(57)【要約】本発明は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２（ＤＳＭ  ３２４８３）、ＰＦ１３（ＤＳＭ  ３２４８５）および／またはＰＬ１３（ＤＳＭ  ３２８４４）から選択される種Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉの少なくとも１つの乳酸菌を花粉に接種すること、ならびに前記乳酸菌を接種した花粉の発酵を含む、発酵花粉の生産のための生物工学的プロセスに関する。得られた発酵花粉は、ハチの巣のハチの巣の中で天然に生産されるビーブレッドと同様の栄養的および官能的特性を有し、食品および栄養補助食品の分野での用途が見出されている。本発明はさらに、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２（ＤＳＭ  ３２４８３）、ＰＦ１３（ＤＳＭ  ３２４８５）および／またはＰＬ１３（ＤＳＭ  ３２８４４）それ自体、ならびにこれらの菌株を含む組成物を包含する。【選択図】図６Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビーブレッドを製造するための微生物学的プロセスであって、ａ）穀物中の花粉にスターター乳酸菌を接種する工程およびｂ）花粉を発酵させる工程を含み、前記プロセスは、接種されたスターター乳酸菌がＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ種の乳酸菌であり、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２、ＰＦ１５およびＰＦ１３株ならびにそれらの混合物から選択されるという事実を特徴とする方法。
【請求項２】
外被覆層を分解するための花粉粒の予備処理を含み、工程ａ）で接種された前記乳酸菌の発酵活性のための穀粒含有率を利用できるようにする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記花粉粒のコーティングペクチン成分を分解または代謝する酵母の接種を前の工程または工程ａ）に含む、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記花粉粒の前記コーティングペクチン成分を分解または代謝する前記酵母が、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ  ａｎｏｍａｌｕｓ種に属し、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｕｖａｒｕｍ  ＡＮ８Ｙ２７Ｂ株である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記発酵工程の後、微生物電荷の軽減のさらなる工程ｃ）を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
乾燥、好ましくは凍結乾燥または噴霧乾燥のさらなるステップを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法により得られたビーブレッドまたは発酵花粉。
【請求項８】
請求項７に記載のビーブレッドまたは発酵花粉および食用担体を含む、組成物。
【請求項９】
心血管疾患、代謝性疾患、骨疾患、脳疾患、腸疾患の治療に使用するか、または腸内微生物の機能性のドライバーとして使用するための、請求項７に記載のビーブレッドまたは請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
毛髪の皮膚の皮膚老化の治療のための、請求項７に記載のビーブレッドまたは請求項８に記載の組成物の使用。
【請求項１１】
受託番号ＤＳＭ  ３２８４３を有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２、受託番号ＤＳＭ  ３２８４５を有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１５、受託番号ＤＳＭ３２８４４を有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＬ１３およびそれらの混合物から選択される、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉの菌株。
【請求項１２】
受託番号ＤＳＭ  ３２８４３を有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２、受託番号ＤＳＭ  ３２８４５を有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１５、受託番号ＤＳＭ３２８４４を有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＬ１３およびそれらの混合物から選択されるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉの株を含む組成物。
【請求項１３】
前記細菌株が生きており、生命維持の、または不活化されている、請求項１２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビーブレッド（ｂｅｅ  ｂｒｅａｄ）の製造のための微生物学的プロセスに関する。
【０００２】
本発明は、栄養、食事または食品の生産のためのバイオテクノロジープロセスの分野に由来する。
【０００３】
特に、本発明は、ハチの巣箱で天然に製造されるビーブレッドに類似した発酵花粉の製造のためのバイオテクノロジープロセスに関する。
【背景技術】
【０００４】
花粉は、顕花植物の雄の雄ずいの胚性要素であり、花の雄ずいの末端部に置かれた花のう中の粉末状の形態であり、植物が生殖細胞の輸送を委託する顕微鏡的構造からなる。ミツバチは、それを集め、ローヤルゼリーの製造および幼虫の摂食に利用する。
【０００５】
自然界では、花粉はミツバチ（Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａ  Ｌ．）のためのタンパク質、脂質、ステロール、ミネラルおよびビタミンの主要な供給源であり、一方食品および食事部門では、その栄養素における高含有量のため、関心が高まっている対象となっている。
【０００６】
ミツバチは植物の花序または環境から花粉を集め、蜜、ハチ蜜および腺分泌物と混合され、幼虫形態および成虫の主要なタンパク質源を構成する顆粒を形成するハチ巣ハチ巣にそれを堆積させる。
【０００７】
ミツバチの巣箱の内側の花粉は、主に乳酸菌および他の微生物によって一連の生化学的変換を受ける。ハチ巣の内部で発酵した花粉を「ビーブレッド」と呼ぶ（非特許文献１）。
【０００８】
ビーブレッドは、複合多糖類の減少、アミノ酸、タンパク質および脂質のプロファイルの変化および簡単な炭水化物の増加および滴定酸性度の増加のような生化学的修飾を受けた後、最初の花粉に関して異なった組成を有する（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。
【０００９】
これらの変化は、ビーブレッドを微生物学的に安定な環境とし、さらにハチ巣での花粉発酵は新鮮な花粉に比べてその消化性および栄養価を増加させる。
【００１０】
抗酸化、抗炎症、肝保護、抗アテローム性動脈硬化、および免疫調節活性などの栄養的および機能的特性により、ビーブレッドはヒトの食事に適した産物となる（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７）。
【００１１】
しかし、利用可能なビーブレッドの量は市場需要に比べて不十分である。なぜなら、ミツバチの巣箱からの除去は高価であり、ミツバチの巣箱の構造に損傷を与える可能性があり、いずれにせよ、ミツバチの巣箱に存在する量は成長する市場需要を満たすことができないからである。この生成物の不足が高い市場価格を決定する。
【００１２】
このような限界や欠点を克服しようと、ミツバチの巣箱の入り口にいる採餌ハチから直接、ミツバチの花粉を集める。その際、花粉を表面に保持するグリッドからなる「花粉トラップ」の助けを借りる。
【００１３】
しかし、いかなる種類のコンディショニングも必要としないビーブレッドとは異なり、新鮮な花粉は安定した基質ではなく、マイコトキシンの産生を刺激することができる。
【００１４】
したがって、採取した新鮮な花粉は、保存する前に乾燥または凍結する必要がある。
【００１５】
しかし、３５℃以上の温度で乾燥すると、栄養分および揮発性化合物の損失を引き起こすことが分かっている。一方、凍結は製造コストが高い。
【００１６】
２つの技術の間の妥協は、低温除湿に代表される。しかし、この技術は、ビーブレッドの官能特性および栄養特性を維持する上で、凍結よりも効果が低いことが証明されている。
【００１７】
したがって、現在、新鮮な製品と同様の官能的、栄養学的特性を有する自然とは異なる起源のビーブレッドを、市場ニーズを満たすのに十分な量、持つ必要性が感じられている。
【００１８】
以上の点から、ハチの巣箱の構造を保護しながら、市場のニーズに適した量の産物を得ることを可能にするビーブレッドの製造のための工業プロセスは、本発明の一般的な対象の一部である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ｖａｓｑｕｅｚ  ＆Ｏｌｏｆｓｓｏｎ，２００９
【非特許文献２】Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４
【非特許文献３】Ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  Ｎｉｃｏｌｓｏｎ，２００６
【非特許文献４】Ａｎｄｅｌｋｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２
【非特許文献５】Ｍａｒｋｉｅｗｉｃｚ−Ｚｕｋｏｗｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３
【非特許文献６】Ｎａｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４
【非特許文献７】Ｄｅｎｉｓｏｗ  ａｎｄ  Ｄｅｎｉｓｏｗ  −  Ｐｉｅｔｒｚｙｋ，２０１６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明の目的の１つは、天然物と同様の官能特性を有するビーブレッドを製造するための微生物学的方法を提供することである。
【００２１】
本発明の別の目的は、新鮮な花粉よりも高い栄養的および機能的価値を有するビーブレッドの生産のためのバイオテクノロジープロセスを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、選択された細菌果性乳酸菌で花粉の発酵を行うことによって、ビーブレッドの形成につながる自然発酵に典型的なものと同様の環境条件が再現されることを観察したことに由来する。
【００２３】
特に、特定の細菌果性乳酸菌で花粉を特定の酵母と組み合わせて発酵させることにより、天然産のッビーブレッドで同化できる発酵花粉が得られ、同じ開始量の花粉に対する生産収量が増加することが見出された。
【００２４】
したがって、本出願人は、グルコースに関して好ましい基質としてフルクトースを使用する乳酸菌の選択された菌株をビーブレッドの生産のための炭素源として同定し、それらをバイオテクノロジープロセス内で使用して、細菌または半細菌のビーブレッドを生産することを見出した。
【００２５】
第１の態様によれば、本発明は、以下を含む、ビーブレッドの製造のための微生物学的プロセスを提供する：
ａ）ビーブレッドの生産のための炭素源としてのグルコースに関する好ましい基質としてフルクトースを用いた接種材料の調製およびスターター乳酸菌による花粉の接種、ならびに
ｂ）花粉発酵の工程であり、
前記工程は、接種されたスターター乳酸菌がＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ種に属することを特徴とする。
【００２６】
本発明者らはまた、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２、ＰＦ１５およびＰＬ１３株ならびにそれらの混合物が、本発明のプロセスのスターター乳酸菌として特に適していることを見出した。
【００２７】
好都合なことに、本発明のバイオテクノロジープロセスで得られたビーブレッドは、天然起源の花粉よりも栄養価が高く、有効期間が長い。
