(57)【要約】  １つまたは複数の他の免疫モジュレーター（すなわち、免疫細胞チェックポイント阻害剤；例えば、ＰＤ−１阻害剤またはＰＤ−１結合剤など）と組み合わせた、免疫モジュレーター（すなわち、ＩＬ−１２）のリガンド誘導性遺伝子スイッチにより制御されるｉｎ  ｖｉｖｏでの発現を介する脳のがん（グリオーマ／神経膠芽腫など）の処置のための改善された方法が本明細書に開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんを有する対象を処置する方法であって、前記対象に、
ａ）Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２ウイルスベクターであって、
ｉ）野生型ヒトＩＬ−１２  ｐ４０と少なくとも８５％同一であるポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド；
ｉｉ）野生型ヒトＩＬ−１２  ｐ３５と少なくとも８５％同一であるポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド；
ｉｉｉ）ＶＰ−１６トランス活性化ドメイン−レチノイン酸Ｘ受容体融合タンパク質（ＶＰ−１６−ＲＸＲ）をコードする第３のポリヌクレオチド；および
ｉｖ）Ｇａｌ４  ＤＮＡ結合ドメインとエクジソン受容体（ＥｃＲ）結合ドメイン融合タンパク質（Ｇａｌ４−ＥｃＲ）をコードする第４のポリヌクレオチド
を含み、ＶＰ−１６−ＲＸＲ融合タンパク質と、Ｇａｌ４−ＥｃＲ融合タンパク質とがリガンド依存性転写因子複合体を形成する、ベクターと、
ｂ）前記リガンド依存性転写因子複合体を活性化するジアシルヒドラジンリガンドと、
ｃ）１つまたは複数の免疫モジュレーターと
を投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記第１のポリヌクレオチドと、前記第２のポリヌクレオチドとが第１のリンカーによって連結されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第３のポリヌクレオチドと、前記第４のポリヌクレオチドとが第２のリンカーによって連結されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１のリンカーおよび／または前記第２のリンカーが、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記第１のリンカーおよび前記第２のリンカーが、異なるＩＲＥＳ配列である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ベクターが複製欠損アデノウイルスベクターである、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ベクターが腫瘍部位に局部的に投与される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ベクターが腫瘍内に、または腫瘍と関連するリンパ節に投与される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ジアシルヒドラジンリガンドが経口的または非経口的に投与される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記免疫モジュレーターが経口的または非経口的に投与される、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ベクターの第１の用量が、前記免疫モジュレーターの１つまたは複数の用量と同時に投与される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ベクターの第１の用量が、前記免疫モジュレーターの１つまたは複数の用量の投与の一定期間後に投与される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記免疫モジュレーターの１つまたは複数の用量が、前記ベクターの投与の約５〜１０日前に前記対象に投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
免疫チェックポイント阻害剤の１つまたは複数の用量が、前記ベクターの投与の約７日前に前記対象に投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ベクターの第１の用量が、前記免疫モジュレーターの１つまたは複数の用量の投与の一定期間前に投与される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ベクターの投与後に、前記免疫モジュレーターの１つまたは複数のその後の用量を投与することをさらに含む、請求項１１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記免疫モジュレーターの１つまたは複数のその後の用量が、前記ベクターの投与の少なくとも７日後に前記対象に投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記免疫モジュレーターの１つまたは複数のその後の用量が、前記ベクターの投与後、７〜２８日以内に前記対象に投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記免疫モジュレーターの１つまたは複数のその後の用量が、前記ベクターの投与の約１５日後に前記対象に投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記免疫モジュレーターのその後の用量が、前記免疫モジュレーターの第１のその後の用量の投与後、２週間毎に１回投与される、請求項１５から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記免疫モジュレーターのその後の用量が、前記免疫モジュレーターの第１のその後の用量の投与後、４週間毎に１回投与される、請求項１５から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ベクターの初期用量と、前記ジアシルヒドラジンリガンドの初期用量とが、他のものと同時に、または逐次的に投与される、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ジアシルヒドラジンリガンドの初期用量が、前記ベクターの初期用量の一定期間後に投与される、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ジアシルヒドラジンリガンドの初期用量が、前記ベクターの初期用量の一定期間前に投与される、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ジアシルヒドラジンリガンドの初期用量が、前記ベクターの投与の約１〜５時間前に投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ジアシルヒドラジンリガンドの１つまたは複数のその後の用量が、前記ジアシルヒドラジンリガンドの初期用量の投与後、１日１回投与される、請求項２０から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ジアシルヒドラジンリガンドのその後の１日用量が、約３〜２８日の期間にわたって投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記期間が１４日である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ベクターが、約１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、または１×１０１２、または２×１０１２個のウイルス粒子（ｖｐ）の単位用量で投与される、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ベクターが、約２×１０１１ｖｐの用量で投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ジアシルヒドラジンリガンドが（Ｒ）−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−（２，２−ジメチルヘキサン−３−イル）−２−エチル−３−メトキシベンゾヒドラジドである、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ジアシルヒドラジンリガンドが、約１ｍｇ〜約１２０ｍｇの単位日用量で投与される、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ジアシルヒドラジンリガンドが、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または１２０ｍｇの単位日用量で投与される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ジアシルヒドラジンリガンドが、約５ｍｇの単位日用量で投与される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ジアシルヒドラジンリガンドが、約１０ｍｇの単位日用量で投与される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記ジアシルヒドラジンリガンドが、約１５ｍｇの単位日用量で投与される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記ジアシルヒドラジンリガンドが、約２０ｍｇの単位日用量で毎日投与される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記免疫モジュレーターが、免疫チェックポイント阻害剤、化学療法、放射線、Ｔ細胞および／もしくはＮＫ細胞を刺激する分子、サイトカイン、抗原特異的結合剤、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、導入されたキメラ抗原受容体を発現する細胞または導入されたＴ細胞受容体を発現する細胞である、請求項１から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記免疫モジュレーターが、ＣＤ３８結合剤、ＳＬＡＭＦ−７（ＣＳＩ）結合剤、ＣＤ９６結合剤、ＤＮＡＭ−１（ＣＤ２２６）結合剤、ＮＫＧ２Ａ結合剤、ＮＫＧ２Ｄ結合剤、ＭＧＮ−３結合剤、ネクチン−１結合剤、ネクチン−２結合剤、樹状細胞ワクチン、腫瘍関連ペプチドワクチン（ＴＵＭＡＰ）ワクチン、がん胎児性抗原ワクチン、ウイルスワクチン、免疫刺激アジュバント、ＬＲＳ結合剤、Ｃ型レクチン結合剤、ＩＦＮ−ガンマ刺激剤、ＴＧＦ−ベータのブロッカーおよび／もしくは阻害剤、ＩＤＯ阻害剤、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１などのサイトカイン、ＣＤ２５結合剤、ＴＬＲ結合剤、ＴＬＲ２結合剤、ＩＤＯ１結合剤、ＴＤＯ結合剤、ＣＤ３９結合剤、ＣＤ７３結合剤、ガレクチン９結合剤、ＨＭＧＢ１結合剤、ホスファチジルセリン結合剤、ＣＥＣＡＭ−１結合剤、ＣＤ４０結合剤、ＣＤ４０Ｌ結合剤、ＯＸ４０結合剤、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）結合剤、４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）結合剤、糖質コルチコイド誘導ＴＮＦＲファミリー関連タンパク質（ＧＩＴＲ）結合剤、ＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）結合剤、ＣＤ２７結合剤またはキラー阻害受容体（ＫＩＲ）結合剤である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、ＰＤ−１結合剤、ＰＤ−Ｌ１結合剤、ＣＴＬＡ−４結合剤、Ｔ細胞活性化のＶドメイン免疫グロブリン抑制因子（ＶＩＳＴＡ）結合剤、ＴＩＭ−３結合剤、ＴＩＭ−３リガンド結合剤、ＬＡＧ−３結合剤、ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを含むＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）結合剤、ＢおよびＴ細胞アテニュエータ−（ＢＴＬＡ）結合剤、Ｂ７−Ｈ３結合剤、ＴＧＦベータとＰＤ−Ｌ１との二重特異性結合剤またはＰＤ−Ｌ１とＢ７．１との二重特異性結合剤である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＰＤ−１結合剤が、ニボルマブ（ＭＤＸ１１０６）、ペンブロリズマブ（ＭＫ−３４７５）、ピジリズマブ（ＣＴ−０１１）、ＭＥＤＩ−０６８０（ＡＭＰ−５１４）、ＰＤＲ−００１、セミプリマブ−ｒｗｌｃ（ＲＥＧＮ２８１０）、ＡＭＰ−２２４、ＳＴＩ−Ａ１１１０、ＡＵＮＰ−１２、またはＢＧＢ−Ａ３１７である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＰＤ−１結合剤がニボルマブ（ＭＤＸ１１０６）である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ニボルマブ（ＭＤＸ１１０６）が約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約７ｍｇ／ｋｇの１つまたは複数の用量で投与される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ニボルマブ（ＭＤＸ１１０６）が約１ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ニボルマブ（ＭＤＸ１１０６）が約３ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
ニボルマブ（ＭＤＸ１１０６）が約３０ｍｇ〜約５００ｍｇの１つまたは複数の一律用量で投与される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
ニボルマブ（ＭＤＸ１１０６）が約２４０ｍｇの一律用量で投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ニボルマブ（ＭＤＸ１１０６）が約４８０ｍｇの一律用量で投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＰＤ−１結合剤がセミプリマブ−ｒｗｌｃ（ＲＥＧＮ−２８１０）である、請求項４１に記載の方法。
【請求項５０】
セミプリマブ−ｒｗｌｃ（ＲＥＧＮ−２８１０）が約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約６ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＰＤ−１結合剤が静脈内投与される、請求項４０から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記対象に、有効量のコルチコステロイドを投与することをさらに含む、請求項１から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記コルチコステロイドがデキサメタゾンである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記対象が、前記ジアシルヒドラジンリガンドの投与前にコルチコステロイドを以前に投与されたことがない、請求項５２または５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記対象が、前記ジアシルヒドラジンリガンドの投与前の４週間以内にコルチコステロイドを以前に投与されたことがない、請求項５２または５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記対象が、前記ジアシルヒドラジンリガンドの投与前にコルチコステロイドを以前に投与されたことがある、請求項５２または５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記対象が、前記ジアシルヒドラジンの投与前の４週間以内にコルチコステロイドを以前に投与されたことがある、請求項５２または５３に記載の方法。
【請求項５８】
前記コルチコステロイドが前記ジアシルヒドラジンリガンドの投与中に投与される、請求項５２から５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
ジアシルヒドラジンリガンドの投与中のコルチコステロイドの累積用量が、約２０ｍｇ未満であるか、または約２０ｍｇに等しい、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記コルチコステロイドが静脈内または経口投与される、請求項５１から５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記がんが原発腫瘍である、請求項１から６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記がんが転移性腫瘍である、請求項１から６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記がんが再発性がんまたは進行性がんである、請求項１から６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記がんが固形腫瘍である、請求項１から６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記がんが、中枢神経系の腫瘍、グリオーマ腫瘍、腎がん腫瘍、卵巣がん腫瘍、頭頸部がん腫瘍、肝臓がん腫瘍、膵がん腫瘍、胃がん腫瘍、食道がん腫瘍、膀胱がん腫瘍、子宮がん腫瘍、腎盂がん腫瘍、尿路上皮細胞がん腫瘍、泌尿生殖器がん腫瘍、子宮頸がん腫瘍、子宮内膜がん腫瘍、陰茎がん腫瘍、甲状腺がん腫瘍、または前立腺がん腫瘍、乳がん腫瘍、メラノーマ腫瘍、グリオーマ腫瘍、結腸がん腫瘍、肺がん腫瘍、肉腫がん腫瘍、または扁平上皮がん腫瘍、または前立腺がん腫瘍である、請求項１から６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記中枢神経系の腫瘍が、脊索腫、頭蓋咽頭腫、神経節細胞腫、頸静脈グロムス、髄膜腫、松果体細胞腫、松果体芽細胞腫、下垂体腺腫、グリオーマ、星状細胞腫、毛様細胞性星状細胞腫、「びまん性」星状細胞腫、未分化星状細胞腫、上衣腫、未分化上衣腫、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）、髄芽腫、乏突起神経膠腫、純粋乏突起神経膠腫、未分化乏突起神経膠腫、未分化乏突起星状細胞腫神経節膠腫、聴神経腫（シュワン腫）、前庭シュワン腫、脳転移、脈絡叢癌、胚芽腫、生殖細胞腫瘍、胚芽異形成性神経上皮腫瘍（ＤＮＥＴ）、絨毛癌、奇形腫、卵黄嚢腫瘍（内胚葉洞腫瘍）、原発性ＣＮＳリンパ腫、血管芽細胞腫、ラブドイド腫瘍、グリオーマ、アデノーマ、芽細胞腫、癌腫、肉腫、松果体腫瘍、髄芽腫、髄様上皮腫、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍（ＡＴＲＴ）、毛様細胞性星状細胞腫、上衣下巨細胞性星状細胞腫（ＳＥＧＡ）、びまん性星状細胞腫、多形黄色星細胞腫（ＰＸＡ）、視神経膠腫、脳幹神経膠腫、局在性脳幹神経膠腫、びまん性正中神経膠腫、びまん性内在性橋膠腫（ＤＩＰＧ）、正中腫瘍、神経節膠腫、頭蓋咽頭腫、松果体部腫瘍、神経膠芽腫、未分化星状細胞腫、多層性ロゼットを有する胚芽腫、未分化神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ）、松果体芽細胞腫、胚細胞腫、脈絡叢乳頭腫、脈絡叢癌、聴神経腫、神経芽細胞腫、下垂体部腫瘍、高悪性度グリオーマ、髄芽腫（ＭＢ）、神経芽細胞腫（ＮＢ）、ユーイング肉腫（ＥＷＳ）または骨肉腫である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記中枢神経系の腫瘍が、グリオーマ、神経膠芽腫、多形神経膠芽腫、未分化乏突起星状細胞腫、びまん性内在性橋膠腫（ＤＩＰＧ）または正中腫瘍である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記神経膠芽腫が再発性神経膠芽腫である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記神経膠芽腫が進行性神経膠芽腫である、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記グリオーマが悪性グリオーマである、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
前記対象がヒトである、請求項１から７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記対象が小児患者または成人患者である、請求項１から７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記対象においてアブスコパル効果をもたらす、請求項１から７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
がんを有する対象を処置する方法であって、前記対象に、
ａ）Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２ウイルスベクターであって、
ｉ）野生型ヒトＩＬ−１２  ｐ４０と少なくとも８５％同一であるポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド；
ｉｉ）野生型ヒトＩＬ−１２  ｐ３５と少なくとも８５％同一であるポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド；
ｉｉｉ）ＶＰ−１６トランス活性化ドメイン−レチノイン酸Ｘ受容体融合タンパク質（ＶＰ−１６−ＲＸＲ）をコードする第３のポリヌクレオチド；および
ｉｖ）Ｇａｌ４  ＤＮＡ結合ドメインとエクジソン受容体（ＥｃＲ）結合ドメイン融合タンパク質（Ｇａｌ４−ＥｃＲ）をコードする第４のポリヌクレオチド
を含み、前記ＶＰ−１６−ＲＸＲ融合タンパク質と、前記Ｇａｌ４−ＥｃＲ融合タンパク質とがリガンド依存性転写因子複合体を形成する、ベクターと、
ｂ）前記リガンド依存性転写因子複合体を活性化するジアシルヒドラジンリガンドと
を投与することを含む、方法。
【請求項７５】
前記第１のポリヌクレオチドと、前記第２のポリヌクレオチドとが第１のリンカーによって連結されている、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記第３のポリヌクレオチドと、前記第４のポリヌクレオチドとが第２のリンカーによって連結されている、請求項７４または７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記第１のリンカーおよび／または前記第２のリンカーが、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列である、請求項７５または７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記第１のリンカーおよび前記第２のリンカーが、異なるＩＲＥＳ配列である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記ベクターが複製欠損アデノウイルスベクターである、請求項７４から７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記ベクターが腫瘍部位に局部的に投与される、請求項７４から７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記ベクターが腫瘍内に、または腫瘍と関連するリンパ節に投与される、請求項７４から８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記ジアシルヒドラジンリガンドが経口的または非経口的に投与される、請求項７４から８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記ベクターの初期用量と、前記ジアシルヒドラジンリガンドの初期用量とが、同時に、または逐次的に投与される、請求項７４から８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記ジアシルヒドラジンリガンドの初期用量が、前記ベクターの初期用量の一定期間後に投与される、請求項７４から８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記ジアシルヒドラジンリガンドの初期用量が、前記ベクターの初期用量の一定期間前に投与される、請求項７４から８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記ジアシルヒドラジンリガンドの初期用量が、前記ベクターの投与の約１〜５時間前に投与される、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記ジアシルヒドラジンリガンドの１つまたは複数のその後の用量が、前記ジアシルヒドラジンリガンドの初期用量の投与後、１日１回投与される、請求項７４から８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記ジアシルヒドラジンリガンドのその後の１日用量が、約３〜２８日の期間にわたって投与される、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記期間が１４日である、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記ベクターが、約１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、または１×１０１２、または２×１０１２個のウイルス粒子（ｖｐ）の単位用量で投与される、請求項７４から８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記ベクターが、約２×１０１１ｖｐの用量で投与される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記ジアシルヒドラジンリガンドが（Ｒ）−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−（２，２−ジメチルヘキサン−３−イル）−２−エチル−３−メトキシベンゾヒドラジドである、請求項７４から９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記ジアシルヒドラジンリガンドが、約１ｍｇ〜約１２０ｍｇの単位日用量で投与される、請求項７４から９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
前記ジアシルヒドラジンリガンドが、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または１２０ｍｇの単位日用量で投与される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記ジアシルヒドラジンリガンドが、約５ｍｇの単位日用量で投与される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
前記ジアシルヒドラジンリガンドが、約１０ｍｇの単位日用量で投与される、請求項９４に記載の方法。
【請求項９７】
前記ジアシルヒドラジンリガンドが、約１５ｍｇの単位日用量で投与される、請求項９４に記載の方法。
【請求項９８】
前記ジアシルヒドラジンリガンドが、約２０ｍｇの単位日用量で投与される、請求項９４に記載の方法。
【請求項９９】
前記対象に、有効量のコルチコステロイドを投与することをさらに含む、請求項７４から９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記コルチコステロイドがデキサメタゾンである、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記対象が、前記ジアシルヒドラジンリガンドの投与前の４週間以内に前記コルチコステロイドを以前に投与されたことがない、請求項９９または１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記対象が、前記ジアシルヒドラジンリガンドの投与前に前記コルチコステロイドを以前に投与されたことがある、請求項９９または１００に記載の方法。
【請求項１０３】
前記対象が、前記ジアシルヒドラジンの投与前の４週間以内に前記コルチコステロイドを以前に投与されたことがある、請求項９９または１００に記載の方法。
【請求項１０４】
前記コルチコステロイドが前記ジアシルヒドラジンリガンドの投与中に投与される、請求項９９から１０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
ジアシルヒドラジンリガンドの投与中のコルチコステロイドの累積用量が、約２０ｍｇ未満であるか、または約２０ｍｇに等しい、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記コルチコステロイドが静脈内または経口投与される、請求項９９から１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記がんが原発腫瘍である、請求項７４から１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記がんが転移性腫瘍である、請求項７４から１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記がんが再発性がんまたは進行性がんである、請求項７４から１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記がんが固形腫瘍である、請求項７４から１０９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記がんが、中枢神経系の腫瘍、グリオーマ腫瘍、腎がん腫瘍、卵巣がん腫瘍、頭頸部がん腫瘍、肝臓がん腫瘍、膵がん腫瘍、胃がん腫瘍、食道がん腫瘍、膀胱がん腫瘍、子宮がん腫瘍、腎盂がん腫瘍、尿路上皮細胞がん腫瘍、泌尿生殖器がん腫瘍、子宮頸がん腫瘍、子宮内膜がん腫瘍、陰茎がん腫瘍、甲状腺がん腫瘍、または前立腺がん腫瘍、乳がん腫瘍、メラノーマ腫瘍、グリオーマ腫瘍、結腸がん腫瘍、肺がん腫瘍、肉腫がん腫瘍、または扁平上皮がん腫瘍、または前立腺がん腫瘍である、請求項１から６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
固形腫瘍が中枢神経系の腫瘍であり、前記中枢神経系の腫瘍が、脊索腫、頭蓋咽頭腫、神経節細胞腫、頸静脈グロムス、髄膜腫、松果体細胞腫、松果体芽細胞腫、下垂体腺腫、グリオーマ、星状細胞腫、毛様細胞性星状細胞腫、「びまん性」星状細胞腫、未分化星状細胞腫、上衣腫、未分化上衣腫、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）、髄芽腫、乏突起神経膠腫、純粋乏突起神経膠腫、未分化乏突起神経膠腫、未分化乏突起星状細胞腫神経節膠腫、聴神経腫（シュワン腫）、前庭シュワン腫、脳転移、脈絡叢癌、胚芽腫、生殖細胞腫瘍、胚芽異形成性神経上皮腫瘍（ＤＮＥＴ）、絨毛癌、奇形腫、卵黄嚢腫瘍（内胚葉洞腫瘍）、原発性ＣＮＳリンパ腫、血管芽細胞腫、ラブドイド腫瘍、グリオーマ、アデノーマ、芽細胞腫、癌腫、肉腫、松果体腫瘍、髄芽腫、髄様上皮腫、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍（ＡＴＲＴ）、毛様細胞性星状細胞腫、上衣下巨細胞性星状細胞腫（ＳＥＧＡ）、びまん性星状細胞腫、多形黄色星細胞腫（ＰＸＡ）、視神経膠腫、脳幹神経膠腫、局在性脳幹神経膠腫、びまん性正中神経膠腫、びまん性内在性橋膠腫（ＤＩＰＧ）、正中腫瘍、神経節膠腫、頭蓋咽頭腫、松果体部腫瘍、神経膠芽腫、未分化星状細胞腫、多層性ロゼットを有する胚芽腫、未分化神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ）、松果体芽細胞腫、胚細胞腫、脈絡叢乳頭腫、脈絡叢癌、聴神経腫、神経芽細胞腫、下垂体部腫瘍、高悪性度グリオーマ、髄芽腫（ＭＢ）、神経芽細胞腫（ＮＢ）、ユーイング肉腫（ＥＷＳ）または骨肉腫である、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記中枢神経系の腫瘍が、グリオーマ、神経膠芽腫、多形神経膠芽腫、未分化乏突起星状細胞腫、びまん性内在性橋膠腫（ＤＩＰＧ）または正中腫瘍である、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記神経膠芽腫が再発性神経膠芽腫である、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記神経膠芽腫が進行性神経膠芽腫である、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１６】
前記グリオーマが悪性グリオーマである、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１７】
前記対象がヒトである、請求項７４から１１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記対象が小児患者または成人患者である、請求項７４から１１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１９】
前記対象においてアブスコパル効果をもたらす、請求項７４から１１８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は、がん免疫療法である。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）は、ＩＬ−１２の局部および全身産生を誘導する、下流の内因性インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）をもたらすサイトカインカスケードを開始させる、およびこれらのシグナル伝達経路により、先天性免疫（すなわち、ＮＫ細胞）と、適応免疫（すなわち、細胞傷害性Ｔリンパ球）との両方を活性化する、ヘテロ二量体（ＩＬ−１２−ｐ７０；ＩＬ−１２−ｐ３５／ｐ４０）炎症性サイトカインである。適応免疫系は、ナイーブな表現型からエフェクター機能型またはメモリー型に変化するようにＴ細胞を誘導する。Ｔｈ１／Ｔｈ２表現型は、ナイーブなＴ細胞活性化の結果を反映する。ＩＬ−１２はまた、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を再モデリングするように作用し、それが病的新血管形成を阻害するように見える抗血管新生効果を有する。ＩＬ−１２は、ＩＬ−１２Ｒ−β１およびＩＬ−１２Ｒ−β２によって形成されるヘテロ二量体受容体である、ＩＬ−１２受容体（ＩＬ−１２Ｒ）に結合する。この受容体複合体は、主にＴ細胞によって発現されるが、他のリンパ球下位集団もＩＬ−１２に応答することがわかっている。
【０００３】
ＩＬ−１２は、先天性免疫と適応免疫を橋渡しする機能を提供するため、ヒトにおける腫瘍免疫療法のための候補である。実際、ＩＬ−１２は、腫瘍療法の動物モデルにおいて有効であることが証明されている。しかしながら、臨床的に重篤な副作用は、ヒト治療剤試験におけるＩＬ−１２の全身投与と関連することが多かった。しかしながら、そのような障害にも拘わらず、ＩＬ−１２は、特に、単独で、または他の腫瘍治療化合物および処置方法と組み合わせて、または特に、全身投与よりもむしろ局部産生によって使用される場合のその完全な治療能力が、完全には精査されておらず、まして実現されていないため、ヒト（臨床）腫瘍学における使用にとって非常に興味深いものであり続けている。
【０００４】
神経膠芽腫の観察された免疫細胞浸潤は、高度に可変性であり、腫瘍の遺伝子組成および突然変異荷重によって駆動されると考えられる（Beier et al. 2012, Doucette et al. 2013）。さらに、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋）の特異性および効率のため、ＩＬ−１２の局部的な、制御された（すなわち、調節可能な）産生によるこれらの細胞の活性化は、これは全身毒性も最小化しながら、正常な脳細胞を残すことができる特に魅力的な治療選択肢である。さらに、同所性マウスモデルにおいて、腫瘍の生存および腫瘍サイズの減少（すなわち、腫瘍細胞殺傷）が、免疫細胞チェックポイント阻害剤を、ＩＬ−１２の制御された投与と組み合わせることによって有意に増強されることも示された（Barrett et al. 2016）。
【０００５】
神経膠芽腫を処置するための併用免疫療法アプローチの有望な例は、再発疾患を有する患者における、ニボルマブ（プログラム細胞死タンパク質１［ＰＤ−１］チェックポイント阻害剤）単剤療法およびイピリムマブ（抗細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ−４）抗体）と組み合わせたニボルマブの安全性および活性の試験である（Reardon et al. 2016）。ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１は、両方とも、拡張されたＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４ファミリーのＴ細胞調節因子のメンバーである。ＰＤ−１は、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞およびマクロファージの表面上に発現される。ＰＤ−１（ＣＤ２７９；Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ１５１１６）は、Ｂ７ファミリーのメンバーである２つのリガンド、ＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１、ＣＤ２７４）およびＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ、ＣＤ２７３）を有する。
【０００６】
ＰＤ−１結合剤またはＰＤ−１阻害剤などの１つまたは複数の免疫モジュレーターと結合したＩＬ−１２による腫瘍免疫刺激は、単剤療法と比較して増強された効能をもたらすはずである。長期生存率も実質的に改善しながら、神経膠芽腫などのがん性腫瘍の退縮において実質的に改善された臨床結果を提供する、ＩＬ−１２と、免疫チェックポイント阻害剤などの免疫モジュレーターとの併用レジメンの満たされない必要性が依然として存在する。全身毒性を軽減し、回避するか、または制限するための解決法についても満たされない必要性が存在する。ＩＬ−１２の制御された産生は、チェックポイント阻害剤、特に、ＰＤ−１阻害剤などの免疫モジュレーターに対する患者の耐性を増大させることができる。
【発明の概要】
【０００７】
一部の実施形態では、本発明は、がんを有する対象を処置する方法であって、対象に、Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２ウイルスベクターであって、野生型ヒトＩＬ−１２  ｐ４０と少なくとも８５％同一であるポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、野生型ヒトＩＬ−１２  ｐ３５と少なくとも８５％同一であるポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、ＶＰ−１６トランス活性化ドメイン−レチノイン酸−Ｘ受容体融合タンパク質（ＶＰ−１６−ＲＸＲ）をコードする第３のポリヌクレオチドおよびＧａｌ４  ＤＮＡ結合ドメインとエクジソン受容体（ＥｃＲ）結合ドメインとの融合タンパク質（Ｇａｌ４−ＥｃＲ）をコードする第４のポリヌクレオチドを含み、ＶＰ−１６−ＲＸＲ融合タンパク質と、Ｇａｌ４−ＥｃＲ融合タンパク質とがリガンド依存性転写因子複合体を形成する、ベクターと；リガンド依存性転写因子複合体を活性化するジアシルヒドラジンリガンドとを投与することによる、方法を提供する。一部の実施形態では、がんを有する対象は、１つまたは複数の免疫モジュレーターをさらに投与される。
【０００８】
一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドと、第２のポリヌクレオチドとは、第１のリンカーによって連結されている。一部の実施形態では、第３のポリヌクレオチドと、第４のポリヌクレオチドとは、第２のリンカーによって連結されている。一部の実施形態では、第１のリンカーおよび／または第２のリンカーは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列である。一部の実施形態では、第１のリンカーと、第２のリンカーとは、異なるＩＲＥＳ配列である。
【０００９】
一部の実施形態では、ベクターは、複製欠損アデノウイルスベクターである。一部の実施形態では、ベクターは、腫瘍部位に局部的に投与される。一部の実施形態では、ベクターは、腫瘍内に、または腫瘍と関連するリンパ節に投与される。
【００１０】
一部の実施形態では、ジアシルヒドラジンリガンドは、経口的または非経口的に投与される。
【００１１】
一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、経口的または非経口的に投与される。
【００１２】
一部の実施形態では、ベクターの第１の用量は、免疫モジュレーターの１つまたは複数の用量と同時に投与される。一部の実施形態では、ベクターの第１の用量は、免疫モジュレーターの１つまたは複数の用量の投与の一定期間後に投与される。一部の実施形態では、免疫モジュレーターの１つまたは複数の用量は、ベクターの投与の約５〜１０日前に対象に投与される。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤の１つまたは複数の用量は、ベクターの投与の約７日前に対象に投与される。一部の実施形態では、ベクターの第１の用量は、免疫モジュレーターの１つまたは複数の用量の投与の一定期間前に投与される。
【００１３】
一部の実施形態では、免疫モジュレーターの１つまたは複数のその後の用量は、ベクターの投与後に投与される。一部の実施形態では、免疫モジュレーターの１つまたは複数のその後の用量は、ベクターの投与の少なくとも７日後に対象に投与される。一部の実施形態では、免疫モジュレーターの１つまたは複数のその後の用量は、ベクターの投与後、７〜２８日以内に対象に投与される。一部の実施形態では、免疫モジュレーターの１つまたは複数のその後の用量は、ベクターの投与の約１５日後に対象に投与される。
【００１４】
一部の実施形態では、免疫モジュレーターのその後の用量は、免疫モジュレーターの第１のその後の用量の投与後、２週間毎に１回投与される。一部の実施形態では、免疫モジュレーターのその後の用量は、免疫モジュレーターの第１のその後の用量の投与後、４週間毎に１回投与される。
【００１５】
一部の実施形態では、ベクターの初期用量およびジアシルヒドラジンリガンドの初期用量は、同時に、または逐次的に投与される。一部の実施形態では、ジアシルヒドラジンリガンドの初期用量は、ベクターの初期用量の一定期間後に投与される。一部の実施形態では、ジアシルヒドラジンリガンドの初期用量は、ベクターの初期用量の一定期間前に投与される。一部の実施形態では、ジアシルヒドラジンリガンドの初期用量は、ベクターの投与の約１〜５時間前に投与される。
【００１６】
一部の実施形態では、ジアシルヒドラジンリガンドの１つまたは複数のその後の用量は、初期用量の投与後、１日１回投与される。一部の実施形態では、ジアシルヒドラジンリガンドのその後の１日用量は、約３〜２８日の期間にわたって投与される。一部の実施形態では、ジアシルヒドラジンリガンドのその後の１日用量は、約１４日の期間にわたって投与される。
【００１７】
一部の実施形態では、ベクターは、約１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、または１×１０１２、または２×１０１２のウイルス粒子（ｖｐ）の単位用量で投与される。一部の実施形態では、ベクターは、約２×１０１１ｖｐの用量で投与される。
【００１８】
一部の実施形態では、ジアシルヒドラジンリガンドは、（Ｒ）−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−（２，２−ジメチルヘキサン−３−イル）−２−エチル−３−メトキシベンゾヒドラジドである。一部の実施形態では、ジアシルヒドラジンリガンドは、約１ｍｇ〜約１２０ｍｇの単位日用量で投与される。
【００１９】
一部の実施形態では、ジアシルヒドラジンリガンドは、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または１２０ｍｇの単位日用量で投与される。一部の実施形態では、ジアシルヒドラジンリガンドは、約５ｍｇの単位日用量で投与される。一部の実施形態では、ジアシルヒドラジンリガンドは、約１０ｍｇの単位日用量で投与される。一部の実施形態では、ジアシルヒドラジンリガンドは、約１５ｍｇの単位日用量で投与される。一部の実施形態では、ジアシルヒドラジンリガンドは、約２０ｍｇの単位日用量で毎日投与される。
【００２０】
一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、免疫チェックポイント阻害剤、化学療法、放射線、Ｔ細胞および／もしくはＮＫ細胞を刺激する分子、サイトカイン、抗原特異的結合剤、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、導入されたキメラ抗原受容体を発現する細胞または導入されたＴ細胞受容体を発現する細胞である。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、ＣＤ３８結合剤、ＳＬＡＭＦ−７（ＣＳＩ）結合剤、ＣＤ９６結合剤、ＤＮＡＭ−１（ＣＤ２２６）結合剤、ＮＫＧ２Ａ結合剤、ＮＫＧ２Ｄ結合剤、ＭＧＮ−３結合剤、ネクチン−１結合剤、ネクチン−２結合剤、樹状細胞ワクチン、腫瘍関連ペプチドワクチン（ＴＵＭＡＰ）、がん胎児性抗原ワクチン、ウイルスワクチン、免疫刺激アジュバント、ＬＲＳ結合剤、Ｃ型レクチン結合剤、ＩＦＮ−ガンマ刺激剤、ＴＧＦ−ベータのブロッカーおよび／もしくは阻害剤、ＩＤＯ阻害剤、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１などのサイトカイン、ＣＤ２５結合剤、ＴＬＲ結合剤、ＴＬＲ２結合剤、ＩＤＯ１結合剤、ＴＤＯ結合剤、ＣＤ３９結合剤、ＣＤ７３結合剤、ガレクチン９結合剤、ＨＭＧＢ１結合剤、ホスファチジルセリン結合剤、ＣＥＣＡＭ−１結合剤、ＣＤ４０結合剤、ＣＤ４０Ｌ結合剤、ＯＸ４０結合剤、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）結合剤、４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）結合剤、糖質コルチコイド誘導ＴＮＦＲファミリー関連タンパク質（ＧＩＴＲ）結合剤、ＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）結合剤、ＣＤ２７結合剤またはキラー阻害受容体（ＫＩＲ）結合剤である。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１結合剤、ＰＤ−Ｌ１結合剤、ＣＴＬＡ−４結合剤、Ｔ細胞活性化のＶドメイン免疫グロブリン抑制因子（ＶＩＳＴＡ）結合剤、ＴＩＭ−３結合剤、ＴＩＭ−３リガンド結合剤、ＬＡＧ−３結合剤、ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを含むＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）結合剤、ＢおよびＴ細胞アテニュエータ−（ＢＴＬＡ）結合剤、Ｂ７−Ｈ３結合剤、ＴＧＦベータとＰＤ−Ｌ１との二重特異性結合剤またはＰＤ−Ｌ１とＢ７．１との二重特異性結合剤である。
【００２１】
一部の実施形態では、ＰＤ−１結合剤は、ニボルマブ（ＭＤＸ１１０６）、ペンブロリズマブ（ＭＫ−３４７５）、ピジリズマブ（ＣＴ−０１１）、ＭＥＤＩ−０６８０（ＡＭＰ−５１４）、ＰＤＲ−００１、セミプリマブ−ｒｗｌｃ（ＲＥＧＮ２８１０）、ＡＭＰ−２２４、ＳＴＩ−Ａ１１１０、ＡＵＮＰ−１２、またはＢＧＢ−Ａ３１７である。一部の実施形態では、ＰＤ−１結合剤は、ニボルマブ（ＭＤＸ１１０６）である。一部の実施形態では、ニボルマブ（ＭＤＸ１１０６）は、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約７ｍｇ／ｋｇの１つまたは複数の用量で投与される。一部の実施形態では、ニボルマブ（ＭＤＸ１１０６）は、約１ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。一部の実施形態では、ニボルマブ（ＭＤＸ１１０６）は、約３ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。一部の実施形態では、ニボルマブ（ＭＤＸ１１０６）は、約３０ｍｇ〜約５００ｍｇの１つまたは複数の一律用量で投与される。一部の実施形態では、ニボルマブ（ＭＤＸ１１０６）は、約２４０ｍｇの一律用量で投与される。一部の実施形態では、ニボルマブ（ＭＤＸ１１０６）は、約４８０ｍｇの一律用量で投与される。
【００２２】
一部の実施形態では、ＰＤ−１結合剤は、セミプリマブ−ｒｗｌｃ（ＲＥＧＮ−２８１０）である。一部の実施形態では、セミプリマブ−ｒｗｌｃ（ＲＥＧＮ−２８１０）は、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約６ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【００２３】
一部の実施形態では、ＰＤ−１結合剤は、静脈内投与される。
【００２４】
一部の実施形態では、本発明の方法において、がんを有する対象は、有効量のコルチコステロイドをさらに投与される。一部の実施形態では、コルチコステロイドは、デキサメタゾンである。
【００２５】
