(57)【要約】  本発明は、バイオマーカー（たとえば、閉塞性睡眠時無呼吸のための）を単離して特性評価をするために、捕獲部位をそれぞれ独立して備える表面を含む複数種の粒子を使用する方法を対象としている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体サンプルからバイオマーカーを除去するための方法であって、
ａ）前記サンプルを、各粒子が独立して捕捉部位（すなわち、捕捉部位の型または種類）を含む複数種の粒子と組み合わせて、混合物を提供すること、
ｂ）前記混合物を混合して、前記バイオマーカーとの１種以上の粒子複合体を提供すること、
ｃ）前記粒子複合体を除去または単離して、枯渇させた溶液を提供すること、
を含み、
それにより、生体サンプルからバイオマーカーを除去する、
方法。
【請求項２】
生体サンプルからバイオマーカーを単離するための方法であって、
ａ）前記サンプルを、各粒子が独立して捕捉部位（すなわち、捕捉部位の型または種類）を含む複数種の粒子と組み合わせて、混合物を提供すること、
ｂ）前記混合物を混合して、前記バイオマーカーとの１種以上の粒子複合体を提供すること、
ｃ）前記粒子複合体を除去または単離して、枯渇させた溶液および濃縮された単離物を提供すること、
を含み、
それにより、生体サンプルからバイオマーカーを単離する、
方法。
【請求項３】
前記サンプルを前記複数種の粒子と組み合わせる前に、前記生体サンプルに条件調節剤が添加される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記条件調節剤は、ｐＨ調整剤、モル濃度調整剤、干渉遮断剤、または遊離剤もしくは放出剤である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
診断試験が行われる前に前記生体サンプルについて行われる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記複数種の粒子には、複数種の捕捉部位（たとえば、それぞれ独立に複数種の捕捉部位と共有結合または非共有結合している複数種の粒子）が含まれる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記複数種の粒子には、第１の捕捉部位を備える第１の粒子が含まれる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記複数種の粒子には、第２の捕捉部位を備える第２の粒子が含まれる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記複数種の粒子には、第３の捕捉部位を備える第３の粒子が含まれる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記複数種の粒子には、第４の捕捉部位を備える第４の粒子が含まれる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記複数種の粒子には、第５の捕捉部位を備える第５の粒子が含まれる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記複数種の粒子には、第６の捕捉部位を備える第６の粒子が含まれる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記複数種の粒子には、第７の捕捉部位を備える第７の粒子が含まれる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記複数種の粒子には、第８の捕捉部位を備える第８の粒子が含まれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記複数種の粒子には、第９の捕捉部位を備える第９の粒子が含まれる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記複数種の粒子には、第１０の捕捉部位を備える第１０の粒子が含まれる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記生体サンプルから第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、または第１０のバイオマーカーを除去、または分離することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記混合物に切断試薬または放出剤を加えて、濃縮された単離物を提供することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１９】
前記バイオマーカーについて診断試験を行うこと（たとえば、本明細書に記載される除去方法または単離方法の後に）をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２０】
前記診断試験は、２種以上のバイオマーカーの存在または不存在を同時に検出する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１の粒子は、大きさ、形状、化学的特性、色、または他の特性が前記第２の粒子と異なる、請求項８に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１の粒子は、大きさ、形状、化学的特性、色、または他の特性が前記第３の粒子と異なる、請求項９に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１の粒子は、大きさ、形状、化学的特性、色、または他の特性が前記第４の粒子と異なる、請求項１０に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１の粒子は、大きさ、形状、化学的特性、色、または他の特性が前記第５の粒子と異なる、請求項１１に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１の粒子は、大きさ、形状、化学的特性、色、または他の特性が前記第６の粒子と異なる、請求項１２に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１の粒子は、大きさ、形状、化学的特性、色、または他の特性が前記第７の粒子と異なる、請求項１３に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１の粒子は、大きさ、形状、化学的特性、色、または他の特性が前記第８の粒子と異なる、請求項１４に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１の粒子は、大きさ、形状、化学的特性、色、または他の特性が前記第９の粒子と異なる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１の粒子は、大きさ、形状、化学的特性、色、または他の特性が前記第１０の粒子と異なる、請求項１６に記載の方法。
【請求項３０】
前記特性は、本明細書に記載のバイオマーカーに対する選択性、親和性、または結合性である、請求項２１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記大きさは直径５０〜１０００ｎｍ（たとえば、１００〜５００ｎｍ、２００〜６００ｎｍ）である、請求項２１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記大きさは直径１〜３ミクロンである、請求項２１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
第１の粒子集団は第２の粒子集団より高い濃度で存在する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３４】
前記第１の粒子対前記第２の粒子の比は、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記第１の粒子は第１の濃度で存在する、請求項７に記載の方法。
【請求項３６】
前記第２の粒子は第２の濃度で存在する、請求項８に記載の方法。
【請求項３７】
前記第３の粒子は第３の濃度で存在する、請求項９に記載の方法。
【請求項３８】
前記第４の粒子は第４の濃度で存在する、請求項１０に記載の方法。
【請求項３９】
前記第５の粒子は第５の濃度で存在する、請求項１１に記載の方法。
【請求項４０】
前記第６の粒子は第６の濃度で存在する、請求項１２に記載の方法。
【請求項４１】
前記第７の粒子は第７の濃度で存在する、請求項１３に記載の方法。
【請求項４２】
前記第８の粒子は第８の濃度で存在する、請求項１４に記載の方法。
【請求項４３】
前記第９の粒子は第９の濃度で存在する、請求項１５に記載の方法。
【請求項４４】
前記第１０の粒子は第１０の濃度で存在する、請求項１６に記載の方法。
【請求項４５】
前記第１の粒子は対照粒子（たとえば、標識または指標（たとえば、既知の量、濃度の標識または指標）を含む粒子）である、請求項７に記載の方法。
【請求項４６】
前記標識または前記指標は、前記サンプルの濃度または容積の測定を提供する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記標識または前記指標は、収率または粒子回収率の測定を提供する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記標識または前記指標は、前記サンプルのロット番号またはバッチ番号の指標を提供する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記バイオマーカーは、ビオチン、ＨＡＭＡ、ＲＦ、異好、または抗ＳＡｖである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５０】
前記バイオマーカーは、細菌の感染の指標である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５１】
前記バイオマーカーは、細菌の捕捉部位である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５２】
前記粒子複合体の除去または単離には、捕捉部位−バイオマーカー複合体の切断、溶出、または選択的放出が含まれる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５３】
前記捕捉部位には、診断試験システムにおける測定のためのシグナル検出分子が含まれる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記サンプルは、組み合わせステップａ）の前に、干渉物質を除去または枯渇させるために、（ｉ）前記サンプルを、前記バイオマーカーに対する特異性がない捕捉部位を含む粒子と組み合わせて、混合物を提供すること、（ｉｉ）前記混合物を混合して、前記干渉物質との粒子複合体を提供すること、および（ｉｉｉ）前記粒子複合体を除去、または完全に除去して、枯渇させた溶液を提供すること、を含む前処理をされる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５５】
複数種の粒子、磁石、チューブ、および取扱説明書を含むキット。
【請求項５６】
患者のウロコルチンＩＩＩペプチド、ウロモジュリンペプチド、オロソムコイド１ペプチド、カリクレイン１ペプチド、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、高感度Ｃ反応性タンパク質、またはこれらの組み合わせを検出する方法であって、
ａ．ヒト患者からサンプルを得ること、および、
ｂ．複数種の粒子により、ウロコルチンＩＩＩペプチド、ウロモジュリンペプチド、オロソムコイド１ペプチド、カリクレイン１ペプチド、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、高感度Ｃ反応性タンパク質、またはこれらの組み合わせが前記サンプル中に存在するか否かを検出すること、およびウロコルチンＩＩＩペプチド、ウロモジュリンペプチド、オロソムコイド１ペプチド、カリクレイン１ペプチド、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、高感度Ｃ反応性タンパク質、またはこれらの組み合わせと、前記複数種の粒子との間の結合を検出すること、
を含む、方法。
【請求項５７】
患者の閉塞性睡眠時無呼吸を診断する方法であって、
ａ．ヒト患者からサンプルを得ること、および、
ｂ．前記サンプルを複数種の粒子と接触させることにより、ウロコルチンＩＩＩペプチド、ウロモジュリンペプチド、オロソムコイド１ペプチド、カリクレイン１ペプチド、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、高感度Ｃ反応性タンパク質、またはこれらの組み合わせが前記サンプル中に存在するか否かを検出すること、およびウロコルチンＩＩＩペプチド、ウロモジュリンペプチド、オロソムコイド１ペプチド、カリクレイン１ペプチド、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、高感度Ｃ反応性タンパク質、またはこれらの組み合わせと、前記複数種の粒子との間の結合を検出すること、ならびに、
ｃ．前記サンプル中にウロコルチンＩＩＩペプチド、ウロモジュリンペプチド、オロソムコイド１ペプチド、カリクレイン１ペプチド、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、高感度Ｃ反応性タンパク質の存在が検出された場合に、閉塞性睡眠時無呼吸の患者であると診断すること、
を含む、方法。
【請求項５８】
前記患者がヒトである、請求項５６または５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ヒトは約９歳から約２歳未満である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
ウロコルチンＩＩＩペプチド、ウロモジュリンペプチド、オロソムコイド１ペプチド、カリクレイン１ペプチド、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、高感度Ｃ反応性タンパク質からなる群の２種以上の存在または不存在を同時に検出することを含む、請求項５６または５７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１８年7月２７日に出願された米国仮特許出願番号第６２／７１１，４１５号、および２０１８年１０月１７日に出願された米国仮特許出願番号第６２／７４７，０１７号、に基づき優先権を主張する。前述の各出願の内容全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、バイオマーカー（たとえば、閉塞性睡眠時無呼吸のための）を単離して特性評価をするために、本明細書に記載されているような捕獲部位をそれぞれ独立して備える表面を含む複数種の粒子（たとえば、微粒子、ナノ粒子；磁性体、非磁性体）を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
臨床検査は、健康アセスメント、ヘルスケア、および究極的には公衆衛生に重要な役割があり、あらゆるライフステージの人に影響を与える。ほとんどの人が一生の間に１回以上臨床検査をするであろう。米国だけで、毎年推定７０〜１００億の臨床検査が行われており、臨床検査の結果は医療の決定のおおよそ７０％に影響を与える。
【０００４】
さらに、２０１８年１月にメディケア・メディケイドサービスセンター（ＣＭＳ）で、メディケアアクセス保護法（ＰＡＭＡ）により求められている新しい臨床検査料金表（ＣＬＦＳ）を実施して以来、ＰＡＭＡは臨床検査の償還金を削減している。ラボの結果が最初に正確であり、トラブルシューティングの努力が軽減され、または時間が短縮され、ラボのワークフローに影響を与えないことは、さらに重要である。
【０００５】
干渉物質とは、たとえば抗体結合に干渉することによって診断試験の結果の正しい値を変化させることができ、または架橋、立体障害、もしくは自己抗体のメカニズムによってアッセイシグナルを増加もしくは減少させることができる、患者の検体中に存在する物質である。イムノアッセイが干渉の影響を受けやすいことが知られている一方、誤った結果が装置（分析装置）もしくは検査室で認識されず、警告シグナルがない場合、または患者の結果が臨床像と合致しないことを医師が検査室に伝えなかった場合、臨床検査室は依然として誤った結果を報告しているかもしれない。問題を引き起こす可能性のあるそのような検体を事前に特定するための実用的な手段がなければ、任意の検体で予期せず不正確な結果が生じる可能性がある。そのような干渉の結果、誤った結果により偽陰性および偽陽性の検査結果となる可能性があり、患者の治療に影響を与え、不要な侵襲的、診断的、もしくは治療的手段につながり、または患者の治療に失敗する可能性がある。
【０００６】
干渉から生じる問題にもかかわらず、たとえば生体サンプル中の存在量または存在比が少ないため、バイオマーカーのスクリーニングおよび診断試験が困難な場合がある。
【０００７】
閉塞性睡眠時無呼吸（ＯＳＡ）のための尿および／または血液バイオマーカーは、子供および成人において、診断を容易にし、費用効果の高い疾患の治療のために使用される。尿および／または血液バイオマーカーの全体的な目的は、ＯＳＡに最適なバイオマーカーの特徴に対処し、測定することである。ＯＳＡは、子供と成人において、心血管疾患、糖尿病、その他の慢性疾患の危険性の増加に関連して非常に有病率の高い障害である。残念ながら、ＯＳＡ患者の最大９０％は診断を受けておらず、この疾患を管理するための適切な治療を受けていない。ＯＳＡの病態生理と結果については多くのことが知られているが、ＯＳＡの分子機構はまだ十分に定義されていない。しかし、プロテオミクスに基づく技術の進歩により、ＯＳＡを含む多くの疾患の潜在的な診断および治療標的としての新規バイオマーカーの発見が容易になった。
【０００８】
疫学研究では、ＯＳＡは成人人口の６〜１３％、小児人口の１〜４％が罹患していることが示されている。ＯＳＡの有病率は、心疾患または代謝障害のある患者では、一般の集団よりも５０％以上高い。未治療のＯＳＡは、生活の質を悪化させ、心血管疾患、高血圧、糖尿病、肥満、脳卒中、うつ病、および様々な代謝性疾患を含む長期的な結果をもたらす。子供では、ＯＳＡは認知障害や行動障害を引き起こし、注意欠陥障害（ＡＤＤ）と誤診されることがある。
【０００９】
現在、ＯＳＡの確定診断には、研究室ベースのポリソムノグラフィー（ＰＳＧ）による一晩睡眠試験が必要とされている。しかし、睡眠の研究は、子供および成人のＯＳＡの診断のためには、手間がかかり、高価であり、手が届かず、不便である。携帯用睡眠モニターを使用した家ベースの付き添いのいない研究が促進されている一方、家ベースのＯＳＡの診断の５６％は依然として、研究室でのＰＳＧ試験による確認を必要としている。１）既知のＯＳＡ陽性患者サンプルにおける潜在的なＯＳＡバイオマーカーの発見および分析の簡素化、および２）複数のバイオマーカーをパネルに組み合わせて、ＯＳＡの正確な診断のために望ましい感度および特異度を達成し、ＯＳＡ治療の有効性にアクセスする技術等の、簡単で安価なスクリーニング検査または診断検査によって、患者のＯＳＡを早期に特定する必要がある。
【００１０】
低濃度のバイオマーカーを正確、精密かつ高感度に測定することが、ＯＳＡを正しく確定診断／除外診断し、患者の転帰を改善するための鍵となる、閉塞性睡眠時無呼吸（ＯＳＡ）診断検査ソリューションの開発が必要とされている。肥満、高血圧、心疾患、糖尿病、行動問題および学習問題を引き起す可能性があり、子供においては意欠陥障害（ＡＤＤ）と誤診される可能性があるＯＳＡを、４，３００万人のアメリカ人が有しているかもしれない。ＣＤＣは、米国における小児ＯＳＡの有病率を約１００万と推定している。ＯＳＡは現在最も診断不足の症状の一つであり、ＯＳＡの診断は慣習的に高価で不便な睡眠試験（ポリソムノグラフィー）を必要とする。小児の場合、親が積極的でないこともよくあり、子どもが睡眠試験に耐えられないこともある。
【００１１】
したがって、検査室のワークフローおよび所要時間に影響を与えることなく、診断試験の前にサンプル干渉物質を除去または最小化し、バイオマーカー濃度を濃縮するための、簡易で、安価で、自動化可能かつ効果的な解決策に対する臨床的ニーズがある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本明細書に記載されるのは、たとえば、モノクローナルマウス抗体で治療されているか、または診断目的のためにモノクローナルマウス抗体を受けている患者における異好抗体等の、誤った試験結果および患者の安全性に対するリスクの増大をもたらす可能性のある既知のサンプル特異的な干渉を管理および軽減するための、簡単で、効果的で、かつ費用効果の高い、生体サンプル中の１種以上のバイオマーカーの検出方法である。本明細書に記載される方法はまた、健康、美容、および体重減少のために、または治療的、たとえば多発性硬化症の治療のために消費者によって摂取される店頭販売（ＯＴＣ）サプリメント、マルチビタミン、および植物性の生薬由来であり得るビオチンが引き起こすサンプル特異的な干渉を管理および軽減することができる。
【００１３】
ある観点では、提供されるのは、生体サンプルからバイオマーカーを除去するための方法であって、ａ）サンプルを、各粒子が独立して捕捉部位（すなわち、捕捉部位の型または種類）を含む複数種の粒子と組み合わせて、混合物を提供すること、ｂ）混合物を混合して、バイオマーカーとの１種以上の粒子複合体を提供すること、ｃ）粒子複合体を除去または単離して、枯渇させた溶液を提供することを含み、それにより、生体サンプルからバイオマーカーを除去する方法である。
【００１４】
ある観点では、提供されるのは、生体サンプルからバイオマーカーを単離するための方法であって、ａ）サンプルを、各粒子が独立して捕捉部位（すなわち、捕捉部位の型または種類）を含む複数種の粒子と組み合わせて、混合物を提供すること、ｂ）混合物を混合して、バイオマーカーとの１種以上の粒子複合体を提供すること、ｃ）粒子複合体を除去または単離して、枯渇させた溶液および濃縮された単離物を提供することを含み、それにより、生体サンプルからバイオマーカーを単離する方法である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書に記載されるのは、本明細書に記載されるような複数種の粒子を本明細書に記載されるような生体サンプルと組み合わせることを含む、生体サンプル中の１種以上の閉塞性睡眠時無呼吸（ＯＳＡ）のバイオマーカーを単離または濃縮するための方法である。
【００１６】
