(57)【要約】スケーラブルで再現性のある方法によるタンパク質治療薬のカプセル化および徐放性のための新しい生分解性ナノ粒子プラットフォームが記載される。具体的には、タンパク質またはペプチドと対イオン・ポリマーとを含む錯体を含むナノ粒子が記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬品と対イオン・ポリマーとを含む錯体であって、対イオン・ポリマーが、医薬品に静電的に結合することを可能にする充電を有する錯体と、生分解性ポリマー全体に分布する錯体を含むマトリックスと、を含むナノ粒子。
【請求項２】
前記対イオン・ポリマーが正に帯電している、請求項1に記載のナノ粒子。
【請求項３】
前記対イオン・ポリマーが負に帯電している、請求項1に記載のナノ粒子。
【請求項４】
前記医薬が正に荷電している、請求項1に記載のナノ粒子。
【請求項５】
前記医薬が負に帯電している、請求項1に記載のナノ粒子。
【請求項６】
医薬が、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、抗体、またはそれらの組み合わせを含む群から選択される、請求項1に記載のナノ粒子。
【請求項７】
前記対イオン・ポリマーが、デキストラン硫酸(DS)、ヘパリン(ヘパリン硫酸)、ヒアルロン酸、またはそれらの組み合わせを含む群から選択される、請求項3に記載のナノ粒子。
【請求項８】
前記生分解性ポリマーが、PLLA、PGA、PLGA、PCL、それらのPEG化したブロック・コポリマー、またはそれらの組み合わせを含む群から選択される共重合体で請求項1に記載のナノ粒子。
【請求項９】
請求項1記載のナノ粒子では、生分解性ポリマーはPEG-b-PLLA;PEG-b-PCL;またはその組み合わせです。
【請求項１０】
(A)医薬品と対イオン・ポリマーを第1の混合工程で混合することで高分子電解質複合体を形成することと、(b)第2の連続混合法を用いて生分解性ポリマーと共沈させることと、(c)生分解性ポリマーマトリクス全体に分布する高分子電解質複合体を含むナノ粒子を形成することと、を含むナノ粒子の製造方法。
【請求項１１】
工程(a)および工程(b)が同時に進行する、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記第1の連続方法がフラッシュ・ナノ複合体形成(flash nanocomplexation)で請求項10に記載の方法。
【請求項１３】
前記高分子電解質複合体(PEC)の形成が、前記医薬品と前記対イオン・ポリマーとの間の静電引力によるもので請求項10に記載の方法。
【請求項１４】
前記高分子電解質複合体(PEC)と前記生分解性ポリマーとの混合が、溶媒誘導フラッシュ・ナノ沈殿(flash nanoprecipitation)(FNP)によるもので請求項10に記載の方法。
【請求項１５】
前記形成ナノ粒子は、前記生分解性ポリマーを前記高分子電解質複合体と一緒に析出させることによって起こる、請求項10に記載の方法。
【請求項１６】
医薬品と対イオン・ポリマーとを含む錯体を含むナノ粒子物を投与することであって、対イオン・ポリマーは、医薬品に静電的に結合することを可能にする充電を有しますと、生分解性ポリマー全体に分布した錯体を含むマトリクスと、疾患を予防または治療するために薬剤を必要とする被験体にと、ナノ粒子を投与されていない対照被験者と比較した疾病の治療または予防と、を含む、薬物デリバリーの方法。
【請求項１７】
剤医薬が、タンパク質、ペプチド、抗体、化学物質、核酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項16に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願へのリファレンス】
【０００１】
本出願は平成30年1月29日に出願された米国仮特許出願第62/623,018号の利益を主張し、これは、あたかも本明細書に完全に記載されているかのように、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質治療薬はますます普及している治療法です。モノクローナル抗体、レセプタートラップ、増殖因子、デザイナータンパク質は、とりわけ自己免疫状態、がん、および眼科的状態に対する重要な治療となっている。Avastin、Enbrel、Rituximab、Lucentis、Eylea、Optivo、Keytruda、その他のようなタンパク質薬は年間販売数十億ドルを占める。これらの薬剤は、製薬パイプラインの大部分を占め、増加しています。効果の特異性および標的外効果の相対的不足は、これらの薬剤を特に魅力的なものにする。これらの様式の重要性が高まっているにもかかわらず、空間的に経時的に制御された投薬プロフィールを可能にするタンパク質のためのデリバリー媒体は、容易には入手できない。
【０００３】
抗体を含むタンパク質治療薬のデリバリーのために、成功するデリバリー・システムのための理想的な特徴は、生分解性、高い負荷能力、制御されたまたは持続された長期放出、タンパク質治療薬の高い安定性の維持、およびスケーラブルな製造方法を含む。これらの物質の大部分はインビボで高濃度で健康な組織に副作用を引き起こし得るので、同じ治療効果を達成しながら、デリバリー物質の投薬量を低下させるので、高負荷水準が望ましい。従って、生分解性物質はまた、これらの物質を体外に取り除くために、毒性を減少させ、そして貨物放出後の外科手術工程を回避するために好ましい。インビボでのタンパク質治療剤の低安定性のために、持続性の長期間の放出がデリバリー・システムが長期間体内の治療濃度を維持するために必要とされ、これは、投与の頻度を減少させる。さらに、製剤化および調製プロセスは、タンパク質治療剤の生物学的活性を維持しなければなならない。最後に、スケーラブルで簡便な製造方法は、このようなデリバリー・システムの信頼性のある製造および臨床的な翻訳にとって重要です。例えば、長期ヒト成長ホルモンソマトロピン荷重注射可能なポリマーデポ(Depot)であるニュートロピンデポ(Depot)は2004年にジェネンテックおよびアルカーメスによって市販されており、製造費が高くついている。上述の主要な要件を満たすためのタンパク質デリバリー・システムの開発において、多大な進歩がなされてきた。しかしながら、タンパク質治療剤の生物物理学的性質(すなわち、高水溶性、高分子量、および残留表面電荷)は、それらを持続放出デバイスにカプセル化することをより困難にする。タンパク質治療のために最も一般的に研究されているデリバリー・システムには、ハイドロゲルおよび固形ポリマーナノ粒子または微粒子が含まれる。配合最適化のために、様々な調製方法が開発されている。タンパク質治療薬のデリバリーのためにこれらのシステムおよび調製方法を使用する場合、有望な結果が示されていますが、それらのうちのほとんどが、同時に上記の要件のすべてを満たすことができでいなかった。
【０００４】
ポリエチレングリコール(PEG)、ヒアルロン酸、デキストラン、アルギン酸塩およびゼラチンのような親水性ポリマーから調製されたハイドロゲルシステムはそれらの親水性および容易なタンパク質充填工程のために、タンパク質デリバリーのための魅力的なプラットホームであり、これは、充填されたタンパク質治療用貨物の変性を回避する。持続放出プロフィールを達成するために、断面はネットワークを形成するために必要とされ、そして断面は共有結合、イオン性または疎水性相互作用によって達成され得る。タンパク質治療薬のハイドロゲルからの放出速度は負荷されたタンパク質治療薬の大きさと同様に、ハイドロゲル中のメッシュ径およびポリマー体積分率によって制御される。一般に、より小さなメッシュ径、より高いポリマー体積分率、およびより大きな荷重タンパク質治療薬を有するハイドロゲルは、より遅い放出を生じる。ハイドロゲル系の限界は使用されるデリバリー物質の親水性の性質のために、持続的な長期放出を達成することが困難である。
【０００５】
タンパク質デリバリーのために広く使用されている別の担体系は、疎水性または両親媒性ポリマーによって調製されたナノ/マイクロ粒子である。ポリ(乳酸)(PLA)、ポリ(グリコール酸)(PGA)、およびそれらの共重合体、ポリ(乳酸-コ-グリコール酸)(PLGA)はそれらの生体適合性および波長可変生分解性のために、粒子調製のために最も広く使用されているポリマーの中にある。ナノ/マイクロ粒子にタンパク質を封入するために最も一般的に使用される方法は水/油/水(w/o/w)エマルジョン系が形成される二重エマルジョン方法であり;油相が水非混和性有機溶媒に溶解された担体ポリマーの溶液であり、第1の水相はタンパク質治療薬の水溶液であり、第2の水相は分散相としての水溶液である。いくつかの稀な場合には代わりに水中油中固体(s/o/w)システムが形成され、一方、第1の水相は有機溶媒中のポリマー溶液中に分散された固体タンパク質粒子で置き換えられる。いずれの場合も、二重エマルジョン系は、有機溶媒が次第に蒸発または抽出される間、安定に保たれ、タンパク質液を内部に捕捉する固形ポリマー微粒子を生成します。ハイドロゲルと比較して、このシステムはタンパク質の疎水性物質を通る拡散が無視できるので、放出持続時間を延長するという長所を有し、したがって、カプセル化タンパク質治療薬の放出速度は、ポリマーマトリクスの分解速度に大きく依存する。しかしながら、このプロセスは、典型的には低い負荷レベルをもたらす。さらに、この方法で使用される有機溶媒およびポリマー基質中の疎水性環境は、負荷されたタンパク質治療薬の変性の危険性を増大させる。これらの粒子からの装填されたタンパク質の特性放出は、3つの相:破裂放出、休眠、および変数動態を有する持続放出相に続きます。このような放出プロフィールは、インビボでの治療結果を制御することが困難であった。
【０００６】
近年、プルドホームグループはフラッシュ・ナノ沈殿(flash nanoprecipitation)(FNP)法を用いてタンパク質荷重ナノ粒子を調製するための方法を開発し、荷重量を向上させた[1]。FNPは動力学的に制御された方法を使用して、閉じ込められた衝突噴流(CIJ)またはマルチインレットボルテックスミキサー(MIVM)デバイスを使用することによって、継続的かつスケーラブルな様式でナノ粒子を生成し、そして小分子量の疎水性薬物のカプセル化のためのナノ粒子を効果的に生成するために使用されてきた。改変FNP法を用いて、タンパク質治療用および両親媒性共重合体を、DMSOまたはメタノールなどの水混和性有機溶媒中に一緒に溶解し、次いで、CIJまたはMIVMデバイス中で、クロロホルムまたはアセトンなどのより極性の低い非溶媒と迅速に混合して、コア中の共重合体のタンパク質および親水性セグメントおよびシェル上の共重合体の疎水性セグメントを有する逆相(すなわち、疎水性シェルを有する親水性コア)ナノ粒子を形成しました。次に、ナノ粒子をシェル断面により安定化させた。例えば、ポリ(n‐ブチルアクリレート)7.5kDa-b-poly(アクリル酸)5.5kDaを用いて、高負荷量(≧50%)のナノ粒子(≦100nm)にモデルタンパク質としてリゾチーム(14.3kDa)をうまく負荷した。しかし、このナノ粒子組立工程後に封入タンパク質の二次構造に変化があるかどうかは不明であり、より重要なことに、このシステムからの封入タンパク質の放出プロファイルは、依然として特徴付けられていない。
【０００７】
疎水性イオン対形成は、タンパク質カプセル化のための方法として報告されている。高分子電解質錯体形成により、正味の正電荷を有するタンパク質はデキストラン硫酸のような反対に荷電した薬剤との錯体形成を通して中和され、複合体ナノ粒子を形成し、これは、ナノ粒子へのカプセル化を容易にするだけでなく、プロテインAに保護作用を提供します。HIP錯体を、ナノ沈殿(nanoprecipitation)または二重エマルジョン方法を通して疎水性または両親媒性ポリマーを用いて調製したナノ粒子に負荷しました。ミトラらはリゾチームとデキストラン硫酸のHIP錯体との成功した錯体形成を報告し、次いで、これをPLGAナノ粒子に装填して、30日間にわたってほぼゼロ次の放出動態を達成した。別の研究では、同じグループが約85%[2]の高いカプセル化効率を有するナノ沈殿(nanoprecipitation)または二重乳化方法を通して、デキストラン硫酸と結合したIgG-FabフラグメントをPLGAナノ粒子にロードした。これらのHIP錯体およびナノ粒子は、スケーラビリティが限定され、バッチ間の変動性がより高い手動混合プロセスを用いて調製した。その結果、スケーラブルで再現性のある方法によるタンパク質治療薬のカプセル化および徐放性のための新しい生分解性ナノ粒子プラットホームが商業的に望まれている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
発明の概要
スケーラブルで再現性のある方法によるタンパク質治療薬のカプセル化および徐放性のための新規な生分解性ナノ粒子プラットホームである。リゾチーム(14.3kDa、pI11.3)、オボアルブミン(45kDa、pI4.5)およびIgG(150kDa、pI6.8)を、タンパク質治療のためのモデルとして使用した。これらのナノ粒子プラットホームを準備するための2つの異なったアプローチがある。ある実施形態に、リソザイムまたはデキストラン硫酸を伴うIgGの高分子電解質複合体(PEC)はフラッシュ・ナノ複合体形成(flash nanocomplexation)(FNC)とよばれる連続処理を通して発生し、その後、フラッシュ・ナノ沈殿(flash nanoprecipitation)(FNP)とよばれる溶剤交換処理でPEG-PLLAまたはPEG-PCLのようなブロック・コポリマーと併用しました。別の実施形態では、PEC錯体形成(FNC)およびフラッシュ・ナノ沈殿(flash nanoprecipitation)(FNP)の結果としてのポリマーナノ粒子生成の2つのプロセスが単一工程の相分離プロセスにおいて組み合わされる。この方法ではポリカチオン溶液(典型的には溶液のpHがpI未満に調整されるタンパク質溶液)、ポリアニオン溶液(例えば、デキストラン硫酸、ヘパリン硫酸塩、または核酸)、および水混和性溶媒に溶解されたブロック・コポリマー(溶媒一対は適切な速度で相分離を適切に誘導するように選択される)が効率的な混合を達成するために最適化された一連の流速で規定された室に導入され、したがって、PECの効率的な荷重を伴う固形またはミセルナノ粒子を得ます。ナノ粒子(ポリエステルが使用される場合)またはミセル(PEG-共ポリエステルブロック・コポリマーが使用される場合)をPEC(例えば、タンパク質およびDS)と一緒に用い、疎水性ポリマーを共沈させ、均一に混合し、したがってナノ粒子からのタンパク質の徐放性を達成するように、高分子電解質錯体形成および溶媒誘発相分離または自己集合を同時に達成することができることは、以前に報告されていない。
【０００９】
混合工程と混合チャンバの形状が類似しているにもかかわらず、ナノ粒子の構造と構造に関して、本発明者らのナノ粒子配合は、プルドホームらによって調製されたものとは区別される。本発明者らのナノ粒子はナノ粒子全体に分布したタンパク質を有するモノリスマトリックスから構成され、一方、Prud'hommeら[1]によって調製されたリバースミセルは疎水性ポリマーシェルによって囲まれたミセルの親水性PEGコアー中にタンパク質パッケージされている。本ナノ粒子の組成物は、タンパク質およびポリアニオン(タンパク質溶液のpHがそのpIより低い場合)またはポリカチオン(タンパク質溶液のpHがそのpIより高い場合)のPECと、疎水性ポリマーまたはPEG-b-ポリマーブロック・コポリマーとを含む。疎水性ポリマーは、親水性ブロックを含む必要はないです。Prud'hommeら[1]のミセルは、PEC、すなわち対イオン高分子電解質を含まない。
【００１０】
タンパク質カプセル化に使用される元の物質は本発明者らのナノ粒子とミトラら[2]によって調製されたものとの間で類似しているが、本発明者らは新規なナノ粒子調製方法を記載し、これはより広範囲のカプセル化能力(ローディングレベル、ならびにタンパク質およびPECのタイプ)を可能にするナノ粒子の新規な配合をもたらす。本発明者らのプロセスを使用して、疎水性のポリマーナノ粒子中に別個のPECナノ粒子をカプセル化し、ここでPECは疎水性のポリマーと共沈した核として働き、その結果、PECがコア全体に均一に分布した多層コアマトリックスナノ粒子の構造が得られる)。より具体的には、一段階法ではPECは瞬間的に形成され、疎水性ポリマー固形ナノ粒子またはミセルの共沈を誘導する核として働き、ナノ粒子全体にわたるPECの均一な分配を生じ、それはまた、より広範囲のPECカプセル化を可能にする。
【００１１】
タンパク質またはペプチドを含む複合体と、対イオン・ポリマーがタンパク質に静電的に結合することを可能にする充電を有する対イオン・ポリマーとを含むナノ粒子がある実施形態である。
【００１２】
ナノ粒子の好適な大きさは、例えば、20〜2000nm;100〜1800nm;500〜1000nm;20〜1000nm;20〜500nm;20〜150nmです。例えば、2,000〜20万;1万~15万;2万〜10万;3万〜7万;2,000〜10万;または10万〜20万の分子量を有していてもよい。本ナノ粒子はまた、生分解性ポリマー全体に均一に分布した錯体を含むマトリクスを含む。適切なマトリックスは、非水溶性の(または疎水性)であり得る。好適な対イオン・ポリマーは、正および/または負に帯電していてもよい。好適な対イオン・ポリマーの例としては、デキストラン硫酸(DS)、ヘパリン(ヘパリン硫酸)、ヒアルロン酸、またはそれらの組合せが挙げられる。例として、ポリペプチドおよび抗体を含むほとんどのタンパク質を使用することができます。本発明で使用される好適な生分解性ポリマーとしては、例えば、PEGを含む共重合体が挙げられる。共重合体の例には、PLLA、PGA、PLGA、PCL、それらのPEG化したブロック・コポリマー、またはそれらの組み合わせが含まれる。本発明で用いられる適当な生分解性ポリマーの一つに、PEG-b-PLLAがある。
【００１３】
本発明の別の実施形態は、(a)第1の連続混合工程を使用してタンパク質と対イオン・ポリマーとを混合することによって高分子電解質複合体を形成すること;(b)第2の連続混合工程を使用して生分解性ポリマーと共沈すること;および(c)生分解性ポリマーマトリクス全体に均一に分布したタンパク質高分子電解質複合体を含むナノ粒子を形成することを含む、ナノ粒子の製造方法である。
【００１４】
驚くべきことに、本発明者らは工程(a)および(b)を同時に実施することによってナノ粒子を形成することができ、第1および第2の連続工程が好ましくはフラッシュ・ナノ複合体形成(flash nanocomplexation)(FNC)で本発明のナノ粒子を製造する1工程方法を発見しました。具体的には、工程処理が好ましくは高分子電解質複合体(PEC)および生分解性ポリマーを溶媒誘発フラッシュ・ナノ沈殿(flash nanoprecipitation)(FNP)によって混合します。本発明の方法は、タンパク質と対イオン・ポリマーとの間の静電引力によって高分子電解質複合体(PEC)を形成します。ナノ粒子は、高分子電解質複合体と一緒に生分解性ポリマーを析出させることによって形成される。
【００１５】
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。以下の参考文献は本発明で使用される用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する:Singletonら、「微生物学及び分子生物学の辞典」(1994年第2版);「科学技術のケンブリッジ辞典」(1988年Walker編);「遺伝学の用語集」、5th Ed、R.Riegerら(eds.)、Springer Verlag(1991年);およびHale&Marham、「the Harper Collins Dictionary of Biology」(1991年)。本明細書中で使用される場合、以下の用語は特に明記しない限り、それらに帰する意味を有する。
