(57)【要約】  本発明は、式（ＩＶ）のマンヌロン二酸またはその薬学上許容可能な塩（式中、ｎは１〜９から選択される整数であり、ｍは０、１または２から選択され、ｍ’は０または１から選択され、ここで、ｎ＝１〜５であるアルギン酸オリゴサッカリン二酸の総重量は組成物の総重量に対して６０％以上であり、グルロン酸の総重量は組成物の総重量に対して５０％以下である）を含んでなるアルギン酸オリゴサッカリン二酸組成物に関する。2021529197.tif 000013
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（ＩＶ）：
【化１】
2021529197.tif 000012
〔式中、ｎは１〜９から選択される整数であり、ｍは０、１または２から選択され、ｍ’は０または１から選択される〕
のマンヌロン酸および／もしくはグルロン酸またはその薬学上許容可能な塩を含んでなる、アルギン酸オリゴサッカリン二酸組成物であって、
ｎ＝１〜５であるアルギン酸オリゴサッカリン二酸の総重量が、前記組成物の総重量に対して６０％以上であり、
グルロン酸の総重量が、前記組成物の総重量に対して５０％以下である、アルギン酸オリゴサッカリン二酸組成物。
【請求項２】
ｍ＋ｍ’＝１または２であるアルギン酸オリゴサッカリン二酸の総重量が、前記組成物の総重量に対して、５０％以上、好ましくは６０％〜９０％、より好ましくは７０％〜９０％である、請求項１に記載のアルギン酸オリゴサッカリン二酸組成物。
【請求項３】
ｍ＋ｍ’＝１であるアルギン酸オリゴサッカリン二酸の総重量が、前記組成物の総重量に対して、１０％以上、好ましくは３０％〜４０％である、請求項２に記載のアルギン酸オリゴサッカリン二酸組成物。
【請求項４】
ｍ＋ｍ’＝２であるアルギン酸オリゴサッカリン二酸の総重量が、前記組成物の総重量に対して、１０％以上、好ましくは３０％〜５０％である、請求項１に記載のアルギン酸オリゴサッカリン二酸組成物。
【請求項５】
ｎ＝１〜５であるアルギン酸オリゴサッカリン二酸の総重量が、前記組成物の総重量に対して、８０％〜９５％である、請求項１に記載のアルギン酸オリゴサッカリン二酸組成物。
【請求項６】
ｎ＝１〜３のアルギン酸オリゴサッカリン二酸の総重量が、前記組成物の総重量に対して、２０％〜７０％である、請求項１に記載のアルギン酸オリゴサッカリン二酸組成物。
【請求項７】
ｎ＝４〜７であるアルギン酸オリゴサッカリン二酸の総重量に対するｎ＝１〜３であるアルギン酸オリゴサッカリン二酸の総重量の比率が１．０〜３．５の間である、請求項１に記載のアルギン酸オリゴサッカリン二酸組成物。
【請求項８】
ｎ＝４〜７であるアルギン酸オリゴサッカリン二酸の総重量に対するｎ＝１〜３であるアルギン酸オリゴサッカリン二酸の総重量の比率が、１．０〜３．０の間である、請求項７に記載のアルギン酸オリゴサッカリン二酸組成物。
【請求項９】
グルロン酸の総重量が前記組成物の総重量に対して、０．１％〜５０％、好ましくは１〜３０％である、請求項１に記載のアルギン酸オリゴサッカリン二酸組成物。
【請求項１０】
前記組成物においてそれぞれの重合度のアルギン酸オリゴサッカリン二酸の重量パーセンテージ含量が、二糖類５〜２５％、三糖類１５〜３０％、四糖類１５〜２８％、五糖類１０〜２５％、六糖類５〜１５％、七糖類３〜１０％、八糖類２〜５％、九糖類１〜５％、十糖類１〜５％である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のアルギン酸オリゴサッカリン二酸組成物。
【請求項１１】
前記組成物においてそれぞれの重合度のアルギン酸オリゴサッカリン二酸の重量パーセンテージ含量が、二糖類１０〜２０％、三糖類１８〜３０％、四糖類１５〜２８％、五糖類１５〜２０％、六糖類５〜１０％、七糖類３〜５％、八糖類２〜３％、九糖類１〜３％、十糖類１〜３％である、請求項１０に記載のアルギン酸オリゴサッカリン二酸組成物。
【請求項１２】
前記薬学上許容可能な塩がナトリウム塩またはカリウム塩である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のアルギン酸オリゴサッカリン二酸組成物。
【請求項１３】
有効量の請求項１〜１２のいずれか一項に記載のアルギン酸オリゴサッカリン二酸組成物および必要に応じて好適な担体を含んでなる、医薬組成物またはヘルスケア製品。
【請求項１４】
アルツハイマー病、パーキンソン病、炎症、疼痛、糖尿病または血管性認知症の治療のための薬剤またはヘルスケア製品の製造における、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のアルギン酸オリゴサッカリン二酸組成物の使用。
【請求項１５】
アルツハイマー病、パーキンソン病、炎症、疼痛、糖尿病または血管性認知症の治療のための薬剤またはヘルスケア製品として使用するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のアルギン酸オリゴサッカリン二酸組成物。
【請求項１６】
アルツハイマー病、パーキンソン病、炎症、疼痛、糖尿病または血管性認知症を有する患者を治療する方法であって、有効量の請求項１〜１２のいずれか一項に記載のアルギン酸オリゴサッカリン二酸組成物を、それを必要とする患者に投与することを含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病動物モデルを用いて生物活性に対する異なる重合度のアルギン酸オリゴ糖およびその割合の効果を評価する生物活性スクリーニング法により得られた最適なアルギン酸オリゴサッカリン二酸組成物に関する。最後に、スクリーニングから最良の生物活性を有する組成物が得られ、所望の標的物質が限外濾過膜分離の方法によって調製される。
【背景技術】
【０００２】
アルギン酸オリゴ糖は、その潜在的な医学的価値のために広く注目を集めている。アルギン酸オリゴ糖は通常、アルギン酸を原料として用いる多段階方法により調製される。
【０００３】
原料のアルギン酸オリゴ糖分子には、β−１，４−グルコシド結合により連結されたＤ−マンヌロン酸から形成されるＭセグメント、α−１，４−グルコシド結合により連結されたＬ−グルロン酸から形成されるＧセグメント、およびこの２つの糖(sacchorides)のハイブリダイゼーションにより形成されるＭＧセグメントが存在する。Ｄ−マンヌロン酸およびＬ−グルロン酸の構造式を以下の式（Ｉ）および式（ＩＩ）に示す。
【化１】
2021529197.tif 000003
【０００４】
アルギン酸オリゴ糖の構造式は、以下の式（ＩＩＩ）により示される。
【化２】
2021529197.tif 000004
【０００５】
ＭセグメントおよびＧセグメントは、原料であるアルギン酸から分離することができる。一般的な方法を、以下に簡単に記載することができる。アルギン酸を予め分解し、ポリマンヌロン酸とポリグルロン酸の多糖混合物を得、次いでこの多糖混合物を酸性沈殿に供し、その中の特定の量のポリグルロン酸を除去する。例えば、中国特許出願第９８８０６６３７．８号およびＣＮ０２８２３７０７．２号に開示された方法を参照。
【０００６】
オリゴマンヌロン酸を調製するための方法は次の通りである：上記で得たＭセグメント中間体を酸性条件下で加熱することによりさらに酸分解に供し、所望の範囲の分子量を有する小断片マンヌロン酸ポリマーを得ることができる。さらに、分解効率は酸化的分解方法により向上させることができ、一方、還元末端は開環サッカリン二酸(saccharic diacid)に酸化することができる。詳細については、Ｍｅｉｙｕ  Ｇｅｎｇらが出願した中国特許出願第２００５８０００９３９６．５号（特許文献１）および米国特許第８，８３５，４０３  Ｂ２号（特許文献２）を参照。便宜上、特許文献１および２を以後まとめて先行文献といい、引用することによりその全体が本明細書の開示の一部とされる。
【０００７】
先行文献において開示されているマンヌロン二酸を得る反応は、以下の反応式（Ｖ）で表すことができる。すなわち、オリゴマンヌロン酸多糖の還元末端にあるマンヌロン酸のＣ１位のアルデヒド基が、カルボキシル基に酸化される。
【化３】
2021529197.tif 000005
【０００８】
上記の酸化変換過程において、慣用される酸化剤は、アルカリ性硫酸銅溶液、すなわちフェーリング試薬である。先行文献は、この酸化方法を採用している。具体的には、アルカリ性条件下で、反応基質のポリマンヌロン酸、すなわち、上記のＭセグメント中間体を硫酸銅溶液に加え、沸騰水浴中で１５分〜２時間反応させる。この方法は、アルデヒド基を酸化するためにＣｕ２＋イオンを酸化剤として用いており、赤れんが色の酸化第一銅の沈殿が、反応において生成される。この反応は、しばしば還元糖の同定に使用される。
【０００９】
先行文献は、オリゴマンナル酸(oligomannaric acid)が、アルツハイマー病（ＡＤ）および糖尿病に効果を有し、重合度が６のオリゴマンナル酸の活性が最良であることを開示している。アルツハイマー病および２型糖尿病の病因は、アミロイド（β−アミロイドおよびアミリン）と密接に関連している。アミロイドタンパク質は、凝集し、次いでタンパク質オリゴマーを形成し、さらに凝集して線維を形成する。これらのタンパク質凝集物は細胞傷害性であり、細胞における酸化反応を誘導してミトコンドリアを損傷させ、炎症反応などのカスケード反応を惹起して、多数のニューロンおよびβ細胞に損傷を引き起こし、最終的に、アルツハイマー病および２型糖尿病の発症に至る。オリゴマンナル酸はアミロイドタンパク質を標的とし、アミロイドタンパク質により誘導されるカスケード反応と拮抗するため、アルツハイマー病および２型糖尿病を予防および治療する効果を有する。
【００１０】
先行文献に開示されている、抗アルツハイマー病および抗糖尿病効果を有するオリゴマンナル酸を得るためには、原料アルギン酸中のグルロン酸を除去する必要がある。アルギン酸中のグルロン酸の含有率は通常３０％を超え、最大約７０％である。よって、高純度のオリゴマンナル酸を得るためには、実際の生産コストは極めて高い。
【発明の概要】
【００１１】
本発明の第１の態様は、式（ＩＶ）：
【化４】
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〔式中、ｎは１〜９から選択される整数であり、ｍは０、１または２から選択され、ｍ’は０または１から選択される〕
のマンヌロン酸および／もしくはグルロン酸またはその薬学上許容可能な塩を含んでなる、アルギン酸オリゴサッカリン二酸組成物であって、
ｎ＝１〜５であるアルギン酸オリゴサッカリン二酸の総重量が、前記組成物の総重量に対して６０％以上であり、グルロン酸の総重量が、前記組成物の総重量に対して５０％以下である、アルギン酸オリゴサッカリン二酸組成物に関する。
【００１２】
本発明の別の態様は、上記のアルギン酸オリゴサッカリン酸組成物を含んでなる医薬組成物またはヘルスケア製品に関する。本発明の他の態様はまた、アルツハイマー病、パーキンソン病、炎症、疼痛、糖尿病または血管性認知症から選択される疾患の治療におけるアルギン酸オリゴサッカリン酸組成物の適用にも関する。
【００１３】
特に、本発明のアルギン酸オリゴサッカリン酸組成物は、マンヌロン酸とグルロン酸の種々の重合度の混合物であり、その主成分は、２〜１０の重合度のオリゴ糖、β−１，４−グルコシド結合により連結されたマンヌロン酸から形成されるＭセグメント、α−１，４−グルコシド結合により連結されたグルロン酸から形成されるＧセグメント、およびこの２つの糖(sacchorides)の混成により形成されるＭＧセグメントである。マンヌロン二酸はアルツハイマー病（ＡＤ）および糖尿病に対して特定の薬理活性を有することが知られている。最も活性の高い糖類は、五糖類〜十糖類、特に、六糖類である。しかしながら、本発明者らは、マンヌロン酸とグルロン酸の、２〜１０の重合度のオリゴサッカリン二酸混合物もまたアルツハイマー病（ＡＤ）および糖尿病に対して薬理活性を有することを見出しているが、その前提はグルロン酸含有率が特定の範囲内で制御されるということである。言い換えれば、本発明のアルギン酸オリゴサッカリン二酸組成物は、大幅に低減された生産コストで調製することができ、これは実際の生産の実現より容易にし、工業的大量生産の実現を容易にする。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、中間体のＮＭＲスペクトルを示す。