ある観点では、本明細書に記載されるのは、生体サンプルからＯＳＡのバイオマーカーを除去するための方法であって、ａ）サンプルを、各粒子が独立して捕捉部位を含む（すなわち、捕捉部位の型または種類）複数種の粒子と組み合わせて、混合物を提供すること、ｂ）混合物を混合して、バイオマーカーとの１種以上の粒子複合体を提供すること、ｃ）粒子複合体を除去または単離して、枯渇させた溶液を提供することを含み、それにより、生体サンプルからバイオマーカーを除去する方法である。
【００１７】
ある観点では、本明細書に記載されるのは、生体サンプルからバイオマーカーを単離するための方法であって、ａ）サンプルを、ａ）サンプルを、各粒子が独立して捕捉部位を含む（すなわち、捕捉部位の型または種類）複数種の粒子と組み合わせて、混合物を提供すること、ｂ）混合物を混合して、バイオマーカーとの１種以上の粒子複合体を提供すること、ｃ）粒子複合体を除去または単離して、枯渇させた溶液および濃縮された単離物を提供することを含み、それにより、生体サンプルからバイオマーカーを単離する方法である。いくつかの実施形態では、複数種の粒子には、複数種の捕捉部位（たとえば、それぞれ独立に複数種の捕捉部位と共有結合または非共有結合している複数種の粒子）が含まれる。
【００１８】
いくつかの実施形態では、サンプルを複数種の粒子と組み合わせる前に、生体サンプルに条件調節剤が添加される。いくつかの実施形態では、条件調節剤は、ｐＨ調整剤、モル濃度調整剤、干渉遮断剤、または遊離剤もしくは放出剤である。
【００１９】
いくつかの実施形態では、複数種の粒子には、第１の捕捉部位を備える第１の粒子が含まれる。いくつかの実施形態では、複数種の粒子には、第２の捕捉部位を備える第２の粒子が含まれる。いくつかの実施形態では、複数種の粒子には、第３の捕捉部位を備える第３の粒子が含まれる。いくつかの実施形態では、複数種の粒子には、第４の捕捉部位を備える第４の粒子が含まれる。いくつかの実施形態では、複数種の粒子には、第５の捕捉部位を備える第５の粒子が含まれる。いくつかの実施形態では、複数種の粒子には、第６の捕捉部位を備える第６の粒子が含まれる。いくつかの実施形態では、複数種の粒子には、第７の捕捉部位を備える第７の粒子が含まれる。いくつかの実施形態では、複数種の粒子には、第８の捕捉部位を備える第８の粒子が含まれる。いくつかの実施形態では、複数種の粒子には、第９の捕捉部位を備える第９の粒子が含まれる。いくつかの実施形態では、複数種の粒子には、第１０の捕捉部位を備える第１０の粒子が含まれる。いくつかの実施形態では、方法には、生体サンプルから第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、または第１０のバイオマーカーを除去または単離する方法が含まれる。
【００２０】
いくつかの実施形態では、方法には、混合物に切断試薬または放出剤を加えて、濃縮された単離物を提供することがさらに含まれる。
【００２１】
いくつかの実施形態では、方法には、バイオマーカーについて診断試験を行うこと（たとえば、本明細書に記載される除去方法または単離方法の後に）がさらに含まれる。いくつかの実施形態では、診断試験は、２種以上のバイオマーカーの存在または不存在を同時に検出する。
【００２２】
いくつかの実施形態では、第１の粒子は、大きさ、形状、化学的特性、色、または他の特性が第２の粒子と異なる。いくつかの実施形態では、第１の粒子は、大きさ、形状、化学的特性、色、または他の特性が第３の粒子と異なる。いくつかの実施形態では、第１の粒子は、大きさ、形状、化学的特性、色、または他の特性が第４の粒子と異なる。いくつかの実施形態では、第１の粒子は、大きさ、形状、化学的特性、色、または他の特性が第５の粒子と異なる。いくつかの実施形態では、第１の粒子は、大きさ、形状、化学的特性、色、または他の特性が第６の粒子と異なる。いくつかの実施形態では、第１の粒子は、大きさ、形状、化学的特性、色、または他の特性が第７の粒子と異なる。いくつかの実施形態では、第１の粒子は、大きさ、形状、化学的特性、色、または他の特性が第８の粒子と異なる。いくつかの実施形態では、第１の粒子は、大きさ、形状、化学的特性、色、または他の特性が第９の粒子と異なる。いくつかの実施形態では、第１の粒子は、大きさ、形状、化学的特性、色、または他の特性が第１０の粒子と異なる。いくつかの実施形態では、特性は、本明細書に記載のバイオマーカーに対する選択性、親和性、または結合性である。
【００２３】
いくつかの実施形態では、大きさは直径５０〜１０００ｎｍ、たとえば、直径５０〜５００ｎｍ、直径５０〜３００ｎｍ、直径５０〜１００ｎｍ、直径２００〜６００ｎｍ、直径４００〜６００ｎｍ、直径１００〜５００ｎｍ、である。いくつかの実施形態では、大きさは直径１〜３ミクロンである。いくつかの実施形態では、粒子は、直径５〜１００ｎｍである。
【００２４】
いくつかの実施形態では、第１の粒子集団は第２の粒子集団より高い濃度で存在する。いくつかの実施形態では、第１の粒子集団は第３の粒子集団より高い濃度で存在する。いくつかの実施形態では、第１の粒子集団は第４の粒子集団より高い濃度で存在する。いくつかの実施形態では、第１の粒子対第２の粒子の比は、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０である。粒子の濃度は、単位容積あたりの質量（たとえば、ｍｇ／ｍＬ、ｇ／Ｌ）または％固体（ｗ／ｖ）の単位で提供される。たとえば、０．５０％ｗ／ｖは、５ｍｇ／ｍＬまたは５ｇ／Ｌと同等である。
【００２５】
いくつかの実施形態では、第１の粒子は第１の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、第２の粒子は第２の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、第３の粒子は第３の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、第４の粒子は第４の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、第５の粒子は第５の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、第６の粒子は第６の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、第７の粒子は第７の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、第８の粒子は第８の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、第９の粒子は第９の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、第１０の粒子は第１０の濃度で存在する。
【００２６】
いくつかの実施形態では、第１の粒子は対照粒子（たとえば、標識または指標（たとえば、既知の量、濃度の標識または指標）を含む粒子）である。いくつかの実施形態では、標識または指標は、サンプルの濃度または容積の測定を提供する。いくつかの実施形態では、標識または指標は、サンプルのロット番号またはバッチ番号の指標を提供する。いくつかの実施形態では、標識または指標は、収率または粒子回収率の測定を提供する。
【００２７】
いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、ビオチン、ＨＡＭＡ、ＲＦ、異好、または抗ＳＡｖである。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、細菌の感染の指標である。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、細菌の捕捉部位である。
【００２８】
いくつかの実施形態では、粒子複合体の除去または単離には、捕捉部位−バイオマーカー複合体の切断、溶出、または選択的放出が含まれる。いくつかの実施形態では、捕捉部位（たとえば、捕捉部位−バイオマーカー複合体の捕捉部位）には、試験系で測定するためのシグナル検出分子が含まれる（または、シグナル検出分子で予め標識されている）。適切なシグナル検出分子には、限定されないが、ＨＲＰ、ＡＬＰ、アクリジニウムエステル、イソルミノール／ルミノール、ルテニウム、Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノール（ＡＢＥＩ）／環状ＡＢＥＩ、またはフルオレセインが含まれる。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるバイオマーカーを除去または単離するための方法の、組み合わせステップａ）の前に、干渉物質を除去または枯渇させるために、サンプルは前処理される。いくつかの実施形態では、干渉物質の除去または枯渇には、（ｉ）サンプルを、バイオマーカーに対する特異性がない捕捉部位を含む粒子と組み合わせて、混合物を提供すること、（ｉｉ）混合物を混合して、干渉物質との粒子複合体を提供すること、および（ｉｉｉ）粒子複合体を除去、または完全に除去して、枯渇させた溶液を提供することが含まれる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）の除去、または完全な除去は、磁気的、物理的、または化学的に行われる。
【００３０】
いくつかの実施形態では、捕捉部位は、ヒト抗動物抗体（たとえば、マウスＩｇＧ、ヒツジＩｇＧ、ヤギＩｇＧ、ウサギＩｇＧ、ウシＩｇＧ、ブタＩｇＧ、ウマＩｇＧ）である。いくつかの実施形態では、捕捉部位は、異好抗体（たとえば、ＦＲ（Ｆｃ特異的））Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、重合ＩｇＧ（１、２ａ、２ｂ型ＩｇＧおよびＩｇＧ断片、血清成分）である。いくつかの実施形態では、捕捉部位はアッセイ特異的な結合剤（たとえば、ビオチン、フルオレセイン、抗フルオレセインｐｏｌｙ／Ｍａｂ、抗ビオチンｐｏｌｙ／Ｍａｂ、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン）である。いくつかの実施形態では、アッセイ特異的なシグナル分子（たとえば、ＨＲＰ、ＡＬＰ、アクリジニウムエステル、イソルミノール／ルミノール、ルテニウム、ＡＢＥＩ／環状ＡＢＥＩ）である。いくつかの実施形態では、捕捉部位はアッセイ特異的な遮断剤（たとえば、ＢＳＡ、魚皮ゼラチン、カゼイン、卵白アルブミン、ＰＶＰ、ＰＶＡ）である。いくつかの実施形態では、捕捉部位は、アッセイ特異的な結合リンカー（たとえば、ＬＣ、ＬＣ−ＬＣ、ＰＥＯ４、ＰＥＯ１６）である。いくつかの実施形態では、捕捉部位は、抗原自己抗体（たとえば、遊離Ｔ３、遊離Ｔ４）である。いくつかの実施形態では、捕捉部位は、タンパク質自己抗体（たとえば、ＭＴＳＨ、ＴｎＩ、ＴｎＴ、非心臓性ＴｎＴ（骨格筋疾患））である。いくつかの実施形態では、捕捉部位は、化学発光基質（たとえば、ルミノール、イソルミノール、イソルミノール誘導体、ＡＢＥＩ、ＡＢＥＩ誘導体、ルテニウム、アクリジニウムエステル）、または蛍光標識（フルオレセインまたは他の蛍光色素分子、および染色剤）である。いくつかの実施形態では、捕捉部位は、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、アビジン、ポリＡ、ポリＤＴ、アプタマー、抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、抗体断片、組み換えタンパク質、酵素、タンパク質、生体分子、重合体、または分子インプリントである。いくつかの実施形態では、捕捉部位は、ビオチン、フルオレセイン、ポリＤＴ、ポリＡ、抗原等である。
【００３１】
ある観点では、本明細書に記載されるのは、複数種の粒子および取扱説明書を含むキットである。いくつかの実施形態では、キットには、複数種の粒子、採集チューブ、および取扱説明書が含まれる。いくつかの実施形態では、キットには、複数種の粒子、磁石、採集チューブ、および取扱説明書が含まれる。
【００３２】
（方法の多重応用）
【００３３】
本明細書に記載されるのは、本明細書に記載される方法の多重応用である。たとえば、ある実施形態では、２種以上の粒子（たとえば、本明細書に記載されるような粒子）は、生体サンプル中の１種以上のバイオマーカーと結合または複合化するために使用される。いくつかの実施形態では、第１の粒子は、第１のバイオマーカー（たとえば、本明細書に記載されるようなバイオマーカー）に結合または除去する第１の捕捉部位を含み、第２の粒子は、第２のバイオマーカー（たとえば、本明細書に記載されるようなバイオマーカー）に結合または除去する第２の捕捉部位を含み、第１および第２の粒子が生体サンプル（たとえば、本明細書に記載されるような生体サンプル）と組み合わせられた場合に、第１のバイオマーカーおよび第２のバイオマーカーは結合し、または生体サンプルから除去される。
【００３４】
いくつかの実施形態では、第１の粒子は、第２の粒子とは異なる物理特性（たとえば、大きさ、色）を有する。
【００３５】
たとえば、本明細書に記載される方法の多重応用のためのキットには、１）抗ヒトＩｇＧで被覆した青色ビーズ、２）抗ヒトＩｇＭで被覆した赤色ビーズ、３）ビオチン−ＰＥＧで被覆した黒色ビーズが含まれる。検出試薬は、定性視覚検出のためのこれら３種の異なるビーズの混合物である。ビーズはまた、蛍光光度計または蛍光プレートリーダーを用いて読み取られた場合に、多重検出のための異なる蛍光／励起光を有する固有の蛍光分子で標識され、半定量的または定量的な結果を得ることができる。カラービーズの使用に加え、ナノ粒子は、分析的な（蛍光、ＵＶ／ｖｉｓ、化学発光、電気化学発光等）検出のために標識することもできる。
【００３６】
ビーズは、ビーズ表面が抗体、タンパク質、抗原、抗体フラグメント、アプタマー、オリゴヌクレオチド（ＰｏｌｙＡ、ＰｏｌｙＤＴ）、分子インプリントポリマー等の共有結合固定のために機能化された、ラテックスなどの非磁性染色ビーズ、ナノビーズ（すなわち、青、赤、黒、緑、黄、紫、白）、染色磁性ビーズ（すなわち、黄、赤、緑）、または未染色磁性ビーズ（茶色）であってもよい。
【００３７】
マイクロアレイ特性評価キットには、少なくとも１つの干渉機構に特異的である各ウェル／スポットに固定化（すなわち、共有結合、親和性相互作用）された１種以上の異なる干渉標的または分析物が含まれる。無希釈のサンプル、または希釈されたサンプルを各ウェル／スポットに添加すると、サンプル特異的な干渉物質が存在する場合にのみ、サンプル特的な干渉物質（サンプル中に存在する場合のみ）が、固定化された干渉標的または分析物（たとえばバイオマーカー、たとえば干渉物質）と相互作用する。たとえば、サンプルにヒト抗ヤギＩｇＧ干渉物質が含まれる場合、ヒトＩｇＧは特定のウェル／スポットに固定化されたヤギＩｇＧに特異的に結合する。別の例として、サンプルにヒト抗ストレプトアビジンＩｇＭが含まれる場合、ヒトＩｇＭは特定のウェル／スポットに固定化されたストレプトアビジンに特異的に結合する。別の例として、サンプル中に遊離ビオチンが存在する場合、それは特定のウェル／スポットに固定化されたストレプトアビジン、ニュートロアビジン、アビジンまたは抗ビオチンＩｇＧに特異的に結合する。別の例として、サンプルに、ヒト抗ヒツジＩｇＧおよびヒト抗ルテニウムＩｇＭ等の２つ以上の異なる干渉物が含まれる場合、サンプルをウェル／スポットに固定化されたヒツジＩｇＧが含まれるウェル／スポットに添加すると、ヒト抗ヒツジＩｇＧのみがこのウェル／スポットに特異的に結合してヒト抗ルテニウムＩｇＧは結合せず、同じサンプルを、ウェル／スポットに固定化されたルテニウムが含まれる別のウェル／スポットに添加すると、ヒト抗ルテニウムＩｇＭのみがこのウェル／スポットに特異的に結合してヒト抗ヒツジＩｇＧは結合しない。
【００３８】
サンプルが入ったウェル／スポットをインキュベートした後、サンプルが所定のウェル／スポットに固定化された干渉標的に特異的であった場合にのみ、サンプル中のヒトＩｇＧ、ヒトＩｇＭ、および／またはビオチン干渉物質だけが所定のウェル／スポットに残るように、ウェル／スポットを洗浄した。ウェル／スポットに固定化された所定の干渉標的に対するサンプル特異的な干渉物質が存在しなかった場合は、洗浄後に検出可能な量のヒトＩｇＧ、ヒトＩｇＭ、またはビオチンはウェル／スポット中に存在しないであろう。
【００３９】
潜在的なサンプル干渉物質の特性評価のために、これら３種の異なるビーズの混合物を各ウェルまたは反応スポットに加え、ヒトＩｇＧおよび／またはヒトＩｇＭがその干渉標的との特異的な結合相互作用を介してウェル／スポットに結合した場合は青色および／または赤色ビーズのみが所定のスポットに結合し、黒色ビーズはビオチンにのみ特異的であるため結合しない。サンプル中の遊離ビオチンの量がビオチン結合能または遊離ビオチンの閾値より少ない場合、黒色ビーズのみが、固定化されたストレプトアビジン、ニュートラアビジン、アビジン、または抗ビオチンＩｇＧを介してウェル／反応に結合する。サンプル中の遊離ビオチンがビオチン結合能または遊離ビオチンの閾値を超える場合、すべてのビオチン結合部位が占有されているか、または飽和しており、いずれの黒色ビーズも結合しない。
【００４０】
対照として、ヒトＩｇＧ、ヒトＩｇＭ、または抗ビオチンタンパク質（ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、アビジン、または抗ビオチンＩｇＧ）が固定化された３つ以上のウェル／スポットとすることができる。３種のビーズ（青色、赤色および黒色）の混合物を所定の対照ウェル／スポットに加え、ヒトＩｇＧ（青色ビーズ）、ヒトＩｇＭ（赤色）、または抗ビオチンタンパク質（黒色）に特異的な色ビーズのみが対照ウェル／スポットに結合し、他の２色のビーズは結合しない。たとえば、対照ウェル／スポットにヒトＩｇＭが固定化されており、３色のビーズの混合物を加えた場合、赤色ビーズ（抗ヒトＩｇＭで被覆された赤色ビーズ）のみが結合し、青色または黒色ビーズは結合しない。別の例として、対照ウェル／スポットに抗ビオチンタンパク質が固定化されており、３色のビーズの混合物を加えた場合、黒色ビーズ（ビオチン−ＰＥＧで被覆された黒色ビーズ）のみが結合し、青色または赤色ビーズは結合しない。しかし、誤った色のビーズが対照ウェル／スポットに結合した場合、または２種以上の色のビーズが対照ウェル／スポットに結合した場合、対照は不合格である。正しい色のビーズが正しい対照ウェル／スポットに結合した場合のみ、対象は合格である。
【００４１】
しかし、ヒトＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）およびＩｇＭ（免疫グロブリンＭ）に加え、３つのさらなる類型のヒト抗体：ヒトＩｇＡ（免疫グロブリンＡ）、ヒトＩｇＤ（免疫グロブリンＤ）、およびヒトＩｇＥ（免疫グロブリンＥ）がある。５類型のヒト抗体があるため、これらの可能性のある干渉機構を検出するために、検出試薬混合物中のさらなるカラービーズ（Ｎ＝６色）が考えられ得る。たとえば、キットには、１）抗ヒトＩｇＧで被覆された青色ビーズ、２）抗ヒトＩｇＭで被覆された赤色ビーズ、３）抗ヒトＩｇＡで被覆された黄色ビーズ、４）抗ヒトＩｇＥで被覆された緑色ビーズ、５）抗ヒトＩｇＤで被覆された茶色ビーズ、６）ビオチン−ＰＥＧで被覆された黒色ビーズが含まれる。
【００４２】
別の例として、抗ヒトＩｇＡ、抗ヒトＩｇＥ、および抗ヒトＩｇＤで共被覆された黄色ビーズ、または各ロット／バッチは単一の抗ヒト抗体で被覆されており、すべてのバッチは、ヒトＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＤに特異的な３つの異なるロットの黄色ビーズを含む黄色ベッドの単一のバッチとしてプールまたはブレンドされている３つの別々のロット／バッチの黄色ビーズ等の、２種以上のヒト抗体型を検出するための単色ビーズを使用することができる。たとえば、検出試薬混合物中のさらなるカラービーズ（Ｎ＝４色）は、それらの可能性のある干渉機構を検出するために使用されてもよい。１）抗ヒトＩｇＧで被覆された青色ビーズ、２）抗ヒトＩｇＭで被覆された赤色ビーズ、３）抗ヒトＩｇＡ、抗ヒトＩｇＥ、抗ヒトＩｇＤで被覆された黄色ビーズ、またはあるロットは抗ヒトＩｇＡで被覆され、第２のロットは抗ヒトＩｇＥで被覆され、第３のロットは抗ヒトＩｇＤで被覆された３つの異なるロットの黄色ビーズのバッチ／プール、４）ビオチン−ＰＥＧで被覆された黒色ビーズ。
【００４３】
ＩｇＭは２価（２つのＦａｂを有し、ＩｇＧ１モルあたり２モルの抗原を結合することができる）であり、ＩｇＭは１０価（１０個のＦａｂを有し、ＩｇＭ１モルあたり１０モルの抗原を結合することができる）であるため、磁性ナノ粒子表面に固定化された同一の干渉標的が、マイクロアレイスポットまたはマイクロタイタープレートウェルにも固定化されている場合、アッセイ干渉特性化キットで特性表標識として磁気的ナノ粒子枯渇試薬を使うこともできる可能性がある。たとえば、磁気的ナノ粒子枯渇試薬が、ヒツジＩｇＧで被覆されており、試験前にヒト抗ヒツジ抗体（ＨＡＳＡ）干渉物質を枯渇させるためのサンプル前処理として、ヒト抗ヒツジＩｇＧおよび／またはヒト抗ヒツジＩｇＭ干渉物質を含むサンプルに加えられた場合、ヒト抗ヒツジＩｇＧおよび／またはヒト抗ヒツジＩｇＭは磁性ナノ粒子表面上に固定化されたヒツジＩｇＧに結合するであろう。サンプル前処理のインキュベートが完了した後、磁性ナノ粒子は、磁気的、物理的、または化学的分離方法を使用してサンプルから分離し、洗浄して結合していない物質をサンプルから除去することができる。洗浄された磁性ナノ粒子を水またはバッファーに入れ、アッセイ干渉特性評価キットのウェルまたはスポットに加えることができる。ウェル／スポットの表面にヒツジＩｇＧが固定化さている場合、任意の２価（ヒトＩｇＧ）および／または１０価（ヒトＩｇＭ）は磁性ナノ粒子表面上のヒツジＩｇＧに結合し、また、ウェル／スポットに固定化されたヒツジＩｇＧにも捕捉／結合して特異的なサンドイッチ複合体を形成することができる。
［磁性ナノ粒子］−（ヒツジＩｇＧ）−［ヒト抗ヒツジＩｇＧ／ＩｇＭ]−（ヒツジＩｇＧ）−[マイクロアレイスポットまたはマイクロタイタープレートウェル］
ウェル／スポットを洗浄した後、茶色（すなわち磁性ナノ粒子）が残っている＝陽性結果、またはヒト抗ヒツジ抗体がサンプルから検出された。洗浄後ウェル／スポットが透明または無色である場合＝陰性結果、またはヒト抗ヒツジ抗体はサンプルから検出されなかった。
【００４４】
（分離の方法）
本明細書に記載された粒子は、生体サンプルを加える前に、一次採血チューブ、２４時間採尿器、採尿器、唾液採集チューブ、採便器、精液採集器、採血バッグ、または任意のサンプル採集チューブもしくは装置等の採集装置に加えることができる。
【００４５】
本明細書に記載された粒子はまた、採集装置にサンプルを採集した後、または第１採集装置から、プラスチックまたはガラスのチューブ、バイアル、瓶、ビーカー、フラスコ、バッグ、缶、マイクロタイタープレート、ＥＬＩＳＡプレート、９６穴プレート、３８４穴プレート、１５３６穴プレート、キュベット、反応モジュール、リザーバー、もしくは液体サンプルの保持、保存、もしくは処理に適した任意の容器等の保存用もしくは移動用装置にサンプルを移した後に、サンプルに加えることもできる。