【００１６】
本開示で使用される「抗体」という用語は免疫グロブリンまたはそのフラグメントもしくは誘導体を指し、インビトロまたはインビボで産生されるかどうかにかかわらず、抗原結合部位を含む任意のポリペプチドを包含する。この用語はポリクローナル、モノクローナル、モノ特異的、多特異的、非特異的、ヒト化、単鎖、キメラ、合成、組換え、雑種、変異、および移植抗体を含みますが、これらに限定されません。本開示の目的のために「インタクトな抗体」という用語によって別途改変されない限り、「抗体」という用語はFab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb、および抗原結合機能、すなわち、例えば、PD-L1に特異的に結合する能力を保持する他の抗体フラグメントなどの抗体フラグメントも含みます。典型的には、このようなフラグメントは抗原結合ドメインを含む。
【００１７】
「抗原結合ドメイン」、「抗原結合フラグメント」、および「結合フラグメント」という用語は抗体と抗原との間の特異的結合に関与するアミノ酸を含む抗体分子の一部を指します。場合によっては抗原が大きい場合、抗原結合ドメインは抗原の一部にのみ結合することができる。抗原結合ドメインとの特異的相互作用に関与する抗原分子の一部は「エピトープ」または「抗原決定基」と呼ばれる。抗原結合ドメインが典型的には抗体軽鎖可変領域(VL)および抗体重鎖可変領域(VH)を含みますが、必ずしも両方を含む必要はないです。例えば、いわゆるFd抗体フラグメントはVH領域のみからなるが、依然としてインタクトな抗体のいくらかの抗原結合機能を保持する。
【００１８】
抗体の結合フラグメントは、組換えDNA技術によって、または完全な抗体の酵素的もしくは化学的切断によって産生される。結合フラグメントには、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、および一本鎖抗体が含まれる。「二重特異性」または「二官能性」抗体以外の抗体はその結合部位の各々が同一であると理解される。酵素パパインによる抗体の消化が「Fab」フラグメントとしても知られる2つの同一の抗原結合フラグメント、および抗原結合活性を有しませんが結晶化する能力を有する「Fc」フラグメントを生じる。酵素ペプシンによる抗体の消化は抗体分子の2つのアームが連結されたままであり、2つの抗原結合部位を含むF(ab')2フラグメントを生じる。F(ab')2フラグメントは抗原結合部位を架橋する能力を有します。本明細書中で使用される場合、「Fv」は抗原認識部位および抗原結合部位の両方を保持する抗体の最小限のフラグメントをいう。本明細書中で使用される場合、「Fab」は重鎖の軽鎖およびCHIドメインの定常ドメインを含む抗体のフラグメントをいう。
【００１９】
「対イオン・ポリマー」とは、ポリマーがタンパク質に静電的に結合することができるような充電を有するポリマーを意味します。例としては、正味の負電荷を有する対イオン・ポリマーに結合する正味の正電荷を有するタンパク質、またはその逆が挙げられる。
【００２０】
「疾病」とは、細胞、組織、または臓器の正常な機能を損傷または妨害するあらゆる状態または障害を意味します。疾患の例には、癌が含まれる。「フラグメント」とは、ポリペプチドの一部を意味する。この部分は、好ましくは参照ポリペプチドの全長の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%を含有する。フラグメントは、10、20、30、40、50、60、70、80、90、または100、200、300、400、500、600、700、800、900、または1000個のアミノ酸を含み得る。
【００２１】
「mAb」という語は、モノクローナル抗体を指す。本発明の抗体は全天然抗体、バイスペシフィック抗体(bispecific antibody);キメラ抗体;Fab、Fab'、一本鎖V領域断片(scFv)、融合ポリペプチド、および非従来型抗体を含むが、全体に限定されない。
【００２２】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」はアミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書中で互換的に使用される。用語が1つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の類似体または模倣体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用される。ポリペプチドは糖タンパク質を形成するために炭水化物残基の付加によって修飾され得ます。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は糖タンパク質、ならびに非糖タンパク質を含む。
【００２３】
「参照配列」は、配列比較の基礎として使用される定義された配列である。参照シーケンスは、指定されたシーケンスのサブセットまたはその全体とすることができる。ポリペプチドについては、基準ポリペプチド配列の長さは一般に、少なくとも約16アミノ酸、好ましくは少なくとも約20アミノ酸、より好ましくは少なくとも約25アミノ酸、およびさらに好ましくは約35アミノ酸、約50アミノ酸、または約100アミノ酸である。
【００２４】
本明細書で使用される「対象」という語は、本明細書に記載される方法が実施される任意の個体または患者を指すことが意図される。一般に、対象はヒトですが、当業者には理解されるように、対象は動物であってもよい。したがって、げっ歯類(マウス、ラット、ハムスター及びモルモットを含みます)、ネコ、イヌ、ウサギ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等を含む飼育動物、霊長類(サル、チンパンジー、オランウータン及びゴリラを含みます)等の哺乳類を含む他の動物が被験者の定義の範囲内に含まれる。
【００２５】
本明細書で提供される範囲は、その範囲内の全ての値について短縮されたものであると理解される。例えば、1~50の範囲は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、用語「処置する」、「処置する」、および同様のものは、それに関連する障害および/処理症状を減少処理改善することをいう。障害または状態を治療することは排除されないが、それに関連する障害、状態または症状を完全に排除することを必要としないことが認識されている。
【００２７】
本明細書で使用される用語「または」は特に明記されない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される用語「a」、「an」、および「the」は、単数または複数であると理解される。
【００２８】
本明細書で使用されるように、特に言及されない限り、または文脈から明らかでない限り、用語「約」は当技術分野における通常の許容範囲内、例えば、平均値の2標準偏差内と理解される。約は、記載された値の10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、または0.01%以内と理解することができます。文脈から特に明確でない限り、本明細書で提供されるすべての数値は、用語「約」によって修正される。
【００２９】
本明細書中に提供される任意の組成物または方法は、本明細書中に提供される他の組成物および方法のいずれかの1つ以上と組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図1は、タンパク質治療薬および対イオン高分子電解質のカプセル化PECによるナノ粒子の2段階(FNC-FNP)調製プロセスの模式図。ここでは、3つの入口デバイスを2つ目の手順について示します。FNPプロセスにおける溶媒交換のための特定の要件に基づいて、これを2つの入口または4つの入口の混合チャンバに切り替えることが可能とである。
【図２】図2〜4は、入口マルチインレットボルテックスミキサを使用したタンパク質治療薬の単一工程カプセル化の模式図。PECは生分解性ポリエステルナノ粒子と共沈し、ポリマーナノ粒子またはミセルコアー全体に分布します。平均30nm〜1000nm、PDI<0.3の波長可変サイズ。2〜5%の範囲のタンパク質負荷量。2週間〜3週間にわたるタンパク質治療薬の徐放性である。
【図３】図3は、水中のDLSによって測定したリゾチーム/DS PECナノ粒子(A)およびリゾチーム/DS:PEG-b-PLLAナノ粒子(B)の粒度分布。コア‐シェルナノ粒子(NP1, NP2,NP3)の3つのバッチを3種類のリゾチーム‐ポリマー重量比で調製し、124〜170nmの範囲の粒径を示した(PDI〜0.17〜0.19)(表1)。(C)リゾチームとポリマーの比率がナノ粒子粒径に及ぼす効果。(D)NP1からNP3までの平均ゼータ電位は、DI水中で測定される。
【図４】図4A〜 4Bは、NP1(A)とNP2(B)のTEM画像である。
【図５】図5は、インビトロでのPBS(pH7.4)中、37℃でのNP1〜NP3からのリゾチームの放出プロフィールである。
【図６】図6A〜6Bは、(A)PBS(pH7.4)中、37℃でのNP4-NP7からのIgGのインビトロ放出プロフィール。(B)37℃でのPBS(pH7.4)中のNP8-NP11からのIgGのインビトロ放出プロフィールである。
【図７】図7は、NP4およびNP8の放出プロフィールの比較である。
【図８】図8A〜8Bは、 リゾチーム/デキストラン硫酸(DS)PECを封入したmPEG‐PCLナノ粒子について、リゾチームのみを用いたmPEG‐PCLナノ粒子、DSのみを用いたmPEG‐PCLナノ粒子、およびmPEG‐PCLを用いないリゾチーム/DS PECナノ粒子と比較して、(A)4つの入口すべてにおいて0.5mL/minの流速で、(B)4つの入口のそれぞれにおいて2mL/min(DS、リゾチーム、mPEG‐PCL)および4mL/min(水)の流速で、水中で測定された水中の輝度平均径の分布を示す図である。
【図９】図9A〜9Bは、 (A)カプセル化ナノゴールド標識免疫グロブリンG(IgG)/DS PECを用いたmPEG‐PCLナノ粒子の透過型電子顕微鏡(TEM)像。スケールバー=100nm。(B)高倍率TEMは、ナノ粒子内のIgGの分布を示す。矢印は、NanoGold標識IgGの例である。スケールバー=50nm。
【図１０】図10A〜10Bは、 37℃のPBS(pH7.4)中での2週間にわたるタンパク質/DS:mPEG-PCLナノ粒子からのタンパク質治療薬のインビトロ放出プロフィール、(A)NP19から放出されるモデルタンパク質としてIgGを使用し、(B)NP27から放出されるモデルタンパク質としてオボアルブミン(OVA)を使用する。
【００３１】
発明の詳細な説明
本発明は、1つ以上のタンパク質および対イオン高分子電解質のカプセル化高分子電解質複合体(PEC)を用いてナノ粒子を調製する方法を包含する。この方法は(1)選択されたタンパク質治療剤を、タンパク質の等電点(pI)よりも低いpHでポリアニオン(例えば、デキストラン硫酸(DS)、ヘパリン硫酸)およびヒアルロン酸など)と、水または水性溶媒中に懸濁されたPECを生じるpHで錯化させ、(2)PEC懸濁液を、水混和性有機溶媒(例えば、アセチルニトリル(ACN)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、テトラヒドロフラン(THF)、ジメチルホルムアミド(DMF)、およびイソプロピルアルコール(IPA)など)中に溶解させた生分解性ポリマーPEG-b-PLLA(またはPLLA、PGA、PLGA、PCL、またはそれらのPEGとの共重合体、またはそれらの組合せ)と共沈させ、両方の工程を、閉じ込められた衝突ジェットミキサーまたはマルチインレットボルテックスミキサーを通して一組の所定の流速で溶液ジェットを注入することによって達成する。この2工程の過程により、PECを含むナノ粒子が生成する(図1)。
【００３２】
あるいは、ナノ粒子が(1)タンパク質の等電点(pI)よりも低いpHで水性溶媒に溶解された選択されたタンパク質治療薬、(2)水性溶媒に溶解されたポリアニオン、例えば、デキストラン硫酸(DS)、ヘパリン(硫酸ヘパリン)およびヒアルロン酸など、(3)生分解性ポリマーPEG-b-PLLA(またはPLLA、PGA、PCL、またはPEGとのそれらのコポリマー、またはそれらの組み合わせ)の溶液ジェットを連続的に注入することによって形成される。アセチルニトリル(ACN)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、テトラヒドロフラン(THF)、ジメチルホルムアミド(DMF)、および(4)閉じ込められた渦を入口所定の流速で、効率的な相分離およびナノ粒子形成を誘導するための特定の溶媒極性を維持するための追加の溶媒ジェットジェットミキサーまたはマルチインレットボルテックスミキサーにより、PEC含有ナノ粒子が形成される(図2)。
【００３３】
本発明はまた、本発明の方法によって作製されるナノ粒子系を含む。このナノ粒子系は以下の特徴を有するタンパク質-ポリイオンPECが埋め込まれた生分解性ポリマーマトリクスから構成される:(1)生分解性ポリマーナノ粒子と共沈された多核として働くPECナノ粒子(任意に、あるナノ粒子はPEGコロナも含有します)であり、一方、PECはポリマーナノ粒子全体に分布される;(2)平均30nm〜1000nmおよび0.3以下の多分散指数(PDI)を有する調整可能な大きさ;(3)2〜25w/w%の範囲のタンパク質負荷量;および(4)2週間〜3ヶ月の範囲のタンパク質治療薬の徐放性。
【００３４】
本発明を例示するために、本発明者は、リソザイム-、バルビン-、およびイグG荷重PLLAナノ粒子、またはPEG-b-PLLAまたはPEG-b-PCLミセルナノ粒子の調製および特性評価の例を説明する。
【実施例】
【００３５】
実施例1：リゾチーム/DS:PEG-b-PLLAナノ粒子の調製
方法
ナノ粒子核の調製と特性評価:リゾチームを脱イオン水に5mg/mLで溶解し、0.1M塩酸を加えてpHを4.0に調整した。次いで、1ミリリットルのリゾチーム溶液を、等容量のDS溶液(20mg/mL、pHを4.0に調整した)と、5mL/分の流速で2つの入口を有するCIJミキサーを通して迅速に混合した。得られたリゾチーム/DS PECナノ粒子のサイズを、動的光散乱(DLS)Zetasizer Nano(Malvern Instruments, Worcestershire,UK)を用いて特徴付けた。それぞれのサンプルを3回測定し、データーを3回の読み取りの平均±標準偏差として報告した。
【００３６】
PEG-b-PLLAミセルナノ粒子の調製および特性評価:前工程で得られた1ミリリットルのリゾチーム/DS PECナノ粒子懸濁液(2.5mg/mL)を、様々な濃度(7.5、12.5、および25mg/mL)でDMSOに溶解したPEG5k-b-PLLA20kの等体積の溶液と、2入口CIJミキサーを介して5mL/分の流速で迅速に混合した。異なったリゾチーム対ポリマー重量比(1:3、1:5および1:10)を有する3つのナノ粒子(NP1、NP2およびNP3)が得られた。分子量カットオフ(MWCO)3.5kDaの透析膜を用いてナノ粒子を脱イオン水に対して12時間透析し、DMSOを除去し、水を2時間毎に交換した。得られた溶液を、100kDaのMWCOフィルターを用いて、4,500rpmで20分間限外濾過により精製し、余分なタンパク質およびDSを除去した。
【００３７】
カプセル化されていないリゾジムの量は、BCA分析によって測定され、カプセル化効率(EE)は次の公式を使用して計算された:EE(%)=(MtotalMfree)/Mtotal×100%、ここで、総供給リゾジムの質量をMtotalrepresentsし、フリーリゾジムの質量をMfreerepresentsしました。ナノ粒子は、DLSゼータサイザーナノを用いて粒径およびゼータ電位によって特徴付けられた。それぞれのサンプルを3回測定し、データーを3回の読み取りの平均±標準偏差として報告した。炭素膜で覆われたイオン化ニッケルグリッド上に10マイクロリットルのナノ粒子液を添加することにより、TEM画像形成のためのサンプルを調製しました。10分後、溶液をピペットで取り除き、6マイクロリットルの2%酢酸ウラニル滴をグリッドに加た。30秒後、溶液を除去し、グリッドを室温で乾燥させた。次に、テクナイFEI-12電子顕微鏡を用いてサンプルを画像化した。
【００３８】
タンパク質のインビトロ放出:1mgのリゾチームを含有する1mLのリゾチーム負荷ナノ粒子懸濁液を、1mLの透析管(SpectrumLab, MWCO50kDa)に添加し、次いでこれを、5mLのPBS(pH7.4)を含有するバイアルに浸漬しました。37℃、撹拌速度100rpmのインキュベーターにバイアルを投入した。外側のPBS媒体を回収し、毎日遊離PBSと交換した。採取した培地を凍結乾燥により濃縮し、さらに400マイクロリットルのDI水中に再構成した。ミクロビシンコニン酸(BCA)アッセイを用いて、放出されたリゾチームの量を定量した。
【００３９】
結果と考察
PECナノ粒子調製および特性評価:FNCを通して急速に混合した後、リゾチームおよびDSは、64nmの平均粒径および0.18の多分散指数(PDI)を有する水溶液中で均一なPECナノ粒子を形成した(図3)。
【００４０】
表1:NP1における粒径、PDI、ゼータ電位、EE、およびリゾチームのNP3
実施例2への負荷レベルの要約。IgGカプセル化PEG-b-PLLAナノ粒子の調製および特性評価
[表１]
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【００４１】
方法
IgG/DS PECナノ粒子の調製および特性評価:IgGを5mg/mLの濃度で脱イオン水に溶解し、続いて0.1M HCl溶液を添加することによってpHを4.0に調整した。次いで、1ミリリットルのIgG溶液を、等容量のDS溶液(20mg/mL、pHを4.0に調整した)と、5mL/分の流速で2つの入口を有するCIJミキサーを通して迅速に混合した。得られたPECナノ粒子懸濁液を、PEG-b-PLLAナノ粒子調製のために直ちに使用した。
【００４２】
IgG/DS:PEG-b-PLLAナノ粒子の調製および特性評価:前工程で得られたIgG/DS PECナノ粒子懸濁液の1mL(2.5mg/mL)を、2つの異なる濃度(12.5および25mg/mL)のPEG5kb-PLLA20kDMSO溶液の等体積と、2つの異なる濃度(12.5および25mg/mL)で、5または10mL/分の流速で2入口CIJミキサーを通して迅速に混合し、2つの異なるIgG対ポリマー率(1:5および1:10)を有するコア-シェルナノ粒子(NP4〜NP7、表2)の4つの異なる製剤を得た(図5)。MWCO3.5kDaの透析膜を用いてナノ粒子を脱イオン水に対して12時間透析し、DMSOを除去し、水を2時間毎に交換した。得られた溶液を、100kDaのMWCOフィルターを用いて、4,500rpmで20分間限外濾過により精製し、余剰IgGおよびDSを除去した。ろ液中のIgG量をマイクロBCA分析により測定し、EE(%)=(MtotalMfree)/Mtotal×100%の公式を用いてEEを計算した。
【００４３】
ここで、総供給IgGの質量をMtotalrepresentsし、自由IgGの質量をMfreerepresentsした。コア‐シェルナノ粒子は、DLSゼータサイザーナノを用いて、大きさとゼータ電位によって特性化した。それぞれのサンプルを3回測定し、データーを3回の読み取りの平均±標準偏差として報告した。