【図２】図２は、生成物Ａ中の二糖類、三糖類および四糖類の質量スペクトルを示す。
【図３】図３は、生成物Ａ中の五糖類、六糖類および七糖類の質量スペクトルを示す。
【図４】図４は、生成物Ａ中の八糖類、九糖類および十糖類の質量スペクトルを示す。
【図５】図５は、生成物ＡのＮＭＲスペクトルを示す。
【図６】図６は、生成物ＢのＮＭＲスペクトルを示す。
【図７】図７は、生成物ＣのＮＭＲスペクトルを示す。
【図８】図８は、生成物ＤのＮＭＲスペクトルを示す。
【図９】図９は、ＡＤ動物のプラットフォーム横断回数に対する種々のオリゴ糖組成物およびマンヌロン二酸六糖類の効果を示す。図の横座標の数字に対応するサンプルは以下のとおりである：ｉ：対照群；ｉｉ：モデル群；ｉｉｉ：生成物Ａ；ｉｖ：生成物Ｂ；ｖ：生成物Ｃ；ｖｉ：生成物Ｄ；ｖｉｉ：マンヌロン二酸六糖類。
【図１０】図１０は、ＡＤ動物の水泳距離に対する種々のオリゴ糖組成物およびマンヌロン二酸六糖類の効果を示し、図の横座標の記号は図９と同様である。
【図１１】図１１は、１１日目のＰＤ動物の降下時間に対する種々のオリゴ糖組成物およびマンヌロン二酸六糖類の効果を示し、図の横座標の記号は図９と同様である。
【図１２】図１２は、１１日目のＰＤ動物の潜時に対する種々のオリゴ糖組成物およびマンヌロン二酸六糖類の効果を示し、図の横座標の記号は図９と同様である。
【図１３ａ】図１３ａおよび１３ｂは、マウスの炎症性腸炎に対する種々のオリゴ糖組成物およびマンヌロン二酸六糖類の治療効果を示し、図の横座標の記号は図９と同様である。
【図１３ｂ】図１３ａおよび１３ｂは、マウスの炎症性腸炎に対する種々のオリゴ糖組成物およびマンヌロン二酸六糖類の治療効果を示し、図の横座標の記号は図９と同様である。
【図１４】図１４は、糖尿病マウスの食後血糖に対する種々のオリゴ糖組成物およびマンヌロン二酸六糖類の効果を示し、図の横座標の記号は図９と同様である。
【図１５】図１５は、酢酸により誘発されたマウスにおけるライジング反応の潜時に対する種々のオリゴ糖組成物およびマンヌロン二酸六糖類の効果を示し、図の横座標の数字に対応するサンプルは以下のとおりである：ｉ：モデル群；ｉｉ：生成物Ａ；ｉｉｉ：生成物Ｂ；ｉｖ：生成物Ｃ；ｖ：生成物Ｄ；ｖｉ：マンヌロン二酸六糖類。
【図１６】図１６は、酢酸により誘発されたマウスにおけるライジング反応の回数に対する種々のオリゴ糖組成物およびマンヌロン二酸六糖類の効果を示し、図の横座標の記号は図１５と同様である。
【図１７】図１７は、ニトログリセリンにより誘発された片頭痛ラットにおけるヘッドスクラッチング回数に対する種々のオリゴ糖組成物およびマンヌロン二酸六糖類の効果を示し、図の横座標の記号は図９と同様である。
【図１８】図１８は、三叉神経節の電気刺激により誘発された片頭痛ラットにおける三叉脊髄核の尾側部（尾側核）のｃ−ｆｏｓ陽性細胞数に対する種々のオリゴ糖組成物およびマンヌロン二酸六糖類の効果を示し、図の横座標の記号は図９と同様である。
【図１９】図１９は、両側総頸動脈閉塞により誘発された血管性認知症を有するマウスの暗所回避試験における潜時に対する種々のオリゴ糖組成物およびマンヌロン二酸六糖類の効果を示し、図の横座標の記号は図９と同様である。
【図２０】図２０は、両側総頸動脈閉塞により誘発された血管性認知症を有するマウスの暗所回避試験における誤りの数に対する種々のオリゴ糖組成物およびマンヌロン二酸六糖類の効果を示し、図の横座標の記号は図９と同様である。
【図２１】図２１は、両側総頸動脈閉塞により誘発された血管性認知症を有するマウスの水迷路試験における逃避潜時に対する種々のオリゴ糖組成物およびマンヌロン二酸六糖類の効果を示し、図の横座標の記号は図９と同様である。
【図２２】図２２は、両側総頸動脈閉塞により誘発された血管性認知症を有するマウスにおけるプラットフォーム横断回数に対する種々のオリゴ糖組成物およびマンヌロン二酸六糖類の効果を示し、図の横座標の記号は図９と同様である。
【発明の具体的説明】
【００１５】
本発明の種々の態様を以下に詳細に説明するが、本発明はこれらの特定の実施態様に限定されない。当業者ならば、以下の実質的な開示を踏まえ、本発明に多少の改変および調整を行うことができ、このような調整も、本発明の範囲に包含される。
【００１６】
アルギン酸オリゴサッカリン二酸組成物
本発明の第１の態様は、式（ＩＶ）：
【化５】
2021529197.tif 000007
〔式中、ｎは１〜９から選択される整数であり、ｍは０、１または２から選択され、ｍ’は０または１から選択される〕
のマンヌロン酸および／もしくはグルロン酸またはその薬学上許容可能な塩を含んでなる、アルギン酸オリゴサッカリン二酸組成物であって、
ｎ＝１〜５であるアルギン酸オリゴサッカリン二酸の総重量は、前記組成物の総重量に対して６０％以上であり、
グルロン酸の総重量は、前記組成物の総重量に対して５０％以下である、アルギン酸オリゴサッカリン二酸組成物に関する。
【００１７】
本発明のアルギン酸オリゴサッカリン酸組成物は、マンヌロン酸とグルロン酸の種々の重合度の混合物であり、その主成分は、２〜１０の重合度のオリゴ糖、β−１，４−グルコシド結合により連結されたマンヌロン酸から形成されるＭセグメント、α−１，４−グルコシド結合により連結されたグルロン酸から形成されるＧセグメント、およびこの２つの糖(sacchorides)のハイブリダイゼーションにより形成されるＭＧセグメントである。先願によれば、マンヌロン二酸はアルツハイマー病（ＡＤ）および糖尿病に対して薬理活性を有することが知られており、マンヌロン二酸における最も活性の高い糖類は、五糖類〜十糖類、特に、六糖類である。しかしながら、既知の従来技術とは異なり、本発明者らは、マンヌロン酸とグルロン酸の、２〜１０の重合度のオリゴサッカリン二酸混合物もまたアルツハイマー病（ＡＤ）および糖尿病に対して薬理活性を有することを見出しているが、グルロン酸含有率は特定の範囲内で制御される必要がある。
【００１８】
実際の調製工程では、上記のような最初のアルギン酸の予備分解後の生成物のグルロン酸含有率は通常、３０％を超え、最大約７０％である。先願に従えば、高い活性を有するオリゴマンナル酸を得るためには、グルロン酸は分離により可能な限り除去しなければならない。しかしながら、本発明者らの上記の発見に基づけば、分解生成物からグルロン酸を分離し除去する必要はない。さらに、本発明者らは、グルロン酸の割合を酸沈澱反応の条件の制御によって特定の範囲内に制御することにより、得られた組成物の活性が、先願に開示されているオリゴマンナル酸六糖類の活性と同等またはむしろそれより良好であり得ることを見出している。また、グルロン酸を不純物として除去する必要がないことから、生成物収量は、先願に開示されている生成物収量よりも有意に高い。よって、それは生産コストを大幅に削減し、廃棄物の排出を低減し、それにより実際の生産の実現が容易となり、産業的大規模生産の実現が容易となる。
【００１９】
好ましい実施態様によれば、本発明のアルギン酸オリゴサッカリン二酸組成物において、ｎ＝１〜５であるアルギン酸オリゴサッカリン二酸の総重量は、前記組成物の総重量に対して８０〜９５％であり、グルロン酸の総重量は、前記組成物の総重量に対して５０％未満である。
【００２０】
好ましい実施態様によれば、本発明のアルギン酸オリゴサッカリン二酸組成物において、ｎ＝４〜７である低重合度のアルギン酸オリゴサッカリン二酸の総重量に対するｎ＝１〜３である低重合度のアルギン酸オリゴサッカリン二酸の総重量の比率は、１．０〜３．５の間である。
【００２１】
好ましい実施態様によれば、本発明のアルギン酸オリゴサッカリン二酸オリゴ糖組成物において、ｍ＋ｍ’＝１または２であるアルギン酸オリゴサッカリン二酸の総重量は、前記組成物の総重量に対して５０％以上、好ましくは６０％〜９０％、より好ましくは７０％〜９０％である。特に、アルギン酸オリゴサッカリン二酸組成物において、ｍ＋ｍ’＝１であるアルギン酸オリゴサッカリン二酸の総重量は、前記組成物の総重量に対して１０％以上、好ましくは３０〜４０％である。別の好ましい実施態様では、アルギン酸オリゴサッカリン二酸組成物において、ｍ＋ｍ’＝２であるアルギン酸オリゴサッカリン二酸の総重量は、前記組成物の総重量に対して１０％以上、好ましくは３０〜５０％である。
【００２２】
好ましい実施態様によれば、本発明のアルギン酸オリゴサッカリン二酸組成物において、ｎ＝１〜５であるアルギン酸オリゴサッカリン二酸の総重量は、前記組成物の総重量に対して８０〜９５％である。
【００２３】
好ましい実施態様によれば、本発明のアルギン酸オリゴサッカリン二酸組成物において、ｎ＝１〜３のアルギン酸オリゴサッカリン二酸の総重量は、前記組成物の総重量に対して２０〜７０％である。
【００２４】
好ましい実施態様によれば、本発明のアルギン酸オリゴサッカリン二酸組成物において、ｎ＝４〜７であるアルギン酸オリゴサッカリン二酸の総重量に対するｎ＝１〜３のアルギン酸オリゴサッカリン二酸の総重量の比率は、１．０〜３．５の間、好ましくは１．０〜３．０の間である。
【００２５】
好ましい実施態様によれば、本発明のアルギン酸オリゴサッカリン二酸組成物において、前記組成物におけるそれぞれの重合度のアルギン酸オリゴサッカリン二酸の重量パーセンテージ含量は、二糖類５〜２５％、三糖類１５〜３０％、四糖類１５〜２８％、五糖類１０〜２５％、六糖類５〜１５％、七糖類３〜１０％、八糖類２〜５％、九糖類１〜５％、十糖類１〜５％である。特に、組成物において、前記組成物におけるオリゴ糖の重量パーセンテージ含量は、二糖類１０〜２０％、三糖類１８〜３０％、四糖類１５〜２８％、五糖類１５〜２０％、六糖類５〜１５％、七糖類３〜５％、八糖類２〜３％、九糖類１〜３％、十糖類１〜３％である。
【００２６】
好ましい実施態様によれば、本発明のアルギン酸オリゴサッカリン二酸組成物において、ｎ＝１〜３であるグルロン酸の総重量は、前記組成物の総重量に対して０．１〜５０％、好ましくは１〜３０％である。
【００２７】
本発明のアルギン酸オリゴサッカリン二酸組成物において、その薬学上許容可能な塩はナトリウム塩またはカリウム塩である。
【００２８】
アルギン酸オリゴサッカリン二酸組成物を調製するための方法
本発明のアルギン酸オリゴサッカリン二酸を調製するための方法は次のとおりである。
【００２９】
アルギン酸の予備分解の後、ポリマンヌロン酸とポリグルロン酸の多糖混合物を得ることができる。この多糖混合物を次に、酸性法により沈澱させて特定の量のポリグルロン酸を除去する。この酸性法による沈澱の過程で、ｐＨが高いほど、得られる多糖混合物中のポリグルロン酸含有率が高くなる。例えば、中国特許出願第９８８０６６３７．８号および第ＣＮ０２８２３７０７．２号に開示されている方法を参照。酸化剤の存在下、前述の多糖混合物の糖鎖は酸化分解を受けて、異なる重合度の酸化オリゴ糖が得られる。これらの酸化オリゴ糖は、オリゴ糖の還元末端におけるマンヌロン酸またはグルロン酸の、３〜６個の炭素を有するサッカリン二酸への酸化を特徴とする。
【００３０】
本発明の反応に特に有利な酸化剤はオゾンである。反応過程で、多糖混合物を含有する溶液にオゾンを導入すると、糖鎖の酸化分解反応が起こり得る。酸化分解工程が行われる温度は、好ましくは０〜７０℃、より好ましくは１０〜４５℃である。上記酸化分解工程のｐＨ値は３〜１３、好ましくは４〜１０、より好ましくは６〜８である。
