(57)【要約】  本発明は、ニュージーランドミドリイガイ（ペルナ・カナリクルス（Perna canaliculus））由来の＜１０ｋＤａ又は＜１ｋＤａの単離分子量分画からなる生物活性非脂質抽出物に関する。本抽出物は、降圧活性、抗酸化活性、抗微生物活性、抗ウイルス活性及び抗寄生虫活性のうち１つ以上から選択される生物活性を示す。本抽出物は、遊離アミノ酸；ペプチド；クリプタイド；糖及び／又はヌクレオシド及びそれらの誘導体を含む糖含有化合物；グリコシド、グリコシルアミン、糖タンパク質、糖ペプチド、ペプチドグリカンなどの複合糖質を含む炭水化物；プリン類を含む窒素含有化合物；フェノール化合物；無機質；代謝産物を含む群から選択される複数の生物活性物質を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニュージーランドミドリイガイ（ペルナ・カナリクルス（Perna canaliculus））から得られる＜１０ｋＤａ又は＜１ｋＤａの単離分子量分画からなる生物活性非脂質抽出物であって、抗酸化活性、降圧活性、抗微生物活性、抗ウイルス活性及び抗寄生虫活性のうち１つ以上から選択される生物活性を示す、抽出物。
【請求項２】
前記＜１０ｋＤａ分画が、遊離アミノ酸；ペプチド；クリプタイド；糖及び／又は、ヌクレオシド及びそれらの誘導体を含む糖含有化合物；複合糖質を含む炭水化物、例えばグリコシド、グリコシルアミン、糖タンパク質、糖ペプチド、ペプチドグリカンなど；プリン類を含む窒素含有化合物；フェノール化合物；無機質；代謝産物を含む群から選択される複数の生物活性物質を含む、請求項１に記載の抽出物。
【請求項３】
前記＜１ｋＤａ分画が、遊離アミノ酸；低分子ペプチド、例えばジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチドなど；低分子クリプタイド；低分子糖及び／又は、ヌクレオシド及びそれらの誘導体を含む糖含有化合物；プリン類を含む低分子窒素含有化合物；低分子フェノール化合物；無機質；低分子代謝産物を含む群から選択される複数の生物活性物質を含む、請求項１に記載の抽出物。
【請求項４】
約１〜１０重量％の遊離形態アミノ酸を含む、請求項１又は２に記載の抽出物。
【請求項５】
比較的より高い割合のアミノ酸アルギニン及び／又はグリシンを含む、請求項４に記載の抽出物。
【請求項６】
ＡＣＥ阻害活性を示す、請求項１に記載の抽出物。
【請求項７】
ＤＰＰＨスカベンジング活性を示す、請求項１に記載の抽出物。
【請求項８】
請求項１〜７の何れか１項に記載の抽出物を含む組成物。
【請求項９】
医薬、栄養補助、獣医学、化粧、機能性化粧品又は食品組成物である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
降圧組成物である、請求項８又は９に記載の組成物。
【請求項１１】
降圧効果が、前記抽出物中に存在する１つ以上の遊離アミノ酸及び／又は１つ以上のクリプタイド及び／又は１つ以上のペプチドにより提供される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記抽出物が、少なくとも３０％の潜在的に生理活性である降圧ペプチドを含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記抽出物が複数のペプチドを含み、そのうち少なくとも１つが、アミノ酸配列：Ｐｈｅ−Ｐｈｅ；Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ；Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ；Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ；Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ；Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ；Ｌｅｕ−Ｔｒｐ；Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ；Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ；Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ；Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ；Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅを有するペプチドを含む群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
抗酸化組成物である、請求項８又は９に記載の組成物。
【請求項１５】
抗酸化効果が、前記抽出物中に存在する、１つ以上の遊離形態アミノ酸及び／又は１つ以上のクリプタイド及び／又は１つ以上のペプチド及び／又は１つ以上の糖又はヌクレオシド及びそれらの誘導体を含む糖含有化合物及び／又はプリン類を含む１つ以上の窒素含有化合物により提供される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記抽出物が、アミノ酸配列：Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ及び／又はＬｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒを有するペプチドから選択される１つ以上のペプチドを含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記抽出物が、少なくとも５％の潜在的に生理活性である抗酸化ペプチドを含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
前記抽出物が単離された＜１ｋＤａ分子量分画である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１９】
抗微生物組成物、抗ウイルス組成物又は抗寄生虫組成物である、請求項８又は９に記載の組成物。
【請求項２０】
前記食品組成物が、機能性食品若しくは飲料、機能性食品若しくは飲料成分、機能性食品若しくは飲料添加物又は健康補助食品である、請求項９に記載の組成物。
【請求項２１】
高い血圧又は高血圧の処置、制御又は予防のための組成物の製造における、請求項１〜６の何れか１項に記載の生物活性抽出物の使用。
【請求項２２】
高い血圧又は高血圧の処置、制御又は予防を必要とする対象に、請求項１〜１３の何れか１項に記載の治療的有効量の生物活性抽出物又は組成物を投与することにより、高い血圧又は高血圧を処置、制御又は予防する方法。
【請求項２３】
ニュージーランドミドリイガイ（ペルナ・カナリクルス（Perna canaliculus））から単離されるＡＣＥ阻害ペプチドであって、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ；Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ；Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ；及びＬｅｕ−Ｔｒｐからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＡＣＥ阻害ペプチド。
【請求項２４】
請求項２３に記載のペプチドのうち１つ以上を含む降圧組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、ニュージーランドミドリイガイ種（ペルナ・カナリクルス（Perna canaliculus））から得られる生物活性イガイ抽出物及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
貝類及び他の海洋生物種の抽出物の潜在的な健康効果及び生理活性特性に関して、長年にわたり幅広い研究が行われてきた（Sularia et. al.,(2015) Marine-Based Nutraceuticals: An Innovative Trend in the Food and Supplement Industries Mar. Drugs (2015) 13, 6336-6351。ニュージーランドミドリイガイ（ペルナ・カナリクルス（Perna canaliculus））のユニークな特性は４０年を超えて研究されてきた。ニュージーランドの沿岸部のマオリ集団は歴史的に、内陸のマオリ集団よりも関節炎の発症が低いことが認められた。これは、沿岸部のマオリ集団がミドリイガイを大量に消費することに起因し、このことから、ミドリイガイ種が抗炎症活性を有したことが示唆される。様々な乾燥ミドリイガイ粉末（脂質構成成分を含む全粉末）は、ヒト及び動物における関節炎の処置のための健康補助食品として販売されてきた。
【０００３】
一部の臨床知見から、ペルナ・カナリクルス（Perna canaliculus）の脂質抽出物が抗炎症活性を有し、関節炎の管理で使用され得ることが示されている（Halpern (2000)  Anti-inflammatory effects of a stabilized lipid extract of Perna canaliculus (Lyprinol); Brien et al. (2008) Systematic review of the nutritional supplement Perna Canaliculus (green-lipped mussel) in the treatment of osteoarthritis Q J Med 2008; 101:167-179）。ミドリイガイの脂質抽出物は、関節炎症状の緩和での使用のために市販されている。
