(57)【要約】【課題】増強されたヒト膵臓トロピズムを有する新規な組換えアデノ随伴ウイルスキャプシドの提供。【解決手段】  本発明は、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、ヒト膵臓組織またはヒト膵島において増加した形質導入および／またはトロピズムを示す、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドに関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドポリペプチドであって、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、ヒト膵臓組織またはヒト膵島において増加した形質導入またはトロピズムを示す、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド。
【請求項２】
前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、分離されたヒト膵島またはインタクトなヒト膵島のいずれかに形質導入される、請求項１に記載の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド。
【請求項３】
前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、増加した形質導入を示す、請求項１に記載の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド。
【請求項４】
前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、増加したトロピズムを示す、請求項１に記載の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド。
【請求項５】
前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、ヒト膵島内の１種以上の細胞において増加した形質導入またはトロピズムをさらに示す、請求項１〜４のいずれかに記載の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド。
【請求項６】
前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、インビボでヒト膵臓組織またはヒト膵島の増加した形質導入を示す、請求項１〜５のいずれかに記載の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド。
【請求項７】
前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、インビトロでヒト膵臓組織またはヒト膵島の増加した形質導入を示す、請求項１〜６のいずれかに記載の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド。
【請求項８】
前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、エクスビボでヒト膵臓組織またはヒト膵島の増加した形質導入を示す、請求項１〜７のいずれかに記載の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド。
【請求項９】
前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、増強された中和プロファイルを示す、請求項１〜８のいずれかに記載の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド。
【請求項１０】
前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、プールされたヒト免疫グロブリンに対する増強された中和プロファイルを示す、請求項１〜９のいずれかに記載の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド。
【請求項１１】
増強された中和プロファイルを示す前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、ＡＡＶ−１０Ａ１（配列番号１）およびＡＡＶ−１０Ａ３（配列番号２）からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれかに記載の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド。
【請求項１２】
増強された中和プロファイルを示す前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、ＡＡＶ−１０Ａ１（配列番号１）である、請求項１〜１１のいずれかに記載の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド。
【請求項１３】
増強された中和プロファイルを示す前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、ＡＡＶ−１０Ａ３（配列番号３）である、請求項１〜１２のいずれかに記載の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド。
【請求項１４】
前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、機能的ＡＡＶキャプシドの一部であり、前記機能的ＡＡＶキャプシドが、非コードＲＮＡ、タンパク質コード配列、発現カセット、多重発現カセット、相同組換えのための配列、ゲノム遺伝子標的化カセット、および治療用発現カセットからなる群から選択される核酸配列をパッケージングしている、請求項１〜１３のいずれかに記載の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド。
【請求項１５】
前記核酸配列が、ＡＡＶベクター内に含まれる、請求項１４に記載の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド。
【請求項１６】
前記発現カセットが、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ発現系である、請求項１４に記載の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド。
【請求項１７】
前記治療用発現カセットが、治療用タンパク質または抗体をコードする、請求項１４に記載の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド。
【請求項１８】
前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド配列が、ＡＡＶ−１０Ａ１（配列番号１）、ＡＡＶ−１０Ａ３（配列番号２）、ＡＡＶ−１０Ａ４（配列番号３）、ＡＡＶ−１０Ａ５（配列番号４）、ＡＡＶ−１８Ａ１（配列番号５）、ＡＡＶ−１０Ｂ１（配列番号６）、ＡＡＶ−１０Ｂ３（配列番号７）、ＡＡＶ−１０Ｂ５（配列番号８）、ＡＡＶ−１０Ｂ６（配列番号９）、ＡＡＶ−１０Ｂ７（配列番号１０）、ＡＡＶ−１８Ｂ２（配列番号１２）、およびＡＡＶ−１８Ｂ３（配列番号１３）からなる群から選択される、請求項１〜１７のいずれかに記載の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド。
【請求項１９】
前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド配列が、ＡＡＶ−１０Ａ１（配列番号１）、ＡＡＶ−１０Ａ３（配列番号２）、およびＡＡＶ−１８Ａ１（配列番号５）からなる群から選択される、請求項１〜１８のいずれかに記載の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド。
【請求項２０】
治療用処置レジメンまたはワクチンにおける、請求項１〜１９のいずれかに記載の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドの使用方法。
【請求項２１】
内分泌障害の治療的処置における、請求項１〜２０のいずれかに記載の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドの使用方法。
【請求項２２】
Ｉ型またはＩＩ型を含む糖尿病の処置における、請求項１〜２１のいずれかに記載の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドの使用方法。
【請求項２３】
対象に投与される核酸の総量を減少させるように、請求項１〜２２のいずれかに記載の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドを使用する方法であって、前記方法は、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドを使用して前記核酸が形質導入されるときに、同様の治療効果を得るために、非変異親キャプシドポリペプチドを使用して前記核酸が形質導入されるときに前記対象に投与される核酸の量と比較して、より少ない総核酸量を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２４】
変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドをコードする核酸配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、ヒト膵臓組織またはヒト膵島において増加した形質導入またはトロピズムを示す、ＡＡＶベクター。
【請求項２５】
前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、増加した形質導入を示す、請求項２４に記載のＡＡＶベクター。
【請求項２６】
前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、増加したトロピズムを示す、請求項２５に記載のＡＡＶベクター。
【請求項２７】
前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、インビボでヒト膵臓組織またはヒト膵島の増加した形質導入を示す、請求項２４〜２６のいずれかに記載のＡＡＶベクター。
【請求項２８】
前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、インビトロでヒト膵臓組織またはヒト膵島の増加した形質導入を示す、請求項２４〜２６のいずれかに記載のＡＡＶベクター。
【請求項２９】
前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、エクスビボでヒト膵臓組織またはヒト膵島の増加した形質導入を示す、請求項２４〜２７のいずれかに記載のＡＡＶベクター。
【請求項３０】
前記ベクターが、非コードＲＮＡ、コード配列、発現カセット、多重発現カセット、相同組換えのための配列、ゲノム遺伝子標的化カセット、および治療用発現カセットからなる群から選択される核酸配列をさらに含む、請求項２４〜２８のいずれかに記載のＡＡＶベクター。
【請求項３１】
前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと同様の核酸発現を可能にする、請求項３０に記載のＡＡＶベクター。
【請求項３２】
前記発現カセットが、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ発現系である、請求項３０に記載のＡＡＶベクター。
【請求項３３】
前記治療用発現カセットが、治療用タンパク質または抗体をコードする、請求項３０に記載のＡＡＶベクター。
【請求項３４】
前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド配列が、ＡＡＶ−１０Ａ１（配列番号１）、ＡＡＶ−１０Ａ３（配列番号２）、ＡＡＶ−１０Ａ４（配列番号３）、ＡＡＶ−１０Ａ５（配列番号４）、ＡＡＶ−１８Ａ１（配列番号５）、ＡＡＶ−１０Ｂ１（配列番号６）、ＡＡＶ−１０Ｂ３（配列番号７）、ＡＡＶ−１０Ｂ５（配列番号８）、ＡＡＶ−１０Ｂ６（配列番号９）、ＡＡＶ−１０Ｂ７（配列番号１０）、ＡＡＶ−１８Ｂ２（配列番号１２）、およびＡＡＶ−１８Ｂ３（配列番号１３）からなる群から選択される、請求項２４〜３３のいずれかに記載のＡＡＶベクター。
【請求項３５】
前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド配列が、ＡＡＶ−１０Ａ１（配列番号１）、ＡＡＶ−１０Ａ３（配列番号２）、およびＡＡＶ−１８Ａ１（配列番号５）からなる群から選択される、請求項２４〜３４のいずれかに記載のＡＡＶベクター。
【請求項３６】
治療用処置レジメンまたはワクチンにおける、請求項２４〜３５のいずれかに記載のＡＡＶベクターの使用方法。
【請求項３７】
内分泌障害の治療用処置における、請求項２４〜３５のいずれかに記載のＡＡＶベクターの使用方法。
【請求項３８】
Ｉ型またはＩＩ型を含む糖尿病の治療用処置における、請求項２４〜３５のいずれかに記載のＡＡＶベクターの使用方法。
【請求項３９】
対象に投与される総ＡＡＶベクターの量を減少させるように、請求項１〜３８のいずれかに記載の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドを使用する方法であって、前記方法は、前記ＡＡＶベクターが変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドによって形質導入されるときに、同様の治療効果を得るために、前記ＡＡＶベクターが非変異親キャプシドポリペプチドによって形質導入されるときに、前記対象に投与されるＡＡＶベクターの量と比較して、より少ない総ＡＡＶベクター量を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項４０】
変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドを生成するための方法であって、前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、ヒト膵臓組織またはヒト膵島において増加した形質導入またはトロピズムを示し、前記方法は、
ａ）変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド遺伝子のライブラリーを生成することであって、前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド遺伝子が、２つ以上の非変異親キャプシドポリペプチド由来の配列を含む複数の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド遺伝子を含むことと、
ｂ）前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド遺伝子ライブラリーをＡＡＶベクターにクローニングすることによってＡＡＶベクターライブラリーを生成することであって、前記ＡＡＶベクターが、複製能を有するＡＡＶベクターであることと、
ｃ）非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、ヒト膵臓組織またはヒト膵島において増加した形質導入またはトロピズムについて、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドをコードするｂ）の前記ＡＡＶベクターライブラリーをスクリーニングすることと、
ｄ）ｃ）の前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドを選択することと、を含む、方法。
【請求項４１】
前記方法が、ｅ）ｄ）の前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドの配列を決定することをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、増加した形質導入を示す、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、増加したトロピズムを示す、請求項４０〜４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、増強された中和プロファイルをさらに示す、請求項４０〜４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、プールされたヒト免疫グロブリンに対する増強された中和プロファイルをさらに示す、請求項４０〜４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
増強された中和プロファイルをさらに示す前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、ＡＡＶ−１０Ａ１（配列番号１）およびＡＡＶ−１０Ａ３（配列番号２）からなる群から選択される、請求項４０〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
増強された中和プロファイルをさらに示す前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、ＡＡＶ−１０Ａ１（配列番号１）である、請求項４０〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
増強された中和プロファイルをさらに示す前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、ＡＡＶ−１０Ａ３（配列番号２）である、請求項４０〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、インビボでヒト膵臓組織またはヒト膵島の増加した形質導入を示す、請求項４０〜４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、インビトロでヒト膵臓組織またはヒト膵島の増加した形質導入を示す、請求項４０〜４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、エクスビボでヒト膵臓組織またはヒト膵島の増加した形質導入を示す、請求項４０〜５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドをコードする核酸配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、ヒト肝臓組織またはヒト肝細胞において増加した形質導入またはトロピズムを示す、ＡＡＶベクター。
【請求項５３】
前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、増加した形質導入を示す、請求項５２に記載のＡＡＶベクター。
【請求項５４】
前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、増加したトロピズムを示す、請求項５３に記載のＡＡＶベクター。
【請求項５５】
前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、インビボでヒト肝臓組織またはヒト肝細胞の増加した形質導入を示す、請求項５２〜５４のいずれかに記載のＡＡＶベクター。
【請求項５６】
前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、インビトロでヒト肝臓組織またはヒト肝細胞の増加した形質導入を示す、請求項５２〜５４のいずれかに記載のＡＡＶベクター。
【請求項５７】
前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、エクスビボでヒト肝臓組織またはヒト肝細胞の増加した形質導入を示す、請求項５２〜５５のいずれかに記載のＡＡＶベクター。
【請求項５８】
前記ベクターが、非コードＲＮＡ、コード配列、発現カセット、多重発現カセット、相同組換えのための配列、ゲノム遺伝子標的化カセット、および治療用発現カセットからなる群から選択される核酸配列をさらに含む、請求項５２〜５６のいずれかに記載のＡＡＶベクター。
【請求項５９】
前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと同様の核酸発現を可能にする、請求項５８に記載のＡＡＶベクター。
【請求項６０】
前記発現カセットが、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ発現系である、請求項５８に記載のＡＡＶベクター。
【請求項６１】
前記治療用発現カセットが、治療用タンパク質または抗体をコードする、請求項５８に記載のＡＡＶベクター。
【請求項６２】
前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド配列が、ＡＡＶ−１０Ａ１（配列番号１）、ＡＡＶ−１０Ａ３（配列番号２）、ＡＡＶ−１０Ａ４（配列番号３）、ＡＡＶ−１０Ａ５（配列番号４）、ＡＡＶ−１８Ａ１（配列番号５）、ＡＡＶ−１０Ｂ１（配列番号６）、ＡＡＶ−１０Ｂ３（配列番号７）、ＡＡＶ−１０Ｂ５（配列番号８）、ＡＡＶ−１０Ｂ６（配列番号９）、ＡＡＶ−１０Ｂ７（配列番号１０）、ＡＡＶ−１８Ｂ２（配列番号１２）、およびＡＡＶ−１８Ｂ３（配列番号１３）からなる群から選択される、請求項５２〜６１のいずれかに記載のＡＡＶベクター。
【請求項６３】
前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド配列が、ＡＡＶ−１０Ａ１（配列番号１）、ＡＡＶ−１０Ａ３（配列番号２）、およびＡＡＶ−１８Ａ１（配列番号５）からなる群から選択される、請求項５２〜６２のいずれかに記載のＡＡＶベクター。
【請求項６４】
治療用処置レジメンまたはワクチンにおける、請求項５２〜６３のいずれかに記載のＡＡＶベクターの使用方法。
【請求項６５】
内分泌障害の治療用処置における、請求項５２〜６３のいずれかに記載のＡＡＶベクターの使用方法。
【請求項６６】
Ｉ型またはＩＩ型を含む糖尿病の治療用処置における、請求項５２〜６３のいずれかに記載のＡＡＶベクターの使用方法。
【請求項６７】
対象に投与される総ＡＡＶベクターの量を減少させるように、請求項１〜６６のいずれかに記載の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドを使用する方法であって、前記方法は、前記ＡＡＶベクターが変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドによって形質導入されるときに、同様の治療効果を得るために、前記ＡＡＶベクターが非変異親キャプシドポリペプチドによって形質導入されるときに前記対象に投与されるＡＡＶベクターの量と比較して、より少ない総ＡＡＶベクター量を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項６８】
変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドを生成するための方法であって、前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、ヒト肝臓組織またはヒト肝細胞において増加した形質導入またはトロピズムを示し、前記方法は、
ａ）変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド遺伝子のライブラリーを生成することであって、前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド遺伝子は、２つ以上の非変異親キャプシドポリペプチド由来の配列を含む複数の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド遺伝子を含むことと、
ｂ）前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド遺伝子ライブラリーをＡＡＶベクターにクローニングすることによってＡＡＶベクターライブラリーを生成することであって、前記ＡＡＶベクターは、複製能を有するＡＡＶベクターであることと、
ｃ）非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、ヒト膵臓組織またはヒト膵島において増加した形質導入またはトロピズムについて、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドをコードするｂ）の前記ＡＡＶベクターライブラリーをスクリーニングすることと、
ｄ）ｃ）の前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドを選択することと、を含む、方法。
【請求項６９】
前記方法が、ｅ）ｄ）の前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドの配列を決定することをさらに含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、増加した形質導入を示す、請求項６８または６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、増加したトロピズムを示す、請求項６８〜７０のいずれかに記載の方法。
【請求項７２】
前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、増強された中和プロファイルをさらに示す、請求項６８〜７１のいずれかに記載の方法。
【請求項７３】
前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、プールされたヒト免疫グロブリンに対する増強された中和プロファイルをさらに示す、請求項６８〜７２のいずれかに記載の方法。
【請求項７４】
増強された中和プロファイルをさらに示す前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、ＡＡＶ−１０Ａ１（配列番号１）およびＡＡＶ−１０Ａ３（配列番号２）からなる群から選択される、請求項６８〜７３のいずれかに記載の方法。
【請求項７５】
増強された中和プロファイルをさらに示す前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、ＡＡＶ−１０Ａ１（配列番号１）である、請求項６８〜７３のいずれかに記載の方法。
【請求項７６】
増強された中和プロファイルをさらに示す前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、ＡＡＶ−１０Ａ３（配列番号２）である、請求項６８〜７３のいずれかに記載の方法。
【請求項７７】
前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、インビボでヒト肝臓組織またはヒト肝細胞の増加した形質導入を示す、請求項６８〜７６のいずれかに記載の方法。
【請求項７８】
前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、インビトロでヒト膵臓組織またはヒト膵島の増加した形質導入を示す、請求項６８〜７７のいずれかに記載の方法。
【請求項７９】
前記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、エクスビボでヒト膵臓組織またはヒト膵島の増加した形質導入を示す、請求項６８〜７８のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年３月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／６５１，０１０号および２０１８年１０月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／７４５，２２６号の優先権を主張し、これらの両方は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府の支援による研究または開発の下で行われた発明に対する権利に関する声明
本発明は、助成番号Ｕ０１ＤＫ０８９５６９の下で米国政府の支援を受けてなされた。米国政府は、本発明の一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、ヒト膵臓組織またはヒト膵島において増加した形質導入および／またはトロピズムを示す、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００４】
望ましい遺伝子の不在もしくは欠陥（機能の喪失）または望ましくない遺伝子もしくは欠陥遺伝子の発現（機能の獲得）によって引き起こされる遺伝的障害は、様々な疾患を引き起こす。現在、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、インビボで遺伝子を送達するための最良の安全性（複製欠損、低い組み込み率、および最小の免疫応答）ならびに有効性プロファイルを有するため、治療用途のための選択される遺伝子移入ベクターとして認識されている。ＡＡＶベクターは、小さな無エンベロープ（ｎｏｎ−ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ）かつ非病原性のヘルパーウイルス依存性ｓｓＤＮＡウイルスであり、様々な組織トロピズムおよび形質導入効率を有する様々な血清型を有する。これまでに単離されたＡＡＶ血清型のうち、ＡＡＶ２およびＡＡＶ８は、重度の血友病Ｂに罹患したヒトの肝臓を標的化するために使用されている。両方のベクターは有効に働き、ＡＡＶ８の場合、治療導入遺伝子の長期発現が文書化された。ヒトの最近のデータは、ＡＡＶベクターで肝臓を標的化することにより、治療レベルでのＦＩＸ導入遺伝子の長期発現が達成されることが実証された。さらに、ＡＡＶ血清型１、２および／またはキメラ２．５を使用したいくつかの第１相および第２相臨床試験が、嚢胞性線維症、血友病、カナバン病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、およびα１アンチトリプシン欠乏症の治療について報告されている（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７）。
【０００５】
パルボウイルスファミリーのメンバーであるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、４．７キロ塩基（ｋｂ）の一本鎖直鎖ＤＮＡゲノムを有する、小さな無エンベロープの二十面体ウイルスである。ＡＡＶは、該ウイルスが精製アデノウイルス株中の汚染物質として発見されたため、Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ属に割り当てられている（非特許文献８）。ＡＡＶは天然で複製欠陥性であるため、ＡＡＶは、その野生型状態では、複製に必要なタンパク質因子を提供するために、ヘルパーウイルス（典型的にはアデノウイルス）に依存する。ＡＡＶの４．７ｋｂゲノムは、複製に重要なヘアピン形状に折り畳まる２つの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接する。ＡＡＶは、天然で複製欠陥性であり、ヒト体内のほぼ全ての細胞種に形質導入することができ、遺伝子治療における治療的使用またはワクチン送達のための理想的なベクターである。野生型状態において、ＡＡＶのライフサイクルは、感染後にＡＡＶゲノムが宿主染色体に部位特異的に組み込まれる潜伏期、およびアデノウイルスまたは単純ヘルペスウイルスのいずれかの感染後、組み込まれたゲノムがその後にレスキューされ、複製され、感染ウイルスにパッケージングされる感染期を含む。ベクター化される（ｖｅｃｔｏｒｉｚｅｄ）際、ＡＡＶのウイルスＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子は除去されて、ウイルス産生中にトランスで提供され、これにより、ＩＴＲが、残存する唯一のウイルスＤＮＡとなる（非特許文献９）。次いで、ＲｅｐおよびＣａｐを可能な移入ベクター構成のアレイに置き換え、遺伝子付加または遺伝子標的化を行う。これらのベクター化組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、分裂細胞および非分裂細胞の両方に形質導入され、膵臓組織のような静止組織において強固な安定した発現を示す。様々な遺伝性または後天性疾患を処置することが完了したかまたは進行中であるｒＡＡＶ遺伝子治療臨床試験の数は、ｒＡＡＶベースの治療の人気が増すにつれて劇的に増加している。同様に、臨床ワクチンの場では、ヒト／サル免疫不全ウイルス（ＨＩＶ／ＳＩＶ）、インフルエンザウイルス、ヘニパウイルス、およびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に対する受動ワクチン手法における抗体発現カセットを送達するためのベクターとしてｒＡＡＶを使用した多くの最近の臨床前研究および１つの継続的な臨床試験が存在している。（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献２１；および非特許文献２２を参照のこと）。非病原性非分裂細胞を含む広範な宿主範囲の感染性、および潜在的な部位特異的染色体組み込みの特性は、ＡＡＶを遺伝子移入の魅力的なツールとする。
【０００６】
西側世界で初めて承認されたｒＡＡＶベースの遺伝子治療（２０１２年に欧州連合で使用することが承認された、リポタンパク質リパーゼ欠損症のためＧｌｙｂｅｒａ（登録商標））は、ｒＡＡＶ治療が世界的に臨床講義に移行する真の可能性へと遺伝子治療団体、投資家、および規制機関を刺激している。しかしながら、様々な組織および細胞種に形質導入するｒＡＡＶの印象的な能力にもかかわらず、その複雑性、導入遺伝子パッケージングサイズの制限、および一般集団における既存の中和抗体の高い普及率など、いくつかの欠点により、臨床用途に対する使用が制限される。遺伝子治療目的のために、形質導入は、効率的かつ高度に細胞種特異的の両方である必要がある。膵臓組織は、送達された導入遺伝子産物の治療レベルの発現を提供するのに十分に高いレベルで形質導入することが、歴史的に最もチャレンジングな組織の１つである。
【０００７】
特にＨＩＶおよびインフルエンザウイルスなどの病原性ウイルスに対する受動免疫保護を提供するワクチンの送達のためのベクターとしてのｒＡＡＶの使用の可能性を取り巻く最近の興奮は、ヒトにおけるこの特有のワクチン接種手法のための高効率な膵臓送達を可能にするｒＡＡＶキャプシドの緊急性を新たにした。既存のｒＡＡＶ血清型での効率的なヒト膵臓形質導入の制限を考慮して、ワクチン戦略のための治療レベルの広域（ｂｒｏａｄ−ｓｐｅｃｔｒｕｍ）抗体または膵臓障害処置に不可欠な遺伝子を発現するのに十分なレベルでヒト膵臓組織またはヒト膵島に効率的に形質導入することができる、臨床ｒＡＡＶベクター候補の生体工学が追求されている。
【０００８】
特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４および特許文献５を含む、様々な公開されている米国特許出願は、ＡＡＶベクターおよびビリオンを記載し、これらの全ては参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０００９】
しかしながら、単一の腹腔内注入においてどの程度のＡＡＶを送達することができるかに対する物理的制限があり、これは、注入されたベクターが疾患の膵臓組織または膵島細胞を特異的かつ効率的に標的化することを確実にするための注入が必要であるという事実によってさらに複雑化するため、膵臓遺伝子治療試験には高レベルの形質導入が必要である。ＡＡＶが優れたヒト膵臓導入を有する場合、治療的適合性を達成するために、より低い用量およびより少ない注入しか必要とされないであろう。同様に、ワクチン送達ツールとしての使用のために、ＡＡＶ内にコードされる抗体の強固な分泌を達成して血液中の循環抗体の治療レベルに到達するためには、高効率な形質導入および安定性が必要である。
【００１０】
したがって、ヒト膵臓組織形質導入が改善されたＡＡＶベクターに対する当該技術分野における必要性が残っている。本発明は、ヒト膵臓組織および／または膵島細胞への形質導入に関して、非変異親キャプシドポリペプチドよりも著しく改善されたヒト膵臓組織形質導入を示す変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドを提供することによって、この必要性を満たす。本発明は、ＤＮＡ遺伝子シャフリングおよびリプログラミング戦略による指向性進化（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）を利用して、ヒト膵島細胞について最良の親細胞（すなわち、ＬＫ０３（主にα細胞特異的である））よりも高い形質導入効率および高い細胞種特異的（例えば、α細胞またはβ細胞特異的）形質導入を有する変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドを特徴付けし、スクリーニングする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１５／０１７６０２７号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１５／００２３９２４号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１４／０３４８７９４号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２０１４／０２４２０３１号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２０１２／０１６４１０６号明細書
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｍ．Ｈｉｌｄｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ａ．Ａｕｒｉｃｃｈｉｏ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ，１２，２６３−２７１（２００４）
【非特許文献２】Ｃ．Ｌｉ，Ｄ．Ｅ．Ｂｏｗｌｅｓ，Ｔ．Ｖ．Ｄｙｋｅ  ａｎｄ  Ｒ．Ｊ．Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１２（１２）：９１３−９２６（２００５）
【非特許文献３】Ｄ．Ｅ．Ｂｏｗｌｅｓ，Ｓ．ＷＪ  ＭｃＰｈｅｅ，Ｃ．Ｌｉ，Ｓ．Ｊ．Ｇｒａｙ，Ｊ．Ｊ．Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ａ．Ｓ．Ｃａｍｐ，Ｊ．Ｌｉ，Ｂ．Ｗａｎｇ，Ｐ．Ｅ．Ｍｏｎａｈａｎ，Ｊ．Ｅ．Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｊ．Ｃ．Ｇｒｉｅｇｅｒ，Ｌａ．Ｇｏｖｉｎｄａｓａｍｙ，Ｍ．Ａｇｂａｎｄｊｅ−ＭｃＫｅｎｎａ，Ｘ．Ｘｉａｏ  ａｎｄ  Ｒ．Ｊ．Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２０，４４３−４５５（２０１２）
【非特許文献４】Ｍ．Ｌ．Ｂｒａｎｔｌｙ，Ｊ．Ｄ．Ｃｈｕｌａｙ，Ｌ．Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｍ．Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ，Ｌ．Ｔ．Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｆ．Ｒｏｕｈａｎｉ，Ｔ．Ｊ．Ｃｏｎｌｏｎ，Ｒ．Ｃａｌｃｅｄｏ，Ｍ．Ｒ．Ｂｅｔｔｓ，Ｃ．Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｂ．Ｊ．Ｂｙｒｎｅ，Ｊ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｔ．Ｒ．Ｆｌｏｔｔｅ，Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｅｓｐｉｔｅ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ａ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｒＡＡＶ１−ＡＡＴ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０６，１６３６３−１６３６８（２００９）
【非特許文献５】Ｔ．Ｒ．Ｆｌｏｔｔｅ，Ｍ．Ｌ．Ｂｒａｎｔｌｙ，Ｌ．Ｔ．Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｂ．Ｊ．Ｂｙｒｎｅ，Ｃ．Ｔ．Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．Ｊ．Ｂａｋｅｒ，Ｍ．Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ，Ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ａｌｐｈａ  １−ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ（ｒＡＡＶ２−ＣＢ−ｈＡＡＴ）ｇｅｎｅ  ｖｅｃｔｏｒ  ｔｏ  ＡＡＴ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ａｄｕｌｔｓ．Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  １５，９３−１２８（２００４）
【非特許文献６】Ｔ．Ｒ．Ｆｌｏｔｔｅ，Ｂ．Ｃ．Ｔｒａｐｎｅｌｌ，Ｍ．Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ，Ｂ．Ｃａｒｅｙ，Ｒ．Ｃａｌｃｅｄｏ，Ｆ．Ｒｏｕｈａｎｉ，Ｍ．Ｃａｍｐｂｅｌｌ−Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ａ．Ｔ．Ｙａｃｈｎｉｓ，Ｒ．Ａ．Ｓａｎｄｈａｕｓ，Ｎ．Ｇ．ＭｃＥｌｖａｎｅｙ，Ｃ．Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｌ．Ｍ．Ｍｅｓｓｉｎａ，Ｊ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｍ．Ｂｒａｎｔｌｙ，Ｄ．Ｒ．Ｋｎｏｐ，Ｇ．Ｊ．Ｙｅ，Ｊ．Ｄ．Ｃｈｕｌａｙ，Ｐｈａｓｅ  ２  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａｌｐｈａ１−ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ：ｉｎｔｅｒｉｍ  ｒｅｓｕｌｔｓ．Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ２２，１２３９−１２４７（２０１１）
【非特許文献７】Ｃ．Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｊ．Ｄ．Ｃｈｕｌａｙ，Ｂ．Ｃ．Ｔｒａｐｎｅｌｌ，Ｍ．Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ，Ｂ．Ｃａｒｅｙ，Ｒ．Ａ．Ｓａｎｄｈａｕｓ，Ｎ．Ｇ．ＭｃＥｌｖａｎｅｙ，Ｌ．Ｍｅｓｓｉｎａ，Ｑ．Ｔａｎｇ，Ｆ．Ｎ．Ｒｏｕｈａｎｉ，Ｍ．Ｃａｍｐｂｅｌｌ−Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ａ．Ｄ．Ｆｕ，Ａ．Ｙａｃｈｎｉｓ，Ｄ．Ｒ．Ｋｎｏｐ，Ｇ．Ｊ．Ｙｅ，Ｍ．Ｂｒａｎｔｌｙ，Ｒ．Ｃａｌｃｅｄｏ，Ｓ．Ｓｏｍａｎａｔｈａｎ，Ｌ．Ｐ．Ｒｉｃｈｍａｎ，Ｒ．Ｈ．Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ，Ｍ．Ａ．Ｈｕｌｍｅ，Ｔ．Ｍ．Ｂｒｕｓｋｏ，Ｊ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｔ．Ｒ．Ｆｌｏｔｔｅ，Ｈｕｍａｎ  Ｔｒｅｇ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｌｌｏｗ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １２３，５３１０−５３１８（２０１３）
【非特許文献８】Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ，Ｆｉｅｌｄ’ｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｅｄ．Ｓｉｘｔｈ，２０１３
【非特許文献９】Ａ．Ｖａｓｉｌｅｖａ，Ｒ．Ｊｅｓｓｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３，８３７−８４７（２００５）
【非特許文献１０】Ｐ．Ｒ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｂ．Ｃ．Ｓｃｈｎｅｐｐ，Ｊ．Ｚｈａｎｇ，Ｍ．Ｊ．Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｓ．Ｍ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｅ．Ｙｕｓｔｅ，Ｒ．Ｃ．Ｄｅｓｒｏｓｉｅｒｓ，Ｋ．Ｒ．Ｃｌａｒｋ，Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １５，９０１−９０６（２００９）
【非特許文献１１】Ａ．Ｂ．Ｂａｌａｚｓ，Ｊ．Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ｍ．Ｈｏｎｇ，Ｄ．Ｓ．Ｒａｏ，Ｌ．Ｙａｎｇ，Ｄ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｎａｔｕｒｅ  ４８１，８１−８４（２０１２）
【非特許文献１２】Ａ．Ｂ．Ｂａｌａｚｓ，Ｙ．Ｏｕｙａｎｇ，Ｃ．Ｍ．Ｈｏｎｇ，Ｊ．Ｃｈｅｎ，Ｓ．Ｍ．Ｎｇｕｙｅｎ，Ｄ．Ｓ．Ｒａｏ，Ｄ．Ｓ．Ａｎ，Ｄ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０，２９６−３００（２０１４）
【非特許文献１３】Ａ．Ｂ．Ｂａｌａｚｓ，Ｊ．Ｄ．Ｂｌｏｏｍ，Ｃ．Ｍ．Ｈｏｎｇ，Ｄ．Ｓ．Ｒａｏ，Ｄ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１，６４７−６５２（２０１３）
【非特許文献１４】Ｍ．Ｐ．Ｌｉｍｂｅｒｉｓ，Ｖ．Ｓ．Ａｄａｍ，Ｇ．Ｗｏｎｇ，Ｊ．Ｇｒｅｎ，Ｄ．Ｋｏｂａｓａ，Ｔ．Ｍ．Ｒｏｓｓ，Ｇ．Ｐ．Ｋｏｂｉｎｇｅｒ，Ａ．Ｔｒｅｔｉａｋｏｖａ，Ｊ．Ｍ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５，１８７ｒａ１７２（２０１３）
【非特許文献１５】Ｍ．Ｐ．Ｌｉｍｂｅｒｉｓ，Ｔ．Ｒａｃｉｎｅ，Ｄ．Ｋｏｂａｓａ，Ｙ．Ｌｉ，Ｇ．Ｆ．Ｇａｏ，Ｇ．Ｋｏｂｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｖｅｃｔｏｒｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｒｏａｄｌｙ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＦＩ６  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ａｉｒｗａｙ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ｐａｒｔｉａｌ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ａ  ｎｅｗ  ａｖｉａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ，Ｈ７Ｎ９．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：ＣＶＩ  ２０，１８３６−１８３７（２０１３）
【非特許文献１６】Ｊ．Ｌｉｎ，Ｒ．Ｃａｌｃｅｄｏ，Ｌ．Ｈ．Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ，Ｐ．Ｂｅｌｌ，Ｓ．Ｓｏｍａｎａｔｈａｎ，Ｊ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８３，１２７３８−１２７５０（２００９）
【非特許文献１７】Ｉ．Ｓｉｐｏ，Ｍ．Ｋｎａｕｆ，Ｈ．Ｆｅｃｈｎｅｒ，Ｗ．Ｐｏｌｌｅｒ，Ｏ．Ｐｌａｎｚ，Ｒ．Ｋｕｒｔｈ，Ｓ．Ｎｏｒｌｅｙ，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２９，１６９０−１６９９（２０１１）
【非特許文献１８】Ａ．Ｐｌｏｑｕｉｎ，Ｊ．Ｓｚｅｃｓｉ，Ｃ．Ｍａｔｈｉｅｕ，Ｖ．Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ，Ｖ．Ｂａｒａｔｅａｕ，Ｋ．Ｃ．Ｏｎｇ，Ｋ．Ｔ．Ｗｏｎｇ，Ｆ．Ｌ．Ｃｏｓｓｅｔ，Ｂ．Ｈｏｒｖａｔ，Ａ．Ｓａｌｖｅｔｔｉ，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ２０７，４６９−４７８（２０１３）
【非特許文献１９】Ｄ．Ｋｕｃｋ，Ｔ．Ｌａｕ，Ｂ．Ｌｅｕｃｈｓ，Ａ．Ｋｅｒｎ，Ｍ．Ｍｕｌｌｅｒ，Ｌ．Ｇｉｓｓｍａｎｎ，Ｊ．Ａ．Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８０，２６２１−２６３０（２００６）
【非特許文献２０】Ｋ．Ｎｉｅｔｏ，Ａ．Ｋｅｒｎ，Ｂ．Ｌｅｕｃｈｓ，Ｌ．Ｇｉｓｓｍａｎｎ，Ｍ．Ｍｕｌｌｅｒ，Ｊ．Ａ．Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  １４，１１２５−１１３７（２００９）
【非特許文献２１】Ｋ．Ｎｉｅｔｏ，Ｃ．Ｓｔａｈｌ−Ｈｅｎｎｉｇ，Ｂ．Ｌｅｕｃｈｓ，Ｍ．Ｍｕｌｌｅｒ，Ｌ．Ｇｉｓｓｍａｎｎ，Ｊ．Ａ．Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ，Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ２３，７３３−７４１（２０１２）
【非特許文献２２】Ｌ．Ｚｈｏｕ，Ｔ．Ｚｈｕ，Ｘ．Ｙｅ，Ｌ．Ｙａｎｇ，Ｂ．Ｗａｎｇ，Ｘ．Ｌｉａｎｇ，Ｌ．Ｌｕ，Ｙ．Ｐ．Ｔｓａｏ，Ｓ．Ｌ．Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｌｉ，Ｘ．Ｘｉａｏ，Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ２１，１０９−１１９（２０１０）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、変異アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドポリペプチドを提供する。変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、ヒト膵臓組織またはヒト膵島において増加した形質導入またはトロピズムを示す。
【００１４】
いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、ヒト膵臓組織またはヒト膵島において増加した形質導入またはトロピズムを示す。
【００１５】
いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、分離したまたはインタクトなヒト膵島のいずれかに形質導入された。
【００１６】
いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、増加した形質導入を示す。
【００１７】
いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、増加したトロピズムを示す。
【００１８】
いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、ヒト膵島内の１種以上の細胞において増加した形質導入またはトロピズムをさらに示す。
【００１９】
いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、インビボでのヒト膵臓組織またはヒト膵島の増加した形質導入を示す。
【００２０】
いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、インビトロでのヒト膵臓組織またはヒト膵島の増加した形質導入を示す。
【００２１】
いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、エクスビボでのヒト膵臓組織またはヒト膵島の増加した形質導入を示す。
【００２２】
いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、増強された中和プロファイルを示す。
【００２３】
いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、プールされたヒト免疫グロブリンに対する増強された中和プロファイルを示す。
【００２４】
いくつかの実施形態では、増強された中和プロファイルを示す変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、ＡＡＶ−１０Ａ１（配列番号１）およびＡＡＶ−１０Ａ３（配列番号２）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、増強された中和プロファイルを示す変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、ＡＡＶ−１０Ａ１（配列番号１）である。いくつかの実施形態では、増強された中和プロファイルを示す変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、ＡＡＶ−１０Ａ３（配列番号２）である。
【００２５】
いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、機能的ＡＡＶキャプシドの一部であり、該機能的ＡＡＶキャプシドは、非コードＲＮＡ、タンパク質コード配列、発現カセット、多重発現（ｍｕｌｔｉ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）カセット、相同組換えのための配列、ゲノム遺伝子標的化カセット、および治療用発現カセットからなる群から選択される核酸配列をパッケージングする。
【００２６】
いくつかの実施形態では、核酸配列は、ＡＡＶベクター内に含まれる。
【００２７】
いくつかの実施形態では、発現カセットは、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ発現系である。
【００２８】
いくつかの実施形態では、治療用発現カセットは、治療用タンパク質または抗体をコードする。
【００２９】
いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、ＡＡＶ−１０Ａ１（配列番号１）、ＡＡＶ−１０Ａ３（配列番号２）、ＡＡＶ−１０Ａ４（配列番号３）、ＡＡＶ−１０Ａ５（配列番号４）、ＡＡＶ−１８Ａ１（配列番号５）、ＡＡＶ−１０Ｂ１（配列番号６）、ＡＡＶ−１０Ｂ３（配列番号７）、ＡＡＶ−１０Ｂ５（配列番号８）、ＡＡＶ−１０Ｂ６（配列番号９）、ＡＡＶ−１０Ｂ７（配列番号１０）、ＡＡＶ−１８Ｂ２（配列番号１２）、およびＡＡＶ−１８Ｂ３（配列番号１３）からなる群から選択される。
【００３０】
いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、ＡＡＶ−１０Ａ１（配列番号１）、ＡＡＶ−１０Ａ３（配列番号２）、およびＡＡＶ−１８Ａ１（配列番号５）からなる群から選択される。
【００３１】
本発明はまた、治療用処置レジメンまたはワクチンにおける本発明の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドの使用方法を提供する。
【００３２】
いくつかの実施形態では、方法は、内分泌障害の治療用処置における上記の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドの使用である。
【００３３】
いくつかの実施形態では、方法は、Ｉ型またはＩＩ型を含む糖尿病の治療用処置における上記の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドの使用である。
【００３４】
本発明はまた、対象に投与される核酸の総量を減少させるように、本発明の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドを使用する方法であって、該方法は、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドを使用して核酸が形質導入されるときに、同様の治療効果を得るために、非変異親キャプシドポリペプチドを使用して核酸が形質導入されるときに対象に投与される核酸の量と比較して、より少ない総核酸量を対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００３５】
本発明はまた、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドをコードする核酸配列を含むＡＡＶベクターであって、該変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、ヒト膵臓組織またはヒト膵島において増加した形質導入またはトロピズムを示す、ＡＡＶベクターを提供する。
【００３６】
いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、増加した形質導入を示す。
【００３７】
いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、増加したトロピズムを示す。
【００３８】
いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、インビボでのヒト膵臓組織またはヒト膵島の増加した形質導入を示す。
