(57)【要約】本出願は、非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体を含む、ヘリコバクター・ピロリを除菌するための経口投与用の薬学的組成物又はキットに関する。本発明の薬学的組成物及びキットは、β−ラクタム抗生剤及び／又は胃酸抑制剤をさらに含んでいてもよい。【選択図】図８a
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体を含む組成物を対象に経口投与するステップを含む、ヘリコバクター・ピロリの除菌方法。
【請求項２】
前記組成物は、β−ラクタム抗生剤をさらに含むことを特徴とする、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組成物は、胃酸抑制剤をさらに含むことを特徴とする、
請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記非吸収性抗生物質は、アミノグリコシド系化合物であることを特徴とする、
請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記粘土鉱物は、スメクタイト系グループ粘土鉱物である、
請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記組成物は、前記非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体が経口投与されて、食道を通って胃に至った後、胃粘液層に付着して抗生物質を放出することを特徴とする、
請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記組成物は、ウレアーゼ抑制活性を有することを特徴とする、
請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記組成物は、ヘリコバクター・ピロリ菌が原因である胃膓疾患の予防又は治療用の薬学的組成物であることを特徴とする、
請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ヘリコバクター・ピロリは、抗生剤耐性のヘリコバクター・ピロリであることを特徴とする、
請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ヘリコバクター・ピロリは、クラリスロマイシン耐性のヘリコバクター・ピロリであることを特徴とする、
請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体を対象に経口投与するステップを含む、ヘリコバクター・ピロリの除菌方法。
【請求項１２】
β−ラクタム抗生剤をさらに経口投与することを特徴とする、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
胃酸抑制剤をさらに経口投与することを特徴とする、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記非吸収性抗生物質は、アミノグリコシド系化合物であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記粘土鉱物は、スメクタイト系グループ粘土鉱物である、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体は、経口投与して、食道を通って胃に至った後、胃粘液層に付着して抗生物質を放出することを特徴とする、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体は、ウレアーゼ抑制活性を有することを特徴とする、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ヘリコバクター・ピロリは、抗生剤耐性のヘリコバクター・ピロリであることを特徴とする、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ヘリコバクター・ピロリは、クラリスロマイシン耐性のヘリコバクター・ピロリであることを特徴とする、
請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体を含む組成物を対象に経口投与するステップを含む、ヘリコバクター・ピロリ菌が原因である胃膓疾患の予防又は治療方法。
【請求項２１】
非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体を対象に経口投与するステップを含む、ヘリコバクター・ピロリ菌が原因である胃膓疾患の予防又は治療方法。
【請求項２２】
非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体を含む、ヘリコバクター・ピロリを除菌するための経口投与用の薬学的組成物。
【請求項２３】
前記薬学的組成物は、β−ラクタム抗生剤をさらに含むことを特徴とする、
請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
前記薬学的組成物は、胃酸抑制剤をさらに含むことを特徴とする、
請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
前記非吸収性抗生物質は、アミノグリコシド系化合物であることを特徴とする、
請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
前記粘土鉱物は、スメクタイト系グループ粘土鉱物である、
請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
前記薬学的組成物は、前記非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体が経口投与されて、食道を通って胃に至った後、胃粘液層に付着して抗生物質を放出することを特徴とする、
請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
前記薬学的組成物は、ウレアーゼ抑制活性を有することを特徴とする、
請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
前記薬学的組成物は、ヘリコバクター・ピロリ菌が原因である胃膓疾患の予防又は治療用の薬学的組成物であることを特徴とする、
請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
前記ヘリコバクター・ピロリは、抗生剤耐性のヘリコバクター・ピロリであることを特徴とする、
請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項３１】
前記ヘリコバクター・ピロリは、クラリスロマイシン耐性のヘリコバクター・ピロリであることを特徴とする、
請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項３２】
非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体を含む、抗生剤耐性のヘリコバクター・ピロリを除菌するための経口投与用キット。
【請求項３３】
前記キットは、β−ラクタム抗生剤をさらに含むことを特徴とする、
請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
前記キットは、胃酸抑制剤をさらに含むことを特徴とする、
請求項３２に記載のキット。
【請求項３５】
前記抗生剤耐性のヘリコバクター・ピロリは、クラリスロマイシン耐性のヘリコバクター・ピロリであることを特徴とする、
請求項３２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体を含む組成物を対象に経口投与するステップを含む、ヘリコバクター・ピロリの除菌方法に関する。また、本発明は、非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体を対象に経口投与するステップを含む、ヘリコバクター・ピロリの除菌方法に関する。また、本発明は、非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体を含む組成物を対象に経口投与するステップを含む、ヘリコバクター・ピロリ菌が原因である胃膓疾患の予防又は治療方法に関する。また、本発明は、非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体を対象に経口投与するステップを含む、ヘリコバクター・ピロリ菌が原因である胃膓疾患の予防又は治療方法に関する。また、本発明は、非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体を含む、ヘリコバクター・ピロリを除菌するための経口投与用の薬学的組成物に関する。また、本発明は、非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体を含む、ヘリコバクター・ピロリを除菌するための経口投与用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｈ．ピロリは、胃粘膜に影響を及ぼすグラム陰性微好気性らせん型の桿菌であって、人の胃の上皮細胞に付着して発見されうる。薬物耐性Ｈ．ピロリ菌株は、治療失敗における最もありふれた原因である。世界人口の約５０％は、Ｈ．ピロリ陽性であって、開発途上国は、８０％〜９０％の有病率を有し、先進国は、３５％〜４０％の有病率を有する。１９９８年、韓国内で初めてＨ．ピロリの除菌治療に関する勧告案が発表されて以来、現在まで一次治療として勧告されている標準三剤法は、クラリスロマイシン、アモキシシリン、胃酸抑制剤を複合して投与する方法である。この標準三剤法の除菌効果は、現在、７０％内外と非常に低い効果を示しているが、未だ既存の三剤療法よりも優れた治療療法は開発されておらず、低い除菌効果にもかかわらず、三剤療法が一次治療として勧告されている実情である（Ｋｏｒｅａｎ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ２０１３；６２：３−２６）。このように、標準三剤療法を含む従来の治療療法は、経口投与した抗生剤が胃で溶解された後、腸で吸収されて血管を通って移動し、最終に胃粘膜へ放出されてＨ．ピロリを除菌する過程を経る（図１）。しかしながら、これは投与した抗生剤が腸で吸収された後、胃粘膜へ放出されて除菌作用を行うため、抗生剤が全身に露出して、抗生剤による副作用のリスク及び患者への負担がある。
