(57)【要約】  本発明は、Epstein-Barrウイルス（ＥＢＶ）の少なくともＢ細胞における、かつ、潜在的には感受性上皮細胞等の他の感受性細胞にもおける再活性化に関連する疾患及び／又は障害に罹患している患者を治療する方法における使用のための、単離された三機能二重特異性抗体であって、前記方法が、前記患者の富化されたＢ細胞の自家細胞調製物を提供することと、前記富化されたＢ細胞を、前記三機能二重特異性抗体と共に、前記三機能二重特異性抗体と前記富化されたＢ細胞との間の物理的相互作用を確立するのに十分な時間にわたってインキュベートして、インキュベーション混合物を得ることと、インキュベーション後に得られた前記インキュベーション混合物を同じ前記患者内へと移すこととを含み、前記三機能二重特異性抗体が、（ａ）Ｂ細胞表面抗原を介してＢ細胞に結合する第１の結合アームと、（ｂ）Ｔ細胞表面抗原を介してＴ細胞に結合する第２の結合アームと、（ｃ）Ｆｃ受容体陽性細胞に結合するＦｃ部分とを含む、抗体を開示する。本発明はまた、ＥＢＶのＢ細胞における再活性化に関連する疾患及び／又は障害に罹患している患者の治療における使用のための、前記単離された三機能二重特異性抗体を含む医薬組成物、並びに、前記医薬組成物を調製するためのex-vivo法を開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Epstein-Barrウイルス（ＥＢＶ）の少なくともＢ細胞における、かつ、潜在的には感受性上皮細胞等の他の感受性細胞にもおける再活性化に関連する疾患及び／又は障害に罹患している患者を治療する方法における使用のための、単離された三機能二重特異性抗体であって、
前記方法が、
前記患者の富化されたＢ細胞の自家細胞調製物を提供することと、
前記富化されたＢ細胞を、前記三機能二重特異性抗体と共に、前記三機能二重特異性抗体と前記富化されたＢ細胞との間の物理的相互作用を確立するのに十分な時間にわたってインキュベートして、インキュベーション混合物を得ることと、
インキュベーション後に得られた前記インキュベーション混合物を同じ前記患者内へと移すこととを含み、
前記三機能二重特異性抗体が、
（ａ）Ｂ細胞表面抗原を介してＢ細胞に結合する第１の結合アームと、
（ｂ）Ｔ細胞表面抗原を介してＴ細胞に結合する第２の結合アームと、
（ｃ）Ｆｃ受容体陽性細胞に結合するＦｃ部分とを含み、
ＥＢＶのＢ細胞における再活性化に関連する前記疾患及び／又は障害が、関節リウマチ、橋本病、１型糖尿病及び多発性硬化症からなる群の１つ以上の自己免疫疾患から選択される、又は、
ＥＢＶのＢ細胞における再活性化に関連する前記疾患及び／又は障害が、慢性前立腺炎、慢性膀胱炎、慢性肝炎（非アルコール性）、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、慢性神経炎症及び代謝症候群からなる群の１つ以上の慢性炎症性疾患から選択される、又は、
ＥＢＶのＢ細胞における再活性化に関連する前記疾患及び／又は障害が、シェーグレン症候群、重症筋無力症、クローン病、尋常性白斑、２型糖尿病、乳管の慢性炎症、膣扁平苔癬、慢性膵炎、慢性気管支炎及び慢性風邪様症状、慢性疲労症候群、慢性乾性咳嗽、慢性鼻炎、寝汗、睡眠障害（不眠症）、多発神経障害性疼痛、（例えば、指、爪先及び顔の）浮腫、子宮内膜症、卵巣嚢胞、生理不順、脱毛、記憶障害、目乾燥及び口腔乾燥、片頭痛、一般的な脱毛症、座瘡、体重増加、集中力欠如、インスリン抵抗性、下痢及び慢性帯状疱疹からなる群の１つ以上の疾患及び障害から選択される、
抗体。
【請求項２】
同じ前記患者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の自家細胞調製物をさらに含み、前記インキュベーション混合物を同じ前記患者内へと移す前に、前記ＰＢＭＣが、前記富化されたＢ細胞と前記三機能二重特異性抗体との前記インキュベーション混合物内へ、前記ＰＢＭＣと前記三機能二重特異性抗体との間の物理的相互作用を確立するのに十分な時間にわたって添加され、該時間は、好ましくは約１分〜約６０分の間である、請求項１に記載の使用のための抗体。
【請求項３】
前記三機能二重特異性抗体と前記富化されたＢ細胞との物理的相互作用を確立するためのインキュベーション時間が、約１分〜約６０分の間である、請求項１又は２に記載の使用のための抗体。
【請求項４】
前記抗体が、約０．１μｇ〜約１００μｇの間の量で投与される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用のための抗体。
【請求項５】
前記抗体がラット／マウス二重特異性抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用のための抗体。
【請求項６】
前記抗体が、Ｆｃγ受容体タイプＩ，ＩＩａ及び／又はＩＩＩのＦｃ部分に結合部位を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用のための抗体。
【請求項７】
前記抗体が、単球、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞及び／又は活性化好中球を、それらのＦｃγ受容体タイプＩ，ＩＩａ及び／又はＩＩＩによって結合可能である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用のための抗体。
【請求項８】
前記抗体が、そのＦｃ部分における以下のアイソタイプの組み合わせの群の少なくとも１種から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用のための抗体：
ラット−ＩｇＧ２ｂ／マウス−ＩｇＧ２ａ、
ラット−ＩｇＧ２ｂ／マウス−ＩｇＧ２ｂ、
ラット−ＩｇＧ２ｂ／ヒト−ＩｇＧ１、
ヒト−ＩｇＧ１／ヒト−ＩｇＧ１−［ヒンジ領域］−ヒト−ＩｇＧ３＊−［ＣＨ２−ＣＨ３］（＊＝白色人種のアロタイプＧ３ｍ（ｂ＋ｇ）＝プロテインＡに結合しない）、
マウス−［ＶＨ−ＣＨ１，ＶＬ−ＣＬ］−ヒト−ＩｇＧ１／ラット−［ＶＨ−ＣＨ１，ＶＬ−ＣＬ］−ヒト−ＩｇＧ１−［ヒンジ領域］−ヒト−ＩｇＧ３＊−［ＣＨ２−ＣＨ３］（＊＝白色人種のアロタイプＧ３ｍ（ｂ＋ｇ）＝プロテインＡに結合しない）、及び、
マウス−［ＶＨ−ＶＬ］−ヒト−［ＣＨ１−ＣＬ］−ヒト−ＩｇＧ１／ラット−［ＶＨ−ＣＨ１，ＶＬ−ＣＬ］−ヒト−ＩｇＧ１−［ヒンジ領域］−ヒト−ＩｇＧ３＊−［ＣＨ２−ＣＨ３］（＊＝白色人種のアロタイプＧ３ｍ（ｂ＋ｇ）＝プロテインＡに結合しない）。
【請求項９】
前記Ｂ細胞表面抗原が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ７２、ＣＤ７５、ＣＤ７８、ＣＤ７９及びＣＤ８０からなる群から選択され、好ましくは、前記Ｂ細胞表面抗原がＣＤ２０である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用のための抗体。
【請求項１０】
前記Ｔ細胞表面抗原が、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌ及びＣＤ４４からなる群から選択され、好ましくは、前記Ｔ細胞表面抗原がＣＤ３である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用のための抗体。
【請求項１１】
前記抗体が、抗ＣＤ３×抗ＣＤ２０、抗ＣＤ３×抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３×抗ＣＤ２２、抗ＣＤ３×抗ＣＤ３８二重特異性抗体からなる群から選択され、好ましくは、前記抗体が抗ＣＤ３×抗ＣＤ２０二重特異性抗体であり、さらに好ましくは、ラット−ＩｇＧ２ｂ／マウス−ＩｇＧ２ａのアイソタイプの組み合わせを備えている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用のための抗体。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の、ＥＢＶの少なくともＢ細胞における、かつ、潜在的には感受性上皮細胞等の他の感受性細胞にもおける再活性化に関連する疾患及び／又は障害に罹患している患者を治療する方法における使用のための、抗体、及び、選択的には薬学的に許容される担体、並びに／又は、賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
前記医薬組成物が「キット・オブ・パーツ」の形態である、請求項１２に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１２又は１３に記載の、ＥＢＶの少なくともＢ細胞における、かつ、潜在的には感受性上皮細胞等の他の感受性細胞にもおける再活性化に関連する疾患及び／又は障害に罹患している患者を治療する方法における使用のための医薬組成物を調製するためのex-vivo法であって、
前記方法が、
前記患者の富化されたＢ細胞の自家細胞調製物を提供することと、
前記富化されたＢ細胞を、前記三機能二重特異性抗体と共に、前記三機能二重特異性抗体と前記富化されたＢ細胞との間の物理的相互作用を確立するのに十分な時間にわたってインキュベートして、インキュベーション混合物を得ることとを含み、
前記三機能二重特異性抗体が、
（ａ）Ｂ細胞表面抗原を介してＢ細胞に結合する第１の結合アームと、
（ｂ）Ｔ細胞表面抗原を介してＴ細胞に結合する第２の結合アームと、
（ｃ）Ｆｃ受容体陽性細胞に結合するＦｃ部分とを含み、
ＥＢＶのＢ細胞における再活性化に関連する前記疾患及び／又は障害が、関節リウマチ、橋本病、１型糖尿病及び多発性硬化症からなる群の１つ以上の自己免疫疾患から選択される、又は、
ＥＢＶのＢ細胞における再活性化に関連する前記疾患及び／又は障害が、慢性前立腺炎、慢性膀胱炎、慢性肝炎（非アルコール性）、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、慢性神経炎症及び代謝症候群からなる群の１つ以上の慢性炎症性疾患から選択される、又は、
ＥＢＶのＢ細胞における再活性化に関連する前記疾患及び／又は障害が、シェーグレン症候群、重症筋無力症、クローン病、尋常性白斑、２型糖尿病、乳管の慢性炎症、膣扁平苔癬、慢性膵炎、慢性気管支炎及び慢性風邪様症状、慢性疲労症候群、慢性乾性咳嗽、慢性鼻炎、寝汗、睡眠障害（不眠症）、多発神経障害性疼痛、（例えば、指、爪先及び顔の）浮腫、子宮内膜症、卵巣嚢胞、生理不順、脱毛、記憶障害、目乾燥及び口腔乾燥、片頭痛、一般的な脱毛症、座瘡、体重増加、集中力欠如、インスリン抵抗性、下痢及び慢性帯状疱疹からなる群の１つ以上の疾患及び障害から選択される、
ex-vivo法。
【請求項１５】
同じ前記患者のＰＢＭＣの自家細胞調製物をさらに含み、前記ＰＢＭＣが、前記富化されたＢ細胞と前記三機能二重特異性抗体との前記インキュベーション混合物内へ、前記ＰＢＭＣと前記三機能二重特異性抗体との間の物理的相互作用を確立するのに十分な時間にわたって添加され、該時間は、好ましくは約１分〜約６０分の間である、請求項１４に記載の医薬組成物を調製するためのex-vivo法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Epstein-Barrウイルス（ＥＢＶ）の少なくともＢ細胞における、かつ、潜在的には感受性上皮細胞等の他の感受性細胞にもおける再活性化に関連する疾患及び／又は障害に罹患している患者を治療する方法における使用のための三機能二重特異性抗体、該使用のための前記抗体を含む医薬組成物、並びに、該使用のための該医薬組成物を調製するためのex-vivo法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Epstein-Barrウイルス（ＥＢＶ）は、世界人口の高い割合（＞９０％）に終生感染を引き起こす二本鎖ＤＮＡヘルペスウイルスである。一次感染は、通常は小児期に起こり、ほとんど無症候性である。先進国では、これらの感染症は、症例の最大５０％においてしばしば青年期まで遅延しており、一部の者では、幾年にもわたって持続する重度の症状を生じさせる。
【０００３】
これらの遅延した一次感染の半分は症候性であって、急性伝染性単核球症（ＡＩＭ）又は腺熱として現れ、発熱、倦怠感、愁訴、咽頭炎及びリンパ節腫脹によって発現する。
【０００４】
適応免疫応答を高めるには時間がかかるため、潜伏期間中には、感染、溶解複製及び再感染のサイクルが細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞による干渉を受けることなく最初に進行する。その結果、ＡＩＭ中に潜伏感染されたメモリーＢ細胞の数は、末梢メモリーＢ細胞コンパートメントの半分又はそれ以上にまで増加する可能性がある（Hochberg et al., J.Virol., 78:5194, 2004）。
【０００５】
無症候性の一次ＥＢＶ感染とＡＩＭとの違いは、ＡＩＭではＥＢＶ感染Ｂ細胞の数がより多いことであり、その症状は、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＥＢＶ感染Ｂ細胞の大規模な破壊によるものであることが示唆されている（Hadinoto et al., Blood, 111:1420, 2008）。
【０００６】
ＥＢＶは、発癌性があると認められた最初のヒトＤＮＡウイルスであった。ＥＢＶは、様々なヒトの悪性腫瘍に関連していることが判明しており、そのような悪性腫瘍としては、例えば、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、未分化鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、唾液腺腫瘍、ホジキン病（ＨＤ）が挙げられる。しかしながら、ＥＢＶ関連疾患のリストはさらに増えている。
【０００７】
そのため、ＥＢＶは、再活性化現象後の免疫障害及び関連疾患の潜在的な誘発因子として議論されている。
【０００８】
そのような免疫障害の理由は、ＥＢＶの溶解サイクル（再活性化現象）の開始が制御されず反復されることにある可能性があり、このことは、健康なＥＢＶ感染者に見られる通常の安定したＥＢＶの潜在状態とは対照的である。
【０００９】
ＥＢＶは、ＣＤ２１表面分子を介してほぼ例外なくＢ細胞に感染する。したがって、著者らは、感染細胞内におけるＥＢＶ ｍＲＮＡのin situ検出法を適用して、所与の時点（血液サンプルを採取した時点）に対する感染Ｂ細胞の割合を推定した。健康なＥＢＶ感染者と同様に、感染Ｂ細胞の頻度は１〜５０／１０ｅ６ Ｂ細胞の範囲にあり（Cohen, NEJM, 2000）、感染Ｂ細胞の頻度が（例えば、１０００倍）高いことは、再活性化現象が急性であることの強力なヒントとなり得る。
【００１０】
２００３年、Michael Penderは、ＥＢＶによる自家反応性Ｂ細胞（Ｂ細胞の最大２０％）への感染が、感染した自家反応性Ｂ細胞のＢ細胞受容体の特異性に依存して、特定の組織の炎症の原因である可能性があると仮定した（Pender, Trends Immunol., 24:584, 2003）。
【００１１】
結果として、ＥＢＶに感染されて活性化された自家反応性Ｂ細胞により、様々な組織において（特に、遺伝的に感受性の高い高齢者（アルツハイマー病及びパーキンソン病の場合）では、考えられるメカニズムの１つとして）慢性炎症が誘発される可能性があり、そのため、起源が不安定な様々な疾患／症状の原因となる可能性がある。そのような疾患／症状の例としては、例えば、アルツハイマー病（Licastro et al., Oncosience, 3: 135-142, 2016）、パーキンソン病（Woulfe J., Neurol. Neuroimmunol. Neuroinflamm. 2016）、慢性疲労症候群、反復感染、睡眠障害、寝汗、リンパ腺の腫れ、慢性膀胱炎、慢性前立腺炎、乳管の慢性炎症、座瘡のような皮膚の炎症、脱毛、集中力欠如、記憶障害が挙げられる。
