(57)【要約】本発明は、トマトの遺伝子Ｓｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０を提供する。この遺伝子のコード化タンパク質のヌクレオチド配列は配列番号１に示される。本発明は、同時に、トマト中で変異遺伝子Ｓｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０をノックアウトすることでその果実のリコペンの含有量を効果的に増加させる上記トマトの遺伝子Ｓｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０の使用をさらに提供する。本発明は、トマト中で変異遺伝子Ｓｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０をノックアウトする方法をさらに同時に提供する。本発明の方法を使用することで、トマトの果実のリコペンの含有量を効果的に増加させる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号１に示される、ことを特徴とするトマト遺伝子Ｓｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０。
【請求項２】
請求項１に記載のトマト遺伝子Ｓｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０の使用であって、
トマト中で変異遺伝子Ｓｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０をノックアウトし、トマト果実中のリコペンの含有量を増加させる、ことを特徴とする使用。
【請求項３】
ｍｕｔａｎｔ−１のＳｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号２に示され、
ｍｕｔａｎｔ−２のＳｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号３に示される、ことを特徴とする請求項２に記載の使用。
【請求項４】
トマト中で変異遺伝子Ｓｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０をノックアウトする方法であって、
ｓｇＲＮＡ−１：５’−ＧＴＣＴＴＣＴＣＡＡＴＡＣＡＴＣＣＡＣＡ−３、および
ｓｇＲＮＡ−２：’５’−ＧＧＧＣＴＧＡＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＧＴＴ−３’
のいずれか１つである、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で編集された標的配列ｓｇＲＮＡを設計するステップ１）と、
ステップ１）で得られた配列によりＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９担体を構築するステップ２）と、
ステップ２）で得られた担体を用いてトマトを変換し、対応する遺伝子組換えトマト植物体：ｍｕｔａｎｔ−１およびｍｕｔａｎｔ−２を得るステップ３）と、
を含み、
前記遺伝子組換えトマト植物体は、変異遺伝子Ｓｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０がノックアウトされたトマト植物体であることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トマト果実中のリコペンを増加させる遺伝子およびその使用に関し、作物分子遺伝分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
トマトは、重量な野菜と果物であり、熟したトマト果実には大量のリコペンが含まれる。リコペンは、自然界で発現されている最も強い酸化防止剤の一つであり、フリーラジカルを除去する効果が他のカロテノイドやビタミンＥよりもはるかに優れており、その一重項酸素消光速度定数がビタミンＥの１００倍である。そのため、リコペンは、老化の遅延、抗がん、消化管疾患、心血管疾患など多くの慢性疾患の抑制効果を有する。遺伝育種の方法によりトマト果実中のリコペンを効果的に増加可能な遺伝子を探すことは、非常に重要な研究と応用価値を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明が解決しようとする技術的課題は、トマト果実中のリコペンの含有量を効果的に向上させることである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上述の技術的問題を解決するために、本発明は、トマトの遺伝子Ｓｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０を提供する。この遺伝子のコード化タンパク質のヌクレオチド配列は配列番号１に示される。
【０００５】
本発明は、トマト中で変異遺伝子Ｓｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０をノックアウトすることでその果実のリコペンの含有量を効果的に増加させる上記遺伝子の使用をさらに提供する。
【０００６】
本発明は、トマト中で変異遺伝子Ｓｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０をノックアウトする方法をさらに提供する。この方法は、
ｓｇＲＮＡ−１：５’−ＧＴＣＴＴＣＴＣＡＡＴＡＣＡＴＣＣＡＣＡ−３、および
ｓｇＲＮＡ−２：’５’−ＧＧＧＣＴＧＡＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＧＴＴ−３’のいずれか１つであるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で編集された標的配列ｓｇＲＮＡを設計するステップ１）と、
ステップ１）で得られた配列によりＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９担体を構築するステップ２）と、