【０００３】
スメクタイトは、Ａｌ、Ｍｇ、Ｆｅからなる八面体シート２個が、Ｓｉ、Ａｌ、Ｆｅからなる四面体シートを上下でサンドイッチ状に結合して、一つの単位層（２：１層）を構成している葉状珪酸塩ミネラルである。スメクタイト単位層は、負電荷を有しているが、これは４価正電荷を有する四面体Ｓｉが、３価正電荷を有するＡｌ又はＦｅと同形置換（ｉｓｏｍｏｐｈｉｃ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）するか、３価正電荷を有する八面体Ａｌ又はＦｅ３＋が、２価正電荷を有するＭｇ又はＦｅ２＋に同形置換されることによって発生する。単位層で発生した負電荷を介して単位層と単位層との間にカチオンが誘導されるが、これはスメクタイトが薬物担体（ｃａｒｒｉｅｒ）として用いられることを意味する。よって、薬物伝達運搬体としてのスメクタイトの利用は、最近、大きな関心を集めてきており、多様な研究がドネペジル（ｄｏｎｅｐｅｚｉｌ）、リンコマイシン（ｌｉｎｃｏｍｙｃｉｎ）、酢酸クロルヘキシジン（ｃｈｌｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ ａｃｅｔａｔｅ）及びテトラサイクリン（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）などを、統制した伝達及び放出のために薬物の挿入したスメクタイトハイブリッドを報告してきた。
【０００４】
アミノグリコシド（ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ）系抗生剤は、グラム陰性菌の治療に用いられる代表的な抗生剤であるものの、経口薬剤がなくて、注射剤のみ使用可能であり、Ｈ．ピロリ除菌治療では使用されたことがなかった。一部の研究では、アミノグリコシドのＨ．ピロリに対するイン・ビトロ活性評価における低い最小抑制濃度を保持することを確認した。テスト済みアミノグリコシドのうち最も活性であるものは、ゲンタマイシン、トブラマイシン（ｔｏｂｒａｍｙｃｉｎ）及びネチルマイシン（ｎｅｔｉｌｍｉｃｉｎ）であり、これらは、それぞれ０．２５〜０．５及び０．１２５〜１．００ｍｇ／ＬのＭＩＣ９０及びＭＩＣ５０値を有する（Ｂｒｅｎｃｉａｇｌｉａ ＭＩ，Ｆｏｒｎａｒａ ＡＭ，Ｓｃａｌｔｒｉｔｏ ＭＭｅｔ ａｌ．Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｍｏｘｉｃｉｌｌｉｎ，ｍｅｔｒｏｎｉｄａｚｏｌｅ，ｂｉｓｍｕｔｈ ｓａｌｉｃｙｌａｔｅ ａｎｄ ｓｉｘ ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ ａｇａｉｎｓｔ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ．ＪＣｈｅｍｏｔｈｅｒ  １９９６；８：５２−４）。しかし、アミノグリコシドは、経口投与するとき、胃腸管ではほぼ吸収されないため、現在まで非経口のみに使用されてきた（Ｔｕｒｎｉｄｇｅ Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ ａｎｄ ｄｏｓｉｎｇ ｏｆ ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ Ｃｌｉｎ ＮｏｒｔｈＡｍ２００３；１７：５０３−２８）。また、実際、イン・ビボ評価におけるアミノグリコシド系抗生剤がＨ．ピロリの除菌に効果を示したということは、報告されたことがない。
【０００５】
この点、本発明者たちは、経口投与した後、胃腸管で効果的に除菌する方式のＨ．ピロリ除菌剤を研究するうちに、本発明のＨ．ピロリ除菌用組成物は、腸で吸収されて、血管を通って胃で放出される方式ではない、経口投与した後、食道を通って胃に至った抗生剤が胃粘液層に付着して、Ｈ．ピロリを効果的に除菌することを確認して、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、経口投与した後、胃粘膜に塗布されて作用するＨ．ピロリ除菌用組成物、及びこれを利用したＨ．ピロリの除菌方法、Ｈ．ピロリが原因である胃膓疾患の予防及び治療方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために本発明は、非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体を含む組成物を対象に経口投与するステップを含む、ヘリコバクター・ピロリの除菌方法を提供する。また、本発明は、非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体を対象に経口投与するステップを含む、ヘリコバクター・ピロリの除菌方法を提供する。また、本発明は、非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体を含む組成物を対象に経口投与するステップを含む、ヘリコバクター・ピロリ菌が原因である胃膓疾患の予防又は治療方法を提供する。また、本発明は、非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体を対象に経口投与するステップを含む、ヘリコバクター・ピロリ菌が原因である胃膓疾患の予防又は治療方法を提供する。また、本発明は、非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体を含む、ヘリコバクター・ピロリを除菌するための経口投与用の薬学的組成物を提供する。また、本発明は、非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体を含む、ヘリコバクター・ピロリを除菌するための経口投与用キットを提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の薬学的組成物及びキットは、板状粘土伝達体を含むところ、胃粘膜への塗布が可能であり、胃粘膜への標的治療が可能である。また、酸度の低い胃内環境における抗生剤の破壊が減少し、腸内細菌に対する影響を最小化する長所がある。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】従来の三剤療法によるＨ．ピロリの除菌過程を示す図面。
【図２】本発明の非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体がＨ．ピロリを除菌する過程を示す図面。
【図３】ゲンタマイシン−スメクタイト複合体（Ｓ−ＧＥＮ）のヘリコバクター・ピロリの除菌活性を示す図面。左上端ディスク：スメクタイト、右上端ディスク：Ｓ−ＧＥＮ、下方ディスク：ゲンタマイシン。
【図４】ネチルマイシン−スメクタイト複合体（Ｓ−ＮＥＴ）のヘリコバクター・ピロリの除菌活性を示す図面。左ディスク：スメクタイト、右ディスク：Ｓ−ＮＥＴ。
【図５】イン・ビボにおける抗Ｈ．ピロリの薬効を確認するためのプロトコル。上記プロトコルは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＨ．ピロリの接種及び感染発達、それから治療に繋がることを含む。
【図６】グループ１〜８を利用したＨ．ピロリ感染の治療効果に対する研究後、胃粘膜組織とＰＣＲの結果。
【図７】抗生剤に対するＨ．ピロリの耐性率を示す図面。
【図８ａ】クラリスロマイシン耐性菌株におけるＣＬＲディスクとＳ−ＧＭディスクのイン・ビトロ抗菌効果を比較した結果。
【図８ｂ】クラリスロマイシン耐性菌株におけるＣＬＲディスクとＳ−ＧＭディスクのイン・ビトロ抗菌効果を比較した結果。
【発明を実施するための最善の形態】
【００１０】
本発明は、非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体を含む組成物を対象に経口投与するステップを含む、ヘリコバクター・ピロリの除菌方法に関する。
【００１１】
また、本発明は、非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体を対象に経口投与するステップを含む、ヘリコバクター・ピロリの除菌方法に関する。
【００１２】
また、本発明は、非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体を含む組成物を対象に経口投与するステップを含む、ヘリコバクター・ピロリ菌が原因である胃膓疾患の予防又は治療方法に関する。
【００１３】
また、本発明は、非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体を対象に経口投与するステップを含む、ヘリコバクター・ピロリ菌が原因である胃膓疾患の予防又は治療方法に関する。
【００１４】
また、本発明は、非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体を含む、ヘリコバクター・ピロリを除菌するための経口投与用の薬学的組成物に関する。
【００１５】
また、本発明は、非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体を含む、抗生剤耐性のヘリコバクター・ピロリを除菌するための経口投与用の薬学的組成物に関する。
【００１６】
また、本発明は、非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体を含む、ヘリコバクター・ピロリを除菌するための経口投与用の薬学的組成物の用途に関する。
【００１７】
また、本発明は、非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体を含む、抗生剤耐性のヘリコバクター・ピロリを除菌するための経口投与用の薬学的組成物の用途に関する。
