質導入Ｔ細胞において発現する、標的となり得る表面抗原（例えば、ＣＤ２０及びトランケートＥＧＦＲ）、が挙げられるがこれらに限定されない。
【０３２２】
例えば、「がん細胞」は、悪性Ｔ細胞、悪性Ｂ細胞、または悪性形質細胞である。
【０３２３】
「悪性Ｂ細胞」は、Ｂ細胞悪性腫瘍に由来するＢ細胞である。Ｂ細胞悪性腫瘍としては、（ＤＬＢＣＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、及びＢ細胞前駆細胞急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、が挙げられるがこれらに限定されない。
【０３２４】
「悪性Ｔ細胞」は、Ｔ細胞悪性腫瘍に由来するＴ細胞である。
【０３２５】
用語「Ｔ細胞悪性腫瘍」とは、Ｔ細胞前駆細胞、成熟Ｔ細胞、またはナチュラルキラー細胞に由来する、広く、極めて不均一なグループの悪性腫瘍のことを意味する。Ｔ細胞悪性腫瘍の非限定例としては、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫（Ｔ−ＡＬＬ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型陽性（ＨＴＬＶ−１＋）成人Ｔ細胞性白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、Ｔ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）、成人Ｔ細胞リンパ腫／白血病（ＨＴＬＶ−１関連）、アグレッシブＮＫ細胞性白血病、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、ＡＬＫ陽性未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、ＡＬＫ陰性血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、乳房インプラント関連未分化大細胞リンパ腫、ＮＫ細胞の慢性リンパ増殖性障害、節外性鼻型ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、腸疾患型Ｔ細胞リンパ腫、濾胞性Ｔ細胞リンパ腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、ＧＩ管の無痛性Ｔ細胞リンパ増殖性障害、単形性上皮向性腸管Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫、ＴＦＨ表現型を伴う節性末梢Ｔ細胞リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、ＮＯＳ、原発性皮膚γδＴ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ８＋アグレッシブ表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚先端型ＣＤ８＋Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ４＋小型／中型Ｔ細胞リンパ増殖性障害［原発性皮膚未分化大細胞リンパ腫（Ｃ−ＡＬＣＬ）、リンパ球様丘疹症］、セザリー症候群、皮下脂肪組織炎様Ｔ細胞リンパ腫、小児期の全身性ＥＢＶ＋Ｔ細胞リンパ腫、及びＴ細胞大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬ）、が挙げられる。
【０３２６】
「健康なドナー」は、本明細書で使用する場合、血液悪性腫瘍（例えば、Ｔ細胞悪性腫瘍）を有していない健康なドナーである。
【０３２７】
用語「治療的に許容される」とは、過度の毒性、炎症、及びアレルギー反応を伴わず、妥当な利益／リスク比に見合い、及び／または、その使用目的において有効である、患者の組織との接触に用いるのに適切な物質のことを意味する。
【０３２８】
用語「治療的に有効」は、疾患もしくは障害の治療に使用する、または、臨床エンドポイントの効果に使用する、活性成分の量を適格とすることを意図している。
【０３２９】
本明細書で使用する場合、「分泌可能なタンパク質」は、別の細胞に影響を及ぼす、細胞が分泌するタンパク質である。例えば、分泌可能なタンパク質としては、サイトカイン、ケモカイン、及び転写因子、が挙げられる。
【０３３０】
用語「ドナー鋳型」とは、相同組換え修復（ＨＤＲ）ＤＮＡ修復経路により二本鎖切断を修復するための鋳型として細胞が使用する基準ゲノム物質のことを意味する。ドナー鋳型は、ゲノム内へと挿入される、二本鎖切断部位の側面を狙う２本のホモロジーアームを有するＤＮＡの断片（発現させる遺伝子、すなわち、ＣＡＲまたはマーカーの遺伝子を含有している）を含有している。一部の実施形態では、ドナー鋳型は、アデノ随伴ウイルス、一本鎖ＤＮＡ、または二本鎖ＤＮＡ、であってもよい。