【００２８】
本発明のプロセスから得られるビーブレッドはまた、プロセスの出発物質として用いられる花粉よりも高い栄養価を有する。
【００２９】
具体的には、本発明の微生物学的／バイオテクノロジー的プロセスによって得られるビーブレッドまたは発酵花粉は、出発物質として使用される未発酵花粉よりも高い総遊離アミノ酸およびペプチド含有量、ならびにより高い消化性タンパク質含有量を有する。
【００３０】
さらに、得られたビーブレッドまたは発酵花粉は、典型的には細胞の抗酸化活性を提供する、より高いレベルの可溶性遊離フェノール化合物を、出発花粉よりも有している。
【００３１】
本プロセスで得られたビーブレッドの栄養的および長期持続性の特徴の組合せは、栄養学的および食事状況において評価可能であり、栄養補助食品、食事または食品の配合物に適している。
【００３２】
好都合なことに、本プロセスで得られたビーブレッドは、巣箱の構造を保護することによって得られる、ビーブレッドに典型的な化学組成を有する。
【００３３】
第２の態様によると、本発明は、本明細書中に記載の実施形態のいずれか１つによって定義されるプロセスで得られるビーブレッドまたは発酵花粉を提供する。
【００３４】
本発明の第３の態様によれば、組成物は、本明細書中に記載の方法で得られたビーブレッドまたは発酵花粉および食用担体を含む。
【００３５】
本発明のさらなる目的は、好ましくはＰＦ１２、ＰＦ１５およびＰＬ１３ならびにそれらの混合物から選択されるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ種に属する選択された乳酸菌である。
【００３６】
一態様によれば、本発明は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ種に属する３つの細菌株に関するが、ここで、該株は以下である：
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２は、２０１８年７月４日に国際寄託センターＬｅｉｂｎｉｚ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ＤＳＭＺ  −  Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨで受託番号ＤＳＭ  ３２８４３とともに寄託された；
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１５は、２０１８年７月４日に国際寄託センターＬｅｉｂｎｉｚ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ＤＳＭＺ  −  Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨで受託番号ＤＳＭ  ３２８４５とともに寄託された；
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＬ１３は、２０１８年７月４日に国際寄託センターＬｅｉｂｎｉｚ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ＤＳＭＺ  −  Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨで受託番号ＤＳＭ  ３２８４４とともに寄託された；
【００３７】
認証が添付されている以前に同定された３株は、Ｇｉｕｌｉａｎｉ  Ｓ．ｐ．Ａ，現在の権利の所有者の会社名に寄託された。
【００３８】
本発明の特徴および利点は、以下の添付図面から明らかであろう：
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、混合スターター（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２、ＰＬ１３およびＰＦ１５ならびにＨａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｕｖａｒｕｍ  ＡＮ８Ｙ２７Ｂで構成される）（実線符号）を接種した花粉ならびに自然発酵を行った非接種花粉（空白符号）の３０℃で９日間インキュベーション中の乳酸菌（ＬｏｇＣＦＵ  ｇ−１）（実線）および滴定酸性度（ｍＬ  ０．１Ｍ  ＮａＯＨ  １０ｇ−１）（ＴＴＡ）（破線）の細胞密度値を示すグラフである；
【図２】図２は、新鮮な花粉（黒棒）および、３０℃で２１６時間発酵した花粉（赤棒）と、混合スターター（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２、ＰＬ１３、ＰＦ１５ならびにＨａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｕｖａｒｕｍ  ＡＮ８Ｙ２７Ｂで構成される）の遊離アミノ酸の濃度（ｍｇ  ｋｇ−１）を示す；
【図３】図３は、新鮮な花粉（黒棒）および３０℃で２１６時間発酵させた花粉（赤棒）におけるタンパク質（総タンパク質の％で表す）と混合スターター（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２、ＰＬ１３およびＰＦ１５ならびにＨａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｕｖａｒｕｍ  ＡＮ８Ｙ２７Ｂで構成される）とのｉｎ  ｖｉｔｒｏ消化率値（赤棒）、ならびに新鮮な花粉（黒棒）および３０℃で２１６時間発酵させた花粉（赤棒）における分子排除クロマトグラフィー（ＲＰ−ＦＰＬＣ、２１４ｎｍ）および混合スターター（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２、ＰＬ１３およびＰＦ１５ならびにＨａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｕｖａｒｕｍ  ＡＮ８Ｙ２７Ｂで構成される）とのペプチドプロファイルに関する２つの曲線を示すグラフＢである；
【図４】図４は、混合スターター（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２、ＰＬ１３およびＰＦ１５ならびにＨａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｕｖａｒｕｍ  ＡＮ８Ｙ２７Ｂで構成される）と３０℃で２１６時間発酵させた新鮮な花粉中および花粉中の水溶性の遊離フェノール化合物（白色棒）およびメタノール（灰色棒）の濃度（ｇ没食子酸ｅｑ  ｋｇ乾重）に関連する棒グラフである。
【図５】図５は、実施例１２の試験に従ってＨ２Ｏ２１ｍＭで誘導された酸化ストレスの誘発後のヒトケラチノサイトＮＣＴＣ２５４４上の細胞生存率に関係する棒グラフを示す。この細胞を、１００、２５０および５００μｇ／ｍｌの試料Ｂ、ＦＥＲ８６７、ＦＥＲ８６８、ＦＥＲ８６９、ＦＥＲ８７０およびＦＥＲ８７１と１６時間インキュベートした。未処理細胞（Ｃｏｎｔｒｏｌ）Ｈ２Ｏ２１ｍＭで処理された細胞（Ｈ２Ｏ２でストレスされた細胞）。＊（ｐ＜０．０５）、＊＊（ｐ＜０．０１）、＊＊＊（ｐ＜０．００５）、＊＊＊＊（ｐ＜０．００１）。  これらの結果は、誘導された酸化ストレスに対して試験された化合物の防御を示すものであり、本発明の過程で得られた発酵ビーブレッドの顕著な抗酸化作用を強調するものである。
【図６Ａ】図６Ａは、実施例１２に従ってｑＲＴ−ＰＣＲによって評価されたヒトケラチノサイトＮＣＴＣ２５４４におけるＴＮＦα遺伝子発現に関係する棒グラフを示す。細胞を、３７℃で１６（Ａ）および２４時間（Ｂ）、５％ＣＯ２でＲＰＭＩ  ２．５％  ＦＣＳ（対照）；ＲＰＭＩ  ２．５％  ＦＣＳおよび１０μｇ／ｍＬ  ＬＰＳ（対照＋ＬＰＳ）；１００、２５０および５００μｇ／ｍＬ試料Ａ（ＦＲＥＳＨ）、Ｂ（対照）およびＦＥＲ８６７、ＦＥＲ８６８、ＦＥＲ８６９、ＦＥＲ８７０およびＦＥＲ８７１で処理した。未処理細胞（対照）ＬＰＳ（ＬＰＳ）１０μｇ／ｍＬで処理した細胞値は、２回実施した２回の実験のＭｅａｎ±ＳＥＭを示す。  これらの結果は、抗炎症活性を示すものであり、本発明のプロセスで得られた発酵ビーブレッドの顕著な抗炎症作用を強調するものである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、実施例１２に従ってｑＲＴ−ＰＣＲによって評価されたヒトケラチノサイトＮＣＴＣ２５４４におけるＴＮＦα遺伝子発現に関係する棒グラフを示す。細胞を、３７℃で１６（Ａ）および２４時間（Ｂ）、５％ＣＯ２でＲＰＭＩ  ２．５％  ＦＣＳ（対照）；ＲＰＭＩ  ２．５％  ＦＣＳおよび１０μｇ／ｍＬ  ＬＰＳ（対照＋ＬＰＳ）；１００、２５０および５００μｇ／ｍＬ試料Ａ（ＦＲＥＳＨ）、Ｂ（対照）およびＦＥＲ８６７、ＦＥＲ８６８、ＦＥＲ８６９、ＦＥＲ８７０およびＦＥＲ８７１で処理した。未処理細胞（対照）ＬＰＳ（ＬＰＳ）１０μｇ／ｍＬで処理した細胞値は、２回実施した２回の実験のＭｅａｎ±ＳＥＭを示す。  これらの結果は、抗炎症活性を示すものであり、本発明のプロセスで得られた発酵ビーブレッドの顕著な抗炎症作用を強調するものである。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明の一般的な態様によれば、花粉に基づく出発物質に、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ種の有利な乳酸菌の１つ以上の選択された株を接種して、ハチ巣のハチ巣の内部に貯蔵された花粉の性質で生じる発酵を実質的に再現する発酵を行う、ビーブレッドに類似した発酵花粉の製造のための微生物学的方法が提供される。
【００４１】
一般的態様によれば、本発明は、請求項１に記載の花粉発酵プロセスに関する。
【００４２】
本発明のプロセスのさらなる実施形態は、請求項２〜７に定義されている。
【００４３】
本発明者らは、本発明のプロセスで得られた発酵花粉が、新鮮な花粉に関しても、より長い有効期間と共に巣箱で自然発酵したビーブレッドに関しても、より良い栄養学的特徴を有することを観察した。この特徴の組み合わせは、本発明の方法で得られた発酵花粉を、栄養的、食事または栄養補助的製品として特に適切にする。
【００４４】
例として、本発明の方法で得られる発酵花粉中に存在する総遊離ポリフェノール含有量は、乾燥重量ｋｇ当たり８４．６４ｇ当量没食子酸に等しく、Ｍａｒｋｉｅｗｉｃｚ−Ｚｕｋｏｗｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｏｌｔｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｚｕｌｕａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５によって文献に記載されているように、乾燥重量ｋｇ当たり８．９〜３６．５２ｇ当量没食子酸に等しい天然発酵で得られるビーブレッドについての文献に示された含有量よりもかなり高い量である。
【００４５】
本明細書中に記載するプロセスの出発物質は、花粉に基づくか、またはそれからなる。適切な花粉は、新鮮なものであっても、除湿されていてもよい。後者は、工業的規模でプロセスを実施するのにより適している。
【００４６】
適切な除湿花粉とは、例えば湿度のパーセンテージが１２％以下になるように、採取後に熱気流で乾燥にさらされる花粉である。例えば、相対湿度が０．５を下回るような低い割合の水は、適切に包装され貯蔵されれば花粉を十分に安定な原料とする。
【００４７】
典型的には、除湿された花粉は果粒の形態にあり、その色はミツバチが訪れる種または種々の植物種の機能である。
【００４８】
一例として、適切な除湿された多植物相花粉は、以下の官能的特徴を有する：
−  外観：小さな粒で、起源の植物種によって色はさまざまである。
−  におい：野菜、乾燥草。
−  味：乾燥花に特徴的な野菜で、干し草である。溶解性：水または有機溶媒に溶けにくい。
−  水分：７〜１５％
−  グルシド：２５〜４８％
−  タンパク質：１１〜２８％
−  脂質：１〜１４％
−  無機塩：１〜５％
【００４９】
本明細書に記載されているプロセス内で、典型的に顆粒または凝集粒子の形態で起こる除湿された花粉は、そのまま使用されてもよく、または、前に処理して顆粒の外殻を分解または破壊して、内部含有率を接種された微生物の発酵活性に利用できるようにすることができる。
【００５０】
典型的にはセルロース、ペクチン物質、カロテノイドおよびポリフェノールを含む花粉粒のコーティング層を破壊するために、物理的処理、例えば、機械的処理または生物学的処理を使用することが可能である。