一部の実施形態では、対象は、ジアシルヒドラジンリガンドの投与前にコルチコステロイドを投与されたことがない。一部の実施形態では、対象は、ジアシルヒドラジンリガンドの投与前の４週間以内にコルチコステロイドを投与されたことがない。一部の実施形態では、対象は、ジアシルヒドラジンリガンドの投与前にコルチコステロイドを以前に投与されたことがある。一部の実施形態では、対象は、ジアシルヒドラジンの投与前の４週間以内にコルチコステロイドを以前に投与されたことがある。一部の実施形態では、コルチコステロイドは、ジアシルヒドラジンリガンドの投与中に投与される。一部の実施形態では、ジアシルヒドラジンリガンドの投与中のコルチコステロイドの累積用量は、約２０ｍｇ未満であるか、またはそれと等しい。一部の実施形態では、コルチコステロイドは、静脈内または経口投与される。
【００２６】
一部の実施形態では、がんは、原発腫瘍である。一部の実施形態では、がんは、転移腫瘍である。一部の実施形態では、がんは、再発がんまたは進行がんである。一部の実施形態では、がんは、固形腫瘍である。一部の実施形態では、がんは、中枢神経系の腫瘍、グリオーマ腫瘍、腎がん腫瘍、卵巣がん腫瘍、頭頸部がん腫瘍、肝臓がん腫瘍、膵がん腫瘍、胃がん腫瘍、食道がん腫瘍、膀胱がん腫瘍、子宮がん腫瘍、腎盂がん腫瘍、尿路上皮細胞がん腫瘍、泌尿生殖器がん腫瘍、子宮頸がん腫瘍、子宮内膜がん腫瘍、陰茎がん腫瘍、甲状腺がん腫瘍、または前立腺がん腫瘍、乳がん腫瘍、メラノーマ腫瘍、グリオーマ腫瘍、結腸がん腫瘍、肺がん腫瘍、肉腫がん腫瘍、または扁平上皮がん腫瘍、または前立腺がん腫瘍である。
【００２７】
一部の実施形態では、中枢神経系の腫瘍は、脊索腫、頭蓋咽頭腫、神経節細胞腫、頸静脈グロムス腫瘍、髄膜腫、松果体細胞腫、松果体芽細胞腫、下垂体腺腫、グリオーマ、星状細胞腫、毛様細胞性星状細胞腫、「びまん性」星状細胞腫、未分化星状細胞腫、上衣腫、未分化上衣腫、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）、髄芽腫、乏突起神経膠腫、純粋乏突起神経膠腫、未分化乏突起神経膠腫、未分化乏突起星状細胞腫神経節膠腫、聴神経腫（シュワン腫）、前庭シュワン腫、脳転移、脈絡叢癌、胚芽腫、生殖細胞腫瘍、胚芽異形成性神経上皮腫瘍（ＤＮＥＴ）、絨毛癌、奇形腫、卵黄嚢腫瘍（内胚葉洞腫瘍）、原発性ＣＮＳリンパ腫、血管芽細胞腫、ラブドイド腫瘍、グリオーマ、アデノーマ、芽細胞腫、癌腫、肉腫、松果体腫瘍、髄芽腫、髄様上皮腫、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍（ＡＴＲＴ）、毛様細胞性星状細胞腫、上衣下巨細胞性星状細胞腫（ＳＥＧＡ）、びまん性星状細胞腫、多形黄色星細胞腫（ＰＸＡ）、視神経膠腫、脳幹神経膠腫、局在性脳幹神経膠腫、びまん性正中神経膠腫、びまん性内在性橋膠腫（ＤＩＰＧ）、正中腫瘍、神経節膠腫、頭蓋咽頭腫、松果体部腫瘍、神経膠芽腫、未分化星状細胞腫、多層性ロゼットを有する胚芽腫、未分化神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ）、松果体芽細胞腫、胚細胞腫、脈絡叢乳頭腫、脈絡叢癌、聴神経腫、神経芽細胞腫、下垂体部腫瘍、高悪性度グリオーマ、髄芽腫（ＭＢ）、神経芽細胞腫（ＮＢ）、ユーイング肉腫（ＥＷＳ）または骨肉腫である。一部の実施形態では、中枢神経系の腫瘍は、グリオーマ、神経膠芽腫、多形神経膠芽腫、未分化乏突起星状細胞腫、びまん性内在性橋膠腫（ＤＩＰＧ）または正中腫瘍である。一部の実施形態では、神経膠芽腫は、再発性神経膠芽腫である。
【００２８】
一部の実施形態では、神経膠芽腫は、進行性神経膠芽腫である。一部の実施形態では、グリオーマは、悪性グリオーマである。
【００２９】
一部の実施形態では、対象は、ヒトである。一部の実施形態では、対象は、小児患者または成人患者である。一部の実施形態では、本発明の方法は、対象においてアブスコパル効果をもたらす。
【００３０】
本発明は、以下の図面を参照すればより完全に理解できる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、ヒトＩＬ−１２（ｈＩＬ−１２）をコードする２シストロン性転写物のための調節されたプロモーター発現系のプラスミドマップを描写する。
【図２】図２は、ＩＬ−２１のための調節されたプロモーター発現系のプラスミドマップを描写する。
【図３】図３は、Ｅ１およびＥ３領域の一部または全部が欠失しており、遺伝子スイッチ成分（「ＲＨＥＯＳＷＩＴＣＨ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＳＹＳＴＥＭ」について「ＲＴＳ」と呼ばれることもある）成分がＥ１領域を置き換えるベクターＡｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２（ｒＡｄ．ＲｈｅｏＩＬ１２）の構造を示す。「ＩＬ１２」と標識された囲みは、ＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）ポリヌクレオチド配列によって分離されたＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−１２ｐ３５コード配列を表す。
【図４】図４Ａは、同所性ＧＬ−２６１グリオーママウスの生成の略図である。図４Ｂは、同所性ＧＬ−２６１グリオーママウスにおける抗ＰＤ−１特異的ｍＡｂ  ＣＤ２７９（クローンＲＭＰ１−１４、ＢｉｏＸＣｅｌｌ、カタログ番号ＢＰ０１４６、Ｗｅｓｔ  Ｌｅｂａｎｏｎ、ＮＨ）の用量レジメンを描写する。
【図５】図５は、正常（対照）Ｃ５７ＢＬ／６対照マウスおよび同所性ＧＬ−２６１グリオーマを担持するマウスにおけるベレジメクス処置の２４時間後のベレジメクスレベルを描写する。
【図６】図６は、Ａｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ−１２＋ベレジメクス＋抗ＰＤ−１抗体、Ａｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ−１２＋ベレジメクス単剤療法、または抗ＰＤ−１抗体単剤療法を受けたマウスにおける全生存期間を描写する。
【図７】図７は、Ａｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ−１２＋ベレジメクス＋抗ＰＤ−１抗体、Ａｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ−１２＋ベレジメクス単剤療法、または抗ＰＤ−１抗体単剤療法を受けたマウスの体重の減少の変化を描写する。
【図８】図８Ａは、Ａｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ−１２＋ベレジメクス＋抗ＰＤ−１抗体、Ａｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ−１２＋ベレジメクス単剤療法、または抗ＰＤ−１抗体単剤療法を受けたマウスにおける腫瘍ＩＬ−１２レベルを描写する。図８Ｂは、Ａｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ−１２＋ベレジメクス＋抗ＰＤ−１抗体、Ａｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ−１２＋ベレジメクス単剤療法、または抗ＰＤ−１抗体単剤療法を受けたマウスにおける腫瘍ＩＦＮ−γレベルを描写する。
【図９】図９Ａは、Ａｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ−１２＋ベレジメクス＋抗ＰＤ−１抗体、Ａｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ−１２＋ベレジメクス単剤療法、または抗ＰＤ−１抗体単剤療法を受けたマウスにおける細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋）に対する効果を描写する。図９Ｂは、Ａｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ−１２＋ベレジメクス＋抗ＰＤ−１抗体、Ａｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ−１２＋ベレジメクス単剤療法、または抗ＰＤ−１抗体単剤療法を受けたマウスにおけるＴ細胞疲弊に対する効果（Ｌａｇ３；ＣＤ２３３）を描写する。
【図１０】図１０Ａは、Ａｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ−１２＋ベレジメクス＋抗ＰＤ−１抗体、Ａｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ−１２＋ベレジメクス単剤療法、または抗ＰＤ−１抗体単剤療法を受けたマウスにおけるＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋）に対する効果を描写する。図１０Ｂは、Ａｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ−１２＋ベレジメクス＋抗ＰＤ−１抗体、Ａｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ−１２＋ベレジメクス単剤療法、または抗ＰＤ−１抗体単剤療法を受けたマウスにおける、細胞傷害性Ｔ細胞の、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比に対する効果を描写する。
【図１１】図１１は、実施例５におけるＡｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２＋ベレジメクス＋抗ＰＤ−１抗体療法の用量レジメンの略図である。
【図１２】図１２Ａおよび図１２Ｂは、実施例８（「主試験」（図１２Ａ）および「拡大サブ試験」（図１２Ｂ））に記載されたＡｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２＋ベレジメクス療法に関する用量レジメンの略図である。
【図１３】図１３は、高用量のデキサメタゾン（２０ｍｇを超えるＤｅｘ）療法（例えば、術後浮腫の内科的管理のため）と比較して、無用量から低用量のデキサメタゾン（２０ｍｇ以下のＤｅｘ）療法（ＬｏＤｅｘ）を受けている神経膠芽腫患者における全生存期間に対するデキサメタゾン使用の影響を示す。
【図１４】図１４Ａおよび図１４Ｂは、主試験（０日目から２８日目まで）と比較した、拡大サブ試験における血清サイトカイン（ＩＬ−１２（図１２Ａ））およびインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）（図１２Ｂ））の差異を示す。同時に、これは、再発神経膠芽腫患者からの血清中のサイトカインの持続的腫瘍内産生を示す。
【図１５】図１５Ａおよび図１５Ｂは、主試験（０日目から２８日目まで）と比較した、拡大サブ試験における免疫細胞サブタイプ（ＣＤ３＋ＣＤ８＋（細胞傷害性Ｔ細胞）（図１５Ａ）；ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＦＯＸＰ３＋ＣＤ１２７ｌｏ／−（調節性Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ）（図１５Ｂ））を示す。同時に、これは、再発神経膠芽腫患者からの全血中の免疫細胞浸潤を示す。
【図１６】図１６Ａおよび図１６Ｂは、フローサイトメトリーを使用してＣＤ３＋ＣＤ８＋／ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＦＯＸＰ３＋ＣＤ１２７ｌｏ／−免疫細胞比により測定した場合の細胞傷害性Ｔ細胞／Ｔｒｅｇの「細胞指数（cytoindex）」比を示す。（Ａ）末梢細胞傷害性免疫応答の増強を示す細胞指数の増加は、０日目の４２から、７４のピークまでの主試験と比較して、拡大サブ試験においては０日目から１４日目の間に２８から４９のピークまで改善した。（Ｂ）サンプルサイズ／パワーを増大させるために主試験と拡大サブ試験とに由来するデータを組み合わせる箱ひげ図として再プロットすると、平均細胞指数（影付きの矢印）は、０日目から７日目から１４日目まで増加した後、２８日目までに減少した。
【図１７】図１７は、実施例１０に記載されるＰＤ−１阻害剤（ニボルマブ）療法と組み合わせた、Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２＋ベレジメクスに関する用量レジメンの略図を示す。
【図１８】図１８Ａおよび図１８Ｂは、実施例１０に記載される１０ｍｇのベレジメクス＋ニボルマブ処置群におけるＩＬ−１２（図１８Ａ）およびインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）（図１８Ｂ）に関する血清サイトカインレベルを示す。
【図１９−１】図１９Ａ、図１９Ｂ、および図１９Ｃは、実施例１０に記載される１０ｍｇのベレジメクス＋ニボルマブ処置群において検出された様々な免疫細胞型／マーカー（ＣＤ３＋ＣＤ８＋（細胞傷害性Ｔ細胞）；ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＦＯＸＰ３＋ＣＤ１２７ｌｏ／−（Ｔｒｅｇ細胞））に関する末梢血のフローサイトメトリーの結果を示す。
【図１９−２】同上。
【図２０】図２０は、試験のコンソートダイアグラムである。１０、２０、３０および４０ｍｇのベレジメクスの用量で処置した患者の数を示した４つの施設での患者の増加。コンプライアンス率（パーセント）は、各患者が薬物を摂取すると期待された合計１４日に対する、経口ベレジメクスが経口投与された日数を表す。
【図２１】図２１Ａ〜図２１Ｄは、ベレジメクスを用いた処置上でのベレジメクス、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γ濃度を描写する一連のグラフを示す。図２１Ａは、それぞれの薬物用量でのベレジメクスのピーク血漿濃度を示す。それぞれの記号は、単一の患者に由来する血漿を表す。図２１Ｂは、外科的切除の時点での血漿中および腫瘍内のベレジメクスを示す。ベレジメクスを、開頭術の開始の約３時間前に各患者に投与した。次いで、切除の時点での血清および腫瘍を、ベレジメクスレベルについてアッセイした。図２１Ｃは、ベレジメクス投与の前、間、および後の末梢血中のインターロイキン−１２を示す。図２１Ｄは、ベレジメクス投与の前、間および後の末梢血中のインターフェロン−γを示す。＊は、Ｐ＜０．０５を示す。
【図２２】図２２Ａ〜図２２Ｄは、処置後の腫瘍の放射線分析および免疫学的分析を示す。処置後の進行が疑われる３人の患者は、造影剤増強が疑われる腫瘍の再切除を受けた。図２２Ａは、右後頭部再発ＧＢＭが切除された１人の患者に由来するＭＲＩ画像を示す。外科手術の１日後（ベースライン）、次いで、４、８および２４週でのＭＲＩスキャンを示す。後頭葉の領域および頭頂葉に対してより上側の１つの領域に注射を与えた。赤色および黄色の矢印は、後頭部および頭頂部の注射経路における増強が変化した領域を示す。図２２Ｂは、図２２Ａに示された同じ患者に由来するＧＢＭの画像を示す。左パネル：Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２の注射前の切除時点での図２２Ａに示された同じ患者のものに由来するＧＢＭ（２０倍の倍率で上パネルに［スケールバーは１００μｍ］および１００倍の倍率で下パネルに［スケールバーは５０μｍ］に示される）。右パネル：処置の１７５日後（偽性進行が疑われる時点）の同じ患者に由来するＧＢＭ。後頭部病変に由来する切除された材料を、ＣＤ３＋（黄色）、ＣＤ８＋（赤色）、ＣＤ３＋ＣＤ８＋（橙色）、ＰＤ−１＋（緑色）、ＰＤ−Ｌ１＋（シアン色）およびＧＦＡＰ（白色）の発現について免疫蛍光組織化学によって分析した（２０倍の倍率で上パネルに［スケールバーは１００μｍ］および１００倍の倍率で下パネルに［スケールバーは５０μｍ］示される）。図２２Ｃおよび図２２Ｄは、注射後に再切除を受けている３人の患者に関する腫瘍中の免疫学的マーカーの処置前（ベースライン）および処置後の発現の定量分析を示す。図２２Ｃは、腫瘍１ｍｍ２あたりのＣＤ３＋、ＣＤ３＋ＣＤ８＋、ＰＤ−１＋、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋、ＣＤ５６＋、およびＰＤ−Ｌ１＋発現細胞の計数を示す。図２２Ｄは、処置の前後での３つのＧＢＭにおけるＩＦＮ−γを示す。
【図２３】図２３Ａおよび図２３Ｂは、生存曲線および処置効能の分析を示す。図２３Ａは、２０ｍｇコホートと、１０、３０および４０ｍｇの組合せコホートとに関するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒの全生存を示す。図２３Ｂは、生存スイムライン（Swimline）を示す。ｘ軸は、生存期間（月数）を列挙し、ｙ軸上にそれぞれの患者数を示す。青色および緑色は、ベレジメクス処置の０日目〜１４日目の間に２０ｍｇ未満もしくは２０ｍｇ、または２０ｍｇを超える累積デキサメタゾンを投与された患者を表す。各バーの終わりでの１０、２０、３０、４０ｍｇのベレジメクスの指定は、各患者が受けたベレジメクスの用量を表す。登録時、疾患の進行時、および他の療法タイムラインにステロイドが投与されている患者が列挙される。中央ＯＳは、１２．７カ月であった。
【図２４】図２４は、全生存について検査されたサブグループの予後因子のフォレストプロットを示す。
【図２５】図２５Ａ〜図２５Ｃは、対象に関する生存確率のグラフを示す。図２５Ａは、対象に関する累積デキサメタゾン用量（２０ｍｇ未満もしくは２０ｍｇのデキサメタゾン、または２０ｍｇを超えるデキサメタゾン）に基づくＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒの生存を示す。図２５Ａは、１０、２０、３０、または４０ｍｇのベレジメクス（０〜１４日目）を投与された対象の生存確率を示す。図２５Ｂは、２０ｍｇのベレジメクス（０〜１４日目）を投与された対象の生存確率を示す。図２５Ｃは、ウイルス注射後、１４〜２８日での末梢血ＣＤ８＋／ＦｏｘＰ３比を示す。三角は死亡した患者を表し、四角は生きている患者を表す。
【図２６】図２６は、Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２＋ＶＤＸ処置の前後での腫瘍の組織および免疫病理学的特徴を示す。５人の対象が、遺伝子療法注射およびＶＤＸ処置後に進行が疑われたため再切除を受けた。これらの５人の対象（ＰＴ１０、ＰＴ１７、ＰＴ３７、ＰＴ３８、およびＰＴ３９）は、全て神経膠芽腫、ＩＤＨ−野生型、Ｗ．Ｈ．Ｏ．グレードＩＶと診断された。死亡後の組織は、ＰＴ３７について入手可能であった。ウイルス注射の時点（０日目）および注射後（ＰＴ１０については３１日目；ＰＴ１７については４５日目；ＰＴ３８については１３０日目；ＰＴ３９については１５９日目およびＰＴ３７については１７６日目ならびに５０５日目での死亡後の腫瘍）での腫瘍組織を、標準的なヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色およびＣＤ８免疫組織化学によって評価した。ＰＴ３７について、最初の診断（−２３０日目）時に行った切除に由来する腫瘍も含まれていた。全ての事例において、血管周囲および浸潤腫瘍でＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の軽度から顕著な増加が観察された。ＰＴ３７について、５０５日での死後検査により、ウイルス注射の１７６日後に観察された顕著な増加とは対照的に、最小限のＣＤ８＋細胞が示された。全ての画像を、２０倍で撮影した。さらなる神経病理学的および遺伝学的特徴は以下の通りであった：ＰＴ３７：腫瘍は、初期診断／処置とウイルス注射との間にＰＩＫ３Ｃ２Ｂ／ＨＤＭ４およびＡＫＴ３の増幅を失うことがわかった。その後の腫瘍は、顕著な巨細胞形態を有していた。生検は、古典的な神経膠芽腫の形態ならびに巨細胞および粘液状領域を含んでいた。ＰＴ３８：処置後の腫瘍（１３０日）は、顕著な紡錘細胞形態を含んでいた。ＰＴ３９：腫瘍は顕著な巨細胞形態を含み、ウイルス注射と、処置後の組織（１５９日）との間にＥＧＦＲおよびＰＤＧＦＲＡ増幅を失ったことがわかった。
【図２７】図２７は、Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ１２＋ベレジメクス療法が、活発な細胞傷害性免疫応答を惹起するカスケードを介してＩＦＮ−γおよび他のサイトカインの下流の産生を駆動する方法を例示する模式図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
詳細な説明
本明細書で提供される方法は、本明細書ではＡｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２と称される、誘導性ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ（登録商標）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＲＴＳ（登録商標））制御されたヒトインターロイキン−１２（ｈＩＬ−１２）をコードするアデノウイルスベクターを使用する。ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２導入遺伝子の転写は、ジアシルヒドラジン活性化因子リガンドであるベレジメクスの存在下でのみ起こる。自然免疫および適応免疫を増強するヘテロ二量体サイトカインであるヒトインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）は、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の産生を強力に刺激し、腫瘍微小環境中のＴ細胞の組成を、Ｔｈ０からＴｈ１に、また、ＣＤ８陽性Ｔリンパ球に変化させる。腫瘍微小環境中でのＡｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２およびベレジメクスシステムを使用したｈＩＬ−１２発現の制御を活用して、腫瘍を標的とするＩＦＮ−γ産生ＣＤ８陽性Ｔ細胞の流入の増加を引き起こすことができる。腫瘍微小環境中でＰＤ１マーカーの過剰発現が惹起されるため、ＰＤ−１阻害剤の使用を、腫瘍の処置を改善するために使用することができる。本明細書で提供される方法は、Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２およびベレジメクスと組み合わせて、抗ＰＤ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）チェックポイント阻害剤であるニボルマブを使用する。
【００３３】
本明細書で提供される方法は、がんの処置において有用である。本開示の方法を使用する処置に適しているがんとしては、例えば、中枢神経系の腫瘍、悪性グリオーマ、原発性神経膠芽腫、再発神経膠芽腫、進行神経膠芽腫、またはびまん性内在性橋膠腫（ＤＩＰＧ）およびびまん性正中神経膠腫腫瘍（例えば、胸腺、脳幹または脊髄における）が挙げられる。本明細書で提供される方法は、成人および小児患者の処置にとって有用である。
【００３４】
アデノウイルスベクター
本発明において使用される好適なウイルスベクターとしては、限定されるものではないが、アデノウイルスに基づくベクターが挙げられる。アデノウイルス（Ａｄ）は、ＤＮＡをｉｎ  ｖｉｖｏで様々な異なる標的細胞型に効率的に移入する３６ｋｂの二本鎖ＤＮＡウイルスである。アデノウイルスベクターは、高力価で産生させることができ、ＤＮＡを複製細胞および非複製細胞に効率的に移入することができる。アデノウイルスベクターゲノムを、ベクターＤＮＡの供給源として任意の種、株、サブタイプ、種、株、もしくはサブタイプの混合物、またはキメラアデノウイルスを使用して生成することができる。アデノウイルスの供給源として用いることができるアデノウイルスストックを、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．）から現在入手可能であるアデノウイルス血清型１〜５１から、または他の任意の供給源から入手可能なアデノウイルスの他の任意の血清型から増幅させることができる。例えば、アデノウイルスは、サブグループＡ（例えば、血清型１２、１８、および３１）、サブグループＢ（例えば、血清型３、７、１１、１４、１６、２１、３４および３５）、サブグループＣ（例えば、血清型１、２、５および６）、サブグループＤ（例えば、血清型８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２〜３０、３２、３３、３６〜３９、および４２〜４７）、サブグループＥ（血清型４）、サブグループＦ（血清型４０および４１）または他の任意のアデノウイルス血清型のものであってもよい。ヒトアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）ゲノムが完全に配列決定されていることを考慮して、本発明のアデノウイルスベクターは、Ａｄ５血清型に関して本明細書に記載される。アデノウイルスベクターは、細胞中で増殖することができる任意のアデノウイルスベクターであってよく、一部の有意な部分では（実質的に必須ではないが）アデノウイルスのゲノムに由来する、またはそれに基づくものである。アデノウイルスベクターは、任意の好適な野生型アデノウイルスのゲノムに基づくものであってもよい。ある特定の実施形態では、アデノウイルスベクターは、Ｃ群、特に、血清型２または５の野生型アデノウイルスのゲノムに由来する。アデノウイルスベクターは、当業界で周知であり、例えば、米国特許第５，５５９，０９９号明細書、第５，７１２，１３６号明細書、第５，７３１，１９０号明細書、第５，８３７，５１１号明細書、第５，８４６，７８２号明細書、第５，８５１，８０６号明細書、第５，９６２，３１１号明細書、第５，９６５，５４１号明細書、第５，９８１，２２５号明細書、第５，９９４，１０６号明細書、第６，０２０，１９１号明細書、および第６，１１３，９１３号明細書、国際公開第９５／３４６７１号パンフレット、第９７／２１８２６号パンフレット、および第００／００６２８号パンフレット、ならびにVirology, B. N. Fields et al., eds., 3d ed., Raven Press, Ltd., New York (1996)中のそれぞれ、Thomas Shenk, “Adenoviridae and their Replication,” and M. S. Horwitz, “Adenoviruses,”Chapters 67 and 68に記載されている。
【００３５】
他の実施形態では、アデノウイルスベクターは、複製欠損である。本明細書で使用される用語「複製欠損」とは、アデノウイルスベクターは、少なくとも１つの複製必須遺伝子機能を欠くゲノムを含むことを意味する。本明細書で使用される場合、遺伝子、遺伝子機能、または遺伝子もしくはゲノム領域の欠損は、核酸配列が全体的または部分的に欠失した遺伝子の機能を損なう、または消し去るのに十分なウイルスゲノムの遺伝物質の欠失と定義される。複製必須遺伝子機能は、複製欠損アデノウイルスベクターの複製（すなわち、増殖）にとって必要とされる遺伝子機能である。複製必須遺伝子機能は、例えば、アデノウイルス初期領域（例えば、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ４領域）、後期領域（例えば、Ｌ１〜Ｌ５領域）、ウイルスパッケージングに関与する遺伝子（例えば、ＩＶａ２遺伝子）、およびウイルス関連ＲＮＡ（例えば、ＶＡ−ＲＮＡ  Ｉおよび／またはＶＡ−ＲＮＡ  ＩＩ）によってコードされる。さらに他の実施形態では、複製欠損アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムの１つまたは複数の領域（例えば、多重複製欠損アデノウイルスベクターをもたらすアデノウイルスゲノムの２つ以上の領域）の少なくとも１つの複製必須遺伝子機能が欠損したアデノウイルスゲノムを含む。アデノウイルスゲノムの１つまたは複数の領域は、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ４領域からなる群から選択される。複製欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ１領域の少なくとも１つの複製必須遺伝子機能の欠損（Ｅ１欠損アデノウイルスベクターと表される）、特に、アデノウイルスＥ１Ａ領域およびアデノウイルスＥ１Ｂ領域のそれぞれの複製必須遺伝子機能の欠損を含んでもよい。Ｅ１領域中でのそのような欠損に加えて、組換えアデノウイルスはまた、国際公開第００／００６２８号パンフレットで考察されたように、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）中に突然変異を有してもよい。特定の実施形態では、ベクターは、Ｅ１領域の少なくとも１つの複製必須遺伝子機能および非必須Ｅ３領域の少なくとも一部（例えば、Ｅ３領域のＸｂａＩ欠失）が欠損している（Ｅ１／Ｅ３欠損アデノウイルスベクターと表される）。
【００３６】
ある特定の実施形態では、アデノウイルスベクターは、「多重欠損（multiply-deficient）」であり、これは、アデノウイルスベクターが、アデノウイルスゲノムの２つ以上の領域のそれぞれにおけるウイルス複製にとって必要とされる１つまたは複数の遺伝子機能を欠損していることを意味する。例えば、上記のＥ１欠損またはＥ１／Ｅ３欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ４領域の少なくとも１つの複製必須遺伝子機能がさらに欠損していてもよい（Ｅ１／Ｅ４欠損アデノウイルスベクターと表される）。Ｅ４領域全体が欠失したアデノウイルスベクターは、より少ない宿主免疫応答を惹起することができる。
【００３７】
あるいは、アデノウイルスベクターは、Ｅ１領域の全部もしくは一部およびＥ２領域の全部もしくは一部の中の複製必須遺伝子機能を欠く（Ｅ１／Ｅ２欠損アデノウイルスベクターと表される）。Ｅ１領域の全部もしくは一部、Ｅ２領域の全部もしくは一部、およびＥ３領域の全部もしくは一部の中の複製必須遺伝子機能を欠くアデノウイルスベクターも、本明細書で企図される。本発明のアデノウイルスベクターがＥ２Ａ領域の複製必須遺伝子機能に欠損を有する場合、ベクターは、約２３０塩基対未満の長さである、Ｅ２Ａ領域の完全な欠失を含まない。一般に、アデノウイルスのＥ２Ａ領域は、ＤＮＡ複製にとって必要とされるポリペプチドである、ＤＢＰ（ＤＮＡ結合タンパク質）をコードする。ＤＢＰは、ウイルス血清型に応じて、４７３〜５２９アミノ酸から構成される。ＤＢＰは、Ｎｔドメインが拡張された球状Ｃｔからなる扁長楕円体として存在する非対称性タンパク質であると考えられる。Ｃｔドメインは核酸に結合する、亜鉛に結合する、およびＤＮＡ鎖伸長のレベルでＤＮＡ合成において機能するＤＢＰの能力の原因となることが研究により示されている。しかしながら、Ｎｔドメインは、転写レベルと転写後レベルとの両方で後期遺伝子発現において機能すると考えられ、タンパク質の効率的な核局在化の原因となり、また、それ自身の発現の増強にも関与し得る。アミノ酸２〜３８の間でのＮｔドメインの欠失は、この領域がＤＢＰ機能にとって重要であることを示した（Brough et al., Virology, 196, 269-281 (1993)）。ＤＢＰのＣｔ領域をコードするＥ２Ａ領域中の欠失は、ウイルス複製に対する効果はないが、ＤＢＰのＮｔドメインのアミノ酸２〜３８をコードするＥ２Ａ領域中の欠失は、ウイルス複製を損なう。一実施形態では、多重複製欠損アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムのＥ２Ａ領域のこの部分を含有する。特に、例えば、保持されるＥ２Ａ領域の望ましい部分は、Ｅ２Ａ領域の５’末端によって定義されるアデノウイルスゲノムのＥ２Ａ領域のその部分、特に、血清型Ａｄ５のアデノウイルスゲノムのＥ２Ａ領域のＡｄ５（２３８１６）からＡｄ５（２４０３２）までの位置である。
【００３８】
アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムの初期領域のみ、アデノウイルスゲノムの後期領域のみ、およびアデノウイルスゲノムの初期領域と後期領域との両方の複製必須遺伝子機能に欠損を有してもよい。アデノウイルスベクターはまた、本質的には全てのアデノウイルスゲノムが除去されていてもよく、その場合、少なくともウイルス逆方向末端反復（ＩＴＲ）および１つもしくは複数のプロモーターまたはウイルスＩＴＲおよびパッケージングシグナルの少なくともいずれかが無傷のまま残っている（すなわち、アデノウイルスアンプリコン）。除去されるアデノウイルスゲノムの領域が大きいほど、ゲノム中に挿入することができる外因性核酸配列の一片も大きくなる。例えば、アデノウイルスゲノムが３６ｋｂであると仮定すると、ウイルスＩＴＲおよび１つまたは複数のプロモーターを無傷のままにすることにより、アデノウイルスの外因性挿入物の収容能力は、約３５ｋｂである。あるいは、ＩＴＲおよびパッケージングシグナルのみを含有する多重欠損アデノウイルスベクターは、約３７〜３８ｋｂの外因性核酸配列の挿入を効率的に可能にする。勿論、欠損アデノウイルス領域のいずれかまたは全部へのスペーサーエレメントの含有は、大きい挿入物のためのアデノウイルスベクターの収容能力を低下させるであろう。多重欠損アデノウイルスベクターを含む、好適な複製欠損アデノウイルスベクターは、米国特許第５，８５１，８０６号明細書および第５，９９４，１０６号明細書ならびに国際公開第９５／３４６７１号パンフレットおよび第９７／２１８２６号パンフレットに開示されている。一実施形態では、本発明の方法における使用のためのベクターは、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／２０５３６号に記載されたものである。
【００３９】
アデノウイルスベクターの異なる領域の欠失は、哺乳動物の免疫応答を変更し得ることが理解されるべきである。特に、異なる領域の欠失は、アデノウイルスベクターによって生成される炎症応答を低減させ得る。さらに、アデノウイルスベクターの外被タンパク質を、国際公開第９８／４０５０９号パンフレットに記載されたように、野生型外被タンパク質に対する中和抗体によって認識されるアデノウイルスベクターの能力または無能力を低下させるように改変することができる。
【００４０】
アデノウイルスベクターは、特に、Ｅ１およびＥ４領域の複製必須遺伝子機能において多重複製欠損である場合、単一複製欠損アデノウイルスベクター、特に、Ｅ１領域に欠損を含むアデノウイルスベクターによって達成されるものと類似する補完細胞株中でのウイルス増殖を提供するスペーサーエレメントを含んでもよい。スペーサーエレメントは、所望の長さのものである任意の配列または複数の配列を含有してもよい。スペーサーエレメント配列は、アデノウイルスゲノムに関してコードまたは非コードおよび天然または非天然であってよいが、それは欠損領域に複製必須機能を回復させない。スペーサーの非存在下では、多重複製欠損アデノウイルスベクターの線維タンパク質の産生および／またはウイルス増殖は、単一複製欠損アデノウイルスベクターのものとの比較によって低下する。しかしながら、少なくとも１つの欠損アデノウイルス領域、好ましくは、Ｅ４領域へのスペーサーの含有は、線維タンパク質産生およびウイルス増殖におけるこの低下に対抗することができる。アデノウイルスベクター中でのスペーサーの使用は、米国特許第５，８５１，８０６号明細書に記載されている。
【００４１】
アデノウイルスベクターの構築は、当業界でよく理解されている。アデノウイルスベクターは、例えば、米国特許第５，９６５，３５８号明細書ならびに国際公開第９８／５６９３７号パンフレット、第９９／１５６８６号パンフレット、および第９９／５４４４１号パンフレットに記載の方法を使用して構築および／または精製することができる。アデノウイルス遺伝子導入ベクターの生産は、当業界で周知であり、例えば、Sambrook et al., supra、Watson et al., supra、Ausubel et al., supra、および本明細書に記載のいくつかの他の参考文献に記載のものなどの標準的な分子生物学的技術を使用することを含む。
【００４２】
複製欠損アデノウイルスベクターは、典型的には、複製欠損アデノウイルスベクター中には存在しないが、高力価のウイルスベクターストックを生成するための適切なレベルでのウイルス増殖にとって必要とされる遺伝子機能を提供する補完細胞株中で生産される。一実施形態では、細胞株は、複製欠損アデノウイルス中には存在しない少なくとも１つ、および／または全部の複製必須遺伝子機能を補完する。補完細胞株は、初期領域、後期領域、ウイルスパッケージング領域、ウイルス関連ＲＮＡ領域、または全てのアデノウイルス機能を含むその組合せによってコードされる少なくとも１つの複製必須遺伝子機能における欠損を補完することができる（例えば、逆方向末端反復（ＩＴＲ）およびパッケージングシグナルのみ、またはＩＴＲおよびアデノウイルスプロモーターのみなどの最小限のアデノウイルス配列を含む、アデノウイルスアンプリコンの増殖を可能にする）。別の実施形態では、補完細胞株は、アデノウイルスゲノムのＥ１領域の少なくとも１つの複製必須遺伝子機能（例えば、２つ以上の複製必須遺伝子機能）における欠損、特に、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ領域のそれぞれの複製必須遺伝子機能における欠損を補完する。さらに、補完細胞株は、アデノウイルスゲノムのＥ２（特に、アデノウイルスＤＮＡポリメラーゼおよび末端タンパク質に関する）および／またはＥ４領域の少なくとも１つの複製必須遺伝子機能における欠損を補完することができる。望ましくは、Ｅ４領域中の欠損を補完する細胞は、Ｅ４−ＯＲＦ６遺伝子配列を含み、Ｅ４−ＯＲＦ６タンパク質を産生する。そのような細胞は、望ましくは、アデノウイルスゲノムのＥ４領域の少なくともＯＲＦ６を含み、他のＯＲＦは含まない。細胞株は、好ましくは、それが、ベクターゲノムが細胞ＤＮＡと組み換わる可能性を最小化する、実際には除去するアデノウイルスベクターと重複しない様式で、補完遺伝子を含有することをさらに特徴とする。したがって、ベクターストック中で避けられない場合、複製可能アデノウイルス（ＲＣＡ）の存在は最小化され、したがって、ある特定の治療目的、特に、遺伝子療法目的にとって好適である。ベクターストック中のＲＣＡの欠如は、非補完細胞中でのアデノウイルスベクターの複製を回避する。補完細胞株の構築は、Sambrook et al., supraおよびAusubel et al., supraによって記載されたものなどの、標準的な分子生物学および細胞培養技術を含む。遺伝子導入ベクター（例えば、アデノウイルスベクター）を生産するための補完細胞株としては、限定されるものではないが、２９３細胞（例えば、Graham et al., J. Gen. Virol., 36, 59-72 1977に記載されている）、ＰＥＲ．Ｃ６細胞（例えば、国際公開第９７／００３２６号パンフレット、ならびに米国特許第５，９９４，１２８号明細書および第６，０３３，９０８号明細書に記載されている）、および２９３−ＯＲＦ６細胞（例えば、国際公開第９５／３４６７１号パンフレットおよびBrough et al., J Virol., 71, 9206-9213 1997に記載されている）が挙げられる。アデノウイルスゲノム（例えば、アデノウイルスゲノムのＥ１領域）への核酸配列の挿入を、公知の方法により、例えば、アデノウイルスゲノムの所与の位置でのユニークな制限部位の導入により容易にすること���できる。
【００４３】
発現ベクター中のポリヌクレオチド配列は、例えば、ｍＲＮＡ転写を指令するプロモーターを含む、適切な発現制御配列に作動可能に連結される。代表的なさらなるプロモーターとしては、限定されるものではないが、構成的プロモーターおよび組織特異的または誘導性プロモーターが挙げられる。構成的真核プロモーターの例としては、限定されるものではないが、マウスメタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター（Hamer et al., J. Mol. Appl. Gen. 1:273 1982）；ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（McKnight, Cell 31:355 1982）；ＳＶ４０初期プロモーター（Benoist et al., Nature 290:304 1981）；およびワクシニアウイルスプロモーターが挙げられる。タンパク質またはポリヌクレオチドの発現を駆動するために使用することができるプロモーターのさらなる例としては、限定されるものではないが、組織特異的プロモーターならびにアルブミンプロモーター（肝細胞）、プロインスリンプロモーター（膵臓ベータ細胞）などの特定のタンパク質のための他の内因性プロモーターが挙げられる。一般に、発現構築物は、転写、開始および終止のための部位、ならびに転写される領域中には、翻訳のためのリボソーム結合部位を含有するであろう。構築物によって発現される成熟転写物のコード部分は、開始位置に翻訳開始ＡＵＧおよび翻訳されるポリペプチドの末端に適切に位置する終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含んでもよい。
【００４４】
遺伝子スイッチシステム
遺伝子スイッチは、特定のリガンドの添加または除去によって遺伝子発現を調節する任意の遺伝子スイッチであってもよい。一実施形態では、遺伝子スイッチは、遺伝子発現のレベルが、存在するリガンドのレベルに依存するものである。本発明の遺伝子スイッチにおいて使用することができるリガンド依存性転写因子複合体の例としては、限定されるものではないが、その対応するリガンド（例えば、糖質コルチコイド、エストロゲン、プロゲスチン、レチノイド、エクジソン、ならびにそのアナログおよび模倣体）によって活性化される核受容体スーパーファミリーのメンバーおよびテトラサイクリンによって活性化されるｒＴＴＡが挙げられる。本発明の一態様では、遺伝子スイッチは、ＥｃＲに基づく遺伝子スイッチである。そのようなシステムの例としては、限定されるものではないが、米国特許第６，２５８，６０３号明細書、第７，０４５，３１５号明細書、米国特許出願公開第２００６／００１４７１１号明細書、第２００７／０１６１０８６号明細書、および国際公開第０１／７０８１６号パンフレットに記載されたシステムが挙げられる。キメラエクジソン受容体システムの例は、米国特許第７，０９１，０３８号明細書、米国特許出願公開第２００２／０１１０８６１号明細書、第２００４／００３３６００号明細書、第２００４／００９６９４２号明細書、第２００５／０２６６４５７号明細書、および第２００６／０１００４１６号明細書、ならびに国際公開第０１／７０８１６号パンフレット、第０２／０６６６１２号パンフレット、第０２／０６６６１３号パンフレット、第０２／０６６６１４号パンフレット、第０２／０６６６１５号パンフレット、第０２／２９０７５号パンフレット、および第２００５／１０８６１７号パンフレットに記載されており、それぞれ、その全体が参照により組み込まれる。
【００４５】
本発明の別の態様では、遺伝子スイッチは、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）と、ＦＫＢＰラパマイシン関連タンパク質（ＦＲＡＰ）とのヘテロ二量体化に基づくものであり、ラパマイシンまたはその非免疫抑制アナログによって調節される。そのようなシステムの例としては、限定されるものではないが、ＡＲＧＥＮＴ（商標）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＡＲＩＡＤ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．）ならびに米国特許第６，０１５，７０９号明細書、第６，１１７，６８０号明細書、第６，４７９，６５３号明細書、第６，１８７，７５７号明細書、および第６，６４９，５９５号明細書に記載されたシステムが挙げられる。
【００４６】
一実施形態では、遺伝子スイッチは、治療スイッチプロモーターの制御下にリガンド依存性転写因子複合体をコードする単一の転写因子配列を含む。転写因子配列は、天然に存在するリガンド依存性転写因子複合体または人工のリガンド依存性転写因子複合体をコードしてもよい。人工転写因子は、転写因子の天然配列が、例えば、配列の突然変異によって、または異なる転写因子に由来するドメインを組み合わせることによって変更されているものである。一実施形態では、転写因子は、Ｈ群核受容体リガンド結合ドメインを含む。一実施形態では、Ｈ群核受容体リガンド結合ドメインは、エクジソン受容体、ユビキタス受容体（ＵＲ）、オーファン受容体１（ＯＲ−１）、ステロイドホルモン核受容体１（ＮＥＲ−１）、レチノイドＸ受容体相互作用タンパク質−１５（ＲＩＰ−１５）、肝臓Ｘ受容体β（ＬＸＲβ）、ステロイドホルモン受容体様タンパク質（ＲＬＤ−１）、肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）、肝臓Ｘ受容体α（ＬＸＲα）、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）、受容体相互作用タンパク質１４（ＲＩＰ−１４）、またはファルネソール受容体（ＨＲＲ−１）に由来する。別の実施形態では、Ｈ群核受容体ＬＢＤは、エクジソン受容体に由来する。
【００４７】
ＥｃＲおよび他のＨ群核受容体は、全メンバーが一般に、必要に応じて、ヘテロ二量体化パートナー（ＨＰ）に融合されて、同時活性化タンパク質（ＣＡＰ）を形成するアミノ末端トランス活性化ドメイン（ＡＤ、「ＴＡ」または「ＴＤ」とも互換的に称される）、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、およびヒンジ領域によってＤＢＤに融合されて、リガンド依存性転写因子（ＬＴＦ）を形成するＬＢＤの存在を特徴とする、核受容体スーパーファミリーのメンバーである。本明細書で使用される場合、用語「ＤＮＡ結合ドメイン」は、ＤＮＡ結合ドメインが特定の応答エレメントと会合するように機能する限り、ＤＮＡ結合タンパク質の全長までの、ＤＮＡ結合タンパク質の最小のポリペプチド配列を含む。核受容体スーパーファミリーのメンバーはまた、４つまたは５つのドメイン：Ａ／Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、および一部のメンバーでは、Ｆの存在を特徴とする（米国特許第４，９８１，７８４号明細書およびEvans, Science 240:889 (1988)を参照されたい）。「Ａ／Ｂ」ドメインはトランス活性化ドメインに対応し、「Ｃ」はＤＮＡ結合ドメインに対応し、「Ｄ」はヒンジ領域に対応し、「Ｅ」はリガンド結合ドメインに対応する。ファミリーの一部のメンバーはまた、「Ｆ」に対応するＬＢＤのカルボキシ末端側に別のトランス活性化ドメインを有してもよい。
【００４８】
ショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）（ミバエ）に由来する以下のポリペプチド配列（エクジソン受容体（８７８ａａ））（配列番号９）は、エクジソン受容体（エクジステロイド受容体）（２０−ヒドロキシ−エクジソン受容体）（２０Ｅ受容体）（ＥｃＲＨ）（核受容体サブファミリー１、Ｈ群メンバー１）に由来するポリペプチド配列の一例であり、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおける受託番号Ｐ３４０２１を有する。
【００４９】
【化１】
2021529199.tif 000002
【００５０】
ＤＢＤは、応答エレメントに対する特異性を付与する、２つのアミノ酸モチーフである、ＰボックスとＤボックスとの間の２個のシステインジンクフィンガーの存在を特徴とする。これらのドメインは、天然の、改変された異種受容体タンパク質のドメイン、または異種受容体タンパク質の異なるドメインのキメラのいずれかであってもよい。ＥｃＲはまた、核受容体ファミリーのサブセットのように、ヘテロ二量体化特性の原因となる明確に定義されていない領域を有する。核受容体のドメインは天然ではモジュール式であるため、ＬＢＤ、ＤＢＤ、およびＡＤは相互に交換してもよい。
【００５１】
別の実施形態では、転写因子は、ＡＤ、発現をモジュレートしようとする治療タンパク質または治療ポリヌクレオチドと関連する応答エレメントを認識するＤＢＤ；およびＨ群核受容体ＬＢＤを含む。ある特定の実施形態では、Ｈ群核受容体ＬＢＤは、置換突然変異を含む。
【００５２】
別の実施形態では、遺伝子スイッチは、第１の治療スイッチプロモーター（ＴＳＰ−１）の制御下に、第１の転写因子配列、例えば、ＣＡＰを、第２の治療スイッチプロモーター（ＴＳＰ−２）の制御下に、第２の転写因子配列、例えば、ＬＴＦを含み、前記第１の転写因子配列および前記第２の転写因子配列によってコードされるタンパク質は、相互作用して、タンパク質複合体（ＬＤＴＦＣ）、すなわち、「デュアルスイッチ」または「２ハイブリッド」ベース遺伝子スイッチを形成する。第１および第２のＴＳＰは、同じであるか、または異なってもよい。この実施形態では、治療分子発現にとって必要とされる遺伝子スイッチ中の２つの異なるＴＳＰの存在は、治療方法の特異性を増強する（図２を参照されたい）。図２はまた、単に適切なＴＳＰを挿入することによって任意の疾患、障害、または状態を処置するために治療遺伝子スイッチを改変する能力を示す。
【００５３】
さらなる実施形態では、第１と第２の転写因子配列、例えば、ＣＡＰまたはＬＴＦは両方とも、単一の治療スイッチプロモーター（例えば、ＴＳＰ−１）の制御下にある。このプロモーターの活性化は、単一のオープンリーディングフレームを有するＣＡＰとＬＴＦの両方を生成するであろう。これは、ＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）などの転写リンカーの使用により達成することができる。この実施形態では、リガンド依存性転写因子複合体の両方の部分は、ＴＳＰ−１の活性化の際に合成される。ＴＳＰ−１は、構成的プロモーターであり得るか、または疾患、障害、もしくは状態と関連する条件下でのみ活性化され得る。
【００５４】
さらなる実施形態では、一方の転写因子配列、例えば、ＬＴＦは、疾患、障害、または状態と関連する条件下でのみ活性化される治療スイッチプロモーター（例えば、ＴＳＰ−２またはＴＳＰ−３）の制御下にあり、他方の転写因子配列、例えば、ＣＡＰは、構成的治療スイッチプロモーター（例えば、ＴＳＰ−１）の制御下にある。この実施形態では、リガンド依存性転写因子複合体の１つの部分は、構成的に存在するが、第２の部分は、疾患、障害、または状態と関連する条件下でのみ合成されるであろう。
【００５５】
別の実施形態では、一方の転写因子配列、例えば、ＣＡＰは、第１のＴＳＰ（例えば、ＴＳＰ−１）の制御下にあり、２つ以上の異なる第２の転写因子配列、例えば、ＬＴＦ−１およびＬＴＦ−２は、異なるＴＳＰ（例えば、図３中のＴＳＰ−２およびＴＳＰ−３）の制御下にある。この実施形態では、ＬＴＦはそれぞれ、異なる因子により調節されるプロモーター配列を認識する異なるＤＢＤを有してもよい（例えば、ＤＢＤ−Ａは、因子により調節されるプロモーター−１（ＦＲＰ−１）と会合した応答エレメントに結合し、ＤＢＤ−Ｂは、因子により調節されるプロモーター−２（ＦＲＰ−２）と会合した応答エレメントに結合する）。因子により調節されるプロモーターはそれぞれ、異なる治療遺伝子に作動可能に連結されていてもよい。この様式で、複数の処置を同時に提供することができる。