【００４４】
IgGのインビトロ放出:1mgのIgGを含有する1mLのIgG負荷ナノ粒子懸濁液を、1mLの透析管(SpectrumLab、MWCO300kDa)に添加し、次いで、これを、5mLのPBS(pH7.4)を含有するバイアルに浸漬した。バイアルを37℃、攪拌速度100rpmのインキュベーターに入れた。めっき浴中のPBS溶液を集め、毎日リフレッシュした。採取した培地を凍結乾燥により濃縮し、さらに400マイクロリットルのDI水を用いて再構成しました。マイクロBCAアッセイを用いて、放出されたIgGの量を定量した。
【００４５】
結果
コア-シェルナノ粒子調製および特性評価:IgG/DS:PEG-b-PLLAナノ粒子(NP4〜NP7)を、2つの異なるIgG対ポリマー比および2つの異なる流速で調製し、35nm〜96nmの範囲のZ平均粒径を示し、狭い粒径分布(PDI値〜0.16〜0.26)を示した(表2)。重合体に対するIgGの比率または流速を減少させると、ナノ粒子の大きさが有意に増加した。これらの結果は、ナノ粒子の粒径が重合体に対するIgGの重量比ならびに流量を調整することによって変化し得ることを実証した。全てのナノ粒子は、-24〜-33mVの範囲のゼータ電位を有する負の表面電荷を示した。カプセル化効率は62〜88%の範囲であり、これは流速の増加またはIgG対ポリマー比の減少と共に増加した。
【００４６】
表2
[表２]
2021519748.tif 000003
【００４７】
平均粒子サイズ、PDI、zeta、NP7におけるIgGのインビトロ放出プロフィール:透析方法を用いてNP4からNP7のインビトロ放出プロフィール(pH7.4)を調査しました。図5Aに示されるように、4つのナノ粒子は全て、最初の2日間のバースト放出、続いて34日間にわたるほぼゼロ次の放出を伴う類似の二相性放出プロフィールを示した。さらに、NP4からNP7への放出速度は同様であり、34日目までにそれぞれ約57%、54%、53%および51%のIgGがNP4からNP7へ放出され、76日目までにそれぞれ95%、87%、85%、82%であった。
【００４８】
実施例3：IgG/DS:PEG-b-PCLナノ粒子の調製
方法
IgG/DS:PEG-b-PCLナノ粒子の調製および特性評価:PEG5k-b-PLLA20kをPEG5k-b-PCL20kで置き換えたことを除いて、実施例2の方法の項に記載されるのと同じ手順を使用して、IgG/DS:PEG-b-PCLナノ粒子を調製し、特徴付けました。2つの異なるIgG対ポリマー率(1:5および1:10)および2つの異なる流量(5および10mL/分)で、4つのナノ粒子NP8-NP11を調製した(図5B)。
【００４９】
IgGのインビトロ放出:200マイクログラムのIgGを含む1mLのIgG/DS:PEG-b-PCLナノ粒子液を1mLの透析管(SpectrumLab, MWCO300kDa)に添加し、次いでこれを5mLのPBS(pH7.4)を含むバイアルに浸漬した。37℃、撹拌速度100rpmのインキュベーターにバイアルを投入した。PBSろ液を収集し、毎日リフレッシュしました。採取した培地を凍結乾燥により濃縮し、さらに400マイクロリットルのDI水を用いて再構成した。マイクロBCAアッセイを用いて、放出されたIgGの量を定量した。
【００５０】
結果
コア‐シェルナノ粒子調製および特性評価:NP8‐NP11は、狭い粒度分布(PDI値〜60.13〜60.22)を有する54〜69nmの範囲のZ‐平均粒度を示した(表3)。特に、本発明者らはポリマーに対するIgGの比の減少または流速の減少が粒径を増加させることを見出し、これは、IgG/DS:PEG-b-PLLAナノ粒子の結果と一致する。全てのナノ粒子は、-24〜6-30mVの範囲のゼータ電位を有する負の表面電荷を示した。NP8〜NP11のEEは69%~90%の範囲であり、これは流速の増加またはIgG対ポリマー比の低下と共に増加した。
【００５１】
[表３]
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【００５２】
NP8からNP11へのIgGのインビトロ放出におけるZ平均サイズ、PDI、ゼータ電位、カプセル化効率、およびIgGの負荷レベル:NP8からNP11へのIgGのインビトロ放出プロフィールを、透析方法を用いてPBS(pH7.4)中で調べた。図5に示すように、4つのナノ粒子は全て、最初の2日間のバースト放出と、その後の27日間にわたるほぼゼロ次の放出とを伴う同様の二相放出プロフィールを示しました。さらに、4つのナノ粒子製剤はすべて、27日目までに放出された40〜45%のIgGと同様の放出速度をもたらした。これらのナノ粒子は、4日目から27日目の間の放出の同様の傾向に続いて、より長い放出期間を有することが予想される。
【００５３】
IgG/DS:PEG-b-PLLAとIgG/DS:PEG-b-PCLナノ粒子との間の比較:同じ条件下で調製したNP4およびNP8の放出プロフィールを図6で比較した。(1)NP4は最初の2日目に20%のIgGが放出されたバースト放出を有し、一方、NP8は最初の4日以内に15%のIgGしか放出しなかったことが分かる;(2)NP8が放出プロフィールを外挿することによって推定されるように、NP8よりも長い放出持続時間を有し得る(図6)。これらの結果は、この系の放出プロファイルが異なる分解速度を有する異なるポリマーを選択することによって改変され得ることを実証した。
【００５４】
実施例4：工程方法によるリゾチーム/DS:mPEG-b-PCLナノ粒子の調製
【００５５】
方法
リゾチーム/DS:mPEG-b-PCLナノ粒子の調製および特性評価:リゾチームを0.5mg/mLの脱イオン水に溶解し、そのpHを0.1M NaOHを用いて8.0に調整した。1ミリリットルのリゾチーム(pH8.0、0.5mg/mL)を、種々の濃度(1.5、2.5、5.0、7.5mg/mL、DMSOに溶解したもの)、デキストラン硫酸(0.5mg/mL、脱イオン水に溶解したもの)、および脱イオン水(pH7.4)の等容量のmPEG10K-b-PCL40Kと、種々の流量比で4入口マルチインレットボルテックスミキサー(MIVM)を通して混合した(表4)。ナノ粒子を透析膜(MWCO3.5kDa)に対して4リットルの脱イオン水に対して24時間透析し、水を6時間毎に交換しながらDMSOを除去しました。調整した溶液を15ミリリットル再生セルロースフィルター(アミコン(R)ウルトラ、MWCO100kDa)を用いて4,500rpmで20分間限外濾過濃縮した。フロースルー中の遊離リゾチームの量を、マイクロBCAアッセイによって測定した。Malvern Zetasizerを用いた動的光散乱(DLS)によりナノ粒子流体力学的径とゼータ電位を決定し、その形態を透過型電子顕微鏡(TEM)により解析した。カプセル化効率(EE%)を、実施例1に記載のように測定した。
【００５６】
リゾチーム:mPEG-b-PCL、DS:mPEG-b-PCL、およびリゾチーム/DSナノ粒子を含む対照ナノ粒子を調製するために、各成分液を調製し、上記のように特徴付けた。リゾチーム:mPEG-b-PCL、DS:mPEG-b-PCLおよびリゾチーム/DS PECナノ粒子のそれぞれについて、欠けている成分(それぞれDS、リゾチームおよびmPEG-b-PCL)を、対応する成分の溶媒単独で置換した。次いで、ナノ粒子を調製し、リゾチーム/DS:mPEG-b-PCLナノ粒子と同じ様式で特徴付けた。
【００５７】
結果と考察
MIVM室内で混乱した流動パターンを生み出すフラッシュミックス条件下で、混合条件下で溶剤極性変化による析出の結果、その後mPEG‐b‐PCLで塗布される錯体をソイザイムとDSが形成した。リオゾチーム/DSナノ複合体はmPEG-b-PCL析出の核生成サイトとして働き、これは、mPEG-b-PCLナノ粒子の迅速かつ均一な増殖を継続的かつスケーラブルな様式で確実にしました。リゾチームのDSへの重量比は、実施例1に記載したように最適化した。mPEG-b-PCL溶液、DS溶液、リゾチーム溶液、およびDI水の流量は、9:9:9:1に制御した。mPEG‐b‐PCL:リゾチームマスレシオと溶液の流速を変えることにより、多分散指数(PDI)で測定した比較的狭い分布で、70~120nmの大きさのナノ粒子の異なったバッチが生成した。リゾチームのカプセル化は、表4で試験した全ての条件下でほぼ終了(>97.2%)でした。概して、より高い流量は、より小さなナノ粒子寸法をもたらした。
【００５８】
表4：NP12~NP18の粒径、PDI、ゼータ電位、EE、LLの概要
[表４]
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【００５９】
mPEG-b-PCLナノ粒子内のリゾチーム/DSナノ複合体のカプセル化を、リゾチームのDSに対する重量比を一定(3:1)に保ち、mPEG-b-PCL溶液、DS溶液、リゾチーム溶液、および脱イオン水の流量を1:1:1:1〜1:1:1:2に調節しながら、最終ナノ粒子配合(表5)から成分を差し引くことによって調査した。両方の流量条件下で、リゾチーム/DS:mPEG-b-PCLナノ粒子は、流体力学的径が最小であった。成分を欠くそれぞれのナノ粒子製剤は、一緒に混合されたすべての成分よりも大きかったものである。mPEG-b-PCLコーティングを含まないリゾチーム/DS錯体はmPEG-b-PCLコーティングを加えると減少する高度に負のゼータ電位を有し、粒子のより緻密な大きさを示し、錯体がポリマーマトリクス内に捕捉され、したがって負の荷電を遮蔽することを示唆した。
【００６０】
表5:サブトラクション成分ナノ粒子の粒径、PDI、およびゼータ電位の要約。
実施例5:工程方法によるオボアルブミン(OVA)/DS:mPEG‐b‐PCLナノ粒子の調製と特性ひ評価
[表５]
2021519748.tif 000006
【００６１】
方法
OVA/DS:mPEG-b-PCLナノ粒子の調製および特性評価:オボアルブミン(OVA)を0.5mg/mLで脱イオン水に溶解し、その後、0.1M HCl液を加えてpHを2.0に調整した。1mLのOVA溶液を、等容量のDS溶液(0.5mg/mL)、種々の濃度(DMSOに溶解した1.5、2.5、5.0、7.5mg/mL)のmPEG10K-b-PCL40K、および脱イオン水(pH7.4)と混合した。これらのナノ粒子を実施例1に記載したように特性決定した。
【００６２】
結果
実施例4に記載されたものと同様に、OVA/DS:mPEG-PCLナノ粒子は表5に列挙されるように、ポリマー対OVAの比率ならびに異なる溶液の流速の比率を同調することによって、異なるフラッシュ混合条件下で調製された。これらのナノ粒子は-11.4〜-26.2mVの範囲のゼータ電位を有する強い負の表面電荷を示しました。カプセル化効率は77.9%〜88.6%の範囲であり、ポリマー:OVAの比率または流速のいずれともほとんど相関しなかった。
【００６３】
表5:NP19〜NP26中のOVAの粒径、PDI、ゼータ電位、EEおよび負荷レベルの要約
[表６]
2021519748.tif 000007
【００６４】
実施例6：工程方法によるIgG/DS:mPEG-b-PCLナノ粒子の調製と特性評価
方法
【００６５】
IgG/DS:mPEG-b-PCLナノ粒子の調製および特性評価:ヒトIgGを、0.5mg/mLの濃度で脱イオン水に溶解し、続いて、0.1M HCl液を加えることによってそのpHを4.0に調整した。次いで、IgG/DS:mPEG-b-PCLナノ粒子を調製し、表6に列挙した条件下で、実施例4および5の方法の項に記載したのと同じ手順を用いて特性決定した。TEMによるIgG/DS:mPEG-b-PCLナノ粒子内でのIgGの分布の特性評価:IgGを、最初に、製造者のプロトコールに従って、Mono-Sulfo-NHS-Nanogold(1.4nm Auナノ粒子、Nanoprobes)を使用して標識した。次いで、Au標識IgGを、表5に示すNP21について上記したのと同じ方法を用いてカプセル化しました。次に、これらのAu-IgG/DS:mPEG-b-PCLナノ粒子を、実施例1に記載した方法を用いて酢酸ウラニル(2%w/v)陰性染色後、透過型電子顕微鏡(FEI Tecnai12)を用いて画像化した。
【００６６】
結果
ナノ粒子中でのIgGカプセル化:調製したIgG/DS:mPEG-b-PCLナノ粒子(NP27-NP36)は、実施例5に記載のOVAカプセル化と同様の様式で、IgGに対するポリマーの質量比および流量比を調整することによって、ナノ粒子の粒径を変化させることができることを実証した。全てのナノ粒子は、-13.4〜-23.6mVの範囲のゼータ電位を有する負の表面電荷を示しました。IgGのカプセル化効率は91.3%から95.6%の範囲でしたが、ポリマー:IgGの比率または流速とは無関係であった。
【００６７】
表6
[表７]
2021519748.tif 000008
【００６８】
IgG/DS:mPEG-PCLナノ粒子内のIgG NP27〜NP34の分布:IgG/DS-mPEG-PCL内のIgG/DS-mPEG-b-PCL内のIgG(1.4nm Auナノ粒子結合金)のIgG/DS-mPEG-b-PCL内の分布をTEM(図9)によって測定したところ、5:1(mPEG-b-PCL:IgG)を超えると、IgG-Auがナノ粒子マトリクス全体に分布することが示された。複数サンプルのイメージ解析はIgG‐Auの比較的均一な分布がmPEG‐b‐PCL:IgG質量比によって影響されるようことを示唆し、複合体がより高い質量比でより密に充填されておらず、逆もまた同様であることを示唆した。
【００６９】
実施例7：工程調製方法によって調製されたタンパク質/DS:mPEG-PCLナノ粒子からのOVAおよびIgGのインビトロ放出の特性評価
【００７０】
方法
1mLの0.3〜0.5mg/mL OVA/DS:mPEG-b-PCLまたはIgG/DS:mPEG-b-PCLナノ粒子を1mLのフロート-a-ライザー透析管(SpectrumLab, MWCO300kDa)に添加し、次いでこれを6mLのPBS(0.5w/v%NaN3を含む、pH7.4)を含むバイアル中に出現させた。次いで、この透析デバイス全体を、30mLの脱イオン水を満たした50mL遠心管に入れ、パラフィルム(R)を用いて密封して、蒸発を最小限にしました。遠心管を振盪インキュベーター中に37℃で200rpmで配置した。2時間、6時間、12時間、24時間、48時間、その後1日1回、6mLを採取した。収集した培地サンプルを-80℃で凍結し、凍結乾燥し、次いで脱イオン水を用いて再構成して、3×および6×濃サンプルのタンパク質放出サンプルを得た。OVAまたはIgGの放出量を定量化するためにマイクロBCAまたはナノオレンジアッセイを用いた。
【００７１】
結果:In Vitro放出プロファイル
NP19からのOVAのin Vitro放出プロフィール:NP19からのOVAのin Vitro放出プロフィールを、透析方法を用いてPBS(pH7.4)中で調べました。図10Aに示されるように、NP19は最初の2日以内に、2工程調製方法によって調製されたNPと同様の二相放出プロファイルを示し、続いて14日間にわたるゼロ次放出を示した。14日目までに、NP19は約38.8%の累積放出を有し、36日目までに完全放出が予測された。
【００７２】
NP27からのIgGのインビトロ放出プロフィール:NP27からのIgGのインビトロ放出プロフィールを、同じ方法を用いてPBS(pH7.4)中で分析した。図10Bに示されるように、NP27は最初の2日間に軽度のバースト放出を伴う類似の放出プロフィールを示し、その後、次の12日間にわたってゼロ次放出が続いた。14日目までに、NP27は26.0%のIgGの累積放出を有し、54日目までに完全放出が予測されました。興味深いことに、この放出プロフィールは、類似の配合(NP19)からのOVAよりも穏やかに遅かったものである。これらのデーターは全般的な徐放性動態は種々のタンパク質について同様であったが、タンパク質治療薬の性質の大きさがナノ粒子からの放出速度に影響を及ぼし得ることを示す。
【００７３】
以下の方法の工程(A)および(b)を同時に行うことにより、ナノ粒子を製造する単一工程方法が発見され、驚くべき結果が得られた。工程の第1工程は、(a)第1の連続混合工程を用いて、タンパク質と対イオン・ポリマーとを混合して高分子電解質複合体を形成する工程である。この方法の第2の工程は、(b)第2の連続混合方法を用いて生分解性ポリマーと共沈させることである。この方法の第3の工程は、(c)生分解性ポリマーマトリクス全体に分布したタンパク質高分子電解質複合体を含むナノ粒子を形成する工程である。
【００７４】
本発明は生分解性ナノ粒子を調製し、ナノ粒子全体にわたってタンパク質PECを均一に分布し、高ペイロード能力を有し、タンパク質治療薬を持続的に放出するための、連続で拡張可能な方法を含むす。タンパク質放出を調節し、有効な保護およびカプセル化をもたらすために、タンパク質治療剤は、FNCと呼ばれる継続的な処理を通して反対側の荷電を運ぶ高分子電解質を有するPECナノ粒子に複合体化される。次に、得られたPECナノ粒子をPEG-b-PLLAまたはPEG-b-PCLポリマーと共沈させ、FNP方法を用いてCIJミキサーまたはMIVMによりミセルナノ粒子を形成する。タンパク質負荷ナノ粒子は、入力溶液のタンパク質対ポリマーの比率および/または流量の重量比を変えることによって、負の表面荷電、狭い粒度分布、および波長可変粒度を示す。最も重要なことに、これらのナノ粒子は、タンパク質の持続的かつ長期の放出を可能にする。これらのナノ粒子の放出速度は、ポリマーに対するタンパク質の重量比を操作することによって、または種々の二ブロック・コポリマーを選択することによって、調整され得る。ナノ粒子製造方法の再現性およびスケーラビリティ、ならびにこれらのナノ粒子によって達成される持続性長期放出を考慮すると、このプラットホームは、多くの抗体薬学を含む種々のタンパク質治療のためのナノ粒子の調製のための大きな可能性を保持する。
【００７５】
本発明の特定の実施形態では、対象に、タンパク質、ペプチド、抗体、化学物質、核酸、またはそれらの組合せなどの医薬品を含む本発明のナノ粒子物を与え、または投与することができる。ナノ粒子は、固形、液状、またはエアロゾルの形成で対象に投与することができる。本ナノ粒子は静脈内、経皮的、経皮的、動脈内、動脈内、局所的、動脈内、動脈内、局所的、皮下、肉眼的、粘膜、局所的、吸入(例えば、エアロゾル吸入)、注入、注入、連続注入、局所潅流浴ターゲット細胞を直接、カテーテルを介して、洗浄器を介して、クレーム中、脂質組成物(例えば、リポソーム)中で、または他の方法または他の任意の組合せによって、当業者に周知のように、前進することができる(例えば、参考として本明細書に組み込まれているRemingtonの薬学科学、18th Ed.Mackプリンティング会社、1990を参照されたい)。
【００７６】
さらに、本発明によれば、投与に適した本発明のナノ粒子は、不活性希釈剤の有無にかかわらず、薬学的に許容可能な担体中で提供される。担体は同化可能であるべきであり、液状、半固体、すなわちペースト、または固体担体を含む。任意の従来の媒体、薬剤、希釈剤または担体が、受領者またはその中に含まれる組成物の治療有効性に有害である場合を除いて、本方法を実施する際に使用するための投与可能な組成物におけるその使用が適切である。担体または希釈剤の例には、脂肪、油、水、生理食塩水溶液、脂質、リポソーム、樹脂、結合剤、充填剤など、またはそれらの組み合わせが含まれる。組成物はまた、1つ以上の成分の酸化を遅らせるために、種々の酸化防止剤を含み得ます。さらに、微生物の作用の予防はパラベン(例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン)、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、またはこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない、種々の抗菌薬(antibacterials)および抗真菌剤などの防腐剤によってもたらされ得る。