【０００４】
ニュージーランドミドリイガイ（ペルナ・カナリクルス（Perna canaliculus））は、高レベルのオメガ−３脂肪酸を含有し、これらは、ビタミン、無機質、タウリン、アミノ酸、ポリフェノール、カロテノイド及びグルコサミノグリカン（ＧＡＧ又はムコ多糖）の活性化合物、コラーゲン及びグリコーゲンを含む他の有益な化合物の豊富な供給源であり、これらの一部は、好ましい健康効果を有することが示されている（Grienke et al. (2014) Bioactive compounds from marine mussels and their effects on human health Food Chemistry 142 (2014) 48-60; Coulson et al in Rainsford et al (2015) Novel Natural Products: Therapeutic Effects in Pain, Arthritis and Gastro-intestinal Diseases, Progress in Drug Research 70）。
【０００５】
しかし、抗炎症特性が脂質分画に起因すると広く考えられているため、ミドリイガイ粉末サプリメントに関する研究は主に、脂質イガイ抽出物の抗炎症特性に焦点が当てられてきた（Coulson et al (2015)）。イガイ粉末又は抽出物中に存在する非脂質構成成分、特に、タンパク質、ペプチド及び他の潜在的に生理活性である物質などの水溶性物質を含む水性又は親水性分画、並びに高分子量構成成分及び不溶性タンパク質などの不溶性物質の潜在的な健康特性についてはあまり注目されておらず、又はあまり研究も行われていない。あらゆる生物活性に寄与する重要な構成成分はイガイ中に存在する脂質構成成分であると広く考えられている。
【０００６】
このために、イガイ加工中、非脂質構成成分は一般に、廃棄されるか、又は医薬若しくは栄養学的使用に適さないが、動物餌における、釣り餌における、及び肥料における、食品香味料若しくはシーズニングとして代わりに使用される、脱脂イガイ粉末などの低価値の副産物を生産するために使用される。現在市販されている脱脂イガイ粉末は、生理活性の目的のために生産されるものではない副産物なので、生理活性は知られていないか又は証明されておらず、生理活性物質はその生成物中で維持又は保持されない。
【０００７】
イガイ中で、脂質構成成分と比較してはるかに大きな体積の非脂質構成成分があるとすると、非脂質副産物を廃棄するか又は低価値の最終製品中でそれらを使用することは無駄であり、イガイ全体の潜在的な健康効果を利用するための機会の喪失である。結果的に、廃棄物を減少させ、より高価値及び有用な最終製品を提供するために、非脂質ミドリイガイ構成成分の潜在的な生理活性及び使用を調べる必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
発明の目的
本発明の目的は、ニュージーランドミドリイガイの非脂質構成成分由来の生物活性抽出物及び／又はこの抽出物を含む組成物を提供すること、又は少なくとも、有用な選択を公共に提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
第１の態様では、本発明は、ニュージーランドミドリイガイ（ペルナ・カナリクルス（Perna canaliculus））由来の＜１０ｋＤａ又は＜１ｋＤａの単離分子量分画からなる生物活性非脂質抽出物に存し、この抽出物は、抗酸化活性、降圧活性、抗微生物活性、抗ウイルス活性及び抗寄生虫活性を含む群のうちの１つ以上から選択される生物活性を示す。
【００１０】
好ましくは、＜１０ｋＤａ抽出物は、遊離アミノ酸；ペプチド；クリプタイド；糖及び／又はヌクレオシド及びそれらの誘導体を含む糖含有化合物；グリコシド、グリコシルアミン、糖タンパク質、糖ペプチド、ペプチドグリカンなどの複合糖質を含む炭水化物；プリン類を含む窒素含有化合物；フェノール化合物；無機質；代謝産物を含む群から選択される複数の生物活性物質を含む。
【００１１】
好ましくは、＜１ｋＤａ抽出物は、遊離アミノ酸；低分子ペプチド、例えばジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチドなど；低分子クリプタイド；低分子の糖及び／又は、ヌクレオシド及びそれらの誘導体を含む糖含有化合物；プリン類を含む低分子窒素含有化合物；低分子フェノール化合物；無機質；低分子代謝産物を含む群から選択される複数の生物活性物質を含む。
【００１２】
好ましくは、本抽出物は、必須アミノ酸を含む複数の遊離形態アミノ酸を含む。
【００１３】
好ましくは、本抽出物は、約１〜１０重量％の遊離形態アミノ酸を含む。
【００１４】
より好ましくは、本抽出物は、約４〜９重量％の遊離形態アミノ酸を含む。
【００１５】
好ましくは、本抽出物は、他のアミノ酸と比較して、より高い割合のアルギニン及び／又はグリシンを含む。
【００１６】
さらなる態様では、本発明は、本明細書中に記載の生物活性抽出物を含む組成物又は調製物に存する。本組成物又は調製物は、好ましくは食品、医薬、薬剤、栄養補助食品、健康補助食品、動物用製品、機能性化粧品又は化粧料である。
【００１７】
さらなる態様では、本発明は、本明細書中に記載のような生物活性抽出物を含む降圧組成物に存する。好ましくは、降圧活性は、本抽出物中に存在する１つ以上の遊離形態アミノ酸及び／又は１つ以上のペプチド及び／又は１つ以上のクリプタイドにより提供される。好ましくは、降圧活性はＡＣＥ阻害効果により提供される。
【００１８】
好ましくは、本抽出物は、少なくとも３０％の潜在的に生理活性である降圧ペプチドを含む。
【００１９】
好ましくは、本抽出物は、複数のペプチドを含み、これらのうち少なくとも１つは、アミノ酸配列：Ｐｈｅ−Ｐｈｅ；Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ；Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ；Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ；Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ；Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ；Ｌｅｕ−Ｔｒｐ；Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ；Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ；Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ；Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ；Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅを有するペプチドを含む群から選択される。より好ましくは、本抽出物は、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ；Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ；Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ；及びＬｅｕ−Ｔｒｐを含む群から選択される少なくとも１つのペプチドを含む。
【００２０】
さらなる態様では、本発明は、ニュージーランドミドリイガイ（ペルナ・カナリクルス（Perna canaliculus））から単離されるＡＣＥ阻害ペプチドに存し、このペプチドは、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ；Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ；Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ；及びＬｅｕ−Ｔｒｐからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。この単離ペプチドは、高い血圧及び／又は高血圧を処置、制御又は予防するための機能性食品及び飲料を含め、組成物に組み込まれ得る。
【００２１】
さらなる態様では、本発明は、高い血圧又は高血圧の処置、制御又は予防のための組成物又は薬剤の製造における、本明細書中に記載のような生物活性抽出物の使用に存する。
【００２２】
またさらなる態様では、本発明は、高い血圧又は高血圧の処置、制御又は予防を必要とする対象に治療的有効量の本明細書中に記載のような生物活性抽出物又は組成物を投与することにより、高い血圧又は高血圧を処置、制御又は予防する方法に存する。
【００２３】
さらなる態様では、本発明は、本明細書中に記載のような生物活性抽出物を含む抗酸化組成物に存する。好ましくは、抗酸化活性は、抽出物中に存在する、１つ以上の遊離形態アミノ酸、及び／又は１つ以上のペプチド、及び／又は１つ以上のクリプタイド、及び／又は１つ以上の糖又はヌクレオシド若しくはそれらの誘導体などの糖含有化合物、及び／又はプリン誘導体などの１つ以上の窒素含有化合物により提供される。
【００２４】
好ましくは、本抽出物は、少なくとも５％の潜在的に生理活性である抗酸化ペプチドを含む。
【００２５】
好ましくは、本抗酸化組成物は、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ及び／又はＬｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒから選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドを含む、複数のペプチドを含む。