【００４６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載された粒子は、生体サンプルを含む採集装置に加えられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載された粒子は、生体サンプルを加える前に、採集装置に加えられる。
【００４７】
ある観点では、本明細書に記載されるのは、採尿器などの、生体サンプルを含む本明細書に記載された採集装置を含む、粒子を放出するための装置（すなわち、放出機構のトリガーとなるスクリューキャップ）である。たとえば、装置は、スクリューキャップを閉じると本明細書に記載された粒子を放出するスクリューキャップを備えるチューブである。
【００４８】
ある観点では、本明細書に記載されるのは、生体サンプル（すなわち、カプセル化された組成物または定義された速度または時点で溶液に溶解する組成物）を含む容器に粒子を放出させる化学物質を含む装置である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される装置は、たとえば、診断試験の前にサンプルの前処理を提供するために、本明細書に記載される粒子の添加を遅延させるように構成されている。
【００４９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるサンプルは、本明細書に記載される粒子の添加の前に、たとえばｐＨを調整したり、サンプル特異的な干渉物質を枯渇もしくは競合させたり、および／または標的バイオマーカーに対するナノ粒子の特異性と結合速度を向上させるためにサンプルにナノ粒子を添加、導入、分散、または混合する前に、マトリックス特有の課題を処理したりするために、化学物質、タンパク質、遮断剤、界面活性剤、またはそれらの組み合わせで前処理することができる。サンプルの前処理後の、サンプルへのナノ粒子の添加の遅延は、サンプルの前処理後のサンプルへのナノ粒子の添加によって物理的に制御することができる。ナノ粒子はまた、ナノ粒子がサンプル中に放出、添加、分散、もしくは混合される前に化学物質、重合体、もしくは糖を溶解する必要があるように、ナノ粒子が化学物質、重合体もしくは糖の殻、コーティング、または重合化によって、カプセル化、遮蔽または保護されている場合、サンプルの前処理の間、サンプル中に存在することもできる。ナノ粒子の遅延放出は、遅延薬物放出技術において今日使用されているような、当業者に知られている化学物質を使用することができる。
【００５０】
粒子の磁気的分離の方法
【００５１】
ある観点では、本明細書で提供されるのは、生体サンプルから干渉物質を除去する方法（たとえば診断試験の前）、または磁性粒子を単離もしくは分離する方法（たとえば、一次採血チューブ、カスタムのサンプル採集装置、二次トランスファーチューブまたはカスタムのサンプル装置内）である。たとえば、磁石ベースの装置は早急に（２分未満、好ましくは３０秒未満）磁性ナノ粒子を側面および／または底面に単離して、本質的に粒子を含まない上清を形成するであろう。粒子を含まない上清は、粒子を含むペレットを崩壊することなく連続して吸引することができ、診断試験のための別個の移動チューブに分注することができる。いくつかの実施形態では、ペレットは分離されるか、または診断試験に供される。いくつかの実施形態では、磁気的分離のための磁石は、大型ピペット装置上の１〜１２のサンプル調製チューブを保持するように設計されたラック中に２〜１２の磁石を備える多磁石装置である。そのようなピペット装置の例には、限定されないが、ＨａｍｉｌｔｏｎまたはＴｅｃａｎにより製造されたものが含まれる。いくつかの実施形態では、磁気的分離のための磁石は、９６穴または３８４穴のマイクロタイタープレートを磁化するように設計された９６または３８４の磁石を備える多磁石装置である。
【００５２】
粒子の物理的分離の方法
【００５３】
ある観点では、本明細書で提供されるのは、物理的な力（たとえば重力）によって、本明細書に記載される粒子を除去するための方法である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される粒子は、物理的な力によって生体サンプルから分離され、単離され、または除去される（たとえば遠心分離により）。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載された診断試験方法の適用の前、たとえば、一次採血チューブ中、カスタムのサンプル採集チューブ中、二次トランスファーチューブ中、またはカスタムのサンプル装置中で使用される。いくつかの実施形態では、粒子を除去する方法は濾過である。
【００５４】
たとえば、フィブロネクチン、および／または他の血栓因子に特異的な磁性ナノ粒子、または血栓成分／構成要素のオフ、その後の「血栓」（血清中）の捕捉もしくは結合のための細胞デブリ（すなわち、赤血球膜特異的）、および／または細胞デブリ（血清または血漿中）の捕捉もしくは結合のための磁性ナノ粒子は、遠心分離ローターおよび／またはチューブホルダーにおける強力な磁石または磁気技術の統合により、遠心分離速度および効率（研究室の効率、ワークフローおよびスループットを改善するためのより短いスピン時間）を増大させる。遠心分離のＲＣＦまたはＧと磁性ナノ粒子複合体（血栓＋磁性ビーズ、細胞デブリ＋磁性ビーズ）の磁気的分離の組み合わせにより、サンプルチューブの側面または底面でのはるかに迅速かつ効率的な分離と上澄みの形成が可能になり、その後の分析のためにサンプルが澄む。たとえば、ほとんどの研究室では、この遠因分離ステップは４分間以上であり、遠心分離と磁性ナノ粒子−血栓／細胞デブリ複合体の磁気的単離／分離の組み合わせにより、２分間以下（好ましくは１分以下）に短縮することができる。
【００５５】
さらに、ナノ粒子または大多数の磁性ナノ粒子が、１、５、１０、２０、３０、またはそれ以上の異なる干渉メカニズム等の１以上の異なるサンプル干渉メカニズムに特異的である場合、それらの干渉物質は、存在するならば、ナノ粒子に捕捉され、遠心分離物からの物理的分離後に、または上述の遠心分離と磁気的分離の組み合わせによって、サンプルから枯渇するであろう。
【００５６】
これらの磁性ナノ粒子はまた、遠心分離、または遠心分離における遠心分離と磁気的分離の組み合わせを介して分離される血栓または細胞デブリへの特異性を必要とせず、それらの表面は、１種超の抗原および／または抗体で共被覆または固定されていてもよく、この場合、１種以上の抗体および／または抗原は血栓または細胞デブリに特異的であり、他の抗原および／または抗体はサンプル干渉物質に特異的である。その際、ナノ粒子は、遠心分離または遠心分離と磁気的分離の組み合わせを介したその後の物理的分離または単離のために、サンプル干渉物質と血栓および／または細胞デブリの両方に特異的に結合するであろう。
【００５７】
血栓および／または細胞デブリに特異的なナノ粒子の使用は、磁性ナノ粒子による特異的に結合、ならびに磁気的分離および単離のためにすべてを磁性体に引っ張ることによって、凝固速度を増加させる。磁場と強度によって形成されたこのビーズベースのペレットはまた、血栓の強制的な近接、またはナノ粒子およびその後の磁石によって特異的に捕捉された凝固因子に基づいて血栓形成を促進する。
【００５８】
粒子の化学的分離の方法
【００５９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される粒子は、化学的分離方法により生体サンプルから分離、単離、または除去される。いくつかの実施形態では、化学的分離方法は、診断試験方法が適用される前、たとえば、一次採血チューブ内、カスタムのサンプル採集装置内、二次トランスファーチューブ内、またはカスタムのサンプル装置内で使用される。
【００６０】
ある観点では、提供されるのは、１種以上の塩、溶媒、重合体、または界面活性剤を提供することを含む、粒子の化学的分離のための方法である。
【００６１】
いくつかの実施形態では、化学的分離方法、たとえば液液相分離は、粒子を相Ａに分画し、ナノ粒子を含まないサンプルを試験される相Ｂに分画する。液液相分離（化学相分離）の薬剤は、塩、可溶性重合体、界面活性剤等によることができる。
【００６２】
たとえば、液液相分離は、極性水性サンプルにヘキサン等の非極性溶媒を加えることで起こすことができ、本明細書に記載されるような診断試験による試験のためのナノ粒子を含まない水相を残して、粒子は非極性相に分画される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される分離の方法は、有機相中にナノ粒子を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される分離の方法は、水相中にナノ粒子を提供する。
【００６３】
粒子および生体サンプルに非極性溶媒と水性極性溶媒を供給して非極性溶媒層および極性溶媒層を提供し、非極性溶媒を含む非極性溶媒層を除去し、粒子を含む水性極性溶媒を単離することにより粒子を単離することを含む、生体サンプル中の粒子を単離する方法。
【００６４】
非極性相を吸引して廃棄する前に、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳのための重水素化された内部対照物質または内部参照粒子等の内部標準物質を添加して使用することにより、サンプルの回収を調整または修正することができる。
【００６５】
いくつかの実施形態では、分離は、磁気的分離と組み合わせて使用される物理的分離である。たとえば、ある観点では、提供されるのは装置（たとえば、磁化された遠心分離機、または重力および磁石の磁力の両方による分離を助ける磁石を備えた遠心分離機）である。ある観点では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載される粒子の分離のための、磁石および遠心分離機を備える装置である。いくつかの実施形態では、該装置は遠心分離時間を大幅に削減する。
【００６６】
（バイオマーカーの除去または濃縮の方法）
本明細書に記載されるのは、生体サンプル中のバイオマーカーの濃度を濃縮する、または増加させるための方法である。「濃縮」は、完全または部分的に、粒子を捕捉し、標的分析物またはバイオマーカーを生体サンプル（たとえば、ヒトもしくは動物の血清、血漿、血液、全血、処理された血液、尿、唾液、便（液体および固体）、精液もしくは精漿、細胞、組織、生検材料、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または任意の液体または固体）からの粒子に結合させることとして定義される。いくつかの実施形態では、濃縮には、たとえば、バイオマーカー特異的ナノ粒子を洗浄して、バイオマーカーの特性評価および測定ステップの前に干渉物質を除去または最小化するために単離することによる、生体サンプルの洗浄および濃縮が含まれる。
【００６７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載された方法は、その後の溶出および試験のため、または診断試験の前にバイオマーカーの濃度を濃縮もしくは増加させるために、生体サンプル中の特定の標的（たとえばバイオマーカー）を分離および精製するために使用される。
【００６８】
バイオマーカー特異的な粒子を洗浄または単離した後、特性評価または測定ステップの前に、粒子は、リン酸塩緩衝生理食塩水（すなわちＰＢＳ  ｐＨ７．２）、またはＬＣ−ＭＳ／ＭＳ互換バッファー等のバッファー中に分散、再構成、または再懸濁することができる。これは、粒子によって捕捉され濃縮されたバイオマーカーの重要な特性評価または測定ステップは、緩衝系内で行われたものであり、同じ特性評価、測定または試験方法または系を使用して血液、血漿、血清または尿中で測定された同じバイオマーカーと比較して、動物の血液、血漿、血清、または尿で測定されたバイオマーカー間のマトリックス効果またはバイアスを導入または引き起こすものである動物またはヒトのマトリックス内でおこなわれたものではないことを意味する。洗浄により、サンプルマトリックス、成分、タンパク質、細胞成分、および関連する干渉またはマトリックス効果を洗い流すことができる。
【００６９】
濃縮は、その後の診断検査、たとえば定量的、半定量的、または定性的分析のために十分な量の分析物が捕捉された場合、完全であると定義され、その後の半定量的分析または定性的分析のために十分な量の分析物またはバイオマーカーが捕捉された場合、部分的であると定義され、また、ＬＣＭＳおよびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（すなわち、重水素化された内部標準）およびＨＰＬＣ（Ｃ１４またはトリチウム内部放射性同位元素の内部標準）等の、内部標準を使用して、目的の分析物またはバイオマーカーの回収を調整することができる測定方法による、定量的、半定量的、または定性的分析のために十分な量の標的の分析物またはバイオマーカー、および内部標準が捕捉された場合も、部分的であると定義される。
【００７０】
ａ）粒子（たとえば、ナノ粒子、マイクロ粒子）をサンプルに加えること、ｂ）粒子（たとえば、ナノ粒子、マイクロ粒子）をサンプルと混合すること、ｃ）粒子（たとえば、ナノ粒子、マイクロ粒子）をサンプルとインキュベートしてバイオマーカーを粒子（たとえば、ナノ粒子、マイクロ粒子）に結合および捕捉させること、ｄ）粒子（たとえば、ナノ粒子、マイクロ粒子）をサンプルから単離または除去すること、ｅ）粒子（たとえば、ナノ粒子、マイクロ粒子）を保存すること、ｆ）適切な希釈剤を使用して粒子（たとえば、ナノ粒子、マイクロ粒子）を洗浄し、非特異的な材料を除去すること、ｇ）バイオマーカー特異的な定量的、半定量的、または定性的な診断試験を用いて、粒子（たとえば、ナノ粒子、マイクロ粒子）に捕捉されたバイオマーカーの量、質量、モル濃度、濃度、または収量を測定すること、を含む、診断試験の前にサンプル中のバイオマーカーを濃縮するための方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、希釈剤には水（たとえば、脱イオン水、注射用水、生理食塩水、緩衝水溶液）が含まれる。
【００７１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される濃縮方法には、洗浄ステップが含まれる。洗浄ステップでは、本明細書に記載されるような干渉物質を除去し、および／または洗浄され、精製され、もしくは単離された関心のあるバイオマーカー（たとえば、本明細書に記載されているようなバイオマーカー）を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される濃縮方法は、異なる起源の２つの生体サンプルを比較する診断試験の前に使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される濃縮方法は、動物のサンプルとヒトのサンプルを比較する診断試験の前に使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される濃縮方法は、血清サンプルと血漿サンプルを比較する診断試験の前に使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される濃縮方法は、高粘度のサンプルに使用される。
【００７２】
本明細書に記載される濃縮方法は、バイオマーカーの特性評価および測定ステップの前にバイオマーカー特異的なナノ粒子が洗浄され、または単離されて前述の干渉物質を除去または最小化することにより、溶血、脂血症、黄疸、ビリルビン、マイクロフィブリン血餅、細胞デブリ、血球、フィブリノーゲン、薬剤代謝、サプリメント、植物性の生薬、およびマルチビタミン等のその他の干渉物質に起因する試験誤差の既知の分析前または分析の原因を軽減、減少、または管理するために使用することができる。
【００７３】
いくつかの実施形態では、濃縮方法には、バイオマーカーが濃縮された第１の生体サンプルをバイオマーカーが濃縮された第２の生体サンプルと結合させることが含まれる。
【００７４】
本明細書で提供されるのは、本明細書に記載される切断試薬により、たとえば、ｐＨ（たとえば、炭酸水素ナトリウム等の塩基で増加したｐＨ、酢酸、トリクロロ酢酸、スルホサリチル酸、塩酸、ギ酸等の酸で減少したｐＨ、ｐＨ２．５〜３．０の１００ｍＭグリシンＨＣｌ、ｐＨ３．０の１００ｍＭクエン酸、ｐＨ１１．５の５０〜１００ｍＭトリエチルアミンまたはトリエタノールアミン、ｐＨ１０．５の１５０ｍＭ水酸化アンモニウム等の一般的なｐＨの溶出バッファー）、ディスプレーサ―または置換剤、競合溶出（たとえば、０．１Ｍ超のカウンターリガンドまたは類似体）、イオン強度および／またはカオトロピック効果（たとえば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、１０ｍＭトリス中ｐＨ７．０の３．５〜４．０Ｍ塩化マグネシウム、ｐＨ７．２の１０ｍＬのリン酸緩衝液中５Ｍ塩化リチウム、ｐＨ７．５の２．５Ｍヨウ化ナトリウム、０．２〜３．０Ｍチオシアン酸ナトリウム）、界面活性剤、洗浄剤、濃縮無機塩、変性（たとえば、２〜６ＭグアニジンＨＣｌ、 ２−８Ｍ尿素、１％デオキシコール酸塩、１％ＳＤＳ）、有機溶剤（たとえば、アルコール、クロロホルム、エタノール、メタノール、アセトニトリル、ヘキサン、ＤＭＳＯ、１０％ジオキサン、ｐＨ８〜１１．５の５０％エチレングリコール（カオトロピックも）、放射線または熱（高温）、構造変化、ジスルフィド結合還元剤（２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）、酵素不活化、カオトロピック剤（尿素、塩化グアニジン、過塩素酸リチウム）、機械的撹拌、超音波処理、およびタンパク質消化酵素（ペプシン、トリプシン）、ならびにそれらの組み合わせ等の溶出戦略を用いた結合相互作用の破壊によって、粒子（たとえば、ナノ粒子、マイクロ粒子）から溶出、解離、または解放されることにより、粒子（たとえば、ナノ粒子、マイクロ粒子）により捕捉および濃縮された標的バイオマーカーの量、質量、モル濃度、濃度、または収量を測定する方法である。
【００７５】
別段の記載がない限り、または本開示から暗示されない限り、本明細書に記載された特定の方法または組成物に関連して記載された任意の実施形態のいずれかは、本明細書に記載された他の実施形態のいずれかと組み合わせて使用することができる。
【００７６】
本発明の方法および組成物は、この分野で知られる任意の適切なアッセイ、たとえば、限定されないが、タンパク質−タンパク質アフィニティアッセイ、タンパク質−リガンドアフィニティアッセイ、核酸アフィニティアッセイ、間接蛍光抗体アッセイ（ＩＦＡＳ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、および酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）を含むこの分野で知られる任意の適切なアフィニティアッセイまたはイムノアッセイ、直接または間接のアッセイ、競合アッセイ、サンドイッチアッセイ、ＣＬＩＡまたはＣＬＩＡ免除試験、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、分析アッセイ等と組み合わせて使用することができる。
【００７７】
診断試験の前に、同じサンプルからサンプルの干渉物質を枯渇させる方法とバイオマーカーを濃縮する方法の両方の方法には、ａ）バイオマーカー特異的な粒子（たとえば、ナノ粒子、マイクロ粒子）をサンプルに添加する前に、化学的および／または生物学的試薬、添加剤または組成物（たとえば、ナノ粒子、マイクロ粒子）をサンプル添加して、サンプル特異的な干渉を遮断または枯渇させること、ｂ）化学的および／または生物学的試薬、添加剤または組成物でサンプルを前処理またはインキュベートした後に、バイオマーカー特異的な粒子（たとえば、ナノ粒子、マイクロ粒子）をサンプルに添加すること、ｃ）バイオマーカー特異的な粒子（たとえば、ナノ粒子、マイクロ粒子）をサンプルとインキュベートして、標的バイオマーカーを粒子（たとえば、ナノ粒子、マイクロ粒子）に結合させ、捕捉させること、ｄ）粒子（たとえば、ナノ粒子、マイクロ粒子）を洗浄し、またはサンプル、ならびに化学的および／もしくは生物学的試薬添加剤または組成物からそれを単離すること、ｅ）診断試験を用いて、粒子（たとえば、ナノ粒子、マイクロ粒子）に捕捉され、濃縮されたバイオマーカーの特性評価をすること、からなる。
【００７８】
たとえば、ある実施形態では、キャプトアビジンに結合した粒子は、中性のｐＨでサンプル中のビオチンに結合するであろう。キャプトアビジンに結合したビオチンは、ｐＨが１０に上昇した場合にビオチンを放出するであろう。
【００７９】
バイオマーカー
【００８０】