【０３３１】
用語「に曝露する」は、本明細書で使用する場合、目的の組成物（例えば、抗体など）を別の目的の組成物（例えば、細胞など）と密着させる状況において、「と培養する」と同義であることを意図しており、短い期間の接触は、用語「と培養する」の代わりに用語「に曝露する」を使用することを意図している。
【０３３２】
用語「患者」は一般的に、用語「対象」と同義であり、ヒトを含む全ての哺乳動物を含む。
【実施例】
【０３３３】
以下の実施例により本発明を更に説明する。
【０３３４】
実施例１−ＣＡＲをＣＤ３ｅ遺伝子座に挿入することによりゲノム編集ＣＡＲ−Ｔ細胞を作製及び試験するための方法
以下の工程を採用して、本明細書で開示する遺伝子編集遺伝子座（ＣＡＲ−Ｔ）からＣＡＲが発現している、ゲノム編集ＣＡＲ−Ｔ細胞を得てもよい。本実施例では、ＣＤ７ＣＡＲＴΔＣＤ７ΔＣＤ３ε細胞の作製について説明する。当業者は理解するように、おそらく異なる効率をもたらすであろうが、ある特定の工程を、以下に記載する順で連続的に実施してもよく、または、順不同に実施してもよい。
【表１２】
2021525524.tif 000037
【０３３５】
工程１−Ｔ細胞の活性化（０日目）。
Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ヒトＰａｎＴ単離キットを使用して、ロイコフェレーシスチャンバーからＴ細胞を精製する。培地に再懸濁させる。細胞をカウントする。３：１のビーズ：細胞比率を得るのに必要なヒトＴ細胞活性化ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの数を求める。Ｔ細胞培地でビーズを２回洗浄する。１．２５６細胞／ｍＬとなるように、ｈＸｃｙｔｅ培地中に細胞を希釈する。ヒトＴ細胞活性化ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを加える。６ウェルプレートに、ウェルあたり、１．２５６細胞／ｍＬ溶液４ｍＬをアリコートする。細胞を３７℃で培養する。
【０３３６】
工程２−ＣＲＩＳＰＲ（２日目）。
標的遺伝子を遺伝的に欠失させて、遺伝子編集遺伝子座にＣＡＲを挿入する。切断を修復して所望の配列を編集遺伝子座に挿入するためのドナー鋳型を使用した、相同組換え修復を用いて、ＤＮＡの二本鎖切断を修復してもよい。Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ、及び標的（複数可）に対するｇＲＮＡをエレクトロポレーションすることにより、標的の欠失を実施してもよい。ドナー鋳型は、二本鎖切断周りのＤＮＡとの相同性を含有し、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡと共にエレクトロポレーションされる、ＤＮＡプラスミドまたは二本鎖直鎖状ＤＮＡであってもよい。加えて、ＡＡＶなどのウイルスベクターをドナー鋳型の供給源として使用してもよい。しかしながら、その他の技術を使用してＤＮＡ二本鎖切断を導入してもよい。これらの技術としては、ＴＡＬＥＮ及びメガヌクレアーゼなどのその他のゲノム編集技術が挙げられる。
【表１３】
2021525524.tif 000038
【０３３７】
手順−ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ４Ｄを使用したヌクレオフェクション−反応あたり４×１０６の細胞。プログラムＥＯ−１１５−１００ｕｌのトランスフェクション容量。全ての助剤をＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｐ３に加える必要がある。適切な数のウェルに望ましい容量の推奨培地（６ウェルプレートに２ｍｌ）を充填してから、加湿インキュベータ内、３７℃／５％ＣＯ２で、プレートを予備培養／平衡化することにより、細胞培養プレートを調製する。ビーズを磁気で取り除く（完全な除去を確保するためにこれを２回実施する）。細胞をカウントし、細胞密度を測定する。必要な数の細胞を、室温、９０×ｇで１０分間、遠心分離にかける。上清を完全に除去する。ＰＢＳ（１ｍｌ）中に再懸濁してから微量遠心チューブに移し、必要な数の細胞を、室温、９０×ｇで１０分間、遠心分離にかける。上清を完全に除去する。完全に室温の４Ｄ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｐ３中に細胞ペレットを慎重に再懸濁する（１００μｌあたり４×１０６）。２０ｕｇのそれぞれのｇＲＮＡ（ｇＣＤ７及びｇＣＤ３ε）を、それぞれのチューブの１５ｕｇのＣａｓ９に加える。