(57)【要約】  本発明は、分子生物学、生命工学、および分子診断学の分野に関する。本発明は、遺伝子、ウイルス、および他の疾患の診断を含めた、核酸を検出するために使用するＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲシステムの開発および最適化に使用することができる。提案した方法の本質は、オリゴヌクレオチドの中性誘導体、すなわち、グアニジンまたは置換グアニジン残基がリン原子上に導入されている、１つ以上のリン酸基を含有するホスホリルグアニジンを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および逆転写と組み合わせたＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を含めた鋳型に基づく増幅のプライマーとして使用することである。本発明は、ＰＣＲのプロセスにおいてより信頼性のある、特異的かつ選択的な結果を得ることを可能にする、特に、オリゴヌクレオチドプライマー中の修飾されたリン酸基の位置および数の様々な組合せを使用することによって、意図的に抑制することを含めてＤＮＡ増幅の副産物の収率を低下させるおよび／またはＰＣＲ産物の収率を制御することによって、ＰＣＲの感度を増加させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
鋳型に基づく酵素的ＤＮＡ合成の方法であって、一般式（Ｉ）：
【化１】
2021505205.tif 000002
に対応する、少なくとも１つの単位間ホスホリルグアニジン基を含有するプライマー
［式中、
Ｘは、前記単位間ホスホリルグアニジン基の５’側にあるオリゴマー（プライマー）の単位または単位の鎖であり、
Ｙは、前記単位間ホスホリルグアニジン基の３’側にあるオリゴマー（プライマー）の単位または単位の鎖であり、
置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４のそれぞれは、水素原子Ｈまたは任意選択で置換された有機基であり得る］
を使用して反応を開始させることを特徴とする、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の鋳型に基づく酵素的ＤＮＡ合成の方法であって、核酸の増幅に使用することを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の鋳型に基づく酵素的ＤＮＡ合成の方法であって、ポリメラーゼ連鎖反応を実施するために使用することを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の鋳型に基づく酵素的ＤＮＡ合成の方法であって、対立遺伝子に特異的なポリメラーゼ連鎖反応を実施するために使用することを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１に記載の鋳型に基づく酵素的ＤＮＡ合成の方法であって、逆転写に使用することを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１に記載の鋳型に基づく酵素的ＤＮＡ合成の方法であって、逆転写および続くポリメラーゼ連鎖反応の両方の段階において使用することを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１に記載の鋳型に基づく酵素的ＤＮＡ合成の方法であって、ローリングサークル機構による核酸の増幅に使用することを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１に記載の鋳型に基づく酵素的ＤＮＡ合成のための、反応混合物。
【請求項９】
請求項１に記載の鋳型に基づく酵素的ＤＮＡ合成のための、１組の反応混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学および分子診断学の分野に関する。本発明の目的は、リン原子上にグアニジンまたは置換グアニジン残基を保有する１つ以上のリン酸基を含有するオリゴヌクレオチドの新しい誘導体、すなわちホスホリルグアニジンの、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および逆転写と組み合わせたＰＣＲを含めた鋳型に基づく増幅のプロセスにおける、プライマーとしての使用である。
【背景技術】
【０００２】
オリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーとして幅広く使用されており、これは、その境界がプライマーのヌクレオチド配列によって決定されるＤＮＡ断片のコピー数の増加を可能にする［１、２］。
【０００３】
プライマーの構造がＰＣＲの効率を大部分決定するため、合理的な設計のフレームワーク内で、確立された基準組に厳密に従って、その配列を選択することが強いられる。ほとんどの場合、天然オリゴデオキシリボヌクレオチドをプライマーとして使用する。標準オリゴヌクレオチドに加えて、ＰＣＲの効率を変更するために修飾された断片が導入されたいくつかのオリゴヌクレオチド誘導体がプライマーとして提案されている。たとえば、そのようなオリゴヌクレオチド誘導体には、「ロックド」核酸（ＬＮＡ）［３］またはオリゴエチレングリコールリン酸ジエステル［４］に基づくヌクレオチド単位を、いわゆる「協同的」プライマーの一部として含有する誘導体が含まれる。さらに、そのような修飾の存在は、ＤＮＡ鋳型と修飾オリゴヌクレオチドプライマーとの間で形成された複合体の融解温度に顕著な影響を与える。たとえば、ＬＮＡ単位は融解温度を上昇させる一方で、ヘキサエチレングリコールはそれを低下させる。
【０００４】
糖−リン酸主鎖の構造を変更することに加えて、ＰＣＲの効率に影響を与える代替選択肢は、複素環窒素塩基の修飾［５］、プライマーと増幅したＤＮＡとの複合体の安定性を増加させる非ヌクレオチド部分の導入［６］である。
【０００５】
ＰＣＲの正確さを高める別の方法は、化学薬品または物理的刺激、たとえば光または温度の作用下で除去することができる［７、８］、３’末端断片の一時的な保護を有する、オリゴヌクレオチド誘導体をプライマーとして使用することである。
【０００６】
オリゴヌクレオチド誘導体に基づく上述の種類のプライマーの不利点は、追加の単量体修飾因子を予備的に得る必要性であり、その後、これを自動オリゴヌクレオチド合成中に使用する。
【０００７】
モルホリノおよびペプチジルヌクレオチドなどの完全に非荷電のオリゴヌクレオチド誘導体は、その糖−リン酸主鎖は酵素によって認識されず［９］、その合成は時間および資源に関し要求がやや多いため、プライマーとして使用されない。
【０００８】
部分的に非荷電のオリゴヌクレオチド、たとえば、リン酸トリエステルの残基を含有するもの、すなわち、酸素原子の残基の代わりに脂肪族アルコールの残基を保有するものを、ＤＮＡ増幅のプライマーとして使用することができるが、その入手には、特殊なホスホルアミドヌクレオチド単量体の使用、ならびに合成後脱遮断および合成されたオリゴヌクレオチドの単離の非標準的条件を必要とする［１０］。プライマー伸長およびＤＮＡ断片増幅の様々な温度様式を用いた、広範囲のＤＮＡポリメラーゼを使用した、反応混合物中での部分的に非荷電のオリゴヌクレオチドの広範な使用について記載された例は存在しない。
【０００９】
提案された方法に最も近い類似物、すなわちプロトタイプは、ヌクレオチド間リン酸基内のリン原子上に、酸素原子の代わりに導入された置換基を含有する、修飾オリゴヌクレオチドプライマー、すなわち、ホスホロチオエート残基を有するオリゴヌクレオチドの存在下で増幅する方法である［１１］。この種類の主鎖修飾を有するプライマーは、標準のヌクレオチド単量体を使用するが、特殊な酸化剤を使用して調製することができる。このプロトタイプの不利点は、以下からなる、そのようなシステムを使用するための限定的な条件である。
・ホスホロチオエート含有プライマーはＤＮＡ検出にのみ使用されること、
・プロトタイプでは、使用する酵素組は、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼによって制限されており（すなわち、補正活性を有するポリメラーゼの使用は非特異的な増幅の減少をもたらさない）、５５〜６１℃の範囲でプライマーを伸長させることができること、
・増幅反応の条件は熱サイクル様式であること、
・ＤＮＡ産物を検出するために使用する修飾オリゴヌクレオチド内に５’末端タグを導入する必要があること。
【００１０】
対照的に、酵素反応におけるホスホリルグアニジンの使用は、以下に関連して、このクラスの化合物の特性のおかげで効率的である。
・合成プロトコルにおいて、その合成には前駆体の追加のアミドホスファイト単量体の導入を必要とせず、標準の自動ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機で実施されること、
・オリゴヌクレオチド中のホスホリルグアニジン基（ＰＧ）の数および位置は限定されず、自動合成によって設定および制御され、それにより、完全に修飾された誘導体および部分的に置換されたリン酸ジエステル残基を有する誘導体の両方を得ることが可能になること、
・ＰＧの存在は、溶液の中等度のイオン強度の条件下でＮＡ／ＮＡ複合体の融解温度の顕著な変化をもたらさないこと、
・本明細書の実施例１に示すように、酸素原子（生理的条件下で負荷電）のうちの１つの代わりにグアニジン基（少なくとも８個の原子）を導入することは、リン原子上の置換基の体積を顕著に増加させ、生理的条件下でＰＧを非荷電にさせること、
