(57)【要約】本開示は、ピーナッツアレルギー及びそれに対する耐性の診断のための、ならびにアレルギー性対象がアレルギーを寛解する見込みがあるかどうかを判定するためのペプチドバイオマーカーを、それを用いた方法及びキットも含めて提供する。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピーナッツに対してアレルギーを有する対象におけるピーナッツに対する臨床的耐性の獲得の検出法であって、以下：
前記対象から得られた血清または血漿中の１種または複数のアレルギー関連免疫グロブリン（ＡＡＩ）が、１種または複数のピーナッツペプチドと結合することを可能にするのに十分な条件下、前記１種または複数のピーナッツペプチドと前記血清または血漿とを接触させることであって、前記１種または複数のピーナッツペプチドは、固相担体にカップリングされており、１種または複数のＡＡＩペプチド固相担体複合体を形成している、前記接触させること、
ＡＡＩ特異的標識化試薬を前記ＡＡＩペプチド固相担体複合体に結合させること、
各ＡＡＩペプチド固相担体複合体に対する前記ＡＡＩ特異的標識化試薬の結合を検出して、前記対象の前記血清または血漿中の前記ＡＡＩと結合した１種または複数のピーナッツペプチドを同定すること、ならびに
前記対象の前記血清または血漿中の前記ＡＡＩと結合した１種または複数のピーナッツペプチドで前記同定されたもの、または前記対象の前記血清または血漿中の前記ＡＡＩの前記濃度を、前記対象の前記血清または血漿中の前記ＡＡＩと結合した１種または複数のピーナッツペプチドの先行して同定されたパネル、または前記対象の前記血清または血漿中の前記ＡＡＩの先行する濃度と比較すること、
を含み、
ピーナッツに対する臨床的耐性の獲得は、以下：
前記対象の前記血清または血漿中のＩｇＥ  ＡＡＩにより認識されるピーナッツペプチドの前記後続の数、及び／または前記対象の前記血清または血漿中のＡＡＩ  ＩｇＥの前記後続の濃度が、前記対象の前記血清または血漿中のＡＡＩ  ＩｇＥにより認識されるピーナッツペプチドの前記先行して同定された数より少ない、及び／または前記対象の前記血清または血漿中のＡＡＩ  ＩｇＥの前記先行する濃度より低い場合、及び／または
前記対象の前記血清または血漿中のＩｇＧ４  ＡＡＩにより認識されるピーナッツペプチドの前記後続の数、及び／または前記対象の前記血清または血漿中のＡＡＩ  ＩｇＧ４の前記後続の濃度が、前記対象の前記血清または血漿中のＡＡＩ  ＩｇＧ４により認識されるピーナッツペプチドの前記先行して同定された数より多い、及び／または前記対象の前記血清または血漿中のＡＡＩ  ＩｇＧ４の前記先行する濃度より高い場合、
に示されているものである、前記方法。
【請求項２】
前記複数のピーナッツペプチドは、ａｒａ  ｈ１アレルゲン（配列番号１）、ａｒａ  ｈ２アレルゲン（配列番号２）、及び／またはａｒａ  ｈ３アレルゲン（配列番号３）に由来する少なくとも２種のペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、以下：
ａｒａ  ｈ１アレルゲンの８位から６６位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、
ａｒａ  ｈ１アレルゲンの１０３位から１５２位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、
ａｒａ  ｈ１アレルゲンの１７６位から１９５位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、
ａｒａ  ｈ２アレルゲンの５位から４０位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、
ａｒａ  ｈ３アレルゲンの９３位から１１５位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、
ａｒａ  ｈ３アレルゲンの３０位から７５位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、及び／または
ａｒａ  ｈ３アレルゲンの１５２位から１６７位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド
から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号４〜６７のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号７、１３、１６、１７、２５、２７、３０、３６、３９、４５、６５、及び６６のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号３９、４５、及び６６のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号５、６、１０、１３、１４、３４、３６、３９、４０、４２、４９、６１、６５、及び６６のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号５、６、９、３４、３６、３９、及び４０のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号２９、３９、４２、４４、４５、５１、及び６３のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号７、８、２９、３１、３９、４５、及び６１のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号３９及び４０のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
各ピーナッツペプチドは、約３つのアミノ酸〜約６０のアミノ酸、約４つのアミノ酸〜約６０のアミノ酸、約６つのアミノ酸〜約３０のアミノ酸、約７つのアミノ酸〜約２０のアミノ酸、約１０のアミノ酸〜約１６のアミノ酸、または約１０のアミノ酸〜約１５のアミノ酸を含む、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
各ピーナッツペプチドは、１５のアミノ酸を含む、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、少なくとも２種のピーナッツペプチド、少なくとも３種のピーナッツペプチド、少なくとも５種のピーナッツペプチド、少なくとも１０種のピーナッツペプチド、少なくとも１５種のピーナッツペプチド、少なくとも２０種のピーナッツペプチド、少なくとも２５種のピーナッツペプチド、少なくとも３０種のピーナッツペプチド、少なくとも３５種のピーナッツペプチド、少なくとも４０種のピーナッツペプチド、少なくとも４５種のピーナッツペプチド、少なくとも５０種のピーナッツペプチド、少なくとも５５種のピーナッツペプチド、少なくとも６０種のピーナッツペプチド、または少なくとも６４種のピーナッツペプチドを含む、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
対象がピーナッツに対してアレルギーを有するという判定は、さらに、以下：全ピーナッツ特異的ＩｇＥ（ｓＩｇＥ）、ピーナッツ構成要素ａｒａ  ｈ１に対するＩｇＥ、ピーナッツ構成要素ａｒａ  ｈ２に対するＩｇＥ、ピーナッツ構成要素ａｒａ  ｈ３に対するＩｇＥ、皮膚プリックテスト結果、臨床歴もしくは家族歴、及び／または患者もしくは臨床医質問票からのデータ
の１つまたは複数の結果を考慮に入れる、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ピーナッツペプチドはそれぞれ、前記固相担体とカップリングするためのリンカーを有する、請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記リンカーは、−ＰＥＧ１２−ビオチンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記固相担体は、微粒子ビーズ、ガラスアレイ、シリコーンアレイ、膜、またはマイクロタイタープレートである、請求項１から１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＡＡＩは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、及び／またはＩｇＥである、請求項１から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＩｇＧは、ＩｇＧ４である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＡＡＩ特異的標識化試薬は、検出可能に標識された抗ヒトＩｇＧ４抗体、検出可能に標識された抗ヒトＩｇＭ抗体、検出可能に標識された抗ヒトＩｇＡ抗体、及び／または検出可能に標識された抗ヒトＩｇＥ抗体である、請求項１から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記検出可能な標識は、フィコエリトリン、蛍光色素、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、及びアルカリホスファターゼから選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
各ＡＡＩペプチド固相担体複合体に対する前記ＡＡＩ特異的標識化試薬の前記結合の前記検出は、フローサイトメトリー分析用の多重ペプチドビーズアッセイまたはラテラルフローアッセイにより行われる、請求項１から２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
対象におけるピーナッツアレルギー、及び／またはピーナッツアレルギーの重篤度の診断法であって、以下：
前記対象から得られた血清または血漿中の１種または複数のアレルギー関連免疫グロブリン（ＡＡＩ）が、１種または複数のピーナッツペプチドと結合することを可能にするのに十分な条件下、前記１種または複数のピーナッツペプチドと前記血清または血漿とを接触させることであって、前記１種または複数のピーナッツペプチドは、固相担体にカップリングされており、１種または複数のＡＡＩペプチド固相担体複合体を形成している、前記接触させること、
ＡＡＩ特異的標識化試薬を前記ＡＡＩペプチド固相担体複合体に結合させること、及び
各ＡＡＩペプチド固相担体複合体に対する前記ＡＡＩ特異的標識化試薬の結合を検出して、前記対象の前記血清または血漿中の前記ＡＡＩと結合した１種または複数のピーナッツペプチドを同定すること、
を含み、
前記対象の前記血清または血漿中のＡＡＩが少なくとも１種のピーナッツペプチドを認識するということは、前記対象がピーナッツに対してアレルギーを有することを示す、前記方法。
【請求項２５】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、ａｒａ  ｈ１アレルゲン（配列番号１）、ａｒａ  ｈ２アレルゲン（配列番号２）、及び／またはａｒａ  ｈ３アレルゲン（配列番号３）に由来する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、以下：
ａｒａ  ｈ１アレルゲンの８位から６６位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、
ａｒａ  ｈ１アレルゲンの１０３位から１５２位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、
ａｒａ  ｈ１アレルゲンの１７６位から１９５位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、
ａｒａ  ｈ２アレルゲンの５位から４０位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、
ａｒａ  ｈ３アレルゲンの９３位から１１５位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、
ａｒａ  ｈ３アレルゲンの３０位から７５位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、及び／または
ａｒａ  ｈ３アレルゲンの１５２位から１６７位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド
から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号４〜６７のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号７、１３、１６、１７、２５、２７、３０、３６、３９、４５、６５、及び６６のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号３９、４５、及び６６のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号５、６、１０、１３、１４、３４、３６、３９、４０、４２、４９、６１、６５、及び６６のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号５、６、９、３４、３６、３９、及び４０のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号２９、３９、４２、４４、４５、５１、及び６３のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号７、８、２９、３１、３９、４５、及び６１のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３４】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号３９及び４０のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３５】
各ピーナッツペプチドは、約３つのアミノ酸〜約６０のアミノ酸、約４つのアミノ酸〜約６０のアミノ酸、約６つのアミノ酸〜約３０のアミノ酸、約７つのアミノ酸〜約２０のアミノ酸、約１０のアミノ酸〜約１６のアミノ酸、または約１０のアミノ酸〜約１５のアミノ酸を含む、請求項２４から３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
各ピーナッツペプチドは、１５のアミノ酸を含む、請求項２４から３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、少なくとも２種のピーナッツペプチド、少なくとも３種のピーナッツペプチド、少なくとも５種のピーナッツペプチド、少なくとも１０種のピーナッツペプチド、少なくとも１５種のピーナッツペプチド、少なくとも２０種のピーナッツペプチド、少なくとも２５種のピーナッツペプチド、少なくとも３０種のピーナッツペプチド、少なくとも３５種のピーナッツペプチド、少なくとも４０種のピーナッツのペプチド、少なくとも４５種のピーナッツペプチド、少なくとも５０種のピーナッツペプチド、少なくとも５５種のピーナッツペプチド、少なくとも６０種のピーナッツペプチド、または少なくとも６４種のピーナッツペプチドを含む、請求項２４から３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
対象がピーナッツに対してアレルギーを有するという判定は、さらに、以下：全ピーナッツ特異的ＩｇＥ（ｓＩｇＥ）、ピーナッツ構成要素ａｒａ  ｈ１に対するＩｇＥ、ピーナッツ構成要素ａｒａ  ｈ２に対するＩｇＥ、ピーナッツ構成要素ａｒａ  ｈ３に対するＩｇＥ、全ピーナッツ特異的ＩｇＧ４（ｓＩｇＧ４）、ピーナッツ構成要素ａｒａ  ｈ１に対するＩｇＧ４、ピーナッツ構成要素ａｒａ  ｈ２に対するＩｇＧ４、ピーナッツ構成要素ａｒａ  ｈ３に対するＩｇＧ４、皮膚プリックテスト結果、臨床歴もしくは家族歴、及び／または患者もしくは臨床医質問票からのデータ
の１つまたは複数の結果を考慮に入れる、請求項２４から３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
対象がピーナッツに対してアレルギーを有するという判定は、さらに、以下：ピーナッツ構成要素ａｒａ  ｈ１に対するＩｇＥ、ピーナッツ構成要素ａｒａ  ｈ２に対するＩｇＥ、及び／またはピーナッツ構成要素ａｒａ  ｈ３に対するＩｇＥ
の１つまたは複数の結果を考慮に入れる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ピーナッツ構成要素ａｒａ  ｈ１に対するＩｇＥの結果は、配列番号７、１３、１６、１７、２５、２７、３０、及び３６から選択されるアミノ酸配列、または配列番号５、６、１０、１３、１４、３４、及び３６から選択されるアミノ酸配列、または配列番号５、６、９、３４、及び３６から選択されるアミノ酸配列、または配列番号７、８、２９、及び３１から選択されるアミノ酸配列、または配列番号２９であるアミノ酸配列を含むピーナッツペプチドでの結果を含み、
前記ピーナッツ構成要素ａｒａ  ｈ２に対するＩｇＥの結果は、配列番号３９から選択されるアミノ酸配列、または配列番号３９、４０、４２、及び４９から選択されるアミノ酸配列、または配列番号３９及び４０から選択されるアミノ酸配列、または配列番号３９、４２、４４、４５、及び５１から選択されるアミノ酸配列、または配列番号３９及び４５から選択されるアミノ酸配列、または配列番号３９及び４０から選択されるアミノ酸配列、または配列番号４０から選択されるアミノ酸配列を含むピーナッツペプチドでの結果を含み、ならびに
前記ピーナッツ構成要素ａｒａ  ｈ３に対するＩｇＥの結果は、配列番号６５から選択されるアミノ酸配列、または配列番号６１、６５、及び６６から選択されるアミノ酸配列、または配列番号６３から選択されるアミノ酸配列、または配列番号６１から選択されるアミノ酸配列を含むピーナッツペプチドでの結果を含む、
請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
対象がピーナッツに対してアレルギーを有するという判定は、さらに、以下：
配列番号３９のアミノ酸配列を含むピーナッツペプチドに対するＩｇＥ、配列番号４５のアミノ酸配列を含むピーナッツペプチドに対するＩｇＧ４、及び配列番号６６のアミノ酸配列を含むピーナッツペプチドに対するＩｇＧ４、
配列番号３９のアミノ酸配列を含むピーナッツペプチドに対するＩｇＥ、配列番号４５のアミノ酸配列を含むピーナッツペプチドに対するＩｇＧ４、及び皮膚プリックテスト、
配列番号３９のアミノ酸配列を含むピーナッツペプチドに対するＩｇＥ、配列番号４５のアミノ酸配列を含むピーナッツペプチドに対するＩｇＧ４、配列番号６６のアミノ酸配列を含むピーナッツペプチドに対するＩｇＧ４、及びｓＩｇＥ、ならびに
配列番号３９のアミノ酸配列を含むピーナッツペプチドに対するＩｇＥ、配列番号４５のアミノ酸配列を含むピーナッツペプチドに対するＩｇＧ４、配列番号６６のアミノ酸配列を含むピーナッツペプチドに対するＩｇＧ４、及びピーナッツ構成要素ａｒａ  ｈ２、
のうちの１つまたは複数の結果を考慮に入れる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
対象がピーナッツに対してアレルギーを有するという判定は、以下：
前記対象のｓＩｇＥが≧０．０３ｋＵＡ／Ｌであるか、それとも＜０．０３ｋＵＡ／Ｌであるかを特定することであって、≧０．０３ｋＵＡ／Ｌは、前記対象がピーナッツに対してアレルギーを有する可能性があることを示し、＜０．０３ｋＵＡ／Ｌは、前記対象がピーナッツに対してアレルギーを有さないことを示す、前記特定すること、及び、
前記対象のｓＩｇＥが≧０．０３ｋＵＡ／Ｌである場合に、配列番号３９のアミノ酸配列を含むピーナッツペプチドに対するＩｇＥ、配列番号４５のアミノ酸配列を含むピーナッツペプチドに対するＩｇＧ４、及び配列番号６６のアミノ酸配列を含むピーナッツペプチドに対するＩｇＧ４の組み合わせが＜０．２０であるか、それとも≧０．２０であるかを特定することであって、＜０．２０は、前記対象がピーナッツに対してアレルギーを有さないことを示し、≧０．２０は、前記対象がピーナッツに対してアレルギーを有することを示す、前記特定すること、
を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記ピーナッツペプチドはそれぞれ、前記固相担体とカップリングするためのリンカーを有する、請求項２４から４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記リンカーは、−ＰＥＧ１２−ビオチンである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記固相担体は、微粒子ビーズ、ガラスアレイ、シリコーンアレイ、膜、またはマイクロタイタープレートである、請求項２４から４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＡＡＩは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、及び／またはＩｇＥである、請求項２４から４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＩｇＧは、ＩｇＧ４である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＡＡＩ特異的標識化試薬は、検出可能に標識された抗ヒトＩｇＧ４抗体、検出可能に標識された抗ヒトＩｇＭ抗体、検出可能に標識された抗ヒトＩｇＡ抗体、及び／または検出可能に標識された抗ヒトＩｇＥ抗体である、請求項２４から４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記検出可能な標識は、フィコエリトリン、蛍光色素、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、及びアルカリホスファターゼから選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
各ＡＡＩペプチド固相担体複合体に対する前記ＡＡＩ特異的標識化試薬の前記結合の前記検出は、フローサイトメトリー分析用の多重ペプチドビーズアッセイまたはラテラルフローアッセイにより行われる、請求項２４から４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
ピーナッツに対してアレルギーを有する対象におけるピーナッツアレルギーの治療中のアレルギーまたは有害事象の強度の上昇の経時的検出法であって、以下：
前記対象から得られた血清または血漿中の１種または複数のアレルギー関連免疫グロブリン（ＡＡＩ）が、１種または複数のピーナッツペプチドと結合することを可能にするのに十分な条件下、前記１種または複数のピーナッツペプチドと前記血清または血漿とを接触させることであって、前記１種または複数のピーナッツペプチドは、固相担体にカップリングされていて１種または複数のＡＡＩペプチド固相担体複合体を形成しており、前記１種または複数のピーナッツペプチドは、ａｒａ  ｈ１アレルゲンの８位から６６位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、ａｒａ  ｈ１アレルゲンの１０３位から１５２位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、ａｒａ  ｈ１アレルゲンの１７６位から１９５位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、ａｒａ  ｈ２アレルゲンの５位から４０位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、ａｒａ  ｈ３アレルゲンの９３位から１１５位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、ａｒａ  ｈ３アレルゲンの３０位から７５位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、及び／またはａｒａ  ｈ３アレルゲンの１５２位から１６７位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチドから選択される、前記接触させること、
ＡＡＩ特異的標識化試薬を前記ＡＡＩペプチド固相担体複合体に結合させること、
各ＡＡＩペプチド固相担体複合体に対する前記ＡＡＩ特異的標識化試薬の結合を検出して、前記対象の前記血清または血漿中の前記ＡＡＩと結合した１種または複数のピーナッツペプチドを同定すること、ならびに
前記対象の前記血清または血漿中の前記ＡＡＩと結合した１種または複数のピーナッツペプチドで前記同定されたもの、または前記対象の前記血清または血漿中の前記ＡＡＩの前記濃度を、前記対象の前記血清中の前記ＡＡＩと結合した１種または複数のピーナッツペプチドの先行して同定されたパネル、または前記対象の前記血清または血漿中の前記ＡＡＩの先行する濃度と比較すること、を含み、
ピーナッツに対する前記アレルギー反応の強度の上昇は、前記対象の前記血清または血漿中のＡＡＩにより認識されるピーナッツペプチドの前記後続の数もしくは反応性パターン、または前記対象の前記血清または血漿中のＡＡＩの前記後続の濃度が、前記対象の前記血清または血漿中のＡＡＩにより認識されるピーナッツペプチドの前記先行して同定された数もしくは反応性パターンより大きい、または前記対象の前記血清または血漿中のＡＡＩの前記先行する濃度より高いことにより示されているものである、前記検出法。
