(57)【要約】  試料における微生物生存率を測定するための組成物、方法、システム、および／またはキットが本明細書に提供される。本開示のある特定の実施形態は、抗菌薬の最小発育阻止濃度を測定するため、および抗菌薬に対する微生物の感受性を測定するための組成物、方法、システム、および／またはキットを含む検出試験に関する。本開示のある特定の実施形態は、試料における微生物の増殖を評価するための組成物、方法、システム、および／またはキットを含む検出試験に関する。
2021533828.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料における微生物の増殖を評価する方法であって、
ａ）微生物を含む試料を用意する工程、
ｂ）微生物を含む試料を、微生物を含む試料の１つまたは複数の部分に分離する工程、
ｃ）試料からの微生物を封入する微小液滴の１つまたは複数の集団を形成する工程、ここで、微小液滴の１つまたは複数の集団が、試料を１つまたは複数の部分に分離する前または後に形成される、
ｄ）微小液滴の１つまたは複数の集団を形成する前または後のいずれかに、試料の１つまたは複数の部分を抗菌薬と接触させる工程、ここで、試料の１つまたは複数の部分の各々が、異なる濃度の抗菌薬と接触される、および
ｅ）微小液滴内に封入された微生物の微生物生存率を測定する工程
を含み、それにより微生物の抗菌薬に対する感受性を決定する、方法。
【請求項２】
前記微生物生存率を測定する工程が、第１の時点において測定された、試料の第１の部分からの微小液滴の第１の集団由来の微小液滴の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値を取得すること、および第２の時点において測定された、試料の第１の部分からの微小液滴の第２の集団由来の微小液滴の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値を取得することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１の時点において測定された微小液滴の複数の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値の平均が、第２の時点において測定された微小液滴の複数の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値の平均と比較される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記微生物生存率を測定する工程が、第１および第２の時点において測定された微小液滴の複数のサブセットに関して、第１の時点において測定された微小液滴の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値を、第２の時点において測定された微小液滴の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値と比較することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
第１および第２の時点において取得された微生物生存率の測定値が微小液滴の別々のサブセットに割り当てられない、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
第１の集団由来の微小液滴の１つまたは複数の別々のサブセットが第２の集団に存在せず、第２の集団由来の微小液滴の１つまたは複数の別々のサブセットが第１の集団に存在しない、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
測定する工程が、追加の時点において測定された、試料の第１の部分からの微小液滴の追加の集団における微小液滴の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値を取得することをさらに含む、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
微小液滴の集団が、微生物生存率を測定する前に、０時間、０．１時間、０．２時間、０．５時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１５時間、１８時間、２１時間、または２４のうちのいずれか１つまたは複数の期間インキュベートされる、請求項２〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
微小液滴が、試料の１つまたは複数の部分を抗菌薬と接触させて１秒、３０秒、１分、１５分、３０分、１時間、または２時間以内に形成される、請求項２〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記微生物生存率を測定する工程が、第１の時点において測定された、試料の第１の部分からの微小液滴の第１の集団における微小液滴の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値を取得すること、および第２の時点において測定された、試料の第１の部分からの微小液滴の第２の集団における微小液滴の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値を取得することをさらに含み、第１および第２の時点において取得された測定値を微小液滴の別々のサブセットに割り当てることをさらに含み、第１の集団における微小液滴の別々のサブセットの少なくとも一部が、第１の時点において微小液滴の別々のサブセットに関して取得された微生物生存率の測定値が第２の時点において取得された微小液滴のその同じ別々のサブセットに関して取得された微生物生存率の測定値と比較することができるような、第２の集団における微小液滴の同じ別々のサブセットである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記微生物生存率を測定する工程が、第１の時点において微小液滴の別々のサブセットに関して取得された微生物生存率の測定値を、第２の時点において取得された微小液滴のその同じ別々のサブセットに関して取得された微生物生存率の測定値と比較することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
第１の集団における微小液滴の少なくとも１つの別々のサブセットが第２の集団に存在せず、第２の集団における微小液滴の少なくとも１つの別々のサブセットが第１の集団に存在しない、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
測定する工程が、追加の時点において測定された、微小液滴の追加の集団における微小液滴の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値を取得することをさらに含む、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
微小液滴の集団が、微生物生存率を測定する前に、０時間、０．１時間、０．２時間、０．５時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１５時間、１８時間、２１時間、または２４時間のうちのいずれか１つまたは複数の期間インキュベートされる、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
微小液滴が、試料の１つまたは複数の部分を抗菌薬と接触させて１秒、３０秒、１分、１５分、３０分、１時間、または２時間以内に形成される、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
微生物生存率を測定する工程が、第１の時点において測定された、試料の第１の部分からの微小液滴の第１の集団における微小液滴の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値を取得すること、および第２の時点において測定された、試料の第１の部分からの微小液滴の第２の集団における微小液滴の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値を取得することを含み、微生物生存率の測定値が、微生物生存率の指標が予め設定した閾値を超過するか否かである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
第１の時点において測定された微小液滴の複数の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値の複合値が、第２の時点において測定された微小液滴の複数の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値の複合値と比較される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
微生物生存率の測定値の複合値が、閾値を超過する、ある時点において測定された微小液滴の複数の別々のサブセットの百分率である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記微生物生存率を測定する工程が、第１および第２の時点において測定された微小液滴の複数のサブセットに関して、第１の時点において取得された微小液滴の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値を、第２の時点において取得された微小液滴の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値と比較することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
第１および第２の時点において取得された微生物生存率の測定値が微小液滴の別々のサブセットに割り当てられない、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記微生物生存率を測定する工程が、微小液滴の複数のサブセットに関して、第１の時点において微小液滴の別々のサブセットに関して取得された微生物生存率の測定値を、第２の時点において取得された微小液滴のその同じ別々のサブセットに関して取得された微生物生存率の測定値と比較することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
第１の集団由来の微小液滴の１つまたは複数の別々のサブセットが第２の集団に存在せず、第２の集団由来の微小液滴の１つまたは複数の別々のサブセットが第１の集団に存在しない、請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
予め設定した閾値が、指標が微生物生存率の決定された測定値に達する場合に超過される、請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
微生物生存率の指標が予め設定した閾値を超過する場合、測定する工程が、追加の時点において測定された、微小液滴の追加の集団における微小液滴の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値を取得することをさらに含む、請求項１６〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
微小液滴の集団が、微生物生存率を測定する前に、０時間、０．１時間、０．２時間、０．５時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１５時間、１８時間、２１時間、または２４時間のうちのいずれか１つまたは複数の期間インキュベートされる、請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
微小液滴が、試料の１つまたは複数の部分を抗菌薬と接触させて１秒、３０秒、１分、１５分、３０分、１時間、または２時間以内に形成される、請求項１６〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
微小液滴の１つまたは複数の集団を形成する前に、抗菌薬と接触した試料の１つまたは複数の部分を異なる時間の期間インキュベートする工程をさらに含み、それによって微小液滴が異なる時点における試料の１つまたは複数の部分のそれぞれから形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
試料の１つまたは複数の部分が、微生物生存率をモニタリングするのに十分な期間インキュベートされる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
試料の１つまたは複数の部分が、微生物のクオラムセンシングを可能にするのに十分な期間インキュベートされる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
試料の１つまたは複数の部分が、微小液滴を形成する前に、０時間、０．１時間、０．２時間、０．５時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１５時間、１８時間、２１時間、または２４時間のうちのいずれか１つまたは複数の期間にわたりインキュベートされる、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
微小生物の抗生物質に対する感受性が、異なる濃度の抗生物質の存在下において微小生物の生存率を測定することによって決定される、請求項２〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
液滴における微生物生存率を測定する工程が、溶菌後のｑＰＣＲまたは蛍光ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を含む遺伝子分析による細菌濃度の決定を含む、微小生物の生存率に影響を及ぼす技術を使用して実施される、請求項２〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
液滴における微生物生存率を測定する工程が、溶液濁度、ｐＨ、または代謝的に活性な色素の蛍光の測定を含む、微小生物の生存率に影響を及ぼさない技術を使用して実施される、請求項２〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記微生物生存率を測定する工程が、第１の時点において測定された、試料の第１の部分からの微小液滴の第１の集団由来の微小液滴の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値を取得すること、および第２の時点において測定された、試料の第１の部分からの微小液滴の第２の集団由来の微小液滴の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値を取得することを含む、請求項２７〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