・オリゴヌクレオチド内へのＰＧの導入は、広いｐＨ範囲での化学的安定性およびヌクレアーゼの作用に対する耐性を有する前記オリゴヌクレオチドを提供すること、
・ホスホリルグアニジン基の数および位置を変えることによって、同じヌクレオチド配列を有する、広範囲の物理化学的特性を有するオリゴヌクレオチドを得ることが可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際特許出願公開第２０１３／０９１８３５号パンフレット［５］
【特許文献２】米国特許第８，３３４，０９９号明細書［７］
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１７／００１５６９９号明細書［１０］
【特許文献４】国際特許出願公開第２０１３／１４０１０７号パンフレット［１１］
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】サイキＲ．Ｋ．（Saiki R.K.）、シャーフＳ．（Scharf S.）、ファルーナＦ．（Faloona F.）、ムリスＫ．Ｂ．（Mullis K.B.）、ホルンＧ．Ｔ．（Horn G.T.）、エルリッチＨ．Ａ．（Erlich H.A.）、アルンハイムＮ．（Arnheim N.）、ベータ−グロビンゲノム配列の酵素的増幅および鎌状赤血球貧血を診断するための制限部位分析（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ａｎｅｍｉａ）／／Ｓｃｉｅｎｃｅ．、１９８５年、第２３０巻、１３５０〜１３５４頁。［１］
【非特許文献２】ムリスＫ．Ｂ．（Mullis K.B.）、ファルーナＦ．Ａ．（Faloona F.A.）、ポリメラーゼに触媒される連鎖反応を介したＤＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの特異的合成（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｖｉａ  ａ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）／／Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１９８７年、第１５５巻、３３５〜３５０頁。［２］
【非特許文献３】バランタインＫ．Ｎ．（Ballantyne K.N.）、ヴァン・オアショットＲ．Ａ．（van Oorschot R.A.）、ミッチェルＲ．Ｊ．（Mitchell R.J.）、ＰＣＲプライマーにおけるロックド核酸は感度および性能を増加させる（Ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ＰＣＲ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）／／Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．、２００８年、第９１号、３０１〜３０５頁。［３］
【非特許文献４】ブレントＣ．（Brent C.）、散乱分野協同的プライマー：非特異的増幅の低下の２５０万倍の改善（Ｓａｔｔｅｒｆｉｅｌｄ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ：  ２．５  ｍｉｌｌｉｏｎ‐ｆｏｌｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）／／Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｄｉａｇｎ．、２０１４年、第１６巻、１６３〜１７３頁。［４］
【非特許文献５】シュナイダーＵ．Ｖ．（Schneider U.V.）、ミッケルセンＮ．Ｄ．（Mikkelsen N.D.）、リンキヴィストＡ．（Lindqvist A.）、オッケルスＬ．Ｍ．（Okkels L.M.）、ヨンクＮ．（Johnk N.）、リスビーＧ．（Lisby G.）、ねじれた挿入核酸修飾プライマーによる、ｑＰＣＲおよび多重鎖エンドポイントＰＣＲにおける改善された効率および頑健性（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ａｎｄ  ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ  ｉｎ  ｑＰＣＲ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ  ＰＣＲ  ｂｙ  ｔｗｉｓｔｅｄ  ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｐｒｉｍｅｒｓ）／／ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．、２０１２年、第７号、ｅ３８４５１。［６］
【非特許文献６】レベデヴＡ．Ｖ．（Lebedev A.V.）、ポールＮ．（Paul N.）、イーＪ．（Yee J.）、ティモシュックＶ．Ａ．（Timoshchuk V.A.）、シュムＪ．（Shum J.）、ミヤギＫ．（Miyagi K.）、ケラムＪ．（Kellum J.）、ホグレフェＲ．Ｉ．（Hogrefe R.I.）、ゾンＧ．（Zon G.）、熱活性化可能なプライマーを用いたホットスタートＰＣＲ：改善されたＰＣＲ性能の新規手法（Ｈｏｔ  ｓｔａｒｔ  ＰＣＲ  ｗｉｔｈ  ｈｅａｔ−ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  ｐｒｉｍｅｒｓ：  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＰＣＲ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）／／Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００８年、第３６巻、ｅ１３１。［８］
【非特許文献７】サマートンＪ．（Summerton J.）、スタインＤ．（Stein D.）、フアングＳ．Ｂ．（Huang S.B.）、マシューズＰ．（Matthews P.）、ウェラーＤ．（Weller D.）、パートリッジＭ．（Partridge M.）、無細胞および細胞系中と比較した、モルホリノおよびホスホロチオエートアンチセンスオリゴマー（Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｉｎ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ａｎｄ  ｉｎ−ｃｅｌｌ  ｓｙｓｔｅｍｓ）／／Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．、１９９７年、第７巻、６３〜７０頁。［９］
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明と類似物との主な違いは、オリゴヌクレオチドプライマーの構造内への１つ以上のホスホリルグアニジン部分の導入である。酸素原子のうちの１つの代わりにグアニジン基を導入することは、リン原子上の置換基の体積を顕著に増加させ、生理的条件下でオリゴヌクレオチドのホスホリルグアニジン誘導体を非荷電にさせる。オリゴヌクレオチドのホスホリルグアニジン誘導体中のリン原子上の、かさ高く中性荷電の基の存在は、鋳型に基づく酵素的ＤＮＡ合成のプライマーとしてのその基質特性の変化をもたらす。反応の初期段階では、プライマー構造中のホスホリルグアニジン部分がポリメラーゼとＤＮＡまたはＲＮＡ基質とのプライマー−鋳型の複合体の構造を乱し、酵素作用の効率を変える。その結果、ホスホリルグアニジン部分を有するプライマーの使用は、鋳型に基づく酵素的ＤＮＡ合成の反応産物の最終的な収率、組成、または蓄積率に影響を与える。特に、反応の感度および標的生成物の蓄積の特異性を、ＰＣＲ中にオリゴヌクレオチドのホスホリルグアニジン誘導体を使用することによって増加させることができる。したがって、鋳型に基づく酵素的合成を初期化するためにプライマー中で使用するホスホリルグアニジン部分は、前記類似物、たとえばホスホロチオエート含有オリゴヌクレオチドとは顕著な違いを提供する。
【００１４】
特許請求した発明の技術的結果は、分析した核酸配列の検出の信頼性、感度、および特異性を増加させることであり、また、鋳型に基づくＤＮＡ合成の方法を単純化することでもある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
技術的結果は、少なくとも１つの単位間ホスホリルグアニジン基を含有するプライマーを、鋳型に基づく核酸の酵素的合成に使用するという事実によって達成する。プライマーの一般構造を図１Ａに示し、式中、Ｚはホスホリルグアニジン基である。
【００１６】
具体的な応用では、上述の方法による、鋳型に基づく酵素的ＤＮＡ合成を使用して、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を一次鋳型として使用して核酸を増幅することができる。本方法は、熱サイクルおよび等温のプロトコルの両方において、特にローリングサークル機構による増幅のプロセスにおいて実行することができる。提案されたＰＣＲ方法の研究および診断目的への応用が、最も需要があると思われる。特に、対立遺伝子に特異的なＰＣＲを使用した単一ヌクレオチド突然変異の検出のための、本方法の使用は、本方法の感度および特異性を増加させることができる。逆転写反応におけるホスホリルグアニジンオリゴヌクレオチドを使用した酵素的ＤＮＡ合成は、独立しておよび続くＰＣＲと組み合わせた場合のどちらも、同等に需要があると思われる。
【００１７】
