(57)【要約】  本発明の一態様は、標的遺伝子の発現を阻害する能力がある二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤に関する。ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、シード領域に存在する少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み；ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含み、及びｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖は、リガンドを含み、ここで、リガンドは、ＡＳＧＰＲリガンドである。本発明の他の態様は、治療用途に適したこれらのｄｓＲＮＡ分子を含む医薬組成物と、例えば様々な病状を治療するために、標的遺伝子の発現を、これらのｄｓＲＮＡ分子を投与することによって阻害する方法とに関する。
2021523720.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子の発現を阻害する能力がある二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子であって、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、前記アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために前記標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで、前記アンチセンス鎖は、５’領域の最初の９つのヌクレオチド位置内における二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾又はその前駆体を含み、ここで、前記センス鎖は、ＡＳＧＰＲリガンドを含み、ここで、前記不安定化修飾は、修飾アンロック核酸（ｍＵＮＡ）及びグリコール核酸（ＧＮＡ）から選択される、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子。
【請求項２】
前記不安定化修飾ｍＵＮＡは、
【化１】
2021523720.tif 000141
（Ｒ＝Ｈ、ＯＨ；ＯＭｅ；Ｃｌ、Ｆ；ＯＨ；Ｏ−（ＣＨ２）２ＯＭｅ；ＳＭｅ、ＮＭｅ２；ＮＨ２；Ｍｅ；ＣＣＨ（アルキン）、Ｏ−ｎＰｒ；Ｏ−アルキル；Ｏ−アルキルアミノであり；
Ｒ’＝Ｈ、Ｍｅであり；
Ｂ＝Ａ；Ｃ；５−Ｍｅ−Ｃ；Ｇ；Ｉ；Ｕ；Ｔ；Ｙ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環；シュードウラシル；ｉｓｏＣ；ｉｓｏＧ；２，６−ジアミノプリン；シュードシトシン；２−アミノプリン；キサントシン；Ｎ６−アルキル−Ａ；Ｏ６−アルキル−Ｇ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；７−デアザプリン、フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環であり；及び
立体化学は、不特定のキラル中心についてＲ又はＳ及びＲとＳとの組み合わせである）
からなる群から選択される、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項３】
前記不安定化修飾ｍＵＮＡは、
【化２】
2021523720.tif 000142
（Ｒ＝Ｈ、ＯＨ；ＯＭｅ；Ｃｌ、Ｆ；ＯＨ；Ｏ−（ＣＨ２）２ＯＭｅ；ＳＭｅ、ＮＭｅ２；ＮＨ２；Ｍｅ；ＣＣＨ（アルキン）、Ｏ−ｎＰｒ；Ｏ−アルキル；Ｏ−アルキルアミノであり；
Ｒ’＝Ｈ、Ｍｅであり；
Ｂ＝Ａ；Ｃ；５−Ｍｅ−Ｃ；Ｇ；Ｉ；Ｕ；Ｔ；Ｙ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環；シュードウラシル；ｉｓｏＣ；ｉｓｏＧ；２，６−ジアミノプリン；シュードシトシン；２−アミノプリン；キサントシン；Ｎ６−アルキル−Ａ；Ｏ６−アルキル−Ｇ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；７−デアザプリン、フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環であり；及び
立体化学は、不特定のキラル中心についてＲ又はＳ及びＲとＳとの組み合わせである）
からなる群から選択される、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項４】
前記不安定化修飾ｍＵＮＡは、
【化３】
2021523720.tif 000143
（Ｒ＝Ｈ、ＯＭｅ；Ｆ；ＯＨ；Ｏ−（ＣＨ２）２ＯＭｅ；ＳＭｅ、ＮＭｅ２；ＮＨ２；Ｍｅ；Ｏ−ｎＰｒ；Ｏ−アルキル；Ｏ−アルキルアミノであり；
Ｒ’＝Ｈ、Ｍｅであり；
Ｂ＝Ａ；Ｃ；５−Ｍｅ−Ｃ；Ｇ；Ｉ；Ｕ；Ｔ；Ｙ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環；シュードウラシル；ｉｓｏＣ；ｉｓｏＧ；２，６−ジアミノプリン；シュードシトシン；２−アミノプリン；キサントシン；Ｎ６−アルキル−Ａ；Ｏ６−アルキル−Ｇ；７−デアザプリンであり；及び
立体化学は、不特定のキラル中心についてＲ又はＳ及びＲとＳとの組み合わせである）
からなる群から選択される、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項５】
前記不安定化修飾ｍＵＮＡは、
【化４】
2021523720.tif 000144
（Ｒ＝Ｈ、ＯＨ；ＯＭｅ；Ｃｌ、Ｆ；ＯＨ；Ｏ−（ＣＨ２）２ＯＭｅ；ＳＭｅ、ＮＭｅ２；ＮＨ２；Ｍｅ；ＣＣＨ（アルキン）、Ｏ−ｎＰｒ；Ｏ−アルキル；Ｏ−アルキルアミノであり；
Ｒ’＝Ｈ、Ｍｅであり；
Ｂ＝Ａ；Ｃ；５−Ｍｅ−Ｃ；Ｇ；Ｉ；Ｕ；Ｔ；Ｙ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環；シュードウラシル；ｉｓｏＣ；ｉｓｏＧ；２，６−ジアミノプリン；シュードシトシン；２−アミノプリン；キサントシン；Ｎ６−アルキル−Ａ；Ｏ６−アルキル−Ｇ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；７−デアザプリン、フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環であり；及び
立体化学は、不特定のキラル中心についてＲ又はＳ及びＲとＳとの組み合わせである）
からなる群から選択される、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項６】
前記不安定化修飾ｍＵＮＡは、
【化５】
2021523720.tif 000145
（Ｒ＝Ｈ、ＯＨ；ＯＭｅ；Ｃｌ、Ｆ；ＯＨ；Ｏ−（ＣＨ２）２ＯＭｅ；ＳＭｅ、ＮＭｅ２；ＮＨ２；Ｍｅ；ＣＣＨ（アルキン）、Ｏ−ｎＰｒ；Ｏ−アルキル；Ｏ−アルキルアミノであり；
Ｒ’＝Ｈ、Ｍｅであり；
Ｂ＝Ａ；Ｃ；５−Ｍｅ−Ｃ；Ｇ；Ｉ；Ｕ；Ｔ；Ｙ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環；シュードウラシル；ｉｓｏＣ；ｉｓｏＧ；２，６−ジアミノプリン；シュードシトシン；２−アミノプリン；キサントシン；Ｎ６−アルキル−Ａ；Ｏ６−アルキル−Ｇ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；７−デアザプリン、フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環であり；及び
立体化学は、不特定のキラル中心についてＲ又はＳ及びＲとＳとの組み合わせである）
からなる群から選択される、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項７】
前記不安定化修飾ｍＵＮＡは、
【化６】
2021523720.tif 000146
（Ｒ＝Ｈ、ＯＭｅ；Ｆ；ＯＨ；Ｏ−（ＣＨ２）２ＯＭｅ；ＳＭｅ、ＮＭｅ２；ＮＨ２；Ｍｅ；Ｏ−ｎＰｒ；Ｏ−アルキル；Ｏ−アルキルアミノであり；
Ｒ’＝Ｈ、Ｍｅであり；
Ｂ＝Ａ；Ｃ；５−Ｍｅ−Ｃ；Ｇ；Ｉ；Ｕ；Ｔ；Ｙ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環；シュードウラシル；ｉｓｏＣ；ｉｓｏＧ；２，６−ジアミノプリン；シュードシトシン；２−アミノプリン；キサントシン；Ｎ６−アルキル−Ａ；Ｏ６−アルキル−Ｇ；７−デアザプリンであり；及び
立体化学は、不特定のキラル中心についてＲ又はＳ及びＲとＳとの組み合わせである）
からなる群から選択される、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項８】
前記不安定化修飾ｍＵＮＡは、
【化７】
2021523720.tif 000147
【化８】
2021523720.tif 000148
【化９】
2021523720.tif 000149
からなる群から選択される、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項９】
前記二本鎖の前記熱不安定化修飾は、
【化１０】
2021523720.tif 000150
（式中、Ｂは、核酸塩基であり、及び＊は、Ｒ、Ｓ又はラセミのいずれかを表す）
からなる群から選択される、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項１０】
少なくとも４つの２’−フルオロを含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項１１】
前記アンチセンス鎖のヌクレオチド３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しない、請求項１０に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項１２】
以下の特徴：
ａ）前記二本鎖の前記熱不安定化修飾は、前記アンチセンス鎖の前記５’領域の４〜８位に位置すること；
ｂ）前記センス及びアンチセンス鎖の各々は、少なくとも２つの２’−フルオロ修飾を含むこと；及び
ｃ）前記センス鎖のいずれかの末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド
を有する、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項１３】
前記アンチセンス鎖のヌクレオチド３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しない、請求項１６に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項１４】
前記アンチセンス鎖は、以下の特徴：
ａ）前記二本鎖修飾の前記熱不安定化修飾は、前記アンチセンス鎖の４〜８位に位置すること；
ｂ）少なくとも２つの２’−フルオロ修飾；
ｃ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１及び２位間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；
ｄ）前記アンチセンス鎖は、１８〜３５ヌクレオチド長を有すること
の少なくとも２つを有する、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項１５】
前記アンチセンス鎖のヌクレオチド３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しない、請求項１４に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項１６】
前記センス鎖は、以下の特徴：
ａ）前記センス鎖のいずれかの末端に結合された前記ＡＳＧＰＲリガンド；
ｂ）少なくとも２つの２’−フルオロ修飾；
ｃ）前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖は、少なくとも１９のヌクレオチド位置にわたる二本鎖領域を形成するのに十分な相補性を示し、ここで、前記二本鎖の前記熱不安定化修飾は、前記二本鎖領域内に位置すること
の少なくとも１つを有する、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項１７】
前記アンチセンス鎖のヌクレオチド３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しない、請求項１４に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項１８】
【化１１】
2021523720.tif 000151
（式中、Ｂは、核酸塩基である）
からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項１９】
前記安定化修飾は、前記アンチセンス鎖の７位に位置する、１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項２０】
前記ＡＳＧＰＲリガンドは、二価又は三価分岐リンカーを通して結合された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項２１】
前記ＡＳＧＰＲリガンドは、
【化１２】
2021523720.tif 000152
である、請求項２０に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項２２】
標的遺伝子の発現を阻害する能力がある二本鎖ＲＮＡ分子であって、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、前記アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために前記標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで、前記アンチセンス鎖は、５’領域の最初の９つのヌクレオチド位置内における二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、及び前記ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、ここで、前記不安定化修飾は、修飾アンロック核酸（ｍＵＮＡ）及びグリコール核酸（ＧＮＡ）から選択される、二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項２３】
前記不安定化修飾ｍＵＮＡは、
【化１３】
2021523720.tif 000153
（Ｒ＝Ｈ、ＯＨ；ＯＭｅ；Ｃｌ、Ｆ；ＯＨ；Ｏ−（ＣＨ２）２ＯＭｅ；ＳＭｅ、ＮＭｅ２；ＮＨ２；Ｍｅ；ＣＣＨ（アルキン）、Ｏ−ｎＰｒ；Ｏ−アルキル；Ｏ−アルキルアミノであり；
Ｒ’＝Ｈ、Ｍｅであり；
Ｂ＝Ａ；Ｃ；５−Ｍｅ−Ｃ；Ｇ；Ｉ；Ｕ；Ｔ；Ｙ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環；シュードウラシル；ｉｓｏＣ；ｉｓｏＧ；２，６−ジアミノプリン；シュードシトシン；２−アミノプリン；キサントシン；Ｎ６−アルキル−Ａ；Ｏ６−アルキル−Ｇ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；７−デアザプリン、フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環であり；及び
立体化学は、不特定のキラル中心についてＲ又はＳ及びＲとＳとの組み合わせである）
からなる群から選択される、請求項２２に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項２４】
前記不安定化修飾ｍＵＮＡは、
【化１４】
2021523720.tif 000154
（Ｒ＝Ｈ、ＯＨ；ＯＭｅ；Ｃｌ、Ｆ；ＯＨ；Ｏ−（ＣＨ２）２ＯＭｅ；ＳＭｅ、ＮＭｅ２；ＮＨ２；Ｍｅ；ＣＣＨ（アルキン）、Ｏ−ｎＰｒ；Ｏ−アルキル；Ｏ−アルキルアミノであり；
Ｒ’＝Ｈ、Ｍｅであり；
Ｂ＝Ａ；Ｃ；５−Ｍｅ−Ｃ；Ｇ；Ｉ；Ｕ；Ｔ；Ｙ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環；シュードウラシル；ｉｓｏＣ；ｉｓｏＧ；２，６−ジアミノプリン；シュードシトシン；２−アミノプリン；キサントシン；Ｎ６−アルキル−Ａ；Ｏ６−アルキル−Ｇ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；７−デアザプリン、フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環であり；及び
立体化学は、不特定のキラル中心についてＲ又はＳ及びＲとＳとの組み合わせである）
からなる群から選択される、請求項２２に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項２５】
前記不安定化修飾ｍＵＮＡは、
【化１５】
2021523720.tif 000155
（Ｒ＝Ｈ、ＯＭｅ；Ｆ；ＯＨ；Ｏ−（ＣＨ２）２ＯＭｅ；ＳＭｅ、ＮＭｅ２；ＮＨ２；Ｍｅ；Ｏ−ｎＰｒ；Ｏ−アルキル；Ｏ−アルキルアミノであり；
Ｒ’＝Ｈ、Ｍｅであり；
Ｂ＝Ａ；Ｃ；５−Ｍｅ−Ｃ；Ｇ；Ｉ；Ｕ；Ｔ；Ｙ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環；シュードウラシル；ｉｓｏＣ；ｉｓｏＧ；２，６−ジアミノプリン；シュードシトシン；２−アミノプリン；キサントシン；Ｎ６−アルキル−Ａ；Ｏ６−アルキル−Ｇ；７−デアザプリンであり；及び
立体化学は、不特定のキラル中心についてＲ又はＳ及びＲとＳとの組み合わせである）
からなる群から選択される、請求項２２に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項２６】
前記不安定化修飾ｍＵＮＡは、
【化１６】
2021523720.tif 000156
（Ｒ＝Ｈ、ＯＨ；ＯＭｅ；Ｃｌ、Ｆ；ＯＨ；Ｏ−（ＣＨ２）２ＯＭｅ；ＳＭｅ、ＮＭｅ２；ＮＨ２；Ｍｅ；ＣＣＨ（アルキン）、Ｏ−ｎＰｒ；Ｏ−アルキル；Ｏ−アルキルアミノであり；
Ｒ’＝Ｈ、Ｍｅであり；
Ｂ＝Ａ；Ｃ；５−Ｍｅ−Ｃ；Ｇ；Ｉ；Ｕ；Ｔ；Ｙ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環；シュードウラシル；ｉｓｏＣ；ｉｓｏＧ；２，６−ジアミノプリン；シュードシトシン；２−アミノプリン；キサントシン；Ｎ６−アルキル−Ａ；Ｏ６−アルキル−Ｇ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；７−デアザプリン、フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環であり；及び
立体化学は、不特定のキラル中心についてＲ又はＳ及びＲとＳとの組み合わせである）
からなる群から選択される、請求項２２に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項２７】
前記不安定化修飾ｍＵＮＡは、
【化１７】
2021523720.tif 000157
（Ｒ＝Ｈ、ＯＨ；ＯＭｅ；Ｃｌ、Ｆ；ＯＨ；Ｏ−（ＣＨ２）２ＯＭｅ；ＳＭｅ、ＮＭｅ２；ＮＨ２；Ｍｅ；ＣＣＨ（アルキン）、Ｏ−ｎＰｒ；Ｏ−アルキル；Ｏ−アルキルアミノであり；
Ｒ’＝Ｈ、Ｍｅであり；
Ｂ＝Ａ；Ｃ；５−Ｍｅ−Ｃ；Ｇ；Ｉ；Ｕ；Ｔ；Ｙ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環；シュードウラシル；ｉｓｏＣ；ｉｓｏＧ；２，６−ジアミノプリン；シュードシトシン；２−アミノプリン；キサントシン；Ｎ６−アルキル−Ａ；Ｏ６−アルキル−Ｇ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；７−デアザプリン、フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環であり；及び
立体化学は、不特定のキラル中心についてＲ又はＳ及びＲとＳとの組み合わせである）
からなる群から選択される、請求項２２に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項２８】
前記不安定化修飾ｍＵＮＡは、
【化１８】
2021523720.tif 000158
（Ｒ＝Ｈ、ＯＭｅ；Ｆ；ＯＨ；Ｏ−（ＣＨ２）２ＯＭｅ；ＳＭｅ、ＮＭｅ２；ＮＨ２；Ｍｅ；Ｏ−ｎＰｒ；Ｏ−アルキル；Ｏ−アルキルアミノであり；
Ｒ’＝Ｈ、Ｍｅであり；
Ｂ＝Ａ；Ｃ；５−Ｍｅ−Ｃ；Ｇ；Ｉ；Ｕ；Ｔ；Ｙ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環；シュードウラシル；ｉｓｏＣ；ｉｓｏＧ；２，６−ジアミノプリン；シュードシトシン；２−アミノプリン；キサントシン；Ｎ６−アルキル−Ａ；Ｏ６−アルキル−Ｇ；７−デアザプリンであり；及び
立体化学は、不特定のキラル中心についてＲ又はＳ及びＲとＳとの組み合わせである）
からなる群から選択される、請求項２２に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項２９】
前記不安定化修飾ｍＵＮＡは、
【化１９】
2021523720.tif 000159
【化２０】
2021523720.tif 000160
【化２１】
2021523720.tif 000161
からなる群から選択される、請求項２２に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項３０】
前記二本鎖の前記熱不安定化修飾は、
【化２２】
2021523720.tif 000162
（式中、Ｂは、核酸塩基であり、及び＊は、Ｒ、Ｓ又はラセミのいずれかを表す）
からなる群から選択される、請求項２２に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項３１】
【化２３】
2021523720.tif 000163
（式中、Ｂは、核酸塩基である）
からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む、請求項２２に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項３２】
約５５℃〜約６７℃の融解温度を有する、請求項２２に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項３３】
前記アンチセンス鎖の少なくとも５０％は、投与後７日目に肝臓に存在する、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項３４】
以下の特徴：（ｉ）前記アンチセンスは、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｉｉ）前記アンチセンスは、１、２、３又は４つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｉｉｉ）前記センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｉｖ）前記センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖ）前記センス鎖は、１、２、３又は４つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｖｉ）前記ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖｉｉ）前記ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｖｉｉｉ）前記アンチセンス鎖の５’末端での平滑末端；及び（ｉｘ）前記センス鎖は、１つ以上のＬＮＡ修飾を含むことの少なくとも１つをさらに有する、請求項４２に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項３５】
前記アンチセンス鎖の３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しない、請求項３４に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項３６】
前記センス鎖は、２１のヌクレオチドを有し、及び前記アンチセンス鎖は、２３のヌクレオチドを有する、請求項１〜３５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項３７】
単独で又は薬学的に許容できる担体若しくは賦形剤と組み合わせて、請求項１〜３６のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤を含む医薬組成物。
【請求項３８】
請求項１〜３６のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ分子を含む遺伝子サイレンシングキット。
【請求項３９】
細胞における標的遺伝子をサイレンシングするための方法であって、請求項１〜３６のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ分子を前記細胞に導入するステップを含む方法。
【請求項４０】
前記ｄｓＲＮＡ剤は、皮下又は静脈内投与を通して投与される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
細胞における標的遺伝子をサイレンシングするための方法であって、請求項１〜３６のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ分子を前記細胞に発現させるステップを含む方法。
【請求項４２】
ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖によって引き起こされるオフターゲット効果を抑制するための方法であって、請求項１〜３６のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ分子を細胞に導入するステップを含む方法。
【請求項４３】
ポリヌクレオチドを、対象における特異的標的に、請求項１〜３６のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤を投与することによって送達するための方法。
【請求項４４】
前記投与するステップは、筋肉内、気管支内、胸膜内、腹腔内、動脈内、リンパ、静脈内、皮下、脳脊髄又はそれらの組み合わせを含む投与手段によって実施される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
【化２４】
2021523720.tif 000164
（Ｒ＝Ｈ、ＯＨ；ＯＭｅ；Ｃｌ、Ｆ；ＯＨ；Ｏ−（ＣＨ２）２ＯＭｅ；ＳＭｅ、ＮＭｅ２；ＮＨ２；Ｍｅ；ＣＣＨ（アルキン）、Ｏ−ｎＰｒ；Ｏ−アルキル；Ｏ−アルキルアミノであり；
Ｒ’＝Ｈ、Ｍｅであり；
Ｂ＝Ａ；Ｃ；５−Ｍｅ−Ｃ；Ｇ；Ｉ；Ｕ；Ｔ；Ｙ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環；シュードウラシル；ｉｓｏＣ；ｉｓｏＧ；２，６−ジアミノプリン；シュードシトシン；２−アミノプリン；キサントシン；Ｎ６−アルキル−Ａ；Ｏ６−アルキル−Ｇ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；７−デアザプリン、フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環であり；及び
立体化学は、不特定のキラル中心についてＲ又はＳ及びＲとＳとの組み合わせである）
からなる群から選択される化合物。
【請求項４６】
【化２５】
2021523720.tif 000165
（Ｒ＝Ｈ、ＯＨ；ＯＭｅ；Ｃｌ、Ｆ；ＯＨ；Ｏ−（ＣＨ２）２ＯＭｅ；ＳＭｅ、ＮＭｅ２；ＮＨ２；Ｍｅ；ＣＣＨ（アルキン）、Ｏ−ｎＰｒ；Ｏ−アルキル；Ｏ−アルキルアミノであり；
Ｒ’＝Ｈ、Ｍｅであり；
Ｂ＝Ａ；Ｃ；５−Ｍｅ−Ｃ；Ｇ；Ｉ；Ｕ；Ｔ；Ｙ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環；シュードウラシル；ｉｓｏＣ；ｉｓｏＧ；２，６−ジアミノプリン；シュードシトシン；２−アミノプリン；キサントシン；Ｎ６−アルキル−Ａ；Ｏ６−アルキル−Ｇ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；７−デアザプリン、フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環であり；及び
立体化学は、不特定のキラル中心についてＲ又はＳ及びＲとＳとの組み合わせである）
からなる群から選択される化合物。
【請求項４７】
【化２６】
2021523720.tif 000166
（Ｒ＝Ｈ、ＯＭｅ；Ｆ；ＯＨ；Ｏ−（ＣＨ２）２ＯＭｅ；ＳＭｅ、ＮＭｅ２；ＮＨ２；Ｍｅ；Ｏ−ｎＰｒ；Ｏ−アルキル；Ｏ−アルキルアミノであり；
Ｒ’＝Ｈ、Ｍｅであり；
Ｂ＝Ａ；Ｃ；５−Ｍｅ−Ｃ；Ｇ；Ｉ；Ｕ；Ｔ；Ｙ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環；シュードウラシル；ｉｓｏＣ；ｉｓｏＧ；２，６−ジアミノプリン；シュードシトシン；２−アミノプリン；キサントシン；Ｎ６−アルキル−Ａ；Ｏ６−アルキル−Ｇ；７−デアザプリンであり；及び
立体化学は、不特定のキラル中心についてＲ又はＳ及びＲとＳとの組み合わせである）
からなる群から選択される化合物。
【請求項４８】
【化２７】
2021523720.tif 000167
（Ｒ＝Ｈ、ＯＨ；ＯＭｅ；Ｃｌ、Ｆ；ＯＨ；Ｏ−（ＣＨ２）２ＯＭｅ；ＳＭｅ、ＮＭｅ２；ＮＨ２；Ｍｅ；ＣＣＨ（アルキン）、Ｏ−ｎＰｒ；Ｏ−アルキル；Ｏ−アルキルアミノであり；
Ｒ’＝Ｈ、Ｍｅであり；
Ｂ＝Ａ；Ｃ；５−Ｍｅ−Ｃ；Ｇ；Ｉ；Ｕ；Ｔ；Ｙ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環；シュードウラシル；ｉｓｏＣ；ｉｓｏＧ；２，６−ジアミノプリン；シュードシトシン；２−アミノプリン；キサントシン；Ｎ６−アルキル−Ａ；Ｏ６−アルキル−Ｇ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；７−デアザプリン、フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環であり；及び
立体化学は、不特定のキラル中心についてＲ又はＳ及びＲとＳとの組み合わせである）
からなる群から選択される化合物。
【請求項４９】
【化２８】
2021523720.tif 000168
（Ｒ＝Ｈ、ＯＨ；ＯＭｅ；Ｃｌ、Ｆ；ＯＨ；Ｏ−（ＣＨ２）２ＯＭｅ；ＳＭｅ、ＮＭｅ２；ＮＨ２；Ｍｅ；ＣＣＨ（アルキン）、Ｏ−ｎＰｒ；Ｏ−アルキル；Ｏ−アルキルアミノであり；
Ｒ’＝Ｈ、Ｍｅであり；
Ｂ＝Ａ；Ｃ；５−Ｍｅ−Ｃ；Ｇ；Ｉ；Ｕ；Ｔ；Ｙ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環；シュードウラシル；ｉｓｏＣ；ｉｓｏＧ；２，６−ジアミノプリン；シュードシトシン；２−アミノプリン；キサントシン；Ｎ６−アルキル−Ａ；Ｏ６−アルキル−Ｇ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；７−デアザプリン、フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環であり；及び
立体化学は、不特定のキラル中心についてＲ又はＳ及びＲとＳとの組み合わせである）
からなる群から選択される化合物。
【請求項５０】
【化２９】
2021523720.tif 000169
（Ｒ＝Ｈ、ＯＭｅ；Ｆ；ＯＨ；Ｏ−（ＣＨ２）２ＯＭｅ；ＳＭｅ、ＮＭｅ２；ＮＨ２；Ｍｅ；Ｏ−ｎＰｒ；Ｏ−アルキル；Ｏ−アルキルアミノであり；
Ｒ’＝Ｈ、Ｍｅであり；
Ｂ＝Ａ；Ｃ；５−Ｍｅ−Ｃ；Ｇ；Ｉ；Ｕ；Ｔ；Ｙ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環；シュードウラシル；ｉｓｏＣ；ｉｓｏＧ；２，６−ジアミノプリン；シュードシトシン；２−アミノプリン；キサントシン；Ｎ６−アルキル−Ａ；Ｏ６−アルキル−Ｇ；７−デアザプリンであり；及び
立体化学は、不特定のキラル中心についてＲ又はＳ及びＲとＳとの組み合わせである）
からなる群から選択される化合物。
【請求項５１】
【化３０】
2021523720.tif 000170
（式中、Ｂは、核酸塩基であり、及び＊は、Ｒ、Ｓ又はラセミのいずれかを表す）
からなる群から選択される化合物。
【請求項５２】
請求項４５〜５１のいずれか一項に記載の化合物を含む核酸。
【請求項５３】
一本鎖、二本鎖、部分的二本鎖、ヘアピン又は環状核酸である、請求項５２に記載の核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下で２０１８年５月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／６７２，４０５号明細書及び２０１８年８月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／７１９，２９１号明細書の利益を主張し、それらの両方の内容は、その全体が参照により本明細書中に援用される。
【０００２】
本発明は、望まれないオフターゲット効果を低減することによる標的遺伝子発現の阻害にとって有利である特定のモチーフを有するＲＮＡｉ二本鎖剤及び治療用途に適したＲＮＡｉ組成物に関する。加えて、本発明は、例えば、様々な疾患の治療のために、これらのＲＮＡｉ二本鎖剤を投与することによって標的遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
ＲＮＡ干渉又は「ＲＮＡｉ」は、二本鎖ＲＮＡｉ（ｄｓＲＮＡ）が遺伝子発現を遮断し得るという観察を記述するため、Ｆｉｒｅ及び同僚らによって最初に造られた用語である（非特許文献１；非特許文献２）。短いｄｓＲＮＡは、脊椎動物を含む多くの生物において遺伝子特異的な転写後サイレンシングを誘導し、遺伝子機能を試験するための新しいツールを提供している。ＲＮＡｉは、そのサイレンシングトリガーに相同なメッセンジャーＲＮＡを破壊する配列特異的な多成分ヌクレアーゼのＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）によって媒介される。ＲＩＳＣは、その二本鎖ＲＮＡトリガーに由来する短いＲＮＡ（約２２ヌクレオチド）を有することが知られるが、この活性のタンパク質成分は、未知のままであった。
【０００４】
ｓｉＲＮＡのオフターゲット効果の１つがｍｉＲＮＡ様効果であり、ここで、ＲＮＡ干渉におけるコアエフェクターであるアルゴノートタンパク質が、ＲＮＡ干渉を誘導するために人工的に導入されるｓｉＲＮＡをｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）として処理する（非特許文献３）。ｍｉＲＮＡは、遺伝子抑制のため、シード領域（５’末端から２〜９位）と標的ｍＲＮＡとの間の塩基対合を通して標的遺伝子の多くを認識する。ｓｉＲＮＡによって引き起こされるオフターゲットは、ｓｉＲＮＡのＲＩＳＣ負荷アンチセンス鎖のシード領域と１つ以上のｍＲＮＡとの塩基相補性に起因する。ｓｉＲＮＡにおけるｍｉＲＮＡ様オフターゲット効果は、幾つかの試験において報告されており、シード領域の配列に応じて多数の遺伝子の発現に影響し、ｓｉＲＮＡに基づく表現型スクリーニングにおいて最大３０％の陽性ヒットの原因になるほど重大である。加えて、ｍｉＲＮＡの場合、シード領域と標的との間の相互作用が弱くなるとき、それらの３’末端領域内での相補的対合（３’相補的対合）を通して標的遺伝子をサイレンシングすることも報告されており、それは、ｍｉＲＮＡ様オフターゲット効果がかかる機構によって媒介される可能性が高いことを意味する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３９１，８０６−８１１
【非特許文献２】Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５，１８８−２００
【非特許文献３】Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ（２０１５）４，ｅ２５２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、ｓｉＲＮＡ遺伝子療法の遺伝子サイレンシングの有効性を損なうことなく、化学修飾の合理的な適用によってｓｉＲＮＡの設計を調節することにより、ｓｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ様オフターゲット効果を除去又は低減するような努力が続けられている。本発明は、その効果を対象とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、オフターゲット遺伝子サイレンシング効果を低減しつつ、標的遺伝子発現の阻害にとって有利であるｄｓＲＮＡ分子にとって有効なヌクレオチド又は化学的モチーフ及び治療用途に適したＲＮＡｉ組成物を提供する。
【０００８】
本発明者らは、特に、ｄｓＲＮＡ分子が、アンチセンス鎖がシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端から数えて５’末端の２〜９位に）二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、及びｄｓＲＮＡ分子が約４０℃〜約８０℃の範囲内の融解温度を有する場合、ＲＮＡ干渉を媒介するのに、不安定化修飾を欠いている親ｄｓＲＮＡ分子よりも有効であり得ることを発見している。一部の実施形態では、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されている修飾アンロック核酸（ｍＵＮＡ）及びグリコール核酸（ＧＮＡ）構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ、２’−ｍＵＮＡからなる群から選択され、その構造は、以下の通りである：
【化１】
2021523720.tif 000003
（式中、塩基は、修飾又は非修飾核酸塩基であり、及び各構造上のアスタリスクは、Ｒ、Ｓ又はラセミのいずれかを表す）。
【０００９】
本明細書に開示されている様々な態様の一部の実施形態では、不安定化修飾は、２’−５’ＲＮＡ、すなわちＭｏｄ８である。一部の好ましい実施形態では、不安定化修飾が２’−５’ＲＮＡである場合、不安定化修飾は、アンチセンス鎖の（５’末端から数えて）７位に存在する。
【００１０】
本明細書に開示されている様々な態様の一部の実施形態では、５’−ｍＵＮＡは、５’−（Ｓ）−Ｍｅ−ＵＮＡ（Ｙ９５）又は５’−（Ｒ）−Ｍｅ−ＵＮＡ（Ｙ９７）であり、その構造は、図３２に示されている。本明細書に開示されている様々な態様の一部の実施形態では、２’−ｍＵＮＡは、２’−（Ｓ）−Ｍｅ−ＵＮＡ（Ｙ９６）又は２’−（Ｒ）−Ｍｅ−ＵＮＡ（Ｙ９８）であり、その構造は、図３２に示されている。本明細書に開示されている様々な態様の一部の実施形態では、３’−ｍＵＮＡは、３’−（Ｓ）−Ｍｅ−ＵＮＡ（Ｙ９９）、３’−（Ｒ）−Ｍｅ−ＵＮＡ（Ｙ１００）又は３’−（Ｒ）−Ｍｅ−４’−（Ｓ）−ヒドロキシメチル−ＵＮＡ（Ｙ１０２）であり、その構造は、図３２に示されている。本明細書に開示される様々な態様の一部の実施形態では、４’−（β）−ＯＭｅ−ＵＮＡ（Ｙ１０１）であり、その構造は、図３２に示されている。
【００１１】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含み、その構造は、以下の通りである：
【化２】
2021523720.tif 000004
（式中、Ｂは、修飾又は非修飾核酸塩基であり、及び各構造上のアスタリスクは、Ｒ、Ｓ又はラセミのいずれかを表す）。
【００１２】
例示的なＨｙｐ−スペーサーヌクレオシドは、以下：
【化３】
2021523720.tif 000005
を含む。
【００１３】
ＴＮＡヌクレオシドの例は、以下：
【化４】
2021523720.tif 000006
を含む。
【００１４】
不安定化修飾のモノマー及びホスホラミダイトも本明細書に提供される。例えば、モノマー及びホスホラミダイトは、実施例１〜３に記載されている修飾アンロック核酸（ｍＵＮＡ）及びグリコール核酸（ＧＮＡ）構成要素から選択することができる。一部の実施形態では、モノマー又はそのホスホラミダイトは、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。本明細書に記載のｍＵＮＡ及び／又はＧＮＡモノマーの１つ以上を含む核酸も本明細書に提供される。限定はされないが、本明細書に記載のｍＵＮＡ及び／又はＧＮＡモノマーの１つ以上を含む核酸は、一本鎖、二本鎖、部分的二本鎖、ヘアピン又は環状核酸であり得る。
【００１５】
したがって、一態様では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害する能力があるｄｓＲＮＡ分子であって、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、アンチセンス鎖は、シード領域内部に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の、５’末端から数えて２〜９位に）二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、及びｄｓＲＮＡは、以下の特徴：（ｉ）約４０℃〜約８０℃の融解温度（Ｔｍ）；（ｉｉ）アンチセンスは、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｉｉｉ）アンチセンスは、１、２、３又は４つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｉｖ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｖ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖｉ）センス鎖は、１、２、３又は４つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；及び（ｉｘ）アンチセンス鎖の５’末端での平滑末端の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８又は９つ全部）をさらに有する、ｄｓＲＮＡ分子を提供する。一部の実施形態では、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。
【００１６】
一部の実施形態では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害する能力があるｄｓＲＮＡ分子であって、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、アンチセンス鎖は、シード領域（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の、５’末端から数えて２〜９位、好ましくは３〜８位）内部に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、及びｄｓＲＮＡ分子は、以下の特徴：（ｉ）約４０℃〜約８０℃の融解温度（Ｔｍ）；（ｉｉ）アンチセンスは、６、７、８、９、１０、１１又は１２の２’−ＯＭｅ修飾を含むこと；（ｉｉｉ）アンチセンスは、１、２、３又は４つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｉｖ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｖ）センス鎖は、６、７、８、９、１０、１１又は１２の２’−ＯＭｅ修飾を含むこと；（ｖｉ）センス鎖は、１、２、３又は４つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも１、２、３、４又は５つの２’−デオキシ修飾を含むこと；（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；及び（ｉｘ）アンチセンス鎖の５’末端の平滑末端の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８又は９つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される、ｄｓＲＮＡ分子を提供する。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【００１７】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃又は６５℃からの範囲の下端及び約７０℃、７５℃又は８０℃からの範囲の上端の融解温度を有する。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約５５℃〜約７０℃の範囲内の融解温度を有する。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約５７℃〜約６７℃の範囲内の融解温度を有する。一部の特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約６０℃〜約６７℃の範囲内の融解温度を有する。一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約６２℃〜約６６℃の範囲内の融解温度を有する。
【００１８】
本発明者らは、少なくとも６０℃の融解温度を有するｄｓＲＮＡ分子がインビボ及びインビトロでより有効であることも発見している。したがって、一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、少なくとも６０℃の融解温度を有する。
【００１９】
本発明者らは、ｄｓＲＮＡ分子がインビボでより有効であるには、投与後、例えばマウス肝臓において、インビボで７日目、アンチセンス鎖が少なくとも４０〜５０％存在する必要があることも発見した。
【００２０】
別の態様では、本発明は、本発明のｄｓＲＮＡ分子を、皮下又は静脈内投与によって対象における特異標的に送達するための方法をさらに提供する。本発明は、前記薬剤を皮下又は静脈内投与によって対象における特異標的に送達するための方法における使用を意図した本発明のｄｓＲＮＡ分子をさらに提供する。
【００２１】
本特許又は出願ファイルは、色付きで作成された少なくとも１つの図面を有する。カラー図面付きの特許又は特許出願公開のコピーは、請求及び必要料金の支払いに応じて特許庁により提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の一部の例示的な不安定化修飾を示す。
【図２】本発明の他の例示的な不安定化修飾を示す。
【図３】アンチセンス鎖のシード領域へのＧＮＡ−ｉｓｏＣの組み込みがＨＡＯ１配列においてＧＮＡ−Ｃよりも高い耐容性を有することを示す棒グラフである。
【図４】アンチセンスシード領域への３’−ＲＮＡの組み込みがデュアルルシフェラーゼアッセイにおけるオフターゲットの位置特異的減少をもたらすことを示すグラフである。
【図５】アンチセンスシード領域への３’−ＲＮＡの組み込みがインビボで十分な耐容性を有することを示す棒グラフである（ＨＡＯ１配列）。
【図６】アンチセンスシード領域へのＭｏｄ５〜７つの組み込みがインビボで十分な耐容性を有することを示すグラフである（ＴＴＲ配列１）。
【図７】アンチセンスシード領域へのＭｏｄ５〜７つの組み込みがインビボで十分な耐容性を有することを示すグラフである（ＴＴＲ配列２）。
【図８】非環状／非天然ヌクレオシドアミダイトを有する例示的なｓｉＲＮＡの概略図である。
【図９】天然に存在する塩基修飾ヌクレオシドを有する例示的なｓｉＲＮＡの概略図である。
【図１０】例示的な銅を含まない「クリック」ケミストリー結合されたＢｉｓ−ＲＮＡｉ構築物を示すスキームである。
【図１１】「クリック」リンカーによるＦ７ノックダウンを示すグラフである。
【図１２】「クリック」リンカーによるＴＴＲノックダウンを示すグラフである。
【図１３】トレオース核酸（ＴＮＡ）及びリボース核酸（ＲＮＡ）の構造を示す。
【図１４】３’−エキソヌクレアーゼに対するＴＮＡ修飾オリゴヌクレオチドの安定性を示すグラフである。
【図１５】５’−エキソヌクレアーゼに対するＴＮＡ修飾オリゴヌクレオチドの安定性を示すグラフである。
【図１６】インビトロのｓｉＲＮＡ活性に対する単一のＴＮＡヌクレオチドの組み込みの影響を示すグラフである。
【図１７】インビトロのｓｉＲＮＡ活性に対する単一のＴＮＡ塩基対の組み込みの影響を示すグラフである。
【図１８】インビトロ遺伝子サイレンシングアッセイの用量反応曲線を示すグラフである。
【図１９−２０】血清ＴＴＲレベルでＴＮＡ修飾ｓｉＲＮＡ二本鎖を使用したマウスにおけるインビボの遺伝子サイレンシングの効果を示すグラフである。
【図２１】ヒトアルゴノート２タンパク質（ｈＡｇｏ２）に結合したＴＮＡの構造モデルを示す。
【図２２】様々な５’−（Ｒ）及び（Ｓ）−メチルグアノシン構成要素の構造を示す。
【図２３】オリゴヌクレオチド内の５’−Ｃ−メチル−ヌクレオシドの構造を示す。
【図２４Ａ】ＰＯ又はＰＳ結合を有する、グアノシン及び（Ｒ）又は（Ｓ）−５’−Ｃ−メチルグアノシン（Ｃ５’−ＭｅＧ）で５’末端が修飾されたｄＴ２０の、５’エキソヌクレアーゼ−ホスホジエステラーゼＩＩとのインキュベーション時の時間の関数としての減衰曲線である。
【図２４Ｂ】ＰＯ又はＰＳ結合を有する、グアノシン及び（Ｒ）又は（Ｓ）−５’−Ｃ−メチルグアノシン（Ｃ５’−ＭｅＧ）で５’末端が修飾されたｄＴ２０の、５’エキソヌクレアーゼ−ホスホジエステラーゼＩＩとのインキュベーション時の時間の関数としての減衰曲線である。
【図２５Ａ】グアノシン及び（Ｒ）又は（Ｓ）−５’−Ｃ−メチルグアノシン（Ｃ５’−ＭｅＧ）で３’末端が修飾されたｄＴ２０の、ヘビ毒ホスホジエステラーゼとのインキュベーション時の時間の関数としての減衰曲線を示す。
【図２５Ｂ】グアノシン及び（Ｒ）又は（Ｓ）−５’−Ｃ−メチルグアノシン（Ｃ５’−ＭｅＧ）で３’末端が修飾されたｄＴ２０の、ヘビ毒ホスホジエステラーゼとのインキュベーション時の時間の関数としての減衰曲線を示す。
【図２６】２つの５’（Ｒ）−Ｃ−Ｍｅ−２’−Ｆ−Ｕ又は５’（Ｓ）−Ｃ−Ｍｅ−２’−Ｆ−Ｕヌクレオチドで３’末端が修飾されたｄＴ１８の相対エキソヌクレアーゼ安定性を示すプロットである。
【図２７】一部の（Ｓ）−及び（Ｒ）−ＭＴＰＡエステルの立体構造を示す。
【図２８】他の一部の（Ｓ）−及び（Ｒ）−ＭＴＰＡエステルの分析に使用される立体構造を示す。
【図２９】ＤＮＡ  Ｐｏｌ−γ及びＰｏｌ−ＲＭＴプロトコルを概略的に示す。
【図３０Ａ】Ｐｏｌ−ＲＭＴによる組み込みアッセイの結果を示す。
【図３０Ｂ】図３０Ａ参照。
【図３１Ａ】Ｐｏｌ−γによる組み込みアッセイの結果を示す。
【図３１Ｂ】図３１Ａ参照。
【図３２】ｍＵＮＡモノマーの構造を示す。
【図３３】ＴＮＡモノマーの構造を示す。
【図３４】３’特異的エキソヌクレアーゼ（ＳＶＰＤ）に対するｍＵＮＡオリゴ安定性のプロットを示す。
【図３５】５’特異的エキソヌクレアーゼ（ホスホジエステラーゼＩＩ）に対するｍＵＮＡオリゴ安定性のプロットを示す。
【図３６】５’−エキソヌクレアーゼ（ホスホジエステラーゼＩＩ）分解に対するＴＮＡ−Ｔの安定性の折れ線グラフを示す。
【図３７】Ｈｙｐモノマーの構造を示す。
【図３８】１００ｎＭでソートされたＴＴＲＤＷ１１０５フリー取り込みのプロットを示す。
【図３９】Ｈｙｐベースのヌクレオシドによるインビボの遺伝子サイレンシングを示す折れ線グラフである。
【図４０】Ｈｙｐベースのヌクレオシドによるインビボの遺伝子サイレンシングを示す折れ線グラフである。
【図４１】Ｈｙｐベースのヌクレオシドによるインビボの遺伝子サイレンシングを示す折れ線グラフである。
【図４２】（Ｓ）−ｉｓｏＧＮＡの組み込みが（Ｓ）−ＧＮＡよりも有意に熱不安定性が小さいことを示す確率プロットである。
【図４３】（Ｓ）−ｉｓｏＧＮＡの組み込みが一般に（Ｓ）−ＧＮＡよりもインビボ活性を改善することを示す折れ線グラフである。
【図４４】アンチセンスシード領域へのＭｏｄ８（２’−５’−ＲＮＡ）の組み込みが、ラット毒性研究における臨床病理学的測定値を改善したことを示す折れ線グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明者らは、特に、ＲＮＡ分子のオフターゲット効果がｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖における特定位置に熱不安定ヌクレオチドを取り込むことにより低減又は阻害され得ることを発見している。アンチセンス鎖における特定位置のこれらの熱不安定化修飾を用いることで、ｄｓＲＮＡ分子は、オフターゲット遺伝子サイレンシングを低下させていながら、親ｄｓＲＮＡに類似する遺伝子サイレンシング活性を保持することができた。さらに、これらの熱不安定化修飾を含むｄｓＲＮＡ分子により、下方制御又は上方制御されるオフターゲット遺伝子の数も、親ｄｓＲＮＡと比べて減少する。
【００２４】
そのようなことから、一態様では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害する能力がある二本鎖ＲＮＡｉ（ｄｓＲＮＡ）剤を提供する。一般に、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、オフターゲット遺伝子サイレンシング及び／又は毒性を低減又は最小化しつつ、高度なオンターゲット遺伝子サイレンシングを示す。限定はされないが、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、そのｄｓＲＮＡ分子と置換され得、限定はされないが、インビトロ又はインビボ適用を含む、ＲＮＡ干渉に基づく遺伝子サイレンシング技術において用いることができる。
【００２５】
一般に、そのｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖（パッセンジャー鎖とも称される）及びアンチセンス鎖（ガイド鎖とも称される）を含む。ｄｓＲＮＡ分子の各鎖は、１２〜４０ヌクレオチド長の範囲であり得る。例えば、各鎖は、１４〜４０ヌクレオチド長、１７〜３７ヌクレオチド長、２５〜３７ヌクレオチド長、２７〜３０ヌクレオチド長、１７〜２３ヌクレオチド長、１７〜２１ヌクレオチド長、１７〜１９ヌクレオチド長、１９〜２５ヌクレオチド長、１９〜２３ヌクレオチド長、１９〜２１ヌクレオチド長、２１〜２５ヌクレオチド長又は２１〜２３ヌクレオチド長であり得る。限定はされないが、センス及びアンチセンス鎖は、等しい長さ又は不等な長さであり得る。
【００２６】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、１８〜３５ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、２１〜２５、１９〜２５、１９〜２１又は２１〜２３ヌクレオチド長である。一部の特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、２３ヌクレオチド長である。アンチセンス鎖と同様、センス鎖は、一部の実施形態では、１８〜３５ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、センス鎖は、２１〜２５、１９〜２５、１９〜２１又は２１〜２３ヌクレオチド長である。一部の特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、２１ヌクレオチド長である。
【００２７】
本発明者らは、インビボでより有効であるべきｄｓＲＮＡ分子では、アンチセンス鎖が幾らかの代謝安定性を有するはずであることも発見した。換言すれば、インビボでより有効であるべきｄｓＲＮＡ分子では、幾らかの量のアンチセンス鎖が、投与後しばらく経過して、インビボで存在する必要がある場合がある。したがって、一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の少なくとも４０％、例えば少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％又は少なくとも８０％が、インビボ投与後５日目、例えばマウス肝臓においてインビボで存在する。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の少なくとも４０％、例えば少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％又は少なくとも８０％が、インビボ投与後６日目、例えばマウス肝臓においてインビボで存在する。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の少なくとも４０％、例えば少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％又は少なくとも８０％が、インビボ投与後７日目、例えばマウス肝臓においてインビボで存在する。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の少なくとも４０％、例えば少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％又は少なくとも８０％が、インビボ投与後８日目、例えばマウス肝臓においてインビボで存在する。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の少なくとも４０％、例えば少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％又は少なくとも８０％が、インビボ投与後９日目、例えばマウス肝臓においてインビボで存在する。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の少なくとも４０％、例えば少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％又は少なくとも８０％が、インビボ投与後１０日目、例えばマウス肝臓においてインビボで存在する。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の少なくとも４０％、例えば少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％又は少なくとも８０％が、インビボ投与後１１日目、例えばマウス肝臓においてインビボで存在する。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の少なくとも４０％、例えば少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％又は少なくとも８０％が、インビボ投与後１２日目、例えばマウス肝臓においてインビボで存在する。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の少なくとも４０％、例えば少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％又は少なくとも８０％が、インビボ投与後１３日目、例えばマウス肝臓においてインビボで存在する。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の少なくとも４０％、例えば少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％又は少なくとも８０％が、インビボ投与後１４日目、例えばマウス肝臓においてインビボで存在する。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の少なくとも４０％、例えば少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％又は少なくとも８０％が、インビボ投与後１５日目、例えばマウス肝臓においてインビボで存在する。
【００２８】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、アンチセンス鎖は、シード領域内部に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の、５’末端から数えて２〜９位に）二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度（Ｔｍ）を有し、及びｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３又は４つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖ）センス鎖は、１、２、３又は４つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；及び（ｖｉｉｉ）アンチセンス鎖の５’末端の平滑末端の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７又は８つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは、任意選択的である。
【００２９】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を有し、ここで、アンチセンス鎖は、シード領域（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の、５’末端から数えて２〜９位）内部に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃のＴｍを有し、及びｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３又は４つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖ）センス鎖は、１、２、３又は４つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むこと；ｖｉｉ）アンチセンス鎖の５’末端の平滑末端の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６又は７つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは、任意選択的である。
【００３０】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、１９、２０、２１、２２又は２３ヌクレオチド塩基対長の二本鎖領域を有し、ここで、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、及びｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは、任意選択的である。
【００３１】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、１９、２０、２１、２２又は２３ヌクレオチド塩基対長の二本鎖領域を有し、ここで、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含み、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃（例えば、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃又は８０℃）の融解温度を有する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは、任意選択的である。
【００３２】
一部の特定の実施形態では、二本鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて５、６、７又は８位に存在し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【００３３】
一部の特定の実施形態では、二本鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて５位に存在し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【００３４】
一部の特定の実施形態では、二本鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて６位に存在し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【００３５】
一部の特定の実施形態では、二本鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて７位に存在し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【００３６】
一部の特定の実施形態では、二本鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて８位に存在し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【００３７】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、アンチセンス鎖は、シード領域（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の、５’末端から数えて２〜９位）内部に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、及びアンチセンス鎖は、以下の特徴：
（ｉ）２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾；及び
（ｉｉ）１、２、３又は４つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合
の一方又は両方をさらに含み；且つセンス鎖は、以下の特徴：
（ｉ）センス鎖とコンジュゲートされるリガンド；
（ｉｉ）２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾；及び
（ｉｉｉ）１、２、３又は４つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合
の１つ、２つ又は３つを含み、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。この一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは、任意選択的である。
【００３８】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、及びリガンドは、センス鎖とコンジュゲートされ、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【００３９】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０ヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、リガンドは、センス鎖とコンジュゲートされ、ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含み、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは、任意選択的である。
【００４０】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、及びｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、ここで、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、前記センス鎖は、リガンドを含み、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。この一部のさらなる実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＰＲリガンドである。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは、任意選択的である。
【００４１】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて４〜８位に位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、前記センス鎖は、リガンドを含み、センス及びアンチセンス鎖の各々は、少なくとも２つの２’−フルオロ修飾を含み、ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。この一部のさらなる実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＰＲリガンドである。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは、任意選択的である。
【００４２】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、ここで、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、前記センス鎖は、リガンドを含み、ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、及びアンチセンスは、以下の特徴：（ｉ）二本鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の４〜８位に位置すること；（ｉｉ）少なくとも２つの２’−フルオロ修飾；（ｉｉｉ）ヌクレオチドの（５’末端から数えて）１及び２位間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；アンチセンス鎖は、１８〜３５ヌクレオチド長を有することの少なくとも２つをさらに含み、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部のさらなる実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＰＲリガンドである。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは、任意選択的である。
【００４３】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、ここで、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、前記センス鎖は、リガンドを含み、ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、センス鎖は、以下の特徴：（ｉ）リガンドは、センス鎖の片末端に結合されること；（ｉｉ）センス鎖は、少なくとも２つの２’−フルオロ修飾を含むこと；及び（ｉｉｉ）センス鎖及びアンチセンス鎖は、少なくとも１９のヌクレオチド位置にわたる二本鎖領域を形成するための十分な相補性を示し、ここで、二本鎖の熱不安定化修飾は、前記二本鎖領域内に位置することの少なくとも１つを有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは、任意選択的である。
【００４４】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、ここで、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、前記センス鎖は、リガンドを含み、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、二本鎖の熱不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’ｍ−ＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは、任意選択的である。
【００４５】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて４〜８位に位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、前記センス鎖は、リガンドを含み、センス及びアンチセンス鎖の各々は、少なくとも２つの２’−フルオロ修飾を含み、ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは、任意選択的である。
【００４６】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、前記アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて７位に位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、前記センス鎖は、リガンドを含み、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは、任意選択的である。
【００４７】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて７位に位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、前記センス鎖は、リガンドを含み、センス及びアンチセンス鎖の各々は、少なくとも２つの２’−フルオロ修飾を含み、ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは、任意選択的である。
【００４８】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、前記センス鎖は、リガンドを含み、ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、ここで、リガンドは、二価又は三価分岐状リンカーを通して結合される１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体を含み、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは、任意選択的である。
【００４９】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、前記センス鎖は、リガンドを含み、ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、ここで、リガンドは、構造：
【化５】
2021523720.tif 000007
のＡＳＧＰＲリガンドであり、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは、任意選択的である。
【００５０】
一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここで、センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、３又は４つの２’−フルオロ修飾を含み、且つ０、１、２又は３つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、アンチセンス鎖は、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含み、且つ２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し；ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含むこと；及び（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有することの少なくとも１つ（例えば、１、２又は３つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは、任意選択的である。
【００５１】
一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここで、センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、（センス鎖の５’末端から数えて）７、１０及び１１位又は７、９、１０及び１１位に２’−フルオロ修飾を含み、任意選択的に、ヌクレオチドの１及び２位間並びにヌクレオチドの２及び３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、アンチセンス鎖は、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含み、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し；ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含むこと；及び（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有することの少なくとも１つ（例えば、１、２又は３つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは、任意選択的である。
【００５２】
一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここで、センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、３又は４つの２’−フルオロ修飾を含み、且つ０、１、２又は３つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、アンチセンス鎖は、２、６、８、９、１４若しくは１６位、又は２、６、１４若しくは１６位、又は２、１４及び１６位に２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンスは、ヌクレオチドの２１及び２２位間並びにヌクレオチドの２２及び２３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し；ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含むこと；及び（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有することの少なくとも１つ（例えば、１、２又は３つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは、任意選択的である。
【００５３】
一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここで、センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、３又は４つの２’−フルオロ修飾を含み、且つ０、１、２又は３つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、アンチセンス鎖は、２、６、８、９、１４若しくは１６位、又は２、６、１４若しくは１６位、又は２、１４及び１６位に２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンスは、ヌクレオチドの２１及び２２位間、ヌクレオチドの２２及び２３位間、ヌクレオチドの１及び２位間、ヌクレオチドの２及び３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し；ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含むこと；及び（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有することの少なくとも１つ（例えば、１、２又は３つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは、任意選択的である。
【００５４】
一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここで、センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、（センス鎖の５’末端から数えて）７、１０及び１１位又は７、９、１０及び１１位に２’−フルオロ修飾を含み、任意選択的に、ヌクレオチドの１及び２位間並びにヌクレオチドの２及び３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、アンチセンス鎖は、２、６、８、９、１４若しくは１６位、又は２、６、１４若しくは１６位、又は２、１４及び１６位に２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンスは、ヌクレオチドの２１及び２２位間並びにヌクレオチドの２２及び２３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し；ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含むこと；及び（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有することの少なくとも１つ（例えば、１、２又は３つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは、任意選択的である。
【００５５】
一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり、ここで、アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、及びｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２４のヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；及び（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、センス鎖の５’末端に平滑末端を含むことの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７又は８つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の特定の実施形態では、センス鎖は、１９、２０又は２１又は２２ヌクレオチド長であり、且つアンチセンス鎖は、２０、２１又は２２ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは、任意選択的である。
【００５６】
一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここで、センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、（センス鎖の５’末端から数えて）７、１０及び１１位又は７、９、１０及び１１位に２’−フルオロ修飾を含み、任意選択的に、ヌクレオチドの１及び２位間並びにヌクレオチドの２及び３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、アンチセンス鎖は、２、６、８、９、１４若しくは１６位、又は２、６、１４若しくは１６位、又は２、１４及び１６位に２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンスは、ヌクレオチドの２１及び２２位間、ヌクレオチドの２２及び２３位間、ヌクレオチドの１及び２位間、ヌクレオチドの２及び３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し；ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含むこと；及び（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有することの少なくとも１つ（例えば、１、２又は３つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは、任意選択的である。
【００５７】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡの一方の末端は、平滑末端であり、且つ他方の末端は、オーバーハングを有し、ここで、アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むこと；及び（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むことの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６又は７つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、オーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端上に存在し、且つ平滑末端は、アンチセンス鎖の５’末端に存在する。一部の特定の実施形態では、オーバーハングは、２、３又は４ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは、任意選択的である。
【００５８】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、１９、２０、２１、２２又は２３ヌクレオチド塩基対長の二本鎖領域を有し、ここで、ｄｓＲＮＡの一方の末端は、平滑末端であり、且つ他方の末端は、オーバーハングを有し、ここで、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、及びｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；及び（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むことの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、５又は６つ全部）をさらに有し、任意選択的に、２ヌクレオチドオーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端上に存在し、平滑末端は、アンチセンス鎖の５’末端に存在し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、オーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端上に存在し、且つ平滑末端は、アンチセンス鎖の５’末端に存在する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは、任意選択的である。
【００５９】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡ二本鎖の両末端に２つの平滑末端も有し得る。
【００６０】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、二本鎖の両末端に平滑末端を有し、ここで、アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、及びｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むこと；及び（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むことの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６又は７つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは、任意選択的である。
【００６１】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、１９、２０、２１、２２又は２３ヌクレオチド塩基対長の二本鎖領域を有し、且つ二本鎖の両末端に平滑末端を有し、ここで、ｄｓＲＮＡの一方の末端は、平滑末端であり、且つ他方の末端は、オーバーハングを有し、ここで、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、及びｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；及び（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むことの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、５又は６つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは、任意選択的である。
【００６２】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、２１ヌクレオチド（ｎｔ）センス鎖及び２３ヌクレオチド（ｎｔ）アンチセンスを含み、ここで、アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、ここで、ｄｓＲＮＡの一方の末端は、平滑末端である一方、他方の末端は、２ｎｔオーバーハングを含み、ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、及びｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むこと；及び（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含むことの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６又は７つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。好ましくは、２ｎｔオーバーハングは、アンチセンスの３’末端に存在する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは、任意選択的である。
【００６３】
一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖を含む本発明のｄｓＲＮＡ分子において、センス鎖は、２５〜３０ヌクレオチド残基長であり、ここで、前記センス鎖の５’末端ヌクレオチド（１位）から始まる１〜２３位は、少なくとも８つのリボヌクレオチドを含み；アンチセンス鎖は、３６〜６６ヌクレオチド残基長であり、３’末端ヌクレオチドから始まる、その位置内の少なくとも８つのリボヌクレオチドがセンス鎖の１〜２３位と対合することで、二本鎖を形成し；ここで、少なくとも、アンチセンス鎖の３’末端ヌクレオチドは、センス鎖と対合せず、最大で６つの連続する３’末端ヌクレオチドは、センス鎖と対合せず、それにより１〜６ヌクレオチドの３’一本鎖オーバーハングを形成し；ここで、アンチセンス鎖の５’末端は、センス鎖と対合しない１０〜３０の連続するヌクレオチドを含み、それにより１０〜３０ヌクレオチドの一本鎖５’オーバーハングを形成し；ここで、少なくとも、センス鎖の５’末端及び３’末端ヌクレオチドは、センス及びアンチセンス鎖が最大相補性のために整列されるとき、アンチセンス鎖のヌクレオチドと塩基対合され、それによりセンス及びアンチセンス鎖間で実質的に二本鎖の領域を形成し；前記二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるとき、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖長の少なくとも１９のリボヌクレオチドに沿って標的ＲＮＡに対して十分に相補的であることで、標的遺伝子発現を低減し；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。例えば、熱不安定化ヌクレオチドは、センス鎖の５’末端の１４〜１７位に対して対向的又は相補的な位置間に存在し、ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；及び（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むこと；及び（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜３０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むことの少なくとも１つ（例���ば、１、２、３、４、５、６又は７つ全部）をさらに有する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは、任意選択的である。
【００６４】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス及びアンチセンス鎖を含み、ここで、前記ｄｓＲＮＡ分子は、少なくとも２５、最大で２９ヌクレオチドの長さを有するセンス鎖を含み、最大で３０ヌクレオチドの長さを有するアンチセンス鎖は、センス鎖と共に、５’末端から１１位で酵素分解を受けやすい修飾ヌクレオチドを含み、ここで、前記センス鎖の３’末端及び前記アンチセンス鎖の５’末端は、平滑末端を形成し、前記アンチセンス鎖は、その３’末端でセンス鎖よりも１〜４ヌクレオチド長く、ここで、少なくとも２５ヌクレオチド長である二本鎖領域では、前記ｄｓＲＮＡ分子が哺乳動物細胞に導入されるとき、前記アンチセンス鎖は、前記アンチセンス鎖長の少なくとも１９ｎｔに沿って標的ｍＲＮＡに対して十分に相補的であることで、標的遺伝子の発現を低減し、ここで、前記ｄｓＲＮＡのダイサー切断により、前記アンチセンス鎖の前記３’末端を含むｓｉＲＮＡが優先的にもたらされ、それにより哺乳動物における標的遺伝子の発現が低減され、ここで、アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；及び（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むこと；及び（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２９ヌクレオチド対長の二本鎖領域を有することの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６又は７つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは、任意選択的である。
【００６５】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、ヌクレオチドの２１及び２２位間並びにヌクレオチドの２２及び２３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、ここで、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、及びｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｉｉ）アンチセンスは、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；及び（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有することの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７又は８つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは、任意選択的である。