１００ｕｌの細胞を、それぞれのチューブのＣａｓ９／ｇＲＮＡに加え、軽く混合してから、全てをＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅ（商標）に移す。軽く叩いて気泡を除去する。プログラム（ヒトＴ細胞刺激ＥＯ−１１５）を使用してエレクトロポレーションを実施する。処理の完了後、専用を使用して、保持器からＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅ（商標）Ｖｅｓｓｅｌを慎重に取り外す。予め温めた培地に細胞を再懸濁する。目的ウェルから培地を除去し、キュベットに加え、２〜３回上下に優しくピペッティングする。ウェルに移す。同一ウェルの培地を用いて繰り返す。３７℃で培養する。
【０３３８】
工程３−ＨＤＲ修復構築物を含有するＡＡＶベクターのＴ細胞への形質導入。
１ｅ４〜１ｅ６のＭＯＩでのエレクトロポレーションの２〜４時間後に、組換えＡＡＶ６ドナーベクターを細胞培養液に加える。
【０３３９】
工程４−ＣＲＩＳＰＲ活性及びＴｄ効率の評価（１０日目）
それぞれの試料から５×１０５の細胞を取り出してフローサイトメトリーで解析する。試料をＲＢで洗浄する。３ｕｌの抗ＣＤ３４  ＰＥ抗体を加える（本発明者らの構築物がヒトトランケートＣＤ３４を含有していることから、これにより、ＣＡＲを検出する）。５ｕｌのＣＤ３  ＡＰＣ及び２ｕｌのＣＤ２  ＢＶ４２１を加える。洗浄する。フローサイトメトリーを実施する。細胞は、ＣＤ３ε陰性、ＣＤ７陰性のはずである。Ｔ細胞を回収する（１１日目）。
【０３４０】
ＣＡＲ−Ｔ細胞の精製。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ａｕｔｏｍａｃｓ上のＣＤ３４＋細胞の陽性選択を用いて、ＣＤ３４＋（ＣＡＲ＋）かつＴＣＲ陰性の細胞を単一工程で精製してもよい。これにより、ＣＡＲ＋細胞が濃縮され、ＴＣＲ＋細胞が除去される（ＣＡＲの挿入がＴＣＲのシグナル伝達を阻害するため）。
【０３４１】
工程５−ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＣＡＲ−Ｔ活性の評価
ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング実験を実施する場合、ＮＳＧマウスに腫瘍（ルシフェラーゼを含有する、５ｅ５のＭＯＬＴ３またはＨＨ）を注入する。（７日目）
【０３４２】
生物発光イメージングを用いて、マウスにおける全身腫瘍組織量のイメージングを行う。マウスあたり２×１０６のＣＤ３４＋ＣＡＲ−Ｔを尾静脈Ｉ．Ｖ．注射する、または、標的細胞（ＭＯＬＴ３またはＨＨ）に対する４時間のクロム放出アッセイを実施する（１１日目）。当業者は、実施例１に明記した期間にある程度の自由度が可能であることを理解するであろう。
【０３４３】
実施例２−ゲノム編集タンデムｔＣＡＲ−Ｔ細胞を作製するための方法
実施例１における手順の変化形態では、２種の抗原を認識するタンデムＣＡＲ−Ｔ細胞を作製してもよい。工程２では、２種の標的それぞれ用のｇＲＮＡ、及びＣａｓ９  ｍＲＮＡをエレクトロポレーションすることにより、細胞表面から２種の抗原を欠失させてもよく、または、上記のとおり抑制してもよい。次に、工程３では、２種の標的を認識するＣＡＲをこのＣＡＲ−Ｔ細胞に形質導入する。タンデムＣＡＲ−Ｔ細胞の変化形態を図２の概略図に示す。ｔＣＡＲ−Ｔ細胞の別の例を表６に示す。
【０３４４】
実施例３−ゲノム編集デュアルＣＡＲ−Ｔ細胞またはゲノム編集タンデムＣＡＲ−Ｔ細胞
上記の方法を使用して、いくつかのタイプのゲノム編集デュアルＣＡＲ−Ｔ細胞またはゲノム編集タンデムＣＡＲ−Ｔ細胞を作製してもよい。図１及び図２は、タンデムＣＡＲ−Ｔ細胞及びデュアルＣＡＲ−Ｔ細胞の例を示している。図は、標的とする抗原を示してはいるが、タンデムＣＡＲ構築物におけるｓｃＦｖ発現の順番を示してはいない。更なる例について、以下の表６〜１１に記載する。
【０３４５】
ＣＡＲの標的抗原でありＣＡＲ−Ｔ細胞上に発現した、１種または複数種の表面タンパク質を欠失した、欠失していない、または抑制した、タンデムＣＡＲ−Ｔ細胞及びデュアルＣＡＲ−Ｔ細胞の別の例については、本明細書に記載する。通常、２種以上の抗原を欠失または抑制した例は、これらのＣＡＲ−Ｔ細胞のための、より高い同胞殺し抵抗性の利点を有する可能性がより高い。タンデムＣＡＲにおいてｓｃＦｖが配向する順番が表６〜１１に記載されているが限定されないということを、更に留意すべきである。例えば、ＣＤ２＊ＣＤ３εは、ＣＤ２＊ＣＤ３εの配向またはＣＤ３ε＊ＣＤ２の配向を有するｔＣＡＲを包含する。
【０３４６】