【請求項５２】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号４〜６７のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号７、１３、１６、１７、２５、２７、３０、３６、３９、４５、６５、及び６６のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号３９、４５、及び６６のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号５、６、１０、１３、１４、３４、３６、３９、４０、４２、４９、６１、６５、及び６６のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号５、６、９、３４、３６、３９、及び４０のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号２９、３９、４２、４４、４５、５１、及び６３のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５８】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号７、８、２９、３１、３９、４５、及び６１のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５９】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号３９及び４０のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項６０】
各ピーナッツペプチドは、約３つのアミノ酸〜約６０のアミノ酸、約４つのアミノ酸〜約６０のアミノ酸、約６つのアミノ酸〜約３０のアミノ酸、約７つのアミノ酸〜約２０のアミノ酸、約１０のアミノ酸〜約１６のアミノ酸、または約１０のアミノ酸〜約１５のアミノ酸を含む、請求項５１から５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
各ピーナッツペプチドは、１５のアミノ酸を含む、請求項５１から６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、少なくとも２種のピーナッツペプチド、少なくとも３種のピーナッツペプチド、少なくとも５種のピーナッツペプチド、少なくとも１０種のピーナッツペプチド、少なくとも１５種のピーナッツペプチド、少なくとも２０種のピーナッツペプチド、少なくとも２５種のピーナッツペプチド、少なくとも３０種のピーナッツペプチド、少なくとも３５種のピーナッツペプチド、少なくとも４０種のピーナッツペプチド、少なくとも４５種のピーナッツペプチド、少なくとも５０種のピーナッツペプチド、少なくとも５５種のピーナッツペプチド、少なくとも６０種のピーナッツペプチド、または少なくとも６４種のピーナッツペプチドを含む、請求項５１から６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
対象がピーナッツに対してアレルギーを有するという判定は、さらに、以下：全ピーナッツ特異的ＩｇＥ（ｓＩｇＥ）、ピーナッツ構成要素ａｒａ  ｈ１に対するＩｇＥ、ピーナッツ構成要素ａｒａ  ｈ２に対するＩｇＥ、ピーナッツ構成要素ａｒａ  ｈ３に対するＩｇＥ、皮膚プリックテスト結果、臨床歴もしくは家族歴、及び／または患者もしくは臨床医質問票からのデータ
のうち１つまたは複数の結果を考慮に入れる、請求項５１から６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記ピーナッツペプチドはそれぞれ、前記固相担体とカップリングするためのリンカーを有する、請求項５１から６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記リンカーは、−ＰＥＧ１２−ビオチンである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記固相担体は、微粒子ビーズ、ガラスアレイ、シリコーンアレイ、膜、またはマイクロタイタープレートである、請求項５１から６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記ＡＡＩは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、及び／またはＩｇＥである、請求項５１から６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記ＩｇＧは、ＩｇＧ４である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＡＡＩ特異的標識化試薬は、検出可能に標識された抗ヒトＩｇＧ４抗体、検出可能に標識された抗ヒトＩｇＭ抗体、検出可能に標識された抗ヒトＩｇＡ抗体、及び／または検出可能に標識された抗ヒトＩｇＥ抗体である、請求項５１から６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
前記検出可能な標識は、フィコエリトリン、蛍光色素、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、及びアルカリホスファターゼから選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
各ＡＡＩペプチド固相担体複合体に対する前記ＡＡＩ特異的標識化試薬の前記結合の前記検出は、フローサイトメトリー分析用の多重ペプチドビーズアッセイまたはラテラルフローアッセイにより行われる、請求項５１から６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
乳幼児を１種または複数のピーナッツアレルゲンに対して感作させることによるピーナッツに対する耐性または非アレルギー性の誘導法であって、前記乳幼児に１種または複数のピーナッツペプチドを投与することを含み、前記１種または複数のピーナッツペプチドは、ａｒａ  ｈ１アレルゲン（配列番号１）、ａｒａ  ｈ２アレルゲン（配列番号２）、及び／またはａｒａ  ｈ３アレルゲン（配列番号３）に由来するものである、前記誘導法。
【請求項７３】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、以下：
ａｒａ  ｈ１アレルゲンの８位から６６位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、
ａｒａ  ｈ１アレルゲンの１０３位から１５２位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、
ａｒａ  ｈ１アレルゲンの１７６位から１９５位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、
ａｒａ  ｈ２アレルゲンの５位から４０位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、
ａｒａ  ｈ３アレルゲンの９３位から１１５位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、
ａｒａ  ｈ３アレルゲンの３０位から７５位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、及び／または
ａｒａ  ｈ３アレルゲンの１５２位から１６７位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド
から選択される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号４〜６７のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号７、１３、１６、１７、２５、２７、３０、３６、３９、４５、６５、及び６６のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７６】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号３９、４５、及び６６のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７７】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号５、６、１０、１３、１４、３４、３６、３９、４０、４２、４９、６１、６５、及び６６のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７８】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号５、６、９、３４、３６、３９、及び４０のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７９】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号２９、３９、４２、４４、４５、５１、及び６３のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項８０】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号７、８、２９、３１、３９、４５、及び６１のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項８１】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号３９及び４０のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項８２】
各ピーナッツペプチドは、約３つのアミノ酸〜約６０のアミノ酸、約４つのアミノ酸〜約６０のアミノ酸、約６つのアミノ酸〜約３０のアミノ酸、約７つのアミノ酸〜約２０のアミノ酸、約１０のアミノ酸〜約１６のアミノ酸、または約１０のアミノ酸〜約１５のアミノ酸を含む、請求項７２から８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
各ピーナッツペプチドは、１５のアミノ酸を含む、請求項７２から８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、少なくとも２種のピーナッツペプチド、少なくとも３種のピーナッツペプチド、少なくとも５種のピーナッツペプチド、少なくとも１０種のピーナッツペプチド、少なくとも１５種のピーナッツペプチド、少なくとも２０種のピーナッツペプチド、少なくとも２５種のピーナッツペプチド、少なくとも３０種のピーナッツペプチド、少なくとも３５種のピーナッツペプチド、少なくとも４０種のピーナッツペプチド、少なくとも４５種のピーナッツペプチド、少なくとも５０種のピーナッツペプチド、少なくとも５５種のピーナッツペプチド、少なくとも６０種のピーナッツペプチド、または少なくとも６４種のピーナッツペプチドを含む、請求項７２から８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
ａｒａ  ｈ１アレルゲン（配列番号１）、ａｒａ  ｈ２アレルゲン（配列番号２）、及び／またはａｒａ  ｈ３アレルゲン（配列番号３）に由来する少なくとも２種のペプチドを含む複数のピーナッツペプチドを含む、アレルゲンエピトープ含有ピーナッツペプチドのセット。
【請求項８６】
前記複数のピーナッツペプチドは、以下：
ａｒａ  ｈ１アレルゲンの８位から６６位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、
ａｒａ  ｈ１アレルゲンの１０３位から１５２位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、
ａｒａ  ｈ１アレルゲンの１７６位から１９５位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、
ａｒａ  ｈ２アレルゲンの５位から４０位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、
ａｒａ  ｈ３アレルゲンの９３位から１１５位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、
ａｒａ  ｈ３アレルゲンの３０位から７５位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、及び／または
ａｒａ  ｈ３アレルゲンの１５２位から１６７位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド
から選択される、請求項８５に記載のピーナッツペプチドのセット。
【請求項８７】
前記複数のピーナッツペプチドは、配列番号４〜６７のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む、請求項８５に記載のピーナッツペプチドのセット。
【請求項８８】
前記複数のピーナッツペプチドは、配列番号７、１３、１６、１７、２５、２７、３０、３６、３９、４５、６５、及び６６のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む、請求項８５に記載のピーナッツペプチドのセット。
【請求項８９】
前記複数のピーナッツペプチドは、配列番号３９、４５、及び６６のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む、請求項８５に記載のピーナッツペプチドのセット。
【請求項９０】
前記複数のピーナッツペプチドは、配列番号５、６、１０、１３、１４、３４、３６、３９、４０、４２、４９、６１、６５、及び６６のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む、請求項８５に記載のピーナッツペプチドのセット。
【請求項９１】
前記複数のピーナッツペプチドは、配列番号５、６、９、３４、３６、３９、及び４０のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む、請求項８５に記載のピーナッツペプチドのセット。
【請求項９２】
前記複数のピーナッツペプチドは、配列番号２９、３９、４２、４４、４５、５１、及び６３のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む、請求項８５に記載のピーナッツペプチドのセット。
【請求項９３】
前記複数のピーナッツペプチドは、配列番号７、８、２９、３１、３９、４５、及び６１のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む、請求項８５に記載のピーナッツペプチドのセット。
【請求項９４】
前記複数のピーナッツペプチドは、配列番号３９及び４０のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む、請求項８５に記載のピーナッツペプチドのセット。
【請求項９５】
各ピーナッツペプチドは、約３つのアミノ酸〜約６０のアミノ酸、約４つのアミノ酸〜約６０のアミノ酸、約６つのアミノ酸〜約３０のアミノ酸、約７つのアミノ酸〜約２０のアミノ酸、約１０のアミノ酸〜約１６のアミノ酸、または約１０のアミノ酸〜約１５のアミノ酸を含む、請求項８５から９４のいずれか１項に記載のピーナッツペプチドのセット。
【請求項９６】
各ピーナッツペプチドは、１５のアミノ酸を含む、請求項８５から９５のいずれか１項に記載のピーナッツペプチドのセット。
【請求項９７】
前記複数のピーナッツペプチドは、少なくとも２種のピーナッツペプチド、少なくとも３種のピーナッツペプチド、少なくとも５種のピーナッツペプチド、少なくとも１０種のピーナッツペプチド、少なくとも１５種のピーナッツペプチド、少なくとも２０種のピーナッツペプチド、少なくとも２５種のピーナッツペプチド、少なくとも３０種のピーナッツペプチド、少なくとも３５種のピーナッツペプチド、少なくとも４０種のピーナッツペプチド、少なくとも４５種のピーナッツペプチド、少なくとも５０種のピーナッツペプチド、少なくとも５５種のピーナッツペプチド、少なくとも６０種のピーナッツペプチド、または少なくとも６４種のピーナッツペプチドを含む、請求項８５から９６のいずれか１項に記載のピーナッツペプチドのセット。
【請求項９８】
ａ）ａｒａ  ｈ１アレルゲン（配列番号１）、ａｒａ  ｈ２アレルゲン（配列番号２）、及び／またはａｒａ  ｈ３アレルゲン（配列番号３）に由来する１種または複数のアレルゲンエピトープ含有ピーナッツペプチドであって、各ピーナッツペプチドは、固相担体にカップリングされている、前記１種または複数のアレルゲンエピトープ含有ピーナッツペプチド、ならびに
ｂ）アレルギー関連免疫グロブリン（ＡＡＩ）特異的標識化試薬、
を含み、まとめてパッケージ化されていて、使用説明書も含む、キット。
【請求項９９】
さらに、結合緩衝液、洗浄緩衝液、及び検出緩衝液のうち１種または複数を含む、請求項９８に記載のキット。
【請求項１００】
さらに、前記ＡＡＩ特異的標識化試薬と特異的に結合するレポーター部分を含む、請求項９８に記載のキット。
【請求項１０１】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、以下：
ａｒａ  ｈ１アレルゲンの８位から６６位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、
ａｒａ  ｈ１アレルゲンの１０３位から１５２位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、
ａｒａ  ｈ１アレルゲンの１７６位から１９５位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、
ａｒａ  ｈ２アレルゲンの５位から４０位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、
ａｒａ  ｈ３アレルゲンの９３位から１１５位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、
ａｒａ  ｈ３アレルゲンの３０位から７５位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、及び／または
ａｒａ  ｈ３アレルゲンの１５２位から１６７位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド
から選択される、請求項９８に記載のキット。
【請求項１０２】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号４〜６７のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項９８に記載のキット。
【請求項１０３】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号７、１３、１６、１７、２５、２７、３０、３６、３９、４５、６５、及び６６のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項９８に記載のキット。
【請求項１０４】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号３９、４５、及び６６のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項９８に記載のキット。
【請求項１０５】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号５、６、１０、１３、１４、３４、３６、３９、４０、４２、４９、６１、６５、及び６６のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項９８に記載のキット。
【請求項１０６】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号５、６、９、３４、３６、３９、及び４０のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項９８に記載のキット。
【請求項１０７】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号２９、３９、４２、４４、４５、５１、及び６３のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項９８に記載のキット。
【請求項１０８】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号７、８、２９、３１、３９、４５、及び６１のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項９８に記載のキット。
【請求項１０９】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号３９及び４０のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項９８に記載のキット。
【請求項１１０】
各ピーナッツペプチドは、約３つのアミノ酸〜約６０のアミノ酸、約４つのアミノ酸〜約６０のアミノ酸、約６つのアミノ酸〜約３０のアミノ酸、約７つのアミノ酸〜約２０のアミノ酸、約１０のアミノ酸〜約１６のアミノ酸、または約１０のアミノ酸〜約１５のアミノ酸を含む、請求項９８から１０９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１１】
各ピーナッツペプチドは、１５のアミノ酸を含む、請求項９８から１０９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１２】
前記１種または複数のピーナッツペプチドは、少なくとも２種のピーナッツペプチド、少なくとも３種のピーナッツペプチド、少なくとも５種のピーナッツペプチド、少なくとも１０種のピーナッツペプチド、少なくとも１５種のピーナッツペプチド、少なくとも２０種のピーナッツペプチド、少なくとも２５種のピーナッツペプチド、少なくとも３０種のピーナッツペプチド、少なくとも３５種のピーナッツペプチド、少なくとも４０種のピーナッツペプチド、少なくとも４５種のピーナッツペプチド、少なくとも５０種のピーナッツペプチド、少なくとも５５種のピーナッツペプチド、少なくとも６０種のピーナッツペプチド、または少なくとも６４種のピーナッツペプチドを含む、請求項９８から１１１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１３】
前記ピーナッツペプチドはそれぞれ、前記固相担体とカップリングするためのリンカーを有する、請求項９８から１１２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１４】
前記リンカーは、−ＰＥＧ１２−ビオチンである、請求項１１３に記載のキット。
【請求項１１５】
前記固相担体は、微粒子ビーズ、ガラスアレイ、シリコーンアレイ、膜、またはマイクロタイタープレートである、請求項９８から１１４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１６】
前記ＡＡＩ特異的標識化試薬は、検出可能に標識された抗ヒトＩｇＧ４抗体、検出可能に標識された抗ヒトＩｇＭ抗体、検出可能に標識された抗ヒトＩｇＡ抗体、及び／または検出可能に標識された抗ヒトＩｇＥ抗体である、請求項９８から１１５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１７】
前記検出可能な標識は、フィコエリトリン、蛍光色素、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、及びアルカリホスファターゼから選択される、請求項１１６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、部分的に、ピーナッツアレルギーの診断のための、及びアレルギー性対象がアレルギーを寛解する見込みがあるかどうかを判定するためのペプチドバイオマーカーに関し、それを用いた方法及びキットも含む。
【背景技術】
【０００２】
食物アレルギーは、成人及び小児の間で共通する問題であり、症候は、軽度の口腔そう痒から生死に関わる可能性のあるアナフィラキシーショックにまで及ぶ場合がある。食物アレルギーは、現在、皮膚プリックテストまたは口腔誘発、ならびに特定ＩｇＥ、及び場合によってはＩｇＧ４など他の血清抗体の血清レベルの測定により診断されている。これらの試験は、臨床反応の見込みを示すものの、食物アレルギーの表現型の違いを区別することもなければ、予後の情報を提供することもない。現在のアレルギー検査は、患者にとってあるレベルのリスクとも関係する。現在のＩｇＥ検査と患者の実際の臨床感度との間の関係性は、通常、反応重篤度と反応を誘発するアレルゲンの量との組み合わせとして定義される弱いものである。現在の検査の別の限界は、小児患者が小児期中にアレルギーを寛解するかしないかを判定できないことである。この場合、特定ＩｇＥレベルと臨床アレルギーの持続期間との間に陽性であるが弱い相関が存在する。
【０００３】