微生物生存率の測定値が、微生物生存率の指標が予め設定した閾値を超過するか否かである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
微小液滴の個々のサブセットが１つまたは複数の微小液滴を含む、請求項２〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
試料の１つまたは複数の部分が培養培地において培養される、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
培養培地が微小液滴の形成前または微小液滴の形成中に添加される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
微生物を封入する微小液滴の１つまたは複数の集団をインデックス付きアレイに固定化する工程をさらに含む、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
微生物を封入する微小液滴の１つまたは複数の集団をハイスループット微小液滴リーダーに通す工程をさらに含む、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
抗菌薬の異なる濃度が、０．００２ｍｇ／Ｌ〜５００ｍｇ／Ｌの範囲の所望の臨床範囲に及ぶ、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
微生物生存率を測定する工程が、標識の蛍光シグナルを測定することを含む、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
蛍光が蛍光リーダーを使用して測定される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
微生物生存率が、生存率指標色素の吸光度または電気化学特性を測定することによって決定される、請求項４２または４３に記載の方法。
【請求項４５】
生存率指標色素が、レサズリン、ホルマザン、またはそれらの類似体もしくは塩を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
微生物生存率が、生存率指標の吸光度もしくは電気化学特性を測定すること、またはｐＨもしくは濁度を測定することによって決定される、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
微小液滴１つ当たりの微生物の平均数が２未満である、請求項１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
微小液滴１つ当たりの微生物の平均数が１未満である、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
微生物が細菌である、請求項１〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
細菌が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｐ．エルギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｓ．エピデルミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、Ｅ．フェカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）、Ｋ．ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｅ．クロアカ（Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ）、Ａ．バウマニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、Ｓ．マルセッセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、またはＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
微生物が細菌であり、抗菌薬が抗生物質である、請求項１〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
抗生物質が、アミノクマリン、アミノグリコシド、アンサマイシン、カルバセフェム、カルバペネム、セファロスポリン、グリコペプチド、リンコサミド、リポペプチド、マクロライド、モノバクタム、ニトロフラン、ペニシリン、ポリペプチド、キノロン、ストレプトグラミン、スルホンアミド、もしくはテトラサイクリン、またはそれらの組合せである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
抗生物質がアンピシリンである、請求項５１または５２に記載の方法。
【請求項５４】
微小液滴が油相および界面活性剤相を含む、請求項１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
微小液滴が、マイクロ流体チャネル、撹拌、電気力、または膜濾過によって配合される、請求項１〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
微小液滴の１つまたは複数の集団が、安定な油中水型エマルションとして配合される、請求項１〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
微生物の抗菌薬に対する感受性を決定することが、微小液滴が形成されない場合よりも短時間で達成される、請求項１〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
微生物の抗菌薬に対する感受性を決定することが、３〜２４時間、３〜２０時間、３〜１５時間、３〜８時間、５〜２０時間、５〜１５時間、または５〜８時間の範囲内の時間で達成される、請求項１〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
微生物の抗菌薬に対する感受性を決定することが、２４時間以下、１５時間以下、１２時間以下、１０時間以下、８時間以下、５時間以下、３時間以下で達成される、請求項１〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
試料が、全血、陽性血液培養、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、喀痰、唾液、骨髄、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液（前立腺液を含む）、カウパー液もしくは射精前液、女性射精液、汗、糞便、毛、涙、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心嚢液、リンパ、粥状液、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌物、粘膜分泌物、便中水分、膵液、副鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液もしくは他の洗浄液、胞胚腔、臍帯血、または母体循環である、請求項１〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、２０１８年８月１７日に提出された米国仮出願第６２／７１９，２９０号の利益を主張する。
本開示は全体として、試料における微小生物の抗生物質に対する感受性を決定するための組成物、方法、システム、および／またはキットを含む検出試験に関する。本開示のある特定の実施形態は、抗菌薬の最小発育阻止濃度を測定するための組成物、方法、システム、および／またはキットを含む検出試験に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物感染症は、毎年数百万の人々が罹患し、１年当たり数百万の死亡者を伴う。病原体種の厳密な診断は多くの場合、最新技術の臨床微生物検査室においてでさえ、取得するのに数日を必要とする。さらに、初期に不正確な療法を受ける患者は、疾患の経過の早期から最適な療法を用いて処置される患者よりも低い生存割合を呈する。微生物感染症を有する患者における病原体診断の迅速性は、予後に重要な影響を与え得る。血液において微生物感染症を検出するための現在の方法は、病院のまたは商業的な臨床微生物検査室において血液を培養することである。液体培養は、流体における、ある種の成長する生物の存在の検出を４〜３０時間以内に可能とすることができる。このアッセイは定量的ではなく、病原体の種類およびそれらの特異的な抗生物質感度に関する知見を有しない場合、せいぜい最適以下である広範囲スペクトルの抗生物質のみがこの時に投与され得る。病原体の具体的な種類を同定するため、および感度検査を実行して、様々な潜在的な抗生物質療法に対するそれらの応答を決定するためには、液体培地において成長する病原体は次いで他の成長培地（例えば寒天プレート）に移さなければならない。完全な診断および感度検査のための総時間は一般的に３〜７日であり、臨床症状に基づく経験的な抗生物質処置は、抗生物質感度の結果が取得されるかなり前、多くの場合は血液培養が患者から最初に採取された１〜３時間以内に開始される。
【０００３】
微生物感染症を有する多くの患者は、感染の始めの数時間以内に急速な衰弱を呈する。したがって、迅速かつ信頼性の高い診断および処置方法は効果的な患者ケアに不可欠である。残念なことに、現在の抗菌薬感受性検査技法は全体として、培養ごとの微小生物の事前の単離（例えば約１２〜約４８時間）と、それに続くさらに約６〜約２４時間を必要とする処理とを必要とする。例えば、感染症の種類に関する確定診断は従来、血液培養の播種、１６〜２４時間のインキュベーション、原因微小生物を固形培地にプレーティングすること、別のインキュベーション期間、および１〜２日後の最終的な同定を伴う微生物学的分析を必要とする。即時の積極的な処置でさえ、一部の患者は多臓器機能障害症候群を生じ、最終的に死亡する。
正確な処置が投与される前に喪失される１時間ごとに、患者転帰の決定的な差が生じ得る。したがって、医師が、感染症が存在するか否か、および存在する場合、どの抗菌薬が処置に効果的であり得るかを迅速に決定することが重要である。
【発明の概要】
【０００４】
試料における微生物生存率を測定するための組成物、方法、システム、および／またはキットが本明細書に記載される。
本明細書に提供される一部の実施形態は、試料における微生物の増殖を評価する方法に関する。一部の実施形態では、方法は、微生物を含む試料を用意する工程、微生物を含む試料を、微生物を含む試料の１つまたは複数の部分に分離する工程、試料からの微生物を封入する微小液滴の１つまたは複数の集団を形成する工程、微小液滴の１つまたは複数の集団を形成する前または後のいずれかに、試料の１つまたは複数の部分を抗菌薬と接触させる工程、および微小液滴内に封入された微生物の微生物生存率を測定する工程を含み、それにより微生物の抗菌薬に対する感受性を決定する。一部の実施形態では、微小液滴の１つまたは複数の集団は、試料を１つまたは複数の部分に分離する前または後に形成される。一部の実施形態では、試料の１つまたは複数の部分のそれぞれは、異なる濃度の抗菌薬と接触する。一部の実施形態では、微生物生存率を測定する工程は、第１の時点において測定された、試料の第１の部分からの微小液滴の第１の集団由来の微小液滴の別々の（個々の、discrete）サブセットからの微生物生存率の測定値（measure）を取得すること、および第２の時点において測定された、試料の第１の部分からの微小液滴の第２の集団由来の微小液滴の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値を取得することを含む。一部の実施形態では、微生物生存率を測定する工程は、第１および第２の時点において測定された微小液滴の複数のサブセットに関して、第１の時点において測定された微小液滴の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値を、第２の時点において測定された微小液滴の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値と比較することをさらに含む。一部の実施形態では、測定する工程は、追加の時点において測定された、試料の第１の部分からの微小液滴の追加の集団における微小液滴の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値を取得することをさらに含む。一部の実施形態では、第１の時点において測定された微小液滴の複数の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値の平均は、第２の時点において測定された微小液滴の複数の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値の平均と比較される。一部の実施形態では、第１および第２の時点において取得された微生物生存率の測定値は微小液滴の別々のサブセットに割り当てられない。一部の実施形態では、第１の集団由来の微小液滴の１つまたは複数の別々のサブセットは第２の集団に存在せず、第２の集団由来の微小液滴の１つまたは複数の別々のサブセットは第１の集団に存在しない。一部の実施形態では、微小液滴の集団は、微生物生存率を測定する前に、０時間、０．１時間、０．２時間、０．５時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１５時間、１８時間、２１時間、または２４のうちのいずれか１つまたは複数の期間インキュベートされる。一部の実施形態では、微小液滴は、試料の１つまたは複数の部分を抗菌薬と接触させて１秒、３０秒、１分、１５分、３０分、１時間、または２時間以内に形成される。一部の実施形態では、微生物生存率を測定する工程は、第１の時点において測定された、試料の第１の部分からの微小液滴の第１の集団における微小液滴の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値を取得すること、および第２の時点において測定された、試料の第１の部分からの微小液滴の第２の集団における微小液滴の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値を取得することをさらに含む。一部の実施形態では、測定する工程は、第１および第２の時点において取得された測定値を微小液滴の別々のサブセットに割り当てることをさらに含み、第１の集団における微小液滴の別々のサブセットの少なくとも一部は、第１の時点において微小液滴の別々のサブセットに関して取得された微生物生存率の測定値が第２の時点において取得された微小液滴のその同じ別々のサブセットに関して取得された微生物生存率の測定値と比較することができるような、第２の集団における微小液滴の同じ別々のサブセットである。
