(57)【要約】本開示は、特にイメージング目的での医療における使用のための、アルギン酸塩、ヒアルロン酸、ジェランガムまたはその誘導体などの多糖類類およびマンガンイオンを含む生体適合性イオン架橋ヒドロゲルポリマーに関する。したがって、本開示のヒドロゲルは、広範囲の治療用途における細胞／薬物送達の時空間制御に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルギン酸塩、ヒアルロナン、ジェランガム、またはそれらの混合物からなるリストから選択される、生体適合性多糖類と、
マンガンの濃度が０．００１〜９ｍＭの間で変化する、イオン架橋剤としてのマンガンと、
を含む、イオン架橋ヒドロゲル。
【請求項２】
前記生体適合性多糖類は、ヒアルロナン、ジェランガム、またはそれらの混合物からなるリストから選択される、先行する請求項に記載のイオン架橋ヒドロゲル。
【請求項３】
ヒアルロナンとジェランガムとの混合物を含む、先行する請求項に記載のイオン架橋ヒドロゲル。
【請求項４】
ジェランガム：ヒアルロナンの質量比は、１００：０〜７５：２５の間で変化し、特に実質的に５０：５０である、先行する請求項のいずれか一項に記載のイオン架橋ヒドロゲル。
【請求項５】
前記ジェランガムは、メタクリル化ジェランガムである、先行する請求項のいずれか一項に記載のイオン架橋ヒドロゲル。
【請求項６】
ヒアルロナンとメタクリル化ジェランガムとの混合物を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載のイオン架橋ヒドロゲル。
【請求項７】
前記マンガンの濃度が０．０１〜５ｍＭの間で変化する、先行する請求項のいずれか一項に記載のイオン架橋ヒドロゲル。
【請求項８】
前記マンガンの濃度は、０．０５〜１ｍＭの間で変化し、好ましくは０．１ｍＭである、先行する請求項のいずれか一項に記載のイオン架橋ヒドロゲル。
【請求項９】
カルシウム、バリウムまたはそれらの混合物から選択される第２のイオン架橋剤をさらに含む、先行する請求項に記載のイオン架橋ヒドロゲル。
【請求項１０】
前記生体適合性多糖類の濃度は、０．２５〜１０％（ｗｔ／Ｖｈｙｄｒｏｇｅｌ）の間で変化する、先行する請求項に記載のイオン架橋ヒドロゲル。
【請求項１１】
前記生体適合性多糖類の濃度は、０．５〜２％（ｗｔ／Ｖｈｙｄｒｏｇｅｌ）の間で変化し、好ましくは０．７５〜１％（ｗｔ／Ｖｈｙｄｒｏｇｅｌ）の間で変化する、先行する請求項に記載のイオン架橋ヒドロゲル。
【請求項１２】
３７℃でのヒドロゲルの複素粘度は、０．０８〜６３０Ｐａ．ｓで変化し、好ましくは２〜１００Ｐａ．ｓで変化する、先行する請求項のいずれか一項に記載のイオン架橋ヒドロゲル。
【請求項１３】
薬物、細胞、またはそれらの混合物をさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載のイオン架橋ヒドロゲル。
【請求項１４】
医療または獣医学で使用するための、先行する請求項のいずれか一項に記載のイオン架橋ヒドロゲル。
【請求項１５】
薬物送達剤または光線力学療法剤として使用するための、先行する請求項に記載のイオン架橋ヒドロゲル。
【請求項１６】
核磁気共鳴造影剤、マンガン造影ＭＲＩとして使用するための、先行する請求項に記載のイオン架橋ヒドロゲル。
【請求項１７】
マンガン造影ＭＲＩによる疾患の治療、手術または診断に使用するための、先行する請求項に記載のイオン架橋ヒドロゲル。
【請求項１８】
腫瘍または神経変性疾患の治療、手術または診断に使用するための、先行する請求項に記載のイオン架橋ヒドロゲル。
【請求項１９】
癌または筋萎縮性側索硬化症の治療、手術または診断に使用するための、先行する請求項に記載のイオン架橋ヒドロゲル。
【請求項２０】
先行する請求項のいずれかに記載されたイオン架橋ヒドロゲルと、治療量において医薬的に許容される賦形剤および／または活性物質もしくは生体分子と、を含む医薬組成物。
【請求項２１】
前記組成物は、経口、非経口、筋肉内、鼻腔内、舌下または気管内経路により投与され、特に注射可能な組成物である、先行する請求項に記載の組成物。
【請求項２２】
先行する請求項のいずれか一項に記載されたイオン架橋ヒドロゲルまたは組成物を含む、ディスク、ファイバーまたは微粒子。
【請求項２３】
先行する請求項のいずれか一項に記載されたイオン架橋ヒドロゲルまたは組成物を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、マンガンを含むヒドロゲル、その方法および使用に関する。本開示に記載されるヒドロゲルは、医療での使用、特に造影剤としての使用に適している。
【背景技術】
【０００２】
ヒドロゲルは、局所的な細胞および薬物の送達を容易にするための非常に魅力的な生体材料足場になりつつある。長期間とリアルタイムとの両方においてヒドロゲルの配置をイメージングすることにより、それらのより正確な投与およびそれらの末期を追うことが可能となる。イオン架橋を介してゲル化されるポリマーベース構造について説明する。
【０００３】
ジェランガムは、細菌スフィンゴモナス・エロデア（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｅｌｏｄｅａ）によって分泌される直鎖アニオン性ヘテロ多糖類である。その分子構造は、グルコース−グルクロン酸−グルコース−ラムノースからなる１つの繰り返し単位に基づく。ネイティブ型、または高アシル型では、アセチル基およびＬ−グリセリル基の、２種類のアシル置換基が存在する。低アシルジェランガムは、両方のアシル残基を除去する、ネイティブジェランガムのアルカリ加水分解を通じて得られる。メタクリル化ジェランガム（ＧＧ−ＭＡ）は、ネイティブ低アシルＧＧの化学修飾によって得られる。低アシルＧＧおよび高アシルＧＧは室温（ＲＴ）では水に溶解しないが、細胞のカプセル化を想定する場合、室温および中性ｐＨでＧＧ−ＭＡを溶解することが可能となり、より使用者と細胞とに優しいものになる。上記のすべての形態のジェランガムは、金属イオンの存在下で、通常ＣａＣｌ２および／またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の添加により、ヒドロゲルを形成する。実際、ジェランガム（ＧＧ）ヒドロゲルは、椎間板（ＩＶＤ）の再生（非特許文献１）、ナノ粒子コーティング（非特許文献２）、脳様組織のバイオプリンティング（非特許文献３）、その他（非特許文献４）を含む、いくつかの用途に上手く使用されている。しかしながら、他のカチオンが調査され得、ＧＧベースのヒドロゲルを形成するために使用され得る。本明細書では、材料を物理的に架橋するためのＭｎＣｌ２の用途、またはＭＲＩのＴ１強調画像を使用したＭＲＩの生体内トラッキング（非特許文献５）を含む生物医学分野でのさらなる用途が開示されている。
【０００４】
ＧＧは、アルギン酸塩およびヒアルロン酸、その他を含む、その他のポリマーと混合できる。加えて、ＧＧは耐酸性および耐熱性があり、繰り返し単位ごとに遊離カルボキシル基を有する。このカルボキシル基の存在により、中性ｐＨ（ｐＫａ＝３．１）でＧＧに負電荷が付与され、ジェランガムと正に帯電したポリマーとの相互作用により高分子電解質複合システムが調製される。
【０００５】
アルギン酸塩は、通常、褐海藻から、または細菌アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）もしくはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）から抽出された多糖類であり、β−Ｄ−マンヌロン酸（Ｍ）およびα−Ｌ−グルロン酸（Ｇ）モノマーからなる直鎖コポリマーブロックを含む。これらのモノマーの割合は、アルギン酸塩の供給源に応じて変化し、それらの架橋反応への関与により、生成された材料の機械的／物理的特性に影響を与える。たとえば、アルギン酸塩のヒドロゲルはイオン架橋（例えば、Ｃａ２＋、Ｂａ２＋、Ｍｎ２＋など）によって生成され、追加されたカチオンはアルギン酸塩のＧまたはＭブロックに結合し、アルギン酸塩がより多くのＧブロックを含んでいる場合はヒドロゲルをより硬くし、Ｍブロックの割合が高い場合はより柔らかくする（非特許文献６）。ＭとＧの比率もまた、細孔のサイズおよび分布に影響し、たとえば、アルギン酸塩がより高いＧ／Ｍブロック比率を含む場合、ヒドロゲルの細孔はより大きくなり、その逆も同様で、意図する目的に合わせてアルギン酸塩を適応または調整できる（非特許文献７）。さらに、アルギン酸塩は優れた生体適合性と生分解性を示し、組織工学や薬物送達の用途に適している（非特許文献８）。アルギン酸塩は、ヒドロゲル、マクロポーラスファイバー（非特許文献８）およびマイクロビーズ（非特許文献９）（たとえば、細胞のカプセル化用）、ナノ粒子（非特許文献１０）（たとえば、薬物送達用）、およびイメージング目的のマイクロスフェアおよび／またはヒドロゲルの形で製造できる（非特許文献１１）。多数のイオンをイメージング研究に使用できるが、形成されたゲルが不安定であるため、架橋目的においてマンガン（Ｍｎ２＋）に焦点を当てた研究はほとんどない。しかしながら、Ｍｎ２＋の徐放はマンガン造影核磁気共鳴画像法（ＭＥＭＲＩ）に役立ち得る。Ｍｎ２＋は、Ｔ１強調画像の細胞内造影剤として使用して、細胞、組織、およびそれらの生体内活動を画像化でき、その常磁性特性と短いＴ１緩和時間により、高コントラストのＴ１強調ＭＲＩを取得できる（非特許文献１２）。
【０００６】
ヒアルロン酸（ＨＡ）は、体の多くの部分の細胞外マトリックスに見られ、二糖β−１，４−Ｄ−グルクロン酸−β−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの交互単位で構成されている、非硫酸化アニオン性グリコサミノグリカンである。ＨＡは生体工学および生体材料科学への重要性が増している材料であり、化粧品から免疫調節に至るまで幅広い分野で用途を見出している。その物理的および化学的性質は、身体の修復に関連するさまざまな技術にとって非常に魅力的である。