【００３１】
本発明においてオゾンを用いる酸化分解反応、従来技術で使用されるアルカリ性硫酸銅の存在下での酸性加水分解（先行文献）または過酸化水素および次亜塩素酸ナトリウム（中国特許出願第０１１０７９５２．５号）は、これら３つの方法が糖鎖分解する可能性があるという点で共通している。違いは、分解生成物の糖鎖の還元末端構造が異なるということである。本発明において得られる酸化分解生成物マンヌロン酸またはグルロン酸の還元末端は、３〜６個の炭素を有する二酸構造を含んでなる。さらに、本発明の酸化分解工程で使用される方法は他の利点も有する：１．反応条件が穏和で、特殊な反応条件は必要でない；２．使用されるオゾンは反応の場で調製され、工業生産において輸送圧力を低減することができる；３．反応後、オゾンは、残留試薬の危険なく自動的に酸素に分解され、環境汚染を引き起こさない。反応工程は、下式（ＶＩ）に示される。
【化６】
2021529197.tif 000008
【００３２】
上記反応式（ＶＩ）および一般式（ＩＶ）の化合物の概略図において、
ｍ＝２およびｍ’＝１であるオリゴ糖は、末端に６個の炭素を有するサッカリン酸であり；
ｍ＝１およびｍ’＝１またはｍ＝２およびｍ’＝０であるオリゴ糖は、末端に５個の炭素を有するサッカリン酸であり；
ｍ＝１およびｍ’＝０またはｍ＝０およびｍ’＝１であるオリゴ糖は、末端に４個の炭素を有するサッカリン酸であり；
ｍ＝０およびｍ’＝０であるオリゴ糖は、末端に３個の炭素を有するサッカリン酸である。
【００３３】
組成物において、ｎ＝１〜５のアルギン酸オリゴサッカリン二酸の総重量は前記組成物の総重量に対して８０〜９５％であり、ｎ＝１〜３であるアルギン酸オリゴサッカリン二酸の総重量は、前記組成物の総重量に対して２０〜７０％であり、ｎ＝４〜７であるアルギン酸オリゴサッカリン二酸の総重量に対するｎ＝１〜３であるアルギン酸オリゴサッカリン二酸の総重量の比率は、１．０〜３．５の間、好ましくは１．０〜３．０の間である。グルロン酸の総重量は、前記組成物の総重量に対して５０％以下、好ましくは０．１％〜５０％の間、最も好ましくは１％〜３０％の間である。
【００３４】
例示的な実施態様では、本発明の調製方法は以下の工程を含んでなる。
【００３５】
（１）アルギン酸オリゴサッカリン二酸生成物の調製：
ポリマンヌロン酸とポリグルロン酸の多糖混合物の調製。上記のように、本発明において用いる原料であるポリマンヌロン酸とポリグルロン酸の多糖混合物は、従来技術において公知の方法、例えば、中国特許出願第９８８０６６３７．８号およびＣＮ０２８２３７０７．２号に開示の方法により調製することができる。一般的な方法は、以下に簡単に説明することができる：アルギン酸を予め分解し、ポリマンヌロン酸とポリグルロン酸の多糖混合物を得る。多糖混合物を再び酸性沈澱に供した後に、ポリグルロン酸部の含有率を調整してポリマンヌロン酸とポリグルロン酸の多糖混合物を得ることができる。
【００３６】
オゾン酸化分解。多糖混合物を、適当な量の水に溶かし、室温でまたは加熱条件下で攪拌する。オゾンを連続的に導入し、反応を開始する。反応のｐＨ値は、希塩酸または希ＮａＯＨ溶液を滴下することにより、３〜１３、好ましくは４〜１０、より好ましくは６〜８に調整することができる。温度は、好ましくは０〜７０℃、より好ましくは１０〜４５℃である。反応完了後、オゾンの導入を停止し、ｐＨを中性に調整する。
【００３７】
膜分離および精製。上記で得た反応生成物を、約１０％の濃度の溶液に調製し、分子カットオフ膜により分離して、単糖類以下の分解生成物を除去する。保持液を回収する。使用する分子カットオフ膜は、１０００Ｄａ〜３０００Ｄａ、好ましくは２０００ＤａのＭＷＣＯを有する。回収した液体を、ロータリーエバポレーターで濃縮し、真空下で乾燥させ、オリゴマーアルギン酸オリゴ糖混合物を得る。分析の後、これらの生成物は総て、含量が特定の割合の範囲内である二糖類〜十糖類のオリゴ糖組成物であることが見出される。実施例１〜３に前記方法を例示する。
【００３８】
（２）オリゴ糖組成物の活性比較
本発明のオリゴ糖組成物の薬理活性を先願のオリゴマンナル酸六糖類と同時に比較する。結果は、本発明のオリゴ糖組成物の薬理活性は、先願のオリゴマンナル酸六糖類の薬理活性よりも有意に高いことを示す。理論に縛られるものではないが、組成物中の二糖類〜六糖類の割合が６０％より高く、かつ、グルロン酸の総重量が組成物の５０％未満である場合、その組成物は最も活性が高いが、グルロン酸の割合が６０％を超える場合、その組成物の活性はまた低下すると考えられる。
【００３９】
本発明はまた、上記のようなアルギン酸オリゴ糖組成物および場合により薬学上許容可能な担体または賦形剤を含んでなる薬剤またはヘルスケア製品も提供する。
【００４０】
Remington’s Pharmaceutical Sciences, Martin, E.W., ed., Mack Publishing Company, 第19版 (1995)に記載されるように、様々な割合の有効成分を含んでなるオリゴ糖組成物を調製するための方法は既知であるか、または本発明の開示に基づいて当業者には自明である。医薬組成物を調製するための方法は、適当な医薬賦形剤、担体、希釈剤などを配合することを含む。
【００４１】
本発明の医薬製剤は、従来の混合、溶解または凍結乾燥の方法を含む既知の方法によって調整される。
【００４２】
本発明の医薬組成物は、経口または非経口（静脈内、筋肉内、局所的または皮下経路による）などの選択された投与様式に好適な様々な経路によって患者に投与される。
【００４３】
従って、薬学上許容可能な担体（例えば、不活性希釈剤または可食担体）と調合された本発明の組成物薬は、全身投与、例えば、経口投与することができる。それらは硬または軟ゼラチンカプセルに封入することができ、打錠することができる。経口の治療的投与では、本発明の有効化合物は、１以上の賦形剤と調合し、飲み込み可能な錠剤、口内錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ラウンドタブレット錠剤などとして使用することができる。このような組成物および製剤は、少なくとも０．１％の有効化合物を含有するべきである。このような組成物および処方物の割合は当然のことながら可変であり、所与の単位投与形の約１重量％〜約９９重量％を含んでなり得る。このような治療上有用な組成物において、有効化合物の量は有効な用量レベルが得られるようなものである。
【００４４】
錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などはまた、トラガカントガム、アラビアガム、コーンスターチもしくはゼラチンなどの結合剤；リン酸二カルシウムなどの賦形剤；およびコーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；およびスクロース、フルクトース、ラクトース、もしくはアスパルテームなどの甘味剤；またはペパーミント、冬緑油もしくはチェリーフレーバーなどの香味剤も含んでなり得る。単位投与形がカプセル剤である場合、上記の種類の材料に加え、
それは植物油またはポリエチレングリコールなどの液体担体もまた含んでなり得る。様々な他の材料がコーティングとして存在してもよく、またはそうでなければ、固体単位投与形の物理的形態を改質する。例えば、錠剤、丸剤またはカプセル剤は、ゼラチン、ワックス、セラックまたは糖でコーティングすることができる。シロップまたはエリキシル剤は、有効化合物、甘味剤としてのスクロースまたはフルクトース、保存剤としてのメチルパラベンまたはプロピルパラベン、色素およびフレーバー（例えば、チェリーフレーバーまたはオレンジフレーバー）を含んでなり得る。単位投与形を調製するために使用されるいずれの材料も、使用される量で、必ず薬学上許容可能であり、非毒性であるべきである。加えて、有効化合物は、徐放性製剤および徐放性デバイスに組み込むこともできる。
【００４５】
有効化合物はまた、注入または注射により静脈内または腹腔内投与することもできる。有効化合物またはその塩の水溶液は、場合により、混和性の非毒性界面活性剤を用いて調製することができる。グリセリン、液体ポリエチレングリコール、トリアセチンおよびそれらの混合物中の分散液ならびにオイルも調製可能である。保存および使用の通常の条件下で、これらの製剤は、微生物の増殖を防ぐために保存剤を含んでなる。
【００４６】
注射または注入に好適な医薬投与形は、無菌注射用または注入用溶液または分散液に好適な即時製剤を含んでなる有効成分の無菌水溶液もしくは分散液または無菌粉末（場合により、リポソームに封入）を含み得る。総ての場合で、最終投与形は、無菌、液体および製造および保存条件下で安定でなければならない。液体担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例え、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、植物油、非毒性グリセリド、およびそれらの好適な混合物を含む溶媒または液体分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、リポソームの形成によるか、必要な粒径の維持によるか、または界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物を防ぐために、様々な抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）が使用可能である。多くの場合、糖類、バッファーまたは塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが好ましい。注射用組成物の吸収の延長は、吸収を遅延させる組成物（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を使用することより作製することができる。
【００４７】
無菌注射用溶液は、好適な溶媒中の必要量の有効化合物を、必要に応じて上記で列挙された様々な他の成分と調合し、次いで、濾過除菌を行うことにより調製される。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、これらの技術は、従前に濾過除菌された溶液中に存在する有効成分とそれ以外の必要な成分の粉末を生成する。
【００４８】
有用な固体担体には、粉砕固体（例えば、タルク、クレー、微晶質セルロース、シリカ、アルミナなど）が含まれる。有用な液体担体には、水、エタノールもしくはエチレングリコールまたは水−エタノール／エチレングリコール混合物が含まれ、本発明の合剤は有効含量で、場合により非毒性界面活性剤の助けで溶解または分散させることができる。所与の使用のために特性を最適化するために、アジュバント（例えば、芳香剤）および付加的抗菌剤を添加することができる。
【００４９】
また、使用者の皮膚に直接適用されるコーティング可能なペースト、ゲル、軟膏、石鹸などを形成するために、液体担体とともに増粘剤（例えば、合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩およびエステル、脂肪アルコール、修飾セルロースまたは修飾無機材料）を使用することもできる。
【００５０】
化合物またはそれらの混合物の治療上必要な量は、化合物それ自体のみならず、投与方法、治療される疾患の性質、ならびに患者の年齢および状態によって異なり、最終的にはその時の医師または臨床家の判断によって異なる。
【００５１】
上述の製剤は、ヒトおよび他の哺乳動物への投与に好適な単位用量を含んでなる物理的に分散した単位である単位投与形で提供することができる。単位投与形は１個のカプセル剤もしくは錠剤、または複数のカプセル剤もしくは錠剤であり得る。関与する特定の治療に応じて、有効成分の単位用量の量は、約０．１〜約１０００ｍｇまたはそれを超えて変更または調整可能である。