通常の実験室の実施では、ルーチン的なプロトコルは多くの場合、市販のすぐに使用できる反応混合物およびそのような混合物の組を使用して、実験を段階的に実施して所望の結果を達成するための指示を用いて行われる。上述の方法による、鋳型に基づく酵素的ＤＮＡ合成は、主段階を提示するか、または、研究もしくは医学的診断目的の実験を行うためのより複雑なプロトコルの不可欠な部分であってもよい。
【００１８】
したがって、本発明は、ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲに基づいた核酸の検出および定量のための改善されたシステムを作製するための、上述の基準を満たすホスホリルグアニジンオリゴヌクレオチドの使用を開示する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
特許請求された発明は、以下の図によって例示されている。
【図１】実施例中で使用した化合物の説明を表す図である。プライマーおよび非荷電のホスホリルグアニジン基（Ｚ）の構造の一般形態（Ａ）、グアニジン残基（ｇ’’）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルグアニジン（ｇ’）、１，３−ジメチルイミダゾリジン−２−イミン（ｇ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（テトラメチレン）グアニジン（ｇ’’’）を保有する、使用したホスホリルグアニジン基の例（Ｂ）を示す。
【図２】実施例中で使用した化合物の説明を表す図である。本発明の実施例中で使用したオリゴヌクレオチドの配列および構造を示し、式中、ｇ’’、ｇ、ｇはホスホリルグアニジン基であり、［３２Ｐ］は放射性標識であり、＊は蛍光標識（ＦＡＭまたはＴＡＭＲＡ）である。
【図３】ＰＧオリゴヌクレオチドがプライマー（Ａ）または鋳型（Ｂ）として作用し、ｇがホスホリルグアニジン基である、本発明の実施例中で使用したモデルシステムを例示する図である。
【図４】オリゴヌクレオチドホスホリルグアニジン誘導体の、熱サイクル（１）および等温（２）様式における熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される反応におけるプライマーとしての使用の例を例示する図である。図は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの存在下における、熱サイクル様式でのＭ３０／Ｚ複合体（システムを図３Ａに示す）の電気泳動分析の結果（Ａ）、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの存在下における、等温様式でのＭ４０／Ｔ複合体（システムを図３Ａに示す）における反応のフルサイズ生成物の蓄積の度合を表し、プライマー配列Ｚ０÷ＺＦおよびＴ０÷Ｔ３を図２に示す。
【図５】オリゴヌクレオチドホスホリルグアニジン誘導体の、中温性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される反応におけるプライマーとしての使用の一例を例示する図である。Ｔ５ファージＤＮＡポリメラーゼの存在下における、Ｍ４０／Ｔ複合体（システムを図３Ａに示す）における反応のフルサイズ生成物の蓄積の度合、プライマー配列Ｔ０÷Ｔ３を図２に示す。
【図６】熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される反応における、オリゴヌクレオチドのホスホリルグアニジン誘導体の鋳型として作用する能力を例示する図である。図はＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの存在におけるＺ／Ｎ８複合体（システムを図３Ｂに示す）の電気泳動分析の結果を示し、プライマー配列Ｚ０÷ＺＦを図２に示す。
【図７】中温性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される反応における、オリゴヌクレオチドのホスホリルグアニジン誘導体の鋳型として作用する能力を例示する図である。クレノウ断片の存在下におけるＺ／Ｎ８複合体（システムを図３Ｂに示す）の電気泳動分析の結果、プライマー配列Ｚ０÷ＺＦを図２に示す。
【図８】オリゴヌクレオチドのホスホリルグアニジン誘導体をプライマーとして使用した場合の、ＰＣＲ効率の変化を示す図である。図中の表はプライマー対のシステムにおける増幅係数を表し、標準のプライマーシステムと比較して、オリゴヌクレオチドのうちの１つが少なくとも１つのホスホリルグアニジン部分を含有する（Ｑ０−Ｚ０）。プライマー配列を図２に示す。３回以上の独立した実験の結果から得られたＰＣＲ効率因子の値を与える。ＳＤは標準偏差である。
【図９】初期プライマー中のホスホリルグアニジン部分を使用した、成長中の相補的ＤＮＡ鎖の長さを制御する可能性を例示する図である。図は、自動毛管分析機で行った断片分析による、対応するプライマー対の存在下における、ｅＧＦＰ遺伝子断片のＰＣＲ産物の長さの分析結果を表し（図のキャプション：Ｑ０−Ｚ０−１対の修飾なしのプライマー、Ｑ０−ＺＨ２およびＱ０−ＺＨ１−オリゴヌクレオチドのホスホリルグアニジン誘導体を有する非修飾プライマーの対）、＊はＦＡＭ蛍光標識であり、プライマー配列Ｑ０、Ｚ０、ＺＨ１、およびＺＨ２を図２に示す。
【図１０】「ホットスタート」技術と組み合わせた場合を含めた、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによって触媒されるＰＣＲの非特異的産物の蓄積の見込みを低下させる、オリゴヌクレオチドのホスホリルグアニジン誘導体の能力を実証する図である。図は、対応するプライマー対の存在下で、標準条件下（Ａ）および遅延「ホット」スタートの条件下（Ｂ）での、Ｔａｑ−ＤＮＡポリメラーゼによって触媒されるＰＣＲの電気泳動分析の結果、ならびにｅＧＦＰ遺伝子断片の増幅産物の熱変性曲線（Ｃ）を表し、Ｍは、１００〜４００ｂｐのＤＮＡ長のマーカーであり、プライマー配列を図２に示す。非特異的産物の融解領域を点線によって示す。
【図１１】ホスホリルグアニジン部分の存在は、初期プライマー配列に相補的な鎖の合成において、酵素と修飾単量体との相互作用が原因で突然変異を引き起こさないことを例示する図である。図は、天然オリゴヌクレオチドプライマーＱ０（右側のカラム）およびＺ０（左側のカラム）を使用した、標準プライマー対（Ｑ０−Ｚ０）およびオリゴヌクレオチドのホスホリルグアニジン誘導体を含有する対（中央の図に示す）の存在下での増幅後の、ＤＮＡ産物のサンガーシーケンシングの結果を表す。フレームは初期プライマーの領域を示し、すべてのプライマーの配列を図２に示す。
【図１２】オリゴヌクレオチドのホスホリルグアニジン誘導体の、ヒト体液（全血および血漿）におけるＤＮＡ決定を含めた市販のＰＣＲシステムにおいて使用するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのプライマーとしての使用の効率を示す図である。図は、１対の標準プライマー（Ｑ０−Ｚ０）および１対のホスホリルグアニジン誘導体を使用した、システムＩ（ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼＰｆｕ）およびＩＩ（ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼＰｆｕおよびＴａｑの混合物）（パネルＡ）、システムＩＩＩ（全体液におけるＰＣＲの市販のシステム）（パネルＢ）におけるＰＣＲの電気泳動分析の結果を表す。Ｍは、１００〜５００ｂｐのＤＮＡ長のマーカーであり、プライマー配列を図２に示す。
【図１３】オリゴヌクレオチドのホスホリルグアニジン誘導体の、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（リバーターゼ）のプライマーとしての使用の可能性を例示する図である。図は、挿入色素ＳＹＢＲおよびＳＹＴＯ−１３（色で強調）の存在下における、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼＭＭＬＶおよびＨＩＶ−ｐ６６を使用した逆転写後の増幅反応の閾値サイクルの値を表し、プライマー配列を図２に示す
【図１４】オリゴヌクレオチドのホスホリルグアニジン誘導体の、ワンステップＲＴ−ＰＣＲシステムにおけるプライマーとしての使用の可能性および利点を示す図である。図は、１対の標準プライマー（Ｕ０−Ｖ０）およびヒト細胞の全ＲＮＡにおけるヒトｓｎＲＮＡのＵ１２配列に特異的なホスホリルグアニジン誘導体対（ＵＨ１−ＶＨ１、ＵＨ１−ＷＨ１）を使用した、ＲＴ産物、次いでＰＣＲの産物の、電気泳動分析の結果（Ａ）および熱変性曲線（Ｂ）を表す。Ｍは、１００〜４００ｂｐのＤＮＡ長のマーカーであり、プライマー配列を図２に示し、非特異的産物の移動度の領域を点線によって示す。
【図１５】オリゴヌクレオチドのホスホリルグアニジン誘導体の、ローリングサークル増幅反応（ＲＣＡ）におけるプライマーとしての使用の結果を例示する図である。図は、標準プライマー（Ｄ０）ならびにプラスミドｐＵＣ１９の配列に特異的なホスホリルグアニジン誘導体（Ｄ２およびＤ３）を使用したローリングサークル反応産物の、電気泳動分析の結果（Ａ）および増幅係数を表し、プライマー配列を図２に示す。「Ｋ−」は、プライマーなしの対照反応の結果に対応する。Ｍは、初期プラスミドの移動度の対照である。