【０００７】
これらの事実は、本開示によって対処される技術的問題を例示するために開示されている。
【発明の概要】
【０００８】
本開示は、医療における使用、特にイメージング目的での使用のための、アルギン酸塩、ヒアルロン酸、ジェランガムまたはその誘導体などの多糖類およびマンガンイオンを含む、生体適合性イオン架橋ヒドロゲルポリマーに関する。したがって、本開示のヒドロゲルは、広範囲の治療用途における細胞／薬物送達の時空間制御に有用である。
【０００９】
多様なイメージング技術は、医療専門家が疾患を診断することや、治療／外科的処置手順を監視することを可能にするために利用できる。すなわち、超音波、シンチグラフィ、ポジトロン断層法（ＰＥＴ）、単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、Ｘ線、コンピューター断層撮影（ＣＴ）である。
【００１０】
本開示の一態様は、マンガンイオンの存在下でのアルギン酸塩、ヒアルロナン、ジェランガム、それらの混合物およびその誘導体などの多糖類を含む様々なポリマーのイオン架橋によって得られる、生体適合性ヒドロゲルの使用に関する。本開示のヒドロゲルは、医学における使用、すなわち、光線力学療法またはイメージング技術における使用のためであり得る。驚くべきことに、これらのＭｎベースのヒドロゲルは、幅広い治療用途で細胞／薬物送達の時空間制御を可能にする。イメージング部分構造は、マンガン造影ＭＲＩ（ＭＥＭＲＩ）技術を使用して、処置手順中にリアルタイムで動物および人間への生体材料投与を監視することと、生体内でのヒドロゲルの経過を追跡することと、を可能にする。
【００１１】
本開示の一態様は、生体適合性多糖類およびイオン架橋剤としてのマンガンを含むイオン架橋ヒドロゲルに関し、ここでマンガンの濃度は、０．００１〜９ｍＭの間で変動する。
【００１２】
より良い結果のための実施形態では、マンガンの濃度は、０．０１〜５ｍＭの間で変動し得、好ましくは０．０５〜１ｍＭ、より好ましくは０．１ｍＭである。
【００１３】
より良い結果のための実施形態では、本開示のイオン架橋ヒドロゲルは、カルシウム、バリウムまたはそれらの混合物から選択される第２のイオン架橋剤をさらに含み得る。
【００１４】
より良い結果のための実施形態では、生体適合性多糖類の濃度は、０．２５〜１０％（ｗｔ／Ｖｈｙｄｒｏｇｅｌ）の間で変動し得、好ましくは０．５〜２％（ｗｔ／Ｖｈｙｄｒｏｇｅｌ）、好ましくは０．７５〜１％（ｗｔ／Ｖｈｙｄｒｏｇｅｌ）の間で変動し得る。
【００１５】
より良い結果のための実施形態では、生体適合性多糖類は、アルギン酸塩、ヒアルロナン、ジェランガム、またはそれらの混合物からなるリストから選択され得る。
【００１６】
より良い結果のための実施形態では、多糖類はヒアルロナンとジェランガムとの混合物である。
【００１７】
より良い結果のための実施形態では、ジェランガム：ヒアルロナンの質量比は、１００：０〜７５：２５の間で変化し、特に実質的に５０：５０である。
【００１８】
より良い結果のための実施形態では、ジェランガムは、メタクリル化ジェランガムであり、好ましくは、メタクリル化度は、０．０１から７０％まで変化し、好ましくは０．０１から５０％まで変化する。メタクリル化度の測定は、様々な方法で行ってもよく、本開示では、メタクリル化度の測定は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法によって行われた。
【００１９】
より良い結果のための実施形態では、３７℃でのヒドロゲル複素粘度は、０．０８〜６３０Ｐａ．ｓで変化し、好ましくは２〜１００Ｐａ．ｓで変化する。粘度の測定は様々な方法で実施してもよく、この開示では、粘度の測定は、レオメータを使用して、レオロジー分析によって実施された。
【００２０】
本開示の別の態様は、医学または獣医学における使用のための、本主題のイオン架橋ヒドロゲルの使用に関する。
【００２１】
より良い結果のための実施形態では、本主題のイオン架橋ヒドロゲルは、薬物送達剤として、または光線力学療法剤として、好ましくは磁気共鳴造影剤として、さらには磁気共鳴造影剤として使用され得る。
【００２２】
より良い結果のための実施形態では、本主題のイオン架橋ヒドロゲルは、核磁気共鳴画像法による疾患の治療、手術または診断、特にマンガン造影ＭＲＩによる疾患の診断に使用され得る。
【００２３】
より良い結果のための実施形態では、本主題のイオン架橋ヒドロゲルは、腫瘍または神経変性疾患、特に癌または筋萎縮性側索硬化症の治療、手術または診断に使用され得る。
【００２４】
本開示の別の態様は、本主題のイオン架橋ヒドロゲルと、治療量において医薬として許容される賦形剤および／または活性物質と、を含む医薬組成物に関する。
【００２５】
より良い結果のための実施形態では、有効成分または生体分子は、薬物、有効成分、成長ホルモン、細胞誘引物質、薬物分子、細胞、組織成長促進剤、細胞誘引物質、またはそれらの組み合わせである。
【００２６】
より良い結果のための実施形態では、組成物は、複数のヒドロゲルを含み得る。
【００２７】
より良い結果のための実施形態では、組成物は、経口、非経口、筋肉内、鼻腔内、舌下または気管内経路によって投与され得る。
【００２８】
より良い結果のための一実施形態では、組成物は注射可能な組成物であり得る。
【００２９】
より良い結果のための実施形態では、組成物は、抗ウイルス剤、鎮痛剤、抗炎症剤、化学療法剤、放射線療法剤、抗生物質、利尿剤、またはそれらの混合物をさらに含み得る。
【００３０】
より良い結果のための実施形態では、組成物は、充填剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、またはそれらの混合物をさらに含み得る。
【００３１】
本開示の別の態様は、イオン架橋ヒドロゲルまたは本主題の組成物を含むディスク、ファイバーまたは微粒子に関する。
【００３２】
本開示の別の態様は、イオン架橋ヒドロゲルまたは本主題の組成物を含むキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
以下の図は、明細書を例示するための好ましい実施形態を提供するものであり、本発明の範囲を限定するものと見なされるべきではない。
【図１】様々な形状を用いたＧＧ−ＭＡベースのヒドロゲルの例である。（Ａ）ＭｎＣｌ２を使用したイオン架橋と、その後の緩衝液への浸漬とによって得られるヒドロゲルディスクである。（Ｂ）ＧＧ−ＭＡ混合物は注射可能で、ファイバーの形成に使用できる。（Ｃ）押出し滴下法は、Ｍｎ２＋ベースの溶液を使用して材料を架橋するＧＧ−ＭＡベースの微粒子を調製するために使用できる。
【図２】ＭｎベースのＧＧ−ＭＡヒドロゲルに関するレオロジー調査である。（Ａ）５分間および（Ｂ）１０分間、架橋を行った、ヒドロゲルの周波数掃引曲線である。（Ｃ）１Ｈｚの周波数で得られたせん断弾性率である。（Ｄ）試験条件における位相角の平均±標準偏差である。
【図３】ＭｎベースのＧＧ−ＭＡヒドロゲルの膨潤および分解挙動を示す。（Ａ）ＰＢＳ溶液に５０４時間（２１日間）浸漬後のヒドロゲルの膨潤、（Ｂ）ヒドロゲルの生成時とＰＢＳへの２１日間の浸漬後との間での重量変化を示す。結果は平均±標準偏差（ｎ＝３）として表される。
【図４】ｈＡＳＣ含有ＧＧＭＡヒドロゲルを用いた試験管内研究の結果を示す。（Ａ）様々な培養時点での生存細胞の割合を示す。（Ｂ）ＤＮＡ定量結果を示す。（Ｃ）生細胞は緑、死細胞は赤で表示される、生／死染色の結果を示す。（Ｄ）ＤＡＰＩ／ファロイジン染色により可視化されたカプセル化後の細胞形態は、核が青に、アクチンが赤に見える（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＞０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎ＝３）。
【図５】ＭｎＣｌ２で架橋されたＧＧ−ＭＡベース混合物のレオロジー調査である。様々な比率（１００：０、７５：２５、５０：５０）のＧＧ−ＭＡ／ＨＡのヒドロゲルを調整した。グラフは、得られたＧ’およびＧ’’係数を経時的に表す。データは少なくとも３つの測定の平均として表される。
【図６】ａＣＳＦで２４時間培養した後、ＭｎＣｌ２で架橋したＧＧ−ＭＡベースの混合物のレオロジー調査である。様々な比率（１００：０、７５：２５、５０：５０）のＧＧ−ＭＡ／ＨＡのヒドロゲルを調整し、ａＣＳＦで３７℃で２４時間培養した。グラフは、テストされた各条件において経時的に取得されたＧ’およびＧ’’係数を表す。データは少なくとも３つの測定の平均として表される。
【図７】凍結乾燥したヒドロゲル溶液の走査型電子顕微鏡写真である。様々なヒドロゲル配合物の表面形態は、ＭｎＣｌ２以外のイオン溶液を添加せずに、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で評価した。
【図８】ヒアルロニダーゼありまたはなしの分解アッセイである。調製後、ヒドロゲルをａＣＳＦ溶液またはヒアルロニダーゼ（ｐＨ７．４）を含むａＣＳＦの中で、３７℃で振盪しながら培養した。結果は、３つのヒドロゲルレプリカの平均±標準偏差として表示される。
【図９】ヒドロゲル溶液をａＣＳＦに注入するのに必要な最大力を示す。最大力（Ｎ）は様々な材料の配合物をａＣＳＦに注入する際に記録される。結果は、３つの異なるレプリカの平均±標準偏差として表される（（＊）ｐ＜０．０５、（＊＊＊＊）ｐ＜０．０００１）。
【図１０】３つのＦＩＴＣ標識デキストラン分子（４、２０、７０ｋＤａ）に対する様々なヒドロゲルの浸透性を示す。様々なヒドロゲル配合物を様々な分子量のデキストランと混合して、それらの浸透性を評価した。結果は、３つの異なるレプリカの平均±標準偏差として表される。