【００５２】
本発明の別の態様は、本発明のアルギン酸オリゴ糖組成物および必要に応じて適当な担体を含んでなる医薬組成物またはヘルスケア製品を提供する。
【００５３】
本発明の別の態様は、アルツハイマー病を治療するためのアルギン酸オリゴ糖組成物の使用を提供する。
【００５４】
本発明のさらに別の態様は、アルツハイマー病を有する患者を治療するための方法であって、それを必要とする患者に有効量の本発明のアルギン酸オリゴ糖組成物を投与することを含んでなる方法を提供する。
【００５５】
本発明の別の態様は、パーキンソン病を治療するためのアルギン酸オリゴ糖組成物の使用を提供する。
【００５６】
本発明のさらに別の態様は、パーキンソン病を有する患者を治療するための方法であって、それを必要とする患者に有効量の本発明のアルギン酸オリゴ糖組成物を投与することを含んでなる方法を提供する。
【００５７】
本発明のさらに別の態様は、炎症を治療するためのアルギン酸オリゴ糖組成物の使用を提供する。
【００５８】
本発明の別の態様は、炎症を有する患者を治療するための方法であって、それを必要とする患者に有効量の本発明のアルギン酸オリゴ糖組成物を投与することを含んでなる方法を提供する。
【００５９】
本発明の別の態様は、疼痛反応を治療するためのアルギン酸オリゴ糖組成物の使用を提供する。
【００６０】
本発明の別の態様は、疼痛を有する患者を治療するための方法であって、それを必要とする患者に有効量の本発明のアルギン酸オリゴ糖組成物を投与することを含んでなる方法を提供する。
【００６１】
本発明の別の態様は、糖尿病を治療するためのアルギン酸オリゴ糖組成物の使用を提供する。
【００６２】
本発明の別の態様は、糖尿病を有する患者を治療するための方法であって、それを必要とする患者に有効量の本発明のアルギン酸オリゴ糖組成物を投与することを含んでなる方法を提供する。
【００６３】
本発明のさらに別の態様は、血管性認知症を治療するためのアルギン酸オリゴ糖組成物の使用を提供する。
【００６４】
本発明の別の態様は、血管性認知症を有する患者を治療するための方法であって、それを必要とする患者に有効量の本発明のアルギン酸オリゴ糖組成物を投与することを含んでなる方法を提供する。
【００６５】
本明細書で言及される疼痛には、急性疼痛、慢性疼痛、神経因性疼痛、術後痛、慢性腰痛、群発性頭痛、ヘルペス神経痛、幻肢痛、中枢痛、歯痛、オピオイド耐性疼痛、内臓痛、術後痛、骨損傷痛、分娩中の疲労および疼痛、日焼けを含む火傷により引き起こされる疼痛、分娩後痛、片頭痛、アンギナ、および尿生殖路関連疼痛（膀胱炎を含む）、血管痛、三叉神経痛、肋間神経痛、外科的切開痛、慢性筋膜炎痛、踵痛、筋肉痛、骨痛、関節痛、癌性疼痛、非癌性疼痛などを含む、様々な疼痛が含まれる。
【００６６】
本明細書で言及される炎症には、急性炎症、慢性炎症、血管炎症、神経炎症、中枢神経系炎症（例えば脳脊髄炎を含む多発性硬化症など）、末梢神経炎症、関節炎（例えば変形性関節症、仙腸骨炎など、乾癬性関節炎、関節リウマチ、関節リウマチなど）、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患（例えばクローン病および潰瘍性大腸炎）、炎症性糖尿病性潰瘍、全身性紅斑性狼瘡、炎症性皮膚疾患（例えば乾癬、アトピー性皮膚炎、湿疹）などを含む様々な炎症が含まれる。
【００６７】
本発明のアルギン酸オリゴ糖組成物は、従来技術とは異なる方法によって調製され、ＭセグメントおよびＧセグメントを分離する必要はない。それは生産過程の複雑さを大幅に減らし、生産コストを大幅に低減し、調製方法は簡単な反応を含み、有効成分は高含量であり、残留反応試薬が無い。試験から、本発明のアルギン酸オリゴ糖組成物がアルツハイマー病、糖尿病、パーキンソン病、様々な炎症反応、疼痛および血管性認知症を予防および治療する可能性を有することが証明される。
【００６８】
動物モデルおよび薬力学的活性の評価
１．抗ＡＤ薬力学的評価のための動物モデル：Ａβ片側脳室内注射を用いてＡＤモデルを誘導し、モリス水迷路を用いてＡＤモデルラットの学習および記憶行動を評価した。
【００６９】
雄Ｗｉｓｔａｒラット（それぞれ体重１８０〜２２０ｇ）を入手し、各群１４匹として、擬似手術対照群、モデル群、薬物投与群に無作為に群分けを行った。これらのラットをペントバルビタールナトリウム（４０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射により麻酔し、定位固定装置に固定した。皮膚の準備を行い、慣例の消毒を行い、皮膚を切り、前頂を露出させ、海馬のＣＡ１領域の位置特定は、“Rat Brain Stereotactic Atlas” (BAO Xinming, SHU Siyun, Beijing, People’s Medical Press, 1991, 28)の「前頂の後方３．０ｍｍ、ミッドステッチ(midstitch)の横２．２ｍｍ、硬膜下２．８ｍｍ」を参照して行った。モデル群および薬物投与群のそれぞれにおいて、微量注入器を用いて頭蓋の右海馬のＣＡ１領域に垂直に針を挿入した。５μｌの凝縮Ａβ（Ａβ１−４０ＰＢＳ溶液で１．４ｍｇ／ｍＬの溶液として作製し、これを３７℃のインキュベーター内で５日間インキュベートして凝集塊を形成させた）流速１μＬ／分でゆっくり注射した。注射が完了した後、針を５分間保持してＡβを完全に分散させ、その後、針をゆっくり抜いた。術創を縫合糸、ラットを加温して覚醒させた。対照群には同量の無菌ＰＢＳを注射し、他の工程は上記と同様とした。対応する薬物を手術の７日前に投与し、試験の終了まで投与を続けた。
【００７０】
モリス水迷路試験は、術後１１日目に行った。
【００７１】
空間定位試験：  各群のラットを連続５日間、１日１回訓練（すなわち、空間定位試験）を行った。動物がプラットフォームを見つけるのにかかった時間（すなわち、逃避潜時）を記録した。約９０秒後にプラットフォームが見つけられなかった場合、それらのラットは学習および記憶を促すために、プラットフォームに向かって一直線に泳いで３０秒間プラットフォームに立つように誘導した。
【００７２】
空間探索試験：  空間定位試験が完了した１日後に、プラットフォームを除去し、ラットをエントリー地点から水に入れ、ラットがプラットフォームを横断する回数およびプラットフォームが位置していた四分円内の水泳距離の、総距離に対するパーセンテージを記録した。動物の学習および記憶機能を評価した。
【００７３】
２．抗パーキンソン病（ＰＤ）の薬力学的評価のための動物モデル
マウスを、各群１４匹として、ブランク対照群、ＭＰＴＰモデル群および薬物投与群に無作為に群分けした。動物を群分けし、同じ日に薬物を与えた。ブランク対照群およびＭＰＴＰモデル群には胃内投与により生理食塩水を与え、他群には連続１７日間、１日１回、対応する薬物を与えた。モデルを確立する薬物は６日目から与えた。５日間、１日１回、ブランク対照群の動物には１０ｍｌ／ｋｇの生理食塩水を皮下に与え、他の動物には２５ｍｇ／ｋｇのＭＰＴＰを皮下に与えた。
【００７４】
行動試験はそれぞれ１１日目、１４日目および１７日目に行った。マウスをロッド（直径８ｍｍ、高さ５５ｃｍ）の粗面の上部に頭を上にして静かに載せた。マウスが頭を上向きから下向きに調整する時間が潜時（Ｔ−ターン）であり、マウスが下へ移動してから総ての肢がロッドの下へ到達するまでの時間が降下時間（Ｔ−ＬＡ）として記録された。３０秒を超える場合には３０秒と記録する。各マウスを５回試験し、結果の平均を取る。
【００７５】
ＭＰＴＰは、黒質のドーパミンニューロンに対して選択的な破壊効果を有する。ＭＰＴＰ誘発ＰＤ動物モデルは、ヒトパーキンソン病の病理学的変化および臨床的特徴に類似する最も古典的な動物モデルである。ＰＤの主要な症状は、安静時振戦、筋緊張の増大、動きの低下などである。ロッドクライミング試験の旋回時間および降下時間は、マウスの全体的な活動および調整調能力を表し得る。
【００７６】
３．抗炎症反応の薬力学的評価のための動物モデル
（１）関節リウマチモデル−コラーゲン誘発関節炎マウスモデル
体重１９〜２２ｇの雄ＤＢＡ／１マウスを入手し、各群８匹として、ブランク対照群、モデル群、および薬物投与群に無作為に群分けを行った。ブランク対照群を除いて、残りのマウスの尾根部にウシＩＩ型コラーゲン−完全フロイントアジュバント（ＣＩＩ−ＣＦＡ）エマルジョン１０ｍｇ／ｋｇを０日目に皮下注射して感作し、２３日目に、１．５ｍｇ／ｋｇのリポ多糖類（ＬＰＳ）を腹腔内注射した。投与は２８日目に開始し、ブランク対照群およびモデル群には生理食塩水を経口投与し、他群には対応する薬物を投与した（１日１回、連続１４日間）。ＬＰＳ注射の後、毎日マウスの病状を観察した。マウスが疾患を発症し始めた時（関節炎の臨床症状の発現）、疾患の様々な程度に従って（発赤、関節変形）および０〜４ポイントの基準に基づいて、臨床スコアリングを実施し、疾患進行の程度を示した。０は紅斑および腫脹なしを意味し；１は足根骨付近または足関節または中足骨付近の紅斑または軽度腫脹、ならびに１本の足趾の発赤および腫脹の発現を意味し；２は足関節および中足骨の軽微な紅斑および腫脹、または２本以上の足趾の発赤および腫脹を意味し；３は足関節、手関節および中足骨の中等度の紅斑および腫脹を意味し；４は足関節、手関節、中足骨および足趾の総ての重度の発赤および腫脹を意味し；各肢の最も高いスコアは４ポイントであり、各動物の最も高いスコアは１６ポイントである。
【００７７】
（２）多発性硬化症モデル−ＭＯＧ誘発多発性硬化症マウスモデル
体重１７〜２０ｇの雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを入手し、そのうち５匹を無作為に選択してブランク対照群とした。残りの動物は、０日目に背部にミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質−完全フロイントアジュバント（ＭＯＧ−ＣＦＡ）エマルジョンを皮下注射して感作し（１０ｍｇ／ｋｇ  ＭＯＧ、２０ｍｇ／ｋｇ  ＣＦＡ）、０日目および２日目に１０μｇ／ｋｇの百日咳毒素を腹腔内注射した。投与は１日目に開始した。ブランク対照群およびモデル群には生理食塩水を経口投与し、他群には対応する薬剤を投与した（１日１回、連続２４日間）。免疫誘導の約１２日後、免疫されたマウスは症状を発症した。疾患進行の程度を示すために、体重および臨床スコアの毎日の詳細な観察および記録を開始した。０〜４ポイントを用いて異なる程度を示す：０は明らかな疾患徴候のない正常な外観を意味し；１は尾が垂れて脱力、片側の後肢脱力を意味し；２は尾が垂れて脱力、両後肢の脱力およびよろめき歩行を意味し；３ポイントは片側後肢の脱力および麻痺を意味し；４は両後肢の脱力および麻痺を意味する。
【００７８】
（３）全身性紅斑性狼瘡モデル−ＭＲＬ／ｌｐｒ紅斑性狼瘡マウスモデル
Ｆａｓｌｐｒ遺伝子にホモ接合型突然変異を有するＭＲＬ／ｌｐｒトランスジェニックマウスは、自然発生的にリンパ系組織過形成を生じ得る。マウスは、１０〜１４週齢前後に全身性紅斑性狼瘡の症状を発症し始めた。雌ＭＲＬ／ｌｐｒトランスジェニックマウス（９週齢）を、各群マウス８匹として、ブランク対照群、薬物投与群に無作為に群分けした。ブランク対照群には生理食塩水を経口投与し、他群には対応する薬物を投与した（１日１回、連続４週間）。リンパ節のスコアリングを週１回行った。０〜６ポイントは異なる程度を示す：０は正常を意味し；１は両側の１箇所に直径１ｃｍ未満を意味し；２は両側の２箇所に直径１ｃｍ未満を意味し；３は両側の３箇所に直径１ｃｍ未満を意味し；４は両側の１箇所に直径１ｃｍ超、および両側のそれ以外の２箇所に直径１ｃｍ未満を意味し；５は両側の２箇所に直径１ｃｍ超、および両側のそれ以外の箇所に１ｃｍ未満を意味し；６は両側の３箇所に直径１ｃｍ超を意味する。
【００７９】
