(57)【要約】  ＡＤＨタンパク質変異体およびその使用が提供される。野生型ＡＤＨタンパク質と比較して、該変異体は、（ｉ）インビトロ無細胞合成系において外来タンパク質の発現純度、効率および収率を強化し、ならびに／または（ｉｉ）Ｎｉ媒体への変異タンパク質の結合能力を低下させることができる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）変異タンパク質であって、前記変異タンパク質が非天然タンパク質であり、前記変異タンパク質が野生型アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）のアミノ酸４５〜１４９のうちに少なくとも１つのヒスチジン（Ｈ）の変異を有する、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）変異タンパク質。
【請求項２】
前記変異が、前記野生型アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）の６７、６９、９３および／または９４位のヒスチジン（Ｈ）を含まない、請求項１に記載の変異タンパク質。
【請求項３】
前記ヒスチジンが、塩基性アミノ酸へ独立に変異されることができる、請求項１または請求項２に記載の変異タンパク質。
【請求項４】
前記ヒスチジンが、以下の群：リジン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）およびこれらの組み合わせから選択される１またはそれより多くのアミノ酸へ独立に変異されることができる、請求項１または請求項２に記載の変異タンパク質。
【請求項５】
前記変異タンパク質が、酵母由来のアルコールデヒドロゲナーゼに基づく改造によって得られ、前記酵母が、好ましくはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、より好ましくはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異タンパク質。
【請求項６】
前記アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）変異タンパク質のアミノ酸配列が、以下の群：
（ａ）そのアミノ酸配列が配列番号：２〜１３の任意の１つであるポリペプチド；
（ｂ）配列番号：２〜１３に示されているアミノ酸配列を有するポリペプチドの１つに由来し、アルコールデヒドロゲナーゼ活性と前記変異タンパクのＮｉ媒体への低下させた結合能力とを有するポリペプチド；前記ポリペプチドは、配列番号：２〜１３に示されているアミノ酸配列の任意の１つ中の１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加によって形成され、置換、欠失または付加に供されるアミノ酸残基の数は、好ましくは１〜２０、より好ましくは１〜１５、より好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜８、より好ましくは１〜３、最も好ましくは１である；
（ｃ）配列番号：２〜１３に示されている配列の任意の１つと少なくとも７０％の配列相同性、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％の配列相同性、より好ましくは少なくとも９５％％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列相同性を有するポリペプチド；前記ポリペプチドは、アルコールデヒドロゲナーゼ活性と前記変異タンパク質のＮｉ媒体への低下させた結合能力とを有する；
（ｄ）配列番号：１、２６、２７または２８に示されている配列と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも８５％または９０％の相同性、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％または９９％の相同性を有するポリペプチド；前記ポリペプチドは、アルコールデヒドロゲナーゼ活性と前記変異タンパク質のＮｉ媒体への低下させた結合能力とを有する；
から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の変異タンパク質。
【請求項７】
ポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドが請求項１〜６のいずれか一項に記載の変異タンパク質をコードし、または請求項１〜６のいずれか一項に記載の変異タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的である、ポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項７に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項９】
宿主細胞であって、前記宿主細胞が請求項８に記載のベクターを含有し、または前記宿主細胞がそのゲノム中に組み込まれた請求項７に記載のポリヌクレオチドを有する、宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）変異タンパク質を製造するための方法であって、
請求項９に記載の宿主細胞が、前記アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）変異タンパク質を発現させるために、発現に適した条件下で培養される工程と；および／または
前記アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）変異タンパク質が単離される工程と
を含む方法。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）変異タンパク質を含む酵素調製物。
【請求項１２】
酵素調製物を調製するための請求項１〜６のいずれか一項に記載の変異タンパク質の使用であって、前記酵素調製物が、（ｉ）インビトロ無細胞合成系での前記外来性タンパク質の発現純度、効率および／もしくは収率を改善し、ならびに／または（ｉｉ）前記変異タンパク質のＮｉ媒体への結合能力を低下させる、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関し、より具体的には、ＡＤＨタンパク質ファミリー変異体およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の分離および精製は、標的タンパク質の一端にポリタグを融合することによって、または標的タンパク質の特異的な特徴を介して、および他の物質を分離するためのクロマトグラフィー法を使用することによって、混合物、抽出物、細胞溶解液、反応生成物などから標的タンパク質が精製される過程を表す。アフィニティークロマトグラフィーは、親和性を有する２つの分子のうちの一方が不溶性マトリックス上に固定されており、２つの分子間の親和性の特異性および可逆性に基づいて、他方の分子が分離および精製される方法を表す。アフィニティークロマトグラフィーのために使用される一般的なポリタグとしては、主に、ヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ、Ｈｉｓ）、グルタチオンＳ転移酵素（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（Ｍａｌｔｏｓｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＭＢＰ）などが挙げられる。固定化金属キレートアフィニティークロマトグラフィー（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｍｅｔａｌ−ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＩＭＡＣ）の原理は、タンパク質表面上のアミノ酸残基が金属イオンと異なる親和性を形成することができるという事実に主に基づいており、親和性は、静電的引力、共有結合および配位結合による結合という３つの種類に分類することができる。タンパク質表面がヒスチジン、システインまたはトリプトファンを含有する場合、対応するイミダゾリル基、チオール基またはインドリル基が金属イオンと配位結合を形成することができる。この方法は、便利な発現、低コスト、標的タンパク質に対する小さな影響およびその他の利点のために、一般的に使用されるタンパク質精製ツールとなった。
【０００３】
しかしながら、実際の応用過程には、この精製方法もある種の問題を有する。Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を例にとると、いくつかの非標的タンパク質もその三次元構造の表面上にいくつかの不連続なヒスチジン残基を有し、このため非標的タンパク質もある程度Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂に結合し、これにより、最終的な標的タンパク質の純度を妨げる。
【０００４】
したがって、非標的タンパク質のヒスチジン残基を改造して、ヒスチジン残基がＮｉ−ＮＴＡ樹脂などのＮｉイオンアフィニティー媒体に結合できないようにし、標的タンパク質の純度を改善する効果を達成するための方法を発明する差し迫った必要性本分野において存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の１つの目的は、非標的タンパク質のヒスチジン残基を改造して、ヒスチジン残基がＮｉ−ＮＴＡ樹脂などのＮｉイオンアフィニティー媒体に結合できないようにし、標的タンパク質の純度を増加させるための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
第一の態様によれば、本発明は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）変異タンパク質を提供する。変異タンパク質は非天然タンパク質であり、変異タンパク質は、野生型アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）のアミノ酸４５〜１４９のうち少なくとも一つのヒスチジン（Ｈ）の変異を有する。
【０００７】
別の好ましい実施形態において、変異は、野生型アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）の６７、６９、９３および／または９４位のヒスチジン（Ｈ）を含まない。
【０００８】
別の好ましい実施形態において、野生型アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）と比較して、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）変異タンパク質のＮｉ媒体への結合能力は、１０％、好ましくは２５％、より好ましくは５０％、より好ましくは８０％、最も好ましくは１００％低下される。
【０００９】
別の好ましい実施形態において、ヒスチジンは、独立に、塩基性アミノ酸へ変異させることができる。
【００１０】
別の好ましい実施形態において、ヒスチジンの独立した変異の種類は同じであることができ、または異なることができる。
【００１１】
別の好ましい実施形態において、ヒスチジンは、以下の群：リジン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）およびこれらの組み合わせから選択される１またはそれより多くのアミノ酸へ独立に変異させることができる。
【００１２】
別の好ましい実施形態において、変異タンパク質は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓに由来する。
【００１３】
別の好ましい実施形態において、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）は、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＡＤＨ３および／またはＡＤＨ４タンパク質を含む。
【００１４】
別の好ましい実施形態において、変異タンパク質は、配列番号：１に対応する野生型アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１）の１またはそれより多くのコアアミノ酸に変異を有し、１またはそれより多くのコアアミノ酸は、以下の群：
４７位のヒスチジン（Ｈ）；
５１位のヒスチジン（Ｈ）；および
１２４位のヒスチジン（Ｈ）
から選択される。
【００１５】
別の好ましい実施形態において、変異タンパク質は、配列番号：２６に対応する野生型アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２）の１またはそれより多くのコアアミノ酸に変異を有し、１またはそれより多くのコアアミノ酸は、以下の群：
４５位のヒスチジン（Ｈ）；
４９位のヒスチジン（Ｈ）；および
１２２位のヒスチジン（Ｈ）
から選択される。
【００１６】
別の好ましい実施形態において、変異タンパク質は、配列番号：２７に対応する野生型アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ３）の１またはそれより多くのコアアミノ酸に変異を有し、１またはそれより多くのコアアミノ酸は、以下の群：
７１位のヒスチジン（Ｈ）；
７５位のヒスチジン（Ｈ）；および
１４８位のヒスチジン（Ｈ）
から選択される。
【００１７】
別の好ましい実施形態において、変異タンパク質は、配列番号：２８に対応する野生型アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ４）の１またはそれより多くのコアアミノ酸に変異を有し、１またはそれより多くのコアアミノ酸は、以下の群：
７２位のヒスチジン（Ｈ）；
７６位のヒスチジン（Ｈ）；および
１４９位のヒスチジン（Ｈ）
から選択される。
【００１８】
別の好ましい実施形態において、４７位のヒスチジン（Ｈ）は、以下の群：リジン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）およびこれらの組み合わせ、好ましくはリジン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）および／またはアルギニン（Ｒ）、より好ましくはリジン（Ｋ）およびアスパラギン（Ｎ）から選択される１またはそれより多くのアミノ酸へ変異されている。
【００１９】
別の好ましい実施形態において、５１位のヒスチジン（Ｈ）は、以下の群：リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）およびこれらの組み合わせ、好ましくはリジン（Ｋ）および／またはアルギニン（Ｒ）、より好ましくはアルギニン（Ｒ）から選択される１またはそれより多くのアミノ酸へ変異されている。
【００２０】
別の好ましい実施形態において、１２４位のヒスチジン（Ｈ）は、以下の群：リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）およびこれらの組み合わせ、好ましくはリジン（Ｋ）から選択される１またはそれより多くのアミノ酸へ変異されている。
【００２１】
別の好ましい実施形態において、変異タンパク質は、配列番号：１に対応する野生型アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）の１またはそれより多くのコアアミノ酸に変異を有し、１またはそれより多くのコアアミノ酸は、以下の群：
４７位のヒスチジン（Ｈ）；および
１２４位のヒスチジン（Ｈ）
から選択される。
【００２２】
別の好ましい実施形態において、４５位のヒスチジン（Ｈ）は、以下の群：リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）およびこれらの組み合わせから選択される１またはそれより多くのアミノ酸へ変異されている。
【００２３】
別の好ましい実施形態において、４９位のヒスチジン（Ｈ）は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）およびこれらの組み合わせからなる群から選択される１またはそれより多くのアミノ酸へ変異されている。
【００２４】
別の好ましい実施形態において、１２２位のヒスチジン（Ｈ）は、以下の群：リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）およびこれらの組み合わせから選択される１またはそれより多くのアミノ酸へ変異されている。
【００２５】
別の好ましい実施形態において、変異タンパク質は、配列番号：２６に対応する野生型アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）の１またはそれより多くのコアアミノ酸に変異を有し、１またはそれより多くのコアアミノ酸は、以下の群：
１２２位のヒスチジン（Ｈ）；および
４５位のヒスチジン（Ｈ）
から選択される。
【００２６】
別の好ましい実施形態において、７１位のヒスチジン（Ｈ）は、以下の群：リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）およびこれらの組み合わせから選択される１またはそれより多くのアミノ酸へ変異されている。
【００２７】
別の好ましい実施形態において、７５位のヒスチジン（Ｈ）は、以下の群：リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）およびこれらの組み合わせから選択される１またはそれより多くのアミノ酸へ変異されている。
【００２８】
別の好ましい実施形態において、１４８位のヒスチジン（Ｈ）は、以下の群：リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）およびこれらの組み合わせから選択される１またはそれより多くのアミノ酸へ変異されている。
【００２９】
別の好ましい実施形態において、変異タンパク質は、配列番号：２７に対応する野生型アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）の１またはそれより多くのコアアミノ酸に変異を有し、１またはそれより多くのコアアミノ酸は、以下の群：
１４８位のヒスチジン（Ｈ）；および
７１位のヒスチジン（Ｈ）
から選択される。
【００３０】
別の好ましい実施形態において、７２位のヒスチジン（Ｈ）は、以下の群：リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）およびこれらの組み合わせから選択される１またはそれより多くのアミノ酸へ変異されている。
【００３１】
別の好ましい実施形態において、７６位のヒスチジン（Ｈ）は、以下の群：リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）およびこれらの組み合わせから選択される１またはそれより多くのアミノ酸へ変異されている。
【００３２】
別の好ましい実施形態において、１４９位のヒスチジン（Ｈ）は、以下の群：リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）およびこれらの組み合わせから選択される１またはそれより多くのアミノ酸へ変異されている。
【００３３】
別の好ましい実施形態において、変異タンパク質は、配列番号：２８に対応する野生型アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）の１またはそれより多くのコアアミノ酸に変異を有し、１またはそれより多くのコアアミノ酸は、以下の群：
１４９位のヒスチジン（Ｈ）；および
７２位のヒスチジン（Ｈ）
から選択される。
【００３４】
別の好ましい実施形態において、変異は、以下の群：Ｈ４７Ｋ；Ｈ４７Ｎ；Ｈ４７Ｑ；Ｈ４７Ｒ；Ｈ５１Ｋ；Ｈ５１Ｒ；Ｈ１２４Ｋ；Ｈ１２４Ｒ；Ｈ４７ＫおよびＨ１２４Ｋ；Ｈ４７ＮおよびＨ１２４Ｋ；Ｈ４７ＱおよびＨ１２４Ｋ；Ｈ４７ＲおよびＨ１２４Ｋから選択される。
【００３５】
別の好ましい実施形態において、変異は、以下の群：Ｈ４７Ｋ；Ｈ４７Ｎ；Ｈ５１Ｒ；Ｈ１２４Ｒ；Ｈ４７ＫおよびＨ１２４Ｋ；Ｈ４７ＮおよびＨ１２４Ｋから選択される。
【００３６】
別の好ましい実施形態において、変異は、以下の群：Ｈ１２２Ｋ；Ｈ１２２Ｒ；Ｈ４５Ｋ；Ｈ４５Ｒ；Ｈ４５Ｎ；Ｈ４５Ｑ；Ｈ４９Ｋ；Ｈ４９Ｒ；Ｈ１２２ＫおよびＨ４５Ｋ；Ｈ１２２ＫおよびＨ４５Ｒ；Ｈ１２２ＫおよびＨ４５Ｎ；Ｈ１２２ＫおよびＨ４５Ｑから選択される。
【００３７】
別の好ましい実施形態において、変異は、以下の群：Ｈ１４８Ｋ；Ｈ１４８Ｒ；Ｈ７１Ｋ；Ｈ７１Ｒ；Ｈ７１Ｎ；Ｈ７１Ｑ；Ｈ７５Ｋ；Ｈ７５Ｒ；Ｈ１４８ＫおよびＨ７１Ｋ；Ｈ１４８ＫおよびＨ７１Ｒ；Ｈ１４８ＫおよびＨ７１Ｎ；Ｈ１４８ＫおよびＨ７１Ｑから選択される。
【００３８】
別の好ましい実施形態において、変異は、以下の群：Ｈ１４９Ｋ；Ｈ１４９Ｒ；Ｈ７２Ｋ；Ｈ７２Ｒ；Ｈ７２Ｎ；Ｈ７２Ｑ；Ｈ７６Ｋ；Ｈ７６Ｒ；Ｈ１４９ＫおよびＨ７２Ｋ；Ｈ１４９ＫおよびＨ７２Ｒ；Ｈ１４９ＫおよびＨ７２Ｎ；Ｈ１４９ＫおよびＨ７２Ｑから選択される。
【００３９】
別の好ましい実施形態において、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）変異タンパク質のアミノ酸配列は、以下の群から選択される。
【００４０】
（１）そのアミノ酸配列が配列番号：２〜１３のいずれか１つであるポリペプチド。
【００４１】
（２）配列番号：２〜１３に示されているアミノ酸配列のポリペプチドに由来し、（１）に記載されているポリペプチドの機能を有するポリペプチドであって、ポリペプチドが、配列番号：２〜１３のいずれか１つに示されているアミノ酸配列中の１またはいくつかの（好ましくは１〜２０、より好ましくは１〜１５、より好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜８、より好ましくは１〜３、最も好ましくは１つの）アミノ酸残基の置換、欠失または付加によって形成されている。
【００４２】
別の好ましい実施形態において、変異タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号：２〜１３のいずれか１つである。
【００４３】
別の好ましい実施形態において、変異タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号：２〜１３と少なくとも７０％の（好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の）配列同一性を有する。
【００４４】
別の好ましい実施形態において、変異（例えば、４７、５１および／または１２４位）を除き、変異タンパク質の残りのアミノ酸配列は、配列番号：１に示されている配列と同一または実質的に同一である。
【００４５】
別の好ましい実施形態において、変異（例えば、４５、４９および／または１２２位）を除き、変異タンパク質の残りのアミノ酸配列は、配列番号：２６に示されている配列と同一または実質的に同一である。
【００４６】
別の好ましい実施形態において、変異（例えば、７１、７５および／または１４８位）を除き、変異タンパク質の残りのアミノ酸配列は、配列番号：２７に示されている配列と同一または実質的に同一である。
【００４７】
別の好ましい実施形態において、変異（例えば、７２、７６および／または１４９位）を除き、変異タンパク質の残りのアミノ酸配列は、配列番号：２８に示されている配列と同一または実質的に同一である。
【００４８】
別の好ましい実施形態において、「残りのアミノ酸配列が実質的に同一である」は、最大５０（好ましくは１〜２０、より好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜５の）アミノ酸が異なり、相違が、アミノ酸の置換、欠失または付加を含み、変異タンパク質が、なお、（ｉ）インビトロ無細胞合成系で外来性タンパク質の発現純度、効率および／もしくは収率を改善することができ；ならびに／または（ｉｉ）変異タンパク質のＮｉ媒体への結合能力を低下させることができることを表す。
【００４９】
別の好ましい実施形態において、配列番号：１、２６、２７または２８に示されている配列との相同性は、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％または９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％または９９％である。
【００５０】
第二の態様によれば、本発明は、ポリヌクレオチドを提供し、該ポリヌクレオチドは、本発明の第一の態様の変異タンパク質をコードする。
【００５１】
別の好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、以下の群：
（ａ）配列番号：２〜１３のいずれか１つに示されているポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）その配列が配列番号：１４〜２５のいずれか１つであるポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号：２〜１３のいずれか１つに示されているポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；野生型ＡＤＨ１タンパク質のヌクレオチド配列に示されている配列に対する、該ポリヌクレオチドの配列の相同性は９５％以上（好ましくは、９８％以上）である；
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）に記載されているポリヌクレオチドのいずれかに相補的なポリヌクレオチド；
から選択される。
【００５２】
別の好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、変異タンパク質のＯＲＦの側面に付属エレメントをさらに含有し、付属エレメントは、以下の群：シグナルペプチド、分泌性ペプチド、タグ配列（６Ｈｉｓなど）およびこれらの組み合わせから選択される。
【００５３】
別の好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、以下の群：ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列およびこれらの組み合わせから選択される。
【００５４】
第三の態様によれば、本発明は、ベクターを提供し、該ベクターは本発明の第二の態様のポリヌクレオチドを含有する。
【００５５】
別の好ましい実施形態において、ベクターは、１またはそれより多くのプロモーターを含み、プロモーターは、核酸配列、エンハンサー、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列、複製起点、選択的マーカー、核酸制限部位および／または相同組換え部位に機能的に連結されている。
【００５６】
別の好ましい実施形態において、ベクターには、プラスミドおよびウイルスベクターが含まれる。
【００５７】
別の好ましい実施形態において、ウイルスベクターは、以下の群：アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０、ポックスウイルスおよびこれらの組み合わせから選択される。
【００５８】
別の好ましい実施形態において、ベクターには、発現ベクター、シャトルベクターおよび組込みベクターが含まれる。
【００５９】
第四の態様によれば、本発明は宿主細胞を提供し、宿主細胞は本発明の第三の態様に係るベクターを含有し、または宿主細胞はそのゲノム中に組み込まれた本発明の第二の態様に係るポリヌクレオチドを有する。
【００６０】
別の好ましい実施形態において、宿主細胞は、酵母細胞、植物細胞または哺乳動物細胞（ヒト細胞よび非ヒト哺乳動物細胞を含む）などの真核生物細胞である。
【００６１】
別の好ましい実施形態において、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核生物細胞である。
【００６２】
別の好ましい実施形態において、酵母細胞は、以下の群：Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓおよびこれらの組み合わせから得られる１またはそれより多くの酵母から選択され、好ましくは酵母細胞はＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、より好ましくは、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓおよび／またはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓを含む。
【００６３】
別の好ましい実施形態において、宿主細胞は、以下の群：Ｅ．ｃｏｌｉ、コムギ麦芽細胞、昆虫細胞、ＳＦ９細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、酵母細胞およびこれらの組み合わせから選択される。
【００６４】
第五の態様によれば、本発明は、本発明の第一の態様のアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）変異タンパク質を製造するための方法であって、
本発明の第四の態様に係る宿主細胞が、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）変異タンパク質を発現させるために発現に適した条件下で培養される工程と；および／または
アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）変異タンパク質が単離される工程と
を含む方法を提供する。
【００６５】
第六の態様によれば、本発明は、酵素調製物を提供し、該酵素調製物は、本発明の第一の態様に係るアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）変異タンパク質を含む。
【００６６】
別の好ましい実施形態において、酵素調製物には、注射調製物および／または凍結乾燥調製物が含まれる。
【００６７】
第七の態様によれば、本発明は、本発明の第一の態様に係る変異タンパク質の使用であって、（ｉ）インビトロ無細胞合成系中での外来性タンパク質の発現純度、効率および／もしくは収率を改善することができる；および／または（ｉｉ）変異タンパク質のＮｉ媒体への結合能力を低下させることができる酵素調製物を調製するために、変異タンパク質が使用される使用を提供する。
【００６８】
別の好ましい実施形態において、Ｎｉは、以下の群：ニッケル元素、ニッケルイオン、遊離のニッケルイオン、ニッケルが結合されているクロマトグラフィー媒体、Ｎｉ＋、Ｎｉビーズ、Ｎｉ−ＮＴＡおよびこれらの組み合わせから選択される。
【００６９】
本発明の範囲内において、上記技術的特徴および本明細書の以下に具体的に記載されている技術的特徴（例えば、実施形態または実施例）は互いに組み合わせることができ、これにより、新たなまたは好ましい技術的解決策を形成することが理解されるべきである。簡潔にするために、詳細は本明細書では繰り返されない。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓゲノム中のＡＤＨ１を改造してＮｉ媒体へのその結合を除去するための設計経路を示す。
【図２】図２は、Ｋ１ＡＤＨファミリータンパク質ＡＤＨ１〜４の配列相同性比較を示す。黒い領域は、配列が高い相同性を有することを表す。
【図３】図３は、ＫｌＡＤＨ１とＳｃＡＤＨ１の間の配列相同性比較を示し、２つの間の配列相同性は８４．９％である。
【図４】図４は、２ＨＣＹをテンプレートとして用いるＫｌＡＤＨ４の相同性モデリングを示す。２ＨＣＹおよびＫｌＡＤＨ４はいずれも四量体であり、各単量体の６Ｈｉｓ集合領域は、それぞれ、枠によって表されている。
【図５】図５は、ＳｃＡＤＨ１四量体の構造図を示す。２つのサブユニットＡおよびＢは、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋結合ドメインを通じて二量体を形成し、２つのＡＢ二量体は「背中合わせ」の四量体を形成する。
【図６】図６は、ＳｃＡＤＨ１中のＨ６６周囲のアミノ酸構造の図を示す。Ｈ６６は、ＡＤＨ１の２つの立体構造において、触媒性Ｚｎ２＋をキレートすることに関与している。図ＡはＮＡＤが結合されている閉じた立体構造を示し、図ＢはＮＡＤが結合されていない開いた立体構造を示す。
【図７】図７は、ＳｃＡＤＨ１中のＨ４８周囲のアミノ酸構造の図を示す。Ｈ４８は、三元複合体の形成に関与しており、基質のプロトン移動過程に影響を与える。
【図８】図８は、ＳｃＡＤＨ１中のＨ４４周囲のアミノ酸構造の図を示す。Ｈ４４のイミダゾール環上のＮＤ１は、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨの結合に関与する可能性がある。
【図９】図９は、ｐＫＭＣａｓ９＿ＳｔＲ＿ＫｌＡＤＨ１のプラスミドプロファイルを示す。該プラススミドは、ｔＲＮＡ−Ｔｙｒプロモーター、ＳＮＲ５２ターミネーターおよびｋａｎａ選択マーカーを有する。
【図１０】図１０は、ｐＫＭＤ１−ΔＫｌＡＤＨ１のプラスミドプロファイルを示す。相同性アーム１および相同性アーム２は、それぞれ、ＫｌＡＤＨ１遺伝子のＯＲＦの約８００ｂｐ上流および下流に位置する遺伝子配列であり、プラスミドはＡｍｐ選択マーカーを有する。
【図１１】図１１は、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｋのプラスミドプロファイルを示す。相同性アーム１および相同性アーム２は、それぞれ、ＫｌＡＤＨ１遺伝子のＯＲＦの約８００ｂｐ上流および下流に位置する遺伝子配列であり、プラスミドはＡｍｐ選択マーカーを有する。
【図１２】図１２は、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｎのプラスミドプロファイルを示す。相同性アーム１および相同性アーム２は、それぞれ、ＫｌＡＤＨ１遺伝子のＯＲＦの約８００ｂｐ上流および下流に位置する遺伝子配列であり、プラスミドはＡｍｐ選択マーカーを有する。