【００５６】
一実施形態では、第１の転写因子配列は、ＴＡＤ（トランス活性化ドメイン）、発現をモジュレートしようとする治療生成物配列と会合した応答エレメントを認識するＤＢＤ（ＤＮＡ結合ドメイン）；およびＨ群核受容体ＬＢＤ（リガンド結合ドメイン）を含むポリペプチドをコードし、第２の転写因子配列は、脊椎動物レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）、無脊椎動物ＲＸＲ、ウルトラスピラクルタンパク質（ＵＳＰ）から選択される核受容体ＬＢＤを含む転写因子、または脊椎動物ＲＸＲ、無脊椎動物ＲＸＲ、およびＵＳＰから選択される少なくとも２つの異なる核受容体リガンド結合ドメインポリペプチド断片を含むキメラ核受容体をコードする（国際公開第０１／７０８１６号パンフレットおよび米国特許出願公開第２００４／００９６９４２号明細書を参照されたい）。「パートナー」核受容体リガンド結合ドメインは、トランケーション突然変異、欠失突然変異、置換突然変異、または別の改変をさらに含んでもよい。
【００５７】
別の実施形態では、遺伝子スイッチは、核受容体ＬＢＤおよび発現をモジュレートしようとする治療生成物配列と会合した応答エレメントを認識するＤＢＤを含む第１のポリペプチドをコードする第１の転写因子配列と、一方の核受容体ＬＢＤがＨ群核受容体ＬＢＤである、ＡＤおよび核受容体ＬＢＤを含む第２のポリペプチドをコードする第２の転写因子配列とを含む。一実施形態では、第１のポリペプチドは、ＡＤを実質的に含まず、第２のポリペプチドは、ＤＢＤを実質的に含まない。本発明の目的のために、「実質的に含まない」とは、問題のタンパク質が活性化または結合活性を提供するのに十分な問題のドメインの配列を含有しないことを意味する。
【００５８】
本発明の別の態様では、第１の転写因子配列は、ヘテロ二量体化パートナーおよびＡＤを含むタンパク質（「ＣＡＰ」）をコードし、第２の転写因子配列は、ＤＢＤおよびＬＢＤを含むタンパク質（「ＬＴＦ」）をコードする。
【００５９】
一方の核受容体ＬＢＤだけがＨ群ＬＢＤである場合、他方の核受容体ＬＢＤは、Ｈ群ＬＢＤと二量体を形成する任意の他の核受容体に由来するものであってよい。例えば、Ｈ群核受容体ＬＢＤがＥｃＲ  ＬＢＤである場合、他方の核受容体ＬＢＤ「パートナー」は、ＥｃＲ、脊椎動物ＲＸＲ、無脊椎動物ＲＸＲ、ウルトラスピラクルタンパク質（ＵＳＰ）、または脊椎動物ＲＸＲ、無脊椎動物ＲＸＲ、またはＵＳＰから選択される少なくとも２つの異なる核受容体ＬＢＤポリペプチド断片を含むキメラ核受容体に由来するものであってよい（全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第０１／７０８１６号パンフレット、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／０５２３５号および米国特許出願公開第２００４／００９６９４２号明細書を参照されたい）。「パートナー」核受容体リガンド結合ドメインは、トランケーション突然変異、欠失突然変異、置換突然変異、または別の改変をさらに含んでもよい。
【００６０】
一実施形態では、脊椎動物ＲＸＲ  ＬＢＤは、ヒト（ホモ・サピエンス（Homo sapiens)）、マウス（ムス・ムスクルス（Mus musculus））、ラット（ラッタス・ノルベギクス（Rattus norvegicus））、ニワトリ（ガルス・ガルス（Gallus gallus））、ブタ（サス・スクロファ・ドメスティカ（Sus scrofa domestica））、カエル（ゼノプス・ラビス（Xenopus laevis））、ゼブラフィッシュ（ダニオ・レリオ（Danio rerio））、被嚢類（ポリアンドロカルパ・ミサキエンシス（Polyandrocarpa misakiensis））、またはクラゲ（トリペダリア・シゾフォラ（Tripedalia cysophora））ＲＸＲに由来する。
【００６１】
一実施形態では、無脊椎動物ＲＸＲリガンド結合ドメインは、バッタ（ロカスタ・ミグラトリア（Locusta migratoria））ウルトラスピラクルポリペプチド（「ＬｍＵＳＰ」）、マダニ（アムブリオマ・アメリカヌム（Amblyomma americanum ））ＲＸＲホモログ１（「ＡｍａＲＸＲ１」）、マダニ（アムブリオマ・アメリカヌム（Amblyomma americanum））ＲＸＲホモログ２（「ＡｍａＲＸＲ２」）、シオマネキ（セルカ・プギラトル（Celuca pugilator））ＲＸＲホモログ（「ＣｐＲＸＲ」）、ゴミムシダマシ（テネブリオ・モリトル（Tenebrio molitor））ＲＸＲホモログ（「ＴｍＲＸＲ」）、ミツバチ（アピス・メリフェラ（Apis mellifera ））ＲＸＲホモログ（「ＡｍＲＸＲ」）、アブラムシ（ミズス・ペルシカエ（Myzus persicae））ＲＸＲホモログ（「ＭｐＲＸＲ」）、または非双翅類／非鱗翅目ＲＸＲホモログに由来する。
【００６２】
一実施形態では、キメラＲＸＲ  ＬＢＤは、脊椎動物種のＲＸＲポリペプチド断片、無脊椎動物種のＲＸＲポリペプチド断片、または非双翅類／非鱗翅目無脊椎動物種のＲＸＲホモログポリペプチド断片から選択される少なくとも２つのポリペプチド断片を含む。本発明における使用のためのキメラＲＸＲリガンド結合ドメインは、少なくとも２つの異なる種のＲＸＲポリペプチド断片を含んでもよいか、または種が同じである場合、２つ以上のポリペプチド断片は、その種のＲＸＲポリペプチド断片の２つ以上の異なるアイソフォームに由来してもよい。そのようなキメラＲＸＲ  ＬＢＤは、例えば、国際公開第２００２／０６６６１４号パンフレットに開示されている。
【００６３】
一実施形態では、キメラＲＸＲリガンド結合ドメインは、少なくとも１つの脊椎動物種のＲＸＲポリペプチド断片および１つの無脊椎動物種のＲＸＲポリペプチド断片を含む。
【００６４】
別の実施形態では、キメラＲＸＲリガンド結合ドメインは、少なくとも１つの脊椎動物種のＲＸＲポリペプチド断片および１つの非双翅類／非鱗翅目無脊椎動物種のＲＸＲホモログポリペプチド断片を含む。
【００６５】
リガンドは、核受容体のＬＢＤと組み合わせ、次に、治療生成物配列と会合したＦＲＰの応答エレメントに結合した場合、治療生成物配列の発現の外部での時間的調節を提供する。本発明の様々な成分が互いに結合する結合メカニズムまたは順序、すなわち、例えば、リガンドのＬＢＤへの結合、ＤＢＤの応答エレメントへの結合、ＡＤのプロモーターへの結合などは重要ではない。
【００６６】
特定の例では、リガンドの、Ｈ群核受容体のＬＢＤおよびその核受容体ＬＢＤパートナーへの結合は、治療生成物配列の発現を可能にする。このメカニズムはＨ群核受容体（ＧＨＮＲ）またはそのパートナーへのリガンド結合の可能性、およびその結果としての活性なホモ二量体複合体（例えば、ＧＨＮＲ＋ＧＨＮＲまたはパートナー＋パートナー）の形成を排除しない。好ましくは、ハイブリッド遺伝子スイッチを産生する１つまたは複数の受容体ドメインを変化させる。典型的には、ハイブリッド遺伝子と得られるハイブリッドタンパク質が、トランス活性化活性、リガンドの補完的結合、および特定の応答エレメントの認識のために選択された宿主細胞または生物中で最適化されるように、３つのドメイン、ＤＢＤ、ＬＢＤ、およびＡＤのうちの１つまたは複数を、他のドメインの供給源とは異なる供給源から選択することができる。さらに、応答エレメント自体を改変するか、または酵母由来ＧＡＬ−４タンパク質（Sadowski et al., Nature 335:563 (1988)を参照されたい）もしくは大腸菌（Escherichia coli）由来ＬｅｘＡタンパク質（Brent et al., Cell 43:729 (1985)を参照されたい）などの他のＤＮＡ結合タンパク質ドメインのための応答エレメント、またはそのような特異的相互作用のために設計、改変、および選択されたタンパク質との標的化された相互作用に特異的な合成応答エレメント（例えば、Kim et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 94:3616 (1997)を参照されたい）で置換して、ハイブリッド受容体を収容させることができる。２ハイブリッドシステムの別の利点は、それらが所望の最終結果による遺伝子発現を駆動するために使用されるプロモーターの選択を可能にするということである。そのような二重制御は、特に、細胞傷害性タンパク質が産生される場合、発現のタイミングならびに発現が起こる細胞の両方を制御することができるため、遺伝子療法の領域において特に重要であり得る。好適なプロモーターに作動可能に連結された遺伝子が、対象の細胞中に導入される場合、外因性遺伝子の発現は、本発明のシステムの存在によって制御される。プロモーターは、構成的もしくは誘導的に調節されてもよく、または組織特異的（すなわち、特定の細胞型においてのみ発現される）であるか、もしくは生物のある特定の発生段階に特異的であってもよい。
【００６７】
第１のハイブリッドタンパク質のＤＮＡ結合ドメインは、リガンドの存在下または非存在下で、応答エレメントの調節下で下流の遺伝子の転写を開始させる、または抑制するこの応答エレメントのＤＮＡ配列に結合する。
【００６８】
機能的なＬＤＴＦＣ、例えば、ＥｃＲ複合体はまた、イムノフィリンなどのさらなるタンパク質を含んでもよい。転写因子として知られる、核受容体ファミリーのタンパク質のさらなるメンバー（ＤＨＲ３８またはベータＦＴＺ−１など）もまた、ＥｃＲ、ＵＳＰ、および／またはＲＸＲのためのリガンド依存的または非依存的パートナーであってもよい。さらに、コアクチベーター（アダプターまたはメディエーターとも呼ばれる）として一般に知られるタンパク質などの他のコファクターが必要であってもよい。これらのタンパク質は、ＤＮＡに配列特異的に結合せず、基本的な転写に関与しない。それらは、アクチベーターのＤＮＡ結合の刺激を含む様々なメカニズムにより、クロマチン構造に影響することにより、またはアクチベーター−開始複合体相互作用を媒介することにより、転写活性化に対するその効果を発揮してもよい。そのようなコアクチベーターの例としては、ＲＩＰ１４０、ＴＩＦ１、ＲＡＰ４６／Ｂａｇ−１、ＡＲＡ７０、ＳＲＣ−１／ＮＣｏＡ−１、ＴＩＦ２／ＧＲＩＰ／ＮＣｏＡ−２、ＡＣＴＲ／ＡＩＢ１／ＲＡＣ３／ｐＣＩＰならびに雑多なコアクチベーターＣ応答エレメントＢ結合タンパク質、ＣＢＰ／ｐ３００が挙げられる（概説については、Glass et al., Curr. Opin. Cell Biol. 9:222 (1997)を参照されたい）。また、リガンドの非存在下で転写活性化を効率的に阻害するためには、コリプレッサー（リプレッサー、サイレンサー、またはサイレンシングメディエーターとしても知られる）として一般に知られるタンパク質コファクターが必要であってもよい。これらのコリプレッサーは、応答エレメントでその活性を沈黙化させる非リガンド化ＥｃＲと相互作用してもよい。現在の証拠は、リガンドの結合が受容体のコンフォメーションを変化させ、コリプレッサーの放出および上記のコアクチベーターの動員をもたらすことによって、それらのサイレンシング活性を無効化することを示唆している。コリプレッサーの例としては、Ｎ−ＣｏＲおよびＳＭＲＴが挙げられる（概説については、Horwitz et al., Mol Endocrinol. 10:1167 (1996)を参照されたい）。これらのコファクターは、細胞もしくは生物内で内因性であってよいか、または調節される、もしくは調節されない様式のいずれかで発現される導入遺伝子として外因的に付加してもよい。
【００６９】
好ましい実施形態では、本発明において使用することができるエクジソン受容体に基づく遺伝子スイッチは、国際公開第２００２／０６６６１２号パンフレット（２００２年２月２０日出願、２００２年８月２９日公開のＰＣＴ／ＵＳ２００２／００５０９０）に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００７０】
さらなる実施形態では、本発明において使用することができるエクジソン受容体に基づく遺伝子スイッチは、国際公開第２００１／０７０８１６号パンフレット（２００１年３月２１日出願、２００１年９月２７日公開のＰＣＴ／ＵＳ０１／０９０５０）；国際公開第２００２／０６６６１４号パンフレット（２００２年２月２０日出願、２００２年８月２９日公開のＰＣＴ／ＵＳ０２／０５７０６）；および国際公開第２００２／０６６６１５号パンフレット（２００２年２月２０日出願、２００２年８月２９日公開のＰＣＴ／ＵＳ０２／０５７０８）に記載されており、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００７１】
リガンド
リガンド活性化されたエクジソン受容体に基づく遺伝子スイッチに適用されるように、本明細書で使用される場合の用語「リガンド」は、遺伝子スイッチを活性化して、そこにコードされるポリペプチドの発現を刺激する能力を有する、溶解度が変化する低分子である。本発明のリガンド依存性転写因子複合体のためのリガンドは、リガンド結合ドメイン、ヘテロ二量体パートナードメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、およびトランス活性化ドメインのうちの１つまたは複数を含むタンパク質複合体に結合する。リガンド依存性転写因子複合体を活性化するリガンドの選択は、使用される遺伝子スイッチの型に依存する。
【００７２】
リガンドの例としては、限定されるものではないが、米国特許第６，０１３，８３６号明細書；第５，１１７，０５７号明細書；第５，５３０，０２８号明細書；および第５，３７８，７２６号明細書ならびに米国特許出願公開第２００５／０２０９２８３号明細書および第２００６／００２０１４６号明細書に開示されたものなどの、エクジソン、２０−ヒドロキシエクジソン、ポナステロンＡ、ムリステロンＡなどのエクジステロイド、９−ｃｉｓ−レチノイン酸、レチノイン酸の合成アナログ、Ｎ，Ｎ’−ジアシルヒドラジン；米国特許出願公開第２００４／０１７１６５１号明細書に記載されたオキサジアゾリン；欧州特許出願第４６１，８０９号明細書に開示されたものなどのジベンゾイルアルキルシアノヒドラジン；米国特許第５，２２５，４４３号に開示されたものなどのＮ−アルキル−Ｎ，Ｎ’−ジアロイルヒドラジン；欧州特許出願第２３４，９９４号明細書に開示されたものなどのＮ−アシル−Ｎ−アルキルカルボニルヒドラジン；米国特許第４，９８５，４６１号明細書に記載されたものなどのＮ−アロイル−Ｎ−アルキル−Ｎ’−アロイルヒドラジン；米国特許出願公開第２００４／００４９０３７号明細書に記載されたものなどのアミドケトン（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）ならびに３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−Ｎ−イソブチル−ベンズアミド、８−Ｏ−アセチルハルパギド、オキシステロール、２２（Ｒ）ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）ヒドロキシコレステロール、２５−エポキシコレステロール、Ｔ０９０１３１７、５−アルファ−６−アルファ−エポキシコレステロール−３−サルフェート（ＥＣＨＳ）、７−ケトコレステロール−３−サルフェート、ファメソール、胆汁酸、１，１−ビホスホネートエステル、幼若ホルモンＩＩＩなどの他の同様の材料が挙げられる。本発明において有用なジアシルヒドラジンリガンドの例としては、ＲＧ−１１５８１９（３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−Ｎ’−（２−メチル−３−メトキシベンゾイル）−ヒドラジド）、ＲＧ−１１５９３２（（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド）、およびＲＧ−１１５８３０（３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド）が挙げられる。例えば、両方ともその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１２／１５５，１１１号明細書および国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００６７５７号を参照されたい。
【００７３】
例えば、エクジソン受容体に基づく遺伝子スイッチのためのリガンドを、任意の好適なリガンドから選択することができる。天然に存在するエクジソンまたはエクジソンアナログ（例えば、２０−ヒドロキシエクジソン、ムリステロンＡ、ポナステロンＡ、ポナステロンＢ、ポナステロンＣ、２６−ヨードポナステロンＡ、イノコステロンまたは２６−メシルイノコステロン）と、非ステロイド誘導剤との両方を、本発明の遺伝子スイッチのためのリガンドとして使用することができる。米国特許第６，３７９，９４５号明細書は、ステロイドと、ある特定の非ステロイド誘導剤との両方に応答する遺伝子スイッチとして作用することができるヘリオティス・ビレセンス（Heliothis virescens）から単離された昆虫ステロイド受容体（「ＨＥｃＲ」）を記載している。非ステロイド誘導剤は、例えば、より低い製造費用、代謝安定性、昆虫、植物、または哺乳動物に存在しないこと、および環境許容性を含む、いくつかの理由から、ステロイドと非ステロイド誘導剤との両方に応答するこのシステムおよび他の多くのシステムにおいて、ステロイドを超える異なる利点を有する。米国特許第６，３７９，９４５号明細書は、エクジソンに基づく遺伝子スイッチのためのリガンドとしての２つのジベンゾイルヒドラジン、１，２−ジベンゾイル−１−ｔｅｒｔ−ブチル−ヒドラジンおよびテブフェノジド（Ｎ−（４−エチルベンゾイル）−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブチル−ヒドラジン）の利用を記載している。また、リガンドとして本発明に含まれるのは、米国特許第５，１１７，０５７号明細書に開示されたものなどの、他のジベンゾイルヒドラジンである。ショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）に由来するエクジソン受容体のための化学リガンドとしてのテブフェノジドの使用も、米国特許第６，１４７，２８２号明細書に開示されている。エクジソンリガンドのさらなる非限定例は、３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−Ｎ−イソブチル−ベンズアミド、８−Ｏ−アセチルハルパギド、１，２−ジアシルヒドラジン、Ｎ’−置換Ｎ，Ｎ’−二置換ヒドラジン、ジベンゾイルアルキルシアノヒドラジン、Ｎ置換Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジアロイルヒドラジン、Ｎ置換Ｎ−アシル−Ｎ−アルキル、カルボニルヒドラジンまたはＮ−アロイル−Ｎ’−アルキルＮ’−アロイルヒドラジンである(例えば、米国特許第６，７２３，５３１号明細書を参照されたい)。
【００７４】
一実施形態では、エクジソンに基づく遺伝子スイッチシステムのためのリガンドは、ジアシルヒドラジンリガンドまたはキラルジアシルヒドラジンリガンドである。遺伝子スイッチシステムにおいて使用されるリガンドは、式Ｉの化合物
【００７５】
【化２】
2021529199.tif 000003
（式中、Ａは、アルコキシ、アリールアルキルオキシまたはアリールオキシであり；Ｂは、置換されていてもよいアリールまたは置換されていてもよいヘテロアリールであり；Ｒ１およびＲ２は独立に、置換されていてもよいアルキル、アリールアルキル、ヒドロキシアルキル、ハロアルキル、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいヘテロシクロ、置換されていてもよいアリールまたは置換されていてもよいヘテロアリールである）；またはその薬学的に許容される塩、水和物、結晶形もしくは非晶形であってよい。
【００７６】
別の実施形態では、リガンドは、式ＩＩのエナンチオマーとして富化された化合物
【００７７】
【化３】
2021529199.tif 000004
（式中、Ａは、アルコキシ、アリールアルキルオキシ、アリールオキシ、アリールアルキル、置換されていてもよいアリールまたは置換されていてもよいヘテロアリールであり；Ｂは、置換されていてもよいアリールまたは置換されていてもよいヘテロアリールであり；Ｒ１およびＲ２は独立に、置換されていてもよいアルキル、アリールアルキル、ヒドロキシアルキル、ハロアルキル、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいヘテロシクロ、置換されていてもよいアリールまたは置換されていてもよいヘテロアリールであるが、但し、Ｒ１はＲ２と等しくなく；Ｒ１およびＲ２を担持する非対称性炭素原子での絶対的な構成は主にＳである）；またはその薬学的に許容される塩、水和物、結晶形もしくは非晶形であってよい。
【００７８】
ある特定の実施形態では、リガンドは、式ＩＩＩのエナンチオマーとして富化された化合物
【００７９】
【化４】
2021529199.tif 000005
（式中、Ａは、アルコキシ、アリールアルキルオキシ、アリールオキシ、アリールアルキル、置換されていてもよいアリールまたは置換されていてもよいヘテロアリールであり；Ｂは、置換されていてもよいアリールまたは置換されていてもよいヘテロアリールであり；Ｒ１およびＲ２は独立に、置換されていてもよいアルキル、アリールアルキル、ヒドロキシアルキル、ハロアルキル、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいヘテロシクロ、置換されていてもよいアリールまたは置換されていてもよいヘテロアリールであるが、但し、Ｒ１はＲ２と等しくなく；Ｒ１およびＲ２を担持する非対称性炭素原子での絶対的な構成は主にＲである）；またはその薬学的に許容される塩、水和物、結晶形もしくは非晶形であってよい。
【００８０】
一実施形態では、リガンドは、少なくとも９５％の鏡像体過剰率を有する（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジドまたはその薬学的に許容される塩、水和物、結晶形もしくは非晶形であってよい。
【００８１】
式Ｉのジアシルヒドラジンリガンドおよび式ＩＩまたはＩＩＩのキラルジアシルヒドラジンリガンドは、エクジソンに基づく遺伝子スイッチシステムと共に使用した場合、本発明の治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドの発現の外部での時間的調節のための手段を提供する。全体として参照により本明細書に組み込まれる２００８年５月２９日に出願された米国特許出願第１２／１５５，１１１号明細書を参照されたい。
【００８２】
本発明において使用されるリガンドは、塩を形成してもよい。本明細書で使用される用語「塩」とは、無機および／または有機の酸および塩基を用いて形成される酸性および／または塩基性の塩を意味する。さらに、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの化合物が塩基性部分と酸性部分との両方を含有する場合、両性イオン（「内塩」）が形成されてもよく、本明細書で使用される用語「塩」の中に含まれる。薬学的に許容される（すなわち、非毒性的な、生理的に許容される）塩が使用されるが、例えば、調製の間に用いることができる単離または精製ステップにおいては、他の塩も有用である。例えば、塩が沈降するものなどの媒体中で、または水性媒体中で、化合物と、等量などの、ある量の酸または塩基とを反応させた後、凍結乾燥させることによって、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの化合物の塩を形成させることができる。
【００８３】
塩基性部分を含有するリガンドは、様々な有機および無機酸と塩を形成してもよい。例示的な酸付加塩としては、酢酸塩（酢酸またはトリハロ酢酸、例えば、トリフルオロ酢酸を用いて形成されるものなど）、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、カンホレート（camphorate）、カンファースルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩（塩酸を用いて形成される）、臭化水素酸塩（臭化水素を用いて形成される）、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩（マレイン酸を用いて形成される）、メタンスルホン酸塩（メタンスルホン酸を用いて形成される）、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、ペクチネート（pectinate）、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩（硫酸を用いて形成されるものなど）、スルホン酸塩（本明細書に記載のものなど）、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩などのトルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩などが挙げられる。
【００８４】
酸性部分を含有するリガンドは、様々な有機および無機塩基と塩を形成してもよい。例示的な塩基性塩としては、アンモニウム塩、ナトリウム、リチウム、およびカリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウムおよびマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、ベンザチン、ジシクロヘキシルアミン、ヒドラバミン（Ｎ，Ｎ−ビス（デヒドロアビエチル）エチレンジアミンを用いて形成される）、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミド、ｔ−ブチルアミンなどの有機塩基（例えば、有機アミン）との塩、ならびにアルギニン、リシンなどのアミノ酸との塩などが挙げられる。
【００８５】
ＦＫ５０６結合ドメインを使用する誘導性遺伝子発現系のためのリガンドの非限定例は、ＦＫ５０６、シクロスポリンＡ、またはラパマイシンである。ＦＫ５０６、ラパマイシン、およびそのアナログは、米国特許第６，６４９，５９５号明細書および第６，１８７，７５７号明細書に開示されている。米国特許第７，２７６，４９８号明細書および第７，２７３，８７４号明細書も参照されたい。
【００８６】
ＥｃＲ複合体などのＬＤＴＦを、ＥｃＲを含む、複合体のタンパク質の１つに結合した活性エクジステロイドまたは非ステロイドリガンドによって活性化することができるが、複合体の他のタンパク質を排除するものではない。ＥｃＲ複合体などのＬＤＴＦは、全メンバーが、アミノ末端トランス活性化ドメイン（本明細書では互換的に使用される「ＡＤ」、「ＴＤ」または「ＴＡ」）、ＤＮＡ結合ドメイン（「ＤＢＤ」）、およびリガンド結合ドメイン（「ＬＢＤ」）を含む１つまたは複数のポリペプチドサブユニットの存在を特徴とする核受容体スーパーファミリーのメンバーであるタンパク質を含む。ＡＤは、「ヘテロ二量体化パートナー」または「ＨＰ」との融合物として存在してもよい。本発明のＡＤおよびＨＰを含む融合タンパク質は、「同時活性化タンパク質」または「ＣＡＰ」と本明細書では称される。ＤＢＤおよびＬＢＤを、本明細書では「リガンド誘導性転写因子（「ＬＴＦ」）と称される、融合タンパク質として発現させることができる。融合パートナーを、リンカー、例えば、ヒンジ領域によって隔てられていてもよい。ＬＴＦファミリーの一部のメンバーはまた、ＬＢＤのカルボキシ末端側に別のトランス活性化ドメインを有してもよい。ＤＢＤは、エクジソン応答エレメントに対する特異性を付与する、２つのアミノ酸モチーフである、ＰボックスとＤボックスとの間の２個のシステインジンクフィンガーの存在を特徴とする。これらのドメインは、天然の、改変された異種受容体タンパク質のドメイン、または異種受容体タンパク質の異なるドメインのキメラのいずれかであってもよい。
【００８７】
外因性遺伝子、応答エレメント、およびＬＤＴＦ、例えば、ＥｃＲ複合体を構成するＤＮＡ配列を、古細菌、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）などの原核細胞、または他の腸内細菌、または植物もしくは動物細胞などの真核細胞中に組み入れることができる。しかしながら、遺伝子によって発現される多くのタンパク質は細菌中では不正確にプロセッシングされるため、真核細胞が好ましい。細胞は、単細胞または多細胞生物の形態にあってもよい。外因性遺伝子、応答エレメント、および受容体複合体のためのヌクレオチド配列を、ＲＮＡ分子として、好ましくは、タバコモザイクウイルスなどの機能的ウイルスＲＮＡの形態で組み入れることもできる。真核細胞のうち、脊椎動物細胞はＥｃＲのための本発明のリガンドに対する応答を提供する分子を天然では欠くため、それらが好ましい。結果として、それらは、本発明のリガンドに対して「実質的に非感受性」である。かくして、本発明において有用なリガンドは、形質転換細胞、または全生物に対する無視できる程度の生理的効果またはその他の効果を有するであろう。したがって、細胞は増殖し、リガンド自体の存在によって実質的に影響されない、所望の生成物を発現することができる。
【００８８】
用語「エクジソン受容体複合体」は一般に、核受容体ファミリーの少なくとも２つのメンバー、エクジソン受容体（「ＥｃＲ」）およびウルトラスピラクル（「ＵＳＰ」）タンパク質を有するヘテロ二量体タンパク質複合体を指す（Yao et al., Nature 366:476 (1993))；Yao et al., Cell 71:63 (1992)を参照されたい）。機能的なＥｃＲ複合体はまたイムノフィリンなどのさらなるタンパク質を含んでもよい。転写因子として知られる、核受容体ファミリーのタンパク質のさらなるメンバー（ＤＨＲ３８またはベータＦＴＺ−１または他の昆虫ホモログなど）もまた、ＥｃＲおよび／またはＵＳＰのためのリガンド依存的または非依存的パートナーであってもよい。ＥｃＲ複合体はまた、ＥｃＲタンパク質と、ウルトラスピラクルタンパク質、レチノイン酸−Ｘ−受容体（「ＲＸＲ」）タンパク質の脊椎動物ホモログとのヘテロ二量体またはＵＳＰとＲＸＲとのキメラであってもよい。ＥｃＲ複合体という用語はまた、ＥｃＲタンパク質またはＵＳＰのホモ二量体複合体も包含する。
【００８９】
ＥｃＲ複合体を、ＥｃＲを含む、複合体のタンパク質の１つに結合した活性エクジステロイドまたは非ステロイドリガンドによって活性化することができるが、複合体の他のタンパク質を排除するものではない。ＥｃＲに基づく遺伝子スイッチに適用される場合、本明細書で使用される用語「リガンド」は、そこにコードされるポリペプチドの発現を刺激する遺伝子スイッチを活性化する能力を有する低分子および可溶性分子を記載する。リガンドの例としては、限定されるものではないが、米国特許第６，０１３，８３６号明細書；第５，１１７，０５７号明細書；第５，５３０，０２８号明細書；および第５，３７８，７２６号明細書ならびに米国特許出願公開第２００５／０２０９２８３号明細書および第２００６／００２０１４６号明細書に開示されたものなどの、エクジソン、２０−ヒドロキシエクジソン、ポナステロンＡ、ムリステロンＡなどのエクジステロイド、９−ｃｉｓ−レチノイン酸、レチノイン酸の合成アナログ、Ｎ，Ｎ’−ジアシルヒドラジン；米国特許出願公開第２００４／０１７１６５１号明細書に記載されたオキサジアゾリン；欧州特許出願第４６１，８０９号明細書に開示されたものなどのジベンゾイルアルキルシアノヒドラジン；米国特許第５，２２５，４４３号に開示されたものなどのＮ−アルキル−Ｎ，Ｎ’−ジアロイルヒドラジン；欧州特許出願第２３４，９９４号明細書に開示されたものなどのＮ−アシル−Ｎ−アルキルカルボニルヒドラジン；米国特許第４，９８５，４６１号明細書に記載されたものなどのＮ−アロイル−Ｎ−アルキル−Ｎ’−アロイルヒドラジン；米国特許出願公開第２００４／００４９０３７号明細書に記載されたものなどのアミドケトン；ならびに３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−Ｎ−イソブチル−ベンズアミド、８−Ｏ−アセチルハルパギド、オキシステロール、２２（Ｒ）ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）ヒドロキシコレステロール、２５−エポキシコレステロール、Ｔ０９０１３１７、５−アルファ−６−アルファ−エポキシコレステロール−３−サルフェート（ＥＣＨＳ）、７−ケトコレステロール−３−サルフェート、ファメソール、胆汁酸、１，１−ビホスホネートエステル、幼若ホルモンＩＩＩなどの他の同様の材料が挙げられる。本発明において有用なジアシルヒドラジンリガンドの例としては、ＲＧ−１１５８１９（３，５−ジメチル安息香酸Ｎ−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−Ｎ’−（２−メチル−３−メトキシ−ベンゾイル）ヒドラジド）、ＲＧ−１１５９３２（（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド）、およびＲＧ−１１５８３０（３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド）が挙げられる。本発明の実施において有用であるさらなるジアシルヒドラジンについては、２００８年５月２９日に出願された米国特許出願第１２／１５５，１１１号明細書および２００８年５月２９日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２００８／００６７５７を参照されたい。
【００９０】
ＥｃＲ複合体は、全メンバーが、アミノ末端トランス活性化ドメイン（「ＴＡ」）、ＤＮＡ結合ドメイン（「ＤＢＤ」）、およびヒンジ領域によって隔てられたリガンド結合ドメイン（「ＬＢＤ」）の存在を特徴とする核受容体スーパーファミリーのメンバーであるタンパク質を含む。ファミリーの一部のメンバーはまた、ＬＢＤのカルボキシ末端側上に別のトランス活性化ドメインを有してもよい。ＤＢＤは、エクジソン応答エレメントに対する特異性を付与する、２つのアミノ酸モチーフである、ＰボックスとＤボックスとの間の２個のシステインジンクフィンガーの存在を特徴とする。これらのドメインは、天然の、改変された異種受容体タンパク質のドメイン、または異種受容体タンパク質の異なるドメインのキメラのいずれかであってもよい。
【００９１】
外因性遺伝子、応答エレメント、およびＥｃＲ複合体を構成するＤＮＡ配列を、古細菌、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）などの原核細胞、または他の腸内細菌、または植物もしくは動物細胞などの真核細胞中に組み入れることができる。しかしながら、遺伝子によって発現される多くのタンパク質は細菌中では不正確にプロセッシングされるため、真核細胞が好ましい。細胞は、単細胞または多細胞生物の形態にあってもよい。外因性遺伝子、応答エレメント、および受容体複合体のためのヌクレオチド配列を、ＲＮＡ分子として、好ましくは、タバコモザイクウイルスなどの機能的ウイルスＲＮＡの形態で組み入れることもできる。真核細胞のうち、脊椎動物細胞はＥｃＲのための本発明のリガンドに対する応答を提供する分子を天然では欠くため、それらが好ましい。結果として、それらは、本発明のリガンドに対して「実質的に非感受性」である。かくして、本発明において有用なリガンドは、形質転換細胞、または全生物に対する無視できる程度の生理的効果またはその他の効果を有するであろう。したがって、細胞は増殖し、リガンド自体の存在によって実質的に影響されない、所望の生成物を発現することができる。
【００９２】
ＥｃＲリガンドは、ＥｃＲ複合体と共に使用され、次に、外因性遺伝子（例えば、ＩＬ−１２）に連結された応答エレメントに結合した場合、外因性遺伝子の発現の外部での時間的調節のための手段を提供する。様々な成分が互いに結合する順序、すなわち、リガンドの受容体複合体への結合および受容体複合体の応答エレメントへの結合は、重要ではない。典型的には、外因性遺伝子の発現のモジュレーションは、ＥｃＲ複合体の、特定の制御、または調節ＤＮＡエレメントへの結合に応答してのものである。ＥｃＲタンパク質は、核受容体ファミリーの他のメンバーのように、少なくとも３つのドメイン、トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、およびリガンド結合ドメインを有する。この受容体はまた、核受容体ファミリーのサブセットのように、ヘテロ二量体化特性の原因となる明確に定義されていない領域を有する。ＵＳＰまたはＲＸＲタンパク質とのヘテロ二量体化後の、リガンドの、ＥｃＲタンパク質のリガンド結合ドメインへの結合により、ヘテロ二量体タンパク質のＤＮＡ結合ドメインは、活性化形態の応答エレメントに結合することができ、かくして、外因性遺伝子の発現または抑制をもたらす。このメカニズムは、リガンドがＥｃＲまたはＵＳＰのいずれかに結合する可能性、およびその結果得られる、活性なホモ二量体複合体（例えば、ＥｃＲ＋ＥｃＲまたはＵＳＰ＋ＵＳＰ）の形成を排除するものではない。一実施形態では、キメラ遺伝子スイッチを産生する１つまたは複数の受容体ドメインを変化させることができる。典型的には、キメラ受容体が、トランス活性化活性、リガンドの補完的結合、および特定の応答エレメントの認識のために選択された宿主細胞または生物中で最適化されるように、３つのドメインのうちの１つまたは複数を、他のドメインの供給源とは異なる供給源から選択することができる。さらに、応答エレメント自体を改変するか、または酵母由来ＧＡＬ−４タンパク質（Sadowski et al., Nature 335:563 (1988)を参照されたい）もしくは大腸菌（E. coli）由来ＬｅｘＡタンパク質（Brent et al., Cell 43:729 (1985)を参照されたい）などの他のＤＮＡ結合タンパク質ドメインのための応答エレメントで置換して、キメラＥｃＲ複合体を収容させることができる。キメラシステムの別の利点は、それらが所望の最終結果による外因性遺伝子を駆動するために使用されるプロモーターの選択を可能にするということである。そのような二重制御は、特に、細胞傷害性タンパク質が産生される場合、発現のタイミングならびに発現が起こる細胞の両方を制御することができるため、遺伝子療法の領域において特に重要であり得る。好適なプロモーターに作動可能に連結された外因性遺伝子が、対象の細胞中に導入される場合、外因性遺伝子の発現は、本発明のリガンドの存在によって制御される。プロモーターは、構成的もしくは誘導的に調節されてもよく、または組織特異的（すなわち、特定の細胞型においてのみ発現される）であるか、もしくは生物のある特定の発生段階に特異的であってもよい。
【００９３】
ある特定の実施形態では、方法において記載される治療スイッチプロモーターは、構成的である。ある特定の実施形態では、治療スイッチプロモーターは、疾患、障害、または状態と関連する条件下で活性化され、例えば、プロモーターは、疾患に応答して、特定の生理状態、発生状態、分化状態、もしくは病態に応答して、および／または１つもしくは複数の特定の生体分子に応答して活性化される；ならびに／またはプロモーターは、特定の組織もしくは細胞型において活性化される。ある特定の実施形態では、疾患、障害、または状態は、治療ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに応答する。例えば、ある特定の非限定的な実施形態では、治療ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、疾患、障害または状態を処置する、防止する、改善する、症状を低減する、進行を防止する、または治癒させるのに有用であるが、これらのことのいずれか１つまたは全部を達成する必要はない。ある特定の実施形態では、第１および第２のポリヌクレオチドは、疾患、障害または状態と関連する条件下でリガンド依存性転写因子複合体の発現を可能にするために導入される。一実施形態では、治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドが、前記疾患、障害、または状態を処置する、改善する、または防止するのに十分なレベルで対象を通して発現され、播種されるように、治療方法が実行される。本明細書で使用される場合、「播種」とは、対象における効果または活性を有するのに十分な程度で、ポリペプチドが発現され、改変された細胞から放出されることを意味する。播種は、全身性、局部性またはその間の任意のものであってもよい。例えば、治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドは、血流またはリンパ系を介して全身的に播種され得る。あるいは、治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドは、処置される組織または臓器中で局部的に播種され得る。
【００９４】
転写因子および受容体タンパク質などの、様々なポリペプチドをコードするいくつかのゲノムおよびｃＤＮＡ核酸配列は、当業界で周知である。当業者は、実質的に全ての既知の遺伝子に関する核酸配列情報に対するアクセスを有し、配列を公開した機関である公共預託機関から直接、核酸分子を取得するか、または日常的な方法を用いて分子を調製することができる。例えば、以下の、配列受託番号の記載を参照されたい。
【００９５】
遺伝子スイッチは、特定のリガンドの添加または除去によって遺伝子発現を調節する任意の遺伝子スイッチシステムであってもよい。一実施形態では、遺伝子スイッチは、遺伝子発現のレベルが、存在するリガンドのレベルに依存するものである。本発明の遺伝子スイッチにおいて使用することができるリガンド依存性転写因子の例としては、限定されるものではないが、その対応するリガンド（例えば、糖質コルチコイド、エストロゲン、プロゲスチン、レチノイド、エクジソン、ならびにそのアナログおよび模倣体）によって活性化される核受容体スーパーファミリーのメンバーおよびテトラサイクリンによって活性化されるｒＴＴＡが挙げられる。本発明の一態様では、遺伝子スイッチは、ＥｃＲに基づく遺伝子スイッチである。そのようなシステムの例としては、限定されるものではないが、米国特許第６，２５８，６０３号明細書、第７，０４５，３１５号明細書、米国特許出願公開第２００６／００１４７１１号明細書、第２００７／０１６１０８６号明細書、および国際公開第０１／７０８１６号パンフレットに記載されたシステムが挙げられる。キメラエクジソン受容体システムの例は、米国特許第７，０９１，０３８号明細書、米国特許出願公開第２００２／０１１０８６１号明細書、第２００４／００３３６００号明細書、第２００４／００９６９４２号明細書、第２００５／０２６６４５７号明細書、および第２００６／０１００４１６号明細書、ならびに国際公開第０１／７０８１６号パンフレット、第０２／０６６６１２号パンフレット、第０２／０６６６１３号パンフレット、第０２／０６６６１４号パンフレット、第０２／０６６６１５号パンフレット、第０２／２９０７５号パンフレット、および第２００５／１０８６１７号パンフレットに記載されている。非ステロイド性エクジソンアゴニストにより調節されるシステムの例は、ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ（登録商標）Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、Ｍａｓｓ．）である。
【００９６】
一実施形態では、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドは、プロモーターの制御下にリガンド依存性転写因子をコードする単一の転写因子配列を含む。転写因子配列は、天然に存在するリガンド依存性転写因子または人工転写因子をコードしてもよい。人工転写因子は、転写因子の天然配列が、例えば、配列の突然変異によって、または異なる転写因子に由来するドメインを組み合わせることによって変更されているものである。一実施形態では、転写因子は、Ｈ群核受容体リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を含む。一実施形態では、Ｈ群核受容体ＬＢＤは、ＥｃＲ、ユビキタス受容体、オーファン受容体１、ＮＥＲ−１、ステロイドホルモン核受容体１、レチノイドＸ受容体相互作用タンパク質−１５、肝臓Ｘ受容体β、ステロイドホルモン受容体様タンパク質、肝臓Ｘ受容体、肝臓Ｘ受容体α、ファルネソイドＸ受容体、受容体相互作用タンパク質１４、またはファルネソール受容体に由来する。別の実施形態では、Ｈ群核受容体ＬＢＤは、エクジソン受容体に由来する。
【００９７】
ＥｃＲおよび他のＨ群核受容体は、全メンバーが一般に、アミノ末端トランス活性化ドメイン（ＴＤ）、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、およびヒンジ領域によってＤＢＤから隔てられたＬＢＤの存在を特徴とする核受容体スーパーファミリーのメンバーである。本明細書で使用される場合、用語「ＤＮＡ結合ドメイン」は、ＤＮＡ結合ドメインが特定の応答エレメントと会合するように機能する限り、ＤＮＡ結合タンパク質の全長までの、ＤＮＡ結合タンパク質の最小のポリペプチド配列を含む。核受容体スーパーファミリーのメンバーはまた、４つまたは５つのドメイン：Ａ／Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、および一部のメンバーでは、Ｆの存在を特徴とする（米国特許第４，９８１，７８４号明細書およびEvans, Science 240:889 (1988)を参照されたい）。「Ａ／Ｂ」ドメインはトランス活性化ドメインに対応し、「Ｃ」はＤＮＡ結合ドメインに対応し、「Ｄ」はヒンジ領域に対応し、「Ｅ」はリガンド結合ドメインに対応する。ファミリーの一部のメンバーはまた、「Ｆ」に対応するＬＢＤのカルボキシ末端側に別のトランス活性化ドメインを有してもよい。
【００９８】
ＤＢＤは、応答エレメントに対する特異性を付与する、２つのアミノ酸モチーフである、ＰボックスとＤボックスとの間の２個のシステインジンクフィンガーの存在を特徴とする。これらのドメインは、天然の、改変された異種受容体タンパク質のドメイン、または異種受容体タンパク質の異なるドメインのキメラのいずれかであってもよい。ＥｃＲはまた、核受容体ファミリーのサブセットのように、ヘテロ二量体化特性の原因となる明確に定義されていない領域を有する。核受容体のドメインは天然ではモジュール式であるため、ＬＢＤ、ＤＢＤ、およびＴＤは相互に交換してもよい。
【００９９】
別の実施形態では、転写因子は、ＴＤ、発現をモジュレートしようとする外因性遺伝子と関連する応答エレメントを認識するＤＢＤ；およびＨ群核受容体ＬＢＤを含む。ある特定の実施形態では、Ｈ群核受容体ＬＢＤは、置換突然変異を含む。
【０１００】
別の実施形態では、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドは、第１のプロモーターの制御下に第１の転写因子配列および第２のプロモーターの制御下に第２の転写因子配列を含み、前記第１の転写因子配列および前記第２の転写因子配列によってコードされるタンパク質は相互作用して、リガンド依存性転写因子として機能するタンパク質複合体、すなわち、「デュアルスイッチ」または「２ハイブリッド」に基づく遺伝子スイッチを形成する。第１および第２のプロモーターは、同じであるか、または異なってもよい。
【０１０１】
ある特定の実施形態では、遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドは、プロモーターの制御下に第１の転写因子配列と第２の転写因子配列とを含み、前記第１の転写因子配列および前記第２の転写因子配列によってコードされるタンパク質は相互作用して、リガンド依存性転写因子として機能するタンパク質複合体、すなわち、「単一の遺伝子スイッチ」を形成する。第１の転写因子配列と第２の転写因子配列とを、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって接続することができる。ＩＲＥＳは、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳであってもよい。
【０１０２】
一実施形態では、第１の転写因子配列は、ＴＤ、発現をモジュレートしようとする外因性遺伝子と会合した応答エレメントを認識するＤＢＤ；およびＨ群核受容体ＬＢＤを含むポリペプチドをコードし、第２の転写因子配列は、脊椎動物ＲＸＲ  ＬＢＤ、無脊椎動物ＲＸＲ  ＬＢＤ、ウルトラスピラクルタンパク質ＬＢＤ、および第１のポリペプチド断片が脊椎動物ＲＸＲ  ＬＢＤ、無脊椎動物ＲＸＲ  ＬＢＤ、またはウルトラスピラクルタンパク質ＬＢＤに由来し、第２のポリペプチド断片が、異なる脊椎動物ＲＸＲ  ＬＢＤ、無脊椎動物ＲＸＲ  ＬＢＤ、またはウルトラスピラクルタンパク質ＬＢＤに由来する、２つのポリペプチド断片を含むキメラＬＢＤから選択される核受容体ＬＢＤを含む転写因子をコードする。
【０１０３】
別の実施形態では、遺伝子スイッチは、核受容体ＬＢＤおよび発現をモジュレートしようとする外因性遺伝子と会合した応答エレメントを認識するＤＢＤを含む第１のポリペプチドをコードする第１の転写因子配列と、一方の核受容体ＬＢＤがＨ群核受容体ＬＢＤである、ＴＤおよび核受容体ＬＢＤを含む第２のポリペプチドをコードする第２の転写因子配列とを含む。一実施形態では、第１のポリペプチドは、ＴＤを実質的に含まず、第２のポリペプチドは、ＤＢＤを実質的に含まない。本発明の目的のために、「実質的に含まない」とは、問題のタンパク質が活性化または結合活性を提供するのに十分な問題のドメインの配列を含有しないことを意味する。
【０１０４】
本発明の別の態様では、第１の転写因子配列は、ヘテロ二量体化パートナーおよびＴＤを含むタンパク質をコードし、第２の転写因子配列は、ＤＢＤおよびＬＢＤを含むタンパク質をコードする。
【０１０５】
一方の核受容体ＬＢＤだけがＨ群ＬＢＤである場合、他方の核受容体ＬＢＤは、Ｈ群ＬＢＤと二量体を形成する任意の他の核受容体に由来するものであってよい。例えば、Ｈ群核受容体ＬＢＤがＥｃＲ  ＬＢＤである場合、他方の核受容体ＬＢＤ「パートナー」は、ＥｃＲ、脊椎動物ＲＸＲ、無脊椎動物ＲＸＲ、ウルトラスピラクルタンパク質（ＵＳＰ）、または脊椎動物ＲＸＲ、無脊椎動物ＲＸＲ、およびＵＳＰから選択される少なくとも２つの異なる核受容体ＬＢＤポリペプチド断片を含むキメラ核受容体に由来するものであってよい（国際公開第０１／７０８１６号パンフレット、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／０５２３５号および米国特許出願公開第２００４／００９６９４２号明細書を参照されたい）。「パートナー」核受容体リガンド結合ドメインは、トランケーション突然変異、欠失突然変異、置換突然変異、または別の改変をさらに含んでもよい。
【０１０６】