さらに最近では、食物アレルゲンに対する臨床反応は、エピトープ認識レベルでアレルゲン特異的ＩｇＥとより良く相関する可能性があることが示唆されてきている。持続性またはより重度のアレルギー反応を持つ患者は、より多数のＩｇＥエピトープを認識することが報告されており、このことは、エピトープマッピングが、アレルギー診断及び予測のさらなる道具となることを示唆している。スポット膜利用免疫アッセイ（ｓｐｏｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ）が、エピトープマッピングに使用されてきている。このシステムでは、ペプチドを膜上で合成し、患者の血清とともにインキュベートする。このプロセスは、多数のペプチドを必要とし、したがって、エラーが起こりやすく、時間がかかり、労力を必要とし、しかも費用がかかる。この形式の免疫アッセイは、大量の患者血清も必要とする。
【０００４】
食物アレルギーの臨床像の著しい多様性は、管理及び治療の成功の障害となっており、したがって、食物アレルギーにおいて、予防の改善、現行症例の管理、及び新規治療の開始に、精密医療戦略が大いに関連する。食物アレルギーエンドタイプ、アレルギー発症のリスク、反応重篤度、及び治療の予後を特定するための敏感かつ特異的バイオマーカーは、精密医療に向かう道筋において必須の構成要素である（非特許文献１）。過去１０年間、持続性食物アレルギー治療のための経口免疫療法（ＯＩＴ）の有効性を評価する研究が多数行われてきた（非特許文献２）。ピーナッツアレルギーでは、ＯＩＴは、許容できる安全性プロファイルを有することが示されており、臨床効果が実証されている（非特許文献３）。臨床反応における改善にも関わらず、ＯＩＴは、顕著な有害効果と関連していて、アナフィラキシーが出た場合があり、１５％〜２０％は有害反応を理由に治療を中止しなければならなかった（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）。有害反応に加えて、ＯＩＴに対する反応は、典型的には、いったん治療を中止すると継続しない、すなわち患者は、一時的にアレルゲンから脱感作しているだけで、耐性を獲得していない（非特許文献２、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２、及び非特許文献１３）。しかしながら、進歩が見られていること、及び新たな食物アレルギー療法がＦＤＡ承認間近であることは明白である。こうした治療アプローチは、診断及び予後判定検査の恩恵を受けるもので、検査は、患者及び担当医が、治療に参加するにあたり疾患の重篤度を把握すること、治療中に患者をモニタリングして有害反応が生じる前にその進行または発生を評価すること、ならびにいったん治療が中止された後に患者の状態を追跡することを助けるだろう。
【０００５】
ピーナッツタンパク質に対するＩｇＥ抗体の産生は、ピーナッツアレルギーの病理発生の中心にある。臨床反応の９５％予測区間であるピーナッツ特異的ＩｇＥ濃度を同定する予測曲線が作成されたものの、ピーナッツＩｇＥは、ＩｇＥレベルが低いと予測能が低く、レベルが高いと、読み取りが２値のみになり、したがって、治療の安全性または有効性を評価する補助として使用するのが困難である。これは、臨床的に関連のないピーナッツ構成要素に対するＩｇＥ抗体の測定による可能性がある。Ａｒａ  ｈ２に対するＩｇＥは、ピーナッツに対する臨床反応を予測する（非特許文献１４）が、同様なＡｒａ  ｈ２レベルを持つ個体間で膨大な臨床的多様性が存在する。主要アレルゲンの完全連続エピトープレパートリーを包含する重複ペプチドで構成されたペプチドマイクロアレイが開発されて、エピトープ特異的免疫グロブリン反応が測定されている（非特許文献１５、及び非特許文献１６）。Ａｒａ  ｈ１、２、及び３中のＩｇＥと結合するピーナッツエピトープ数は、反応重篤度を予測する（非特許文献１７）。要素分解型診断方法（ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ）として、ピーナッツ、Ａｒａ  ｈ１、Ａｒａ  ｈ２、及びＡｒａ  ｈ３に対するｓＩｇＥの存在は、「真の」ピーナッツアレルギー及び重度反応のリスクが高いことの指標である（例えば、アレルギー診断において、ｓＩｇＥレベル≧０．３５ｋＵＡ／Ｌは、７５〜９５％ＰＰＶ、９０％ＮＰＶを示す。非特許文献１８。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｉｃｈｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１５，１３５，３５７−６７
【非特許文献２】Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１６，１３７，１１０３−１１１０
【非特許文献３】Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｐｒａｃｔ．，２０１７，５，３３５−３４４
【非特許文献４】Ｋｅｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１２，１２９，４４８−４５５
【非特許文献５】Ｌｏｎｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００８，１２１，３４３−７
【非特許文献６】Ｍｅｇｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００８，１９，４１２−４１９
【非特許文献７】Ｓｋｒｉｐａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００８，１２２，１１５４−６０
【非特許文献８】Ｓｔａｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｌｌｅｒｇｙ，２００７，６２，１２６１−１２６９
【非特許文献９】Ｂｕｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２０１２，３６７，２３３−２４３
【非特許文献１０】Ｂｕｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００８，１２１，１３４４−１３５０
【非特許文献１１】Ｂｕｒｋｓ，Ａｒｂ．Ｐａｕｌ  Ｅｈｒｌｉｃｈ  Ｉｎｓｔ．Ｂｕｎｄｅｓｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｉｍｐｆｓｔｏｆｆｅ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ａｒｚｎｅｉｍ  Ｌａｎｇｅｎ  Ｈｅｓｓ，２０１３，９７，１２２−１２３
【非特許文献１２】Ｇｏｒｅｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１５，１３５，１２８３−１２９２
【非特許文献１３】Ｋｅｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１３，１３２，７３７−７３９
【非特許文献１４】Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｐｒａｃｔ．，２０１３，１，７５−８２
【非特許文献１５】Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００９，１２４，３１５−２２
【非特許文献１６】Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１２，１２９，１３２１−１３２８
【非特許文献１７】Ｆｌｉｎｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００８，１２１，７３７−７４３
【非特許文献１８】Ｋｌｅｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１３，１３１，１５７−１６３）
【発明の概要】
【０００７】
歴史的には、人々は特定タンパク質に対してアレルギーを発症すると考えられていたが、その化学反応及び免疫応答は、はるかに詳細である。全ピーナッツ抽出物でも構成要素に分けてさえも、それらに対するＩｇＥの研究は、分子レベルでの真の反応の特異性を提供しない。タンパク質は、その構造に沿って種々のエピトープを有し、これらエピトープは、アレルギー反応中に抗体が結合する特異的標的である。したがって、より高い分解能のアレルギー検査パネルなら、患者のアレルギー反応の原因となるタンパク質内の特異的エピトープを同定することができる。本明細書中記載される方法は、ピーナッツで見られるタンパク質を、そのタンパク質全体を形成しているより短い構成要素（エピトープ）に細かく分けることにより、各エピトープに対して抗体がどのように結合するかに基づいて抗体反応性を階層化することができ、それにより各患者のエピトープ結合パターンを確立し、及びより正確かつ予測的診断が可能になるという前提に、一部基づいている。
【０００８】
本明細書中記載されるとおり、本方法は、ピーナッツで見られるタンパク質を、より小さなペプチド、すなわち２つ以上のアミノ酸からなる化合物へと細かく分ける。次いで、マッピングされたペプチドを、個別に、ビーズにカップリングさせて、高処理分析及びエピトープ結合評価を可能にする。患者のＩｇＥ反応の反応性、すなわち、血流中の、アレルギー性免疫応答で「火を灯すマッチ」として作用する抗体を、試験する。反応では、抗体は、ペプチドがカップリングしたビーズに結合し、本方法は、ペプチドあたりの個別化された反応を分離し特定するように設計されているので、臨床医は、患者のアレルギープロファイルのより正確で完全な実像を得ることができる。結果は、個別のペプチドの結果で「マッピング」され、患者の分類に使用される治療反応プロファイルを形成する。
【０００９】
本開示は、対象において、ピーナッツアレルギー、及び／またはピーナッツアレルギーの重篤度を診断する方法を提供し、本方法は、以下を含む：対象から得られた血清または血漿中の１種または複数のアレルギー関連免疫グロブリン（ＡＡＩ）が、１種または複数のピーナッツペプチドと結合することを可能にするのに十分な条件下、１種または複数のピーナッツペプチドと血清または血漿とを接触させること（ただし、１種または複数のピーナッツペプチドは、固相担体にカップリングされており、１種または複数のＡＡＩペプチド固相担体複合体を形成している）、ＡＡＩ特異的標識化試薬をＡＡＩペプチド固相担体複合体に結合させること、及び、各ＡＡＩペプチド固相担体複合体に対するＡＡＩ特異的標識化試薬の結合を検出して、対象の血清または血漿中のＡＡＩと結合した１種または複数のピーナッツペプチドを同定すること、対象の血清または血漿中のＡＡＩが少なくとも１種のピーナッツペプチドを認識するということは、その対象がピーナッツに対してアレルギーを有することを示す。
【００１０】
本開示は、ピーナッツに対してアレルギーを有する対象において、ピーナッツに対する臨床的耐性の獲得を検出する方法も提供し、本方法は、以下を含む：対象から得られた血清または血漿中の１種または複数のアレルギー関連免疫グロブリン（ＡＡＩ）が、１種または複数のピーナッツペプチドと結合することを可能にするのに十分な条件下、１種または複数のピーナッツペプチドと血清または血漿とを接触させること（ただし、１種または複数のピーナッツペプチドは、固相担体にカップリングされており、１種または複数のＡＡＩペプチド固相担体複合体を形成している）、ＡＡＩ特異的標識化試薬をＡＡＩペプチド固相担体複合体に結合させること、各ＡＡＩペプチド固相担体複合体に対するＡＡＩ特異的標識化試薬の結合を検出して、対象の血清または血漿中のＡＡＩと結合した１種または複数のピーナッツペプチドを同定すること、及び、対象の血清または血漿中のＡＡＩと結合した１種または複数のピーナッツペプチドで同定されたもの、または対象の血清または血漿中のＡＡＩの濃度を、対象の血清または血漿中のＡＡＩと結合した１種または複数のピーナッツペプチドの先行して同定されたパネル、または対象の血清または血漿中のＡＡＩの先行する濃度と比較すること（以下の場合に、ピーナッツに対する臨床的耐性の獲得が、示されている：対象の血清または血漿中のＩｇＥ  ＡＡＩにより認識されるピーナッツペプチドの後続の数、及び／または対象の血清または血漿中のＡＡＩ  ＩｇＥの後続の濃度が、対象の血清または血漿中のＡＡＩ  ＩｇＥにより認識されるピーナッツペプチドの先行して同定された数より少ない、及び／または対象の血清または血漿中のＡＡＩ  ＩｇＥの先行する濃度より低い場合、及び／または対象の血清または血漿中のＩｇＧ４  ＡＡＩにより認識されるピーナッツペプチドの後続の数、及び／または対象の血清または血漿中のＡＡＩ  ＩｇＧ４の後続の濃度が、対象の血清または血漿中のＡＡＩ  ＩｇＧ４により認識されるピーナッツペプチドの先行して同定された数より多い、及び／または対象の血清または血漿中のＡＡＩ  ＩｇＧ４の先行する濃度より高い場合）。
【００１１】
本開示は、ピーナッツに対してアレルギーを有する対象において、ピーナッツに対するアレルギーの治療中、経時的に、アレルギー強度の上昇または有害事象を検出する方法も提供し、本方法は、以下を含む：対象から得られた血清または血漿中の１種または複数のアレルギー関連免疫グロブリン（ＡＡＩ）が、１種または複数のピーナッツペプチドと結合することを可能にするのに十分な条件下、１種または複数のピーナッツペプチドと血清または血漿とを接触させること（ただし、１種または複数のピーナッツペプチドは、固相担体にカップリングされており、１種または複数のＡＡＩペプチド固相担体複合体を形成しており、及びただし、１種または複数のピーナッツペプチドは、ａｒａ  ｈ１アレルゲンの８位から６６位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、ａｒａ  ｈ１アレルゲンの１０３位から１５２位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、ａｒａ  ｈ１アレルゲンの１７６位から１９５位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、ａｒａ  ｈ２アレルゲンの５位から４０位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、ａｒａ  ｈ３アレルゲンの９３位から１１５位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、ａｒａ  ｈ３アレルゲンの３０位から７５位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、及び／またはａｒａ  ｈ３アレルゲンの１５２位から１６７位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチドから選択される）、ＡＡＩ特異的標識化試薬をＡＡＩペプチド固相担体複合体に結合させること、各ＡＡＩペプチド固相担体複合体に対するＡＡＩ特異的標識化試薬の結合を検出して、対象の血清または血漿中のＡＡＩと結合した１種または複数のピーナッツペプチドを同定すること、ならびに、対象の血清または血漿中のＡＡＩと結合した１種または複数のピーナッツペプチドで同定されたもの、または対象の血清または血漿中のＡＡＩの濃度を、対象の血清中のＡＡＩと結合した１種または複数のピーナッツペプチドの先行して同定されたパネル、または対象の血清または血漿中のＡＡＩの先行する濃度と比較すること（対象の血清または血漿中のＡＡＩにより認識されるピーナッツペプチドの後続の数もしくは反応性パターン、または対象の血清または血漿中のＡＡＩの後続の濃度が、対象の血清または血漿中のＡＡＩにより認識されるピーナッツペプチドの先行して同定された数または反応性パターンより大きい、及び／または対象の血清または血漿中のＡＡＩの先行する濃度より高い場合に、ピーナッツに対するアレルギー反応の強度の上昇が示されている）。
【００１２】
本開示は、ピーナッツに対する耐性を誘導するまたはアレルギーをなくすために、乳幼児を１種または複数のピーナッツアレルゲンに感作させる方法も提供し、本方法は、１種または複数のピーナッツペプチドを乳幼児に投与することを含み、ただし、１種または複数のピーナッツペプチドは、ａｒａ  ｈ１アレルゲン（配列番号１）、ａｒａ  ｈ２アレルゲン（配列番号２）、及び／またはａｒａ  ｈ３アレルゲン（配列番号３）に由来するものである。
【００１３】
本開示は、アレルゲンエピトープ含有ピーナッツペプチドのセットも提供し、本セットは、ａｒａ  ｈ１アレルゲン（配列番号１）、ａｒａ  ｈ２アレルゲン（配列番号２）、及び／またはａｒａ  ｈ３アレルゲン（配列番号３）に由来する少なくとも２種のペプチドを含む複数のピーナッツペプチドを含む。
【００１４】
本開示は、キットも提供し、本キットは、以下：ａｒａ  ｈ１アレルゲン（配列番号１）、ａｒａ  ｈ２アレルゲン（配列番号２）、及び／またはａｒａ  ｈ３アレルゲン（配列番号３）に由来する１種または複数のアレルゲンエピトープ含有ピーナッツペプチド（各ピーナッツペプチドは固相担体にカップリングされている）、及びアレルギー関連免疫グロブリン（ＡＡＩ）特異的標識化試薬、を含み、これらはまとめてパッケージ化されており、使用説明書も含んでいる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１−１】回避者と摂取者の間のＩｇＥエピトープに対するＩｇＥ反応の代表的な違いを、試験来院時にわたり臨床試験開始時のベースライン来院との比較で示す（Ｖ１２−Ｖ１、Ｖ３０−Ｖ１、及びＶ６０−Ｖ１）。
【図１−２】同上。
【図１−３】同上。
【図１−４】同上。
【図２−１】回避者と摂取者の間のＩｇＧ４エピトープに対するＩｇＧ４反応の代表的な違いを、試験来院時にわたり臨床試験開始時のベースライン来院との比較で示す（Ｖ１２−Ｖ１、Ｖ３０−Ｖ１、及びＶ６０−Ｖ１）。
【図２−２】同上。
【図２−３】同上。
【図２−４】同上。
【図３−１】群間の代表的なＩｇＥ反応を基に来院あたりの変化を示す。
【図３−２】同上。
【図３−３】同上。
【図４−１】来院６０での代表的なＩｇＧ４反応の変化を示す。
【図４−２】同上。
【図４−３】同上。
【図４−４】同上。
【図５−１】Ｖ６０での回避者における代表的なＩｇＧ４反応を示す。
【図５−２】同上。
【図６−１】感作された摂取者における代表的なＩｇＧ４エピトープ拡大を回避者と比較して示す。
【図６−２】同上。
【図６−３】同上。
【図６−４】同上。
【図６−５】同上。
【図７−１】６４のピーナッツアレルギー性エピトープアッセイ及びＥＢスコアの代表的結果を、年齢１、２．５、及び５歳の時点で、それぞれのベースライン来院時と比較して示す。
【図７−２】同上。
【図８−１】エピトーププロファイルの代表的結果を示す。
【図８−２】同上。
【図９】代表的なエピトープモデルを訓練結果で示す。
【図１０】代表的なエピトープモデルを訓練結果で示す。
【図１１】エピトープモデルとＩｍｍｕｎｏＣＡＰの比較の代表的な結果を示す。
【図１２】エピトープ及びエピトープ＋ｓＩｇＥのＣＶにおける代表的なＡＵＣを示す。
【図１３】試験におけるエピトープモデルの精度の代表的結果を示す。
【図１４】ＣｏＦａｒ２における成績のＲＯＣプロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書中使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定することを意図しない。
複数の例示実施形態を説明する前に、当然のことながら、実施形態は、以下の説明に記載される詳細な構成またはプロセス工程に限定されない。本明細書中記載される実施形態は、修飾可能であり、様々なやり方で実施または実行することができる。
【００１７】
本開示全体を通じて「いくつかの実施形態」という言及、またはその派生表現は、その実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造、材料、または特質が、少なくとも１つの実施形態に含まれていることを意味する。したがって、本開示全体を通じて各所に出現する「実施形態によっては」などの語句は、必ずしも同一実施形態を示すとは限らず、むしろ、概して、任意の他の実施形態によるものとすることができる。そのうえさらに、特定の特徴、構造、材料、または特質は、１つまたは複数の実施形態において、任意の適切な様式で組みわせることができる。
【００１８】
本明細書中使用される場合、「アレルギー関連免疫グロブリン」及び「ＡＡＩ」という用語は、ピーナッツアレルゲンに対する過敏症に介在する血清中の免疫グロブリンを示す。そのような免疫グロブリンとして、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、及びＩｇＧ（ＩｇＧ４を含む）のうち１種または複数が挙げられる。
【００１９】
本明細書中使用される場合、「反応性の（ｒｅａｃｔｉｖｅ）」、「反応性（ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）」、「認識する」などの用語は、アレルギー関連免疫グロブリンの、アレルゲンエピトープ含有ペプチドと結合する能力を示す。反応性のレベルは、血清または血漿中のＡＡＩ濃度を示し、高い反応性は、ＡＡＩ濃度がより高いことと関連し、低い反応性は、ＡＡＩ濃度がより低いことと関連する。相対的ＡＡＩ濃度（すなわち、相対的血清または血漿反応性）は、アッセイで検出されるシグナルの量により決定される。アレルゲンエピトープ含有ペプチドに対するＡＡＩの反応性のレベルは、アレルギー反応の強度も示す（すなわち、反応性が高いほど、アレルギー反応がより強いことと関連する）。
【００２０】
本明細書中使用される場合、「臨床的耐性」という用語は、アレルギー性対象が、ピーナッツアレルゲンへの曝露の結果として獲得する、ピーナッツアレルゲンに対する免疫学的耐性（すなわち、免疫療法の結果として獲得した耐性）を示す。
【００２１】
本明細書中使用される場合、「自然耐性」という用語は、生存期間中のアレルゲンへの自然曝露の結果として、または曝露不在下でのいずれかにより、アレルギー性対象が、経時的な生化学過程として獲得する、ピーナッツアレルゲンに対する免疫学的耐性を示す。
【００２２】
本開示は、ａｒａ  ｈ１アレルゲン（配列番号１）、ａｒａ  ｈ２アレルゲン（配列番号２）、及び／またはａｒａ  ｈ３アレルゲン（配列番号３）に由来する少なくとも２種のペプチドを含む複数のピーナッツペプチドを含むアレルゲンエピトープ含有ピーナッツペプチドのセットを提供する。
【００２３】
実施形態によっては、複数のピーナッツペプチドは、以下から選択される：ａｒａ  ｈ１アレルゲンの８位から６６位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、ａｒａ  ｈ１アレルゲンの１０３位から１５２位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、ａｒａ  ｈ１アレルゲンの１７６位から１９５位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、ａｒａ  ｈ２アレルゲンの５位から４０位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、ａｒａ  ｈ３アレルゲンの９３位から１１５位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、ａｒａ  ｈ３アレルゲンの３０位から７５位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、及び／またはａｒａ  ｈ３アレルゲンの１５２位から１６７位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド。
【００２４】
実施形態によっては、複数のピーナッツペプチドは、配列番号４〜６７のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む。実施形態によっては、複数のピーナッツペプチドは、配列番号７、１３、１６、１７、２５、２７、３０、３６、３９、４５、６５、及び６６のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む。実施形態によっては、複数のピーナッツペプチドは、配列番号３９、４５、及び６６のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む。実施形態によっては、複数のピーナッツペプチドは、配列番号５、６、１０、１３、１４、３４、３６、３９、４０、４２、４９、６１、６５、及び６６のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む。実施形態によっては、複数のピーナッツペプチドは、配列番号５、６、９、３４、３６、３９、及び４０のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む。実施形態によっては、複数のピーナッツペプチドは、配列番号２９、３９、４２、４４、４５、５１、及び６３のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む。実施形態によっては、複数のピーナッツペプチドは、配列番号７、８、２９、３１、３９、４５、及び６１のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む。実施形態によっては、複数のピーナッツペプチドは、配列番号３９及び４０のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む。実施形態によっては、複数のピーナッツペプチドは、配列番号３９のアミノ酸配列を有するペプチドを含む。実施形態によっては、複数のピーナッツペプチドは、配列番号４０のアミノ酸配列を有するペプチドを含む。
【００２５】