【図１３】図１３は、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｑのプラスミドプロファイルを示す。相同性アーム１および相同性アーム２は、それぞれ、ＫｌＡＤＨ１遺伝子のＯＲＦの約８００ｂｐ上流および下流に位置する遺伝子配列であり、プラスミドはＡｍｐ選択マーカーを有する。
【図１４】図１４は、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｒのプラスミドプロファイルを示す。相同性アーム１および相同性アーム２は、それぞれ、ＫｌＡＤＨ１遺伝子のＯＲＦの約８００ｂｐ上流および下流に位置する遺伝子配列であり、プラスミドはＡｍｐ選択マーカーを有する。
【図１５】図１５は、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ５１Ｋのプラスミドプロファイルを示す。相同性アーム１および相同性アーム２は、それぞれ、ＫｌＡＤＨ１遺伝子のＯＲＦの約８００ｂｐ上流および下流に位置する遺伝子配列であり、プラスミドはＡｍｐ選択マーカーを有する。
【図１６】図１６は、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ５１Ｒのプラスミドプロファイルを示す。相同性アーム１および相同性アーム２は、それぞれ、ＫｌＡＤＨ１遺伝子のＯＲＦの約８００ｂｐ上流および下流に位置する遺伝子配列であり、プラスミドはＡｍｐ選択マーカーを有する。
【図１７】図１７は、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｋのプラスミドプロファイルを示す。相同性アーム１および相同性アーム２は、それぞれ、ＫｌＡＤＨ１遺伝子のＯＲＦの約８００ｂｐ上流および下流に位置する遺伝子配列であり、プラスミドはＡｍｐ選択マーカーを有する。
【図１８】図１８は、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｒのプラスミドプロファイルを示す。相同性アーム１および相同性アーム２は、それぞれ、ＫｌＡＤＨ１遺伝子のＯＲＦの約８００ｂｐ上流および下流に位置する遺伝子配列であり、プラスミドはＡｍｐ選択マーカーを有する。
【図１９】図１９は、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＫＨ１２４Ｋのプラスミドプロファイルを示す。相同性アーム１および相同性アーム２は、それぞれ、ＫｌＡＤＨ１遺伝子のＯＲＦの約８００ｂｐ上流および下流に位置する遺伝子配列であり、プラスミドはＡｍｐ選択マーカーを有する。
【図２０】図２０は、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＮＨ１２４Ｋのプラスミドプロファイルを示す。相同性アーム１および相同性アーム２は、それぞれ、ＫｌＡＤＨ１遺伝子のＯＲＦの約８００ｂｐ上流および下流に位置する遺伝子配列であり、プラスミドはＡｍｐ選択マーカーを有する。
【図２１】図２１は、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＱＨ１２４Ｋのプラスミドプロファイルを示す。相同性アーム１および相同性アーム２は、それぞれ、ＫｌＡＤＨ１遺伝子のＯＲＦの約８００ｂｐ上流および下流に位置する遺伝子配列であり、プラスミドはＡｍｐ選択マーカーを有する。
【図２２】図２２は、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＲＨ１２４Ｋのプラスミドプロファイルを示す。相同性アーム１および相同性アーム２は、それぞれ、ＫｌＡＤＨ１遺伝子のＯＲＦの約８００ｂｐ上流および下流に位置する遺伝子配列であり、プラスミドはＡｍｐ選択マーカーを有する。
【図２３】図２３は、Ｎｉ−ＮＴＡによる精製のポリアクリルアミドゲル分析を示す。図に示されているように、ＫｌＡＤＨ１遺伝子のノックアウトおよび異なる位置でのＨｉｓ変異は、Ｎｉ−ＮＴＡへのＫｌＡＤＨ１の親和性を著しく低下させることができる。標的バンドのサイズは約３７ＫＤであり、バンドは、左から右へ、それぞれ、マーカー、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ野生型細胞株ＷＴ、ＫｌＡＤＨ１がノックアウトされている細胞株ΔＡＤＨ１、ＫｌＡＤＨ１の単一変異を有する細胞株Ｈ４７Ｋ、Ｈ４７Ｎ、Ｈ４７Ｒ、Ｈ５１Ｋ、Ｈ１２４Ｋ、Ｈ１２４ＫＨ４７ＫおよびＨ１２４ＫＨ４７Ｎを表す。
【図２４】図２４は、野生型細胞株ＷＴ、ＫｌＡＤＨ１がノックアウトされている細胞株ΔＡＤＨ１およびＫｌＡＤＨ１の単一変異を有する細胞株Ｈ４７Ｋの無細胞転写−翻訳活性の分析を示す。図に示されているように、バンドは、それぞれ、左から右に、ΔＡＤＨ１、ＫｌＡＤＨ１  Ｈ４７Ｋ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ野生型細胞株ＷＴおよび陰性対照を表す。
【図２５】図２５は、野生型細胞株ＷＴおよびＫｌＡＤＨ１の単一変異を有する細胞株Ｈ４７Ｋ（Ｍｕｔ）の無細胞転写−翻訳によって調製された標的タンパク質の精製分析を示す。図に示されているように、バンドは、それぞれ、左から右に、ＫｌＡＤＨ１の単一変異を有する細胞株Ｈ４７Ｋ（Ｍｕｔ）およびＫ．ｌａｃｔｉｓ野生型細胞株ＷＴを表す。図Ａは、外来性標的タンパク質を添加しない、ＫｌＡＤＨ１とＮｉ−ＮＴＡ間の親和性分析を示す。図Ｂは、ＫｌＡＤＨ１の単一変異を有する細胞株Ｈ４７Ｋの無細胞転写−翻訳系に標的タンパク質Ｎ−Ｈｉｓ８−ｅＧＦＰが添加されたときの、ｅＧＦＰの精製分析を示す。図Ｃは、ＫｌＡＤＨ１の単一変異を有する細胞株Ｈ４７Ｋの無細胞転写−翻訳系に標的タンパク質Ｎ−Ｈｉｓ８−Ｓｔｒｅｐ−ｅＧＦＰが添加されたときの、Ｓｔｒｅｐ−ｅＧＦＰの精製分析を示す。
【図２６】図２６は、それぞれ、ＫｌＡＤＨ１遺伝子のノックアウトおよびＫｌＡＤＨ１遺伝子に対する部位特異的変異によって、標的タンパク質の純度および特異性を改善するための、ＫｌＡＤＨ１のＮｉ媒体への結合能の除去を要約する。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
大規模で徹底的な研究の後、本発明者らは、予想外のことに、ＡＤＨファミリータンパク質変異体を得た。野生型ＡＤＨファミリータンパク質と比べて、本発明のＡＤＨファミリータンパク質変異体は、著しく、（ｉ）インビトロ無細胞合成系での外来性タンパク質の発現純度、効率および／もしくは収率を改善することができ、ならびに／または（ｉｉ）変異タンパク質のＮｉ媒体への結合能力を低下させることができる。これを基礎にして、本発明者らは本発明を完成した。
用語
本開示の理解を容易にするために、まず、ある種の用語を定義する。本願において使用される場合、本明細書中に別段の明記がなければ、以下の用語の各々は、以下に与えられた意味を有するものとする。その他の定義は、本願全体を通じて記載されている。
【００７２】
「約」という用語は、当業者によって決定される特定の値または組成の許容され得る誤差範囲内の値または組成を表し得、誤差範囲は、一部に、値または組成物がどのように測定または決定されるかに依存するであろう。例えば、本明細書において使用される場合、「約１００」という表現は、９９〜１０１の間の全ての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）を含む。
【００７３】
本明細書において使用される場合、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という用語は、非限定的、半限定的または限定的であると理解することができる。換言すれば、これらの用語には、「実質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）」も含まれる。
【００７４】
配列同一性（または相同性）は、（参照ヌクレオチド配列またはタンパク質の長さの５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％であり得る）所定の比較ウィンドウに沿って、２つの並置された配列を比較し、同じ残基が出現する位置の数を決定することによって決定される。通常、これは、百分率として表される。ヌクレオチド配列同一性の測定は、当業者に周知の方法である。
【００７５】
本明細書において使用される場合、「被験体」および「必要とする被験体」という用語は、任意の哺乳動物または非哺乳動物を表す。哺乳動物としては、ヒト、脊椎動物（げっ歯類など）、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、キリン、シカ、ラクダ、カモシカ、野ウサギ（ｈａｒｅ）およびウサギが挙げられるが、これらに限定されない。
ＡＤＨファミリータンパク質
ヒトおよび動物の肝臓、植物および微生物の細胞中には、大量のアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）ファミリータンパク質を見出すことができる。生物中での短鎖アルコールの代謝のための鍵となる酵素として、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）ファミリータンパク質は、多くの生理的過程において重要な役割を果たす。例えば、ヒトおよび哺乳動物では、アルコールデヒドロゲナーゼおよびアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）は、体内でのアルコールの代謝に関与するアルコールデヒドロゲナーゼ系を構成する。
【００７６】
ＡＤＨファミリータンパク質には、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＡＤＨ３および／またはＡＤＨ４タンパク質が含まれる。
【００７７】
図２に示されているように、本発明は、ＡＤＨ２（配列番号：２６の４５〜１２２位）、ＡＤＨ３（配列番号：２７の７１〜１４８位）およびＡＤＨ４（配列番号：２８の７２〜１４９位）がＡＤＨ１（配列番号：１の４７〜１２４位）に対して高度に相同である（約９８．７％）こと、ならびにＡＤＨ２（Ｈ４５、Ｈ４９、Ｈ１２２）、ＡＤＨ３（Ｈ７１、Ｈ７５、Ｈ１４８）およびＡＤＨ４（Ｈ７２、Ｈ７６、Ｈ１４９）が、それぞれ、ＡＤＨ１中のＨ４７、Ｈ５１およびＨ１２４に対応すること、すなわち、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＡＤＨ３およびＡＤＨ４の変異部位間の対応する関係が以下のとおりであることを初めて見出した。
【００７８】
【表１】
2021525528.tif 000003
野生型ＡＤＨファミリータンパク質
本明細書において使用される場合、「野生型ＡＤＨファミリータンパク質」は、遺伝子工学技術（ゲノム配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）など）を通じてそのヌクレオチド配列を取得することができ、ヌクレオチド配列からそのアミノ酸配列を推定することができる、人工の改造を有さない天然に存在するＡＤＨファミリータンパク質を表す。野生型ＡＤＨファミリータンパク質の源は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ野生型細胞株である。野生型ＡＤＨファミリータンパク質には、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＡＤＨ３および／またはＡＤＨ４タンパク質が含まれる。
【００７９】
本発明の好ましい実施形態において、野生型ＡＤＨファミリータンパク質（例えば、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＡＤＨ３、ＡＤＨ４）のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号：１、２６、２７または２８に示されている。
ＡＤＨファミリータンパク質変異体およびそのコード核酸
本明細書において使用される場合、「変異タンパク質」、「本発明の変異タンパク質」、「本発明のＡＤＨ変異タンパク質」、「本発明の変異されたＡＤＨタンパク質」、「ＡＤＨ変異体」および「ＡＤＨファミリータンパク質の変異体」という用語は互換的に使用することができ、全て、天然に存在しない変異体ＡＤＨタンパク質を表し、変異タンパク質は、野生型アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）の４５〜１４９位のアミノ酸に少なくとも１つのヒスチジン（Ｈ）の変異を有する。
【００８０】
さらに、本発明において、変異は、野生型アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）の６７、６９、９３および／または９４位のヒスチジン（Ｈ）を含まない。
【００８１】
本発明において、ヒスチジンは、塩基性アミノ酸へ独立に変異させることができ、ヒスチジンの独立の変異の種類は同一であることができ、または異なることができる。
【００８２】
好ましい実施形態において、ヒスチジンは、以下の群：リジン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）およびこれらの組み合わせから選択される１またはそれより多くのアミノ酸へ変異させることができる。
【００８３】
好ましい実施形態において、本発明の変異体ＡＤＨタンパク質は、配列番号：１、２６、２７または２８に示されているタンパク質を人工的に改造することによって得られたタンパク質である。
【００８４】
ここで、変異タンパク質は、活性に関連するコアアミノ酸を含有し、コアアミノ酸の少なくとも１つは人工的に改造されており、本発明の変異タンパク質は、著しく、（ｉ）インビトロ無細胞合成系での外来性タンパク質の発現純度、効率および／もしくは収率を改善することができ、ならびに／または（ｉｉ）変異タンパク質のＮｉ媒体への結合能力を低下させることができる。
【００８５】
「コアアミノ酸」という用語は、配列番号：１、２６、２７または２８の配列を基礎とし、配列番号：１、２６、２７または２８と少なくとも８０％の（例えば、８４％、８５％、９０％、９２％、９５％、９８％の）相同性を有する配列を表し、対応する位置は本明細書に記載されている特異的なアミノ酸である。例えば、配列番号：１に示されている配列に基づいて、コアアミノ酸は、
４７位のヒスチジン（Ｈ）；および／または
５１位のヒスチジン（Ｈ）；および／または
１２４位のヒスチジン（Ｈ）
である。
【００８６】
例えば、配列番号：２６に示されている配列に基づいて、コアアミノ酸は、
４５位のヒスチジン（Ｈ）；および／または
４９位のヒスチジン（Ｈ）；および／または
１２２位のヒスチジン（Ｈ）
である。
【００８７】
例えば、配列番号：２７に示されている配列に基づいて、コアアミノ酸は、
７１位のヒスチジン（Ｈ）；および／または
７５位のヒスチジン（Ｈ）；および／または
１４８位のヒスチジン（Ｈ）
である。
【００８８】
例えば、配列番号：２８に示されている配列に基づいて、コアアミノ酸は、
７２位のヒスチジン（Ｈ）；および／または
７６位のヒスチジン（Ｈ）；および／または
１４９位のヒスチジン（Ｈ）
である。
【００８９】
上記コアアミノ酸を変異させることによって得られた変異タンパク質は、著しく、（ｉ）インビトロ無細胞合成系での外来性タンパク質の発現純度、効率および／もしくは収率を改善することができ、ならびに／または（ｉｉ）変異タンパク質のＮｉ媒体への結合能力を低下させることができるという活性を有する。
【００９０】
別の好ましい実施形態において、４７位のヒスチジン（Ｈ）は、以下の群：リジン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）およびこれらの組み合わせ、好ましくはリジン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）および／またはアルギニン（Ｒ）、より好ましくはリジン（Ｋ）および／またはアスパラギン（Ｎ）から選択される１またはそれより多くのアミノ酸へ変異されている。
【００９１】
別の好ましい実施形態において、５１位のヒスチジン（Ｈ）は、以下の群：リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）およびこれらの組み合わせ、好ましくはリジン（Ｋ）および／またはアルギニン（Ｒ）、より好ましくはアルギニン（Ｒ）から選択される１またはそれより多くのアミノ酸へ変異されている。
【００９２】
別の好ましい実施形態において、１２４位のヒスチジン（Ｈ）は、以下の群：リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）およびこれらの組み合わせ、好ましくはリジン（Ｋ）から選択される１またはそれより多くのアミノ酸へ変異されている。
【００９３】
別の好ましい実施形態において、変異タンパク質は、配列番号：１に対応する野生型アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）の１またはそれより多くのコアアミノ酸に変異を有し、１またはそれより多くのコアアミノ酸は、以下の群：
４７位のヒスチジン（Ｈ）；および
１２４位のヒスチジン（Ｈ）
から選択される。
【００９４】
別の好ましい実施形態において、４５位のヒスチジン（Ｈ）は、以下の群：リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）およびこれらの組み合わせから選択される１またはそれより多くのアミノ酸へ変異されている。
【００９５】
別の好ましい実施形態において、４９位のヒスチジン（Ｈ）は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）およびこれらの組み合わせからなる群から選択される１またはそれより多くのアミノ酸へ変異されている。
【００９６】
別の好ましい実施形態において、１２２位のヒスチジン（Ｈ）は、以下の群：リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）およびこれらの組み合わせから選択される１またはそれより多くのアミノ酸へ変異されている。
【００９７】
別の好ましい実施形態において、変異タンパク質は、配列番号：２６に対応する野生型アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）の１またはそれより多くのコアアミノ酸に変異を有し、１またはそれより多くのコアアミノ酸は、以下の群：
１２２位のヒスチジン（Ｈ）；および
４５位のヒスチジン（Ｈ）
から選択される。
【００９８】
別の好ましい実施形態において、７１位のヒスチジン（Ｈ）は、以下の群：リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）およびこれらの組み合わせから選択される１またはそれより多くのアミノ酸へ変異されている。
【００９９】
別の好ましい実施形態において、７５位のヒスチジン（Ｈ）は、以下の群：リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）およびこれらの組み合わせから選択される１またはそれより多くのアミノ酸へ変異されている。
【０１００】
別の好ましい実施形態において、１４８位のヒスチジン（Ｈ）は、以下の群：リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）およびこれらの組み合わせから選択される１またはそれより多くのアミノ酸へ変異されている。
【０１０１】
別の好ましい実施形態において、変異タンパク質は、配列番号：２７に対応する野生型アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）の１またはそれより多くのコアアミノ酸に変異を有し、１またはそれより多くのコアアミノ酸は、以下の群：
１４８位のヒスチジン（Ｈ）；および
７１位のヒスチジン（Ｈ）
から選択される。
【０１０２】
別の好ましい実施形態において、７２位のヒスチジン（Ｈ）は、以下の群：リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）およびこれらの組み合わせから選択される１またはそれより多くのアミノ酸へ変異されている。
【０１０３】
別の好ましい実施形態において、７６位のヒスチジン（Ｈ）は、以下の群：リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）およびこれらの組み合わせから選択される１またはそれより多くのアミノ酸へ変異されている。
【０１０４】
別の好ましい実施形態において、１４９位のヒスチジン（Ｈ）は、以下の群：リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）およびこれらの組み合わせから選択される１またはそれより多くのアミノ酸へ変異されている。
【０１０５】
別の好ましい実施形態において、変異タンパク質は、配列番号：２８に対応する野生型アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）の１またはそれより多くのコアアミノ酸に変異を有し、１またはそれより多くのコアアミノ酸は、以下の群：
１４９位のヒスチジン（Ｈ）；および
７２位のヒスチジン（Ｈ）
から選択される。
【０１０６】
本発明の変異されたＡＤＨタンパク質中のアミノ酸連続番号は、野生型ＡＤＨタンパク質のアミノ酸配列（好ましくは、配列番号：１、２６、２７または２８）に基づいていることが理解されるべきである。ある具体的な変異タンパク質が配列番号：１、２６、２７または２８に示されている配列と少なくとも８０％の相同性を有する場合、変異タンパク質のアミノ酸配列連続番号は、アミノ酸のＮ末端またはＣ末端方向の１〜５の転位位置など、配列番号：１、２６、２７または２８のアミノ酸連続番号と比べて転位を有する可能性がある。本分野における慣用の配列並置技術を用いると、このような転位は合理的な範疇にあり、８０％の（例えば、９０％、９５％、９８％の）相同性を有し、同一または類似の活性を有する変異タンパク質は、アミノ酸連続番号の転位の故に、本発明の変異タンパク質の範囲から除外されるべきではないことが一般に当業者によって理解されている。
【０１０７】
本発明の変異タンパク質は、合成されたタンパク質または組換えタンパク質である、すなわち、化学的に合成された生成物であり得、または組換え技術を用いて原核生物もしくは真核生物宿主（例えば、細菌、酵母、植物）から産生されることができる。組換え産生スキームにおいて使用される宿主によって、本発明の変異タンパク質はグリコシル化または非グリコシル化されることができる。本発明の変異タンパク質は、開始メチオニン残基を包含することもでき、または除外することもできる。
【０１０８】
本発明は、変異タンパク質の断片、誘導体および類縁体も含む。本明細書において使用される場合、「断片」、「誘導体」および「類縁体」という用語は、変異タンパク質と同じ生物学的機能または活性を実質的に保持するタンパク質を表す。
【０１０９】
本発明の変異タンパク質の断片、誘導体または類縁体は、（ｉ）１またはそれより多くの保存的もしくは非保存的アミノ酸残基（好ましくは、保存的アミノ酸残基）が置換されているのに対して、このような得られる置換されたアミノ酸残基は遺伝コードによってコードされてもよく、またはコードされなくてもよい変異タンパク質、（ｉｉ）１もしくはそれより多くのアミノ酸残基中に置換基を有する変異タンパク質、または（ｉｉｉ）別の化合物（ポリエチレングリコールなどの、変異タンパク質の半減期を延長する化合物など）との成熟変異タンパク質の融合によって形成された変異タンパク質、または（ｉｖ）変異タンパク質配列への追加のアミノ酸配列の融合によって形成された変異タンパク質（リーディング配列または分泌性配列またはこの変異タンパク質を精製するために使用される配列またはプロテイノゲン配列または抗原ＩｇＧ断片の、変異タンパク質との融合によって形成される融合タンパク質など）であり得る。本明細書の教示にしたがって、これらの断片、誘導体および類縁体は、当業者に周知の範疇に属する。本発明において、保存的に置換されたアミノ酸は、好ましくは、表Iにしたがうアミノ酸置換によって生成される。
【０１１０】
【表２】
2021525528.tif 000004
【０１１１】
本発明の活性な変異タンパク質は、著しく、（ｉ）インビトロ無細胞合成系での外来性タンパク質の発現純度、効率および／もしくは収率を改善し、ならびに／または（ｉｉ）変異タンパク質のＮｉ媒体への結合能力を低下させるという活性を有する。
【０１１２】
本発明において、変異タンパク質は、本発明の第一の態様において記載されているとおりである。好ましくは、変異タンパク質は、配列番号：２〜１３のいずれか１つに示されているアミノ酸配列である。
【０１１３】
本発明の変異タンパク質は、一般的には、配列番号：２〜１３のいずれか１つに示されている配列と比較されたより高い相同性（同一性）を有することが理解されるべきである。好ましくは、変異タンパク質は、配列番号：２〜１３に示されている配列のいずれかと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％〜９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の相同性を有する。
【０１１４】
さらに、本発明の変異タンパク質は修飾されることもできる。修飾（通常、一次構造を変化させない）形態には、アセチル化またはカルボキシル化などの、変異タンパク質のインビボまたはインビトロで化学的に誘導された形態が含まれる。修飾には、合成およびプロセシングにおいてまたは変異タンパク質のさらなるプロセシング工程において実施されるグリコシル化修飾などのグリコシル化も含まれる。この修飾は、グリコシル化を行う酵素（哺乳動物のグリコシラーゼまたはデグリコシラーゼなど）に変異タンパク質を曝露することによって達成することができる。修飾形態には、リン酸化されたアミノ酸残基（ホスホチロシン、ホスホセリン、ホスホスレオニンなど）を有する配列がさらに含まれる。修飾形態には、修飾されており、これにより、タンパク質分解に対する増加した耐性または改善された溶解度を得る変異タンパク質がさらに含まれる。
【０１１５】
「変異タンパク質をコードするポリヌクレオチド」という用語は、本発明の変異タンパク質をコードするポリヌクレオチドであり得、さらなるコード配列および／または非コード配列をさらに含有するポリヌクレオチドでもあり得る。
【０１１６】
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態であり得る。別の好ましい実施形態において、ヌクレオチドはＤＮＡである。ＤＮＡ形態には、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡが含まれる。ＤＮＡは、一本鎖または二本鎖であり得る。ＤＮＡは、コード鎖または非コード鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード領域配列は、配列番号：２〜１３の任意の１つに示されているポリペプチドをコードする配列と同じであり得、または縮退バリアントであり得る。本明細書において使用される場合、本発明における「縮退バリアント」は、配列番号：２〜１３の任意の１つに示されているポリペプチドをコードするが、対応するコード領域の配列が異なる核酸配列を表す。
【０１１７】
本発明は、先述のポリヌクレオチドのバリアントにも関する。バリアントは、本発明のものと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは変異タンパク質の断片、類縁体および誘導体をコードする。これらのヌクレオチドバリアントには、置換バリアント、欠失バリアントおよび挿入バリアントが含まれる。本分野において公知であるように、対立遺伝子バリアントはポリヌクレオチドの別の形態である。対立遺伝子バリアントは、１またはそれより多くのヌクレオチドの置換、欠失または挿入であり得るが、対立遺伝子バリアントによってコードされる変異タンパク質の機能を実質的に変化させない。
【０１１８】
核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはＰＮＡであり得る。核酸配列は、ゲノム、組換えまたは合成であり得る。核酸配列は、単離されまたは精製されることができる。核酸配列は、一本鎖または二本鎖であり得る。好ましくは、核酸配列は、本明細書に記載されている光感受性タンパク質をコードするであろう。核酸配列は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓに記載されているクローニング技術などのクローニング技術によって、例えば、制限酵素消化、連結およびゲル電気泳動を含む標準的な分子クローニング技術によって得ることができる。核酸配列は、例えば、ＰＣＲ技術を用いて単離することができる。単離は、任意の不純物からのならびにその起源中で当該核酸配列と付随して天然に見出されるその他の核酸配列および／またはタンパク質からの核酸配列の単離を意味する。好ましくは、核酸配列は、精製／製造過程からの細胞物質、培地またはその他の化学物質も含有しない。核酸配列は、合成であり得る、例えば、直接的化学合成によって作製することができる。核酸配列は、裸の核酸として与えることができ、またはタンパク質もしくは脂質との複合体の形態で与えることができる。
【０１１９】
本発明は、先述の配列とともにハイブリッド形成し、先述の配列と少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチドにも関する。本発明は、特に、厳しい条件（または厳密な条件）下で本発明のポリヌクレオチドとともにハイブリッド形成することができるポリヌクレオチドに関する。本発明において、「厳しい条件」は、（１）０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃など、より低いイオン強度およびより高い温度でのハイブリダイゼーションおよび溶出；または（２）５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清／０．１％  Ｆｉｃｏｌｌ、４２℃などの変性剤の存在下でのハイブリダイゼーション；または（３）２つの配列間の同一性が少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％である場合にのみハイブリダイゼーションが起こる、を表す。
【０１２０】
本発明の変異タンパク質およびポリヌクレオチドは、好ましくは、単離された形態で与えられ、より好ましくは、均一状態まで精製される。
【０１２１】
本発明の完全長ポリヌクレオチド配列は、通常、ＰＣＲ増幅法、組換え法または人工の合成法によって取得することができる。ＰＣＲ増幅法のために、本発明に開示された関連ヌクレオチド配列、特にオープンリーディングフレーム配列にしたがってプライマーを設計することができ、市販のｃＤＮＡライブラリーまたは当業者に公知の慣用の方法にしたがって調製されたｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとして用いて、関連配列を増幅することができる。配列が長い場合、ＰＣＲ増幅を２回またはそれより多く実施することがしばしば必要であり、次いで、ＰＣＲ増幅の各々から得られた増幅された断片は、正しい順序で一緒に接合される。
【０１２２】
関連配列が得られたら、組換え方法によって、関連配列を大量に得ることができる。これは、通常、ベクター中への関連配列のクローニング、細胞中への形質転換、関連配列を得るための慣用の方法による増殖された宿主細胞からのその後の単離を表す。
【０１２３】
さらに、関連配列、特に、短い断片長を有する関連配列も、人工的合成方法によって合成することができる。通常、まず多くの小さな断片を合成し、次いで、長い配列を有する断片を得るために連結を実行する。
【０１２４】
現在、本発明のタンパク質（またはその断片もしくは誘導体）をコードするＤＮＡ配列は、完全に化学合成を介して得ることができる。次いで、ＤＮＡ配列は、本分野において公知の様々な既存のＤＮＡ分子（例えば、ベクターなど）および細胞中に導入することができる。さらに、化学合成を介して本発明のタンパク質配列中に変異を導入することもできる。
【０１２５】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドを得るために、ＰＣＲ技術を用いてＤＮＡ／ＲＮＡを増幅する方法が使用される。特に、ライブラリーから完全長ｃＤＮＡを得ることが困難である場合、好ましくは、ＲＡＣＥ法（ＲＡＣＥ、Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ）を使用することができる。ＰＣＲのために使用されるプライマーは、本明細書に開示されている本発明の配列情報にしたがって適切に選択することができ、慣用の方法によって合成することができる。増幅されたＤＮＡ／ＲＮＡ断片は、ゲル電気泳動などの慣用の方法によって分離し、精製することができる。
【０１２６】
本発明において、ＡＤＨタンパク質変異体のＤＮＡコード配列は、配列番号：１４〜２５のいずれか１つに示されているヌクレオチド配列である。
発現ベクターおよび宿主細胞
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含有するベクター、本発明のベクターを用いるまたは本発明の変異タンパク質のコード配列を用いる遺伝子工学によって作製された宿主細胞にも関し、組換え技術を通じて本発明のポリペプチドを作製するための方法に関する。
【０１２７】
慣用の組換えＤＮＡ技術を通じて、本発明のポリヌクレオチド配列は、組換え変異タンパク質を発現または作製するために使用することができる。一般的に言えば、この方法は、以下の工程：
（１）本発明の変異タンパク質をコードするポリヌクレオチド（またはバリアント）でまたはポリヌクレオチドを含有する組換え発現ベクターで適切な宿主細胞を形質転換または形質導入する工程；
（２）適切な培地中で宿主細胞を培養する工程；ならびに
（３）培地または細胞からタンパク質を単離および精製する工程；
を含む。
【０１２８】