【００５１】
適切な機械的処置には、花粉の粉砕、粉砕、微粉砕、高圧および／もしくは超音波または熱処理が含まれる。
【００５２】
花粉粒の外壁部を分解するために、出発マトリックスまたは花粉の栄養学的特徴を実質的に改変しない、あるいはより栄養価の高い製品を得ることができるような、より小さな粒子または他の技術で、顆粒の断片化または寸法的減少を行うことが可能である。
【００５３】
花粉粒の外層の分解は、そのサイズ縮小のための処理を含み、食品または製薬業界で伝統的に使用されている装置に頼ることができる。
【００５４】
例えば、振動アーム顆粒剤のような適切なメッシュギャップを有する金属メッシュを通る花粉の通過を含む装置、またはナイフ、ボールベアリング等の種々のタイプのミルまたはこれらの装置の組合せを使用する装置を使用することができる。
【００５５】
花粉粒のサイズ縮小または粉砕は、例えば、チョッパーおよびナイフを有する４方向ミキサー、流体媒体、超音波システムおよび他の市販の装置に浸漬したステータロータホモジナイザーを用いて、湿潤技術を用いて行うこともできる。
【００５６】
加熱処理は、高圧処理（ＨＰＰ）のような高圧の助けを借りて低温殺菌を可能にする周囲の圧力よりも高い状態または超音波処理または他のプロセスで任意に使用することもできる。
【００５７】
例えば、圧力下での熱処理の場合、花粉を１０％水中で簡便に再構成することができる。
【００５８】
超音波治療の場合は、花粉をそのまま使用してもよい。
【００５９】
また、水およびアルコールの混合物など、１つ以上の溶媒抽出段階をあらかじめ受けた昆虫好性花粉から得られた精製花粉抽出物を出発物質として用いることも可能である。
【００６０】
いくつかの実施形態によれば、花粉の外被層は、例えば、花粉を酵母で処理することによって、生物学的分解によって壊される。
【００６１】
したがって、本発明のいくつかの実施形態は、花粉粒を被うペクチン成分を分解または代謝する酵母の添加を提供する。典型的には、酵母の添加は、プロセスの工程ａ）前または中に行われ得る。
【００６２】
添加された酵母は花粉粒と接触し、花粉の外被の崩壊の過程を引き起こし、その工程ｂ）で穀粒内部に存在する栄養素と接種された乳酸菌との接触を容易にする。
【００６３】
典型的には、酵母の添加は、出発花粉が処理されておらず、特に、穀粒の被覆層を破壊することを目的とした粉砕または粉砕などの機械的作用を受けていない場合に行われる。
【００６４】
好ましい実施態様によれば、種Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ  ａｎｏｍａｌｕｓまたはＨａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｕｖａｒｕｍに属する花粉粒をコーティングするペクチン成分を分解または代謝する酵母は、２種の混合物である。
【００６５】
１つの実施形態によれば、使用される酵母は、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｕｖａｒｕｍ  ＡＮ８Ｙ２７Ｂ株である。
【００６６】
本発明のプロセスの実施形態において、接種材料は、成長基質として花粉自体を用いて調製される。
【００６７】
他の実施形態では、接種された微生物の成長基質は、フルクトース酵母ペプトン、ＦＹＰｅｄなどの適切な培養培地であり、任意に、酵母または野菜の抽出物およびペプトンを含み、これらは微生物に急速な成長に必要な栄養を提供する。
【００６８】
あるいは、花粉と抽出物／ペプトンの混合物を使用することも可能である。
【００６９】
本発明のプロセスの好ましい実施態様において、乳酸菌および酵母の接種材料は、別々に調製される。
【００７０】
プロセスの発酵ｂ）の工程は、Ｌａｔｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に典型的に属する乳酸菌、便宜的にはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ種を接種することによって行われる。
【００７１】
好ましい実施態様によれば、工程ａ）は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２、ＰＦ１５およびＰＬ１３株ならびにそれらの混合物から選択されるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ種に属する乳酸菌の接種を含む。これらの選択された各細菌株は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ種にも属する他の乳酸桿菌よりも予想外に高い花粉ベースの基質上での成長およびコロニー形成の容量を有する。さらに、以下の実施例で報告された実験の部で立証されているように、前記３株は、抗菌性化合物を酸性化し、産生する驚くべき能力を有する。
【００７２】
有利には、本発明の方法の発酵工程は、バイオリアクター内で、典型的には好気的条件下で実施される。
【００７３】
いくつかの実施形態によると、バイオリアクター内部の生成物の湿度は、全質量の３０〜９５％の範囲である。
【００７４】
典型的には、花粉を含む混合物および接種された微生物は、湿度値が低い場合、半固体の形態、例えば、３０〜４５％であってよく、湿度値が高い場合、半固体または液体の形態、例えば、６０〜９５％であってよい。
【００７５】
いくつかの実施形態によると、発酵の工程ｂ）の始めのバイオリアクター内の環境のｐＨは、４〜６の範囲にある。
【００７６】
本発明の好ましい実施形態において、系のｐＨは５．２５＋／−０．２５の間の値を有し、従来のｐＨ補正器の追加によって前記範囲内で修正される可能性がある。
【００７７】
一般的には、工程ｂ）提供の間、以下の反応パラメータおよび条件をモニタリングする：
−  糖（グルコースおよびフルクトース）の量
−  全滴定酸性度
−  ｐＨ
−  乳酸および酢酸
−  細胞密度
【００７８】
所望の量の有機酸／細胞密度／遊離フェノール酸／残留糖／遊離アミノ酸が得られる場合、プロセスを中断することができる。
【００７９】
本発明の方法の実施形態において、得られた発酵花粉は、微生物負荷を低減する工程ｃ）に供される。一実施態様によれば、得られた発酵花粉は、任意に工程ｃ）に供され、低温乾燥段階に供され、例えば、典型的にはライオスタットで低温乾燥される。あるいは、発酵した花粉は、−４０℃以下の程度などの温度で、遠心分離後に便宜的に冷凍保存してもよい。
【００８０】
本発明の別の実施態様において、発酵花粉は、微生物を生存させ、かつ生命を維持する目的で凍結乾燥される。代わりに、得られた発酵花粉またはバイオマスは、０より低い温度で、例えば−４０℃以下の程度で、典型的には遠心分離後に凍結保存してもよい。
【００８１】
本発明の目的のために、発酵花粉から水を除去するために、例えば、スプレー乾燥に頼ることによって、他の従来技術を使用することもできる。
【００８２】
１つの実施形態によれば、本発明のプロセスは、以下の工程を含む：
−  好ましくは−２０℃で保存された、または乾燥もしくは除湿された花粉に基づく新鮮な非前処理花粉に基づく出発物質の供給、＋４℃または室温で便宜的に保存され、および／または粉砕、微粉砕、微粉化、熱処理、高圧、および／または超音波処理、または花粉抽出物により任意に前処理された；
−  蒸留水による任意の希釈および５．２５±０．２５の値に達するまでの花粉ｐＨ値の補正；
−  Ｌ．ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２、ＰＦ１５およびＰＬ１３またはそれらの混合株から選択される乳酸菌を含む細胞懸濁液の接種、ならびにＷｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ属またはＨａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｕｖａｒｕｍ種、例えばＡＮ８Ｙ２７Ｂ株に属するペクチン分解活性を有する酵母の接種；
−  最終湿度が３０〜９５％に達するまで通常蒸留水を加える。典型的には、最終的な水分値には、例えば、約２１．５６％に等しい花粉の初期の水分含有量および接種段階の間に加えられる水分も含まれる。
−  滅菌チューブまたはバイオリアクター中で好ましくは３０℃で２４〜２１６時間インキュベートし、発酵花粉を単離した。
【００８３】
いくつかの実施形態によると、上記のプロセスから得られた発酵花粉を、リオスタット内で凍結乾燥するか、または、好ましくは遠心分離後に、約−２０℃またはそれ以下の温度で凍結することができる。
【００８４】
ある実施態様において、発酵花粉は、微生物負荷を減少させるため、水を除去するため、または発酵花粉を安定化させるための他の処理に供することができる。
【００８５】
第２の態様によれば、本発明は、本明細書中に記載の実施形態のいずれか１つに記載のプロセスで得られるビーブレッドまたは発酵花粉を提供する。本発明の方法で得られた発酵花粉は、出発花粉よりも高いレベルの遊離水溶性フェノール化合物を有する。これらおよびその他の機能については、以下の例で詳細に説明する。
【００８６】
本発明の他の実施形態において、発酵の工程ｂ）に起因する可能性のある液体画分は、固体成分から分離され、食品、食事または栄養目的に使用される。
【００８７】
液体分画と固体状画の両方が栄養学的使用を見つけるかもしれない。
【００８８】
本発明の第３の態様によれば、栄養または栄養学的組成物は、本明細書に記載されている実施形態のいずれか１つおよび食用担体に従って得られる発酵花粉を含むことが提供される。
【００８９】
第４の態様によれば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２、ＰＦ１５およびＰＬ１３株およびそれらの混合物、ならびに食用担体に属する乳酸菌を含む組成物が提供される。
【００９０】
組成物の細菌株は、例えばタインダリゼーションによって、従来の技術に従って、生存および生存可能であるか、または不活化された形態であり得る。
【００９１】
本明細書に記載される組成物は、経口投与に適している。
【００９２】
経口投与用の組成物は、固体または液体の形態であり得る。固体形態の場合、それらは、生物学的活性成分および１つ以上の生理学的に許容可能な賦形剤として本明細書に記載されるプロセスから得られるビーブレッドを含む。
【００９３】
典型的な固体形態組成物は、錠剤、顆粒、カプセル、粉末、即時投与形態、キャンディー、チューインガム、異なる組成および形状のゼリー豆を含む。
【００９４】
本発明は、本発明を投与するための食用担体となり得る任意の固体状、半固体状および液体剤形に適用される。
【００９５】
本発明は、固体状、半固体または液体の形態であるように、投与前に製剤を希釈するかまたは使用する全ての剤形に適用される。
【００９６】
錠剤は、一般に、植物抽出物が、典型的には乾燥形態で分散されている、適切な担体または賦形剤を含む。
【００９７】
この場合、配合物に含有される適切な賦形剤は、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、酢酸酪酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、およびそれらの混合物などのセルロース誘導体である。
【００９８】
適切な賦形剤のさらなる例は、ラクタムファミリーに属するポリマー、例えば、ピロリドンおよびその誘導体、例えば、ポリビニルピロリドン、ポリビニルポリピロリドンおよびそれらの混合物、無機塩、例えば、カルシウムまたはリン酸二カルシウム、潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、トリアシルグリセロールおよびそれらの混合物を含む。
【００９９】
液体形態の場合、組成物は、発酵の工程ｂ）の最後に分離された液体画分を、生物学的に活性な成分として、および１つ以上の生理学的に許容される賦形剤を含有する。
【０１００】
液体形態の典型的な組成物は、溶液、エマルジョン、懸濁液、シロップを含む。
【０１０１】
本発明の組成物に含まれる本発明の方法で得られるビーブレッドまたは発酵花粉は、様々な量で存在し得、例えば、０．０００１重量％〜１００重量％、０．００１重量％〜５０重量％、０．１重量％〜２０重量％、典型的には０．５〜５重量％の範囲に含まれ得る。
【０１０２】
特定の実施形態によれば、本発明の組成物は、ビタミン、ミネラル、微量栄養素および他の活性物質などの１つ以上の活性物質をさらに含む。
【０１０３】
いくつかの実施形態によると、経口投与のための組成物は、機能性食品、栄養補助食品組成物、食事生成物、補体または栄養生成物である。