【０００５】
一部の実施形態では、微生物生存率を測定する工程は、第１の時点において微小液滴の別々のサブセットに関して取得された微生物生存率の測定値を、第２の時点において取得された微小液滴のその同じ別々のサブセットに関して取得された微生物生存率の測定値と比較することをさらに含む。一部の実施形態では、第１の集団における微小液滴の少なくとも１つの別々のサブセットは第２の集団に存在せず、第２の集団における微小液滴の少なくとも１つの別々のサブセットは第１の集団に存在しない。一部の実施形態では、測定する工程は、追加の時点において測定された、微小液滴の追加の集団における微小液滴の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値を取得することをさらに含む。一部の実施形態では、微生物生存率を測定する工程は、第１の時点において測定された、試料の第１の部分からの微小液滴の第１の集団における微小液滴の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値を取得すること、および第２の時点において測定された、試料の第１の部分からの微小液滴の第２の集団における微小液滴の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値を取得することを含む。一部の実施形態では、微生物生存率の測定値は、微生物生存率の指標が予め設定した閾値を超過するか否かである。一部の実施形態では、微生物生存率の測定値の複合値は、閾値を超過する、ある時点において測定された微小液滴の複数の別々のサブセットの百分率である。一部の実施形態では、予め設定した閾値は、指標が微生物生存率の決定された測定値に達する場合に超過される。一部の実施形態では、第１の時点において測定された微小液滴の複数の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値の複合値は、第２の時点において測定された微小液滴の複数の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値の複合値と比較される。一部の実施形態では、微生物生存率を測定する工程は、第１および第２の時点において測定された微小液滴の複数のサブセットに関して、第１の時点において取得された微小液滴の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値を、第２の時点において取得された微小液滴の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値と比較することをさらに含む。一部の実施形態では、第１および第２の時点において取得された微生物生存率の測定値は微小液滴の別々のサブセットに割り当てられない。一部の実施形態では、微生物生存率を測定する工程は、微小液滴の複数のサブセットに関して、第１の時点において微小液滴の別々のサブセットに関して取得された微生物生存率の測定値を、第２の時点において取得された微小液滴のその同じ別々のサブセットに関して取得された微生物生存率の測定値と比較することをさらに含む。一部の実施形態では、第１の集団由来の微小液滴の１つまたは複数の別々のサブセットは第２の集団に存在せず、第２の集団由来の微小液滴の１つまたは複数の別々のサブセットは第１の集団に存在しない。一部の実施形態では、微生物生存率の指標が予め設定した閾値を超過する場合、測定する工程は、追加の時点において測定された、微小液滴の追加の集団における微小液滴の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値を取得することをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、微小液滴の１つまたは複数の集団を形成する前に、抗菌薬と接触した試料の１つまたは複数の部分を異なる時間の期間インキュベートする工程をさらに含み、それによって微小液滴が異なる時点における試料の１つまたは複数の部分のそれぞれから形成される。一部の実施形態では、試料の１つまたは複数の部分は、微生物生存率をモニタリングするのに十分な期間インキュベートされる。一部の実施形態では、試料の１つまたは複数の部分は、微生物のクオラムセンシングを可能にするのに十分な期間インキュベートされる。一部の実施形態では、試料の１つまたは複数の部分は、微小液滴を形成する前に、０時間、０．１時間、０．２時間、０．５時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１５時間、１８時間、２１時間、または２４時間のうちのいずれか１つまたは複数の期間にわたりインキュベートされる。一部の実施形態では、微小生物の抗生物質に対する感受性は、異なる濃度の抗生物質の存在下において微小生物の生存率を測定することによって決定される。
【０００６】
一部の実施形態では、液滴における微生物生存率を測定する工程は、溶菌後のｑＰＣＲまたは蛍光ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を含む遺伝子分析による細菌濃度の決定を含む、微小生物の生存率に影響を及ぼす技術を使用して実施される。一部の実施形態では、液滴における微生物生存率を測定する工程は、溶液濁度、ｐＨ、または代謝的に活性な色素の蛍光の測定を含む、微小生物の生存率に影響を及ぼさない技術を使用して実施される。一部の実施形態では、微生物生存率を測定する工程は、第１の時点において測定された、試料の第１の部分からの微小液滴の第１の集団由来の微小液滴の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値を取得すること、および第２の時点において測定された、試料の第１の部分からの微小液滴の第２の集団由来の微小液滴の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値を取得することを含む。一部の実施形態では、微生物生存率の測定値は、微生物生存率の指標が予め設定した閾値を超過するか否かである。一部の実施形態では、微小液滴の個々のサブセットは１つまたは複数の微小液滴を含む。一部の実施形態では、試料の１つまたは複数の部分は培養培地において培養される。一部の実施形態では、培養培地は微小液滴の形成前または微小液滴の形成中に添加される。一部の実施形態では、方法は、微生物を封入する微小液滴の１つまたは複数の集団をインデックス付きアレイ（ｉｎｄｅｘｅｄ  ａｒｒａｙ）に固定化する工程をさらに含む。一部の実施形態では、方法は、微生物を封入する微小液滴の１つまたは複数の集団をハイスループット微小液滴リーダーに通す工程をさらに含む。一部の実施形態では、抗菌薬の異なる濃度は、０．００２ｍｇ／Ｌ〜５００ｍｇ／Ｌの範囲の所望の臨床範囲に及ぶ。一部の実施形態では、微生物生存率を測定する工程は、標識の蛍光シグナルを測定することを含む。一部の実施形態では、蛍光は蛍光リーダーを使用して測定される。一部の実施形態では、微生物生存率は、生存率指標色素の吸光度または電気化学特性を測定することによって決定される。一部の実施形態では、生存率指標色素は、レサズリン、ホルマザン、またはそれらの類似体（アナログ）もしくは塩を含む。一部の実施形態では、微生物生存率は、生存率指標の吸光度もしくは電気化学特性を測定すること、またはｐＨもしくは濁度を測定することによって決定される。一部の実施形態では、微小液滴１つ当たりの微生物の平均数は２未満である。一部の実施形態では、微小液滴１つ当たりの微生物の平均数は１未満である。一部の実施形態では、微生物は細菌である。一部の実施形態では、細菌は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｐ．エルギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｓ．エピデルミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、Ｅ．フェカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）、Ｋ．ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｅ．クロアカ（Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ）、Ａ．バウマニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、Ｓ．マルセッセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、またはＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）である。一部の実施形態では、微生物は細菌であり、抗菌薬は抗生物質である。一部の実施形���では、抗生物質は、アミノクマリン、アミノグリコシド、アンサマイシン、カルバセフェム、カルバペネム、セファロスポリン、グリコペプチド、リンコサミド、リポペプチド、マクロライド、モノバクタム、ニトロフラン、ペニシリン、ポリペプチド、キノロン、ストレプトグラミン、スルホンアミド、もしくはテトラサイクリン、またはそれらの組合せである。一部の実施形態では、抗生物質はアンピシリンである。一部の実施形態では、微小液滴は油相および界面活性剤相を含む。一部の実施形態では、微小液滴は、マイクロ流体チャネル、撹拌、電気力、または膜濾過によって配合される。一部の実施形態では、微小液滴の１つまたは複数の集団は、安定な油中水型エマルションとして配合される。一部の実施形態では、微生物の抗菌薬に対する感受性を決定することは、微小液滴が形成されない場合よりも短時間で達成される。一部の実施形態では、微生物の抗菌薬に対する感受性を決定することは、３〜２４時間、３〜２０時間、３〜１５時間、３〜８時間、５〜２０時間、５〜１５時間、または５〜８時間の範囲内の時間で達成される。一部の実施形態では、微生物の抗菌薬に対する感受性を決定することは、２４時間以下、１５時間以下、１２時間以下、１０時間以下、８時間以下、５時間以下、３時間以下で達成される。一部の実施形態では、試料は、全血、陽性血液培養、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、喀痰、唾液、骨髄、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液（前立腺液を含む）、カウパー液もしくは射精前液、女性射精液、汗、糞便、毛、涙、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心嚢液、リンパ、粥状液、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌物、粘膜分泌物、便中水分、膵液、副鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液もしくは他の洗浄液、胞胚腔、臍帯血、または母体循環である。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】微小液滴の別々のサブセットに関する微生物生存率を評価する方法のある実施形態の概略図を示す。
【図２】図１の方法の微生物生存率の測定のある実施形態のグラフ図であって、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）超の濃度の抗生物質を含む微小液滴（破線）と比較した、抗生物質を含まないかまたはＭＩＣ未満の濃度の抗生物質を含む微小液滴（実線）を含む、微小液滴蛍光強度を時間の関数として示す、グラフ図を示す。
【図３Ａ】蛍光生存率指標を使用した微小液滴抗生物質感受性検査のある実施形態の結果を示す図である。図３Ａは、抗生物質を含まない試料（条件Ａ）およびＭＩＣの２倍の抗生物質を含む試料（条件Ｂ）における、１時間、２時間、および３時間時点の微小液滴の蛍光強度の変化を示す。図３Ｂは、図３Ａの条件下における微小液滴の顕微鏡写真を示す。図３Ｃは、抗生物質を有しない大腸菌を含有する微小液滴の顕微鏡写真を示す。図３Ｄは、大腸菌およびＭＩＣの２倍の抗生物質を含有する微小液滴の顕微鏡写真を示す。
【図３Ｂ】蛍光生存率指標を使用した微小液滴抗生物質感受性検査のある実施形態の結果を示す図である。図３Ａは、抗生物質を含まない試料（条件Ａ）およびＭＩＣの２倍の抗生物質を含む試料（条件Ｂ）における、１時間、２時間、および３時間時点の微小液滴の蛍光強度の変化を示す。図３Ｂは、図３Ａの条件下における微小液滴の顕微鏡写真を示す。図３Ｃは、抗生物質を有しない大腸菌を含有する微小液滴の顕微鏡写真を示す。図３Ｄは、大腸菌およびＭＩＣの２倍の抗生物質を含有する微小液滴の顕微鏡写真を示す。
【図３Ｃ】蛍光生存率指標を使用した微小液滴抗生物質感受性検査のある実施形態の結果を示す図である。図３Ａは、抗生物質を含まない試料（条件Ａ）およびＭＩＣの２倍の抗生物質を含む試料（条件Ｂ）における、１時間、２時間、および３時間時点の微小液滴の蛍光強度の変化を示す。図３Ｂは、図３Ａの条件下における微小液滴の顕微鏡写真を示す。図３Ｃは、抗生物質を有しない大腸菌を含有する微小液滴の顕微鏡写真を示す。図３Ｄは、大腸菌およびＭＩＣの２倍の抗生物質を含有する微小液滴の顕微鏡写真を示す。
【図３Ｄ】蛍光生存率指標を使用した微小液滴抗生物質感受性検査のある実施形態の結果を示す図である。図３Ａは、抗生物質を含まない試料（条件Ａ）およびＭＩＣの２倍の抗生物質を含む試料（条件Ｂ）における、１時間、２時間、および３時間時点の微小液滴の蛍光強度の変化を示す。図３Ｂは、図３Ａの条件下における微小液滴の顕微鏡写真を示す。図３Ｃは、抗生物質を有しない大腸菌を含有する微小液滴の顕微鏡写真を示す。図３Ｄは、大腸菌およびＭＩＣの２倍の抗生物質を含有する微小液滴の顕微鏡写真を示す。
【図４】複数の微小液滴に関する微生物生存率を評価する方法のある実施形態の概略図を示す。
【図５】微小液滴に関する微生物生存率を、所定の閾値を超過する微小液滴における微生物生存率を測定することに基づいて評価する方法のある実施形態の概略図を示す。
【図６】図５の方法の微生物生存率の測定のある実施形態のグラフ図であって、ＭＩＣ超の濃度の抗生物質を含む微小液滴（破線）と比較した、抗生物質を含まないかまたはＭＩＣ未満の濃度の抗生物質を含む微小液滴（実線）を含む、閾値を超過する微小液滴における微生物生存率を時間の関数として示す、グラフ図を示す。