本発明において、変異タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、組換え発現ベクター中に挿入することができる。「組換え発現ベクター」という用語は、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、アデノウイルスおよびレトロウイルスなどの哺乳動物細胞ウイルスまたは本分野において周知の他のベクターを表す。宿主内で複製され、安定であることができる限り、任意のプラスミドおよびベクターを使用することができる。発現ベクターの重要な特徴は、発現ベクターが、通常、複製起点、プロモーター、マーカー遺伝子および翻訳調節エレメントを含有することである。
【０１２９】
本発明の変異タンパク質をコードするＤＮＡ配列および適切な転写／翻訳調節シグナルを含有する発現ベクターを構築するために、当業者に周知の方法を使用することができる。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡ技術、ＤＮＡ合成技術、インビボ組換え技術などが含まれる。ＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成を誘導するために、発現ベクター中に適切なプロモーターに効果的に連結されることができる。これらのプロモーターの代表例としては、Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃまたはｔｒｐプロモーター；λファージのＰＬプロモーター；ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、レトロウイルスのＬＴＲおよび原核生物もしくは真核生物細胞またはその中のウイルス中で遺伝子発現を調節することができるいくつかの他の公知のプロモーターを含む真核生物プロモーターが挙げられる。発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写終結因子も含む。
【０１３０】
さらに、発現ベクターは、好ましくは、真核生物細胞培養に対してはジヒドロ葉酸還元酵素、ネオマイシン耐性および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）など、またはＥ．ｃｏｌｉに対してはテトラサイクリン耐性もしくはアンピシリン耐性など、形質転換された宿主細胞を選択するための表現型の特徴を与えるために、１またはそれより多くの選択的マーカー遺伝子を含有する。
【０１３１】
上記適切なＤＮＡ配列および適切なプロモーターまたは調節配列を含有するベクターは、適切な宿主細胞を形質転換して、適切な宿主細胞がタンパク質を発現できるようにするために使用することができる。
【０１３２】
宿主細胞は、原核生物細胞（Ｅ．ｃｏｌｉなど）、または下等な真核生物細胞、または酵母細胞、植物細胞もしくは哺乳動物細胞（ヒト細胞および非ヒト哺乳動物細胞を含む）などの高等真核生物細胞であり得る。代表例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、コムギ麦芽細胞、昆虫細胞、ＳＦ９細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、酵母細胞などが挙げられる。本発明の好ましい実施形態において、酵母細胞（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓまたはこれらの組み合わせなど、好ましくは酵母細胞はＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓを含み、より好ましくは、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓおよび／またはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓを含む）が宿主細胞として選択される。
【０１３３】
本発明のポリヌクレオチドが高等真核生物細胞中で発現される場合、エンハンサー配列がベクター中に挿入されれば、転写は増強されるであろう。エンハンサーは、プロモーターに対して作用して遺伝子転写を増強する、通常、約１０〜３００塩基対のＤＮＡのシス作用因子である。例としては、複製起点の後期側の１００〜２７０塩基対のＳＶ４０エンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサーなどが挙げられる。
【０１３４】
当業者は、適切なベクター、プロモーター、エンハンサーおよび宿主細胞をどのようにして選択するかを知っている。
【０１３５】
組換えＤＮＡを使用することによる宿主細胞の形質転換は、当業者に周知の慣用技術を使用することによって実施することができる。宿主がＥ．ｃｏｌｉなどの原核生物である場合、ＤＮＡを吸収することができるコンピテント細胞は、対数増殖期後に採集し、ＣａＣｌ２法によって処理することができ、使用される工程は本分野において周知である。別の方法は、ＭｇＣｌ２を使用することである。必要であれば、形質転換は、電気穿孔によって実施することもできる。宿主が真核生物である場合、以下のＤＮＡ形質移入法を選択することができる：リン酸カルシウム共沈法および慣用の機械的方法、例えば、微量注入、電気穿孔、リポソームパッケージングなど。
【０１３６】
得られた形質転換体は、本発明の遺伝子によってコードされるポリペプチドを発現するための慣用の方法によって培養することができる。使用される宿主細胞によって、培養中で使用される培地は、様々な慣用の培地から選択することができる。培養は、宿主細胞の増殖に適した条件下で実施される。宿主細胞が適切な細胞密度まで増殖した後、選択されたプロモーターが、適切な方法（温度切り替えまたは化学的誘導など）によって誘導され、細胞をさらなる期間培養する。
【０１３７】
上記方法に挙げられている組換えポリペプチドは、細胞の内側でもしくは細胞膜上で発現されることができ、または細胞の外側に分泌されることができる。必要であれば、組換えタンパク質は、その物理的、化学的およびその他の特徴によって、様々な分離方法を介して分離および精製することができる。これらの方法は、当業者に周知である。これらの方法の例としては、慣用の再生処理、タンパク質沈殿剤での処理（塩析法）、遠心、細菌の浸透圧性溶解、超処理（ｕｌｔｒａ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）、超遠心分離法、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）およびその他の様々な液体クロマトグラフィー技術ならびにこれらの方法の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３８】
本発明の主な利点には、以下のものが含まれる。
【０１３９】
（１）本発明は、Ｎｉ媒体に結合する細胞中の成分の質量分析同定を介して、Ｎｉ媒体に結合することができる細胞内タンパク質の種類を決定する。
【０１４０】
（２）初めて、本発明は、細胞ゲノム中のＡＤＨファミリータンパク質を系統的に分析することによって、Ｎｉ媒体に結合し得るＡＤＨファミリータンパク質中の一連のヒスチジン部位を提供する。
【０１４１】
（３）初めて、本発明は、ＡＤＨ１の遺伝子ノックアウトおよびＮｉ媒体に結合し得るＡＤＨ１中の一連のヒスチジン部位の部位特異的変異を通じて、ＡＤＨ１のＮｉ媒体への結合能力を著しく低下させることができるいくつかの株を得る。
【０１４２】
（４）上記複数の細胞株の無細胞系転写−翻訳活性を分析することによって、ＡＤＨ１の部位特異的変異は、無細胞系転写−翻訳活性に対して遺伝子ノックアウトより小さな効果を有することが見出され、無細胞系転写−翻訳活性に影響を及ぼさず、かつＡＤＨ１のＮｉ媒体への結合能力を著しく低下させる細胞株が初めて得られる。
【０１４３】
（５）本発明は、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）を例として挙げているが、原核生物細胞、真核生物細胞、酵母細胞、ヒト源細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどを含むその他の細胞にも、同じ設計、分析および実験方法が適用され得る。
【０１４４】
（６）本発明において、ＡＤＨファミリータンパク質のコアアミノ酸の変異は、著しく、（ｉ）インビトロ無細胞合成系での外来性タンパク質の発現純度、効率および／もしくは収率を改善することができ、ならびに／または（ｉｉ）変異タンパク質のＮｉ媒体への結合能力を低下させることができることが初めて見出された。
【０１４５】
本発明は、具体的な実施例（または実施形態）とともに、以下でさらに例示される。これらの実施例（または実施形態）は、専ら例示のために与えられており、本発明の範囲に対する限定とみなされるべきでないことが理解されるべきである。以下の実施例（または実施形態）中で具体的に記載された条件がない実験方法に関しては、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ．ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されている条件などの慣用の条件に従うか、または製造業者によって推奨される条件に従うことができる。別段の記載がなければ、百分率および部は、重量百分率および重量部を表す。
【０１４６】
別段の記載がなければ、本発明の実施例において使用される試薬および材料は全て市販の生成物である。
【０１４７】
本発明は、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）を例として挙げているが、原核生物細胞、真核生物細胞、酵母細胞、ヒト源細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびその他の細胞を含むその他の細胞にも、同じ設計、分析および実験方法が適用され得る。
一般的な方法
本発明は、以下のような設計および方法を提供する：Ｎｉ精製および質量分析解析を通じて、Ｎｉ結合タンパク質が同定され、次いで、これを基礎として、ゲノム中のＡＤＨファミリータンパク質を点変異に供して、ＡＤＨファミリータンパク質のＮｉ媒体への結合能力を低下させ、これにより、Ｎｉによって精製されるタンパク質の効率、収率および純度を向上させる。以下の工程が含まれる：
（１）以下の方法によるＡＤＨファミリータンパク質の同定および分析：
Ａ．Ｎｉによって精製されたタンパク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動分析；
Ｂ．非特異的バンド（３５〜５０ｋＤａ）の質量分析解析；および
Ｃ．ＡＤＨタンパク質として同定された主要な非特異的バンドを同定するための、質量分析解析の結果のペプチド比較；
（２）以下の方法によるＮｉ媒体へのＫ．ｌａｃｔｉｓ  ＡＤＨファミリータンパク質の潜在的な結合部位の分析：
Ａ．Ｋ．ｌａｃｔｉｓ中のＡＤＨ１タンパク質およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中のＡＤＨ１タンパク質の配列並置；
Ｂ．相同性モデリングのためのテンプレートとしてＳｃＡＤＨを使用し、ＡＤＨ１中のＨ４７、Ｈ５１およびＨ１２４；ＡＤＨ２中のＨ４５、Ｈ４９およびＨ１２２；Ｈ７１、Ｈ７５およびＨ１４８中のＡＤＨ３；ＡＤＨ４中のＨ７２、Ｈ７６およびＨ１４９など、ＫｌＡＤＨ中のＨｉｓ豊富な領域部位を見出すこと；
Ｃ．改造がＡＤＨの触媒活性に影響を与えるかどうかなど、この領域中のＨｉｓ部位に対して改造可能性分析を実施し、以下の群：Ｈ１２４Ｋ、Ｈ１２４Ｒ、Ｈ４７Ｋ、Ｈ４７Ｒ、Ｈ４７Ｎ、Ｈ４７Ｑ、Ｈ５１Ｋ、Ｈ５１Ｒ、Ｈ１２４ＫＨ４７Ｋ、Ｈ１２４ＫＨ４７Ｒ、Ｈ１２４ＫＨ４７Ｎ、Ｈ１２４ＫＨ４７Ｑおよびこれらの組み合わせから選択されるＡＤＨ１の部位特異的変異；以下の群；Ｈ１２２Ｋ、Ｈ１２２Ｒ、Ｈ４５Ｋ、Ｈ４５Ｒ、Ｈ４５Ｎ、Ｈ４５Ｑ、Ｈ４９Ｋ、Ｈ４９Ｒ、Ｈ１２２ＫＨ４５Ｋ、Ｈ１２２ＫＨ４５Ｒ、Ｈ１２２ＫＨ４５Ｎ、Ｈ１２２ＫＨ４５Ｑおよびこれらの組み合わせから選択されるＡＤＨ２の部位特異的変異；以下の群：Ｈ１４８Ｋ、Ｈ１４８Ｒ、Ｈ７１Ｋ、Ｈ７１Ｒ、Ｈ７１Ｎ、Ｈ７１Ｑ、Ｈ７５Ｋ、Ｈ７５Ｒ、Ｈ１４８ＫＨ７１Ｋ、Ｈ１４８ＫＨ７１Ｒ、Ｈ１４８ＫＨ７１Ｎ、Ｈ１４８ＫＨ７１Ｑおよびこれらの組み合わせから選択されるＡＤＨ３の部位特異的変異；以下の群：Ｈ１４９Ｋ、Ｈ１４９Ｒ、Ｈ７２Ｋ、Ｈ７２Ｒ、Ｈ７２Ｎ、Ｈ７２Ｑ、Ｈ７６Ｋ、Ｈ７６Ｒ、Ｈ１４９ＫＨ７２Ｋ、Ｈ１４９ＫＨ７２Ｒ、Ｈ１４９ＫＨ７２Ｎ、Ｈ１４９ＫＨ７２Ｑおよびこれらの組み合わせから選択されるＡＤＨ４の部位特異的変異など、別のアミノ酸を最終的に選択すること；
（３）Ｃａｓ９−ｇＲＮＡクローニングベクターの構築、構築方法が以下のとおりである：
Ａ．特異的な遺伝子の配列に対して、それぞれ、その遺伝子のスプライシングを導くｇＲＮＡ配列を設計すること；
Ｂ．Ｃａｓ９を含有するベクター中に上記ｇＲＮＡ配列を組み替えて、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９がその中で同時発現される第一のベクターを得ること；
（４）以下の方法による特異的な遺伝子のノックアウトのために使用されるドナーＤＮＡの構築：
Ａ．遺伝子データベースから特異的な遺伝子のヌクレオチド配列をダウンロードし、それぞれ、遺伝子の８００ｂｐ上流および下流に位置する配列を使用することによって第二のベクターを構築すること；
Ｂ．プライマーＭ１３ＦおよびＭ１３Ｒを用いて第二のベクターを増幅し、アルコール沈殿によって、得られたＰＣＲ生成物を濃縮してドナーＤＮＡを得ること；
（５）以下の方法によるヒスチジン残基の特異的点変異を有するドナーＤＮＡの構築：
Ａ．遺伝子データベースから特異的な遺伝子のヌクレオチド配列をダウンロードし、標的遺伝子ならびにそれぞれ標的遺伝子の８００ｂｐ上流および下流に位置する配列を使用し、アミノ酸残基の一部に点変異を施し、ｇＲＮＡに同義変異を施すことによって第二のベクターを構築すること；
Ｂ．プライマーＭ１３ＦおよびＭ１３Ｒを用いて第二のベクターを増幅し、アルコール沈殿によって、得られたＰＣＲ生成物を濃縮してドナーＤＮＡを得ること；
（６）以下の方法によって、特異的な遺伝子のノックアウトまたは点変異を有する細胞株を取得すること：
Ａ．第一のベクターおよびドナーＤＮＡをコンピテント細胞中に同時に形質転換すること；
Ｂ．拡大培養のために単クローンの細胞をスクリーニングし、ゲノムを抽出し、ＡＤＨ遺伝子および相同性アームを増幅するためのプライマーを設計し、配列決定によって、増幅されたＰＣＲ生成物を確認する；
（７）以下の方法によって、遺伝子ノックアウトまたは点変異に供された株のＮｉ媒体への結合能力を試験する：
Ａ．遺伝子ノックアウトまたは点変異に供された得られた株に対して拡大培養を実施し、細胞破砕を実施して、細胞溶解物を得ること；
Ｂ．Ｎｉ媒体を通じて細胞溶解物を精製し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を介して、精製された生成物を分析すること；
（８）無細胞インビトロタンパク質合成系。
【０１４８】
遺伝子改変された細胞株を用いて、酵母細胞溶解物を調製し、インビトロタンパク質翻訳系中に添加する。２０〜３０℃で、２〜１２時間、反応系を放置し、多機能マイクロプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用することによって吸光度の値を読み取り、増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）の活性を検出する。
［実施例１］
Ｋ．ｌａｃｔｉｓ中のＡＤＨファミリー遺伝子の分析および特異的改造
１．１  Ｋ．ｌａｃｔｉｓ中のＡＤＨファミリー遺伝子の分析
Ｋ．ｌａｃｔｉｓ中で発現されたＨｉｓタグ標識された標的タンパク質がＮｉ媒体でアフィニティー精製されると、３５〜５０ｋＤａに明白な非特異的バンドが存在した。質量分析の結果は、非特異的なタンパク質が、主に、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ中のＡＤＨファミリータンパク質に由来することを示した（表１）。ＡＤＨは、ＮＡＤ（Ｐ）依存性酸化還元酵素であり、ほぼ全ての生物中に存在し、それぞれ、アルデヒドおよびケトンへの第一級および第二級アルコールの可逆的酸化を触媒する。Ｋ．ｌａｃｔｉｓ中のＡＤＨファミリータンパク質には、ＫｌＡＤＨ１、ＫｌＡＤＨ２、ＫｌＡＤＨ３およびＫｌＡＤＨ４の４つの種類が含まれ、これらの全てが染色体のＤＮＡによってコードされている。それらのうち、ＫｌＬＡ０Ｆ２１０１０ｇのＫＥＧＧデータベースコードを有するＡＤＨ１遺伝子配列（配列番号３２）は染色体Ｆに位置しており；ＫｌＬＡ０Ｆ１８２６０ｇのＫＥＧＧデータベースコードを有するＡＤＨ２遺伝子配列（配列番号２９）は染色体Ｆに位置しており；  ＫｌＬＡ０Ｂ０９０６４ｇのＫＥＧＧデータベースコードを有するＡＤＨ３遺伝子配列（配列番号３０）は染色体Ｂに位置しており；ＫｌＬＡ０Ｆ１３５３０ｇのＫＥＧＧデータベースコードを有するＡＤＨ４遺伝子配列（配列番号３１）は染色体Ｆに位置している。それらのうち、ＡＤＨ１およびＡＤＨ２は、細胞質中でそれらの機能を実行するのに対して、ＡＤＨ３およびＡＤＨ４は、ミトコンドリア中でそれらの機能を実行し、それぞれ、３７．３ｋＤａ、３７．１ｋＤａ、３９．６ｋＤａおよび４０．２ｋＤａの相対的分子量を有する。これらの４つのＡＤＨタンパク質のアミノ酸配列は高度に相同性があり、それらの三次構造も極めて類似している。
【０１４９】
【表３】
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【０１５０】
Ｋ．ｌａｃｔｉｓ中のＡＤＨファミリータンパク質の結晶構造は未だ知られていないので、本発明者らは、その空間的三次構造を予測するために相同性モデリングを使用した。Ｋ．ｌａｃｔｉｓ中のＫｌＡＤＨ１とＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＰＤＢ  ＮＯ．４Ｗ６Ｚ）中のＳｃＡＤＨ１との間の一次配列並置は、これら２つが８４．９％の配列相同性を有する四量体であることを示す。ＳｃＡＤＨ１をテンプレートとして使用する相同性モデリングは、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ中のＫｌＡＤＨ１の各単量体が、それぞれ、４７、５１、６９、１２４、２４３および３２１位に位置する合計６つのＨｉｓを含有することを示した。完全な四量体は、合計４つのＨｉｓ豊富な領域を含有する。各単量体の５番目のＨｉｓが相対的に独立していることを除き、各単量体の他の５つのＨｉｓが空間中で近接しており、他の５つのＨｉｓのうち、空間中で（および配列中でも）最も近接しているのは、各単量体の前の３〜４つのＨｉｓである。
【０１５１】
Ｋ．ｌａｃｔｉｓ中の４つのＡＤＨは高度に相同であり、５つのＨｉｓは高度に保存されているので、ＫｌＡＤＨ２、ＫｌＡＤＨ３およびＫｌＡＤＨ４の空間的構造もＫｌＡＤＨ１の空間的構造に類似している、すなわち、各ＡＤＨタンパク質の最初の４つのＨｉｓは空間中でクラスターを形成し得、これにより、Ｎｉ媒体への親和性を生じる。
１．２  Ｋ．ｌａｃｔｉｓ中のＡＤＨファミリー遺伝子の特異的改造
Ｎｉ媒体へのＡＤＨの親和性を除去するときのＡＤＨ活性に対する効果をできるだけ最小化することの必要性に照らすと、ＫｌＡＤＨ中のＨｉｓの機能の分析が鍵となる。多数の比較およびスクリーニングを通じて、ＳｃＡＤＨ１タンパク質中の６つのＨｉｓと相同なＫｌＡＤＨ１タンパク質中の６つのＨｉｓのうち、Ｈ４４、Ｈ４８、Ｈ６６およびＨ１２１は、ＫｌＡＤＨ１中でクラスター化された４つのＨｉｓとの相同性故に、本発明の分析のキーポイントとなる。図６に示されているように、Ｈ６６は、ＳｃＡＤＨ１の２つの立体構造の両方で、触媒性Ｚｎ２＋をキレートすることに関与しているので、ＡＤＨの触媒活性に対して重要な影響を果たし得、本発明の改造の標的として採用されない。図７に示されているように、Ｈ４８は補酵素に結合しないが、三元複合体の形成に関与し、基質のプロトン移動過程に影響を与える。本発明の研究は、Ｈ４４イミダゾール環上のＮＤ１はＮＡＤ＋のＯ２Ａと水素結合を形成し得、これによって、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨの結合に関与することを見出した。Ｈ４４Ｒは、ＮＡＤ＋およびＮＡＤＨの解離定数を２〜４倍低下させ、変換数を４〜６倍減少させることができる。さらに、Ｈ１２１の側鎖は、Ｔ１３０と水素結合を形成することができる。
【０１５２】
上記研究に基づいて、本発明では、ＳｃＡＤＨ１中のＡＤＨ１の機能に対して比較的小さな影響を有する３つのＨｉｓ部位（それぞれ、Ｈ４４、Ｈ４８およびＨ１２１）を類似の機能を有するアミノ酸に変異させ、最後に、ＫｌＡＤＨ１に対して設計された点変異スキームは、Ｈ１２４Ｋ、Ｈ１２４Ｒ、Ｈ４７Ｋ、Ｈ４７Ｒ、Ｈ４７Ｎ、Ｈ４７Ｑ、Ｈ５１Ｋ、Ｈ５１Ｒ、Ｈ１２４ＫＨ４７Ｋ、Ｈ１２４ＫＨ４７Ｒ、Ｈ１２４ＫＨ４７ＮおよびＨ１２４ＫＨ４７Ｑであった。
【０１５３】
Ｋ．ｌａｃｔｉｓ中のＡＤＨ２、ＡＤＨ３およびＡＤＨ４はＡＤＨ１と高度に相同性であるので（図２）、すなわち、ＡＤＨ２中のＨ４５、Ｈ４９およびＨ１２２、ＡＤＨ３中のＨ７１、Ｈ７５およびＨ１４８、ＡＤＨ４中のＨ７２、Ｈ７６およびＨ１４９は、それぞれ、ＡＤＨ１中のＨ４７、Ｈ５１およびＨ１２４に対応する。
【０１５４】
したがって、本発明では、ＡＤＨ１遺伝子のノックアウトならびにＨ４７、Ｈ５１およびＨ１２４の部位特異的変異において具体的に示されているとおり、Ｎｉ媒体へのＡＤＨ１の結合を低下させるための例としてＡＤＨ１を採用する。ＡＤＨ１に対する方法と類似の方法を使用することによって、ＡＤＨ２、ＡＤＨ３およびＡＤＨ４も対応する部位において改変操作することができる。
［実施例２］
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介したＡＤＨ１遺伝子の標的化されたノックアウト
２．１  ＫｌＡＤＨ１  ＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡ配列の決定
ＫｌＡＤＨ１中に設計された点変異にしたがって、ＰＡＭ配列（ＮＧＧ）を選択し、対応するｇＲＮＡ配列を決定した。本実施例においてｇＲＮＡを選択するための原理は以下のとおりである：ＧＣ含量は中程度（４０％〜６０％）であるべきであり、ポリＴ構造の存在は回避すべきである。この実施形態において、ＫｌＡＤＨ１  ｇＲＮＡ１配列は、ＴＧＧＧＴＧＡＡＡＡＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣである。
【０１５５】
プラスミド構築および形質転換のための方法は以下のとおりである：プライマーｐＫＭＣａｓ９−ＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ＰＦ：ＴＧＧＧＴＧＡＡＡＡＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣおよびｐＣａｓ９−ＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ＰＲ：ＧＣＣＣＴＴＧＡＣＧＴＴＴＴＣＡＣＣＣＡＡＡＡＧＴＣＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＣＧを使用し、ｐＣＡＳプラスミドをテンプレートとして使用して、ＰＣＲ増幅を行った。１７μＬの増幅された生成物を採取し、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を加え、混合した後、３７℃で３時間、混合物をインキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理された混合物を５０μＬのＤＨ５αコンピテント細胞中に加えた。混合物を３０分間氷上に置き、４２℃で４５秒間、熱ショックを加えた後、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加し、次いで、３７℃で１時間、振盪しながら培養した。その後、Ｋａｎ耐性ＬＢ固体培地上に混合物を被覆し、次いで、単クローンのコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を実施した。２つの単クローンのコロニーを選び出し、次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性と検出され、配列決定によって確認された後、プラスミドを抽出および保存し、ｐＫＭＣａｓ９＿ＳｔＲ＿ＫｌＡＤＨ１と名付けた。
２．２  ドナーＤＮＡプラスミドの構築および増幅
本実施例では、直鎖ドナーＤＮＡの保存および増幅を容易にするために、ドナーＤＮＡをｐＫＭＤ１プラスミド中にまず挿入し、次いで、直鎖ドナーＤＮＡ配列を得るためにＰＣＲによって増幅した。
【０１５６】
ｐＫＭＤ１プラスミドをテンプレートとして用いて、ｐＫＭＤ１−ＰＦ：ＡＴＣＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧおよびｐＫＭＤ１−ＰＲ：ＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧのプライマーを使用することによって、ＰＣＲ増幅過程を実行した。１７μＬの増幅された生成物を採取し、次いで、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を加え、混合した後、３７℃で３時間、混合物をインキュベートし、プラスミド骨格の直鎖断片ｐＫＭＤ１−Ｔを得た。
２．２．１  ドナープラスミドｐＫＭＤ１−ΔＫｌＡＤＨ１の構築
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ＨＲ１−ＰＦ：ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＡＴＧＧＡＣＡＡＴＡＣＧＴＴＡＣＣＧＡＧＡＴＧＡＧＧおよびＫｌＡＤＨ１−ＨＲ１−ＰＲ：ＧＡＡＧＡＧＡＴＴＴＣＡＴＴＴＡＴＣＴＴＴＴＴＴＴＡＧＴＡＴＡＧＡＧＴＴＴＧＴＧＴＧＴＴＴＡＡＡＧＣＴＴＧのプライマーを使用することによって、１つのＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をΔＫｌＡＤＨ１−Ｆ１と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ＨＲ２−ＰＦ：ＣＡＡＡＣＴＣＴＡＴＡＣＴＡＡＡＡＡＡＡＧＡＴＡＡＡＴＧＡＡＡＴＣＴＣＴＴＣＣＧＣＡＴＴＣＡＡＧＴＣＡＴＧＡＣおよびＫｌＡＤＨ１−ＨＲ２−ＰＲ：ＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＴＴＡＴＡＣＴＧＧＧＴＡＧＡＴＴＴＣＡＡＡＣＧＧＧＡＣのプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をΔＫｌＡＤＨ１−Ｆ２と名付けた。
【０１５７】
１μＬのそれぞれの増幅された生成物ΔＫｌＡＤＨ１−Ｆ１、ΔＫｌＡＤＨ１−Ｆ２およびｐＫＭＤ１−Ｔを混合し、５μＬのＣｌｏｎｉｎｇ  Ｍｉｘ（ＴｒａｎｓＧｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙから得られるＴｒａｎｓｇｅｎｅ  ｐＥＡＳＹ−Ｕｎｉ  Ｓｅａｍｌｅｓｓ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｋｉｔという名称のキット、以下同様）および２μＬの水を加えた。混合後、５０℃の水中に１時間、混合物を浸漬した。水浴後、混合物を２分間氷上に置いた。１０μＬの反応混合物を全て、５０μＬのＴｒａｎｓ−Ｔ１コンピテント細胞（ＴｒａｎｓＧｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙから得られる、以下同様）中に加えた。混合物を３０分間氷上に置き、４２℃で３０秒間、熱ショックを加えた後、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加し、次いで、３７℃で１時間、振盪しながら培養した。その後、Ａｍｐ耐性ＬＢ固体培地上に混合物を被覆し、次いで、単クローンのコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を実施した。６つの単クローンのコロニーを選び出し、次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性と検出され、配列決定によって確認された後、プラスミドを抽出および保存し、ｐＫＭＤ１−ΔＫｌＡＤＨ１と名付けた。
２．３  Ｋ．ｌａｃｔｉｓの電気形質転換
コンピテント細胞を−８０℃の冷凍庫から取り出し、氷上で融解し、４００ｎｇのｇＲＮＡおよびＣａｓ９プラスミド（またはｇＲＮＡ／ｃａｓ９断片）および１０００ｎｇのドナーＤＮＡ断片を加えた。混合後、混合物を電気穿孔キュベット中に移し、２分間氷中に浸した。（１．５ｋＶ、２００Ωおよび２５μＦのパラメータでの）電気ショックのために、電気穿孔キュベットを電気穿孔装置の中に置いた。電気ショックの完了後、混合物に７００μＬのＹＰＤを直ちに加え、次いで、２００ｒｐｍの速度で、３０℃で１〜３時間、振盪機上でインキュベートした。２〜２００μＬの混合物を採り、ＹＰＤ（Ｇ４１８耐性を有する）プレート上に播種し、単クローンのコロニーが出現するまで、３０℃で２〜３日間培養した。
２．４  陽性の同定
形質転換された細胞を有するプレートから、１２〜２４の単クローンのコロニーを選び出した。細胞をテンプレートとして用いて、ＡＤＨ１−ＣＦ：ＧＴＧＡＴＧＧＡＡＣＡＣＧＧＧＡＡＴＡＧおよびＡＤＨ１−ＣＲ：ＣＡＣＡＴＡＴＡＣＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＧの同定プライマーを使用するＰＣＲによって、試料を検出した。ＰＣＲによって陽性を検査され、配列決定によって同定された株を、陽性の株として決定し、ΔＡＤＨ１と名付けた。
［実施例３］
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＡＤＨ１  Ｈ４７部位の部位特異的変異
３．１  ＫｌＡＤＨ１  ＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡ配列の決定
ＫｌＡＤＨ１中に設計された点変異にしたがって、ＰＡＭ配列（ＮＧＧ）を選択し、対応するｇＲＮＡ配列を決定した。本実施例においてｇＲＮＡを選択するための原理は以下のとおりである：ｇＲＮＡは設計された変異部位の近くにあるべきであり、ＧＣ含量は中程度（４０％〜６０％）であるべきであり、ポリＴ構造の存在は回避すべきである。この実施形態において、ＫｌＡＤＨ１  ｇＲＮＡ１配列は、ＴＧＧＧＴＧＡＡＡＡＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣである。
【０１５８】
プラスミド構築および形質転換のための方法は以下のとおりである：プライマーｐＣａｓ９−ＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ＰＦ：ＴＧＧＧＴＧＡＡＡＡＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣおよびｐＣａｓ９−ＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ＰＲ：ＧＣＣＣＴＴＧＡＣＧＴＴＴＴＣＡＣＣＣＡＡＡＡＧＴＣＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＣＧを使用し、ｐＣＡＳプラスミドをテンプレートとして使用して、ＰＣＲ増幅を行った。１７μＬの増幅された生成物を採取し、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を加えた。混合後、３７℃で３時間、混合物をインキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理された混合物を５０μＬのＤＨ５αコンピテント細胞中に加えた。混合物を３０分間氷上に置き、４２℃で４５秒間、熱ショックを加えた後、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加し、次いで、３７℃で１時間、振盪しながら培養した。その後、Ｋａｎ耐性ＬＢ固体培地上に混合物を被覆し、次いで、単クローンのコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を実施した。２つの単クローンのコロニーを選び出し、次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性と検出され、配列決定によって確認された後、プラスミドを抽出および保存し、ｐＫＭＣａｓ９＿ＳｔＲ＿ＫｌＡＤＨ１と名付けた。
３．２  ドナーＤＮＡプラスミドの構築および増幅
本実施例では、直鎖ドナーＤＮＡの保存および増幅を容易にするために、ドナーＤＮＡをｐＫＭＤ１プラスミド中にまず挿入し、次いで、直鎖ドナーＤＮＡ配列を得るためにＰＣＲによって増幅した。
【０１５９】
ｐＫＭＤ１プラスミドをテンプレートとして用いて、ｐＫＭＤ１−ＰＦ：ＡＴＣＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧおよびｐＫＭＤ１−ＰＲ：ＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧのプライマーを使用することによって、ＰＣＲ増幅過程を実行した。１７μＬの増幅された生成物を採取し、次いで、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を加え、混合した後、３７℃で３時間、混合物をインキュベートし、プラスミド骨格の直鎖断片ｐＫＭＤ１−Ｔを得た。
３．２．１  ドナープラスミドｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｋの構築