【００１８】
また、本発明は、非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体を含む、ヘリコバクター・ピロリを除菌するための経口投与用キットに関する。
【００１９】
また、本発明は、非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体を含む、抗生剤耐性のヘリコバクター・ピロリを除菌するための経口投与用キットに関する。
【００２０】
また、本発明は、本発明の薬学的組成物を対象に投与するステップを含む、ヘリコバクター・ピロリの除菌方法に関する。
【００２１】
また、本発明は、本発明の薬学的組成物を対象に投与するステップを含む、抗生剤耐性のヘリコバクター・ピロリの除菌方法に関する。
【００２２】
また、本発明は、本発明の薬学的組成物を対象に投与するステップを含む、抗生剤耐性のヘリコバクター・ピロリが原因である疾患の予防又は治療方法に関する。
【００２３】
以下では、本発明を詳説する。
【００２４】
非吸収性抗生物質
本発明の非吸収性抗生物質は、粘土鉱物と複合体の形態で経口投与した後、食道を通って胃に至るときに胃粘膜に塗布される。胃粘膜に塗布された複合体から前記抗生物質が放出されて、Ｈ．ピロリを除菌することになる。
【００２５】
本発明の非吸収性抗生物質は、複合体が経口投与された後、胃におけるＨ．ピロリの除菌に用いられない場合、吸収せずに排泄されることにより、抗生剤の副作用及び患者への負担を軽減させる。また、この場合、本発明の非吸収性抗生物質は、粘土鉱物と結合した複合体の形態であるため、腸内細菌に対する影響が少なく、胃酸条件で抗生剤の破壊を最小化する。
【００２６】
本発明の非吸収性抗生物質は、特に制限されるものではないが、アミノグリコシド系化合物であってもよい。
【００２７】
本発明のアミノグリコシド系化合物は、ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ）、トブラマイシン（ｔｏｂｒａｍｙｃｉｎ）、アミカシン（ａｍｉｋａｃｉｎ）、ネオマイシン（ｎｅｏｍｙｃｉｎ）、ネチルマイシン（ｎｅｔｉｌｍｉｃｉｎ）などであってもよく、好ましくは、ゲンタマイシンであってもよい。
【００２８】
粘土鉱物
通常、粘土鉱物は、ケイ酸板（ｓｉｌｉｃａ ｓｈｅｅｔ）とアルミナ板（ａｌｕｍｉｎａ ｓｈｅｅｔ）とが結合して形成された結晶単位の積層された層状構造、すなわち、板状構造を有するが、このような粘土鉱物のうち、層間膨脹性を有する粘土鉱物では、結晶単位の間に水素結合が存在せず、結晶単位間の結合力が弱いため、これら結晶単位間に水分が吸入されると、膨脹されうる。したがって、層間膨脹性を有する粘土鉱物の結晶単位間には、相対的に大きなサイズを有するイオンであっても、容易に流入させることができる。一方、層間膨脹性を有する粘土鉱物においては、４価正電荷を有する四面体Ｓｉが、３価正電荷を有するＡｌ又はＦｅと同形置換（ｉｓｏｍｏｒｐｈｉｃ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）されるか、３価正電荷を有する八面体Ａｌ又はＦｅ３＋が、２価正電荷を有するＭｇ又はＦｅ２＋に同形置換されることにより、負の層電荷が発生するものの、層と層との間又は表面にカルシウムイオン（Ｃａ２＋）、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）、ナトリウムイオン（Ｎａ＋）、カリウムイオン（Ｋ＋）などのカチオンが結合して、全体としては電気的に中性であるようになる。
【００２９】
本発明の粘土鉱物は、板状構造、具体的には、層間膨脹性を有しており、内部に抗生物質を挿入して、伝達体として使用されうる粘土鉱物である。本発明の粘土鉱物は、スメクタイト系鉱物であってもよく、例えば、モンモリロナイト（ｍｏｎｔｍｏｒｉｌｌｏｎｉｔｅ）又はベントナイト（ｂｅｎｔｏｎｉｔｅ）、バイデライト（ｂｅｉｄｅｌｌｉｔｅ）、ノントロナイト（ｎｏｎｔｒｏｎｉｔｅ）、サポナイト（ｓａｐｏｎｉｔｅ）、ヘクトライト（ｈｅｃｔｏｒｉｔｅ）などであってもよい。
【００３０】
非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体
本発明の非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体において、粘土鉱物は、前記非吸収性抗生物質を胃粘液層へ伝達する伝達体、すなわち、担体として用いられる。前記複合体は、粘土鉱物内に非吸収性抗生物質の挿入した構造である。前記非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体が経口投与されて、食道を通って胃に至った後、胃粘液層に付着して抗生物質を放出することになる（図２）。すなわち、本発明の複合体は、経口投与して、食道を通って胃に至った後、胃で抗生物質が溶解されて、溶解された抗生物質が腸へ移動し、腸で吸収されて、血管に乗って移動し、胃粘膜へ放出されてＨ．ピロリを除菌する過程で除菌を行うことではない。
【００３１】
本発明の粘土鉱物は、板状構造であるところ、胃粘液層（粘膜）への塗布が可能であり、薬物担持力に優れるところ、胃粘液層への標的治療が可能である。また、患部に効果的に最小抑制濃度（ＭＩＣ）の保持が可能であり、抗生物質に対する患者への負担が軽減する。
【００３２】
本発明の非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体は、当業界に公開された通常の方法を利用して製造することができる。粘土鉱物と医薬とを結合させた複合体の製造方法は、今まで複数の論文などにより公開されたことがあり、当業者は、これを適宜利用して、本発明の複合体を製造することができる。例えば、本発明の非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体は、その全体が本発明に参照として含まれる韓国登録特許１０−１５４１８７６号の方法により製造することができる。この場合、本発明の複合体は、イオン交換膜によって互いに分離された第１空間及び第２空間に膨脹性格子構造を有する粘土鉱物微粒子の分散溶液及び抗生物質溶液をそれぞれ供給し、第１時間の間に維持するステップ；及び前記第２空間から前記抗生物質溶液を除去した後、前記第２空間に抗生物質イオン洗浄溶液を供給するステップを含む、複合体の製造方法を利用して製造することができる。
【００３３】
β−ラクタム抗生剤
本発明の非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体は、β−ラクタム抗生剤及び／又は胃酸抑制剤と共に対象に投与することができる。よって、本発明の薬学的組成物及びキットは、非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体のほか、β−ラクタム抗生剤及び胃酸抑制剤をさらに含んでいてもよい。
【００３４】
前記β−ラクタム抗生剤は、ペニシリン、メチシリン（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ）、アンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）、アモキシシリン、セファロスポリン、カルバペネムなどであってもよく、好ましくは、アモキシシリンであってもよい。
【００３５】
胃酸抑制剤
本発明の非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体は、β−ラクタム抗生剤及び／又は胃酸抑制剤と共に対象に投与することができる。本発明の胃酸抑制剤は、プロトンポンプ抑制剤である。本発明の胃酸抑制剤は、通常の胃酸抑制剤を使用すればよく、特に制限されるものではない。例えば、本発明の胃酸抑制剤は、オメプラゾール（ｏｍｅｐｒａｚｏｌｅ）、エソメプラゾール（ｅｓｏｍｅｐｒａｚｏｌｅ）、ラベプラゾール（ｒａｂｅｐｒａｚｏｌｅ）、ランソプラゾール（ｌａｎｓｏｐｒａｚｏｌｅ）、パントプラゾール（ｐａｎｔｏｐｒａｚｏｌｅ）などであってもよい。本発明の薬学的組成物又はキットを利用する対象が、胃に弱いか、胃酸が分泌し過ぎる場合、非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体と共に胃酸抑制剤を併用して投与することができる。
【００３６】
キット
本発明のキットは、非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体を含む。好ましくは、本発明のキットは、β−ラクタム抗生剤及び／又は胃酸抑制剤をさらに含む。本発明のキットは、Ｈ．ピロリを除菌するための経口投与用キットである。
【００３７】
薬学的組成物
本発明の組成物は、薬学的組成物であってもよく、本明細書における用語「組成物」と「薬学的組成物」は、互いに交換可能に使用されうる。本発明の薬学的組成物は、非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体を含む。好ましくは、本発明の薬学的組成物は、β−ラクタム抗生剤及び／又は胃酸抑制剤をさらに含む。
【００３８】
本発明の薬学的組成物の前記非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体は、経口投与して、食道を通って胃に至った後、胃粘液層に付着して抗生物質が放出される。前記薬学的組成物は、ウレアーゼ抑制活性を有し、ヘリコバクター・ピロリ菌が原因である胃膓疾患の予防又は治療用の薬学的組成物であってもよい。
【００３９】
本発明の薬学的組成物は、Ｈ．ピロリが原因である疾患の予防、改善又は治療用の薬学的組成物であってもよい。前記ヘリコバクター・ピロリが原因である疾患は、胃腸管の損傷、胃炎、胃潰瘍、十二指膓潰瘍、胃炎、胃癌又はＭＡＬＴリンパ種でありうる。
【００４０】