【００３９】
いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、インビトロでのヒト膵臓組織またはヒト膵島の増加した形質導入を示す。
【００４０】
いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、エクスビボでのヒト膵臓組織またはヒト膵島の増加した形質導入を示す。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、非コードＲＮＡ、コード配列、発現カセット、多重発現カセット、相同組換えのための配列、ゲノム遺伝子標的化カセット、および治療用発現カセットからなる群から選択される核酸配列をさらに含む。
【００４２】
いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドと同様の核酸発現を可能にする。
【００４３】
いくつかの実施形態では、発現カセットは、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ発現系である。
【００４４】
いくつかの実施形態では、治療用発現カセットは、治療用タンパク質または抗体をコードする。
【００４５】
いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド配列はＡＡＶ−１０Ａ１（配列番号１）、ＡＡＶ−１０Ａ３（配列番号２）、ＡＡＶ−１０Ａ４（配列番号３）、ＡＡＶ−１０Ａ５（配列番号４）、ＡＡＶ−１８Ａ１（配列番号５）、ＡＡＶ−１０Ｂ１（配列番号６）、ＡＡＶ−１０Ｂ３（配列番号７）、ＡＡＶ−１０Ｂ５（配列番号８）、ＡＡＶ−１０Ｂ６（配列番号９）、ＡＡＶ−１０Ｂ７（配列番号１０）、ＡＡＶ−１８Ｂ２（配列番号１２）、およびＡＡＶ−１８Ｂ３（配列番号１３）からなる群から選択される。
【００４６】
いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド配列は、ＡＡＶ−１０Ａ１（配列番号１）、ＡＡＶ−１０Ａ３（配列番号２）、およびＡＡＶ−１８Ａ１（配列番号５）からなる群から選択される。
【００４７】
本発明はまた、処置レジメンまたはワクチンにおける本発明のＡＡＶベクターの使用方法を提供する。
【００４８】
いくつかの実施形態では、方法は、内分泌障害の治療的処置における上記のＡＡＶベクターの使用である。
【００４９】
いくつかの実施形態では、方法は、Ｉ型またはＩＩ型を含む糖尿病の治療用処置における上記のＡＡＶベクターの使用である。
【００５０】
本発明はさらに、対象に投与されるＡＡＶベクター総量を減少するための、本発明の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドの使用方法であって、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドによってＡＡＶベクターが形質導入されるときに、同様の治療効果を得るために、非変異親キャプシドポリペプチドによってＡＡＶベクターが形質導入されるときに対象に投与されるＡＡＶベクターの量と比較して、より少ない総ＡＡＶベクター量を対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００５１】
いくつかの実施形態では、本発明は、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドを生成するための方法であって、該変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、ヒト膵臓組織またはヒト膵島において増加した形質導入またはトロピズムを示し、該方法は、
ａ）変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド遺伝子のライブラリーを生成することであって、上記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド遺伝子が、２つ以上の非変異親キャプシドポリペプチド由来の配列を含む複数の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド遺伝子を含むことと、
ｂ）上記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド遺伝子ライブラリーをＡＡＶベクターにクローニングすることによってＡＡＶベクターライブラリーを生成することであって、上記ＡＡＶベクターが、複製能を有するＡＡＶベクターであることと、
ｃ）非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、ヒト膵臓組織またはヒト膵島において増加した形質導入またはトロピズムについて、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドをコードするｂ）の上記ＡＡＶベクターライブラリーをスクリーニングすることと、
ｄ）ｃ）の上記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドを選択することと、を含む、方法を提供する。
【００５２】
いくつかの実施形態では、方法は、ｅ）ｄ）から上記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドの配列を決定することをさらに含む。
【００５３】
いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、増加した形質導入を示す。
【００５４】
いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、増加したトロピズムを示す。
【００５５】
いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、増強された中和プロファイルをさらに示す。いくつかの実施形態では、本発明の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、プールされたヒト免疫グロブリンに対する増強された中和プロファイルをさらに示す。
【００５６】
いくつかの実施形態では、増強された中和プロファイルをさらに示す変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、ＡＡＶ−１０Ａ１（配列番号１）およびＡＡＶ−１０Ａ３（配列番号２）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、増強された中和プロファイルをさらに示す変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、ＡＡＶ−１０Ａ１（配列番号１）である。いくつかの実施形態では、増強された中和プロファイルをさらに示す変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、ＡＡＶ−１０Ａ３（配列番号２）である。
【００５７】
いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、１つ以上の非筋肉ヒト組織において増加した形質導入またはトロピズムをさらに示す。
【００５８】
いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、インビボでのヒト膵臓組織またはヒト膵島の増加した形質導入を示す。
【００５９】
いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、インビトロでのヒト膵臓組織またはヒト膵島の増加した形質導入を示す。
【００６０】
いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、エクスビボでのヒト膵臓組織またはヒト膵島の増加した形質導入を示す。
【００６１】
本発明の他の目的、利点、および実施形態は、以下の詳細な説明から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】指向性分子進化のための図示。
【図２】シャフリングに使用される親キャプシドアミノ酸配列の系統関係。シャフリングに使用される親キャプシド配列間の系統発生学的距離。アミノ酸配列について多様性範囲を示す。
【図３】バーコード化キャプシドシャフリング（ｂａｒｃｏｄｅｄ  ｃａｐｓｉｄ  ｓｈｕｆｆｌｅｄ）ＡＡＶライブラリーの生成。ライブラリー生成ワークフロー：最初に、シャフリングキャプシド配列のクローニングのための骨格として使用する、ＡＡＶベクターバーコードライブラリーを生成した。
【図４】プラスミドおよびＡＡＶレベルでの、ランダムに選択された１０個の親ライブラリークローンにおけるキャプシドアミノ酸配列の交差分析。親の寄与は、以下の順序で示される（上から下へ）：ｐｏ２、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ３Ｂ、ＬＫ０３、ＡＡＶ８、ｒｈ１０、ＡＡＶ９ｈｕ１４、ＡＡＶ２、ＤＪ。
【図５】アミノ酸位置による、列挙される１０個の親ライブラリーにおける親の寄与。キャプシド配列をプラスミドライブラリー（上パネル）およびＡＡＶライブラリー（下パネル）から増幅し、ＰａｃＢｉｏハイスループット配列決定によって分析した。（Ａ）１０個の親と比較した、プラスミドレベルおよびＡＡＶレベルでのランダムな１０個の親ライブラリークローンのアミノ酸位置による保存分析。（Ｂ）キャプシド配列全体にわたる親の寄与を示す、プラスミドレベル（上）およびＡＡＶレベル（下）における１０個の親ライブラリーキャプシドのＰａｃＢｉｏハイスループット配列決定。
【図６】１８個の親ライブラリー（プラスミドレベル）。
【図７】１８個の親混合物の生産。
【図８】インタクトな膵島および分離された膵島でのシャフリングライブラリーならびに親バーコード化ＡＡＶ混合物の継代レジメン：スクリーニングＡ．ヒト膵島での親混合物およびシャフリングバーコード化ＡＡＶライブラリーの継代レジメン。
【図９】ＡＡＶライブラリーおよび１８個の親混合物の複製。
【図１０】１８個の親対照混合物の組成（左）および継代中の親キャプシドＡＡＶの濃縮（右）。最も濃縮された親ＡＡＶのみを右パネルに示す。（Ａ）ＮＧＳ  ＢＣ配列決定によって決定される１８個の親プールの組成。（Ｂ）インタクトな膵島および分離された膵島での１８個の親混合物の３回の連続した継代による親ＡＡＶの濃縮。
【図１１】１０個の親ライブラリー（左）および１８個の親ライブラリー（右）の継代中のシャフリングＡＡＶキャプシド変異体の濃縮。最も濃縮したＡＡＶ変異体のみが異なる色で示されており、その他は全てグレーである。さらなる分析のために選択された変異体を名称によって示す。インタクトな膵島および分離された膵島での両方のライブラリーの３回の選択ラウンドによるキャプシド配列の濃縮。各経過後、ＢＣ配列をＭｉＳｅｑを使用してＮＧＳによって分析した。色付け部分は、濃縮されたＡＡＶ集団を表す。最も改善された表現型を有する変異体が示される（ＫＰ１、ＫＰ２、ＫＰ３）。
【図１２】インタクトな膵島でのシャフリングライブラリーの継代レジメン：スクリーニングＢ。
【図１３】１０個の親ライブラリーの継代中のシャフリングＡＡＶキャプシド変異体の濃縮。最も濃縮したＡＡＶ変異体のみが異なる色で示されており、その他は全てグレーである。さらなる分析のために選択された変異体を名称によって示す。赤色の名称は、２つの独立したスクリーニングで濃縮された変異体を示す。
【図１４】１８個の親ライブラリー（上部パネル）、Ａｄ５なしの１０個の親ライブラリーのラウンド１（下部パネル）の継代中のシャフリングＡＡＶキャプシド変異体の濃縮。最も濃縮したＡＡＶ変異体のみが異なる色で示されており、その他は全てグレーである。さらなる分析のために選択された変異体を名称によって示す。赤色の名称は、２つの独立したスクリーニングで濃縮された変異体を示す。
【図１５】ＡＡＶベクターによる分離されたヒト膵島への形質導入。
【図１６】遺伝子治療のための組換えＡＡＶ。
【図１７】ＰａｃＢｉｏ配列決定により、良好なキャプシド−ＢＣ結合が明らかにされている。
【図１８】ＧＦＰを発現するｒＡＡＶの生成。濃縮ＡＡＶ種由来のキャプシド配列をＢＣ配列特異的リバースプライマーを使用して増幅し、トリプルプラスミドトランスフェクションにより、２９３Ｔ細胞中でｒＡＡＶを産生した。次いで、粗またはタカラキット精製ｒＡＡＶ調製物を使用して、ｑＰＣＲによるベクターコピー数について定量化し、膵島細胞に形質導入するために使用した。
【図１９】膵島細胞における形質導入効率。
【図２０】形質導入の繰り返し：上位の変異体のみ、ＭＯＩ  １Ｋ対１０Ｋ。
【図２１】最良のキャプシド変異体の組成（交差、アミノ酸）。ライブラリーの親は、親の侵入順に異なる色で示されている。大きな点は、１００％の親一致を表し（すなわち、問題の位置は、１つの親のみと一致する）、小さな点は、各位置での複数の親一致（すなわち、位置は、２つ以上の親と一致する）を表す。各キメラについての実線は、交差間の配列内で同定されたライブラリー親を表す。交差間の細い水平平行線のセットは、多数の親が等しい確率で一致することを示す。
【図２２】１０Ａ１および１８Ａ１は、ＬＫ０３より著しく良好にβ細胞に形質導入する。
【図２３】膵島のＧｒｏｍｐｅ形質導入。インタクトな膵島全体を氷上で１〜２時間（２％ＦＢＳ／ＣＭＲＬ）、ＭＯＩ＝１０Ｋで形質導入し、培養物に３日間懸濁した。ＦＡＣＳ：２Ｂ４／８Ｇ１２  ｍＡｂｓ。
【図２４】総膵島ＧＦＰ＋（ＨＩＣ１−２Ｂ４＋集団）の定量化。
【図２５】ＡＬＰＨＡ  ＧＦＰ＋（２Ｂ４＋８Ｇ１２＋）細胞の定量化。
【図２６】ＢＥＴＡ  ＧＦＰ＋（２Ｂ４＋８Ｇ１２−／ｌｏ）細胞の定量化。（ｌｏ＝低い発現）。
【図２７】他のＧＦＰ＋（２Ｂ４＋８Ｇ１２ｉｎｔ）細胞の定量化。（ｉｎｔ＝中程度の発現）。
【図２８】異なる群でのＧＦＰ発現細胞の定量化および蛍光強度の中央値。
【図２９】スクリーニングＡ由来のベクター化キャプシド変異体。
【図３０】ヒト膵島細胞での選択されたキャプシド変異体の形質導入効率。キット１Ｅ＋０５個の分離された膵島細胞を、１ＫのＭＯＩで、半精製または粗ｒＡＡＶで形質導入した。４８時間後、形質導入効率をＦＡＣＳによって評価した。
【図３１】ヒト膵島細胞上の選択されたキャプシド変異体の形質導入効率。１Ｅ＋０５個の分離された膵島細胞を、１Ｋおよび１０ＫのＭＯＩで半精製ｒＡＡＶで形質導入した。４８時間後、形質導入効率をＦＡＣＳによって評価した。最良の親ＬＫ０３を上回る形質導入の改善が示される。
【図３２】アミノ酸レベルでの最良キャプシド変異体の交差分析。
【図３３】１ＫのＭＯＩでの１Ｅ＋０５個の分離された膵島細胞への形質導入後のＧＦＰ発現細胞の定量化。
【図３４】ＬＫ０３と比較したキャプシド変異体性能。
【図３５】形質導入のためのキャプシド変異体のベクター化および試験。濃縮変異体の検証：（Ａ）濃縮ＡＡＶ変異体由来のキャプシド配列をＢＣ特異的プライマーを使用して増幅し、ＧＦＰ導入遺伝子を有するｓｃＡＡＶベクターをパッケージングするために使用した。（Ｂ）変異体の粗ウイルス調製物、および最良の親のうちの１つ（ＬＫ０３）を使用して、１，０００のＭＯＩで分離された膵島細胞に形質導入した。（Ｃ）ＣｓＣｌ精製ｒＡＡＶを最良の変異体用に調製し、２つの異なるＭＯＩを使用して、膵島細胞への形質導入を２重で（ｉｎ  ｄｕｐｌｉｃａｔｅｓ）分析した。濃縮変異体の検証：（Ａ）濃縮ＡＡＶ変異体由来のキャプシド配列をＢＣ特異的プライマーを使用して増幅し、ＧＦＰ導入遺伝子を有するｓｃＡＡＶベクターをパッケージングするために使用した。（Ｂ）変異体の粗ウイルス調製物、および最良の親のうちの１つ（ＬＫ０３）を使用して、１，０００のＭＯＩで分離された膵島細胞に形質導入した。（Ｃ）ＣｓＣｌ精製ｒＡＡＶを最良の変異体用に調製し、２つの異なるＭＯＩを使用して、膵島細胞への形質導入を２重で分析した。
【図３６】２つの異なるドナー由来のヒト膵島への形質導入（ＭＯＩ１０，０００）。ＡＡＶ  ＤＪ、ＡＡＶ  ＬＫ０３、および新規な変異体のうちの２つの膵島亜集団特異的形質導入効率。２つの異なるドナー（ＡおよびＢ）由来のインタクトな膵島を、１０，０００のＭＯＩで、ＧＦＰを発現するｒＡＡＶで形質導入した。２日後、膵島を単一細胞懸濁液中に分離し、表面マーカーの染色、続いて、ＦＡＣＳを使用して、α細胞またはβ細胞特異的形質導入について分析した。
【図３７】膵島形質導入および細胞内染色。
【図３８】最良のキャプシド変異体の組成（Ｘ−ｏｖｅｒ、アミノ酸）。ライブラリーの親は、親の侵入順に異なる色で示されている。大きな点は、１００％の親一致を表し（すなわち、問題の位置は、１つの親のみと一致する）、小さな点は、各位置での複数の親一致（すなわち、位置は、２つ以上の親と一致する）を表す。各キメラについての実線は、交差間の配列内で同定されたライブラリー親を表す。交差間の細い水平平行線のセットは、多数の親が等しい確率で一致することを示す。（Ａ）３つの最良の変異体のキャプシドアミノ酸配列の交差分析。ＤＪおよびＬＫ０３の配列は、示される親配列からなるキメラであるため、親配列として含まれない。（Ｂ）シャフリング変異体を、ＵＣＳＦキメラを使用して、ＡＡＶ２  ＶＰ３の結晶構造上に３Ｄ偽色マッピングした。色分けは、（Ａ）のように、色を使用したアミノ酸寄与を示す。
【図３９】様々なヒト細胞種および非ヒト細胞種への形質導入効率。
【図４０】膵島変異体は、筋肉細胞に対して、最良のＮＰ２２変異体よりも良好な性能を有する。
【図４１】精製ｒＡＡＶ調製物のウェスタンブロットの結果。
【図４２】新規なｒＡＡＶ変異体をＢａｌｂ／ＳＣＩＤマウスに注射し、各変異体の形質導入効率をインビボで試験した。
【図４３】インビボルシフェラーゼ画像化により、新規なＡＡＶ変異体のインビボ形質導入効率を研究した。
【図４４】新規なＡＡＶ変異体のインビボ形質導入効率の定量化（７日目および１４日目）。
【図４５】新規なＡＡＶ変異体のインビボ形質導入効率の結果（１週目および２週目）。
【図４６】新規なＡＡＶ変異体の中和プロファイル。プールされたヒト免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）による中和に対する新規なキャプシド変異体の感受性。２つの異なるバッチ由来の示された濃度のＩＶＩＧを、ｒＡＡＶの２．２Ｅ＋０７個のベクターコピーと共に、１００ｕｌの体積中、３７℃で１時間インキュベートし、続いて、１００のＭＯＩでの許容Ｈｕｈ７細胞への形質導入を２重で行った。形質導入の２４時間後に、細胞溶解物由来のルシフェラーゼ活性を決定した。プールされたヒト免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）による中和に対する新規なキャプシド変異体の感受性。２つの異なるバッチ由来の示された濃度のＩＶＩＧを、ｒＡＡＶの２．２Ｅ＋０７個のベクターコピーと共に、１００ｕｌの体積中、３７℃で１時間インキュベートし、続いて、１００のＭＯＩでの許容Ｈｕｈ７細胞への形質導入を２重で行った。形質導入の２４時間後に、細胞溶解物由来のルシフェラーゼ活性を決定した。
【図４７】新規なＡＡＶ変異体のインビボ肝臓形質導入効率（７日目、１４日目、２１日目、および３３日目）。新規なキャプシド変異体のインビボ形質導入効率。Ｂａｌｂ／Ｃ  ＳＣＩＤマウスに、様々なキャプシドがパッケージングされた２Ｅ＋１０ｖｇのＡＡＶルシフェラーゼベクターを注射し、Ａｍｉ画像化システムを使用して、肝臓におけるルシフェラーゼ活性を数週間にわたってモニタリングした。各群の平均値は、最小値および最大値で示される。新規なキャプシド変異体のインビボ形質導入効率。Ｂａｌｂ／Ｃ  ＳＣＩＤマウスに、様々なキャプシドがパッケージングされた２Ｅ＋１０ｖｇのＡＡＶルシフェラーゼベクターを注射し、Ａｍｉ画像化システムを使用して、肝臓におけるルシフェラーゼ活性を数週間にわたってモニタリングした。各群の平均値は、最小および最大で示される。
【図４８】様々な臓器におけるルシフェラーゼ発現（エクスビボ、５週目）。ｒＡＡＶの注射の３４日後に様々なマウス臓器で測定したルシフェラーゼ活性。溶解緩衝液中で臓器をホモジナイズし、ルシフェラーゼ活性についてアッセイした。各個々のマウスのデータを示し、群によって色分けする。ｒＡＡＶの注射の３４日後に様々なマウス臓器で測定したルシフェラーゼ活性。溶解緩衝液中で臓器をホモジナイズし、ルシフェラーゼ活性についてアッセイした。各個々のマウスのデータを示し、群によって色分けする。
【図４９】様々な臓器でのベクターコピー数（５週目）。図１３様々なヒト細胞種および非ヒト細胞種への形質導入効率についての新規な変異体の分析。キャプシド配列を使用して、ＡＡＶルシフェラーゼベクターをパッケージングし、２重で形質導入した一次ヒト膵島を除いて、細胞を１，０００のＭＯＩで３重で形質導入した。形質導入の２日後に、形質導入効率のための読み出しとして、細胞溶解物中のルシフェラーゼ活性を決定した。様々なヒト細胞種および非ヒト細胞種への形質導入効率についての新規な変異体の分析。キャプシド配列を使用して、ＡＡＶルシフェラーゼベクターをパッケージングし、２重で形質導入した一次ヒト膵島を除いて、細胞を１，０００のＭＯＩで３重で形質導入した。形質導入の２日後に、形質導入効率のための読み出しとして、細胞溶解物中のルシフェラーゼ活性を決定した。
【図５０】１０個の親ライブラリーおよび１８個の親プールにおける親の寄与。（Ａ、Ｂ）１０個の親ライブラリーから得られたキメラキャプシド配列を、ＰａｃＢｉｏ配列決定によってプラスミドレベル（Ａ）またはＡＡＶレベル（Ｂ）で分析し、親の寄与を各アミノ酸位置に割り当てた。（Ｃ）バーコードのハイスループット配列決定を使用して分析した、１８個の親プールにおける親の寄与。（Ｄ）キャプシド配列のＰａｃＢｉｏ配列決定を使用して分析した、１８個の親プールにおける親の寄与。
【図５１】インタクトな膵島および分離された膵島での３回の継代ラウンド中の１８個の親混合物、１０個の親ライブラリー、および１８個の親ライブラリーの複製。２０，０００のＭＯＩを使用して、インタクトな膵島を示されたＡＡＶ調製物で感染させ、２，０００のＭＯＩを使用して、分離された膵島細胞を感染させた。アデノウイルス５を使用してＡＡＶを複製し、４日後にウイルスを上清および細胞から採取した。ウイルス種の複製をｒｅｐ  ｑＰＣＲによって決定した。各ラウンドについて、感染に使用された総ウイルスゲノムコピーおよび取り出された総ウイルスゲノムコピーを示す。
【図５２】３回の継代ラウンド中の別個のキャプシドの濃縮。各経過後に、バーコード配列をウイルスゲノムから増幅し、ハイスループット配列決定によって分析した。１８個の親混合物の継代についての濃縮された親キャプシドの色分けは、図１ｃに示される親プールの色分けと同一である。最も改善されたキャプシド（ＫＰ１、ＫＰ２、ＫＰ３）の起源を示す。
【図５３】濃縮されたキャプシド配列のレスキューおよび膵島形質導入のための選択されたキャプシドの評価。（Ａ）前方プライマーはｒｅｐ遺伝子の３’端の配列にアニールされ、逆プライマーは増幅される変異体キャプシドの右バーコードの配列に特異的であった。（Ｂ）ＧＦＰを発現する自己相補的ＡＡＶをＬＫ０３および１２個の新規なキャプシド配列と共にパッケージングし、１，０００個の低ＭＯＩを使用して、膵島細胞に形質導入した。４８時間後、細胞をＦＡＣＳを使用して、ＧＦＰ発現について選別した。（Ｃ）分離された膵島細胞を、２つの最良の親キャプシドを用いて生成されたＣｓＣｌ勾配で精製したｓｃＣＡＧ−ＧＦＰ  ｒＡＡＶ調製物、および事前スクリーニングにおいて上位のトランスデューサーであった新規なキャプシドで形質導入した。形質導入のために、３つの異なるＭＯＩを使用した。形質導入効率は、ＧＦＰ陽性細胞の割合（左グラフ）、およびＧＦＰ陽性細胞集団内の蛍光強度の中央値（右グラフ）として両方示される。（Ｄ）新規な変異体のα細胞およびβ細胞特異的形質導入効率。２つの新規な変異キャプシドならびにＡＡＶ−ＤＪおよびＡＡＶ−ＬＫ０３キャプシドがパッケージングされたＧＦＰ発現ｒＡＡＶを使用して、インタクトな膵島を１０，００のＭＯＩで形質導入し、α細胞およびβ細胞特異的形質導入を表面染色、続いて、ＦＡＣＳによって決定した。データは、２つの異なるドナー由来の膵島を使用した２つの個々の実験の標準偏差と共に平均値として示され、統計的に有意な差を示す。＊：ｐ＜０．１、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１
【図５４】選択されたシャフリングＡＡＶキャプシド変異体のアミノ酸配列および構造組成。（Ａ）ベクター化シャフリングキャプシドにおける親キャプシド断片交差のアミノ酸配列マッピング分析。ライブラリーの親を左記のように異なる色で示す。大きな点は、１００％の親一致を表し（すなわち、問題の位置は、１つの親のみと一致する）、小さな点は、各位置での複数の親一致（すなわち、位置は、２つ以上の親と一致する）を表す。各キメラについての実線は、交差間の配列内で同定されたライブラリー親を表す。交差間の細い水平平行線のセットは、多数の親が等しい確率で一致することを示す。垂直のスパイクは、親間における速くて単一の位置スイッチを示す。ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、およびＡＡＰ  ＯＲＦを以下に示す。（Ｂ）ベクター化シャフリングキャプシドにおける親ＡＡＰ断片交差のアミノ酸配列マッピング分析。（Ｃ）最大可能性に基づいて親血清型由来の配列を比較することによって、各キメラの配列中の各アミノ酸位置について濃縮スコアを計算した。示されているように、ライブラリーの親を異なる色で示す。（Ｄ）シャフリング変異体のＶＰ３配列を、ＡＡＶ２  ＶＬＰの結晶構造上に３Ｄ偽色マッピングした。色分けは、（Ａ）および（Ｂ）のように色を使用して親アミノ酸の寄与を示す。（Ｅ）シャフリング変異体のＡＡＶ３Ｂと異なる残基を、ＡＡＶ６  ＶＰ３の結晶構造上に３Ｄ偽色マッピングした。薄い灰色の残基は、ＡＡＶ３Ｂアミノ酸に対応し、色付きの残基は、他の血清型に由来する表面曝露アミノ酸を示す。ＡＡＶ３Ｂを除いて、色分けは（Ａ）および（Ｂ）と同様である。
【図５５】ホタルルシフェラーゼ発現ｒＡＡＶを使用したインビトロ形質導入実験。（Ａ）様々なヒトおよび非ヒト由来細胞種での新規なキャプシドならびにＡＡＶ−ＤＪおよびＡＡＶ−ＬＫ０３キャプシドへの形質導入効率。ホタルルシフェラーゼ発現カセットがパッケージングされたｒＡＡＶを含む異なるキャプシドを、１，０００のＭＯＩで各々３重で細胞（膵島細胞を除く）に形質導入し、形質導入の４８時間後、ルシフェラーゼ活性アッセイで細胞溶解物を分析した。組換えホタルルシフェラーゼ酵素の２倍希釈液を使用して標準曲線を調製し、標準曲線に基づいて、生（ｒａｗ）発光単位をルシフェラーゼ分子に計算した。（Ｂ）２つの異なるバッチのプールされたヒト免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）の希釈液を使用して、異なるキャプシドがパッケージングされたｒＡＡＶの中和アッセイ。Ｈｕｈ−７細胞を、異なる濃度のＩＶＩＧで３７℃で１時間事前にインキュベートしたホタルルシフェラーゼ発現ｒＡＡＶで１００のＭＯＩで生物学的に２重で形質導入した。形質導入の２４時間後、細胞溶解物におけるルシフェラーゼ活性を測定した。各試料について、標準偏差と共に平均値を示す。統計的に有意な差のみをグラフ下の凡例に示す。＊＊＊：ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１．
【図５６】新規なキャプシドならびにＡＡＶ８およびＤＪキャプシドがパッケージングされたｒＡＡＶのインビボ形質導入効率。Ｂａｌｂ／Ｃ  ＳＣＩＤマウスに、各々２Ｅ１０ｖｇのホタルルシフェラーゼ発現ｒＡＡＶを尾静脈を介して注射し、ルシフェリン基質を腹腔内注射した後、ライブイメージングを使用して、肝臓におけるルシフェラーゼ発現を数週間にわたってモニタリングした。３匹の動物を含むＡＡＶ８群を除き、各群について４匹の動物に注射した。各群の腹部輝度平均値（ｍｅａｎ  ｖｅｎｔｒａｌ  ｒａｄｉａｎｃｅ）を、標準偏差と共に各時点で示す。ＡＡＶ８群由来の１匹の動物を、基質の注射に失敗したために分析から省いた。統計的に有意な差のみをグラフ下の凡例に示す。＊＊：ｐ＜０．０１
【図５７】インビボでヒト化肝臓を有するマウスにおけるヒト肝細胞形質導入の検証および定量化。（Ａ）様々なキャプシド血清型を用いる２Ｅ１１ｖｇの静脈注射においてｓｓＡＡＶ−ＲＦＰで形質導入したヒト化肝臓を有する処置マウスの代表的な免疫蛍光画像。肝臓切片上のＤＡＰＩ（青色）、ヒト特異的ＦＡＨ（緑色）、およびウイルス−ＲＦＰ（赤色）。スケールバー、５０μＭ．（Ｂ）全肝細胞（左パネル）およびヒト肝細胞（右パネル）への形質導入効率の定量化、ならびにヒト肝細胞再集団（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）レベル（下パネル）の定量化各データ点は、各マウスの関心領域を表す（個々の生物学的複製物、「材料および方法」を参照のこと）。各マウスの合計６〜９つの関心領域を走査し、分析した。各群の平均および標準偏差を示す。統計学的に有意な差のみをグラフに示す。＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１
【図５８】ライブラリー生成に使用される親キャプシド。（Ａ）アミノ酸レベルにおける１８個の親キャプシドの系統関係。１０個の親ライブラリーの生成に使用される親キャプシドを赤色で示す。Ｇｅｎｉｏｕｓ６．０．６を使用して近隣結合（ｎｅｉｇｈｂｏｕｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ）ツリーを構築した。（Ｂ）親の寄与を示す、キメラキャプシドＤＪおよびＬＫ０３の交差分析。シンプルな可視化のために、両方のキメラについて同じ親キャプシド配列が示されるが、それらは異なる親組成を有する異なるライブラリーに由来する。ＡＡＶ−ＤＪは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９ｈｕ１４、ＡＡＶ−ウシ、ＡＡＶ−鳥類、およびＡＡＶ−ヤギ１キャプシド配列を含むライブラリーに由来し、ＡＡＶ−ＬＫ０３は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９ｈｕ１４、ＡＡＶ−ウシ、ＡＡＶ−鳥類、およびＡＡＶ−ヤギ１配列を含むライブラリーに由来した。（Ｃ）親の寄与を示す、ＡＡＶ−ＤＪおよびＡＡＶ−ＬＫ０３についてのＡＡＰ交差分析。
【図５９】ランダムクローンのＳａｎｇｅｒ配列決定による１０個の親ライブラリーの分析。（Ａ）プラスミドライブラリー（左）ならびにＡＡＶライブラリー（右）に由来するいくつかのシャフリングキャプシドのアミノ酸配列の交差分析。一致のため、ＬＫ０３およびＤＪは個々の親として示していない。十字で記される位置は、デノボ変異ではなく、ＡＡＶ４からの短いストレッチを含むＡＡＶ−ＬＫ０３に由来した。親キャプシドを以下の順番で示す。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９ｈｕ１４、ＡＡＶ−アカゲザル１０、ＡＡＶ−ブタ２。（Ｂ）プラスミドおよびＡＡＶレベル（ｒＡＡＶ）での、投入した８個の親配列および１０個の親ライブラリーのキャプシド配列に沿った保存分析。
【図６０】ランダムクローンのＳａｎｇｅｒ配列決定による１８個の親ライブラリーの分析。（Ａ）プラスミドライブラリーに由来するいくつかのシャフリングキャプシドのアミノ酸配列の交差分析。親キャプシドを以下の順番で示す。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３  Ｂ、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９ｈｕ１４、ＡＡＶ−アカゲザル１０、ＡＡＶ−ブタ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ−ウシ、ＡＡＶ−ヤギ１、ＡＡＶ−ブタ１、ＡＡＶ−マウス１、およびＡＡＶ−鳥類。（Ｂ）投入する１６個の親配列ならびに１８個の親ライブラリーのキャプシド配列に沿った保存分析。キャプシドＤＪおよびＬＫ０３は、使用される親由来の断片からなるキメラであるため、親として列挙されない。
【図６１】ヒト膵島についての第２のライブラリースクリーニングの結果。（Ａ）インタクトな膵島での３回の継代ラウンド中の１０個の親ライブラリーおよび１８個の親ライブラリーの複製。１０００または５０，０００のＭＯＩを使用して、１０個の親ライブラリーを生物学的に２重で膵島に感染させた。１８個の親ライブラリーによる感染は、５０，０００のＭＯＩを使用して、生物学的に３重で行った。アデノウイルス５を使用してＡＡＶを複製し、４日後にウイルスを上清および細胞から採取した。ウイルス種の複製をｒｅｐ  ｑＰＣＲによって決定した。各ラウンドについて、感染に使用された総ウイルスゲノムコピーおよび取り出された総ウイルスゲノムコピーを示す。（Ｂ）３回の継代ラウンド中の異なるキャプシドの濃縮。各経過後に、バーコード配列をウイルスゲノムから増幅し、ハイスループット配列決定によって分析した。
【図６２】異なるキメラおよび野生型ＡＡＶキャプシドの形質導入効率。（Ａ）分離された膵島細胞を、１，０００のＭＯＩでｒＡＡＶ（ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ｂ、ＤＪ、およびＬＫ０３キャプシド）で形質導入し、形質導入の４８時間後、フローサイトメトリーによって形質導入効率を決定した。（Ｂ）分離された膵島細胞を、２つの最良の親キャプシドを用いて生成されたＣｓＣｌ勾配で精製したｓｃＣＡＧ−ＧＦＰ  ｒＡＡＶ調製物、および事前スクリーニングにおいて上位のトランスデューサーであった新規なキャプシドで形質導入した。形質導入のために、３つの異なるＭＯＩを使用した。形質導入効率は、各細胞の蛍光強度と関連したＧＦＰ発現細胞の数の関数として測定される。
【図６３】ヌクレオチドレベルでの親の寄与、ならびにベクターゲノムおよびタンパク質組成物のパッケージングについての新規なキャプシドの分析。（Ａ）ベクター化シャフリングキャプシドにおける親キャプシド断片交差のヌクレオチド配列マッピング分析。ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、およびＡＡＰコード配列は、ＫＰ１、ＫＰ２、およびＫＰ３配列の交差分析下で示される。（Ｂ）ＤＪ、ＬＫ０３、ならびに新規なキャプシド変異体がパッケージングされたｓｓＣＡＧ−ＦＬｕｃベクターゲノムのアルカリ性サザンブロット分析。各レーンに１Ｅ０９ｖｇを充填した。サイズ規格は、所望のサイズの断片を得るために異なる制限酵素で消化されたプラスミドで構成された。ベクターゲノムを、ＤＪ、ＬＫ０３、ならびに新規なキャプシド変異体がパッケージングされたｓｃＣＡＧ−ＧＦＰベクターゲノムのアルカリ性サザンブロット分析のＦＬｕｃ特異的放射標識プローブ（Ｃ）でプローブした（ｐｒｏｂｅｄ）。サイズ規格は、所望のサイズの断片を得るために異なる制限酵素で消化されたプラスミドで構成された。ベクターゲノムを、ＧＦＰ特異的放射標識プローブでプローブした。（Ｄ）精製ｓｃＣＡＧ−ＧＦＰベクター調製物のウェスタンブロット分析１Ｅ０９ｖｇに相当する精製ウイルスを４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上に充填し、ニトロセルロースメンブレン上に移し、３つ全てのキャプシドタンパク質のＣ末端において高度に保存されたエピトープを認識するＢ１抗体でプローブした。
【図６４】新規なキャプシドならびにＡＡＶ８およびＤＪキャプシドと共にパッケージングされたｒＡＡＶのインビボ形質導入効率。（Ａ）Ｂａｌｂ／Ｃ  ＳＣＩＤマウスに、２Ｅ１０ｖｇの各ホタルルシフェラーゼ発現ｒＡＡＶを尾静脈を介して注射し、ルシフェリン基質を腹腔内注射した後、ライブイメージングを使用して、肝臓におけるルシフェラーゼ発現を数週間にわたってモニタリングした。３匹の動物を含むＡＡＶ８群を除いて、各群について４匹の動物に注射した。閾値５Ｅ０７で、最大輝度を２Ｅ０９に設定した。（Ｂ）注射後３４日目にマウスを犠牲にさせ、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイシステムを使用して、いくつかの臓器をエクスビボでルシフェラーゼ発現について分析した。（Ｃ）ゲノムＤＮＡをマウス肝臓から単離し、ｑＰＣＲによってベクターコピー数について分析した。群間の統計的に有意な差のみを示す。＊：ｐ＜０．１、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１
【図６５Ａ−１】新規な配列のアミノ酸アラインメント。（Ａ）新規な変異体のキャプシド配列および８つの親血清型を、ＭｅｇＡｌｉｇｎを使用してアラインメントした。コンセンサス配列との差異のみを示す。ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の開始部位を示す。
【図６５Ａ−２】新規な配列のアミノ酸アラインメント。（Ａ）新規な変異体のキャプシド配列および８つの親血清型を、ＭｅｇＡｌｉｇｎを使用してアラインメントした。コンセンサス配列との差異のみを示す。ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の開始部位を示す。
【図６５Ｂ】新規な配列のアミノ酸アラインメント。（Ｂ）新規な変異体ならびに８種の親血清型の組み立て活性化タンパク質（ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＡＡＰ）配列をアラインメントした。
【図６６】ヒト胚性幹細胞由来β細胞のキャプシドＫＰ１の形質導入効率。ＤＪ、ＬＫ０３およびＫＰ１キャプシドを使用してＴｏｍａｔｏ  Ｒｅｄベクターをパッケージングし、ｈＥＳＣ由来成熟β細胞を示されるＭＯＩで形質導入した。β細胞マーカーＣペプチドの細胞内染色を形質導入後６日目に行い、細胞をフローサイトメトリーによって分析した。
【図６７】ヒト肝細胞再集団レベル、全ての肝細胞およびヒト肝細胞への形質導入効率の定量化。各データポイントは、各マウスの関心領域を表す。各マウスの合計６〜９個の関心領域を走査し、分析した。各マウスの平均値および標準偏差を示す。群間の統計的に有意な差のみをグラフに示す。＊＊：ｐ０．０１、＊＊＊＊：ｐ０．０００１
【図６８】ヒト膵島およびｈＥＳＣ由来β細胞上の新規なおよび親ＡＡＶキャプシドの形質導入効率。（Ａ）ＤＪ、ＬＫ０３およびＫＰ１キャプシドを使用してＴｏｍａｔｏ  Ｒｅｄベクターをパッケージングし、ｈＥＳＣ由来成熟β細胞を示したＭＯＩで形質導入した。β細胞マーカーＣペプチドの細胞内染色を形質導入後６日目に行い、細胞をフローサイトメトリーによって分析した。（Ｂ）同じ細胞を免疫蛍光画像化によっても分析した。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
序論
より高い治療レベルの核酸発現を達成するように、遺伝子治療のためのヒト膵臓組織またはヒト膵島において増加した形質導入を可能にする遺伝子治療ベクターの必要性が当該技術分野に依然として存在する。本発明は、この必要性を満たし、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、ヒト膵臓組織またはヒト膵島において増加した形質導入および／またはトロピズムを示す変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドを提供する。
【００６４】
詳細説明
様々な実施形態では、本発明は、変異アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドポリペプチドであって、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、ヒト膵臓組織またはヒト膵島において増加した形質導入またはトロピズムを示す、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、組換え変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドまたは変異ｒＡＡＶキャプシドポリペプチドと称される。
【００６５】
他の様々な実施形態では、本発明は、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドをコードする核酸配列を含むＡＡＶベクターであって、該変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドをコードするベクターと比較して、ヒト膵臓組織またはヒト膵島において増加した形質導入またはトロピズムを示す、ＡＡＶベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、組換えＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶベクターと称される。
【００６６】
いくつかの実施形態では、本発明は、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドであって、該変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、実質的に同一の非変異親ＡＡＶキャプシドタンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸の差異（例えば、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失）を含み、該変異体ＡＡＶキャプシドタンパク質が、非変異親キャプシドポリペプチドをコードするベクターと比較して、ヒト膵臓組織またはヒト膵島において増加した形質導入またはトロピズムを示す、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、天然に存在するＡＡＶキャプシドポリペプチドに存在するアミノ酸配列を含まない。
【００６７】
いくつかの実施形態では、本発明は、ａ）変異ＡＡＶキャプシドタンパク質を含み、該変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、実質的に同一の非変異親ＡＡＶキャプシドタンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸の差異（例えば、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失）を含み、該変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が、非変異親キャプシドポリペプチドをコードするベクターと比較して、ヒト膵臓組織またはヒト膵島において増加した形質導入またはトロピズムを示す、ＡＡＶベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、天然に存在するＡＡＶキャプシドポリペプチドに存在するアミノ酸配列を含まない。
【００６８】
本発明をより詳細に記載する前に、本発明は本明細書に記載される特定の実施形態に限定されず、そのような実施形態は変化し得ると理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、用語は限定的であることを意図するものではないことも理解されたい。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。ある範囲の値が提供される場合、文脈が別段で明確に指示していない限り、その範囲の上限と下限との間に、下限の単位の１０分の１までの各介在値、およびその記載された範囲内の他の記載された値もしくは介在値も本発明の範囲に包含されると理解されたい。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立してより小さい範囲に含まれてもよく、記載される範囲内の任意の具体的に除外される制限を受けること条件として、本発明にも包含される。記載された範囲が限界の一方または両方を含む場合、これらの含まれる限界の一方または両方を除く範囲も本発明に含まれる。特定の範囲は、「約」という用語が数値範囲に先行して本明細書に示される。「約」という用語は、本明細書で使用され、それが先行する正確な数、ならびに該用語が先行する数に近いまたはほぼその数についての文字による補助を提供する。数値が具体的に記載された数値に近いか、または具体的に記載された数値におおよそ近いかを決定する際に、記載されていない近いまたはおおよその数値は、示される文脈において、具体的に記載された数値の実質的な等価物を提供する数値であってもよい。本明細書に列挙される全ての刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物、特許または特許出願が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているのと同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。さらに、各引用される刊行物、特許、または特許出願は、刊行物が引用されたものに関連した主題を開示および記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日前のその開示のためのものであり、本明細書に記載の発明が先行発明によりそのような刊行物に先行する資格を有さないことを認めるものとして解釈されるべきではない。さらに、提供される公開日は、実際の公開日とは異なる可能性があり、これは独立して確認する必要があり得る。
【００６９】
特許請求の範囲は、いずれの任意選択による要素を排除するように起草され得ることにさらに留意されたい。このため、この記述は、特許請求された要素の列挙に関連した「専ら」、「のみ」などのような排他的な用語の使用、または「否定的」制限の使用に対する先行詞として機能することが意図される。本開示を読んだ際に当業者に明らかとなるように、本明細書に記載および例示される個々の実施形態の各々は、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のうちのいずれかの特徴と容易に分離させるかまたは組み合わせられる個別の構成成分および特徴を有する。任意の記載の方法を、記載する事象の順序でまたは論理的に可能な他の順序で行ってもよい。本明細書に記載されものと等価な任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用してもよいが、説明に役立つ代表的方法および材料をここで説明する。
【００７０】
本発明において説明するように、以下の用語を用い、以下に示すように定義する。
【００７１】
略語
「ＡＡＶ」は、アデノ随伴ウイルスの略称であり、ウイルス自体またはその誘導体を指すために使用されてもよい。この用語は、別段で必要とされる場合を除き、全てのサブタイプならびに天然に存在する形態および組換え形態の両方を包含する。「ｒＡＡＶ」という略称は、組換えＡＡＶベクター（または「ｒＡＡＶベクター」）とも称される組換えアデノ随伴ウイルスを指す。
【００７２】
定義
「ＡＡＶ」という用語には、１型ＡＡＶ（ＡＡＶ１）、２型ＡＡＶ（ＡＡＶ２）、３型ＡＡＶ（ＡＡＶ３）、４型ＡＡＶ（ＡＡＶ４）、５型ＡＡＶ（ＡＡＶ５）、６型ＡＡＶ（ＡＡＶ６）、７型ＡＡＶ（ＡＡＶ７）、８型ＡＡＶ（ＡＡＶ８）、９型ＡＡＶ（ＡＡＶ９）、９＿ｈｕ１４、鳥類ＡＡＶ、ウシ（ｂｏｖｉｎｅ）ＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウシＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、およびウシ（ｏｖｉｎｅ）ＡＡＶが含まれる。「霊長類ＡＡＶ」は、霊長類に感染することができるＡＡＶを指し、「非霊長類ＡＡＶ」は、非霊長類哺乳動物に感染することができるＡＡＶを指し、「ウシＡＡＶ」は、ウシ哺乳動物に感染することができるＡＡＶを指すなどである。
【００７３】
本明細書で使用される「ＡＡＶベクター」とは、いくつかの実施形態では、変異キャプシドポリペプチドを含む様々な核酸配列をコードするＡＡＶベクター核酸配列を指し（すなわち、ＡＡＶベクターは、変異キャプシドポリペプチドとも称される、変異キャプシドポリペプチドをコードする核酸配列を含む）、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、膵臓組織またはヒト膵島において増加した形質導入またはトロピズムを示す。ＡＡＶベクターはまた、核酸挿入物の一部として、ＡＡＶ起源ではない異種核酸配列を含むことができる。この異種核酸配列は、典型的には、細胞の遺伝子形質転換のための関心の配列を含む。一般的に、異種ポリヌクレオチドは、少なくとも１つ、一般的には２つのＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）に隣接している。
【００７４】
「非変異親キャプシドポリペプチド」という語句は、任意の天然に存在するＡＡＶキャプシドポリペプチドおよび／または任意のＡＡＶ野生型キャプシドポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、非変異親キャプシドポリペプチドには、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ウシＡＡＶ、および／または鳥類ＡＡＶキャプシドポリペプチドが含まれる。
【００７５】
変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドおよび非変異親キャプシドポリペプチドの文脈における「実質的に同一である」という用語は、１個以上のアミノ酸変化を有する配列を指す。いくつかの実施形態では、これらの変化は、キャプシドポリペプチドのパッケージング機能に影響を及ぼさない。いくつかの実施形態では、実質的に同一には、非変異親キャプシドポリペプチドと約９９％、約９８％、約９７％、約９６％、約９５％、約９４％、約９３％、約９２％、約９１％、または約９０％同一の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが含まれる。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドのサブ領域にわたって、例えば、ポリペプチド配列全長の約２５％超、約５０％超、約７５％超、または約９０％超にわたって、非変異親キャプシドポリペプチドと実質的に同一であり得る。
【００７６】
「ＡＡＶビリオン」もしくは「ＡＡＶウイルス」もしくは「ＡＡＶウイルス粒子」または「ＡＡＶベクター粒子」とは、少なくとも１つのＡＡＶキャプシドポリペプチド（変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドおよび非変異親キャプシドポリペプチドの両方を含む）およびキャプシド化（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｅｄ）ポリヌクレオチドＡＡＶ移入ベクターから成るウイルス粒子を指す。該粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達されるトランス遺伝子などの、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、該粒子は、「ＡＡＶベクター粒子」または単に「ＡＡＶベクター」と称される。したがって、ＡＡＶビリオンまたはＡＡＶベクター粒子の産生には、必然的にＡＡＶベクターの産生が含まれるが、それは、そのようなベクターが、ＡＡＶビリオンまたはＡＡＶベクター粒子内に含まれるからである。
【００７７】
「パッケージング」とは、核酸配列および／または他の治療分子をキャプシド化するＡＡＶビリオンまたはＡＡＶ粒子の組み立てをもたらす一連の細胞内事象を指す。パッケージングとは、本明細書に記載の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドを含むキャプシドへの、核酸配列および／または他の治療分子のキャプシド化を指すことができる。一般的に、ＡＡＶは、約５ｋｂの限られたパッケージング能力を有する。
【００７８】
本明細書で使用される「治療分子」という語句は、核酸（例えば、ベクターを含む）、ポリペプチド（例えば、抗体を含む）、およびワクチン、ならびに本発明の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドによってパッケージングされ得る任意の他の治療分子を含むことができる。
【００７９】
ＡＡＶ「ｒｅｐ」および「ｃａｐ」遺伝子は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の複製およびキャプシド化タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を指す。ＡＡＶ  ｒｅｐ（複製）およびｃａｐ（キャプシド）は、本明細書ではＡＡＶ「パッケージング遺伝子」と称される。
【００８０】
ＡＡＶについての「ヘルパーウイルス」は、ＡＡＶ（例えば、野生型ＡＡＶ）が哺乳動物細胞によって複製およびパッケージングされることを可能にするウイルスを指す。アデノウイルス、ヘルペスウイルス、およびポックスウイルス、例えば、ワクシニアを含む、ＡＡＶのための様々なそのようなヘルパーウイルスが当該技術分野で既知である。アデノウイルスは多くの異なる下位群を包含するが、サブグループＣのアデノウイルス５型が最も一般的に使用される。ヒト、非ヒト哺乳動物、および鳥類起源の多数のアデノウイルスが知られており、ＡＴＣＣなどの預託機関から入手可能である。ヘルペスファミリーのウイルスには、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）およびエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）が挙げられ、これらもＡＴＣＣなどの預託機関から入手可能である。
【００８１】
「ヘルパーウイルス機能」とは、（本明細書に記載の複製およびパッケージングのための他の要件と併せて）ＡＡＶ複製およびパッケージングを可能にするヘルパーウイルスゲノムにコードされている機能を指す。本明細書中に記載されるように、「ヘルパーウイルス機能」は、ヘルパーウイルスを提供すること、または例えば必要な機能（複数可）をコードするポリヌクレオチド配列をトランスでプロデューサー細胞に提供することによることを含む多くの方法で提供され得る。
【００８２】
「感染性」ビリオン、ウイルス、またはウイルス粒子は、ウイルス種に対してトロピズムを有する細胞に送達可能なポリヌクレオチド構成成分を含むものである。この用語は、いずれかのウイルスの複製能力を必ずしも意味するものではない。本明細書で使用する場合、「感染性」ウイルスまたはウイルス粒子は、標的細胞にアクセスした際に標的細胞に感染することができ、標的細胞中で異種核酸を発現することができるものである。したがって、「感染性」は、ウイルス粒子が標的細胞にアクセスし、標的細胞に侵入し、標的細胞中で異種核酸を発現する能力を指す。感染性は、インビトロでの感染性またはインビボでの感染性を指すことができる。感染性ウイルス粒子を計数するためのアッセイは、本開示の他箇所および当該技術分野において説明されている。ウイルス感染性は、感染性ウイルス粒子対全ウイルス粒子の比として表すことができる。総ウイルス粒子は、ウイルスゲノムコピーの数として表すことができる。ウイルス粒子が細胞中で異種核酸を発現する能力を「形質導入」と称することができる。ウイルス粒子が細胞中で異種核酸を発現する能力は、マーカー遺伝子の評価、例えば、ＧＦＰがウイルス粒子に感染した細胞内で産生されて検出および／もしくは測定される、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）アッセイ（例えば、ウイルスが、ＧＦＰをコードするヌクレオチド配列を含む場合）、または例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）もしくは蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）による産生タンパク質の測定を含む、多くの技術を使用してアッセイすることができる。
【００８３】
「複製能を有する（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）」ビリオンまたはウイルス（例えば、複製能を有するＡＡＶ）という用語は、表現型的に野生型の感染性ウイルスを指し、感染した細胞中で（すなわち、ヘルパーウイルスまたはヘルパーウイルス機能の存在下で）複製可能である。ＡＡＶの場合、複製能は、一般的に、機能的ＡＡＶパッケージング遺伝子の存在を必要とする。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶベクターは、１つ以上のＡＡＶパッケージング遺伝子を欠如しており、哺乳動物細胞（特にヒト細胞内）内での複製能を有さない。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、任意のＡＡＶパッケージング遺伝子配列を欠如しており、ＡＡＶパッケージング遺伝子と移入されるＡＡＶベクターとの間の組換えによって、複製能を有するＡＡＶを生成する可能性を最小限に抑える。多くの実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶベクター調製物は、あったとしてもわずかな、複製能を有するＡＡＶ（ｒｃＡＡＶ、ＲＣＡとも称される）を含むものである（例えば、ＡＡＶ粒子１０２個あたり約１個未満のｒｃＡＡＶ、ＡＡＶ粒子１０４個あたり約１個未満のｒｃＡＡＶ、ＡＡＶ粒子１０８個あたり約１個未満のｒｃＡＡＶ、ＡＡＶ粒子１０１２個あたり約１個未満のｒｃＡＡＶ、またはｒｃＡＡＶなし）。
【００８４】