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ＨＲ１−ＰＦ：ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＡＴＧＧＡＣＡＡＴＡＣＧＴＴＡＣＣＧＡＧＡＴＧＡＧＧおよびＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｋ−ＰＲ：ＡＧＣＡＴＧＡＡＧＧＴＣＡＧＴＴＴＴＡＣＡＧＡＣＡＣＣＧＧＡＧＴＡＣＴＴＧＡＣＧのプライマーを使用することによって、１つのＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｋ−Ｆ１と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｋ−ＰＦ：ＧＴＡＡＡＡＣＴＧＡＣＣＴＴＣＡＴＧＣＴＴＧＧＡＡＧＧＧＴＧＡＣＴＧＧＣＣＴＴＴＧおよびＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＲ：ＣＣＡＡＣＣＴＴＴＡＡＣＡＴＴＣＴＣＴＣＣＣＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＣＧＡＣＡＣＣＡＧのプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｋ−Ｆ２と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＦ：ＧＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＧＴＴＧＧＡＡＧＡＴＴＧＧＴＧＡＣＴＴＣＧＣＴＧＧおよびＫｌＡＤＨ１−ＨＲ２−ＰＲ：ＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＴＴＡＴＡＣＴＧＧＧＴＡＧＡＴＴＴＣＡＡＡＣＧＧＧＡＣのプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｎ−Ｆ３と名付けた。
【０１６０】
増幅された生成物ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｋ−Ｆ１、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｋ−Ｆ２、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｋ−Ｆ３およびｐＫＭＤ１−Ｔのそれぞれ１μＬを混合し、５μＬのＣｌｏｎｉｎｇ  Ｍｉｘおよび１μＬの水を添加した。混合後、５０℃の水中に１時間、混合物を浸漬した。水浴後、混合物を２分間氷上に置いた。１０μＬの反応混合物を全て、５０μＬのＴｒａｎｓ−Ｔ１コンピテント細胞中に加えた。混合物を３０分間氷上に置き、４２℃で３０秒間、熱ショックを加えた後、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加し、次いで、３７℃で１時間、振盪しながら培養した。その後、Ａｍｐ耐性ＬＢ固体培地上に混合物を被覆し、次いで、単クローンのコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を実施した。６つの単クローンのコロニーを選び出し、次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性と検出され、配列決定によって確認された後、プラスミドを抽出および保存し、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｋと名付けた。
３．２．２  ドナープラスミドｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｎの構築
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ＨＲ１−ＰＦ：ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＡＴＧＧＡＣＡＡＴＡＣＧＴＴＡＣＣＧＡＧＡＴＧＡＧＧおよびＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｎ−ＰＲ：ＡＧＣＡＴＧＡＡＧＧＴＣＡＧＴＡＴＴＡＣＡＧＡＣＡＣＣＧＧＡＧＴＡＣＴＴＧＡＣＧのプライマーを使用することによって、１つのＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｎ−Ｆ１と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｎ−ＰＦ：ＧＴＡＡＴＡＣＴＧＡＣＣＴＴＣＡＴＧＣＴＴＧＧＡＡＧＧＧＴＧＡＣＴＧＧＣＣＴＴＴＧおよびＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＲ：ＣＣＡＡＣＣＴＴＴＡＡＣＡＴＴＣＴＣＴＣＣＣＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＣＧＡＣＡＣＣＡＧのプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｎ−Ｆ２と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＦ：ＧＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＧＴＴＧＧＡＡＧＡＴＴＧＧＴＧＡＣＴＴＣＧＣＴＧＧおよびＫｌＡＤＨ１−ＨＲ２−ＰＲ：ＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＴＴＡＴＡＣＴＧＧＧＴＡＧＡＴＴＴＣＡＡＡＣＧＧＧＡＣのプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｎ−Ｆ３と名付けた。
【０１６１】
増幅された生成物ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｎ−Ｆ１、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｎ−Ｆ２、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｎ−Ｆ３およびｐＫＭＤ１−Ｔのそれぞれ１μＬを混合し、５μＬのＣｌｏｎｉｎｇ  Ｍｉｘおよび１μＬの水を添加した。混合後、５０℃の水中に１時間、混合物を浸漬した。水浴後、混合物を２分間氷上に置いた。１０μＬの反応混合物を全て、５０μＬのＴｒａｎｓ−Ｔ１コンピテント細胞中に加えた。混合物を３０分間氷上に置き、４２℃で３０秒間、熱ショックを加えた後、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加し、次いで、３７℃で１時間、振盪しながら培養した。その後、Ａｍｐ耐性ＬＢ固体培地上に混合物を被覆し、次いで、単クローンのコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を実施した。６つの単クローンのコロニーを選び出し、次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性と検出され、配列決定によって確認された後、プラスミドを抽出および保存し、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｎと名付けた。
３．２．３  ドナープラスミドｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｑの構築
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ＨＲ１−ＰＦ：ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＡＴＧＧＡＣＡＡＴＡＣＧＴＴＡＣＣＧＡＧＡＴＧＡＧＧおよびＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｑ−ＰＲ：ＡＧＣＡＴＧＡＡＧＧＴＣＡＧＴＴＴＧＡＣＡＧＡＣＡＣＣＧＧＡＧＴＡＣＴＴＧＡＣＧのプライマーを使用することによって、１つのＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｑ−Ｆ１と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｑ−ＰＦ：ＧＴＣＡＡＡＣＴＧＡＣＣＴＴＣＡＴＧＣＴＴＧＧＡＡＧＧＧＴＧＡＣＴＧＧＣＣＴＴＴＧおよびＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＲ：ＣＣＡＡＣＣＴＴＴＡＡＣＡＴＴＣＴＣＴＣＣＣＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＣＧＡＣＡＣＣＡＧのプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｑ−Ｆ２と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＦ：ＧＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＧＴＴＧＧＡＡＧＡＴＴＧＧＴＧＡＣＴＴＣＧＣＴＧＧおよびＫｌＡＤＨ１−ＨＲ２−ＰＲ：ＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＴＴＡＴＡＣＴＧＧＧＴＡＧＡＴＴＴＣＡＡＡＣＧＧＧＡＣのプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｑ−Ｆ３と名付けた。
【０１６２】
増幅された生成物ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｑ−Ｆ１、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｑ−Ｆ２、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｑ−Ｆ３およびｐＫＭＤ１−Ｔのそれぞれ１μＬを混合し、５μＬのＣｌｏｎｉｎｇ  Ｍｉｘおよび１μＬの水を添加した。混合後、５０℃の水中に１時間、混合物を浸漬した。水浴後、混合物を２分間氷上に置いた。１０μＬの反応混合物を全て、５０μＬのＴｒａｎｓ−Ｔ１コンピテント細胞中に加えた。混合物を３０分間氷上に置き、４２℃で３０秒間、熱ショックを加えた後、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加し、次いで、３７℃で１時間、振盪しながら培養した。その後、Ａｍｐ耐性ＬＢ固体培地上に混合物を被覆し、次いで、単クローンのコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を実施した。６つの単クローンのコロニーを選び出し、次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性と検出され、配列決定によって確認された後、プラスミドを抽出および保存し、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｑと名付けた。
３．２．４  ドナープラスミドｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｒの構築
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ＨＲ１−ＰＦ：ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＡＴＧＧＡＣＡＡＴＡＣＧＴＴＡＣＣＧＡＧＡＴＧＡＧＧおよびＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｒ−ＰＲ：ＡＧＣＡＴＧＡＡＧＧＴＣＡＧＴＴＣＴＡＣＡＧＡＣＡＣＣＧＧＡＧＴＡＣＴＴＧＡＣＧのプライマーを使用することによって、１つのＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｒ−Ｆ１と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｒ−ＰＦ：ＧＴＡＧＡＡＣＴＧＡＣＣＴＴＣＡＴＧＣＴＴＧＧＡＡＧＧＧＴＧＡＣＴＧＧＣＣＴＴＴＧおよびＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＲ：ＣＣＡＡＣＣＴＴＴＡＡＣＡＴＴＣＴＣＴＣＣＣＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＣＧＡＣＡＣＣＡＧのプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｒ−Ｆ２と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＦ：ＧＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＧＴＴＧＧＡＡＧＡＴＴＧＧＴＧＡＣＴＴＣＧＣＴＧＧおよびＫｌＡＤＨ１−ＨＲ２−ＰＲ：ＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＴＴＡＴＡＣＴＧＧＧＴＡＧＡＴＴＴＣＡＡＡＣＧＧＧＡＣのプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｒ−Ｆ３と名付けた。
【０１６３】
増幅された生成物ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｒ−Ｆ１、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｒ−Ｆ２、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｒ−Ｆ３およびｐＫＭＤ１−Ｔのそれぞれ１μＬを混合し、５μＬのＣｌｏｎｉｎｇ  Ｍｉｘおよび１μＬの水を添加した。混合後、５０℃の水中に１時間、混合物を浸漬した。水浴後、混合物を２分間氷上に置いた。１０μＬの反応混合物を全て、５０μＬのＴｒａｎｓ−Ｔ１コンピテント細胞中に加えた。混合物を３０分間氷上に置き、４２℃で３０秒間、熱ショックを加えた後、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加し、次いで、３７℃で１時間、振盪しながら培養した。その後、Ａｍｐ耐性ＬＢ固体培地上に混合物を被覆し、次いで、単クローンのコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を実施した。６つの単クローンのコロニーを選び出し、次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性と検出され、配列決定によって確認された後、プラスミドを抽出および保存し、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｒと名付けた。
３．３  Ｋ．ｌａｃｔｉｓの電気形質転換（実施例２．３と同じ）
３．４  陽性の同定
形質転換された細胞を有するプレートから、１２〜２４の単クローンのコロニーを選び出した。ＡＤＨ１−ｍ−ＣＦ：ＴＧＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＧＴおよびＡＤＨ１−ｍ−ＣＲ：ＴＧＡＣＧＧＴＣＧＴＴＡＡＣＴＡＡＧＡＴの同定プライマーを使用し、細胞をテンプレートとして使用することによるＰＣＲによって、試料を検出した。ＰＣＲによって陽性を検査され、配列決定によって同定された株を、陽性の株として決定し、それぞれ、ＡＤＨ１  Ｈ４７Ｋ、ＡＤＨ１  Ｈ４７Ｎ、ＡＤＨ１  Ｈ４７ＱおよびＡＤＨ１  Ｈ４７Ｒと名付けた。
［実施例４］
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＡＤＨ１  Ｈ５１部位の部位特異的変異
４．１  ＫｌＡＤＨ１  ＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡ配列の決定
ＫｌＡＤＨ１中に設計された点変異にしたがって、ＰＡＭ配列（ＮＧＧ）を選択し、対応するｇＲＮＡ配列を決定した。本実施例においてｇＲＮＡを選択するための原理は以下のとおりである：ｇＲＮＡは設計された変異部位の近くにあるべきであり、ＧＣ含量は中程度（４０％〜６０％）であるべきであり、ポリＴ構造の存在は回避すべきである。この実施形態において、ＫｌＡＤＨ１  ｇＲＮＡ１配列は、ＴＧＧＧＴＧＡＡＡＡＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣである。
【０１６４】
プラスミド構築および形質転換のための方法は以下のとおりである：プライマーｐＣａｓ９−ＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ＰＦ：ＴＧＧＧＴＧＡＡＡＡＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣおよびｐＣａｓ９−ＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ＰＲ：ＧＣＣＣＴＴＧＡＣＧＴＴＴＴＣＡＣＣＣＡＡＡＡＧＴＣＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＣＧを使用し、ｐＣＡＳプラスミドをテンプレートとして使用して、ＰＣＲ増幅を行った。１７μＬの増幅された生成物を採取し、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を加えた。混合後、３７℃で３時間、混合物をインキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理された混合物を５０μＬのＤＨ５αコンピテント細胞中に加えた。混合物を３０分間氷上に置き、４２℃で４５秒間、熱ショックを加えた後、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加し、次いで、３７℃で１時間、振盪しながら培養した。その後、Ｋａｎ耐性ＬＢ固体培地上に混合物を被覆し、次いで、単クローンのコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を実施した。２つの単クローンのコロニーを選び出し、次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性と検出され、配列決定によって確認された後、プラスミドを抽出および保存し、ｐＫＭＣａｓ９＿ＳｔＲ＿ＫｌＡＤＨ１と名付けた。
４．２  ドナーＤＮＡプラスミドの構築および増幅
本実施例では、直鎖ドナーＤＮＡの保存および増幅を容易にするために、ドナーＤＮＡをｐＫＭＤ１プラスミド中にまず挿入し、次いで、直鎖ドナーＤＮＡ配列を得るためにＰＣＲによって増幅した。
【０１６５】
ｐＫＭＤ１プラスミドをテンプレートとして用いて、ｐＫＭＤ１−ＰＦ：ＡＴＣＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧおよびｐＫＭＤ１−ＰＲ：ＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧのプライマーを使用することによって、１つのＰＣＲ増幅過程を実行した。１７μＬの増幅された生成物を採取し、次いで、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を加え、混合した後、３７℃で３時間、混合物をインキュベートし、プラスミド骨格の直鎖断片ｐＫＭＤ１−Ｔを得た。
４．２．１  ドナープラスミドｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ５１Ｋの構築
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ＨＲ１−ＰＦ：ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＡＴＧＧＡＣＡＡＴＡＣＧＴＴＡＣＣＧＡＧＡＴＧＡＧＧおよびＫｌＡＤＨ１−Ｈ５１Ｋ−ＰＲ：ＣＣＡＡＧＣＴＴＴＡＡＧＧＴＣＡＧＴＡＴＧＡＣＡＧＡＣＡＣＣＧＧＡＧＴＡＣＴＴＧＡＣＧのプライマーを使用することによって、１つのＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ５１Ｋ−Ｆ１と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ５１Ｋ−ＰＦ：ＧＴＣＡＴＡＣＴＧＡＣＣＴＴＡＡＡＧＣＴＴＧＧＡＡＧＧＧＴＧＡＣＴＧＧＣＣＴＴＴＧおよびＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＲ：ＣＣＡＡＣＣＴＴＴＡＡＣＡＴＴＣＴＣＴＣＣＣＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＣＧＡＣＡＣＣＡＧのプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ５１Ｋ−Ｆ２と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＦ：ＧＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＧＴＴＧＧＡＡＧＡＴＴＧＧＴＧＡＣＴＴＣＧＣＴＧＧおよびＫｌＡＤＨ１−ＨＲ２−ＰＲ：ＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＴＴＡＴＡＣＴＧＧＧＴＡＧＡＴＴＴＣＡＡＡＣＧＧＧＡＣのプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ５１Ｋ−Ｆ３と名付けた。
【０１６６】
増幅された生成物ＫｌＡＤＨ１−Ｈ５１Ｋ−Ｆ１、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ５１Ｋ−Ｆ２、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ５１Ｋ−Ｆ３およびｐＫＭＤ１−Ｔのそれぞれ１μＬを混合し、５μＬのＣｌｏｎｉｎｇ  Ｍｉｘおよび１μＬの水を添加した。混合後、５０℃の水中に１時間、混合物を浸漬した。水浴後、混合物を２分間氷上に置いた。１０μＬの反応混合物を全て、５０μＬのＴｒａｎｓ−Ｔ１コンピテント細胞中に加えた。混合物を３０分間氷上に置き、４２℃で３０秒間、熱ショックを加えた後、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加し、次いで、３７℃で１時間、振盪しながら培養した。その後、Ａｍｐ耐性ＬＢ固体培地上に混合物を被覆し、次いで、単クローンのコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を実施した。６つの単クローンのコロニーを選び出し、次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性と検出され、配列決定によって確認された後、プラスミドを抽出および保存し、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ５１Ｋと名付けた。
４．２．２  ドナープラスミドｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ５１Ｒの構築
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ＨＲ１−ＰＦ：ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＡＴＧＧＡＣＡＡＴＡＣＧＴＴＡＣＣＧＡＧＡＴＧＡＧＧおよびＫｌＡＤＨ１−Ｈ５１Ｒ−ＰＲ：ＣＣＡＡＧＣＴＣＴＡＡＧＧＴＣＡＧＴＡＴＧＡＣＡＧＡＣＡＣＣＧＧＡＧＴＡＣＴＴＧＡＣＧのプライマーを使用することによって、１つのＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ５１Ｒ−Ｆ１と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ５１Ｒ−ＰＦ：ＧＴＣＡＴＡＣＴＧＡＣＣＴＴＡＧＡＧＣＴＴＧＧＡＡＧＧＧＴＧＡＣＴＧＧＣＣＴＴＴＧおよびＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＲ：ＣＣＡＡＣＣＴＴＴＡＡＣＡＴＴＣＴＣＴＣＣＣＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＣＧＡＣＡＣＣＡＧのプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ５１Ｒ−Ｆ２と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＦ：ＧＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＧＴＴＧＧＡＡＧＡＴＴＧＧＴＧＡＣＴＴＣＧＣＴＧＧおよびＫｌＡＤＨ１−ＨＲ２−ＰＲ：ＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＴＴＡＴＡＣＴＧＧＧＴＡＧＡＴＴＴＣＡＡＡＣＧＧＧＡＣのプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ５１Ｒ−Ｆ３と名付けた。
【０１６７】
増幅された生成物ＫｌＡＤＨ１−Ｈ５１Ｒ−Ｆ１、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ５１Ｒ−Ｆ２、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ５１Ｒ−Ｆ３およびｐＫＭＤ１−Ｔのそれぞれ１μＬを混合し、５μＬのＣｌｏｎｉｎｇ  Ｍｉｘおよび１μＬの水を添加した。混合後、５０℃の水中に１時間、混合物を浸漬した。水浴後、混合物を２分間氷上に置いた。１０μＬの反応混合物を全て、５０μＬのＴｒａｎｓ−Ｔ１コンピテント細胞中に加えた。混合物を３０分間氷上に置き、４２℃で３０秒間、熱ショックを加えた後、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加し、次いで、３７℃で１時間、振盪しながら培養した。その後、Ａｍｐ耐性ＬＢ固体培地上に混合物を被覆し、次いで、単クローンのコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を実施した。６つの単クローンのコロニーを選び出し、次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性と検出され、配列決定によって確認された後、プラスミドを抽出および保存し、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ５１Ｒと名付けた。
４．３  Ｋ．ｌａｃｔｉｓの電気形質転換（実施例２．３と同じ）
４．４  陽性の同定
形質転換された細胞を有するプレートから、１２〜２４の単クローンのコロニーを選び出した。細胞をテンプレートとして用いて、ＡＤＨ１−ｍ−ＣＦ：ＴＧＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＧＴおよびＡＤＨ１−ｍ−ＣＲ：ＴＧＡＣＧＧＴＣＧＴＴＡＡＣＴＡＡＧＡＴの同定プライマーを使用するＰＣＲによって、試料を検出した。ＰＣＲによって陽性を検査され、配列決定によって同定された株を、陽性の株として決定し、それぞれ、ＡＤＨ１  Ｈ５１ＫおよびＡＤＨ１  Ｈ５１Ｒと名付けた。
［実施例５］
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＡＤＨ１  Ｈ１２４部位の部位特異的変異
５．１  ＫｌＡＤＨ１  ＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡ配列の決定
ＫｌＡＤＨ１中に設計された点変異にしたがって、ＰＡＭ配列（ＮＧＧ）を選択し、対応するｇＲＮＡ配列を決定した。本実施例においてｇＲＮＡを選択するための原理は以下のとおりである：ｇＲＮＡは設計された変異部位の近くにあるべきであり、ＧＣ含量は中程度（４０％〜６０％）であるべきであり、ポリＴ構造の存在は回避すべきである。この実施形態において、ＫｌＡＤＨ１  ｇＲＮＡ１配列は、ＴＧＧＧＴＧＡＡＡＡＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣである。
【０１６８】
プラスミド構築および形質転換のための方法は以下のとおりである：プライマーｐＣａｓ９−ＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ＰＦ：ＴＧＧＧＴＧＡＡＡＡＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣおよびｐＣａｓ９−ＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ＰＲ：ＧＣＣＣＴＴＧＡＣＧＴＴＴＴＣＡＣＣＣＡＡＡＡＧＴＣＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＣＧを使用し、ｐＣＡＳプラスミドをテンプレートとして使用して、ＰＣＲ増幅を行った。１７μＬの増幅された生成物を採取し、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を加え、混合した後、３７℃で３時間、混合物をインキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理された混合物を５０μＬのＤＨ５αコンピテント細胞中に加えた。混合物を３０分間氷上に置き、４２℃で４５秒間、熱ショックを加えた後、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加し、次いで、３７℃で１時間、振盪しながら培養した。その後、Ｋａｎ耐性ＬＢ固体培地上に混合物を被覆し、次いで、単クローンのコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を実施した。２つの単クローンのコロニーを選び出し、次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性と検出され、配列決定によって確認された後、プラスミドを抽出および保存し、ｐＫＭＣａｓ９＿ＳｔＲ＿ＫｌＡＤＨ１と名付けた。
５．２  ドナーＤＮＡプラスミドの構築および増幅
本実施例では、直鎖ドナーＤＮＡの保存および増幅を容易にするために、ドナーＤＮＡをｐＫＭＤ１プラスミド中にまず挿入し、次いで、直鎖ドナーＤＮＡ配列を得るためにＰＣＲによって増幅した。
【０１６９】
ｐＫＭＤ１プラスミドをテンプレートとして用いて、ｐＫＭＤ１−ＰＦ：ＡＴＣＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧおよびｐＫＭＤ１−ＰＲ：ＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧのプライマーを使用することによって、ＰＣＲ増幅過程を実行した。１７μＬの増幅された生成物を採取し、次いで、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を加え、混合した後、３７℃で３時間、混合物をインキュベートし、プラスミド骨格の直鎖断片ｐＫＭＤ１−Ｔを得た。
５．２．１  ドナープラスミドｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｋの構築
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ＨＲ１−ＰＦ：ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＡＴＧＧＡＣＡＡＴＡＣＧＴＴＡＣＣＧＡＧＡＴＧＡＧＧおよびＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＲ：ＣＣＡＡＣＣＴＴＴＡＡＣＡＴＴＣＴＣＴＣＣＣＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＣＧＡＣＡＣＣＡＧのプライマーを使用することによって、１つのＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｋ−Ｆ１と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＦ：ＧＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＧＴＴＧＧＡＡＧＡＴＴＧＧＴＧＡＣＴＴＣＧＣＴＧＧおよびＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｋ−ＰＲ：ＣＣＡＴＣＴＴＴＴＧＴＡＴＡＴＣＣＡＣＴＣＡＡＧＴＣＡＧＣＴＴＣＴＧＧＡＣＡＧＴＴＧＧのプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｋ−Ｆ２と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｋ−ＰＦ：ＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＡＴＡＣＡＡＡＡＧＡＴＧＧＴＴＣＴＴＴＣＣＡＡＣＡＡＴＡＣＧＣＴＡＣＴＧＣおよびＫｌＡＤＨ１−ＨＲ２−ＰＲ：ＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＴＴＡＴＡＣＴＧＧＧＴＡＧＡＴＴＴＣＡＡＡＣＧＧＧＡＣのプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｋ−Ｆ３と名付けた。
【０１７０】
増幅された生成物ＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｋ−Ｆ１、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｋ−Ｆ２、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｋ−Ｆ３およびｐＫＭＤ１−Ｔのそれぞれ１μＬを混合し、５μＬのＣｌｏｎｉｎｇ  Ｍｉｘおよび１μＬの水を添加した。混合後、５０℃の水中に１時間、混合物を浸漬した。水浴後、混合物を２分間氷上に置いた。１０μＬの反応混合物を全て、５０μＬのＴｒａｎｓ−Ｔ１コンピテント細胞中に加えた。混合物を３０分間氷上に置き、４２℃で３０秒間、熱ショックを加えた後、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加し、次いで、３７℃で１時間、振盪しながら培養した。その後、Ａｍｐ耐性ＬＢ固体培地上に混合物を被覆し、次いで、単クローンのコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を実施した。６つの単クローンのコロニーを選び出し、次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性と検出され、配列決定によって確認された後、プラスミドを抽出および保存し、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｋと名付けた。