【００７７】
ナノ粒子は任意の好都合かつ実用的な様式で、すなわち、液、懸濁、乳化、混合、カプセル化、吸着などによって、担体と組み合わせることができる。このような手順は、当業者にとって日常的である。本発明の具体的な実施形態では、本発明のナノ粒子が半固体または固体担体と完全に組み合わせるか、または混合することができる。混合は、粉砕のような任意の好都合な方法で行うことができる。安定化剤はまた、組成物を治療活性の喪失、すなわち胃における変性から保護するために、混合工程において添加され得る。該組成物に用いる安定剤としては、バッファー、グリジン、リジン等のアミノ酸、デキストロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、ショ糖、マルトース、ソルビトール、マンニトール等の炭水化物が挙げられる。
【００７８】
更なる実施形態に、本発明は、本発明のナノ粒子および1つ以上の脂質、ならびに水溶性溶剤を含む医薬脂質媒体組成物の使用に関し得る。本明細書中で使用される場合、用語「脂質」は水に特徴的に不溶であり、有機溶媒で抽出可能である広範囲の物質のいずれかを含むと定義され、この広範なクラスの化合物は当業者に周知であり、そして用語「脂質」は、本明細書中で使用される場合、任意の特定の構造に限定されない。例としては、長鎖脂肪族炭化水素およびそれらの誘導体を含有する化合物が挙げられる。脂質は天然に存在するか、または合成(すなわち、ヒトによって設計または産生される)であり得る。しかしながら、脂質は、通常、生物学的物質です。生物学的脂質は当技術分野でよく知られており、例えば、中性脂肪、リン脂質、ホスホグリセリド、ステロイド、テルペン、溶解脂質、スフィンゴ糖脂質、糖脂質、スルファチド、エーテル結合脂肪酸およびエステル結合脂肪酸を有する脂質、ならびに重合性脂質、ならびにそれらの組合せを含む。もちろん、脂質として当業者のある者によって理解される、本明細書中に特に記載される化合物以外の化合物もまた、本発明の組成物および方法によって包含される。
【００７９】
当業者は、リピド媒体中に1つ以上のナノ粒子を分散させるために用いることができる一連の技術に精通している。例えば、1つ以上のナノ粒子は、当業者に公知の任意の手段によって、脂質を含む液中に分散され、脂質で溶解され、脂質で乳化され、脂質と混合され、脂質と結合され、脂質に共有結合され、脂質中の懸濁液として含まれ、ミセルまたはリポソームに含まれ、または複合体化され、あるいは脂質または脂質と会合され得る。分散液はリポソームの形成をもたらしてもよいし、もたらさなくてもよい。
【００８０】
動物患者に投与される本ナノ粒子の実際の投与量は、体重、状態の重症度、治療される疾病の種類、以前のまたは同時の治療介入、患者の特発性および投与経路などの身体的および生理的要因によって決定することができる。用量および投与経路に応じて、好ましい用量および/または有効量の投与回数は、被験体の応答に従って変化し得る。投与の責任を負う医師は、いずれにしても、組成物中の活性成分の濃度および個々の被験体のための適切な用量を決定する。
【００８１】
ある特定の実施形態に、本発明のナノ粒子物を含む医薬組成物は例えば、少なくとも約0.1%の活性化合物を含み得る。他の実施形態では、活性化合物が単位の重量の約2%〜約75%、または例えば約25%〜約60%、およびその中で導き出すことができる任意の範囲を含むことができる。当然のことながら、各治療的に有用な組成物中の活性化合物の量は、化合物の任意の所与の単位用量において適切な投薬量が得られるような方法で調製され得る。溶解性、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与経路、製品貯蔵寿命、ならびに他の薬理学的考察のような因子は、そのような医薬製剤を調製する当業者によって意図され、それ自体、種々の投薬量および処置レジメンが所望され得る。他の非限定的な例において、用量はまた、約1マイクログラム/kg体重、約5マイクログラム/kg体重、約10マイクログラム/kg体重、約50マイクログラム/kg体重、約100マイクログラム/kg体重、約200マイクログラム/kg体重、約350マイクログラム/kg体重、約500マイクログラム/kg体重、約1ミリグラム/kg体重、約5ミリグラム/kg体重、約10ミリグラム/kg体重、約50ミリグラム/kg体重、約100ミリグラム/kg体重、約200ミリグラム/kg体重、約350ミリグラム/kg体重、約500ミリグラム/kg体重、約1000mg/kg体重、またはそれ以上/照射量、およびそこで誘導可能な任意の範囲を含んでもよい。本明細書に列挙される数からの誘導可能な範囲の非限定的な例において、約5mg/kg/体重〜約100mg/kg/体重、約5マイクログラム/kg/体重~約500ミリグラム/kg/体重などの範囲を、上記の数に基づいて投与することができる。
【００８２】
Alimentary Compositions and Formulations
本開示のある実施形態、本発明のナノ粒子物は、消化経路を介して投与されるように製剤化される。Alimentary経路には、組成物が消化管と直接接触している全ての可能な投与経路が含まれる。具体的には、本明細書に開示される医薬組成物が経口、口腔、直腸、または舌下に投与されてもよい。このように、これらの組成物は不活性希釈剤または同化可能な食用担体と共に処方され得るか、またはそれらはハードシェルまたはソフトシェルゼラチンカプセルに封入され得るか、またはそれらは錠剤に圧縮され得るか、またはそれらは食餌の食物と直接的に組み込まれ得る。 ある特定の実施形態に、活性化合物を含むナノ粒子物を賦形剤と混合し、摂取可能な錠剤、口腔表、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェハなどの形態で使用することができる(Mathiowitzら、1997;Hwangら、1998;米国特許第5,641,515号;第5,580,579号および第5,792号、第451号、それぞれその全体が本明細書に具体的に参考として援用される)。錠剤、トローチ、ピル、カプセルなどはまた、以下のものを含み得る:例えば、トラガントゴム、アラビアゴム、コーンスターチ、ゼラチン、またはそれらの組み合わせなどの結合剤;例えば、リン酸二カルシウム、マンニトール、ラクトース、ラクトース、デンプン、ステアリン酸MG、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、またはそれらの組み合わせなどの賦形剤;例えば、コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸、またはそれらの組み合わせなどの崩壊剤;例えば、ステアリン酸MGなどの潤滑剤;例えば、スクロース、ラクトース、サッカリン、またはそれらの組み合わせなどの甘味剤;例えば、ペパーミント、ウィンターグリーンの油、チェリーフレーバー、オレンジフレーバーなどのフレーバー剤。投薬ユニット形態がカプセルである場合、それは、上記の型の物質に加えて、液状担体を含み得る。種々の他の物質が、コーティングに応じて、またはそうでなければ投薬単位の物理的な形態を改変するために存在し得る。例えば、錠剤、丸剤またはカプセル剤はシェラック、糖または両方でコーチングすることができる。剤形がカプセル剤である場合、それは、上記の種類の物質に加えて、液状担体などの担体を含有する可能性がある。ゼラチンカプセル、錠剤、または丸剤は、腸溶コーティングされてもよい。腸内コーティングは、pHが酸性である胃または上腸における配合物の変性を防止する。U.S.Pat.参照。No.5,629,001。小腸に到達すると、その中の塩基性pHはコーティングを溶解し、特殊な細胞、例えば、上皮腸細胞およびパイエル板M細胞によって放出および吸収されることを可能にする。エリキシルのシロップは活性化合物ショ糖を甘味剤として、メチルおよびプロピルパラベンを防腐剤として、染料および香料(例えば、チェリーまたはオレンジ香料)を含有し得る。もちろん、任意の投薬ユニット形態を調製する際に使用される任意の物質は薬学的に純粋であり、そして使用される量において実質的に無毒であるべきでる。さらに、活性化合物は、徐放性調製物および製剤に組み込まれ得る。
【００８３】
経口投与のために、本発明のナノ粒子を含む組成物は代わりに口腔洗浄剤、歯磨き剤、口腔タブレット、経口噴霧剤、または舌下経口投与製剤の形成で、1つ以上の賦形剤と共に組み込まれてもよい。例えば、ホウ酸ナトリウム溶液(Dobell's Solution)のような適当な溶媒中に必要量の活性成分を組み込んだ洗口剤を調製することができる。あるいは、活性成分がホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび重炭酸カリウムを含有するものなどの経口溶液に組み込むか、歯磨剤中に分散させるか、または水、結合剤、研磨剤、着香剤、発泡剤、および湿潤剤を含み得る組成物に治療有効量で添加することができます。あるいは、組成物が舌の下に置かれ得るか、さもなければ口の中に溶解され得る錠剤   または溶液形態に形成され得る。他の消化投与様式に適したさらなる製剤には、座薬が含まれる。坐剤は、直腸への挿入のための、通常薬用で種々の重量および形状の固体投薬形態である。挿入後、坐剤は、腔の液において柔らかになる、融解する、または溶解します。概して、坐剤については、伝統的な担体が例えば、ポリアルキレングリコール、トリグリセリド、またはそれらの組み合わせを含み得る。ある特定の実施形態に、坐剤は例えば、約0.5%~約10%、好ましくは約1%~約2%の活性成分を含む混合物から形成することができる。
【００８４】
非経口組成物および配合
更なる実施形態に、本発明のナノ粒子物は、非経口経路を介して投与され得る。本明細書中で使用される場合、用語「非経口」は、消化管をバイパスする経路を含む。具体的には本明細書中に開示される医薬組成物が例えば、静脈内、皮内、筋肉内、動脈内、髄腔内、皮下、または腹腔内に投与され得るが、これらに限定されない。品番。6,7537,514, 6,613,308、5,466,468、5,543,158;5,641,515;および5,399,363(それぞれ、その全体が参照により本明細書に特に援用される)。遊離塩基または薬理学的に許容可能な塩としての活性化合物を含む本ナノ粒子の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製され得る。グリセロール、液状ポリエチレングリコール、およびその混合物中で、油中で、分散液を調製することもできる。保存および使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐために保存料を含みます。注射可能な使用に適した医薬形態は、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射可能溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末を含む(米国特許第5,466,468号、その全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる)。全ての場合において、この形態は、無菌でなければならず、そして容易な注射可能性が存在する程度に流体でなければならない。それは、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、バクテリアおよび真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は例えば、水、エタノール、ポリオール(すなわち、グリセリン、プロピレングリコール、および液状ポリエチレングリコールなど)、それらの好適な混合物、および/または植物油を含む溶剤または分散媒体である。適切な流動性は例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散液の際に必要とされる粒径の維持により、および界面活性剤の使用により維持され得ます。微生物の作用の予防は種々の抗菌薬(antibacterials)および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張化剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含むのが好ましい。注射用混合液の吸収は注射用混合液中に、例えばステアリン酸アルミニウムやゼラチンのような吸収遅延剤を施用することにより延長可能である。
【００８５】
水溶液での非経口投与に関しては、例えば、溶液は必要であれば適当に緩衝化し、希釈液を十分な生理食塩水またはグルコースでまず等張させる。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内投与に特に適している。これに関連して、使用することができる無菌水性媒体は、本開示に照らして当業者に知られている。例えば、1つの投薬量は等張NaCl溶液に溶解され得、そして皮下注射液を添加するか、または注入の提案された部位に注射され得る(例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」第15版、1035〜1038頁および1570~1580頁を参照のこと)。処置される被検体の状態に依存して、ある程度の用量の変形例が必然的に生じ得ます。いずれにしても、投与責任者が個々の被検体に適した用量を決定します。さらに、ヒトへの投与のためには、製剤が米国食品医薬品局生物学標準局が要求する無菌性、発熱性、一般的な安全性および純度の基準を満たさなければならない。
【００８６】
滅菌注射溶液は必要な量の活性化合物を前記例示の種々の他の成分と共に適当な溶媒に配合し、必要であれば、続いて濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散液は、種々の滅菌された活性成分を、塩基性分散媒および上記に列挙されたものからの必要とされる他の成分を含有する滅菌媒体中に組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、活性成分の粉末+その以前に滅菌濾過された溶液から任意のさらなる所望の成分を生じる真空乾燥および凍結乾燥技術である。粉末化された配合物は、安定化剤の有無にかかわらず、例えば水または生理食塩水のような液状担体と混合される。
【００８７】
その他の医薬組成物および配合
本発明の他の好ましい実施形態では、活性化合物または薬剤を含むナノ粒子物が種々の種々の経路、例えば、局所(すなわち、経皮)投与、粘膜投与(鼻腔内、膣内など)および/または吸入を介する投与のために処方され得る。局所投与のための医薬組成物は、軟膏、ペースト、クリームまたは粉末などの薬用用途のために製剤化された活性化合物を含むナノ粒子を含み得る。軟膏は局所適用のための全ての油性、吸着性、乳化および水溶性塩基の組成物を含むが、クリームおよびローションは乳化塩基のみを含む組成物です。局所的に投与される薬物は、皮膚を通る活性成分の吸着を容易にするための浸透促進剤を含み得ます。適切な浸透促進剤には、グリセリン、アルコール、アルキルメチルスルホキシド、ピロリドンおよびルアロカプラムが含まれる。局所適用のための組成物のための可能な塩基としては、ポリエチレングリコール、ラノリン、コールドクリームおよびワセリン、ならびに任意の他の適切な吸収剤、エマルジョンまたは水溶性軟膏塩基が挙げられる。局所製剤はまた、活性成分を保存し、均質な配合物を提供するために、乳化剤、ゲル化剤、および抗菌剤(antimicrobials)の保存剤を含んでもよい。本発明の経皮投与はまた、「パッチ」の使用を含み得る。例えば、パッチは、1つ以上の有効成分を、所定の速度で、そして固定された期間にわたって連続的な様式で供給し得る。
【００８８】
ある特定の実施形態に、本ナノ粒子を含む医薬組成物は、点眼剤、鼻腔内スプレー、吸入、および/または他のエアロゾルデリバリー媒体によって送達され得る。経鼻エアロゾルスプレーを介して組成物を肺に直接的に送達するための方法は例えば、米国特許に記載されている。品番。5,756,353 よび5,804,212(それぞれ、その全体が参照により本明細書に具体的に援用される)。同様に、経皮内微粒子樹脂(竹永他、1998年)やリソフォシチルグリセロール化合物(米国特許第5,725号、871号、本書全文中で具体的に取り上げます)を用いた医薬品のデリバリーも、製薬業界において広く知られている。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持体マトリックスの形態の経粘膜薬物デリバリーは、米国特許に記載されている。No.5,780,045(その全体が参照により本明細書に特に組み込まれる)。
【００８９】
「エアロゾル」という語は、液化または加圧気体推進剤中に分散された液状粒子の微細に分割された固形物のコロイド系を指す。吸入のための本発明の典型的なエアロゾルは、液体推進剤中の活性成分の懸濁液、または液体推進剤と適当な溶媒との混合物からなる。好適な推進剤としては、炭化水素および炭化水素エーテルが挙げられる。好適な容器は、推進剤の圧力要件に応じて変化します。エアロゾルの投与は、対象の年齢、重量、ならびに症状の重症度および応答によって変化する。
【００９０】
開示のキット
本明細書中に記載される組成物のいずれも、キットに含まれ得る。非限定的な例では本発明のナノ粒子(例えば、薬剤または活性成分を含みます)はキットに含まれてもよい。キットは適切にアリコートされたナノ粒子、およびいくつかの場合には1つ以上のさらなる薬剤を含み得る。キットの成分は、水性媒体または凍結乾燥形態のいずれかで包装することができる。キットのボトル手段は一般に、少なくとも1つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、シリンジまたは他のボトル装置を含み、その中に、成分を入れることができ、好ましくは、適切に等分することができる。キット中に2つ以上の成分が存在する場合、キットはまた、一般に、第2、第3、または他の追加の容器を含み、その中に追加の成分が別々に配置され得る。しかし、成分の種々組み合わせを1つのバイアル中に含めてもよい。本発明のキットはまた、典型的には、本発明の1つ以上のナノ粒子および任意の他の試薬容器を、商用販売するために密閉して収容するための手段を含みます。そのような容器は、所望のバイアルを含ませるインジェクション又は使い捨て型プラスチック容器を含む。
【００９１】
キットの成分が1つ以上の液体溶液で提供される場合、液体溶液は水溶液であり、滅菌水溶液が特に好ましい。本発明の1つ以上のナノ粒子は、注射可能な組成物に製剤化されてもよい。このケースでは容器手段がそれ自体、シリンジ、ピペット、および/または他のそのような装置であってもよく、それから、処方物は体内の感染領域に適用され、動物中に注射され、および/またはキットの他の成分に適用され、および/または混合されてもよい。しかしながら、キットの成分は、乾燥粉末として提供されてもよい。試薬および/または成分が乾燥粉末として提供される場合には、粉末を適した溶媒の添加によって再構成することができる。溶媒が別の容器手段の中に同じく提供されることが想定されている。
【００９２】
参考文献
Pagels, R.F.;Prud'homme,R.K.Journal of Controlled Release. 2015, 219: 519-535.
Patel, A.;Gaudana,R.;Mitra,A.K.Journal of Microencapsulation. 2014, 31: 542-550.