【００１２】
過去２０年間では、様々な自己免疫疾患についてのＥＢＶの関与に関するデータが、複数の出版物によって提示されており、例えば、関節リウマチ／シェーグレン症候群；多発性硬化症；全身性エリテマトーデス；１型糖尿病；クローン病／慢性大腸炎、乾癬、尋常性白斑、橋本病甲状腺炎、円形／一般的な脱毛症、及び、重症筋無力症について提示されている（Pender, Autoimmune Diseases, 2012）。
【００１３】
関節リウマチ（ＲＡ）／シェーグレン症候群
ＥＢＶがＲＡの病因に関与している可能性があるという最初の直接的な証拠の１つは、１９９７年からのTakei et al.の調査であった。著者らは、ＥＢＥＲ−１を標的とするin situハイブリダイゼーションにより、滑膜表層細胞の標本（ｎ＝３４）の２３．５％でＥＢＶを検出した。しかしながら、２０の変形性関節症及び対照群として使用された１つの乾癬性関節炎のいずれにおいても、ＥＢＶは検出されなかった（ｐ＜０．０５）。
【００１４】
Blaschke et al., (2000) による研究は、概してTakei et al.による結果を確認しており、滑液の細胞は、ＲＡ患者（ｎ＝５５）の３０％にＥＢＶ−ＤＮＡを保有していたのに対し、対照例（ｎ＝５５）では１６％であった（ｐ＝０．０２）。さらに、このグループは、健康な対照群と比較して、抗ＥＢＮＡ−１抗体について２倍の増加が見られた（ｐ＝０．０２９）。興味深いことに、ＲＡ患者の２４％は、ＥＢＶ感染の再活性化の血清学的証拠を有していたのに対し、対照群はその血清学的証拠を全く有していなかった（ｐ＝０．０２８）。
【００１５】
Balandraud et al.によるさらなる調査は、リアルタイムｑＰＣＲ法を使用した８４人のＲＡ患者と６９人の正常対照群を対象とした２００３年の研究において、ＲＡ患者では対照群と比較して、ＥＢＶ ＤＮＡ負荷がほぼ１０倍に増加したことを示した。ＥＢＶ負荷は経時的に安定しており、疾患修飾性抗リウマチ薬又はＨＬＡ−ＤＲの影響を受けなかった。そのため、ＲＡを患う患者において、抗体によって高度に認識されているが排除されないＥＢＶは、慢性免疫複合体疾患を引き起こす典型的な候補であり、抗ＥＢＶ抗体反応はＲＡの発症に最も関連性のある慢性自家抗体反応の１つと見なされるべきである（Van Boekel et al., Arthritis Res., 4:87, 2002）。最近のレビューでは、この分野について要約されている（Fuest, EuJMI, 4:267, 2011）。
【００１６】
多発性硬化症
ＭＳの病因におけるＥＢＶの関与もまた、大いに議論されている。ＭＳ患者における以下の所見は、そのような仮説を支持している。
ａ）脳内におけるＥＢＶ感染Ｂ細胞及び形質細胞の蓄積（Serafini et al., J. Exp. Med, 2007）
ｂ）血清及び脳脊髄液（ＣＳＦ）中における抗ＥＢＶ抗体レベルの上昇（Jaquiery et al., Eur. J. Immunol., 2010）
ｃ）ＥＢＶ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞免疫の変化（Jaquiery et al., 2010；Pender, J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 2009）
ｄ）対照群と比較したＭＳ患者の唾液中のＥＢＶ量の増加（Yea et al., Neurology, 2013）
【００１７】
現在、これらの発見及びＭＳの病因におけるＥＢＶの可能な役割を説明するために、以下の主要なメカニズムが議論されている。
（ｉ）ＣＮＳ抗原とＥＢＶ抗原間との交差反応性（擬態）
（ｉｉ）再活性化現象を伴うＥＢＶ感染の制御障害
（ｉｉｉ）ＥＢＶ特異的Ｔ細胞による脳内のバイスタンダー損傷
（ｉｖ）脳内の自家反応性Ｔ細胞に共刺激シグナルを与えることが可能な自家反応性Ｂ細胞のＥＢＶ感染
【００１８】
１型＋２型糖尿病
１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の発症とウイルス感染との関係は、過去２０年間において議論されてきた。ウイルスは、様々な方法でＴ１Ｄの病因に関与している可能性がある。ウイルス誘発性の自己免疫の場合、ＥＢＶは、例えば、ムンプスウイルス、コクサッキーウイルス、風疹ウイルス及びサイトメガロウイルスのような他のウイルスに加えて議論される（Jun et al., Diabetes Metab. Res. Rev., 2003）。真性糖尿病（１型及び２型）の発症の別の理由は、慢性全身性炎症であり得る。これに関連して、ＨＨＶ−６及びＥＢＶの再活性化について説明する。例えば、Heaseker et al., (2013) の最近の調査では、ＨＨＶ−６及びＥＢＶの高い抗体価と糖尿病との関連が見られた。
【００１９】
まとめると、既存のデータは、遺伝的要因及び（ビタミンＤレベルの低下、追加の感染症のような）さらなる補因子を合わせて、又は、比較的遅い（例えば、１０代又は成人期の）感染症に起因するＥＢＶに対する不均衡な免疫反応によって、既存のＥＢＶ感染の制御が弱まっていることによって様々な自己免疫疾患が誘発される可能性があることを示唆している。
【００２０】
今日まで、ＥＢＶの再活性化に関連する疾患に対して利用可能な治療薬は存在せず、Ｂ細胞におけるＥＢＶの再活性化に苛まれている患者の治療に使用するための薬剤を提供することの要求がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
したがって、本発明の第１の目的は、Ｂ細胞におけるＥＢＶの再活性化に苛まれている患者の治療に使用するための薬剤、特に、Ｂ細胞におけるＥＢＶの再活性化に関連する疾患の改善又は治療に使用するための薬剤を提供することである。この目的を達成するために、以下の特性を有することを特徴とする三機能二重特異性抗体が使用される。（ａ）Ｂ細胞表面抗原を介してＢ細胞に結合する。（ｂ）Ｔ細胞表面抗原を介してＴ細胞に結合する。（ｃ）該抗体のＦｃ部分を介してＦｃ受容体陽性細胞に結合する。
【００２２】
本発明の第２の目的は、Ｂ細胞におけるＥＢＶの再活性化に苛まれている患者の治療に使用するための医薬組成物を提供することである。この目的を達成するために、Ｂ細胞におけるＥＢＶの再活性化に苛まれている患者の治療に使用するための、前記抗体、及び、選択的には薬学的に許容される担体、並びに／又は、賦形剤を含む医薬調製物が提供される。
【００２３】
本発明の第３の目的は、Ｂ細胞におけるＥＢＶの再活性化の治療方法において使用するための前記医薬組成物を調製するためのex-vivo法を提供することである。この目的を達成するために、前記ex-vivo法は、Ｂ細胞におけるＥＢＶの再活性化に苛まれている患者の自家Ｂ細胞を、前記三機能二重特異性抗体と、前記三機能二重特異性抗体とＢ細胞との間の物理的相互作用を確立するのに十分な時間にわたって接触させることを含むインキュベーションステップを含む。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明者らは、ex-vivoで三機能二重特異性抗体を、ＥＢＶ感染Ｂ細胞を包含する富化された自家Ｂ細胞調製物と、前記三機能二重特異性抗体と前記ＥＢＶ感染Ｂ細胞との間の物理的相互作用を確立するのに十分な時間接触させ、その後に処理された自家細胞を同じ患者の体内へ再び移すことによって、Ｔ細胞及び補助細胞によるＥＢＶ感染Ｂ細胞の再標的化された殺傷を誘発することを見出した。富化された自家Ｂ細胞集団の再標的化された殺傷を、事例１に示す。この結果、ＥＢＶ由来の抗原は、例えば樹状細胞、皮膚又はマクロファージのランゲルハンス細胞、単球、ナチュラルキラー細胞及び／又は活性化好中球等の、Ｆｃ受容体陽性のプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって貪食される。最終的に、これらの取り込まれたＥＢＶ由来の抗原は処理されて、プロフェッショナルＡＰＣ（抗原提示細胞）によって新たに提示され、患者のＥＢＶに対するポリクローナル体液性及び細胞性免疫応答を引き起こす（図１）。その結果、ＥＢＶに対する既存だが潜在的に弱い又は不完全な免疫応答が強化され、ＥＢＶの再活性化を防止又は低減することによって、患者がＥＢＶをより適切に制御できるようになる。
【００２５】
本発明のさらなる態様及び実施形態は従属請求項に開示されており、以下の詳細な説明及び事例から理解され得るが、それらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
添付の図面は、本発明の実施形態を示しており、それらの実施形態のさらなる理解を伝える。詳細な説明と併せて、これらの図面は本発明の概念及び原理の説明として役立つ。他の実施形態及びさらなる利点は、これらの図面から導出され得る。
【００２７】
【図１】Ｂ細胞におけるＥＢＶの再活性化並びに関連する病気及び症状に罹患している患者の治療に使用するための、Ｂ細胞、Ｔ細胞及びＦｃ受容体陽性補助細胞に結合可能な三機能二重特異性抗体に関与する、治療的ワクチン接種の原理。
【図２Ａ】三機能二重特異性抗体に媒介されるin vitroでの富化された自家Ｂ細胞の殺傷。
【図２Ｂ】三機能二重特異性抗体に媒介されるin vitroでの富化された自家Ｂ細胞の殺傷。
【図２Ｃ】三機能二重特異性抗体に媒介されるin vitroでの富化された自家Ｂ細胞の殺傷。
【図３】ＥＢＶ−ＥＢＥＲ １＋２プローブを使用した事例２の患者からの富化されたＢ細胞のin situハイブリダイゼーション。
【図４】ＥＢＶ−ＥＢＥＲ １＋２プローブを使用した事例３の患者からの富化されたＢ細胞のin situハイブリダイゼーション。
【図５】ＥＢＶ−ＥＢＥＲ １＋２プローブを使用した事例４の患者からの富化されたＢ細胞のin situハイブリダイゼーション。
【図６】ＥＢＶ−ＥＢＥＲ １＋２プローブを使用した事例５の患者からの富化されたＢ細胞のin situハイブリダイゼーション。
【図７】ＥＢＶ−ＥＢＥＲ １＋２プローブを使用した事例６の患者からの富化されたＢ細胞のin situハイブリダイゼーション。
【図８】ＥＢＶ−ＥＢＥＲ １＋２プローブを使用した事例７の患者からの富化されたＢ細胞のin situハイブリダイゼーション。
【図９】ＥＢＶ−ＥＢＥＲ １＋２プローブを使用した事例７の患者からの富化されたＢ細胞のin situハイブリダイゼーション。
【図１０】ＥＢＶ−ＥＢＥＲ １＋２プローブを使用した事例８の患者からの富化されたＢ細胞のin situハイブリダイゼーション。
【図１１】ＥＢＶ−ＥＢＥＲ １＋２プローブを使用した事例９の患者からの富化されたＢ細胞のin situハイブリダイゼーション。
【図１２】ＥＢＶ−ＥＢＥＲ １＋２プローブを使用した事例９の患者からの富化されたＢ細胞のin situハイブリダイゼーション。
【図１３】ＥＢＶ−ＥＢＥＲ １＋２プローブを使用した事例１０の患者からの富化されたＢ細胞のin situハイブリダイゼーション。
【図１４】ＥＢＶ−ＥＢＥＲ １＋２プローブを使用した事例１０の患者からの富化されたＢ細胞のin situハイブリダイゼーション。
【図１５】ＥＢＶ−ＥＢＥＲ １＋２プローブを使用した事例１１の患者からの富化されたＢ細胞のin situハイブリダイゼーション。
【図１６】ＥＢＶ−ＥＢＥＲ １＋２プローブを使用した事例１１の患者からの富化されたＢ細胞のin situハイブリダイゼーション。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
定義
本発明を以下に詳細に説明するが、本発明は、これらは変更可能であって、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル及び試薬に限定されないことを理解されたい。本明細書で使用される用語もまた、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることを理解されたい。別段の定義がない限り、本明細書にて使用される全ての技術的及び科学的用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【００２９】
以下、本発明の要素について説明する。これらの要素は、特定の実施形態と共にリストされているが、それらは、追加の実施形態を作成するために、任意の方法及び任意の数で組み合わせられ得ることを理解されたい。様々に記載された事例及び好ましい実施形態は、本発明を明示的に記載された実施形態のみに限定するものと解釈されるべきではない。本説明は、明示的に記載された実施形態を任意の数の開示された及び／又は好ましい要素と組み合わせた実施形態をサポート及び包含すると理解されるべきである。さらに、本出願において記載された全ての要素についての任意の順列及び組み合わせが、文脈により別段の指示がされていない限り、本出願の説明によって開示されているとみなされるべきである。
【００３０】
本明細書及び以下の特許請求の範囲の全体を通して、文脈上別段の定めがない限り、用語「含む（“comprise”）」並びに「含む（“comprises”）」及び「含んでいる（“comprising”）」等の変形は、記載された部分、整数又はステップを含むことを意味するが、他の記載されていない部分、整数又はステップを除外することを意味しないと理解される。用語「からなる（“consist of”）」は、用語「含む（“comprise”）」の特定の実施形態であって、他の記載されていない部分、整数又はステップは除外される。本発明の文脈において、用語「含む（“comprise”）」は、用語「からなる（“consist of”）」を包含する。したがって、用語「含んでいる（“comprising”）」は、用語「含んでいる（“including”）」及び用語「からなる（“consisting”）」を包含し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、Ｘのみからなるものであってもよく、何らかの追加のもの（例えば、Ｘ＋Ｙ）を含んでいてもよい。
【００３１】
本発明を説明する文脈で（特に特許請求の範囲の文脈で）使用される用語“a”及び“an”及び“the”並びに同様の参照は、本明細書にて別段の指示がない限り、又は、文脈が明らかに矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方をカバーすると解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、単に範囲内にある個別の値を個々に参照する簡略表記法として提供することを意図している。本明細書にて別段の記載がない限り、個々の値は、本明細書に個別に記載されているかのように仕様に組み込まれる。本明細書のいかなる文言も、特許請求されていない要素が本発明の実施に不可欠であることを示すものとして解釈されるべきでない。
【００３２】
単語「実質的に」は、「完全に」を除外しない。例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくてもよい。必要に応じて、「実質的に」という言葉は、本発明の定義から省略されてもよい。
【００３３】
本開示で与えられる全ての値は、文脈からそうでないことが明らかな場合を除き、単語「約」が補われていると理解されるべきである。
【００３４】
本発明の第１の態様は、Epstein-Barrウイルス（ＥＢＶ）の少なくともＢ細胞における、かつ、潜在的には感受性上皮細胞等の他の感受性細胞にもおける再活性化に関連する疾患及び／又は障害に罹患している患者を治療する方法における使用のための、単離された三機能二重特異性抗体であって、