５．２．２  ドナープラスミドｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｒの構築
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ＨＲ１−ＰＦ：ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＡＴＧＧＡＣＡＡＴＡＣＧＴＴＡＣＣＧＡＧＡＴＧＡＧＧおよびＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＲ：ＣＣＡＡＣＣＴＴＴＡＡＣＡＴＴＣＴＣＴＣＣＣＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＣＧＡＣＡＣＣＡＧのプライマーを使用することによって、１つのＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｋ−Ｆ１と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＦ：ＧＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＧＴＴＧＧＡＡＧＡＴＴＧＧＴＧＡＣＴＴＣＧＣＴＧＧおよびＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｒ−ＰＲ：ＣＣＡＴＣＴＣＴＴＧＴＡＴＡＴＣＣＡＣＴＣＡＡＧＴＣＡＧＣＴＴＣＴＧＧＡＣＡＧＴＴＧＧのプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｒ−Ｆ２と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｒ−ＰＦ：ＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＡＴＡＣＡＡＧＡＧＡＴＧＧＴＴＣＴＴＴＣＣＡＡＣＡＡＴＡＣＧＣＴＡＣＴＧＣおよびＫｌＡＤＨ１−ＨＲ２−ＰＲ：ＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＴＴＡＴＡＣＴＧＧＧＴＡＧＡＴＴＴＣＡＡＡＣＧＧＧＡＣのプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｒ−Ｆ３と名付けた。
【０１７１】
増幅された生成物ＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｒ−Ｆ１、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｒ−Ｆ２、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｒ−Ｆ３およびｐＫＭＤ１−Ｔのそれぞれ１μＬを混合し、５μＬのＣｌｏｎｉｎｇ  Ｍｉｘおよび１μＬの水を添加した。混合後、５０℃の水中に１時間、混合物を浸漬した。水浴後、混合物を２分間氷上に置いた。１０μＬの反応混合物を全て、５０μＬのＴｒａｎｓ−Ｔ１コンピテント細胞中に加えた。混合物を３０分間氷上に置き、４２℃で３０秒間、熱ショックを加えた後、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加し、次いで、３７℃で１時間、振盪しながら培養した。その後、Ａｍｐ耐性ＬＢ固体培地上に混合物を被覆し、次いで、単クローンのコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を実施した。６つの単クローンのコロニーを選び出し、次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性と検出され、配列決定によって確認された後、プラスミドを抽出および保存し、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｒと名付けた。
５．３  Ｋ．ｌａｃｔｉｓの電気形質転換（実施例２．３と同じ）
５．４  陽性の同定
形質転換された細胞を有するプレートから、１２〜２４の単クローンのコロニーを選び出した。細胞をテンプレートとして用いて、ＡＤＨ１−ｍ−ＣＦ：ＴＧＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＧＴおよびＡＤＨ１−ｍ−ＣＲ：ＴＧＡＣＧＧＴＣＧＴＴＡＡＣＴＡＡＧＡＴの同定プライマーを使用するＰＣＲによって、試料を検出した。ＰＣＲによって陽性を検査され、配列決定によって同定された株を、陽性の株として決定し、それぞれ、ＡＤＨ１  Ｈ１２４ＫおよびＡＤＨ１  Ｈ１２４Ｒと名付けた。
［実施例６］
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＡＤＨ１  Ｈ４７およびＨ１２４部位の同時部位特異的変異
６．１  ＫｌＡＤＨ１  ＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡ配列の決定
ＫｌＡＤＨ１中に設計された点変異にしたがって、ＰＡＭ配列（ＮＧＧ）を選択し、対応するｇＲＮＡ配列を決定した。本実施例においてｇＲＮＡを選択するための原理は以下のとおりである：ｇＲＮＡは設計された変異部位の近くにあるべきであり、ＧＣ含量は中程度（４０％〜６０％）であるべきであり、ポリＴ構造の存在は回避すべきである。この実施形態において、ＫｌＡＤＨ１  ｇＲＮＡ１配列は、ＴＧＧＧＴＧＡＡＡＡＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣである。
【０１７２】
プラスミド構築および形質転換のための方法は以下のとおりである：プライマーｐＣａｓ９−ＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ＰＦ：ＴＧＧＧＴＧＡＡＡＡＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣおよびｐＣａｓ９−ＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ＰＲ：ＧＣＣＣＴＴＧＡＣＧＴＴＴＴＣＡＣＣＣＡＡＡＡＧＴＣＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＣＧを使用し、ｐＣＡＳプラスミドをテンプレートとして使用して、ＰＣＲ増幅を行った。１７μＬの増幅された生成物を採取し、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を加え、混合した後、３７℃で３時間、混合物をインキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理された混合物を５０μＬのＤＨ５αコンピテント細胞中に加えた。混合物を３０分間氷上に置き、４２℃で４５秒間、熱ショックを加えた後、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加し、次いで、３７℃で１時間、振盪しながら培養した。その後、Ｋａｎ耐性ＬＢ固体培地上に混合物を被覆し、次いで、単クローンのコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を実施した。２つの単クローンのコロニーを選び出し、次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性と検出され、配列決定によって確認された後、プラスミドを抽出および保存し、ｐＫＭＣａｓ９＿ＳｔＲ＿ＫｌＡＤＨ１と名付けた。
６．２  ドナーＤＮＡプラスミドの構築および増幅
本実施例では、直鎖ドナーＤＮＡの保存および増幅を容易にするために、ドナーＤＮＡをｐＫＭＤ１プラスミド中にまず挿入し、次いで、直鎖ドナーＤＮＡ配列を得るためにＰＣＲによって増幅した。
【０１７３】
ｐＫＭＤ１プラスミドをテンプレートとして用いて、ｐＫＭＤ１−ＰＦ：ＡＴＣＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧおよびｐＫＭＤ１−ＰＲ：ＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧのプライマーを使用することによって、ＰＣＲ増幅過程を実行した。１７μＬの増幅された生成物を採取し、次いで、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を加え、混合した後、３７℃で３時間、混合物をインキュベートし、プラスミド骨格の直鎖断片ｐＫＭＤ１−Ｔを得た。
６．２．１  ドナープラスミドｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＫＨ１２４Ｋの構築
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ＨＲ１−ＰＦ：ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＡＴＧＧＡＣＡＡＴＡＣＧＴＴＡＣＣＧＡＧＡＴＧＡＧＧおよびＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｋ−ＰＲ：ＡＧＣＡＴＧＡＡＧＧＴＣＡＧＴＴＴＴＡＣＡＧＡＣＡＣＣＧＧＡＧＴＡＣＴＴＧＡＣＧのプライマーを使用することによって、１つのＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＫＨ１２４Ｋ−Ｆ１と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｋ−ＰＦ：ＧＴＡＡＡＡＣＴＧＡＣＣＴＴＣＡＴＧＣＴＴＧＧＡＡＧＧＧＴＧＡＣＴＧＧＣＣＴＴＴＧおよびＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＲ：ＣＣＡＡＣＣＴＴＴＡＡＣＡＴＴＣＴＣＴＣＣＣＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＣＧＡＣＡＣＣＡＧのプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＫＨ１２４Ｋ−Ｆ２と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＦ：ＧＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＧＴＴＧＧＡＡＧＡＴＴＧＧＴＧＡＣＴＴＣＧＣＴＧＧおよびＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｋ−ＰＲ：ＣＣＡＴＣＴＴＴＴＧＴＡＴＡＴＣＣＡＣＴＣＡＡＧＴＣＡＧＣＴＴＣＴＧＧＡＣＡＧＴＴＧＧのプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＫＨ１２４Ｋ−Ｆ３と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｋ−ＰＦ：ＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＡＴＡＣＡＡＡＡＧＡＴＧＧＴＴＣＴＴＴＣＣＡＡＣＡＡＴＡＣＧＣＴＡＣＴＧＣおよびＫｌＡＤＨ１−ＨＲ２−ＰＲ：ＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＴＴＡＴＡＣＴＧＧＧＴＡＧＡＴＴＴＣＡＡＡＣＧＧＧＡＣのプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＫＨ１２４Ｋ−Ｆ４と名付けた。
【０１７４】
増幅された生成物ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＫＨ１２４Ｋ−Ｆ１、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＫＨ１２４Ｋ−Ｆ２、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＫＨ１２４Ｋ−Ｆ３、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＫＨ１２４Ｋ−Ｆ４およびｐＫＭＤ１−Ｔのそれぞれ１μＬを混合し、５μＬのＣｌｏｎｉｎｇ  Ｍｉｘを添加した。混合後、５０℃の水中に１時間、混合物を浸漬した。水浴後、混合物を２分間氷上に置いた。１０μＬの反応混合物を全て、５０μＬのＴｒａｎｓ−Ｔ１コンピテント細胞中に加えた。混合物を３０分間氷上に置き、４２℃で３０秒間、熱ショックを加えた後、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加し、次いで、３７℃で１時間、振盪しながら培養した。その後、Ａｍｐ耐性ＬＢ固体培地上に混合物を被覆し、次いで、単クローンのコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を実施した。６つの単クローンのコロニーを選び出し、次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性と検出され、配列決定によって確認された後、プラスミドを抽出および保存し、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＫＨ１２４Ｋと名付けた。
６．２．２  ドナープラスミドｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＮＨ１２４Ｋの構築
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ＨＲ１−ＰＦ：ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＡＴＧＧＡＣＡＡＴＡＣＧＴＴＡＣＣＧＡＧＡＴＧＡＧＧおよびＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｎ−ＰＲ：ＡＧＣＡＴＧＡＡＧＧＴＣＡＧＴＡＴＴＡＣＡＧＡＣＡＣＣＧＧＡＧＴＡＣＴＴＧＡＣＧのプライマーを使用することによって、１つのＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＮＨ１２４Ｋ−Ｆ１と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｎ−ＰＦ：ＧＴＡＡＴＡＣＴＧＡＣＣＴＴＣＡＴＧＣＴＴＧＧＡＡＧＧＧＴＧＡＣＴＧＧＣＣＴＴＴＧおよびＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＲ：ＣＣＡＡＣＣＴＴＴＡＡＣＡＴＴＣＴＣＴＣＣＣＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＣＧＡＣＡＣＣＡＧのプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＮＨ１２４Ｋ−Ｆ２と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＦ：ＧＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＧＴＴＧＧＡＡＧＡＴＴＧＧＴＧＡＣＴＴＣＧＣＴＧＧおよびＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｋ−ＰＲ：ＣＣＡＴＣＴＴＴＴＧＴＡＴＡＴＣＣＡＣＴＣＡＡＧＴＣＡＧＣＴＴＣＴＧＧＡＣＡＧＴＴＧＧのプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＮＨ１２４Ｋ−Ｆ３と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｋ−ＰＦ：ＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＡＴＡＣＡＡＡＡＧＡＴＧＧＴＴＣＴＴＴＣＣＡＡＣＡＡＴＡＣＧＣＴＡＣＴＧＣおよびＫｌＡＤＨ１−ＨＲ２−ＰＲ：ＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＴＴＡＴＡＣＴＧＧＧＴＡＧＡＴＴＴＣＡＡＡＣＧＧＧＡＣのプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＮＨ１２４Ｋ−Ｆ４と名付けた。
【０１７５】
増幅された生成物ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＮＨ１２４Ｋ−Ｆ１、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＮＨ１２４Ｋ−Ｆ２、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＮＨ１２４Ｋ−Ｆ３、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＮＨ１２４Ｋ−Ｆ４およびｐＫＭＤ１−Ｔのそれぞれ１μＬを混合し、５μＬのＣｌｏｎｉｎｇ  Ｍｉｘを添加した。混合後、５０℃の水中に１時間、混合物を浸漬した。水浴後、混合物を２分間氷上に置いた。１０μＬの反応混合物を全て、５０μＬのＴｒａｎｓ−Ｔ１コンピテント細胞中に加えた。混合物を３０分間氷上に置き、４２℃で３０秒間、熱ショックを加えた後、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加し、次いで、３７℃で１時間、振盪しながら培養した。その後、Ａｍｐ耐性ＬＢ固体培地上に混合物を被覆し、次いで、単クローンのコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を実施した。６つの単クローンのコロニーを選び出し、次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性と検出され、配列決定によって確認された後、プラスミドを抽出および保存し、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＮＨ１２４Ｋと名付けた。
６．２．３  ドナープラスミドｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＱＨ１２４Ｋの構築
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ＨＲ１−ＰＦ：ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＡＴＧＧＡＣＡＡＴＡＣＧＴＴＡＣＣＧＡＧＡＴＧＡＧＧおよびＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｑ−ＰＲ：ＡＧＣＡＴＧＡＡＧＧＴＣＡＧＴＴＴＧＡＣＡＧＡＣＡＣＣＧＧＡＧＴＡＣＴＴＧＡＣＧのプライマーを使用することによって、１つのＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＱＨ１２４Ｋ−Ｆ１と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｑ−ＰＦ：ＧＴＣＡＡＡＣＴＧＡＣＣＴＴＣＡＴＧＣＴＴＧＧＡＡＧＧＧＴＧＡＣＴＧＧＣＣＴＴＴＧおよびＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＲ：ＣＣＡＡＣＣＴＴＴＡＡＣＡＴＴＣＴＣＴＣＣＣＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＣＧＡＣＡＣＣＡＧのプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＱＨ１２４Ｋ−Ｆ２と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＦ：ＧＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＧＴＴＧＧＡＡＧＡＴＴＧＧＴＧＡＣＴＴＣＧＣＴＧＧおよびＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｋ−ＰＲ：ＣＣＡＴＣＴＴＴＴＧＴＡＴＡＴＣＣＡＣＴＣＡＡＧＴＣＡＧＣＴＴＣＴＧＧＡＣＡＧＴＴＧＧのプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＱＨ１２４Ｋ−Ｆ３と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｋ−ＰＦ：ＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＡＴＡＣＡＡＡＡＧＡＴＧＧＴＴＣＴＴＴＣＣＡＡＣＡＡＴＡＣＧＣＴＡＣＴＧＣおよびＫｌＡＤＨ１−ＨＲ２−ＰＲ：ＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＴＴＡＴＡＣＴＧＧＧＴＡＧＡＴＴＴＣＡＡＡＣＧＧＧＡＣのプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＱＨ１２４Ｋ−Ｆ４と名付けた。
【０１７６】
増幅された生成物ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＱＨ１２４Ｋ−Ｆ１、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＱＨ１２４Ｋ−Ｆ２、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＱＨ１２４Ｋ−Ｆ３、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＱＨ１２４Ｋ−Ｆ４およびｐＫＭＤ１−Ｔのそれぞれ１μＬを混合し、５μＬのＣｌｏｎｉｎｇ  Ｍｉｘを添加した。混合後、５０℃の水中に１時間、混合物を浸漬した。水浴後、混合物を２分間氷上に置いた。１０μＬの反応混合物を全て、５０μＬのＴｒａｎｓ−Ｔ１コンピテント細胞中に加えた。混合物を３０分間氷上に置き、４２℃で３０秒間、熱ショックを加えた後、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加し、次いで、３７℃で１時間、振盪しながら培養した。その後、Ａｍｐ耐性ＬＢ固体培地上に混合物を被覆し、次いで、単クローンのコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を実施した。６つの単クローンのコロニーを選び出し、次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性と検出され、配列決定によって確認された後、プラスミドを抽出および保存し、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＱＨ１２４Ｋと名付けた。
６．２．４  ドナープラスミドｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＲＨ１２４Ｋの構築
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ＨＲ１−ＰＦ：ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＡＴＧＧＡＣＡＡＴＡＣＧＴＴＡＣＣＧＡＧＡＴＧＡＧＧおよびＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｒ−ＰＲ：ＡＧＣＡＴＧＡＡＧＧＴＣＡＧＴＴＣＴＡＣＡＧＡＣＡＣＣＧＧＡＧＴＡＣＴＴＧＡＣＧのプライマーを使用することによって、１つのＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＲＨ１２４Ｋ−Ｆ１と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｒ−ＰＦ：ＧＴＡＧＡＡＣＴＧＡＣＣＴＴＣＡＴＧＣＴＴＧＧＡＡＧＧＧＴＧＡＣＴＧＧＣＣＴＴＴＧおよびＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＲ：ＣＣＡＡＣＣＴＴＴＡＡＣＡＴＴＣＴＣＴＣＣＣＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＣＧＡＣＡＣＣＡＧのプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＲＨ１２４Ｋ−Ｆ２と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＦ：ＧＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＧＴＴＧＧＡＡＧＡＴＴＧＧＴＧＡＣＴＴＣＧＣＴＧＧおよびＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｋ−ＰＲ：ＣＣＡＴＣＴＴＴＴＧＴＡＴＡＴＣＣＡＣＴＣＡＡＧＴＣＡＧＣＴＴＣＴＧＧＡＣＡＧＴＴＧＧのプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＲＨ１２４Ｋ−Ｆ３と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｋ−ＰＦ：ＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＡＴＡＣＡＡＡＡＧＡＴＧＧＴＴＣＴＴＴＣＣＡＡＣＡＡＴＡＣＧＣＴＡＣＴＧＣおよびＫｌＡＤＨ１−ＨＲ２−ＰＲ：ＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＴＴＡＴＡＣＴＧＧＧＴＡＧＡＴＴＴＣＡＡＡＣＧＧＧＡＣのプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＲＨ１２４Ｋ−Ｆ４と名付けた。
【０１７７】
増幅された生成物ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＲＨ１２４Ｋ−Ｆ１、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＲＨ１２４Ｋ−Ｆ２、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＲＨ１２４Ｋ−Ｆ３、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＲＨ１２４Ｋ−Ｆ４およびｐＫＭＤ１−Ｔのそれぞれ１μＬを混合し、５μＬのＣｌｏｎｉｎｇ  Ｍｉｘを添加した。混合後、５０℃の水中に１時間、混合物を浸漬した。水浴後、混合物を２分間氷上に置いた。１０μＬの反応混合物を全て、５０μＬのＴｒａｎｓ−Ｔ１コンピテント細胞中に加えた。混合物を３０分間氷上に置き、４２℃で３０秒間、熱ショックを加えた後、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加し、次いで、３７℃で１時間、振盪しながら培養した。その後、Ａｍｐ耐性ＬＢ固体培地上に混合物を被覆し、次いで、単クローンのコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を実施した。６つの単クローンのコロニーを選び出し、次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性と検出され、配列決定によって確認された後、プラスミドを抽出および保存し、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＲＨ１２４Ｋと名付けた。
６．３  Ｋ．ｌａｃｔｉｓの電気形質転換（実施例２．３と同じ）
６．４  陽性の同定
形質転換された細胞を有するプレートから、１２〜２４の単クローンのコロニーを選び出した。細胞をテンプレートとして用いて、ＡＤＨ１−ｍ−ＣＦ：ＴＧＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＧＴおよびＡＤＨ１−ｍ−ＣＲ：ＴＧＡＣＧＧＴＣＧＴＴＡＡＣＴＡＡＧＡＴの同定プライマーを使用するＰＣＲによって、試料を検出した。ＰＣＲによって陽性を検査され、配列決定によって同定された株を、陽性の株として決定し、それぞれ、ＡＤＨ１  Ｈ４７ＫＨ１２４Ｋ、ＡＤＨ１  Ｈ４７ＮＨ１２４Ｋ、ＡＤＨ１  Ｈ４７ＱＨ１２４ＫおよびＡＤＨ１  Ｈ４７ＲＨ１２４Ｋと名付けた。
［実施例７］
ＫｌＡＤＨ１改造された細胞株の内因性タンパク質のＮｉ媒体への結合能力の分析
７．１  タンパク質精製系のための試薬調製
結合緩衝液：０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．９。
【０１７８】
洗浄緩衝液：０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、６０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．９。
７．２  ＫｌＡＤＨ１改造された細胞株中の内因性タンパク質の精製および内因性タンパク質のＮｉ媒体への結合能力の分析
結合緩衝液によって、Ｎｉ−ＮＴＡビーズを平衡化し、適切な量のＫｌＡＤＨ１改造された細胞株の細胞溶解物を添加し、４℃で６０分間インキュベートし、洗浄緩衝液でビーズを洗浄し、洗浄緩衝液の除去後に、少量の搭載緩衝液を加え、９６℃で５分間の処理を実施した。上記試料をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。
［実施例８］
インビトロタンパク質合成系
８．１  インビトロタンパク質合成系のための保存溶液の調製
最終濃度：２２ｍＭ  ４−ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸（７．４のｐＨ）、３０〜１５０ｍＭ酢酸カリウム、１．０〜５．０ｍＭ酢酸マグネシウム、１．５〜４ｍＭのヌクレオシド三リン酸（アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）およびウリジン三リン酸（ＵＴＰ））の混合物、０．０８〜０．２４ｍＭのアミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、セリン、チロシン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニンおよびヒスチジン）の混合物、２５ｍＭホスホクレアチン、１．７ｍＭジチオスレイトール、０．２７ｍｇ／ｍＬクレアチンホスホキナーゼ、０．０２７〜０．０５４ｍｇ／ｍＬ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、１％〜４％ＰＥＧ、０．５％〜２％スクロースおよび最後に添加される５０体積％の細胞抽出物。
８．２  インビトロタンパク質合成反応
上記反応系を２０〜３０℃の環境中に置き、反応のために、２〜１２時間、混合物を放置した。
【０１７９】
増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）の活性のアッセイ：反応の数時間後に、９６ウェル白色プレートまたは３８４ウェル白色プレート中に、１０μＬの反応溶液を加え、その後に、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  ２１２０多機能マイクロプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）中に、混合物を直ちに配置し、増強緑色蛍光タンパク質の活性を検出するために、吸光度を読み取り、ここで、活性の単位は、図２４に示されているように、相対的蛍光単位（ＲＦＵ）値である。
［実施例９］
インビトロタンパク質合成および精製
９．１  インビトロタンパク質合成
野生型細胞株と比較して、ΔＡＤＨ１細胞株は著しく低下した無細胞系転写−翻訳活性を有するのに対して、ＡＤＨ１  Ｈ４７Ｋ細胞株は明らかな変化を有さなかったという結果に照らして、ＡＤＨ１  Ｈ４７Ｋが、本発明者らのインビトロタンパク質合成研究のための材料となった。ＡＤＨ１  Ｈ４７Ｋ細胞株の無細胞転写−翻訳系を、Ｎ−Ｈｉｓ８−ｅＧＦＰおよびＮ−Ｈｉｓ８−Ｓｔｒｅｐ−ＧＦＰのテンプレートとともに添加した。上記反応系を２０〜３０℃の環境中に置き、２〜１２時間の反応のために混合物を放置した。
９．２  インビトロタンパク質精製
結合緩衝液によって、Ｎｉ−ＮＴＡビーズを平衡化し、適切な量の上記反応系を添加し、４℃で６０分間インキュベートし、洗浄緩衝液でビーズを洗浄し、洗浄緩衝液の除去後に、少量の搭載緩衝液を加え、９６℃で５分間の処理を実施した。上記試料をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。結果が、図２５に示されている。
本発明の実施例の結果は、以下のことを示す。
【０１８０】
本発明の実施例７の結果は、野生型細胞株と比べて、本発明の改造された細胞株によってＮｉ媒体への親和性は全て、著しく低下されることを示した。
【０１８１】
それらのうち、ΔＡＤＨ１、ＡＤＨ１  Ｈ４７Ｋ、ＡＤＨ１  Ｈ４７Ｎ、ＡＤＨ１  Ｈ５１Ｒ、ＡＤＨ１  Ｈ１２４Ｋ、ＡＤＨ１  Ｈ４７ＫＨ１２４ＫおよびＡＤＨ１  Ｈ４７ＮＨ１２４Ｋなどの細胞株は、Ｎｉ媒体と最も低い親和性を有した。
【０１８２】
ΔＡＤＨ１、ＡＤＨ１  Ｈ４７Ｋ、ＡＤＨ１  Ｈ４７Ｎ、ＡＤＨ１  Ｈ５１Ｒ、ＡＤＨ１  Ｈ１２４Ｋ、ＡＤＨ１  Ｈ４７ＫＨ１２４ＫおよびＡＤＨ１  Ｈ４７ＮＨ１２４ＫはＮｉ媒体に対して類似の親和性を有し、本発明は、無細胞系転写−翻訳活性を分析するために、ΔＡＤＨ１およびＡＤＨ１  Ｈ４７Ｋを選択した。
【０１８３】
結果を図２４に示した。野生型無細胞系の転写−翻訳活性の相対的蛍光単位（ＲＦＵ）値は４４２であり、ΔＡＤＨ１無細胞系のＲＦＵ値は１２であって、これは野生型無細胞系のＲＦＵ値より著しく低く、ＡＤＨ１遺伝子のノックアウトが無細胞系転写−翻訳活性に対して大きな負の影響を有したことを示している。ＡＤＨ１  Ｈ４７Ｋの無細胞系の相対的蛍光単位（ＲＦＵ）値は４１９であり、野生型細胞株のＲＦＵ値と比較して著しい変化を有していなかった。