【００６６】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、ヌクレオチドの１及び２位間、ヌクレオチドの２及び３位間、ヌクレオチドの２１及び２２位間並びにヌクレオチドの２２及び２３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、ここで、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、及びｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｉｉｉ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｉｖ）センス鎖は、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｖ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；及び（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有することの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７又は８つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは、任意選択的である。
【００６７】
一部の実施形態では、センス鎖は、ヌクレオチドの１及び２位間並びにヌクレオチドの２及び３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、ここで、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、及びｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖ）センス鎖は、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；及び（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有することの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７又は８つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは、任意選択的である。
【００６８】
一部の実施形態では、センス鎖は、ヌクレオチドの１及び２位間並びにヌクレオチドの２及び３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、アンチセンス鎖は、ヌクレオチドの１及び２位間、ヌクレオチドの２及び３位間、ヌクレオチドの２１及び２２位間並びにヌクレオチドの２２及び２３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、ここで、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、及びｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｉｉｉ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｉｖ）センス鎖は、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｖ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；及び（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有することの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６又は７つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは、任意選択的である。
【００６９】
一態様では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害する能力があるｄｓＲＮＡ分子であって、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０ヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、アンチセンス鎖は、シード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端から数えて５’末端の２〜９位に）二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ｄｓＲＮＡは、以下の特徴：
（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含むこと；
（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；
（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；
（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；
（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；
（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むこと；
（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；及び
（ｖｉｉｉ）アンチセンス鎖の５’末端の平滑末端
の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７又は８つ全部）をさらに有する、ｄｓＲＮＡ分子を提供する。
【００７０】
一部の特定の実施形態では、二本鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて７位に存在し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【００７１】
一部の実施形態では、二本鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の、アンチセンス鎖の５’末端から数えて２、３、４、５、６、８又は９位に存在し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【００７２】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０ヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、アンチセンス鎖は、シード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端から数えて５’末端の２〜９位に）二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、及びアンチセンス鎖は、以下の特徴：
（ｉ）２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾；及び
（ｉｉ）１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合
の一方又は両方をさらに含み、且つセンス鎖は、以下の特徴：
（ｉ）センス鎖とコンジュゲートされたリガンド；
（ｉｉ）２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾；及び
（ｉｉｉ）１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合
の１、２又は３つを含む。
ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【００７３】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０ヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、及びリガンドは、センス鎖とコンジュゲートされ、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【００７４】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０ヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、リガンドは、センス鎖とコンジュゲートされ、ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含み、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【００７５】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０ヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、前記センス鎖は、リガンドを含む。この一部のさらなる実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＰＲリガンドであり、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【００７６】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０ヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて４〜８位に位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、前記センス鎖は、リガンドを含み、ここで、センス及びアンチセンス鎖の各々は、少なくとも２つの２’−フルオロ修飾を含み、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。この一部のさらなる実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＰＲリガンドである。
【００７７】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０ヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、前記センス鎖は、リガンドを含み、及びアンチセンスは、以下の特徴：（ｉ）二本鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の４〜８位に位置すること；（ｉｉ）少なくとも２つの２’−フルオロ修飾；（ｉｉｉ）ヌクレオチドの（５’末端から数えて）１及び２位間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合ことの少なくとも２つをさらに含み、且つアンチセンス鎖は、１８〜３５ヌクレオチド長を有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部のさらなる実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＰＲリガンドである。
【００７８】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、ここで、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで、前記センス鎖は、リガンドを含み、センス鎖は、以下の特徴：（ｉ）リガンドは、センス鎖の片末端に結合されること；（ｉｉ）センス鎖は、少なくとも２つの２’−フルオロ修飾を含むこと；及び（ｉｉｉ）センス鎖及びアンチセンス鎖は、少なくとも１９のヌクレオチド位置にわたる二本鎖領域を形成するのに十分な相補性を示すことの少なくとも１つを有し、ここで、二本鎖の熱不安定化修飾は、前記二本鎖領域内に位置し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【００７９】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０ヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、前記センス鎖は、リガンドを含み、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【００８０】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０ヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて４〜８位に位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、前記センス鎖は、リガンドを含み、ここで、センス及びアンチセンス鎖の各々は、少なくとも２つの２’−フルオロ修飾を含み、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【００８１】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、前記アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて７位に位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで、前記センス鎖は、リガンドを含み、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【００８２】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０ヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて７位に位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、前記センス鎖は、リガンドを含み、ここで、センス及びアンチセンス鎖の各々は、少なくとも２つの２’−フルオロ修飾を含み、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【００８３】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、ここで、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで、前記センス鎖は、リガンドを含み、ここで、リガンドは、二価又は三価分岐リンカーを通して結合された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体を含み、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【００８４】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、ここで、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで、前記センス鎖は、リガンドを含み、ここで、リガンドは、構造：
【化６】
2021523720.tif 000008
のＡＳＧＰＲリガンドであり、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【００８５】
一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここで、センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、３又は４つの２’−フルオロ修飾を含み、且つ０、１、２又は３つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、アンチセンス鎖は、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含み、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含むこと；及び（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有することの少なくとも１つ（例えば、１、２又は３つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【００８６】
一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここで、センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、（センス鎖の５’末端から数えて）７、１０及び１１位又は７、９、１０及び１１位に２’−フルオロ修飾を含み、任意選択的に、ヌクレオチド１及び２位間並びにヌクレオチド２及び３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、アンチセンス鎖は、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含み、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含むこと；及び（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有することの少なくとも１つ（例えば、１、２又は３つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【００８７】
一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここで、センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、３又は４つの２’−フルオロ修飾を含み、且つ０、１、２又は３つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、アンチセンス鎖は、２、６、８、９、１４若しくは１６位、又は２、６、１４若しくは１６位、又は２、１４及び１６位に２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンスは、ヌクレオチド２１及び２２位間並びにヌクレオチド２２及び２３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含むこと；及び（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有することの少なくとも１つ（例えば、１、２又は３つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【００８８】
一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここで、センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、３又は４つの２’−フルオロ修飾を含み、且つ０、１、２又は３つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、アンチセンス鎖は、２、６、８、９、１４若しくは１６位、又は２、６、１４若しくは１６位、又は２、１４及び１６位に２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンスは、ヌクレオチド２１及び２２位間、ヌクレオチド２２及び２３位間、ヌクレオチド１及び２位間、ヌクレオチド２及び３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含むこと；及び（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有することの少なくとも１つ（例えば、１、２又は３つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【００８９】
一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここで、センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、（センス鎖の５’末端から数えて）７、１０及び１１位又は７、９、１０及び１１位に２’−フルオロ修飾を含み、任意選択的に、ヌクレオチド１及び２位間並びにヌクレオチド２及び３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、アンチセンス鎖は、２、６、８、９、１４若しくは１６位、又は２、６、１４若しくは１６位、又は２、１４及び１６位に２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンスは、ヌクレオチド２１及び２２位間並びにヌクレオチド２２及び２３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含むこと；及び（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有することの少なくとも１つ（例えば、１、２又は３つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【００９０】
一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここで、センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、（センス鎖の５’末端から数えて）７、１０及び１１位又は７、９、１０及び１１位に２’−フルオロ修飾を含み、任意選択的に、ヌクレオチド１及び２位間並びにヌクレオチド２及び３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、アンチセンス鎖は、２、６、８、９、１４若しくは１６位、又は２、６、１４若しくは１６位、又は２、１４及び１６位に２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンスは、ヌクレオチド２１及び２２位間、ヌクレオチド２２及び２３位間、ヌクレオチド１及び２位間、ヌクレオチド２及び３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含むこと；及び（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有することの少なくとも１つ（例えば、１、２又は３つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【００９１】
特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、
（ａ）センス鎖であって、
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価分岐リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；及び
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）７、１０及び１１位の２’−Ｆ修飾
を有するセンス鎖と、
（ｂ）アンチセンス鎖であって、
（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）２、６〜８、９、１４及び１６位に２’−Ｆ修飾；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド２１及び２２位間並びにヌクレオチド２２及び２３位間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；及び
（ｉｖ）（５’末端から数えて）７位の二本鎖の熱不安定化修飾
を有するアンチセンス鎖とを含み、ここで、ｄｓＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドオーバーハング、またアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【００９２】
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、
（ａ）センス鎖であって、
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価分岐リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）７、９、１０及び１１位の２’−Ｆ修飾；及び
（ｉｖ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１及び２位間並びにヌクレオチド２及び３位間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合
を有するセンス鎖と、
（ｂ）アンチセンス鎖であって、
（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）２、６、１４及び１６位の２’−Ｆ修飾；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１及び２位間、ヌクレオチド２及び３位間、ヌクレオチド２１及び２２位間並びにヌクレオチド２２及び２３位間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；及び
（ｉｖ）（５’末端から数えて）７位の二本鎖の熱不安定化修飾
を有するアンチセンス鎖とを含み、ここで、ｄｓＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドオーバーハング、またアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【００９３】
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、
（ａ）センス鎖であって、
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価分岐リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）７、９、１０及び１１位の２’−Ｆ修飾；及び
（ｉｖ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１及び２位間並びにヌクレオチド２及び３位間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合
を有するセンス鎖と、
（ｂ）アンチセンス鎖であって、
（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）２、１４及び１６位の２’−Ｆ修飾；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１及び２位間、ヌクレオチド２及び３位間、ヌクレオチド２１及び２２位間並びにヌクレオチド２２及び２３位間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；及び
（ｉｖ）（５’末端から数えて）６又は７位の二本鎖の熱不安定化修飾
を有するアンチセンス鎖とを含み、ここで、ｄｓＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドオーバーハング、またアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【００９４】
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、
（ａ）センス鎖であって、
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価分岐リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）７、９、１０及び１１位の２’−Ｆ修飾；及び
（ｉｖ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１及び２位間並びにヌクレオチド２及び３位間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合
を有するセンス鎖と、
（ｂ）アンチセンス鎖であって、
（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）２、６、８、９、１４及び１６位の２’−Ｆ修飾；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１及び２位間、ヌクレオチド２及び３位間、ヌクレオチド２１及び２２位間並びにヌクレオチド２２及び２３位間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；及び
（ｉｖ）（５’末端から数えて）７位の二本鎖の熱不安定化修飾
を有するアンチセンス鎖とを含み、ここで、ｄｓＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドオーバーハング、またアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【００９５】
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、
（ｉ）（５’末端から数えて）２、１４及び１６位の２’−Ｆ修飾；及び
（ｉｉ）（５’末端から数えて）６又は７位の二本鎖の熱不安定化修飾
を有するアンチセンス鎖を含み、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【００９６】
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、
（ａ）センス鎖であって、
（ｉ）三価分岐リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含むＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１及び２位間並びにヌクレオチド２及び３位間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合
を有するセンス鎖と、
（ｂ）アンチセンス鎖であって、
（ｉ）（５’末端から数えて）２、１４及び１６位の２’−Ｆ修飾；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）６又は７位の二本鎖の熱不安定化修飾
を有するアンチセンス鎖とを含み、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【００９７】
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、
（ａ）センス鎖であって、
（ｉ）三価分岐リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１及び２位間並びにヌクレオチド２及び３位間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合
を有するセンス鎖と、
（ｂ）アンチセンス鎖であって、
（ｉｉ）（５’末端から数えて）２、１４及び１６位の２’−Ｆ修飾；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１及び２位間、ヌクレオチド２及び３位間、ヌクレオチド２１及び２２位間並びにヌクレオチド２２及び２３位間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；及び
（ｉｖ）（５’末端から数えて）６又は７位の二本鎖の熱不安定化修飾
を有するアンチセンス鎖とを含み、ここで、ｄｓＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドオーバーハング、またアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【００９８】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、少なくとも１つのＡＳＧＰＲリガンドをさらに含む。例えば、ＡＳＧＰＲリガンドは、二価又は三価分岐リンカーを通じて結合された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体、例えば、
【化７】
2021523720.tif 000009
が挙げられる。
【００９９】
一例では、ＡＳＧＰＲリガンドは、センス鎖の３’末端に結合される。
【０１００】
場合によっては、アンチセンス鎖のシード領域、例えば２〜９位、特に３〜９位における２’−フルオロ修飾は、ｄｓＲＮＡのインビトロ効力に対して最小の効果を有しつつ、ｄｓＲＮＡのインビボ活性に悪影響を与え得る。本発明者らは、特に、かかるｄｓＲＮＡのインビボ活性が、２’−フルオロ修飾の一部又は全部をアンチセンス鎖のシード領域、すなわち５’末端から数えて２〜９位、特に３〜９位から除去することにより、親ｄｓＲＮＡに対して匹敵するレベルまで回復し得ることを発見している。
【０１０１】
したがって、一部の実施形態では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害する能力があるｄｓＲＮＡ分子であって、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し且つアンチセンス鎖は、シード領域内部に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の、５’末端から数えて２〜９位に）二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ｄｓＲＮＡは、以下の特徴：（ｉ）約４０℃〜約８０℃の融解温度（Ｔｍ）；（ｉｉ）アンチセンスは、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０の２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｉｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｉｖ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｖ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖｉ）センス鎖は、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｉｘ）アンチセンス鎖の５’末端での平滑末端；（ｘ）センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０のＬＮＡ修飾を含むことの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される、ｄｓＲＮＡ分子を提供する。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０１０２】
一部の実施形態では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害する能力があるｄｓＲＮＡ分子であって、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、アンチセンス鎖は、シード領域内部に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の、５’末端から数えて２〜９位に）二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ｄｓＲＮＡは、以下の特徴：（ｉ）約４０℃〜約８０℃の融解温度（Ｔｍ）；（ｉｉ）アンチセンスは、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０の２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｉｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｉｖ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｖ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖｉ）センス鎖は、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｉｘ）アンチセンス鎖の５’末端での平滑末端；及び（ｘ）センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０のＬＮＡ修飾を含むことの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０全部）をさらに有し、且つ２’−フルオロ修飾は、アンチセンス鎖の（５’末端から数えて）３〜９位に存在しない、ｄｓＲＮＡ分子を提供し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０１０３】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、アンチセンス鎖は、シード領域内部に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の、５’末端から数えて２〜９位に）二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、アンチセンス鎖は、以下の特徴：（ｉ）２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０の２’−フルオロ修飾（ここで、アンチセンスは、（５’末端から数えて）３〜９位に２’−フルオロ修飾を有しない）；及び（ｉｉ）１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の一方又は両方をさらに含み；センス鎖は、以下の特徴：（ｉ）センス鎖とコンジュゲートされたリガンド；（ｉｉ）２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾；（ｉｉｉ）１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合；及び（ｉｖ）１、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０のＬＮＡ修飾の１、２又は３つを含み、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１０４】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、アンチセンス鎖は、シード領域内部に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の、５’末端から数えて２〜９位に）二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、アンチセンス鎖は、（ｉ）２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０の２’−フルオロ修飾；及び（ｉｉ）１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合をさらに含み、センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０のＬＮＡ修飾を含み、ここで、センス鎖は、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）センス鎖とコンジュゲートされたリガンド；（ｉｉ）２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾；（ｉｉｉ）１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合；及び（ｉｖ）１、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０のＬＮＡ修飾の１、２又は３つを含み、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１０５】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、アンチセンス鎖は、シード領域内部に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の、５’末端から数えて２〜９位に）二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、アンチセンス鎖は、１、２、３又は４つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合をさらに含み、ここで、アンチセンス鎖は、任意選択的に、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０の２’−フルオロ修飾を含み；センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０のＬＮＡ修飾を含み、センス鎖は、任意選択的に、センス鎖とコンジュゲートされたリガンド、２、３、４若しくは５つの２’−フルオロ修飾；及び／又は１、２、３、４若しくは５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１０６】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、アンチセンス鎖は、シード領域内部に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の、５’末端から数えて２〜９位に）二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、アンチセンス鎖は、１、２、３又は４つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合をさらに含み、ここで、アンチセンス鎖は、任意選択的に、（５’末端から数えて）３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しないという条件で、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０の２’−フルオロ修飾を含み；センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０のＬＮＡ修飾を含み、センス鎖は、任意選択的に、センス鎖とコンジュゲートされたリガンド、２、３、４若しくは５つの２’−フルオロ修飾；及び／又は１、２、３、４若しくは５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１０７】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、リガンドは、センス鎖とコンジュゲートされ、ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含み、且つ（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在せず、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０１０８】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、ここで、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、前記センス鎖は、リガンドを含み、ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、且つ（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在せず、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。この一部のさらなる実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＰＲリガンドである。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１０９】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて４〜８位に位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで、前記センス鎖は、リガンドを含み、ここで、センス及びアンチセンス鎖の各々は、少なくとも２つの２’−フルオロ修飾を含み、ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、且つ（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在せず、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。この一部のさらなる実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＰＲリガンドである。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１１０】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、ここで、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで、前記センス鎖は、リガンドを含み、ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、ここでアンチセンスは、以下の特徴：（ｉ）二本鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の４〜８位に位置すること；（ｉｉ）少なくとも２つの２’−フルオロ修飾；（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１及び２位間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；及び（ｉｖ）アンチセンス鎖は、１８〜３５ヌクレオチド長を有することの少なくとも２つをさらに含み、且つ（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在せず、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部のさらなる実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＰＲリガンドである。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１１１】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、ここで、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで、前記センス鎖は、リガンドを含み、ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、センス鎖は、以下の特徴：（ｉ）リガンドは、センス鎖の片末端に結合されること；（ｉｉ）センス鎖は、少なくとも２つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｉｉｉ）センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０のＬＮＡ修飾を含むこと；及び（ｉｖ）センス鎖及びアンチセンス鎖は、少なくとも１９のヌクレオチド位置にわたる二本鎖領域を形成するのに十分な相補性を示すことの少なくとも１つを有し、ここで、二本鎖の熱不安定化修飾は、前記二本鎖領域内に位置し、（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在せず、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１１２】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて４〜８位に位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで、前記センス鎖は、リガンド、任意選択的に少なくとも１つのＬＮＡ修飾を含み、センス及びアンチセンス鎖の各々は、少なくとも２つの２’−フルオロ修飾を含み、ここで、（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在せず、ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１１３】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、前記アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて５、６又は７位に位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで、（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在せず、ここで、前記センス鎖は、リガンド、任意選択的に少なくとも１つのＬＮＡ修飾を含み、ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０１１４】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて５、６又は７位に位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで、前記センス鎖は、リガンド、任意選択的に少なくとも１つのＬＮＡ修飾を含み、センス及びアンチセンス鎖の各々は、少なくとも２つの２’−フルオロ修飾を含み、ここで、（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在せず、ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１１５】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、ここで、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで、前記センス鎖は、リガンド、任意選択的に少なくとも１つのＬＮＡ修飾を含み、ここで、（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在せず、ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、ここで、リガンドは、二価又は三価分岐リンカーを通して結合された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体を含み、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０１１６】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、ここで、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで、前記センス鎖は、リガンド、任意選択的に少なくとも１つのＬＮＡ修飾を含み、ここで、（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在せず、ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、ここで、リガンドは、構造：
【化８】
2021523720.tif 000010
のＡＳＧＰＲリガンドであり、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０１１７】
一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここで、センス鎖は、リガンドとコンジュゲートし、任意選択的に、少なくとも１つのＬＮＡ修飾を含み、３又は４つの２’−フルオロ修飾を含み、且つ０、１、２又は３つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、アンチセンス鎖は、（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−修飾が存在しないという条件で、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含み、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し；ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含むこと；及び（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有することの少なくとも１つ（例えば、１、２又は３つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１１８】
一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここで、センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、（センス鎖の５’末端から数えて）７、１０及び１１位又は７、９、１０及び１１位に２’−フルオロ修飾を含み、任意選択的に、ヌクレオチド１及び２位間並びにヌクレオチド２及び３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、任意選択的に、少なくとも１つのＬＮＡ修飾を含み；ここで、アンチセンス鎖は、（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−修飾が存在しないという条件で、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含み、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し；ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含むこと；及び（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有することの少なくとも１つ（例えば、１、２又は３つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１１９】
一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここで、センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、３又は４つの２’−フルオロ修飾を含み、０、１、２又は３つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、任意選択的に、少なくとも１つのＬＮＡ修飾を含み；ここで、アンチセンス鎖は、２、１４又は１６位に２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンスは、ヌクレオチド２１及び２２位間並びにヌクレオチド２２及び２３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し；ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含むこと；及び（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有することの少なくとも１つ（例えば、１、２又は３つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１２０】
一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここで、センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、３又は４つの２’−フルオロ修飾を含み、少なくとも１つのＬＮＡ修飾を含み、任意選択的に、０、１、２又は３つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、アンチセンス鎖は、２、１４又は１６位に２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンスは、ヌクレオチド２１及び２２位間並びにヌクレオチド２２及び２３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し；ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含むこと；及び（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有することの少なくとも１つ（例えば、１、２又は３つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１２１】
一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここで、センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、３又は４つの２’−フルオロ修飾を含み、０、１、２又は３つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、任意選択的に、少なくとも１つのＬＮＡ修飾を含み；ここで、アンチセンス鎖は、２、１４又は１６位に２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンスは、ヌクレオチド２１及び２２位間、ヌクレオチド２２及び２３位間、ヌクレオチド１及び２位間、ヌクレオチド２及び３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し；ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含むこと；及び（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有することの少なくとも１つ（例えば、１、２又は３つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１２２】
一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここで、センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、３又は４つの２’−フルオロ修飾を含み、０、１、２又は３つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、少なくとも１つのＬＮＡ修飾を含み；ここで、アンチセンス鎖は、２、１４又は１６位に２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンスは、ヌクレオチド２１及び２２位間、ヌクレオチド２２及び２３位間、ヌクレオチド１及び２位間、ヌクレオチド２及び３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し；ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含むこと；及び（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有することの少なくとも１つ（例えば、１、２又は３つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１２３】
一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここで、センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、（センス鎖の５’末端から数えて）７、１０及び１１位又は７、９、１０及び１１位に２’−フルオロ修飾を含み、任意選択的に、ヌクレオチド１及び２位間並びにヌクレオチド２及び３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、任意選択的に、少なくとも１つのＬＮＡ修飾を含み；ここで、アンチセンス鎖は、２、１４又は１６位に２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンスは、ヌクレオチド２１及び２２位間並びにヌクレオチド２２及び２３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し；ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含むこと；及び（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有することの少なくとも１つ（例えば、１、２又は３つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１２４】
一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここで、センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、（センス鎖の５’末端から数えて）７、１０及び１１位又は７、９、１０及び１１位に２’−フルオロ修飾を含み、少なくとも１つのＬＮＡ修飾を含み、任意選択的に、ヌクレオチド１及び２位間並びにヌクレオチド２及び３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、アンチセンス鎖は、２、１４又は１６位に２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンスは、ヌクレオチド２１及び２２位間並びにヌクレオチド２２及び２３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し；ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含むこと；及び（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有することの少なくとも１つ（例えば、１、２又は３つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１２５】
一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり、ここで、アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−修飾が存在しないという条件で、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２４ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、センス鎖の５’末端に平滑末端を含むこと；及び（ｉｘ）センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９  １つ又は１０のＬＮＡ修飾を含むことの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８又は９つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の特定の実施形態では、センス鎖は、１９、２０又は２１又は２２ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖は、２０、２１又は２２ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１２６】
一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり、ここで、アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチド及び１、２、３又は４つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有し、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０のＬＮＡ修飾を含み、ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−修飾が存在しないという条件で、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｉｉｉ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｉｖ）センス鎖は、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｖ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２４ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；及び（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、センス鎖の５’末端に平滑末端を含むことの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６又は７つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の特定の実施形態では、センス鎖は、１９、２０又は２１又は２２ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖は、２０、２１又は２２ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１２７】
一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここで、センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、（センス鎖の５’末端から数えて）７、１０及び１１位又は７、９、１０及び１１位に２’−フルオロ修飾を含み、任意選択的に、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０のＬＮＡ修飾を含み、任意選択的に、ヌクレオチド１及び２位間並びにヌクレオチド２及び３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、アンチセンス鎖は、２、９、１４若しくは１６位又は２、１４若しくは１６位に２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンスは、ヌクレオチド２１及び２２位間、ヌクレオチド２２及び２３位間、ヌクレオチド１及び２位間、ヌクレオチド２及び３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し；ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含むこと；及び（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有することの少なくとも１つ（例えば、１、２又は３つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１２８】
一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここで、センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、（センス鎖の５’末端から数えて）７、１０及び１１位又は７、９、１０及び１１位に２’−フルオロ修飾を含み、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０のＬＡＮ修飾を含み、任意選択的に、ヌクレオチド１及び２位間並びにヌクレオチド２及び３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、アンチセンス鎖は、２、９、１４若しくは１６位又は２、１４若しくは１６位に２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンスは、ヌクレオチド２１及び２２位間、ヌクレオチド２２及び２３位間、ヌクレオチド１及び２位間、ヌクレオチド２及び３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し；ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含むこと；及び（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有することの少なくとも１つ（例えば、１、２又は３つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１２９】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡの一方の末端は、平滑末端であり、且つ他方の末端は、オーバーハングを有し、ここで、アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含み、ここで、（５’末端から数えて）３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しないこと；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；及び（ｖｉｉ）センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０のＬＮＡ修飾を含むことの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７又は８つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、オーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端上に存在し、且つ平滑末端は、アンチセンス鎖の５’末端に存在する。一部の特定の実施形態では、オーバーハングは、２、３又は４ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１３０】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、１９、２０、２１、２２又は２３ヌクレオチド塩基対長の二本鎖領域を有し、ここで、ｄｓＲＮＡの一方の末端は、平滑末端であり、且つ他方の末端は、オーバーハングを有し、ここで、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含み、ここで、（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しないこと；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３又は４つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むこと；及び（ｖｉｉ）センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０のＬＮＡ修飾を含むことの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、５、６又は７つ全部）をさらに有し、任意選択的に、２ヌクレオチドオーバーハングアンチセンス鎖の３’末端側に存在し、且つ平滑末端は、アンチセンス鎖の５’末端に存在し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、オーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端上に存在し、且つ平滑末端は、アンチセンス鎖の５’末端に存在する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１３１】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡ二本鎖の両末端に２つの平滑末端も有し得る。
【０１３２】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、二本鎖の両末端に平滑末端を有し、ここで、アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含み、ここで、（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しないこと；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；及び（ｖｉｉｉ）センス鎖は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０のＬＮＡ修飾を含むことの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７又は８つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１３３】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、１９、２０、２１、２２又は２３ヌクレオチド塩基対長の二本鎖領域を有し、且つ二本鎖の両末端に平滑末端を有し、ここで、ｄｓＲＮＡの一方の末端は、平滑末端であり、且つ他方の末端は、オーバーハングを有し、ここで、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含み、ここで、（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しないこと；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むこと；及び（ｖｉｉ）センス鎖は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０のＬＮＡ修飾を含むことの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、５、６又は７つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１３４】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、２１ヌクレオチド（ｎｔ）のセンス鎖及び２３ヌクレオチド（ｎｔ）のアンチセンスを含み、ここで、アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、ここで、ｄｓＲＮＡの一方の末端は平滑である一方、他方の末端は、２ｎｔオーバーハングを含み、ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含み、ここで、（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しないこと；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含み、好ましくは、２ｎｔオーバーハングは、アンチセンスの３’末端に存在すること；及び（ｖｉｉｉ）センス鎖は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０のＬＮＡ修飾を含むことの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７又は８つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１３５】
一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖を含む本発明のｄｓＲＮＡ分子において、センス鎖は、２５〜３０ヌクレオチド残基長であり、ここで、前記センス鎖の５’末端ヌクレオチド（１位）から始まる１〜２３位は、少なくとも８つのリボヌクレオチドを含み；アンチセンス鎖は、３６〜６６ヌクレオチド残基長であり、３’末端ヌクレオチドから始まる、その位置内の少なくとも８つのリボヌクレオチドがセンス鎖の１〜２３位と対合することで、二本鎖を形成し；ここで、少なくとも、アンチセンス鎖の３’末端ヌクレオチドは、センス鎖と対合せず、最大で６つの連続する３’末端ヌクレオチドは、センス鎖と対合せず、それにより１〜６ヌクレオチドの３’一本鎖オーバーハングを形成し；ここで、アンチセンス鎖の５’末端は、センス鎖と対合しない１０〜３０の連続するヌクレオチドを含み、それにより１０〜３０ヌクレオチドの一本鎖５’オーバーハングを形成し；ここで、少なくとも、センス鎖の５’末端及び３’末端ヌクレオチドは、センス及びアンチセンス鎖が最大相補性のために整列されるとき、アンチセンス鎖のヌクレオチドと塩基対合され、それによりセンス及びアンチセンス鎖間で実質的に二本鎖の領域を形成し；前記二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるとき、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖長の少なくとも１９のリボヌクレオチドに沿って標的ＲＮＡに対して十分に相補的であることで、標的遺伝子発現を低減し；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０１３６】
例えば、熱不安定化ヌクレオチドは、センス鎖の５’末端の１４〜１７位に対して対向的又は相補的な位置間に存在し、ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含み、ここで、（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しないこと；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；及び（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜３０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；及びセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０のＬＮＡ修飾を含むことの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７又は８つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１３７】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス及びアンチセンス鎖を含み、ここで、前記ｄｓＲＮＡ分子は、少なくとも２５、最大で２９ヌクレオチドの長さを有するセンス鎖を含み、最大で３０ヌクレオチドの長さを有するアンチセンス鎖は、センス鎖と共に、５’末端から１１位で酵素分解を受けやすい修飾ヌクレオチドを含み、ここで、前記センス鎖の３’末端及び前記アンチセンス鎖の５’末端は、平滑末端を形成し、前記アンチセンス鎖は、その３’末端でセンス鎖よりも１〜４ヌクレオチド長く、ここで、少なくとも２５ヌクレオチド長である二本鎖領域では、前記ｄｓＲＮＡ分子が哺乳動物細胞に導入されるとき、前記アンチセンス鎖は、前記アンチセンス鎖長の少なくとも１９ｎｔに沿って標的ｍＲＮＡに対して十分に相補的であることで、標的遺伝子の発現を低減し、ここで、前記ｄｓＲＮＡのダイサー切断により、前記アンチセンス鎖の前記３’末端を含むｓｉＲＮＡが優先的にもたらされ、それにより哺乳動物における標的遺伝子の発現が低減され、ここで、アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含み、ここで、（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しないこと；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；及び（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２９ヌクレオチド対長の二本鎖領域を有すること；及び（ｖｉｉｉ）センス鎖は、１、２、３、４、５、７、８、９つ又は１０のＬＮＡ修飾を含むことの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７又は８つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１３８】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド２１及び２２位間並びにヌクレオチド２２及び２３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、ここで、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含み、ここで、（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しないこと；（ｉｉ）アンチセンスは、３又は４つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有すること；及び（ｉｘ）センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０のＬＮＡ修飾を含むことの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８又は９つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１３９】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド１及び２位間、ヌクレオチド２及び３位間、ヌクレオチド２１及び２２位間並びにヌクレオチド２２及び２３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、ここで、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含み、ここで、（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しないこと；（ｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｉｉｉ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｉｖ）センス鎖は、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｖ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有すること；及び（ｉｘ）センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０のＬＮＡ修飾を含むことの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８又は９つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１４０】
一部の実施形態では、センス鎖は、ヌクレオチド１及び２位間並びにヌクレオチド２及び３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、ここで、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含み、ここで、（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しないこと；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有すること；及び（ｉｘ）センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０のＬＮＡ修飾を含むことの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８又は９つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１４１】
一部の実施形態では、センス鎖は、ヌクレオチド１及び２位間並びにヌクレオチド２及び３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド１及び２位間、ヌクレオチド２及び３位間、ヌクレオチド２１及び２２位間並びにヌクレオチド２２及び２３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、ここで、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｉｉｉ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含み、ここで、（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しないこと；（ｉｖ）センス鎖は、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｖ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有すること；及び（ｖｉｉｉ）センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０のＬＮＡ修飾を含むことの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７又は８つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１４２】
一態様では、本発明は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む、標的遺伝子の発現を阻害する能力があるｄｓＲＮＡ分子であって、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、アンチセンス鎖は、シード領域内部に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の、５’末端から数えて２〜９位に）二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ｄｓＲＮＡ分子は、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含み、ここで、（５’末端から数えて）３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しないこと；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｖｉｉｉ）アンチセンス鎖の５’末端での平滑末端；及び（ｉｘ）センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０のＬＮＡ修飾を含むことの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８又は９つ全部）をさらに有する、ｄｓＲＮＡ分子を提供し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１４３】
一部の特定の実施形態では、二本鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の、アンチセンス鎖の５’末端から数えて５、６又は７位に存在し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０１４４】
一部の実施形態では、二本鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の、アンチセンス鎖の５’末端から数えて２、３、４、８又は９位に存在し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０１４５】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、アンチセンス鎖は、シード領域内部に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の、５’末端から数えて２〜９位に）二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、アンチセンス鎖は、以下の特徴：（ｉ）２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾（（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）３〜９位に２’−修飾が存在しない）；及び（ｉｉ）１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の一方又は両方をさらに含み；センス鎖は、以下の特徴：（ｉ）センス鎖とコンジュゲートされたリガンド；（ｉｉ）２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾；（ｉｉｉ）１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合；及び（ｉｖ）１、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０のＬＮＡ修飾の１、２、３又は４を含み、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０１４６】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、リガンドは、センス鎖とコンジュゲートされ、ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含み、且つ（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−修飾が存在せず、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０１４７】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、ここで、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、前記センス鎖は、リガンドを含み、且つ（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−修飾が存在せず、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。この一部のさらなる実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＰＲリガンドである。
【０１４８】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて４〜８位に位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで、前記センス鎖は、リガンドを含み、センス及びアンチセンス鎖の各々は、少なくとも２つの２’−フルオロ修飾を含み、且つ（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−修飾が存在せず、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。この一部のさらなる実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＰＲリガンドである。
【０１４９】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、ここで、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで、前記センス鎖は、リガンドを含み、ここで、アンチセンスは、以下の特徴：（ｉ）二本鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の４〜８位に位置すること；（ｉｉ）少なくとも２つの２’−フルオロ修飾（ここで、（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−修飾が存在しない）；（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１及び２位間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合の少なくとも２つをさらに含み；且つアンチセンス鎖は、１８〜３５ヌクレオチド長を有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部のさらなる実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＰＲリガンドである。