【図７】試料を抗生物質中でインキュベートし、各測定点において微小液滴を調製することによって微生物生存率を評価する方法のある実施形態の概略図を示す。
【図８】図７に概説された方法の微生物生存率の測定のある実施形態のグラフ図であって、ＭＩＣ超の濃度の抗生物質を含む微小液滴（破線）と比較した、抗生物質を含まないかまたはＭＩＣ未満の濃度の抗生物質を含む微小液滴（実線）を含む、閾値を超過する微小液滴における微生物生存率を時間の関数として示す、グラフ図を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
高まっている抗菌薬耐性および縮小している抗菌薬パイプラインは、ますます多くの数の患者が抗菌薬耐性細菌に感染するという世界的な公衆衛生危機を創出している。感染症の発症の数時間以内に与えることができる適切な抗菌薬療法は、患者転帰に良い影響をもたらすことができる。しかしながら、感染症を同定するための現在の実践は、過剰な時間を必要とする。したがって、より迅速な抗菌薬感受性検査、好ましくは血液試料が採取された後数時間以内に特異的な抗菌薬感受性を同定することができる抗菌薬感受性検査に対する強力な必要性が存在する。したがって、この種の迅速な試験は、医師が最適以下または完全に非効果的な抗菌薬で開始するのではなく、初めから最適な薬物療法を始めることを可能とし、それゆえ臨床応答性を大きく向上するだろう。現在の抗菌薬感受性検査（ＡＳＴ）実践を改善する主な取組みは、結果を得るまでの標的時間（ｔａｒｇｅｔ  ＴＴＲ：ｔａｒｇｅｔ  ｔｉｍｅ  ｔｏ  ｒｅｓｕｌｔ）を短縮することを目的としている。
【０００９】
微小液滴ベース微生物同定（ＩＤ）および抗菌薬感受性検査（ＡＳＴ）では、臨床検体は小体積の微小液滴に分割され、そのそれぞれは少数の生物、典型的には微小液滴１つ当たり１〜５匹の生物を含有する。この手法は、各占有された微小液滴内において生物の高く効果的な濃度を可能にし、また、各微生物が独立した微小液滴に隔離されるため、迅速な結果を得るまでの時間、および複数微生物感染を伴う検体の検体直接検査を可能にし得る。
微小液滴ベースＩＤ／ＡＳＴ技術の課題は、多数の微小液滴が生成されること、およびこれらの微小液滴の多くがいかなる生物細胞も含有しない場合があることである。したがって、多数の微小液滴が、臨床的に関連のある結果を取得するために評価されなければならない。
【００１０】
したがって、本明細書に提供される一部の実施形態は、微生物を有する試料を用意する工程、試料からの微生物を微小液滴内に封入する工程であって、試料が、微小液滴を形成する前または後に部分に分けられる工程、微小液滴の形成前または後のいずれかに、試料の各部分を異なる濃度の抗菌薬と接触させる工程、および微小液滴内の微生物の微生物生存率を測定する工程によって微生物の抗菌薬に対する感受性を決定する方法に関する。本明細書に記載されるこの方法は、本明細書にさらに詳細に記載される実施形態、方法、システム、および形態に応じて改変、修正、または変更されてもよい。
本明細書に記載される実施形態、方法、および形態の一部は、例えば、単離されたコロニーを取得するための検体培養の必要性がない検体直接法；占有された微小液滴における高い開始濃度をもたらす、微小液滴における試料の分割に起因する増加した細菌濃度；および別々の増殖事象が検出され得る迅速な成長検出を含む１つまたは複数の利点を含む。
【００１１】
理論に拘束されることを望むものではないが、本明細書に記載される抗菌薬感受性検査法の実施形態は、異なる病原体によって引き起こされる試料の微生物感染症（例えば、菌血症、真菌血症、ウイルス血症）を迅速に検出し、原因物質（例えば微生物病原体）の抗菌薬感度および耐性プロファイルを提供することができる。
さらに、本明細書に開示される微小液滴ベースＡＳＴの実施形態の、既存のＡＳＴ法に対する利点としては、検体直接（低力価）および／または複数微生物（混合感染）試料を取り扱う可能性が挙げられる。これらの利点のうちのいずれも、主として臨床検体の非常に小体積の微小液滴への分割のために生じ、微小液滴のそれぞれは、１匹以下の生物を含有するように調整することができ、個々に扱うことができる。本明細書に記載される微小液滴を使用するＡＳＴの実施形態は、微小液滴を使用して、臨床検体から直接（固形培地において培養することに関する必要性を伴わずに）実施され、結果を得るまでの時間（ＴＴＲ）の有意な節約をもたらし得る。細菌を小体積に分割する実施形態はまた、生物の高く効果的な濃度を可能にし、より速い反応動態を生じ、それによりＴＴＲをさらに改善する。
【００１２】
微小液滴を使用してＡＳＴを実施する実施形態の追加の利点は、「遅発性耐性」細菌表現型を検査することに関する改善したＴＴＲである。これらの細菌薬組合せは、細菌を耐性であると正確に同定するために必要とされる非常に長いＴＴＲのために、現在のＡＳＴ技術と新興のＡＳＴ技術との両方に関して特に挑戦的である。
したがって、本明細書に提供される一部の実施形態は、抗菌薬の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を決定するための新規な組成物、方法、システム、および／またはキットに関する。一部の実施形態では、抗菌薬ＭＩＣを決定するための方法は、微生物を有する試料をある濃度の抗菌薬に曝露する工程、微生物を微小液滴内に封入する工程、および微小液滴内の微生物の微生物生存率を測定する工程によって実施される。
【００１３】
本明細書に記載されるように、方法の変更は、微小液滴の調製、微小液滴における微生物生存率の測定、および／または微生物生存率を測定するためのステップに基づいて実施され得る。方法の一部の変更は、本明細書に形態として記載される。追加の変更および／または形態が実施されてもよいこと、ならびに一部の実施形態では、任意の所与の形態の態様が異なる形態からの態様と交換されても、置き換えられても、置換されてもよいことは当業者によって理解されるだろう。さらに、一部の実施形態では、任意の所与の形態の様々な態様は、除去されても、追加されても、改められても、そうでなければ変更されてもよい。
【００１４】
＜形態１−微小液滴の集団における微生物生存率の測定＞
本明細書に提供される一部の実施形態は、微生物生存率を決定するための第１の形態に関する。微生物生存率を決定するための第１の形態は、図１に概略的に示される。本明細書に記載されるように、微生物生存率を決定するための第１の形態は、微生物を中に有する試料を用意する工程、試料をいくつかの部分に分ける工程、部分が形成される前または後のいずれかに、試料からの微生物を封入する微小液滴を調製する工程（図１は最初に部分を形成することを示す）、微小液滴を調製する前または後のいずれかに、各部分を異なる濃度の目的の抗菌薬に接触させる工程（図１は微小液滴を形成する前に抗生物質を添加することを示す）、および微生物生存率のシグナルを測定することによって微生物の生存率を測定する工程を含む。微生物生存率のシグナルを測定することは、微小液滴の集団由来の微小液滴の別々のサブセットまたは微小液滴の複数の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値を取得することによって実施され得る。次いで、第１の時点における微小液滴の別々のサブセットからの測定に関する結果は、微小液滴がこの第１の時点において得られた試料の部分に関する結果を生成するために組み合わせることができる。このプロセスは、その部分における微生物生存率を経時的に決定するために追加の時点において反復され、それにより微生物の所与の濃度の抗菌薬に対する感受性を決定することができる。典型的には、各時点において測定される微小液滴の集団が、微小液滴が得られる試料の部分の代表例である限り、第１およびその後の時点において全く同じ微小液滴の集団を測定する必要はない。次いで、異なる濃度の抗菌薬に曝露された様々な部分からの結果は、微生物の抗菌薬に対する感受性を決定するために使用することができる。抗菌薬感受性の決定は、測定が行われた試料の部分に存在する濃度の抗菌薬と接触した場合に微生物の成長が経時的に生じないことを示す、微生物生存率の測定値が経時的に増加しないことを決定する際に行うことができる。反対に、微生物生存率の測定値の経時的な増加は、測定が行われた試料の部分に存在する濃度の抗菌薬における微生物の成長を示す。最小発育阻止濃度は、異なる濃度の抗菌薬に曝露された試料のいくつかの部分からの抗菌薬感受性および／または微生物成長の結果を利用して決定することができる。
【００１５】
一部の実施形態では、各部分から微小液滴を調製する工程は、各部分における微小液滴の集団を生じる。一部の実施形態では、微小液滴のサイズは、目的の微生物を封入するのに十分なサイズ、例えば、約２μｍ〜約５００μｍ、２μｍ〜２００μｍ、２μｍ〜５０μｍ、２μｍ〜１０μｍ、１０μｍ〜２００μｍ、１０μｍ〜５０μｍ、５０μｍ〜２００μｍ、または５０μｍ〜１００μｍの範囲内のサイズである。微小液滴のサイズおよびそれを調製するための方法は、本明細書においてさらに詳細に記載される。例えば、一部の実施形態では、試料の第１の部分は第１の濃度の抗菌薬と接触し、微小液滴の１つまたは複数の集団がそこから形成され；試料の第２の部分は第２の濃度の抗菌薬と接触し、微小液滴の１つまたは複数の集団がそこから形成され；各部分が、試験される異なる濃度の抗菌薬を有する所望の数の部分に関しても同様である。あるいは、微小液滴は、部分を抗菌薬と接触させる前に部分から形成されてもよい。抗菌薬の濃度は典型的には、本明細書により詳細に記載されるように、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）であるかまたはＭＩＣであると思われる抗菌薬の濃度を含む、ある範囲の抗菌薬の濃度を含むように選択される。一部の実施形態では、試料の１つまたは複数の部分は、例えば対照を目的として、いかなる抗菌薬にも曝露されない（０の抗菌薬濃度）。
【００１６】
一部の実施形態では、第１の形態は、微生物生存率のシグナルの経時的な変化を決定するために、第１の時点において測定された、試料の部分からの微小液滴の第１の集団由来の微小液滴の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値を取得すること、および第２の時点において試料の同じ部分からの微小液滴の第２の集団由来の微小液滴の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値を取得することを含む微生物生存率を測定する工程を含む。一部の実施形態では、測定値は、第１および／または第２の時点において微小液滴の複数の別々のサブセットから取得される。微小液滴のサブセットは１つまたは１つより多い微小液滴を含み、例えば、サブセットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、もしくは１００００の微小液滴、または先行する値のいずれか２つによって定義される範囲、例えば、１〜５、１〜１０、５〜１０、５〜２０、１０〜５０、１０〜１００、５０〜１００、５０〜５００、１００〜５００、１００〜１０００、５００〜１０００、５００〜５０００、１０００〜５０００、１０００〜１００００、もしくは５０００〜１００００の微小液滴を含むかまたは少なくとも含む。一部の実施形態では、微生物生存率の測定値の測定は、例えば第３の時点、第４の時点、第５の時点等の追加の時点において微小液滴の追加の別々のサブセットを測定することによって実施される場合があり、微小液滴における微生物生存率を決定するのに十分な所与の数の時点に関しても同様である。例えば、一部の実施形態では、微生物生存率の測定値は、第３の時点において、試料の同じ部分から取得された微小液滴の第３の集団から取得される。追加の時点および微小液滴の集団に関する微生物生存率の測定は、例えば、第４の時点において微小液滴の第４の集団から、第５の時点において微小液滴の第５の集団から、第６の時点において微小液滴の第６の集団から、第７の時点において微小液滴の第７の集団から、第８の時点において微小液滴の第８の集団から、第９の時点において微小液滴の第９の集団から、第１０の時点において微小液滴の第１０の集団から、またはそれよりも多く等、任意の所与のアッセイのために必要とされるように実施されてもよい。一部の実施形態では、微生物生存率の測定が時間０（例えば微生物を封入する微小液滴が形成される時間）〜時間２４時間の範囲で選択される時点。したがって、一部の実施形態では、時点は、０、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５分、または０．５、０．７５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１８、２１、もしくは２４時間、あるいは前述した値のいずれか２つによって定義される範囲内の量の時間において測定を含む。一部の実施形態では、時点は、０〜１５分、０〜１０分、０〜５分、０〜１分、５〜１５分、５〜１０分、もしくは１０〜１５分、０〜２４時間、０〜２１、０〜１８、０〜１５、０〜１２、０〜１０、０〜６、０〜５時間、０〜４時間、０〜３時間、０〜２時間、０〜１時間、０〜０．５時間、０．２５〜６時間、０．２５〜５時間、０．２５〜４時間、０．２５〜３時間、０．２５〜２時間、０．２５〜１時間、０．２５〜０．５時間、１〜６時間、１〜５時間、１〜３時間、もしくは１〜２時間、または抗菌薬感受性の決定が実現され得るまで、任意の所与の回数の測定を含む。一部の実施形態では、抗菌薬感受性は、２４、２０、１５、１０、８、５、３、もしくは１時間以下の、試料を抗菌薬と接触させてから抗菌薬感受性の決定を行うまでの時間、または微生物が試験された抗菌薬に対して感受性であるおよび／もしくは感受性でないという決定を行うのに十分な量の時間で生じる。一部の実施形態では、抗菌薬感受性は、２４時間以下、１５時間以下の、試料を抗菌薬と接触させてから抗菌薬感受性の決定を行うまでの時間で生じ、一部の実施形態ではそれは１２時間以下であり、一部の実施形態ではそれは１０時間以下であり、一部の実施形態ではそれは８時間以下であり、一部の実施形態ではそれは５時間以下であり、一部の実施形態ではそれは３時間以下であり、一部の実施形態ではそれは１時間以下である。一部の実施形態では、微生物が抗菌薬に対して感受性であるおよび／または感受性でないということに関する決定は、本明細書に記載される微小液滴感受性検査を使用して、微小液滴において形成されない場合に抗菌薬感受性を検査する場合よりも短時間で達成される。このプロセスは、試料の追加の部分に関して反復することができる。一部の実施形態では、このプロセスは、試料の第２、第３、第４、第５、またはそれ以上の部分に関して反復される。
【００１７】