一実施形態では、脊椎動物ＲＸＲ  ＬＢＤは、ヒト（ホモ・サピエンス（Homo sapiens)）、マウス（ムス・ムスクルス（Mus musculus））、ラット（ラッタス・ノルベギクス（Rattus norvegicus））、ニワトリ（ガルス・ガルス（Gallus gallus））、ブタ（サス・スクロファ・ドメスティカ（Sus scrofa domestica））、カエル（ゼノプス・ラビス（Xenopus laevis））、ゼブラフィッシュ（ダニオ・レリオ（Danio rerio））、被嚢類（ポリアンドロカルパ・ミサキエンシス（Polyandrocarpa misakiensis））、またはクラゲ（トリペダリア・シゾフォラ（Tripedalia cysophora））ＲＸＲに由来する。
【０１０７】
一実施形態では、無脊椎動物ＲＸＲリガンド結合ドメインは、バッタ（ロカスタ・ミグラトリア（Locusta migratoria））ウルトラスピラクルポリペプチド（「ＬｍＵＳＰ」）、マダニ（アムブリオマ・アメリカヌム（Amblyomma americanum））ＲＸＲホモログ１（「ＡｍａＲＸＲ１」）、マダニ（アムブリオマ・アメリカヌム（Amblyomma americanum））ＲＸＲホモログ２（「ＡｍａＲＸＲ２」）、シオマネキ（セルカ・プギラトル（Celuca pugilator））ＲＸＲホモログ（「ＣｐＲＸＲ」）、ゴミムシダマシ（テネブリオ・モリトル（Tenebrio molitor））ＲＸＲホモログ（「ＴｍＲＸＲ」）、ミツバチ（アピス・メリフェラ（Apis mellifera ））ＲＸＲホモログ（「ＡｍＲＸＲ」）、アブラムシ（ミズス・ペルシカエ（Myzus persicae））ＲＸＲホモログ（「ＭｐＲＸＲ」）、または非双翅類／非鱗翅目ＲＸＲホモログに由来する。
【０１０８】
一実施形態では、キメラＲＸＲ  ＬＢＤは、脊椎動物種のＲＸＲポリペプチド断片、無脊椎動物種のＲＸＲポリペプチド断片、および非双翅類／非鱗翅目無脊椎動物種のＲＸＲホモログポリペプチド断片から選択される少なくとも２つのポリペプチド断片を含む。本発明における使用のためのキメラＲＸＲリガンド結合ドメインは、少なくとも２つの異なる種のＲＸＲポリペプチド断片を含んでもよいか、または種が同じである場合、２つ以上のポリペプチド断片は、その種のＲＸＲポリペプチド断片の２つ以上の異なるアイソフォームに由来してもよい。
【０１０９】
一実施形態では、キメラＲＸＲリガンド結合ドメインは、少なくとも１つの脊椎動物種のＲＸＲポリペプチド断片および１つの無脊椎動物種のＲＸＲポリペプチド断片を含む。
【０１１０】
別の実施形態では、キメラＲＸＲリガンド結合ドメインは、少なくとも１つの脊椎動物種のＲＸＲポリペプチド断片および１つの非双翅類／非鱗翅目無脊椎動物種のＲＸＲホモログポリペプチド断片を含む。
【０１１１】
リガンドは、核受容体のＬＢＤと組み合わせ、次に、外因性遺伝子に連結された応答エレメントに結合した場合、外因性遺伝子の発現の外部での時間的調節を提供する。本発明の様々な成分が互いに結合する結合メカニズムまたは順序、すなわち、例えば、リガンドのＬＢＤへの結合、ＤＢＤの応答エレメントへの結合、ＴＤのプロモーターへの結合などは重要ではない。
【０１１２】
特定の例では、リガンドの、Ｈ群核受容体のＬＢＤおよびその核受容体ＬＢＤパートナーへの結合は、外因性遺伝子の発現を可能にする。このメカニズムはＨ群核受容体（ＧＨＮＲ）またはそのパートナーへのリガンド結合の可能性、およびその結果としての活性なホモ二量体複合体（例えば、ＧＨＮＲ＋ＧＨＮＲまたはパートナー＋パートナー）の形成を排除しない。好ましくは、ハイブリッド遺伝子スイッチを産生する１つまたは複数の受容体ドメインを変化させる。典型的には、ハイブリッド遺伝子と得られるハイブリッドタンパク質が、トランス活性化活性、リガンドの補完的結合、および特定の応答エレメントの認識のために選択された宿主細胞または生物中で最適化されるように、３つのドメイン、ＤＢＤ、ＬＢＤ、およびＴＤのうちの１つまたは複数を、他のドメインの供給源とは異なる供給源から選択することができる。さらに、応答エレメント自体を改変するか、または酵母由来ＧＡＬ−４タンパク質（Sadowski et al., Nature 335:563 (1988)を参照されたい）もしくは大腸菌（Escherichia coli）由来ＬｅｘＡタンパク質（Brent et al., Cell 43:729 (1985)を参照されたい）などの他のＤＮＡ結合タンパク質ドメインのための応答エレメント、またはそのような特異的相互作用のために設計、改変、および選択されたタンパク質との標的化された相互作用に特異的な合成応答エレメント（例えば、Kim et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 94:3616 (1997)を参照されたい）で置換して、ハイブリッド受容体を収容させることができる。
【０１１３】
機能的なＥｃＲ複合体はまた、イムノフィリンなどのさらなるタンパク質を含んでもよい。転写因子として知られる、核受容体ファミリーのタンパク質のさらなるメンバー（ＤＨＲ３８またはベータＦＴＺ−１など）もまた、ＥｃＲ、ＵＳＰ、および／またはＲＸＲのためのリガンド依存的または非依存的パートナーであってもよい。さらに、コアクチベーター（アダプターまたはメディエーターとも呼ばれる）として一般に知られるタンパク質などの他のコファクターが必要であってもよい。これらのタンパク質は、ＤＮＡに配列特異的に結合せず、基本的な転写に関与しない。それらは、アクチベーターのＤＮＡ結合の刺激を含む様々なメカニズムにより、クロマチン構造に影響することにより、またはアクチベーター−開始複合体相互作用を媒介することにより、転写活性化に対するその効果を発揮してもよい。そのようなコアクチベーターの例としては、ＲＩＰ１４０、ＴＩＦ１、ＲＡＰ４６／Ｂａｇ−１、ＡＲＡ７０、ＳＲＣ−１／ＮＣｏＡ−１、ＴＩＦ２／ＧＲＩＰ／ＮＣｏＡ−２、ＡＣＴＲ／ＡＩＢ１／ＲＡＣ３／ｐＣＩＰならびに雑多なコアクチベーターＣ応答エレメントＢ結合タンパク質、ＣＢＰ／ｐ３００が挙げられる（概説については、Glass et al., Curr. Opin. Cell Biol. 9:222 1997を参照されたい）。また、リガンドの非存在下で転写活性化を効率的に阻害するためには、コリプレッサー（リプレッサー、サイレンサー、またはサイレンシングメディエーターとしても知られる）として一般に知られるタンパク質コファクターが必要であってもよい。これらのコリプレッサーは、応答エレメントでその活性を沈黙化させる非リガンド化ＥｃＲと相互作用してもよい。現在の証拠は、リガンドの結合が受容体のコンフォメーションを変化させ、コリプレッサーの放出および上記のコアクチベーターの動員をもたらすことによって、それらのサイレンシング活性を無効化することを示唆している。コリプレッサーの例としては、Ｎ−ＣｏＲおよびＳＭＲＴが挙げられる（概説については、Horwitz et al., Mol Endocrinol. 10:1167 1996を参照されたい）。これらのコファクターは、細胞もしくは生物内で内因性であってよいか、または調節される、もしくは調節されない様式のいずれかで発現される導入遺伝子として外因的に付加してもよい。
【０１１４】
インターロイキン１２の誘導性発現を示すベクター
本明細書で使用される場合、用語「ｒＡＤ．ＲｈｅｏＩＬ１２」または「Ａｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ−１２」または「Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２」とは、活性化リガンドの存在下でＩＬ−１２タンパク質を産生することができる、ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ（登録商標）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＲＴＳ（登録商標））の遺伝子スイッチの制御下に、ヒトＩＬ−１２（ｈＩＬ−１２）遺伝子またはマウスＩＬ−１２（ｍＩＬ−１２）遺伝子を担持するアデノウイルスポリヌクレオチドベクターを指す。本明細書で使用される場合、用語「ｒＡｄ．ｃＩＬ１２」とは、構成的プロモーターの制御下にＩＬ−１２遺伝子を含有するアデノウイルスポリヌクレオチド制御ベクターを指す。
【０１１５】
組換えアデノウイルスベクターとして使用される組換えＤＮＡは、ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ（登録商標）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＲＴＳ（登録商標））の制御下でのヒトＩＬ−１２および１つまたは複数の他のイムノモジュレーター（immunodulator）の発現を可能にする。ＲＴＳ（登録商標）は、ヒトユビキチンＣプロモーターから発現される２シストロン性メッセージを含み、２つの融合タンパク質： Ｇａｌ４−ＥｃＲおよびＶＰ１６−ＲＸＲをコードする。Ｇａｌ４−ＥｃＲは、酵母Ｇａｌ４のＤＮＡ結合ドメイン（アミノ酸１〜１４７）と、昆虫コリストネウラ・フミフェラーナ（Choristoneura fumiferana）に由来するエクジソン受容体のＤＥＦドメインとの融合物である。別の実施形態では、ＲＴＳ（登録商標）は、ヒトユビキチンＣプロモーターから発現される２シストロン性メッセージからなり、２つの融合タンパク質：Ｇａｌ４−ＥｃＲおよびＶＰ１６−ＲＸＲをコードする。Ｇａｌ４−ＥｃＲは、酵母Ｇａｌ４のＤＮＡ結合ドメイン（アミノ酸１〜１４７）と、昆虫コリストネウラ・フミフェラーナ（Choristoneura fumiferana）に由来するエクジソン受容体のＤＥＦドメインとの融合物である。ＶＰ１６−ＲＸＲは、ＨＳＶ−ＶＰ１６の転写活性化ドメインと、ヒトおよびバッタ配列に由来するキメラＲＸＲのＥＦドメインとの融合物である。これらのＧａｌ４−ＥｃＲとＶＰ１６−ＲＸＲ配列とは、ＥＭＣＶ由来内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって隔てられている。これらの２つの融合タンパク質は、Ｇａｌ４−ＥｃＲが低分子薬物（ＲＧ−１１５９３２）に結合する時に二量体化し、ｈＩＬ−１２および６個のＧａｌ４結合部位と合成最小プロモーターとを含有するＧａｌ４応答性プロモーターに由来する１つまたは複数の他のイムノモジュレーターの転写を活性化する。上記のＲＴＳ転写単位は、ｈＩＬ−１２および１つまたは複数の他のイムノモジュレーター転写単位の下流に配置される。この全体のＲＴＳ−ｈＩＬ１２−イムノモジュレーターカセットは、Ｅ１領域が欠失した部位でアデノウイルス５ゲノム中に組み込まれる。アデノウイルス骨格は、Ｅ３遺伝子も欠く。アデノウイルスベクターＡｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２のためのマップは、米国特許出願公開第２００９／０１２３４４１号明細書の図８に示される。
【０１１６】
一部の実施形態では、本開示のＩＬ−１２  ｐ４０は、
【０１１７】
【化５】
2021529199.tif 000006
のアミノ酸配列を含む。
【０１１８】
一部の実施形態では、本開示のＩＬ−１２  ｐ４０は、
【０１１９】
【化６】
2021529199.tif 000007
のポリヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１２０】
一部の実施形態では、本開示のＩＬ−１２  ｐ４０は、
【０１２１】
【化７】
2021529199.tif 000008
のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージの同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【０１２２】
一部の実施形態では、本開示のＩＬ−１２  ｐ３５は、
【０１２３】
【化８】
2021529199.tif 000009
のアミノ酸配列を含む。
【０１２４】
一部の実施形態では、本開示のＩＬ−１２  ｐ３５は、
【０１２５】
【化９】
2021529199.tif 000010
のポリヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１２６】
一部の実施形態では、本開示のＩＬ−１２  ｐ３５は、
【０１２７】
【化１０】
2021529199.tif 000011
のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージの同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【０１２８】
本明細書で使用される場合、用語「ＩＬ−１２ｐ７０」とは、ｐ４０およびｐ３５と一般に称される２つのサブユニットを天然で有する、ＩＬ−１２タンパク質を指す。ＩＬ−１２ｐ７０という用語は、融合タンパク質がサブユニットの間にリンカーアミノ酸を含んでもよい、ＩＬ−１２の２つのサブユニット（ＩＬ−１２  ｐ４０およびＩＬ−１２  ｐ３５）を含む融合タンパク質を包含する。
【０１２９】
一実施形態では、組換えアデノウイルスベクターは、ウイルスベクター配列に加えて以下の例示的な調節エレメントを含有する：ヒトユビキチンＣプロモーター、ＥＭＣＶ由来内部リボソーム進入部位、６コピーのＧａｌ４結合部位、３コピーのＳＰ−１結合部位、および合成最小プロモーター配列を含有する誘導性プロモーター、ＳＶ４０ポリアデニル化部位、ならびにヒトアルファ−グロビン遺伝子に由来する転写終結配列。他の調節エレメントを代替物として使用することができることが理解されるべきである。
【０１３０】
一実施形態では、組換えアデノウイルスベクターＡｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２−イムノモジュレーターは、以下の様式で生産される。ＥＭＣＶ−ＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）によって隔てられた、受容体融合タンパク質、ＶＰ１６−ＲＸＲおよびＧａｌ４−ＥｃＲのコード配列を、ヒトユビキチンＣプロモーター（構成的プロモーター）の制御下でアデノウイルスシャトルベクター中に挿入する。続いて、ＩＲＥＳによって隔てられたｈＩＬ−１２のｐ４０およびｐ３５サブユニット、ならびに１つまたは複数の他のイムノモジュレーターのコード配列を、ユビキチンＣプロモーターおよび受容体配列の上流に挿入された６コピーのＧａｌ４結合部位を含有する合成誘導性プロモーターの制御下に置く。シャトルベクターは、左端からマップ単位１６（ｍｕ１６）まで、Ｅ１配列が欠失し、ＲＴＳにより置き換えられたアデノウイルス血清型５配列および１つまたは複数の他のイムノモジュレーター配列（ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２）を含有する。アクチベーター薬依存的ＩＬ−１２および他のイムノモジュレーターの発現のためのＨＴ−１０８０細胞中での一過的トランスフェクションにより、ＲＴＳ−ｈＩＬ１２−イムノモジュレーターを担持するシャトルベクターを試験する。次いで、ＨＥＫ２９３細胞中での同時トランスフェクションにより、シャトルベクターをアデノウイルス骨格で組み換えて、組換えアデノウイルスＡｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２−イムノモジュレーターを得る。アデノウイルス骨格は、ゲノムの左端およびＥ３遺伝子にｍｕ０〜９．２の配列欠失を含有する。シャトルベクターおよびアデノウイルス骨格は、それらの間の組換えおよび組換えアデノウイルスベクターの産生を可能にする、ｍｕ９．２からｍｕ１６までの重複配列を含有する。組換えアデノウイルスベクターはＥ１およびＥ３領域に欠損を有するため、ウイルスは、正常な哺乳動物細胞中では複製欠損である。しかしながら、ウイルスは、アデノウイルス−５のＥ１領域を担持し、したがって、Ｅ１機能をトランスに提供するＨＥＫ２９３細胞中で複製することができる。
【０１３１】
ある特定の実施形態では、Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ１２およびその成分は、
２００１年３月２１日に出願された国際公開第２００１／０７０８１６号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２００１／０９０５０）中の配列番号１〜６４；
２００２年２月２０日に出願された国際公開第２００２／０６６６１２号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２００２／００５０９０）中の配列番号１〜１１３；
２００２年２月２０日に出願された国際公開第２００２／０６６６１４号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２００２／００５７０６）中の配列番号１〜７５；
２００８年１０月８日に出願された国際公開第２００９／０４８５６０号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１１５６３）中の配列番号１〜８および１３；
２００９年１０月８日に出願された国際公開第２０１０／０４２１８９号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００５５１０）中の配列番号１〜２４および２９；ならびに
２０１１年３月２３日に出願された国際公開第２０１１／１１９７７３号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２９６８２）中の配列番号１〜６、２４〜２９、４７〜６２
に記載および開示されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列によってコードされる。上記の参照された刊行物のそれぞれにおける開示および配列表に由来する配列は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３２】
ＩＬ−１２の生物活性もまた周知であり、限定されるものではないが、ナイーブなＴ細胞のＴｈ１細胞への分化、Ｔ細胞の増殖および機能の刺激、Ｔおよびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞からのインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）および腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）の産生、ＩＦＮ−ガンマのＩＬ−４媒介性抑制の低減、ＮＫ細胞およびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞傷害活性の増強、ＩＬ−１２Ｒ−３１およびＩＬ−１２Ｒ−１３２の発現の刺激、ＭＨＣ  ＩおよびＩＩ分子の上方調節による腫瘍抗原の提示の容易化、ならびに抗血管新生活性が挙げられる。図２７は、上記のサイトカインカスケードの略図である。用語「ＩＬ−１２の機能を有するタンパク質」は、野生型ＩＬ−１２配列の突然変異体であって、野生型配列が、アミノ酸の１つまたは複数の付加、欠失、または置換によって変更された突然変異体、ならびにＩＬ−１２の１つまたは複数の生物活性を模倣する非ＩＬ−１２タンパク質を包含する。
【０１３３】
一実施形態では、ＶＰ１６−ＲＸＲとＧａｌ４−ＥｃＲのコード配列が、ＥＭＣＶ内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列によって隔てられており、ヒトユビキチンＣプロモーターの制御下でアデノウイルスシャトルベクター中に挿入された、遺伝子スイッチを含有する核酸アデノウイルスベクターが提供される。例えば、ＩＲＥＳ配列によって隔てられ、合成誘導性プロモーターの制御下に置かれた、ＩＬ−１２のｐ４０とｐ３５サブユニットのコード配列を、ユビキチンＣプロモーターの上流に挿入する。別の例では、合成誘導性プロモーターの制御下に置かれたＴＮＦ−アルファのコード配列を、ユビキチンＣプロモーターの上流に挿入する。
【０１３４】
別の実施形態では、本発明は、２つの融合タンパク質のための転写単位（ＶＰ１６−ＲＸＲおよびＧａｌ４−ＥｃＲ）ならびに大腸菌（E.coli）ＢＪ５１８３細胞中でアデノウイルス骨格（ＡｄＥａｓｙｌ）と組み換えられた誘導性ＩＬ−１２サブユニットを担持するシャトルベクターを提供する。組換えクローンを検証した後、ｒＡｄ．ＲｈｅｏＩＬ１２ゲノムを担持するプラスミドをＸＬ１０−Ｇｏｌｄ細胞中で増殖させ、それから精製し、プラスミド骨格から消化し、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞または他の好適な細胞株へのトランスフェクションによってパッケージングする。
【０１３５】
濃縮を増強するためのベクターの精製を、密度勾配精製（例えば、塩化セシウム（ＣｓＣｌ））またはクロマトグラフィー技術（例えば、カラムもしくはバッチクロマトグラフィー）などの任意の好適な方法によって達成することができる。例えば、本発明のベクターを、２回または３回のＣｓＣｌ密度勾配精製ステップにかけてもよい。ベクター、例えば、複製欠損アデノウイルスベクターは、望ましくは、アデノウイルスに感染した細胞を溶解すること、溶解物をクロマトグラフィー樹脂に加えること、クロマトグラフィー樹脂からアデノウイルスを溶出させること、およびアデノウイルスを含有する画分を収集することを含む方法を使用して、複製欠損アデノウイルスベクターに感染した細胞から精製される。
【０１３６】
特定の実施形態では、得られる一次ウイルスストックは、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞または他の好適な細胞株の再感染によって増幅され、ＣｓＣｌ密度勾配遠心分離または他の好適な精製法によって精製される。
【０１３７】
一実施形態では、ＩＬ−１２遺伝子は、野生型遺伝子配列である。別の実施形態では、ＩＬ−１２遺伝子は、改変された遺伝子配列、例えば、キメラ配列または好ましいコドンを使用するように改変されている配列である。
【０１３８】
一実施形態では、ＩＬ−１２遺伝子は、ヒト野生型配列である。別の実施形態では、配列は、野生型ヒト配列と少なくとも８５％同一、例えば、野生型ヒト配列と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一である。例えば、配列番号３および配列番号４を参照されたい。さらなる実施形態では、遺伝子配列は、ヒトポリペプチドをコードする。別の実施形態では、遺伝子は、野生型ヒトポリペプチドと少なくとも８５％同一、例えば、野生型ヒトポリペプチドと少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるポリペプチドをコードする。例えば、配列番号７および配列番号８を参照されたい。
【０１３９】
一実施形態では、ＩＬ−１２遺伝子は、野生型マウスＩＬ−１２配列である。別の実施形態では、配列は、野生型マウスＩＬ−１２と少なくとも８５％同一、例えば、野生型マウスＩＬ−１２と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一である。例えば、配列番号１および配列番号２を参照されたい。さらなる実施形態では、ＩＬ−１２遺伝子配列は、マウスＩＬ−１２ポリペプチドをコードする。別の実施形態では、遺伝子は、野生型マウスＩＬ−１２と少なくとも８５％同一、例えば、野生型マウスＩＬ−１２と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるポリペプチドをコードする。例えば、配列番号５および配列番号６を参照されたい。
【０１４０】
免疫モジュレーター
「免疫モジュレーター」は、Ｔ細胞などの免疫系の細胞、および一部のがん細胞の変化を誘導する、増幅させる、減弱させる、または防止する、薬物（限定されるものではないが、抗体（免疫グロブリン）および他のタンパク質などの高分子もしくは低分子）、ワクチンまたは細胞療法の型である。免疫モジュレーターの非限定例は、表１０に示される。免疫モジュレーターを、単独で、または他の化合物と共に使用して、がんを処置することができる。
【０１４１】
【表１−１】
2021529199.tif 000012
【０１４２】
【表１−２】
2021529199.tif 000013
【０１４３】
【表１−３】
2021529199.tif 000014
【０１４４】
免疫モジュレーターは、例えば、免疫チェックポイント阻害剤、ワクチン、Ｔ細胞および／もしくはＮＫ細胞を刺激する分子、サイトカイン、抗原特異的結合剤、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、導入されたキメラ抗原受容体を発現する細胞または導入されたＴ細胞受容体を発現する細胞である。他の関連する免疫モジュレーターとしては、化学療法または放射線が挙げられる。
【０１４５】
「免疫チェックポイント阻害剤」は、Ｔ細胞などの一部の型の免疫系細胞、および一部のがん細胞によって作られるある特定のタンパク質を遮断する薬物（限定されるものではないが、抗体（免疫グロブリン）および他のタンパク質を含む高分子または低分子）の型である。これらのタンパク質は、免疫応答を抑制し、Ｔ細胞ががん細胞を殺傷するのを制限または防止するのを助ける。これらのタンパク質が遮断された場合、免疫系に対する分子「ブレーキ」が開放され、Ｔ細胞はより良好に（すなわち、より効率的に）がん細胞を殺傷することができる。Ｔ細胞またはがん細胞上に見出されるチェックポイントタンパク質の例としては、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１およびＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／Ｂ７−２が挙げられる。免疫チェックポイント阻害剤を、単独で、または他の化合物と共に使用して、がんを処置することができる。
【０１４６】
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、例えば、ＰＤ−１結合剤、ＰＤ−Ｌ１結合剤、ＣＴＬＡ−４結合剤、Ｔ細胞活性化のＶドメイン免疫グロブリン抑制因子（ＶＩＳＴＡ）結合剤、ＴＩＭ−３結合剤、ＴＩＭ−３リガンド結合剤、ＬＡＧ−３結合剤、ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを含むＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）結合剤、ＢおよびＴ細胞アテニュエータ−（ＢＴＬＡ）結合剤、Ｂ７−Ｈ３結合剤、ＴＧＦベータとＰＤ−Ｌ１との二重特異性結合剤またはＰＤ−Ｌ１とＢ７．１との二重特異性結合剤である。
【０１４７】
一部の実施形態では、ＰＤ−１結合剤は、ＰＤ−１に特異的に結合する抗体である。一部の実施形態では、ＰＤ−１結合剤は、アンタゴニストである。一部の実施形態では、ＰＤ−１に結合する抗体は、Ｍｅｒｃｋによって開発されたペンブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ、ＭＫ−３４７５；ＣＡＳ番号１３７４８５３−９１−４）、Ｃｕｒｅｔｅｃｈ  Ｌｔｄ．によって開発されたピジリズマブ（ＣＴ−０１１；ＣＡＳ番号１０３６７３０−４２−３）、Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒ  Ｓｑｕｉｂｂによって開発されたニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ、ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ−１１０６；ＣＡＳ番号９４６４１４−９４−４）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｎｃａ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅによって開発されたＭＥＤＩ０６８０（ＡＭＰ−５１４）、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発されたセミプリマブ−ｒｗｌｃ（ＲＥＧＮ２８１０、ＬＩＢＴＡＹＯ（登録商標）、ＣＡＳ番号１８０１３４２−６０−８）、ＢｅｉＧｅｎｅ  Ｌｔｄ．によって開発されたＢＧＢ−Ａ３１７、Ｎｏｖａｒｔｉｓによって開発されたスパルタリズマブ（ＰＤＲ−００１；ＣＡＳ番号１９３５６９４−８８−４）、またはＳｏｒｒｅｎｔｏ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによって開発されたＳＴＩ−Ａ１１１０である。一部の実施形態では、ＰＤ−１に結合する抗体は、国際公開第２０１４／１７９６６４号パンフレットに記載されており、例えば、Ａｎａｐｔｙｓｂｉｏによって開発されたＡＰＥ２０５８、ＡＰＥ１９２２、ＡＰＥ１９２３、ＡＰＥ１９２４、ＡＰＥ１９５０、もしくはＡＰＥ１９６３として同定された抗体、またはこれらの抗体のいずれかのＣＤＲ領域を含有する抗体である。他の実施形態では、ＰＤ−１結合剤は、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２の細胞外ドメインを含む融合タンパク質、例えば、ＡＭＰ−２２４（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）である。他の実施形態では、ＰＤ−１結合剤は、ペプチド阻害剤、例えば、Ａｕｒｉｇｅｎｅによって開発されたＡＵＮＰ−１２である。
【０１４８】
ニボルマブ重鎖配列：
【０１４９】
【化１１】
2021529199.tif 000015
【０１５０】
ニボルマブ軽鎖配列：
【０１５１】
【化１２】
2021529199.tif 000016
【０１５２】
WHO Drug Information, "International Nonproprietary Names for Pharmaceutical Substances (INN)", Vol. 26, No. 2, 2012を参照されたい。
【０１５３】
一部の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１結合剤は、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗体である。一部の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１結合剤は、アンタゴニストである。一部の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによって開発されたアテゾリズマブ（ＲＧ７４４６、ＭＰＤＬ３２８０Ａ；Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ；ＣＡＳ番号１３８０７２３−４４−３）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅによって開発されたデュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６、ＩＭＦＩＮＺＩ（登録商標）、ＣＡＳ番号１４２８９３５−６０−７）、Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂによって開発されたＢＭＳ−９３６５５９（ＭＤＸ−１１０５）、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ；Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ；Ｂａｖｅｎｃｉｏ；ＣＡＳ番号１５３７０３２−８２−８）、ＫＤ０３３（Ｋａｄｍｏｎ）、ＫＤ０３３の抗体部分、ＳＴＩ−Ａ  １０１４（Ｓｏｒｒｅｎｔｏ  Ｔｈｅｒｐｅｕｔｉｃｓ）またはＣＫ−３０１（Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）である。一部の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体は、国際公開第２０１４／０５５８９７号パンフレットに記載されており、例えば、Ａｂ−１４、Ａｂ−１６、Ａｂ−３０、Ａｂ−３１、Ａｂ−４２、Ａｂ−５０、Ａｂ−５２、もしくはＡｂ−５５、またはこれらの抗体のいずれかのＣＤＲ領域を含有する抗体である。
【０１５４】
一部の実施形態では、ＣＴＬＡ−４結合剤は、ＣＴＬＡ−４に特異的に結合する抗体である。一部の実施形態では、ＣＴＬＡ−４結合剤は、アンタゴニストである。一部の実施形態では、ＣＴＬＡ−４に結合する抗体は、Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂによって開発されたイピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ）またはＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／ＡｓｔｒａＺｅｎｉｃａ、次いで、Ｐｆｉｚｅｒによって開発されたトレメリムマブ（ＣＰ−６７５，２０６）である。一部の実施形態では、ＣＴＬＡ−４結合剤は、拮抗作用性ＣＴＬＡ−４融合タンパク質または可溶性ＣＴＬＡ−４受容体、例えば、Ｋａｈｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｔｄ．によって開発されたＫＡＨＲ−１０２である。
【０１５５】
一部の実施形態では、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）結合剤は、アンチカリンなどの結合分子である。一部の実施形態では、４１−ＢＢ結合剤は、アゴニストである。一部の実施形態では、アンチカリンは、ＰＲＳ−３４３（Ｐｉｅｒｉｓ  ＡＧ）である。一部の実施形態では、４−１ＢＢ結合剤は、４−１ＢＢに特異的に結合するアゴニスト抗体である。一部の実施形態では、４−１ＢＢに結合する抗体は、Ｐｆｉｚｅｒによって開発されたＰＦ−２５６６（ＰＦ−０５０８２５６６）またはＢｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂによって開発されたウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３）である。
【０１５６】
一部の実施形態では、ＬＡＧ３結合剤は、ＬＡＧ３に特異的に結合する抗体である。一部の実施形態では、ＬＡＧ３結合剤は、アンタゴニストである。一部の実施形態では、ＬＡＧ３に結合する抗体は、Ｐｒｉｍａ  ＢｉｏＭｅｄによって開発されたＩＭＰ７０１、Ｐｒｉｍａ  ＢｉｏＭｅｄ／ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅによって開発されたＩＭＰ７３１、Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂによって開発されたＢＭＳ−９８６０１６、Ｎｏｖａｒｔｉｓによって開発されたＬＡＧ５２５、およびＧｌａｘｏ  ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅによって開発されたＧＳＫ２８３１７８１である。一部の実施形態では、ＬＡＧ−３アンタゴニストは、可溶性ＬＡＧ−３受容体、例えば、Ｐｒｉｍａ  ＢｉｏＭｅｄによって開発されたＩＭＰ３２１を含む。
【０１５７】
一部の実施形態では、ＫＩＲ結合剤は、ＫＩＲに特異的に結合する抗体である。一部の実施形態では、ＫＩＲ結合剤は、アンタゴニストである。一部の実施形態では、ＫＩＲに結合する抗体は、Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ／Ｉｎｎａｔｅ  Ｐｈａｒｍａによって開発されたリリルマブである。
【０１５８】
一部の実施形態では、ＩＬ−１２の制御された発現と、限定されるものではないが、ＰＤ−１特異的抗体（例えば、ニボルマブ）などのチェックポイント阻害剤との組合せは、限定されるものではないが、脳のがん（例えば、グリオーマ／神経膠芽腫）などのがんの処置の改善を提供し、ＩＬ−１２は、Ｔ細胞（キラーＴ細胞など）の腫瘍への治療的に有効な動員および浸潤を提供するが、チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ−１抗体）は、腫瘍内での免疫細胞の機能および活性の増強および／または改善（すなわち、抗腫瘍免疫細胞活性の改善）を提供する。
【０１５９】
一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤の投与と共に、本発明の方法はまた、ＩＬ−１２のリガンド誘導性遺伝子スイッチにより制御される発現を行うことができるアデノウイルスの投与も含み、アデノウイルスは腫瘍内に、または腫瘍の近くに（例えば、隣接して）投与される。
【０１６０】
一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤の投与と共に、本発明の方法はまた、ＩＬ−１２のリガンド誘導性遺伝子スイッチにより制御される発現を行うことができるアデノウイルスの投与も含み、アデノウイルスは、定位固定送達により、腫瘍内に、または腫瘍の近くに（例えば、隣接して）投与される。
【０１６１】
処置方法
様々な態様では、本発明は、治療有効量の本明細書に記載のＡｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ１２ウイルスベクターを、それを必要とする対象に投与することによって、対象におけるがんを防止する、その進行を遅延させる、処置する、その症状を軽減する、またはそうでなければ改善する方法を提供する。
【０１６２】
本発明の治療方法は、ポリヌクレオチド、例えば、Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ１２の、対象へのｉｎ  ｖｉｖｏでの導入を含む。ポリヌクレオチドを、全身的または局部的に対象に導入することができる。例えば、ポリヌクレオチドは、腫瘍部位で腫瘍内に、または腫瘍と関連するリンパ節に導入される。
【０１６３】
Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ１２ウイルスベクターの有効量は、約１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、または１×１０１２、または２×１０１２個のウイルス粒子（ｖｐ）の単位用量である。好ましくは、ウイルスベクターは、２×１０１１ｖｐの単位用量で投与される。
【０１６４】
一部の事例では、ベクターを、注入により送達することができる。一部の事例では、腫瘍、腫瘍部位またはリンパ節への直接投与は、注射筒による液体医薬組成物の注入を含む。別の例では、直接投与は、カニューレまたはベクターの送達のための他の好適な器具による注入を含んでもよい。他の例では、直接投与は、ＩＬ−１２などの導入遺伝子の送達のための好適なベクターをさらに含む埋込み体を含んでもよい。一部の事例では、埋込み体を、腫瘍中に、またはその近くに直接埋め込んでもよい。
【０１６５】
Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ１２ウイルスベクターは、単回投与または複数回投与、例えば、２、３、４回以上の投与として投与される。
【０１６６】
本発明の方法に従って処置することができるがんは、原発性、進行性、転移性または再発性腫瘍を含む。好ましくは、腫瘍は、固形腫瘍である。がんとしては、例えば、中枢神経系の腫瘍、グリオーマ腫瘍、腎がん腫瘍、卵巣がん腫瘍、頭頸部がん腫瘍、肝臓がん腫瘍、膵がん腫瘍、胃がん腫瘍、食道がん腫瘍、膀胱がん腫瘍、子宮がん腫瘍、腎盂がん腫瘍、尿路上皮細胞がん腫瘍、泌尿生殖器がん腫瘍、子宮頸がん腫瘍、子宮内膜がん腫瘍、陰茎がん腫瘍、甲状腺がん腫瘍、または前立腺がん腫瘍、乳がん腫瘍、メラノーマ腫瘍、グリオーマ腫瘍、結腸がん腫瘍、肺がん腫瘍、肉腫がん腫瘍、または扁平上皮がん腫瘍、または前立腺がん腫瘍が挙げられる。
【０１６７】
中枢神経系の腫瘍としては、例えば、脊索腫、頭蓋咽頭腫、神経節細胞腫、頸静脈グロムス腫瘍、髄膜腫、松果体細胞腫、松果体芽細胞腫、下垂体腺腫、グリオーマ、星状細胞腫、毛様細胞性星状細胞腫、「びまん性」星状細胞腫、未分化星状細胞腫、上衣腫、未分化上衣腫、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）、髄芽腫、乏突起神経膠腫 、純粋乏突起神経膠腫 、未分化乏突起神経膠腫 、未分化乏突起星状細胞腫神経節膠腫、聴神経腫（シュワン腫）、前庭シュワン腫、脳転移、脈絡叢癌、胚芽腫、生殖細胞腫瘍、胚芽異形成性神経上皮腫瘍（ＤＮＥＴ）、絨毛癌、奇形腫、卵黄嚢腫瘍（内胚葉洞腫瘍）、原発性ＣＮＳリンパ腫、血管芽細胞腫、ラブドイド腫瘍、グリオーマ、アデノーマ、芽細胞腫、癌腫、肉腫、松果体腫瘍、髄芽腫、髄様上皮腫、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍（ＡＴＲＴ）、毛様細胞性星状細胞腫、上衣下巨細胞性星状細胞腫（ＳＥＧＡ）、びまん性星状細胞腫、多形黄色星細胞腫（ＰＸＡ）、視神経膠腫、脳幹神経膠腫、局在性脳幹神経膠腫、びまん性正中神経膠腫、びまん性内在性橋膠腫（ＤＩＰＧ）、正中腫瘍、神経節膠腫、頭蓋咽頭腫、松果体部腫瘍、神経膠芽腫、未分化星状細胞腫、多層性ロゼットを有する胚芽腫、未分化神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ）、松果体芽細胞腫、胚細胞腫、脈絡叢乳頭腫、脈絡叢癌、聴神経腫、神経芽細胞腫、下垂体部腫瘍、高悪性度グリオーマ、髄芽腫（ＭＢ）、神経芽細胞腫（ＮＢ）、ユーイング肉腫（ＥＷＳ）または骨肉腫が挙げられる。
【０１６８】
一実施形態では、本発明の方法は、限定されるものではないが、悪性グリオーマ、原発性神経膠芽腫、再発性神経膠芽腫、進行性神経膠芽腫、またはびまん性内在性橋膠腫（ＤＩＰＧ）およびびまん性正中神経膠腫腫瘍（例えば、視床、脳幹または脊髄における）などの脳のがんを処置するために使用される。
【０１６９】
一部の態様では、本発明の方法を使用して、脳または中枢神経系の他の場所（例えば、軟髄膜または脊髄）に転移するがんを処置することができる。
【０１７０】
他の態様では、本発明の方法を使用して、再発性神経膠芽腫、進行性神経膠芽腫、または悪性グリオーマを処置することができる。
【０１７１】
ポリヌクレオチドによるポリペプチド（例えば、ＩＬ−１２）の発現は、本明細書に記載のリガンドの対象への投与によって誘導される。
【０１７２】
リガンドを、任意の好適な方法によって、全身的（例えば、経口的、静脈内的）に、または局部的（例えば、腹腔内、髄腔内、脳室内、疾患または障害が起こっている組織または臓器への直接注入）に投与することができる。好ましくは、リガンドは、経口的に投与される。
【０１７３】
リガンドは、約１ｍｇ〜約１２０ｍｇの単位日用量で投与される。例えば、リガンドは、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または１２０ｍｇの単位日用量で投与される。一部の実施形態では、リガンドは、約５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、または２０ｍｇの単位日用量で投与される。
【０１７４】
リガンドは、１日１回、１日２回または１日置きに投与される。
【０１７５】
必要に応じて、対象は、本明細書に記載の１つまたは複数の免疫モジュレーターを投与される。免疫モジュレーターは、経口的または非経口的に投与される。例えば、免疫モジュレーターは、静脈内投与される。免疫モジュレーターは、特定の免疫モジュレーターについて当業界で公知の用量で投与される。例えば、免疫モジュレーターは、ＦＤＡに認可された用量で投与される。
【０１７６】
好ましい方法では、免疫モジュレーターは、ＰＤ−１結合剤などのチェックポイント阻害剤である。例えば、ＰＤ−１結合剤は、ＰＤ−１抗体である。
【０１７７】
ＰＤ−１抗体は、ニボルマブ（ＭＤＸ１１０６）であり、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約７ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。例えば、ニボルマブは、約０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ以上の用量で投与される。
【０１７８】
あるいは、ニボルマブは、約２００ｍｇ〜約５００ｍｇの一律用量で投与される。例えば、一律用量は、２４０ｍｇまたは４８０ｍｇである。
【０１７９】
ＰＤ１−１抗体は、セミプリマブ−ｒｗｌｃ（ＲＥＧＮ−２８１０）であり、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約６ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。例えば、セミプリマブ−ｒｗｌｃは、約０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ以上の用量で投与される。さらなる実施形態では、方法は、必要に応じて、例えば、デキサメタゾンなどのコルチコステロイドを対象に投与することを含む。一部の態様では、コルチコステロイドは、リガンドの投与中に投与される。リガンドの投与中のコルチコステロイドの累積用量は、約５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇまたは３０ｍｇ未満であるか、またはそれに等しい。好ましくは、累積用量は、２０ｍｇ未満であるか、またはそれに等しい。
【０１８０】
コルチコステロイドは、経口的または非経口的に投与される。例えば、コルチコステロイドは、静脈内投与される。
【０１８１】
必要に応じて、血管増殖阻害剤が対象に投与される。例えば、血管増殖阻害剤は、ベバシズマブである。一部の実施形態では、ベバシズマブは、１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される。
【０１８２】
用語「対象」または「個体」または「患者」は、疾患もしくは障害を有するか、または疾患もしくは障害を有すると疑われる個体などを参照して本明細書で使用される。対象、個体または患者は、本開示では互換的に使用することができ、哺乳動物および非哺乳動物を包含する。対象は、小児患者または成人患者である。
【０１８３】
哺乳動物の例としては、限定されるものではないが、哺乳動物クラスの任意のメンバー：ヒト、チンパンジー、および他の類人猿およびサル種などの非ヒト霊長類；ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの農業用動物；ウサギ、イヌ、およびネコなどの家庭用動物；ラット、マウスおよびモルモットなどの齧歯類を含む実験動物が挙げられる。非哺乳動物の例としては、限定されるものではないが、鳥類、魚類などが挙げられる。本明細書で提供される方法および組成物の一部の態様では、哺乳動物はヒトである。
【０１８４】
対象は、コルチコステロイドを以前に投与されたことがない。あるいは、対象は、コルチコステロイドを以前に投与されたことがある。例えば、リガンドの投与前の４週間以内に、コルチコステロイドを以前に投与されたことがない。あるいは、対象は、リガンドの投与前の４週間以内に、コルチコステロイドを投与されたことがある。
【０１８５】
投薬レジメン
本発明は、Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ１２ベクター、リガンド（例えば、ベレジメクス）および必要に応じて、免疫モジュレーター（「治療化合物」）を用いて、がんを有する対象を処置するための投薬レジメンを提供する。（「治療化合物」）の用量は、上記されている。
【０１８６】
ベクターの初期用量およびリガンドの初期用量は、同時に、または逐次的に投与される。例えば、リガンドの初期用量は、ベクターの初期用量の一定期間後に投与される。あるいは、リガンドの初期用量は、ベクターの初期用量の一定期間前に投与される。一部の実施形態では、リガンドの初期用量は、ベクターの投与の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２時間前に投与される。一部の実施形態では、リガンドの１つまたは複数のその後の用量は、リガンドの初期用量の投与後、１日１回投与される。他の実施形態では、リガンドの１つまたは複数のその後の用量は、リガンドの初期用量の投与後、３〜２８日にわたって１日１回投与される。例えば、リガンドのその後の１日用量は、リガンドの初期用量の投与後、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８日以上にわたって投与される。好ましくは、リガンドは、リガンドの初期用量の投与後、１４日にわたって毎日投与される。一部の実施形態では、コルチコステロイドは、リガンドの処置期間中に対象にさらに投与される。
【０１８７】
血管増殖阻害剤は、リガンドの処置期間の前に投与される。例えば、１、２、３、４、５、６以上の用量の血管増殖阻害剤が、リガンドの処置期間の前に投与される。好ましくは、投与される１、２または３用量の血管増殖阻害剤が、リガンドの処置期間の前に投与される。
【０１８８】
ベクターの初期用量および免疫モジュレーターの初期用量は、同時に、または逐次的に投与される。例えば、ベクターの初期用量は、免疫モジュレーターの初期用量の一定期間後に投与される。あるいは、ベクターの初期用量は、免疫モジュレーターの初期用量の一定期間前に投与される。一部の実施形態では、免疫モジュレーターの初期用量は、ベクターの投与の約１、２、３、４、５、６、７日以上前に投与される。一部の実施形態では、免疫モジュレーターの１つまたは複数のその後の用量は、ベクターの初期用量の投与後に投与される。例えば、免疫モジュレーターの１つまたは複数のその後の用量は、ベクターの投与後、７〜２８日以内に投与される。一部の実施形態では、免疫モジュレーターの１つまたは複数のその後の用量は、ベクターの投与の少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８日以上後に投与される。好ましくは、免疫モジュレーターのその後の用量の１つは、ベクターの投与の１５日後に投与される。
【０１８９】
他の実施形態では、免疫モジュレーターのその後の用量は、免疫モジュレーターの第１のその後の用量後、１、２、３または４週毎に１回投与される。好ましくは、免疫モジュレーターのその後の用量は、免疫モジュレーターの第１のその後の用量後、２週毎に１回または４週毎に１回投与される。
【０１９０】
医薬組成物