【０１５０】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、ここで、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで、前記センス鎖は、リガンドを含み、センス鎖は、以下の特徴：（ｉ）リガンドは、センス鎖の片末端に結合されること；（ｉｉ）センス鎖は、少なくとも２つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｉｉｉ）センス鎖及びアンチセンス鎖は、少なくとも１９のヌクレオチド位置にわたる二本鎖領域を形成するのに十分な相補性を示すこと；（ｉｖ）センス鎖は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０のＬＮＡ修飾を含むことの少なくとも１つを有し、二本鎖の熱不安定化修飾は、前記二本鎖領域内に位置し、且つ（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−修飾が存在せず、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０１５１】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、ここで、（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−修飾が存在せず、ここで、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで、前記センス鎖は、リガンドを含み、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０１５２】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて４〜８位に位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで、前記センス鎖は、リガンドを含み、センス及びアンチセンス鎖の各々は、少なくとも２つの２’−フルオロ修飾を含み、（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−修飾が存在せず、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０１５３】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、ここで、（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−修飾が存在せず、ここで、前記アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて５、６又は７位に位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで、前記センス鎖は、リガンドを含み、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０１５４】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて５、６又は７位に位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで、前記センス鎖は、リガンドを含み、センス及びアンチセンス鎖の各々は、少なくとも２つの２’−フルオロ修飾を含み、（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−修飾が存在せず、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０１５５】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、ここで、（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−修飾が存在せず、ここで、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで、前記センス鎖は、リガンドを含み、ここで、リガンドは、二価又は三価分岐リンカーを通して結合された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体を含み、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０１５６】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、ここで、（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−修飾が存在せず、ここで、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで、前記センス鎖は、リガンドを含み、ここで、リガンドは、構造：
【化９】
2021523720.tif 000011
のＡＳＧＰＲリガンドであり、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０１５７】
一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここで、センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、３又は４つの２’−フルオロ修飾を含み、且つ０、１、２又は３つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、アンチセンス鎖は、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含み、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含むこと；及び（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有することの少なくとも１つ（例えば、１、２又は３つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０１５８】
一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここで、センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、（センス鎖の５’末端から数えて）７、１０及び１１位又は７、９、１０及び１１位に２’−フルオロ修飾を含み、任意選択的に、ヌクレオチド１及び２位間並びにヌクレオチド２及び３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、任意選択的に、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０のＬＮＡ修飾を含み；ここで、アンチセンス鎖は、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含み、ここで、アンチセンス鎖の３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在せず、２、３又は４つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含むこと；及び（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有することの少なくとも１つ（例えば、１、２又は３つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０１５９】
一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここで、センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、３又は４つの２’−フルオロ修飾を含み、０又は２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、任意選択的に、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０のＬＮＡ修飾を含み；ここで、アンチセンス鎖は、２、１４又は１６位又は２、１４及び１６位に２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンスは、ヌクレオチド２１及び２２位間並びにヌクレオチド２２及び２３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含むこと；及び（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有することの少なくとも１つ（例えば、１、２又は３つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０１６０】
一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここで、センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、３又は４つの２’−フルオロ修飾を含み、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０のＬＮＡ修飾を含み、任意選択的に、０又は２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、アンチセンス鎖は、２、１４又は１６位又は２、１４及び１６位に２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンスは、ヌクレオチド２１及び２２位間並びにヌクレオチド２２及び２３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含むこと；及び（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有することの少なくとも１つ（例えば、１、２又は３つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０１６１】
一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここで、センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、３又は４つの２’−フルオロ修飾を含み、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０のＬＮＡ修飾を含み、且つ０、１、２又は３つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、アンチセンス鎖は、２、１４又は１６位又は２、１４及び１６位に２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンスは、ヌクレオチド２１及び２２位間並びにヌクレオチド２２及び２３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含むこと；及び（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有することの少なくとも１つ（例えば、１、２又は３つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０１６２】
一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここで、センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、３又は４つの２’−フルオロ修飾を含み、０、１、２又は３つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、任意選択的に、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０のＬＮＡ修飾を含み；ここで、アンチセンス鎖は、２、１４又は１６位に２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンスは、ヌクレオチド２１及び２２位間、ヌクレオチド２２及び２３位間、ヌクレオチド１及び２位間、ヌクレオチド２及び３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含むこと；及び（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有することの少なくとも１つ（例えば、１、２又は３つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０１６３】
一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここで、センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、３又は４つの２’−フルオロ修飾を含み、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０のＬＮＡ修飾を含み、任意選択的に、０、１、２又は３つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、アンチセンス鎖は、２、１４又は１６位に２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンスは、ヌクレオチド２１及び２２位間、ヌクレオチド２２及び２３位間、ヌクレオチド１及び２位間、ヌクレオチド２及び３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含むこと；及び（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有することの少なくとも１つ（例えば、１、２又は３つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０１６４】
一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここで、センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、３又は４つの２’−フルオロ修飾を含み、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０のＬＮＡ修飾を含み、０、１、２又は３つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、アンチセンス鎖は、２、１４又は１６位に２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンスは、ヌクレオチド２１及び２２位間、ヌクレオチド２２及び２３位間、ヌクレオチド１及び２位間、ヌクレオチド２及び３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含むこと；及び（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有することの少なくとも１つ（例えば、１、２又は３つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０１６５】
一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここで、センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、（センス鎖の５’末端から数えて）７、１０及び１１位又は７、９、１０及び１１位に２’−フルオロ修飾を含み、任意選択的に、ヌクレオチド１及び２位間並びにヌクレオチド２及び３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、任意選択的に、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０のＬＮＡ修飾を含み；ここで、アンチセンス鎖は、２、１４及び１６位に２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンスは、ヌクレオチド２１及び２２位間並びにヌクレオチド２２及び２３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含むこと；及び（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有することの少なくとも１つ（例えば、１、２又は３つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０１６６】
一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここで、センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、（センス鎖の５’末端から数えて）７、１０及び１１位又は７、９、１０及び１１位に２’−フルオロ修飾を含み、ヌクレオチド１及び２位間並びにヌクレオチド２及び３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、任意選択的に、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０のＬＮＡ修飾を含み；ここで、アンチセンス鎖は、２、１４及び１６位に２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンスは、ヌクレオチド２１及び２２位間並びにヌクレオチド２２及び２３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含むこと；及び（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有することの少なくとも１つ（例えば、１、２又は３つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０１６７】
一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここで、センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、（センス鎖の５’末端から数えて）７、１０及び１１位又は７、９、１０及び１１位に２’−フルオロ修飾を含み、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０のＬＮＡ修飾を含み、任意選択的に、ヌクレオチド１及び２位間並びにヌクレオチド２及び３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、アンチセンス鎖は、２、１４及び１６位に２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンスは、ヌクレオチド２１及び２２位間並びにヌクレオチド２２及び２３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含むこと；及び（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有することの少なくとも１つ（例えば、１、２又は３つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０１６８】
一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここで、センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、（センス鎖の５’末端から数えて）７、１０及び１１位又は７、９、１０及び１１位に２’−フルオロ修飾を含み、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０のＬＮＡ修飾を含み、ヌクレオチド１及び２位間並びにヌクレオチド２及び３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、アンチセンス鎖は、２、１４及び１６位に２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンスは、ヌクレオチド２１及び２２位間並びにヌクレオチド２２及び２３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含むこと；及び（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有することの少なくとも１つ（例えば、１、２又は３つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０１６９】
一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここで、センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、（センス鎖の５’末端から数えて）７、１０及び１１位又は７、９、１０及び１１位に２’−フルオロ修飾を含み、任意選択的に、ヌクレオチド１及び２位間並びにヌクレオチド２及び３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、任意選択的に、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０のＬＮＡ修飾を含み；ここで、アンチセンス鎖は、２、１４又は１６位に２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンスは、ヌクレオチド２１及び２２位間、ヌクレオチド２２及び２３位間、ヌクレオチド１及び２位間、ヌクレオチド２及び３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含むこと；及び（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有することの少なくとも１つ（例えば、１、２又は３つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０１７０】
一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここで、センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、（センス鎖の５’末端から数えて）７、１０及び１１位又は７、９、１０及び１１位に２’−フルオロ修飾を含み、ヌクレオチド１及び２位間並びにヌクレオチド２及び３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、任意選択的に、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０のＬＮＡ修飾を含み；ここで、アンチセンス鎖は、２、１４又は１６位に２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンスは、ヌクレオチド２１及び２２位間、ヌクレオチド２２及び２３位間、ヌクレオチド１及び２位間、ヌクレオチド２及び３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含むこと；及び（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有することの少なくとも１つ（例えば、１、２又は３つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０１７１】
一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここで、センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、（センス鎖の５’末端から数えて）７、１０及び１１位又は７、９、１０及び１１位に２’−フルオロ修飾を含み、任意選択的に、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０のＬＮＡ修飾を含み、任意選択的に、ヌクレオチド１及び２位間並びにヌクレオチド２及び３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、アンチセンス鎖は、２、１４又は１６位に２’−フルオロ修飾を含み；アンチセンスは、ヌクレオチド２１及び２２位間、ヌクレオチド２２及び２３位間、ヌクレオチド１及び２位間、ヌクレオチド２及び３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含むこと；及び（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有することの少なくとも１つ（例えば、１、２又は３つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０１７２】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有し且つアンチセンス鎖は、シード領域内部に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の、５’末端から数えて２〜９位に）二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度（Ｔｍ）を有し、及びｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｖｉｉｉ）アンチセンス鎖の５’末端での平滑末端；（ｉｘ）但し、アンチセンス鎖の（５’末端から数えて）３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しないことの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８又は９つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１７３】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を有し、ここで、アンチセンス鎖は、シード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の、５’末端から数えて５’末端の２〜９位に）二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃のＴｍを有し、ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むこと；及びｖｉｉ）アンチセンス鎖の５’末端での平滑末端、但しアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しないことの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６又は７つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１７４】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、１９、２０、２１、２２又は２３ヌクレオチド塩基対長の二本鎖領域を有し、ここで、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、及びｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、但しアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在せず、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１７５】
特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、
（ａ）センス鎖であって、
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価分岐リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；及び
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）７、１０及び１１位の２’−Ｆ修飾
を有するセンス鎖と、
（ｂ）アンチセンス鎖であって、
（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）２、１４及び１６位の２’−Ｆ修飾；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド２１及び２２位間並びにヌクレオチド２２及び２３位間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；及び
（ｉｖ）（５’末端から数えて）５、６又は７位の二本鎖の熱不安定化修飾
を有するアンチセンス鎖とを含み、ここで、ｄｓＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドオーバーハング、またアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０１７６】
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、
（ａ）センス鎖であって、
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価分岐リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）７、９、１０及び１１位の２’−Ｆ修飾；及び
（ｉｖ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１及び２位間並びにヌクレオチド２及び３位間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合
を有するセンス鎖と、
（ｂ）アンチセンス鎖であって、
（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）２、１４及び１６位の２’−Ｆ修飾；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１及び２位間、ヌクレオチド２及び３位間、ヌクレオチド２１及び２２位間並びにヌクレオチド２２及び２３位間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；及び
（ｉｖ）（５’末端から数えて）５、６又は７位の二本鎖の熱不安定化修飾
を有するアンチセンス鎖とを含み、ここで、ｄｓＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドオーバーハング、またアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０１７７】
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、
（ａ）センス鎖であって、
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価分岐リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）７、９、１０及び１１位の２’−Ｆ修飾；及び
（ｉｖ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１及び２位間並びにヌクレオチド２及び３位間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合
を有するセンス鎖と、
（ｂ）アンチセンス鎖であって、
（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）２、１４及び１６位の２’−Ｆ修飾；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１及び２位間、ヌクレオチド２及び３位間、ヌクレオチド２１及び２２位間並びにヌクレオチド２２及び２３位間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；及び
（ｉｖ）（５’末端から数えて）５、６又は７位の二本鎖の熱不安定化修飾
を有するアンチセンス鎖とを含み、ここで、ｄｓＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドオーバーハング、またアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０１７８】
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、
（ａ）センス鎖であって、
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価分岐リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）７、９、１０及び１１位の２’−Ｆ修飾；及び
（ｉｖ）少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上）のＬＮＡ修飾
を有するセンス鎖と、
（ｂ）アンチセンス鎖であって、
（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）２、１４及び１６位の２’−Ｆ修飾；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１及び２位間、ヌクレオチド２及び３位間、ヌクレオチド２１及び２２位間並びにヌクレオチド２２及び２３位間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；及び
（ｉｖ）（５’末端から数えて）５、６又は７位の二本鎖の熱不安定化修飾
を有するアンチセンス鎖とを含み、ここで、ｄｓＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドオーバーハング、またアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０１７９】
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、
（ａ）センス鎖であって、
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価分岐リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）７、９、１０及び１１位の２’−Ｆ修飾；及び
（ｉｖ）（５’末端から数えて）１、２及び３位の少なくとも１つ（例えば、１、２又は３）のＬＮＡ修飾
を有するセンス鎖と、
（ｂ）アンチセンス鎖であって、
（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）２、１４及び１６位の２’−Ｆ修飾；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１及び２位間、ヌクレオチド２及び３位間、ヌクレオチド２１及び２２位間並びにヌクレオチド２２及び２３位間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；及び
（ｉｖ）（５’末端から数えて）５、６又は７位の二本鎖の熱不安定化修飾
を有するアンチセンス鎖とを含み、ここで、ｄｓＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドオーバーハング、またアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０１８０】
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、
（ａ）センス鎖であって、
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価分岐リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）７、９、１０及び１１位の２’−Ｆ修飾；
（ｉｖ）少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上）のＬＮＡ修飾；及び
（ｉｖ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１及び２位間並びにヌクレオチド２及び３位間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合
を有するセンス鎖と、
（ｂ）アンチセンス鎖であって、
（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）２、１４及び１６位の２’−Ｆ修飾；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１及び２位間、ヌクレオチド２及び３位間、ヌクレオチド２１及び２２位間並びにヌクレオチド２２及び２３位間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；及び
（ｉｖ）（５’末端から数えて）５、６又は７位の二本鎖の熱不安定化修飾
を有するアンチセンス鎖とを含み、ここで、ｄｓＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドオーバーハング、またアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０１８１】
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、
（ａ）センス鎖であって、
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価分岐リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）７、９、１０及び１１位の２’−Ｆ修飾；及び
（ｉｖ）（５’末端から数えて）１、２及び３位の少なくとも１つ（例えば、１、２又は３）のＬＮＡ修飾
を有するセンス鎖と、
（ｂ）アンチセンス鎖であって、
（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）２、１４及び１６位の２’−Ｆ修飾；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１及び２位間、ヌクレオチド２及び３位間、ヌクレオチド２１及び２２位間並びにヌクレオチド２２及び２３位間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；及び
（ｉｖ）（５’末端から数えて）５、６又は７位の二本鎖の熱不安定化修飾
を有するアンチセンス鎖とを含み、ここで、ｄｓＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドオーバーハング、またアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０１８２】
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、
（ａ）センス鎖であって、
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価分岐リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）７、９、１０及び１１位の２’−Ｆ修飾；
（ｉｖ）（５’末端から数えて）１、２及び３位の少なくとも１つ（例えば、１、２又は３）のＬＮＡ修飾；及び
（ｉｖ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１及び２位間並びにヌクレオチド２及び３位間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合
を有するセンス鎖と、
（ｂ）アンチセンス鎖であって、
（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）２、１４及び１６位の２’−Ｆ修飾；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１及び２位間、ヌクレオチド２及び３位間、ヌクレオチド２１及び２２位間並びにヌクレオチド２２及び２３位間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；及び
（ｉｖ）（５’末端から数えて）５、６又は７位の二本鎖の熱不安定化修飾
を有するアンチセンス鎖とを含み、ここで、ｄｓＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドオーバーハング、またアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０１８３】
一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり、ここで、アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２４ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；及び（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、センス鎖の５’末端に平滑末端を含むことの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７又は８つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の特定の実施形態では、センス鎖は、１９、２０又は２１又は２２ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖は、２０、２１又は２２ヌクレオチド長である。
【０１８４】
センス鎖及びアンチセンス鎖は、典型的には、二本鎖ｄｓＲＮＡを形成する。ｄｓＲＮＡ分子の二本鎖領域は、１２〜４０ヌクレオチド対長であり得る。例えば、二本鎖領域は、１４〜４０ヌクレオチド対長、１７〜３０ヌクレオチド対長、２５〜３５ヌクレオチド長、２７〜３５ヌクレオチド対長、１７〜２３ヌクレオチド対長、１７〜２１ヌクレオチド対長、１７〜１９ヌクレオチド対長、１９〜２５ヌクレオチド対長、１９〜２３ヌクレオチド対長、１９〜２１ヌクレオチド対長、２１〜２５ヌクレオチド対長又は２１〜２３ヌクレオチド対長であり得る。別の例では、二本鎖領域は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６及び２７ヌクレオチド対長から選択される。
【０１８５】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を有し、ここで、アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；及び（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むこと；及び（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含むことの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６又は７つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の特定の実施形態では、二本鎖領域は、１８、１９、２０、２１、２２又は２３ヌクレオチド対長である。特定の実施形態では、二本鎖領域は、２１ヌクレオチド対長である。
【０１８６】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、鎖の３’末端又は５’末端又は両末端に、ｄｓＲＮＡ分子の１つ以上のオーバーハング領域及び／又はキャッピング基を含む。オーバーハングは、１〜１０ヌクレオチド長、１〜６ヌクレオチド長、例えば２〜６ヌクレオチド長、１〜５ヌクレオチド長、２〜５ヌクレオチド長、１〜４ヌクレオチド長、２〜４ヌクレオチド長、１〜３ヌクレオチド長、２〜３ヌクレオチド長又は１〜２ヌクレオチド長であり得る。オーバーハングは、一方の鎖が他方の鎖よりも長いことの結果又は同じ長さの２本の鎖がねじれ形であることの結果であり得る。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとミスマッチを形成し得るか、又は標的化されている遺伝子配列に対して相補的であり得るか、又は他の配列であり得る。第１鎖と第２鎖は、例えば、ヘアピンを形成するための追加的塩基又は他の非塩基リンカーによっても連結され得る。
【０１８７】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子のオーバーハング領域内のヌクレオチドは、各々独立して、修飾又は非修飾ヌクレオチド、例えば、限定はされないが、２’−糖修飾、例えば２’−フルオロ２’−Ｏ−メチル、チミジン（Ｔ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メトキシエチルアデノシン、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルシチジン、ＧＮＡ、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ、ｈ’ＧＮＡ及びそれらの任意の組み合わせであり得る。例えば、ＴＴは、片鎖上の片末端におけるオーバーハング配列であり得る。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとミスマッチを形成し得るか、又は標的化されている遺伝子配列に対して相補的であり得るか、又は他の配列であり得る。
【０１８８】
本発明のｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖又は両鎖での５’又は３’オーバーハングは、リン酸化され得る。一部の実施形態では、オーバーハング領域は、２つのヌクレオチド間にホスホロチオエートを有する２つのヌクレオチドを含み、ここで、２つのヌクレオチドは、同じであるか又は異なり得る。一部の実施形態では、オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖又は両鎖の３’末端に存在する。一部の実施形態では、この３’オーバーハングは、アンチセンス鎖内に存在する。一部の実施形態では、この３’オーバーハングは、センス鎖内に存在する。
【０１８９】
本発明のｄｓＲＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡの干渉活性を、その全体的安定性に影響することなく強化し得るような単一オーバーハングのみを含み得る。例えば、一本鎖オーバーハングは、センス鎖の３’末端又は代替的にはアンチセンス鎖の３’末端に位置する。ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端（又はセンス鎖の３’末端）又はその逆に位置する平滑末端も有し得る。一般に、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端にヌクレオチドオーバーハングを有し、５’末端は平滑末端である。理論によって拘束されないが、アンチセンス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の３’末端オーバーハングでの非対称平滑末端は、ＲＩＳＣプロセスに負荷するガイド鎖を支持する。例えば、単一オーバーハングは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチド長を含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の５’末端での平滑末端に２ヌクレオチドオーバーハングを有する。
【０１９０】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡの一方の末端は、平滑末端であり、且つ他方の末端は、オーバーハングを有し、ここで、アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むこと；及び（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むことの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６又は７つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、オーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端上に存在し、平滑末端は、アンチセンス鎖の５’末端に存在する。一部の特定の実施形態では、オーバーハングは、２、３又は４ヌクレオチド長である。
【０１９１】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、１９、２０、２１、２２又は２３ヌクレオチド塩基対長の二本鎖領域を有し、ここで、ｄｓＲＮＡの一方の末端は、平滑末端であり、且つ他方の末端は、オーバーハングを有し、ここで、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、及びｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；及び（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含み、且つ任意選択的に、２ヌクレオチドオーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端上に存在し、且つ平滑末端は、アンチセンス鎖の５’末端に存在することの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、５又は６つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。一部の実施形態では、オーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端上に存在し、且つ平滑末端は、アンチセンス鎖の５’末端に存在する。
【０１９２】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡ二本鎖の両末端に２つの平滑末端も有し得る。
【０１９３】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、二本鎖の両末端に平滑末端を有し、ここで、アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むこと；及び（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むことの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６又は７つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０１９４】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、１９、２０、２１、２２又は２３ヌクレオチド塩基対長の二本鎖領域を有し、二本鎖の両末端に平滑末端を有し、ここで、ｄｓＲＮＡの一方の末端は、平滑末端であり、且つ他方の末端は、オーバーハングを有し、ここで、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、及びｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；及び（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むことの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、５又は６つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０１９５】
熱不安定化修飾
上記の通り、ｄｓＲＮＡ分子は、オフターゲット遺伝子サイレンシングを低減又は阻害するため、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）熱不安定化修飾を組み込むことにより、ＲＮＡ干渉について最適化され得る。本発明者らは、アンチセンス鎖の５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含むアンチセンス鎖を有するｄｓＲＮＡが、オフターゲット遺伝子サイレンシング活性を低下させていることを発見している。したがって、一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’領域の最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５又はそれ以上）の熱不安定化修飾を含む。一部の実施形態では、二本鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から２〜９位又は好ましくは４〜８位に位置する。一部のさらなる実施形態では、二本鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から６、７又は８位に位置する。
【０１９６】
さらに一部のさらなる実施形態では、二本鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から７位に位置する。用語「熱不安定化修飾」は、より低い完全融解温度（Ｔｍ）（好ましくは、かかる修飾を有しない場合のｄｓＲＮＡのＴｍよりも１、２、３又は４℃低いＴｍを有するｄｓＲＮＡをもたらすことになる修飾を含む。一部の実施形態では、二本鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から２、３、４、５又は９位に位置する。
【０１９７】
熱不安定化修飾は、限定はされないが、脱塩基修飾；逆鎖における対向するヌクレオチドとのミスマッチ；及び糖修飾、例えば２’−デオキシ修飾又は非環状ヌクレオチド、例えばアンロックド核酸（ＵＮＡ）又はグリコール核酸（ＧＮＡ）を含み得る。例えば、熱不安定化修飾として、限定はされないが、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素を挙げることができる。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。
【０１９８】
一部の実施形態では、不安定化修飾ｍＵＮＡは、
【化１０】
2021523720.tif 000012
（式中、
Ｒは、Ｈ、ＯＨ；ＯＭｅ；Ｃｌ、Ｆ；ＯＨ；Ｏ−（ＣＨ２）２ＯＭｅ；ＳＭｅ、ＮＭｅ２；ＮＨ２；Ｍｅ；ＣＣＨ（アルキン）、Ｏ−ｎＰｒ；Ｏ−アルキル；又はＯ−アルキルアミノであり；
Ｒ’は、Ｈ又はＭｅであり、
Ｂは、Ａ；Ｃ；５−Ｍｅ−Ｃ；Ｇ；Ｉ；Ｕ；Ｔ；Ｙ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環；シュードウラシル；ｉｓｏＣ；ｉｓｏＧ；２，６−ジアミノプリン；シュードシトシン；２−アミノプリン；キサントシン；Ｎ６−アルキル−Ａ；Ｏ６−アルキル−Ｇ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；７−デアザプリン、フェノキサジン；Ｇクランプ；又は非正準の単環式、二環式及び三環式複素環であり、及び
立体化学は、不特定のキラル中心についてＲ又はＳ及びＲとＳとの組み合わせである）
からなる群から選択される。
【０１９９】
一部の実施形態では、不安定化修飾ｍＵＮＡは、
【化１１】
2021523720.tif 000013
（式中、
Ｒは、Ｈ、ＯＨ；ＯＭｅ；Ｃｌ、Ｆ；ＯＨ；Ｏ−（ＣＨ２）２ＯＭｅ；ＳＭｅ、ＮＭｅ２；ＮＨ２；Ｍｅ；ＣＣＨ（アルキン）、Ｏ−ｎＰｒ；Ｏ−アルキル；又はＯ−アルキルアミノであり；
Ｒ’は、Ｈ又はＭｅであり、
Ｂは、Ａ；Ｃ；５−Ｍｅ−Ｃ；Ｇ；Ｉ；Ｕ；Ｔ；Ｙ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環；シュードウラシル；ｉｓｏＣ；ｉｓｏＧ；２，６−ジアミノプリン；シュードシトシン；２−アミノプリン；キサントシン；Ｎ６−アルキル−Ａ；Ｏ６−アルキル−Ｇ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；７−デアザプリン、フェノキサジン；Ｇクランプ；又は非正準の単環式、二環式及び三環式複素環であり、及び
立体化学は、不特定のキラル中心についてＲ又はＳ及びＲとＳとの組み合わせである）
からなる群から選択される。
【０２００】
一部の実施形態では、不安定化修飾ｍＵＮＡは、
【化１２】
2021523720.tif 000014
（式中、
Ｒは、Ｈ、ＯＭｅ；Ｆ；ＯＨ；Ｏ−（ＣＨ２）２ＯＭｅ；ＳＭｅ、ＮＭｅ２；ＮＨ２；Ｍｅ；Ｏ−ｎＰｒ；Ｏ−アルキル；又はＯ−アルキルアミノであり；
Ｒ’は、Ｈ又はＭｅであり、
Ｂは、Ａ；Ｃ；５−Ｍｅ−Ｃ；Ｇ；Ｉ；Ｕ；Ｔ；Ｙ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環；シュードウラシル；ｉｓｏＣ；ｉｓｏＧ；２，６−ジアミノプリン；シュードシトシン；２−アミノプリン；キサントシン；Ｎ６−アルキル−Ａ；Ｏ６−アルキル−Ｇ；又は７−デアザプリンであり、及び
立体化学は、不特定のキラル中心についてＲ又はＳ及びＲとＳとの組み合わせである）
からなる群から選択される。
【０２０１】
一部の実施形態では、不安定化修飾ｍＵＮＡは、
【化１３】
2021523720.tif 000015
（式中、
Ｒは、Ｈ、ＯＨ；ＯＭｅ；Ｃｌ、Ｆ；ＯＨ；Ｏ−（ＣＨ２）２ＯＭｅ；ＳＭｅ、ＮＭｅ２；ＮＨ２；Ｍｅ；ＣＣＨ（アルキン）、Ｏ−ｎＰｒ；Ｏ−アルキル；又はＯ−アルキルアミノであり；
Ｒ’は、Ｈ又はＭｅであり；
Ｂは、Ａ；Ｃ；５−Ｍｅ−Ｃ；Ｇ；Ｉ；Ｕ；Ｔ；Ｙ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環；シュードウラシル；ｉｓｏＣ；ｉｓｏＧ；２，６−ジアミノプリン；シュードシトシン；２−アミノプリン；キサントシン；Ｎ６−アルキル−Ａ；Ｏ６−アルキル−Ｇ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；７−デアザプリン、フェノキサジン；Ｇクランプ；又は非正準の単環式、二環式及び三環式複素環であり、及び
立体化学は、不特定のキラル中心についてＲ又はＳ及びＲとＳとの組み合わせである）
からなる群から選択される。
【０２０２】
一部の実施形態では、不安定化修飾ｍＵＮＡは、
【化１４】
2021523720.tif 000016
（式中、
Ｒは、Ｈ、ＯＨ；ＯＭｅ；Ｃｌ、Ｆ；ＯＨ；Ｏ−（ＣＨ２）２ＯＭｅ；ＳＭｅ、ＮＭｅ２；ＮＨ２；Ｍｅ；ＣＣＨ（アルキン）、Ｏ−ｎＰｒ；Ｏ−アルキル；又はＯ−アルキルアミノであり；
Ｒ’は、Ｈ又はＭｅであり、
Ｂは、Ａ；Ｃ；５−Ｍｅ−Ｃ；Ｇ；Ｉ；Ｕ；Ｔ；Ｙ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環；シュードウラシル；ｉｓｏＣ；ｉｓｏＧ；２，６−ジアミノプリン；シュードシトシン；２−アミノプリン；キサントシン；Ｎ６−アルキル−Ａ；Ｏ６−アルキル−Ｇ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；７−デアザプリン、フェノキサジン；Ｇクランプ；又は非正準の単環式、二環式及び三環式複素環であり、及び
立体化学は、不特定のキラル中心についてＲ又はＳ及びＲとＳとの組み合わせである）
からなる群から選択される。
【０２０３】
一部の実施形態では、修飾ｍＵＮＡは、
【化１５】
2021523720.tif 000017
（式中、
Ｒは、Ｈ、ＯＭｅ；Ｆ；ＯＨ；Ｏ−（ＣＨ２）２ＯＭｅ；ＳＭｅ、ＮＭｅ２；ＮＨ２；Ｍｅ；Ｏ−ｎＰｒ；Ｏ−アルキル；又はＯ−アルキルアミノであり；
Ｒ’は、Ｈ又はＭｅであり、
Ｂは、Ａ；Ｃ；５−Ｍｅ−Ｃ；Ｇ；Ｉ；Ｕ；Ｔ；Ｙ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環；シュードウラシル；ｉｓｏＣ；ｉｓｏＧ；２，６−ジアミノプリン；シュードシトシン；２−アミノプリン；キサントシン；Ｎ６−アルキル−Ａ；Ｏ６−アルキル−Ｇ；又は７−デアザプリンであり、及び
立体化学は、不特定のキラル中心についてＲ又はＳ及びＲとＳとの組み合わせである）
からなる群から選択される。
【０２０４】
一部の実施形態では、修飾ｍＵＮＡは、
【化１６】
2021523720.tif 000018
【化１７】
2021523720.tif 000019
【化１８】
2021523720.tif 000020
からなる群から選択される。
【０２０５】
例示的な脱塩基修飾は、限定はされないが、以下：
【化１９】
2021523720.tif 000021
（式中、Ｒは、Ｈ、Ｍｅ、Ｅｔ又はＯＭｅであり；Ｒ’は、Ｈ、Ｍｅ、Ｅｔ又はＯＭｅであり；Ｒ’’＝Ｈ、Ｍｅ、Ｅｔ又はＯＭｅである）
【化２０】
2021523720.tif 000022
（式中、Ｂは、修飾又は非修飾核酸塩基であり、及び各構造上のアスタリスクは、Ｒ、Ｓ又はラセミのいずれかを表す）
を含む。
【０２０６】
例示的な糖修飾は、限定はされないが、以下：
【化２１】
2021523720.tif 000023
（式中、Ｂは、修飾又は非修飾核酸塩基であり、及び各構造上のアスタリスクは、Ｒ、Ｓ又はラセミのいずれかを表す）
を含む。
【０２０７】
一部の実施形態では、二本鎖の熱不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０２０８】
用語「非環状ヌクレオチド」は、例えば、リボース炭素間の結合のいずれか（例えば、Ｃ１’−Ｃ２’、Ｃ２’−Ｃ３’、Ｃ３’−Ｃ４’、Ｃ４’−Ｏ４’又はＣ１’−Ｏ４’）が不在であり、且つ／又はリボース炭素若しくは酸素の少なくとも１つ（例えば、Ｃ１’、Ｃ２’、Ｃ３’、Ｃ４’又はＯ４’）が独立して又は組み合わせてヌクレオチドから不在である場合、非環状リボース糖を有する任意のヌクレオチドを指す。一部の実施形態では、非環状ヌクレオチドは、
【化２２】
2021523720.tif 000024
（式中、Ｂは、修飾又は非修飾核酸塩基であり、Ｒ１及びＲ２は、独立して、Ｈ、ハロゲン、ＯＲ３又はアルキルであり；且つＲ３は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール又は糖である）
である。用語「ＵＮＡ」は、アンロックド非環状核酸を指し、ここで、糖の結合のいずれかは除去されており、アンロックド「糖」残基を形成する。一例では、ＵＮＡは、Ｃ１’−Ｃ４’間の結合（すなわちＣ１’及びＣ４’炭素間の炭素−酸素−炭素共有結合）が除去されている単量体も包含する。別の例では、糖のＣ２’−Ｃ３’結合（すなわちＣ２’及びＣ３’炭素間の炭素−炭素共有結合）が除去される（Ｍｉｋｈａｉｌｏｖｅｔ．ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２６（１７）：２０５９（１９８５）；及びＦｌｕｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．，１０：１０３９（２００９）（ここで、それら全体が参照により援用される）を参照）。非環状誘導体は、ワトソン・クリック対合に影響することなく、より大きい骨格の柔軟性をもたらす。非環状ヌクレオチドは、２’−５’又は３’−５’結合を介して連結され得る。
【０２０９】
用語「ＧＮＡ」は、ＤＮＡ又はＲＮＡに類似するが、その「骨格」の組成においてホスホジエステル結合によって連結される反復グリセロール単位から構成される点で異なるポリマーであるグリコール核酸を指す。
【化２３】
2021523720.tif 000025
【０２１０】
二本鎖の熱不安定化修飾は、ｄｓＲＮＡ二本鎖内で、熱不安定化ヌクレオチドと逆鎖内の対向するヌクレオチドとの間でミスマッチ（すなわち非相補性塩基対）であり得る。例示的なミスマッチ塩基対として、Ｇ：Ｇ、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕ、Ｇ：Ｔ、Ａ：Ａ、Ａ：Ｃ、Ｃ：Ｃ、Ｃ：Ｕ、Ｃ：Ｔ、Ｕ：Ｕ、Ｔ：Ｔ、Ｕ：Ｔ又はそれらの組み合わせが挙げられる。当技術分野で公知の他のミスマッチ塩基対形成も本発明に従う。ミスマッチは、天然に存在するヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドのいずれかのヌクレオチド間で生じ得、すなわちミスマッチ塩基対形成は、ヌクレオチドのリボース糖上の修飾と独立して、各々のヌクレオチドからの核酸塩基間で生じ得る。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、２’−デオキシ核酸塩基である、ミスマッチ対合における少なくとも１つの核酸塩基を有し；例えば、２’−デオキシ核酸塩基は、センス鎖内に存在する。
【０２１１】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖のシード領域内の二本鎖の熱不安定化修飾は、標的ｍＲＮＡ上の相補性塩基に対する障害されたＷ−Ｃ  Ｈ結合を有するヌクレオチドを含み、例えば、
【化２４】
2021523720.tif 000026
が挙げられる。
【０２１２】
脱塩基ヌクレオチド、非環状ヌクレオチド修飾（ＵＮＡ及びＧＮＡを含む）及びミスマッチ修飾のより多くの例が、国際公開第２０１１／１３３８７６号パンフレット（その全体が参照により本明細書中に援用される）中に詳述されている。
【０２１３】
熱不安定化修飾は、対向塩基と水素結合を形成する能力が低下又は消失したユニバーサル塩基及びリン酸修飾も含み得る。
【０２１４】
一部の実施形態では、二本鎖の熱不安定化修飾は、限定はされないが、逆鎖内の塩基と水素結合を形成する能力が損なわれるか又は完全に失われた核酸塩基修飾などの非標準塩基を有するヌクレオチドを含む。これらの核酸塩基修飾は、国際公開第２０１０／００１１８９５号パンフレット（その全体が参照により本明細書中に援用される）中に記載の通り、ｄｓＲＮＡ二本鎖の中心的領域の不安定化について評価されている。例示的な核酸塩基修飾は次の通りである。
【化２５】
2021523720.tif 000027
【０２１５】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖のシード領域内の二本鎖の熱不安定化修飾は、標的ｍＲＮＡ上の塩基に対して相補的な１つ以上のα−ヌクレオチド、例えば、
【化２６】
2021523720.tif 000028
（式中、Ｒは、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、Ｆ、ＮＨ２、ＮＨＭｅ、ＮＭｅ２又はＯ−アルキルである）
を含む。
【０２１６】
天然リン酸ジエステル結合と比べて、ｄｓＲＮＡ二本鎖の熱安定性を低下させることで知られる例示的なリン酸修飾として、
【化２７】
2021523720.tif 000029
が挙げられる。
【０２１７】
Ｒ基におけるアルキルは、Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。Ｒ基における具体的なアルキルとして、限定はされないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ペンチル及びヘキシルが挙げられる。
【０２１８】
一部の実施形態では、例示的な不安定化修飾は、図１に示される。
【０２１９】
熱不安定化修飾を含むアンチセンス鎖に加えて、ｄｓＲＮＡは、１つ以上の安定化修飾も含み得る。例えば、ｄｓＲＮＡは、少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上）の安定化修飾を含み得る。限定はされないが、安定化修飾は全て、片鎖内に存在し得る。一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖の両方は、少なくとも２つの安定化修飾を含む。安定化修飾は、センス鎖又はアンチセンス鎖の任意のヌクレオチド上に存在し得る。例えば、安定化修飾は、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖上の全てのヌクレオチド上に存在し得るか；各安定化修飾は、センス鎖又はアンチセンス鎖上に交互パターンで存在し得るか；又はセンス鎖又はアンチセンス鎖は、両方の安定化修飾を交互パターンで含む。センス鎖上の安定化修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同じであるか又は異なり得、センス鎖上の安定化修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上の安定化修飾の交互パターンに対する変化を有し得る。
【０２２０】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上）の安定化修飾を含む。限定はされないが、アンチセンス鎖における安定化修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態では、アンチセンスは、５’末端から２、６、８、９、１４及び１６位に安定化修飾を含む。一部の他の実施形態では、アンチセンスは、５’末端から２、６、１４及び１６位に安定化修飾を含む。さらに一部の他の実施形態では、アンチセンスは、５’末端から２、１４及び１６位に安定化修飾を含む。
【０２２１】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾に隣接した少なくとも１つの安定化修飾を含む。例えば、安定化修飾は、不安定化修飾の５’末端又は３’末端、すなわち不安定化修飾の位置から−１又は＋１位のヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾の５’末端及び３’末端の各々、すなわち不安定化修飾の位置から−１及び＋１位に安定化修飾を含む。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾の３’末端、すなわち不安定化修飾の位置から＋１及び＋２位に少なくとも２つの安定化修飾を含む。
【０２２２】
一部の実施形態では、センス鎖は、少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上）の安定化修飾を含む。限定はされないが、センス鎖における安定化修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態では、センス鎖は、５’末端から７、１０及び１１位に安定化修飾を含む。一部の他の実施形態では、センス鎖は、５’末端から７、９、１０及び１１位に安定化修飾を含む。一部の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えてアンチセンス鎖の１１、１２及び１５位に対して対向的又は相補的な位置に安定化修飾を含む。一部の他の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えてアンチセンス鎖の１１、１２、１３及び１５位に対して対向的又は相補的な位置に安定化修飾を含む。一部の実施形態では、センス鎖は、２、３又は４つの安定化修飾の遮断を含む。
【０２２３】
一部の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖における二本鎖の熱不安定化修飾に対して対向的又は相補的な位置に安定化修飾を含まない。
【０２２４】
例示的な熱安定化修飾として、限定はされないが、２’−フルオロ修飾が挙げられる。他の熱安定化修飾として、限定はされないが、ＬＮＡが挙げられる。
【０２２５】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、少なくとも４つ（例えば、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上）の２’−フルオロヌクレオチドを含む。限定はされないが、２’−フルオロヌクレオチドの全部が片鎖に存在し得る。一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖の両方は、少なくとも２つの２’−フルオロヌクレオチドを含む。２’−フルオロ修飾は、センス鎖又はアンチセンス鎖の任意のヌクレオチド上に存在し得る。例えば、２’−フルオロ修飾は、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖上の全てのヌクレオチド上に存在し得るか；各２’−フルオロ修飾は、センス鎖又はアンチセンス鎖上に交互パターンで存在し得るか；又はセンス鎖又はアンチセンス鎖は、両方の２’−フルオロ修飾を交互パターンで含む。センス鎖上の安定化修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同じであるか又は異なり得、センス鎖上での２’−フルオロ修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上の２’−フルオロ修飾の交互パターンに対する変化を有し得る。
【０２２６】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上）の２’−フルオロヌクレオチドを含む。限定はされないが、アンチセンス鎖における２’−フルオロ修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態では、アンチセンスは、５’末端から２、６、８、９、１４及び１６位に２’−フルオロヌクレオチドを含む。一部の他の実施形態では、アンチセンスは、５’末端から２、６、１４及び１６位に２’−フルオロヌクレオチドを含む。さらに一部の他の実施形態では、アンチセンスは、５’末端から２、１４及び１６位に２’−フルオロヌクレオチドを含む。
【０２２７】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾に隣接した少なくとも１つの２’−フルオロヌクレオチドを含む。例えば、２’−フルオロヌクレオチドは、不安定化修飾の５’末端又は３’末端、すなわち不安定化修飾の位置から−１又は＋１位のヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾の５’末端及び３’末端の各々、すなわち不安定化修飾の位置から−１及び＋１位に２’−フルオロヌクレオチドを含む。
【０２２８】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾の３’末端、すなわち不安定化修飾の位置から＋１及び＋２位に少なくとも２つの２’−フルオロヌクレオチドを含む。
【０２２９】
一部の実施形態では、センス鎖は、少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上）の２’−フルオロヌクレオチドを含む。限定はされないが、センス鎖における２’−フルオロ修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態では、アンチセンスは、５’末端から７、１０及び１１位に２’−フルオロヌクレオチドを含む。一部の他の実施形態では、センス鎖は、５’末端から７、９、１０及び１１位に２’−フルオロヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えてアンチセンス鎖の１１、１２及び１５位に対して対向的又は相補的な位置に２’−フルオロヌクレオチドを含む。一部の他の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えてアンチセンス鎖の１１、１２、１３及び１５位に対して対向的又は相補的な位置に２’−フルオロヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、センス鎖は、２、３又は４つの２’−フルオロヌクレオチドの遮断を含む。
【０２３０】
一部の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖における二本鎖の熱不安定化修飾に対して対向的又は相補的な位置に２’−フルオロヌクレオチドを含まない。
【０２３１】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、２１ヌクレオチド（ｎｔ）のセンス鎖及び２３ヌクレオチド（ｎｔ）のアンチセンスを含み、ここで、アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位）に存在し、ここで、ｄｓＲＮＡの一方の末端は平滑である一方、他方の末端は、２ｎｔオーバーハングを含み、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むこと；及び（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含むことの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６又は７つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。好ましくは、２ｎｔオーバーハングは、アンチセンスの３’末端に存在する。
【０２３２】
一部の実施形態では、センス及びアンチセンス鎖を含む本発明のｄｓＲＮＡ分子において、センス鎖は、２５〜３０ヌクレオチド残基長であり、ここで、前記センス鎖の５’末端ヌクレオチド（１位）から始まる１〜２３位は、少なくとも８つのリボヌクレオチドを含み；アンチセンス鎖は、３６〜６６ヌクレオチド残基長であり、３’末端ヌクレオチドから始まる、その位置内の少なくとも８つのリボヌクレオチドがセンス鎖の１〜２３位と対合することで、二本鎖を形成し；ここで、少なくとも、アンチセンス鎖の３’末端ヌクレオチドは、センス鎖と対合せず、最大で６つの連続する３’末端ヌクレオチドは、センス鎖と対合せず、それにより１〜６ヌクレオチドの３’一本鎖オーバーハングを形成し；ここで、アンチセンス鎖の５’末端は、センス鎖と対合しない１０〜３０の連続するヌクレオチドを含み、それにより１０〜３０ヌクレオチドの一本鎖５’オーバーハングを形成し；ここで、少なくとも、センス鎖の５’末端及び３’末端ヌクレオチドは、センス及びアンチセンス鎖が最大相補性のために整列されるとき、アンチセンス鎖のヌクレオチドと塩基対合され、それによりセンス及びアンチセンス鎖間で実質的に二本鎖の領域を形成し；前記二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるとき、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖長の少なくとも１９のリボヌクレオチドに沿って標的ＲＮＡに対して十分に相補的であることで、標的遺伝子発現を低減し；ここで、アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に存在し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。例えば、熱不安定化ヌクレオチドは、センス鎖の５’末端の１４〜１７位に対して対向的又は相補的な位置間に存在し、ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；及び（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むこと；及び（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜３０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むことの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６又は７つ全部）を���らに有する。
【０２３３】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス及びアンチセンス鎖を含み、ここで、前記ｄｓＲＮＡ分子は、少なくとも２５、最大で２９ヌクレオチドの長さを有するセンス鎖を含み、最大で３０ヌクレオチドの長さを有するアンチセンス鎖は、センス鎖と共に、５’末端から１１位で酵素分解を受けやすい修飾ヌクレオチドを含み、ここで、前記センス鎖の３’末端及び前記アンチセンス鎖の５’末端は、平滑末端を形成し、前記アンチセンス鎖は、その３’末端でセンス鎖よりも１〜４ヌクレオチド長く、ここで、少なくとも２５ヌクレオチド長である二本鎖領域では、前記ｄｓＲＮＡ分子が哺乳動物細胞に導入されるとき、前記アンチセンス鎖は、前記アンチセンス鎖長の少なくとも１９ｎｔに沿って標的ｍＲＮＡに対して十分に相補的であることで、標的遺伝子の発現を低減し、ここで、前記ｄｓＲＮＡのダイサー切断により、前記アンチセンス鎖の前記３’末端を含むｓｉＲＮＡが優先的にもたらされ、それにより哺乳動物における標的遺伝子の発現が低減され、ここで、アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、ここで、ｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；及び（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むこと；及び（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２９ヌクレオチド対長の二本鎖領域を有することの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６又は７つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０２３４】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖及びアンチセンス鎖における全てのヌクレオチドは、修飾され得る。各ヌクレオチドは、同じ又は異なる修飾で修飾され得、その修飾は、非結合リン酸酸素及び／又は１つ以上の結合リン酸酸素の一方又は両方の１つ以上の変更；リボース糖の成分、例えばリボース糖の２’ヒドロキシルの変更；リン酸部分の「デホスホ」リンカーでの大量の置換；天然塩基の修飾又は置換；及びリボース−リン酸骨格の置換又は修飾を含み得る。
【０２３５】
核酸がサブユニットのポリマーであることから、例えば、塩基、又はリン酸部分、又はリン酸部分の非連結Ｏの修飾といった修飾の多くは、核酸内部で反復される位置で生じる。場合によっては、修飾は核酸中のあらゆる対象位置で生じることになるが、多くの場合、そうならない。例として、修飾は、３’又は５’末端位置に限って生じ得るか、又は末端領域内、例えば末端ヌクレオチド上のある位置又は鎖の最後の２、３、４、５又は１０ヌクレオチド中に限って生じ得る。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域又はその両方において生じ得る。修飾は、ＲＮＡの二本鎖領域内に限って生じ得るか、又はＲＮＡの一本鎖領域内に限って生じ得る。例えば、非連結Ｏ位置でのホスホロチオエート修飾は、一末端又は両末端に限って生じ得るか、末端領域内、例えば末端ヌクレオチド上のある位置又は鎖の最後の２、３、４、５又は１０ヌクレオチド中に限って生じ得るか、又は二本鎖及び一本鎖領域内、特に末端で生じ得る。５’末端は、リン酸化され得る。
【０２３６】
例えば、安定性を増強させるか、オーバーハング中に特定塩基を含めるか、又は一本鎖オーバーハング中、例えば５’若しくは３’オーバーハング中又は両方に修飾ヌクレオチド若しくはヌクレオチド代替物を含めることは可能であり得る。例えば、オーバーハング中にプリンヌクレオチドを含めることが望ましい可能性がある。一部の実施形態では、３’若しくは５’オーバーハング中の塩基の全部若しくは一部を例えば本明細書に記載の修飾で修飾し得る。修飾は、例えば、リボース糖の２’位での当技術分野で公知の修飾による修飾の使用、例えば核酸塩基のリボ糖に代わるデオキシリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロ（２’−Ｆ）若しくは２’−Ｏ−メチル修飾の使用及びリン酸基における修飾、例えばホスホロチオエート修飾を含み得る。オーバーハングは、標的配列と相同である必要はない。
【０２３７】
一部の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の各残基は、独立してＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’−メトキシエチル、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、２’−デオキシ又は２’−フルオロで修飾される。それらの鎖は、２つ以上の修飾を含み得る。一部の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の各残基は、独立して２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロで修飾される。これらの修飾が、アンチセンス鎖に存在する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾に加えて存在することは理解されるべきである。
【０２３８】
少なくとも２つの異なる修飾は、典型的にはセンス鎖及びアンチセンス鎖上に存在する。それら２つの修飾は、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロ修飾、非環状ヌクレオチド又はその他であり得る。一部の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の各々は、２’−Ｏ−メチル又は２’−デオキシから選択される、２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の各残基は、独立して、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）ヌクレオチド、２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）ヌクレオチド、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）ヌクレオチド又は２’−アラ−Ｆヌクレオチドで修飾される。再び、これらの修飾が、アンチセンス鎖に存在する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾に加えて存在することは理解されるべきである。
【０２３９】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、特に、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、Ｂ４’領域内に交互パターンの修飾を含む。用語「交互モチーフ」又は「交互パターン」は、本明細書で用いられるとき、１つ以上の修飾を有するモチーフであって、各修飾が１本の鎖の交互ヌクレオチド上で生じるものを指す。交互ヌクレオチドは、１つ置きのヌクレオチドごとに１つ又は３つのヌクレオチドごとに１つ又は類似パターンを指し得る。例えば、Ａ、Ｂ及びＣの各々がヌクレオチドに対する１つの修飾タイプを表す場合、交互モチーフは、「ＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢ．．．」、「ＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ．．．」、「ＡＡＢＡＡＢＡＡＢＡＡＢ．．．」、「ＡＡＡＢＡＡＡＢＡＡＡＢ．．．」、「ＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ．．．」又は「ＡＢＣＡＢＣＡＢＣＡＢＣ．．．」などであり得る。
【０２４０】
交互モチーフ内に含まれる修飾のタイプは、同じであるか又は異なり得る。例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの各々がヌクレオチドに対する１つの修飾タイプを表す場合、交互パターン、すなわち１つ置きのヌクレオチドに対する修飾は、同じであり得るが、センス鎖又はアンチセンス鎖の各々は、例えば、「ＡＢＡＢＡＢ．．．」、「ＡＣＡＣＡＣ．．．」、「ＢＤＢＤＢＤ．．．」又は「ＣＤＣＤＣＤ．．．」など、交互モチーフ内部の幾つかの修飾の可能性から選択され得る。
【０２４１】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖上の交互モチーフにおける修飾パターンが、アンチセンス鎖上の交互モチーフにおける修飾パターンに対して変化することを含む。センス鎖のヌクレオチドの修飾基がアンチセンス鎖のヌクレオチドの異なる修飾基に対応し、その逆もいえるような変化であり得る。例えば、センス鎖がｄｓＲＮＡ二本鎖におけるアンチセンス鎖と対合するとき、二本鎖領域内部で、センス鎖内の交互モチーフは鎖の５’−３’から「ＡＢＡＢＡＢ」で開始し得、且つアンチセンス鎖内の交互モチーフは鎖の３’−５’から「ＢＡＢＡＢＡ」で開始し得る。別の例として、二本鎖領域内部で、センス鎖内の交互モチーフは鎖の５’−３’から「ＡＡＢＢＡＡＢＢ」で開始し得、且つアンチセンス鎖内の交互モチーフは鎖の３’−５’から「ＢＢＡＡＢＢＡＡ」で開始し得、それによりセンス鎖とアンチセンス鎖との間に修飾パターンの完全な変化又は部分的変化が存在する。
【０２４２】
本発明のｄｓＲＮＡ分子は、少なくとも１つのホスホロチオエート又はメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合をさらに含み得る。ホスホロチオエート又はメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾は、センス鎖若しくはアンチセンス鎖又は両方の、鎖の任意の位置における任意のヌクレオチド上に生じ得る。例えば、ヌクレオチド間結合修飾は、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖上の全てのヌクレオチド上に生じ得るか；各ヌクレオチド間結合修飾は、センス鎖又はアンチセンス鎖上に交互パターンで生じ得るか；又はセンス鎖若しくはアンチセンス鎖は、両方のヌクレオチド間結合修飾を交互パターンで含む。センス鎖上のヌクレオチド間結合修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同じであるか又は異なり得、センス鎖上のヌクレオチド間結合修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上のヌクレオチド間結合修飾の交互パターンに対して変化を有し得る。
【０２４３】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、オーバーハング領域内にホスホロチオエート又はメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾を含む。例えば、オーバーハング領域は、２つのヌクレオチド間にホスホロチオエート又はメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合を有する２つのヌクレオチドを含む。ヌクレオチド間結合修飾は、オーバーハングヌクレオチドを二本鎖領域内部の末端の対合ヌクレオチドと連結するためにも設けられ得る。例えば、少なくとも２、３、４若しくは全てのオーバーハングヌクレオチドは、ホスホロチオエート又はメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合を通じて連結され得、任意選択的に、オーバーハングヌクレオチドをオーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドと連結する、追加的なホスホロチオエート又はメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合が存在し得る。例えば、末端の３つのヌクレオチド間に少なくとも２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合が存在し得、ここで、３つのうちの２つのヌクレオチドはオーバーハングヌクレオチドであり、且つ３つ目はオーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。好ましくは、これら末端の３つのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端に存在し得る。
【０２４４】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６のリン酸ヌクレオチド間結合によって分離される、２〜１０のホスホロチオエート又はメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の１〜１０のブロックを含み、ホスホロチオエート又はメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の一方は、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記センス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホン酸及びリン酸のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むアンチセンス鎖又はホスホロチオエート若しくはメチルホスホン酸若しくはリン酸の結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【０２４５】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８のリン酸ヌクレオチド間結合によって分離される２つのホスホロチオエート又はメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ここで、ホスホロチオエート又はメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の一方は、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホン酸及びリン酸のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖又はホスホロチオエート若しくはメチルホスホン酸若しくはリン酸の結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【０２４６】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６のリン酸ヌクレオチド間結合によって分離される３つのホスホロチオエート又はメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ここで、ホスホロチオエート又はメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の一方は、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホン酸及びリン酸のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖又はホスホロチオエート若しくはメチルホスホン酸若しくはリン酸の結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【０２４７】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４のリン酸ヌクレオチド間結合によって分離される４つのホスホロチオエート又はメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ここで、ホスホロチオエート又はメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の一方は、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホン酸及びリン酸のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖又はホスホロチオエート若しくはメチルホスホン酸若しくはリン酸の結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【０２４８】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２のリン酸ヌクレオチド間結合によって分離される５つのホスホロチオエート又はメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ここで、ホスホロチオエート又はメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の一方は、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホン酸及びリン酸のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖又はホスホロチオエート若しくはメチルホスホン酸若しくはリン酸の結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【０２４９】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０のリン酸ヌクレオチド間結合によって分離される６つのホスホロチオエート又はメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ここで、ホスホロチオエート又はメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の一方は、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホン酸及びリン酸のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖又はホスホロチオエート若しくはメチルホスホン酸若しくはリン酸の結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【０２５０】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７又は８つのリン酸ヌクレオチド間結合によって分離される７つのホスホロチオエート又はメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ここで、ホスホロチオエート又はメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の一方は、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホン酸及びリン酸のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖又はホスホロチオエート若しくはメチルホスホン酸若しくはリン酸の結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【０２５１】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５又は６つのリン酸ヌクレオチド間結合によって分離される８つのホスホロチオエート又はメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ここで、ホスホロチオエート又はメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の一方は、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホン酸及びリン酸のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖又はホスホロチオエート若しくはメチルホスホン酸若しくはリン酸の結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【０２５２】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３又は４つのリン酸ヌクレオチド間結合によって分離される９つのホスホロチオエート又はメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ここで、ホスホロチオエート又はメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の一方は、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホン酸及びリン酸のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖又はホスホロチオエート若しくはメチルホスホン酸若しくはリン酸の結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【０２５３】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス及び／又はアンチセンス鎖の末端位置の１〜１０以内に１つ以上のホスホロチオエート又はメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０のヌクレオチドは、センス及び／又はアンチセンス鎖の一端又は両端でホスホロチオエート又はメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合を通じて連結され得る。