本明細書に記載されるのは、単離方法、または生体サンプル中に存在する１以上のバイオマーカーを単離もしくは濃縮するための方法である。本明細書でいう「バイオマーカー（単数または複数）」は、老化または疾患等の進行、事象、または状態の、特徴的な生物学的指標または生物学的に由来する指標（たとえば代謝物）として定義される。バイオマーカーは、内因性および／または外因性分析物、抗原、小分子、大分子、薬物、治療剤、代謝物、生体異物、化学物質、ペプチド、タンパク質、タンパク質消化物、ウイルス抗原、細菌、細胞、細胞溶解物、細胞表面マーカー、抗原決定基、抗体、抗体の断片、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ受容体、受容体のリガンド、ホルモン、ホルモンの受容体、酵素、酵素の基質、一本鎖オリゴヌクレオチド、一本鎖ポリヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖ポリヌクレオチド、ポリマー、分子インプリントポリマー、およびアプタマーであってもよい。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、本明細書に記載される干渉物質（たとえば、抗体結合を阻害することにより診断試験の結果の正しい値を変化させることができる、または架橋、立体障害、または自己抗体のメカニズムによりアッセイシグナルを増加または減少させることができる、患者のサンプル中に存在する物質）である。本明細書で使用する「干渉物質」は、限定されないが、自己抗体、リウマチ因子（ＲＦ）、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ウシ、マウス、ウマ、ブタ、およびロバのポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体等のヒト抗動物抗体（ＨＡＡＡ）等の、異好性または異好様の干渉物質、および化学発光性基質（ルミノール、イソルミノール、イソルミノール誘導体、ＡＢＥＩ、ＡＢＥＩ誘導体、ルテニウム、アクリジニウムエステル）、フルオレセインまたは他の蛍光色素分子、および染色剤等の蛍光標識、捕獲部位（ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、アビジン、キャプトアビジン、ポリＡ、ポリＤＴ、アプタマー、抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、抗体断片、組み換えタンパク質、酵素、タンパク質、生体分子、ポリマー、分子インプリントポリマー）およびそれらの結合相手（すなわち、ビオチン、フルオレセイン、ポリＤＴ、ポリＡ、抗原等）、結合リンカー（ＬＣ、ＬＣ−ＬＣ、ＰＥＯ、ＰＥＯｎ）、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、卵白アルブミン、ゼラチン、マウス、ヤギ、ヒツジ、およびウサギなどの精製ポリおよびモノクローナルＩｇＧ、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−８０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、プルロニック（登録商標）およびテトロニック等の三元ブロック共重合体、および、質量分析（すなわち、ＨＰＬＣ、ＭＳ、ＬＣＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、分子診断、ラテラルフロー、ポイントオブケア（ＰｏＣ）、ＣＬＩＡおよびＣＬＩＡ免除の試験および装置による、抗体ベースの診断試験、非抗体ベースの診断試験、またはその後の分析のためのサンプル前処理方法および装置の設計に典型的に使用される、Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ社およびＳｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社等から市販されているブロッキング剤、ブロッキングタンパク質およびポリマー系のブロッキング試薬等の、試験設計またはアッセイ製剤に使用されるアッセイ特異的な干渉物質であり得る。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、本明細書に記載された生体サンプル中で確認される。
【００８１】
（フィブリノーゲン）
フィブリノーゲンは、組織や血管の損傷時にトロンビンによってフィブリンに変換され、その結果、フィブリンベースの血栓が形成される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法で使用される、本明細書に記載される粒子（たとえば、抗フィブリノーゲン（たとえばマウス抗フィブリノーゲン）で誘導体化された粒子）は、全血中のフィブリノーゲンと結合し、分離（たとえば、化学的分離）を可能にする。フィブリンを介して血栓に結合した粒子は、粒子を含まない血清試験のために、遠心分離後に、血清から単離し、除去することができる。いくつかの実施形態では、バイオマーカーはフィブリノーゲンである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、抗フィブリノーゲンで誘導された粒子を使用して、サンプル（たとえば血液サンプル）の遠心分離の必要性を排除する。
【００８２】
たとえば、いくつかの実施形態では、これらの磁性ナノ粒子はまた、遠心分離、または遠心分離における遠心分離と磁気的分離の組み合わせを介して分離される血栓または細胞デブリへの特異性を必要とせず、それらの表面は、１種超の抗原および／または抗体で共被覆または固定されていてもよく、この場合、抗体（単数または複数）は血栓または細胞デブリに特異的であり、他の抗原および／または抗体はサンプル干渉物質に特異的である。その際、ナノ粒子は、遠心分離または遠心分離と磁気的分離の組み合わせを介したその後の物理的分離または単離のために、サンプル干渉物質と血栓および／または細胞デブリの両方に特異的に結合するであろう。
【００８３】
血栓および／または細胞デブリに特異的なナノ粒子の使用は、磁性ナノ粒子による特異的に結合、ならびに磁気的分離および単離のためにすべてを磁性体に引っ張ることによって、凝固速度を増加させるかもしれない。磁場と強度によって形成されたこのビーズベースのペレットはまた、血栓の強制的な近接、またはナノ粒子およびその後の磁石によって特異的に捕捉された凝固因子に基づいて血栓形成を促進するかもしれない。
【００８４】
（外傷性脳障害）
ある実施形態では、バイオマーカーは外傷性脳障害のためのものである。急性脳損傷の重症度および大きさ、血液脳関門（ＢＢＢ）の完全性に関連するバイオマーカーは９種類（９）あるが、それらは極めて低い血中循環濃度で存在しており、既存のイムノアッセイ技術や試験プラットフォームを用いて検出および定量するのが非常に困難である。Ｂａｎｙａｎ  ＢＴＩ試験（２０１８年２月１４日にＦＤＡ承認）は、それらのバイオマーカーのうち２種類だけを測定するが、本明細書に記載される方法および装置（たとえば、濃縮方法、濃縮のための装置）は、患者の９種類のバイオマーカー全てを同時に測定し、患者の診断と予後を助けることができる。９種類の各バイオマーカー用の捕捉部位で誘導体化された粒子を、ＴＢＩが疑われる患者からの生体サンプルに添加してもよい。いくつかの実施形態では、外傷性脳障害のバイオマーカーは、Ｓ１００Ｂ、ＧＦＡＰ、ＮＬＦ、ＮＦＨ、γ−エノラーゼ（ＮＳＥ）、α−ＩＩスペクトリン、ＵＣＨ−Ｌ１、総タウ、およびリン酸化タウからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、外傷性脳障害のバイオマーカーは、ＧＦＡＰおよびＵＣＨ−Ｌ１から選択される。
【００８５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法（たとえば濃縮方法）は、Ｓ１００Ｂ、ＧＦＡＰ、ＮＬＦ、ＮＦＨ、γ−エノラーゼ（ＮＳＥ）、α−ＩＩスペクトリン、ＵＣＨ−Ｌ１、全タウ、およびリン酸化タウからなる群から選択される１、２、３、４、５、６、７、８、または９種の外傷性脳障害のバイオマーカーを単離または濃縮するために使用される。
【００８６】
（アルツハイマー病）
ある実施形態では、バイオマーカーはアルツハイマー病のためのものである。アルツハイマー病の重症度および大きさに関連するバイオマーカーは２種類（２）ある。いくつかの実施形態では、アルツハイマー病のバイオマーカーは、アミロイドβ、ＢＡＣＥ１、および可溶性Ａβ前駆体タンパク質（ｓＡＰＰ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、アルツハイマー病のバイオマーカーは、βアミロイド（１−４２）、ホスホタウ（１８１ｐ）、および全タウからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法（たとえば濃縮方法）は、アミロイドベータ、ＢＡＣＥ１、および可溶性Ａβ前駆体タンパク質（ｓＡＰＰ）からなる群から選択される１、２、または３種のアルツハイマー病のバイオマーカーを単離または濃縮するために使用される。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、アミロイドベータ、ＢＡＣＥ１、または可溶性Ａβ前駆体タンパク質（ｓＡＰＰ）である。いくつかの実施形態では、アルツハイマー病のためのバイオマーカーは、生体サンプル（たとえばＣＳＦ）中で確認される。
【００８７】
（性感染症）
ある実施形態では、バイオマーカーは性感染症（ＳＴＤ）のためのものである。ＳＴＤの感染に特徴的なバイオマーカーは少なくとも１０種類（１０）ある。いくつかの実施形態では、ＳＴＤバイオマーカーは、クラミジア、淋病、梅毒、トリコモナス、ＨＰＶ、ヘルペス１および２、ＨＳＶ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＩＶ１および２、ならびにＨＩＶ抗体のためのバイオマーカーである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法（たとえば濃縮方法）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３種類のＳＴＤバイオマーカー：クラミジア、淋病、梅毒、トリコモナス、ＨＰＶ、ヘルペス１および２、ＨＳＶ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＩＶ１および２、ならびにＨＩＶ抗体を単離または濃縮するために使用される。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは尿中に存在する（たとえば、クラミジア、淋病、トリコモナス）。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、血中、血清中、または血漿中に存在する（たとえば、梅毒、ＨＰＶ、ヘルペス１および２、ＨＳＶ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＩＶ１および２、ならびにＨＩＶ抗体）。
【００８８】
（細菌の感染）
ある実施形態では、バイオマーカーは細菌の感染のためのものである。細菌感染のための現在のゴールドスタンダードの試験は、陽性結果が分子診断等の確認試験に反映されるまでに２４〜４８時間かかり得る血液培養である。本明細書に記載されているのは、敗血症を予防または管理するために患者を首尾よく治療するために重要である短縮された時間、たとえば６０分以下（例えば、５０分、４０分、３０分、２０分以下）、最短３０分以下で細菌の感染を確定診断／除外診断するための方法である。細菌の感染に特徴的なバイオマーカーは少なくとも３０種類（３０）ある。いくつかの実施形態では、細菌のバイオマーカーは、敗血症を引き起こす細菌種（たとえば、フェシウム菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ））のバイオマーカーからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、フェシウム菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ））のバイオマーカーである。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、グラム陽性菌またはグラム陰性菌のバイオマーカーである。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、酵母病原体（たとえば、血流病原体に関連する酵母病原体）のバイオマーカーである。
【００８９】
いくつかの実施形態では、グラム陽性菌は、腸球菌属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、レンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、アガラクチア菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、または化膿性レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）である。
【００９０】
いくつかの実施形態では、グラム陰性菌は、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）複合体、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、または霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）である。
【００９１】
いくつかの実施形態では、酵母病原体は、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ）、カンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、またはカンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）である。
【００９２】
いくつかの実施形態では、質量分析法が続く。リンカー（すなわち、粒子を表面捕捉部分に結合させるリンカー）を切断するために、切断剤（例えば、還元剤（例えば、ＤＴＴまたはＴＣＥＰ））を細菌−粒子結合複合体に添加する方法が想定される。得られた細菌を培養、またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法もしくは分子診断法により分析する。
【００９３】
リンカー（すなわち、粒子を表面捕捉部分に結合させるリンカー）を切断するために、切断剤（例えば、還元剤（例えば、ＤＴＴまたはＴＣＥＰ））を細菌−粒子結合複合体に添加する方法が想定される。得られた細菌を培養し、またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法もしくは分子診断法により分析する。
【００９４】
（甲状腺機能）
ＴＳＨ濃度は、甲状腺ホルモンの過剰（甲状腺機能亢進症）または欠乏（甲状腺機能低下症）が疑われる患者の甲状腺機能検査の一環として測定される。本明細書のいくつかの実施形態で記載される方法は、甲状腺機能を評価するために使用される。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは抗原（たとえばＴＳＨ）である。いくつかの実施形態では、捕捉部位は、抗原（たとえばＴＳＨ）に対する特異性を有する自己抗体（たとえば遊離自己抗体、複合自己抗体）である。
【００９５】
（心機能）
本明細書のいくつかの実施形態に記載される方法は、心機能を評価するために使用される。トロポニンの血中循環濃度の上昇は、心疾患、たとえば心筋梗塞のバイオマーカーである。Ｃａｒｄｉａｃ  ＩおよびＴは、心筋損傷の特異的な指標である。トロポニンのサブユニットもまた、心臓の健康状態のマーカーである。特にｃＴｎＩおよびｃＴｎＴは、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、たとえば、１型および２型の心筋梗塞、不安定狭心症、術後の心筋外傷、および関連する疾患のバイオマーカーである。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、遊離ｃＴｎＩ、遊離ｃＴｎＴ、２成分のｃＴｎＩ−ＴｎＣ、または３成分のｃＴｎＩ−ＴｎＣ−ＴｎＴである。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは心不全の指標である。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは脳卒中の指標である（たとえば、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｈａｊｏｕｒｎａｌｓ．ｏｒｇ／ｄｏｉ／１０．１１６１／ＳＴＲＯＫＥＡＨＡ．１１７．０１７０７６、およびｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．３６０ｄｘ．ｃｏｍ／ｂｕｓｉｎｅｓｓ−ｎｅｗｓ／ｒｏｃｈｅ−ｔｅｓｔ−ｈｅｌｐｓ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ−ｂｌｅｅｄｉｎｇ−ｒｉｓｋ−ｓｔｒｏｋｅ−ｒｉｓｋ−ｐａｔｉｅｎｔｓ−ｃｏｎｓｉｄｅｒｉｎｇ＃．Ｗ１ｊｚ０ｔｈＫｈｃＡに記載されており、それらの全体が参照により本明細書に援用される）。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは線維症の指標である（たとえば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｎｌｉｎｅｊａｃｃ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／６５／２２／２４４９に記載されており、その全体が参照により本明細書に援用される）。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは急性冠状動脈症候群（ＡＣＳ）の診断のためのものである。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、心筋トロポニン（Ｉ、Ｉ−Ｃ、Ｉ−Ｃ−Ｔ、Ｔ）および他の心筋トロポニン断片、ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ、ＡＮＰ、ＣＮＰ）、Ｎ末端断片（たとえば、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、ＮＴ−ｐｒｏＣＮＰ）、グリコシル化、非グリコシル化、ＣＲＰ，ミオグロビン、クレアチニンキナーゼ（ＣＫ）、ＣＫ−ＭＢ、ｓＳＴ２、ＧＤＦ−１５、ガレクチン−３のためのものである。
【００９６】
（閉塞性睡眠時無呼吸（ＯＳＡ））
ウロコルチンＩＩＩペプチド、ウロモジュリンペプチド、オロソムコイド１ペプチド、およびカリクレイン１ペプチドは、ＯＳＡを診断するために使用され得る。ＯＳＡを診断するための方法およびバイオマーカーは、それぞれの全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２００６／００２９９８０号、米国特許出願公開第２０１６／０１６１４８９号、米国特許８，９９９，６５８号、および米国特許９，４３５，８１４号に記載されている。ＯＳＡのバイオマーカーはまた、その全体が参照により本明細書に援用される、Ｄｅ  Ｌｕｃａ  Ｃａｎｔｏら、Ｓｌｅｅｐ  Ｍｅｄ．Ｒｅｖ．２０１５年１０月；２３：２８−４５にも記載されている。本明細書のいくつかの実施形態に記載される方法は、改善されたＯＳＡを診断するための方法に関する。いくつかの実施形態では、ＯＳＡのバイオマーカーは、ウロコルチンＩＩＩペプチド、ウロモジュリンペプチド、オロソムコイド１ペプチド、カリクレイン１ペプチド、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、高感度Ｃ反応性タンパク質、またはこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、バイオマーカー（たとえば、ウロモジュリンペプチド）は、サンプル中に低濃度で存在する。いくつかの実施形態では、捕捉部位は、ウロコルチンＩＩＩペプチド、ウロモジュリンペプチド、オロソムコイド１ペプチド、カリクレイン１ペプチド、またはそれらの組み合わせに特異的な抗体である。
【００９７】
ある観点では、本明細書に記載されるのは、患者のウロコルチンＩＩＩペプチド、ウロモジュリンペプチド、オロソムコイド１ペプチド、カリクレイン１ペプチド、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、高感度Ｃ反応性タンパク質、またはこれらの組み合わせを検出する方法であって、ａ．ヒト患者からサンプルを得ること、およびｂ．複数種の粒子により、ウロコルチンＩＩＩペプチド、ウロモジュリンペプチド、オロソムコイド１ペプチド、カリクレイン１ペプチド、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、高感度Ｃ反応性タンパク質、またはこれらの組み合わせがサンプル中に存在するか否かを検出すること、およびウロコルチンＩＩＩペプチド、ウロモジュリンペプチド、オロソムコイド１ペプチド、カリクレイン１ペプチド、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、高感度Ｃ反応性タンパク質、またはこれらの組み合わせと、複数種の粒子との間の結合を検出することが含まれる方法である。ある観点では、本明細書に記載されるのは、患者の閉塞性睡眠時無呼吸を診断する方法であって、ａ．ヒト患者からサンプルを得ること、およびｂ．サンプルを複数種の粒子と接触させることにより、ウロコルチンＩＩＩペプチド、ウロモジュリンペプチド、オロソムコイド１ペプチド、カリクレイン１ペプチド、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、高感度Ｃ反応性タンパク質、またはこれらの組み合わせがサンプル中に存在するか否かを検出すること、およびウロコルチンＩＩＩペプチド、ウロモジュリンペプチド、オロソムコイド１ペプチド、カリクレイン１ペプチド、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、高感度Ｃ反応性タンパク質、またはこれらの組み合わせと、複数種の粒子との間の結合を検出すること、ならびにｃ．サンプル中にウロコルチンＩＩＩペプチド、ウロモジュリンペプチド、オロソムコイド１ペプチド、カリクレイン１ペプチド、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、高感度Ｃ反応性タンパク質が検出された場合に、閉塞性睡眠時無呼吸の患者であると診断することが含まれる方法である。いくつかの実施形態では、患者はヒトである。いくつかの実施形態では、ヒトは約９歳から約２歳未満である。いくつかの実施形態では、方法には、ウロコルチンＩＩＩペプチド、ウロモジュリンペプチド、オロソムコイド１ペプチド、カリクレイン１ペプチド、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、高感度Ｃ反応性タンパク質からなる群の２種以上の存在または不存在を同時に検出することが含まれる。
【００９８】
いくつかの実施形態では、サンプルは尿サンプルである。いくつかの実施形態では、サンプルは血液サンプルである。いくつかの実施形態では、小児患者の尿サンプルにおけるマルチマーカーアプローチ（ウロモジュリン、ウロコルチン−３、オロソムコイド−１、カリクレイン）が用いられている。いくつかの実施形態では、成人集団における尿のリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｌ−ＰＧＤＳ）濃度の測定は、重度のＯＳＡ患者を同定するためのマーカーとして使用される。いくつかの実施形態では、成人集団における酸化ストレスマルチバイオマーカーアプローチ（Ｌ−ＰＧＤＳ、Ｆ２−イソプロスタン、他）は、ＯＳＡを予測するために使用され得る。いくつかの実施形態では、ＯＳＡのバイオマーカーは、クロマトグラフィーおよび／またはＭＳ法を用いて評価される。いくつかの実施形態では、脂質プロファイル、アドレナリン作動性/ドーパミン作動性バイオマーカーおよび誘導体、アミノ酸、酸化ストレスバイオマーカー、ならびに他の微小分子を含むタンパク質および代謝物は、ＯＳＡの診断および／または効果的な治療に使用される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−６および／またはｈｓＣＲＰは、成人のＯＳＡ患者の病的状態の有無にかかわらず識別するためのバイオマーカーとして使用される。いくつかの実施形態では、骨髄関連タンパク質（ＭＲＰ）８／１４は、小児の病的状態の有無にかかわらず識別するために使用される。いくつかの実施形態では、血清ｓＬＯＸ−１濃度は、ＯＳＡの存在の独立した予測因子として使用される。いくつかの実施形態では、血清ＹＫＬ−４０濃度の上昇は、ＯＳＡの存在の独立した危険因子として使用される。いくつかの実施形態では、血清ケメリン濃度の上昇は、ＯＳＡ  の存在と重症度の独立した予測マーカーとして使用される。