【０１０４】
この組成物は、固体成分を含有するタイプの袋またはスティックパックの熱耐性アルミニウムの袋、または液体中の固体成分の分散体、液体中の固体の現代的再構成のための容器、食品グレードの油または他の適合性の液体中に分散された固体を含有する硬カプセルまたは軟カプセル、液体中の固体の分散体を含有するバイアルまたはボトルのような従来の剤形で市販され得る。
【０１０５】
いくつかの態様によると、本発明は、本明細書に記載されたプロセスの実施形態、または代謝、心血管、骨、脳または腸のマイクロバイオーム機能性の処理に使用するために、または腸のマイクロバイオーム機能性のドライバーとして使用するために含有する組成物のいずれか１つによって得られるビーブレッドに関する。
【０１０６】
他の態様によれば、本発明は、本明細書に記載の方法の実施形態のいずれか１つに従って得られた、またはそれを含有する組成物の、毛髪処理のための、特にアンチエイジング処理としての、または皮膚老化を低減するための、皮膚の経口摂取または美容的使用による処理のための、ビーブレッドの使用を提供する。
【０１０７】
本発明のプロセスで得られたビーブレッドは、細胞の抗酸化活性を有し、フリーラジカル、典型的には腫瘍、前癌性疾患または日焼け、皮膚のしみ、ざらつきまたは皮膚老化の結果のような発赤状態の非生理的製造を生じる疾患、典型的には腫瘍、前癌性疾患または日光性疾患または発赤状態を生じる疾患の予防または治療に使用される。さらに、本発明のビーブレッドは、生理学的健康状態における個々の生物を維持する際の用途を見出す。
【０１０８】
さらなる態様によれば、本発明は、ＰＦ１２、ＰＦ１５およびＰＬ１３から選択されるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ種に属する選択された乳酸菌、ならびにそれらの混合物を提供する。
【０１０９】
本発明者らは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２、ＰＦ１５、およびＰＬ１３株を、同種に属する他の株と比較して、以下の表１に示す成長、酸性化の驚くほど改善された能力について、以下の表２および表３に示す抗菌性化合物の製造のために選択した。
【０１１０】
例として、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２、ＰＦ１５、およびＰＬ１３細菌株の選択のために使用されるプロトコルを以下に記載する。以下の実施例１でより詳細に記載されるプロトコルは、花、花粉、ビーブレッド、およびハチの胃腸管から単離された細菌株を試験することを含む。
【０１１１】
同定した菌株の成長、酸性化および抗菌性化合物の産生能を試験した。
【０１１２】
細菌成長のモデル系として水性花粉エキスを用いた。花粉エキスは以下の手順で得た。
【０１１３】
１００グラムの花粉をガラスビーズと共に添加し、１リットルの蒸留水と混合し、５００ｒｐｍで２時間撹拌した。混合物を、１０，０００×ｇで２０分間遠心分離した。上清を採取し、残留物をさらに、上記のように酸性化メタノール（０．１％ＨＣｌ、ｖ／ｖ）１リットル、ヘキサン／アセトン／エタノールの混合物５０：２５：２５（ｖ／ｖ／ｖ）、および沸騰水でそれぞれ連続的に抽出した。全ての抽出物を乾燥し、１０ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、一緒に混合し、さらに蒸留水中で希釈して、１リットルの最終体積とした。花粉抽出物は、０．２２μｍの空隙率の膜上で滅菌ろ過して滅菌した。菌株を約７．０  ｌｏｇＣＦＵ／ｍｌの最終細胞密度で個別に接種し、花粉抽出物を３０℃で２４時間インキュベートした。成長および酸性化をモニタリングし、菌株の成長および酸性化動態を、Ｇｏｍｐｅｒｔｚ方程式を用いて数学的にモデル化した。菌株の抗菌活性を、８種類の悪化または病原性指標細菌および８種類の指標真菌に対して試験した。菌株の抗菌活性を試験するために、乳酸菌を３０℃で２４時間花粉抽出物中で増殖させ、上清を４℃で１０分間１００００×ｇで遠心分離して回収し、０．２２μｍの空隙率の膜上で滅菌ろ過して滅菌した。抗細菌活性は、寒天拡散ウェルによりアッセイし、一方抗真菌活性は、寒天希釈アッセイによりアッセイした。
【０１１４】
以下の表１は、様々な種に属し、花、花粉、ビーブレッドおよびミツバチの消化管から分離した乳酸菌株を用いて３０℃で２４時間発酵させた花粉抽出物におけるｐＨ変化量（ΔｐＨ）として表した、光学密度、ＤＯ６２０および酸性化として表した細胞密度のデータを示す。
【０１１５】
【表１（１）】
2021530215.tif 000003
【表１（２）】
2021530215.tif 000004
【表１（３）】
2021530215.tif 000005
【表１（４）】
2021530215.tif 000006
【０１１６】
実験データからわかるように、選択したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２、ＰＦ１５、およびＰＬ１３株は、同じ細菌種に属する、試験した他の株で認められたものよりも驚くほど高い成長能、酸性化能を有する。
【０１１７】
以下の表２は、３０℃で２４時間乳酸菌株で発酵させた花粉抽出物の阻害スペクトル＊を示す。病原性または悪化指標菌‡８株に対する抗菌力を検討した。対照として未発酵花粉エキスを用いた。
【０１１８】
【表２（１）】
2021530215.tif 000007
【表２（２）】
2021530215.tif 000008
【０１１９】
以下の表３は、３０℃で２４時間乳酸菌で発酵させた花粉抽出物の阻害スペクトル＊を示したものである。指標菌‡８株に対する抗真菌活性を検討した。未発酵花粉抽出物を添加したジャガイモデキストロース寒天（ＰＤＡ）上での指標菌株の成長に関して、菌糸成長の阻害のパーセンテージを計算した。
【０１２０】
【表３（１）】
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【表３（２）】
2021530215.tif 000010
【０１２１】
表２および３の実験データは、さらに、選択されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２、ＰＦ１５、およびＰＬ１３株が、同じまたは他の細菌種に属する、試験された他の株について見出されたものよりも驚くほど高い抗菌活性を有することを強調する。
【０１２２】
用語
本文脈において、花粉という用語は、ミツバチを採餌して集め、それらによって処理される昆虫好性花粉を意味する；前記花粉は、単一の植物種（単相）またはいくつかの植物種（多相）から来ることがある。
【０１２３】
機能性食品とは、その中に含まれる従来の栄養素に加えて、問題または生理学的状態に対して便益または保護を提供し得るあらゆる改変食品または食品成分を意味する。
【０１２４】
「栄養補助食品」とは、食用物質から単離または精製された生成物をいう。栄養補助食品とは、それが生理学的利益を有するか、またはそれが問題または生理学的障害に対する保護を提供することが示された場合である。
【０１２５】
栄養補助食品とは、ビタミン、ミネラル、植物抽出物、アミノ酸、代謝産物、抽出物、濃縮物またはこれらの成分の混合物を含む製品を意味する。
【０１２６】
「食用担体」という用語は、食品、栄養補助食品または食事／食品サプリメントの調合において使用され得るあらゆる食用担体を意味する。
【０１２７】
本記載の範囲内で、本発明の方法で得られたビーブレッドおよび発酵花粉という用語は、同一の生成物を表示し、互換可能である。
【０１２８】
従来技術専用の前章に記載された伝統的なビーブレッドの官能特性および／または栄養特性は、本発明の方法で得られた発酵花粉のものと実質的に類似している。
【０１２９】
以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態のみの例示的な目的のために提供される。
【実施例】
【０１３０】
実施例１
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２、ＰＦ１５およびＰＬ１３の細菌株の選択に関するプロトコル
乳酸スターター細菌の３細菌株を選択するために、種々の種に属し、花、花粉、ビーブレッドおよびミツバチの胃腸管から分離した９３細菌株について、その成長、酸性化および抗細菌性化合物産生能を試験した。
【０１３１】
細菌成長のモデル系として花粉抽出物を用いた。花粉抽出物は以下のように得られた。
【０１３２】
１００グラムの花粉をガラスビーズと共に添加し、１リットルの蒸留水と混合し、５００ｒｐｍで２時間撹拌した。混合物を、１００００×ｇで２０分間遠心分離した。上清を採取し、残留物をさらに、それぞれ上記のように酸性化メタノール（０．１％ＨＣｌ、ｖ／ｖ）１リットル、ヘキサン／アセトン／エタノール混合物５０：２５：２５（ｖ／ｖ／ｖ）、沸騰水で連続的に抽出した。全ての抽出物を乾燥し、１０ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、一緒に混合し、さらに蒸留水中で希釈して、１リットルの最終体積とした。花粉抽出物は、０．２２μｍの空隙率の膜上で滅菌ろ過して滅菌した。菌株を約７．０  ｌｏｇＣＦＵ／ｍｌの最終細胞密度で個別に接種し、花粉抽出物を３０℃で２４時間インキュベートした。成長および酸性化をモニタリングし、菌株の成長および酸性化動態を、Ｇｏｍｐｅｒｔｚ方程式を用いて数学的にモデル化した。菌株の抗菌活性を、８種類の悪化または病原性指標細菌および８種類の指標真菌に対して試験した。菌株の抗菌活性を試験するために、乳酸菌を３０℃で２４時間花粉抽出物中で成長させ、上清を４℃で１０分間１００００×ｇで遠心分離して回収し、０．２２μｍの空隙率の膜上で滅菌ろ過して滅菌した。抗細菌活性は寒天拡散ウェルによりアッセイし、一方抗真菌活性は寒天希釈アッセイによりアッセイした。
【０１３３】
Ｌ．ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２、ＰＦ１５、ＰＬ１３株は、成長能、酸性化能（上記表１）および抗菌化合物の産生能（上記表２、３）が良好であったため選択した。
【０１３４】
実施例２
乳酸菌を用いた花粉抽出物の発酵
実施例１に記載のプロトコルに従って得られた花粉抽出物を、９３の乳酸菌の成長のためのモデル系として使用し、その成長および酸性化の能力を試験した。菌株を、３０℃で２４時間、ＦＹＰブロス（蒸留水１Ｌ当たりＤ−フルクトース１０ｇ、酵母抽出物１０ｇ、ポリペプトン＊５ｇ、酢酸ナトリウム２ｇ、Ｔｗｅｅｎ  ８０  ０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．２ｇ、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ、ＮａＣｌ０．０１ｇ［ｐＨ６．８］）で成長させた。遠心分離（４℃で１０分間１００００×ｇ）により細胞を回収し、５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０で２回洗浄し、花粉抽出液中に約７  ＬｏｇＣＦＵ／ｍｌの最終密度まで懸濁した。その後、花粉抽出物を、３０℃で２４時間インキュベートした。成長（光学密度、ＤＯ６２０）と酸性化（ｐＨ変化、ΔｐＨ）を、インキュベーション中にモニタリングした。
【０１３５】
結果
種々の種に属する９３の乳酸菌株について、花粉抽出物中の成長能および酸性化能を試験した（表１）。細胞密度の最高値（ＤＯ６２０  １．４７３〜２．１０２）および最も高い酸性化能力は、種Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉに属する株で発酵した花粉抽出物において見出された（表１）。
【０１３６】
実施例３
選択した乳酸菌株で発酵した花粉抽出物の抗微生物活性