【０２５４】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス及び／又はアンチセンス鎖各々の二本鎖の内部領域の１〜１０以内に１つ以上のホスホロチオエート又はメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０のヌクレオチドは、二本鎖領域のセンス鎖の５’末端から数えて８〜１６位でホスホロチオエートメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合を通じて連結され得；ｄｓＲＮＡ分子は、任意選択的に、１つ以上のホスホロチオエート又はメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾を末端１〜１０位以内にさらに含み得る。
【０２５５】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１〜５位以内に１〜５つのホスホロチオエート又はメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に１〜５つのホスホロチオエート又はメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾並びにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１及び２位に１〜５つのホスホロチオエート又はメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に１〜５つのホスホロチオエート又はメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２５６】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１〜５位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に１つのホスホロチオエート又はメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾並びにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１及び２位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエート又はメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２５７】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾並びにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１及び２位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２５８】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾並びにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１及び２位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２５９】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾並びにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１及び２位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２６０】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１〜５位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾並びにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２６１】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１〜５位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾並びにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２６２】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１〜５位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾並びにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２６３】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾並びにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１及び２位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２６４】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾並びにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２６５】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾並びにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２６６】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾並びにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１及び２位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２６７】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と２０及び２１位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾並びにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と２１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２６８】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と２１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾並びにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と２０及び２１位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２６９】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と２１及び２２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾並びにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と２１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２７０】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と２１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾並びにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と２１及び２２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２７１】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と２２及び２３位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾並びにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾及び２１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２７２】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と２１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾並びにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と２３及び２３位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２７３】
一部の実施形態では、本発明の化合物は、骨格キラル中心のパターンを含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも５つのヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも６つのヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも７つのヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも８つのヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも９つのヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１０のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１１のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１２のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１３のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１４のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１５のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１６のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１７のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１８のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１９のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｒｐ立体配置において８以下のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｒｐ立体配置において７以下のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｒｐ立体配置において６以下のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｒｐ立体配置において５以下のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｒｐ立体配置において４以下のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｒｐ立体配置において３以下のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｒｐ立体配置において２以下のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｒｐ立体配置において１以下のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、（非限定例として、リン酸ジエステルである）キラルでない８以下のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、キラルでない７以下のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、キラルでない６以下のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、キラルでない５以下のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、キラルでない４以下のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、キラルでない３以下のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、キラルでない２以下のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、キラルでない１以下のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｓｐ立体配置における少なくとも１０のヌクレオチド間結合及びキラルでない８以下のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｓｐ立体配置における少なくとも１１のヌクレオチド間結合及びキラルでない７以下のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｓｐ立体配置における少なくとも１２のヌクレオチド間結合及びキラルでない６以下のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｓｐ立体配置における少なくとも１３のヌクレオチド間結合及びキラルでない６以下のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｓｐ立体配置における少なくとも１４のヌクレオチド間結合及びキラルでない５以下のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｓｐ立体配置における少なくとも１５のヌクレオチド間結合及びキラルでない４以下のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、Ｓｐ立体配置におけるヌクレオチド間結合は、任意選択的に、隣接的又は非隣接的である。一部の実施形態では、Ｒｐ立体配置におけるヌクレオチド間結合は、任意選択的に、隣接的又は非隣接的である。一部の実施形態では、キラルでないヌクレオチド間結合は、任意選択的に、隣接的又は非隣接的である。
【０２７４】
一部の実施形態では、本発明の化合物は、立体化学ブロックであるブロックを含む。一部の実施形態では、ブロックは、ブロックの各ヌクレオチド間結合がＲｐであるようなＲｐブロックである。一部の実施形態では、５’−ブロックがＲｐブロックである。一部の実施形態では、３’−ブロックがＲｐブロックである。一部の実施形態では、ブロックは、ブロックの各ヌクレオチド間結合がＳｐであるようなＳｐブロックである。一部の実施形態では、５’−ブロックがＳｐブロックである。一部の実施形態では、３’−ブロックがＳｐブロックである。一部の実施形態では、提供されるオリゴヌクレオチドは、Ｒｐ及びＳｐブロックの両方を含む。一部の実施形態では、提供されるオリゴヌクレオチドは、１つ以上のＲｐを含むが、Ｓｐブロックを含まない。一部の実施形態では、提供されるオリゴヌクレオチドは、１つ以上のＳｐを含むが、Ｒｐブロックを含まない。一部の実施形態では、提供されるオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオチド間結合が天然リン酸結合であるような１つ以上のＰＯブロックを含む。
【０２７５】
一部の実施形態では、本発明の化合物は、５’−ブロックは、各糖部分が２’−Ｆ修飾を含むようなＳｐブロックである。一部の実施形態では、５’−ブロックは、ヌクレオチド間結合の各々が修飾ヌクレオチド間結合であり、且つ各糖部分が２’−Ｆ修飾を含むようなＳｐブロックである。一部の実施形態では、５’−ブロックは、ヌクレオチド間結合の各々がホスホロチオエート結合であり、且つ各糖部分が２’−Ｆ修飾を含むようなＳｐブロックである。一部の実施形態では、５’−ブロックは、４以上のヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態では、５’−ブロックは、５以上のヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態では、５’−ブロックは、６以上のヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態では、５’−ブロックは、７以上のヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態では、３’−ブロックは、各糖部分が２’−Ｆ修飾を含むようなＳｐブロックである。一部の実施形態では、３’−ブロックは、ヌクレオチド間結合の各々が修飾ヌクレオチド間結合であり、且つ各糖部分が２’−Ｆ修飾を含むようなＳｐブロックである。一部の実施形態では、３’−ブロックは、ヌクレオチド間結合の各々がホスホロチオエート結合であり、且つ各糖部分が２’−Ｆ修飾を含むようなＳｐブロックである。一部の実施形態では、３’−ブロックは、４以上のヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態では、３’−ブロックは、５以上のヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態では、３’−ブロックは、６以上のヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態では、３’−ブロックは、７以上のヌクレオシド単位を含む。
【０２７６】
一部の実施形態では、本発明の化合物は、ある領域内にあるタイプのヌクレオシドを含むか、又はオリゴヌクレオチドは、特定タイプのヌクレオチド間結合、例えば天然リン酸結合、修飾ヌクレオチド間結合、Ｒｐキラルヌクレオチド間結合、Ｓｐキラルヌクレオチド間結合などによって後続される。一部の実施形態では、Ａは、Ｓｐによって後続される。一部の実施形態では、Ａは、Ｒｐによって後続される。一部の実施形態では、Ａは、天然リン酸結合（ＰＯ）によって後続される。一部の実施形態では、Ｕは、Ｓｐによって後続される。一部の実施形態では、Ｕは、Ｒｐによって後続される。一部の実施形態では、Ｕは、天然リン酸結合（ＰＯ）によって後続される。一部の実施形態では、Ｃは、Ｓｐによって後続される。一部の実施形態では、Ｃは、Ｒｐによって後続される。一部の実施形態では、Ｃは、天然リン酸結合（ＰＯ）によって後続される。一部の実施形態では、Ｇは、Ｓｐによって後続される。一部の実施形態では、Ｇは、Ｒｐによって後続される。一部の実施形態では、Ｇは、天然リン酸結合（ＰＯ）によって後続される。一部の実施形態では、Ｃ及びＵは、Ｓｐによって後続される。一部の実施形態では、Ｃ及びＵは、Ｒｐによって後続される。一部の実施形態では、Ｃ及びＵは、天然リン酸結合（ＰＯ）によって後続される。一部の実施形態では、Ａ及びＧは、Ｓｐによって後続される。一部の実施形態では、Ａ及びＧは、Ｒｐによって後続される。
【０２７７】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、ヌクレオチドの２１及び２２位間とヌクレオチド２２及び２３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、ここで、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、及びｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｉｉ）アンチセンスは、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；及び（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有することの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７又は８つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０２７８】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、ヌクレオチドの１及び２位間、ヌクレオチドの２及び３位間、ヌクレオチドの２１及び２２位間並びにヌクレオチドの２２及び２３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、ここで、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、及びｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｉｉｉ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｉｖ）センス鎖は、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｖ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；及び（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有することの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７又は８つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０２７９】
一部の実施形態では、センス鎖は、ヌクレオチドの１及び２位間とヌクレオチドの２及び３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、ここで、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、及びｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖ）センス鎖は、３、４又は５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；及び（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有することの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７又は８つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０２８０】
一部の実施形態では、センス鎖は、ヌクレオチドの１及び２位間とヌクレオチドの２及び３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、アンチセンス鎖は、ヌクレオチドの１及び２位間、ヌクレオチドの２及び３位間、ヌクレオチドの２１及び２２位間並びにヌクレオチドの２２及び２３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、ここで、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、及びｄｓＲＮＡは、任意選択的に、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５又は６つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされること；（ｉｉｉ）センス鎖は、２、３、４又は５つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｉｖ）センス鎖は、３又は４つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むこと；（ｖ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含むこと；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含むこと；及び（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有することの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６又は７つ全部）をさらに有し、ここで、不安定化修飾は、本明細書の実施例１〜３に記載されているｍＵＮＡ及びＧＮＡ構成要素から選択される。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ−ｉｓｏＣ、ＧＮＡ−ｉｓｏＧ、５’−ｍＵＮＡ、４’−ｍＵＮＡ、３’−ｍＵＮＡ及び２’−ｍＵＮＡからなる群から選択される。この一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ＧＮＡ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ、５’−Ｍｅ、Ｈｙ  ｐ−スペーサー、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ及びｈ’ＧＮＡ（ＭｏｄＡ−ＭｏｄＫ）からなる群から選択される少なくとも１つの熱不安定化修飾をさらに含む。
【０２８１】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、二本鎖内部に、標的とのミスマッチ又はその組み合わせを含む。ミスマッチは、オーバーハング領域内又は二本鎖領域内に存在し得る。塩基対は、解離又は融解を促進するその傾向に基づいて順位付けされ得る（例えば、最も簡単な手法は、特定の対合の会合又は解離の自由エネルギーについて、その対合を個別の対合に基づいて検討することであるが、酷似又は類似の分析も用いることができる）。解離を促進する観点では、Ａ：ＵはＧ：Ｃよりも好ましく；Ｇ：ＵはＧ：Ｃよりも好ましく；且つＩ：ＣはＧ：Ｃよりも好ましい（Ｉ＝イノシン）。ミスマッチ、例えば非基準若しくは基準以外の対合（本明細書中の他の箇所で記載の通り）は、基準（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）対合よりも好ましく；ユニバーサル塩基を含む対合は、基準の対合よりも好ましい。
【０２８２】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、二本鎖の５’末端でのアンチセンス鎖の解離を促進するため、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｕ、Ｉ：Ｃ及びミスマッチ対、例えば非基準若しくは基準以外の対合又はユニバーサル塩基を含む対合の群から独立して選択することができる、アンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内部の最初の１、２、３、４若しくは５つの塩基対の少なくとも１つを含む。
【０２８３】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖における５’末端からの二本鎖領域内部の１位のヌクレオチドは、Ａ、ｄＡ、ｄＵ、Ｕ及びｄＴからなる群から選択される。代わりに、アンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内部の最初の１、２若しくは３つの塩基対の少なくとも１つはＡＵ塩基対である。例えば、アンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内部の最初の塩基対はＡＵ塩基対である。
【０２８４】
本発明者らは、４’修飾及び／又は５’修飾ヌクレオチドを、一本鎖又は二本鎖オリゴヌクレオチドの任意の位置でジヌクレオチドのリン酸ジエステル（ＰＯ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）及び／又はジチオリン酸（ＰＳ２）結合の３’末端に導入することが、ヌクレオチド間結合に対して立体効果を発揮し、ひいてはそれをヌクレアーゼに対して保護又は安定化し得ることを見出した。
【０２８５】
一部の実施形態では、５’修飾ヌクレオシドは、一本鎖又は二本鎖ｓｉＲＮＡの任意の位置でジヌクレオチドの３’末端に導入される。例えば、一本鎖又は二本鎖ｓｉＲＮＡの任意の位置でジヌクレオチドの３’末端に５’−アルキル化ヌクレオシドが導入され得る。リボース糖の５’位置のアルキル基は、ラセミ又はキラル純粋なＲ若しくはＳ異性体であり得る。例示的な５’−アルキル化ヌクレオシドが、５’−メチルヌクレオシドである。５’−メチルは、ラセミ又はキラル純粋なＲ若しくはＳ異性体のいずれかであり得る。
【０２８６】
一部の実施形態では、４’修飾ヌクレオシドは、一本鎖又は二本鎖ｓｉＲＮＡの任意の位置でジヌクレオチドの３’末端に導入される。例えば、４’−アルキル化ヌクレオシドは、一本鎖又は二本鎖ｓｉＲＮＡの任意の位置でジヌクレオチドの３’末端に導入され得る。リボース糖の４’位置のアルキル基は、ラセミ又はキラル純粋なＲ若しくはＳ異性体であり得る。例示的な４’−アルキル化ヌクレオシドは、４’−メチルヌクレオシドである。４’−メチルは、ラセミ又はキラル純粋なＲ若しくはＳ異性体のいずれかであり得る。代わりに、４’−Ｏ−アルキル化ヌクレオシドは、一本鎖又は二本鎖ｓｉＲＮＡの任意の位置でジヌクレオチドの３’末端に導入され得る。リボース糖の４’−Ｏ−アルキルは、ラセミ又はキラル純粋なＲ若しくはＳ異性体であり得る。例示的な４’−Ｏ−アルキル化ヌクレオシドは、４’−Ｏ−メチルヌクレオシドである。４’−Ｏ−メチルは、ラセミ又はキラル純粋なＲ若しくはＳ異性体のいずれかであり得る。
【０２８７】
一部の実施形態では、５’−アルキル化ヌクレオシドは、ｄｓＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖上の任意の位置に導入され、かかる修飾は、ｄｓＲＮＡの効力を維持又は改善する。５’−アルキルは、ラセミ又はキラル純粋なＲ若しくはＳ異性体のいずれかであり得る。例示的な５’−アルキル化ヌクレオシドは、５’−メチルヌクレオシドである。５’−メチルは、ラセミ又はキラル純粋なＲ若しくはＳ異性体のいずれかであり得る。
【０２８８】
一部の実施形態では、４’−アルキル化ヌクレオシドは、ｄｓＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖上の任意の位置に導入され、かかる修飾は、ｄｓＲＮＡの効力を維持又は改善する。４’−アルキルは、ラセミ又はキラル純粋なＲ若しくはＳ異性体のいずれかであり得る。例示的な４’−アルキル化ヌクレオシドは、４’−メチルヌクレオシドである。４’−メチルは、ラセミ又はキラル純粋なＲ若しくはＳ異性体のいずれかであり得る。
【０２８９】
一部の実施形態では、４’−Ｏ−アルキル化ヌクレオシドは、ｄｓＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖上の任意の位置に導入され、かかる修飾は、ｄｓＲＮＡの効力を維持又は改善する。５’−アルキルは、ラセミ又はキラル純粋なＲ若しくはＳ異性体のいずれかであり得る。例示的な４’−Ｏ−アルキル化ヌクレオシドは、４’−Ｏ−メチルヌクレオシドである。４’−Ｏ−メチルは、ラセミ又はキラル純粋なＲ若しくはＳ異性体のいずれかであり得る。
【０２９０】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、２’−５’結合（２’−Ｈ、２’−ＯＨ及び２’−ＯＭｅを有し、且つＰ＝Ｏ又はＰ＝Ｓを有する）を含み得る。例えば、２’−５’結合修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するか若しくはセンス鎖のアンチセンス鎖への結合を阻害するために用いることができるか、又はＲＩＳＣによるセンス鎖活性化を回避するためにセンス鎖の５’末端で用いることができる。
【０２９１】
別の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、Ｌ糖（例えば、２’−Ｈ、２’−ＯＨ及び２’−ＯＭｅを有するＬリボース、Ｌ−アラビノース）を含み得る。例えば、これらのＬ糖修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するか若しくはセンス鎖のアンチセンス鎖への結合を阻害するために用いることができるか、又はＲＩＳＣによるセンス鎖活性化を回避するためにセンス鎖の５’末端で用いることができる。
【０２９２】
様々な出版物にて、本発明のｄｓＲＮＡと共に全てを用いることができる多量体ｓｉＲＮＡが記載されている。かかる出版物は、国際公開第２００７／０９１２６９号パンフレット、米国特許第７８５８７６９号明細書、国際公開第２０１０／１４１５１１号パンフレット、国際公開第２００７／１１７６８６号パンフレット、国際公開第２００９／０１４８８７号パンフレット及び国際公開第２０１１／０３１５２０号パンフレット（それら全体がここで援用される）を含む。
【０２９３】
１つ以上の炭水化物部分のｄｓＲＮＡ分子への結合を含むｄｓＲＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡ分子の１つ以上の特性を最適化し得る。多くの場合、炭水化物部分は、ｄｓＲＮＡ分子の修飾サブユニットに結合されることになる。例えば、ｄｓＲＮＡ分子の１つ以上のリボヌクレオチドサブユニットのリボース糖は、別の部分、例えば炭水化物リガンドが結合した非炭水化物（好ましくは環状）担体と置換され得る。サブユニットのリボース糖がそのように置換されているリボヌクレオチドサブユニットは、本明細書中でリボース置換修飾サブユニット（ＲＲＭＳ）と称される。環状担体は炭素環式環系であり得、すなわち、全ての環原子は、炭素原子であるか、又は複素環式環系、すなわち１つ以上の環原子は、ヘテロ原子、例えば窒素、酸素、硫黄であり得る。環状担体は、単環式環系であり得るか、又は２つ以上の環、例えば融合環を含み得る。環状担体は、完全飽和環系であり得るか、又は１つ以上の二重結合を含み得る。
【０２９４】
リガンドは、担体によってポリヌクレオチドに付着され得る。担体は、（ｉ）少なくとも１つの「骨格付着点（ｂａｃｋｂｏｎｅ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｐｏｉｎｔ）」、好ましくは２つの「骨格付着点」、及び（ｉｉ）少なくとも１つの「テザー付着点（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｐｏｉｎｔ）」を含む。「骨格付着点」は、本明細書で用いられるとき、官能基、例えばヒドロキシル基又は一般にリボ核酸の骨格、例えばリン酸塩の骨格若しくは例えば硫黄を含有する修飾リン酸塩の骨格への担体の組み込みに利用可能であり、且つ適した結合を指す。「テザー付着点」（ＴＡＰ）は、一部の実施形態では、選択された部分を接続する環状担体の構成環原子、例えば炭素原子又はヘテロ原子（骨格付着点を提供する原子とは異なる）を指す。その部分は、例えば糖質、例えば単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖及び多糖であり得る。任意選択的に、選択された部分は、介在テザー（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ  ｔｅｔｈｅｒ）によって環状担体に接続される。したがって、環状担体は、官能基、例えばアミノ基を含むことが多いか、又は一般に別の化学的実体、例えばリガンドの構成環への組み込み又は繋留に適した結合を可能にする。
【０２９５】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、担体を介してリガンドに結合され得、ここで、担体は、環式基又は非環式基であり得；好ましくは、環式基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフリル及びデカリンから選択され；好ましくは、非環式基は、セリノール骨格又はジエタノールアミン骨格から選択される。
【０２９６】
本発明の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤は、任意選択的に、１つ以上のリガンドにコンジュゲートされ得る。リガンドは、３’末端、５’末端又は両末端で、センス鎖、アンチセンス鎖又は両鎖に結合され得る。例えば、リガンドは、センス鎖、特にセンス鎖の３’末端にコンジュゲートされ得る。
【０２９７】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、５’リン酸化されるか、又は５’プライム末端にホスホリル類似体を含む。５’−リン酸修飾は、ＲＩＳＣ媒介遺伝子サイレンシングに適合するものを含む。好適な修飾は、５’−一リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−二リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−三リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−グアノシンキャップ（７−メチル化又は非メチル化）（７ｍ−Ｇ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）及び任意の修飾又は非修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−モノチオリン酸（ホスホロチオエート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−モノジチオリン酸（ジチオリン酸；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−ホスホロチオラート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５’）；酸素／硫黄が置換された一リン酸、二リン酸及び三リン酸の任意のさらなる組み合わせ（例えば、５’−α−チオ三リン酸、５’−γ−チオ三リン酸など）、５’−ホスホロアミド酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−アルキルホスホネート（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例えばＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−、５’−アルケニルホスホネート（すなわちビニル、置換ビニル）、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ−５’−ＣＨ２−）、５’−アルキルエーテルホスホネート（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２−）、エトキシメチルなど、例えばＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−）を含む。一例では、修飾は、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖内に配置され得る。
【０２９８】
リガンド
多種多様な実体が、本発明のオリゴヌクレオチドにカップリングされ得る。好ましい部分は、好ましくは共有結合的に、直接的に又は介在テザーを介して間接的にカップリングされたリガンドである。
【０２９９】
好ましい実施形態では、リガンドは、それが中に組み込まれる分子の分布、ターゲティング又は寿命を変化させる。好ましい実施形態では、リガンドは、選択される標的、例えば分子、細胞若しくは細胞型、区画、受容体、例えば細胞若しくは臓器区画、組織、臓器又は身体領域に対して、例えばかかるリガンドを有しない種と比べて、増強された親和性をもたらす。選択された標的に対して増強された親和性をもたらすリガンドは、標的化リガンドとも称される。
【０３００】
一部のリガンドは、エンドソーム溶解特性を有し得る。エンドソーム溶解リガンドは、エンドソームの溶解及び／又は本発明の組成物若しくはその成分の細胞のエンドソームから細胞質への輸送を促進する。エンドソーム溶解リガンドは、ｐＨ依存性の膜活性及び膜融合性を示す、ポリアニオンペプチド又はペプチドミメティックであり得る。一部の実施形態では、エンドソーム溶解リガンドは、エンドソームｐＨでその活性型立体構造を取る。「活性型」立体構造は、エンドソーム溶解リガンドが、エンドソームの溶解及び／又は本発明の組成物若しくはその成分の細胞のエンドソームから細胞質への輸送を促進するような立体構造である。例示的なエンドソーム溶解リガンドとして、ＧＡＬＡペプチド（Ｓｕｂｂａｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８７，２６：２９６４−２９７２、その全体が参照により援用される）、ＥＡＬＡペプチド（Ｖｏｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９６，１１８：１５８１−１５８６、その全体が参照により援用される）及びそれらの誘導体（Ｔｕｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２００２，１５５９：５６−６８、その全体が参照により援用される）が挙げられる。一部の実施形態では、エンドソーム溶解成分は、ｐＨの変化に応答して、電荷又はプロトン化にて変化を経ることになる化学基（例えば、アミノ酸）を含有し得る。エンドソーム溶解成分は、線状又は分岐状であり得る。
【０３０１】
リガンドは、輸送、ハイブリダイゼーション及び特異性特性を改善し得、また得られる天然又は修飾オリゴリボヌクレオチド或いは本明細書に記載の単量体及び／又は天然若しくは修飾リボヌクレオチドの任意の組み合わせを含むポリマー分子のヌクレアーゼ耐性を改善し得る。
【０３０２】
リガンドは、一般に、例えば取り込みを増強するための治療修飾因子；例えば分布を監視するための診断化合物又はレポーター基；架橋剤；及びヌクレアーゼ耐性を与える部分を含み得る。一般例として、脂質、ステロイド、ビタミン、糖、タンパク質、ペプチド、ポリアミン及びペプチド模倣物が挙げられる。
【０３０３】
リガンドは、天然に存在する物質、例えばタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）又はグロブリン）；炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン又はヒアルロン酸）；又は脂質を含み得る。リガンドは、組換え又は合成分子、例えば合成ポリマー、例えば合成ポリアミノ酸、オリゴヌクレオチド（例えば、アプタマー）でもあり得る。ポリアミノ酸の例として、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物共重合体、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）共重合体、ジビニルエーテル−マレイン無水物共重合体、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド共重合体（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−アクリル酸エチル）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー又はポリホスファジンであるポリアミノ酸が挙げられる。ポリアミンの例として、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬ペプチド−ポリアミン、ペプチドミメティックポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの四級塩又はαヘリカルペプチドが挙げられる。
【０３０４】
リガンドは、標的基、例えば細胞又は組織標的化剤、例えばレクチン、糖タンパク質、脂質又はタンパク質、例えば腎細胞などの特定細胞型に結合する抗体も含み得る。標的基は、サイロトロピン、メラノトロトピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤タンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸塩、ビタミンＢ１２、ビオチン、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチドミメティック又はアプタマーであり得る。
【０３０５】
リガンドのその他の例としては、染料、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ又はキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、例えばコレステロールなどの親油性分子、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル又はフェノキサジン）及びペプチド複合体（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進薬（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザ大環状化合物のＥｕ３＋複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ又はＡＰが挙げられる。
【０３０６】
リガンドは、例えば、糖タンパク質などのタンパク質；又は例えば共リガンドに特異的親和性を有する分子などのペプチド；又は例えばがん細胞、内皮細胞又は骨細胞などの指定された細胞型に結合する抗体などの抗体であり得る。リガンドは、ホルモン及びホルモン受容体も含み得る。それらは、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補助因子、多価乳糖、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース、多価フコース又はアプタマーなどの非ペプチド化学種も含み得る。リガンドは、例えば、リポ多糖、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ活性化因子又はＮＦ−κＢ活性化因子であり得る。
【０３０７】
リガンドは、例えば、細胞の微小管、微小繊維及び／又は中間径フィラメントを破壊することで、例えば細胞の細胞骨格を破壊することにより、細胞へのｉＲＮＡ剤の取り込みを増大させ得る薬剤などの物質であり得る。薬剤は、例えば、タキソン（ｔａｘｏｎ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド（ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン又はミオセルビンであり得る。
【０３０８】
リガンドは、オリゴヌクレオチドの細胞への取り込みを、例えば炎症性応答を活性化することにより増強し得る。かかる効果を有することになる例示的リガンドは、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１β又はγインターフェロンを含む。
【０３０９】
一態様では、リガンドは、脂質又は脂質に基づく分子である。このような脂質又は脂質ベースの分子は、好ましくは、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの血清タンパク質と結合する。ＨＳＡ結合リガンドは、例えば、身体の非腎臓標的組織などの標的組織への複合体の分布を可能にする。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞をはじめとする肝臓であり得る。ＨＳＡに結合し得るその他の分子もリガンドとして使用され得る。例えば、ナプロキセン又はアスピリンを使用し得る。脂質又は脂質ベースのリガンドは、（ａ）複合体の分解耐性を増大させ得て、（ｂ）標的細胞又は細胞膜の標的化又はそれへの輸送を増大させ得て、及び／又は（ｃ）例えばＨＳＡなどの血清タンパク質の結合を調節するのに使用し得る。
【０３１０】
例えば、複合体の標的組織への結合を調節するなど、阻害のために、脂質ベースのリガンドを使用し得る。例えば、より強力にＨＳＡに結合する脂質又は脂質ベースのリガンドは、腎臓に標的化される可能性がより低く、したがって身体から除去される可能性がより低い。より弱くＨＳＡに結合する脂質又は脂質ベースのリガンドは、複合体を腎臓に標的化するのに使用し得る。
【０３１１】
好ましい実施形態では、脂質ベースのリガンドはＨＳＡに結合する。好ましくは、それは、複合体が好ましくは非腎臓組織に分布するように、十分な親和性でＨＳＡと結合する。しかし、親和性は、ＨＳＡリガンド結合が逆転され得ない程度にまで、強力ではないことが好ましい。
【０３１２】
他の好ましい実施形態では、複合体が好ましくは腎臓に分布するように、脂質ベースのリガンドはＨＳＡと弱く結合するか又は全く結合しない。腎細胞を標的とするその他の部分も、脂質ベースのリガンドに代えて又はそれに加えて使用し得る。
【０３１３】
別の態様では、リガンドは、例えば、増殖細胞などの標的細胞に取り込まれる、ビタミンなどの部分である。これらは、例えば、がん細胞などの悪性又は非悪性型などの望まれない細胞増殖によって特徴付けられる障害を治療するのに、特に有用である。例示的なビタミンとしては、ビタミンＡ、Ｅ及びＫが挙げられる。その他の例示的なビタミンとしては、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサールなどのＢビタミン又はがん細胞に取り込まれるその他のビタミン又は栄養素が挙げられる。またＨＡＳ及び低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）及び高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）も挙げられる。
【０３１４】
別の態様では、リガンドは細胞透過剤であり、好ましくはらせん細胞透過剤である。好ましくは、細胞透過剤は両親媒性である。例示的な細胞透過剤は、ｔａｔ又はアンテノペディアなどのペプチドである。細胞透過剤がペプチドである場合、それはペプチジル模倣薬、逆転異性体、非ペプチド又は偽ペプチド結合及びＤ−アミノ酸使用をはじめとする、修飾を受け得る。らせん剤は、好ましくは親油性及び疎油性相を有するα−らせん剤である。
【０３１５】
リガンドは、ペプチド又はペプチド模倣体であり得る。ペプチド模倣薬（本明細書においてオリゴペプチド模倣薬とも称される）は、天然ペプチドに類似する定義された三次元構造に折り畳み可能な分子である。ペプチド又はペプチド模倣薬部分は、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０アミノ酸長など、約５〜５０アミノ酸長であり得る。ペプチド又はペプチド模倣薬は、例えば、細胞透過性ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド又は疎水性ペプチド（例えば、主にＴｙｒ、Ｔｒｐ又はＰｈｅからなる）であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、束縛ペプチド又は架橋ペプチドであり得る。別の代案では、ペプチド部分は、疎水性膜移行配列（ＭＴＳ）を含み得る。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰを有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦ類似体（例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ）も標的部分であり得る。ペプチド部分は、細胞膜を越えて、ペプチド、オリゴヌクレオチド及びタンパク質をはじめとする、多数の極性分子を輸送し得る「送達」ペプチドであり得る。例えば、ＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ）及びショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）アンテナペディアタンパク質（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ）からの配列は、送達ペプチドとして機能できることが分かっている。ペプチド又はペプチドミメティック、例えばファージディスプレイライブラリー又は１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリー（Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２−９４，１９９１、その全体が参照により援用される）から同定されるペプチドは、ＤＮＡのランダム配列によりコードされ得る。好ましくは、組み込まれた単量体単位を介してｉＲＮＡ剤に繋ぎ止められたペプチド又はペプチドミメティックは、細胞を標的とするペプチド、例えばアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）−ペプチド又はＲＧＤミミックである。ペプチド部分は、約５アミノ酸長〜約４０アミノ酸長の範囲であり得る。ペプチド部分は、例えば、安定性を増強するか又は立体構造的特性を導くために構造的修飾を有し得る。下記の構造的修飾のいずれかを用いることができる。腫瘍細胞、例えば内皮腫瘍細胞又は乳がん腫瘍細胞を標的とするため、ＲＧＤペプチド部分を用いることができる（Ｚｉｔｚｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６２：５１３９−４３，２００２、その全体が参照により援用される）。ＲＧＤペプチドは、肺、腎臓、脾臓又は肝臓を含む種々の他の組織の腫瘍へのｉＲＮＡ剤の標的化を促進し得る（Ａｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：７８３−７８７，２００１、その全体が参照により援用される）。好ましくは、ＲＧＤペプチドは、腎臓へのｉＲＮＡ剤の標的化を促進することになる。ＲＧＤペプチドは、線状又は環状であり得、また特定組織への標的化を促進するため、修飾、例えばグリコシル化又はメチル化がなされ得る。例えば、グリコシル化されたＲＧＤペプチドは、ｉＲＮＡ剤を、αＶβ３を発現する腫瘍細胞に送達し得る（Ｈａｕｂｎｅ���  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，４２：３２６−３３６，２００１、その全体が参照により援用される）。増殖性細胞内に豊富に存在するマーカーを標的にするペプチドを用いることができる。例えば、ＲＧＤ含有ペプチド及びペプチドミメティックは、がん細胞、特にインテグリンを提示する細胞を標的にし得る。したがって、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤを有する環状ペプチド、Ｄ−アミノ酸を含むＲＧＤペプチド並びに合成ＲＧＤミミックを用いることができる。ＲＧＤに加えて、インテグリンリガンドを標的にする他の部分を用いることができる。一般に、増殖性細胞及び血管新生を制御するため、かかるリガンドを用いることができる。このタイプのリガンドの好ましいコンジュゲートは、ＰＥＣＡＭ−１、ＶＥＧＦ又は他のがん遺伝子、例えば本明細書に記載のがん遺伝子を標的にする。
【０３１６】
「細胞透過性ペプチド」は、例えば、細菌又は真菌細胞などの微生物細胞又はヒト細胞などの哺乳類細胞などの細胞に浸透できる。微生物細胞透過性ペプチドは、例えば、α−らせん直鎖ペプチド（例えば、ＬＬ−３７又はセクロピン（Ｃｅｒｏｐｉｎ）Ｐ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α−デフェンシン、β−デフェンシン又はバクテネシン）又は１つ又は２つの主要アミノ酸（例えば、ＰＲ−３９又はインドリシジン）のみを含有するペプチドであり得る。細胞透過性ペプチドは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）も含み得る。例えば、細胞浸透ペプチドは、二連の両親媒性ペプチド、例えばＭＰＧであり得、それはＨＩＶ−１  ｇｐ４１及びＳＶ４０ラージＴ抗原のＮＬＳの融合ペプチドドメインから誘導される（Ｓｉｍｅｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２７１７−２７２４，２００３、その全体が参照により援用される）。
【０３１７】
一部の実施形態では、標的化ペプチドは、両親媒性α−ヘリカルペプチドであり得る。例示的な両親媒性α−ヘリカルペプチドとして、限定はされないが、セクロピン、リコトキシン、パラダキシン、ブフォリン、ＣＰＦ、ボンビニン様ペプチド（ＢＬＰ）、カテリシジン、セラトトキシン、Ｓ．クラバ（Ｓ．Ｃｌａｖａ）ペプチド、メクラウナギ腸管抗菌ペプチド（ＨＦＩＡＰ）、マガイニン、ブレビニン−２、ダーマセプチン、メリチン、プレウロシディン、Ｈ２Ａペプチド、アフリカツメガエルのペプチド、エスカレンチン−１及びカエリンが挙げられる。らせん安定性の完全性を維持するため、好ましくは幾つかの要素が考慮されることになる。例えば、最大数のらせん安定化残基が用いられることになり（例えば、ｌｅｕ、ａｌａ又はｌｙｓ）、最小数のらせん不安定化残基が用いられることになる（例えば、プロリン又は環状単量体単位。キャッピング残基が検討されることになり（例えば、Ｇｌｙは例示的なＮ−キャッピング残基であり、且つ／又はさらなるＨ結合を提供し、らせんを安定化するため、Ｃ末端アミド化を用いることができる。ｉ±３又はｉ±４位によって分離された、反対の電荷を有する残基間での塩架橋の形成は、安定性をもたらし得る。例えば、リジン、アルギニン、ホモアルギニン、オルニチン又はヒスチジンなどのカチオン性残基は、アニオン性残基のグルタミン酸又はアスパラギン酸と塩架橋を形成し得る。
【０３１８】
ペプチド及びペプチドミメティックリガンドは、天然又は修飾ペプチド、例えばＤ又はＬペプチド；α、β又はγペプチド；Ｎ−メチルペプチド；アザペプチド；１つ以上のアミドを有するペプチド、すなわち結合が１つ以上の尿素、チオ尿素、カルバメート又はスルホニル尿素結合と置換されたペプチド；又は環状ペプチドを有するものを含む。
【０３１９】
標的リガンドは、特定の受容体を標的とする能力がある任意のリガンドであり得る。例として、葉酸塩、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、マンノース、マンノース−６Ｐ、糖のクラスター、例えばＧａｌＮＡｃクラスター、マンノースクラスター、ガラクトースクラスター又はアプタマーが挙げられる。クラスターは、２つ以上の糖単位の組み合わせである。標的化リガンドは、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、ＰＳＭＡ、エンドセリン、ＧＣＰＩＩ、ソマトスタチン、ＬＤＬ及びＨＤＬリガンドも含む。リガンドは、核酸、例えばアプタマーにも基づき得る。アプタマーは、修飾されないか、又は本明細書に開示される修飾の任意の組み合わせを有し得る。
【０３２０】
エンドソーム放出剤は、イミダゾール、ポリ又はオリゴイミダゾール、ＰＥＩ、ペプチド、膜融合ペプチド、ポリカルボキシレート、ポリカチオン、マスク化オリゴ若しくはポリカチオン又はアニオン、アセタール、ポリアセタール、ケタール／ポリケタール、オルトエステル、マスク化若しくは非マスク化カチオン又はアニオン電荷を有するポリマー、マスク化若しくは非マスク化カチオン又はアニオン電荷を有するデンドリマーを含む。
【０３２１】
ＰＫ修飾因子は、薬物動態修飾因子を表す。ＰＫ修飾因子は、脂溶性剤（ｌｉｐｏｐｈｉｌｅｓ）、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミンなどを含む。例示的なＰＫ修飾因子として、限定はされないが、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド（ｄｉａｌｋｙｌｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ）、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンなどが挙げられる。幾つかのホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドは、血清タンパク質、すなわち短いオリゴヌクレオチド、例えば約５塩基、１０塩基、１５塩基又は２０塩基のオリゴヌクレオチドに結合することも知られており、骨格において複数のホスホロチオエート結合を含むことで、さらにリガンドとして（例えば、ＰＫ調節性リガンドとして）本発明に適する。
【０３２２】
さらに、血清成分（例えば、血清タンパク質）に結合するアプタマーもＰＫ調節性リガンドとして本発明に適する。
【０３２３】
本発明に適した他のリガンドコンジュゲートは、米国特許出願の、２００４年８月１０日に出願された米国特許出願第１０／９１６，１８５号明細書；２００４年９月２１日に出願された米国特許出願第１０／９４６，８７３号明細書；２００７年８月３日に出願された米国特許出願第１０／８３３，９３４号明細書；２００５年４月２７日に出願された米国特許出願第１１／１１５，９８９号明細書及び２００７年１１月２１日に出願された米国特許出願第１１／９４４，２２７号明細書（あらゆる目的でそれら全体が参照により援用される）に記載されている。
【０３２４】
２つ以上のリガンドが存在するとき、リガンドは、全部が同じ特性を有する、全部が異なる特性を有するか、又は一部のリガンドが同じ特性を有する一方、その他は異なる特性を有する可能性がある。例えば、リガンドは、標的化特性を有する、エンドソーム溶解活性を有するか、又はＰＫ調節特性を有する可能性がある。好ましい実施形態では、全てのリガンドが、異なる特性を有する。
【０３２５】
リガンドは、様々な場所、例えば３’末端、５’末端及び／又は内部位置で、オリゴヌクレオチドにカップリングされ得る。好ましい実施形態では、リガンドは、介在テザー、例えば本明細書に記載の担体を介してオリゴヌクレオチドに結合される。リガンド又はテザーリガンドは、単量体上に、前記単量体が伸長鎖に組み込まれるときに存在し得る。一部の実施形態では、リガンドは、前記「前駆体」単量体が伸長鎖に組み込まれた後、「前駆体」単量体へのカップリングを介して組み込まれ得る。例えば、例えばＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＮＨ２などのアミノ終端テザー（すなわち会合されるリガンドを有しない）を有する単量体は、伸長するオリゴヌクレオチド鎖に組み込まれ得る。その後の操作において、すなわち前駆体単量体の鎖への組み込み後、求電子基、例えばペンタフルオロフェニルエステル又はアルデヒド基を有するリガンドは、次いでリガンドの求電子基を前駆体単量体のテザーの末端求核基とカップリングすることにより、前駆体単量体に結合され得る。
【０３２６】
別の例では、クリックケミストリー反応への関与に適した化学基、例えばアジド又はアルキン終端テザー／リンカーを有する単量体が組み込まれ得る。その後の操作において、すなわち前駆体単量体の鎖への組み込み後、相補的化学基、例えばアルキン又はアジドを有するリガンドは、アルキン及びアジドを一緒にカップリングすることにより、前駆体単量体に結合され得る。
【０３２７】
二重鎖オリゴヌクレオチドでは、リガンドは、片鎖又は両鎖に結合され得る。一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、センス鎖にコンジュゲートされたリガンドを有する。他の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖にコンジュゲートされたリガンドを有する。
【０３２８】
一部の実施形態では、リガンドは、核酸塩基、糖部分又は核酸分子のヌクレオシド間結合にコンジュゲートされ得る。プリン核酸塩基又はその誘導体へのコンジュゲーションは、環内及び環外原子を含む、任意の位置で生じ得る。一部の実施形態では、プリン核酸塩基の２位、６位、７位又は８位は、コンジュゲート部分に結合される。ピリミジン核酸塩基又はその誘導体へのコンジュゲーションも任意の位置で生じ得る。一部の実施形態では、ピリミジン核酸塩基の２位、５位及び６位は、コンジュゲート部分と置換され得る。ヌクレオシドの糖部分へのコンジュゲーションは、任意の炭素原子で生じ得る。コンジュゲート部分に結合され得る糖部分の炭素原子の例として、２’、３’及び５’炭素原子が挙げられる。１’位も例えば脱塩基残基においてコンジュゲート部分に結合され得る。ヌクレオシド間結合もコンジュゲート部分を有し得る。リン含有結合（例えば、リン酸ジエステル、ホスホロチオエート、ジチオリン酸、ホスホロアミド酸など）では、コンジュゲート部分は、リン原子に直接的に、又はリン原子に結合されたＯ、Ｎ若しくはＳ原子に結合され得る。アミン又はアミド含有ヌクレオシド間結合（例えば、ＰＮＡ）では、コンジュゲート部分は、アミン若しくはアミドの窒素原子又は隣接する炭素原子に結合され得る。
【０３２９】
一部の実施形態では、リガンドは、センス鎖にコンジュゲートされる。本明細書に記載の通り、リガンドは、センス鎖の３’末端、５’末端又は内部位置にコンジュゲートされ得る。一部の実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端にコンジュゲートされる。さらに、リガンドは、センス鎖の核酸塩基、糖部分又はヌクレオチド間結合にコンジュゲートされ得る。
【０３３０】
ＲＮＡ干渉の分野における任意の好適なリガンドが用いられ得るが、リガンドは、典型的には、炭水化物、例えば単糖（ＧａｌＮＡｃなど）、二糖、三糖、四糖、多糖である。
【０３３１】
リガンドを核酸にコンジュゲートするリンカーは、上で検討されたものを含む。例えば、リガンドは、一価、二価又は三価分岐リンカーを通じて結合された１つ以上のＧａｌＮＡｃ（Ｎ−アセチルガラクトサミン）誘導体であり得る。
【０３３２】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、二価及び三価分岐リンカーにコンジュゲートされ、式（ＩＶ）−（ＶＩＩ）：
【化２８】
2021523720.tif 000030
（式中、ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂ及びｑ５Ｃは、独立して、０〜２０の各存在を表し、ここで、反復単位は、同じ又は異なる可能性があり；
Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ５Ａ、Ｔ５Ｂ、Ｔ５Ｃは、各々独立して、不在、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ又はＣＨ２Ｏの各存在を表し；
Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、Ｑ５Ｃは、独立して、不在、アルキレン、置換アルキレンの各存在を表し、ここで、１つ以上のメチレンが、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ’’）、Ｃ≡Ｃ又はＣ（Ｏ）の１つ以上により中断又は終結され得；
Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃは、各々独立して、不在、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒａ）−ＮＨ−、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、
【化２９】
2021523720.tif 000031
又はヘテロシクリルの各存在を表し；
Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ及びＬ５Ｃは、リガンドを表す；すなわち各々独立して、単糖（ＧａｌＮＡｃなど）、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖又は多糖の各存在を表し；且つ
Ｒａは、Ｈ又はアミノ酸側鎖である）
のいずれかに示される構造を含む。
【０３３３】
三価コンジュゲートＧａｌＮＡｃ誘導体は、標的遺伝子、例えば式（ＶＩＩ）：
【化３０】
2021523720.tif 000032
（式中、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ及びＬ５Ｃは、単糖、例えばＧａｌＮＡｃ誘導体を表す）
のものの発現を阻害するための、ＲＮＡｉ剤との併用において特に有用である。
【０３３４】
ＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートする好適な二価及び三価分岐リンカー基の例として、限定はされないが、以下の化合物：
【化３１】
2021523720.tif 000033
【化３２】
2021523720.tif 000034
【化３３】
2021523720.tif 000035
が挙げられる。
【０３３５】
定義
本明細書で用いられるとき、用語「ｄｓＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」及び「ｉＲＮＡ剤」は、標的ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ、例えばタンパク質をコードする遺伝子の転写物のサイレンシングを媒介し得る薬剤と交換可能に用いられる。便宜上、かかるｍＲＮＡは、本明細書中でサイレンシング対象のｍＲＮＡとも称される。かかる遺伝子は、標的遺伝子とも称される。一般に、サイレンシング対象のＲＮＡは、内因性遺伝子又は病原体遺伝子である。さらに、ｍＲＮＡ以外のＲＮＡ、例えばｔＲＮＡ及びウイルスＲＮＡも標的にされ得る。
【０３３６】
本明細書で用いられるとき、語句「ＲＮＡｉを媒介する」は、配列特異的様式で標的ＲＮＡをサイレンシングする能力を指す。理論によって拘束されることを望まないが、サイレンシングでは、ＲＮＡｉ機構又はプロセス及びガイドＲＮＡ、例えば２１〜２３ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ剤が用いられることが考えられる。
【０３３７】
本明細書で用いられるとき、「特異的にハイブリダイズ可能な」及び「相補的な」は、本発明の化合物と標的ＲＮＡ分子との間に安定且つ特異的な結合が生じるのに十分な程度の相補性を示すように用いられる用語である。特異的結合は、特異的結合が所望されるような条件下、すなわちアッセイ若しくは治療的処置の場合又はインビトロアッセイの場合の生理的条件下、アッセイが実施されるような条件下において、オリゴマー化合物の非標的配列への非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性を必要とする。非標的配列は、典型的には少なくとも５つのヌクレオチド分異なる。
【０３３８】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、標的ＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡ分子が標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の産生をサイレンシングするような標的ｍＲＮＡに対して「十分に相補的」である。別の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、標的ＲＮＡに対して「正確に相補的」であり、例えば、標的ＲＮＡ及びｄｓＲＮＡ二本鎖剤は、アニールし、例えば専ら正確な相補性の領域内でワトソン・クリック塩基対からなるハイブリッドを形成する。「十分に相補的な」標的ＲＮＡは、標的ＲＮＡに対して正確に相補的な（例えば、少なくとも１０ヌクレオチドの）内部領域を含み得る。さらに、一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、単一ヌクレオチド差異を特異的に区別する。この場合、ｄｓＲＮＡ分子は、正確な相補性が単一ヌクレオチド差異（例えば、その７ヌクレオチド以内の）領域内に見出される場合に限り、ＲＮＡｉを媒介する。
【０３３９】
本明細書で用いられるとき、用語「オリゴヌクレオチド」は、例えば、１００、２００、３００又は４００ヌクレオチドより短い長さの核酸分子（ＲＮＡ又はＤＮＡ）を指す。
【０３４０】
用語「ＢＮＡ」は、架橋化核酸を指し、制約された又は接近困難なＲＮＡとして示されることが多い。ＢＮＡは、「固定された」Ｃ３’エンドの糖パッカリングを伴う、５員、６員又はさらに７員架橋構造を有し得る。架橋は、典型的にはリボースの２’位、４’位に取り込まれ、２’、４’ＢＮＡヌクレオチド（例えば、ＬＮＡ又はＥＮＡ）をもたらす。ＢＮＡヌクレオチドの例として、以下のヌクレオシド：
【化３４】
2021523720.tif 000036
が挙げられる。
【０３４１】
用語「ＬＮＡ」は、ロックド核酸を指し、制約された又は接近困難なＲＮＡとして示されることが多い。ＬＮＡは、修飾されたＲＮＡヌクレオチドである。ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、２’ヒドロキシルを同じリボース糖の４’炭素に連結する余分な架橋（例えば、メチレン架橋又はエチレン架橋）で修飾される。例えば、架橋は、３’エンドＮｏｒｔｈ）立体構造：
【化３５】
2021523720.tif 000037
においてリボースを「ロックし」得る。
【０３４２】
用語「ＥＮＡ」は、エチレン架橋核酸を指し、制約された又は接近困難なＲＮＡとして示されることが多い。
【０３４３】
「切断部位」は、本明細書中で、ｉＲＮＡ剤を用いることによるＲＩＳＣ機構によって切断される標的遺伝子又はセンス鎖における骨格結合を意味する。また標的切断部位領域は、切断部位の両側に少なくとも１つ又は少なくとも２つのヌクレオチドを含む。センス鎖では、切断部位は、センス鎖自体がＲＮＡｉ機構により切断されるべき標的であった場合、切断されることになるセンス鎖における骨格結合である。切断部位は、当技術分野で公知の方法、例えばＳｏｕｔｓｃｈｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００４）４３２，１７３−１７８（その全体が参照により援用される）に詳述されるような５’−ＲＡＣＥアッセイを用いて判定され得る。当技術分野で周知であるように、２つの２１ヌクレオチド長の鎖（ここで、それらの鎖は、３’末端に２ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有する１９の連続する塩基対の二本鎖領域を形成する）を含む円錐状の二本鎖ＲＮＡｉ剤における切断部位領域の場合、切断部位領域は、センス鎖の５’末端から９〜１２位に対応する。
【０３４４】
切断可能な連結基
切断可能な連結基は、細胞外部で十分に安定であるが、標的細胞への侵入時、切断され、リンカーが一緒に保持している２つの部分を放出するものである。本発明に従うｄｓＲＮＡ分子の好ましい実施形態では、切断可能な連結基は、標的細胞において、又は第１の参照状態（例えば、細胞内状態を模倣するか又は表すように選択され得る）下において、又は第２の参照状態（例えば、血液又は血清中に見出される状態を模倣するか又は表すように選択され得る）下において、対象の血液中よりも少なくとも１０倍以上、好ましくは少なくとも１００倍速く切断される。
【０３４５】
切断可能な連結基は、切断剤、例えばｐＨ、酸化還元電位又は分解性分子の存在の影響を受けやすい。一般に、切断剤は、血清又は血液中よりも細胞内部により広く存在しているか、又はより高いレベル若しくは活性で見出される。かかる分解剤の例として、特定の基質のために選択されるか、又は基質特異性を有しないレドックス剤、例えば細胞内に存在する、酸化若しくは還元酵素又は還元によりレドックス切断可能な連結基を分解し得る還元剤、例えばメルカプタン；エステラーゼ；エンドソーム又は酸性環境を創出し得る薬剤、例えば５以下のｐＨをもたらすもの；一般酸として作用することにより酸切断可能な連結基を加水分解又は分解し得る酵素、ペプチダーゼ（基質特異的であり得る）及びホスファターゼが挙げられる。
【０３４６】
ジスルフィド結合などの切断可能連結基は、ｐＨに対する感受性が高くあり得る。ヒト血清のｐＨが７．４であるのに対し、細胞内平均ｐＨはわずかにより低く、約７．１〜７．３の範囲にわたる。エンドソームは、５．５〜６．０の範囲のより酸性のｐＨを有し、リソソームは、約５．０のさらにより酸性のｐＨを有する。幾つかのリンカーは、好ましいｐＨで切断される切断可能連結基を有し、それによって細胞中のリガンドから又は細胞の所望の区画にカチオン性脂質が放出される。
【０３４７】
リンカーは、特定の酵素によって切断可能な切断可能連結基を含み得る。リンカーに組み込まれる切断可能連結基のタイプは、標的とされる細胞に左右され得る。例えば、肝臓を標的化するリガンドは、エステル基を含むリンカーを通じてカチオン性脂質に連結し得る。肝細胞はエステラーゼに富み、したがってリンカーは、エステラーゼが豊富でない細胞型よりも、肝細胞中でより効率的に切断される。エステラーゼに富むその他の細胞型としては、肺、腎皮質及び精巣の細胞が挙げられる。
【０３４８】
ペプチド結合を含有するリンカーは、肝細胞及び滑膜細胞などのペプチダーゼに富んだ細胞型を標的化する際に使用し得る。
【０３４９】
一般に切断可能連結基の候補の適合性は、候補連結基を切断する分解性作用物質（条件）の能力を検査することで評価し得る。切断可能連結基の候補は、血中において又はその他の非標的組織との接触時、切断に抵抗する能力についても検査することが望ましい。したがって第１の条件が標的細胞中での切断を示すように選択され、第２の条件がその他の組織又は例えば血液又は血清などの生体液中での切断を示すように選択される、第１及び第２の条件間の切断の相対的感受性を判定し得る。評価は、無細胞系中、細胞中、細胞培養中、臓器又は組織培養中又は全身の動物中で実施し得る。無細胞又は培養条件で最初の評価を行い、全身の動物中でのさらなる評価によって確認することが有用なこともあり得る。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液又は血清（又は細胞外条件を模倣するように選択された生体外条件下）と比較して、細胞中（又は細胞内条件を模倣するように選択された生体外条件下）で、少なくとも２、４、１０又は１００倍より迅速に切断される。
【０３５０】
酸化還元切断可能連結基
切断可能な連結基の１つのクラスは、レドックス切断可能な連結基であり、それは、本発明に従うｄｓＲＮＡ分子において用いられ得、還元又は酸化時に切断される。還元的切断可能連結基の一例は、ジスルフィド連結基（−Ｓ−Ｓ−）である。切断可能連結基候補が、適切な「還元的切断可能連結基」であるか、又は例えば特定のｉＲＮＡ部分及び特定の標的作用物質と共に使用するのに適するかどうかを判定するために、本明細書に記載される方法に頼ることができる。例えば、候補は、例えば、標的細胞などの細胞中で観察される切断速度を模倣する、当技術分野で公知の試薬を使用して、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）又はその他の還元剤とのインキュベーションによって評価し得る。候補は、血液又は血清条件を模倣するように選択される条件下でも評価され得る。好ましい実施形態では、１つの候補化合物は、血中で最大で１０％切断される。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液（又は細胞外条件を模倣するように選択された生体外条件下）と比較して、細胞中（又は細胞内条件を模倣するように選択された生体外条件下）で、少なくとも２、４、１０又は約１００倍より迅速に分解される。候補化合物の切断速度は、細胞内媒体を模倣するように選択された条件下で標準酵素動態アッセイを使用して、細胞外媒体を模倣するように選択された条件と比較して判定し得る。
【０３５１】
リン酸ベースの切断可能連結基
リン酸に基づく切断可能な連結基は、本発明に従うｄｓＲＮＡ分子において用いられ得、リン酸基を分解又は加水分解する薬剤により切断される。細胞中でリン酸基を切断する作用物質の一例は、細胞内のホスファターゼなどの酵素である。リン酸ベースの連結基の例は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｓ−である。好ましい実施形態は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｓ−である。好ましい実施形態は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−である。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
【０３５２】
酸切断可能連結基
酸切断可能な連結基は、本発明に従うｄｓＲＮＡ分子において用いられ得、酸性条件下で切断される連結基である。好ましい実施形態では、酸切断可能連結基は、ｐＨ約６．５以下（例えば、約６．０、５．５、５．０以下）の酸性環境内において又は一般酸として作用し得る酵素などの作用物質によって切断される。細胞内では、エンドソーム及びリソソームなどの特定の低ｐＨ細胞小器官が、酸切断可能連結基の切断環境を提供し得る。酸切断可能連結基の例としては、ヒドラゾン、エステル及びアミノ酸エステルが挙げられるが、これに限定されるものではない。酸切断可能基は、一般式−Ｃ＝ＮＮ−、Ｃ（Ｏ）Ｏ又は−ＯＣ（Ｏ）を有し得る。好ましい実施形態は、炭素がエステルの酸素に付着する場合（アルコキシ基）は、アリール基、置換アルキル基又はジメチルペンチル又はｔ−ブチルなどの三級アルキル基である。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
【０３５３】
エステルベースの連結基
エステルに基づく切断可能な連結基は、本発明に従うｄｓＲＮＡ分子において用いられ得、細胞内でエステラーゼ及びアミダーゼなどの酵素により切断される。エステルベースの切断可能連結基の例としては、アルキレン、アルケニレン及びアルキニレン基のエステルが挙げられるが、これに限定されるものではない。エステル切断可能連結基は、一般式−Ｃ（Ｏ）Ｏ−又は−ＯＣ（Ｏ）−を有する。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
【０３５４】
ペプチドベースの切断基
ペプチドに基づく切断可能な連結基は、本発明に従うｄｓＲＮＡ分子において用いられ得、細胞内でペプチダーゼ及びプロテアーゼなどの酵素により切断される。ペプチドベースの切断可能連結基は、アミノ酸間に形成されて、オリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）及びポリペプチドを生じる、ペプチド結合である。ペプチドベースの切断可能基には、アミド基（−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）は含まれない。アミド基は、あらゆるアルキレン、アルケニレン又はアルキニレン間に形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸間に形成されて、ペプチド及びタンパク質を生じる特殊なタイプのアミド結合である。ペプチドベースの切断基は、一般にアミノ酸間に形成されて、ペプチド及びタンパク質を生じるペプチド結合（すなわちアミド結合）に限定され、アミド官能基全体は含まない。ペプチドベースの切断可能連結基は、一般式−ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）−を有し、式中、ＲＡ及びＲＢは２つの隣接するアミノ酸のＲ基である。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。本明細書で用いられるとき、「炭水化物」は、少なくとも６つの炭素原子（線状、分岐状又は環状であり得る）を有すると共に、酸素、窒素又は硫黄原子が各炭素原子に結合された、１つ以上の単糖単位から本質的に構成されるいずれかの炭水化物である化合物；又は一部として、各々が少なくとも６つの炭素原子（線状、分岐状又は環状であり得る）を有すると共に、酸素、窒素又は硫黄原子が各炭素原子に結合された、１つ以上の単糖単位から構成される炭水化物部分を有する化合物を指す。代表的な炭水化物は、糖（約４〜９の単糖単位を有する単糖、二糖、三糖及びオリゴ糖）並びにデンプン、グリコゲン、セルロース及び多糖類ガムなどの多糖を含む。具体的な単糖として、Ｃ５及び上記（好ましくはＣ５〜Ｃ８）糖が挙げられ；二糖及び三糖として、２又は３の単糖単位を有する糖（好ましくはＣ５〜Ｃ８）が挙げられる。
【０３５５】
本発明は、インビトロで標的遺伝子の発現を阻害するための、本明細書に定義されるようなｄｓＲＮＡ分子の使用にさらに関する。一部の実施形態では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害するための、ｄｓＲＮＡ分子の使用にさらに関する。
【０３５６】
本発明は、対象における標的遺伝子の発現の阻害における使用を意図した、本明細書に定義されるようなｄｓＲＮＡ分子にさらに関する。対象は、任意の動物、例えば哺乳動物、例えばマウス、ラット、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ又はヒトであり得る。
【０３５７】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、緩衝液中で投与される。
【０３５８】
一部の実施形態では、本明細書に記載のｓｉＲＮＡ化合物は、対象への投与を意図して配合され得る。配合されたｓｉＲＮＡ組成物は、種々の状態を想定可能である。幾つかの例では、その組成物は、少なくとも部分的には、結晶性、均一結晶性及び／又は無水性（例えば、８０未満、５０、３０、２０又は１０％の水）である。別の例では、ｓｉＲＮＡは、水相中、例えば水を含む溶液中に存在する。
【０３５９】
水相又は結晶組成物は、例えば、送達媒体、例えばリポソーム（特に水相用）又は粒子（例えば、結晶組成物に適し得るような微小粒子）中に取り込まれ得る。一般に、ｓｉＲＮＡ組成物は、本明細書に記載の通り、意図される投与方法に適合するような様式で配合される。例えば、特定の実施形態では、その組成物は、以下の方法：噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、蒸発、流動層乾燥若しくはこれらの技術の組み合わせ；又は脂質を用いた超音波処理、凍結乾燥、凝縮及び他の自己組織化の少なくとも１つにより調製される。
【０３６０】
ｓｉＲＮＡ製剤は、別の薬剤、例えば別の治療薬又はｓｉＲＮＡを安定化する薬剤、例えばｓｉＲＮＡと複合してｉＲＮＰを形成するタンパク質と組み合わせて配合され得る。さらに他の薬剤として、キレート剤、例えばＥＤＴＡ（例えば、Ｍｇ２＋などの二価カチオンを除去するため）、塩、リボヌクレアーゼ阻害剤（例えば、ＲＮＡｓｉｎなどの広範特異性リボヌクレアーゼ阻害剤）などが挙げられる。
【０３６１】
一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ製剤は、別のｓｉＲＮＡ化合物、例えば第２の遺伝子に関して又は同じ遺伝子に関してＲＮＡｉを媒介し得る第２のｓｉＲＮＡを含む。さらに他の製剤として、少なくとも３、５、１０、２０、５０又は１００以上の異なるｓｉＲＮＡ種を挙げることができる。かかるｓｉＲＮＡは、類似した数の異なる遺伝子に関してＲＮＡｉを媒介し得る。
【０３６２】
一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ製剤は、少なくとも第２の治療薬（例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡ以外の薬剤）を含む。例えば、ウイルス性疾患、例えばＨＩＶの治療のためのｓｉＲＮＡ組成物であれば、既知の抗ウイルス剤（例えば、プロテアーゼ阻害剤又は逆転写酵素阻害剤）を含み得る。別の例では、がんの治療のためのｓｉＲＮＡ組成物であれば、化学療法剤をさらに含み得る。
【０３６３】
本発明に従うｄｓＲＮＡ分子の投与に用いることができる例示的な製剤が、以下に検討される。
【０３６４】
リポソーム．説明の簡略化のため、このセクションにおける製剤、組成物及び方法は、主に非修飾ｓｉＲＮＡ化合物に関して検討される。しかし、これらの製剤、組成物及び方法が、他のｓｉＲＮＡ化合物、例えば修飾ｓｉＲＮＡと併せて実施可能であり、且つかかる実施が本発明の範囲内に含まれるように理解され得る。ｓｉＲＮＡ化合物、例えば二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物又はｓｓｉＲＮＡ化合物、（例えば、前駆体、例えばｓｓｉＲＮＡ化合物にプロセシング可能なより大きいｓｉＲＮＡ化合物又はｓｉＲＮＡ化合物、例えば二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、若しくはｓｓｉＲＮＡ化合物、若しくはその前駆体をコードするＤＮＡ）製剤は、膜状分子集合体、例えばリポソーム又はミセルでの送達のために配合され得る。本明細書の用法では、「リポソーム」という用語は、例えば、１つの二重層又は複数の二重層などの、少なくとも１つの二重層に配列された両親媒性脂質から構成される小胞を指す。リポソームは、親油性材料と水性内部から形成される膜を有する、単層の又は多重膜小胞を含む。水性部分は、ｓｉＲＮＡ組成物を含有する。親油性材料は、水性内部を水性外部から隔離し、水性外部は、典型的にｓｉＲＮＡ組成物を含まないが、場合により含み得る。リポソームは、活性成分の作用部位への移行と送達のために有用である。リポソーム膜は生体膜と構造的に類似するため、リポソームを組織に適用すると、リポソーム性二重層は細胞膜の二重層と融合する。リポソームと細胞の融合が進行するにつれて、ｓｉＲＮＡを含む内部水性内容物が細胞内に送達され、そこではｓｉＲＮＡが標的ＲＮＡに特異的に結合し得て、ＲＮＡｉを媒介し得る。場合によっては、リポソームも特異的に標的化され、例えばｓｉＲＮＡを特定の細胞型に誘導する。
【０３６５】
ｓｉＲＮＡを含有するリポソームは、多様な方法によって調製し得る。一例では、リポソームの脂質成分は、脂質成分なしでミセルが形成されるように、洗剤に溶解される。例えば、脂質成分は、両親媒性カチオン性脂質又は脂質複合体であり得る。洗剤は、高い臨界ミセル濃度を有し得て、非イオン性であり得る。例示的な洗剤としては、コール酸、ＣＨＡＰＳ、オクチルグルコシド、デオキシコール酸及びラウロイルサルコシンが挙げられる。次にｓｉＲＮＡ調製物は、脂質成分を含むミセルに添加される。脂質上のカチオン基はｓｉＲＮＡと相互作用して、ｓｉＲＮＡ周囲で凝縮してリポソームを形成する。凝縮後、例えば透析によって洗剤を除去し、ｓｉＲＮＡのリポソーム調製物を得る。
【０３６６】
必要に応じて、例えば凝縮を助ける担体化合物を、制御された添加によって縮合反応中に添加し得る。例えば、担体化合物は、核酸以外のポリマー（例えば、スペルミン又はスペルミジン）であり得る。ｐＨも調節して、凝縮を支援し得る。
【０３６７】