実施形態によっては、各ピーナッツペプチドは、約３つのアミノ酸〜約６０のアミノ酸、約４つのアミノ酸〜約６０のアミノ酸、約６つのアミノ酸〜約３０のアミノ酸、約７つのアミノ酸〜約２０のアミノ酸、約１０のアミノ酸〜約１６のアミノ酸、または約１０のアミノ酸〜約１５のアミノ酸を含む。実施形態によっては、各ピーナッツペプチドは、１５のアミノ酸を含む。
【００２６】
実施形態によっては、複数のピーナッツペプチドは、少なくとも２種のピーナッツペプチド、少なくとも３種のピーナッツペプチド、少なくとも５種のピーナッツペプチド、少なくとも１０種のピーナッツペプチド、少なくとも１５種のピーナッツペプチド、少なくとも２０種のピーナッツペプチド、少なくとも２５種のピーナッツペプチド、少なくとも３０種のピーナッツペプチド、少なくとも３５種のピーナッツペプチド、少なくとも４０種のピーナッツペプチド、少なくとも４５種のピーナッツペプチド、少なくとも５０種のピーナッツペプチド、少なくとも５５種のピーナッツペプチド、少なくとも６０種のピーナッツペプチド、または少なくとも６４種のピーナッツペプチドを含む。実施形態によっては、複数のピーナッツペプチドは、約２〜約６４種のピーナッツペプチド、約２〜約６０種のピーナッツペプチド、約２〜約５５種のピーナッツペプチド、約２〜約５０種のピーナッツペプチド、約２〜約４５種のピーナッツペプチド、約２〜約４０種のピーナッツペプチド、約２〜約３５種のピーナッツペプチド、約２〜約３０種のピーナッツペプチド、約２〜約２５種のピーナッツペプチド、約２〜約２０種のピーナッツペプチド、約２〜約１５種のピーナッツペプチド、または約２〜約１０種のピーナッツペプチドを含む。実施形態によっては、複数のピーナッツペプチドは、約２〜約６４種のピーナッツペプチド、約５〜約６４種のピーナッツペプチド、約１０〜約６４種のピーナッツペプチド、約１５〜約６４種のピーナッツペプチド、約２０〜約６４種のピーナッツペプチド、約２５〜約６４種のピーナッツペプチド、約３０〜約６４種のピーナッツペプチド、約３５〜約６４種のピーナッツペプチド、約４０〜約６４種のピーナッツペプチド、約４５〜約６４種のピーナッツペプチド、約５０〜約６４種のピーナッツペプチド、または約５５〜約６４種のピーナッツペプチドを含む。
【００２７】
当然のことながら、本明細書中開示されるアレルゲンエピトープ含有ペプチドは、特定のアミノ酸配列を有する特定の実施形態として説明されているものの、当業者なら、そのようなペプチドのそれぞれを、そのペプチドの由来するタンパク質のＮ末端またはＣ末端方向のいずれかに移動させることにより、関連エピトープを依然として含有しながらも、指定されるものとは異なるアミノ酸がその関連エピトープの横に配置されている関連ペプチド配列を得られることがわかるだろう。したがって、全ての実施形態において、アレルゲンエピトープ含有ペプチドは、開示されるペプチド配列と、２、４、６、または８以上の連続するアミノ酸が重複しているアミノ酸配列を有することができる。
【００２８】
同じくわかるだろうが、配列番号４〜６７に表されるペプチド全６４種の分析は、本明細書中記載される方法で有用な結果を得るためには必ずしも常に必要ではない。配列番号４〜６７に表されるペプチドの中から選択された十分な数のペプチドを用いて、統計上信頼できる結果を得ることが可能である。例えば、対象のピーナッツアレルギー状態が不明である場合、配列番号４〜６７に表されるペプチドの中から選択されるアレルゲンエピトープ含有ペプチドの数を増やして分析することが一般に望ましく、その結果、配列番号４〜６７に表されるペプチドのごく少数との反応性が関与する可能性がある軽度〜中等度のピーナッツアレルギーの検出が確実になる。反対に、対象が高強度のピーナッツアレルギーを有することが既知である場合、配列番号４〜６７に表されるペプチドの中から選択されるアレルゲンエピトープ含有ペプチドを少なくしても、アレルギー強度の変化または臨床的耐性の獲得を検出するには十分である可能性がある。なぜなら、配列番号４〜６７に表されるペプチドの多数が、最初から反応性であるだろうからである。しかしながら、アレルギー強度の変化または臨床的耐性の獲得は、血清と反応するペプチドの数の変化、ならびに特定ペプチドと反応する血清ＩｇＥの濃度の変化により裏付けられるため、アッセイには、配列番号４〜６７に表されるペプチドの中から選択される十分に大きなペプチドセットを含めることで、特定の対象について診断を与えるペプチドに関する変化を見逃さないことを確実にすることが、特に望ましい。したがって、本明細書中記載される方法のいずれかで使用するために配列番号４〜６７に表されるペプチドの中から選択される複数のアレルゲンエピトープ含有ペプチドは、配列番号４〜６７の６４種のペプチド全部、２０〜２５種のペプチドのサブセット、１５〜２０種のペプチドのサブセット、１０〜１５種のペプチドのサブセット、５〜１０種のペプチドのサブセット、または２〜５種のペプチドのサブセットである場合がある。
【００２９】
本開示は、対象におけるピーナッツアレルギー、及び／またはピーナッツアレルギーの重篤度を診断する方法も提供し、本方法は、以下を含む：対象から得られた血清または血漿中の１種または複数のアレルギー関連免疫グロブリン（ＡＡＩ）が、１種または複数のピーナッツペプチドと結合することを可能にするのに十分な条件下、１種または複数のピーナッツペプチドと血清または血漿とを接触させること（ただし、１種または複数のピーナッツペプチドは、固相担体にカップリングされており、１種または複数のＡＡＩペプチド固相担体複合体を形成している）、ＡＡＩ特異的標識化試薬をＡＡＩペプチド固相担体複合体に結合させること、及び、各ＡＡＩペプチド固相担体複合体に対するＡＡＩ特異的標識化試薬の結合を検出して、対象の血清または血漿中のＡＡＩと結合した１種または複数のピーナッツペプチドを同定すること、対象の血清または血漿中のＡＡＩが少なくとも１種のピーナッツペプチドを認識するということは、その対象がピーナッツに対してアレルギーを有することを示す。
【００３０】
実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、ａｒａ  ｈ１アレルゲン（配列番号１）、ａｒａ  ｈ２アレルゲン（配列番号２）、及び／またはａｒａ  ｈ３アレルゲン（配列番号３）に由来する。
【００３１】
実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、以下から選択される：ａｒａ  ｈ１アレルゲンの８位から６６位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、ａｒａ  ｈ１アレルゲンの１０３位から１５２位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、ａｒａ  ｈ１アレルゲンの１７６位から１９５位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、ａｒａ  ｈ２アレルゲンの５位から４０位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、ａｒａ  ｈ３アレルゲンの９３位から１１５位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、ａｒａ  ｈ３アレルゲンの３０位から７５位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、及び／またはａｒａ  ｈ３アレルゲンの１５２位から１６７位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド。
【００３２】
実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号４〜６７のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号７、１３、１６、１７、２５、２７、３０、３６、３９、４５、６５、及び６６のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号３９、４５、及び６６のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号５、６、１０、１３、１４、３４、３６、３９、４０、４２、４９、６１、６５、及び６６のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号５、６、９、３４、３６、３９、及び４０のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号２９、３９、４２、４４、４５、５１、及び６３のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号７、８、２９、３１、３９、４５、及び６１のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号３９及び４０のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号３９のアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号４０のアミノ酸配列を含む。
【００３３】
実施形態によっては、各ピーナッツペプチドは、約３つのアミノ酸〜約６０のアミノ酸、約４つのアミノ酸〜約６０のアミノ酸、約６つのアミノ酸〜約３０のアミノ酸、約７つのアミノ酸〜約２０のアミノ酸、約１０のアミノ酸〜約１６のアミノ酸、または約１０のアミノ酸〜約１５のアミノ酸を含む。実施形態によっては、各ピーナッツペプチドは、１５のアミノ酸を含む。
【００３４】
実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、少なくとも２種のピーナッツペプチド、少なくとも３種のピーナッツペプチド、少なくとも５種のピーナッツペプチド、少なくとも１０種のピーナッツペプチド、少なくとも１５種のピーナッツペプチド、少なくとも２０種のピーナッツペプチド、少なくとも２５種のピーナッツペプチド、少なくとも３０種のピーナッツペプチド、少なくとも３５種のピーナッツペプチド、少なくとも４０種のピーナッツペプチド、少なくとも４５種のピーナッツペプチド、少なくとも５０種のピーナッツペプチド、少なくとも５５種のピーナッツペプチド、少なくとも６０種のピーナッツペプチド、または少なくとも６４種のピーナッツペプチドを含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、約２〜約６４種のピーナッツペプチド、約２〜約６０種のピーナッツペプチド、約２〜約５５種のピーナッツペプチド、約２〜約５０種のピーナッツペプチド、約２〜約４５種のピーナッツペプチド、約２〜約４０種のピーナッツペプチド、約２〜約３５種のピーナッツペプチド、約２〜約３０種のピーナッツペプチド、約２〜約２５種のピーナッツペプチド、約２〜約２０種のピーナッツペプチド、約２〜約１５種のピーナッツペプチド、または約２〜約１０種のピーナッツペプチドを含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、約２〜約６４種のピーナッツペプチド、約５〜約６４種のピーナッツペプチド、約１０〜約６４種のピーナッツペプチド、約１５〜約６４種のピーナッツペプチド、約２０〜約６４種のピーナッツペプチド、約２５〜約６４種のピーナッツペプチド、約３０〜約６４種のピーナッツペプチド、約３５〜約６４種のピーナッツペプチド、約４０〜約６４種のピーナッツペプチド、約４５〜約６４種のピーナッツペプチド、約５０〜約６４種のピーナッツペプチド、または約５５〜約６４種のピーナッツペプチドを含む。
【００３５】
実施形態によっては、対象がピーナッツに対してアレルギーを有するという判定は、さらに、以下の１つまたは複数の結果を考慮に入れる：全ピーナッツ特異的ＩｇＥ（ｓＩｇＥ）、ピーナッツ構成要素ａｒａ  ｈ１に対するＩｇＥ、ピーナッツ構成要素ａｒａ  ｈ２に対するＩｇＥ、ピーナッツ構成要素ａｒａ  ｈ３に対するＩｇＥ、全ピーナッツ特異的ＩｇＧ４（ｓＩｇＧ４）、ピーナッツ構成要素ａｒａ  ｈ１に対するＩｇＧ４、ピーナッツ構成要素ａｒａ  ｈ２に対するＩｇＧ４、ピーナッツ構成要素ａｒａ  ｈ３に対するＩｇＧ４、皮膚プリックテスト結果、臨床歴もしくは家族歴、及び／または患者もしくは臨床医質問票からのデータ。実施形態によっては、対象がピーナッツに対してアレルギーを有するという判定は、さらに、以下の１つまたは複数の結果を考慮に入れる：ピーナッツ構成要素ａｒａ  ｈ１に対するＩｇＥ、ピーナッツ構成要素ａｒａ  ｈ２に対するＩｇＥ、及び／またはピーナッツ構成要素ａｒａ  ｈ３に対するＩｇＥ。
【００３６】
実施形態によっては、ピーナッツ構成要素ａｒａ  ｈ１に対するＩｇＥの結果は、配列番号７、１３、１６、１７、２５、２７、３０、及び３６から選択されるアミノ酸配列、または配列番号５、６、１０、１３、１４、３４、及び３６から選択されるアミノ酸配列、または配列番号５、６、９、３４、及び３６から選択されるアミノ酸配列、または配列番号７、８、２９、及び３１から選択されるアミノ酸配列、または配列番号２９から選択されるアミノ酸配列を含むピーナッツペプチドでの結果を含み、ピーナッツ構成要素ａｒａ  ｈ２に対するＩｇＥの結果は、配列番号３９から選択されるアミノ酸配列、または配列番号３９、４０、４２、及び４９から選択されるアミノ酸配列、または配列番号３９及び４０から選択されるアミノ酸配列、または配列番号３９、４２、４４、４５、及び５１から選択されるアミノ酸配列、または配列番号３９及び４５から選択されるアミノ酸配列、または配列番号３９及び４０から選択されるアミノ酸配列、または配列番号４０から選択されるアミノ酸配列を含むピーナッツペプチドでの結果を含み、及び／またはピーナッツ構成要素ａｒａ  ｈ３に対するＩｇＥの結果は、配列番号６５から選択されるアミノ酸配列、または配列番号６１、６５、及び６６から選択されるアミノ酸配列、または配列番号６３から選択されるアミノ酸配列、または配列番号６１から選択されるアミノ酸配列を含むピーナッツペプチドでの結果を含む。
【００３７】
実施形態によっては、対象がピーナッツに対してアレルギーを有するという判定は、さらに、以下の１つまたは複数の結果を考慮に入れる：配列番号３９のアミノ酸配列を含むピーナッツペプチドに対するＩｇＥ、配列番号４５のアミノ酸配列を含むピーナッツペプチドに対するＩｇＧ４、及び配列番号６６のアミノ酸配列を含むピーナッツペプチドに対するＩｇＧ４、配列番号３９のアミノ酸配列を含むピーナッツペプチドに対するＩｇＥ、配列番号４５のアミノ酸配列を含むピーナッツペプチドに対するＩｇＧ４、及び皮膚プリックテスト、配列番号３９のアミノ酸配列を含むピーナッツペプチドに対するＩｇＥ、配列番号４５のアミノ酸配列を含むピーナッツペプチドに対するＩｇＧ４、配列番号６６のアミノ酸配列を含むピーナッツペプチドに対するＩｇＧ４、及びｓＩｇＥ、ならびに配列番号３９のアミノ酸配列を含むピーナッツペプチドに対するＩｇＥ、配列番号４５のアミノ酸配列を含むピーナッツペプチドに対するＩｇＧ４、配列番号６６のアミノ酸配列を含むピーナッツペプチドに対するＩｇＧ４、及びピーナッツ構成要素ａｒａ  ｈ２。
【００３８】
実施形態によっては、対象がピーナッツに対してアレルギーを有するという判定は、以下を含む：対象のｓＩｇＥが≧０．０３ｋＵＡ／Ｌであるか、それとも＜０．０３ｋＵＡ／Ｌであるかを特定すること（≧０．０３ｋＵＡ／Ｌは、対象がピーナッツに対してアレルギーを有する可能性があることを示し、＜０．０３ｋＵＡ／Ｌは、対象がピーナッツに対してアレルギーを有さないことを示す）、及び、対象のｓＩｇＥが≧０．０３ｋＵＡ／Ｌである場合に、配列番号３９のアミノ酸配列を含むピーナッツペプチドに対するＩｇＥ、配列番号４５のアミノ酸配列を含むピーナッツペプチドに対するＩｇＧ４、及び配列番号６６のアミノ酸配列を含むピーナッツペプチドに対するＩｇＧ４の組み合わせが＜０．２０であるか、それとも≧０．２０であるかを特定すること（＜０．２０は、対象がピーナッツに対してアレルギーを有さないことを示し、≧０．２０は、対象がピーナッツに対してアレルギーを有することを示す）。
【００３９】
実施形態によっては、対象がピーナッツに対してアレルギーを有するかどうかを判定するときに、皮膚プリックテスト（ＳＰＴ）も考慮に入れる。例えば、単一閾値テストにおいて、ｓＩｇＥ≦０．１０、またはＳＰＴ≦Ｔ１、またはｈ２．００８≦０．８、またはｈ２．０ｌ０≦Ｔ２ならば、対象はアレルギーを有さない、そうでなければ、対象はアレルギーを有する。二重閾値テストにおいて、ｓＩｇＥ≦０．１０、またはＳＰＴ≦Ｔ１、またはｈ２．００８≦０．８、またはｈ２．０ｌ０≦Ｔ２ならば、対象はアレルギーを有さない、そうでない場合、ｈ２．０ｌ０≧Ｔ３ならば、対象はアレルギーを有する。Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３は、様々な閾値である。これらの閾値は、アルゴリズムの一部として利用者が選択するものであり、ＡＵＣ、ＮＰＶ、及びＰＰＶなどの測定基準が最良の成績を与える場合に基づいて評価される。
【００４０】
実施形態によっては、ピーナッツペプチドはそれぞれ、固相担体とカップリングするためのリンカーを有する。実施形態によっては、リンカーは、−ＰＥＧ１２−ビオチンである。実施形態によっては、リンカーは、３、６、９、または１２個の炭素を含むことができる。実施形態によっては、ビオチンは、クリックケミストリーリンカー（例えば、アジド−ＤＢＣＯ、アミン−ＮＨＳエステル、チオール−マレイミド、ヒドラゾンなど）で置き換えることができる。
【００４１】
実施形態によっては、固相担体は、微粒子ビーズ、ガラスアレイ、シリコーンアレイ、膜、またはマイクロタイタープレートである。実施形態によっては、ビーズ、マイクロタイタープレート壁、またはクロマトグラフィー材料の離散した位置など、各固相担体は、単一ペプチドにより占有されている。次いで、対象から得られた血清または血漿中の抗ペプチドＡＡＩ（もし存在するならば）と各固相担体上または固相担体の離散した位置上のペプチドとの特異的結合に適切な条件下、固相担体を、血清または血漿と接触させて、固相担体上でペプチドＡＡＩ複合体を形成させる。次いで、各固相担体上または固相担体の離散した位置上の複合体を、複合体と特異的に、典型的には固定された血清または血漿ＡＡＩ抗体と結合することにより、結合する標識化試薬と接触させて、固相担体上で形成されたあらゆるペプチドＡＡＩ複合体を検出する。全ての複合体を普遍的に検出する単一標識試薬が、一般的に、使用されることになる。そうすると、特定のペプチドＡＡＩ複合体を、その複合体のマイクロタイタープレート上またはクロマトグラフィー担体上の位置により同定することができる。各ペプチドが結合した固相担体が異なるスペクトル特性を有する場合、特定のペプチドＡＡＩ複合体は、いったん複合体と結合した標識化試薬の検出可能なシグナルを介して複合体の存在が同定されてしまうと、ペプチドＡＡＩ複合体を伴う固相担体のスペクトル特性を分析することによっても同定することができる。例として、マイクロタイタープレートの各ウェルにおけるペプチドＡＡＩ複合体の有無は、複合体が、レポーター部分、例えば、蛍光色素、発色性色素、酵素標識、または放射性標識などと結合した抗ヒトＡＡＩ抗体と結合することにより特定可能である。あるいは、抗ヒトＡＡＩ抗体は、直接には検出可能ではないレポーター部分と結合している場合があり、そのため第二の直接検出可能なレポーター部分が標識化試薬と特異的に結合することが、結合分析に必要である。
【００４２】
実施形態によっては、ＡＡＩは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、及び／またはＩｇＥである。実施形態によっては、ＩｇＧは、ＩｇＧ４である。
実施形態によっては、ＡＡＩ特異的標識化試薬は、検出可能に標識された抗ヒトＩｇＧ４抗体、検出可能に標識された抗ヒトＩｇＭ抗体、検出可能に標識された抗ヒトＩｇＡ抗体、及び／または検出可能に標識された抗ヒトＩｇＥ抗体である。実施形態によっては、検出可能な標識は、フィコエリトリン、蛍光色素、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、及びアルカリホスファターゼから選択される。実施形態によっては、標識化試薬は、直接検出可能な第一レポーター部分、例えば、蛍光色素、放射標識、または有色色素と結合している場合がある。実施形態によっては、フィコエリトリン（ＰＥ）分子を、抗アレルギー関連免疫グロブリンに直接カップリングさせて、検出に使用することができる。あるいは、第一レポーター部分は、間接的に検出可能（例えば、発色性色素の酵素標識）なレポーター部分の場合があり、第一レポーター部分に特異的な結合パートナーを、直接検出可能な標識に結合させることができる（第二レポーター部分）。例えば、ビオチン結合抗ＡＡＩ抗体を、ビオチン結合抗ＡＡＩ検出のためのストレプトアビジン結合蛍光色素と組み合わせて使用することができる。実施形態によっては、検出可能な標識は、銀染色、量子ドット、または屈折手法を介して観察することができる。
【００４３】
実施形態によっては、各ＡＡＩペプチド固相担体複合体に対するＡＡＩ特異的標識化試薬の結合の検出は、フローサイトメトリー分析用の多重ペプチドビーズアッセイまたはラテラルフローアッセイにより行われる。上述の実施形態のどれでも、マイクロアレイ免疫アッセイの形式であることができ、この場合、複数のアレルゲンエピトープ含有ペプチドのそれぞれが、マイクロタイタープレートの別個のウェルに結合されていて、血清と反応してＡＡＩと結合する。結合したＡＡＩは、ＡＡＩ特異的標識化試薬、例えば、蛍光標識などのレポーター部分と結合した抗ＡＡＩ抗体などとの結合により検出される。結合した標識化試薬の蛍光は、血清または血漿中に、ウェルと結合したペプチドに含まれるアレルゲンエピトープに対する抗体が存在することを示す。複数のアレルゲンエピトープ含有ペプチドを、ラテラルフロー免疫アッセイフォーマットで使用することもでき、この場合、各ペプチドは、多孔性またはクロマトグラフィー担体の離散した領域に固定されていて、ＡＡＩをペプチドと結合させるために、血清または血漿を、担体を通過させることにより、ペプチドと接触させる。このアッセイでは、ＡＡＩ特異的標識化試薬は、抗ＡＡＩ抗体と結合した発色団または色素を含むことができる。標識化試薬を複合体に結合させるため、標識化試薬も、担体を通過させることにより、ペプチドＡＡＩ複合体と接触させ、これにより、血清または血漿中に、担体の各離散場所に固定されたペプチドに含まれるアレルゲンエピトープに対する抗体が存在するかどうかが示される。
【００４４】
上述の実施形態のどれでも、フローサイトメトリーアッセイの形式であることもでき、この場合、各アレルゲンエピトープ含有ペプチドは、フローサイトメトリーによる分析に適切な別個に同定可能な固相担体、例えばビーズと結合している。典型的には、ペプチドは、固相担体上のペプチド特異的捕捉抗体に結合することにより、または固相担体との化学結合により、固相担体と結合している。実施形態によっては、アレルゲンエピトープ含有ペプチドが結合したビーズを、対象の血清または血漿と接触させて、ペプチドを介してビーズに結合するあらゆるペプチド特異的ＡＡＩを結合させ、そうして、ビーズ上にペプチドＡＡＩ複合体を形成させる。例えば、蛍光レポーター部分などを有するＡＡＩ特異的標識化試薬を、次いで、ペプチドＡＡＩ複合体と結合させ、フローサイトメトリーによりビーズを定量または定性分析する。これにより、アレルゲンエピトープ含有ペプチドが結合した各ビーズに付随する結合した標識化試薬からの蛍光が検出され、それにより、ペプチド及びそれに対して反応するＡＡＩが血清中に存在することが同定される。複数のアレルゲンエピトープ含有ペプチドのうち少なくとも１種に対して反応するＡＡＩの存在は、対象がピーナッツに対してアレルギーを有することを示し、反応性ペプチドの数の経時的変化または１種または複数のペプチドに対して反応するＡＡＩの濃度の経時的変化は、その期間にわたる、アレルギー強度の上昇、アレルギー強度の低下、または臨床的耐性の獲得を示す。
【００４５】
実施形態によっては、フローサイトメトリーアッセイは、ＬＵＭＩＮＥＸ  ｘＭＡＰ技術など、ペプチド及びタンパク質の定量及び検出に微粒子アレイプラットフォームを使用する多重アッセイの場合がある。複数のアレルゲンエピトープ含有ペプチドのそれぞれは、異なるスペクトル特性を持つビーズのセットに結合されていて、このセットを用いて、フローサイトメトリーにより、付随するアレルゲンエピトープ含有ペプチドを同定することができる。次いで、ビーズのセットを、対象の血清または血漿と接触させて、ペプチド認識ＡＡＩを各ビーズと結合させ、ビーズ上にペプチドＡＡＩ複合体を形成させ、そして、例えば、蛍光レポーター部分を有するＡＡＩ特異的標識化試薬を、複合体のＡＡＩに結合させる。各ビーズのスペクトル特性及び結合した標識化試薬から出る付随する蛍光量をモニタリングすることにより、ビーズを分析する。このプロセスにより、ビーズ上のペプチドの同定、及びそれに対して反応する血清または血漿ＡＡＩの有無の同定が可能になる。アッセイ結果は、本明細書中記載されるとおりに解釈される。
【００４６】
