(57)【要約】本開示は、例えば、複数のｍｉＲＮＡの発現のためのｍｉＲＮＡ発現構築物、及び標的遺伝子発現をノックダウンするためのその使用に関する。いくつかの態様において、発現構築物は、プロモーター要素と、スペーサー配列と、ｍｉＲＮＡコード配列と、を含む。いくつかの態様において、構築物は、増強された免疫細胞機能を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーター要素と、少なくとも５０ヌクレオチドの長さのスペーサーと、ｍｉＲＮＡヘアピンと、を含む、ｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項２】
前記スペーサーが、５０〜１，０００ヌクレオチドの長さである、請求項１に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項３】
前記スペーサーが、５０〜９００、５０〜８００、１００〜８００、または５０〜８００ヌクレオチドの長さである、請求項１に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項４】
前記スペーサーが、少なくとも６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、または２００ヌクレオチドの長さである、請求項１に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項５】
前記スペーサーが、前記プロモーター要素に対して異種である、請求項１に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項６】
前記スペーサーが、コードされたオープンリーディングフレームを含む、請求項１に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項７】
前記スペーサーが、少なくとも３７５ヌクレオチドの長さである、請求項１に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項８】
前記プロモーターが、真核生物プロモーターである、請求項１に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項９】
前記真核生物プロモーターが、Ｐｏｌ  ＩＩまたはＰｏｌ  ＩＩＩプロモーターである、請求項８に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項１０】
前記真核生物プロモーターが、Ｐｏｌ  ＩＩプロモーターである、請求項９に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項１１】
前記プロモーターが、誘導性、組織特異的、または細胞系統特異的プロモーターである、請求項１に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項１２】
前記プロモーター要素が、表１のプロモーター要素から選択される、請求項１〜１１のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項１３】
前記プロモーター要素が、前記ＥＦ１αプロモーターと少なくとも８０％同一である、請求項１２に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項１４】
前記ＥＦ１αプロモーターが、前記ＥＦ１αプロモーターのスプライスバリアントである、請求項１３に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項１５】
前記ＥＦ１αプロモーターの前記スプライスバリアントが、ＥＦ１ｓである、請求項１４に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項１６】
前記ＥＦ１ｓプロモーターが、配列番号４５と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一である配列を有する、請求項１５に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項１７】
前記スペーサーが、表９のスペーサーから選択される、請求項１〜１６のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項１８】
前記スペーサーが、配列番号４６と少なくとも８０％同一である、請求項１７に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項１９】
前記スペーサーの配列が、配列番号４６である、請求項１８に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項２０】
前記スペーサーが、配列番号４７と少なくとも８０％同一である、請求項１７に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項２１】
前記スペーサーの配列が、配列番号４７である、請求項２０に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項２２】
前記スペーサーが、配列番号４８と少なくとも８０％同一である、請求項１７に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項２３】
前記スペーサーの配列が、配列番号４８である、請求項２２に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項２４】
前記スペーサーが、配列番号４９と少なくとも８０％同一である、請求項１７に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項２５】
前記スペーサーの配列が、配列番号４９である、請求項２４に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項２６】
前記ｍｉＲＮＡヘアピンが、５’から３’へ、かつ（ａ）〜（ｇ）の順序で：
（ａ）配列番号２５の配列を含むｍｉｒ−１６フランキング配列、
（ｂ）配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、または配列番号３０のｍｉｒ−１６配列を含む第１の下側ステム配列、
（ｃ）２２ヌクレオチドの長さのアンチセンス標的配列、
（ｄ）配列番号３１の配列を含むｍｉｒ−３０ループ配列、
（ｅ）前記（ｃ）の配列に対して１つまたは２つのミスマッチを含むことを除き、前記（ｃ）の配列と相補的であるセンス配列であって、前記１つまたは２つのミスマッチが、
ｉ）前記センス配列の８〜１４位に位置するミスマッチ、または
ｉｉ）前記センス配列の終端の３’位（２２位）におけるミスマッチを含む、前記センス配列、
（ｆ）前記（ｂ）の配列と相補的である、第２の下側ステム配列、及び
（ｇ）第２のフランキング配列、を含む、請求項１〜２５のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項２７】
前記ｍｉＲＮＡヘアピンの前記センス配列（ｅ）が、前記センス配列（ｅ）のヌクレオチド１１位に位置する配列（ｃ）に対して１つのミスマッチを含む、請求項２６に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項２８】
前記ｍｉＲＮＡヘアピンの前記センス配列（ｅ）が、（ｉ）前記センス配列（ｅ）の１１位、及び（ｉｉ）前記センス配列（ｅ）の末端の３’ヌクレオチド（２２位）に位置する配列（ｃ）に対して２つのミスマッチを含む、請求項２６に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項２９】
フランキング配列（ｇ）が、前記ｍｉｒ−１６フランキング配列（ａ）と相補的ではない、請求項２６〜２８のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項３０】
前記ｍｉＲＮＡヘアピン配列が、表６に記載されている配列から選択される、請求項１〜２９のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項３１】
前記核酸分子が、ＲＮＡである、請求項１〜３０のいずれか１項に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項３２】
前記核酸分子が、ＤＮＡである、請求項１〜３０のいずれか１項に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項３３】
前記核酸分子が、前記ｍｉＲＮＡヘアピンのうちの少なくとも２つの反復を含む、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項３４】
前記少なくとも２つの反復が、介在配列によって分離されている、請求項３３に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項３５】
前記アンチセンス標的配列が、ＣＣＲ５  ｍＲＮＡ配列と相補的である、請求項２６〜３４のいずれか１項に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項３６】
請求項１〜３５のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物を含む、発現ベクター。
【請求項３７】
請求項１に記載の核酸配列の２つ以上のコピーを含む、請求項３６に記載の発現ベクター。
【請求項３８】
請求項１に記載の核酸配列の２つ以上のコピーが、ポリシストロニック転写産物をコードする配列を形成する、請求項３７に記載の発現ベクター。
【請求項３９】
前記発現ベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである、請求項３６に記載の発現ベクター。
【請求項４０】
少なくとも１つの薬剤耐性マーカーをさらに含む、請求項３６に記載の発現ベクター。
【請求項４１】
請求項１〜３５のいずれか１項に記載の核酸分子または請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項４２】
前記宿主細胞が、免疫エフェクター細胞である、請求項４１に記載の宿主細胞。
【請求項４３】
前記宿主細胞が、Ｔ細胞またはＣＡＲ  Ｔ細胞である、請求項４１に記載の宿主細胞。
【請求項４４】
細胞内の遺伝子の発現を低減するための方法であって、前記細胞において請求項２６〜３５のいずれか１項に記載の核酸分子を発現させることを含み、前記アンチセンス標的配列（ｃ）が、前記遺伝子のセンス鎖と相補的である、前記方法。
【請求項４５】
前記細胞における前記核酸分子の発現が、核酸を用いて、前記細胞をトランスフェクトすることを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞における前記核酸分子の発現が、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって前記細胞のゲノムに前記核酸分子を挿入することを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞における前記核酸分子の発現が、前記核酸分子を発現ベクターから発現することを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記発現ベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記遺伝子が、ＣＣＲ５である、請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞が、ヒト細胞である、請求項４４に記載の方法。
【請求項５１】
インビボ法としてさらに規定される、請求項４４に記載の方法。
【請求項５２】
インビトロまたはエクスビボ法としてさらに規定される、請求項４４に記載の方法。
【請求項５３】
前記核酸分子を発現する細胞を、生物に移植することをさらに含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記細胞が、生物に含まれる、請求項４４に記載の方法。
【請求項５５】
組換え核酸分子であって、プロモーター要素と、少なくとも５０ヌクレオチドの長さのスペーサーと、少なくとも１つのｍｉＲＮＡヘアピンと、を含み、前記ｍｉＲＮＡヘアピンが、５’から３’へ、かつ（ａ）〜（ｇ）の順序で：
（ａ）ｍｉｒ−１６フランキング配列、
（ｂ）ｍｉｒ−１６配列を含む第１の下側ステム配列、
（ｃ）２２ヌクレオチドの長さのアンチセンス標的配列、
（ｄ）ｍｉｒ−３０ループ配列、
（ｅ）前記（ｃ）の配列に対して１つまたは２つのミスマッチを含むことを除き、前記（ｃ）の配列と相補的である、センス配列であって、前記１つまたは２つのミスマッチが、
ｉ）前記センス配列の８〜１４位に位置するミスマッチ、または
ｉｉ）前記センス配列の終端の３’位（２２位）におけるミスマッチを含む、前記センス配列、
（ｆ）前記（ｂ）の配列と相補的である、第２の下側ステム配列であって、前記下側ステムが、少なくとも１１ヌクレオチドの長さである、前記第２の下側ステム配列、及び
（ｇ）第２のフランキング配列、を含む、前記組換え核酸分子。
【請求項５６】
前記下側ステムが、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７ヌクレオチドの長さである、請求項５５に記載の核酸分子。
【請求項５７】
前記第１の下側ステム（ｂ）が、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、または配列番号３０のｍｉｒ−１６配列を含む、請求項５５に記載の核酸分子。
【請求項５８】
前記ｍｉｒ−１６フランキング配列（ａ）が、配列番号２５の配列を含む、請求項５５に記載の核酸分子。
【請求項５９】
前記ｍｉｒ−３０ループ配列が、配列番号３１の配列を含む、請求項５５に記載の核酸分子。
【請求項６０】
前記センス配列（ｅ）が、前記センス配列（ｅ）のヌクレオチド１１位に位置する配列（ｃ）に対して１つのミスマッチを含む、請求項５５に記載の核酸分子。
【請求項６１】
前記センス配列（ｅ）が、（ｉ）前記センス配列（ｅ）の１１位、及び（ｉｉ）前記センス配列（ｅ）の末端の３’ヌクレオチド（２２位）に位置する配列（ｃ）に対して２つのミスマッチを含む、請求項５５に記載の核酸分子。
【請求項６２】
フランキング配列（ｇ）を含み、前記フランキング配列が、前記ｍｉｒ−１６フランキング配列（ａ）と相補的でない、請求項５５〜６１のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項６３】
前記ｍｉＲＮＡヘアピン配列が、表６または表１０に記載されている配列から選択される、請求項５５〜６２のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項６４】
前記核酸分子が、ＲＮＡである、請求項５５〜６３のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項６５】
前記核酸分子が、ＤＮＡである、請求項５５〜６３のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項６６】
前記核酸分子が、前記配列（ａ）〜（ｇ）のうちの少なくとも２つの反復を含む、請求項５５〜６５のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項６７】
前記少なくとも２つの反復が、介在配列によって分離されている、請求項６６に記載の核酸分子。
【請求項６８】
前記アンチセンス標的配列が、ＣＣＲ５  ｍＲＮＡ配列と相補的である、請求項５５〜６７のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項６９】
請求項５５〜６８のいずれか１項に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項７０】
前記プロモーターが、真核生物プロモーターである、請求項６９に記載の発現ベクター。
【請求項７１】
前記真核生物プロモーターが、Ｐｏｌ  ＩＩまたはＰｏｌ  ＩＩＩプロモーターである、請求項７０に記載の発現ベクター。
【請求項７２】
前記真核生物プロモーターが、Ｐｏｌ  ＩＩプロモーターである、請求項７１に記載の発現ベクター。
【請求項７３】
前記プロモーターが、誘導性、組織特異的または細胞系統特異的プロモーターである、請求項６９に記載の発現ベクター。
【請求項７４】
請求項５５に記載の核酸配列の２以上のコピーを含む、請求項６９に記載の発現ベクター。
【請求項７５】
請求項５５に記載の核酸配列の２つ以上のコピーが、ポリシストロニック転写産物をコードする配列を形成する、請求項７４に記載の発現ベクター。
【請求項７６】
前記発現ベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである、請求項６９に記載の発現ベクター。
【請求項７７】
少なくとも１つの薬剤耐性マーカーをさらに含む、請求項６９に記載の発現ベクター。
【請求項７８】
請求項５５〜６８のいずれか１項に記載の核酸分子または請求項６９〜７７のいずれか１項に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項７９】
細胞内の遺伝子の発現を低減するための方法であって、前記細胞において請求項５５〜６８のいずれか１項に記載の核酸分子を発現させることを含み、前記アンチセンス標的配列（ｃ）が、前記遺伝子のセンス鎖と相補的である、前記方法。
【請求項８０】
前記細胞における前記核酸分子の発現が、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して、前記細胞のゲノムに前記核酸分子を組み込むことを含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記細胞における前記核酸分子の発現が、核酸を用いて、前記細胞をトランスフェクトすることを含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
前記細胞における前記核酸分子の発現が、前記核酸分子を発現ベクターから発現することを含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８３】
前記発現ベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記遺伝子が、ＣＣＲ５である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８５】
前記細胞が、ヒト細胞である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８６】
インビボ法としてさらに規定される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８７】
インビトロまたはエクスビボ法としてさらに規定される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８８】
前記核酸分子を発現する細胞を、生物に移植することをさらに含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記細胞が、生物に含まれる、請求項７９に記載の方法。
【請求項９０】
プロモーター配列及び少なくとも２つのｍｉＲＮＡヘアピンを含むｍｉＲＮＡ発現構築物であって、前記少なくとも２つのｍｉＲＮＡヘアピンが、免疫チェックポイント遺伝子の転写産物を標的とする、前記ｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項９１】
前記少なくとも２つのｍｉＲＮＡヘアピンが、同一である、請求項９０に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項９２】
前記少なくとも２つのｍｉＲＮＡヘアピンが、異なる配列を標的とする、請求項９０に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項９３】
前記少なくとも２つのｍｉＲＮＡヘアピンが、同じ遺伝子の転写産物の異なる配列を標的とする、請求項９２に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項９４】
前記ｍｉＲＮＡヘアピンが、異なる転写産物を標的とする、請求項９２に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項９５】
前記ｍｉＲＮＡヘアピンが、異なる遺伝子の転写産物を標的とする、請求項９４に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項９６】
少なくとも３つのｍｉＲＮＡヘアピンを含む、請求項９０に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項９７】
前記少なくとも３つのｍｉＲＮＡヘアピンが、それぞれ、異なる、請求項９６に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項９８】
前記少なくとも３つのｍｉＲＮＡヘアピンのうちの少なくとも２つが、異なる、請求項９６に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項９９】
前記少なくとも３つの異なるｍｉＲＮＡヘアピンが、２つまたは３つの異なる免疫チェックポイント遺伝子の転写産物を標的とする、請求項９７に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項１００】
少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のｍｉＲＮＡヘアピンを含む、請求項９０のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項１０１】
前記少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のｍｉＲＮＡヘアピンのうちの少なくとも２つが、異なる、請求項１００に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項１０２】
前記少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のｍｉＲＮＡヘアピンが、それぞれ、異なる、請求項１００に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項１０３】
前記少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０の異なるｍｉＲＮＡヘアピンが、２つ、３つ、４つ、または５つの異なる免疫チェックポイント遺伝子の転写産物を標的とする、請求項１０２に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項１０４】
前記プロモーターと前記少なくとも２つのｍｉＲＮＡヘアピンとの間にスペーサー配列位置をさらに含む、請求項９０に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項１０５】
前記スペーサーが、５０〜１，０００ヌクレオチドの長さである、請求項９０に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項１０６】
前記少なくとも２つのｍｉＲＮＡヘアピンが、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、アデノシンＡ２ａ受容体、ＡＲＧ２（アルギナーゼ２）、Ｖｉｓｔａ、ＩＤＯ、ＦＡＳ、ＳＩＲＰアルファ、ＣＩＳＨ、ＳＨＰ−１、ＦＯＸＰ３、ＬＡＩＲ１、ＰＶＲＩＧ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＣＤ１６０、ＣＲＴＡＭ、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＣＤ２４４、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＴＧＦＲＢＲＩ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ１、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２、及びＧＵＣＹ１Ｂ３からなる群から選択される少なくとも１つの免疫チェックポイント遺伝子の転写産物を標的とする、請求項９０に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項１０７】
前記プロモーター配列が、前記ＥＦ１ｓプロモーター配列と少なくとも８０％同一である、請求項９０〜１０６のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項１０８】
前記プロモーター配列が、前記ＵＢＩプロモーター配列と少なくとも８０％同一である、請求項９０〜１０６のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項１０９】