送達媒体の構成成分としてポリヌクレオチド／カチオン性脂質複合体を組み込んだ安定なポリヌクレオチド送達媒体を作製するための方法についてのさらなる説明は、例えば、国際公開第９６／３７１９４号パンフレットに記載されている。リポソーム形成は、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ８：７４１３−７４１７，１９８７；米国特許第４，８９７，３５５号明細書；米国特許第５，１７１，６７８号明細書；Ｂａｎｇｈａｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３：２３８，１９６５；Ｏｌｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ５５７：９，１９７９；Ｓｚｏｋａ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５：４１９４，１９７８；Ｍａｙｈｅｗ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ７７５：１６９，１９８４；Ｋｉｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ７２８：３３９，１９８３；及びＦｕｋｕｎａｇａ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１５：７５７，１９８４（それら全体が参照により援用される）に記載されている例示的方法の１つ以上の態様も含み得る。送達媒体としての使用を意図した適切な大きさの脂質凝集体を調製するために一般に用いられる技術には、超音波処理及び凍結−解凍＋放出が含まれる（例えば、Ｍａｙｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ８５８：１６１，１９８６を参照、その全体が参照により援用される）。一様に小さく（５０〜２００ｎｍ）、比較的均一な凝集体が所望されるとき、顕微溶液化を用いることができる（Ｍａｙｈｅｗ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ７７５：１６９，１９８４（その全体が参照により援用される））。これらの方法は、ｓｉＲＮＡ製剤のリポソームへのパッケージングに容易に適応される。
【０３６８】
ｐＨ感受性であるか又は負に帯電したリポソームは、核酸分子を封入し、それらと複合体を形成しない。核酸分子と脂質の両方が同様に帯電されることから、複合体形成ではなく反発が生じる。にもかかわらず、一部の核酸分子は、これらのリポソームの水性内部内に封入される。ｐＨ感受性リポソームは、チミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを培養下で細胞単層に送達するのに用いられている。外因性遺伝子の発現は、標的細胞において検出された（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１９，（１９９２）２６９−２７４、その全体が参照により援用される）。
【０３６９】
１つの主要タイプのリポソーム組成物は、天然由来ホスファチジルコリン以外に、リン脂質を含む。例えば、中性リポソーム組成物は、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）又はジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成され得る。アニオン性リポソーム組成物が、一般にジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成されるのに対し、アニオン性融合性リポソームは、主にジオレオイルスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別のタイプのリポソーム組成物は、例えば、ダイズＰＣ及び卵ＰＣなどのホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成される。別のタイプは、リン脂質及び／又はホスファチジルコリン及び／又はコレステロールの混合物から形成される。
【０３７０】
試験管内で及びリポソームを細胞内に導入するその他の方法の例としては、米国特許第５，２８３，１８５号明細書；米国特許第５，１７１，６７８号明細書；国際公開第９４／００５６９号パンフレット；国際公開第９３／２４６４０号パンフレット；国際公開第９１／１６０２４号パンフレット；Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５５０，１９９４；Ｎａｂｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１１３０７，１９９３；Ｎａｂｅｌ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：６４９，１９９２；Ｇｅｒｓｈｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：７１４３，１９９３；及びＳｔｒａｕｓｓ  ＥＭＢＯ  Ｊ．１１：４１７，１９９２が挙げられる。
【０３７１】
一部の実施形態では、カチオン性リポソームが使用される。カチオン性リポソームは、細胞膜に融合できる利点を有する。非カチオン性リポソームは、原形質膜と効率的に融合できないが、生体内でマクロファージに取り込まれ、ｓｉＲＮＡをマクロファージに送達するのに使用され得る。
【０３７２】
リポソームのさらなる利点としては、以下が挙げられる。天然リン脂質から得られるリポソームは、生体適合性且つ生分解性であり；リポソームには、幅広い水及び脂質可溶性薬剤を組み込み得て；リポソームは、それらの内部区画にカプセル化されたｓｉＲＮＡを代謝及び分解から保護し得る（Ｒｏｓｏｆｆ，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，”Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２４５）。リポソーム製剤の調製における重要な考察は、リポソームの脂質表面電荷、小胞サイズ及び水性容量である。
【０３７３】
正に帯電した合成カチオン性脂質であるＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＴＭＡ）を使用して、小型リポソームを形成し得て、それは核酸と自然発生的に相互作用して、組織培養細胞の細胞膜の負に帯電した脂質と融合できる脂質−核酸複合体を形成し、ｓｉＲＮＡ送達をもたらす（ＤＯＴＭＡ及びそのＤＮＡとの併用の説明については、その全体が参照により援用される、例えばＦｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８：７４１３−７４１７，１９８７及び米国特許第４，８９７，３５５号明細書を参照されたい）。
【０３７４】
ＡＤＯＴＭＡ類似体である１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）をリン脂質と組み合わせて使用し、ＤＮＡ錯化小胞を形成し得る。リポフェクチン（商標）Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）は、生体組織培養細胞に、高アニオン性核酸を送達するための効果的薬剤であり、それは負に帯電したポリヌクレオチドと自然発生的に相互作用して複合体を形成する、正に帯電したＤＯＴＭＡリポソームを含む。十分に正に帯電したリポソームを使用すれば、得られる複合体上の正味電荷も正である。このようにして調製された正に帯電した複合体は、負に帯電した細胞表面に自然発生的に付着して、原形質膜と融合し、例えば組織培養細胞内に機能性核酸を効率的に送達する。別の市販のカチオン性脂質、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３，３−（トリメチルアンモニア）プロパン（「ＤＯＴＡＰ」）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）は、オレオイル部分がエーテル結合でなくエステルによって結合することで、ＤＯＴＭＡと異なる。
【０３７５】
その他の報告されたカチオン性脂質化合物としては、２つの脂質タイプの１つと共役するカルボキシスペルミンをはじめとする、多様な部分と共役しているものが挙げられ、例えば５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタオレオイルアミド（「ＤＯＧＳ」）（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標），Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）及びジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５−カルボキシスペルミル−アミド（「ＤＰＰＥＳ」）などの化合物が挙げられる（例えば、米国特許第５，１７１，６７８号明細書を参照されたい）。
【０３７６】
別のカチオン性脂質複合体は、ＤＯＰＥと組み合わされてリポソームに調合されているコレステロール（「ＤＣ−Ｃｈｏｌ」）による、脂質の誘導体化を含む（その全体が参照により援用される、Ｇａｏ，Ｘ．ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７９：２８０，１９９１を参照されたい）。ポリリジンをＤＯＰＥに共役させて生成されるリポポリリジンが、血清存在下における形質移入に効果的であると報告されている（Ｚｈｏｕ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０６５：８，１９９１）。特定の細胞系では、共役するカチオン性脂質を含有するこれらのリポソームは、ＤＯＴＭＡ含有組成物より低い毒性を示し、より効率的な形質移入を提供すると言われている。その他の市販のカチオン性脂質製品としては、ＤＭＲＩＥ及びＤＭＲＩＥ−ＨＰ（Ｖｉｃａｌ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）及びリポフェクタミン（ＤＯＳＰＡ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）が挙げられる。オリゴヌクレオチドの送達に適したその他のカチオン性脂質は、国際公開第９８／３９３５９号パンフレット及び国際公開第９６／３７１９４号パンフレットに記載される。
【０３７７】
リポソーム製剤は局所投与に特に適しており、リポソームはその他の製剤に優る幾つかの利点を示す。このような利点としては、投与薬剤の高い全身性吸収に関連した副作用の低下、所望標的における投与薬剤の蓄積増大及びｓｉＲＮＡを皮膚内に投与する能力が挙げられる。幾つかの実装では、リポソームは、ｓｉＲＮＡを表皮細胞に送達するのに、また例えば皮膚内などの皮膚組織内へのｓｉＲＮＡの浸透を高めるのに使用される。例えば、リポソームは、局所的に塗布し得る。リポソームとして調合された治療薬の皮膚への局所送達が、実証されている（例えば、その全体が参照により援用される、Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，１９９２，ｖｏｌ．２，４０５−４１０及びｄｕ  Ｐｌｅｓｓｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８，１９９２，２５９−２６５；Ｍａｎｎｉｎｏ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ  Ｆｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，Ｓ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６８２−６９０，１９８８；Ｉｔａｎｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ５６：２６７−２７６．１９８７；Ｎｉｃｏｌａｕ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１４９：１５７−１７６，１９８７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄ  Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１０１：５１２−５２７，１９８３；Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｙ．ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７８５１−７８５５，１９８７を参照されたい）。
【０３７８】
非イオン性リポソームシステム、特に非イオン性界面活性剤とコレステロールを含むシステムが研究され、皮膚への薬剤送達におけるそれらの効用が判定されている。Ｎｏｖａｓｏｍｅ  Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）及びＮｏｖａｓｏｍｅ  ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤が、マウスの皮膚の真皮内に薬剤を送達するのに使用された。ｓｉＲＮＡを含むこのような製剤は、皮膚疾患を治療するのに有用である。
【０３７９】
ｓｉＲＮＡを含むリポソームは、高度に変形可能にし得る。このような変形能は、リポソームの平均半径よりも小さい孔を通り抜けて、リポソームが浸透できるようにし得る。例えば、トランスファーソームは、変形可能なリポソームの一種である。トランスファーソームは、通常は界面活性剤である表面エッジ活性化剤を、標準リポソーム組成物に添加して、作成し得る。ｓｉＲＮＡを含むトランスファーソームは、皮膚内のケラチノサイトにｓｉＲＮＡを送達するために、例えば感染によって皮下送達し得る。無傷の哺乳類皮膚を越えるために、脂質小胞は、適切な経皮勾配の影響下で、それぞれ直径が５０ｎｍ未満の一連の細孔を通過しなくてはならない。さらに脂質特性のために、これらのトランスファーソームは、自己最適化し（例えば、皮膚孔の形状に適応する）、自己修復し得て、断片化することなく頻繁にそれらの標的に到達し得て、自己装填することが多い。
【０３８０】
本発明に適する他の製剤が、２００８年１月２日に出願された米国仮特許出願第６１／０１８，６１６号明細書；２００８年１月２日に出願された米国仮特許出願第６１／０１８，６１１号明細書；２００８年３月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／０３９，７４８号明細書；２００８年４月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／０４７，０８７号明細書及び２００８年５月８日に出願された米国仮特許出願第６１／０５１，５２８号明細書に記載されている。２００７年１０月３日に出願されたＰＣＴ出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８０３３１号パンフレットも、本発明に適する製剤について記載している。
【０３８１】
界面活性剤．説明の簡略化のため、このセクションにおける製剤、組成物及び方法は、主に非修飾ｓｉＲＮＡ化合物に関して検討される。しかし、これらの製剤、組成物及び方法が、他のｓｉＲＮＡ化合物、例えば修飾ｓｉＲＮＡと併せて実施可能であり、且つかかる実施が本発明の範囲内に含まれるように理解され得る。界面活性剤では、乳剤（マイクロエマルションを含む）及びリポソーム（上記参照）などの製剤において幅広い用途が見出される。ｓｉＲＮＡ（又は前駆体、例えばｓｉＲＮＡにプロセシング可能なより大きいｄｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ若しくは前駆体をコードするＤＮＡ）組成物は、界面活性剤を含み得る。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、界面活性剤を含む乳濁液として配合される。天然及び合成両方の多数の異なる界面活性剤型の特性の分類及び格付けの最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ：ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ／ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ  ｂａｌａｎｃｅ）の使用による。親水性基の性質は、製剤中で使用される異なる界面活性剤を分類する、最も有用な手段を提供する（Ｒｉｅｇｅｒ，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ”，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９８８，ｐ．２８５）。
【０３８２】
界面活性剤分子がイオン化されない場合、それは非イオン性界面活性剤に分類される。非イオン性界面活性剤には、医薬製品における幅広い用途があり、広いｐＨ価範囲にわたって使用できる。一般にそれらのＨＬＢ値は、それらの構造に応じて２〜約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤としては、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル及びエトキシル化エステルなどの非イオン性エステルが挙げられる。脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコール及びエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーなどの非イオン性アルカノールアミド及びエーテルもこのクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤クラスの最も良く見られる構成員である。
【０３８３】
界面活性剤分子が、水への溶解又は分散時に負電荷を保有する場合、界面活性剤はアニオン性に分類される。アニオン性界面活性剤としては、石鹸などのカルボン酸塩、ラクチル酸アシル、アミノ酸のアシルアミド、硫酸アルキル及びエトキシル化硫酸アルキルなどの硫酸エステル、アルキルベンゼンスルホネートなどのスルホネート、イセチオン酸アシル、タウリン酸アシル及びスルホコハク酸アシル及びリン酸アシルが挙げられる。アニオン性界面活性剤クラスの最も重要な構成員は、硫酸アルキル及び石鹸である。
【０３８４】
界面活性剤分子が、水への溶解又は分散時に正電荷を保有する場合、界面活性剤はカチオン性に分類される。カチオン性界面活性剤としては、四級アンモニウム塩及びエトキシル化アミンが挙げられる。四級アンモニウム塩が、このクラスで最も良く使用される構成員である。
【０３８５】
界面活性剤分子が、陽性又は陰性電荷のいずれかを有する能力を有する場合、界面活性剤は両性に分類される。両性界面活性剤としては、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタイン及びリン脂質が挙げられる。
【０３８６】
医薬品、製剤中及びエマルション中の界面活性剤の使用については、概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ”，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９８８，ｐ．２８５）。
【０３８７】
ミセル及び他の膜状製剤．説明の簡略化のため、このセクションにおけるミセル及び他の製剤、組成物及び方法は、主に非修飾ｓｉＲＮＡ化合物に関して検討される。しかし、これらのミセル及び他の製剤、組成物及び方法が、他のｓｉＲＮＡ化合物、例えば修飾ｓｉＲＮＡ化合物と併せて実施可能であり、且つかかる実施が本発明の範囲内に含まれるように理解され得る。ｓｉＲＮＡ化合物、例えば二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物又はｓｓｉＲＮＡ化合物、（例えば、前駆体、例えばｓｓｉＲＮＡ化合物にプロセシング可能なより大きいｓｉＲＮＡ化合物又はｓｉＲＮＡ化合物、例えば二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、若しくはｓｓｉＲＮＡ化合物、若しくはその前駆体をコードするＤＮＡ））組成物は、ミセル製剤として提供され得る。「ミセル」は、その中で、分子の疎水性部分が全て内側を向き、親水性部分が周囲の水性相に接したままであるように、両親媒性分子が球状構造に配列される、特定タイプの分子アセンブリーと、本明細書で定義される。環境が疎水性であれば、逆の配置が存在する。
【０３８８】
経皮膜を通じた送達に適した混合ミセル調合物は、ｓｉＲＮＡ組成物、アルカリ金属Ｃ８〜Ｃ２２アルキル硫酸塩及びミセル形成化合物の水溶液を混合して調製され得る。例示的なミセル形成化合物としては、レシチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の薬学的に許容可能な塩、グリコール酸、乳酸、カモミール抽出物、キュウリ抽出物、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノオレイン、モノオレアート、モノラウレート、ルリヂサ油、月見草油、メントール、トリヒドロキシオキソコラニルグリシンとその薬学的に許容可能な塩、グリセリン、ポリグリセリン、リジン、ポリリジン、トリオレイン、ポリオキシエチレンエーテル及びその類似体、ポリドカノールアルキルエーテル及びその類似体、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸及びそれらの混合物が挙げられる。ミセル形成化合物は、アルカリ金属アルキル硫酸塩の添加と同時に又はその後に添加され得る。混合ミセルは、成分を実質的にどのように混合しても形成するが、より小型のミセルを提供するためには、激しく混合される。
【０３８９】
一方法では、ｓｉＲＮＡ組成物と、少なくともアルカリ金属アルキル硫酸塩とを含有する、第１のミセル組成物が調製される。次に第１のミセル組成物は、少なくとも３つのミセル形成化合物と混合されて、混合ミセル組成物が形成する。別の方法では、ミセル組成物は、ｓｉＲＮＡ組成物、アルカリ金属アルキル硫酸塩及び少なくとも１つのミセル形成化合物を混合して調製され、激しい混合を伴う残りのミセル形成化合物の添加がそれに続く。
【０３９０】
フェノール及び／又はｍ−クレゾールを混合ミセル組成物に添加して、調合物を安定化し、細菌増殖から保護し得る。代わりに、ミセル形成成分と共に、フェノール及び／又はｍ−クレゾールを添加し得る。グリセリンなどの等張剤も混合ミセル組成物形成後に添加され得る。
【０３９１】
ミセル調合物を噴霧として送達するためには、調合物を煙霧剤計量分配装置に入れて、計量分配装置に噴霧剤を装填し得る。加圧下にある噴霧剤は、計量分配装置内で液体形態である。成分の比率は、水性相と噴霧剤相が１つになるように、すなわち１つの相になるように調節される。２つの相がある場合、例えば定量バルブを通じて内容物の一部を分散する前に、計量分配装置を振盪する必要がある。医薬品の分注用量は、定量バルブから精微噴霧で噴射される。
【０３９２】
噴霧剤としては、水素含有クロロフルオロカーボン、水素含有フルオロカーボン、ジメチルエーテル及びジエチルエーテルが挙げられる。特定の実施形態では、ＨＦＡ  １３４ａ（１，１，１，２ーテトラフルオロエタン）を使用し得る。
【０３９３】
必須成分の特定濃度は、比較的簡単な実験法によって判定し得る。口腔を通じた吸収のためには、注射を通じた用量又は胃腸管を通じた投与の例えば少なくとも２倍又は３倍に増大させることが、往々にして望ましい。
【０３９４】
粒子．説明の簡略化のため、このセクションにおける粒子、製剤、組成物及び方法は、主に修飾ｓｉＲＮＡ化合物に関して検討される。しかし、これらの粒子、製剤、組成物及び方法が、他のｓｉＲＮＡ化合物、例えば非修飾ｓｉＲＮＡ化合物と併せて実施可能であり、且つかかる実施が本発明の範囲内に含まれるように理解され得る。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡ化合物、例えば二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物又はｓｓｉＲＮＡ化合物、（例えば、前駆体、例えばｓｓｉＲＮＡ化合物にプロセシング可能なより大きいｓｉＲＮＡ化合物又はｓｉＲＮＡ化合物、例えば二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、若しくはｓｓｉＲＮＡ化合物、若しくはその前駆体をコードするＤＮＡ）製剤は、粒子、例えば微小粒子に組み込まれ得る。微小粒子が、噴霧乾燥により作製され得るが、凍結乾燥、蒸発、流動層乾燥、真空乾燥又はこれらの技術の組み合わせを含む他の方法によっても作製され得る。
【０３９５】
医薬組成物
本発明のｉＲＮＡ剤は、薬学的使用のため、配合され得る。本発明は、本明細書に定義されるようなｄｓＲＮＡ分子を含む医薬組成物にさらに関する。薬学的に許容できる組成物は、単独で摂取されるか、又は１つ以上の薬学的に許容できる担体（添加剤）、賦形剤及び／又は希釈剤と一緒に配合される、先行する実施形態のいずれかにおけるｄｓＲＮＡ分子の１つ以上を治療有効量で含む。
【０３９６】
医薬組成物は、固体又は液体形態、例えば（１）経口投与、例えば水薬（水溶液又は非水溶液又は懸濁液）、錠剤、例えば頬側、舌下及び全身吸収を標的とするもの、ボーラス、散剤、顆粒剤、舌への塗布のためのペースト剤；（２）例えば、例えば無菌溶液若しくは懸濁液又は徐放性製剤としての皮下、筋肉内、静脈内又は硬膜外注射による非経口投与；（３）例えば、皮膚に適用されるクリーム、軟膏剤又は徐放性パッチ若しくはスプレーとしての局所適用；（４）例えば、ペッサリー、クリーム又はフォームとして腟内又は直腸内；（５）舌下；（６）眼内；（７）経皮；又は（８）経鼻に適応するものでの投与に特化して配合され得る。皮下又は静脈内方法を用いる送達は、特に有利であり得る。
【０３９７】
語句「治療有効量」は、本明細書で用いられるとき、任意の医学的処置に適用可能な合理的なリスク・ベネフィット比で、少なくとも動物における細胞の亜集団において幾らかの所望される治療効果をもたらすのに有効である本発明の化合物を含む化合物、材料又は組成物の量を意味する。
【０３９８】
語句「薬学的に許容できる」は、合理的なリスク・ベネフィット比に適う、過剰な毒性、刺激作用、アレルギー反応又は他の課題若しくは合併症と伴わない、ヒト及び動物の組織と接触させる使用に適した、健全な医学的判断の範囲内に含まれる、化合物、材料、組成物及び／又は剤形を指すように本明細書中で用いられる。
【０３９９】
語句「薬学的に許容できる担体」は、本明細書で用いられるとき、対象化合物を１つの臓器又は身体の一部から別の臓器又は身体の一部へ運搬又は輸送することに関与する、薬学的に許容できる材料、組成物又は媒体、例えば液体又は固体充填剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤（例えば、滑沢剤、タルク、マグネシウム、カルシウム又はステアリン酸亜鉛又はステアリン酸）又は溶媒封入材料を意味する。各担体は、製剤のその他の成分に適合しており、且つ患者に対して有害でないという意味で「許容できる」必要がある。薬学的に許容できる担体として役立ち得る材料の幾つかの例として、（１）糖、例えばラクトース、グルコース及びスクロース；（２）デンプン、例えばコーンスターチ及びジャガイモデンプン；（３）セルロース及びその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロース；（４）粉末化トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）平滑剤、例えばマグネシウムステート、ラウリル硫酸ナトリウム及びタルク；（８）賦形剤、例えばココアバター及び坐剤ワックス；（９）油、例えばピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油及び大豆油；（１０）グリコール、例えばプロピレングリコール；（１１）ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコール；（１２）エステル、例えばオレイン酸エチル及びラウリン酸エチル；（１３）寒天；（１４）緩衝剤、例えば水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェンフリー水；（１７）等張食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネート及び／又はポリ無水物；（２２）増量剤、例えばポリペプチド及びアミノ酸（２３）血清成分、例えば血清アルブミン、ＨＤＬ及びＬＤＬ；並びに（２２）医薬製剤中に用いられる他の無毒性親和性物質が挙げられる。
【０４００】
製剤は、便宜上、単位剤形で提示され得、また薬学の技術分野で周知の任意の方法により調製され得る。単一剤形を作製するために担体材料と組み合わせ可能な活性成分の量は、治療を受けているホスト、特定の投与様式に応じて変動することになる。単一剤形を作製するために担体材料と組み合わせ可能な活性成分の量は、一般に治療効果をもたらすような化合物の量となる。一般に、１００％中でのこの量は、活性成分が約０．１％〜約９９％、好ましくは約５％〜約７０％、最も好ましくは約１０％〜約３０％の範囲となる。
【０４０１】
特定の実施形態では、本発明の製剤は、シクロデキストリン、セルロース、リポソーム、ミセル形成剤、例えば胆汁酸及び高分子担体、例えばポリエステル及びポリ無水物からなる群から選択される賦形剤；及び本発明の化合物を含む。特定の実施形態では、上記製剤は、本発明の化合物を経口生体利用可能にする。
【０４０２】
ｉＲＮＡ製剤は、別の薬剤、例えば別の治療薬又はｉＲＮＡを安定化する薬剤、例えばｉＲＮＡと複合してｉＲＮＰを形成するタンパク質と組み合わせて配合され得る。さらに他の薬剤として、キレート剤、例えばＥＤＴＡ（例えば、Ｍｇ２＋などの二価カチオンを除去するため）、塩、リボヌクレアーゼ阻害剤（例えば、ＲＮＡｓｉｎなどの広範特異性リボヌクレアーゼ阻害剤）などが挙げられる。
【０４０３】
これらの製剤又は組成物を調製する方法は、本発明の化合物を担体、任意選択的に１つ以上の付属成分と会合させるステップを含む。一般に、その製剤は、本発明の化合物を液体担体若しくは微粉化された固体担体又は両方と均一且つ緊密に会合させ、次いで必要な場合、生成物を形成させることにより調製される。
【０４０４】
場合によっては、薬剤の効果を延長させるため、皮下又は筋肉内注射からの薬剤の吸収を遅らせることが望ましい。これは、水難溶性を有する結晶質又は非晶質材料の懸濁液の使用により行われ得る。ここで、薬剤の吸収速度は、その溶解速度に依存し、次いで結晶サイズ及び結晶性形態に依存し得る。代わりに、非経口的に投与される薬剤形態の遅延吸収は、薬剤を油媒体に溶解又は懸濁することによって行われる。
【０４０５】
本発明に記載の化合物は、他の医薬品に類似して、ヒト又は動物薬において用いられる任意の便宜的方法での投与のために配合され得る。
【０４０６】
用語「治療」は、予防、治療及び治癒も包含することが意図される。この治療を受けている患者は、一般に、霊長類、特にヒト及び他の哺乳類、例えばウマ、ウシ、ブタ及びヒツジ；並びに家禽及びペットを含む、需要のある任意の動物である。
【０４０７】
二本鎖ＲＮＡｉ剤は、インビボで細胞において、例えば細胞内に送達される外因性ＤＮＡ鋳型から作製される。例えば、ＤＮＡ鋳型は、ベクターに挿入され、遺伝子療法ベクターとして用いられ得る。遺伝子療法ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与により（米国特許第５，３２８，４７０号明細書、その全体が参照により援用される）又は定位注射により（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：３０５４−３０５７、その全体が参照により援用される）、対象に送達され得る。遺伝子療法ベクターの薬剤は、許容できる希釈剤中の遺伝子療法ベクターを含み得るか、又は遺伝子送達媒体が包埋される持続放出マトリックスを含み得る。例えば、ＤＮＡ鋳型は、２つの転写単位、すなわちｄｓＲＮＡ分子のトップ鎖を含む転写物を生成するものとｄｓＲＮＡ分子のボトム鎖を含む転写物を生成するものとを含み得る。その鋳型が転写されるとき、ｄｓＲＮＡ分子が生成され、遺伝子サイレンシングを媒介するｓｉＲＮＡ剤断片にプロセシングされる。
【０４０８】
送達の経路
本明細書で定義されるようなｄｓＲＮＡ分子又は本明細書で定義されるようなｄｓＲＮＡ分子を含む医薬組成物は、異なる送達経路を用いて対象に投与され得る。ｉＲＮＡを含む組成物は、種々の経路により対象に送達され得る。例示的経路は、静脈内、皮下、局所、直腸、肛門、膣、経鼻、肺、眼内を含む。
【０４０９】
本発明のｉＲＮＡ分子及び／又はｄｓＲＮＡ分子は、投与に適した医薬組成物に組み込まれ得る。かかる組成物は、典型的には、ｉＲＮＡの１種以上及び薬学的に許容できる担体を含む。本明細書で用いられるとき、用語「薬学的に許容できる担体」は、薬学的投与に適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤などを含むことが意図される。医薬活性物質におけるかかる媒体及び薬剤の使用は、当技術分野で周知である。任意の通常の媒体又は薬剤が活性化合物に不適合でない限り、組成物中でのその使用が検討される。補足的活性化合物も組成物中に組み込まれ得る。
【０４１０】
本発明の組成物は、局所又は全身治療が所望されるか否かに応じて、また治療されるべき領域に対して、多くの方法で投与され得る。投与は、局所（眼、膣、直腸、鼻腔内、経皮を含む）、経口又は非経口であり得る。非経口投与は、静脈内点滴、皮下、腹腔内若しくは筋肉内注射又はくも膜下腔内若しくは脳室内投与を含む。
【０４１１】
投与の経路及び部位は、標的化を増強するように選択され得る。例えば、筋細胞を標的にするため、目的の筋肉への筋肉内注射であれば、論理的な選択となる。肺細胞であれば、ｉＲＮＡをエアロゾル形態で投与することにより標的にされ得る。血管内皮細胞であれば、バルーンカテーテルをｉＲＮＡでコーティングし、ＤＮＡを機械的に導入することにより標的にされ得る。
【０４１２】
用量
一態様では、本発明は、ｄｓＲＮＡ分子、例えばｓｉＲＮＡ剤を対象（例えば、ヒト対象）に投与する方法を特徴とする。別の態様では、本発明は、対象における標的遺伝子の発現を阻害することにおける使用を意図した、本明細書で定義されるようなｄｓＲＮＡ分子に関する。その方法又は医学的使用は、ｄｓＲＮＡ分子、例えばｓｉＲＮＡ剤、例えば（ａ）二本鎖部分が１４〜４０ヌクレオチド（ｎｔ）長、例えば２１〜２３ｎｔであり、（ｂ）標的ＲＮＡ（例えば、内因性又は病原体標的ＲＮＡ）に対して相補的であり、任意選択的に、（ｃ）１〜５ヌクレオチド長の少なくとも１つの３’オーバーハングを含む二本鎖ｓｉＲＮＡ剤を単位用量で投与することを含む。一部の実施形態では、単位用量は、ＲＮＡ剤の１０ｍｇ／ｋｇ体重未満又は１０未満、５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５若しくは０．００００１ｍｇ／ｋｇ体重及び２００ｎモル未満（例えば、約４．４×１０１６コピー）／ｋｇ体重又はＲＮＡ剤の１５００未満、７５０、３００、１５０、７５、１５、７．５、１．５、０．７５、０．１５、０．０７５、０．０１５、０．００７５、０．００１５、０．０００７５、０．０００１５ｎモル／ｋｇ体重である。
【０４１３】
規定量は、疾患又は障害、例えば標的ＲＮＡに関連した疾患又は障害を治療又は予防するのに有効な量であり得る。例えば、単位用量は、注射（例えば、静脈内、皮下又は筋肉内）、吸入投与又は局所適用により投与され得る。一部の実施形態では、用量は、１０未満、５、２、１又は０．１ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。
【０４１４】
一部の実施形態では、単位用量は、１日１回よりも少ない、例えば２、４、８又は３０日ごとよりも少ない頻度で投与される。別の実施形態では、単位用量は、ある頻度（例えば、定期的頻度）で投与されない。例えば、単位用量は、単回投与され得る。
【０４１５】
一部の実施形態では、有効用量は、他の伝統的な治療様式で投与される。一部の実施形態では、対象は、ウイルス感染を有し、その様式は、ｄｓＲＮＡ分子以外、例えばｓｉＲＮＡ剤以外の抗ウイルス剤である。別の実施形態では、対象は、アテローム性動脈硬化症を有し、ｄｓＲＮＡ分子、例えばｓｉＲＮＡ剤は、例えば、外科的介入後、例えば血管形成術と組み合わせて、有効用量で投与される。
【０４１６】
一部の実施形態では、対象に、ｄｓＲＮＡ分子、例えばｓｉＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓｉＲＮＡ剤にプロセシング可能なより大きいｄｓＲＮＡ分子又はｄｓＲＮＡ分子、例えばｓｉＲＮＡ剤若しくはその前駆体をコードするＤＮＡ）が、初期用量及び１回以上の維持用量で投与される。１又は複数の維持用量は、初期用量と同じであるか又は初期用量よりも低い、例えば初期用量よりも半分少ない可能性がある。維持投与計画は、対象を、０．０１μｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲、例えば１０、１、０．１、０．０１、０．００１又は０．００００１ｍｇ／ｋｇ体重／日の１又は複数回用量で治療することを含み得る。維持用量は、例えば、２、５、１０又は３０日ごとに１回以下、投与される。さらに、治療計画は、一時期続き得、その期間は、患者の特定疾患の性質、その重症度及び全身状態に応じて変動することになる。特定の実施形態では、その用量は、１日１回以下、例えば２４、３６、４８又はより長時間ごとに１回以下、例えば５又は８日ごとに１回以下送達され得る。治療後、患者は、その状態における変化について、また病態の症状の軽減について監視され得る。その化合物の用量は、患者が現在の用量レベルに対して有意に応答しない場合に増加され得るか、又はその用量は、病態の症状の軽減が認められる場合、病態が消失している場合若しくは望まれない副作用が認められる場合に低減され得る。
【０４１７】
有効用量は、所望されるとき又は特定の環境下で適切と考えられるとき、単回用量又は２回以上の用量で投与され得る。反復又は頻回注入を容易にすることが望まれる場合、送達デバイス、例えばポンプ、半永久ステント（例えば、静脈内、腹腔内、大槽内又は関節内）又はリザーバーの移植が得策である場合がある。
【０４１８】
一部の実施形態では、その組成物は、複数のｄｓＲＮＡ分子種を含む。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子種は、天然に存在する標的配列に対して別種と重複せず、またそれらに隣接しない配列を有する。別の実施形態では、複数のｄｓＲＮＡ分子種は、異なる天然に存在する標的遺伝子に特異的である。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、対立遺伝子特異的である。
【０４１９】
本明細書に記載の本発明のｄｓＲＮＡ分子は、幾つかの方法で、哺乳類、特に非ヒト霊長類又はヒトなどの大型哺乳類に投与され得る。
【０４２０】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子、例えばｓｉＲＮＡ剤、組成物の投与は、非経口、例えば静脈内（例えば、ボーラス又は拡散注入として）、皮内、腹腔内、筋肉内、髄腔内、脳室内、頭蓋内、皮下、経粘膜、頬側、舌下、内視鏡、直腸、経口、膣、局所、肺、鼻腔内、尿道又は眼内投与である。投与は、対象又は別の人物、例えばヘルスケア提供者によって提供され得る。投薬は、測定用量において又は定量用量を送達する計量分配装置で提供され得る。選択された送達様式は、以下により詳細に検討される。
【０４２１】
本発明は、本明細書に記載のｄｓＲＮＡ分子の直腸投与又は送達のための方法、組成物及びキットを提供する。
【０４２２】
特定の実施形態では、本発明は、上記の方法における使用を意図した本発明のｄｓＲＮＡ分子に関する。
【０４２３】
標的遺伝子の発現を阻害する方法
本発明の実施形態は、標的遺伝子の発現を阻害するための方法にも関する。この方法は、先の実施形態のいずれかにおけるｄｓＲＮＡ分子を、標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量で投与するステップを含む。本発明は、標的細胞における標的遺伝子の発現を阻害するための、本明細書で定義されるようなｄｓＲＮＡ分子の使用にさらに関する。好ましい実施形態では、本発明は、インビトロで標的細胞における標的遺伝子の発現を阻害するためのｄｓＲＮＡ分子の使用にさらに関する。
【０４２４】
別の態様での本発明は、細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法であって、本発明のｄｓＲＮＡ分子を前記細胞に提供することを含む方法に関する。一部の実施形態では、標的遺伝子は、第ＶＩＩ因子、Ｅｇ５、ＰＣＳＫ９、ＴＰＸ２、ａｐｏＢ、ＳＡＡ、ＴＴＲ、ＲＳＶ、ＰＤＧＦβ遺伝子、Ｅｒｂ−Ｂ遺伝子、Ｓｒｃ遺伝子、ＣＲＫ遺伝子、ＧＲＢ２遺伝子、ＲＡＳ遺伝子、ＭＥＫＫ遺伝子、ＪＮＫ遺伝子、ＲＡＦ遺伝子、Ｅｒｋ１／２遺伝子、ＰＣＮＡ（ｐ２１）遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＪＵＮ遺伝子、ＦＯＳ遺伝子、ＢＣＬ−２遺伝子、ヘプシジン、活性化タンパク質Ｃ、サイクリンＤ遺伝子、ＶＥＧＦ遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、サイクリンＡ遺伝子、サイクリンＥ遺伝子、ＷＮＴ−１遺伝子、β−カテニン遺伝子、ｃ−ＭＥＴ遺伝子、ＰＫＣ遺伝子、ＮＦＫＢ遺伝子、ＳＴＡＴ３遺伝子、サバイビン遺伝子、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ遺伝子、トポイソメラーゼＩ遺伝子、トポイソメラーゼＩＩα遺伝子、ｐ７３遺伝子における突然変異、ｐ２１（ＷＡＦ１／ＣＩＰ１）遺伝子における突然変異、ｐ２７（ＫＩＰ１）遺伝子における突然変異、ＰＰＭ１Ｄ遺伝子における突然変異、ＲＡＳ遺伝子における突然変異、カベオリンＩ遺伝子における突然変異、ＭＩＢＩ遺伝子における突然変異、ＭＴＡＩ遺伝子における突然変異、Ｍ６８遺伝子における突然変異、腫瘍サプレッサー遺伝子における突然変異及びｐ５３腫瘍サプレッサー遺伝子における突然変異、からなる群から選択される。
【０４２５】
特定の実施形態では、本発明は、上記の方法における使用を意図した本発明のｄｓＲＮＡ分子に関する。
【０４２６】
一部の他の態様において、本発明は、リガンド又は第２のオリゴヌクレオチドとコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドを調製するための方法に関する。この方法は、銅を含まない「クリック」コンジュゲーションを含む。方法の一般的なバージョンをスキーム１に示す。
【化３６】
2021523720.tif 000038
【０４２７】
示されるように、ジベンジルシクロオクチン（ＤＢＣＯ）部分を含む第１のオリゴヌクレオチドは、リガンド又は第２のオリゴヌクレオチドと反応し、ここで、リガンド及び第２のオリゴヌクレオチドは、アジド官能基を含む。コンジュゲートを調製するために、ＤＢＣＯ部分を３’末端又は５’末端のいずれかでオリゴヌクレオチドに結合させることができる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、３’又は５’末端のいずれかに３つの連続する２’−Ｆ−ヌクレオチド（例えば、２’−Ｆヌクレオチドトリプレット）を含み、ＤＢＣＯ部分は、末端２’−Ｆヌクレオチドにコンジュゲートされる。３つの２’−Ｆヌクレオチドは、全て同じであるか又は全て異なり得る。代わりに、３つの２’−Ｆの２つは同一であり得、互いに且つヌクレオチド及びＤＢＣＯ部分に関して、任意の線形順序で配置され得る。この方法は、Ｂｉｓ−ＲＮＡｉ合成用のロングマー（ｌｏｎｇｍｅｒ）鎖を調製するのに役立ち得る。したがって、ＤＢＣＯ部分は、Ｂｉｓ−ＲＮＡｉを調製するためのセンス鎖又はアンチセンス鎖の３’又は５’末端のどこにでも配置することができる。
【０４２８】
本発明は、限定するものと解釈されるべきでない以下の実施例によりさらにさらに例示される。本願全体を通して引用される、全ての参考文献、係属中の特許出願及び公開された特許の内容は、ここで、参照により明示的に援用される。
【実施例】
【０４２９】
実施例１：新規の修飾アンロック核酸（ｍＵＮＡ）及びグリコール核酸（ＧＮＡ）構成要素の設計及び合成
新規ｍＵＮＡ及びＧＮＡ誘導体の合成アプローチを以下に示す。簡潔には、置換フラノース環及び／又は修飾塩基を有するヌクレオシド誘導体は、新規非環状ヌクレオシド誘導体を得るために、ＮａＩＯ４によってそれらの２’−及び３’−炭素−炭素結合で酸化的に切断し、その後ＮａＢＨ４還元することができる。これらのヌクレオシド、５’−リン酸誘導体を有するヌクレオシドプロドラッグ及び３’−ホスホラミダイトは、オリゴヌクレオチド治療剤及び抗ウイルス剤として適用可能であり得る。
【０４３０】
修飾ＵＮＡ構成要素の一般的な合成アプローチをスキーム２に示す。
【化３７】
2021523720.tif 000039
【０４３１】
例示的なｍＵＮＡ構成要素
【化３８】
2021523720.tif 000040
【０４３２】
４’修飾ｍＵＮＡ構成要素（１）
【化３９】
2021523720.tif 000041
（式中、
Ｒは、Ｈ、ＯＨ；ＯＭｅ；Ｃｌ、Ｆ；ＯＨ；Ｏ−（ＣＨ２）２ＯＭｅ；ＳＭｅ、ＮＭｅ２；ＮＨ２；Ｍｅ；ＣＣＨ（アルキン）、Ｏ−ｎＰｒ；Ｏ−アルキル；又はＯ−アルキルアミノであり；
Ｒ’は、Ｈ又はＭｅであり；
Ｂは、Ａ；Ｃ；５−Ｍｅ−Ｃ；Ｇ；Ｉ；Ｕ；Ｔ；Ｙ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環；シュードウラシル；ｉｓｏＣ；ｉｓｏＧ；２，６−ジアミノプリン；シュードシトシン；２−アミノプリン；キサントシン；Ｎ６−アルキル−Ａ；Ｏ６−アルキル−Ｇ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；７−デアザプリン、フェノキサジン；Ｇクランプ；又は非正準の単環式、二環式及び三環式複素環であり、及び
立体化学は、不特定のキラル中心についてＲ又はＳ及びＲとＳとの組み合わせである。）
【０４３３】
４’修飾ｍＵＮＡ構成要素（２）
【化４０】
2021523720.tif 000042
（式中、
Ｒは、Ｈ、ＯＨ；ＯＭｅ；Ｃｌ、Ｆ；ＯＨ；Ｏ−（ＣＨ２）２ＯＭｅ；ＳＭｅ、ＮＭｅ２；ＮＨ２；Ｍｅ；ＣＣＨ（アルキン）、Ｏ−ｎＰｒ；Ｏ−アルキル；又はＯ−アルキルアミノであり；
Ｒ’は、Ｈ又はＭｅであり；
Ｂは、Ａ；Ｃ；５−Ｍｅ−Ｃ；Ｇ；Ｉ；Ｕ；Ｔ；Ｙ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環；シュードウラシル；ｉｓｏＣ；ｉｓｏＧ；２，６−ジアミノプリン；シュードシトシン；２−アミノプリン；キサントシン；Ｎ６−アルキル−Ａ；Ｏ６−アルキル−Ｇ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；７−デアザプリン、フェノキサジン；Ｇクランプ；又は非正準の単環式、二環式及び三環式複素環であり、及び
立体化学は、不特定のキラル中心についてＲ又はＳ及びＲとＳとの組み合わせである。）
【０４３４】
４’修飾ｍＵＮＡ構成要素（３）
【化４１】
2021523720.tif 000043
（式中、
Ｒは、Ｈ、ＯＭｅ；Ｆ；ＯＨ；Ｏ−（ＣＨ２）２ＯＭｅ；ＳＭｅ、ＮＭｅ２；ＮＨ２；Ｍｅ；Ｏ−ｎＰｒ；Ｏ−アルキル；又はＯ−アルキルアミノであり；
Ｒ’は、Ｈ又はＭｅであり；
Ｂは、Ａ；Ｃ；５−Ｍｅ−Ｃ；Ｇ；Ｉ；Ｕ；Ｔ；Ｙ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環；シュードウラシル；ｉｓｏＣ；ｉｓｏＧ；２，６−ジアミノプリン；シュードシトシン；２−アミノプリン；キサントシン；Ｎ６−アルキル−Ａ；Ｏ６−アルキル−Ｇ；又は７−デアザプリンであり、及び
立体化学は、不特定のキラル中心についてＲ又はＳ及びＲとＳとの組み合わせである。）
【０４３５】
４’修飾ｍＵＮＡ構成要素（４）
【化４２】
2021523720.tif 000044
（式中、
Ｒは、Ｈ；ＯＭｅ；ＯＥｔ、Ｆ；ＯＴＢＤＭＳ；Ｏ−（ＣＨ２）２ＯＭｅ；ＳＭｅ、ＮＭｅ２；ＮＰｈｔｈ；Ｍｅ；Ｏ−ｎＰｒ；Ｏ−アルキル；又はＯ−アルキルアミノであり；
Ｒ’は、Ｈ又はＭｅであり；
Ｂｐは、ＡＢｚ；ＣＡｃ；５−Ｍｅ−ＣＢｚ；Ｇ；Ｉ；Ｕ；Ｔ；Ｙ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環；シュードウラシルｉｓｏＣ；ｉｓｏＧ；２，６−ジアミノプリン；シュードシトシン；２−アミノプリン；キサントシン；Ｎ６−アルキル−Ａ；Ｏ６−アルキル−Ｇ；又は７−デアザプリンであり、及び
立体化学は、不特定のキラル中心についてＲ又はＳ及びＲとＳとの組み合わせである。）
【０４３６】
４’修飾ｍＵＮＡ構成要素（５）
【化４３】
2021523720.tif 000045
（式中、
Ｒは、ＯＭｅ；ＯＥｔ、Ｆ；ＯＴＢＤＭＳ；Ｏ−（ＣＨ２）２ＯＭｅ；ＳＭｅ、ＮＭｅ２；ＮＰｈｔｈ；Ｍｅ；Ｏ−ｎＰｒ；Ｏ−アルキル；又はＯ−アルキルアミノであり；
Ｒ’は、Ｈ又はＭｅであり；
Ｂｐは、ＡＢｚ；ＣＡｃ；５−Ｍｅ−ＣＢｚ；Ｇ；Ｉ；Ｕ；Ｔ；Ｙ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環；シュードウラシルｉｓｏＣ；ｉｓｏＧ；２，６−ジアミノプリン；シュードシトシン；２−アミノプリン；キサントシン；Ｎ６−アルキル−Ａ；Ｏ６−アルキル−Ｇ；又は７−デアザプリンであり、及び
立体化学は、不特定のキラル中心についてＲ又はＳ及びＲとＳとの組み合わせである。）
【０４３７】
４’修飾ｍＵＮＡ構成要素（６）
【化４４】
2021523720.tif 000046
（式中、
Ｒは、Ｈ、ＯＭｅ；ＯＥｔ、Ｆ；ＯＴＢＤＭＳ；Ｏ−（ＣＨ２）２ＯＭｅ；ＳＭｅ、ＮＭｅ２；ＮＰｈｔｈ；Ｍｅ；Ｏ−ｎＰｒ；Ｏ−アルキル；又はＯ−アルキルアミノであり；
Ｒ’は、Ｈ又はＭｅであり、
Ｂｐは、ＡＢｚ；ＣＡｃ；５−Ｍｅ−ＣＢｚ；Ｇ；Ｉ；Ｕ；Ｔ；Ｙ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環；シュードウラシルｉｓｏＣ；ｉｓｏＧ；２，６−ジアミノプリン；シュードシトシン；２−アミノプリン；キサントシン；Ｎ６−アルキル−Ａ；Ｏ６−アルキル−Ｇ；又は７−デアザプリンであり、及び
立体化学は、不特定のキラル中心についてＲ又はＳ及びＲとＳとの組み合わせである。）
【０４３８】
３’−ホスホラミダイト基を有する他のｍＵＮＡ構成要素
【化４５】
2021523720.tif 000047
【化４６】
2021523720.tif 000048
【０４３９】
２’−ホスホラミダイト基を有する他のｍＵＮＡ構成要素
【化４７】
2021523720.tif 000049
【化４８】
2021523720.tif 000050
【０４４０】
修飾ＵＮＡヌクレオシド（１）
【化４９】
2021523720.tif 000051
（式中、
Ｒは、Ｈ、ＯＨ；ＯＭｅ；Ｃｌ、Ｆ；ＯＨ；Ｏ−（ＣＨ２）２ＯＭｅ；ＳＭｅ、ＮＭｅ２；ＮＨ２；Ｍｅ；ＣＣＨ（アルキン）、Ｏ−ｎＰｒ；Ｏ−アルキル；又はＯ−アルキルアミノであり；
Ｒ’は、Ｈ又はＭｅであり、
Ｂは、Ａ；Ｃ；５−Ｍｅ−Ｃ；Ｇ；Ｉ；Ｕ；Ｔ；Ｙ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環；シュードウラシル；ｉｓｏＣ；ｉｓｏＧ；２，６−ジアミノプリン；シュードシトシン；２−アミノプリン；キサントシン；Ｎ６−アルキル−Ａ；Ｏ６−アルキル−Ｇ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；７−デアザプリン、フェノキサジン；Ｇクランプ；又は非正準の単環式、二環式及び三環式複素環であり、及び
立体化学は、不特定のキラル中心についてＲ又はＳ及びＲとＳとの組み合わせである。）
【０４４１】
修飾ＵＮＡヌクレオシド（３２）
【化５０】
2021523720.tif 000052
（式中、
Ｒは、Ｈ、ＯＨ；ＯＭｅ；Ｃｌ、Ｆ；ＯＨ；Ｏ−（ＣＨ２）２ＯＭｅ；ＳＭｅ、ＮＭｅ２；ＮＨ２；Ｍｅ；ＣＣＨ（アルキン）、Ｏ−ｎＰｒ；Ｏ−アルキル；Ｏ−アルキルアミノであり；
Ｒ’は、Ｈ又はＭｅであり；
Ｂは、Ａ；Ｃ；５−Ｍｅ−Ｃ；Ｇ；Ｉ；Ｕ；Ｔ；Ｙ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環；シュードウラシル；ｉｓｏＣ；ｉｓｏＧ；２，６−ジアミノプリン；シュードシトシン；２−アミノプリン；キサントシン；Ｎ６−アルキル−Ａ；Ｏ６−アルキル−Ｇ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；７−デアザプリン、フェノキサジン；Ｇクランプ；又は非正準の単環式、二環式及び三環式複素環であり、及び
立体化学は、不特定のキラル中心についてＲ又はＳ及びＲとＳとの組み合わせである。）
【０４４２】
修飾ＵＮＡヌクレオシド（３）
【化５１】
2021523720.tif 000053
（式中、
Ｒは、Ｈ、ＯＭｅ；Ｆ；ＯＨ；Ｏ−（ＣＨ２）２ＯＭｅ；ＳＭｅ、ＮＭｅ２；ＮＨ２；Ｍｅ；Ｏ−ｎＰｒ；Ｏ−アルキル；又はＯ−アルキルアミノであり；
Ｒ’は、Ｈ又はＭｅであり；
Ｂは、Ａ；Ｃ；５−Ｍｅ−Ｃ；Ｇ；Ｉ；Ｕ；Ｔ；Ｙ；２−チオウリジン；４−チオウリジン；Ｃ５修飾ピリミジン；Ｃ２修飾プリン；Ｎ８修飾プリン；フェノキサジン；Ｇクランプ；非正準の単環式、二環式及び三環式複素環；シュードウラシル；ｉｓｏＣ；ｉｓｏＧ；２，６−ジアミノプリン；シュードシトシン；２−アミノプリン；キサントシン；Ｎ６−アルキル−Ａ；Ｏ６−アルキル−Ｇ；又は７−デアザプリンであり、及び
立体化学は、不特定のキラル中心についてＲ又はＳ及びＲとＳとの組み合わせである。）
【０４４３】
５’−リン酸類似体による修飾ＵＮＡ遊離ヌクレオシド
【化５２】
2021523720.tif 000054
【化５３】
2021523720.tif 000055
【化５４】
2021523720.tif 000056
【０４４４】
実施例２：モノマーの合成
５’−（Ｓ）−メチル−Ｕ−ＵＮＡ構成要素の合成
【化５５】
2021523720.tif 000057
化合物３の合成：０℃に冷却した無水ジクロロメタン（５００ｍＬ）中の化合物１（２０．０ｇ、４２．３ｍｍｏｌ）の溶液に、デス・マーチン・ペルヨージナン（２１．５ｇ、５０．８ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）を添加した。反応物を０℃で１時間撹拌し、室温に温め、さらに１．５時間撹拌した。次に、０℃で激しく撹拌した１０％Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液（３００ｍＬ）及び飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（３００ｍＬ）の混合物にゆっくりと加えることにより、反応をクエンチし、１時間撹拌した。クエンチ後、有機層をＤＣＭで３回抽出し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。高真空で乾燥すると、生成物は薄片状の白色固体として得られた。乾燥した粗物質を無水ＴＨＦ（３００ｍＬ）中に再懸濁し、溶液を０℃でＴＨＦ（３００ｍＬ）中のＭｅ３Ａｌ（トルエン中２Ｍ、６３．５ｍＬ、１２６．９ｍｍｏｌ、３ｅｑ）の撹拌溶液に、カニューレによって添加した。粗物質フラスコを追加のＴＨＦですすぎ、カニューレを介して反応物に添加した。０℃で１時間撹拌した後、反応物を室温に温め、一晩撹拌した。反応物を０℃にし、Ｈ３ＰＯ４水溶液（１０％）及びＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液の１：１溶液２０ｍＬを徐々に添加することによりクエンチした。溶媒を減圧下で除去した後、粗残留物をＤＣＭ及び飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で抽出した。有機層を分離し、ブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥及び濾過し、減圧下で濃縮した。粗物質をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中０〜３０％ＥｔＯＡｃ、２％トリエチルアミン）で精製して、化合物３を白色の泡状物として得た（５．８５ｇ、１２．０２ｍｍｏｌ、２５％；Ｒｆ＝０．４８、ヘキサン中５０％ＥｔＯＡｃで展開）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １１．３５（ｓ，１Ｈ），８．０７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），５．８３（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），５．７１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），５．２７（ｄ，Ｊ＝４．２Ｈｚ，１Ｈ），４．２６（ｄｄ，Ｊ＝６．１，４．４Ｈｚ，１Ｈ），４．１２（ｄｄ，Ｊ＝４．５，２．５Ｈｚ，１Ｈ），３．８８−３．７８（ｍ，１Ｈ），３．７２（ｔ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），１．１４（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ），０．８９（ｓ，９Ｈ），０．８３（ｓ，９Ｈ），０．０８（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，６Ｈ），−０．０４（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １６２．９４，１５０．７４，１４０．１７，１０２．０５，８８．５４，８６．４３，７４．７５，７２．９０，６５．０４，２５．７０，２５．５９，１９．９８，１７．７４，１７．６０，−４．６３，−４．７７，−４．８４，−５．０７．
【０４４５】
化合物４の合成：無水ＴＨＦ（５０ｍＬ）及び無水ピリジン（１０ｍＬ）中の化合物３（５．８５ｇ、１２．０２ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＴｒＣｌ（１２．２ｇ、３６．１ｍｍｏｌ、３ｅｑ）及びＡｇＮＯ３（４．０８ｇ、２４．０ｍｍｏｌ、２ｅｑ）を添加し、混合物を周囲温度で一晩撹拌した。２４時間後、追加のＤＭＴｒＣｌ（６．１１ｇ、１８．０ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）及びＡｇＮＯ３（２．０４ｇ、１２．０ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）を反応物に添加した。混合物を周囲温度で一晩撹拌した。混合物をセライトで濾過し、濾過ケーキをＤＣＭで洗浄した。濾液を減圧下で濃縮し、残留物をＤＣＭ及び飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で抽出した。有機層をブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥及び濾過し、濃縮した。粗残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中０〜２５％ＥｔＯＡｃ、２％トリエチルアミン）で精製して、化合物４を黄色の泡状物として得た（８．０５ｇ、１０．２ｍｍｏｌ、８５％、Ｒｆ＝０．３５、ヘキサン中３３％ＥｔＯＡｃで展開）。
【０４４６】
化合物５の合成：ＴＨＦ（５１ｍＬ）中の化合物４（８．０５ｇ、１０．２ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１Ｍ、２５．５ｍＬ、２５．５ｍｍｏｌ、２ｅｑ）を添加した。室温で一晩撹拌した後、溶媒を減圧下で除去した。粗残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中０〜１００％ＥｔＯＡｃ、次にＥｔＯＡＣ中２．５％ＭｅＯＨ、２％トリエチルアミン）で精製して、化合物５を黄白色の泡状物として得た（５．８４ｇ、定量的収率；Ｒｆ＝０．５０、ＥｔＯＡｃ中５％ＭｅＯＨで展開）。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １１．４１−１１．３４（ｍ，１Ｈ），７．５７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．４６−７．４０（ｍ，２Ｈ），７．３０（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，６Ｈ），７．２１（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），６．８８（ｄｄ，Ｊ＝８．８，６．７Ｈｚ，４Ｈ），５．６８（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），５．５８（ｄｄ，Ｊ＝８．０，１．６Ｈｚ，１Ｈ），５．３９（ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ），５．０３（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），４．０１（ｈ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ），３．７４（ｓ，３Ｈ），３．７２（ｓ，４Ｈ），３．６１−３．５１（ｍ，１Ｈ），０．６７（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １６２．９３，１５８．０６，１５０．６７，１４６．１１，１４０．４７，１３６．４０，１３６．３０，１３０．１６，１３０．０８，１２７．９５，１２７．６１，１２６．６１，１１２．９９，１０１．９３，８７．２５，８６．４３，８５．８１，７２．５６，６９．２４，６８．８９，５５．００，５４．９９，１７．０９．
【０４４７】
化合物６の合成：ジオキサン（１３５ｍＬ）及びＨ２Ｏ（２５ｍＬ）中の化合物５（５．８４ｇ、１０．４２ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｈ２Ｏ（２５ｍＬ）に溶解したＮａＩＯ４（２．４５ｇ、１１．４６ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）を添加した。二層の反応混合物を周囲温度で４時間激しく撹拌した。反応混合物を焼結漏斗で濾過し、濾過ケーキを追加のジオキサンで洗浄した。濾液にＮａＢＨ４（０．４３４ｇ、１１．４６ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）を添加した。周囲温度で２時間撹拌した後、混合物を０℃に冷却し、次に、１：１ｖ／ｖのＡｃＯＨ：ピリジン緩衝液でクエンチした。溶媒を減圧下で除去した後、粗残留物をＥｔＯＡｃ及び飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で抽出した。有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。粗物質をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０〜５％ＭｅＯＨ、２％トリエチルアミン）で精製して、化合物６を白色の泡状物として得た（５．０１ｇ、８．９０ｍｍｏｌ、８５％；Ｒｆ＝０．１３、ＤＣＭ中５％ＭｅＯＨで展開）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １１．１４（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３５（ｄｄ，Ｊ＝８．０，１．８Ｈｚ，３Ｈ），７．３０−７．１５（ｍ，７Ｈ），６．９０−６．７８（ｍ，４Ｈ），５．６４（ｄｄ，Ｊ＝６．４，４．７Ｈｚ，１Ｈ），５．４７（ｄｄ，Ｊ＝８．０，２．２Ｈｚ，１Ｈ），５．０１（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），４．６８（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），３．８２（ｄｄ，Ｊ＝１１．７，５．７，２．２Ｈｚ，１Ｈ），３．６０−３．５１（ｍ，２Ｈ），３．５０−３．３９（ｍ，２Ｈ），３．２４−３．１７（ｍ，１Ｈ），３．１２−３．０１（ｍ，１Ｈ），２．０７（ｓ，２Ｈ），１．１９（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），０．５６（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １６３．０８，１５８．０９，１５８．０３，１５０．８０，１４５．６４，１４０．５７，１３６．４９，１３６．１１，１２９．７５，１２９．６０，１２７．６５，１２７．６２，１２６．６８，１１３．０２，１０１．１８，８５．８０，８４．７３，８１．６９，６８．８２，６１．２４，６０．３６，５４．９８，４５．４８，３９．２４，１５．３８，８．４９，１．１２．
【０４４８】
化合物７の合成：−７８℃に冷却した、無水ＤＣＭ（２４５ｍＬ）及びピリジン（７ｍＬ）中の化合物６（５．０１ｇ、８．９０ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化ベンゾイル（１．１４ｍＬ、９．７９ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）をゆっくりと添加した。−７８℃で１時間撹拌した後、反応混合物を０℃とし、ＥｔＯＨ（５ｍＬ）でクエンチした。混合物をＤＣＭ及び飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で抽出した。有機層をブラインで洗浄し、分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中０〜７５％ＥｔＯＡＣ）で精製して、化合物７を白色の泡状物として得た（１．３１ｇ、１．９６ｍｍｏｌ、２２％；Ｒｆ＝０．３２、ヘキサン中５０％ＥｔＯＡｃで発展）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １１．２９−１１．２５（ｍ，１Ｈ），７．８７（ｄｄ，Ｊ＝８．４，１．４Ｈｚ，２Ｈ），７．６９−７．６１（ｍ，１Ｈ），７．５５−７．４６（ｍ，３Ｈ），７．３９−７．３２（ｍ，２Ｈ），７．２７（ｄ，Ｊ＝１．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２５（ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ，２Ｈ），７．２３（ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，３Ｈ），７．２２（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．２０（ｔ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，１Ｈ），６．０３（ｄｄ，Ｊ＝６．８，５．０Ｈｚ，１Ｈ），５．５７−５．５２（ｍ，１Ｈ），４．７８（ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，１Ｈ），４．５０（ｄｄ，Ｊ＝１１．５，５．０Ｈｚ，１Ｈ），４．３３（ｄｄ，Ｊ＝１１．５，６．８Ｈｚ，１Ｈ），３．８４（ｄｄｄ，Ｊ＝１１．６，５．１，２．２Ｈｚ，１Ｈ），３．７２（ｓ，７Ｈ），３．５９（ｄｄｄ，Ｊ＝１１．６，８．４，５．５Ｈｚ，１Ｈ），３．５４−３．４７（ｍ，１Ｈ），３．１２（ｄｄｄ，Ｊ＝８．５，４．６，２．２Ｈｚ，１Ｈ），０．６９（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １６４．９３，１６２．９４，１５８．１２，１５８．０６，１５０．５８，１４５．５９，１３９．９３，１３６．４０，１３６．１０，１３３．５５，１２９．７４，１２９．６２，１２９．１２，１２９．０１，１２８．７７，１２７．６８，１２７．６４，１２６．７１，１１３．０３，１０１．８８，８５．８８，８１．７６，８１．６０，６８．７４，６３．３６，６０．４２，５４．９８，３９．４０，３９．１８，３８．９７，１５．５０．
【０４４９】
化合物８の合成：ＤＣＭ（１０ｍｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．６６ｍｌ、５．４ｍｍｏｌ）中の化合物７（１．２１ｇ、１．８１ｍｍｏｌ）の溶液に、２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイト（０．６９５ｍｌ、２．２ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。混合物を０℃で２時間撹拌した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）で希釈し、次に、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。アミダイト８をヘキサンから沈殿させた（１．３３ｇ、１．５ｍｍｏｌ、８５％）。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ  １４８．８１，１４８．５８．
【０４５０】
化合物９の合成：ＣＨ２Ｃｌ２中での無水コハク酸及びＤＭＡＰを使用した化合物７の標準的なコハク化と、それに続くＤＭＦ中でのＨＢＴＵ及びＤＩＰＥＡを使用したＣＰＧローディングにより、化合物９が得られる。
【０４５１】
５’−（Ｒ）−メチル−Ｕ−ＵＮＡ構成要素の合成
【化５６】
2021523720.tif 000058
化合物１１の合成：無水ＴＨＦ（４８．５ｍＬ）中の化合物３（２．３６ｇ、４．８５ｍｍｏｌ）の溶液に、ｐ−ニトロ安息香酸（４．０５ｇ、２４．２５ｍｍｏｌ、５．０ｅｑ）、トリフェニルホスフィン（６．３６ｇ、２４．２５ｍｍｏｌ、５．０ｅｑ）及びＤＩＡＤ（４．６９ｍＬ、２４．２５ｍｍｏｌ、５．０ｅｑ）を０℃で添加した。反応物を周囲温度で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。粗物質をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中０〜２５％ＥｔＯＡｃ）で精製して、化合物１０を黄白色の泡状物として得た（２．８６ｇ、４．５０ｍｍｏｌ、Ｒｆ＝０．３７、ヘキサン中３３％ＥｔＯＡｃで展開）。この物質をメタノール溶液（１００ｍＬ）中の７Ｎアンモニアに再懸濁し、室温で一晩撹拌した。溶媒を除去し、粗物質をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中０〜３０％ＥｔＯＡｃ）で精製して、化合物１１を白色の泡状物として得た（１．４７ｇ、３．０１ｍｍｏｌ、６２％、２ステップ；Ｒｆ＝０．２７、ヘキサン中３３％ＥｔＯＡｃで展開）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １１．３７（ｓ，１Ｈ），７．８５（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），５．８９（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），５．７１（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），５．１９（ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，１Ｈ），４．３０（ｄｄ，Ｊ＝７．８，４．５Ｈｚ，１Ｈ），４．２１（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ），３．８２−３．７３（ｍ，１Ｈ），３．６２（ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，１Ｈ），１．１１（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ），０．８９（ｓ，９Ｈ），０．８１（ｓ，９Ｈ），０．１０（ｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，６Ｈ），０．００（ｓ，３Ｈ），−０．０９（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １６２．７８，１５０．８７，１４０．６６，１０２．４１，９０．００，８５．７５，７３．９０，７１．６４，６６．３９，３９．１８，２５．６９，２５．５６，２０．０８，１７．７１，１７．５７，−４．５７，−４．６３，−４．７０，−５．２２．
【０４５２】
化合物１２の合成：無水ＴＨＦ（１１．５ｍＬ）及び無水ピリジン（２．２ｍＬ）中の化合物１１（１．４０ｇ、２．８８ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＴｒＣｌ（２．９２ｇ、８．６３ｍｍｏｌ、３ｅｑ）及びＡｇＮＯ３（０．９７ｇ、５．７５ｍｍｏｌ、２ｅｑ）を添加し、混合物を周囲温度で一晩撹拌した。混合物をセライトで濾過し、濾過ケーキをＤＣＭで洗浄した。濾液を減圧下で濃縮し、残留物をＤＣＭ及び飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で抽出した。有機層をブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥及び濾過し、濃縮した。粗残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中０〜２５％ＥｔＯＡｃ、２％トリエチルアミン）で精製して、化合物１２を明るい黄色の泡状物として得た（２．０３ｇ、２．５７ｍｍｏｌ、８９％、Ｒｆ＝０．２７、ヘキサン中３３％ＥｔＯＡｃで展開）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １１．３８（ｓ，１Ｈ），７．４６−７．３８（ｍ，２Ｈ），７．３０（ｔｄ，Ｊ＝８．１，７．７，５．７Ｈｚ，７Ｈ），７．２６−７．１７（ｍ，１Ｈ），６．９４−６．８４（ｍ，４Ｈ），５．６６（ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ），５．３１（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），４．１１（ｄｄ，Ｊ＝４．６，３．２Ｈｚ，１Ｈ），４．０６−４．０２（ｍ，１Ｈ），３．８６（ｄｄ，Ｊ＝４．６，３．２Ｈｚ，１Ｈ），３．７４（ｓ，６Ｈ），３．４９−３．４１（ｍ，１Ｈ），０．８５（ｓ，９Ｈ），０．８２（ｓ，８Ｈ），０．７９（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，３Ｈ），０．０６（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，５Ｈ），０．０１（ｓ，３Ｈ），−０．０８（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １５８．１３，１５８．０９，１５０．４２，１４１．１３，１３５．８４，１３０．０７，１３０．０３，１２７．７５，１２７．６５，１２６．６６，１１３．０９，１１３．０４，１０１．８６，８８．２８，８７．２４，８６．１６，７３．３２，７１．４４，６９．５３，５５．００，２５．６４，２５．５４，１７．６２，１７．５４，１７．０９，−４．４５，−４．６４，−４．８６，−５．０７．
【０４５３】
化合物１３の合成：ＴＨＦ（１２．９ｍＬ）中の化合物１２（２．０３ｇ、２．５７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＢＡＦ（５．１４ｇ、５．１４ｍｍｏｌ、２ｅｑ）を添加した。室温で一晩撹拌した後、溶媒を減圧下で除去した。粗残留物をシリカゲルに前吸収し（２％トリエチルアミンで前処理）、次に、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中０〜１００％ＥｔＯＡｃ、次にＥｔＯＡＣ中２．５％ＭｅＯＨ、２％トリエチルアミン）により精製して、化合物１３を白色の泡状物として得た（１．００ｇ、１．７８ｍｍｏｌ、６９％；Ｒｆ＝０．４５、ＥｔＯＡｃ中５％ＭｅＯＨで展開）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １１．３５（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．４７−７．４０（ｍ，２Ｈ），７．３１（ｄｄｄ，Ｊ＝１０．１，７．７，３．８Ｈｚ，７Ｈ），７．２５−７．１８（ｍ，１Ｈ），６．９５−６．８４（ｍ，４Ｈ），５．６８（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１Ｈ），５．３７（ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ），５．１８（ｄｄ，Ｊ＝８．１，２．０Ｈｚ，１Ｈ），５．０９（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），４．１８（ｑ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，１Ｈ），３．９７（ｑ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１Ｈ），３．７４（ｓ，６Ｈ），３．６８（ｄｄ，Ｊ＝４．３，３．１Ｈｚ，１Ｈ），３．４８−３．３９（ｍ，１Ｈ），０．７６（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １６２．８３，１５８．１０，１５８．０８，１５０．６１，１４６．３３，１４０．７７，１３６．２６，１３６．１６，１３０．１３，１３０．０９，１２７．８４，１２７．６９，１２６．５８，１１３．１０，１１３．０６，１０１．６５，８７．３６，８６．９２，８５．９８，７２．５３，６９．６７，６８．９６，５５．０５，５５．０３，１７．０８．
【０４５４】
化合物１４の合成：ジオキサン（２４ｍＬ）及びＨ２Ｏ（３ｍＬ）中の化合物１３の溶液（１．００ｇ、１．７８ｍｍｏｌ）に、Ｈ２Ｏ（３ｍＬ）に溶解したＮａＩＯ４（０．４２ｇ、１．９６ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）を添加した。二層の反応混合物を周囲温度で４時間激しく撹拌した。反応混合物を濾過し、濾過ケーキを追加のジオキサンで洗浄した。濾液にＮａＢＨ４（０．０７４ｇ、１．９６ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）を添加した。周囲温度で２時間撹拌した後、混合物を０℃に冷却し、次に、１：１ｖ／ｖのＡｃＯＨ：ピリジン緩衝液でクエンチした。溶媒を減圧下で除去した後、粗残留物をＥｔＯＡｃ及び飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で抽出した。有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。粗物質をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０〜５％ＭｅＯＨ、２％トリエチルアミン）で精製して、化合物１４を白色の泡状物として得た（２５０ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ、２５％；Ｒｆ＝０．２８、ＤＣＭ中５％ＭｅＯＨで展開）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １１．２２（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ），７．６５（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．３７−７．３０（ｍ，２Ｈ），７．２９−７．１４（ｍ，８Ｈ），６．９０−６．７７（ｍ，４Ｈ），５．６５（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ），５．５３（ｄｄ，Ｊ＝８．０，２．２Ｈｚ，１Ｈ），５．１０（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１Ｈ），４．６４（ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，１Ｈ），３．７３（ｓ，７Ｈ），３．６３−３．４３（ｍ，３Ｈ），３．３０−３．１４（ｍ，２Ｈ），３．０４−２．９５（ｍ，１Ｈ），１．２３（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），０．７７（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １６３．３０，１５７．９７，１５１．０６，１４５．８１，１４１．３０，１３６．４５，１３６．３６，１２９．９１，１２９．８６，１２７．９０，１２７．５５，１２６．４８，１１２．９８，１１２．９６，１０１．４８，８５．７９，８４．２５，８３．０７，６９．００，６１．６５，６１．０３，５４．９８，１５．８０，１．１２．
【０４５５】
化合物１５の合成：−７８℃に冷却した、無水ＤＣＭ（２１５ｍＬ）及びピリジン（１．５ｍＬ）中の化合物１４（４．６３ｇ、７．７５ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化ベンゾイル（１．０ｍＬ、８．５３ｍｍｏｌ）を滴下した。−７８℃で１時間撹拌した後、反応混合物を０℃とし、ＥｔＯＨ（５ｍＬ）でクエンチした。混合物をＤＣＭ及び飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で抽出した。有機層をブラインで洗浄し、分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中０〜７５％ＥｔＯＡＣ）で精製して、化合物１５を白色の泡状物として得た（２．３０ｇ、３．４５ｍｍｏｌ、４５％；Ｒｆ＝０．５４、ヘキサン中５０％ＥｔＯＡｃで発展）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １１．３２（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．８８（ｄｄ，Ｊ＝８．４，１．４Ｈｚ，２Ｈ），７．７９（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．７０−７．６３（ｍ，１Ｈ），７．５３（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），７．３７−７．３１（ｍ，２Ｈ），７．２９−７．１５（ｍ，７Ｈ），６．８７−６．７８（ｍ，４Ｈ），６．０３（ｄｄ，Ｊ＝６．７，５．０Ｈｚ，１Ｈ），５．５３（ｄｄ，Ｊ＝８．０，２．１Ｈｚ，１Ｈ），４．７３（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），４．５５（ｄｄ，Ｊ＝１１．４，５．０Ｈｚ，１Ｈ），４．４０（ｄｄ，Ｊ＝１１．４，６．８Ｈｚ，１Ｈ），３．７３（ｓ，６Ｈ），３．５７（ｑｄ，Ｊ＝６．４，１．８Ｈｚ，１Ｈ），３．３５−３．２５（ｍ，２Ｈ），３．２０（ｄｔ，Ｊ＝１１．４，５．０Ｈｚ，１Ｈ），２．９７−２．９１（ｍ，１Ｈ），０．８５（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １６４．９６，１６３．０８，１５８．０２，１５０．８６，１４５．７５，１４０．７３，１３６．３７，１３６．２４，１３３．６０，１２９．９２，１２９．８５，１２９．１０，１２９．０５，１２８．８３，１２７．８８，１２７．５９，１２６．５４，１１３．０４，１１３．００，１０２．０８，８５．９２，８３．０５，８１．２５，６８．９２，６３．６３，６１．１３，５５．００，３９．９９，１５．７４．
【０４５６】
化合物１６の合成：ＤＣＭ（３０ｍｌ）及びＤＩＰＥＡ（２．３０ｍＬ、１８．９ｍｍｏｌ）中の化合物１５（２．３０ｇ、３．４５ｍｍｏｌ）の溶液に、２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイト（２．４１ｍｌ、７．５７ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。混合物を０℃で２時間撹拌した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）で希釈し、次に、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗物質をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中０〜３３％酢酸エチル）で精製して、ホスホラミダイト１６（２．３１ｇ、２．６６ｍｍｏｌ、７７％、Ｒｆ＝０．４１；ヘキサン中５０％酢酸エチルで展開）を得た。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２  ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ  １４８．７８，１４８．７４．
【０４５７】
化合物１７の合成：ＣＨ２Ｃｌ２中での無水コハク酸及びＤＭＡＰを使用した化合物１５の標準的なコハク化と、それに続くＤＭＦ中でのＨＢＴＵ及びＤＩＰＥＡを使用したＣＰＧローディングにより、化合物１７が得られる。
【０４５８】
４’−Ｃ−（β）−メトキシ−Ｕ−ＵＮＡ構成要素の合成
【化５７】
2021523720.tif 000059
化合物２１及び２２の合成：ｍＣＰＢＡ（１９．９ｇ、１１６ｍｍｏｌ）を、メタノール（２７５ｍｌ）中の化合物１（２５．０ｇ、５５．９ｍｍｏｌ）の冷却溶液に添加し、混合物を室温で一晩撹拌した。１０％Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液及び飽和ＮａＨＣＯ３水溶液のそれぞれ約１００ｍｌを溶液に添加し、１５分間撹拌した。次に、反応混合物をＤＣＭで抽出した（１５０ｍｌで３回）。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗物質をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中１．７％ＭｅＯＨ）で精製して、化合物２２（８．８ｇ、１７．５ｍｍｏｌ、３１％、Ｒｆ＝０．４２；ＤＣＭ中５％ＭｅＯＨで展開）及び２１（１．０ｇ、１．９ｍｍｏｌ、３．６％、Ｒｆ＝０．４８；ＤＣＭ中５％ＭｅＯＨで展開）を得た。化合物２２：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １１．４４（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．４２（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．０１（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），５．８１（ｄｄ，Ｊ＝８．１，２．０Ｈｚ，１Ｈ），４．７４（ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，１Ｈ），４．５６（ｄｄ，Ｊ＝７．４，３．７Ｈｚ，１Ｈ），４．００（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，１Ｈ），３．５５（ｔ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，２Ｈ），３．３１（ｓ，１Ｈ），３．２９（ｓ，３Ｈ），０．８６（ｄ，Ｊ＝４０．３Ｈｚ，１８Ｈ），０．１２（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，６Ｈ），−０．０１（ｓ，３Ｈ），−０．０９（ｓ  ３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １６２．６０，１５０．９８，１４０．１６，１０９．５３，１０３．４９，８６．１４，７５．１８，７４．９１，５５．４５，４８．８５，２５．８２，２５．７７，１７．９９，１７．７７，−４．３３，−４．３９，−４．９７，−５．１０．化合物２１：  １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １１．４１（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．７６（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），５．９９（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），５．７３（ｄｄ，Ｊ＝８．４，２．４Ｈｚ，１Ｈ），５．３４（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），４．３２（ｄｄ，Ｊ＝７．２，５．２Ｈｚ，１Ｈ），４．２２（ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ），３．５４−３．４１（ｍ，２Ｈ），３．３０（ｓ，３Ｈ），０．９０（ｓ，９Ｈ），０．８０（ｓ，９Ｈ），０．０７（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，６Ｈ），−０．０１（ｓ，３Ｈ），−０．１０（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １６２．６０，１５０．９８，１４０．１６，１０９．５３，１０３．４９，８６．１４，７５．１８，７４．９１，５５．４５，４８．８５，２５．８２，２５．７７，１７．９９，１７．７７，−４．３３，−４．３９，−４．９７，−５．１０．
【０４５９】
化合物２３の合成：無水ピリジン（６０ｍｌ）中の化合物２２（８．８ｇ、１７．５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＴｒＣｌ（８．８９ｇ、２６．３ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を除去した後、残留物をＤＣＭ及び飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗物質をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して、化合物２３（１４．１ｇ、１７．９ｍｍｏｌ、９９％、Ｒｆ＝０．７７；ヘキサン中５０％ＥｔＯＡＣで展開）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １１．４６（ｓ，１Ｈ），７．６１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．４６−７．３７（ｍ，２Ｈ），７．３３−７．２３（ｍ，６Ｈ），７．２２−７．１５（ｍ，１Ｈ），６．８６（ｄｄ，Ｊ＝９．０，３．１Ｈｚ，４Ｈ），６．０１（ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，１Ｈ），５．８０（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），４．４３（ｔ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，１Ｈ），４．０３（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ），３．７１（ｓ，６Ｈ），３．６５（ｄ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ，１Ｈ），３．４５（ｓ，３Ｈ），２．８８（ｄ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ，１Ｈ），０．７１（ｓ，８Ｈ），０．６３（ｓ，８Ｈ），−０．０３（ｓ，３Ｈ），−０．０４（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，６Ｈ），−０．１９（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １５８．０７，１５０．８０，１４４．８６，１４０．２９，１３５．７１，１２９．５９，１２９．５７，１２７．７７，１２７．５５，１２６．５７，１１３．２０，１１３．１２，１０８．０３，１０２．８１，８８．５１，７５．６４，７４．３６，６４．５６，５４．９７，５２．３２，２５．６３，２５．５０，１７．５１，１７．４４，−４．３３，−４．８１，−４．８６，−５．１８．
【０４６０】
化合物２４の合成：ＴＨＦ（１００ｍｌ）中の化合物２３（１２．１ｇ、１５．０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＨＦ中の１Ｍ  ＴＢＡＦ３０ｍｌ（３０ｍｍｏｌ）を添加した。反応物をアルゴン雰囲気下で一晩撹拌し、翌日、溶媒を真空下で蒸発させた。粗物質をＥｔＯＡｃ中２％ＭｅＯＨでカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物２４（８．３１ｇ、１４．４ｍｍｏｌ、９６％、Ｒｆ＝０．４８；ＤＣＭ中１０％ＭｅＯＨで展開）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １１．３５（ｓ，１Ｈ），７．４８−７．４２（ｍ，２Ｈ），７．３９（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３４−７．１７（ｍ，８Ｈ），６．８７（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，３Ｈ），５．９８（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），５．７１（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，２Ｈ），５．５２（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，１Ｈ），４．４４（ｔｄ，Ｊ＝７．２，４．２Ｈｚ，１Ｈ），４．０５（ｔ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ），３．７２（ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ，７Ｈ），３．４４（ｄ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，１Ｈ），３．３１（ｓ，３Ｈ），２．８３（ｓ，４Ｈ），２．８０（ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，１Ｈ），１．９８（ｓ，１Ｈ）．
【０４６１】
化合物２５の合成：化合物２４（７．２８ｇ、１２．６ｍｍｏｌ）をジオキサン（８５ｍｌ）及び水（１５ｍｌ）に溶解した。ＮａＩＯ４（３．２４ｇ、１５．２ｍｍｏｌ）を、室温で撹拌しながらこの溶液にゆっくりと添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌し、次に濾過し、沈殿物を１００ｍｌの追加のジオキサンを使用して洗浄した。濾液にＮａＢＨ４（０．５００ｇ、１９．０ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を再び室温で３時間撹拌した。ピリジンと酢酸の１：１混合物２０ｍｌで反応をクエンチした。溶媒を除去した後、残留物をＤＣＭ及び飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗物質をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０〜３％ＭｅＯＨ）で精製して、化合物２５（５．４０ｇ、９．３３ｍｏｌ、７４％、Ｒｆ＝０．２６；ＤＣＭ中５％ＭｅＯＨで展開）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １１．１２（ｓ，１Ｈ），７．４７（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．４２−７．１２（ｍ，９Ｈ），６．９５−６．８２（ｍ，４Ｈ），５．８４（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ），５．５０（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），５．０８（ｓ，１Ｈ），４．８５（ｔ，Ｊ＝３．９Ｈｚ，１Ｈ），３．７３（ｓ，６Ｈ），３．４４（ｄｄ，Ｊ＝７．１，３．９Ｈｚ，３Ｈ），３．２６（ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，１Ｈ），２．９０（ｓ，３Ｈ），２．８７（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １６３．４０，１５８．０４，１５０．４１，１４４．６６，１４１．８０，１３５．４６，１３５．０９，１２９．７５，１２９．７０，１２７．７８，１２７．６６，１２６．６４，１１３．１５，１１３．１１，１０２．８２，１００．９１，７５．３２，６１．９５，５９．６３，５８．８５，５４．９９，４８．１３，４５．５５，１０．２３．