「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書では互換的に使用され、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を含む、全ての形態の核酸、オリゴヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドには、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、およびアンチセンスＤＮＡ、およびスプライシングされたもしくはスプライシングされていないｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ＲＮＡアンタゴミル、ならびに阻害ＤＮＡまたはＲＮＡ（ＲＮＡｉ、例えば、低分子もしくは短鎖ヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アプタマー、低分子もしくは短鎖干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡ）が含まれる。ポリヌクレオチドには、非コードＲＮＡも含まれ、これには、例えば、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ＲＮＡアンタゴミル、アプタマー、および当業者に既知の任意の他の非コードＲＮＡを含むが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドには、天然に存在する、合成された、および意図的に改変または修飾されたポリヌクレオチド、ならびに類似体および誘導体が含まれる。「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそれらの類似体を含む、任意の長さのヌクレオチドの多量体形態を指し、核酸配列と同義である。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの修飾されたヌクレオチドを含んでもよく、非ヌクレオチド成分によって妨害され得る。存在する場合、ヌクレオチド構造の修飾は、ポリマーの組み立ての前または後に付与され得る。ポリヌクレオチドという用語は、本明細書で使用する場合、二本鎖および一本鎖分子を同義に指す。別段特定されない限り、または必要とされない限り、ポリヌクレオチドを含む本明細書の任意の実施形態は、二本鎖形態、および二本鎖形態を構成することが既知であるかまたは予測される２つの相補的一本鎖形態の各々の両方を包含する。ポリヌクレオチドは、一重鎖、二重鎖、もしくは３重で鎖、直鎖状または円形であり得、任意の長さであり得る。ポリヌクレオチドを考察する際に、特定のポリヌクレオチドの配列または構造は、５’から３’方向に配列を提供する慣例に従って、本明細書に記載されてもよい。
【００８５】
「遺伝子」は、転写および翻訳された後に特定のタンパク質またはポリペプチドをコードすることができる少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを指す。
【００８６】
「低分子干渉」もしくは「短鎖干渉ＲＮＡ」またはｓｉＲＮＡは、関心の遺伝子（「標的遺伝子」）へと標的化されるヌクレオチドのＲＮＡ二重鎖である。「ＲＮＡ二重鎖」は、ＲＮＡ分子の２つの領域間の相補的対形成によって形成される構造を指す。ｓｉＲＮＡは、遺伝子に「標的化」され、ｓｉＲＮＡの二重鎖部分のヌクレオチド配列は、標的化された遺伝子のヌクレオチド配列に相補的である。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡの二本鎖の長さは３０ヌクレオチド未満である。いくつかの実施形態では、二重鎖は、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、または１０ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、二本鎖の長さは、１９〜２５ヌクレオチド長である。ｓｉＲＮＡのＲＮＡ二重鎖部分は、ヘアピン構造の一部であり得る。二重鎖部分に加えて、ヘアピン構造は、二重鎖を形成する２つの配列の間に位置するループ部分を含んでもよい。ループの長さは様々であり得る。いくつかの実施形態では、ループは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３ヌクレオチド長である。ヘアピン構造はまた、３’突出（ｏｖｅｒｈａｎｇ）部分または５’突出部分を含むことができる。いくつかの実施形態では、突出部は、０、１、２、３、４、または５ヌクレオチド長の３’または５’突出である。
【００８７】
本明細書で使用する場合、「マイクロＲＮＡ」という用語は、内因性マイクロＲＮＡおよび人工マイクロＲＮＡ（例えば、合成ｍｉＲＮＡ）を含むがこれらに限定されない、任意の種類の干渉ＲＮＡを指す。内因性マイクロＲＮＡは、ｍＲＮＡの生産的利用を調節することができるゲノム中に天然にコードされる小さなＲＮＡである。人工マイクロＲＮＡは、ｍＲＮＡの活性を調節することができる、内因性マイクロＲＮＡ以外の任意の種類のＲＮＡ配列であり得る。マイクロＲＮＡ配列は、これらの配列のうちのいずれか１つ以上からなるＲＮＡ分子であり得る。マイクロＲＮＡ（または「ｍｉＲＮＡ」）配列は、Ｌｉｍ，ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１７，９９１−１００８，Ｌｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９９，１５４０，Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ａｍｂｒｏｓｅ，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４，８６２，Ｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４，８５８−８６１，Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２，７３５−７３９，Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４，８５３−８５７，ａｎｄ  Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，ＲＮＡ，９，１７５−１７９などの刊行物に記載されている。マイクロＲＮＡの例には、より大きなＲＮＡの任意のＲＮＡ断片が含まれるか、またはｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｎｃＲＮＡ、ｔｎｃＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、もしくは他の小さな非コードＲＮＡである。例えば、米国特許出願第２００５０２７２９２３号、同第２００５０２６６５５２号、同第２００５０１４２５８１号、および同第２００５００７５４９２号を参照のこと。「マイクロＲＮＡ前駆体」（または「プレｍｉＲＮＡ」）は、中に組み込まれたマイクロＲＮＡ配列を有するステムループ構造を有する核酸を指す。「成熟マイクロＲＮＡ」（または「成熟ｍｉＲＮＡ」）は、マイクロＲＮＡ前駆体（「プレｍｉＲＮＡ」）から切断された、または合成された（例えば、無細胞合成によって実験室で合成された）マイクロＲＮＡを含み、約１９ヌクレオチド〜約２７ヌクレオチドの長さを有し、例えば、成熟マイクロＲＮＡは、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２１ｎｔ、２２ｎｔ、２３ｎｔ、２４ｎｔ、２５ｎｔ、２６ｎｔ、または２７ｎｔの長さを有することができる。成熟マイクロＲＮＡは、標的ｍＲＮＡに結合し、標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる。
【００８８】
ポリヌクレオチドに適用される「組換え」は、ポリヌクレオチドが、クローニング、制限、またはライゲーション工程、および天然に見出されるポリヌクレオチドとは別個のおよび／または異なる構築物をもたらす他の手順の様々な組み合わせの産物であることを意味する。組換えウイルスは、組換えポリヌクレオチドをカプセル化するウイルス粒子である。これらの用語は、それぞれ、元のポリヌクレオチド構築物の複製物および元のウイルス構築物の子孫を含む。
【００８９】
「制御要素」または「制御配列」という用語は、ポリヌクレオチドの複製、重複（ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、転写、スプライシング、翻訳、または分解を含む、ポリヌクレオチドの機能的調節に寄与する分子の相互作用に関与するヌクレオチド配列を指す。この調節は、プロセスの頻度、速度、または特異性に影響を及ぼし得、本来は増強性または阻害性であり得る。当該技術分野で既知の制御要素には、例えば、プロモーター、エンハンサー、およびデグロンなどの転写調節配列が含まれる。プロモーターは、ある特定の条件下では、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、通常はプロモーターの下流（３’方向）に位置するコード領域の転写を開始することができるＤＮＡ領域である。
【００９０】
「作動的に連結された」または「作動可能に連結された」という用語は、遺伝要素の並置を指し、該要素は、それらが予想される様式で作動することを可能にする関係にある。例えば、プロモーターがコード配列の転写の開始を助ける場合、プロモーターはコード領域に作動可能に連結される。この機能的関係が維持される限り、プロモーターとコード領域との間に介在残基が存在し得る。
【００９１】
「異種」という用語は、それが比較されている残りの実体とは遺伝子型的に（ｇｅｎｏｔｙｐｉｃａｌｌｙ）異なる実体に由来することを意味する。例えば、遺伝子工学技法によって異なる種に由来するプラスミドまたはベクターに導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである。天然のコード配列から除去され、コード配列に作動的に連結されたプロモーターは、天然には見出されず、異種ピロモーターに連結している。例えば、異種遺伝子産物をコードする異種核酸配列を含むＡＡＶは、天然に存在する野生型ＡＡＶに通常は含まれない核酸を含むＡＡＶであり、コードされた異種遺伝子産物は、天然に存在する野生型ＡＡＶによって通常はコードされない遺伝子産物である。変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドをコードする核酸を含むＡＡＶは、異種核酸配列を含む。宿主細胞に移入される／送達されると、ビリオン内に含まれる異種ポリヌクレオチドが発現され得る（例えば、転写され、適切な場合翻訳される）。あるいは、ビリオン内に含まれる宿主細胞に移入／送達された異種ポリヌクレオチドは、発現される必要はない。「異種」という用語は、ポリヌクレオチドに関して本明細書で必ずしも使用されるわけではないが、「異種」という修飾語がない場合でもポリヌクレオチドを参照することは、その省略にもかかわらず異種ポリヌクレオチドを含むことを意図する。
【００９２】
「遺伝子改変」および「遺伝子修飾」（およびその文法上の異形）は、本明細書では互換的に使用され、遺伝要素（例えば、ポリヌクレオチド）が有糸分裂または減数分裂以外によって細胞に導入されるプロセスを指す。要素は、細胞に対して異種であってもよく、または細胞に既に存在する要素の追加のコピーまたは改善版であってもよい。遺伝子改変は、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、またはポリヌクレオチド−リポソーム複合体など、当該技術分野で既知である任意のプロセスによって、細胞を組換えプラスミドまたは他のポリヌクレオチドでトランスフェクトすることによって行ってもよい。遺伝子改変はまた、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスまたはウイルスベクターを用いる形質導入または感染によって行われてもよい。一般的に、遺伝子要素は、細胞内の染色体または微小染色体に導入されるが、細胞およびその子孫の表現型および／または遺伝子型を変化させる任意の改変がこの用語に含まれてもよい。
【００９３】
配列が、インビトロでの延長した細胞培養中、その機能を発揮するために利用可能である場合、細胞は、遺伝子配列によって「安定して」改変され、形質導入され、遺伝子修飾され、または形質転換されると言う。一般的に、そのような細胞は、遺伝子改変が導入され、改変された細胞の子孫によっても遺伝可能である点で、「遺伝的に（ｈｅｒｉｔａｂｌｙ）」改変される（遺伝子修飾される）。
【００９４】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。「ポリヌクレオチド配列」によってコードされる「ポリペプチド」、「タンパク質」、および「ペプチド」には、天然のタンパク質と同様に、全長天然配列、ならびにサブ配列、修飾形態、または変異体が天然全長タンパク質のある程度の機能性を保持する限り、機能的サブ配列、修飾形態、または配列変異体が含まれる。本明細書に記載の方法および使用において、そのようなポリペプチド、タンパク質、およびポリヌクレオチド配列によってコードされるペプチドは、欠陥内因性タンパク質と同一であるか、もしくはその発現が不十分であるか、または処置された哺乳動物において欠乏し得るが、必要ではない。これらの用語は、修飾アミノ酸ポリマー、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、リン酸化、メチル化、カルボキシル化、脱アミド化、アセチル化、または標識化成分との結合も包含する。哺乳動物対象に遺伝子産物を送達する状況において考察した場合、抗血管新生ポリペプチド、神経保護ポリペプチドなどのポリペプチド、ならびにそのための組成物は、それぞれのインタクトなポリペプチド、またはインタクトなタンパク質の所望の生化学的機能を保持するその任意の断片もしくは遺伝子操作された誘導体を指す。
【００９５】
本明細書で使用する場合、本開示方法で使用される遺伝的にコードされたＬ−エナチオマーアミノ酸の略称は、慣用的であり、表１に以下の通りである。
【００９６】
【表１】
2021519791.tif 000003
【００９７】
「親水性アミノ酸」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７９：１２５−１４２の正規化されたコンセンサス疎水性スケールに従って、０未満の疎水性を示すアミノ酸を指す。遺伝的にコードされた親水性アミノ酸には、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、およびＡｒｇ（Ｒ）が含まれる。
【００９８】
「酸性アミノ酸」は、ｐＫ値が７未満の側鎖を有する親水性アミノ酸を指す。酸性アミノ酸は、典型的には、水素イオンの喪失に起因して、生理的ｐＨにおいて負に荷電した側鎖を有する。遺伝的にコードされた酸性アミノ酸には、Ｇｌｕ（Ｅ）およびＡｓｐ（Ｄ）が含まれる。
【００９９】
「塩基性アミノ酸」は、ｐＫ値が７超の側鎖を有する親水性アミノ酸を指す。塩基性アミノ酸は、典型的には、水素イオンとの会合に起因して、生理的ｐＨにおいて正に荷電した側鎖を有する。遺伝的にコードされた塩基性アミノ酸には、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ａｒｇ（Ｒ）、およびＬｙｓ（Ｋ）が含まれる。
【０１００】
「極性アミノ酸」とは、生理学的ｐＨにおいて未荷電の側鎖を有するが、２つの原子によって共通して共有される対の電子が、原子のうちの１つによってより密接に保持される少なくとも１つの結合を有する親水性アミノ酸を指す。遺伝的にコードされた極性アミノ酸には、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、およびＴｈｒ（Ｔ）が含まれる。
【０１０１】
「疎水性アミノ酸」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，１９８４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７９：１２５−１４２の正規化されたコンセンサス疎水性スケールに従って、０超の疎水性を示すアミノ酸を指す。例示的な疎水性アミノ酸には、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、およびプロリン類似体が含まれる。
【０１０２】
「芳香族アミノ酸」とは、少なくとも１つの芳香族または複素芳香族環を有する側鎖を有する疎水性アミノ酸を指す。芳香族または複素芳香族環は、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＮ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＯ２、−ＮＯ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ、−ＮＲＲ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲなどの１つ以上の置換基を含んでもよく、式中、各Ｒは、独立して、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルケニル、置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキニル、置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルキニル、（Ｃ１〜Ｃ２１））アリール、置換（Ｃ５〜Ｃ２０）アリール、（Ｃ６〜Ｃ２６）アルカリル、置換（Ｃ６〜Ｃ２６）アルカリル、５〜２０員ヘテロアリール、置換５〜２０員ヘテロアリール、６〜２６員アルクヘテロアリール（ａｌｋｈｅｔｅｒｏａｒｙｌ）、または置換６〜２６員アルクヘテロアリールである。遺伝的にコードされた芳香族アミノ酸には、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、およびＴｒｐ（Ｗ）が含まれる。
【０１０３】
「非極性アミノ酸」とは、生理学的ｐＨにおいて未荷電の側鎖を有し、２つの原子によって共通して共有される一対の電子が、概して２つの原子の各々によって等しく保持される結合を有する（すなわち、側鎖は極性ではない）疎水性アミノ酸を指す。遺伝的にコードされた無極性（ａｐｏｌａｒ）アミノ酸には、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、およびＡｌａ（Ａ）が含まれる。
【０１０４】
「脂肪族アミノ酸」は、脂肪族炭化水素側鎖を有する疎水性アミノ酸を指す。遺伝的にコードされた脂肪族アミノ酸には、Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、およびＩｌｅ（Ｉ）が含まれる。
【０１０５】
アミノ酸に関する「非天然」という用語は、上記表１に列挙される２０個のアミノ酸のうちの１つとして含まれない任意のアミノ酸分子、ならびに当業者に既知の任意の修飾または誘導体化アミノ酸を含むことができる。非天然アミノ酸には、β−アラニン、α−アミノ酪酸、γ−アミノ酪酸、γ−（アミノフェニル）酪酸、α−アミノイソ酪酸、ε−アミノカプロン酸、７−アミノヘプタノイン酸、β−アスパラギン酸、アミノ安息香酸、アミノフェニル酢酸、アミノフェニル酪酸、γ−グルタミン酸、システイン（ＡＣＭ）、ε−リジン、メチオニンスルホン、ノルロイシン、ノルバリン、オルニチン、ｄ−オルニチン、ｐ−ニトロ−フェニルアラニン、ヒドロキシプロリン、１，２，３，４，−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、およびチオプロリンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０６】
キャプシドポリペプチドなどのポリペプチドに関する「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」または「変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）」という用語は、非変異ポリペプチド配列とも称される親ポリペプチド配列と少なくとも１つのアミノ酸によって異なるポリペプチド配列を指す。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、キャプシドポリペプチドであり、変異体は、少なくとも１つのアミノ酸置換によって異なる。アミノ酸には、天然に存在するアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸、ならびにそれらの誘導体も含まれる。アミノ酸にはまた、Ｄ型およびＬ型の両方が含まれる。
【０１０７】
「単離された」プラスミド、核酸、ベクター、ウイルス、ビリオン、宿主細胞、タンパク質、または他の物質は、物質もしくは類似の物質が天然に発生する場合に存在するか、または最初に調製されるものに由来する他の構成成分のうちの少なくともいくつかが欠如した物質の調製物を指す。このため、例えば、単離された物質は、精製技法を使用してそれを源混合物から濃縮することによって調製されてもよい。濃縮は、溶液の体積あたりの重量などの絶対的な基準で測定することができ、または供給源混合物中に存在する干渉する可能性のある第２の物質との関連で測定することができる。本開示の実施形態の濃縮が増えることによって、増々、より単離される。単離されたプラスミド、核酸、ベクター、ウイルス、宿主細胞、または他の物質は、いくつかの実施形態では、例えば、約８０％〜約９０％純粋、少なくとも約９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、少なくとも約９８％純粋、または少なくとも約９９％以上純粋に精製される。
【０１０８】
「高度に保存された」という用語は、少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは９７％超の同一性を意味する。同一性は、当業者に既知のアルゴリズムおよびコンピュータプログラムを用いて当業者によって容易に決定される。
【０１０９】
核酸配列またはアミノ酸配列の文脈における「パーセント配列同一性」または「同一である」という用語は、最大限対応するようにアラインメントさせたときに同じである２つの配列中の残基を指す。配列同一性の比較の長さは、ゲノムノ全長、遺伝子コード配列の全長、または少なくとも約５００〜５０００個のヌクレオチドの断片にわたってもよい。しかしながら、少なくとも約９個のヌクレオチド、通常は少なくとも約２０〜２４個のヌクレオチド、少なくとも約２８〜３２個のヌクレオチド、少なくとも約３６個以上のヌクレオチドなどのより小さい断片間の同一性がまた、所望されてもよい。同様に、「パーセント配列同一性」は、タンパク質の全長にわたるアミノ酸配列またはその断片について容易に決定され得る。好適には、断片は、長さが少なくとも約８個のアミノ酸であり、最大で約７００個のアミノ酸であることができる。
【０１１０】
本明細書で使用する場合、「処置」、「処置する」などの用語は、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指す。この効果は、疾患またはその症状を完全にまたは部分的に防止するという点で予防的であり得、ならびに／または疾患および／もしくは疾患に起因する有害作用の部分的もしくは完全な治癒という点で処置であり得る。本明細書で使用する場合、「処置」は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の処置を含み、該「処置」には、（ａ）疾患にかかりやすいかまたは疾患に罹患するリスクがあるが、疾患を有するとまだ診断されていない対象において、疾患が発生するのを防止すること、（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち、その発達を阻害すること、および（ｃ）疾患を緩和すること、すなわち、疾患の退行を引き起こすことを含む。
【０１１１】
「個体」、「宿主」、「対象」、および「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用され、サルおよびヒトを含む、ヒトおよび非ヒト霊長類、競技哺乳動物（例えば、ウマ）、哺乳動物の家畜（例えば、ヒツジ、ヤギなど）、哺乳動物ペット（イヌ、ネコなど）、ならびにげっ歯類（例えば、マウス、ラットなど）を含むがこれらに限定されない、哺乳動物を指す。
【０１１２】
「薬学的に許容される」および「生理学的に許容される」という用語は、１つ以上の投与経路、インビボ送達または接触に好適な、生物学的に許容される製剤、気体、液体、または固体、またはそれらの混合物を意味する。「薬学的に許容される」または「生理学的に許容される」組成物は、生物学的にまたはさもなければ望ましくない材料であり、例えば、材料は、実質的に望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく対象に投与され得る。したがって、このような医薬組成物は、例えば、本明細書に開示されるＡＡＶベクターもしくはＡＡＶビリオン、または形質転換細胞を対象に投与するために使用されてもよい。
【０１１３】
本明細書で使用される「単位剤形」という語句は、処置される対象の単位投与量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、任意選択で薬学的担体（賦形剤、希釈剤、ビヒクル、または充填剤）と関連して所定の量を含み、１回以上の用量で投与される場合、所望の効果（例えば、予防的または治療的効果）を生じる。いくつかの実施形態では、単位剤形は、例えば、液体組成物または凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）もしくは凍結乾燥状態（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）の組成物を含むアンプルおよびバイアル内にあってもよく、例えば、滅菌液体担体は、インビボでの投与もしくは送達の前に添加することができる。個々の単位剤形は、多用量キットまたは容器に含まれ得る。ＡＡＶベクターまたはＡＡＶビリオン、およびその医薬組成物は、投与を容易にし、かつ投与量を均一にするために、単一または多数の単位剤形中にパッケージングすることができる。
【０１１４】
「治療有効量」は、実験および／または臨床試験により決定することができる比較的広い範囲に属する。例えば、インビボ注射、例えば、対象の組織（例えば、膵臓組織）に直接注射する場合、治療有効用量は、対象の体重１キログラムあたり約１０６〜約１０１５ほどのＡＡＶビリオンである。いくつかの実施形態では、治療有効用量は、対象の体重１キログラムあたり約１０８〜１０１２ほどのＡＡＶビリオンである。他の有効投与量は、用量応答曲線を確立する日常的な試験より、当業者によって容易に確立することができる。
【０１１５】
「有効量」または「十分な量」とは、単回投与または多数回投与で、単独でまたは１つ以上の他の組成物（薬物などの治療剤）、処置、プロトコル、もしくは治療レジメン薬剤（例えば、ワクチンレジメンを含む）との組み合わせで、任意の持続時間（長期もしくは短期）の検出可能な応答、任意の持続時間（例えば、分、時、日、月、年、もしくは治癒）における予想されるもしくは所望の転帰または任意の測定可能もしくは検出可能な程度の対象に対する利益を提供する量を指す。
【０１１６】
処置のための「有効量」または「十分な量」（例えば、改善するため、または治療上の利益もしくは改善を提供するため）の用量は、典型的には、疾患の１つ、多数、もしくは全ての有害な症状、結果、または合併症、例えば、疾患によって引き起こされるかもしくは疾患に関連する１つ以上の有害な症状、障害、病気、病態、または合併症に対する応答を測定可能な範囲で提供するのに有効であるが、疾患の進行または悪化を減少、軽減、阻害、抑制、制限、または制御することも満足な結果である。
【０１１７】
「予防」およびその文法的変形は、対象に対する接触、投与、またはインビボ送達が疾患前である方法を意味する。対象への投与またはインビボ送達は、疾患によって引き起こされるかまたは疾患に関連する有害な症状、状態、合併症などの発症前に行うことができる。例えば、記載される方法および使用の候補としてそのような対象を同定するために、スクリーニング（例えば、遺伝子）を使用することができるが、対象では、疾患が顕在化されなくてもよい。したがって、そのような対象には、機能的遺伝子産物（タンパク質）の不十分な量もしくは欠乏について陽性であるとスクリーニングされた対象、または疾患をもたらす異常、部分的に機能的もしくは非機能的な遺伝子産物（タンパク質）を産生する対象、および疾患をもたらす異常または欠陥（変異）遺伝子産物（タンパク質）について陽性であるとスクリーニングされた対象が含まれるが、そのような対象では、疾患の症状が顕在化されなくてもよい。
【０１１８】
「増強された中和プロファイル」という語句は、対象における中和抗体結合をより良く回避するＡＡＶベクターまたはビリオンの能力を指す。いくつかの場合では、より少ない中和抗体により、ＡＡＶ感染がより高いレベルの形質導入を生じさせることが可能となり、これにより、本発明の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド、ＡＡＶベクター、およびビリオンが遺伝子治療目的により適したものとなる。
【０１１９】
「トロピズム」と「形質導入」は、相互に関連していますが、違いがある。本明細書で使用される「トロピズム」という用語は、ＡＡＶベクターまたはビリオンが１つ以上の特定の細胞種に感染する能力を指すが、ベクターが、１つ以上の特定の細胞種において細胞に形質導入するためにどのように機能するかも包含することができ、すなわち、トロピズムは、特定の細胞種もしくは組織種へのＡＡＶベクターもしくはビリオンの優先的な侵入、および／または特定の細胞種または組織種への侵入、続いて、任意選択でかつ好ましくは、細胞内のＡＡＶベクターまたはビリオンによって担持される配列の発現（例えば、転写、および任意選択で翻訳）を容易にする、例えば、組換えウイルスでは、異種ヌクレオチド配列の発現を容易にする細胞表面との優先的な相互作用を指す。本明細書で使用する場合、「形質導入」という用語は、ＡＡＶベクターまたはビリオンが１つ以上の特定の細胞種に感染する能力を指し、すなわち、形質導入は、ＡＡＶベクターまたはビリオンの細胞への侵入、およびベクターゲノムから発現を得るためのＡＡＶベクターまたはビリオン内に含まれる遺伝物質の細胞中への移入を指す。全ての事例ではないが、いくつかの場合では、形質導入およびトロピズムは相関し得る。
【０１２０】
「トロピズムプロファイル」という用語は、１つ以上の標的細胞、組織、および／または臓器への形質導入のパターンを指す。例えば、いくつかのシャフリングＡＡＶキャプシド（変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド）は、ヒト膵臓組織またはヒト膵島の効率的な形質導入を提供する。逆に、いくつかのシャフリングＡＡＶキャプシドは、肝臓、性腺、および／または低レベルの生殖細胞への形質導入のみを有する。本明細書に開示される変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、ヒト膵臓組織またはヒト膵島の効率的かつ／または増強された形質導入を提供する。
【０１２１】
別途示さない限り、「効率的な形質導入」もしくは「効率的なトロピズム」または同様の用語は、好適な対照（例えば、それぞれ、対照への形質導入またはトロピズムの少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２５％、１５０％、１７５％、または２００％以上）を参照して決定することができる。好適な制御は、所望のトロピズムプロファイルを含む様々な要因に依存する。同様に、好適な対照を参照することによって、キャプシドおよび／またはウイルスが、標的組織について「効率的に形質導入しない」か、もしくは「効率的なトロピズムを有しない」か、または同様の用語であるかどうかを決定することができる。
【０１２２】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示していない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「組換えＡＡＶビリオン」への言及は、複数のそのようなビリオンを含み、「宿主細胞」への言及は、１つ以上の宿主細胞および当業者に既知のその等価物などへの言及を含む。特許請求の範囲は、いずれの任意選択の要素も排除するように起草され得ることにさらに留意されたい。このため、この記述は、特許請求された要素の列挙に関連した「専ら」、「のみ」などのような排他的な用語の使用、または「否定的」制限の使用に対する先行詞として機能することが意図される。
【０１２３】
本発明についてさらに記載する前に、本発明は、記載される特定の実施形態に限定されず、したがって、当然変化してもよいことが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
【０１２４】
ＡＡＶキャプシドおよびベクターの特徴
本発明のＡＡＶベクターは、多くの特徴を有する。いくつかの実施形態では、ベクターは、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドをコードする核酸配列を含む。そのようなＡＡＶベクターおよびそれらの特徴は、以下に詳細に説明される。
【０１２５】
本発明の例示的なＡＡＶベクターは、野生型または非変異親キャプシドタンパク質由来の少なくとも１つのアミノ酸についてアミノ酸配列が異なる変異ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする核酸を含む。アミノ酸の差異は、キャプシド中の溶媒アクセス可能部位、例えば、溶媒アクセス可能ループ中、または内腔中（すなわち、ＡＡＶキャプシドの内部空間）に位置することができる。いくつかの実施形態では、内腔は、ＡＡＶキャプシドの内部空間を含む。例えば、アミノ酸置換は、ＡＡＶキャプシドポリペプチド中のＧＨループに位置することができる。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９キャプシドポリペプチドにおけるアミノ酸置換を含む。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、本発明は、変異アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸であって、該変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、非変異キャプシドアミノ酸配列または非変異親キャプシドポリペプチド配列のサブ部分に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％を有するアミノ酸配列を含み、非変異親キャプシドポリペプチドをコードするベクターと比較して、膵臓組織またはヒト膵島において増加した形質導入またはトロピスヒトを示す、核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、変異アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸であって、該変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、親非変異キャプシドアミノ酸配列または非変異親キャプシドポリペプチド配列のサブ部分、例えば、野生型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９キャプシドポリペプチドに対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％を有するアミノ酸配列を含み、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドをコードするベクターと比較して、膵臓組織またはヒト膵島において増加した形質導入またはトロピズムを示す、単離核酸を提供する。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、ＡＡＶ血清型１、３、６、８、および９（すなわち、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９）由来の非変異親キャプシドポリペプチド配列由来の１つ以上の領域またはサブ部分を含む。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、配列番号２７〜４４のいずれか１つから選択される非変異親キャプシドポリペプチド配列由来の１つ以上の領域またはサブ部分を含む。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、対象ＡＡＶベクターは、非変異親キャプシドポリペプチドまたは非変異親キャプシドポリペプチドのサブ部分と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有する変異キャプシドポリペプチドをコードすることができる。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、当該技術分野で既知の他のベクター／プラスミドによってコードされる。いくつかの実施形態では、非変異親キャプシドポリペプチド配列は、配列番号２７〜４４のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、非変異親キャプシドポリペプチド配列は、配列番号４５〜６２のいずれか１つによってコードされる。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、アミノ酸またはその断片に言及する場合、実質的相同性または「実質的類似性」を示し、これは、好適なアミノ酸の挿入または欠失と、別のアミノ酸（もしくはその相補鎖）とが最適にアラインメントされた場合、アラインメントされた配列の少なくとも約９５％〜約９９％においてアミノ酸配列同一性があることを示す。いくつかの実施形態では、相同性は、全長配列またはそのポリペプチド、例えば、キャプシドタンパク質、もしくは少なくとも８個のアミノ酸、もしくはより好ましくは長さが少なくとも約１５個のアミノ酸のそれらの断片であり、非変異親キャプシドポリペプチド配列のサブ部分が含まれる。例えば、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチド配列または非変異親キャプシドポリペプチドのサブ部分と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含むことができる。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド配列は、配列番号１〜７のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド配列は、配列番号８〜１４のいずれか１つによってコードされる。いくつかの実施形態では、非変異親キャプシドポリペプチド配列は、配列番号２７〜４４のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、非変異親キャプシドポリペプチド配列は、配列番号４５〜６２のいずれか１つによってコードされる。
【０１２９】
【表２−１】
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【０１３０】
【表２−２】
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【０１３１】
【表２−３】
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【０１３２】
【表２−４】
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【０１３３】
【表２−５】
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【０１３４】
【表３−１】
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【０１３５】
【表３−２】
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【０１３６】
【表３−３】
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【０１３７】
【表３−４】
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【０１３８】
【表３−５】
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【０１３９】
【表３−６】
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【０１４０】
【表３−７】
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【０１４１】
【表３−８】
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【０１４２】
【表３−９】
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【０１４３】
【表４−１】
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【０１４４】
【表４−２】
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【０１４５】
【表４−３】
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【０１４６】
【表４−４】
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【０１４７】
【表４−５】
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【０１４８】
【表５−１】
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【０１４９】
【表５−２】
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【０１５０】
【表５−３】
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【０１５１】
【表５−４】
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【０１５２】
【表５−５】
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【０１５３】
【表５−６】
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【０１５４】
【表５−７】
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【０１５５】
【表５−８】
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【０１５６】
【表５−９】
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【０１５７】
【表５−１０】
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【０１５８】
【表５−１１】
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【０１５９】
【表５−１２】
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【０１６０】
いくつかの実施形態では、本発明の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、ヒト膵臓組織またはヒト膵島において増加した形質導入を示す。いくつかの実施形態では、形質導入は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または約１００％増加する。いくつかの実施形態では、形質導入は、約５％〜約８０％、約１０％〜約７０％、約２０％〜約６０％、約３０％〜約６０％、または約４０％〜約５０％増加する。いくつかの実施形態では、非変異親キャプシドポリペプチド配列は、配列番号２７〜４４のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、非変異親キャプシドポリペプチド配列は、配列番号４５〜６２のいずれか１つによってコードされる。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、本発明の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、ヒト膵臓組織またはヒト膵島において増加したトロピズムを示す。いくつかの実施形態では、トロピズムは、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または約１００％増加する。いくつかの実施形態では、トロピズムは、約５％〜約８０％、約１０％〜約７０％、約２０％〜約６０％、約３０％〜約６０％、または約４０％〜約５０％増加する。いくつかの実施形態では、非変異親キャプシドポリペプチド配列は、配列番号２７〜４４のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、非変異親キャプシドポリペプチド配列は、配列番号４５〜６２のいずれか１つによってコードされる。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、本発明の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、増強された中和プロファイルをさらに示す。いくつかの実施形態では、本発明の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、プールされたヒト免疫グロブリンに対する増強された中和プロファイルをさらに示す。いくつかの実施形態では、中和プロファイルは、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または約１００％増強される。いくつかの実施形態では、中和プロファイルは、約５％〜約８０％、約１０％〜約７０％、約２０％〜約６０％、約３０％〜約６０％、または約４０％〜約５０％増強される。いくつかの実施形態では、増強された中和プロファイルは、宿主における中和抗体の生成の減少によって決定される。いくつかの実施形態では、中和抗体の生成の減少は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または約１００％の減少である。いくつかの実施形態では、中和抗体の生成の減少は、約５％〜約８０％、約１０％〜約７０％、約２０％〜約６０％、約３０％〜約６０％、または約４０％〜約５０％の減少である。いくつかの実施形態では、非変異親キャプシドポリペプチド配列は、配列番号２７〜４４のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、非変異親キャプシドポリペプチド配列は、配列番号４５〜６２のいずれか１つによってコードされる。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、増強された中和プロファイルを示す変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、ＡＡＶ−１０Ａ１（配列番号１）およびＡＡＶ−１０Ａ３（配列番号２）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、増強された中和プロファイルを示す変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、ＡＡＶ−１０Ａ１（配列番号１）である。いくつかの実施形態では、増強された中和プロファイルを示す変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、ＡＡＶ−１０Ａ３（配列番号２）である。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、本発明の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、１つ以上のヒト幹細胞種において増加した形質導入またはトロピズムをさらに示す。いくつかの実施形態では、ヒト幹細胞の種類には、胚幹細胞、成体組織幹細胞（すなわち、体細胞幹細胞）、骨髄、前駆細胞、人工多能性幹細胞、およびリプログラム（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ）幹細胞が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、成体幹細胞は、オルガノイド（ｏｒｇａｎｏｉｄ）幹細胞（すなわち、体内の関心の任意の臓器または臓器系に由来する幹細胞）を含むことができる。身体の器官には、例えば、皮膚、髪の毛、爪、感覚受容器官、汗腺、油腺、骨、筋肉、脳、脊髄、神経、下垂体、松果腺、視床下部、甲状腺、副甲状腺、胸腺、副腎、膵臓（膵島組織）、心臓、血管、リンパ節、リンパ管、胸腺、脾臓、扁桃腺、鼻、咽頭、喉頭、気管、気管支、肺、口、咽頭、食道、胃、小腸、大腸、直腸、肛門管、歯、唾液腺、舌、肝臓、胆嚢、膵臓、盲腸、腎臓、尿管、膀胱、尿道、精巣、精管（輸精管）、尿道、前立腺、陰茎、陰嚢、卵巣、子宮、卵管（ファロピアン管）、膣、外陰部、および乳腺（乳房）が含まれるが、これらに限定されない。身体の臓器系には、外皮系、骨格系、筋肉系、神経系、内分泌系、心臓血管系、リンパ系、呼吸器系、消化器系、泌尿器系、および生殖器系が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、形質導入および／またはトロピズムは、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または約１００％増加する。いくつかの実施形態では、形質導入および／またはトロピズムは、約５％〜約８０％、約１０％〜約７０％、約２０％〜約６０％、または約３０％〜約６０％増加する。いくつかの実施形態では、非変異親キャプシドポリペプチド配列は、配列番号２７〜４４のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、非変異親キャプシドポリペプチド配列は、配列番号４５〜６２のいずれか１つによってコードされる。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、本発明の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、１つ以上の非膵臓ヒト組織において増加した形質導入またはトロピズムをさらに示す。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドをコードするベクターと比較して、１つ以上の非膵臓ヒト組織において増加した形質導入をさらに示す。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドをコードするベクターと比較して、１つ以上の非膵臓ヒト組織において増加したトロピズムをさらに示す。いくつかの実施形態では、形質導入および／またはトロピズムは、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または約１００％増加する。いくつかの実施形態では、形質導入および／またはトロピズムは、約５％〜約８０％、約１０％〜約７０％、約２０％〜約６０％、または約３０％〜約６０％増加する。いくつかの実施形態では、非変異親キャプシドポリペプチド配列は、配列番号２７〜４４のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、非変異親キャプシドポリペプチド配列は、配列番号４５〜６２のいずれか１つによってコードされる。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、本発明の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、１つ以上の非膵臓ヒト組織において増加した形質導入またはトロピズムをさらに示す。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドをコードするベクターと比較して、１つ以上の非膵臓ヒト組織において増加した形質導入をさらに示す。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドをコードするベクターと比較して、１つ以上の非膵臓ヒト組織において増加したトロピズムをさらに示す。いくつかの実施形態では、形質導入および／またはトロピズムは、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または約１００％増加する。いくつかの実施形態では、形質導入および／またはトロピズムは、約５％〜約８０％、約１０％〜約７０％、約２０％〜約６０％、または約３０％〜約６０％増加する。いくつかの実施形態では、非変異親キャプシドポリペプチド配列は、配列番号２７〜４４のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、非変異親キャプシドポリペプチド配列は、配列番号４５〜６２のいずれか１つによってコードされる。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド配列はＡＡＶ−１０Ａ１（配列番号１）、ＡＡＶ−１０Ａ３（配列番号２）、ＡＡＶ−１０Ａ４（配列番号３）、ＡＡＶ−１０Ａ５（配列番号４）、ＡＡＶ−１８Ａ１（配列番号５）、ＡＡＶ−１０Ｂ１（配列番号６）、ＡＡＶ−１０Ｂ３（配列番号７）、ＡＡＶ−１０Ｂ５（配列番号８）、ＡＡＶ−１０Ｂ６（配列番号９）、ＡＡＶ−１０Ｂ７（配列番号１０）、ＡＡＶ−１８Ｂ２（配列番号１２）、およびＡＡＶ−１８Ｂ３（配列番号１３）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド配列は、ＡＡＶ−１０Ａ１（配列番号１）、ＡＡＶ−１０Ａ３（配列番号２）、およびＡＡＶ−１８Ａ１（配列番号５）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、新規な変異をさらに含む。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドに対して、約９９％、約９８％、約９７％、約９６％、約９５％、約９４％、約９３％、約９２％、約９１％、または約９０％の同一性を示す。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、ＡＡＶ−１０Ａ１（配列番号１）、ＡＡＶ−１０Ａ３（配列番号２）、ＡＡＶ−１０Ａ４（配列番号３）、ＡＡＶ−１０Ａ５（配列番号４）、ＡＡＶ−１８Ａ１（配列番号５）、ＡＡＶ−１０Ｂ１（配列番号６）、ＡＡＶ−１０Ｂ３（配列番号７）、ＡＡＶ−１０Ｂ５（配列番号８）、ＡＡＶ−１０Ｂ６（配列番号９）、ＡＡＶ−１０Ｂ７（配列番号１０）、ＡＡＶ−１８Ｂ２（配列番号１２）、およびＡＡＶ−１８Ｂ３（配列番号１３）と約９９％、約９８％、約９７％、約９６％、約９５％、約９４％、約９３％、約９２％、約９１％、または約９０％の同一性を示す。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、ＡＡＶ−１０Ａ１（配列番号１）、ＡＡＶ−１０Ａ３（配列番号２）、およびＡＡＶ−１８Ａ１（配列番号５）の１つ以上のサブ領域と約９９％、約９８％、約９７％、約９６％、約９５％、約９４％、約９３％、約９２％、約９１％、または約９０％の同一性を示す。いくつかの実施形態では、非変異親キャプシドポリペプチド配列は、配列番号２７〜４４のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、非変異親キャプシドポリペプチド配列は、配列番号４５〜６２のいずれか１つによってコードされる。
【０１６８】
本発明はまた、ＡＡＶ−１０Ａ１（配列番号１）、ＡＡＶ−１０Ａ３（配列番号２）、ＡＡＶ−１０Ａ４（配列番号３）、ＡＡＶ−１０Ａ５（配列番号４）、ＡＡＶ−１８Ａ１（配列番号５）、ＡＡＶ−１０Ｂ１（配列番号６）、ＡＡＶ−１０Ｂ３（配列番号７）、ＡＡＶ−１０Ｂ５（配列番号８）、ＡＡＶ−１０Ｂ６（配列番号９）、ＡＡＶ−１０Ｂ７（配列番号１０）、ＡＡＶ−１８Ｂ２（配列番号１２）、およびＡＡＶ−１８Ｂ３（配列番号１３）などの変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドを生成することを提供する。いくつかの実施形態では、本発明はまた、ＡＡＶ−１０Ａ１（配列番号１）、ＡＡＶ−１０Ａ３（配列番号２）、およびＡＡＶ−１８Ａ１（配列番号５）などの変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドを生成することを提供する。これらの方法は、ライブラリー生成の既知の技術を用いるが、該方法は、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド生成中に複製能を有するＡＡＶベクターを用いる点（すなわち、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドの選択および進化）において新規である。本発明は、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドの生成方法であって、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、ヒト膵臓組織またはヒト膵島において増加した形質導入またはトロピズムを示し、該方法が、
ａ）変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド遺伝子のライブラリーを生成することであって、上記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド遺伝子は、２つ以上の非変異親キャプシドポリペプチド由来の配列を含む複数の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド遺伝子を含むことと、
ｂ）上記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド遺伝子ライブラリーをＡＡＶベクターにクローニングすることによってＡＡＶベクターライブラリーを生成することであって、上記ＡＡＶベクターが複製能を有するＡＡＶベクターであることと、
ｃ）非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、ヒト膵臓組織またはヒト膵島において増加した形質導入またはトロピズムを示す変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドをコードするｂ）の上記ＡＡＶベクターライブラリーをスクリーニングすることと、