本発明の薬学的組成物は、前記非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体、β−ラクタム抗生剤及び／又は胃酸抑制剤を０．０１〜８０重量％含んでいてもよく、好ましくは、０．０２〜６５重量％含んでいてもよい。しかし、これは投薬者の必要に応じて増減することができ、年齢、食生活、栄養状態、病気の進行の程度など、状況によって適宜増減することができる。本発明の薬学的組成物内の前記非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体、β−ラクタム抗生剤及び／又は胃酸抑制剤の割合、すなわち、組成は、当業者が適宜決定することができる。
【００４１】
本発明の薬学的組成物は、経口投与が可能であり、一般的な医薬品製剤の形態で使用されうる。好ましい薬剤学的製剤は、錠剤、硬質又は軟質カプセル剤、液剤、懸濁剤、シロップ、チューイングタブレットなどのような経口投与用製剤があり、これら薬剤学的製剤は、薬剤学的に許容可能な通常の担体、例えば、経口投与用製剤の場合には賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、可溶化剤、懸濁剤、保存剤又は増量剤などを用いて調剤することができる。
【００４２】
本発明の薬学的組成物の投与用量は、患者の状態、年齢、性別及び余病など、様々な要因に応じて専門家によって決定されうるが、通常は、大人１ｋｇ当たり０．１ｍｇ〜１０ｇ、好ましくは、１０ｍｇ〜５ｇの用量に投与することができる。また、単位剤形当たり前記薬学的組成物の１日用量又はこれの１／２、１／３又は１／４の用量が含有されるようにして、１日に１〜６回投与することができる。しかし、健康及び衛生を目的とするか又は健康調節を目的とする長期摂取の場合、前記量は、前記範囲以下であってもよく、担当医者は、これを適宜調節することができる。
【００４３】
ヘリコバクター・ピロリが原因である疾患
本発明の薬学的組成物及びキットは、ヘリコバクター・ピロリが原因である疾患の予防、改善又は治療のためのものであってもよい。前記ヘリコバクター・ピロリが原因である疾患は、胃腸管の損傷、胃炎、胃潰瘍、十二指膓潰瘍、胃炎、胃癌又はＭＡＬＴリンパ種でありうる。前記ヘリコバクター・ピロリは、通常のヘリコバクター・ピロリであってもよく、抗生剤耐性のヘリコバクター・ピロリであってもよい。このとき、抗生剤耐性のヘリコバクター・ピロリは、クラリスロマイシン耐性のヘリコバクター・ピロリであってもよい。本発明の薬学的組成物及びキットは、クラリスロマイシン耐性のヘリコバクター・ピロリに対して除菌活性を有する。
【００４４】
治療方法又は除菌方法
本発明は、本発明の薬学的組成物を対象に経口投与するステップを含む、Ｈ．ピロリの除菌方法に関する。また、本発明は、本発明の薬学的組成物を対象に経口投与するステップを含む、抗生剤耐性のＨ．ピロリの除菌方法に関する。また、本発明は、本発明の薬学的組成物を対象に経口投与するステップを含む、Ｈ．ピロリが原因である疾患の予防、改善又は治療方法に関する。また、本発明は、本発明の薬学的組成物を対象に経口投与するステップを含む、抗生剤耐性のＨ．ピロリが原因である疾患の予防、改善又は治療方法に関する。
【００４５】
前記対象は、Ｈ．ピロリに感染したと診断されるか、又はＨ．ピロリに感染するおそれのある哺乳動物であってもよい。また、前記対象は、抗生剤耐性のＨ．ピロリに感染したと診断されるか、又は抗生剤耐性のＨ．ピロリに感染するおそれのある哺乳動物であってもよい。前記哺乳動物は、人を含むか又は含まなくてもよい。よって、本発明の治療方法は、抗生剤耐性のＨ．ピロリに感染したか、抗生剤耐性のＨ．ピロリに感染するおそれのある対象を治療することができ、従来のＨ．ピロリ除菌用医薬よりも治療対象の幅が広い。また、本発明の除菌方法は、抗生剤耐性のＨ．ピロリも除菌することができるところ、従来のＨ．ピロリ除菌用医薬よりも除菌対象の幅が広い。
【００４６】
抗生剤耐性のヘリコバクター・ピロリ
本発明の非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体、又は前記複合体を含む薬学的組成物は、抗生剤耐性のヘリコバクター・ピロリに対して除菌活性を有する。前記抗生剤耐性のヘリコバクター・ピロリは、クラリスロマイシン耐性のヘリコバクター・ピロリであるのが好ましい。例えば、前記抗生剤耐性のヘリコバクター・ピロリは、クラリスロマイシンに対して単独耐性を有するヘリコバクター・ピロリであってもよく、クラリスロマイシン及びメトロニダゾール（ｍｅｔｒｏｎｉｄａｚｏｌｅ）に対する同時耐性を有するか、又はクラリスロマイシンのほかにも、メトロニダゾール、テトラサイクリン（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、レボフロキサシン（ｌｅｖｏｆｌｏｘａｃｉｎ）などから選択される１以上の抗生剤に対しても耐性を有する、すなわち、複数個の抗生剤に対する多剤耐性を有するヘリコバクター・ピロリであってもよい。アモキシシリン耐性は、１０％未満である反面、最近、クラリスロマイシンに対するヘリコバクター・ピロリの耐性は、増加しつつあり、Ｈ．ピロリの除菌治療が失敗した主な原因は、クラリスロマイシン耐性である。よって、クラリスロマイシン耐性のヘリコバクター・ピロリに対して除菌活性を有する本発明の非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体、又は前記複合体を含む薬学的組成物は、従来の除菌治療に対して失敗した対象に特に有用である。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
本発明の利点及び特徴、そしてそれらを達成する方法は、詳細に後述されている実施例を参照すれば明確になる。しかし、本発明は、以下に開示する実施例に限定されるものではなく、互いに異なる様々な形態に具現されるものである。但し、本実施例は、本発明の開示を完全にして、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に発明の範疇を完全に知らせるために提供されるものであり、本発明は、請求項の範疇によって定義されるだけである。
【００４８】
＜材料及び方法＞
＜実験倫理＞
韓国仁川のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｅｆｆｉｃａｃｙ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓのｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅより承認されて、ラットたちに対して動物試験を行った。マウス実験は、円光大学校薬学大学校のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅより検討及び承認された。マウスたちは、韓国益山の円光大学校の動物利用及び管理のためのガイドライン及び統制に従い処理され、任意に水と標準実験食餌を供給された。
【００４９】
＜統計分析＞
データは、平均±ＳＤと示しており、実験群は、非母数Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ−Ｕテストを利用して比較した。ＭＩＮＩＴＡＢ統計ソフトウェアプログラム（Ｍｉｎｉｔａｂ Ｉｎｃ．，ＰＡ，ＵＳＡ）を利用して、検出の割合に対して９５％ＣＩｓを得た。もし、両値の９５％ＣＩが重畳しなければ、それらは、相当相違するものと考慮された。Ｐ値＜０．０５は、統計的に重要なものと考慮された。結果は、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ Ｐａｃｋａｇｅ ｆｏｒ Ｓｏｃｉａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＳＰＳＳ １２．０ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ；ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）を利用して分析した。
【００５０】
＜実験例１＞抗生物質−粘土鉱物複合体の除菌活性
＜１−１＞ 抗生物質の挿入
ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ）溶液（２ｍｇ／ｍＬ）は、Ｂｉｏ Ｂａｓｉｃ Ｉｎｃ．生産のＵｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ（ＵＳＰ）等級のゲンタマイシン硫酸塩を利用して製造した。
【００５１】
Ｃａ−スメクタイト（ｓｍｅｃｔｉｔｅ）は、韓国内慶北地域のベントナイトを精製して製造した。ゲンタマイシン−スメクタイト複合体であるＳ−ＧＥＮ（ゲンタマイシン−挿入したスメクタイトハイブリッド）は、Ｃａ−スメクタイトのグラム当たりゲンタマイシン溶液２５０ｍｌを混合し、２４時間強くかき混ぜながら製造した。本明細書において、ゲンタマイシン−スメクタイト複合体である用語Ｓ−ＧＥＮ（ゲンタマイシン−挿入したスメクタイトハイブリッド）は、用語Ｓ−ＧＭと互いに交換可能に混用して使われる。混合後、ハイブリッド溶液は、８時間、５０℃で５Ｌの蒸留水で透析し、これは硫酸塩イオンがＰｂＣｌ２に検出されないまで、３回又は４回繰り返した。ハイブリッド粉末は、２日〜３日間透析されたハイブリッド溶液を凍結乾燥することで得た。ハイブリッドから放出されたゲンタマイシンの量は、バッチ−放出テストによって決定されたが、このとき、２５ｍＬのｐＨ１．２溶液が、繰り返してハイブリッド粉末の同じ１００ｍｇに添加された。上清液からゲンタマイシン濃度は、ＬＣ−ＭＳを利用して測定した。ＬＣ分析は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＩＣＳシステムを利用して行われた。ＭＳ分析は、エレクトロスプレーイオン化とＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＭＳＱ Ｐｌｕｓ単一四極子（ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ）質量分析計を利用して行われた。１時間内に放出されたゲンタマイシンの総量は、ハイブリッド１００ｍｇ当たり〜５．０ｍｇと確認された。
【００５２】