前記ｍｉＲＮＡ発現構築物が、キメラ抗原受容体配列をさらに含む、請求項９０〜１０８のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項１１０】
前記ｍｉＲＮＡ発現構築物が、Ｔ細胞受容体配列をさらに含む、請求項９０〜１０８のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項１１１】
前記ｍｉＲＮＡ発現構築物が、選択遺伝子をさらに含む、請求項９０〜１１０のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項１１２】
前記選択遺伝子が、ＬＮＧＦＲまたはその誘導体である、請求項１１１に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項１１３】
前記ｍｉＲＮＡ発現構築物が、自殺遺伝子をさらに含む、請求項９０〜１１０のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項１１４】
前記自殺遺伝子が、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）、切断型内皮増殖因子受容体（ｔＥＧＦＲ）、ＲＱＲ８、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、及びチミジル酸生成酵素（ＴＹＭＳ）からなる群から選択される、請求項１１３に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項１１５】
前記ｍｉＲＮＡ発現構築物が、ペプチド切断部位をさらに含む、請求項９０〜１１３のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項１１６】
前記ペプチド切断部位が、２Ａペプチドである、請求項１１５に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項１１７】
前記２Ａペプチドが、２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ、ＢｍＣＰＶ  ２Ａ、及びＢｍＩＦＶ  ２Ａを含む群から選択される、請求項１１６に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項１１８】
前記２Ａペプチドが、Ｔ２Ａである、請求項１１７に記載のｍｉＲＮＡ発現構築物。
【請求項１１９】
請求項９０〜１１８のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物を含む、ベクター。
【請求項１２０】
前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項１１９に記載のベクター。
【請求項１２１】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである、請求項１２０に記載のベクター。
【請求項１２２】
請求項９０〜１１８のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物または請求項１１９〜１２１のいずれかに記載のベクターを含む、哺乳動物細胞。
【請求項１２３】
前記哺乳動物細胞が、免疫エフェクター細胞である、請求項１２２に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１２４】
前記細胞が、ＣＣＲ５の発現の低減のために操作される、請求項１２２に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１２５】
前記免疫エフェクター細胞が、Ｔ細胞、ＴＩＬＳ、ＴＣＲ操作されたＴ細胞、ＣＡＲ  Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫ／Ｔ細胞、Ｔ制御性細胞、単球、及びマクロファージを含む群から選択される、請求項１２３に記載の免疫エフェクター細胞。
【請求項１２６】
操作された免疫エフェクター細胞を調製するための方法であって、請求項９０〜１１８のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物を用いて、前記免疫エフェクター細胞をトランスフェクトもしくは形質導入すること、または請求項１１８〜１２１のいずれかに記載のベクターを用いて、前記免疫エフェクター細胞を形質導入することを含む、前記方法。
【請求項１２７】
操作された免疫エフェクター細胞を調製するための方法であって、免疫エフェクター細胞にキメラ抗原受容体配列またはＴ細胞受容体配列をトランスフェクトまたは形質導入し、次いで、前記細胞に、請求項９０〜１１８のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物または請求項１１９〜１２１のいずれかに記載のベクターをトランスフェクトまたは形質導入することを含む、前記方法。
【請求項１２８】
操作された免疫エフェクター細胞を調製するための方法であって、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ｍｅｇａＴＡＬ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって、請求項９０〜１１８のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物を前記細胞のゲノムに組み込むことを含む、前記方法。
【請求項１２９】
患者からの操作された免疫エフェクター細胞を調製するための方法であって、
（ａ）前記患者からの免疫エフェクター細胞を収集することと、
（ｂ）操作された免疫エフェクター細胞を生成するために、請求項９０〜１１８のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物を用いて、前記免疫エフェクター細胞をトランスフェクトすること、または請求項１１９〜１２１のいずれかに記載のベクターを用いて、前記免疫エフェクター細胞を形質導入することと、を含む、前記方法。
【請求項１３０】
患者からの操作された免疫エフェクター細胞を調製するための方法であって、
（ａ）前記患者から免疫エフェクター細胞を収集することと、
（ｂ）改変された免疫エフェクター細胞を生成するために、キメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体を用いて、前記免疫エフェクター細胞を形質導入またはトランスフェクトすることと、
（ｃ）操作された免疫エフェクター細胞を生成するために、請求項９０〜１１８のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物または請求項１１９〜１２１のいずれかに記載のベクターを用いて、前記改変された免疫エフェクター細胞を形質導入またはトランスフェクトすることと、を含む、前記方法。
【請求項１３１】
前記キメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体が、前記ｍｉＲＮＡ発現構築物またはベクターによってコードされる、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
前記ｍｉＲＮＡ発現構築物を用いた前記免疫エフェクター細胞の形質導入またはトランスフェクトが、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ｍｅｇａＴＡＬ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって、前記ゲノムに、前記ｍｉＲＮＡ発現構築物を組み込むことを含む、請求項１２９〜１３１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３３】
治療を必要とする患者を治療する方法であって、前記患者に、請求項１２２〜１３２のいずれかに記載の細胞を導入することを含む、前記方法。
【請求項１３４】
ＣＣＲ５及び免疫チェックポイント阻害遺伝子を標的とする１つ以上のｍｉＲＮＡ発現構築物を含む、免疫エフェクター細胞。
【請求項１３５】
前記チェックポイント阻害遺伝子が、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、アデノシンＡ２ａ受容体、ＡＲＧ２（アルギナーゼ２）、Ｖｉｓｔａ、ＩＤＯ、ＦＡＳ、ＳＩＲＰアルファ、ＣＩＳＨ、ＳＨＰ−１、ＦＯＸＰ３、ＬＡＩＲ１、ＰＶＲＩＧ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＣＤ１６０、ＣＲＴＡＭ、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＣＤ２４４、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＴＧＦＲＢＲＩ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ１、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２、またはＧＵＣＹ１Ｂ３である、請求項１３４に記載の細胞。
【請求項１３６】
前記チェックポイント阻害遺伝子が、ＰＤ１である、請求項１３４に記載の細胞。
【請求項１３７】
前記ＰＤ１標的配列が、配列番号５９である、請求項１３４に記載の細胞。
【請求項１３８】
前記免疫エフェクター細胞が、Ｔ細胞、ＴＩＬＳ、ＴＣＲ操作されたＴ細胞、ＣＡＲ  Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫ／Ｔ細胞、Ｔ制御性細胞、単球、及びマクロファージからなる群から選択される、請求項１３４に記載の細胞。
【請求項１３９】
前記免疫エフェクター細胞が、Ｔ細胞である、請求項１３４に記載の細胞。
【請求項１４０】
前記免疫エフェクター細胞が、ＣＡＲ  Ｔ細胞である、請求項１３８に記載の細胞。
【請求項１４１】
前記ＣＡＲが、ＨＩＶ感染細胞を標的とする、請求項１４０に記載の細胞。
【請求項１４２】
ＣＣＲ５及び少なくとも２つの免疫チェックポイント阻害遺伝子を標的とする１つ以上のｍｉＲＮＡ発現構築物を含む、請求項１３４に記載の細胞。
【請求項１４３】
前記細胞に、請求項９０〜１１８のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ発現構築物または請求項１１９〜１２１のいずれかに記載のベクターを含む、請求項１３４に記載の細胞。
【請求項１４４】
前記ｍｉＲＮＡ発現構築物が、請求項１〜４０のいずれか１項に従う、請求項１３４に記載の細胞。
【請求項１４５】
ＣＣＲ５及び免疫チェックポイント阻害遺伝子を標的とするｍｉＲＮＡ配列を含む、発現構築物。
【請求項１４６】
前記ｍｉＲＮＡ配列が、請求項１〜４０のいずれか１項に従う、請求項１４５に記載の構築物。
【請求項１４７】
ＣＡＲ発現配列をさらに含む、請求項１４５に記載の構築物。
【請求項１４８】
前記ＣＡＲが、ＨＩＶ感染細胞を標的とする、請求項１４７に記載の構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１８年３月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／６５０，４０３号、及び２０１８年３月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／６５０，３８７号の利益を主張し、当該仮出願の全体は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表の取り込み
２０ＫＢであり（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）において測定）、２０１９年４月１日に作成されたファイル名「ＵＧＥＮ．Ｐ００２０ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」中に含まれている配列表は、電子申請によって本明細書とともに提出され、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
１．発明の分野
本発明は、一般に、分子生物学の分野に関する。より具体的には、それは、ｍｉＲＮＡの発現のためのベクター及びその使用に関する。
【０００４】
２．先行技術の記載
ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）遺伝子及びその調節機序の発見及び特徴付けは、遺伝子発現の生理学的調節の新たな理解をもたらしただけでなく、ｍｉＲＮＡベースの治療法の新たな可能性も開いた。ｍｉＲＮＡ遺伝子の最重要項目はヘアピンであり、最終的にはリボ核タンパク質複合体を生じさせ、その転写産物の同定及び破壊を通じて標的遺伝子の発現をノックダウンする。ヘアピンの構造要素は、ＤＲＯＳＨＡ及びＤＩＣＥＲによるプロセシングのためのシグナルを提供し、約２０〜２３ｂｐの成熟ｍｉＲＮＡ二重鎖の形成をもたらす（Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。成熟ｍｉＲＮＡ二重鎖の機能的な鎖は、ＲＩＳＣ複合体に組み込まれ、標的ｍＲＮＡの認識を促進し、最終的には遺伝子ノックダウンを促進する。短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などの合成ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ経路の副産物は、現在、分子生物学で一般的に使用されているツールである。しかしながら、その経路は、その治療可能性に応えていない（Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｎａｉｒ，２０１６）。ｓｉＲＮＡは、クリニックで最も進んでいるが、寿命が短く、長期的な遺伝子修正には適していない。ＤＲＯＳＨＡプロセシングをバイパスするｓｈＲＮＡは、細胞質を二本鎖ＲＮＡで過負荷にし、天然のｍｉＲＮＡ経路を妨害することによって毒性を引き起こし得る（Ｂｏｕｄｒｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００９、Ｇｒｉｍｍ，２０１１）。合成ｍｉＲＮＡは、天然経路を模倣しているため、上記の制限を克服しなければならない（Ｍａｃｚｕｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）が、ｓｈＲＮＡと比較して、ｍｉＲＮＡのノックダウン活性が比較的弱いため、それらの使用が制限され得る（Ｂｏｕｄｒｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【０００５】
レンチウイルスベクターを使用して、合成ｍｉＲＮＡ遺伝子を発現させることができ、そのため、導入遺伝子のゲノムの組み込み及びレシピエント細胞での長期発現が、これまで患者で安全であることが示されている（Ａｉｕｔｉ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｂｉｆｆｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。しかしながら、さらなる研究は、病理学的遺伝子発現の効率的な治療的補正を可能にする程度まで、合成ｍｉＲＮＡ遺伝子によるノックダウンを最適化するために必要とされる。
【０００６】
ヘアピンの三次元構造を含む合成ｍｉＲＮＡ遺伝子のアーキテクチャは、ノックダウン効率にとって非常に重要である（Ｍｙｂｕｒｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｆｏｗｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。下側ステムの長さは、ＤＲＯＳＨＡによる効率的なプロセシングと、利用可能な成熟ｍｉＲＮＡ鎖の相対的な豊富さにとって重要であり、その結果、標的遺伝子のノックダウンが増大する。しかしながら、ｍｉＲＮＡ遺伝子のアーキテクチャは、ヘアピン構造に限定されない。他の重要な要素には、「スペーサー」と称される、ヘアピンに直接連結されていないプロモーター及びヌクレオチド配列が含まれる。ほとんどの場合、ｍｉＲＮＡ遺伝子は、組織特異的なまたは／及び誘導性発現を可能にするｐｏｌＩＩ依存性プロモーターによって駆動される（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｇｉｒｙ−Ｌａｔｅｒｒｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｇｉｒｙ−Ｌａｔｅｒｒｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。スペーサーの存在は、ノックダウン効率を増大するように思われる（Ｓｔｅｇｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）が、スペーサーの配列の長さまたは他の生物物理学的パラメーターが重要であるかどうかは不明である。
【０００７】
天然のｍｉＲＮＡ遺伝子は、連結された形態で発生し、それらのアーキテクチャは、単一のプロモーターの制御下で、いくつかのヘアピンの配置からなる（Ｂｏｕｒｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。このような連結は、バイオテクノロジーにとって強力なツールとなり得る（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。ｍｉＲＮＡヘアピンの間に空間的にそれらを分離する介在配列があり得、所望の任意の配列であり得る。
【０００８】
養子細胞療法（ＡＣＴ）、特にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）で操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の使用は、様々ながん及びウイルス感染症の治療にかなり有望である。ある特定のがん、特に血液学的悪性腫瘍では、非常に高い治癒率が報告されている（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）が、他の悪性腫瘍、特に固形腫瘍では限られた成功しか見られていない（Ｏ’Ｈａｒａ，２０１６、Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７、Ｉｒｖｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。これらの失敗の多くは、操作された免疫細胞が克服するための物理的、分子的、及び免疫抑制の障壁を提供する敵対的な腫瘍微小環境に起因する。同様に、今日まで、免疫細胞の活性を刺激するため、または免疫チェックポイントを阻害するために使用することができる構築物は、開発されていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
いくつかの実施形態において、本開示は、プロモーター要素と、少なくとも５０ヌクレオチドの長さのスペーサーと、ｍｉＲＮＡヘアピンと、を含む、ｍｉＲＮＡ発現構築物を提供する。いくつかの態様において、スペーサーは、５０〜１，０００ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様において、スペーサーは、５０〜９００、５０〜８００、１００〜８００、１５０〜８００、１５０〜７５０、２００〜７５０、２００〜７００、２５０〜７００、２５０〜６５０、３００〜６００、３００〜５５０、または３００〜５００ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様において、スペーサーは、少なくとも６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３６５、３７０、または３７５ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様において、スペーサーは、プロモーター要素に対して異種である。いくつかの態様において、スペーサーは、コードされたオープンリーディングフレームを含む。
【００１０】
実施形態によるプロモーター要素は、真核生物プロモーターであり得る。いくつかの態様において、真核生物プロモーターは、Ｐｏｌ  ＩＩまたはＰｏｌ  ＩＩＩプロモーターである。ある特定の態様において、真核生物プロモーターは、Ｐｏｌ  ＩＩプロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターは、誘導性、組織特異的、または細胞系統特異的プロモーターである。ある特定の態様において、プロモーター要素は、表１のプロモーター要素から選択される。いくつかの態様において、プロモーター要素は、ＥＦ１αプロモーターと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。いくつかの態様において、ＥＦ１αプロモーターは、ＥＦ１αプロモーターのスプライスバリアントである。いくつかの態様において、ＥＦ１αプロモーターのスプライスバリアントは、ＥＦ１ｓである。いくつかの態様において、ＥＦ１ｓプロモーターは、配列番号４５と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有する。いくつかの態様において、ＥＦ１ｓプロモーターは、配列番号４５と１００％同一である配列を有する。
【００１１】
実施形態によるスペーサーは、表９のスペーサーから選択することができる。いくつかの態様において、スペーサーは、配列番号４６と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。ある特定の態様において、スペーサーは、配列番号４６と１００％同一である。いくつかの態様において、スペーサーは、配列番号４７と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。特定の態様において、スペーサーは、配列番号４７と同一である。いくつかの態様において、スペーサーは、配列番号４８と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。特定の態様において、スペーサーは、配列番号４８と同一である。いくつかの態様において、スペーサーは、配列番号４９と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。特定の態様において、スペーサーは、配列番号４９と同一である。
【００１２】
実施形態によるｍｉＲＮＡヘアピンは、５’から３’へ、かつ（ａ）〜（ｇ）の順序で、（ａ）配列番号２５の配列を含むｍｉｒ−１６フランキング配列、（ｂ）配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、または配列番号３０のｍｉｒ−１６配列を含む第１の下側ステム配列、（ｃ）２２ヌクレオチドの長さのアンチセンス標的配列、（ｄ）配列番号３１の配列を含むｍｉｒ−３０ループ配列、（ｅ）（ｃ）の配列に対して１つまたは２つのミスマッチを含むことを除き、（ｃ）の配列と相補的であるセンス配列であって、１つまたは２つのミスマッチが、ｉ）センス配列の８〜１４位に位置するミスマッチ、またはｉｉ）センス配列の終端の３’位（２２位）におけるミスマッチを含む、センス配列、（ｆ）（ｂ）の配列と相補的である第２の下側ステム配列、及び（ｇ）第２のフランキング配列、を含み得る。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡヘアピンのセンス配列（ｅ）は、センス配列（ｅ）のヌクレオチド１１位に位置する配列（ｃ）に対して１つのミスマッチを含む。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡヘアピンのセンス配列（ｅ）は、（ｉ）センス配列（ｅ）の１１位及び（ｉｉ）センス配列（ｅ）の終端の３’ヌクレオチド（２２位）に位置する配列（ｃ）に対して２つのミスマッチを含む。いくつかの態様において、フランキング配列（ｇ）は、ｍｉｒ−１６フランキング配列（ａ）と相補的ではない。ある特定の態様において、ｍｉＲＮＡヘアピン配列は、表６に記載されている配列から選択される。いくつかの態様において、アンチセンス標的配列は、ＣＣＲ５  ｍＲＮＡ配列と相補的である。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡ発現構築物は、ｍｉＲＮＡヘアピンのうちの少なくとも２つの反復を含む。いくつかの態様において、少なくとも２つの反復は、介在配列によって分離されている。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡ発現構築物は、ＤＮＡである。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡ発現構築物は、ＲＮＡである。
【００１３】