生存率の測定値は、試料の所与の部分（例えば、第１、第２、第３の部分等）に関して、第１、第２、およびその後の時点において取得されると、生存率を各部分に関して経時的に決定するために比較することができる。一部の実施形態では、様々な時点のそれぞれにおける別々の測定値は、各時点における集計測定値が互いに比較することができるように集計される。例えば、一実施形態では、第１の時点において測定された微小液滴の複数の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値の平均は、第２の時点において測定された微小液滴の複数の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値の平均と比較される。一部の実施形態では、時点間の比較前にいくつかの別々のサブセットの測定からのデータを集計するのではなく、サブセットからの別々のデータ点が経時的に比較され、別々のデータ点からの経時的な比較が、比較を取得するために集計される。例えば、一実施形態では、第１の時点において測定された微小液滴の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値は、第１および第２の時点において測定された微小液滴の複数のサブセットに関して、第２の時点において測定された微小液滴の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値と比較され、複数の別々の比較は、第１の時点と第２の時点との比較を取得するために平均されてもよい。
【００１８】
一部の実施形態では、第１の時点において測定されたサブセットおよび／または第１の集団における個々の微小液滴は、第２またはその後の時点中に測定されたサブセットおよび／または第２の集団における同じ微小液滴ではない。第１の時点において測定されたサブセットおよび／または第１の集団における個々の微小液滴と、第２またはその後の時点において測定されたサブセットおよび／または集団における個々の微小液滴との間に重複が存在してもよいが、完全に同じ個々の微小液滴が各時点において測定されることは必要ではない。したがって、一部の実施形態では、第１の集団由来の微小液滴の１つまたは複数の別々のサブセットは第２の集団に存在せず、第２の集団由来の微小液滴の１つまたは複数の別々のサブセットは第１の集団に存在せず、第３、第４、第５、および任意のその後の集団および時点に関しても同様である。他の実施形態では、第１の集団由来の微小液滴の別々のサブセットが第２およびその後の集団由来の微小液滴の同じ別々のサブセットであるような、微小液滴の同じ別々のサブセットが、第１および第２の時点、ならびに任意のその後の時点において測定される。一部の実施形態では、第１、第２、および任意のその後の時点において取得された微生物生存率の測定値は、微小液滴の同じ別々のサブセットが各時点において測定されていようがいまいが、微小液滴の別々のサブセットに割り当てられない。
【００１９】
図２における実施形態に示すように、微生物生存率の測定値の測定は、蛍光強度、例えばレサズリンの蛍光強度を決定することによって経時的に行われ得る。蛍光強度の測定値は、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）未満の抗菌薬に曝露されている微小液滴かまたは抗菌薬が添加されていない微小液滴（実線）、およびＭＩＣ超の抗菌薬に曝露されている微小液滴（破線）に関して示される。実線は、抗菌薬の非存在またはＭＩＣ未満の濃度の抗菌薬の存在のために経時的に増加した微生物による成長に起因する増加した蛍光強度を示す。破線は、ＭＩＣ超の抗菌薬濃度の結果として経時的な微生物による成長がないために蛍光強度の増加がないかまたは取るに足らないことを示す。
【００２０】
図３は、形態１に記載される方法のある実施形態を使用した微生物生存率の測定の結果を例証する。図３Ａは、微小液滴内に封入された大腸菌に関する蛍光生存率指標を使用した微小液滴ＡＳＴを示す。大腸菌を封入する微小液滴は、抗生物質に曝露されなかった試料の第１の部分（条件Ａ）、またはＭＩＣの２倍の濃度の抗生物質に曝露された試料の第２の部分（条件Ｂ）から調製した。この例において使用した抗生物質はアンピシリンであった。微小液滴は、形成され、１時間（ｔ１）、２時間（ｔ２）、および３時間（ｔ３）を含む規定の時間インキュベートされた。図３Ａは、試料の２つの部分（条件ＡまたはＢ）から得られた、３つの時点（ｔ１、ｔ２、ｔ３）における微小液滴の３つの集団由来の微小液滴（この場合は単一の微小液滴）の別々のサブセットからの測定値のプロットを示す。三角形は各サブセットの平均を表し、エラーバーは平均の１つの標準偏差を示す。図３Ｂは、条件ＡおよびＢのそれぞれからの、各時点における各集団由来の代表的な微小液滴の顕微鏡写真を示す。時間１時間では、蛍光強度は条件ＡとＢとの両方における微小液滴に関して低いままであった。時間２時間および３時間では、蛍光強度は条件Ａにおける微小液滴に関して増加し、抗生物質の非存在に起因する大腸菌成長を示したが、蛍光強度は条件Ｂにおける微小液滴に関しては低いままであり、ＭＩＣの２倍のアンピシリンの存在のために大腸菌成長がないことを示した。図３Ｃは、抗生物質に曝露されておらず、抗生物質が存在しない場合に大腸菌の存在を示す微小液滴（条件Ａ）の顕微鏡写真を示す。図３Ｄは、ＭＩＣの２倍のアンピシリンに曝露された微小液滴（条件Ｂ）の顕微鏡写真を示し、大腸菌は存在しない。
【００２１】
＜形態２−微小液滴の別々のサブセットにおける経時的な微生物生存率の測定＞
本明細書に提供される一部の実施形態は、形態１および本明細書に開示される他の形態に関する、微生物生存率を決定するための第２の形態に関する。したがって、形態１を含むがこれに限定されない他の形態に関する開示は、形態２にも適用可能である。微生物生存率を決定するための形態２のある実施形態は、図４に概略的に示される。形態１に関して記載したように、微生物生存率を決定するための第２の形態は、微生物を中に有する試料を用意する工程、試料をいくつかの部分に分ける工程、部分が形成される前または後のいずれかに、試料からの微生物を封入する微小液滴を調製する工程（図４は最初に部分を形成することを示す）、微小液滴を調製する前または後のいずれかに、各部分を異なる濃度の目的の抗菌薬に接触させる工程（図４は微小液滴を形成する前に抗菌薬を添加することを示す）、ならびに第１、第２、および任意に追加の時点において微小液滴の集団由来の微小液滴の別々のサブセットにおける微生物生存率のシグナルを測定することによって微生物の生存率を測定する工程を含む。本明細書に開示されるように、時点は様々な回数および時間の範囲にわたって選択され得る。さらに、本明細書に開示されるように、時点は、微生物が抗菌薬に対して感受性であるおよび／または感受性でないという決定のための十分な時間を与えるように選択される。一部の実施形態では、微生物が抗菌薬に対して感受性であるおよび／または感受性でないということに関する決定は、本明細書に記載される微小液滴感受性検査を使用して、微小液滴において形成されない場合に抗菌薬感受性を検査する場合よりも短時間（例えば、２４時間以下、１５時間以下、１２時間以下、１０時間以下、８時間以下、５時間以下、３時間以下、１時間以下）で達成される。形態２の実施形態は、第１の時点における微小液滴（例えば単一の微小液滴）の特定の別々のサブセットからの結果が、微小液滴の集団全体にわたって、第２の時点における微小液滴（例えば単一の微小液滴）のその同じ別々のサブセットからの結果と比較することができるように、微小液滴の集団由来の微生物生存率のシグナルを微小液滴の別々のサブセットに割り当てることを含む。典型的には、異なる濃度の抗菌薬に曝露された試料の各部分に関して、測定値は、代表的な数の微小液滴が試料の各部分に関して測定されることを保証するのに十分な数の微小液滴の別々のサブセットから得られる。次いで、微小液滴の別々のサブセットそれぞれに関する経時的な結果は、微小液滴が得られた試料の部分に関する結果を生成するために組み合わせることができ、異なる濃度の抗菌薬に曝露された様々な部分からの結果は、微生物の抗菌薬に対する感受性を決定するために使用される。
【００２２】
形態２のある実施形態では、微生物を含む試料は、微生物を含む試料の１つまたは複数の部分に分離され、試料の１つまたは複数の部分は抗菌薬と接触し、試料の１つまたは複数の部分のそれぞれは異なる濃度の抗菌薬と接触する。次いで、微生物を封入する微小液滴の１つまたは複数の集団が試料の１つまたは複数の部分から形成される。次いで、微小液滴内に封入された微生物の生存率が測定される。形態２のある実施形態は、第１の時点において測定された、試料の第１の部分からの微小液滴の第１の集団における微小液滴の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値を取得すること、および第２の時点において測定された、試料の第１の部分からの微小液滴の第２の集団における微小液滴の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値を取得することを含み、第１および第２の時点において取得された測定値を微小液滴の別々のサブセットに割り当てることをさらに含み、第１の集団における微小液滴の別々のサブセットの少なくとも一部は、第１の時点において微小液滴の別々のサブセットに関して取得された微生物生存率の測定値が第２の時点において取得された微小液滴のその同じ別々のサブセットに関して取得された微生物生存率の測定値と比較することができるような、第２の集団における微小液滴の同じ別々のサブセットである。一部の実施形態は、微小液滴の少なくとも複数のサブセットに関して、第１の時点において微小液滴の別々のサブセットに関して取得された微生物生存率の測定値と、第２の時点（および任意の追加の時点）において取得された微小液滴のその同じ別々のサブセットに関して取得された微生物生存率の測定値との比較を実際に行うことを含む。本明細書で述べられるように、微小液滴のサブセットは１つまたは１つより多い微小液滴を含み、例えば、サブセットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、もしくは１００００の微小液滴、または先行する値のいずれか２つによって定義される範囲、例えば、１〜５、１〜１０、５〜１０、５〜２０、１０〜５０、１０〜１００、５０〜１００、５０〜５００、１００〜５００、１００〜１０００、５００〜１０００、５００〜５０００、１０００〜５０００、１０００〜１００００、もしくは５０００〜１００００の微小液滴を含むかまたは少なくとも含む。
【００２３】
形態１に関して本明細書で議論されたように、微小液滴の追加の集団およびそのサブセットは、追加の時点（例えば、第３、第４、第５、第６、第７等）において測定することができる。形態２の一部の実施形態に関して、第１、第２、および任意のその後の時点において取得された測定値は、微小液滴の別々のサブセットに割り当てられ、第１の集団における微小液滴の少なくとも１つまたは複数の別々のサブセットは、第１の時点において微小液滴（例えば単一の微小液滴）の別々のサブセットに関して取得された微生物生存率の測定値が第２および任意のその後の時点（例えば、第３、第４、第５、第６等）において取得された微小液滴のその同じ別々のサブセットに関して取得された微生物生存率の測定値と比較することができるような、第２および任意のその後の集団における微小液滴の同じ別々のサブセットである。一部の実施形態では、第１および第２、または任意のその後の集団における全ての微小液滴が比較を行うために利用されなければならないわけではないため、第１の集団における微小液滴の少なくとも１つの別々のサブセットは第２の集団にも任意のその後の集団にも存在せず、第２の集団または任意のその後の集団における微小液滴の少なくとも１つの別々のサブセットは第１の集団に存在しない。
【００２４】
形態２の実施形態を含むがこれらに限定される一部の実施形態では、第１の時点およびその後の時点において微小液滴の別々のサブセットを測定することは、微小液滴の別々のサブセットにインデックスを付けることを含んでもよい。インデックスを付けることは、例えば、微生物生存率の測定値を微小液滴の特定のサブセットに割り当てるため、または微小液滴の代表的な数のサブセットが試料の部分に関して測定されることを保証するために使用することができる。一部の実施形態では、微小液滴はインデックス付きアレイに置かれ、微生物生存率の測定はインデックス付きアレイにおいて実施される。インデックスを付けることは、当技術分野で公知の方法によって実施され得る。例えば、インデックスを付けることは、一部の実施形態では、光学および／または磁気レポーター（例えば、有機蛍光体、量子ドット、ＳＥＲＳタグを含む）を各試料微小液滴内に組み込むことによって実施され得る。
【００２５】
＜形態３−シグナルが閾値を超過する場合の微小液滴における微生物生存率の測定＞
本明細書に提供される一部の実施形態は、本明細書に開示される他の形態、例えば形態１および２に関する、微生物生存率を決定するための第３の形態に関する。したがって、形態１および２を含むがこれらに限定されない他の形態に関連する開示は、形態３にも適用可能である。微生物生存率を決定するための第３の形態のある実施形態は、図５に示される。形態１に関して記載したように、微生物生存率を決定するための第３の形態は、微生物を中に有する試料を用意する工程、試料をいくつかの部分に分ける工程、部分が形成される前または後のいずれかに、試料からの微生物を封入する微小液滴を調製する工程（図５は最初に部分を形成することを示す）、微小液滴を調製する前または後のいずれかに、各部分を異なる濃度の目的の抗菌薬に接触させる工程（図５は微小液滴を形成する前に抗生物質を添加することを示す）、および微生物生存率のシグナルを測定することによって微生物の生存率を測定する工程を含む。微生物生存率のシグナルを測定することは、微小液滴の集団由来の微小液滴（例えば単一の微小液滴）の１つまたは複数の別々のサブセットにおける微生物生存率を測定することによって実施され得る。形態３の実施形態は、シグナルのレベルまたは量を単に測定することと異なり、微生物生存率のシグナルが微小液滴（例えば単一の微小液滴）の別々のサブセットにおいて閾値の値を超過するか否かを測定することを含む。したがって、この意味において、微生物生存率の測定値はデジタル−閾値を超過するかまたは超過しないかのいずれか−である。このことは、閾値を超過する試料の部分における微小液滴のサブセットの量または数の変化を経時的に測定することを可能とする。その量または数が一定のままであるかまたは時間と共に増加しない場合、その部分における微生物は、生存しておらず、したがって試料のその部分における抗菌薬濃度に対して感受性である。対照的に、閾値を超過する微小液滴のサブセットの数または量が経時的に増加して飽和レベルに達する場合、これは、微生物が試料のその部分における抗菌薬の濃度において生存していることを示す。
【００２６】