ＣＡＲの標的抗原でありＣＡＲ−Ｔ細胞上に発現した、１種または複数種の表面タンパク質を欠失していない、欠失した、または抑制した、多発性骨髄腫細胞上に発現した抗原を標的とするモノＣＡＲ−Ｔ細胞、タンデムＣＡＲ−Ｔ細胞及びデュアルＣＡＲ−Ｔ細胞の別の例については、本明細書に記載する。通常、２種以上の抗原を欠失または抑制した例は、これらのＣＡＲ−Ｔ細胞のための、より高い同胞殺し抵抗性の利点を有する可能性がより高い。
【０３４７】
実施例４−ゲノム編集デュアルＣＡＲ−Ｔ細胞またはゲノム編集タンデムＣＡＲ−Ｔ細胞を用いた患者（複数可）の治療
図１及び図２に示す、上記の方法により作製した細胞を用いて、患者を治療してもよい。例えば、デュアルＣＡＲ−Ｔ細胞またはタンデムＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖させた集団を患者に注入してもよい。
【０３４８】
デュアルＣＡＲ−Ｔ細胞またはタンデムＣＡＲ−Ｔ細胞は、アロ反応性を誘導せずに、がん細胞を標的とする。例えば、ＣＤ２＊ＣＤ３ε−ｄＣＡＲＴΔＣＤ２ΔＣＤ３ε細胞は、ＣＤ２表面抗原及びＣＤε表面抗原を保有するがん細胞（及びその他の非がん細胞）を標的とし得る。
【０３４９】
実施例５−Ｔ−ＡＬＬの異種モデルを用いたＣＤ２＊ＣＤ３Δ−ｄＣＡＲＴΔＣＤ２ΔＣＤ３εの有効性試験
Ｔ−ＡＬＬの異種モデルを用いたＣＤ２＊ＣＤ３Δ−ｄＣＡＲＴΔＣＤ２ΔＣＤ３εの有効性試験：５×１０５のＣｌｉｃｋ  Ｂｅｅｔｌｅ  Ｒｅｄルシフェラーゼ（ＣＢＲ）標識ジャーカット（Ｔ−ＡＬＬ−ＦＡＣＳにより９９％  ＣＤ２＋、９９％  ＣＤ３）細胞をＮＳＧレシピエントにＩ．Ｖ．注射してから、ＣＤ２＊ＣＤ３ε−ｄＣＡＲＴΔＣＤ２ΔＣＤ３ε（ＷＣ５またはＷＣ１３）対照細胞、ＣＤ３ＣＡＲＴΔＣＤ２ΔＣＤ３ε（ＵＣＡＲＴ３）対照細胞、ＣＤ２ＣＡＲＴΔＣＤ２ΔＣＤ３ε（ＵＣＡＲＴ２）対照細胞、または、非標的ＣＤ１９−ＣＡＲΔＣＤ２ΔＣＤ３ε（ＵＣＡＲＴ１９）対照細胞を、＋４日目にＩ．Ｖ．注入する。ＣＤ１９−ＣＡＲΔＣＤ２ΔＣＤ３εを投与されたマウスまたは腫瘍のみを注入されたマウスとは対照的に、ＣＤ２＊ＣＤ３ε−ｄＣＡＲＴΔＣＤ２ΔＣＤ３εを投与されたマウスは、図１３に示すとおり、生物発光イメージングを用いて測定する際に、有意に長期間にわたる生存及び全身腫瘍組織量の低下を示す。今後のモデルでは、ＣＤ２＊ＣＤ３ε−ｄＣＡＲＴΔＣＤ２ΔＣＤ３εは、ＣＤ３ＣＡＲＴΔＣＤ２ΔＣＤ３ε、ＣＤ２ＣＡＲＴΔＣＤ２ΔＣＤ３εに対する生存優位性をもたらし得、ＣＤ２（ＣＤ２ＣＡＲＴΔＣＤ２ΔＣＤ３ε）またはＣＤ３（ＣＤ３ＣＡＲＴΔＣＤ２ΔＣＤ３ε）のいずれかの標的細胞を欠失したこのモデルのタイプは、全身腫瘍組織量を低下させ得る。
【０３５０】
実施例６−ゲノム編集モノＣＡＲ−Ｔ細胞
ＣＡＲの標的抗原でありＣＡＲ−Ｔ細胞上に発現した、１種または複数種の表面タンパク質を欠失していない、欠失した、または抑制した、血液悪性腫瘍上に発現した抗原を標的とするゲノム編集モノＣＡＲ−Ｔ細胞の例については、以下に示す。通常、２種以上の抗原を欠失または抑制した例は、これらのＣＡＲ−Ｔ細胞のための、より高い同胞殺し抵抗性の利点を有する可能性がより高い。
【０３５１】
実施例７−活性化前の編集により作製したゲノム編集ＵＣＡＲＴ２／３細胞
０日目に、解凍用の緩衝液中で細胞を解凍した。その後、細胞を培地に再懸濁し、２時間静置した。細胞を回収してカウントした。必要な数の細胞を、室温、１００×ｇで１０分間、遠心分離にかけた。上清を完全に除去し、細胞をＰＢＳ（１ｍｌ）中に再懸濁してから微量遠心チューブに移し、室温、１００×ｇで１０分間、遠心分離にかけた。上清を完全に除去してから、緩衝液Ｐ３中に細胞を再懸濁し、カウントを行って、１ｍＬあたり５×１０７にカウントを調節した。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡを入れたチューブに１００μｌの細胞プール容量を加え、軽く混合してから、全てをＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅ（商標）に移し、それを軽く叩いて気泡を除去した。その後、プログラム（ヒトＴ細胞刺激ＥＯ−１１５）を使用してエレクトロポレーションを開始した。この手順の後、予め温めた培地に活性化した細胞を移してから、２ｍＬのアリコートで１２ウェルプレートに分配した。アリコートした試料を２４時間静置した。
【０３５２】
１日目に、表１４に示すとおり、Ｔ  Ｃｅｌｌ  ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）を用いて細胞を活性化させた。
【表１４】
2021525524.tif 000039
【０３５３】
２日目に、それぞれのｍｌの培地用に１μｌのポリブレンを加えた（８ｍｇ／ｍｌストック）。必要量のウイルスを加えて、必要とされるＭ．Ｏ．Ｉ（感染多重度）を得た。細胞及びウイルスを混合し、３７℃のインキュベータに戻した。