花粉発酵中の乳酸菌の抗菌性化合物産生能を試験するために、細菌を、実施例１に記載したように花粉抽出物中で成長させ、遠心分離（４℃で１０分間１００００×ｇ）により上清を回収し、０．２２μｍの空隙率の膜上で滅菌ろ過により滅菌した。抽出物の抗細菌活性を、寒天ウェルからの拡散アッセイによりアッセイした。分析は、指標菌株の成長のための寒天−水１５ｍｌ（２％寒天、ｗ／ｖ）および特定寒天培地５ｍｌからなる２層で行い（表２）、至適成長温度で２４時間インキュベートした指標菌株の培養から回収した細胞を細胞密度約４  ＬｏｇＣＦＵ／ｍｌまで接種した。ウェル（直径５ｍｍ）を二重層にし、各ウェルに発酵および無細胞花粉抽出物１００μｌを添加した。対照として未発酵花粉抽出物を用いた。プレートは、花粉抽出物の放射状拡散を可能にするために４℃で１時間保存し、３０または３７℃で２４時間インキュベートした。抽出物の抗真菌活性を、寒天希釈アッセイによりアッセイし、指標として用いた真菌菌糸体の半径方向成長速度を評価した（表３）。発酵および無細胞花粉抽出物を、３０％（ｖ／ｖ）の濃度で成長培地（ジャガイモデキストロース寒天、ＰＤＡ）に加え、培地１５ｍｌをペトリ皿（直径９０ｍｍ）に注いだ。対照プレートは、花粉抽出物を添加せずにＰＤＡのみを含んでいた。アッセイは、培養培地を含むペトリ皿の中央に直径３ｍｍの菌糸体キャップを置くことによって行った。好気条件で２５℃で８日間インキュベートした後、菌糸体（直径ｍｍ）の半径方向成長を測定した。成長阻害パーセンテージは、以下のように計算される：［（対照における菌糸体の成長−花粉抽出物の存在下における菌糸体の成長）／対照における菌糸体の成長］×１００。その結果は、少なくとも４回の菌糸成長の測定値の平均として表される。
【０１３７】
結果
発酵花粉抽出物は、高い抗菌活性よび抗真菌活性を有し、未発酵花粉抽出物よりも有意に高かった（Ｐ＜０．０５）（表２および３）。混合スターターの形態でＬ．ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２、ＰＦ１５およびＰＬ１３株を使用することで、最も広い阻害スペクトルが確保される。
【０１３８】
実施例４
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２、ＰＦ１５、ＰＬ１３の培養物の調製および接種のプロトコル
１）ＦＹＰブロス中でＬ．ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２、ＰＦ１５およびＰＬ１３株（Ｄ−フルクトース１０ｇ、酵母抽出物１０ｇ、ポリペプトン＊５ｇ、酢酸ナトリウム２ｇ、Ｔｗｅｅｎ  ８０  ０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．２ｇ、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ、蒸留水［ｐＨ６．８］１リットル当たり０．０１ｇのＮａＣｌ）を３０℃で２４時間成長させる。
２）各培養ブロスを１００００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離する。
３）上清を除去し、細胞を生理的溶液（９ｇ／ｌのＮａＣｌ）に再懸濁する。
４）各細胞懸濁液を１００００×ｇで４℃で１０分間遠心分離する。
５）上清を除去し、細胞を生理的溶液（９ｇ／ｌのＮａＣｌ）に再懸濁する。
６）各セル懸濁液を１００００×ｇで４℃で１０分間遠心分離する。
７）上清を除去し、細胞を生理的溶液（９ｇ／ｌのＮａＣｌ）に再懸濁する。
８）各セル懸濁液を、光学密度０．２５に相当する９  ＬｏｇＣＦＵ／ｍｌの細胞密度になるように、細胞懸濁液１００μｌおよび水９００μｌを含むキュベット上の波長６２０ｎｍにおける分光光度計で読み取る。
９）８  ＬｏｇＣＦＵ／ｇに相当する最終接種材料を得るために、各株の細胞懸濁液を１：１０の比率で花粉に加える（あらかじめ解凍して室温に持ち込んだ）。
＊ポリペプトンは、他のタンパク質加水分解物（例えば、ペプトン、肉抽出物、トリプトン）と置き換えてもよい。
【０１３９】
実施例５
Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ  ａｎｏｍａｌｕｓまたはＨａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｕｖａｒｕｍ  ＡＮ８Ｙ２７ＢまたはＷｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ属もしくはＨａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ属に属する他の酵母の培養物の調製および接種のプロトコル：
１）Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ  ａｎｏｍａｌｕｓまたはＨａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｕｖａｒｕｍ  ＡＮ８Ｙ２７Ｂ、またはＷｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓもしくはＨａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ属に属する別の酵母を酵母抽出物ペプトンデキストロースブロス（ＹＰＤ，Ｏｘｏｉｄ）中で３０℃で４８〜７２時間成長させる。
２）培養ブロスを１００００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離する。
３）上清を除去し、細胞を生理的溶液（９ｇ／ｌのＮａＣｌ）に再懸濁する。
４）細胞懸濁液を１０，０００×ｇで４℃で１０分間遠心分離する。
５）上清を除去し、細胞を生理的溶液（９ｇ／ｌのＮａＣｌ）に再懸濁する。
６）細胞懸濁液を１００００×ｇで４℃で１０分間遠心分離する。
７）上清を除去し、細胞を生理的溶液（９ｇ／ｌのＮａＣｌ）に再懸濁する。
８）細胞懸濁液を、光学密度０．１に相当する７  ＬｏｇＣＦＵ／ｍｌの細胞密度になるように、細胞懸濁液１００μｌおよび水９００μｌを含むキュベット上の波長６００ｎｍにおける分光光度計で読取する。
９）細胞懸濁液を１００００×ｇで４℃で１０分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を最初の体積より１００倍低い体積に再懸濁する
１０）８  ＬｏｇＣＦＵ／ｇに相当する最終接種材料を得るために、１：１０の割合で株の細胞懸濁液を花粉（以前に解凍して室温に持ち込んだもの）に加える。
【０１４０】
実施例６
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２、ＰＦ１５、およびＰＬ１３の培養物の調製および接種のプロトコル
１）Ｌ．ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２、ＰＦ１５およびＰＬ１３をＦＹＰブロス（蒸留水［ｐＨ６．８］１Ｌ当たりＤ−フルクトース１０ｇ、酵母抽出物１０ｇ、ポリペプトン＊５ｇ、酢酸ナトリウム２ｇ、Ｔｗｅｅｎ  ８０  ０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．２ｇ、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ、０．０１ｇのＮａＣｌ）中で、前接種材料の調製のために３０℃、２４時間成長させる。
２）顆粒中の乾燥花粉で調製し、＋４℃で保存した成長培地中の各株の前接種材料の培養を１０％ずつ移し、顆粒の外被層を少なくとも部分的に破壊するためにミルまたは顆粒剤で前処理し、１０〜２０％の濃度（重量／重量）で滅菌脱塩水中に再懸濁し、ｐＨ値５．２５±０．２５にし、３０℃で２４時間インキュベートする。
３）７〜８  ＬｏｇＣＦＵ／ｇに相当する最終接種材料を得るように、バイオリアクター内で各菌株の培養物を１：１０の比率で接種する。成長培地は、花粉を顆粒中で乾燥させて調製し、＋４℃で保存し、ポイント１に記載されるように顆粒の外壁部を弱めるために前処理し、１０〜２０％の濃度まで滅菌脱塩水中に再懸濁させる。
＊ポリペプトンは、他のタンパク質加水分解物（例えば、細菌学的ペプトン、肉抽出物、トリプトン）と置き換えてもよい。
【０１４１】
実施例７
選択した株Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２，ＰＦ１５およびＰＬ１３ならびに酵母Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｕｖａｒｕｍ  ＡＮ８Ｙ２７Ｂから構成される混合スターターを用いた新鮮花粉の発酵
１）原材料：未処理の新鮮花粉で−２０℃保存
２）１０８ＣＦＵ／ｇの細胞密度で接種したＬ．ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２、ＰＦ１５およびＰＬ１３、ならびにＨ．ｕｖａｒｕｍ  ＡＮ８Ｙ２７Ｂから構成される混合スターターの接種。Ｌ．ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２、ＰＦ１５、およびＰＬ１３、ならびにＨ．ｕｖａｒｕｍ  ＡＮ８Ｙ２７Ｂの培養物の調製および接種のプロトコルを、実施例４および５に記載する。
３）最終湿度が４０％になるまで蒸留水を加える（最終湿度値には、花粉の初期水分量［約２１．５６％］および接種ステップ中に加えた水分も含まなければならない）。
４）５０ｍｌ滅菌チューブで３０℃で２１６時間インキュベートする。
【０１４２】
結果
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２、ＰＬ１３およびＰＦ１５、ならびにＨａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｕｖａｒｕｍ  ＡＮ８Ｙ２７Ｂの選択された株から構成される混合スターターの密度８  ＬｏｇＣＦＵ／ｇに接種し、最終的な花粉湿度４０％で３０℃で２１６時間インキュベートすることを含む、新鮮花粉の発酵プロトコルを定義した。ＦＹＰ寒天培地でのプレート計数および滴定酸性度（ＴＴＡ）の測定により、インキュベーション中の乳酸菌の成長および酸性化を、発酵中にモニタリングした（図１）。ＴＴＡ乳酸菌の細胞密度を、混合スターター接種を除いて同じ条件で処理した、非接種花粉（対照）の自然発酵中にモニターした（図１）。ＴＴＡ乳酸菌の細胞密度は、混合スターター接種を除いて同じ条件で処理された、接種されていない花粉（対照）の自発的な発酵中にモニタリングされた（図１）。選択した混合スターターを添加すると、花粉中の乳酸菌の細胞密度は、９６時間後に約９  ＬｏｇＣＦＵ  ｇ−１に達し、１４４時間まで一定に保たれ、残りのインキュベーション時間中約７  ＬｏｇＣＦＵｇ−１に減少した。そうでなければ、花粉の自発的な発酵中に、乳酸菌は１２０時間後にのみ約９  ＬｏｇＣＦＵ  ｇ−１の密度に達し、残りのインキュベーション時間中に急速に４  ＬｏｇＣＦＵｇ−１に低下した。発酵中のＴＴＡの増加は、乳酸菌の成長と一致した。花粉の自発的な発酵中、酸性化は、選択した混合スターターで行った発酵に比べて遅く、強度も低かった（Ｐ＜０．０５）。
【０１４３】
実施例８
花粉発酵プロトコル
１）原料：前処理しておらず、−２０℃で保存した、または＋４℃もしくは室温で保存した乾燥もしくは除湿し、５．２５＋／−０．２５の値に達するまで花粉のｐＨ値を粉砕および補正して前処理した新鮮な花粉、
２）１０７ＣＦＵ／ｇの細胞密度で、選択した乳酸菌Ｌ．ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２、ＰＦ１５およびＰＬ１３、ならびに酵母Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ  ａｎｏｍａｌｕｓから構成される混合スターターの接種。
３）最終湿度７０％まで蒸留水を加える。
４）滅菌試験管またはバイオリアクター中で３０℃で６０時間インキュベートする。
【０１４４】
発酵花粉は、ライオスタットで凍結乾燥する。
【０１４５】
実施例９
機械的前処理による酵母接種なしで選択したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２株、ＰＦ１５株およびＰＬ１３株を用いたバイオリアクターにおける花粉発酵プロトコル
１）原料：顆粒中で乾燥し＋４℃で保存した花粉で、ミルまたは顆粒剤中で機械的に前処理し、滅菌脱塩水中でバイオリアクター内に再懸濁した顆粒の外壁部を破壊して、最終容量５Ｌに至る濃度１０〜２０％（重量／重量）になるようにする
２）５．２５＋／−０．２５の間の値に達するまでのｐＨ値の補正。
３）１０７〜１０８ＣＦＵ／ｇの細胞密度でのＬ．ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２、ＰＦ１５およびＰＬ１３で構成されたスターターの接種。Ｌ．ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２、ＰＦ１５およびＰＬ１３の培養物の調製および接種のためのプロトコルは、以下の実施例６に記載される。
４）３０℃で２〜４日間、７０〜１００ｒｐｍで攪拌しながらインキュベートし、発酵培地を均質に保つ。