一方、同じ方法によりゲンタマイシンに代えて、ネチルマイシンを用いて、ネチルマイシン−スメクタイト複合体であるＳ−ＮＥＴを製造した。
【００５３】
＜１−２＞ イン・ビトロにおける除菌活性評価
Ｓ−ＧＥＮ及びＳ−ＮＥＴの除菌活性を評価した。ヘリコバクター・ピロリ菌を培地に塗布（赤色）した後、ディスク状に試料を作り、培地上に置いて、除菌効能を測定した。このとき、ディスクの周りに赤色がなくなると、除菌効能があることを意味する。
【００５４】
その結果、ゲンタマイシン−スメクタイト複合体（Ｓ−ＧＥＮ）及びネチルマイシン−スメクタイト複合体（Ｓ−ＮＥＴ）は、いずれもヘリコバクター・ピロリの除菌活性を有することが確認された（図３及び図４、図３の左上端：スメクタイト、右上端：Ｓ−ＧＥＮ、下方：ゲンタマイシン；図４の左：スメクタイト、右：Ｓ−ＮＥＴ）。
【００５５】
＜実験例２＞ ラットにおける胃粘膜への塗布
７週令オスＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットたち（体重２２０ｇ±２０％）は、胃粘膜への塗布をテストするために、韓国烏山のＳａｍｔａｋｏ Ｌｔｄ．より購入した。ラットたちは、実験の前、２４時間禁食された。１０匹のラットの２グループは、１０ｍＬ／ｋｇ（１５０ｍｇ／ｋｇ）であり、スメクタイト（ｓｍｅｃｔｉｔｅ）又はＳ−ＧＥＮが摂取されており、１時間後、安楽死された。胃粘膜への塗布効率を分析するために、ラットたちの胃は、大彎（ｇｒｅａｔｅｒ ｃｕｒｖａｔｕｒｅ）に沿って切除及び切断され、固定された（ｐｉｎｎｅｄ）。胃分布割合は、下記式１に従って計算した。
【００５６】
＜式１＞
胃分布割合（％）＝｛胃分布領域（ｃｍ２）／胃全体領域（ｃｍ２）｝×１００
【００５７】
割合及び領域は、Ｌｅｉｃａ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｕｉｔｅ Ｖ４（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｔｄ．，Ｋｏｒｅａ）を利用して分析した。胃分布割合は、平均（±標準偏差）に示した。
【００５８】
＜実験例３＞ イン・ビボにおける抗Ｈ．ピロリの薬効
＜３−１＞ 実験動物たちの接種
４週令オスＣ５７ＢＬ／６マウスたちは、抗Ｈ．ピロリを評価するために、日本静岡のＪａｐａｎ ＳＬＣ，Ｉｎｃ．より購入した。マウスたちは、実験開始の当時、５週令で、１８〜２０ｇの体重を有していた。接種のために、Ｈ．ピロリＳＳ１を用いた。バクテリアは、微細好気条件下（１０％ＣＯ２、８５％Ｎ２ ａｎｄ  ５％Ｏ２）７２時間、３７℃でブルセラ血液寒天（Ｍｅｒｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で培養された。イン・ビボにおける抗Ｈ．ピロリを評価するために、８０匹のマウスが実験の前に１週間適応された。
【００５９】
適応後、動物たちは、１２時間禁食され、７０匹は、２．０×１０９ｃｆｕ／ｍＬ  Ｈ．ピロリ懸濁液０．５ｍＬにより感染し、週当り３回に４８時間毎に経口摂食を介して胃内へ投与した。接種日は、０日と考慮され、その次から１日〜２１日と考慮された。感染していないグループは、正常対照群として利用しており、等価体積のＰＢＳ及び蒸留水を加えた。
【００６０】
＜３−２＞ 実験動物たちの処理
マウスたちは、１０匹ずつ、下記の８グループに分けられて、最後の接種後、１ 週間休んだ：
【００６１】
グループ１：感染していないマウスたちの正常群。
グループ２：蒸留水を加えた無処理対照群。
グループ３：アモキシシリン（ａｍｏｘｉｃｉｌｌｉｎ）（１４．２５ｍｇ／ｋｇ）、クラリスロマイシン（ｃｌａｒｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）（７．１５ｍｇ／ｋｇ）及び胃酸抑制剤（ｐｒｏｔｏｎ  ｐｕｍｐ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）（ＰＰＩ、４００μｍｏｌ／ｋｇで、ＰＰＩを加えたあらゆるグループにおいてオメプラゾール（ｏｍｅｐｒａｚｏｌｅ）が用いられた）で処理され、陽性対照群として利用した。
グループ４：アモキシシリン（１４．２５ｍｇ／ｋｇ）、ゲンタマイシン（４ｍｇ／ｋｇ）及びＰＰＩ（４００μｍｏｌ／ｋｇ）で処理された。
グループ５：アモキシシリン（１４．２５ｍｇ／ｋｇ）、Ｓ−ＧＥＮ（７８ｍｇ／ｋｇ）及びＰＰＩ（４００μｍｏｌ／ｋｇ）で処理された。
グループ６：ゲンタマイシン（４ｍｇ／ｋｇ）及びＰＰＩ（４００μｍｏｌ／ｋｇ）で処理された。
グループ７：Ｓ−ＧＥＮ（７８ｍｇ／ｋｇ）及びＰＰＩ（４００μｍｏｌ／ｋｇ）で処理された。
グループ８：アモキシシリン（１４．２５ｍｇ／ｋｇ）及びＰＰＩ（４００μｍｏｌ／ｋｇ）で処理された。
【００６２】
上記処理は、７日連続して、１日に１回経口投与により行われた。感染したマウスたちにおいて、Ｈ．ピロリの血清学的地位を確認するために、Ｈ．ピロリ兔疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）水準は、処理の前、ＥＬＩＳＡキット（Ｃｕｓａｂｉｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，ＵＳＡ）で確認された。
【００６３】
＜実験例４＞ バクテリア確認
最後に投与して１２時間後、マウスたちは安楽死されて、胃組織を抽出した。幽門から胃粘膜は、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ−ｌｉｋｅ ｏｒｇａｎｉｓｍ（ＣＬＯ）テスト及びＨ．ピロリに対するＰＣＲのために生体検査された。さらに、マウス当たり０．５ｇの大便が直腸及び大腸から収集されており、同一体積の蒸留水で懸濁され、Ｈ．ピロリ抗原（Ａｇ）の検出及び大便におけるＨ．ピロリＰＣＲのために濾過された。
【００６４】
＜４−１＞ ＣＬＯテスト
幽門部の胃粘膜サンプルは、ＣＬＯキット（Ａｓａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）で分析されており、ウレアーゼ（ｕｒｅａｓｅ）活性を試験するために、１２時間３７℃で培養された。反応（色変化）は、薄い黄色であるときは陰性、又は暗い赤であるときは陽性と見なされた。反応点数は、０〜３であって、０は色の変化がないし、１は明るい赤、２は明るい紫、３は暗い赤である。
【００６５】
＜４−２＞ 胃粘膜におけるＨ．ピロリＰＣＲ
Ｈ．ピロリＤＮＡは、ビードビーター／フェノール抽出方法（Ｋｉｍ Ｂ−Ｊ，Ｌｅｅ Ｓ−Ｈ，ＬｙｕＭ−Ａ ｅｔ ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｐｅｃｉｅｓ ｂｙ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｇｅｎｅ（ｒｐｏＢ）．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９９９；３７：１７１４−２０）を利用して製造した。バクテリア懸濁液は、２００μＬのフェノール、クロロホルム、イソアミルアルコール（５０：４９：１）及びガラスビード（直径０．１ｍｍ；Ｂｉｏｓｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，ＯＫ，ＵＳＡ）２００μＬ（ｐａｃｅｄ ｖｏｌｕｍｅ）で満たした２．０ｍＬスクリューキャップマイクロ遠心分離チューブに位置された。チューブは、ミニビードビーター（ｂｅａｔｅｒ）（Ｂｉｏｓｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）により３０秒間震動し、相分離のために遠心分離された（１５分間１２，０００ｇ）。水相（ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ）は、その後、他のきれいなチューブへ移動され、１０μＬの３Ｍソジウムアセテート及び２５０μＬのとても冷たい無水（ａｂｓｏｌｕｔｅ）エタノールが添加された。ＤＮＡを沈殿させるために、混合物は、１０分間、２０℃で維持された。収獲したＤＮＡペレットは、６０μＬのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファー（ｐＨ８．０）に溶解され、ＰＣＲのための鋳型ＤＮＡとして使用された。ＰＣＲは、ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ ＰＣＲ Ｐｒｅｍｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｋｏｒｅａ）を用いて行われた。最初の変性／活性化ステップ（５分間９５℃）後、ＤＮＡ（５０ｎｇ）は、下記のプライマーを利用して変性（６０秒間９４℃）、アニーリング（６０秒間６２℃）及び伸び（９０秒で７２℃）の３５サイクルのうち、２０μＬ体積で増幅された：Ｈ．ピロリ−特異的ｕｒｅＡ及びｕｒｅＣ、センス５０−ＴＧＡＴＧＣＴＣＣＡＣＴＡＣＧＣＴＧＧＡ−３０（序列番号１）及びアンチセンス５０−ＧＧＧＴＡＴＧＣＡＣＧＧＴＴＡＣＧＡＧＴ−３０（序列番号２）（予想産物２６５ｂｐ）（Ｋｉｍ ＹＢ，Ｋｉｍ ＳＴ，Ｌｅｅ ＳＷ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｇａｓｔｒｏｓｃｏｐｉｃ ｂｉｏｐｓｙ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｏｎ ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ−ｌｉｋｅ ｏｒｇａｎｉｓｍ（ＣＬＯ）ｔｅｓｔ．Ｋｏｒｅａｎ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ２０００；３５：４２２−８）、及びＧＡＰＤＨ、センス５０−ＴＧＧＧＧＴＧＡＴＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧ−ＡＧ−３０（序列番号３）、及びアンチセンス５０−ＧＧＴＴＴＣＴＣＣＡＧＧＣＧＧＣＡＴＧＴＣ−３０（序列番号４）（予想産物４９７ｂｐ）（Ｋｕｎｄｕ Ｐ，Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ ＡＫ，Ｐａｔｒａ Ｒ ｅｔ ａｌ．Ｃａｇ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｓ ａｎｄ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ−９  ａｎｄ  −２ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ ｂｙ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ感染。Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２００６；２８１：３４６５１−６２）。ＰＣＲ産物は、１．５％アガロスゲルで電気泳動によって分析された。