いくつかの実施形態において、本開示は、プロモーター要素と、少なくとも５０ヌクレオチドの長さのスペーサーと、ｍｉＲＮＡヘアピンと、を含む、ｍｉＲＮＡ発現構築物を含む発現ベクターを提供する。いくつかの態様において、発現ベクターは、ｍｉＲＮＡ発現構築物の２つ以上のコピーを含む。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡ発現構築物の２つ以上のコピーは、ポリシストロニック転写産物をコードする配列を形成する。いくつかの態様において、発現ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである。さらなる態様において、発現ベクターは、少なくとも１つの薬剤耐性マーカーを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態において、本開示は、プロモーター要素と、少なくとも５０ヌクレオチドの長さのスペーサーと、ｍｉＲＮＡヘアピンと、を含む、ｍｉＲＮＡ発現構築物、またはｍｉＲＮＡ発現構築物を含む発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００１５】
いくつかの実施形態において、本開示は、細胞内の遺伝子の発現を低減させるための方法であって、プロモーター要素と、少なくとも５０ヌクレオチドの長さのスペーサーと、ｍｉＲＮＡヘアピンと、を含む、ｍｉＲＮＡ発現構築物を発現させることを含み、ｍｉＲＮＡヘアピンは、（ａ）配列番号２５の配列を含むｍｉｒ−１６フランキング配列、（ｂ）配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、または配列番号３０のｍｉｒ−１６配列を含む第１の下側ステム配列、（ｃ）２２ヌクレオチドの長さのアンチセンス標的配列、（ｄ）配列番号３１の配列を含むｍｉｒ−３０ループ配列、（ｅ）（ｃ）の配列に対して１つまたは２つのミスマッチを含むことを除き、（ｃ）の配列と相補的である、センス配列であって、１つまたは２つのミスマッチが、ｉ）センス配列の８〜１４位に位置するミスマッチ、またはｉｉ）センス配列の終端の３’位（２２位）におけるミスマッチを含む、センス配列、（ｆ）（ｂ）の配列と相補的である、第２の下側ステム配列、及び（ｇ）第２のフランキング配列、を含み、アンチセンス標的配列（ｃ）は、遺伝子のセンス鎖と相補的である、方法を提供する。いくつかの態様において、細胞内のｍｉＲＮＡ発現構築物の発現は、ｍｉＲＮＡ発現構築物を含む核酸を用いて、細胞をトランスフェクトすることを含む。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡ発現構築物の発現は、ｍｉＲＮＡ発現構築物を発現ベクターから発現させることを含む。いくつかの態様において、発現ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである。いくつかの態様において、サイレンシングされる遺伝子は、ＣＣＲ５である。いくつかの態様において、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの態様において、本方法は、インビボ法である。他の態様において、本方法は、インビトロまたはエクスビボ法である。いくつかの態様において、本方法は、ｍｉＲＮＡ発現構築物を発現する細胞を、生物に移植することをさらに含む。いくつかの態様において、細胞は、生物内に含まれる。
【００１６】
いくつかの実施形態において、本開示は、プロモーター要素と、少なくとも５０ヌクレオチドの長さのスペーサーと、少なくとも１つのｍｉＲＮＡヘアピンと、を含む、組換え核酸分子であって、ｍｉＲＮＡヘアピンは、５’から３’へ、かつ（ａ）〜（ｇ）の順序で、（ａ）ｍｉｒ−１６フランキング配列、（ｂ）ｍｉｒ−１６配列を含む第１の下側ステム配列、（ｃ）２２ヌクレオチドの長さのアンチセンス標的配列、（ｄ）ｍｉｒ−３０ループ配列、（ｅ）（ｃ）の配列に対して１つまたは２つのミスマッチを含むことを除き、（ｃ）の配列と相補的である、センス配列であって、１つまたは２つのミスマッチが、ｉ）センス配列の８〜１４位に位置するミスマッチ、またはｉｉ）センス配列の終端の３’位（２２位）におけるミスマッチを含む、センス配列、（ｆ）（ｂ）の配列と相補的である、第２の下側ステム配列であって、下側ステムが、少なくとも１１ヌクレオチドの長さである、第２の下側ステム配列、及び（ｇ）第２のフランキング配列、を含む、組換え核酸分子を提供する。いくつかの態様において、下側ステムは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様において、第１の下側ステム（ｂ）は、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９または配列番号３０のｍｉｒ−１６配列を含む。いくつかの態様において、ｍｉｒ−１６フランキング配列（ａ）は、配列番号２５の配列を含む。いくつかの態様において、ｍｉｒ−３０ループ配列は、配列番号３１の配列を含む。いくつかの態様において、センス配列（ｅ）は、センス配列（ｅ）のヌクレオチド１１位に位置する配列（ｃ）に対して１つのミスマッチを含む。いくつかの態様において、センス配列（ｅ）は、（ｉ）センス配列（ｅ）の１１位、及び（ｉｉ）センス配列（ｅ）の終端の３’ヌクレオチド（２２位）に位置する配列（ｃ）に対して２つのミスマッチを含む。いくつかの態様において、第２のフランキング配列（ｇ）は、ｍｉｒ−１６フランキング配列（ａ）と相補的ではない。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡヘアピン配列は、表６に記載されている配列から選択される。いくつかの態様において、組換え核酸分子は、配列（ａ）〜（ｇ）のうちの少なくとも２つの反復を含む。いくつかの態様において、少なくとも２つの反復は、介在配列によって分離されている。いくつかの態様において、アンチセンス標的配列は、ＣＣＲ５  ｍＲＮＡ配列と相補的である。いくつかの態様において、組換え核酸分子は、ＲＮＡである。いくつかの態様において、組換え核酸分子は、ＤＮＡである。
【００１７】
いくつかの実施形態において、本開示は、プロモーター要素と、少なくとも５０ヌクレオチドの長さのスペーサーと、少なくとも１つのｍｉＲＮＡヘアピンと、を含む組換え核酸分子であって、ｍｉＲＮＡヘアピンは、５’から３’へ、かつ（ａ）〜（ｇ）の順序で、（ａ）ｍｉｒ−１６フランキング配列、（ｂ）ｍｉｒ−１６配列を含む第１の下側ステム配列、（ｃ）２２ヌクレオチドの長さのアンチセンス標的配列、（ｄ）ｍｉｒ−３０ループ配列、（ｅ）（ｃ）の配列に対して１つまたは２つのミスマッチを含むことを除き、（ｃ）の配列と相補的である、センス配列であって、１つまたは２つのミスマッチが、ｉ）センス配列の８〜１４位に位置するミスマッチ、またはｉｉ）センス配列の終端の３’位（２２位）におけるミスマッチを含む、センス配列、（ｆ）（ｂ）の配列と相補的である、第２の下側ステム配列であって、下側ステムが、少なくとも１１ヌクレオチドの長さである、第２の下側ステム配列、及び（ｇ）第２のフランキング配列、を含む、組換え核酸分子を含む発現ベクターを提供する。いくつかの態様において、プロモーターは、真核生物プロモーターである。ある特定の態様において、真核生物プロモーターは、Ｐｏｌ  ＩＩまたはＰｏｌ  ＩＩＩプロモーターである。特定の態様において、真核生物プロモーターは、Ｐｏｌ  ＩＩプロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターは、誘導性、組織特異的または細胞系統特異的プロモーターである。いくつかの態様において、発現ベクターは、組換え核酸分子の２つ以上のコピーを含む。いくつかの態様において、組換え核酸分子の２つ以上のコピーは、ポリシストロニック転写産物をコードする配列を形成する。いくつかの態様において、発現ベクターは、ウイルスベクターである。ある特定の態様において、発現ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである。いくつかの態様において、発現ベクターは、少なくとも１つの薬剤耐性マーカーをさらに含む。
【００１８】
いくつかの実施形態において、本開示は、プロモーター要素と、少なくとも５０ヌクレオチドの長さのスペーサーと、少なくとも１つのｍｉＲＮＡヘアピンと、を含む組換え核酸分子であって、ｍｉＲＮＡヘアピンは、５’から３’へ、かつ（ａ）〜（ｇ）の順序で、（ａ）ｍｉｒ−１６フランキング配列、（ｂ）ｍｉｒ−１６配列を含む第１の下側ステム配列、（ｃ）２２ヌクレオチドの長さのアンチセンス標的配列、（ｄ）ｍｉｒ−３０ループ配列、（ｅ）（ｃ）の配列に対して１つまたは２つのミスマッチを含むことを除き、（ｃ）の配列と相補的である、センス配列であって、１つまたは２つのミスマッチが、ｉ）センス配列の８〜１４位に位置するミスマッチ、またはｉｉ）センス配列の終端の３’位（２２位）におけるミスマッチを含む、センス配列、（ｆ）（ｂ）の配列と相補的である、第２の下側ステム配列であって、下側ステムが、少なくとも１１ヌクレオチドの長さである、第２の下側ステム配列、及び（ｇ）第２のフランキング配列、を含む、組換え核酸分子、または組換え核酸分子を含む発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００１９】
いくつかの実施形態において、本開示は、細胞内の遺伝子の発現を低減させるための方法であって、プロモーター要素と、少なくとも５０ヌクレオチドの長さのスペーサーと、少なくとも１つのｍｉＲＮＡヘアピンと、を含む、組換え核酸分子であって、ｍｉＲＮＡヘアピンは、５’から３’へ、かつ（ａ）〜（ｇ）の順序で、（ａ）ｍｉｒ−１６フランキング配列、（ｂ）ｍｉｒ−１６配列を含む第１の下側ステム配列、（ｃ）２２ヌクレオチドの長さのアンチセンス標的配列、（ｄ）ｍｉｒ−３０ループ配列、（ｅ）（ｃ）の配列に対して１つまたは２つのミスマッチを含むことを除き、（ｃ）の配列と相補的である、センス配列であって、１つまたは２つのミスマッチが、ｉ）センス配列の８〜１４位に位置するミスマッチ、またはｉｉ）センス配列の終端の３’位（２２位）におけるミスマッチを含む、センス配列、（ｆ）（ｂ）の配列と相補的である、第２の下側ステム配列であって、下側ステムが、少なくとも１１ヌクレオチドの長さである、第２の下側ステム配列、及び（ｇ）細胞内の第２のフランキング配列、を含み、アンチセンス標的配列（ｃ）は、遺伝子のセンス鎖と相補的である、組換え核酸分子を発現することを含む、方法を提供する。いくつかの態様において、細胞内の核酸分子の発現は、組換え核酸を用いて、細胞をトランスフェクトすることを含む。いくつかの態様において、細胞内の組換え核酸分子の発現は、核酸分子を発現ベクターから発現することを含む。いくつかの態様において、発現ベクターは、ウイルスベクターである。特定の態様において、発現ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである。いくつかの態様において、遺伝子は、ＣＣＲ５である。いくつかの態様において、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの態様において、本方法は、インビボ法としてさらに規定される。他の態様において、本方法は、インビトロまたはエクスビボ法として規定される。いくつかの態様において、本方法は、組換え核酸分子を発現する細胞を、生物に移植することをさらに含む。いくつかの態様において、細胞は、生物内に含まれる。
【００２０】
いくつかの実施形態において、本開示は、プロモーター配列及び少なくとも２つのｍｉＲＮＡヘアピンを含むｍｉＲＮＡ発現構築物であって、当該少なくとも２つのｍｉＲＮＡヘアピンは、免疫チェックポイント遺伝子の転写産物を標的とする、ｍｉＲＮＡ発現構築物を提供する。いくつかの態様において、少なくとも２つのｍｉＲＮＡヘアピンは、異なる配列を標的とする。いくつかの態様において、少なくとも２つのｍｉＲＮＡヘアピンは、同じ遺伝子の転写産物の異なる配列を標的とする。別の態様において、ｍｉＲＮＡヘアピンは、異なる転写産物を標的とする。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡヘアピンは、異なる遺伝子の転写産物を標的とする。いくつかの態様において、少なくとも２つのｍｉＲＮＡヘアピンは、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、アデノシンＡ２ａ受容体、Ｖｉｓｔａ、ＩＤＯ、ＦＡＳ、ＳＩＲＰアルファ、ＣＩＳＨ、ＳＨＰ−１、ＦＯＸＰ３、ＬＡＩＲ１、ＰＶＲＩＧ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＣＤ１６０、ＣＲＴＡＭ、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＣＤ２４４、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＴＧＦＲＢＲＩ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ１、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２、及びＧＵＣＹ１Ｂ３からなる群から選択される少なくとも１つの免疫チェックポイント遺伝子の転写産物を標的とする。
【００２１】
実施形態によるｍｉＲＮＡ発現構築物は、少なくとも３つのｍｉＲＮＡヘアピンを含み得る。いくつかの態様において、少なくとも３つのｍｉＲＮＡヘアピンは、それぞれ、異なる。いくつかの態様において、少なくとも３つの異なるｍｉＲＮＡヘアピンは、少なくとも１つの免疫チェックポイント遺伝子の転写産物を標的とする。いくつかの態様において、少なくとも３つの異なるｍｉＲＮＡヘアピンは、３つの異なる免疫チェックポイント遺伝子を標的とする。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡ発現構築物は、少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のｍｉＲＮＡヘアピンを含む。いくつかの態様において、少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のｍｉＲＮＡヘアピンは、それぞれ、異なる。いくつかの態様において、少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のｍｉＲＮＡヘアピンは、２つ、３つ、４つ、または５つの異なる免疫チェックポイント遺伝子の転写産物を標的とする。
【００２２】
いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ発現構築物は、プロモーターと少なくとも２つのｍｉＲＮＡヘアピンとの間に位置するスペーサー配列を含み得る。いくつかの態様において、スペーサーは、５０〜１，０００ヌクレオチドの長さである。
【００２３】
いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡ発現構築物のプロモーター配列は、ＥＦ１ｓプロモーター配列と少なくとも８０％同一である。いくつかの態様において、プロモーター配列は、ＥＦ１ｓプロモーター配列と少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。いくつかの態様において、プロモーター配列は、ＥＦ１ｓプロモーター配列と同一である。
【００２４】
いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡ発現構築物のプロモーター配列は、ＵＢＩプロモーター配列と少なくとも８０％同一である。いくつかの態様において、プロモーター配列は、ＵＢＩプロモーター配列と少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。いくつかの態様において、プロモーター配列は、ＵＢＩプロモーター配列と同一である。
【００２５】
実施形態によるｍｉＲＮＡ発現構築物は、受容体配列をさらに含み得る。いくつかの態様において、受容体配列は、キメラ抗原受容体である。いくつかの態様において、受容体配列は、Ｔ細胞受容体配列である。
【００２６】
実施形態によるｍｉＲＮＡ発現構築物は、選択的マーカーをさらに含み得る。いくつかの態様において、選択的マーカーは、選択遺伝子である。いくつかの態様において、選択遺伝子は、ＬＮＧＦＲまたはその誘導体である。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡ発現構築物は、自殺遺伝子をさらに含む。例えば、自殺遺伝子は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）、切断型内皮増殖因子受容体（ｔＥＧＦＲ）、ＲＱＲ８、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、またはチミジル酸生成酵素（ＴＹＭＳ）であり得る。
【００２７】
実施形態によるｍｉＲＮＡ発現構築物は、ペプチド切断部位を含み得る。いくつかの態様において、ペプチド切断部位は、２Ａペプチドである。いくつかの態様において、２Ａペプチドは、２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ、ＢｍＣＰＶ  ２Ａ、及びＢｍＩＦＶ  ２Ａを含む群から選択される。特定の態様において、２Ａペプチドは、Ｔ２Ａである。
【００２８】
いくつかの実施形態において、本開示は、プロモーター配列及び少なくとも２つのｍｉＲＮＡヘアピンを含むｍｉＲＮＡ発現構築物であって、当該少なくとも２つのｍｉＲＮＡヘアピンは、免疫チェックポイント遺伝子の転写産物を標的とする、ｍｉＲＮＡ発現構築物を含む、ベクターを提供する。いくつかの態様において、ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである。
【００２９】
いくつかの実施形態において、本開示は、プロモーター配列及び少なくとも２つのｍｉＲＮＡヘアピンを含むｍｉＲＮＡ発現構築物であって、当該少なくとも２つのｍｉＲＮＡヘアピンは、免疫チェックポイント遺伝子の転写産物を標的とする、ｍｉＲＮＡ発現構築物、または当該ｍｉＲＮＡ発現構築物を含むベクターを含む、哺乳動物細胞を提供する。いくつかの態様において、哺乳動物細胞は、免疫エフェクター細胞である。いくつかの態様において、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ＴＩＬＳ、ＴＣＲ操作されたＴ細胞、ＣＡＲ  Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫ／Ｔ細胞、及びＴ制御性細胞を含む群から選択される。
【００３０】
いくつかの実施形態において、操作された免疫エフェクター細胞を調製するための方法であって、実施形態によるｍｉＲＮＡ発現構築物を用いて、免疫エフェクター細胞をトランスフェクトもしくは形質導入すること、または実施形態によるｍｉＲＮＡ発現構築物を含むベクターを用いて、免疫エフェクター細胞を形質導入することを含む、方法が提供される。いくつかの態様において、操作された免疫エフェクター細胞を調製するための方法は、免疫エフェクター細胞に、キメラ抗原受容体配列またはＴ細胞受容体配列をトランスフェクトまたは形質導入し、次いで、当該細胞に、実施形態のｍｉＲＮＡ発現構築物または実施形態のｍｉＲＮＡ発現構築物を含むベクターをトランスフェクトまたは形質導入することを含む。
【００３１】
いくつかの実施形態において、患者からの操作された免疫エフェクター細胞を調製するための方法が提供される。いくつかの態様において、患者からの操作された免疫エフェクター細胞を調製するための方法は、（ａ）患者からの免疫エフェクター細胞を収集することと、（ｂ）操作された免疫エフェクター細胞を生成するために、実施形態のｍｉＲＮＡ発現構築物を用いて、免疫エフェクター細胞をトランスフェクトすること、またはｍｉＲＮＡ発現構築物を含むベクターを用いて、免疫エフェクター細胞を形質導入することと、を含む。いくつかの態様において、患者からの操作された免疫細胞を調製するための方法は、（ａ）患者からの免疫エフェクター細胞を収集することと、（ｂ）改変された免疫エフェクター細胞を生成するために、キメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体を用いて、免疫エフェクター細胞を形質導入またはトランスフェクトすることと、（ｃ）操作された免疫エフェクター細胞を生成するために、実施形態によるｍｉＲＮＡ発現構築物、または実施形態によるｍｉＲＮＡ発現構築物を含むベクターを用いて、改変された免疫エフェクター細胞を形質導入またはトランスフェクトすることと、を含む。さらに別の態様において、実施形態の免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫ／Ｔ細胞である。いくつかの態様において、免疫エフェクター細胞は、組換えＴ細胞受容体またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに発現する。
【００３２】
いくつかの実施形態において、治療を必要とする患者を治療するための方法であって、患者に、実施形態による操作された免疫エフェクター細胞を導入することを含む、方法が提供される。例えば、いくつかの態様において、患者は、がんを有する患者である。
【００３３】
さらなる実施形態において、ＣＣＲ５及び免疫チェックポイント阻害遺伝子を標的とする１つ以上のｍｉＲＮＡ発現構築物を含む、免疫エフェクター細胞が提供される。例えば、チェックポイント阻害遺伝子は、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、アデノシンＡ２ａ受容体、ＡＲＧ２（アルギナーゼ２）、Ｖｉｓｔａ、ＩＤＯ、ＦＡＳ、ＳＩＲＰアルファ、ＣＩＳＨ、ＳＨＰ−１、ＦＯＸＰ３、ＬＡＩＲ１、ＰＶＲＩＧ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＣＤ１６０、ＣＲＴＡＭ、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＣＤ２４４、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＴＧＦＲＢＲＩ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ１、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２、またはＧＵＣＹ１Ｂ３であり得る。いくつかの態様において、チェックポイント阻害遺伝子は、ＰＤ１である。いくつかの態様において、ＰＤ１標的配列は、配列番号５９、６０、または６１、好ましくは配列番号５９である。いくつかの態様において、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ＴＩＬＳ、ＴＣＲ操作されたＴ細胞、ＣＡＲ  Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫ／Ｔ細胞、Ｔ制御性細胞、単球、及びマクロファージからなる群から選択される。例えば、細胞は、ＣＡＲ  Ｔ細胞などのＴ細胞であり得る。いくつかの態様において、細胞は、ＨＩＶ感染細胞を標的としたＣＡＲを含む。さらなる態様において、細胞は、ＣＣＲ５及び少なくとも２つの免疫チェックポイント阻害遺伝子を標的とする１つ以上のｍｉＲＮＡ発現構築物を含む。したがって、細胞は、実施形態のｍｉＲＮＡ発現構築物のうちのいずれかを含むことができる。
【００３４】
なおさらなる実施形態において、ＣＣＲ５及び免疫チェックポイント阻害遺伝子を標的とするｍｉＲＮＡ配列を含む、発現構築物が提供される。例えば、ｍｉＲＮＡ配列は、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかによる配列であり得る。いくつかの態様において、構築物は、ＨＩＶ感染細胞を標的とするＣＡＲ配列などのＣＡＲ発現配列をさらに含む。
【００３５】
本明細書で使用される場合、特定の成分に関して「本質的に含まない」は、特定の成分が意図的に組成物に配合されておらず、及び／または汚染物質としてもしくは微量でのみ存在することを意味するために本明細書で使用される。組成物のいかなる意図しない汚染物質から生じる特定の成分の総量は、好ましくは０．０１％を下回る。特定の成分のいかなる量も標準の分析方法では検出することができない組成物が、最も好ましい。
【００３６】
本明細書で使用される場合、本明細書及び特許請求の範囲における、「ａ」または「ａｎ」は、１つ以上を意味してもよい。本明細書で使用される場合、本明細書及び特許請求の範囲における、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語と併せて使用される場合、「ａ」または「ａｎ」という単語は、１つ以上を意味してもよい。本明細書で使用される場合、本明細書及び特許請求の範囲における、「別の」または「さらなる」は、少なくとも第２の、またはそれ以上を意味してもよい。
【００３７】
本明細書で使用される場合、本明細書及び特許請求の範囲における、「約」という用語は、値を決定するために用いられるデバイス、方法についての誤差の固有の変動、または試験対象間に存在する変動を含むことを示すために使用される。
【００３８】
本発明の他の目的、特徴、及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の趣旨及び範囲内の様々な変更及び修正が、この詳細な説明から当業者に明らかになるため、詳細な説明及び具体的な実施例は、本発明のある特定の実施形態を示すが、例示説明のみの目的でのみ与えられることが理解されるべきである。