（４）炎症性腸疾患（ＩＢＤ）モデル−デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発大腸炎マウスモデル
体重１８〜２０ｇの雌Ｃ５７マウス（７〜８週齢）を入手し、各群マウス８匹として、ブランク対照群、モデル群、薬物投与群に無作為に群分けを行った。モデル群および薬物投与群のマウスには、１〜７日目に飲料水として２．５％高分子量ポリマーデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を投与し、投与は１日目に開始した。対照群およびモデル群には生理食塩水を経口投与し、それ以外の群には対応する薬剤を投与した（１日１回、連続３０日間）。３１日目に、マウスを頸椎脱臼によりと殺し、腹腔を開いて腸間膜を分離した。それぞれのマウスの回盲部起始部から肛門終端部を摘出した。各群、順次サンプル摘出を行った。結腸の長さを測定した。
【００８０】
４．抗糖尿病薬力学的評価のための動物モデル
雄ＮＩＨマウスを用い、各群１０匹として、正常対照群、モデル群、および薬物投与群に無作為に群分けした。試験日に、標準群を除き、残りの(reset)動物に１５０ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシンを腹腔内注射した。対応する薬物を１０日間投与した。１１日目に、眼球を取り出し、血糖濃度を測定するために採血した。
【００８１】
５．抗疼痛薬力学的評価のための動物モデル
（１）酢酸により誘発されるマウス疼痛モデル
Ｋｕｎｍｉｎｇマウス、半分は雄、半分は雌、体重１８〜２２ｇを、各群１０匹として、ブランク対照群、モデル群、および薬物投与群に無作為に群分けした。群分け当日から、ブランク対照群には、連続７日間、１日１回、２０ｍｌ／ｋｇの蒸留水を胃内に与え、他群には、連続７日間、１日１回、対応する薬物を胃内投与した。最後の投与の１時間後に、各群のマウスに０．２ｍｌの０．６％酢酸溶液を腹腔内投与し、ライジング潜時（酢酸注射からライジング反応の発生までの時間）および酢酸の注射後２０分以内のマウスのライジング回数を記録した。
【００８２】
酢酸溶液などの化学物質のマウスの腹腔への注射は、マウスの腹膜を刺激し、間欠的な持続疼痛を生じさせることができ、これは腹部の凹み、前腹壁がケージの底部に付く、臀部の屈曲および後肢の進展により現れ、ライジング反応と呼ばれる特異な姿勢を示す。特定の時間内のライジング潜時（酢酸注射からライジング反応の発生までの時間）およびライジング回数は、疼痛の重篤度を表し得る。ライジング潜時が短く、ライジング回数が多いほど、疼痛は重篤である。
【００８３】
（２）ニトログリセリンにより誘発される片頭痛ラットモデル
ＳＤ雄ラット、体重１８０〜２２０ｇを、各群８匹として、ブランク対照群、モデル群、および薬物投与群に無作為に群分けした。投与は群分け当日に開始した。ブランク対照群およびモデル群には、連続２８日間、１日１回、蒸留水を胃内に与え、他群には、連続２８日間、１日１回、対応する薬物を胃内投与した。最後の投与の３０分後に、ブランク対照群を除く動物に生理食塩水を与え、他群には、モデルを確立するために、１０ｍｇ／ｋｇのニトログリセリンを右肩に皮下注射した。モデル確立の後、ラットの耳の発赤の出現時間および持続時間、ならびにモデル確立後３０〜４５分以内のヘッドスクラッチ回数を観察した。脳組織の５−ＨＴ含量を蛍光分光測光法で決定し、Ｅｘ３５６ｎｍ／Ｅｍ４８３ｎｍ波長で測定した。結果はｎｇ／ｇ脳重量で示す。
【００８４】
片頭痛は、血管および神経機構の相互作用による血管および神経の機能不全である。ニトログリセリンは、三叉神経線維の過敏感反応を引き起こし、髄膜血管の拡張、神経性炎症の形成ならびに視床下部、脳幹および脊髄ニューロンの機能の亢進によって片頭痛を引き起こし得る。ニトログリセリンモデルは、１９９５年に確立された動物モデルであり、現在では古典的動物片頭痛モデルとなっている。ニトログリセリンの病原機序に従い、片頭痛の重篤度を評価するために、血管拡張により誘発される耳の発赤時間、疼痛より引き起こされるヘッドスクラッチングの回数およびセロトニン（５−ＨＴ）の（脳組織の疼痛感受性因子）の含量の検出を用いた。耳の発赤が長く、ヘッドスクラッチングの回数が多く、５−ＨＴ含量が高いほど、片頭痛は重篤である。
【００８５】
（３）三叉神経節の電気刺激により誘発される片頭痛ラットモデル
ＳＤラット、５か月齢、雄、体重２００〜２４０ｇを、各群１０匹として、ブランク対照群、擬似手術群、モデル群、および薬物投与群に無作為に群分けした。
【００８６】
各群に対応する薬物を経口投与し、ブランク対照群、擬似手術群、およびモデル群には蒸留水を経口投与した。１０日間の連続投与後に、ブランク対照群以外の総てのラットを抱水クロラール３５０ｍｇ／ｋｇの腹腔内注射により麻酔した。ラットを定位固定装置に固定し、頭頂部を正中切開した。皮膚および筋肉を層毎に切断し、矢状縫合の中央部に橈骨を露出させた。歯科用ドリルを用いて前頂から３ｍｍ後部、３ｍｍ横に孔を開けた後、三叉神経節に電極を挿入した（硬膜から深さ９．５ｍｍ）。手術後も麻酔を継続した。手術は総て無菌条件下で行った。刺激電極をデバッグした。電気刺激パラメーターは、１０分間の刺激で、周期２００ミリ秒、振幅１０ｖ、およびパルス幅(wave width)５ミリ秒とした。擬似手術群では、電極を挿入するだけで刺激は与えなかった。刺激７分前に右大腿静脈に５０ｍｇ／ｋｇのエバンスブルーを注射し、次いで、刺激後２０分以内に灌流および固定を行った。
【００８７】
刺激終了の５分後に、左心室を２分間灌流した。開頭し、全脳を取り出し、病理学的切片において免疫組織化学によりｃ−ｆｏｓを特定するために固定した。電極の位置も特定し、電極挿入部位の硬膜およびもう一方の大脳半球の対応する位置を分離した後、脱イオン水で洗浄し、それをスライドグラス上に平らに拡げ、３７℃で１５分間乾燥させ、７０％グリセロールで固定した。刺激側および対照側の示された領域の蛍光強度を、共焦顕微鏡下、興奮波長６４７ｎｍおよび発光波長６８０ｎｍで検出する。刺激側／対照側の蛍光強度の比を計算して血漿タンパク質管外遊出（ＰＰＥ）を示す。切片厚１０μｍの全脳の連続凍結冠状切片を作製し、ｃ−ｆｏｓ陽性細胞を免疫組織化学蛍光標識した。共焦顕微鏡下で無作為に５視野を選択して、三叉脊髄核の尾側部の実験側と対照側の陽性細胞数を決定し、５視野の平均を陽性細胞の平均数とした。
【００８８】
三叉神経血管系の活性化は、片頭痛患者の疼痛の発生に重要な部分であり、髄膜の神経炎症は片頭痛疼痛の発生と持続に重要な役割を果たす。硬膜に分布している三叉神経が刺激されると、この神経は血管作用物質を放出して、髄膜の血管拡張、血漿成分の管外遊出、肥満細胞の脱顆粒および血小板の活性化を引き起こし、片頭痛を生じる。加えて、疼痛刺激後に放出された神経伝達物質が細胞膜上の対応する受容体に結合する。このセカンドメッセンジャーの作用下で、核内でｃ−ｆｏｓ  ｍＲＮＡ遺伝子が発現され、翻訳され、ｃ−ｆｏｓタンパク質へと合成され、身体に長期の生理作用を及ぼす。従って、片頭痛の発生中、三叉神経の脊髄路核および大縫線内のｃ−ｆｏｓ  ｍＲＮＡおよびｃ−ｆｏｓタンパク質発現細胞の数は増える。よって、片頭痛の程度は、片頭痛動物の硬膜から浸出した血清タンパク質の量および三叉脊髄核の尾側部（尾側核）のｃ−ｆｏｓ陽性細胞の数を測定することによって表すことができる。細胞の数が少ないほど、片頭痛の重篤度は低い。
【００８９】
６．抗血管性認知症の薬力学的評価のための動物モデル
（１）抗血管性認知症の薬力学的評価のための動物モデル−両側総頸動脈閉塞(bilateral common carotid artery occlusion)（ＢＣＣＡｏ）により引き起こされる血管性認知症を有するマウスモデル
両側総頸動脈閉塞（ＢＣＣＡｏ）モデルは、全脳虚血および再潅流により確立される当分野で慣用されている血管性認知症モデルである。
【００９０】
１．１  動物の群分けおよび投与
雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス、体重２２±２ｇを選択し、各群１０匹として、擬似手術群、３０分両側総頸動脈閉塞（ＢＣＣＡｏ）モデル群（３０分ＢＣＣＡｏ群と略す）、および薬物投与群に無作為に群分けした。動物を群分けした後に、擬似手術群および３０分ＢＣＣＡｏ群のマウスには、連続５日間、１日１回、蒸留水を胃内投与し、その後、ＢＣＣＡｏ手術を行った。薬物投与群のマウスには、連続５日間、１日１回、対応する薬物を胃内投与し、その後、ＢＣＣＡｏ手術を行った。ＢＣＣＡｏ手術は、各群のマウスをペントバルビタールナトリウムで麻酔し、モデル群および薬物投与群のマウスの両側総頸動脈を分離して３０分間閉塞させた後、閉塞を除き、頚の創傷を縫合するというものであった。擬似手術群については、両側総頸動脈を分離した後に閉塞させずに、そのまま頚の切開部を縫合した。ＢＣＣＡｏの２４時間後に、各群のマウスに、さらに連続２３日の投与(aministration)の間、術前の投与計画に従って対応する薬物または蒸留水の胃内投与を続けた。マウスの学習および記憶力に対するマンヌロン二酸組成物の改善効果を評価するために、暗所回避試験をＢＣＣＡｏ後７日目に行い、モリス水迷路試験を１３日目に開始した。この行動試験の後、マウスを屠殺し、脳組織を固定した。ＢＣＣＡｏ後のマウスの海馬のニューロン損傷および損傷したニューロンに対するマンヌロン二酸組成物の保護効果をＨＥ染色などの方法により評価した。
【００９１】
１．２  暗所回避試験
空間識別におけるマウスの学習および記憶力を試験するため暗所回避試験を使用する。空間的位置の記憶障害は、海馬または海馬周辺の領域が損傷を受けた際にのみ現れ得る。暗所回避試験ボックスは、マウスの暗闇を追跡し光を避ける習性を利用するように設計された装置である。ボックスの半分は暗室で、もう半分は明室であり、つなぐために中央に小さな孔がある。暗室の床は、銅グリッドで覆われている。動物は暗室に入るとショックを受け、逃避して明室に戻る。動物を２４時間訓練した後に、再び試験を行う。暗所回避試験の潜時は、動物が明室に入れられてから最初に暗室に入るまでの時間を指す。暗所回避試験の潜時が長く、回避誤り回数が少ないほど、動物の記憶は良好である。
【００９２】
１．３  モリス水迷路行動検定
モリス水迷路(Morris water maze)（ＭＷＭ）試験は、実験動物が泳がされ、水中に隠れたプラットフォームを見つけることを学ぶという試験である。この試験は主として、空間的位置および方向（空間的位置認識）に関する実験動物の学習および記憶力を試験するために使用される。マウスモリス水迷路は主として、直径８０ｃｍ高さ７０ｃｍの円筒形のプールと直径８ｃｍの可動式プラットフォームから構成される。プール上の空にあるデジタルカメラがコンピューターに接続されている。試験前に、予め透明な水をプールに注ぐ。水深は１５ｃｍであり、水面はプラットフォーム表面の０．５ｃｍ上である。プールの水を不透明にするために牛乳を加える。試験中、プラットフォームの位置は不変とする。モリス水迷路行動は以下の２つの指標を含む。
【００９３】
空間定位試験は、水迷路を学習し記憶を獲得するマウスの能力を測定するために使用される。この試験は、ＢＣＣＡＯ後１３日目に開始し、４日間続けた。マウスを午前と午後の両方に１回、合計８回訓練した。訓練中、マウスは西の四分円の１／２弧においてプールに入り、頭をプールの壁面に向けて入水する。１２０秒以内にプラットフォームが見つけられなければ、実験者がマウスをプラットフォームに導き、学習および記憶を誘導するために３０秒間放置する。ルートマップおよびマウスがプラットフォームを見つけてよじ登るのに要した時間を観察および記録し、すなわち、モリス水迷路試験の逃避潜時と水泳速度を記録する。モリス水迷路試験の逃避潜時は、マウスが入水してからプラットフォームを見つけるまでの時間を指す。モリス水迷路試験の逃避潜時が短いほど、動物の記憶は良好である。