【００９９】
いくつかの実施形態では、サンプルは尿であり、ＯＳＡのバイオマーカーはウロモジュリン、ウロコルチン−３、オロソムコイド−１、カリクレイン、リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｌ−ＰＧＤＳ）、Ｆ２−イソプロスタン、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、サンプルは血清または血液であり、ＯＳＡのバイオマーカーはＩＬ−６、ｈｓＣＲＰ、ｓＬＯＸ−１、ＹＫＬ−４０、骨髄関連タンパク質（ＭＲＰ）８／１４、ケメリン、またはそれらの組み合わせである。
【０１００】
いくつかの実施形態では、正確度および精度は、大きいサンプル量（すなわち、１ｍＬ、１０ｍＬ、１００ｍＬ、１０００ｍＬ等）、また、非常に小さいサンプル量（すなわち、新生児、小児、高齢者）、典型的には現在検査できない、または検査前にサンプルを希釈する必要があって試験の感度、正確度、および精度が低下するサンプルを検査して、非常に希薄または低濃度のバイオマーカーの検出可能性を向上させることができる。いくつかの実施形態では、生体サンプルは、１ｍＬ、１０ｍＬ、１００ｍＬ、１０００ｍＬ、またはさらに大きい容量である。いくつかの実施形態では、生体サンプルは、０．５ｍＬ、０．２５ｍＬ、０．１ｍＬ、０．０５ｍＬ、またはそれ未満の容量である。
【０１０１】
また、本明細書で提供されるのは、バイオマーカー特性評価ステップまたは試験方法の前に、洗浄ステップまたは粒子分離の後、粒子から、捕捉したバイオマーカーを選択的に放出もしくは溶出、または捕捉部位−バイオマーカー複合体を選択的に放出もしくは溶出させることによる、診断試験の前に粒子サンプルの前処理を用いてバイオマーカーの濃縮を助ける方法である。
【０１０２】
本明細書で使用される「切断試薬」または「放出剤」は、粒子表面の捕捉部位とバイオマーカーの結合を崩壊させ、たとえば、捕捉部位を置換または溶出させることなくバイオマーカーのみを置換または溶出させる、酸性または塩基性のｐＨ、高モル濃度の塩、糖、化学置換剤、洗浄剤、界面活性剤、および／もしくはキレート剤、またはそれらの組み合わせである。洗浄、または磁石によりサンプルマトリックスから粒子を単離した後、粒子は放出剤を含む溶出溶液で処理し、バイオマーカーを溶液内に選択的に放出させることができる。粒子は、急速に（２分未満、理想的には３０秒未満）サンプル装置（バイアル、試験管、他）の側面および／または底面に単離され、本質的に粒子を含まないサンプル上清を形成することができる。粒子を含まないサンプル上清は、その後、粒子を含むペレットを崩すことなく吸引し、別のトランスファーチューブに分注、またはバイオマーカーを試験するために直接分析系（すなわち、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳまたはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）に入れることができる。
【０１０３】
たとえば、本明細書に記載される切断試薬または放出剤は、（たとえば、炭酸水素ナトリウム等の塩基で増加したｐＨ、酢酸、トリクロロ酢酸、スルホサリチル酸、塩酸、ギ酸等の酸で減少したｐＨ、ｐＨ２．５〜３．０の１００ｍＭグリシンＨＣｌ、ｐＨ３．０の１００ｍＭクエン酸、ｐＨ１１．５の５０〜１００ｍＭトリエチルアミンまたはトリエタノールアミン、ｐＨ１０．５の１５０ｍＭ水酸化アンモニウム等の一般的なｐＨの溶出バッファー）、ディスプレーサ―または置換剤、競合溶出（たとえば、０．１Ｍ超のカウンターリガンドまたは類似体）、イオン強度および／またはカオトロピック効果（たとえば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、１０ｍＭトリス中ｐＨ７．０の３．５〜４．０Ｍ塩化マグネシウム、ｐＨ７．２の１０ｍＬのリン酸緩衝液中５Ｍ塩化リチウム、ｐＨ７．５の２．５Ｍヨウ化ナトリウム、０．２〜３．０Ｍチオシアン酸ナトリウム）、界面活性剤、洗浄剤、濃縮無機塩、変性（たとえば、２〜６ＭグアニジンＨＣｌ、 ２−８Ｍ尿素、１％デオキシコール酸塩、１％ＳＤＳ）、有機溶剤（たとえば、アルコール、クロロホルム、エタノール、メタノール、アセトニトリル、ヘキサン、ＤＭＳＯ、１０％ジオキサン、ｐＨ８〜１１．５の５０％エチレングリコール（カオトロピックも）、放射線または熱（高温）、構造変化、ジスルフィド結合還元剤（２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）、酵素不活化、カオトロピック剤（尿素、塩化グアニジン、過塩素酸リチウム）、機械的撹拌、超音波処理、およびタンパク質消化酵素（ペプシン、トリプシン）、ならびにそれらの組み合わせ等の溶出戦略を用いて、本明細書に記載される粒子と本明細書に記載される捕捉部位の間の、本明細書に記載される結合相互作用または切断可能な結合を崩壊させる。
【０１０４】
（特性評価の方法）
本明細書に記載されるのは、その後の特性評価、または診断試験のために、バイオマーカーを枯渇させる、および／または濃縮するための方法である。本明細書に記載されたバイオマーカー（たとえば干渉物質）の特性評価には、本明細書に記載されたバイオマーカー（たとえば、本明細書に記載された干渉物質）の同定および／または定量が含まれる。
【０１０５】
本明細書に記載されるバイオマーカーの特性評価には、検出感度を向上させるためのシグナル増幅技術（たとえば、化学発光、蛍光、金属増強蛍光）を含むことができる。
【０１０６】
たとえば、バイオマーカーの特性評価は、検出が、視覚的（カラービーズ）または標識された粒子を使用して特定のシグナル（ＵＶ／ｖｉｓ吸光度、蛍光、化学発光、電気化学発光、比濁法等）を測定することができる、単一または複合的な特性評価アプローチに使用することができる。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、バイオマーカーの存在はＭＡＬＤＩ−ＭＳにより判定される。いくつかの実施形態では、バイオマーカーの存在は、分子診断法により判定される。いくつかの実施形態では、バイオマーカーの存在は、イムノアッセイにより判定される。
【０１０８】
（本発明の粒子）
本明細書に記載されるのは、生体サンプルの単離、枯渇、および／または濃縮のための粒子である。いくつかの実施形態では、粒子には、切断不可能な結合および捕捉部位（たとえば、１種以上の捕捉部位を提示する機能がある粒子表面）が含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される粒子には、捕捉部位（たとえば、本明細書に記載されるバイオマーカーに高い特異性を有する捕獲部位）が含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される粒子（たとえば、本明細書に記載される粒子の表面、本明細書に記載される捕捉部位と結合していない粒子表面）は、不活性（たとえば、本明細書に記載のバイオマーカーへの有意な結合を示さない）である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される粒子は、粒子または診断試験にさらなる変更を加えることなく、本明細書に記載される診断試験において使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される粒子は、サンプルを変化させることなく（たとえばさらなるバイオマーカー（たとえば干渉）を追加または除去することなく）、サンプルに添加したり、サンプルから除去したりすることができる。粒子は、本明細書ではビーズとも言われる。
【０１０９】
本明細書に記載される粒子は、平均直径が０．０５マイクロメートル〜最大３．００マイクロメートル、または好ましくは直径０．１００マイクロメートル〜１．１、さらに好ましくは０．２００マイクロメートル〜０．６００マイクロメートル、さらに好ましくは直径０．１００マイクロメートル〜０．５００マイクロメートルであり、十分に小さい。いくつかの実施形態では、粒子は、直径５ｎｍ〜１００ｎｍである。いくつかの実施形態では、粒子は、直径５０ｎｍ〜１００ｎｍである。いくつかの実施形態では、粒子は、直径１００ｎｍ〜５００ｎｍである。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される粒子（たとえば、マイクロ粒子、ナノ粒子）にはコアまたは支持体が含まれ、コアまたは支持体は、酸化鉄、強磁性酸化鉄、Ｆｅ２Ｏ３、およびＦｅ３Ｏ４、マグヘマイト、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される常磁性または超常磁性の材料である。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、粒子の表面には、疎水性の有機重合体または共重合体が含まれる。いくつかの実施形態では、粒子（たとえば、ナノ粒子、マイクロ粒子）の表面には、限定されないが、セラミック、ガラス、重合体、共重合体、金属、ラテックス、シリカ、金、銀、または合金等のコロイド状金属、ポリスチレン、誘導体化ポリスチレン、ポリ（ジビニルベンゼン）、スチレンアシル酸エステル共重合体、スチレンブタジエン共重合体、スチレンジビニルベンゼン共重合体、ポリ（スチレンオキシエチレン）、ポリメタクリル酸メチル、ポリメタクリル酸エステル、ポリウレタン、ポリグルタルアルデヒド、ポリエチレンイミン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、ポリオレフィン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリアクリロニトリル、ポリスルホン、ポリ（エーテルスルホン）、熱分解物質、ブロック共重合体、および前述の共重合体、シリコーン、またはシリカ、メチロールメラミン、デキストランもしくはポリ（エチレングリコール）デキストラン（ＰＥＧ−ＤＥＸ）などの生分解性ポリマー、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される材料等の有機重合体または共重合体が含まれる。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、粒子表面には、カルボキシル、トシル、エポキシ、アミン、スルフヒドリル、ヒドロキシル、エステル、塩化メチル、マレイミド等のその捕捉部位の共有結合（カップリング、共役、結合）クリックケミストリー機能性の［銅（Ｉ）触媒アジド−アルキン環化付加反応（ＣｕＡＡＣ）、歪促進アジド−アルキン環化付加反応（ＳＰＡＡＣ）、歪促進アルキン−ニトロン環化付加反応（ＳＰＡＮＣ）、ならびに、アルケンとアジドの［３＋２］環化付加反応、アルケンとテトラジンの逆電子要請型Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応、およびアルケンとテトラゾールの光クリック反応等の歪型アルケン反応］のための官能基または複数の官能基、Ｓ−ＨｙＮｉｃ（スクシンイミジル−６−ヒドラジノ−ニコチンアミド）およびＳ−４ＦＢ（Ｎ−スクシンイミジル−４−ホルミルベンズアミド）ヘテロ二官能性架橋剤、ならびに光反応性化学物質が含まれる。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、「遮断剤」は、タンパク質、重合体、界面活性剤、洗浄剤、またはそれらの組み合わせをいう。いくつかの実施形態では、捕捉部位の本明細書に記載される粒子への結合は、タンパク質、重合体、界面活性剤、洗浄剤、またはそれらの組み合わせ等の遮断剤で遮断される。遮断剤は、アルブミン、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、卵白アルブミン、ゼラチン、カゼイン、酸加水分解カゼイン、ガンマグロブリン、精製ＩｇＧ、動物の血清、ポリクローナル抗体、およびモノクローナル抗体等のタンパク質、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ
）、タンパク質と重合体の組み合わせ、ペプチド、（ＰＥＯ）ｎ−ＮＨＳまたは（ＰＥＯ）ｎ−マレイミド等のＰＥＧ化試薬、プルロニック（登録商標）Ｆ１０８、Ｆ１２７、およびＦ６８等のトリブロック共重合体等の重合体、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）、およびＴｗｅｅｎ ８０（非イオン性）等の非イオン性界面活性剤、ＣＨＡＰＳ等の双性イオン界面活性剤、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、デオキシコール酸塩、コール酸塩、およびサルコシル等のイオン性界面活性剤、界面活性剤、ショ糖等の糖、および異好抗体遮断試薬（Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社）、ＭＡＫ３３（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）、免疫グロブリン阻害試薬（ＩＩＲ）（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ社）、ヘテロブロック（Ｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社）、ブロックマスター（ＪＳＲ社）、ＴＲＵ  Ｂｌｏｃｋ（Ｍｅｒｉｄｉａｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ならびにＳｔａｂｉｌＣｏａｔ（登録商標）およびＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄ（登録商標）（Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ社）等の市販の遮断剤からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、遮断剤は、本明細書に記載される粒子に結合している（たとえば、切断可能な結合、切断不可能な結合）。いくつかの実施形態では、遮断剤は、本明細書に記載される粒子に結合（たとえば、切断可能な結合、切断不可能な結合）していない。
【０１１４】
（捕捉部位）
本明細書に記載されるのは、本明細書に記載されるような干渉物質、または本明細書に記載されるようなバイオマーカーと結合する１種以上の捕捉部位を含む粒子である。本明細書に記載されるように、「捕捉部位」は、抗体、抗体の結合断片、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、受容体、受容体のリガンド、ホルモン、ホルモンの受容体、酵素、酵素の基質、一本鎖オリゴヌクレオチド、一本鎖ポリヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖ポリヌクレオチド、抗原、ペプチド、ポリマー、分子インプリントポリマー、アプタマー、およびタンパク質からなる群から選択される。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、捕捉部位はタンパク質である。タンパク質は、たとえば、一量体、二量体、多量体、または融合タンパク質であり得る。特定の実施形態では、タンパク質には、たとえば抗体、抗体の断片、ＢＳＡ、卵白アルブミン、ＢＳＡの断片、卵白アルブミンの断片、マウスＩｇＧ、重合マウスＩｇＧ、標的ＨＡＭＡおよびＲＦ干渉メカニズムに対する抗体断片（Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２）および異なるサブクラスのマウスＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＥ、ＩｇＤ）、標的ＨＡＡＡ干渉に対する精製した動物ポリクローナル抗体（すなわち、ウシ、ヤギ、マウス、ウサギ、ヒツジ）、ストレプトアビジン、ＡＬＰ、ＨＲＰ、標的ＭＡＳＩ干渉に対するＢＳＡ（イソルミノール、ルテニウム、アクリジニウムとのコンジュゲート）等の少なくとも１種のアルブミンまたはそれらの混合物が含まれる。
【０１１６】
少なくとも１つの実施形態では、本発明は結合表面に２種以上の異なる捕捉部位を提供する。
【０１１７】
（捕捉部位の生成）
ある観点では、提供されるのは、遊離自己抗体または自己抗体複合体に対する複合体特異的、または構造特異的な抗体を産生または生成することを含む、捕捉部位を製造する方法である。遊離自己抗体は、まだ抗原標的と複合体化していない自己抗体である。複合自己抗体は、抗原標的と複合体を形成している自己抗体である。
【０１１８】
ある観点では、提供されるのは、ＭＴＳＨ等の自己抗体複合体に対する複合体特異的、または構造特異的な抗体を産生または生成することを含む、捕捉部位を製造する方法である。いくつかの実施形態では、自己抗体はトリヨードチロニン（Ｔ３）またはチロキシン（Ｔ４）である。いくつかの実施形態では、自己抗体複合体はＭＴＳＨである。たとえば、複合体特異的または構造特異的な抗体は、ＭＴＳＨ等の自己抗体複合体に産生され、ヒト血清から精製することができ、捕捉部位として使用することができる。このようにして、抗体は、ｈＩｇＧまたはｈＩｇＭとＴＳＨの複合体に対してのみ特異性を有するであろう。ＭＴＳＨは、技術および公表された方法に基づいて、またはタンパク質生化学および精製の分野の当業者によって精製することができる。いくつかの実施形態では、自己抗体アッセイの干渉の可能性が最も高い自己免疫疾患患者は、自己抗体を産生または生成するために使用される。たとえば、その全体が引用される参考文献である国際公開第２０１４１１４７８０号、国際公開第２０１６１１３７１９号、および国際公開第２０１６１１３７２０号のＢＮＰのためのＨｙＴｅｓｔ  ＳＥＳアッセイを参照。
【０１１９】
（甲状腺特異的な抗体）
たとえば、ある実施形態では、自己抗体は、抗甲状腺自己抗体（抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体、サイロトロピン受容体抗体、サイログロブリン抗体）である。抗甲状腺自己抗体は、甲状腺の１以上の構成要素を標的とする自己抗体標的である。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、自己抗体は遊離自己抗体（たとえばサイロトロピン（ＴＳＨ））である。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、自己抗体は複合自己抗体（たとえばＭＴＳＨ）である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される捕捉部位は、複合自己抗体に対する特異性、またはＭＴＳＨ等の抗原標的に既に結合しているｈＩｇＧおよび／またはｈＩｇＭに対する構造特異性を備えて生成される抗体である。いくつかの実施形態では、自己抗体はＴ３およびＴ４である。
【０１２２】
以下に示すのは、アフィニティアッセイが設計される用途に応じて、分析物の結合剤（捕捉部位）と分析物からなる結合対の一方のメンバーとして、または他方のメンバーとして機能し得る物質の非限定的なリストである。このような物質は、たとえば捕捉部位（分析物の結合剤）として使用することができ、または本発明で使用することができる捕捉部位を生成するために使用することができる（たとえば、特異的な抗体を生成するためのハプテン／抗原としての使用による）。イムノアッセイを含むアフィニティアッセイは、サンプル中の分析物であるそのような物質の存在および／または濃度を検出するために、本発明に従って設計することができる。特定の実施形態では、分析物に結合する本発明の捕捉部位は、サンプル中の分析物としてのこれらの物質を検出するために使用することができる。あるいは、以下にリストアップする物質は、本発明に従って固相支持体表面に関連づけられ、それらと相互作用する捕捉分子（たとえば、リストアップした物質、に特異的な抗体もしくはその断片、結合タンパク質、または酵素等）を捕捉するために使用することができる。
【０１２３】