【００３９】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある特定の態様をさらに裏付けるために含まれる。本発明は、これらの図面のうちの１つ以上を参照することにより、本明細書で提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、よりよく理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】スペーサー配列は、ポリメラーゼＩＩプロモーター駆動ｍｉＲＮＡノックダウンに必要とされる。（ａ）この実験で使用されたｍｉＲＧＥベースの概略図。すべてのヘアピンは、ＣＣＲ５を標的とするように設計された。２つの異なるｐｏｌ  ＩＩ依存性プロモーター（ユビキチンＣ及び短伸長因子１）は、スペーサーとしてＧＦＰ配列の有無にかかわらず、ｍｉＲＧＥ発現（シングルまたはトリプルヘアピン）を駆動する。プロモーターの５’または３’におけるスペーサーの位置も調べた。（ｂ）ユビキチンＣプロモーターまたは短伸長因子１プロモーターで発現した構築物を、ＣＣＲ５を発現するＨｅＬａ細胞内に０．２の感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入した。形質導入集団（ｍＣｈｅｒｒｙ＋）対非形質導入集団（ｍＣｈｅｒｒｙ−）のＣＣＲ５発現のフローサイトメトリーによる決定：ＷＴ  ＨｅＬａ細胞（二重陰性）、ＨｅＬａ  Ｒ５細胞（ＣＣＲ５陽性）。Ｒ５＋対照ｍＣｈｅｒｒｙベクター；Ｒ５＋ＧＦＰスペーサー付きシングルｍｉｒＧＥヘアピン）。（ｂ’）形質導入（赤）集団及び非形質導入（青）集団における平均ＡＰＣ蛍光値を使用して、ｍｉＲＮＡ媒介性ＣＣＲ５ノックダウンを計算した。（ｃ）ＵＢＩプロモーター構築物によるＣＣＲ５の相対的発現を示す棒グラフ。（ｄ）ＥＦ１短プロモーター構築物によるＣＣＲ５の相対的発現を示すヒストグラム。（ｅ）棒グラフで計算された異なる構築物の連結効率（Ｅ）。Ｅ＝１である場合、連結されたヘアピンで相加効果が観察されない（効率は０％である）。Ｅ＝３である場合、ヘアピンの完全な相加効果が連結で観察される（効率は１００％である）。データは、３つの独立した実験の平均＋／−ＳＥＭを表す。
【図２】ｍｉＲＮＡベースのノックダウンの効率は、スペーサーに依存する。（ａ）ＣＣＲ５を標的とするシングルｍｉＲＧＥヘアピンベースの構築物は、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＭＧＳＴ−２（ミクロソームグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−２）、ｄＮＧＦＲ（切断型神経成長因子受容体）、ＨＯ−１（ヘムオキシゲナーゼ−１）、ＨＯ−１、及びＨ２Ｂ（ヒストン２Ｂ）のコード配列からまたは非コード配列（ＣＤ４遺伝子の最初のイントロン＝ｉＣＤ４１）から誘導され、ＨｅＬａ  Ｒ５細胞内で０．２のＭＯＩで形質導入した異なるスペーサーで設計された。ＦＡＣＳ免疫染色によって評価された、非形質導入集団と比較した形質導入集団におけるＣＣＲ５の発現を示すヒストグラム。ｍｉＲＧＥ構築物は、（ｂ）切断型ＧＦＰ（ＧＦＰ１及びＧＦＰ２）、または（ｃ）第１のイントロンのＣＤ４（ｉＣＤ４２及びｉＣＤ４３）を用いて設計され、ＨｅＬａ  Ｒ５細胞内で０．２のＭＯＩで形質導入された。ヒストグラムは、非形質導入集団と比較して、形質導入集団のＣＣＲ５発現のレベルを示す。データは、３つの独立した実験の平均＋／−ＳＥＭを表す。
【図３】スペーサー配列は、ｍｉＲＮＡヘアピン連結の相加効果を決定する。（ａ）スペーサーとしてＭＧＳＴ２、Ｈ２Ｂ、及びＧＦＰの効率を、ＨｅＬａ発現ＣＣＲ５細胞内のｍｉＲＧＥヘアピン連結（３つのヘアピン連結）で評価した。（ｂ）ヒストグラムは、ＧＦＰスペーサー（黒色の棒）、ＧＦＰの第２の部分（ＧＦＰ２）（斜線）、ＭＧＳＴ２スペーサー（濃い灰色の棒）、及びＨ２Ｂスペーサー（透明な灰色の棒）の残りの非形質導入集団と比較した形質導入集団のＣＣＲ５発現のレベルを示す。（ｃ）棒グラフは、図９の式で計算された、トリプルヘアピン構築物の連結効率を示す。連結効率の計算では、シングルｍｉＲＧＥヘアピンによるＣＣＲ５ノックダウン（ノックダウン効率（ＫＰ））、及びトリプルｍｉＲＧＥ連結効率（（ＣＰ））が考慮された。（ｄ〜ｅ）スペーサーとしてＭＧＳＴ２及びＧＦＰの効率も、ＮＡＤＰＨオキシダーゼサブユニットｐ２２ｐｈｏｘを標的とするトリプルヘアピン連結で比較された。ＱＰＣＲ（ｄ）による前骨髄球性白血病細胞株ＰＬＢ９８５で評価されたｐ２２ｐｈｏｘのｍＲＮＡレベル及びＡｍｐｌｅｘ  ｒｅｄアッセイによるＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性（ｅ）。データは、３つの独立した実験の平均＋／−ＳＥＭを表す。
【図４】細胞株及び組織外植片におけるＧＦＰスペーサーの翻訳非依存性活性。（ａ）開始コドン（ＡＴＧ）の３’にあるＧＦＰ  ｃＤＮＡのすべての可能なリーディングフレームに停止コドンがある、停止ＧＦＰスペーサーの設計。（ｂ）ＨｅＬａ  Ｒ５細胞は、ＧＦＰのコード形態及び非コード形態の両方を用いて、１超のＭＯＩで形質導入した。ＦＡＣＳヒストグラムは、形質導入細胞中のＧＦＰの蛍光を示す。停止ＧＦＰ構築物で形質導入された細胞のＧＦＰ蛍光は、対照（非形質導入ＨｅＬａ細胞）に相当した。（ｃ）停止ＧＦＰ配列のスペーサー活性は、ＨｅＬａＲ５細胞中での０．２のＭＯＩ形質導入後のＣＣＲ５発現に対するＦＡＣＳによっても評価した。ヒストグラムは、ＦＡＣＳ免疫染色によって評価されたように、非形質導入集団と比較して、形質導入集団のＣＣＲ５の発現を示す。データは、３つの独立した実験の平均＋／−ＳＥＭを表す。（ｄ）ｐ２２ｐｈｏｘ（１０６〜１０７のベクター粒子）を標的とする増加した量の停止ＧＦＰトリプルｍｉＲＧＥヘアピン連結で形質導入した新生児ラット蝸牛外植片の器官型培養。有毛細胞は、ミオシン７ａ（緑色）で染色され、効率的に形質導入された細胞は、マーカー遺伝子ｍＣｈｅｒｒｙ（赤色）を発現する。５日後、ウイルス遺伝子ＧＡＧ（ｅ）及びｐ２２ｐｈｏｘ（ｆ）のインビトロでの発現を、ｑＰＣＲによって評価した。ＴＵ＝変換単位。
【図５】スペーサー配列は、定常状態レベルを調節するが、ｍｉＲＧＥの半減期は調節しない。ＣＣＲ５を発現するＨｅＬａを、スペーサーとしてＧＦＰ、ＬＮＧＦＲ、ＭＧＳＴ２、またはｉＣＤ４１を含む単一のヘアピンベクターを形質導入した。（ａ）未処理（ｐｒｉ−ｍｉＲＧＥ）または（ｅ）成熟ｍｉＲＧＥレベルは、ｐｒｉ−ｍｉＲＧＥのフランキング領域（Ｆ１−Ｒ１）または成熟ｍｉＲＧＥの標的鎖（Ｆ２−Ｒ２）に一致するプライマーを使用したｑＰＣＲによって評価した。（ｂ）スペーサーとしてＧＦＰ、ＮＧＦＲ、及びＭＧＳＴ２を使用した未処理のｍｉＲＧＥレベルの代表的なｑＰＣＲ増幅プロット。スペーサーなしまたはスペーサーとしてｉＣＤ４１を使用した場合、ｍｉＲＧＥレベルは、検出閾値を下回っていたことに留意すべきである。ＧＡＰＤＨは、ハウスキーピング遺伝子として使用した。０．２のΔＲｎを閾値（赤い線）として定義した。（ｃ）棒グラフは、３つの独立した実験からの平均として、未処理のｍｉＲＧＥの相対レベルを示す。１．０に正規化されたｍｉＲＧＥ発現の最大値は、２８．１±０．３のＣｔ値に対応する。ＢＴ＝検出閾値を下回る。（ｄ）転写は、異なる時点（０〜２４０分）で、アクチノマイシンＤでブロックされ、スペーサーの効果は、未処理のｍｉＲＧＥ半減期で評価された。グラフは、経時的に相対的なｍｉＲＧＥの減衰を示し、各スペーサーの半減期を表に表す。（ｆ及びｇ）シングルヘアピン（ｆ）または異なるスペーサーによるトリプルヘアピン連結（ｇ）で形質導入したＨｅＬａ細胞からのｑＰＣＲによって評価された成熟ｍｉＲＧＥの定常状態レベルの比較。データは、３つの独立した実験の平均＋／−ＳＥＭを表す。
【図６】連結の最大化、及びマルチ標的ノックダウンの達成。（ａ）ＣＣＲ５を標的とする停止ＧＦＰトリプル連結（ｍｉｒＧＥ  ７−７−７）の効率を、ＣＣＲ５または第２の標的であるＧＦＰを標的とする第４または５のヘアピンを含む構築物と比較した。棒グラフは、ｑＰＣＲによって評価されたように、ＣＣＲ５（７）（ｂ）またはＧＦＰ（Ｇ）（ｄ）を標的とする成熟ｍｉＲＧＥの定常状態レベルと、ＨｅＬａ細胞中のＣＣＲ５発現（ｃ）またはＧＦＰ発現（ｅ）をノックダウンするこれらの構築物の能力を示す。ＣＣＲ５またはＧＦＰを標的とするシングルｍｉＲＧＥヘアピンを発現するベクターを、対照として使用した。（ｆ）スペーサーとして、停止ＧＦＰをＭＧＳＴ２に置き換えた場合、第４及び第５のヘアピンの活性は、シングルｍｉＲＧＥヘアピン対照（ｍｉＲＧＦＰ）または停止ＧＦＰ構築物の第５のヘアピンと比較して減少した。データは、３つの独立した実験の平均＋／−ＳＥＭを表す。
【図７】ノックダウン効率におけるスペーサーの長さ及び生物物理学的特徴の影響。ＣＣＲ５ノックダウンと（ａ）最小自由エネルギー／長さ、または（ｂ）この図に記載されているスペーサーのＧＣ含量との間の相関関係を示すプロット。
【図８】ＮＯＸ３活性を標的とする効率的なｍｉＲＧＥ連結の設計のための全体的な戦略。（ａ）候補ｓｉＲＮＡ配列は、コンピュータによる設計であり、標的ｍＲＮＡ（ＮＯＸ３、ｐ２２ｐｈｏｘ、またはＮＯＸＯ１）をノックダウンする能力で選択される。次いで、最も活性なｓｉＲＮＡ配列を、ｍｉＲＧＥ骨格にクローニングして、ＳＭＩＧを構築する。ＳＭＩＧ効率の検証は、同じ標的発現細胞株で検証される。（ｂ）ＮＯＸ３複合体（ＮＯＸ３、ｐ２２ｐｈｏｘ、及びＮｏｘＯ１）をコードするｍＲＮＡを標的とする８つのｓｉＲＮＡ候補の効力を、アンプレックスレッド法によってＮＯＸ３活性に関して評価した。（ｃ）ＮＯＸ活性における最も効率的な配列（ｐ２２ｐｈｏｘを標的にする）の効果は、ウエスタンブロットによって検証された。（ｄ〜ｅ）最も活性なｓｉＲＮＡ配列を使用して設計されたトリプルヘアピン連結ＳＭＩＧの効率は、ＱＰＣＲ（ｄ）またはＲＯＳの生成の測定（ｅ）のいずれかによって、ＮＯＸ３発現細胞株で確認された。
【図９】ｍｉＲＧＥヘアピンの連結効率の計算。（ａ）ＧＦＰ、ＭＧＳＴ２、及びＨ２Ｂスペーサーの連結効率（Ｅ）の計算を可能にする式を示す表。連結効率の計算では、シングルｍｉＲＧＥヘアピン（ノックダウン効力（ＫＰ））及びトリプルｍｉＲＧＥ連結（連結効力（ＣＰ））を使用したＣＣＲ５ノックダウンを検討した。（ｂ）ノックダウン効力（ＫＰ）、連結効率（Ｅ）、及びそれらの積、一般的なベクター効率をまとめた表。（ｃ）前者もヒストグラムに表す。
【図１０】内因性免疫チェックポイントノックダウンによる再指向性の免疫療法細胞を生成するための予言的な合成ミニ遺伝子の概略図。プロモーターは、組織特異的な発現を可能にするために選択され、スペーサー配列及び長さは、すべてのｍｉＲＮＡヘアピンの発現を可能にするために最適化されている。ｍｉＲＮＡヘアピンは、目的の特異的遺伝子（複数可）を標的し得るが、ＣＡＲまたはＴＣＲ配列は、特異的抗原に免疫療法細胞を標的化することができる。Ｔ２Ａは、切断ペプチド部位であり、ＬＮＧＦＲは、操作された細胞の選択を可能にするが、自殺遺伝子は、毒性の場合に細胞の迅速な除去を可能にし得る。
【図１１】最適化されたミニ遺伝子アーキテクチャは、循環細胞中のＣＣＲ５の持続的なインビボでノックダウンが可能になる。（Ａ）６匹のＮＧＳ新生児マウスに、ＣＣＲ５を標的とするトリプルヘアピン連結による形質導入後、２６０，０００個のヒトＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ）を生着させた。２８週齢で、ＣＣＲ５発現の分析のために血液を採取した。（Ｂ）非形質導入ＨＳＣを移植したマウス（左）または停止ＧＦＰ−７７７形質導入ＨＳＣを移植したマウス（中央）からのＣＤ４＋Ｔ細胞を示すＦＡＣＳプロット。右のプロットは、無関連抗体（非形質導入ＨＳＣ）で染色されたＣＤ４＋Ｔ細胞を示す。ｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞は、効果的に形質導入された細胞を示す。（Ｃ）無関連抗体（アイソタイプ）と比較した、単一の移植マウスにおける形質導入（ｍＣｈｅｒｒｙ＋）のＣＣＲ５の発現レベル、及び残りの非形質導入（ｍＣｈｅｒｒｙ＿）のＣＤ４  Ｔ細胞集団を示すヒストグラム。点線の右側の細胞は、高いＣＣＲ５発現ＣＤ４  Ｔ細胞を表す。（Ｄ）５匹の生着マウスにおける高ＣＣＲ５  ＣＤ４＋Ｔ細胞集団におけるＣＣＲ５発現レベルの比較。非形質導入ヒトＣＤ３４＋細胞を生着させたマウス（ｎ＝３）における非形質導入対照鎖。
【図１２】移植から２３週間後のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるヒト造血幹細胞の生着率。（ａ）非形質導入ＨＳＣを移植したマウス、または（ｂ）ＣＣＲ５を標的とするトリプルヘアピン連結で形質導入したＨＳＣを移植した６匹のマウスにおけるヒトＣＤ４５マーカーを発現するヒト循環白血球を示すＦＡＣＳプロット。生着率は、１２．４％〜４４％である。
【図１３】移植されたマウスの血液からのヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の同定。全リンパ球を、それらのＦＳＣ／ＳＳＣ座標に従って選択した（ａ）。ダブレット除去（ｂ）後に、ヒト白血球をヒトＣＤ４５染色で選択し（ｃ）、次いでヒトリンパ球をヒトＣＤ３抗体で選択した（ｄ）。最後に、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ヒトＣＤ４及びヒトＣＤ８抗体でＣＤ８＋Ｔ細胞から区別した（ｅ）。
【図１４】ＣＣＲ５に対して１〜３つのヘアピンｍｉｒＧＥ構築物を使用したＣＣＲ５下方制御の効率。（Ａ）それぞれが同一でＣＣＲ５を標的とする、１〜３つのヘアピンを示す治療用ミニ遺伝子のアーキテクチャ。（Ｂ）形質導入ＨｅＬａＲ５細胞（ｍＣｈｅｒｒｙ陽性集団）内の蛍光強度の減少を示す整列フローサイトメトリーヒストグラム。（Ｃ）対照ベクター（ｎ＝３）のみのｍＣｈｅｒｒｙで形質導入されたＨｅＬａＲ５細胞と比較した場合、相対的なＣＣＲ５発現レベル。
【図１５】ＰＤ１下方制御に対して最適な標的配列の同定。コンピュータ内での設計に基づいて同定された３つのＰＤ１標的配列は、シングルヘアピンｍｉｒＧＥ治療用ミニ遺伝子の構築に使用され、（Ａ）に示される実験計画に従って初代Ｔ細胞の形質導入のためにレンチウイルスベクターにパッケージ化された。（Ｂ〜Ｃ）ＰＤ１−１Ａ構築物が形質導入Ｔ細胞集団（ｍＣｈｅｒｒｙ＋）のＰＤ１発現の低下に最も効果的であることを示すフローサイトメトリーのドットプロット及びヒストグラム；（Ｄ〜Ｅ）ＰＤ１発現細胞及び発現レベルの相対的な減少を示す棒グラフ（ｎ＝４）。
【図１６】１つ〜３つのヘアピンｍｉｒＧＥ治療用ミニ遺伝子によるＰＤ１下方制御。ＰＤ１のｍｉｒＧＥ下方制御にアクセス可能な標的配列を特定した後、２つ及び３つのヘアピンミニ遺伝子（同じヘアピン配列）が構築された。次いで、構築物を、健康なドナーからの初代Ｔ細胞の形質導入のためにレンチウイルスベクターにパッケージングした（Ａ）。（Ｂ〜Ｃ）１つのヘアピン構築物と比較した場合の２及び３つのヘアピン構築物によるＰＤ１のノックダウンの増加を示すフローサイトメトリードットプロット及びヒストグラム。（Ｄ〜Ｅ）ＰＤ１発現細胞及びＰＤ１発現レベルの相対的な減少を示し、２つ及び３つのヘアピン構築物を使用したＰＤ１の同等のノックダウンを示す棒グラフ（ｎ＝３）。
【図１７】末端位置に２つのＣＣＲ５標的ヘアピンを有するｍｉｒＧＥ構築物を使用したＣＣＲ５下方制御の効率。（Ａ）ＰＤ１及びＧＦＰを標的とするヘアピンと比較したＣＣＲ５を標的とするヘアピンの位置を示す治療用ミニ遺伝子のアーキテクチャ。（Ｂ）形質導入ＨｅＬａＲ５細胞（ｍＣｈｅｒｒｙ陽性集団）内の蛍光強度の減少を示す整列フローサイトメトリーヒストグラム。（Ｃ）ｍＣｈｅｒｒｙのみのコントロールベクターで形質導入されたＨｅＬａＲ５細胞と比較した場合、相対的なＣＣＲ５発現レベル。
【図１８】ＨＬ−６０標的細胞との４日間の共培養後の抗ｃＫｉｔ  ＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＰＤ１ノックダウンの効果。（Ａ）ｍＣｈｅｒｒｙ陽性に基づく、ｍｉｒＧＥ（３つのヘアピン）を標的とするＰＤ１を有する抗ｃＫｉｔ  ＣＡＲＴ細胞の形質導入率、（Ｂ）ｍＣｈｅｒｒｙ発現に基づく、４日目のｍｉｒＧＥ発現ＣＡＲＴ細胞の増加、（Ｃ）ＨＬ−６０標的細胞との４日間の共培養後の抗ｃＫｉｔ  ＣＡＲＴ細胞の絶対細胞数、（Ｄ）４日間の共培養期間におけるＣＡＲ  Ｔ細胞の倍数増加（１日目の１００，０００個のＣＡＲ  Ｔ細胞から開始）、（Ｅ〜Ｆ）４日間の共培養期間後のフローサイトメトリードットプロット、オーバーレイ及びＣＡＲ  Ｔ細胞のヒストグラム、（Ｇ）ＰＤ１発現ＣＡＲ  Ｔ細胞の割合。
【図１９】初代Ｔ細胞中のＣＣＲ５及びＰＤ１のノックダウン。（Ａ〜Ｂ）４つのヘアピンｍｉｒＧＥ構築物（ＰＤ１に対して２つのヘアピン、続いてＣＣＲ５に対して２つのヘアピン）及び対照ベクター（ｍＣｈｅｒｒｙのみ）で形質導入された初代Ｔ細胞中のＣＣＲ５とＰＤ１の両方のノックダウンを独立して示す、フローサイトメトリードットプロット、オーバーレイ、及びヒストグラム、（Ｃ）非形質導入（ｍＣｈｅｒｒｙ陰性）Ｔ細胞集団及び４つのヘアピンで形質導入（ｍＣｈｅｒｒｙ陽性）Ｔ細胞集団をゲートとした、ＣＣＲ５対ＰＤ１集団のオーバーレイドットプロット。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
Ｉ．本発明の実施形態
本発明は、一般に、ｍｉＲＮＡ発現構築物に関する。本発明は、複数のｍｉＲＮＡの発現のための構築物に関する。本発明はさらに、プロモーターとｍｉＲＮＡ配列との間のスペーサー配列の使用に関する。いくつかの態様において、スペーサー配列は、ＧＦＰからのものであり得る。
【００４２】
ＩＩ．ＲＮＡ阻害
阻害性核酸は、細胞内での遺伝子の転写を阻害し得るか、または遺伝子転写産物の翻訳を防ぎ得る。阻害性核酸は、１６〜１０００ヌクレオチドの長さであり得、ある特定の実施形態において、１８〜１００ヌクレオチドの長さであり得る。ある特定の実施形態において、阻害性核酸は、目的の遺伝子に結合またはハイブリダイズする単離された核酸である。
【００４３】
阻害性核酸は、当該技術分野で公知である。例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及び二本鎖ＲＮＡは、米国特許第６，５０６，５５９号及び同第６，５７３，０９９号、ならびに米国特許公開第２００３／００５１２６３号、同第２００３／００５５０２０号、同第２００４／０２６５８３９号、同第２００２／０１６８７０７号、同第２００３／０１５９１６１号、及び同第２００４／００６４８４２号に記載されており、これらはすべて、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００４４】
１９９８年のＦｉｒｅ及び仲間によるＲＮＡｉの発見以来、生化学的機序は、急速に特徴付けられた。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、ＲＮＡａｓｅ  ＩＩＩファミリーリボヌクレアーゼであるＤｉｃｅｒによって切断される。このプロセスにより、約２１ヌクレオチドの長さのｍｉＲＮＡを得る。これらのｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡに誘導される多タンパク質ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれている。ＲＩＳＣは、相補領域の中央で標的ｍＲＮＡを切断する。哺乳動物細胞では、短いＲＮＡ断片（約２２ヌクレオチド）である関連ｍｉＲＮＡが見出される。不完全なヘアピンＲＮＡ構造を有するより長い（約７０ヌクレオチド）前駆体のダイサー媒介性切断後、ｍｉＲＮＡが生成される。ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ−タンパク質複合体（ｍｉＲＮＰ）に組み込まれ、標的ｍＲＮＡの翻訳抑制を引き起こす。
【００４５】
ＲＮＡｉの設計には、ｓｉＲＮＡの性質、サイレンシング効果の持続性、送達システムの選択などの考慮する必要のあるいくつかの要因がある。ＲＮＡｉ効果を生み出すために、生物に導入されるｍｉＲＮＡは、通常、エキソン配列を含む。さらに、ＲＮＡｉプロセスは、相同性に依存するため、遺伝子特異性配列ではなく相同配列間の相互干渉の可能性を最小限に抑えながら、遺伝子特異性を最大化するように配列を慎重に選択しなければならない。特に、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡの配列と標的遺伝子のヌクレオチド配列の一部との間で８０、８５、９０、９５、９８％、さらには１００％超の同一性を示す。標的遺伝子と約８０％未満同一である配列は、実質的に効果が低い。したがって、ｍｉＲＮＡと阻害する標的遺伝子との同一性が高ければ高いほど、関連のない遺伝子の発現が影響を受ける可能性は低くなる。
【００４６】
加えて、ｍｉＲＮＡのサイズは、考慮すべき重要なことである。いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも約１９〜２５ヌクレオチドを含み、標的遺伝子発現を調節することができるｍｉＲＮＡ分子に関する。本発明の文脈において、ｍｉＲＮＡは、特に、５００、２００、１００、５０、２５、２４、２３、または２２ヌクレオチド未満の長さである。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡは、約２５ヌクレオチド〜約３５ヌクレオチドの長さ、または約１９ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドの長さである。
【００４７】
ｍｉＲＮＡ媒介性遺伝子サイレンシングの有効性を改善するために、ｍＲＮＡの標的部位を選択するためのガイドラインがｍｉＲＮＡの最適設計のために開発された（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｗａｄｈｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。これらの戦略は、最大の遺伝子ノックダウンを達成するためにｓｉＲＮＡ配列を選択するための合理的なアプローチを可能にし得る。細胞及び組織へのｍｉＲＮＡの侵入を促進するために、プラスミド及びウイルスベクター、例えば、アデノウイルス、レンチウイルス、及びレトロウイルスを含む様々なベクターが使用されている（Ｗａｄｈｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【００４８】
阻害性核酸内で、核酸の成分は、全体を通して同じ型または同種である必要はない（例えば、阻害性核酸は、ヌクレオチド及び核酸またはヌクレオチド類似体を含んでもよい）。一般には、阻害性核酸は、二本鎖構造を形成し、二本鎖構造は、部分的にまたは完全に相補的である２つの別々の核酸から生じ得る。本発明のある特定の実施形態において、阻害性核酸は、単一の核酸（ポリヌクレオチド）または核酸類似体のみを含み、それ自体と相補することによって二本鎖構造を形成（例えば、ヘアピンループを形成）し得る。阻害性核酸の二本鎖構造は、その中のすべての範囲を含め、１６〜５００またはそれ以上の連続した核酸塩基を含み得る。阻害性核酸は、相補的な核酸（同じ核酸の別の部分であっても、別個の相補的核酸であってもよい）とハイブリダイズして二本鎖構造を形成する、１７〜３５個の連続した核酸塩基、より具体的には１８〜３０個の連続した核酸塩基、より具体的には１９〜２５個の核酸塩基、より具体的には２０〜２３個の連続した核酸塩基、または２０〜２２個の連続した核酸塩基、または２１個の連続した核酸塩基を含み得る。
【００４９】
ｍｉＲＮＡは、商業的供給源、天然の供給源から入手することができるか、または当業者に周知の多くの技法のいずれかを使用して合成することができる。例えば、予め設計されたｍｉＲＮＡの商業的供給源には、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳｔｅａｌｔｈＴＭ  Ｓｅｌｅｃｔ技術（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）、及びＱｉａｇｅｎ（登録商標）（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）が含まれる。本発明の組成物及び方法において適用され得る阻害性核酸は、任意の供給源によって、標的遺伝子の検証された下方制御因子であることが見出された任意の核酸配列であり得る。
【００５０】
いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ分子は、完全長タンパク質をコードする核酸配列のうちのいずれかの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドに対して、少なくとも７５、８０、８５、もしくは９０％相同であり、特に少なくとも９５％、９９％、もしくは１００％類似もしくは同一、または前述の間の任意のパーセンテージ（例えば、本発明は、７５％以上、８０％以上、８５％以上などを企図し、当該範囲は、その間のすべての整数を含むことを意図している）である。
【００５１】