ｄ）ｃ）の上記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドを選択することと、を含む、方法を提供する。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、方法は、ｅ）ｄ）から上記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドの配列を決定することをさらに含む。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、本発明のスクリーニング方法によって生成される変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドをコードするベクターと比較して、ヒト膵臓組織またはヒト膵島において増加した形質導入を示す。いくつかの実施形態では、形質導入は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または約１００％増加する。いくつかの実施形態では、形質導入は、約５％〜約８０％、約１０％〜約７０％、約２０％〜約６０％、約３０％〜約６０％、または約４０％〜約５０％増加する。いくつかの実施形態では、非変異親キャプシドポリペプチド配列は、配列番号２７〜４４のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、非変異親キャプシドポリペプチド配列は、配列番号４５〜６２のいずれか１つによってコードされる。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、本発明のスクリーニング方法によって生成される変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドをコードするベクターと比較して、ヒト膵臓組織またはヒト膵島において増加したトロピズムを示す。いくつかの実施形態では、トロピズムは、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または約１００％増加する。いくつかの実施形態では、トロピズムは、約５％〜約８０％、約１０％〜約７０％、約２０％〜約６０％、約３０％〜約６０％、または約４０％〜約５０％増加する。いくつかの実施形態では、非変異親キャプシドポリペプチド配列は、配列番号２７〜４４のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、非変異親キャプシドポリペプチド配列は、配列番号４５〜６２のいずれか１つによってコードされる。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、本発明のスクリーニング方法によって生成される変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドをコードするベクターと比較して、増強された中和プロファイルをさらに示す。いくつかの実施形態では、中和プロファイルは、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または約１００％増強される。いくつかの実施形態では、中和プロファイルは、約５％〜約８０％、約１０％〜約７０％、約２０％〜約６０％、約３０％〜約６０％、または約４０％〜約５０％増強される。いくつかの実施形態では、増強された中和プロファイルは、宿主における中和抗体の生成の減少によって決定される。いくつかの実施形態では、中和抗体の生成の減少は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または約１００％の減少である。いくつかの実施形態では、中和抗体の生成の減少は、約５％〜約８０％、約１０％〜約７０％、約２０％〜約６０％、約３０％〜約６０％、または約４０％〜約５０％の減少である。いくつかの実施形態では、非変異親キャプシドポリペプチド配列は、配列番号２７〜４４のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、非変異親キャプシドポリペプチド配列は、配列番号４５〜６２のいずれか１つによってコードされる。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、本発明のスクリーニング方法によって生成される変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドをコードするベクターと比較して、１つ以上の非膵臓ヒト組織において増加した形質導入またはトロピズムをさらに示す。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドをコードするベクターと比較して、１つ以上の非膵臓ヒト組織において増加した形質導入をさらに示す。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドをコードするベクターと比較して、１つ以上の非膵臓ヒト組織において増加したトロピズムをさらに示す。いくつかの実施形態では、形質導入および／またはトロピズムは、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または約１００％増加する。いくつかの実施形態では、形質導入および／またはトロピズムは、約５％〜約８０％、約１０％〜約７０％、約２０％〜約６０％、または約３０％〜約６０％増加する。いくつかの実施形態では、非変異親キャプシドポリペプチド配列は、配列番号２７〜４４のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、非変異親キャプシドポリペプチド配列は、配列番号４５〜６２のいずれか１つによってコードされる。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、本発明のスクリーニング方法によって生成される変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドをコードするベクターと比較して、１つ以上の非膵臓ヒト組織において増加した形質導入またはトロピズムをさらに示す。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドをコードするベクターと比較して、１つ以上の非膵臓ヒト組織において増加した形質導入をさらに示す。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドをコードするベクターと比較して、１つ以上の非膵臓ヒト組織において増加したトロピズムをさらに示す。いくつかの実施形態では、形質導入および／またはトロピズムは、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または約１００％増加する。いくつかの実施形態では、形質導入および／またはトロピズムは、約５％〜約８０％、約１０％〜約７０％、約２０％〜約６０％、または約３０％〜約６０％増加する。いくつかの実施形態では、非変異親キャプシドポリペプチド配列は、配列番号２７〜４４のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、非変異親キャプシドポリペプチド配列は、配列番号４５〜６２のいずれか１つによってコードされる。
【０１７５】
形質導入は、例えば、以下の実施例２に記載されるものを含む免疫蛍光およびフローサイトメトリー分析、ならびに当該技術分野で既知の他の方法を含む、当該技術分野で既知の技術によって測定することができる。インビトロ導入分析は、ヒト膵臓組織またはヒト膵島細胞において、再び当該技術分野で説明されるように、または例えばＧＦＰ発現（または別のマーカー遺伝子）を測定することを含む以下の実施例１および２に記載されるように、導入を決定するために行うことができる。インビボまたはエクスビボ導入分析は、再び当該技術分野で説明されるように、またはルシフェラーゼ発現（もしくは別のマーカー遺伝子）を測定することを含む以下の実施例で記載されるように、例えばホタルシフェラーゼベースアッセイを含む当該技術分野で既知の技術によって、導入を決定するために測定することができる。いくつかの実施形態では、形質導入効率の変化を決定するために、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドがパッケージングされたＡＡＶベクターからのマーカー発現が、非変異親キャプシドポリペプチドがパッケージングされたＡＡＶベクターからのマーカー発現と比較される。いくつかの実施形態では、形質導入が、トロピズムを決定するために異なる細胞種について比較され、すなわち、トロピズムプロファイルと称する場合もある特定の細胞種についてのトロピズムを決定するために、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドがパッケージングされたＡＡＶベクターからの形質導入を、少なくとも２つの異なる細胞種における非変異キャプシドポリペプチドがパッケージングされたＡＡＶからの形質導入と比較する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの細胞種は、ヒト膵臓組織またはヒト膵島細胞由来である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの細胞種は、ヒトα−膵島細胞またはβ−膵島細胞である。いくつかの実施形態では、少なくとも第２の細胞種は、血液細胞、血幹細胞、肝臓細胞、性腺、生殖細胞、関節組織もしくは細胞、膵臓（α−膵島細胞および／もしくはβ−膵島細胞を含む）、脾臓組織もしくは細胞、胃腸管、肺組織もしくは細胞、ならびに／または腎臓組織もしくは細胞を含むが、これらに限定されない。
【０１７６】
変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドを生成するための方法には、一連または複数のＡＡＶ擬似種（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９＿ｈｕ１４、ウシＡＡＶ、鳥類ＡＡＶ）由来のキャプシド遺伝子のファミリーを用いて開始される、キャプシドタンパク質のＤＮＡシャフリングが含まれ、該キャプシド遺伝子は、酵素的にシャフリングされて、キャプシド遺伝子の多様なライブラリーを作製し、該キャプシド遺伝子は、ＡＡＶシャトルプラスミドに再びクローニングされ、生きた複製ウイルスライブラリーを生成するために利用される（例えば、図１および図３を参照のこと）。非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、シャフリングキャプシド（すなわち、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド）がヒト膵臓組織および／またはヒト膵島を機能的に形質導入し得る確率を最大限にするために、本発明は、インタクトな一次ヒト膵島および分離ヒト膵島細胞において２つの同時スクリーニングを行うことを企図する。
【０１７７】
両方のスクリーニングの完了時に、完全なＳａｎｇｅｒ配列決定、および親血清型（すなわち、親非変異キャプシドポリペプチド配列）との系統比較のために、変異体が各スクリーニングから選択される。いくつかの実施形態では、親非変異キャプシドポリペプチド配列は、初期のライブラリーに入ったものである。各スクリーニングから最も高度に選択された変異体（例えば、形質導入および／またはトロピズムの最も高い増加を示す変異体）は、いくつかの場合ではその後の検証実験で使用するために、単離され、発現構築物と共にベクター化される。いくつかの実施形態では、各スクリーニングから選択される進化したキャプシド（すなわち、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド）に対する各親ＡＡＶ血清型（すなわち、非変異親キャプシドポリペプチド）の遺伝的寄与度を評価するために、新規なキャプシド（すなわち、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド）中の各位置に対する親（すなわち、非変異親キャプシドポリペプチド）の寄与確率についての濃縮スコアを計算するために、交差マッピング（例えば、図４および図２１を参照）および生物情報学的予測分析（例えば、図１０および図１１を参照）を行うことができる。両方の方法論により、進化したキャプシド変異体の高度にシャフリングされた性質が実証され、選択されたキャプシド内に存在する特有のドメインおよび共有ドメインの両方が明らかにされた。いくつかの実施形態では、進化した変異体に最も寄与する親キャプシド（すなわち、非変異親キャプシドポリペプチド）には、ＡＡＶ−１０Ａ１（配列番号１）、ＡＡＶ−１０Ａ３（配列番号２）、およびＡＡＶ−１８Ａ１（配列番号５）が含まれる。
【０１７８】
インビトロでの特徴付けは、様々な膵臓由来細胞株における対照血清型（すなわち、非変異親キャプシドポリペプチド）を上回る変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドによる形質導入の有意な増加を実証するために使用される。
【０１７９】
そのような分析のために、ＡＡＶベクター化変異体（変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドからなるＡＡＶベクター）の大規模な超高純度産生を行うことができ、最終的な臨床使用のために十分に高い力価（例えば、変異体ＡＡＶ−１０Ａ１（配列番号１）、ＡＡＶ−１０Ａ３（配列番号２）、ＡＡＶ−１０Ａ４（配列番号３）、ＡＡＶ−１０Ａ５（配列番号４）、ＡＡＶ−１８Ａ１（配列番号５）、ＡＡＶ−１０Ｂ１（配列番号６）、ＡＡＶ−１０Ｂ３（配列番号７）、ＡＡＶ−１０Ｂ５（配列番号８）、ＡＡＶ−１０Ｂ６（配列番号９）、ＡＡＶ−１０Ｂ７（配列番号１０）、ＡＡＶ−１８Ｂ２（配列番号１２）、およびＡＡＶ−１８Ｂ３（配列番号１３）、特に、ＡＡＶ−１０Ａ１（配列番号１）、ＡＡＶ−１０Ａ３（配列番号２）、およびＡＡＶ−１８Ａ１（配列番号５）を生成することができるものをさらに検証するために考慮する。
【０１８０】
本発明の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドをコードするＡＡＶベクターの活性を調べるために、エクスビボヒト膵臓組織を使用してさらなる検証を行うことができる。エクスビボヒト膵臓外植形質導入は、ヒト膵臓組織における有意に増加した発現を特異的に検証するために使用される。エクスビボ分析および／またはアッセイで使用するための試料には、外科標本からのヒト膵臓単離物が含まれ得るが、これらに限定されない。そのようなヒト膵臓標本は、外科的単離によって、男性および女性患者の両方から得ることができる。エクスビボ分析および／またはアッセイで使用するための試料には、非ヒト膵臓単離物が含まれ得るが、これらに限定されない。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、ヒト膵臓または膵島は、インビトロ分析および／またはアッセイに使用することができる。
【０１８２】
キメラヒト化膵臓異種移植片は、ヒト様インビボ系をモデル化するための強力なツールであるが、それらは、マウス細胞が継続的に存在すること、ならびにマウスおよびヒトタンパク質の両方を同時に発現する融合産物のキメラ特性を考慮すると、ヒト患者における予測される形質導入を正確に規定する能力について限定される。いくつかの実施形態では、死亡した臓器ドナーから回収された膵島を、患者への移植前に特定の転写因子を発現するｒＡＡＶで処置することができる。膵島移植は、１型糖尿病の処置として長年行われており、当業者に周知の手術である。いくつかの実施形態では、死亡した臓器ドナーから回収された膵島を、本明細書に記載される本発明のｒＡＡＶベクターで処置することができる。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、変異親キャプシドポリペプチドをコードするＡＡＶベクターの増加した形質導入が、分裂および非分裂ヒト膵臓細胞種の両方において示される。いくつかの実施形態では、変異親キャプシドポリペプチドをコードするＡＡＶベクターの増加した形質導入が、分裂膵臓細胞において示される。いくつかの実施形態では、変異親キャプシドポリペプチドをコードするＡＡＶベクターの増加した形質導入が、長期の導入遺伝子発現を有する非分裂膵臓細胞において示される。
【０１８４】
ＡＡＶベクター要素
核酸挿入物（異種ヌクレオチド配列とも称される）は、インビボでヌクレオチド配列におけるその転写または発現を指示する制御要素に動作可能に連結することができる。そのような制御要素は、選択された遺伝子（例えば、内因性細胞制御要素と通常関連する制御配列を含むことができる。あるいは、異種制御配列を用いることができる。有用な異種対照配列は、一般的に、哺乳動物またはウイルス遺伝子をコードする配列に由来するものを含む。例には、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ  ＭＬＰ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、目的遺伝子に対して異種である内因性細胞プロモーター、ＣＭＶ即時型初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）などのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、合成プロモーター、ハイブリッドプロモーターなどが含まれるが、これらに限定されない。さらに、マウスメタロチオネイン遺伝子などの非ウイルス遺伝子由来の配列も使用することができる。そのようなプロモーター配列は、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）から市販されている。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、細胞種特異的または組織特異的プロモーターは、異種遺伝子産物をコードする核酸挿入物（異種ヌクレオチド配列とも称される）に作動可能に連結することができ、特定の細胞種または組織において選択的または優先的に遺伝子産物を産生することを可能にする。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、異種核酸に作動可能に連結することができる。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、核酸は、本発明の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドと共にパッケージングされる。いくつかの実施形態では、核酸挿入物またはパッケージングされる核酸は、少なくとも５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、または１５００個の核酸長である。いくつかの実施形態では、核酸挿入物またはパッケージングされる核酸は、少なくとも５０個の核酸〜少なくとも１５００個の核酸である。いくつかの実施形態では、核酸挿入物またはパッケージングされる核酸は、少なくとも１００個の核酸〜少なくとも１４００個の核酸である。いくつかの実施形態では、核酸挿入物またはパッケージングされる核酸は、少なくとも２００個の核酸〜少なくとも１１００個の核酸である。いくつかの実施形態では、核酸挿入物またはパッケージングされる核酸は、少なくとも３００個の核酸〜少なくとも１０００個の核酸である。いくつかの実施形態では、核酸挿入物またはパッケージングされる核酸は、少なくとも１００個の核酸〜少なくとも９００個の核酸である。いくつかの実施形態では、核酸挿入物またはパッケージングされる核酸は、少なくとも２００個の核酸〜少なくとも９００個の核酸である。いくつかの実施形態では、核酸挿入物またはパッケージングされる核酸は、少なくとも３００個の核酸〜少なくとも９００個の核酸である。いくつかの実施形態では、核酸挿入物またはパッケージングされる核酸は、少なくとも１００個の核酸〜少なくとも６００個の核酸である。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドによってパッケージングされるＡＡＶベクターは、全長で少なくとも約２０００個の核酸であり、全長で最大約５０００個の核酸である。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドによってパッケージングされるＡＡＶベクターは、約２０００個の核酸、約２４００個の核酸、約２８００個の核酸、約３０００個の核酸、約３２００個の核酸、約３４００個の核酸、約３６００個の核酸、約３８００個の核酸、約４０００個の核酸、約４２００個の核酸、約４４００個の核酸、約４６００個の核酸、約４７００個の核酸、または約４８００個の核酸である。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドによってパッケージングされるＡＡＶベクターは、約２０００個の核酸（２ｋｂ）〜約５０００個の核酸（５ｋｂ）である。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドによってパッケージングされるＡＡＶベクターは、約２４００個の核酸（２．４ｋｂ）〜約４８００個の核酸（４．８ｋｂ）である。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドによってパッケージングされるＡＡＶベクターは、約３０００個の核酸（３ｋｂ）〜約５０００個の核酸（５ｋｂ）である。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドによってパッケージングされるＡＡＶベクターは、約３０００個の核酸（３ｋｂ）〜約４０００個の核酸（４ｋｂ）である。
【０１８８】
本明細書に開示されるＡＡＶベクターまたはＡＡＶビリオンはまた、ＡＡＶベクターによりトランスフェクトされた細胞中または本発明に従って産生されたＡＡＶビリオンに感染した細胞中で転写、翻訳、および／または発現を可能にするような様式で核酸挿入物（異種ヌクレオチド配列とも称される）に作動可能に連結された従来の制御要素を含むことができる。本明細書中で使用される場合、「作動可能に連結された」配列は、関心の遺伝子と連続する発現制御配列および目的の遺伝子を制御するためにトランスでまたは遠隔で作用する発現制御配列の両方を含む。
【０１８９】
発現制御配列には、適切な転写開始、終結、プロモーター、およびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を高める配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を増大する配列；および必要に応じて、コードされた産物の分泌を増大する配列が含まれる。天然、構成的、誘導性、および／または組織特異的プロモーターを含む非常に多くの発現制御配列は当該技術分野で既知であり、利用され得る。
【０１９０】
構成的プロモーターの例には、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択でＲＳＶエンハンサーを有する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意選択でＣＭＶエンハンサーを有する）（例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５３０（１９８５）を参照のこと）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１プロモーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれるが、これに限定されない。誘導性プロモーターは、遺伝子発現の調節を可能にし、外来的に供給される化合物、温度などの環境因子、または特定の生理学的状態（例えば、急性期、細胞の特定の分化状態、もしくは複製細胞中のみ）の存在によって調節することができる。誘導性プロモーターおよび誘導系は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、およびＡｒｉａｄを含むが限定するものではない、様々な商業的供給者から入手可能である。多くの他の系が記載されており、当業者によって容易に選択することができる。外因的に供給される化合物によって調節される誘導性プロモーターの例には、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（ＷＯ９８／１００８８）、エクジソン昆虫プロモーター（Ｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：３３４６−３３５１）、テトラサイクリン抑制系（Ｇｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７−５５５１）、テトラサイクリン誘導系（Ｇｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６−１７６９，ｓｅｅ  ａｌｓｏ  Ｈａｒｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２：５１２−５１８）、ＲＵ４８６誘導系（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５：２３９−２４３およびＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，４：４３２−４４１）、およびラパマイシン誘導系（Ｍａｇａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：２８６５−２８７２）が含まれる。この文脈において有用である他の種類の誘導性プロモーターは、特定の生理学的状態、例えば、温度、急性期、特定の細胞分化状態、または複製細胞中のみにより調節されるものである。
【０１９１】
別の実施形態では、核酸挿入物の天然プロモーター（異種のヌクレオチド配列とも称される）が使用される。核酸挿入物（異種ヌクレオチド配列とも称される）の発現が天然の発現を模倣することが所望される場合、天然プロモーターが好ましいものであり得る。核酸挿入物（異種ヌクレオチド配列とも称される）の発現を時間的もしくは発生的に、もしくは組織特異的に、または特定の転写刺激に応答して調節する必要がある場合に、天然プロモーターを使用してもよい。さらなる実施形態では、エンハンサー要素、ポリアデニル化部位、またはコザックコンセンサス配列などの他の天然発現制御要素はまた、天然の発現を模倣するために使用されてもよい。
【０１９２】
核酸挿入物（異種ヌクレオチド配列とも称される）の別の実施形態は、組織特異的プロモーターに作動可能に連結された遺伝子を含む。例えば、膵臓での発現が所望される場合、膵臓で活性なプロモーターが使用されるべきである。これらには、天然に存在するプロモーターよりも高い活性を有する、骨格βアクチン、ミオシン軽鎖２Ａ、ジストロフィン、および筋クレアチンキナーゼをコードする遺伝子由来のプロモーターが含まれる（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７：２４１−２４５（１９９９）を参照のこと）。組織特異的であるプロモーターの例は、特に、肝臓（アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５１２４−３２；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇ  ｅｔ  ａｌ，（１９９６）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，３：１００２−９；α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，７：１５０３−１４）、骨オステオカルシン（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，２４：１８５−９６）；骨シアロタンパク質（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１１：６５４−６４）、リンパ球（ＣＤ２，Ｈａｎｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：１０６３−８；免疫グロブリン重鎖；Ｔ細胞レセプター鎖）、ニューロン、例えば、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１３：５０３−１５）、ニューロフィラメント軽鎖遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６１１−５）、およびニューロン特異的  ｖｇｆ  遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３−８４）について既知である。
【０１９３】
様々な実施形態では、１つ以上の治療的に有用な核酸挿入物（異種ヌクレオチド配列とも称される）を有するＡＡＶベクターまたはＡＡＶビリオンは、特に、選択マーカーまたはレポーター遺伝子、例えば、ゲネチシン、ハイグロマイシン、またはプリマイシン耐性をコードする配列を含む。選択可能なレポーターまたはマーカー遺伝子は、例えばアンピシリン耐性を調べることを含む、細菌細胞中のプラスミド／ベクターの存在をシグナル伝達するために使用することができる。プラスミドの他の成分は、複製起点を含むことができる。これらおよび他のプロモーターならびにベクター要素の選択は、慣用的であり、多くのそのような配列が利用可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．およびその中で引用されている参考文献を参照のこと）。
【０１９４】
宿主細胞およびパッケージング
宿主細胞は、感染性ＡＡＶベクターを生成するため、および開示されたＡＡＶベクターに基づいてＡＡＶビリオンを生成するために必要である。したがって、本発明は、本発明のＡＡＶベクターに基づいてＡＡＶビリオンを生成およびパッケージングするための宿主細胞を提供する。様々な宿主細胞が、当該技術分野で既知であり、本発明の方法に用途を見出される。本明細書に記載されるまたは当該技術分野において既知の任意の宿主細胞を、本明細書に記載の組成物および方法で用いることができる。
【０１９５】
本明細書の開示は、さらに、宿主細胞、例えば、対象核酸を含む単離された（遺伝子修飾された）宿主細胞を提供する。対象宿主細胞は、単離された細胞、例えば、インビトロ培養物中の細胞であり得る。対象宿主細胞は、以下に記載される対象ＡＡＶベクターまたはＡＡＶビリオンを産生するのに有用である。対象宿主細胞が対象ＡＡＶビリオンを産生するために使用される場合、これを「パッケージング細胞」と称する。いくつかの実施形態では、対象宿主細胞は、対象ＡＡＶベクターで安定的に遺伝子修飾される。他の実施形態では、対象宿主細胞は、対象ＡＡＶベクターで一過性で遺伝子修飾される。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、対象核酸は、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム媒介トランスフェクション、バキュロウイルス感染などを含むがこれらに限定されない確立された技術を使用して、宿主細胞に安定的にまたは一過性で導入される。安定的な形質転換のために、対象核酸は、一般的に、選択マーカー、例えば、ネオマイシン耐性などのいくつかの周知の選択マーカーのいずれかをさらに含む。
【０１９７】
一般的に、本発明によるＡＡＶベクターをトランスフェクションによって送達する場合、ＡＡＶベクターは、約５μｇ〜約１００μｇのＤＮＡ、約１０〜約５０μｇのＤＮＡから約１×１０４個の細胞〜約１×１０１３個の細胞、または約１×１０５個の細胞の量で送達される。しかしながら、選択されたベクター、送達方法、および選択された宿主細胞などの因子を考慮して、宿主細胞に対するベクターＤＮＡの相対量を調整することができ、そのような調整は当業者の技能レベル内である。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、感染性ビリオンの生成に使用するための宿主細胞は、原核（例えば、細菌）細胞を含む任意の生物、ならびに昆虫細胞、酵母細胞、および哺乳動物細胞を含む真核細胞から選択することができる。対象宿主細胞は、様々な細胞、例えば、哺乳動物細胞（例えば、マウス細胞および霊長類細胞（例えば、ヒト細胞）を含む）のいずれかに対象核酸（すなわち、ＡＡＶベクター）を導入することによって生成される。特に望ましい宿主細胞は、任意の哺乳動物種の中から選択される。いくつかの実施形態では、細胞には、Ａ５４９、ＷＥＨＩ、１０Ｔ１／２、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０、ＷＩ３８、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、２９３、Ｖｅｒｏ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、Ｈｕｈ−７  Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、ＲＡＴ１、Ｓｆ９、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）、ヒト胚幹細胞、ヒト成体組織幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、リプログラム幹細胞、オルガノイド幹細胞、骨髄幹細胞、ＨＬＨｅｐＧ２、ＨｅｐＧ２、ならびにヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、およびハムスターを含む哺乳動物由来の一次線維芽細胞、肝細胞、および筋芽細胞などが含まれるが、これらに限定されない。細胞を提供する哺乳動物種の選択は、本発明を限定するものではなく、哺乳動物細胞の種類、すなわち、線維芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞などを限定するものでもない。使用する細胞に対して必要なことは、ＡＡＶベクターによる感染またはトランスフェクションが可能であることである。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、いくつかの実施形態では本明細書に記載の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドを含む、細胞中で安定してトランスフェクトされたＲｅｐおよびＣａｐを有する細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本発明の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドまたは本明細書に記載のＡＡＶベクターの一部、例えば、ＡＡＶベクター内に含まれる異種核酸配列を発現する。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、本発明による宿主細胞の調製物は、選択されたＤＮＡ配列組み立てなどの技術を伴う。この組み立ては、従来の技術を利用して達成されてもよい。そのような技術には、周知であり、かつ上記で引用したＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．に記載された、ｃＤＮＡおよびゲノムクローニング、ポリメラーゼ連鎖反応、合成方法、および所望のヌクレオチド配列を提供する任意の他の好適な方法と組み合わせたアデノウイルスおよびＡＡＶゲノムの重複したオリゴヌクレオチド配列の使用が含まれる。
【０２００】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターの宿主細胞への導入は、当業者に既知であり、かつ本明細書全体を通して考察されているような技術を使用して達成されてもよい。好ましい実施形態では、標準的なトランスフェクション技術、例えば、ＣａＰＯ４トランスフェクションもしくはエレクトロポレーション、および／またはハイブリッドアデノウイルス／ＡＡＶベクターによる、ヒト胚性腎臓細胞株ＨＥＫ２９３（トランス作用Ｅ１タンパク質を提供する機能的アデノウイルスＥ１遺伝子を含むヒト腎臓細胞株）などの細胞株への感染が使用される。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾された宿主細胞は、上記のような変異ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に加えて、１つ以上のＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。他の実施形態では、対象宿主細胞は、ＡＡＶベクターをさらに含む。そのような宿主細胞を使用してＡＡＶビリオンを生成することができる。ＡＡＶビリオンを生成する方法は、例えば、米国特許出願公開第２００５／００５３９２２号および米国特許出願公開第２００９／０２０２４９０号に記載されている。
【０２０２】
ＡＡＶベクターに加えて、例示的な実施形態では、宿主細胞は、宿主細胞でのＡＡＶキャプシドポリペプチド（変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドおよび非変異親キャプシドポリペプチドを含む）の発現を駆動する配列、および核酸挿入物（異種ヌクレオチド配列とも称される）に見出されるＡＡＶ反転末端反復（ＩＴＲ）の血清型または交差相補（ｃｒｏｓｓ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）血清型と同じ血清型のＲｅｐ配列を含む。ＡＡＶ ＣａｐおよびＲｅｐ配列は、ＡＡＶ供給源から独立して取得されてもよく、当業者に既知の任意の様式で、または本明細書に記載されるようにして宿主細胞に導入されてもよい。さらに、例えば、ＡＡＶ８キャプシド中でＡＡＶベクターをシュードタイピングする（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｉｎｇ）場合、必須Ｒｅｐタンパク質の各々をコードする配列は、ＡＡＶ８によって供給されてもよく、またはＲｅｐタンパク質をコードする配列は、異なるＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、および／もしくはＡＡＶ９）によって供給されてもよい。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、上記のものなどの好適なプロモーター（例えば、本発明の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドを含む）の制御下でキャプシドタンパク質を安定的に含む。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、誘導性プロモーターの制御下で発現される。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、トランスで宿主細胞に供給される。宿主細胞にトランスで送達される場合、キャプシドタンパク質は、宿主細胞での選択されたキャプシドタンパク質の発現を指示するのに必要な配列を含むプラスミドにより送達されてもよい。いくつかの実施形態では、トランスで宿主細胞に送達される場合、キャプシドタンパク質をコードするベクター（例えば、本発明の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドを含む）はまた、ＡＡＶ、例えばＲｅｐ配列をパッケージングするために必要な他の配列を有する。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、上記のものなどの好適なプロモーターの制御下でＲｅｐ配列を安定的に含む。いくつかの実施形態では、必須Ｒｅｐタンパク質は、誘導性プロモーターの制御下で発現される。別の実施形態では、Ｒｅｐタンパク質は、トランスで宿主細胞に供給される。トランスで宿主細胞に送達される場合、Ｒｅｐタンパク質は、宿主細胞での選択されたＲｅｐタンパク質の発現を指示するために必要な配列を含むプラスミドにより送達されてもよい。いくつかの実施形態では、トランスで宿主細胞に送達される場合、キャプシドタンパク質（例えば、本発明の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドを含む）をコードするベクターはまた、ＡＡＶベクター、例えば、Ｒｅｐ配列をパッケージングするために必要な他の配列を有する。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、Ｒｅｐ配列およびＣａｐ配列は、単一核酸分子上で宿主細胞にトランスフェクションされてもよく、非組み込みエピソームとして細胞内に安定して存在してもよい。別の実施形態では、ＲｅｐおよびＣａｐ配列は、細胞の染色体に安定的に組み込まれる。別の実施形態は、宿主細胞で一過性で発現されるＲｅｐおよびＣａｐ配列を有する。例えば、そのようなトランスフェクションのための有用な核酸分子は、５’から３’に、プロモーター、プロモーターとＲｅｐ遺伝子配列の開始部位との間に挿入された任意選択によるスペーサー、ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子配列、およびＡＡＶ Ｃａｐ遺伝子配列を含む。
【０２０６】
Ｒｅｐおよびキャプシドを提供する分子は、宿主細胞内に一過性で（すなわち、トランスフェクションを介して）存在することができるが、いくつかの実施形態では、Ｒｅｐおよびキャプシドタンパク質のうちの１つまたは両方、ならびにそれらの発現を制御するプロモーターは、例えば、エピソームとして、または宿主細胞の染色体への組み込みによって、宿主細胞中で安定的に発現される。本発明の実施形態を構築するために使用される方法は、上記参照文献に記載されるものなどの従来の遺伝子工学または組換え工学技術である。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、パッケージング宿主細胞は、本発明のＡＡＶベクターをＡＶビリオンにパッケージングするために、ヘルパー機能を必要とし得る。いくつかの実施形態では、これらの機能は、ヘルペスウイルスによって供給されてもよい。いくつかの実施形態では、必要なヘルパー機能は、各々ヒトまたは非ヒト霊長類アデノウイルス供給源から提供され、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、バージニア州マナサス（米国）を含む様々な供給源から入手可能である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｅ１ａ遺伝子産物、Ｅ１ｂ遺伝子産物、Ｅ２ａ遺伝子産物、および／またはＥ４  ＯＲＦ６遺伝子産物を提供し、および／またはそれらを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＶＡＩ  ＲＮＡなどの他のアデノウイルス遺伝子を含んでもよい。いくつかの実施形態では、宿主細胞には、他のアデノウイルス遺伝子または遺伝子機能は存在しない。
【０２０８】
異種核酸、核酸遺伝子産物、およびポリペプチド遺伝子産物
様々な実施形態では、本発明は、核酸およびポリペプチドを含む様々な治療用分子をパッケージングすることができるキャプシドを形成することができる、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、治療用分子はワクチンである。様々な実施形態では、本発明は、例えば、導入遺伝子挿入物または他の核酸挿入物を含む、核酸挿入物を含むことができるＡＡＶベクターを提供する。これにより、ベクターがポリペプチドを発現することが可能になる。そのような核酸は、異種核酸、核酸遺伝子産物、およびポリペプチド遺伝子産物を含むことができる。核酸挿入物の特徴は、以下に記載される。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶベクターは、核酸挿入物を含む。いくつかの実施形態では、核酸挿入物には、非コードＲＮＡ、タンパク質コード配列、発現カセット、多重発現カセット、相同性組換えのための配列、ゲノム遺伝子標的化カセット、および治療用発現カセットからなる群から選択される核酸配列を含むが、これらに限定されない。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、発現カセットは、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ発現系である。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、核酸挿入物は、異種遺伝子産物、例えば、核酸遺伝子産物またはポリペプチド遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、アプタマーである。遺伝子産物は、自己相補的核酸であり得る。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、ポリペプチドである。
【０２１２】
好適な異種遺伝子産物には、干渉ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、およびアプタマーが含まれる。遺伝子産物が干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）である場合、好適なＲＮＡｉには、細胞中の標的ポリペプチドのレベルを低下させるＲＮＡｉが含まれる。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、例示的なポリペプチド、核酸、または他の治療用分子には、膵臓組織関連疾患の処置に有用なものが含まれる。例示的な膵臓組織関連疾患には、真性糖尿病（例えば、Ｉ型およびＩＩ型）、急性膵炎、慢性膵炎、遺伝性膵炎、自己免疫性膵炎、膵臓癌（例えば、膵臓腺癌、膵腺房細胞癌、嚢胞腺癌、膵芽腫、膵粘液性嚢胞腫瘍など）、膵臓良性腫瘍（例えば、膵漿液嚢胞腺腫、充実性偽乳頭状膵臓腫瘍など）、膵内分泌腫瘍、嚢胞性線維症、膵外分泌不全（ＥＰＩ）、膵偽嚢胞、膵嚢胞、シュワッハマン・ダイアモンド症候群、ヨハンソン・ブリザード症候群、一般的なチャンネル症候群（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｃｈａｎｎｅｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ゾリンジャー・エリソン症候群、総胆管嚢胞、膵管出血、または先天性膵臓異常（例えば、膵管癒合不全、輪状膵、異所性膵組織）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、例示的なポリペプチドには、神経保護ポリペプチドおよび抗血管新生ポリペプチドが含まれる。好適なポリペプチドには、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ−２）、ナーチュリン（ｎｕｒｔｕｒｉｎ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ；例えば、神経成長因子−β）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）、ニューロトロフィン−６（ＮＴ−６）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、Ｗｎｔポリペプチド、可溶性Ｆｌｔ−１、アンジオスタチン、エンドスタチン、ＶＥＧＦ、抗ＶＥＧＦ抗体、可溶性ＶＥＧＦＲ、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、およびヘッジホッグファミリーのメンバー（ソニックヘッジホッグ、インディアンヘッジホッグ、およびデザートヘッジホッグなど）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、異種核酸配列によってコードされる有用な治療用産物には、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン、アンギオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン成長因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、ＴＧＦαを含む形質転換成長因子αスーパーファミリーのいずれか１つ、アクチビン、インヒビン、または骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）ＢＭＰ１−１５のいずれか、ヘレグリン／ニューレグリン／ＡＲＩＡ／ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）成長因子ファミリーのいずれか１つ、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経栄養素ＮＴ−３およびＮＴ−４／５、毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニューチュリン（ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）、アグリン、セマフォリン／コラプシン（ｃｏｌｌａｐｓｉｎ）、ネトリン−１およびネトリン−２、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグ、ならびにチロシンヒドロキシラーゼを含むが、これらに限定されない、ホルモンならびに成長因子および分化因子が挙げられる。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、有用な異種核酸配列産物は、サイトカインおよびリンホカイン、例えば、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ）ＩＬ−１〜ＩＬ−２５（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、およびＩＬ−１８を含む）、単球走化性タンパク質、白血病阻害因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子αおよびβ、インターフェロン（α、β、およびγ）、幹細胞因子、ｆｌｋ−２／ｆｌｔ３リガンドを含むが、これらに限定されない、免疫系を調節するタンパク質が含まれる。免疫系によって産生される遺伝子産物も本発明において有用である。これらには、免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、一本鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、一本鎖Ｔ細胞受容体、クラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ分子、ならびに操作された免疫グロブリンおよびＭＨＣ分子が含まれるが、これらに限定されない。有用な遺伝子産物には、補体調節タンパク質、例えば、補体調節タンパク質、膜補因子タンパク質（ＭＣＰ）、分解促進因子（ｄｅｃａｙ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）（ＤＡＦ）、ＣＲ１、ＣＦ２、およびＣＤ５９も含まれる。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、有用な異種核酸配列産物には、ホルモン、成長因子、サイトカイン、リンホカイン、調節タンパク質、および免疫系タンパク質のうちのいずれか１つの受容体が含まれる。有用な異種核酸配列には、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）受容体、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）受容体、およびスカベンジャー受容体を含む、コレステロール調節および／または脂質調節のための受容体も含まれる。本発明は、グルココルチコイド受容体およびエストロゲン受容体を含むステロイドホルモン受容体スーパーファミリーのメンバー、ビタミンＤ受容体、ならびに他の核受容体などの遺伝子産物の使用も包含する。さらに、有用な遺伝子産物には、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍａｘ、ｍａｄ、血清応答因子（ＳＲＦ）、ＡＰ−１、ＡＰ−２、ｍｙｂ、ＭｙｏＤ、およびミオゲニンなどの転写因子、ＥＴＳボックス含有タンパク質、ＴＦＥ３、Ｅ２Ｆ、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＡＴＦ３、ＡＴＦ４、ＺＦ５、ＮＦＡＴ、ＣＲＥＢ、ＨＮＦ−４、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＰ１、ＣＣＡＡＴボックス結合タンパク質、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ−１）、ウィルムス腫瘍タンパク質、ＥＴＳ結合タンパク質、ＳＴＡＴ、ＧＡＴＡボックス結合タンパク質、例えば、ＧＡＴＡ−３、および翼状らせん（ｗｉｎｇｅｄ  ｈｅｌｉｘ）タンパク質のフォークヘッドファミリーが含まれる。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、有用な異種核酸配列産物には、カルバモイルシンセターゼＩ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノスクシネートシンセターゼ、アルギノスクシネートリアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセトアセテートヒドラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、α−１アンチトリプシン、グルコース−６−ホスファターゼ、ポルホビリノゲンデアミナーゼ、シスタチオンβ−シンターゼ、分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル−ｃｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インスリン、β−グルコシダーゼ、ピルベートカルボキシレート、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、Ｈ−プロテイン、Ｔ−プロテイン、嚢胞性線維症膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）配列、およびジストロフィンｃＤＮＡ配列が含まれる。さらに他の有用な遺伝子産物には、酵素の欠乏活性に起因する様々な状態に有用である酵素置換療法に有用な酵素が含まれる。例えば、マンノース−６−ホスフェートを含む酵素が、リソソーム蓄積疾患の治療に利用されてもよい（例えば、好適な遺伝子には、β−グルクルオニダーゼ（ＧＵＳＢ）をコードする遺伝子が含まれる）。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、有用な異種核酸配列産物には、血友病Ｂ（第ＩＸ因子を含む）および血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子およびその変異体、例えば、ヘテロ二量体の軽鎖および重鎖ならびにＢ欠失ドメインを含む；米国特許第６，２００，５６０号および米国特許第６，２２１，３４９号）を含む、血友病の処置に使用されるものが含まれる。第ＶＩＩＩ因子遺伝子は２３５１個のアミノ酸をコードし、タンパク質はＡ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２としてアミノ末端からカルボキシ末端へと指定される６つのドメインを有する（Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ，３１２：３３０；Ｖｅｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：３３７；およびＴｏｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ，３４２：３３７）。ヒト第ＶＩＩＩ因子は細胞内で処理されて、Ａ１、Ａ２、およびＢドメインを含む重鎖ならびにＡ３、Ｃ１、およびＣ２ドメインを含む軽鎖を主に含むヘテロ二量体が得られる。一本鎖ポリペプチドおよびヘテロ二量体の両方は、Ａ２ドメインとＢドメインとの間のトロンビン切断によって活性化されるまで、血漿中で不活性前駆体として循環し、該活性化によりＢドメインが放出され、Ａ１ドメインおよびＡ２ドメインからなる重鎖をもたらす。Ｂドメインは、タンパク質の活性化された凝固促進（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ）形態で欠失される。さらに、天然タンパク質において、Ｂドメインに隣接する２つのポリペプチド鎖（「ａ」および「ｂ」）は、二価カルシウムカチオンに結合される。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、有用な遺伝子産物には、挿入、欠失、またはアミノ酸置換を含む天然に存在しないアミノ酸配列を有するキメラまたはハイブリッドポリペプチドなどの、天然に存在しないポリペプチドが含まれる。例えば、一本鎖の操作された免疫グロブリンは、特定の免疫不全患者に有用であり得る。他の種類の天然に存在しない遺伝子配列には、標的の過剰発現を低減するために使用されるアンチセンス分子およびリボザイムなどの触媒核酸が含まれる。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、本発明は、幹細胞障害、例えば、骨髄幹細胞または成体組織幹細胞（すなわち、体細胞幹細胞）のいずれかにおける障害の処置方法を提供する。いくつかの実施形態では、成体幹細胞は、オルガノイド幹細胞（すなわち、体内の関心の任意の臓器または臓器系に由来する幹細胞）を含むことができる。身体の器官には、例えば、皮膚、髪の毛、爪、感覚受容器官、汗腺、油腺、骨、筋肉、脳、脊髄、神経、下垂体、松果腺、視床下部、甲状腺、副甲状腺、胸腺、副腎、膵臓（膵島組織）、心臓、血管、リンパ節、リンパ管、胸腺、脾臓、扁桃腺、鼻、咽頭、喉頭、気管、気管支、肺、口、咽頭、食道、胃、小腸、大腸、直腸、肛門管、歯、唾液腺、舌、肝臓、胆嚢、膵臓、盲腸、腎臓、尿管、膀胱、尿道、精巣、精管（輸精管）、尿道、前立腺、陰茎、陰嚢、卵巣、子宮、卵管（ファロピアン管）、膣、外陰部、および乳腺（乳房）が含まれるが、これらに限定されない。身体の臓器系には、外皮系、骨格系、筋肉系、神経系、内分泌系、心臓血管系、リンパ系、呼吸器系、消化器系、泌尿器系、および生殖器系が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、処置のための障害は、任意の１つ以上のオルガノイド幹細胞（すなわち、体内の任意の関心の臓器または臓器系に由来する幹細胞）における障害である。いくつかの実施形態では、処置はインビボである（例えば、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドが投与は、直接に対象に対してである）。いくつかの実施形態では、処置はエクスビボである（例えば、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドの投与は、対象から単離された幹細胞に対してであり、次いで処置された幹細胞は対象に戻される）。