【００２６】
好ましくは、本抗酸化組成物は、分子量が＜１ｋＤａの単離抽出物を含む。好ましくは、本抽出物はＤＰＰＨスカベンジング活性を示す。
【００２７】
本抽出物又は抗酸化組成物は、食品、化粧品及び医薬品を含む多岐にわたる製品の保存の際に天然の抗酸化剤として使用され得る。
【００２８】
さらなる態様では、本発明は、本明細書中に記載のような生物活性抽出物を含む抗微生物組成物に存する。本抽出物又は抗微生物組成物は、食品、洗浄製品、化粧品及び医薬品を含む多岐にわたる製品の保存の際に天然の抗微生物剤として使用され得る。
【００２９】
さらなる態様では、本発明は、本明細書中に記載のような生物活性抽出物を含む抗ウイルス組成物に存する。抗ウイルス特性を有する抽出物は、様々な健康製品中に含まれ得る。
【００３０】
さらなる態様では、本発明は、本明細書中に記載のような生物活性抽出物を含む抗寄生虫組成物に存する。抗寄生虫特性を有する抽出物は、様々な健康製品及び動物用製品中に含まれ得る。
【００３１】
さらなる態様では、本発明は、本明細書中に記載のような生物活性抽出物及び１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物に存する。
【００３２】
さらなる態様では、本発明は、本明細書中に記載のような生物活性抽出物及び１つ以上の栄養学的に許容可能な賦形剤を含む栄養補助組成物に存する。本栄養補助組成物は、健康補助食品又は栄養補給剤であり得る。
【００３３】
さらなる態様では、本発明は、本明細書中に記載のような生物活性抽出物を含む食品組成物に存する。本食品組成物は、機能性食品若しくは飲料、機能性食品若しくは飲料成分、機能性食品若しくは飲料添加物又は健康補助食品であり得る。
【００３４】
またさらなる態様では、本発明は、抗酸化組成物の製造における、本明細書中に記載のような生物活性抽出物の使用に存する。
【００３５】
またさらなる態様では、本発明は、抗微生物組成物の製造における本明細書中に記載のような生物活性抽出物の使用に存する。
【００３６】
またさらなる態様では、本発明は、医薬組成物、動物用組成物、栄養補助組成物、機能性化粧品組成物、食品又は化粧品の製造における本明細書中に記載のような生物活性抽出物の使用に存する。
【００３７】
定義
本願において、文脈から必要とされない限り、次の用語は次の定義を有する：
「粗製抽出物」は、何らかの形態のミドリイガイ（殻を含むか又は除く）由来の（非分画化）抽出物全体又は何らかの形態のミドリイガイ由来の脱脂若しくは脱脂肪抽出物を意味する。
【００３８】
「親水性分画」は、粗製全イガイ抽出物に対して少なくとも１回の脂質除去、分離又は抽出段階を行った後に残留する抽出物の分画を意味し、この分画は主に非脂質構成成分及び非脂質分子を含むが、一部の疎水性物質が分画中に依然として残留し得る。
【００３９】
「生物活性抽出物」は、遺伝子発現、細胞、組織、器官又は生物において薬理学的（又は生化学的及び／又は生理学的）効果を発揮する抽出物を意味する。
【００４０】
「クリプタイド」は、親タンパク質の配列内に隠されているか又は暗号化されている潜在的な生理活性ペプチドを意味する。
【００４１】
説明
ここで、単なる例として添付の図面を参照して本発明を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、実施例３で参照されるような試験試料３のSuperdex 75分画化のクロマトグラムを示す。
【図２】図２は、Superdex 75分画化から回収した試験試料３分画中のタンパク質及び糖濃度並びにＤＰＰＨスカベンジング活性を示すグラフである。
【図３】図３は、Superdex 75分画化から回収した試料３分画中のタンパク質濃度及びＤＰＰＨスカベンジング活性を示すグラフであり、選択した分画の濃縮物での結果と比較する。
【図４】図４は、Superdex 75分画化からの試料３分画（Ａ８、９  １０及び１２、Ｂ１及びＢ２）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。
【図５】図５は、Superdex 75分画化からの試料３分画（Ｂ８、９、１０、１１及び１２）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。
【図６】図６は、タンパク質及び糖濃度の合計による正規化ＤＰＰＨスカベンジング活性を示すグラフである。
【図７】図７は、試料３−Ｂ１０Ｃ分画化に対するＣ１８クロマトグラムである。
【図８】図８は、試料３−Ｂ１１Ｃ分画化に対するＣ１８クロマトグラムである。
【図９】図９は、Superdex 75分画、Ｂ９Ｃ〜Ｂ１２Ｃに対するＬＣ−ＭＳの結果を示す。
【図１０】図１０は、Superdex 75分画、Ｂ９Ｃ〜Ｂ１２Ｃに対するＬＣ−ＭＳの結果を示す。
【図１１】図１１は、Superdex 75分画、Ｂ９Ｃ〜Ｂ１２Ｃに対するＬＣ−ＭＳの結果を示す。
【図１２】図１２は、Superdex 75分画、Ｂ９Ｃ〜Ｂ１２Ｃに対するＬＣ−ＭＳの結果を示す。
【図１３】図１３は、Ｂ１０Ｃ−Ｆ７並びにＢ１１Ｃ−２２、２３及び２４のＣ１８分析からのＬＣ−ＭＳの結果を示す。
【図１４】図１４は、Ｂ１０Ｃ−Ｆ７並びにＢ１１Ｃ−２２、２３及び２４のＣ１８分析からのＬＣ−ＭＳの結果を示す。
【図１５】図１５は、Ｂ１０Ｃ−Ｆ７並びにＢ１１Ｃ−２２、２３及び２４のＣ１８分析からのＬＣ−ＭＳの結果を示す。
【図１６】図１６は、Ｂ１０Ｃ−Ｆ７並びにＢ１１Ｃ−２２、２３及び２４のＣ１８分析からのＬＣ−ＭＳの結果を示す。
【図１７】図１７は、ある生物活性化合物のＭＳ／ＭＳ分析を示す。
【図１８】図１８は、ある生物活性化合物のＭＳ／ＭＳ分析を示す。
【図１９】図１９は、ある生物活性化合物のＭＳ／ＭＳ分析を示す。
【図２０】図２０は、ある生物活性化合物のＭＳ／ＭＳ分析を示す。
【図２１】図２１は、ある生物活性化合物のＭＳ／ＭＳ分析を示す。
【図２２】図２２は、ある生物活性化合物のＭＳ／ＭＳ分析を示す。
【図２３】図２３は、本発明の抽出物のＡＣＥ阻害用量反応曲線を示すグラフである。
【図２４】図２４は、試験した抽出物中に存在する遊離形態アミノ酸の分布及び相対的割合を示す表である。
【図２５】図２５は、試験した抽出物中に存在する潜在的な生理活性ペプチドの総数を示すグラフである。
【図２６】図２６は、試験した抽出物中に存在する潜在的な生理活性ペプチドのタイプ及び相対的割合を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
次の記載は、本発明の好ましい実施形態に関して発明を記載するが、これらの好ましい実施形態は本発明を純粋に例示しようとするものなので、本発明はこれらに何ら限定されず、本発明の範囲から逸脱することなく、当業者にとって容易に明らかになるであろう可能な変更及び変形がなされ得ることが想定される。
【００４４】
本発明は、ニュージーランドミドリイガイ（ペルナ・カナリクルス（Perna canaliculus））由来の生物活性抽出物に関し、この抽出物は、粗製イガイ抽出物から得られる実質的に非脂質であるか又は親水性である構成成分を含む。驚くべきことに、ミドリイガイから抽出される非脂質構成成分は、降圧、抗酸化剤、抗微生物、抗ウイルス及び抗寄生虫活性を含むある一定の生理活性を示すことが分かった。
【００４５】
本発明の抽出物は、粗製の全（未分画化）ミドリイガイ抽出物又は組成物を生成させるために、殻付き又は殻なしの生きているイガイ、新鮮イガイ、凍結イガイを含め、何らかのミドリイガイ出発材料から得られ得る。或いは、本発明の抽出物は、既に脂質構成成分が実質的に除去されている（例えば脱脂若しくは脱脂肪イガイ抽出物、組成物又は粉末）、液体、半乾燥若しくは乾燥状態の粗製全（未分画化）イガイ組成物から、又は何らかの液体、半乾燥若しくは乾燥状態のミドリイガイ抽出物若しくは組成物から得られ得る。イガイ出発材料中に存在する生理活性構成成分の大部分を保持しているように、本発明の抽出物を得るために使用される粗製イガイ組成物が加工されていることが重要である。例えば、イガイ出発材料中に存在する生理活性構成成分を破壊するように加工中に過剰な熱を使用しないことが重要である。好ましくは、可能な限り生理活性構成成分を多く維持するために、穏やかな低温加工法を使用して粗製抽出物を生成させる。
【００４６】
全イガイ組成物又は抽出物を作製するための加工法は、一般的には次の段階を含む：（１）イガイの殻からの身又は肉の除去−例えば、これは手作業で、又は例えば圧搾若しくは機械的な開殻若しくは脱殻技術を用いて機械的に、又は高圧加工し、続いて殻を分離することにより行い得；（２）身又は肉を小片に縮小するためのサイズ縮小−これは、イガイの身又は肉を刻み、すり潰し、ブレンドし、遠心分離又は微粉砕することなどの機械的ホモジナイズを含むホモジナイズ技術により行い得るか、又は或いは、酵素加水分解、酸若しくはアルカリ加水分解を含む生体内分解工程又は発酵を含む他の手段により身又は肉を液状化し得る。
【００４７】
出願者の特許出願第ＰＣＴ／ＮＺ２０１７／０５０１６７号において、丸ごとの生きているイガイに対して行われ得、イガイの殻を開くか又は間隙を作り（好ましくは穏やかに暖めることによる）、標的基質をエマルジョンの形態へと液状化するのに十分な時間にわたり生きているイガイの１つ以上の標的基質を酵素処方に曝露し、続いて残留殻、殻の破片及び非標的基質又は非標的生体物質を除去することを含む酵素処理方法が記載されている。これは、抽出物の高収率（量）及び生物活性物質の高収率（質）の両方をもたらすので、粗製全イガイ抽出物を作製する好ましい方法である。例えば、出願者の研究から、特許出願第ＰＣＴ／ＮＺ２０１７／０５０１６７号に記載の酵素加水分解工程により作製されたイガイ抽出物は一般に、他の工程により作製された粗製イガイ抽出物との比較において、より高い生理活性レベルを有する。