ｍｉＲＮＡはまた、１つ以上のヌクレオチドの変更も含んでもよい。そのような変更は、例えば、１９〜２５ヌクレオチドのＲＮＡの末端（複数可）または内部（ＲＮＡの１つ以上のヌクレオチド）に対して、非ヌクレオチド材料の付加を含むことができる。ある特定の態様において、ＲＮＡ分子は、３’−ヒドロキシル基を含有する。本発明のＲＮＡ分子内のヌクレオチドはまた、天然に存在しないヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含む、非標準ヌクレオチドも含むことができる。二本鎖オリゴヌクレオチドは、修飾された骨格、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、または当該技術分野で公知の他の修飾された骨格を含有してもよいか、または非天然のヌクレオシド間結合を含有してもよい。ｓｉＲＮＡの追加的な修飾（例えば、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチド、１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、及び反転デオキシ脱塩基残基組み込み）は、米国特許出願公開第２００４／００１９００１号及び米国特許第６，６７３，６１１号（そのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる）において見出すことができる。集合的に、上記のそのような変更された核酸またはＲＮＡはすべて、修飾ｍｉＲＮＡと称される。
【００５２】
ＩＩ．クローニング、遺伝子導入、及び発現のためのベクター
ある特定の態様において、発現ベクターは、特定の遺伝子の発現を阻害する核酸などの目的の核酸を発現するために使用される。発現は、適切なシグナルがベクター内に提供され、宿主細胞における目的の遺伝子の発現を駆動する、ウイルス及び哺乳動物の両方の源からのエンハンサー／プロモーターなどの様々な調節要素を含むことを必要とする。宿主細胞におけるＲＮＡの安定性を最適化するために設計された要素も定義される。生成物を発現する永続安定細胞クローンを確立するための多数のドミナント薬物選択マーカーの使用のための条件も提供され、薬物選択マーカーの発現をポリペプチドの発現と関連付ける要素も提供される。
【００５３】
Ａ．調節要素
本出願の全体を通して、「発現構築物」または「発現ベクター」という用語は、配列をコードする核酸の一部またはすべてが転写され得る遺伝子産物をコードする核酸を含有する任意の型の遺伝子構築物を含むことを意味する。転写産物は、タンパク質に翻訳され得るが、翻訳される必要はない。ある特定の実施形態において、発現は、遺伝子の転写及び遺伝子産物へのｍＲＮＡの翻訳の両方を含む。他の実施形態において、発現は、目的の遺伝子をコードする核酸の転写のみを含み、すなわち、実施形態のＲＮＡ分子の場合と同様である。
【００５４】
ある特定の実施形態において、遺伝子産物をコードする核酸は、プロモーターの転写制御下にある。「プロモーター」は、遺伝子の特異的転写を開始するために必要とされる、細胞の合成機械または導入された合成機械によって認識されるＤＮＡ配列を指す。「転写制御下」という語句は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼの開始及び遺伝子の発現を制御するために、核酸に対して正しい位置及び方向にあることを意味する。
【００５５】
プロモーターという用語は、真核生物のＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ）Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩのための開始部位の周囲に密集した転写制御モジュールの群を指すために本明細書において使用される。プロモーターの組織化に関する思考の大部分は、ＨＳＶチミジンキナーゼ（ｔｋ）及びＳＶ４０初期転写単位のためのものを含む、いくつかのウイルスＰｏｌ  ＩＩプロモーターの分析に由来する。より最近の研究によって強化されたこれらの研究は、各々、約７〜２０ｂｐのＤＮＡからなり、転写活性化タンパク質または抑制タンパク質のための１つ以上の認識部位を含有している不連続の機能性モジュールから、プロモーターが構成されることを示している。
【００５６】
各プロモーター内の少なくとも１つのモジュールは、ＲＮＡ合成のための開始部位を位置決めするために機能する。これの最も周知の例は、ＴＡＴＡボックスであるが、哺乳動物末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のためのプロモーター及びＳＶ４０後期遺伝子のためのプロモーターのような、ＴＡＴＡボックスを欠くいくつかのプロモーターにおいては、開始部位自体に重なる不連続の要素が、開始の場所を固定するのを助ける。
【００５７】
付加的なプロモーター要素は、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、最近、多くのプロモーターが開始部位の下流にも機能性の要素を含有していることが示された。要素が反転されるかまたは互いに関して移動される場合に、プロモーター機能が保存されるように、プロモーター要素間の間隔は柔軟であることが多い。ｔｋプロモーターにおいて、プロモーター要素間の間隔は、５０ｂｐ間隔にまで増加し得、その後、活性が減退し始める。プロモーターに応じて、個々の要素は、転写を活性化するため、協同的にまたは独立に機能することができると考えられる。
【００５８】
いくつかの実施形態において、プロモーターは、短伸長因子１（ＥＦ１ｓ）プロモーターを含む。他の実施形態において、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長末端反復、ラットインスリンプロモーター、及びグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを使用して、目的のコード配列の高レベルの発現を得ることができる。発現のレベルが所定の目的のために十分であるならば、目的のコード配列の発現を達成するための、当該技術分野において周知である他のウイルスまたは哺乳動物細胞または細菌ファージのプロモーターの使用も、同様に企図される。
【００５９】
周知の特性を有するプロモーターを用いることにより、トランスフェクションまたは形質転換の後の目的のタンパク質の発現のレベル及びパターンを最適化することができる。さらに、特定の生理学的シグナルに応答して調節されるプロモーターの選択は、遺伝子産物の誘導可能な発現を可能にすることができる。表１及び２は、本発明の文脈において、目的の遺伝子の発現を調節するために使用され得るいくつかの調節要素を列挙する。この表は、遺伝子発現の促進に関与するすべての可能な要素を網羅することを意図したものではなく、単にその例示である。いくつかの態様において、本実施形態に従って使用するためのプロモーターは、構成的プロモーターなどの非組織特異的プロモーターである。
【００６０】
エンハンサーは、同じＤＮＡ分子上の遠隔の位置に位置するプロモーターからの転写を増大させる遺伝的要素である。エンハンサーは、プロモーターと非常に類似して構成される。すなわち、それらは、それらの各々が１つ以上の転写タンパク質に結合する多くの個別の要素から構成される。
【００６１】
エンハンサーとプロモーターとの間の基本的な区別は、作動的なものである。エンハンサー領域は全体として、遠位における転写を刺激することが可能でなければならない。これは、プロモーター領域またはその構成要素である要素に当てはまる必要はない。他方では、プロモーターは、ＲＮＡ合成の開始を、特定の部位において特定の配向性で方向付ける１つ以上の要素を有さなければならないのに対し、エンハンサーは、これらの特異性を欠く。プロモーター及びエンハンサーは、重複し、連続的であることが多く、極めて類似のモジュラー構成を有すると考えられることが多い。
【００６２】
以下は、発現構築物内の目的の遺伝子またはｍｉＲＮＡをコードする核酸と組み合わせて使用され得る、ウイルスプロモーター、細胞プロモーター／エンハンサー、及び誘導性プロモーター／エンハンサーの一覧である（表１及び表２）。加えて、プロモーター／エンハンサーの組み合わせ（真核生物プロモーターデータベースＥＰＤＢによる）も、目的の遺伝子またはｍｉＲＮＡの発現を駆動するために使用され得る。切断型プロモーターはまた、発現を駆動するために使用され得る。真核細胞は、適切な細菌ポリメラーゼが、送達複合体の一部として、またはさらなる遺伝子発現構築物として供給される場合、ある特定の細菌プロモーターからの細胞質内転写を支持し得る。
【表１−１】
2021519587.tif 000002
【表１−２】
2021519587.tif 000003
【表１−３】
2021519587.tif 000004
【表１−４】
2021519587.tif 000005
【表１−５】
2021519587.tif 000006
【表１−６】
2021519587.tif 000007
【表１−７】
2021519587.tif 000008
【表２−１】
2021519587.tif 000009
【表２−２】
2021519587.tif 000010
【表２−３】
2021519587.tif 000011
【００６３】
任意のｃＤＮＡ挿入物が使用される場合、典型的には、遺伝子転写産物の適切なポリアデニル化を達成するために、ポリアデニル化シグナルを含む。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の実施の成功にとって重大ではないと考えられ、ヒト成長ホルモン及びＳＶ４０ポリアデニル化シグナルなどの任意のそのような配列が使用され得る。しかしながら、いくつかの態様において、ポリアデニル化シグナル配列は、実施形態のベクターに含まれない。例えば、レンチウイルスベクター（３’ＬＴＲの前）にそのようなシグナル配列を組み込むと、結果として生じるレンチウイルス力価を低下させ得る。
【００６４】
スペーサー配列は、核酸構築物に含まれ得る。スペーサーの存在は、ｍｉＲＮＡのノックダウン効率を高めるように思われる（Ｓｔｅｇｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。スペーサーは、任意のヌクレオチド配列であり得る。いくつかの態様において、スペーサーは、ＧＦＰである。
【００６５】
また、ターミネーターも、発現カセットの要素として企図される。これらの要素は、メッセージレベルを増強し、カセットから他の配列へのリードスルーを最小化するのに役立ち得る。
【００６６】
Ｂ．選択可能なマーカー
本発明のある特定の実施形態において、細胞は、本発明の核酸構築物を含み、細胞は、マーカーを発現構築物内に含めることによって、インビトロ、エキソビボ、またはインビボにおいて同定することができる。そのようなマーカーは、同定可能な変化を細胞へと付与し、発現構築物を含有する細胞の容易な同定を可能にし得る。通常、薬物選択マーカーの組入れは、クローニング及び形質転換細胞の選択の一助となり、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン、及びヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子は、有用な選択可能なマーカーである。あるいは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などの酵素も使用することができる。また、免疫学的マーカーも使用することができる。使用される選択可能なマーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現することができる限りにおいて重要ではないと考えられる。選択可能なマーカーのさらなる例は、当業者に周知である。
【００６７】
ＩＩＩ．核酸分子及び発現ベクターの送達
ある特定の態様において、実施形態の核酸を送達するためのベクターを構築して、これらの因子を細胞内で発現させ得る。特定の態様において、以下の系及び方法は、所望の細胞型への核酸の送達において使用され得る。
【００６８】
Ａ．相同組換え
実施形態のある特定の態様において、実施形態の核酸分子をコードするベクターを、細胞へと、特定の様式で、例えば、相同組換えを介して導入することができる。幹細胞内で遺伝子を発現させるための現行の手法は、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）またはゲノム内にランダムに組み込まれるトランス遺伝子の使用を伴っている。これらのアプローチは、部分的には、ランダムに組み込まれたベクターが、内因性の遺伝子発現及び／またはトランス遺伝子発現のサイレンシングを活性化させるかまたは抑制し得るために、成功していない。ランダムな組込みと関連する問題は、標的ゲノム内の特異的な遺伝子座への相同組換えにより部分的に克服し得る。
【００６９】
一般組換えとしても知られている相同組換え（ＨＲ）は、ヌクレオチド配列が、ＤＮＡの類似であるかまたは同一な２つの鎖の間で交換される、生命のすべての形態において使用される一種の遺伝子組換えである。この技法は、１９８０年代半ば以降、哺乳動物細胞内のゲノム操作のための標準的な方法となっている。このプロセスは、ＤＮＡの物理的な切断及び最終的な再接合によるいくつかのステップを伴う。このプロセスは、天然において、潜在的に致命性のＤＮＡにおける二本鎖切断を修復するのに極めて広く使用されている。加えて、相同組換えは、真核生物が、精子及び卵子などの生殖細胞を作り出すプロセスである減数分裂中に、ＤＮＡ配列の新しい組み合わせをもたらす。これらのＤＮＡの新しい組み合わせは、子孫における遺伝子変異であって、時間経過において、集団が環境条件の変化へと進化的に適合することを可能とする遺伝子変異を表す。相同組換えはまた、細菌及びウイルスの異なる株及び種の間で遺伝物質を交換する、遺伝子の水平移動においても使用される。相同組換えはまた、遺伝子変化を標的生物へと導入するための、分子生物学における技法としても使用されている。
【００７０】
相同組換えは、標的ゲノムの修飾として使用することができる。哺乳動物細胞内の標準的なＨＲの効率は、処理される細胞のうちの１０−６〜１０−９であるに過ぎない（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，１９９０）。メガヌクレアーゼ、またはＩ−ＳｃｅＩなどのホーミングエンドヌクレアーゼの使用は、ＨＲの効率を増大させるために使用されている。天然のメガヌクレアーゼならびに標的特異性を改変した操作されたメガヌクレアーゼのいずれも、ＨＲの効率を増大させるために利用されている（Ｐｉｎｇｏｕｄ  ａｎｄ  Ｓｉｌｖａ，２００７、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。ＨＲの効率を増大させるための別の経路は、キメラエンドヌクレアーゼを、プログラム可能なＤＮＡ特異性ドメインで操作することである（Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合性ドメインを、ＦｏｋＩ（Ｄｕｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５、ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３０６０６において総説されている）などのＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの触媒性ドメインと融合させた、このようなキメラ分子の一例である。このような特異性分子の別のクラスは、ＦｏｋＩなどのＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの触媒性ドメインと融合させた、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合性ドメインを含む（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１：ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０００１５４）。
【００７１】
Ｂ．核酸送達系
当業者は、標準的な組換え法によりベクターを構築するのに十分に装備され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６を参照されたく、それらのいずれも、参照により本明細書に組み込まれる）。ベクターには、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、及び植物ウイルス）、及び人工染色体（例えば、ＹＡＣ）、例えば、レトロウイルスベクター（例えば、モロニーマウス白血病ウイルスベクター（ＭｏＭＬＶ）、ＭＳＣＶ、ＳＦＦＶ、ＭＰＳＶ、ＳＮＶなどに由来する）、レンチウイルスベクター（例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＢＩＶ、ＦＩＶなどに由来する）、それらの複製コンピテント形態、複製欠損形態、及びガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）形態を含むアデノウイルス（Ａｄ）ベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、サルウイルス４０（ＳＶ−４０）ベクター、ウシパピローマウイルスベクター、エプスタイン−バーウイルス、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ハーベイマウス肉腫ウイルスベクター、マウス乳房腫瘍ウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。
【００７２】
１．エピソームベクター
本発明のある特定の態様において、例えば、体細胞の再プログラミングするために、プラスミドまたはリポソームベースの染色体外（すなわち、エピソーム）ベクターの使用もまた、提供され得る。そのようなエピソームベクターは、例えば、ｏｒｉＰベースのベクター及び／またはＥＢＶタンパク質であるＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするベクターを含み得る。これらのベクターは、ＤＮＡの大型断片を細胞へと導入し、染色体外で維持し、細胞周期１周期当たり１回ずつ複製し、娘細胞へと効率的に分割し、免疫応答を実質的に誘発しないことを可能とし得る。
【００７３】
特に、ｏｒｉＰベースの発現ベクターを複製するのに必要とされる唯一のウイルスタンパク質であるＥＢＮＡ−１は、その抗原をＭＨＣクラスＩ分子上に提示するために必要とされるプロセシングをバイパスする効率的な機序を発生させているため、細胞性免疫応答を誘発しない（Ｌｅｖｉｔｓｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。さらに、ＥＢＮＡ−１は、いくつかの細胞株において、トランスにおいて、クローニングされた遺伝子の発現を増強するように作用して、クローニングされた遺伝子の発現を１００倍まで誘導し得る（Ｌａｎｇｌｅ−Ｒｏｕａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。最後に、そのようなｏｒｉＰベースの発現ベクターの作製は、安価である。
【００７４】
他の染色体外ベクターは、他のリンパ向性ヘルペスウイルスベースのベクターを含む。リンパ向性ヘルペスウイルスは、リンパ芽球（例えば、ヒトＢリンパ芽球）内で複製され、その天然の生活環の一部にわたりプラスミドとなる。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、「リンパ向性」ヘルペスウイルスではない。例示的なリンパ向性ヘルペスウイルスには、ＥＢＶ、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）；ヘルペスウイルスサイミリ（ＨＳ）、及びマレック病ウイルス（ＭＤＶ）が含まれるが、これらに限定されない。また、酵母ＡＲＳ、アデノウイルス、ＳＶ４０、またはＢＰＶなど、エピソームベースのベクターの他の供給源も企図される。
【００７５】
当業者は、標準的な組換え法によりベクターを構築するのに十分に装備され得る（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４を参照されたく、それらのいずれも、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００７６】
ベクターはまた、遺伝子送達及び／または遺伝子発現をさらにモジュレートするか、または他の形で有益な特性を標的細胞へともたらす、他の構成要素または機能性も含み得る。そのような他の構成要素は、例えば、細胞への結合または標的に影響を及ぼす構成要素（細胞型または組織特異的結合を媒介する構成要素を含む）；ベクター核酸の細胞による取込みに影響を及ぼす構成要素；ポリヌクレオチドの、取込みの後における細胞内の局在化に影響を及ぼす構成要素（核局在化を媒介する作用物質など）；及びポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼす構成要素を含む。
【００７７】
そのような構成要素はまた、ベクターによって送達される核酸を取り込み、発現させている細胞を検出または選択するために使用することができる検出可能な及び／または選択マーカーなどのマーカーも含み得る。そのような構成要素は、ベクターの天然の特色としてもたらされ得る（結合及び取り込みを媒介する構成要素または機能性を有するある種のウイルスベクターの使用など）か、またはベクターは、そのような機能性をもたらすように改変され得る。当該技術分野では、多種多様なそのようなベクターが公知であり、一般に利用可能である。ベクターを宿主細胞内で維持する場合、ベクターは、有糸分裂中に細胞によって自律的構造として安定的に複製させることができるか、または宿主細胞のゲノム内に組み込むこともできるか、または宿主細胞の核内もしくは細胞質内で維持させることができる。
【００７８】
２．トランスポゾンベースの系
特定の実施形態によれば、核酸の導入は、トランスポゾン−トランスポザーゼ系を使用し得る。使用されるトランスポゾン−トランスポザーゼ系は、周知のＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ、Ｆｒｏｇ  Ｐｒｉｎｃｅのトランスポゾン−トランスポザーゼ系（後者の記載については、例えば、ＥＰ１５０７８６５を参照）、またはＴＴＡＡ特異的トランスポゾン系ｐｉｇｇｙｂａｃｋ系であり得る。
【００７９】
トランスポゾンとは、単一の細胞のゲノム内の異なる位置へと転々と移動し得る、転位と呼ばれるプロセスのＤＮＡの配列である。そのプロセスにおいて、トランスポゾンは、変異を引き起こし、ゲノム内のＤＮＡの量を変化させ得る。トランスポゾンはまた、かつては、ジャンピング遺伝子とも呼ばれ、可動遺伝要素の例である。
【００８０】
様々な可動遺伝要素が存在し、これらは、それらの転位機序に基づいて群分けすることができる。クラスＩの可動遺伝要素またはレトロトランスポゾンは、まず、ＲＮＡへと転写され、次いで、逆転写酵素により再度ＤＮＡへと逆転写され、次いで、ゲノム内の別の位置に挿入されることによってそれ自体がコピーされる。クラスＩＩの可動遺伝要素は、トランスポザーゼを使用して、１つの位置から別の位置へと直接移動して、ゲノム内で「カットアンドペースト」される。
【００８１】
３．ウイルスベクター
組換えウイルスベクターの作製では、非必須遺伝子は、典型的には、異種（または非天然の）タンパク質または核酸の遺伝子またはコード配列で置き換える。ウイルスベクターとは、核酸、及び、可能なら、タンパク質を細胞に導入するためにウイルス配列を活用する一種の発現構築物である。ｐＨ依存的機序またはｐＨ非依存的機序を介して細胞に感染するかまたは細胞に侵入し、それらの遺伝子カーゴを宿主細胞ゲノムに組み込み、ウイルス遺伝子を安定的かつ効率的に発現させるある種のウイルスの能力により、ウイルスは、外来核酸を細胞（例えば、哺乳動物細胞）に転移させるための魅力的な候補物質となっている。本発明のある特定の態様の核酸を送達するために使用され得るウイルスベクターの非限定的な例を、以下に記載している。
【００８２】
レトロウイルスは、それらの遺伝子を宿主ゲノムに組み込み、大量の外来遺伝材料を移動させ、広範なスペクトルの種及び細胞型に感染し、特別な細胞株にパッケージングされるそれらの能力のために、遺伝子送達ベクターとして有望である（Ｍｉｌｌｅｒ，１９９２）。
【００８３】
レトロウイルスベクターを構築するためには、核酸を、ある種のウイルス配列の代わりに、ウイルスゲノムに挿入して、複製欠損ウイルスを生成させる。ビリオンを生成させるために、パッケージング細胞株は、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、及びｅｎｖ遺伝子を含有するが、ＬＴＲを伴わず、パッケージング構成要素が構築される（Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）。組換えプラスミドが、レトロウイルスのＬＴＲと一緒にｃＤＮＡを含有し、パッケージング配列を特別な細胞株導入する（例えば、例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）場合、パッケージング配列は、組換えプラスミド（すなわち、ベクターゲノム）のＲＮＡ転写物を、ウイルス粒子にパッケージングすることを可能とし、次いで、これを、培養培地中に分泌させる（Ｎｉｃｏｌａｓ  ａｎｄ  Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，１９８８、Ｔｅｍｉｎ，１９８６、Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）。次いで、組換えレトロウイルスを含有する培地を回収し、任意に濃縮し、遺伝子導入のために使用する。ベクター粒子表面を覆うために使用されるエンベロープタンパク質の向性に応じて、レトロウイルスベクターは、多種多様な細胞型に感染することが可能である。しかしながら、組み込み及び安定的な発現は、宿主細胞の分裂が必要である（Ｐａｓｋｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９７５）。