本明細書中で引用する刊行物、特許出願および特許を含むすべての文献を、各文献を個々に具体的に示し、参照して組み込むのと、また、その内容のすべてをここで述べるのと同じ限度で、ここで参照して組み込む。
【００９３】
用語「a」および「an」および「The」ならびに本発明を説明する文脈(特に、以下の特許請求の範囲の文脈)における同様の指示対象の使用は本明細書中で別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数形および複数形の両方を包含すると解釈されるべきである。用語「備える」、「有する」、「含む」、および「含む」は別段の指示がない限り、限定されない用語(すなわち、「含みますが限定されない」を意味します)として解釈されるべきである。本明細書中の値域の記載は本明細書中で特に指示がない限り、単に、範囲内に入る各別個の値を個々に言及する簡潔な方法として役立つことを意図し、各別個の値はあたかもそれが本明細書中に個々に記載されたかのように、本明細書中に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施することができる本明細書中で使用するあらゆる例または例示的な言い回し(例えば「など」)は特に主張しない限り、単に本発明をよりよく説明することだけを意図し、本発明の範囲に対する制限を設けるものではない。明細書中の如何なる言い回しも、本発明の実施に不可欠で請求項に記載されていない要素を示すものとは解釈されないものとする。
【００９４】
本発明の好ましい実施態様を、発明者らが知っている本発明を実施するための最良の形態を含めて本明細書で記載している。これらの好ましい実施態様の変形は、上述の記載を読めば当業者には明らかとなり得る。本発明者は熟練者が適宜このような変形を適用することを期待しており、本明細書中で具体的に説明される以外の方法で発明が実施されることを予定している。従って本発明は準拠法で許されているように、本明細書に添付された請求項に記載の内容の修正および均等物をすべて含む。更に、上述の要素のあらゆる可能な変形でのあらゆる組み合わせが、本明細書に別段の指示がない限り、または明らかに文脈に矛盾しない限り、本発明に包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【誤訳訂正書】
【提出日】令和2年12月11日(2020.12.11)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は平成30年1月29日に出願された米国仮特許出願第62/623,018号の優先権を主張するものであり、仮特許出願に言及されていたすべての目的、意図は本明細書に完全に組み込まれ記載されている。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質治療薬は普及、増加している治療法である。モノクローナル抗体、レセプタートラップ、増殖因子、デザイナータンパク質は、自己免疫疾患、がん、及び眼科疾患に対してとりわけ重要な治療法となっている。アバスチン、エンブレル、リツキシマブ、ルセンティス、アイリーア、オプジーボ、キイトルーダ、等のタンパク質治療薬の年間販売額は数十億ドルになる。これらのタンパク質薬剤は、製薬会社の開発パイプラインの大部分を占め、その数も増加している。作用の標的への特異性が高いこと、及び標的外作用がかなり低いことが、これタンパク質製剤を特に魅力的なものにしている。これらの治療法の重要性が高まっているにもかかわらず、タンパク質製剤化で利用できる、空間時間的に投薬プロフィールの制御を可能にするデリバリーベシクルは、未だ開発されていない。
【０００３】
抗体を含むタンパク質治療薬のデリバリーで、デリバリー・システムの成功に必要な条件は、生分解性であること、高い封入能力があること、制御または持続的長期間の放出が可能であること、タンパク質治療薬を長期間安定に維持可能であること、及び大規模製造が可能な製造方法であることである。高い負荷能力は特に望ましいものである。。なぜなら、これらデリバリー物質の大部分は、インビボで高濃度になると健康な組織に副作用を引き起こすかもしれないからである。高い負荷能力は同等の治療効果達成に必要なデリバリー物質の投薬量を低下することができるからだ。デリバリー物質の生分解性も薬剤法出後、生分解され毒性が減少し、体外に取り除くための外科手術が不要になるので、望ましいことである。インビボでのタンパク質治療薬が低安定であるため、長期間持続的に放出するデリバリー・システムが体内の治療濃度を長期に維持するために必要とされる。このシステムにより投与頻度を減少させるであろう。さらに、調整、製剤化過程で、タンパク質治療薬の生物学的活性を維持されねばならない。最後に、製造方法が簡単で、大規模化が可能であることが、このようなデリバリー・システムの製造の信頼性、及び臨床応用にとって重要である。例えば、長期ヒト成長ホルモンソマトロピン負荷注射可能なポリマーデポであるニュートロピンデポはジェネンテック、及びアルカーメスによって市販されていたが、製造費が高すぎるために2004年に取り下げられた。
【０００４】
上述の主要な要件を満たすためにタンパク質デリバリー・システムの開発は大きく進歩してきた。しかしながら、タンパク質治療薬の生物物理学的性質(すなわち、高水溶性、高分子量、及び残留表面電荷)が、持続放出デバイスにカプセル化することをより困難にしている。タンパク質治療薬のために最も一般的に研究されているデリバリー・システムは、ハイドロゲル、固形ポリマーナノまたはマイクロ粒子である。製剤化を最適化するために、様々な調製方法が開発されている。これらのシステム、及び調製方法はタンパク質治療薬のデリバリーで有望な結果が示されているが、ほとんどが、上記の要件のすべてを同時に満たせていないものである。
【０００５】
ポリエチレングリコール(PEG)、ヒアルロン酸、デキストラン、アルギン酸塩およびゼラチンのような親水性ポリマーから調製されたハイドロゲルシステムは、それらの親水性および簡単なタンパク質負荷工程のために、タンパク質デリバリーの魅力的なプラットホームであり、この簡単な負荷工程がタンパク質治療薬の変性を回避する。持続的放出プロフィールを達成するために、架橋結合によりネットワークを形成することが必要とされる。架橋結合は共有結合、イオン性または疎水性相互作用によって達成される。タンパク質治療薬のハイドロゲルからの放出速度は、負荷されたタンパク質治療薬分子の大きさと同様に、ハイドロゲル中のメッシュ径およびポリマーの体積分率によって制御される。一般に、小さなメッシュ径、高いポリマーの体積分率、および大きな分子量のタンパク質治療薬よりなるハイドロゲルは、放出が遅くなる。ハイドロゲル系の限界は、使用されるデリバリー物質の親水性の性質のため、持続的長期放出を達成することが困難であることである。
【０００６】
タンパク質デリバリーのために広く使用されている別の担体系は、疎水性または両親媒性ポリマーによって調製されたナノ/マイクロ粒子である。ポリ(乳酸)(PLA)、ポリ(グリコール酸)(PGA)、およびそれらの共重合体、ポリ(乳酸-コ-グリコール酸)(PLGA)は、それらの生体適合性および生分解性が調整可能であるため、粒子調製に最も広く使用されているポリマーである。ナノ/マイクロ粒子にタンパク質を負荷するために最も一般的に使用される方法は、水/油/水(w/o/w)エマルジョンシステムが形成される二重エマルジョン方法である。その構造は、油相が水非混和性有機溶媒に溶解された担体ポリマーの溶液、第1の水相はタンパク質治療薬の水溶液、第2の水相は分散相としての水溶液の３相よりなっている。いくつかの稀な場合には、代わりに固体/油/水(s/o/w)システムが形成され、第1の水相は有機溶媒中のポリマー溶液中に分散された固形タンパク質粒子で置き換えられる。いずれの場合も、二重エマルジョン系は、有機溶媒が次第に蒸発または抽出される間、安定に保たれ、タンパク質液を内部に捕捉する固形ポリマー粒子を生成する。ハイドロゲルと比較して、このシステムは、タンパク質の疎水性物質を通る拡散が無視できるので、カプセル化タンパク質治療薬の放出速度は、ポリマーマトリクスの分解速度に大きく依存することになり、放出持続時間を延長できるという長所を有する。しかし、この工程では、負荷量が極端に少なくなる。さらに、この方法で使用される有機溶媒およびポリマー基質中の疎水性環境は、負荷されたタンパク質治療薬の変性の危険性を増大させる。これらの粒子に負荷されたタンパク質の放出は、特徴的な3相よりなる。１．破裂放出、２．放出休止、３．放出速度が変動しやすい持続放出。このような放出特性では、インビボで期待する治療結果を得ることが困難であった。
【０００７】
近年、Prud'hommeグループはフラッシュ・ナノ沈殿法(FNP)を用い、タンパク質負荷ナノ粒子を調製する方法を開発し、ナノ粒子のタンパク質負荷量を増大させた[非特許文献1]。FNPは、拘束衝突ジェット(CIJ)、又はマルチインレットボルテックスミキサー(MIVM)を利用し、製造工程速度を制御することで、継続的かつ大量製造可能な方式でのナノ粒子生成を可能にした。FNPは小分子量の疎水性薬物を効果的にナノ粒子カプセル化するために使用されてきた。FNP法を改良することで、タンパク質治療薬と両親媒性共重合体を、DMSOまたはメタノールなどの水混和性有機溶媒中に一緒に溶解したものと、クロロホルムまたはアセトンなどのより極性の低い非溶媒とを、CIJまたはMIVMを用い迅速に混合することで、逆相ナノ粒子を作成した。逆相ナノ粒子は、内側のコアが共重合体の親水性セグメントとタンパク質よりなる親水性で、外側のシェルが共重合体の疎水性セグメントよりなる疎水性の構造になっている。次に、このナノ粒子のシェルを架橋することで安定化させた。例えば、ポリ(n‐ブチルアクリレート)7.5kダルトンとpoly(アクリル酸)5.5kダルトンを用いて、モデルタンパク質のリゾチーム(14.3kDa)で高負荷量(≧50%)のナノ粒子(≦100nm)を作成した。しかし、このナノ粒子に負荷工程でタンパク質の二次構造に変化があるかどうかは不明であり、より重要なことは、負荷されたタンパク質のこのシステムからの放出プロファイルは、依然として特徴付けられていない。
【０００８】
タンパク質カプセル化の方法として疎水性イオン対形成法（HIP）が報告されている。正味の正電荷を有するタンパク質はデキストラン硫酸のような反対に荷電した薬剤と高分子電解質複合体を形成することで、電気的に中和され、複合体ナノ粒子を形成する。この方法で、ナノ粒子へのカプセル化を容易にするだけでなく、タンパク質を変性から保護することを可能にする。ナノ沈殿法または二重エマルジョン法で、HIP複合体は、疎水性または両親媒性ポリマーを用いて調製したナノ粒子に負荷される。Mitraらはリゾチームとデキストラン硫酸のHIP複合体形成に成功したと報告した。これをPLGAナノ粒子に負荷して、30日間にわたってほぼ零次速度の放出を達成した。同グループの別の報告では、デキストラン硫酸とIgG-FabフラグメントのHIP複合体をナノ沈殿法または二重エマルジョン法をもちいて、約85%の高いカプセル化効率で、PLGAナノ粒子に負荷に成功している[非特許文献2]。これらのHIP複合体およびナノ粒子作成には、人力での混合工程が用いられているため、大量製造化が難しく、バッチ間の品質の変動も大きいものであった。したがって、タンパク質治療薬をカプセル化および徐放化するナノ粒子を大量に再現性良く製造する新規生分解性ナノ粒子プラットホームが商業的に必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Pagels, R. F.; Prud'homme, R. K. Journal of Controlled Release. 2015,219: 519-535.
【非特許文献２】Patel, A.; Gaudana, R.; Mitra, A. K. Journal of Microencapsulation. 2014, 31: 542-550
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、大量製造可能で再現性のある方法によりタンパク質治療薬のカプセル化および徐放性を可能にする新規生分解性ナノ粒子プラットホームについてである。リゾチーム(14.3kDa、pI11.3)、オボアルブミン(45kDa、pI4.5)およびIgG(150kDa、pI6.8)を、タンパク質治療薬のためのモデルとして使用した。これらのナノ粒子プラットホームを準備するための2つの異なったアプローチがある。一つの実施例では、リゾチーム、又はIgGとデキストラン硫酸との高分子電解質複合体(PEC)をフラッシュ・ナノ複合体形成法(FNC)とよばれる連続工程で作成し、その後、フラッシュ・ナノ沈殿(FNP)とよばれる溶剤交換処理でPEG-PLLAまたはPEG-PCLのようなブロック・コポリマーと共沈させた。別の実施例では、PEC複合体形成(FNC)およびフラッシュ・ナノ沈殿(FNP)の結果としてのポリマーナノ粒子生成の2つのプロセスが単一工程の相分離プロセスに組み合わされている。この方法ではポリカチオン溶液(典型的には溶液のpHがpI未満に調整されたタンパク質溶液)、ポリアニオン溶液(例えば、デキストラン硫酸、ヘパリン硫酸塩、または核酸)、及び水混和性溶媒に溶解されたブロック・コポリマー(溶媒の組合せは適切な速度で相分離を適切に誘導するように選択される)が、効率的に混合するように最適化された一連の流速で規定されたチャンバーに導入される。結果、PECを効率的に負荷した固形またはミセルナノ粒子がえられる。上述の高分子電解質複合体形成および溶媒誘発相分離または自己集合を同時に実施する方法は、これまで報告されていない。この方法により、ナノ粒子(ポリエステルが使用される場合)またはミセル(PEG-共ポリエステルブロック・コポリマーが使用される場合)をPEC(例えば、タンパク質およびDS)と疎水性ポリマーを共沈させ、均一に混合し、結果、タンパク質を徐放するナノ粒子が作成できた。
【００１１】
混合工程と混合チャンバーの形状が類似しているにもかかわらず、本発明者らのナノ粒子製剤形態は、その構造と組成に関して、Prud'hommeらによって調製されたものとは区別される。本発明者らのナノ粒子はナノ粒子全体にタンパク質が分布したモノリスマトリックスから構成される。一方、Prud'hommeら[非特許文献1]によって調製されたリバースミセルは、疎水性ポリマー・シェルによって囲まれたミセルの親水性PEGコア中にタンパク質が負荷されている。本発明者らのナノ粒子の組成物は、タンパク質およびポリ陰イオン(タンパク質溶液のpHがそのpIより低い場合)又はポリ陽イオン(タンパク質溶液のpHがそのpIより高い場合)のPECと、疎水性ポリマーまたはPEG-b-ポリマーブロック・コポリマーである。疎水性ポリマーは、必ずしも親水性ブロックを含む必要はない。Prud'hommeら[非特許文献1]のミセルは、PEC、すなわち対イオン高分子電解質を含まないものである。
【００１２】
タンパク質カプセル化に使用される材料は、本発明者らのナノ粒子とMitraら[非特許文献2]の調整したナノ粒子で類似している。しかし、本発明者らは、新規ナノ粒子調製法を記載している。この調整法で、カプセル化能(負荷量、ならびにタンパク質およびPECの種類)が上がった新規のナノ粒子製剤ができる。本発明者らの方法を使用して、疎水性ポリマーナノ粒子中にばらばらのPECナノ粒子をカプセル化した。ここでPECは一つの疎水性ポリマーと共沈した一つの核として働き、その結果、PECがコア全体に均一に分布した多層コアマトリックスナノ粒子の構造ができる。より具体的には、一段法ではPECは瞬間的に形成され、疎水性ポリマー固形ナノ粒子またはミセルの共沈を誘導する核として働き、ナノ粒子全体にわたるPECの均一な分配を生じる。それはまた、より広範囲のPECカプセル化を可能にする。
【００１３】
本発明の実施例として、以下のナノ粒子がある。このナノ粒子は、タンパク質又はペプチドと対イオン・ポリマーを含む複合体である。ここで、対イオン・ポリマーはタンパク質に静電的に結合することを可能にする電荷をもっている。
【００１４】
ナノ粒子の好適な大きさは、例えば、20〜2000nm;100〜1800nm;500〜1000nm;20〜1000nm;20〜500nm;20〜150nmである。本発明で用いられるタンパク質又はペプチドの分子量は、例えば、2,000〜20万;1万~15万;2万〜10万;3万〜7万;2,000〜10万;または10万〜20万である。本ナノ粒子は、また、生分解性ポリマー全体に均一に分布した複合体を含むマトリクスを含むものである。適切なマトリックスは、非水溶性(又は疎水性)であることがある。好適な対イオン・ポリマーは、正及び/又は負に荷電していることがある。好適な対イオン・ポリマーの例としては、デキストラン硫酸(DS)、ヘパリン(ヘパリン硫酸)、ヒアルロン酸、又はそれらの組合せがある。本発明では、例えばポリペプチド及び抗体を含むほとんどのタンパク質を使用することがある。本発明で使用される好適な生分解性ポリマーとしては、例えば、PEGを含む共重合体が挙げられる。共重合体の例には、PLLA、PGA、PLGA、PCL、これらのPEG化したブロック・コポリマー、又はそれらの組み合わせたものが含まれる。本発明で用いられる適当な生分解性ポリマーの一つに、PEG-b-PLLAがある。
【００１５】
本発明の別の実施例は、以下、a, b, cの製造法を含むナノ粒子を作成する方法である。(a)第1の連続混合工程としてタンパク質と対イオン・ポリマーとを混合することによって高分子電解質複合体を形成すること。(b)第2の連続混合工程として、生分解性ポリマーと共沈すること。(c)生分解性ポリマーマトリクス全体に均一に分布したタンパク質高分子電解質複合体を含むナノ粒子を製造すること。
【００１６】
驚くべきことに、本発明者らはナノ粒子を1工程で製造する方法を発明した。前記の(a)および(b)工程を同時に実施することでナノ粒子を形成することができることがあり、第1および第2の連続工程は、フラッシュ・ナノ複合体形成法(FNC)が望ましい。具体的には、１工程で、高分子電解質複合体(PEC)と生分解性ポリマーを溶媒誘発フラッシュ・ナノ沈殿法(FNP)によって混合することが好ましい。本発明の方法は、タンパク質と対イオン・ポリマーとの間の静電引力によって高分子電解質複合体(PEC)を形成することである。ナノ粒子は、高分子電解質複合体（PEC）と一緒に生分解性ポリマーを沈殿させることによって形成される。
【００１７】
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。以下の参考文献は本発明で使用される用語の多くの一般的な定義を当業者に提供するものである。Singletoneton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed.20 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); and Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書中で使用される場合、以下の用語は特に明記しない限り、以下に記載された意味を有する。
【００１８】
本開示で使用される「抗体」という用語は免疫グロブリン、又はそのフラグメントもしくはその誘導体を指し、インビトロ、又はインビボで産生されるかどうかにかかわらず、抗原結合部位を含む任意のポリペプチドを包含する。この用語はポリクローナル、モノクローナル、モノ特異的、多特異的、非特異的、ヒト化、単鎖、キメラ、合成、組換え、雑種、変異、および移植抗体を含むが、これらに限定されない。本開示の目的のために「インタクトな抗体」という用語によって別途改変されない限り、「抗体」という用語はFab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb、および抗原結合機能、すなわち、例えば、PD-L1に特異的に結合する能力を保持する他の抗体フラグメントなどの抗体フラグメントも含む。一般的には、このようなフラグメントは抗原結合ドメインを含む。
【００１９】
「抗原結合ドメイン」、「抗原結合フラグメント」、および「結合フラグメント」という用語は抗体と抗原との間の特異的結合に関与するアミノ酸を含む抗体分子の一部を指す。例えば、抗原が大きい場合、抗原結合ドメインは抗原の一部にのみ結合することがある。抗原結合ドメインとの特異的相互作用に関与する抗原分子の一部は「エピトープ」、又は「抗原決定基」と呼ばれる。抗原結合ドメインが一般的には抗体軽鎖可変領域(VL)、及び抗体重鎖可変領域(VH)を含むが、必ずしも両方を含む必要はない。例えば、いわゆるFd抗体フラグメントはVH領域のみからなるが、依然としてインタクトな抗体の抗原結合機能を、ある程度保持する。
【００２０】