【図１１】Ｍｎ２＋で架橋された様々なＧＧ−ＭＡベースの混合物でカプセル化した後のｈＡＳＣの代謝活性を示す。代謝活性は、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（Ｒ）アッセイを使用して評価された。各ゲルは３つ調製され、測定値は平均±標準偏差として表される。
【図１２】ａＣＳＦへの押し出しによるファイバー形成である。
【図１３】７日間の培養後、ＧＧ−ＭＡベースのファイバーでカプセル化されたｈＡＳＣを示す。ファイバーは、３１Ｇの針と１０μｌのハミルトンシリンジを組み合わせて形成した。細胞は核およびヒドロゲルを染色するＤＡＰＩ（青）と、細胞質アクチンを染色するファロイジン（赤）と、で染色される。
【図１４】様々なアルギン酸塩で生成されたＭｎ微粒子のＳＥＭおよびＥＤＳ分析である。
【図１５】臨床３Ｔスキャナーを使用したＭｎ２＋ファントムのＴ１強調ＭＲＩを示す。
【図１６】試験管内でのアルギン酸ヒドロゲルにおけるＭｎＣｌ２の安定性のＭＲＩ分析である。
【図１７】髄腔内におけるＭｎ２＋ベースのアルギン酸塩送達のＴ１強調ＭＲＩスキャンである。
【図１８】ＭＲＩにおけるマンガンヒドロゲルの信号安定性を示す。（Ａ）ＭｎＣｌ２または（Ｂ）ＭｎＣｌ２小型粒子に異なる溶液を追加した、ＣａＭ（＞７５μｍ）粒子（Ｎｏｖａｍａｔｒｉｘ、ＦＭＣ、デュポン）で架橋された低粘度のマンヌロン酸ベースのアルギン酸（ＬＶＭ）である。架橋後のヒドロゲルを人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）に注入し、Ｔ１強調シーケンスを使用して臨床ＭＲＩ（Ｍａｇｎｅｔｏｍ  Ｔｒｉｏ  ３Ｔ、シーメンス）でファントムとして１４日間スキャンした。ＭｎＣｌ２溶液を含むアルギン酸塩は、注射後５日目まで視認できたが（Ａ）、５％および１０％の小型ＭｎＣｌ２粒子を含むアルギン酸塩は１４日間視認できた。
【図１９】ＭｎベースのＧＧ−ＭＡ／ＨＡヒドロゲル混合物のさまざまな配合物のＴ１強調信号を示す。
【図２０】ヒドロゲルカプセル化時の細胞生存率を示す代表的な画像である。（Ａ）様々なヒドロゲル配合物にカプセル化されたｈＡＳＣｓは、３１Ｇ針と連結されたハミルトンシリンジを使用して押し出された。０．１ｍＭのＭｎＣｌ２の補充は、生細胞が緑に、死細胞が赤に表示される、培養１日後および７日後の生／死染色で観察されるように、細胞生存率には影響しなかった。スケールバーは５００μｍである。（Ｂ）ハミルトンシリンジを使用した細胞のカプセル化と押し出しに使用される実験の準備である。ａＣＳＦへの押し出しは、１０μｌ／分の速度を使用して、シリンジポンプによって制御された。（Ｃ）培養の１日後および７日後の生／死染色後、１８Ｇ針を使用してファイバーを押し出した。押し出しは、シリンジポンプで５０μｌ／分の流量を使用して制御した。スケールバーは５００μｍである。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本開示は、医療における使用、特にイメージング目的での使用のためのアルギン酸塩、ヒアルロン酸、ジェランガムまたはその誘導体などの多糖類とマンガンイオンとを含む、生体適合性イオン架橋ヒドロゲルポリマーに関する。したがって、本開示のヒドロゲルは、広範囲の治療用途における細胞／薬物送達の時空間制御に有用である。
【００３５】
ジェランガムおよびその誘導体、アルギン酸塩、ヒアルロン酸またはそれらの混合物を含む、様々な多糖類を使用するヒドロゲルは、ディスク、ファイバーまたは微粒子を含む様々な形態を用いて調製され得る（図１）。
【００３６】
一実施形態では、ディスクは、ヒドロゲル溶液を使用して、１％ＧＧ−ＭＡをＭｎＣｌ２溶液と混合して、異なる濃度のＭｎ２＋（０、０．１、１ｍＭのＭｎ２＋）を有するヒドロゲルを得ることによって調製され得る。次に、これらの溶液を７５：２５および５０：５０の比率で１％ヒアルロン酸ナトリウムと混合し、シリコン型に注いだ。ディスクの形状は、人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、疑似体液（ＳＢＦ）、その他などのイオン性溶液／緩衝液との接触後に得られる。高濃度のＭｎ２＋（２０ｍＭより高い）の場合、イオン溶液を添加せずにディスクを形成できる。
【００３７】
一実施形態では、ファイバーは、ａＣＳＦまたは別の緩衝液に直接押し出された上記の混合物を使用して調製され得る。この溶液に存在するイオンは、ゲル溶液中に存在するＧＧをさらに架橋し得、注入されたゲルにファイバー形状を与える。
【００３８】
一実施形態では、微粒子は、アルギン酸塩、ジェランガム、および所望の濃度のヒアルロン酸を含むジェランガムを使用して調製され得、次いで、ＣａＣｌ２およびＭｎＣｌ２の溶液に押し出され得る。
【００３９】
一実施形態では、本開示のマンガンベースのＧＧ−ＭＡヒドロゲルは、ヒドロゲルを得るために様々な二価イオンで架橋された、内製のメタクリル化ジェランガム（ＧＧ−ＭＡ）を使用して調製され得る。簡潔に言うと、ＧＧ−ＭＡ粉末を、完全に溶解すると１％ｗ／ｖの最終濃度となるように、一定の混合の下で蒸留水に溶解した。次に、１００μＬのＧＧ−ＭＡ溶液を円筒状ＰＤＭＳ型に分注し、５０μＬのＭｎＣｌ２（４０、８０、１２０ｍＭ）で、室温で１０分間架橋した。次に、得られたヒドロゲルをＰＤＭＳ型から取り外し、ＰＢＳで洗浄した。
【００４０】
一実施形態では、膨潤および分解の試験をＧＧ−ＭＡヒドロゲルについて行った。そのために、ヒドロゲルを−８０℃で凍結し、凍結乾燥した。次に、得られた構造を重量測定（初期乾燥重量、Ｗｉｄ）し、水和し、３７℃で６０ｒｐｍ連続振盪を行いながら、最大２１日間、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）と共にインキュベートし、三重に行った。定められた時点（１時間、３時間、６時間、８時間、１日、３日、１週間、２週間、３週間）で、足場をインキュベーション溶液から取り出し、過剰ＰＢＳを除去した後、重量（湿重量、Ｗｗ）を測定した。次に、数式１を使用して吸水量（ＷＵ）を計算した。
【００４１】
【数１】
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【００４２】
３週間のインキュベーション後、足場を再度−８０℃で凍結し、凍結乾燥した。次に、得られた構造の重量を計測して、最終的な乾燥重量（Ｗｆｄ）を得た。数式２を使用して、ヒドロゲルの分解を推定した。
【００４３】
【数２】
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【００４４】
一実施形態では、レオロジー分析は、取得ソフトウェアｒＳｐａｃｅを使用して、Ｋｉｎｅｘｕｓ  Ｐｒｏ＋レオメータ（マルバーンインストゥルメンツ、英国）を使用して実行された。測定システムには、ステンレス鋼（３１６グレード）の平行板、つまり直径８ｍｍの上部測定ジオメトリプレートと、粗面仕上の２０ｍｍ下部ペデスタルと、が取り付けられていた（サンプルのずれおよびその結果実験で生じるエラーを防ぐため）。ポリマー溶液と架橋剤との間の接触時間の影響も分析された。そのために、ヒドロゲルを５分間または１０分間架橋し、その後、３７℃で周波数掃引曲線を０．０１−１〜１００ｓ−１で取得し、１ディケードにつき５サンプルを取得した。すべてのプロットは、少なくとも３つの実験の平均である。
【００４５】
一実施形態では、ヒト脂肪由来幹細胞（ｈＡＳＣ）を、男性から得られた膝蓋下脂肪体（ヒトホファ体（ＨＨＢ））から単離した。これはミーニョ大学の倫理委員会によって承認されたものである。すべてのサンプルは、外科的処置後２４時間以内に処理された。未分化細胞を培養し、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、参照番号１０２７０１０６、ＥＵ承認済）と、１０，０００Ｕ．ｍＬ−１のペニシリンＧナトリウム、１０，０００ｍｇ  ｍＬ−１のストレプトマイシン硫酸塩およびＦｕｎｇｉｚｏｎｅＶＲ（ファンギゾンＶＲ）としての２５ｍｇ．ｍＬ−１のアムホテリシンＢとともに０．８５％生理食塩水（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールスバッド、カリフォルニア）中に調製した１％抗生物質−抗真菌液と、を添加した、最小必須培地（ａｌｐｈａ−ＭＥＭ、シグマ、米国）を第１継代まで使用して、基本条件下で増殖させた。細胞は第２継代で使用された。
【００４６】
一実施形態では、本開示のマンガンベースのｈＡＳＣ含有ＧＧＭＡヒドロゲルは、フェノールレッド（ライフテクノロジーズ、カールスバッド、カリフォルニア）と共にＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（１ｘ）を使用することによって培養フラスコから分離されたサブコンフルエント培養物（９０％コンフルエント）を使用して調製され得、続いて１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離される（５８１０Ｒ、エッペンドルフ、ハンブルク、ドイツ）。次に、上清を捨て、ペレットを１％（ｗ／ｖ）ＧＧＭＡ溶液と混合して、最終的な細胞密度を１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとした。ｈＡＳＣ含有ヒドロゲルは、１００μＬの細胞を含むＧＧ−ＭＡ溶液を円筒状ＰＤＭＳ型に分注し、続いて５０μＬの４０ｍＭのＭｎＣｌ２または５０μＬの１００ｍＭのＣａＣｌ２（対照）を添加して、調製した。次に、型を３７℃、空気中の５％ＣＯ２の加湿雰囲気に１０分間配置した。次に、得られたヒドロゲルをＰＤＭＳ型から取り外し、ＰＢＳで穏やかに洗浄し、各ウェルに５００μＬの細胞培地を有する４８ウェルプレート（コーニング、米国）に移した。すべての条件は三重（ｎ＝３）に行われた。