ステップ２）で得られた担体を用いてトマト（ＭｉｃｒｏＴｏｍ）を変換し、対応する遺伝子組換えトマト植物体を得るステップ３）と、
を含む。
上記遺伝子組換えトマト植物体は、変異遺伝子Ｓｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０がノックアウトされたトマト植物体である。
【０００７】
本発明の技術案は以下の通りである。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術により、Ｓｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０遺伝子コード配列（配列番号１）を特異的に標的とするｓｇＲＮＡを設計し、トマト品種ＭｉｃｒｏＴｏｍのＳｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０遺伝子をノックアウトし、この遺伝子の複数のノックアウト変異体植物体を得る。これらの変異体に対してＰＣＲ増幅およびシーケンシング分析した結果、Ｓｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０遺伝子の２つの異なるタイプのフレームシフト変異ｍｕｔａｎｔ−１およびｍｕｔａｎｔ−２が同定された（図１）。ｍｕｔａｎｔ−１のＳｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０遺伝子配列は配列番号２であり、ｍｕｔａｎｔ−２のＳｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０遺伝子配列は配列番号３である。
【発明の効果】
【０００８】
Ｓｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０遺伝子の２つ変異体およびその対照品種ＭｉｃｒｏＴｏｍの果実を比較した結果、変異体の熟した果実は対照品種よりも明らかに赤く（図２）、その果実中のリコペンの含有量は対照品種よりも顕著に高い（図３）ことが発見された。また、ｑＰＣＲ技術により未熟果実中のリコペンを合成する重要な酵素の遺伝子ＰＤＳ（ｐｈｙｔｏｅｎｅ  ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ）の発現を分析した結果、Ｓｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０遺伝子の２つの変異体において、この遺伝子の発現は、対照品種よりも顕著に高いことが発見された（図４）。これらの結果から分かるように、トマトＰＤＳ遺伝子の発現はＳｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０遺伝子によりダウンレギュレートされ、トマト中でＳｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０遺伝子をノックアウトすることにより、果実中のＰＤＳ遺伝子の発現量の増加を効果的に促進し、果実中のリコペンの生合成を促進し、リコペンの含有量を向上させ流ことができ、重要な育種価値を有する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
以下、図面を参照しながら本発明の具体的な実施形態をさらに詳しく説明する。
図３および図４における数値は平均値±標準差であり、＊＊は、トマトＳｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０遺伝子変異体と野生型対照ＭｉｃｒｏＴｏｍとの比較において、ｔ検定には顕著な有意差（Ｐ＜０．０１）が存在することを示す。
【００１０】
【図１】トマトＳｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０遺伝子がノックアウトされた変異体のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的部位のシーケンシング分析である。ＭｉｃｒｏＴｏｍは野生型対照品種を示す。ｍｕｔａｎｔ−１およびｍｕｔａｎｔ−２はＳｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０遺伝子の２つの異なるノックアウト変異体を示す。
【図２】トマトＳｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０遺伝子変異体と野生型対照ＭｉｃｒｏＴｏｍとの果実比較図である。
【図３】トマトＳｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０遺伝子変異体および野生型対照ＭｉｃｒｏＴｏｍの果実リコペン含有量の測定を示す。
【図４】トマトＳｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０遺伝子変異体および野生型対照ＭｉｃｒｏＴｏｍの未熟果実中のフィトエン不飽和化酵素をコードする遺伝子ＰＤＳの発現レベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
＜ステップ１＞
トマトＳｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０遺伝子がノックアウトされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９担体の構築
Ｓｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０遺伝子のコード配列（配列番号１）に基づいてＣＲＩＳＰＲ  Ｄｅｓｉｇｎプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／）により２つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で編集された標的配列ｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ−１：５’−ＧＴＣＴＴＣＴＣＡＡＴＡＣＡＴＣＣＡＣＡ−３’、ｓｇＲＮＡ−２：５’−ＧＧＧＣＴＧＡＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＧＴＴ−３’）を設計し、バイオテクノロジー企業でｓｇＲＮＡのＤＮＡ配列を合成した。そして、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９キット（Ｂｉｏｇｌｅ，Ｃｈｉｎａ）により対応するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９担体を構築した。構築は製品マニュアルに従って操作した。
【００１２】
＜ステップ２＞
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９担体で構築されたトマト遺伝的変換
Ｋｉｍｕｒａなどの方法（Ｋｉｍｕｒａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ，ＣＨＳ  Ｐｒｏｔｏｃ，２００８）により構築した２つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９担体を用いてそれぞれトマト品種ＭｉｃｒｏＴｏｍを変換し、遺伝子組換えトマト植物体を得た。
【００１３】
＜ステップ３＞
遺伝子組換えトマト中のｓｇＲＮＡ標的部位のシーケンシング分析
トマトの葉の総ＤＮＡの抽出：トマトの葉を０．１ｇ取り、液体窒素で研磨した後、６００μｌ抽出液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．０，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，１．５％ＳＤＳ）を加え、６５℃で６０分間インキュベートした。２００μｌの５Ｍ  ＫＡＣを加え、均一に混合した後、氷浴で１０分間冷却した後、５００μｌクロロホルムを加え、均一に混合し、１００００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を取り、５００μｌイソプロパノールを加え、均一に混合し、１２０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を捨て、７５％エタノールで沈殿を洗浄し、１２０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を捨て、逆さまにしてＤＮＡを１５分間乾燥させた後、３０μｌ純水を加えてＤＮＡを溶解した。
【００１４】
ＧｏＴａｑ（登録商標）Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）ＰＣＲキットを用いて会社でプライマーＦ：５’−ＣＡＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＧＡＡＣＧＧＡＧ−３’およびＲ：５’−ＴＴＴＡＣＣＴＧＴＧＧＡＡＧＴＧＡＴ−３’を合成し、遺伝子組換えトマト植物体およびその対照品種ＭｉｃｒｏＴｏｍのゲノムＤＮＡをテンプレートとし、それぞれＳｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０遺伝子に対してＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ反応系は、製品マニュアルに従って操作した。ＰＣＲ増幅プログラムは、予備変性：９４℃、５分間；変性：９４℃、３０秒；アニーリング：５５℃、３０秒；伸長：７２℃、４５秒；３５×サイクル；伸長：７２℃、１０分間である。ＰＣＲ生成物を１％アガロースゲル中で３０分間電気泳動し、臭化エチジウム（ＥＢ）で染色した。
【００１５】
ＰＣＲ生成物をバイオテクノロジー企業に郵送してシーケンシング分析を行った。配列をＳｅｑＭａｎソフトウェアで比較し、Ｓｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０遺伝子の２種類のホモ接合型変異体ｍｕｔａｎｔ−１およびｍｕｔａｎｔ−２を同定した。２つの変異体は、異なる位置でそれぞれ１つの塩基Ｔが欠失し、１つの塩基Ｃが挿入され（図１）、いずれもＳｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０遺伝子にフレームシフト変異が発生し、この遺伝子機能の喪失が引き起こされた。
【００１６】
変異体ｍｕｔａｎｔ−１のヌクレオチド配列は配列番号２に示され、変異体ｍｕｔａｎｔ−２のヌクレオチド配列は配列番号３に示される。
【００１７】
＜ステップ４＞
トマト果実のリコペン含有量の測定
同定されたＳｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０遺伝子の２つの変異体と対照品種ＭｉｃｒｏＴｏｍを温室（２５℃、照明１６時間、暗所８時間）で植え付けた。トマトの果実が熟した後、各品種からランダムに３株を選択し、各株から３つの熟した果実を取った。
【００１８】
０．２ｇの果実組織を秤量し、液体窒素で粉末に研磨した後、８ｍＬのヘキサン：エタノール：アセトン（２：１：１，Ｖ：Ｖ：Ｖ）混合液を加え、室温条件下でシェーカー上（１００ｒｐｍ）に置き、一晩静置した。１ｍＬのＨ２Ｏを加え、渦巻き振とうし、溶媒層（上層液）を取り、分光光度計を用いてヘキサンを対照として５０３ｎｍでの吸光度を測定し、３回繰り返して測定し、以下の一般式でトマト果実中のリコペンの含有量を算出した。
リコペン（μｇ／ｇ）＝（ｘ／ｙ）×Ａ５０３×３．１２
式中、ｘはヘキサンの量（ｍｌ）であり、ｙは果実組織の重量（ｇ）であり、Ａ５０３は５０３ｎｍでの吸光度であり、３．１２は消光係数である。
測定結果についてｔ検定により変異体と野生型対照との間の有意差を分析した。
【００１９】