抗体の結合フラグメントは、組換えDNA技術によって、又はインタクトな抗体の酵素的、又は化学的切断によって産生される。結合フラグメントには、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、および一本鎖抗体が含まれる。「二重特異性」または「二機能性」抗体以外の抗体はその結合部位の各々が同一であると理解される。酵素パパインによる抗体の消化が「Fab」フラグメントとしても知られる2つの同一の抗原結合フラグメント、及び抗原結合活性は無いが結晶化する能力をもつ「Fc」フラグメントを生じる。酵素ペプシンによる抗体の消化は抗体分子の2つのアームが連結されたままであり、2つの抗原結合部位を含むF(ab')2フラグメントを生じる。F(ab')2フラグメントは抗原結合部位を架橋する能力を有する。本明細書中で使用される場合、「Fv」は抗原認識部位、及び抗原結合部位の両方を保持する抗体の最小のフラグメントをいう。本明細書中で使用される場合、「Fab」は軽鎖の定常ドメイン、及び重鎖のCHIドメインを含む抗体のフラグメントをいう。
【００２１】
「対イオン・ポリマー」とは、ポリマーがタンパク質に静電的に結合することができるような電荷を有するポリマーを意味する。例としては、正味の負電荷を有する対イオン・ポリマーに結合する正味の正電荷を有するタンパク質、又はその逆がある。
【００２２】
「疾患」とは、細胞、組織、又は臓器の正常な機能を損傷または妨害するあらゆる状態又、は障害を意味する。疾患の例には、がんが含まれる。
【００２３】
「フラグメント」とは、ポリペプチドの一部を意味する。この部分は、好ましくは参照ポリペプチドの全長の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、又は90%を含有する。フラグメントは、10、20、30、40、50、60、70、80、90、又は100、200、300、400、500、600、700、800、900、又は1000個のアミノ酸を含むことがある。
【００２４】
「mAb」という語は、モノクローナル抗体を指す。本発明の抗体はネイティブ抗体、バイスペシフィック抗体;キメラ抗体;Fab、Fab'、一本鎖V領域フラグメント(scFv)、融合ポリペプチド、及び従来型で無い抗体を含むが、これらに限定するものではない。
【００２５】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」はアミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書中で相互に互換的に使用される。これらの用語は、1つ以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の類似体又は模倣体であるアミノ酸ポリマー、又は天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用される。ポリペプチドは糖タンパク質を形成する炭水化物残基の付加によって修飾されることがある。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は糖タンパク質、及び非糖タンパク質を含むものである。
【００２６】
「参照配列」とは、配列比較の参照として使用されることが明示された配列である。参照配列は、特定された配列の全体、又はそのサブセットとすることがある。ポリペプチドについては、基準のポリペプチド配列の長さは一般に、少なくとも約16アミノ酸、好ましくは少なくとも約20アミノ酸、より好ましくは少なくとも約25アミノ酸、又は、さらに好ましくは約35アミノ酸、約50アミノ酸、又は約100アミノ酸である。
【００２７】
本明細書で使用される「被験者」という語は、本明細書に記載される方法が実施される任意の個人、又は患者を指すものである。一般に、被験者はヒトであるが、当業者には理解されるように、被験者は動物であってもよい。したがって、げっ歯類(マウス、ラット、ハムスター、モルモットを含む)、ネコ、イヌ、ウサギ、家畜（ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等を含む）、霊長類(サル、チンパンジー、オランウータン、ゴリラを含む)等の哺乳類を含む動物が被験者の定義の範囲内に含まれる。
【００２８】
本明細書で提供される範囲は、その範囲内の全ての値について略記されたものであると理解される。例えば、1―50の範囲は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50が含まれる。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、用語「治療する」、「治療」、「処置」、及び同様のものは、治療対象の障害かつ/または症状を減少、又は改善することを意味する。障害、症状を治療するとは、障害、症状を完全に治癒することではないと認識されている。ただし完全に治療される可能性を否定していることではない。
【００３０】
本明細書で使用される用語「または」は特に明記されない限り、または文脈から明らかでない限り、包括すると理解される。本明細書で使用される用語「一つの」、および「その」、「それらの」は、特に明記されない限り、文脈から明らかでない限り、単数、又は複数であると理解される。
【００３１】
本明細書で使用される用語「約」は、特に言及されない限り、又は文脈から明らかでない限り、当技術分野における通常の許容範囲内、例えば、平均値の2標準偏差内と理解される。約は、記載された値の10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、または0.01%以内と理解することができる。文脈から特に明確でない限り、本明細書で提供されるすべての数値は、用語「約」によって修正される。
【００３２】
本明細書で提供される任意の組成物、又は方法は、本明細書中に提供される他の組成物、及び方法のいずれかの1つ以上と組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】タンパク質治療薬および対イオン高分子電解質のカプセル化PECによるナノ粒子の2段(FNC-FNP)調製プロセスの模式図である。ここでは、3つの注入口を持つデバイスを第2段として示している。FNP工程で溶媒交換の特定の要件に基づいて、これを2つの注入口または4つの注入口の混合チャンバーに切り替えることが可能である。
【図２】４つの注入口を持つ多注入口ボルテックスミキサを使用したタンパク質治療薬の単一工程カプセル化の模式図である。PECは生分解性ポリエステルナノ粒子と共沈し、ポリマーナノ粒子、又はミセルコア全体に分布する。平均30nm〜1000nm、PDI<0.3の範囲でサイズを変えることが可能である。タンパク質負荷量の範囲は2〜25%である。2週間〜3週間にわたるタンパク質治療薬の徐放性がある。
【図３】水中のDLSによって測定したリゾチーム/DS PECナノ粒子(A)及びリゾチーム/DS:PEG-b-PLLAナノ粒子(B)の粒度分布図である。コア‐シェルナノ粒子(NP1, NP2,NP3)の3つのバッチを3種類のリゾチーム‐ポリマー重量比で調製した。平均粒子径124〜170nmの範囲の粒径を示し、狭い分布であった(PDI〜0.17〜0.19)(表1)。(C)リゾチームとポリマーの比率がナノ粒子粒径に及ぼす効果を示す図である。(D)NP1からNP3までの平均ゼータ電位は、脱イオン水中で測定される。
【図４】（A）NP1と（B）NP2のTEM画像である。
【図５】PBS(pH7.4)中、37℃でのNP1-NP3からのリゾチームのインビトロ放出プロフィール図である。
【図６】(A)PBS(pH7.4)中、37℃でのNP4-NP7かのIgGのインビトロ放出プロフィール図である。(B) PBS(pH7.4)中、37℃でのNP8-NP11からのIgGのインビトロ放出プロフィールの図である。
【図７】NP4及びNP8の放出プロフィールの比較図である。
【図８】リゾチーム/デキストラン硫酸(DS)PECを負荷したmPEG‐PCLナノ粒子と、リゾチームのみを用いたmPEG‐PCLナノ粒子、DSのみを用いたmPEG‐PCLナノ粒子、及びmPEG‐PCLを用いないリゾチーム/DS PECナノ粒子の水中の強度平均径の分布を動的光散乱法で測定し比較した図である。(A)4つの注入口からの流速がすべて0.5mL/minで製造した時の図である。(B)4つの注入口のうちDS、リゾチーム、mPEG‐PCLが流速2mL/min、水が4mL/minで製造した時の図である。
【図９】(A)カプセル化ナノゴールド標識免疫グロブリンG(IgG)/DS PECを用いたmPEG‐PCLナノ粒子の透過型電子顕微鏡(TEM)像である。スケールバー=100nm。(B)高倍率TEMは、ナノ粒子内のIgGの分布を示す。矢印は、NanoGold標識IgGの例である。スケールバー=50nm。
【図１０】37℃のPBS(pH7.4)中で、2週間にわたるタンパク質/DS:mPEG-PCLナノ粒子からのタンパク質治療薬のインビトロ放出プロフィール図である。(A)NP19から放出されるモデルタンパク質としてIgGを使用した図である。(B)NP27から放出されるモデルタンパク質としてオボアルブミン(OVA)を使用した図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明は、1つ以上のタンパク質、及び対イオン高分子電解質のカプセル化高分子電解質複合体(PEC)を用いてナノ粒子を調製する方法を含むものである。このプロセスは連続する２工程よりなる：(1)選択されたタンパク質治療薬を、ポリアニオン(例えば、デキストラン硫酸(DS)、へパチリン（ヘパリン硫酸）、及びヒアルロン酸など)と、タンパク質の等電点(pI)よりも低いpHで混ぜ合わせ、水、又は水性溶媒中に懸濁されたPECを作り出し、その後(2)前記PEC懸濁液を、水混和性有機溶媒(例えば、アセチルニトリル(ACN)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、テトラヒドロフラン(THF)、ジメチルホルムアミド(DMF)、およびイソプロピルアルコール(IPA)など)中に溶解させた生分解性ポリマーPEG-b-PLLA(又はPLLA、PGA、PLGA、PCL、又はそれらのPEGとの共重合体、又はそれらの組合せ)と共沈させる；両方の工程を、拘束衝突ジェットミキサー、又はマルチインレットボルテックスミキサーで１組の所定の流速で溶液ジェットを注入することによって達成される。この2工程の過程により、PECを含むナノ粒子を製造する(図1)。
【００３５】
別法として、ナノ粒子は、高分子複合体形成とフラシュ・ナノ沈殿の工程を同時にすることで製造される。これは、以下の溶液ジェットを連続的に注入することよりなる：(1) 選択されたタンパク質治療薬はタンパク質の等電点(pI)よりも低いpHで水性溶媒に溶解される、(2) 水性溶媒に溶解したポリアニオン、例えば、デキストラン硫酸(DS)、ヘパリン(硫酸ヘパリン)、及びヒアルロン酸など、(3)水有機溶剤ミセルに溶解した生分解性ポリマーPEG-b-PLLA(またはPLLA、PGA、PCL、またはPEGとのそれらのコポリマー、またはそれらの組み合わせ)。有機溶剤として、例えば、アセチルニトリル(ACN)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、テトラヒドロフラン(THF)、ジメチルホルムアミド(DMF)、イソプロピルアルコール（IPA）等がある。並びに(4)効率的な相分離、及びナノ粒子形成を所定の流速で、拘束衝突ジェットミキサー、又はマルチインレットボルテックスミキサーで特定の溶媒極性を維持するための追加の溶媒ジェットである。以上の結果、PEC含有ナノ粒子が製造される(図2)。
【００３６】
本発明は、また、本発明の方法によって作製されるナノ粒子システムを含む。このナノ粒子システムはタンパク質-ポリイオンPECが埋め込まれた生分解性ポリマーマトリクスから構成され、以下の特徴を有する：(1)PECナノ粒子は生分解性ポリマーナノ粒子と共沈された多核として働く (必要に応じて、あるナノ粒子はPEGコロナも含有する)、一方、PECはポリマーナノ粒子全体に分布する；(2)調整可能な大きさは平均30nm〜1000nmで0.3以下の多分散指数(PDI)を有する。(3)タンパク質負荷量は、2〜25w/w%の範囲である；並びに(4)タンパク質治療薬の徐放性は2週間〜3ヶ月の範囲である。
【実施例】
【００３７】
本発明を例示するために、本発明者は、リゾチーム、オボアルブミン、及びIgG負荷PLLAナノ粒子、又はPEG-b-PLLA又はPEG-b-PCLミセルナノ粒子の製造およびキャラクタリゼーションの例を説明する。
【００３８】
（実施例１）
リゾチーム/DS:PEG-b-PLLAナノ粒子の調製
方法
PECナノ粒子核の調製とキャラクタリゼーション:リゾチームを脱イオン水（DI）に5mg/mLで溶解し、次に0.1M塩酸溶液を加えてpHを4.0に調整した。次に、1ミリリットルのリゾチーム溶液を、等容量のDS溶液(20mg/mL、pHを4.0に調整)と、5mL/分の流速で2つの注入口を有するCIJミキサーを用いて迅速に混合した。得られたリゾチーム/DS PECナノ粒子のサイズを、動的光散乱(DLS)測定器、Zetasizer Nano(Malvern Instruments, Worcestershire, UK)を用いて分析した。それぞれのサンプルを3回測定し、データを3回の結果の平均±標準偏差として報告した。
【００３９】
PEG-b-PLLAミセルナノ粒子の調整、及びキャラクタリゼーション:前工程で得られた1ミリリットルのリゾチーム/DS PECナノ粒子懸濁液(2.5mg/mL)を、様々な濃度(7.5、12.5、及び25mg/mL)でDMSOに溶解したPEG5k-b-PLLA20kの等体積の溶液と、2注入口CIJミキサーを介して5mL/分の流速で迅速に混合した。異なったリゾチーム対ポリマー重量比(1:3、1:5および1:10)を有する3種のナノ粒子(NP1、NP2およびNP3)が得られた。分子量カットオフ(MWCO)3.5kDaの透析膜を用いてナノ粒子を脱イオン水に対して12時間透析し、水を2時間毎に交換しDMSOを除去した。得られた溶液を、100kDaのMWCOフィルターを用いて、4,500rpmで20分間限外ろ過により精製し、余分なタンパク質およびDSを除去した。
【００４０】
カプセル化されていないリゾチームの量は、BCAアッセイによって測定され、カプセル化効率(EE)は次の式で計算されたものである。
EE(%)=(Mtotal-Mfree)/Mtotal×100%
【００４１】
ここで、総供給リゾチームの質量をMtotalとし、遊離のリゾチームの質量をMfreeとした。
【００４２】
ナノ粒子は、DLS Zetasizer Nanoを用いて粒径、及びゼータ電位によってキャラクタリゼーションした。それぞれのサンプルを3回測定し、データを3回の結果の平均±標準偏差として報告した。炭素膜で覆われたイオン化ニッケルグリッド上に10マイクロリットルのナノ粒子液を添加することにより、TEM画像形成のためのサンプルを調製した。10分後、溶液をピペットで取り除き、6マイクロリットルの2%酢酸ウラニル滴をグリッドに加た。30秒後、溶液を除去し、グリッドを室温で乾燥させた。次に、テクナイFEI-12電子顕微鏡を用いて試料を画像化した。
【００４３】
タンパク質のインビトロ放出:1mgのリゾチームを含有する1mLのリゾチーム負荷ナノ粒子懸濁液を、1mLの透析管(SpectrumLab, MWCO50kDa)にいれ、次にこれを、5mLのPBS(pH7.4)いりのバイアルに浸した。37℃、撹拌速度100rpmのインキュベーターにバイアルを投入した。外側のPBS溶液を回収し、毎日、新しいPBSと交換した。採取した溶液を凍結乾燥により濃縮し、さらに400マイクロリットルの脱イオン水中に再溶解した。ミクロビシンコニン酸(BCA)アッセイを用いて、放出されたリゾチームの量を定量した。
【００４４】
結果と考察
PECナノ粒子調製、及びキャラクタリゼーション:FNCを通して急速に混合した後、リゾチーム、及びDSは、水溶液中で64nmの平均粒径、及び0.18の多分散指数(PDI)を有する均一なPECナノ粒子を形成した(図3)。
【表１】
2021519748.tif 000023
【００４５】
（実施例２）
IgG/DS PECナノ粒子の調製、及びキャラクタリゼーション
方法
IgG/DS PECナノ粒子の調製、及びキャラクタリゼーション:IgGを5mg/mLの濃度で脱イオン水に溶解し、続いて0.1M HCl溶液を添加することによってpHを4.0に調整した。次に、1ミリリットルのIgG溶液を、等容量のDS溶液(20mg/mL、pHを4.0に調整)と、5mL/分の流速で2つの注入口を有するCIJミキサーを通して迅速に混合した。得られたPECナノ粒子懸濁液を、PEG-b-PLLAナノ粒子調製のために直ちに使用した。
【００４６】
IgG/DS:PEG-b-PLLAナノ粒子の調製、及びキャラクタリゼーション:前工程で得られたIgG/DS PECナノ粒子懸濁液の1mL(2.5mg/mL)を、2つの異なる濃度(12.5、及び25mg/mL)のPEG5k-b-PLLA20k DMSO溶液の等体積と、2つの異なる濃度(12.5および25mg/mL)で、5、又は10mL/分の流速で2注入口CIJミキサーを通して迅速に混合し、2つの異なるIgG対ポリマー率(1:5および1:10)を有するコア-シェルナノ粒子(NP4〜NP7、表2)の4つの異なる製剤を得た(図5)。MWCO3.5kDaの透析膜を用いてナノ粒子を脱イオン水に対して12時間透析し、DMSOを除去した。水は2時間毎に交換した。得られた溶液を、100kDaのMWCOフィルターを用いて、4,500rpmで20分間限外ろ過により精製し、余剰IgG、及びDSを除去した。ろ液中のIgG量をマイクロBCAアッセイにより測定し、次の式を用いてEEを計算した。
EE(%)=(Mtotal-Mfree)/Mtotal×100%
ここで、IgGの総供給質量をMtotalとし、遊離IgGの質量をMfreeとした。コア‐シェルナノ粒子は、DLS Zetasizer Nanoを用いて、大きさとゼータ電位によってキャラクタリゼーションした。それぞれのサンプルを3回測定し、3回の結果の平均±標準偏差をデータとして報告した。
【００４７】
IgGのインビトロ放出:1mgのIgGを含有する1mLのIgG負荷ナノ粒子懸濁液を、1mLの透析管(SpectrumLab、MWCO300kDa)にいれ、次に、これを、5mLのPBS(pH7.4)を含有するバイアルに浸した。バイアルを37℃、攪拌速度100rpmのインキュベーターに入れた。バイアル中のPBS溶液を毎日交換採取した。採取した溶液を凍結乾燥により濃縮し、さらに400マイクロリットルの脱イオン水を用いて再溶解した。マイクロBCAアッセイを用いて、放出されたIgGの量を定量した。
【００４８】
結果
コア-シェルナノ粒子調製、及びキャラクタリゼーション:IgG/DS:PEG-b-PLLAナノ粒子(NP4〜NP7)を、2つの異なるIgG対ポリマー比、及び2つの異なる流速で調製した。35nm〜96nmの範囲のZ平均粒径を示し、狭い粒径分布(PDI値〜0.16〜0.26)を示した(表2)。重合体に対するIgGの比率または流速を減少させると、ナノ粒子の大きさが有意に増加した。これらの結果は、ナノ粒子の粒径が重合体に対するIgGの重量比、及び流量を調整することによって変化し得ることを示している。全てのナノ粒子は、-24〜-33mVの範囲のゼータ電位を有する負の表面電荷を示した。カプセル化効率は62〜88%の範囲であり、これは流速の増加、又はIgG対ポリマー比の減少に伴い増加した。
【表２】
2021519748.tif 000024
【００４９】
インビトロ放出プロフィール:透析方法を用い、NP4からNP7のPBS(pH7.4)中へのインビトロ放出プロフィールを調査した。図5Aに示されるように、4つのナノ粒子は全て、最初の2日間のバースト放出、続いて34日間ほぼゼロ次の放出を伴う類似の二相性放出プロフィールを示した。さらに、NP4からNP7の放出速度は同様であり、34日目までにそれぞれ約57%、54%、53%、及び51%のIgGがNP4からNP7で放出され、76日目までにそれぞれ95%、87%、85%、82%が放出された。
【００５０】
（実施例３）
IgG/DS:PEG-b-PCLナノ粒子の調製
方法
IgG/DS:PEG-b-PCLナノ粒子の調製、及びキャラクタリゼーション:PEG5k-b-PLLA20kをPEG5k-b-PCL20kで置き換えたことを除いて、実施例2の方法に記載されたものと同じ手順で、IgG/DS:PEG-b-PCLナノ粒子を調製し、キャラクタリゼーションした。2つの異なるIgG対ポリマー率(1:5および1:10)、及び2つの異なる流量(5および10mL/分)で、4つのナノ粒子NP8〜NP11を調製した(図5B)。
【００５１】
IgGのインビトロ放出:200マイクログラムのIgGを含む1mLのIgG/DS:PEG-b-PCLナノ粒子液を1mLの透析管(SpectrumLab, MWCO300kDa)にいれ、次いでこれを5mLのPBS(pH7.4)を含むバイアルに浸した。37℃、撹拌速度100rpmのインキュベーターにバイアルを投入した。PBSのろ液を毎日交換採取した。採取した溶液を凍結乾燥により濃縮し、さらに400マイクロリットルの脱イオン水を用いて再溶解した。マイクロBCAアッセイを用いて、放出されたIgGの量を定量した。
【００５２】
結果