【０４６２】
化合物２６の合成：−７８℃のＤＣＭ（１７５ｍｌ）及びピリジン（７ｍＬ）中の化合物２５（４．７ｇ、８．１２ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＣＭ（５０ｍＬ）中のＢｚＣｌ（１．０４ｍｌ、８．９ｍｍｏｌ）の溶液を３０分間にわたって添加した。次に、反応混合物を−７８℃で１時間撹拌し、次に、室温に戻し、その時点で、５ｍｌのエタノールを添加して反応をクエンチした。混合物を２５０ｍｌのＮａＨＣＯ３で洗浄し、１００ｍｌのＤＣＭで３回抽出した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。カラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０〜３％ＭｅＯＨ）での精製により、化合物２６（２．７３ｇ、４．０ｍｍｏｌ、４９％、Ｒｆ＝０．３０；ＤＣＭ中５％ＭｅＯＨで展開）が得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １１．２４（ｓ，１Ｈ），７．８５−７．７７（ｍ，２Ｈ），７．６８（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．６６−７．６２（ｍ，１Ｈ），７．４９（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），７．４３−７．３７（ｍ，２Ｈ），７．３３−７．１４（ｍ，７Ｈ），６．８６（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，３Ｈ），６．２２（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），５．５９（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），４．９９（ｔ，Ｊ＝４．２Ｈｚ，１Ｈ），４．３８（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ），３．７３（ｄｄ，Ｊ＝１１．５，４．１Ｈｚ，１Ｈ），３．７０（ｓ，６Ｈ），３．４７（ｄｄ，Ｊ＝１１．５，４．１Ｈｚ，１Ｈ），３．２６（ｄ，Ｊ＝９．９Ｈｚ，１Ｈ），２．９８（ｄ，Ｊ＝１０．２Ｈｚ，１Ｈ），２．９６（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １６４．８６，１６３．１３，１５８．０７，１５０．３０，１４４．５２，１４１．０８，１３５．２３，１３５．０１，１３３．６２，１２９．７２，１２９．７０，１２９．０７，１２８．８９，１２８．７９，１２７．８１，１２７．６３，１２６．６８，１１３．１６，１１３．１３，１０３．３８，１０１．７２，８５．４０，７２．７７，６３．７３，５９．６４，５９．３６，５４．９６，４８．５６．
【０４６３】
化合物２７の合成：ＤＣＭ（２０ｍｌ）中の化合物２６（２．５８ｇ、３．７７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（１．３８ｍｌ、１１．３１ｍｍｏｌ）及び２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイト（１．３２ｍｌ、４．１５ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。反応混合物を室温にし、３時間撹拌した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）で希釈し、次に、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。純粋な化合物２７（３．８９ｇ、４．４ｍｍｏｌ、定量的収率）は、粗混合物を沈殿させ、１Ｌのヘキサン中の最小限のＤＣＭに溶解して得た。ＤＣＭに溶解することにより固体を収集し、次に濃縮して、白色の泡状物にした。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ  １４８．７０，１４８．６８．
【０４６４】
化合物２８の合成：化合物２７（２．４３ｇ、３．５６ｍｍｏｌ）を８０％ＡｃＯＨ（８０ｍＬ）で処理した。溶媒を除去した後、残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（１．１ｇ、２．８９ｍｍｏｌ、８１％）により精製した。
【０４６５】
化合物２９の合成：化合物２９は、化合物２３で説明したように、ＤＭＴｒＣｌ及びピリジンを使用した標準条件を使用して合成される。
【０４６６】
化合物３０の合成：化合物３０は、化合物２７について記載されているように、ホスフィチル化の標準条件を使用して合成される。
【０４６７】
２’−メチル−Ｕ−ＵＮＡ構成要素の合成
【化５８】
2021523720.tif 000060
試薬及び条件：（ｉ）ＮａＩＯ４／Ｈ２Ｏ／ＤＣＭ、室温、４時間；（ｉｉ）ＲｕＣｌ（ｐ−シメン）［（Ｓ，Ｓ）−Ｔｓ−ＤＰＥＮ］／ＨＣＯＯＮａ／Ｈ２Ｏ／ＡｃＯＥｔ、室温、１２時間、２ステップで８０％；（ｉｉｉ）ＴＢＳＣｌ／ピリジン、室温、３時間、６４％；（ｉｖ）ＢｚＣｌ／Ｅｔ３Ｎ／ＤＣＭ、室温、４時間、９０％；（ｖ）ＮＥｔ３・ＨＦ／ＴＨＦ、室温、８時間、９６％；（ｖｉ）２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイト／ＤＩＥＡ／ＤＣＭ、１時間、８７％；（ｖｉｉ）（ａ）無水コハク酸／ＤＭＡＰ／ＣＨ２Ｃｌ２（ｂ）アミノアルキルＣＰＧ／ＨＢＴＵ／ＤＩＥＡ／ＤＭ。
【０４６８】
化合物５２の合成：ＤＣＭ（１０ｍＬ）中の化合物５１（５００ｍｇ、０．８９３ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｈ２Ｏ（１０ｍＬ）中のＮａＩＯ４（２８７ｍｇ、１．３４ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を４時間激しく撹拌し、反応の完了をＴＬＣでチェックした。有機層を分離し、真空中で蒸発させた。得られたケトアルデヒドの無色泡状物をさらに精製することなく次のステップに使用した。丸底フラスコにη６−（ｐ−シメン）−（Ｓ，Ｓ）−Ｎ−トルエンスルホニル−１，２−ジフェニルエチレンジアミン（１−）ルテニウム（ＩＩ）クロリド（１５ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ、２．５ｍｏｌ％）及びケトアルデヒド（５００ｍｇ、０．８９３ｍｍｏｌ）を入れ、系をＡｒで３回フラッシュした。水（１３ｍＬ）中のギ酸ナトリウム（２．２７ｇ、３３．３ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、続いて酢酸エチル（３ｍＬ）を添加した。得られた二相混合物を室温で２４時間激しく撹拌した。有機相を分離し、水相をさらに１０ｍＬの酢酸エチルで抽出した。合わせた有機層から、減圧下、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去した。粗残留物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物５２を無色の泡状物として得た（４０１ｍｇ、２ステップで８０％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  １１．３４（ｓ，１Ｈ），７．６０（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．３７−７．０８（ｍ，９Ｈ），６．８５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，４Ｈ），５．４８（ｄｄ，Ｊ＝１５．５，６．５Ｈｚ，２Ｈ），５．０８（ｄ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，１Ｈ），４．７２（ｓ，１Ｈ），３．７２（ｓ，７Ｈ），３．５５（ｓ，３Ｈ），３．１０（ｓ，２Ｈ），１．０３（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １６３．２１，１５７．９９，１５１．０８，１４４．８１，１４１．５７，１３５．６１，１３５．５１，１２９．６１，１２９．５７，１２７．７５，１２７．６３，１２６．５９，１１３．１２，１１３．０９，１０１．２０，８６．４６，８５．５０，７９．５４，６７．１１，６３．６４，６０．４４，５９．７５，５４．９９，３９．２３，１８．３８，１４．０９．ＨＲＭＳ；Ｃ３１Ｈ３４Ｎ２Ｏ８Ｎａについて計算した［Ｍ＋Ｎａ］＋，５８５．２２１３；実測値：５８５．２２２４．
【０４６９】
化合物５３の合成：乾燥ピリジン（１０ｍＬ）中の化合物５２（５２０ｍｇ、０．９２５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＢＳＣｌ（１５４ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（１１ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、次に、得られた混合物をＤＣＭで希釈した。反応を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液でクエンチした。有機層を分離し、ブラインで洗浄し、真空で濃縮した。粗残留物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物５３を無色の泡状物として得た（４００ｍｇ、６４％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １１．３４（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．６２（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．４５−７．０６（ｍ，９Ｈ），７．００−６．６９（ｍ，４Ｈ），５．６２−５．３１（ｍ，２Ｈ），４．９８（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１Ｈ），３．７３（ｄｄｄ，Ｊ＝４１．８，１１．１，５．２Ｈｚ，８Ｈ），３．６０−３．３８（ｍ，２Ｈ），３．０５（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，２Ｈ），１．０５（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ），０．７４（ｓ，９Ｈ），−０．０７（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，６Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １６３．２１，１５８．０１，１５１．０７，１４４．７６，１４１．６１，１３５．５９，１３５．４１，１２９．５６，１２９．５４，１２７．７１，１２７．５７，１２６．５７，１１３．０９，１１３．０６，１０１．０２，８５．９２，８５．６１，７８．３１，６６．８７，６３．３６，６１．４１，５４．９６，２５．５８，１８．５６，１７．７０，−５．６５，−５．６９．ＨＲＭＳ；Ｃ３７Ｈ４８Ｎ２Ｏ８ＳｉＮａについて計算した［Ｍ＋Ｎａ］＋，６９９．３０７８；実測値：６９９．３０６７．
【０４７０】
化合物５４の合成：乾燥ＤＣＭ（１００ｍＬ）中の化合物５３（６．６ｇ、９．７６ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｅｔ３Ｎ（１３．５ｍＬ、９７．６ｍｍｏｌ）及びＢｚＣｌ（５．６ｍＬ、４８．８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で４時間撹拌し、次に、得られた混合物をＤＣＭで希釈した。反応を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液でクエンチした。有機層を分離し、ブラインで洗浄し、真空で濃縮した。粗残留物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物５４を無色の泡状物として得た（７．８ｇ、９０％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ８．０７−７．１１（ｍ，２０Ｈ），６．９８−６．６９（ｍ，４Ｈ），６．０２（ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１Ｈ），５．６９−５．２７（ｍ，２Ｈ），３．８１−３．４２（ｍ，９Ｈ），３．１７（ｑｄ，Ｊ＝１０．７，４．４Ｈｚ，２Ｈ），１．３７（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ），０．７１（ｓ，９Ｈ），−０．１０（ｄ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ，６Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １６９．１９，１６５．０１，１６１．６１，１５８．０８，１４９．３５，１４４．６６，１４１．００，１３５．５７，１３５．５２，１３５．３０，１３３．６０，１３０．９２，１３０．２３，１２９．６２，１２９．４７，１２９．２３，１２９．１８，１２８．７３，１２７．７８，１２７．６３，１２６．７１，１１３．１４，１１３．１１，１０１．１９，８５．９１，８４．６６，７８．６５，６９．９９，６３．２３，６１．８１，５４．９６，２５．５４，１７．６７，１４．９９，−５．７６．ＨＲＭＳ；Ｃ５１Ｈ５６Ｎ２Ｏ１０ＳｉＮａについて計算した［Ｍ＋Ｎａ］＋，９０７．３６０２；実測値：９０７．３６１１．
【０４７１】
化合物５５の合成：乾燥ＴＨＦ（８３ｍＬ）中の化合物５４（７．３ｇ、８．２５ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｅｔ３Ｎ・３ＨＦ（１３．４ｍＬ、８２．５ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を室温で８時間撹拌し、次に、ＡｃＯＥｔで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液でクエンチした。有機層を分離し、ブラインで洗浄し、真空で濃縮した。粗残留物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物５５を無色の泡状物として得た（６．１ｇ、９６％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ８．０５−７．１１（ｍ，２０Ｈ），７．０４−６．６７（ｍ，４Ｈ），６．０４（ｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ，１Ｈ），５．６７−５．２５（ｍ，２Ｈ），４．８５（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），３．７２−３．７０（ｍ，７Ｈ），３．６０−３．３８（ｍ，２Ｈ），３．１８（ｑｄ，Ｊ＝１０．７，５．１Ｈｚ，２Ｈ），１．３９（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−  ｄ６）δ  １６９．１９，１６５．１０，１６１．６０，１５８．０５，１４９．２６，１４４．６４，１４１．００，１３５．５６，１３５．５０，１３５．３７，１３３．５６，１３０．９５，１３０．１９，１２９．６５，１２９．４７，１２９．２１，１２９．１７，１２８．７３，１２７．７８，１２７．７０，１２６．７２，１１３．１４，１１３．１２，１００．８４，８５．８３，８４．５４，７９．１２，７０．０６，６３．６３，６０．４８，５４．９７，１４．９４．ＨＲＭＳ；Ｃ４５Ｈ４２Ｎ２Ｏ１０Ｎａについて計算した［Ｍ＋Ｎａ］＋，７９３．２７３７；実測値：７９３．２７２４．
【０４７２】
化合物５６の合成：乾燥ＤＣＭ８ｍＬ中の化合物５５（５６８ｍｇ、０．７３７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（３８５μＬ、２．２１ｍｍｏｌ）及び２−シアノエチルクロロ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト（１８１μＬ、０．８１１ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を室温で１時間撹拌し、次に、ＤＣＭで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で反応をクエンチした。有機層を分離し、ブラインで洗浄し、真空で濃縮した。粗残留物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物５６を無色の泡状物として得た（６２３ｍｇ、８７％）。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ  ８．０９−７．８９（ｍ，４Ｈ），７．８６−７．１３（ｍ，１６Ｈ），６．９５−６．７４（ｍ，４Ｈ），６．０１（ｄｄ，Ｊ＝８．７，３．７Ｈｚ，１Ｈ），５．４５（ｄｔｔ，Ｊ＝２１．１，８．２，４．１Ｈｚ，２Ｈ），３．９０−３．６０（ｍ，１１Ｈ），３．５１（ｄｄｑ，Ｊ＝１３．５，１０．３，６．７Ｈｚ，２Ｈ），３．４４−３．１０（ｍ，２Ｈ），２．５４（ｄｔ，Ｊ＝８．８，５．９Ｈｚ，２Ｈ），１．４４（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，３Ｈ），１．３２−０．９３（ｍ，１２Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ  １６９．１２，１６５．２７，１６１．６９，１５８．３７，１４９．４４，１４４．５８，１４０．４３，１３５．１０，１３３．０９，１３１．１４，１２９．９４，１２９．６９，１２９．６７，１２９．３９，１２９．１１，１２８．３３，１２７．６９，１２７．５４，１２６．５７，１１８．１２，１１６．９６，１１２．７６，１１２．７５，１００．８２，８４．６１，６９．８６，５４．５８，４２．５８，４２．４６，２３．６７，２３．６２，２３．５５，２３．４８，１９．６８，１９．６２．３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ  １４９．６７；１４９．２９．ＨＲＭＳ；Ｃ５４Ｈ６０Ｎ４Ｏ１１Ｐについて計算した［Ｍ＋Ｈ］＋，９７１．３９９６；実測値：９７１．３９８９．
【０４７３】
化合物５７の合成：ＣＨ２Ｃｌ２中での無水コハク酸及びＤＭＡＰを使用した化合物５５の標準的なコハク化と、それに続くＤＭＦ中でのＨＢＴＵ及びＤＩＰＥＡを使用したＣＰＧローディングにより、化合物５７が得られる。
【０４７４】
２’−（Ｒ）−メチル−Ｕ−ＵＮＡ構成要素の合成
【化５９】
2021523720.tif 000061
試薬及び条件：（ｉ）ＢｚＯＨ、ＤＩＡＤ、ＰＰｈ３、ＴＨＦ、室温、３時間；ＮａＯＨ水溶液、室温、３時間、８０％；（ｉｉ）ＢｚＣｌ、Ｅｔ３Ｎ、ＤＣＭ、室温、４時間、９２％；（ｉｉｉ）ＮＥｔ３・ＨＦ、ＴＨＦ、室温、８時間、９７％；（ｉｖ）２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイト、ＤＩＥＡ、ＤＣＭ、１時間、８０％；（ｖ）（ａ）無水コハク酸／ＤＭＡＰ／ＣＨ２Ｃｌ２（ｂ）アミノアルキルＣＰＧ／ＨＢＴＵ／ＤＩＥＡ／ＤＭＦ。
【０４７５】
化合物５８の合成：乾燥ＴＨＦ１００ｍＬ中の化合物５３（２．２ｇ、３．２５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＰＰｈ３（４．２６ｇ、１６．３ｍｍｏｌ）、ＢｚＯＨ（１．９８ｇ、１６．３ｍｍｏｌ）及びＤＩＡＤ（３．１５ｍＬ、１６．３ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、反応の完了をＴＬＣでチェックした。溶媒を真空で除去した。粗残留物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、２，２’−アンヒドロ−ヌクレオシド及びＤＩＡＤ副生成物の混合物を得た。この混合物をＴＨＦ（５０ｍＬ）に溶解した。混合物の溶液に１Ｎ  ＮａＯＨ水溶液（１０ｍＬ）を滴下した。得られた混合物を３時間撹拌した。溶媒を真空で除去した。粗残留物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物５８を無色の泡状物として得た（１．８ｇ、８０％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １１．３０（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．６２（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．４３−７．０４（ｍ，９Ｈ），６．９６−６．６５（ｍ，４Ｈ），５．６０−５．４０（ｍ，２Ｈ），５．０７（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），３．９６−３．４４（ｍ，１０Ｈ），３．１１−２．７７（ｍ，２Ｈ），１．１４（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，３Ｈ），０．７５（ｓ，９Ｈ），−０．０５（ｓ，６Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １６３．２２，１５８．００，１５７．９９，１５１．７８，１４４．７５，１４１．４２，１３５．５８，１３５．３８，１２９．５１，１２９．４６，１２７．７０，１２７．５３，１２６．５６，１１３．１０，１１３．０６，１０１．７０，８６．２５，８５．４４，７７．７１，６６．１１，６３．０７，６１．５１，５４．９６，２５．５９，１９．７２，１７．７３，−５．６６，−５．６８．ＨＲＭＳ；Ｃ３７Ｈ４８Ｎ２Ｏ８ＳｉＮａについて計算した［Ｍ＋Ｎａ］＋，６９９．３０７８；実測値：６９９．３０９９．
【０４７６】
化合物５９の合成：乾燥ＤＣＭ（５０ｍＬ）中の化合物５８（３．３ｇ、４．８８ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｅｔ３Ｎ（６．８ｍＬ、４８．８ｍｍｏｌ）及びＢｚＣｌ（２．８ｍＬ、２４．４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で４時間撹拌し、次に、得られた混合物をＤＣＭで希釈した。反応を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液でクエンチした。有機層を分離し、ブラインで洗浄し、真空で濃縮した。粗残留物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物５９を無色の泡状物として得た（４．０ｇ、９２％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ８．１１−７．７６（ｍ，３Ｈ），７．７６−７．５６（ｍ，４Ｈ），７．４８（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），７．３９−７．０２（ｍ，１１Ｈ），７．０８−６．６９（ｍ，４Ｈ），６．０３（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），５．８３（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），５．４０（ｐ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ），３．７０（ｓ，９Ｈ），３．１９−２．９３（ｍ，２Ｈ），１．４１（ｄ，Ｊ＝６．Ｈｚ，３Ｈ），０．７５（ｓ，９Ｈ），−０．０６（ｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，６Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １６４．４８，１６１．５８，１５８．０７，１５８．０５，１４９．７７，１４１．６３，１３５．５０，１３５．４２，１３５．３１，１３３．７２，１３０．７７，１２９．８１，１２９．６１，１２９．５５，１２９．３４，１２９．２１，１２８．９９，１２８．８７，１２７．７７，１２７．５８，１２６．６６，１１３．１６，１１３．１２，１０２．０４，８５．７４，７８．７５，７０．３８，６２．９７，６１．９１，５４．９６，３９．９７，２５．５９，１７．７１，１６．１９，−５．６７，−５．７１．ＨＲＭＳ；Ｃ５１Ｈ５６Ｎ２Ｏ１０ＳｉＮａについて計算した［Ｍ＋Ｎａ］＋，９０７．３６０２；実測値：９０７．３６１６．
【０４７７】
化合物６０の合成：乾燥ＴＨＦ（４３ｍＬ）中の化合物６０（３．８ｇ、４．３０ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｅｔ３Ｎ・３ＨＦ（６．９８ｍＬ、４３．０ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を室温で８時間撹拌し、次に、得られた混合物をＤＣＭで希釈した。反応を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液でクエンチした。有機層を分離し、ブラインで洗浄し、真空で濃縮した。粗残留物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物６０を無色の泡状物として得た（３．２ｇ、９７％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ７．９６（ｄｄ，Ｊ＝８．２，１．４Ｈｚ，１Ｈ），７．９０（ｄｔ，Ｊ＝８．３，１．４Ｈｚ，２Ｈ），７．７４−７．６１（ｍ，４Ｈ），７．４８（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），７．４０−７．１６（ｍ，１１Ｈ），６．８６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，４Ｈ），６．０３（ｄｄ，Ｊ＝７．１，２．０Ｈｚ，１Ｈ），５．８４（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），５．４６−５．３４（ｍ，１Ｈ），４．８６（ｔｄ，Ｊ＝５．１，１．７Ｈｚ，１Ｈ），３．６６−３．６２（ｍ，７Ｈ），３．５２（ｓ，２Ｈ），３．２１−３．０１（ｍ，２Ｈ），１．４８−１．３７（ｍ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １６９．１４，１６４．５３，１６１．６０，１５８．０３，１５８．０１，１４９．７６，１４４．７４，１４１．６６，１３５．５０，１３５．４３，１３３．７０，１３０．８２，１２９．８０，１２９．６５，１２９．５７，１２９．３５，１２９．２２，１２９．０２，１２８．８７，１２７．７８，１２７．６４，１２６．６５，１１３．１５，１１３．１３，１０１．９４，８５．６２，８４．９４，７９．３８，７０．５３，６３．４４，６０．５１，５４．９６，１６．３３，１４．０７．ＨＲＭＳ；Ｃ４５Ｈ４２Ｎ２Ｏ１０Ｎａについて計算した［Ｍ＋Ｎａ］＋，７９３．２７３７；実測値：７９３．２７４２．
【０４７８】
化合物６１の合成：乾燥ＤＣＭ（７ｍＬ）中の化合物６０（５４３ｍｇ、０．７０５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（３６８μＬ、２．１２ｍｍｏｌ）及び２−シアノエチルクロロ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト（１７３μＬ、０．７７６ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を室温で１時間撹拌し、次に、得られた混合物をＤＣＭで希釈した。反応を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液でクエンチした。有機層を分離し、ブラインで洗浄し、真空で濃縮した。粗残留物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物６１を無色の泡状物として得た（５４９ｍｇ、８０％）。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ  ７．９５（ｄｄｄ，Ｊ＝８．４，２．７，１．４Ｈｚ，２Ｈ），７．８１−７．５６（ｍ，５Ｈ），７．５２−７．３５（ｍ，４Ｈ），７．３５−７．１６（ｍ，９Ｈ），６．９０−６．７７（ｍ，４Ｈ），６．０４（ｄｄ，Ｊ＝８．７，６．８Ｈｚ，１Ｈ），５．３９（ｄｔ，Ｊ＝１１．２，６．５Ｈｚ，１Ｈ），３．８６−３．６１（ｍ，１１Ｈ），３．６２−３．４０（ｍ，２Ｈ），３．３３−３．１１（ｍ，２Ｈ），２．５６（ｑ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ），１．４５（ｄｄ，Ｊ＝６．４，３．９Ｈｚ，３Ｈ），１．３０−０．９７（ｍ，１２Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ  １６６．０５，１６３．０１，１５９．７６，１５１．２９，１４６．０７，１４２．０３，１４２．００，１３６．９４，１３６．８４，１３６．３１，１３４．５９，１３２．３７，１３１．０５，１３１．０１，１３０．９７，１３０．６７，１３０．５６，１３０．４４，１２９．８２，１２９．０４，１２８．９１，１２７．９２，１１９．５２，１１８．３５，１１４．１６，１１４．１４，１０３．３２，８７．３８，８６．０３，７１．８３，７１．７８，６４．５７，５５．９８，４４．０１，４３．９０，４３．８８，２５．１１，２５．０９，２５．０２，２４．９９，２４．９６，２４．８９，２１．１０，２１．０３，１７．０８，１７．０４，２．０１，１．８０，１．６７．３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ  １４９．６１，１４９．２９．ＨＲＭＳ；Ｃ５４Ｈ６０Ｎ４Ｏ１１Ｐについて計算した［Ｍ＋Ｈ］＋，９７１．３９９６；実測値：９７１．３９６７．
【０４７９】
化合物６２の合成：ＣＨ２Ｃｌ２中での無水コハク酸及びＤＭＡＰを使用した化合物６０の標準的なコハク化と、それに続くＤＭＦ中でのＨＢＴＵ及びＤＩＰＥＡを使用したＣＰＧローディングにより、化合物６２が得られる。
【０４８０】
２’−メチル−Ｕ−ＵＮＡモッシャーエステルの合成
【化６０】
2021523720.tif 000062
試薬及び条件：（ｉ）（Ｓ）−ＭＴＰＡＣｌ／ＤＭＡＰ／Ｅｔ３Ｎ／ＭｅＣＮ、室温、５時間、５２〜７７％；（ｉｉ）（Ｒ）−ＭＴＰＡＣｌ／ＤＭＡＰ／Ｅｔ３Ｎ／ＭｅＣＮ、室温、５時間、５４〜７８％。
【０４８１】
化合物６３の合成：乾燥ＭｅＣＮ（２ｍＬ）中の化合物５３（１００ｍｇ、０．１４８ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（１．８ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）、Ｅｔ３Ｎ（１０３μＬ、０．７４０ｍｍｏｌ）の溶液に、（Ｓ）−（＋）−ＭＴＰＡＣｌ（３３．２μＬ、０．１７８ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を室温で５時間撹拌し、次に、得られた混合物をＡｃＯＥｔで希釈した。反応を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液でクエンチした。有機層を分離し、ブラインで洗浄し、真空で濃縮した。粗残留物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物６３を無色の泡状物として得た（６８ｍｇ、５２％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １１．４４（ｓ，１Ｈ），７．６０−７．０８（ｍ，１５Ｈ），６．８４（ｄｄ，Ｊ＝８．９，３．５Ｈｚ，４Ｈ），５．８６（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１Ｈ），５．４８−５．１９（ｍ，２Ｈ），３．７２（ｓ，６Ｈ），３．５１−３．３４（ｍ，５Ｈ），２．９３（ｔ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，３Ｈ），１．３１（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ），０．６９（ｓ，９Ｈ），−０．１５（ｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，６Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １６５．０３，１６２．８３，１５８．０２，１５０．９０，１４４．６５，１３９．９４，１３５．４２，１３５．２４，１３１．２０，１２９．８１，１２９．５６，１２８．４１，１２７．６８，１２７．５２，１２６．８５，１２６．５９，１１３．０６，１１３．０３，１０２．０６，８５．６３，８２．９６，７７．６７，７２．７９，６３．２２，６１．０７，５５．３５，５４．９５，３９．２３，２５．４８，１７．５９，１５．０９，−５．７８，−５．８４．ＨＲＭＳ；Ｃ４７Ｈ５５Ｆ３Ｎ２Ｏ１０ＳｉＮａについて計算した［Ｍ＋Ｎａ］＋，９１５．３４７６；実測値：９１５．３４８５．
【０４８２】
化合物６４の合成：乾燥ＭｅＣＮ（２ｍＬ）中の化合物５３（１００ｍｇ、０．１４８ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（１．８ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）、Ｅｔ３Ｎ（１０３μＬ、０．７４０ｍｍｏｌ）の溶液に、（Ｒ）−（−）−ＭＴＰＡＣｌ（３３．２μＬ、０．１７８ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を室温で５時間撹拌し、次に、得られた混合物をＡｃＯＥｔで希釈した。反応を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液でクエンチした。有機層を分離し、ブラインで洗浄し、真空で濃縮した。粗残留物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物６４を無色の泡状物として得た（７０ｍｇ、５４％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １１．４８（ｓ，１Ｈ）；７．６５（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），７．５３−７．０２（ｍ，１３Ｈ），６．９４−６．６５（ｍ，４Ｈ），５．８８（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），５．５６−５．２７（ｍ，２Ｈ），３．８７−３．４４（ｍ，９Ｈ），３．３１（ｓ，３Ｈ），３．０４（ｔ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，２Ｈ），１．２０（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ），０．６８（ｓ，９Ｈ），−０．１５（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，６Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １５８．０４，１５０．９８，１４４．６７，１３５．４５，１３５．２５，１２９．９４，１２９．５８，１２８．５３，１２７．７１，１２７．５４，１２７．１６，１２６．６１，１１３．０９，１１３．０６，１０２．３０，７７．７７，７２．９４，６３．２７，６１．２５，５５．１９，５４．９７，３９．０６，２５．５０，１７．６２，１４．７６，−５．８３，−５．８６．ＨＲＭＳ；Ｃ４７Ｈ５５Ｆ３Ｎ２Ｏ１０ＳｉＮａについて計算した［Ｍ＋Ｎａ］＋，９１５．３４７６；実測値：９１５．３４８４．
【０４８３】
化合物６５の合成：乾燥ＭｅＣＮ（２ｍＬ）中の化合物５８（１００ｍｇ、０．１４８ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（１．８ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）、Ｅｔ３Ｎ（１０３μＬ、０．７４０ｍｍｏｌ）の溶液に、（Ｓ）−（＋）−ＭＴＰＡＣｌ（３３．２μＬ、０．１７８ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を室温で５時間撹拌し、次に、得られた混合物をＡｃＯＥｔで希釈した。反応を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液でクエンチした。有機層を分離し、ブラインで洗浄し、真空で濃縮した。粗残留物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物６５を無色の泡状物として得た（１０１ｍｇ、７７％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １１．４７（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．６７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．５６−７．０４（ｍ，１４Ｈ），６．９４−６．７１（ｍ，４Ｈ），５．９８（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），５．６２−５．２３（ｍ，２Ｈ），３．７１（ｓ，６Ｈ）；３．６８−３．４４（ｍ，２Ｈ），３．３６（ｓ，３Ｈ），３．０１（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ），１．３０（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，３Ｈ），０．７４（ｓ，９Ｈ），−０．０６（ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，６Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １６４．６８，１６２．８８，１５８．０１，１５１．２５，１４４．６８，１４０．５４，１３５．４８，１３５．２９，１３１．１２，１２９．９６，１２９．５１，１２９．４５，１２８．６１，１２７．７２，１２７．４９，１２６．８６，１２６．６０，１１３．１１，１１３．０７，１０２．４７，７８．８０，７２．３０，６２．９０，６１．８０，５５．０１，５４．９６，２５．５６，１７．６８，１５．６９，−５．７１．ＨＲＭＳ；Ｃ４７Ｈ５５Ｆ３Ｎ２Ｏ１０ＳｉＮａについて計算した［Ｍ＋Ｎａ］＋，９１５．３４７６；実測値：９１５．３４６０．
【０４８４】
化合物６６の合成：乾燥ＭｅＣＮ（２ｍＬ）中の化合物５８（１００ｍｇ、０．１４８ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（１．８ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）、Ｅｔ３Ｎ（１０３μＬ、０．７４０ｍｍｏｌ）の溶液に、（Ｒ）−（−）−ＭＴＰＡＣｌ（３３．２μＬ、０．１７８ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を室温で５時間撹拌し、次に、得られた混合物をＡｃＯＥｔで希釈した。反応を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液でクエンチした。有機層を分離し、ブラインで洗浄し、真空で濃縮した。粗残留物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物６６を無色の泡状物として得た（１０２ｍｇ、７８％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １１．２８（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５６−７．０２（ｍ，１５Ｈ），６．９８−６．７１（ｍ，４Ｈ），５．８９（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），５．５４−５．２９（ｍ，２Ｈ），３．７２（ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ，６Ｈ），３．６７−３．４４（ｍ，３Ｈ），３．４０（ｓ，３Ｈ）；３．１１−２．８５（ｍ，２Ｈ），１．３９（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，３Ｈ），０．７５（ｓ，９Ｈ），−０．０６（ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，６Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １６４．５４，１６２．８３，１５８．０２，１５８．００，１５１．１０，１４４．６８，１３５．５０，１３５．３１，１３１．００，１２９．９０，１２９．４９，１２９．４３，１２８．５７，１２７．７１，１２７．４９，１２６．７１，１２６．５８，１１３．１２，１１３．０７，１０２．３９，８５．５４，７８．７０，７１．７１，６２．８２，６１．７７，５５．１７，５４．９７，３９．２５，２５．５７，１７．７０，１６．０８，−５．７０，−５．７２．ＨＲＭＳ；Ｃ４７Ｈ５５Ｆ３Ｎ２Ｏ１０ＳｉＮａについて計算した［Ｍ＋Ｎａ］＋，９１５．３４７６；実測値：９１５．３４６６．
【０４８５】
３’−（Ｓ）−メチル−Ｕ−ＵＮＡ構成要素の合成
【化６１】
2021523720.tif 000063
試薬及び条件：（ｉ）ＴＢＤＰＳＣｌ、ＤＭＡＰ、ピリジン、室温、１２時間、９２％；（ｉｉ）Ｐｂ（ＡｃＯ）４、ＤＣＭ、室温、１時間；（ｉｉｉ）ＲｕＣｌ（ｐ−シメン）［（Ｒ，Ｒ）−Ｔｓ−ＤＰＥＮ］、ＨＣＯＯＮａ、Ｈ２Ｏ／ＡｃＯＥｔ、室温、２４時間、２ステップで７６％；（ｉｖ）Ｂｚ２Ｏ、ＤＭＡＰ、ピリジン、室温、５時間、８５％；（ｖ）ＴＢＡＦ、ＴＨＦ、室温、１時間、９５％；（ｖｉ）ＤＭＴｒＣｌ、ピリジン、室温、５時間、９８％；（ｖｉｉ）２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイト、ＤＩＥＡ、ＤＣＭ、室温、１〜２時間、８１〜８６％；（ｖｉｉｉ）（ａ）無水コハク酸／ＤＭＡＰ／ＣＨ２Ｃｌ２（ｂ）アミノアルキルＣＰＧ／ＨＢＴＵ／ＤＩＥＡ／ＤＭＦ
【０４８６】
化合物７２の合成：ピリジン（３５０ｍＬ）中の化合物７１（９ｇ、３４．９ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＡＰ（４２６ｍｇ、３．４９ｍｍｏｌ）及びＴＢＤＰＳＣｌ（１３．６ｍＬ、５２．４ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた混合物を１２時間撹拌し、次に、ＤＣＭで希釈した。反応を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液でクエンチした。有機層を分離し、ブラインで洗浄し、真空で除去した。粗残留物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物７２を無色の泡状物として得た（１６ｇ、９２％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １１．２７（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．８４−７．２７（ｍ，１１Ｈ），５．８９（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），５．６２（ｓ，１Ｈ），５．４９（ｄｄ，Ｊ＝８．２，２．２Ｈｚ，１Ｈ），５．０４（ｓ，１Ｈ），４．０２−３．６０（ｍ，４Ｈ），１．１１（ｓ，３Ｈ），０．９９（ｓ，９Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １６３．２３，１５０．４３，１４１．２４，１３５．１３，１３５．０８，１３２．８６，１３２．６５，１２９．８９，１２７．９０，１２７．８５，１００．２７，９１．３５，８６．７４，８２．４０，７７．３３，６２．５７，２６．５７，１８．９１，１８．７０．ＨＲＭＳ；Ｃ２６Ｈ３３Ｎ２Ｏ６Ｓｉについて計算した［Ｍ＋Ｈ］＋，４９７．２１０８；実測値：４９７．２１０８．
【０４８７】
化合物７３の合成：ＤＣＭ（２４０ｍＬ）中の化合物７２（１２ｇ、２４．２ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｐｂ（ＡｃＯ）４（２１．５ｇ、４８．４ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を１時間激しく撹拌し、反応の完了をＴＬＣでチェックした。反応をブラインでクエンチした。得られた混合物を過剰量のＥｔ２Ｏで希釈し、次に不溶性物質を、セライトパッドを通して濾別した。有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空で蒸発させた。得られたケトアルデヒドの無色形態をさらに精製することなく次のステップに使用した。丸底フラスコにη６−（ｐ−シメン）−（Ｓ，Ｓ）−Ｎ−トルエンスルホニル−１，２−ジフェニルエチレンジアミン（１−）ルテニウム（ＩＩ）クロリド（３６０ｍｇ、０．５７６ｍｍｏｌ、２．５ｍｏｌ％）及びケトアルデヒド（１２ｇ、２４．２ｍｍｏｌ）を入れ、系をアルゴンで３回フラッシュした。水（３００ｍＬ）中のギ酸ナトリウム（５４．５ｇ、８００ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、続いて酢酸エチル（７５ｍＬ）を添加した。得られた二相混合物を室温で２４時間激しく撹拌した。有機相を分離し、水相をさらに１００ｍＬの酢酸エチルで抽出した。合わせた有機層から、減圧下、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去した。粗残留物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物７３を無色の泡状物として得た（９．２ｇ、２ステップで７６％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １１．２５（ｓ，１Ｈ），７．６６−７．３３（ｍ，１１Ｈ），７．２９−７．０６（ｍ，１Ｈ），５．８８（ｄｄ，Ｊ＝６．５，４．９Ｈｚ，１Ｈ），５．４０（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），５．１９−５．００（ｍ，１Ｈ），４．７７（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ），３．９１−３．８０（ｍ，１Ｈ）；３．７３−３．６４（ｍ，１Ｈ），３６０−３．４９（ｍ，３Ｈ）；１．０１（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ）；０．９３（ｓ，９Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １６３．１４，１５１．２８，１４０．８７，１３４．９６，１３４．９１，１３２．７３，１３２．６４，１２９．８３，１２８．８５，１２８．１５，１２７．８３，１２５．２６，１０１．５３，８４．０６，８３．２０，６５．４８，６３．１８，６１．１６，２６．５３，１８．６３，１８．０５．ＨＲＭＳ；Ｃ２６Ｈ３４Ｎ２Ｏ６ＳｉＮａについて計算した［Ｍ＋Ｎａ］＋，５２１．２０８４；実測値：５２１．２０７６．
【０４８８】
化合物７４の合成：乾燥ピリジン（７２ｍＬ）中の化合物７３（３．６ｇ、７．２３ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＡＰ（８８ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）及びＢｚ２Ｏ（１．７ｍｇ、７．５９ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で５時間撹拌し、次に、得られた混合物をＤＣＭで希釈した。反応を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液でクエンチした。有機層を分離し、ブラインで洗浄し、真空で除去した。粗残留物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物７４を無色の形態として得た（３．７ｇ、８５％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １１．３７（ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，１Ｈ），８．０３−７．８２（ｍ，２Ｈ），７．８２−７．２９（ｍ，１４Ｈ），６．３１（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），５．４３（ｄｄ，Ｊ＝８．１，１．８Ｈｚ，１Ｈ），４．８９（ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１Ｈ），４．６３（ｄｄ，Ｊ＝１１．６，５．１Ｈｚ，１Ｈ），４．４６（ｄｄ，Ｊ＝１１．５，６．２Ｈｚ，１Ｈ），３．８９（ｓ，１Ｈ），３．７７−３．４２（ｍ，３Ｈ），１．０３（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ），０．９４（ｓ，９Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １６５．００，１６２．９７，１５０．９０，１４９．５６，１４０．２９，１３５．０３，１３４．９６，１３４．９２，１３３．５７，１３２．６５，１３２．５７，１２９．８６，１２９．１４，１２９．１１，１２８．９８，１２８．７６，１２７．８５，１２７．８２，１０１．９６，８３．３７，８１．２９，６５．５２，６３．４７，６３．１１，３９．２４，２６．５３，１８．６３，１７．８５．
【０４８９】
化合物７５の合成：乾燥ＴＨＦ（５０ｍＬ）中の化合物７４（３．８ｇ、６．３１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＨＦ溶液（１２．６ｍＬ、１２．６ｍｍｏｌ）中の１Ｍ  ＴＢＡＦを添加した。反応混合物を室温で１時間撹拌し、次に、得られた混合物をＡｃＯＥｔで希釈した。反応物を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液に注いだ。有機層を分離し、ブラインで洗浄し、真空で除去した。粗残留物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物７５を無色の泡状物として得た（２．２ｇ、９５％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １１．２８（ｓ，１Ｈ），７．９８−７．８４（ｍ，２Ｈ），７．８４−７．４４（ｍ，４Ｈ），６．２５（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ），５．６１（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），４．８８−４．７０（ｍ，１Ｈ），４．５８（ｄｔ，Ｊ＝９．５，５．４Ｈｚ，２Ｈ），４．４０（ｄｄ，Ｊ＝１１．５，６．３Ｈｚ，１Ｈ），３．７６（ｄｄｄ，Ｊ＝９．０，６．５，４．４Ｈｚ，１Ｈ），３．５５−３．２１（ｍ，３Ｈ），１．０７（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １６５．０４，１６３．２６，１５１．０３，１４０．９６，１３３．５９，１２９．３３−１２８．６３（ｍ），１０１．４６，８４．３９，８１．５７，６５．８３，６３．６３，６０．７０，１７．９５．
【０４９０】
化合物７６の合成：乾燥ピリジン（８５ｍＬ）中の化合物７５（３．１ｇ、８．５２ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＴｒＣｌ（３．１７ｇ、９．３７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で５時間撹拌し、次に、ＤＣＭで希釈した。反応を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液でクエンチした。有機層を分離し、ブラインで洗浄し、真空で除去した。粗残留物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物７６を無色の泡状物として得た（５．２ｇ、９８％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １１．４１（ｓ，１Ｈ），７．９６−７．８２（ｍ，２Ｈ），７．８２−７．４３（ｍ，４Ｈ），７．４１−７．０４（ｍ，９Ｈ），７．０２−６．７３（ｍ，４Ｈ），６．３２−６．１２（ｍ，１Ｈ），５．５１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），４．８４（ｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，１Ｈ），４．６５（ｄｄ，Ｊ＝１１．６，５．２Ｈｚ，１Ｈ），４．４９（ｄｄ，Ｊ＝１１．５，６．８Ｈｚ，１Ｈ），３．７９−３．６１（ｍ，８Ｈ），３．１７−２．７４（ｍ，２Ｈ），０．９０（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １６４．９９，１６３．０４，１５７．９７，１５７．９４，１５１．０５，１４４．７０，１４０．６３，１３５．５３，１３５．４４，１３３．６０，１２９．５４，１２９．４５，１２９．１２，１２８．９９，１２８．８０，１２７．７３，１２７．６５，１２７．５７，１２６．５７，１１３．１０，１１３．０８，１０２．０８，８５．５７，８２．７７，８１．６２，６６．０４，６３．３１，６２．９１，５９．７１，５４．９６，３９．０５，１７．８７，１４．０５．
【０４９１】
化合物７７の合成：乾燥ＤＣＭ（３８ｍＬ）中の化合物７６（２．５ｇ、３．７５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（２ｍＬ、１１．３ｍｍｏｌ）及び２−シアノエチルクロロ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト（９２１μＬ、１４．１３ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を室温で１時間撹拌し、次に、ＤＣＭで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で反応をクエンチした。有機層を分離し、ブラインで洗浄し、真空で濃縮した。粗残留物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物７７を無色の泡状物として得た（２．８ｇ、８６％）。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ  ９．０３（ｓ，１Ｈ）；７．９６（ｄｄｔ，Ｊ＝８．４，３．１，１．７Ｈｚ，２Ｈ），７．７３−７．１２（ｍ，１３Ｈ），６．８３（ｄｄｄ，Ｊ＝８．９，４．１，２．１Ｈｚ，４Ｈ），６．３０（ｄｔ，Ｊ＝８．８，５．３Ｈｚ，１Ｈ），４．６１−４．３５（ｍ，２Ｈ），４．１９−３．９８（ｍ，１Ｈ），３．８２−３．４０（ｍ，１２Ｈ），３．２８−２．９９（ｍ，２Ｈ），２．６５−２．５３（ｍ，２Ｈ），１．２６−０．８９（ｍ，１５Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ  １５９．７０，１３６．９１，１３４．４９，１３１．０１，１３０．９９，１３０．９４，１３０．５４，１２９．７０，１２８．９８，１２８．８９，１２７．８７，１１８．３６，１１４．１２，１０３．１１，６４．８１，６４．１５，５５．９７，４３．９７，４３．８７，２５．０２，２４．９５，２４．８７，１．８９，１．３３，１．２２，１．０６．３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，アセトニトリル−  ｄ３）δ  １４８．９９，１４８．８０．
【０４９２】
化合物７８の合成：ＣＨ２Ｃｌ２中での無水コハク酸及びＤＭＡＰを使用した化合物７６の標準的なコハク化と、それに続くＤＭＦ中でのＨＢＴＵ及びＤＩＰＥＡを使用したＣＰＧローディングにより、化合物７８が得られる。
【０４９３】
３’−（Ｒ）−メチル−Ｕ−ＵＮＡ構成要素の合成
【化６２】
2021523720.tif 000064
試薬及び条件：（ｉ）ＢｚＯＨ、ＤＩＡＤ、ＰＰｈ３、ＴＨＦ、室温、５時間；ＮａＯＨ水溶液、室温、１２時間、７７％；（ｉｉ）Ｂｚ２Ｏ、ＤＭＡＰ、ピリジン、室温、５時間、８４％；（ｉｉｉ）２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイト、ＤＩＥＡ、ＤＣＭ、室温、１〜２時間、８１％；（ｉｖ）（ａ）無水コハク酸／ＤＭＡＰ／ＣＨ２Ｃｌ２（ｂ）アミノアルキルＣＰＧ／ＨＢＴＵ／ＤＩＥＡ／ＤＭＦ。
【０４９４】
化合物７９の合成：乾燥ＴＨＦ（５０ｍＬ）中の化合物７６（３．３７ｇ、５．０６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＰＰｈ３（２．７０ｇ、１５．２ｍｍｏｌ）、ＢｚＯＨ（１．８５ｇ、１５．２ｍｍｏｌ）及びＤＩＡＤ（２．９９ｍＬ、１５．２ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を室温で５時間撹拌し、反応の完了をＴＬＣでチェックした。溶媒を真空で除去した。粗残留物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、ジベンゾイル化ヌクレオシドを得た。この化合物をＴＨＦ（５０ｍＬ）に溶解した。混合物の溶液に１Ｎ  ＮａＯＨ水溶液（１０ｍＬ）を滴下した。得られた混合物を１２時間撹拌し、次に、溶媒を真空で除去した。粗残留物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物７９を無色の泡状物として得た（２．２ｇ、２ステップで７７％）。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １１．４８−１１．１５（ｍ，１Ｈ），７．６２（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．３９−７．０４（ｍ，８Ｈ），６．９７−６．６７（ｍ，４Ｈ），５．８１（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１Ｈ），５．４９（ｄｄ，Ｊ＝８．０，１．５Ｈｚ，１Ｈ），５．１７（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１Ｈ），４．７４（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ），３．９５−３．４０（ｍ，１０Ｈ），３．１１−２．７９（ｍ，２Ｈ），０．８６（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １６３．２１，１５７．９４，１５１．３９，１４４．７６，１４１．１６，１３５．５５，１３５．５４，１２９．５７，１２９．４８，１２７．７１，１２７．６０，１２６．５３，１１３．０８，１１３．０６，１０１．６７，８５．２９，８４．７７，８２．９９，６５．８７，６２．８６，６１．１５，５４．９７，３９．２５，３９．０８，１８．５３．
【０４９５】
化合物８０の合成：乾燥ピリジン（３６ｍＬ）中の化合物７９（２ｇ、３．５６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＡＰ（４４ｍｇ、０．３５６ｍｍｏｌ）及びＢｚ２Ｏ（８４５ｍｇ、３．７４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で５時間撹拌し、次に、得られた混合物をＤＣＭで希釈した。反応を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液でクエンチした。有機層を分離し、ブラインで洗浄し、真空で除去した。粗残留物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物８０を無色の泡状物として得た（２．０ｇ、８４％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １１．４５（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．９９−７．４１（ｍ，６Ｈ），７．４１−７．０３（ｍ，９Ｈ），６．９５−６．５８（ｍ，４Ｈ），６．２０（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），５．５４（ｄｄ，Ｊ＝８．０，２．１Ｈｚ，１Ｈ），４．８６（ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，１Ｈ），４．７０（ｄｄ，Ｊ＝１１．６，５．５Ｈｚ，１Ｈ），４．５１（ｄｄ，Ｊ＝１１．５，６．６Ｈｚ，１Ｈ），３．７１（ｓ，８Ｈ），３．１７−２．８０（ｍ，２Ｈ），０．８４（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １６５．０１，１６３．０７，１５７．９７，１５７．９４，１５１．０８，１４４．７３，１４０．７３，１３５．５１，１３５．４８，１３３．６６，１２９．５９，１２９．５０，１２９．１０，１２８．９９，１２８．８５，１２７．７４，１２７．６１，１２６．５７，１１３．０９，１０２．１８，８５．３９，８３．１５，８１．８９，６５．７３，６３．３８，６２．７３，５９．７４，５４．９８，３８．９７，１８．４８，１４．０７．
【０４９６】
化合物８１の合成：乾燥ＤＣＭ（３０ｍＬ）中の化合物８０（２．００ｇ、３．００ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（１．５７ｍＬ、９．００ｍｍｏｌ）及び２−シアノエチルクロロ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト（７３７μＬ、３．３０ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を室温で２時間撹拌し、次に、ＤＣＭで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で反応をクエンチした。有機層を分離し、ブラインで洗浄し、真空で濃縮した。粗残留物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物８１を無色の泡状物として得た（２．１ｇ、８１％）。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ  ７．９５（ｄｄｄ，Ｊ＝８．４，２．７，１．４Ｈｚ，２Ｈ），７．８１−７．５６（ｍ，５Ｈ），７．５２−７．３５（ｍ，４Ｈ），７．３５−７．１６（ｍ，９Ｈ），６．９０−６．７７（ｍ，４Ｈ），６．０４（ｄｄ，Ｊ＝８．７，６．８Ｈｚ，１Ｈ），５．３９（ｄｔ，Ｊ＝１１．２，６．５Ｈｚ，１Ｈ），３．８６−３．６１（ｍ，１１Ｈ），３．６２−３．４０（ｍ，２Ｈ），３．３３−３．１１（ｍ，２Ｈ），２．５６（ｑ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ），１．４５（ｄｄ，Ｊ＝６．４，３．９Ｈｚ，３Ｈ），１．３０−０．９７（ｍ，１２Ｈ）．１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ  ９．０９（ｓ，１Ｈ），７．９７（ｄｔ，Ｊ＝８．５，１．６Ｈｚ，２Ｈ），７．７３−７．１１（ｍ，１７Ｈ），６．９６−６．７５（ｍ，５Ｈ），６．２３（ｔｄ，Ｊ＝５．５，３．３Ｈｚ，１Ｈ），５．５０（ｄｄ，Ｊ＝８．１，６．７Ｈｚ，１Ｈ），４．６７−４．３８（ｍ，３Ｈ），４．２８−３．９９（ｍ，２Ｈ），３．８６−３．４０（ｍ，１５Ｈ），３．２５（ｄｄｄ，Ｊ＝１２．７，１０．５，２．５Ｈｚ，１Ｈ），３．１８−３．０２（ｍ，１Ｈ），１．２９−０．９２（ｍ，２３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ  １６６．５３，１６３．８２，１５９．６７，１５９．６７，１５１．９８，１４６．０１，１４１．４２，１３６．９２，１３４．５５，１３１．０４，１３１．０４，１３０．９８，１３０．４８，１３０．４８，１２９．７５，１２９．７５，１２８．８６，１２８．８６，１２７．８３，１１８．３７，１１４．０７，１１４．０７，１０３．３２，８７．２４，８３．１３，８２．９１，７０．４４，７０．２８，６４．８１，６４．００，６１．０３，５９．３５，５５．９５，５５．９５，４６．０１，４４．０７，２４．９４，２３．１５，２１．０１，２０．９４，１７．８１，１４．５８，２．０１，１．８１，１．６０，１．３９，１．１９，０．９８，０．７７．３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ  １４９．１２，１４８．４２．
【０４９７】
化合物８２の合成：ＣＨ２Ｃｌ２中での無水コハク酸及びＤＭＡＰを使用した化合物８０の標準的なコハク化と、それに続くＤＭＦ中でのＨＢＴＵ及びＤＩＰＥＡを使用したＣＰＧローディングにより、化合物８２が得られる。
【０４９８】
３’−メチル−Ｕ−ＵＮＡモッシャーエステルの合成
【化６３】
2021523720.tif 000065
試薬及び条件：（ｉ）（Ｓ）−ＭＴＰＡＣｌ、ＤＭＡＰ、Ｅｔ３Ｎ、ＭｅＣＮ、室温、３時間、７６〜８１％；（ｉｉ）（Ｒ）−ＭＴＰＡＣｌ、ＤＭＡＰ、Ｅｔ３Ｎ、ＭｅＣＮ、室温、３〜５時間、６７〜７０％。
【０４９９】
化合物８３の合成：乾燥ＭｅＣＮ（３ｍＬ）中の化合物７６（１５０ｍｇ、０．２２５ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（３ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）、Ｅｔ３Ｎ（１５７μＬ、１．１３ｍｍｏｌ）の溶液に、（Ｓ）−（＋）−ＭＴＰＡＣｌ（５０．５μＬ、０．２７ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、次に、ＡｃＯＥｔで希釈した。反応を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液でクエンチした。有機層を分離し、ブラインで洗浄し、真空で除去した。粗残留物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物８３を無色の泡状物として得た（１６１ｍｇ、８１％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １１．４７（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．９９−７．７４（ｍ，２Ｈ），７．７４−７．５８（ｍ，２Ｈ），７．５８−７．００（ｍ，１６Ｈ），７．００−６．６３（ｍ，４Ｈ），６．０５（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ），５．６２−５．３４（ｍ，２Ｈ），３．７２（ｓ，７Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ），２．９７（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），１．１３（ｄｄ，Ｊ＝１５．８，６．９Ｈｚ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １６４．９３，１６４．８６，１６２．９３，１５８．０４，１５１．０１，１４４．４２，１４０．４３，１３５．２７，１３５．１１，１３３．６４，１３１．３５，１２９．６９，１２９．４３，１２９．３８，１２９．１２，１２８．８２，１２８．７６，１２８．５３，１２８．４１，１２７．７７，１２７．４６，１２６．９３，１２６．６７，１２４．２２，１１３．１４，１１３．１１，１０２．２７，８５．９６，８３．８１，８１．１７，７９．９１，７２．５２，６３．０５，６１．９４，５５．１５，５４．９７，１４．７２．
【０５００】
化合物８４の合成：乾燥ＭｅＣＮ（３ｍＬ）中の化合物７６（１５０ｍｇ、０．２２５ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（３ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）、Ｅｔ３Ｎ（１５７μＬ、１．１３ｍｍｏｌ）の溶液に、（Ｒ）−（−）−ＭＴＰＡＣｌ（５０．５μＬ、０．２７ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、次に、ＡｃＯＥｔで希釈した。反応を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液でクエンチした。有機層を分離し、ブラインで洗浄し、真空で除去した。粗残留物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物８４を無色の泡状物として得た（１３９ｍｇ、７０％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １１．４９（ｓ，１Ｈ），７．９４−６．９８（ｍ，２０Ｈ），６．９６−６．６１（ｍ，４Ｈ），６．１６（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ），５．５５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），５．３８（ｑｄ，Ｊ＝６．４，２．１Ｈｚ，１Ｈ），４．４０（ｄｄｄ，Ｊ＝４０．１，１１．５，５．７Ｈｚ，２Ｈ），３．８７（ｄｄｄ，Ｊ＝６．８，３．８，１．９Ｈｚ，１Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ），３．１９−２．８５（ｍ，２Ｈ），１．０３（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １６４．９１，１６４．８３，１６２．９８，１５８．０４，１５８．０２，１５１．０７，１４４．３９，１４０．５３，１３５．２３，１３５．１３，１３３．６０，１３１．４６，１２９．７２，１２９．４７，１２９．４１，１２９．０６，１２８．７９，１２８．７５，１２８．４５，１２７．７６，１２７．５１，１２６．７９，１２６．６７，１１３．１３，１１３．１１，１０２．３５，８５．９６，８１．１２，７９．６５，７２．７８，６３．１５，６１．９５，５５．２７，５４．９６，１４．３７．
【０５０１】
化合物８５の合成：乾燥ＭｅＣＮ（３ｍＬ）中の化合物７９（１００ｍｇ、０．１５０ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（２ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）、Ｅｔ３Ｎ（１０４μＬ、０．７５０ｍｍｏｌ）の溶液に、（Ｓ）−（＋）−ＭＴＰＡＣｌ（３３．６μＬ、０．１８０ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を室温で５時間撹拌し、次に、ＡｃＯＥｔで希釈した。反応を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液でクエンチした。有機層を分離し、ブラインで洗浄し、真空で除去した。粗残留物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物８５を無色の泡状物として得た（１０１ｍｇ、７６％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １１．４６（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），８．０３−７．７４（ｍ，２Ｈ），７．８０−７．０２（ｍ，１８Ｈ），６．８２（ｄｄ，Ｊ＝８．９，２．７Ｈｚ，４Ｈ），６．１６（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１Ｈ），５．４７（ｄｄｄ，Ｊ＝５４．４，７．４，３．０Ｈｚ，２Ｈ），４．５３（ｄｄｄ，Ｊ＝４８．６，１１．６，５．９Ｈｚ，２Ｈ），４．０９−３．９５（ｍ，２Ｈ），３．７１（ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ，６Ｈ），３．２２（ｓ，３Ｈ），３．０２（ｄｄｄ，Ｊ＝３５．９，１０．３，５．６Ｈｚ，２Ｈ），１．１５−１．０６（ｍ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １６５．１０，１６４．９２，１６２．８８，１５８．０７，１５０．８６，１４４．３２，１４０．２６，１３５．１１，１３５．０４，１３３．６６，１３１．０８，１２９．８５，１２９．４４，１２９．３９，１２９．０８，１２８．８４，１２８．８０，１２８．５４，１２７．７８，１２７．４６，１２７．０２，１２６．７１，１１３．１４，１１３．１１，１０２．３７，８５．８１，８２．１５，７９．５１，７２．０５，６３．２９，６２．０３，５９．７２，５５．０５，５４．９７，３９．２４，２０．７１，１４．５４，１４．０４．
【０５０２】
化合物８６の合成：乾燥ＭｅＣＮ（３ｍＬ）中の化合物７９（１００ｍｇ、０．１５０ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（２ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）、Ｅｔ３Ｎ（１０４μＬ、０．７５０ｍｍｏｌ）の溶液に、（Ｒ）−（−）−ＭＴＰＡＣｌ（３３．６μＬ、０．１８０ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、次に、ＡｃＯＥｔで希釈した。反応を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液でクエンチした。有機層を分離し、ブラインで洗浄し、真空で除去した。粗残留物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物８６を無色の泡状物として得た（８９ｍｇ、６７％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １１．４５（ｓ，１Ｈ），７．９６−７．８０（ｍ，２Ｈ），７．７２−６．９６（ｍ，１８Ｈ），６．９２−６．６９（ｍ，４Ｈ），６．１１（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１Ｈ），５．６７−５．２１（ｍ，２Ｈ），４．５５−４．３１（ｍ，２Ｈ），３．９７−３．８５（ｍ，１Ｈ），３．７１（ｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，６Ｈ），３．２９（ｓ，３Ｈ），２．９２（ｄｄｄ，Ｊ＝５０．１，１０．２，５．５Ｈｚ，２Ｈ），１．２４（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １６５．０５，１６４．８９，１６２．８５，１５８．０４，１５０．８３，１４４．３５，１４０．１２，１３５．１０，１３５．０６，１３３．６９，１３１．１４，１２９．８４，１２９．４５，１２９．３６，１２９．０９，１２８．８７，１２８．８２，１２８．５２，１２７．７４，１２７．４３，１２６．９４，１２６．８０，１２６．６７，１２４．１４，１２１．８５，１１３．０９，１１３．０６，１０２．３７，８５．７０，８１．９０，７９．４５，７２．３４，６３．１７，６２．１０，５９．７２，５５．１１，５４．９７，３９．２４，２０．７２，１４．８８，１４．０４．
【０５０３】
ｉｓｏＣ−ＧＮＡ構成要素の合成
【化６４】
2021523720.tif 000066
化合物１０２の合成：無水ＤＭＦ（３４ｍＬ）中の化合物１００（１．９０ｇ、５．８５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＮａＨ（鉱油中６０％；１３７ｍｇ、３．４２ｍｍｏｌ、０．２ｅｑ）を添加した。反応混合物を室温で１時間撹拌し、次に化合物１０１（５．８５ｇ、１５．５ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。混合物を１１０℃で１８時間加熱した。溶媒を減圧下で除去した後、残留物をＥｔＯＡｃ及びＨ２Ｏで抽出した。有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗物質をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中０〜１０％ＭｅＯＨ）で精製して、化合物１０２を微黄色の泡状物として得た（３．２７ｇ、６．７１ｍｍｏｌ、４３％、Ｒｆ＝０．４４；ＣＨ２Ｃｌ２中８％ＭｅＯＨで展開）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ７．４４（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），７．３６−７．１１（ｍ，８Ｈ），６．９７−６．８３（ｍ，４Ｈ），６．７３（ｓ，２Ｈ），５．４７（ｄｔ，Ｊ＝１４．４，７．３Ｈｚ，２Ｈ），３．９３（ｂｒｓ，１Ｈ），３．８５（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，１Ｈ），３．７４（ｓ，６Ｈ），３．７０−３．５８（ｍ，１Ｈ），２．９６（ｄｄｄ，Ｊ＝２８．５，９．４，５．０Ｈｚ，２Ｈ）．
【０５０４】
化合物１０３の合成：ＭｅＯＨ（４０ｍＬ）中の化合物１０２（３．２５ｇ、６．６７ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドジメチルアセタール（１．７７ｍＬ、１３．３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。減圧下で溶媒を除去した後、残留物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中０〜８％ＭｅＯＨ）で精製して、化合物１０３を微黄色の泡状物として得た（３．４７ｇ、６．３９ｍｍｏｌ、９６％、Ｒｆ＝０．４１；ＣＨ２Ｃｌ２中８％ＭｅＯＨで展開）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ８．５９（ｓ，１Ｈ），７．４０（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），７．３７−７．１９（ｍ，８Ｈ），６．９４−６．８２（ｍ，４Ｈ），５．５９（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），５．１７（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１Ｈ），４．４３（ｄｄ，Ｊ＝１３．４，３．５Ｈｚ，１Ｈ），３．９７（ｓ，１Ｈ），３．７４（ｓ，６Ｈ），３．５１（ｄｄ，Ｊ＝１３．４，８．６Ｈｚ，１Ｈ），３．１７（ｓ，３Ｈ），３．００−２．９６（ｍ，４Ｈ），２．９２−２．８２（ｍ，１Ｈ）．
【０５０５】
化合物１０４の合成：ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．２９ｍＬ、７．３８ｍｍｏｌ）中の化合物１０３（２．００ｇ、３．６９ｍｍｏｌ）の溶液に、２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイト（１．３２ｍＬ、５．９０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物をアルゴン雰囲気下、室温で一晩撹拌した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）で希釈し、次に、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗物質をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中３３〜１００％ＥｔＯＡｃ、次にＣＨ２Ｃｌ２：アセトン：Ｅｔ３Ｎ＝５０：５０：１）で精製して、化合物１０４（８８０ｍｇ、１．１８ｍｍｏｌ、３２％、Ｒｆ＝０．４１、ＣＨ２Ｃｌ２中８％ＭｅＯＨで展開）を微黄色の泡状物として得た。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）：δ  １５０．２８，１４９．９９．
【０５０６】
化合物１０５の合成：化合物１０３（２５０ｍｇ、０．４６１ｍｍｏｌ）を８０％ＡｃＯＨ（１０ｍＬ）で一晩処理した。溶媒を除去した後、粗生成物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中０〜２０％ＭｅＯＨ）で精製して、化合物１０５を得た（８３ｍｇ、０．３４５ｍｍｏｌ、７５％、Ｒｆ＝０．２６；ＣＨ２Ｃｌ２中１５％ＭｅＯＨで展開）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ８．５８（ｓ，１Ｈ），７．４１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），５．６４（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），４．９６（ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），４．７２（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），４．３１（ｄｄ，Ｊ＝１３．４，３．４Ｈｚ，１Ｈ），３．７４（ｄｄｄ，Ｊ＝９．０，５．８，３．４Ｈｚ，１Ｈ），３．４９（ｄｄ，Ｊ＝１３．４，８．４Ｈｚ，１Ｈ），３．４２−３．２４（ｍ，１Ｈ），３．１７（ｓ，３Ｈ），３．０３（ｓ，３Ｈ）．
【０５０７】
化合物１０６の合成：ＣＨ２Ｃｌ２中での無水コハク酸及びＤＭＡＰを使用した化合物１０３の標準的なコハク化と、それに続くＤＭＦ中でのＨＢＴＵ及びＤＩＰＥＡを使用したＣＰＧローディングにより、化合物１０６が得られる。
【０５０８】
ｉｓｏＧ−ＧＮＡ構成要素の合成
【化６５】
2021523720.tif 000067
化合物１０７の合成：無水ＤＭＦ（１２５ｍＬ）中の２，６−ジアミノプリン（９．３８ｇ、６２．５ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ＮａＨ（鉱油中６０％；５００ｍｇ、１２．５ｍｍｏｌ、０．２ｅｑ．）を添加した。反応混合物を室温で１時間撹拌し、次にＤＭＦ（１００ｍＬ）中の化合物１０１（２２．４ｇ、５９．５ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。混合物を１１０℃で２１時間加熱した。減圧下で溶媒を除去した後、粗物質をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中０〜１０％ＭｅＯＨ）で精製して、化合物１０７を微黄色の泡状物として得た（１９．３ｇ、３６．６ｍｍｏｌ、６１％、Ｒｆ＝０．３３；ＣＨ２Ｃｌ２中８％ＭｅＯＨで展開）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ７．５７（ｓ，１Ｈ），７．４６−７．３６（ｍ，２Ｈ），７．３６−７．１２（ｍ，８Ｈ），６．８７（ｄｄ，Ｊ＝８．９，３．３Ｈｚ，４Ｈ），６．６１（ｓ，２Ｈ），５．７１（ｓ，２Ｈ），５．４３（ｄ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，１Ｈ），４．１６−３．８８（ｍ，３Ｈ），３．７４（ｓ，６Ｈ），２．９６−２．８６（ｍ，２Ｈ）．
【０５０９】
化合物１０８の合成：化合物１０７（１９．０ｇ、３６．１ｍｍｏｌ）を８０％ＡｃＯＨ（５００ｍＬ）で一晩処理した。溶媒を除去した後、残留物をトルエン（２００ｍＬ）及びＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）に溶解した。白色の沈殿物が形成され、濾過された。固体をＣＨ２Ｃｌ２で洗浄して、化合物１０８をオフホワイトの粉末として得た（８．６８ｇ、３０．５ｍｍｏｌ、酢酸塩として８４％、Ｒｆ＝０．１８；ＣＨ２Ｃｌ２中２０％ＭｅＯＨで展開）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ７．６１（ｓ，１Ｈ），６．６５（ｓ，２Ｈ），５．７９（ｓ，２Ｈ），４．０９（ｄｄ，Ｊ＝１３．８，３．６Ｈｚ，１Ｈ），３．９４−３．６６（ｍ，２Ｈ），３．５１−３．０６（ｍ，２Ｈ），１．９１（ｓ，３Ｈ）．
【０５１０】
化合物１０９の合成：Ｈ２Ｏ（２５０ｍＬ）中の化合物１０８（７．８８ｇ、２７．７ｍｍｏｌ）の懸濁液に、５０℃でＨ２Ｏ（４７ｍＬ）中のＮａＮＯ２（７．４１ｇ、１０７．４ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。次に、ＡｃＯＨ（１１．１ｍＬ、１９３．９ｍｍｏｌ）を滴下した。混合物を５０℃で１０分間加熱し、次に室温に冷却し、Ｈ２Ｏ（２５０ｍＬ）で希釈した。濃ＮＨ４ＯＨを溶液に添加して、ｐＨ８に調整した。溶液を蒸発させ、残留物をＨ２Ｏ（２５０ｍＬ）に再懸濁した。得られた沈殿物を濾過し、ケースを真空で乾燥させた。材料をフラスコに移し、次にトルエンと共蒸発させ、次に真空中で一晩乾燥させて、化合物１０９を淡紫色の固体として得た（７．６１ｇ、９６％）。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ７．６２（ｓ，１Ｈ），４．０２（ｄｄ，Ｊ＝１３．９，３．６Ｈｚ，１Ｈ），３．８１（ｄｄ，Ｊ＝１４．０，７．１Ｈｚ，１Ｈ），３．７７−３．６８（ｍ，１Ｈ），３．３４（ｄｄ，Ｊ＝１１．２，５．１Ｈｚ，１Ｈ），３．２１（ｄｄ，Ｊ＝１１．２，６．４Ｈｚ，１Ｈ），１．８３（ｓ，３Ｈ）．
【０５１１】
化合物１１０の合成：ＭｅＯＨ（５４ｍＬ）中の化合物１０９（３．０３ｇ、１３．５ｍｍｏｌ）の懸濁液に、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドジメチルアセタール（３．５７ｍＬ、２６．９ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１５時間撹拌した。追加のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドジメチルアセタール（１．８ｍＬ）及びＭｅＯＨ（２０ｍＬ）を添加し、５５℃で３時間加熱した。混合物を蒸発させ、残留物を真空中で乾燥させて、化合物１１０を灰色の粉末として得た（３．６８ｇ、１３．１ｍｍｏｌ、９７％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １０．９７（ｓ，１Ｈ），９．２０（ｓ，１Ｈ），７．７７（ｓ，１Ｈ），５．１４（ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，１Ｈ），４．９５（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１Ｈ），４．１６−３．９４（ｍ，１Ｈ），３．９２−３．６６（ｍ，２Ｈ），３．３９−３．２０（ｍ，２Ｈ），３．２０（ｓ，３Ｈ），３．１０（ｓ，３Ｈ）．
【０５１２】
化合物１１１の合成：無水ピリジン（１８０ｍＬ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２．９７ｍＬ、１７．０ｍｍｏｌ）中の化合物１１０（３．６６ｇ、１３．１ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ジフェニルカルバモイルクロリド（３．０４ｇ、１３．１ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で２時間撹拌し、次に、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５０ｍＬ）でクエンチした。混合物をＣＨ２Ｃｌ２（３００ｍＬ）で抽出し、有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗物質をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中０〜８％ＭｅＯＨ）で精製して、１１１（２．８２ｇ、５．９３ｍｍｏｌ、４５％、Ｒｆ＝０．２４、ＣＨ２Ｃｌ２中８％ＭｅＯＨで展開）を褐色の泡状物として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ８．９３（ｓ，１Ｈ），８．１４（ｓ，１Ｈ），７．４４−７．２８（ｍ，１０Ｈ），５．０９（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），４．８２（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），４．２８（ｄｄ，Ｊ＝１３．９，３．５Ｈｚ，１Ｈ），３．９９（ｄｄ，Ｊ＝１３．９，８．５Ｈｚ，１Ｈ），３．８４−３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４４−３．３３（ｍ，２Ｈ），３．２１（ｓ，３Ｈ），３．１３（ｓ，３Ｈ）．
【０５１３】
化合物１１２の合成：ピリジン（４ｍＬ）中の化合物１１１（３８５ｍｇ、０．８１０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＴｒＣｌ（２７４ｍｇ、０．８１０ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を一晩撹拌した。溶媒を除去した後、残留物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中０〜８％ＭｅＯＨ）で精製して、化合物１１２を淡黄色の泡状物として得た（３９２ｍｇ、０．５０４ｍｍｏｌ、６２％、Ｒｆ＝０．３４、ＣＨ２Ｃｌ２中５％ＭｅＯＨ中で展開）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ８．９１（ｓ，１Ｈ），８．０９（ｓ，１Ｈ），７．４７−７．１１（ｍ，２１Ｈ），６．８３（ｄｄ，Ｊ＝９．０，３．２Ｈｚ，４Ｈ），５．３３（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），４．３２（ｄｄ，Ｊ＝１３．６，３．６Ｈｚ，１Ｈ），４．１７−３．９５（ｍ，２Ｈ），３．７０（ｓ，６Ｈ），３．２２（ｓ，３Ｈ），３．１３（ｓ，３Ｈ），３．００（ｄｄ，Ｊ＝９．３，５．０Ｈｚ，１Ｈ），２．８６（ｄｄ，Ｊ＝９．４，６．０Ｈｚ，１Ｈ）．
【０５１４】
化合物１１３の合成：ＣＨ２Ｃｌ２中の２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピル−クロロホスホラミダイト及びＤＩＰＥＡを使用した化合物１１２の標準的なホスフィチル化により、化合物１１３が８０％の収率で得られる。３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２  ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ  １５０．６５，１４９．９８。
【０５１５】
化合物１１４の合成：ＣＨ２Ｃｌ２中での無水コハク酸及びＤＭＡＰを使用した化合物１１２の標準的なコハク化と、それに続くＤＭＦ中でのＨＢＴＵ及びＤＩＰＥＡを使用したＣＰＧローディングにより、化合物１１４が得られる。１１４のローディング：７９μｍｏｌ／ｇ。
【０５１６】
３’−Ｃ−（Ｒ）−メチル−４’−（Ｓ）−Ｕ−ＵＮＡ構成要素の合成
【化６６】
2021523720.tif 000068
化合物２０２の合成：無水トルエン（４５ｍＬ）中の化合物２０１（２．００ｇ、６．４４ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ＰＰｈ３（２．０３ｇ、７．７３ｍｍｏｌ）及びＤＩＡＤ（１．５０ｍＬ、７．７３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１１０℃で２２時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去した後、残留物をＥｔＯＡｃ及び飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で抽出した。有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗物質を精製したシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中０〜３３％ＥｔＯＡｃ）で化合物２０２（１．８３ｇ、６．２６ｍｍｏｌ、９７％、Ｒｆ＝０．３３；ヘキサン中２０％ＥｔＯＡｃで展開）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ７．４４−７．２４（ｍ，５Ｈ），５．７５（ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，１Ｈ），４．７６（ｔ，Ｊ＝４．１Ｈｚ，１Ｈ），４．６３（ｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，１Ｈ），４．５０（ｄ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ，１Ｈ），３．９７（ｄｄ，Ｊ＝８．９，３．４Ｈｚ，１Ｈ），３．６７（ｄｄ，Ｊ＝８．９，４．４Ｈｚ，１Ｈ），３．１８−３．１２（ｍ，１Ｈ），２．７４（ｄｄ，Ｊ＝５．３，４．３Ｈｚ，１Ｈ），２．６１（ｄｄ，Ｊ＝５．３，２．７Ｈｚ，１Ｈ），１．４５（ｓ，３Ｈ），１．２９（ｓ，３Ｈ）  １３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  １３７．６７，１２８．２６，１２７．７５，１２７．６７，１１１．９０，１０３．６６，７７．６３，７７．０８，７６．７９，７０．８３，５０．２３，４３．４７，２６．６４，２６．５２．
【０５１７】