分析物の結合剤（捕捉部位）と分析物からなる結合対の一方のメンバーとして、または他方のメンバーとして機能し得る物質の非限定的なリストには、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）、ＣＡ１９−９、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−ｔ、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ｓＩＬ−２Ｒ、ｓＩＬ−４Ｒ、ｓＩＬ−６Ｒ、ＳＩＶコア抗原、ＩＬ−１ＲＡ、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−ガンマ、ＧＭ−ＣＳＦ；ＰＳＡ、ｐＰＳＡ、ＢＰＳＡ、ｉｎＰＳＡ、非α１抗キモトリプシン複合型ＰＳＡ、α１抗キモトリプシン複合型ＰＳＡ等のＰＳＡ（前立腺特異抗原）、ｈＫ２、ｈＫ４、およびｈＫ１５、ｅｋ−ｒｈＫ２、Ａｌａ−ｒｈＫ２、ＴＷＴ−ｒｈＫ２、Ｘａ−ｒｈＫ２、ＨＷＴ−ｒｈＫ２、ならびに他のカリクレイン等の前立腺カリクレインのイソ型；ＨＩＶ−１ｐ２４；フェリチン、Ｌフェリチン、トロポニンＩ、ＢＮＰ、レプチン、ジゴキシン、ミオグロビン、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチドまたは脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、Ｎ末端プロＢＮＰ、ＣＮＰ、Ｎ末端プロＣＮＰ（１−５０）、Ｎ末端ＣＮＰ−５３（５１−８１）、ＣＮＰ−２２（８２−１０３）、ＣＮＰ−５３（５１−１０３）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）；ヒト成長ホルモン、骨型アルカリホスファターゼ、ヒト卵胞刺激ホルモン、ヒト黄体ホルモン、プロラクチン；ヒト絨毛性ゴナドトロフィン（たとえば、ＣＧα、ＣＧβ）；可溶性ＳＴ２、サイログロブリン；抗サイログロブリン；ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）防御抗原、炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）致死因子、炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）胞子抗原、野兎病菌（Ｆ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）ＬＰＳ、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）エンテロトキシンＢ、ペスト菌（Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ）莢膜Ｆ１抗原、インスリン、アルファフェトプロテイン（たとえば、ＡＦＰ３００）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１５．３抗原、ＣＡ１９．９抗原、ＣＡ１２５抗原、ＨＡＶ  Ａｂ、ＨＡＶ  Ｉｇｍ、ＨＢｃ  Ａｂ、ＨＢｃ  Ｉｇｍ、ＨＩＶ１／２、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｓＡｂ、ＨＣＶ  Ａｂ、抗ｐ５３、ヒスタミン；ネオプテリン；ｓ−ＶＣＡＭ−１、セロトニン、ｓＦａｓ、ｓＦａｓリガンド、ｓＧＭ−ＣＳＦＲ、ｓ１ＣＡＭ−１、チミジンキナーゼ、ＩｇＥ、ＥＰＯ、内因子Ａｂ、ハプトグロブリン、抗カルジオリピン、抗ｄｓＤＮＡ、抗Ｒｏ、Ｒｏ、抗Ｌａ、抗ＳＭ、ＳＭ、抗ｎＲＮＰ、抗ヒストン、抗Ｓｃｌ−７０、Ｓｃｌ−７０、抗核抗体、抗セントロメア抗体、ＳＳ−Ａ、ＳＳ−Ｂ、Ｓｍ、Ｕ１−ＲＮＰ、Ｊｏ−１、ＣＫ、ＣＫ−ＭＢ、ＣＲＰ、虚血変性アルブミン、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ｏｘＬＤＬ、ＶＬＤＬ、トロポニンＴ、トロポニンＩ、トロポニンＣ、微量アルブミン、アミラーゼ、ＡＬＰ、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＧＧＴ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、プレアルブミン、抗ストレプトリジン、クラミジア、ＣＭＶ  ＩｇＧ、トキソＩｇＧ、トキソＩｇＭ、アポリポタンパク質Ａ、アポリポタンパク質Ｂ、Ｃ３、Ｃ４、プロパージン因子Ｂ、アルブミン、α１−酸性糖タンパク質、α１−アンチトリプシン、α１−マイクログロブリン、α２−マイク��グロブリン、抗ストレプトリジン−Ｏ、アンチトロンビンＩＩＩ、アポリポタンパク質Ａ１、アポリポタンパク質Ｂ、β２−マイクログロブリン、セルロプラスミン、補体成分Ｃ３、補体成分Ｃ４、Ｃ反応性タンパク質、ＤＮａｓｅＢ、フェリチン、遊離カッパＬ鎖、遊離ラムダＬ鎖、ハプトグロビン、免疫グロブリンＡ、免疫グロブリンＡ（ＣＳＦ）、免疫グロブリンＥ、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＧ（ＣＳＦ）、免疫グロブリンＧ（尿）、免疫グロブリンＧサブクラス、免疫グロブリンＭ、免疫グロブリンＭ（ＣＳＦ）、カッパＬ鎖、ラムダＬ鎖、リポタンパク質（ａ）、微量アルブミン、プレアルブミン、プロパージン因子Ｂ、リウマチ因子、フェリチン、トランスフェリン、トランスフェリン（尿）、風疹ＩｇＧ、サイログロブリン抗体、トキソプラズマＩｇＭ、トキソプラズマＩｇＧ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）−３、ヘプシン、ｐｉｍ１キナーゼ、Ｅカドヘリン、ＥＺＨ２、ａ−メチルアシルＣｏＡラセマーゼ、ＴＧＦベータ、ＩＬ６ＳＲ、ＧＡＤ、ＩＡ−２、ＣＤ−６４、好中球ＣＤ−６４、ＣＤ−２０、ＣＤ−３３、ＣＤ−５２、シトクロムＰ４５０のイソ型、ｓ−ＶＣＡＭ−１、ｓＦａｓ、ｓＩＣＡＭ、Ｂ型肝炎表面抗原、トロンボプラスチン、ＨＩＶｐ２４、ＨＩＶｇｐ４１／１２０、ＨＣＶＣ２２、ＨＣＶＣ３３、ヘモグロビンＡ１ｃ、ＧＡＤ６５、ＩＡ２、ビタミンＤ、２５−ＯＨビタミンＤ、１、２５（ＯＨ）２ビタミンＤ、２４、２５（ＯＨ）２ビタミンＤ、２５、２６（ＯＨ）２ビタミンＤ、ビタミンＤの３エピマー、ＦＧＦ２３、スクレロスチン、プロカルシトニン、カルシトニン、クロストリディオイデス・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡおよびＢ、ヘリコバクター・ピロリ（ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）、ＨＳＶ１、ＨＳＶ２が含まれる。
【０１２４】
アフィニティアッセイが設計される用途に応じて、分析物の結合剤（捕捉部位）と分析物からなる結合対の一方のメンバーとして、または他方のメンバーとして機能することができ、本発明で使用し得る適切な物質には、たとえば抗体またはその断片のような、生物学的基準のためのＷＨＯ国際研究所によって保持され、特性評価され、および／または配布されているＷＨＯ国際生物学的参照物質（２００５年６月３０日に更新され、当技術分野でよく知られている物質をリストアップしたｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｂｌｏｏｄｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｒｅ＿ｍａｔｅｒｉａｌｓで入手可能であり、これは参照によって本明細書に援用される）のいずれかに特異的な部位が含まれる。
【０１２５】
物質に続く括弧内のＷＨＯコードによって特定される、そのような適切な国際標準の部分的なリストには：ヒト組み換えトロンボプラスチン（ｒＴＦ／９５）、ウサギトロンボプラスチン（ＲＢＴ／９０）、甲状腺刺激抗体（９０／６７２）、ヒト組み換え組織プラスミノーゲンアクチベーター（９８／７１４）、高分子ウロキナーゼ（８７／５９４）、前立腺特異抗体（９６／６６８）、前立腺特異抗体９０：１０（９６／７００）；ヒト血漿タンパク質Ｃ（８６／６２２）、ヒト血漿タンパク質Ｓ（９３／５９０）、リウマチ関節炎血清（Ｗ１０６６）、血清アミロイドＡタンパク質（９２／６８０）、ストレプトキナーゼ（００／４６４）、ヒトトロンビン（０１／５８０）、ウシ組み合わせトロンボプラスチン（ＯＢＴ／７９）、抗Ｄ陽性対照静注用免疫グロブリン（０２／２２８）、島細胞抗体（９７／５５０）、リポタンパク質ａ（ＩＦＣＣ  ＳＲＭ２Ｂ）、ヒトパルボウイルスＢ１９ＤＮＡ（９９／８００）、ヒトプラスミン（９７／５３６）、ヒトプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤１（９２／６５４）、血小板第４因子（８３／５０５）、プレカリクレインアクチベーター（８２／５３０）、ヒト脳ＣＪＤコントロールおよびヒト脳散発性ＣＪＤ調製物１およびヒト脳散発性ＣＪＤ調製物２およびヒト脳変異体ＣＪＤ（なし；それぞれＷＨＯ  ＴＲＳ  ＥＣＢＳ報告書Ｎｏ．９２６、５３ｓｕｐ．ｒｄ報告書、脳ホモジネートに引用）、Ｃ１ｑ、Ｃ４、Ｃ５、因子Ｂ、および全機能補体ＣＨ５０を含むヒト血清補体成分（Ｗ１０３２）、ヒト血清免疫グロブリンＥ（７５／５０２）、ヒト血清免疫グロブリンＧ、Ａ、およびＭ（６７／８６）、ヒト血清タンパク質アルブミン、アルファ１−アンチトリプシン、アルファ２−マクログロブリン、セルロプラスミン、補体成分Ｃ３、トランスフェリン（Ｗ１０３１）、抗Ｄ陰性対照静注用免疫グロブリン（０２／２２６）、Ａ型肝炎ＲＮＡ（００／５６０）、Ｂ型肝炎表面抗原サブタイプａｄｗ２遺伝子型Ａ（０３／２６２および００／５８８）、Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡ（９７／７４６）、Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡ（９６／７９８）、ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原（９０／６３６）、ＨＩＶ−１ＲＮＡ（９７／６５６）、ＨＩＶ−１ＲＮＡ遺伝子型（１０  Ｉ０１／４６６のセット）、ヒトフィブリノーゲン濃縮物（９８／６１４）、ヒト血漿フィブリノーゲン（９８／６１２）、上昇Ａ２ヘモグロビン（８９／６６６）、上昇Ｆヘモグロビン（８５／６１６）、ヘモグロビンシアン化物（９８／７０８）、低分子ヘパリン（８５／６００および９０／６８６）、未分画ヘパリン（９７／５７８）、血液凝固因子ＶＩＩＩおよびフォン・ヴィルブランド因子（０２／１５０）、ヒト血液凝固因子ＶＩＩＩ濃縮物（９９／６７８）、ヒト血液凝固因子ＸＩＩＩ血漿（０２／２０６）、ヒト血液凝固因子ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ（９９／８２６）、ヒト血液凝固因子ＩＩおよびＸ濃縮物（９８／５９０）、ヒト癌胎児性抗原（７３／６０１）、ヒトＣ反応性タンパク質（８５／５０６）、組み換えヒトフェリチン（９４／５７２）、アポリポタンパク質Ｂ（ＳＰ３−０７）、ベータ２マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、ヒトベータトロンボグロブリン（８３／５０１）、ヒト��液凝固因子ＩＸ濃縮物（９６／８５４）、ヒト血液凝固因子ＩＸａ濃縮物（９７／５６２）、ヒト血液凝固因子Ｖライデン、ヒトｇＤＮＡサンプルＦＶ野生型、ＦＶＬホモ接合体、ＦＶＬヘテロ接合体（０３／２５４、０３／２６０、０３／２４８）、ヒト血液凝固因子ＶＩＩ濃縮物（９７／５９２）、ヒト血液凝固因子ＶＩＩａ濃縮物（８９／６８８）、ヒト抗梅毒血清（ＨＳ）、ヒト抗破傷風免疫グロブリン（ＴＥ−３）、ヒト抗トロンビン濃縮物（９６／５２０）、ヒト血漿抗トロンビン（９３／７６８）、ヒト抗サイログロブリン血清（６５／９３）、抗トキソプラズマ血清（ＴＯＸＭ）、ヒト抗トキソプラズマ血清（ＩｇＧ）（０１／６００）、ヒト抗水痘帯状疱疹免疫グロブリン（Ｗ１０４４）、アポリポタンパク質Ａ−１（ＳＰ１−０１）、ヒト抗インターフェロンベータ血清（Ｇ０３８−５０１−５７２）、ヒト抗はしか血清（６６／２０２）、抗核リボ核タンパク質血清（Ｗ１０６３）、抗核内因子（均質）血清（６６／２３３）、抗パルボウイルスＢ１９（ＩｇＧ）血清（９１／６０２）、１、２、３型抗パルボウイルス血清（６６／２０２）、ヒト抗狂犬病免疫グロブリン（ＲＡＩ）、ヒト抗風疹免疫グロブリン（ＲＵＢＩ−１−９４）、抗平滑筋血清（Ｗ１０６２）、ヒト抗二本鎖ＤＮＡ血清（Ｗｏ／８０）、ヒト抗Ｅ完全血液型別血清（Ｗ１００５）、ヒト抗エキノコックス血清（ＥＣＨＳ）、ヒト抗Ａ型肝炎免疫グロブリン（９７／６４６）、ヒト抗Ｂ型肝炎免疫グロブリン（Ｗ１０４２）、ヒト抗Ｅ型肝炎血清（９５／５８４）、抗ヒト血小板抗原１ａ（９３／７１０）、抗ヒト血小板抗原５ｂ（９９／６６６）、ヒト抗インターフェロンアルファ血清（Ｂ０３７−５０１−５７２）、ヒトαフェトプロテイン（ＡＦＰ）、アンクロッド（７４／５８１）、ヒト抗Ａ血液型別血清（Ｗ１００１）、ヒト抗Ｂ血液型別血清（Ｗ１００２）、ヒト抗Ｃ完全血液型別血清（Ｗ１００４）、抗Ｄ（抗Ｒｈ０）完全血液型別血清（９９／８３６）、ヒト抗Ｄ（抗Ｒｈ０）不完全血液型別血清（Ｗ１００６）、およびヒト抗Ｄ免疫グロブリン（０１／５７２）が含まれる。
【０１２６】
アフィニティアッセイが設計される用途に応じて分析物の結合剤（捕捉部位）と分析物からなる結合対の一方のメンバーとして、または他方のメンバーとして機能し得る適切な物質の他の例には、化合物を認識することができる抗体を生成するためにハプテンとして使用することができる化合物が含まれ、限定されないが、以下：限定されないが、プロゲステロン、エストロゲン、テストステロン、プロゲスチン、副腎皮質ステロイド、およびデヒドロエピアンドロステロンを含むホルモン、および、ＷＨＯにより国際参照標準としてリストアップされている非タンパク質／非ポリペプチド抗原の任意の塩、エステル、またはエーテルが含まれる。物質に続く括弧内のＷＨＯコードによって特定される、そのような適切な国際参照標準の部分的なリストには、ビタミンＢ１２（ＷＨＯ８１．５６３）、葉酸塩（ＷＨＯ９５／５２８）、ホモシステイン、トランスコバラミン、Ｔ４／Ｔ３、および参照により本明細書に援用されるＷＨＯの国際生物学的参照物質のカタログ（ＷＨＯのウェブ、たとえば２００５年６月３０日に更新されたｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｂｌｏｏｄｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｒｅｆ＿ｍａｔｅｒｉａｌｓ／のページで入手可能）に記載の他の物質が含まれる。本明細書に記載される方法および組成物は、前述の１種以上のＷＨＯ参照標準または参照標準を含む混合物を含むことができる。
【０１２７】
アフィニティアッセイが設計される用途に応じて分析物の結合剤（捕捉部位）と分析物からなる結合対の一方のメンバーとして、または他方のメンバーとして機能し得る物質の他の例には、乱用薬物が含まれる。乱用薬物には、たとえば、以下の薬剤のリスト：ヘロイン、モルヒネ、ヒドロモルフォン、コデイン、オキシコドン、ヒドロコドン、フェンタニル、デメロール、メタドン、ダーボン、スタドール、タルウィン、パレゴリック、ブプレネックス；たとえば、アンフェタミン、メタンフェタミン等の覚醒剤；メチルアンフェタミン、エチルアンフェタミン、メチルフェニデート、エフェドリン、プソイドエフェドリン、エフェドラ、麻黄、メチレンジオキシアンフェタミン（ＭＤＳ）、フェンテルミン、フェニルプロパノールアミン；アミフェナゾール、ベミグリド、ベンズフェタミン、ブロマタン、クロルフェンテルミン、クロプロパミド、クロテタミド、ジエチルプロピオン、ジメチルアンフェタミン、ドキサプラム、エタミバン、フェンカムファミン、メクロフェノキサート、メチルフェニデート、ニケタミド、ペモリン、ペンテトラゾール、フェンジメトラジン、フェンメトラジン、フェンテルミン、フェニルプロパノールアミン、ピクロトキシン、ピプラドール、プロリンタン、ストリキニーネ、シネフリン、フェンシクリジン、およびエンジェルダスト、ＰＣＰ、ケタミン等の類似体；たとえばバルビツール酸塩、グルテチミド、メタカロン、およびメプロバメート、メトヘキシタール、チアミル、チオペンタール、アモバルビタール、ペントバルビタール、セコバルビタール、ブタルビタール、ブタバルビタール、タルブタール、およびアプロバルビタール、フェノバルビタール、メホバルビタールなどの抗うつ剤；たとえばエスタゾラム、フルラゼパム、テマゼパム、トリアゾラム、ミダゾラム、アルプラゾラム、クロルジアゼポキシド、クロラゼプ酸塩、ジアゼパム、ハラゼパム、ロラゼパム、オキサゼパム、プラゼパム、クアゼパム、クロナゼパム、フルニトラゼパムなどのベンゾジアザペン；ガンマヒドロキシル酪酸およびガンマブチロラクトン等のＧＢＨ薬；グルテチミド、メタカロン、メプロバメート、カリソプロドール、ゾルピデム、ザレプロン；テトラヒドラカンナビノールおよび類似体等のカンナビノイド薬；コカイン、３−４メチレンジオキシメタンフェタミン（ＭＤＭＡ）；たとえばメスカリンおよびＬＳＤ等の幻覚剤、ならびにそれらの代謝物（たとえば、血中、尿中、および他の生体物質中に存在する代謝物）、ならびにそれらの任意の塩、エステル、またはエーテルが含まれる。
【０１２８】
（実施例）
（実施例１：少量のバイオマーカー濃縮）
４０ｍＬのＰＢＳ中の非常に低濃度のバイオマーカー（０．０１９５μＩＵ  ＴＳＨ／ｍＬまたは０．４９７ｐｇ  ＰＴＨ／ｍＬ）は、ストレプトアビジンで被覆された５５０ｎｍの超常磁性ナノ粒子を使用して濃縮し、その後、ビオチン化抗ＴＳＨ抗体（ＶＥＲＡＰＲＥＰ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ  ＴＳＨ試薬）またはビオチン化抗ＰＴＨモノクローナル抗体（ＶＥＲＡＰＲＥＰ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ  ＰＴＨ試薬）で被覆した。
【０１２９】
第１の研究では、５５０ｎｍのＶＥＲＡＰＲＥＰ  Ｂｉｏｔｉｎをビオチン化抗ＴＳＨ捕捉抗体で被覆することによりＶＥＲＡＰＲＥＰ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ  ＴＳＨ試薬を調製した。０．０８ｍＬのＴＳＨ抗原（１０μＩＵ／ｍＬ、ＥＬＩＳＡ校正用）を、４１ｍＬ  ＰＢＳバッファーで、ＤＲＧ  ＴＳＨ  Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ＥＬＩＳＡ（品番ＥＩＡ−１７９０、ロット番号ＲＮ５８８４９）の機能感度未満（０．０５４μＩＵ／ｍＬ未満）である０．０１９５μＩＵ／ｍＬに希釈し、１ｍＬをベースラインサンプル（濃縮前）として保存した。４０ｍＬのサンプルをＶＥＲＡＰＲＥＰ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ  ＴＳＨのプロトコールを用いて処理し、その後のＴＳＨ  ＥＬＩＳＡ試験用に１．０  ｍＬの濃縮サンプルを作製した。
１．  １０μＩＵ／ｍＬのＴＳＨ標準液８０μＬを４１．０ｍＬのＰＢＳで０．０１９５μＩＵ／ｍＬに希釈し、ベースラインサンプルとして１．０ｍＬを保存する（濃縮前）。
２．  １０μＩＵ／ｍＬ  ＴＳＨ標準液８０μＬを１．０ｍＬのＶＥＲＡＰＲＥＰ  Ｃｌｅａｖｅ  ａｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌで０．８０μＩＵ／ｍＬに希釈する。
３．  ＰＢＳ中の０．０１９５μＩＵ／ｍＬ  ＴＳＨ  ４０μＬを５０ｍＬファルコンチューブに加える。
４．  ＶＥＲＡＰＲＥＰ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ  ＴＳＨ混合物を加える。
５．  室温で６０分間混合しながらインキュベートする。
６．  Ｄｅｘｔｅｒ  ＬｉｆｅＳｅｐ（登録商標）５０ＳＸを使用して、６０分間ＶＥＲＡＰＲＥＰ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ  ＴＳＨを磁気的に分離する。
７．  ４０ｍＬのＰＢＳをデカンテーションして廃棄する。
８．  ４．０ｍＬのＰＢＳ洗浄バッファーを加え、混合する。
９．  Ｄｅｘｔｅｒ  ＬｉｆｅＳｅｐ（登録商標）５０ＳＸを使用して、３０分間、４ｍＬのＰＢＳ洗浄バッファー中のＶＥＲＡＰＲＥＰ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ  ＴＳＨを磁気的に分離する。
１０．  ４ｍＬのＰＢＳをデカンテーションして廃棄する。
１１．  １ｍＬのＰＢＳ洗浄バッファーを加え、混合する。
１２．  １ｍＬのＶＥＲＡＰＲＥＰ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ  ＴＳＨを、１．７５ｍＬのコニカル底のスナップキャップバイアルに移す。
１３．  Ｄｅｘｔｅｒ  ＬｉｆｅＳｅｐ（登録商標）１．５Ｓを使用して、１０分間、１ｍＬのＰＢＳ洗浄バッファー中のＶＥＲＡＰＲＥＰ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ  ＴＳＨを磁気的に分離する。
１４．  １ｍＬのＰＢＳを吸引して廃棄する。
１５．  １ｍＬのＶＥＲＡＰＲＥＰ  Ｃｌｅａｖｅを加え、混合する。
１６．  Ｄｅｘｔｅｒ  ＬｉｆｅＳｅｐ（登録商標）１．５Ｓを使用して、１０分間、１ｍＬのＶＥＲＡＰＲＥＰ  Ｃｌｅａｖｅ中のＶＥＲＡＰＲＥＰ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ  ＴＳＨを磁気的に分離する。
１７．  １ｍＬの上清（濃縮サンプル）を吸引して保存し、対照、ベースラインサンプル、および濃縮サンプルを試験した。
【０１３０】
０．０８ｍＬのＴＳＨ抗原（１０μＩＵ／ｍＬ、ＥＬＩＳＡ校正用）も、対照としてＶＥＲＡＰＲＥＰ  Ｃｌｅａｖｅ  ｂｕｆｆｅｒ１ｍＬで０．８００μＩＵ／ｍＬに希釈した。ベースラインサンプル、濃縮サンプル、対照をＤＲＧ  ＴＳＨ  Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ＥＬＩＳＡで測定し、濃縮サンプルのＴＳＨ回収率を［濃縮サンプルの結果］／［対照の結果］×１００％として算出した。予想通り、希釈したＴＳＨベースラインサンプルはＵｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ＥＬＩＳＡ  では検出されず、０．００μＩＵ／ｍＬと表示された。わずか０．８０ｍｇの試薬を使用して、ＶＥＲＡＰＲＥＰ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ  ＴＳＨは、希釈したＴＳＨを、検出不可能な状態から０．７３μＩＵ／ｍＬまで濃縮することに成功した（表１）。対照と比較して９８．６％の回収率であったが、ＴＳＨ  ＥＬＩＳＡにおけるＶＥＲＡＰＲＥＰ  Ｃｌｅａｖｅバッファーのマトリックス効果によりアッセイシグナルが抑制された可能性がある（表２）。
【０１３１】
【表１】
2021533384.tif 000002
【０１３２】
【表２】
2021533384.tif 000003
【０１３３】
第２の研究では、５５０ｎｍ  ＶＥＲＡＰＲＥＰ  Ｂｉｏｔｉｎをビオチン化抗ＰＴＨ捕捉部位で被覆することにより、ＶＥＲＡＰＲＥＰ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ  ＰＴＨ試薬を調製した。０．０２１ｍＬのＰＴＨ抗原（９７１ｐｇ／ｍＬ、ＥＬＩＳＡ校正用）も、ＤＲＧ  ＰＴＨ（Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ）Ｉｎｔａｃｔ  ＥＬＩＳＡ（品番ＥＩＡ−３６４５、ロット番号２８９６）の機能感度未満（１．５６ｐｇ／ｍＬ未満）の４１ｍＬ  ＰＢＳバッファーで０．４９７ｐｇ／ｍＬに希釈し、１ｍＬをベースラインサンプル（濃縮前）として保存した。４０ｍＬのサンプルをＶＥＲＡＰＲＥＰ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ  ＰＴＨのプロトコールを用いて処理し、その後のＰＴＨ  ＥＬＩＳＡ検査用に１．０ｍＬの濃縮サンプルを作製した。
１．  ９７１ｐｇ／ｍＬのＰＴＨ標準液２１μＬを４１．０ｍＬのＰＢＳで０．４９７ｐｇ／ｍＬに希釈し、ベースライン検体として１．０ｍＬを保存する（濃縮前）。
２．  ９７１ｐｇ／ｍＬのＰＴＨ標準液２１μＬを、対照として１．０ｍＬのＶＥＲＡＰＲＥＰ  Ｃｌｅａｖｅで２０．４ｐｇ／ｍＬに希釈する。
３．  ＰＢＳ中の０．４９７ｐｇ／ｍＬ  ＰＴＨ  ４０ｍＬを５０ｍＬのファルコンチューブに加える。
４．  ＶＥＲＡＰＲＥＰ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ  ＰＴＨを加え、混合する。
５．  室温で３０分間混合しながらインキュベートする。
６．  Ｄｅｘｔｅｒ  ＬｉｆｅＳｅｐ（登録商標）５０ＳＸを用いて、１５分間ＶＥＲＡＰＲＥＰ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ  ＰＴＨを磁気的に分離する。