【図１６】対立遺伝子に特異的なＰＣＲにおいてオリゴヌクレオチドのホスホリルグアニジン誘導体をプライマーとして使用した突然変異の同定の選択性の増加を示す図である。図は、１対の標準プライマーＳ０＋Ｓ、ならびに１対の標準およびホスホリルグアニジン誘導体Ｓ１＋Ｓの存在下における、対立遺伝子に特異的なＰＣＲによるゲノムＤＮＡ中のＫＲＡＳ遺伝子において、単一ヌクレオチド突然変異Ｔ／Ｃを同定するための実験の略図を表す。プライマー配列を図２に示す。ΔＣｔ値をプライマー名の隣に示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
［用語および定義］
すぐに使用できる反応混合物とは、通常はルーチン的な研究課題を解決するために設計されている、核酸増幅段階に必要な構成要素の事前に調製された混合物である。
【００２１】
鋳型に基づく酵素的ＤＮＡ合成とは、追加のヌクレオチド単位を順次挿入することによる、ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される、３’末端でのプライマーの伸長のプロセスである。
【００２２】
キットとは、すぐに使用できる反応混合物の事前に集成された組、ならびに研究実験および診断的分析の一部としてルーチン的な課題を行うためのプロトコルである。たとえば、単一チューブ内でのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写、および逆転写に続くＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）のキットが、分子および医学生物学の分野において幅広く使用されている。
【００２３】
プライマーとは、部分的または完全にヌクレオチドの性質を有する単位からなるオリゴマーであり、前記オリゴマーは、相補的相互作用の原理によるＤＮＡ鋳型の認識およびＤＮＡポリメラーゼによって触媒されるポリメラーゼ反応の開始を提供する構造の断片を含有しており、酵素反応中に３’末端で少なくとも１つの追加の単量体単位によって伸長可能である。
【００２４】
ＰＧオリゴヌクレオチドとは、グアニジンまたは置換グアニジン残基がリン原子上に導入されている１つ以上のリン酸基を含有する、オリゴヌクレオチドの誘導体である。
【００２５】
（略記および規定）
ＢＳＡ  −  ウシ血清アルブミン、
ＤＴＴ  −  ジチオスレイトール、
ＤＮＡ  −  デオキシリボ核酸、
ｄｓ  −  二本鎖、
ｓｎＲＮＡ  −  核内低分子ＲＮＡ、
ＮＡ  −  核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、
ＲＴ  −  逆転写、
ＲＴ−ＰＣＲ  −  逆転写と組み合わせたＰＣＲ、または逆転写に続くＰＣＲ、
ｂｐ  −  塩基対（ヌクレオチド対）、
ＰＣＲ  −  ポリメラーゼ連鎖反応、
リバーターゼ  −  ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、
ＲＮＡ  −  リボ核酸、
トリス  −  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、
ＰＧ  −  ホスホリルグアニジン基、
クレノウ断片  −  ポリメラーゼおよび３’−５’−エキソヌクレアーゼ活性を保持しており、５’−３’−エキソヌクレアーゼ活性を失っている、大腸菌からの細菌ＤＮＡポリメラーゼＩの大きなタンパク質断片、
Ｃｔ  −  閾値サイクル、
ＧＦＰ  −  緑色蛍光タンパク質、
ｋｅｆｆ  −  増幅係数、
ＬＮＡ  −  「ロックド」核酸、
ＲＯＸ、ＢＨＱ２、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ  −  蛍光色素、
ＲＣＡ  −  ローリングサークル増幅反応、
ＳＤ  −  標準偏差、
ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、ＳＹＴＯ−１３−ＤＮＡ  −  挿入蛍光色素、
ＫＲＡＳ  −  原癌遺伝子、Ｒａｓタンパク質ファミリーのメンバー。
【００２６】
鋳型に基づく核酸の合成の酵素反応における、修飾オリゴヌクレオチドの使用には、反応の全収率に影響を与える様々な効果が伴う場合がある。オリゴヌクレオチドプライマーの既知の化学的修飾のほとんどは、核酸基質と酵素との相互作用の混乱をもたらす。このコンテキストにおいて、オリゴヌクレオチドの完全に非荷電の誘導体は、その炭水化物−リン酸主鎖が酵素によって認識されないことが文献から明らかであったため［９］、プライマーとして一度も使用しなかった。
【００２７】
本発明は、鋳型に基づく酵素的ＤＮＡ合成システムにおける、ホスホリルグアニジン部分を有するプライマーの使用の可能性を記載している。類似物と比較して、ホスホリルグアニジン部分を含有するプライマーを使用した、鋳型に基づく酵素的ＤＮＡ合成の方法［１２〜１４］は、本発明中に開示したいくつかの利点を組み合わせており、その組合せにより技術的結果の達成が確実となる。
【００２８】
ホスホリルグアニジン基（Ｚ）含有プライマーの一般構造を図１Ａに示し、式中、置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４のそれぞれは、水素原子Ｈまたは任意選択で置換された有機基であり得る。置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４のそれぞれは、Ｈ、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、−Ｃ６〜１０アリール、または−Ｃ５〜１０ヘテロアリール（たとえば、図１Ａ、ｇ’’、ｇ’）を含む群から独立して選択され、式中、それぞれのアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルキレン、またはヘテロアルキレンは、さらに置換されていてよく、さらに、Ｒ１およびＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、５〜８員の複素環を形成し、一部の応用では、Ｒ１およびＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、５〜８員の複素環、好ましくは、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリンを形成し、これは、そのような置換基の大きさは、ＰＧオリゴヌクレオチドと鋳型に基づく合成反応の開始に必要な酵素との相互作用を排除するべきでないためである。好ましくは、Ｒ１およびＲ２は、それらが結合している原子と一緒になって、５員の複素環、たとえばピロリジンを形成する（図１、ｇ’’’）。一部の応用では、Ｒ２およびＲ３は、一緒になって、２〜４個の原子のアルキレンまたはヘテロアルキレン鎖を形成し、Ｒ１およびＲ４はそれぞれ、ＨおよびＣ１〜４アルキルを含む群から独立して選択される。一部の応用では、Ｒ２およびＲ３は一緒になってＣＨ２−ＣＨ２鎖を形成し、Ｒ１およびＲ４は−Ｈまたはメチルである（たとえば、図１、ｇ）。本発明によって包含される好ましい化合物の一部は、図１Ｂに示す、グアニジン（ｇ’’）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルグアニジン（ｇ’）、１，３−ジメチルイミダゾリジン−２−イミン（ｇ）、またはＮ，Ｎ’−ビス（テトラメチレン）グアニジン（ｇ’’’）残基を保有するＰＧ式に対応する。
【００２９】
図１．プライマーおよび非荷電のホスホリルグアニジン基（Ｚ）の構造の一般形態（Ａ）、グアニジン（ｇ’’）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルグアニジン（ｇ’）、１，３−ジメチルイミダゾリジン−２−イミン（ｇ）、またはＮ，Ｎ’−ビス（テトラメチレン）グアニジン（ｇ’’’）残基を保有する、使用したホスホリルグアニジン基の例（Ｂ）。
【００３０】
ＰＧ修飾プライマーを構築するためのアルゴリズムは、少なくとも１つのホスホリルグアニジン部分のオリゴヌクレオチド内への導入を含み、オリゴヌクレオチドの完全に非荷電のホスホリルグアニジン誘導体のプライマーとしての使用を可能にする（図２）。しかし、プライマー中のホスホリルグアニジン部分の存在は、プライマーおよび最終産物に追加の特性をもたらす、追加の官能基の導入を排除しない。たとえば、鋳型に基づくＤＮＡ合成の反応産物のさらなる検出のために、ＰＧ修飾プライマー内への蛍光および放射性標識の導入の可能性が提示されている。
【００３１】
プライマーとして使用される（いかなる）修飾オリゴヌクレオチドの主要な特性および選択基準の１つは、反応を開始するためのコンピテントなプライマー−鋳型の複合体を形成するその能力、および相補鎖の３’末端領域の合成のための鋳型として作用するその能力（初期プライマーのヌクレオチド配列が鋳型として作用する場合）である。負荷電の単位間リン酸基を中性基で置き換えること、およびリン原子上の置換基の体積の変化は、オリゴヌクレオチドがＤＮＡおよびＲＮＡ鋳型と相互作用する能力に影響を与えるはずであり、ＤＮＡまたはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって伸長されるはずである。本発明は、プライマーとして作用する、および相補鎖の伸長プロセスにおける鋳型の特性を提供する、ホスホリルグアニジン部分を含有するオリゴヌクレオチドの能力を実証する実施例の記載を含有する。鋳型に基づくＤＮＡ合成、特に、分子診断学、生命工学、および遺伝子工学におけるＤＮＡ増幅の様々な応用は、広範囲のＤＮＡポリメラーゼの使用を示唆している。ホスホリルグアニジンは、熱サイクルおよび等温様式（実施例２、３、４、５、６、１０、１３）、ならびにＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（実施例１１、１２）の条件下で、３’→５’／５’→３’エキソヌクレアーゼ活性の存在にかかわらず、中温性および好熱性のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの両方の広範囲の基質として作用することが示された。