【００８４】
レンチウイルスは、共通のレトロウイルス遺伝子であるｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖに加えて、調節的または構造的機能を伴う他の遺伝子も含有する。当該技術分野では、レンチウイルスベクターが周知である（例えば、Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７、Ｂｌｏｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７、Ｇｉｒｙ−Ｌａｔｅｒｒｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、米国特許第６，０１３，５１６号及び同第５，９９４，１３６号を参照）。
【００８５】
組換えレンチウイルスベクターは、非分裂細胞に感染することができ、インビボ及びエクスビボでの両方の遺伝子移入及び核酸配列の発現に使用することができる。例えば、非分裂細胞に感染することができる組換えレンチウイルスであって、適切な宿主細胞にパッケージング機能を保有する２つの以上のベクター、すなわち、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ、ならびにｒｅｖ及びｔａｔもトランスフェクトする組換えレンチウイルスは、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，９９４，１３６号に記載されている。
【００８６】
Ｃ．核酸の送達
本発明によりプログラムされる細胞へのＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸の細胞の導入は、本明細書で記載される通り、または当業者に公知の通り、導入は、細胞を形質転換するために核酸を送達するための任意の適切な方法を使用し得る。このような方法には、例えば、エクスビボにおけるトランスフェクション（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９、Ｎａｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，１９８９）、マイクロインジェクション（Ｈａｒｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，１９８５、米国特許第５，７８９，２１５号、参照により本明細書に組み込まれる）を含む注入（米国特許第５，９９４，６２４号、同第５，９８１，２７４号、同第５，９４５，１００号、同第５，７８０，４４８号、同第５，７３６，５２４号、同第５，７０２，９３２号、同第５，６５６，６１０号、同第５，５８９，４６６号、及び同第５，５８０，８５９号、それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）；電気穿孔（米国特許第５，３８４，２５３号、参照により本明細書に組み込まれる；Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６、Ｐｏｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）；リン酸カルシウム沈殿（Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ，１９７３、Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ，１９８７、Ｒｉｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）；ＤＥＡＥ−デキストランに続く、ポリエチレングリコールの使用（Ｇｏｐａｌ，１９８５）；直接的な超音波によるローディング（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）；リポソームを媒介するトランスフェクション（Ｎｉｃｏｌａｕ  ａｎｄ  Ｓｅｎｅ，１９８２、Ｆｒａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９、Ｎｉｃｏｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７、Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０、Ｋａｎｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９、Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）及び受容体を媒介するトランスフェクション（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，１９８７、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，１９８８）；微粒子衝撃法（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）（ＰＣＴ公開第ＷＯ  ９４／０９６９９及び９５／０６１２８、米国特許第５，６１０，０４２号、同第５，３２２，７８３号、同第５，５６３，０５５号、同第５，５５０，３１８号、同第５，５３８，８７７号、及び同第５，５３８，８８０号、それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）；炭化ケイ素繊維による撹拌（Ｋａｅｐｐｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０、米国特許第５，３０２，５２３号及び同第５，４６４，７６５号、それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）；Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを媒介する形質転換（米国特許第５，５９１，６１６号及び同第５，５６３，０５５号、それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）；乾燥／阻害を媒介するＤＮＡの取り込み（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）、ならびにこのような方法の任意の組み合わせによる、ＤＮＡの直接的な送達が含まれるが、これらに限定されない。これらの技法などの技法の適用を介して、細胞小器官（複数可）、細胞（複数可）、組織（複数可）、または生物（複数可）を、安定的または一過性に形質転換することができる。
【００８７】
１．リポソームを媒介するトランスフェクション
本発明のある特定の実施形態において、核酸は、例えば、リポソームなどの脂質複合体内に封じ込めることができる。リポソームとは、リン脂質二重層膜及び内部の水性媒体を特徴とする小胞構造である。多層状リポソームは、水性媒体によって隔てられた複数の脂質層を有する。リポソームは、リン脂質を過剰な水溶液中に懸濁させる場合に自発的に形成される。脂質の構成要素は、閉止構造を形成する前に自己再配列し、水及び溶存させた溶質を脂質二重層の間に封じ込める（Ｇｈｏｓｈ  ａｎｄ  Ｂａｃｈｈａｗａｔ，１９９１）。また、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）またはＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）と複合させた核酸も企図される。使用されるリポソームの量は、リポソームの性質、ならびに使用される細胞の性質により変化させ得、例えば、細胞１００万〜１０００万個当たり約５〜約２０μｇのベクターＤＮＡが、企図され得る。
【００８８】
インビトロにおけるリポソームを媒介する核酸送達及び外来ＤＮＡの発現は、大きな成功を収めている（Ｎｉｃｏｌａｕ  ａｎｄ  Ｓｅｎｅ，１９８２、Ｆｒａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９、Ｎｉｃｏｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）。また、培養されたニワトリ胚細胞内、ＨｅＬａ細胞内、及び肝癌細胞内におけるリポソームを媒介する送達及び外来ＤＮＡの発現の実現可能性も裏付けられている（Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０）。
【００８９】
本発明のある特定の実施形態において、リポソームを、血球凝集性ウイルス（ＨＶＪ）と複合させることができる。これは、細胞膜との融合を容易とし、リポソームに封入されたＤＮＡの細胞への侵入を促進することが示されている（Ｋａｎｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。他の実施形態において、リポソームは、核内非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）と複合させるか、またはこれらと併せて用いることができる（Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。さらにさらなる実施形態において、リポソームは、ＨＶＪ及びＨＭＧ−１の両方と複合させるか、またはこれらと併せて用いることができる。他の実施形態において、送達ビヒクルは、リガンド及びリポソームを含み得る。
【００９０】
２．電気穿孔
本発明のある特定の実施形態において、核酸を、電気穿孔を介して、細胞小器官、細胞、組織、または生物に導入する。電気穿孔は、細胞及びＤＮＡの懸濁液の、高電圧の放電への曝露を伴う。レシピエント細胞は、機械的損傷によって形質転換をさらに受けやすくすることもできる。また、使用されるベクターの量は、使用される細胞の性質により変化させ得、例えば、細胞１００万〜１０００万個当たり約５〜約２０μｇのベクターＤＮＡが、企図され得る。
【００９１】
電気穿孔を使用する真核細胞のトランスフェクションは、大きな成功を収めている。この様式で、マウスプレＢリンパ球に、ヒトカッパ免疫グロブリン遺伝子がトランスフェクトされており（Ｐｏｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）、ラット肝細胞に、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子がトランスフェクトされている（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６）。
【００９２】
３．リン酸カルシウム
本発明の他の実施形態において、核酸は、リン酸カルシウム沈殿を使用して細胞に導入される。この技法を使用して、ヒトＫＢ細胞に、アデノウイルス５ＤＮＡがトランスフェクトされている（Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ，１９７３）。この様式ではまた、マウスＬ（Ａ９）細胞、マウスＣ１２７細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＶ−１細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、及びＨｅＬａ細胞に、ネオマイシンマーカー遺伝子がトランスフェクトされ（Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ，１９８７）、ラット肝細胞に、様々なマーカー遺伝子がトランスフェクトされた（Ｒｉｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。
【００９３】
４．ＤＥＡＥ−デキストラン
別の実施形態において、ＤＥＡＥ−デキストラン、続いてポリエチレングリコールを使用して、核酸は、細胞に送達される。この様式で、レポータープラスミドが、マウス骨髄腫細胞及び赤白血病細胞へと導入された（Ｇｏｐａｌ，１９８５）。
【００９４】
Ｄ．細胞の培養
一般に、本発明の細胞は、細胞の成長を持続させることが可能な、栄養物質に富む緩衝液である培養培地中で培養する。
【００９５】
本明細書に記載の方法に従って幹細胞を単離し、増殖させ、分化させるのに適する培養培地には、高ブドウ糖のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、Ｌｉｅｂｏｖｉｔｚ  Ｌ−１５、ＲＰＭＩ  １６４０、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、及びＯｐｔｉ−ＭＥＭ  ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．）が含まれるが、これらに限定されない。既知組成培地は、ヒト血清アルブミン、ヒトＥｘ  Ｃｙｔｅリポタンパク質、トランスフェリン、インスリン、ビタミン、必須アミノ酸、及び非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、グルタミン、及びマイトジェンを補充した、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（Ｇｉｂｃｏ）などの最小必須培地を含み、これもまた適する。本明細書で使用される場合、マイトジェンは、細胞の細胞分裂を刺激する薬剤を指す。薬剤は、細胞が細胞分裂を始めることを促し、有糸分裂を誘発する化学物質、通常はタンパク質の何らかの形態であり得る。一実施形態において、米国出願第０８／４６４，５９９号及びＷＯ９６／３９４８７において記載されている無血清培地などの無血清培地、ならびに米国特許第５，４８６，３５９号において記載されている「完全培地」が、本明細書に記載される方法による使用のために企図されている。いくつかの実施形態において、培養培地には、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ヒト自家血清、ヒトＡＢ型血清、またはヘパリンを補充した血小板に富む血漿（２Ｕ／ｍｌ）を補充する。細胞培養物は、例えば、培養液のｐＨを維持するように、５％〜１２％のＣＯ２雰囲気中で維持し、加湿雰囲気中３７℃でインキュベートし、８５％未満のコンフルエンシーを維持するように継代培養することができる。
【実施例】
【００９６】
ＩＶ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を裏付けるために含まれる。以下に続く実施例において開示された技術は、本発明の実行において良好に機能するように本発明者によって発見された技術を表し、したがって、その好適な実行のモードを構成すると考えられ得ることを、当業者に理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、多くの変更が開示される特定の実施形態においてなされるが、それでも同様なまたは類似する結果を得ることができることを理解するべきである。
【００９７】
実施例１−材料及び方法
ｍｉＲＮＡを含むプラスミド及びレンチウイルスベクターの構築。プラスミドを、以前に記載されたようにゲートウェイ系を使用して構築した（Ｍｙｂｕｒｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。ＭＧＳＴ２を除いて、スペーサー配列は、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ  ＩＩポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用したＰＣＲによって増幅され、順方向及び逆方向プライマーは、それぞれ、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ制限部位を持ち、消化／ライゲーションステップによってｐＥＮＴＲベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングされた（表３）。スペーサーのクローニングのために使用されるプライマーのほとんどは、５’末端にＡｔｔＢ１（順方向プライマー）及びＡｔｔＢ２（逆方向プライマー）の組換え部位を用いて設計された（表４）。
【００９８】
ＭＧＳＴ２スペーサーを、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ制限消化、続いてｐＥＮＴＲベクターへのライゲーションによって、ｐＯＴＢ７−ＭＧＳＴ２プラスミド（ｔｒａｎｓｏｍｉｃ）から得た。ｍｉｒＧＥヘアピンは、同じ戦略を用いて増幅し、順方向プライマー及び逆方向プライマーは、それぞれ、ＳｐｅＩ及びＢａｍＨＩ制限部位を有した。ｍｉＲＧＥヘアピンの要素を、表５に示し得る。ｍｉＲＧＥヘアピン連結体は、ｍｉＲＧＥプライマー上の制限酵素の異なる連結を使用して、またはＳｕｎ  ｅｔ  ａｌ，２００６のように平滑ライゲーションによって作製された。新しいｍｉＲＧＥの追加ごとに、ｐＥＮＴＲベクターを配列決定することによって検証した。スペーサー及びｍｉＲＧＥヘアピンを含む各クローンのアンプリコン部分は、配列決定によって系統的に検証された。ｍｉＲＧＥ  ＰＣＲテンプレート及びプライマーのオリゴは、Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ（Ｂａｌｇａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から得た。ＣＣＲ５、ＧＦＰ、及びＰ２２のｐｈｏｘを標的とするｍｉＲＧＥヘアピンテンプレート配列は、表６に入手可能である。
【００９９】
最終的なレンチベクタープラスミドは、ヒトＵＢＩプロモーター（ｐＥＮＴＲ−Ｌ４−ＵＢＩ−Ｌ１Ｒ）または短伸長因子１プロモーター（ｐＥＮＴＲ−Ｌ４−ＥＦｓ−Ｌ１Ｒ）を含むｐＥＮＴＲプラスミドと、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ）プロモーター上のｍＣｈｅｒｒｙマーカー遺伝子をコードするさらなる転写ユニットを含むレンチベクター目的カセット（ｐＣＷＸ−Ｒ４ｄＥＳＴ−Ｒ２−ＰＣ）とのＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を媒介する組換えによって生成された。ＧＦＰ標的配列−ＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴ（配列番号５７）−は、以前の刊行物から取り入れられた（Ｍｏｔｔｅｔ−Ｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。ヒトＣＣＲ５（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＮＭ＿０００５７９．３）標的配列（Ｔ７）５’ａＡＧＴＧＴＣＡＡＧＴＣＣＡＡＴＣＴＡＴＧＡ（配列番号５８）は、以前に使用された（Ｍｙｂｕｒｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【表３−１】
2021519587.tif 000012
【表３−２】
2021519587.tif 000013
【表３−３】
2021519587.tif 000014
【表４−１】
2021519587.tif 000015
【表４−２】
2021519587.tif 000016
【表４−３】
2021519587.tif 000017
【表５−１】
2021519587.tif 000018
【表５−２】
2021519587.tif 000019
【表６−１】
2021519587.tif 000020
【表６−２】
2021519587.tif 000021
【０１００】
レンチウイルスベクターの生成及び滴定。レンチウイルスベクターストックは、以前に記載されているように、特定のレンチベクタートランスファープラスミド、ｐｓＰＡＸ２プラスミドをコードするｇａｇ／ｐｏｌ、及びｐＣＡＧ−ＶＳＶＧエンベローププラスミドを用いたＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞の一時的なトランスフェクションを使用して生成された（Ｇｉｒｙ−Ｌａｔｅｒｒｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１ａ、Ｇｉｒｙ−Ｌａｔｅｒｒｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１ａ）。レンチベクター滴定は、ＨＴ−１０８０細胞の形質導入、続いて形質導入から５日後のｍｃｈｅｒｒｙ−陽性細胞のフローサイトメトリーによる定量化を使用して実施した（Ｇｉｒｙ−Ｌａｔｅｒｒｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１ａ、Ｇｉｒｙ−Ｌａｔｅｒｒｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１ａ）。
【０１０１】
細胞培養及びノックダウン分析。すべての細胞株は、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン、１％ストレプトマイシン、及び１％  Ｌ−グルタミンを補充した高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（Ｓｉｇｍａ）で培養した。ノックダウンアッセイごとに、形質導入から少なくとも５日後に、細胞を分析した。ＣＣＲ５ノックダウン研究では、本明細書ではＨｅＬａＲ５と名付けられた、高レベルのヒトＣＣＲ５を発現する、ＨｅＬａ由来のＴＺＭｂｌ細胞のサブクローン（ＡＩＤＳ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）を使用した。ＧＦＰノックダウンでは、１コピーのベクターでのＧＦＰ形質導入及びＧＦＰ陽性細胞の選別後に、同じ細胞を使用した。ＣＣＲ５の発現は、抗ヒトＣＣＲ５−ＡＰＣ抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  Ｃａｔ．５５０８５６）と、ＦＡＣＳ  Ｃｙａｎ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用したフローサイトメトリー分析を使用して検出した。ＧＦＰ発現は、ＧＦＰ蛍光中央値を使用して同じフローサイトメーターで評価された。簡潔に言えば、ＨｅＬａ細胞を、０．２のＭＯＩでｍｉＲＧＥベースのノックダウンベクターを用いて形質導入して、細胞当たりの高コピー数のベクターの存在を回避し、同等の条件を得た。ＧＦＰまたはＣＣＲ５の発現は、形質導入した細胞集団と残りの形質導入されていない細胞集団との間で比較し、形質導入されていない集団に対するＣＣＲ５発現のパーセンテージとして表した。
【０１０２】
リアルタイム定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応。コルチ器官の細胞または器官型外植片を採取し、製造元の指示に従ってＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙミニキットを使用してｍＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ濃度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐを使用して決定した。製造元の指示に従って、Ｔａｋａｒａ  ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ試薬キットを使用し、ｃＤＮＡ合成には５００ｎｇを使用した。リアルタイムＰＣＲは、ＡＢＩからの７９００ＨＴＳＤＳシステムでＳＹＢＲグリーンアッセイを使用して実行した。各プライマーの効率は、ｃＤＮＡの段階希釈液を用いて検証した。相対発現レベルは、２つのハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ及びＥＦ１ａ、ならびにＧＡＧレンチベクター遺伝子の幾何平均に対する正規化によって計算した。最高の正規化された相対量は、１．０の値として任意に指定した。倍率変化は、これらの正規化された量の平均の商から計算され、±ＳＥＭとして報告した。使用されたｑＰＣＲプライマーの配列を、表７に示す。
【表７−１】
2021519587.tif 000022
【表７−２】
2021519587.tif 000023
【０１０３】
成熟ｍｉＲＮＡ検出のための定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応。ＨｅＬａ  Ｒ５細胞は、異なるＳＭＩＧを担持するレンチベクターを用いて０．２のＭＯＩで形質導入した。形質導入集団（ｍＣｈｅｒｒｙを発現）は、ＦＡＣＳによって分類され、ベクター／細胞の単一コピーを持つ均一な細胞集団を得た。製造元の指示に従って、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ濃度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐを使用して決定した。逆転写には１００ｎｇのＲＮＡを使用した（ｍｉＲＣＵＲＹ  ＬＮＡ（商標）ｍｉＲＮＡ  ＰＣＲ、ポリアデニル化、及びｃＤＮＡ合成キット（ｅｘｉｑｏｎ））。逆転写の後、ＬＮＡ（商標）で強化されたプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅（ＥｘｉＬＥＮＴＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎマスターミックスキット（ｅｘｉｑｏｎ））を行った。成熟ｍｉＲＧＥの相対発現レベルは、２つのハウスキーピングｍｉＲＮＡ（Ｕ６及びＲＮＵ５Ｇ）の幾何平均に対する正規化することによって計算した。倍率変化は、これらの正規化された量の平均の商から計算され、±ＳＥＭとして報告した。ＬＮＡ（商標）で強化されたプライマーの配列は、製造元から提供されなかった。