【００９４】
空間探索試験は、プラットフォームを見つける学習をした後にプラットフォームの空間的場所の記憶を保持するマウスの能力を測定するために使用される。空間定位試験が終了した後に、１日おいてプラットフォームを除去した。マウスを同じエントリー地点から水に入れ、元のプラットフォームを横切る回数を測定した。データの取得および処理はイメージオートマチックモニタリングおよびプロセシングシステムによって完成させた。
【００９５】
（２）中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）により引き起こされる血管性認知症を有するラットモデル
中大脳動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion)（ＭＣＡＯ）モデルは、局所的脳虚血により確立される当分野で慣用されている血管性認知症モデルである。
【００９６】
２．１  動物の群分けおよび投与
雄Ｗｉｓｔａｒラットを選択し、各群１０匹として、ブランク対照群、擬似手術群、モデル群（ＭＣＡＯ群）、および薬物投与群に無作為に群分けした。ブランク群、擬似手術群、およびＭＣＡＯ群の動物には、蒸留水を経口投与し、アルギンオリゴ糖群には総て、対応する用量のアルギンオリゴ糖を経口投与した。各群における連続７日の投与の後、ブランク群のラットを除き、他群のラットを３５０ｍｇ／ｋｇの抱水クロラールの腹腔内注射により麻酔し、ラットボードに左側臥位で固定した。手術顕微鏡下で、外耳道と眼角とをつなぐ中点に沿って皮膚を切開して頬骨弓を露出させた。リン酸塩骨と下顎間の距離を小型の伸延器で拡げた。頭骨の基部に２ｍｍ×２ｍｍの骨窓を開けた。硬膜を開放して中大脳動脈を露出させ、中大脳動脈の片側を高周波電気焼灼により凝固させて局所的虚血を生じさせた（擬似手術群の動物では、中大脳動脈を露出させただけで凝固は行わなかった）。切開部を層毎に縫合した。手術中および手術後の室温は２４〜２５℃に厳格に制御した。手術後、術前投与計画に従って各群に薬物または蒸留水を与え続けた。手術後１１日目に各群にモリス水迷路試験を行った。
【００９７】
この試験では、各群のラットを連続５日間、１日１回、訓練した（すなわち、空間定位試験）。動物がプラットフォームを見つけるのにかかった時間（すなわち、モリス水迷路試験の逃避潜時）を記録した。約１２０秒間プラットフォームを見つけられなかった個体は、学習および記憶を促すために、プラットフォームに向かって一直線に泳いで３０秒間プラットフォームに立つように誘導した。空間定位試験が終了した後、１日おいてプラットフォームを除去した。ラットをエントリー地点から水に入れ、ラットが元のプラットフォームに到達する時間およびラットが元のプラットフォームを横断する回数を記録した（すなわち、空間探索試験）。動物の学習および記憶機能を評価した。モリス水迷路試験の逃避潜時は、ラットが入水してからプラットフォームを見つけるまでの時間を指す。モリス水迷路試験の逃避潜時が短いほど、動物の記憶は良好である。
【実施例】
【００９８】
本発明の利点を、以下の限定されない例においてさらに示す。しかしながら、実施例で使用される特定の材料およびその量、ならびに他の実験条件は、本発明を限定するものと解釈してはならない。特に断りのない限り、本発明における部、割合、パーセンテージ、および同様のものは総て、質量で算出する。
【００９９】
実施例１：
工程１）：アルギン酸オリゴ糖混合物の調製
５Ｋｇのアルギン酸ナトリウムを約１０％の溶液に調製し、希塩酸を加えることにより、ｐＨを約３．０に調整した。この溶液を８０℃に加熱し、撹拌した。これを１０時間反応させた後、加熱を停止した。室温に冷却した後、ＮａＯＨを加えることによりｐＨを９．０に調整し、希塩酸を加えることにより、さらに３．２に調整した、この溶液を５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を回収し、ＨＣｌを加えることによりｐＨを１．０に調整した。遠心分離後、沈殿を回収し、ロータリーエバポレーターで濃縮し、真空乾燥して、１５００ｇの中間体を得た。
【０１００】
中間体のＮＭＲスペクトルについては図１を参照。ＮＭＲ測定方法は次のとおりである：サンプル調製：３０ｍｇの供試サンプルを秤量し、０．５ｍｌのＤ２Ｏに溶解させ、凍結乾燥させ；溶解のために０．５ｍｌの重水素化重水をさらに加え；再び凍結乾燥を行い；最後に、凍結乾燥させたサンプル粉末を適当量の重水で溶解させ、ＮＭＲチューブに移し、１００ｍｇ／ｍｌの供試溶液として調製し；０．０１％（ｗ／ｖ）の重水素化ＴＳＰ（トリメチルシリルプロピオン酸）ナトリウム塩を内部標準として加えた。
【０１０１】
核磁気データの取得および処理：４００Ｍフーリエ変換核磁気共鳴装置により６０℃で一次元水素スペクトルを収集した。パルスシーケンスは４５°パルスで、各取得は４秒であり、緩和時間は１秒であり、蓄積は２０回であり、スペクトル幅は−２ｐｐｍ〜１０ｐｐｍであった。データ収集の後、フーリエ変換を用いて一次元水素スペクトルを得、ＴＳＰメチル水素シグナルを０．００ｐｐｍに設定した。
【０１０２】
中間体がマンヌロン酸セグメント（Ｍ−ブロック、化学シフト５．１ｐｐｍ）およびグルロン酸セグメント（Ｇ−ブロック、化学シフト５．５ｐｐｍ）、ならびにマンヌロン酸とグルロン酸のキメラセグメント（ＭＧ−ブロック、化学シフト５．３ｐｐｍ）を含んでいたことが図１から見て取れる。５００ｇを秤量し、蒸留水に溶かして、５Ｌの容量の溶液を調製した。溶液をＮａＯＨでｐＨ６．５に調整し、水浴中で加熱して、反応温度を７５℃に制御した。オゾンを質量濃度流速８ｇ／時で反応溶液に導入するように、酸素ボンベの出口のガス流速およびオゾン発生器の出力を調整した。４時間の反応の後、オゾンの導入を停止し、好適な量の水を加えて、溶液の濃度を約１０％に調整した。２，０００Ｄａの分子量カットオフを有する限外濾過膜で溶液を濾過し、保持液を回収した。回収した液体を、ロータリーエバポレーターで濃縮し、真空下で乾燥させ、３５０ｇの生成物Ａを得た。
【０１０３】
工程２）：アルギン酸オリゴサッカリン二酸生成物Ａにおける種々の重合度を有するオリゴ糖の割合および構造の分析
上記乾燥アルギン酸オリゴサッカリン二酸生成物Ａ１００ｍｇを正確に秤量し、濃度１０ｍｇ／ｍＬまで水に溶かし、０．２２μｍ濾過膜に通して試験サンプル溶液を得た。組成物における異なる重合度を有するオリゴ糖の割合を、多角度光散乱（ＭＡＬＳ，Ｗｙａｔｔ  Ｃｏ．）と組み合わせたＳｕｐｅｒｄｅｘペプチド分子排除クロマトグラフィー（ＧＥ  Ｃｏ．）により測定した。実験条件は、以下のとおりであった。
クロマトグラフィーカラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘペプチド１０／３００Ｇｌ
移動相：０．１ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ
注入量：１０μＬ
流速：０．３ｍＬ／分
試験結果：二糖類〜十糖類は、それぞれｄｐ２〜ｄｐ１０で表し、ｄｐ２は１８％、ｄｐ３は２４％、ｄｐ４は２３％、ｄｐ５は１４％、ｄｐ６は８％、ｄｐ７は７％、ｄｐ８は２％、ｄｐ９は２％およびｄｐ１０は２％であった。
【０１０４】
工程３）：アルギン酸オリゴサッカリン二酸生成物Ａにおける種々の重合度を有するオリゴ糖の構造のＬＣ−ＭＳ分析
実験条件：
クロマトグラフィーカラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘペプチド１０／３００Ｇｌ
移動相：２０％メタノール＋８０％  ８０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮＨ４Ａｃ
流速：０．１ｍＬ／分
カラム温度：２５℃±０．８℃
質量分析条件：Ａｇｉｌｅｎｔ  ６５４０  ＱＴＯＦ；イオン源：ＥＳＩ衝突電圧１２０Ｖ；陰イオンモード。取得したシグナルの幅（ｍ／ｚ）は、１００〜１０００であった。
【０１０５】
種々の重合度を有するオリゴ糖の質量スペクトルを図１〜３に示す。質量スペクトルにおける種々のシグナルピークを割り当て、生成物Ａにおける全オリゴ糖の分子構造、すなわち一般式（ＩＩＩ）に示される構造を確認した。シグナルの割り当ておよびシグナルに対応する構造は、以下の表１を参照。
【０１０６】
【表１】
2021529197.tif 000009
【０１０７】
上記の質量分析構造解析から、生成物Ａにおける糖鎖の還元末端のマンヌロン酸またはグルロン酸は、サッカリン二酸構造（構造は一般式ＩＶを参照）に酸化され、この構造は、含有率が約１０〜３０％である６個の炭素原子を含んでなるマンナル二酸（mannaric diacid）またはグルロン二酸構造（ｍ＋ｍ’＝３）であり得るか、または、マンナル二酸またはグルロン二酸の脱炭酸生成物、すなわち、５個の炭素原子を含んでなるサッカリン二酸（ｍ＋ｍ’＝２）（３０〜５０％）および４個の炭素原子を含んでなるサッカリン二酸（ｍ＋ｍ’＝１）（３０〜４０％）であり得ることが分かった。
【０１０８】
工程４）アルギン酸オリゴサッカリン二酸生成物Ａのグルロン酸含有率のＮＭＲ分析
サンプル調製：５０ｍｇの供試サンプルを秤量し、０．５ｍｌのＤ２Ｏに溶解させ、凍結乾燥させ；溶解のために０．５ｍｌの重水素化重水をさらに加え；再び凍結乾燥を行い；最後に、凍結乾燥させたサンプル粉末を適当量の重水で溶解させ、それらを総てＮＭＲチューブに移し、１００ｍｇ／ｍｌの供試溶液として調製し；０．０１％（ｗ／ｖ）の重水素化ＴＳＰ（トリメチルシリルプロピオン酸）ナトリウム塩を内部標準として加えた。
【０１０９】
核磁気データの取得および処理：４００Ｍフーリエ変換核磁気共鳴装置により室温で一次元水素スペクトルを収集した。パルスシーケンスは４５°パルスで、各取得は４秒であり、緩和時間は１秒であり、蓄積は２０回であり、スペクトル幅は−２ｐｐｍ〜１０ｐｐｍであった。データ収集の後、フーリエ変換を用いて一次元水素スペクトルを得、ＴＳＰメチル水素シグナルを０．００ｐｐｍに設定した。生成物Ａのプロトン核磁気共鳴スペクトルを図５に示す。図５において、化学シフト４．６ｐｐｍの多重線はマンヌロン酸（Ｍ）Ｃ−１位の水素シグナルであり、５．０ｐｐｍはグルロン酸（Ｇ）のＣ−１位の水素シグナルであり、４．９ｐｐｍはマンヌロン酸およびグルロン酸（ＭＧ）のキメラセグメントのＣ−１水素シグナルである。グルロン酸含有率を計算するための式は以下のとおりである。
【数１】
2021529197.tif 000010
【０１１０】
上式において、Ｉ４．６、Ｉ５．０およびＩ４．９はそれぞれ、マンヌロン酸（Ｍ）、グルロン酸（Ｇ）、マンヌロン酸とグルロン酸キメラのキメラセグメント（ＭＧ）のＣ−１位の水素シグナル積分値である。計算により、Ａのグルロン酸含有率は３０％である。
【０１１１】
実施例２：
１００ｇの市販のアルギン酸ナトリウム（Ｓｉｎｏｐｈａｒｍ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏ．のウェブサイトから購入、ＣＡＳ  Ｎｏ．９００５−３８−３、ＣＰ企画、上海試験）を秤量し、蒸留水を加えて均一に混合し、膨潤後に容量０．８Ｌの溶液として調製した。この溶液をＮａＯＨでｐＨ４．０に調整し、室温（２５℃）にて反応を行った。オゾンを質量濃度流速１ｇ／時で反応溶液に導入するように、酸素ボンベの出口のガス流速およびオゾン発生器の出力を調整した。１０時間の反応の後、オゾンの導入を停止し、好適な量の水を加えて、溶液の濃度を約１５％に調整した。１，０００Ｄａの分子量カットオフを有する限外濾過膜で溶液を濾過し、保持液を回収した。回収した液体を、ロータリーエバポレーターで濃縮し、真空下で乾燥させ、８０ｇの生成物Ｂを得た。
【０１１２】