【００６６】
＜４−３＞ マウスの大便におけるＨ．ピロリ抗原の検出
Ｈ．ピロリ抗原は、製造者の指針に従い、商業的に利用可能なＳＤ ＢｉｏｌｉｎｅＨ．ピロリＡｇキット（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）を利用して評価した。標本（２５０ｍｇ）は、室温で３０分間希釈溶液と培養され、その次に、１００μＬがＨ．ピロリ抗原試験装置に位置された。結果は、１５分後にチェックした。単一の赤い線は、陰性を示し、このうち赤い線は、陽性Ｈ．ピロリ結果を示した（Ｍｏｏｎ Ｄ−Ｉ，Ｓｈｉｎ Ｅ−Ｈ，ＯｈＨ−Ｇ ｅｔ ａｌ．Ｕｓｅｆｕｌｎｅｓｓ ｏｆ ａ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ ｓｔｏｏｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ  Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ｉｎｆｅｃｔｅｄ Ｃ５７ＢＬ／６  ｍｉｃｅ．Ｌａｂ Ａｎｉｍ Ｒｅｓ ２０１３；２９：２７−３２）。
【００６７】
＜４−４＞ マウスの大便におけるＨ．ピロリＰＣＲ
大便検体からゲノムＤＮＡは、製造者の指針に従い、ＡｃｃｕＰｒｅｐ Ｓｔｏｏｌ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｋｏｒｅａ）を利用して抽出した（Ｌｅｅ Ｊ−Ｕ，Ｊｕｎｇ Ｋ，Ｋｉｍ Ｏ． Ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｖｅｒｔｉｃａｌ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ ｉｎ ａｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ．ＪＶｅｔＳｃｉ２００６；７：２２５−８）。序列番号１及び２のプライマーのセットは、Ｈ．ピロリ−特異的ｕｒｅＡ及びｕｒｅＣ（２６５ｂｐ）を増幅させるために用いられた（Ｋｉｍ ＹＢ，Ｋｉｍ ＳＴ，Ｌｅｅ ＳＷ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｇａｓｔｒｏｓｃｏｐｉｃ ｂｉｏｐｓｙ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｏｎ ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ−ｌｉｋｅ ｏｒｇａｎｉｓｍ（ＣＬＯ）ｔｅｓｔ．Ｋｏｒｅａｎ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ２０００；３５：４２２−８）。鋳型ＤＮＡ（５０ｎｇ）及び各プライマー２０ｐｍｏｌは、１ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、２５０μＭの各デオキシヌクレオシドトリホスファート、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．３）、４０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２及びゲルローディング染料を含むＰＣＲ混合物チューブに添加した。体積は、蒸留水を利用して２０μＬに調整した。９５℃で５分間の初期変性後、反応混合物は、３５増幅サイクルに加えられ（９４℃で６０秒、６２℃で６０秒、それから７２℃で９０秒）、次いで、７２℃で１０分の伸びが続いた（ＧｅｎｅＡｍｐ  ９７００，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，ＵＳＡ）。
【００６８】
ＰＣＲ産物は、１．５％アガロスゲルで電気泳動された（ＬｅｅＨ−Ａ，Ｐａｒｋ Ｙ−Ｓ，ＫｉｍＯ． Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ ｆｅｃｅｓ ｏｆ ｄｏｇｓ ｕｓｉｎｇ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｌａｂ Ａｎｉｍ Ｒｅｓ ２００７；２３：３３９−４４）。
【００６９】
＜実験例５＞ 炎症性サイトカインの定量化
マウスの目（ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ）静脈叢（ｖｅｎｏｕｓ ｐｌｅｘｕｓ）内へヘパリン化した（ｈｅｐａｒｉｎｉｚｅｄ）マイクロヘマトクリット（ｍｉｃｒｏｈａｅｍａｔｏｃｒｉｔ）チューブの挿入によって、２１日目にＩＬ−８及びＴＮＦ−α分析のために血漿を得た。血漿ＩＬ−８及びＴＮＦ−ａレベルは、マウスＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）を利用して測定された。
【００７０】
＜実験例６＞ Ｓ−ＧＥＮの処理条件によるイン・ビボにおける抗Ｈ．ピロリの薬効
＜６−１＞ 実験動物たちの接種
オスＣ５７ＢＬ／６マウスたちは、抗Ｈ．ピロリ評価のために、日本静岡のＪａｐａｎ ＳＬＣ，Ｉｎｃ．より購入した。４週令マウスたちを適応させた後、１ 週間Ｈ．ピロリＳＳ１を３回にわたって感染させて、２週間維持し、その後、試験物質を指定した用量に合わせて懸濁し、マウスｋｇ当たり１０ｍｌずつ、毎日同じ時間に経口投与した。このとき、１日に１回、７日間経口投与した。
【００７１】
＜６−２＞ 実験動物たちの処理
マウスたちは、１０匹ずつ、下記の５グループに分けられて、最後の接種後、１週間休んだ：
【００７２】
正常対照群：ｖｅｈｉｃｌｅ（感染なし）、ＰＢＳ投与。蒸留水１０ｍｇ／ｋｇを加えた。
陰性対照群：ｖｅｈｉｃｌｅ（Ｈ．ピロリ感染）蒸留水１０ｍｇ／ｋｇを加えた。
【００７３】
試験群１：（Ｈ．ピロリ感染）ＡＭＸ（１４．２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）、ＣＬＲ（１４．３ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）、ＰＰＩ（１３８ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）
試験群２：（Ｈ．ピロリ感染）ＡＭＸ（１４．２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）、Ｓ−ＧＭ（２０２ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）、ＰＰＩ（１３８ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）（このとき、Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ ８ｍｇ／ｋｇ）
試験群３：（Ｈ．ピロリ感染）ＡＭＸ（１４．２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）、Ｓ−ＧＭ（１０１ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）
【００７４】
ＡＭＸ：アモキシシリン
ＣＬＲ：クラリスロマイシン
Ｓ−ＧＭ：ゲンタマイシン−挿入したスメクタイトハイブリッド
ＰＰＩ：胃酸抑制剤
【００７５】
＜実験例７＞ 抗生剤耐性Ｈ．ピロリ菌に対するＳ−ＧＭの除菌効果
＜７−１＞ 抗生剤耐性率評価
現在、臨床におけるヘリコバクター除菌治療のために実際使用中である抗生剤（ａｍｏｘｉｃｉｌｌｉｎ，ｃｌａｒｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ，ｍｅｔｒｏｎｉｄａｚｏｌｅ，ｌｅｖｏｆｌｏｘａｃｉｎ，ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎ）と、スメクタイトと複合物を作り、新しい治療剤として用いる非吸収性抗生剤の候補群（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ，ｎｅｔｉｌｍｉｃｉｎ，ｔｏｂｒａｍｙｃｉｎ，ａｍｉｋａｃｉｎ）に対するｉｎ ｖｉｒｔｏ ＭＩＣを測定して、ＭＩＣ５０、ＭＩＣ９０を確認した。このために、１，２６５名の患者検体から得た１８７個の培養陽性臨床菌株を利用した。
【００７６】
＜７−２＞ イン・ビトロにおける除菌活性評価
クラリスロマイシン耐性菌株（ＣＬＲのＭＩＣ：４８ｍｇ／Ｌ）に対して、Ｓ−ＧＭ及びクラリスロマイシンの除菌活性を評価した。クルリスロマイシン耐性のヘリコバクター・ピロリ菌を培地に塗布（赤色）した後、ディスク状に試料を作り、培地上に置いて、除菌効能を測定した。このとき、ディスクの周りに赤色がなくなると、除菌効能があることを意味する。
【００７７】
＜結果＞
実験例２の結果
ラットたちにおける胃粘液層への塗布
１０ｍＬ／ｋｇ（１５０ｍｇ／ｋｇ）の実験条件を選択し、ハイブリッドから薬物放出時間を考慮して、経口投与１時間後、実験ラットたちを安楽死させた。Ｓ−ＧＥＮは、６０．２％（±１４．３％）塗布の割合を示した。
【００７８】
実験例３の結果
イン・ビボにおける抗Ｈ．ピロリ評価
Ｈ．ピロリに対するＳ−ＧＥＮのイン・ビボ薬効を評価するために、Ｈ．ピロリ感染モデルを作った（図５）。また、ピロリ感染を確認するために、Ｈ．ピロリＩｇＧレベルを処理前後に確認した（表１：各グループにおけるＨ．ピロリＩｇＧの血漿濃度）。