本明細書中記載される方法のどれにおいても使用するのに特に有用な定量アッセイは、フローサイトメトリー分析用の多重ペプチドビーズアッセイ、例えば、ＬＵＭＩＮＥＸ  ｅｘＭＡＰ多重ビーズアッセイであり、これは、ＥＬＩＳＡの代替高処理アッセイである。このアッセイでは、識別可能な割合の赤色及び近赤外フルオロフォアで染色されたポリスチレンビーズ（微粒子）が、固相担体として使用される。ペプチドは、ビーズと化学結合している、またはビーズにコーティングされたペプチド特異的捕捉抗体を通じてそこに結合していることができる。フルオロフォアの割合は、デジタルシグナル処理を用いてフローサイトメーターにより同定可能な各ビーズ集団の「スペクトル上のアドレス」を定義する。第三の蛍光色の検出は、ビーズに結合した標識化試薬のレポーター部分の蛍光強度の測定に使用される。特定の「スペクトル上のアドレス」を有するビーズに各ペプチドが結合することにより、複数の分析物を同時に検出することができる。ビーズを、ビーズに結合したペプチドに対して特異的なＡＡＩを含有する血清または血漿と接触させた後、レポーター部分を結合させた抗ヒトＡＡＩ抗体を加える。実施形態によっては、抗ヒトＡＡＩのレポーター部分はビオチンであり、フィコエリトリン（ＰＥ）結合ストレプトアビジンとの結合により、検出用の蛍光シグナルがもたらされる。標識化試薬の結合後、ビーズは、デュアルレーザー流動系検出装置、例えば、ＬＵＭＩＮＥＸ２００またはＢｉｏ−Ｒａｄ  ＢＩＯ−ＰＬＥＸ分析器で分析する。第一のレーザーは、ビーズを分類し、それに結合したペプチドを同定する。第二のレーザーは、レポーター由来シグナルの大きさを特定し、この大きさは、結合した血清または血漿ＡＡＩの量に正比例する。
【００４７】
代替アッセイフォーマットは、ラテラルフローまたは免疫クロマトグラフィーアッセイである。そうしたアッセイでは、選択されたアレルゲンエピトープ含有ペプチド（複数可）が、多孔性担体に固定され、ＡＡＩを含有する血清または血漿は、通り抜けによりペプチド（複数可）と接触して、免疫複合体を形成する。免疫複合体は、多孔性担体を通ってさらに移動することにより、適切な検出試薬を用いた免疫複合体検出用の特異的捕捉試薬と接触する。
【００４８】
実施形態によっては、ピーナッツアレルゲンへの曝露後、少なくとも１種のペプチドが、血清または血漿ＡＡＩと中等度または高度に反応性であり（Ｓ／Ｎ＞２）、反応性ペプチドのうち１種または複数の反応性が、約６ヶ月の間少なくとも２倍より減少しない場合、対象は、ピーナッツアレルギーを有すると診断される。
【００４９】
実施形態によっては、ピーナッツアレルギーの診断法は、定性的方法である（すなわち、選択されたペプチドそれぞれに対して反応するＡＡＩの有無にのみ基づく）。選択されたペプチドのいずれかに対して中等度または高度に反応するＡＡＩの存在は、ある度合いのピーナッツアレルギーを示すと見なすことができるが、ただし、その反応性は、短期間、例えば約６ヶ月の間に実質的に減少しないものである。本方法は、半定量的である場合もある（すなわち、対象の血清または血漿に反応するペプチドの数が多いほど、相対的にアレルギー強度も高くなり、その反対に、反応性ペプチドの数が少ないほど、相対的にアレルギー強度が低くなる）。５〜１５種のペプチドに対する血清または血漿反応性は、軽度〜中等度のピーナッツアレルギーを示す可能性があり、この範囲内で下限にある反応性は、一般に、軽度ピーナッツアレルギーと特性決定される。１６〜３０、１６〜２５、１６〜２０、１６〜１８、または６４種全てのペプチドに対する血清反応性は、中等度〜重度ピーナッツアレルギーを示す可能性があり、この範囲内で下限にある反応性は、一般に、中等度ピーナッツアレルギーと特性決定される。中間範囲で、１０〜２０、１２〜１８、または１４〜１６種のペプチドに対する血清反応性は、一般に、中等度ピーナッツアレルギーを示すと見なすことができる。これらのペプチドの特に有用な特性として、非アレルギー性個体の血清または血漿に対しては、一般に約８〜１０種以下のペプチドしか反応性が高くなく（Ｓ／Ｎ＞１０）、したがって、本診断アッセイの結果に従来のアッセイよりも高い信頼性をもたらす。
【００５０】
実施形態によっては、個別のピーナッツペプチドとの結合を分析するため、血清または血漿中のＡＡＩによるペプチドの認識は、結合の値が≧０．１、≧０．２、または≧０．３であるならば有意であるとする。
【００５１】
実施形態によっては、ピーナッツアレルギーの診断法は、定量的方法である（選択されたペプチドそれぞれに対するＡＡＩの反応性のレベルの定量に基づく）。実施形態によっては、反応性のレベルは、ペプチドＡＡＩ複合体に結合した標識化試薬の量と相関し、レポーター部分からのシグナルレベルが高いほど、血清または血漿中の特定ペプチド特異的ＡＡＩ濃度が高いことを示す。特定ペプチドＡＡＩ複合体に結合したレポーター部分の量または濃度を得るにあたり、蛍光色素から出る蛍光の量、有色もしくは発色性色素から出るまたは酵素標識から出る呈色の強度、あるいは放射性標識から出る放射能の量は、複合体中の結合したＡＡＩの量、したがって、その濃度と正の相関にある。これらのパラメーターを測定する方法は、当該分野で既知である。ペプチドのいずれかと反応するＡＡＩの相対量は、ピーナッツアレルギーの程度または強度を示すと見なすことができる。すなわち、複数の選択されたペプチド、または選択されたペプチド内の１種または複数のペプチドの反応性のレベルが高いほど、アレルギーは強くなる。逆に、複数の選択されたペプチド、または選択されたペプチド内の１種または複数のペプチドの反応性のレベルが低いほど、アレルギーは弱くなる。
【００５２】
軽度アレルギーを有する個体の血清または血漿は、より強いアレルギーを有する個体の血清または血漿よりも少ないペプチドと反応する。したがって、本開示は、ピーナッツアレルギーを診断する方法を提供するだけでなく、アレルギー強度を特定する方法、及びピーナッツに対する臨床的耐性の獲得の検出も含めて経時的なアレルギー強度の変化を特定する方法も提供する。
【００５３】
実施形態によっては、アレルギー性対象の血清または血漿と反応するアレルゲンエピトープ含有ペプチドの数は、アレルギー反応の強度と正の相関を有する、すなわち、反応するペプチドの数が少ないほどピーナッツに対するアレルギー反応は軽くなり、反応するペプチドの数が多いほどピーナッツに対するアレルギーはより高くなる。実施形態によっては、ペプチドに対する血清ＩｇＥの結合の強度（例えば、血清または血漿中のＩｇＥ濃度の測定）は、アレルギー反応の強度と相関する（すなわち、全ペプチドに対して、または全ペプチドの中のサブセットに対して反応性が弱いほど、全ペプチドに対する、またはペプチドのサブセットに対する反応性が強い場合に比べて、アレルギー反応がより中等度であることを示す）。
【００５４】
これまで知られていた、ピーナッツタンパク質中のペプチドエピトープの分析に基づくピーナッツアレルギーのアッセイは、エピトープに対するＩｇＥ及びＩｇＧ４の結合の相対的親和性の分析に依存する競合免疫アッセイである。抗体結合の親和性は、対象がピーナッツに対する臨床的耐性を獲得するかどうかと関係すると考えられている。対照的に、実施形態によっては、本明細書中記載される方法は、ピーナッツタンパク質エピトープのセット中の個別ペプチドそれぞれに対するＡＡＩ結合の有無を分析することに、部分的に基づいており、このＡＡＩ結合は、対象の血清または血漿中のＩｇＥが結合するエピトープ（すなわち、ペプチド）の数に基づく、ピーナッツアレルギーの診断、アレルギー反応の強度、及び患者が耐性を獲得するかアレルギー反応の上昇を経験するかいずれかの可能性と相関する。実施形態によっては、本明細書中記載される方法は、アレルゲンエピトープ含有ペプチドのそれぞれと反応するＡＡＩの血清または血漿中の濃度の分析に、部分的に基づいており、このＡＡＩの濃度も、アレルギー反応の強度と相関する。
【００５５】
本明細書中使用される場合、アレルゲンエピトープ含有ペプチドに対して「非反応性」または「陰性の」反応性という言及は、アッセイにおける信号対雑音比（Ｓ／Ｎ）が約２未満であることを意味する。典型的なバックグラウンドシグナル（Ｎ）は、非アレルゲン性個体由来の血清または血漿のプールにより作成される。あるいは、陰性ペプチドを、バックグラウンドシグナルを確立する基準として使用することができる。本明細書中使用される場合、アレルゲンエピトープ含有ペプチドに対して「弱い」または「中等度の」反応性という言及は、Ｓ／Ｎが約２〜１０であることを意味するが、この値は、ペプチド及びアレルギーに応じて変わる可能性がある。本明細書中使用される場合、アレルゲンエピトープ含有ペプチドに対して「高い」または「強い」反応性という言及は、Ｓ／Ｎが約１０超であることを意味する。
【００５６】
ピーナッツアレルギーまたはそれに対する耐性の診断法に有用な、及びアレルギーの強度の増減の検出法に有用なペプチドには、ピーナッツタンパク質の非反応性エピトープを含むペプチドも含まれる。これらのペプチドは、陰性対照として有用である。
【００５７】
実施形態によっては、各ペプチドＡＡＩ複合体に対する標識化試薬の結合の分析は、結合の程度の分析を含む場合があり、結合の程度は、血清または血漿中の各ペプチド特異的ＡＡＩの濃度を示す。全てのペプチド、またはそのサブセットに対する血清または血漿の反応性が低〜中程度であることは、血清中のペプチド特異的ＡＡＩの濃度がより低く、軽度〜中等度のピーナッツアレルギーであることを示し、全てのペプチド、またはそのサブセットに対する血清または血漿の反応性が高いことは、血清中のペプチド特異的ＡＡＩの濃度がより高く、ピーナッツアレルギーがより重度であることを示す。ピーナッツアレルギーを診断するための結合分析は、血清または血漿と反応するペプチドの数と、ペプチドとの血清または血漿ＡＡＩの結合の程度の、一方または両方を用いる場合がある。
【００５８】
本開示は、ピーナッツに対してアレルギーを有する対象において、ピーナッツに対する臨床的耐性の獲得を検出する方法も提供し、本方法は、以下を含む：対象から得られた血清または血漿中の１種または複数のアレルギー関連免疫グロブリン（ＡＡＩ）が、１種または複数のピーナッツペプチドと結合することを可能にするのに十分な条件下、１種または複数のピーナッツペプチドと血清または血漿とを接触させること（ただし、１種または複数のピーナッツペプチドは、固相担体にカップリングされており、１種または複数のＡＡＩペプチド固相担体複合体を形成している）、ＡＡＩ特異的標識化試薬をＡＡＩペプチド固相担体複合体に結合させること、各ＡＡＩペプチド固相担体複合体に対するＡＡＩ特異的標識化試薬の結合を検出して、対象の血清または血漿中のＡＡＩと結合した１種または複数のピーナッツペプチドを同定すること、及び、対象の血清または血漿中のＡＡＩと結合した１種または複数のピーナッツペプチドで同定されたもの、または対象の血清または血漿中のＡＡＩの濃度を、対象の血清または血漿中のＡＡＩと結合した１種または複数のピーナッツペプチドの先行して同定されたパネル、または対象の血清または血漿中のＡＡＩの先行する濃度と比較すること（以下の場合に、ピーナッツに対する臨床的耐性の獲得が、示されている：対象の血清または血漿中のＩｇＥ  ＡＡＩにより認識されるピーナッツペプチドの後続の数、及び／または対象の血清または血漿中のＡＡＩ  ＩｇＥの後続の濃度が、対象の血清または血漿中のＡＡＩ  ＩｇＥにより認識されるピーナッツペプチドの先行して同定された数より少ない、及び／または対象の血清または血漿中のＡＡＩ  ＩｇＥの先行する濃度より低い場合、及び／または対象の血清または血漿中のＩｇＧ４  ＡＡＩにより認識されるピーナッツペプチドの後続の数、及び／または対象の血清または血漿中のＡＡＩ  ＩｇＧ４の後続の濃度が、対象の血清または血漿中のＡＡＩ  ＩｇＧ４により認識されるピーナッツペプチドの先行して同定された数より多い、及び／または対象の血清または血漿中のＡＡＩ  ＩｇＧ４の先行する濃度より高い場合）。
【００５９】
実施形態によっては、パネル同定を受ける対象の年齢（例えば、初期、その後の任意の時点、及び／または最終時）は、約２歳〜約５０歳が可能である。
実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、本明細書中記載されるとおりである。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、ａｒａ  ｈ１アレルゲン（配列番号１）、ａｒａ  ｈ２アレルゲン（配列番号２）、及び／またはａｒａ  ｈ３アレルゲン（配列番号３）に由来する少なくとも２種のペプチドを含む。
【００６０】
実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、以下から選択される：ａｒａ  ｈ１アレルゲンの８位から６６位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、ａｒａ  ｈ１アレルゲンの１０３位から１５２位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、ａｒａ  ｈ１アレルゲンの１７６位から１９５位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、ａｒａ  ｈ２アレルゲンの５位から４０位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、ａｒａ  ｈ３アレルゲンの９３位から１１５位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、ａｒａ  ｈ３アレルゲンの３０位から７５位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、及び／またはａｒａ  ｈ３アレルゲンの１５２位から１６７位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド。
【００６１】
実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号４〜６７のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号７、１３、１６、１７、２５、２７、３０、３６、３９、４５、６５、及び６６のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号３９、４５、及び６６のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号５、６、１０、１３、１４、３４、３６、３９、４０、４２、４９、６１、６５、及び６６のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号５、６、９、３４、３６、３９、及び４０のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号２９、３９、４２、４４、４５、５１、及び６３のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号７、８、２９、３１、３９、４５、及び６１のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号３９及び４０のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号３９のアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号４０のアミノ酸配列を含む。
【００６２】
実施形態によっては、各ピーナッツペプチドは、約３つのアミノ酸〜約６０のアミノ酸、約４つのアミノ酸〜約６０のアミノ酸、約６つのアミノ酸〜約３０のアミノ酸、約７つのアミノ酸〜約２０のアミノ酸、約１０のアミノ酸〜約１６のアミノ酸、または約１０のアミノ酸〜約１５のアミノ酸を含む。実施形態によっては、各ピーナッツペプチドは、１５のアミノ酸を含む。
【００６３】
実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、少なくとも２種のピーナッツペプチド、少なくとも３種のピーナッツペプチド、少なくとも５種のピーナッツペプチド、少なくとも１０種のピーナッツペプチド、少なくとも１５種のピーナッツペプチド、少なくとも２０種のピーナッツペプチド、少なくとも２５種のピーナッツペプチド、少なくとも３０種のピーナッツペプチド、少なくとも３５種のピーナッツペプチド、少なくとも４０種のピーナッツペプチド、少なくとも４５種のピーナッツペプチド、少なくとも５０種のピーナッツペプチド、少なくとも５５種のピーナッツペプチド、少なくとも６０種のピーナッツペプチド、または少なくとも６４種のピーナッツペプチドを含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、約２〜約６４種のピーナッツペプチド、約２〜約６０種のピーナッツペプチド、約２〜約５５種のピーナッツペプチド、約２〜約５０種のピーナッツペプチド、約２〜約４５種のピーナッツペプチド、約２〜約４０種のピーナッツペプチド、約２〜約３５種のピーナッツペプチド、約２〜約３０種のピーナッツペプチド、約２〜約２５種のピーナッツペプチド、約２〜約２０種のピーナッツペプチド、約２〜約１５種のピーナッツペプチド、または約２〜約１０種のピーナッツペプチドを含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、約２〜約６４種のピーナッツペプチド、約５〜約６４種のピーナッツペプチド、約１０〜約６４種のピーナッツペプチド、約１５〜約６４種のピーナッツペプチド、約２０〜約６４種のピーナッツペプチド、約２５〜約６４種のピーナッツペプチド、約３０〜約６４種のピーナッツペプチド、約３５〜約６４種のピーナッツペプチド、約４０〜約６４種のピーナッツペプチド、約４５〜約６４種のピーナッツペプチド、約５０〜約６４種のピーナッツペプチド、または約５５〜約６４種のピーナッツペプチドを含む。
【００６４】
実施形態によっては、対象がピーナッツに対してアレルギーを有するという判定は、さらに、以下の１つまたは複数の結果を考慮に入れる：全ピーナッツ特異的ＩｇＥ（ｓＩｇＥ）、ピーナッツ構成要素ａｒａ  ｈ１に対するＩｇＥ、ピーナッツ構成要素ａｒａ  ｈ２に対するＩｇＥ、ピーナッツ構成要素ａｒａ  ｈ３に対するＩｇＥ、皮膚プリックテスト結果、臨床歴もしくは家族歴、及び／または患者もしくは臨床医質問票からのデータ。
【００６５】
実施形態によっては、ピーナッツペプチドはそれぞれ、固相担体とカップリングするためのリンカーを有する。実施形態によっては、リンカーは、−ＰＥＧ１２−ビオチンである。実施形態によっては、リンカーは、３、６、９、または１２個の炭素を含むことができる。実施形態によっては、ビオチンは、クリックケミストリーリンカー（例えば、アジド−ＤＢＣＯ、アミン−ＮＨＳエステル、チオール−マレイミド、ヒドラゾンなど）で置き換えることができる。実施形態によっては、固相担体は、微粒子ビーズ、ガラスアレイ、シリコーンアレイ、膜、またはマイクロタイタープレートである。実施形態によっては、固相担体は、本明細書中記載されるとおりである。
【００６６】
実施形態によっては、ＡＡＩは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、及び／またはＩｇＥである。実施形態によっては、ＩｇＧは、ＩｇＧ４である。
実施形態によっては、ＡＡＩ特異的標識化試薬は、検出可能に標識された抗ヒトＩｇＧ４抗体、検出可能に標識された抗ヒトＩｇＭ抗体、検出可能に標識された抗ヒトＩｇＡ抗体、及び／または検出可能に標識された抗ヒトＩｇＥ抗体である。実施形態によっては、検出可能な標識は、フィコエリトリン、蛍光色素、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、及びアルカリホスファターゼから選択される。実施形態によっては、検出可能な標識は、銀染色、量子ドット、または屈折手法を介して観察することができる。実施形態によっては、検出可能な標識は、本明細書中記載されるとおりである。
【００６７】
実施形態によっては、各ＡＡＩペプチド固相担体複合体に対するＡＡＩ特異的標識化試薬の結合の検出は、フローサイトメトリー分析用の多重ペプチドビーズアッセイまたはラテラルフローアッセイにより行われる。実施形態によっては、検出アッセイは、本明細書中記載されるとおりである。
【００６８】
本開示は、ピーナッツに対してアレルギーを有する対象において、ピーナッツに対するアレルギーの治療中、経時的に、アレルギーまたは有害事象の強度の上昇を検出する方法も提供し、本方法は、以下を含む：対象から得られた血清または血漿中の１種または複数のアレルギー関連免疫グロブリン（ＡＡＩ）が、１種または複数のピーナッツペプチドと結合することを可能にするのに十分な条件下、１種または複数のピーナッツペプチドと血清または血漿とを接触させること（ただし、１種または複数のピーナッツペプチドは、固相担体にカップリングされており、１種または複数のＡＡＩペプチド固相担体複合体を形成しており、及びただし、１種または複数のピーナッツペプチドは、ａｒａ  ｈ１アレルゲンの８位から６６位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、ａｒａ  ｈ１アレルゲンの１０３位から１５２位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、ａｒａ  ｈ１アレルゲンの１７６位から１９５位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、ａｒａ  ｈ２アレルゲンの５位から４０位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、ａｒａ  ｈ３アレルゲンの９３位から１１５位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、ａｒａ  ｈ３アレルゲンの３０位から７５位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、及び／またはａｒａ  ｈ３アレルゲンの１５２位から１６７位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチドから選択される）、ＡＡＩ特異的標識化試薬をＡＡＩペプチド固相担体複合体に結合させること、各ＡＡＩペプチド固相担体複合体に対するＡＡＩ特異的標識化試薬の結合を検出して、対象の血清または血漿中のＡＡＩと結合した１種または複数のピーナッツペプチドを同定すること、ならびに、対象の血清中のＡＡＩと結合した１種または複数のピーナッツペプチドで同定されたもの、または対象の血清または血漿中のＡＡＩの濃度を、対象の血清または血漿中のＡＡＩと結合した１種または複数のピーナッツペプチドの先行して同定されたパネル、または対象の血清または血漿中のＡＡＩの先行する濃度と比較すること（対象の血清または血漿中のＡＡＩにより認識されるピーナッツペプチドの後続の数もしくは反応性パターン、または対象の血清または血漿中のＡＡＩの後続の濃度が、対象の血清または血漿中のＡＡＩにより認識されるピーナッツペプチドの先行して同定された数もしくは反応性パターンより大きい、または対象の血清または血漿中のＡＡＩの先行する濃度より高い場合に、ピーナッツに対するアレルギー反応の強度の上昇が、示されている）。
【００６９】
実施形態によっては、対象は１種のピーナッツペプチドまたは１つのピーナッツペプチドサブセットから異なるピーナッツペプチドまたはピーナッツペプチドサブセットへと、アレルギー性ピーナッツペプチドの正体の移行（「ホットスポット」への移行−本明細書中記載されるピーナッツエピトープの具体的なサブセットを参照）を起こしている場合があり、これは、治療中にピーナッツアレルギーの強度が上昇するまたは有害事象が存在することを示す場合がある。
【００７０】
実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、本明細書中記載されるとおりである。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号４〜６７のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号７、１３、１６、１７、２５、２７、３０、３６、３９、４５、６５、及び６６のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号３９、４５、及び６６のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号５、６、１０、１３、１４、３４、３６、３９、４０、４２、４９、６１、６５、及び６６のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号５、６、９、３４、３６、３９、及び４０のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号２９、３９、４２、４４、４５、５１、及び６３のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号７、８、２９、３１、３９、４５、及び６１のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号３９及び４０のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号３９のアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号４０のアミノ酸配列を含む。
【００７１】
実施形態によっては、各ピーナッツペプチドは、約３つのアミノ酸〜約６０のアミノ酸、約４つのアミノ酸〜約６０のアミノ酸、約６つのアミノ酸〜約３０のアミノ酸、約７つのアミノ酸〜約２０のアミノ酸、約１０のアミノ酸〜約１６のアミノ酸、または約１０のアミノ酸〜約１５のアミノ酸を含む。実施形態によっては、各ピーナッツペプチドは、１５のアミノ酸を含む。
【００７２】