【０３５４】
３日目に、活性化細胞を洗浄して刺激を除去した。
【０３５５】
１２日目に、ＦＡＣＳ解析が高純度のＣＤ３−ＣＤ２−／ＣＡＲ−Ｔ細胞を示したが、図５（クローン５及びクローン６）、図６（クローン７及びクローン８）、図７（クローン１３及びクローン１４）、及び図８（クローン１５及びクローン１６）を参照されたい。（５１Ｃｒ）標識ゲノム編集ジャーカット細胞（ΔＣＤ２、ΔＣＤ３、及びΔＣＤ２ΔＣＤ３）を用いて、標準的な４時間のクロム放出（５１Ｃｒ）アッセイを実施した。これらの実験は、互いとは無関係に、ＣＤ２標的及びＣＤ３標的に対する機能的な腫瘍殺傷効果を示した（図９Ａ、図９Ｂ、図９Ｃ、及び図９Ｄを参照のこと）。
【０３５６】
実施例８−ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞の腫瘍細胞殺傷
先ず、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ−Ｔのｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効性について、５１Ｃｒ標識ＭＭ．１Ｓ標的細胞を用いた標準的な４時間のクロム放出（５１Ｃｒ）アッセイを使用して、試験を行った。ｉｎ  ｖｉｖｏ追跡を可能とするために、ＧＦＰに融合したＣｌｉｃｋ  Ｂｅｅｔｌｅ  Ｒｅｄルシフェラーゼを発現するようにヒト骨髄腫細胞株（ＢＣＭＡ＋／ＣＤ１９−）を修飾した（ＭＭ．１Ｓ−ＣＧ）。ＣＡＲ−Ｔ細胞を５１Ｃｒ標識ＭＭ．１Ｓ−ＣＧ細胞と、エフェクター（ＣＡＲ−Ｔ）対標的（ＭＭ．１Ｓ−ＣＧ）の比率の範囲で、４時間培養し、ＭＭ．１Ｓ−ＣＧ細胞死のマーカーとして、放出５１Ｃｒを測定した（図１０Ｂ）。複数のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）の比率において、効率的な殺傷が認められた。非形質導入活性化Ｔ細胞及びＣＤ１９−ＣＡＲ−Ｔを陰性対照として使用したが、ＭＭ．１Ｓ−ＣＧ細胞の殺傷を誘導しなかった。次に、５００，０００のＭＭ．１Ｓ−ＣＧヒト骨髄腫細胞をＮＳＧマウスに移植（Ｉ．Ｖ．）することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性についての試験を行った。２８日後、全身腫瘍組織量が増加した際に、マウスを治療せずに放置する、または、２×１０６のＣＤ１９−ＣＡＲ−ＴもしくはＢＣＭＡ  ＣＡＲ−Ｔで治療した。５０日目あたりに死亡した対照と比較して、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ−Ｔで治療した７匹全てのマウスは、ほぼ１５０日間またはそれ以上まで生存した（図１０Ｃ）。ＢＣＭＡ  ＣＡＲ−Ｔコホートにおいて死亡した１匹のマウスの死因は不明である。フローサイトメトリー解析により、そのマウスにＧＦＰ＋腫瘍細胞がないことが明らかとなった。経時的な生物発光イメージング（ＢＬＩ）により、実験期間中にわたり決して上昇しなかったバックグラウンドレベルに対するシグナルの強力な低下が明らかとなった（図１０Ｄ）。
【０３５７】
実施例９−ＣＳ１−ＣＡＲ−Ｔ細胞の腫瘍細胞殺傷
５×１０５のＭＭ．１Ｓ−ＣＧをＮＳＧマウスに注射することにより、ＣＳ１−ＣＡＲ−Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性、２８日後、全身腫瘍組織量が増加した際（ＢＬＩシグナル１０１０光子束）に、２×１０６のＣＳ１−ＣＡＲ−Ｔ細胞または陰性対照ＣＤ１９−ＣＡＲ−Ｔ細胞を注射した。ＣＳ１−ＣＡＲ−Ｔ細胞の特異度を試験するための方法として、マウスにまた、ＣＳ１を欠いたＭＭ．１Ｓ−ＣＧ細胞（Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ技術を使用した、ＭＭ．１Ｓ−ＣＧΔＣＳ１）を移植した。ＣＳ１−ＣＡＲ−Ｔ細胞で治療した全てのマウス（ｎ＝１０）が＞９０日間生存した（図１１Ｂ）一方で、ＣＤ１９対照マウス（ｎ＝８）の中央生存は４３日間であった。本発明者らは、上記のＣＳ１−ＣＡＲ−ＴまたはＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔを用いて、ＭＭ．１Ｓ−ＣＧΔＣＳ１を移植したマウスの治療を行った。それらマウスの生存は、対照マウスと同様（４９日間）であり、ｉｎ  ｖｉｖｏ特異度を示した。経時的な生物発光イメージング（ＢＬＩ）は、ＣＳ１−ＣＡＲ−Ｔ治療マウスが、光子束の３対数の低下、及び骨髄腫瘍の排除を示したことを示した（図１１Ｃ）。ＣＳ１の発現を維持する髄外腫瘍を発症したＣＳ１−ＣＡＲ−Ｔマウスのサブセットは、抗原回避が生じなかったことを示唆した。