【０１０４】
Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄアッセイによる活性酸素種の測定。ＰＬＢ−９８５細胞を、ＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養し、上記のように形質導入し、１．２５％ＤＭＳＯの存在下で５日間、好中球様細胞に分化した。次いで、１００ｎＭのホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）でＮＯＸ２を刺激した後、無傷のＰＬＢ−９８５細胞によって生成されたＨ２Ｏ２のレベルを、前述のようにＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ蛍光を使用して測定した（Ｊａｑｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。蛍光は、３７°ＣでＦｌｕｏＳＴＡＲ  ＯＰＴＩＭＡ、ＢＭＧ  ｌａｂｔｅｃｈ装置を使用して測定した。
【０１０５】
ラットのコルチ器官の器官型培養及び形質導入。生後３日目のＷｉｓｔａｒラットの首を切り、頭を矢状断面に切断し、脳を取り出した。２つの耳包を分離し、単対物双眼顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  ＳＭＺ８００，Ｊａｐａｎ）下での滅菌解剖のために、鉗子（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵＳＡ）を使用して、氷冷ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）に移した。骨を取り除いた後、透過性ポリエステルメンブレン（孔径０．４μｍ）を含むＴｒａｎｓｗｅｌｌ−Ｃｌｅａｒインサート（６ウェルフォーマット、Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＵＳＡ）に蝸牛を移した。製造元のプロトコルに従って、メンブレンをＣｅｌｌｔａｋ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＵＳＡ）でプレコーティングした。次いで、コルチ器官（ＯＣ）を、血管条及び蝸牛軸から分離し、有毛細胞を上に向けてインサートに播種した。解剖培地を慎重に除去し、１．５ｍｌの耳の培養培地：（ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）、０．０１％アンピシリン（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）、及び１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を、インサートメンブレン下の下部コンパートメントに添加した。翌日、インサートの培地を取り除き、それらを空のウェルに移した。形質導入のために、２００μｌの耳の培養培地を、ｐ２２ｐｈｏｘを標的とする停止ＧＦＰトリプルｍｉＲＧＥヘアピンレンチベクターの１０６、５×１０６、または１０７個の粒子を含む、７０μｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＵＳＡ）と一緒に外植片に添加した。３７℃及び５％  ＣＯ２での３０分のインキュベーション後、１．５ｍｌの耳の培養培地を下部コンパートメントに添加した。培地を、翌２日に新鮮な耳の培養培地と交換した。最初の形質導入から５日後、蝸牛外植片を、ｍＲＮＡ分離のためにトリプシンで剥離するか、または４％の免疫染色用パラホルムアルデヒドを用いて１０分間固定した。
【０１０６】
コルチ器官のラット器官型培養の免疫染色及び共焦点顕微鏡。細胞を、４％のパラホルムアルデヒドで１０分間室温で固定した。外植片を、（インサートメンブレンを切断することによって）２４ウェルプレートに移し、ＰＢＳで３回洗浄し、３％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００で３０分間透過した。蝸牛外植片を、２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．０１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００を含むブロッキングバッファーに室温で１時間浸した。外植片を、ブロッキング緩衝液中の抗ＭｙｏＶＩＩａ（１：５００、ウサギ；Ｐｒｏｔｅｕｓ，ＵＳＡ）抗体で４℃で一晩インキュベートした。翌日、組織を、ＰＢＳで３回すすぎ、ブロッキング緩衝液中の二次抗体抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８（１：５００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）で室温で２時間インキュベートした。外植片を、再度ＰＢＳで３回洗浄し、ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）を含むＦｌｕｏｒｏｓｈｉｅｌｄを使用してスライドガラスに装着した。標識された細胞は、ＣＣＤカメラ（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＰｌａｎａｐｏｃｈｒｏｍａｔ  １０ｘ／０．３  ＮＡ対物レンズを備えた共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７１０）で可視化した。
【０１０７】
ヒト化マウス白血球におけるＣＣＲ５のノックダウン。磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して臍帯血から単離されたヒトＣＤ３４を、活性化培地（２０ｎｇ／ｍＬの組換えヒト［ｒｈ］幹細胞因子（ＳＣＦ）、２０ｎｇ／ｍＬのｒｈ  Ｆｌｔ３−Ｌ、２０ｎｇ／ｍＬのｒｈインターロイキン−３［ＩＬ−３］、２０ｎｇ／ｍＬのｒｈ  ＴＰＯ１、１ｖ／ｖ％のペニシリン−ストレプトマイシン［Ｐｅｎｓｔｒｅｐ］を含むＣｅｌｌ  Ｇｒｏ培地）中で培養した。細胞を、プレ刺激のための活性化培地中の１．０＿１０６細胞／ｍＬで３７＿Ｃで＿２４時間、２４ウェルプレートに播種した。形質導入の翌日、Ｌｅｎｔｉｂｌａｓｔ  Ｂを、１：１，０００の希釈液中の培地に添加した。形質導入のために使用したＭＯＩは、５０であった。０．１＿１０６個の細胞を含む１つのウェルは、形質導入されず、陰性対照としての役割を果たした。ＣＤ３４細胞を、４８時間培養した後、形質導入対照を除いて採取した。移植用に指定された細胞を凍結し、液体Ｎ２中で新生児ＮＧＳマウスを移植するまで保存した。次いで、新生児ＮＧＳマウスに１Ｇｙを照射し、次いで２６０，０００個のＣＤ３４＋細胞を移植した。生後２３週目に、マウスからの末梢血を分析することによって生着を確認した。次いで、ＣＣＲ５発現を、２８週齢で、抗体：ＢｉｏＬｅｇｅｎｄからの、ｈｕＣＤ４５  ＦＩＴＣ（３０４００６）、ＣＤ３  ＡＦ７００（３００４２４）、ＣＤ４  ＰＥ−ＣＹ７（３００５１２）、ＣＤ８  ＢＶ４２１（３０１０３６）、及びＣＣＲ５  ＡＰＣ（３５９１２２）（またはイソコントロール＃４００６１１）を使用して調査した。
【０１０８】
スペーサー配列の最小自由エネルギーの予測。スペーサーの最小自由エネルギー（ＭＦＥ）は、ＲＮＡフォールドウェブサーバー（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｖｉｅｎｎａ、ｒｎａ．ｔｂｉ．ｕｎｉｖｉｅ．ａｃ．ａｔ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＲＮＡＷｅｂＳｕｉｔｅ／ＲＮＡｆｏｌｄ．ｃｇｉのワールドワイドウェブで利用可能）を使用して計算した。スペーサー間のＭＦＥを比較できるように、得られた値をスペーサーの長さで除した。
【０１０９】
トリプルヘアピン連結効率の計算。トリプルヘアピン構築物（Ｅ）の連結効率は、式Ｅ＝ｌｎ（ＣＰ）／ｌｎ（ＫＰ）（式中、ＫＰ及びＣＰは、それぞれ、シングルヘアピン構築物及びトリプルヘアピン構築物で得られたＣＣＲ５のノックダウンである）に従って計算した。Ｅ＝３である場合、ヘアピンの完全な相加効果が連結で観察される。Ｅ＝１である場合、トリプルヘアピン構築物は、シングルヘアピン構築物と同じくらい効率的であり、ヘアピン連結の相加効果は、観察されない。
【０１１０】
統計分析。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して、統計分析を行った。一元配置分散分析と、それに続くボンフェローニの多重比較検定、及びｔ検定（ノンパラメトリック、マン・ホイットニーＵ検定）。
【０１１１】
実施例２−結果
スペーサー配列は、ポリメラーゼＩＩプロモーター駆動型ｍｉＲＮＡを媒介とする標的遺伝子ノックダウンに必要である。ｍｉＲＧＥベースのノックダウンを最適化し、スペーサーの役割をよりよく理解するために、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）配列を、レンチウイルスベクターのｍｉＲＧＥヘアピン配列の５’または３’末端に配置した（図１ａ）。ＣＣＲ５（Ｒ５細胞）を発現するＨｅＬａ細胞は、０．２のＭＯＩで形質導入され、トランス遺伝子／細胞の１つを超えるコピーを有する統計的確率が低下した（図１ｂ）。ＣＣＲ５を標的とするシングルヘアピン及びトリプルヘアピンの両方を使用した。２つの異なるｐｏｌＩＩ依存性プロモーター：ユビキチンプロモーター（ＵＢＩ）及び伸長因子１プロモーターのスプライシングされたバージョン、ＥＦ２５（ｃｇａｔｇｇｃｔｃｃｇｇｔｇｃｃｃｇｔｃａｇｔｇｇｇｃａｇａｇｃｇｃａｃａｔｃｇｃｃｃａｃａｇｔｃｃｃｃｇａｇａａｇｔｔｇｇｇｇｇｇａｇｇｇｇｔｃｇｇｃａａｔｔｇａａｃｃｇｇｔｇｃｃｔａｇａｇａａｇｇｔｇｇｃｇｃｇｇｇｇｔａａａｃｔｇｇｇａａａｇｔｇａｔｇｔｃｇｔｇｔａｃｔｇｇｃｔｃｃｇｃｃｔｔｔｔｔｃｃｃｇａｇｇｇｔｇｇｇｇｇａｇａａｃｃｇｔａｔａｔａａｇｔｇｃａｇｔａｇｔｃｇｃｃｇｔｇａａｃｇｔｔｃｔｔｔｔｔｃｇｃａａｃｇｇｇｔｔｔｇｃｃｇｃｃａｇａａｃａｃａｇｇｔｇｔｃｇｔｇａｃｇｃｇ；配列番号４５）を使用した。ＵＢＩプロモーターを使用した場合、スペーサーが存在しないため、３つのヘアピンを使用した場合でも、ＣＣＲ５ノックダウンは完全に排除した（図１ｃ）。
【０１１２】
スペーサーの効果は、その位置によって異なる。プロモーターとｍｉＲＮＡの間にスペーサーがあると、シングルヘアピンで効率的なＣＣＲ５ノックダウンが観察され、連結されたトリプルヘアピン構築物で著しく強化された。スペーサーを、ｍｉＲＮＡ遺伝子の３’位置に配置すると、シングルヘアピンは、ＣＣＲ５ノックダウン効率の低下を示したが、連結体のノックダウン効果の増加は完全に失われた（図１ｃ及び１ｅ）。状況は、ＥＦプロモーターではわずかに異なった（図１ｄ）。シングルヘアピンの有効性は、スペーサーの存在に依存しなかったが、スペーサーがない場合、トリプル連結の相加効果は観察されなかった（図１ｅ）。対照的に、プロモーターとヘアピンの間のスペーサーでは、トリプル連結の最大効果が達成されたが、３’のスペーサーではそれほど顕著な効果は観察されなかった。
【０１１３】
まとめると、２つのタイプのｐｏｌＩＩ依存性プロモーターを介して効率的にノックダウンを推進するには、スペーサー配列（ｍｉＲＮＡの５’に優先的に位置している）が必要であることをデータが示す。スペーサーはまた、ヘアピン連結の相加効果にも必要である（図１ｅ）。
【０１１４】
ｍｉＲＮＡベースのノックダウンの効率は、スペーサー配列に依存する。いくつかのコード及び非コードスペーサー配列の効力を評価した（図２ａ；表８）。コード配列を持つ５つのｍｉＲＧＥミニ遺伝子が、スペーサー：緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ミクロソームグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−２（ＭＧＳＴ２）、短縮型神経成長因子受容体（ｄＮＧＦＲ）、ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）、及びヒストン２Ｂ（Ｈ２Ｂ）ｃＤＮＡとして生成された（表９）。ＣＤ４遺伝子の第１のイントロンであるｉＣＤ４は、非コードスペーサー配列として使用された。それぞれのミニ遺伝子を担持するレンチベクターを使用して、ＨｅＬａＲ５細胞を形質導入した。ＣＣＲ５タンパク質の有意なノックダウンが、すべてのコード配列（ＭＧＳＴ、ＬＮＧＦＲ、ＨＯ−１、及びＨ２Ｂスペーサー）を持つ形質導入細胞集団で観察された。ＧＦＰ配列スペーサーは、ＣＣＲ５の最高のノックダウンをもたらした。最もパフォーマンスの悪いスペーサーは、ｉＣＤ４及びＨ２Ｂ（１０％未満のノックダウン）であったが、他のコード配列は中程度の効率をもたらした（図２ａ）。
【０１１５】
【表８−１】
2021519587.tif 000024
【表８−２】
2021519587.tif 000025
【表９−１】
2021519587.tif 000026
【表９−２】
2021519587.tif 000027
【表９−３】
2021519587.tif 000028
【表９−４】
2021519587.tif 000029
【表９−５】
2021519587.tif 000030
【表９−６】
2021519587.tif 000031
【表９−７】
2021519587.tif 000032
【表９−８】
2021519587.tif 000033
【表９−９】
2021519587.tif 000034
【表９−１０】
2021519587.tif 000035
【０１１６】
スペーサー配列は、ｍｉＲＮＡヘアピン連結の相加効果を決定する。ベクターの連結効力におけるスペーサー配列の役割を確認するために、マルチヘアピン構築物を異なるスペーサー（ＧＦＰ、ＧＦＰ２、ＭＧＳＴ２、またはＨ２Ｂ）で設計した（図３ａ）。ＧＦＰまたはＧＦＰ２配列がスペーサーとして使用された場合、３つのヘアピンの連結により、シグナルヘアピン構築物と比較して、ＣＣＲ５ノックダウンが劇的に向上した（６０％から８５％のＣＣＲ５ノックダウン）（図３ｂ及び３ｃ）。ＭＧＳＴ２をスペーサーとして使用した場合、実質的に異なる結果を得た。シングルヘアピンでは、ＧＦＰ配列ほど強力ではないが、ＭＧＳＴ２配列は良好なスペーサー活性を示した（図２）。しかしながら、スペーサーとしてＭＧＳＴ２を使用した場合（連結効率はほぼ１である）、３つのヘアピン連結の相加効果は観察されなかった（図３ｃ）。したがって、連結活性と比較して、スペーサー効力とシグナルヘアピンとの間には解離がある。前者は、ＧＦＰ及びＭＧＳＴ２に匹敵する範囲にあるが、後者は、スペーサーとしてのＭＧＳＴ２には実質的にない（図３ｃ）。スペーサーとしてＨ２Ｂを使用した場合は、逆のことが観察され、シングルヘアピン（約１０％）を使用した場合、かなり不十分なノックダウンが観察され、一方、トリプルヘアピン構築物を使用したＣＣＲ５ノックダウン（４０％のノックダウン）によって判断されるように、改善された連結効果があった（図３ｂ及び３ｃ）。この観察がＣＣＲ５以外の遺伝子を標的とするヘアピンにも適用するかどうかを調査するために、スペーサー配列としてＭＧＳＴ２またはＧＦＰのいずれかを使用してＮＯＸサブユニットｐ２２ｐｈｏｘ（ＣＹＢＡ）を標的とするトリプルヘアピンＳＭＩＧを構築した（図３ｄ及び３ｅ；図７も参照）。これらの構築物を使用して、前骨髄球性白血病細胞株ＰＬＢ−９８５を形質導入し、好中球様表現型に分化すると、すべての食細胞ＮＡＤＰＨオキシダーゼサブユニット（ＮＯＸ２及びｐ２２ｐｈｏｘ／ＣＹＢＡを含む）を発現し、このＮＡＤＰＨオキシダーゼを介して活性酸素種（ＲＯＳ）を生成する。ＭＧＳＴ２スペーサー／トリプルヘアピン構築物を使用して、ＣＹＢＡのｍＲＮＡレベルは５０％減少したが、ＧＦＰスペーサーＣＹＢＡ  ｍＲＮＡノックダウンでは、８０％超であった（図３ｄ）。食細胞ＮＡＤＰＨオキシダーゼの機能的活性、すなわちＲＯＳの生成が評価された（図３ｅ）。ＲＯＳの生成は、ｐ２２ｐｈｏｘを標的とするＧＦＰトリプルヘアピン連結では、６０％抑制された。対照的に、スペーサーとしてＧＦＰをＭＧＳＴ２に置き換えることによって、ＲＯＳの生成は、２０％以下抑制された。これらのデータは、シングルヘアピンを用いて効率的なノックダウンが見られるが、ＭＧＳＴ２スペーサーの連結活性が低いことを確認する（図３ｃ及び図８）。これらの実験は、スペーサー配列がシングルヘアピンを用いたノックダウン効率に必要であるだけでなく、相加的な連結効果、つまり連結効力にも必要であることを実証する。
【０１１７】
細胞株及び組織外植片におけるＧＦＰスペーサーの翻訳に依存しない活性。試験された候補の中で、ＧＦＰ配列は、シングルヘアピンによるノックダウン効力及び連結効力の両方に関して、スペーサーとして最も効率的であった。ＣＤ４イントロンは不活性であったが、他のコード配列もいくつかの有意なノックダウン活性をもたらした。ＳＭＩＧの最適な機能のためにＧＦＰのタンパク質翻訳が必要かどうかを試験するために、考えられる各リーディングフレームにおいて停止コドンを含む構築物を生成した（図４ａ）。停止ＧＦＰで形質導入された細胞では、蛍光は検出されなかった（図４ｂ）。停止ＧＦＰスペーサーによって達成されたＣＣＲ５ノックダウンは、標準ＧＦＰスペーサーによるノックダウンに相当した（シングルヘアピン構築物を用いて約５０％）。これらの結果は、スペーサーのタンパク質翻訳がＳＭＩＧの機能にとって重要ではないことを示しており、異種遺伝子ＧＦＰの翻訳につながらず、したがって将来的な臨床使用に対応する非常に効率的なスペーサーを提供する。
【０１１８】
停止ＧＦＰスペーサーを含む最適化されたＳＭＩＧの治療可能性を実証するために、治療に応用できる可能性がある、内耳ＮＡＤＰＨオキシダーゼＮＯＸ３のノックダウンが検討された。この活性酸素種（ＲＯＳ）を生成するＮＡＤＰＨオキシダーゼは、内耳の損傷につながるＲＯＳの関連源であることが示されているため、内耳保護の魅力的なノックダウン標的である２６。ＵＢＩプロモーターの制御下で、ＮＯＸ３サブユニットｐ２２ｐｈｏｘを標的とし、スペーサーとして停止ＧＦＰを用いた、トリプルｍｉＲＧＥ連結が、設計された。形質導入細胞を同定するために、ＰＧＫプロモーターの制御下で、ｍＣｈｅｒｒｙコード配列も構築物に含まれた。新生児ラット蝸牛外植片に、この構築物を形質導入した（図４ｄ）。レンチウイルスＧＡＧ遺伝子を検出及び定量するために、ＲＴ  ＰＣＲを使用したベクター形質導入の用量反応（図４ｅ）。形質導入細胞は、ｍＣｈｅｒｒｙ赤色蛍光によっても同定され得る（図４ｄ；緑色蛍光は有毛細胞のマーカーである）。少数の有毛細胞が、実験条件下でベクターで形質導入されたが、結果はｐ２２ｐｈｏｘ  ｍＲＮＡの用量依存的な減少を示し、第２の臨床的に関連する標的遺伝子を持つｍｉＲＧＥベクターの効率を確認した（図４ｆ）。
【０１１９】
ヒト造血幹細胞に由来する循環白血球におけるＣＣＲ５の持続したｍｉＲＮＡ媒介性ノックダウン：インビボでの効力及び停止ＧＦＰスペーサーを含む最適化されたＳＭＩＧの治療可能性をさらに実証するために、別の有望な臨床応用、すなわち、インビボでのＨＩＶ補助受容体ＣＣＲ５のノックダウンを検討した（図１１）。この目的のために、ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ）に、伸長因子プロモーターの制御下で、ＣＣＲ５を標的とし、スペーサーとして停止ＧＦＰを用いた、トリプルｍｉＲＧＥ連結を形質導入した。形質導入細胞を同定するために、ＰＧＫプロモーターの制御下で、ｍＣｈｅｒｒｙコード配列も構築物に含まれた。形質導入後、ＨＳＣは、照射後にＮＧＳ（ＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマ）マウスに生着し（図１１Ａ）、２３週間後、１２．４％〜４４％の間で変動する生着率を達成した（図１２）。生着から２８週間後、循環血液中のＣＣＲ５発現を検討した（図１１、１３）。結果は、形質導入されていない対照及びｍＣｈｅｒｒｙ陰性細胞におけるＣＣＲ５の発現に関して２種類のＣＤ４＋Ｔ細胞を明らかにした（図１１Ｂ及び１１Ｃ）。高いＣＣＲ５を発現するＣＤ４  Ｔ細胞の割合は、６匹の生着された動物のうち５匹で平均してほぼ２５％となる１０％未満から５０％以上まで変動した（図１１Ｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ及び非形質導入対照を参照）。６匹の生着した動物のうちの１匹では、高いＣＣＲ５  ＣＤ４  Ｔ細胞集団は、実質的には存在せず、したがって図１１Ｄでは考慮されなかったことに留意すべきである。重要なことには、ＣＣＲ５発現レベルの劇的な減少が、ｍＣｈｅｒｒｙ＋形質導入集団で観察された（図５Ｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ＋）。
【０１２０】
スペーサー配列は、定常状態レベルを調節するが、ｍｉＲＧＥの半減期は調節しない。ＰＣＲプライマーは、未処理のｍｉＲＧＥヘアピン（ｐｒｉ−ｍｉＲＧＥ）（図５ａ）または成熟ｍｉＲＧＥ（図５ｅ）を定量化するために設計された。図５ｂ及びｃに見られるように、ｍｉＲＧＥ  ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの相対的発現は、ＭＧＳＴ−２またはＮＧＦＲベースのベクターで形質導入された細胞よりも停止ＧＦＰスペーサーで形質導入された細胞で有意に強力であった。スペーサーがない場合にも見られるように、ｍｉＲＧＥの発現は、スペーサーとしてＣＤ４の第１のイントロンを用いた検出閾値を下回っていたことに留意すべきである。ｍｉＲＧＥの定常状態レベルのこの増加が転写産物の半減期の延長によるものかどうかを検討するために、ＨｅＬａ  Ｒ５細胞を、アクチノマイシンＤで異なる期間中に処理して、転写をブロックした（図５ｄ）。ｍＲＮＡを採取し、ｍｉＲＧＥ発現レベルを、異なる時点でのｐｒｉ−ｍｉＲＧＥのｑＰＣＲによって評価した。結果は、ＮＧＦＲ及びＭＧＳＴスペーサーを用いて見られたのと同様に、停止ＧＦＰスペーサーを用いて推定された約３０分間のｍｉｒＧＥ半減期を示した（図５ｄ）。成熟ｍｉＲＧＥの定常状態レベルは、停止ＧＦＰスペーサーが成熟ｍｉＲＧＥの最良の発現を可能にすることを実証した（図５ｆ）。また、この観察は、停止ＧＦＰスペーサー及びＭＧＳＴ２スペーサーをトリプルヘアピン連結と比較した場合にも有効であった（図５ｇ）。興味深いことに、前駆体及び成熟ｍｉＲＧＥの両方のレベルは、同様に、スペーサー配列によって影響を受けた。これらの結果は、スペーサー活性がｍｉＲＮＡ転写産物の安定性にもプロセシングにも関連していないことを強く示唆している。むしろ、これらの結果は、スペーサーがＳＭＩＧの転写に関連している機序を示唆している。
【０１２１】
連結の最大化、及びマルチ標的遺伝子ノックダウンの達成。シングルプロモーター駆動型ｍｉＲＮＡクラスターを備えたマルチ標的遺伝子ノックダウンベクターの可能性をさらに検討するために、ＣＣＲ５または第２の標的遺伝子（この場合はＧＦＰ）を標的とする、第４及び第５のｍｉｒＧＥヘアピンを、トリプルＣＣＲ５構築物に添加した（図６ａ）。ヘアピンの連結により、連結に存在するヘアピンの数の関数として成熟ｍｉＲＧＥの定常状態レベルが大幅に増加した（図６ｂ）。興味深いことに、最高の成熟ｍｉＲＧＥレベルをもたらしたが、ＣＣＲ５を標的とする第４のヘアピンの添加は、ｍｉＲＧＥによるＣＣＲ５標的部位の飽和の可能性を主張するトリプルヘアピン構築物と比較して、ＣＣＲ５の発現はさらに減少しなかった（図６ｃ）。一方、第４のヘアピンを、ＧＦＰを標的とするヘアピンと置き換えた場合、ＣＣＲ５ノックダウンが最大レベル（約９０％）にとどまっただけでなく、ＧＦＰ蛍光も大幅に減少した（図６ｃ）。したがって、４番目の位置にあるヘアピンはＣＣＲ５ノックダウンをさらに向上させなかったが、ＧＦＰノックダウン（図６ｄ）及び成熟ｍｉＲＧＥ−ＧＦＰの定常状態レベル（図６ｅ）を見ても分かるように、明らかに効率的に処理された。興味深いことに、ＧＦＰを標的とする第５のヘアピンは、依然としてＣＣＲ５のノックダウンに影響を与えることなく、第４のヘアピンと同様のノックダウン効率及び成熟ｍｉＲＧＥのレベルを示した。さらに重要なことには、ｍｉＲＧＥ＿ＧＦＰの定常状態レベル、ならびに第４または第５のｍｉＲＧＥヘアピンによって媒介されるＧＦＰノックダウンは、ＧＦＰを標的とするシングルｍｉＲＧＥヘアピンで達成されたノックダウンに相当した。したがって、プロモーターとしてＵＢＩ、及びスペーサーとして停止ＧＦＰを使用した場合、最大５つの連結ヘアピンを使用しても活性の損失はなかった。しかしながら、５つのヘアピン連結の効率は、スペーサーに強く依存した。実際、スペーサーとしてＭＧＳＴ２を使用すると、第４及び第５のヘアピンＧＦＰノックダウン効力が劇的に低下した（図６ｆ）。これらのデータは、最適化されたＳＭＩＧアーキテクチャが、シングルプロモーター駆動型のマルチヘアピン構築物に対する効率的なマルチ標的遺伝子ノックダウンを可能にすることを実証する。
【０１２２】
実施例３−免疫チェックポイントノックダウンのための仮想的な合成ミニ遺伝子