Ｂにおける種々の重合度のオリゴ糖成分の割合を、多角度光散乱（ＭＡＬＳ，Ｗｙａｔｔ  Ｃｏ．）と組み合わせたＳｕｐｅｒｄｅｘペプチド分子排除クロマトグラフィー（ＧＥ  Ｃｏ．）により決定した。測定方法は、実施例１の関連部分と同じであった。試験結果：二糖類〜十糖類は、それぞれｄｐ２〜ｄｐ１０で表し、ｄｐ２は２５％であり、ｄｐ３は２４％であり、ｄｐ４は１８％であり、ｄｐ５は１３％であり、ｄｐ６は１０％であり、ｄｐ７は５％であり、ｄｐ８は２％であり、ｄｐ９は２％でありおよびｄｐ１０は１％であった。
【０１１３】
生成物Ｂのグルロン酸含有率は、４００Ｍフーリエ変換核磁気共鳴装置を用いて６０℃で５０％であると決定された。測定方法は、実施例１の関連部分と同じであった。プロトン核磁気共鳴スペクトルを図６に示す。マンヌロン酸（Ｍ、化学シフト値４．６ｐｐｍ）およびグルロン酸（Ｇ、化学シフト値５．０ｐｐｍ）の積分面積は比較的近いが、マンヌロン酸とグルロン酸のキメラセグメント（ＭＧ、化学シフト４．９ｐｐｍ）の積分面積は小さいことが図から見て取れる。グルロン酸生成物（Ｇ）の含有率を計算するための式によれば、Ｇの含有率５０％である。
【０１１４】
実施例３：
実施例１の中間体１００ｇを秤量した。懸濁のために水を加えた後、粉末の完全な溶解を可能とするためにＮａＯＨを加えてｐＨ値を塩基性に調整した。この溶液最終的に１Ｌの溶液として調製し、さらにＨＣｌを加えてｐＨ値を２．９５に調整した。白色沈澱の部分が出現し、これを遠心分離により除去した。上清を回収した。さらなる希釈のために蒸留水を容量１．５Ｌの溶液となるまで加えた。この溶液をＮａＯＨでｐＨ９．０に調整し、４５℃の水浴で反応を行った。オゾンを質量濃度流速３ｇ／時で反応溶液に導入するように、酸素ボンベの出口のガス流速およびオゾン発生器の出力を調整した。２時間の反応の後、オゾンの導入を停止し、好適な量の水を加えて、溶液の濃度を約５％に調整した。３，０００Ｄａの分子量カットオフを有する限外濾過膜で溶液を濾過し、保持液を回収した。回収した液体を、ロータリーエバポレーターで濃縮し、真空下で乾燥させ、６０ｇの生成物Ｃを得た。
【０１１５】
Ｃにおける種々の重合度のオリゴ糖の割合を、多角度光散乱（ＭＡＬＳ，Ｗｙａｔｔ  Ｃｏ．）と組み合わせたＳｕｐｅｒｄｅｘペプチド分子排除クロマトグラフィー（ＧＥ  Ｃｏ．）により決定した。測定方法は、実施例１の関連部分と同じであった。試験結果：二糖類〜十糖類は、それぞれｄｐ２〜ｄｐ１０で表し、ｄｐ２は９％であり、ｄｐ３は２１％であり、ｄｐ４は２７％であり、ｄｐ５は１８％であり、ｄｐ６は１３％であり、ｄｐ７は６％であり、ｄｐ８は３％であり、ｄｐ９は２％であり、およびｄｐ１０は１％であった。
【０１１６】
生成物Ｃのグルロン酸の含有率は、４００Ｍフーリエ変換核磁気共鳴装置を用いて６０℃で１０％であると決定され、決定方法は、実施例１の関連部分と同じであった。試験結果を図７に示す。対応するシグナルをそれぞれ積分することにより、マンヌロン酸（Ｍ、化学シフト値４．６ｐｐｍ）の積分面積はグルロン酸（Ｇ、化学シフト値５．０ｐｐｍ）の積分面積の１３倍であり、マンヌロン酸とグルロン酸のキメラセグメント（ＭＧ、化学シフト４．９ｐｐｍ）の積分面積はグルロン酸の積分面積に近い。実施例１に示されるグルロン酸生成物（Ｇ）の含有率を計算するための式によれば、Ｇの含有率は１０％である。
【０１１７】
実施例４：
アルギン酸オリゴサッカリン二酸組成物とマンヌロン二酸六糖類の間の薬理活性の評価
サンプル調製：
１．マンヌロン二酸六糖類の調製
先行特許第２００５８０００９３９６．５号の実施例１および２に開示されている方法を参照し、２０ｇのマンヌロン二酸六糖類を調製した。
【０１１８】
本願の以上の実施例１、２、および３で調製された生成物Ａ、Ｂ、およびＣのオリゴ糖の割合およびグルロン酸含有率を以下の表２に示す。
【０１１９】
２．生成物Ｄの調製
Ｇ含有率の高い生成物を、上記実施例２の調製方法を参照して調製した。アルギン酸ナトリウム原料は、Ｑｉｎｇｄａｏ  Ｈａｉｚｈｉｌｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．により調製されたＧ含有率の高いサンプルであり、調製方法は実施例の対応する部分と同じであった。具体的には、Ｇ含有率の高いアルギン酸ナトリウム粉末５００ｇを蒸留水と均一に混合し、膨潤後に容量５Ｌの溶液として調製し、次いで、ＮａＯＨでｐＨ４．０に調整し、室温２５℃にて反応させた。オゾンを質量濃度流速１ｇ／時で反応溶液に導入するように、酸素ボンベの出口のガス流速およびオゾン発生器の出力を調整した。１２時間の反応の後、オゾンの導入を停止し、好適な量の水を加えて、溶液の濃度を約１５％に調整した。１，０００Ｄａの分子量カットオフを有する限外濾過膜で溶液を濾過し、保持液を回収した。回収した液体を、ロータリーエバポレーターで濃縮し、真空下で乾燥させ、３５０ｇの生成物Ｄを得た。
【０１２０】
Ｄにおける種々の重合度のオリゴ糖成分の割合を、多角度光散乱（ＭＡＬＳ，Ｗｙａｔｔ  Ｃｏ．）と組み合わせたＳｕｐｅｒｄｅｘペプチド分子排除クロマトグラフィー（ＧＥ  Ｃｏ．）により決定した。測定方法は、実施例１の関連部分と同じであった。試験結果：二糖類〜十糖類は、それぞれｄｐ２〜ｄｐ１０で表し、ｄｐ２は１８％であり、ｄｐ３は２６％であり、ｄｐ４は２０％であり、ｄｐ５は１５％であり、ｄｐ６は８％であり、ｄｐ７は７％であり、ｄｐ８は３％であり、ｄｐ９は２％であり、およびｄｐ１０は１％であった。
【０１２１】
生成物Ｄのグルロン酸の含有率は、４００Ｍフーリエ変換核磁気共鳴装置を用いて６０℃で６０％であると決定され、測定方法は、実施例１の関連部分と同じであった。水素核磁気共鳴スペクトルを図８に示す。グルロン酸（Ｇ、化学シフト値５．０ｐｐｍ）の積分面積はマンヌロン酸（Ｍ、化学シフト値４．６ｐｐｍ）の積分面積より大きく、マンヌロン酸とグルロン酸のキメラセグメント（ＭＧ、化学シフト４．９ｐｐｍ）の積分面積は小さいことが図から見て取れる。実施例１のグルロン酸生成物（Ｇ）の含有率を計算するための式によれば、Ｇの含有率は６０％である。
【０１２２】
【表２】
2021529197.tif 000011
【０１２３】
上記４種類のサンプルＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤならびにマンヌロン二酸六糖類サンプルそれぞれ１０ｇを採取した。「抗ＡＤの薬力学的評価のための動物モデル」、「抗ＰＤの薬力学的評価のための動物モデル」、「抗炎症反応の薬力学的評価のための動物モデル」、「抗糖尿病の薬力学的評価のための動物モデル」、「抗疼痛の薬力学的評価のための動物モデル」、および「抗血管性認知症の薬力学的評価のための動物モデル」に記載されている方法に従い、これらのアルギン酸オリゴサッカリン二酸組成物の薬理活性をマンヌロン二酸六糖類の薬理活性と比較した。
【０１２４】
１．抗ＡＤの薬力学的評価
本試験では、擬似手術対照群と比較して、モデル群ではプラットフォームを見つけ出す潜時が有意に長く、評価モデルの確立に成功していたことを示す。モデル群と比較して、各薬物投与群のプラットフォームを見つけ出す潜時は有意に短かった。
【０１２５】
空間定位試験が終了した後、１日おいてプラットフォームを除去し、空間探索試験を開始した。動物がプラットフォームを横断する回数およびプラットフォームが位置していた四分円内の水泳距離の、総距離に対するパーセンテージを観察および記録した。動物の学習および記憶機能を評価した。結果は、図９に示されるように、擬似手術対照群と比較して、モデル群ではプラットフォーム横断回数が有意に減少し、薬物投与群ではプラットフォーム横断回数が有意に増えていたことを示した。プラットフォームが位置していた四分円内の水泳距離の、総距離に対するパーセンテージにも、プラットフォーム横断回数と同様の傾向があった。図１０に示されるように、擬似手術対照群と比較して、元のプラットフォームが位置していた四分円内の水泳距離の、総距離に対するパーセンテージはモデル群では有意に減少し、薬物投与群の、元のプラットフォームが位置していた四分円内の水泳距離の、総距離に対するパーセンテージは、有意に高まっていた。
【０１２６】
試験結果は、生成物Ａ、Ｂ、およびＣの薬力学的活性がマンヌロン二酸六糖類よりも強いことを示し、これは特定の量のグルロン酸を含んでなり、かつ、６０％より高い割合の二糖類〜六糖類を有するオリゴ糖組成物が相乗作用を持っていたことを示す。しかしながら、より高いグルロン酸含有率を有するオリゴ糖組成物Ｄの活性は低下した。
【０１２７】
２．抗ＰＤの薬力学的評価
本試験では、ブランク対照群と比較して、モデル群の潜時および降下時間は有意に長かった。モデル群と比較して、各薬物投与群の潜時および降下時間は様々な程度で短縮された。中でも、生成物Ａ、Ｂ、およびＣの薬力学的活性は、従前に最も活性が高いと予想されていた単一の重合度のマンヌロン二酸六糖類よりも良好であった。しかし、生成物Ｄの活性は、マンヌロン二酸六糖類の活性よりも弱かった。理論に縛られるものではないが、組成物中のグルロン酸の含有率および二糖類〜六糖類の割合は生成物の活性に有意な効果を有するが、グルロン酸の割合が高すぎると、組成物の活性は低下すると推測される。図１１および１２参照。
【０１２８】
３．抗炎症反応の薬力学的評価
（１）コラーゲン誘発関節炎マウスモデル
本試験では、正常対照群と比較して、モデル群は明白な関節炎の症状ならびに足関節(ankle jioint)、手関節および中足骨の中等度の紅斑および膨潤を示した。臨床スコアは６ポイントに達し、関節炎モデルの確立に成功していたことを示す。モデル群と比較して、各薬物投与群の罹患率は様々な程度で低下していた。生成物Ａ、Ｂ、およびＣは、単一の重合度のマンヌロン二酸六糖類と比較してマウスの発症時間を有意に遅延させ、臨床スコアもまた、マンヌロン二酸六糖類と比較して低く、生成物Ａ、Ｂ、およびＣの薬力学的活性がマンヌロン二酸六糖類の薬力学的活性よりも良好であったことを示す。しかし、生成物Ｄの発症はより早く、臨床スコアはより高く、生成物Ｄの活性はマンヌロン二酸六糖類よりも弱かったことを表す。これは、組成物中のグルロン酸の含有率および二糖類〜六糖類の割合が生成物の活性に有意な影響を及ぼすことを実証する。しかしながら、グルロン酸の含有率が高すぎると、組成物の活性は低下する。
【０１２９】
（２）ＭＯＧ誘発多発性硬化症マウスモデル
実験において、正常対照群と比較して、モデル群のほとんどのマウスは、両後肢に脱力と麻痺を示した。モデル群の平均臨床スコアは３ポイントに達し、多発性硬化症モデルの確立に成功していたことを示す。モデル群と比較して、各薬物投与群の炎症進行は様々な程度で軽減された。全実験中および終了時点での生成物Ａ、Ｂ、およびＣの臨床スコアはマンヌロン二酸六糖類よりも低く、生成物Ａ、Ｂ、およびＣの薬力学的活性がマンヌロン二酸六糖類よりも良好であったが、全実験中および終了時点での生成物Ｄの臨床スコアはやや高く、生成物Ｄの抗炎症活性が最も弱かったことを示す。これは、組成物中のグルロン酸の含有率および二糖類〜六糖類の割合が生成物の活性に有意な影響を及ぼすことを実証する。しかしながら、グルロン酸の含有率が高すぎると、組成物の活性は低下する。
【０１３０】
（３）ＭＲＬ／ｌｐｒ紅斑性狼瘡マウスモデル
１０週目から始まり、トランスジェニックマウスは疾患を発症し始め、リンパ節の主張が見られ、リンパ節スコアは経時的に増し続け、モデル群の疾患の発症が成功し、疾患が急速に進行したことを示す。モデル群と比較して、各薬物投与群の疾患の進行は様々な程度で軽減した。生成物Ａ、Ｂ、およびＣは、マンヌロン二酸六糖類と比較して、マウスの発症時間を有意に遅延させ、リンパ節スコアもまたマンヌロン二酸六糖類のスコアよりも低く、生成物Ａ、Ｂ、およびＣの薬力学的活性がマンヌロン二酸六糖類の活性よりも良好であったことを示す。しかしながら、生成物Ｄの発症時間はより早く、そのリンパ節スコアも高く、生成物Ｄの活性がマンヌロン二酸六糖類の活性よりも弱かったことを表す。これは、組成物中のグルロン酸の含有率および二糖類〜六糖類の割合が生成物の活性に有意な影響を及ぼすことを実証する。しかしながら、グルロン酸の含有率が高すぎると、組成物の活性は低下する。