【０１８４】
他の変異細胞株の無細胞系転写−翻訳活性を分析するために、同じ方法を使用した。結果は、他の変異細胞株の無細胞系転写−翻訳活性の相対的蛍光単位（ＲＦＵ）値は３００〜４００であり、野生型細胞株の無細胞系転写−翻訳活性のＲＦＵ値と実質的に等しい値であった。
【０１８５】
さらに、本発明のＫｌＡＤＨ１  Ｈ４７Ｋの無細胞転写−翻訳系中での外来性タンパク質Ｎ−Ｈｉｓ８−ｅＧＦＰおよびＮ−Ｈｉｓ８−Ｓｔｒｅｐ−ｅＧＦＰの発現純度を分析した。結果を図２５に示した。野生型細胞株（ＷＴ）と比較して、ＫｌＡＤＨ１  Ｈ４７Ｋ細胞株は３７ｋＤに著しく弱まったＡＤＨ１タンパク質バンドを示し、ＫｌＡＤＨ１  Ｈ４７Ｋの無細胞転写−翻訳系において、外来性タンパク質Ｎ−Ｈｉｓ８−ｅＧＦＰおよびＮ−Ｈｉｓ８−Ｓｔｒｅｐ−ｅＧＦＰの純度が著しく改善されたことを示している。
【０１８６】
同じ方法を使用することによって、他の変異細胞株の純度を分析した。結果は、外来性タンパク質Ｎ−Ｈｉｓ８−ｅＧＦＰおよびＮ−Ｈｉｓ８−Ｓｔｒｅｐ−ｅＧＦＰの純度が、野生型細胞株（ＷＴ）の純度と比較して、他の変異細胞株の無細胞転写−翻訳系においても著しく改善されることを示した。
【０１８７】
上記結果は全て、本発明におけるＡＤＨファミリータンパク質の部位特異的変異はＡＤＨファミリータンパク質のＮｉ媒体への結合能力を低下させることができるのみならず、株の無細胞系転写−翻訳活性に影響を与えず、細胞株の無細胞系転写−翻訳活性における外来性タンパク質の発現純度をさらに効果的に改善できることを示している。
【０１８８】
本発明で言及されている全ての文書は、各文献が参考文献として個別に引用されているのと同様に、本願における参考文献として引用される。さらに、当業者は、上記教示に照らして、本発明に様々な変更または改変を施すことができること、均等物も本願の添付された特許請求の範囲によって定義されている範囲に属することが理解されるべきである。
【図１】
2021525528.tif 000006
【図２】
2021525528.tif 000007
【図３】
2021525528.tif 000008
【図４】
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【図５】
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【図６】
2021525528.tif 000011
【図７】
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【図８】
2021525528.tif 000013
【図９】
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【図１０】
2021525528.tif 000015
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年3月8日(2021.3.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
別の好ましい実施形態において、Ｎｉは、以下の群：ニッケル元素、ニッケルイオン、遊離のニッケルイオン、ニッケルが結合されているクロマトグラフィー媒体、Ｎｉ２＋、Ｎｉビーズ、Ｎｉ−ＮＴＡおよびこれらの組み合わせから選択される。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
第八の態様によれば、本発明は、遺伝子改変された株が提供され、ここで内因性ＡＤＨタンパク質をコードする遺伝子は本発明の第一の態様に従う変異タンパク質をコードするポリヌクレオチドに変異され、内因性ＡＤＨタンパク質はＮｉ媒体に親和性を有し、変異タンパク質はＡＤＨ活性及びＮｉ媒体への低下した結合能力を有する。
いくつかの好ましい実施形態において、遺伝子改変された株は酵母に由来する。
いくつかの好ましい実施形態において、遺伝子改変された株はＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓに由来する。
いくつかの好ましい実施形態において、遺伝子改変された株はＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓに由来する。
第九の態様によれば、本発明は、本発明の第八の態様に従う遺伝子改変された株の細胞溶解物を提供する。
第十の態様によれば、本発明は、本発明の第九の態様に従う細胞溶解物を含むインビトロタンパク質合成系を提供する。
いくつかの好ましい実施形態において、インビトロタンパク質合成系は、無細胞系である。
いくつかの好ましい実施形態において、インビトロタンパク質合成系は、無細胞転写及び翻訳系である。
第十一の態様によれば、本発明は、本発明の第一の態様に従うＡＤＨ変異タンパク質を含む酵素調製物を提供する。
第十二の態様によれば、本発明は、本発明の第八の態様に従う遺伝子改変された株を製造する方法を提供する。
第十三の態様によれば、本発明は、本発明の第八の態様に従う遺伝子改変された株、又は本発明の第九の態様に従う細胞溶解物、又はタンパク質合成に適用可能な本発明の第十の態様に従うインビトロタンパク質合成系の使用を提供し、精製にＮｉ媒体を用いたとき、改善された発現タンパク質の生成物純度が提供される。
本発明の範囲内において、上記技術的特徴および本明細書の以下に具体的に記載されている技術的特徴（例えば、実施形態または実施例）は互いに組み合わせることができ、これにより、新たなまたは好ましい技術的解決策を形成することが理解されるべきである。簡潔にするために、詳細は本明細書では繰り返されない。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
【図１】図１は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓゲノム中のＡＤＨ１遺伝子を改造してＮｉ媒体へのその結合を除去するための設計経路を示す。
【図２】図２は、ＫｌＡＤＨファミリータンパク質ＡＤＨ１〜４の配列相同性比較を示す。黒い領域は、配列が高い相同性を有することを表す。
【図３】図３は、ＫｌＡＤＨ１とＳｃＡＤＨ１の間の配列相同性比較を示し、２つの間の配列相同性は８４．９％である。
【図４】図４は、２ＨＣＹをテンプレートとして用いるＫｌＡＤＨ４の相同性モデリングを示す。２ＨＣＹおよびＫｌＡＤＨ４はいずれも四量体であり、各単量体の６Ｈｉｓ集合領域は、それぞれ、枠によって表されている。
【図５】図５は、ＳｃＡＤＨ１四量体の構造図を示す。２つのサブユニットＡおよびＢは、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋結合ドメインを通じて二量体を形成し、２つのＡＢ二量体は「背中合わせ」の四量体を形成する。
【図６】図６は、ＳｃＡＤＨ１中のＨ６６周囲のアミノ酸構造の図を示す。Ｈ６６は、ＡＤＨ１の２つの立体構造において、触媒性Ｚｎ２＋をキレートすることに関与している。図ＡはＮＡＤが結合されている閉じた立体構造を示し、図ＢはＮＡＤが結合されていない開いた立体構造を示す。
【図７】図７は、ＳｃＡＤＨ１中のＨ４８周囲のアミノ酸構造の図を示す。Ｈ４８は、三元複合体の形成に関与しており、基質のプロトン移動過程に影響を与える。
【図８】図８は、ＳｃＡＤＨ１中のＨ４４周囲のアミノ酸構造の図を示す。Ｈ４４のイミダゾール環上のＮＤ１は、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨの結合に関与する可能性がある。
【図９】図９は、ｐＫＭＣａｓ９＿ＳｔＲ＿ＫｌＡＤＨ１のプラスミドプロファイルを示す。該プラススミドは、ｔＲＮＡ−Ｔｙｒプロモーター、ＳＮＲ５２ターミネーターおよびｋａｎａ選択マーカーを有する。
【図１０】図１０は、ｐＫＭＤ１−ΔＫｌＡＤＨ１のプラスミドプロファイルを示す。相同性アーム１および相同性アーム２は、それぞれ、ＫｌＡＤＨ１遺伝子のＯＲＦの約８００ｂｐ上流および下流に位置する遺伝子配列であり、プラスミドはＡｍｐ選択マーカーを有する。
【図１１】図１１は、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｋのプラスミドプロファイルを示す。相同性アーム１および相同性アーム２は、それぞれ、ＫｌＡＤＨ１遺伝子のＯＲＦの約８００ｂｐ上流および下流に位置する遺伝子配列であり、プラスミドはＡｍｐ選択マーカーを有する。
【図１２】図１２は、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｎのプラスミドプロファイルを示す。相同性アーム１および相同性アーム２は、それぞれ、ＫｌＡＤＨ１遺伝子のＯＲＦの約８００ｂｐ上流および下流に位置する遺伝子配列であり、プラスミドはＡｍｐ選択マーカーを有する。
【図１３】図１３は、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｑのプラスミドプロファイルを示す。相同性アーム１および相同性アーム２は、それぞれ、ＫｌＡＤＨ１遺伝子のＯＲＦの約８００ｂｐ上流および下流に位置する遺伝子配列であり、プラスミドはＡｍｐ選択マーカーを有する。
【図１４】図１４は、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｒのプラスミドプロファイルを示す。相同性アーム１および相同性アーム２は、それぞれ、ＫｌＡＤＨ１遺伝子のＯＲＦの約８００ｂｐ上流および下流に位置する遺伝子配列であり、プラスミドはＡｍｐ選択マーカーを有する。
【図１５】図１５は、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ５１Ｋのプラスミドプロファイルを示す。相同性アーム１および相同性アーム２は、それぞれ、ＫｌＡＤＨ１遺伝子のＯＲＦの約８００ｂｐ上流および下流に位置する遺伝子配列であり、プラスミドはＡｍｐ選択マーカーを有する。
【図１６】図１６は、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ５１Ｒのプラスミドプロファイルを示す。相同性アーム１および相同性アーム２は、それぞれ、ＫｌＡＤＨ１遺伝子のＯＲＦの約８００ｂｐ上流および下流に位置する遺伝子配列であり、プラスミドはＡｍｐ選択マーカーを有する。
【図１７】図１７は、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｋのプラスミドプロファイルを示す。相同性アーム１および相同性アーム２は、それぞれ、ＫｌＡＤＨ１遺伝子のＯＲＦの約８００ｂｐ上流および下流に位置する遺伝子配列であり、プラスミドはＡｍｐ選択マーカーを有する。
【図１８】図１８は、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｒのプラスミドプロファイルを示す。相同性アーム１および相同性アーム２は、それぞれ、ＫｌＡＤＨ１遺伝子のＯＲＦの約８００ｂｐ上流および下流に位置する遺伝子配列であり、プラスミドはＡｍｐ選択マーカーを有する。
【図１９】図１９は、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＫＨ１２４Ｋのプラスミドプロファイルを示す。相同性アーム１および相同性アーム２は、それぞれ、ＫｌＡＤＨ１遺伝子のＯＲＦの約８００ｂｐ上流および下流に位置する遺伝子配列であり、プラスミドはＡｍｐ選択マーカーを有する。
【図２０】図２０は、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＮＨ１２４Ｋのプラスミドプロファイルを示す。相同性アーム１および相同性アーム２は、それぞれ、ＫｌＡＤＨ１遺伝子のＯＲＦの約８００ｂｐ上流および下流に位置する遺伝子配列であり、プラスミドはＡｍｐ選択マーカーを有する。
【図２１】図２１は、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＱＨ１２４Ｋのプラスミドプロファイルを示す。相同性アーム１および相同性アーム２は、それぞれ、ＫｌＡＤＨ１遺伝子のＯＲＦの約８００ｂｐ上流および下流に位置する遺伝子配列であり、プラスミドはＡｍｐ選択マーカーを有する。
【図２２】図２２は、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＲＨ１２４Ｋのプラスミドプロファイルを示す。相同性アーム１および相同性アーム２は、それぞれ、ＫｌＡＤＨ１遺伝子のＯＲＦの約８００ｂｐ上流および下流に位置する遺伝子配列であり、プラスミドはＡｍｐ選択マーカーを有する。
【図２３】図２３は、Ｎｉ−ＮＴＡによる精製のポリアクリルアミドゲル分析を示す。図に示されているように、ＫｌＡＤＨ１遺伝子のノックアウトおよび異なる位置でのＨｉｓ変異は、Ｎｉ−ＮＴＡへのＫｌＡＤＨ１の親和性を著しく低下させることができる。標的バンドのサイズは約３７ＫＤであり、バンドは、左から右へ、それぞれ、マーカー、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ野生型細胞株ＷＴ、ＫｌＡＤＨ１がノックアウトされている細胞株ΔＡＤＨ１、ＫｌＡＤＨ１の単一変異を有する細胞株Ｈ４７Ｋ、Ｈ４７Ｎ、Ｈ４７Ｒ、Ｈ５１Ｋ、Ｈ１２４Ｋ、Ｈ１２４ＫＨ４７ＫおよびＨ１２４ＫＨ４７Ｎを表す。
【図２４】図２４は、野生型細胞株ＷＴ、ＫｌＡＤＨ１がノックアウトされている細胞株ΔＡＤＨ１およびＫｌＡＤＨ１の単一変異を有する細胞株Ｈ４７Ｋの無細胞転写−翻訳活性の分析を示す。図に示されているように、バンドは、それぞれ、左から右に、ΔＡＤＨ１、ＫｌＡＤＨ１  Ｈ４７Ｋ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ野生型細胞株ＷＴおよび陰性対照を表す。
【図２５】図２５は、野生型細胞株ＷＴおよびＫｌＡＤＨ１の単一変異を有する細胞株Ｈ４７Ｋ（Ｍｕｔ）の無細胞転写−翻訳によって調製された標的タンパク質の精製分析を示す。図に示されているように、バンドは、それぞれ、左から右に、ＫｌＡＤＨ１の単一変異を有する細胞株Ｈ４７Ｋ（Ｍｕｔ）およびＫ．ｌａｃｔｉｓ野生型細胞株ＷＴを表す。図Ａは、外来性標的タンパク質を添加しない、ＫｌＡＤＨ１とＮｉ−ＮＴＡ間の親和性分析を示す。図Ｂは、ＫｌＡＤＨ１の単一変異を有する細胞株Ｈ４７Ｋの無細胞転写−翻訳系に標的タンパク質Ｎ−Ｈｉｓ８−ｅＧＦＰが添加されたときの、ｅＧＦＰの精製分析を示す。図Ｃは、ＫｌＡＤＨ１の単一変異を有する細胞株Ｈ４７Ｋの無細胞転写−翻訳系に標的タンパク質Ｎ−Ｈｉｓ８−Ｓｔｒｅｐ−ｅＧＦＰが添加されたときの、Ｓｔｒｅｐ−ｅＧＦＰの精製分析を示す。
【図２６】図２６は、それぞれ、ＫｌＡＤＨ１遺伝子のノックアウトおよびＫｌＡＤＨ１遺伝子に対する部位特異的変異によって、標的タンパク質の純度および特異性を改善するための、ＫｌＡＤＨ１のＮｉ媒体への結合能の除去を要約する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５４】
したがって、本発明では、ＡＤＨ１遺伝子のノックアウトならびにＨ４７、Ｈ５１およびＨ１２４の部位特異的変異において具体的に示されているとおり、Ｎｉ媒体へのＡＤＨ１の結合を低下させるための例としてＡＤＨ１を採用する。ＡＤＨ１に対する方法と類似の方法を使用することによって、ＡＤＨ２、ＡＤＨ３およびＡＤＨ４も対応する部位において改変操作することができる。
［実施例２］
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介したＡＤＨ１遺伝子の標的化されたノックアウト
２．１  ＫｌＡＤＨ１  ＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡ配列の決定
ＫｌＡＤＨ１中に設計された点変異にしたがって、ＰＡＭ配列（ＮＧＧ）を選択し、対応するｇＲＮＡ配列を決定した。本実施例においてｇＲＮＡを選択するための原理は以下のとおりである：ＧＣ含量は中程度（４０％〜６０％）であるべきであり、ポリＴ構造の存在は回避すべきである。この実施形態において、ＫｌＡＤＨ１  ｇＲＮＡ１配列は、ＴＧＧＧＴＧＡＡＡＡＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣ（配列番号：３３）である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５５】
プラスミド構築および形質転換のための方法は以下のとおりである：プライマーｐＫＭＣａｓ９−ＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ＰＦ：ＴＧＧＧＴＧＡＡＡＡＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣ（配列番号：３４）およびｐＣａｓ９−ＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ＰＲ：ＧＣＣＣＴＴＧＡＣＧＴＴＴＴＣＡＣＣＣＡＡＡＡＧＴＣＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＣＧ（配列番号：３５）を使用し、ｐＣＡＳプラスミドをテンプレートとして使用して、ＰＣＲ増幅を行った。１７μＬの増幅された生成物を採取し、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を加え、混合した後、３７℃で３時間、混合物をインキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理された混合物を５０μＬのＤＨ５αコンピテント細胞中に加えた。混合物を３０分間氷上に置き、４２℃で４５秒間、熱ショックを加えた後、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加し、次いで、３７℃で１時間、振盪しながら培養した。その後、Ｋａｎ耐性ＬＢ固体培地上に混合物を被覆し、次いで、単クローンのコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を実施した。２つの単クローンのコロニーを選び出し、次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性と検出され、配列決定によって確認された後、プラスミドを抽出および保存し、ｐＫＭＣａｓ９＿ＳｔＲ＿ＫｌＡＤＨ１と名付けた。
２．２  ドナーＤＮＡプラスミドの構築および増幅
本実施例では、直鎖ドナーＤＮＡの保存および増幅を容易にするために、ドナーＤＮＡをｐＫＭＤ１プラスミド中にまず挿入し、次いで、直鎖ドナーＤＮＡ配列を得るためにＰＣＲによって増幅した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５６】
ｐＫＭＤ１プラスミドをテンプレートとして用いて、ｐＫＭＤ１−ＰＦ：ＡＴＣＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧ（配列番号：３６）およびｐＫＭＤ１−ＰＲ：ＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧ（配列番号：３７）のプライマーを使用することによって、ＰＣＲ増幅過程を実行した。１７μＬの増幅された生成物を採取し、次いで、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を加え、混合した後、３７℃で３時間、混合物をインキュベートし、プラスミド骨格の直鎖断片ｐＫＭＤ１−Ｔを得た。
２．２．１  ドナープラスミドｐＫＭＤ１−ΔＫｌＡＤＨ１の構築
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ＨＲ１−ＰＦ：ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＡＴＧＧＡＣＡＡＴＡＣＧＴＴＡＣＣＧＡＧＡＴＧＡＧＧ（配列番号：３８）およびＫｌＡＤＨ１−ＨＲ１−ＰＲ：ＧＡＡＧＡＧＡＴＴＴＣＡＴＴＴＡＴＣＴＴＴＴＴＴＴＡＧＴＡＴＡＧＡＧＴＴＴＧＴＧＴＧＴＴＴＡＡＡＧＣＴＴＧ（配列番号：３９）のプライマーを使用することによって、１つのＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をΔＫｌＡＤＨ１−Ｆ１と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ＨＲ２−ＰＦ：ＣＡＡＡＣＴＣＴＡＴＡＣＴＡＡＡＡＡＡＡＧＡＴＡＡＡＴＧＡＡＡＴＣＴＣＴＴＣＣＧＣＡＴＴＣＡＡＧＴＣＡＴＧＡＣ（配列番号：４０）およびＫｌＡＤＨ１−ＨＲ２−ＰＲ：ＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＴＴＡＴＡＣＴＧＧＧＴＡＧＡＴＴＴＣＡＡＡＣＧＧＧＡＣ（配列番号：４１）のプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をΔＫｌＡＤＨ１−Ｆ２と名付けた。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５７】
１μＬのそれぞれの増幅された生成物ΔＫｌＡＤＨ１−Ｆ１、ΔＫｌＡＤＨ１−Ｆ２およびｐＫＭＤ１−Ｔを混合し、５μＬのＣｌｏｎｉｎｇ  Ｍｉｘ（ＴｒａｎｓＧｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙから得られるＴｒａｎｓｇｅｎｅ  ｐＥＡＳＹ−Ｕｎｉ  Ｓｅａｍｌｅｓｓ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｋｉｔという名称のキット、以下同様）および２μＬの水を加えた。混合後、５０℃の水中に１時間、混合物を浸漬した。水浴後、混合物を２分間氷上に置いた。１０μＬの反応混合物を全て、５０μＬのＴｒａｎｓ−Ｔ１コンピテント細胞（ＴｒａｎｓＧｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙから得られる、以下同様）中に加えた。混合物を３０分間氷上に置き、４２℃で３０秒間、熱ショックを加えた後、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加し、次いで、３７℃で１時間、振盪しながら培養した。その後、Ａｍｐ耐性ＬＢ固体培地上に混合物を被覆し、次いで、単クローンのコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を実施した。６つの単クローンのコロニーを選び出し、次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性と検出され、配列決定によって確認された後、プラスミドを抽出および保存し、ｐＫＭＤ１−ΔＫｌＡＤＨ１と名付けた。
２．３  Ｋ．ｌａｃｔｉｓの電気形質転換
コンピテント細胞を−８０℃の冷凍庫から取り出し、氷上で融解し、４００ｎｇのｇＲＮＡおよびＣａｓ９プラスミド（またはｇＲＮＡ／ｃａｓ９断片）および１０００ｎｇのドナーＤＮＡ断片を加えた。混合後、混合物を電気穿孔キュベット中に移し、２分間氷中に浸した。（１．５ｋＶ、２００Ωおよび２５μＦのパラメータでの）電気ショックのために、電気穿孔キュベットを電気穿孔装置の中に置いた。電気ショックの完了後、混合物に７００μＬのＹＰＤを直ちに加え、次いで、２００ｒｐｍの速度で、３０℃で１〜３時間、振盪機上でインキュベートした。２〜２００μＬの混合物を採り、ＹＰＤ（Ｇ４１８耐性を有する）プレート上に播種し、単クローンのコロニーが出現するまで、３０℃で２〜３日間培養した。
２．４  陽性の同定
形質転換された細胞を有するプレートから、１２〜２４の単クローンのコロニーを選び出した。細胞をテンプレートとして用いて、ＡＤＨ１−ＣＦ：ＧＴＧＡＴＧＧＡＡＣＡＣＧＧＧＡＡＴＡＧ（配列番号：４２）およびＡＤＨ１−ＣＲ：ＣＡＣＡＴＡＴＡＣＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＧ（配列番号：４３）の同定プライマーを使用するＰＣＲによって、試料を検出した。ＰＣＲによって陽性を検査され、配列決定によって同定された株を、陽性の株として決定し、ΔＡＤＨ１と名付けた。
［実施例３］
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＡＤＨ１  Ｈ４７部位の部位特異的変異
３．１  ＫｌＡＤＨ１  ＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡ配列の決定
ＫｌＡＤＨ１中に設計された点変異にしたがって、ＰＡＭ配列（ＮＧＧ）を選択し、対応するｇＲＮＡ配列を決定した。本実施例においてｇＲＮＡを選択するための原理は以下のとおりである：ｇＲＮＡは設計された変異部位の近くにあるべきであり、ＧＣ含量は中程度（４０％〜６０％）であるべきであり、ポリＴ構造の存在は回避すべきである。この実施形態において、ＫｌＡＤＨ１  ｇＲＮＡ１配列は、ＴＧＧＧＴＧＡＡＡＡＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣ（配列番号：３３）である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５８】
プラスミド構築および形質転換のための方法は以下のとおりである：プライマーｐＣａｓ９−ＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ＰＦ：ＴＧＧＧＴＧＡＡＡＡＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣ（配列番号：３４）およびｐＣａｓ９−ＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ＰＲ：ＧＣＣＣＴＴＧＡＣＧＴＴＴＴＣＡＣＣＣＡＡＡＡＧＴＣＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＣＧ（配列番号：３５）を使用し、ｐＣＡＳプラスミドをテンプレートとして使用して、ＰＣＲ増幅を行った。１７μＬの増幅された生成物を採取し、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を加えた。混合後、３７℃で３時間、混合物をインキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理された混合物を５０μＬのＤＨ５αコンピテント細胞中に加えた。混合物を３０分間氷上に置き、４２℃で４５秒間、熱ショックを加えた後、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加し、次いで、３７℃で１時間、振盪しながら培養した。その後、Ｋａｎ耐性ＬＢ固体培地上に混合物を被覆し、次いで、単クローンのコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を実施した。２つの単クローンのコロニーを選び出し、次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性と検出され、配列決定によって確認された後、プラスミドを抽出および保存し、ｐＫＭＣａｓ９＿ＳｔＲ＿ＫｌＡＤＨ１と名付けた。
３．２  ドナーＤＮＡプラスミドの構築および増幅
本実施例では、直鎖ドナーＤＮＡの保存および増幅を容易にするために、ドナーＤＮＡをｐＫＭＤ１プラスミド中にまず挿入し、次いで、直鎖ドナーＤＮＡ配列を得るためにＰＣＲによって増幅した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５９】
ｐＫＭＤ１プラスミドをテンプレートとして用いて、ｐＫＭＤ１−ＰＦ：ＡＴＣＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧ（配列番号：３６）およびｐＫＭＤ１−ＰＲ：ＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧ（配列番号：３７）のプライマーを使用することによって、ＰＣＲ増幅過程を実行した。１７μＬの増幅された生成物を採取し、次いで、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を加え、混合した後、３７℃で３時間、混合物をインキュベートし、プラスミド骨格の直鎖断片ｐＫＭＤ１−Ｔを得た。
３．２．１  ドナープラスミドｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｋの構築
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ＨＲ１−ＰＦ：ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＡＴＧＧＡＣＡＡＴＡＣＧＴＴＡＣＣＧＡＧＡＴＧＡＧＧ（配列番号：３８）およびＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｋ−ＰＲ：ＡＧＣＡＴＧＡＡＧＧＴＣＡＧＴＴＴＴＡＣＡＧＡＣＡＣＣＧＧＡＧＴＡＣＴＴＧＡＣＧ（配列番号：４４）のプライマーを使用することによって、１つのＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｋ−Ｆ１と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｋ−ＰＦ：ＧＴＡＡＡＡＣＴＧＡＣＣＴＴＣＡＴＧＣＴＴＧＧＡＡＧＧＧＴＧＡＣＴＧＧＣＣＴＴＴＧ（配列番号：４５）およびＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＲ：ＣＣＡＡＣＣＴＴＴＡＡＣＡＴＴＣＴＣＴＣＣＣＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＣＧＡＣＡＣＣＡＧ（配列番号：４６）のプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｋ−Ｆ２と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＦ：ＧＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＧＴＴＧＧＡＡＧＡＴＴＧＧＴＧＡＣＴＴＣＧＣＴＧＧ（配列番号：４７）およびＫｌＡＤＨ１−ＨＲ２−ＰＲ：ＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＴＴＡＴＡＣＴＧＧＧＴＡＧＡＴＴＴＣＡＡＡＣＧＧＧＡＣ（配列番号：４１）のプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｎ−Ｆ３と名付けた。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６０】
増幅された生成物ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｋ−Ｆ１、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｋ−Ｆ２、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｋ−Ｆ３およびｐＫＭＤ１−Ｔのそれぞれ１μＬを混合し、５μＬのＣｌｏｎｉｎｇ  Ｍｉｘおよび１μＬの水を添加した。混合後、５０℃の水中に１時間、混合物を浸漬した。水浴後、混合物を２分間氷上に置いた。１０μＬの反応混合物を全て、５０μＬのＴｒａｎｓ−Ｔ１コンピテント細胞中に加えた。混合物を３０分間氷上に置き、４２℃で３０秒間、熱ショックを加えた後、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加し、次いで、３７℃で１時間、振盪しながら培養した。その後、Ａｍｐ耐性ＬＢ固体培地上に混合物を被覆し、次いで、単クローンのコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を実施した。６つの単クローンのコロニーを選び出し、次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性と検出され、配列決定によって確認された後、プラスミドを抽出および保存し、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｋと名付けた。
３．２．２  ドナープラスミドｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｎの構築
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ＨＲ１−ＰＦ：ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＡＴＧＧＡＣＡＡＴＡＣＧＴＴＡＣＣＧＡＧＡＴＧＡＧＧ（配列番号：３８）およびＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｎ−ＰＲ：ＡＧＣＡＴＧＡＡＧＧＴＣＡＧＴＡＴＴＡＣＡＧＡＣＡＣＣＧＧＡＧＴＡＣＴＴＧＡＣＧ（配列番号：４８）のプライマーを使用することによって、１つのＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｎ−Ｆ１と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｎ−ＰＦ：ＧＴＡＡＴＡＣＴＧＡＣＣＴＴＣＡＴＧＣＴＴＧＧＡＡＧＧＧＴＧＡＣＴＧＧＣＣＴＴＴＧ（配列番号：４９）およびＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＲ：ＣＣＡＡＣＣＴＴＴＡＡＣＡＴＴＣＴＣＴＣＣＣＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＣＧＡＣＡＣＣＡＧ（配列番号：４６）のプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｎ−Ｆ２と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＦ：ＧＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＧＴＴＧＧＡＡＧＡＴＴＧＧＴＧＡＣＴＴＣＧＣＴＧＧ（配列番号：４７）およびＫｌＡＤＨ１−ＨＲ２−ＰＲ：ＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＴＴＡＴＡＣＴＧＧＧＴＡＧＡＴＴＴＣＡＡＡＣＧＧＧＡＣ（配列番号：４１）のプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｎ−Ｆ３と名付けた。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６１】