【００３２】
提示した発明は、様々な温度（温度プロトコル）での、ポリメラーゼ（酵素）反応のための、ホスホリルグアニジン部分を有するプライマーの使用の可能性を例示する。新しいプライマークラスの記載した特性は、核酸の検出および定量のための様々なプロトコルに基づいて、合成および診断学のシステムの開発に使用することができる。
【００３３】
ＰＣＲ反応におけるＤＮＡの増幅、および続くＰＣＲを用いた逆転写反応におけるＲＮＡの増幅のためのＰＧ修飾プライマーの使用が、最も需要があると思われる。事前に選択した数および位置のホスホリルグアニジン部分を有するプライマーを使用して得られた結果は、反応の非特異的産物の収率を低下させることによって増加した特異性および感度を実証している。ホスホリルグアニジン部分を含有するプライマーを用いたＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲによる核酸の定性的および定量的決定の結果の品質を改善させる主要な特長は、多くの場合「プライマー二量体」として分類される短い非特異的産物の収率の減少である。（実施例８、１０、１２）。記載した特性は、核酸の定量の感度および信頼性のレベルを低下させる。副産物の収率の低下は、ホスホリルグアニジン部分を有するプライマーの使用を、反応混合物の他の構成要素を改変させることに向けられた既知の解決策、たとえば「ホットスタート」技術と組み合わせることによっても達成することができる。ＰＣＲにおいて使用した場合、ホスホリルグアニジンは増幅係数を変えることができる。ＰＧ修飾単量体の位置、数、および頻度に応じて、増幅効率は、非修飾のプライマーを用いた標準の反応に匹敵することができる、または増幅の完全な排除まで顕著に低下させることができる。プライマーヌクレオチド配列が鋳型として作用する場合、増幅効率に対する影響は、重合反応の開始および相補鎖の伸長である２つの主な段階における、修飾単量体の関与が原因であり得る。増幅効率のわずかな（１０〜１５％以内）の減少しか許容しない修飾単量体の位置および数を選択する場合、ホスホリルグアニジン部分を有するプライマーの使用は、特定の問題を解決するために標準（非修飾）プライマーから切り替える際に、増幅プロトコル、特にＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲの変更を必要としない。さらに、実施例では、酵素反応におけるＰＧ修飾プライマーおよび標準プライマーの同時使用の可能性を実証している（図１０、実施例８）。ホスホリルグアニジン部分を含有するプライマーを使用した、鋳型に基づく酵素的合成は、「ローリングサークル」機構によって、ＤＮＡの等温増幅プロトコルにおいてうまく実行できることも示された。対立遺伝子に特異的なＰＣＲにおけるＰＧ修飾プライマーの使用は、ゲノム中の単一ヌクレオチド突然変異の検出の信頼性の増加を可能にする。
【００３４】
サンガー方法によるシーケンシングを使用して、ホスホリルグアニジン部分の存在は、酵素と修飾単量体との相互作用が原因の突然変異の形成を引き起こさないことが示された。この特性は、核酸の増幅、事前に定義された配列の構築、およびその一次構造の決定に関連する、研究および実用上の問題を解決するためのＰＧ修飾プライマーの適用性を提供する。
【００３５】
鎖うちの一方の３’末端領域の合成、特に「粘着」末端の形成の制御は、所定のヌクレオチド配列を有する人工ＤＮＡ分子の構築におけるいくつかの遺伝子工学的課題を解決するために興味深い。たとえば、「粘着」末端ＰＣＲ産物を発現プラスミドＤＮＡベクターの構築において使用することができる。本発明は、フルサイズ相補鎖を得ることおよび３’末端単位の一部分の合成を防止することの両方の可能性を実証している。
【００３６】
増幅システムの構成要素の選択において重要なパラメータは、ヒトおよび動物の疾患の診断において必要な様々な対象、たとえば、合成核酸、プラスミドＤＮＡ、全ＲＮＡ、細胞および組織のゲノムＤＮＡ、ウイルス核酸、ならびに全体液（たとえば、血液および血漿）を、鋳型として使用した反応の実施の可能性である。本発明の例示する実施例では、鋳型の様々な変異を用いたＰＧ修飾プライマーの使用の成功が提示されており、これは、得られた技術的結果の広範な実行の可能性を提供する。
【００３７】
多くの場合、市販のすぐに使用できる反応混合物がルーチン的な課題を解決するための実験室の実施に含められている。さらに、実験を行い、化学的または診断的結果を達成するために必要な構成要素を含有する試薬組および指示を使用して、複雑な段階的な操作が実行される。実用的な目的のために、ホスホリルグアニジン部分を有するプライマーを使用した、鋳型に基づく酵素的ＤＮＡ合成の方法を、核酸を検出および増幅するための、すぐに使用できる反応混合物および試薬または反応混合物の組を使用して実行することができ、これらは、研究上および診断的な課題の両方を解決するために需要がある。さらに、オリゴヌクレオチドのホスホリルグアニジン誘導体を使用した核酸の増幅の段階は、より複雑なプロトコルおよびそれを実行するための試薬組、たとえば、高性能方法を使用した遺伝子発現の示差的分析のためのＤＮＡライブラリの調製の一部となることができる。提案した方法の使用は、鋳型に基づくＤＮＡ合成の特定の段階の結果を改善させることができるだけでなく、個々の応用においても、一部の段階、たとえば非特異的な副産物からの中間の精製を排除する。
【００３８】
本発明は、本発明の範囲を限定しない、具体的な実行の以下の実施例によって、以下により詳細に例示する。実施例から生じる、本発明の特許請求項の範囲内にある本発明の数々の実施形態は、上記説明および以下の実施例に基づいて当業者に明らかとなるであろう。当業者は、鋳型に基づくＤＮＡ合成反応においてプライマーとして使用するオリゴヌクレオチド中の特定の基または基の組合せおよび位置が適切であるかどうかを、経験的かつ独立して決定するであろう。
【実施例】
【００３９】
＜実施例１：以下に使用するシステムの説明＞
ＰＧオリゴヌクレオチドおよび非修飾のオリゴデオキシリボヌクレオチドを図２に示す。オリゴヌクレオチドは８〜４０個のヌクレオチド単位を含有していた。ホスホリルグアニジン基（ＰＧ）は非修飾（ｇ’’）、分枝状（ｇ’）、ロックド（ｇ）の残基、およびかさ高い置換基を有するグアニジン残基（ｇ’’’）として提示されている（図１Ｂ）。オリゴヌクレオチド中のＰＧの数は、１つの基から１００％の範囲であった（図２）。
【００４０】
ＰＧオリゴヌクレオチドはプライマーオリゴヌクレオチド（図３Ａ）または鋳型（図３Ｂ）として作用し、蛍光（＊−ＦＡＭもしくはＴＡＭＲＡ）または放射性標識（［３２Ｐ］）を含有していた。
【００４１】
天然およびＰＧオリゴヌクレオチド（図２）、ｅＧＦＰ遺伝子を含有するプラスミドＤＮＡ、事前に加えたプラスミドＤＮＡを含有するヒト全血および血漿調製物、Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡ（ＨＣＶ）、ヒト乳腺癌細胞ＭＣＦ−７の全ＲＮＡ、プラスミドｐＵＣ１９、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型として使用した。
【００４２】
３’→５’／５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するまたは有さない、中温性および好熱性の酵素をＤＮＡポリメラーゼとして使用した：Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５ファージＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ断片）、ＤＮＡポリメラーゼＰｆｕ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（リバーターゼ）ＭＭＬＶ、およびＨＩＶ−ｐ６６、ＤＮＡポリメラーゼファイ２９。
【００４３】
＜実施例２：熱サイクル（１）および等温（２）様式において熱安定性ポリメラーゼによって触媒される反応におけるプライマーとしてのＰＧオリゴヌクレオチド＞
（１）プライマーとしてのＰＧオリゴヌクレオチドの使用を実証するために（システムを図３Ａに示す）、反応混合物（１０μＬ）は以下を含有していた：天然オリゴヌクレオチドＭ３０（１０μＭ）、非修飾のオリゴヌクレオチドＺ０またはＰＧオリゴヌクレオチドＺ１÷ＺＨ１（１０μＭ、プライマー配列Ｚ０÷ＺＦを図２に示す）、三リン酸の組（それぞれ０．１ｍＭ）ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、および蛍光標識したｄＵＴＰ（フルオレセイン−６−アミノチオカルボニル−［５−（３−アミノアリル）−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸］）、１．８ｍＭのＭｇＣｌ２、トリス−ＨＣｌ（１０ｍＭ）、ｐＨ８．８、ＫＣｌ（５０ｍＭ）、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（２単位の活性）。反応は熱サイクル様式で実施した：９５℃で１０秒間、６１℃で１０秒間、７２℃で３０秒間（３２サイクル）。２５分後、アセトン中に過塩素酸リチウムの２％溶液を加えることによって反応を停止させた。すべての試料を、２０％の変性ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動分析によって分離し、蛍光スキャナーを使用して電気泳動分析の結果を記録した（図４Ａ）。ＤＮＡ鋳型に対するＰＧオリゴヌクレオチドの伸長の効率（図４Ａ中のレーンＺ１−ＺＦ）を、天然オリゴヌクレオチドＺ０のそれ（図４Ａ中のレーンＺ０）と比較した。