実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、少なくとも２種のピーナッツペプチド、少なくとも３種のピーナッツペプチド、少なくとも５種のピーナッツペプチド、少なくとも１０種のピーナッツペプチド、少なくとも１５種のピーナッツペプチド、少なくとも２０種のピーナッツペプチド、少なくとも２５種のピーナッツペプチド、少なくとも３０種のピーナッツペプチド、少なくとも３５種のピーナッツペプチド、少なくとも４０種のピーナッツペプチド、少なくとも４５種のピーナッツペプチド、少なくとも５０種のピーナッツペプチド、少なくとも５５種のピーナッツペプチド、少なくとも６０種のピーナッツペプチド、または少なくとも６４種のピーナッツペプチドを含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、約２〜約６４種のピーナッツペプチド、約２〜約６０種のピーナッツペプチド、約２〜約５５種のピーナッツペプチド、約２〜約５０種のピーナッツペプチド、約２〜約４５種のピーナッツペプチド、約２〜約４０種のピーナッツペプチド、約２〜約３５種のピーナッツペプチド、約２〜約３０種のピーナッツペプチド、約２〜約２５種のピーナッツペプチド、約２〜約２０種のピーナッツペプチド、約２〜約１５種のピーナッツペプチド、または約２〜約１０種のピーナッツペプチドを含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、約２〜約６４種のピーナッツペプチド、約５〜約６４種のピーナッツペプチド、約１０〜約６４種のピーナッツペプチド、約１５〜約６４種のピーナッツペプチド、約２０〜約６４種のピーナッツペプチド、約２５〜約６４種のピーナッツペプチド、約３０〜約６４種のピーナッツペプチド、約３５〜約６４種のピーナッツペプチド、約４０〜約６４種のピーナッツペプチド、約４５〜約６４種のピーナッツペプチド、約５０〜約６４種のピーナッツペプチド、または約５５〜約６４種のピーナッツペプチドを含む。
【００７３】
実施形態によっては、対象がピーナッツに対してアレルギーを有するという判定は、さらに、以下の１つまたは複数の結果を考慮に入れる：全ピーナッツ特異的ＩｇＥ（ｓＩｇＥ）、ピーナッツ構成要素ａｒａ  ｈ１に対するＩｇＥ、ピーナッツ構成要素ａｒａ  ｈ２に対するＩｇＥ、ピーナッツ構成要素ａｒａ  ｈ３に対するＩｇＥ、皮膚プリックテスト結果、臨床歴もしくは家族歴、及び／または患者もしくは臨床医質問票からのデータ。
【００７４】
実施形態によっては、ピーナッツペプチドはそれぞれ、固相担体とカップリングするためのリンカーを有する。実施形態によっては、リンカーは、−ＰＥＧ１２−ビオチンである。実施形態によっては、リンカーは、３、６、９、または１２個の炭素を含むことができる。実施形態によっては、ビオチンは、クリックケミストリーリンカー（例えば、アジド−ＤＢＣＯ、アミン−ＮＨＳエステル、チオール−マレイミド、ヒドラゾンなど）で置き換えることができる。実施形態によっては、固相担体は、微粒子ビーズ、ガラスアレイ、シリコーンアレイ、膜、またはマイクロタイタープレートである。実施形態によっては、固相担体は、本明細書中記載されるとおりである。
【００７５】
実施形態によっては、ＡＡＩは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、及び／またはＩｇＥである。実施形態によっては、ＩｇＧは、ＩｇＧ４である。
実施形態によっては、ＡＡＩ特異的標識化試薬は、検出可能に標識された抗ヒトＩｇＧ４抗体、検出可能に標識された抗ヒトＩｇＭ抗体、検出可能に標識された抗ヒトＩｇＡ抗体、及び／または検出可能に標識された抗ヒトＩｇＥ抗体である。実施形態によっては、検出可能な標識は、フィコエリトリン、蛍光色素、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、及びアルカリホスファターゼから選択される。実施形態によっては、検出可能な標識は、銀染色、量子ドット、または屈折手法を介して観察することができる。実施形態によっては、検出可能な標識は、本明細書中記載されるとおりである。
【００７６】
実施形態によっては、各ＡＡＩペプチド固相担体複合体に対するＡＡＩ特異的標識化試薬の結合の検出は、フローサイトメトリー分析用の多重ペプチドビーズアッセイまたはラテラルフローアッセイにより行われる。実施形態によっては、検出アッセイは、本明細書中記載されるとおりである。
【００７７】
固相担体上のペプチドＡＡＩ複合体に対する各ペプチド特異的ＡＡＩの結合度は定量可能であるため、配列番号４〜６７で表されるペプチドの中から選択された複数のペプチドは、ピーナッツアレルギーであると診断された対象において経時的にピーナッツアレルギー強度の上昇を検出する方法または最初に非アレルギー性と診断された対象において経時的にピーナッツアレルギー発症を検出する方法においても有用である。初期アッセイを、本明細書中記載されるとおりの配列番号４〜６７の中から選択された複数のペプチドで行い、反応性ペプチドの初期数または各ペプチド特異的ＡＡＩの初期濃度を得る。初期アッセイの後続の時点で、配列番号４〜６７の中から選択された、初期プロファイルと同一の複数のペプチドで分析を繰り返し、反応性ペプチドの後続の数またはペプチド特異的ＡＡＩの後続の濃度を得る。この方法は、以下のとおり要約することができる：配列番号４〜６７の中から選択された複数のペプチドに対する対象の血清または血漿ＡＡＩ反応性の初期プロファイルを提供すること（この初期プロファイルは、対象の血清または血漿中のＡＡＩにより認識される（ＡＡＩが結合する）ペプチドの初期数または各ペプチドを認識する（各ペプチドと結合する）対象の血清または血漿中のＡＡＩの初期濃度を示す）、初期プロファイルの後続の時点で、血清または血漿中のＡＡＩが各固相担体上のペプチドと結合することを可能にするのに十分な条件下、個別に同定可能な固相担体と結合した同一の複数のペプチドの各ペプチドを、対象由来の血清または血漿と接触させ、ペプチドＡＡＩ複合体を形成させること、ＡＡＩ特異的標識化試薬を複合体に結合させること、及び、各ペプチドＡＡＩ複合体に対する標識化試薬の結合を分析して、対象の血清または血漿中のＡＡＩにより認識されるペプチドの後続の数または選択されたペプチドそれぞれと反応する対象の血清または血漿中のＡＡＩの後続の濃度を同定すること。
【００７８】
アレルギー強度の上昇を検出する方法は、本明細書中記載されるものも含めて、任意の適切なアッセイフォーマットを利用することができる。標識化試薬の結合を分析するのに利用可能な分析の種類の例も、本明細書中記載されるとおりである。初期プロファイルに比べて後続の時点でＡＡＩと反応するペプチドの数が増加すること（初期プロファイルではＡＡＩと反応するペプチドがない状態と比較しての増加も含む）、または初期プロファイルに比べて後続の時点でペプチドのいずれかに対するＡＡＩの結合強度が上昇すること（初期プロファイルでは特定ペプチドに対する結合がない状態から後続の時点では検出可能な結合がある状態への上昇を含む）は、以前にピーナッツアレルギーであると診断された対象におけるピーナッツアレルギー強度の上昇、または以前に非アレルギー性だった対象におけるピーナッツアレルギー発症を示す。本明細書中記載されるとおり、対象の初期プロファイルと後続の時点でのプロファイルの比較を用いて、特定アレルギーにおける対象の重篤度の上昇もしくは耐性の低下を予測する、またはアレルゲンに対する臨床的耐性もしくは自然耐性の獲得の見込みを予測することができる。
【００７９】
本開示は、ピーナッツに対する耐性を誘導するまたはアレルギーをなくすために、乳幼児を１種または複数のピーナッツアレルゲンに感作させる方法も提供し、本方法は、１種または複数のピーナッツペプチドを乳幼児に投与することを含み、ただし、１種または複数のピーナッツペプチドは、ａｒａ  ｈ１アレルゲン（配列番号１）、ａｒａ  ｈ２アレルゲン（配列番号２）、及び／またはａｒａ  ｈ３アレルゲン（配列番号３）に由来するものである。
【００８０】
実施形態によっては、投与（例えば、初期投与、任意の後続投与、及び／または最終投与）を受ける対象の年齢は、約１歳未満、約２歳未満、約３歳未満、約４歳未満、約５歳未満、または約６歳未満が可能である。全ペプチドまたは個別ペプチドの量は、投与１回あたり約１グラム以下が可能である。投与は、経口、舌下、皮内、皮下、吸入、または経皮によることが可能である。
【００８１】
実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、本明細書中記載されるとおりである。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、以下から選択される：ａｒａ  ｈ１アレルゲンの８位から６６位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、ａｒａ  ｈ１アレルゲンの１０３位から１５２位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、ａｒａ  ｈ１アレルゲンの１７６位から１９５位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、ａｒａ  ｈ２アレルゲンの５位から４０位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、ａｒａ  ｈ３アレルゲンの９３位から１１５位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、ａｒａ  ｈ３アレルゲンの３０位から７５位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、及び／またはａｒａ  ｈ３アレルゲンの１５２位から１６７位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド。
【００８２】
実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号４〜６７のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号７、１３、１６、１７、２５、２７、３０、３６、３９、４５、６５、及び６６のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号３９、４５、及び６６のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号５、６、１０、１３、１４、３４、３６、３９、４０、４２、４９、６１、６５、及び６６のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号５、６、９、３４、３６、３９、及び４０のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号２９、３９、４２、４４、４５、５１、及び６３のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号７、８、２９、３１、３９、４５、及び６１のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号３９及び４０のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号３９のアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号４０のアミノ酸配列を含む。
【００８３】
実施形態によっては、各ピーナッツペプチドは、約３つのアミノ酸〜約６０のアミノ酸、約４つのアミノ酸〜約６０のアミノ酸、約６つのアミノ酸〜約３０のアミノ酸、約７つのアミノ酸〜約２０のアミノ酸、約１０のアミノ酸〜約１６のアミノ酸、または約１０のアミノ酸〜約１５のアミノ酸を含む。実施形態によっては、各ピーナッツペプチドは、１５のアミノ酸を含む。
【００８４】
実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、少なくとも２種のピーナッツペプチド、少なくとも３種のピーナッツペプチド、少なくとも５種のピーナッツペプチド、少なくとも１０種のピーナッツペプチド、少なくとも１５種のピーナッツペプチド、少なくとも２０種のピーナッツペプチド、少なくとも２５種のピーナッツペプチド、少なくとも３０種のピーナッツペプチド、少なくとも３５種のピーナッツペプチド、少なくとも４０種のピーナッツペプチド、少なくとも４５種のピーナッツペプチド、少なくとも５０種のピーナッツペプチド、少なくとも５５種のピーナッツペプチド、少なくとも６０種のピーナッツペプチド、または少なくとも６４種のピーナッツペプチドを含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、約２〜約６４種のピーナッツペプチド、約２〜約６０種のピーナッツペプチド、約２〜約５５種のピーナッツペプチド、約２〜約５０種のピーナッツペプチド、約２〜約４５種のピーナッツペプチド、約２〜約４０種のピーナッツペプチド、約２〜約３５種のピーナッツペプチド、約２〜約３０種のピーナッツペプチド、約２〜約２５種のピーナッツペプチド、約２〜約２０種のピーナッツペプチド、約２〜約１５種のピーナッツペプチド、または約２〜約１０種のピーナッツペプチドを含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、約２〜約６４種のピーナッツペプチド、約５〜約６４種のピーナッツペプチド、約１０〜約６４種のピーナッツペプチド、約１５〜約６４種のピーナッツペプチド、約２０〜約６４種のピーナッツペプチド、約２５〜約６４種のピーナッツペプチド、約３０〜約６４種のピーナッツペプチド、約３５〜約６４種のピーナッツペプチド、約４０〜約６４種のピーナッツペプチド、約４５〜約６４種のピーナッツペプチド、約５０〜約６４種のピーナッツペプチド、または約５５〜約６４種のピーナッツペプチドを含む。
【００８５】
実施形態によっては、臨床的耐性の獲得の初期検出を用いて、患者がアレルギーに対して自然耐性を獲得する、または治療に反応するのいずれかであるかどうかを予測することができる。実施形態によっては、アレルギー性対象を、免疫原と接触させて（免疫療法）から、初期プロファイルが分析される。後続の時点で、初期プロファイルにおいてペプチドと高い反応性であった全ＡＡＩの血清濃度に少なくとも２倍の低下が存在するならば、対象は、ピーナッツに対して臨床的または自然耐性のいずれかを獲得する見込みがある。後続の時点で、初期プロファイルにおいてペプチドと高い反応性であった全ＡＡＩよりも少ないＡＡＩの血清濃度に少なくとも２倍の低下が存在するならば、対象は、ピーナッツに対して部分的な臨床的または自然耐性のみを獲得する見込みがある。
【００８６】
配列番号４〜６７で表されるペプチドの中から選択された複数のペプチドは、ピーナッツアレルギーであると診断された対象において、ピーナッツタンパク質に対する臨床的耐性の獲得を検出する方法においても有用である。実施形態によっては、アッセイは、概して、アレルギー強度の上昇の検出について本明細書中記載されるとおりであり、初期の時点で、最初に、配列番号４〜６７の中から選択された複数のペプチドに対する血清または血漿ＡＡＩ反応性の初期プロファイルを確立するために行われる。初期プロファイルは、本明細書中記載されるとおり、選択されたペプチドに対する血清または血漿の反応性の半定量的または定量的分析に基づく。次いで、固相担体に結合させた選択されたペプチドを、初期プロファイルの後続の時点で得られた、対象由来の血清または血漿と接触させ、アッセイを本明細書中記載されるとおりに行い、後続の時点でのピーナッツアレルギー強度を半定量または定量する。初期プロファイルと比較して後続の時点でＡＡＩと反応するペプチドの数が減少、または初期プロファイルと比較して後続の時点でペプチドのいずれかに対するＡＡＩの結合強度が低下、特に少なくとも２倍、減少または低下することは、ピーナッツタンパク質に対する臨床的耐性の獲得を示す。当然のことながら、以前にピーナッツアレルギーであると診断された対象におけるピーナッツタンパク質に対する臨床的耐性の獲得は、初期プロファイルと後続の時点の間の期間にわたる経時的なアレルギー強度の低下も示し、また本方法は、そのような経時的なアレルギー強度の低下の検出及び予測にも使用可能である。
【００８７】
アレルギーを治療するための免疫療法アプローチは、患者を治療及び脱感作するために全タンパク質またはピーナッツ抽出物を使用することに主に焦点を置いてきた。ペプチドは、ピーナッツアレルギーの治療において、より的を絞った、及びより安全なアプローチとなる可能性がある魅力的な代替物である。Ａｒａ  ｈ１、Ａｒａ  ｈ２、及びＡｒａ  ｈ３の重要なＩｇＥ反応領域由来の特定のペプチド（例えば、Ａｒａ  ｈ１：８−６６、Ａｒａ  ｈ２：５−４０、及びＡｒａ  ｈ３：９３−１１５）は、個別に、併用して、または他の治療アプローチと併用してのいずれかで、ピーナッツアレルギーの治療にある種の有用性を有する可能性がある。特定のペプチドは、アレルギーを治療するために、経口、舌下、皮内、皮下、吸入、または経皮経路を介して投与することができる。
【００８８】
本開示は、キットも提供し、本キットは、以下：ａｒａ  ｈ１アレルゲン（配列番号１）、ａｒａ  ｈ２アレルゲン（配列番号２）、及び／またはａｒａ  ｈ３アレルゲン（配列番号３）に由来する１種または複数のアレルゲンエピトープ含有ピーナッツペプチド（各ピーナッツペプチドは固相担体にカップリングされている）、及びアレルギー関連免疫グロブリン（ＡＡＩ）特異的標識化試薬、を含み、これらはまとめてパッケージ化されており、使用説明書も含んでいる。
【００８９】
実施形態によっては、キットは、さらに、結合用緩衝液、洗浄用緩衝液、及び検出用緩衝液のうち１種または複数を含む。実施形態によっては、キットは、さらに、ＡＡＩ特異的標識化試薬に特異的に結合するレポーター部分を含む。
【００９０】
実施形態によっては、キット中の１種または複数のピーナッツペプチドは、以下から選択される：ａｒａ  ｈ１アレルゲンの８位から６６位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、ａｒａ  ｈ１アレルゲンの１０３位から１５２位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、ａｒａ  ｈ１アレルゲンの１７６位から１９５位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、ａｒａ  ｈ２アレルゲンの５位から４０位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、ａｒａ  ｈ３アレルゲンの９３位から１１５位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、ａｒａ  ｈ３アレルゲンの３０位から７５位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド、及び／またはａｒａ  ｈ３アレルゲンの１５２位から１６７位の中の少なくとも３連続するアミノ酸を有するペプチド。
【００９１】
実施形態によっては、キット中の１種または複数のピーナッツペプチドは、本明細書中記載されるとおりである。実施形態によっては、キット中の１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号４〜６７のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号７、１３、１６、１７、２５、２７、３０、３６、３９、４５、６５、及び６６のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号３９、４５、及び６６のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号５、６、１０、１３、１４、３４、３６、３９、４０、４２、４９、６１、６５、及び６６のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号５、６、９、３４、３６、３９、及び４０のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号２９、３９、４２、４４、４５、５１、及び６３のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号７、８、２９、３１、３９、４５、及び６１のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号３９及び４０のうちの任意の１種または複数から選択されるアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号３９のアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、配列番号４０のアミノ酸配列を含む。
【００９２】
実施形態によっては、キット中の各ピーナッツペプチドは、約３つのアミノ酸〜約６０のアミノ酸、約４つのアミノ酸〜約６０のアミノ酸、約６つのアミノ酸〜約３０のアミノ酸、約７つのアミノ酸〜約２０のアミノ酸、約１０のアミノ酸〜約１６のアミノ酸、約１０のアミノ酸〜約１５のアミノ酸を含む。実施形態によっては、各ピーナッツペプチドは、１５のアミノ酸を含む。
【００９３】
実施形態によっては、キット中の１種または複数のピーナッツペプチドは、少なくとも２種のピーナッツペプチド、少なくとも３種のピーナッツペプチド、少なくとも５種のピーナッツペプチド、少なくとも１０種のピーナッツペプチド、少なくとも１５種のピーナッツペプチド、少なくとも２０種のピーナッツペプチド、少なくとも２５種のピーナッツペプチド、少なくとも３０種のピーナッツペプチド、少なくとも３５種のピーナッツペプチド、少なくとも４０種のピーナッツペプチド、少なくとも４５種のピーナッツペプチド、少なくとも５０種のピーナッツペプチド、少なくとも５５種のピーナッツペプチド、少なくとも６０種のピーナッツペプチド、または少なくとも６４種のピーナッツペプチドを含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、約２〜約６４種のピーナッツペプチド、約２〜約６０種のピーナッツペプチド、約２〜約５５種のピーナッツペプチド、約２〜約５０種のピーナッツペプチド、約２〜約４５種のピーナッツペプチド、約２〜約４０種のピーナッツペプチド、約２〜約３５種のピーナッツペプチド、約２〜約３０種のピーナッツペプチド、約２〜約２５種のピーナッツペプチド、約２〜約２０種のピーナッツペプチド、約２〜約１５種のピーナッツペプチド、または約２〜約１０種のピーナッツペプチドを含む。実施形態によっては、１種または複数のピーナッツペプチドは、約２〜約６４種のピーナッツペプチド、約５〜約６４種のピーナッツペプチド、約１０〜約６４種のピーナッツペプチド、約１５〜約６４種のピーナッツペプチド、約２０〜約６４種のピーナッツペプチド、約２５〜約６４種のピーナッツペプチド、約３０〜約６４種のピーナッツペプチド、約３５〜約６４種のピーナッツペプチド、約４０〜約６４種のピーナッツペプチド、約４５〜約６４種のピーナッツペプチド、約５０〜約６４種のピーナッツペプチド、または約５５〜約６４種のピーナッツペプチドを含む。
【００９４】
実施形態によっては、キット中のピーナッツペプチドはそれぞれ、固相担体とカップリングするためのリンカーを有する。実施形態によっては、リンカーは、−ＰＥＧ１２−ビオチンである。実施形態によっては、リンカーは、３、６、９、または１２個の炭素を含むことができる。実施形態によっては、ビオチンは、クリックケミストリーリンカー（例えば、アジド−ＤＢＣＯ、アミン−ＮＨＳエステル、チオール−マレイミド、ヒドラゾンなど）で置き換えることができる。実施形態によっては、固相担体は、微粒子ビーズ、ガラスアレイ、シリコーンアレイ、膜、またはマイクロタイタープレートである。実施形態によっては、固相担体は、本明細書中記載されるとおりである。
【００９５】
実施形態によっては、ＡＡＩ特異的標識化試薬は、検出可能に標識された抗ヒトＩｇＧ４抗体、検出可能に標識された抗ヒトＩｇＭ抗体、検出可能に標識された抗ヒトＩｇＡ抗体、及び／または検出可能に標識された抗ヒトＩｇＥ抗体である。実施形態によっては、検出可能な標識は、フィコエリトリン、蛍光色素、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、及びアルカリホスファターゼから選択される。実施形態によっては、検出可能な標識は、銀染色、量子ドット、または屈折手法を介して観察することができる。実施形態によっては、標識化試薬は、本明細書中記載されるとおりである。
【００９６】
使用者の利便性のため、本明細書中記載される方法のいずれかで使用するための試薬も一緒にキットの形態にパッケージ化することができ、キットは、配列番号４〜６７で表されるペプチドの中から選択された複数のアレルゲンエピトープ含有ペプチドまたは任意のその有用なサブグループ、第一レポーター部分、及び任意選択で（もし間接的検出に必要であれば）標識化試薬と特異的に結合する第二レポーター部分と結合した抗ヒトＩｇＥ抗体を含む標識化試薬を含む。キットは、典型的には、本明細書中記載される方法の１つまたは複数でこれらの試薬を使用するための説明書を含むことになる。
【００９７】