本明細書に記載のウイルスベクター、リガンド、免疫モジュレーターおよびコルチコステロイド（本明細書では「治療化合物」とも称される）を、投与にとって好適な医薬組成物に組み込むことができる。そのような組成物は、典型的には、治療化合物と、薬学的に許容される担体とを含む。本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」は、薬学的投与と適合する、任意かつ全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むことが意図される。好適な担体は、当該分野における標準的な参考書である、Remington’s Pharmaceutical Sciencesの最新版に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。そのような担体または希釈剤の好適な例としては、限定されるものではないが、水、食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。リポソームおよび非水性ビヒクル、例えば、固定油を使用することもできる。薬学的活性物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当業界で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、組成物中でのその使用が企図される。また、補助活性化合物を組成物中に含有させることもできる。
【０１９１】
本開示の医薬組成物は、その意図される投与経路と適合するように製剤化される。投与経路の例としては、非経口（例えば、静脈内、皮内、皮下）、経口（吸入を含む）、局所（すなわち、経皮）、経粘膜、または直腸投与が挙げられる。非経口、皮内、または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分：滅菌希釈剤、例えば、注射用水、食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗細菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；緩衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩、および等張性の調整のための薬剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロースを含んでもよい。ｐＨを、酸または塩基、例えば、塩酸または水酸化ナトリウムを用いて調整することができる。非経口調製物を、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射筒または複数用量バイアルに封入することができる。
【０１９２】
注入可能な使用にとって好適な医薬組成物としては、滅菌水性溶液（水溶性の場合）または分散体および滅菌注射溶液または分散体の即興的調製のための滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与については、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ；Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は、無菌でなければならず、容易な注射針通過性が存在する程度に流体であるべきである。それは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および菌類などの微生物の汚染作用に対して保存しなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、ならびにその好適な混合物を含有する、溶媒または分散媒体であってもよい。例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散体の場合、必要とされる粒径の維持により、および界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。微生物の作用の防止を、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。一部の実施形態では、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、塩化ナトリウムを組成物中に含有させることが好ましい。組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含有させることによって、注入可能組成物の長期的吸収をもたらすことができる。
【０１９３】
必要に応じて、上に列挙された成分の１つまたは組合せと共に、適切な溶媒中に、必要な量の治療化合物を含有させた後、滅菌濾過を行うことによって、滅菌注入可能溶液を調製することができる。一般に、分散体は、活性化合物を、基本分散媒体および上に列挙されたものに由来する必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に含有させることによって調製される。滅菌注入可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法は、活性成分と、その予め滅菌濾過された溶液に由来するさらなる所望の成分との粉末を得る、減圧乾燥および凍結乾燥である。
【０１９４】
経口組成物は一般に、不活性希釈剤または食用担体を含む。それらを、ゼラチンカプセルに封入するか、または錠剤中に圧縮することができる。経口治療剤投与のために、活性化合物を、賦形剤と共に含有させ、錠剤、トローチ剤、またはカプセルの形態で使用することができる。経口組成物を、液体担体中の化合物を経口的に適用し、口の中で回し、はき出す、または嚥下する、洗口液としての使用のための液体担体を使用して調製することもできる。薬学的に適合する結合剤、および／またはアジュバント材料を、組成物の一部として含有させることができる。錠剤、ピル剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分のいずれか、または類似する性質の化合物：微結晶性セルロース、トラガカントゴムもしくはゼラチンなどの結合剤；スターチもしくはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、もしくはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはＳｔｅｒｏｔｅなどの滑沢剤；コロイド性二酸化ケイ素などの流動促進剤；スクロースもしくはサッカリンなどの甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香料などの香味剤を含有してもよい。
【０１９５】
吸入による投与のために、治療化合物は、好適な推進剤、例えば、二酸化炭素などの気体を含有する、加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーから、エアロゾルスプレーの形態で送達される。
【０１９６】
また、全身投与は、経粘膜または経皮手段によるものであってもよい。経粘膜または経皮投与のために、バリアを透過させるのに好適な浸透剤が、製剤中で使用される。そのような浸透剤は、当業界で一般に公知であり、例えば、経粘膜投与のための、界面活性剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与を、鼻スプレーまたは坐剤の使用によって達成することができる。経皮投与のために、活性化合物は、当業界で一般に公知の軟膏剤、軟膏、ゲル、またはクリーム中で製剤化される。
【０１９７】
治療化合物を、直腸送達のために坐剤（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を用いる）、または停留浣腸の形態で調製することもできる。
【０１９８】
一実施形態では、活性化合物は、埋込み体およびマイクロカプセル送達系を含む、制御放出製剤などの、身体からの迅速な除去に対して化合物を保護する担体を用いて調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの、生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤の調製のための方法は、当業者には明らかであろう。材料を、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手することもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体と共に、感染細胞を標的とするリポソームを含む）を、薬学的に許容される担体として使用することもできる。これらのものを、当業者には公知の、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号明細書に記載の方法に従って調製することができる。
【０１９９】
投与の容易性および用量の均一性のために単位剤形中で経口または非経口組成物を製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される場合、単位剤形とは、治療しようとする対象のための単一の用量として適した物理的に個別の単位を指す；それぞれの単位は、必要とされる薬学的担体と共に所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の治療化合物を含有する。本開示の単位剤形のための明細は、治療化合物の独特の特徴および達成しようとする特定の治療効果、ならびに個体の処置のためのそのような治療化合物を組み合わせる当業界において固有の制限によって決定され、それらに直接依存する。
【０２００】
医薬組成物を、投与のための指示書と共に、容器、パック、またはディスペンサー中に含有させることができる。
【０２０１】
定義
別途定義されない限り、本発明に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によって別途要求されない限り、単数形の用語は、複数を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴまたはポリヌクレオチド化学ならびにハイブリダイゼーションと関連して使用される命名法、およびそれらの技術は、周知のものであり、当業界で一般的に使用されている。組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）のための標準的な技術が使用される。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様書に従って、または当業界で一般的に達成されるように、または本明細書に記載のように実施される。前記技術および手順は一般に、当業界で周知の従来の方法に従って、ならびに本明細書を通して引用および考察される様々な一般的な、より特定の参考文献に記載されたように実施される。例えば、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))を参照されたい。本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品化学および薬化学と関連して使用される命名法、ならびにそれらの実験手順および技術は、当業界で周知であり、一般的に使用されているものである。化学合成、化学分析、医薬品調製、製剤化、および送達、ならびに患者の処置のための標準的な技術が使用される。
【０２０２】
本発明の目的のための用語「単離された」は、その元の環境(それが天然に存在する環境)から取り出された生物材料(細胞、核酸またはタンパク質)を指す。例えば、植物または動物中に天然状態で存在するポリヌクレオチドは単離されていないが、天然に存在する隣接する核酸から分離された同じポリヌクレオチドは、「単離された」とされる。
【０２０３】
生物材料に適用される場合の用語「精製された」は、その材料が、他の化合物の存在を含まない、絶対的な純度を示す形態で存在することを必要としない。それはむしろ、相対的な定義である。
【０２０４】
「核酸」、「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、および「ポリヌクレオチド」は、互換的に使用され、一本鎖形態、または二本鎖らせんのいずれかの、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンもしくはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、もしくはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステルポリマー形態、またはホスホロチオエートおよびチオエステルなどのその任意のホスホエステルアナログを指す。二本鎖のＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡらせんがあり得る。核酸分子、特に、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子という用語は、その分子の一次および二次構造のみを指し、それを任意の特定の三次形態に限定するものではない。かくして、この用語は、特に、線状または環状ＤＮＡ分子（例えば、制限断片）、プラスミド、スーパーコイルＤＮＡおよび染色体に認められる、二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を考察する際に、配列を、転写されないＤＮＡ鎖と共に５’から３’の方向の配列のみ（すなわち、ｍＲＮＡと相同な配列を有する鎖）を与える通常の慣例に従って本明細書に記載することができる。「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的操作を受けたＤＮＡ分子である。ＤＮＡとしては、限定されるものではないが、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、合成ＤＮＡ、および半合成ＤＮＡが挙げられる。
【０２０５】
ポリヌクレオチド配列に適用される場合の用語「断片」とは、参照核酸と比較して減少した長さのヌクレオチド配列を指し、共通の位置にわたって、参照核酸と同一のヌクレオチド配列を含む。本発明によるそのような核酸断片は、必要に応じて、それが構成要素であるより大きなポリヌクレオチドに含まれていてもよい。そのような断片は、本発明による核酸の少なくとも６、８、９、１０、１２、１５、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３９、４０、４２、４５、４８、５０、５１、５４、５７、６０、６３、６６、７０、７５、７８、８０、９０、１００、１０５、１２０、１３５、１５０、２００、３００、５００、７２０、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００個の、またはそれより多い連続するヌクレオチドに由来する長さの範囲のオリゴヌクレオチドを含む、またはあるいは、それからなる。
【０２０６】
本明細書で使用される場合、「単離された核酸断片」とは、必要に応じて、合成の、非天然の、または変更されたヌクレオチド塩基を含有する、一本鎖または二本鎖である、ＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを指す。ＤＮＡのポリマーの形態の単離された核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つまたは複数のセグメントを含んでもよい。
【０２０７】
「遺伝子」とは、転写のみ（例えば、生物活性ＲＮＡ種）または転写と翻訳（例えば、ポリペプチド）によって産生される機能的分子を含む、機能的分子をコードするヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを指す。用語「遺伝子」は、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ核酸を包含する。「遺伝子」はまた、コード配列の前（５’非コード配列）および後（３’非コード配列）の調節配列を含む、特定のＲＮＡ、タンパク質またはポリペプチドを発現する核酸断片を指す。「天然遺伝子」とは、それ自身の調節配列と共に天然に見出される遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」とは、天然では一緒に見出されない調節および／またはコード配列を含む、天然遺伝子ではない任意の遺伝子を指す。したがって、キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ供給源に由来するが、天然に見出されるものとは異なる様式で配置された調節配列およびコード配列を含んでもよい。キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来するコード配列および／または異なる供給源に由来する調節配列を含んでもよい。「内因性遺伝子」とは、生物のゲノム中のその天然の位置にある天然遺伝子を指す。「外来」遺伝子または「異種」遺伝子とは、宿主生物中には通常見出されないが、遺伝子導入によって宿主生物中に導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は、非天然生物に挿入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含んでもよい。「導入遺伝子」は、形質転換手順によってゲノムに導入された遺伝子である。例えば、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）遺伝子は、ＥＬ−１２タンパク質をコードする。ＩＬ−１２は、ジスルフィド結合を介して連結された３５ｋＤのサブユニット（ｐ３５）と４０ｋＤのサブユニット（ｐ４０）とのヘテロ二量体であり、完全に機能的なＩＬ−１２ｐ７０を作る。ＩＬ−１２遺伝子は、ｐ３５サブユニットとｐ４０サブユニットとの両方をコードする。
【０２０８】
「異種ＤＮＡ」とは、細胞、または細胞の染色体部位には天然に位置しないＤＮＡを指す。異種ＤＮＡは、細胞にとって外来の遺伝子を含んでもよい。
【０２０９】
用語「ゲノム」は、染色体ならびにミトコンドリア、葉緑体およびウイルスのＤＮＡまたはＲＮＡを含む。用語「プローブ」とは、相補的一本鎖標的核酸と塩基対を形成して、二本鎖分子を形成することができる一本鎖核酸分子を指す。
【０２１０】
本明細書で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」とは、ゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、プラスミドＤＮＡまたはｍＲＮＡ分子にハイブリダイズし得る短い核酸を指す。オリゴヌクレオチドを、例えば、Ｐ−ヌクレオチドまたはビオチンなどの標識が共有的にコンジュゲートされたヌクレオチドで標識することができる。標識されたオリゴヌクレオチドを、核酸の存在を検出するためのプローブとして使用することができる。オリゴヌクレオチド（標識することができる一方または両方）を、ＤＮＡ配列決定のために、核酸の完全長もしくは断片をクローニングするため、または核酸の存在を検出するための、ＰＣＲプライマーとして使用することができる。オリゴヌクレオチドを使用して、ＤＮＡ分子との三重らせんを形成させることもできる。一般に、オリゴヌクレオチドは、好ましくは、核酸合成装置上で合成的に調製される。したがって、オリゴヌクレオチドを、チオエステル結合などの、天然には存在しないホスホエステルアナログ結合を用いて調製することができる。
【０２１１】
「プライマー」は、標的核酸配列にハイブリダイズして、好適な条件下でのＤＮＡ合成のための開始点として役立ち得る二本鎖核酸領域を創出するオリゴヌクレオチドを指す。そのようなプライマーを、ポリメラーゼ連鎖反応において、またはＤＮＡ配列決定のために使用することができる。
【０２１２】
「ポリメラーゼ連鎖反応」は、ＰＣＲと省略され、特定の核酸配列を酵素的に増幅させるためのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法を指す。ＰＣＲは、各サイクルが、３つの段階：標的分子の鎖を分離するための鋳型核酸の変性、一本鎖ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーの鋳型核酸へのアニーリング、およびＤＮＡポリメラーゼによるアニーリングしたプライマーの伸長を含む、温度サイクルの反復的連続を含む。ＰＣＲは、標的分子の存在を検出し、定量的または半定量的条件下で、核酸の出発プール内のその標的分子の相対量を決定するための手段を提供する。
【０２１３】
「逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応」は、ＲＴ−ＰＣＲと省略され、標的ｃＤＮＡ分子または複数の分子を、ＲＮＡ分子または複数の分子から酵素的に産生した後、上記の標的ｃＤＮＡ分子または複数の分子内の特定の核酸配列または複数の配列を酵素的に増幅させるためのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法を指す。ＲＴ-ＰＣＲは、また、標的分子の存在を検出し、定量的または半定量的条件下で、核酸の出発プール内のその標的分子の相対量を決定するための手段を提供する。
【０２１４】
ＤＮＡ「コード配列」または「コード領域」とは、ポリペプチドをコードし、好適な調節配列の制御下に置かれた場合、細胞中、ｅｘ  ｖｉｖｏで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、またはｉｎ  ｖｉｖｏでポリペプチドに転写および翻訳され得る二本鎖ＤＮＡ配列を指す。「好適な調節配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、中、または下流（３’非コード配列）に位置し、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセッシングもしくは安定性、または翻訳に影響するヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセッシング部位、エフェクター結合部位およびステムループ構造を含んでもよい。コード配列の境界は、５’（アミノ）−末端の開始コドンおよび３’（カルボキシル）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列は、限定されるものではないが、原核配列、ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ配列、およびさらには、合成ＤＮＡ配列を含んでもよい。コード配列が真核細胞中での発現を意図される場合、ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は、通常はコード配列に対して３’側に位置するであろう。
【０２１５】
「オープンリーディングフレーム」は、ＯＲＦと省略され、ＡＴＧまたはＡＵＧなどの翻訳開始シグナルまたは開始コドン、および終結コドンを含み、ポリペプチド配列に潜在的に翻訳され得る、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかである、ある長さの核酸配列を指す。
【０２１６】
用語「ヘッド−トゥ−ヘッド（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄ）」は、互いに関連する２つのポリヌクレオチド配列の配向を記載するために本明細書で使用される。２つのポリヌクレオチドは、一方のポリヌクレオチドのコード鎖の５’末端が他方のポリヌクレオチドのコード鎖の５’末端に隣接する場合にヘッド−トゥ−ヘッドの配向で位置し、それによって、各ポリヌクレオチドの転写の方向が、他方のポリヌクレオチドの５’末端から離れて進む。用語「ヘッド−トゥ−ヘッド」は、（５’）−トゥ−（５’）と省略してもよく、記号（＞）または（３’＜−５’５’−＞＞３’）によって示すこともできる。
【０２１７】
用語「テイル−トゥ−テイル（ｔａｉｌ−ｔｏ−ｔａｉｌ）」は、互いに関連する２つのポリヌクレオチド配列の配向を記載するために本明細書で使用される。２つのポリヌクレオチドは、一方のポリヌクレオチドのコード鎖の３’末端が他方のポリヌクレオチドのコード鎖の３’末端に隣接する場合にテイル−トゥ−テイルの配向で位置し、それによって、各ポリヌクレオチドの転写の方向が、他方のポリヌクレオチドに向かって進む。用語「テイル−トゥ−テイル」は、（３’）−トゥ−（３’）と省略してもよく、記号（→＜−）または（５’−３’３’−５’）によって示すこともできる。
【０２１８】
用語「ヘッド−トゥ−テイル（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ）」は、互いに関連する２つのポリヌクレオチド配列の配向を記載するために本明細書で使用される。２つのポリヌクレオチドは、一方のポリヌクレオチドのコード鎖の５’末端が他方のポリヌクレオチドのコード鎖の３’末端に隣接する場合にヘッド−トゥ−テイルの配向で位置し、それによって、各ポリヌクレオチドの転写の方向が、他方のポリヌクレオチドのものと同じ方向で進む。用語「ヘッド−トゥ−テイル」は、（５’）−トゥ−（３’）と省略してもよく、記号（−＞−）または（５’→３’５’−３’）によって示すこともできる。
【０２１９】
用語「下流」とは、参照ヌクレオチド配列に対して３’に位置するヌクレオチド配列を指す。特に、下流のヌクレオチド配列は一般に、転写開始点の後にある配列に関する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写開始部位の下流に位置する。
【０２２０】
用語「上流」とは、参照ヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列を指す。特に、上流のヌクレオチド配列は一般に、コード配列または転写開始点の５’側に位置する配列に関する。例えば、多くのプロモーターは、転写開始部位の上流に位置する。
【０２２１】
用語「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」は、互換的に使用され、二本鎖ＤＮＡ内の特定のヌクレオチド配列に結合し、その中で切断する酵素を指す。
【０２２２】
「相同組換え」とは、外来ＤＮＡ配列の、別のＤＮＡ分子への挿入、例えば、ベクターの、染色体中への挿入を指す。好ましくは、ベクターは、相同組換えのための特定の染色体部位を標的とする。特異的相同組換えのために、ベクターは、相補的結合およびベクターの染色体への組み込みを可能にする、染色体の配列に対して十分に長い相同領域を含有するであろう。より長い相同領域、およびより高い程度の配列類似性は、相同組換えの効率を増大させることができる。
【０２２３】
「ベクター」とは、核酸のクローニングおよび／または核酸の宿主細胞への導入のための任意のビヒクルを指す。ベクターは、別のＤＮＡセグメントを結合させて、結合したセグメントの複製をもたらすことができるレプリコンであってもよい。「レプリコン」とは、ｉｎ  ｖｉｖｏでＤＮＡ複製の自律単位として機能する、すなわち、それ自身の制御下で複製することができる任意の遺伝子エレメント（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）を指す。用語「ベクター」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、核酸を細胞中に導入するためのウイルスビヒクルと非ウイルスビヒクルとの両方を含む。当業界で公知の多数のベクターを使用して、核酸を操作する、応答エレメントおよびプロモーターを遺伝子中に組み込む、などをすることができる。あり得るベクターとしては、例えば、ラムダ誘導体などのバクテリオファージ、またはｐＢＲ３２２もしくはｐＵＣプラスミド誘導体、またはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターなどのプラスミドを含む、例えば、プラスミドまたは改変ウイルスが挙げられる。本発明において有用であるベクターの別の例は、国際公開第２００７／０３８２７６号パンフレットに記載のＵＬＴＲＡＶＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｔｒｅｘｏｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｂｌａｃｋｓｂｕｒｇ、ＶＡ）である。例えば、適切なＤＮＡ断片を、相補的な付着末端を有する選択されたベクター中にライゲーションすることによって、応答エレメントおよびプロモーターに対応するＤＮＡ断片の、好適なベクター中への挿入を達成することができる。あるいは、ＤＮＡ分子の末端を酵素的に改変するか、またはヌクレオチド配列（リンカー）をＤＮＡ末端中にライゲーションすることによって任意の部位を生産することができる。そのようなベクターを、細胞ゲノム中にマーカーを組み込んだ細胞の選択を提供する選択マーカー遺伝子を含有するように操作することができる。そのようなマーカーは、マーカーによってコードされるタンパク質を組み込み、発現する宿主細胞の同定および／または選択を可能にする。
【０２２４】
細胞、ならびに生きている動物の対象における様々な遺伝子送達用途においては、ウイルスベクター、特に、レトロウイルスベクターが使用されてきた。使用することができるウイルスベクターとしては、限定されるものではないが、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックス、バキュロウイルス、ワクシニア、単純ヘルペス、エプスタイン・バー、アデノウイルス、ジェミニウイルス、およびカリモウイルスベクターが挙げられる。非ウイルスベクターとしては、プラスミド、リポソーム、電気的に荷電した脂質（サイトフェクチン）、ＤＮＡ−タンパク質複合体、およびバイオポリマーが挙げられる。核酸に加えて、ベクターはまた、核酸導入の結果（どの組織への導入、発現の持続期間など）を選択、測定、およびモニタリングするのに有用な１つまたは複数の調節領域、および／または選択マーカーを含んでもよい。
【０２２５】
用語「プラスミド」とは、細胞の中央代謝の一部ではなく、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態にある遺伝子を担持することが多い染色体外エレメントを指す。そのようなエレメントは、適切な３’非翻訳配列と共に、プロモーター断片および選択された遺伝子産物のためのＤＮＡ配列を細胞中に導入することができるユニークな構築物に、いくつかのヌクレオチド配列が連結されているか、または組み換わっている、任意の起源に由来する、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの、自律複製配列、ゲノム組込み配列、線状、環状、もしくはスーパーコイルのファージまたはヌクレオチド配列であってよい。
【０２２６】
「クローニングベクター」とは、連続的に複製し、別の核酸セグメントを結合させて、結合したセグメントの複製をもたらすことができる、プラスミド、ファージまたはコスミドなどの複製起点を含む、単位長さの核酸、好ましくは、ＤＮＡである「レプリコン」を指す。クローニングベクターは、ある細胞型において複製し、別の細胞型において発現することができる（「シャトルベクター」）。クローニングベクターは、ベクターを含む細胞の選択のために使用することができる１つもしくは複数の配列および／または目的の配列の挿入のための１つもしくは複数のクローニング部位を含んでもよい。
【０２２７】
用語「発現ベクター」とは、挿入された核酸配列の発現を可能にするように設計されたベクター、プラスミドまたはビヒクルを指す。クローニングされた遺伝子、すなわち、挿入された核酸配列は通常、プロモーター、最小プロモーター、エンハンサーなどの制御エレメントの制御下に置かれる。所望の宿主細胞中での核酸の発現を駆動するのに有用である開始制御領域またはプロモーターは数多く、当業者であれば精通している。限定されるものではないが、ウイルスプロモーター、細菌プロモーター、動物プロモーター、哺乳動物プロモーター、合成プロモーター、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、発症または疾患関連プロモーター、発生特異的プロモーター、誘導性プロモーター、光調節性プロモーター；ＣＹＣ  Ｊ、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨ０５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ、アルカリホスファターゼプロモーター（サッカロミセス（Saccharomyces）中での発現にとって有用）；ＡＯＸ１プロモーター（ピチア（Pichia）中での発現にとって有用）；β−ラクタマーゼ、ｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ＩＰＪ＾、ＩＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃプロモーター（大腸菌（Escherichia coli）中での発現にとって有用）；光調節性、種子特異的、花粉特異的、卵巣特異的、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ、ＣＭＶ  ３５Ｓ最小、キャッサバ静脈モザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ）、クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質、リブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ、新芽特異的、根特異的、キチナーゼ、ストレス誘導性、イネツングロ桿菌状ウイルス、植物スーパープロモーター、ジャガイモロイシンアミノペプチダーゼ、硝酸リダクターゼ、マンノピンシンターゼ、ノパリンシンターゼ、ユビキチン、ゼインタンパク質、およびアントシアニンプロモーター（植物細胞中での発現にとって有用）；限定されるものではないが、ＳＶ４０初期（ＳＶ４０ｅ）プロモーター領域、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の３’長い末端反復配列（ＬＴＲ）に含有されるプロモーター、ＥＩＡのプロモーターまたはアデノウイルス（Ａｄ）の主要後期プロモーター（ＭＬＰ）遺伝子、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、バキュロウイルスＩＥ１プロモーター、伸長因子１アルファ（ＥＦ１）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ユビキチン（Ｕｂｃ）プロモーター、アルブミンプロモーター、マウスメタロチオネイン−Ｌプロモーターの調節配列および転写制御領域、遍在性プロモーター（ＨＰＲＴ、ビメンチン、ｃｔ−アクチン、チューブリンなど）、中間フィラメント（デスミン、ニューロフィラメント、ケラチン、ＧＦＡＰなど）のプロモーター、治療遺伝子（ＭＤＲ、ＣＦＴＲまたは第ＶＩＩＩ因子型などの）のプロモーター、発症または疾患関連プロモーター、ならびに膵腺房細胞において活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域；膵臓ベータ細胞において活性なインスリン遺伝子制御領域、リンパ系細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域、精巣、乳房、リンパ系細胞および���満細胞において活性なマウス乳腺腫瘍ウイルス制御領域；肝臓において活性な、アルブミン遺伝子、ＡｐｏＡＩおよびＡｐｏＡＩＩ制御領域−’Ｉ−、肝臓において活性なアルファ−フェトタンパク質遺伝子制御領域、肝臓において活性なアルファ１−抗トリプシン遺伝子制御領域、骨髄細胞において活性なベータ−グロビン遺伝子制御領域、脳内のオリゴデンドロサイト細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域、骨格筋において活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域、および視床下部において活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域などの、トランスジェニック動物において組織特異性を示し、それにおいて使用されてきたプロモーター、ピルビン酸キナーゼプロモーター、ビリンプロモーター、脂肪酸結合腸タンパク質のプロモーター、平滑筋細胞ａ−アクチンのプロモーターなどを含む当業界で公知の動物および哺乳動物プロモーターなどの、これらの遺伝子の発現を駆動することができる実質的に任意のプロモーターを、発現ベクター中で使用することができる。さらに、これらの発現配列を、エンハンサーまたは調節配列などの付加によって改変することができる。
【０２２８】
用語「トランスフェクション」とは、細胞による外因性または異種ＲＮＡまたはＤＮＡの取込みを指す。そのようなＲＮＡまたはＤＮＡが細胞の内部に導入されている場合、細胞は、外因性または異種ＲＮＡまたはＤＮＡによって「トランスフェクト」されている。トランスフェクトされたＲＮＡまたはＤＮＡが表現型の変化を示す場合、細胞は、外因性または異種ＲＮＡまたはＤＮＡによって「形質転換」されている。形質転換するＲＮＡまたはＤＮＡを、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡ中に組み込む（共有的に連結する）ことができる。
【０２２９】
「形質転換」とは、遺伝的に安定な継承をもたらす、宿主生物のゲノムへの核酸断片の導入を指す。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換」生物と呼ばれる。
【０２３０】
さらに、本発明によるポリヌクレオチドを含む組換えベクターは、その増幅またはその発現が求められる細胞宿主中での複製のための１つもしくは複数の起点、マーカーまたは選択マーカーを含んでもよい。
【０２３１】
用語「選択マーカー」とは、マーカー遺伝子の効果、すなわち、抗生物質に対する耐性、除草剤に対する耐性、比色マーカー、酵素、蛍光マーカーなどであって、目的の核酸の継承を追跡するため、および／または目的の核酸を継承した細胞もしくは生物を同定するために使用される、その効果に基づいて選択することができる、識別因子、通常は、抗生物質または化学物質耐性遺伝子を指す。当業界で公知であり、使用される選択マーカー遺伝子の例としては、アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ヒグロマイシン、ビアラホス除草剤、スルホンアミドなどに対する耐性を提供する遺伝子；および表現型マーカーとして使用される遺伝子、すなわち、アントシアニン調節遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子などが挙げられる。[00291]用語「リポーター遺伝子」とは、目的の核酸の継承を追跡するため、目的の核酸を継承した細胞もしくは生物を同定するため、および／または遺伝子発現の誘導もしくは転写を測定するために使用される、リポーター遺伝子の効果に基づいて同定することができる識別因子をコードする核酸を指す。当業界で公知であり、使用されるリポーター遺伝子の例としては、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、β−グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）などが挙げられる。選択マーカー遺伝子はまた、リポーター遺伝子と考えることもできる。
【０２３２】
「プロモーター」および「プロモーター配列」は互換的に使用され、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列は、プロモーター配列に対して３’側に位置する。プロモーターは、その全体が天然の遺伝子に由来するか、または天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントから構成されるか、またはさらには、合成ＤＮＡセグメントを含んでもよい。当業者であれば、異なるプロモーターは、異なる組織もしくは細胞型において、または異なる発生段階で、または異なる環境条件もしくは生理条件に応答して、遺伝子の発現を指令することができることを理解できる。多くの時間で多くの細胞型における遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般的には「構成的プロモーター」と称される。特定の細胞型における遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般的には、「細胞特異的プロモーター」または「組織特異的プロモーター」と称される。特定の発生または細胞分化の段階での遺伝子発現を引き起こすプロモーターは、一般的には、「発生特異的プロモーター」または「細胞分化特異的プロモーター」と称される。プロモーターを誘導する薬剤、生体分子、化学物質、リガンド、光などによる細胞の曝露または処理の後に誘導され、遺伝子発現を引き起こすプロモーターは、一般的には、「誘導性プロモーター」または「調節性プロモーター」と称される。多くの場合、調節配列の正確な境界は完全に定義されていないため、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有してもよいことがさらに認識される。
【０２３３】
本発明のベクターのいずれかにおいて、ベクターは必要に応じて、本明細書に開示されるプロモーターを含む。
【０２３４】
本発明のベクターのいずれかにおいて、ベクターは必要に応じて、組織特異的プロモーターを含む。一実施形態では、組織特異的プロモーターは、本明細書に開示される組織特異的プロモーターである。
【０２３５】
プロモーター配列は、典型的には、転写開始部位によってその３’末端に結合され、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで転写を開始させるのに必要な最小数の塩基またはエレメントを含むように上流（５’方向）に伸長する。プロモーター配列内には、転写開始部位（例えば、ヌクレアーゼＳＩを用いてマッピングすることによって都合良く定義される）、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出される。
【０２３６】
「治療スイッチプロモーター」（「ＴＳＰ」）とは、遺伝子スイッチ成分の発現を制御するプロモーターを指す。遺伝子スイッチおよびその様々な成分は、本明細書の他の箇所に詳細に記載される。ある特定の実施形態では、ＴＳＰは、構成的、すなわち、継続的に活性である。構成的ＴＳＰは、構成的−遍在的（すなわち、一般的には、任意の組織もしくは細胞において、追加の因子もしくは調節因子を必要とすることなく機能する）または構成的−組織もしくは細胞特異的（すなわち、一般的には、特定の組織型もしくは細胞型において、追加の因子もしくは調節因子を必要とすることなく機能する）のいずれかであってよい。ある特定の実施形態では、本発明のＴＳＰは、疾患、障害、または状態と関連する条件下で活性化される。２つ以上のＴＳＰが含まれる本発明のある特定の実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターと活性化可能プロモーターとの組合せであってもよい。本明細書で使用される場合、「疾患、障害、または状態と関連する条件下で活性化されるプロモーター」としては、限定されるものではないが、疾患特異的プロモーター、特定の生理条件、発生条件、分化条件、または病態に応答するプロモーター、特定の生体分子に応答するプロモーター、および疾患、障害、または状態と関連する特定の組織または細胞型、例えば、腫瘍組織または悪性細胞に特異的なプロモーターが挙げられる。ＴＳＰは、天然に存在するプロモーターの配列、天然に存在するプロモーターに由来する改変された配列、または合成の配列（例えば、プロモーターの応答性を変更するための最小プロモーター配列への応答エレメントの挿入）を含んでもよい。
【０２３７】
コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写し、次いで、ｔｒａｎｓ−ＲＮＡスプライシングされ（コード配列がイントロンを含有する場合）、コード配列によってコードされるタンパク質に翻訳される場合、細胞中で転写および翻訳制御配列の「制御下」にある。
【０２３８】
「転写および翻訳制御配列」とは、宿主細胞中でのコード配列の発現を提供する、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどのＤＮＡ調節配列を指す。真核細胞では、ポリアデニル化シグナルが制御配列である。
【０２３９】
用語「応答エレメント」とは、転写因子のＤＮＡ結合ドメインとの相互作用によって媒介されるプロモーターに対する応答性を付与する１つまたは複数のｃｉｓ作用性ＤＮＡエレメントを指す。このＤＮＡエレメントは、その配列においてパリンドローム（完全もしくは不完全）であってよいか、または可変数のヌクレオチドによって隔てられた配列モチーフもしくはハーフサイトから構成されていてもよい。ハーフサイトは、類似または同一であってよく、直接もしくは反転リピートとして、または単一のハーフサイトもしくは直列に隣接するハーフサイトの多量体として配置されていてもよい。応答エレメントは、応答エレメントが組み込まれる細胞または生物の性質に応じて、異なる生物から単離された最小プロモーターを含んでもよい。転写因子のＤＮＡ結合ドメインは、リガンドの存在下または非存在下で、応答エレメントの調節下で下流の遺伝子の転写を開始させる、または抑制するこの応答エレメントのＤＮＡ配列に結合する。天然エクジソン受容体の応答エレメントのＤＮＡ配列の例としては、ＲＲＧＧ／ＴＴＣＡＮＴＧＡＣ／ＡＣＹＹ（配列番号１６）（Cherbas et. al., Genes Dev. 5:120 (1991)を参照されたい）；ＡＧＧＴＣＡＮ（ｎ）ＡＧＧＴＣＡ（配列中、Ｎ（ｎ）は１つまたは複数のスペーサーヌクレオチドである）（配列番号１７）（DAvino et al., Mol. Cell. Endocrinol. 113:1 (1995)を参照されたい）；およびＧＧＧＴＴＧＡＡＴＧＡＡＴＴＴ（配列番号１８）（Antoniewski et al., Mol. Cell Biol. 14:4465 (1994)を参照されたい）が挙げられる。
【０２４０】
用語「作動可能に連結された」とは、一方の機能が他方によって影響されるような、単一の核酸断片上での核酸配列の結合を指す。例えば、プロモーターは、それがコード配列の発現に影響することができる場合（すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にあるということ）、そのコード配列と作動可能に連結されている。コード配列を、センスまたはアンチセンスの配向で調節配列に作動可能に連結することができる。
【０２４１】
本明細書で使用される用語「発現」とは、核酸またはポリヌクレオチドに由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡの、タンパク質またはポリペプチドへの翻訳を指してもよい。用語「カセット」、「発現カセット」および「遺伝子発現カセット」とは、特定の制限部位で、または相同組換えによって、核酸またはポリヌクレオチドに挿入することができるＤＮＡのセグメントを指す。ＤＮＡのセグメントは、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、カセットおよび制限部位は、転写および翻訳のための適切な読み枠でのカセットの挿入を確保するように設計される。「形質転換カセット」とは、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、特定の宿主細胞の形質転換を容易にするポリヌクレオチドに加えて、エレメントを有する特定のベクターを指す。本発明のカセット、発現カセット、遺伝子発現カセットおよび形質転換カセットはまた、宿主細胞中での目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現の増強を可能にするエレメントを含んでもよい。これらのエレメントは、限定されるものではないが、プロモーター、最小プロモーター、エンハンサー、応答エレメント、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列などを含んでもよい。
【０２４２】
本発明の目的のために、用語「遺伝子スイッチ」とは、プロモーターと結合した応答エレメントと、１つまたは複数のリガンドの存在下で、応答エレメントおよびプロモーターが組み込まれた遺伝子の発現をモジュレートする、リガンド依存性転写因子に基づく系との組合せを指す。用語「遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチド」とは、プロモーターと結合した応答エレメントと、１つまたは複数のリガンドの存在下で、応答エレメントおよびプロモーターが組み込まれた遺伝子の発現をモジュレートする、リガンド依存性転写因子に基づく系をコードするポリヌクレオチドとの組合せを指す。
【０２４３】
本発明の治療スイッチプロモーターは、特定の疾患、障害、または状態を処置する、改善する、または防止するのに有用な任意のプロモーターであってもよい。例としては、限定されるものではないが、特定の疾患、障害、または状態の間にのみ発現の増加を示す遺伝子のプロモーターおよび特定の細胞条件下（増殖、アポトーシス、ｐＨの変化、酸化状態、酸素レベル）で発現の増加を示す遺伝子のプロモーターが挙げられる。遺伝子スイッチが１つより多い転写因子配列を含む一部の実施形態では、疾患または状態特異的プロモーターと、組織または細胞型特異的プロモーターとを組み合わせて、治療生成物が発現される組織を限定することによって、治療方法の特異性を増大させることができる。かくして、組織または細胞型特異的プロモーターは、治療スイッチプロモーターの定義内に包含される。
【０２４４】
疾患特異的プロモーターの例として、がんを処置するための有用なプロモーターは、がん遺伝子のプロモーターを含む。がん遺伝子のクラスの例としては、限定されるものではないが、増殖因子、増殖因子受容体、タンパク質キナーゼ、プログラム細胞死調節因子および転写因子が挙げられる。がん遺伝子の特定例としては、限定されるものではないが、ｓｉｓ、ｅｒｂＢ、ｅｒｂＢ−２、ｒａｓ、ａｂｌ、ｍｙｃおよびｂｃｌ−２およびＴＥＲＴが挙げられる。他のがん関連遺伝子の例としては、腫瘍関連抗原遺伝子および新生物細胞中で過剰発現される他の遺伝子（例えば、ＭＡＧＥ−１、がん胎児性抗原、チロシナーゼ、前立腺特異的抗原、前立腺特異的膜抗原、ｐ５３、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ−４、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、Ｔ／Ｔｎ、ＭＡＲＴ−１、ｇｐｌＯＯ、ＧＭ２、Ｔｎ、ｓＴｎ、およびＴｈｏｍｐｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原（ＴＦ））が挙げられる。
【０２４５】
遺伝子スイッチ中に挿入されるプロモーターの起源は、天然または合成であってよく、プロモーターの起源は本明細書に記載の発明の範囲を限定するべきではない。換言すれば、プロモーターは、細胞から直接クローニングされたものであってもよく、またはプロモーターは、異なる起源から以前にクローニングされたものであってもよく、またはプロモーターは、合成されたものであってもよい。
【０２４６】