【００４４】
（２）プライマーとしてのＰＧオリゴヌクレオチドの使用を実証するために（システムを図３Ａに示す）、反応混合物（１０μＬ）は以下を含有していた：天然オリゴヌクレオチドＭ４０（３０μＭ）、放射性標識したオリゴヌクレオチドＴ０÷Ｔ３（１０μＭ、プライマー配列Ｔ０÷Ｔ３を図２に示す）、三リン酸の組（それぞれ０．２ｍＭ）、１．８ｍＭのＭｇＣｌ２、トリス−ＨＣｌ（１０ｍＭ）、ｐＨ８．８、ＫＣｌ（５０ｍＭ）、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（１単位の活性）。反応は等温様式（図４Ｂ）で２０〜１２０分間、３７℃で実施し、アセトン中に過塩素酸リチウムの２％溶液を加えることによって停止させた。すべての試料を、１５％の変性ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動分析によって分離した。反応のフルサイズ生成物の蓄積の度合を、反応産物に対応するバンドの強度対レーン中のすべてのバンドの全強度の比として計算した。すべての実験において、決定の相対誤差は１５％を超えなかった（図４Ｂ）。
【００４５】
ＰＧオリゴヌクレオチドは、熱安定性Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの存在下、および熱サイクル温度様式の条件下において、天然オリゴヌクレオチドプライマーＺ０と同様に、フルサイズ生成物を伸長させるためのプライマーとして作用することができることが見られた（図４Ａ）。３’末端近くに２つの連続したＰＧを含有するオリゴヌクレオチドＺ１、２について、伸長の効率の減少が観察された。等温条件下では（図４Ｂ）、同様の結果が得られ、オリゴヌクレオチドＴ１およびＴ２の反応のフルサイズ生成物の蓄積の度合はＴ０のそれに近かった。反応のフルサイズ生成物の蓄積の度合の減少が、３’末端近くにＰＧを含有するオリゴヌクレオチドＴ３で観察された。
【００４６】
＜実施例３：中温性ポリメラーゼによって触媒される反応におけるプライマーとしてのＰＧオリゴヌクレオチド＞
プライマーとしてのＰＧオリゴヌクレオチドの使用を実証するために（システムを図３Ａに示す）、反応混合物（５μＬ）は以下を含有していた：天然オリゴヌクレオチドＭ４０（３０μＭ）、放射性標識したオリゴヌクレオチドＴ０−Ｔ３（１０μＭ、プライマー配列Ｔ０−Ｔ３を図２に示す）、三リン酸の組（それぞれ０．２ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（２０ｍＭ）、トリス−ＨＣｌ（５０ｍＭ）、ｐＨ８．０、ＮａＣｌ（１００μＭ）、ＤＴＴ（５ｍＭ）、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、Ｔ５ファージＤＮＡポリメラーゼ（５００μＭ）。反応を６〜６０分間実施し、試料を電気泳動に施用するために使用する、７ｍＭのＥＤＴＡを含有する溶液を加えることによって停止させた。すべての試料を分離し、実施例２（２）と同様に分析した。すべての実験において、決定の相対誤差は１５％を超えなかった（図５）。
【００４７】
すべてのＰＧオリゴヌクレオチドが、中温性Ｔ５ファージＤＮＡポリメラーゼの存在下、等温様式においてプライマーとして作用できることが見られたが（図５）、ＰＧオリゴヌクレオチドのフルサイズ生成物への伸長の効率は、天然オリゴヌクレオチドＴ０の場合よりも低かった。
【００４８】
＜実施例４：熱安定性ポリメラーゼによって触媒される反応における鋳型としてのＰＧオリゴヌクレオチド＞
鋳型としてのＰＧオリゴヌクレオチドの使用を実証するために（システムを図３Ｂに示す）、反応混合物（１０μＬ）は以下を含有していた：非修飾のオリゴヌクレオチドＺ０またはＰＧオリゴヌクレオチドＺ１÷ＺＦ（１０μＭ、プライマー配列Ｚ０÷ＺＦを図２に示す）、蛍光標識した天然プライマーＦＡＭ−Ｎ８（１０μＭ、配列を図２に示す）、ｄＮＴＰ三リン酸の完全な組（１０ｍＭ）、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（２単位の活性）、１．８ｍＭのＭｇＣｌ２、トリス−ＨＣｌ（１０ｍＭ）、ｐＨ８．８、ＫＣｌ（５０ｍＭ）、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０。反応は熱サイクル様式で実施した：９５℃で１０秒間、６１℃で１０秒間、７２℃で３０秒間（３２サイクル）。反応を停止させ、実施例２（１）と同様に分析した。
【００４９】
すべてのＰＧオリゴヌクレオチドが、熱安定性Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの存在下、熱サイクル様式において鋳型として作用できることが見られた（図６）。天然オリゴヌクレオチドのフルサイズ生成物への伸長の効率は、ＰＧとＰＧ−オリゴヌクレオチドの３’末端との間の距離の増加に伴って増加した。連続した（ＺＨ１）または交互に修飾されたＰＧ（ＺＨ２、ＺＦ）を含有するＰＧオリゴヌクレオチドが、フルサイズ生成物の収率に対して最大の影響を発揮した。
【００５０】
＜実施例５：中温性ポリメラーゼによって触媒される反応における鋳型としてのＰＧオリゴヌクレオチド＞
鋳型としてのＰＧオリゴヌクレオチドの使用を実証するために（システムを図３Ｂに示す）、反応混合物（１０μＬ）は以下を含有していた：１０μＭの非修飾のオリゴヌクレオチドＺ０またはＰＧオリゴヌクレオチドＺ１−ＺＦ（プライマー配列Ｚ０−ＺＦを図２に示す）、１０μＭのＴＡＭＲＡ標識した天然プライマー＊Ｎ８（図２）、ｄＮＴＰ三リン酸の完全な組（１０ｍＭ）、クレノウ断片（２単位の活性）、トリス−ＨＣｌ（５０ｍＭ）、ｐＨ７．６、ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）、ＤＴＴ（５ｍＭ）。反応を３０分間、等温様式、３７℃で実施した。反応を停止させ、実施例２と同様に分析した。
【００５１】
すべてのＰＧオリゴヌクレオチドが、中温性ポリメラーゼ、すなわちクレノウ断片の存在下、等温様式において鋳型として作用できることが見出された（図７）。天然オリゴヌクレオチドのフルサイズ生成物への伸長の効率は、ＰＧと天然オリゴヌクレオチドの３’末端との間の距離の増加に伴って増加した。連続したホスホリルグアニジン基を含有するＰＧオリゴヌクレオチドＺＨ１が、フルサイズ生成物の収率に対して最大の影響を発揮した。
【００５２】
＜実施例６：ＰＧオリゴデオキシリボヌクレオチドをプライマーとして使用したＰＣＲ効率＞
ｅＧＦＰ遺伝子断片の増幅を、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、５０ｍＭのＫＣｌ、０．２ｍＭのそれぞれのデオキシヌクレオシド三リン酸、２ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０３単位の活性／μＬのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含有する反応緩衝液中で実施した。
【００５３】
増幅様式は、９５℃で５分間、４７サイクルの９５℃で１０秒間、６１℃で１０秒間、７２℃で１０秒間であった。
【００５４】
１０−９ｇ〜１０−１７ｇのｅＧＦＰ遺伝子を含有するプラスミドＤＮＡの１０倍段階希釈を、鋳型として使用した。
【００５５】
標準の天然オリゴヌクレオチドおよびＰＧオリゴヌクレオチドに基づく、図８に示す対を、プライマーとして使用した（フォワード＋リバース）。ＰＧオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド鎖中のホスホリルグアニジン単位の数および位置が異なっていた。オリゴヌクレオチド配列を図２に示す。それぞれのプライマーの濃度は５００ｎＭであった。
【００５６】
増幅効率は、挿入色素ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉの存在下、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ９６機器（Ｒｏｃｈｅ、スイス）にて、リアルタイムＰＣＲによって決定した。
【００５７】
増幅効率は、増幅係数の値（ｋｅｆｆ）に基づいて、プログラムＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ９６ソフトウェア、バージョン１．１．０．１３２０で実行した、従属Ｃｔ（ｌｇ  Ｃ０）（式中、Ｃｔは閾値サイクルであり、Ｃ０は鋳型の初期濃度である）の座標を線形化する手法を使用して比較した。増幅係数の値を図８に示す（３回以上の独立した実験から得られたＰＣＲ効率因子の値を与え、ＳＤは標準偏差である）。プライマー構造中の単一のＰＧ（プライマーＺ１÷Ｚ９を参照）は増幅効率に顕著な影響を与えなかったことが見られた。ホスホリルグアニジン基の影響は、プライマー鎖におけるその位置によって決定された。連続して配置されたＰＧ（プライマーＺＨ１）は、ｋｅｆｆを顕著に、すなわち１．４４まで低下させた。「１つおいて次の」位置への修飾の導入（交互に修飾されたホスホリルグアニジン単位）はフルサイズ生成物の蓄積を確実にした。
【００５８】
＜実施例７：成長中のＤＮＡ鎖の長さの決定＞
ｅＧＦＰ遺伝子断片の増幅を、実施例６で既に記載した反応緩衝液中で実施した。
【００５９】