前記方法が、
前記患者の富化されたＢ細胞の自家細胞調製物を提供することと、
前記富化されたＢ細胞を、前記三機能二重特異性抗体と共に、前記三機能二重特異性抗体と前記富化されたＢ細胞との間の物理的相互作用を確立するのに十分な時間にわたってインキュベートして、インキュベーション混合物を得ることと、
インキュベーション後に得られた前記インキュベーション混合物を同じ前記患者内へと移すこととを含み、
前記三機能二重特異性抗体が、
（ａ）Ｂ細胞表面抗原を介してＢ細胞に結合する第１の結合アームと、
（ｂ）Ｔ細胞表面抗原を介してＴ細胞に結合する第２の結合アームと、
（ｃ）Ｆｃ受容体陽性細胞に結合するＦｃ部分とを含み、
ＥＢＶのＢ細胞における再活性化に関連する前記疾患及び／又は障害が、関節リウマチ、橋本病、１型糖尿病及び多発性硬化症からなる群の１つ以上の自己免疫疾患から選択される、又は、
ＥＢＶのＢ細胞における再活性化に関連する前記疾患及び／又は障害が、慢性前立腺炎、慢性膀胱炎、慢性肝炎（非アルコール性）、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、慢性神経炎症及び代謝症候群からなる群の１つ以上の慢性炎症性疾患から選択される、又は、
ＥＢＶのＢ細胞における再活性化に関連する前記疾患及び／又は障害が、シェーグレン症候群、重症筋無力症、クローン病、尋常性白斑、２型糖尿病、乳管の慢性炎症、膣扁平苔癬、慢性膵炎、慢性気管支炎及び慢性風邪様症状、慢性疲労症候群、慢性乾性咳嗽、慢性鼻炎、寝汗、睡眠障害（不眠症）、多発神経障害性疼痛、（例えば、指、爪先及び顔の）浮腫、子宮内膜症、卵巣嚢胞、生理不順、脱毛、記憶障害、目乾燥及び口腔乾燥、片頭痛、一般的な脱毛症、座瘡、体重増加、集中力欠如、インスリン抵抗性、下痢及び慢性帯状疱疹からなる群の１つ以上の疾患及び障害から選択される、
抗体が開示される。
【００３５】
好ましくは、本発明に係る使用のための抗体は、同じ前記患者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の自家細胞調製物をさらに含み、前記ＰＢＭＣが、前記富化されたＢ細胞と前記三機能二重特異性抗体との前記インキュベーション混合物内へ、前記ＰＢＭＣと前記三機能二重特異性抗体との間の物理的相互作用を確立するのに十分な時間にわたって添加される。
【００３６】
ＰＢＭＣ及び自家Ｂ細胞は、抗体と同時に又は連続して混合及びインキュベートされてもよい。
【００３７】
前記三機能二重特異性抗体と前記富化されたＢ細胞との間の物理的相互作用を確立するためのインキュベーション時間は、１分〜６０分、好ましくは１分〜２０分、さらにより好ましくは５分〜２０分の間、例えば、８分〜１５分の間（例えば，８，９，１０，１１，１２，１３，１４又は１５分）であってもよい。
【００３８】
前記三機能二重特異性抗体と前記ＰＢＭＣとの間の物理的相互作用を確立するためのインキュベーション時間は、１分〜６０分、好ましくは１分〜２０分、さらにより好ましくは５分〜２０分の間、例えば、８分〜１５分又は１０分〜１５分の間（例えば，８，９，１０，１１，１２，１３，１４又は１５分）であってもよい。
【００３９】
本発明者は、フローサイトメトリー測定の実施において、１０〜１５分のインキュベーション時間が、前記抗体とＢ細胞との間、又は、前記抗体とＰＢＭＣとの間に優れた結合親和性をもたらすことを発見した。インキュベーション時間が１０分未満の場合、結合親和性は許容範囲内であるが、それでも最適ではない。インキュベーション時間が１５分を超える場合、結合親和性をそれ以上大幅に改善できない。
【００４０】
本発明によれば、抗体は、好ましくは０．１〜１００μｇの量で、より好ましくは０．４〜５０μｇの量で、さらに好ましくは０．６〜２０μｇの量で、さらにより好ましくは０．８〜１０μｇの量で投与される。
【００４１】
この点において、本発明に係る使用のための三機能二重特異性抗体は、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ウマ、ロバ、ブタ、又は、免疫化可能かつ抗体を生成するのに適した他の動物内で生成されてもよい。好ましくは、本発明に係る使用のための抗体は、マウス又はラット内で生成される。
【００４２】
本発明に係る使用のための抗体はまた、トランスジェニック動物内で生成されてもよい。この点において、トランスジェニック動物は、哺乳動物、鳥又は魚であり得る。
【００４３】
本発明に係る使用のための抗体はまた、抗体を分泌可能な細胞において生成されてもよい。このような細胞には、以下に限定されないが、ＣＨＯ、２９３、ＣＯＳ又はＮＳ０細胞が含まれる。
【００４４】
用語「抗体」は、本発明に係る特徴的な特性が保持されている限り、様々な形態の抗体、好ましくはモノクローナル抗体を包含しており、モノクローナル抗体としては、以下に限定されないが、全抗体、抗体フラグメント、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及び遺伝子操作された抗体（バリアント又はミュータント抗体）が含まれる。ヒト又はヒト化モノクローナル抗体及び組換え抗体、特に、組換えモノクローナル抗体が好ましい。したがって、本発明に係る抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。さらに、抗体はまた、多鎖抗体（multi-chain antibody）、すなわち複数の鎖を含む抗体であって、単鎖抗体（single-chain antibody）とは異なる抗体であることが好ましい。
【００４５】
本明細書にて使用される用語「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域を有する抗体を含むことを意図している。ヒト抗体は、技術水準において周知である（van Dijk, M. A., and van de Winkel, J. G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374）。ヒト抗体はまた、免疫化時に、内因性免疫グロブリン産生がない状態でヒト抗体の完全なレパートリー又は選択物を産生可能なトランスジェニック動物（例えば、マウス）内で産生され得る。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイをそのような生殖系列変異マウス内へ移すと、結果として抗原チャレンジ時にヒト抗体が産生される（例えば、Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555；Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258；Bruggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 3340）。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリにおいても産生され得る（Hoogenboom, H. R., and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388；Marks, J. D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597）。Cole et al. 及びBoerner et al.の技術はまた、ヒトモノクローナル抗体の調製にも利用可能である（Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) 及びBoerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95）。本明細書にて使用される用語「ヒト抗体」には、（例えば、可変領域において）改変されて本発明に係る特性を生じるそのような抗体もまた含まれる。
【００４６】
本明細書にて使用される場合、用語「組換え抗体」は、自然界には存在しない全ての抗体、特に、組換え手段によって調製、発現、作成又は単離された抗体を含むことが意図され、そのような抗体としては、例えば、ＣＨＯ細胞等の宿主細胞若しくは動物（例えば、マウス）から単離された抗体、又は、宿主細胞内にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体が挙げられる。そのような組換え抗体は、天然に生じる抗体と比較して、再配列された形態の可変及び定常領域を有する。
【００４７】
本明細書にて使用される場合、「三機能性」抗体は、本発明の文脈において、Ｂ細胞及びＴ細胞を採用していると同時にＦｃ受容体陽性細胞もまた採用している、特定のクラスの二重特異性抗体として理解される。本発明の文脈において、三機能二重特異性抗体は、該抗体のＦｃ部分を介してＦｃ受容体陽性細胞に結合する。
【００４８】
本明細書にて使用される場合、用語「Ｆｃ部分」は、免疫グロブリン重鎖の部分に由来する配列であって、パパイン切断部位のすぐ上流のヒンジ領域において開始し、免疫グロブリン重鎖のＣ末端にて終了する配列を示す。したがって、「Ｆｃ部分」は、完全なＦｃ領域又はその一部（例えば、ドメイン）であってもよい。好ましくは、「Ｆｃ部分」は、完全なＦｃ領域の完全な機能性を媒介し、該機能性は、例えば、Ｆｃ受容体結合を含む。したがって、本発明に従って使用される抗体は、好ましくは完全なＦｃ領域を含み、ここで、完全なＦｃ領域は、少なくともヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。Ｆｃ部分はまた、天然に存在するＦｃ領域と比較して、１つ又は複数のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を含んでいてもよい。例えば、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン又はＣＨ３ドメイン（又はその一部）のうちの少なくとも１つが欠失されていてもよい。例えば、Ｆｃ部分は、以下を含む又はそれらからなる：（ｉ）ＣＨ２ドメイン（又はその一部）に融合されたヒンジドメイン（又はその一部）、（ｉｉ）ＣＨ３ドメイン（又はその一部）に融合されたヒンジドメイン（又はその一部）、（ｉｉｉ）ＣＨ３ドメイン（又はその一部）に融合されたＣＨ２ドメイン（又はその一部）、（ｉｖ）ヒンジドメイン（又はその一部）、（ｖ）ＣＨ２ドメイン（又はその一部）、又は、（ｖｉ）ＣＨ３ドメイン又はその一部。
【００４９】
好ましくは、本発明に係る使用のための三機能二重特異性抗体は、Ｆｃ受容体についての該抗体のＦｃ部分に、１つ又は複数の結合部位を含む。
【００５０】
より好ましくは、三機能二重特異性抗体は、Ｆｃγ受容体タイプＩ，ＩＩａ及び／又はＩＩＩのＦｃ部分に１つ又は複数の結合部位を含む。
【００５１】
さらに好ましくは、三機能二重特異性抗体は、Ｆｃγ受容体タイプＩ，ＩＩａ及び／又はＩＩＩのＦｃ部分に１つの結合部位を含む。
【００５２】
Ｆｃγ受容体タイプＩ，ＩＩａ及び／又はＩＩＩを含む細胞には、以下に限定されないが、単球、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞及び／又は活性化好中球が含まれる。好ましくは、三機能二重特異性抗体は、単球、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、及び／又は、それらのＦｃγ受容体タイプＩ，ＩＩａ及び／又はＩＩＩによって活性化された好中球に結合可能である。
【００５３】
本発明に係る使用のための三機能二重特異性抗体は、そのＦｃ部分において以下のアイソタイプの組み合わせのうちの１つを示していてもよい：ラット−ＩｇＧ２ｂ／マウス−ＩｇＧ２ａ、ラット−ＩｇＧ２ｂ／マウス−ＩｇＧ２ｂ、ラット−ＩｇＧ２ｂ／ヒト−ＩｇＧ１、ヒト−ＩｇＧ１／ヒト−ＩｇＧ１−［ヒンジ領域］−ヒト−ＩｇＧ３＊−［ＣＨ２−ＣＨ３］（＊＝白色人種のアロタイプＧ３ｍ（ｂ＋ｇ）＝プロテインＡに結合しない）、マウス−［ＶＨ−ＣＨ１，ＶＬ−ＣＬ］−ヒト−ＩｇＧ１／ラット−［ＶＨ−ＣＨ１，ＶＬ−ＣＬ］−ヒト−ＩｇＧ１−［ヒンジ領域］−ヒト−ＩｇＧ３＊−［ＣＨ２−ＣＨ３］（＊＝白色人種のアロタイプＧ３ｍ（ｂ＋ｇ）＝プロテインＡに結合しない）、マウス−［ＶＨ−ＶＬ］−ヒト−［ＣＨ１−ＣＬ］−ヒト−ＩｇＧ１／ラット−［ＶＨ−ＣＨ１，ＶＬ−ＣＬ］−ヒト−ＩｇＧ１−［ヒンジ領域］−ヒト−ＩｇＧ３＊−［ＣＨ２−ＣＨ３］（＊＝白色人種のアロタイプＧ３ｍ（ｂ＋ｇ）＝プロテインＡに結合しない）。
【００５４】
好ましくは、三機能二重特異性抗体は、ラット／マウス二種抗体であり、そのＦｃ部分においてラット−ＩｇＧ２ｂ／マウス−ＩｇＧ２ａのアイソタイプの組み合わせを示す。
【００５５】
本明細書にて使用される場合、用語「二重特異性」は、２つの異なるエピトープ、すなわち、Ｔ細胞表面抗原上及びＢ細胞抗原上に結合する能力を示す。さらに、単一の「特異性」は、単一の抗体における１つ、２つ、３つ又はそれ以上の同一のパラトープを示してもよい（１つの単一抗体分子中のパラトープにおける実際の数は「結合価」と称される）。例えば、単一のネイティブＩｇＧ抗体は、２つの同一のパラトープを有するため、単一特異性かつ二価である。本明細書にて使用される場合、「パラトープ」は、抗体のエピトープ結合部位を示す。したがって、用語「二重特異性抗体」は、２つの異なるパラトープを有し、２つの異なるエピトープに結合する能力を有する抗体を示す。
【００５６】
好ましくは、本発明に係る二重特異性抗体は、４つのパラトープを含んでいてもよく、このとき、２つのパラトープのそれぞれは同一であり（すなわち、同じ特異性を有する）、したがって、抗体は、二重特異性かつ四価（２つの特異性のそれぞれについて２つの同一のパラトープ）である。したがって、「２つの特異性」は、２つの特異性のみを参照する限り、２，３，４，５，６，８，１０，１２又はそれ以上のパラトープによって実現されてもよい。最も好ましくは、二重特異性抗体は、各特異性に対して１つの単一のパラトープを含み、すなわち、二重特異性抗体は、合計２つのパラトープを含む。二重特異性抗体はまた、２つの特異性のそれぞれについて２つの同一のパラトープを含むことが好ましく、すなわち、二重特異性抗体は、合計４つのパラトープを含むことが好ましい。好ましくは、二重特異性抗体は、２つの特異性のそれぞれについて３つの（同一の）パラトープを含み、すなわち、二重特異性抗体は、合計６つのパラトープを含む。
【００５７】
本明細書にて使用される場合、用語「抗原」は、適応免疫応答の受容体の標的として、特に抗体、Ｔ細胞受容体及び／又はＢ細胞受容体の標的として機能する任意の構造物質を示す。「エピトープ」は、「抗原決定基」としても知られており、免疫系によって、特に抗体、Ｔ細胞受容体及び／又はＢ細胞受容体によって認識される抗原の一部（又は断片）である。したがって、１つの抗原は少なくとも１つのエピトープを有し、すなわち、単一の抗原は１つ又は複数のエピトープを有する。抗原は、（ｉ）ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質、（ｉｉ）多糖類、（ｉｉｉ）脂質、（ｉｖ）リポタンパク質又はリポペプチド、（ｖ）糖脂質、（ｖｉ）核酸、又は（ｖｉｉ）小分子薬又は毒素であってもよい。したがって、抗原は、ペプチド、タンパク質、多糖類、脂質、リポタンパク質及び糖脂質を含むそれらの組み合わせ、核酸（例えば、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、デコイＤＮＡ、プラスミド）、若しくは、小分子薬物（例えば、シクロスポリンＡ、パクリタキセル、ドキソルビシン、メトトレキサート、５−アミノレブリン酸）、又は、それらの任意の組み合わせであってもよい。好ましくは、抗原は、（ｉ）ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質、（ｉｉ）多糖類、（ｉｉｉ）脂質、（ｉｖ）リポタンパク質又はリポペプチド、及び、（ｖ）糖脂質から選択され、より好ましくは、抗原は、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質である。