一部の実施形態では、微生物生存率を測定する工程は、第１の時点において測定された、試料の第１の部分からの微小液滴の第１の集団における微小液滴の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値を取得すること、および第２の時点において測定された、試料の第１の部分からの微小液滴の第２の集団における微小液滴の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値を取得することを含み、微生物生存率の測定値は、微生物生存率の指標が予め設定した閾値を超過するか否かである。一部の実施形態では、予め設定した閾値は、微生物生存率の測定値が、微生物が生存していることを示すために決定された量を超過する場合に超過される。例えば、閾値としては、超過された場合、微生物の成長が、試験されている抗菌薬（および抗菌薬濃度）が最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）未満であることを示し得る量を超過している値が挙げられ得る。一部の実施形態では、閾値は、指標が蛍光の決定された測定値に達する場合に超過される。微小液滴のサブセットは１つまたは１つより多い微小液滴を含み、例えば、サブセットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、もしくは１００００の微小液滴、または先行する値のいずれか２つによって定義される範囲、例えば、１〜５、１〜１０、５〜１０、５〜２０、１０〜５０、１０〜１００、５０〜１００、５０〜５００、１００〜５００、１００〜１０００、５００〜１０００、５００〜５０００、１０００〜５０００、１０００〜１００００、もしくは５０００〜１００００の微小液滴を含むかまたは少なくとも含む。
【００２７】
第１および第２の時点（ならびに任意のその後の時点）において取得された複数の測定値の比較はいくつかの形態を取ることができる。例えば、微小液滴の同じサブセットは、サブセットが閾値を超過していない状態から閾値を超過している状態へ変わるかどうかを決定するために経時的にモニタリングされ得る。このことは複数のサブセットに関して行われ得る。あるいは、複数のサブセットにおける閾値を超過するサブセットの数または百分率は、その数または百分率が増加しているかどうかを決定するために経時的にモニタリングされ得る。この場合、厳密に同じサブセットが第１、第２、および任意のその後の時点においてモニタリングされる必要はないが、モニタリングされているサブセットは、部分的にまたは完全に同じサブセットであってもよい。本明細書に開示されるように、時点は様々な回数および時間の範囲にわたって選択され得る。さらに、本明細書に開示されるように、時点は、例えば微生物生存率のシグナルが閾値を超過する場合に微生物が抗菌薬に対して感受性であるおよび／または感受性でないという決定のための十分な時間を与えるように選択される。一部の実施形態では、微生物が抗菌薬に対して感受性であるおよび／または感受性でないということに関する決定は、本明細書に記載される微小液滴感受性検査を使用して、微小液滴において形成されない場合に抗菌薬感受性を検査する場合よりも短時間（例えば、２４時間以下、１５時間以下、１２時間以下、１０時間以下、８時間以下、５時間以下、３時間以下、１時間以下）で達成される。一部の実施形態では、第１の時点において測定された微小液滴の複数の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値の複合値は、第２および／またはその後の時点において測定された微小液滴の複数の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値の複合値と比較される。一部の実施形態では、微生物生存率の測定値の複合値は、閾値を超過する、ある時点において測定された微小液滴の複数の別々のサブセットの百分率である。一部の実施形態は、第１、第２、および任意のその後の時点において測定された微小液滴の複数のサブセットに関して、第１の時点において取得された微小液滴の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値を、第２の時点および任意のその後の時点において取得された微小液滴の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値と比較することを含む。一部の実施形態では、第１、第２、および任意のその後の時点において取得された微生物生存率の測定値は微小液滴の別々のサブセットに割り当てられない。一部の実施形態では、それらは割り当てられ、一部の実施形態は、微小液滴の複数のサブセットに関して、第１の時点において微小液滴の別々のサブセットに関して取得された微生物生存率の測定値を、第２および任意のその後の時点において取得された微小液滴のその同じ別々のサブセットに関して取得された微生物生存率の測定値と比較することを含む。一部の実施形態では、第１の集団由来の微小液滴の１つまたは複数の別々のサブセットは第２の集団に存在せず、第２の集団由来の微小液滴の１つまたは複数の別々のサブセットは第１の集団に存在せず、任意の追加の集団に関しても同様である。
【００２８】
本明細書で使用する場合、「割り当てる」または「割当て」という用語は、微生物生存率の測定値を微小液滴または微小液滴の別々の集団に帰属させることを指し、微生物生存率の測定値は、具体的な微小液滴または具体的な微小液滴の別々の集団に対応し得る。
【００２９】
微生物生存率の測定は、本明細書に記載されるように、例えばこれらに限定されないが、微小液滴の集団および／または微小液滴の別々のサブセットに関する微生物生存率の測定を含む形態１または形態２に関して記載されているように実施され得る。微生物生存率の測定は、微生物生存率のシグナルが予め設定した閾値を超過するまで経時的に、連続的または定期的に実施され得る。一部の実施形態では、微小液滴の別々のサブセットまたは微小液滴の集団それぞれに関して、所定の閾値を超える微生物生存率の測定値、例えば蛍光強度の測定値を呈する微小液滴のサブセットの数または百分率が決定される。例えば、所定の閾値を超過する微小液滴のサブセットの数は、ハイスループット微小液滴分析装置を用いて微小液滴（例えば、サブセット１つ当たり単一、２つ、３つ、または４つ以上の微小液滴）のサブセットを走査し、蛍光強度等の微生物生存率の測定値が予め設定した閾値を超過するおよび／またはしない別個の検出器事象を計数することによって決定することができる。評価された微小液滴のサブセットの総数と比較された、閾値の値を超過する微小液滴のサブセットの数は、微小液滴の所与の集団（例えば抗菌薬の所与の濃度）に関する微生物生存率の百分率を提供する。一部の実施形態では、微小液滴の集団に関する微生物生存率の百分率を決定することは、微小液滴の集団に関する微生物生存率を、同じ濃度の抗菌薬を有する試料の各部分に関する時間の関数として決定するために様々な時点において反復される。次いで、微生物生存率が評価され、ＭＩＣが抗菌薬濃度全体にわたる測定値から決定される。
【００３０】
測定値が閾値を超過するか否かに基づいて微生物生存率を決定することによる、形態３の方法によって微生物生存率を測定するある実施形態は、図６に示される。図６に示すように、微生物生存率は、微生物生存率の測定値と、その微生物生存率の測定値が所定の閾値を超過するか否かとを決定することによって、時間の関数として測定される。抗菌薬に曝露されていないかまたはＭＩＣ未満の抗菌薬に曝露されている微小液滴は、蛍光強度を経時的に増加する。蛍光強度のシグナルが予め設定した閾値を超過すると、微生物生存率の指示値が決定される（実線）。対照的に、閾値を超過しない任意のシグナルは、生存率が０であることを示す。例えば、ＭＩＣ超の抗菌薬に曝露されている微小液滴は、予め設定した閾値を超過せず（破線）、微生物生存率が０であるという決定が評価される。
【００３１】
＜形態４−測定時点における微小液滴の形成＞
本明細書に提供される一部の実施形態は、本明細書に開示される他の形態、例えば形態１、２、および３に関する、微生物生存率を決定するための第４の形態に関する。したがって、形態１、２、および３を含むがこれらに限定されない他の形態に関連する開示は、形態４にも適用可能である。微生物生存率を決定するための第４の形態のある実施形態は、図７に示される。形態１に関して記載したように、微生物生存率を決定するための第４の形態は、微生物を中に有する試料を用意する工程、試料をいくつかの部分に分ける工程、各部分を異なる濃度の目的の抗菌薬に曝露する工程を含む。形態４の実施形態では、微小液滴は直ちには調製されない。代わりに、異なる濃度の抗菌薬を有する試料の各部分における微生物はある時間の期間培養され、微小液滴は様々な測定時点において各部分から調製される。次いで、微生物の微生物生存率の測定値の測定は、本明細書（形態１〜３の実施形態を含むがこれらに限定されない）に記載されるように、微小液滴の集団由来の微小液滴の１つまたは複数の別々のサブセットの微生物生存率のシグナルを測定することによって実施される。したがって、形態４では、試料の部分は、様々な測定時点において形成される微小液滴を形成する前に、ある時間の期間にわたり培養される。試料の部分を培養し、様々な測定時点において微小液滴を作製することに関するいくつかの理由が存在し得る。例えば、一部の微生物は、培養における微生物の密度に応じて（例えばクオラムセンシングのために）抗菌薬に対する耐性を喪失または獲得する。これらの効果は、微生物が微小液滴環境において培養される場合、観察されないことがある。別の理由は、培養を維持し、様々な時点において必要に応じて培養から微小液滴を作製することによって、微小液滴における微生物の生存率が、微小液滴が調製された後に維持される必要がないというものである。このことは１つまたは複数の利点、例えば、微小液滴を調製するために使用される材料および方式における向上した融通性、ならびに／または微小液滴を取り扱うことに関する向上した容易性（例えば温度、酸素レベル等を維持する必要性がないこと）を有し得る。加えて、微生物の生存率が維持される必要がないため、生存率を評価するために使用される手段が成長を阻止するかまたは微生物を死滅させることを許容することができ、成長を阻止するかまたは微生物を死滅させる追加の試験が行われてもよい（例えば微生物を溶解して遺伝子分析を行うこと）。形態４では微小液滴の生存率を維持することが可能であってもよく、それゆえ様々な時間培養した後に調製された微小液滴の生存率もまた経時的に評価することができる。この点において、形態４の特徴は、微小液滴の生存率が経時的に評価される、本明細書に開示されるある特定の実施形態（例えば形態２の実施形態）の特徴と組み合わせることができる。
【００３２】
一部の実施形態では、微生物生存率を測定する方法は、微小液滴の１つまたは複数の集団を形成する前に、抗菌薬と接触した試料の１つまたは複数の部分を異なる時間の期間インキュベートする工程を含み、それによって微小液滴が異なる時点における試料の１つまたは複数の部分のそれぞれから形成される。一部の実施形態では、試料の１つまたは複数の部分は、任意の細菌密度依存性現象を生じさせるのに十分な期間インキュベートされる。一部の実施形態では、試料の１つまたは複数の部分は、微小液滴を形成する前に、０時間、０．１時間、０．２時間、０．５時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１５時間、１８時間、２０時間、または２４時間のうちのいずれか１つまたは複数の期間にわたりインキュベートされる。一部の実施形態では、微小液滴の形成後、微小液滴は、微生物生存率を決定するために測定される。一部の実施形態では、微小液滴の測定は、微小液滴内に封入された微生物が生存しているかまたは生存していないかに関係なく実施され得る。一部の実施形態では、微生物生存率を測定する工程は、第１の時点において測定された、試料の第１の部分からの微小液滴の第１の集団由来の微小液滴の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値を取得すること、および第２の時点において測定された、試料の第１の部分からの微小液滴の第２の集団由来の微小液滴の別々のサブセットからの微生物生存率の測定値を取得することを含む。一部の実施形態では、微生物生存率の測定値は、微生物生存率の指標が予め設定した閾値を超過するか否かである。微小液滴のサブセットは１つまたは１つより多い微小液滴を含み、例えば、サブセットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、もしくは１００００の微小液滴、または先行する値のいずれか２つによって定義される範囲、例えば、１〜５、１〜１０、５〜１０、５〜２０、１０〜５０、１０〜１００、５０〜１００、５０〜５００、１００〜５００、１００〜１０００、５００〜１０００、５００〜５０００、１０００〜５０００、１０００〜１００００、もしくは５０００〜１００００の微小液滴を含むかまたは少なくとも含む。形態４の実施形態において使用することができる微小液滴のサブセットにおける微生物生存率の測定値に関するさらなる詳細は、形態１、２、および３に関する開示を含むがこれらに限定される本明細書に提供される。一部の実施形態では、各時点において形成された微小液滴を使用して微生物生存率を測定する方法は、例えば、生存率に影響をもたらす検出化学を可能にする終点におけるＡＳＴ読取り、密度依存性耐性機構の決定を可能にする微小液滴生成前の試料の大量培養、および最大化した微小液滴占有率を含む利点を提供する。
【００３３】
一部の実施形態では、液滴における微生物生存率を測定する工程は、微小生物の生存率に影響を及ぼす技術を使用して実施される。微小生物の生存率に影響を及ぼす技術としては、例えば微小生物の溶解を使用する技術、例えば溶菌後のｑＰＣＲまたは蛍光ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を含み得る遺伝子分析技術による細菌濃度の決定等が挙げられ得る。一部の実施形態では、液滴における微生物生存率を測定する工程は、微小生物の生存率に影響を及ぼさない技術を使用して実施される。微小生物の生存率に影響を及ぼさない技術としては、例えば、溶液濁度、ｐＨ、または代謝的に活性な色素の蛍光の測定が挙げられ得る。
【００３４】
形態４のある実施形態は、測定された微生物生存率を蛍光強度における時間の関数として示す図８に示される。抗菌薬に曝露されていないかまたはＭＩＣ未満の抗菌薬に曝露されている微小液滴は、蛍光強度を増加する（実線）。対照的に、ＭＩＣ超の抗菌薬に曝露されている微小液滴は、予め設定した閾値を超過せず、したがって蛍光強度の増加がないことが観察される（破線）。
【００３５】