増幅された生成物ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｎ−Ｆ１、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｎ−Ｆ２、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｎ−Ｆ３およびｐＫＭＤ１−Ｔのそれぞれ１μＬを混合し、５μＬのＣｌｏｎｉｎｇ  Ｍｉｘおよび１μＬの水を添加した。混合後、５０℃の水中に１時間、混合物を浸漬した。水浴後、混合物を２分間氷上に置いた。１０μＬの反応混合物を全て、５０μＬのＴｒａｎｓ−Ｔ１コンピテント細胞中に加えた。混合物を３０分間氷上に置き、４２℃で３０秒間、熱ショックを加えた後、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加し、次いで、３７℃で１時間、振盪しながら培養した。その後、Ａｍｐ耐性ＬＢ固体培地上に混合物を被覆し、次いで、単クローンのコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を実施した。６つの単クローンのコロニーを選び出し、次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性と検出され、配列決定によって確認された後、プラスミドを抽出および保存し、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｎと名付けた。
３．２．３  ドナープラスミドｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｑの構築
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ＨＲ１−ＰＦ：ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＡＴＧＧＡＣＡＡＴＡＣＧＴＴＡＣＣＧＡＧＡＴＧＡＧＧ（配列番号：３８）およびＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｑ−ＰＲ：ＡＧＣＡＴＧＡＡＧＧＴＣＡＧＴＴＴＧＡＣＡＧＡＣＡＣＣＧＧＡＧＴＡＣＴＴＧＡＣＧ（配列番号：５０）のプライマーを使用することによって、１つのＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｑ−Ｆ１と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｑ−ＰＦ：ＧＴＣＡＡＡＣＴＧＡＣＣＴＴＣＡＴＧＣＴＴＧＧＡＡＧＧＧＴＧＡＣＴＧＧＣＣＴＴＴＧ（配列番号：５１）およびＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＲ：ＣＣＡＡＣＣＴＴＴＡＡＣＡＴＴＣＴＣＴＣＣＣＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＣＧＡＣＡＣＣＡＧ（配列番号：４６）のプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｑ−Ｆ２と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＦ：ＧＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＧＴＴＧＧＡＡＧＡＴＴＧＧＴＧＡＣＴＴＣＧＣＴＧＧ（配列番号：４７）およびＫｌＡＤＨ１−ＨＲ２−ＰＲ：ＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＴＴＡＴＡＣＴＧＧＧＴＡＧＡＴＴＴＣＡＡＡＣＧＧＧＡＣ（配列番号：４１）のプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｑ−Ｆ３と名付けた。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６２】
増幅された生成物ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｑ−Ｆ１、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｑ−Ｆ２、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｑ−Ｆ３およびｐＫＭＤ１−Ｔのそれぞれ１μＬを混合し、５μＬのＣｌｏｎｉｎｇ  Ｍｉｘおよび１μＬの水を添加した。混合後、５０℃の水中に１時間、混合物を浸漬した。水浴後、混合物を２分間氷上に置いた。１０μＬの反応混合物を全て、５０μＬのＴｒａｎｓ−Ｔ１コンピテント細胞中に加えた。混合物を３０分間氷上に置き、４２℃で３０秒間、熱ショックを加えた後、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加し、次いで、３７℃で１時間、振盪しながら培養した。その後、Ａｍｐ耐性ＬＢ固体培地上に混合物を被覆し、次いで、単クローンのコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を実施した。６つの単クローンのコロニーを選び出し、次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性と検出され、配列決定によって確認された後、プラスミドを抽出および保存し、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｑと名付けた。
３．２．４  ドナープラスミドｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｒの構築
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ＨＲ１−ＰＦ：ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＡＴＧＧＡＣＡＡＴＡＣＧＴＴＡＣＣＧＡＧＡＴＧＡＧＧ（配列番号：３８）およびＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｒ−ＰＲ：ＡＧＣＡＴＧＡＡＧＧＴＣＡＧＴＴＣＴＡＣＡＧＡＣＡＣＣＧＧＡＧＴＡＣＴＴＧＡＣＧ（配列番号：５２）のプライマーを使用することによって、１つのＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｒ−Ｆ１と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｒ−ＰＦ：ＧＴＡＧＡＡＣＴＧＡＣＣＴＴＣＡＴＧＣＴＴＧＧＡＡＧＧＧＴＧＡＣＴＧＧＣＣＴＴＴＧ（配列番号：５３）およびＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＲ：ＣＣＡＡＣＣＴＴＴＡＡＣＡＴＴＣＴＣＴＣＣＣＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＣＧＡＣＡＣＣＡＧ（配列番号：４６）のプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｒ−Ｆ２と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＦ：ＧＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＧＴＴＧＧＡＡＧＡＴＴＧＧＴＧＡＣＴＴＣＧＣＴＧＧ（配列番号：４７）およびＫｌＡＤＨ１−ＨＲ２−ＰＲ：ＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＴＴＡＴＡＣＴＧＧＧＴＡＧＡＴＴＴＣＡＡＡＣＧＧＧＡＣ（配列番号：４１）のプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｒ−Ｆ３と名付けた。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６３】
増幅された生成物ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｒ−Ｆ１、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｒ−Ｆ２、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｒ−Ｆ３およびｐＫＭＤ１−Ｔのそれぞれ１μＬを混合し、５μＬのＣｌｏｎｉｎｇ  Ｍｉｘおよび１μＬの水を添加した。混合後、５０℃の水中に１時間、混合物を浸漬した。水浴後、混合物を２分間氷上に置いた。１０μＬの反応混合物を全て、５０μＬのＴｒａｎｓ−Ｔ１コンピテント細胞中に加えた。混合物を３０分間氷上に置き、４２℃で３０秒間、熱ショックを加えた後、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加し、次いで、３７℃で１時間、振盪しながら培養した。その後、Ａｍｐ耐性ＬＢ固体培地上に混合物を被覆し、次いで、単クローンのコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を実施した。６つの単クローンのコロニーを選び出し、次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性と検出され、配列決定によって確認された後、プラスミドを抽出および保存し、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｒと名付けた。
３．３  Ｋ．ｌａｃｔｉｓの電気形質転換（実施例２．３と同じ）
３．４  陽性の同定
形質転換された細胞を有するプレートから、１２〜２４の単クローンのコロニーを選び出した。ＡＤＨ１−ｍ−ＣＦ：ＴＧＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＧＴ（配列番号：５４）およびＡＤＨ１−ｍ−ＣＲ：ＴＧＡＣＧＧＴＣＧＴＴＡＡＣＴＡＡＧＡＴ（配列番号：５５）の同定プライマーを使用し、細胞をテンプレートとして使用することによるＰＣＲによって、試料を検出した。ＰＣＲによって陽性を検査され、配列決定によって同定された株を、陽性の株として決定し、それぞれ、ＡＤＨ１  Ｈ４７Ｋ、ＡＤＨ１  Ｈ４７Ｎ、ＡＤＨ１  Ｈ４７ＱおよびＡＤＨ１  Ｈ４７Ｒと名付けた。
［実施例４］
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＡＤＨ１  Ｈ５１部位の部位特異的変異
４．１  ＫｌＡＤＨ１  ＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡ配列の決定
ＫｌＡＤＨ１中に設計された点変異にしたがって、ＰＡＭ配列（ＮＧＧ）を選択し、対応するｇＲＮＡ配列を決定した。本実施例においてｇＲＮＡを選択するための原理は以下のとおりである：ｇＲＮＡは設計された変異部位の近くにあるべきであり、ＧＣ含量は中程度（４０％〜６０％）であるべきであり、ポリＴ構造の存在は回避すべきである。この実施形態において、ＫｌＡＤＨ１  ｇＲＮＡ１配列は、ＴＧＧＧＴＧＡＡＡＡＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣ（配列番号：３３）である。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６４】
プラスミド構築および形質転換のための方法は以下のとおりである：プライマーｐＣａｓ９−ＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ＰＦ：ＴＧＧＧＴＧＡＡＡＡＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣ（配列番号：３４）およびｐＣａｓ９−ＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ＰＲ：ＧＣＣＣＴＴＧＡＣＧＴＴＴＴＣＡＣＣＣＡＡＡＡＧＴＣＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＣＧ（配列番号：３５）を使用し、ｐＣＡＳプラスミドをテンプレートとして使用して、ＰＣＲ増幅を行った。１７μＬの増幅された生成物を採取し、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を加えた。混合後、３７℃で３時間、混合物をインキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理された混合物を５０μＬのＤＨ５αコンピテント細胞中に加えた。混合物を３０分間氷上に置き、４２℃で４５秒間、熱ショックを加えた後、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加し、次いで、３７℃で１時間、振盪しながら培養した。その後、Ｋａｎ耐性ＬＢ固体培地上に混合物を被覆し、次いで、単クローンのコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を実施した。２つの単クローンのコロニーを選び出し、次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性と検出され、配列決定によって確認された後、プラスミドを抽出および保存し、ｐＫＭＣａｓ９＿ＳｔＲ＿ＫｌＡＤＨ１と名付けた。
４．２  ドナーＤＮＡプラスミドの構築および増幅
本実施例では、直鎖ドナーＤＮＡの保存および増幅を容易にするために、ドナーＤＮＡをｐＫＭＤ１プラスミド中にまず挿入し、次いで、直鎖ドナーＤＮＡ配列を得るためにＰＣＲによって増幅した。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６５】
ｐＫＭＤ１プラスミドをテンプレートとして用いて、ｐＫＭＤ１−ＰＦ：ＡＴＣＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧ（配列番号：３６）およびｐＫＭＤ１−ＰＲ：ＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧ（配列番号：３７）のプライマーを使用することによって、１つのＰＣＲ増幅過程を実行した。１７μＬの増幅された生成物を採取し、次いで、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を加え、混合した後、３７℃で３時間、混合物をインキュベートし、プラスミド骨格の直鎖断片ｐＫＭＤ１−Ｔを得た。
４．２．１  ドナープラスミドｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ５１Ｋの構築
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ＨＲ１−ＰＦ：ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＡＴＧＧＡＣＡＡＴＡＣＧＴＴＡＣＣＧＡＧＡＴＧＡＧＧ（配列番号：３８）およびＫｌＡＤＨ１−Ｈ５１Ｋ−ＰＲ：ＣＣＡＡＧＣＴＴＴＡＡＧＧＴＣＡＧＴＡＴＧＡＣＡＧＡＣＡＣＣＧＧＡＧＴＡＣＴＴＧＡＣＧ（配列番号：５６）のプライマーを使用することによって、１つのＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ５１Ｋ−Ｆ１と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ５１Ｋ−ＰＦ：ＧＴＣＡＴＡＣＴＧＡＣＣＴＴＡＡＡＧＣＴＴＧＧＡＡＧＧＧＴＧＡＣＴＧＧＣＣＴＴＴＧ（配列番号：５７）およびＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＲ：ＣＣＡＡＣＣＴＴＴＡＡＣＡＴＴＣＴＣＴＣＣＣＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＣＧＡＣＡＣＣＡＧ（配列番号：４６）のプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ５１Ｋ−Ｆ２と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＦ：ＧＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＧＴＴＧＧＡＡＧＡＴＴＧＧＴＧＡＣＴＴＣＧＣＴＧＧ（配列番号：４７）およびＫｌＡＤＨ１−ＨＲ２−ＰＲ：ＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＴＴＡＴＡＣＴＧＧＧＴＡＧＡＴＴＴＣＡＡＡＣＧＧＧＡＣ（配列番号：４１）のプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ５１Ｋ−Ｆ３と名付けた。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６６】
増幅された生成物ＫｌＡＤＨ１−Ｈ５１Ｋ−Ｆ１、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ５１Ｋ−Ｆ２、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ５１Ｋ−Ｆ３およびｐＫＭＤ１−Ｔのそれぞれ１μＬを混合し、５μＬのＣｌｏｎｉｎｇ  Ｍｉｘおよび１μＬの水を添加した。混合後、５０℃の水中に１時間、混合物を浸漬した。水浴後、混合物を２分間氷上に置いた。１０μＬの反応混合物を全て、５０μＬのＴｒａｎｓ−Ｔ１コンピテント細胞中に加えた。混合物を３０分間氷上に置き、４２℃で３０秒間、熱ショックを加えた後、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加し、次いで、３７℃で１時間、振盪しながら培養した。その後、Ａｍｐ耐性ＬＢ固体培地上に混合物を被覆し、次いで、単クローンのコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を実施した。６つの単クローンのコロニーを選び出し、次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性と検出され、配列決定によって確認された後、プラスミドを抽出および保存し、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ５１Ｋと名付けた。
４．２．２  ドナープラスミドｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ５１Ｒの構築
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ＨＲ１−ＰＦ：ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＡＴＧＧＡＣＡＡＴＡＣＧＴＴＡＣＣＧＡＧＡＴＧＡＧＧ（配列番号：３８）およびＫｌＡＤＨ１−Ｈ５１Ｒ−ＰＲ：ＣＣＡＡＧＣＴＣＴＡＡＧＧＴＣＡＧＴＡＴＧＡＣＡＧＡＣＡＣＣＧＧＡＧＴＡＣＴＴＧＡＣＧ（配列番号：５８）のプライマーを使用することによって、１つのＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ５１Ｒ−Ｆ１と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ５１Ｒ−ＰＦ：ＧＴＣＡＴＡＣＴＧＡＣＣＴＴＡＧＡＧＣＴＴＧＧＡＡＧＧＧＴＧＡＣＴＧＧＣＣＴＴＴＧ（配列番号：５９）およびＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＲ：ＣＣＡＡＣＣＴＴＴＡＡＣＡＴＴＣＴＣＴＣＣＣＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＣＧＡＣＡＣＣＡＧ（配列番号：４６）のプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ５１Ｒ−Ｆ２と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＦ：ＧＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＧＴＴＧＧＡＡＧＡＴＴＧＧＴＧＡＣＴＴＣＧＣＴＧＧ（配列番号：４７）およびＫｌＡＤＨ１−ＨＲ２−ＰＲ：ＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＴＴＡＴＡＣＴＧＧＧＴＡＧＡＴＴＴＣＡＡＡＣＧＧＧＡＣ（配列番号：４１）のプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ５１Ｒ−Ｆ３と名付けた。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６７】
増幅された生成物ＫｌＡＤＨ１−Ｈ５１Ｒ−Ｆ１、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ５１Ｒ−Ｆ２、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ５１Ｒ−Ｆ３およびｐＫＭＤ１−Ｔのそれぞれ１μＬを混合し、５μＬのＣｌｏｎｉｎｇ  Ｍｉｘおよび１μＬの水を添加した。混合後、５０℃の水中に１時間、混合物を浸漬した。水浴後、混合物を２分間氷上に置いた。１０μＬの反応混合物を全て、５０μＬのＴｒａｎｓ−Ｔ１コンピテント細胞中に加えた。混合物を３０分間氷上に置き、４２℃で３０秒間、熱ショックを加えた後、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加し、次いで、３７℃で１時間、振盪しながら培養した。その後、Ａｍｐ耐性ＬＢ固体培地上に混合物を被覆し、次いで、単クローンのコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を実施した。６つの単クローンのコロニーを選び出し、次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性と検出され、配列決定によって確認された後、プラスミドを抽出および保存し、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ５１Ｒと名付けた。
４．３  Ｋ．ｌａｃｔｉｓの電気形質転換（実施例２．３と同じ）
４．４  陽性の同定
形質転換された細胞を有するプレートから、１２〜２４の単クローンのコロニーを選び出した。細胞をテンプレートとして用いて、ＡＤＨ１−ｍ−ＣＦ：ＴＧＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＧＴ（配列番号：５４）およびＡＤＨ１−ｍ−ＣＲ：ＴＧＡＣＧＧＴＣＧＴＴＡＡＣＴＡＡＧＡＴ（配列番号：５５）の同定プライマーを使用するＰＣＲによって、試料を検出した。ＰＣＲによって陽性を検査され、配列決定によって同定された株を、陽性の株として決定し、それぞれ、ＡＤＨ１  Ｈ５１ＫおよびＡＤＨ１  Ｈ５１Ｒと名付けた。
［実施例５］
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＡＤＨ１  Ｈ１２４部位の部位特異的変異
５．１  ＫｌＡＤＨ１  ＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡ配列の決定
ＫｌＡＤＨ１中に設計された点変異にしたがって、ＰＡＭ配列（ＮＧＧ）を選択し、対応するｇＲＮＡ配列を決定した。本実施例においてｇＲＮＡを選択するための原理は以下のとおりである：ｇＲＮＡは設計された変異部位の近くにあるべきであり、ＧＣ含量は中程度（４０％〜６０％）であるべきであり、ポリＴ構造の存在は回避すべきである。この実施形態において、ＫｌＡＤＨ１  ｇＲＮＡ１配列は、ＴＧＧＧＴＧＡＡＡＡＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣ（配列番号：３３）である。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６８】
プラスミド構築および形質転換のための方法は以下のとおりである：プライマーｐＣａｓ９−ＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ＰＦ：ＴＧＧＧＴＧＡＡＡＡＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣ（配列番号：３４）およびｐＣａｓ９−ＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ＰＲ：ＧＣＣＣＴＴＧＡＣＧＴＴＴＴＣＡＣＣＣＡＡＡＡＧＴＣＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＣＧ（配列番号：３５）を使用し、ｐＣＡＳプラスミドをテンプレートとして使用して、ＰＣＲ増幅を行った。１７μＬの増幅された生成物を採取し、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を加え、混合した後、３７℃で３時間、混合物をインキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理された混合物を５０μＬのＤＨ５αコンピテント細胞中に加えた。混合物を３０分間氷上に置き、４２℃で４５秒間、熱ショックを加えた後、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加し、次いで、３７℃で１時間、振盪しながら培養した。その後、Ｋａｎ耐性ＬＢ固体培地上に混合物を被覆し、次いで、単クローンのコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を実施した。２つの単クローンのコロニーを選び出し、次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性と検出され、配列決定によって確認された後、プラスミドを抽出および保存し、ｐＫＭＣａｓ９＿ＳｔＲ＿ＫｌＡＤＨ１と名付けた。
５．２  ドナーＤＮＡプラスミドの構築および増幅
本実施例では、直鎖ドナーＤＮＡの保存および増幅を容易にするために、ドナーＤＮＡをｐＫＭＤ１プラスミド中にまず挿入し、次いで、直鎖ドナーＤＮＡ配列を得るためにＰＣＲによって増幅した。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６９】
ｐＫＭＤ１プラスミドをテンプレートとして用いて、ｐＫＭＤ１−ＰＦ：ＡＴＣＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧ（配列番号：３６）およびｐＫＭＤ１−ＰＲ：ＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧ（配列番号：３７）のプライマーを使用することによって、ＰＣＲ増幅過程を実行した。１７μＬの増幅された生成物を採取し、次いで、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を加え、混合した後、３７℃で３時間、混合物をインキュベートし、プラスミド骨格の直鎖断片ｐＫＭＤ１−Ｔを得た。
５．２．１  ドナープラスミドｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｋの構築
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ＨＲ１−ＰＦ：ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＡＴＧＧＡＣＡＡＴＡＣＧＴＴＡＣＣＧＡＧＡＴＧＡＧＧ（配列番号：３８）およびＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＲ：ＣＣＡＡＣＣＴＴＴＡＡＣＡＴＴＣＴＣＴＣＣＣＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＣＧＡＣＡＣＣＡＧ（配列番号：４６）のプライマーを使用することによって、１つのＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｋ−Ｆ１と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＦ：ＧＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＧＴＴＧＧＡＡＧＡＴＴＧＧＴＧＡＣＴＴＣＧＣＴＧＧ（配列番号：４７）およびＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｋ−ＰＲ：ＣＣＡＴＣＴＴＴＴＧＴＡＴＡＴＣＣＡＣＴＣＡＡＧＴＣＡＧＣＴＴＣＴＧＧＡＣＡＧＴＴＧＧ（配列番号：６０）のプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｋ−Ｆ２と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｋ−ＰＦ：ＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＡＴＡＣＡＡＡＡＧＡＴＧＧＴＴＣＴＴＴＣＣＡＡＣＡＡＴＡＣＧＣＴＡＣＴＧＣ（配列番号：６１）およびＫｌＡＤＨ１−ＨＲ２−ＰＲ：ＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＴＴＡＴＡＣＴＧＧＧＴＡＧＡＴＴＴＣＡＡＡＣＧＧＧＡＣ（配列番号：４１）のプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｋ−Ｆ３と名付けた。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７０】
増幅された生成物ＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｋ−Ｆ１、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｋ−Ｆ２、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｋ−Ｆ３およびｐＫＭＤ１−Ｔのそれぞれ１μＬを混合し、５μＬのＣｌｏｎｉｎｇ  Ｍｉｘおよび１μＬの水を添加した。混合後、５０℃の水中に１時間、混合物を浸漬した。水浴後、混合物を２分間氷上に置いた。１０μＬの反応混合物を全て、５０μＬのＴｒａｎｓ−Ｔ１コンピテント細胞中に加えた。混合物を３０分間氷上に置き、４２℃で３０秒間、熱ショックを加えた後、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加し、次いで、３７℃で１時間、振盪しながら培養した。その後、Ａｍｐ耐性ＬＢ固体培地上に混合物を被覆し、次いで、単クローンのコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を実施した。６つの単クローンのコロニーを選び出し、次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性と検出され、配列決定によって確認された後、プラスミドを抽出および保存し、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｋと名付けた。
５．２．２  ドナープラスミドｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｒの構築
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ＨＲ１−ＰＦ：ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＡＴＧＧＡＣＡＡＴＡＣＧＴＴＡＣＣＧＡＧＡＴＧＡＧＧ（配列番号：３８）およびＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＲ：ＣＣＡＡＣＣＴＴＴＡＡＣＡＴＴＣＴＣＴＣＣＣＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＣＧＡＣＡＣＣＡＧ（配列番号：４６）のプライマーを使用することによって、１つのＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｋ−Ｆ１と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＦ：ＧＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＧＴＴＧＧＡＡＧＡＴＴＧＧＴＧＡＣＴＴＣＧＣＴＧＧ（配列番号：４７）およびＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｒ−ＰＲ：ＣＣＡＴＣＴＣＴＴＧＴＡＴＡＴＣＣＡＣＴＣＡＡＧＴＣＡＧＣＴＴＣＴＧＧＡＣＡＧＴＴＧＧ（配列番号：６２）のプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｒ−Ｆ２と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｒ−ＰＦ：ＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＡＴＡＣＡＡＧＡＧＡＴＧＧＴＴＣＴＴＴＣＣＡＡＣＡＡＴＡＣＧＣＴＡＣＴＧＣ（配列番号：６３）およびＫｌＡＤＨ１−ＨＲ２−ＰＲ：ＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＴＴＡＴＡＣＴＧＧＧＴＡＧＡＴＴＴＣＡＡＡＣＧＧＧＡＣ（配列番号：４１）のプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｒ−Ｆ３と名付けた。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７１】