コア‐シェルナノ粒子調製およびキャラクタリゼーション:NP8‐NP11は、狭い粒度分布(PDI値〜60.13〜60.22)を有する54〜69nmの範囲のZ‐平均粒度を示した(表3)。特に、本発明者らはポリマーに対するIgGの比の減少または流速の減少が粒径を増加させることを見出した。これは、IgG/DS:PEG-b-PLLAナノ粒子の結果と一致する。全てのナノ粒子は、-24から-30mVの範囲のゼータ電位を有する負の表面電荷を示した。NP8〜NP11のEEは69%~90%の範囲であり、これは流速の増加またはIgG対ポリマー比の低下に伴い増加した。
【表３】
2021519748.tif 000025
【００５３】
IgGのインビトロ放出:NP8からNP11のIgGのインビトロ放出プロフィールを、透析方法を用いてPBS(pH7.4)中で調べた。図5に示すように、4つのナノ粒子は全て、最初の2日間のバースト放出と、その後の27日間ほぼゼロ次の放出を伴う類似の二相放出プロフィールを示しました。さらに、4つのナノ粒子製剤はすべて、27日目までに40〜45%のIgGを放出するというほぼ同様の放出速度であった。これらのナノ粒子は、4日目から27日目の間の放出速度が同様の傾向で続いていることより、より長い放出期間を有することが推定される。
【００５４】
IgG/DS:PEG-b-PLLAとIgG/DS:PEG-b-PCLナノ粒子との間の比較:同じ条件下で調製したNP4、及びNP8の放出プロフィールを図6で比較した。(1)NP4は最初の2日目に20%のIgGが放出されたバースト放出があり、一方、NP8は最初の4日以内に15%のIgGしか放出しなかった。(2)NP8の放出プロフィールを外挿することより推定されるように、NP４よりも長い放出持続時間を持つであろう(図6)。これらの結果は、この系の放出プロファイルが異なる分解速度を有する異なるポリマーを選択することによって改変され得ることを示している。
【００５５】
（実施例４）
１段工程法によるリゾチーム/DS:mPEG-b-PCLナノ粒子の調製
方法
リゾチーム/DS:mPEG-b-PCLナノ粒子の調製、及びキャラクタリゼーション:リゾチームを0.5mg/mLの濃度で脱イオン水に溶解し、そのpHを0.1M NaOHを用いて8.0に調整した。1ミリリットルのリゾチーム(pH8.0、0.5mg/mL)を、等容量の種々の濃度のmPEG10K-b-PCL40K (1.5、2.5、5.0、7.5mg/mL、DMSOに溶解したもの)、デキストラン硫酸(0.5mg/mL、脱イオン水に溶解したもの)、及び脱イオン水(pH7.4)と、種々の流量比で4注入口マルチインレットボルテックスミキサー(MIVM)で混合した(表4)。前記ナノ粒子からDMSOを除去するために、透析膜(MWCO3.5kDa)を用い、4リットルの脱イオン水を6時間毎に交換しながら24時間透析した。
【００５６】
得られた溶液を15ミリリットル再生セルロースフィルター(Amicon（登録商標）Ultra、MWCO100kDa)を用いて4,500rpmで20分間限外ろ過濃縮した。フロースルー中の遊離リゾチームの量を、マイクロBCAアッセイによって測定した。Malvern Zetasizerを用いた動的光散乱(DLS)によりナノ粒子流体力学的径とゼータ電位を決定し、その形態を透過型電子顕微鏡(TEM)により解析した。カプセル化効率(EE%)を、実施例1の記載に従い測定した。
【００５７】
リゾチーム:mPEG-b-PCL、DS:mPEG-b-PCL、及びリゾチーム/DSのナノ粒子を含む対照ナノ粒子を調製するために、各成分液を調製し、上記のようにキャラクタリゼーションした。リゾチーム:mPEG-b-PCL、DS:mPEG-b-PCL、及びリゾチーム/DS PECのナノ粒子のそれぞれについて、欠けている成分(それぞれDS、リゾチーム、及びmPEG-b-PCL)を、対応する成分の溶媒単独で置換した。次いで、ナノ粒子を調製し、リゾチーム/DS:mPEG-b-PCLナノ粒子と同じ方法でキャラクタリゼーションした。
【００５８】
結果と考察
MIVMチャンバー内で乱流パターンを生み出すフラッシュミックス条件下で、リゾチームとDSが複合体を形成し、混合条件下で溶剤の極性変化による沈殿の結果、その後mPEG-b-PCLでコートされる。リゾチーム/DSナノ複合体はmPEG-b-PCL沈殿の核生成サイトとして働き、これにより、継続かつスケーラブルな様式でmPEG-b-PCLナノ粒子を迅速かつ均一に増加させることを確実にした。リゾチームとDSの重量比は、実施例1に記載したように最適化された。mPEG-b-PCL溶液、DS溶液、リゾチーム溶液、及び脱イオン水の流速度は、9:9:9:1に制御された。mPEG-b-PCL:リゾチームの重量比と溶液の流速を変えることにより、多分散指数(PDI)の比較的狭い分布で、平均半径70~120nmの大きさのナノ粒子を異なったバッチが生成できた。リゾチームのカプセル化は、表4で試験した全ての条件下でほぼ完璧(>97.2%)であった。概して、より速い流速は、より小さな粒子径のナノ粒子を形成する。
【表４】
2021519748.tif 000026
【００５９】
mPEG-b-PCLナノ粒子内のリゾチーム/DSナノ複合体のカプセル化を、最終ナノ粒子製剤から成分を差し引くことによって検討した(表5)。検討条件は、リゾチームのDSに対する重量比を一定(3:1)に保ち、mPEG-b-PCL溶液、DS溶液、リゾチーム溶液、及び脱イオン水の流速を1:1:1:1から1:1:1:2に調節してである。両方の流速条件下で、リゾチーム/DS:mPEG-b-PCLナノ粒子は、流体力学的径が最小であった。一成分を欠くそれぞれのナノ粒子製剤は、全成分混合ナノ粒子製剤よりも大きかった。mPEG-b-PCLコーティングを含まないリゾチーム/DS複合体は高い負のゼータ電位を有しmPEG-b-PCLコーティングを加えると減少し、粒子がよりコンパクトになり、このことは、複合体がポリマーマトリクス内に捕捉され、結果負の荷電を遮蔽することを示唆している。
【表５】
2021519748.tif 000027
【００６０】
（実施例５）
一段工程法によるオボアルブミン(OVA)/DS:mPEG‐b‐PCLナノ粒子の調製、及びキャラクタリゼーション
方法
OVA/DS:mPEG-b-PCLナノ粒子の調製、及びキャラクタリゼーション:オボアルブミン(OVA)を0.5mg/mLで脱イオン水に溶解し、その後、0.1M HCl液を加えてpHを2.0に調整した。1mLのOVA溶液を、等容量のDS溶液(0.5mg/mL)、種々の濃度mPEG10K-b-PCL40K (DMSO中濃度、1.5、2.5、5.0、7.5mg/mL)、及び脱イオン水(pH7.4)と混合した。これらのナノ粒子を実施例1に記載したようにキャラクタリゼーションした。
【００６１】
結果
実施例4に記載されたものと同様に、OVA/DS:mPEG-PCLナノ粒子は表5に列挙されるように、ポリマー対OVAの重量比、及び溶液の流速を変えて調整し、種々のフラッシュ混合条件下で調製された。これらのナノ粒子は-11.4〜-26.2mVの範囲のゼータ電位を有する強い負の表面電荷を示した。カプセル化効率は77.9%〜88.6%の範囲であり、ポリマー:OVAの重量比と流速のどちらとも、ほとんど相関しなかった。
【表６】
2021519748.tif 000028
【００６２】
（実施例６）
１段工程法によるIgG/DS:mPEG-b-PCLナノ粒子の調製、及びキャラクタリゼーション
方法
IgG/DS:mPEG-b-PCLナノ粒子の調製、及びキャラクタリゼーション:ヒトIgGを、0.5mg/mLの濃度で脱イオン水に溶解し、続いて、0.1M HCl液を加えることによってそのpHを4.0に調整した。次に、IgG/DS:mPEG-b-PCLナノ粒子を調製し、表７に列挙した条件下で、実施例4、及び5の方法に記載したものと同じ手順を用いてキャラクタリゼーションした。
【００６３】
TEMによるIgG/DS:mPEG-b-PCLナノ粒子内でのIgGの分布のキャラクタリゼーション:初めにIgGを、製造業者のプロトコールに従い、Mono-Sulfo-NHS-Nanogold(1.4nm Auナノ粒子、Nanoprobes)を用いて標識した。次に、Au標識IgGを、表６に記載されたNP21と同じ方法でカプセル化した。次に、これらのAu-IgG/DS:mPEG-b-PCLナノ粒子を、実施例1に記載した手順で酢酸ウラニル(2%w/v)陰性染色後、透過型電子顕微鏡(FEI Tecnai12)を用いて画像化した。
【００６４】
結果
ナノ粒子へのIgGカプセル化:調製したIgG/DS:mPEG-b-PCLナノ粒子(NP27〜NP36)は、実施例5に記載のOVAカプセル化法と類似の方法で、IgGに対するポリマーの重量比、及び流速の調整で、ナノ粒子の粒径を変化させることができることを実証した。全てのナノ粒子は、-13.4〜-23.6mVの範囲のゼータ電位を有する負の表面電荷を示した。IgGのカプセル化効率は91.3%から95.6%の範囲であったが、ポリマー:IgGの重量比と流速とは無関係であった。
【表７】
2021519748.tif 000029
【００６５】
IgG/DS:mPEG-PCLナノ粒子内のIgGの分布:IgG/DS-mPEG-b-PCL内のIgG-Au(1.4nm Auナノ粒子結合金)の分布をTEM(図9)によって測定した。重量比5:1(mPEG-b-PCL:IgG)を超えると、IgG-Auがナノ粒子マトリクス全体に分布していた。複数試料の画像解析の結果はIgG‐Auの比較的均一な分布がmPEG-b-PCL:IgGの重量比により影響されることを示唆した。複合体の重量比が高くなると、その充填密度が低くなることが示唆された。その逆もまた同様であった。
【００６６】
（実施例７）
１工程調製方法によって調製されたタンパク質/DS:mPEG-PCLナノ粒子からのOVA及びIgGのインビトロ放出のキャラクタリゼーション
方法
1mLの0.3〜0.5mg/mL OVA/DS:mPEG-b-PCL、又はIgG/DS:mPEG-b-PCLナノ粒子を1mLのFloat-a-Lyzer透析管(SpectrumLab, MWCO300kDa)に入れ、次に、この透析管を6mLのPBS(0.5w/v%NaN3を含む、pH7.4)を含むバイアル中に浸した。次に、この透析デバイス全体を、30mLの脱イオン水を満たした50mL遠心管に入れ、パラフィルム(R)を用いて密封して、蒸発を最小限にした。この遠心管を振盪インキュベーターで37℃、200rpmで振盪攪拌した。攪拌開始2時間後、6時間後、12時間後、24時間後、48時間後、その後1日1回、6mLのPBS溶液を交換採取した。収集した試料溶液を-80℃で凍結し、凍結乾燥した。凍結乾燥した試料を脱イオン水で再溶解して、3倍、及び6倍濃縮したタンパク質放出試料を得た。OVA、又はIgGの放出量は、マイクロBCA、又はNanoOrangeアッセイで定量した。
【００６７】
結果
インビトロ放出プロファイル
OVAのNP19からのインビトロ放出プロフィール: OVAのNP19からのインビトロ放出プロフィールを、PBS(pH7.4)溶液を用いた透析法で検討した。図10Aに示されるように、NP19は最初の2日間、2工程調製方法によって調製されたNPと同様の二相放出プロファイルを示し、続いて14日間にわたるゼロ次放出を示した。14日目までに、NP19は約38.8%の累積放出をし、36日目までに完全放出することが予想された。
【００６８】
IgGのNP27からのインビトロ放出プロフィール: IgGのNP27からPBS(pH7.4)溶液へのインビトロ放出プロフィールを、同様の方法で分析した。図10Bに示されるように、NP27は最初の2日間に軽度のバースト放出し、その後、次の12日間にわたってゼロ次放出を伴う類似の放出プロフィールを示した。14日目までに、NP27は26.0%のIgGの累積放出をし、54日目までに完全放出が予想された。興味深いことに、この放出プロフィールは、類似の配合(NP19)からのOVAよりも穏やかで遅かった。これらのデータは全般的な徐放性動態は種々のタンパク質について同様であったが、タンパク質治療薬の大きさがナノ粒子からの放出速度に影響を及ぼし得ることを示している。
【００６９】
以下の工程(a)、及び(b)を同時に行うことにより、ナノ粒子を製造する単一工程法が発明されるという驚くべき結果が得られた。第１工程は、(a)１番目の連続混合工程を用いて、タンパク質と対イオン・ポリマーとを混合し高分子電解質複合体を形成する工程である。第２の工程は、(b)2番目の連続混合方法を用いて生分解性ポリマーと共沈させることである。第３番目の工程は、(c)生分解性ポリマーマトリクス全体に分布したタンパク質高分子電解質複合体を含むナノ粒子を形成することである。
【００７０】
本発明は、ナノ粒子全体にわたってタンパク質PECを均一に分布し、高い負荷能力を有し、タンパク質治療薬を持続的に放出する生分解性ナノ粒子を調製するための、連続でスケーラブル方法を含んでいる。タンパク質放出を調節し、効果的な保護およびカプセル化をもたらすために、タンパク質治療薬は、FNCと呼ばれる連続処理を通し、反対荷電を持つ高分子電解質とPECナノ粒子に複合体化される。次に、得られたPECナノ粒子を、乾燥させずにPEG-b-PLLA、又はPEG-b-PCLポリマーと共沈させ、CIJミキサー、又はMIVMを用いたFNP法によりミセルナノ粒子が形成すれる。タンパク質負荷ナノ粒子は、注入溶液のタンパク質対ポリマーの重量比、及び/又は流速を変えることによって、負の表面荷電、粒度分布、及び粒子径が調整可能である。最も重要なことは、これらのナノ粒子は、タンパク質の持続的かつ長期の放出を可能にすることである。これらのナノ粒子の放出速度は、ポリマーに対するタンパク質の重量比を操作することによって、または種々の２ブロック・コポリマーを選択することによって、調整することが可能である。ナノ粒子製造方法の再現性、並びに拡張可能性、並びにこれらのナノ粒子によって達成される持続的長期放出を考慮すると、このプラットホームは、多くの抗体薬を含む種々のタンパク質治療薬のナノ粒子を調製する大きな可能性がある。
【００７１】
本開示の特定の実施例として、被験者に、タンパク質、ペプチド、抗体、化学物質、核酸、又はそれらの組合せなどの医薬品を含む本発明のナノ粒子を投与することがある。ナノ粒子は、固形、液状、又はエアロゾルの形状で被験者に投与することがある。本ナノ粒子は、静脈内、皮内、経皮、クモ膜下腔内、動脈内、腹腔内、鼻腔内、膣内、直腸内、局所的、筋肉内、皮下、粘膜、経口、局所的、吸入(例えば、エアロゾル吸入)、注射、注入、連続注入、カテーテルを介して、洗浄器を介して、標的細胞を直接的に局所潅流浴、クリーム中、脂質組成物(例えば、リポソーム)中、又は他の方法、又は当業者に周知の他の任意の組合せで、投与可能である。(例えば、本明細書に参考文献として取上げられているRemington's PharmaceuticalSciences,18th Ed. Mack Printing Company、1990を参照されたい)。
【００７２】
さらに、本開示によれば、投与に適した本発明のナノ粒子は、不活性希釈剤の有無にかかわらず、薬学的に許容される担体で提供される。担体は吸収可能で、液体、半固体、すなわちペースト、又は固体を含む。溶媒、薬剤、希釈剤、又は担体が、レシピエント、又はナノ粒子に含まれる組成物の治療有効性に有害である場合を除き、本方法を実施する際に使用する投与可能な組成物として使用することは適切である。担体、又は希釈剤の例として、脂肪、油、水、生理食塩水溶液、脂質、リポソーム、樹脂、結合剤、充填剤など、、又はそれらの組み合わせが含まれる。組成物は、また1つ以上の成分の酸化を遅らせるために、種々の酸化防止剤を含むことがある。さらに、微生物の増殖の予防として、種々の抗菌薬、及び抗真菌剤などの防腐薬が使えるだろう。抗菌剤、抗真菌剤として、パラベン(例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン)、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、またはこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されるものではない。
【００７３】
本発明によると、ナノ粒子は、任意の便利で実用的な方法、すなわち、溶液、懸濁液、乳化、混和、カプセル化、吸収などによって、前記担体と組み合わせてもよい。そのような手順は、当該技術に熟練した者にとって日常的なものである。
【００７４】
本発明の特定の実施例では、本発明のナノ粒子は、半固体、又は固体の担体と十分に結合、又は混合されることがある。混合は、粉砕のような任意の便利な方法で行うことができる。安定化剤も、組成物の治療活性の喪失、例えば、胃における変性、から保護するために、混合工程において添加することができる。当該組成物に用いる安定剤としては、バッファー、グリシン、リジン等のアミノ酸、デキストロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、ショ糖、マルトース、ソルビトール、マンニトール等の炭水化物が挙げられる。
【００７５】
更なる実施例に、本発明は、本発明のナノ粒子と１種以上の脂質と水性溶媒とを含む医薬用脂質担体組成物の使用に関するものであってもよい。本明細書中で使用される場合、用語「脂質」とは、その特徴として、水に不溶であり、有機溶媒で抽出可能である広範囲の物質のいずれかを含むと定義される。この広範のクラスの化合物は当業者に周知である。用語「脂質」は、本明細書中で使用される場合、任意の特定の構造に限定されない。
【００７６】
例としては、長鎖脂肪族炭化水素、及びそれらの誘導体を含有する化合物が挙げられる。脂質は天然に存在するか、又は合成物(すなわち、ヒトによって設計、又は産生される物)であり得る。しかしながら、脂質は、通常、生物学的物質である。生物学的脂質は当該技術分野でよく知られている。例えば、中性脂肪、リン脂質、ホスホグリセリド、ステロイド、テルペン、溶解脂質、スフィンゴ糖脂質、糖脂質、スルファチド、エーテル結合脂肪酸、並びにエステル結合脂肪酸を有する脂質、並びに重合性脂質、並びにそれらの組合せが含まれる。もちろん、本明細書中に特に記載される化合物以外の化合物も、脂質として当業者が理解している化合物は、本発明の組成物および方法に包含される。
【００７７】
当業者は、脂質担体中に1つ以上のナノ粒子を分散させるために用いることができる一連の技術に精通している。例えば、1つ以上のナノ粒子は、当業者に公知の任意の手段によって、脂質を含む液中に分散され、脂質で溶解され、脂質で乳化され、脂質と混合され、脂質と結合され、脂質に共有結合され、脂質中の懸濁液として含まれ、ミセル、又はリポソームに含まれ、又は複合体化され、そうでなければ、当技術分野の通常の熟練者に知られている任意の手段によって脂質、又は脂質構造と会合している。分散液はリポソームを形成することも、形成しないこともある。
【００７８】
動物の患者に投与される本ナノ粒子の実際の投与量は、体重、症状の重症度、治療される疾患の種類、以前の、又は同時に実施される介入治療、患者の特発性および投与経路などの身体的および生理的要因によって決定することができる。用量、及び投与経路に応じて、適切な用量、及び/又は有効量の投与回数は、被験者の反応に従って変化し得る。投与の責任を負う医師は、いずれにおいても、組成物中の活性成分の濃度および個々の被験者のために適切な用量を決定する。
【００７９】
ある実施例では、本発明のナノ粒子を含む医薬組成物は、例えば、少なくとも約0.1%の活性化合物を含むことがある。他の実施例では、活性化合物を例えば単位重量の約2%から約75%、または約25%から約60%、及びこれらの範囲内の中の任意の範囲で含むことがある。当然のことながら、各治療上有用な組成物中の活性化合物（複数可）の量は、適切な投与量が化合物の任意の所定の単位用量で得られるような方法で調製することができる。
【００８０】
溶解性、バイオアベイラビリティー、生物学的半減期、投与経路、製品の保存期間、及び他の薬学的考慮事項のような要因は、そのような医薬製剤を調製する技術に熟練した者によって考慮される。それ故に、様々な投与量、及び治療レジメンが望まれる。他の非限定的な例において、用量はまた、約1マイクログラム/ kg/体重、約5マイクログラム/ kg/体重、約10マイクログラム/ kg/体重、約50マイクログラム/ kg/体重、約100マイクログラム/ kg/体重、約200マイクログラム/ kg/体重、約350マイクログラム/ kg/体重、約500マイクログラム/ kg/体重、約1ミリグラム/ kg/体重、約5ミリグラム/ kg/体重、約10ミリグラム/ kg/体重、約50ミリグラム/ kg/体重、約100ミリグラム kg/体重、約200ミリグラム/ kg/体重、約350ミリグラム/ kg/体重、約500ミリグラム/ kg/体重、約1000mg/ kg/体重、又はそれ以上の投与量、およびそこから誘導可能な任意の範囲を含んでもよい。本明細書に列挙される数字からの推定可能な範囲の非限定的な例において、約5mg/kg/体重、約100mg/kg/体重、約5マイクログラム/kg/体重、約500ミリグラム/kg/体重などの範囲を、上記の数字に基づいて投与することができる。
【００８１】
消化器用組成と製剤