【００４８】
一般的には、粗製イガイ組成物（全組成物又は「脱脂」組成物の何れか）を乾燥させ、次いで粉砕又は製粉して粉末形態にする。一般に、凍結乾燥又は噴霧乾燥などの低温乾燥法を使用するが、フラッシュ乾燥、真空乾燥又はベルト乾燥などの他の乾燥法を使用し得る。
【００４９】
所望の生物活性分画を粗製イガイ組成物又は抽出物から単離するために、粗製イガイ組成物又は抽出物に対して少なくとも１回の分離、分画化又は抽出段階を行うことによって、本発明の生物活性抽出物を作製する。
【００５０】
粗製抽出物が全イガイ抽出物又は組成物である場合、全イガイ組成物又は抽出物をその主要分画、即ち脂質に富む又は疎水性分画；及び非脂質又は親水性分画（幾分かの疎水性物質をさらに含有し得る）へと分離するために最初に少なくとも１回の分離段階を行い得る。これは、当技術分野で公知の方法、例えば水若しくは溶媒抽出方法；脂質分画の吸い上げ若しくは汲み上げ；遠心分離；デカント；トリカンティング（tricanting）；沈殿若しくは結晶化法；固相抽出（ＳＰＥ）法；ゲルろ過若しくはサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）法；イオン交換クロマトグラフィー；限外ろ過；又はナノろ過により達成し得る。
【００５１】
分離段階後、当技術分野で公知の方法を使用して、粗製抽出物からの特異的な分子量の分画、即ち＜１０ｋＤａ及び＜１ｋＤａ分画を単離するために１回以上の分画化段階を行う。
【００５２】
或いは、より高い分子量を有する脂質構成成分は自然に保持液中に残るので、脂質及び非脂質を最初に分離することなく、粗製抽出物から特異的な分子量の分画、即ち＜１０ｋＤａ及び＜１ｋＤａ分画を単離し得る。固相抽出法、膜ろ過法、限外ろ過法、ナノろ過法、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ＳＥＣ（ゲルろ過）、ＨＰＬＣ及びイオン交換クロマトグラフィーを含むクロマトグラフィー法を含む当技術分野で公知の方法によって、分画化段階を行い得る。
【００５３】
本発明の濃縮生物活性抽出物を作製するために、当技術分野で公知の方法（例えば低温真空蒸発）によって単離分画を濃縮し得る。単離分画はまた、当技術分野で公知の方法によるさらなる精製段階を使用することによって、必要に応じて容易にまた精製し得る。
【００５４】
本発明の生物活性抽出物は、好ましくは、例えば凍結乾燥などの低温乾燥法又は噴霧乾燥、真空乾燥若しくはベルト乾燥などの他のフラッシュ乾燥技術を使用して乾燥させる。これにより、抽出物を容易に使用し、様々な生成物形態に組み込むことが可能になる。
【００５５】
本発明の抽出物を作製する、ある好ましい方法の例は次のように記載される。特許出願第ＰＣＴ／ＮＺ２０１７／０５０１６７号に記載の酵素処理方法を使用して、粗製全イガイ抽出物を調製する。即ち、丸ごとの生きているイガイを開くか又は「間隙を作り」、イガイをエマルジョン形態に液状化するのに十分な時間にわたり、十分な温度で、酵素処方物に曝露し、続いて残留殻及び／又は殻の破片及び他の非標的生体物質を分離する。好ましくは、酵素処方物は、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）由来の少なくとも１つのプロテアーゼを含む。好ましくは、少なくとも５０分間にわたり、５０〜５５℃の温度でイガイを酵素に曝露する。次に、この工程により作製される液体イガイ組成物を使用して、分子量が＜１０ｋＤａ又は＜１ｋＤａである化合物を含む所望の分画を回収するために液体組成物に対して限外ろ過法を使用して少なくとも１つの分離、分画化又は抽出段階を行うことにより、本発明の抽出物を調製し得る。或いは、所望の分画を回収するために限外ろ過を行う前に、例えば凍結乾燥又は噴霧乾燥によってこの液体組成物を乾燥させ、任意選択により粉末へと製粉又は粉砕し得る。
【００５６】
本発明の生物活性抽出物は、タンパク質、クリプタイド、ペプチド、遊離アミノ酸、核酸、無機質、糖又はヌクレオシド及びそれらの誘導体などの化合物を含有する糖、グリコシド、グリコシルアミン、糖タンパク質、糖ペプチド、ペプチドグリカンなどの複合糖質を含む炭水化物、プリン誘導体を含む窒素含有化合物、フェノール化合物並びに他の低分子代謝産物など、実質的に非脂質性の構成成分を含む。一部の低分子疎水性物質が抽出物中に依然として存在し得る。
【００５７】
驚くべきことに、本発明の抽出物は、例えば降圧剤、抗酸化剤、抗微生物剤、抗ウイルス剤及び／又は抗寄生虫剤のような、多くの使用の可能性を有する複数の生物活性構成成分を含むことが分かった。
【００５８】
「降圧剤」及び「降圧組成物」という用語は、本明細書中で使用される場合、一般に高い血圧又は高血圧により引き起こされ得るか又はその結果生じ得る状態の処置又は予防を含む、一般に高い血圧又は高血圧の状態の処置又は予防に使用され得る物質又は組成物に関する。
【００５９】
「抗酸化剤」及び「抗酸化組成物」という用語は、本明細書中で使用される場合、酸化経路に関与する酵素の阻害など、酸化及び／又は酸化過程を完全に又は部分的に阻害することにより、酸化ストレスを低下させることが可能であるか、又は生体においてフリーラジカルなどの損傷を与える可能性のある酸化剤を除去し得る、物質又は組成物に関する。
【００６０】
「抗微生物剤」及び「抗微生物組成物」という用語は、本明細書中で使用される場合、微生物、特に病原性微生物の増殖を、完全若しくは部分的に無効にするか又は阻害することが可能である物質又は組成物に関する。
【００６１】
「抗ウイルス剤」及び「抗ウイルス組成物」という用語は、本明細書中で使用される場合、ウイルスの影響又は感染に対抗することを支援する物質又は組成物に関する。
【００６２】
「抗寄生虫剤」及び「抗寄生虫組成物」という用語は、本明細書中で使用される場合、寄生虫感染に対抗することを支援する物質又は組成物に関する。
【００６３】
本発明の生物活性抽出物がこれらの用途のための多岐にわたる組成物へと処方され得ることが想定される。例えば、機能性食品又は飲料処方物、食品又は飲料成分、機能性食品香味料若しくはシーズニングとしての食品への応用において本抽出物を使用し得るか、又は化粧品の製造において（例えば抗酸化剤）又は必要に応じて適切な担体及び賦形剤を使用した、医薬、栄養補助食品若しくは健康補助食品組成物、例えば錠剤、カプセル、カシェ、シロップ、エリキシル若しくは他の剤型など、の製造において、これらを使用し得る。本抽出物はまた、栄養補助的なペットフード、健康補助食品及び動物用薬剤など、動物に対する適用でも使用し得る。
【００６４】
例えば、次のものを含め、様々な抗酸化的な適用においてミドリイガイ由来の非脂質単離活性分画を使用し得る：
（食料品がそれらの味及び色を維持し、長期間にわたり食用に適したものであり続けることを確実にし、食料品中に存在するある種のビタミン及びアミノ酸を破壊し得る酸化が起こるのを防止するための添加物又は保存剤のような）食品用途；
健康補助食品又は栄養補給剤又は機能性食品若しくは飲料（抗酸化剤は、多岐にわたる疾病及び慢性疾患を引き起こし得るフリーラジカルの損傷性の影響を相殺するので、良好な健康に非常に重要であることが分かっている）を含む、医薬及び／又は栄養補助食品用途；
化粧用途（抗酸化剤は、日焼けによる損傷及び早期老化からの皮膚の保護に役立つことが示されている）。
【００６５】
さらなる例として、本発明の抽出物は、食品用途、医薬用途、クリーニング用途、パーソナルケア用途及び工業的用途を含め、様々な抗微生物用途で使用され得る。
【００６６】
さらなる例として、次のものを含む降圧目的のための様々な用途において本発明の抽出物を使用し得る：
機能性食品用途（高い血圧又は高血圧を処置、制御又は予防するために特別に設計される食品又は飲料製品中の機能的成分として）；
（高い血圧又は高血圧を処置、制御又は予防するために設計される）健康補助食品又は栄養補給剤を含む医薬及び／又は栄養補助的な用途。
【００６７】
同様に、抗ウイルス又は抗寄生虫目的の様々な用途で本発明の抽出物を使用し得る。
【００６８】
従って、本発明は、剤型に依存し、必要に応じて、任意選択により、生理学的に許容可能な担体、保存剤、緩衝液、安定化剤などを含む従来の添加物及び／又は賦形剤とともに、本発明の生物活性抽出物を含有する組成物を提供する。
【００６９】
次の実施例は例示目的のためにのみ提供する。
【実施例】
【００７０】
実施例１−降圧活性
特に高血圧により心血管系リスク及び他の健康問題のリスクが上昇するため、世界中で高血圧の成人が多数存在し、増加していることから、公衆衛生システムにおいて高血圧予防、処置及び調節は非常に重要なものとなっている。高血圧の調節は一般に、レニン・アンジオテンシン・アルドステロン系（ＲＡＡＳ）並びに一酸化窒素（ＮＯ）系及び交感神経系（ＳＮＳ）系に関連する。ＲＡＡＳ内の重要な酵素としてはレニンが挙げられるが、これは、アンジオテンシン−Ｉ及びアンジオテンシン−Ｉ−変換酵素（ＡＣＥ）を生じさせるために肝臓により産生されるアンジオテンシノーゲンに対して作用する。ＡＣＥは、デカペプチドアンジオテンシンＩからＣ末端Ｈｉｓ−Ｌｅｕを放出させ、それをアンジオテンシンＩＩに変換するジペプチジルカルボキシペプチダーゼである。アンジオテンシンＩＩは、強力な血管収縮剤及び塩保持ペプチドである。アンジオテンシンＩＩが異常に高レベルであると、高血圧になり、肺細動脈及びサルコイドーシスなどの疾患につながる。
【００７１】
現在、高血圧の臨床処置においていくつかの合成ペプチドが使用されている。これらには、カプトプリルを含むスルフィドリル含有物質、第１のＡＣＥ阻害剤、ゾフェノプリル、エナラプリル、ラミプリル、キナプリル、ペリンドプリル、リシノプリル及びベナザプリルを含むジカルボキシラート含有物質並びにホシノプリルを含むホスホナート含有物質が含まれる。しかし、合成ＡＣＥ阻害剤には、咳嗽、眩暈、頭痛、発赤、胸痛及び他の医薬品との有害な相互作用を含む、いくつかの望ましくないが一般的な副作用がある。さらに、これらは、先天異常を引き起こし得るため、妊婦には使用できない。従って、高血圧予防に対する食事療法及び食事アプローチを調べることを含め、これらの合成薬物に対するより安全な代替物を発見することに研究の焦点が当てられている。