増幅様式は、９５℃で５分間、２８サイクルの９５℃で１０秒間、６１℃で１０秒間、７２℃で１０秒間であった。
【００６０】
ｅＧＦＰ遺伝子を１０−１０ｇ／反応の量で含有するプラスミドＤＮＡを鋳型として使用した。
【００６１】
（＊Ｑ０−Ｚ０）、（＊Ｑ０−ＺＨ１）、（＊Ｑ０−ＺＨ２）の対（式中、＊は蛍光ＦＡＭ標識である）をプライマーとして使用した。ＰＧオリゴヌクレオチド配列を図２に示す。それぞれのプライマーの濃度は５００ｎＭであった。
【００６２】
断片分析を使用したＰＣＲ産物の正確な長さの決定を自動毛管分析機にて行った。図９に提示するデータは、オリゴヌクレオチドＺ０およびＺＨ２の使用が、２２８ｂｐの長さを有するフルサイズのＰＣＲ産物の入手を可能にしたことを示している。同時に、オリゴヌクレオチドＺＨ１の使用は相補鎖の５’末端の前の８個のヌクレオチドの合成の終結をもたらし、これは「粘着」末端を有するＤＮＡ分子の形成をもたらした。
【００６３】
＜実施例８：標準およびＰＧ修飾オリゴデオキシリボヌクレオチドをプライマーとして使用した、Ｔａｑ−ＤＮＡポリメラーゼによって触媒されるＰＣＲの特異的および非特異的産物の蓄積の比較＞
ｅＧＦＰ遺伝子断片の増幅を、実施例６で既に記載した反応緩衝液中で実施した。
【００６４】
増幅様式は既に実施例７に記載されている。
【００６５】
使用した鋳型は既に実施例６に記載されている。
【００６６】
標準の天然オリゴヌクレオチド（Ｑ０−Ｚ０）、修飾ＰＧオリゴヌクレオチド（ＱＨ２−ＺＨ２）、標準および修飾オリゴヌクレオチド（ＱＨ２−Ｚ０）、ならびに３つのオリゴヌクレオチドの混合物（Ｚ０−ＱＨ２／Ｑ０、最後のものは５０／５０％の比）の対をプライマーとして使用した（フォワード−リバース）。オリゴヌクレオチド配列を図２に示す。プライマーの濃度は５００ｎＭであった。
【００６７】
アガロースゲル電気泳動によって（図１０ＡおよびＢ、Ｍは、１００〜４００ｂｐのＤＮＡ長のマーカーである）、ならびに挿入色素ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉの存在下でｉＱ５機器（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、米国）におけるＰＣＲ産物の熱変性によって（図１０Ｂ）、ＰＣＲ産物の分析を実施した。
【００６８】
天然オリゴヌクレオチド（Ｑ０−Ｚ０）および天然と修飾オリゴヌクレオチドの混合物（ＱＨ２−Ｚ０）と（Ｚ０−ＱＨ２／Ｑ０）の両方の使用と比較して、修飾ＰＧオリゴヌクレオチド対（ＱＨ２−ＺＨ２）の使用が信頼性を増加させ、非特異的産物の形成の顕著な低下を可能にしたことが見られた（図１０ＡおよびＢ）。
【００６９】
天然プライマーと比較して、修飾ＰＧオリゴヌクレオチドプライマーに対して延期した「ホット」スタートを用いたＰＣＲシステムを使用して、非特異的産物の完全な非存在が達成された（図１０Ｂ）。
【００７０】
＜実施例９：成長中のＤＮＡ鎖における突然変異の分析＞
ｅＧＦＰ遺伝子断片の増幅を、実施例６で既に記載した反応緩衝液中で実施した。
【００７１】
増幅様式は既に実施例７に記載されている。
【００７２】
使用した鋳型は既に実施例６に記載されている。
【００７３】
（Ｑ０−Ｚ０）、（Ｑ０−ＺＨ１）、（ＱН２−ＺＨ２）の対をプライマーとして使用した（フォワード−リバース）。オリゴヌクレオチド配列を図２に示す。
【００７４】
増幅の完了後、ＰＣＲ産物の精製、および、標準手順に従って蛍光標識したターミネーターＢｉｇＤｙｅ３．１を使用した、サンガー法によるそのシーケンシングを実施した。天然オリゴヌクレオチドプライマーＱ０およびＺ０をシーケンシングに使用した。図１１は、天然オリゴヌクレオチドプライマーＱ０（右側のカラム）およびＺ０（左側のカラム）を使用した、中央に示したプライマー対の存在下での増幅後のＤＮＡ産物のサンガーシーケンシングの結果を示す。フレームは初期プライマーの領域を示す。
【００７５】
天然プライマー対の存在下における、成長中のＤＮＡ鎖のヌクレオチド組成は、一方または両方のプライマーがＰＧを含有する対の存在下において得られた組成に対応することが見られた（図１１）。プライマー領域中の相補鎖を伸長させる場合に、初期プライマー中のＰＧの存在は、成長中のＤＮＡ鎖において突然変異を引き起こさなかった。同時に、隣接した位置における連続したＰＧの存在は修飾された鋳型上の成長中の鎖の伸長を終結させ、最終産物の長さの制御が可能となり、実施例７に記載のように一本鎖「粘着末端」が形成された。
【００７６】
＜実施例１０：市販のＰＣＲシステムにおいて使用するＤＮＡポリメラーゼのプライマーとしての、ＰＧオリゴヌクレオチドの使用＞
３つの市販のシステムを、プライマーとしてのＰＧオリゴヌクレオチドの使用を実証するために選択した。システムＩはＤＮＡポリメラーゼＰｆｕを含有しており（Ｓｉｌｅｋｓ、ロシア）、システムＩＩは長い断片のＰＣＲ（「ロングレンジ」の型のＰＣＲ）用にポリメラーゼＴａｑおよびＰｆｕの混合物を含有しており（Ｂｉｏｌａｂｍｉｘ、ロシア）、ポリメラーゼ「ＩｎＢｌｏｏｄ」（Ｅｖｒｏｇｅｎ、ロシア）を用いた全血に対するＰＣＲ「ＩｎＢｌｏｏｄ  ＰＣＲキット」（Ｅｖｒｏｇｅｎ、ロシア）のためのシステムＩＩＩであった。
【００７７】
システムＩおよびＩＩでは、ｅＧＦＰ遺伝子を含有する１ｎｇのプラスミドＤＮＡを鋳型として使用した、増幅を以下の様式で行った：９５℃で５分間の予備変性、３２サイクルの９℃で１０秒間、６１℃で１０秒間、７２℃で１０秒間。
【００７８】
システムＩＩＩでは、２％の比（血漿のみ）で事前に加えた０．２ｎｇのプラスミドＤＮＡ／体液１μＬを含有するヒト全血および血漿の調製物を鋳型として使用し、反応混合物の全体積２５μＬの５％、１０％、２０％、および２５％。９５℃で５分間、２６サイクルの９５℃で１０秒間、６１℃で１０秒間、７２℃で１０秒間の様式で増幅を実施した。
【００７９】
使用したプライマー対は、（Ｑ０−Ｚ０）、（Ｑ０−ＺＨ２）、（ＱＨ２−Ｚ０）、（ＱＨ２−ＺＨ２）であった。オリゴヌクレオチド配列を図２に示す。
【００８０】
アガロースゲル電気泳動によるＰＣＲ産物の分析の結果を図１２に提示する（Ｍは、１００〜５００ｂｐのＤＮＡ長のマーカーである）。様々な市販のポリメラーゼおよび緩衝液混合物の存在下でＰＧオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して、所定の長さのＰＣＲ産物が具体的に形成されたことが見られた（図１２ＡおよびＢ）。ＰＧオリゴヌクレオチドは体液中でのＰＣＲに適していた。本結果により、市販のＰＣＲシステムにおいて使用する様々なＤＮＡポリメラーゼによって触媒されるＰＣＲにおいて、ＰＧ修飾オリゴデオキシリボヌクレオチドをプライマーとして効率的に使用することが可能であると結論づけることが可能となる。
【００８１】
＜実施例１１：ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（リバーターゼ）のプライマーとしてのＰＧオリゴヌクレオチド＞
本実施例では、天然オリゴヌクレオチドＰ０と比較した、フルオレセインで標識したＰＧオリゴヌクレオチドＰ７−Ｐ２４の、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡを検出するためのプライマーとしての使用の可能性を実証した。オリゴヌクレオチド配列を図２に示す。修飾ＰＧプライマーは７個（オリゴヌクレオチドの５’末端から）〜２１個の連続したＰＧを含有していた。
【００８２】
ＨＣＶ感染ドナーの新鮮な血清を分析の出発物質として使用した。ＨＣＶ  ＲＮＡを「ＲｅａｌＢｅｓｔ」Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  １００キット（ＶｅｃｔｏｒーＢｅｓｔ、ロシア）を使用して単離し、記載された手順に従って、天然オリゴヌクレオチドＰ０またはＰＧオリゴヌクレオチドＰ７−Ｐ２１のどちらかおよびリバーターゼ（ＭＭＬＶまたはＨＩＶ−ｐ６６）を逆転写段階で使用して、ＲＴ−ＰＣＲ反応内に導入した。以下の組成物の混合物中で逆転写反応（５０μＬ）を実施した：ＰＧオリゴヌクレオチド（０．５μＭ）、ＭｇＣｌ２（３ｍＭ）、トリス−ＨＣｌ（５０ｍＭ）、ｐＨ８．０、（ＮＨ４）２ＳＯ４（１０ｍＭ）、ＫＣｌ（３０ｍＭ）、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０、ｄＮＴＰ三リン酸の組（それぞれ０．４ｍＭ）、ＢＳＡ  １００μｇ／ｍＬ、ＭＭＬＶまたはＨＩＶ−ｐ６６（１０単位の活性）。逆転写反応を少なくとも２つ組で、以下の温度様式で実施した：４５℃で３０分間、９５℃で３分間。
【００８３】
次に、得られたｃＤＮＡをＨＣＶ特異的断片のＰＣＲに使用した。以下の組成物の混合物でＰＣＲを実施した：プライマーＣＴＣＣＣＧＧＧＡＧＡＧＣＣＡＴＡＧおよびＴＣＣＡＡＧＡＡＡＧＧＡＣＣＣＧＧＴＣ（それぞれ０．５μＭ）、緩衝液（ＭｇＣｌ２（３ｍＭ）、トリス−ＳＯ４（５０ｍＭ）、ｐＨ８．０、（ＮＨ４）２ＳＯ４（１０ｍＭ）、ＫＣｌ（３０ｍＭ）、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０）、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（１単位の活性）、蛍光標識した加水分解性プローブ５’−ＲＯＸ−ＴＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＧＴＡＣＡＣＣＧ−（ＢＨＱ２）（０．２５μＭ）、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（１／１００００の希釈率）またはＳＹＴＯ−１３（１／２５００の希釈率）。５０℃で２分間、４９サイクルの９４℃で１０秒間、６０℃で２０秒間、５℃で５秒間、９５℃で１分間の様式で増幅を実施した。ＣＦＸ９６機器（ＢｉｏＲａｄ、米国）およびＲｅａｌＢｅｓｔ  ＨＣＶ  ＲＮＡキットを使用したＨＣＶ検出のプロセスを、リアルタイム様式で、２つのチャネルを介して実施した：ＲＯＸは蛍光標識した加水分解性プローブの特異的検出であり、ＦＡＭはＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ色素（図１３、通常のスタイル）またはＳＹＴＯ−１３（図１３、太字および色で強調）を使用したｄｓＤＮＡの非特異的検出である。増幅の結果、ＰＣＲ緩衝液条件下で８６〜８８℃の融点を有していた７９ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。