本開示の一つの実施例として、本発明のナノ粒子は、消化器経路を介して投与されるように製剤化される。消化器経路は、組成物が消化器と直接接触している全ての可能な投与経路が含む。具体的には、本明細書に開示される医薬組成物が経口、口腔内、直腸内、又は舌下に投与されてもよい。このように、これらの組成物は不活性希釈剤、又は吸収可能な食用担体と共に処方され得るか、又は、それらはハードシェル又はソフトシェルゼラチンカプセルに負荷され得るか、又はそれらは錠剤中に圧縮され得るか、又はそれらは食餌の食物と直接的に組み込まれ得る。
【００８２】
ある実施例では、活性化合物を含むナノ粒子を賦形剤と混合し、摂取可能な錠剤、口腔錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウェハなどの形態で使用することができる(Mathiowitzら、1997;Hwangら、1998;米国特許第5,641,515号;第5,580,579号、及び第5,792451号、それぞれの明細書の全体が参照としてここに引用される)。
【００８３】
錠剤、トローチ、丸剤、カプセルなどは、以下のものも含み得る: 結合剤、例えば、トラガントゴム、アラビアゴム、コーンスターチ、ゼラチン、またはそれらの組み合わせなど; 賦形剤、例えば、リン酸二カルシウム、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、又はそれらの組み合わせなど; 崩壊剤、例えば、コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸、又はそれらの組み合わせなど; 潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムなど; 甘味剤、例えば、スクロース、ラクトース、サッカリン、又はそれらの組み合わせなど; フレーバー剤、例えば、ペパーミント、ウィンターグリーンの油、チェリーフレーバー、オレンジフレーバーなど。投薬ユニット形態がカプセルである場合、それは、上記の種類の物質に加えて、液状担体を含み得る。種々の他の物質が、コーティング、又はそうでなければ投薬単位の物理的な形態を改変するために添加し得る。
【００８４】
例えば、錠剤、丸剤、又はカプセル剤はシェラック、糖、又は両方でコーティングすることができる。投与剤形がカプセル剤である場合、それは、上記の種類の物質に加えて、液状担体などの担体を含有する可能性がある。ゼラチンカプセル、錠剤、又は丸剤は、腸溶コーティングされてもよい。腸内コーティングは、pHが酸性である胃、又は上腸における配合物の変性を防止する。米国特許番号5,629,001を参照する。
【００８５】
小腸に到達すると、小腸中の塩基性pHはコーティングを溶解し組成物が放出され、機能分化細胞、例えば、上皮腸細胞、及びパイエル板M細胞によって吸収されることを可能にする。エリキシル剤のシロップは、活性化合物ショ糖を甘味剤とし、メチル、及びプロピルパラベンを防腐剤とし、染料、及び香料、例えば、チェリー、又はオレンジ香料、を含有し得る。もちろん、任意の投薬単位形態を調製する際に使用される任意の物質は薬学的に純粋であり、使用される量において実質的に無毒であるべきでる。さらに、活性化合物は、徐放性調製物、及び製剤に組み込まれ得る。
【００８６】
経口投与のために、本発明のナノ粒子を含む別な組成物は口腔洗浄剤、歯磨き剤、口腔タブレット、経口噴霧剤、又は舌下経口投与製剤の剤型で、1つ以上の賦形剤と共に組み込まれてもよい。例えば、ホウ酸ナトリウム溶液(Dobell's Solution)のような適当な溶媒中に必要量の活性成分を組み込んだ洗口剤を調製することができる。若しくは、活性成分がホウ酸ナトリウム、グリセリン、及び重炭酸カリウムを含有する経口溶液に組み込むか、歯磨剤中に分散させるか、若しくは水、結合剤、研磨剤、着香剤、発泡剤、および湿潤剤を含み得る組成物に治療有効量で添加することができる。若しくは、組成物が舌の下に置かれ得るか、さもなければ口の中で溶解され得る錠剤、又は溶液形態に形成され得る。
【００８７】
他の消化器投与様式に適した別な製剤には、座薬が含まれる。坐剤は、直腸への挿入のための種々の重量および形状の固体投薬形態であり通常に薬用される。挿入後、坐剤は、腔の液において柔らかくなり、融解、または溶解する。一般的に、坐剤は、伝統的な担体、例えば、ポリアルキレングリコール、トリグリセリド、又はそれらの組み合わせを含み得る。ある実施例として、坐剤は例えば、約0.5%~約10%、好ましくは約1%~約2%の活性成分を含む混合物から形成することができる。
【００８８】
非経口組成物および製剤
更なる実施形態に、本発明のナノ粒子物は、非経口経路を介して投与され得る。本明細書中で使用される場合、用語「非経口」は、消化管をバイパスする経路を含む。具体的には本明細書中に開示される医薬組成物が例えば、静脈内、皮内、筋肉内、動脈内、髄腔内、皮下、又は腹腔内に投与され得るが、これらに限定されない。米国特許番号6,7537,514, 6,613,308, 5,466,468, 5,543,158, 5,641,515, および5,399,363を参照(それぞれ、その全体が本明細書の参照として組込まれる)。
【００８９】
本ナノ粒子の溶液は、遊離塩基、又は薬理学的に許容可能な塩として活性化合物を含み、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合され、水中で調製され得る。分散液は、また、グリセロール、液状ポリエチレングリコール、並びにその混合物中で、並びに油中で、調製することも可能である。通常の条件下の保存、及び使用で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐために保存料を含む。注射可能な使用に適した医薬形態は、滅菌水溶液、又は分散液、及び滅菌注射可能溶液、又は分散液の即時調製のための滅菌粉末を含む(米国特許第5,466,468号、その全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる)。全ての場合において、前記形態は、無菌でなければならず、そして容易に注射可能な程度に流体でなければならない。前記形態は、製造、及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、バクテリア、及び真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は例えば、水、エタノール、ポリオール(すなわち、グリセリン、プロピレングリコール、及び液状ポリエチレングリコールなど)、それらの好適な混合物、及び/又は植物油を含む溶剤、又は分散媒体である。適切な流動性は例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、及び界面活性剤の使用により、分散液の際に必要とされる粒径が維持され得る。微生物の作用の予防は種々の抗菌薬、及び抗真菌薬、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張化剤、例えば糖、又は塩化ナトリウムを含むのが好ましい。注射用混合液の吸収は注射用混合液中に、例えばステアリン酸アルミニウムやゼラチンのような吸収遅延剤を使用することにより延長可能である。
【００９０】
水溶液での非経口投与に関しては、例えば、溶液は必要であれば適当に緩衝化し、十分な生理食塩水、又はグルコースでまず等張に希釈する。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内投与に特に適している。これに関連して、使用することができる無菌水性媒体は、本開示に関係する当業者に知られている。例えば、1投薬量は等張NaCl溶液に溶解され得、次に注射液として皮下、又は指示された部位に注射され得る(例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」第15版、1035〜1038頁、及び1570~1580頁を参照のこと)。処置される被検者の状態に依存して、ある程度の用量の変形例が必然的に生じ得る。どのような場合でも、投与責任者が個々の被検者に適した用量を決定する。さらに、ヒトへの投与するためには、製剤は米国食品医薬品局生物学標準局が要求する無菌性、発熱性、一般的な安全性および純度の基準を満たさなければならない。
【００９１】
滅菌注射溶液は必要な量の活性化合物を前記例示の種々の他の成分と共に適当な溶媒に配合し、必要であれば、続いてろ過滅菌することによって調製される。一般に、分散液は、種々の滅菌された活性成分を、塩基性分散媒、及び上記に列挙されたものからの必要とされる他の成分を含有する滅菌媒体中に組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術である。前記技術で活性成分の粉末とその以前に滅菌ろ過された溶液から任意の追加所望の成分を生じる。粉末化された配合物は、安定化剤の有無にかかわらず、例えば水または生理食塩水のような液状担体と混合される。
【００９２】
その他の医薬組成物、及び製剤
本発明の他の好ましい実施例では、活性化合物、又は薬剤を含む前記ナノ粒子物が種々の経路、例えば、局所(すなわち、経皮)投与、粘膜投与(鼻腔内、膣内など)、及び/又は吸入を介する投与のために処方され得る。局所投与のための医薬組成物は、軟膏、ペースト、クリーム、又は粉末などの薬用用途のために製剤化された活性化合物を含む前記ナノ粒子を含み得る。軟膏は局所適用のための全ての油性、吸着性、乳化、及び水溶性ベースの組成物を含むが、クリーム、及びローションは乳化ベースのみを含む組成物である。局所的に投与される薬物は、皮膚を通る活性成分の吸着を容易にするための浸透促進剤を含み得る。適切な浸透促進剤には、グリセリン、アルコール、アルキルメチルスルホキシド、ピロリドン、及びルアロカプラムが含まれる。局所投与のための組成物の可能なベースとして、ポリエチレングリコール、ラノリン、コールドクリーム、並びにワセリン、並びに任意の他の適切な吸収剤、エマルジョン又は水溶性軟膏ベースが挙げられる。局所製剤はまた、活性成分を保存し、均質な配合物を提供するために、乳化剤、ゲル化剤、及び保存剤としての抗菌剤を含んでもよい。本発明の経皮投与は、また、「パッチ」の使用を含み得る。例えば、パッチは、1つ以上の有効成分を、所定の速度で、そして決められた期間にわたって連続的な様式で供給し得る。
【００９３】
ある特定の実施例では、本ナノ粒子を含む医薬組成物は、点眼剤、鼻腔内スプレー、吸入、及び/又は他のエアロゾルデリバリー媒体によって送達され得る。経鼻エアロゾルスプレーを介して組成物を肺に直接的に送達するための方法は例えば、米国特許番号5,756,353、及び5,804,212に記載されている。 (それぞれ、その全体が参照として本明細書に具体的に組込まれる)。同様に、鼻腔内微粒子樹脂(Takenaga et al., 1998)やリソホスファチジル・グリセロール化合物(米国特許第5,725,871号、全体が参照としてで具体的に本明細書に組込まれる)を用いた医薬品のデリバリーも、製薬業界において広く知られている。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持体マトリックスの形態の経粘膜薬物デリバリーは、米国特許番号5,780,045に記載されている。 (その全体が参照により本明細書に特に組込まれる)。
【００９４】
「エアロゾル」という語は、液化、又は加圧気体推進剤中に分散された液状粒子の微細に分割された固形物のコロイド系を指す。吸入のための本発明の典型的なエアロゾルは、液体推進剤中の活性成分の懸濁液、又は液体推進剤と適当な溶媒との混合物からなる。
【００９５】
好適な推進剤としては、炭化水素、及び炭化水素エーテルが挙げられる。好適な容器は、推進剤の圧力要件に応じて変化する。エアロゾルの投与は、対象の年齢、重量、ならびに症状の重症度、及び反応によって変化する。
【００９６】
開示のキット
本明細書中に記載される組成物のいずれも、キットに含まれ得る。非限定的な例では本発明のナノ粒子(例えば、薬剤、又は活性成分を含む)はキットに含まれてもよい。キットは適切に分注されたナノ粒子、及びいくつかの場合には1つ以上のさらなる薬剤を含み得る。キットの成分は、水性媒体、又は凍結乾燥形態のいずれかで包装することができる。キットの容器体は一般に、少なくとも1つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、シリンジ又はその他の容器体を含み、その中に、成分を入れることができ、好ましくは、適切に等分することができる。キット中に2つ以上の成分が存在する場合、キットは、また一般に、第2、第3、又は他の追加の容器を含み、その中に追加の成分が別々に配置され得る。しかし、成分の種々組み合わせを1つのバイアル中に含めてもよい。本発明のキットはまた、典型的には、本発明の1つ以上のナノ粒子、及び任意の他の試薬容器を、商用販売するために密閉して収容するための手段を含む。そのような容器として、所望のバイアルを保管する射出成形またはブロー成形したプラスチック容器を含む。
【００９７】
キットの成分が1つ以上の液体溶液で提供される場合、液体溶液は水溶液であり、滅菌水溶液が特に好ましい。本発明の1つ以上のナノ粒子は、注射可能な組成物に製剤化されてもよい。この場合では容器それ自体が、シリンジ、ピペット、及び/又は他の類似の装置であってもよい。これらの容器から、処方物は体内の感染部位に適用されたり、動物中に注射されたり、及び/又はキットの他の成分に添加されたり、及び/又は混合されてもよい。しかしながら、キットの成分は、乾燥粉末として提供されてもよい。試薬、及び/又は成分が乾燥粉末として提供される場合には、粉末を適した溶媒の添加によって再構成することができる。溶媒が別の容器で提供されることが想定されている。
【００９８】
参考文献
1．Pagels, R.F.; Prud'homme, R. K. Journal of Controlled Release.2015,219:519-535.
2．Patel, A.; Gaudana, R.; Mitra, A. K. Journal of Microencapsulation. 2014, 31: 542-550.
【００９９】
本明細書で引用された出版物、特許出願、特許を含むすべての参照は、それぞれの参考文献が個別に参照により組み込まれることが明示されており、その全体が本明細書に記載されているかのように、同じ範囲で参照により組み込まれる。
【０１００】
用語「その」並びに「この」並びに「前記」並びに本発明を説明する文脈(特に、以下の特許請求の範囲の文脈)における同様の指示対象の使用は本明細書中で別段の指示がない限り、又は文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数形、及び複数形の両方を包含すると解釈されるべきである。用語「備える」、「有する」、「含む」、および「なる」は別段の指示がない限り、限定されない用語(すなわち、「含むが限定されない」を意味する)として解釈されるべきである。本明細書中の値域の記載は本明細書中で特に指示がない限り、単に、範囲内に入る各別個の値を個々に言及する簡潔な方法として役立つことを意図し、各別個の値はあたかもそれが本明細書中に個々に記載されたかのように、本明細書中に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施することができる本明細書中で使用するあらゆる例、又は例示的な言い回し(例えば「など」)は特に主張しない限り、単に本発明をよりよく説明することだけを意図し、本発明の範囲に対する制限を設けるものではない。明細書中の如何なる言い回しも、本発明の実施に不可欠で請求項に記載されていない要素を示すものとは解釈されないものとする。
【０１０１】
本発明の好ましい実施例を、発明者らが知っている本発明を実施するための最良の形態を含めて本明細書で記載している。これらの好ましい実施態様の変形は、上述の記載を読めば当業者には明らかとなり得る。本発明者は熟練者が適宜このような変形を適用することを期待しており、本明細書中で具体的に説明される以外の方法で発明が実施されることを予定している。従って本発明は準拠法で許されているように、本明細書に添付された請求項に記載の内容の修正および均等物をすべて含む。更に、上述の要素のあらゆる可能な変形でのあらゆる組み合わせが、本明細書に別段の指示がない限り、または明らかに文脈に矛盾しない限り、本発明に包含される。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含むナノ粒子：
医薬品及び対イオン・ポリマーを含む複合体、ここで、前記対イオン・ポリマーは、前記対イオン・ポリマーが前記医薬品に静電的に結合することを可能にする電荷を有する；並びに、
生分解性ポリマー全体に分布する前記複合体を含むマトリックス。
【請求項２】
請求項１に記載のナノ粒子、ここで、前記対イオン・ポリマーが正に荷電している。
【請求項３】
請求項１に記載のナノ粒子、ここで、前記対イオン・ポリマーが負に荷電している。
【請求項４】
請求項１に記載のナノ粒子、ここで、前記医薬品が正に荷電している。
【請求項５】
請求項１に記載のナノ粒子、ここで、前記医薬品が負に荷電している。
【請求項６】
請求項１に記載のナノ粒子、ここで、前記医薬品が、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、抗体、又はそれらの組み合わせ、を含む群より選択される。
【請求項７】
請求項３に記載のナノ粒子、ここで、前記対イオン・ポリマーが、デキストラン硫酸(DS)、ヘパリン(ヘパリン硫酸)、ヒアルロン酸、又はそれらの組み合わせ、を含む群より選択される。
【請求項８】
請求項１に記載のナノ粒子、ここで、前記生分解性ポリマーが、PLLA、PGA、PLGA、PCL、それらのPEG化したブロック・コポリマー、又はそれらの組み合わせ、を含む群より選択されるコポリマーである。
【請求項９】
請求項１に記載のナノ粒子、ここで、前記生分解性ポリマーが、PEG-b-PLL；PEG-b-PCL；又はそれらの組み合わせである。
【請求項１０】
以下を含むナノ粒子の製造方法：
（a）第1の連続混合処理を使用して、医薬品と対イオン・ポリマーとを混合することにより、高分子電解質複合体を形成させること；
（b）第2の連続混合処理を使用して、生分解性ポリマーと共沈させること；及び、
（c）前記生分解性ポリマーのマトリクス全体に分布する高分子電解質複合体を含むナノ粒子を形成させること。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法、ここで、工程(a)及び工程(b)を同時に実施する。
【請求項１２】
請求項１０に記載の方法、ここで、第1の連続処理がフラッシュ・ナノ複合体形成(FNC)である。
【請求項１３】
請求項１０に記載の方法、ここで、前記高分子電解質複合体(PEC)を形成させることが、前記医薬品と前記対イオン・ポリマーとの間の静電引力による。
【請求項１４】
請求項１０に記載の方法、ここで、前記高分子電解質複合体(PEC)と前記生分解性ポリマーとを混合することが、溶媒誘導フラッシュ・ナノ沈殿(FNP)による。
【請求項１５】
請求項１０に記載の方法、ここで、前記ナノ粒子を形成させることが、前記生分解性ポリマーを前記高分子電解質複合体（PEC）と一緒に沈殿させることによって起こる。
【請求項１６】
以下を含む薬物デリバリーの方法：
医薬品及び対イオン・ポリマーを含む複合体（ここで、前記対イオン・ポリマーは、前記対イオン・ポリマーが前記医薬品に静電的に結合することを可能にする電荷を有する）；並びに、生分解性ポリマー全体に分布する前記複合体を含むマトリックス、を含むナノ粒子を、疾患を予防する、又は治療するために、前記医薬品を必要とする対象に投与すること；並びに、
前記ナノ粒子を投与していない対照の対象との比較で、前記疾患を治療すること又は予防すること。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法、ここで、前記医薬品が、タンパク質、ペプチド、抗体、化学物質、核酸、及びそれらの組み合わせ、からなる群より選択される。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】全図
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１】
2021519748.tif 000030
【図２】
2021519748.tif 000031
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
2021519748.tif 000037
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
2021519748.tif 000039
【図９Ａ】
2021519748.tif 000040
【図９Ｂ】
2021519748.tif 000041
【図１０Ａ】
2021519748.tif 000042
【図１０Ｂ】
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【国際調査報告】
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2021519748.tif 000045