【０２２２】
異種核酸配列の発現の低減および／または調節は、癌および乾癬などの過増殖細胞によって特徴付けられる過増殖状態の処置に特に望ましい。標的ポリペプチドには、正常細胞と比較して、過剰増殖細胞において排他的にまたはより高いレベルで産生されるポリペプチドが含まれる。標的抗原には、癌遺伝子、例えば、ｍｙｂ、ｍｙｃ、ｆｙｎ、ならびにトランスロケーション遺伝子ｂｃｒ／ａｂｌ、ｒａｓ、ｓｒｃ、Ｐ５３、ｎｅｕ、ｔｒｋ、およびＥＧＲＦによってコードされるポリペプチドが含まれる。標的抗原としての癌遺伝子産物に加えて、抗癌処置および保護レジメンのための標的ポリペプチドは、Ｂ細胞リンパ腫によって作られる抗体の可変領域およびＴ細胞リンパ腫のＴ細胞受容体の可変領域を含み、いくつかの実施形態では、自己免疫疾患の標的抗原として使用される。他の腫瘍関連ポリペプチドは、モノクローナル抗体１７−１Ａによって認識されるポリペプチドおよび葉酸結合ポリペプチドを含む腫瘍細胞においてより高いレベルで見出されるポリペプチドなどの標的ポリペプチドとして使用することができる。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、好適な治療用ポリペプチドおよびタンパク質は、細胞受容体および「自己」指向性抗体を産生する細胞を含む、自己免疫に関連する標的に対する広範囲にわたる保護免疫応答を付与することによって自己免疫疾患および障害に罹患した個体を処置するのに有用なものを含む。Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患には、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫性甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、クローン病、および潰瘍性大腸炎が含まれる。これらの疾患の各々は、内因性抗原に結合し、自己免疫疾患に関連する炎症性カスケードを開始するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって特徴付けられる。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、異種核酸配列は、細菌、ウイルス、真菌、寄生微生物、もしくはヒトおよび非ヒト脊椎動物に感染する多細胞寄生虫を含む、他の病原体に対してヒトもしくは非ヒト動物を免疫化するのに有用な（すなわち、例えばワクチンとして有用な）免疫原、または癌細胞もしくは腫瘍細胞由来の免疫原をコードする。細菌病原体の例には、ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｉ、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ（およびそれによって産生される毒素、例えば、エンテロトキシンＢ）、およびｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉを含む、病原性グラム陽性球菌（ｃｏｃｃｉ）が含まれる。病原性グラム陰性球菌には、髄膜球菌（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ）、淋菌（ｇｏｎｏｃｏｃｃｕｓ）が含まれる。病原性腸グラム陰性桿菌（ｂａｃｉｌｌｉ）には、ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ；ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｉａ、およびｅｉｋｅｎｅｌｌａ；類鼻疽；ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ；ｓｈｉｇｅｌｌａ；ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ；ｍｏｒａｘｅｌｌａ；Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉ（軟性下疳を引き起こす）；ｂｒｕｃｅｌｌａ種（ブルセラ症）；Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ（野兎病を引き起こす）；Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ（ペスト）および他のＹｅｒｓｉｎｉａ（ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）；Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓおよびｓｐｉｒｉｌｌｕｍが含まれ、グラム陽性桿菌には、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ；Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ（ジフテリア症を引き起こす）；ｃｈｏｌｅｒａ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ．ａｎｔｈｒａｃｉａ（炭疽を引き起こす）；ｄｏｎｏｖａｎｏｓｉｓ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓによって引き起こされる鼠径部肉芽腫）；ならびにバルトネラ症が含まれる。    病原性嫌気性細菌によって引き起こされる疾患には、破傷風、ボツリヌス中毒（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍおよびその毒素）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓおよびそのイプシロン毒素、他のｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、結核、ハンセン病、ならびに他のｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａが含まれる。病原性スピロヘータ疾患には、梅毒、トレポネーマ症、イチゴ腫（ｙａｗｓ）、ピンタ（ｐｉｎｔａ）、および風土病性梅毒、ならびにレプトスピラ症が含まれる。高病原体細菌および病原性真菌によって引き起こされる他の感染症には、鼻疽病（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ）、放線菌症、ノカルジア症、クリプトコッカス症、ブラストミセス症、ヒストプラズマ症、およびコクシジオイデス症、カンジダ症、アスペルギルス症、およびムコール症、スポロトリクム症、パラコクシジオイド症、ペトリエリジオシス症、トルロプシス症、マイセトーマ、およびクロモミコーシス、ならびに皮膚糸状菌症が含まれる。リケッチア感染症には、チフス熱、ロッキー山紅斑熱、Ｑ熱（Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉ）、およびリケッチア痘が含まれる。マイコプラズマおよびクラミジア感染症の例には、肺炎マイコプラズマ、性病性リンパ肉芽腫（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈ��ｍａｔｉｓによって引きこされる）、オウム病、および周産期クラミジア感染症が含まれる。病原性原虫および蠕虫ならびにそれらによって生じる感染症を包含する病原性真核生物には、アメーバ症（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａによって引き起こされる）、マラリア症（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍによって引き起こされる）、リーシュマニア症（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａによって引き起こされる）、トリパノソーマ症（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａによって引き起こされる）、トキソプラズマ症（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉによって引き起こされる）、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ、バベシア症（Ｂａｂｅｓｉａによって引き起こされる）、ジアルジア症（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａによって引き起こされる）、旋毛虫症（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ属の円虫によって引き起こされる）、フィラリア症（Ｆｉｌａｒｉｏｉｄｅａの回虫によって引き起こされる）、住血吸虫症（寄生虫Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａの５種のうちの１つに感染した淡水産巻貝によって運ばれる）、線虫（ｎｅｍａｔｏｄｅ）感染症（Ｎｅｍａｔｏｄａ）、吸虫（ｔｒｅｍａｔｏｄｅ）または吸虫（ｆｌｕｋｅ）感染症（Ｐｌａｔｙｈｅｌｍｉｎｔｈｅｓ）、および条虫（ｃｅｓｔｏｄｅ）感染症が含まれる。ウイルスの例には、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ；例えば、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）、インフルエンザ（例えば、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、およびインフルエンザＣ）、パラインフルエンザ肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、およびＥ型肝炎）、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ；ＨＨＶ；例えば、単純ヘルペスウイルス１型および２型、別名、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２を含むが、これらに限定されない、単純ヘルペスウイルス１型、２型、３型、４型、５型、６Ａ型、６Ｂ型、７型、および８型）、水痘帯状疱疹（ｖａｒｉｃｅｌｌａ−ｚｏｓｔｅｒ）ウイルス（ＨＨＶ−３）、エプスタインバールウイルス（ＨＨＶ−４）、ロゼオロウイルス（ＨＨＶ−６ＡおよびＨＨＶ−６Ｂ）；ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（ＨＨＶ−５）、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス；ＫＳＨＶ；ＨＶ−８）、パポウイルス（例えば、ヒトパピローマウイルス；ＨＰＶ；ＨＰＶ−１、ＨＰＶ−２、ＨＰＶ−１６、およびＨＰＶ−１８）、パルボウイルス（例えばパルボウイルスＢ１９）、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス（例えば、モルビリウイルス、レスピロウイルス、ルブラウイルウイルス、フェルラウイルス、ニューモウイルス、およびメタニューモウイルス）、ピコルナウイルス（例えば、口蹄疫ウイルス、アクアマウイルスＡ、脳心筋炎ウイルス（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、タイロウイルス、コサウイルスＡ、カリシウイルスＡ、エンテロウイルスＡ、エンテロウイルスＢ、エンテロウイルスＣ、エンテロウイルスＤ、エンテロウイルスＥ、エンテロウイルスＦ、エンテロウイルスＧ、エンテロウイルスＨ、エンテロウイルスＪ、ライノウイルスＡ、ライノウイルスＢ、ライノウイルスＣ、アイチウイルスＡ、アイチウイルスＢ、アイチウイルスＣ、メレグリウイルスＡ（ｍｅｌｅｇｒｉｖｉｒｕｓ  Ａ）、ヒ��パレコウイルス、ユンガンウィルス（ｌｊｕｎｇａｎ  ｖｉｒｕｓ）、およびサリウイルスＡ（ｓａｌｉｖｉｒｕｓ  Ａ））、トガウイルス（例えば、フラビウイルス、アルファウイルス、およびルビウイルス）、牛痘ウイルス、ウマポックスウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、デングウイルス、東ウマ脳炎ウイルス、エボラウイルス、ハンタウイルス、ヒトコロナウイルス、ヒトエンテロウイルス６８、ヒトエンテロウイルス７０、非ＨＩＶレトロウイルス、ライノウイルス、呼吸系発疹ウイルス（ＲＳＶ）、ＳＡＲＳコロナウイルス、ヒトスプーマレトロウイルス（Ｈｕｍａｎ  ｓｐｕｍａｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、ヒトＴリンパウイルス、イスファハンウイルス、日本脳炎ウイルス、ラッサウイルス、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス、ＭＥＲＳコロナウイルス、麻疹ウイルス、メンゴ脳心筋炎ウイルス（Ｍｅｎｇｏ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、サルポックウイルス、ムンプスウイルス、ノーウォークウイルス、ピキンデウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ロタウイルス（例えば、ロタウイルスＡ、ロタウイルスＢ、ロタウイルスＣ）、風疹ウイルス、セント・ルイス脳炎ウイルス、トスカーナウイルス、ウークニエミウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ウエストナイルウイルス、黄熱病ウイルス、およびジカウイルス、ならびに当業者に既知の任意の他のウイルスが含まれるが、これらに限定されない。
【０２２５】
ＡＡＶビリオンを生成するための方法
様々な実施形態では、本発明は、本発明のＡＡＶビリオンを生成するための方法を提供する。ＡＡＶビリオンを生成するための様々な方法は、当該技術分野で既知であり、本明細書に記載のＡＡＶベクターを含むＡＡＶビリオンを生成するために使用することができる。一般的に、本方法は、本発明のＡＡＶベクターを、ＡＡＶベクターをＡＡＶビリオンにパッケージングすることができる宿主細胞に挿入または形質導入することを含む。例示的な方法が以下に記載され、参照されるが、当業者に既知の任意の方法を用いて、本発明のＡＡＶビリオンを生成することができる。
【０２２６】
異種核酸を含み、ＡＡＶビリオンを生成するために使用されるＡＡＶベクターは、当該技術分野で周知である方法を使用して構築することができる。例えば、Ｋｏｅｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１７：２０８８；Ｋｏｅｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．，１６：１７０３−１７０９；ならびに米国特許第７，４３９，０６５号、同第６，９５１，７５８号、および同第６，４９１，９０７号を参照のこと。例えば、異種配列は、ＡＡＶゲノムから取り出した主なＡＡＶオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）と共に、ＡＡＶゲノムに直接挿入することができる。ＩＴＲの十分な部分が複製およびパッケージング機能が依然として可能である限り、ＡＡＶゲノムの他の部分も欠失することができる。そのような構築物は、当該技術分野で周知の技術を使用して設計することができる。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号および同第５，１３９，９４１号、国際公開第ＷＯ９２／０１０７０号（１９９２年１月２３日公開）および同第ＷＯ９３／０３７６９号（１９９３年３月４日公開）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８−３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９０（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：５３３−５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９；Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３−８０１；Ｓｈｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ（１９９４）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：１６５−１６９；およびＺｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１８６７−１８７５を参照のこと。
【０２２７】
ＡＡＶビリオンを産生するために、ＡＡＶベクターは、トランスフェクションなどによる既知の技術を使用して好適な宿主細胞に導入される。多くのトランスフェクション技術が当該技術分野において一般的に知られている。例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ａｎｄ  Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｇｅｎｅ  １３：１９７を参照のこと。特に好適なトランスフェクション方法には、リン酸カルシウム共沈殿（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌ．５２：４５６−４６７）、培養細胞への直接的マイクロインジェクション（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．（１９８０）Ｃｅｌｌ  ２２：４７９−４８８）、エレクトロポレーション（Ｓｈｉｇｅｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：７４２−７５１）、リポソーム媒介遺伝子移入（Ｍａｎｎｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６８２−６９０）、脂質媒介性形質導入（Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７）、および高速微小射出物（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）を使用する核酸送達（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：７０−７３）が含まれる。
【０２２８】
ＡＡＶビリオンを産生するのに好適な宿主細胞は、異種ＡＡＶ ＤＮＡ分子のレシピエントとして使用することができるかまたは使用されてきた任意の種および／または種類の細胞を含み、ヘルパーウイルスからの必要なＡＡＶ産生補因子の発現を支持することができる。そのような宿主細胞には、異種ＤＮＡ分子のレシピエントとして使用することができるかまたは使用されてきた微生物、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞が含まれ得るが、これらに限定されない。この用語は、トランスフェクションされた元の細胞の子孫を含む。したがって、本明細書で使用される「宿主細胞」は、一般的に、外因性ＤＮＡ配列でトランスフェクションされた細胞を指す。安定したヒト細胞株ＨＥＫ２９３（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ受託番号ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３により容易に入手可能）由来の細胞を使用することができる。ヒト細胞株ＨＥＫ２９３は、アデノウイルス５型ＤＮＡ断片で形質転換されたヒト胚性腎臓細胞株であり（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９）、アデノウイルスＥｌａおよびＥｌｂ遺伝子を発現する（Ａｉｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ９４：４６０）。ＨＥＫ２９３細胞株は容易にトランスフェクトされ、ＡＡＶビリオンを産生するための好都合なプラットフォームを提供する。
【０２２９】
昆虫細胞においＡＡＶビリオンを産生する方法は、当該技術分野で既知であり、対象ＡＡＶビリオンを産生するために使用することができる。例えば、米国特許出願公開第２００９／０２０３０７１号、米国特許第７，２７１，００２号、およびＣｈｅｎ（２００８）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６：９２４を参照のこと。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶビリオンまたはＡＡＶベクターは、本明細書に記載される方法または当該技術分野で既知の方法のいずれかによって、感染性ビリオンまたはウイルス粒子にパッケージングされる。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、同様のパッケージングを可能にする。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドがパッケージングされたＡＡＶベクターは、非変異親キャプシドポリペプチドからパッケージングされたベクターよりも良好に、インビボで細胞に形質導入する。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドがパッケージングされたＡＡＶベクターは、非変異親キャプシドポリペプチドからパッケージングされたベクターよりも、インビトロで細胞中に形質導入する。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドからパッケージングされた核酸よりも高い核酸発現をもたらす。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、上記変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドがパッケージングされたＡＡＶベクターは、非変異親キャプシドポリペプチドからパッケージングされた導入遺伝子よりも良好な導入遺伝子発現をもたらす。
【０２３６】
医薬組成物および投与
本発明は、本明細書に記載される本発明の方法による対象の処置に有用な医薬組成物を提供する。さらに、本発明は、記載される医薬組成物を投与するための投与レジメンを提供する。本発明は、ａ）本明細書に記載の対象ＡＡＶベクターまたはＡＡＶビリオン、および本明細書に記載の変異ポリペプチドを含むキャプシドによってパッケージングされるかまたは該キャプシド内にパッケージングされる治療分子、ならびにｂ）薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、または緩衝剤を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、または緩衝剤は、ヒトにおける使用に好適である。
【０２３７】
そのような賦形剤、担体、希釈剤、および緩衝剤には、過度の毒性を伴わずに投与することができる任意の医薬品が含まれる。薬学的に許容される賦形剤には、限定されないが、水、生理食塩水、グリセロール、およびエタノールなどの液体が含まれる。薬学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの無機酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩が含まれてもよい。さらに、補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などが、そのようなビヒクル中に存在してもよい。多種多様な薬学的に許容される賦形剤が当該技術分野で既知であり、本明細書で詳細に考察される必要はない。薬学的に許容される賦形剤は、例えば、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９９９）Ｈ．Ｃ．Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，７ｔｈ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ；ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（２０００）Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，３ｒｄ  ｅｄ．Ａｍｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃ．を含む、様々な刊行物に十分に記載されている。
【０２３８】
対象組成物は、本発明の対象変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドを含む液体、または溶液中、懸濁液中、もしくはその両方に変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドを含むＡＡＶビリオンを含むことができる。本明細書で使用する場合、液体組成物にはゲルが含まれる。いくつかの場合では、液体組成物は水性である。いくつかの実施形態では、組成物は、インサイチュでゲル化可能な水性組成物、例えば、インサイチュでゲル化可能な水溶液である。水性組成物は、光学的に適合するｐＨおよび浸透圧を有する。
【０２３９】
そのような組成物には、薬剤投与またはインビボ接触もしくは送達に適合する、溶媒（水性または非水性）、溶液（水性または非水性）、乳剤（例えば、水中油または油中水）、懸濁液、シロップ剤、エリキシル剤、分散および懸濁媒体、コーティング剤、等張化剤、ならびに吸収促進剤または遅延剤が含まれる。水性および非水性溶媒、溶液および懸濁液は、懸濁剤および増粘剤を含んでもよい。そのような薬学的に許容される担体には、錠剤（コーティングまたは非コーティング）、カプセル剤（硬質または軟質）、マイクロビーズ、粉剤、顆粒剤、および結晶が含まれる。補助活性化合物（例えば、防腐剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、および抗真菌剤）を組成物に組み込むことができる。
【０２４０】
医薬組成物は、本明細書に記載されるかまたは当業者に既知のように、投与または送達の特定の経路に適合するように製剤化することができる。したがって、医薬組成物は、様々な経路による投与に好適な担体、希釈剤、または賦形剤を含む。
【０２４１】
非経口投与に好適な組成物は、活性化合物の水溶液および非水溶液、懸濁液、または乳剤を含む。調製物は、典型的には無菌であり、意図されるレシピエントの血液と等張性であり得る。非限定的な説明に役立つ実施例には、水、生理食塩水、デキストロース、フルクトース、エタノール、動物オイル、植物オイル、または合成オイルが含まれる。
【０２４２】
腹腔内または静脈内投与（例えば、局所接触）の場合、浸透剤を医薬組成物中に含めることができる。浸透剤は、当該技術分野で既知であり、例えば、経粘膜投与のために、界面活性剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与のために、活性成分を当該技術分野で一般的に既知のエアゾール剤、スプレー剤、軟膏剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔｓ）、膏薬（ｓａｌｖｅｓ）、ゲル剤、またはクリーム剤へと製剤化することができる。皮膚との接触のために、医薬組成物は、典型的には、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、ペースト剤、ゲル剤、スプレー剤、エアゾール剤、またはオイルを含む。有用な担体には、Ｖａｓｅｌｉｎｅ（登録商標）、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、経粘膜増強剤、およびこれらの組み合わせが含まれる。
【０２４３】
共溶媒および補助剤を製剤に添加してもよい。共溶媒の非限定的な例は、ヒドロキシル基または他の極性基、例えば、アルコール、例えば、イソプロピルアルコール；グリコール、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、グリコールエーテル；グリセロール；ポリオキシエチレンアルコールおよびポリオキシエチレン脂肪酸エステルが挙げられる。補助剤には、例えば、界面活性剤、例えば、大豆レシチンおよびオレイン酸；ソルビタンエステル、例えば、トリオレイン酸ソルビタンエステル；およびポリビニルピロリドンが挙げられる。
【０２４４】
医薬組成物およびＡＡＶベクターまたはＡＡＶビリオンに適切な送達系、ならびに方法および使用は、当該技術分野で既知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２００３）２０ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）１８ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．；Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ（１９９６）１２ｔｈ  ｅｄ．，Ｍｅｒｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ，Ｎ．Ｊ．；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｓｏｌｉｄ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ（１９９３），Ｔｅｃｈｎｏｎｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｐａ．；Ａｎｓｅｌ  ａｎｄ  Ｓｔｏｋｌｏｓａ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（２００１）１１ｔｈ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．；ａｎｄ  Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９８０），Ｒ．Ｌ．Ｊｕｌｉａｎｏ，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．２５３−３１５を参照のこと）。
【０２４５】
用量は、処置が予防的または治療的であるかどうか、処置の対象となる疾患の種類、発症、進行、重症度、頻度、持続期間、もしくは確率、所望の臨床エンドポイント、以前の処置もしくは同時処置、対象の一般的な健康状態、年齢、性別、人種、または免疫能力、および当業者によって理解される他の要因によって変化し、かつ、それらに依存し得る。用量、数、頻度、または持続時間は、処置もしくは治療の任意の有害な副作用、合併症、または他の危険因子、および対象の状態によって示されるように、比例して増加または減少してもよい。当業者は、治療的または予防的利益を提供するのに十分な量を提供するために必要な投与量および時期に影響を及ぼし得る要因を理解するであろう。
【０２４６】
本明細書に開示される本発明の方法および使用は、対象が処置の対象となる疾患を有するか、もしくは疾患の１つ以上の症状を有すると同定されるか、またはスクリーニングされて、対象が疾患の１つ以上の症状を有さないにもかかわらず、本明細書に記載されるように陽性として同定された後、約１時間〜約２時間、約２時間〜約４時間、約４時間〜約１２時間、約１２時間〜約２４時間、または約２４時間〜約７２時間以内に実施することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される本発明は、約１時間以内、約２時間以内、約３時間以内、約４時間以内、約５時間以内、約６時間以内、約７時間以内、約８時間以内、約９時間以内、約１０時間以内、約１１時間以内、約１２時間以内、約２４時間以内、約３６時間以内、約４８時間以内、または約７２時間以上以内に実施することができる。もちろん、本発明の方法および使用は、対象が処置の対象となる疾患を有するか、もしくは疾患の１つ以上の症状を有すると同定された後、またはスクリーニングされ、本明細書に記載されるように陽性として同定されてから、約１日後〜約７日後、約７日後〜約１４日後、約１４日後〜約２１日後、約２１日後〜約４８日以上後、数ヶ月後または数年後に実施することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される本発明は、約１日以内、約２日以内、約３日以内、約４日以内、約５日以内、約６日以内、約７日以内、約８日以内、約９日以内、約１０日以内、約１１日以内、約１２日以内、約１４日以内、約２１日以内、約３６日以内、または約４８日以上以内に実施することができる。
【０２４７】
いくつかの実施形態では、本発明は、キットに、パッケージング材料およびその中の１つ以上の構成成分を提供する。キットは、典型的には、構成成分の説明書またはキット中の構成成分のインビトロ、インビボ、もしくはエクスビボでの使用のための指示書を含む、ラベルまたはパッケージング挿入文書を含む。キットは、そのような構成成分の集合物、例えば、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド、ＡＡＶベクター、またはＡＡＶビリオン、および任意選択で第２の活性物、例えば、別の化合物、薬剤、薬物、または組成物を含むことができる。
【０２４８】
キットとは、１つ以上のキット構成成分を収容する物理的構造物を指す。パッケージング材料は、構成成分を無菌で維持することができ、そのような目的のために一般的に使用される材料（例えば、紙、段ボール、ガラス、プラスチック、箔、アンプル、バイアル、チューブなど）で作製することができる。
【０２４９】
ラベルまたは挿入文書は、その中の１つ以上の構成成分の同定情報、用量、ならびに作用機序、薬物動態、および薬力学を含む活性成分の臨床薬理を含むことができる。ラベルまたは挿入文書は、製造業者、ロット番号、製造業者の場所および日付、有効期限を同定する情報を含む。ラベルまたは挿入文書は、製造業者情報、ロット番号、製造業者の場所、および日付を同定する情報を含む。ラベルまたは挿入文書は、キット構成成分が使用され得る疾患に関する情報を含むことができる。ラベルまたは挿入文書は、方法、使用、または処置プロトコルもしくは治療レジメンでキット構成成分のうちの１つ以上を使用するための臨床医または対象のための指示書を含むことができる。指示書は、投与量、頻度、または持続期間、および本明細書に記載の方法、使用、処置プロトコル、または予防もしくは治療レジメンのいずれかを実施するための指示書を含むことができる。
【０２５０】
ラベルまたは挿入文書は、構成成分が提供し得る任意の利益、例えば、予防的または治療的利益に関する情報を含むことができる。ラベルまたは挿入文書は、潜在的な副作用、合併症、または反応に関する情報、例えば、特定の組成物を使用することが適切ではない状況に関する対象または臨床医への警告を含むことができる。有害な副作用または合併症はまた、対象が、組成物と適合性がない場合があり得る１つ以上の他の薬物を服用しているか、もしくは将来服用する予定であるか、もしくは現在服用中であるか、または対象が、別の適合性がない処置プロトコルもしくは治療レジメンを受けているか、もしくは将来受ける予定であるか、もしくは現在受けている場合に生じ得、したがって、指示書は、そのような不適合性に関する情報を含むことができる。
【０２５１】
ラベルまたは挿入文書は、「印刷物」、例えば、紙もしくは段ボールを含み、または構成成分、キット、もしくは梱包材（例えば、箱）に分離もしくは固定され、またはキット構成成分を含むアンプル、チューブ、もしくはバイアルに付着される。ラベルまたは挿入文書は、さらに、コンピュータ読取可能媒体、例えば、バーコード印刷ラベル、ディスク、光ディスク、例えば、ＣＤ−またはＤＶＤ−ＲＯＭ／ＲＡＭ、ＤＶＤ、ＭＰ３、磁気テープ、もしくは電気記憶媒体、例えば、ＲＡＭおよびＲＯＭ、またはこれらのハイブリッド、例えば、磁気／光学記憶媒体、フラッシュ媒体、もしくはメモリタイプカードを含むことができる。
【０２５２】
疾患の処置方法
本発明はまた、本発明のＡＡＶベクターおよび／または核酸を投与することによって対象の疾患の処置方法を提供し、ここで、本明細書に記載のＡＡＶベクターおよび／または核酸は、機能的ＡＡＶキャプシド内にパッケージングされ、機能的ＡＡＶキャプシドは、本発明の１つ以上の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドを含む。例示的な実施形態では、本発明は、それを必要とする対象に本発明の医薬組成物を投与して、対象の疾患を処置する方法を提供する。様々な実施形態では、対象は、本発明の組成物の投与を他に必要としない。いくつかの実施形態では、本発明は、ワクチン投与のための方法を提供する。
【０２５３】
いくつかの実施形態では、変異ＡＶキャプシドポリペプチドは、異種遺伝子産物、例えば処置タンパク質またはワクチンをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸からなる治療用発現カセットをパッケージングする。いくつかの実施形態では、ＡＡＶビリオンまたはＡＡＶベクターは、異種遺伝子産物、例えば処置タンパク質またはワクチンをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸からなる治療用発現カセットを含む。
【０２５４】
いくつかの実施形態では、本発明の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、ワクチン送達の一部として用いられる。ワクチン送達は、治療用タンパク質のいずれか、ならびに本明細書に記載の核酸の送達を含むことができる。いくつかの実施形態では、本発明の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、ワクチンレジメンの一部として用いられ、本明細書に記載の方法に従って投与される。
【０２５５】
いくつかの実施形態では、本発明の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド、ＡＡＶビリオン、またはＡＡＶベクターは、治療的処置レジメンで使用される。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、本発明の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド、ＡＡＶビリオン、またはＡＡＶベクターは、治療用ポリペプチド産生に使用される。
【０２５７】
いくつかの事例では、主題の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドまたはＡＡＶベクターは、主題の細胞に導入されるとき、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドによってパッケージングされるか、またはＡＡＶベクターによってコードされる異種遺伝子産物の高レベル産生を提供する。例えば、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドによってパッケージングされた、またはＡＡＶによってコード化された異種ポリペプチドは、約１μｇ〜約５０μｇ以上のレベルで産生され得る。
【０２５８】
いくつかの事例では、対象変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド、ＡＡＶビリオン、またはＡＡＶベクターは、対象に導入されるとき、標的細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または８０％超において、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドによってパッケージングされるか、またはＡＡＶベクターによってコードされる異種遺伝子産物の産生を提供する。
【０２５９】
いくつかの実施形態では、本発明は、疾患を処置する方法を提供し、方法は、上記の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドまたは対象ＡＡＶベクターによってパッケージングされる有効量の治療分子を、それを必要とする個体に投与することを含む。
【０２６０】
対象変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドまたは対象ＡＡＶベクターは、全身、局部、もしくは局所、または任意の経路、例えば、注射、注入、経口（例えば、摂取もしくは吸入）、または局所（例えば、経皮）によって投与され得る。そのような送達および投与方法には、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮膚内、皮下、空洞内、頭蓋内、経皮（局所）、非経口、例えば、経粘膜または直腸が含まれる。例示的な投与および送達経路には、静脈内、腹腔内、動脈内、筋肉内、非経口、皮下、胸膜内、局所、真皮内、経皮、非経口、例えば、経粘膜、頭蓋内、脊髄内、経口（消化）、粘膜、呼吸、鼻腔内、挿管、肺内、肺内滴下、口腔内、舌下、血管内、鞘内、腔内、イオン形成、眼内、眼科、光学、腺内、臓器内、およびリンパ内が含まれる。
【０２６１】
いくつかの事例では、治療有効量の変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドまたは対象ＡＡＶベクターによってパッケージングされる治療分子は、１回以上の用量で個体に投与される場合、個体における疾患もしくは障害の進行を遅延させるのに有効であるか、または症状を改善するのに有効である量である。例えば、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドまたは対象ＡＡＶベクターによってパッケージングされる治療分子の治療有効量は、１回以上の用量で個体に投与される場合、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドまたはＡＡＶベクターによってパッケージングされる治療分子による処置の不在下での疾患の進行と比較して、疾患の進行を少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または約８０％超遅延させるのに有効な量であり得る。
【０２６２】
したがって、処置の治療効果または有益な効果は、特定の対象に提供される、任意の客観的もしくは主観的に測定可能なもしくは検出可能な改善または利益である。治療効果または有益な効果は、疾患の全てもしくは任意の特定の有害な症状、障害、疾患、または合併症の完全な焼灼療法であってもよいが、必要ではない。したがって、満足のいく臨床エンドポイントは、疾患によって引き起こされるかもしくはそれに関連する有害な症状、障害、疾患、または合併症、あるいは疾患によって引き起こされるかもしくはそれに関連する１つ以上の有害な症状、障害、疾患、もしくは合併症の悪化もしくは進行の阻害、減少、軽減、抑制、防止、制限、または制御が、短期間または長期間（時間、数日、数週間、数ヶ月など）にわたって存在する場合に達成される。
【０２６３】
臨床症状の改善はまた、当該技術分野において既知の１つ以上の方法によってモニタリングすることができ、治療有効性の指標として使用することができる。臨床症状はまた、間接眼鏡検査、眼底撮影、蛍光眼底血管撮影、光干渉断層撮影、網膜電図（全視野、多焦点、または他）、外眼検査、細隙灯生体顕微鏡検査（ｓｌｉｔ  ｌａｍｐ  ｂｉｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、圧平眼圧測定、パキメトリー、自動屈折測定（ａｕｔｏｒｅｆａｃｔｉｏｎ）、または他の視覚機能の測定などの、解剖学的または生理学的手段によってモニタリングされてもよい。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド、対象ＡＡＶベクター、またはＡＡＶウイルスによってパッケージングされる治療分子（例えば、ワクチンを含む）は、対象に導入された場合、約２日〜約６ヶ月、例えば、約２日〜約７日、約１週間〜約４週間、約１ヶ月〜約２ヶ月、または約２ヶ月〜約６ヶ月の期間にわたって異種遺伝子産物の産生を提供する。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチド、対象ＡＡＶベクターまたはウイルスによってパッケージングされる治療分子（例えば、ワクチンを含む）は、対象に導入された場合、６ヶ月超、例えば、約６ヶ月〜２０年以上、または１年超、例えば、約６ヶ月〜約１年、約１年〜約２年、約２年〜約５年、約５年〜約１０年、約１０年〜約１５年、約１５年〜約２０年、または２０年超の期間にわたってコードされる異種遺伝子産物の産生を提供する。いくつかの実施形態では、投与レジメンは、ワクチン接種レジメンの一部である。
【０２６４】
対象ＡＡＶビリオンの多数回用量を、それを必要とする個体に投与することができる。一定期間にわたって多数回用量が投与される場合、活性剤は、月に１回〜年に約１回、年に約１回〜２年に１回、２年に約１回〜５年に１回、または５年に約１回〜１０年に約１回、一定期間にわたって投与される。例えば、対象ＡＡＶビリオンは、約３ヶ月〜約２年、約２年〜約５年、約５年〜約１０年、約１０年〜約２０年、または２０年超の期間にわたって投与される。実際の投与頻度および実際の処置期間は、様々な要因に依存する。いくつかの実施形態では、投与レジメンは、ワクチン接種レジメンの一部である。
【０２６５】
治療効果を達成するための用量、例えば、ベクターゲノム／体重１キログラムあたり（ｖｇ／ｋｇ）での用量は、投与経路、治療効果を達成するために必要な異種ポリヌクレオチド発現レベル、処置される特定の疾患、ウイルスベクターに対する任意の宿主免疫応答、異種ポリヌクレオチドまたは発現産物（タンパク質）に対する宿主免疫応答、ならびに発現されるタンパク質の安定性を含むが、これらに限定されないいくつかの要因に基づいて変動する。当業者は、前述の要因ならびに他の要因に基づいて、特定の疾患または障害を有する患者を処置するためのビリオン用量範囲を容易に決定することができる。一般的に、用量は、治療効果を達成するために、対象の体重の１キログラムあたり、少なくとも約、またはそれ超の、例えば、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、または１×１０１４以上のベクターゲノムの範囲である。
【０２６６】
いくつかの実施形態では、本発明の変異ＡＡＶポリペプチドは、対象に投与される総ＡＡＶベクターまたは他の治療分子の量を減少させるように用いることができ、上記ＡＡＶベクターまたは他の治療分子が、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドを使用して形質導入されるときに、同様の治療効果を得るために（すなわち、両方の投与量は、同様の治療効果または区別できない治療効果を誘導する）、変異ＡＡＶベクターまたは他の治療分子が非変異親キャプシドポリペプチド使用して形質導入されるときに対象に投与されるＡＡＶベクターまたは他の治療分子の量と比較して、より少ない総ＡＡＶベクターまたは他の治療分子が対象に投与される。いくつかの実施形態では、対象に投与される総ベクターまたは他の治療分子は、ＡＡＶベクターまたは他の治療分子が変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドを使用して形質導入される場合、同様の治療効果を得るために（すなわち、両方の投与量は、同様の治療効果または区別できない治療効果を誘導する）、ＡＡＶベクターまたは他の治療分子が、非変異親キャプシドポリペプチドを使用して形質導入される場合と比較して、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％以上、減少する。いくつかの実施形態では、対象に投与される総ベクターまたは他の治療分子は、ＡＡＶベクターまたは他の治療分子が変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドを使用して形質導入される場合、同様の治療効果を得るために（すなわち、両方の投与量は、同様の治療効果または区別できない治療効果を誘導する）、ＡＡＶベクターまたは他の治療分子が、非変異親キャプシドポリペプチドを使用して形質導入される場合と比較して、約５％〜約８０％、約１０％〜約７５％、約１５％〜約６５％、約２０％〜約６０％、または約１０％〜約５０％、減少する。
【０２６７】
有効量または十分な量は、単回の投与で提供されることができるが、それは必要ではなく、多数回の投与を必要としてもよく、単独でまたは別の組成物（例えば、薬剤）、処置、プロトコル、もしくは処置レジメンと組み合わせて投与することができるが、それは必要ではない。例えば、量は、対象の必要性、処置される疾患の種類、状態、および重症度、または処置の副作用（ある場合）によって示されるように、比例して増加してもよい。さらに、有効量または十分な量は、第２の組成物（例えば、別の薬物もしくは薬剤）、処置、プロトコル、または治療レジメンなしに単回または多数回投与される場合には、有効または十分である必要はなく、その理由は、所与の対象において有効または十分であるとみなされるために、そのような用量を上回る追加の用量、量もしくは持続時間、もしくは追加の組成物（例えば、薬物もしくは薬剤）、処置、プロトコル、または処置レジメンが含まれ得るからである。有効とみなされる量には、凝固障害（例えば、血友病ＡまたはＢ）の処置のための組換え凝固因子タンパク質の投与などの別の処置、治療レジメン、またはプロトコルの使用の減少をもたらす量も含まれる。
【０２６８】
有効量または十分な量は、処置されるありとあらゆる対象、または所与の群もしくは集団中の処置される対象の大部分において有効である必要はない。有効量または十分な量とは、群または一般集団ではなく、特定の対象における有効性または十分性を意味する。そのような方法に典型的であるように、いくつかの対象は、所与の処置方法または使用に対して、より大きな反応もしくはより小さな反応を示すか、または全く反応を示さないであろう。したがって、適切な量は、処置される状態、所望の治療効果、および個々の対象（例えば、対象内のバイオアベイラビリティ、性別、年齢など）に依存する。
【０２６９】
疾患もしくはその症状または根底にある細胞応答に関して、検出可能または測定可能な改善には、疾患または疾患によって引き起こされるかもしくは疾患に関連する合併症の、主観的もしくは客観的な減少、軽減、阻害、抑制、発生の制限もしくは制御、頻度、重症度、進行、持続期間、または疾患の症状もしくは根底にある原因もしくは結果の改善、または疾患の好転が含まれる。
【０２７０】
したがって、成功的な処置の成果は、対象における疾患、または疾患の１つ以上の有害な症状もしくは根本的な原因もしくは結果の発生、頻度、重症度、進行、または持続時間を減少し、軽減し、阻害し、抑制し、制限し、制御し、または防止する「治療効果」または「利益」をもたらすことができる。したがって、疾患または有害症状のうちの１つ以上の根底にある原因に影響を及ぼす処置方法および使用は、有益であると考えられる。疾患の安定化などの悪化またはその有害な症状の減少または軽減も、成功的な処置の成果である。
【０２７１】
したがって、治療上の利益または改善は、疾患、または疾患に関連する任意の１つ、殆どもしくは全ての有害な症状、合併症、結果、または根底にある原因の完全な除去である必要はない。したがって、短期もしくは長期の持続期間（時、日、週、月など）にわたって、対象の疾患における漸進的な改善、または疾患の発生、頻度、重症度、進行、もしくは持続時間における部分的な減少、軽減、阻害、抑制、制限、制御、もしくは防止、または疾患の阻害もしくは好転（例えば、１つ以上の症状もしくは合併症の安定化）がある場合に、満足のいくエンドポイントが達成される。疾患の潜在的な治療効果または改善を提供する処置などの方法または使用の有効性は、様々な方法によって確認することができる。
【０２７２】
開示される方法および使用は、所望の治療、有益、付加的、相乗的、または相補的な活性または効果を有する任意の化合物、薬剤、薬物、処置、または他の治療レジメンもしくはプロトコルと組み合わせることができる。例示的な組み合わせ組成物および処置には、第２の活性剤、例えば、生物製剤（タンパク質）、薬剤および薬物が含まれる。そのような生物製剤（タンパク質）、薬剤、薬物、処置、および治療は、本発明の任意の他の方法または使用、例えば、血液凝固疾患の対象を処置する治療方法の前に、実質的に同時に、またはそれに続いて投与するか行うことができる。
【０２７３】
化合物、薬剤、薬物、処置、または他の治療レジメンもしくはプロトコルは、組み合わせ組成物として投与されてもよく、または別々に、例えば、本明細書に記載のＡＡＶベクターもしくはＡＡＶビリオンの送達と同時にもしくは連続的にもしくは逐次的に（送達の前または後に）投与することができる。したがって、本発明は、本発明の方法または使用が、本明細書に記載されるかまたは当業者に既知である任意の化合物、薬剤、薬物、治療レジメン、処置プロトコル、プロセス、療法または組成物と組み合わされる場合の組み合わせを提供する。化合物、薬剤、薬物、治療レジメン、処置プロトコル、プロセス、療法または組成物は、本明細書に記載のＡＡＶベクターまたはＡＡＶビリオンを対象に投与する前、実質的に同時、または投与後に投与または実施することができる。したがって、組み合わせの実施形態の具体的な非限定的な例には、前述のまたは他の化合物、薬剤、薬物、治療レジメン、処置プロトコル、プロセス、療法もしくは組成物が含まれる。
【０２７４】
本発明の方法および使用は、特に、別の化合物、薬剤、薬物、治療レジメン、処置プロトコル、プロセス、または療法の必要性または使用の低減をもたらす方法および使用も含む。例えば、血液凝固疾患に関して、本発明の方法または使用は、所与の対象において、対象における欠損または欠陥（異常または変異）内因性凝固因子を補充するための組換え凝固因子タンパク質の投与の投与頻度が低いか、もしくはその投与の用量が低減したか、またはその投与が排除された場合、治療利益を有する。したがって、本発明に従って、別の処置または治療の必要性または使用を低減する方法および使用が提供される。
【０２７５】
本発明は、動物において有用であり、獣医学的用途を含む。したがって、好適な対象には、ヒトなどの哺乳動物、および非ヒト哺乳動物が含まれる。「対象」という用語は、動物、典型的には哺乳動物、例えばヒト、非ヒト霊長類（類人猿、テナガザル、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、マカク）、飼育動物（ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ａｎｉｍａｌ）（イヌおよびネコ）、家畜（ｆａｒｍ  ａｎｉｍａｌ）（ニワトリおよびカモ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタなどの家禽）、および実験動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモット）を指す。ヒト対象には、胎児対象、新生児対象、乳児対象、幼若対象、および成人対象が含まれる。対象には、動物性疾患モデル、例えば、血液凝固疾患のマウスおよび他の動物モデル、ならびに当業者に既知の他のものが含まれる。
【０２７６】
本発明に従って処置可能な疾患の非限定的な特定の例には、本明細書に記載される疾患および膵臓疾患が含まれる。膵臓疾患には、真性糖尿病（例えば、Ｉ型およびＩＩ型）、急性膵炎、慢性膵炎、遺伝性膵炎、自己免疫性膵炎、膵臓癌（例えば、膵臓腺癌、膵腺房細胞癌、嚢胞腺癌、膵芽腫、膵粘液性嚢胞腫瘍など）、膵臓良性腫瘍（例えば、膵漿液嚢胞腺腫、充実性偽乳頭状膵臓腫瘍など）、膵内分泌腫瘍、嚢胞性線維症、膵外分泌不全（ＥＰＩ）、膵偽嚢胞、膵嚢胞、シュワッハマン・ダイアモンド症候群、ヨハンソン・ブリザード症候群、一般的なチャンネル症候群（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｃｈａｎｎｅｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ゾリンジャー・エリソン症候群、総胆管嚢胞、膵管出血、または先天性膵臓異常（例えば、膵管癒合不全、輪状膵、異所性膵組織）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２７７】
一実施形態では、本発明の方法または使用は、（ａ）キャプシドが本明細書に記載されるように調製された変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドを含むＡＡＶビリオンを提供することであって、ＡＡＶビリオンが異種核酸配列を含み、異種核酸配列が、上記核酸配列の転写を付与する発現制御要素に作動可能に連結される、提供することと、（ｂ）上記異種核酸が哺乳動物内で発現されるように、ある量のＡＡＶビリオンを哺乳動物に投与することと、を含む。
【０２７８】
一実施形態では、本発明の方法または使用は、（ａ）本明細書に記載されるように調製された変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドによってパッケージングされた治療分子（例えば、ワクチンを含む）を提供することであって、該治療分子が異種核酸配列を含み、該異種核酸配列が、該核酸配列の転写を付与する発現制御要素に作動可能に連結されている、提供することと、（ｂ）上記異種核酸が上記哺乳動物において発現されるように、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドによってパッケージングされた、ある量の治療分子（例えば、ワクチンを含む）を上記哺乳動物に投与することと、を含む。
【０２７９】