化合物２０３の合成：ＴＨＦ（４０ｍＬ）中の化合物２０２（１．８２ｇ、６．２３ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＨＦ中の２Ｍ  ＬｉＡｌＨ４（２．５０ｍＬ、４．９８ｍｍｏｌ）を１０℃で添加した。反応混合物を−１０℃で３０分間、次に、室温で２時間、撹拌した。減圧下で溶媒を除去した後、残留物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中０〜５０％ＥｔＯＡｃ）で精製して、化合物２０３を得た（１．８３ｇ、６．２２ｍｍｏｌ、定量的収率、Ｒｆ＝０．４２；ヘキサン中５０％ＥｔＯＡｃで展開）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ７．４３−７．２３（ｍ，５Ｈ），５．７１（ｄ，Ｊ＝３．８Ｈｚ，１Ｈ），４．７２（ｔ，Ｊ＝３．８Ｈｚ，１Ｈ），４．６８−４．６０（ｍ，２Ｈ），４．５０（ｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，１Ｈ），３．８８−３．７４（ｍ，３Ｈ），１．４５（ｓ，３Ｈ），１．３０（ｓ，３Ｈ），１．０３（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  １３８．１０，１２８．１８，１２７．５６，１２７．４９，１１１．６０，１０３．７６，８１．９６，７７．２６，７７．２４，７０．８２，６５．１５，２６．７６，２６．７１，１８．２６．
【０５１８】
化合物２０４の合成：ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の化合物２０３（２．０７ｇ、７．０３ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＢＤＰＳＣｌ（２．７３ｍＬ、１０．５ｍｍｏｌ）及びイミダゾール（１．４４ｇ、２１．１ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で除去した後、残留物をＣＨ２Ｃｌ２及び飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で抽出した。有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗物質をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中０〜１０％のＥｔＯＡｃ）で精製して、化合物２０４（４．８５ｇ、定量的収率、Ｒｆ＝０．４１；ヘキサン中１０％ＥｔＯＡｃで展開）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ７．７０−７．５５（ｍ，７Ｈ），７．５１−７．２２（ｍ，１５Ｈ），５．６３（ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，１Ｈ），４．７９（ｔ，Ｊ＝４．１Ｈｚ，１Ｈ），４．６７（ｄ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ，１Ｈ），４．４６（ｄ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ，１Ｈ），４．１０−３．９２（ｍ，３Ｈ），３．８８（ｄｄ，Ｊ＝８．８，１．６Ｈｚ，１Ｈ），１．４２（ｓ，３Ｈ），１．３０（ｓ，３Ｈ），０．９５３−０．９４７（ｍ，１２Ｈ）．
【０５１９】
化合物２０６の合成：ＡｃＯＨ（１５ｍＬ）及びＡｃ２Ｏ（３ｍＬ）中の化合物２０４（３．００ｇ、５．６３ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｈ２ＳＯ４（１０滴）を０℃で添加した。反応混合物を室温で１４時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残留物をＥｔＯＡｃ及びＨ２Ｏで抽出した。有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗物質をＣＨ３ＣＮと共蒸発させ、次のステップを使用した。ＣＨ３ＣＮ（３５ｍＬ）中の粗物質の溶液に、ウラシル（１．８８ｇ、１６．８ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（６．８５ｍＬ、２８．０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を４０℃で１５分間撹拌し、ＴＭＳＯＴｆ（１．５２ｍＬ、８．４０ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。混合物を８０℃で２時間撹拌した。標準的な後処理及びシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中０〜５０％ＥｔＯＡｃ）による精製により、化合物２０６（２．０１ｇ、３．２０ｍｍｏｌ、５７％、Ｒｆ＝０．３２；ヘキサン中５０％ＥｔＯＡｃで展開）が得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  １１．４３（ｓ，１Ｈ），７．６６−７．５９（ｍ，４Ｈ），７．５５（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．５１−７．２２（ｍ，１２Ｈ），５．８４（ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，１Ｈ），５．５１（ｄｄ，Ｊ＝８．１，１．４Ｈｚ，１Ｈ），５．４１（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），４．５８−４．４３（ｍ，２Ｈ），４．４０（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１Ｈ），４．１４（ｄｄ，Ｊ＝６．４，３．５Ｈｚ，１Ｈ），３．８７（ｄｄ，Ｊ＝５．８，３．５Ｈｚ，１Ｈ），２．０６（ｓ，３Ｈ），１．０７−０．９５（ｍ，９Ｈ），０．９０（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  １６９．６９，１６２．９０，１５０．２６，１４１．７３，１３７．６０，１３５．４０，１３５．２６，１３３．５２，１３３．２７，１２９．８８，１２９．８７，１２８．２７，１２７．７６，１２７．７２，１２７．７０，１０２．０８，８７．５２，８４．９０，７４．８８，７２．５１，７１．９２，６８．４４，２６．８２，２０．５３，１８．７９，１８．６０．
【０５２０】
化合物２０７の合成：ＭｅＯＨ（３０ｍＬ）中の化合物２０６（１．９４ｇ、３．０９ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃でＫ２ＣＯ３（８５４ｍｇ、６．１８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を、ＭｅＯＨ（０．２ｍＬ）を添加して０℃で３時間撹拌した。ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）及びＨ２Ｏ（２０ｍＬ）を添加し、次に抽出した。有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗物質をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中０〜７５％ＥｔＯＡｃ）で精製して、化合物２０７（１．６８ｇ、２．８６ｍｍｏｌ、９３％、Ｒｆ＝０．２８；ヘキサン中６７％ＥｔＯＡｃで展開）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  １１．４０（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．６７−７．５７（ｍ，４Ｈ），７．５３−７．２４（ｍ，１２Ｈ），５．７７（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ），５．５９（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，１Ｈ），５．４８（ｄｄ，Ｊ＝８．０，２．１Ｈｚ，１Ｈ），４．７３（ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，１Ｈ），４．５３（ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，１Ｈ），４．２２（ｑ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），４．１３−３．９８（ｍ，２Ｈ），３．８４（ｔ，Ｊ＝４．２Ｈｚ，１Ｈ），０．９９（ｓ，９Ｈ），０．９１（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  １６２．８５，１５０．７３，１４０．８４，１３８．２７，１３５．４０，１３５．２２，１３３．５３，１３３．３８，１２９．８８，１２８．１５，１２７．７９，１２７．７４，１２７．４６，１２７．４１，１０２．０１，８７．５１，８５．５６，７６．３２，７１．５０，７１．２９，６９．０２，２６．８２，１９．１２，１８．８２．
【０５２１】
化合物２０８の合成：ＥｔＯＨ（１５０ｍＬ）中の化合物２０７（３．７０ｇ、６．３１ｍｍｏｌ）の溶液に、シクロヘキセン（３２．１ｍＬ、０．３１７ｍｏｌ、５０ｅｑ）及び炭素上の水酸化パラジウム（２０重量％ローディング；２．２３ｇ）を添加した。混合物を８０℃で３時間加熱した。反応混合物をセライトで濾過し、次に、濃縮した。粗物質をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中０〜５％ＭｅＯＨ）で精製して、化合物２０８（２．８０ｇ、５．６４ｍｍｏｌ、８９％、Ｒｆ＝０．１６；ＣＨ２Ｃｌ２中５％ＭｅＯＨで展開）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  １１．３７（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．６５−７．６２（ｍ，４Ｈ），７．５６−７．２６（ｍ，７Ｈ），５．７２（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ），５．５４−５．３０（ｍ，２Ｈ），５．１１（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），４．２３−４．０４（ｍ，２Ｈ），３．９７（ｑ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，１Ｈ），３．６７（ｔ，Ｊ＝４．２Ｈｚ，１Ｈ），１．０２（ｓ，９Ｈ），０．９６（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  １６２．８５，１５０．７２，１４０．８５，１３５．４１，１３５．２４，１３３．７１，１３３．５０，１２９．８５，１２９．８３，１２７．７７，１２７．７３，１０１．９７，８７．４２，８７．１５，７１．８８，６９．１５，６８．９１，２６．８４，１９．２０，１８．８８．
【０５２２】
化合物２０９の合成：ジオキサン（７０ｍＬ）中の化合物２０８（２．８０ｇ、５．６４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＮａＩＯ４（１．３３ｇ、６．２０ｍｍｏｌ）Ｈ２Ｏ（１２ｍＬ）の溶液を添加した。反応混合物を周囲温度で２時間激しく撹拌した。反応混合物を焼結漏斗で濾過し、濾過ケーキを追加のジオキサンで洗浄した。濾液にＮａＢＨ４（３２０ｍｇ、８．４６ｍｍｏｌ）を添加した。周囲温度で２時間撹拌した後、溶媒を減圧下で除去した。粗物質をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０〜５％ＭｅＯＨ）で精製して、化合物２０９を白色泡状物として得た（２．７３ｇ、５．４７ｍｍｏｌ、９７％；Ｒｆ＝０．２０、ＤＣＭ中５％ＭｅＯＨで展開）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  １１．２３（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．６３−７．５３（ｍ，４Ｈ），７．５１−７．３５（ｍ，８Ｈ），５．８６（ｄｄ，Ｊ＝６．７，５．０Ｈｚ，１Ｈ），５．４５（ｄｄ，Ｊ＝８．０，２．１Ｈｚ，１Ｈ），５．１０（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１Ｈ），４．７７（ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，１Ｈ），３．８１（ｄｄ，Ｊ＝６．４，３．５Ｈｚ，１Ｈ），３．７１−３．５９（ｍ，１Ｈ），３．５８−３．４４（ｍ，４Ｈ），０．９５（ｓ，９Ｈ），０．８７（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  １６３．１５，１５１．３３，１４０．９３，１３５．３８，１３５．３１，１３３．７３，１３３．００，１２９．８１，１２９．７１，１２７．７２，１２７．６１，１０１．５６，８３．６７，８３．５８，６８．９４，６１．３１，６０．２１，２６．７５，１８．７４，１８．５４．
【０５２３】
化合物２１０の合成：−７８℃に冷却した、無水ＤＣＭ（４０ｍＬ）及びピリジン（１．１７ｍＬ、１４．４ｍｍｏｌ）中の化合物２０９（７２０ｍｇ、１．４４ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化ベンゾイル（０．１８４ｍＬ、１．５８ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。−７８℃で２時間撹拌した後、反応混合物を０℃とし、ＥｔＯＨ（１ｍＬ）でクエンチした。混合物をＤＣＭ（４０ｍＬ）で希釈し、次に飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２０ｍＬ）で洗浄した。有機層をブラインで洗浄し、分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中０〜８０％ＥｔＯＡＣ）で精製して、化合物２１０を白色の泡状物として得た（３６１ｍｇ、０．５９９ｍｍｏｌ、４２％；Ｒｆ＝０．６４、ヘキサン中８０％ＥｔＯＡｃで発展）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  １１．３４（ｓ，１Ｈ），８．０２−７．８２（ｍ，２Ｈ），７．７１−７．６３（ｍ，１Ｈ），７．６１−７．５０（ｍ，７Ｈ），７．４９−７．３６（ｍ，６Ｈ），６．２７（ｄｄ，Ｊ＝６．６，５．１Ｈｚ，１Ｈ），５．４５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），４．８９（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１Ｈ），４．５８（ｄｄ，Ｊ＝１１．５，５．１Ｈｚ，１Ｈ），４．４３（ｄｄ，Ｊ＝１１．５，６．６Ｈｚ，１Ｈ），３．８５（ｄｄ，Ｊ＝６．４，２．８Ｈｚ，１Ｈ），３．６１−３．５５（ｍ，３Ｈ），０．９５（ｓ，９Ｈ），０．９３（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  １６４．９８，１６２．９７，１５０．９９，１４０．２４，１３５．３８，１３５．３１，１３３．６９，１３３．６２，１３２．９５，１２９．８５，１２９．７５，１２９．１１，１２９．０３，１２８．８２，１２７．７４，１２７．６３，１０２．０３，８３．７６，８０．９５，６９．１３，６３．５１，６０．３５，２６．７５，１８．７５，１８．４５．
【０５２４】
化合物２１１の合成：無水ピリジン（５ｍＬ）中の化合物２１０（５８５ｍｇ、０．９７１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＴｒＣｌ（４９５ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１６時間撹拌した。溶媒を除去した後、残留物をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）及び飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５０ｍＬ）で抽出した。有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗物質をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中０〜３３％ＥｔＯＡｃ）で精製して、化合物２１１（７６４ｍｇ、０．８４４ｍｍｏｌ、８７％、Ｒｆ＝０．２２、ヘキサン中３３％ＥｔＯＡｃで展開）を白色の泡状物として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  １１．４２（ｓ，１Ｈ），７．８６−７．７３（ｍ，２Ｈ），７．７３−７．５９（ｍ，１Ｈ），７．５２−７．４０（ｍ，９Ｈ），７．３４（ｔｔ，Ｊ＝７．３，４．０Ｈｚ，６Ｈ），７．２９−７．１４（ｍ，７Ｈ），６．８０（ｄｄ，Ｊ＝８．９，３．１Ｈｚ，４Ｈ），６．４４（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１Ｈ），５．４７（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），４．４７（ｄｄ，Ｊ＝１１．５，５．５Ｈｚ，１Ｈ），４．３７（ｄｄ，Ｊ＝１１．５，６．４Ｈｚ，１Ｈ），３．８１（ｄｔ，Ｊ＝７．９，４．２Ｈｚ，１Ｈ），３．６９（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，７Ｈ），３．２６（ｄｄ，Ｊ＝１０．２，４．５Ｈｚ，１Ｈ），３．１３（ｄｄ，Ｊ＝１０．２，７．１Ｈｚ，１Ｈ），０．８３（ｓ，９Ｈ），０．７８（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  １６４．７９，１６２．９７，１５８．０５，１５８．０１，１５１．１２，１４４．６０，１４０．１４，１３５．５１，１３５．３５，１３５．３０，１３３．６１，１３３．４３，１３２．７３，１２９．８４，１２９．７７，１２９．５８，１２９．４９，１２９．０８，１２８．９０，１２８．７４，１２７．８０，１２７．６８，１２７．６０，１２７．５４，１２６．６４，１１３．１１，１０２．２２，８６．１５，８１．６５，８１．２１，６９．５３，６３．４２，６３．３６，５４．９７，５４．９５，２６．６３，１８．７４，１８．６３．
【０５２５】
化合物２１２の合成：ＴＨＦ（８ｍＬ）中の化合物２１１（７４０ｍｇ、０．８１８ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（１．０６ｍｍｏｌ、１．０６ｍＬ）中の１Ｍ  ｎ−ＴＢＡＦで一晩処理した。溶媒を除去した後、残留物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中０〜６６％ＥｔＯＡｃ）で精製して、化合物２１２を白色の固体として得た（２２６ｍｇ、０．３３９ｍｍｏｌ、４１％、Ｒｆ＝０．２５、ヘキサン中６６％ＥｔＯＡｃで展開）。この化合物は、標準的なジメトキシトリチル化により、９３％の収率で化合物２１３からも合成された。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  １１．３８（ｓ，１Ｈ），７．８８−７．７６（ｍ，３Ｈ），７．７２−７．６１（ｍ，１Ｈ），７．４９（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），７．４４−７．３７（ｍ，２Ｈ），７．３２−７．２４（ｍ，６Ｈ），７．２４−７．１６（ｍ，１Ｈ），６．８４（ｄｄ，Ｊ＝８．７，５．８Ｈｚ，４Ｈ），６．４５（ｄｄ，Ｊ＝７．１，５．１Ｈｚ，１Ｈ），５．６７（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），４．６４（ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ），４．５５（ｄｄ，Ｊ＝１１．６，５．１Ｈｚ，１Ｈ），４．４８（ｄｄ，Ｊ＝１１．５，７．１Ｈｚ，１Ｈ），３．６９（ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，６Ｈ），３．６６−３．５７（ｍ，１Ｈ），３．５１（ｑ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ），３．２７（ｄｄ，Ｊ＝１０．３，３．２Ｈｚ，１Ｈ），３．０８（ｄｄ，Ｊ＝１０．２，７．２Ｈｚ，１Ｈ），０．８９（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  １６４．８５，１６３．１６，１５８．０２，１５７．９９，１５１．３２，１４４．７４，１４１．０９，１３５．６７，１３５．５４，１３３．６３，１２９．６５，１２９．５９，１２９．１１，１２８．９３，１２８．７９，１２７．８１，１２７．６８，１２６．６４，１１３．１５，１１３．１２，１０１．９１，８５．９１，８２．２９，８１．２６，６５．６１，６３．８９，６３．２８，５４．９７，５４．９５，１９．１８．
【０５２６】
化合物２１３の合成：ＴＨＦ（５ｍＬ）中の化合物２１０（３６１ｍｇ、０．５９９ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（０．７１９ｍｍｏｌ、０．７１９ｍＬ）中の１Ｍ  ｎ−ＴＢＡＦで２時間処理した。溶媒を除去した後、残留物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中０〜１００％ＥｔＯＡｃ、次にＥｔＯＡｃ中５％ＭｅＯＨ）で精製して、化合物２１３を白色の固体として得た（２０９ｍｇ、０．５７４ｍｍｏｌ、９６％、Ｒｆ＝０．２９、ＥｔＯＡｃ中５％ＭｅＯＨで展開）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  １１．３１（ｓ，１Ｈ），７．９５−７．８５（ｍ，２Ｈ），７．７９（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．７４−７．６１（ｍ，１Ｈ），７．５３（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），６．２６（ｄｄ，Ｊ＝７．０，５．１Ｈｚ，１Ｈ），５．６５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），４．７７（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），４．６９−４．５５（ｍ，２Ｈ），４．４５（ｄｄ，Ｊ＝１１．５，７．１Ｈｚ，１Ｈ），３．６１（ｄｄｔ，Ｊ＝１３．８，６．４，４．５Ｈｚ，２Ｈ），３．５０（ｄｔ，Ｊ＝１１．８，６．１Ｈｚ，１Ｈ），３．３８−３．３０（ｍ，２Ｈ），０．９９（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １６５．００，１６３．１８，１５１．１６，１４１．１１，１３３．６１，１２９．１３，１２８．８４，１０１．６４，８４．００，６５．１２，６３．４０，６０．７７，１８．８０．
【０５２７】
化合物２１４の合成：ＤＣＭ（１５ｍｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．６５１ｍｌ、３．７４ｍｍｏｌ）中の化合物２１２（１．２５ｇ、１．８７ｍｍｏｌ）の溶液に、２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイト（０．５４４ｍＬ、２．４４ｍｍｏｌ）及び１−メチルイミダゾール（０．１４９ｍＬ、１．８７ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）で希釈し、次に、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗物質をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中０〜５０％ＥｔＯＡｃ）で精製して、化合物２１４（１．４０ｇ、１．６１ｍｍｏｌ、８６％、Ｒｆ＝０．２０、０．２７、ヘキサン中５０％ＥｔＯＡｃで展開）をジアステレオマーの混合物として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）：δ  ９．１６（ｓ，１Ｈ），７．９０−７．８７（ｍ，２Ｈ），７．６４−７．５９（ｍ，２Ｈ），７．４７−７．４１（ｍ，４Ｈ），７．３２−７．１９（ｍ，７Ｈ），６．８４−６．８０  （ｍ，４Ｈ），６．４４（ｑ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），５．６９（ｄｄ，Ｊ＝１１．９，８．１Ｈｚ，１Ｈ），４．５１（ｄｄｄ，Ｊ＝２３．０，１１．６，５．３Ｈｚ，１Ｈ），４．３９（ｄｄｄ，Ｊ＝２０．８，１１．６，６．０Ｈｚ，１Ｈ），４．０３−３．１５（ｍ，１５Ｈ），２．５９（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），２．５０（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），１．１６−０．９４（ｍ，１５Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）：δ  １６６．３４，１６３．９８，１６３．９６，１５９．６６，１５９．６３，１５２．０４，１５１．９８，１４６．００，１４５．９７，１４１．５９，１４１．５５，１３６．９３，１３６．８２，１３６．７４，１３４．４２，１３４．３９，１３０．９９，１３０．９３，１３０．８８，１３０．４４，１３０．４１，１３０．３９，１２９．６５，１２９．６３，１２８．９６，１２８．８８，１２７．８１，１１８．２９，１１４．０９，１１４．０８，１０３．０９，１０３．０４，８７．７０，８７．６６，８３．１７，８３．１４，８２．８９，８２．７６，８２．７１，７１．４５，７１．３０，７０．７２，７０．５８，６４．７２，６４．６９，６４．６７，６４．６２，５９．４１，５９．３４，５９．２７，５９．１９，５５．８７，４３．８９，４３．７９，４３．７５，４３．６６，２５．０５，２４．９９，２４．９２，２４．８６，２４．８１，２４．６９，２４．６３，２０．９９，２０．９３，２０．９１，２０．８５，１８．２９，１８．２６，１７．６５，１７．６２．３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）：δ  １４９．３８，１４８．５６．
【０５２８】
化合物２１５の合成：ＣＨ２Ｃｌ２中での無水コハク酸及びＤＭＡＰを使用した化合物２１２の標準的なコハク化と、それに続くＤＭＦ中でのＨＢＴＵ及びＤＩＰＥＡを使用したＣＰＧローディングにより、化合物２１５が得られる。
【０５２９】
実施例３：非環状糖構造を持つグアニン誘導体を有する構成要素の合成
５’−（Ｒ）−メチル−グアニン−ＵＮＡ構成要素の合成
【化６７】
2021523720.tif 000069
保護されたグアニン類似体２５１を２０５とカップリングして２５２を得る。アセチル基及びベンジル基の除去により２５４が得られる。ＴＢＤＰＳ基がＤＭＴｒ基に変化して２５５が得られ、次に、酸化的開裂とそれに続く還元により２５６が得られる。選択的ベンゾイル化により２５７が得られ、これがアミダイト２５８に変換され、ＣＰＧにロードされて、標準条件を使用して２５９が得られる。
【０５３０】
イノシン−ＵＮＡ構成要素の合成
【化６８】
2021523720.tif 000070
構成要素２６３及び２６４は、上記の他のＵＮＡ誘導体について説明したのと同様の手順を使用して、５’−ＤＭＴｒで保護されたイノシンリボヌクレオシド２６０から合成される。
【０５３１】
イノシン−ＧＮＡ／ＳＮＡ構成要素の合成
【化６９】
2021523720.tif 000071
化合物２６６、イノシン−ＧＮＡは、アデノシンデアミナーゼで処理することにより、Ａ−ＧＮＡ  ２６５から合成される。その後のＤＭＴｒ保護とそれに続くリン酸化及びＣＰＧローディングにより、２６８及び２６９が得られる。２６６のジオールの酸化的開裂とそれに続く穏やかな酸化により２７０が得られ、これが２７１とカップリングしてイノシン−ＳＮＡ（セリノール核酸）前駆体２７２が得られる。２７３及び２７４は、上記のように合成することができる。
【０５３２】
ｉｓｏＧ−ＵＮＡ構成要素の合成
【化７０】
2021523720.tif 000072
ジアミノＡリボヌクレオシド２７５から出発して、スキーム１１のｉｓｏＧ−ＧＮＡの合成について説明した同様の手順で２７９が得られる。上記のＵＮＡ類似体合成の標準的な生成材料により、ｉｓｏＧ−ＵＮＡ構成要素２８２及び２８３を得ることができる。
【０５３３】
ｉｓｏＧ−ＳＮＡ構成要素の合成
【化７１】
2021523720.tif 000073
１１１のジオールの酸化的開裂とそれに続く穏やかな酸化により２８４が得られ、これが２７１とカップリングしてｉｓｏＧ−ＳＮＡ（セリノール核酸）前駆体２８５が得られる。２８６及び２８７は、上記のように合成することができる。
【０５３４】
２−アミノプリン−ＵＮＡ構成要素の合成
【化７２】
2021523720.tif 000074
２−アミノプリンリボヌクレオシド２８８から出発して、ＴＭＳによる一過性の保護とそれに続くｉＢｕＣｌによる環外アミノ保護、次いでアルカリ後処理により、２８９が得られる。上記のＵＮＡ類似体合成の標準的な生成材料により、２−アミノプリン−ＵＮＡ構成要素２９３及び２９４を得ることができる。
【０５３５】
２−アミノプリン−ＧＮＡ／ＳＮＡ構成要素の合成
【化７３】
2021523720.tif 000075
アクトニド（ａｃｔｏｎｉｄｅ）で保護されたクロロ化合物で２９５をＮ−アルキル化すると、２９６が得られる。その後の塩基保護、酸処理及びＤＭＴｒ保護により２９９が得られる。３００及び３０１は、上記のように合成することができる。２９８のジオールの酸化的開裂とそれに続く穏やかな酸化により酸３０２が得られ、これが２７１とカップリングして２−アミノプリン−ＳＮＡ（セリノール核酸）前駆体３０３が得られる。３０４及び３０５は、上記のように合成することができる。
【０５３６】
キサントシン−ＵＮＡ構成要素の合成
【化７４】
2021523720.tif 000076
キサントシン３０６をアセチル化して３０７を得る。二重光延反応とそれに続くアルカリ処理及びＤＭＴｒ保護により３０９が得られる。上記のＵＮＡ類似体合成の標準的な生成材料により、キサントシン−ＵＮＡ構成要素３１２及び３１３を得ることができる。
【０５３７】
キサントシン−ＧＮＡ構成要素の合成
【化７５】
2021523720.tif 000077
Ｇ−ＧＮＡのアセチル化により３１５が得られ、環外アミンのＤＭＴｒ反応の後に３１６が得られる。光延反応及び酸処理により３１８が得られる。酸性条件下で亜硝酸ナトリウムにより３１８を処理することにより、３１９が得られる。光延反応、アセチル基の除去及びＤＭＴｒ保護により３２２が得られる。３２３及び３２４は上記のように合成することができる。
【０５３８】
キサントシン−ＳＮＡ構成要素の合成
【化７６】
2021523720.tif 000078
３２１のジオールの酸化的開裂とそれに続く穏やかな酸化により酸３２５が得られ、これが２７１とカップリングしてキサントシン−ＳＮＡ（セリノール核酸）前駆体３２６が得られる。３２７及び３２８は、上記のように合成することができる。
【０５３９】
Ｎ１−メチル−Ｇ−ＵＮＡ構成要素の合成
【化７７】
2021523720.tif 000079
グアノシン３２９をＤＭＳＯ中のＭｅＩで処理して３３０を得る。環外アミノ保護とそれに続くＤＭＴｒ反応により３３２が得られる。上記のＵＮＡ類似体合成の標準的な生成材料により、Ｎ１−メチルＧ−ＵＮＡ構成要素３３５及び３３６を得ることができる。
【０５４０】
Ｎ１−メチル−Ｇ−ＧＮＡ構成要素の合成
【化７８】
2021523720.tif 000080
Ｇ−ＧＮＡのメチル化により３１４が得られる。環外アミノ基及び５’−ヒドロキシル基の保護により３３９が得られる。標準的なリン酸化及びコハク化とそれに続くＣＰＧローディングにより、３４０と３４１がそれぞれ得られる。
【０５４１】
Ｎ１−メチル−Ｇ−ＳＮＡ構成要素の合成
【化７９】
2021523720.tif 000081
３３８のジオールの酸化的開裂とそれに続く穏やかな酸化により酸３４２が得られ、これが２７１とカップリングしてＮ１−メチルＧ−ＳＮＡ（セリノール核酸）前駆体３４３が得られる。３４４及び３４５は、上記のように合成することができる。
【０５４２】
Ｏ６−アルキル−ＵＮＡ構成要素の合成
【化８０】
2021523720.tif 000082
３４６をＮａＯＭｅで処理した後、ｄｍｆで保護することにより、３４８が得られる。その後のＤＭＴｒ反応及び上記のＵＮＡ類似体合成の標準手順に従うと、Ｏ６−アルキル−Ｇ−ＵＮＡ構成要素３５２及び３５３を得ることができる。
【０５４３】
Ｏ６−アルキル−ＧＮＡ／ＳＮＡ構成要素の合成
【化８１】
2021523720.tif 000083
３５４のアミノ基の保護により３５５が得られる。標準的なリン酸化及びコハク化とそれに続くＣＰＧローディングにより、３５６と３５７がそれぞれ得られる。３５５の酸処理により３５８が得られる。３５８のジオールの酸化的開裂とそれに続く穏やかな酸化により酸３５９が得られ、これが２７１とカップリングしてＯ６−アルキル化Ｇ−ＳＮＡ（セリノール核酸）前駆体３６０が得られる。３６１及び３６２は、上記のように合成することができる。
【０５４４】
実施例４：ヒドロキシプロリノールベースのヌクレオシドアミダイトの合成
【化８２】
2021523720.tif 000084
化合物（１０１ａ）−カルボン酸（５．００ｇ、２７．１ｍｍｏｌ）及びＨＢＴＵ（１０．２７ｇ、２７．１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１００ｍＬ）中に取り、反応混合物を、氷水混合物中、アルゴン下で冷却した。ＤＩＥＡ（１４．１ｍＬ、３ｅｑ．）を添加し、溶液を５分間撹拌した。ＤＭＦ（５０ｍＬ）中の化合物１００（１３．１８ｇ、２７．１ｍｍｏｌ）の溶液を上記の混合物に添加し、２時間撹拌した。ＴＬＣをチェックし、混合物を氷水混合物に注ぎ、沈殿した化合物を濾過し、真空下で乾燥させた。それをシリカゲルクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製して、化合物１０１ａをオフホワイトの固体として得た（１２．２０、７６％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １１．２８（ｄ，Ｊ＝１７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．３８−７．２５（ｍ，４Ｈ），７．２５−７．１３（ｍ，４Ｈ），６．８８（ｄｄ，Ｊ＝９．５，２．６Ｈｚ，３Ｈ），５．０９（ｄ，Ｊ＝４．１Ｈｚ，１Ｈ），４．５６（ｄ，Ｊ＝１６．７Ｈｚ，１Ｈ），４．４９−４．４０（ｍ，１Ｈ），４．２０−４．０９（ｍ，１Ｈ），３．７２（ｄ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，５Ｈ），３．６７（ｄｄ，Ｊ＝１０．６，５．３Ｈｚ，１Ｈ），３．３７（ｄｄ，Ｊ＝１０．４，４．０Ｈｚ，１Ｈ），３．１５（ｄｄ，Ｊ＝８．９，５．３Ｈｚ，１Ｈ），２．９８（ｄｄ，Ｊ＝８．９，３．２Ｈｚ，１Ｈ），２．０５−１．９５（ｍ，１Ｈ），１．９５−１．７９（ｍ，１Ｈ），１．７４（ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ，２Ｈ）．
【０５４５】
化合物（１０２ａ）−化合物１０１ａ（４．０ｇ、６．８３ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加え、排気し、アルゴンでパージした。出発物質をアセトニトリルに溶解し、ジイソプロピルアミン（１．３１ｍｌ、７．５１ｍｍｏｌ）及び２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト（３．３８ｍｌ、１０．２５ｍｍｏｌ）をシリンジで添加した。１Ｈ−テトラゾール（１６．７ｍＬ、７．５１ｍｍｏｌ、０．４５Ｍ）の溶液を添加し、室温で１時間撹拌した。反応をＴＬＣ（５０％ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）でチェックし、反応物を減圧下で濃縮した。残留物をジクロロメタンに溶解し、分液漏斗に加え、有機層を飽和重炭酸ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を分離し、ブラインで洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体を濾別し、母液を濃縮した。残留物をシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィー（２０％〜１００％ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）で精製し、生成物画分を合わせて減圧濃縮して、１０２ａを得た（４．９６ｇ、９３％）。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ  ９．０６（ｓ，１Ｈ），７．４４−７．３５（ｍ，３Ｈ），７．３４−７．２４（ｍ，８Ｈ），７．２４−７．１８（ｍ，１Ｈ），７．０３（ｔ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，１Ｈ），６．９１−６．８２（ｍ，５Ｈ），４．７５（ｍ，１Ｈ），４．５５−４．３２（ｍ，３Ｈ），４．２４（ｍ，１Ｈ），４．１８−３．９９（ｍ，１Ｈ），３．８７（ｄｄ，Ｊ＝１０．６，５．８Ｈｚ，１Ｈ），３．８４−３．７８（ｍ，１Ｈ），３．７６（ｓ，１０Ｈ），３．６１（ｍ，４Ｈ），３．５４−３．４４（ｍ，１Ｈ），３．４１−３．２８（ｍ，２Ｈ），３．０２（ｍ，１Ｈ），２．７５（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１Ｈ），２．６４（ｍ，３Ｈ），２．２２−２．１５（ｍ，１Ｈ），２．１２−１．９９（ｍ，１Ｈ），１．８２（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，３Ｈ），１．７６（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，１Ｈ），１．２３（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），１．２１−１．０９（ｍ，１７Ｈ）．３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ  １４９．１３，１４８．６３，１４８．５０，１４８．３０．
【０５４６】
化合物（１０１ｂ）−カルボン酸（５．００ｇ、２３．６８ｍｍｏｌ）及びＨＢＴＵ（８．９８ｇ、２３．６８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１００ｍＬ）中に取り、反応混合物を氷水混合物中、アルゴン下で冷却した。ＤＩＥＡ（１２．３６ｍＬ、３ｅｑ．）を添加し、溶液を５分間撹拌した。ＤＭＦ（５０ｍＬ）中の化合物１００（９．９３ｇ、２３．６８ｍｍｏｌ）の溶液を上記の混合物に添加し、２時間撹拌した。ＴＬＣをチェックし、混合物を氷水混合物に注ぎ、沈殿した化合物を濾過し、真空下で乾燥させた。それをシリカゲルクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製して、化合物１０１ｂを淡黄色の固体として得た（１３．１、８２％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １１．２０（ｓ，１Ｈ），８．０４−７．９４（ｍ，３Ｈ），７．６６−７．５７（ｍ，１Ｈ），７．５１（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．３５−７．２８（ｍ，４Ｈ），７．２５（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），７．２３−７．１４（ｍ，４Ｈ），６．８９（ｍ，４Ｈ），５．１２（ｄ，Ｊ＝４．１Ｈｚ，１Ｈ），４．８５−４．５８（ｍ，２Ｈ），４．４７（ｍ，１Ｈ），４．１６（ｍ，１Ｈ），３．７２（ｄ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，７Ｈ），３．４２（ｄｄ，Ｊ＝１０．５，３．９Ｈｚ，１Ｈ），３．１７（ｄｄ，Ｊ＝８．９，５．３Ｈｚ，１Ｈ），３．００（ｄｄ，Ｊ＝８．９，３．１Ｈｚ，１Ｈ），２．０７−１．９４（ｍ，１Ｈ），１．８７（ｍ，１Ｈ）．
【０５４７】
化合物（１０２ｂ）−化合物１０１ｂ（２．０ｇ、２．９７ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加え、排気し、アルゴンでパージした。出発物質をアセトニトリルに溶解し、ジイソプロピルアミン（０．５７４ｍｌ、３．３ｍｍｏｌ）及び２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト（１．４７ｍｌ、４．４６ｍｍｏｌ）をシリンジで添加した。１Ｈ−テトラゾール（７．３３ｍＬ、３．３ｍｍｏｌ、０．４５Ｍ）の溶液を添加し、室温で１時間撹拌した。反応をＴＬＣ（７０％ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）でチェックし、反応物を減圧下で濃縮した。残留物をジクロロメタンに溶解し、分液漏斗に加え、有機層を飽和重炭酸ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を分離し、ブライン溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体を濾別し、母液を濃縮した。残留物をシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィー（２０％〜１００％ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）で精製し、生成物画分を合わせて減圧濃縮して、１０２ｂを得た（２．３６ｇ、９１％）。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ  ９．１０（ｓ，１Ｈ），７．９６（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），７．７３−７．６６（ｍ，１Ｈ），７．６７−７．６０（ｍ，１Ｈ），７．５６−７．４８（ｍ，２Ｈ），７．４３（ｍ，１Ｈ），７．４１−７．３７（ｍ，１Ｈ），７．３５−７．３０（ｍ，２Ｈ），７．３０−７．２５（ｍ，３Ｈ），７．２５−７．１８（ｍ，１Ｈ），６．８７（ｍ，３Ｈ），４．８５−４．６９（ｍ，１Ｈ），４．６８−４．５０（ｍ，１Ｈ），４．２４（ｍ，１Ｈ），３．９０−３．７９（ｍ，１Ｈ），３．７６（ｓ，５Ｈ），３．７１−３．５３（ｍ，２Ｈ），３．５３−３．４１（ｍ，１Ｈ），３．４０−３．２８（ｍ，１Ｈ），３．０３（ｍ，１Ｈ），２．６５（ｍ，１Ｈ），２．２３−２．１５（ｍ，１Ｈ），２．０８（ｍ，１Ｈ），１．２３（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），１．２１−１．１４（ｍ，８Ｈ）．３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ  １４９．１３，１４８．６０，１４８．５０，１４８．３０．
【０５４８】
化合物（１０１ｃ）−カルボン酸（５．００ｇ、１６．８２ｍｍｏｌ）及びＨＢＴＵ（６．３７ｇ、１６．８２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１００ｍＬ）中に取り、反応混合物を氷水混合物中、アルゴン下で冷却した。ＤＩＥＡ（８．８０ｍＬ、３ｅｑ．）を添加し、溶液を５分間撹拌した。ＤＭＦ（５０ｍＬ）中の化合物１００（７．０５ｇ、２７．１ｍｍｏｌ）の溶液を上記の混合物に添加し、２時間撹拌した。ＴＬＣをチェックし、混合物を氷水混合物に注ぎ、沈殿した化合物を濾過し、真空下で乾燥させた。それをシリカゲルクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製して、化合物１０１ｃを淡褐色の固体として得た（９．３０、７９％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １１．１６（ｓ，１Ｈ），８．６８（ｓ，１Ｈ），８．３４（ｓ，１Ｈ），８．０９−８．０１（ｍ，２Ｈ），７．６９−７．５９（ｍ，１Ｈ），７．５５（ｄｄ，Ｊ＝８．３，６．９Ｈｚ，２Ｈ），７．２９（ｍ，４Ｈ），７．２４−７．１３（ｍ，４Ｈ），６．９２−６．７９（ｍ，４Ｈ），５．３３−５．１２（ｍ，２Ｈ），４．５０（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ），４．１８（ｑ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１Ｈ），３．８１（ｄｄ，Ｊ＝１０．６，５．２Ｈｚ，１Ｈ），３．７０（ｄｄ，Ｊ＝６．５，１．７Ｈｚ，６Ｈ），３．５３（ｍ，２Ｈ），３．３２（ｍ，１Ｈ），３．１７（ｍ，１Ｈ），３．００（ｄｄ，Ｊ＝９．０，３．２Ｈｚ，１Ｈ），２．０４（ｍ，１Ｈ），１．９０（ｍ，１Ｈ），１．３１−１．２０（ｍ，１Ｈ），０．８３（ｍ，１Ｈ）．
【０５４９】
化合物（１０２ｃ）−化合物１０１ｃ（２．０ｇ、２．８６ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加え、排気し、アルゴンでパージした。出発物質をアセトニトリルに溶解し、ジイソプロピルアミン（０．５４９ｍｌ、３．１５ｍｍｏｌ）及び２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト（１．４１ｍｌ、４．２９ｍｍｏｌ）をシリンジで添加した。１Ｈ−テトラゾール（７．０ｍＬ、３．１５ｍｍｏｌ、０．４５Ｍ）の溶液を添加し、室温で１時間撹拌した。反応をＴＬＣ（１００％ＥｔＯＡｃ）でチェックし、反応物を減圧下で濃縮した。残留物をジクロロメタンに溶解し、分液漏斗に加え、有機層を飽和重炭酸ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を分離し、ブライン溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体を濾別し、母液を濃縮した。残留物をシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィー（２０％〜１００％ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）で精製し、生成物画分を合わせて減圧濃縮して、１０２ｃを得た（２．２５ｇ、９０％）。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ  ９．７４（ｓ，１Ｈ），８．６０（ｄ，Ｊ＝３２．４Ｈｚ，１Ｈ），８．１１（ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，１Ｈ），８．０３（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．６４（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．５４（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．４７−７．４１（ｍ，１Ｈ），７．３８（ｍ，２Ｈ），７．３３（ｍ，１Ｈ），７．３０−７．１７（ｍ，６Ｈ），６．８９−６．７７（ｍ，４Ｈ），５．１５−５．０９（ｍ，１Ｈ），４．７９（ｍ，１Ｈ），４．２５（ｄｄ，Ｊ＝８．５，４．６Ｈｚ，１Ｈ），４．１６−４．０７（ｍ，１Ｈ），４．０３（ｍ，１Ｈ），３．９３（ｄｄ，Ｊ＝１０．９，５．１Ｈｚ，１Ｈ），３．９０−３．８３（ｍ，１Ｈ），３．８３−３．７６（ｍ，２Ｈ），３．７３（ｄｄ，Ｊ＝５．５，２．０Ｈｚ，７Ｈ），３．６３（ｍ，３Ｈ），３．５７−３．４０（ｍ，２Ｈ），３．３２（ｓ，１Ｈ），３．０３（ｍ，１Ｈ），２．７６（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１Ｈ），２．７０（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１Ｈ），２．６５（ｍ，１Ｈ），２．３７（ｄｄ，Ｊ＝３．６，１．８Ｈｚ，１４Ｈ），２．２０（ｍ，１Ｈ），２．１７−２．０４（ｍ，１Ｈ），１．２５−１．１３（ｍ，１９Ｈ），１．１０（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，１Ｈ）．３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ  １４９．５２，１４９．１４，１４８．７６，１４８．６７，１４８．３１．
【０５５０】
化合物（１０１ｄ）−カルボン酸（５．００ｇ、１７．９１ｍｍｏｌ）及びＨＢＴＵ（６．７９ｇ、１７．９１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１００ｍＬ）中に取り、反応混合物を氷水混合物中、アルゴン下で冷却した。ＤＩＥＡ（９．３４ｍＬ、３ｅｑ．）を添加し、溶液を５分間撹拌した。ＤＭＦ（５０ｍＬ）中の化合物１００（７．５１ｇ、１７．９１ｍｍｏｌ）の溶液を上記の混合物に添加し、２時間撹拌した。ＴＬＣをチェックし、混合物を氷水混合物に注ぎ、沈殿した化合物を濾過し、真空下で乾燥させた。それをシリカゲルクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製して、化合物１０１ｄをオフホワイトの固体として得た（８．１０、６６％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １２．０５（ｓ，１Ｈ），１１．６５（ｓ，１Ｈ），７．８３（ｓ，１Ｈ），７．３４−７．２６（ｍ，４Ｈ），７．２６−７．２０（ｍ，１Ｈ），７．２０−７．１４（ｍ，４Ｈ），６．８５（ｍ，４Ｈ），５．１８（ｄ，Ｊ＝３．８Ｈｚ，１Ｈ），５．０５−４．９６（ｍ，１Ｈ），４．９１（ｄ，Ｊ＝１７．１Ｈｚ，１Ｈ），４．４４（ｍ，１Ｈ），４．１４（ｍ，１Ｈ），３．７０（ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ，５Ｈ），３．６８（ｓ，１Ｈ），３．６３（ｄｄ，Ｊ＝１０．７，４．９Ｈｚ，１Ｈ），３．４４（ｄｄ，Ｊ＝１０．６，３．３Ｈｚ，１Ｈ），３．２０−３．０９（ｍ，１Ｈ），３．０３（ｄｄ，Ｊ＝８．８，６．０Ｈｚ，１Ｈ），２．７９−２．６４（ｍ，１Ｈ），２．０４（ｍ，１Ｈ），１．９３（ｍ，１Ｈ），１．０９（ｍ，６Ｈ）．
【０５５１】
化合物（１０２ｄ）−化合物１０１ｄ（１．４ｇ、２．０６ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加え、排気し、アルゴンでパージした。出発物質をジクロロメタンに溶解し、ジイソプロピルアミン（０．４ｍｌ、２．３ｍｍｏｌ）及び２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト（１．０２ｍｌ、３．０９ｍｍｏｌ）をシリンジで添加した。１Ｈ−テトラゾール（５．１１ｍＬ、２．３ｍｍｏｌ、０．４５Ｍ）の溶液を添加し、反応物を室温で１時間撹拌した。反応をＴＬＣ（７０％ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）でチェックし、反応物を減圧下で濃縮した。残留物をジクロロメタンに溶解し、分液漏斗に加え、有機層を飽和重炭酸ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を分離し、ブライン溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体を濾別し、母液を濃縮した。残留物をシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィー（４０％〜１００％ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）で精製し、生成物画分を合わせて減圧濃縮して、１０２ｄを得た（１．４５ｇ、８０％）。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ  １２．００（ｓ，１Ｈ），１０．１０（ｓ，１Ｈ），７．６５（ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，１Ｈ），７．４４（ｄｄ，Ｊ＝１６．１，６．９Ｈｚ，１Ｈ），７．３８（ｄｄ，Ｊ＝７．５，１．８Ｈｚ，２Ｈ），７．３４−７．２８（ｍ，２Ｈ），７．２６（ｍ，６Ｈ），７．２１（ｍ，１Ｈ），６．８３（ｍ，５Ｈ），４．９３−４．８０（ｍ，２Ｈ），４．８０−４．７２（ｍ，１Ｈ），４．７２−４．５３（ｍ，１Ｈ），４．３２−４．２０（ｍ，１Ｈ），４．１４−３．９４（ｍ，１Ｈ），３．８８（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｍ，２Ｈ），３．７６−３．７０（ｍ，９Ｈ），３．６１（ｍ，４Ｈ），３．４９（ｄ，Ｊ＝１８．４Ｈｚ，１Ｈ），３．３１（ｍ，１Ｈ），３．０６（ｍ，１Ｈ），２．７６（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１Ｈ），２．７２−２．６１（ｍ，３Ｈ），２．５７−２．４５（ｍ，２Ｈ），２．４３−２．３１（ｍ，２１Ｈ），２．２５−２．０３（ｍ，３Ｈ），１．２２（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，５Ｈ），１．１７（ｍ，１６Ｈ），１．０７（ｄｄ，Ｊ＝２３．６，６．８Ｈｚ，７Ｈ）．３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ  １４９．２５，１４９．０１，１４８．８０，１４８．２２．
【０５５２】
実施例５：
オリゴヌクレオチド合成及び精製：全てのオリゴヌクレオチドは、汎用的又は習慣的サポートを用いて、１μモルの規模で、ＭｅｒＭａｄｅ１９２シンセサイザー上で調製した。全てのホスホラミダイトは、カップリング時間を４００秒に延長した点を除き、２−シアノエチルホスホラミダイトのための標準プロトコルを用いて、１００％アセトニトリル又は９：１のアセトニトリル：ＤＭＦにおける１００ｍＭの濃度で用いた。新規に形成された結合の酸化を、９：１のアセトニトリル：水における５０ｍＭ  Ｉ２の溶液を用いて行い、リン酸結合をもたらし、９：１のピリジン：アセトニトリルにおける１００ｍＭ  ＤＤＴＴにより、ホスホロチオエート結合をもたらした。トリチルオフの合成後、カラムを４０％水性メチルアミン１５０μＬと共に４５分間インキュベートし、溶液を、真空を介して９６ウェルプレートに流した。インキュベーションを反復し、水性メチルアミンの新しい部分を流した後、粗オリゴヌクレオチド溶液を含有するプレートを密封し、室温でさらに６０分間振盪し、全ての保護基を完全に除去した。９：１アセトニトリル：ＥｔＯＨを１．２ｍＬで各ウェルに添加することにより粗オリゴヌクレオチドの沈殿を得た後、−２０℃で一晩インキュベートした。次に、プレートを３０００ＲＰＭで４５分間遠心分離し、各ウェルから上清を除去し、ペレットを９５０μＬの２０ｍＭ水性ＮａＯＡｃに再懸濁した。最後に、水を用いてＧＥ  Ｈｉ−Ｔｒａｐ脱塩カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５  Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ）上で各未精製溶液を脱塩し、最終オリゴヌクレオチド生成物を溶出させた。全ての同一性及び純度は、各々、ＥＳＩ−ＭＳ及びＩＥＸ  ＨＰＬＣを用いて確認した。
【０５５３】
温度依存性ＵＶ分光学：融解試験は、サーモプログラマーを備えたＣａｒｙ  ３００分光光度計上での経路長が１ｃｍの石英セルにおいて、０．１０×ＰＢＳ（１．０ｍＭ  Ｎａ／Ｋリン酸緩衝液、ｐＨ７．４、１３．７ｍＭ  ＮａＣｌ及び０．３ｍＭ  ＫＣｌを有する）中、（相補的修飾センス鎖と対合した修飾アンチセンス鎖からなる）１μＭの二本鎖濃度で実施した。試料溶液８００μＬを含有する各キュベットを、軽鉱油２００μＬでカバーした。１℃／分の加熱速度、１５〜９０℃での融解曲線を２６０ｎｍで監視した。融解温度（Ｔｍ）は、平滑化された加熱曲線の最初の派生物から算出し、報告された値は、少なくとも２つの独立した測定の結果である。
【０５５４】
インビトロ活性研究
細胞培養及びトランスフェクション：３８４ウェルプレート内で４．９μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ＋０．１μＬのリポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ／ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１３７７８−１５０）を５μＬのｓｉＲＮＡ二本鎖／ウェルに添加することにより、Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｍｏｕｓｅ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｇｉｂｃｏ）をトランスフェクトし、室温で１５分間インキュベートした。次に、約５×１０３個の細胞を含有する４０μＬのダルベッコ改変イーグル培地（Ｈｅｐ３ｂ）又はウィリアムズ培地（ＰＭＨ）をｓｉＲＮＡ混合物に添加した。細胞を３７℃で２４時間インキュベートし、次にＲＮＡ精製のために処理した。実験は、１０ｎＭ及び０．１ｎＭの用量のｓｉＲＮＡで実施された。
【０５５５】
ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ  ｍＲＮＡ単離キットを用いた全ＲＮＡ単離：ＲＮＡは、ＤＹＮＡＢＥＡＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号６１０１２）を使用し、ＢｉｏＴｅｋ−ＥＬ４０６プラットフォームで自動プロトコルを使用して分離された。簡潔には、７０μＬの溶解／結合緩衝液と、３μＬの磁気ビーズを含有する１０μＬの溶解緩衝液とを各ウェルに添加した。プレートを電磁シェーカー上で１０分間、室温でインキュベートし、次に磁気ビーズを捕捉し、上清を除去した。次に、ビーズに結合したＲＮＡを１５０μＬの洗浄緩衝液Ａで２回、洗浄緩衝液Ｂで１回洗浄した。次に、ビーズを溶出緩衝液１５０μＬで洗浄し、再捕捉し、上清を除去した。
【０５５６】
ＡＢＩ高性能ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号４３６８８１３）を用いたｃＤＮＡ合成：反応１回あたり、１０ｘ緩衝液１．２μＬ、２５ｘ  ｄＮＴＰ  ０．４８μＬ、１０ｘランダムプライマー１．２μＬ、逆転写酵素０．６μＬ、リボヌクレアーゼ阻害剤０．６μＬ及びＨ２Ｏ  ７．９２μＬを含有する１２μＬのマスターミックスを、上記で単離したＲＮＡに添加した。プレートを密封し、混合し、電磁シェーカー上で、室温で１０分間、続いて３７℃で２時間インキュベートした。
【０５５７】
リアルタイムＰＣＲ：２μＬのｃＤＮＡを、２μＬの水、０．５μＬの適切なＧＡＰＤＨ  ＴａｑＭａｎ  ＶＩＣプローブ又は標的プローブ及び３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号０４８８７３０１００１）の１ウェルあたり５μＬのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号０４８８７３０１００１）を含有するマスターミックスに添加した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０リアルタイムＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）で、リアルタイムＰＣＲを実施した。各二本鎖は四重に試験され、データは非標的化対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞に対して正規化された。相対倍率変化を計算するため、リアルタイムデータをΔΔＣｔ法を用いて分析し、非標的化対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞を用いて実施したアッセイに対して正規化した。
【０５５８】
インビトロレポーターアッセイ
Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ：Ｃｏｓ７細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、トリプシン処理によりプレートから放出させる前、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ（ＡＴＣＣ）中、５％ＣＯ２の雰囲気下、３７℃でほぼコンフルエントになるまで増殖させた。１ウェルあたり５μＬのｓｉＲＮＡ二本鎖と５μＬのｐｓｉＣＨＥＣＫ２プラスミド及び１ウェルあたり５μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭと０．１μＬのリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ．カタログ＃  １３７７８−１５０）を添加することにより、ｓｉＲＮＡ及びｐｓｉＣＨＣＥＣＫ２プラスミドのトランスフェクションを実施し、次に、室温で１５分間インキュベートした。次に、混合物を細胞に添加し、３５ｕｌの新鮮な完全培地に再懸濁した。トランスフェクトされた細胞は、５％ＣＯ２の雰囲気下、３７℃でインキュベートされた。
【０５５９】
ｓｉＲＮＡ及びｐｓｉＣＨＥＣＫ２プラスミドをトランスフェクトしてから４８時間後、ホタルルシフェラーゼ（トランスフェクション対照）及びウミシイタケルシフェラーゼ（標的配列に融合）を測定した。まず、培地を細胞から除去した。次に、培地体積に等しい２０μＬのＤｕａｌ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼ試薬を各ウェルに添加し混合することにより、ホタルルシフェラーゼ活性を測定した。混合物を室温で３０分間インキュベートした後、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で発光（５００ｎｍ）を測定して、ホタルルシフェラーゼシグナルを検出した。ウミシイタケルシフェラーゼ活性は、２０μＬの室温のＤｕａｌ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏ（登録商標）試薬を各ウェルに添加して測定し、プレートを１０〜１５分間インキュベートした後、発光を再度測定してウミシイタケルシフェラーゼシグナルを測定した。Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏ（登録商標）試薬は、ホタルルシフェラーゼシグナルをクエンチし、ウミシイタケルシフェラーゼ反応の発光を持続させる。ｓｉＲＮＡ活性は、各ウェル内のホタル（対照）シグナルに対してウミシイタケシグナルを正規化することによって決定した。次に、同一のベクターでトランスフェクトされたが、ｓｉＲＮＡで処理されていないか、又は非標的化ｓｉＲＮＡで処理された細胞と比較して、ｓｉＲＮＡ活性の大きさを評価した。全てのトランスフェクションはｎ＝２以上で行われた。
【０５６０】
６．インビボマウス及びラット試験
全ての試験は、適用可能なものとしての地方、州及び連邦規制に合致し、且つＡｌｎｙｌａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓでの動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ））によって認可されたプロトコルを用いて実施した。
【０５６１】
マウス薬力学試験では、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、単回用量の媒体対照（１×ＰＢＳ又は０．９％塩化ナトリウム）を投与するか、又はｓｉＲＮＡを上背に皮下投与した。採血は、後眼窩採血によって収集した。血清を１３０００ｒｐｍ、室温で、１０分間遠心分離することにより分離した。ｍＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ分析のため、マウス肝臓を収集し、直ぐに液体窒素で急速凍結し、−８０℃で貯蔵した。
【０５６２】
７．ｍＲＮＡ及びｓｉＲＮＡの定量
ｍｉＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者の使用説明書に従い、ＲＮＡを抽出し、高性能ｃＤＮＡ逆転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、製造業者の使用説明書に従い、ｃＤＮＡに変換し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を用いるＲｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０  ＩＩで、遺伝子特異的なＴａｑｍａｎプローブ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いる定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）により、ｍＲＮＡレベルを評価した。
【０５６３】
ｓｉＲＮＡへの曝露を定量化するため、細胞ペレットを、０．２５％トリトンＸ１００を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁し、９５℃で１０分間加熱し、１４，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、ＴａｑＭａｎマイクロＲＮＡ逆転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、製造業者の使用説明書に従い、上清に対して逆転写を実施した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を用いるＲｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０  ＩＩで、製造業者の使用説明書に従い、ｑＰＣＲを実施した。
【０５６４】
結果
インビトロ活性
インビトロ活性：インビトロ活性アッセイの結果を表１にまとめる。データが示すように、アンチセンス鎖のシード領域でｉｓｏＣ又はｉｓｏＧを使用したグリコール酸（ＧＮＡ）修飾は、ＧＮＡ−Ｃ又はＧＮＡ−Ｇよりも効果的にオンターゲット活性を維持する。メチルＵＮＡ（ｍＵＮＡ）及び２’−５’−ＲＮＡ修飾は、アンチセンス５〜８のシード領域の様々な位置に組み込まれたときに、親と比較してオンターゲット活性も保持する。
【０５６５】
【表１】
2021523720.tif 000085
【０５６６】
インビトロレポーターアッセイ
オフターゲットレポーターアッセイの結果を表２にまとめる。
【０５６７】
【表２】
2021523720.tif 000086
【０５６８】
温度依存性ＵＶ分光
温度依存性ＵＶ分光の結果を表３にまとめる。
【０５６９】
【表３】
2021523720.tif 000087
【０５７０】
マウスの薬力学的データ
インビボ試験の結果を表４にまとめる。ＧＮＡ−ｉｓｏＣ又はｍＵＮＡの修飾は、インビボで効力を維持する。
【０５７１】
【表４】
2021523720.tif 000088
【０５７２】
【表５】
2021523720.tif 000089
【０５７３】
【表６】
2021523720.tif 000090
【０５７４】
実施例６：銅を含まないクリック結合したビス−ＲＮＡｉ
銅を含まない「クリック」コンジュゲーションを使用してＢｉｓ−ＲＮＡｉを調製するための例示的なアプローチを、図１０を参照して示す。示されるように、３’又は５’末端にアジド官能基を有する２つの個別に合成された鎖は、ＤＢＣＯで官能化された鎖にカップリングすることができる。このアプローチでは、ヌクレオチドリンカー設計（例えば、２’−Ｆトリプレット）を簡単に組み込むことができる。この方法は、３’−５’結合又は５’−５’結合の設計を可能にする。このアプローチは、各センス鎖を別々に調製することも可能にし、ロングマー鎖で遭遇するより低い収率及び困難な不純物が従来の方法によって作られることを回避する。
【０５７５】
ロングマーのコンジュゲーション合成：
３つの異なるリンカー、Ｑ３２７、Ｑ３２８及びＱ３２４は、全て歪み促進型アジド−シクロオクチン付加を使用して構築された。スキーム３１、３２及び３３は、これらのリンカーの調製を示す。いずれの場合も、Ｆ７センス鎖の５’末端はジベンジルシクロオクチン部分（ＤＢＣＯ）で官能化され、ＴＴＲセンス鎖の３’又は５’末端はアジドで官能化された。鎖を「クリック」して合わせるために、等モル量の各鎖（水中０．４５Ｍ）及び３０％０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．１）を室温で１２時間混合した。粗リガンドコンジュゲート及び非コンジュゲートオリゴヌクレオチドは、５０ｍＬ／分の流速で１３０分にわたり、３０〜６２％緩衝液Ｂの直線勾配で、ＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｓｕｐｅｒ  Ｑ−５ＰＷ支持体（ＴＯＳＯＨ  Ｃｏｒｐ．）を使用した陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＩＥＸ−ＨＰＬＣ）によって精製された（緩衝液Ａ：１０％ＣＨ３ＣＮ中０．０２Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ１１及び緩衝液Ｂ：緩衝液Ａ＋１Ｍ  ＮａＢｒ）。ロングマーは、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をカスタムパックしたＡＰ−２ガラスカラム（２０×３００ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ）を使用したＡＫＴＡ  Ｐｒｉｍｅクロマトグラフィーシステムによるサイズ排除クロマトグラフィーで脱塩し、ヌクレアーゼを含まない滅菌水で溶出した。
【０５７６】
表７に、銅を含まない「クリック」コンジュゲーションリンカーＱ３２７、Ｑ３２８及びＱ３２４を使用したＢｉｓ−ＲＮＡｉコンジュゲートの一部の例を示す。表８にこれらのコンジュゲートに関する一部の情報をまとめる。
【化８３】
2021523720.tif 000091
【化８４】
2021523720.tif 000092
【化８５】
2021523720.tif 000093
【０５７７】
【表７】
2021523720.tif 000094
【０５７８】
【表８】
2021523720.tif 000095
【０５７９】
一般的なオリゴヌクレオチド合成：ＦＶＩＩ及びｍＴＴＲ  ｓｉＲＮＡ配列は、固体支持体媒介性ホスホラミダイト化学を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＢＩ３９４で、１μｍｏｌスケールで合成された。固体支持体は、カスタムＧａｌＮＡｃリガンド、カスタムＬ８（アミン基）又は２’ＯＭｅ  ＲＮＡ官能化支持体をロードした制御された細孔ガラス（５００Å）であった。補助合成試薬、２’−Ｆ及び２’−Ｏ−メチルＲＮＡ及びデオキシホスホラミダイトは、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）及びＨｏｎｇｅｎｅ（中国）から入手した。カスタムＱ８、Ｑ３００ブロモヘキシル（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）及びＱ１８７  ＤＢＣＯ−ＴＥＧ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）は、対応するホスホラミダイトとして導入された。３’ＧａｌＮＡｃコンジュゲート一本鎖の合成は、ＧａｌＮＡｃ修飾ＣＰＧ支持体上で実施した。カスタムＣＰＧユニバーサル固体支持体をアンチセンス一本鎖の合成に使用した。全てのホスホラミダイト（アセトニトリル中０．１５Ｍ）のカップリング時間は、活性剤として５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール（ＥＴＴ）（アセトニトリル中０．２５Ｍ）を使用して１０分間であった。ホスホロチオエート結合は、ピリジン中の３−（（ジメチルアミノ−メチリデン）アミノ）−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−チオン（ＤＤＴＴ、（ＡＭ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ＣＡ，ＵＳＡ）の０．０９Ｍ溶液を使用して生成された。酸化時間は３分であった。全ての配列は、ＤＭＴ基を最終的に除去して合成された（「ＤＭＴオフ」）。
【０５８０】
固相合成が完了すると、オリゴリボヌクレオチドが固体支持体から切断され、３５℃で１６時間、５％ジエチルアミン９５％アンモニア水溶液で脱保護された。粗リガンドコンジュゲート及び非コンジュゲートオリゴヌクレオチドは、５０ｍＬ／分の流速で１３０分にわたり、２２〜４２％緩衝液Ｂの直線勾配で、ＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｓｕｐｅｒ  Ｑ−５ＰＷ支持体（ＴＯＳＯＨ  Ｃｏｒｐ．）を使用した陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＩＥＸ−ＨＰＬＣ）によって精製された（緩衝液Ａ：１０％ＣＨ３ＣＮ中０．０２Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ８．５及び緩衝液Ｂ：緩衝液Ａ＋１Ｍ  ＮａＢｒ）。全ての一本鎖を、８５％を超えるＨＰＬＣ（２６０ｎｍ）純度に精製し、次にＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をカスタムパックしたＡＰ−２ガラスカラム（２０×３００ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ）を使用したＡＫＴＡ  Ｐｒｉｍｅクロマトグラフィーシステムによるサイズ排除クロマトグラフィーで脱塩し、ヌクレアーゼを含まない滅菌水で溶出した。
【０５８１】
アジドは、ＮＨＳエステル合成後コンジュゲーション（クリックケミストリーツール）又は５’ヘキシルブロモホスホラミダイトからの樹脂上変換により導入した。ブロモヘキシル変換のために、支持体をアセトニトリルで洗浄し、真空下で乾燥させた。支持体をチューブに移し、ＮａＮ３をＤＭＦに添加した。支持体を１．３時間にわたり６５℃に加熱し、ＤＭＦで３回、ＤＣＭで３回洗浄した後、標準条件下で切断した。非アミダイトＤＢＣＯ修飾は、ＮＨＳエステル合成後コンジュゲーション（クリックケミストリーツール）により導入された。アジド及びＤＢＣＯ  ＮＨＳの両方のコンジュゲーションは、５０／５０アセトニトル０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ１１）ｖ／ｖ溶液中で３時間実施した。
【０５８２】
アニーリング：３本以下の一本鎖で構成される多重鎖構築物の場合、ＦＶＩＩ及びｍＴＴＲ一本鎖のアニーリングは、センス及びアンチセンス一本鎖の等モル混合物を混合することによって実施した。相補的な一本鎖を組み合わせた後、混合物を凍結乾燥して乾燥させた。次に、粉末を１ＸＰＢＳ緩衝液で再構成した。全ての場合において、非変性ＩＥＸ−ＨＰＬＣ法は、単一実体の多重鎖構築物に対応する単一のクロマトグラムピークの存在を示した。
【０５８３】
インビボ研究：全ての動物は病原体のない環境で飼育され、動物を含む全ての手順は、該当する地域、州及び連邦の規制に従って実施され、動物実験委員会（Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（７〜８週齢）は、Ｃｈａｒｌｅｓ  ＲｉｖｅｒＬａｂｓから入手した。Ｂｉｓ−ｓｉＲＮＡ化合物（ＦＶＩＩ及びＴＴＲを標的とする）を滅菌ＰＢＳで適切な濃度に希釈した。マウスは、０日目に１０ｍＬ／ｋｇ容量の皮下（ｓ．ｃ．）注射によりＰＢＳ又はＢｉｓ−ｓｉＲＮＡ化合物のいずれかを投与された。血液試料は、様々な時点（０日目［投与前］、７日目、１４日目、２１日目及び２８日目）での後眼窩採血によって動物から収集され、血清へと処理された（Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ  Ｓｅｒｕｍ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒ  Ｔｕｂｅｓ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）。第ＶＩＩ因子タンパク質の血清レベルは、活性ベースの発色アッセイ（Ｂｉｏｐｈｅｎ  ＦＶＩＩ、Ａｎｉａｒａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｓｏｎ，ＯＨ）を使用して決定された。ＴＴＲタンパク質の血清レベルは、マウスＴＴＲ  ＥＬＩＳＡを使用して決定された。表９に実験設計をまとめる。
【０５８４】
【表９】
2021523720.tif 000096
【０５８５】
マウスＴＴＲ血清タンパク質法：ＴＴＲ血清タンパク質は、市販の酵素結合免疫吸着アッセイ、４１−ＡＬＢＭＳ−Ｅ０１（ＡＬＰＣＯ、Ｓａｌｅｍ，ＮＨ）を、製造業者の説明書に従って使用して定量した。簡潔には、血清試料を１Ｘ  ＡＬＰＣＯキット希釈緩衝液で４０００倍に希釈した。８ポイントのマウスＴＴＲ標準曲線は、０〜１０００ｎｇ／ｍＬの範囲の２．５倍段階希釈を使用して作成された。標準物及び試料（１００  ｕＬ）をプレートに添加し、室温で３０分間インキュベートした。プレートを１Ｘ  ＡＬＰＣＯキット洗浄緩衝液で洗浄し、安定化緩衝液中の西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートしたアフィニティー精製抗プレアルブミン抗体と共に室温で２０分間インキュベートした。ＡＬＰＣＯキット１Ｘ洗浄緩衝液で洗浄した後、プレートを室温、暗所で１０分間、ｐＨ３．３でクエン酸緩衝液中の３，３’、５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）及び過酸化水素と共にインキュベートした。１ウェルあたり０．３ｍＬの硫酸１００μＬで反応をクエンチした。４０５ｎｍでの吸光度をＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダーで読み取り、Ｓｏｆｔｍａｘ  Ｐｒｏソフトウェアで計算した４パラメーター曲線（ｙ＝（Ａ−Ｄ）／（１＋（ｘ／Ｃ）＾Ｂ）＋Ｄ）にデータを適合させて、ｕｇ／ｍＬで表される血清ＴＴＲタンパク質レベルを決定した。各時点でのタンパク質レベルは、ビヒクル対照血清タンパク質値のそれぞれのグループ平均に対して正規化された。
【０５８６】
インビボ研究の結果：上記のように、２８日目まで毎週の時点で試料採取した。試料をＴＴＦ及びＦ７レベルについて分析し、混合物と比較した。結果を図１１及び１２に示す。図１１は経時的なＦ７ノックダウンを示し、図１２は経時的なＴＴＲノックダウンを示す。
【０５８７】
実施例７：アンモニア水溶液中のオリゴヌクレオチドを含有する５’−［Ｏ，Ｏ−ビス（ピバロイルオキシメチル）］−（Ｅ）−ビニルホスホネートの脱保護のためのスカベンジャー添加剤としてのＮ，Ｎ−ジエチルアミン
５’−（Ｅ）−ビニルホスホネート（ＶＰ）は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）における天然の５’−一リン酸の効果的な生物学的等価体である。ＶＰ−ｓｉＲＮＡの固相合成には、最適なオリゴヌクレオチド脱保護条件と組み合わせて適切に保護されたＶＰ−ホスホラミダイトの使用が必要である。標準のアンモニア水溶液脱保護条件に３％（ｖ）の原液ジエチルアミンを添加すると、５’−［Ｏ，Ｏ−ビス（ピバロイルオキシメチル）］（ＰＯＭ）で保護されたＶＰオリゴヌクレオチドのクリーンで迅速なワンステップ脱保護が可能になり、副反応及び不純物が最小限に抑えられ、ＶＰオリゴヌクレオチド合成の範囲を大幅に拡大する。
【０５８８】
近年、オリゴヌクレオチド（ＯＮ）ベースの治療法、特にＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）ベースの治療法は、様々な疾患適用に対して臨床的有用性が実証されている［（ａ）Ｓｅｌｖａｍ，Ｃ．，Ｍｕｔｉｓｙａ，Ｄ．，Ｐｒａｋａｓｈ，Ｓ．，Ｒａｎｇａｎｎａ，Ｋ．＆Ｔｈｉｌａｇａｖａｔｈｉ，Ｒ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｉＲＮＡ：Ｒｅｃｅｎｔ  ｔｒｅｎｄｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．９０，６６５−６７８（２０１７）；（ｂ）Ｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ａ．＆Ｃａｓｔａｎｏｔｔｏ，Ｄ．ＦＤＡ−Ａｐｐｒｏｖｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｉｎ  ２０１７．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２５，１０６９−１０７５（２０１７）；（ｃ）Ｔｉｔｚｅ−ｄｅ−Ａｌｍｅｉｄａ，Ｒ．，Ｄａｖｉｄ，Ｃ．＆Ｔｉｔｚｅ−ｄｅ−Ａｌｍｅｉｄａ，Ｓ．Ｓ．Ｔｈｅ  Ｒａｃｅ  ｏｆ  １０  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＲＮＡｉ−Ｂａｓｅｄ  Ｄｒｕｇｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍａｒｋｅｔ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．３４，１３３９−１３６３（２０１７）］。最近、遺伝性ＡＴＴＲアミロイドーシスを有する患者におけるパチシランのＡＰＯＬＬＯ第３相臨床試験の肯定的な結果により、患者にＲＮＡｉベースの治療法をもたらす見込みが現実化した［（ａ）Ａｄａｍｓ，Ｄ．，Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｄｕａｒｔｅ，Ａ．，Ｏ’Ｒｉｏｒｄａｎ，Ｗ．，Ｙａｎｇ，Ｃ．Ｃ．，Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｔ．，Ｋｒｉｓｔｅｎ，Ａ．，Ｔｏｕｒｎｅｖ，Ｉ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｈ．，Ｃｏｅｌｈｏ，Ｔ．，Ｂｅｒｋ，Ｊ．，Ｌｉｎ，Ｋ．Ｐ．，Ｓｗｅｅｔｓｅｒ，Ｍ．，Ｇａｎｄｈｉ，Ｐ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｇｏｌｌｏｂ，Ｊ．＆Ｓｕｈｒ，Ｏ．Ｂ．Ｐａｔｉｓｉｒａｎ，ａｎ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  ＲＮＡｉ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ＡＴＴＲ  ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ：ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｐｈａｓｅ  ３  ＡＰＯＬＬＯ  ｓｔｕｄｙ．ＥＵ  ＡＴＴＲ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２，２０１７，Ｐａｒｉｓ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｌｎｙｌａｍ．ｃｏｍ／ｗｐ−ｃｏｎｔｅｎｔ／ｕｐｌｏａｄｓ／２０１７／２０１１／ＥＵ−ＡＴＴＲ  ２０１７＿ＡＰＯＬＬＯＴＲＬ＿ＣＡＰＥＬＬＡ＿ＦＩＮＡＬ＿２０１２  Ｎｏｖ２０１７．ｐｄｆ（２０１７）；（ｂ）Ａｄａｍｓ，Ｄ．，Ｓｕｈｒ，Ｏ．Ｂ．，Ｄｙｃｋ，Ｐ．Ｊ．，Ｌｉｔｃｈｙ，Ｗ．Ｊ．，Ｌｅａｈｙ，Ｒ．Ｇ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｇｏｌｌｏｂ，Ｊ．＆Ｃｏｅｌｈｏ，Ｔ．Ｔｒｉａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｒａｔｉｏｎａｌｅ  ｆｏｒ  ＡＰＯＬＬＯ，ａ  Ｐｈａｓｅ  ３，ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｐａｔｉｓｉｒａｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ＡＴＴＲ  ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ．ＢＭＣ  Ｎｅｕｒｏｌ  １７，１８１（２０１７）］。ｓｉＲＮＡの化学的修飾は、代謝の不安定性、免疫刺激並びに全体的に不利な生体内分布及び薬物動態に対処することにより、薬物のような特性をもたらすために必要である［（ａ）Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．＆Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．Ｇ．Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｔｏ  ｈａｒｎｅｓｓ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｉＲＮＡｓ  ａｎｄ  ａｎｔａｇｏｍｉｒｓ．（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ＬＬＣ，２００８）；（ｂ）Ｓｈｅｎ，Ｘ．＆Ｃｏｒｅｙ，Ｄ．Ｒ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＲＮＡｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｘ１２３９（２０１７）］。これは、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）−ｓｉＲＮＡコンジュゲートの開発に特に影響を与え［Ｎａｉｒ，Ｊ．Ｋ．，Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ，Ｊ．Ｌ．Ｓ．，Ｃｈａｎ，Ａ．，Ｃｈａｒｉｓｓｅ，Ｋ．，Ａｌａｍ，Ｍ．Ｒ．，Ｗａｎｇ，Ｑ．，Ｈｏｅｋｓｔｒａ，Ｍ．，Ｋａｎｄａｓａｍｙ，Ｐ．，Ｋｅｌ’ｉｎ，Ａ．Ｖ．，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｓ．，Ｔａｎｅｊａ，Ｎ．，Ｏ’Ｓｈｅａ，Ｊ．，Ｓｈａｉｋｈ，Ｓ．，Ｚｈａｎｇ，Ｌ．，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓｌｕｉｓ，Ｒ．Ｊ．，Ｊｕｎｇ，Ｍ．Ｅ．，Ａｋｉｎｃ，Ａ．，Ｈｕｔａｂａｒａｔ，Ｒ．，Ｋｕｃｈｉｍａｎｃｈｉ，Ｓ．，Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｋ．，Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｔ．，ｖａｎ  Ｂｅｒｋｅｌ，Ｔ．Ｊ．Ｃ．，Ｍａｉｅｒ，Ｍ．Ａ．，Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．Ｇ．＆Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ−Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｓｉＲＮＡ  Ｌｏｃａｌｉｚｅｓ  ｉｎ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  Ｅｌｉｃｉｔｓ  Ｒｏｂｕｓｔ  ＲＮＡｉ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３６，１６９５８−１６９６１（２０１４）．］、臨床試験への急速な進展を可能にした［（ａ）Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｋ．，Ｗｈｉｔｅ，Ｓ．，Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，Ａ．，Ｂｅｔｔｅｎｃｏｕｒｔ，Ｂ．Ｒ．，Ｓｔｒａｈｓ，Ａ．，Ｃｌａｕｓｅｎ，Ｖ．，Ｗｉｊｎｇａａｒｄ，Ｐ．，Ｈｏｒｔｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｔａｕｂｅｌ，Ｊ．，Ｂｒｏｏｋｓ，Ａ．，Ｆｅｒｎａｎｄｏ，Ｃ．，Ｋａｕｆｆｍａｎ，Ｒ．Ｓ．，Ｋａｌｌｅｎｄ，Ｄ．，Ｖａｉｓｈｎａｗ，Ａ．＆Ｓｉｍｏｎ，Ａ．Ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｄｕｒａｂｌｅ  ＲＮＡｉ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ＰＣＳＫ９．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３７６，４１−５１（２０１７）；（ｂ）Ｐａｓｉ，Ｋ．Ｊ．，Ｒａｎｇａｒａｊａｎ，Ｓ．，Ｇｅｏｒｇｉｅｖ，Ｐ．，Ｍａｎｔ，Ｔ．，Ｃｒｅａｇｈ，Ｍ．Ｄ．，Ｌｉｓｓｉｔｃｈｋｏｖ，Ｔ．，Ｂｅｖａｎ，Ｄ．，Ａｕｓｔｉｎ，Ｓ．，Ｈａｙ，Ｃ．Ｒ．，Ｈｅｇｅｍａｎｎ，Ｉ．，Ｋａｚｍｉ，Ｒ．，Ｃｈｏｗｄａｒｙ，Ｐ．，Ｇｅｒｃｈｅｖａ−Ｋｙｕｃｈｕｋｏｖａ，Ｌ．，Ｍａｍｏｎｏｖ，Ｖ．，Ｔｉｍｏｆｅｅｖａ，Ｍ．，Ｓｏｈ，Ｃ．−Ｈ．，Ｇａｒｇ，Ｐ．，Ｖａｉｓｈｎａｗ，Ａ．，Ａｋｉｎｃ，Ａ．，Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｂ．＆Ｒａｇｎｉ，Ｍ．Ｖ．Ｔａｒｇｅｔｉ���ｇ  ｏｆ  Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｉｎ  Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ａ  ｏｒ  Ｂ  ｗｉｔｈ  ＲＮＡｉ  Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３７７，８１９−８２８（２０１７）；（ｃ）Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｔ．Ｓ．，Ｋａｒｓｔｅｎ，Ｖ．，Ｃｈａｎ，Ａ．，Ｃｈｉｅｓａ，Ｊ．，Ｂｏｙｃｅ，Ｍ．，Ｂｅｔｔｅｎｃｏｕｒｔ，Ｂ．Ｒ．，Ｈｕｔａｂａｒａｔ，Ｒ．，Ｎｏｃｈｕｒ，Ｓ．，Ｖａｉｓｈｎａｗ，Ａ．＆Ｇｏｌｌｏｂ，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒｏｏｆ  ｏｆ  Ｃｏｎｃｅｐｔ  ｆｏｒ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ−Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２５，７１−７８（２０１７）］。
【０５８９】
ＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡコンジュゲートでは、高いｉｎｖｉｖｏ効力と作用持続時間を達成するために、２’−Ｏ−メチル（ＯＭｅ）及び２’−デオキシ−２’−フルオロ（Ｆ）などのリボース修飾の使用が不可欠であった［（ａ）Ｆｏｓｔｅｒ，Ｄ．Ｊ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｃ．Ｒ．，Ｓｈａｉｋｈ，Ｓ．，Ｔｒａｐｐ，Ｃ．，Ｓｃｈｌｅｇｅｌ，Ｍ．Ｋ．，Ｑｉａｎ，Ｋ．，Ｓｅｈｇａｌ，Ａ．，Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．Ｇ．，Ｊａｄｈａｖ，Ｖ．，Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．，Ｋｕｃｈｉｍａｎｃｈｉ，Ｓ．，Ｍａｉｅｒ，Ｍ．Ａ．＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｓ．Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｓｉＲＮＡ  Ｄｅｓｉｇｎｓ  Ｆｕｒｔｈｅｒ  Ｉｍｐｒｏｖｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｏｆ  ＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２０１７．１０１２．１０２１（２０１８）；（ｂ）Ｎａｉｒ，Ｊ．Ｋ．，Ａｔｔａｒｗａｌａ，Ｈ．，Ｓｅｈｇａｌ，Ａ．，Ｗａｎｇ，Ｑ．，Ａｌｕｒｉ，Ｋ．，Ｚｈａｎｇ，Ｘ．，Ｇａｏ，Ｍ．，Ｌｉｕ，Ｊ．，Ｉｎｄｒａｋａｎｔｉ，Ｒ．，Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ，Ｓ．，Ｋｒｅｔｓｃｈｍｅｒ，Ｐ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｃ．Ｒ．，Ｇｕｐｔａ，Ｓ．，Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ，Ｊ．Ｌ．Ｓ．，Ｂｏｓｈａｒ，Ｊ．Ａ．，Ｊａｄｈａｖ，Ｖ．，Ｃｈａｒｉｓｓｅ，Ｋ．，Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｔ．，Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｋ．，Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．，Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．Ｇ．，Ａｋｉｎｃ，Ａ．，Ｈｕｔａｂａｒａｔ，Ｒ．＆Ｍａｉｅｒ，Ｍ．Ａ．Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｎ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４５，１０９６９−１０９７７（２０１７）］。しかし、実質的な化学修飾は、ｓｉＲＮＡの内因性５’−一リン酸化を妨げ得る。実際、Ｃｌｐ１キナーゼ媒介性ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖のリン酸化は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）のアルゴノート（Ａｇｏ２）タンパク質への効果的なローディングをもたらして、遺伝子サイレンシングを誘発する、重要なステップである［（ａ）Ｗｅｉｔｚｅｒ，Ｓ．＆Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｊ．Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＲＮＡ  ｋｉｎａｓｅ  ｈＣｌｐ１  ｉｓ  ａｃｔｉｖｅ  ｏｎ  ３’ｔｒａｎｓｆｅｒ  ＲＮＡ  ｅｘｏｎｓ  ａｎｄ  ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４４７，２２２−２２６（２００７）；（ｂ）Ｓｃｈｉｒｌｅ，Ｎ．Ｔ．，Ｋｉｎｂｅｒｇｅｒ，Ｇ．Ａ．，Ｍｕｒｒａｙ，Ｈ．Ｆ．，Ｌｉｍａ，Ｗ．Ｆ．，Ｐｒａｋａｓｈ，Ｔ．Ｐ．＆ＭａｃＲａｅ，Ｉ．Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ａｒｇｏｎａｕｔｅ−２  Ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  ａ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｉＲＮＡ  Ｇｕｉｄｅ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３８，８６９４−８６９７（２０１６）；（ｃ）Ｔｏｌｉａ，Ｎ．Ｈ．＆Ｊｏｓｈｕａ−Ｔｏｒ，Ｌ．Ｓｌｉｃｅｒ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ａｒｇｏｎａｕｔｅｓ．Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３，３６−４３（２００６）］。さら��、５’−一リン酸はリソソームコンパートメント内のホスファターゼによって急速に加水分解されるため、アンチセンス鎖への未修飾の５’−一リン酸の化学的導入は、このリン酸化の問題を回避しない［Ｌｉｍａ，Ｗ．Ｆ．，Ｐｒａｋａｓｈ，Ｔ．Ｐ．，Ｍｕｒｒａｙ，Ｈ．Ｍ．，Ｋｉｎｂｅｒｇｅｒ，Ｇ．Ａ．，Ｌｉ，Ｗ．，Ｃｈａｐｐｅｌｌ，Ａ．Ｅ．，Ｌｉ，Ｃ．Ｓ．，Ｍｕｒｒａｙ，Ｓ．Ｆ．，Ｇａｕｓ，Ｈ．，Ｓｅｔｈ，Ｐ．Ｐ．，Ｓｗａｙｚｅ，Ｅ．Ｅ．＆Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｓｉＲＮＡｓ  Ａｃｔｉｖａｔｅ  ＲＮＡｉ  ｉｎ  Ａｎｉｍａｌｓ．Ｃｅｌｌ  １５０，８８３−８９４（２０１２）］。最近、治療用ｓｉＲＮＡにおける使用のための幾つかのホスファターゼ安定リン酸模倣体が開発された［（ａ）Ｈａｒａｓｚｔｉ，Ｒ．Ａ．，Ｒｏｕｘ，Ｌ．，Ｃｏｌｅｓ，Ａ．Ｈ．，Ｔｕｒａｎｏｖ，Ａ．Ａ．，Ａｌｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｆ．，Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉａ，Ｄ．，Ｇｏｄｉｎｈｏ，Ｂ．Ｍ．，Ａｒｏｎｉｎ，Ｎ．＆Ｋｈｖｏｒｏｖａ，Ａ．５’−Ｖｉｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｔｉｓｓｕｅ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｓｉＲＮＡｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１７）；（ｂ）Ｐａｒｍａｒ，Ｒ．，Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ，Ｊ．Ｌ．Ｓ．，Ｌｉｕ，Ｊ．，Ｆｏｓｔｅｒ，Ｄ．Ｊ．，Ｂｒｉｇｈａｍ，Ｂ．，Ｔｈｅｉｌｅ，Ｃ．Ｓ．，Ｃｈａｒｉｓｓｅ，Ｋ．，Ａｋｉｎｃ，Ａ．，Ｇｕｉｄｒｙ，Ｅ．，Ｐｅｉ，Ｙ．，Ｓｔｒａｐｐｓ，Ｗ．，Ｃａｎｃｉｌｌａ，Ｍ．，Ｓｔａｎｔｏｎ，Ｍ．Ｇ．，Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．Ｇ．，Ｓｅｐｐ−Ｌｏｒｅｎｚｉｎｏ，Ｌ．，Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．，Ｍｅｙｅｒｓ，Ｒ．，Ｍａｉｅｒ，Ｍ．Ａ．＆Ｊａｄｈａｖ，Ｖ．５’−（Ｅ）−Ｖｉｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ：Ａ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｍｉｍｉｃ  Ｃａｎ  Ｉｍｐｒｏｖｅ  ｔｈｅ  ＲＮＡｉ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ−ＧａｌＮＡｃ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  １７，９８５−９８９（２０１６）；（ｃ）Ｐｒａｋａｓｈ，Ｔ．Ｐ．，Ｌｉｍａ，Ｗ．Ｆ．，Ｍｕｒｒａｙ，Ｈ．Ｍ．，Ｌｉ，Ｗ．，Ｋｉｎｂｅｒｇｅｒ，Ｇ．Ａ．，Ｃｈａｐｐｅｌｌ，Ａ．Ｅ．，Ｇａｕｓ，Ｈ．，Ｓｅｔｈ，Ｐ．Ｐ．，Ｂｈａｔ，Ｂ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．＆Ｓｗａｙｚｅ，Ｅ．Ｅ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ  ｓｔａｂｌｅ  ５’−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｎａｌｏｇｓ  ｔｈａｔ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｓｉＲＮＡ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４３，２９９３−３０１１（２０１５）  （ｄ）Ｚｌａｔｅｖ，Ｉ．，Ｆｏｓｔｅｒ，Ｄ．Ｊ．，Ｌｉｕ，Ｊ．，Ｃｈａｒｉｓｓｅ，Ｋ．，Ｂｒｉｇｈａｍ，Ｂ．，Ｐａｒｍａｒ，Ｒ．Ｇ．，Ｊａｄｈａｖ，Ｖ．，Ｍａｉｅｒ，Ｍ．Ａ．，Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．Ｇ．，Ｅｇｌｉ，Ｍ．＆Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．５’−Ｃ−Ｍａｌｏｎｙｌ  ＲＮＡ：Ｓｍａｌｌ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｗｉｔｈ  ５’−Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｉｏｉｓｏｓｔｅｒｅ  Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ  Ｇｅｎｅ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ．ＡＣＳ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １１，９５３−９６０（２０１６）］。それらの中で、（Ｅ）−ビニルホスホネート（ＶＰ）は、天然の５’−一リン酸の最も効果的な生物学的等価体であることが証明されている［（ａ）Ｅｌｋａｙａｍ，Ｅ．，Ｊｏｓｈｕａ−Ｔｏｒ，Ｌ．，Ｐａｒｍａｒ，Ｒ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｃ．Ｒ．，Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ，Ｊ．Ｌ．，Ｔｈｅｉｌｅ，Ｃ．Ｓ．＆Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．ｓｉＲＮＡ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ａｎ（Ｅ）−ｖｉｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ｍｏｉｅｔｙ  ａｔ  ｔｈｅ  ５  ｅｎｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｕｉｄｅ  ｓｔｒａｎｄ  ａｕｇｍｅｎｔｓ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  Ａｒｇｏｎａｕｔｅ−２．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４５，３５２８−３５３６（２０１７）；（ｂ）Ｐｒａｋａｓｈ，Ｔ．Ｐ．，Ｋｉｎｂｅｒｇｅｒ，Ｇ．Ａ．，Ｍｕｒｒａｙ，Ｈ．Ｍ．，Ｃｈａｐｐｅｌｌ，Ａ．，Ｒｉｎｅｙ，Ｓ．，Ｇｒａｈａｍ，Ｍ．Ｊ．，Ｌｉｍａ，Ｗ．Ｆ．，Ｓｗａｙｚｅ，Ｅ．Ｅ．＆Ｓｅｔｈ，Ｐ．Ｐ．Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ，５’−ｖｉｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ａｎｄ  ＧａｌＮＡｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｉＲＮＡ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２６，２８１７−２８２０（２０１６）］。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の５’末端に付加した場合、ＶＰは、インビボで代謝安定性の増強及び効力の増強を提供した。
【０５９０】
ＶＰ−ｓｉＲＮＡの効率的な固相合成には、最適なＯＮ脱保護条件と組み合わせて適切に保護されたＶＰ−ホスホラミダイトが必要である。ＶＰ−ｓｉＲＮＡ合成の第１の反復は、ＯＮ合成中の５’−（Ｏ，Ｏ−ジエチル）ＶＰホスホラミダイトの使用であった。しかし、２つのＶＰエチル基の除去には、ヨウ化トリメチルシリル及びメルカプトエタノールを使用して、固体支持体に付着したままのＯＮで実施される過酷な脱保護条件が必要であり、これにより、分解及び／又は副生成物が生じ、収率の低下につながる。別のＶＰ保護基である５’−［Ｏ，Ｏ−ビス（ピバロイルオキシメチル）］（ＰＯＭ）ＶＰは、標準的な固相合成との互換性がより高く、５’−ホスホネート修飾ＯＮの大規模合成を促進及び可能にし得る［Ｐａｒｍａｒ，Ｒ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｃ．Ｒ．，Ｍａｔｓｕｄａ，Ｓ．，Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ，Ｊ．Ｌ．，Ｔｈｅｉｌｅ，Ｃ．Ｓ．，Ｃｈａｒｉｓｓｅ，Ｋ．，Ｆｏｓｔｅｒ，Ｄ．Ｊ．，Ｚｌａｔｅｖ，Ｉ．，Ｊａｄｈａｖ，Ｖ．，Ｍａｉｅｒ，Ｍ．Ａ．，Ｅｇｌｉ，Ｍ．，Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．＆Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．Ｇ．Ｆａｃｉｌｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｇｅｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  ２’−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ５’−（Ｅ）−ａｎｄ  ５’−（Ｚ）−Ｖｉｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｉＲＮＡ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．ＤＯＩ：１０．１０２１／ａｃｓ．ｊｍｅｄｃｈｅｍ．７ｂ０１１４７（２０１８）］。
【０５９１】
結果及び考察
ＰＯＭ  ＶＰ脱保護の最適条件が本明細書において確立され、クリーンで迅速なワンステップ手順を提供し、副反応及び不純物を最小限に抑え、ＶＰ  ＯＮ合成の範囲を大幅に拡大する。（ｉ）アセトニトリル中の塩基溶液（例えば、ジエチルアミン又はピペリジン）の定常流による支持体結合ＰＯＭ  ＶＰ  ＯＮの処理［Ｃａｐａｌｄｉ，Ｄ．Ｃ．，Ｇａｕｓ，Ｈ．，Ｋｒｏｔｚ，Ａ．Ｈ．，Ａｒｎｏｌｄ，Ｊ．，Ｃａｒｔｙ，Ｒ．Ｌ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｍ．Ｎ．，Ｓｃｏｚｚａｒｉ，Ａ．Ｎ．，Ｌｏｗｅｒｙ，Ｋ．，Ｃｏｌｅ，Ｄ．Ｌ．＆Ｒａｖｉｋｕｍａｒ，Ｖ．Ｔ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ−Ｑｕａｌｉｔｙ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｄｒｕｇｓ．Ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ  ｔｏ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：  Ａｄｄｕｃｔ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｖｏｉｄａｎｃｅ．Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ７，８３２−８３８（２００３）］、その後の（ｉｉ）飽和（２８〜３０％−ｗ／ｖ）アンモニア水溶液（水酸化アンモニウム溶液）との固体支持体のインキュベーションを含む標準的な２ステップのＯＮ脱保護プロトコルが最初に適用された。ＰＯＭ  ＶＰ  ５’末端ヌクレオチドの存在は、塩基媒介性鎖切断を誘導することが見出された：５’末端ヌクレオチドは、ＶＰ化合物Ｉから失われ、所望の完全長ＶＰ化合物ＩＩＩの主要な不純物（−３１７ａｍｕ、約２０％）として、対応するＮ−１構造ＩＩに５’−一リン酸が付着したままとなる。スキーム３４は、脱保護スキーム並びに化合物Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩを示す。脱保護は、上記の（ｉ）及び（ｉｉ）の２ステッププロトコル又は７（下記）に示す条件を使用することによって行うことができる。
【化８６】
2021523720.tif 000097
【０５９２】
特定のいかなる理論にも拘束されることなく、末端５’−ヌクレオチドにＰＯＭ  ＶＰホスホノトリエステルが存在する場合、ＶＰホスホノトリエステル部分内で結果として生じる負電荷を非局在化する可能性があるため、その４’プロトンは特に塩基に対して不安定であると仮定される。これにより、脱離基が３’−Ｏ−リン酸であり、残りがＯＮである、β脱離反応が起こる。一方、支持体上ピペリジン処理を実施しなかった場合（スキーム３４、ステップ（ｉｉ）のみ）、Ｎ−１化合物ＩＩ（−３１７ａｍｕ）は観察されなかった。しかし、カラム上の塩基処理がない場合、リン酸保護シアノエチル基から放出されたアクリロニトリルを下のウラシル塩基構造ＡのＮ１位に付加することにより得られる、大量のアクリロニトリル付加物（＋５３ａｍｕ）が検出された。
【０５９３】
これらのアクリロニトリル付加物を回避する方法は、単一ステップのアンモニア処理を、アクリロニトリルの効果的なスカベンジャーとなると考えられる、より求核性の高い塩基（例えば、メチルアミン）に置き換えることである。しかし、より強力な求核性アミンを使用すると、脱ピリミジン化分解カスケードにおける中間のＣ−６位へのアミンの求核付加（構造Ｂ）によって得られる、別のウラシル塩基不純物が生成され得る［（ａ）Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ，Ｄ．Ｊ．，Ｔｉｍａｒ，Ｚ．，Ｍｙｅｒｓｏｎ，Ｊ．，Ｓｉｅｒｚｃｈａｌａ，Ａ．Ｂ．，Ｔｕｒｎｅｒ，Ｊ．，Ｆｅｒｒｅｉｒａ，Ｆ．，Ｋｕｐｉｈａｒ，Ｚ．，Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ，Ｇ．，Ｈｉｌｌ，Ｋ．Ｗ．，Ｐｏｗｅｌｌ，Ｊ．Ａ．，Ｓａｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．＆Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅｄ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ＲＮＡ  Ｕｓｉｎｇ  ２’−Ｏ−Ｔｈｉｏｎｏｃａｒｂａｍａｔｅ−Ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １３３，１１５４０−１１５５６（２０１１）；（ｂ）Ｓｈｅｔｌａｒ，Ｍ．Ｄ．，Ｈｏｍ，Ｋ．＆Ｖｅｎｄｉｔｔｏ，Ｖ．Ｊ．Ｐｈｏｔｏｈｙｄｒａｔｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｕｒｉｄｉｎｅ，２’−Ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ  ａｎｄ  ２’−Ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ  ｗｉｔｈ  Ａｍｉｎｅｓ  ａｔ  Ｎｅａｒ  Ｎｅｕｔｒａｌ  ｐＨ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ  ８９，８６９−８７７（２０１３）］。
【化８７】
2021523720.tif 000098
【０５９４】
チミン及びウラシルは、不純物としてＡ及びＢを生成するのに最も感受性の高い核酸塩基であると報告されている。構造Ａはウラシル（Ｙ＝Ｈ）又はチミン（Ｙ＝Ｍｅ）のＮ１−シアノエチル付加物であり、構造ＢはウラシルのＣ−６アミノ付加物である。「最悪の場合」のＯＮ−１、交互の２’−デオキシチミジン−２’−フルオロウリジン２０−ｍｅｒ（表９）が実験のために選択された。２’−デオキシチミジンは、アクリロニトリル付加に対して最も感受性の高いヌクレオチドであることがよく知られている［Ｕｍｅｍｏｔｏ，Ｔ．＆Ｗａｄａ，Ｔ．Ｎｉｔｒｏｍｅｔｈａｎｅ  ａｓ  ａ  ｓｃａｖｅｎｇｅｒ  ｏｆ  ａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４６，４２５１−４２５３（２００５）］一方、２’−フルオロウリジンは、メチルアミンなどの強アミン塩基によって容易に分解される。ＯＮ−１は、最適な条件をＰＯＭ  ＶＰ  ＯＮに変換する前に、核酸塩基不純物Ａ及びＢを狭く探索することに焦点を当てた実験を可能にした。
【０５９５】
制御された細孔ガラス（ＣＰＧ）固体支持体からのＯＮ−１の切断は、最初に４つの一般的に使用される脱保護条件を使用して実施された（表９、エントリー１〜４）：エントリー１：３５℃で２０時間、２８〜３０％アンモニア水溶液との直接インキュベーション；エントリー２：６０℃で１５分間、４０％ｗ／ｖメチルアミン水溶液とのインキュベーション；エントリー３：室温で３時間、１：１（ｖ／ｖ）のアンモニアとメチルアミン混合物（ＡＭＡ）とのインキュベーション；エントリー４：ＡＣＮ中５％ピペリジンのフローで１５分間にわたり３回ＣＰＧを洗浄することによる前処理の後、３５℃で２０時間、アンモニア水溶液とのインキュベーション。単一のアンモニアインキュベーション試料は、大量の＋５３ａｍｕアクリロニトリル付加物を示した（エントリー１、表１０）。一方、ＰＯＭで保護されたＶＰ  ＯＮの脱保護の現在の標準であるメチルアミンによる迅速な処理は、ウラシル（及びチミン）塩基へのメチルアミンの大量の付加物を示した（エントリー２、表１０）。同様の有意なメチルアミン付加物（ｃ．ａ．２０％）もＡＭＡ処理で観察された（エントリー３、表１０）。ＶＰ  ＯＮ脱保護（スキーム１）とは互換性がないが、ピペリジンで前処理した支持体条件（エントリー４、表１０）は、ＯＮ−１にアクリロニトリルもアミン付加物も示さず、本発明者らが将来の最適な脱保護条件を探索する上でエミュレートするベンチマークとして設定された。
【０５９６】
これらのベンチマーク研究に続いて、本発明者らは、アクリロニトリルを捕捉するために、カラム上のピペリジン処理を、アンモニア脱保護溶液への様々なアミンの直接的付加に置き換えることにした。この処理は、ＶＰ関連のＮ−１不純物を排除すると同時に、全ての核酸塩基付加物不純物を最小限に抑えるように設計されている。
【０５９７】
メチルアミン、ｎ−ブチルアミン、ｎ−プロピルアミン又はジエチルアミン（これらは全て容易に入手でき、安価である）は、３５℃で２０時間にわたりＯＮ−１を切断する間、スカベンジャー（３％、ｖ／ｖ）としてアンモニア水溶液に添加した（表９）。他のより疎水性の高いアミンは、本発明者らの以前の経験ではリン酸骨格に結合する傾向があり、精製中に分離することが難しいため、これらの研究に含まれなかった。さらに、前述のアクリロニトリルスカベンジャーであるニトロメタンは良好な結果を示したが、培地の色が濃くなり、分析及び精製が困難となった（補足情報に例）。観察された主な副産物（Ａ及びＢ）は、ＲＰ−ＨＰＬＣ／ＭＳ分析によって定量化された。滞留時間のシフトが明確であるため、アミン付加物のピークはＬＣ／ＭＳ分析で簡単に定量できる一方で、アクリロニトリル付加物は、主生成物のピークと共溶出する傾向があり、ＬＣ／ＭＳで測定された相対存在量のみ報告することができた（表１０）。
【０５９８】
【表１０】
2021523720.tif 000099
【０５９９】
これらの実験から、使用した他のアミンと比較して、３％ジエチルアミン（ＤＥＡ）は、生成される両方の核酸塩基付加物の量を最小限に抑えながら、生成物の純度及び収率の点で優れた結果をもたらすと判定された（表１０、エントリー５〜８）。これらの結果に基づいて、プロピルアミン及びブチルアミンはこれ以上考察しなかった。さらに、６０℃で５時間の３％ＤＥＡアンモニアとのインキュベーション（表１０、エントリー９）は、３５℃で２０時間のインキュベーションとほぼ同一の結果を提供し、必要に応じて、柔軟性及び脱保護時間の短縮を可能にした。３％ＤＥＡ溶液は、全体的に最も効果的であるが、アクリロニトリル付加物を完全には除去しなかった。したがって、本発明者らは、５％ＤＥＡ（ｖ／ｖ）溶液の増加により、３５℃及び６０℃でＯＮ−１によるこのような不純物が減少するかどうかを試験した（表１０、エントリー１０及び１１）。しかし、３％ＤＥＡ溶液で観察されたように、ほぼ区別できない結果が得られた。
【０６００】
次に、これらの同じ試験条件を、２’−Ｆ／ＯＭｅ化学修飾を有するオリゴヌクレオチド及びＰＯＭ保護ＶＰ（ＯＮ２、表１０）に適用した。この場合も、６０℃で１５分間のメチルアミン処理の以前の標準では、大量のメチルアミン付加物が示されたが（表１０、エントリー１２）、ピペリジンによる前処理は、Ｎ−１生成物を引き起こし（エントリー１３）、純粋なアンモニアは大量のアクリロニトリル付加物があった（表１０、エントリー１４）。スカベンジャーアミンを３％溶液（メチルアミン及びＤＥＡ）として試験した場合、アクリロニトリル付加物はほとんど存在せず、Ｎ−１＋リン酸塩は見られなかった（表１０、エントリー１５〜１６）。しかし、メチルアミンの場合にアミン付加物が観察されたのに対し、ＤＥＡ条件では検出可能な付加物は観察されなかった。表１１に示すように、アンモニア溶液中の３％ＤＥＡの結果は、ホスホロチオエート修飾の有無にかかわらず、他の幾つかの２’−Ｆ／ＯＭｅ修飾配列間で繰り返され、アクリロニトリル又はアミン付加物が形成されていないクリーンなプロファイルを示している。同様に、３５℃で２０時間と６０℃で５時間の脱保護を比較によると、ほぼ同一の結果が示され、したがって、必要に応じてより迅速な脱保護が可能となった。
【０６０１】
【表１１】
2021523720.tif 000100
【０６０２】
ＰＯＭで保護されたＶＰ部分は、標準的なオリゴヌクレオチド脱保護試薬を使用して容易に脱保護できる、安定したリン酸模倣体である。望ましくない副生成物を引き起こすジエチルアミン又はピペリジン溶液で前処理する代わりに、本明細書に記載のアンモニア水溶液中のＤＥＡの３％溶液を３５℃で２０時間又は６０℃で５時間の切断に使用して、後続のイオン交換又は逆相精製で良好な収率及び純度の粗ＯＮを得ることができる。本明細書で報告される条件は、従来の脱保護中に観察されるアクリロニトリル及びメチルアミン付加物を最小限に抑え、より高い収率を提供し、ＰＯＭ保護ＶＰを伴う又は伴わない他のオリゴヌクレオチドの一般的な脱保護として使用され得る。
【０６０３】
実施例８：ｓｉＲＮＡのスレオフラノシル核酸（ＴＮＡ）遺伝子サイレンシング活性
（３’−２’）ホスホジエステル骨格（ＴＮＡ）を有するα−（Ｌ）−スレオフラノシル核酸は、代替の核酸である［Ｓｃｈｏｎｉｎｇ，Ｋ．Ｕ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００，２９０，１３４７］。ＴＮＡの糖リン酸骨格と、比較のためにＲＮＡを、図１３に示す。ＴＮＡは、非天然の４炭素のトレオース糖で構成されており、安定した逆平行のワトソン−クリック二本鎖構造の形成を可能にする固有の糖リン酸骨格を有する。ＴＮＡはまた、ＤＮＡ及びＲＮＡの相補鎖との効率的なクロスペアリングを示し、生物学的に適切な条件下で強力なヌクレアーゼ安定性を示す。ＴＮＡは、その塩基対形成特性及び構造的特徴に関してよく研究されてきたにもかかわらず［（ａ）Ｗｉｌｄｓ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００２，１２４，１３７１６．（ｂ）Ｐａｌｌａｎ，Ｐ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００３，４２，５８９３．（ｃ）Ａｎｏｓｏｖａ  Ｉ．ｅｔ  ａｌ．ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ２０１６，１７，１７０５．（ｄ）Ｅｂｅｒｔ，Ｍ．Ｏ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００８，１３０，１５１０５．（ｅ）Ｓｃｈｏｎｉｎｇ，Ｋ．Ｕ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ２００２，８５，３９９］、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）におけるその潜在的な用途についてはほとんど知られていない。
【０６０４】
例示的なｓｉＲＮＡ修飾は、５’−メチル［Ｋｅｌ’ｉｎ，Ａ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１６，８１，２２６１］、ｓｉＲＮＡ−ＧａｌＮＡｃコンジュゲート［（ａ）Ｎａｉｒ，Ｊ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１４，１３６，１６９５８．（ｂ）Ｍａｔｓｕｄａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２０１５，１０，１１８１．（ｃ）Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．Ｇ．ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ２０１５，１６，９０３．（ｄ）Ｎａｉｒ，Ｊ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１７，４５，１０９６９．（ｅ）Ｍｅａｄｅ，Ｂ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４，３２，１２５６］、４’−修飾［（ａ）Ｌｉｂｏｓｋａ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１１，９，８２６１．（ｂ）Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｍｏｎｔｅｒｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２０１５，１０，２０１６．（ｃ）Ｍａｌｅｋ−Ａｄａｍｉａｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１７，１３９，１４５４２．（ｄ）Ｍａｌｅｋ−Ａｄａｍｉａｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１８，ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓ．ｊｏｃ．８ｂ０１３２９．（ｅ）Ｈａｒｐ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１８，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｙ７０３］、ＧＮＡ［（ａ）Ｓｃｈｌｅｇｅｌ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１７，１３９，８５３７．（ｂ）Ｊａｎａｓ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２０１８，９，７２３］及びビニルホスホネート［（ａ）Ｐａｒｍａｒ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ２０１６，１７，９８５．（ｂ）Ｅｌｋａｙａｍ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１７，４５，３５２８．（ｃ）Ｐａｒｍａｒ，Ｒ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ  ２０１８，６１，７３４．（ｄ）Ｓｃｈｉｒｌｅ，Ｎ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１６，１３８，８６９４］である。
【０６０５】
ＴＮＡホスホラミダイト構成要素は、スキーム３５に示されるように最適化された合成条件を使用して、合成し、ｓｉＲＮＡに組み込むことができる［Ｓａｕ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２０１６，８１，２３０２］。オリゴヌクレオチド代謝安定性、二本鎖熱安定性及びｓｉＲＮＡのインビトロ遺伝子サイレンシング活性に対するＴＮＡ組み込みの効果を評価した。
【化８８】
2021523720.tif 000101
【０６０６】
５−ＭｅＣ−ＴＮＡ（化合物２）の合成：ＴＮＡ構成要素５−ＭｅＣ−ＴＮＡの調製例をスキーム３６に示す。
【化８９】
2021523720.tif 000102
化合物２の合成：ＣＨ２Ｃｌ２（４０ｍＬ）中の化合物１（５．００ｇ、７．８９ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（４．１３ｍＬ、２３．７ｍｍｏｌ）及び２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイト（２．１１ｍｌ、９．４７ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。反応混合物を室温にし、３時間撹拌した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）で希釈し、次に、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗物質をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中０〜３３％ＥｔＯＡｃ）で精製して、化合物２（５．９０ｇ、７．０７ｍｍｏｌ、９０％、Ｒｆ＝０．３６、ヘキサン中３３％ＥｔＯＡｃで展開）を淡黄色の泡状物として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  １３．４０（ｓ，１Ｈ），８．３０（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．８３−７．０９（ｍ，１３Ｈ），６．９４−６．６８（ｍ，４Ｈ），５．８７−５．５９（ｍ，１Ｈ），４．３０−４．２４（ｍ，１Ｈ），４．１５−４．０５（ｍ，２Ｈ），３．９１−３．４７（ｍ，１３Ｈ），２．７２−２．３３（ｍ，３Ｈ），１．２９−０．９３（ｍ，１２Ｈ）．３１Ｐ  ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）：δ  １５２．９８，１５１．７３．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）：δ  １８０．２４，１６１．７９，１５９．８８，１５９．８５，１４８．６０，１４５．８８，１４０．４４，１３８．４１，１３６．８１，１３６．７５，１３６．７２，１３６．５５，１３３．３５，１３０．９３，１３０．８５，１３０．８１，１３０．５４，１２９．１９，１２９．１７，１２９．１３，１２８．８０，１２８．７０，１２７．９９，１２７．９７，１１９．５８，１１９．３２，１１８．２７，１１４．５８，１１４．５１，１１４．４８，１１０．４４，１１０．３４，９３．１３，９３．０７，９２．８８，９２．８６，８９．０９，８９．０３，８１．９８，８１．８４，８１．７２，７８．５１，７８．４６，７８．１７，７８．１５，７６．４６，７６．３４，５９．６４，５９．４８，５９．４５，５９．３０，５５．９５，５５．９３，４４．４２，４４．３１，４４．２４，４４．１４，２４．９０，２４．８７，２４．８３，２４．８２，２４．７７，２４．７３，２４．６８，２０．８７，２０．８１，２０．７２，２０．６６，１３．８０，１３．７８．
【０６０７】
３’又は５’特異的エキソヌクレアーゼに対する修飾オリゴヌクレオチドの安定性：オリゴヌクレオチドは、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．２）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２又は５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．５）のいずれか（１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２は、３’−又は５’−特異的エキソヌクレアーゼのそれぞれに対する安定性を評価するため）の中で、最終濃度０．１ｍｇ／ｍＬで調製した。１ｍＬ／分の流量で７．５分間にわたる３７〜５２％の移動相（１Ｍ  ＮａＢｒ、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ１１、１５％ＭｅＣＮ；固定相：２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５％ＭｅＣＮ、ｐＨ１１）の勾配を使用したＩＥＸ  ＨＰＬＣ（ｄｉｏｎｅｘ  ＤＮＡＰａｃ  ＰＡ２００，４×２５０ｍｍ）による分析の前に、エキソヌクレアーゼ（３’−安定性について１５０ｍＵ／ｍＬ  ＳＶＰＤＥ又は５’−安定性について５００ｍＵ／ｍＬホスホジエステラーゼＩＩ）を直ちに添加した。所与の時点で試料を最大２４時間分析した。完全長オリゴヌクレオチドの量は、Ａ２６０での曲線下面積として決定した。完全長オリゴヌクレオチドのパーセントは、ｔ＝０での曲線下面積で割り、１００を掛けることによって計算した。酵素の活性は、末端ホスホロチオエート結合を有するオリゴデオキシチミジレートを含めることにより、各実験について検証した（それぞれ、３’−又は５’−エキソヌクレアーゼ活性について５’−Ｔ１９・Ｔ又は５’−Ｔ・Ｔ１９）。酵素の各アリコートは、実験の直前に解凍した。半減期は、一次速度論に適合させることによって決定した。
【０６０８】
３’−エキソヌクレアーゼに対するＴＮＡ修飾オリゴヌクレオチドの安定性の結果を図１４に示す。Ｔ−ＴＮＡ（オリゴ５）の単一組み込みは、単一のＰＳ結合３’−ｄＴｓｄＴ（オリゴ１）と比較した場合、約５倍の安定性の改善を示した。Ｔ−ＴＮＡ（オリゴ７）の二重組み込みは、３’−ｄＴｓｄＴと比較した場合、３’−エキソヌクレアーゼに対して８倍を超える耐性を有するＰＯ結合の有意な安定化を提供した。ＴＮＡ−Ｔは、２’−Ｆ−Ｕと比較して顕著な安定性を示した（オリゴ７対３）。
【０６０９】
５’−エキソヌクレアーゼに対するＴＮＡ修飾オリゴヌクレオチドの安定性の結果を図１５に示す。Ｔ−ＴＮＡは、単一のＰＳ結合（５’−ｄＴｓｄＴ）と比較して、ホスホジエステラーゼＩＩによる分解に対して１０倍を超える耐性を有するＰＯ結合（オリゴ１０）の有意な安定化を提供する。ＰＳ結合（オリゴ１１）と組み合わせたＴ−ＴＮＡは、これらの条件下での分解に対して著しく耐性がある（２４時間で約４％の分解）。
【０６１０】
ＵＶ熱融解温度の決定：熱融解温度は、温度上昇（１℃／分）に伴うＡ２６０を監視することにより、１×ＰＢＳ（［ＮａＣｌ］＝１３７ｍＭ、［ＫＣｌ］＝２．７ｍＭ、［Ｎａ２ＨＰＯ４］＝１０ｍＭ、［ＫＨ２ＰＯ４］＝１．８ｍＭ、ｐＨ７．４）中の両鎖の等モル濃度（２．５μＭ）で測定した。値は一次導関数の最大値として報告され、少なくとも２回の実験の平均である。結果を表１２及び１３に示す。ＴＮＡは、ＤＮＡのわずかな不安定化と、ＲＮＡのより大きい不安定化を示した。構造ｘ及びｙを次に示す：
【化９０】
2021523720.tif 000103
【０６１１】
【表１２】
2021523720.tif 000104
【０６１２】
【表１３】
2021523720.tif 000105
【０６１３】
Ｔｔｒ  ｍＲＮＡ定量化のためのＲＴ  ｑＰＣＲ：初代マウス肝細胞（ＰＭＨ）は、１０％ウシ胎児血清を含むＷｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ培地で培養した。ＲＮＡｉＭＡＸ試薬を使用した細胞のトランスフェクションは、製造業者の推奨プロトコルに従って行われた。したがって、トランスフェクションの直前に細胞を解凍し、次に約５０００細胞／ウェルのシード密度で３８４ウェルプレートにプレーティングした。前インキュベートした脂質／ｓｉＲＮＡ複合体（０．１μＬ  ＲＮＡｉＭａｘ、ｓｉＲＮＡ、５μＬ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中１５分間）を３８４ウェルコラーゲンコーティングプレート（ＢｉｏＣｏａｔ；Ｃｏｒｎｉｎｇ）に添加し、細胞を３７℃で２０時間、５％ＣＯ２の雰囲気中でインキュベートした。１０〜０．０３６ｎＭの範囲の８つの６倍段階希釈物を使用して、用量反応実験を実施した。細胞を洗浄及び溶解する前に培地を除去した。製造業者のプロトコルに従ってＤｙｎａｂｅａｄｓ  ｍＲＮＡ分離キットを使用して、ＲＮＡを抽出し、続いてＡＢＩ高容量ｃＤＮＡ逆転写キットで逆転写した。定量化はリアルタイムＰＣＲによって行われ、ｃＤＮＡ（２μＬ）は、３８４ウェル５０プレートの１ウェルあたり０．５μＬのマウスＧａｐｄｈ  ＴａｑＭａｎプローブ、０．５μＬのＴｔｒ  ＴａｑＭａｎプローブ及び５μＬのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ４８０プローブマスターミックスを含有するマスターミックスに添加した。リアルタイムＰＣＲは、ΔΔＣｔ（ＲＱ）アッセイを使用してＡＢＩ  ７９００ＨＴＲＴ−ＰＣＲシステムで実行された。各二本鎖及び濃度は、４つの生物学的複製で試験した。相対倍率変化を計算するため、リアルタイムデータをΔΔＣｔ法を用いて分析し、非特異的ｓｉＲＮＡ  １０ｎＭをトランスフェクトした細胞を用いて実施したアッセイに対して正規化した。ＩＣ５０値は、ＸＬＦｉｔを使用した４パラメーター適合モデルを使用して計算された。
【０６１４】
図１６は、インビトロのｓｉＲＮＡ活性に対する単一のＴＮＡヌクレオチドの組み込みの影響を示す。図１７は、インビトロのｓｉＲＮＡ活性に対する単一のＴＮＡ塩基対の組み込みの影響を示す。図１８は、インビトロ遺伝子サイレンシングアッセイの用量反応曲線を示す。
【０６１５】
インビボスクリーニング：全ての試験は、適用可能な場合、地方、州及び連邦規制に準じたプロトコルを用いて実施され、動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。動物は、ＰＢＳ中１０μＬ／ｇの注射量として調製された１ｍｇ／ｋｇ  ｓｉＲＮＡの単回の肩甲骨下皮下注射を受けた。投与前又は投与後の示された時間に、動物をイソフルランで麻酔し、後眼窩採血によって血液を得た。ＴＴＲタンパク質は、全血から分離された血清からのＥＬＩＳＡによって定量化された。ＥＬＩＳＡは、血清試料を３０２５倍に希釈した後、製造業者のプロトコル（ＡＬＰＣＯ、４１−ＰＡＬＭＳ−Ｅ０１）に従って実行した。データは、採血前のＴＴＲレベルに対して正規化した。全ての試料は二重に分析され、各データポイントは各コホート内の全てのマウスの平均である（ｎ＝３）。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍでの多重比較のために、Ｔｕｋｅｙ事後検定を用いた両方向ＡＮＯＶＡを使用してデータを分析した。
【０６１６】
インビボスクリーニングの結果は図１９及び２０に示され、血清ＴＴＲレベルでＴＮＡ修飾ｓｉＲＮＡ二本鎖を使用したマウスにおけるインビボの遺伝子サイレンシングの効果を示す。図１９は結果を示す折れ線グラフであり、図２０は結果を示す棒グラフである。
【０６１７】
Ｔ−ＴＮＡの単回組み込みにより、３’末端と５’末端の両方でＰＯ結合が大幅に安定化され、単一のＰＳ結合と比較した場合、それぞれ約５倍及び１０倍の改善を有する。モデル配列を使用したＴｍ研究は、ＴＮＡが、ＤＮＡのわずかな不安定化と、ＲＮＡのより大きい不安定化を示すことを示した。単一のＴＮＡヌクレオチドをｓｉＲＮＡ二本鎖のシード領域に組み込むと、インビトロで同様のレベルのＴＴＲ  ｍＲＮＡのノックダウンが生じた。さらに、シード領域内にＴＮＡ塩基対を含有するｓｉＲＮＡは、対応する親ｓｉＲＮＡと同等のノックダウンをインビトロで示した。インビボ遺伝子サイレンシングは、単一のＴＮＡ置換を含む二本鎖のインビトロの結果とよく相関し、構造モデルは、ＴＮＡがＡｇｏ２に結合した二本鎖によく適応していることを示唆している。ｈＡｇｏ２に結合したＴＮＡの構造モデルを図２１に示す。
【０６１８】
実施例９：５’−（Ｒ）及び（Ｓ）−メチルグアノシンを含有するオリゴヌクレオチド構成要素。
ｓｉＲＮＡ鎖を構成するヌクレオシドモノマーの化学修飾は、効力、熱力学的安定性を調節し、これらの核酸ベースの薬剤の生体安定性を高めることができる。それらは、ｓｉＲＮＡのオフターゲット効果を低減する可能性もある。立体異性的に純粋な５’−Ｃ−メチル２’−デオキシ及び２’−Ｏ−メチル及び２’−フルオロ修飾ヌクレオシドを合成し、これらのモノマーをｓｉＲＮＡに組み込んだ。５’−Ｃ−メチルピリミジンヌクレオシドは、対応する適切に保護された２’修飾又は２’−デオキシヌクレオシド前駆体から調製された［Ｋｅｌ’ｉｎ，Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１６，８１，２２６１−２２７９］。２’−修飾５’−Ｃ−メチルピリミジン含有ｓｉＲＮＡは、５’−Ｃ−メチルデオキシ残基を有するｓｉＲＮＡよりも優れたエキソヌクレアーゼ安定性を示した。５’−（Ｒ）−及び（Ｓ）−メチルグアノシン構成要素の合成も本明細書において報告されている。５’−Ｃ−メチルグアノシンは、スキーム３７に示すように、過去にＢｅｉｇｅｌｍａｎらによってＬ−ラムノースから開始して合成された［Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ，Ｋａｒｐｅｉｓｋｙ，ａｎｄ  Ｕｓｍａｎ，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １９９５，１４，９０１］。そのアプローチとは対照的に、本発明者らはグアノシンから出発し、グアノシンは、スキーム３８に示すように、適切に３’保護され、酸化され、５’位でメチル化された。純粋な（Ｒ）及び（Ｓ）異性体を単離し、対応するホスホラミダイト、制御された細孔ガラス（ＣＰＧ）及び三リン酸を作製するために使用した。図２２に示すように、様々な５’−（Ｒ）−及び（Ｓ）−メチルグアノシン構成要素がこれらの方法で合成された。ｓｉＲＮＡ鎖を構成するヌクレオシドモノマーの化学修飾は、効力を調節することができる。
【化９１】
2021523720.tif 000106
【０６１９】
スキーム３７の試薬及び条件は次の通りである：（ｉ）Ｈ２ＳＯ４、ＣｕＳＯ４／アセトン、室温（ｉｉ）ＴｓＣｌ／ピリジン、０℃〜室温（ｉｉｉ）ＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨ、０℃〜室温。５−（Ｓ）−異性体は、５−（Ｒ）−異性体３から光延反応により合成された。５’−（Ｒ）−Ｃ−Ｍｅで修飾されたＡ、Ｇ及びＣを使用して、ハンマーヘッド型リボザイムを修飾した。修飾リボザイムは、野生型リボザイムと同様の活性を有していた。
【化９２】
2021523720.tif 000107
【０６２０】
スキーム３８について使用される試薬及び条件は次の通りである：（ｉ）１）ＴＭＳＣｌ／ピリジン、０℃〜室温、１時間。２）ｉ−ＢｕＣｌ／ピリジン、０℃〜室温、一晩；９３％。（ｉｉ）デス・マーチン・ペルヨージナン／ＤＣＭ、０℃〜室温、２時間。（ｉｉｉ）ＭｅＭｇＢｒ／ＤＣＭ、０℃、３０分間；９及び１９の混合物として２ステップ３３％。９と１９は分離できない。（ｉｖ）ＴＢＤＰＳＣｌ、イミダゾール／ＤＭＦ、室温、一晩；１０について１７％、２０について２３％。
【０６２１】
オリゴヌクレオチド内の５’−Ｃ−メチル−ヌクレオシドの分子モデリングからの構造結果を図２３に示す。図２３に示すように、（Ｒ）−異性体は、高度に水和された負の静電分極の極性領域に突出しており（青球）、リン酸の水和に干渉（フラッシュ）し、リン酸骨格（矢印）との立体衝突に関与する。メチル基の立体効果による摂動は、（Ｓ）−異性体よりも（Ｒ）−異性体において顕著である。
【０６２２】
実施例１０：５’−ヌクレアーゼ及び３’−ヌクレアーゼの安定性に対する５’−Ｃ−メチルグアノシン修飾の効果
５’−ヌクレアーゼの安定性：エナンチオマー的に純粋な（Ｒ）−及び（Ｓ）−５’−Ｃ−メチル（Ｃ５’−Ｍｅ）グアノシン置換ヌクレオシドの５’−エキソヌクレアーゼ安定性を評価するために、ＰＯ又はＰＳ結合による１つの修飾ヌクレオチドにより、ｄＴ２０テンプレート配列を５’末端で修飾した（表１４）。化合物の構造を、比較のためにグアノシンと共に以下に示す。
【化９３】
2021523720.tif 000108
【０６２３】
ＰＳ結合を有する５’末端ｄＴ及びＰＯ又はＰＳ結合を有する５’末端グアノシン（Ｇ）を有するｄＴ２０テンプレートを対照として使用した。ＯＮをホスホジエステラーゼ−ＩＩ（５００ｍＵ／ｍＬ）とインキュベートし、各修飾ＯＮの半減期（Ｔ１／２）を、時間の関数としての全長ＯＮのＨＰＬＣベースの定量化によって決定した。結果を表１４にまとめ、ＨＰＬＣ安定性プロファイルを、ＰＯ又はＰＳ結合を有する、グアノシン及び（Ｒ）又は（Ｓ）−５’−Ｃ−メチルグアノシン（Ｃ５’−ＭｅＧ）で５’末端が修飾されたｄＴ２０の、５’エキソヌクレアーゼ−ホスホジエステラーゼＩＩとのインキュベーション時の時間の関数としての減衰曲線を示す、図２４Ａ及び２４Ｂに示す。図２４Ａは、以下の条件に対するものである：ａ）酵素濃度５００ｍＵ／ｍＬ、オリゴ濃度０．１ｍｇ／ｍＬ、５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ６．５）：１０Ｍｍ  ＭｇＣｌ２。図２４Ｂは、以下の条件に対するものである：酵素濃度１００ｍＵ／ｍＬ、オリゴ濃度０．１ｍｇ／ｍＬ、５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ６．５）：１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２。完全長ＯＮのパーセンテージは、所与の時点での完全長ＯＮに対応するピーク下面積を、ｔ＝０での完全長で除し、１００を掛けることによって計算される。
【０６２４】
ＰＯ結合によりｄＴ１９の５’末端に結合した全てのＯＮは、ＰＳ結合を有するｄＴ残基と比較して安定性が低く、ＰＥ−ＩＩとのインキュベーションの際、最初の時点で分解された。５’末端にグアニンを有する全てのＯＮは、ｄＴｐｓｄＴ１９と比較してより安定していた。ＰＳで結合された単一の（Ｒ）−５’Ｍｅ−Ｇにより修飾されたＯＮは、２４時間まで劣化を示さず、一方、（Ｓ）−５’−Ｃ−メチル−Ｇは、対照Ｇと比較して、７２時間及び４１時間のＴ１／２値でそれぞれより安定であった。ＰＯ結合を介して結合した（Ｒ）及び（Ｓ）−５’−Ｃ−メチル異性体の安定性の違いを見出すため、ＰＥ−ＩＩの濃度を下げて（１００ｍＵ／ｍＬ）同様の実験を行った。結果を表１４にまとめ、ＨＰＬＣ安定性プロファイルを図２４Ｂに示す。（Ｒ）−及び（Ｓ）−５’−Ｃ−Ｍｅ−グアノシン及び対照Ｇについて、同様の傾向が観察された。Ｇ及び（Ｓ）−５’−Ｃ−メチル−Ｇ異性体は、ＰＥ−ＩＩの濃度を下げたインキュベーション時、最初の時点までに分解された一方、（Ｒ）−５’−Ｃ−メチル−Ｇ異性体は、４．３時間のＴ１／２値で安定であった。ｄＴｐｓｄＴ１９は、この低下した濃度で最も安定した、５３時間のＴ１／２値を有するオリゴである。
【０６２５】
【表１４】
2021523720.tif 000109
【０６２６】
３’−ヌクレアーゼの安定性：エナンチオマー的に純粋な（Ｒ）−及び（Ｓ）−５’−Ｃ−メチル（Ｃ５’−Ｍｅ）グアノシン置換ヌクレオシドの３’−エキソヌクレアーゼ安定性を評価するために、ＰＯ又はＰＳ結合による１つ又は２つの修飾ヌクレオチドにより、ｄＴ２０テンプレート配列を３’末端で修飾した（表１４）。ＰＳ結合を有する３’末端ｄＴ及びＰＯ又はＰＳ結合を有する３’末端グアノシン（Ｇ）を有するｄＴ２０テンプレートを対照として使用した。ＯＮを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）：１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２の存在下でＳＶＰＤ（ホスホジエステラーゼ−Ｉ）（７５ｍＵ／ｍＬ）とインキュベートし、各修飾ＯＮの半減期（Ｔ１／２）を、時間の関数としての全長ＯＮのＨＰＬＣベースの定量化によって決定した。結果を表１４にまとめ、ＨＰＬＣ安定性プロファイルを図２５Ａ及び２５Ｂに示す。図２５Ａ及び２５Ｂは、グアノシン及び（Ｒ）又は（Ｓ）−５’−Ｃ−メチルグアノシン（Ｃ５’−ＭｅＧ）で３’末端が修飾されたｄＴ２０の、ヘビ毒ホスホジエステラーゼとのインキュベーション時の時間の関数としてのＨＰＬＣ安定性プロファイルを示す。図２５Ａは、ｄＴと修飾ヌクレオシドとの間のＰＯ又はＰＳ結合による単一組み込みの場合であり、図２５Ｂは、２つの修飾ヌクレオシド間のＰＯ及びＰＳ結合による二重組み込みの場合である。
【０６２７】
２’−Ｆ−Ｕ−２’−Ｆ−Ｕにより３’末端で修飾されたｄＴ２０と比較して、５’−（Ｓ）−Ｃ−Ｍｅ−２’−Ｆ−Ｕ及び５’−（Ｒ）−Ｃ−Ｍｅ−２’−Ｆ−Ｕは、より高い耐性を３’−エキソヌクレアーゼに付与した。（Ｓ）異性体は（Ｒ）異性体よりも耐性が高かった［Ｋｅｌ’ｉｎ，Ａ．Ｖ．；Ｚｌａｔｅｖ，Ｉ．；Ｈａｒｐ，Ｊ．；Ｊａｙａｒａｍａｎ，Ｍ．；Ｂｉｓｂｅ，Ａ．；Ｏ’Ｓｈｅａ，Ｊ．；Ｔａｎｅｊａ，Ｎ．；Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｒ．Ｍ．；Ｋｈａｎ，Ｓ．；Ｃｈａｒｉｓｓｅ，Ｋ．；Ｍａｉｅｒ，Ｍ．Ａ．；Ｅｇｌｉ，Ｍ．；Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．Ｇ．；Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１６，８１，２２６１］。５’−（Ｓ）−Ｃ−Ｍｅ−Ｇ及び５’−（Ｒ）−Ｃ−Ｍｅ−Ｇは、Ｂｅｉｇｅｌｍａｎらによって報告され、改変リボザイム活性が評価された［Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ，Ｌ．；Ｋａｒｐｅｉｓｋｙ，Ａ．；Ｕｓｍａｎ，Ｎ．Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １９９５，１４，９０１］。例としてグアニンを使用したｓｉＲＮＡにおけるこの修飾の有用性を評価した。図２６は、ヘビ毒ホスホジエステラーゼとのインキュベーション時に、２つの５’−（Ｒ）−Ｃ−Ｍｅ−２’−Ｆ−Ｕ又は５’−（Ｓ）−Ｃ−Ｍｅ−２’−Ｆ−Ｕヌクレオチド（構造は下に示す）により３’末端で修飾された、ｄＴ１８のＨＰＬＣ分析結果を時間の関数で示す。ｄＴと修飾ヌクレオチドとの間にホスホロチオエート（ＰＳ）結合が存在した。
【化９４】
2021523720.tif 000110
【０６２８】
【表１５】
2021523720.tif 000111
【０６２９】
特定の（Ｒ）−異性体及び（Ｓ）−異性体中間体に由来する構成要素：スキーム３９は、（Ｒ）−異性体中間体１０及び（Ｓ）−異性体中間体２０に由来する構成要素を示す。スキームで使用される試薬及び条件は次の通りである：（ｉ）８０％ＴＦＡ／ＤＣＭ水溶液、０℃〜室温、一晩；１１について８３％、２１について７０％。（ｉｉ）Ｂｚ２Ｏ、ＤＭＡＰ／ピリジン、室温、一晩；１２、２２について９９％。（ｉｉｉ）ＴＨＦ中の１Ｍ  ＴＢＡＦ／ＴＨＦ、室温、一晩；１３について８７％、２３について９４％。（ｉｖ）ＤＭＴｒＣｌ、ＡｇＮＯ３／ピリジン−ＴＨＦ、室温、一晩；１４について９８％、２４について９８％。（ｖ）Ｈ２Ｏ中１Ｍ  ＮａＯＨ／ＴＨＦ−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ、０℃、３０分；１５、２５について９６％。（ｖｉ）ＴＢＳＣｌ、ＡｇＮＯ３／ＴＨＦ−ピリジン、室温、一晩；１６について５０％、２６について５３％。（ｖｉｉ）ｉ−Ｐｒ２ＮＰ（Ｃｌ）Ｏ（ＣＨ２）２ＣＮ、ＤＩＰＥＡ、１−メチルイミダゾール／ＤＣＭ、室温、２時間；１７について８８％、２７について６５％。（ｖｉｉｉ）１）無水コハク酸、ＤＭＡＰ／ＤＣＭ、室温、一晩。２）ＬＣＡＡ−ＣＰＧ（孔径５００ÅＮＨ２、１７１μｍｏｌ／ｇ）、ＨＢＴＵ、ＤＩＰＥＡ／ＤＭＦ、室温、一晩。３）Ａｃ２Ｏ／ピリジン、室温、一晩；ローディング：１８について７０μｍｏｌ／ｇ、２８について９７μｍｏｌ／ｇ。表１６は、１００−１０×３ＪＨ１’−Ｈ２’として計算された１Ｈ−ＮＭＲ３ＪＨ−Ｈカップリング定数に基づくＣ３’−ｅｎｄｏ配座異性体の推定パーセンテージを示す。
【０６３０】
【表１６】
2021523720.tif 000112
【化９５】
2021523720.tif 000113
【０６３１】
立体配置の割り当て：立体配置の割り当ては、モッシャーエステル（ＭＴＰＡ）分析の原理を使用して行われた［Ｈｏｙｅ，Ｔ．Ｒ．；Ｊｅｆｆｒｅｙ，Ｃ．Ｓ．；Ｓｈａｏ，Ｆ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ２００７，２，２４５１］。
【０６３２】
ＭＴＰＡを使用した５’−（Ｒ）の割り当てをスキーム４０に示す。スキーム４０で使用した試薬及び条件は次の通りであった：（ｉ）ＴＨＦ中の１Ｍ  ＴＢＡＦ／ＴＨＦ、室温、一晩；８２％。（ｉｉ）（Ｒ）−（−）−ＭＴＰＡＣｌ／ＤＣＭ−ピリジン、０℃〜室温、２時間；７２％。（ｉｉｉ）（Ｓ）−（＋）−ＭＴＰＡＣｌ／ＤＣＭ−ピリジン、０℃〜室温、２時間；３８％。（Ｓ）−及び（Ｒ）−ＭＴＰＡエステル２９及び３０の分析に使用した立体構造を図２７に示す。結果を表１７に示す。
【化９６】
2021523720.tif 000114
【０６３３】
【表１７】
2021523720.tif 000115
【０６３４】
ＭＴＰＡを使用した５’−（Ｓ）の割り当てをスキーム４１に示す。スキーム４１で使用した試薬及び条件は次の通りであった：（ｉ）ＴＨＦ中の１Ｍ  ＴＢＡＦ／ＴＨＦ、室温、一晩；７８％。（ｉｉ）（Ｒ）−（−）−ＭＴＰＡＣｌ／ＤＣＭ−ピリジン、０℃〜室温、２時間；３１％。（ｉｉｉ）（Ｓ）−（＋）−ＭＴＰＡＣｌ／ＤＣＭ−ピリジン、０℃〜室温、２時間；５１％。（Ｓ）−及び（Ｒ）−ＭＴＰＡエステル３１及び３２の分析に使用した立体構造を図２８に示す。結果を表１８に示す。
【化９７】
2021523720.tif 000116
【０６３５】
【表１８】
2021523720.tif 000117
【０６３６】
実施例１１：ＲＮＡポリメラーゼ基質としての（Ｒ）−及び／又は（Ｓ）−異性体の評価
三リン酸の合成：スキーム４２に示すように三リン酸を合成した［Ｚｌａｔｅｖ，Ｉ．；Ｌａｃｋｅｙ，Ｊ．Ｇ．；Ｚｈａｎｇ，Ｌ．；Ｄｅｌｌ，Ａ．；ＭｃＲａｅ，Ｋ．；Ｓｈａｉｋｈ，Ｓ．；Ｄｕｎｃａｎ，Ｒ．Ｇ．；Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．Ｇ．；Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１３，２１，７２２．］。スキーム４２の試薬及び条件は次の通りであった：（ｉ）〜（ｉｉｉ）は、表２０に従ってＡＢＩ−３９４シンセサイザーで実施された。（ｉｖ）１）ＮＨ４ＯＨ／ＥｔＯＨ、室温、一晩。２）１Ｍ  ＴＢＡＦ／ＴＨＦ、室温、一晩。３）ＡＭＡ／Ｈ２Ｏ、室温、一晩；３４について２８％、３８について３９％。表１９は、１００−１０×３ＪＨ１’−Ｈ２’として計算された１Ｈ−ＮＭＲ３ＪＨ−Ｈカップリング定数に基づくＣ３’−ｅｎｄｏ配座異性体の推定パーセンテージを示す。表２０にＡＢＩ−３９４プロトコルを記載する。
【０６３７】
【表１９】
2021523720.tif 000118
【０６３８】
【表２０】
2021523720.tif 000119
【０６３９】
【化９８】
2021523720.tif 000120
５’−（Ｒ）−及び（Ｓ）−Ｃ−Ｍｅ−グアノシン三リン酸の評価：５’−（Ｒ）−及び（Ｓ）−Ｃ−Ｍｅ−グアノシン三リン酸は、Ｐｏｌ−ＲＭＴ及びＤＮＡＰｏｌ−γで評価した。ミトコンドリア毒性は、ヌクレオシド類似体薬に共通する特徴である（肝臓／代謝効果、ミオパチー、末梢神経障害）。ミトコンドリアの複製は、有糸分裂後の細胞を含む、細胞周期の全ての段階で発生する。有糸分裂後の細胞におけるミト複製（ｍｉｔｏ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）は、内因性ヌクレオチドプールを優先的な消費するようになる。ミトコンドリアポリメラーゼ（ｐｏｌ−γ、Ｐｏｌ−ＲＭＴ）は、制限されたエキソヌクレアーゼ（プルーフリーディング）機能を有する。核ＤＮＡに対する変化／効果は、他の試験システムで現れる可能性がより高い。図２９は、ＤＮＡＰｏｌ−γ及びＰｏｌ−ＲＭＴプロトコルを概略的に示す。図２９に示すように、Ａｔｔｏ−４２５標識プライマーは、非常に少ない反応量で高感度の蛍光検出を可能にする。プライマー伸長産物の最適な分離のための蛍光検出を備えた分析用ＩＥＸ−ＨＰＬＣが検出に使用され、特に、競合混合物における検出で重要である。このアッセイは、組み込み効率の評価に適用した。
【０６４０】
図３０は、Ｐｏｌ−ＲＭＴによる組み込みアッセイの結果を示す。５’−（Ｓ）−Ｃ−Ｍｅ−Ｇ三リン酸（ＧＴＰ）はＰｏｌ−ＲＭＴに高濃度で組み込まれるが、５’−（Ｒ）−Ｃ−Ｍｅ−ＧＴＰはＰｏｌ−ＲＭＴに組み込まれていないようである。反応条件は、２００ｎＭテンプレート、５０ｎＭプライマー、３００ｎＭ酵素及び１ｍＭ又は１００μＭ  ＮＴＰ、３０分間、３５℃であった。
【０６４１】
図３１は、Ｐｏｌ−γによる組み込みアッセイの結果を示す。５’−（Ｓ）も（Ｒ）−Ｃ−Ｍｅ−Ｇｔｐも、高濃度ではＰｏｌ−γに組み込まれない。反応条件は、以下の通りであった：反応：１００ｎＭテンプレート、１００ｎＭプライマー、酵素４０単位及び１ｍＭ又は１００μＭ  ｄＮＴＰ、３０分間、３７℃；５  ｎＭプライマーに希釈し、ＦＬＤ−ＩＥＸ−ＨＰＬＣ（Ｅｘ：４３７、Ｅｍ：４８３ｎｍ）で分析した。
【０６４２】
実施例１２：
ｍＵＮＡのオリゴ合成及び特性評価：本明細書で説明する修飾ヌクレオシドを有するＲＮＡオリゴヌクレオチドは、標準的なホスホラミダイト化学を用いたＡＢＩ  ３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーで、市販のウリジン（Ｕ）、４−Ｎ−アセチルシチジン（ＣＡｃ）、６−Ｎ−ベンゾイルアデノシン（ＡＢｚ）及び２−Ｎ−イソブチリルグアノシン（ＧｉＢｕ）の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホラミダイトモノマーと、２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル保護ホスホラミダイト、２’−フルオロ置換ホスホラミダイト、２’−Ｏ−メチルホスホラミダイト及び本明細書に示す修飾ヌクレオシド構成要素を使用して合成することができる。合成後、オリゴヌクレオチドに結合したＣＰＧのごく一部を、マイクロチューブ（１ｍＬ）中の１００μＬのメチルアミン溶液（水中４０ｗｔ％、Ａｌｄｒｉｃｈ）により６５℃で１０分間又は濃水酸化アンモニウムにより５５℃で８時間、処理する。混合物をドライアイス上で５分間冷却し、固体懸濁液を遠心沈殿する。上清（８０μＬ）を別のマイクロチューブにデカントし、１２０μＬのＴＥＡ・３ＨＦ（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．）と共に６５℃で１２分間加熱する。粗オリゴヌクレオチドの純度はＲＰ−ＨＰＬＣ又はＩＥＸ−ＨＰＬＣで分析し、質量はＬＣ−ＭＳ実験で確認する。図３２は、ｍＵＮＡモノマーの構造を示す。
【０６４３】
【表２１】
2021523720.tif 000121
【０６４４】
【表２２】
2021523720.tif 000122
【０６４５】
【表２３】
2021523720.tif 000123
【０６４６】
【表２４】
2021523720.tif 000124
【０６４７】
【表２５】
2021523720.tif 000125
【０６４８】
【表２６】
2021523720.tif 000126
【０６４９】
【表２７】
2021523720.tif 000127
【０６５０】
【表２８】
2021523720.tif 000128
【０６５１】
ｍＵＮＡ１２−ｍｅｒ二本鎖のＵＶ熱融解温度の決定：熱融解温度は、温度上昇（１℃／分）に伴うＡ２６０を監視することにより、（ａ）１×ＰＢＳ（［ＮａＣｌ］＝１３７ｍＭ、［ＫＣｌ］＝２．７ｍＭ、［Ｎａ２ＨＰＯ４］＝８ｍＭ、［ＫＨ２ＰＯ４］＝２ｍＭ、ｐＨ７．４）中又は（ｂ）８×ＰＢＳ（［ＮａＣｌ］＝１．１ｍＭ、［ＫＣｌ］＝２２ｍＭ、［Ｎａ２ＨＰＯ４］＝６４ｍＭ、［ＫＨ２ＰＯ４］＝１６ｍＭ、ｐＨ７．４）中の両鎖の等モル濃度（２．０μＭ）で測定した。値は一次導関数の最大値として報告され、少なくとも２回の実験の平均である。
【０６５２】
【表２９】
2021523720.tif 000129
【０６５３】
ｍＵＮＡ２１−／２３−ｍｅｒ二本鎖のＵＶ熱融解温度の決定：熱融解温度は、温度上昇（１℃／分）に伴うＡ２６０を監視することにより、（ａ）０．２５×ＰＢＳ（［ＮａＣｌ］＝３４ｍＭ、［ＫＣｌ］＝０．６８ｍＭ、［Ｎａ２ＨＰＯ４］＝２ｍＭ、［ＫＨ２ＰＯ４］＝０．５ｍＭ、ｐＨ７．４）中の両鎖の等モル濃度（１．０μＭ）で測定した。値は一次導関数の最大値として報告され、少なくとも２回の実験の平均である。
【０６５４】
【表３０】
2021523720.tif 000130
【０６５５】
ＴＮＡ１２−ｍｅｒ二本鎖のＵＶ熱融解温度の決定：熱融解温度は、温度上昇（１℃／分）に伴うＡ２６０を監視することにより、１×ＰＢＳ（［ＮａＣｌ］＝１３７ｍＭ、［ＫＣｌ］＝２．７ｍＭ、［Ｎａ２ＨＰＯ４］＝８ｍＭ、［ＫＨ２ＰＯ４］＝２ｍＭ、ｐＨ７．４）中の両鎖の等モル濃度（２．０μＭ）で測定した。値は一次導関数の最大値として報告され、少なくとも２回の実験の平均である。図３３は、ＴＮＡモノマーの構造を示す。
【０６５６】
【表３１】
2021523720.tif 000131
【０６５７】
ＴＮＡ２１−／２３−ｍｅｒ二本鎖のＵＶ熱融解温度の決定：熱融解温度は、温度上昇（１℃／分）に伴うＡ２６０を監視することにより、（ａ）０．１×ＰＢＳ（［ＮａＣｌ］＝１４ｍＭ、［ＫＣｌ］＝０．２７ｍＭ、［Ｎａ２ＨＰＯ４］＝０．８ｍＭ、［ＫＨ２ＰＯ４］＝０．２ｍＭ、ｐＨ７．４）中の両鎖の等モル濃度（１．０μＭ）で測定した。値は一次導関数の最大値として報告され、少なくとも２回の実験の平均である。
【０６５８】
【表３２】
2021523720.tif 000132
【０６５９】
３’又は５’特異的エキソヌクレアーゼに対する修飾オリゴヌクレオチドの安定性：修飾オリゴヌクレオチドは、３００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．２）、６０ｍＭ  ＭｇＣｌ２又は３００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．５）のいずれか（６０ｍＭ  ＭｇＣｌ２は、３’−又は５’−特異的エキソヌクレアーゼのそれぞれに対する安定性を評価するため）の中で、最終濃度０．１ｍｇ／ｍＬで調製した。１ｍＬ／分の流量で１６分間にわたる３１〜５２％の移動相（１Ｍ  ＮａＢｒ、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ１１、１５％ＭｅＣＮ；固定相：２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５％ＭｅＣＮ、ｐＨ１１）の勾配を使用したＩＥＸ  ＨＰＬＣ（ｄｉｏｎｅｘ  ＤＮＡＰａｃ  ＰＡ２００，４×２５０ｍｍ）による分析の前に、エキソヌクレアーゼ（３’−安定性について１５ｍＵ／ｍＬ  ＳＶＰＤＥ又は５’−安定性について５００ｍＵ／ｍＬホスホジエステラーゼＩＩ）を直ちに添加した。所与の時点で試料を最大２４時間分析した。完全長オリゴヌクレオチドの量は、Ａ２６０での曲線下面積として決定した。完全長オリゴヌクレオチドのパーセントは、ｔ＝０での曲線下面積で割り、１００を掛けることによって計算した。酵素の活性は、末端ホスホロチオエート結合を有するオリゴデオキシチミジレートを含めることにより、各実験について検証した（それぞれ、３’−又は５’−エキソヌクレアーゼ活性について５’−Ｔ１９・Ｔ又は５’−Ｔ・Ｔ１９）。酵素の各アリコートは、実験の直前に解凍した。半減期は、一次速度論に適合させることによって決定した。
【０６６０】
図３４は、３’特異的エキソヌクレアーゼ（ＳＶＰＤ）に対するｍＵＮＡオリゴ安定性のプロットを示す。図３５は、５’特異的エキソヌクレアーゼ（ホスホジエステラーゼＩＩ）に対するｍＵＮＡオリゴ安定性のプロットを示す。図３６は、５’−エキソヌクレアーゼ（ホスホジエステラーゼＩＩ）分解に対するＴＮＡ−Ｔの安定性の折れ線グラフを示す。
【０６６１】
【表３３】
2021523720.tif 000133
【０６６２】
示された濃度でのトランスフェクションを介して初代マウス肝細胞で測定されたオンターゲット活性。ＣＯＳ−７細胞にｓｉＲＮＡを同時トランスフェクトしたルシフェラーゼレポータープラスミドを使用して測定されたオフターゲットＩＣ５０。
【０６６３】
【表３４】
2021523720.tif 000134
【０６６４】
示された濃度でのトランスフェクションを介して初代マウス肝細胞で測定されたオンターゲット活性。ＣＯＳ−７細胞にｓｉＲＮＡを同時トランスフェクトしたルシフェラーゼレポータープラスミドを使用して測定されたオフターゲットＩＣ５０。
【０６６５】
【表３５】
2021523720.tif 000135
【０６６６】
示された濃度でのトランスフェクションを介して初代マウス肝細胞で測定されたオンターゲット活性。ＣＯＳ−７細胞にｓｉＲＮＡを同時トランスフェクトしたルシフェラーゼレポータープラスミドを使用して測定されたオフターゲットＩＣ５０。
【０６６７】
ＨｙｐベースのヌクレオシドによるＴＴＲインビトロ遺伝子サイレンシングを研究した。使用した配列を表３６に示す。図３７は、Ｈｙｐモノマーの構造を示す。
【０６６８】
【表３６】
2021523720.tif 000136
【０６６９】
図３８は、１００ｎＭでソートされたＴＴＲＤＷ１１０５フリー取り込みのプロットを示す。
【０６７０】
ＨｙｐベースのヌクレオシドによるＧＯ１インビトロ遺伝子サイレンシング。使用した配列を表３７に示す。トランスフェクションの結果を表３８にまとめる。
【０６７１】
【表３７】
2021523720.tif 000137
【０６７２】
【表３８】
2021523720.tif 000138
【０６７３】
Ｈｙｐベースのヌクレオシドによるインビボ遺伝子サイレンシングの結果を図３９〜４１に示す。図４２に示すように、（Ｓ）−ｉｓｏＧＮＡの組み込みは、（Ｓ）−ＧＮＡよりも熱不安定性が有意に小さくなる。図４３からわかるように、（Ｓ）−ｉｓｏＧＮＡの組み込みが一般に（Ｓ）−ＧＮＡよりもインビボ活性を改善する。
【０６７４】
実施例１３：アンチセンスシード領域へのＭｏｄ８（２’−５’ＲＮＡ）の組み込み
Ｍｏｄ８（２’−５’ＲＮＡ）はアンチセンスシード領域に組み込まれ、その効果が研究された。図４４は、アンチセンスシード領域へのＭｏｄ８（２’−５’−ＲＮＡ）の組み込みが、ラット毒性研究における臨床病理学的測定値を改善したことを示す。親ｓｉＲＮＡ又は単一のＭｏｄ８（２’−５’ＲＮＡ結合）を有するｓｉＲＮＡの単回用量（３０ｍｇ／ｋｇ）の皮下投与後のラットの臨床病理パラメーターを表３９にまとめる。
【０６７５】
【表３９】
2021523720.tif 000139
【０６７６】
実施例１４：代替の３’−ｍＵＮＡ合成
スキーム４３は、３’−メチル−ＵＮＡ−ウリジンホスホラミダイトの合成を示す。
【化９９】
2021523720.tif 000140
試薬及び条件：（ｉ）ＢＳＡ、ＴＭＳＯＴｆ、ウラシル、ＭｅＣＮ、還流、１時間、７９％；（ｉｉ）ＮＨ３、ＭｅＯＨ、室温、３日間、８０％；（ｉｉｉ）ＮａＩＯ４、１，４−ジオキサン、Ｈ２Ｏ、室温、１．５時間；（ｉｖ）ＮａＢＨ４、２ステップで８５％；（ｖ）ＤＭＴｒＣｌ、ＤＭＡＰ、ピリジン、室温、１２時間、３０％；（ｖｉ）Ｂｚ２Ｏ、ＤＭＡＰ、ピリジン、室温、５時間、６５〜８０％；（ｖｉｉ）２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイト、ＤＩＥＡ、ＤＣＭ、室温、１〜２時間、８１〜８６％；（ｖｉｉｉ）ＢｚＯＨ、ＤＩＡＤ、ＰＰｈ３、ＴＨＦ、室温、５時間；（ｉｘ）ＮａＯＨ水溶液、室温、１２時間、２ステップで７７％。
【０６７７】
化合物４０２：ＭｅＣＮ（８０ｍＬ）中の１−Ｏ−アセチル−２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾリ−Ｌ−ラムノフラノース（４０１）（３．７０ｇ、７．１４ｍｍｏｌ；Ｌｅｒｎｅｒ，Ｌ．Ｍ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９７６，４１，３０６−３１０）及びウラシル（１．６１ｇ、１４．３ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（１０．６ｍＬ、４２．９ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を１時間還流し、Ｍｅ３ＳｉＯＴｆ（１．５５ｍＬ、８．５７ｍｍｏｌ）を室温で滴下した。再び１時間還流した後、混合物を飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１００ｍＬ）でクエンチし、蒸発させ、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、濃縮し、シリカゲル上のカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中２５％ＡｃＯＥｔ）により精製して、化合物４０２を白色の泡状物として得た（３．２２ｇ、７９％、Ｒｆ＝０．１５；ヘキサン中２５％ＡｃＯＥｔで展開）。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １１．４６（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．９５−７．３０（ｍ，１６Ｈ），６．２６−６．１９（ｍ，２Ｈ），６．１０−６．０７（ｍ，１Ｈ），５．７３（ｄｄ，Ｊ＝８．５，２．０Ｈｚ，１Ｈ），５．４１−５．３４（ｍ，１Ｈ），５．０５（ｄｄ，Ｊ＝８．５，３．０Ｈｚ，１Ｈ），１．４３（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １６４．５９，１６４．５３，１６４．４１，１６３．１２，１５０．６１，１４２．４２，１３３．９０，１３３．８３，１３３．４２，１２９．２９，１２９．２２，１２９．１６，１２９．１０，１２８．８２，１２８．６５，１２８．６１，１２８．５９，１２８．２４，１０２．３４，８９．１３，８１．７５，７４．１１，７１．９６，６７．８１，１７．２２．ＨＲＭＳ；Ｃ３１Ｈ２７Ｎ２Ｏ９Ｎａについて計算した［Ｍ＋Ｈ］＋，５９３．１５３６；実測値：５９．
【０６７８】
化合物４０３：化合物４０２（９．６０ｇ、１６．８ｍｍｏｌ）を１Ｎ  ＮＨ３ＭｅＯＨ溶液（１６８ｍＬ）に溶解した。得られた混合物を室温で３日間撹拌し、次に、蒸発させた。粗残留物をシリカゲル上のカラムクロマトグラフィー（ＡｃＯＥｔ中１０％ＭｅＯＨ）により精製して、化合物４０３を白色の粉末として得た（３．４１ｇ、８０％、Ｒｆ＝０．２３；ＡｃＯＥｔ中の１０％ＭｅＯＨで展開）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １１．２９（ｂｒｓ，１Ｈ），７．７５（ｄ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ，１Ｈ），５．７７（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），５．６４（ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，１Ｈ），５．３３（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），５．０３（ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，１Ｈ），４．５６（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１Ｈ），４．３９−４．３１（ｍ，１Ｈ），４．０６（ｂｒｓ，１Ｈ），３．９１（ｄｄ，Ｊ＝３．０，１０．５Ｈｚ，１Ｈ），３．８６−３．７６（ｍ，１Ｈ），１．０５（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ）．１３Ｃ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １６３．１１，１５０．９５，１４１．９０，１０２．０７，８８．２４，８５．４０，７４．３２，７０．５２，６３．４５，２０．５３．ＨＲＭＳ；Ｃ１０Ｈ１５Ｎ２Ｏ６について計算した［Ｍ＋Ｈ］＋，２５９．０９３０；実測値：２５９．０９３１．
【０６７９】
化合物４０４：１，４−ジオキサン（２５ｍＬ）及び水（５ｍＬ）の混合物中の化合物４０３（６４０ｍｇ、２．４８ｍｍｏｌ）の溶液に、ＮａＩＯ４（５９１ｍｇ、２．７２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１．５時間撹拌し、次に、１，４−ジオキサンで希釈し、セライトパッドを通して濾過した。固形残留物を１，４−ジオキサンで洗浄し、次に、水素化ホウ素ナトリウム（９４．０ｍｇ、２．４８ｍｍｏｌ）を濾液に添加した。得られた混合物を１５分間撹拌し、溶媒を真空で除去した。粗残留物をシリカゲル上のカラムクロマトグラフィー（ＡｃＯＥｔ中１０〜２０％ＭｅＯＨ）により精製して、化合物４０４を無色の粘着性ガラスとして得た（５４８ｍｇ、８５％、Ｒｆ＝０．３４；ＡｃＯＥｔ中１５％ＭｅＯＨで展開）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １１．１６（ｂｒｓ，１Ｈ），７．６０（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），５．８３（ｍ，１Ｈ），５．５５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），５．０６（ｍ，１Ｈ），４．６８（ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ），４．４９−４．４１（ｍ，１Ｈ），３．７６−３．６７（ｍ，１Ｈ），３．６５−３．４６（ｍ，１Ｈ），３．３８−３．２１（ｍ，３Ｈ），１．０５（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １６３．４９，１５１．３９，１４１．６１，１０１．００，８４．３３，８３．９０，６５．８５，６１．４６，６０．７３，１８．２５．ＨＲＭＳ；Ｃ１０Ｈ１６Ｎ２Ｏ６Ｎａについて計算した［Ｍ＋Ｈ］＋，２８３．０９０６；実測値：２８３．０９１６．
【０６８０】
化合物４０５：乾燥ピリジン８０ｍＬ中の化合物４０４（２．０４ｇ、７．８４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＴｒＣｌ（２．８９ｇ、８．６３ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（９５．８ｍｇ、０．７８４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１２時間撹拌し、次に、ＣＨ２Ｃｌ２で希釈した。反応を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液でクエンチした。有機層を分離し、ブラインで洗浄した。溶媒を真空で除去した。粗残留物をシリカゲル上のカラムクロマトグラフィー（ＡｃＯＥｔ）により精製して、化合物４０５を白色の形態として得た（１．３２ｇ、３０％、Ｒｆ＝０．５２；ＡｃＯＥｔで展開）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １１．３１（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，１Ｈ），７．５８（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．３５−７．１０（ｍ，９Ｈ），６．８８−６．８１（ｍ，４Ｈ），５．８９−５．８０（ｍ，１Ｈ），５．４６（ｄｄ，Ｊ＝１．２，８．０Ｈｚ，１Ｈ），５．１３−５．０６（ｍ，１Ｈ），４．７２（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ），３．７８−３．５２（ｍ，１０Ｈ），３．０４−２．７８（ｍ，２Ｈ），０．８７（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １６３．２８，１５７．９８，１５７．９６，１５１．５１，１４４．８２，１４１．２３，１３５．６６，１３５．５４，１２９．５８，１２９．４９，１２７．７７，１２７．６１，１２６．５８，１１３．１４，１１３．１１，１０１．６７，８５．４５，８４．４２，８２．５６，６６．０８，６３．０２，６１．０１，５５．０３，５５．００，１８．０９．ＨＲＭＳ；Ｃ３１Ｈ３４Ｎ２Ｏ８Ｎａについて計算した［Ｍ＋Ｎａ］＋，５８５．２２１３；実測値：５８５．２２０５．
【０６８１】
化合物４０６：乾燥ピリジン８．５ｍＬ中の化合物４０５（５００ｍｇ、０．８９０ｍｍｏｌ）の溶液に、無水安息香酸（２１１ｍｇ、０．９７９ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（１０．９ｍｇ、０．０８９０ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。反応混合物を室温で５時間撹拌し、次に、ＣＨ２Ｃｌ２で希釈した。反応を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液でクエンチした。有機層を分離し、ブラインで洗浄した。溶媒を真空で除去した。粗残留物をシリカゲル上のカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中５０％ＡｃＯＥｔ）により精製して、化合物４０６を白色の形態として得た（４７４ｇ、８０％、Ｒｆ＝０．３４；ヘキサン中５０％ＡｃＯＥｔで展開）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １１．４３（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．９６−７．８２（ｍ，２Ｈ），７．８２−７．４３（ｍ，４Ｈ），７．４１−７．０４（ｍ，９Ｈ），７．０２−６．７３（ｍ，４Ｈ），６．３２−６．１２（ｍ，１Ｈ），５．５１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），４．８４（ｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，１Ｈ），４．６５（ｄｄ，Ｊ＝１１．６，５．２Ｈｚ，１Ｈ），４．４９（ｄｄ，Ｊ＝１１．５，６．８Ｈｚ，１Ｈ），３．７９−３．６１（ｍ，８Ｈ），３．１７−２．７４（ｍ，２Ｈ），０．９０（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １６５．０２，１６３．１０，１５７．９９，１５７．９７，１５１．１０，１４４．７５，１４０．７０，１３５．５６，１３５．４６，１３３．６５，１２９．５８，１２９．４９，１２９．１６，１２９．０１，１２８．８４，１２７．７７，１２７．６０，１２６．６１，１１３．１３，１０２．１３，８５．５８，８２．８１，８１．６４，６６．０８，６３．３４，６２．９４，５５．０１，５４．９８，１７．９１．ＨＲＭＳ；Ｃ３８Ｈ３８Ｎ２Ｏ９Ｎａについて計算された［Ｍ＋Ｎａ］＋，６８９．２４７５；実測値：６８９．２５０５．
【０６８２】
化合物４０７：乾燥ＤＣＭ３８ｍＬ中の化合物４０６（２．５０ｇ、３．７５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（１．９７ｍＬ、１１．３ｍｍｏｌ）及び２−シアノエチルクロロ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト（９２１μＬ、１４．１ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を室温で１時間撹拌し、次に、ＤＣＭで希釈した。反応を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液でクエンチした。有機層を分離し、ブラインで洗浄した。溶媒を真空で除去した。粗残留物をシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーにより精製して、ジアステレオマー４０７の混合物を無色の形態として得た（２．７９ｇ、８６％、Ｒｆ＝０．２３；ヘキサン中４０％ＡｃＯＥｔで展開）。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ  ９．２０（ｂｒｓ，１Ｈ）；７．９９−７．９３（ｍ，２Ｈ），７．６４−７．１８（ｍ，１３Ｈ），６．８５−６．８０（ｍ，４Ｈ），６．３４−６．２８（ｍ，１Ｈ），５．４９（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），４．５９−４．４０（ｍ，２Ｈ），４．１９−４．０５（ｍ，１Ｈ），３．７９−３．４８（ｍ，１２Ｈ），３．１９−３．０９（ｍ，２Ｈ），２．６２−２．５７（ｍ，２Ｈ），１．１６−１．０１（ｍ，１５Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ  １６６．４４，１６３．９４，１５９．６２，１５９．５９，１５１．９０，１５１．８２，１４５．９７，１４５．９５，１４１．４６，１４１．４１，１３６．８０，１３６．７７，１３６．７３，１３４．３８，１３０．９１，１３０．８９，１３０．８４，１３０．８０，１３０．４６，１３０．４４，１３０．４３，１２９．６０，１２８．８８，１２８．８２，１２８．７９，１２７．７７，１１９．５２，１１４．０３，１１４．０１，１０３．０５，１０３．００，８７．４８，８７．４５，８３．３０，８３．２６，８３．０８，８２．９９，８２．８９，８２．８６，７１．６４，７１．５１，７１．３５，７１．２１，６４．７６，６４．７２，６４．０９，６４．０６，５９．５２，５９．３７，５９．１４，５８．９９，５５．８７，５５．８６，４３．８８，４３．８７，４３．７９，４３．７７，２５．０５，２４．９９，２４．９３，２４．８７，２４．８１，２４．７９，２４．７３，２１．０２，２０．９８，２０．９６，２０．９２，１７．４０，１７．３９，１７．２２，１７．１９．３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ  １４８．９４；１４８．７５．ＨＲＭＳ；Ｃ４７Ｈ５６Ｎ４Ｏ１０Ｐについて計算した［Ｍ＋Ｈ］＋，８６７．３７３４；実測値：８６７．３７４２．
【０６８３】
化合物４０９：乾燥ＴＨＦ９ｍＬ中の化合物４０５（５００ｇ、０．８９０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＰＰｈ３（６２２ｍｇ、２．６７ｍｍｏｌ）、安息香酸（５４３ｍｇ、４．４５ｍｍｏｌ）及びＤＩＡＤ（５２６μＬ、２．６７ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を室温で５時間撹拌し、反応の完了をＴＬＣでチェックした。溶媒を真空で除去した。粗残留物をシリカゲル上のカラムクロマトグラフィー（ＡｃＯＥｔ中５〜１０％ＭｅＯＨ）により精製して、２，２’−アンヒドロ−ヌクレオシド４０８（Ｒｆ＝０．１１；ＡｃＯＥｔで展開）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ７．９３（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．８８−７．８４（ｍ，２Ｈ），７．７０−７．６４（ｍ，１Ｈ），７．５３−７．４８（ｍ，２Ｈ）７．３６−７．１６（ｍ，９Ｈ），６．８５−６．７６（ｍ，４Ｈ），６．１３（ｄｄ，Ｊ＝５．６，１．６Ｈｚ，１Ｈ），５．７６（ｄｔ，Ｊ＝７．６，１２．４Ｈｚ，１Ｈ），４．６７（ｄｄ，Ｊ＝１０．０，５．６Ｈｚ，１Ｈ），４．５１−４．４１（ｍ，２Ｈ），３．７０（ｓ，３Ｈ），３．６９（ｓ，３Ｈ），３．２６（ｄｄ，Ｊ＝１０．０，３．６Ｈｚ，１Ｈ），２．９６（ｄｄ，Ｊ＝１０．４，５．２Ｈｚ，１Ｈ），１．１５（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １７１．００，１６４．９１，１６０．２３，１５８．１２，１５８．０５，１４４．５５，１３６．７７，１３５．１０，１３５．０５，１３３．５２，１２９．６２，１２９．４８，１２９．１６，１２８．７８，１２７．８６，１２７．５１，１２６．７５，１１３．１８，１０８．７２，８７．６２，８５．６３，８０．１２，７３．４０，７０．４９，６２．５６，５５．０２，５４．９８，５４．９６，１５．３７．ＨＲＭＳ；Ｃ３８Ｈ３７Ｎ２Ｏ８について計算した［Ｍ＋Ｈ］＋，６４９．２５５０；実測値：６４９．２５４６．
【０６８４】
化合物４０８をＴＨＦ１０ｍＬに溶解した。混合物の溶液に１Ｎ  ＮａＯＨ水溶液３ｍＬを滴下した。得られた混合物を１２時間撹拌した。溶媒を真空で除去した。粗残留物をシリカゲル上のカラムクロマトグラフィー（ＡｃＯＥｔ中０〜５％ＭｅＯＨ）により精製して、化合物４０９を白色の形態として得た（４５２ｇ、２ステップで９０％、Ｒｆ＝０．３２；ＡｃＯＥｔで展開）。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １１．３９（ｂｒｓ，１Ｈ），７．６３（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．３９−７．０４（ｍ，９Ｈ），６．９７−６．６７（ｍ，４Ｈ），５．８２（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１Ｈ），５．４９（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），５．２３−５．１６（ｍ，１Ｈ），４．７７（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ），３．８４−３．４６（ｍ，１０Ｈ），３．０６−２．８４（ｍ，２Ｈ），０．８６（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １６３．２７，１５７．９７，１５７．９５，１５１．４４，１４４．８１，１４１．２２，１３５．５８，１３５．５６，１２９．６１，１２９．５２，１２７．７５，１２７．６３，１２６．５７，１１３．１０，１０１．７３，８５．３１，８４．８０，８３．０２，６５．９０，６２．８８，６１．１６，５５．００，５４．９８，１８．５５．ＨＲＭＳ；Ｃ３１Ｈ３４Ｎ２Ｏ８Ｎａについて計算した［Ｍ＋Ｎａ］＋，５８５．２２１３；実測値：５８５．２２０５．
【０６８５】
化合物４１０：乾燥ピリジン３６ｍＬ中の化合物４０９（２．００ｇ、３．５６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＡＰ（４３．５ｍｇ、０．３５６ｍｍｏｌ）及びＢｚ２Ｏ（８４５ｍｇ、３．７４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で５時間撹拌し、次に、得られた混合物をＤＣＭで希釈した。反応を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液でクエンチした。有機層を分離し、ブラインで洗浄した。溶媒を真空で除去した。粗残留物をシリカゲル上のカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中５０％ＡｃＯＥｔ）により精製して、化合物４１０を無色の形態として得た（１．９９ｇ、８４％、Ｒｆ＝０．３４；ヘキサン中５０％ＡｃＯＥｔで展開）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １１．４５（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．９９−７．４１（ｍ，６Ｈ），７．４１−７．０３（ｍ，９Ｈ），６．９５−６．５８（ｍ，４Ｈ），６．２０（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），５．５４（ｄｄ，Ｊ＝７．６，１．６Ｈｚ，１Ｈ），４．８６（ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ），４．７０（ｄｄ，Ｊ＝１２．０，５．６Ｈｚ，１Ｈ），４．５１（ｄｄ，Ｊ＝１２．０，５．６Ｈｚ，１Ｈ），３．８６−３．５２（ｍ，８Ｈ），３．１０−２．９１（ｍ，２Ｈ），０．８４（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １６５．０３，１６３．１０，１５７．９８，１５７．９６，１５１．１１，１４４．７５，１４０．７６，１３５．５２，１３５．４９，１３３．６９，１２９．６１，１２９．５２，１２９．１２，１２９．００，１２８．８７，１２７．７５，１２７．６２，１２６．５９，１１３．１０，１０２．２０，８５．４０，８３．１７，８１．９０，６５．７５，６３．４０，６２．７３，５５．００，５４．９７，１８．４９．ＨＲＭＳ；Ｃ３８Ｈ３８Ｎ２Ｏ９Ｎａについて計算した［Ｍ＋Ｎａ］＋，６８９．２４７５；実測値：６８９．２４９０．
【０６８６】
化合物４１１：乾燥ＤＣＭ３０ｍＬ中の化合物４１０（２．００ｇ、３．００ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（１．５７ｍＬ、９．００ｍｍｏｌ）及び２−シアノエチルクロロ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト（７３７μＬ、３．３０ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を室温で２時間撹拌し、次に、ＤＣＭで希釈した。反応を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液でクエンチした。有機層を分離し、ブラインで洗浄した。溶媒を真空で除去した。粗残留物をシリカゲル上のカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中５０％ＡｃＯＥｔ）により精製して、化合物４１１を無色の形態として得た（２．１１ｇ、８１％、Ｒｆ＝０．６５；ヘキサン中５０％ＡｃＯＥｔで展開）。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ  ８．００−７．９４（ｍ，２Ｈ），７．６４−７．１６（ｍ，１３Ｈ），６．８６−６．８１（ｍ，４Ｈ），６．２８−６．２２（ｍ，１Ｈ），５．５６−５．４８（ｍ，１Ｈ），４．６９−４．４４（ｍ，３Ｈ），４．２３−４．０３（ｍ，１Ｈ），３．８６−３．４２（ｍ，１２Ｈ），３．３１−３．０４（ｍ，２Ｈ），２．６１−２．５１（ｍ，２Ｈ），１．２８−０．９８（ｍ，１５Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ  １６６．５１，１６４．０７，１６４．０４，１５９．６６，１５９．６４，１５１．９８，１４５．９９，１４１．４９，１４１．４３，１３６．８９，１３６．８４，１３６．８３，１３６．８１，１３４．５４，１３４．５２，１３１．０３，１３０．９７，１３０．４７，１２９．７３，１２９．０２，１２９．００，１２８．８５，１２７．８４，１２７．８２，１１９．５６，１１４．１１，１１４．０７，１０３．３４，１０３．３０，８７．２６，８７．２４，８３．１９，８３．０２，８２．９９，８２．９６，８２．８７，８２．８３，７０．４３，７０．３１，６４．８４，６４．８２，６４．０１，６３．９１，５９．３２，５９．２９，５９．１７，５９．１４，５８．１９，５５．９５，４４．０６，４４．００，４３．９６，４３．９０，２５．０９，２５．０３，２４．９９，２４．９５，２４．９４，２４．８９，２４．８２，２４．７６，２２．０３，２１．０７，２１．０２，２１．００，２０．９５，１７．８７，１７．８４．３１Ｐ  ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ  １４９．１０；１４８．４１．ＨＲＭＳ；Ｃ４７Ｈ５６Ｎ４Ｏ１０Ｐ  について計算した［Ｍ＋Ｈ］＋，８６７．３７３４；実測値：８６７．３７６０．
【０６８７】
本明細書中で参照される米国特許、米国特許出願公開、外国特許、外国特許出願及び非特許論文の全てが、それら全体が参照により本明細書中に援用される。実施形態の態様は、さらなる実施形態をさらに提供するため、様々な特許、出願及び公開の概念を利用する必要がある場合、変更され得る。
【０６８８】
実施形態に対するこれら及び他の変更形態は、上記の詳細な説明のためになされ得る。一般に、以下の特許請求の範囲では、用いられる用語は、特許請求の範囲を、明細書及び特許請求の範囲に開示される具体的な実施形態に限定するように解釈されるべきではないが、かかる特許請求の範囲に権利が付与されている均等物の全範囲と共に、あらゆる考えられる実施形態を含むように解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。
【図１】
2021523720.tif 000171
【図２】
2021523720.tif 000172
【図３】
2021523720.tif 000173
【図４】
2021523720.tif 000174
【図５】
2021523720.tif 000175
【図６】
2021523720.tif 000176
【図７】
2021523720.tif 000177
【図８】
2021523720.tif 000178
【図９】
2021523720.tif 000179
【図１０】
2021523720.tif 000180
【図１１】
2021523720.tif 000181
【図１２】
2021523720.tif 000182
【図１３】
2021523720.tif 000183
【図１４】
2021523720.tif 000184
【図１５】
2021523720.tif 000185
【図１６】
2021523720.tif 000186
【図１７】
2021523720.tif 000187
【図１８】
2021523720.tif 000188
【図１９】
2021523720.tif 000189
【図２０】
2021523720.tif 000190
【図２１】
2021523720.tif 000191
【図２２】
2021523720.tif 000192
【図２３】
2021523720.tif 000193
【図２４Ａ】
2021523720.tif 000194
【図２４Ｂ】
2021523720.tif 000195
【図２５Ａ】
2021523720.tif 000196
【図２５Ｂ】
2021523720.tif 000197
【図２６】
2021523720.tif 000198
【図２７】
2021523720.tif 000199
【図２８】
2021523720.tif 000200
【図２９】
2021523720.tif 000201
【図３０Ａ】
2021523720.tif 000202
【図３０Ｂ】
2021523720.tif 000203
【図３１Ａ】
2021523720.tif 000204
【図３１Ｂ】
2021523720.tif 000205
【図３２】
2021523720.tif 000206
【図３３】
2021523720.tif 000207
【図３４】
2021523720.tif 000208
【図３５】
2021523720.tif 000209
【図３６】
2021523720.tif 000210
【図３７】
2021523720.tif 000211
【図３８】
2021523720.tif 000212
【図３９】
2021523720.tif 000213
【図４０】
2021523720.tif 000214
【図４１】
2021523720.tif 000215
【図４２】
2021523720.tif 000216
【図４３】
2021523720.tif 000217
【図４４】
2021523720.tif 000218
【配列表】
2021523720000001.app
【国際調査報告】
2021523720.tif 000219
2021523720.tif 000220
2021523720.tif 000221