【００７２】
ニュージーランドミドリイガイ抽出物の潜在的な降圧効果を調べるため、それらがＡＣＥに対する何らかの阻害活性を示すか否かを調べることにより、乾燥粗製全イガイ組成物から得られる次の非脂質抽出物を降圧活性について試験した。
【００７３】
【表１】
2021519304.tif 000002
【００７４】
この試験において、上記試料においてＡＣＥの阻害活性をスクリーニングするために、ＡＣＥアッセイを使用した。ＡＣＥ基質Ｎ−［３−（２−フリル）アクリロイル］−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（ＦＡＰＧＧ）及びウサギ肺からのＡＣＥは両方ともSigmaから購入した。０．３Ｍ  ＮａＣｌを含有するＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８）中０．５ｍＭでＦＡＰＧＧの作業溶液を調製した。ＡＣＥは２Ｕ／ｍＬ溶液で保管し、アッセイ前に同じＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液中で０．２Ｕ／ｍＬに新たに希釈した。カプトプリル、ＡＣＥ阻害剤を１ｍＭに調製し、陽性対照としてアッセイ中で使用した。
【００７５】
ＡＣＥアッセイの測定は、ＡＣＥ添加後のＦＡＰＧＧの加水分解に基づく。放出されたＦＡＰにより３４０ｎｍでの吸収低下が起こる。３７℃まで予め温めた９６ウェルプレート中でアッセイを行った。試料の２０μＬのアリコート（三つ組み）をウェルに添加し、続いて２０μＬのＡＣＥ及び１８０μＬのＦＡＰＧＧを添加した。３７℃にて１０分間、カイネティックモードで分光光度計（SpectraMax M4）において３４０ｎｍでの吸収を測定した。最大加水分解速度（１０分間の時間枠に対する吸収低下の勾配として測定）をＡＣＥ活性として使用した。ＡＣＥ阻害を次のように計算した：
【数１】
2021519304.tif 000003
式中、Δ試料は、試料での加水分解の勾配であり、Δ対照は、対照（阻害剤なし）における加水分解の速度である。
【００７６】
アッセイ緩衝液（０．３Ｍ  ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８）で１０ｍｇ／ｍＬ可溶性ストック液から５、１、０．１、０．０１及び０．００１ｍｇ／ｍＬに全ての試料を希釈した。１０ｍｇ／ｍＬ及び５ｍｇ／ｍＬでの最初の試験から、試料１〜５においてほぼ１００％の阻害が明らかになり、さらなる希釈液では、全試料がＡＣＥ阻害活性の相違を示し始めた。異なる濃度の各試料中のＡＣＥ阻害活性間の相関をExcelでプロットし、各試料に対してＩＣ５０値を計算するために、数式フィットを行った。ＩＣ５０値を以下の表で列挙する。
【００７７】
【表２】
2021519304.tif 000004
【００７８】
全ての試料が０．１ｍｇ／ｍＬより高い濃度で良好なＡＣＥ阻害（＞７０％）を示した。
【００７９】
比較として、同じ方法を使用して、上記試料それぞれの対応物であるエタノール抽出物（即ちエタノール又はＤＭＳＯ抽出により各試料から分離された脂質分画）も試験し、その結果から、９種類の試料のそれぞれの脂質分画の活性は、それらの親水性分画対応物よりもはるかに低かった（５００分の１）ことが示された。これを以下の表で示すが、ＩＣ５０値は、上記表でのμｇ／ｍＬとは異なり、ｍｇ／ｍＬで示す。
【００８０】
【表３】
2021519304.tif 000005
【００８１】
ＡＣＥ阻害活性アッセイにおいて、親水性抽出物試料は、ＩＣ５０値が高濃度（ｍｇ／ｍＬレベル）である脂質抽出物試料と比較して、非常に低濃度（μｇ／ｍＬレベル）のＩＣ５０値を示した。これは、脂質構成成分ではなくミドリイガイ組成物中に存在する親水性構成成分が降圧活性の殆どに寄与し得ることを示す。
【００８２】
実施例２−分画化試料のＡＣＥ阻害活性
実施例１に記載の研究の結果として、２つの分画化ミドリイガイ抽出物試料を次のように作製した。
【００８３】
【表４】
2021519304.tif 000006
【００８４】
１０ｋＤａ膜（Amicon Ultra-0.5mL, Millipore, USA）を取り付けた小スケールの遠心ろ過ユニットを使用して、１０ｋＤａろ過段階を行った。全部で０．４ｍＬの各試料を遠心ユニットに載せ、次いで１４，０００×ｇで１０分間遠心分離した。保持液はおよそ４０μＬであり、約１０倍濃縮した。ろ液及び保持液の両方を回収し、粉末を溶解させるために異なる緩衝試薬（ＤＭＳＯ又はＤＭＳＯと水との混合液）を使用したことを除き、実施例１に記載の方法と同じ方法を使用してＡＣＥ阻害活性について試験した。
【００８５】
分画を水で希釈し、推定５ｍｇ／ｍＬレベルで試験した。ＡＣＥ阻害活性の結果を次の表でまとめる。
【００８６】
【表５】
2021519304.tif 000007
【００８７】
この結果から、両試料が単離＜１０ｋＤａ分子量分画においてより高いＡＣＥ阻害活性を有したことが示された。
【００８８】
これらの結果に基づき、ＡＣＥ阻害活性の用量反応に対するさらなる試験のために試料Ａを選択した。
【００８９】
２つの分画：分画＞１０ｋＤａ及び分画＜１０ｋＤａを凍結乾燥した。分画＜１０ｋＤａの乾燥粉末は灰白色であり、僅かに黄色みがあった。分画＞１０ｋＤａの乾燥粉末は薄茶色であった。両分画化粉末を水中で再溶解させて最初に１０ｍｇ／ｍＬにし、次に試験用に水中で５、２及び１ｍｇ／ｍＬに希釈した。周知のアンジオテンシン変換酵素阻害剤であるカプトプリル（Sigma）を陽性対照として使用し、０．１１、０．２２、０．４４ｍｇ／ｍＬで試験した。結果を以下の表でまとめ、図２３で示す。
【００９０】
【表６】
2021519304.tif 000008
【００９１】
実施例３−降圧化合物
実施例１で示されるような親水性分画の降圧及び／又はＡＣＥ阻害活性に関与すると思われる物質をさらに解明するために、ニュージーランドミドリイガイ由来の親水性イガイ抽出物の単離分画に対してペプチド分析を行った。この分析で使用した抽出物は、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）由来の酵素（NEUTRASEとして市販されている）を使用したイガイ肉／組織の酵素加水分解により作製された全ミドリイガイ組成物から作製した。５５〜６０℃の温度で５０〜６０分間、酵素加水分解を行った。分子量が＜１０ｋＤａである物質を含む分画を作製するために、液体クロマトグラフィーを使用して抽出物を単離し、次いでそれを質量分析に供して、分画中に存在するペプチドを同定した。ペプチドを同定したら、カスタムバイオインフォマティクスソフトウェアを使用して、ペプチドを潜在的な機能特性及び／又は生理学的効果とリンクさせるために、それらを分析した。
【００９２】
ペプチド分析の結果を以下の表で列挙する。
【００９３】
【表７】
2021519304.tif 000009
【００９４】
これらの結果から、単離＜１０ｋＤａ分画が、抽出物中に降圧及び／又はＡＣＥ阻害活性に寄与すると思われる多くのペプチドを含んだことが示される。これらは、２〜３個のアミノ酸からなるジペプチド及びトリペプチドなどの低分子ペプチドである。これらのペプチドのそれぞれの分子量範囲は、約２００〜５００ダルトンであると思われる。この試料中には、他のペプチドよりも多くのトリペプチドＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ及びジペプチドＬｅｕ−Ｔｒｐがある。例えば、そのまま抽出物として、又は高い血圧及び／又は高血圧の処置、制御又は予防のための様々な組成物中で、の何れかでＡＣＥ阻害ペプチドとして使用するために、＜１ｋＤａ分子量分画を得るためのさらなる限外ろ過段階によって、上記表で特定されるＡＣＥ阻害ペプチドの１つ以上又はこれらのペプチドの組み合わせをさらに単離し、濃縮し得ることが想定される。
【００９５】
さらなる試験から、本発明の抽出物により示される降圧及び／又はＡＣＥ阻害活性に関与し得る数百のクリプタイド又は潜在的な生理活性ペプチドがあることが示された（実施例７参照）。本発明の抽出物中に存在するペプチドのタイプ及び数は、単離分画を得るために使用した抽出物及び／又は出発材料（粗製抽出物）の製造方法により変動すると思われる。例えば、粗製抽出物を作るために酵素加水分解が使用される場合、その工程で使用される酵素並びに時間及び温度パラメーターは、得られる単離１０ｋＤａ又はより小さい分画中に存在するペプチドのタイプ及び数と関係があると思われる。しかし、僅かに少ないが依然として多数であるこれらのペプチドが他の方法により調製した抽出物中に存在するので、酵素加水分解は、降圧ペプチド及び／又はＡＣＥ阻害ペプチドを伴う抽出物を得るために必須ではないことは明らかである。
【００９６】
実施例３−抗酸化活性
酸化工程及びフリーラジカルの形成は、多くの様々なタイプの疾患又は健康状態に対する原因又は寄与因子であると思われる。さらに、食物の酸化は、食品劣化の主要な原因の１つである。食品及び製薬工業において、酸化及び食品損傷を防ぐためにブチル化ヒドロキシトルエンなどの合成抗酸化剤が使用される。しかし、合成抗酸化剤の使用は、これらの化合物の潜在的な健康リスクにより厳しく規制される。従って、天然の抗酸化剤の単離及び使用は、様々な健康効果を提供するという点並びに食品、化粧品及び医薬品中で使用される合成抗酸化剤の天然代替物を提供するという点で有益である。
【００９７】
非脂質ミドリイガイ抽出物の潜在的な抗酸化活性を調べるために、実施例１に記載の同じ９種類の試料を抗酸化活性についても試験した。