７．  ４０ｍＬのＰＢＳをデカンテーションして廃棄する。
８．  ４．０ｍＬのＰＢＳ洗浄バッファーを加え、混合する。
９．  Ｄｅｘｔｅｒ  ＬｉｆｅＳｅｐ（登録商標）５０ＳＸを使用して、１０分間、４ｍＬのＰＢＳ洗浄バッファー中のＶＥＲＡＰＲＥＰ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ  ＰＴＨを磁気的に分離する。
１０．  ４ｍＬのＰＢＳをデカンテーションして廃棄する。
１１．  １．０ｍＬのＰＢＳ洗浄バッファーを加え、混合する。
１２．  １ｍＬのＶＥＲＡＰＲＥＰ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ  ＰＴＨを、１．７５ｍＬのコニカル底のスナップキャップバイアルに移す。
１３．  Ｄｅｘｔｅｒ  ＬｉｆｅＳｅｐ（登録商標）１．５Ｓを使用して、１０分間、１ｍＬのＰＢＳ洗浄バッファー中のＶＥＲＡＰＲＥＰ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ  ＰＴＨを磁気的に分離する。
１４．  １ｍＬのＰＢＳを吸引して廃棄する。
１５．  １ｍＬのＶＥＲＡＰＲＥＰ  Ｃｌｅａｖｅを加え、混合する。
１６．  Ｄｅｘｔｅｒ  ＬｉｆｅＳｅｐ（登録商標）１．５Ｓを使用して、１０分間、１ｍＬのＶＥＲＡＰＲＥＰ  Ｃｌｅａｖｅ中のＶＥＲＡＰＲＥＰ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ  ＰＴＨを磁気的に分離する。
１７．  １ｍＬの上清（濃縮サンプル）を吸引して保存し、対照、ベースラインサンプル、および濃縮サンプルを試験した。
【０１３４】
０．０２１ｍＬのＰＴＨ抗原（９７１ｐｇ／ｍＬ、ＥＬＩＳＡ校正用）も、対照として、ＶＥＲＡＰＲＥＰ  Ｃｌｅａｖｅバッファー１ｍＬで２０．４ｐｇ／ｍＬに希釈した。ベースラインサンプル、濃縮サンプルおよび対照をＤＲＧ  ＰＴＨ（Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ）Ｉｎｔａｃｔ  ＥＬＩＳＡで検査し、濃縮サンプルのＰＴＨ回収率を［濃縮サンプル結果］／［コントロール結果］×１００％として計算した。希釈したＰＴＨベースラインサンプルは、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるＶＥＲＡＰＲＥＰ  Ｃｌｅａｖｅバッファーのマトリックス効果により１３．５ｐｇ／ｍＬとなった。このマトリックス効果によりアッセイシグナルが向上した。わずか０．８０ｍｇの試薬を使用したＶＥＲＡＰＲＥＰ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ  ＰＴＨは、希釈したＰＴＨを４２．３ｐｇ／ｍＬまで濃縮することに成功した（表３）。対照と比較して１０９％の回収であった（表４）。
【０１３５】
【表３】
2021533384.tif 000004
【０１３６】
【表４】
2021533384.tif 000005
【０１３７】
（実施例４：その後の質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳまたはＭＡＬＤＩ−ＭＳ）分析のための尿からの低濃度バイオマーカー濃縮）
以下では、バイオマーカーに特異的な捕捉部位で被覆された超常磁性ナノ粒子を使用して、大容量の尿サンプルから低濃度のバイオマーカー、およびスパイクされた内部標準（ＩＳＴＤ）を濃縮するための質量分析サンプルの前処理プロトコールについて説明する。全く同一のプロトコールはまた、同じサンプルからの２つ以上のバイオマーカーおよび対応するスパイクされたＩＳＴＤを多重化して濃縮するために、各集団が異なる捕捉部位で被覆されている、混合された、またはプールされた異なる複数の超常磁性ナノ粒子集団を使用することができる。２以上のバイオマーカーの濃縮および特性評価により、単一のバイオマーカーの特性評価では不可能な疾患の臨床診断および／または予後のためのアルゴリズムを容易に使用できる。たとえば、閉塞性睡眠時無呼吸（ＯＳＡ）を尿から診断するために、ＶＥＲＡＰＲＥＰ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ試薬は、カリクレイン−１、ウロモジュリン、ウロコルチン−３、およびオロソムコイド−１を捕捉して濃縮するための４種類の抗体、またはカリクレイン−１、ウロモジュリン、ウロコルチン−３、およびオルソムコイド−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、および高感度Ｃ反応性タンパク質を捕捉して濃縮するための７種類の抗体から構成され得る。
１．  患者の尿を採集する（採尿カップ等の標準的な採尿プロトコールを使用）。
２．  採尿サンプルを混合する。
３．  ４０ｍＬの尿を５０ｍＬのファルコンチューブに加える。
４．  濃縮するための、バイオマーカー用の重水素化した内部標準を加え、混合する。
５．  ＶＥＲＡＰＲＥＰ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎを加え、混合する。
６．  ＶＥＲＡＰＲＥＰ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅを加え、混合する。
７．  インキュベート：ＶＥＲＡＰＲＥＰ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅによりバイオマーカーおよび重水素化された内部標準が捕捉される。
８．  Ｄｅｘｔｅｒ  ＬｉｆｅＳｅｐ（登録商標）５０ＳＸを使用して、４０ｍＬの尿中のＶＥＲＡＰＲＥＰ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅを磁気的に分離する。
９．  尿を吸引して廃棄する。
１０．  ４ｍＬのＰＢＳ洗浄バッファーを加え、混合する。
１１．  Ｄｅｘｔｅｒ  ＬｉｆｅＳｅｐ（登録商標）５０ＳＸを使用して、４ｍＬのＰＢＳ洗浄バッファー中のＶＥＲＡＰＲＥＰ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅを磁気的に分離する。
１２．  尿を吸引して廃棄する。
１３．  ステップ１２をさらに２回（２×）繰り返す。
１４．  １ｍＬのＶＥＲＡＰＲＥＰ  Ｃｌｅａｖｅを加え、混合する（質量分析対応バッファー）。
１５．  Ｄｅｘｔｅｒ  ＬｉｆｅＳｅｐ（登録商標）１．５Ｓを使用して、１ｍＬのＶＥＲＡＰＲＥＰ  Ｃｌｅａｖｅ中のＶＥＲＡＰＲＥＰ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅを磁気的に分離する。
１６．  １ｍＬの上清サンプルを吸引し、ＬＣ−ＭＳで試験した。
１７．  １）４０ｍＬの尿サンプルサイズ、２）バイオマーカーのＬＣ−ＭＳ定量、３）重水素化された内部標準物質の回収率に基づいて報告されたバイオマーカーの値の調整に基づき、最終バイオマーカー濃度を決定した。
【０１３８】
捕捉され濃縮されたバイオマーカー（１または複数）の選択的放出または切断は、ｐＨの変化（グリシンｐＨ２．５の溶出後に中和するなどの酸性ｐＨ、またはｐＨ１０．０以上のアルカリ性ｐＨ）、ＴＣＥＰもしくはＤＴＴのような還元剤で切断されるジスルフィド結合のような切断可能なリンカーの使用、またはコンカナバリンＡ上の結合部位を競合させるモノマーアビジンとのＤ−ビオチンのモル過剰またはコンカナバリンＡとの糖のモル過剰のような競合溶出の使用によって達成することができる。
【０１３９】
（実施例５：低濃度のバイオマーカーの濃縮前のサンプル干渉物質枯渇のためのサンプル前処理）
以下に、低濃度のバイオマーカーを濃縮する前にサンプル干渉物質を枯渇させるためのサンプル前処理のプロトコールを説明する。このプロトコールでは、試薬Ａの微粒子上の捕獲部位が濃縮されるバイオマーカーに対する特異性を有しないことを除いて、試薬Ｂのマイクロ粒子と全く同じマイクロ粒子が含まれる試薬Ａでサンプルを前処理する。サンプルの干渉物質を枯渇させるためにサンプル前処理を行った後、試薬Ａのビーズは、磁気的、物理的、または化学的にサンプルから除去される。次に、干渉物質が枯渇した、または干渉物質を含まないサンプルを試薬Ｂに加え、または試薬Ｂと混合して、干渉物質がない状態でバイオマーカーを捕捉および濃縮する。
【０１４０】
この方法は、９６穴または３８４穴プレート磁石等の磁性、常磁性または超常磁性のマイクロ粒子を捕獲するために、デッキ上の磁石を使用して、ＨａｍｉｌｔｏｎやＴｅｃａｎ等の液体処理システム上で自動化されている。
１．サンプルラックをシステム上に載せる。
２．サンプルを吸引し、チューブ、９６穴プレート、または３８４穴プレート等の反応容器Ａに分注する。
３．混合試薬Ａ（磁性マイクロ粒子）を吸引して反応容器Ａに分注し、混合し、インキュベートしてサンプル特異的な干渉物質を捕捉し、枯渇させる。
４．反応容器Ａを磁石位置（たとえばチューブ用の単一の磁石、または９６穴もしくは３８４穴磁気分離器）に移動し、試薬Ａを分離する。
５．前処理したサンプルを吸引し、チューブ、９６穴プレート、または３８４穴プレート等の反応容器Ｂに分注する。
６．混合試薬Ｂを反応容器に加え、混合し、インキュベートして、干渉物質がない状態（試薬Ａでのサンプル前処理により枯渇し、除去される）でバイオマーカーを捕捉するか、またはバイオマーカーを濃縮する。
７．  反応容器Ｂを磁石位置（たとえばチューブ用の単一の磁石、または９６穴もしくは３８４穴プレート磁気分離器）に移動し、試薬Ａを分離する。
８．サンプル上清およびマトリックスを吸引／除去し、廃棄して試薬Ｂを洗浄する。
９．捕捉されたバイオマーカーを測定するために、試薬Ｂを直接測定系で試験するか、または、試験系での測定のために、バイオマーカーは試薬Ｂから切断、溶出、もしくは選択放出され、または捕捉部位−バイオマーカー複合体は試薬Ｂから切断、溶出、もしくは選択放出され、または（前もって標識された捕捉部位）−バイオマーカー複合体は試薬Ｂから切断、溶出、もしくは選択放出される。
【０１４１】
（略語）
ＡＢＥＩ  Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノール
ＡＬＰ  アルカリホスファターゼ
ＢＳＡ  ウシ血清アルブミン
Ｆａｂ  断片抗体結合
Ｆｃ  断片、結晶化可能
ＨＡＡＡ  ヒト抗動物抗体
ＨＡＭＡ  ヒト抗マウス抗体
ＨＡＳＡ  ヒト抗ヒツジ抗体
ＩＦＵ  使用のための説明
ＩｇＧ  抗体または免疫グロブリン
ＩｇＭ  免疫グロブリンＭ
ＨＲＰ  西洋ワサビペルオキシダーゼ
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ  液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法
ＬＤＴ  研究室で開発された試験
Ｍａｂ  モノクローナル抗体
ＭＡＳＩ  製造アッセイ特異的な干渉
ＭＦＧ  ＩＶＤメーカー
ＰＭＰ  超常磁性微粒子
ＰＢＣＴ  一次採血チューブ
ＲＦ  リウマチ因子
ＲＬＵ  相対光単位またはアッセイ応答シグナル
ＲＵＯ  研究利用に限る
ＳＡｖ  ストレプトアビジン
ＳＴＴ  二次トランスファーチューブ
ＴＡＴ  ターンアラウンドタイム
ＷＦ  ワークフロー
【０１４２】
（定義）
本明細書で使用される「サンプル」または「生体サンプル」は、診断、予後、スクリーニング、リスク評価、重症度分類、および治療薬モニタリング等のモニタリングのために試験される、ヒトまたは動物の血清、血漿（すなわち、ＥＤＴＡ、ヘパリンリチウム、クエン酸ナトリウム）、血液、全血、処理された血液、尿、唾液、便（液体および固体）、精液または精漿、羊水、脳脊髄液、細胞、組織、生検材料、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または任意の液体または溶解した固体、もしくは処理された固体材料をいう。いくつかの実施形態では、サンプルは大容量サンプルである。いくつかの実施形態では、サンプルには複数のサンプル（たとえば、同一または異なる対象からの２以上のサンプル）が含まれる。いくつかの実施形態では、サンプルには、サンプル中に低濃度で存在するバイオマーカーが含まれる。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、サンプルは、一次採血チューブ（ＰＢＣＴ）、二次トランスファーチューブ（ＳＳＴ）、２４時間（２４ｈｒ）採尿器、ＢＤバキュテイナバリコア（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  Ｂａｒｒｉｃｏｒ）チューブ、ナノテイナー（ｎａｎｏｔａｉｎｅｒ）、唾液採集チューブ、血液スポット濾紙、または便および精液用等の任意の採集チューブもしくは装置、ヘパリンナトリウム、ヘパリンリチウム、もしくはヘパリンアンモニウムを含む、淡緑色もしくは緑色トップの血漿分離チューブ（ＰＳＴ）、クエン酸ナトリウム（すなわち、３．２％または３．８％）もしくはクエン酸塩、テオフィリン、アデノシン、ジピリダモール（ＣＴＡＤ）を含む、淡青色トップのチューブ、ガラスチューブ（添加剤なし）もしくはプラスチックチューブ（血栓活性化剤を含む）に血清を採集するための血清学または免疫血液学用の赤トップチューブ、ガラスチューブ（添加剤なし）もしくはプラスチックチューブ（血栓活性化剤を含む）に血清を採集するための化学用の赤トップチューブ、分子診断およびウイルス負荷の検出において血漿を試験するための、ＥＤＴＡ  Ｋ２、ＥＤＴＡ  Ｋ３、液体ＥＤＴＡ溶液（すなわち、８％）を含む紫ラベンダートップのチューブもしくはＥＤＴＡ  Ｋ２／ゲルチューブ、血液銀行ＥＤＴＡ用のピンクトップチューブ、シュウ酸カリウムおよびフッ化ナトリウム、フッ化ナトリウム／ＥＤＴＡ、もしくはフッ化ナトリウムを含む灰色トップチューブ（抗凝血なし、血清サンプル用）、ＡＣＤ溶液ＡまたはＡＣＤ溶液Ｂを含む黄色トップチューブ、ロイヤルブルートップチューブ（血清、添加剤なしまたはヘパリンナトリウム）、白トップチューブ、または任意の用途もしくは診断試験のタイプのための、添加剤なしもしくは任意の添加剤、またはそれらの組み合わせを含む、血液採集用の任意の色もしくは任意の型のチューブに採集される。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、サンプルは、尿、２４時間尿、唾液、および便、または目的のバイオマーカーが希釈されている、もしくは測定が困難である等、困難なタイプのサンプルである。たとえば、生体サンプルは、患者の集団（たとえば、新生児、小児、老人、妊婦、腫瘍、自己免疫疾患）のために困難な場合がある。たとえば、いくつかのバイオマーカーは、たとえば循環中もしくは尿中で希釈されすぎていて、または低濃度すぎて、現行のＰＯＣＴおよび主要な研究室分析装置により確実に検出することができず、正確かつ精密に測定することができない。いくつかの実施形態では、困難なサンプルは脳脊髄液（ＣＳＦ）である。
【０１４５】
本明細書で使用される「採集装置」は、一次採血チューブ（ＰＢＣＴ），２４時間採尿器、採尿器、唾液採集チューブ、採便器、精液採集器、血液採集バッグ、またはサンプルを添加する前の任意のサンプル採集チューブもしくは装置であり得る。
【０１４６】
ＰＣＢＴおよび二次トランスファーチューブ（ＳＳＴ）は、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＢＤ）、Ｇｒｅｉｎｅｒ、ＶＷＲ、およびＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ等の会社の市販の標準チューブもしくはカスタムの採集チューブ（ゲル分離剤ありまたはなし）、ガラスチューブ、プラスチックチューブ、ヘパリンナトリウム、ヘパリンリチウム、もしくはヘパリンアンモニウムを含む、淡緑色もしくは緑色トップの血漿分離チューブ（ＰＳＴ）、クエン酸ナトリウム（すなわち、３．２％または３．８％）もしくはクエン酸塩、テオフィリン、アデノシン、ジピリダモール（ＣＴＡＤ）を含む、淡青色トップのチューブ、ガラスチューブ（添加剤なし）もしくはプラスチックチューブ（血栓活性化剤を含む）に血清を採集するための血清学または免疫血液学用の赤トップチューブ、ガラスチューブ（添加剤なし）もしくはプラスチックチューブ（血栓活性化剤を含む）に血清を採集するための化学用の赤トップチューブ、分子診断およびウイルス負荷の検出において血漿を試験するための、ＥＤＴＡ  Ｋ２、ＥＤＴＡ  Ｋ３、液体ＥＤＴＡ溶液（すなわち、８％）を含む紫ラベンダートップのチューブもしくはＥＤＴＡ  Ｋ２／ゲルチューブ、血液銀行ＥＤＴＡ用のピンクトップチューブ、シュウ酸カリウムおよびフッ化ナトリウム、フッ化ナトリウム／ＥＤＴＡ、もしくはフッ化ナトリウムを含む灰色トップチューブ（抗凝血なし、血清サンプル用）、ＡＣＤ溶液ＡまたはＡＣＤ溶液Ｂを含む黄色トップチューブ、ロイヤルブルートップチューブ（血清、添加剤なしまたはヘパリンナトリウム）、白トップチューブ、または任意の用途もしくは診断試験のタイプのための、添加剤なしもしくは任意の添加剤、またはそれらの組み合わせを含む、血液採集用の任意の色もしくは任意の型のチューブであってもよい。
【０１４７】
本明細書で使用される「保存装置」または「トランスファー装置」は、採集装置で受け取ったサンプルおよび／または他の成分を受け取ることができる装置をいう。保存またはトランスファー装置は、プラスチックもしくはガラスのチューブ、バイアル、ボトル、ビーカー、フラスコ、バッグ、缶、マイクロタイタープレート、ＥＬＩＳＡプレート、９６穴プレート、３８４穴プレート、１５３６穴プレート、キュベット、反応モジュール、リザーバー、または、液体サンプルの保持、保存、もしくは処理に適した任意の容器であってもよい。
【０１４８】
本明細書でいう「診断試験」には、限定されないが、抗体系の診断試験、非抗体系の診断試験、免疫抽出（ＩＥ）および固相抽出（ＳＰＥ）等の、クロマトグラフィー法、分光光度法、および質量分析法（すなわち、ＨＰＬＣ、ＭＳ、ＬＣＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によるその後の分析のためのサンプル前処理の方法もしくは装置、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、分子診断、ラテラルフロー（ＬＦ）、ポイントオブケア（ＰｏＣ）、直販（ＤＴＣ）、ＣＬＩＡおよびＣＬＩＡ免除の試験および装置、研究使用に限られる（ＲＵＯ）試験、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ診断（ＩＶＤ）試験、研究室で開発された試験（ＬＤＴ）、コンパニオン診断、ならびに、診断、予後、スクリーニング、リスク評価、重症度分類、および治療薬モニタリング等のモニタリングのための任意の試験が含まれる。いくつかの実施形態では、診断試験には、ターンアラウンドタイムが短い診断試験（ＳＴＡＴ）、外来試験、ラテラルフロー試験、ポイントオブケア（ＰｏＣ）試験、分子診断試験、ＨＰＬＣ、ＭＳ、ＬＣＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、ＣＬＩＡおよびＣＬＩＡ免除の試験、ならびに、診断、予後、スクリーニング、リスク評価、重症度分類、治療モニタリング、および治療薬モニタリングのための任意の診断試験が含まれる。
【０１４９】
（付記）
（付記１）
生体サンプルからバイオマーカーを除去するための方法であって、
ａ）前記サンプルを、各粒子が独立して捕捉部位（すなわち、捕捉部位の型または種類）を含む複数種の粒子と組み合わせて、混合物を提供すること、
ｂ）前記混合物を混合して、前記バイオマーカーとの１種以上の粒子複合体を提供すること、
ｃ）前記粒子複合体を除去または単離して、枯渇させた溶液を提供すること、
を含み、
それにより、生体サンプルからバイオマーカーを除去する、
方法。
【０１５０】
（付記２）
生体サンプルからバイオマーカーを単離するための方法であって、
ａ）前記サンプルを、各粒子が独立して捕捉部位（すなわち、捕捉部位の型または種類）を含む複数種の粒子と組み合わせて、混合物を提供すること、
ｂ）前記混合物を混合して、前記バイオマーカーとの１種以上の粒子複合体を提供すること、
ｃ）前記粒子複合体を除去または単離して、枯渇させた溶液および濃縮された単離物を提供すること、
を含み、
それにより、生体サンプルからバイオマーカーを単離する、
方法。
【０１５１】
（付記３）
前記サンプルを前記複数種の粒子と組み合わせる前に、前記生体サンプルに条件調節剤が添加される、付記１または２に記載の方法。
【０１５２】
（付記４）
前記条件調節剤は、ｐＨ調整剤、モル濃度調整剤、干渉遮断剤、または遊離剤もしくは放出剤である、付記３に記載の方法。
【０１５３】
（付記５）
診断試験が行われる前に前記生体サンプルについて行われる、付記１または２に記載の方法。
【０１５４】
（付記６）
前記複数種の粒子には、複数種の捕捉部位（たとえば、それぞれ独立に複数種の捕捉部位と共有結合または非共有結合している複数種の粒子）が含まれる、付記１または２に記載の方法。
【０１５５】
（付記７）
前記複数種の粒子には、第１の捕捉部位を備える第１の粒子が含まれる、付記１または２に記載の方法。
【０１５６】
（付記８）
前記複数種の粒子には、第２の捕捉部位を備える第２の粒子が含まれる、付記７に記載の方法。
【０１５７】
（付記９）
前記複数種の粒子には、第３の捕捉部位を備える第３の粒子が含まれる、付記８に記載の方法。
【０１５８】
（付記１０）
前記複数種の粒子には、第４の捕捉部位を備える第４の粒子が含まれる、付記９に記載の方法。
【０１５９】
（付記１１）
前記複数種の粒子には、第５の捕捉部位を備える第５の粒子が含まれる、付記１０に記載の方法。
【０１６０】
（付記１２）
前記複数種の粒子には、第６の捕捉部位を備える第６の粒子が含まれる、付記１１に記載の方法。
【０１６１】
（付記１３）
前記複数種の粒子には、第７の捕捉部位を備える第７の粒子が含まれる、付記１２に記載の方法。
【０１６２】
（付記１４）
前記複数種の粒子には、第８の捕捉部位を備える第８の粒子が含まれる、付記１３に記載の方法。
【０１６３】
（付記１５）
前記複数種の粒子には、第９の捕捉部位を備える第９の粒子が含まれる、付記１４に記載の方法。
【０１６４】
（付記１６）
前記複数種の粒子には、第１０の捕捉部位を備える第１０の粒子が含まれる、付記１５に記載の方法。
【０１６５】
（付記１７）
前記生体サンプルから第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、または第１０のバイオマーカーを除去、または分離することを含む、付記１６に記載の方法。
【０１６６】
（付記１８）
前記混合物に切断試薬または放出剤を加えて、濃縮された単離物を提供することをさらに含む、付記１または２に記載の方法。