微小液滴を形成する前に抗菌薬を含む試料の部分を培養する時点は、時間０（例えば抗菌薬が試料の部分と接触する時間）〜時間２４時間の範囲で選択される。したがって、一部の実施形態では、時点は、０、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５分、または０．５、０．７５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１８、２１、もしくは２４時間、あるいは前述した値のいずれか２つによって定義される範囲内の量の時間培養することを含む。一部の実施形態では、時点は、０〜１５分、０〜１０分、０〜５分、０〜１分、５〜１５分、５〜１０分、もしくは１０〜１５分、または０〜２４時間、０〜２１、０〜１８、０〜１５、０〜１２、０〜１０、０〜６、０〜５時間、０〜４時間、０〜３時間、０〜２時間、０〜１時間、０〜０．５時間、０．２５〜６時間、０．２５〜５時間、０．２５〜４時間、０．２５〜３時間、０．２５〜２時間、０．２５〜１時間、０．２５〜０．５時間、１〜６時間、１〜５時間、１〜３時間、もしくは１〜２時間培養することを含む。所与の時間の期間の培養後、微小液滴は形成され、微生物生存率の測定値は、典型的には微小液滴を形成した後可能な限り早く決定される。微生物生存率の決定は、微生物が抗菌薬に対して感受性であるおよび／または感受性でないということを決定するために行われる。一部の実施形態では、微生物が抗菌薬に対して感受性であるおよび／または感受性でないということに関する決定は、本明細書に記載される微小液滴感受性検査を使用して、微小液滴において形成されない場合に抗菌薬感受性を検査する場合よりも短時間で達成される。
【００３６】
形態４の一部の実施形態は、各時点において微小液滴を形成し、各測定点において形成された微小液滴の各集団に関して微生物生存率が所定の閾値を超過するか否かを決定することによって、微小液滴の微生物生存率を測定する工程を含む。図７は形態４の概略図を例証する。試料は部分に分けられ、各部分は所望の範囲に及ぶ異なる濃度の抗菌薬と接触する。各部分に関して、微小液滴は各所望の測定時点において調製される。一部の実施形態では、微小液滴の別々のサブセットは、本明細書に開示される試料の部分を培養する追加の期間の後でもよい各時点において測定され、微生物生存率は、微小液滴の別々のサブセットに関して（例えば形態１）、または微小液滴の同じサブセットに関して（例えば形態２）測定される。一部の実施形態では、微生物生存率の測定値は、微生物生存率のシグナルが閾値を超過する場合に評価される（例えば形態３）。しかしながら、時間０において微小液滴を形成し、その後、その後の時点において微小液滴の微生物生存率を測定するのではなく、微小液滴は、試料の部分が、微小液滴が形成されて測定される測定時点まで抗菌薬と共にインキュベートされるように、測定時点においてのみ形成される。一部の実施形態では、測定は、例えばハイスループット微小液滴分析装置またはインデックス付きアレイを使用することを含む、本明細書に開示される方法のいずれかにおいて実施することができる。一部の実施形態では、閾値を超過する微小液滴の数または百分率は抗菌薬の各濃度に関する時間の関数として決定され、微生物生存率およびＭＩＣは測定値から評価される。
【００３７】
上に記載した形態のそれぞれにおいて、それぞれのステップは別々のプロセスとして記載されているが、これらのステップのうちの１つまたは複数はシステムにおいて実施されてもよい。したがって、例えば、プロセスのうちの１つまたは複数はマイクロ流体デバイスにおいて実施されてもよい。マイクロ流体デバイスは、プロセスを自動化するため、および／または多数の試料の同時処理を可能にするために使用されてもよい。当業者は、本開示の実践において使用することができる生体液を収集する、取り扱う、および処理するための、当技術分野における方法を十分に認識している。加えて、様々なステップのためのマイクロ流体デバイスは、組み合わせて、本明細書に記載される形態のいずれかを実行するための１つのシステムにすることができる。
【００３８】
＜微生物生存率の測定＞
記載されるように、本明細書に提供される一部の実施形態は、抗菌薬感受性検査（ＡＳＴ）のための方法に関する。本明細書に記載される方法、実施形態、システム、または形態のいずれも、微生物を微小液滴内に封入することによる微生物ＡＳＴを可能にするように、交換可能であり得るか、修正され得るか、または変更され得る。理論に拘束されることを望むものではないが、本明細書に記載される方法の実施形態、実施形態、システム、および形態は、ＭＩＣ付近における高い感度、微生物生存率の迅速な決定、および／または広い範囲の抗菌薬濃度にわたる微生物生存率の大規模決定を含む、微生物生存率を測定することに関する１つまたは複数の利点を有し得る。
【００３９】
本明細書に記載される実施形態、方法、システム、または形態のいずれにおいても、微小液滴は、異なる抗菌薬濃度において任意の時間の期間インキュベートされ得る。微生物による成長はインキュベーション期間中にモニタリングされてもよく、インキュベーション期間は、検出シグナル、例えば蛍光または微生物数の十分な差が微小液滴間に存在するようになるまで継続することができる。例えば、一部の実施形態では、インキュベーションは、約１５、３０、または４５秒、約１、２、３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０、３００、または３６０分以上であり得る。一実施形態では、インキュベーションは、２時間超、例えば、少なくとも約２時間、少なくとも約６時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２日、少なくとも約３日である。封入された微生物の増殖および／または成長速度に応じて、当業者はその後の分析、例えば細胞生存率分析に最適なインキュベーション持続時間を決定することができる。
【００４０】
本明細書に記載される実施形態、方法、システム、または形態のいずれにおいても、微生物が中に封入された微小液滴の別々のサブセットは、微小液滴内の微生物の抗菌薬に対する感受性を決定するために測定され得る。一部の実施形態では、微生物の抗菌薬に対する感受性を決定することは、微小液滴の蛍光強度を測定することによって実施される。一部の実施形態では、微生物の抗菌薬に対する感受性を決定することは、微生物のインキュベーション中または微生物のインキュベーション後に実施される。一部の実施形態では、微生物の抗菌薬に対する感受性を決定することは、微生物生存率を継続的にモニタリングすることによって連続的に、または微生物生存率を１つもしくは複数の別個の時点においてモニタリングすることによって定期的に実施される。
【００４１】
本明細書に記載される実施形態、方法、システム、または形態のいずれにおいても、試料は試料の部分に分けられ得、試料の各部分は異なる濃度の抗菌薬と接触し得る。一部の実施形態では、試料の各部分に関して、微生物生存率の測定値は、微小液滴をインデックス付きアレイに配置して調査するかまたはハイスループット微小液滴リーダーを使用するかのいずれかによって、微小液滴の別々のサブセットに関して時間の関数として測定される。測定は、例えば、初期の時点（例えば第１の時点）およびその後の時点（例えば、第２、第３、第４等）において微小液滴の別々のサブセットの蛍光強度を測定することによって行うことができる。微小液滴の別々のサブセットに関して測定された蛍光強度は、各抗菌薬濃度における細菌生存率を評価するために使用され得る。一部の実施形態では、測定は、インキュベーション中の多数の時点、例えば第１の時点および次いで第２の時点において実施される。一部の実施形態では、微小液滴（例えば単一の微小液滴）の別々のサブセットに関する微生物生存率の測定値は、時間０、１時間、２時間、３時間、またはそれ以降の時点において測定される。一部の実施形態では、測定は、時間０〜時間２４時間の時間枠内の任意の数の所望の時点において実施される。本明細書に開示されるように、時点は様々な回数および時間の範囲にわたって選択され得る。さらに、本明細書に開示されるように、時点は、例えば微生物生存率のシグナルが閾値を超過する場合に微生物が抗生物質に対して感受性であるおよび／または感受性でないという決定のための十分な時間を与えるように選択される。一部の実施形態では、微生物が抗菌薬に対して感受性であるおよび／または感受性でないということに関する決定は、本明細書に記載される微小液滴感受性検査を使用して、微小液滴において形成されない場合に抗菌薬感受性を検査する場合よりも短時間で達成される。したがって、一部の実施形態では、微生物の抗菌薬に対する感受性を決定することは、３〜２４時間、３〜２０時間、３〜１５時間、３〜８時間、５〜２０時間、５〜１５時間、もしくは５〜８時間の範囲内の時間で、または前述した値のいずれか２つによって定義される範囲内の量の時間内に達成される。一部の実施形態では、微生物の抗菌薬に対する感受性を決定することは、２４時間以下、１５時間以下、１２時間以下、１０時間以下、８時間以下、５時間以下、３時間以下で達成される）。
【００４２】
一部の実施形態では、微生物生存率の測定が時間０（例えば微生物を封入する微小液滴が形成される時間）〜時間２４時間の範囲で選択される時点。したがって、一部の実施形態では、時点は、０、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５分、または０．５、０．７５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１８、２１、もしくは２４時間、あるいは前述した値のいずれか２つによって定義される範囲内の量の時間において測定を含む。一部の実施形態では、時点は、０〜１５分、０〜１０分、０〜５分、０〜１分、５〜１５分、５〜１０分、もしくは１０〜１５分、０〜２４時間、０〜２１、０〜１８、０〜１５、０〜１２、０〜１０、０〜６、０〜５時間、０〜４時間、０〜３時間、０〜２時間、０〜１時間、０〜０．５時間、０．２５〜６時間、０．２５〜５時間、０．２５〜４時間、０．２５〜３時間、０．２５〜２時間、０．２５〜１時間、０．２５〜０．５時間、１〜６時間、１〜５時間、１〜３時間、もしくは１〜２時間、または抗菌薬感受性の決定が実現され得るまで、任意の所与の回数の測定を含む。一部の実施形態では、抗菌薬感受性は、２４、２０、１５、１０、８、５、もしくは３時間以下の、試料を抗菌薬と接触させてから抗菌薬感受性の決定を行うまでの時間、または微生物が試験された抗菌薬に対して感受性であるおよび／もしくは感受性でないという決定を行うのに十分な量の時間で生じる。
【００４３】
本明細書に記載される実施形態、方法、システム、または形態のいずれにおいても、微生物生存率の測定値は、第１の時点において、第１の濃度の抗菌薬に曝露された第１の部分からの微小液滴の別々のサブセットから取得され得、微生物生存率の測定値は、第２の時点において、第１の濃度の抗菌薬に曝露された第１の部分からの微小液滴の別々のサブセットから取得される。一部の実施形態では、第１の時点における微小液滴の別々のサブセットからの微生物生存率の平均測定値は、第２の時点において測定された微小液滴の別々のサブセットからの微生物生存率の平均測定値と比較される。微生物は、例えば、抗菌薬の存在下における成長（細菌の特定の抗菌薬に対する耐性を決定するため）、細胞死（殺菌活性を決定するため）、および／または成長の阻止（静菌活性を決定するため）に関して観察することができる。例えば、微生物成長および／または細胞死は、（ｉ）対照もしくは基準と比較される微小液滴のサブセットにおける微生物の数を計数すること、（ｉｉ）対照もしくは基準と比較される、微小液滴のサブセットにおける微生物の総量、（ｉｉｉ）対照もしくは基準と比較される、微小液滴のサブセットにおける少なくとも１つの微生物マーカーを発現する細胞の比、（ｉｖ）対照もしくは基準と比較される、微小液滴のサブセットにおける相対的な代謝産物レベル、または（ｖ）それらの任意の組合せによって評価することができる。一部の実施形態では、微生物による成長または微生物の機能的応答は、例えば顕微鏡検査またはフローサイトメトリーによってリアルタイムで決定またはモニタリングすることができる。
【００４４】
試料における微生物の生存率を決定するための、当技術分野で公知のいずれの方法も、微小液滴内に封入された微生物の生存率を、経時的に、かつ異なる濃度の抗菌薬に曝露された封入された微生物の成長と比較して決定するために使用することができる。全体として、細胞生存率は、細胞溶解もしくは膜漏出アッセイ（例えば乳酸脱水素酵素アッセイ）、ミトコンドリア活性もしくはカスパーゼアッセイ（例えばレサズリンおよびホルマザン（ＭＴＴ／ＸＴＴ）アッセイ）、活性酸素種（ＲＯＳ）産生アッセイ、機能アッセイ、またはゲノムおよびプロテオームアッセイを使用してアッセイすることができる。例示的な方法としては、これらに限定されないが、ＡＴＰ検査、ＲＯＳ検査、カルセインＡＭ、ｐＨ感受性色素、クローン原性アッセイ、エチジウムホモダイマーアッセイ、エバンスブルー、フルオレセインジアセテート加水分解／ヨウ化プロピジウム染色（ＦＤＡ／ＰＩ染色）、フローサイトメトリー、ホルマザンベースアッセイ（ＭＴＴ／ＸＴＴ）、緑色蛍光タンパク質、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、メチルバイオレット、ヨウ化プロピジウム、壊死、アポトーシス、および正常細胞を識別することができるＤＮＡ染色、レサズリン、トリパンブルー（生細胞排除色素（色素は死細胞の細胞膜のみを横断する））、７−アミノアクチノマイシンＤ、ＴＵＮＥＬアッセイ、細胞標識または染色（例えば細胞透過性色素（例えばカルボン酸ジアセテート、スクシンイミジルエステル（カルボキシ−ＤＦＦＤＡ、ＳＥ））、細胞不透過性色素、シアニン、フェナントリジン（ｐｈｅｎａｎｔｒｉｄｉｎｅ）、アクリジン、インドール、イミダゾール、核酸染色、細胞透過性反応トレーサー（例えば細胞内活性化蛍光色素であるＣＭＲＡ、ＣＭＦ２ＨＣ（４−クロロメチル−６，８−ジフルオロ−７−ヒドロキシクマリン）、ＣＭＦＤＡ（５−クロロメチルフルオレセインジアセテート）、ＣＭＴＭＲ（５−（および−６）−（（（４−クロロメチル）ベンゾイル）アミノ）テトラメチルローダミン）、ＣＭＡＣ（７−アミノ−４−クロロメチルクマリン）、ＣＭＨＣ（４−クロロメチル−７−ヒドロキシクマリン））、またはそれらの任意の組合せ）、蛍光ＤＮＡ色素（例えば、ＤＡＰＩ、ヘキスト（Ｈｅｏｃｈｓｔ）ファミリー、ＳＹＢＲファミリー、ＳＹＴＯファミリー（例えばＳＹＴＯ９）、ＳＹＴＯＸファミリー（例えばＳＹＴＯＸグリーン）、臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム、アクリジン、またはそれらの任意の組合せ）；発色性色素（例えば、エオジン、ヘマトキシリン、メチレンブルー、アズール、またはそれらの任意の組合せ）；細胞質染色（例えば、カルコフロールホワイト、過ヨウ素酸シッフ染色、またはそれらの任意の組合せ）；代謝染色（例えば、本明細書に記載される任意の代謝染色、任意のジアセテート色素（ローダミンベース色素、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎ）、またはそれらの任意の組合せを含む）、レサズリン／レゾルフィン（アラマーブルー）；ＲＯＳ染色（例えば、本明細書に記載される任意のＲＯＳ染色、ＤＣＦＤＡおよび関連ファミリー、カルセインアセトキシメチルおよび関連ファミリー）；膜染色（例えば、ボディピー、ＦＭ１〜４３、ＦＭ４〜６４、およびそれらの機能的等価物、ＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）染色、Ｄｉｌ、ＤｉＯ、ＤｉＡ）；生物学的染色（例えば、標識抗体、標識キチン結合タンパク質）、光学撮像、染色後の顕微鏡撮像、ＥＬＩＳＡ、質量分光分析（例えば、ペプチド、タンパク質、グリコペプチド、リポペプチド、炭水化物、および／または代謝産物の）、メタボロミクスフィンガープリント（ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ  ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ）の修正、ＲＮＡまたはタンパク質内容物の分解等が挙げられる。一部の実施形態では、微生物の成長または抗菌薬に対する機能的応答の検出は、固相、マイクロ流体、または微小液滴ベースアッセイを使用して行うことができる。一部の実施形態では、微生物の成長または抗菌薬に対する機能的応答の検出は、質量分析計の使用を含むことができる。一部の実施形態では、微生物の成長または抗菌薬に対する機能的応答の検出は、少なくとも１種の代謝産物、または代謝プロファイルの検出を含むことができる。一部の実施形態では、微生物の成長または抗菌薬に対する機能的応答の検出は、転写変化の検出を含むことができる。一部の実施形態では、微小液滴における微生物生存率は、微小液滴における微生物の撮像を実施して、増殖データと形態データとの両方を収集することによって決定してもよい。一部の実施形態では、本明細書に開示される分析の方法は、ＭＩＣを決定するために微生物計数データに適用されてもよい。一部の実施形態では、微生物生存率の測定値の測定は、微小液滴の別々のサブセットを、インデックス付きアレイに、または高速走査装置を使用することによって、分布させることを含む。