分析した結果、Ｓｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０遺伝子変異体ｍｕｔａｎｔ−１およびｍｕｔａｎｔ−２果実のリコペン含有量はいずれも対照品種ＭｉｃｒｏＴｏｍよりも顕著に高かった（図２、３）。
【００２０】
＜ステップ５＞
リコペンを合成するための重要な酵素遺伝子ＰＤＳ（ｐｈｙｔｏｅｎｅ  ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ）の発現分析
上記Ｓｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０遺伝子の２つの変異体および対照品種ＭｉｃｒｏＴｏｍの未熟果実を取り、各品種からランダムに３株を選択し、各株から３つの果実を取った。ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，  Ｇｅｒｍａｎ）キットを用いてトマト果実のＲＮＡを抽出した。方法は製品マニュアルに従って操作した。Ｐｒｉｍｅ  ＳｃｒｉｐｔＴＭ  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ｇＤＮＡ  Ｅｒａｓｅｒ（Ｔａｋａｒａ，Ｊａｐａｎ）キットを用いてＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。方法は製品マニュアルに従って操作した。
【００２１】
ＴＢ  ＧｒｅｅｎＴＭ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  ＴａｑＴＭ（Ｔａｋａｒａ，Ｊａｐａｎ）Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＰＣＲキットを用いて会社で内参Ａｃｔｉｎ遺伝子および目的遺伝子ＰＤＳの発現プライマー：Ａｃｔｉｎ  Ｆ：５’−ＣＡＧＣＡＧＡＴＧＴＧＧＡＴＣＴＣＡＡＡ−３’およびＡｃｔｉｎ  Ｒ：５’−ＣＴＧＴＧＧＡＣＡＡＴＧＧＡＡＧＧＡＣ−３’；ＰＤＳ  Ｆ：５’−ＡＣＧＡＡＡＣＡＧＡＡＡＴＡＣＴＴＧＧＣ−３’およびＰＤＳ  Ｒ：５’−ＣＴＴＣＣＧＡＣＡＡＣＴＴＣＴＴＴＴＧＧ−３’を合成した。キットの説明に従って操作し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社の７５００Ｆａｓｔ  ｑＰＣＲ機によりリアルタイム蛍光定量的ＰＣＲ分析を行い、２−△△Ｃｔ法によりＰＤＳ遺伝子の発現レベルを分析した。
【００２２】
分析した結果、Ｓｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０遺伝子変異体ｍｕｔａｎｔ−１およびｍｕｔａｎｔ−２の果実のＰＤＳ遺伝子の発現レベルは、いずれも対照品種ＭｉｃｒｏＴｏｍよりも顕著に高かった（図４）。
【００２３】
以上の説明は、本発明のいくつかの具体的な実施例に過ぎない。本発明は、以上の実施例に限定されず、たくさんの変形例を含む。当業者が本発明の開示内容から直接導出または想到できる全ての変形は、いずれも本発明の保護範囲に含まれる。
【図１】
2021519105.tif 000003
【図２】
2021519105.tif 000004
【図３】
2021519105.tif 000005
【図４】
2021519105.tif 000006
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年12月28日(2020.12.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子のヌクレオチド配列が配列番号１に示されるトマト遺伝子Ｓｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０の使用であって、
トマト中で変異遺伝子Ｓｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０をノックアウトし、トマト果実中のリコペンの含有量を増加させる、ことを特徴とする使用。
【請求項２】
ｍｕｔａｎｔ−１のＳｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号２に示され、
ｍｕｔａｎｔ−２のＳｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号３に示される、ことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
トマト中で変異遺伝子Ｓｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０をノックアウトする方法であって、
ｓｇＲＮＡ−１：５’−ＧＴＣＴＴＣＴＣＡＡＴＡＣＡＴＣＣＡＣＡ−３、および
ｓｇＲＮＡ−２：’５’−ＧＧＧＣＴＧＡＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＧＴＴ−３’
のいずれか１つである、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で編集された標的配列ｓｇＲＮＡを設計するステップ１）と、
ステップ１）で得られた配列によりＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９担体を構築するステップ２）と、
ステップ２）で得られた担体を用いてトマトを変換し、対応する遺伝子組換えトマト植物体：ｍｕｔａｎｔ−１およびｍｕｔａｎｔ−２を得るステップ３）と、
を含み、
前記遺伝子組換えトマト植物体は、変異遺伝子Ｓｏｌｙｃ０９ｇ００５７３０がノックアウトされたトマト植物体であることを特徴とする方法。
【国際調査報告】
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2021519105.tif 000008
2021519105.tif 000009
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