【００５８】
本明細書にて使用される場合、「Ｂ細胞表面抗原」は、Ｂ細胞表面関連抗原又はＢ細胞表面特異的抗原を示し、「Ｔ細胞表面抗原」は、Ｔ細胞表面関連抗原又はＴ細胞特異的抗原を示す。本発明の文脈において、Ｂ細胞表面抗原又はＴ細胞表面抗原は、分化抗原群（ＣＤ）分子であってもよい。ＣＤ分子は、白血球の同定に有用な細胞表面のマーカーである。本発明に係る使用のための二重特異性抗体は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ７２、ＣＤ７５、ＣＤ７８、ＣＤ７９及びＣＤ８０からなる群から選択されるＢ細胞表面抗原を介して、Ｂ細胞に結合してもよい。このことは、本発明による使用のための抗体が、好ましくは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ７２、ＣＤ７５、ＣＤ７８、ＣＤ７９及びＣＤ８０からなる群から選択されるＢ細胞表面抗原のエピトープを認識して結合可能なパラトープを含むことを意味する。この特異性は、好ましくは、Ｂ細胞の採用を促進する。
【００５９】
好ましくは、Ｂ細胞表面抗原は、ＣＤ２０である。このことは、本発明に係る使用のための抗体が、さらに好ましくは、ＣＤ２０のエピトープを認識して結合可能なパラトープを含むことを意味する。
【００６０】
本発明に係る使用のための二重特異性抗体は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌ及びＣＤ４４からなる群から選択されるＴ細胞表面抗原を介してＴ細胞に結合してもよい。このことは、本発明による使用のための抗体が、好ましくは、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌ及びＣＤ４４からなる群から選択されるＴ細胞表面抗原のエピトープを認識して結合可能なパラトープを含むことを意味する。この特異性は、好ましくは、Ｔ細胞の採用を促進する。
【００６１】
好ましくは、Ｔ細胞表面抗原は、ＣＤ３である。このことは、本発明に係る使用のための抗体が、さらに好ましくは、ＣＤ３のエピトープを認識して結合可能なパラトープを含むことを意味する。
【００６２】
本発明に係る使用のための二重特異性抗体は、以下に結合し得る：（１）該抗体の第１のパラトープによって、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ７２、ＣＤ７５、ＣＤ７８、ＣＤ７９及びＣＤ８０からなる群から選択されるＢ細胞表面抗原、好ましくはＣＤ２０のエピトープに結合する。（２）同時に、該抗体の第２のパラトープによって、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌ及びＣＤ４４からなる群から選択されるＴ細胞表面抗原、好ましくはＣＤ３のエピトープに結合する。
【００６３】
本発明に係る使用のための二重特異性抗体は、ＣＤ３に対する１つのパラトープ及びＣＤ２０に対する１つのパラトープ（抗ＣＤ３×抗ＣＤ２０）を含んでいてもよい。前記抗体は、ＣＤ３に対する１つのパラトープ及びＣＤ１９に対する１つのパラトープ（抗ＣＤ３×抗ＣＤ１９）を含んでいてもよい。前記抗体は、ＣＤ３に対する１つのパラトープ及びＣＤ２２に対する１つのパラトープ（抗ＣＤ３×抗ＣＤ２２）を含んでいてもよい。前記抗体は、ＣＤ３に対する１つのパラトープ及びＣＤ３８に対する１つのパラトープ（抗ＣＤ３×抗ＣＤ３８）を含んでいてもよい。このことは、本発明に係る使用のための抗体が、好ましくは、抗ＣＤ３×抗ＣＤ２０二重特異性抗体、抗ＣＤ３×抗ＣＤ１９二重特異性抗体、抗ＣＤ３×抗ＣＤ２２二重特異性抗体、抗ＣＤ３×抗ＣＤ３８二重特異性抗体からなる群から選択されることを意味する。
【００６４】
より好ましくは、本発明に係る使用のための二重特異性抗体は、抗ＣＤ３×抗ＣＤ２０二重特異性抗体を含む。
【００６５】
したがって、本発明に係る使用のための三機能二重特異性抗体は、以下を含んでいてもよい：（１）ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ７２、ＣＤ７５、ＣＤ７８、ＣＤ７９及びＣＤ８０からなる群から選択されるＢ細胞表面抗原、好ましくはＣＤ２０のエピトープを認識して結合可能な１つのパラトープ、（２）ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌ及びＣＤ４４からなる群から選択されるＴ細胞表面抗原、好ましくはＣＤ３のエピトープを認識して結合可能な１つのパラトープ、（３）Ｆｃ受容体陽性細胞に結合可能な１つのＦｃ部分、好ましくは、Ｆｃγ受容体タイプＩ，ＩＩａ及び／又はＩＩＩの結合部位を包含する１つのＦｃ部分。
【００６６】
好ましくは、本発明に係る使用のための三機能二重特異性抗体は、以下を含む：（１）ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ７２、ＣＤ７５、ＣＤ７８、ＣＤ７９及びＣＤ８０からなる群から選択されるＢ細胞表面抗原、好ましくはＣＤ２０のエピトープを認識して結合可能な１つのパラトープ、（２）ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌ及びＣＤ４４からなる群から選択されるＴ細胞表面抗原、好ましくはＣＤ３のエピトープを認識して結合可能な１つのパラトープ、（３）Ｆｃ受容体陽性細胞に結合可能な１つのＦｃ部分、好ましくは、Ｆｃγ受容体タイプＩ，ＩＩａ及び／又はＩＩＩの結合部位を含む１つのＦｃ部分、より好ましくは、ラット−ＩｇＧ２ｂ／マウス−ＩｇＧ２ａ、ラット−ＩｇＧ２ｂ／マウス−ＩｇＧ２ｂ、ラット−ＩｇＧ２ｂ／ヒト−ＩｇＧ１、ヒト−ＩｇＧ１／ヒト−ＩｇＧ１−［ヒンジ領域］−ヒト−ＩｇＧ３＊−［ＣＨ２−ＣＨ３］（＊＝白色人種のアロタイプＧ３ｍ（ｂ＋ｇ）＝プロテインＡに結合しない）、マウス−［ＶＨ−ＣＨ１，ＶＬ−ＣＬ］−ヒト−ＩｇＧ１／ラット−［ＶＨ−ＣＨ１，ＶＬ−ＣＬ］−ヒト−ＩｇＧ１−［ヒンジ領域］−ヒト−ＩｇＧ３＊−［ＣＨ２−ＣＨ３］（＊＝白色人種のアロタイプＧ３ｍ（ｂ＋ｇ）＝プロテインＡに結合しない）からなる群から選択される１つのアイソタイプの組み合わせを含むＦｃ部分、さらにより好ましくは、ラット−ＩｇＧ２ｂ／マウス−ＩｇＧ２ａのアイソタイプの組み合わせを含むＦｃ部分。
【００６７】
本発明に係る使用のための三機能二重特異性抗体は、抗ＣＤ３×抗ＣＤ２０二重特異性抗体、抗ＣＤ３×抗ＣＤ１９二重特異性抗体、抗ＣＤ３×抗ＣＤ２２二重特異性抗体、抗ＣＤ３×抗ＣＤ３８二重特異性抗体からなる群から選択されてもよく、好ましくは、ラット−ＩｇＧ２ｂ／マウス−ＩｇＧ２ａ、ラット−ＩｇＧ２ｂ／マウス−ＩｇＧ２ｂ、ラット−ＩｇＧ２ｂ／ヒト−ＩｇＧ１、ヒト−ＩｇＧ１／ヒト−ＩｇＧ１−［ヒンジ領域］−ヒト−ＩｇＧ３＊−［ＣＨ２−ＣＨ３］（＊＝白色人種のアロタイプＧ３ｍ（ｂ＋ｇ）＝プロテインＡに結合しない）、又は、マウス−［ＶＨ−ＣＨ１，ＶＬ−ＣＬ］−ヒト−ＩｇＧ１／ラット−［ＶＨ−ＣＨ１，ＶＬ−ＣＬ］−ヒト−ＩｇＧ１−［ヒンジ領域］−ヒト−ＩｇＧ３＊−［ＣＨ２−ＣＨ３］（＊＝白色人種のアロタイプＧ３ｍ（ｂ＋ｇ）＝プロテインＡに結合しない）からなる群から選択される１つのアイソタイプの組み合わせを備えたものであってもよく、さらにより好ましくは、ラット−ＩｇＧ２ｂ／マウス−ＩｇＧ２ａのアイソタイプの組み合わせを備えたものであってもよい。
【００６８】
本発明において、２つのパラトープ及びＦｃ部分のアイソタイプの組み合わせは、上記にて開示されるように、適切であれば、任意に組み合わせられ得る。本発明に係る使用のための三機能二重特異性抗体は、ラット−ＩｇＧ２ｂ／マウス−ＩｇＧ２ａ、ヒト−ＩｇＧ１／ヒト−ＩｇＧ１−［ヒンジ領域］−ヒト−ＩｇＧ３＊−［ＣＨ２−ＣＨ３］（＊＝白色人種のアロタイプＧ３ｍ（ｂ＋ｇ）＝プロテインＡに結合しない）、マウス−［ＶＨ−ＣＨ１，ＶＬ−ＣＬ］−ヒト−ＩｇＧ１／ラット−［ＶＨ−ＣＨ１，ＶＬ−ＣＬ］−ヒト−ＩｇＧ１−［ヒンジ領域］−ヒト−ＩｇＧ３＊−［ＣＨ２−ＣＨ３］（＊＝白色人種のアロタイプＧ３ｍ（ｂ＋ｇ）＝プロテインＡに結合しない）、又は、マウス−［ＶＨ−ＶＬ］−ヒト−［ＣＨ１−ＣＬ］−ヒト−ＩｇＧ１／ラット−［ＶＨ−ＣＨ１，ＶＬ−ＣＬ］−ヒト−ＩｇＧ１−［ヒンジ領域］−ヒト−ＩｇＧ３＊−［ＣＨ２−ＣＨ３］（＊＝白色人種のアロタイプＧ３ｍ（ｂ＋ｇ）＝プロテインＡに結合しない）のアイソタイプの組み合わせを有する抗ＣＤ３×抗ＣＤ２０であってもよい。さらなる２つのパラトープの組み合わせ及びＦｃ部分のアイソタイプの組み合わせは、さらなる発明スキルを用いることなく熟練者より得ることができる。前述のさらなる組み合わせは、異なる実験的又は実際的な状況に応じて有用であり得る。以下の事例は、上記の組み合わせで抗体を使用したが、本発明は、本明細書に記載される他の任意の三機能二重特異性抗体を用いて実施して、同じ効果を得ることができる。
【００６９】
好ましくは、本発明の文脈における二重特異性抗体は、任意の二重特異性抗体フォーマットであってもよく、例えば、Spiess C., Zhai Q. and Carter P.J. (2015) Molecular Immunology 67: 95-106に記載されているような二重特異性抗体フォーマットであってもよい。例えば、二重特異性抗体は、全ＩｇＧ様分子等の全抗体、又は、全抗体ではないが抗体特性を保持する該抗体のフラグメントであり得る。これらは、小型組換えフォーマットであってもよく、例えば、tandem single chain variable fragment molecule、diabody、single chain diabody、bispecific T-cell engager及びこれらの様々な他の誘導体としての小型組換えフォーマットであってもよい（例えば、Byrne H. et al., 2013, Trends Biotech, 31 (11): 621-632の図２は、様々な二重特異性抗体フォーマットを示している）。いくつかの二重特異性抗体フォーマットは、疾患プロセスで重要な役割を果たす標的細胞に対してエフェクター細胞をリダイレクトし得る。例えば、いくつかの二重特異性抗体フォーマットは、エフェクター細胞をＢ細胞に向けて再標的化可能であり、様々な二重特異性抗体構築物は、例えば、エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体に結合してトリガすることによって、又は、Ｔ細胞受容体複合体に結合することによって、免疫系の細胞を再標的化するように設計された。
【００７０】
本発明に係る使用のための抗体は、任意の抗体フォーマットであってもよい。二重特異性抗体フォーマットの例には、以下に限定されないが、クアドローマ、化学的結合Ｆａｂ（フラグメント抗原結合）、及びBiTE（登録商標）（bispecific T cell engager（二重特異性Ｔ細胞誘導））が含まれる。本発明の一実施形態では、使用される抗体は、好ましくは、BiTE（登録商標）（bispecific T cell engager）である。
【００７１】
したがって、本発明に係る使用のための抗体は、Triomab；ハイブリッドハイブリドーマ（クアドローマ）；Multispecific anticalin platform（Pieris社）；Diabody；Single chain diabody；Tandem single chain Fv fragment；TandAb、Trispecific Ab（Affimed社）（105-110 kDa）；Dart（dual affinity retargeting；Macrogenics社）；Bispecific Xmab（Xencor社）；Bispecific T cell engager（Bites；Amgen社；55kDa）；Triplebody；Tribody = Fab-scFv Fusion Protein（CreativeBiolabs社）multifunctional recombinant antibody derivates（多機能組換え抗体誘導体）（110 kDa）；Duobody platform（Genmab社）；Dock and lock platform；Knob into hole（KIH）platform；Humanized bispecific IgG antibody（ヒト化二重特異性IgG抗体）（REGN1979）（Regeneron社）；Mab2 bispecific antibody（Mab2 二重特異性抗体）（F-Star社）；DVD-Ig = dual variable domain immunoglobulin（二重可変領域抗体）（Abbvie社）；kappa-lambda body；TBTI = tetravalent bispecific tandem Ig（四価二重特異性タンデムIg）；及び、CrossMabを含む群から選択されてもよい。
【００７２】
本発明に係る使用のための抗体は、CrossMab；DAF（two-in-one）；DAF（four-in-one）；DutaMab；DT-IgG；Knobs-in-holes common LC；Knobs-in-holes assembly；Charge pair；Fab-arm exchange；SEEDbody；Triomab；LUZ-Y；Fcab；及び、Orthogonal Fabを含む二重特異性ＩｇＧ様抗体から選択されてもよい。これらの二重特異性抗体フォーマットは、例えば、Spiess C., Zhai Q. and Carter P.J.（2015） Molecular Immunology 67: 95-106、特に図１及び対応する説明（例えば、p.95-101）に示され記載されている。
【００７３】
本発明に係る使用のための抗体は、DVD-IgG；IgG(H)-scFv；scFv-(H)IgG；IgG(L)-scFv；scFV-(L)IgG；IgG(L,H)-Fv；IgG(H)-V；V(H)-IgG；IgG(L)-V；V(L)-IgG；KIH IgG-scFab；2scFv-IgG；IgG-2scFv；scFv4-Ig；scFv4-Ig；Zybody；及び、DVI-IgG（four-in-one）を含む追加の抗原結合部分を有するＩｇＧ付加（appended）抗体から選択されてもよい。これらの二重特異性抗体フォーマットは、例えば、Spiess C., Zhai Q. and Carter P.J.（2015） Molecular Immunology 67: 95-106、特に図１及び対応する説明（例えば、p.95-101）に示され記載されている。
【００７４】
本発明に係る使用のための抗体は、Nanobody；Nanobody-HAS；BiTE；Diabody；DART；TandAb；scDiabody；sc-Diabody-CH3；Diabody-CH3；Triple Body；Miniantibody；Minibody；TriBi minibody；scFv-CH3 KIH；Fab-scFv；scFv-CH-CL-scFv；F(ab’)2；F(ab’)2-scFv2；scFv-KIH；Fab-scFv-Fc；Tetravalent HCAb；scDiabody-Fc；Diabody-Fc；Tandem scFv-Fc；及び、Intrabodyを含む二重特異性抗体フラグメントから選択されてもよい。これらの二重特異性抗体フォーマットは、例えば、Spiess C., Zhai Q. and Carter P.J.（2015） Molecular Immunology 67: 95-106、特に図１及び対応する説明（例えば、p.95-101）に示され記載されている。