別の実施形態では、本発明の方法または使用は、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドによってパッケージングされた異種ポリヌクレオチド、変異ＡＡＶキャプシドポリペプチドによってパッケージングされた複数の異種ポリヌクレオチド、本明細書に記載されるように調製されたＡＡＶビリオン、または異種核酸配列を含む複数のＡＡＶビリオンを哺乳動物もしくは哺乳動物の細胞に投与し、それによって、異種ポリヌクレオチド配列を哺乳動物または哺乳動物の細胞に送達または移入することにより、異種ポリヌクレオチド配列を哺乳動物または哺乳動物の細胞に送達または移入することを含む。いくつかの実施形態では、異種核酸配列は、哺乳動物で発現されるタンパク質をコードし、または異種核酸配列は、哺乳動物における内因性タンパク質の発現を低減する阻害配列またはタンパク質をコードする。
例として、血友病に関して、治療効果を得るためには、正常な個体に見出される因子濃度の１％超の血液凝固因子濃度が、重症疾患表現型を中等度の疾患表現型に変えるために必要であると考えられる。重症の表現型は、関節損傷および命に関わる出血によって特徴付けられる。中等度の疾患表現型を軽度の疾患表現型に変えるには、正常値の約５％超の血液凝固因子濃度が必要と考えられる。そのような血友病対象の処置に関して、所望の治療効果を達成するために、典型的な用量は、少なくとも１×１０１０のＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）／対象の体重１ｋｇあたり（ｖｇ／ｋｇ）、もしくは約１×１０１０〜約１×１０１１ｖｇ／対象の体重１ｋｇあたり、もしくは約１×１０１１〜約１×１０１２ｖｇ／対象の体重１ｋｇあたり、または約１×１０１２〜約１×１０１３ｖｇ／対象の体重１ｋｇあたりである。
【実施例】
【０２８０】
実施例１：ヒト膵島標的化のためのＡＡＶの指向性進化
序論
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、様々な細胞種への遺伝子移入の強力なビヒクルとして非常に関心が高い。ＡＡＶは、ヒト遺伝子治療のための有望なビヒクルとなるいくつかの特徴を有するが、その複雑性、導入遺伝子パッケージングサイズの制限、および一般集団における既存の中和抗体の高い発生率など、いくつかの欠点により、臨床用途のためのその使用が妨げられる。遺伝子治療の目的のために、形質導入は、効率的かつ高度に細胞種特異性の両方である必要がある。ＡＡＶ細胞トロピズムおよび免疫原性は、構造キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の配列によって決定される。
【０２８１】
ＤＮＡシャフリングは、特定の機能を有する分子のインビトロ進化のための強力な方法であり、医療、医薬品、および農業研究などの多種多様な分野での用途を有する。ＡＡＶキャプシド配列のシャフリングは、インビトロおよびインビボでの改善された細胞形質導入能力を有する組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を進化させるために過去において成功裏に使用されている（Ｄ．Ｇｒｉｍｍ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２，５８８７−５９１１（２００８）、およびＬ．Ｌｉｓｏｗｓｋｉ．Ｎａｔｕｒｅ，５０６，３８２−３８６（２０１３））。
【０２８２】
目的
本研究の目的は、糖尿病研究の分野における遺伝子治療用途のためのＡＡＶベクターを生成することである。ハイスループット配列決定のための特有のバーコードで標識付けされたシャフリングされたキャプシド配列を含む高度に複雑なＡＡＶライブラリーを生成し、一次ヒト膵島において多数回の継代ラウンドを行うことによる膵島形質導入の改善についてスクリーニングした。
【０２８３】
結果
様々なＡＡＶ野生型血清型および前述の変異体（図２）由来のキャプシド遺伝子をＤＮａｓｅシャフリング法（Ｗ．Ｐ．Ｓｔｅｍｍｅｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，１０７４７−１０７５１（１９９４））を使用してシャフリングし、キャプシドポリＡ（ｃａｐ  ｐｏｌｙＡ）の下流にバーコード配列を含むＡＡＶ骨格ライブラリーにクローニングした（図３）。各ＡＡＶ変異体を特有のバーコードで標識付けすることにより、ハイスループット配列決定による継代ラウンド間の変異体の濃縮の追跡が可能になる。１０個の親ライブラリーをより詳細に分析し、Ｓａｎｇｅｒ配列決定による良好な交差率を有することが見出された（図４）（Ｗ．Ｈｕａｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６０，９１−９４（２０１６））。ＰａｃＢｉｏ配列決定技術を使用してハイスループットキャプシド＋ＢＣ配列決定を行い、１０個の親キャプシド配列の同様の寄与レベル（図５）ならびに良好なキャプシド−ＢＣ結合を明らかにした（例えば、図１を参照のこと）。
【０２８４】
ヒト膵島に、高い感染多重度（ＭＯＩ）で、キャプシドシャフリングされたバーコード化ＡＡＶライブラリー、および各々特有のバーコードで標識付けした親キャプシドＡＡＶの対照プールを感染させた（図８および図１２）。殆どのスクリーニングにおいて、ヒトアデノウイルス５を、ＡＡＶを複製するためのヘルパーとして添加した。インタクトな膵島および分離された膵島の両方を実験に使用し、各スクリーニングについて３回の継代ラウンドを行った。各ラウンドにおいて、ＡＡＶ複製をｑＰＣＲによって評価し、ＡＡＶライブラリーおよび１８個の親混合物の両方が膵島において複製していることが示された（データは示していない）。
【０２８５】
ウイルスゲノムから増幅されたＡＡＶバーコードのＭｉＳｅｑシーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してハイスループット配列決定を各継代ラウンド後に行った。１８個の親混合物によるインタクトな膵島の感染により、ＤＪキャプシド配列を含むＡＡＶに対する選択圧が明らかとなったが（図１０）、ＬＫ０３は、膵島形質導入についてＤＪよりも優れていることが見出された。これは、形質導入の改善を付与するキャプシド配列を有する変異体が、長時間の継代中に失われ得るが、良好に複製するそれらの変異体は集団を引き継ぎ得ることを示唆している。この理由により、１０個の親ライブラリーを使用して、Ａｄ５との重感染を含まない１回のスクリーングを行った。両方のライブラリーを継代した後に得られたバーコードのディープシークエンシングにより、いくつかのキャプシド変異体の急速な濃縮が明らかになった（図１１、１３、１４）。
【０２８６】
実施例２：増強されたヒト膵臓組織またはヒト膵島細胞トロピズムを有する新規な組換えアデノ随伴ウイルスキャプシド
目的
本発明の目的は、ヒト膵島細胞に形質導入するための増強された能力を有するｒＡＡＶベクターを見出すことであった。これは、内分泌障害特異的１型および２型糖尿病の新規な処置に有用である。
【０２８７】
技術的説明
ＡＡＶキャプシドライブラリーを使用して、分離されたヒト膵島またはインタクトなヒト膵島のいずれかを選択的に形質導入したＡＡＶを選択した。これらのキャプシド配列をバーコード特異的リバースプライマーを使用して増幅し、導入遺伝子としてＧＦＰを有するｒＡＡＶを生成した（図１８）。Ａｃｃｕｍａｘを使用して膵島を分離し、３７℃、ＭＯＩ＝１Ｋまたは１０Ｋｖｇ／細胞で４８時間形質導入し（１０％ＦＢＳ／ＣＭＲＬ）、プレーティングし、形質導入の４８時間後にフローサイトメトリーによって分析した。インタクトなヒト膵島を、氷上、ＭＯＩ＝１０Ｋｖｇ／細胞で１〜２時間形質導入し（２％ＦＢＳ／ＣＭＲＬ）、続いて、形質導入後２日目の培地交換を伴って、３日間懸濁培養し、次いでフローサイトメトリーによって分析した。２Ｂ４（膵島表面マーカー）および８Ｇ１２（α細胞表面マーカー）に対するモノクローナル抗体を使用して、フローサイトメトリーを行った。数回継代した後、最も多く見られるキャプシドを単離し、配列決定した。ＧＦＰレポーターを発現するｒＡＡＶベクターを、ヒト膵島の形質導入において現在最も強固であると考えられる以前に単離したｒＡＡＶと比較した。
【０２８８】
冷（ｃｏｌｄ）形質導入プロトコルを使用して、２つの異なるドナー（ＭＯＩ１０，０００）由来のインタクトなヒト膵島で形質導入を行った。汎膵島マーカーおよびα細胞特異的マーカーに対する抗体を使用して、表面染色を行った。
【０２８９】
冷形質導入プロトコル膵島全体をペレット化し、上清を除去した（１５ｍＬ  Ｆａｌｃｏｎチューブ中）。１００μＬのＣＭＲＬ＋２％のＦＢＳを膵島に添加した。ＡＡＶを添加し、チューブを何回か軽く叩いた。氷上の１５ｍＬ  Ｆａｌｃｏｎチューブ（ほぼ平らに（約１０〜１５度の角度で）横たわっている）をインキュベートし、アイスバケットを冷えた部屋で水平型（ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ）シェーカー（約１００ｒｐｍ）上部に１〜２時間置いた。膵島培養培地（ＣＭＲＬ−１０６６＋１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ＋０．５％ヒト血清アルブミン＋２％ＦＢＳ＋１０ｍＭニコチンアミド＋抗生物質／抗真菌剤＋１ＸＧｌｕｔａｍａｘ）を３７℃で予熱した。２４ウェル形式の非コーティング／再懸濁プレート中に、１ウェルあたり３５０〜５００の膵島（ＡＡＶを有する）を移した。１ウェルあたり１ｍＬの予熱した膵島培養培地を添加した。３７℃、湿度５％のＣＯ２インキュベーター中で２日間放置する。２日目に培地を変えた。ＦＡＣＳ（Ｄｏｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＦＡＣＳ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ、表面抗体を使用して膵島をα、β、非α／非βに細分化する）のために３日目に膵島を採取した。
【０２９０】
新規な変異体の形質導入効率をインビボで試験した。ＣＡＧ−Ｆｌｕｃを有する４つの群（ＤＪ、ＡＡＶ８、ＫＰ１、ＫＰ２、およびＫＰ３）における異なるＡＡＶを、Ｂａｌｂ／ＳＣＩＤマウス（ｎ＝４匹のマウス／群）に２ｅ１０ｖｇ／マウスで注射した（図４２を参照）。インビボでのルシフェラーゼ画像化を、毎週、４〜６週間行った。いくつかの臓器（例えば、肝臓、膵臓、肺、心臓、脳、脾臓、腎臓）を採取し、７日目および５週目にルシフェラーゼ活性、Ｆｌｕｃ転写産物レベル、およびベクターコピー数について分析した。
【０２９１】
結果
一次ヒト膵島細胞への形質導入効率をＦＡＣＳによって評価した。いくつかのキャプシド変異体は、最良の親ＬＫ０３と比較した場合に、改善された形質導入を示した（図１９、２０、２２〜２８、３０、３１、３３、および３４）。インスリンおよびグルカゴンについての細胞内染色により、変異体のいずれかがα細胞またはβ細胞に対する選択性を示すかどうかが明らかになる。それらの相対的形質導入効率を比較し、上位候補は、これまでの至適基準の約１０倍強固であった。
【０２９２】
本研究は、キャプシドへの追加の遺伝子改変が、標的細胞、例えば、膵島細胞への効率的な遺伝子移入のための増強されたｒＡＡＶ形質導入を提供することを実証している。これは、膵臓α細胞および／またはβ細胞に対する特異性の標的化に対する重要な解決策を提供する。
【０２９３】
２つの異なるドナー由来のインタクトなヒト膵島に対して形質導入を行った（ＭＯＩ１０，０００）。汎膵島マーカーおよびα細胞特異的マーカーに対する抗体を使用して表面染色を行い、結果を図３５〜３６に示す。新規な変異体の増強された形質導入効率が、様々なヒト細胞株および非ヒト細胞株において示された（図３９）。新規な変異体のうちの２つ、ＫＰ１およびＫＰ３は、ＬＫ０３よりも良好な中和プロファイルを有した（図４６）。
【０２９４】
新規な変異体への形質導入効率をＢａｌｂ／ＳＣＩＤマウスにおいてインビボで試験した。Ｂａｌｂ／ＳＣＩＤマウスに、異なるキャプシドがパッケージングされた２Ｅ＋１０ｖｇのルシフェラーゼベクターを尾部に注射した。肝臓（腹部および背部）におけるルシフェラーゼ発現を７日間および１４日間モニタリングした。次いで、ルシフェラーゼ発現（腹部）を毎週、５週間にわたってモニタリングした（３３日目）。７日目および１４日目のルシフェラーゼ画像化の結果を図４３に示し、図４４および図４５では定量化している。新規な変異体のインビボ肝臓形質導入効率は、１４日目〜３３日目には安定していた（図４７）。様々な臓器におけるルシフェラーゼ発現を５週目にイクスビボで試験した（図４８）。肝臓におけるベクターコピー数は、脳、心臓、および脾臓と比較して上昇した（図４９）。
【０２９５】
実施例３：一次ヒト膵島細胞の増強された形質導入のためのバーコード化アデノ随伴ウイルスキャプシドシャフリングライブラリーの生成およびスクリーニング
要約
ランゲルハンス膵島への安全かつ有効な遺伝子移入は、糖尿病の処置に有望な手法である。膵島への組換えＡＡＶ媒介遺伝子の移入は、それらの細胞を高い効率で形質導入するＡＡＶ血清型の欠如によって妨げられる。ヒト膵島について改善されたトロピズムを有する新規なＡＡＶ血清型を同定するために、２つの高度に複雑なバーコード化された複製能を有するキャプシドライブラリーを構築し、多様性を単分子ＤＮＡ配列決定によって検証し、連続的な選択をヒト膵島で行った。濃縮されたバーコードを、ハイスループット配列決定によって追跡し、以前に同定した最良のキャプシドと比較して５〜１０倍の効率を有する、分離された膵島およびインタクトな膵島に形質導入することができる３つのキャプシド変異体を同定した。インタクトなヒト膵島に浸透することができるこれらの新規なＡＡＶキャプシド変異体は、糖尿病を有する患者の処置のための強力な遺伝子治療ツールを表す。キャプシドのうちの１つはまた、ヒト化キメラマウスモデルにおけるマウスおよびヒト肝細胞の両方への形質導入において強固であり、したがって、ヒト臨床試験での使用前の臨床前試験のための代用キャプシドを使用する必要性のない多機能ベクターを提供する。
【０２９６】
序論
ウイルス遺伝子移入ベクターの開発は、依然として積極的な調査分野である１。組換えＡＡＶベクターは、臨床前および臨床試験における生物全体への遺伝子移入の安全なビヒクルとして現れているが、依然として重要な制限がある２。ｒＡＡＶの主な欠点は、約５ｋｂの制限されたパッケージングサイズ、既存の中和抗体による迅速なウイルス除去、天然に存在する血清型の制限された宿主トロピズム、およびＡＡＶのエピソーム性による分裂細胞で発現する導入遺伝子の喪失である。ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３タンパク質からなるキャプシドは、様々な受容体および共受容体の認識に基づく細胞トロピズムの主な決定因子を有する３。さらに、キャプシド変異体は、キャプシド脱脱殻（ｕｎｃｏａｔｉｎｇ）４、細胞内輸送、および核侵入５などの様々な侵入後事象を示し得、これらは、組織および種の間の形質導入の差異をもたらす。天然および非天然ＡＡＶキャプシド変異体は、バイオマイニング（ｂｉｏ−ｍｉｎｉｎｇ）、すなわち、天然に存在するＡＡＶの単離および特徴付け６、キャプシドペプチドディスプレイライブラリーのスクリーニング７〜９、細胞特異的設計アンキリンリピートタンパク質（Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  Ａｎｋｙｒｉｎ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）（ＤＡＲＰｉｎｓ）を示すライブラリー１０、およびランダムＤＮＡシャフリング１１によって得られるキャプシドライブラリーのスクリーニングを使用して単離されており、これまでに最も徹底的に探索されてきた経路である。最近、祖先ＡＡＶキャプシド配列からなるライブラリーの作成およびスクリーニングは、非常に特異的な細胞標的化を有するＡＡＶを得るための貴重なツールとして記載されている１２。
【０２９７】
指向性進化は、大きく加速する様式で自然進化を模倣する強力なツールである。最も重要なことに、配列−機能の関係に関する事前知識は必要なく、これは合理的な設計戦略とは対照的である。所望の配列の高度の多様性のライブラリーを作成し、続いて、所望の表現型を示す変異体についてスクリーニングする。ＤＮａｓｅ媒介シャフリング１３〜１４、Ｓｔａｇｇｅｒｅｄ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ（ＳＴＥＰ）１５、Ｒａｎｄｏｍ  Ｃｈｉｍｅｒａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｎ  Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  Ｔｅｍｐｌａｔｅｓ１６、制限酵素媒介シャフリング１７、およびその他（詳細なプロトコルについては、１８を参照のこと）などの、ライブラリー生成のためのいくつかの方法が記載されている。本研究のために、いくつかの全長ＡＡＶキャプシド配列のＤＮａｓｅ媒介ファミリーシャフリング１３、１９を用いて、高度に複雑かつ機能的なライブラリーを作製した。この技術は、関連する遺伝子のファミリーに由来するランダムに断片化されたＤＮＡが、ハイブリダイゼーションによるキメラ全長配列に再組み立てする能力を利用する１３〜１４。部分的に再組み立てされたＰＣＲ産物が、関連するが同一ではない鋳型の相同位置でプライミングし（ｐｒｉｍｅ）、したがって、鋳型スイッチが開始されたときに、交差が発生する。１５塩基未満の同一性に基づく交差は、ライブラリーの複雑性（ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ）を得ることが困難であるので１３〜１４、したがって、品質は、親配列の多様性と負の相関関係にある傾向がある。ＤＮＡシャフリングを使用して、所望の表現型についてスクリーニングすることができる遺伝子の大きなライブラリーを作製することができる。この技術の成功した用途は、様々な酵素、プロモーター、免疫調節タンパク質の特性の改善など、多くの分野で記載されている１９〜３２。２０００年にＳｏｏｎｇらは、ウイルス進化のためのＤＮＡシャフリングの用途を最初に記載した２０。この高度に多様なウイルスライブラリーを利用するために、数回の継代ラウンド全体を通してストリンジェントな選択圧に供され、濃縮された変異体が回収される。この技術により、改善されたエンベロープ安定性を有するモロニー白血病ウイルス（ＭＬＶ）粒子２６、ならびに新規な宿主細胞トロピズムを有するＭＬＶおよびＨＩＶ−１が開発された２５、２８。２００８年に、Ｇｒｉｍｍ，Ｄらは、キャプシドシャフリングおよび多数回の選択ラウンドにより、改善されたＡＡＶ変異体の選択に成功したことを最初に報告した８。ＡＡＶキャプシド進化のための異なる方法（ＳＴＥＰと組み合わせたエラープローン（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ）は、以前に記載されている３３。間もなく、別の者が、ＡＡＶキャプシドシャフリングライブラリーを作成し、スクリーニングした３４〜４０（総説については１１を参照のこと）。これらのスクリーニングのいくつかは、選択のラウンド間で濃縮されたＡＡＶ変異体を複製するためにヒトアデノウイルス５の存在下で行われたが、アデノウイルスのないＡＡＶライブラリースクリーニングも報告されている４１〜４４。
【０２９８】
推定３，０３０万の米国人が、１型または２型真性糖尿病のいずれかに罹患している４５。糖尿病を治療するための様々な戦略が長年にわたって評価されてきた。死んだヒト膵島の肝管への移植は、１型糖尿病患者でのβ細胞を交換するために使用されており、これまでに成功は限定的である（総説については４６を参照のこと）。膵島には血管が多く、生存するには大量の酸素が必要である。移植された膵島の血管再生は数週間かかるため、それらの移植片では、酸素欠乏により、非常に多くの細胞が死滅する。特定の転写因子を供給または抑制するエクスビボ遺伝子治療は、移植片の生存率および機能を改善するために使用され得る（総説については４７を参照のこと）。最近、ＰＨＬＤＡ３のノックアウトが、マウスにおける移植された膵島の生存率の増加をもたらすことが示された４８。この手法に加えて、再発性自己免疫破壊による移植された膵島の喪失を防止することが最も重要である。最近、ある研究は、Ｉｇｆ１を過剰発現し、したがってマウスにおける自己免疫性糖尿病への進行を妨害するためのＡＡＶの使用について記載している４９。
【０２９９】
処置のための別の戦略は、Ｐｄｘ１、Ｎｇｎ３、ＭａｆＡ、Ｐａｘ４、およびＡｒｘなどの特定の転写因子の過剰発現または抑制によって、グルカゴン産生α細胞または他の内分泌もしくは外分泌膵臓細胞種をβ細胞に変換することである５０〜５８（総説については５９を参照のこと）。糖尿病マウスモデルにおけるフォリスタチン過剰発現は、β細胞機能を保持することが示されている６０。
【０３００】
今日まで、膵島のための遺伝子治療用ビヒクルとしてのＡＡＶの使用を記述した研究はほんのわずかしかなく、作業の殆どはマウス膵島で行われてきた。マウスにおける腹腔内送達後にβ細胞の高度に特異的な形質導入を達成するためのβ細胞種特異的インスリンプロモーターと組み合わせたＡＡＶ８キャプシドが記載されている６１。別の研究では、ＡＡＶ６が、インビトロで高効率でおよび管内経路を介してマウス膵島に形質導入することが見出されたが、ＡＡＶ８は、全身送達されたときにより強固な血清型であることが示された６２。フェニルアラニンへの表面曝露キャプシドチロシン残基の部位特異的変異誘発は、細胞内ユビキチン化−プロテアソーム分解からの回避により、いくつかの血清型の形質導入効率を増強することが記載されている６３〜６７。最近、Ｙ−Ｆ変異体ＡＡＶ８ベクターは、野生型ＡＡＶ８と比較して、マウス膵島への遺伝子移入が最大１０倍改善されることが報告されている６８。興味深いことに、ラットにおける研究により、ＡＡＶ５がこのげっ歯類での膵島形質導入のための最良のキャプシドであることが見出された６９。ＡＡＶ２は、ヒト膵島７０、７１への形質導入のために最も頻繁に記載されている血清型である。より最近では、キャプシド変異体ＤＪおよびＬＫ０３は、ＡＡＶ２およびＡＡＶ３Ｂと比較して、ヒト膵島でより良好な形質導入効率を有することが見出されたが、それらのキャプシドではα細胞に対する強い選好が観察された７２。
【０３０１】
本研究は、さらに増強されたヒト膵島細胞形質導入効率を有するキャプシド変異体を開発することを模索した。この目的のために、キャプシドシャフリングされたバーコード化ＡＡＶライブラリーをヒト膵島での多数回の選択ラウンドに供し、形質導入効率の改善について濃縮したキャプシド変異体を分析した。キャプシドのバーコード化を行い、キャプシドのＳａｎｇｅｒに基づく低スループット配列分析ではなく、バーコードのハイスループット配列決定を用いることによってキメラ変異体の濃縮を続いて行った。ＡＡＶバーコードＳｅｑと称されるこの新規な技術は、最初に、小さなＡＡＶライブラリーまたは親プールに由来する変異体のインビボ追跡について記載されている７３。試験した全ての候補の中で、３つのキメラ変異体は、ヒト膵島への形質導入能力、特にβ細胞への形質導入能力、ならびにインビトロおよびインビボにおける他の細胞種への形質導入能力が大きく改善されていることが見出された。これらの新規なキャプシドは、糖尿病処置のために膵島を標的化するもの以外に、様々な遺伝子治療用途に有用であり得る。
【０３０２】
結果：
ヒト膵島形質導入効率についての親キャプシドの評価
最初の工程は、ＡＡＶ−ＤＪおよびＡＡＶ−ＬＫ０３が、密接に関連する天然血清型ＡＡＶ−２およびＡＡＶ３Ｂよりも高いヒト膵島形質導入効率を有することを示す以前のデータを確認することであった７２。異なるキャプシドによりパッケージングした一本鎖（ｓｓ）および自己相補的（ｓｃ）ＧＦＰ発現ベクターをヒト膵島に形質導入し、フローサイトメトリーを用いて形質導入効率を測定した（図６２Ａ）。予測した通り、ＡＡＶ−ＤＪおよびＡＡＶ−ＬＫ０３は、ＡＡＶ２およびＡＡＶ３Ｂよりも、ヒト膵島において高い形質導入率を有した。この結果を確認することにより、シャフリングされたキャプシドライブラリーでスクリーニングを行う前の検証研究の基礎が提供された。本研究のために、各々がキャプシドコード配列の直ぐ下流に特有のバーコード（ＢＣ）配列を有する親ＡＡＶを含む対照ＡＡＶプールを生成した。等しいコピー数の１８個の親ＡＡＶの各々を混合した後、プールを精製し、バーコードのハイスループット配列決定によってその組成を分析した（図５０Ｃ）。親ＡＡＶのうちのいくつかは、プール中で低い割合または高い割合を占めていたが、１８個の親プールは、キャプシド選択スクリーニングにおけるバーコード配列決定に使用するための最初の検証としてのパイロット（ｐｉｌｏｔ）ライブラリースクリーニングにおいて有用であることが見出された。どのキャプシドがヒト膵島のインタクトな形質導入に最も適していたかを評価するために、インタクトなヒト膵島および分離されたヒト膵島を１８個の親プールに感染させ、ヒトアデノウイルス５に重感染させて、ＡＡＶを複製した。中央の膵島細胞が周辺の膵島細胞よりも感染しにくいことが推論されたため、インタクトな膵島の感染では分離した膵島の感染よりも１０倍高い感染多重度（ＭＯＩ）を使用した。連続した３回の選択ラウンドを行い、ＡＡＶ複製（図５１）およびウイルスプールの組成（図５２）を各ラウンドにおいて評価した。ラウンド１およびラウンド２の選択では、インタクトな膵島での増殖後、投入量と比較して、より低いコピー数のウイルスゲノムを回収したが、ラウンド３では複製物が増した。２０００の低いＭＯＩを使用して、分離された膵島細胞に感染させたとき、膵島培養後に得られるウイルスの量は、各選択ラウンドでの投入量よりも高かった。ＢＣ配列の次世代配列決定（ＮＧＳ）を使用して、各ラウンドでのＡＡＶの組成を評価した。各試料について４００，０００〜１，０００，０００個の配列読み取りを得た。１回の選択ラウンド後、特にインタクトな膵島を使用したときに、プールの多様性がすでに減少していたため、特定の親ＡＡＶは、他のものよりも明らかな利点を有していた（図５２）。ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ｂ、ならびにシャフリングされた変異体ＤＪおよびＬＫ０３は、第１の継代後にすでに濃縮された。インタクトな膵島における第３の継代後、予測した通り、ＡＡＶ−ＤＪおよびＡＡＶ−ＬＫ０３は等しく存在し、ＡＡＶ２およびＡＡＶ３Ｂはより低い程度で存在した。分離された膵島細胞での１８個の親プールの継代により、ＡＡＶ−ＤＪの早期の濃縮が明らかとなり、ＡＡＶ２、ＬＫ０３、ＡＡＶ３Ｂ、およびＡＡＶ−アカゲザル１０の割合はより低かった。この実験は、ＡＡＶ−ＤＪおよびＡＡＶ−ＬＫ０３が一次ヒト膵島を強固に形質導入することを示した以前の形質導入研究を確認したため、該実験により、我々の選択スクリーニング手法の正当性が立証された。
【０３０３】
多様性の高いバーコード化キャプシドシャフリングＡＡＶライブラリーの生成
シャフリングされたＡＡＶライブラリーを生成する前に、多様性の高いＡＡＶバーコード（ＢＣ）ライブラリーを作成した。この目的のために、２０ヌクレオチド（ｎｔ）長のリンカーによって分離された２つの１２ヌクレオチド（ｎｔ）長のランダムバーコード配列からなる断片を、ＡＡＶ２  ｐ５プロモーターおよびｒｅｐ遺伝子を含むがキャプシド配列は含まないＡＡＶベクターを含むＩＴＲにクローニングした。バーコード断片を、キャプシドポリＡ配列の直ぐ３’側にクローニングし、したがって、ハイスループット配列決定により、選択プロセス全体にわたって変異体濃縮の追跡が可能となった。ＢＣを有するまたは有しない野生型ＡＡＶの複製研究によって示されるように、ＢＣ配列の挿入は、ウイルス機能に悪影響を及ぼさなかった（データは示していない）。バーコードプラスミドライブラリーのハイスループット配列決定により、十分に高い多様性が示され、全ＢＣ読み取りの９３％超が特有の配列を有していた（表６）。１２０万超の読み取りのうち、１つのＢＣ配列のみが６回存在し、２０個の異なるＢＣ配列が５回繰り返し存在し、３４２個の異なるＢＣ配列が各々４回見出され、４８４４個のＢＣが各々３回繰り返し存在していることが検出され、７４，４３３個のＢＣ配列（６％）が２回見出された。バーコードのハイスループット配列決定は増幅工程を伴うため、ＢＣライブラリーにおける反復バーコードの実際の数がそれより低かった可能性が非常に高い。バーコードライブラリーのサイズは、形質転換反応物のアリコートから得られたコロニー数に基づいて１Ｅ０７であると推定された。次いで、１０個の関連するＡＡＶまたは１８個以上の多様なＡＡＶ由来の配列を使用してシャフリングされたキャプシドを生成し、ＢＣライブラリーベクターにクローニングした。シャフリングに使用される親配列の系統分析を図５８Ａに示す。これらのキャプシド配列のうちの２つ、ＤＪおよびＬＫ０３は、以前の生成ライブラリーを使用して当実験室で行われた以前のスクリーニングから得られ、ＤＪについてはＡＡＶ２、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９ｈｕ１４のハイブリッドであり、またはＬＫ０３についてはＡＡＶ１、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９ｈｕ１４のハイブリッドである（図５８Ｂ）。図５８Ｂは、ＤＪおよびＬＫ０３キャプシドの組成物を示し、図５８Ｃは、ＤＪおよびＬＫ０３組み立て活性化タンパク質（ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＡＡＰ）の組成物を示す。キャプシドは、バーコード化された１０個の親ライブラリーをシャフリングし、１８個の親ライブラリーは各々、ライブラリー形質転換反応物の小さなアリコートをプレーティングした後に寒天プレート上で増殖したコロニー数によって推定される、約５Ｅ０６個の異なるクローンのサイズを有した。ＢＣ配列決定後の複製数が少ないことを考えると、複雑性は、ライブラリーの各々について少なくとも１００万であると推定された。
【０３０４】
【表６】
2021519791.tif 000035
【０３０５】
ライブラリーの多様性の程度を、３つの異なる方法−バーコードのハイスループットＭｉＳｅｑ分析、バーコードを含むキャプシドのＰａｃＢｉｏ配列決定、ならびにバーコードを含むキャプシドのＳａｎｇｅｒ配列決定を使用して評価した。プラスミドライブラリーならびにＡＡＶライブラリー由来のバーコードの増幅およびハイスループット配列決定により、低い複製数で非常に高い程度の複雑性が明らかになった。各試料について少なくとも１００万回の読み取りを得た（表６）。１０個の親ライブラリーを、プラスミドレベルで、すなわち２９３Ｔ細胞へのトランスフェクション前に分析したところ、全ての読み取りのうちの８８．３％が特有の配列を含み、最大の複製数は１２５万の読み取りのうちの７つの読み取りであることが見出された。１８個の親プラスミドライブラリーについて、読み取りのうちの８８．６％が特有であり、１つの単一ＢＣ配列について得られた最大読み取り数は、１８０万の読み取りのうちの８つであった。ＡＡＶライブラリーのＮＧＳデータ分析により、１０個の親ライブラリーおよび１８個の親ライブラリーではそれぞれ、約７６％および８０％の特有のＢＣ配列が明らかとなった（表６）。１０個の親ＡＡＶライブラリーでは、１つの単一ＢＣ配列が２８７の読み取り（０．０２５％）で表され、１８個の親ＡＡＶライブラリーでは、単一ＢＣについて得られた読み取りのうちの最多数は２３２（０．０２３％）であった。より低い数、特に１０倍以下で存在する他の複製物もあった。
【０３０６】
低スループット方法として、プラスミドライブラリーおよび１０個の親ＡＡＶライブラリーの両方由来のいくつかのキャプシドを、Ｓａｎｇｅｒ配列決定によって分析し、Ｇｉｌｌａｍ研究室によってオンラインで利用可能になったＸｏｖｅｒプログラムを使用して組換え分析に供した。（図５９Ａ、図６０Ａ）。ＡＡＶレベルにおける多様性の分析のために、キャプシドおよびバーコードに及ぶ領域を、抽出したウイルスゲノムから増幅し、クローニングし、配列決定した（図５９Ａ、右パネル）。シャフリングされたキャプシドの交差図を示すことに加えて、Ｘｏｖｅｒソフトウェアによって生成された親の寄与データを使用して、キャプシド配列全体にわたって保存分析を行った。各アミノ酸残基の保存値を計算し、グラフ化した（図５９Ｂ、図６０Ｂ）。この分析を使用することにより、ライブラリー内の配列多様性が、親配列と比較して著しく低下したかどうかを評価することが可能になる。プラスミドおよびＡＡＶレベルでの１０個の親ライブラリーの場合では、保存パターンは、親配列のものと密接に一致したが（図５９Ｂ）、１８個の親プラスミドライブラリーは、殆どのキャプシドにわたって親よりも高い保存レベルを示した（図６０Ｂ）。キャプシドアミノ酸配列の交差分析により、１０個の親ライブラリーが良好にシャフリングされたことが示され、１キャプシドあたり１１個の交差事象の平均的割合であった。少数のクローンは、キメラ親ＬＫ０３内のＡＡＶ４由来配列に由来するグルタミンを２４位に含んでいた。一致するゆえに、ＬＫ０３およびＤＪは、交差分析数値に親として含まれず、したがって、この残基は、デノボ（ｄｅ  ｎｏｖｏ）変異として特徴付けられる。１８個の親ライブラリーは十分にシャフリングされず、平均８個の交差であった。この観察は、親キャプシドの大部分が大きなストレッチ全体にわたって互いに相同性が低いことで説明することができる。１５塩基未満の同一性に基づいて交差を得ることは困難である１３。これは、等価モル量の各親を混合したときに、互いに相同性が低い断片が容易に組換えられないことに起因する可能性が高い。より少ない交差がライブラリーキャプシドの３’半分内で見出された観察はまた、キャプシドのこの部分が異なる血清型間の低い配列相同性のいくつかのストレッチを含むため、この制限によって説明することができる。ＡＡＶレベルについての１０個の親ライブラリーの複雑性は、プラスミドレベルについての複雑性と同様であることが見出され、これは、２９３Ｔ細胞でのＡＡＶ産生中のキャプシド組み立てが多様性を大幅に低減する障壁ではないことを示している（図５９）。さらに、交差分析パターンにより、親はライブラリー内でほぼ等しくかつランダムに存在するようであるが、ＡＡＶ３Ｂ配列はシャフリングされたクローンの３’部分を幾分好ましいものとするようであることが示される。これは、ＡＡＶ３Ｂに加えて、キメラキャプシドＬＫ０３をシャフリングするための親配列として使用したという事実によって部分的に説明することができる。ＬＫ０３の３’半分全体がＡＡＶ３Ｂに由来しており、したがって、ＡＡＶ３Ｂ配列を含む断片が、初期の断片プールにおいて大きな割合を占めた。個々のキャプシド���Ｓａｎｇｅｒ配列決定に加えて、２９３Ｔ細胞へのトランスフェクション前に、プラスミドレベル（図５０Ａ）およびＡＡＶレベル（図５０Ｂ）での１０個の親ライブラリーのＰａｃＢｉｏ配列決定を行った。プラスミドレベルでの１０個の親ライブラリーでは２１，０００の全長読み取りを得たが、その読み取りの約半数を１０個の親ＡＡＶライブラリーについて分析した。グラフは、キャプシドの全長にわたる各親アミノ酸残基の寄与を示す。Ｓａｎｇｅｒ配列決定によってすでに観察されたように、ＰａｃＢｉｏ配列決定により、キャプシド遺伝子の５’半分が、３’半分よりも、全ての親配列のより均一な分布を含んでいることが明らかとなった。特に、ＡＡＶブタ２およびＡＡＶ９ｈｕ１４由来の残基の寄与は、アミノ酸４５０位〜６５０位の配列ストレッチにおいて著しく減少したが、ＡＡＶ３Ｂ配列は大きな割合を占めた。ＡＡＶ３Ｂ配列が大きな割合を占めるこことは、ＡＡＶ３Ｂ由来の大きな配列ストレッチを含むＬＫ０３（図５８Ｂ）がシャフリングの親として使用された事実に少なくとも部分的に起因する可能性がある。
【０３０７】
実施した別の分析は、各キャプシドが特有のバーコード配列に連結されて、非常に高いレベルのキャプシド−ＢＣ連結が見出されるかどうかを確認することであった。ＰａｃＢｉｏ配列決定によれば、全ての配列の０．５％のみが、同一のバーコードを共有する異なるキャプシドを有していた。異なるバーコードが共通のキャプシド配列を共有するケースは検出されなかった。
【０３０８】
親ＡＡＶプールの生成および分析
対照ＡＡＶプールを、１８個のバーコード化親ＡＡＶの各々の等量（ベクターゲノムコピー数に基づく）から生成し、次いで、２回のＣｓＣｌ遠心分離によってこのプールを精製した。このプールの組成を、バーコードのハイスループット配列決定によって分析した（図５０Ｃ）。親ＡＡＶのうちのいくつかは、プール中で幾分低い割合を占めていたが、等量の各ウイルスを精製前にプールした。これらの親ＡＡＶは、ＣｓＣｌ勾配において収集された画分外の密度でバンド付けが行われた可能性がある。それにも関わらず、殆どの親配列のプールにおいて非常に均等に存在していた。増幅キャプシド＋ＢＣ配列のＰａｃＢｉｏハイスループット配列決定によっても、親ＡＡＶプールを分析した（図５０Ｄ）。ＰａｃＢｉｏ配列決定を使用して、ＢＣ  ＮＧＳデータと比較してプールの組成について同様であるが同一ではないデータを得た。これらの相違は、特定のＢＣ配列またはキャプシド＋ＢＣ配列のわずかな増幅の差異に起因し得る。その欠点にもかかわらず、１８個の親プールは、キャプシド選択スクリーニングにおけるバーコード配列決定に使用するための最初の検証としてのパイロットライブラリースクリーニングにおいて有用であることが見出された。
【０３０９】
ヒト膵島における１８個の親プールの継代
まず、ＡＡＶ−２の形質導入効率をＡＡＶ−ＤＪおよびＡＡＶ−ＬＫ０３と比較したが（図６２Ａ）、それは、後者の２つのベクターがヒト膵島において最も強固であることを示す以前の未公開の研究による（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＳＧＣＴ  ａｂｓｔｒａｃｔ）。この結果（図６２Ａ）を確認することより、シャフリングキャプシドライブラリーによりスクリーニングを行う前の検証研究の基礎が提供された。ＡＡＶキャプシドの１８個の親プールを、それぞれ２０Ｋおよび２ＫのＭＯＩでインタクトな膵島ならびに分離されたヒト膵島に感染させ、ヒトアデノウイルス５に重感染させて、ＡＡＶを複製した。連続した３回の選択ラウンドを行い、ＡＡＶ複製（図５１）およびウイルスプールの組成（図５２）を各ラウンドにおいて評価した。ラウンド１およびラウンド２の選択では、インタクトな膵島での増殖後、投入量と比較して、より低いコピー数のウイルスゲノムを回収したが、ラウンド３では複製物が増した。２０００の低いＭＯＩを使用して、分離された膵島細胞に感染させたとき、膵島培養後に得られるウイルスの量は、各選択ラウンドでの投入量よりも高かった。ＢＣ配列のＮＧＳを使用して、各ラウンドにおいてＡＡＶの組成を評価した。各試料について４００，０００〜１，０００，０００の読み取りを得た。１回の選択ラウンド後、特にインタクトな膵島が使用されたときに、プールの多様性がすでに減少したため、特定の親ＡＡＶは、他の親ＡＡＶよりも明らかな利点を有していた（図５２）。ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ｂ、ならびにシャフリングされた変異体ＤＪおよびＬＫ０３は、第１の継代後にすでに濃縮された。インタクトな膵島における第３の継代後には、ＤＪおよびＬＫ０３は等しく存在していたが、分離された膵島の第２の継代後には、ＤＪは明らかにウイルスプールの大半を占め、我々の選択スクリーニング手法の正当性をさらに立証した。
【０３１０】
ヒト膵島におけるキャプシッドシャフリングライブラリーの継代
両方のライブラリーを使用して、インタクトな膵島ならびに分離された膵島にそれぞれ２０Ｋおよび２ＫのＭＯＩで感染させ、Ａｄ５を使用してＡＡＶを複製した。各ラウンドのウイルス複製をｑＰＣＲによって評価した後（図５１）、変異体濃縮をＢＣ配列のＮＧＳによって追跡した（図５２）。ＮＧＳ試料サイズは、４００，０００〜８００，０００の配列読み取りであった。１８個の親プールとは対照的に、各選択ラウンドでのライブラリーの複製が観察され、これは、特定のキャプシド配列が、改善されたトロピズム、形質導入、および／または複製を提供することを示し得る。１８個の親ライブラリーの場合には、別個のキャプシド変異体が早くもラウンド１で選択された。２つの異なるＭＯＩ（１０Ｋおよび５０Ｋ）を使用したインタクトな膵島に対する第２のライブラリースクリーニングセットを、１０個の親ライブラリーについて２重で行った。さらに、５０ＫのＭＯＩを使用して、別の１８個の親ライブラリースクリーニングを３重で行った。このライブラリースクリーニングの複製データを図６１Ａに示し、ＢＣ ＮＧＳデータを図６１Ｂに示す。同様のレベルの複製および濃縮が、この第２のライブラリースクリーニングセット中に観察された。しかしながら、今回は、１つの変異体が、１０個の親ライブラリーの２つの独立したスクリーニング（ＭＯＩ１０Ｋ  ＢおよびＭＯＩ  ５０Ｋ  Ｂ）で濃縮されることが見出され（変異体１０Ｂ５、黄色で強調表示）、これは、この特定の変異体が膵島における有意な選択の利点を有し得ることを示している。１８個の親ライブラリーの３重のスクリーニングのうちの２回において、異なる変異体が濃縮されることが見出された（１８Ｂ２、マゼンタ色で強調表示）。
【０３１１】
改善された膵島形質導入のための選択されたＡＡＶキャプシド変異体の評価
ＢＣ配列特異的リバースプライマー（図５３Ａ）を使用して、３回の選択ラウンド後に、異なるスクリーニングから合計１７個の濃縮されたキャプシド配列を収集し（これらの変異体の濃縮データについては、図５２および図６１Ｂを参照）、ＴＯＰＯクローニングし、配列決定した。各ＢＣについてのいくつかのクローンを配列決定し、左のＢＣ配列がＢＣ  ＮＧＳによって得られる配列と一致することを確かめた。いくつかのキャプシドでは、クローンのうちのいくつかで、特に５’末端において、キャプシド配列が異なることが観察された。これは、不完全な伸長後の鋳型スイッチングに起因する可能性が高く３〜５、ＰＣＲ条件および酵素を最適化することによって改善され得る。投入したライブラリーの徹底的な分析を行って、低いレベルのライブラリークローンが同一のバーコードに連結された異なるキャプシドを含むことが見出されだけであるため、それが不十分なキャプシドＢＣ連結に起因するとは考えられない。また、２つの密接に関連する親配列を使用した実験により、増幅中に鋳型スイッチングが実際に起こったことが明らかになった（データは図示せず）。コンセンサス配列と一致するキャプシドをベクター化することを決定した。濃縮されたキャプシドは全て、３’半分においてＡＡＶ３Ｂからの大きな寄与を有していたが、５’半分は非常により多様であることが見出された（データは示していない）。３’半分におけるＡＡＶ３Ｂ配列は、投入ライブラリーにおいて明確に大きな割合を占めたが、ＳａｎｇｅｒおよびＰａｃＢｉｏ配列決定によって示されるように、依然として、他の親配列の非常に良好な寄与があった。ＤＪおよびＬＫ０３キャプシドが、ＡＡＶ２またはＡＡＶ３Ｂキャプシドよりも高い効率で膵島に形質導入することが以前の実験において確立されており（図６２Ａ）、したがって、新規なキャプシドをＤＪおよびＬＫ０３のみと比較した。１７個全てのキャプシド変異体、および以前に確立した最良の膵島キャプシドのうちの１つ（ＬＫ０３）を使用して、ＣＡＧプロモーターによって駆動される導入遺伝子としてＧＦＰを有する自己相補的ＡＡＶベクターがパッケージングされた。キャプシドのうちの３つは、高力価のｒＡＡＶの生成に失敗し、さらなる評価から除外した。最初の事前スクリーニングでは、粗細胞溶解物由来のｒＡＡＶを使用して、分離された膵島細胞を低ＭＯＩで形質導入した。形質導入の２日後に、ＧＦＰ発現細胞のフローサイトメトリーによって形質導入効率を決定した。多数のキャプシド変異体が、ＡＡＶ−ＬＫ０３よりも高い形質導入効率を示したが、他のものはほんのわずかしか改善されなかったか、または全く改善されなかった（図５３Ｂ）。最も改善された３つのキャプシド（１０Ａ１、１８Ａ１、および１０Ａ３）は全て、ライブラリースクリーニングの第１のセットに由来し、以後、ＫＰ１、ＫＰ２、およびＫＰ３と称する。これらのキャプシドを使用して、２回ＣｓＣｌ勾配精製された高力価ｒＡＡＶ調製物を生成した。分離された膵島細胞を、３つの異なるＭＯＩを使用して、それらの変異体ならびにＡＡＶ−ＤＪおよびＡＡＶ−ＬＫ０３で形質導入し、形質導入についてＦＡＣＳによって分析した。変異体は、最良の親よりもかな���高い効率で膵島細胞に形質導入することを確認した（図５３Ｃ、図６２Ａ）。同じ画分の膵島細胞をＡＡＶ−ＤＪまたはＡＡＶ−ＬＫ０３で形質導入するためには、変異キャプシドＡＡＶと比較して、少なくとも１０倍の高い力価が必要であった。次の工程は、新規なキャプシドがα細胞またはβ細胞を特異的に標的化するかどうかを決定することであった。ＫＰ１およびＫＰ２キャプシドがパッケージングされたｓｃＣＡＧ−ＧＦＰベクターを高いＭＯＩで形質導入した膵島の亜集団特異的染色により、ＡＡＶ−ＤＪおよびＡＡＶ−ＬＫ０３と比較して改善されたβ細胞形質導入が明らかとなったが、α細胞形質導入はあまり改善されなかった（図５３Ｄ）。さらに、インタクトな膵島をこの実験で使用したため、新規なＡＡＶは、膵島に浸透することができ、十分に高いＭＯＩが使用した場合にはα細胞およびβ細胞のほぼ全てに形質導入することが実証された。
【０３１２】
β細胞を、最近開発された濃縮プロトコル７５後にヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から生成し、３つの異なるＭＯＩを使用して、新規なキャプシドのうちの１つをＡＡＶ−ＤＪおよびＡＡＶ−ＬＫ０３と比較される形質導入効率について試験した。Ｔｏｍａｔｏ  Ｒｅｄ発現ベクターをこの実験で使用し、細胞をβ細胞マーカーＣペプチドについて染色した（図６６、図６８）。患者由来の膵島細胞において観察されたものと同様に、それらの細胞におけるＡＡＶ−ＫＰ１と同様の形質導入率を達成するためには、５〜１０倍高い力価のＡＡＶ−ＤＪまたはＡＡＶ−ＬＫ０３が必要であった。形質導入効率は、Ｔｏｍａｔｏ  Ｒｅｄ発現細胞の割合、およびそれらの細胞における形質導入細胞ＡＡＶ−ＫＰ１の蛍光強度の両方から決定されることに留意されたい。
【０３１３】
次の工程は、改善されたキャプシドの共通配列の特徴を解明することを試みた。図５４Ａは、最も高い膵島細胞形質導入効率を有する３つの最も改善されたキャプシドアミノ酸キャプシド配列の交差分析を示す。キャプシドＫＰ１のＮ末端部分は、多くの異なる親配列由来のストレッチを含むが、キャプシドＫＰ２およびＫＰ３は、この配列ストレッチにおける多様性が少ない。しかしながら、膵島スクリーニング中に濃縮された全てのキャプシドに見られるように、それらのキャプシドのＣ末端半分の殆どがＡＡＶ３Ｂに由来し、このストレッチが、膵島細胞トロピズムに重要な配列決定因子を含み得ることを示唆している。ＡＡＶ３Ｂは、ＫＰ１およびＫＰ３と９２％の配列同一性を有し、ＫＰ２と９５％の同一性を有する３つの新規なキャプシドと最も密接に関連する親キャプシドである。ヌクレオチド配列との交差分析を行う場合（図６３Ａ）、親の寄与は、殆どの部分についてアミノ酸配列に関して見出されるものと非常に類似していたが、いくつかの親の寄与パターンが異なった。ＫＰ２キャプシドの場合の例として、ヌクレオチド９００位の周辺の領域は、アミノ酸交差分析が示唆するように、ＡＡＶ１またはＡＡＶ６キャプシドではなく、ＡＡＶ−ブタ２キャプシドに由来した。Ｘｏｖｅｒプログラムは、交差事象の数を最小限にすることを常に試みる。アミノ酸２７５位〜３１３位の親配列は全て、共通のアミノ酸配列を共有する（図６５Ａ）が、異なるヌクレオチド配列を有するため、このストレッチは、アミノ酸配列を使用する場合、ＡＡＶ１またはＡＡＶ６に由来するものとして示されるが、ヌクレオチド配列を使用して分析を行う場合、ＡＡＶ６およびＡＡＶ−ブタ２に由来するものとして示される。交差数も、ヌクレオチド配列と比較して、アミノ酸配列では低かった。一例として、ＫＰ１キャプシドは、ヌクレオチドレベルで１９個の交差を有していたが、これは、アミノ酸レベルで１５個の交差事象に低減された。キャプシドの機能性はアミノ酸配列によって決定されるので、アミノ酸配列交差分析に焦点を当てた。３つ全ての改善されたキャプシドが、ａａ ２２５〜２６７の配列ストレッチにおいてＡＡＶ１およびＡＡＶ６に特有の３つの残基を共有するという事実は、これらの残基がヒト膵島形質導入に重要であることを示し得る（図５４Ａ、図６５Ａ）。ＡＡＰは、キャプシド遺伝子内の異なるリーディングフレームを使用しているので、このタンパク質についての交差分析も行った。３つの新規な変異体全てが、キメラＡＡＰ配列を含むことが見出された（図５４Ｂ、図６５Ｂ）。ヌクレオチド配列交差分析で見られるように、いくつかのＫＰ２  ＡＡＰ残基はＡＡＶ−ブタ２に由来した。交差分析に加えて、濃縮分析を行い、３つ全てのキャプシドにおける特定のアミノ酸残基についての強い選択圧を確認した（図５４Ｃ）。Ｎ末端では、２つの最も改善された変異体ＫＰ１およびＫＰ３は、ＡＡＶ２残基の強い選択を示したが、Ｃ末端では、それらは、ＡＡＶ８由来の残基を共有した。ＫＰ２キャプシドは、１５０位および２１０位の間にいくつかのＡＡＶ２残基の強い濃縮を示す。３つのキャプシドは全て、ＡＡＶ３Ｂについての重要なＨＳＰＧ結合部位であると記載されている位置にアルギニンを有する（図Ｓ６５Ａの５９７位）７６．新規な変異体の予測３次元構造ＶＰ３キャプシドマッピングを行い、キャプシドの外側に提示される残基を明らかにした（図５Ｄ）。改善された３つのキャプシドは全て、ＡＡＶ８またはＡＡＶ−アカゲザル１０のいずれかに由来する、５倍対称孔においてＶＰ３超可変領域（ＨＶＲ）Ｉ（７７に従って標識付けされる）中にグルタミン酸（図Ｓ６５Ａにおける３３０位）を含むことが見出された。ＡＡＶ３Ｂ、およびＡＡＶ９ｈｕ１４を除く全ての他の親は、この位置にアスパラギン酸残基を有する。３つ全てのキャプシド間で共有される他の２つの残基は、ＨＶＲ  Ｉ中のアラニンおよびトレオニンである（図Ｓ６５Ａにおける２６４位および２６６位）。ＫＰ１およびＫＰ３キャプシドはまた、ＨＶＲ  ＩＩ中の表面曝露残基アルギニン（図Ｓ６５Ａにおける３３３位）を含み、これは、親キャプシドＡＡＶ８、ＡＡＶ９ｈｕ１４、およびＡＡＶ−アカゲザル１０によっても共有される。さらに、ＫＰ１およびＫＰ３キャプシドは、Ｇａｏ  ａｎｄ  ｃｏｌｌｅａｇｕｅｓ７８によってＨＶＲ１１と称されるＨＶＲ  ＶＩＩＩとＩＸとの間の可変ストレッチ内に、残基アスパラギン酸、アスパラギン、ロイシン、およびアスパラギンを提示する（図Ｓ６５Ａにおける６６０位、６６６位、６７０位、および６７１位）。ＨＶＲ  ＩＸ  ＫＰ１およびＫＰ３キャプシドは、ＡＡＶ８由来の表面曝露残基チロシン、トレオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、およびグルタミン酸を共有する（Ｓ６５Ａにおける７０９位、７１２位、７１３位、７１７位、７１９位、および７２１位）。ＫＰ１キャプシドは、ＡＡＶ−ブタ２に由来する表面曝露メチオニンを示し、ＫＰ３は、この位置にＡＡＶ３Ｂに由来するバリンを有する（図Ｓ６５Ａにおける３９０位）。さらに、ＫＰ１は、６６４位にＡＡＶ９ｈｕ１４由来のアラニンを含み、ＫＰ３は、この位置にＡＡＶ３Ｂと同じトレオニン残基を有する。表面曝露残基６６７（リジン）および６６８（アスパラギン酸）は、ＫＰ１についてＡＡＶ９ｈｕ１４に由来し、ＫＰ３についてＡＡＶ８に由来した（グルタミンおよびセリン）。キャプシド表面に提示される残基に加えて、３つの新規なキャプシドは全て、キャプシド内部に埋入されるいくつかのＶＰ３残基を共有していた（それぞれ、２２５位、２３４位、３１３位、および３１５位のアラニン、トレオニン、アルギニン、およびアスパラギン）。それらの残基はまた、非コーティングおよび他の侵入後工程に関与し得るため、観察された強力な形質導入効率に寄与する可能性がある。
【０３１４】
次の工程は、新規なキャプシドが、ＡＡＶ−ＤＪおよびＡＡＶ−ＬＫ０３キャプシドと同様の効率で自己相補的および一本鎖ベクターゲノムをパッケージングするかどうかを評価することであった。したがって、ＣｓＣｌ精製ｒＡＡＶ調製物由来の単離されたベクターゲノムを使用してアルカリ性サザンブロット分析を行い（図６３Ｂ）、一本鎖ＣＡＧ−ホタルルシフェラーゼゲノムが３．７ｋｂの予想サイズでパッケージングされていることが見出された（図６３Ｂ）。自己相補的ＣＡＧ−ＧＦＰゲノムがパッケージングされたｒＡＡＶ調製物を分析したときに、４．３ｋｂのバンドが見出され、該バンドは、ｔｒｓ欠失ＩＴＲにおいて結合された２つの発現カセットを有する自己相補的全長ゲノムを表す。しかしながら、予測された４．３ｋｂの生成物に加えて、予測サイズの約半分のバンドが観察され、これは、単鎖ベクターを表している可能性がある（図６３Ｃ）。その理由は、野生型ＡＴＧ開始コドンを有するｒｅｐを発現するパッケージングベクターがウイルス産生に使用されたという事実であり得るが、これは、ｓｃベクターを生成するときのｓｓゲノムパッケージングの増加レベルに関連しているからである。より効率の低いＡＣＧ開始コドンへのＡＴＧ開始コドンの変異後における低いレベルのＲｅｐタンパク質発現は、より高い割合のｄｓゲノムパッケージに関連している（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）７９。また、トランスフェクション後の５２時間超のインキュベーション時間は、二本鎖（ｄｓ）が一本鎖（ｓｓ）ゲノムに戻ることを増加させることが記載されている（Ｇｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）８０。しかしながら、本研究では、全長および短いゲノムが、新規な変異体ならびにＡＡＶ−ＤＪおよびＡＡＶ−ＬＫ０３について等しい効率でパッケージングされたことに留意することが重要である。したがって、新規なキャプシドの形質導入効率の改善は、全長機能的ゲノムのパッケージングの増加に起因し得ない。さらに、キャプシドタンパク質変異体は、１０：１：１の予測される化学測定における３つ全てのキャプシドタンパク質ＶＰ３、ＶＰ１、およびＶＰ２からなる（図６３Ｄ）。
【０３１５】
一連の多様な細胞株における形質導入効率の評価
いくつかの一次細胞ならびにヒトおよび動物供給源に由来する細胞株を、１ＫのＭＯＩで、２つの親（ＤＪ、ＬＫ０３）および３つの進化したキャプシド（ＫＰ１、ＫＰ２、ＫＰ３）がパッケージングされた一本鎖ホタルルシフェラーゼｒＡＡＶベクターで形質導入し、ルシフェラーゼアッセイを使用して形質導入効率について分析した。ＡＡＶ−ＬＫ０３は、マウス細胞に効率的に形質導入されなかったが、ＡＡＶ−ＤＪは、高効率で全ての細胞株に形質導入された。新規な変異体は、ヒト膵島細胞２９３、Ｈｅｌａ、ＨｕＨ７、Ｒ７Ｔ１、αＴＣ１、ＨｅｐＧ２、ＣＨＯ  Ｋ１、ヒト筋肉幹細胞、マウス筋芽細胞、ＳＮＵ  ７３７、およびＦＲｈＫ−４細胞では、ＡＡＶ−ＤＪと比較して改善された形質導入効率を示した（図５５Ａ、図６４Ａ）。ＡＡＶ−ＫＰ１は、一般的に、最も高い増強度を示した。ＤＪと比較した新規なキャプシド変異体の形質導入は、ヒトケラチノサイト、分化ヒト筋芽細胞、および一次マウス胚線維芽細胞では改善されなかったか、またはわずかに改善されただけであった。
【０３１６】
新規なキャプシド変異体の中和プロファイル
新規なキャプシド変異体ならびにＡＡＶ−ＤＪおよびＡＡＶ−ＬＫ０３を、２つの異なるバッチのプールされたヒト免疫グロブリンによる中和に対する感受性について分析した（図５５Ｂ）。実験は、各試料について、７つの生物学的複製物において行われ、これらを２つの独立した実験間で分けた。ＡＡＶ−ＤＪは、中和に対する最も高い耐性を示し、５０％の阻害に約１２０μｇ／ｍＬのＩＶＩＧを必要としたが、ＡＡＶ−ＬＫ０３は、非常に感受性であり、５０％の中和はたった約１５μｇ／ｍＬで達成された。ＡＡＶ−ＫＰ２は、ＡＡＶ−ＬＫ０３と同様の中和プロファイルを有した一方、ＡＡＶ−ＫＰ１およびＡＡＶ−ＫＰ３は、中和するためにより多くのＩＶＩＧ（ＫＰ３については４５ｕｇ／ｍｌ、およびＫＰ１については５５ｕｇ／ｍｌ）が必要であった。要約すると、プールされたヒトＩＶＩＧを中和のために使用したとき、新規な変異キャプシドのうちの２つは、ＡＡＶ−ＬＫ０３よりも良好に作用したが、ＡＡＶ−ＤＪよりも好ましくなかった。
【０３１７】
マウスにおけるＡＡＶ−ＫＰ変異体のインビボ生体分布
マウスに、ＡＡＶ８、ＡＡＶ−ＤＪ、ならびにＡＡＶ−ＫＰ１、ＫＰ２、およびＫＰ３キャプシドがパッケージングされたホタルルシフェラーゼベクターｒＡＡＶをマウス１匹あたり２Ｅ１０ｖｇで静脈内注射し、ライブ画像化によって、導入遺伝子発現を数週間にわたってモニタリングした（図５６、図６４Ａ）。ＡＡＶの大部分は肝臓を標的とすることが見出された。ＡＡＶ−ＫＰ１は、ＡＡＶ−ＤＪよりも急速にマウス肝臓に形質導入するようであったが、定常状態の発現がその後の時点で達成されると、発現レベルはわずかに高いだけであった。注射から３５日後、各マウスからいくつかの臓器を採取し、ルシフェラーゼ発現について分析した。肝臓を除いて、各マウス群内での高い変動性を伴って、非常に低い発現レベルが検出された（図６４Ｂ）。ＡＡＶ−ＫＰ２およびＡＡＶ−ＫＰ３注射マウスは、心臓組織では、ＡＡＶ−ＤＪまたはＡＡＶ８注射マウスよりも高いルシフェラーゼ発現を有し、３つの変異体は全て、ＤＪまたはＡＡＶ８よりも高い効率で脾臓を形質導入した。ＫＰ変異ＡＡＶ注射マウス由来の腎臓組織はまた、ＡＡＶ−ＤＪ注射マウス由来の腎臓組織よりも高いルシフェラーゼ発現を有したが、ＡＡＶ−８注射マウスと比較して、レベルは有意に高くなかった。ｑＰＣＲを使用して、ベクターゲノムを臓器において定量化した。しかしながら、明らかにバックグラウンドを超えるベクターゲノムコピーは、肝臓試料でのみ検出された（図６４Ｃ）。ＡＡＶ−ＫＰ１を注射したマウスは、ＡＡＶ−ＤＪまたはＡＡＶ−８パッケージングベクターを受けたマウスよりも高いベクターコピー数を含んでいた。ＡＡＶ−ＫＰ３注射マウスは、ＡＡＶ８注射マウスよりも有意に多くのベクターゲノムを肝臓に含んでいた。しかしながら、ＡＡＶ−ＫＰ２注射マウスは、ＡＡＶ８注射マウスと同様のレベルのｒＡＡＶゲノムを含んでいた。
【０３１８】
インビボにおける異種移植肝臓モデルにおける機能的肝細胞形質導入の評価
ヒト化ＦＲＧ異種移植マウスを形質導入して、シャフリングしたキャプシドのうちの１つの機能的ヒト肝臓形質導入能力を適切なインビボ環境で評価した。高レベルのヒトアルブミン（５．６〜８ｍｇ／ｍＬ）の発現によって示されるように、マウスにおいて、ヒト肝細胞を高度に再増殖させた。ヒト化マウスに、ＤＪ、ＬＫ０３、またはＫＰ１キャプシドがパッケージングされたｒＡＡＶを発現するＴｏｍａｔｏ  Ｒｅｄを１Ｅ１１ｖｇ／マウスの用量で静脈内注射により投与し、ＡＡＶ投与の１４日後に、ヒトおよびマウス肝細胞におけるＴｏｍａｔｏ  Ｒｅｄタンパク質の発現について評価した（図５７）。ＬＫ０３は、ヒト肝細胞では高い形質導入効率を有するが、マウス肝細胞ではそうではなく、ＤＪによる形質導入はヒト細胞に特異的ではないことが観察された。ＫＰ１はまた、ヒトおよびマウスの肝細胞の両方に形質導入することが見出されたが、ＤＪで見出されたものよりもレベルが高かった。４つのＡＡＶ−ＫＰ１注射マウスのうちの３つにおいて、ヒト肝細胞への形質導入効率は、ＡＡＶ−ＬＫ０３注射マウスに見出されるものと同様であった。しかしながら、ＡＡＶ−ＬＫ０３とは異なり、ＡＡＶ−ＫＰ１は、マウスおよびヒト細胞の両方を形質導入したため、ＡＡＶ−ＫＰ１注射マウスでは、総形質導入はより高かった。
【０３１９】
考察