実施形態によっては、キットは、直接検出可能なレポーター部分と結合させて提供することが可能な抗ヒトＡＡＩ抗体を含む場合がある。直接検出可能なレポーター部分とは、特異的結合パートナーとの結合を必要とせずに、同定及び／または定量が可能なもののことである。抗ヒトＡＡＩ抗体と結合させることが可能な直接検出可能なレポーター部分の例として、蛍光色素、有色色素、発色性色素、及び後続の化学反応により検出可能な酵素標識、及び放射性標識が挙げられる。実施形態によっては、抗ヒトＡＡＩ抗体は、間接的に検出可能なレポーター部分、すなわち、それ自身は検出可能ではないが、直接検出可能なレポーター部分を含む第二レポーター部分と反応するまたは相互作用するレポーター部分、例えば、直接検出可能な標識と結合したレポーター部分の特異的結合パートナーなどと結合させて提供することが可能である。間接的に検出可能なレポーター部分の例として、ビオチン、ジゴキシゲニン、及び他のハプテンが挙げられ、これらは、直接検出するために標識化された二次抗体（例えば、抗ジゴキシゲニン）または他の結合パートナー（例えば、ストレプトアビジン）が続いて結合することにより検出可能になる。当然のことながら、これらの標識化試薬及びレポーター部分のどれでも、本明細書中記載される方法における適切なアッセイフォーマットで、及びキットの構成要素として、有用である。実施形態によっては、本明細書中記載されるフローサイトメトリー多重アッセイを行うためのキットにおいて、キットの構成要素は、配列番号４〜６７で表されるペプチドの中から選択された複数のアレルゲンエピトープ含有ペプチド、ビオチン化抗ヒトＡＡＩ抗体（第一レポーター部分を持つ標識化試薬）、及びＰＥと結合したストレプトアビジン（第二レポーター部分）を含む場合がある。
【００９８】
上記キットのいずれかに含まれる配列番号４〜６７の中から選択された複数のアレルゲンエピトープ含有ペプチドは、配列番号４〜６７の全ての６４種のペプチド、２０〜２５種のペプチドのサブセット、１５〜２０種のペプチドのサブセット、１０〜１５種のペプチドのサブセット、５〜１０種のペプチドのサブセット、または２〜５種のペプチドのサブセットである場合がある。上記キットのいずれかに含まれる配列番号４〜６７の中から選択された複数のアレルゲンエピトープ含有ペプチドは、関連するペプチドサブグループの１つまたは複数である場合もある。
【００９９】
本明細書中記載される方法は、以下のものとして使用することができる：１）スクリーニングアッセイ（例えば、ピーナッツアレルギーの家族歴のため高リスクである患者に治療アプローチ／介入を説明するため（患者は、アレルゲンに接触する場合がある、または重症反応の可能性のため接触を回避する場合がある）、ピーナッツに対するアレルギーまたは感受性を示す患者に患者の食事及び／または寛解の見込みについて指導するため（ＡＩＴを介した脱感作療法の開始））、２）診断アッセイ（例えば、ピーナッツアレルギーが疑われる患者の診断のため、患者のアレルギー反応の重篤度に基づき、曝露レベルに基づき、アレルゲンの提示に基づき（アレルゲンタンパク質変性のレベルに基づき）患者を階層化するため、反応性がピーナッツ内の特定タンパク質によるものであって交差反応応答によるものではないことを確認する（構成要素に基づき反応性を報告）、３）予測アッセイ（例えば、治療アウトカムを予測する、患者が治療に反応するかどうかを判定する、最適な治療アプローチを予測する、有効な開始用量及び／または治療期間（例えば、１年対３年）を予測する、４）予後診断アッセイ（例えば、患者がアレルギーを寛解するかどうかを判定する、アレルギーが治療とは無関係に経時的に重症化するかどうかを判定する、疾患の特性決定を支援して、治療の決定に影響を与え、患者を指導し、及び薬物／用量選択に影響を与える）、４）モニタリングアッセイ（例えば、ＡＩＴの結果としての有害事象、及び特定アウトカムの判定（例えば、脱感作、持続性不反応、耐性レベル、及び後退））。
【０１００】
ピーナッツペプチド配列として、以下が挙げられる：ＡＴＨＡＫＳＳＰＹＱＫＫＴＥＮ（ａｒａ  ｈ１．００８、配列番号４）、ＬＱＳＣＱＱＥＰＤＤＬＫＱＫＡ（ａｒａ  ｈ１．０１５、配列番号５）、ＲＣＴＫＬＥＹＤＰＲＣＶＹＤＰ（ａｒａ  ｈ１．０２１、配列番号６）、ＫＬＥＹＤＰＲＣＶＹＤＰＲＧＨ（ａｒａ  ｈ１．０２２、配列番号７）、ＹＤＰＲＧＨＴＧＴＴＮＱＲＳＰ（ａｒａ  ｈ１．０２５、配列番号８）、ＲＳＰＰＧＥＲＴＲＧＲＱＰＧＤ（ａｒａ  ｈ１．０２９、配列番号９）、ＰＧＥＲＴＲＧＲＱＰＧＤＹＤＤ（ａｒａ  ｈ１．０３０、配列番号１０）、ＰＧＤＹＤＤＤＲＲＱＰＲＲＥＥ（ａｒａ  ｈ１．０３３、配列番号１１）、ＤＲＲＱＰＲＲＥＥＧＧＲＷＧＰ（ａｒａ  ｈ１．０３５、配列番号１２）、ＡＧＰＲＥＲＥＲＥＥＤＷＲＱＰ（ａｒａ  ｈ１．０４０、配列番号１３）、ＲＥＲＥＲＥＥＤＷＲＱＰＲＥＤ（ａｒａ  ｈ１．０４１、配列番号１４）、ＲＱＰＲＥＤＷＲＲＰＳＨＱＱＰ（ａｒａ  ｈ１．０４４、配列番号１５）、ＲＥＤＷＲＲＰＳＨＱＱＰＲＫＩ（ａｒａ  ｈ１．０４５、配列番号１６）、ＰＳＨＱＱＰＲＫＩＲＰＥＧＲＥ（ａｒａ  ｈ１．０４７、配列番号１７）、ＲＰＥＧＲＥＧＥＱＥＷＧＴＰＧ（ａｒａ  ｈ１．０５０、配列番号１８）、ＲＥＥＴＳＲＮＮＰＦＹＦＰＳＲ（ａｒａ  ｈ１．０５６、配列番号１９）、ＮＮＰＦＹＦＰＳＲＲＦＳＴＲＹ（ａｒａ  ｈ１．０５８、配列番号２０）、ＳＧＦＩＳＹＩＬＮＲＨＤＮＱＮ（ａｒａ  ｈ１．０９０、配列番号２１）、ＳＭＰＶＮＴＰＧＱＦＥＤＦＦＰ（ａｒａ  ｈ１．０９７、配列番号２２）、ＲＤＱＳＳＹＬＱＧＦＳＲＮＴＬ（ａｒａ  ｈ１．１０３、配列番号２３）、ＳＥＥＥＧＤＩＴＮＰＩＮＬＲＥ（ａｒａ  ｈ１．１３０、配列番号２４）、ＥＧＤＩＴＮＰＩＮＬＲＥＧＥＰ（ａｒａ  ｈ１．１３１、配列番号２５）、ＮＮＦＧＫＬＦＥＶＫＰＤＫＫＮ（ａｒａ  ｈ１．１３７、配列番号２６）、ＲＹＴＡＲＬＫＥＧＤＶＦＩＭＰ（ａｒａ  ｈ１．１６７、配列番号２７）、ＤＶＦＩＭＰＡＡＨＰＶＡＩＮＡ（ａｒａ  ｈ１．１７０、配列番号２８）、ＰＶＡＩＮＡＳＳＥＬＨＬＬＧＦ（ａｒａ  ｈ１．１７３、配列番号２９）、ＬＨＬＬＧＦＧＩＮＡＥＮＮＨＲ（ａｒａ  ｈ１．１７６、配列番号３０）、ＡＥＮＮＨＲＩＦＬＡＧＤＫＤＮ（ａｒａ  ｈ１．１７９、配列番号３１）、ＮＨＲＩＦＬＡＧＤＫＤＮＶＩＤ（ａｒａ  ｈ１．１８０、配列番号３２）、ＶＩＤＱＩＥＫＱＡＫＤＬＡＦＰ（ａｒａ  ｈ１．１８４、配列番号３３）、ＫＱＡＫＤＬＡＦＰＧＳＧＥＱＶ（ａｒａ  ｈ１．１８６、配列番号３４）、ＫＤＬＡＦＰＧＳＧＥＱＶＥＫＬ（ａｒａ  ｈ１．１８７、配列番号３５）、ＳＨＦＶＳＡＲＰＱＳＱＳＱＳＰ（ａｒａ  ｈ１．１９４、配列番号３６）、ＱＥＥＥＮＱＧＧＫＧＰＬＬＳＩ（ａｒａ  ｈ１．２０３、配列番号３７）、ＡＡＨＡＳＡＲＱＱＷＥＬＱＧＤ（ａｒａ  ｈ２．００５、配列番号３８）、ＷＥＬＱＧＤＲＲＣＱＳＱＬＥＲ（ａｒａ  ｈ２．００８、配列番号３９）、ＲＲＣＱＳＱＬＥＲＡＮＬＲＰＣ（ａｒａ  ｈ２．０１０、配列番号４０）、ＲＰＣＥＱＨＬＭＱＫＩＱＲＤＥ（ａｒａ  ｈ２．０１４、配列番号４１）、ＫＩＱＲＤＥＤＳＹＥＲＤＰＹＳ（ａｒａ  ｈ２．０１７、配列番号４２）、ＲＤＥＤＳＹＥＲＤＰＹＳＰＳＱ（ａｒａ  ｈ２．０１８、配列番号４３）、ＤＳＹＥＲＤＰＹＳＰＳＱＤＰＹ（ａｒａ  ｈ２．０１９、配列番号４４）、ＰＹＳＰＳＱＤＰＹＳＰＳＰＹＤ（ａｒａ  ｈ２．０２１、配列番号４５）、ＣＣＮＥＬＮＥＦＥＮＮＱＲＣＭ（ａｒａ  ｈ２．０３０、配列番号４６）、ＥＬＮＥＦＥＮＮＱＲＣＭＣＥＡ（ａｒａ  ｈ２．０３１、配列番号４７）、ＬＱＱＩＭＥＮＱＳＤＲＬＱＧＲ（ａｒａ  ｈ２．０３６、配列番号４８）、ＩＭＥＮＱＳＤＲＬＱＧＲＱＱＥ（ａｒａ  ｈ２．０３７、配列番号４９）、ＮＱＳＤＲＬＱＧＲＱＱＥＱＱＦ（ａｒａ  ｈ２．０３８、配列番号５０）、ＱＧＲＱＱＥＱＱＦＫＲＥＬＲＮ（ａｒａ  ｈ２．０４０、配列番号５１）、ＫＲＥＬＲＮＬＰＱＱＣＧＬＲＡ（ａｒａ  ｈ２．０４３、配列番号５２）、ＬＰＱＱＣＧＬＲＡＰＱＲＣＤＬ（ａｒａ  ｈ２．０４５、配列番号５３）、ＬＲＲＮＡＬＲＲＰＦＹＳＮＡＰ（ａｒａ  ｈ３．０１８、配列番号５４）、ＨＹＥＥＰＨＴＱＧＲＲＳＱＳＱ（ａｒａ  ｈ３．０３０、配列番号５５）、ＥＰＨＴＱＧＲＲＳＱＳＱＲＰＰ（ａｒａ  ｈ３．０３１、配列番号５６）、ＱＧＥＤＱＳＱＱＱＲＤＳＨＱＫ（ａｒａ  ｈ３．０３７、配列番号５７）、ＮＴＥＱＥＦＬＲＹＱＱＱＳＲＱ（ａｒａ  ｈ３．０６０、配列番号５８）、ＰＹＳＰＱＳＱＰＲＱＥＥＲＥＦ（ａｒａ  ｈ３．０６８、配列番号５９）、ＥＧＧＮＩＦＳＧＦＴＰＥＦＬＥ（ａｒａ  ｈ３．０７９、配列番号６０）、ＮＩＦＳＧＦＴＰＥＦＬＥＱＡＦ（ａｒａ  ｈ３．０８０、配列番号６１）、ＡＩＶＴＶＲＧＧＬＲＩＬＳＰＤ（ａｒａ  ｈ３．０９２、配列番号６２）、ＴＶＲＧＧＬＲＩＬＳＰＤＲＫＲ（ａｒａ  ｈ３．０９３、配列番号６３）、ＥＹＤＥＤＥＹＥＹＤＥＥＤＲＲ（ａｒａ  ｈ３．１００、配列番号６４）、ＹＥＹＤＥＥＤＲＲＲＧＲＧＳＲ（ａｒａ  ｈ３．１０２、配列番号６５）、ＩＡＮＬＡＧＥＮＳＶＩＤＮＬＰ（ａｒａ  ｈ３．１５２、配列番号６６）、及びＲＱＬＫＮＮＮＰＦＫＦＦＶＰＰ（ａｒａ  ｈ３．１６２、配列番号６７）。
【０１０１】
これらのペプチドの１種または複数のどれでも、そのカルボキシ末端で、例えば、−ＰＥＧ１２−ビオチンと結合することができる。
本明細書中開示される発明の対象をより効率的に理解できるようにするため、実施例を以下に提供する。当然ながら、これらの実施例は、例示のみを目的とし、どのような形でも特許請求される対象を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１０２】
実施例１：エピトープアッセイを用いたＬＥＡＰコホートの分析
背景として、幼い小児でピーナッツアレルギーを予防する最良の戦略を決定するために無作為化比較試験（ＲＣＴ）（例えば、ピーナッツアレルギーについての早期学習（Ｌｅａｒｎｉｎｇ  Ｅａｒｌｙ  Ａｂｏｕｔ  Ｐｅａｎｕｔ  Ａｌｌｅｒｇｙ、ＬＥＡＰ））が過去に行われた。ＬＥＡＰ試験は、年齢が４ヶ月〜１１ヶ月の６４０人の小児からなり、彼らは、ピーナッツアレルギーのリスクが高いと同定されていた。小児は２つの群に分けられた：回避群及び摂取群（１週間あたり、ピーナッツを含有する軽食を３食超、ピーナッツタンパク質６ｇ）である。この試験の結果は、経口負荷試験（ＯＦＣ）により判定したところ、５歳までにピーナッツアレルギーを発症した小児の割合が、摂取群に比べて回避群で４倍〜６倍高かったことを示した。ＬＥＡＰ試験の結果は、例えば、Ｔｏｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２０１５，３７２，８０３−８１３に開示されている。こうして、試験は、米国におけるピーナッツアレルギー予防のためのガイドラインに変化をもたらした。
【０１０３】
方法：
個別エピトープ、エピトープ併用、及びエピトープと他の臨床もしくは診断法（例えば、皮膚プリックテスト、ピーナッツ特異的ＩｇＥ、患者歴、及びピーナッツ構成要素ＩｇＥ）との併用の重要性を評価するため、ＬＥＡＰ患者コホートのサブセットを、本明細書中記載されるエピトープ試験を用いて、さらに評価した。詳細には、ＬＥＡＰ試験中の時点で、血漿のアリコートを少なくとも２つ追加で有する、プロトコルあたりのＬＥＡＰ（ＬＥＡＰ  Ｐｅｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）対象３４１人のサブセットを選択した。３４１人の対象の診断分類（すなわち、５歳−来院６０時点のアレルギー状態）を表１に示す。
【０１０４】
【表１】
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診断分類は、以下のとおり決定した。「アレルギー性」対象は、来院６０時点のピーナッツＯＦＣ後に臨床アレルギー症候を示した。「感作」対象は、ＩｇＥ感作されていたが、アレルギーではなく、最初の来院３回の間少なくとも１種のピーナッツ特異的ＩｇＥが＞０．１ｋＵＡ／Ｌであり、来院６０時点のＯＦＣをパスした。「非アレルギー性」対象（回避者及び摂取者から、１：１の比で無作為に選択した１００人の対象）は、感作されておらず、アレルギーでもなく、皮膚プリックテスト（ＳＰＴ）で陰性であり、最初の来院３回の間ピーナッツ特異的ＩｇＥが≦０．１ｋＵ／Ｌ＊であり、来院６０時点のＯＦＣをパスした。
【０１０５】
６４種の特定エピトープでの対象のＩｇＥ及びＩｇＧ４反応性を評価するためのアッセイは、エピトープの選択から開始して、ビーズカップリング、試料アッセイ、データ取得、及び統計分析を、以下に示すとおりに行った。手短に述べると、Ｃ末端ビオチン／ＰＥＧ１２リンカーを有する化学修飾された合成ピーナッツペプチド（１５アミノ酸長、３種の主要ピーナッツタンパク質由来の直鎖エピトープ５０種−Ａｒａ  ｈ１の２７種のエピトープ、Ａｒａ  ｈ２の１３種のエピトープ、及びＡｒａ  ｈ３の１０種のエピトープである）を、Ｌｕｍｉｎｅｘ  ＬｕｍＡｖｉｄｉｎ微粒子と、ＰＢＳ／１％ＢＳＡの緩衝液中４，０００ｎＭの濃度で、遮光し、穏やかに一定回転させながら、室温で３０分間、カップリングさせた。カップリングの前に、貯蔵微粒子を、１０，０００×ｇで２分間遠心し、水浴超音波処理器中で超音波処理し、中速でボルテックスして、微粒子を再懸濁させた。調製した微粒子を入れた複数のバイアルを、引き続き１つにまとめて再度ペレット化し、それから上清を除去して、カップリングのためＰＢＳ／１％ＢＳＡに再懸濁させた。カップリングさせた微粒子を、ＰＢＳ−ＴＢＮ／アジド緩衝液（ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０／０．０５％アジ化ナトリウム）を用いて遠心し、ＰＢＳ−ＴＢＮに再懸濁させることにより２回洗い、ガラス血球計算器で計数した。
【０１０６】
６４種の異なるピーナッツペプチドがカップリングしたビーズ領域を１つにまとめて、１，０００ビーズ／種の濃度で「６４重体」を形成し、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイを行った。ヒト血漿試料のウェルを３つ組で、ＰＢＳ−ＴＢＮ（ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０）緩衝液で１：１０に希釈し、ペプチドがカップリングした微粒子多重体とともに、遮光し振盪しながら室温で２時間インキュベートした。プレートを引き続きＰＢＳ−ＴＢＮで２回洗い、フィコエリトリンと直接カップリングしたマウス抗ヒトＩｇＥまたはＩｇＧ４からなる二次検出抗体をウェルに加え、遮光し振盪しながら室温で３０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−ＴＢＮで３回洗い、１００μＬのＰＢＳ−ＴＢＮで再懸濁させ、二次プレートに移してから、高ＲＰ１及び最小カウントを１領域あたり５０ビーズに設定したＬｕｍｉｎｅｘ−１００で読んだ。各プレートには、３つ組で測定される無作為に選択した患者１５０人の試料由来の血漿の混合物を含むプレート間対照試料（ＩＰＣ）、ならびに３つ組で測定される緩衝液のみ（陰性）の対照が含まれていた。エピトープアッセイから得られる生データは、蛍光強度中央値（ＭＦＩ）で記録された。全てのデータを、以下の式を用いてｌｏｇ２変換した：エピトープ値＝ｌｏｇ２（ＭＦＩ＋０．０５）−平均（ｌｏｇ２（緩衝液＋０．０５））。
【０１０７】
経時的エピトープ変化の評価：回避者対摂取者の比較：
試験群（回避者及び摂取者）の間でのＩｇＥエピトープの差異を評価するため、試験開始時のベースライン来院と比較した各試験来院（Ｖ１２−Ｖ１、Ｖ３０−Ｖ１、及びＶ６０−Ｖ１）間で、各エピトープ値が何倍変化したかを求めた。結果をエピトープごとにプロットし、図１にまとめる。１９種のエピトープで、回避者における変化が摂取者よりも大きかったことが観察された。これらの結果は、ＩｇＥ系列エピトープ特異的抗体が、５歳（来院６０時点）までにピーナッツアレルギーを発症した回避者群の小児で早期に発生したことを示す。系列エピトープ特異的ＩｇＥ抗体は、主に２つの領域で発生した：Ａｒａ  ｈ１：００８〜０６６及びＡｒａ  ｈ２：００５〜０４０。また、Ａｒａ  ｈ３：９３〜１１５に対して遅発反応があるようである。ＩｇＥ特異的結合の遅発変化は、主にピーナッツ回避者群におけるものである、それらは、２つの領域に対して特異的であり、またそれらは、持続して経時的に結合を増強させる。摂取者に早期（Ｖ１２）のＩｇＥのわずかな上昇が観察されたが、アレルギーを発症した対象で見られたものと同じエピトープに対してではなかった。要するに、ＩｇＥは、摂取者群で早期に発生することが観察されたが、アレルギーを発症した患者と重複する領域においてではなかった。これらのデータは、ある特定のピーナッツエピトープに対するＩｇＥ反応が、天然及び一過性両方の可能性があることを示唆する。まとめると、データは、これらのピーナッツ特異的タンパク質におけるある特定のエピトープが、ＩｇＥアレルギー反応を意味している可能性があることを示唆する。
【０１０８】
試験群（回避者及び摂取者）の間でのＩｇＧ４エピトープの差異を評価するため、試験開始時のベースライン来院と比較した各試験来院（Ｖ１２−Ｖ１、Ｖ３０−Ｖ１、及びＶ６０−Ｖ１）間で各エピトープ値が何倍変化したかを求めた。結果をエピトープごとにプロットし、図２にまとめる。Ｖ３０では、ＩｇＧ４は、両群において全てのエピトープで存在したが、摂取者の方でより多かった。摂取者は、非常に早期に、関連するアレルギーエピトープに対してＩｇＧ４をＩｇＥの代わりに生成し、一方で回避者は、最終的にＩｇＧ４を生成するものの、ＩｇＥの後であった。回避者は、非経口曝露、例えば環境曝露に関連したもの（例えば、ほこり中のアレルゲン及び患者の質問票）によるＩｇＧ４も生成した。要するに、これらの結果は、Ｖ３０時にＩｇＧ４は全てのエピトープで存在するが、全体的には摂取者群でより大きな結合を実証することを示す。さらに、摂取者群は、非常に早期（ＶＩ２）に、重要なＩｇＥエピトープでＩｇＧ４を生成し、一方で回避者は、これらの同一エピトープでＩｇＧ４を生成するものの、ＩｇＥがすでに生成された後でのみだった。
【０１０９】
全ての回避者がアレルギー性になったのではなかったことから、エピトープ反応性を、これらのアレルギー性回避者と非アレルギー性回避者の間で比較した。結果を図３にまとめる。いずれの来院時でも、非アレルギー群と感作群との間に治療差は観察されなかった。感作対象者で結合したエピトープは、アレルギー性になったものとは主に異なっていた。経時的な治療変化で有意差があったペプチドは少数であり、それも感作対象についてのみであった。要するに、これらの結果は、ＩｇＥエピトープ特異的反応性は全て、アレルギー性回避者によるものであって非アレルギー性回避者によるものではなかったことを示す。さらに、図３にまとめるとおり、感作患者でＶ６０までに変化していたＩｇＥエピトープはほんのわずかであり、これらの変化はアレルギー群で観察されたものと異なっている。
【０１１０】
ＩｇＧ４エピトープ結合についてのさらなる検討を、図４にまとめる。ピーナッツ摂取を回避した非アレルギー性対象は、アレルギー性または感作性どちらの対象よりも早く（Ｖ１２及びＶ３０）、より多くのＩｇＧ４を生成した。感作群とアレルギー群の間に有意差はなく、ＩｇＧ４が防御性ではないことを示唆する。Ｖ６０時に感作していた患者の間では、ピーナッツ摂取は、エピトープ特異的ＩｇＧ４の早期発生を招き、特にアレルギー性対象がＩｇＥを発生させる２つの領域においてそうであった。要するに、深刻な変化はＶ６０時に全ての群で生じているものの、非アレルギー性回避者は、アレルギー性または感作患者よりも早く（Ｖ１２、Ｖ３０）、より多くのＩｇＧ４を生成した。しかしながら、感作患者のＩｇＧ４反応とアレルギー性患者のＩｇＧ４反応の間に全体的な差異はなく、ＩｇＧ４が防御性である見込みは低いことを示唆する。
【０１１１】
Ｖ６０時のＩｇＧ４反応は、年齢５歳後に保護性であるようには思われなかったものの、回避者群の非アレルギー性患者は、アレルギー性または感作患者に比べて早く（Ｖ１２、Ｖ３０）により多くのＩｇＧ４を生成した。また、感作患者のＩｇＧ４反応とアレルギー性患者のＩｇＧ４反応の間に有意差はなく、ＩｇＧ４が全体的なアレルギー反応において防御性ではないことを示唆する。結果を図５にまとめる。
【０１１２】
しかしながら、図６にまとめるとおり、摂取は、回避者に比べて、感作した摂取者において早期（Ｖ１２及びＶ３０）のＩｇＧ４エピトープ増大を招いた。ＩｇＧ４のこの早期増大は、特に、アレルギー性患者でＩｇＥ反応性が最も強く観察された領域で観察された。要するに、Ｖ６０時に感作されていた患者の間では、ピーナッツ摂取は、エピトープ特異的ＩｇＧ４のより早い発生を、特に、アレルギー性患者がＩｇＥ抗体を発生させる２つの領域で招いた。これらの結果は、アレルギー反応の相殺におけるＩｇＧ４の早期役割の可能性を示唆する。
【０１１３】
これらのデータをまとめると、特定ペプチドでのＩｇＥ反応及び恐らくはＩｇＧ４反応が、有用な診断道具となる、または１種または複数の免疫療法アプローチ、例えば、経口、舌下、皮内、皮下、吸入、経皮、またはそれら方法の組み合わせにより治療されている患者の治療反応モニタリングにおいて、適切な用量、治療の進行、有害反応、及び成功したアウトカムを評価するための有用な道具となる可能性が示唆される。このデータは、治療後の患者を追跡して、食物耐性が維持されているかどうか、それとも治療を再開する必要があるかどうかを判定することが可能である可能性も示唆する。
【０１１４】
本明細書中使用される分析は、アレルギー分野の当業者が一般的に採用する線形回帰分析である。簡単に述べると、線形回帰は、観測値（例えば、アレルギー症例及び非アレルギー例）を変数（例えば、エピトープ及びＩｇＥ測定値）に当てはめる線形モデルを構築する標準的な統計アプローチである。例えば、ＭａｔｌａｂバージョンＲ２０１５ｂを用いて線形回帰法を適用すると、結果として以下のモデルが構築され、式中、ｘ１、ｘ２、及びｘ３は、ＩｇＥ及びＩｇＧ４エピトープ変数を表す。
【０１１５】
一般化された線形回帰モデル：
ｌｏｇｉｔ（ｙ）〜１＋ｘ１＋ｘ２＋ｘ３
分布＝二項
【０１１６】
【表２】
2021525378.tif 000004
観察数１３３、自由度の誤差数１２９
分散：１
回帰モデルに対するΧ２検定：２５．２、Ｐ値＝１．４２ｅ−０５
閾値は、得られる線形回帰モデルの陰性的中率を最適化するように選択される。ＩｇＥ閾値の単位は、（ＫＵ／Ｌ）である。１種を超えるエピトープに関する線形回帰モデルの閾値は無次元である。
【０１１７】
実施例２：ピーナッツアレルギー予測のためのエピトープ分類器の評価
この同一（ＬＥＡＰ）コホートを用いてＩｇＥ及びＩｇＧ４エピトープ反応性の診断応用可能性を評価するため、ＯＦＣにより最終診断が確定した患者を選択して、アレルギー予測のためのアルゴリズムを開発し、分類器を同定した。
【０１１８】
ＬＥＡＰ試験に登録されたピーナッツアレルギーリスクの高い小児３４１人由来の試料を用い、ＩｇＥ／ＩｇＧ４エピトープ特異的結合を５年にわたり評価した（図７）。ＩｇＥエピトープ特異的抗体は、回避者群の患者で発生し、５歳時にピーナッツアレルギーを有する患者について特異的であり、２つの領域で優勢である（図７、左パネルの緑色矢印を参照）。ＩｇＧ４エピトープ特異的抗体は、全ての患者で増加しており、ピーナッツ回避者でも非経口経路を介してピーナッツ曝露が生じていることを示唆する。詳細には、ピーナッツ摂取者は、ＩｇＧ４を早期に発生させ（図７、右パネルを参照）、特に関連領域でそうであり（緑色矢印を参照）、ＩｇＥの代わりに「防御性」ＩｇＧ４反応へと方向転換したが、ピーナッツ回避者は、最終的に、ＩｇＥに加えてＩｇＧ４抗体を発生させた。このアッセイは、ピーナッツに関して確証されており、ＰＡ患者の以前のＣＯＦＡＲコホートにおいて及びこのＬＥＡＰコホートにおいて全てのピーナッツ特異的エピトープに関して＞０．９０（大部分で＞０．９５）という同様な優れたＩＣＣ値であることが明らかとなった。これらの結果は、ピーナッツを早期に摂取するか回避するかにより、介入アウトカムと関連したＩｇＥエピトープレパートリーの変化が誘導されることを示す。
【０１１９】
ＡＵＣ成績が上位のエピトープ：
症例及び対照を、それぞれ、ＯＦＣ確認済みアレルギー性及び非アレルギー性患者と定義した。次いで、全てのＩｇＥエピトープを、アレルギー性であるか非アレルギー性であるかの予測の分類器として個別に評価した。ＡＵＣを、成績計量として用いた。成績が上位１０位までのエピトープ（アレルギー性エピトープ）を表２に示す。
【０１２０】
【表３】
2021525378.tif 000005
上位のＡＵＣ成績での統合試験：
症例及び対照を、それぞれ、ＯＦＣ確認済みアレルギー性及び非アレルギー性患者と定義した。ＩｇＥ及び／またはＩｇＧ４エピトープのパネルを、アレルギー性であるか非アレルギー性であるかの予測の分類器として評価した。ＡＵＣを、成績計量として用いた。また、他の臨床測定、例えば、ＳＰＴ結果、特異的ピーナッツＩｇＥ（ｓＩｇＥ）測定値、及びピーナッツ全タンパク質構成要素（Ａｒａ  ｈ２）なども組み込んだパネルの例も含めた。パネルは、標準線形回帰方法を用いることにより形成した。［ＡＢＣ］という表記を用いて、エピトープのパネル及び／または臨床測定Ａ、Ｂ、及びＣを線形回帰により１つのパネルに統合したことを示す。因子（ピーナッツペプチド及び／または本明細書中記載される他の因子）の組み合わせを評価するために線形回帰を使用することは、当業者に周知である。そのような組み合わせの代表例として、以下が挙げられるが、それらに限定されない：
［ＩｇＥ＿Ａｒａ  ｈ２．００８、ＩｇＧ４＿Ａｒａ  ｈ２．０２１、ＩｇＧ４＿ａｒａ  ｈ３．１５２］は、ＡＵＣ＝７７％である
［ＩｇＥ＿Ａｒａ  ｈ２．００８、ＩｇＧ４＿Ａｒａ  ｈ２．０２１、ＳＰＴ］は、ＡＵＣ＝８１％である
［ＩｇＥ＿Ａｒａ  ｈ２．００８、ＩｇＧ４＿Ａｒａ  ｈ２．０２１、ＩｇＧ４＿ａｒａ  ｈ３．１５２、ｓＩｇＥ］は、ＡＵＣ＝８１％である
［ＩｇＥ＿Ａｒａ  ｈ２．００８、ＩｇＧ４＿Ａｒａ  ｈ２．０２１、ＩｇＧ４＿ａｒａ  ｈ３．１５２、Ａｒａ  ｈ２］は、ＡＵＣ＝７５％である
一般に、ピーナッツペプチドの任意の組み合わせと任意の他の因子の併用についてＡＵＣが５０％未満である場合は、非アレルギー状態を示し、ＡＵＣが５０％以上である場合は、アレルギー状態を示す。実施形態によっては、ピーナッツペプチドの任意の組み合わせと任意の他の因子の併用についてＡＵＣが５５％未満である場合は、非アレルギー状態を示し、ＡＵＣが５５％以上である場合は、アレルギー状態を示す。実施形態によっては、ピーナッツペプチドの任意の組み合わせと任意の他の因子の併用についてＡＵＣが６０％未満である場合は、非アレルギー状態を示し、ＡＵＣが６０％以上である場合は、アレルギー状態を示す。実施形態によっては、ピーナッツペプチドの任意の組み合わせと任意の他の因子の併用についてＡＵＣが６５％未満である場合は、非アレルギー状態を示し、ＡＵＣが６５％以上である場合は、アレルギー状態を示す。実施形態によっては、ピーナッツペプチドの任意の組み合わせと任意の他の因子の併用についてＡＵＣが７０％未満である場合は、非アレルギー状態を示し、ＡＵＣが７０％以上である場合は、アレルギー状態を示す。