【００４７】
一実施形態では、ヒドロゲルディスクにおける細胞増殖は、製造業者の指示に従って、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  Ｐｉｃｏ−Ｇｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡアッセイキット（ライフテクノロジーズ、カールスバッド、カリフォルニア、米国）を使用して定量化された（ｎ＝９）。簡潔に言うと、最初にＧＧＭＡ足場をＰＢＳで洗浄し、次に１ｍＬの超高純度滅菌水を使用して細胞を機械的に破壊し、細胞を溶解した。３７℃で１時間熱衝撃を与え、続いて−８０℃で凍結し、サンプル分析まで保持した。ＤＮＡ定量値の読み取りにおいて、各バイアルからの２８．７μＬの上清を７１．３μＬのＰｉｃｏＧｒｅｅｎ標準溶液および１００μＬのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液と混合した。サンプルの蛍光強度をマイクロプレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ；  バイオテック、バーモント）で記録し、励起波長は４８５／２０ｎｍ、発光波長は５２８／２０ｎｍであった。標準曲線は、サンプルのＤＮＡ含有量を定量化するために、様々な濃度の標準ｄｓＤＮＡ溶液を使用して作成された。３つの独立した実験が行われた。細胞播種のない足場を、蛍光強度補正の陰性対照として使用した。
【００４８】
一実施形態では、生死アッセイおよびＤＡＰＩ−ファロイジン蛍光アッセイを、培養期間の各時間に実施した。カルセイン−ＡＭとヨウ化プロピジウム染料とを使用して、生死アッセイを行った。カルセイン−ＡＭは、内因性エステラーゼによって加水分解され、負に帯電した緑色蛍光細胞マーカーであるカルセインになり、細胞質に保持される。ＰＩは膜非透過性で、死細胞のＤＮＡにのみ結合する。簡潔に言えば、各時点で、培養培地を除去し、１μＬのカルセイン−ＡＭおよび０．５μＬのＰＩを含む５００μＬのＰＢＳを各ウェルに加えた。次に、サンプルを遮光して３７℃で１０分間培養した。培養後、サンプルをＰＢＳで３回洗浄し、蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｉｍａｇｅ  ＲＺ１Ｍ、ツァイス、ドイツ）によって暗所の中で直ちに可視化した。カルセイン−ＡＭを伴う場合、蛍光フィルター（４９４ｎｍの蛍光励起および５１７ｎｍの発光）を通して、生細胞は明るい緑色に見えた。ＰＩを伴う場合、ローダミンフィルター（５３５ｎｍの蛍光励起および６１７ｎｍの発光）により、死細胞は明るい赤に見えた。生／死の比率は、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒソフトウェア（ブロードインスティテュート、マサチューセッツ州ケンブリッジ、米国）を使用して取得した。ＤＡＰＩおよびファロイジン色素を使用して、ＤＡＰＩ−ファロイジンアッセイを実施した。ＤＡＰＩは、細胞核を青色で描くことにより、優先的に二本鎖ＤＮＡを染色する。ファロイジンは、Ｆ−アクチンを標識する選択性を備えた二環式ペプチドであり、固定細胞におけるアクチンフィラメントの分布を明らかにする。染色の前に、各時点で培地を除去し、１０％ホルマリンを各ウェルに加えた。室温で１時間後、ホルマリンを除去し、ＰＢＳで置き換え、染色に使用するまで４℃に配置した。染色のために、最初に０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘを５分間添加して、細胞を浸透化した。ＰＢＳでの洗浄時に、１μＬのＤＡＰＩと５μＬのファロイジンとを含む１ｍＬのＰＢＳを各ウェルに加えた。遮光された室温環境で４５分後、サンプルをＰＢＳで３回洗浄し、すぐに暗所で共焦点顕微鏡（ＴＣＳ  ＳＰ８、ライカ）で可視化した。それぞれＤＡＰＩおよびファロイジン色素により、細胞核は明るい青色に見え、Ｆ−アクチンフィラメントは明るい赤色に見えた。
【００４９】
データは、テューキーの比較検定を使用した２因子分散分析（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ７ソフトウェア）によって分析され、サンプル間の統計的有意差はｐ＜０．０５であると見なされた。細胞生存率データとＤＮＡ濃度とを平均し、平均±標準偏差をプロットした。統計的有意性は、両側ｔ検定によって決定された。選択された統計的有意差の臨界レベルはｐ＜０．０５だった。
【００５０】
本開示のヒドロゲルは、試験されたすべての条件／配合物について正しく得られた。ヒドロゲルを得るための所望の時間をよりよく理解するために、レオロジー分析が行われた。ＬＶＲ測定から、１Ｈｚの周波数で、０．０１％のせん断ひずみがマンガンベースのＧＧ−ＭＡゲルの継続的な振動実験で正しく使用されることが定義された。振動せん断測定から得られた周波数掃引曲線を図２のＡおよびＢに示す。これは、ＧＧ−ＭＡのゲルを溶液と５分間（Ａ）および１０分間（Ｂ）接触させた場合の、貯蔵弾性率（Ｇ’）の周波数依存性を示す。損失弾性率（Ｇ’’）はチャートには示されていないが、常に貯蔵弾性率よりも小さかった。Ｇ’は、せん断応力中に保存された変形エネルギー、つまり材料の剛性を測定するものである。
【００５１】
一実施形態では、５分間の架橋と１０分間の架橋との比較を単純化するために、１Ｈｚで得られたＧ’の値が一緒にプロットされた（図２−Ｃ）。５分間の架橋後、１２０ｍＭのＭｎＣｌ２で架橋したヒドロゲルはより高いゲル特性を示し、４０ｍＭのＭｎＣｌ２で架橋したものは最も低い特性を示した。驚くべきことに、より長い架橋時間、つまり１０分間では、４０ｍＭのＭｎＣｌ２で得られたヒドロゲルはより高いゲル特性を備えたものであり、他の２つの条件では、最低濃度のＭｎＣｌ２で５分間架橋されたもののような、より弱いヒドロゲルが得られた。
【００５２】
一実施形態では、粘弾性エマルジョンの内部構造の相互作用強度は、減衰係数（または損失係数）として知られる比Ｇ’’／Ｇ’の大きさによって測定される。この係数、ｔａｎδはＧ’’／Ｇ’によって決定される。減衰係数は、粘性液体の場合は１より高く、弾性固体の場合は１未満である。これは、対応する位相角（δ）によっても測定され得、粘性液体の場合は９０°近く（高い損失弾性率Ｇ’’）であり、弾性固体の場合は０°近く（高い貯蔵弾性率Ｇ’）である。したがって、配合物と使用した接触時間との間の違いをよりよく理解するために、各配合の平均位相角（異なる接触時間である５分間および１０分間において）を決定した。前述のように、Ｇ’’は常にＧ’よりも小さく、結果として位相角の値が小さくなり、すべてのサンプルのゲル特性を示した（図２−Ｄ）。４０ｍＭのＭｎＣｌ２と１０分間接触しているヒドロゲルは低い位相角度を有するように見えるが、貯蔵弾性率が高いため、異なる条件間で有意差は見られなかった。
【００５３】
一実施形態では、膨潤試験から、異なる濃度のマンガンが使用された場合でも、異なるヒドロゲル間に有意差が見られなかったため、膨潤能力は類似していると結論付けられた（図３−Ａ）。それにもかかわらず、１２０ｍＭのマンガンで得られたヒドロゲルは、おそらく架橋点の数が多いために、より低い膨潤能力を示し、より密なポリマーネットワークをもたらした。
【００５４】
一実施形態では、ＰＢＳへの浸漬によって引き起こされる重量変化に関して、結果もまた統計的に有意ではなかった（図３−Ｂ）。加えて、変化は比較的小さく、これは２１日間の浸漬後も足場は安定したままであったことを示す。興味深いことに、最低濃度のマンガンで架橋したサンプルでは、この培養期間後に重量が増加した。これは、凍結乾燥プロセス後にヒドロゲルネットワーク内に残っている塩が原因であり得る。１２０ｍＭのＭｎＣｌ２で架橋したサンプルは膨潤能力がより低く、すなわちヒドロゲルへの塩の流入が少ないため、最終重量は影響を受けなかった。
【００５５】
一実施形態では、最初の試験管内研究は、４０ｍＭのＭｎＣｌ２で架橋されたＧＧ−ＭＡヒドロゲルを使用して行われた。そのために、ｈＡＳＣ含有ＧＧ−ＭＡを、３７℃で１０分間、４０ｍＭのＭｎＣｌ２の溶液で架橋した（Ｍｎ−ＧＧ−ＭＡ）。１００ｍＭのＣａＣｌ２で架橋された細胞含有ＧＧ−ＭＡヒドロゲルは、ＧＧ−ＭＡゲル化（Ｃａ−ＧＧ−ＭＡ）の黄金律と見なされているため、対照として使用された。次に、カプセル化された細胞を、５％ＣＯ２の空気中の加湿雰囲気下、３７℃で最大７日間の培養中に維持した。
【００５６】
一実施形態では、生／死染色を使用して、カプセル化プロセス後（ｔ＝０日）ならびに１日、３日および７日の培養期間を通して、細胞生存率を評価することが可能であった。図４のＡおよびＣに示すように、ヒドロゲルがＭｎＣｌ２で架橋された場合、細胞生存率は大幅に低下した。７日間の培養後、Ｃａ−ＧＧ−ＭＡヒドロゲルにカプセル化された生存細胞の９３％と比較して、Ｍｎ−ＧＧ−ＭＡヒドロゲルにカプセル化された細胞は５９％のみが生存可能だった。
【００５７】
一実施形態では、各時点で個々のヒドロゲルに存在するＤＮＡの量を読み取ることにより、細胞増殖を調査した。図４−Ｂに示すように、ＤＮＡ量は７日間の実験で大幅に変化することはなく、これは、細胞がＣａベースとＭｎベースの両方のヒドロゲル内で非増殖状態であることを示している。
【００５８】
ＤＡＰＩ（核、青）およびファロイジン（アクチン、赤）で染色されたサンプルからの共焦点画像によって示されるように、ｈＡＳＣはゲル内に入ると、円形形態を獲得した。図４−Ｄに示すように、円形形態は７日間の実験を通して維持されたが、３日後にいくつかの破片が認められたため、細胞質の分解が発生し得る。
【００５９】