【００９８】
ＤＰＰＨスカベンジング法を使用して（即ち安定なフリーラジカル２，２−ジフェニル−１−（２，４，６−トリニトロフェニル）ヒドラジルを基質として使用することにより）、試料の抗酸化活性を試験した。ＤＰＰＨ溶液を０．１ｍＭエタノール中で調製し、使用前は暗所にてフリーザー中で維持した。陽性対照は、クエン酸及びＮａＨＰＯ４を含有する緩衝液（ｐＨ５）中で０．１ｍｇ／ｍＬとして調製したアスコルビン酸であった。等量の試料溶液及びＤＰＰＨ溶液を一緒に添加し、アッセイ試験管又はプレートを暗所で３０分間温置し、続いて分光光度計上で５１７ｎｍでの吸収測定を行った。各試料のブランク対照実験において、ＤＰＰＨをエタノールで置き換えた。ＤＰＰＨブランク対照実験において、試料を培地（水又は溶媒）で置き換え、試料を調製した。
【００９９】
試料対ＤＰＰＨ単独からの吸収のパーセンテージによりスカベンジング活性（ＤＰＰＨ阻害％）を計算する。
【数２】
2021519304.tif 000010
【０１００】
１０ｍｇ／ｍＬの濃度で全試料を試験した。その結果から、全試料が抗酸化活性を有したことが示された（全試料において８０％を上回る阻害）。結果を以下の表でまとめる。
【０１０１】
【表８】
2021519304.tif 000011
【０１０２】
特に、特許出願第ＰＣＴ／ＮＺ２０１７／０５０１６７号に記載の酵素処理法により作製された乾燥イガイ組成物（特に試料４、５及び７）は、非常に良好な抗酸化活性を示した。この方法により作製される組成物も、親水性構成成分の非常により高い収率を提供する（約７０％の収率、それに対して他の工程では約３０％の収率）ので、この処理法により得られる親水性分画はより高い全体的生理活性を有する。
【０１０３】
比較として、ＤＰＰＨ阻害活性について、上記親水性抽出物のそれぞれの対応する脂質抽出物も試験したところ、各脂質抽出物試料は、良好な（しかし僅かに低い）レベルの活性を示した。両分画が全体的なＤＰＰＨ阻害活性に寄与する一方で、驚くべきことに、親水性抽出物がより高い活性を示すことが分かり、粗製イガイ抽出物又は組成物から、脂質分画よりも高い親水性分画の収率が得られ得ると考えると、非脂質又は親水性構成成分を含むより有効な生物活性抽出物をより少ない原材料から作製し得る。
【０１０４】
実施例４−分画化試料の抗酸化活性
ＤＰＰＨスカベンジング活性について実施例２の試料Ａを試験した。実施例３に記載のものと同じ方法を使用して、５ｍｇ／ｍＬの１０ｋＤａ膜ろ過後の保持液（＞１０ｋＤａ）及び１０ｋＤａ膜ろ過後のろ液（＜１０ｋＤａ）の両方を試験した。この試験の結果を次の表で示す。
【０１０５】
【表９】
2021519304.tif 000012
【０１０６】
この試験は、単離＜１０ｋＤａ分画においてＤＰＰＨスカベンジング活性がより高かったことを示す。
【０１０７】
実施例５−抗酸化化合物
実施例３に記載の親水性抽出物試料中のどの構成成分がＤＰＰＨ阻害活性に関与したかをさらに同定するために、さらなる研究用に試料３を選択した。Superdex 75を使用してサイズ排除クロマトグラフィーによって試料を分画化した。試料３の２．５ｍＬ（５０ｍｇ）のアリコートを毎回載せ、ＰＢＳ緩衝液（５０ｍＭリン酸緩衝液、１５０ｍＭ  ＮａＣｌでｐＨ７．２）で１ｍＬ／ｍｉｎの流速にて２カラム体積（２×１２０ｍＬ）で溶出した。分画をそれぞれ５ｍＬで回収し、タンパク質及び糖濃度並びにＤＰＰＨ阻害について最初の３６分画を分析した。タンパク質及びペプチドを含有する全分画に対して、銀染色を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。高いＤＰＰＨスカベンジング活性がある分画を５回の実験から合わせ（全部で２５０ｍｇ載せる）、凍結乾燥を介して濃縮した。それらの元の体積の１０分の１の水で乾燥分画を再構成した。これらの濃縮分画に対してＤＰＰＨスカベンジング活性分析及びタンパク質測定を再び行って、それらのＤＰＰＨ阻害活性を確認した。
【０１０８】
Superdex 75分画化クロマトグラフィーの結果を図１で示す。Superdex 75分画化から、高いＤＰＰＨ阻害活性を示した試験試料３のいくつかの分画が明らかになった。各分画におけるタンパク質濃度、糖濃度及びＤＰＰＨ阻害活性を図２及び３で示す。最初の３０〜８０ｍＬ（半カラム体積）で殆どのタンパク質が溶出され、１０５〜１２０ｍＬの１カラム体積の終了時に少量のタンパク質を回収した。殆ど２つの領域：Ａ８〜Ａ９及びＢ８〜Ｂ１１で糖含量が溶出された。ＤＰＰＨスカベンジング活性はタンパク質濃度トレースに従わなかったが、その分画においてある程度、糖トレースと同調したことが分かった。ＤＰＰＨスカベンジング活性は分画Ｂ１０でピークになり、２つの隣接する分画Ｂ９及びＢ１１も良好な活性を明らかにした。凍結乾燥を介して最大ＤＰＰＨ阻害活性を示す分画を濃縮し、次いで水で再構成して、体積で１０倍の濃縮試料を得た。ＤＰＰＨ阻害を再び試験し、Ｂ８、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１１及びＢ１２の濃縮液は、２〜４倍の活性向上を示した。これにより、これらの分画におけるＤＰＰＨスカベンジング活性が確認される。
【０１０９】
可視化のために銀染色を行うＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質含有分画全てを分析し、図４及び５で結果を示す。図４は、試験試料３が、分画Ａ８〜Ｂ２で溶出された７５ｋＤａ未満の主要なタンパク質バンドを有することを示す。分画Ａ１２、Ｂ１及びＢ２は、２８〜３８ｋＤａ前後で主要なタンパク質バンドを示した。２８ｋＤａ未満、特に６ｋＤａ前後のより小さいペプチドが分画Ｂ８で溶出されたが、分画Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１１及びＢ１２ではあまり明らかでなかった（図５参照）。Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１１及びＢ１２におけるペプチドの量が低いのは、はるかに小さなペプチド及び／又は遊離形態アミノ酸及び／又は他の非タンパク質分子の存在によるものである可能性が最も高い。
【０１１０】
各分画のタンパク質及び糖の総濃度によりＤＰＰＨスカベンジング活性を正規化した場合、Ｂ１１が最大活性を保持する（図６参照）。Ｂ１１及びＢ１２中のタンパク質含量は無視でき（タンパク質検出限界より低い）、一方で糖含量は３９μｇ／ｍＬ及び５３μｇ／ｍＬ（以下表４参照）である。
【０１１１】
【表１０】
2021519304.tif 000013
【０１１２】
Superdex 75分離から得られる濃縮活性分画のうち４分画、即ちＢ９Ｃ、Ｂ１０Ｃ、Ｂ１１Ｃ及びＢ１２Ｃにおいてさらなる分析を行った。これらの分画は、＜１０ｋＤａ分子量分画（図５参照）であり、Ｃ１８カラムを用いたＨＰＬＣ−ＭＳにより分析した。ダイオードアレイ検出器及びQToF Premier Tandem質量分析装置（ＭＳ）を備えたWaters Alliance 2795 UPLCにおいてＬＣ−ＭＳ分析を行った。Ｃ１８カラムはKinetex XB-C18（１００×３．０ｍｍ、２．６μ）であった。タンパク質及び糖の量による正規化後、Ｂ１０Ｃ及びＢ１１ＣのＤＰＰＨ活性がより高いことに基づいて、Ｃ１８分取カラム（Prodigy  ５ｕ、ＯＤＳ（３）１００Ａ、１０×２５０ｍｍ）によるさらなる分画化のためにＢ１０Ｃ及びＢ１１Ｃを選択した。ＵＶ／ＶＩＳ検出器（Gilson 156）及び分画回収装置（GX-241）付きのGilson分取ＨＰＬＣシステムでＣ１８分画化を行った。３つの波長（２１０ｎｍ、２８０ｎｍ及び３６０ｎｍ）によりクロマトグラムを監視した。分画を５ｍＬごとに回収した。上記のようにＬＣ−ＭＳによりＣ１８分画化後の選択分画を分析した。Ｃ１８におけるＢ１０Ｃ及びＢ１１Ｃ分画化のクロマトグラムを図７及び８で示す。クロマトグラムから、Ｃ１８分離後、Ｂ１０Ｃが４つの主要なピーク、Ｆ５、６、７及びＦ２０を有することが示された。
【０１１３】
Ｂ１０Ｃのように、Ｂ１１Ｃの分画化も２つの領域：５分の保持時間点前後の３個のより早いピーク及び１０分の保持時間点前後の５個のピークに集中した。興味深いことに、ＵＶトレースは、Ｂ１０Ｃにおけるものと同様の保持時間で各ピークに対する異なる強度を示し、これにより異なる化合物の可能性が示された。Superdex 75分画、即ちＢ９Ｃ、Ｂ１０Ｃ、Ｂ１１Ｃ及びＢ１２Ｃに対するＬＣ−ＭＳの結果を図９〜１２で示す。Ｂ９Ｃ、Ｂ１０Ｃ、Ｂ１１Ｃ及びＢ１２Ｃに対するＬＣ−ＭＳデータは全て、これらの分画のそれぞれにおいていくつかの生物活性化合物があることを示唆する。
【０１１４】
図９のＵＶ及びＭＳチャートは、分画Ｂ９Ｃが糖を含有することを示す。これらは、四糖又は最大４個の６−炭素糖のオリゴ糖の混合物であると思われる。数個のアミノ酸も後のピークで示され、これらは、遊離形態で、又は糖ペプチドとして存在し得る。
【０１１５】
Ｂ１０Ｃ及びＢ１１Ｃのクロマトグラムは、主要なピークの保持時間についてある程度のレベルの類似性を示す（図１０及び１１）。しかし、ＭＳデータのさらなる分析から、この２つの試料が異なる組成を有することが示された。Ｂ１０Ｃ中のＲＴ２．６ｍｉｎのピークは、２個の６−Ｃ糖単位及び１個の５−Ｃ糖単位を有すると思われる糖化合物を含有し得る。ロイシン質量断片の存在から、遊離形態としてそれが存在するか又は糖含有化合物に連結されているかの何れかであることが示唆される。ＲＴ３．６ｍｉｎのピークも、２個の６−Ｃ糖単位を有すると思われる糖化合物であり得る。２個のアミノ酸、フェニルアラニン及びトリプトファンの質量断片が存在し、これは低分子糖ペプチド又は遊離形態アミノ酸の何れかであり得た。
【０１１６】