【００７５】
本発明に係る使用のための抗体は、Dock and Lock；ImmTAC；HSAbody；scDiabody-HAS；及び、Tandem scFv-Toxinを含む二重特異性融合タンパク質から選択されてもよい。これらの二重特異性抗体フォーマットは、例えば、Spiess C., Zhai Q. and Carter P.J.（2015） Molecular Immunology 67: 95-106、特に図１及び対応する説明（例えば、p.95-101）に示され記載されている。
【００７６】
本発明に係る使用のための抗体は、gG-IgG；Cov-X-Body；及び、scFv1-PEG-scFv2を含む二重特異性抗体コンジュゲートから選択することができる。これらの二重特異性抗体フォーマットは、例えば、Spiess C., Zhai Q. and Carter P.J.（2015） Molecular Immunology 67: 95-106、特に図１及び対応する説明（例えば、p.95-101）に示され記載されている。
【００７７】
本発明に係る使用のための抗体は、bispecific T-cell engager（二重特異性Ｔ細胞誘導）（BiTETM）及び二重特異性三機能性抗体からなる群から選択されることもまた好ましい。
【００７８】
本発明に係る使用のための抗体が、少なくとも２つの異なる一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含むこともまた好ましい。本明細書では、ｓｃＦｖは、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質であって、これらのＶＨ及びＶＬが短いリンカーペプチドと接続されているものとして理解される。前記ペプチドは、典型的には、少なくとも５個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは約２５個のアミノ酸を含む。リンカーは通常、柔軟性のためにグリシン豊富であると共に、溶解性のためにセリン又はスレオニン豊富であり、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に接続する又はその逆を行い得る。ｓｃＦｖは、定常領域が除去されると共にリンカーが導入されているにもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持している可能性がある。典型的には、ｓｃＦｖは、ハイブリドーマに由来するサブクローン化された重鎖及び軽鎖から直接作成され得る。ＳｃＦｖは一般的に、例えばフローサイトメトリー、免疫組織化学において、及び、人工Ｔ細胞受容体の抗原結合ドメインとして使用される。本発明の文脈において、ＳｃＦｖは、好ましくは人工Ｔ細胞受容体の抗原結合ドメインとして使用される。
【００７９】
好ましくは、本発明に係る使用のための抗体は、ＩｇＧ様フォーマット（ＩｇＧに基づく。「ＩｇＧタイプ」とも称される）を有し、その場合、ＩｇＧ様フォーマットを有する抗体は、通常、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含む。一般的に、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、抗体の一種として知られている。本明細書では、ＩｇＧは、抗体モノマーに典型的なＹ字型に配置された２つの同一の重鎖及び２つの同一の軽鎖の４つのペプチド鎖から構成されるタンパク質複合体として理解される。各ＩｇＧには、典型的には２つの抗原結合部位があり、それらは異なっていてもよく、同一であってもよい。ヒトの血清抗体の約７５％を占めるＩｇＧは、循環系で見られる最も一般的なタイプの抗体である。生理学的に、ＩｇＧ分子は、プラズマＢ細胞によって作成及び放出される。
【００８０】
ＩｇＧ様フォーマットを有する抗体の例には、クアドローマ及び様々なＩｇＧ−ｓｃＦｖフォーマットが含まれ（Byrne H. et al. (2013) Trends Biotech, 31 (11): 621-632、図２Ａ〜Ｅを参照）、その場合はクアドローマが好ましく、このクアドローマは、好ましくは２つの異なるハイブリドーマの融合によって生成される。ＩｇＧクラス内では、抗体は、好ましくは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブクラスに基づいていてもよく、その場合、ＩｇＧ１に基づく抗体（「ＩｇＧ１タイプ」とも称される）が好ましい。あるいは、本発明に係る使用のための多重特異性抗体又は二重特異性抗体等の抗原結合フラグメントは、任意の免疫グロブリンクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ等）及びサブクラス（例えば、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等）に基づいていてもよい。
【００８１】
好ましい二重特異性ＩｇＧ様抗体フォーマットには、例えば、ハイブリッドハイブリドーマ（クアドローマ）、共通の軽鎖を有するknobs-into-holes、様々なＩｇＧ−ｓｃＦｖフォーマット、様々なｓｃＦｖ−ＩｇＧフォーマット、two-in-oneＩｇＧ、二重ＶドメインＩｇＧ、ＩｇＧ−Ｖ、及び、Ｖ−ＩｇＧが含まれ、これらは例えば、Chan, A.C. and Carter, P.J. (2010) Nat Rev Immu 10: 301-316 の図３ｃに示され、該文献中に記載されている。さらに好ましい二重特異性ＩｇＧ様抗体フォーマットには、例えば、DAF、CrossMab、IgG-dsscFv、DVD、IgG-dsFV、IgG-scFab、scFab-dsscFv及びFv2-Fcが含まれ、これらはWeidle U.H. et al. (2013) Cancer Genomics and Proteomics 10: 1-18の図１Ａに示され、該文献中に記載されている。さらに好ましい二重特異性ＩｇＧ様抗体フォーマットには、DAF（two-in-one）；DAF（four-in-one）；DutaMab；DT-IgG；Knobs-in-holes assembly；Charge pair；Fab-arm exchange；SEEDbody；Triomab；LUZ-Y；Fcab；Orthogonal Fab；DVD-IgG；IgG(H)-scFv；scFv-(H)IgG；IgG(L)-scFv；scFV-(L)IgG；IgG(L,H)-Fv；IgG(H)-V；V(H)-IgG；IgG(L)-V；V(L)-IgG；KIH IgG-scFab；2scFv-IgG；IgG-2scFv；scFv4-Ig；scFv4-Ig；Zybody；and DVI-IgG（four-in-oneが含まれ、これらは例えば、Spiess C., Zhai Q. and Carter P.J. (2015) Molecular Immunology 67: 95-106、特に図１及び対応する説明、例えば、p.95-101に示され記載されている。
【００８２】
本発明に係る使用のための三機能二重特異性抗体は、以下の３つの主要な方法によって生成されてもよい：（ｉ）化学的架橋を含む化学的コンジュゲーション、（ｉｉ）２つの異なるハイブリドーマ細胞株の融合、又は、（ｉｉｉ）組換えＤＮＡ技術を含む遺伝的アプローチ。２つの異なるハイブリドーマの融合により、二重特異性分子を含む不均一な抗体集団を分泌するハイブリッドハイブリドーマ（又は「クアドローマ」）が生成される。
【００８３】
代替アプローチには、２つの異なるｍＡｂ及び／又はより小さな抗体フラグメントの化学的コンジュゲーションが含まれていてもよい。２つの異なる抗体又は抗体フラグメントをリンクするための酸化的再結合ストラテジーは、複数の天然ジスルフィド結合の再酸化中に副反応が存在するため、非効率的であることが判明している。現在の化学的コンジュゲーションの方法は、ホモ又はヘテロ二官能性架橋試薬の使用に焦点を合わせている。組換えＤＮＡ技術は、遺伝子の人工的な操作を通じて最大範囲の二重特異性抗体を生み出しており、最も多様な二重特異性抗体生成のためのアプローチを表している（過去２０年間において４５のフォーマット。Byrne H. et al. (2013) Trends Biotech, 31 (11): 621-632を参照）。
【００８４】
治療法のプロトコル
本発明で使用するための三機能二重特異性抗体の文脈では、ＥＢＶ感染症の患者が特定されることになる。Ｂ細胞におけるＥＢＶの再活性化に起因して、患者は、関節リウマチ、橋本病、１型糖尿病及び多発性硬化症からなる群の１つ以上の自己免疫疾患から選択される、又は、慢性前立腺炎、慢性膀胱炎、慢性肝炎（非アルコール性）、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、慢性神経炎症及び代謝症候群からなる群の１つ以上の慢性炎症性疾患から選択される、又は、シェーグレン症候群、重症筋無力症、クローン病、尋常性白斑、２型糖尿病、乳管の慢性炎症、膣扁平苔癬、慢性膵炎、慢性気管支炎及び慢性風邪様症状、慢性疲労症候群、慢性乾性咳嗽、慢性鼻炎、寝汗、睡眠障害（不眠症）、多発神経障害性疼痛、（例えば、指、爪先及び顔の）浮腫、子宮内膜症、卵巣嚢胞、生理不順、脱毛、記憶障害、目乾燥及び口腔乾燥、片頭痛、一般的な脱毛症、座瘡、体重増加、集中力欠如、インスリン抵抗性、下痢及び慢性帯状疱疹からなる群の１つ以上の疾患及び障害から選択される、前記ＥＢＶ再活性化現象に関連する様々な障害及び／又は疾患に罹患している可能性がある。
【００８５】
前記障害及び／又は疾患はまた、鬱病、アレルギー性鼻炎、慢性喘息、乳糖、グルテンアレルギー、複数のアレルギー（主に鼻水、かゆみ）、乾癬、膀胱機能不全及び続発性開放隅角緑内障のうちの１つ以上であり得る。
【００８６】
第１のステップでは、ＥＢＶの再活性化に苛まれている患者から、自家Ｂ細胞が単離される。例えば、これらの自家Ｂ細胞は、前記患者から単離された末梢血の自家単核細胞（ＰＢＭＣ）から得られ、その後に単離されたＰＢＭＣから自家Ｂ細胞が富化されてもよい。
【００８７】
第２のステップでは、前記富化されたＢ細胞は、本発明の三機能二重特異性抗体と共に、前記三機能二重特異性抗体と前記富化されたＢ細胞との間の物理的相互作用を確立するのに十分な時間にわたってインキュベートされて、インキュベーション混合物が得られ、該二重特異性抗体は、以下を含む：（ａ）Ｂ細胞表面抗原を介してＢ細胞に結合する第１の結合アーム、（ｂ）Ｔ細胞表面抗原を介してＴ細胞に結合する第２の結合アーム、（ｃ）Ｆｃ受容体陽性細胞に結合するＦｃ部分。このインキュベーションの時間は、好ましくは１分〜６０分の間である。より好ましいインキュベーション時間は上記に開示されており、インキュベーション時間が１０分〜１５分であれば、前記抗体と前記Ｂ細胞との間に優れた結合親和性が生じる。
【００８８】
第３のステップでは、第２のステップから得られた前記インキュベーション混合物が、前記Ｂ細胞又はＰＢＭＣが単離された同じ患者内へと戻される。ＰＢＭＣは任意の末梢血細胞であり、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、単球を含む。これらの細胞は、当業者に知られる通常の方法によって（例えば、標準的なフィコール密度遠心分離を実行することによって）全血から単離可能である。ＰＢＭＣの単離後、ＰＢＭＣに含まれるＢ細胞は、当業者に知られる通常の方法によって（例えば、適切な免疫磁気ビーズを使用して）富化されてもよい。前記ＰＢＭＣ及びＢ細胞は、インキュベーションのために通常の細胞培養培地に保持されてもよく、このときに、前記抗体とＢ細胞又はＰＢＭＣとの間の物理的結合が開始される。続いて、発色性in situハイブリダイゼーションを実施して、富化されたＢ細胞におけるＥＢＶ特異的ＲＮＡの発現を検出し、Ｂ細胞におけるＥＢＶの感染を同定してもよい。好ましくは、ＥＢＶ特異的ＲＮＡは、いかに限定されないが、ＥＢＥＲ、ＥＢＮＡ１又はＥＢＮＡ２ ＲＮＡである。
【００８９】
好ましくは、上記の第２のステップは、同じ患者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の自家細胞調製物をさらに含み、前記ＰＢＭＣが、前記富化されたＢ細胞と前記三機能二重特異性抗体とのインキュベーション混合物内へ、前記ＰＢＭＣと前記三機能二重特異性抗体との間の物理的相互作用を確立するのに十分な時間にわたって添加され、該時間は、好ましくは１分〜６０分の間である。より好ましいインキュベーション時間は上記に開示されており、より好ましいインキュベーション時間は上記に開示されており、インキュベーション時間が１０分〜１５分であれば、前記抗体と前記Ｂ細胞との間に優れた結合親和性が生じる。
【００９０】
ＰＢＭＣ及び自家Ｂ細胞は、抗体と同時に又は連続して混合及びインキュベートされてもよい。
【００９１】
上記の第３のステップでは、前記富化されたＢ細胞と結合し、好ましくは前記ＰＢＭＣとも結合する三機能二重特異性抗体が、前記Ｂ細胞又はＰＢＭＣが単離される患者内へと戻される。
【００９２】
患者に（例えば、皮下に）投与されて戻された後、抗体は、例えばＴ細胞上のＣＤ３及び例えば副免疫細胞上のＦｃγ受容体との結合を介して結合された、免疫細胞の活性化を開始する。これらの相互作用によって、関与するＥＢＶ感染Ｂ細胞のウイルス物質の貪食、及び、Ｆｃ受容体陽性のプロフェッショナル抗原提示細胞内でのウイルス物質のプロセシングが導かれる。最終的に、ウイルス特異的ペプチドが、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩ分子を介して、適切なＴ細胞受容体を有するＴ細胞へと提示される。これら全ての相互作用によって、最終的にポリクローナル体液性及び細胞性抗ＥＢＶ免疫応答が導かれる。このような反応によって、患者がＥＢＶ感染をよりよく制御することが容易になり、該患者がＥＢＶ再活性化に関連する疾患から予防される。
【００９３】
本発明の文脈における三機能二重特異性抗体の使用のために、抗体は、インキュベーション中に、好ましくは０．１〜１００μｇの量で、より好ましくは０．４〜５０μｇの量で、さらに好ましくは０．６〜２０μｇの量で、さらにより好ましくは０．８〜１０μｇの量で投与されてもよい。この量は、患者へと投与される量でもある。
【００９４】
本発明の第２の態様では、本発明の第１の態様に係る、Ｂ細胞におけるＥＢＶの再活性化に関連する疾患及び／又は障害に罹患している患者を治療する方法における使用のための抗体を含む医薬組成物であって、
前記方法が、
前記患者の富化されたＢ細胞の自家細胞調製物を提供することと、
前記富化されたＢ細胞を、前記三機能二重特異性抗体と共に、前記三機能二重特異性抗体と前記富化されたＢ細胞との間の物理的相互作用を確立するのに十分な時間にわたってインキュベートして、インキュベーション混合物を得ることと、
インキュベーション後に得られた前記インキュベーション混合物を同じ前記患者内へと移すこととを含み、
前記三機能二重特異性抗体が、
（ａ）Ｂ細胞表面抗原を介してＢ細胞に結合する第１の結合アームと、
（ｂ）Ｔ細胞表面抗原を介してＴ細胞に結合する第２の結合アームと、
（ｃ）Ｆｃ受容体陽性細胞に結合するＦｃ部分とを含み、
ＥＢＶのＢ細胞における再活性化に関連する前記疾患及び／又は障害が、関節リウマチ、橋本病、１型糖尿病及び多発性硬化症からなる群の１つ以上の自己免疫疾患から選択される、又は、