【０１６７】
（付記１９）
前記バイオマーカーについて診断試験を行うこと（たとえば、本明細書に記載される除去方法または単離方法の後に）をさらに含む、付記１または２に記載の方法。
【０１６８】
（付記２０）
前記診断試験は、２種以上のバイオマーカーの存在または不存在を同時に検出する、付記１９に記載の方法。
【０１６９】
（付記２１）
前記第１の粒子は、大きさ、形状、化学的特性、色、または他の特性が前記第２の粒子と異なる、付記８に記載の方法。
【０１７０】
（付記２２）
前記第１の粒子は、大きさ、形状、化学的特性、色、または他の特性が前記第３の粒子と異なる、付記９に記載の方法。
【０１７１】
（付記２３）
前記第１の粒子は、大きさ、形状、化学的特性、色、または他の特性が前記第４の粒子と異なる、付記１０に記載の方法。
【０１７２】
（付記２４）
前記第１の粒子は、大きさ、形状、化学的特性、色、または他の特性が前記第５の粒子と異なる、付記１１に記載の方法。
【０１７３】
（付記２５）
前記第１の粒子は、大きさ、形状、化学的特性、色、または他の特性が前記第６の粒子と異なる、付記１２に記載の方法。
【０１７４】
（付記２６）
前記第１の粒子は、大きさ、形状、化学的特性、色、または他の特性が前記第７の粒子と異なる、付記１３に記載の方法。
【０１７５】
（付記２７）
前記第１の粒子は、大きさ、形状、化学的特性、色、または他の特性が前記第８の粒子と異なる、付記１４に記載の方法。
【０１７６】
（付記２８）
前記第１の粒子は、大きさ、形状、化学的特性、色、または他の特性が前記第９の粒子と異なる、付記１５に記載の方法。
【０１７７】
（付記２９）
前記第１の粒子は、大きさ、形状、化学的特性、色、または他の特性が前記第１０の粒子と異なる、付記１６に記載の方法。
【０１７８】
（付記３０）
前記特性は、本明細書に記載のバイオマーカーに対する選択性、親和性、または結合性である、付記２１〜２９のいずれか１つに記載の方法。
【０１７９】
（付記３１）
前記大きさは直径５０〜１０００ｎｍ（たとえば、１００〜５００ｎｍ、２００〜６００ｎｍ）である、付記２１〜２９のいずれか１つに記載の方法。
【０１８０】
（付記３２）
前記大きさは直径１〜３ミクロンである、付記２１〜２９のいずれか１つに記載の方法。
【０１８１】
（付記３３）
第１の粒子集団は第２の粒子集団より高い濃度で存在する、付記１または２に記載の方法。
【０１８２】
（付記３４）
前記第１の粒子対前記第２の粒子の比は、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０である、付記３３に記載の方法。
【０１８３】
（付記３５）
前記第１の粒子は第１の濃度で存在する、付記７に記載の方法。
【０１８４】
（付記３６）
前記第２の粒子は第２の濃度で存在する、付記８に記載の方法。
【０１８５】
（付記３７）
前記第３の粒子は第３の濃度で存在する、付記９に記載の方法。
【０１８６】
（付記３８）
前記第４の粒子は第４の濃度で存在する、付記１０に記載の方法。
【０１８７】
（付記３９）
前記第５の粒子は第５の濃度で存在する、付記１１に記載の方法。
【０１８８】
（付記４０）
前記第６の粒子は第６の濃度で存在する、付記１２に記載の方法。
【０１８９】
（付記４１）
前記第７の粒子は第７の濃度で存在する、付記１３に記載の方法。
【０１９０】
（付記４２）
前記第８の粒子は第８の濃度で存在する、付記１４に記載の方法。
【０１９１】
（付記４３）
前記第９の粒子は第９の濃度で存在する、付記１５に記載の方法。
【０１９２】
（付記４４）
前記第１０の粒子は第１０の濃度で存在する、付記１６に記載の方法。
【０１９３】
（付記４５）
前記第１の粒子は対照粒子（たとえば、標識または指標（たとえば、既知の量、濃度の標識または指標）を含む粒子）である、付記７に記載の方法。
【０１９４】
（付記４６）
前記標識または前記指標は、前記サンプルの濃度または容積の測定を提供する、付記４５に記載の方法。
【０１９５】
（付記４７）
前記標識または前記指標は、収率または粒子回収率の測定を提供する、付記４５に記載の方法。
【０１９６】
（付記４８）
前記標識または前記指標は、前記サンプルのロット番号またはバッチ番号の指標を提供する、付記４５に記載の方法。
【０１９７】
（付記４９）
前記バイオマーカーは、ビオチン、ＨＡＭＡ、ＲＦ、異好、または抗ＳＡｖである、付記１または２に記載の方法。
【０１９８】
（付記５０）
前記バイオマーカーは、細菌の感染の指標である、付記１または２に記載の方法。
【０１９９】
（付記５１）
前記バイオマーカーは、細菌の捕捉部位である、付記１または２に記載の方法。
【０２００】
（付記５２）
前記粒子複合体の除去または単離には、捕捉部位−バイオマーカー複合体の切断、溶出、または選択的放出が含まれる、付記１または２に記載の方法。
【０２０１】
（付記５３）
前記捕捉部位には、診断試験システムにおける測定のためのシグナル検出分子が含まれる、付記５２に記載の方法。
【０２０２】
（付記５４）
前記サンプルは、組み合わせステップａ）の前に、干渉物質を除去または枯渇させるために、（ｉ）前記サンプルを、前記バイオマーカーに対する特異性がない捕捉部位を含む粒子と組み合わせて、混合物を提供すること、（ｉｉ）前記混合物を混合して、前記干渉物質との粒子複合体を提供すること、および（ｉｉｉ）前記粒子複合体を除去、または完全に除去して、枯渇させた溶液を提供すること、を含む前処理をされる、付記１または２に記載の方法。
【０２０３】
（付記５５）
複数種の粒子、磁石、チューブ、および取扱説明書を含むキット。
【０２０４】
（付記５６）
患者のウロコルチンＩＩＩペプチド、ウロモジュリンペプチド、オロソムコイド１ペプチド、カリクレイン１ペプチド、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、高感度Ｃ反応性タンパク質、またはこれらの組み合わせを検出する方法であって、
ａ．ヒト患者からサンプルを得ること、および、
ｂ．複数種の粒子により、ウロコルチンＩＩＩペプチド、ウロモジュリンペプチド、オロソムコイド１ペプチド、カリクレイン１ペプチド、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、高感度Ｃ反応性タンパク質、またはこれらの組み合わせが前記サンプル中に存在するか否かを検出すること、およびウロコルチンＩＩＩペプチド、ウロモジュリンペプチド、オロソムコイド１ペプチド、カリクレイン１ペプチド、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、高感度Ｃ反応性タンパク質、またはこれらの組み合わせと、前記複数種の粒子との間の結合を検出すること、
を含む、方法。
【０２０５】
（付記５７）
患者の閉塞性睡眠時無呼吸を診断する方法であって、
ａ．ヒト患者からサンプルを得ること、および、
ｂ．前記サンプルを複数種の粒子と接触させることにより、ウロコルチンＩＩＩペプチド、ウロモジュリンペプチド、オロソムコイド１ペプチド、カリクレイン１ペプチド、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、高感度Ｃ反応性タンパク質、またはこれらの組み合わせが前記サンプル中に存在するか否かを検出すること、およびウロコルチンＩＩＩペプチド、ウロモジュリンペプチド、オロソムコイド１ペプチド、カリクレイン１ペプチド、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、高感度Ｃ反応性タンパク質、またはこれらの組み合わせと、前記複数種の粒子との間の結合を検出すること、ならびに、
ｃ．前記サンプル中にウロコルチンＩＩＩペプチド、ウロモジュリンペプチド、オロソムコイド１ペプチド、カリクレイン１ペプチド、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、高感度Ｃ反応性タンパク質の存在が検出された場合に、閉塞性睡眠時無呼吸の患者であると診断すること、
を含む、方法。
【０２０６】
（付記５８）
前記患者がヒトである、付記５６または５７に記載の方法。
【０２０７】
（付記５９）
前記ヒトは約９歳から約２歳未満である、付記５８に記載の方法。
【０２０８】
（付記６０）
ウロコルチンＩＩＩペプチド、ウロモジュリンペプチド、オロソムコイド１ペプチド、カリクレイン１ペプチド、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、高感度Ｃ反応性タンパク質からなる群の２種以上の存在または不存在を同時に検出することを含む、付記５６または５７に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】令和3年4月5日(2021.4.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体サンプルからバイオマーカーを除去するための方法であって、
ａ）前記サンプルを、各粒子が独立して捕捉部位（すなわち、捕捉部位の型または種類）を含む複数種の粒子と組み合わせて、混合物を提供すること、
ｂ）前記混合物を混合して、前記バイオマーカーとの１種以上の粒子複合体を提供すること、
ｃ）前記粒子複合体を除去または単離して、枯渇させた溶液を提供すること、
を含み、
それにより、生体サンプルからバイオマーカーを除去する、
方法。
【請求項２】
生体サンプルからバイオマーカーを単離するための方法であって、
ａ）前記サンプルを、各粒子が独立して捕捉部位（すなわち、捕捉部位の型または種類）を含む複数種の粒子と組み合わせて、混合物を提供すること、
ｂ）前記混合物を混合して、前記バイオマーカーとの１種以上の粒子複合体を提供すること、
ｃ）前記粒子複合体を除去または単離して、枯渇させた溶液および濃縮された単離物を提供すること、
を含み、
それにより、生体サンプルからバイオマーカーを単離する、
方法。
【請求項３】
前記サンプルを前記複数種の粒子と組み合わせる前に、前記生体サンプルに条件調節剤が添加される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記条件調節剤は、ｐＨ調整剤、モル濃度調整剤、干渉遮断剤、または遊離剤もしくは放出剤である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
診断試験が行われる前に前記生体サンプルについて行われる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記複数種の粒子には、複数種の捕捉部位（たとえば、それぞれ独立に複数種の捕捉部位と共有結合または非共有結合している複数種の粒子）が含まれる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記複数種の粒子には、第１の捕捉部位を備える第１の粒子が含まれる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記複数種の粒子には、第２の捕捉部位を備える第２の粒子が含まれる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記複数種の粒子には、第３の捕捉部位を備える第３の粒子が含まれる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記複数種の粒子には、第４の捕捉部位を備える第４の粒子が含まれる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記複数種の粒子には、第５の捕捉部位を備える第５の粒子が含まれる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記複数種の粒子には、第６の捕捉部位を備える第６の粒子が含まれる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記複数種の粒子には、第７の捕捉部位を備える第７の粒子が含まれる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記複数種の粒子には、第８の捕捉部位を備える第８の粒子が含まれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記複数種の粒子には、第９の捕捉部位を備える第９の粒子が含まれる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記複数種の粒子には、第１０の捕捉部位を備える第１０の粒子が含まれる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記生体サンプルから第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、または第１０のバイオマーカーを除去、または分離することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記混合物に切断試薬または放出剤を加えて、濃縮された単離物を提供することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１９】
前記バイオマーカーについて診断試験を行うこと（たとえば、本明細書に記載される除去方法または単離方法の後に）をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２０】
前記診断試験は、２種以上のバイオマーカーの存在または不存在を同時に検出する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１の粒子は、大きさ、形状、化学的特性、色、または他の特性が前記第２の粒子と異なる、請求項８に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１の粒子は、大きさ、形状、化学的特性、色、または他の特性が前記第３の粒子と異なる、請求項９に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１の粒子は、大きさ、形状、化学的特性、色、または他の特性が前記第４の粒子と異なる、請求項１０に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１の粒子は、大きさ、形状、化学的特性、色、または他の特性が前記第５の粒子と異なる、請求項１１に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１の粒子は、大きさ、形状、化学的特性、色、または他の特性が前記第６の粒子と異なる、請求項１２に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１の粒子は、大きさ、形状、化学的特性、色、または他の特性が前記第７の粒子と異なる、請求項１３に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１の粒子は、大きさ、形状、化学的特性、色、または他の特性が前記第８の粒子と異なる、請求項１４に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１の粒子は、大きさ、形状、化学的特性、色、または他の特性が前記第９の粒子と異なる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１の粒子は、大きさ、形状、化学的特性、色、または他の特性が前記第１０の粒子と異なる、請求項１６に記載の方法。
【請求項３０】
前記特性は、本明細書に記載のバイオマーカーに対する選択性、親和性、または結合性である、請求項２１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記大きさは直径５０〜１０００ｎｍ（たとえば、１００〜５００ｎｍ、２００〜６００ｎｍ）である、請求項２１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記大きさは直径１〜３ミクロンである、請求項２１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
第１の粒子集団は第２の粒子集団より高い濃度で存在する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３４】
前記第１の粒子対前記第２の粒子の比は、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記第１の粒子は第１の濃度で存在する、請求項７に記載の方法。
【請求項３６】
前記第２の粒子は第２の濃度で存在する、請求項８に記載の方法。
【請求項３７】
前記第３の粒子は第３の濃度で存在する、請求項９に記載の方法。
【請求項３８】
前記第４の粒子は第４の濃度で存在する、請求項１０に記載の方法。
【請求項３９】
前記第５の粒子は第５の濃度で存在する、請求項１１に記載の方法。
【請求項４０】
前記第６の粒子は第６の濃度で存在する、請求項１２に記載の方法。
【請求項４１】
前記第７の粒子は第７の濃度で存在する、請求項１３に記載の方法。
【請求項４２】
前記第８の粒子は第８の濃度で存在する、請求項１４に記載の方法。
【請求項４３】
前記第９の粒子は第９の濃度で存在する、請求項１５に記載の方法。
【請求項４４】
前記第１０の粒子は第１０の濃度で存在する、請求項１６に記載の方法。
【請求項４５】
前記第１の粒子は対照粒子（たとえば、標識または指標（たとえば、既知の量、濃度の標識または指標）を含む粒子）である、請求項７に記載の方法。
【請求項４６】
前記標識または前記指標は、前記サンプルの濃度または容積の測定を提供する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記標識または前記指標は、収率または粒子回収率の測定を提供する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記標識または前記指標は、前記サンプルのロット番号またはバッチ番号の指標を提供する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記バイオマーカーは、ビオチン、ＨＡＭＡ、ＲＦ、異好、または抗ＳＡｖである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５０】
前記バイオマーカーは、細菌の感染の指標である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５１】
前記バイオマーカーは、細菌の捕捉部位である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５２】
前記粒子複合体の除去または単離には、捕捉部位−バイオマーカー複合体の切断、溶出、または選択的放出が含まれる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５３】
前記捕捉部位には、診断試験システムにおける測定のためのシグナル検出分子が含まれる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記サンプルは、組み合わせステップａ）の前に、干渉物質を除去または枯渇させるために、（ｉ）前記サンプルを、前記バイオマーカーに対する特異性がない捕捉部位を含む粒子と組み合わせて、混合物を提供すること、（ｉｉ）前記混合物を混合して、前記干渉物質との粒子複合体を提供すること、および（ｉｉｉ）前記粒子複合体を除去、または完全に除去して、枯渇させた溶液を提供すること、を含む前処理をされる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５５】
複数種の粒子、磁石、チューブ、および取扱説明書を含むキット。
【請求項５６】
患者のウロコルチンＩＩＩペプチド、ウロモジュリンペプチド、オロソムコイド１ペプチド、カリクレイン１ペプチド、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、高感度Ｃ反応性タンパク質、またはこれらの組み合わせを検出する方法であって、
複数種の粒子により、ウロコルチンＩＩＩペプチド、ウロモジュリンペプチド、オロソムコイド１ペプチド、カリクレイン１ペプチド、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、高感度Ｃ反応性タンパク質、またはこれらの組み合わせが、ヒト患者からのサンプル中に存在するか否かを検出すること、およびウロコルチンＩＩＩペプチド、ウロモジュリンペプチド、オロソムコイド１ペプチド、カリクレイン１ペプチド、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、高感度Ｃ反応性タンパク質、またはこれらの組み合わせと、前記複数種の粒子との間の結合を、前記サンプル中で検出すること、
を含む、方法。
【請求項５７】
患者の閉塞性睡眠時無呼吸の診断を補助する方法であって、
ヒト患者からのサンプルを複数種の粒子と接触させることにより、ウロコルチンＩＩＩペプチド、ウロモジュリンペプチド、オロソムコイド１ペプチド、カリクレイン１ペプチド、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、高感度Ｃ反応性タンパク質、またはこれらの組み合わせが、前記サンプル中に存在するか否かを検出すること、およびウロコルチンＩＩＩペプチド、ウロモジュリンペプチド、オロソムコイド１ペプチド、カリクレイン１ペプチド、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、高感度Ｃ反応性タンパク質、またはこれらの組み合わせと、前記複数種の粒子との間の結合を、前記サンプル中で検出すること、ならびに、
前記サンプル中にウロコルチンＩＩＩペプチド、ウロモジュリンペプチド、オロソムコイド１ペプチド、カリクレイン１ペプチド、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、高感度Ｃ反応性タンパク質の存在が検出された場合に、閉塞性睡眠時無呼吸の患者として前記患者を選択すること、
を含む、方法。
【請求項５８】
前記ヒトは約９歳から約２歳未満である、請求項５６または５７に記載の方法。
【請求項５９】
ウロコルチンＩＩＩペプチド、ウロモジュリンペプチド、オロソムコイド１ペプチド、カリクレイン１ペプチド、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、高感度Ｃ反応性タンパク質からなる群の２種以上の存在または不存在を同時に検出することを含む、請求項５６または５７に記載の方法。
【国際調査報告】
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