遺伝子スイッチに関する用語「エクジソン受容体に基づく」とは、天然に存在する、または合成のエクジソン受容体リガンド結合ドメインの少なくとも機能的部分を含み、エクジソン受容体リガンド結合ドメインに結合するリガンドに応答して遺伝子発現を調節する遺伝子スイッチを指す。エクジソン応答システムの例は、米国特許第７，０９１，０３８号明細書および第６，２５８，６０３号明細書に記載されている。一実施形態では、システムは、図１に例示される構成的プロモーターの下で発現される、２つの融合タンパク質、Ｇａｌ４  ＤＮＡ結合ドメインと融合した突然変異誘発されたエクジソン受容体（ＥＲ）のＤＥＦドメインおよびＶＰ１６転写活性化ドメインと融合したキメラＲＸＲのＥＦドメインを含有する、ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ（登録商標）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＲＴＳ）である。
【０２４７】
用語「リガンド依存性転写因子」（ＬＤＴＦ）とは、複合体が転写因子により調節されるプロモーターによって駆動される遺伝子発現を調節することができる、１つまたは複数のタンパク質サブユニットを含む転写因子を指す。１つのそのような例は、「エクジソン受容体複合体」であり、一般に、核受容体ファミリーの少なくとも２つのメンバー、エクジソン受容体（「ＥｃＲ」）およびウルトラスピラクル（「ＵＳＰ」）タンパク質を有するヘテロ二量体タンパク質複合体を指す（Yao et al., Nature 366:476 (1993))；Yao et al., Cell 71:63 (1992)を参照されたい）。機能的なＬＤＴＦ、例えば、ＥｃＲ複合体はまた、イムノフィリンなどのさらなるタンパク質を含んでもよい。転写因子として知られる、核受容体ファミリーのタンパク質のさらなるメンバー（ＤＨＲ３８またはベータＦＴＺ−１または他の昆虫ホモログなど）もまた、ＥｃＲおよび／またはＵＳＰのためのリガンド依存的または非依存的パートナーであってもよい。ＥｃＲ複合体などのＬＤＴＦＣはまた、ＥｃＲタンパク質と、ウルトラスピラクルタンパク質、レチノイン酸−Ｘ−受容体（「ＲＸＲ」）タンパク質の脊椎動物ホモログとのヘテロ二量体またはＵＳＰとＲＸＲとのキメラであってもよい。用語「ＬＤＴＦＣ」および「ＥｃＲ複合体」はまた、ＥｃＲタンパク質またはＵＳＰのホモ二量体複合体、ならびに単一のポリペプチドまたは三量体、四量体、および同じ機能を果たす他の多量体も包含する。
【０２４８】
用語「モジュレートする」とは、核酸または遺伝子発現を誘導する、低減する、または阻害することを意味し、タンパク質またはポリペプチド産生の対応する誘導、低減または阻害をもたらす。
【０２４９】
本発明によるポリヌクレオチドまたはベクターは、宿主細胞中での遺伝子の発現を駆動するのに好適な少なくとも１つのプロモーターをさらに含んでもよい。
【０２５０】
本発明の実施形態において使用することができるエンハンサーとしては、限定されるものではないが、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー、伸長因子１（ＥＦ１）エンハンサー、酵母エンハンサー、ウイルス遺伝子エンハンサーなどが挙げられる。
【０２５１】
終結制御領域、すなわち、ターミネーターまたはポリアデニル化配列はまた、好ましい宿主にとってネイティブな様々な遺伝子に由来するものであってもよい。必要に応じて、終結部位は、不必要であってよいが、含まれる場合、それが最も好ましい。本発明の一実施形態では、終結制御領域は、合成配列、合成ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ウイルスターミネーター配列などを含むか、またはそれらに由来してもよい。
【０２５２】
用語「３’非コード配列」または「３’非翻訳領域（ＵＴＲ）」とは、コード配列の下流（３’）に位置するＤＮＡ配列を指し、ポリアデニル化［ポリ（Ａ）］認識配列およびｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響することができる調節シグナルをコードする他の配列を含んでもよい。ポリアデニル化シグナルは、通常、ポリアデニル酸の束の、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端への付加に影響することを特徴とする。
【０２５３】
「調節領域」とは、第２の核酸配列の発現を調節する核酸配列を指す。調節領域は、特定の核酸（相同領域）の発現を天然で担う配列を含んでもよいか、または異なるタンパク質もしくはさらには合成タンパク質（異種領域）の発現を担う異なる起源の配列を含んでもよい。特に、これらの配列は、原核、真核、もしくはウイルス遺伝子の配列であってよいか、または特異的もしくは非特異的様式で、および誘導性もしくは非誘導性様式で、遺伝子の転写を刺激もしくは抑制する誘導された配列であってもよい。調節領域は、複製起点、ＲＮＡスプライス部位、プロモーター、エンハンサー、転写終結配列、およびポリペプチドを標的細胞の分泌経路に指向させるシグナル配列を含む。
【０２５４】
「異種起源」に由来する調節領域とは、発現される核酸と天然では会合しない調節領域を指す。異種調節領域に含まれるのは、異なる種に由来する調節領域、異なる遺伝子に由来する調節領域、ハイブリッド調節配列、および天然には存在しないが、当業者によって設計される調節配列である。
【０２５５】
「ＲＮＡ転写物」とは、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼにより触媒される転写の結果得られる生成物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、それは一次転写物と称されるか、またはそれは一次転写物の転写後プロセッシングに由来するＲＮＡ配列であってよく、成熟ＲＮＡと称される。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とは、イントロン内にあり、細胞によってタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡと相補的であり、ｍＲＮＡに由来する二本鎖ＤＮＡを指す。「センス」ＲＮＡとは、ｍＲＮＡを含み、したがって、細胞によってタンパク質に翻訳され得るＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的一次転写物またはｍＲＮＡの全部または一部と相補的であり、標的遺伝子の発現を遮断するＲＮＡ転写物を指す。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写物の任意の部分、すなわち、５’非コード配列、３’非コード配列、またはコード配列とのものであってよい。「機能的ＲＮＡ」とは、翻訳されないが、細胞プロセスに対する効果を有する、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、または他のＲＮＡを指す。
【０２５６】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、互換的に使用され、共有的に連結されたアミノ酸残基を含むポリマー化合物を指す。
【０２５７】
「単離されたポリペプチド」、「単離されたペプチド」または「単離されたタンパク質」とは、通常はその天然状態でそれと会合する化合物（例えば、他のタンパク質またはポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質）を実質的に含まないポリペプチドまたはタンパク質を指す。「単離された」は、他の化合物との人工もしくは合成混合物、または生物活性を阻害せず、例えば、不完全な精製、安定剤の添加、もしくは薬学的に許容される調製物への混合に起因し得る、不純物の存在を排除することを意味しない。
【０２５８】
ポリペプチドに適用される場合の用語「断片」とは、アミノ酸配列が参照ポリペプチドのそれよりも短く、これらの参照ポリペプチドの全部分にわたって、同一のアミノ酸配列を含む、ポリペプチドを指す。そのような断片は、必要に応じて、それらが一部であるより大きいポリペプチド中に含まれていてもよい。本発明によるポリペプチドのそのような断片は、少なくとも２、３、４、５、６、８、１０、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２５、２６、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、２４０、または３００アミノ酸以上の長さを有してもよい。
【０２５９】
ポリペプチドまたはタンパク質の「バリアント」とは、ポリペプチドまたはタンパク質に由来し、ポリペプチドまたはタンパク質の少なくとも１つの生物学的特性を保持する任意のアナログ、断片、誘導体、または突然変異体を指す。ポリペプチドまたはタンパク質の様々なバリアントが天然に存在してもよい。これらのバリアントは、タンパク質をコードする構造遺伝子のヌクレオチド配列における差異を特徴とする対立遺伝子変異であってもよいか、または差次的スプライシングもしくは翻訳後改変を含んでもよい。当業者であれば、単一または複数のアミノ酸置換、欠失、付加、または置き換えを有するバリアントを生産することができる。これらのバリアントは、特に、（ａ）１つまたは複数のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸で置換されたバリアント、（ｂ）１つまたは複数のアミノ酸がポリペプチドまたはタンパク質に付加されたバリアント、（ｃ）１つまたは複数のアミノ酸が置換基を含むバリアント、および（ｄ）ポリペプチドまたはタンパク質が血清アルブミンなどの別のポリペプチドと融合されたバリアントを含んでもよい。遺伝子技術（抑制、欠失、突然変異など）、化学的技術、および酵素的技術を含む、これらのバリアントを取得するための技術は、当業者には公知である。一実施形態では、バリアントポリペプチドは、少なくとも約１４アミノ酸を含む。
【０２６０】
用語「相同性」とは、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド部分の間の同一性のパーセントを指す。ある部分から別の部分までの配列間の一致を、当業界で公知の技術によって決定することができる。例えば、配列情報を整列させ、容易に入手可能なコンピュータープログラムを使用することによる、２つのポリペプチド分子間の配列情報の直接比較によって、相同性を決定することができる。あるいは、相同領域間で安定な二重鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、次いで、一本鎖特異的ヌクレアーゼによる消化および消化された断片のサイズ決定によって、相同性を決定することができる。
【０２６１】
本明細書で使用される場合、用語「相同な」とは、全てのその文法的形態および綴りの変化において、スーパーファミリーに由来するタンパク質（例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー）および異なる種に由来する相同タンパク質（例えば、ミオシン軽鎖など）を含む、「共通の進化起源」を有するタンパク質間の関係を指す（Reeck et al., Cell 50:667 (1987)）。そのようなタンパク質（およびそのコード遺伝子）は、その高い程度の配列類似性によって反映されるように、配列相同性を有する。しかしながら、一般的な使用および本出願においては、用語「相同」は、「高く」などの副詞で修飾される場合、配列類似性を指し、共通の進化起源を指さなくてもよい。
【０２６２】
本明細書で使用される用語「に対応する」とは、類似性または相同性が測定される分子と、正確な位置が同一であるにしろ、それとは異なるにしろ、類似する、または相同な配列を指す。核酸またはアミノ酸配列アラインメントは、余白を含んでもよい。かくして、用語「に対応する」とは、配列類似性を指し、アミノ酸残基またはヌクレオチド塩基の番号付けを指さない。
【０２６３】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、当業者による配列の手動での評価によって、またはＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ；Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1993))；ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/で入手可能）などのアルゴリズムを使用するコンピューターにより自動化された配列比較および同定によって、ポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定するのに十分な、そのポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含む。一般に、ポリペプチドまたは核酸配列を、公知のタンパク質または遺伝子と相同であると推定的に同定するためには、１０個以上の連続するアミノ酸または３０個以上のヌクレオチドの配列が必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関しては、２０〜３０個の連続するヌクレオチドを含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを、遺伝子同定（例えば、サザンハイブリダイゼーション）および単離（例えば、細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）の配列依存的方法において使用することができる。さらに、１２〜１５塩基の短いオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲにおける増幅プライマーとして使用して、そのプライマーを含む特定の核酸断片を取得することができる。したがって、ヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、その配列を含む核酸断片を特異的に同定および／または単離するのに十分な配列を含む。
【０２６４】
当業界で公知のように、用語「同一性パーセント」は、配列を比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係である。当業界では、「同一性」はまた、一連のそのような配列間の一致によって決定される、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」および「類似性」は、限定されるものではないが、Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, New York (1988)；Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, New York (1993)；Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, New Jersey (1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987)；およびSequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, New York (1991)に記載されたものを含む、公知の方法によって容易に算出することができる。同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間で最良の一致を与えるように設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公共的に利用可能なコンピュータープログラムに成文化されている。配列アラインメントおよび同一性パーセントの計算を、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（またはより最近では、ＭｅｇＡｌｉｇｎ  Ｐｒｏ）プログラムなどの配列分析ソフトウェアを使用して実施することができる。配列の複数のアラインメントを、デフォルトパラメーター（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）でアラインメントのＣｌｕｓｔａｌ法（Higgins et al., CABIOS. 5:151 1989）を使用して実施することができる。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用するペアワイズアラインメントのためのデフォルトパラメーター：ＫＴＵＰＬＥ  １、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５を選択することができる。
【０２６５】
本明細書で使用される場合、２つ以上の個別に作動可能な遺伝子調節系は、ａ）選択された濃度での、対応するリガンドによる所与の系のモジュレーションが、その系の遺伝子の発現の規模の測定可能な変化をもたらす場合、およびｂ）その変化が、実際のモジュレーションの同時性または連続性にも拘わらず、細胞、組織、または生物中で同時に作動可能な他の全ての系の発現の変化とは統計的に有意に異なる場合、「直交」であると言われる。好ましくは、それぞれ個別に作動可能な遺伝子調節系のモジュレーションは、細胞、組織、または生物中の他の全ての作動可能な系よりも少なくとも２倍高い、例えば、少なくとも５倍、１０倍、１００倍、または５００倍高い遺伝子発現の変化をもたらす。理想的には、選択された濃度での対応するリガンドによる所与の系のそれぞれのモジュレーションは、その系の遺伝子の発現の規模の測定可能な変化をもたらし、細胞、組織、または生物中で作動可能な他の全ての系の発現の測定可能な変化をもたらさない。そのような場合、複数の誘導性遺伝子調節系は、「完全直交」と言われる。有用な直交リガンドおよび直交受容体に基づく遺伝子発現系は、米国特許出願公開第２００２／０１１０８６１号明細書に記載されている。
【０２６６】
用語「外因性遺伝子」とは、対象にとって外来の遺伝子、すなわち、形質転換プロセスによって対象に導入される遺伝子、非突然変異型の内因性突然変異遺伝子または突然変異型の内因性非突然変異遺伝子を意味する。形質転換の方法は、本発明にとって重要ではなく、当業者には公知の対象にとって好適な任意の方法であってよい。外因性遺伝子は、逆転写酵素などによってＤＮＡ中間体を介して機能し得るＤＮＡまたはＲＮＡの形態で対象に導入される天然遺伝子または合成遺伝子のいずれかであってもよい。そのような遺伝子を、標的細胞に導入する、対象に直接的に導入する、または形質転換細胞の対象への導入によって間接的に導入することができる。
【０２６７】
用語「治療生成物」とは、そのような生成物が発現される宿主細胞に対して有益な機能を授ける治療ポリペプチドまたは治療ポリヌクレオチドを指す。治療ポリペプチドは、限定されるものではないが、３アミノ酸長ほどの小ささのペプチド、単鎖または多鎖タンパク質、および融合タンパク質を含んでもよい。治療ポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ、リボザイム、およびＲＮＡ外部ガイド配列を含んでもよい。治療生成物は、天然に存在する配列、合成配列または天然配列と合成配列との組合せを含んでもよい。
【０２６８】
本明細書で使用される場合、用語「活性化すること」または「活性化する」とは、目的の遺伝子、例えば、ＩＬ−１２の発現をもたらす、遺伝子スイッチの細胞活性の任意の測定可能な増加を指す。
【０２６９】
本明細書で使用される場合、疾患を「処置すること」または疾患の「処置」という用語は、疾患の兆候または症状を軽減する努力において、１つもしくは複数の薬物またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで操作された細胞を、哺乳動物（ヒトまたは非ヒト）に投与することを含んでもよい、プロトコールを実行することを指す。かくして、「処置すること」または「処置」は、必ずしも、兆候または症状の完全な軽減を必要とすると解釈されるべきではなく、治癒を必要とせず、具体的には、対象に対してわずかな効果しかないプロトコールも含む。
【０２７０】
本明細書で使用される場合、「免疫細胞」は、樹状細胞、マクロファージ、好中球、肥満細胞、好酸球、好塩基球、ナチュラルキラー細胞およびリンパ球（例えば、ＢおよびＴ細胞）を含む。
【０２７１】
本明細書で使用される場合、用語「ＭＯＩ」または「感染多重度」とは、特定の実験において単一の細胞に感染するアデノウイルス粒子（例えば、組換えアデノウイルスまたは対照アデノウイルス）の平均数を指す。
【０２７２】
本明細書で使用される場合、用語「結合剤」とは、ポリペプチドまたはポリペプチドのエピトープに結合する分子を指す。結合剤は、アンタゴニストまたはアゴニストであってもよい。
【０２７３】
本明細書で使用される場合、用語「腫瘍」とは、前がん性またはがん性細胞および／または組織であるにしろ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかでの全ての良性または悪性の細胞成長および増殖を指す。
【０２７４】
本明細書で使用される場合、用語「結合剤」は、標的に結合する組成物である。結合剤は、引力相互作用によって、可逆性または不可逆性であってもよい、標的分子との安定な会合を形成する分子である。引力相互作用は、例えば、限定されるものではないが、静電相互作用、ファンデルワールス力および疎水性効果を含む、非共有相互作用を含んでもよい。例えば、ＰＤ−１結合剤は、ＰＤ−１に結合する。結合剤は、アンタゴニスト、アゴニストまたは共刺激分子であってもよい。本明細書で使用される場合、用語「腫瘍」とは、前がん性またはがん性細胞および／または組織であるにしろ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかでの全ての良性または悪性の細胞成長および増殖を指す。
【０２７５】
本明細書で使用される場合、「用量レジメン」または「投薬レジメン」は、決定された用量のセットに基づく処置レジメンを含む。
【０２７６】
本明細書で使用される場合、用語「投薬」とは、治療目標（例えば、中枢神経系腫瘍の処置）を達成するための物質（例えば、Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２およびベレジメクスおよびニボルマブ）の投与を指す。
【実施例】
【０２７７】
以下の実施例は、例示的なものであり、限定を意図するものではなく、当業者であれば、他の実施形態を利用することができることを容易に理解できるであろう。
【０２７８】
[実施例１]
ベレジメクスはＧＬ−２６１同所性グリオーママウスおよび正常マウスにおいて血液脳関門を横断する
同所性ＧＬ−２６１グリオーママウスを生成するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの群に、冠状縫合および矢状縫合の交点に対して約２ｍｍ遠位に頭蓋内注入により１×１０５個のＧＬ−２６１グリオーマ細胞を投与した。５日目に、動物を、処置群の１つに無作為に割り当てた。ＧＬ−２６１、マウスグリオーマ腫瘍細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入した。
【０２７９】
ベレジメクスを、４５０ｍｇ／ｍ２／日または１，２００ｍｇ／ｍ２／日で、経口強制摂取（ＰＯ）により、正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたは同所性ＧＬ−２６１グリオーママウスに投与した。終末血およびＣＳＦを、正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたは同所性ＧＬ−２６１グリオーママウスについては、処置の２日後に、同所性ＧＬ−２６１グリオーママウスについては、処置の１３日後に収集した。ベレジメクス処置の２４時間後のベレジメクスレベルを定量し、図５に示した。これらのデータは、経口投与されたベレジメクスが、グリオーマにおけるＡｄ−ＲＴＳ−ＩＬ−１２＋ベレジメクスの投与によるｉｎ  ｖｉｖｏでのＩＬ−１２発現の評価を保証するのに十分なレベルで、正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスと同所性ＧＬ−２６１グリオーママウスとの両方において血液脳関門を横断することを示していた。
【０２８０】
[実施例２]
抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＡｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ−１２＋ベレジメクスは生存を改善する
同所性ＧＬ−２６１マウスモデルを使用して、ベレジメクスのみを用いた、エクジソン受容体に基づく発現系により制御される、ベレジメクス誘導性発現によりマウスＩＬ−１２を発現するアデノウイルス（すなわち、「Ａｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ−１２」と称される）（５×１０９ウイルス粒子（ｖｐ））の効果（１０〜３０ｍｇ／ｍ２／日で１４日間）と、ＰＤ−１特異的モノクローナル抗体（すなわち、ｍＡｂ  ＲＭＰ１−１４）（７．５および１５ｍｇ／ｍ２の抗ＰＤ−１抗体）と組み合わせたベレジメクスを用いた、Ａｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ−１２の効果とを評価した。
【０２８１】
図６に示されるように、処置しない全てのマウスは、３５日目までに疾患進行に屈する。免疫療法の８０日後、Ａｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ−１２＋ベレジメクス単剤療法を受けている７０〜８０％が生存し、抗ＰＤ−１単剤療法を受けている３０〜４０％が生存し、Ａｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ−１２＋３０ｍｇ／ｍ２のベレジメクスと、１５ｍｇ／ｍ２の抗ＰＤ−１抗体（抗マウスＰＤ−１抗体（ＣＤ２７９、クローンＲＭＰ１−１４、ＩｎＶｉｖｏＰｌｕｓ、カタログ番号ＢＰ０１４６、ＢｉｏＸＣｅｌｌ、Ｗｅｓｔ  Ｌｅｂａｎｏｎ、ＮＨ）との組合せを受けている１００％が生存していた。
【０２８２】
腫瘍に局在化したＩＬ−１２の増加が観察され（１００ｐｇ／ｍｇ）、これはＡｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ−１２＋ベレジメクスの５日後に、ピーク血漿レベルで観察されたものよりも１５倍高かった。さらに、Ａｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ−１２＋ベレジメクスと、抗ＰＤ−１抗体との組合せは、腫瘍中のピークＩＬ−１２レベルを持続させ、いずれかの免疫療法のみについて観察される最小限の変化と比較して、脾臓中の活性化Ｔ細胞の１００〜１５０％の増加と関連していた。さらに、単剤療法と比較して、調節性Ｔ細胞（ＦｏｘＰ３＋）が有意に減少していた。結論として、ＰＤ−１の阻害と組み合わせたＩＬ−１２を用いた制御された局部免疫刺激を使用するマウスモデル試験により、この型の療法がグリオーマの処置のための潜在的に有望な手法であることが示された。
【０２８３】
疾患進行と一致して、Ａｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ−１２＋ベレジメクスと、抗ＰＤ−１抗体との併用療法は、図７に示されるように、Ａｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ−１２＋ベレジメクス単剤療法または抗ＰＤ−１抗体単剤療法と比較して、体重変化の減少を増大させた。ベレジメクスを中止した場合、全ての群が回復した。
【０２８４】
[実施例３]
局部サイトカイン産生に対する、抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＡｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ−１２＋ベレジメクスの効果
ＧＬ−２６１同所性グリオーママウスモデルにおいて腫瘍中でＩＬ−１２を局部的に産生し、ＩＦＮ−γ産生を刺激する、抗ＰＤ−１抗体を含む、または含まない、５×１０９個の腫瘍内Ａｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ−１２＋３０ｍｇ／ｍ２の経口ベレジメクスの能力を探索した。各群のマウスに由来する腫瘍試料を、ＥＬＩＳＡによるＩＬ−１２およびＩＦＮ−γレベルの評価のために収集した。図８Ａに示されるように、腫瘍ＩＬ−１２が増加し（１００ｐｇ／ｍｇ）、これは、Ａｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ−１２＋ベレジメクスの５日後の血漿ピークのものよりも１５倍高かった。Ａｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ−１２＋ベレジメクスと、抗ＰＤ−１抗体との組合せは、腫瘍中で持続的なピークＩＬ−１２レベルをもたらした。ＩＦＮ−γは、ＩＬ−１２のピーク増大と一致する同様の傾向に従った；それにより、ベクターにより産生されるＩＬ−１２が生物学的に活性であることが確認された。
【０２８５】
[実施例４]
Ｔ細胞活性化に対する、抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＡｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ−１２＋ベレジメクスの効果
ＧＬ−２６１同所性グリオーママウスモデルにおいて、腫瘍微小環境ならびにエフェクターおよび調節性Ｔ細胞の動員に対する抗ＰＤ−１抗体療法と組み合わせたＡｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ−１２＋ベレジメクスの効果を評価した。いずれかの免疫療法のみについて観察された最小限の変化と比較して、脾臓において活性化された細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋）の１００％〜１５０％の増加が観察された（図９Ａ）。活性薬剤投薬期間に一部の処置群ではＴ細胞疲弊（ＬＡＧ３＋）の増加も観察された（図９Ｂ）。さらに、単剤療法と比較して、調節性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋）の有意な減少があった（図１０ＡおよびＢ）。結論として、ＰＤ−１の阻害と組み合わせたＩＬ−１２による制御された局部免疫刺激は、グリオーマの処置のための潜在的に有望な手法である。
【０２８６】
［実施例５］
抗ＰＤ−１抗体療法と組み合わせたＡｄ−ＲＴＳ−ｍＩＬ−１２＋ベレジメクスに関する臨床プロトコール
以下は、本発明を実施するための（ヒト）臨床プロトコールにおいて；すなわち、限定されるものではないが、再発性または進行性神経膠芽腫を含むグリオーマの処置のためのＰＤ−１特異的抗体と組み合わせたＡｄ−ＲＴＳ−ＩＬ−１２＋ベレジメクスの投与の形態で使用することができるパラメーターの例である。
【０２８７】
標的とされる目標は、（１）再発性または進行性神経膠芽腫を有する対象における、抗ＰＤ−１免疫グロブリン（例えば、限定されるものではないが、ニボルマブ）と組み合わせた、変化するレベル（用量）の経口（ＰＯ）ベレジメクス（低分子アクチベーターリガンド）を使用して、Ａｄ−ＲＴＳによるＩＬ−１２のアデノウイルス送達および発現の腫瘍内投与の安全性および忍容性を評価すること；（２）抗ＰＤ−１抗体（例えば、ニボルマブ）と共に投与した場合のＡｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２＋ベレジメクスの最適用量を決定すること；（３）抗ＰＤ−１抗体（例えば、ニボルマブ）と共に投与した場合のＡｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２＋ベレジメクスの客観的腫瘍奏功率（ＯＲＲ）、無進行生存（ＰＦＳ）、および偽性進行率（ＰＳＰ）を決定すること（調査者による応答の評価による）；（４）ニボルマブと共に投与した場合のＡｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２＋ベレジメクスの全生存（ＯＳ）を決定すること；（５）ニボルマブと共に投与した場合のＡｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２＋ベレジメクスにより惹起される細胞性および体液性免疫応答を評価すること；ならびに（６）抗ＰＤ−１抗体（例えば、ニボルマブ）の投与後のベレジメクスの薬物動態（ＰＫ）プロファイルを決定することである。
【０２８８】
標的試験集団は、再発性または進行性神経膠芽腫などのグリオーマを有するヒト成人（対象）を含む。ある特定の試験サブセットでは、神経膠芽腫を有する対象は、免疫チェックポイント経路の阻害剤（例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＰＤ−Ｌ２、抗ＣＤ１３７、もしくは抗ＣＴＬＡ−４抗体）、またはＴ細胞を特異的に標的化する他の薬剤で以前に処置されたことがない。
【０２８９】
標的対象集団に関する基準は、（１）１８歳以上かつ７５歳以下の年齢の男性または女性の対象；（２）腫瘍切除、腫瘍生検、および／または試料収集の提供；（３）組織学的に確認された小脳テント上神経膠芽腫またはアーカイブ組織に由来する他の世界保健機関（ＷＨＯ）のグレードＩＩＩもしくはＩＶの悪性グリオーマ；（４）標準初期療法後の神経腫瘍における応答評価（ＲＡＮＯ）基準による磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）による腫瘍再発／進行のエビデンス；（５）外科手術および／または生検ならびに化学放射線を含む以前の標準治療の抗腫瘍処置を含んでもよい。試験基準は、対象が、医師により決定された場合、もしあれば、以前の処置の毒性効果から回復したことを含んでもよい。以前の療法からのそのような「ウォッシュアウト期間」は、以下のように定義することができる：（１）ニトロソウレア、６週間；（２）他の細胞傷害剤、４週間；（３）ベバシズマブを含む抗血管新生剤、４週間；（４）低分子チロシンキナーゼ阻害剤を含む他のがん標的剤、２週間；（５）ワクチンに基づく療法、３カ月；（６）登録前および処置後に造影剤を用いる標準的なＭＲＩスキャンを受けることができる；（７）７０以上のカルノフスキーパフォーマンスステータス；（８）十分な骨髄保存ならびに肝機能および腎機能（以下の検査値要件：（ａ）ヘモグロビン≧９ｇ／Ｌ；（ｂ）リンパ球＞５００／ｍｍ３；（ｃ）絶対好中球数≧１５００／ｍｍ３；（ｄ）血小板≧１００，０００／ｍｍ３；（ｅ）血清クレアチニン、正常上限（ＵＬＮ）の１．５倍以下；（ｆ）アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）およびアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、肝臓転移が立証された対象については、ＵＬＮの２．５倍以下、ＡＬＴおよびＡＳＴ、ＵＬＮの５倍以下；（ｇ）総ビリルビン、ＵＬＮの１．５倍未満；（ｈ）正常施設限界内の国際標準化比（ＩＮＲ）および活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）によって評価される）；（９）男性および女性の対象が、初期試験スクリーニングから試験薬の最後の用量後まで、高度に信頼できる避妊方法（１年あたりの予想失敗率が５％未満である）を使用することに同意する。妊娠の可能性がある女性（閉経周辺期の女性は、少なくとも１２カ月間にわたって無月経であり、妊娠の可能性がないと考えなければならない）は、スクリーニング時に妊娠テスト陰性でなければならない；（１０）正常なＥＣＧおよびパルスオキシメトリーによる末梢酸素飽和度（ＳｐＯ２）≧９０％によって示される正常な心肺機能。
【０２９０】
対象除外基準は、（１）ベレジメクスを開始する４週間以内の放射線療法処置；（２）臨床的に有意な頭蓋内圧の上昇（例えば、切迫しているヘルニア形成または即時の苦痛緩和処置の要求）または制御されていない発作を示す対象；（３）既知の免疫抑制疾患、または自己免疫状態、および／または慢性ウイルス感染（例えば、ヒト免疫不全ウイルス［ＨＩＶ］、肝炎）；（４）最初のベレジメクス投与の２週間以内の臨床的に意義のある急性感染の処置のための全身性抗細菌剤、抗真菌剤、または抗ウイルス剤の使用。慢性感染のための同時療法は許可されない。対象は、Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２注入前に熱がない；必要に応じて、予防的な抗生物質のみが手術時に使用される；（５）試験薬の最初の投与前の７日以内の酵素誘導性抗てんかん薬（ＥＩＡＥＤ）の使用（注：レベチラセタムはＥＩＡＥＤではなく、許可される）；（６）皮膚の非メラノーマがんまたは子宮頸部のｉｎ  ｓｉｔｕの癌腫または非転移性前立腺がんを除く、処置を必要とする他の同時に起こる臨床的に活性な悪性疾患；（７）女性看護師または妊娠女性；（８）ベレジメクスへの以前の曝露；（９）医療モニターと相談なしでの、ベレジメクス投与前の７日以内のシトクロムＰ４５０  ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）（ＥＣ１．１４．１３．９７）を誘導する、阻害する、またはその基質である薬剤の使用；（１０）神経外科手順に関する禁忌の存在；（１１）対象の安全および／または試験プロトコールの順守を脅かす不安定な、または臨床的に意義のある同時に起こる医学的状態（例としては、限定されるものではないが、スクリーニングの２カ月以内の大腸炎、肺炎、不安定狭心症、鬱血性心不全、心筋梗塞、および生命を脅かす心室性不整脈または制御されていない喘息のための進行中の維持療法が挙げられる）；ならびに（１２）心筋炎または鬱血性心不全（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｌａｓｓｆｉｃａｔｉｏｎ  ＩＩＩまたはＩＶによって定義される）、ならびに試験登録の６カ月前の不安定狭心症、重篤な制御されていない心臓不整脈、制御されていない感染、または心筋梗塞の病歴、のうちのいずれか１つまたは複数を含んでもよい。
【０２９１】
試験設計。試験例は、再発性または進行性神経膠芽腫を有する対象における、静脈内（ＩＶ）投与されるＰＤ−１特異的抗体（例えば、ニボルマブ）と組み合わせた、ＰＯ投与されるＡｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ１２（２×１０１１ウイルス粒子［ｖｐ］）および２つの漸増用量のベレジメクス（１０および２０ｍｇ）の腫瘍内注入を含む。変動するコルチコステロイドの使用または曝露（直前の使用または曝露なし（すなわち、外因的に投与されるコルチコステロイドが対象の系に検出可能に残存しないように、その後、モニタリングまたは検出の現在の日常的な方法を使用する）；治療的に低いコルチコステロイド用量の使用または曝露；試験プロトコールおよび処置の直前および／またはその間の、治療的に高いコルチコステロイド用量の使用または曝露などを含む）の存在下で観察される安全性プロファイルに基づいて、ニボルマブと組み合わせて投与された場合のＡｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２＋ベレジメクスの安全性および許容量を決定する。
【０２９２】
対象を３つのコホートに登録して、１ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇのＰＤ−１特異的抗体（例えば、ニボルマブ）と共に、２つの異なる用量レベルのベレジメクス（例えば、１０ｍｇまたは２０ｍｇ）を受けさせることができる。Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ１２の用量は、コホート間で一定（２×１０１１ｖｐ）に保持してもよい。
【０２９３】
例えば、全てのコホートにおいて、対象は、−７日目に抗ＰＤ−１抗体（例えば、ニボルマブ）を受けてもよい。０日目に、対象は、Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ１２の注入の３（±２）時間前に、１用量のベレジメクスを摂取してもよい。Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ１２（２×１０１１ｖｐ）は、０日目に注入により投与される。Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ１２投与の日は、０日目と指定される。Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２を、腫瘍内に、または腫瘍の辺縁部に送達し、例えば、０．１ｍＬの全量を送達してもよい。
【０２９４】
Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２注入の後、ベレジメクスを、例えば、１４日間にわたって毎日、経口投与してもよい。最初の開頭術後のベレジメクス用量を、好ましくは、食事と共に１日目に与えてもよい。その後のベレジメクス用量を、例えば、朝の通常の食事の約３０分以内に、１日１回摂取してもよい。２〜１４日目の投薬は、１日目の投薬とほぼ同じ１日の時間（±１時間）であってもよい。
【０２９５】
対象は、１５日目に、およびその後２週間毎に、１用量のＰＤ−１特異的抗体（例えば、ニボルマブ）（例えば、１ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇのいずれか）を受けてもよい。ニボルマブ投薬の遅延は、改善された治療効果を可能にしてもよい。試験例のスキームは、図１１に示される。
【０２９６】
用量漸増。対象の用量漸増は、標準的な３＋３（３プラス３）試験形式に従って進行してもよい。例えば、第１のコホートにおける対象を、次の対象が投薬される前、２８日目までモニタリングしてもよい。その後のコホートでは、第１の対象を、同じコホートにおける第２および第３の対象を登録する前、２８日目までモニタリングしてもよい。用量制限毒性（ＤＬＴ）評価期間は、０日目〜２８日目と定義してもよい。対象がＡｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２＋ベレジメクスではなく、ＰＤ−１特異的抗体（例えば、ニボルマブ）を受ける場合、ＤＬＴに関して少なくとも３人の対象の評価を可能にするために、対象を替えてもよい。用量漸増するための安全性の決定および推奨は、コホートにおける全ての投薬された対象が、Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２注入後、少なくとも２８日間にわたって評価された後に行われてもよい。対象は、１５日目および２８日目に、コホート特異的用量のＰＤ−１特異的抗体（例えば、ニボルマブ）を受けてもよい。資格のある調査者による再検討の後、１ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−１抗体（例えば、ニボルマブ）を受けた対象に、その後の用量について３ｍｇ／ｋｇのニボルマブまで漸増させることを許可してもよい。
【０２９７】
ベレジメクス用量脱漸増。用量漸増を進行させるべきではないと決定された場合、用量脱漸増を行ってもよい。ベレジメクス用量の脱漸増は、以下の通りであってよい：２以上のＤＬＴが観察されたコホートから５ｍｇの増分（例えば、２０ｍｇから減少して１５ｍｇ）での脱漸増。脱漸増コホートにおいて、２より小さいＤＬＴがある場合、最大許容量（ＭＴＤ）に達していると考えてもよいか、または５ｍｇずつ用量を漸増することを考えてもよい（例えば、１０ｍｇから増加して１５ｍｇ）。ＰＤ−１特異的抗体（例えば、ニボルマブ）と関連すると考えられる毒性の事象では、ＰＤ−１特異的抗体（例えば、ニボルマブ）投薬の個別管理を、製品ラベルに従って行うことができる。
【０２９８】
試験期間。対象スクリーニングの開始時から、生存追跡の完了までの試験の持続期間は、登録のための１８カ月および追跡のための２４カ月を含む、約４２カ月であってもよい。試験を完了する最後の対象が試験上で６カ月に達した後、一次分析を実施することができる。試験の開始は、最初の対象が試験に同意する日付と定義され、試験終了日は、最後の対象の最後の訪問の日付である。
【０２９９】
ＤＬＴの定義。ＤＬＴは、以下の状態のいずれかを満たす、０日目から２８日目までにニボルマブおよびＡｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２＋ベレジメクスを受けた対象において起こる事象と定義される：（１）手術的介入を必要とし、Ａｄ  ＲＴＳ  ｈＩＬ１２＋ベレジメクスおよびニボルマブに起因すると感じられた任意の局部反応；（２）緊急の介入を必要とする生命を脅かす結果を有するか、または死亡をもたらし、Ａｄ  ＲＴＳ  ｈＩＬ１２＋ベレジメクスおよびニボルマブに起因すると感じられる任意の局部反応；（３）Ａｄ  ＲＴＳ  ｈＩＬ１２＋ベレジメクスおよびニボルマブと少なくとも関連すると思われる任意のグレード３以上の非血液学的有害事象；（４）Ａｄ  ＲＴＳ  ｈＩＬ１２＋ベレジメクスおよびニボルマブと少なくとも関連すると思われ、少なくとも５日間持続する任意のグレード４の血液毒性；（５）Ａｄ  ＲＴＳ  ｈＩＬ１２＋ベレジメクスおよびニボルマブと少なくとも関連すると思われるグレード３以上の血小板減少症。診断的脳腫瘍生検は、ＤＬＴとは考えない。疲労、発作、頭痛、および脳浮腫は、この集団において一般的に観察され、毒性の等級に従って記録されるが、Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２＋ベレジメクスとニボルマブとの組合せとの関係が主な寄与因子であると見なされない限り、ＤＬＴと考えない。
【０３００】
停止規則。いずれかの対象が、ＤＬＴ評価期間において、手術的介入を必要とする局部反応；緊急の介入を必要とする生命を脅かす結果を有するか、もしくは死亡をもたらす局部反応；または５日間持続するグレード４の血液毒性を経験する場合、安全審査委員会による事象の審査の間、新しい対象の登録を停止する。ＳＲＣは、関連する用量レベルでの追加患者の登録、関連する用量レベルでのベレジメクス投薬の脱漸増、または追加対象の登録前のプロトコールの修正もしくは試験への登録の中止に関する決定を行う。投薬を脱漸増する決定が行われる事象では、ＳＲＣは、以前に評価されたより低い用量での投薬の妥当性または中間の用量レベルの探索を評価する。いずれかの対象が、ＤＬＴ評価期間において、手術的介入を必要とする局部反応；緊急の介入を必要とする生命を脅かす結果を有するか、もしくは死亡をもたらす局部反応を経験する場合、資格のある調査者は、試験薬との関係を考察し、進行中の対象において活性薬剤投薬を継続する決定を行うために緊急のＳＲＣ会合を開催するか否かを決定する。
【０３０１】
ＭＴＤの定義。ＭＴＤは、同じコホートの３３％以上の対象がＤＬＴを経験する用量よりも下の用量レベルと定義される。同じコホートにおいて２のＤＬＴが生じる場合、用量漸増は、ＤＬＴを経験するコホートにおいて停止する。
【０３０２】
安全性評価。国立がん研究所（ＮＣＩ）の有害事象共通用語基準（ＣＴＣＡＥ）ｖ４．０３を使用して、全安全集団（ＯＳＰ）および評価可能安全集団（ＥＳＰ）において、安全性を評価する。ＤＬＴ評価期間（０日目から２８日目まで）に、いずれかの対象が手術的介入を必要とし、Ａｄ  ＲＴＳ  ｈＩＬ１２＋ベレジメクスとニボルマブとの組合せに起因すると感じられる局部反応；緊急の介入を必要とする生命を脅かす結果を有するか、もしくは死亡をもたらし、Ａｄ  ＲＴＳ  ｈＩＬ１２＋ベレジメクスとニボルマブとの組合せに起因すると感じられる任意の局部反応；またはＡｄ  ＲＴＳ  ｈＩＬ１２＋ベレジメクスとニボルマブとの組合せと少なくとも関連すると思われ、少なくとも５日間持続する任意のグレード４の血液毒性を経験する場合、ＳＲＣによる事象の審査の間、新しい対象の登録を停止する。安全性評価は、ＡＥ報告ならびにバイタルサイン、身体検査および神経学的検査、心電図（ＥＣＧ）、臨床検査値、ならびにＡＥの頻度および重症度のモニタリングの結果の医学的審査に基づくであろう。ＡＥの発生を表にし、潜在的有意性および臨床的重要性について審査する。安全性データの報告期間は、ＩＣＦ署名の日付から、任意の試験薬の最後の投与の３０日後までであろう。
【０３０３】
ＭＴＤの評価。拡大コホートは、このサブ試験においては前向きに計画されない。決定されたＭＴＤでの、拡大コホートの一部としての、追加対象を登録する決定は、プロトコールに記載されたように、ＭＴＤが同定され、安全性が評価された後にのみＳＲＣによって行われるであろう。
【０３０４】
効能の評価。（１）腫瘍応答評価。ＥＳＰを、ＯＲＲ、ＰＦＳ、ＰＳＰ、およびＯＳの調査者による評価のために評価する。応答を、ｉＲＡＮＯ基準を使用して評価する。（２）免疫応答評価。限定されるものではないが、ＩＬ１２、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、インターフェロンガンマ誘導タンパク質１０（ＩＰ１０）、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ１０、およびウイルス成分またはｈＩＬ１２に対する中和抗体のレベルなどの、免疫学的および生物学的マーカーを、処置前および処置後の血清試料中で評価する。（３）限定されるものではないが、分化クラスター（ＣＤ）抗原ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、およびＦＯＸＰ３、ＣＤ５６、ＣＤ４５ＲＯ、ナチュラルキラー（ＮＫ）、ＰＤ−Ｌ１、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）、およびヒト白血球抗原対立遺伝子状態などの、免疫細胞集団マーカーを、末梢血および腫瘍中で評価する。（４）薬物動態。ベレジメクスのＰＫを、用量漸増および任意の提唱される拡大コホートにおける各用量レベルで評価する。
【０３０５】
[実施例６]
再発性または進行性神経膠芽腫を有する対象におけるＡｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２＋ベレジメクスの評価のための拡大サブ試験臨床プロトコール
以下は、本発明を実行するための（ヒト）臨床プロトコールにおいて：すなわち、再発性神経膠芽腫または進行性神経膠芽腫の処置のためのＡｄ−ＲＴＳ−ＩＬ−１２＋ベレジメクスの投与の形態で使用することができるパラメーターの例である。
【０３０６】