図１１において、Ｂ１１ＣはＲＴ２．１７ｍｉｎ及びＲＴ２．８４ｍｉｎでそれぞれピークを示す。これらのピークは、それぞれ５９２及び４００の分子量（ＭＷ）の化合物に関することが推定される。奇数を示すＭＳ断片全てにより、これらの２個のピークが偶数個の窒素（例えば０、２、４又は６個）を含有することが確実である。ＲＴ３．５８ｍｉｎのより後のピークはフェニルアラニンを含有し得る。
【０１１７】
Ｂ１２ＣのＵＶ及びＭＳクロマトグラムの両方（図１２）が主要ピークを２個のみ示す。より早いピークは、Ｂ１０Ｃ及びＢ１１Ｃで見られるような低分子糖として確認され；ＲＴ１．９５ｍｉｎの第２のピーク中の主要化合物の分子量は２６８であり、おそらく５−Ｃ糖及びプリン誘導体−ヒポキサンチンにより形成される。
【０１１８】
分取Ｃ１８カラムにおいてＢ１０Ｃ及びＢ１１Ｃのさらなる分画化を行った。さらにＣ１８分析用カラムを介したＬＣ−ＭＳによって次の分画：Ｂ１０Ｃ−Ｆ７、Ｂ１１Ｃ−２２、２３及び２４を分析した。分画Ｂ１０Ｃ−Ｆ７のＬＣ−ＭＳデータから、おそらくヒスチジンに連結され、ＭＷが６６３であるオリゴ糖含有化合物が示された（図１３）。この化合物はＦ７で優勢であり、そのＵＶ及びＭＳシグナル強度により評価して、他よりも量が１０倍多い。Ｆ７における他の３個のピークのＭＳデータから、最初の１個（ＲＴ１．９ｍｉｎ）がＭＷ  ２４４の化合物であり、第２のピーク（ＲＴ２．７ｍｉｎ）がＭＷ  １４５の分子を含有し、最後の１個（ＲＴ３．９ｍｉｎ）が遊離形態ヒスチジンのＭＳ断片化と一致することが示唆される。
【０１１９】
Ｂ１１Ｃ分画化からの活性分画、Ｆ２２−２４、のクロマトグラムから、多糖ピーク（ＲＴ＜２ｍｉｎ）がより少ないか又は枯渇したことが示された。Ｆ２２及び２３は、Ｃ１８クロマトグラフィー後、３．５ｍｉｎ〜５．６ｍｉｎに溶出されるＵＶトレースに４個の主要ピークがある同様のクロマトグラム（図１４〜１６）を示したが、それらの間でピークの高さの比が異なった。Ｆ２２における最初の２個のピークは、後の２個のピークよりも高く、一方でＦ２３では４個のピーク間でバランスの取れた分布がある。Ｆ２４のみがＲＴ４．５ｍｉｎで１個の主要ＵＶピークを有する。
【０１２０】
Ｆ２２及びＦ２３の両方における第１のピーク（ＲＴ３．７ｍｉｎ）のＭＳ分析から、５−Ｃ糖及び５Ｃ−糖と連結される、可能性があるヌクレオシド−核酸塩基様化合物を含有するＭＷ  ２９０（ＮａなしでＭＷ  ２６８）の化合物が示唆される。この化合物はＢ１２Ｃ分析でも見られた。第２のピーク（ＲＴ４．１ｍｉｎ）は、少なくとも１個の６Ｃ糖単位を含有し、５９２の総ＭＷを有する分子であり得、おそらく偶数個の窒素を含有する。第３のピーク（ＲＴ４．７ｍｉｎ）は、質量１３６の単位（ヒポキサンチン）及び１２７の断片ＭＳ（チミン）を含有する４００の総ＭＷを有する分子であり得る。最後のピーク（ＲＴ５．４ｍｉｎ）はその遊離形態でフェニルアラニン（ＭＷ  １６５）を含有する。
【０１２１】
これらの４個の分子（ＭＷ  ２６８、５９２、４００及び１６５）をさらに検証するために、それらのＭＷを標的とするこれらの４個の化合物のＭＳ／ＭＳ分析をポジティブモード（ＭＳ＋）で行った。この結果（図１７〜１９）から、最初の２つの化合物の両方がヒポキサンチン（２個の窒素を含有）であると思われるＭＳ１３７の主要断片を含有することが明らかになり、それらが構造関連であり得ることが示唆される。実際に、ＭＳ２６９とＭＳ４３１との間で６Ｃ−糖単位の相違があり、第１の化合物は、第２の化合物よりも６Ｃ−糖単位が２個少ないことが示唆される。ＭＳ１３７のさらなるＭＳ／ＭＳ分析から、それがヒポキサンチンであることが確認される（図２０）。
【０１２２】
２６９のＭＳ／ＭＳにおいて、ＭＳ２６９と１３７との間の質量の相違は５Ｃ−糖の欠失であり（１３２）、Ｂ１１Ｃ−２２の第１のピークがヌクレオシドに相当し得、第２の化合物がさらなる２個の６−Ｃ糖を伴うヌクレオシドであることが示唆される。第３のピークのＭＳ／ＭＳスペクトルは、ＭＳ２６５及びＭＳ１４９の２個の主要断片を有し、質量１１６−デオキシル５−炭素糖（デオキシリボース）の喪失があり、１４９（１２７＋Ｎａ＋）のさらなるＭＳ／ＭＳから１０３及び７９が得られ、チミンのＭＳ＋断片化と一致する（図２１）。これらのＭＳデータから、第３のピークは、ナトリウム塩形態のヒポキサンチンを伴うチミジン（ＭＷ  ２４２）であり得る（総ＭＷ  ４００）ことが示唆される。第４のピークのＭＳ／ＭＳは、その遊離形態のフェニルアラニン（ＭＷ  １６５）の典型的な質量断片化を示した（図２２）。
【０１２３】
Ｆ２２〜２４の３つの未知の化合物の構造分析のために、ＵＶスペクトルをそれぞれスキャンした。最初の２個のピーク（ＲＴ３．５ｍｉｎ及び４．０ｍｉｎ）は、２４８ｎｍの同じ最適ＵＶ吸収を示し、それにより、これらの２つの化合物間の構造類似性がさらに裏付けられる。第３のピークは、チミジンの場合のようにケトン含有化合物を示す２６７ｎｍで最適ＵＶ吸収を有する。Sigma Aldrich（www.sigmaaldrich.com）から、ヒポキサンチンに対する最大ＵＶ吸収は２４９ｎｍであり、チミジンでは２６７ｎｍであり、Ｂ１１Ｃにおける３つの未知の化合物においてＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析から得られる結論が裏付けられる。
【０１２４】
Ｂ１０Ｃ〜Ｆ７における４個のピークについてＵＶスペクトルもスキャンした。優勢なピーク（ＲＴ１．３ｍｉｎ）は２７３ｎｍで最適ＵＶ吸収を有し、第２のピーク（ＲＴ１．８ｍｉｎ）は３１８ｎｍで、第３のピーク（ＲＴ２．４ｍｉｎ）は１９０ｎｍであり、これは芳香族環がないことを示し、最後のピーク（ＲＴ３．８ｍｉｎ）は２５３ｎｍで最適ＵＶ吸収を有する。これにより、Ｂ１０Ｃ〜Ｆ７における化合物がＢ１１Ｃの場合とは異なることが確認される。
【０１２５】
これらの結果から、本発明の抽出物の抗酸化活性に関与すると思われる複数の生物活性化合物があることが示される。抗酸化活性についてのリード生理活性化合物は分子量が１ｋＤａ未満であると思われる（例えばＭＷ  ６６３、ＭＷ  １６５、ＭＷ  ２６８、ＭＷ  ５９２及びＭＷ  ４００の化合物）。従って、＜１ｋＤａの分子量分画を含む本発明の濃縮抽出物は、顕著な抗酸化特性を有すると思われる。抗酸化活性は、ヒスチジン及びフェニルアラニンなどの遊離形態アミノ酸、一部の低分子ペプチド又はクリプタイド、糖並びにヌクレオシド及びそれらの誘導体などの糖含有化合物、並びにプリン誘導体ヒポキサンチンなどの窒素含有化合物の組み合わせにより提供される可能性が高い。
【０１２６】
実施例６−  ＜１０ｋＤａ分画の遊離アミノ酸分析
方法
以下で調製されるような１０種類の分画化イガイ粉末試料を遊離アミノ酸含量について分析した。
【０１２７】
【表１１】
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【０１２８】
熱分解済みのガラスバイアル中で最初に２０ｍｇの各試料を正確に秤量した。次に３００μＬの０．１Ｍ  ＨＣｌを各試料に添加し、短時間ボルテックス処理し、次に３時間、超音波処理した。超音波処理段階後、試料を４０，０００ｇで１時間遠心分離した。０．４５ミクロンフィルター（Advantec）に通して上清をろ過し、ろ液を新しいEppendorfチューブで回収し、真空下で乾燥させ、次いで１ｍＬ  Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液、ｐＨ７．４中で溶解させた。AccQ-Tag試薬（Waters）を用いて遊離アミノ酸の誘導体化を行った。
【０１２９】
Ultimate 3000 HPLCシステム（Dionex）を使用して、遊離アミノ分析を行った。５μＬの誘導体化試料をThermofisher XL C18 Accucoreカラム（４．６ｍｍ  ｉ．ｄ×２５０ｍｍ、４μｍ粒子）上に注入し、C18 guardカラムと同様に保護した。５２分にわたり、１．５〜１６．５％移動相Ｂの勾配を使用し、１．０ｍＬ／ｍｉｎの流速を使用して３７℃でアミノ酸の分離を行った。移動相ＡはＬＣグレード水中のAccQ-Tag溶出液Ａであり、移動相Ｂは、１００％  ＬＣグレードアセトニトリルであった。蛍光検出器（Dionex ultimate FLD 3000）を使用した定量分析のために２５０ｎｍの励起波長及び３９５ｎｍの発光波長を使用した。
【０１３０】
結果
絶対量（ｍｇ／１００ｍｇ）としてアミノ酸分析からの結果を図２４で示す。この結果から、試験した試料の全てがアミノ酸の同様の範囲及び量を有したことが示される。各試料中の総遊離形態アミノ酸のｗ／ｗパーセンテージは約１〜１０％の範囲であり、試料の大部分は７〜９％ｗ／ｗの遊離形態アミノ酸を有した。
【０１３１】
各試料中に存在する最も突出したアミノ酸はアルギニンであり、次いでグリシンであった。他のアミノ酸の存在量ははるかに少量であった。他のアミノ酸と比較して、各試料中のアルギニンのパーセンテージは約３０〜５０％であった。他のアミノ酸と比較して、各試料中のグリシンのパーセンテージは約１５〜３５％であった。
【０１３２】
アルギニンは必須アミノ酸である。研究から、アルギニンが血圧を低下させることが示されている。メタ解析から、Ｌ−アルギニンが血圧を低下させることが示され、統合して推定すると、収縮期血圧について５．４ｍｍＨｇ及び拡張期血圧について２．７ｍｍＨｇであった。（Dong JY, Qin LQ, Zhang Z, Zhao Y, Wang J, Arigoni F, Zhang W (Dec 2011).“Effect of oral L-arginine supplementation on blood pressure: a meta-analysis of randomized, double-blind, placebo-controlled trials”. review. American Heart Journal. 162 (6): 959-965参照）。Ｌ−アルギニンの補給により、拡張期血圧を低下させ、子癇前症の一部として高血圧の女性を含め妊娠高血圧の女性の場合は妊娠期間が長くなることも示されている（Gui S, Jia J, Niu X, Bai Y, Zou H, Deng J, Zhou R (Mar 2014).“Arginine supplementation for improving maternal and neonatal outcomes in hypertensive disorder of pregnancy: a systematic review”. (review). Journal of the Renin-Angiotensin-Aldosterone System. 15 (1): 88-96）。