本研究で同定された新規なキャプシドは、ヒト膵島細胞、特にβ細胞への形質導入において少なくとも１０倍超の効率であった。変異体のうちの１つを、ｈＥＳＣ由来のβ細胞への形質導入効率について試験したときに、同様のレベルの改善が達成された。さらに、キャプシド変異体ＡＡＶ−ＤＪおよびＡＡＶ−ＬＫ０３が、ＡＡＶ２またはＡＡＶ３Ｂと同等またはより良好な効率で一次ヒト膵島に形質導入することができるという従前の観察が確認された。しかしながら、高ＭＯＩは、膵島中心内の細胞を効率的に標的化するために必要であり、β細胞形質導入はα細胞よりも効率的ではなかった。
【０３２０】
最近、いくつかの研究は、マウスにおける逆行性膵導管内送達を使用し、ｒＡＡＶベクターを膵臓に安全かつ効果的に投与する４９，８１，８２。いくつかの転写因子の過剰発現または阻害は、膵臓膵島の祖先およびコミットされた膵島α細胞をβ細胞に効果的に変換することが見出された５０、５２〜５８。内視鏡逆行性胆管膵造影（ＥＲＣＰ）は、膵臓および胆管を調べるために患者に日常的に使用され、糖尿病処置のための新規なベクターを送達するために使用することができる。
【０３２１】
他の研究者が、所望の特性についてスクリーニングすることができるライブラリーを生成するために、ＡＡＶまたは任意の他のウイルス由来の遺伝子のいずれかと共に、自らの研究室でこのプロトコルを容易に適用することができるように、バーコード化キャプシドシャフリングＡＡＶライブラリーの生成方法が非常に詳細に記載されている。ライブラリー生成のためのプロトコルに加えて、継代レジメン中に親の対照として有用であることが証明された親のＡＡＶを含むプールの生成も記載されている。所望の特性を有するＡＡＶキャプシドを単離するための選択パラメータを最適化するために、このプールを任意のライブラリー選択で使用することができる。特定のスクリーニングの適切なＭＯＩおよび選択ラウンド数を事前に決定することによって、費用および時間を最小限にすることができる。５回の選択ラウンドを日常的に使用する本出願人の研究室での研究とは対照的に、本研究では、３回の選択ラウンドが、変異体を濃縮および増幅するのに十分であり、変異体を確実に単離し得るレベルまで形質導入が改善されることが見出された。
【０３２２】
さらに、短いＤＮＡバーコードおよび単一分子ＤＮＡ配列決定手法を組み合わせることにより、他の重要なパラメータ、例えば、選択プロセス中に使用する最良のＭＯＩ、および効率的な濃縮に必要なスクリーニングラウンド数を最適化することが可能になる。トランスフェクションによってプラスミドライブラリーからＡＡＶライブラリーを生成する場合、ウイルス産生のための以前のプロトコルと比較して、ＡＡＶプラスミドＤＮＡの量をほぼ２０倍低下させることにより、細胞にライブラリープラスミドＤＮＡを過剰充填しないように注意した。１細胞あたり５０００個のＡＡＶゲノムのトランスフェクションコピー数は、高力価ライブラリーを依然として達成しつつ、クロスパッケージング（ｃｒｏｓｓ−ｐａｃｋａｇｉｎｇ）を最小限にするのに十分に低いことが報告されている８３。パッケージングキャプシドと対応するウイルスゲノムとの間の配列の差によって特徴付けられるクロスパッケージングの可能性を除外することはできないが、我々のスクリーニングからの濃縮キャプシドのうちのいくつかは、所望の表現型を示すことが見出され、これは、クロスパッケージングまたはモザイク現象（ｍｏｓａｉｃｉｓｍ）が我々のライブラリーにおいて大きな問題ではなかったことを示唆している。さらに、トランスフェクション中に高濃度のＡＡＶプラスミドを使用して以前に生成したＡＡＶライブラリーでは、表現型が大きく改善された変異体を生成することに成功し８，３７〜３９、これは、これまで分からなかった理由により、ＡＡＶパッケージングの場合には強力なキャプシド遺伝子型の連結があるようであることを示唆している１１。
【０３２３】
ヒト膵島においてライブラリーをスクリーニングしたとき、いくつかのキャプシド配列が濃縮され、そのうちの３つは、ヒト膵島のみならず、様々な他の細胞種についても改善された形質導入効率を有していた。新規なキャプシド中のどのアミノ酸残基が膵島表現型の改善に関与するかは明らかではないが、膵島細胞および他の細胞種の増強された形質導入を提供し得る、改善されたキャプシド配列中のいくつかの特徴に注目した。３つの改善されたキャプシドの全てのＣ末端部分は、ＡＡＶ３Ｂ残基について強く濃縮され、これは、これらのアミノ酸が膵島トロピズムに重要な役割を果たし得ることを示唆している。Ｎ末端では、２つの最も改善された変異体ＫＰ１およびＫＰ３が、ＡＡＶ２残基の強い選択を示し、３つのキャプシドは全て、ＡＡＶ１またはＡＡＶ６のいずれかに由来するトレオニンを２６５位に含んでいた（図６５Ａ）。３つのキャプシドは全て、５９４位（図６５Ａの５９７位）にアルギニンを有し、これは、ＡＡＶ３Ｂ６（Ｌｅｒｃｈ  ａｎｄ  Ｃｈａｐｍａｎ）の重要なＨＳＰＧ結合部位であると説明されている。
【０３２４】
ＫＰ１が、ＡＡＶ３ＢおよびＡＡＶＬＫ０３と類似するにもかかわらず、ヒト化肝マウスモデルにおいて、マウス肝細胞およびヒト肝細胞を形質導入したことは興味深い。いくつかのヒト肝臓ＡＡＶ高形質導入ベクター（Ｌｉｓｏｗｓｋｉ  Ｐａｕｌｋ）３７、３９について選択するために、このヒト化モデルを以前に使用したが、そのうちの１つは、初期ヒト試験において強固なｈＦＶＩＩＩ発現を提供することが示されている８４、８５。しかしながら、以前のスクリーニングで選択されたベクターは全て、インビトロおよびインビボでのマウス組織または細胞の不十分な形質導入を示した。対照的に、ＫＰ１変異体は、キメラマウスモデルにおいて、同様のヒト肝細胞形質導入を示したが、ＡＡＶＬＫ０３とは対照的に、効率的なマウス肝臓形質導入を示した。これは、マウス細胞への形質導入が比較的低いために、このマウスモデルにおけるヒト肝細胞への形質導入が誇張されたことを示唆している者もいるので興味深い。ヒト化マウスモデルで得られたヒト肝細胞の結果が、マウス肝細胞導入の程度に影響される場合、おそらく、ＫＰ１変異体は、ヒト試験で試験されたときにさらにより強固な形質導入を提供するであろう。最低でも、このベクターはマウスおよびヒトの肝臓の両方に形質導入するので、臨床前検査のための代替のキャプシドは必要ない。最終的には、これらのキャプシドは、ヒト臨床肝臓ベース遺伝子治療試験における将来の研究の良好な候補である。
【０３２５】
Ｇｒｉｍｍのグループによる最近の報告書は、指向性進化研究のために生成されたＡＡＶキャプシドライブラリーの機能性が、キメラ変異体プールの大部分における組み立て活性化タンパク質（ＡＡＰ）の不活性化によって深刻に損なわれ得るという懸念を解決した８６。ＡＡＰは、ウイルス組み立てにおいて重要な役割を果たすことが以前より記載されていたが９，８７〜８９、組換えに対して著しく寛容であるようである。他のシャフリングライブラリー由来のランダムキャプシドは、パッケージング効率について以前に試験され、驚くべきことに、キャプシドの大部分が正常またはほんのわずかに低減したｒＡＡＶ力価を生じることが見出され、これは、ランダム化ＡＡＰ配列が殆どの場合において有害ではなかったことを示している。本研究で選択した全てのキメラのＡＡＰ配列はキメラであり、２つのキャプシドで得られたｒＡＡＶ力価は、ＬＫ０３で得られた力価よりも低かった。ウイルス産生中に野生型ＡＡＰを供給することが力価を増強するかどうかは評価しなかったが、これはｒＡＡＶ産生を促進する可能性がある。
【０３２６】
濃縮された変異体のバーコードのハイスループット分析が、キャプシド全体のクローニングおよび配列決定よりも、非常に費用対効果が高く、完全であるため、分子進化研究のためのバーコード化ライブラリーの使用は非常に有益であることが見出された。本研究のために生成されたライブラリーは、多くの他の標的細胞に対するスクリーニングにおいて現在評価され、他の臨床遺伝子治療用途に有用な他のＡＡＶキャプシド変異体の発見をもたらし得る。
【０３２７】
方法：
特有のバーコード配列のライブラリーを含むＡＡＶベクターの生成。キャプシドコード配列をＰａｃＩおよびＡｓｃＩ含有リンカー断片と置き換えた野生型ＡＡＶ２ベクター（ハイデルベルク大学（独国）のＤ．ＧｒｉｍｍおよびＳ．Ｇｒｏｓｓｅ，Ｇｅｒｍａｎｙによって親切に提供された）を、バーコード化ＡＡＶライブラリーの構築のための出発材料として使用した。２つの特有の制限部位（ＡｇｅＩおよびＥａｇＩ）を、元の配列における２つのヌクレオチドを変異させることによって、キャプシドポリアデニル化シグナルの直ぐ下流に導入した（キャプシドポリアＡシグナルの最後のヌクレオチドを出発点としてカウントした場合に、６位および２４位において、ＡをＴとし、ＴをＣとした）。２０ｎｔ長のスペーサー配列によって分離された１２個のランダムヌクレオチドの２つのストレッチからなるバーコードを、前述のようにして生成した７３。簡単に述べると、５’末端のＡｇｅＩ制限部位配列を有するオリゴヌクレオチド、これに続く１２個のランダムヌクレオチドおよび２０ｎｔ長のスペーサー配列（ＣＴＡ  ＡＡＣ  ＣＧＧ  ＴＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＡＣ  ＧＧＡ  ＡＡＴ  ＡＣＧ  ＡＴＧ  ＴＣＧ  ＧＧＡ）を、５’末端にＥａｇＩ部位を含むオリゴヌクレオチド、これに続く１２個のランダムヌクレオチド、およびアンチセンスペーサー配列（ＴＴＣ  ＴＣＧ  ＧＣＣ  ＧＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＴＣ  ＣＣＧ  ＡＣＡ  ＴＣＧ  ＴＡＴ  ＴＴＣ  ＣＧＴ）にアニールし、エキソヌクレアーゼ活性（ＮＥＢ）を欠いたＫｌｅｎｏｗポリメラーゼを使用して延長した。断片を、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、その後、ＡｇｅＩおよびＥａｇＩで消化し、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製カラムを使用して精製した。ベクターを同じ制限酵素で消化し、脱リン酸化し、フェノール−クロロホルム精製し、エタノール沈殿させた。最初にいくつかのライゲーション反応を設定し、プライマーｒｉｇｈｔＦ（ＣＧＣ  ＧＣＣ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＡＡＴ  ＡＡＡ  Ｃ）およびＱＳｅｑＲｅｖ（ＴＡＧ  ＡＧＣ  ＡＡＣ  ＴＡＧ  ＡＧＴ  ＴＣＧ）を使用してコロニーＰＣＲを行うことによって可能な多数のバーコード挿入物について試験することにより、最適なベクターと挿入物との比を評価した。スケールアップ反応のために、バーコードを、１〜２．５のベクターとベクターとのモル比で、合計体積３０μＬでライゲーションして、指示書（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従ってＳｔｒａｔａｃｌｅａｎ樹脂を使用して脱塩し、２μＬのアリコートでＤＨ１０Ｂ−ＭｅｇａＸ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションした細胞をプールし、５００ｍｌのＬＢ−Ａｍｐ培地に接種するために使用した。ライブラリーサイズおよび多様性を評価するために、アリコートをプレーティングした。３７℃のシェーカー細菌中で１６時間後、細菌を採取し、Ｍｅｇａｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してプラスミドＤＮＡを単離した。ＩＴＲの完全性は、ＸｍａＩおよびＡｈｄＩによる消化によって確認された。バーコード多様性を評価するために、試験プレートからのいくつかの個々のクローンを配列決定���た。
【０３２８】
キャプシドシャフリングバーコード化ＡＡＶライブラリーの生成。ＤＮＡｓｅ  Ｉ媒介ファミリーシャフリングを本質的に前述２５、９０、９１のようにして行った。１６個のＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９ｈｕ１４、ＡＡＶ１２、ＡＡＶアゲハ１０、ＡＡＶブタ１、ＡＡＶブタ２、ＡＡＶウシ、ＡＡＶマウス１、ＡＡＶ鳥類、ＡＡＶヤギ１）由来のキャプシド配列、および以前のスクリーニング８、３７で選択されたシャフリング変異体ＡＡＶ  ＤＪおよびＡＡＶ  ＬＫ０３由来のキャプシド配列を、シャフリング反応の親配列として使用した。キャプシド配列は、様々な供給源（Ｄ．Ｇｒｉｍｍ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｋａｙ  ｌａｂ，ＶｅｃｔｏｒＣｏｒｅ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ）から得た。全ての配列は、直ぐ５’側にＰａｃＩ部位およびキャップの３’にＡｓｃＩ部位を含み、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングした。シャフリング前に、隣接ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ配列中に位置するプライマー（ｏｕｔｅｒ  Ｆ：ＡＡＴ  ＴＡＡ  ＣＣＣ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＡＡＧ  Ｇ、ｏｕｔｅｒ  Ｒ：ＧＴＡ  ＡＴＡ  ＣＧＡ  ＣＴＣ  ＡＣＴ  ＡＴＡ  ＧＧＧ  Ｃ）を使用して、キャプシド配列を個々に増幅した。Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｆｌｅｘポリメラーゼ（ＮＥＢ）を増幅のために使用し、２５回のＰＣＲサイクルを使用した（３０秒間９８℃、１０秒間９８℃、１５秒間５６℃、１分１５秒間７２℃の２５サイクル、続いて１０分間７２℃）。Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＰＣＲ産物を精製し、１８個のキャプシド（１８個の親ライブラリーの場合）または１０個のキャプシド（１０個の親ライブラリーの場合、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９ｈｕ１４、ＡＡＶ１２、ＡＡＶアカゲザル１０、ＤＪ、ＬＫ０３）の全てを等モル比でプールし、ＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｓｉｇｍａ）を使用して室温（ＲＴ）で断片化した。異なるインキュベーション時点で、アリコートを１．５％のアガロースゲル上で分析し、ドライアイス／エタノール浴中でインキュベーションすることによって、反応を一時的に停止した。断片の大部分が１００ｂｐ〜５００ｂｐの範囲になるまで、インキュベーション時間およびＤＮＡｓｅ濃度を調整した。次いで、全反応物を１．５％のアガロースゲルに充填し、所望のサイズ範囲を有する断片をゲルから電気泳動溶出し、２ラウンドのフェノール−クロロホルム精製、続いて１ラウンドのクロロホルム精製およびエタノール沈殿を使用して精製を行った。次いで、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｆｌｅｘポリメラーゼおよび以下のサイクル条件：３０秒間９８℃、１０秒間９８℃、３０秒間４２℃、４５秒間７２℃の４０サイクル、続いて１０分間７２℃を使用して、ＤＮＡ断片をプライマーレス（ｐｒｉｍｅｒ−ｌｅｓｓ）ＰＣＲで再組み立てした。
【０３２９】
プライマーｒｅｓｃｕｅＦ（ＧＴＣ  ＴＧＡ  ＧＴＧ  ＡＣＴ  ＡＧＣ  ＡＴＴ  ＣＧ）およびｒｅｓｃｕｅＲ  （ＧＴＣ  ＴＡＣ  ＴＧＡ  ＡＧＣ  ＴＣＡ  ＣＴＧ  ＡＧ）、ならびに以下のサイクル条件：３０秒間９８℃、１０秒間９８℃、１５秒間５７℃、１分１５秒間７２℃の２５サイクル、続いて１０分間７２℃を使用して、全長キャプシド配列を組み立て反応から増幅した。アンプリコンを新鮮なＰＣＲ混合物で４倍希釈し、端部を充填するために、１０分間の伸長を伴う１つの追加のサイクルに供した。ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＰＣＲ産物を濃縮した後、該ＰＣＲ産物をＰａｃＩおよびＡｓｃＩで消化し、ＰａｃＩ、ＡｓｃＩで処理され、脱リン化され、フェノール−クロロホルム精製されたＢＣライブラリーベクターにライゲーションした。ライゲーション反応物をＳｔｒａｔａｃｌｅａｎ樹脂を使用して脱塩し、ＭｅｇａＸ  ＤＨ１０Ｂ細胞にエレクトロポレーションし、ＢＣライブラリーベクターの生成のために上記で記載したようにして液体培養で増殖させた。Ｓａｎｇｅｒ配列決定を使用してライブラリーのサイズおよび多様性を評価するために、形質転換細胞のアリコートをプレーティングした。プライマーｃａｐＦ（ＴＧＧ  ＡＴＧ  ＡＣＴ  ＧＣＡ  ＴＣＴ  ＴＴＧ  ＡＡ）、ｃａｐＦ２（ＡＴＴ  ＧＧＣ  ＡＴＴ  ＧＣＧ  ＡＴＴ  ＣＣ）、およびＱＳｅｑＲｅｖ（ＴＡＧ  ＡＧＣ  ＡＡＣ  ＴＡＧ  ＡＧＴ  ＴＣＧ）を使用して、１０個の親ライブラリーの４０個のクローンおよび１８個の親ライブラリーの２０個のクローンを配列決定した。
【０３３０】
リン酸カルシウムトランスフェクション法を使用して、ＡＡＶライブラリーをＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞において生成した。ＡＡＶ産生中にクロスパッケージング事象が起こる可能性を最小限にするために、通常のプロトコルと比較して、トランスフェクションされたライブラリープラスミドＤＮＡの量を約２０倍減少して、１細胞あたり約５０００コピーとした。簡単に述べると、トランスフェクションの２日前に、２５個のＴ２２５フラスコを１フラスコあたり８Ｅ０６個の細胞で４０ｍｌ培地に播種した。形質導入日には、細胞は８０％〜９０％コンフルエントであった。１フラスコあたり２０ｍｌの培地を、トランスフェクションの１．５時間前に新鮮な培地に置き換え、Ｔ２２５あたり、４ｍｌの３００ｍＭ  ＣａＣｌ２中の４０μｇのｐＡｄ５ヘルパープラスミドおよび２μｇのライブラリープラスミドの混合物を調製した。等量のＣａＣｌ２／ＤＮＡ混合物および２×ＨＢＳ（２８０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．２８、１．５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．１２）を混合し、８ｍＬの混合物を各フラスコに添加した。３日間後、細胞を各フラスコの０．５ｍｌの５００ｍＭ  ＥＤＴＡを使用して単離し、細胞ペレットをベンゾナーゼ消化緩衝液（２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５）に再懸濁した。ＡＡＶを３つの凍結解凍サイクルに供することによってＡＡＶを細胞から放出させ、非キャプシド化ＤＮＡをベンゾナーゼ（２００−Ｕ／ｍｌ、１時間３７℃）で消化することによって除去し、細胞破片を遠心分離によってペレット化し、続いて上清の別のＣａＣｌ２沈殿工程（２５ｍＭ最終濃度、氷上で１時間）、および８％ＰＥＧ−８００００および６２５ｍＭ  ＮａＣｌの最終濃度を使用したＡＡＶ沈殿工程を行った。ウイルスをＨＥＰＥＳ−ＥＤＴＡ緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．２８、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁し、ＣｓＣｌと混合して１．３７１の最終難溶性指数（ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｉｎｄｅｘ）（ＲＩ）にした後、超遠心分離器中で４５０００Ｒｐｍで２３時間遠心分離した。１８ゲージ針で遠心分離管の底部を貫通した後に画分を収集し、ＲＩが１．３７６６〜１．３７１１の範囲の画分をプールし、ＨＥＰＥＳ−ＥＤＴＡ再懸濁緩衝液で１．３７１０のＲＩに調整した。第２のＣｓＣｌ勾配遠心分離工程を、６５０００Ｒｐｍで少なくとも８時間行った。画分を収集し、１．３７６６〜１．３７１１のＲＩを有する画分をＰＢＳに対して一晩透析し、続いて、新鮮なＰＢＳに対して更に４時間およびＰＢＳ中の５％ソルビトールに対して２時間透析した。全ての透析工程を４℃で行った。ウイルスを透析カセットから回収し、プルロニック（登録商標）Ｆ−６８を添加して０．００１％の最終濃度とした。ウイルスを滅菌濾過し、アリコートとし、アリコートで−８０℃で保存した。ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｐｉｎキット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号５７７０４）を使用して、１０μｌの精製ウイルスからゲノムＤＮＡを抽出し、ＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子特異的プライマープローブセット（ｒｅｐＦ：ＴＴＣ  ＧＡＴ  ＣＡＡ  ＣＴＡ  ＣＧＣ  ＡＧＡ  ＣＡＧ、ｒｅｐＲ：ＧＴＣ  ＣＧＴ  ＧＡＧ  ＴＧＡ  ＡＧＣ  ��ＧＡ  ＴＡＴ  Ｔ、ｒｅｐ  プローブ：ＴＣＴ  ＧＡＴ  ＧＣＴ  ＧＴＴ  ＴＣＣ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＡＣＡ）を使用したｑＰＣＲにより、ウイルスゲノム力価を決定した。
【０３３１】
バーコード化親ＡＡＶプールの生成。１８個全ての親ＡＡＶ由来のキャプシドを、ＰａｃＩおよびＡｓｃＩ制限部位を使用してＢＣライブラリーベクターにクローニングした。各親ＡＡＶは、配列分析によって確認されるように特有のバーコード配列を含み、２〜６個のＴ２２５の間で、２９３Ｔ細胞を各親ＡＡＶでトランスフェクトした（１個のＴ２２５あたり、３７．５ｕｇのＡＡＶプラスミドおよび３７．５ｕｇのｐＡｄ５ヘルパープラスミド）。各バーコード化親キャプシドＡＡＶの粗溶解物が生成され、２．８Ｅ１２ｖｇの１０個の親または１．１Ｅ１２ｖｇの１８個の親をプールし、それぞれ１０個の親混合物および１８個の親混合物を生成した。ＡＡＶプールを、上記のような二回のＣｓＣｌ勾配遠心分離によって精製した。
【０３３２】
進化したＡＡＶキャプシドの配列寄与度分析。Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ５．３ソフトウェアを使用してコンティグを組み立て、Ｍｕｓｃｌｅ多重配列アラインメントソフトウェア（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  １４．５．３）でアラインした。Ｘｏｖｅｒ３．０  ＤＮＡ／タンパク質シャフリングパターン分析ソフトウェアを使用して、シャフリングされた変異体の親断片交差マップを生成した。各親血清型を図に示すように色分けした。
【０３３３】
ＡＡＶプールおよびライブラリーのＰａｃＢｉｏ配列決定。１０個の親ライブラリーおよび１８個の親プールについて、抽出されたウイルスゲノムからｃａｐＦおよびＱＳｅｑＲｅｖを使用して、キャプシドおよびＢＣ配列を含む２．４ｋｂの断片を増幅し、１％のアガロースゲルに充填し、ＳｙｂｒＳａｆｅでの染色によって可視化し、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してゲル精製した。１０個の親ライブラリーをまた、プラスミドレベルについて評価した後、制限酵素（ＰａｃＩおよびＸｂａＩ）を使用してＡＡＶライブラリーを生成し、キャプシド配列を放出させ、増幅されたキャプシド配列について上記のようにゲル精製した。ライブラリー調製物およびＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＰａｃＢｉｏ）配列決定を、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＰａｃＢｉｏ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｅｒｖｉｃｅで行った。簡単に述べると、ＳＭＲＴｂｅｌｌ鋳型調製キットバージョン１．０（ＰａｃＢｉｏカタログ番号１００−２５９−１００）を使用して、ＰａｃＢｉｏの「Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ａｎｄ  Ｃｈｅｃｋｌｉｓｔ−２ｋｂ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」プロトコルに従って、ＳＭＲＴ  ｂｅｌｌライブラリーを調製した。ＰａｃＢｉｏ「Ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｎｎｅａｌｉｎｇ」計算機を使用して、ＳＭＲＴｂｅｌｌライブラリーのアニーリングおよび結合のための適切な濃度を決定した。ＳＭＲＴｂｅｌｌライブラリーをアニールし、ＤＮＡ／Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｐ６バージョン２．０（ＰａｃＢｉｏカタログ番号１００−３７２−７００）を使用して配列決定するためにＰ６  ＤＮＡポリメラーゼに結合した。標準的なＭａｇＢｅａｄプロトコルおよびＭａｇＢｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒキットバージョン２．０（ＰａｃＢｉｏカタログ番号１００−６４２−８００）を使用して、結合したＳＭＲＴｂｅｌｌライブラリーをＳＭＲＴ細胞に充填ドした。ＤＮＡ配列決定キット４．０バージョン２（ＰａｃＢｉｏカタログ番号１００−６１２−４００、Ｐ６／Ｃ４化学としても既知である）を用いて、標準的なＭａｇＢｅａｄ配列決定プロトコルを続けた。「ステージ開始（Ｓｔａｇｅ  Ｓｔａｒｔ）」を有効にしていない状態で６時間のムービータイムにわたって配列決定データを収集した。ＰａｃＢｉｏ  ＳＭＲＴポータルおよびＲＳ_ＲｅａｄｓＯｆＩｎｓｅｒｔ．１プロトコルを使用し、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｆｕｌｌ  Ｐａｓｓ＝３および最小予測精度＝９５％でフィルタリング設定して、ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＣＣＳ）読み取りを生成した。
【０３３４】
ＰａｃＢｉｏ配列読み取りのバイオインフォマティクス評価２，２５０〜２，３８０ヌクレオチドのキャプシド配列全長を用いるＣＣＳ読み取りを、下流のバイオインフォマティクス分析に含んだ。Ｘｏｖｅｒ３．０ＤＮＡ／タンパク質シャフリングパターン分析ソフトウェアを使用して親断片の同一性を最初に評価するインハウスのアルゴリズムを使用して、ＣＳＳ読み取りにおけるインデルを修正した。各交差断片の親同一性を決定したら、この情報を使用して、修正のためにインデルを決定した。インデルを提供しなかった一塩基多型（ＳＮＰ）を維持した。ＰａｃＢｉｏプラットフォームでのＳＮＰエラー比率は１．３〜１．７％である。この比率を超えるＳＮＰ頻度は、デノボ変異から生じたと仮定した。次いで、ＦＡＳＴＡ形式の修正した配列をＭＵＳＣＬＥを使用してアラインした。ＲＡｘＭＬ１２１３３（Ｓｔａｍａｔａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．２００５）の最大尤度法（ｍａｘｉｍｕｍ−ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ｍｅｔｈｏｄ）を使用して、系統分析を行った。
【０３３５】
偽色（ｆａｌｓｅ−ｃｏｌｏｒｅｄ）構造キャプシドマッピング。（図５４Ｄ）ＵＣＳＦキメラバージョン１．１２を使用して、キメラキャプシド（ＶＰ３配列のみ）をＡＡＶ２  ＶＬＰ構造５ＩＰＩ（Ｄｒｏｕｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）に偽色マッピングした。マッピングされた色は、親断片交差マップで使用される親血清型色に対応する。キャプシド外観図は、表現された全ての鎖を表し、断面図は、キャプシド内腔を曝露する、５倍対称軸で円筒形を囲む鎖を有する。
【０３３６】
代替偽色構造キャプシドマッピング。（図５４Ｅ）ＰｙＭＯＬバージョン２．３．０を使用して、キメラキャプシド（ＶＰ３配列のみ）をＡＡＶ６構造４Ｖ８６９４上に偽色マッピングした。最も近い親ＡＡＶ３Ｂと異なる表面曝露アミノ酸のみを示す。灰色で示されるＡＡＶ３Ｂを除き、全てのマッピングされたアミノ酸残基色は、交差および濃縮図で使用される親血清型色に対応する。
【０３３７】
保存および濃縮計算。ＭａｃＶｅｃｔｏｒバージョン１４．５．３を使用して得られたアラインメントプロファイルを使用して、各位置でのアミノ酸保存を計算した。平均保存値を３０個のアミノ酸残基のストレッチについて計算し、該平均保存値を使用してグラフを生成した。シャフリングライブラリー中のアラインされた各位置における各親の割合を同定するインハウスのアルゴリズムを使用して、親保存パーセントを決定した。最大の正方形サイズは、１００％の変異体がその位置でその親由来のアミノ酸を共有することを示す。他の全ての正方形サイズは、その位置にその親由来のそのアミノ酸を有する０〜１００％の変異体の割合に比例する。最大尤度に基づく親血清型由来の配列の比較により、各キメラの配列における各アミノ酸位置について濃縮スコアを算出した。Ｘｏｖｅｒバージョン３．０．７４を使用して、各キメラについて、交差データ分析セットを生成した。Ｅｘｃｅｌバージョン１６．２０を使用して、それらのデータを濃縮スコアに変換した。示されているように、ライブラリーの親を異なる色で示す。
【０３３８】
統計。統計分析をＰｒｉｓｍ  ｖ７．０ｄを使用して行った。テューキーの多重比較検定を使用する２元配置分散分析により、実験値を評価した。Ｐ値＜０．０５は、統計的に有意であるとみなした。
【０３３９】
ＡＡＶバーコードのハイスループット配列決定。バーコード配列を、インデックスプライマーＦ（Ｆ：ＡＡＴ  ＧＡＴ  ＡＣＧ  ＧＣＧ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＧＡＧ  ＡＴＣ  ＴＡＣ  ＡＣＴ  ＣＴＴ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＣＡＣ  ＧＡＣ  ＧＣＴ  ＣＴＴ  ＣＣＧ  ＡＴＣ  Ｔ（Ｉ）ＣＧＣ  ＧＣＣ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＡＡＴ  ＡＡＡ  Ｃ、およびＲ：ＣＡＡ  ＧＣＡ  ＧＡＡ  ＧＡＣ  ＧＧＣ  ＡＴＡ  ＣＧＡ  ＧＡＴ  ＣＧＧ  ＴＣＴ  ＣＧＧ  ＣＡＴ  ＴＣＣ  ＴＧＣ  ＴＧＡ  ＡＣＣ  ＧＣＴ  ＣＴＴ  ＣＣＧ  ＡＴＣ  Ｔ（Ｉ）ＴＡＧ  ＡＧＣ  ＡＡＣ  ＴＡＧ  ＡＧＴ  ＴＣＧ（指数（Ｉ）は、４〜６ヌクレオチドを含む）を用いて増幅し、アガロースゲルを含む２％  ＳｙｂｒＳａｆｅからゲル精製し、プールし（最大３０個の試料）、ＭｉＳｅｑ機器で配列決定する。ＰＣＲサイクル数は、増幅バイアスを回避するために最小限にし、ｒｅｐ  ｑＰＣＲによって決定されるように、投入ＡＡＶゲノムの濃度に依存した。以下のサイクル条件を使用した：２分間９８℃、１５秒間９８℃、１５秒間５０℃、２０秒間７２℃の１５〜３０サイクル、最終１５分間の伸長を７２℃で行った。全ての増幅について、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｆｌｅｘ（ＮＥＢ）を使用した。
【０３４０】
細胞培養条件
ヒト膵島培養。死亡した非糖尿病臓器ドナー由来のヒト膵臓膵島は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｉｓｌｅｔ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ＩＩＤＰ）またはＳｔａｎｆｏｒｄ  Ｉｓｌｅｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｅを通じてアルバータ大学によって提供され、１０％  ＦＢＳ、ペニシリン−ストレプトマイシン、１％インスリントランスフェリンセレニウム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ、２．５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むＣＭＲＬ−１０６６中で培養した。全ての膵島細胞培養実験において超低付着表面ディッシュ（ｕｌｔｒａ−ｌｏｗ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｄｉｓｈ）を使用した。
【０３４１】
ｈＥＳＣ由来β細胞：Ｍｅｌ１  ＩＮＳＧＦＰ／Ｗヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）をＳ．Ｊ．Ｍｉｃａｌｌｅｆ  ａｎｄ  Ｅ．Ｇ．Ｓｔａｎｌｅｙ（Ｍｏｎａｓｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から得た。細胞を維持し、ｈＥＳＣ培地［１０％  ＫＳＲ（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）］中のマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）上で増殖させた。β細胞へのｈＥＳＣの段階的分化を以前に記載されたプロトコル７５に従って行った。簡単に述べると、ＴｒｙｐＬＥ（Ｇｉｂｃｏ）を使用して、コンフルエントｈＥＳＣを単細胞懸濁液中に分離し、計数し、１０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）および１０ｎｇ／ｍｌのヘレグリンＢ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補充した５．５ｍｌのｈＥＳＣ培地中の６ウェル懸濁液プレート中に１ウェルあたり５．５×１０６個の細胞で播種した。プレートを３７℃および５％ＣＯ２で１００ｒｐｍのオービタルシェーカー上でインキュベートし、３Ｄ球体形成を誘導した。２４時間後、球体をＰＢＳで洗浄し、１日目の培地に再懸濁した。１日目から２０日目まで、培地を毎日換えた。培地の組成は以下の通りである：１日目０．２％  ＦＢＳ、１：５，０００  ＩＴＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ、および５０ｎｇ／ｍｌ  ＷＮＴ３ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む、ＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）。２日目０．２％ＦＢＳ、１：２，０００ＩＴＳ、および１００ｎｇ／ｍｌアアクチビンＡを含む、ＲＰＭＩ。３日目：０．２％ＦＢＳ、１：１，０００ＩＴＳ、２．５μＭ ＴＧＦｂｉ  ＩＶ（ＣａｌＢｉｏＣｈｅｍ）、および２５ｎｇ／ｍｌ  ＫＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む、ＲＰＭＩ。４〜５日目０．４％ＦＢＳ、１：１，０００ＩＴＳ、および２５ｎｇ／ｍｌ  ＫＧＦを含む、ＲＰＭＩ。６〜７日目１：１００  Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ）を含む２５ｍＭ  グルコースおよび３ｎＭ  ＴＴＮＰＢ（Ｓｉｇｍａ）を含む、ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）。８日目１：１００  Ｂ２７を含む２５ｍＭグルコース、３ｎＭ  ＴＴＮＰＢ、および５０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む、ＤＭＥＭ。９〜１１日目１：１００  Ｂ２７を含む２５ｍＭグルコース、５０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ、および５０ｎｇ／ｍｌ  ＫＧＦを含む、ＤＭＥＭ。１２〜２０日目１：１００  Ｂ２７を含む２５ｍＭグルコース、１：１００  Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）、１：１００  ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ）、１０μｍ  ＡＬＫｉ  ＩＩ（Ａｘｘｏｒａ）、５００ｎＭ  ＬＤＮ  −１９３１８９（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、１μｍ  Ｘｘｉ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、１μＭ  Ｔ３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．５ｍＭビタミンＣ、１ｍＭ  Ｎ−アセチルシステイン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０μＭ硫酸亜鉛（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、および１０μｇ／ｍｌの硫酸ヘパリンを含む、ＤＭＥＭ。２０日目に、球体を収集し、Ａｃｃｕｍａｘ（ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に３７℃で１０分間インキュベートし、単一細胞に分離した。活ＧＦＰが高い細胞をＡｒｉａ  ＩＩ上で低流量で選別し、１０％ＦＢＳ、１：１００  Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）、１：１００ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ）、１０μｍ  ＡＬＫｉ  ＩＩ（Ａｘｘｏｒａ）、０．５ｍＭビタミンＣ、１μＭ  Ｔ３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１ｍＭ  Ｎ−アセチルシステイン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０μＭ硫酸亜鉛（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、および１０μｇ／ｍｌ硫酸ヘパリンを含むＣＭＲＬ中、１クラスターあたり１，０００個の細胞で、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ−４００（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で再凝集させた。２３日目に、再凝集した濃縮βクラスター（ｅＢＣ）をＡｇｇｒｅｗｅｌｌｓから移し、１００ｒｐｍでオービタルシェーカー上に置き、さらに６日間培養した。再凝集後、３日毎に培地を換えた。
【０３４２】
ヒト骨格筋幹細胞および筋管の培養。６人の個々のドナーから単離された一次筋幹細胞のプール（スタンフォード州Ｇ．チャービルからの親切な贈呈）を初期継代において凍結し、アリコートを実験に使用した。プレートを、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中の細胞外マトリックスタンパク質（Ｓｉｇｍａ）で１：５００でコーティングした。ｈＭｕＳＣ培地は、記載されるように９５、幹状態を維持するために、２０％  ＦＢＳ、１％  インスリンートランスフェリンーセレン、１％  抗生物質／抗真菌剤、および１０μＭ  ｐ３８ｉ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙカタログ番号ＳＢ２０３５８０）を補充したＤＭＥＭ：ＭＣＤＢ培地の１：１混合物である。一次ｈＭｕＳＣを筋管に分化させるための培地はｐ３８ｉを欠如しており、２０％ＦＢＳの代わりに２％ウマ血清飢餓（ｈｏｒｓｅ  ｓｅｒｕｍ  ｓｔａｒｖｅ）を７日間含んだ。２日毎に全ての培地を換えた。
【０３４３】
マウス骨格筋筋芽細胞の培養。野生型Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−１７７２）を、１０％  ＦＢＳおよび１％  抗生物質／抗真菌剤を補充したＤＭＥＭ中で維持した。
【０３４４】
２９３および２９３Ｔ細胞株の培養。ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−１５７３）およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−３２１６）を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１％抗真菌剤−抗生物質、１１ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．２８、および１ｍＭピルビン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ中で培養した。
【０３４５】
ＨｅＬａ細胞の培養。ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＣＬ−２）を、１０％  ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１％抗真菌剤−抗生物質を含むＤＭＥＭ中で培養した。
【０３４６】
マウス膵臓β細胞の培養。Ｒ７Ｔ１細胞（Ｈ．Ｍｏｅｌｌｅｒ，Ｓｔａｎｆｏｒｄからの親切な贈呈物）を、１０％  ＦＢＳ、２ｍＭ  グルタミン、１％抗真菌剤−抗生物質、１ｕｇ／ｍｌ  ドキシサイクリンを含むＤＭＥＭ中で培養した。
【０３４７】
マウス膵臓α細胞の培養。αＴＣ１クローン６細胞（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−２９３４）を、１０％  ＦＢＳ、２ｍＭ  グルタミン、１％抗真菌剤−抗生物質、１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭ  ＮＥＡＡを含むＤＭＥＭ中で培養した。
【０３４８】
ラット肝腫細胞の培養。Ｈ４ＴＧ細胞（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−１５７８）を、１０％  ＦＢＳ、４ｍＭ  グルタミン、１％抗真菌剤−抗生物質を含むＤＭＥＭ中で培養した。
【０３４９】
ヒト肝細胞癌細胞の培養。ＳＮＵ−３８７細胞（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−２２３７）およびＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣカタログ番号ＨＢ−８０６５）を、１０％  ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１％抗真菌剤−抗生物質、１％非必須アミノ酸を含むＲＰＭＩ中で培養した。ＨｕＨ７細胞を、１０％  ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１％抗真菌剤−抗生物質、１％非必須アミノ酸を含むＤＭＥＭ中で培養した。
【０３５０】
ヒトケラチノサイトの培養。ＨａＣａＴ細胞（Ａ．Ｏｒｏ、Ｓｔａｎｆｏｒｄからの親切な贈呈物）を、１０％  ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で培養した。
【０３５１】
ハムスター卵巣細胞の培養。ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＣＬ−６１）を、１０％  ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＨａｍ’ｓ  Ｆ１２中で培養した。
【０３５２】
アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅ）腎臓細胞の培養。ＦＲｈＫ−４細胞（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−１６８８）を、１０％  ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で培養した。
【０３５３】
マウス線維芽細胞の培養。Ｅ１４で誘導した一次マウス胚性線維芽細胞を、１０％  ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１％非必須アミノ酸、１％抗真菌剤−抗生物質、５５ｕＭ  β−メルカプトエタノールを含むＤＭＥＭ中で培養した。
【０３５４】
ヒト膵島でのＡＡＶライブラリーの選択。１０ｍｌの完全培地を含む１０ｃｍペトリディッシュ中に膵島を放置し、ＡＡＶ感染の一晩前に回収した。膵島にインタクトで感染させたか、または感染前にＡｃｃｕｍａｘを使用して（１０００個の膵島当量あたり、１ｍｌのＡｃｃｕｍａｘ［ＩＥＱ］）、膵島を単細胞懸濁液中に分離した約３００のＩＥＱまたは１．７Ｅ０５個の分散された膵島細胞を超低付着表面２４ウェルプレートのいくつかのウェルに播種し、様々なＭＯＩの１８個の親ＡＡＶ混合物またはＡＡＶライブラリーのいずれかに感染させ、３７℃インキュベーター中で６時間インキュベートした。残った投入ウイルス細胞を除去するために２回ＰＢＳ洗浄した後、ＡＴＣＣ（カタログ番号ＶＲ−５）から得られたヒトアデノウイルス５を超感染させた。インタクトな膵島については、８Ｅ０７のＰＦＵを使用し、分離された膵島細胞については、４Ｅ０７のＰＦＵを１ウェルあたり１ｍｌ培地に添加した。３７℃で４日後、細胞および上清を採取し、３回の凍結解凍サイクルに供し、６５℃で３０分間インキュベートしてＡｄ５を不活性化した。細胞破片を遠心分離によって除去し（２分間、１０，０００ｘｇ）、ｒｅｐプライマープローブセットを使用したｑＰＣＲによる力価測定のために、ウイルスゲノムを１００ｕｌの清澄上清から単離した。その後の継代ラウンドでは、十分に高い力価を達成した場合、初期感染と同様のＭＯＩを使用した。力価が低い場合、２００ｕｌの最大体積を感染のために使用した。
【０３５５】
ベクタープラスミド。ＣＡＧプロモーターの制御下でＧＦＰを発現する自己相補的ｒＡＡＶベクター（ｐｓｃＡＡＶ−ＣＡＧ−ＧＦＰ、Ａｄｄｇｅｎｅ、カタログ番号８３２７９）を、プラスミドｐｓｃＡＶ−ＧＦＰ（Ｊｏｎ  Ｔ  Ｇｒａｙ、Ａｄｄｇｅｎｅからの贈呈物、カタログ番号３２３９６）中のＣＭＶプロモーターをｐＡＶ−ＣＡＧ−ＧＦＰー（Ｅｄｗａｄ  Ｂｏｙｄｅｎ、Ａｄｄｇｅｎからの贈呈物、カタログ番号３７８２５）由来のＣＡＧプロモーターで置き換えることによって生成した。ＣＡＧプロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼを発現する一本鎖ｒＡＡＶベクター（ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ＦＬｕｃ、Ａｄｄｇｅｎｅ、カタログ番号  ８３２８１）を、プラスミドｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ＧＦＰ中のＧＦＰ配列をプラスミドｐＡＡＶ−ＥＦ１α−ＦＬｕｃ−ＷＰＲＥ−ＨＧＨｐＡ（Ａｄｄｇｅｎｅ、カタログ番号８７９５１）から得られるホタルシフェラーゼ配列で置き換えることによって生成した。コドン多様化（ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ）Ｔｏｍａｔｏ  Ｒｅｄを発現する一本鎖ｒＡＡＶベクターは、Ｅｄｗａｒｄ  Ｂｏｙｄｅｎからの贈呈物（ｐＡＶ−ＣＡＧ−ｔｄＴｏｍａｔｏ、Ａｄｄｇｅｎｅ、カタログ番号５９４６２）であった。
【０３５６】
濃縮されたＡＡＶキャプシド配列の回収および評価第３回の選択ラウンド後に、プライマーｃａｐＦおよび３’末端にそれぞれのＢＣ特異的配列を含むリバースプライマーを使用して、ウイルスゲノムからキャプシド配列を増幅した。左のＢＣが所望の変異体の特異的増幅の対照として作用するように、右のＢＣを選択してプライマー配列に含めた。ウイルス力価およびウイルスプールにおける特定の変異体の頻度に従って、ＰＣＲサイクル数を調整した。以下の増幅パラメータを使用した：２分間９８℃、１５秒間９８℃、２０秒間６１℃、２分間７２℃の２５〜３０サイクル、および７２℃での最終１０分間の伸長。ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＴＯＰＯクローニングし、配列決定した。各ＢＣについてのいくつかのクローンを配列決定し、左のＢＣ配列がＢＣ  ＮＧＳによって得られる配列と一致することを確かめた。いくつかのキャプシドでは、クローンのうちのいくつかで、特に５’末端において、キャプシド配列が異なることが観察された。これは、不完全な伸長後の鋳型スイッチングに起因する可能性が高く９６〜９８、ＰＣＲ条件および酵素を最適化することによって改善され得る。コンセンサス配列と一致したキャプシド配列を使用して、リン酸カルシウムトリプルトランスフェクションにより、自己相補的ＣＡＧプロモーター駆動ＧＦＰ発現ベクターがパッケージングされた。各Ｔ２２５フラスコでは、２５ｕｇ  ｓｃ  ＣＡＧ−ＧＦＰ移入ベクター、２５ｕｇパッケージングプラスミド、および２５ｕｇ  ｐＡｄ５ヘルパープラスミドを使用した。粗細胞溶解物を生成し、ＧＦＰ特異的プライマープローブセットを使用したｑＰＣＲによってｒＡＡＶ力価を決定し、１ＫのＭＯＩを使用して、分離されたヒト膵島細胞への形質導入効率について試験した。形質導入の４８時間後、再凝集した擬（ｐｓｅｕｄｏ）膵島をＡｃｃｕｍａｘと共にインキュベートした後、Ｄｉｓｐａｓｅで処理することによって単細胞懸濁液中に分離させた。ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ機器を使用して、ＧＦＰ発現細胞の数を評価し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアバージョン１０を使用して、データを分析し、グラフ化した。選択されたキャプシド変異体を使用して、異なる発現ベクターがパッケージングされたＣｓＣｌ勾配精製ベクター調製物を生成した。
【０３５７】
アルカリ性サザンブロットによるパッケージングされたベクターゲノムの分析。標準的な方法を使用してｒＡＡＶキャプシドにパッケージングされたＤＮＡのサイズを分析するために、アルカリ性サザンブロット分析を行った。簡単に述べると、アルカリ性ローディング緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＯＨ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、３％  Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２５％ブロムクレゾール、０．０４２％キシレン）中の１Ｅ０９個のウイルスゲノムを、５０ｍＭ  ＮａＯＨ、１ｍＭ  ランニング緩衝液を含む１％アルカリアガロースゲル上に充填した。ゲルを４℃、４０ｍＶで２４時間でランニングし、１２時間後に緩衝液を１度交換した。ゲルブロッティング後、メンブレンを、回転させながら６５℃で２時間、ＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂ  Ｐｌｕｓ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ緩衝液（Ｓｉｇｍａ）中の１０ｕｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡと事前にハイブリダイゼーションした。３００ｎｔ長の３２Ｐ標識プローブを含むＧＦＰまたはＦＬｕｃ配列を添加し、回転させながら６５℃でハイブリダイズさせたままとした。メンブレンを低ストリンジェント条件下（２×クエン酸塩ナトリウム、６５℃で２０分）で２回洗浄し、続いて高ストリンジェント条件下（０．１％  ＳＤＳを含む２×クエン酸塩ナトリウム、６５℃で３０分）で１回洗浄した。メンブレンをホスホイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ）スクリーニング上に曝露し、Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して可視化した。ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅソフトウェアを使用して画像分析を行った。
【０３５８】
ウェスタンブロットによるキャプシドタンパク質の分析。標準的な方法および装置を使用してウェスタンブロット分析を行った。簡単に述べると、ＭＯＰＳランニング緩衝液を使用して、タンパク質を４〜１２％  ＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で分解した。キャプシドタンパク質の検出のために、メンブレンを、モノクローナル抗体Ｂ１（ＡＲＰ、カタログ番号０３−６１０５８）を用いて、１：２００希釈で室温で２時間、プローブした。次いで、メンブレンを、マウスＩｇＧに対するホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識二次抗体と共に１時間インキュベートし、続いて、Ｐｉｅｒｃｅ  ＥＣＬ２基質およびＢｉｏｒａｄ  Ｃｈｅｍｄｏｃイメージャーを使用してＨＲＰ検出を行った。
【０３５９】
キャプシド変異体の細胞種特異的形質導入効率の評価これらの研究のために冷（ｃｏｌｄ）形質導入法を行った。簡単に述べると、約３００個のインタクトな膵島を２％ＦＢＳを含む１００ｕｌのＣＭＲＬに再懸濁し、ｒＡＡＶを１０ＫのＭＯＩで添加し（１膵島あたり１，０００個の細胞を想定）、冷たい室内で水平型シェーカー上で軽く揺らしながら、混合物を氷上でインキュベートした。２時間後、１ｍｌの事前に温めた完全培地（１０ｍＭ  ＨＥＰＥ、０．５％ヒト血清アルブミン、２％ＦＢＳ、１０ｍＭ  ニコチンアミド、１％抗真菌剤−抗生物質、１％  Ｇｌｕｔａｍａｘを含む、ＣＭＲＬ−１０６６）を各試料に添加し、２４ウェルの超低付着プレート上で膵島をインキュベートした。培地を２日後に置き換え、膵島を採取し、分離し、表面抗体を使用して前に記載したようにＦＡＣＳによって分析し、α−、β−、および非α−／非β細胞に細分した９９。
【０３６０】
ｈＥＳＣ由来β細胞における形質導入効率についてのｒＡＡＶの評価。組換えＡＡＶを、１０、１００、１０００のＭＯＩで、２０個の球体から選別された８００，０００個の高ＧＦＰ細胞と混合し、１０％ＦＢＳ、１：１００ Ｇｌｕｔａｍａｘ、１：１００  ＮＥＡＡ、１０μｍ  ＡＬＫｉ  ＩＩ、０．５ｍＭビタミンＣ、１μＭ  Ｔ３、１ｍＭ  Ｎ−アセチルシステイン、１０μＭ硫酸亜鉛、および１０μｇ／ｍｌ硫酸ヘパリンを含むＣＭＲＬ中でＡｇｇｒｅｗｅｌｌ−４００で再凝集させた。３日後に培地を換え、この際、再凝集したｅＢＣを６ウェル懸濁液プレートに移した。それらを１００ｒｐｍでオービタルシェーカー上に置き、さらに３日間培養した。続いて、ｅＢＣを分離し、固定化し、透過処理し、以前に記載されているように１００、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａＸ２０  Ｄｕａｌでの分析のために、抗ヒトＣペプチド抗体（１：２００）および抗ヒトＲＦＰ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、１：５００）について染色した。データをＦｌｏｗｊｏソフトウェアで分析した。分子プローブ抗体標識キットを使用し、製造業者の指示書に従って、抗ヒトＣペプチド抗体をインハウスでコンジュゲートした。Ｌｅｉｃａ  ＤＭＩ４０００  Ｂを使用してライブイメージを撮影した。
【０３６１】
様々な細胞株への形質導入効率のための変異体の評価。ＡＡＶ  ＤＪ、ＡＡＶ  ＬＫ０３、ならびに変異体ＡＡＶ  ＫＰ１、ＫＰ２、およびＫＰ３のキャプシド配列を使用して、一本鎖ＣＡＧ−ホタルルシフェラーゼベクターがパッケージングされた。組換えＡＡＶ調製物を２回ＣｓＣｌ精製し、これを使用して、様々なヒトおよびマウス一次細胞および細胞株を１００および１０００のＭＯＩで３重で形質導入した。分化されたヒト筋肉細胞を除き、全ての細胞が、形質導入時に約６０〜７０％コンフルエントとなるように、形質導入の１日前に４８ウェルプレート上に播種された（サイズおよび増殖速度に応じて、１ウェルあたり２０，０００〜８０，０００の播種密度）。形質導入の４８時間後にルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性についてアッセイした。精製された組換えルシフェラーゼタンパク質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して標準曲線を生成した。
【０３６２】
中和アッセイ。プールされたヒト免疫グロブリン画分（ＩＶＩＧ，Ｂａｘｔｅｒ）の２つの異なるバッチを使用して、中和抗体に対する感受性について新規な変異体を評価した。中和アッセイを、本質的に記載の通りに行った（Ｍｅｌｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）１０１。簡単に述べると、ＩＶＩＧ調製物を補体不活性化ＦＢＳに希釈し、異なるキャプシドがパッケージングされた各ｓｓＣＡＧ−ＦＬｕｃベクターの２Ｅ０８個のベクターゲノムと共に、総体積１００ｕｌで、３７℃で１時間インキュベートした。前日に４８ウェルプレート上に播種したＨｕｈ７細胞（１ウェルあたり５Ｅ０４個）を、ウイルス−ＩＶＩＧ混合物で３重で形質導入し（各ウェル２２．５μｌ、約１００のＭＯＩに対応する）、細胞溶解物中のルシフェラーゼ活性を２４時間後に決定した。
【０３６３】
マウス。ＮＯＤ株バックグラウンド（ＮＯＤ−ｓｔｒａｉｎ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）（ＦＲＧ／Ｎ）のＦａｈ／Ｒａｇ２／Ｉｌ２ｒｇｃ（ＦＲＧ）欠損雌マウスを収容し、オレゴン健康科学大学の特定病原体除去施設で維持した。ＦＲＧ／Ｎマウスを、自由にさせて食品照射した高脂肪低タンパク質マウス食餌（Ｌａｂ  Ｄｉｅｔカタログ番号Ｐｉｃｏｌａｂ−５ＬＪ５）で維持し、チロシン経路を通る流量を減少させた。移植日から、ＦＲＧ／Ｎマウスを酸性水で１週間維持し、細菌の増殖を防止した。翌週、マウスに対して、１週間の８ｍｇ／Ｌ  ＳＭＸ−ＴＭＰ抗生物質水（食味のために０．７−ｍｏｌ／Ｌデキストロースを補充）に切り替えた。その後、ＦＲＧ／Ｎマウスに対して、記載したように、１ｍｇ／Ｌ  ＮＴＢＣ水のオンおよびオフにより循環させた。６〜８週齢の雌Ｂａｌｂ／Ｃ  ＳＣＩＤマウスを、画像化研究のためにＴｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（カタログ番号００１８０３）から購入した。スタンフォード大学の動物実験委員会、オレゴン保健科学大学、および小児医療研究センターは、全てのマウス手順を承認した。
【０３６４】
肝細胞移植。形質導入研究のためのドナーヒト肝細胞を、ＢｉｏｒｅｃｌａｒｎａｔｉｏｎＩＶＴから取得した（ロット番号ＱＩＥ）。ヒト細胞移植を促進するために、移植の２４時間前にウロキナーゼを発現する組換えヒトアデノウイルス（５Ｅ１０  ＰＦＵ、眼窩後投与）を投与して、離乳ＦＲＧ／Ｎマウスを事前調整した。５Ｅ０５〜１Ｅ０６個のヒト肝細胞を、麻酔したレシピエントＦＲＧ／Ｎマウスに脾臓内注射し、ヒト肝細胞移植および増殖を促進するためにＮＴＢＣのオン／オフで循環させた。広域スペクトラムの抗生物質（４ｍｇ／ｋｇのＣｅｆｔｉｏｆｕｒ）を手術直前および手術後２日間、腹腔内注射により投与した。移植の６ヶ月後、移植の尺度として循環ヒトアルブミンレベルを、Ｂｅｔｈｙｌ定量ヒトアルブミンＥＬＩＳＡキット（カタログ番号Ｅ８８−１２９）で決定した。