ＥＢＶのＢ細胞における再活性化に関連する前記疾患及び／又は障害が、慢性前立腺炎、慢性膀胱炎、慢性肝炎（非アルコール性）、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、慢性神経炎症及び代謝症候群からなる群の１つ以上の慢性炎症性疾患から選択される、又は、
ＥＢＶのＢ細胞における再活性化に関連する前記疾患及び／又は障害が、シェーグレン症候群、重症筋無力症、クローン病、尋常性白斑、２型糖尿病、乳管の慢性炎症、膣扁平苔癬、慢性膵炎、慢性気管支炎及び慢性風邪様症状、慢性疲労症候群、慢性乾性咳嗽、慢性鼻炎、寝汗、睡眠障害（不眠症）、多発神経障害性疼痛、（例えば、指、爪先及び顔の）浮腫、子宮内膜症、卵巣嚢胞、生理不順、脱毛、記憶障害、目乾燥及び口腔乾燥、片頭痛、一般的な脱毛症、座瘡、体重増加、集中力欠如、インスリン抵抗性、下痢及び慢性帯状疱疹からなる群の１つ以上の疾患及び障害から選択される、
医薬組成物が開示される。
【００９５】
好ましくは、使用のための医薬組成物はまた、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を含み、該担体及び／又は賦形剤は、例えば、結合剤、潤滑剤、崩壊剤、充填剤及び希釈剤を含む。
【００９６】
使用のための医薬組成物は、本発明の第１の態様に係る、Ｂ細胞におけるＥＢＶの再活性化に関連する疾患及び／又は障害に罹患している患者の富化されたＢ細胞の自家細胞調製物を含む。富化されたＢ細胞は、上記の方法のいずれかによって調製され得る。
【００９７】
本発明のさらなる実施形態では、本発明に係る使用のための前記医薬組成物は、同じ前記患者のＰＢＭＣの自家細胞調製物をさらに含み、前記インキュベーション混合物を同じ前記患者内へと移す前に、前記ＰＢＭＣが、前記富化されたＢ細胞と前記三機能二重特異性抗体との前記インキュベーション混合物内へ、前記ＰＢＭＣと前記三機能二重特異性抗体との間の物理的相互作用を確立するのに十分な時間にわたって添加される。ＰＢＭＣは、例えば、標準的なフィコール密度遠心分離を実行することによって、上記のように全血から単離することができる。
【００９８】
ＰＢＭＣ及び自家Ｂ細胞は、抗体と同時に又は連続して混合及びインキュベートされてもよい。
【００９９】
前記Ｂ細胞及び前記抗体のインキュベーションの時間、前記ＰＢＭＣ及び前記抗体のインキュベーションの時間及びインキュベーションに使用される抗体の量は、上記に開示されるように適用されてもよい。
【０１００】
さらに別の実施形態では、本発明に係る使用のための前記医薬組成物は、キット・オブ・パーツの形態であり、該キット・オブ・パーツは、上記に開示される三機能二重特異性抗体と、ＥＢＶ感染患者からの富化された自家Ｂ細胞の調製物と、好ましくは、同じ患者からの自家ＰＢＭＣの調製物とを含み、これらの構成要素の少なくとも２つが、別々の容器において提供される。前記Ｂ細胞は、前記三機能二重特異性抗体と共に、前記三機能二重特異性抗体とＢ細胞との間の物理的相互作用を確立するのに十分な時間にわたってインキュベートされ、それによってインキュベーション混合物が得られる。好ましくは、前記ＰＢＭＣは、前記インキュベーション混合物を同じ患者内へと移す前に、前記富化されたＢ細胞と前記三機能二重特異性抗体とのインキュベーション混合物へ、前記ＰＢＭＣと前記三機能二重特異性抗体との間の物理的相互作用を確立するのに十分な期間にわたって添加される。前記Ｂ細胞及び前記抗体のインキュベーションの時間、前記ＰＢＭＣ及び前記抗体のインキュベーションの時間及びインキュベーションに使用される抗体の量は、上記に開示されるように適用されてもよい。ＰＢＭＣ及び自家Ｂ細胞は、抗体と同時に又は連続して混合及びインキュベートされてもよい。
【０１０１】
本発明の第３の態様では、本発明の第２の態様に係る、ＥＢＶのＢ細胞における再活性化に関連する疾患及び／又は障害に罹患している患者を治療する方法における使用のための医薬組成物を調製するためのex-vivo法であって、
前記方法が、
前記患者の富化されたＢ細胞の自家細胞調製物を提供することと、
前記富化されたＢ細胞を、前記三機能二重特異性抗体と共に、前記三機能二重特異性抗体と前記富化されたＢ細胞との間の物理的相互作用を確立するのに十分な時間にわたってインキュベートして、インキュベーション混合物を得ることとを含み、
前記三機能二重特異性抗体が、
（ａ）Ｂ細胞表面抗原を介してＢ細胞に結合する第１の結合アームと、
（ｂ）Ｔ細胞表面抗原を介してＴ細胞に結合する第２の結合アームと、
（ｃ）Ｆｃ受容体陽性細胞に結合するＦｃ部分とを含み、
ＥＢＶのＢ細胞における再活性化に関連する前記疾患及び／又は障害が、関節リウマチ、橋本病、１型糖尿病及び多発性硬化症からなる群の１つ以上の自己免疫疾患から選択される、又は、
ＥＢＶのＢ細胞における再活性化に関連する前記疾患及び／又は障害が、慢性前立腺炎、慢性膀胱炎、慢性肝炎（非アルコール性）、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、慢性神経炎症及び代謝症候群からなる群の１つ以上の慢性炎症性疾患から選択される、又は、
ＥＢＶのＢ細胞における再活性化に関連する前記疾患及び／又は障害が、シェーグレン症候群、重症筋無力症、クローン病、尋常性白斑、２型糖尿病、乳管の慢性炎症、膣扁平苔癬、慢性膵炎、慢性気管支炎及び慢性風邪様症状、慢性疲労症候群、慢性乾性咳嗽、慢性鼻炎、寝汗、睡眠障害（不眠症）、多発神経障害性疼痛、（例えば、指、爪先及び顔の）浮腫、子宮内膜症、卵巣嚢胞、生理不順、脱毛、記憶障害、目乾燥及び口腔乾燥、片頭痛、一般的な脱毛症、座瘡、体重増加、集中力欠如、インスリン抵抗性、下痢及び慢性帯状疱疹からなる群の１つ以上の疾患及び障害から選択される、
ex-vivo法が開示される。好ましくは、Ｂ細胞は、上記の方法のいずれかによって調製される。前記自家Ｂ細胞と前記三機能二重特異性抗体とのインキュベーションの時間は、１分〜６０分の間、好ましくは１分〜２０分の間、より好ましくは５分〜２０分の間、さらにより好ましくは８分〜１５分、さらに好ましくは１０分〜１５分の間（例えば，８，９，１０，１１，１２，１３，１４又は１５分）であってもよい。好ましくは、抗体は、上記に開示された量で使用される。
【０１０２】
好ましくは、前記ex-vivo法は、Ｂ細胞におけるＥＢＶの再活性化を伴う同じ患者のＰＢＭＣを、前記富化された自家Ｂ細胞と前記三機能二重特異性抗体との上記のインキュベーション混合物内へ、前記三機能二重特異性抗体と前記ＰＢＭＣとの間の物理的相互作用を確立するのに十分な時間にわたって添加することを含む。ＰＢＭＣ及び自家Ｂ細胞は、抗体と同時に又は連続して混合及びインキュベートされてもよい。ＰＢＭＣは、例えば、標準的なフィコール密度遠心分離を実行することによって、全血から単離することができる。前記ＰＢＭＣの前記インキュベートされた自家Ｂ細胞及び三機能二重特異性抗体とのインキュベーションの時間は、１分〜６０分の間、好ましくは１分〜２０分の間、より好ましくは５分〜２０分の間、さらにより好ましくは８分〜１５分、さらに好ましくは１０分〜１５分の間（例えば，８，９，１０，１１，１２，１３，１４又は１５分）であってもよい。
【０１０３】
本発明において、三機能二重特異性抗体は、（ｉ）Ｔ細胞、及び、（ｉｉ）補助免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞及び／又は活性化された好中球）、並びに、他のＦｃ受容体発現細胞等のＦｃ受容体発現細胞を、（ｉｉｉ）標的Ｂ細胞と同時に、採用及び活性化可能である。これらの異なるクラスのエフェクター細胞を同時活性化することにより、例えば、貪食及びパーフォリン媒介細胞傷害等の様々なメカニズムによって、ＥＢＶ感染Ｂ細胞を効率的に殺傷する。典型的には、Ｆｃ受容体を含む三機能性抗体の正味の効果は、Ｔ細胞及びＦｃ受容体陽性細胞を、標的Ｂ細胞（すなわち、ＥＢＶ感染Ｂ細胞）にリンクすることであり、それによってウイルス感染細胞が破壊される。
【０１０４】
三機能性抗体は、特に（ｉ）抗体依存性細胞傷害、（ｉｉ）Ｔ細胞媒介細胞傷害、及び、（ｉｉｉ）抗ウイルス免疫の誘導によって、標的細胞の除去を引き起こす。しかしながら、実際には、従来の（モノクローナル及び単一特異性）抗体によって実行されるのは、最初の作用機序のみである。従来の抗体とは対照的に、本発明における三機能二重特異性抗体は、細胞傷害能力がより高く、発現の比較的弱い抗原にさえ結合する。したがって、本発明における三機能二重特異性抗体は、従来の抗体と比較して、同等の用量での標的化された細胞の排除における効力がより大きい（１，０００倍超）。
【０１０５】
上記の実施形態は、適切であれば、任意に組み合わせられ得る。本発明のさらなる可能な実施形態及び実装形態はまた、本発明の事例に関して、前述又は以下に明示的に言及されていない特徴の組み合わせを含む。特に、当業者はまた、本発明のそれぞれの基本形態に対する改良又は追加として、個別の態様を付加すると考えられる。
【０１０６】
以下、本発明の様々な事例について詳細に説明する。しかしながら、それらの事例は例示的なものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【０１０７】
材料及び方法：
ＰＢＭＣの調製及びＢ細胞の富化
末梢血の単核細胞（ＰＢＭＣ）は、ヒトPancoll溶液（Pan Biotech社、ドイツ）を適用した標準的なフィコール密度遠心分離によって、非凝固ＥＤＴＡ又はヘパリン血液から単離した。単離されたＰＢＭＣを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Pan Biotech社、ドイツ）により２回洗浄した。赤血球溶解緩衝液により、赤血球を溶解した。１ｍｌの血液から、約１×１０Ｅｘｐ６のＰＢＭＣを単離することができた。ＰＢＭＣ調製物のＢ細胞は、CELLectioTM Pan Mouse IgG kit（Dynal Biotech社、ドイツ）を使用して、免疫磁気ビーズによって富化した。まず、ＰＢＭＣ調製物のＢ細胞（１×１０Ｅｘｐ７／ｍｌ）を、抗ＣＤ２０モノクローナルマウス抗体（ＴＰＡ１０、Trion Research社）により標識した。次に、抗マウスＩｇＧと結合した磁気ビーズを添加することによって、標識されたＢ細胞を単離した。捕捉する抗体はＤＮＡリンカーを介して該ビーズにリンクしているため、捕捉されたＢ細胞は、ＤＮＡｓｅによる酵素的切断によってビーズから放出された。最後に、残留ビーズが見えなくなるまで、細胞をＰＢＳにより数回洗浄した。Ｂ細胞富化の有効性は、ＦＡＣＳ分析によって制御され、通常は７０〜９９％の範囲であった。
【０１０８】
ＥＢＶ特異的ＥＢＥＲ ＲＮＡの検出のための発色性in situハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）
非翻訳性ＥＢＶ特異的ＥＢＥＲ１及びＥＢＥＲ２ ＲＮＡを発現する潜在的にＥＢＶ感染されたＢ細胞及びＰＢＭＣは、ジゴキシゲニン標識ＥＢＥＲ ＲＮＡ特異的オリゴヌクレオチドプローブ（Zytovision社、ZytoFast EBVプローブ、ＩＶＤ医療器具、ドイツ）を適用するＣＩＳＨによって検出した。ＰＢＭＣ及びＢ細胞は、上記のように調製された。in situハイブリダイゼーションは、製造業者の指示に従って実施した。サイトスピンは、顕微鏡検査によって分析した。陽性染色された細胞が、赤く見えた。
【０１０９】
Ｂ細胞上のｇｐ３５０抗原の検出
２５０×１０Ｅｘｐ３の富化されたＢ細胞をスライドガラス上で遠心分離して、１０％ＡＢ血清溶液中のＥＢＶｇｐ３５０特異的ラットモノクローナル抗体により３０分間染色した。抗体標識細胞は、ＡＰＡＡＰ（アルカリホスファターゼ抗アルカリホスファターゼ）法によって染色した。赤色に陽性染色された細胞をカウントするコンピュータ化された画像分析システム（MDS、Applied Imaging社）によって、サイトスピンスライドを分析した。
【０１１０】
サイトカインの定量化
血漿サンプル中のサイトカインレベルは、サイトカインＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αを含むpremixed 8-plex fluorokine X-Map kit（R&D System社、米国ミネソタ州）と共にLuminex system 200（Luminex社、米国テキサス州）を適用して分析した。指示された時点でサンプルを収集し、−２０℃で保存して、一括で（in batch）測定した。サイトカインの検出限界は、３．２ｐｇ／ｍｌである。
【０１１１】
抗ＥＢＮＡ−１及びＶＣＡＩｇＧ抗体の検出
ＥＢＶ抗原ＥＢＮＡ−１（Epstein-Barr核抗原１）及びＶＣＡ（外殻抗原）に特異的な患者の血漿中の抗体を、製造元（medac社、ドイツ）の指示に従い、ＩＶＤキットＥＬＩＳＡによって決定した。簡単に説明すると、プレコート及びプレブロックされたマイクロタイタープレート上で、血漿サンプルをインキュベートした。洗浄ステップの後に、結合したＥＢＶ特異的ＩｇＧ抗体を、ペルオキシダーゼにコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧ抗体によって検出した。最後に、洗浄されたプレートを、ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）基質溶液を使用して成育（develop）させ、硫酸により反応を停止した。マイクロタイタープレートは、Versamaxプレートリーダー（Molecular Devices社、米国）を使用して、４５０ｎｍにて測定した。ＥＢＶ特異的抗体濃度は、検量線での補間によって計算した。１１ＡＵ／ｍｌより大きい結果を、陽性とみなした。
【０１１２】
自家細胞ワクチンの調製
ＰＢＭＣ及びＢ細胞富化は、６０ｍｌのＥＤＴＡ末梢血から上記のようにして実施した。全ての操作は、層流空気流下の無菌条件下にて実施した。Ｂ細胞画分の細胞２５０×１０３個（０．５ｍｌ ＰＢＳ中）及びＰＢＭＣ５００×１０３個（０．５ｍｌ ＰＢＳ中）を、別々の滅菌セプタム密封ガラスバイアル内に充填した。次に、特異性抗ＣＤ２０×抗ＣＤ３を有する三機能二重特異性抗体１μｇ（０．１ｍｌ ＰＢＳ中）をＢ細胞画分へと添加して、該細胞を室温で１０分間インキュベートした。続いて、ＰＢＭＣ画分をプレインキュベートした自家Ｂ細胞画分へと添加して、さらに１０分間インキュベートした。最終的に、細胞調製物全体を、皮下投与により患者に戻した。追加免疫化の適用（boost application）のために、同じ手順を繰り返した。
【０１１３】
事例
次に、これらの事例を参照して、本発明を詳細に説明する。しかしながら、それらの事例は例示的なものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【０１１４】
事例１
三機能二重特異性抗体に媒介される、in vitroでの富化された自家Ｂ細胞の殺傷
事例１は、in vitroでのＣＤ２０特異的三機能二重特異性抗体によって標的化された、富化された自家Ｂ細胞の効果的な殺傷を示す。方法及び材料の説にて説明したように、健康なドナーからの２５０，０００個の富化されたＢ細胞と５００，０００個のＰＢＭＣとを調製した。これらの細胞を、３機能性二重特異性抗ＣＤ３×抗ＣＤ２０抗体であるＢｉ２０ １μｇの存在下又は非存在下において混合及びインキュベートした（図１）。２４ウェルプレートにおける総量１ｍｌの培地（８．９％ＦＣＳ、Ｌ−グルタミン２ｍＭ、ピルビン酸ナトリウム１ｍＭ及び１ｘ非必須アミノ酸を添加したＲＰＭＩ１６４０培地）において、３７℃かつ５％ＣＯ２で細胞を培養した。３日後に、FACS-Calibur及びCellquest proソフトウェア（Becton Dickinson社、米国）を使用したフローサイトメトリーによって、細胞を分析した。Ｂ細胞は、ＰＥ（フィコエリトリン）にコンジュゲートされた抗ヒトＣＤ２０モノクローナル抗体（Caltag社、米国）で染色して、ヒストグラム統計によって定量化した。図２Ａに示すように、Ｂ細胞の富化における効率は、８０％を超えていた。３日後に、Ｂｉ２０を使用しないアプローチにて検出されたＢ細胞集団は、平均９．２４％であった（ｎ＝２；図２Ｂ）。対照的に、Ｂｉ２０を添加したアプローチでは、平均３．７５％のＢ細胞（ｎ＝２）のみが定量化された（図２Ｃ）。実際に、ヒストグラムを比較すると、別個のＣＤ２０＋Ｂ細胞集団が完全に消失したことが示されている。したがって、三機能二重特異性抗体Ｂｉ２０を添加したことにより、再標的化された細胞傷害性によって、標的化されたＢ細胞が効率的かつ完全に排除された。