５）発酵花粉をライオスタットで凍結乾燥する（９Ａ）か、またはスプレー乾燥して乾燥させる（９Ｂ）。
【０１４６】
実施例１０
熱前処理による酵母接種なしで選択したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２、ＰＦ１５およびＰＬ１３株を用いたバイオリアクターにおける花粉発酵プロトコル
１）原料：顆粒中の除湿花粉、熱前処理（１２１℃、１５’）したものをバイオリアクター内で滅菌脱塩水中に１０〜２０％の濃度（重量／重量）で再懸濁し、最終容量５Ｌとした。
２）５．２５＋／−０．２５の間の値に達するまでのｐＨ値の補正。
３）１０７〜１０８ＣＦＵ／ｇの細胞密度でのＬ．ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２、ＰＦ１５およびＰＬ１３で構成されたスターターの接種。Ｌ．ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２、ＰＦ１５およびＰＬ１３の培養物の調製および接種のためのプロトコルは、以下の実施例６に記載される。
４）３０℃で２〜４日間、７０〜１００ｒｐｍで攪拌しながらインキュベートし、発酵培地を均質に保つ。
５）発酵花粉をライオスタットで凍結乾燥する（１０Ａ）か、またはスプレー乾燥して乾燥させる（１０Ｂ）。
Ｌ．ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２，ＰＦ１５，ＰＬ１３で構成されたスターターの接種。Ｌ．ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２、ＰＦ１５およびＰＬ１３の培養物の調製および接種のためのプロトコルは、以下の実施例６に記載される。
３０℃で２〜４日間、７０〜１００ｒｐｍで撹拌しながらインキュベートし、発酵培地を均質に保つ。
発酵花粉をライオスタット（１０Ａ）で凍結乾燥するか、噴霧乾燥（１０Ｂ）して乾燥させる。
【０１４７】
実施例１１
選択株Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２、ＰＦ１５およびＰＬ１３ならびに酵母Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｕｖａｒｕｍ  ＡＮ８Ｙ２７Ｂから構成される混合スターターを用いた発酵花粉の栄養強化
実施例７に記載されたプロトコルに従って得られた発酵花粉を、化学的および栄養学的観点から特性評価した。花粉中の単一、全および遊離アミノ酸含有量は、カチオン交換カラムを装備したＢｉｏｃｈｒｏｍ  ３０  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  （Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  Ｌｔｄ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐａｒｋ，Ｅｎｇｌａｎｄ）により測定した（図２）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ消化をシミュレートする多相プロトコルを用いて、花粉タンパク質の消化性を推定した（図３）。さらに、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２  １０／３００  ＧＬカラムおよび２１４ｎｍ  ＵＶ検出器を搭載したＡＥＫＴＡ  ＦＰＬＣシステムを用いて、花粉のペプチドプロファイルを解析した（図３）。Ｆｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ法（図４）により、水およびメタノールに可溶である有利フェノール化合物中の含有量を測定した。
【０１４８】
結果
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２、ＰＬ１３およびＰＦ１５、ならびにＨａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｕｖａｒｕｍ  ＡＮ８Ｙ２７Ｂ（図２）およびペプチド（図３）からなる混合スターターを用いた発酵花粉では、新鮮花粉と比較して、それぞれ約１４および１２ｇ  ｋｇ−１（乾燥重）の有意な総遊離アミノ酸の増加（Ｐ＜０．０５）が観察された。さらに、発酵花粉は、新鮮な花粉（６２．１１±０．８％）と比較して、可消化性タンパク質（７５．１４±０．７％）においてより大きな（Ｐ＜０．０５）含有率を示した（図３）。さらに、新鮮花粉（８．４３±０．８５および４５．７３±４．８１ｇ没食子酸ｅｑ．ｋｇ乾燥重量−１）と比較して、発酵花粉では水溶性（１５．９８±０．６４ｇ没食子酸ｅｑ．ｋｇ乾燥重量）およびメタノール溶性（６９．５３±４．５２ｇ没食子酸ｅｑ．ｋｇ乾燥重量−１）遊離フェノール化合物のより高い濃度（Ｐ＜０．０５）が認められた。
【０１４９】
実施例１２
１．実験的試験
２．実験作業の目的
以下に報告する実験手順は、発酵花粉（ビーブレッド）の異なる試験のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を検討し、ヒトケラチノサイトに対するその抗酸化活性および抗炎症活性（ＴＮＦ−α）を特性化することを目的とする。
【０１５０】
３．材料
３．１  試験試料
【表４】
2021530215.tif 000011
＊  選択したスターターは、Ｌ．ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２、ＰＦ１５、およびＰＦ３、ならびにＷｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ  ａｎｏｍａｌｕｓ  ＬＣＦ１６９５で構成される
【０１５１】
発酵生成物は、３０℃で１２時間保持した。
【０１５２】
すべての抽出物を培地（１００％溶液溶解度ストック）で５０ｍｇ／ｍｌに希釈し、滅菌ろ過した（５ｍｇ／ｍＬ）。保存株は、−２０℃で保存した。
【０１５３】
３．２  使用した試薬および器具
【表５】
2021530215.tif 000012
【０１５４】
【表６】
2021530215.tif 000013
【０１５５】
３．３  使用した生物学的モデル
３．３．１  ヒトケラチノサイトの培養
ヒトケラチノサイトＮＣＴＣ２５４４の不死化株を使用し（Ｐｅｒｒｙ  Ｖ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，１９５７）、滅菌フラスコ（２５ｃｍ３）で培養し、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリンおよびストレプトマイシンと０．１％ゲンタマイシンの存在下でグルタミン２ｍＭを添加したＲＰＭＩ培養培地中で、５％ＣＯ２の湿気下で３７℃でインキュベートした。
【０１５６】
１：３分割は、１ＸＰＢＳ（Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まないリン酸緩衝液）で洗浄し、細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ液で３７℃で２分間脱離することにより、単層を達成した後に２日毎に行う。この細胞を、２５ｃｍ３の滅菌フラスコ中で培養に保持し、５％ＣＯ２の湿潤雰囲気中で３７℃でインキュベートした。
【０１５７】
【表７】
2021530215.tif 000014
【０１５８】
３．３．２  対照
３．３．２．１  誘導された酸化ストレスＭＴＴ試験
陰性対照：２．５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、グルタミン２ｍＭを添加したＲＰＭＩで処理していない細胞を、１％ペニシリンおよびストレプトマイシンと０．１％ゲンタマイシンの存在下で、３７℃および５％ＣＯ２（暗所）で（９６ウェル）培養プレートに保存した。
【０１５９】
陽性対照：２．５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、グルタミン２ｍＭを添加したＲＰＭＩ中で過酸化水素１ｍＭで２時間処理した細胞を、１％ペニシリンおよびストレプトマイシンと０．１％ゲンタマイシンの存在下で、３７℃および５％ＣＯ２（暗所）で（９６ウェル）培養プレートに保持した。
【０１６０】
３．３．２．２  抗炎症活性試験
陰性対照：２．５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、グルタミン２ｍＭを添加したＲＰＭＩで処理していない細胞を、１％ペニシリンおよびストレプトマイシンと０．１％ゲンタマイシンの存在下で、３７℃および５％ＣＯ２の２５ｃｍ２培養プレート中（１２ウェル）に保存した。
【０１６１】
陽性対照：２．５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、グルタミン２ｍＭを添加したＲＰＭＩで処理していない細胞を、１％ペニシリンおよびストレプトマイシンと０．１％ゲンタマイシン１０μｇ／ｍＬ  ＬＰＳの存在下で、３７℃および５％ＣＯ２の２５ｃｍ２培養プレートに（１２ウェル）保存した。
【０１６２】
４．方法
４．１  ヒトケラチノサイト株ＮＣＴＣ２５４４に誘導される酸化ストレスに対する保護の研究
４．２．１  方法の原理
Ｒａｊａｐａｋｓｅおよび共同研究者（２００５）により２００５年に実施された研究は、活性化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗酸化活性を研究するためにＭＴＴアッセイのような高度に使用され汎用される方法を用いる可能性を実証した。具体的には、この方法によって、このような化合物の後に酸化ストレスにさらされた細胞に対する保護作用を検討することが可能である。酸化ストレスの誘導は、ＲＯＳの形成を介して細胞内の酸化的損傷の産生を誘導する薬剤である過酸化水素とインキュベートすることによって行われる。いかなる保護作用も、同じ酸化ストレスにさらされた細胞と比較して、試験される活性化合物に前処理／前曝露された細胞の酸化ストレス後の細胞生存性の評価を通して決定することができる。より高い細胞生存率は、試験した化合物の保護作用に対応するであろう。
【０１６３】
４．２．２  実験手順
アッセイは、Ｃｏｄａと共同研究者（Ｃｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）が記載した方法に従って実施し、若干の変更を加えた。
【０１６４】
ヒトケラチノサイトＮＣＴＣ２５４４を、５×１０４細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種し、約８０％のコンフルエントに達するまで５％ＣＯ２で３７℃でインキュベートした。
【０１６５】
次に、それぞれ試料Ｂ、ＦＥＲ８６７、ＦＥＲ８６８、ＦＥＲ８６９、ＦＥＲ８７０およびＦＥＲ８７１について、細胞を、それぞれ１００〜２５０および５００μｇ／ｍＬの濃度で、試験すべき活性化合物およびそれぞれの対照と１６時間インキュベートした。
【０１６６】
希釈液は、１％ペニシリンとストレプトマイシンおよび０．１％ゲンタマイシンの存在下で、ＤＭＳＯのストック５０ｍｇ／ｍＬから開始し、滅菌ろ過し、２．５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、グルタミン２ｍＭを添加したＲＰＭＩ培地を用いて調製した。
【０１６７】
陽性対照としてＨ２Ｏ２１ｍＭで処理した細胞を用いた。代わりに、培養物のみで保持した細胞（ＲＰＭＩ  ２．５％ＦＢＳ）を陰性対照として用いた。
【０１６８】
アルファトコフェロールを基準値酸化防止剤として、それぞれ１００、２５０および５００μｇ／ｍｌの濃度で試験した。
【０１６９】
１６時間の前処理を経て、細胞はＰＢＳ  １Ｘで洗浄され、暗所で３７℃、５％のＣＯ２で、１ｍｍのＨ２Ｏ２溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）で９０分間インキュベートされた。
【０１７０】
いったん酸化ストレス誘導段階が終了したら、ポイント４．１．２（ＭＴＴアッセイ）に記載された方法に従って、様々な試料の細胞生存率を評価した。
【０１７１】
データは、以下の式に従って、ストレスを与えなかった対照細胞（ｃｔｒ）と比較した細胞生存率のパーセンテージで表した：
％  細胞生存率／ｃｔｒ＝（Ａｂｓ試料／Ａｂｓｃｔｒ）＊１００
【０１７２】
すべての試験は少なくとも２回、２つ１組で実施された。
【０１７３】
４．３  抗炎症活性（ＴＮＦ−α）の検討
４．４．１  実験手順