【００７９】
【表１】
2021533173.tif 000003
【００８０】
ＡＭＸ：アモキシシリン
ＣＬＲ：クラリスロマイシン
ＧＥＮ：ゼンタマイシン
Ａデータ等は、感染した７０匹のマウス（グループ２〜８）の平均±標準偏差に示した。
*グループ１と相当相違する（ｐ＜０．０１）
**グループ２と相当相違する（ｐ＜０．０１）
【００８１】
実験例４の結果
胃粘膜のＨ．ピロリＰＣＲ及びＣＬＯテスト
マウスたちにおいて、Ｈ．ピロリの繰り返した胃内接種は、胃粘膜のＣＬＯテストで陽性反応（赤色）を作った（表２：処理後の胃粘膜でＣＬＯテストした結果）。
【００８２】
【表２】
2021533173.tif 000004
【００８３】
ａ各グループは、１０匹のマウスで構成される。
ｂ発生パーセント（ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ）（９５％ ＣＩ）は、ＭｉｎｉＴａｂ統計プログラムにより計算された。
*グループ２と相当相違する（ｐ＜０．０５）
【００８４】
胃粘膜の治癒率（１００−陽性反応）は、グループ３〜８においてそれぞれ７０％、６０％、８０％、５０％、６０％及び６０％であった。グループ５のＣＬＯ点数は、Ｈ．ピロリ感染したグループのうち最も低かったし、グループ２のそれよりも相当低かった。
【００８５】
Ｈ．ピロリ−特異的ｕｒｅＡ及びｕｒｅＣ（２６５ｂｐ）の ＰＣＲ産物は、１．５％アガロスゲルで電気泳動され、視覚化した（図６）。
【００８６】
治癒率は、ＣＬＯテストによって確認されたものと同一であった。
【００８７】
マウスの大便におけるＨ．ピロリ抗原及びＰＣＲ
大便におけるＨ．ピロリを検出するために、大便抗原キットを利用した。グループ２における陽性結果、そして、他のグループにおける陰性結果が継続して観察された。
【００８８】
Ｈ．ピロリ感染したマウスたちにおける治療的効果を評価するために、Ｈ．ピロリＰＣＲが行われた（表３：処理後、大便におけるＨ．ピロリのＰＣＲ分析）。治癒率は、グループ３（標準治療）及びグループ５（アモキシシリン／Ｓ−ＧＥＮ／ＰＰＩで治療）におけいてそれぞれ９０％及び１００％であった。
【００８９】
【表３】
2021533173.tif 000005
【００９０】
ａ各グループは、１０匹のマウスで構成される。
ｂ発生パーセント（ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ）（９５％ＣＩ）は、ＭｉｎｉＴａｂ統計プログラムにより計算された。
*グループ２と相当相違する（ｐ＜０．０５）
【００９１】
実験例５の結果
炎症性サイトカインの定量化
Ｓ−ＧＥＮを含む抗Ｈ．ピロリがサイトカインの生産に及ぶ影響を確認するために、炎症性サイトカインの血漿濃度は、マウスたちにおいて測定した（表４）。治療グループにおけるＩＬ−８及びＴＮＦ−ａのレベルは、グループ２におけるそれらよりも相当低かった（表４：ＩＬ−８及びＴＮＦ−ａの血漿濃度）。グループ５におけるＩＬ−８及びＴＮＦ−ａの血漿レベルは、処理グループのうち最も低かった。
【００９２】
【表４】
2021533173.tif 000006
【００９３】
データは、グループ当たり１０匹のマウスに対する平均±標準偏差に示した（μｇ／ｍｌ）。
ａ各グループは、１０匹のマウスで構成される。
*グループ２と相当相違する（ｐ＜０．０５）
**グループ２と相当相違する（ｐ＜０．０１）
【００９４】
実験例６の結果
実験例６で処理した実験動物たちは、下記の表５のとおりである。
【００９５】
【表５】
2021533173.tif 000007
【００９６】
［１回投与用量］（**１日に１回投与）
ＡＭＸ：アモキシシリン
ＣＬＲ：クラリスロマイシン
Ｓ−ＧＭ：ゲンタマイシン−挿入したスメクタイトハイブリッド
ＰＰＩ：胃酸抑制剤
【００９７】
血中Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ＩｇＧ抗体力価
１）Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ感染有無確認及び群構成のための測定結果
ＥＬＩＳＡ方法によりＨ．ｐｙｌｏｒｉ抗体を測定して、平均及び標準偏差を算定した結果、非感染群は０．０４±０．０１、感染群の平均値は０．１０±０．１０と測定された。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ抗体は、非感染群と比べて、感染群で１５０．０％と、統計的に有意に上昇した。（ｐ＜０．０５）（表６）
【００９８】
【表６】
2021533173.tif 000008
【００９９】
感染１週後、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ抗体ＩｇＧテスト値
データは、平均±標準偏差に示した。統計的分析は、Ｓｉｇｍａ  ｐｌｏｔ ｓｔａｔｉｓｔｉｃにより行った。*非感染群との比較。*ｐ＜０．０５。
【０１００】
２）最終Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ抗体ＩｇＧ測定結果
剖検時、血液でのＨ．ｐｙｌｏｒｉ抗体を測定して、平均及び標準偏差を算定した結果、非感染群（正常対照群）：０．３３±０．１３、感染対照群である陰性対照群：０．６３±０．２９、試験群１（ＡＭＸ＋ＣＬＲ＋ＰＰＩ投与群）：０．２７±０．０７、試験群２（ＡＭＸ＋Ｓ−ＧＭ＋ＰＰＩ投与群）：０．１９±０．０４、試験群３（ＡＭＸ＋Ｓ−ＧＭ投与群）：０．２２±０．０６と測定された。
【０１０１】
Ｈ．ｐｙｌｏｒｉに感染した陰性対照群は、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉに感染していない非感染群である正常対照群と比べて、９０．９％以上Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ抗体上昇が測定されて、統計的に有意にＨ．ｐｙｌｏｒｉ感染が維持されたことを確認した（ｐ＜０．０１）。陽性対照物質である試験群１（ＡＭＸ＋ＣＬＲ＋ＰＰＩ投与群）では、陰性対照群と比べて、５７．１％と、統計的に有意にＨ．ｐｙｌｏｒｉ抗体が減少した（ｐ＜０．０１）。試験物質群である試験群２（ＡＭＸ＋Ｓ−ＧＭ＋ＰＰＩ投与群）及び試験群３（ＡＭＸ＋Ｓ−ＧＭ投与群）では、陰性対照群と比べて、各６９．８％及び６５．１％と、統計的に有意にＨ．ｐｙｌｏｒｉ抗体が減少した（ｐ＜０．０１）。試験物質群の試験群２と試験群３では、陽性対照群である試験群１と比べて、各２９．６％、１８．５％と、統計的に有意に減少しており、特に、試験群２の減少効果に優れた（ｐ＜０．０１、ｐ＜０．０５）。
【０１０２】
胃組織の病理学的分析結果
剖検後に摘出した胃組織を目視で観察した結果、非感染群（正常対照群）と感染群である陰性対照群及び試験群１〜３において、いずれも特異病変は観察することができなかった。組織病理の結果、胃組織で観察された所見は、粘膜上皮細胞消失（Ｄａｍａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）、炎症細胞浸潤（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｅｌｌ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）及び粘膜下浮腫（Ｓｕｂｍｕｃｏｓａｌ ｅｄｅｍａ）に対して点数化した。各項目別に観察されなければ、０点、Ｍｉｌｄ０．５点、Ｍｏｄｅｒａｔｅ１点に分類した。
【０１０３】
その結果、正常対照群では、上皮細胞消失０．１０±０．２１点、炎症細胞浸潤０．１５±０．２４点、粘膜下浮腫０．１０±０．３２点と観察されており、総点（Ｔｏｔａｌ ｓｃｏｒｅ）は、０．３５±０．４１点であった。陰性対照群では、上皮細胞消失０．６５±０．３４点、炎症細胞浸潤０．４０±０．３２点、粘膜下浮腫０．５５±０．３７点と観察されており、総点は、１．６０±０．８１点であった。試験群１（ＡＭＸ＋ＣＬＲ＋ＰＰＩ投与群）では、上皮細胞消失０．３０±０．４２点、炎症細胞浸潤０．４０±０．４６点、粘膜下浮腫０．６０±０．４６点と観察されており、総点は、１．３０±１．１４点であった。試験群２（ＡＭＸ＋Ｓ−ＧＭ＋ＰＰＩ投与群）では、上皮細胞消失０．３０±０．３５点、炎症細胞浸潤０．１５±０．２４点、粘膜下浮腫０．３５±０．３４点と観察されており、総点は、０．８０±０．７９点であった。試験群３（ＡＭＸ＋Ｓ−ＧＭ＋ＰＰＩ投与群）では、上皮細胞消失０．６０±０．３９点、炎症細胞浸潤０．４０±０．４６点、粘膜下浮腫０．６５±０．４１点と観察されており、総点は、１．６５±１．１１点であった（表７）。
【０１０４】
【表７】
2021533173.tif 000009
【０１０５】
データ等は、平均±標準偏差に示した。統計的分析は、Ｓｉｇｍａ  ｐｌｏｔ ｓｔａｔｉｓｔｉｃにより行った。*非感染群との比較。**ｐ＜０．０１、＃陰性対照群との比較、＃＃ｐ＜０．０１。
【０１０６】
群別「上皮細胞消失（Ｄａｍａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）」項目に対する点数を比較した結果、陰性対照群は、正常対照群と比べて、統計的に有意な増加が観察されており（ｐ＜０．０１）、試験群１（ＡＭＸ＋ＣＬＲ＋ＰＰＩ投与群）と試験群３（ＡＭＸ＋Ｓ−ＧＭ＋ＰＰＩ投与群）でのみ、陰性対照群と比べて、各５３．８％及び５３．８％と、統計的に有意に減少した（表７）。
【０１０７】
群別「炎症細胞浸潤（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｅｌｌ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）」項目に対する点数を比較した結果、陰性対照群は、正常対照群と比べて、統計的に有意な増加が観察されており（ｐ＜０．０１）、試験群２（ＡＭＸ＋Ｓ−ＧＭ＋ＰＰＩ投与群）でのみ、陰性対照群と比べて、６２．５％と、統計的に有意に減少した（表７）。
【０１０８】