内因性免疫チェックポイントノックダウンによる免疫療法細胞の再方向付け。免疫チェックポイントをノックダウンするために使用され得る仮想的な合成ミニ遺伝子の概略図を、図１０に示す。合成ミニ遺伝子は、プロモーター配列、スペーサー配列、少なくとも２つのｍｉＲＮＡヘアピン、及びキメラ抗原受容体配列、またはＴ細胞受容体配列からなる。合成ミニ遺伝子は、任意に、低親和性神経成長因子受容体（ＬＮＧＦＲ）または自殺遺伝子配列などの選択配列を含み得る。さらに、ｍｉＲＮＡヘアピン、ＣＡＲまたはＴＣＲ配列、及び選択配列を等しく発現させるために、ＣＡＲまたはＴＣＲ配列は、２Ａ配列またはＴ２Ａ配列などの「切断可能なペプチド」によって選択配列から分離され得る。これらの合成ミニ遺伝子は、任意の免疫チェックポイントに向けられたｍｉＲＮＡヘアピン配列を含み得る。具体的には、ｍｉＲＮＡヘアピン配列は、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、アデノシンＡ２ａ受容体、Ｖｉｓｔａ、ＩＤＯ、ＦＡＳ、ＳＩＲＰアルファ、ＣＩＳＨ、ＳＨＰ−１、ＦＯＸＰ３、ＬＡＩＲ１、ＰＶＲＩＧ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＣＤ１６０、ＣＲＴＡＭ、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＣＤ２４４、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＴＧＦＲＢＲＩ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ１、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２、及びＧＵＣＹ１Ｂ３  ｍＲＮＡを標的とし得る。使用されるプロモーターは、ＥＦ１もしくはＵＢＩなどの任意の哺乳動物プロモーター、または表１に記載されている任意のプロモーターであり得る。スペーサー配列は、任意の長さまたは配列、特に表９に記載されているスペーサーのうちの１つであり得る。任意の免疫エフェクター細胞は、これらのｍｉＲＮＡ発現構築物で標的とされ得る。具体的には、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ＴＣＲ操作されたＴ細胞、ＣＡＲ  Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＴ制御性細胞は、合成ｍｉＲＮＡ構築物で操作され得る。
【０１２３】
本明細書で提供される合成ミニ遺伝子を使用して、内因性免疫チェックポイントノックダウンを伴う腫瘍浸潤リンパ球を生成することができる。免疫チェックポイントノックダウンでこれらのＴＩＬを生成するために、ＴＩＬは、患者の腫瘍組織から単離して、精製され得る。これらの精製されたＴＩＬは、１つ以上の免疫チェックポイントの遺伝子発現をノックダウンするために、免疫チェックポイントｍＲＮＡに向けられたｍｉＲＮＡヘアピンを含む治療用ミニ遺伝子を含むレンチウイルスベクターで形質導入され得る。次いで、改変されたＴＩＬは、エクスビボで拡張され、最終的に患者に再導入され得る。
【０１２４】
内因性免疫チェックポイントノックダウンを伴うＣＡＲ  Ｔ細胞またはＴＣＲ操作されたＴ細胞は、ＴＩＬと同様に生成され得る。Ｔ細胞は、白血球除去によって患者から採取することができる。次いで、採取された細胞は、免疫チェックポイントｍＲＮＡならびにＣＡＲまたは操作されたＴＣＲ配列を標的とするｍｉＲＮＡヘアピンを含むシングルベクターで形質導入され得る。図１０に示すように、シングルベクター中にこれらを有すると、Ｔ細胞の収集から患者の治療までのより効率的なターンアラウンドタイムを可能にする。あるいは、採取されたＴ細胞は、２つの別々のベクターで処理され得る。第１のベクターは、ＣＡＲまたは操作されたＴＣＲ配列を含み得、細胞に形質導入またはトランスフェクトされ得る。次いで、第２のベクターは、免疫チェックポイントｍＲＮＡを標的とするｍｉＲＮＡヘアピンを備えたｍｉＲＮＡ発現構築物を含むレンチベクターを含む。第２のベクターの形質導入後、これらの改変されたＴ細胞は、エクスビボで拡張され、その後、患者に再導入され得る。
【０１２５】
実施例４−合成ミニ遺伝子は遺伝子ノックダウンを標的とする
シングル及びダブルヘアピンｍｉｒＧＥ構築物は、ＨｅＬａＲ５細胞において高効率でＣＣＲ５をノックダウンする
最適化された治療用ミニ遺伝子アーキテクチャ（ＥＦ１ｓプロモーター、ＧＦＰ２スペーサーを使用して、シングル及びダブルＣＣＲ５を標的とするｍｉｒＧＥヘアピンを構築して、確立した３つのヘアピン構築物と比較して、どれだけ効率的にＣＣＲ５を下方制御することができるかを評価した（図１４）。ＨｅＬａＲ５細胞は、１．０のＭＯＩで構築物を担持するレンチウイルスベクターで形質導入され、ＣＣＲ５の下方制御は、形質導入から５〜７日後に測定された。すべての構築物はまた、形質導入細胞を同定するためのｍＣｈｅｒｒｙで報告された遺伝子も担持した。ＣＣＲ５のノックダウンは、同じサンプル内の形質導入細胞（ｍＣｈｅｒｒｙ陽性）対非形質導入細胞のＭＦＩを測定することによって、フローサイトメトリーを介して測定され、この比は、ｍＣｈｅｒｒｙを発現するように、対照レンチウイルスベクターで形質導入したＨｅＬａＲ５細胞に対して比較した。
【０１２６】
結果は、対照ベクターで形質導入された細胞と比較した場合、ＭＦＩの有意な減少及び蛍光強度の全体的なシフトによって示されるように、３つすべての構築物によるＣＣＲ５の高効率の下方制御を示した（図１４Ｂ）。シングル、ダブル、及びトリプルヘアピン構築物に対する相対ＣＣＲ５発現レベルは、それぞれ、１６．５％、１５％、及び１５．７％（平均ｎ＝６）であった。特に、ＨｅＬａＲ５細胞での最大のＣＣＲ５ノックダウンは、最適化された治療用ミニ遺伝子アーキテクチャ（ＥＦ１ｓプロモーター、ＧＦＰ２スペーサー）を使用する場合に、シグナルｍｉｒＧＥヘアピンで達成することができる。
【０１２７】
初代Ｔ細胞におけるＰＤ１の高効率のノックダウン
ＰＤ１がＴの枯渇、及びより広くは操作されたＴ細胞療法の分野で果たす中心的な役割を考慮して、ＰＤ１を最大限に下方制御し得る治療用ミニ遺伝子が開発された。ＰＤ１をサイレンシングするための３つのｍｉｒＧＥ構築物は、前述のアプローチに従って設計された（Ｍｙｂｕｒｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、参照により本明細書に組み込まれる）。標的配列は、ｉ−Ｓｃｏｒｅ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ、ＢＬＯＣＫ−ｉＴ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ  ｓｉＲＮＡ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｆｉｎｄｅｒ、及びｓｉＤＥＳＩＧＮ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を含むオンラインソフトウェアツールを使用して特定した。これらのツールのスコアリングに基づいて、上位１０個の標的配列の一覧を生成した。次いで、ＢＬＡＳＴを使用してヒトゲノム全体にわたる相同性について、標的配列をそれぞれスクリーニングし、任意の他の遺伝子との７０％超の相同性を、除外した。最後に、ｍｉｒＧＥ及び最適化された治療用ミニ遺伝子アーキテクチャ（ＥＦ１ｓプロモーター、ＧＦＰ２スペーサー）にクローニングするために、３つの標的配列を選択した（表１０）。一旦構築したら、３つのミニ遺伝子を、レンチウイルスベクターにパッケージし、１．０及び２．５のＭＯＩで２人の健康なドナーからの初代Ｔ細胞を形質導入するために使用した。すべての構築物はまた、形質導入細胞を同定するためのｍＣｈｅｒｒｙで報告された遺伝子も担持した。ＰＤ１発現レベルは、フローサイトメトリーを使用して形質導入から５〜７日後に測定された。ＰＤ１が初代Ｔ細胞に均一に発現せず、構成的にも発現しないため、初めに、ＰＤ１発現Ｔ細胞の割合を決定し、次いで対照形質導入（ｍＣｈｅｒｒｙのみ）Ｔ細胞に対して、ＰＤ１発現細胞のＭＦＩを比較した。
【表１０】
2021519587.tif 000036
【０１２８】
ｍｉｒＧＥノックダウンでアクセス可能であり得る標的配列の最初のスクリーニングにより、有意な効果を示す３つの候補のうちの１つをもたらした（ＰＤ１−１Ａ）。フローサイトメトリーのドットプロット及びヒストグラムの例（図１５Ｂ〜Ｃ）に見られるように、ＰＤ１−１Ａ  ｍｉｒＧＥで形質導入された細胞の蛍光強度に明らかなシフトがあったが、ＰＤ１−２Ａ及び３Ａで形質導入されたＴ細胞ではそうではなかった。ＰＤ１−１Ａで形質導入されたＴ細胞は、２７％のＰＤ１を発現する細胞の平均減少率を有した（図１５Ｄ）が、ＰＤ１−２Ａ及びＰＤ１−３Ａ構築物で形質導入されたＴ細胞は、１２％及び９％の減少を有した（ｐ＝０．０４７、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ  ＡＮＯＶＡ）。さらに、ＰＤ１を発現するＴ細胞集団内では、ＰＤ１−１Ａ構築物で形質導入された細胞内でＰＤ１発現が４８％減少した（図１５Ｅ）が、ＰＤ１−２Ａ及び３Ａ構築物で形質導入されたＴ細胞は、３％及び１４％の減少を有した（ｐ＜０．００１、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ  ＡＮＯＶＡ）。
【０１２９】
したがって、ＰＤ１−１Ａ  ｍｉｒＧＥは、ＰＤ１の最大ノックダウンを達成するために、２つ及び３つのヘアピン構築物のさらなる開発に適用された（図１６）。これまでに使用したのと同じドナーから採取したＴ細胞を使用して、図１６Ａに示す実験計画に従って、形質導入し、ＰＤ１ノックダウンを評価した。フローサイトメトリーのデータ（図１６Ｂ〜Ｃ）は、さらなるＰＤ１下方制御が、２つ及び３つのヘアピンｍｉｒＧＥ構築物で達成することができることを示したが、最大ノックダウンが２つのヘアピンで達成された（３つのヘアピン構築物を使用する場合に無視し得る差があったため）ことを示した。２つ及び３つのヘアピン構築物の両方が、対照ベクターと比較して、ＰＤ１発現細胞の比率を４５％減少させ、ＰＤ１発現細胞上のＰＤ１発現をほぼ４０％減少させた（図１６Ｄ〜Ｅ）。
【０１３０】
ＣＡＲ  Ｔ細胞のＰＤ１ノックダウンは、Ｔ細胞の枯渇から保護する
ＰＤ１標的構築物がＴ細胞の枯渇から保護されるかどうかを評価するために、抗ｃＫｉｔ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を形質導入し、４日間にわたって１：１５及び１：３０のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）の比で、ＨＬ−６０腫瘍細胞でこれらの細胞を共培養した。抗ｃＫｉｔ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（これまでに選択された）の純粋な集団を解凍し、１．０のＭＯＩでＰＤ１に対する３つのヘアピンｍｉｒＧＥ治療用ミニ遺伝子を担持するレンチベクターで２４時間後に形質導入した。共培養は、１００，０００個のＣＡＲ  Ｔ細胞（ＰＤ１ノックダウンの有無にかかわらず抗ｃＫｉｔ）で開始され、１５０万及び３００万個のＨＬ−６０腫瘍細胞を添加し、それぞれ、１：１５及び１：３０のＥ：Ｔの比を達成した。（標的細胞と共培養されていない）ＣＡＲ  Ｔ細胞のみの陰性制御群も含まれた。すべての条件は、ＩＬ−２を含まない培地で培養し、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＲＰＭＩ、１０％のＦＢＳ、１％のペンストレップ及び１ｘグルタマックスを用いて作製された。共培養から４日後、ＣＤ３陽性Ｔ細胞でのＰＤ１発現の計数及びフローサイトメトリー分析のために、細胞を回収した。
【０１３１】
約２０％の形質導入率は、ＰＤ１を標的とする治療用ミニ遺伝子（ｍＣｈｅｒｒｙ陽性に基づいて）で形質導入された抗ｃＫｉｔ  ＣＡＲＴ細胞で達成された。４日目に、陰性対照群で形質導入率を再度評価したが、これは１８．６％であると報告された（図１８Ａ）。ｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の割合は、Ｅ：Ｔの比が１：１５及び１：３０の群で評価された場合、１．５倍の増加があり（陰性対照と比較して、図１８Ｂ）、ＰＤ１ノックダウンＣＡＲ  Ｔ細胞が、ＰＤ１ノックダウンを用いないＣＡＲ  Ｔ細胞よりも高い速度で増殖していたことを示す。陰性対照ＣＡＲ  Ｔ細胞は、４日間にわたって１００，０００個から４７０万個に拡張した（図１８Ｃ）。ＰＤ１ノックダウンを用いない群では、抗ｃＫｉｔ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、それぞれ、Ｅ：Ｔの比が１：１５及び１：３０の条件下で、２３０万個及び１７０万個に拡張した。発生時に約２０％のＰＤ１ノックダウンＣＡＲＴ細胞を有した群では、３２０万個及び２３０万個の細胞計数は、それぞれ、Ｅ：Ｔの比が１：１５及び１：３０の条件で記録した。したがって、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の割合が１．５倍に増加したという事実とともに、ＰＤ１ノックダウンを用いないＣＡＲ  Ｔ細胞がより急速に枯渇し、増殖及び／または細胞死の減少につながることが明らかになった。これらのデータは、両方のＥ：Ｔの条件、具体的には、（４日目の１．５倍の比率に基づいて）ｍＣｈｅｒｒｙ陽性のＣＡＲ  Ｔ細胞集団における倍数増加を評価した場合に、確認された。（約２０％のＰＤ１ノックダウンのサブ集団を用いない）抗ｃＫｉｔ  ＣＡＲ  Ｔ細胞群と比較する場合、ＰＤ１ノックダウンを有するＣＡＲ  Ｔ細胞は、Ｅ：Ｔが１：１５の比（２３対４８倍）で２倍を超え、１：３０の比（１７対３３倍）で約２倍の増殖速度を有した。
【０１３２】
ｍＣｈｅｒｒｙで形質導入されたＣＡＲ  Ｔ細胞のＰＤ１ノックダウンは、フローサイトメトリー分析を介して確認された（図１８Ｅ）。ドットプロットで見られるように、同じサンプル（ｍＣｈｅｒｒｙ陰性）内の非形質導入ＣＡＲ  Ｔ細胞集団と比較し、ｍｉｒＧＥ治療用ミニ遺伝子で形質導入されなかったＣＡＲ  Ｔ細胞群と比較した場合、ＣＡＲ  Ｔ細胞のＰＤ１発現集団は、大幅に減少する。この効果は、１：１５及び１：３０の両方の実験群で観察され、これは、本明細書でこれまでに報告されたＰＤ１ノックダウンデータと一致する。比較する場合に、１：１５及び１：３０のＥ：Ｔの条件を、重ね合わせたフローサイトメトリーのドットプロットと整列したヒストグラムを条件と比較した場合（図１８Ｆ）、１：３０の条件のＣＡＲ  Ｔ細胞が、これらのＣＡＲ  Ｔ細胞がＰＤ１ノックダウンのものよりもかなり枯渇していることを示す場合には、蛍光強度及びＰＤ１発現細胞に基づいてＰＤ１の全体的により高い頻度を表すことが明らかになった。最後に、ＰＤ１発現ＣＡＲ  Ｔ細胞の割合を、２つのＥ：Ｔ条件から評価した（図１８Ｇ）。Ｅ：Ｔの１：１５の比で、ＣＡＲ  Ｔ細胞の両群は、中央値２０％のＰＤ１発現細胞を有した。ＰＤ１ノックダウンＣＡＲ  Ｔ細胞が（４日間にわたって１．５倍に増加を有する）この集団の約２８％構成されていたことを踏まえれば、これらの細胞がこれらのサンプル内の全体的なＣＡＲ  Ｔ細胞集団を救助するのに役立ったことは明らかである。この救助効果は、１：３０の条件でさらに明らかであり、ＰＤ１ノックダウンを用いないＣＡＲ  Ｔ細胞のほぼ７０％がＰＤ１陽性であったが、ＰＤ１ノックダウンを用いて約２０％のＣＡＲ  Ｔ細胞で開始した群では４０％未満まで減少した。
【０１３３】
マルチ標的ｍｉｒＧＥヘアピンは、ＣＣＲ５ノックダウンの効率を維持する
最大６つのｍｉｒＧＥヘアピンが最適化された治療用ミニ遺伝子アーキテクチャ（ＥＦ１ｓプロモーター、ＧＦＰ２スペーサー）で発現され得るかどうかを評価するために、ＰＤ１、ＧＦＰ、及びＣＣＲ５に対するマルチ標的ヘアピン構築物を構築した（図１７Ａ）。ＣＣＲ５を標的とするｍｉｒＧＥが治療用ミニ遺伝子の末端に位置している場合のＣＣＲ５ノックダウンの潜在的な影響が評価された。ＣＣＲ５を標的とするヘアピンが４つのヘアピン構築物内で３位及び４位にある場合に、ＣＣＲ５ノックダウンが減少するかどうかを判定するための研究が行われた。同様に、５位及び６位でのこれらのヘアピンの配置がＣＣＲ５ノックダウンに影響を与えるかどうかを評価した。これを試験するために、ＨｅＬａＲ５細胞にこれらの構築物で形質導入し、２つのヘアピンＣＣＲ５を標的とするベクター及び対照ベクター（ｍＣｈｅｒｒｙのみ）と比較してＣＣＲ５の下方制御を評価した。ＣＣＲ５ノックダウンは、フローサイトメトリーを使用して評価した。結果は、ＣＣＲ５の下方制御の無視できる差（ｐ＝０．１３５、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ  ＡＮＯＶＡ）が、２つのヘアピン、４つのヘアピン、及び６つのヘアピン構築物では、それぞれ、８５％、８１％、及び８２％であったことを示した（図１７Ｂ〜Ｃ）。これらのデータは、ＣＣＲ５及びＰＤ１に対するシングルヘアピンｍｉｒＧＥの高効率を示すデータとともに、下方制御のために少なくとも２つの臨床的に関連する遺伝子を標的とするための治療用ミニ遺伝子技術の使用を実証する。
【０１３４】
初代Ｔ細胞における４つのヘアピン治療用ミニ遺伝子は、ＰＤ１及びＣＣＲ５を効果的に下方制御する
４つのヘアピンｍｉｒＧＥ構築物（ＰＤ１に対して２つのヘアピン、ＣＣＲ５に対して２つのヘアピン）を使用して、初代Ｔ細胞を前述のように形質導入し、これら２つの臨床的に関連する標的遺伝子のノックダウンについて評価した。形質導入から５日後、ＰＤ１及びＣＣＲ５の発現を、フローサイトメトリーにより評価した（図１９）。実際、ＰＤ１とＣＣＲ５の両方を発現する細胞の有意な減少が観察された。重ね合わせたドットプロット及びヒストグラムでは、ＣＣＲ５及びＰＤ１の実質的な減少が観察された（図１９Ａ及び１９Ｂ）。ＣＣＲ５対ＰＤ１をプロットし、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性及びｍＣｈｅｒｒｙ陰性集団を重ね合わせることによって（図１９Ｃ）、ＣＣＲ５＋ＰＤ１＋集団の顕著な減少は、４つのヘアピンｍｉｒＧＥ構築物で形質導入されたＴ細胞で観察された（特に、非形質導入Ｔ細胞のＣＣＲ５＋ＰＤ１＋集団を著しく曝露、すなわちドットプロットの右上数十年のドット）。これらのデータは、ｍｉｒＧＥ治療用ミニ遺伝子が、２つの臨床的に関連する標的遺伝子の発現を効率的にノックダウンすることができることを示す。
＊＊＊
【０１３５】
本明細書に開示され主張される方法のすべては、本開示に照らして、過度の実験なしに実行かつ達成され得る。本発明の組成物及び方法が、好ましい実施形態に関して記述されてきたが、変形が、本発明の概念、趣旨、または範囲から逸脱することなく、本明細書に記載される方法に及びステップにおいてまたは方法のステップの順序において適用されてもよいことが、当業者には明らかであろう。より具体的には、同一または類似の結果が達成され得る限り、化学的及び生理学的の両方に関連するある特定の作用物質が、本明細書に記載される作用物質に置き換えられてもよいことが明らかであろう。当業者に明確なすべてのこうした類似の置換及び修正は、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の趣旨、範囲、及び概念の範囲内にあるとみなされる。
【０１３６】
参考文献
以下の参考文献は、これらが例示的な手法または他の細部の補足を本明細書に記載されるものに提供する限りにおいて、特に参考により本明細書に組み込まれる。
Ａｉｕｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３４１：１２３３１５１，２０１３．
Ｂｉｆｆｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３４１：１２３３１５８，２０１３．
Ｂｏｕｄｒｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，１４：１８３４−１８４４，２００８．
Ｂｏｕｄｒｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，１７：１６９−１７５，２００９
Ｂｏｕｒｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２３５：２６−３３，２０１６．
Ｆｏｗｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，４４：ｅ４８，２０１６．
Ｇｉｒｙ−Ｌａｔｅｒｒｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，２２：１２５５−１２６７，２０１１．
Ｇｉｒｙ−Ｌａｔｅｒｒｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，７３７：  １８３−２０９，２０１１．
Ｇｒｉｍｍ，Ｓｉｌｅｎｃｅ２：８，２０１１．
Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，４６：３４−４０，２０１０．
Ｊａｑｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１６４：５０７−５２０，２０１１
Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｂｏ  Ｊ２３：４０５１−４０６０，２００４．
Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，３６：２８１１−２８２４，２００８．
Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｂｅｒｋｈｏｕｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，９４２：２３３−２５７，２０１３．
Ｍａｃｚｕｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２１：２１７−２２７，２０１３．
Ｍｏｔｔｅｔ−Ｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，８１：２８６１−２８６８，２００７．
Ｍｙｂｕｒｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，３：ｅ２０７，２０１４．
Ｏｓｏｒｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１６９：７１−８１，２０１４．
Ｒｕｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４４８：８３−８６，２００７．
Ｓｅｙｈａｎ，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｓｙｓｔ，１２：２９５−３１２，２０１６．
Ｓｉｂｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，４０：９８６３−９８７５，２０１２．
Ｓｔｅｇｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１０２：１３２１２−１３２１７，２００５．
Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｎａｉｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５２：１４１７−１４２０，２０１６．
Ｓｕｎ，Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４１：５９−６３，２００６．
Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１：２２８−２３４．，２００９．
Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，２１：５８８−６０１，２０１３．
【図１】
2021519587.tif 000037
【図２】
2021519587.tif 000038
【図３】
2021519587.tif 000039
【図４】
2021519587.tif 000040
【図５】
2021519587.tif 000041
【図６】
2021519587.tif 000042
【図７】
2021519587.tif 000043
【図８】
2021519587.tif 000044
【図９】
2021519587.tif 000045
【図１０】
2021519587.tif 000046
【図１１】
2021519587.tif 000047
【図１２】
2021519587.tif 000048
【図１３】
2021519587.tif 000049
【図１４】
2021519587.tif 000050
【図１５】
2021519587.tif 000051
【図１６】
2021519587.tif 000052
【図１７】
2021519587.tif 000053
【図１８】
2021519587.tif 000054
【図１９】
2021519587.tif 000055
【配列表】
2021519587000001.app
【国際調査報告】
2021519587.tif 000056
2021519587.tif 000057
2021519587.tif 000058
2021519587.tif 000059
2021519587.tif 000060
2021519587.tif 000061