増幅された生成物ＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｒ−Ｆ１、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｒ−Ｆ２、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｒ−Ｆ３およびｐＫＭＤ１−Ｔのそれぞれ１μＬを混合し、５μＬのＣｌｏｎｉｎｇ  Ｍｉｘおよび１μＬの水を添加した。混合後、５０℃の水中に１時間、混合物を浸漬した。水浴後、混合物を２分間氷上に置いた。１０μＬの反応混合物を全て、５０μＬのＴｒａｎｓ−Ｔ１コンピテント細胞中に加えた。混合物を３０分間氷上に置き、４２℃で３０秒間、熱ショックを加えた後、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加し、次いで、３７℃で１時間、振盪しながら培養した。その後、Ａｍｐ耐性ＬＢ固体培地上に混合物を被覆し、次いで、単クローンのコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を実施した。６つの単クローンのコロニーを選び出し、次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性と検出され、配列決定によって確認された後、プラスミドを抽出および保存し、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｒと名付けた。
５．３  Ｋ．ｌａｃｔｉｓの電気形質転換（実施例２．３と同じ）
５．４  陽性の同定
形質転換された細胞を有するプレートから、１２〜２４の単クローンのコロニーを選び出した。細胞をテンプレートとして用いて、ＡＤＨ１−ｍ−ＣＦ：ＴＧＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＧＴ（配列番号：５４）およびＡＤＨ１−ｍ−ＣＲ：ＴＧＡＣＧＧＴＣＧＴＴＡＡＣＴＡＡＧＡＴ（配列番号：５５）の同定プライマーを使用するＰＣＲによって、試料を検出した。ＰＣＲによって陽性を検査され、配列決定によって同定された株を、陽性の株として決定し、それぞれ、ＡＤＨ１  Ｈ１２４ＫおよびＡＤＨ１  Ｈ１２４Ｒと名付けた。
［実施例６］
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＡＤＨ１  Ｈ４７およびＨ１２４部位の同時部位特異的変異
６．１  ＫｌＡＤＨ１  ＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡ配列の決定
ＫｌＡＤＨ１中に設計された点変異にしたがって、ＰＡＭ配列（ＮＧＧ）を選択し、対応するｇＲＮＡ配列を決定した。本実施例においてｇＲＮＡを選択するための原理は以下のとおりである：ｇＲＮＡは設計された変異部位の近くにあるべきであり、ＧＣ含量は中程度（４０％〜６０％）であるべきであり、ポリＴ構造の存在は回避すべきである。この実施形態において、ＫｌＡＤＨ１  ｇＲＮＡ１配列は、ＴＧＧＧＴＧＡＡＡＡＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣ（配列番号：３３）である。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７２】
プラスミド構築および形質転換のための方法は以下のとおりである：プライマーｐＣａｓ９−ＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ＰＦ：ＴＧＧＧＴＧＡＡＡＡＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣ（配列番号：３４）およびｐＣａｓ９−ＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ＰＲ：ＧＣＣＣＴＴＧＡＣＧＴＴＴＴＣＡＣＣＣＡＡＡＡＧＴＣＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＣＧ（配列番号：３５）を使用し、ｐＣＡＳプラスミドをテンプレートとして使用して、ＰＣＲ増幅を行った。１７μＬの増幅された生成物を採取し、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を加え、混合した後、３７℃で３時間、混合物をインキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理された混合物を５０μＬのＤＨ５αコンピテント細胞中に加えた。混合物を３０分間氷上に置き、４２℃で４５秒間、熱ショックを加えた後、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加し、次いで、３７℃で１時間、振盪しながら培養した。その後、Ｋａｎ耐性ＬＢ固体培地上に混合物を被覆し、次いで、単クローンのコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を実施した。２つの単クローンのコロニーを選び出し、次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性と検出され、配列決定によって確認された後、プラスミドを抽出および保存し、ｐＫＭＣａｓ９＿ＳｔＲ＿ＫｌＡＤＨ１と名付けた。
６．２  ドナーＤＮＡプラスミドの構築および増幅
本実施例では、直鎖ドナーＤＮＡの保存および増幅を容易にするために、ドナーＤＮＡをｐＫＭＤ１プラスミド中にまず挿入し、次いで、直鎖ドナーＤＮＡ配列を得るためにＰＣＲによって増幅した。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７３】
ｐＫＭＤ１プラスミドをテンプレートとして用いて、ｐＫＭＤ１−ＰＦ：ＡＴＣＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧ（配列番号：３６）およびｐＫＭＤ１−ＰＲ：ＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧ（配列番号：３７）のプライマーを使用することによって、ＰＣＲ増幅過程を実行した。１７μＬの増幅された生成物を採取し、次いで、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を加え、混合した後、３７℃で３時間、混合物をインキュベートし、プラスミド骨格の直鎖断片ｐＫＭＤ１−Ｔを得た。
６．２．１  ドナープラスミドｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＫＨ１２４Ｋの構築
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ＨＲ１−ＰＦ：ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＡＴＧＧＡＣＡＡＴＡＣＧＴＴＡＣＣＧＡＧＡＴＧＡＧＧ（配列番号：３８）およびＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｋ−ＰＲ：ＡＧＣＡＴＧＡＡＧＧＴＣＡＧＴＴＴＴＡＣＡＧＡＣＡＣＣＧＧＡＧＴＡＣＴＴＧＡＣＧ（配列番号：４４）のプライマーを使用することによって、１つのＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＫＨ１２４Ｋ−Ｆ１と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｋ−ＰＦ：ＧＴＡＡＡＡＣＴＧＡＣＣＴＴＣＡＴＧＣＴＴＧＧＡＡＧＧＧＴＧＡＣＴＧＧＣＣＴＴＴＧ（配列番号：４５）およびＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＲ：ＣＣＡＡＣＣＴＴＴＡＡＣＡＴＴＣＴＣＴＣＣＣＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＣＧＡＣＡＣＣＡＧ（配列番号：４６）のプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＫＨ１２４Ｋ−Ｆ２と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＦ：ＧＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＧＴＴＧＧＡＡＧＡＴＴＧＧＴＧＡＣＴＴＣＧＣＴＧＧ（配列番号：４７）およびＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｋ−ＰＲ：ＣＣＡＴＣＴＴＴＴＧＴＡＴＡＴＣＣＡＣＴＣＡＡＧＴＣＡＧＣＴＴＣＴＧＧＡＣＡＧＴＴＧＧ（配列番号：６０）のプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＫＨ１２４Ｋ−Ｆ３と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｋ−ＰＦ：ＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＡＴＡＣＡＡＡＡＧＡＴＧＧＴＴＣＴＴＴＣＣＡＡＣＡＡＴＡＣＧＣＴＡＣＴＧＣ（配列番号：６１）およびＫｌＡＤＨ１−ＨＲ２−ＰＲ：ＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＴＴＡＴＡＣＴＧＧＧＴＡＧＡＴＴＴＣＡＡＡＣＧＧＧＡＣ（配列番号：４１）のプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＫＨ１２４Ｋ−Ｆ４と名付けた。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７４】
増幅された生成物ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＫＨ１２４Ｋ−Ｆ１、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＫＨ１２４Ｋ−Ｆ２、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＫＨ１２４Ｋ−Ｆ３、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＫＨ１２４Ｋ−Ｆ４およびｐＫＭＤ１−Ｔのそれぞれ１μＬを混合し、５μＬのＣｌｏｎｉｎｇ  Ｍｉｘを添加した。混合後、５０℃の水中に１時間、混合物を浸漬した。水浴後、混合物を２分間氷上に置いた。１０μＬの反応混合物を全て、５０μＬのＴｒａｎｓ−Ｔ１コンピテント細胞中に加えた。混合物を３０分間氷上に置き、４２℃で３０秒間、熱ショックを加えた後、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加し、次いで、３７℃で１時間、振盪しながら培養した。その後、Ａｍｐ耐性ＬＢ固体培地上に混合物を被覆し、次いで、単クローンのコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を実施した。６つの単クローンのコロニーを選び出し、次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性と検出され、配列決定によって確認された後、プラスミドを抽出および保存し、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＫＨ１２４Ｋと名付けた。
６．２．２  ドナープラスミドｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＮＨ１２４Ｋの構築
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ＨＲ１−ＰＦ：ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＡＴＧＧＡＣＡＡＴＡＣＧＴＴＡＣＣＧＡＧＡＴＧＡＧＧ（配列番号：３８）およびＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｎ−ＰＲ：ＡＧＣＡＴＧＡＡＧＧＴＣＡＧＴＡＴＴＡＣＡＧＡＣＡＣＣＧＧＡＧＴＡＣＴＴＧＡＣＧ（配列番号：４８）のプライマーを使用することによって、１つのＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＮＨ１２４Ｋ−Ｆ１と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｎ−ＰＦ：ＧＴＡＡＴＡＣＴＧＡＣＣＴＴＣＡＴＧＣＴＴＧＧＡＡＧＧＧＴＧＡＣＴＧＧＣＣＴＴＴＧ（配列番号：４９）およびＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＲ：ＣＣＡＡＣＣＴＴＴＡＡＣＡＴＴＣＴＣＴＣＣＣＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＣＧＡＣＡＣＣＡＧ（配列番号：４６）のプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＮＨ１２４Ｋ−Ｆ２と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＦ：ＧＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＧＴＴＧＧＡＡＧＡＴＴＧＧＴＧＡＣＴＴＣＧＣＴＧＧ（配列番号：４７）およびＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｋ−ＰＲ：ＣＣＡＴＣＴＴＴＴＧＴＡＴＡＴＣＣＡＣＴＣＡＡＧＴＣＡＧＣＴＴＣＴＧＧＡＣＡＧＴＴＧＧ（配列番号：６０）のプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＮＨ１２４Ｋ−Ｆ３と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｋ−ＰＦ：ＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＡＴＡＣＡＡＡＡＧＡＴＧＧＴＴＣＴＴＴＣＣＡＡＣＡＡＴＡＣＧＣＴＡＣＴＧＣ（配列番号：６１）およびＫｌＡＤＨ１−ＨＲ２−ＰＲ：ＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＴＴＡＴＡＣＴＧＧＧＴＡＧＡＴＴＴＣＡＡＡＣＧＧＧＡＣ（配列番号：４１）のプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＮＨ１２４Ｋ−Ｆ４と名付けた。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７５】
増幅された生成物ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＮＨ１２４Ｋ−Ｆ１、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＮＨ１２４Ｋ−Ｆ２、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＮＨ１２４Ｋ−Ｆ３、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＮＨ１２４Ｋ−Ｆ４およびｐＫＭＤ１−Ｔのそれぞれ１μＬを混合し、５μＬのＣｌｏｎｉｎｇ  Ｍｉｘを添加した。混合後、５０℃の水中に１時間、混合物を浸漬した。水浴後、混合物を２分間氷上に置いた。１０μＬの反応混合物を全て、５０μＬのＴｒａｎｓ−Ｔ１コンピテント細胞中に加えた。混合物を３０分間氷上に置き、４２℃で３０秒間、熱ショックを加えた後、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加し、次いで、３７℃で１時間、振盪しながら培養した。その後、Ａｍｐ耐性ＬＢ固体培地上に混合物を被覆し、次いで、単クローンのコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を実施した。６つの単クローンのコロニーを選び出し、次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性と検出され、配列決定によって確認された後、プラスミドを抽出および保存し、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＮＨ１２４Ｋと名付けた。
６．２．３  ドナープラスミドｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＱＨ１２４Ｋの構築
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ＨＲ１−ＰＦ：ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＡＴＧＧＡＣＡＡＴＡＣＧＴＴＡＣＣＧＡＧＡＴＧＡＧＧ（配列番号：３８）およびＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｑ−ＰＲ：ＡＧＣＡＴＧＡＡＧＧＴＣＡＧＴＴＴＧＡＣＡＧＡＣＡＣＣＧＧＡＧＴＡＣＴＴＧＡＣＧ（配列番号：５０）のプライマーを使用することによって、１つのＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＱＨ１２４Ｋ−Ｆ１と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｑ−ＰＦ：ＧＴＣＡＡＡＣＴＧＡＣＣＴＴＣＡＴＧＣＴＴＧＧＡＡＧＧＧＴＧＡＣＴＧＧＣＣＴＴＴＧ（配列番号：５１）およびＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＲ：ＣＣＡＡＣＣＴＴＴＡＡＣＡＴＴＣＴＣＴＣＣＣＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＣＧＡＣＡＣＣＡＧ（配列番号：４６）のプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＱＨ１２４Ｋ−Ｆ２と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＦ：ＧＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＧＴＴＧＧＡＡＧＡＴＴＧＧＴＧＡＣＴＴＣＧＣＴＧＧ（配列番号：４７）およびＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｋ−ＰＲ：ＣＣＡＴＣＴＴＴＴＧＴＡＴＡＴＣＣＡＣＴＣＡＡＧＴＣＡＧＣＴＴＣＴＧＧＡＣＡＧＴＴＧＧ（配列番号：６０）のプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＱＨ１２４Ｋ−Ｆ３と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｋ−ＰＦ：ＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＡＴＡＣＡＡＡＡＧＡＴＧＧＴＴＣＴＴＴＣＣＡＡＣＡＡＴＡＣＧＣＴＡＣＴＧＣ（配列番号：６１）およびＫｌＡＤＨ１−ＨＲ２−ＰＲ：ＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＴＴＡＴＡＣＴＧＧＧＴＡＧＡＴＴＴＣＡＡＡＣＧＧＧＡＣ（配列番号：４１）のプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＱＨ１２４Ｋ−Ｆ４と名付けた。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７６】
増幅された生成物ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＱＨ１２４Ｋ−Ｆ１、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＱＨ１２４Ｋ−Ｆ２、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＱＨ１２４Ｋ−Ｆ３、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＱＨ１２４Ｋ−Ｆ４およびｐＫＭＤ１−Ｔのそれぞれ１μＬを混合し、５μＬのＣｌｏｎｉｎｇ  Ｍｉｘを添加した。混合後、５０℃の水中に１時間、混合物を浸漬した。水浴後、混合物を２分間氷上に置いた。１０μＬの反応混合物を全て、５０μＬのＴｒａｎｓ−Ｔ１コンピテント細胞中に加えた。混合物を３０分間氷上に置き、４２℃で３０秒間、熱ショックを加えた後、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加し、次いで、３７℃で１時間、振盪しながら培養した。その後、Ａｍｐ耐性ＬＢ固体培地上に混合物を被覆し、次いで、単クローンのコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を実施した。６つの単クローンのコロニーを選び出し、次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性と検出され、配列決定によって確認された後、プラスミドを抽出および保存し、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＱＨ１２４Ｋと名付けた。
６．２．４  ドナープラスミドｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＲＨ１２４Ｋの構築
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ＨＲ１−ＰＦ：ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＡＴＧＧＡＣＡＡＴＡＣＧＴＴＡＣＣＧＡＧＡＴＧＡＧＧ（配列番号：３８）およびＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｒ−ＰＲ：ＡＧＣＡＴＧＡＡＧＧＴＣＡＧＴＴＣＴＡＣＡＧＡＣＡＣＣＧＧＡＧＴＡＣＴＴＧＡＣＧ（配列番号：５２）のプライマーを使用することによって、１つのＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＲＨ１２４Ｋ−Ｆ１と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７Ｒ−ＰＦ：ＧＴＡＧＡＡＣＴＧＡＣＣＴＴＣＡＴＧＣＴＴＧＧＡＡＧＧＧＴＧＡＣＴＧＧＣＣＴＴＴＧ（配列番号：５３）およびＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＲ：ＣＣＡＡＣＣＴＴＴＡＡＣＡＴＴＣＴＣＴＣＣＣＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＣＧＡＣＡＣＣＡＧ（配列番号：４６）のプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＲＨ１２４Ｋ−Ｆ２と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−ｇＲＮＡ１−ｍ−ＰＦ：ＧＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＧＴＴＧＧＡＡＧＡＴＴＧＧＴＧＡＣＴＴＣＧＣＴＧＧ（配列番号：４７）およびＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｋ−ＰＲ：ＣＣＡＴＣＴＴＴＴＧＴＡＴＡＴＣＣＡＣＴＣＡＡＧＴＣＡＧＣＴＴＣＴＧＧＡＣＡＧＴＴＧＧ（配列番号：６０）のプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＲＨ１２４Ｋ−Ｆ３と名付けた；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ１２４Ｋ−ＰＦ：ＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＡＴＡＣＡＡＡＡＧＡＴＧＧＴＴＣＴＴＴＣＣＡＡＣＡＡＴＡＣＧＣＴＡＣＴＧＣ（配列番号：６１）およびＫｌＡＤＨ１−ＨＲ２−ＰＲ：ＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＴＴＡＴＡＣＴＧＧＧＴＡＧＡＴＴＴＣＡＡＡＣＧＧＧＡＣ（配列番号：４１）のプライマーを使用することによって、別のＰＣＲ増幅過程を実施し、生成物をＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＲＨ１２４Ｋ−Ｆ４と名付けた。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７７】
増幅された生成物ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＲＨ１２４Ｋ−Ｆ１、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＲＨ１２４Ｋ−Ｆ２、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＲＨ１２４Ｋ−Ｆ３、ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＲＨ１２４Ｋ−Ｆ４およびｐＫＭＤ１−Ｔのそれぞれ１μＬを混合し、５μＬのＣｌｏｎｉｎｇ  Ｍｉｘを添加した。混合後、５０℃の水中に１時間、混合物を浸漬した。水浴後、混合物を２分間氷上に置いた。１０μＬの反応混合物を全て、５０μＬのＴｒａｎｓ−Ｔ１コンピテント細胞中に加えた。混合物を３０分間氷上に置き、４２℃で３０秒間、熱ショックを加えた後、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加し、次いで、３７℃で１時間、振盪しながら培養した。その後、Ａｍｐ耐性ＬＢ固体培地上に混合物を被覆し、次いで、単クローンのコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を実施した。６つの単クローンのコロニーを選び出し、次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性と検出され、配列決定によって確認された後、プラスミドを抽出および保存し、ｐＫＭＤ１−ＫｌＡＤＨ１−Ｈ４７ＲＨ１２４Ｋと名付けた。
６．３  Ｋ．ｌａｃｔｉｓの電気形質転換（実施例２．３と同じ）
６．４  陽性の同定
形質転換された細胞を有するプレートから、１２〜２４の単クローンのコロニーを選び出した。細胞をテンプレートとして用いて、ＡＤＨ１−ｍ−ＣＦ：ＴＧＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＧＴ（配列番号：５４）およびＡＤＨ１−ｍ−ＣＲ：ＴＧＡＣＧＧＴＣＧＴＴＡＡＣＴＡＡＧＡＴ（配列番号：５５）の同定プライマーを使用するＰＣＲによって、試料を検出した。ＰＣＲによって陽性を検査され、配列決定によって同定された株を、陽性の株として決定し、それぞれ、ＡＤＨ１  Ｈ４７ＫＨ１２４Ｋ、ＡＤＨ１  Ｈ４７ＮＨ１２４Ｋ、ＡＤＨ１  Ｈ４７ＱＨ１２４ＫおよびＡＤＨ１  Ｈ４７ＲＨ１２４Ｋと名付けた。
［実施例７］
ＫｌＡＤＨ１改造された細胞株の内因性タンパク質のＮｉ媒体への結合能力の分析
７．１  タンパク質精製系のための試薬調製
結合緩衝液：０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．９。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８７】
上記結果は全て、本発明におけるＡＤＨファミリータンパク質の部位特異的変異はＡＤＨファミリータンパク質のＮｉ媒体への結合能力を低下させることができるのみならず、株の無細胞系転写−翻訳活性に影響を与えず、細胞株の無細胞系転写−翻訳系における外来性タンパク質の発現純度をさらに効果的に改善できることを示している。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）変異タンパク質であって、前記変異タンパク質が非天然タンパク質であり、前記変異タンパク質が野生型ＡＤＨのアミノ酸４５〜１４９のうちに少なくとも１つのヒスチジン（Ｈ）の変異を有する、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）変異タンパク質。
【請求項２】
前記変異が、前記野生型ＡＤＨの６７、６９、９３および／または９４位のヒスチジン（Ｈ）を含まない、請求項１に記載の変異タンパク質。
【請求項３】
前記変異を受けたヒスチジンが、塩基性アミノ酸へ独立に変異されることができる、請求項１または請求項２に記載の変異タンパク質。
【請求項４】
前記変異を受けたヒスチジンが、以下の群：リジン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）およびこれらの組み合わせから選択される１またはそれより多くのアミノ酸へ独立に変異されることができる、請求項１または請求項２に記載の変異タンパク質。
【請求項５】
前記変異タンパク質が、酵母由来のＡＤＨに基づく改造によって得られ、前記酵母が、好ましくはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、より好ましくはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異タンパク質。
【請求項６】
前記ＡＤＨ変異タンパク質のアミノ酸配列が、以下の群：
（ａ）そのアミノ酸配列が配列番号：２〜１３の任意の１つであるポリペプチド；
（ｂ）配列番号：２〜１３に示されているアミノ酸配列を有するポリペプチドの１つに由来し、ＡＤＨ活性と前記変異タンパクのＮｉ媒体への低下させた結合能力とを有するポリペプチド；前記ポリペプチドは、配列番号：２〜１３に示されているアミノ酸配列の任意の１つ中の１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加によって形成され、置換、欠失または付加に供されるアミノ酸残基の数は、好ましくは１〜２０、より好ましくは１〜１５、より好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜８、より好ましくは１〜３、最も好ましくは１である；
（ｃ）配列番号：２〜１３に示されている配列の任意の１つと少なくとも７０％の配列相同性、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％の配列相同性、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列相同性を有するポリペプチド；前記ポリペプチドは、ＡＤＨ活性と前記変異タンパク質のＮｉ媒体への低下させた結合能力とを有する；
（ｄ）配列番号：１、２６、２７または２８に示されている配列と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも８５％または９０％の相同性、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％または９９％の相同性を有するポリペプチド；前記ポリペプチドは、ＡＤＨ活性と前記変異タンパク質のＮｉ媒体への低下させた結合能力とを有する；
から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の変異タンパク質。
【請求項７】
ポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドが請求項１〜６のいずれか一項に記載の変異タンパク質をコードし、または請求項１〜６のいずれか一項に記載の変異タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的である、ポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項７に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項９】
内因性ＡＤＨタンパク質をコードする遺伝子が請求項１〜６のいずれか一項に記載の変異タンパク質をコードするポリヌクレオチドに変異され、
前記内因性ＡＤＨタンパク質は、Ｎｉ媒体に親和性を有し、
前記変異タンパク質は、ＡＤＨ活性及び低下したＮｉ媒体への結合能力を有し、
好ましくは、前記遺伝子改変された株は、酵母に由来し、
さらに好ましくは、前記遺伝子改変された株は、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓに由来し、
さらに好ましくは、前記遺伝子改変された株は、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓに由来する、遺伝子改変された株。
【請求項１０】
請求項９に記載された遺伝子改変された株の細胞溶解物。
【請求項１１】
請求項１０に記載された細胞溶解物を含み、
好ましくは、前記インビトロタンパク質合成系は無細胞系であり、
さらに好ましくは、前記インビトロタンパク質合成系は、無細胞転写及び翻訳系である、インビトロタンパク質合成系。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のＡＤＨ変異タンパク質を含む酵素調製物。
【請求項１３】
請求項９に記載の遺伝子改変された株を製造する方法。
【請求項１４】
精製にＮｉ媒体を用いたとき、改善された発現タンパク質の生成物純度を提供する、請求項９に記載の遺伝子改変された株、又は請求項１０に記載の細胞溶解物、又はタンパク質合成に適用可能な請求項１１に記載のインビトロタンパク質合成系の使用。
【国際調査報告】
2021525528.tif 000032
2021525528.tif 000033
2021525528.tif 000034
2021525528.tif 000035