本開示のマンガンベースのヒドロゲルは、試験されたすべての条件で正しく得られた。これらのヒドロゲルは、膨潤と分解の調査で示されているように、高い膨潤能力と非分解性の性質を有する。マンガンでＧＧ−ＭＡを架橋した後、細胞含有ヒドロゲルが正しく得られた。
【００６０】
一実施形態では、ＭｎＣｌ２で架橋されたＧＧ−ＭＡ／ＨＡ混合物は、ヒドロゲルを得るために、本発明のマンガンベースのＧＧ−ＭＡヒドロゲル、すなわち、異なる二価イオンで架橋された内製のメタクリル化ジェランガム（ＧＧ−ＭＡ）を使用して調製することができる。簡単に説明すると、ＧＧ−ＭＡ粉末は、完全に溶解した場合に１％ｗ／ｖの最終濃度となる一定の混合の下で蒸留水に溶解された。次に、ＭｎＣｌ２溶液を添加して、さまざまな濃度のＭｎ２＋（０、０．１、１ｍＭのＭｎ２＋）を含む０．７５％（ｗ／ｖ）ＧＧ−ＭＡヒドロゲルを得た。次に、これらの溶液を１％ヒアルロン酸ナトリウムと、７５：２５および５０：５０の比率で混合し、シリコン型に注いだ。最終的な形状は、人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）との接触後に得られた。
【００６１】
一実施形態では、ＭｎＣｌ２で架橋されたＧＧ−ＭＡ／ＨＡ混合物のヒドロゲルのレオロジー分析は、取得ソフトウェアｒＳｐａｃｅを使用して、Ｋｉｎｅｘｕｓ  Ｐｒｏ＋レオメータ（マルバーンインストゥルメンツ、英国）を使用して行われた。測定システムには、ステンレス鋼（３１６グレード）の平行プレート、すなわち直径８ｍｍの上部測定ジオメトリプレートと、粗面仕上の２０ｍｍ下部ペデスタル（サンプルのずれおよび実験で生じるエラーを防ぐため）と、が取り付けられていた。すべてのデータは３７℃で収集され、プロットは少なくとも３つの実験の平均である。
【００６２】
一実施形態では、様々なヒドロゲルの表面形態は、走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）によって特徴付けられた。そのために、ゲルを−８０℃で凍結し、凍結乾燥（ＬｙｏＡｌｆａ  １０／１５、テルスター）した。ＳＥＭによる可視化の前に、サンプルは相互導電性接着テープで固定され、スパッタコーター（ＥＭ  ＡＣＥ６００、ライカ、ドイツ）を使用して金の薄層でコーティングされた。最後に、１５ｋＶの加速電圧で動作するＦＥＩ  Ｎｏｖａ  ＮａｎｏＳＥＭ  ２００を使用してカプセルを可視化した。
【００６３】
ヒドロゲルの安定性は、ヒドロゲルをａＣＳＦ溶液および最終濃度２，６Ｕ（血漿濃度）のヒアルロニダーゼ溶液を有するａＣＳＦで培養することで調査した。準備後、ヒドロゲルの重量を測定し（初期重量、Ｗｉ）、酵素を含むまたは含まないａＣＳＦ（ｐＨ７．４）内で、３７℃で７日間振盪しながら培養した。各時点（１時間、３時間、１日、３日および７日）で、サンプルをａＣＳＦ溶液から取り出し、重量測定（湿重量、Ｗｗ）し、そして再び溶液中に置いた。次に、以下の数式１を使用してヒドロゲル分解（ＷＤ）を計算した。
【００６４】
【数３】
2021507946.tif 000004
【００６５】
３１Ｇの針からＧＧ−ＭＡ混合溶液を押し出せる可能性を、注入装置（Ｐａｒａｌａｂ）を使用して調査した。測定は、３１Ｇの針を組み合わせた１０μＬのハミルトンシリンジを用いて行った。シリンジに、ＧＧ−ＭＡ混合物と蒸留水とを満たした。次に、一定の速度を用いて、シリンジピストンに力を加えることにより、針を通して各溶液を注入した。３１Ｇの針を通して材料を注入するためにピストンに加えられた負荷は、適切なソフトウェアを使用して測定および記録された。
【００６６】
一実施形態では、様々なＧＧ−ＭＡ混合物ディスクの浸透性は、様々な分子量を有する蛍光標識分子を使用して評価された。異なる分子量（４、２０および７０ｋＤａ）のフルオレセインイソチオシアネート−デキストラン（Ｄｅｘｔｒａｎ−ＦＩＴＣ、Ｓｉｇｍａ）をＧＧ−ＭＡ溶液と混合し、前述のようにゲルを調製した。次に、各ゲルを、３７℃の振盪ウォーターバスを使用して、ａＣＳＦ中で７日間（１６８時間）培養した。様々な時点で、少量の上清を回収し、各サンプルに同量の新しいａＣＳＦを加えた。１６８時間で、ゲルを１ｍＬのａＣＳＦで機械的に破壊し、遠心分離した。得られた上清を使用して、カプセル内に残っているＦＩＴＣ標識分子の濃度を計算した。抽出した上清の蛍光発光を、マイクロプレートリーダー（Ｇｅｎ  ５  ２．０１、Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ、バイオテック）で、４８５／２０ｎｍの励起波長および５２８／２０ｎｍの発光波長で測定した。放出された蛍光標識分子の最終濃度は、定義された濃度の標準曲線を使用して得られた。
【００６７】
ヒト脂肪由来幹細胞（ｈＡＳＣｓ）は、男性から得られた膝蓋下脂肪体（ヒトホファ体（ＨＨＢ））から単離された。これはミーニョ大学の倫理委員会によって承認されたものである。すべてのサンプルは、外科的処置後２４時間以内に処理された。未分化細胞を培養し、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、参照番号１０２７０１０６、ＥＵ承認済）と、１０，０００Ｕ．ｍＬ−１のペニシリンＧナトリウム、１０，０００ｍｇ  ｍＬ−１のストレプトマイシン硫酸塩およびＦｕｎｇｉｚｏｎｅＶＲ（ファンギゾンＶＲ）としての２５ｍｇ．ｍＬ−１のアムホテリシンＢとともに０．８５％生理食塩水（ライフテクノロジーズ、カールスバッド、カリフォルニア）中に調製した１％抗生物質−抗真菌液と、を添加した、最小必須培地（ａｌｐｈａ−ＭＥＭ、シグマ、米国）を第１継代まで使用して、基本条件下で増殖させた。細胞は第２継代で使用された。
【００６８】
一実施形態では、サブコンフルエント培養物（９０％コンフルエント）を、フェノールレッド（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）と共にＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（１ｘ）を使用して培養フラスコから分離し、続いて１２００ｒｐｍで５分間遠心分離（５８１０Ｒ、エッペンドルフ、ハンブルク、ドイツ）した。次に、上清を捨て、ペレットをＭｎ架橋ＧＧ−ＭＡおよびＨＡのさまざまな混合物と混合して、最終的な細胞密度を１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとした。ｈＡＳＣ含有ヒドロゲルは、１００μＬの細胞含有ゲル溶液を２４ウェルプレートに分注し、続いて５０μＬの細胞培地を加えることで調製した。ゲル化後、各ウェルに１ｍＬの細胞培地を満たし、プレートを３７℃で、空気中の５％ＣＯ２の加湿雰囲気下に置いた。すべての条件は三重に行われた（ｎ＝３）。
【００６９】
一実施形態では、製造業者の指示に従って、わずかな変更を加えたＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（Ｒ）アッセイ（バイオ・ラッドラボラトリーズ）を使用して細胞生存率を評価した。簡潔に言うと、２４時間の培養後、細胞培地を交換し、２０％（ｖ／ｖ）ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（アラマーブルー）を補充した新しい培地を添加した。次に、プレートを３７℃の暗所、５％ＣＯ２の空気中の加湿雰囲気で４時間培養した。その後、マイクロプレートリーダー（Ｇｅｎ  ５  ２．０１、Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ、バイオテック）で、励起波長５２８／２０ｎｍおよび発光波長５９０／２０ｎｍで蛍光を測定した。
【００７０】
一実施形態では、ヒト脂肪由来幹細胞（ｈＡＳＣ）は、女性から得られたヒト脂肪吸引物から単離された。これは、倫理委員会によって承認された。すべてのサンプルは、外科的処置後２４時間以内に処理された。未分化細胞を、ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（登録商標）（ロンザ）を補充したＭＳＣＧＭ（登録商標）ヒト間葉系幹細胞増殖培地を使用して基本条件下で培養および増殖させ、２〜４継代で使用した。
【００７１】
一実施形態では、本開示のマンガンベースのｈＡＳＣ含有ＧＧＭＡヒドロゲルは、サブコンフルエント培養物（９０％コンフルエント）を使用して調製することができる。ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（１ｘ）とフェノールレッド（ライフテクノロジーズ、カールスバッド、カリフォルニア）とを使用して細胞を培養フラスコから分離し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した（５８１０Ｒ、エッペンドルフ、ハンブルグ、ドイツ）。次に、上清を廃棄し、ペレットを０．７５％（ｗ／ｖ）ＧＧＭＡ溶液（０．１ｍＭのＭｎＣｌ２を含むもの、または含まないもの）と混合した。３１Ｇまたは１８Ｇの針を使用して、細胞を含むＧＧ−ＭＡ溶液をａＣＳＦに押し出し、ｈＡＳＣ含有ヒドロゲルを調製した。次に、ａＣＳＦを新しい培地に交換し、ファイバーを３７℃、空気中の５％ＣＯ２の加湿雰囲気で培養した。すべての条件は三重（ｎ＝３）に行われた。
【００７２】