【０３５８】
実施例１０−ＢＣＭＡ及びＣＳ１を標的とするタンデム（ｔＣＡＲ）の有効性及び細胞殺傷
骨髄腫ＣＡＲ−Ｔ細胞の有効性及び殺傷を向上させようとして、ＢＣＭＡ及びＣＳ１を標的とする、タンデムで２種のｓｃＦｖを発現する二重標的化ＣＡＲ−Ｔ（ｔＣＡＲ）を設計した。対照として、単標的化ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−Ｔ細胞と単標的化ＣＳ１−ＣＡＲ−Ｔ細胞が並んだタンデムＣＡＲの試験を行った。ＣＤ１９−ＣＡＲ−Ｔ細胞を陰性対照として使用した。先ず、それぞれのｓｃＦｖがｔＣＡＲにおいて発現していることを確認した。これを実施するために、図１２Ａに記載のそれぞれのＣＡＲ構築物を発現するレンチウイルスにジャーカット細胞を感染させた。それぞれ別々の蛍光性蛍光体で標識したヒト組換えＢＣＭＡタンパク質及びヒト組換えＣＳ１タンパク質と共に、ＣＡＲ−Ｔ細胞を培養した。陰性対照ＣＡＲ−Ｔ細胞をゲーティング（青色）し、実験のＣＡＲ−Ｔ細胞をオーバーレイ（赤色）した。予想どおり、ＣＤ１９  ＣＡＲを発現するジャーカット細胞は、ＢＣＭＡタンパク質またはＣＳ１タンパク質のいずれにも結合しなかった（下部左側の象限、図１２Ｂ）。ＢＣＭＡ  ＣＡＲタンパク質を発現するジャーカット細胞は、ＢＣＭＡタンパク質に結合した（上部左側の象限、図１２Ｂ）。ＣＳ１  ＣＡＲタンパク質を発現するジャーカット細胞は、ＣＳ１タンパク質に結合した（下部右側の象限、図１２Ｂ）。タンデムＢＣＭＡ−ＣＳ１  ＣＡＲタンパク質を発現するジャーカット細胞は、両方の組換えタンパク質に結合し（上部右側の象限、図１２Ｂ）、両方のｓｃＦｖの発現を示唆した。
【０３５９】
標準的な４時間のクロム放出（５１Ｃｒ）アッセイを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効性について、単一ＣＡＲ−Ｔ細胞及びタンデムＣＡＲ−Ｔ細胞の試験を行った。これらの実験では、エフェクター対標的細胞の比率（Ｅ：Ｔ比率）の範囲で、ＣＡＲ−Ｔ細胞を培養した。ＢＣＭＡ−ＣＳ１  ｔＣＡＲＴ細胞は、両方の単標的化ＣＡＲ−Ｔ細胞と同様の有効性で、ＭＭ．１Ｓ−ＣＧ細胞を殺傷した。追加の実験により、ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性において、二重標的化ＢＣＭＡ−ＣＳ１  ＣＡＲ−Ｔ細胞が最適化されるであろう。
【０３６０】
実施例１１−ｇＲＮＡ選択のためのオフターゲット解析
Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ＆  ｉＰＳＣにおいて、ガイドＲＮＡを設計して活性を確認した。Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ＆  ｉＰＳＣにおいて、ガイドＲＮＡを設計して活性を確認した。任意のｇＲＮＡに対して相補的な配列は、標的遺伝子座を含むがこれらに限定されないゲノム中にわたり存在し得る。短い配列はオフターゲットにハイブリダイズする可能性がより高い。同様に、ｇＲＮＡ内のある程度長い配列は、ゲノム中にわたり、完全マッチ（長＿０）またはニアマッチ（それぞれ、単一のヌクレオチド差または２つのヌクレオチド差を表す、長＿１、長＿２）を有し得る。これらもまたオフターゲットにハイブリダイズする、要するに、関係ない遺伝子の編集をもたらして編集効率を低下させる場合がある。
【０３６１】
ｈＣＤ２の２つのエキソン（ＣＦ５８及びＣＦ５９）について、選択したｇＲＮＡのオフターゲット解析を実施して、完全マッチであるまたは最大１もしくは２つのミスマッチを含有し、標的部位を含み得る、ヒトゲノムにおける部位の数を決定した。エキソンＣＦ５８の結果を表１５に列挙し、エキソンＣＦ５９の結果を表１６に列挙する。
【表１５−１】
2021525524.tif 000040
【表１５−２】
2021525524.tif 000041
【表１６−１】
2021525524.tif 000042
【表１６−２】
2021525524.tif 000043
【０３６２】
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）により、表１５及び表１６のｇＲＮＡ配列をｇＲＮＡ活性に正規化した（ＮＨＥＪに対する正規化率）。ＧＦＰを対照として使用した。シークエンシング解析後、オフターゲットプロファイルに基づき、以下のｇＲＮＡ、ＣＦ５８．ＣＤ２．ｇ１（４１．２％）、ＣＦ５８．ＣＤ２．ｇ２３（１３．２％）、ＣＦ５９．ＣＤ２．ｇ２０（２６．６％）、ＣＦ５９．ＣＤ２．ｇ１３（６６．２％）、ＣＦ５９．ＣＤ２．ｇ１７（１７．５％）、を推奨した。１５％以上の正規化ＮＨＥＪ頻度を有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、細胞株及び動物モデルの作製プロジェクト用の良好な候補である。