試験目的。（１）再発性または進行性神経膠芽腫を有する対象における、腫瘍内アデノウイルスＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ＲＴＳ（登録商標））ヒトインターロイキン−１２（Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２）および経口（ＰＯ）ベレジメクス（ＲＴＳアクチベーターリガンド）の安全性および忍容性を決定する。（２）Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２＋ベレジメクスの全生存（ＯＳ）を決定する。（３）ベレジメクスの薬物動態（ＰＫ）プロファイルを決定する。（４）脳腫瘍と血液とのベレジメクス濃度比を決定する。（５）客観的腫瘍奏功率（ＯＲＲ）、無進行生存（ＰＦＳ）、および偽性進行率（ＰＳＰ）などを（調査者による応答評価によって）決定する。（６）Ａｄ  ＲＴＳ  ｈＩＬ１２＋ベレジメクスによって惹起される細胞性および体液性免疫応答を評価する。
【０３０７】
試験設計。再発性または進行性神経膠芽腫を有する対象における、Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２（２×１０１１個のウイルス粒子［ｖｐ］）の腫瘍内注入およびＰＯ投与される２０ｍｇのベレジメクスの試験例。この試験は、スクリーニング期間、処置期間、および生存追跡期間を含む。インフォームドコンセント文書（ＩＣＦ）に署名した後、対象は適格性を評価するためのスクリーニング期間に入る。Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２の２×１０１１ｖｐおよびベレジメクス２０ｍｇの用量は一定である。Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２投与の日は、０日目と指定される。０日目に、対象は、Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２の注入の３±２時間前に、１用量のベレジメクスを摂取し、Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２（２×１０１１ｖｐ）をフリーハンド注射によって投与する。Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２を、０．１ｍＬの全量について、腫瘍内に、または腫瘍の辺縁部に送達する。各部位に送達される総量を、ＣＲＦに記録する。計画された合計注入容量未満が投与される事象では、その理由を提示する。脳室内もしくは大脳基底槽への注入または他の重要部位を避けるために、注意を払うべきである。Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２注入の後、ベレジメクスを１４日間にわたって経口投与する。最初の開頭術後のベレジメクス用量を、好ましくは、食事と共に１日目に与えるべきである。その後のベレジメクス用量を、朝の通常の食事の約３０分以内に、１日１回摂取すべきである。２〜１４日目の投薬は、１日目の投薬とほぼ同じ１日の時間（＋／−１時間）であるべきである。
【０３０８】
適格集団。試験例の集団は、代替的な治癒療法がない再発性または進行性のグレードＩＶの神経膠芽腫（本明細書では以後、神経膠芽腫と称する）を有する成人対象を含んでもよい。グレードＩＩＩの悪性グリオーマを有する対象は、このサブ試験に参加するのに適格ではない。試験例の集団は、神経膠芽腫についてベバシズマブで以前に処置されたことがなく（浮腫を制御するためのベバシズマブの短期使用（４用量未満）は許容される）、以前の４週間にコルチコステロイドを受けたことがない、登録にとって適格である、その疾患を有する対象を含んでもよい。
【０３０９】
対象組入れ基準は、以下のいずれか１つまたは複数を含んでもよい：（１）１８歳以上７５歳以下の年齢の男性または女性の対象；（２）任意の試験特異的手順を受ける前の、腫瘍切除、腫瘍生検、試料収集、および治験薬による処置に関するインフォームドコンセント文書の提供；（３）組織学的に確認された小脳テント上神経膠芽腫；（４）標準初期療法後の神経腫瘍における応答評価（ＲＡＮＯ）基準による磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）による腫瘍再発／進行のエビデンス；（５）外科手術および／または生検ならびに化学放射線を含む以前の標準治療の抗腫瘍処置。登録時に、対象は、担当医によって決定されるように、以前の処置の毒性効果から回復していなければならない。以前の療法からのウォッシュアウト期間は、以下のように意図される：（ａ）ニトロソウレア：６週間；（ｂ）他の細胞傷害剤：４週間；（ｃ）抗血管新生剤：４週間（浮腫を制御するためのベバシズマブの短期使用（４用量未満）は許容される）；（ｄ）低分子チロシンキナーゼ阻害剤を含む標的剤：２週間；（ｅ）ワクチンに基づく療法：３カ月；（６）登録前および処置後に造影剤を用いる標準的なＭＲＩスキャンを受けることができる；（７）７０以上のカルノフスキーパフォーマンスステータス；（８）十分な骨髄保存ならびに肝機能および腎機能（以下の検査値要件：（ａ）ヘモグロビン≧９ｇ／Ｌ；（ｂ）リンパ球＞５００／ｍｍ３；（ｃ）絶対好中球数≧１５００／ｍｍ３；（ｄ）血小板≧１００，０００／ｍｍ３；（ｅ）血清クレアチニン、正常上限（ＵＬＮ）の１．５倍以下；（ｆ）アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）およびアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、ＵＬＮの２．５倍以下。肝臓転移が立証された対象については、ＡＬＴおよびＡＳＴ、ＵＬＮの５倍以下；（ｇ）総ビリルビン、ＵＬＮの１．５倍未満；（ｈ）正常施設限界内の国際標準化比（ＩＮＲ）および活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）または部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）によって評価される）；（９）男性および女性の対象が、スクリーニング訪問から試験薬の最後の用量の２８日後まで、高度に信頼できる避妊方法（１年あたりの予想失敗率が５％未満である）を使用することに同意しなければならない。妊娠の可能性がある女性（閉経周辺期の女性は、少なくとも１２カ月間にわたって無月経であり、妊娠の可能性がないと考えなければならない）は、スクリーニング時に妊娠テスト陰性でなければならない。
【０３１０】
対象除外基準は、以下のいずれか１つまたは複数を含んでもよい：（１）ベレジメクスを開始する４週間以内の放射線療法処置；（２）臨床的に有意な頭蓋内圧の上昇（例えば、切迫しているヘルニア形成または即時の苦痛緩和処置の要求）または制御されていない発作を示す対象；（３）既知の免疫抑制疾患、または自己免疫状態、および／または慢性ウイルス感染（例えば、ヒト免疫不全ウイルス［ＨＩＶ］、肝炎）；（４）最初のベレジメクス投与の２週間以内の臨床的に意義のある急性感染の処置のための全身性抗細菌剤、抗真菌剤、または抗ウイルス剤の使用。慢性感染のための同時療法は許可されない。対象は、Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２注入前に熱がない；予防的な抗生物質のみが手術時に使用される；（５）試験薬の最初の投与前の７日以内の酵素誘導性抗てんかん薬（ＥＩＡＥＤ）の使用。注：レベチラセタム（Ｋｅｐｐｒａ（登録商標））はＥＩＡＥＤではなく、許可される；（６）皮膚の非メラノーマがんまたは子宮頸部のｉｎ  ｓｉｔｕの癌腫または非転移性前立腺がんを除く、処置を必要とする他の同時に起こる臨床的に活性な悪性疾患；（７）女性看護師または妊娠女性；（８）ベレジメクスへの以前の曝露；（９）医療モニターと相談なしでの、ベレジメクス投与前の７日以内のＣＹＰ４５０３Ａ４を誘導する、阻害する、またはその基質である薬剤の使用；（１０）神経外科手順に関する禁忌の存在；（１１）調査者または医療モニターの見解で、対象の安全および／またはプロトコールの順守を脅かす不安定な、または臨床的に意義のある同時に起こる医学的状態。例としては、限定されるものではないが、スクリーニングの２カ月以内の大腸炎、肺炎、不安定狭心症、鬱血性心不全、心筋梗塞、および生命を脅かす心室性不整脈または制御されていない喘息のための進行中の維持療法が挙げられる；（１２）それらの疾患のためのベバシズマブによる以前の処置（浮腫を制御するためのベバシズマブの短期使用（４用量未満）は許可される）；（１３）以前の４週間に全身性コルチコステロイドを受けている対象。
【０３１１】
試験期間。対象スクリーニングの開始時から、生存追跡の完了までのこの試験の持続期間は、登録のための１２カ月および追跡のための２４カ月を含む、約３６カ月と予測される。試験を完了する最後の対象が試験上で１２カ月に達した後、一次分析を実施する。試験の開始は、最初の対象が試験に同意する日付と定義され、試験終了日は、最後の対象の最後の訪問の日付である。
【０３１２】
停止規則。いずれかの対象が、処置期間および初期追跡期間において、手術的介入を必要とする局部反応；緊急の介入を必要とする生命を脅かす結果を有するか、もしくは死亡をもたらす局部反応；５日間持続するグレード４の血液毒性；または投薬の３０日以内に起こる死亡（進行性疾患と関連する死亡以外）を経験する場合、安全審査委員会（ＳＲＣ）による事象の審査の間、新しい対象の登録を停止する。ＳＲＣは、関連する用量レベルでの追加患者の登録、ベレジメクス投薬の脱漸増、または追加対象の登録前のサブ試験プロトコールの修正もしくは試験への登録の中止に関する決定を行う。投薬を脱漸増する決定が行われる事象では、ＳＲＣは、以前に評価されたより低い用量での投薬の妥当性または中間の用量レベルの探索を評価する。いずれかの対象が、処置期間および初期追跡期間において、手術的介入を必要とする局部反応；緊急の介入を必要とする生命を脅かす結果を有するか、もしくは死亡をもたらす局部反応を経験する場合、資格のある調査者は、試験薬との関係を考察し、進行中の対象において活性薬剤投薬を継続する決定を行うために緊急のＳＲＣ会合を開催するか否かを決定する。
【０３１３】
安全性評価。国立がん研究所（ＮＣＩ）の有害事象共通用語基準（ＣＴＣＡＥ）ｖ４．０３を使用して、全安全集団（ＯＳＰ）および評価可能安全集団（ＥＳＰ）において、安全性を評価する。安全性評価は、ＡＥ報告ならびにバイタルサイン、身体検査および神経学的検査、心電図（ＥＣＧ）、臨床検査値、ならびにＡＥの頻度および重症度のモニタリングの結果の医学的審査に基づくであろう。ＡＥの発生を表にし、潜在的有意性および臨床的重要性について審査する。安全性データの報告期間は、ＩＣＦ署名の日付から、任意の試験薬の最後の投与の３０日後までであろう。
【０３１４】
効能の評価。（１）腫瘍応答評価：ＥＳＰを、ＯＲＲ、ＰＦＳ、ＰＳＰ、およびＯＳの調査者による評価のために評価する。応答を、ｉＲＡＮＯ基準を使用して評価する。（２）免疫応答評価：限定されるものではないが、ＩＬ１２、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、インターフェロンガンマ誘導タンパク質１０（ＩＰ１０）、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ１０、およびウイルス成分またはｈＩＬ１２に対する中和抗体のレベルなどの、免疫学的および生物学的マーカーを、処置前および処置後の血清試料中で評価する。限定されるものではないが、分化クラスター（ＣＤ）抗原ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、およびＦＯＸＰ３、ＣＤ５６、ＣＤ４５ＲＯ、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、および細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）などの、免疫細胞集団マーカーを、末梢血および腫瘍中で評価する。（３）薬物動態：ベレジメクスのＰＫパラメーターを、標準的な方法を使用してベレジメクスの血漿レベルに基づいて評価および決定し、それらのものは、限定されるものではないが、最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）、最大血漿濃度までの時間（Ｔｍａｘ）、半減期（ｔ１／２）、曲線下面積（ＡＵＣ）、分布体積（Ｖｄ）、およびクリアランス（ＣＬ）を含むであろう。
【０３１５】
[実施例７]
小児脳腫瘍対象におけるＡｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２＋ベレジメクスの評価のための臨床プロトコール
以下は、本発明を実施するための（ヒト）臨床プロトコールにおいて：すなわち、びまん性内在性橋膠腫（ＤＩＰＧ）患者などの、小児脳腫瘍対象の処置のための、ＰＤ−１特異的抗体と組み合わせたＡｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２＋ベレジメクスの投与の形態で使用することができるパラメーターの例である。
【０３１６】
標的目標は、（１）小児脳腫瘍対象における腫瘍内Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２および変化するＰＯベレジメクス用量の安全性および忍容性を決定すること；（２）腫瘍内Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２と共に与えた場合の、小児脳腫瘍対象における第ＩＩ相ベレジメクス推奨用量を決定すること；（３）Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２＋ベレジメクスで処置した対象におけるベレジメクスの薬物動態（ＰＫ）を決定すること；（４）Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２＋ベレジメクスで処置した対象（第１治療群のみ）における、脳腫瘍と血液とのベレジメクス濃度比を決定すること；（５）小児脳腫瘍対象におけるＡｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２＋ベレジメクスにより惹起される細胞性および体液性免疫応答を評価すること；（６）Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２＋ベレジメクスで処置した対象の客観的腫瘍奏功率（ＯＲＲ）および無進行生存（ＰＦＳ）を含む、調査者による応答の評価を決定すること；（７）Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２＋ベレジメクスで処置した対象の全生存（ＯＳ）を決定すること；（８）処置に対する応答の予測において腫瘍および／または血液マーカーの値を評価することである。
【０３１７】
試験設計：試験例は、小児脳腫瘍対象における、腫瘍内注入により投与されたＡｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２および変化するＰＯベレジメクス用量を含む。この試験は、可変的コルチコステロイド曝露の存在下で観察される安全性プロファイルに基づいて安全かつ忍容できる第ＩＩ相小児用量を決定するために、１回固定用量の腫瘍内Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２（２×１０１１個のウイルス粒子［ｖｐ］）および漸増ベレジメクス用量を調査する。試験例は、３つの期間に分割される：スクリーニング期間、処置期間、および追跡期間（初期および長期）。必要に応じて、インフォームドコンセント文書（ＩＣＦ）または対象同意書に署名した後、対象は適格性を評価するためのスクリーニング期間に入る。適格な対象を、診断に従って、２つの治療群のうちの１つに階層化する。第１治療群は、びまん性内在性橋膠腫（ＤＩＰＧ）を有する対象を除いて、標準治療の開頭術および腫瘍切除のためにスケジュール化される小児脳腫瘍対象に開かれている。第２治療群は、以前の標準的な局所放射線療法（２週間以上および１０週間以下）の後にあるＤＩＰＧを有する対象にのみ開かれている。第１治療群の対象は、切除手順の前に１用量のベレジメクスを受ける。試料（腫瘍、血液、および脳脊髄液［ＣＳＦ］［入手可能な場合］）を、以下に記載されるように収集する。Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２腫瘍内注入の後、第１治療群の対象は、合計１５用量のベレジメクスについて１４日間にわたってＰＯベレジメクスを継続する。第２治療群の対象は、定位固定注射によって単回Ａｄ  ＲＴＳ  ｈＩＬ−１２（２×１０１１ｖｐ）用量を受け、１４日間にわたってＰＯベレジメクスを受ける。
【０３１８】
第１治療群：開頭術および腫瘍切除（ＤＩＰＧを除く）のためにスケジュール化された小児脳腫瘍対象。腫瘍切除について臨床適応となる対象は、空腹時に、開頭術手順の３（±２）時間前にベレジメクスを受ける（他の薬剤を除く）。腫瘍切除時に、脳腫瘍、血液、およびＣＳＦ（入手可能な場合）試料を収集して、脳腫瘍、血液、およびＣＳＦ（入手可能な場合）の間のベレジメクス濃度比を決定する。腫瘍切除の直後、Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２（２×１０１１ｖｐ）を、０．１ｍＬの全量について残存腫瘍内の約２部位にフリーハンド注射によって投与する。各部位に送達される総量を、症例報告書(ＣＲＦ）に記録する。計画された合計注入容量未満が投与される事象では、その理由を提示する。脳室内もしくは大脳基底槽への注入または他の重要部位を避けるために、注意を払うべきである。Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２投与の日は、０日目と指定される。利用可能な場合、術中磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）スキャンを行って、Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２注入物を造影剤増強腫瘍組織の領域に誘導すべきである。Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２注入の後、ＰＯベレジメクスを１４日間にわたって１日１回（ＱＤ）投与する。最初の切除後ベレジメクス用量は、１日目に、好ましくは、朝の通常の食事の完了後、約３０分以内に与えるべきである。ベレジメクス用量間は最小で１０時間であるべきである。その後のベレジメクス用量（２〜１４日目）は、１日目の投与とほぼ同じ日の時間（±１時間）に、通常の食事の完了の約３０分以内に摂取すべきである。
【０３１９】
第２治療群：腫瘍切除を受けないＤＩＰＧを有する対象。腫瘍切除を受けないＤＩＰＧを有する対象は、０日目に標準的な定位固定手術によってＡｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２を受ける。定位固定手術の時点で、脳腫瘍生検および血液試料を収集する。Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２（２×１０１１ｖｐ）を、定位固定注射によって腫瘍内部位に投与する。Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２投与の日は、０日目と指定される。Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２を、０．１ｍＬの全量について、腫瘍内部位に、または腫瘍の末梢に送達する。各部位に送達される総量を、ＣＲＦに記録する。計画された合計注入容量未満が投与される事象では、その理由を提示する。脳室内もしくは大脳基底槽への注入または他の重要部位を避けるために、注意を払うべきである。Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２注入の後、ＰＯベレジメクスを１４日間にわたってＱＤで投与する。最初のベレジメクス用量は、１日目に、好ましくは、朝の通常の食事の完了後、約３０分以内に与えるべきである。その後のベレジメクス用量（２〜１４日目）は、１日目の投与とほぼ同じ日の時間（±１時間）に、通常の食事の完了の約３０分以内にＱＤで摂取すべきである。ベレジメクス用量間は最小で１０時間であるべきである。
【０３２０】
コホート：例えば、２つの用量のベレジメクス（１０ｍｇおよび２０ｍｇ）を使用する。対象の登録およびベレジメクスの用量漸増は、異なる安全性および忍容性プロファイルを示してもよい２群（すなわち、治療群）の対象を独立に評価するために改変された、標準的な３＋３設計に従って進行し、各治療群の第１のコホートは１０ｍｇのベレジメクスを受け、次いで、各治療群の第２のコホートは２０ｍｇのベレジメクスを受ける。試験治療群および割り当て用量を、４つのコホートに分割することができる。コホート１−第１治療群、開頭術手順、１０ｍｇベレジメクス用量（ＢＳＡ調整用量）；コホート２−第１治療群、開頭術手順、２０ｍｇベレジメクス用量（ＢＳＡ調整用量）；コホート３−第２治療群、定位固定手順、１０ｍｇベレジメクス用量（ＢＳＡ調整用量）；コホート４−第２治療群、定位固定手順、２０ｍｇベレジメクス用量（ＢＳＡ調整用量）。
【０３２１】
各コホートは、適格性基準を満たす２１歳以下の対象からなる。コホート１中の最後の対象が用量制限毒性（ＤＬＴ）評価期間を完了し、ＳＲＣが認可したら、コホート２およびコホート３について登録を開いてもよい。コホート３中の最後の対象がＤＬＴ評価期間を完了し、ＳＲＣが認可したら、コホート４について登録を開いてもよい。各コホート中の各対象を、Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２注入後、２８日間にわたってモニタリングした後、追加の対象を同じコホートにおいて登録する。ＤＬＴの評価期間は、Ａｄ  ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２注入後、２８日である（０日目〜２８日目）。用量漸増するための安全性の決定および推奨は、コホートにおける全ての投薬された対象が、Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２注入後、少なくとも２８日間にわたって評価された後に行われる。
【０３２２】
試験集団。試験集団例は、ａ）従来の処置に応答しない、または代替的な治癒療法が存在しない、脳室系と直接つながっていない、再発性または難治性の小脳テント上脳腫瘍およびｂ）以前の標準的な局所放射線療法後の、生検が予め得られているＤＩＰＧを有する小児対象を含む。
【０３２３】
標的対象集団に関する基準は、以下を含んでもよい：（１）カプセル全体を嚥下する能力を示し、予め得られた生検の結果へのアクセスを提供する意思がある２１歳以下の男性または女性の対象；（２）適用可能な場合、任意の試験特異的手順を受ける前の、腫瘍切除、定位固定手術、腫瘍生検、試料収集、および／または試験薬による処置に関するインフォームドコンセント文書および同意書の提供；（３）第１治療群：脳室系と直接つながっていない（例えば、腫瘍と脳室とが物理的に分離しており、腫瘍が脳室系に直接開かれていない）、ＭＲＩによる二次元測定において２５％を超える増加を示したか、またはそうでなければ既知でない治癒的療法を用いては説明されない有意な神経増悪を示す難治性である、再発性または進行性小脳テント上腫瘍のエビデンス。第２治療群：ＤＩＰＧの臨床提示および脳橋の約２／３が含まれる同等のＭＲＩ。対象は、標準的な局所放射線療法（すなわち、５４００〜５９６０ｃＧｙの用量および１ｍｇ／ｍ２／日の最大デキサメタゾン）後、２週間以上１０週間以下であるべきである；（４）登録の時点で、対象は、主治医によって決定される場合、以前の処置の毒性効果から回復していなければならない。以前の療法からのウォッシュアウト期間は、以下のように意図される：（ａ）低分子チロシンキナーゼ阻害剤を含む標的剤：２週間；（ｂ）他の細胞傷害剤：３週間；（ｃ）ニトロソウレア：６週間；（ｄ）モノクローナル抗体免疫療法（例えば、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４）：６週間；（ｅ）ワクチンに基づくおよび／またはウイルス療法：３カ月；（５）以前の７日間にわたって安定または減少用量のデキサメタゾンにある；（６）登録前および処置後に造影剤を用いた標準的なＭＲＩスキャンを受けることができる；（７）年齢に適した機能的パフォーマンス：（ａ）５０以上のランスキースコアもしくは（ｂ）５０を超えるカルノフスキースコアもしくは（ｃ）２以下の米国東海岸癌臨床試験グループ（ＥＣＯＧ）スコアを有する；（８）以下の検査値要件：（ａ）ヘモグロビン≧８ｇ／Ｌ；（ｂ）絶対リンパ球数≧５００／ｍｍ３；（ｃ）絶対好中球数≧１０００／ｍｍ３；（ｄ）血小板≧１００，０００／ｍｍ３（増殖因子を輸血されていない［５日未満］）；（ｅ）血清クレアチニン、年齢に関する正常上限（ＵＬＮ）の１．５倍以下；（ｆ）アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）およびアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、年齢に関するＵＬＮの２．５倍以下；（ｇ）総ビリルビン、年齢に関するＵＬＮの１．５倍未満；（ｈ）正常施設限界内の国際標準化比（ＩＮＲ）および活性化トロンボプラスチン時間；（９）妊娠可能性のある男性および女性の対象が、スクリーニング訪問から試験薬の最後の用量の２８日後まで、高度に信頼できる避妊方法（１年あたりの予想失敗率が１％未満である）を使用することに同意しなければならない。妊娠可能性のある女性は、スクリーニング時に妊娠テスト陰性でなければならない。
【０３２４】
対象除外基準は、以下のいずれか１つまたは複数を含んでもよい：（１）最初のベレジメクス用量前の放射線療法処置：（ａ）４週間以下の局所照射；（ｂ）６週間以下の全脳照射；（ｃ）１２週間以下の頭蓋脊髄照射；第２治療群の対象（すなわち、ＤＩＰＧを有する）は、標準的な局所放射線療法（５４００〜５９６０ｃＧｙの用量および１ｍｇ／ｍ２／日の最大デキサメタゾン）後、２週間以上、１０週間以下でなければならない；（２）臨床的に有意な頭蓋内圧の上昇（例えば、切迫しているヘルニア形成または即時の苦痛緩和処置の要求）または制御されていない発作を示す対象；（３）体表面積（ＢＳＡ）が、提供される投薬表あたり、７５％未満の、または１２５％を超える標的用量に曝露される対象；（４）既知の免疫抑制疾患、自己免疫状態、および／または慢性ウイルス感染（例えば、ヒト免疫不全ウイルス［ＨＩＶ］、肝炎）；（５）最初のベレジメクス投与の２週間以内の臨床的に意義のある急性感染の処置のための全身性抗細菌剤、抗真菌剤、または抗ウイルス剤の使用。慢性感染のための同時療法は許可されない。対象は、Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２注入前に熱がない；予防的な抗生物質のみが手術時に許可される；（６）試験薬の最初の投与前の７日以内の酵素誘導性抗てんかん薬（ＥＩＡＥＤ）の使用。禁止および許可される抗てんかん薬については、別表４を参照されたい；（７）処置を必要とする、他の同時的な臨床的に活性な悪性疾患；（８）女性看護師または妊娠女性；（９）ベレジメクスへの以前の曝露；（１０）医療モニターと相談なしでの、ベレジメクス投与前の７日以内のシトクロムｐ４５０（ＣＹＰ４５０）３Ａ４を誘導する、阻害する、またはその基質である薬剤の使用；（１１）医療モニターと相談なしでのヘパリンまたはアセチルサリチル酸（ＡＳＡ）の使用；（１２）神経外科手順に関する禁忌の存在；（１３）医療モニターによって同意される調査者の見解で、対象の安全および／またはプロトコールの順守を脅かす不安定な、または臨床的に意義のある同時に起こる医学的状態。
【０３２５】
安全性評価。最初のレベルの安全性監視は、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｏｎｉｔｏｒのサイトを介して行う。試験の調査者、医療モニター、および他の適切なスポンサー代表者を含む、正式な安全審査委員会（ＳＲＣ）は、全体の安全性監視を提供する。また、必要に応じて、追加の外部の医療専門家および科学専門家を審査に参加するよう招いてもよい。別のチャーターがＳＲＣの活動を説明するであろう。簡単に述べると、ＳＲＣは、各コホート内の対象の安全性を評価する。各コホートの第１の対象に関して重要な安全事象が生じない場合、第２および第３の対象を登録し、処置する。第１の対象に関して重要な安全事象が生じる場合、安全事象を評価し、同じコホートにおける第２および第３の対象の登録に関する推奨および決定を行うために、ＳＲＣが開催される。各コホートの完了時に、ＳＲＣは、その後のコホートへの登録を開始してもよいかどうかを決定するために収集されたデータを審査するために、ＳＲＣは会合を行う。２０ｍｇのベレジメクス用量が割り当てられたコホートにおける登録（すなわち、コホート２および４）は、ＳＲＣが、より低レベルでの投薬（すなわち、適用可能な場合、コホート１および３）が用量漸増を不可能にするＤＬＴをもたらさなかったと決定するまで開始しない。第２治療群コホートの用量漸増または開始の推奨に加えて、ＳＲＣは、拡大コホートが許可されるべきかどうかを決定する。ＳＲＣが、漸増および／または拡大が保証されないと決定する事象では、調査の停止に関する決定が行われる。ＳＲＣの裁量で、より低用量で調査を継続してもよい。
【０３２６】
試験薬の用量および投与の様式。（１）Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２を、フリーハンド注射により、腫瘍切除の直後の残存腫瘍部位に（第１治療群）、または定位固定注入により腫瘍内部位に（第２治療群）投与する。（２）ベレジメクスを、ＰＯにより投与する。ベレジメクス用量間は最小で１０時間であるべきである。
【０３２７】
第１治療群：（コホート１および２）は、計画された開頭術の３（±２）時間前にベレジメクスを受け、さらに１４日間にわたってＡｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２投与後にベレジメクス投薬を継続する。その後のベレジメクス用量（1〜１４日目）は、１日目の投与とほぼ同じ日の時間（±１時間）に、通常の食事の完了の約３０分以内にＱＤで摂取すべきである。
【０３２８】
第２治療群：（コホート３および４）は、１４日間にわたるＡｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２投与後にのみベレジメクスを受ける。最初のベレジメクス用量は、１日目に、好ましくは、朝の通常の食事の完了後、約３０分以内に与えるべきである。その後のベレジメクス用量（２〜１４日目）は、１日目の投与とほぼ同じ日の時間（±１時間）に、通常の食事の完了の約３０分以内にＱＤで摂取すべきである。
【０３２９】
成人集団における第ＩＩＩ相用量（２０ｍｇ［約１０．６ｍｇ／ｍ２］）に基づいて、この試験は、Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２（２×１０１１ｖｐ）投与後に与えられる以下のＢＳＡ調整ベレジメクス用量を探索する。コホート１における出発用量は、１０ｍｇであり、これは約５．３ｍｇ／ｍ２である。実際に投与される用量は、対象のＢＳＡおよび利用可能なカプセルのサイズに依存するであろう。ベレジメクスは経口薬剤であり、固定されたカプセルサイズ（５ｍｇおよび２０ｍｇ）で供給されるため、実際の投与用量は、対象のＢＳＡに基づくものであり、５ｍｇずつに設定された丸め制約によって束縛される。スポンサーは、標的のｍｇ／ｍ２用量の２５％以内での投薬を可能にするように設計されたＢＳＡにより調整された投薬アルゴリズムを開発した。対象のＢＳＡが、７５％未満のまたは１２５％を超える標的割り当て用量に対象を曝露する場合、実際の投与用量は、標的ｍｇ／ｍ２用量が達成されることを確保するように改変される。対象に適切に投薬するために、登録のための最小限のＢＳＡ制限が満たされなければならない。ＢＳＡが相関投与用量を有しない潜在的な対象は、調査者および医療モニターの裁量で登録してもよいが、推奨される小児第ＩＩ相用量の評価において考慮されないであろう。これらの対象の投薬は、コホートがＳＲＣによって審査され、特定のレベル（１０ｍｇまたは２０ｍｇ）での投薬が漸増にとって、または推奨第２相小児用量として適切であると決定した場合にのみ開始することができる。これらの対象は、別々に分析される。
【０３３０】
表９は、このアルゴリズムを例示し、対象が５ｍｇの最小カプセルサイズに基づいて割り当てられた用量レベルで受けるＢＳＡにより調整された実際の投与用量を捕捉する。
【０３３１】
【表２】
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【０３３２】
用量漸増。各コホート中の各対象を、その後の対象が登録される前に２８日間モニタリングする。ＳＲＣは、コホート１中の最後の対象が２８日間のＤＬＴ評価期間を完了した後に開催する。ＳＲＣは、（１）コホート２の登録開始または調査の中止；（２）コホート３の登録開始に関する推奨を行う；ＳＲＣがコホート２および３の登録を推奨する場合、これらのコホートは同時に開始し、各コホート中の各対象を、その後の対象が同じコホート中に登録される前に２８日間にわたってモニタリングする。ＳＲＣは、各コホート中の最後の対象が２８日間のＤＬＴ評価期間を完了した後に開催する。コホート２および３は、ＳＲＣによって独立に審査される。ＳＲＣは、（１）コホート１の拡大またはコホート２の拡大；（２）コホート３の拡大またはコホート４の登録開始に関する推奨を行う。
【０３３３】
用量脱漸増。ＳＲＣは、コホートが、現行のベレジメクス用量で継続すること、より低い用量レベルで投薬を開始すること、または処置の中止を含む、他の手段を取ることを推奨する。漸増が進行すべきでないと決定される場合、用量の脱漸増を行ってよく、ＳＲＣは以下のようにベレジメクス用量を脱漸増することを考慮する：（１）２以上のＤＬＴが観察されたコホートから５ｍｇの増分での脱漸増（例えば、１５ｍｇ、２０ｍｇから脱漸増される）；（２）用量脱漸増コホートに２以上のＤＬＴが存在する場合、ＳＲＣは、５ｍｇのさらなる増分でベレジメクス用量を脱漸増すること（例えば、１０ｍｇから５ｍｇ減少する）、または以前に試験された用量レベルを推奨小児第ＩＩ相用量と宣言することを考慮する。
【０３３４】
ＤＬＴの定義。ＤＬＴは、以下の条件のうちの少なくとも１つを満たす最初の２８日間（すなわち、０日目〜２８日目）以内に起こる事象と定義される：（１）手術的介入を必要とし、試験薬に起因すると感じられる任意の局部反応；（２）緊急の介入を必要とする生命を脅かす結果を有するか、または死亡をもたらし、試験薬に起因すると感じられる任意の局部反応；（３）試験薬と少なくとも関連すると思われ、３日以上持続する任意のグレード３以上の非血液学的有害事象；（４）吐き気および嘔吐は、少なくともグレード３でなく、制吐剤に不応性でない限り、ＤＬＴとは考えない；（５）試験薬と少なくとも関連すると思われるグレード３以上の血小板減少症（５０，０００／ｍｍ３未満）；（６）試験薬と少なくとも関連すると思われ、５日以上持続する任意のグレード４の血液毒性（血小板減少症を除く）；（７）ＤＬＴが観察される前であるが、観察される毒性が、より高用量で許容できない毒性の強い可能性を示す場合、医療モニターによって用量漸増を停止させてもよい。診断的脳腫瘍生検は、ＤＬＴとは考えない。発作、頭痛、および脳浮腫または脳橋浮腫は、この集団において一般的に観察され、毒性の等級に従って記録されるが、試験薬との関係が主な寄与因子であると見なされない限り、ＤＬＴと考えない。一過的な神経学的変化が第２治療群において予想され、それらが１０日を超えて持続しない限り、ＤＬＴとは考えない。推奨小児第ＩＩ相用量での拡大コホートは、ＳＲＣによって適切と見なされる場合、各治療群において認められる。第１治療群では、拡大コホートへの登録を、用量漸増コホートにおいて収集されたデータに基づいて、特定の腫瘍型に限定してもよい。Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２およびベレジメクス用量での拡大コホートにおける追加の対象を登録する決定は、ＳＲＣによって行われる。拡大コホートが実行される場合、ベレジメクス用量を、毒性の事象において個々の対象について遅延させるか、または減少させることができる。拡大コホート中の対象の３３％以上がＤＬＴを経験する場合、用量漸増段階における定義を使用して、ＳＲＣによって推奨されるように、用量漸増段階において試験される次のより低用量で、または中間の用量で、追加の対象を登録してもよい。
【０３３５】
推奨小児第ＩＩ相用量の定義。推奨小児第ＩＩ相ベレジメクス用量を、以下に定義されるように、評価可能安全集団（ＥＳＰ）から決定する。推奨小児第ＩＩ相用量は、同じコホート中の対象の３３％以上がＤＬＴを経験する用量より低い用量レベルと定義される。同じコホートにおいて２のＤＬＴが生じる場合、用量漸増は、ＤＬＴを経験するコホートにおいて停止する。
【０３３６】
安全性評価。国立がん研究所（ＮＣＩ）の有害事象共通用語基準（ＣＴＣＡＥ）ｖ４．０３を使用して、以下に定義されるように、全安全集団（ＯＳＰ）および評価可能安全集団（ＥＳＰ）において、安全性を評価する。ＤＬＴ評価期間（０日目〜２８日目）において、いずれかの対象が手術的介入を必要とし、試験薬に起因すると感じられる局部反応；緊急の介入を必要とする生命を脅かす結果を有するか、もしくは死亡をもたらし、試験薬に起因すると感じられる任意の局部反応；または試験薬と少なくとも関連すると思われ、５日以上持続する、血小板減少症を除く、任意のグレード４の血液毒性を経験する場合、ＳＲＣによる審査の間、新しい対象の登録を停止する。安全性評価は、有害事象報告ならびにバイタルサイン、身体検査および神経学的検査、心電図（ＥＣＧ）、臨床検査値、ならびに有害事象の頻度および重症度のモニタリングの結果の医学的審査に基づくであろう。有害事象の発生を表にし、潜在的有意性および臨床的重要性について審査する。尿、糞便、唾液、口腔、および血液試料を収集し、ウイルス複製について試験する。安全性データの報告期間は、ＩＣＦまたは同意書署名の日付から、初期の追跡期間までであろう。
【０３３７】
評価のための基準。（１）腫瘍応答評価および全生存：ＥＳＰを、ＯＲＲ、ＰＦＳ、およびＯＳの調査者による評価のために評価する。腫瘍応答評価を特性評価するために使用される、ベースライン（２日目）での神経腫瘍に関する免疫療法応答評価（ｉＲＡＮＯ）基準を使用して、応答を評価する。小児ＲＡＮＯ基準の非存在下では、成人の応答基準を使用する。（２）免疫応答評価：ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−γ誘導タンパク質１０（ＩＰ−１０）、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、およびウイルス成分またはｈＩＬ−１２に対する中和抗体のレベルなどの、免疫学的および生物学的マーカーを、処置前および処置後の血清試料中で評価する。（３）分化クラスター（ＣＤ）抗原ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、およびＦＯＸＰ３、ＣＤ５６、ＣＤ４５ＲＯ、およびヒト白血球抗原対立遺伝子状態などの、免疫細胞集団マーカーを、試験手順のスケジュールにおいてスケジュール化されるように評価する。（４）薬物動態評価：ベレジメクスのＰＫパラメーターを、第１治療群および第２治療群における対象について、用量漸増および任意の提唱される拡大コホートにおけるそれぞれの用量レベルで評価する。
【０３３８】
統計的方法。（１）分析集団：（ａ）ＯＳＰは、少なくとも１用量のベレジメクス（腫瘍切除前および／もしくは定位固定手順後）を受けた全ての対象ならびに／またはＡｄ  ＲＴＳ  ｈＩＬ−１２を受けた全ての対象を含む；（ｂ）ＥＳＰは、Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２およびＡｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２投与後に少なくとも１用量のベレジメクスを受けた全ての対象を含む；（ｃ）薬物動態集団（ＰＫＰ）は、十分な時点でベレジメクスを受けた全ての対象を含む；（２）安全性分析：ＯＳＰを使用して、全ての安全性変数について安全性評価を実行する。ＥＳＰを使用して、以前に記載されたような、標準的な３＋３設計に基づいて、第１治療群と第２治療群とについて別々に、より高いベレジメクス用量への漸増に関する決定を行う。第１治療群および第２治療群（すなわち、それぞれ、コホート１および３）における第１の（１０ｍｇ）ベレジメクス用量コホートについては、最小で３人のＥＳＰ対象が、安全性の評価にとって適格でなければならない。さらに、任意のＤＬＴの評価を、プロトコールにより定義される基準に従って実施する。安全性変数を表にし、治療群および用量コホートによって提示する。試験薬への曝露および試験処置の中止の理由を表にする。全ての治療中に発生した有害事象（ＴＥＡＥ）を、医薬規制用語集（ＭｅｄＤＲＡ）を使用して器官別大分類および基本用語に従って符号化する。ＴＥＡＥを、試験薬、重症度、および重篤度との関係に従って対象の数およびパーセントによって表にする。検査室パラメーターを、訪問ごとにまとめる。バイタルサインおよび身体検査データを、訪問ごとに列挙する；（３）腫瘍応答および全生存分析：腫瘍応答分析を、ＥＳＰ上で実施する。調査者によるＯＲＲおよびＰＦＳの評価を、それぞれのコホートについて決定する。ＯＳは、試験薬の最初の用量から、死亡日までの期間と定義されるか、または試験薬の最初の用量後、２年経過しても生存している対象については、最後の追跡接触日で対象を審査する。両側信頼区間を、ＯＲＲについて計算する。ＰＦＳおよびＯＳを、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法を使用して分析する；（４）薬力学的、ＰＫ、および免疫学的分析：ベレジメクスＰＫパラメーターを、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ  Ｐｈｏｅｎｉｘ  ６４を使用してベレジメクスの血液（血漿）レベルに基づいて決定する。利用可能な薬力学的、免疫学的、および生物学的応答マーカーデータを、コホートごと、および訪問ごとにまとめる。
【０３３９】
試料サイズの決定。対象数の選択は、異なる安全性および忍容性プロファイルを示してもよい２人の対象の治療群の独立評価のために改変された、標準的な３＋３設計に基づくものであった。コホートあたり３〜６人の対象を含む、約２４人の対象をこの試験に登録することができる。毒性または疾患進行以外の理由でＤＬＴ評価期間（０日目〜２８日目）に試験から離脱する対象を、置き換えてもよい。
【０３４０】
試験期間。対象スクリーニングの開始時から、生存追跡の完了までのこの試験の持続期間は、登録のための２４カ月および追跡のための２４カ月を含む、約４８カ月と予測される。試験開始は、最初の対象が試験に同意する日付と定義される；試験停止日は、生存追跡期間における最後のプロトコールに定義された評価の日付である。
【０３４１】
[実施例８]
再発性または進行性神経膠芽腫または悪性グリオーマを有する対象における単剤療法としてのＡｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２およびベレジメクスの投与
背景：Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２（Ａｄ）は、リガンド誘導性遺伝子スイッチと協調して作用する、経口投与されるアクチベーターリガンド、ベレジメクス（Ｖ）の制御下でのインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）の発現のための組換えアデノウイルスにより送達される遺伝子療法である（「ＲＴＳ（登録商標）」と称されることもある）。Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２の投与は、ＩＬ−１２過剰発現および／または望ましくない程度のＩＬ−１２全身毒性によって引き起こされ得る有害効果を制御および／または低減する能力を同時に提供しながら、抗がんエフェクターＴ細胞応答の惹起を提供する。
【０３４２】
方法（主試験）：再発性または進行性神経膠芽腫（ｒＧＢＭ）またはグレードＩＩＩ悪性グリオーマ神経膠芽腫を有する成人対象における、局部誘導性ＩＬ−１２発現の安全性および忍容性を評価する非盲検の単一治療群第１相試験を開始した；スキームについては図１２Ａ（「主試験」）およびＣＯＮＳＯＲＴフローダイアグラムについては図２０を参照されたい。この試験は、可変的なコルチコステロイド曝露の存在下で観察された安全性プロファイルに基づいて安全かつ忍容性の用量を決定するために、２つの腫瘍内Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２用量（２×１０１１ｖｐまたは１×１０１２ｖｐ）および漸増ベレジメクス用量（１０ｍｇから４０ｍｇまで）を調査することである。第１群は、標準治療の切除手順の前に１用量のベレジメクスを受け、Ａｄをフリーハンドの腫瘍内注射によって投与した後、経口Ｖを１４日間にわたってＱＤで継続した。腫瘍切除についてスケジュール化されなかった対象（第２群）は、定位固定注入によりＡｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２（２×１０１１ｖｐまたは１×１０１２ｖｐ）を受けた後、１４日間にわたって経口ベレジメクスを継続した。ベバシズマブについてナイーブであり（すなわち、ベバシズマブで以前に処置されていない）、Ａｄ注入前の４週間に非ステロイド依存性であった再発性神経膠芽腫（ｒＧＢＭ）を有する成人対象における局部誘導性ＩＬ−１２発現の安全性および忍容性を評価する非盲検の単一治療群第１相試験を開始した；図１２Ａ（「主試験」）を参照されたい。Ａｄを、ＱＤ×１５用量の経口Ｖ（２０ｍｇ／用量）と共に腫瘍内注入（２×１０１１ｖｐの用量で）により投与した。
【０３４３】
結果（主試験）：主試験では、Ｖ、ＩＬ−１２およびインターフェロン−γの用量関連増加が、約４０％のＶの腫瘍浸透と共に末梢血において観察された（図２１Ａ〜２１Ｄ）。Ｖ投与の３（±２）時間後、４つのコホートにわたるピークＩＬ−１２血清濃度は、２５〜１０９ｐｇ／ｍＬであったが、ピークＩＦＮ−γ血清濃度は１５〜１６８ｐｇ／ｍＬであった。サイトカイン放出症候群を含む、有害事象の頻度および重症度は、Ｖ用量と相関し、中止時に即座に逆転した。２０ｍｇのＶは、優れた薬物コンプライアンスおよび１３．１カ月の平均追跡で１２．７カ月の中央全生存（ｍＯＳ）を有していた（図２３Ａ〜２３Ｂおよび図２４）。同時のコルチコステロイドは生存に負に影響した：累積で２０ｍｇを超える、および２０ｍｇ以下のデキサメタゾンを受ける患者において（０〜１４日目）、ｍＯＳは、全ての患者においては、それぞれ、６．４カ月と１６．７カ月であり、２０ｍｇのＶコホートにおいては、それぞれ、６．４カ月および１７．８カ月であった（図２５Ａ〜２５Ｃ）。Ａｄ＋Ｖ処置後に疑われた主試験に由来する５／５の対象における再切除は、ＩＦＮ−γおよびまたＰＤ−１も産生するＣＤ８＋腫瘍浸潤リンパ球の増加と共に、多くは偽性進行を示した（図２２Ａ〜２２Ｄおよび図２６）。これらの新しい炎症浸潤は、ｈＩＬ−１２の免疫学的抗腫瘍効果を支援する。
【０３４４】
拡大サブ試験のための論拠：開頭術を受ける３１人の対象を、主試験において４つの用量のベレジメクスで登録し、１５人は２０ｍｇで処置した。この用量でのｍＯＳは、１２．７カ月であり、平均追跡期間は１３．１カ月であった。主試験における活性薬剤処置中のステロイド使用のアドホック分析は、図１３、図２５Ａ〜２５Ｃ、および表１に示されるように、ｍＯＳに対して負の影響を示し、中央全生存（ｍＯＳ）は、活性薬剤投薬中に２０ｍｇ以下（２０ｍｇ未満または２０ｍｇに等しい）の累積用量のステロイドを受けた対象について、２０ｍｇコホートにおいて１７．８カ月まで増加した。これらの結果は、効能をさらに調査するための「拡大サブ試験」（図１２Ｂを参照されたい）のための設計をもたらした。さらなる変化は、再発性神経膠芽腫の診断の要求、ベバシズマブによる以前の処置がないこと、および試験登録前の４週間にわたってステロイド使用がないことを含んでいた。さらに、２０ｍｇのＶで投与され、活性Ｖ投薬中に累積ステロイド曝露が最小限である（すなわち、２０ｍｇ以下（２０ｍｇ未満または２０ｍｇに等しい））対象は、改善されたｍＯＳ（１７．８カ月）を有することが観察された；さらなる詳細については、図２４、図２５Ａ〜２５Ｂおよび図１３を参照されたい。処置された評価対象の約６５％が、０〜１４日目に２０ｍｇ以下のデキサメタゾンの累積用量を受けた。観察された安全性プロファイルは、白血球数、血小板数の減少および／またはトランスアミナーゼの増加と共に、風邪のような症状を特徴とするサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）と示す許容し得る結果を示した。全ての観察された有害反応は可逆性であり、ベレジメクスの中止時に管理可能であった。
【０３４５】
方法（拡大サブ試験）：ベバシズマブについてナイーブであり（すなわち、ベバシズマブで以前に処置されていない）、Ａｄ注入前の４週間に非ステロイド依存性であった再発性神経膠芽腫（ｒＧＢＭ）を有する成人対象における局部誘導性ＩＬ−１２発現の安全性および忍容性を評価する非盲検の単一治療群第１相サブ試験を続いて開始した；図１２Ｂ（「拡大サブ試験」）を参照されたい。標準治療の切除後、０日目〜１４日目までＱＤ×１５用量の経口Ｖ（２０ｍｇ／用量）と共に、Ａｄをフリーハンド腫瘍内注入（２×１０１１ｖｐの用量）により投与した。
【０３４６】
結果（拡大サブ試験）：拡大サブ試験では、Ａｄ＋Ｖ（２０ｍｇ／用量でＶを用いる）は、血清ＩＬ−１２および下流のＩＦＮ−γ発現を、３日目に０．８ｐｇ／ｍＬのＩＬ−１２の中央ベースラインから８．８ｐｇ／ｍＬのＩＬ−１２まで；および０ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ−γの中央ベースラインから８．６ｐｇ／ｍｌのＩＦＮ−γまで増加させた。細胞傷害性Ｔ細胞、Ｔｒｅｇおよび末梢免疫細胞活性化における類似する傾向が、用量漸増中に観察された。中央ベースラインと１４日目との間に、細胞傷害性Ｔ細胞は増加し（ＣＤ３＋ＣＤ８＋は２６％から２８％に）、Ｔｒｅｇは減少する（ＦｏｘＰ３＋は１．３％から０．９％に）と共に、免疫系の正味の活性化が得られた（ＣＤ８＋／ＦｏｘＰ３＋比は２０から４６に）。中央全生存（ｍＯＳ）は、現在までの試験において、２０ｍｇのＶを受けた対象において１２．７カ月と観察された。
【０３４７】
【表３】
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【０３４８】
【表４】
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【０３４９】
【表５】
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【０３５０】
【表６】
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【０３５１】