【０１３３】
従って＜１０ｋＤａ分画それぞれが多量の遊離形態アルギニンを含むので、これは本発明の抽出物の降圧活性において重要な役割を果たし得る。
【０１３４】
各試料中の２番目に多いアミノ酸は、多くの様々な筋肉、認知及び身体における代謝機能に関与するグリシンであった。
【０１３５】
この試料には、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン及びバリンを含め、他の必須アミノ酸も含まれた。本発明の抽出物中の遊離形態必須アミノ酸の存在は、遊離形態アミノ酸が身体によってより容易に吸収されるので有利である。従って、本発明の抽出物は、必須アミノ酸の供給源を提供するために、健康補助食品及び栄養補給剤中で、並びに機能性食品及び飲料製品として使用され得る。
【０１３６】
実施例７−  ＜１０ｋＤａ分画のペプチド／クリプタイド分析
クリプタイドは、消費後に好ましい生理的機能を発揮するタンパク質内に隠されるか又は暗号化される生理活性ペプチドである。クリプタイドは一般に３〜２０個のアミノ酸残基を含有し、それらの生理活性は固有のアミノ酸組成物及びペプチド配列内の位置に基づく。これらは、それらの親タンパク質の配列において不活性であるが、酵素性加水分解、発酵若しくは他の食品加工方法を含む多くの方法によるか、又は胃腸（ＧＩ）消化により放出され得る。好ましい生理的機能を発揮するために、クリプタイドは、消費後、腸障壁を横断し、ＧＩ管における酵素分解を生き延びなければならない。クリプタイドは多機能であることが多く、それらのアミノ酸配列に依存して、ヒト身体中で遊離する場合、異なる標的部位でいくつかの有益な生理的効果を発揮し得る。
【０１３７】
方法
クリプタイド、従って潜在的に生理活性であるペプチドの中身、について以下で調製されるような６個の分画化イガイ粉末試料を分析した。
【０１３８】
【表１２】
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【０１３９】
試料調製
２０ｍｇ／ｍＬ溶液を作製するために５分間にわたり超音波処理によりＬＣ  ＭＳ水中で試料を完全に溶解させた。次に、１０，０００ｇで４℃にて１時間、この溶液を遠心分離した。次に、得られた透明な上清を５％（ｖ／ｖ）アセトニトリルで４回希釈し、４℃にて１０，０００ｇで３０分間、遠心分離によって４００μＬの希釈溶液のそれぞれを１０Ｋ  ＭＷＣＯフィルター（Pall）に通してろ過した。次にろ液を真空濃縮器で乾燥させ、質量分析用の５０μＬの０．１％ギ酸中で再懸濁した。
【０１４０】
ＬＣ−ＭＳ及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析
CaptiveSpray源（Bruker Daltonik, Bremen, Germany）を備えるImpact II質量分析計と組み合わせたナノフローUltimate 3000 UPLC（Dionex）においてＬＣ−ＭＳを行った。各試料について、３０００ｎＬ／ｍｉｎの流速でC18 PepMap100 nano-Trapカラム（３００μｍ  ＩＤ×５ｍｍ、５ミクロン１００Å）上に１μＬの試料を載せた。次に、トラップカラムを分析用カラムProntoSIL C18AQ（１００μｍ  ＩＤ×１５０ｍｍ  ３ミクロン２００Å）にインライン（in line）で切り替えた。逆相溶出勾配は、６０分にわたり２％〜２０％〜４５％Ｂであり、６００ｎＬ／ｍｉｎの流速で全部で８８分であった。溶媒Ａは、０．１％ギ酸入りのＬＣＭＳグレード水であり；溶媒Ｂは０．１％ギ酸入りのＬＣＭＳグレードＡＣＮであった。データ依存型ＭＳ／ＭＳモードでこの試料を測定し、取得速度は、前駆体強度に依存して、ＭＳで２Ｈｚ、ＭＳ／ＭＳモードで１〜５Ｈｚであった。６０ｓｅｃのダイナミックエクスクルーションで陽イオン化モードにて分析を行った。
【０１４１】
ペプチド同定
PeaksX studio（Bioinformatics solutions Inc.）を使用してペプチドを同定した。前駆体質量に対する１０．０ｐｐｍのエラー及びフラグメントイオンに対する０．２Ｄａを考慮した。最初にデノボを介して化合物を調べ、続いてNCBI Mytilusデータベースに対して検索した。検索パラメーターは酵素を含まず、可変修飾はメチオニンの酸化及びアスパラギン又はグルタミンの脱アミド化であった。次に、さらに他の修飾について、及び再び単一アミノ酸置換についてSpiderにより化合物を検索した。
【０１４２】
生理活性ペプチド検索
関連する化学文献から得られるさらなる配列とともに、BIOPEP、PeptideDB、APD2及びEROPを含む様々なデータベースから集められた６９，３２６個のペプチドエントリーからのペプチドの推定生理活性の一致について検索するために、Custom Visual Base for Applications（ＶＢＡ）マクロを使用した。
【０１４３】
結果
この分析から、試験した試料のうち少なくとも２つにおける次のペプチド配列：Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ及びＬｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒに対する完全一致が明らかになった。これらのペプチド配列は、バイオインフォマティクス分析で抗酸化ペプチドとして同定された。
【０１４４】
各試料中で同定されるクリプタイド又は潜在的な生理活性ペプチドの総数を図２５で示す。これらの結果から、数百の潜在的な生理活性ペプチドが各試料中で同定されたことが示される（少なくとも６００）。特に、酵素加水分解を使用して調製した試料中でより多数のクリプタイドが同定され、これにより、酵素加水分解を使用して調製された粗製抽出物から得られた本発明の抽出物は、より多数の生理活性ペプチド及び幅広い範囲にわたる可能性がある生理活性物質を有することが示唆される。
【０１４５】
上記のようなバイオインフォマティクスを使用してクリプタイドの潜在的な生理活性を分析し、ある種の生理活性と関連付けられ得るこれらのクリプタイドを図２６で示すが、この図面は、各試料中に存在する潜在的な生理活性ペプチドのタイプ及び割合を示す。
【０１４６】
この結果から、各試料が、降圧／ＡＣＥ阻害活性；抗酸化活性；抗微生物活性；抗ウイルス活性及び抗寄生虫活性を含む一連の生理活性に起因し得る多数のクリプタイドを含んでいたことが示される。この分析から、本発明の抽出物中に潜在的に生理活性である降圧及び／又はＡＣＥ阻害ペプチドの高い割合が存在することが明らかになった。
【０１４７】
単離＜１０ｋＤａ分画は約３４〜３８％の潜在的に生理活性である降圧及び／又はＡＣＥ阻害ペプチドを含有した。
【０１４８】
この分析によってまた、単離＜１０ｋＤａ分画が約５〜８％の潜在的に生理活性である抗酸化ペプチド及び約４〜８％の潜在的に生理活性である抗微生物ペプチドを含有したことも示される。より少量の潜在的に生理活性である抗ウイルス及び抗寄生虫ペプチドも各試料中で同定された。従って、これらの生理活性特性をもたらすために、単独で又は様々な組成物中での何れかで、本発明の抽出物が使用され得ることが想定される。
【０１４９】
長所
ａ）本発明の生理活性抽出物は、良好なレベルの生物活性を示し、従って、廃棄するか又は低価値の副産物中で使用する代わりに、高価値の製品を作製するための多くの方法で利用し得（複数の健康効果を有する様々な製品を含む）；
ｂ）ミドリイガイからはるかに高い収率（それらの脂質抽出物対応物と比較）で非脂質又は親水性構成成分が得られ得、従って、より少ない原材料を使用して、より高い効力の単離抽出物及び組成物を作製し得；
ｃ）非脂質構成成分を含む組成物は、これらの官能特性に関与する脂溶性の芳香又は揮発物を含む脂質分画が除去されているので、臭い及び味が改善されており（魚臭さがより少ない）；
ｄ）本発明の抽出物は、多くの応用での、及び多くの異なる製品フォーマットでの使用に適切である。これらは、例えば食品の栄養価を向上させるために、様々な医薬、獣医学、栄養補助（健康補助食品など）、化粧品又は食品用途で、及びまた機能性食品の開発においても使用され得る可能性があり；
ｅ）本発明の抽出物は、望ましくない副作用又は健康リスクがあることが多い合成薬物又は化合物（合成ＡＣＥ阻害剤及び合成抗酸化剤など）に対する適切な天然代替物を提供し得る。これらはまた作製のための費用もより低い。
【０１５０】
改変物
本願の記載を通じて、「を含む（comprise）」という語及びこの語の変形物、例えば「を含むこと（comprising）」及び「を含む（comprises）」などは、他の添加物、構成成分、成分又は段階を排除するものではない。
【０１５１】
当然ではあるが、前述のものが本発明の例示的な例として与えられている一方で、全てのこのような及び他のそれに対する修飾及び変形は、当業者にとって明らかであるように、本明細書において上で記載されるように本発明の広い範囲及び区域内に入るものとすることが理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【国際調査報告】
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