【０３６３】
ｈＣＤ３Ｅについて、選択したｇＲＮＡのオフターゲット解析を実施して、完全マッチであるまたは最大１もしくは２つのミスマッチを含有し、標的部位を含み得る、ヒトゲノムにおける部位の数を決定した。ｈＣＤ３Ｅの結果を表１７に列挙する。
【表１７】
2021525524.tif 000044
【０３６４】
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）により、表１７のｇＲＮＡ配列をｇＲＮＡ活性に正規化した（ＮＨＥＪに対する正規化率）。ＧＦＰを対照として使用した。シークエンシング解析後、オフターゲットプロファイルに基づき、以下のｇＲＮＡ、ＭＳ１０４４．ＣＤ３Ｅ．ｓｐ２８（＞１５％）、及びＭＳ１０４４．ＣＤ３Ｅ．ｓｐ１２（＞１５％）、を推奨した。１５％以上の正規化ＮＨＥＪ頻度を有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、細胞株及び動物モデルの作製プロジェクト用の良好な候補である。
【０３６５】
ｈＣＤ５の３つのエキソン（エキソン３、エキソン４、及びエキソン５）について、選択したｇＲＮＡのオフターゲット解析を実施して、完全マッチであるまたは最大１もしくは２つのミスマッチを含有し、標的部位を含み得る、ヒトゲノムにおける部位の数を決定した。エキソン３の結果を表１８に列挙し、エキソン４の結果を表１９に列挙し、エキソン５の結果を表２０に列挙する。
【表１８−１】
2021525524.tif 000045
【表１８−２】
2021525524.tif 000046
【表１８−３】
2021525524.tif 000047
【表１９】
2021525524.tif 000048
【表２０−１】
2021525524.tif 000049
【表２０−２】
2021525524.tif 000050
【表２０−３】
2021525524.tif 000051
【０３６６】
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）により、表１８、表１９、及び表２０のｇＲＮＡ配列をｇＲＮＡ活性に正規化した（ＮＨＥＪに対する正規化率）。ＧＦＰを対照として使用した。シークエンシング解析後、オフターゲットプロファイルに基づき、以下のｇＲＮＡ、エキソン３：ＳＰ５９７．ｈＣＤ５．ｇ２（７６．５％）、ＳＰ５９７．ｈＣＤ５．ｇ２２（３６．３％）、ＳＰ５９７．ｈＣＤ５．ｇ３９（１６．０％）、ＳＰ５９７．ｈＣＤ５．ｇ４６、エキソン４：ＳＰ５９８．ｈＣＤ５．ｇ７、ＳＰ５９８．ｈＣＤ５．ｇ１０（５８．５％）、エキソン５：ＳＰ５９９．ｈＣＤ５．ｇ５（５１．０％）、ＳＰ５９９．ｈＣＤ５．ｇ３０、ＳＰ５９９．ｈＣＤ５．ｇ４２、ＳＰ５９９．ｈＣＤ５．ｇ５８（４１．０％）、を推奨した。
【０３６７】
ｈＣＳＦ２について、選択したｇＲＮＡのオフターゲット解析を実施して、完全マッチであるまたは最大１もしくは２つのミスマッチを含有し、標的部位を含み得る、ヒトゲノムにおける部位の数を決定した。ｈＣＳＦ２の結果を表２１に列挙する。
【表２１】
2021525524.tif 000052
【０３６８】
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）により、表２１のｇＲＮＡ配列をｇＲＮＡ活性に正規化した（ＮＨＥＪに対する正規化率）。ＧＦＰを対照として使用した。シークエンシング解析後、オフターゲットプロファイルに基づき、以下のｇＲＮＡ、ＭＳ１０８６．ＣＳＦ２．ｓｐ８（＞１５％）、及びＭＳ１０８６．ＣＳＦ２．ｓｐ１０（＞１５％）、を推奨した。
【０３６９】
ｈＣＴＬＡ４の２つのエキソン（エキソン１及びエキソン２）について、選択したｇＲＮＡのオフターゲット解析を実施して、完全マッチであるまたは最大１もしくは２つのミスマッチを含有し、標的部位を含み得る、ヒトゲノムにおける部位の数を決定した。ｈＣＴＬＡ４のエキソン１の結果を表２２に列挙し、ｈＣＴＬＡ４のエキソン２の結果を表２３に列挙する。
【表２２】
2021525524.tif 000053
【表２３−１】
2021525524.tif 000054
【表２３−２】
2021525524.tif 000055
【０３７０】
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）により、表２２及び表２３のｇＲＮＡ配列をｇＲＮＡ活性に正規化した（ＮＨＥＪに対する正規化率）。ＧＦＰを対照として使用した。シークエンシング解析後、オフターゲットプロファイルに基づき、以下のｇＲＮＡ、エキソン１：ＳＰ６２１．ｈＣＴＬＡ４．ｇ２（＞１５％）、及びＳＰ６２１．ｈＣＴＬＡ４．ｇ１２（＞１５％）、エキソン２：ＳＰ６２２．ｈＣＴＬＡ４．ｇ２（＞１５％）、ＳＰ６２２．ｈＣＴＬＡ４．ｇ９（＞１５％）、及びＳＰ６２２．ｈＣＴＬＡ４．ｇ３３（＞１５％）、を推奨した。