結論：血漿および腫瘍Ｖピーク血漿ＰＫレベルは用量依存的であり、ＩＬ−１２および下流のＩＦＮ−γの産生をもたらし、両方とも血清中で検出可能であった（図２１Ａ〜２１Ｄ）。血清組換えＩＬ−１２は、３日目にピークに達し、内因性血清ＩＦＮ−γの下流の産生は主試験と拡大サブ試験の両方において７日目にピークに達した（全てのＶコホートについては、図２１Ｃおよび図２１Ｄ、ならびに図１４Ａおよび図１４Ｂ）。平均細胞指数は０日目から７日目、次いで、１４日目まで増加した後、２８日目まで減少した（主試験とサブ試験とのデータを合わせた）（図１６Ａおよび１６Ｂ）。この末梢免疫応答は、主試験において見られた結果と一致し、ＯＳと相関していた。したがって、Ｖは血液脳関門を横断し、腫瘍中に注入されたアデノウイルスベクターからの組換えＩＬ−１２の転写を調節し、腫瘍内免疫応答を惹起し、持続させる。したがって、Ｖは血液脳関門を横断し、腫瘍中に注入されたアデノウイルスベクターからの組換えＩＬ−１２の転写を調節し、腫瘍内免疫応答を惹起し、持続させる。主試験と拡大サブ試験との両方における薬物関連毒性は、ベレジメクスの中止時に可逆的であり、薬物関連死はなかった。拡大サブ試験では、ｍＯＳは２０１９年６月４日時点で、ＳＮＯ２０１９のデータカットオフにまだ達していない。拡大サブ試験におけるより高いパーセンテージの対象（２０１９年５月６日のＡＳＣＯ２０１９データカットオフで約７５％および２０１９年６月４日のＳＮＯ２０１９データカットオフで６５％に対して、主試験では４０％）は、低用量の同時的ステロイドを受け（合計２０ｍｇ以下のデキサメタゾン、０〜１４日目）、主試験ではＯＳの改善に向かう傾向を示した（図２５Ｃ）。ｒＧＢＭを有する対象においてＡｄ＋Ｖを使用する局部での調節されたＩＬ−１２産生は、免疫系を迅速かつ安全に活性化する。ｒＧＢＭ患者におけるＡｄ＋Ｖの投与による局部での制御されたＩＬ−１２発現は、治療的に望ましい効果を示す生物活性（例えば、図１５Ａおよび図１５Ｂを参照されたい）および好ましい安全性プロファイルをもたらす。末梢細胞傷害性免疫応答の増強に関する新たなバイオマーカーである細胞指数は、末梢ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γ濃度の増加後に増加した（図１４Ａおよび図１４Ｂ）。０日目と比較して、平均細胞指数は、主試験と拡大サブ試験とに由来する合わせたデータにおいて、７日目、次いで、１４日目に増加した後、２８日目までに減少した（図１６Ａおよび図１６Ｂ）。対象は、主試験と比較して、拡大サブ試験において、活性薬剤の投薬中に予防および手順後の浮腫の制御のために少ないデキサメタゾンを受けた（２０１９年５月６日時点で７５％または２０１９年６月４日時点で６５％であるのに対して、合計２０ｍｇ以下で４０％）。より少ない／低下させたステロイドの使用は、臨床転帰の改善と関連する。図１２〜１９および図２０〜２６を参照されたい。
【０３５２】
[実施例９]
脳腫瘍またはＤＩＰＧを有する小児対象におけるＡｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２およびベレジメクスの投与
背景：びまん性内在性橋膠腫（ＤＩＰＧ）は、小児の間で有意な致死率を有する満たされない要求があり、９カ月のｍＯＳおよび２年で１０％未満の生存率である。Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２（Ａｄ）は、リガンド誘導性遺伝子スイッチと協調して作用する、経口投与されるアクチベーターリガンド、ベレジメクス（Ｖ）の制御下でのインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）の発現のための組換えアデノウイルスにより送達される遺伝子療法である（「ＲＴＳ（登録商標）」と称されることもある）。ＩＬ−１２の局部発現は、腫瘍への細胞傷害性Ｔ細胞の流入およびその後の腫瘍細胞死をもたらす。Ａｄを５×１０９ｖｐで投与すると共に、３〜３０ｍｇ／ｍ２の用量およびＱＤ×１４でＶを投与したＧＬ−２６１髄質グリオーマ同所性マウスモデルにおける非臨床試験は、生存における用量関連増加を示した。８５日目のＡｄ＋Ｖ（１０ｍｇ／ｍ２のＶを用いる；ヒト等価用量２０ｍｇ）で、１２匹の動物のうちの６７％が生存し、ビヒクルについての１６日のｍＯＳおよびテモゾロミドについての２５日のｍＯＳと比較して、臨床兆候を示さなかった；ＤＩＰＧの処置においてＡｄ＋Ｖ単剤療法に関する治療的に有益な効果を示す。
【０３５３】
方法：小児脳腫瘍対象におけるＡｄ＋Ｖの安全性および忍容性を決定するための第１相用量漸増試験を行う。この試験は、２つの「治療群」を含む。第１治療群は、びまん性内在性橋膠腫（ＤＩＰＧ）を有する対象を除く、標準治療の開頭術および腫瘍切除を受けるようにスケジュール化された小児脳腫瘍対象からなる。第２治療群は、ＤＩＰＧを有し、以前の標準的な局所放射線療法後の対象からなる。第１治療群の対象は、腫瘍切除の前に１用量のＶを受け、次いで、Ａｄ（２×１０１１ｖｐ）の術中腫瘍内注入後、さらに１４日間にわたって経口Ｖを投与される。第２治療群の対象は、単回のＡｄ定位固定注入を受け、次いで、１４日間にわたって経口Ｖを受ける。両治療群とも、１０または２０ｍｇ  ＰＯで、体表面積（ＢＳＡ）により調整された、漸増用量のＶを受ける。評価項目の測定は、有害事象（ＡＥ）率によって決定される安全性の評価およびコホートによって分析されるＤＬＴの発生率、Ｖの薬物動態、Ｖの腫瘍と血液との比、惹起される免疫応答の免疫学的およびバイオマーカー特性評価、ならびに客観的奏功率、無進行生存、および全生存の調査者による評価を含む。
【０３５４】
[実施例１０]
再発性または進行性神経膠芽腫を有する対象における、ＰＤ−１阻害剤と組み合わせたＡｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２＋ベレジメクスの投与
概要：Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２（Ａｄ）は、リガンド誘導性遺伝子スイッチと協調して作用する、経口投与されるアクチベーターリガンド、ベレジメクス（Ｖ）の制御下でのインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）の発現のための組換えアデノウイルスにより送達される遺伝子療法である（「ＲＴＳ（登録商標）」と称されることもある）。Ａｄ＋Ｖの腫瘍内投与は、標的化された腫瘍細胞細胞傷害性をもたらす、細胞傷害性Ｔ細胞の腫瘍および局部組織流入を惹起する。ニボルマブ（「ｎｉｖｏ」）は、プログラム細胞死タンパク質−１に結合し（抗ＰＤ−１）、それによって、Ｔ細胞の活性を増強する；すなわち、がん細胞および腫瘍／腫瘍細胞のＴ細胞抗腫瘍生着の増加のための（受容体アンタゴニスト）抗体である。ＧＬ−２６１同所性マウスでは、生存に対する上掲の相加的な効果が、Ａｄ＋Ｖ（３０ｍｇ／ｍ２）ＱＤ×１４日と、抗ＰＤ−１抗体との併用療法に関して観察され、全動物の生存率は、Ａｄ＋Ｖについては６３％であるのに対して、抗ＰＤ−１抗体のみについては４０％であった（図６）
【０３５５】
方法：再発性神経膠芽腫（ｒＧＢＭ）を有する成人対象における、ニボルマブと組み合わせた局部誘導性ＩＬ−１２発現の安全性および忍容性を評価する非盲検の用量漸増第１相試験を開始した。（−）７日目（すなわち、Ａｄ＋Ｖの投与の７日前）、１５日目（Ａｄ＋Ｖの投与後）のニボルマブ静脈内輸注（１〜３ｍｇ／ｋｇの用量）と共に、ＱＤ×１５  ＰＯで、次いで、Ｑ２Ｗ（すなわち、２週間毎に１回）で、１日のベレジメクス（Ｖ）（１０〜２０ｍｇの用量）と共に、Ａｄを腫瘍内注入（２×１０１１ｖｐ（２ｅ１１ｖｐ）の用量を使用する）により投与した。表５および図１７を参照されたい。
【０３５６】
【表７】
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【０３５７】
【表８】
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【０３５８】
結果：ニボルマブ単独では、末梢ＩＬ−１２レベルを変化させなかった（中央ベースライン０．９ｐｇ／ｍｌに対して０日目の１．０ｐｇ／ｍｌ）。Ａｄ＋Ｖは、３日目に末梢ＩＬ−１２を５．５ｐｇ／ｍｌに増加させた。ニボルマブ単独では、末梢細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋中央ベースライン２３％に対して０日目で２６％）を増加させ、Ａｄ＋ＶはＣＤ３＋ＣＤ８＋を１４日目で３１％までさらに増加させた。ニボルマブ単独では、Ｔｒｅｇ（ＦｏｘＰ３ベースライン１．５％に対して０日目に０．８％）を減少させ、Ａｄ＋ＶはＴｒｅｇを０．３％（１４日目）にさらに減少させた。併用療法は、免疫系の正味の活性化をもたらした（ＣＤ８＋／ＦｏｘＰ３＋比ベースライン１５に対して２９（０日目）および８０（１４日目））。暫定安全性データは、Ｖ投薬期間にＡｄ＋Ｖによる単剤療法と比較して類似する有害事象（ＡＥ）プロファイルを示した。ニボルマブを用いるその後の処置期間におけるＡＥは、以前に報告されたものと一致していた。観察された有害反応は、管理可能であり、可逆性であった。毒性の相乗効果は観察されなかった。図１８Ａ、図１８Ｂ、図１９Ａ、および図１９Ｂを参照されたい。
【０３５９】
【表９】
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【０３６０】
【表１０】
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【０３６１】
【表１１】
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【０３６２】
結論：登録は、患者とコホートとの間で必要とされる規則的な停止と共に、３＋３用量漸増試験において進行する。平均追跡期間は、４．５カ月である（多くの最近登録された患者については、最小で０．４カ月、最初の登録患者については最大で１０．１カ月）。６６％が低用量の同時的ステロイド（合計２０ｍｇ以下のデキサメタゾン、０〜１４日目）を受けた。ニボルマブの予備的投薬は、Ａｄ＋Ｖ前のサイトカインレベルに影響しなかった。Ａｄ＋Ｖ（制御されたＩＬ−１２）の開始後の血清中の組換えＩＬ−１２＋内因性ＩＦＮ−γの測定値の増加は、Ａｄ＋Ｖ単剤療法の以前に報告されたデータと一致する。ＩＬ−１２の効果に関する新しいバイオマーカーである細胞指数は、免疫系の活性化を示した。有意な重複毒性は同定されなかった。ｒＧＢＭを有する成人患者における、抗ＰＤ−１阻害剤と組み合わせたＡｄ＋Ｖを使用する局部での制御されたＩＬ−１２発現は、治療的に望ましい効果および好ましい安全性プロファイルを示す生物活性をもたらす。
【０３６３】
本発明の実施形態（Ｅ）は、以下を含む。
【０３６４】
Ｅ１．がん性腫瘍を有する対象を処置する、および／または対象におけるがん性腫瘍の発達を防止する方法であって、
Ａ）対象に、エクジソン受容体に基づく遺伝子スイッチをコードするポリヌクレオチドであって、
（１）少なくとも１つの転写因子配列がリガンド依存性転写因子をコードする、プロモーターに作動可能に連結されている少なくとも１つの転写因子配列、および
（２）第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとが、リガンド依存性転写因子によって活性化されるプロモーターに作動可能に連結されている、野生型ＩＬ−１２  ｐ４０と少なくとも８５％同一である第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、野生型ＩＬ−１２  ｐ３５と少なくとも８５％同一である第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド
を含む、ポリヌクレオチドを含む有効量のベクターを投与することと；
Ｂ）対象に、リガンド依存性転写因子を活性化する有効量のジアシルヒドラジンリガンドを投与することと；
Ｃ）対象に、有効量の免疫チェックポイント阻害剤を投与することと
を含む、方法。
【０３６５】
Ｅ２．ジアシルヒドラジンリガンド（例えば、ベレジメクス）の第１の用量が、ベクターの投与の約２４時間前からベクターの投与の約３６時間後までの期間に対象に投与される、Ｅ１に記載の方法。
【０３６６】
Ｅ３．ジアシルヒドラジンリガンドが３〜２８日の期間にわたって毎日投与される、Ｅ１またはＥ２に記載の方法。
【０３６７】
Ｅ４．ジアシルヒドラジンリガンドが１４日の期間にわたって毎日投与される、Ｅ１〜Ｅ３のいずれか１つに記載の方法。
【０３６８】
Ｅ５．ジアシルヒドラジンリガンドが約５〜約８０ｍｇの用量で毎日投与される、Ｅ１〜Ｅ４のいずれか１つに記載の方法。
【０３６９】
Ｅ６．ジアシルヒドラジンリガンドが約１０ｍｇの用量で毎日投与される、Ｅ１〜Ｅ５のいずれか１つに記載の方法。
【０３７０】
Ｅ７．ジアシルヒドラジンリガンドが約２０ｍｇの用量で毎日投与される、Ｅ１〜Ｅ５のいずれか１つに記載の方法。
【０３７１】
Ｅ８．ジアシルヒドラジンリガンドが経口投与される、Ｅ１〜Ｅ７のいずれか１つに記載の方法。
【０３７２】
Ｅ９．ジアシルヒドラジンリガンドが（Ｒ）−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−（２，２−ジメチルヘキサン−３−イル）−２−エチル−３−メトキシベンゾヒドラジドである、Ｅ１〜Ｅ８のいずれか１つに記載の方法。
【０３７３】
Ｅ１０．ベクターがアデノウイルスベクターである、Ｅ１〜Ｅ９のいずれか１つに記載の方法。
【０３７４】
Ｅ１１．ベクターがアデノウイルス血清型５ベクターである、Ｅ１〜Ｅ１０のいずれか１つに記載の方法。
【０３７５】
Ｅ１２．ベクターが複製欠損アデノウイルスベクターである、Ｅ１〜Ｅ１１のいずれか１つに記載の方法。
【０３７６】
Ｅ１３．ベクターが腫瘍内投与される、Ｅ１〜Ｅ１２のいずれか１つに記載の方法。
【０３７７】
Ｅ１４．ベクターが約０．０１×１０１１個のウイルス粒子から約２０×１０１１個のウイルス粒子までの用量で投与される、Ｅ１〜Ｅ１３のいずれか１つに記載の方法。
【０３７８】
Ｅ１５．ベクターが約２×１０１１個のウイルス粒子の用量で投与される、Ｅ１〜Ｅ１４のいずれか１つに記載の方法。
【０３７９】
Ｅ１６．ベクターが約３×１０１１個のウイルス粒子の用量で投与される、Ｅ１〜Ｅ１４のいずれか１つに記載の方法。
【０３８０】
Ｅ１７．野生型ＩＬ−１２  ｐ４０が野生型ヒトＩＬ−１２  ｐ４０であり、野生型ＩＬ−１２  ｐ３５が野生型ヒトＩＬ−１２  ｐ３５である、Ｅ１〜Ｅ１６のいずれか１つに記載の方法。
【０３８１】
Ｅ１８．野生型ＩＬ−１２  ｐ４０が野生型マウスＩＬ−１２  ｐ４０であり、野生型ＩＬ−１２  ｐ３５が野生型マウスＩＬ−１２  ｐ３５である、Ｅ１〜Ｅ１６のいずれか１つに記載の方法。
【０３８２】
Ｅ１９．第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとがリンカーによって連結されている、Ｅ１〜Ｅ１８のいずれか１つに記載の方法。
【０３８３】
Ｅ２０．リンカーがリボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列である、Ｅ１９に記載の方法。
【０３８４】
Ｅ２１．免疫チェックポイント阻害剤が、第１の用量が投与される日から出発して１、２、３、４、５、または６週間毎に１回投与される、Ｅ１〜Ｅ２０のいずれか１つに記載の方法。
【０３８５】
Ｅ２２．免疫チェックポイント阻害剤が、第２の用量が投与される日から出発して１、２、３、４、５、または６週間毎に１回投与される、Ｅ１〜Ｅ２０のいずれか１つに記載の方法。
【０３８６】
Ｅ２３．免疫チェックポイント阻害剤の第１の用量が、ベクターの投与の約５〜１０日前に対象に投与され、免疫チェックポイント阻害剤の第２の用量が、ベクターの投与の約７〜２８日後に対象に投与される、Ｅ１〜Ｅ２０のいずれか１つに記載の方法。
【０３８７】
Ｅ２４．免疫チェックポイント阻害剤の第１の用量が、ベクターの投与の約７日前に対象に投与される、Ｅ２３に記載の方法。
【０３８８】
Ｅ２５．免疫チェックポイント阻害剤の第２の用量が、ベクターの投与の約１５日後に対象に投与される、Ｅ２３に記載の方法。
【０３８９】
Ｅ２５ａ．免疫チェックポイント阻害剤の第２の用量が、ベクターの投与と同時に対象に投与される、Ｅ２３に記載の方法。
【０３９０】
Ｅ２５ｂ．免疫チェックポイント阻害剤の追加用量が、ベクターの投与後、逐次的投薬によって対象に投与される、Ｅ２３に記載の方法。
【０３９１】
Ｅ２６．免疫チェックポイント阻害剤が、第２の用量が投与される日から出発して２週間毎に１回または３週間毎に１回投与される、Ｅ２３〜Ｅ２５のいずれか１つに記載の方法。
【０３９２】
Ｅ２７．免疫チェックポイント阻害剤の第１の用量が、ベクターの投与の約２４時間前からベクターの投与の約３６時間後までの期間に対象に投与される、Ｅ１〜Ｅ２０のいずれか１つに記載の方法。
【０３９３】
Ｅ２８．免疫チェックポイント阻害剤の第１の用量が、ベクターの投与の約１〜２８日後に対象に投与される、Ｅ１〜Ｅ２０のいずれか１つに記載の方法。
【０３９４】
Ｅ２９．免疫チェックポイント阻害剤が、ＰＤ−１アンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ２アンタゴニスト、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、ＣＤ１３７アンタゴニスト、ＣＤ８０アンタゴニスト、ＣＤ８６アンタゴニスト、ＫＩＲアンタゴニスト、Ｔｉｍ−３アンタゴニスト、ＬＡＧ３アンタゴニスト、ＩｇおよびＩＴＩＭドメイン（ＴＩＧＩＴ）を含むＴ細胞免疫受容体のアンタゴニスト、ＣＤ９６アンタゴニスト、またはＩＤＯ１アンタゴニストである、Ｅ１〜Ｅ２８のいずれか１つに記載の方法。
【０３９５】
Ｅ２９ａ．Ａｄ＋Ｖ療法と組み合わせる免疫モジュレーターが、ＩＬ−１２以外のサイトカイン；ＣＤ２５アンタゴニスト；ＢおよびＴ細胞アテニュエータ−（ＢＴＬＡ）；限定されるものではないが、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）および４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、糖質コルチコイド誘導ＴＮＦＲファミリー関連タンパク質（ＧＩＴＲ）、ＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）、ＣＤ２７アンタゴニストを含む腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーの標的化可能メンバー；ＣＤ２０アンタゴニストなどの腫瘍関連タンパク質；トランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）；ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを含むＴ細胞免疫受容体；Ｔ細胞共刺激（例えば、ｏ−刺激受容体は腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーのメンバーである）；ＣＤ２７６（Ｂ７−Ｈ３）アンタゴニスト、ＶＴＣＮ１（Ｂ７−Ｈ４）アンタゴニスト、Ａ２ＡＲアンタゴニスト、ＢＴＬＡアンタゴニスト、ＮＯＸ２アンタゴニスト、ＶＩＳＴＡアンタゴニスト、ＳＩＧＬＥＣ７アンタゴニスト、ＳＩＧＬＥＣ９アンタゴニスト；Ｔ細胞誘導ワクチン；樹状細胞誘導ワクチン；ＮＫ細胞誘導ワクチン；輸注によるＴ細胞の投与；および輸注によるＮＫ細胞の投与である、Ｅ１〜Ｅ２８のいずれか１つに記載の方法。
【０３９６】
Ｅ２９ｂ．Ａｄ＋Ｖ療法と組み合わせる免疫モジュレーターが、特に、モダリティが新抗原の産生を惹起するのを助ける場合、化学療法、ＳＲＳを含む照射または外科手術などの異なる治療モダリティのものである、Ｅ１〜Ｅ２８のいずれか１つに記載の方法。
【０３９７】
Ｅ３０．ＰＤ−１アンタゴニストが、ニボルマブ（ＭＤＸ１１０６）、ペンブロリズマブ（ＭＫ−３４７５）、ピジリズマブ（ＣＴ−０１１）、ＭＥＤＩ−０６８０（ＡＭＰ−５１４）、ＰＤＲ００１、セミプリマブ−ｒｗｌｃ（ＲＥＧＮ２８１０）、ＡＭＰ−２２４、ＳＴＩ−Ａ１１１０、ＡＵＮＰ−１２、またはＢＧＢ−Ａ３１７である、Ｅ２９に記載の方法。
【０３９８】
Ｅ３１．ＰＤ−１アンタゴニストがニボルマブであり、ＰＤ−１アンタゴニストが約０．５ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、Ｅ２９またはＥ３０に記載の方法。
【０３９９】
Ｅ３２．ＰＤ−１アンタゴニストがニボルマブであり、ＰＤ−１アンタゴニストが約１ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、Ｅ２９〜Ｅ３１のいずれか１つに記載の方法。
【０４００】
Ｅ３３．ＰＤ−１アンタゴニストがニボルマブであり、ＰＤ−１アンタゴニストが約３ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、Ｅ２９〜Ｅ３１のいずれか１つに記載の方法。
【０４０１】
Ｅ３３ａ．ＰＤ−１アンタゴニストがニボルマブであり、ＰＤ−１アンタゴニストが２週間毎に約２４０ｍｇの一律用量で投与される、Ｅ２９〜Ｅ３１のいずれか１つに記載の方法。
【０４０２】
Ｅ３３ｂ．ＰＤ−１アンタゴニストがニボルマブであり、ＰＤ−１アンタゴニストが４週間毎に約４８０ｍｇの一律用量で投与される、Ｅ２９〜Ｅ３１のいずれか１つに記載の方法。
【０４０３】
Ｅ３４．ＰＤ−１アンタゴニストがペンブロリズマブであり、ＰＤ−１アンタゴニストが約５０ｍｇ〜約３００ｍｇの用量で投与される、Ｅ２９またはＥ３０に記載の方法。
【０４０４】
Ｅ３５．ＰＤ−１アンタゴニストがピジリズマブであり、ＰＤ−１アンタゴニストが約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、Ｅ２９またはＥ３０に記載の方法。
【０４０５】
Ｅ３６．ＰＤ−１アンタゴニストがＭＥＤＩ−０６８０であり、ＰＤ−１アンタゴニストが約５ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、Ｅ２９またはＥ３０に記載の方法。
【０４０６】
Ｅ３７．ＰＤ−１アンタゴニストがＰＤＲ００１であり、ＰＤ−１アンタゴニストが約１００ｍｇ〜約８００ｍｇの用量で投与される、Ｅ２９またはＥ３０に記載の方法。
【０４０７】
Ｅ３８．ＰＤ−１アンタゴニストがセミプリマブ−ｒｗｌｃ（ＲＥＧＮ２８１０）であり、ＰＤ−１アンタゴニストが約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約６ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、Ｅ２９またはＥ３０に記載の方法。
【０４０８】
Ｅ３９．ＰＤ−１アンタゴニストがＢＧＢ−Ａ３１７であり、ＰＤ−１アンタゴニストが約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約６ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、Ｅ２９またはＥ３０に記載の方法。
【０４０９】
Ｅ４０．ＰＤ−１アンタゴニストがＡＭＰ−２２４であり、ＰＤ−１アンタゴニストが約２ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、Ｅ２９またはＥ３０に記載の方法。
【０４１０】
Ｅ４１．ＰＤ−Ｌ１アンタゴニストが、アテゾリズマブ（ＲＧ７４４６、ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、ＭＥＤＩ４７３６（デュルバルマブ）、ＢＭＳ−９３６５５９（ＭＤＸ−１１０５）、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）、またはＫＤ０３３（Ｋａｄｍｏｎ）である、Ｅ２９に記載の方法。
【０４１１】
Ｅ４２．ＰＤ−Ｌ１アンタゴニストがアテゾリズマブであり、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニストが約５００ｍｇ〜約２０００ｍｇの用量で投与される、Ｅ２９またはＥ４１に記載の方法。
【０４１２】
Ｅ４３．ＰＤ−Ｌ１アンタゴニストがＭＥＤＩ４７３６であり、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニストが約５００ｍｇ〜約２０００ｍｇの用量で投与される、Ｅ２９またはＥ４１に記載の方法。
【０４１３】
Ｅ４４．ＰＤ−Ｌ１アンタゴニストがＢＭＳ−９３６５５９であり、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニストが約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、Ｅ２９またはＥ４１に記載の方法。
【０４１４】
Ｅ４５．ＰＤ−Ｌ１アンタゴニストがアベルマブであり、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニストが約５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、Ｅ２９またはＥ４１に記載の方法。
【０４１５】
Ｅ４６．ＣＴＬＡ−４アンタゴニストが、イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ）、トレメリムマブ（ＣＰ−６７５，２０６）、またはＫＡＨＲ−１０２である、Ｅ２９に記載の方法。
【０４１６】
Ｅ４７．ＣＴＬＡ−４アンタゴニストがイピリムマブであり、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストが約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、Ｅ２９またはＥ４６に記載の方法。
【０４１７】
Ｅ４８．ＣＴＬＡ−４アンタゴニストがトレメリムマブであり、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストが約１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、Ｅ２９またはＥ４６に記載の方法。
【０４１８】
Ｅ４９．ＣＴＬＡ−４アンタゴニストがＫＡＨＲ−１０２であり、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストが約１μｇ／ｋｇ〜約２０μｇ／ｋｇの用量で投与される、Ｅ２９またはＥ４６に記載の方法。
【０４１９】
Ｅ５０．ＣＤ１３７アンタゴニストが、ＰＲＳ−３４３、ＰＦ−２５６６（ＰＦ−０５０８２５６６）、またはウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３）である、Ｅ２９に記載の方法。
【０４２０】
Ｅ５１．ＣＤ１３７アンタゴニストがＰＲＳ−３４３であり、ＣＤ１３７アンタゴニストが約０．０１μｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、Ｅ２９またはＥ５０に記載の方法。
【０４２１】
Ｅ５２．ＣＤ１３７アンタゴニストがＰＦ−２５６６であり、ＣＤ１３７アンタゴニストが約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、Ｅ２９またはＥ５０に記載の方法。
【０４２２】
Ｅ５３．ＣＤ１３７アンタゴニストがウレルマブであり、ＣＤ１３７アンタゴニストが約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、Ｅ２９またはＥ５０に記載の方法。
【０４２３】
Ｅ５４．ＬＡＧ３アンタゴニストが、ＩＭＰ７０１、ＩＭＰ７３１、ＢＭＳ−９８６０１６、ＬＡＧ５２５、ＧＳＫ２８３１７８１、またはＩＭＰ３２１である、Ｅ２９に記載の方法。
【０４２４】
Ｅ５５．ＬＡＧ３アンタゴニストがＩＭＰ７０１、ＩＭＰ７３１、ＩＭＰ３２１、またはＬＡＧ５２５であり、ＬＡＧ３アンタゴニストが約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、Ｅ２９またはＥ５４に記載の方法。
【０４２５】
Ｅ５６．ＬＡＧ３アンタゴニストがＧＳＫ２８３１７８１であり、ＬＡＧ３アンタゴニストが約２０ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、Ｅ２９またはＥ５４に記載の方法。
【０４２６】
Ｅ５７．ＬＡＧ３アンタゴニストがＢＭＳ−９８６０１６であり、ＬＡＧ３アンタゴニストが約２０ｍｇ〜約２００ｍｇの用量で投与される、Ｅ２９またはＥ５４に記載の方法。
【０４２７】
Ｅ５８．ＫＩＲアンタゴニストがリリルマブ（ＩＰＨ２１０２）である、Ｅ２９に記載の方法。
【０４２８】
Ｅ５９．ＫＩＲアンタゴニストが約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、Ｅ２９またはＥ５８に記載の方法。
【０４２９】
Ｅ６０．がん性腫瘍が固形腫瘍である、Ｅ１〜Ｅ５９のいずれか１つに記載の方法。
【０４３０】
Ｅ６１．がん性腫瘍が、限定されるものではないが、以下の型：グリオーマ腫瘍、腎がん腫瘍、卵巣がん腫瘍、頭頸部がん腫瘍、肝臓がん腫瘍、膵がん腫瘍、胃がん腫瘍、食道がん腫瘍、尿路上皮細胞（膀胱、子宮、もしくは腎盂）がん腫瘍、泌尿生殖器（子宮頸部、子宮内膜もしく陰茎）がん腫瘍、甲状腺がん腫瘍、または前立腺がん腫瘍を含む、原発性、進行性または再発性腫瘍である、Ｅ１〜Ｅ６０のいずれか１つに記載の方法。
【０４３１】
Ｅ６１ａ．がん性腫瘍が、限定されるものではないが、以下の型：乳がん腫瘍、メラノーマ腫瘍、結腸がん腫瘍、肺がん腫瘍、または扁平上皮がん腫瘍を含む、原発性、進行性または再発性腫瘍である、Ｅ１〜Ｅ６０のいずれか１つに記載の方法。
【０４３２】
Ｅ６１ｂ．がん性腫瘍が、脳に転移する腫瘍である、Ｅ１〜Ｅ６１ａのいずれか１つに記載の方法。
【０４３３】
Ｅ６２．対象が免疫チェックポイント阻害剤またはＴ細胞を特異的に標的化する他の薬剤で以前に処置されたことがなく、免疫チェックポイント阻害剤またはＴ細胞を特異的に標的化する薬剤が、限定されるものではないが、ＰＤ−１アンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ２アンタゴニスト、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、ＣＤ１３７アンタゴニスト、ＣＤ８０アンタゴニスト、ＣＤ８６、ＩＤＯ１アンタゴニスト、ＫＩＲアンタゴニスト、ＴＩＭ−３アンタゴニスト、ＬＡＧ３アンタゴニスト、ＴＩＧＩＴアンタゴニスト、ＣＤ９６アンタゴニスト、ＣＤ２７６（Ｂ７−Ｈ３）アンタゴニスト、ＶＴＣＮ１（Ｂ７−Ｈ４）アンタゴニスト、Ａ２ＡＲアンタゴニスト、ＢＴＬＡアンタゴニスト、ＮＯＸ２アンタゴニスト、ＶＩＳＴＡアンタゴニスト、ＳＩＧＬＥＣ７アンタゴニスト、ＳＩＧＬＥＣ９アンタゴニスト、またはＩＤＯ１アンタゴニストを含む、Ｅ１〜Ｅ６１のいずれか１つに記載の方法。
【０４３４】
Ｅ６３．対象がヒト成人である、Ｅ１〜Ｅ６２のいずれか１つに記載の方法。
【０４３５】
Ｅ６４．対象がヒト小児である、Ｅ１〜Ｅ６２のいずれか１つに記載の方法。
【０４３６】
Ｅ６５．対象においてアブスコパル効果をもたらす、Ｅ１〜Ｅ６４のいずれか１つに記載の方法。
【０４３７】
Ｅ６６．脳のがんを有する対象を処置する方法であって、対象に、複製欠損アデノウイルスベクターを含む組成物を投与することを含み、
対象が、免疫チェックポイント阻害剤を以前に投与されたことがある、それを同時に投与されたことがある、またはそれをさらに投与され、
アデノウイルスベクターが、エクジソン受容体に基づくポリペプチドまたは複数のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、
前記エクジソン受容体に基づくポリペプチドまたは複数のポリペプチドが、リガンド誘導性（リガンドにより活性化される）転写因子として機能し、
アデノウイルスベクターが、前記リガンド誘導性転写因子によって活性化され得るプロモーターポリヌクレオチド配列をさらに含み、
前記リガンド誘導性転写因子が、ジアシルヒドラジンリガンドとの接触、またはそれへの曝露に応答して転写を活性化し、
アデノウイルスベクターが、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含み、ＩＬ−１２がＩＬ−１２  ｐ３５およびｐ４０ポリペプチドサブユニットの一方もしくは両方を含むか、または生物学的に活性な単鎖ＩＬ−１２ポリペプチドであり、
ＩＬ−１２をコードするポリヌクレオチドが、ジアシルヒドラジンリガンドの対象への投与が対象におけるＩＬ−１２の産生を誘導することができるように、プロモーターポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、方法。
【０４３８】
Ｅ６７．脳のがんを有する対象を処置する方法であって、対象に、１つまたは複数の免疫モジュレーターを投与することを含み、
対象が、複製欠損アデノウイルスベクターを以前に投与されたことがある、それを同時に投与されたことがある、またはそれをさらに投与され、
対象が、ジアシルヒドラジンリガンドを以前に投与されたことがある、それを同時に投与されたことがある、またはそれをさらに投与され、
アデノウイルスベクターが、エクジソン受容体に基づくポリペプチドまたは複数のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、
前記エクジソン受容体に基づくポリペプチドまたは複数のポリペプチドが、リガンド誘導性（リガンドにより活性化される）転写因子として機能し、
アデノウイルスベクターが、前記リガンド誘導性転写因子によって活性化され得るプロモーターポリヌクレオチド配列をさらに含み、
前記リガンド誘導性転写因子が、ジアシルヒドラジンリガンドとの接触、またはそれへの曝露に応答して転写を活性化し、
アデノウイルスベクターが、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含み、
ＩＬ−１２が、ＩＬ−１２  ｐ３５およびｐ４０ポリペプチドサブユニットの一方もしくは両方を含むか、または生物学的に活性な単鎖ＩＬ−１２ポリペプチドであり、
ＩＬ−１２をコードするポリヌクレオチドが、ジアシルヒドラジンリガンドの対象への投与が対象におけるＩＬ−１２の産生を誘導することができるように、プロモーターポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、方法。
【０４３９】
Ｅ６８．脳のがんを有する対象を処置する方法であって、対象に、ジアシルヒドラジンリガンドを投与することを含み、
対象が、複製欠損アデノウイルスベクターを以前に投与されたことがある、それを同時に投与されたことがある、またはそれをさらに投与され、
対象が、免疫チェックポイント阻害剤を以前に投与されたことがある、それを同時に投与されたことがある、またはそれをさらに投与され、
アデノウイルスベクターが、エクジソン受容体に基づくポリペプチドまたは複数のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、
前記エクジソン受容体に基づくポリペプチドまたは複数のポリペプチドが、リガンド誘導性（リガンドにより活性化される）転写因子として機能し、
アデノウイルスベクターが、前記リガンド誘導性転写因子によって活性化され得るプロモーターポリヌクレオチド配列をさらに含み、
前記リガンド誘導性転写因子が、ジアシルヒドラジンリガンドとの接触、またはそれへの曝露に応答して転写を活性化し、
アデノウイルスベクターが、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含み、
ＩＬ−１２が、ＩＬ−１２  ｐ３５およびｐ４０ポリペプチドサブユニットの一方もしくは両方を含むか、または生物学的に活性な単鎖ＩＬ−１２ポリペプチドであり、
ＩＬ−１２をコードするポリヌクレオチドが、ジアシルヒドラジンリガンドの対象への投与が対象におけるＩＬ−１２の産生を誘導することができるように、プロモーターポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、方法。
【０４４０】
Ｅ６９．対象が１８歳以上のヒトまたは１８歳より下のヒトである、Ｅ６６〜Ｅ６８のいずれか１つに記載の方法。
【０４４１】
Ｅ７０．脳のがんが、グリオーマ、神経膠芽腫、再発性神経膠芽腫、進行性神経膠芽腫、びまん性内在性橋膠腫（ＤＩＰＧ）、または他のびまん性正中神経膠腫（例えば、視床、脳幹もしくは脊髄）である、Ｅ６６〜Ｅ６８のいずれか１つに記載の方法。
【０４４２】
Ｅ７１．複製欠損アデノウイルスベクターが、５型アデノウイルスゲノムに由来した、Ｅ６６〜６８のいずれか１つに記載の方法。
【０４４３】
Ｅ７２．アデノウイルスが腫瘍内投与される、Ｅ１〜Ｅ７１のいずれか１つに記載の方法。
【０４４４】
Ｅ７３．アデノウイルスが、定位固定標的化および送達によって腫瘍内投与される、Ｅ７２に記載の方法。
【０４４５】
Ｅ７４．ジアシルヒドラジンリガンドがベレジメクスである、Ｅ６６〜Ｅ６８のいずれか１つに記載の方法。
【０４４６】
Ｅ７５．ベレジメクスの任意の１回または複数回の投与が、５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、８０ｍｇ、１００ｍｇ、１２０ｍｇまたは１５０ｍｇの用量で経口投与される、Ｅ７４に記載の方法。
【０４４７】
Ｅ７６．エクジソン受容体に基づくポリペプチドが、ヘルペスウイルスＶＰ１６トランス活性化ドメインポリペプチド配列、キメラ哺乳動物レチノイドＸ受容体（ＲｘＲ）および昆虫ウルトラスピラクル（ＵＳＰ）ポリペプチド配列、Ｇａｌ４  ＤＮＡ結合ドメインポリペプチド配列、およびトウヒノシントメハマキ、コリストネウラ・フミフェラーナ（Choristoneura fumiferana）に由来するアミノ酸置換突然変異エクジソン受容体リガンド結合ドメインポリペプチドを含む、Ｅ６６〜Ｅ６８のいずれか１つに記載の方法。
【０４４８】
Ｅ７７．免疫チェックポイント阻害剤が、ＰＤ−１アンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ２アンタゴニスト、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、ＣＤ１３７アンタゴニスト、ＣＤ８０アンタゴニスト、ＣＤ８６アンタゴニスト、ＫＩＲアンタゴニスト、Ｔｉｍ−３アンタゴニスト、ＬＡＧ３アンタゴニスト、ＴＩＧＩＴアンタゴニスト、ＣＤ２０アンタゴニスト、ＣＤ９６アンタゴニスト、またはＩＤＯ１アンタゴニストである、Ｅ６６〜Ｅ６８のいずれか１つに記載の方法。
【０４４９】
Ｅ７８．免疫チェックポイント阻害剤が、ニボルマブ（ＭＤＸ１１０６）、ペンブロリズマブ（ＭＫ−３４７５）、ピジリズマブ（ＣＴ−０１１）、ＭＥＤＩ−０６８０（ＡＭＰ−５１４）、ＰＤＲ００１、セミプリマブ−ｒｗｌｃ（ＲＥＧＮ２８１０）、ＡＭＰ−２２４、ＳＴＩ−Ａ１１１０、ＡＵＮＰ−１２、またはＢＧＢ−Ａ３１７である、Ｅ６６〜Ｅ６８のいずれか１つに記載の方法。
【０４５０】
Ｅ７９．対象が、Ｅ１〜Ｅ７６のいずれか１つに記載の処置方法の前にコルチコステロイドを投与されていない、Ｅ１〜Ｅ７８のいずれか１つに記載の方法。
【０４５１】
Ｅ８０．コルチコステロイドの対象への投与が、Ｅ１〜Ｅ７６のいずれか１つに記載の処置方法の前に中止されている、または減少している、Ｅ１〜Ｅ７８のいずれか１つに記載の方法。
【０４５２】
Ｅ８１．コルチコステロイドの対象への投与が、Ｅ１〜Ｅ７６のいずれか１つに記載の処置方法の間に減少する、または中止される、Ｅ１〜Ｅ７８のいずれか１つに記載の方法。
【０４５３】
Ｅ８２．コルチコステロイドがデキサメタゾンである、Ｅ７７〜Ｅ８１のいずれか１つに記載の方法。
【０４５４】
Ｅ８３．処置方法が、Ｔ細胞の腫瘍への動員の増強または増加をもたらす、Ｅ１〜Ｅ８２のいずれか１つに記載の方法。
【０４５５】
Ｅ８４．腫瘍中でのＴ細胞活性が、免疫チェックポイントタンパク質または免疫チェックポイントアクチベーターの発現または細胞表面提示の減少によって改善される、または増強される、Ｅ８３に記載の方法。
【０４５６】
Ｅ８５．ベレジメクスが漸増用量で投与される、Ｅ１〜Ｅ８４のいずれか１つに記載の方法。
【０４５７】
Ｅ８６．第１の用量が１０ｍｇであり、その後の用量または複数の用量が１０ｍｇより多い、Ｅ８５に記載の方法。
【０４５８】
Ｅ８７．第１の用量が１０ｍｇであり、１つまたは複数のその後の用量が２０ｍｇである、Ｅ８５に記載の方法。
【０４５９】
Ｅ８８．第１の用量が１０ｍｇであり、１つまたは複数のその後の用量が３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、８０ｍｇ、１００ｍｇ、１２０ｍｇまたは１５０ｍｇである、Ｅ８５に記載の方法。
【０４６０】
Ｅ８９．免疫チェックポイント阻害剤が、１ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇで静脈内投与される、Ｅ１〜Ｅ８８のいずれかに記載の方法。
【０４６１】
Ｅ９０．免疫チェックポイント阻害剤が抗ＰＤ−１抗体である、Ｅ８９に記載の方法。
【０４６２】
Ｅ９１．ＰＤ−１特異的抗体がニボルマブである、Ｅ９０に記載の方法。
【０４６３】
Ｅ９２．ニボルマブがＯＰＤＩＶＯ（登録商標）ＰＤ−１特異的抗体である、Ｅ９１に記載の方法。
【０４６４】
Ｅ９３．免疫チェックポイント阻害剤が、腫瘍切除の１週間前に投与される、Ｅ８９〜Ｅ９２のいずれかに記載の方法。
【０４６５】
Ｅ９４．免疫チェックポイント阻害剤が、腫瘍切除の１５日後にさらに投与される、Ｅ９３に記載の方法。
【０４６６】
Ｅ９５．免疫チェックポイント阻害剤が、さらなる投与の中止まで約２週間毎にさらに投与される、Ｅ９４に記載の方法。
【０４６７】
省略形
Ａｄ＝Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２（すなわち、ヒトインターロイキン−１２の制御された（リガンド誘導性）転写および発現（合成）のためのリガンド誘導性遺伝子スイッチを含む組換えアデノウイルス）。
Ａｄ＋Ｖ＝Ａｄ−ＲＴＳ−ｈＩＬ−１２およびベレジメクス
ＡＥ＝有害事象
抗ＰＤ−１＝プログラム細胞死タンパク質−１結合抗体
抗ＰＤ−Ｌ１＝プログラム細胞死リガンド−１結合抗体
ＣＡＰ＝同時活性化タンパク質
ＣＤ３＝分化クラスター３タンパク質
ＣＤ８＝分化クラスター８タンパク質
ＣＹＰ３Ａ４＝シトクロムＰ４５０  ３Ａ４
ＤＢＤ＝ＤＮＡ結合ドメイン
ＤＩＰＧ＝びまん性内在性橋膠腫
ＦｏｘＰ３＝フォークヘッドボックスＰ３タンパク質（例えば、Liang Y, et al.,"Tumor-infiltrating CD8+ and FOXP3+ lymphocytes before and after neoadjuvant chemotherapy in cervical cancer", Diagn Pathol. (2018) Nov 24;13(1):93 (doi: 10.1186/s13000-018-0770-4)およびそこで引用される参考文献を参照されたい）。
ＧＬ−２６１＝グリオーマのグリオーマ２６１マウスモデル
ｈＩＬ−１２（ｈＩＬ１２）＝ヒトインターロイキン−１２
ＩＬ−１２（ＩＬ１２）＝インターロイキン−１２
ｋｇ＝キログラム。
ＬＴＦ＝リガンド依存性転写因子
ｍ２＝対象の体表面積の標準尺度
ｍｇ＝ミリグラム
ｍＩＬ−１２（ｍＩＬ１２）＝マウスインターロイキン−１２
ｍＬ＝ミリリットル
ｍＯＳ＝中央全生存
ｎｉｖｏ＝ニボルマブ
ＰＤ−１＝プログラム細胞死タンパク質−１
ＰＤ−Ｌ１＝プログラム細胞死リガンド−１（受容体タンパク質）
ｐｇ＝ピコグラム
ＰＯ＝ｐｅｒ  ｏｓ；口による；経口
Ｑ２Ｗ＝２週毎に１回
ＱＤ＝１日１回
ＱＤ×１４＝１４日間にわたって１日１回
ＱＷ＝週１回
ｒＧＢＭ＝再発性神経膠芽腫
ＲＴＳ＝作動可能に連結された遺伝子のリガンド誘導性転写活性化および発現のための遺伝子スイッチ（別名、「ＲＨＥＯＳＷＩＴＣＨ（登録商標）ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＳＹＳＴＥＭ」）
Ｔ細胞＝リンパ球型の免疫細胞；典型的には、胸腺によって産生またはプロセッシングされる
Ｔｒｅｇ＝調節性Ｔ細胞
ＴＳＰ＝治療スイッチプロモーター
Ｖ＝ベレジメクス
ｖｐ＝ウイルス粒子
ｖｓ＝対
Ｘ１４＝１４倍
【０４６８】
さらなる参考文献：
AMGEN: "A Phase 1b/3, Multicenter, Open-label Trial of Talimogene Laherparepvec in Combination With Pembrolizumab (MK-3475) for Treatment of Unresected,Stage IIIB to IVM1c Melanoma (MASTERKEY-265)", 22 June 2015
NATIONAL CANCER INSTITUTE (NCI): "Randomized Phase II/III Study of Nivolumab Plus Ipilimumab Plus Sargramostim Versus Nivolumab Plus Ipilimumab in Patients With Unresectable Stage III or Stage IV Melanoma", 9 April 2015
Barrett, et al., “Localized Regulated Expression of IL-12 as a Gene Therapy Approach to Cancer Immunotherapy”American Society of Gene & Cell Therapy 19th Annual Meeting (2016); Control/Tracking Number: 2016-A-231-ASGCT
Lebel, et al., “Phase 1 study of intratumoral viral delivery of Ad-RTS-hIL-12 + oral veledimex is well tolerated and suggests survival benefit in recurrent high grade glioma”
ASCO Poster, “CTLA-4 Antagonist Monoclonal Antibody for the Treatment of Cancer”, Worldwide Primary Investigator’s Meeting (2005)
欧州特許出願公開第２５９１７９６号明細書、２０１２年３月２１日付のサーチレポートおよび意見書。
Allard, et al., Clinical Cancer Research, 19(20): 5626-5635 (2013)
Chiocca, et al., American Academy of Neurological Surgery, Slides 1-12; Annual Meeting (2017)
Jackson, et al., Clinical and Developmental Immunology, vol. 2011, Article ID 732413, 20 pages, (2011)
Kim et al., Journal of Immunology Research, vol. 2016, Article ID 4683607, 14 pages
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Patel, et al., Cancers, 6:1953-1985 (2014)
Storz, Ulrich, "Intellectual property issues of immune checkpoint inhibitors", MAbs. 2016 Jan; 8(1): 10-26 (Published online 2015 Oct 14. doi:  10.1080/19420862.2015.1107688)
米国特許第９，８１５，８９８号明細書
米国特許第９，８８４，９１３号明細書
米国特許第９，９８８，４５２号明細書
国際公開第２００４／０２９１９７号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２００２／０１９８９８）
国際公開第２００９／０４８５６０号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１１５６３）
国際公開第２０１３／０４３６４７号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５５９９２）
国際公開第２０１３／０５３７７５号パンフレット（ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０７００８８）
国際公開第２０１４／０２２１３８号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５１５３５）
国際公開第２０１４／０４７３５０号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０６０７１６）
国際公開第２０１４／１８９８０５号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０３８５２５）
国際公開第２０１５／０６９７７０号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６４１３３）
国際公開第２０１５／１１２９００号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１２７５４）
国際公開第２０１７／０１９８９６号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４４５４７）
【０４６９】
参照による組込み
本明細書で参照される全ての刊行物および他の文献（発行された特許、特許出願、その中の配列表、ならびに他の関連する開示物）および科学論文または他の論文の開示は、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる。任意のそのような組み込まれた参考文献中の陳述または他の情報が本出願と矛盾するか、または相反する事象では、本出願の開示が手掛かりをもたらし、支配し、制御するものとする。
【０４７０】
等価物
本発明を、その精神または必須の特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具体化することができる。前記実施形態は、したがって、本明細書に記載の本発明に対する限定というよりもむしろ、あらゆる点で例示と考えるべきである。本発明の範囲は、かくして、前記説明によってというよりもむしろ、添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の意味および等価性の範囲内にある全ての変化が、その中に包含されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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