別の実施形態では、生死蛍光アッセイは、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）生存能力／細胞毒性キットを使用して、哺乳動物細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））について、培養の１日後および７日後に行われた。簡潔に言うと、各時点で、培地を除去し、０．５μＬ．ｍｌ−１のカルセイン−ＡＭと２μＬ．ｍｌ−１のエチジウムホモダイマー−１とを含む２００μＬのＰＢＳを各ウェルに加えた。次に、サンプルを室温で遮光して３０分間培養した後、蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｉｍａｇｅ  ＲＺ１Ｍ、ツァイス、ドイツ）で暗所で可視化した。カルセイン−ＡＭを伴う場合、蛍光フィルター（４９４ｎｍの蛍光励起と５１７ｎｍの発光）を通して、生細胞は明るい緑色に見えた。エチジウムホモダイマー−１を伴う場合、ローダミンフィルター（５３５ｎｍの蛍光励起および６１７ｎｍの発光）を介して、死細胞は明るい赤に見えた。
【００７３】
一実施形態では、調製後、０．１Ｈｚの単一周波数を使用して、経時的なそれらのレオロジー特性に関してヒドロゲル混合物が特徴付けられ、０．０１％のせん断ひずみが継続振動実験で正しく使用されるように定義された。図５に示すように、最低濃度（０．１ｍＭ）のＭｎ２＋を使用してまたは使用せずに調製したヒドロゲルは、１ｍＭのＭｎ２＋を使用して調製したものと比較して、Ｇ’（材料剛性）がかなり低くなっている。これは、Ｍｎ２＋二価カチオンとして、ＧＧ−ＭＡ分子と相互作用し、らせんコイル構造への架橋プロセスをトリガーする、Ｍｎ２＋イオンとＧＧ−ＭＡネットワークとの間の相互作用を確認するものである。驚くべきことに、７５：２５の比率のＧＧ−ＭＡ／ＨＡが使用された場合、結果として得られるヒドロゲルはより強いものであった。少量のＨＡを追加することで、ＧＧ−ＭＡネットワーク内への浸透が可能になり、Ｍｎ２＋イオンとの架橋が可能になる。しかし、ＨＡの質量比率が５０％まで増加すると、存在するカチオンによって架橋されないより多くの量のＨＡが存在するため、形成されるネットワークは弱くなる。別の興味深い観察は、Ｇ’がテストされたすべての条件で時間とともに増加するという事実に拠っている。これは、架橋を強化するヒドロゲルマトリックスを介したイオンの拡散が原因である可能性がある。
【００７４】
一実施形態では、ａＣＳＦ中での培養後のレオロジー特性も調査した（図６）。そのために、すべてのヒドロゲルを３７℃で２４時間、ａＣＳＦ中で培養した。予想通り、この溶液に浸すとＧ’係数が増加した。ＧＧ−ＭＡマトリックスをさらに架橋するさまざまなカチオンが存在するためである。このポリマーはＧＧ−ＭＡのようにイオン架橋されていないため、ネットワークにＨＡを追加すると、得られるヒドロゲルの剛性が低下すると結論付けることもできた。
【００７５】
一実施形態では、ゲルの形態は、走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）を使用して評価された。図７に示すように、表面形態は配合物に大きく依存する。ＧＧ−ＭＡのみのヒドロゲルは蜂の巣状の構造を有するが、ＨＡが混合物に追加されると、ヒドロゲルは、ＧＧ−ＭＡの結果であるより多孔性の領域と混合されたＨＡから生じる、ネットワークのような構造を示す。ただし、高濃度のＭｎ２＋の場合、一部のＧＧ−ＭＡネットワークがすでに形成されており、ＨＡの浸透が不可であるため、ＨＡの閉じ込めが不十分なために生じ得る多孔質構造が優勢である。
【００７６】
一実施形態では、ヒドロゲルの安定性は、ａＣＳＦ溶液およびヒアルロニダーゼ（２．６Ｕ、血漿濃度）を有するａＣＳＦ中での７日間の培養に沿ったヒドロゲルの重量変化を測定することによって評価された。
【００７７】
一実施形態では、ゲルをシリコン型においてａＣＳＦ中で調製し、次に、３７℃で７日間振盪しながらウォーターバス中のａＣＳＦまたはａＣＳＦ／ヒアルロニダーゼ溶液中に保持して、分解速度を評価した。各時点（１、３、２４、７２、および１６８時間）で、サンプルをａＣＳＦ溶液から取り出し、重量を測定して再び溶液中に置いた。図８に示すように、７日間の培養後、Ｍｎ２＋の含有量やヒアルロニダーゼの存在とは無関係に、ＨＡなしのヒドロゲルが初期質量の８０％に減少したことを確認できた。７５：２５の配合では、すべての条件で初期質量の約６０％への減少が観察された。５０：５０の配合では、０および０．１ｍＭのＭｎ２＋で質量が４０％減少し、１ｍＭのＭｎ２＋で２０％へ減少したことが観察された。試験したすべての条件で、ヒアルロニダーゼの存在はゲルの分解速度に大きな影響を与えなかった。したがって、ＨＡで調製されたゲルのより高い分解プロファイル（７５：２５および５０：５０）は、ＨＡの酵素分解の結果ではなく、溶液へのこのポリマーの放出の結果であると推測できる。ＨＡが架橋されておらず、ＧＧ−ＭＡ鎖内に閉じ込められているためである。その結果、ＧＧ−ＭＡおよびＨＡの含有量が５０：５０であるヒドロゲルが速く分解した。このプロセスは、ヒドロゲルの質量５０：５０の条件が、ａＣＳＦ溶液での７日間の培養後に最低質量に達した理由を説明している。酵素がＨＡを分解するよりも速く、ヒアルロン酸ナトリウムがヒドロゲルから洗い流されたため、７５：２５配合物に対するヒアルロニダーゼの有意な影響は観察されなかった。
【００７８】
一実施形態では、ヒドロゲルの注入性は、３１Ｇの針と連結されたハミルトンシリンジを用いた、ａＣＳＦへの材料の押し出しによって調査された。ヒドロゲルのすべての配合物は注射可能であり、ゲル溶液を注入するのに必要な力は、水を注入するのに必要な力と同様だが、４つの条件では、材料を溶液に注入するのに使用される最大力が大きく異なった（図９）。この実験の間、針の凝固は観察されなかった。さらに、各実験でヒドロゲルを注入するために使用される最大力は、すべての配合物で類似していた。驚くべきことに、ＧＧ−ＭＡ  ０ｍＭ  Ｍｎ２＋では０．８Ｎに達し、他の条件で得られた値と比較して高い値であった。
【００７９】
一実施形態では、浸透性は、ゲル溶液と混合された、４ｋＤａ、２０ｋＤａおよび７０ｋＤａの３つのサイズを有するＦＩＴＣ標識デキストラン分子を使用して調査された。ａＣＳＦを添加してゲルを調製し、規定のディスクを作成し、３７℃で振盪しながら最大７日間培養した。各時点で、上清のサンプルを取り出し、同量の新しいａＣＳＦを加えた。
【００８０】
一実施形態では、図１０に示すように、同じＧＧ−ＭＡ／ＨＡ比を有するが異なるＭｎ２＋濃度を有するヒドロゲルが同様の放出傾向を示したので、Ｍｎ２＋濃度は放出プロファイルに影響を及ぼさない。唯一の例外は条件７５：２５で、この条件においてＭｎ２＋はヒドロゲルからのデキストランの放出を減少させるようである。ただし、ポリマー間の比率を変更すると、強い傾向が見られる。驚くべきことに、Ｍｎ２＋で架橋された７５：２５の比率のヒドロゲルはすべての荷を放出せず、７０％近くで安定水準に達した。１００：０および５０：５０の比率では、すべてのデキストランが放出されたが、プロファイルが異なる。ＧＧ−ＭＡのみで調製されたヒドロゲルはすべてのＭｎ２＋濃度で速い放出があったが、Ｍｎ２＋イオンが存在する場合、５０：５０混合物は遅い放出プロファイルを示した。すべてのヒドロゲルは、テストされたすべての分子、つまり４ｋＤａのサイズの小さな分子および最大７０ｋＤａの大きな分子に対して浸透性であり、これは、細胞が成長因子の送達剤として使用されることを意図している場合に、最も重要である。
【００８１】
一実施形態では、生体適合性調査は、すべてのヒドロゲル配合物、ヒト脂肪幹細胞（ｈＡＳＣ）に対して行われた。そのために、細胞をゲル溶液と微細に混合し、１ｘ１０６ｃｅｌｌ／ｍＬの濃度を構成した。次に、１００μＬの細胞含有ゲル溶液を２４ウェルプレートに分注し、続いてさらに架橋するために５０μＬの細胞培地を加えた。細胞生存率は、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（Ｒ）アッセイを使用して代謝活性を定量化することにより測定された。
【００８２】
一実施形態では、マンガンベースのヒドロゲルの混合物が、試験されたすべての条件および比率について正しく得られた。得られたヒドロゲル溶液は、小さい分子および大きい分子について速い放出特性を有するため、ａＣＳＦに簡単に注入でき、治療分子の送達剤として使用できる。細胞生存率アッセイは、濃度０．１ｍＭのＭｎＣｌ２を使用して調製されたゲルは、細胞のカプセル化時に細胞にとって低い有害性を表すことが示された。
【００８３】
別の実施形態では、試験管内ファントムの準備および臨床３Ｔスキャナー（ＭａｇｎｅｔｏｍＴｒｉｏ３Ｔ、シーメンス）でのイメージングを行った。図１９に示すように、Ｍｎベースのヒドロゲル混合物を、各チューブに１ｍＬの容量の溶液が入った１．５ｍＬエッペンドルフチューブに配置し、Ｔ１強調シーケンスを使用してイメージングした。Ｔ１強調ターボスピンエコーシーケンスは、イメージングマトリクス＝３８４ｘ３８４、フリップ角度＝１５０、エコー時間＝９．３、繰り返し時間＝６５０、スライス厚１ｍｍのパラメータで使用された。
【００８４】
一実施形態では、異なる含有量のＭｎ２＋を有するＧＧ−ＭＡベースのヒドロゲルは、イオン溶液への材料の単純な押し出しによってファイバーとして調製することができる。例として、ＨＡとＭｎＣｌ２とを異なる比率で含むＧＧ−ＭＡベースのヒドロゲルを調製し、２１Ｇの針と組み合わせた１ｍＬのプラスチック製シリンジから、人体に存在する脳脊髄液を試験管内で模倣するイオン溶液である、ａＣＳＦに押し出した。図１２に示すように、針の被覆なしでゲルが上手く押し出され、押し出し後も安定したファイバーが形成される。ファイバーは様々な針を使用して形成できるため、その直径は針の内径に大きく依存する。
【００８５】
別の実施形態では、３１Ｇの針（内径１３３±１９．０μｍ）で形成されたファイバーは、平均直径６３３．５８±３３．８０μｍのファイバーを生じる。これらのファイバーは、ヒト脂肪由来幹細胞（ｈＡＳＣ）を最大７日間カプセル化するために使用された。図１３に示すように、７日間の培養後、ファイバー内に細胞が見つかった。ファイバーの外側に存在する、紡錘状の形状を持つ細胞とは対照的に、カプセル化された細胞は、カプセル化された細胞に典型的な円形形態を示した。