【０１２１】
階層的統合試験（理論予測）
この実施例で使用される方法は、上記のものと同じであるが、ただし、分類が階層的様式で行われることが異なる。最初に、ｓＩｇＥ測定を用いて、非アレルギー性症例を同定する。次いで、ｓＩｇＥにより分類されない患者について、ロジスティック回帰パネル［ＩｇＥ＿Ａｒａ  ｈ２．００８、ＩｇＧ４＿Ａｒａ  ｈ２．０２１、ＩｇＧ４＿ａｒａ  ｈ３．１５２］を用いて、残りの患者をアレルギー性または非アレルギー性いずれかであると分類する。ｓＩｇＥ≦０．０３ｋＵＡ／Ｌならば、対象を「非アレルギー性」とする。［ＩｇＥ＿Ａｒａ  ｈ２．００８、ＩｇＧ４＿Ａｒａ  ｈ２．０２１、ＩｇＧ４＿ａｒａ  ｈ３．１５２］≦０．２０ならば、対象を「非アレルギー性」とする。それ以外は、対象を「アレルギー性」とする。この階層的分類器の閾値は、分類の決定を下すために使用される。因子のこの組み合わせは、本明細書中、例えば、偽陽性を排除するために使用される。これらの組み合わせは、異なる分類結果を得るために変更することができる。提示される実施例において、階層的分類器の感度及び特異性は、それぞれ、９０％及び５４％である。
【０１２２】
実施例３：臨床試験
本明細書中提示される強力なデータに基づき、ピーナッツエピトープに対するＩｇＥ／ＩｇＧ４の結合パターンが、非常に有益な情報を与えるものであり、患者のアレルギー疾患の重篤度を特性決定する、患者を長期間評価して臨床試験初期及び臨床試験中の投薬を指導する、臨床試験中の有害事象を追跡または予測する（安全性を改善するため）、臨床試験の臨床的終了点において患者のアレルギー状態を確認する、及び患者の治療後をモニタリングして治療反応性を維持するために追加治療が必要であるか／いつ必要になるかを判定するのに有用となることが予想される。
【０１２３】
患者の試料のサブセットを同定することになる。最低でも、試料は、Ａｒｌ０１処置群及び偽薬群の両方を含むことになり、これらの群は、以下の患者を含む：１）臨床的終了点まで臨床試験に残る患者、２）臨床的終了点後もモニタリングを継続し、不反応性の持続を評価する患者、３）有害反応を理由に臨床試験から離脱する患者、４）有害反応がなく臨床試験から離脱する患者、５）臨床試験中、長期にわたり複数の時点で血清成分及びＯＦＣデータが利用可能な患者、ならびに６）異なる投薬スケジュール群に分けられた、または臨床試験中に異なる速度で増量された患者。
【０１２４】
臨床試験に登録された患者からＯＩＴの開始後に様々な時点で採取された血漿または血清試料は、臨床試験に関する臨床情報を盲検化して評価されることになる。試料は、本明細書中記載される方法（例えば、６４重体ピーナッツ（ａｒａ  ｈ１、ｈ２、及びｈ３）エピトープ試験）を用いて、ＩｇＥ、ＩｇＧ４、及びＩｇＡエピトープ結合について評価されることになる。
【０１２５】
エピトーププロファイリング（ビーズ系エピトープアッセイ（ＢＢＥＡ）：エピトープマッピングのため、本方法は、特定の食物で見られるタンパク質を、それより小さなペプチド、すなわち２つ以上のアミノ酸からなる化合物に細分する。エピトープを区別するため、マッピングされたペプチドを、別々にビーズに結合させて、高処理分析及びエピトープ結合評価ができるようにする。エピトープパターン決定のため、患者のＩｇＥ反応の反応性を特定する。反応では、抗体はペプチドビーズに結合し、試験は、ペプチドあたりの個別の反応を単離して特定するように設計されているので、臨床医は、患者のアレルギープロファイルをより正確かつ完全な図式で得ることができる。結果は、個別のペプチド結果で「マッピング」され、これにより患者を分類するのに用いられる治療反応プロファイルが形成される。
【０１２６】
簡単に述べると、エピトープアッセイのため、ピーナッツペプチド（ＣＳ  Ｂｉｏ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ、ＵＳＡ）をＬｕｍＡｖｉｄｉｎビーズ（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）とカップリングさせ、ＰＢＳ−ＴＢＮ緩衝液（１×ＰＢＳ＋０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０＋０．１％ＢＳＡ）中で貯蔵した。ペプチドがカップリングしたビーズのマスター混合物を、ＰＢＳ−ＴＢＮ緩衝液で用意し、ビーズマスター混合物１００μＬをフィルタープレートに加えた。ビーズを洗浄後、対象の血漿の１：１０希釈液１００μＬを三つ組のウェルに加えた。プレートを、シェーカー上室温で３００ｒｐｍで２時間インキュベートした。過剰な血漿を除去し、プレートを洗った。マウス抗ヒトＩｇＥ−ＰＥ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｐｉｅｒｃｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｃｌｏｎｅ  ＢＥ５、ＰＢＳ−ＴＢＮに１：５０で希釈）またはマウス抗ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ−ＰＥ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、Ｃｌｏｎｅ  ＨＰ６０２５、ＰＢＳ−ＴＢＮに１：４００で希釈）二次抗体を５０μＬ／ウェルで加え、プレートを３０分間インキュベートした。最終洗浄後、ＰＢＳ−ＴＢＮ緩衝液１００μＬを各ウェルに加えてビーズを再懸濁させ、次いでこれを固定底９６ウェル読み取りプレートに移し、Ｌｕｍｉｎｅｘ  ２００装置（Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）１００／２００（商標）Ｓｙｓｔｅｍ、Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）で定量した。
【０１２７】
全ての試料は３つ組で処理した。バックグラウンド強度を除外するため、緩衝液試料（ＰＢＳ−ＴＢＮ緩衝液）も、各プレートにおいて３つ組で処理した。各エピトープ及び試料の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）は、Ｌｕｍｉｎｅｘリーダーの出力から直接得た。各試料ｉ及びエピトープｊについて、結合測定値Ｂｉｊは、以下のとおり定義した：
【０１２８】
【数１】
2021525378.tif 000006
式中、ｎｓは、非特異的結合（緩衝剤）試料を表す。
【０１２９】
実施例４：臨床試験コホート
ＣｏＦＡＲ２予測小児コホートのピーナッツの非アレルギー性及びアレルギー性患者の血漿試料を分析に使用した。各来院時のアレルギー診断は、以下のとおり定義した：１）アレルギー性（血清学的：ピーナッツｓＩｇＥ＞１４ｋＵＡ／Ｌ、確定：ＯＦＣ＋または（確証的履歴＋血清学的））、２）非アレルギー性（感作された：耐性であるがピーナッツｓＩｇＥ＞０．３５ｋＵＡ／Ｌ、感作されていない：耐性であり、ピーナッツｓＩｇＥのエビデンスなし）。３回の来院が計画された：１）ベースライン（約０歳）、２）来院２（約２歳）、及び３）来院５（約４＋歳）。ベースラインの情報を表３に示す。
【０１３０】
【表４】
2021525378.tif 000007
先行試験は、年齢（若いほど多い）、性別（男性で多い）、人種（アフリカ系アメリカ人で多い）、及びアレルギー反応の程度及び履歴が、ピーナッツアレルギーを予測することを示した。本発明のコホートでは、アレルギー性群と非アレルギー性群は、ベースラインでこれらの予測因子が互角であった。ＣｏＦＡＲは、ピーナッツアレルギーのリスクが高い小児患者を登録するため、ＡＤの有病率は、両群で非常に高い（９０％及び９８％）。患者のベースライン情報を表４に示す。
【０１３１】
【表５−１】
2021525378.tif 000008
【０１３２】
【表５−２】
2021525378.tif 000009
ベースラインでは、全てのアレルギー性患者は「血清学的」である。
【０１３３】
時間とともに、より多くのアレルギー性小児が、より多数のエピトープと結合するＩｇＥを示した。ＩｇＥエピトープレパートリーの明白な差異が、全ての来院時にわたり、アレルギー性小児と非アレルギー性小児の間で観察された。ＩｇＧ４は、全てのアウトカムにわたり年齢とともに増加し、来院５時点に２つの群の間でＩｇＧ４プロファイルは非常に類似していた。図８に結果を示す。
【０１３４】
エピトープに関して複数のモデルが開発されてきており、そのようなモデルとして、例えば、ランダムフォレスト（ＲＦ）及び交差検証（ＣＶ）が挙げられる。ＲＦモデルは、交差検証で、特に年齢が２歳及び４＋歳の小児に関して良く機能した（表５を参照）。ＲＦモデルは、訓練セットにおいて、患者のほぼ１００％で正確にアレルギー診断を予測することができる（表６を参照）。ＣＶは、全ての訓練反復においてモデルがどの程度うまくいったかの尺度であり、予測モデルの不偏評価と見なされる（図９を参照）。
【０１３５】
【表６】
2021525378.tif 000010
実際の試験で、エピトープモデルを実行した。試験データは、以下のとおりであった：１）Ｖ０時に３５人（２１人のアレルギー性）患者、２）Ｖ２時に３１人（１４人のアレルギー性）患者、及び３）Ｖ５時に４６人（２４人のアレルギー性）患者。試験のＡＵＣは、以下の結果となった：１）Ｖ０時に０．７０、１１人の誤分類、２）Ｖ２時に０．８８、４人の誤分類、３）Ｖ５時に０．８４、７人の誤分類、及び４）来院全体で０．８４、１８人の誤分類。試験の成績測定基準を図１０に示す。
【０１３６】
試験データでのエピトープモデルの成績を、ＩｍｍｕｎｏＣＡＰデータに基づくアレルギー診断と比較した。ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ診断は、患者が、ピーナッツ、Ａｒａ  ｈ１、Ａｒａ  ｈ２、及びＡｒａ  ｈ３に対して陽性（≧０．３５ｋＵＡ／Ｌ）ｓＩｇＥを有していれば「アレルギー性」であった。各来院（及び全ての来院をまとめて）について、エピトープに基づくモデルは、構成要素に基づくアレルギー診断よりも成績が優れていた（図１１を参照）。試験データでは１０人の患者しかＯＦＣで確定した診断を有していなかったが、エピトープ及びＩｍｍｕｎｏＣＡＰは両方とも８／１０の小児を正確に診断した。
【０１３７】
エピトープとピーナッツに対するｓＩｇＥとの関連性を調べた。年齢が２歳未満の小児は、構成タンパク質またはそれらの直鎖エピトープに対してよりも全ピーナッツ抽出物に対して抗体を発達させる見込みがより高い。また、全ピーナッツに対するｓＩｇＥを含めることは、非常に幼い年齢でアレルギー性小児を同定するのに役立つ可能性がある。ＣＶのＡＵＣを図１２に示す。予想どおり、０歳モデルについて、ｓＩｇＥは、最上位の予測因子であり、ＣＶのモデル成績は改善され、ＡＵＣは０．９８に到達した（０．８９に比べて）。来院２及び５時点のＡＵＣは同じままであった。
【０１３８】
３通りの予測因子の組を用いて、アレルギーアウトカムを予測した：１）エピトープ、２）エピトープ＋ピーナッツ特異的ＩｇＥ、及び３）ピーナッツ特異的＋構成要素特異的ＩｇＥ：ピーナッツ、Ａｒａ  ｈ１、Ａｒａ  ｈ２、及びＡｒａ  ｈ３に対するｓＩｇＥ。エピトープに対するＩｇＥ抗体単独で、患者の大多数において、ピーナッツアレルギーを正確に診断することができ、構成要素よりも良い結果であった（表７及び図１３を参照）。ピーナッツに対するｓＩｇＥを加えると、ＣＶ及び試験におけるエピトープモデルの成績がさらに改善され、９５％（１０７／１１２）の患者が正確に診断された。
【０１３９】
【表７】
2021525378.tif 000011
エピトーププロファイルは、ピーナッツアレルギーを診断する予測バイオマーカーとして有望な成績を示す。ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ標準ガイドラインを用いた場合に７０％であったのに比べて、エピトープのみを使用した場合、いずれの来院時でも小児の８３％が「アレルギー性」であると正確に同定された。エピトープ及び構成要素の両方の試験は、２歳来院時及びその後の小児のピーナッツアレルギーを同定する場合により良い成績となった。全ピーナッツに対するｓＩｇＥをエピトープモデルに追加すると、診断モデルの成績を顕著に改善し、試験データにおいて精度が＞９５％であった。
【０１４０】
実施例５：ピーナッツアレルギー診断法の発見及び検証
方法
発見：試験法の発見は、ＬＥＡＰ試験の回避群にいた１３３人の対象（３１人がアレルギー性、１０２人が非アレルギー性）で行った。全ての診断は、年齢５歳でＯＦＣにより確定した。血漿試料は、各対象について２．５歳及び５歳で得た。これらの試料を、上記のＢＢＥＡ方法を用いて分析し、各対象について２．５歳及び５歳でのＩｇＥ及びＩｇＧ４エピトープレベルを得た。各対象についてのＩｇＥ（ＩｇＧ４）エピトープレベルを、全てのＩｇＥ（ＩｇＧ４）エピトープ測定値の中央値で正規化した。
【０１４１】
５歳でのデータを分析して、アレルギー性対象と非アレルギー性対象とを区別するのに最良の成績を与えるＩｇＥまたはＩｇＧ４エピトープを特定した。具体的には、最良の成績を与えるＩｇＥまたはＩｇＧ４エピトープとは、ピーナッツ特異的ＩｇＥ（ｓＩｇＥ）レベルが０．１ｋＵ／Ｌ未満であることによる対象の最初の格付け後、これらの対象をアレルギー性または非アレルギー性として分類するのに最良のＡＵＣを持つものである。次いで、当該ＩｇＥまたはＩｇＧ４エピトープが２．５歳での最良の成績を与えるエピトープでもあることを確認した。
【０１４２】
最良の成績を与えるエピトープ及び判断閾値の同定後、診断試験を完全に締め切り、それから検証した。
検証：試験法の検証は、ＣｏＦＡＲ２試験にいた８１人の対象（２３人がアレルギー性、５８人が非アレルギー性）で行った。全ての診断は、年齢５歳時にＯＦＣにより確定した。血漿試料は、各対象について２歳及び５歳時に得た。これらの試料を、上記のＢＢＥＡ方法を用いて分析し、各対象について２歳及び５歳時のＩｇＥ及びＩｇＧ４エピトープレベルを得た。各対象についてのエピトープレベルを、全てのＩｇＥ（ＩｇＧ４）エピトープ測定値の中央値で正規化した。診断試験が完全に締め切られるまで、全てのデータは匿名のままであった。
【０１４３】
診断試験の検証は、事前に定義された仮説及び閾値を用いて行った。最初に、ｓＩｇＥの閾値０．１Ｋｕ／Ｌ及び最適ＩｇＥ（ＩｇＧ４）エピトープの閾値０．３０を用いた診断試験の成績は、５歳時の対象に関するカイ二乗検定を用いたところ、統計上有意であった。同様に、２歳時の対象の診断試験の成績も評価した。全てのデータ分析は、Ｍａｔｌａｂ  Ｒ２０ｌ５ｂを用いて行った。
【０１４４】
統合された試験アルゴリズムでは、閾値Ｔに関する様々な値が検証され、使用された中に含まれていたのは、最初のクエリー：ｓＩｇＥ≦０．１０であるか？である。この最初のクエリーに対する答えが「はい」ならば、「非アレルゲン性」という結論が得られる。最初のクエリーに対する答えが「いいえ」ならば、追加クエリー：ＩｇＥ  ｈ２．００８≦Ｔであるか？が要求される。この追加クエリーに対する答えが「はい」ならば、「非アレルゲン性」という結論が得られる。追加クエリーに対する答えが「いいえ」ならば、「アレルゲン性」という結論が得られる。ｓＩｇＥの単位はｋＵ／Ｌであり、ＩｇＥ  ｈ２．００８測定値は無次元量である。
【０１４５】
結果
発見：表８は、ＬＥＡＰコホートにおける上位３位のＩｇＥ及び／またはＩｇＧ４エピトープの成績を、それら自身及び閾値０．１ｋＵ／ＬのｓＩｇＥで格付け後の両方で、示す。データは、２．５歳及び５歳時のものである。
【０１４６】
【表８】
2021525378.tif 000012
発見データは、エピトープＩｇＥ  ｈ２．００８が、２．５歳及び５歳時の両方で最高の成績を有することを示す。そのうえさらに、当該エピトープは、単独で及びｓＩｇＥとの組み合わせの両方で、最高の成績を有する。
【０１４７】
検証：ＬＥＡＰ試験及びＣｏＦＡＲ２試験の人口構成は、例えば、Ｔｏｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２０１５，３７２，８０３−８１３及びワールドワイドウェブの「ｌｅａｐｓｔｕｄｙ．ｃｏ．ｕｋ／］（ＬＥＡＰ）に、ならびにＳｉｃｈｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＣＩ，２０１６，１３７，ＡＢ１５２及びワールドワイドウェブの「ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ００３５６ｌ７４］（ＣｏＦＡＲ２）に記載されている。
【０１４８】
図１４に、構成要素ｈ１、ｈ２、ｈ３、エピトープＩｇＥ  ｈ２．００８、ｓＩｇＥ、及びｓＩｇＥとの組み合わせの成績を比較したＲＯＣプロットを示す。
表９に、個別の測定及びｓＩｇＥと統合したものの成績を示す。統合した試験（ｓＩｇＥ＋ｈ２．００８）は、閾値Ｔの様々な例示の値について表す。
【０１４９】
【表９】
2021525378.tif 000013
この実施例では、統合された試験は、Ｔ＝０．３０で強力なルールアウト試験であり、ＮＰＶが９６％である。反対に、Ｔ＝２．０では、統合された試験は、強力なルールイン試験であり、ＰＰＶが９２％である。Ｔ＝１．２では、統合された試験は、強力なルールインかつルールアウト試験の両方である。
【０１５０】
２歳時、ｓＩｇＥ＋Ｉｇｅ＿ｈ２．００８の成績は一定しており、ＡＵＣ、感度、特異性、ＮＰＶ、及びＰＰＶはそれぞれ、８８％、９６％、７１％、９８％、及び５６％である。ＩｇＥ  ｈ２．００８の統計上の有意性は、それ自身またはｓＩｇＥと組み合わせて、２歳及び５歳時に、Ｐ値＜０．０００１である。
【０１５１】
実施例６：多重エピトープ分類器
方法
ＬＥＡＰ及びＣｏＦＡＲ２の試料セットで以下の基準に関してＩｇＥエピトープを評価した：１）両試験にまたがり再現性の高い成績（ＡＵＣ）、及び２）両試験にまたがり、高い成績を与えるサイズ２のエピトープパネルにおける関与の頻度（ロジスティック回帰モデルを使用）。
【０１５２】
結果
上記の基準を用いると、以下の表１０のエピトープリストが、多重エピトープパネルで良い成績を与える最も再現性の高いエピトープである。一変量予測因子としてのそれらの成績を示してあるが、ロジスティック回帰当てはめを用いてＩｇＥ  ｈ２．００８との組み合わせについても示す。
【０１５３】
【表１０】
2021525378.tif 000014
高成績の多重エピトープ診断分類器の形成において、表１１のエピトープはその中から選ぶのに最適なエピトープ類である。
【０１５４】
実施例７：多重バイオマーカー分類器
方法
ＬＥＡＰ及びＣｏＦＡＲ２の試料セットのＩｇＥエピトープを、皮膚プリックテスト（ＳＰＴ）と組み合わせ、以下の基準に関してピーナッツ特異的ＩｇＥ（ｓＩｇＥ）を評価した：１）両試験にまたがり再現性の高い成績（ＡＵＣ）、及び２）高い成績を与えるエピトープパネルにおける関与の頻度（ロジスティック回帰モデルを使用）。ＳＰＴは、膨疹の大きさに関して報告した。
【０１５５】
使用目的症例：使用目的症例は、ＳＰＴが行われた後に検査依頼が出される血液検査である。ＳＰＴの結果（膨疹の大きさ）は、検査依頼書で提供されることになる。
使用目的：血液検査の使用目的は、試験された対象がピーナッツアレルギーを有するか否かを、高い可能性で判定することである。
【０１５６】
単一閾値試験：単一閾値試験は、以下のとおりである：ｓＩｇＥ≦０．１０、またはＳＰＴ≦Ｔ１、またはｈ２．００８≦０．８、またはｈ２．０１０≦Ｔ２ならば、対象は非アレルギー性である。そうでなければ、対象はアレルギー性である。
【０１５７】
基本的に、試験での状態がピーナッツアレルギー性であるとされるためには、対象は立体構造的エピトープヒット（ｓＩｇＥ）、陽性のＳＰＴ、及び複数の直鎖エピトープヒットを有してなければならない。
【０１５８】
この試験の成績は、Ｔ１及びＴ２の選択に依存するものであり、それらを表１１に示す。
【０１５９】
【表１１】
2021525378.tif 000015
二重閾値試験：二重閾値試験は、以下のとおりであり、Ｔ２及びＴ３がそれぞれ下及び上閾値である：ｓＩｇＥ≦０．１０、またはＳＰＴ≦Ｔ１、またはｈ２．００８≦０．８、またはｈ２．０１０≦Ｔ２ならば、対象は非アレルギー性である。そうでなければ、ｈ２．０１０≧Ｔ３ならば、対象はアレルギー性である。そうでなければ、試験結果は、判定保留である。
【０１６０】
この試験の成績は、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３の選択に依存するものであり、それらを表１２に示す。
【０１６１】
【表１２】
2021525378.tif 000016
なお、２つの閾値が存在する場合、試験の感度及び特異性は特定することができない。二重閾値試験は、ほとんどの個体について解釈が困難である。
＊判定保留例のパーセンテージは、推定である。
【０１６２】
実施例８：ランダムフォレスト分類器
方法
ＣｏＦＡＲ自然歴試験にいた対象３１８人からなるコホートを利用して、３〜１５月齢から８歳までの高リスク乳幼児における連続アレルゲン性ピーナッツエピトープに対するＩｇＥ及びＩｇＧ４の結合を測定し、臨床的ピーナッツアレルギーの予測にそれらが利用できるかどうか判定した。Ａｒａ  ｈ１〜３で見られる連続エピトープに対するＩｇＥ及びＩｇＧ４抗体の結合を、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズ系アッセイを用いて評価した。３１８人の対象由来の血清を、ベースライン、２年後、及び５年後に、ＩｇＥ及びＩｇＧ４エピトープ特異的抗体について評価した。ランダムフォレスト及び機械学習アルゴリズムを用いて、エピトープ結合プロファイル（ＥＢＰ）に基づき対象のアレルギー状態のアウトカムを予測することができるモデルを構築した。モデルの成績を、当該コホートから得られた匿名試料（当初のセットの３０％）を用いたリサンプリング法及び検証により評価し、精度、ＡＵＣ、感度、及び特異性を、信頼区間と合わせて得た。２２５人の対象を「モデル開発」のために無作為に選択し、９３人を「試験」のために選択し、５年後にはそれぞれ、合計１２２人及び４８人のアレルギー性患者を選択した。
【０１６３】
結果
年齢無関係モデル及び各年齢に特異的なモデルを用いたところ、後者がより良好な結果をもたらすことがわかった。ＩｇＥプロファイルは、ＯＦＣアウトカムを予測するのに十分であったが、ＩｇＧ４のみを用いたモデルでは同じような成績を出せなかった。年齢無関係モデルは、年齢特異的モデルほど正確ではなかった。評価した戦略の中で、ダウンブートストラップリサンプリングを用いるランダムフォレストアルゴリズムが最良の成績を出し、０年目の交差検証で平均ＡＵＣ＞０．８７であり、２年後及び５年後に行われたＯＦＣについて０．９９及び０．９５に到達した。次いで、各年齢群についての最終的なＩｇＥに基づくモデルを、「見えない」試験データで評価した。ベースラインでのアレルギー状態は、７６人の患者で正確に予測され（精度８２％）、２年後及び５年後ではアレルギー状態がより正確に予測された（それぞれ、９１％及び８７％）。特異性は、全ての年齢群にまたがり互角であったものの、１年目についてのモデルは、より低い真陽性率を有していた。アレルギー性患者が幼いほど、非直鎖、立体構造エピトープに対する反応性を発生させる傾向があるため、分類器としてピーナッツ特異的ＩｇＥを用いたアルゴリズムも開発した。ピーナッツ特異的ＩｇＥ（ｓＩｇＥ）を含めると、エピトープ単独に比べて、ランダムフォレストアルゴリズムを用いるモデルの劇的な改善が見られた。成績は、以下の表１３にまとめるとおりである。
【０１６４】
【表１３】
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表１３において、ランダムフォレスト予測因子Ｔ１（ｓＩｇＥなし）及びＴ２（ｓＩｇＥあり）の一部として上位モデルの「バギング頻度（Ｂａｇｇｉｎｇ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）」の少なくとも７５％で出現したエピトープを以下に列挙する：
Ｔ１エピトープ、ＢＦ順：ｈ２．００８＿ＩｇＥ、ｈ２．００８＿ＩｇＧ４、ｈ１．０２１＿ＩｇＥ、ｈ１．０３０＿ＩｇＥ、ｈ１．０４０＿ＩｇＥ、ｈ３．１０２＿ＩｇＥ、ｈ１．１８６＿ＩｇＧ４、ｈ１．０１５＿ＩｇＥ、ｈ２．０１０＿ＩｇＧ４、ｈ２．０３７＿ＩｇＧ４、ｈ３．０８０＿ＩｇＥ、ｈ１．１９４＿ＩｇＥ、ｈ１．０４１＿ＩｇＥ、ｈ３．１５２＿ＩｇＧ４、ｈ２．０１７＿ＩｇＥ、Ｔ２エピトープ、ＢＦ順：ｈ２．００８＿ＩｇＥ、ｈ２．００８＿ＩｇＧ４、ｈ１．０２１＿ＩｇＥ、ｈ１．０１５＿ＩｇＥ、ｈ１．０２９＿ＩｇＥ、ｈ２．０１０＿ＩｇＧ４、ｈ１．１９４＿ＩｇＥ、ｈ１．１８６＿ＩｇＧ４。
【０１６５】
記載される発明の対象の様々な修飾が、本明細書中記載されるものに加えて、上記の説明から当業者に明らかとなるだろう。そのような修飾も、添付の特許請求の範囲内に含まれるものとする。本出願中引用される各参照（雑誌論文、米国特許及び非米国特許、特許出願公開、国際特許出願公開、遺伝子バンク受入番号などが挙げられるが、これらに限定されない）は、そのまま全体が本明細書中参照により援用される。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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