【０１３１】
（４）デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発大腸炎マウスモデル
試験の完了後、正常対照群と比較して、モデル群の結腸は炎症のために有意に短くなり、ほとんどのマウスの体重が低下した。モデル群では、その後半数近くの動物が死亡し、この腸管炎症が極めて重篤であったことを示す。モデル群と比較して、各薬物投与群の腸管炎症は様々な程度で軽減され、このことは、結腸長の回復および生存率の改善に反映された。図１３ａおよび１３ｂから、生成物Ａ、Ｂ、およびＣがマウスの結腸長および動物生存率をマンヌロン二酸六糖類よりも良好にしたことが見て取れ、生成物Ａ、Ｂ、およびＣの薬理活性(pharmalogical activities)が総て、マンヌロン二酸六糖類の薬理活性(pharmalogical activity)よりも良好であったことを示す。しかしながら、生成物Ｄは、マンヌロン二酸六糖類と比較して、短い結腸長およびやや低い生存率を示し、生成物Ｄの活性がマンヌロン二酸六糖類の活性よりも弱かったことを表す。同様に、これらの試験結果は従前の試験とも一致し、組成物中のグルロン酸の含有率および二糖類〜六糖類の割合が生成物の活性に有意な影響を及ぼすことを示す。しかしながら、グルロン酸の含有率が高すぎると、組成物の活性は低下する。
【０１３２】
４．抗糖尿病の薬力学的評価
本試験では、モデル群を正常対照群と比較し、モデル群の食後血糖は有意に高く、評価モデルの確率に成功したことを示す。モデル群と比較して、各薬物投与群の食後血糖は有意に低かった。中でも、生成物Ａ、Ｂ、およびＣの薬力学的活性はマンヌロン二酸六糖類の薬力学的活性よりも良好であったが、生成物Ｄの活性はマンヌロン二酸六糖類の活性よりも弱かった。これらの試験結果は従前の試験とも一致し、組成物中のグルロン酸の含有率および二糖類〜六糖類の割合が生成物の活性に有意な影響を及ぼすことを示す。しかしながら、グルロン酸の含有率が高すぎると、組成物の活性は低下する。図１４参照。
【０１３３】
５．抗疼痛薬力学的評価
（１）酢酸により誘発される疼痛マウスモデル
実験において、ブランク対照群と比較して、モデル群のライジング潜時は有意に短く、ライジング回数は有意に多く、評価モデルの確立に成功したことを示している。モデル群と比較して、各薬物投与群のライジング潜時は有意に延長され、ライジング回数は有意に減少した。中でも、生成物Ａ、Ｂ、およびＣは、マウスのライジング潜時をマンヌロン二酸六糖類よりも延長することができ、ライジング回数をマンヌロン二酸六糖類よりも少なくすることができ、生成物Ａ、Ｂ、およびＣ薬力学的活性がマンヌロン二酸六糖類よりも良好であったことを示す。しかしながら、生成物Ｄはマンヌロン二酸六糖類と比較して、短いライジング潜時およびやや多いライジング回数を示し、を反映して、生成物Ｄの活性がマンヌロン二酸六糖類よりも弱かったことを示す。同様に、これらの試験結果は従前の試験とも一致し、組成物中のグルロン酸の含有率および二糖類〜六糖類の割合が生成物の活性に有意な影響を及ぼすことを示す。しかしながら、グルロン酸の含有率が高すぎると、組成物の活性は低下する。図１５および１６参照。
【０１３４】
（２）ニトログリセリンにより誘発される片頭痛ラットモデル
ラットはニトログリセリンの皮下注射の約３分後に耳の発赤を示し、これは約２．５時間持続した。モデル群におけるモデル確立後３０〜４５分以内のヘッドスクラッチング回数は、ブランク対照群よりも有意に多かった。モデル群と比較して、薬物投与群は、耳の発赤の出現の有意な遅延、耳の発赤の持続時間の短縮、および３０〜４５分以内のヘッドスクラッチング回数の減少を示した。中でも、生成物Ａ、Ｂ、およびＣは、ラットのヘッドスクラッチング回数をマンヌロン二酸六糖類よりも少なくすることができ、生成物Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤの薬理活性(pharmalogical activities)は総て、マンヌロン二酸六糖類の薬理活性(pharmalogical activity)よりも良好であったことを示す。しかしながら、生成物Ｄは、マンヌロン二酸六糖類と比較して、やや多いマウスのヘッドスクラッチング回数を示し、生成物Ｄの活性がマンヌロン二酸六糖類よりも弱かったことを表す。同様に、これらの試験結果は従前の試験とも一致し、組成物中のグルロン酸の含有率および二糖類〜六糖類の割合が生成物の活性に有意な影響を及ぼすことを示す。しかしながら、グルロン酸の含有率が高すぎると、組成物の活性は低下する。図１７参照。
【０１３５】
（３）三叉神経節の電気刺激により誘発される片頭痛モデル
ラット三叉神経節の電気刺激は、硬膜血清タンパク質の滲出を明らかに引き起こした。ブランク対照群および擬似手術群と比較して、モデル群では、ＰＰＥ速度は有意に増大し、ｃ−ｆｏｓ発現陽性細胞の数は有意に増大した。モデル群と比較して、薬物投与群では、ＰＰＥ速度は有意に低下し、ｃ−ｆｏｓ発現陽性細胞の数は有意に減少した。中でも、生成物Ａ、Ｂ、およびＣにおけるｃ−ｆｏｓ発現陽性細胞の数はマンヌロン二酸六糖類よりも少なく、生成物Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤの薬理活性(pharmalogical activities)は総て、マンヌロン二酸六糖類の薬理活性(pharmalogical activity)よりも良好であったことを示す。しかしながら、生成物Ｄは、マンヌロン二酸六糖類と比較して、やや多数のｃ−ｆｏｓ発現陽性細胞を示し、生成物Ｄの活性がマンヌロン二酸六糖類よりも弱かったことを表す。同様に、これらの試験結果は従前の試験とも一致し、組成物中のグルロン酸の含有率および二糖類〜六糖類の割合が生成物の活性に有意な影響を及ぼすことを示す。しかしながら、グルロン酸の含有率が高すぎると、組成物の活性は低下する。図１８参照。
【０１３６】
６．抗血管性認知症の薬力学的評価
（１）両側総頸動脈閉塞（ＢＣＣＡｏ）により誘発される血管性認知症を有するマウスモデル
１．１  暗所回避試験の試験結果
本試験では、モデル群を擬似手術対照群と比較した。モデル群では、暗所回避試験の潜時は有意に短く、誤りの数は有意に増え、モデル群のマウスの記憶力が有意に低下し、評価モデルの確立に成功していたことを示す。モデル群と比較して、各薬物投与群の暗所回避試験における潜時は有意に増し、誤りの数は有意に減少した。中でも、生成物Ａ、Ｂ、およびＣ群のマウスの潜時はマンヌロン二酸六糖類よりも長く、生成物Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤの薬理活性(pharmalogical activities)は総て、マンヌロン二酸六糖類の薬理活性(pharmalogical activity)よりも良好であったことを示す。しかしながら、生成物Ｄは、マンヌロン二酸六糖類と比較してマウスのややより短い潜時を示し、生成物Ｄの活性がマンヌロン二酸六糖類よりも弱かったことを表す。同様に、これらの試験結果は従前の試験とも一致し、組成物中のグルロン酸の含有率および二糖類〜六糖類の割合が生成物の活性に有意な影響を及ぼすことを示す。しかしながら、グルロン酸の含有率が高すぎると、組成物の活性は低下する。図１９および２０参照。
【０１３７】
１．２  モリス水迷路試験の結果
本試験では、擬似手術群と比較して、モデル群のマウスのモリス水迷路試験における逃避潜時が有意に長く、ＢＣＣＡｏ誘発血管性認知症マウスモデルの確立に成功していたことを示す。モデル群と比較して、各薬物投与群の逃避潜時は有意に短かった。中でも、生成物Ａ、Ｂ、およびＣ群のマウスの逃避潜時はマンヌロン二酸六糖類よりも短く、生成物Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤの薬理活性(pharmalogical activities)は総て、マンヌロン二酸六糖類の薬理活性(pharmalogical activity)よりも良好であったことを示す。しかしながら、生成物Ｄは、マンヌロン二酸六糖類と比較してやや長い逃避潜時を示し、生成物Ｄの活性がマンヌロン二酸六糖類よりも弱かったことを表す。図２１参照。
【０１３８】
水迷路空間定位試験の４日後に、プラットフォームを除去した。動物がプラットフォームを横断した回数を観察するために空間探索試験を行った。擬似手術群と比較して、モデル群において、マウスが元のプラットフォームを横断した回数は有意に減少し、ＢＣＣＡｏマウスの記憶力が有意に低下していたことを示し、一方、各薬物投与群においてマウスが元のプラットフォームを横断した回数は増加した。中でも、生成物Ａ、Ｂ、およびＣ群においてマウスがプラットフォームを横断した回数はマンヌロン二酸六糖類よりも多く、生成物Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤの薬理活性(pharmalogical activities)は総て、マンヌロン二酸六糖類の薬理活性(pharmalogical activity)よりも良好であったことを示す。しかしながら、生成物Ｄでは、マウスがプラットフォームを横断した回数はマンヌロン二酸六糖類と比較してやや少なく、生成物Ｄの活性がマンヌロン二酸六糖類よりも弱かったことを表す。図２２参照。
【０１３９】
（２）中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）により引き起こされる血管性認知症を有するラットにおける効果
本試験では、擬似手術群と比較して、モデル群のラットのモリス水迷路試験における逃避潜時は有意に長く、ＭＣＡＯ誘発マウス血管性認知症モデルの確立に成功していたことを示す。モデル群と比較して、各薬物投与群の逃避潜時は有意に短かった。中でも、生成物Ａ、Ｂ、およびＣのラットの逃避潜時はマンヌロン二酸六糖類よりも短く、生成物Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤの薬理活性(pharmalogical activities)は総て、マンヌロン二酸六糖類の薬理活性(pharmalogical activity)よりも良好であったことを示す。しかしながら(Howver)、生成物Ｄは、マンヌロン二酸六糖類と比較してやや長い逃避潜時を示し、生成物Ｄの活性がマンヌロン二酸六糖類よりも弱かったことを表す。
【０１４０】
空間定位試験が終了した１日後に、動物が２分以内にプラットフォームを横断した回数を観察および決定するために空間探索試験を行った。擬似手術群と比較して、モデル群では、ラットが元のプラットフォームを横断した回数が有意に減少し、ＭＣＡＯ群のラットの記憶力が有意に低下していたことを示し、一方、各薬物投与群のラットが元のプラットフォームを横断した回数は増加した。中でも、生成物Ａ、Ｂ、およびＣにおけるラットがプラットフォームを横断した回数はマンヌロン二酸六糖類の場合よりも多く、生成物Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤの薬理活性(pharmalogical activities)は総て、マンヌロン二酸六糖類の薬理活性(pharmalogical activity)よりも良好であったことを示す。しかしながら、生成物Ｄでは、ラットがプラットフォームを横断した回数は、マンヌロン二酸六糖類と比較してやや少なく、生成物Ｄの活性がマンヌロン二酸六糖類よりも弱かったことを表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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