【０３６５】
インビボ形質導入実験。野生型マウス肝臓形質導入効率の評価のために、白色Ｂａｌｂ／Ｃ  ＳＣＩＤマウスに、ノルモダイナミックな（ｎｏｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ）静脈内側尾静脈注射により、各ＣＡＧ−ホタルルシフェラーゼベクターの２Ｅ１０ベクターゲノムを注射した。ＡＡＶ８をＬＫ０３の代わりに使用したが、それは、このキャプシドが以前に高度にヒト特異的であることが示されているためである。１ｇ体重あたり１５０μｇのＤ−ルシフェリン（Ｂｉｏｓｙｎｔｈカタログ番号Ｌ−８２２０）の腹腔内注射、およびＡｍｉイメージングシステム使用した腹腔ルシフェラーゼ読み取りによって、肝臓におけるルシフェラーゼ活性について、マウスを週１回モニタリングした。３５日目にマウスを犠牲死させ、様々な臓器（肝臓、膵臓、心臓、肺、脾臓、脳、および腎臓）を回収した。Ｂｕｌｌｅｔ  Ｓｔｏｒｍホモジナイザーを使用して、臓器をＰａｓｓｉｖｅ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中でホモジナイズし、１ｍｇの各組織試料由来のルシフェラーゼ活性を上記のように測定した。１０ｍｇの各組織試料からゲノムＤＮＡを単離し、ｑＰＣＲを使用してベクターコピー数を決定した。ルシフェラーゼ用のプライマーは、ＦＬｕｃ  Ｆ：ＣＡＣ  ＡＴＡ  ＴＣＧ  ＡＧＧ  ＴＧＧ  ＡＣＡ  ＴＴＡ  Ｃ、およびＦＬｕｃ  Ｒ：ＴＧ  ＴＴＴ  ＧＴＡ  ＴＴＣ  ＡＧＣ  ＣＣＡ  ＴＡＧであった。マウスアクチンプライマー（ｍ−ａｃｔＦ：ＣＣＴ  ＧＴＡ  ＴＧＣ  ＣＴＣ  ＴＧＧ  ＴＣＧ  ＴＡ、およびｍ−ａｃｔＲ：ＣＣＴ  ＣＧＴ  ＡＧＡ  ＴＧＧ  ＧＣＡ  ＣＡＧ  Ｔ）を標準化のために使用した。
【０３６６】
インビボでのヒト肝細胞形質導入の評価のために、ヒト化ＦＲＧ／Ｎマウス（１群あたり３匹のマウス）に、ＤＪ、ＬＫ０３、またはＫＰ１キャプシドでシュードタイピングされた１Ｅ１１個のｓｓＣＡＧ−Ｔｄ  Ｔｏｍａｔｏ  Ｒｅｄベクターゲノムを静脈内注射し、この１４日間の形質導入中、１ｍｇ／Ｌ  ＮＴＢＣ上で維持した。吸入用イソフルラン麻酔下で肝臓を採取した。肝臓組織をいくつかの葉から切り取って、いくつかの２×５ｍｍの片とし、光から保護して２５℃で５時間、１０倍の体積の４％  ＰＦＡ中で固定した。固定組織をＰＢＳ中で１回洗浄し、スクロース低温保護および再水和シリーズに供した（２５℃で２時間でのスクロース１０％  ｗ／ｖ、４℃で１晩でのスクロース２０％  ｗ／ｖ、２５℃で４時間でのスクロース３０％  ｗ／ｖ）。肝臓片をＰＢＳ中ですすぎ、吸水乾燥を行い、ＯＣＴ（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋカタログ番号４５８３）を用いてクリオモルド（ｃｒｙｏｍｏｌｄ）（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋカタログ番号４５５７）に封入し（ｍｏｕｎｔｅｄ）、液体窒素冷却したイソペンタン浴中で凍結した。標識したクリオモルドをアルミホイルで包み、切片化するまで−８０℃で置いた。
【０３６７】
肝臓免疫組織化学。４〜５つの葉を有する各肝臓試料を、１切片あたり５μＭでマイクロトームで切断した。スライドをメタノール中で−２０℃で１分間固定し、室温（ＲＴ）で空気乾燥した。通知を除いて、以下の全ての手順を室温で行った。スライドをＰＢＴ（ＰＢＳ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）中で３×５分間洗浄し、ＰＢＳ中の０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００に１×１０分間透過させ、ＰＢＴ中で２×５分間洗浄した。加湿チャンバー中で１時間、ＰＢＴ＋１０％正常ロバ血清（カタログ番号ａｂ７４７５；Ａｂｃａｍ）でブロッキングを行った。ウサギ抗ヒトＦＡＨ抗体（カタログ番号ＨＰＡ０４１３７０；Ｓｉｇｍａ）を１：２００でＰＢＴに添加し、４℃で一晩インキュベートした。染色後、洗浄をＰＢＴ中で３×５分間行った。ロバ抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  ＩｇＧ抗体（カタログ番号Ａ−２１２０６；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の二次抗体をＰＢＴ（１：５００、８０ｎｇ／ｍＬのＤＡＰＩを含む）に添加し、室温で１時間インキュベートした。スライドをＰＢＴで３×５分間洗浄し、ＰＢＳで１×５分間洗浄し、続いて、ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ試薬（カタログ番号９０７１Ｓ；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を用いて封入した。抗体正当性対照（ｖａｌｉｄｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ）は、二次のみの染色、ならびに陽性対照ヒト肝臓組織切片（カタログ番号ＨＦ−３１４；Ｚｙａｇｅｎ）および陰性対照未処置マウス肝切片（カタログ番号ＭＦ−３１４−Ｃ５７；Ｚｙａｇｅｎ）について示すことを含んでいた。Ｚｅｎ  Ｐｒｏソフトウェアによる２０×対物でのＺｅｉｓｓレーザースキャニング共焦点倒立顕微鏡（ＬＳＭ  ８８０）で画像化を行った。ＡＡＶ−ＲＦＰシグナルを走査し、直接捕捉した。ヒト肝細胞形質導入の定量化をＶｏｌｏｃｉｔｙソフトウェア（ｖ６．３）を使用して行い、眼による計数で確認した。簡単に述べると、各肝臓試料の異なる切片由来の異なる葉にわたる６〜９つの異なる目的領域を走査し、１切片あたり平均で約１，０００個の細胞が計数された。約３０％〜８０％のＦＡＨ陽性染色を有する領域を分析のために選択した。走査面積あたりのヒト肝細胞のパーセンテージは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ ４８８シグナル（ＦＡＨ陽性）を有する細胞数をＤＡＰＩシグナルを有する細胞数（総細胞数）で割ったものとして示した。総形質導入効率は、ＲＦＰシグナルを有する細胞の数（ＡＡＶ陽性）をＤＡＰＩシグナルを有する細胞の数で割ることによって計算した。これらの２つの数値の重複は、異なるＡＡＶ血清型についてのヒト肝細胞への形質導入効率を表していた。
【０３６８】
実施例３の参考文献
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２９．Ｓｔｕｔｚｍａｎ−Ｅｎｇｗａｌｌ，Ｋ，Ｃｏｎｌｏｎ，Ｓ，Ｆｅｄｅｃｈｋｏ，Ｒ，ＭｃＡｒｔｈｕｒ，Ｈ，Ｐｅｋｒｕｎ，Ｋ，Ｃｈｅｎ，Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）．Ｓｅｍｉ−ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｏｆ  ａｖｅＣ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ｓｃａｌｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｏｒａｍｅｃｔｉｎ  ｂｙ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ．Ｍｅｔａｂ  Ｅｎｇ  ７：２７−３７．
３０．Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ，Ｓｅｍｙｏｎｏｖ，Ａ，Ｄａｗｅｓ，Ｇ，Ｃｒａｍｅｒｉ，Ａ，Ｌｙｏｎｓ，Ｒ，Ｓｔｅｍｍｅｒ，ＷＰ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）．Ｄｉｖｅｒｓｅ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂｙ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １６：８８１−８９２．
３１．Ｚｈａｎｇ，ＪＨ，Ｄａｗｅｓ，Ｇ，ａｎｄ  Ｓｔｅｍｍｅｒ，ＷＰ（１９９７）．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  ａ  ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９４：４５０４−４５０９．
３２．Ａｐｔ，Ｄ，Ｒａｖｉｐｒａｋａｓｈ，Ｋ，Ｂｒｉｎｋｍａｎ，Ａ，Ｓｅｍｙｏｎｏｖ，Ａ，Ｙａｎｇ，Ｓ，Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｃ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）．Ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｆｏｕｒ  ｄｅｎｇｕｅ  ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ  ｂｙ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｄｅｎｇｕｅ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ａｎｔｉｇｅｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２４：３３５−３４４．
３３．Ｍａｈｅｓｈｒｉ，Ｎ，Ｋｏｅｒｂｅｒ，ＪＴ，Ｋａｓｐａｒ，ＢＫ，ａｎｄ  Ｓｃｈａｆｆｅｒ，ＤＶ（２００６）．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｙｉｅｌｄｓ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２４：１９８−２０４．
３４．Ａｓｕｒｉ，Ｐ，Ｂａｒｔｅｌ，ＭＡ，Ｖａｚｉｎ，Ｔ，Ｊａｎｇ，ＪＨ，Ｗｏｎｇ，ＴＢ，ａｎｄ  Ｓｃｈａｆｆｅｒ，ＤＶ（２０１２）．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０：３２９−３３８．
３５．Ｋｏｅｒｂｅｒ，ＪＴ，Ｊａｎｇ，ＪＨ，ａｎｄ  Ｓｃｈａｆｆｅｒ，ＤＶ（２００８）．ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｏｆ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｙｉｅｌｄｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｖｉｒａｌ  ｐｒｏｇｅｎｙ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １６：１７０３−１７０９．
３６．Ｌｉ，Ｗ，Ａｓｏｋａｎ，Ａ，Ｗｕ，Ｚ，Ｖａｎ  Ｄｙｋｅ，Ｔ，ＤｉＰｒｉｍｉｏ，Ｎ，Ｊｏｈｎｓｏｎ，ＪＳ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｈｕｆｆｌｅｄ  ＡＡＶ  Ｇｅｎｏｍｅｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １６：１２５２−１２６０．
３７．Ｌｉｓｏｗｓｋｉ，Ｌ，Ｄａｎｅ，ＡＰ，Ｃｈｕ，Ｋ，Ｚｈａｎｇ，Ｙ，Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，ＳＣ，Ｗｉｌｓｏｎ，ＥＭ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ｒｅｌｅｖａｎｔ  ＡＡＶ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｉｎ  ａ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｌｉｖｅｒ  ｍｏｄｅｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ５０６：３８２−３８６．
３８．Ｐａｕｌｋ，ＮＫ，Ｐｅｋｒｕｎ，Ｋ，Ｃｈａｒｖｉｌｌｅ，ＧＷ，Ｍａｇｕｉｒｅ−Ｎｇｕｙｅｎ，Ｋ，Ｗｏｓｃｚｙｎａ，ＭＮ，Ｘｕ，Ｊ，ｅｔ  ａｌ．（２０１８）．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｖｉｒａｌ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｍｕｓｃｌｅ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｌｉｎ  Ｄｅｖ  １０：１４４−１５５．
３９．Ｐａｕｌｋ，ＮＫ，Ｐｅｋｒｕｎ，Ｋ，Ｚｈｕ，Ｅ，Ｎｙｇａａｒｄ，Ｓ，Ｌｉ，Ｂ，Ｘｕ，Ｊ，ｅｔ  ａｌ．（２０１８）．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＡＡＶ  Ｃａｐｓｉｄｓ  ｗｉｔｈ  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｈｉｇｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  ａｎｄ  Ｕｎｉｑｕｅ  Ｈｕｍｏｒａｌ  Ｓｅｒｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２６：２８９−３０３．
４０．Ｗａｒｄ，Ｐ，ａｎｄ  Ｗａｌｓｈ，ＣＥ（２００９）．Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ＡＡＶ  Ｃａｐ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｌｔｅｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３８６：２３７−２４８．
４１．Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ，ＳＲ，Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ，Ｚ，Ｈａｒｒｉｓ，ＡＦ，Ｍａｉｔｌａｎｄ，ＳＡ，Ｆｅｒｒｅｉｒａ，ＪＳ，Ｚｈａｎｇ，Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）．Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｙｉｅｌｄｓ  ＡＡＶ−Ｂ１  Ｃａｐｓｉｄ  ｆｏｒ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２４：１２４７−１２５７．
４２．Ｄａｌｋａｒａ，Ｄ，Ｂｙｒｎｅ，ＬＣ，Ｋｌｉｍｃｚａｋ，ＲＲ，Ｖｉｓｅｌ，Ｍ，Ｙｉｎ，Ｌ，Ｍｅｒｉｇａｎ，ＷＨ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ｉｎ  ｖｉｖｏ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｏｕｔｅｒ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｖｉｔｒｅｏｕｓ．Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ５：１８９ｒａ１７６．
４３．Ｔｅｒｖｏ，ＤＧ，Ｈｗａｎｇ，ＢＹ，Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎ，Ｓ，Ｇａｊ，Ｔ，Ｌａｖｚｉｎ，Ｍ，Ｒｉｔｏｌａ，ＫＤ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）．Ａ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ  ＡＡＶ  Ｖａｒｉａｎｔ  Ｐｅｒｍｉｔｓ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｒｅｔｒｏｇｒａｄｅ  Ａｃｃｅｓｓ  ｔｏ  Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ  Ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｎｅｕｒｏｎ  ９２：３７２−３８２．
４４．Ｙａｎｇ，Ｌ，Ｊｉａｎｇ，Ｊ，Ｄｒｏｕｉｎ，ＬＭ，Ａｇｂａｎｄｊｅ−ＭｃＫｅｎｎａ，Ｍ，Ｃｈｅｎ，Ｃ，Ｑｉａｏ，Ｃ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ａ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ  ｔｒｏｐｉｃ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）  ｅｖｏｌｖｅｄ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０６：３９４６−３９５１．
４５．ＣＤＣ（２０１７）．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  Ｒｅｐｏｒｔ．ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ．
４６．Ｂｒｕｎｉ，Ａ，Ｇａｌａ−Ｌｏｐｅｚ，Ｂ，Ｐｅｐｐｅｒ，ＡＲ，Ａｂｕａｌｈａｓｓａｎ，ＮＳ，ａｎｄ  Ｓｈａｐｉｒｏ，ＡＪ（２０１４）．Ｉｓｌｅｔ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  １  ｄｉａｂｅｔｅｓ：ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｔａｂ  Ｓｙｎｄｒ  Ｏｂｅｓ  ７：２１１−２２３．
４７．Ｗａｎｇ，Ｘ，Ｍｅｌｏｃｈｅ，Ｍ，Ｖｅｒｃｈｅｒｅ，ＣＢ，Ｏｕ，Ｄ，Ｍｕｉ，Ａ，ａｎｄ  Ｗａｒｎｏｃｋ，ＧＬ（２０１１）．Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｉｓｌｅｔ  ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ  ｂｙ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２０１１：５９４８５１．
４８．Ｓａｋａｔａ，Ｎ，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｙ，Ｃｈｅｎ，Ｙ，Ｓｈｉｍｏｄａ，Ｍ，Ｙｏｓｈｉｍａｔｓｕ，Ｇ，Ｕｎｎｏ，Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）．Ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｆａｍｉｌｙ  Ａ，ｍｅｍｂｅｒ  ３（ＰＨＬＤＡ３）  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｉｓｌｅｔｓ  ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｐｏｘｉｃ  ｄａｍａｇｅ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  １２：ｅ０１８７９２７．
４９．Ｍａｌｌｏｌ，Ｃ，Ｃａｓａｎａ，Ｅ，Ｊｉｍｅｎｅｚ，Ｖ，Ｃａｓｅｌｌａｓ，Ａ，Ｈａｕｒｉｇｏｔ，Ｖ，Ｊａｍｂｒｉｎａ，Ｃ，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）．ＡＡＶ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｇｆｌ  ｃｏｕｎｔｅｒａｃｔｓ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｏ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｍｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ６：６６４−６８０．
５０．Ｃｏｌｌｏｍｂａｔ，Ｐ，Ｘｕ，Ｘ，Ｒａｖａｓｓａｒｄ，Ｐ，Ｓｏｓａ−Ｐｉｎｅｄａ，Ｂ，Ｄｕｓｓａｕｄ，Ｓ，Ｂｉｌｌｅｓｔｒｕｐ，Ｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｔｈｅ  ｅｃｔｏｐｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｘ４  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ  ｃｏｎｖｅｒｔｓ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙ  ｂｅｔａ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  １３８：４４９−４６２．
５１．Ｃｏｕｒｔｎｅｙ，Ｍ，Ｇｊｅｒｎｅｓ，Ｅ，Ｄｒｕｅｌｌｅ，Ｎ，Ｒａｖａｕｄ，Ｃ，Ｖｉｅｉｒａ，Ａ，Ｂｅｎ−Ｏｔｈｍａｎ，Ｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ｔｈｅ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｒｘ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｌｐｈａ−ｃｅｌｌｓ  ｔｒｉｇｇｅｒｓ  ｔｈｅｉｒ  ｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｂｅｔａ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ．ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ  ９：ｅ１００３９３４．
５２．Ｌｉｍａ，ＭＪ，Ｍｕｉｒ，ＫＲ，Ｄｏｃｈｅｒｔｙ，ＨＭ，ＭｃＧｏｗａｎ，ＮＷ，Ｆｏｒｂｅｓ，Ｓ，Ｈｅｒｅｍａｎｓ，Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｂｅｔａ−Ｌｉｋｅ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｘｏｃｒｉｎｅ  Ｐａｎｃｒｅａｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  １１：ｅ０１５６２０４．
５３．Ｗａｎｇ，Ｙ，Ｄｏｒｒｅｌｌ，Ｃ，Ｎａｕｇｌｅｒ，ＷＥ，Ｈｅｓｋｅｔｔ，Ｍ，Ｓｐｅｌｌｍａｎ，Ｐ，Ｌｉ，Ｂ，ｅｔ  ａｌ．（２０１８）．Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ  Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ  ｂｙ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｄｕｃｔｓ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２６：１３２７−１３４２．
５４．Ｘｉａｏ，Ｘ，Ｇｕｏ，Ｐ，Ｓｈｉｏｔａ，Ｃ，Ｚｈａｎｇ，Ｔ，Ｃｏｕｄｒｉｅｔ，ＧＭ，Ｆｉｓｃｈｂａｃｈ，Ｓ，ｅｔ  ａｌ．（２０１８）．Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  Ａｌｐｈａ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  Ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌｓ，Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｖｉｒａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｖｅｒｓｅｓ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２２：７８−９０  ｅ７４．
５５．Ｚｈａｎｇ，Ｙ，Ｆａｖａ，ＧＥ，Ｗａｎｇ，Ｈ，Ｍａｕｖａｉｓ−Ｊａｒｖｉｓ，Ｆ，Ｆｏｎｓｅｃａ，ＶＡ，ａｎｄ  Ｗｕ，Ｈ（２０１６）．ＰＡＸ４  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｌｐｈａ−ｔｏ−ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｆｅｒｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｂｅｎｅｆｉｔｓ  ｆｏｒ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２４：２５１−２６０．
５６．Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｈｙ，Ｈ，Ｇｕ，Ｘ，Ｅｎｇｅ，Ｍ，Ｄａｉ，Ｘ，Ｗａｎｇ，Ｙ，Ｄａｍｏｎｄ，Ｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）．Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  Ａｄｕｌｔ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｉｓｌｅｔ  ａｌｐｈａ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｂｅｔａ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｂｏｔｈ  Ｄｎｍｔｌ  ａｎｄ  Ａｒｘ．Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ  ２５：６２２−６３４．
５７．Ｍａｔｓｕｏｋａ，ＴＡ，Ｋａｗａｓｈｉｍａ，Ｓ，Ｍｉｙａｔｓｕｋａ，Ｔ，Ｓａｓａｋｉ，Ｓ，Ｓｈｉｍｏ，Ｎ，Ｋａｔａｋａｍｉ，Ｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）．Ｍａｆａ  Ｅｎａｂｌｅｓ  Ｐｄｘｌ  ｔｏ  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ  Ｃｏｎｖｅｒｔ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｉｓｌｅｔ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ  Ｉｓｌｅｔ  ａｌｐｈａ−Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎｔｏ  ｂｅｔａ−Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６６：１２９３−１３００．
５８．Ｆｕｒｕｙａｍａ，Ｋ，Ｃｈｅｒａ，Ｓ，ｖａｎ  Ｇｕｒｐ，Ｌ，Ｏｒｏｐｅｚａ，Ｄ，Ｇｈｉｌａ，Ｌ，Ｄａｍｏｎｄ，Ｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１９）．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｒｅｌｉｅｆ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ｇｌｕｃｏｓｅ−ｓｅｎｓｉｎｇ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ａｌｐｈａ−ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ．
５９．Ｖｉｅｉｒａ，Ａ，Ｃｏｕｒｔｎｅｙ，Ｍ，Ｄｒｕｅｌｌｅ，Ｎ，Ａｖｏｌｉｏ，Ｆ，Ｎａｐｏｌｉｔａｎｏ，Ｔ，Ｈａｄｚｉｃ，Ｂ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）．  ｂｅｔａ−Ｃｅｌｌ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｓ  ａ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｙｐｅ  １  ｄｉａｂｅｔｅｓ：ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｃｅｌｌ  ｓｏｕｒｃｅｓ  ａｎｄ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｘｅｓ  ｏｆ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｏｂｅｓ  Ｍｅｔａｂ  １８  Ｓｕｐｐｌ  １：１３７−１４３．
６０．Ｚｈａｏ，Ｃ，Ｑｉａｏ，Ｃ，Ｔａｎｇ，ＲＨ，Ｊｉａｎｇ，Ｊ，Ｌｉ，Ｊ，Ｍａｒｔｉｎ，ＣＢ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．Ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｂｙ  Ｆｏｒｃｅｄ  Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｂｅｔａ−ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｄｂ／ｄｂ  Ｍｉｃｅ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２３：８６６−８７４．
６１．Ｆｌｏｒｅｓ，ＲＲ，Ｚｈｏｕ，Ｌ，ａｎｄ  Ｒｏｂｂｉｎｓ，ＰＤ（２０１４）．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−２  ｉｎ  ｂｅｔａ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ＡＡＶ８  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  ｐｒｅ−ｄｉａｂｅｔｉｃ  ＮＯＤ  ｍｉｃｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＦｏｘＰ３−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２１：７１５−７２２．
６２．Ｗａｎｇ，Ｚ，Ｚｈｕ，Ｔ，Ｒｅｈｍａｎ，ＫＫ，Ｂｅｒｔｅｒａ，Ｓ，Ｚｈａｎｇ，Ｊ，Ｃｈｅｎ，Ｃ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）．Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ  ａｎｄ  ｓｔａｂｌｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｂｙ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｖｉａ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｒｏｕｔｅｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５５：８７５−８８４．
６３．Ｍａｒｔｉｎｉ，ＳＶ，Ｓｉｌｖａ，ＡＬ，Ｆｅｒｒｅｉｒａ，Ｄ，Ｒａｂｅｌｏ，Ｒ，Ｏｒｎｅｌｌａｓ，ＦＭ，Ｇｏｍｅｓ，Ｋ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）．Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＡＡＶ９  Ｃａｐｓｉｄ  Ｉｍｐｒｏｖｅｓ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｌｕｎｇ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３９：５４４−５５３．
６４．Ｍｏｗａｔ，ＦＭ，Ｇｏｒｎｉｋ，ＫＲ，Ｄｉｎｃｕｌｅｓｃｕ，Ａ，Ｂｏｙｅ，ＳＬ，Ｈａｕｓｗｉｒｔｈ，ＷＷ，Ｐｅｔｅｒｓｅｎ−Ｊｏｎｅｓ，ＳＭ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｃａｐｓｉｄ−ｍｕｔａｎｔ  ＡＡＶ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃａｎｉｎｅ  ｒｅｔｉｎａ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌ  ｏｒ  ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２１：９６−１０５．
６５．Ｚｈｏｎｇ，Ｌ，Ｌｉ，Ｂ，Ｍａｈ，ＣＳ，Ｇｏｖｉｎｄａｓａｍｙ，Ｌ，Ａｇｂａｎｄｊｅ−ＭｃＫｅｎｎａ，Ｍ，Ｃｏｏｐｅｒ，Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）．Ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ２  ｖｅｃｔｏｒｓ：ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅｓ  ｌｅａｄ  ｔｏ  ｈｉｇｈ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ａｔ  ｌｏｗｅｒ  ｄｏｓｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０５：７８２７−７８３２．
６６．Ｓｏｎｇ，Ｌ，Ｋａｕｓｓ，ＭＡ，Ｋｏｐｉｎ，Ｅ，Ｃｈａｎｄｒａ，Ｍ，Ｕｌ−Ｈａｓａｎ，Ｔ，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｅ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｃａｐｓｉｄ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＡＡＶ６  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ａ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  １５：９８６−９９８．
６７．Ｓｏｎｇ，Ｌ，Ｌｉ，Ｘ，Ｊａｙａｎｄｈａｒａｎ，ＧＲ，Ｗａｎｇ，Ｙ，Ａｓｌａｎｉｄｉ，ＧＶ，Ｌｉｎｇ，Ｃ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ｈｉｇｈ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｌｉｎｅａｇｅ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ＡＡＶ６  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｍｏｄｅｌ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８：ｅ５８７５７．
６８．Ｃｈｅｎ，Ｍ，Ｍａｅｎｇ，Ｋ，Ｎａｗａｂ，Ａ，Ｆｒａｎｃｏｉｓ，ＲＡ，Ｂｒａｙ，ＪＫ，Ｒｅｉｎｈａｒｄ，ＭＫ，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｐａｎｃｒｅａｓ  ａｎｄ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｔｕｍｏｒｓ  ｂｙ  Ｃａｐｓｉｄ−Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ＡＡＶ８  Ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８：４９−５９．
６９．Ｃｒａｉｇ，ＡＴ，Ｇａｖｒｉｌｏｖａ，Ｏ，Ｄｗｙｅｒ，ＮＫ，Ｊｏｕ，Ｗ，Ｐａｃｋ，Ｓ，Ｌｉｕ，Ｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｔ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｖｉｒｏｌ  Ｊ  ６：６１．
７０．Ｆｌｏｔｔｅ，Ｔ，Ａｇａｒｗａｌ，Ａ，Ｗａｎｇ，Ｊ，Ｓｏｎｇ，Ｓ，Ｆｅｎｊｖｅｓ，ＥＳ，Ｉｎｖｅｒａｒｄｉ，Ｌ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５０：５１５−５２０．
７１．Ｋａｐｔｕｒｃｚａｋ，ＭＨ，Ｆｌｏｔｔｅ，Ｔ，ａｎｄ  Ａｔｋｉｎｓｏｎ，ＭＡ（２００１）．Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）  ａｓ  ａ  ｖｅｈｉｃｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ：ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｖｉｒａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｏ  ｐｒｏｌｏｎｇ  ｇｒａｆｔ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  １  ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｃｕｒｒ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １：２４５−２５８．
７２．Ｓｏｎｇ，Ｚ，Ｇａｌｉｖｏ，ＦＨ，Ａｄａｃｈｉ，Ｋ，Ｇｒｏｍｐｅ，Ｍ，Ｎａｋａｉ，Ｈ（２０１７）．Ｓｔｒｏｎｇ  Ａｌｐｈａ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＡＶ  Ｓｔｒａｉｎｓ  Ｔｈａｔ  Ｂｅｓｔ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｉｓｌｅｔｓ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２５：４７．
７３．Ａｄａｃｈｉ，Ｋ，Ｅｎｏｋｉ，Ｔ，Ｋａｗａｎｏ，Ｙ，Ｖｅｒａｚ，Ｍ，ａｎｄ  Ｎａｋａｉ，Ｈ（２０１４）．Ｄｒａｗｉｎｇ  ａ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍａｐ  ｏｆ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｃａｐｓｉｄ  ｂｙ  ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ５：３０７５．
７４．Ｈｕａｎｇ，Ｗ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，ＷＡ，Ｂｏｄｅｎ，Ｍ，ａｎｄ  Ｇｉｌｌａｍ，ＥＭ（２０１６）．ＲｅＸ：Ａ  ｓｕｉｔｅ  ｏｆ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｓｉｇｎ，ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６０：９１−９４．
７５．Ｎａｉｒ，ＧＧ，Ｌｉｕ，ＪＳ，Ｒｕｓｓ，ＨＡ，Ｔｒａｎ，Ｓ，Ｓａｘｔｏｎ，ＭＳ，Ｃｈｅｎ，Ｒ，ｅｔ  ａｌ．（２０１９）．Ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｉｎｇ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｃｅｌｌ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｂｅｔａ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２１：２６３−２７４．
７６．Ｌｅｒｃｈ，ＴＦ，ａｎｄ  Ｃｈａｐｍａｎ，ＭＳ（２０１２）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｐａｒｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｏｎ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ３Ｂ（ＡＡＶ−３Ｂ）．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４２３：６−１３．
７７．Ｍａｙｓ，ＬＥ，Ｗａｎｇ，Ｌ，Ｔｅｎｎｅｙ，Ｒ，Ｂｅｌｌ，Ｐ，Ｎａｍ，ＨＪ，Ｌｉｎ，Ｊ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ｍａｐｐｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｃａｐｓｉｄ  ｆｒｏｍ  ｉｓｏｌａｔｅ  ｒｈｅｓｕｓ  ３２．３３．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８７：９４７３−９４８５．
７８．Ｇａｏ，Ｇ，Ａｌｖｉｒａ，ＭＲ，Ｓｏｍａｎａｔｈａｎ，Ｓ，Ｌｕ，Ｙ，Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ，ＬＨ，Ｒｕｘ，ＪＪ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）．Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｕｎｄｅｒｇｏ  ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｎａｔｕｒａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １００：６０８１−６０８６．
７９．Ｗｕ，Ｊ，Ｚｈａｏ，Ｗ，Ｚｈｏｎｇ，Ｌ，Ｈａｎ，Ｚ，Ｌｉ，Ｂ，Ｍａ，Ｗ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）．Ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ：ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｒｅｐ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ｐｕｒｉｔｙ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １８：１７１−１８２．
８０．Ｇｒａｙ，ＳＪ，Ｃｈｏｉ，ＶＷ，Ａｓｏｋａｎ，Ａ，Ｈａｂｅｒｍａｎ，ＲＡ，ＭｃＣｏｗｎ，ＴＪ，ａｎｄ  Ｓａｍｕｌｓｋｉ，ＲＪ（２０１１）．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｃｈａｐｔｅｒ  ４：Ｕｎｉｔ  ４  １７．
８１．Ｑｕｉｒｉｎ，ＫＡ，Ｋｗｏｎ，ＪＪ，Ａｌｉｏｕｆｉ，Ａ，Ｆａｃｔｏｒａ，Ｔ，Ｔｅｍｍ，ＣＪ，Ｊａｃｏｂｓｅｎ，Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（２０１８）．Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ＡＡＶ  Ｒｅｔｒｏｇｒａｄｅ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｄｕｃｔａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｎ  Ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｉｃｅ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｌｉｎ  Ｄｅｖ  ８：８−２０．
８２．Ｊｉｍｅｎｅｚ，Ｖ，Ａｙｕｓｏ，Ｅ，Ｍａｌｌｏｌ，Ｃ，Ａｇｕｄｏ，Ｊ，Ｃａｓｅｌｌａｓ，Ａ，Ｏｂａｃｈ，Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｂｅｔａ  ｃｅｌｌｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ  ６，８  ａｎｄ  ９．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ５４：１０７５−１０８６．
８３．Ｎｏｎｎｅｎｍａｃｈｅｒ，Ｍ，ｖａｎ  Ｂａｋｅｌ，Ｈ，Ｈａｊｊａｒ，ＲＪ，ａｎｄ  Ｗｅｂｅｒ，Ｔ（２０１５）．Ｈｉｇｈ  ｃａｐｓｉｄ−ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ  ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＡＶ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｆｏｒ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２３：６７５−６８２．
８４．Ｄｏｓｈｉ，ＢＳ，ａｎｄ  Ａｒｒｕｄａ，ＶＲ（２０１８）．Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ：ｗｈａｔ  ｄｏｅｓ  ｔｈｅ  ｆｕｔｕｒｅ  ｈｏｌｄ？  Ｔｈｅｒ  Ａｄｖ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ９：２７３−２９３．
８５．Ｇｅｏｒｇｅ，Ｌ，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）．Ｓｐｋ−８０１１：ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｐｈａｓｅ  １／２  ｄｏｓｅ  ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  ＡＡＶ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ａ．  Ｂｌｏｏｄ  １３０．
８６．Ｈｅｒｒｍａｎｎ，ＡＫ，Ｇｒｏｓｓｅ，Ｓ，Ｂｏｒｎｅｒ，Ｋ，Ｋｒａｍｅｒ，Ｃ，Ｗｉｅｄｔｋｅ，Ｅ，Ｇｕｎｋｅｌ，Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（２０１８）．Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＡＰ）  ｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）  ｃａｐｓｉｄｓ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．
８７．Ｓｏｎｎｔａｇ，Ｆ，Ｋｏｔｈｅｒ，Ｋ，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｋ，Ｗｅｇｈｏｆｅｒ，Ｍ，Ｒａｕｐｐ，Ｃ，Ｎｉｅｔｏ，Ｋ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｔｈｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｃａｐｓｉｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８５：１２６８６−１２６９７．
８８．Ｓｏｎｎｔａｇ，Ｆ，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｋ，ａｎｄ  Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ，ＪＡ（２０１０）．Ａ  ｖｉｒａｌ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｆａｃｔｏｒ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ＡＡＶ２  ｃａｐｓｉｄ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｏｌｕｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０７：１０２２０−１０２２５．
８９．Ｇｒｏｓｓｅ，Ｓ，Ｐｅｎａｕｄ−Ｂｕｄｌｏｏ，Ｍ，Ｈｅｒｒｍａｎｎ，ＡＫ，Ｂｏｒｎｅｒ，Ｋ，Ｆａｋｈｉｒｉ，Ｊ，Ｌａｋｅｔａ，Ｖ，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）．Ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｏｆ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ−Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒ  Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃａｐｓｉｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ａｎｄ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ９１．
９０．Ｈｅｒｒｍａｎｎ，ＡＫ，Ｂｅｎｄｅｒ，Ｃ，Ｋｉｅｎｌｅ，Ｅ，Ｇｒｏｓｓｅ，Ｓ，Ｅｌ  Ａｎｄａｒｉ，Ｊ，Ｂｏｔｔａ，Ｊ，ｅｔ  ａｌ．（２０１８）．Ａ  ｒｏｂｕｓｔ  ａｎｄ  ａｌｌ−ｉｎｃｌｕｓｉｖｅ  ｐｉｐｅｌｉｎｅ  ｆｏｒ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｏｆ  Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ（ＡＡＶ）．ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ  Ｂｉｏｌ．
９１．Ｋｉｅｎｌｅ，Ｅ，Ｓｅｎｉｓ，Ｅ，Ｂｏｒｎｅｒ，Ｋ，Ｎｉｏｐｅｋ，Ｄ，Ｗｉｅｄｔｋｅ，Ｅ，Ｇｒｏｓｓｅ，Ｓ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｖｉａ  ＤＮＡ  ｆａｍｉｌｙ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ．Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ．
９２．Ｓｔａｍａｔａｋｉｓ，Ａ（２０１５）．Ｕｓｉｎｇ  ＲＡｘＭＬ  ｔｏ  Ｉｎｆｅｒ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｉｅｓ．Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ５１：６  １４  １１−１４．
９３．Ｓｔａｍａｔａｋｉｓ，Ａ，Ｌｕｄｗｉｇ，Ｔ，ａｎｄ  Ｍｅｉｅｒ，Ｈ（２００５）．ＲＡｘＭＬ−ＩＩＩ：ａ  ｆａｓｔ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ｍａｘｉｍｕｍ  ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ−ｂａｓｅｄ  ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｒｅｅｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２１：４５６−４６３．
９４．Ｘｉｅ，Ｑ，Ｌｅｒｃｈ，ＴＦ，Ｍｅｙｅｒ，ＮＬ，ａｎｄ  Ｃｈａｐｍａｎ，ＭＳ（２０１１）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｎ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ６（ＡＡＶ−６）．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４２０：１０−１９．
９５．Ｃｈａｒｖｉｌｌｅ，ＧＷ，Ｃｈｅｕｎｇ，ＴＨ，Ｙｏｏ，Ｂ，Ｓａｎｔｏｓ，ＰＪ，Ｌｅｅ，ＧＫ，Ｓｈｒａｇｅｒ，ＪＢ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．Ｅｘ  Ｖｉｖｏ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｓｅｌｆ−Ｒｅｎｅｗａｌ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ５：６２１−６３２．
９６．Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｉ，Ｄ，ａｎｄ  Ｍａｉｌａｎｄｅｒ，ＰＣ（２００８）．Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ａｒｔｉｆａｃｔｓ  ｂｙ  ｌｉｎｅａｒ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｔｅｃｈ  １９：１８４−１８８．
９７．Ｏｄｅｌｂｅｒｇ，ＳＪ，Ｗｅｉｓｓ，ＲＢ，Ｈａｔａ，Ａ，ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ，Ｒ（１９９５）．Ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ｄｕｒｉｎｇ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｙ  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２３：２０４９−２０５７．
９８．Ｐａａｂｏ，Ｓ，Ｉｒｗｉｎ，ＤＭ，ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ，ＡＣ（１９９０）．ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｊｕｍｐｉｎｇ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｅｍｐｌａｔｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６５：４７１８−４７２１．
９９．Ｄｏｒｒｅｌｌ，Ｃ，Ａｂｒａｈａｍ，ＳＬ，Ｌａｎｘｏｎ−Ｃｏｏｋｓｏｎ，ＫＭ，Ｃａｎａｄａｙ，ＰＳ，Ｓｔｒｅｅｔｅｒ，ＰＲ，ａｎｄ  Ｇｒｏｍｐｅ，Ｍ（２００８）．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｊｏｒ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｃｕｌｔｕｒｅ−ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｍａｒｋｅｒｓ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  １：１８３−１９４．
１００．Ｒｕｓｓ，ＨＡ，Ｐａｒｅｎｔ，ＡＶ，Ｒｉｎｇｌｅｒ，ＪＪ，Ｈｅｎｎｉｎｇｓ，ＴＧ，Ｎａｉｒ，ＧＧ，Ｓｈｖｅｙｇｅｒｔ，Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｂｅｔａ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．ＥＭＢＯ  Ｊ  ３４：１７５９−１７７２．
１０１．Ｍｅｌｉａｎｉ，Ａ，Ｌｅｂｏｒｇｎｅ，Ｃ，Ｔｒｉｆｆａｕｌｔ，Ｓ，Ｊｅａｎｓｏｎ−Ｌｅｈ，Ｌ，Ｖｅｒｏｎ，Ｐ，ａｎｄ  Ｍｉｎｇｏｚｚｉ，Ｆ（２０１５）．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｉｔｅｒ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６：４５−５３．
【０３６９】
上述の実施例は、本発明の組成物、システム、および方法の実施形態を製造および使用する方法の完全な開示および説明を当業者に提供し、本発明者が本発明とみなすものの範囲を制限することを意図するものではない。当業者に明らかである本発明を実施するための上記様式の修正は、以下の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。本明細書で言及される全ての特許および刊行物は、本発明に関連する技術分野の当業者のレベルを示す。本開示で引用される全ての参考文献は、各参考文献が参照によりその全体が個別に組み込まれたかのように、参照により組み込まれる。
【０３７０】
全ての見出しおよび項目の名称は、明確性および参照目的のためにのみ使用され、決して限定するとみなすものではない。例えば、当業者は、本明細書に記載される発明の趣旨および範囲に従って、異なる見出しおよび項目から様々な態様を適宜組み合わせることの有用性を理解するであろう。
【０３７１】
本明細書中で引用される全ての参考文献は、各個々の刊行物または特許もしくは特許出願が、その全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれることを具体的かつ個別に示しているかのように、その全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。
【０３７２】
当業者に明らかであるように、本出願の多くの修正および変形をその真意および範囲から逸脱せずに行うことができる。本明細書に記載される具体的な実施形態および実施例は、例としてのみ提示され、本出願は、特許請求の範囲によって適格性が付与される十分な範囲の等価物と共に、添付の特許請求の範囲の用語によってのみ限定されることとなる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５Ａ−１】
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【図６５Ａ−２】
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【図６５Ｂ】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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