【００８４】
反応閾値サイクル値Ｃｔ（閾値サイクル）を決定することによって、ＰＧオリゴヌクレオチドと天然オリゴヌクレオチドとのプライマーとしての基質特性の比較を実施し、これを図１３に示す。Ｃｔ値を実施例６で既に記載したように計算した。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（ＭＭＬＶおよびＨＩＶ−ｐ６６リバーターゼ）を使用して分析したＲＮＡ鋳型に対するｃＤＮＡを得る際に、ＰＧオリゴヌクレオチドをプライマーとして作用することができることが見られた。
【００８５】
＜実施例１２：ワンステップＲＴ−ＰＣＲシステムにおけるＤＮＡポリメラーゼのプライマーとしてのＰＧオリゴヌクレオチド＞
ＭＭＬＶリバーターゼおよび熱安定性ＤＮＡ依存性Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含有するワンステップＲＴ−ＰＣＲ「ＢｉｏＭａｓｔｅｒ  ＲＴ−ＰＣＲ  ＳＹＢＲ  Ｂｌｕｅ（２×）」（Ｂｉｏｌａｂｍｉｘ、ロシア）のシステムでは、ヒトＵ１２  ｓｎＲＮＡ配列に特異的なプライマーを使用した。
【００８６】
天然オリゴヌクレオチド（Ｕ０、Ｖ０）およびＰＧオリゴヌクレオチド（ＵＨ１、ＶＨ１、ＷＨ１）をプライマーとして使用した。オリゴヌクレオチド配列を図２に示す。それぞれのプライマーの濃度は４８０〜７００ｎＭであった。
【００８７】
ＲＴ−ＰＣＲを、６ｎｇ／μＬ〜８ｐｇ／μＬの濃度範囲のヒト乳腺癌細胞ＭＣＦ−７の全ＲＮＡ調製物に対して行った。
【００８８】
逆反応を４５℃で４５分間実施した。
【００８９】
増幅様式は、９５℃で５分間、４８サイクルの９５℃で１０秒間、６０℃で１０秒間、７２℃で１０秒間であった。
【００９０】
ＲＴ−ＰＣＲ産物の分析を、熱変性および１．５％のゲルにおける水平ゲル電気泳動、次いで臭化エチジウムを用いたヌクレオチド物質の可視化によって実施した（図１４Ａ、Ｍは、１００〜４００ｂｐのＤＮＡ長のマーカーである）。分析したプライマー対では、見かけの効率因子は以下のように決定された：対（Ｕ０−Ｖ０）では１．７、（ＵＨ１−ＶＨ１）では１．６３、および（ＵＨ１−ＷＨ１）では１．５６。
【００９１】
ＰＧ修飾プライマーを使用した場合、より低い融点を有する非特異的な増幅産物の形成は、はるかに低い程度で起こったことが見られた（図１４Ｂ）。得られた結果により、ＰＧオリゴヌクレオチドをワンステップＲＴ−ＰＣＲシステムにおけるプライマーとして使用して、すなわち、ＰＧ修飾プライマーは、ＲＴ段階において（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって触媒）、その後、増幅段階において（ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって触媒）、種として役割を果たすことができたことが実証された。
【００９２】
＜実施例１３：ローリングサークル機構（ＲＣＡ）による増幅反応におけるプライマーとしてのＰＧオリゴヌクレオチド＞
本実施例は、ＰＧオリゴヌクレオチドおよび天然オリゴヌクレオチドを使用した場合の、ローリングサークル機構（ＲＣＡ）によるＤＮＡ増幅反応の効率の比較を実証する。
【００９３】
ＤＮＡプラスミドｐＵＣ１９（０．２ｎｇ）の増幅を、トリス−ＨＣｌ（５０ｍＭ）、ｐＨ７．５、ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（１０ｍＭ）、ＤＴＴ（４ｍＭ）、デオキシヌクレオシド三リン酸の組（それぞれ０．２ｍＭ）の存在下、ＢＳＡ（２００ｎｇ／μＬ）、挿入色素ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、ＤＮＡポリメラーゼファイ２９（０．５単位の活性／μＬ）、１μｍのプライマーのうちの１つを含有する反応緩衝液中で実施した。
【００９４】
増幅様式は３０℃で１４時間であった。
【００９５】
ＰＧオリゴヌクレオチドＤ２およびＤ３ならびに天然オリゴヌクレオチドＤ０をプライマーとして使用した。オリゴヌクレオチド配列を図２に示す。修飾ＰＧプライマーは、２個および３個までの連続したＰＧをオリゴヌクレオチドの３’末端に含有していた。
【００９６】
増幅産物は、２００ｎｇのプラスミドｐＵＣ１９をマーカー（Ｍ）として使用して、０．８％アガロース中のアガロースゲル電気泳動によって分析した。分析の結果を図１５Ａに提示し、「Ｋ−」は、プライマーなしの対照反応の結果に対応する。ＰＧオリゴヌクレオチドの場合、増幅産物の蓄積が観察されたことが見られた（図１５Ａ）。同時に、増幅産物（それぞれのプライマーＤ２、Ｄ３、およびＤ０のもの）を３×１０−６倍希釈し、５０μＬの得られた溶液を使用して、増幅係数を、ＰＣＲ方法によって、９つ組で、リアルタイム様式において、蛍光標識した加水分解性プローブの存在下で、ｐＵＣ９部位の１０５個のヌクレオチドの長さまで推定した。その後、閾値反応サイクルの平均値（Ｃｔ）および特異的プライマーのＣｔ間の相違（ΔＣｔ）および増幅反応の初期条件に対応する初期鋳型の希釈率（ＤＮＡプラスミドｐＵＣ１９の０．２ｎｇの量での増幅）を計算した。
【００９７】
得られたΔＣｔ値を使用して、初期条件の効率が１であると仮定してＲＣＡ増幅係数を計算した（図１１Ｂ）。表に提示したデータを比較すると、増幅係数は、ＰＧオリゴヌクレオチドＤ２およびＤ３を使用した場合に元の天然プライマーＤ０よりも高かった、すなわち、それぞれ２４７．３および２９．９と比較して９．４であったことが見られた。
【００９８】
＜実施例１４：ＰＧオリゴヌクレオチドを対立遺伝子に特異的なＰＣＲにおけるプライマーとして使用した、突然変異検出の選択性の増加＞
トリス−ＨＣｌ（６５ｍＭ）、ｐＨ８．９、（ＮＨ４）２ＳＯ４（２４ｍＭ）、ＭｇＳＯ４（３ｍＭ）、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０、デオキシヌクレオシド三リン酸の組（それぞれ０．２ｍＭ）、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（０．０３単位の活性／μＬ）、蛍光標識した加水分解性プローブ５’−ヘキサ−ＣＴＧＴＡＴＣＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣ−ＢＨＱ２−３’（１００ｎＭ）を含有する緩衝液中で、鋳型の増幅を実施した。
【００９９】
増幅様式は、９５℃で３分間、５０サイクルの９５℃で１０秒間、６０℃で４０秒間であった。
【０１００】
ＫＲＡＳ遺伝子断片（ＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧ（Ｇ／Ａ）ＣＧＴＡＧＧＣＡＡＧＡＧＴＧＣＣＴＴＧＡＣＧＡＴＡＣＡＧＣＴＡＡＴＴＣＡＧＡＡＴＣＡＴＴＴＴＧＴＧＧＡＣＧＡＡＴＡＴＧ）中に突然変異ｃ．３８Ｇ＞Ａ（Ｇ１３Ｄ）を含有する対照プラスミドを加えたまたは加えていない、結腸直腸癌組織を有する組織ブロックから単離した２ｎｇのヒトゲノムＤＮＡを、鋳型として、ゲノムＤＮＡ中のＫＲＡＳ遺伝子断片の総量に対して１．１％の量で使用した。
【０１０１】
オリゴヌクレオチド対（フォワード＋リバース）をプライマーとして使用した：天然オリゴヌクレオチドＳ０＋ＳおよびＳ１＋Ｓ、ここで、ＳおよびＳ０は天然オリゴヌクレオチドであり、Ｓ１はＰＧオリゴヌクレオチドである。それぞれのプライマーを３００ｎＭの濃度で反応混合物に加えた。プライマー構造を図２に示す。プライマー対Ｓ０＋ＳおよびＳ１＋Ｓの存在下において、対立遺伝子に特異的なＰＣＲ方法を使用した、鋳型中の単一ヌクレオチド突然変異Ｔ／Ｃの検出の略図を図１６に示す。
【０１０２】
突然変異検出の選択性は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ９６機器（Ｒｏｃｈｅ、スイス）を使用したリアルタイムＰＣＲによって決定した。
【０１０３】
それぞれのプライマー対について、閾値反応サイクルの平均値（Ｃｔ）および１．１％の突然変異を含有する試料と突然変異なしの試料との間の相違（ΔＣｔ）を計算した。対（Ｓ１＋Ｓ）のΔＣｔは９．２７であった一方で、（Ｓ０＋Ｓ）は４．４２であったことが見出された（図１６、ΔＣｔ値を対応するプライマー名の隣に示す）。したがって、ＰＧオリゴヌクレオチドを含有する対の選択性は、天然オリゴヌクレオチドに基づく対のそれよりも高かったと結論づけることができる。
【０１０４】
＜引用した参考文献のリスト＞
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【図１】
2021505205.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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