ＮＣＴＣ２５４４細胞におけるＴＮＦ−α炎症マーカーの遺伝子発現を、相対定量ＲＴ−ＰＣＲ（定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応−ｑＲＴ−ＰＣＲ）により評価した。
【０１７４】
この分析には３段階の連続ステップが必要であった：
・全ＲＮＡの抽出；
・ｃＤＮＡの逆転写；
ｑＲＴ−ＰＣＲ。
【０１７５】
ヒトケラチノサイトＮＣＴＣ２５４４を、０．５×１０６  細胞／ウェルの密度で１２ウェルプレートに播種し、約８０％のコンフルエントに達するまでインキュベートした。
【０１７６】
次いで、細胞を、１００、２５０および５００μｇ／ｍＬの濃度で、試料Ｂ、ＦＥＲ８６７、ＦＥＲ８６８、ＦＥＲ８６９、ＦＥＲ８７０およびＦＥＲ８７１とともに、それぞれ１６および２４時間インキュベートした。
【０１７７】
希釈液は、１％ペニシリンとストレプトマイシンおよび０．１％ゲンタマイシンの存在下で、２．５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、グルタミン２ｍＭを添加した培地（ＲＰＭＩ）中のストック５０ｍｇ／ｍＬから始めて調製した。
【０１７８】
ＬＰＳ  （リポ多糖類）を１０μｇ／ｍＬの量で炎症のインデューサーとして使用し、１６および２４時間処理溶液と共インキュベートした。
【０１７９】
陰性対照として、培養培地のみで保持した細胞（ＲＰＭＩ  ２．５％ＦＢＳ）を用いた。
【０１８０】
代わりに、培養培地のみ（ＲＰＭＩ  ２．５％ＦＢＳ）および１０μｇ／ｍＬ  ＬＰＳに保持した細胞を、陰性対照として用いた。
【０１８１】
インキュベート後、ＲＮＡを抽出した。
【０１８２】
ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉとＭａｃｋｅｙ（１９９５）によって記載されたものに従って、ＮＣＴＣ２５４４細胞から全ＲＮＡを抽出した。
【０１８３】
関心の活性化合物とのインキュベーション後、細胞をＰＢＳ（１×）で洗浄し、最終的にＲＮＡ抽出手順に供した。抽出後、抽出ＲＮＡをＱｉａＥｘｐｅｒｔ（Ｑｉａｇｅｎ）装置を用いて定量し、２６０ｎｍ波長で抽出された全ＲＮＡのμｇ／ｍＬ中の濃度を計算した。
【０１８４】
最後に、１％アガロースゲル上で電気泳動を行うことによって、ＲＮＡの完全性（２μｇ／ｍＬ）を評価した。
【０１８５】
ＲＮＡの鎖を鋳型として用いてＮＡ分子を合成できる酵素を用いて、全ＲＮＡをｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）に変換した。このＤＮＡ−ポリメラーゼＲＮＡ依存性酵素は、逆転写酵素とよばれる。
【０１８６】
それは、ＲＮＡの一本鎖の３’末端に結合し、ランダムプライマーおよびデオキシヌクレオシド三リン酸（ＤＮＴＰＳ）を介して、それは、ｃＤＮＡの鎖を合成する。
【０１８７】
この目的のために、５Ｘ  ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  Ｂｕｆｆｅｒ（リアルタイム用）；ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ１；ＯｌｉｇｏｄＴＰｒｉｍｅｒ；Ｒａｎｄｏｍ  ６  ｍｅｒｓ；ＲＮＡｓｅ非含有２  ｄＨ２Ｏを含む市販キット「ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ試薬キット（ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）」（ＴａｋａｒａＢｉｏＩｎｃ．、日本）を使用した。
【０１８８】
抽出し、定量したＲＮＡを、２μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、ｃＤＮＡに逆転写した。１０μＬのマスターミックス（５Ｘ  ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  Ｂｕｆｆｅｒ（リアルタイム用）；ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ１；ＯｌｉｇｏｄＴＰｒｉｍｅｒ；Ｒａｎｄｏｍ  ６  ｍｅｒｓ１００μＭ）を調製し、そこに１０μＬのＲＮＡ  （２μｇ／ｍｌ）を加えた。
【０１８９】
試料を、サーマルサイクラー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｍｘ３０００Ｐ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｔａｌｙ  Ｓ．ｐ．Ａ．、イタリア、ミラノ）に置き、次の条件で再登録に供した：
３７℃、１５分間；
８５℃、５秒間；
４℃保持
【０１９０】
逆転写後、試料にＤＥＰＣ水３０μＬを加えて、最終濃度４０ｎｇ／μＬのｃＤＮＡを得た。
【０１９１】
ｑＲＴ−ＰＣＲは、反応中に放出される蛍光をモニタリングすることにより、増幅産物をリアルタイムに増幅および定量する方法である。
【０１９２】
ＲＴ−ＰＣＲ増幅には、ＴａｑＭａｎ（登録商標）（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）プローブシステムを用いた。以下のＴａｑＭａｎプローブを用いた：Ｈｓ００１７４１２８＿ｍ１（ＴＮＦ−α）およびＨｓ９９９９９９０５＿ｍ１（ＧＡＰＤＨ）。ＧＡＰＤＨ．対照遺伝子（ハウスキーピング）としてＨｓ９９９９９９０５＿ｍ１を用いた。
【０１９３】
Ｔａｑｍａｎプローブは、増幅が進むにつれて蛍光の発達を可能にするプローブの一種である。レポーター（フルオロフォアＦＡＭ（商標））はその５’末端に結合し、一方クエンチャーは３’末端に結合する。レポーターとクエンチャーとの間の近さは、蛍光シグナル発光を打ち消す。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ）蛍光の５’エソヌクレアーゼ活性のみが検出され、増幅産物の蓄積は、各サイクルの間に増加するレポーターの蛍光の増加を通して評価することができる。
【０１９４】
ｑＲＴ−ＰＣＲ用にマスターミックスを以下のように設定した：
・１０μｌの「２Ｘ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ」；
・１μｌの「２０×  ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ」（２つのプライマーおよびフルオロフォア標識蛍光プローブＦＡＭ（商標）を含む）；
・０．４μｌの受動的参照Ｒｏｘ  ＩＩ；
・５μｌのＤＥＰＣ水
【０１９５】
Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘには、標的遺伝子用に４μＬのｃＤＮＡを、ハウスキーピング遺伝子用に１μＬのｃＤＮＡを添加した。
【０１９６】
増幅は、以下の条件で４０回実施した：
・９５℃、３０秒（Ａｍｐｌｉｔａｑａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）；
・９５℃、５秒（変性）
・６０℃、２０秒（アニーリング−延長）；
【０１９７】
各分析は、２つ１組で実施した。
【０１９８】
得られたデータは、２−ΔΔＣｔの方法に従って解析し、したがってハウスキーピング遺伝子と比較して標準化し、対照試料（未処理細胞）上で校正した、目的遺伝子の式の相対値を算出することが可能であった：
ΔΔＣｔ＝ΔＣｔｔａｒｇｅｔ−ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ（対照）−ΔＣｔｔａｒｇｅｔ−ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ（処理細胞）
【０１９９】
２−ΔΔＣｔは、増幅率を１００％と仮定して算出した。
【０２００】
５．結果
５．１  誘導された酸化ストレスに対する保護アッセイ
図５は、既知の作用の抗酸化剤、α−トコフェロールと比較して、試験した試料の誘導された酸化ストレスに対する保護の活性に関係するデータを示す。
【０２０１】
結果は、２５０および５００μｇ／ｍＬの濃度で分析した全ての化合物に対し誘導された酸化ストレスに対する有意な保護活性を示し、この活性はα−トコフェロールのそれと同等である。
【０２０２】
５．２  抗炎症活性（ＴＮＦ−α）の検討
添付した図６ＡおよびＢは、試料Ｂ（対象）、ＦＥＲ８６７、ＦＥＲ８６８、ＦＥＲ８６９、ＦＥＲ８７０およびＦＥＲ８７１を、それぞれ１００〜２５０および５００μｇ／ｍＬの濃度で１６時間（図６ａ）および２４時間（図６Ｂ）処理した後のＴＮＦ−α遺伝子発現データを示す。
【０２０３】
１６時間の処理後、１００、２５０および５００μｇ／ｍＬの濃度で試験した試料Ｂ、およびＦＥＲ８６７は、最も有意な抗炎症活性を示す（図６Ａ）。
【０２０４】
抗炎症活性は、特にＦＥＲ８６７試料については、処理の２４時間後により明白である（図６Ｂ）。
【０２０５】
６．結論
結論として、実施した試験は、２５０および５００μｇ／ｍｌの濃度で試験した全試料について、誘導された酸化ストレスに対する有意な保護活性を示した（図５）。
【０２０６】
さらに、消炎作用の研究では、１６時間の治療後に、１００および２５０μｇ／ｍｌの濃度で試験した試料Ｂ，ＦＥＲ８６７が有意な消炎活性を示すことが示された（図６Ａ）。
【０２０７】
化合物ＦＥＲ８６９について、５００μｇ／ｍｌの濃度は、ＴＮＦ−α関連ｍＲＮＡ式を有意に低下させた。１００および５００μｇ／ｍＬの濃度のＦＥＲ８７１は、ｍＲＮＡ産生の減少を示す。被験化合物の抗炎症活性は、特にＦＥＲ８６７化合物については、２４時間の処理後により明らかである（図６Ｂ）。
【０２０８】
書誌学
Ａｒｃｈ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｒｅｓ  １９７６；２５６（３）：２５５−２６０−  ＰＭＩＤ：９９０１０２
Ａｒｃｈ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｒｅｓ  １９７６；２６１（１）：２７−３１
Ｍｏｓｍａｎｎ  Ｔ，１９８３．Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６５（１−２），５５−６３．
Ｒａｊａｐａｋｓｅ  Ｎ，Ｍｅｎｄｉｓ  Ｅ，Ｂｙｕｎ  ＨＧ，Ｋｉｍ  ＳＫ，２００５．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓＯｆ  ｇｉａｎｔ  ｓｑｕｉｄ  ｍｕｓｃｌｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓＯｎ  ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄＯｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｊ  ＮｕｔｒＢｉｏｃｈｅｍ  １６（９），５６２−５６９．
Ｃｏｄａ  Ｒ，Ｒｉｚｚｅｌｌｏ  ＣＧ，Ｐｉｎｔｏ  Ｄ，Ｇｏｂｂｅｔｔｉ  Ｍ，２０１２．Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｌａｃｔｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅ  Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｓｏｕｒｄｏｕｇｈ  ＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎＯｆ  Ｃｅｒｅａｌ  Ｆｌｏｕｒｓ．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７８（４），１０８７−１０９６．
Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ  Ｐ，Ｍａｃｋｅｙ  Ｋ．ＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎＯｆ  ｔｈｅ  ＴＲＩ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎＯｆ  ＲＮＡ  ｆｒｏｍ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ−ｒｉｃｈ  ｓｏｕｒｃｅｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９９５；１９：９４２−５．