【０３７１】
ｈＰＤＣＤ１の２つのエキソン（ＣＦ６０及びＣＦ６１）について、選択したｇＲＮＡのオフターゲット解析を実施して、完全マッチであるまたは最大１もしくは２つのミスマッチを含有し、標的部位を含み得る、ヒトゲノムにおける部位の数を決定した。エキソンＣＦ６０の結果を表２４に列挙し、エキソンＣＦ６１の結果を表２５に列挙する。
【表２４】
2021525524.tif 000056
【表２５−１】
2021525524.tif 000057
【表２５−２】
2021525524.tif 000058
【表２５−３】
2021525524.tif 000059
【０３７２】
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）により、表２４及び表２５のｇＲＮＡ配列をｇＲＮＡ活性に正規化した（ＮＨＥＪに対する正規化率）。ＧＦＰを対照として使用した。シークエンシング解析後、オフターゲットプロファイルに基づき、以下のｇＲＮＡ、ＣＦ６０．ＰＤＣＤ１．ｇ１２（６５．６％）、ＣＦ６０．ＰＤＣＤ１．ｇ３（６９．２％）、ＣＦ６１．ＰＤＣＤ１．ｇ６、ＣＦ６１．ＰＤＣＤ１．ｇ２（７２．７％）、及びＣＦ６１．ＰＤＣＤ１．ｇ３５（２４．０％）、を推奨した。
【０３７３】
ｈＴＩＭ３の２つのエキソン（エキソン２及びエキソン３）について、選択したｇＲＮＡのオフターゲット解析を実施して、完全マッチであるまたは最大１もしくは２つのミスマッチを含有し、標的部位を含み得る、ヒトゲノムにおける部位の数を決定した。エキソン２の結果を表２６に列挙し、エキソン３の結果を表２７に列挙する。
【表２６−１】
2021525524.tif 000060
【表２６−２】
2021525524.tif 000061
【表２６−３】
2021525524.tif 000062
【表２７】
2021525524.tif 000063
【０３７４】
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）により、表２６及び表２７のｇＲＮＡ配列をｇＲＮＡ活性に正規化した（ＮＨＥＪに対する正規化率）。ＧＦＰを対照として使用した。シークエンシング解析後、オフターゲットプロファイルに基づき、以下のｇＲＮＡ、エキソン２：ＳＰ６１９．ｈＴＩＭ３．ｇ１２（４５．０％）、ＳＰ６１９．ｈＴＩＭ３．ｇ２０（６０．９％）、及びＳＰ６１９．ｈＴＩＭ３．ｇ４９（４５．４％）、エキソン３：ＳＰ６２０．ｈＴＩＭ３．ｇ５（５８．０％）、及びＳＰ６２０．ｈＴＩＭ３．ｇ７（２．９％）、を推奨した。
【０３７５】
当業者は、上で開示した方法を適宜変更して、本明細書で開示するその他のモノ、デュアル、及びタンデムＣＡＲ−Ｔ細胞を作製し、それらの活性を確認することができる。
【０３７６】
上記実施例において、その特定の実施形態の特定の詳細を参照しながら、本発明を説明してきたが、変更及び変化形態が本発明の趣旨及び範囲に包含されるということを理解されたい。
【図１】
2021525524.tif 000064
【図２】
2021525524.tif 000065
【図３】
2021525524.tif 000066
【図４】
2021525524.tif 000067
【図５】
2021525524.tif 000068
【図６】
2021525524.tif 000069
【図７】
2021525524.tif 000070
【図８】
2021525524.tif 000071
【図９Ａ】
2021525524.tif 000072
【図９Ｂ】
2021525524.tif 000073
【図９Ｃ】
2021525524.tif 000074
【図９Ｄ】
2021525524.tif 000075
【図１０Ａ】
2021525524.tif 000076
【図１０Ｂ】
2021525524.tif 000077
【図１０Ｃ】
2021525524.tif 000078
【図１０Ｄ】
2021525524.tif 000079
【図１１Ａ】
2021525524.tif 000080
【図１１Ｂ】
2021525524.tif 000081
【図１１Ｃ】
2021525524.tif 000082
【図１２Ａ】
2021525524.tif 000083
【図１２Ｂ】
2021525524.tif 000084
【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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