【０１１５】
事例２（慢性疲労症候群、慢性乾性咳嗽、寝汗）
ＥＢＶ検査が陽性の４９歳の女性は、１０年間にわたって、断続的に繰り返される倦怠感、リンパ浮腫、慢性中耳炎、寝汗に苛まれていた。さらに、この患者は２０１０年５月に膵炎と診断され、２０１０年７月に直腸癌を発症した。ＥＢＶは、ＰＣＲ分析によって腫瘍細胞で検出され、後に手術痕で検出された。この患者は、２０００年から慢性乾性咳嗽を有している。
【０１１６】
精密なＥＢＶ診断では、例えば、患者の富化されたＢ細胞画分内において、ＥＢＥＲ−１＋２ ＣＩＳＨ陽性Ｂ細胞の頻度が高いこと（＞５０％）及びＩＬ−８値がわずかに上昇していることが評価できた。
【０１１７】
この診断及び未対処の医療的要求のため、患者は治験中の治療用抗ＥＢＶワクチンによる人道的使用治療に参加することを決定した。
【０１１８】
ワクチン細胞調製物を調製するために、６０ｍｌのＥＤＴＡ末梢血を患者から採取した。まず、リンパ球をフィコール勾配遠心分離によって単離した。続いて、ＣＤ２０特異的抗体を使用して、免疫磁気ビーズによって単離されたＰＢＭＣの画分からＢ細胞を富化した。
【０１１９】
ＤＮａｓｅ消化と免疫磁気ビーズを除去するためのいくつかの洗浄ステップの後、富化されたＢ細胞画分（＞８５％）を生成することができた。
【０１２０】
次に、Ｂ細胞画分の細胞２５０×１０３個（０．５ｍｌ滅菌ＰＢＳ内）を、１μｇ（０．１ｍｌ ＰＢＳ）のＢｉ２０と共に、１０分間にわたってインキュベートした。このＢｉ２０は、抗ＣＤ２０×抗ＣＤ３特異性を持つ三機能二重特異性抗体である。
【０１２１】
続いて、ＰＢＭＣ５００×１０３個（０．５ｍｌの滅菌ＰＢＳ内）を、プレインキュベートした自家Ｂ細胞画分へと添加し、さらに１０分間インキュベートした。
【０１２２】
全ての操作は、室温での層流空気流下の無菌条件下にて実施した。
【０１２３】
最終的に、細胞調製物全体を、皮下投与により患者に戻した（２０１５年２月２６日）。
【０１２４】
追加免疫化の適用のために、同じ手順を繰り返した（２０１５年３月２５日及び２０１６年２月２日）。
【０１２５】
治療前、治療中及び治療後に、以下の診断パネルについて評価した。
【０１２６】
免疫学的結果：
【表１】
2021523128.tif 000002
【０１２７】
【表２】
2021523128.tif 000003
【０１２８】
【表３】
2021523128.tif 000004
【０１２９】
【表４】
2021523128.tif 000005
【０１３０】
臨床結果：
細胞調製物の２回目の投与（追加免疫化）後、咳が改善され、ＥＢＶが手術痕及び血液中において陰性として検査された（ＰＣＲ分析）。さらに、患者は寝汗が改善されたことを説明し、集中力の改善だけでなく、より元気になったと感じていた。さらに、最後の治療以来、重度の感染症は観察されず、便通の正常化が見られた。患者のＥＢＶ感染Ｂ細胞は、著しく減少している（図３）。
【０１３１】
事例３（インスリン抵抗性、２型糖尿病、性的能力の問題）
ＥＢＶ及びヘルペスウイルス１型、２型、ＣＭＶ及びクラミジア肺炎の検査で陽性であった５０歳の男性は、高インスリン抵抗性、肝臓酵素上昇、肝臓の代謝機能不全、高コレステロール血症、高トリグリセリド、睡眠障害、倦怠感、集中力欠如及び性的能力の問題を伴うメタボリックシンドロームに苛まれていた。
【０１３２】
精密なＥＢＶ診断では、例えば、患者の富化されたＢ細胞画分内において、ＥＢＮＡ−１＋２ ＣＩＳＨ陽性Ｂ細胞の頻度が高いこと（５０−７５％）が評価できた。この診断及び未対処の医療的要求のため、患者は、事例２にも開示されるような治験中の治療用抗ＥＢＶワクチンによる人道的使用治療に参加することを決定した。
【０１３３】
事例１及び２と同様の細胞調製物をex-vivoで作製し、皮下投与により患者に戻した（２０１５年５月１３日）。
【０１３４】
追加免疫化の適用のために、同じ手順を繰り返した（２０１５年６月１０日）。
【０１３５】
【表５】
2021523128.tif 000006
【０１３６】
臨床結果：
患者は、倦怠感及び性的能力、肝酵素、トリグリセリドの症状の改善、並びに、コレステロール値及びインスリン抵抗性の改善を示した。患者はよく眠れるようになった。患者のＥＢＶ感染Ｂ細胞は、著しく減少している（図４）。
【０１３７】
事例４（皮膚の炎症、睡眠障害、反復感染）
ＥＢＶの検査で陽性であった（ＰＣＲ）４１歳の女性は、慢性気管支炎、代謝症候群、自律神経失調症、極度の倦怠感、便秘及び大量のガス、乳糖不耐症、体重減少、睡眠障害、慢性風邪（chronic flue）、顔面及び背中における大規模な座瘡様の皮膚の問題、寝汗、顎下腺及び頸部腺のリンパ節腫脹に苛まれていた。さらに、ヘルペス−１について、ＰＣＲにより陽性の検査を受けた。ＣＭＶ、ヘルペス−６、並びに、ヘルペス−１及び−２について、ＩｇＧ力価が高かった。
【０１３８】
精密なＥＢＶ診断では、例えば、患者の富化されたＢ細胞画分内において、ＥＢＮＡ−１＋２ ＣＩＳＨ陽性Ｂ細胞の頻度が高いこと（＞７５％）及びＩＬ−８値がわずかに上昇していることが評価できた（表参照）。
【０１３９】
この診断及び未対処の医療的要求のため、患者は、事例２にも開示されるような治験中の治療用抗ＥＢＶワクチンによる人道的使用治療に参加することを決定した。
【０１４０】
事例１及び２と同様の細胞調製物をex-vivoで作製し、皮下投与により患者に戻した（２０１５年３月２６日）。
【０１４１】
追加免疫化の適用のために、同じ手順を繰り返した（２０１５年５月５日）。
【０１４２】
治療前、治療中及び治療後に、以下の診断パネルについて評価した。
【０１４３】
免疫学的結果：
【表６】
2021523128.tif 000007
【０１４４】
【表７】
2021523128.tif 000008
【０１４５】
血液学的結果：
【表８】
2021523128.tif 000009
【０１４６】
【表９】
2021523128.tif 000010
【０１４７】
臨床結果：
皮膚の炎症及び倦怠感の症状の改善が観察された。気管支感染症の発生率は、大幅に減少した。患者は、寝汗をかくことなく、再び正常に眠ることができるようになった。便通が正常化することにより、体重が改善されると共に、自律神経失調症が改善された（神経性胃炎が改善された）。患者のＥＢＶ感染Ｂ細胞は、著しく減少している（図５）。
【０１４８】
事例５（手指、足指及び顔面における多発神経障害性疼痛及び浮腫、反復感染、睡眠障害、リンパ節腫脹、子宮内膜症、慢性膀胱炎、乳管の慢性炎症）
ＥＢＶの検査で陽性であった４８歳の女性は、子宮内膜症、倦怠感、記憶力及び集中力の問題、睡眠の問題、寝汗、鼠径部と顎下腺のリンパ節腫脹、慢性膀胱炎、両乳房の乳管の慢性炎症、手指及び爪先の多発神経障害性疼痛、脚、手指及び顔面のリンパ浮腫、並びに、アレルギー（鼻水）に苛まれていた。この患者は、２０１４年に膀胱癌を発症した（ステージ１）。この患者は、ヘルペス６型、ＣＭＶ、クラミジア肺炎に対して高いＩＧＧを示した。
【０１４９】
精密なＥＢＶ診断では、例えば、患者の富化されたＢ細胞画分内において、ＥＢＥＲ−１＋２ ＣＩＳＨ陽性Ｂ細胞の頻度が高いこと（＞７５％）及びＩＬ−８値がわずかに上昇していることが評価できた（表参照）。
【０１５０】
この診断及び未対処の医療的要求のため、患者は、事例２にも開示されるような治験中の治療用抗ＥＢＶワクチンによる人道的使用治療に参加することを決定した。
【０１５１】
事例１及び２と同様の細胞調製物をex-vivoで作製し、皮下投与により患者に戻した（２０１５年３月２４日）。
【０１５２】
追加免疫化の適用のために、同じ手順を繰り返した（２０１５年５月５日）。
【０１５３】
治療前、治療中及び治療後に、以下の診断パネルについて評価した。
【０１５４】
免疫学的結果：
【表１０】
2021523128.tif 000011
【０１５５】
【表１１】
2021523128.tif 000012
【０１５６】
【表１２】
2021523128.tif 000013
【０１５７】
臨床結果：
追加免疫化後、患者は集中力及び記憶力の改善、並びに、睡眠の正常化を示した。乳房の乳管の慢性炎症と共に、倦怠感の症状が解消した。手指、爪先及び顔面において、多発神経障害性疼痛及び浮腫が改善された。アレルギー症状（鼻水）の改善も観察され、感染率は低下した。患者のＥＢＶ感染Ｂ細胞は、著しく減少している（図６）。
【０１５８】
事例６（インスリン抵抗性、２型糖尿病、シェーグレン症候群、関節リウマチ、橋本病、脱毛、記憶障害、目乾燥及び口腔乾燥）
ＥＢＶの検査で陽性となった５８歳の女性は、シェーグレン症候群、関節リウマチ、橋本病、脱毛、記憶障害、目乾燥及び口腔乾燥、インスリン抵抗性に苛まれていた。
【０１５９】
精密なＥＢＶ診断では、例えば、患者の富化されたＢ細胞画分内において、ＥＢＥＲ−１＋２ ＣＩＳＨ陽性Ｂ細胞の頻度が高いこと（５０−７５％）が評価できた。
【０１６０】
この診断及び未対処の医療的要求のため、患者は、事例２にも開示されるような治験中の治療用抗ＥＢＶワクチンによる人道的使用治療に参加することを決定した。
【０１６１】
事例１及び２と同様の細胞調製物をex-vivoで作製し、皮下投与により患者に戻した（２０１５年７月２９日）。
【０１６２】
追加免疫化の適用のために、同じ手順を繰り返した（２０１５年９月１５日）。
【０１６３】
治療前、治療中及び治療後に、以下の診断パネルについて評価した。
【０１６４】
免疫学的結果：
【表１３】
2021523128.tif 000014
【０１６５】
【表１４】
2021523128.tif 000015
【０１６６】
【表１５】
2021523128.tif 000016
【０１６７】
【表１６】
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【０１６８】
臨床結果：
インスリン抵抗性及び感染率の有意な低下が観察された。典型的なシェーグレン症候群である皮膚の変色が改善された。脱毛は停止した。患者のＥＢＶ感染Ｂ細胞は、著しく減少している（図７）。
【０１６９】
事例７（関節リウマチ、インスリン抵抗性）
ＥＢＶの検査で陽性となった４４歳の男性は、関節リウマチ、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性に苛まれていた。
【０１７０】
精密なＥＢＶ診断では、例えば、患者の富化されたＢ細胞画分内において、ＥＢＥＲ−１＋２ ＣＩＳＨ陽性Ｂ細胞の頻度が中程度であること（２５−５０％）が評価できた。加えて、非常に多数（３８）のｇｐ３５０陽性Ｂ細胞が検出されており、この患者におけるＥＢＶ再活性化が活発であると言える。
【０１７１】
この診断及び未対処の医療的要求のため、患者は、事例２にも開示されるような治験中の治療用抗ＥＢＶワクチンによる人道的使用治療に参加することを決定した。
【０１７２】
事例１及び２と同様の細胞調製物をex-vivoで作製し、皮下投与により患者に戻した（２０１５年８月１８日）。
【０１７３】
追加免疫化の適用のために、同じ手順を繰り返した（２０１５年９月１５日）。
【０１７４】
治療前、治療中及び治療後に、以下の診断パネルについて評価した。
【０１７５】
免疫学的結果：
【表１７】
2021523128.tif 000018
【０１７６】
【表１８】
2021523128.tif 000019
【０１７７】
【表１９】
2021523128.tif 000020
【０１７８】
臨床結果：
追加免疫化の７週間後（２０１５年９月１５日）、関節リウマチの症状は大幅に改善された。これは、炎症性サイトカインＩＬ−５、ＩＬ−２２、ＩＮＦ−γ及びリウマチ関連の検査値（ＲＦ、ＡＮＡ−ＩＦＴ）の低下と一致している。２０１５年９月以降、鎮痛剤は必要なかった（少なくとも６カ月の追跡調査）。手関節の腫れは、有意に減少した。インスリン抵抗性は、正常化した。２０１６年の間、関節リウマチの再発は観察されず、橋本病症候群及び湿疹（酒さ）は安定した状態を維持していた。患者のＥＢＶ感染Ｂ細胞は、治療の進行に伴い著しく減少している（図８及び図９）。
【０１７９】
事例８（１型糖尿病）
ＥＢＶの検査で陽性となった９歳の少女は、１型糖尿病のインスリン抵抗性に苛まれていた。
【０１８０】
精密なＥＢＶ診断では、例えば、患者の富化されたＢ細胞画分内において、ＥＢＮＡ−１＋２ ＣＩＳＨ陽性Ｂ細胞の頻度が高いこと（５０−７５％）が評価できた。
【０１８１】
この診断及び未対処の医療的要求のため、患者は、事例２にも開示されるような治験中の治療用抗ＥＢＶワクチンによる人道的使用治療に参加することを決定した。
【０１８２】
事例１及び２と同様の細胞調製物をex-vivoで作製し、皮下投与により患者に戻した（２０１５年１１月１１日）。
【０１８３】
【表２０】
2021523128.tif 000021
【０１８４】
臨床結果：
治療後、成長は改善され、気力全般及び睡眠の質も改善された。ＨＢＡ１ｃ値は安定した状態を維持しており、追跡調査の間、重度の感染は観察されなかった。患者のＥＢＶ感染Ｂ細胞は、著しく減少している（図１０）。
【０１８５】
事例９（膣扁平苔癬）
ＥＢＶの検査で陽性となった６５歳の女性は、膣扁平苔癬、慢性の膣感染症、慢性の膣疼痛、慢性疲労、集中力欠如に苛まれていた。
【０１８６】
精密なＥＢＶ診断では、例えば、患者の富化されたＢ細胞画分内において、ＥＢＥＲ−１＋２ ＣＩＳＨ陽性Ｂ細胞の頻度が高いこと（５０−７５％）が評価できた。
【０１８７】
この診断及び未対処の医療的要求のため、患者は、事例２にも開示されるような治験中の治療用抗ＥＢＶワクチンによる人道的使用治療に参加することを決定した。
【０１８８】
事例１及び２と同様の細胞調製物をex-vivoで作製し、２０１５年１０月２２日に皮下投与により患者に戻した。
【０１８９】
追加免疫化の適用のために、同じ手順を繰り返した（２０１５年１１月１９日）。
【０１９０】
治療前、治療中及び治療後に、以下の診断パネルについて評価した。
【０１９１】
【表２１】
2021523128.tif 000022
【０１９２】
臨床結果：
２０１５年１０月には、患者は慢性の膣感染症、慢性の膣疼痛、慢性疲労、集中力欠如を示していた。２０１６年１月、２０１６年５月、２０１６年１０月の治療後の検査の間、患者の状況は絶えず改善し続けていた。このことは検査パラメーターによっても確認され、このとき、Ｂ細胞ＥＢＶ負荷及びサイトカイン力価の低下が観察されていた。２０１７年６月における最後の検査では、Ｂ細胞ＥＢＶ負荷は未だ２５％未満であり、患者は再び正常な元気があり、感染はなく、膣扁平苔癬は減少し、膣疼痛はなかった。患者のＥＢＶ感染Ｂ細胞は、治療の進行に伴い著しく減少している（図１１及び１２）。
【０１９３】
事例１０（慢性膀胱炎及び前立腺炎）
ＥＢＶの検査で陽性となった６５歳の男性は、慢性膀胱炎及び前立腺炎、鬱病、倦怠感、咳、並びに、インスリン抵抗性に苛まれていた。
【０１９４】
精密なＥＢＶ診断では、例えば、患者の富化されたＢ細胞画分内において、ＥＢＥＲ−１＋２ ＣＩＳＨ陽性Ｂ細胞の頻度が高いこと（＞７５％）が評価できた。
【０１９５】
この診断及び未対処の医療的要求のため、患者は、事例２にも開示されるような治験中の治療用抗ＥＢＶワクチンによる人道的使用治療に参加することを決定した。
【０１９６】
事例１及び２と同様の細胞調製物をex-vivoで作製し、２０１５年１０月１６日に皮下投与により患者に戻した。