群別「粘膜下浮腫（Ｓｕｂｍｕｃｏｓａｌ ｅｄｅｍａ）」項目に対する点数を比較した結果、陰性対照群は、正常対照群と比べて、統計的に有意な増加が観察されたが（ｐ＜０．０１）、その他群の間には統計的に有意な相違点が観察されなかった（表７）。
【０１０９】
群別３種類の組織病理学的所見（上皮細胞消失、炎症細胞浸潤、粘膜下浮腫）の点数を合算した総点（Ｔｏｔａｌ ｓｃｏｒｅ）を比較した結果、陰性対照群は、正常対照群と比べて、統計的に有意な増加が観察されており（ｐ＜０．０１）、試験群１（ＡＭＸ＋Ｓ−ＧＭ＋ＰＰＩ投与群）でのみ、陰性対照群と比べて、５０．０％と、統計的に有意に減少した（表７）。
【０１１０】
ＣＬＯ迅速要素分解酵素の検査結果
胃組織でＣＬＯ迅速要素分解酵素の検査を行い、全体検体数に対する陽性検体数の百分率を算定するために図式化した。
【０１１１】
その結果、中間ほどの色を示す場合（ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ）にも、治療に反応を見せた個体と見なす場合、治療率は、標準治療群である試験群１（ＡＭＸ＋ＣＬＲ＋ＰＰＩ投与群）が５０％、試験群２（ＡＭＸ＋Ｓ−ＧＭ＋ＰＰＩ投与群）が７０％、及び試験群３（ＡＭＸ＋Ｓ−ＧＭ投与群）が１０％の結果と表され、試験群２が最も良い治療率を示した（表８）。  
【０１１２】
【表８】
2021533173.tif 000010
【０１１３】
実験例７の結果
抗生剤別耐性率
Ｃｌａｒｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎは、耐性率が２９．８％と非常に高く表されており、臨床において、ヘリコバクターを除菌するために多く使用していないｌｅｖｏｆｌｏｘａｃｉｎに対する耐性率が、３７．２％と最も高く表された。よって、Ｃｌａｒｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎは、粘土鉱物複合体を製造するために好適でないと判断された。粘土鉱物複合体に用いられる候補抗生剤群であるアミノグリコシド系抗生剤は、ＭＩＣ１μｇ／ｍＬを基準としたとき、ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎとｎｅｔｉｌｍｉｃｉｎが比較的に低いＭＩＣと耐性率（それぞれ２．７８％、１．４３％）を示しており、好適な候補抗生剤群と判断された。しかし、ｔｏｂｒａｍｙｃｉｎ（ＴＯＢ）は、耐性率が３６．３％、ａｍｉｋａｃｉｎ（ＡＭＫ）も耐性率が６１．３％と表されて、候補抗生剤群として適当でないと判断された（図７）。ＡＭＸ：ａｍｏｘｉｃｉｌｌｉｎ，ＣＬＲ：ｃｌａｒｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ，ＭＴＺ：ｍｅｔｒｏｎｉｄａｚｏｌｅ，ＴＥＴ：ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎ，ＬＥＶ：ｌｅｖｏｆｌｏｘａｃｉｎ ．ＧＭ：ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ，ＮＥＴ：ｎｅｔｉｌｍｉｃｉｎ，ＴＯＢ：ｔｏｂｒａｍｙｃｉｎ，ＡＭＫ：ａｍｉｋａｃｉｎ。
【０１１４】
クラリスロマイシン耐性菌に対する除菌効果
クラリスロマイシン耐性のＨ．ピロリに対して、イン・ビトロにおける除菌効果を評価した。２回繰り返した試験の結果、ゲンタマイシン−スメクタイト複合体（Ｓ−ＧＭ）は、ディスクの周りにｃｌｅａｒ ｚｏｎｅが現われた。よって、ゲンタマイシン−スメクタイト複合体（Ｓ−ＧＭ）は、クラリスロマイシン耐性のＨ．ピロリに対して除菌活性を有するものと確認された。一方、クラリスロマイシン（ＣＬＲ）ディスクの周りには、ｃｌｅａｒ ｚｏｎｅが現われなかった。２回繰り返した試験の結果は、同様に示され、各結果は、図８Ａ及び図８Ｂに示す（図８Ａ及び図８Ｂ：上端：ＣＬＲ：クラリスロマイシン、下端：Ｓ−ＧＭ：ゲンタマイシン−スメクタイト複合体）。
【０１１５】
実験結果の検討
本発明では、マウスモデルにおけるＳ−ＧＥＮの抗Ｈ．ピロリ薬効を評価した。本発明の実験結果は、Ｈ．ピロリ治療において、現在、世界的標準である三剤（ｔｒｉｐｌｅ）療法を含む、他の治療療法等のそれと比較して、マウスの胃でＨ．ピロリロードを減少させるにあたって、Ｓ−ＧＥＮの相当改善した抗微生物薬効を立証した。
【０１１６】
本発明者たちは、Ｓ−ＧＥＮを開発し、それがＨ．ピロリの感染治療に効果的であるか否かを評価した。Ｈ．ピロリは、主に胃粘膜の上皮表面に付着した粘液層内に住む。よって、効果的な治療のためにＳ−ＧＥＮは、前記粘液層を横切って胃壁上（ｏｎ）に維持されなければならない。本発明において、Ｓ−ＧＥＮは、末端の胃壁（ｏｎ）によく分布されており、Ｓ−ＧＥＮの６０．２％存在が観察されたが、これは、１時間まで効果的にＳ−ＧＥＮが維持されたことを示す。この結果は、Ｓ−ＧＥＮがＨ．ピロリの直接的な除菌に使用されうることを提案する。
【０１１７】
処理後、胃粘膜でＨ．ピロリＰＣＲ及びＣＬＯテストした結果において、グループ５は、治ったグループのうち最も高い治癒率（８０％）を示した。さらに、グループ５のＣＬＯ値は、治ったグループのうち最も低かった（０．６±１．３）。抗Ｈ．ピロリの薬効は、グループ５において明確であった。Ｈ．ピロリ感染に対する治療後、大便にしたＨ．ピロリＰＣＲテストの場合、陰性結果は、グループ５でのみ観察し続けた。よって、Ｓ−ＧＥＮ三剤治療によって付与した、優れた抗Ｈ．ピロリ活性は、それの直接的な除菌効果及び従来の抗生剤の他の療法と比較して、胃粘膜でさらに長い時間塗布されて、除菌効果がもっと持続すると説明することができる。
【０１１８】
興味深いことは、Ｓ−ＧＥＮ−治ったマウスたちは、Ｈ．ピロリ感染しているものの、治っていないマウスたちと比較して、相当減少したＨ．ピロリ−誘導された伝染症性（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカイン（ＩＬ−８及びＴＮＦ−ａ）を有した。ＩＬ−８は、好中球を引き寄せて、炎症を促進し、ＩＬ−１βと共にＴＮＦ−αは、ガストリン分泌を誘導するが、これはＨ．ピロリ−誘導された高ガストリン血症（ｈｙｐｅｒｇａｓｔｒｉｎａｅｍｉａ）及び炎症反応において、これらサイトカインの役割を提案する。Ｈ．ピロリに対する免疫反応は、疾病の発病に寄与する。よって、ここで観察されたとおり、伝染症性反応の減少は、組織の損傷を永久化するために責任のある染症性反応を減少させると予想される。Ｓ−ＧＥＮの治療後、他の療法によって達成されたものよりも、さらに良い抗Ｈ．ピロリ効果及び集落化（ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ）の初期除去が胃の炎症を減少させることができた。
【０１１９】
本発明におけるＳ−ＧＥＮにした治療は、マウスの体重に影響を及ぼさなかった。経口投与によるスメクタイトの安全性は立証されており、ゲンタマイシンは、胃粘膜を通って吸収されなかった。
【０１２０】
本発明者たちは、Ｈ．ピロリに対抗して、Ｓ−ＧＥＮの強い抗微生物の活性及び胃粘膜層におけるＳ−ＧＥＮの長時間塗布効果を立証した。Ｓ−ＧＥＮ処理は、ＰＰＩを含む二剤（ｄｏｕｂｌｅ）又は三剤療法により治ったマウスたち、又は治っていないマウスたちと比べて、イン・ビボにおけるバクテリア負担を減少させた。直接的な除菌効果に加えて、Ｓ−ＧＥＮは、炎症性サイトカインの生産を抑制して、炎症反応を減少させることを助けた。
【０１２１】
また、Ｓ−ＧＥＮをβ−ラクタム抗生剤及び胃酸抑制剤と共に投与時、ヘリコバクター・ピロリの除菌効果は、Ｓ−ＧＥＮをβ−ラクタム抗生剤のみと共に投与した場合の除菌効果よりも有意に高いことを確認することができた。
【０１２２】
さらに、臨床における広く用いられる抗生剤であるクラリスロマイシンに対するＨ．ピロリの耐性率は、２９．８％と高いが、Ｓ−ＧＥＮは、クラリスロマイシン耐性のＨ．ピロリに対しても除菌活性を有するところ、Ｓ−ＧＥＮは、クラリスロマイシンに対して除菌効果のない患者にとっても有用であると判断される。
【産業上利用可能性】
【０１２３】
本発明は、非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体、又はこれを含む組成物を対象に投与するステップを含む、ヘリコバクター・ピロリの除菌方法に関する。また、本発明は、非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体、又はこれを含む組成物を対象に投与するステップを含む、ヘリコバクター・ピロリが原因である胃膓疾患の予防又は治療方法に関する。また、本発明は、非吸収性抗生物質及び粘土鉱物の複合体を含む、ヘリコバクター・ピロリを除菌するための経口投与用の薬学的組成物又はキットに関する。本発明の組成物及びキットは、β−ラクタム抗生剤及び／又は胃酸抑制剤をさらに含んでいてもよい。
【序列リストＦｒｅｅＴｅｘｔ】
【０１２４】
序列番号１は、Ｈ．ピロリ−特異的ｕｒｅＡ及びｕｒｅＣを増幅するためのセンスプライマーの塩基序列である。
序列番号２は、Ｈ．ピロリ−特異的ｕｒｅＡ及びｕｒｅＣを増幅するためのアンチセンスプライマーの塩基序列である。
序列番号３は、ＧＡＰＤＨを増幅するためのセンスプライマーの塩基序列である。
序列番号４は、ＧＡＰＤＨを増幅するためのアンチセンスプライマーの塩基序列である。
【図１】
2021533173.tif 000011
【図２】
2021533173.tif 000012
【図３】
2021533173.tif 000013
【図４】
2021533173.tif 000014
【図５】
2021533173.tif 000015
【図６】
2021533173.tif 000016
【図７】
2021533173.tif 000017
【図８ａ】
2021533173.tif 000018
【図８ｂ】
2021533173.tif 000019
【配列表】
2021533173000001.app
【国際調査報告】
2021533173.tif 000020
2021533173.tif 000021
2021533173.tif 000022
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