【００８６】
別の実施形態では、細胞生存率は、様々なヒドロゲル配合物へのカプセル化後にも評価された。図２０に示すように、細胞はすべての試験条件で最大７日間培養可能であった。また、試験管内で細胞生存率を損なうことなく、様々な直径の細胞含有ファイバーを押し出すことが可能であった。様々な動物の解剖学を考慮して、２つの異なるアプローチが使用された。３１Ｇ針を備えた小さなハミルトンシリンジを使用して、マウスモデル脊髄への送達を模倣した。一方、１８Ｇ針と組み合わせた大きなシリンジは、豚や犬などの大きな動物モデルへの送達をシミュレートするのに好適であった。
【００８７】
一実施形態では、微粒子は、Ｍｎ含有浴溶液への重力滴下によって形成することができる。例として、異なるＧ／Ｍ比（ＬＶＧ、ＭＶＧ、ＶＬＶＧ、ＬＶＭ、ＭＶＭ、ＶＬＶＭ）のアルギン酸塩を使用して、粒子を生成できる。そのため、それらをＮａＣｌ（０．９％）に溶解して、最終濃度１％（ｗ／ｖ）のアルギン酸塩を得た。次に、０．９％のＮａＣｌ中にアルギン酸カルシウム（ＣａＭ＞７５）を１％（ｗ／ｖ）で、２０ｎＭのマンガン（ＭｎＣｌ２）と混合して、沈殿溶液として使用した。最後に、異なるアルギン酸塩の各溶液１ｍＬを２７Ｇの針が付いたシリンジに入れ、沈殿溶液に滴下して押し出して、異なるＭｎＣｌ２微粒子を得た。製造後、各微粒子バッチはエッペンドルフに移され、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）およびエネルギー分散分光法（ＥＤＳ）でさらに分析するために、凍結乾燥の準備のために−８０℃で凍結された。図１に示すように、使用したすべてのタイプのアルギン酸塩について、微粒子が正しく生成された。ＥＤＳ分析により、微粒子の表面にＭｎ２＋イオンが存在することが確認され、ＭＥＭＲＩベースのアプローチへの応用への道が開かれた。
【００８８】
一実施形態では、試験管内ファントムの準備および臨床３Ｔスキャナーでのイメージング（Ｍａｇｎｅｔｏｍ  Ｔｒｉｏ  ３Ｔ、シーメンス）を行った。マンガン（ＭｎＣｌ２）は、０．０００１〜８０ｍＭの範囲の濃度で水に溶解した。マンガンの段階希釈液を１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに配置し、各チューブに１ｍＬの溶液を入れ、Ｔ１強調シーケンスを使用してイメージングした。Ｔ１強調ターボスピンエコーシーケンスは、イメージングマトリクス＝３８４ｘ３８４、フリップ角度＝１５０、エコー時間＝９．３、繰り返し時間＝６５０、スライス厚１ｍｍのパラメータで使用された。
【００８９】
一実施形態では、信号強度測定を伴うＭＲＩ分析は、０．００１ｍＭの濃度でＭｎ２＋濃度への明確な依存性（図１５）を明らかにし、それを下回る信号は水のレベルであった。より高い濃度では、０．１ｍＭの濃度でピークに達する、信号の明確な増大があった。濃度をさらに上げると、信号強度が低下した。これらの実験に基づいて、後続のイメージング研究に最適な０．１ｍＭのＭｎ２＋濃度を確立した。
【００９０】
一実施形態では、試験管内でアルギン酸塩ヒドロゲル中のＭｎＣｌ２の安定性が分析された。低粘度のマンヌロン酸ベースのアルギン酸塩（ＬＶＭ）とＣａＭ（＞７５μｍ）の粒子を０．９％ＮａＣｌで希釈して、１％の配合物を得た。０．１ｍＭ濃度のＭｎ２＋を得るために、ＭｎＣｌ２溶液（ＮａＣｌ）をＬＶＭに添加した。次に、ＬＶＭ／ＭｎＣｌ２溶液をＣａＭ溶液粒子と架橋して、ヒドロゲルを得た。ゲル化の２分後、半浸透性インサート（面積０．４７ｃｍ２、孔径０．４μｍ）にヒドロゲルを装填し、１日間、２日間および３日間、揺動体で洗浄するためにインサートを人工脳脊髄液に浸した。相対的な信号分析のために、ヒドロゲルをＭａｇｎｅｔｏｍ  Ｔｒｉｏ  ３Ｔスキャナーでスキャンした。これにより、時間とともに信号強度が徐々に低下することがわかった（図１６）。
【００９１】
一実施形態では、Ｍｎ２＋ベースのヒドロゲルの髄腔内移植のために、平均体重４５ｋｇの４匹の幼若大ヨークシャー種ブタを使用した。すべての動物処置は、地域の倫理委員会によって承認された。イソフルラン麻酔を施したブタを血管造影テーブルに置き、ＭＲＩ対応カテーテルを腰椎穿刺を介して髄腔内に導入した。カテーテルはＣアームＸ線誘導装置のもとで脊髄の胸椎部に進められた。その後、カテーテルを所定の位置に固定した後、処置注射手順のために動物をＭＲＩ室に移した。
【００９２】
一実施形態では、ベースラインＭＲＩスキャンのセットを取得した後、Ｍｎ２＋標識ヒドロゲルを注射用に準備した。低粘度のマンヌロン酸ベースのアルギン酸塩（ＬＶＭ）およびＣａＭ（＞７５μｍ）粒子を０．９％ＮａＣｌで希釈して、１％の配合物を得た。ＭｎＣｌ２溶液（ＮａＣｌ）をＬＶＭに添加して、０．１ｍＭ濃度のＭｎ２＋を得た。次に、ＬＶＭ／ＭｎＣｌ２溶液をＣａＭ溶液粒子で架橋して、ヒドロゲルを得た。架橋から２分後、ヒドロゲルをカテーテルを介して髄腔内にゆっくりと注入し、リアルタイムＴ１ＭＲＩを継続した。処置のリアルタイムイメージングでは、Ｔ１フラッシュシーケンスを、イメージングマトリクス＝１９２ｘ１９２、フリップ角度＝５７、エコー時間＝２．２７ｍｓ、繰り返し時間＝２３ｍｓ、スライス厚３ｍｍ、時間分解能＝４秒のパラメータで使用した。
【００９３】
一実施形態では、ヒドロゲル注入中の動的イメージングは、注入されたＭｎ２＋標識ヒドロゲルに対応する高強度領域を明らかにした。高強度は最初にカテーテルの先端で見られ、注入手順全体を通じて吻側および尾側に拡大した。試験を行ったブタにおいては、ヒドロゲル配合物で覆われた領域は１０〜１５ｃｍの範囲であった（図１７）。注射の２４時間後のフォローアップスキャンでは、炎症反応やＣＳＦ循環の閉塞の形跡は表れなかった。その時には、マンガンの強化は検出されなかった。
【００９４】
この文書で使用される「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む、備える）」という用語は、述べられた特徴、整数、ステップ、構成要素の存在を示すことを意図しているが、１つ以上の他の特徴、整数、ステップ、構成要素またはそれらの組み合わせの存在または追加を排除することを意図していない。
【００９５】
要素または特徴の単数形が特許請求の範囲の明細書で使用されている場合、特に除外されていない場合、複数形も含まれ、その逆も同様である。例えば、「ａ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（多糖類）」または「ｔｈｅ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（多糖類）」という用語は、複数形である「ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ（多糖類）」または「ｔｈｅ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ（多糖類）」も含み、その逆も同様である。請求項において、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの冠詞は、反対の指示がない限り、または文脈から明白でない限り、１つまたは複数を意味し得る。集合の１つ以上の要素の間に「ｏｒ（または）」を含む請求項または説明は、集合要素の１つ、複数、またはすべてが、特定の製品またはプロセスに存在する、使われている、または関連している場合、反対の指示がない限り、または文脈から明白でない限り、満たされていると見なされる。本発明は、集合の正に１つの要素が、所与の製品またはプロセスに存在するか、使用されるか、さもなければ関連する、実施形態を含む。本発明はまた、集合の要素の２つ以上、またはすべてが、所与の製品またはプロセスに存在するか、使用されるか、さもなければ関連する、実施形態を含む。
【００９６】
さらに、本発明は、別のクレームに導入された１つ以上の請求項または説明の関連部分からの、１つ以上の制限、要素、節、記述用語などが含まれるすべての変形、組み合わせ、および置換を包含することを理解されたい。たとえば、別の請求項に依存している請求項は、同じ基本請求項に依存している他の請求項で見つかった１つ以上の制限を含めるように変更できる。
【００９７】
さらに、請求項が組成物を記載する場合、特に指示されない限り、または矛盾または齟齬が生じることが当業者に明らかでない限り、本明細書に開示される目的のいずれかのために組成物を使用する方法が含まれ、本明細書に開示される製造方法または当技術分野で既知の他の方法のいずれかに従って組成物を製造する方法が含まれることを理解されたい。
【００９８】
範囲が指定されている場合、端点が含まれる。さらに、別段の指示がない限り、または当業者の文脈および／または理解から明白でない限り、範囲として表される値は、文脈から明らかにそうではない場合を除き、本発明の異なる実施形態で述べられた範囲内の特定の値、範囲の下限の単位の１０分の１までを想定できることを理解されたい。また、別段の指示がない限り、または文脈および／または当業者の理解から明白でない限り、範囲として表される値は、所与の範囲内の任意の部分範囲を想定することができ、部分範囲の端点は、範囲の下限の単位の１０分の１と同じ精度で表現されることもまた、理解されたい。
【００９９】
本開示は、記載された実施形態に限定されるように見られるべきではなく、当業者は、その修正に対する多くの可能性を予測するであろう。
【０１００】
上述の実施形態は組み合わせることができる。
【０１０１】
以下の特許請求の範囲は、本開示の特定の実施形態をさらに説明する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０１０２】