【０２０９】
実施例１３
軟質ゼリーカプセル
各ソフトゼリーカプセル（真珠）は、以下を含有する：ｑ．ｔｙ  ｕ．ｍ．
酵母を接種せずに、選択したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ菌株ＰＦ１２、ＰＦ１５、およびＰＬ１３で発酵させた花粉、例５参照  １００ｍｇ
大豆油  ２５０ｍｇ
大豆レシチン  ５ｍｇ
脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリド  ３０ｍｇ
シェルの構成成分：
ゼラチン  １４５ｍｇ
グリセロール  ６７ｍｇ
【０２１０】
実施例１４
錠剤
各投与量は、以下を含む。ｑ．ｔｙ  ｕ．ｍ．
酵母を接種せずに、選択したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ菌株ＰＦ１２、ＰＦ１５、およびＰＬ１３で発酵させた花粉、例５参照  ２００ｍｇ
微結晶セルロース  １００ｍｇ
ＢｉｏＧＡＢＡ  ［ブドウのマスト（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ  Ｌ．フルーツ）の発酵からのガンマアミノ酪酸、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍＣ４８］  １００ｍｇ
ポリビニルプロロリドン  ３５ｍｇ
コメ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ種子乾燥抽出物）  ５０ｍｇ
アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ  花乾燥抽出物）  ４０ｍｇ
クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ  Ｈ  Ｃｈｉｃｋ）葉状物乾燥抽出物  ３０ｍｇ
ホスファチジルセリン  ４０ｍｇ
Ｍｅｌｉｓｓａ（ＭｅｌｉｓｓａＯｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ  Ｌ）の葉および花の乾燥抽出物  １００ｍｇ
グリホニア［Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ（ＤＣ）Ｂａｉｌｌ］種子乾燥抽出物  ５１ｍｇ
Ｌ−テアニン  １２．６ｍｇ
二酸化ケイ素  １０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム  １０ｍｇ
【０２１１】
実施例１５
チュアブル錠剤
各投与量は、以下を含む。ｑ．ｔｙ  ｕ．ｍ．
マルトデキストリン  ５０〜３００ｍｇ
デキストロース  ５０〜３００ｍｇ
フルクトース  ５０〜３００ｍｇ
酵母を接種せずに、選択したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ菌株ＰＦ１２、ＰＦ１５、およびＰＬ１３で発酵させた花粉、例５参照  １００ｍｇ
芳香  １０〜３０ｍｇ
トウモロコシデンプン  １０〜３０ｍｇ
微結晶セルロース  １０〜３０ｍｇ
二酸化ケイ素  ５〜１５ｍｇ
ロイシン  ５〜１５ｍｇ
【０２１２】
実施例１６
錠剤
各投与量は、以下を含む。ｑ．ｔｙ  ｕ．ｍ．
リン酸カルシウム  １５０ｍｇ
酵母を接種せずに、選択したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ菌株ＰＦ１２、ＰＦ１５、およびＰＬ１３で発酵させた花粉、例５参照  ５０ｍｇ
ボスウェリア（Ｂｏｓｗｅｌｌｉａ  ｓｅｒｒｒａｔａ  Ｒｏｘｂ）乾燥抽出物樹脂  １５０ｍｇ
パルミトイルエタノールアミド（ＰＥＡ）  １５０ｍｇ
ＢｉｏＧＡＢＡ  ［ブドウのマスト発酵（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ  Ｌ．フルーツ）からのガンマアミノ酪酸、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍＣ４８］  １００ｍｇ
γ−アミノ酪酸  ４９ｍｇ
ウコン（Ｃｕｒｃｕｍａ  ｌｏｎｇａ  Ｌ．）乾燥抽出物  １００ｍｇ
微結晶セルロース  ５０ｍｇ
ビタミンＤ（コレカルシフェロール）  ０．００５ｍｇ
ビタミンＢ３（ニコチンアミド）  １６ｍｇ
ヒドロキシプロピルセルロース  ３０ｍｇ
二酸化ケイ素  ６ｍｇ
脂肪酸のモノおよびジグリセリド  １０ｍｇ
ビタミンＢ１（一硝酸チアミン）  １．３６ｍｇ
ビタミンＢ２（リボフラビン）  １４ｍｇ
ビタミンＢ５（パントテン酸カルシウム）  ６．５ｍｇ
ビタミンＢ６（ピリドキシン塩酸塩）  １．７ｍｇ
ビタミンＫ２（メナキノン−７）  ０．０７５ｍｇ
ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）  ０．０２６ｍｇ
【０２１３】
実施例１７
錠剤
各投与量は、以下を含む。ｑ．ｔｙ  ｕ．ｍ．
アシュワガンダ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ  Ｌ  Ｄｕｎａｌ）根乾燥抽出物  １５０ｍｇ
選択した菌株Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２、ＰＦ１５、ＰＬ１３、および酵母Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｕｖａｒｕｍ  ＡＮ８Ｙ２７Ｂｒｅｆで構成される混合スターターを使用して発酵させた花粉。例４参照  ５０ｍｇ
微結晶セルロース  １００ｍｇ
酸化マグネシウム  １００ｍｇ
バコパ（Ｂａｃｏｐａ  ｍｏｎｎｉｅｒｉ  Ｌ  Ｐｅｎｎｅｌ）乾燥抽出物トップ  １００ｍｇ
ＢｉｏＧＡＢＡ［ブドウのマスト（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ  Ｌ．フルーツ）の発酵からのガンマアミノ酪酸、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍＣ４８］  １００ｍｇ
リン酸カルシウム  １００ｍｇ
γ−アミノ酪酸  ４９ｍｇ
サフラン（Ｃｒｏｃｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ）花抽出物  ３０ｍｇ
ヒドロキシプロピルメチルセルロース  ３０ｍｇ
ビスグリシン酸亜鉛  １０ｍｇ
二酸化ケイ素  ７ｍｇ
（６Ｓ）５−メチルテトラヒドロ葉酸、グルコサミン塩  ０．２ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム  １１ｍｇ
【０２１４】
実施例１８
免疫刺激ＢＡＲ  ３０グラム
酵母を接種せずに、選択した菌株Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２、ＰＦ１５、およびＰＬ１３で発酵させた花粉、例５参照  ２ｇ
グルコースおよびフルクトースシロップ  １０〜１４ｇ
米片  １０〜１２ｇ
ヒマワリレシチン  ０．５〜３ｇ
パーム油（Ｅｌａｅｉｓｇｕｉｎｅｎｓｉｓ）  ０．５〜３％
トウモロコシマルトデキストリン  １〜２ｇ
アカイ（ＥｕｔｅｒｐｅＯｌｅｒａｃｅａ）脱水果実  ３〜４ｇ
レイシン（Ｖｉｔｉｓ  ａｐｙｒｅｎａ  Ｌ）脱水果実  １〜２ｇ
クエン酸  ｑ．ｂ
芳香  ｑ．ｂ
【０２１５】
実施例１９
硬質ゼリーカプセル
各硬質ゼリーカプセルは、以下を含む：ｑ．ｔｙ  ｕ．ｍ．
選択した菌株Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２、ＰＦ１５、ＰＬ１３、および酵母Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｕｖａｒｕｍ  ＡＮ８Ｙ２７Ｂｒｅｆで構成される混合スターターを使用して発酵させた花粉。例４参照  ２００ｍｇ
マルトデキストリン  ５〜５０ｍｇ
不溶性天然繊維  ５〜１００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム  １〜１０ｍｇ
二酸化ケイ素  ３〜６ｍｇ
天然ゼリー外被
【０２１６】
実施例２０
経口水溶性顆粒
各サシェには以下が含まれる：ｑ．ｔｙ  ｕ．ｍ．
選択した菌株Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ  ＰＦ１２、ＰＦ１５、ＰＬ１３、および酵母Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｕｖａｒｕｍ  ＡＮ８Ｙ２７Ｂｒｅｆで構成される混合スターターを使用して発酵させた花粉。例４参照  １０００ｍｇ
イヌリン  ２００〜６００ｍｇ
マルトデキストリン  ０．５〜３．０ｇ
リンゴ酸  １〜１０ｍｇ
芳香  １０．０〜５０．０ｍｇ
スクラロース  ０．００５ｍｇ
【０２１７】
実施例２１
スティックパック中の顆粒状ブレンド
各サシェは、以下を含む：ｑ．ｔｙ  ｕ．ｍ．
酵母を接種せずに、選択したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ菌株ＰＦ１２、ＰＦ１５、およびＰＬ１３で発酵させた花粉、例５参照  ５００ｍｇ
エキナシア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ  ｐｕｒｐｕｒｅａ）地上部乾燥抽出物  ３００ｍｇ
蜂蜜芳香  １０ｍｇ
イヌリン  １〜２ｇ
アラビアゴム  ０．５〜２ｇ
リンゴ酸  ０〜１００ｍｇ
スクラロース  ０．００５ｍｇ
芳香  ０．２５ｍｇ
【０２１８】
例２２
錠剤
各錠剤は、以下を含む：
酵母を接種せずに、選択したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ菌株ＰＦ１２、ＰＦ１５、およびＰＬ１３で発酵させた花粉、例５参照  ５０ｍｇ
微結晶セルロース  ５０ｍｇ
Ｂｒｏｃｃｏｌｉ（ＢｒａｓｓｉｃａＯｌｅｒａｃｅａ  ｉｔａｌｉｃａ  ｖａｒ）花序乾燥抽出物  １２５ｍｇ
ＢｉｏＧＡＢＡ  ［ブドウのマスト（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ  Ｌ．フルーツ）の発酵からのガンマアミノ酪酸  １００ｍｇ
発酵花粉  １００ｍｇ
マスタード（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ  Ｌ  Ｃｚｅｒｎ）種子乾燥抽出物  ７５ｍｇ
Ａｒｔｉｃｈｏｋｅ（Ｃｙｎａｒａ  ｓｃｏｌｙｍｕｓ  Ｌ）葉乾燥抽出物  ６０ｍｇ
アセロラ（Ｍａｌｐｉｇｈｉａｇｌａｂｒａ  Ｌ）果実乾燥抽出物  １００ｍｇ
オレンジ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ  Ｌ）果実乾燥抽出物  ５０ｍｇ
リン酸カルシウム  ５０ｍｇ
ベートルート（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  Ｌ）全植物乾燥抽出物  ５０ｍｇ
ヒドロキシプロピルセルロース  ２０ｍｇ
ベイベリー（Ｍｙｒｉｃａ  ｃｅｒｉｆｅｒａ  Ｌ）樹皮乾燥抽出物  ３０ｍｇ
Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ  ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ）根乾燥抽出物  ３０ｍｇ
ケルセチン  ３０ｍｇ
ビタミンＥ（トコトリエノールトコフェロール）  ６ｍｇ
Β−シトステロール  ２０ｍｇ
リコピン  １０ｍｇ
ニコチンアミド  １６ｍｇ
二酸化ケイ素  １０ｍｇ
脂肪酸のモノおよびジグリセリド  １０ｍｇ
ガレオプシス（Ｇａｌｅｏｐｓｉｓ  ｓｅｇｅｔｕｍ  Ｎｅｃｋｅｒ）地上部乾燥抽出物  ５ｍｇ
スペルミジン三塩酸塩  ０．５ｍｇ
ビオチン  ０．０５ｍｇ
【図１】
2021530215.tif 000015
【図２】
2021530215.tif 000016
【図３】
2021530215.tif 000017
【図３Ｂ】
2021530215.tif 000018
【図４】
2021530215.tif 000019
【図５】
2021530215.tif 000020
【図６Ａ】
2021530215.tif 000021
【図６Ｂ】
2021530215.tif 000022
【国際調査報告】
2021530215.tif 000023
2021530215.tif 000024
2021530215.tif 000025