【０１９７】
追加免疫化の適用のために、同じ手順を繰り返した（２０１７年４月２７日）。
【０１９８】
治療前、治療中及び治療後に、以下の診断パネルについて評価した。
【０１９９】
【表２２】
2021523128.tif 000023
【０２００】
臨床結果：
２０１６年５月の訪問中の治療後、集中力（concentration）及び精神集中力（focusing）の改善が観察された。前立腺炎は、２０１６年３月における１回の再発で止まり、抗生物質で治療することができた。膀胱炎は、一般的な感染率と同様に改善された。抗うつ薬を３種類の抗うつ薬から１種類の抗うつ薬まで減らすことができたと共に、バルビツール酸塩もまた減らすことができた。線維筋痛性の疼痛の軽減もまた観察された。患者のＥＢＶ感染Ｂ細胞は、治療の進行に伴い著しく減少してする（図１３及び１４）。
【０２０１】
事例１１（多発性硬化症）
ＥＢＶの検査で陽性となった４０歳の女性は、多発性硬化症（ＭＳ）に苛まれていた。精密なＥＢＶ診断では、例えば、患者の富化されたＢ細胞画分内において、ＥＢＥＲ−１＋２
ＣＩＳＨ陽性Ｂ細胞の頻度が高いこと（＞７５％）が評価できた。
【０２０２】
この診断及び未対処の医療的要求のため、患者は、事例２にも開示されるような治験中の治療用抗ＥＢＶワクチンによる人道的使用治療に参加することを決定した。
【０２０３】
事例１及び２と同様の細胞調製物をex-vivoで作製し、皮下投与により患者に戻した（２０１５年１２月３日）。
【０２０４】
追加免疫化の適用のために、同じ手順を繰り返した（２０１６年１１月６日）。
【０２０５】
治療前、治療中及び治療後に、以下の診断パネルについて評価した。
【０２０６】
【表２３】
2021523128.tif 000024
【０２０７】
臨床結果
患者は、２０１１年半ばにＭＲＩ及び腰椎吸引によって最初に診断された進行性多発性硬化症を有しており、脚のだるさ、足のしびれ、歩行及びバランスを取ることの困難さ、両脚の電撃痛（down shooting pain）の症状があった。患者は、アボネックス３０ｍｇ、コルチゾンによる治療を受けた。２０１２年の初めに、患者において進行が発症し、ＭＲＩにてより活動性のＭＳ病変Ｃ４／５（頸椎）が見られた。その後、治療法をインターフェロンに変更した。患者は、集中力の問題、睡眠障害、倦怠感、主に右脚及び足のしびれの増加、歩行の不均衡の症状を発症した。２０１３年１２月、鬱病のさらなる進行と発症の下で、ＭＲＩにてより進行性のＭＳ病変Ｃ４／５を伴う多発性湿疹（初めて診断された）が見られた。治療法をrefib、コルチゾンに変更した。患者は、痛みの増大により１ｋｍ未満しか歩かず、かつ歩行に補助が必要となる症状や、右腕の衰弱及び集中力の問題という症状があった。２０１４年３月に、ＭＲＩにて疾患の進行が見られ、小脳領域（脳）及び胸椎（Ｔ２＝正確な局在：第２胸椎）の新たな病変、並びに、病変Ｃ４／５の新たな進行を伴っていた。標準的な治療法は、もはや利用できなかった。ファンプリジン、２ｘ樹状細胞療法による試験を行った。
【０２０８】
試験治療の開始時に、患者はめまい、倦怠感の増加、脚のだるさ、右側の比較的多くのしびれ、及び、睡眠障害の症状を有していた。
【０２０９】
２０１４年７月に、ＭＲＩにてＣ４／５病変の疾患の進行が見られ、脳のしびれ、神経変性、脱髄プロセスが増加した。体外循環光療法及び抗炎症剤注入による治療を開始した。患者は、右脚制御不能、倦怠感の増加、記憶及び集中力の問題の増加、より深刻な睡眠の問題の症状を有していた。
【０２１０】
２０１５年２月：ＭＲＩにて安定した疾患Ｃ４／５が見られ、Ｔ２は活動性が低下し、小脳は正常で、湿疹は減少していた。ハーブ抽出物（ウコン）とオメガ３−脂肪酸による抗炎症療法を継続した。患者は、歩行の改善、しびれの減少、睡眠の改善及び気力の増加の病状を有していた。
【０２１１】
２０１５年１１月：ＭＲＩにてＣ４／５の進行及びＴ２の進行が見られた。患者は、倦怠感の増加、右足のしびれの増加、右腕の感覚の低下、右手の指のうずき、回転性めまい（Vertigo）及びめまいの症状を示した。最初の治療的ＥＢＶワクチン接種（人道的使用）を、２０１５年１２月初旬に開始した。
【０２１２】
２０１６年６月：ＭＲＩにて安定した疾患Ｃ４／５及びＴ２が見られた。患者は、さらなるしびれの改善、バランス機能の改善、回転性めまい無し、めまい無し、気力の増加の病状を示した。
【０２１３】
２０１６年１０月：ＭＲＩにて安定したＣ４／５疾患及びＴ２の軽度の進行が見られた。患者は、足及び脚のしびれの増加、湿疹無し、良好な気力、良好な睡眠という病状を示した。
【０２１４】
２０１６年１１月６日：２回目の治療的ＥＢＶワクチン接種を開始した。
【０２１５】
２０１７年３月：ＭＲＩにて、Ｃ４／５は安定していた。患者は、しびれの減少という病状を有していた。
【０２１６】
２０１７年９月：ＭＲＩにてＣ４／５の非活動性病変が見られ、Ｔ２の病変は見られなかった。
【０２１７】
２０１８年４月：ＭＲＩ：患者は安定した見た目を示した。
【０２１８】
患者のＥＢＶ感染Ｂ細胞は、ＥＢＶワクチン接種療法の進行に伴い著しく減少している（図１５及び１６）。
【０２１９】
事例１２（片頭痛、円形脱毛症、座瘡、体重増加、慢性疲労症候群、集中力不足、記憶力不足）
ＥＢＶ再活性化の検査で陽性となった（ＥＢＥＲ−１＋２ ＣＩＳＨ陽性Ｂ細胞の頻度が高い）女性患者（生年月日：１９９７年１月２８日）は、片頭痛、円形脱毛症、座瘡、体重増加、慢性疲労症候群、集中力不足及び記憶力不足を含む自己免疫症状を示していた。
【０２２０】
事例１及び２と同様の細胞調製物をex-vivoで作製し、２０１５年８月に皮下投与により患者に戻した。
【０２２１】
追加免疫化の適用のために、２０１５年１０月に同じ手順を繰り返した。
【０２２２】
【表２４】
2021523128.tif 000025
【０２２３】
臨床結果：
２０１６年６月以降、患者は正常な発毛、８ｋｇの体重減少、正常な集中力、気力の増加を示した。これ以上の頭痛は観察されなかった。臨床転帰の改善は、ＥＢＶ陽性Ｂ細胞の減少（ＣＩＳＨ分析によれば、５０−７５％カテゴリーから＜２５％カテゴリーへの減少が示された）、免疫複合体（ＣＩＣ−ＩｇＭ、ＣＩＣ−ＩｇＧ及びＣＩＣ−Ｃ３）の減少、並びに、ＩＬ−８、ＩＬ−１７及びＩＬ−２２についての正常化した炎症性サイトカイン値に相関している。
【０２２４】
事例１３（メタボリックシンドローム、体重増加、記憶力不足、逆流症、脱毛）
ＥＢＶ再活性化の検査で陽性となった（ＥＢＥＲ−１＋２ ＣＩＳＨ陽性Ｂ細胞の頻度が高い）女性患者（生年月日：１９８９年１０月９日）は、メタボリックシンドローム、体重増加、記憶力不足、逆流症、脱毛を含む自己免疫症状を示していた。
【０２２５】
事例１及び２と同様の細胞調製物をex-vivoで作製し、２０１５年８月に皮下投与により患者に戻した。
【０２２６】
追加免疫化の適用のために、２０１５年１０月に同じ手順を繰り返した。
【０２２７】
【表２５】
2021523128.tif 000026
【０２２８】
臨床結果：
２０１６年以降、患者は気力の改善、５ｋｇの体重減少を示した。２０１８年以降、患者は１０ｋｇの体重減少、正常な発毛、正常になった記憶力を示し、感染はなかった。臨床転帰の改善は、ＥＢＶ陽性Ｂ細胞の減少（ＣＩＳＨ分析によれば、５０−７５％カテゴリーから＜２５％カテゴリーへの減少が示された）、免疫複合体（ＣＩＣ−ＩｇＭ、ＣＩＣ−ＩｇＧ及びＣＩＣ−Ｃ３）の減少、並びに、ＩＬ−８及びＩＬ−２２についての正常化した炎症性サイトカイン値及び正常化したＨＯＭＡ値に相関している。
【０２２９】
事例１４（慢性帯状疱疹、慢性前立腺炎、慢性疲労症候群）
ＥＢＶ再活性化の検査で陽性となった（ＥＢＥＲ−１＋２ ＣＩＳＨ陽性Ｂ細胞の頻度が高い）男性患者（生年月日：１９５７年６月３０日）は、慢性帯状疱疹、慢性前立腺炎及び慢性疲労症候群を示しており、複数の抗生物質治療を受けていた。
【０２３０】
事例１及び２と同様の細胞調製物をex-vivoで作製し、２０１５年１１月６日に皮下投与により患者に戻した。
【０２３１】
追加免疫化の適用のために、２０１５年１１月末に同じ手順を繰り返した。
【０２３２】
【表２６】
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【０２３３】
臨床結果：
２０１６年以降、患者は帯状疱疹及び倦怠感がなく、抗生物質の減少及び前立腺炎感染の頻度の減少を示した。臨床転帰の改善は、ＥＢＶ陽性Ｂ細胞の減少（ＣＩＳＨ分析によれば、５０−７５％カテゴリーから２５−５０％カテゴリーへの減少が示された）、免疫複合体（ＣＩＣ−ＩｇＭ及びＣＩＣ−ＩｇＧ）の減少、抗核抗体の減少及びＰＳＡの正常値への低下に相関している。
【０２３４】
事例１５（慢性肝炎（非ＨＢＶ、ＨＣＶ）、慢性膵炎、慢性疲労症候群、下痢／ＩＢＳ、慢性気管支炎）
ＥＢＶ再活性化の検査で陽性となった（ＥＢＥＲ−１＋２ ＣＩＳＨ陽性Ｂ細胞の頻度が高い）男性患者（生年月日：１９６５年６月２３日）は、慢性肝炎（非ＨＢＶ、ＨＣＶ）、慢性膵炎、慢性疲労症候群、下痢／ＩＢＳ及び慢性気管支炎を含む自己免疫症状及びＥＢＶ誘発性肝炎を示していた。
【０２３５】
事例１及び２と同様の細胞調製物をex-vivoで作製し、２０１５年１１月に皮下投与により患者に戻した。
【０２３６】
追加免疫化の適用のために同じ手順を繰り返し、１回目の追加免疫化は２０１５年１１月に、２回目の追加免疫化は２０１７年６月に行った。
【０２３７】
【表２７】
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【０２３８】
臨床結果：
２０１８年以降、患者は倦怠感及び下痢がなく、正常化したＩＢＳ（過敏性腸症候群）及び感染症の頻度の減少を示した。肝炎は改善し、肝酵素は正常値まで減少した。さらに、臨床転帰の改善は、ＥＢＶ陽性Ｂ細胞の減少（特に、Trivaccによる２回目の追加免疫化後。ＣＩＳＨ分析によれば、７５％カテゴリーから＜２５％カテゴリーへの減少が示された）、免疫複合体（ＣＩＣ−ＩｇＭ、ＣＩＣ−ＩｇＧ及びＣＩＣ−Ｃ３）の減少、抗核抗体の減少及び炎症性サイトカインＩＬ−６及びＩＬ−８の減少に相関している。
【０２３９】
事例１６（慢性疲労症候群、下痢／ＩＢＳを伴う大腸炎、慢性風邪様症状、橋本病）
ＥＢＶ再活性化の検査で陽性となった（ＥＢＥＲ−１＋２ ＣＩＳＨ陽性Ｂ細胞の頻度が高い）男性患者（生年月日：１９８６年８月１日）は、慢性疲労症候群、下痢／ＩＢＳを伴う大腸炎、慢性風邪様症状及び橋本病を含む自己免疫症状を示していた。
【０２４０】
事例１及び２と同様の細胞調製物をex-vivoで作製し、２０１５年１０月に皮下投与により患者に戻した。
【０２４１】
追加免疫化の適用のために、２０１５年１１月に同じ手順を繰り返した。
【０２４２】
【表２８】
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【０２４３】
臨床結果：
２０１８年以降、患者は倦怠感及び下痢がなく、正常化したＩＢＳ（過敏性腸症候群）、感染症の頻度の減少、良好な集中力及び正常な記憶力を示した。橋本病は、ＴＳＨ及び抗ＴＰＯが正常値まで低下したことに相関して正常化した。さらに、臨床転帰の改善は、ＥＢＶ陽性Ｂ細胞の減少（ＣＩＳＨ分析によれば、７５％カテゴリーから＜２５％カテゴリーへの減少が示された）、免疫複合体（ＣＩＣ−ＩｇＡ、ＣＩＣ−ＩｇＭ、ＣＩＣ−ＩｇＧ及びＣＩＣ−Ｃ３）の減少、抗核抗体の減少及び炎症性サイトカインＩＬ−６及びＩＬ−８の減少に相関している。
【０２４４】
事例１７（橋本病、ＥＢＶ−自己免疫性肝炎、ＥＢＶ−インスリン抵抗性を伴う自己免疫性膵炎）
ＥＢＶ再活性化の検査で陽性となった（ＥＢＥＲ−１＋２ ＣＩＳＨ陽性Ｂ細胞の頻度が高い）患者（生年月日：１９７８年１２月１４日）は、橋本病、ＥＢＶ−自己免疫性肝炎及びインスリン抵抗性を伴うＥＢＶ−膵炎自己免疫を含む自己免疫症状を示していた。
【０２４５】
以下に、この患者の病歴を示す。
１９９２年            単核球症
１９９８年            カンピロバクター、はしか（ルベオラ）の再活性化
２００３年            ヘルペス帯状疱疹
２０１４年７月        充実性肺炎
２０１５年７月        充実性肺炎
２０１５年１０月      ウイルス誘発性心膜炎（ＥＢＶ及びヘルペス２）
２０１５年１２月      インフルエンザＢ、Ｂ細胞におけるＥＢＶ陽性（ＣＩＳＨ）
２０１６年１月        糖尿病、筋緊張亢進
２０１６年４月        胸水、エンテロウイルス及びコクサッキーウイルス陰性
２０１８年５月        ＩＢＳ（過敏性腸症候群）、食道静脈瘤及び出血
２０１８年７月        ＥＢＶベースの肝炎及び膵炎、糖尿病／インスリン抵抗性の悪化、１回目の治療的ＥＢＶワクチン接種
２０１８年９〜１２月  トルリシティによる治療、しかし副作用のために中止
２０１９年１月        ＨＯＭＡ値の大幅な改善、糖尿病無し、ＩＢＳの改善、下痢の減少、肝炎の再活性化
２回目の治療的ＥＢＶワクチン接種
２０１９年３月        一般的に、臨床状況の改善は、１回目及び２回目の治療的ＥＢＶワクチン接種（Trivacc）後に観察できた。したがって、橋本病（抗ＴＰＯ値が正常化）、インスリン抵抗性（ＨＯＭＡが２０．８から４．０まで減少）及び肝炎（２回目のＥＢＶワクチン接種後に、ＧＯＴ、ＧＰＴ、ＧＧＴ及びビリルビンについて肝臓値が改善）について、臨床状況及び検査値が改善した。並行して、ＰＣＲデータによれば、ＥＢＶのウイルス量は大幅に減少した（ＰＣＲサイクルは３１．０８から３２．２７まで増加し、これはウイルス量が少ないことを示している）。この結果は、末梢血中のＥＢＶ陽性Ｂ細胞の減少（ＣＩＳＨの結果は、２回目のワクチン接種後に＞７５％カテゴリーから２５−５０％カテゴリーへと減少した）によって裏付けられた。さらに、自己免疫応答のマーカーとしての血液中における免疫複合体も減少し、ＣＩＣ−ＩｇＡ、ＣＩＣ−ＩｇＧ、ＣＩＣ−Ｃ３のバックグラウンド値に達した。抗核抗体（ＡＮＡ−ＩＦＴ）もまた、バックグラウンドレベルまで減少した。
【０２４６】
【表２９】
2021523128.tif 000030
【０２４７】
【表３０】
2021523128.tif 000031
【０２４８】
【表３１】
2021523128.tif 000032
【０２４９】
【表３２】
2021523128.tif 000033
【０２５０】
ＰＣＲ−ウイルス
【表３３】
2021523128.tif 000034
【図１】
2021523128.tif 000035
【図２Ａ】
2021523128.tif 000036
【図２Ｂ】
2021523128.tif 000037
【図２Ｃ】
2021523128.tif 000038
【図３】
2021523128.tif 000039
【図４】
2021523128.tif 000040
【図５】
2021523128.tif 000041
【図６】
2021523128.tif 000042
【図７】
2021523128.tif 000043
【図８】
2021523128.tif 000044
【図９】
2021523128.tif 000045
【図１０】
2021523128.tif 000046
【図１１】
2021523128.tif 000047
【図１２】
2021523128.tif 000048
【図１３】
2021523128.tif 000049
【図１４】
2021523128.tif 000050
【図１５】
2021523128.tif 000051
【図１６】
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【国際調査報告】
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