【非特許文献１】Ｊ．Ｓｉｌｖａ−Ｃｏｒｒｅｉａ，Ｊ．Ｍ．Ｏｌｉｖｅｉｒａ，Ｓ．Ｇ．Ｃａｒｉｄａｄｅ，Ｊ．Ｔ．Ｏｌｉｖｅｉｒａ，Ｒ．Ａ．Ｓｏｕｓａ，Ｊ．Ｆ．Ｍａｎｏ，ｅｔ  ａｌ．，  ’’Ｇｅｌｌａｎ  ｇｕｍ−ｂａｓｅｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ  ｔｉｓｓｕｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．，  ’’  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖｏｌ．５，ｐｐ．ｅ９７−１０７，２０１１．
【非特許文献２】Ｓ．Ｖｉｅｉｒａ，Ｓ．Ｖｉａｌ，Ｆ．Ｒ．Ｍａｉａ，Ｍ．Ｃａｒｖａｌｈｏ，Ｒ．Ｌ．Ｒｅｉｓ，Ｐ．Ｌ．Ｇｒａｎｊａ，ｅｔ  ａｌ．，  ’’Ｇｅｌｌａｎ  ｇｕｍ−ｃｏａｔｅｄ  ｇｏｌｄ  ｎａｎｏｒｏｄｓ：  ａｎ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｂｏｎｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，’’  ＲＳＣ  Ａｄｖ．，ｖｏｌ．５，ｐｐ．７７９９６−７８００５，２０１５．
【非特許文献３】Ｒ．Ｌｏｚａｎｏ，Ｌ．Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｋ．Ｊ．Ｇｉｌｍｏｒｅ，Ｒ．Ｇｏｒｋｉｎ，Ｅ．Ｍ．Ｓｔｅｗａｒｔ，ｅｔ  ａｌ．，  ’’３Ｄ  ｐｒｉｎｔｉｎｇ  ｏｆ  ｌａｙｅｒｅｄ  ｂｒａｉｎ−ｌｉｋｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｇｅｌｌａｎ  ｇｕｍ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ，’’  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，ｖｏｌ．６７，ｐｐ．２６４−２７３，２０１５．
【非特許文献４】Ｌ．Ｒ．Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｋ．Ｊ．Ｇｉｌｍｏｒｅ，Ｇ．Ｇ．Ｗａｌｌａｃｅ，ａｎｄ  Ｍ．Ｉｎ  Ｈｅｔ  Ｐａｎｈｕｉｓ，  ’’Ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｇｅｌｌａｎ  ｇｕｍ，’’  Ｂｉｏｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ，ｖｏｌ．４，ｐｐ．１２７６−９０，Ａｕｇ  １６  ２０１６．
【非特許文献５】Ｙ．  Ａ．  Ｍｏｒｃｈ，  Ｉ．  Ｓａｎｄｖｉｇ，  Ｏ．  Ｏｌｓｅｎ，  Ｉ．  Ｄｏｎａｔｉ，  Ｍ．  Ｔｈｕｅｎ，  Ｇ．  Ｓｋｊａｋ−Ｂｒａｅｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  ’’Ｍｎ−ａｌｇｉｎａｔｅ  ｇｅｌｓ  ａｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｍｎ２＋  ｉｎ  ｍａｎｇａｎｅｓｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＭＲＩ，’’  Ｃｏｎｔｒａｓｔ  Ｍｅｄｉａ  Ｍｏｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ，  ｖｏｌ．  ７，  ｐｐ．  ２６５−７５，  Ｍａｒ−Ａｐｒ  ２０１２．
【非特許文献６】Ｓ．Ｐｉｎａ，Ｊ．Ｍ．Ｏｌｉｖｅｉｒａ，ａｎｄ  Ｒ．Ｌ．Ｒｅｉｓ，  ’’Ｎａｔｕｒａｌ−Ｂａｓｅｄ  Ｎａｎｏｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｏｎｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：  Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ，’’  Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，ｖｏｌ．２７，ｎｏ．７，ｐｐ．１１４３−１１６９，Ｆｅｂ．２０１５．
【非特許文献７】Ｓ．Ｖｉｅｉｒａ，Ａ．ｄａ  Ｓｉｌｖａ  Ｍｏｒａｉｓ，Ｊ．Ｓｉｌｖａ−Ｃｏｒｒｅｉａ，Ｊ．Ｍ．Ｏｌｉｖｅｉｒａ，ａｎｄ  Ｒ．Ｌ．Ｒｅｉｓ，  ’’Ｎａｔｕｒａｌ−Ｂａｓｅｄ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ：  Ｆｒｏｍ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｔｏ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，’’  ｉｎ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｎｏ．Ｍ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ，ＵＳＡ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２０１７，ｐｐ．１−２７．
【非特許文献８】Ｓ．Ｃ．Ｙ．Ｌｉｎ，Ｙ．Ｗａｎｇ，Ｄ．Ｆ．Ｗｅｒｔｈｅｉｍ，ａｎｄ  Ａ．Ｇ．Ａ．Ｃｏｏｍｂｅｓ，  ’’Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ，  ｃｅｌｌ−ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｎｇ  ａｌｇｉｎａｔｅ  ｆｉｂｒｅｓ  ｆｏｒ  ｎｅｒｖｅ  ｒｅｐａｉｒ，’’  Ｍａｔｅｒ．  Ｓｃｉ．  Ｅｎｇ．  Ｃ，ｖｏｌ．７３，ｐｐ．６５３−６６４，２０１７．
【非特許文献９】Ｅ．ＫＯＨ，Ｙ．Ｃ．ＪＵＮＧ，Ｈ．−Ｍ．ＷＯＯ，ａｎｄＢ．−Ｊ．ＫＡＮＧ，  ’’Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  ａｌｇｉｎａｔｅ−ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｃａｎｉｎｅ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｖｉａｂｌｅ  ｃｅｌｌ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ，’’  Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．７９，ｎｏ．３，ｐｐ．４９２−５０１，２０１７．
【非特許文献１０】Ｈ．Ｄａｅｍｉ  ａｎｄ  Ｍ．Ｂａｒｉｋａｎｉ，  ’’Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｕｍ  ａｌｇｉｎａｔｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ，  ｓｏｄｉｕｍ  ｈｏｍｏｐｏｌｙｍａｎｎｕｒｏｎａｔｅ  ｓａｌｔ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ，’’  Ｓｃｉ．Ｉｒａｎ．，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．６，ｐｐ．２０２３−２０２８，２０１２．
【非特許文献１１】Ｑ．Ｗａｎｇ，Ｓ．Ｌｉｕ，Ｆ．Ｙａｎｇ，Ｌ．Ｇａｎ，Ｘ．Ｙａｎｇ，ａｎｄ  Ｙ．Ｙａｎｇ，  ’’Ｍａｇｎｅｔｉｃ  ａｌｇｉｎａｔｅ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ＭＲＩ  ｆａｂｒｉｃａｔｅｄ  ｕｓｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ａｎｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｏｆ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｄｕａｌ  ｄｒｕｇｓ，’’  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖｏｌ．１２，ｐｐ．４３３５−４３４７，２０１７．
【非特許文献１２】Ｙ’．Ａ．Ｍｏ／ｒｃｈ，Ｉ．Ｓａｎｄｖｉｇ，Ｏ／．Ｏｌｓｅｎ，Ｉ．Ｄｏｎａｔｉ，Ｍ．Ｔｈｕｅｎ，Ｇ．Ｓｋｊａ＆ｋ−Ｂｒａｅ＆ｋ，Ｏ．Ｈａｒａｌｄｓｅｔｈ，ａｎｄ  Ｃ．Ｂｒｅｋｋｅｎ，  ’’Ｍｎ−ａｌｇｉｎａｔｅ  ｇｅｌｓ  ａｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｍｎ  ２＋  ｉｎ  ｍａｎｇａｎｅｓｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＭＲＩ，’’  Ｃｏｎｔｒａｓｔ  Ｍｅｄｉａ  Ｍｏｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ，ｖｏｌ．７，ｎｏ．２，ｐｐ．２６５−２７５，２０１２．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−Ａ】
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【図１４−Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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