【００４５】
本明細書に記載される実施形態、方法、システム、または形態のいずれにおいても、微生物生存率の測定値の測定は、微小液滴における蛍光色素を測定することによって実施され得る。一部の実施形態では、蛍光色素は生存率指標色素である。一部の実施形態では、蛍光色素はレサズリンである。レサズリンは、細菌増殖の結果としてレゾルフィンに還元される。レゾルフィンはレサズリンと比較して高い蛍光量子収率を有し、細菌が微小液滴内において成長するにつれ増加する蛍光強度をもたらす。一部の実施形態では、微生物生存率の測定値は微小液滴蛍光の測定値から評価され得、ＭＩＣはそこから決定され得る。一部の実施形態では、ＭＩＣ決定に関するアルゴリズムが開発および使用される。
【００４６】
＜微小液滴＞
本明細書に提供され、微生物生存率を測定するための本明細書に記載される形態のいずれかにおいて調製される微小液滴は、マイクロ流体デバイスまたは微小液滴生成のための他のデバイスを使用して製造され得る。一部の実施形態では、微小液滴は、目的の微生物を封入するのに十分なサイズである。例えば、微小液滴は、２μｍ〜約５００μｍ、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、もしくは５００μｍ等の直径、または前述した値のいずれか２つによって定義される範囲内の直径のサイズの範囲であり得る。一部の実施形態では、微小液滴は、２μｍ〜５００μｍ、２μｍ〜５０μｍ、２μｍ〜１０μｍ、１０μｍ〜２００μｍ、１０μｍ〜５０μｍ、５０μｍ〜２００μｍ、または５０μｍ〜１００μｍの範囲である。微小液滴のサイズは、微小液滴の調製の形態または具体的な所望のサイズ範囲に基づいていてもよい。当業者は、微小液滴サイズが、具体的な目的の微生物または使用される特定のアッセイに適合するようにサイズの点で修正することができることを理解するだろう。一部の実施形態では、微小液滴は、ピコリットルの範囲の体積、例えば、０．００１、０．０１、０．１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは１０００ｐｌ、または前述した値のいずれか２つによって定義される範囲内の体積を有する。一部の実施形態では、微小液滴は、０．００１ｐｌ〜１０００ｐｌ、０．００１ｐｌ〜１００ｐｌ、１００ｐｌ〜１０００ｐｌ、１００ｐｌ〜５００ｐｌ、または５００ｐｌ〜１０００ｐｌの体積を有する。
【００４７】
本明細書に記載される実施形態、方法、システム、または形態のいずれにおいても、微小液滴は、試料を抗菌薬と接触させた後に形成され得る。一部の実施形態では、微小液滴は、試料を抗生物質と接触させた後、１、２、３、４、５、１０、１５、３０、４５、もしくは６０秒以内、または１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、もしくは６０分以内、または１、２、３、４、５、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、もしくは２４時間以内、あるいは前述した値のいずれか２つによって定義される時間枠内に形成される。一部の実施形態では、微小液滴は、試料の１つまたは複数の部分を抗菌薬と接触させて１秒、３０秒、１分、１５分、３０分、１時間、または２時間以内に形成される。
【００４８】
本明細書に記載される実施形態、方法、システム、または形態のいずれにおいても、微小液滴は、目的の微生物を含有する試料を、界面活性剤を含有する連続疎水性油相に分散することによって作製された安定な油中水型エマルションであり得る。界面活性剤の例としては、これらに限定されないが、スルホネート、アルキルサルフェート、ポリアルコキシル化ソルビタンのモノエステル、ポリエステルポリオール、脂肪族アルコールエステル、芳香族アルコールエステル、トール油脂肪酸ジエタノールアミド、ポリオキシエチレン（５）ソルビタンモノオレエート、ポリアクリル酸のアンモニウム塩、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸／アクリル酸コポリマーのアンモニウム塩、アルキルスルホネート、アルキルアリールスルホネート、α−オレフィンスルホネート、ジフェニルエーテルスルホネート、ソルビタンモノオレエート、α−スルホ脂肪酸メチルエステルが挙げられ得る。界面活性剤の組合せもまた使用され得る。
【００４９】
微小液滴生産の他の方法としては、例えば、膜乳化、外力、例えば機械的剪断（インペラ駆動微小液滴生成装置）、または電気的力、例えば誘電泳動調節微小液滴生成装置が挙げられ得る。
【００５０】
本明細書に記載される実施形態、方法、システム、または形態のいずれにおいても、微小液滴サイズ、界面活性剤、および油は、微小液滴に対する液滴、または微小液滴に対する油からの分子（例えば、アッセイ試薬、色素、抗菌薬、栄養素、代謝産物）の拡散を抑制または排除するように最適化され得る。一部の実施形態では、微小液滴サイズ、界面活性剤、および油は、油相から微小液滴へのガス拡散を可能にするかまたは増強するように最適化される。一部の実施形態では、微小液滴サイズ、界面活性剤、および油は、微小液滴安定性を改善し、望ましくない微小液滴合一または融合を抑制するように最適化される。一部の実施形態では、微小液滴組成物は、臨床検体マトリックスにおいて生じるＡＳＴ反応を容易にするように最適化される。
【００５１】
本明細書に記載される実施形態、方法、システム、または形態のいずれにおいても、微小液滴の生産は、微生物を含有する試料の存在下において実施され得る。一部の実施形態では、微生物の存在下における微小液滴の生産は、単一微生物の微小液滴内への封入をもたらす。微小液滴内における微生物の占有率および分布は、試料における微生物の濃度を調整することによって変更することができる。所定の濃度の抗菌薬および生存率指標色素もまた、微小液滴が形成される点において微小液滴に組み込むことも、マイクロインジェクションまたは微小液滴合一等の手法を使用してより後の時点において各微小液滴に添加することもできる。次いで、これらの微小液滴は、バイアルにおいて収集され、適切な細菌成長条件においてインキュベートされ、一定の間隔でモニタリングされ得る。
【００５２】
微小液滴を使用してＡＳＴを実施するための本明細書に開示される方法は、任意の実施形態、または目的の微小液滴特性を経時的に測定することができる器具に適用することができる。これらの方法は、微小液滴を生成および調査するために使用される実施形態に依存しないが、ある特定の微小液滴特質から恩恵を受ける場合がある。これらの特質の一部は、微小液滴のサイズ／体積、ＡＳＴの持続時間にわたる微小液滴の安定性、ならびに細菌増殖を支持する油系および水系の組成物である。微小液滴の蛍光強度をモニタリングするために使用することができるシステムとしては、（ａ）微小液滴の配置およびそれらのその後の蛍光読出しのためのインデックス付きアレイ、または（ｂ）微小液滴のハイスループット調査を可能にする器具が挙げられる。
【００５３】
本明細書に記載される実施形態、方法、システム、または形態のいずれにおいても、試料は部分に分けられ得、各部分は異なる濃度の抗菌薬に曝露され得る。一部の実施形態では、試料における微生物は、最初に微小液滴内に封入され、次いで抗菌薬に曝露される。一部の実施形態では、微生物は、抗菌薬への曝露と同時に微小液滴内に封入される。したがって、微生物を含有する試料は、微小液滴内への封入前、封入中、または封入後に抗菌薬に曝露され得る。限定されないが、１つまたは複数の部分における微生物は、例えば組合せ療法の有効性を決定するために、２、３、または４種以上の抗菌剤を含む少なくとも１種の抗菌剤と共にインキュベートされ得る。少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０以上）の部分は、対照として役立てるために、いかなる抗菌剤の添加もせずにインキュベートされ得る。あるいはまたは加えて、少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０以上）の部分は、陽性対照として役立てるために、広域スペクトルの抗菌剤と共にインキュベートされ得る。
【００５４】
本明細書に記載される実施形態、方法、システム、または形態のいずれにおいても、異なる濃度の抗菌薬を含む試料の各部分は、微小液滴生成装置に導入され得、微小液滴は、単一微生物、または微小液滴１つ当たり平均１匹未満の微生物を封入するために生成される。一部の実施形態では、微小液滴は、抗菌薬への曝露と同時に生成される。一部の実施形態では、微小液滴は、時間０において、所望の臨床範囲に及ぶ異なる濃度の添加された抗菌薬を含む試料から生成される。一部の実施形態では、微小液滴は、微生物生存率を決定するために測定される。微小液滴を測定することは、微小液滴のサブセットを測定することを含み得る。微小液滴のサブセットは１つまたは１つより多い微小液滴を含み、例えば、サブセットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、もしくは１００００の微小液滴、または先行する値のいずれか２つによって定義される範囲、例えば、１〜５、１〜１０、５〜１０、５〜２０、１０〜５０、１０〜１００、５０〜１００、５０〜５００、１００〜５００、１００〜１０００、５００〜１０００、５００〜５０００、１０００〜５０００、１０００〜１００００、もしくは５０００〜１００００の微小液滴を含むかまたは少なくとも含む。
【００５５】
微生物を様々な濃度の抗菌薬と共に封入する微小液滴は、微生物による成長に好適な任意の条件下においてインキュベートすることができる。当業者は、微生物による成長（例えば細菌による成長）に最適な培養条件、例えばそれらを好適な温度および雰囲気において、例えば適当なレベルの酸素および／または二酸化炭素の存在下または非存在下において約２０℃〜約４５℃でインキュベートすることを容易に決定することができる。一部の実施形態では、インキュベーションは約２５℃〜約４０℃、または約３０℃〜約４２℃、または約３５℃〜約４０℃である。一実施形態では、インキュベーションは約３７℃である。
【００５６】
＜抗菌剤＞
本明細書に記載される実施形態、方法、システム、または形態のいずれも、試料を抗菌剤と接触させる工程を含み得る。本明細書に記載される実施形態または形態のいずれにおいても、抗菌剤は微小液滴に組み込まれ得るか、または抗菌剤は微小液滴に曝露することができる。一部の実施形態では、抗菌剤は、デバイスにおいて規定の濃度および／または量で乾燥され、微生物を含有する試料の部分によって再構成された後に液滴を形成する。乾燥された抗菌薬の量は、試料の部分によって再構成される場合、結果として生じる濃度が所望の範囲内となるように調整することができる。一部の実施形態では、抗菌剤は、微小液滴の形成前に試料に添加されるのではなく、微小液滴が調製された後に微小液滴に添加される。
【００５７】
本明細書に記載される実施形態、方法、システム、または形態のいずれにおいても、抗菌剤は、微生物（例えば、細菌、真菌、ウイルス、寄生虫、および微生物胞子）の成長を阻止し、それによりそれらの発生および微生物作用または病原性作用を防止する、天然に存在する薬剤か、半合成剤か、または完全合成剤である薬剤であり得る。抗菌剤は当業者に公知である。しかしながら、例として、抗菌剤は、有機または無機低分子；サッカリン；オリゴ糖；多糖；生体高分子、例えば、ペプチド、タンパク質、ならびにペプチドアナログおよび誘導体；ペプチド模倣体；抗体およびその抗原結合断片；核酸；核酸アナログおよび誘導体；グリコーゲンまたは他の糖；免疫原；抗原；細菌、植物、真菌、または動物細胞等の生物学的材料から作製された抽出物；動物組織；天然に存在する組成物または合成組成物；ならびにそれらの任意の組合せからなる群から選択することができる。一部の実施形態では、抗菌剤としては、抗細菌剤（または抗生物質）、抗真菌剤、抗原虫剤、抗ウイルス剤、およびそれらの混合物が挙げられる。
【００５８】
抗生物質の非限定的な例としては、例えば、アミノグリコシド（例えば、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、トブラマイシン、パロモマイシン、ストレプトマイシン、スペクチノマイシンを含む）、アンサマイシン（例えば、ゲルダナマイシン、ハービマイシン、リファキシミンを含む）、カルバセフェム（例えばロラカルベフを含む）、カルバペネム（例えば、エルタペネム、抗シュードモナス、ドリペネム、イミペネム、シラスタチン、メロペネム、ビアペネム、パニペネムを含む）、セファロスポリン（例えば、セファゾリン、セファレキシン、セファドロキシル、セファピリン、セファゼドン、セファザフル、セフラジン、セフロキサジン、セフテゾール、セファログリシン、セファセトリル、セファロニウム、セファロリジン、セファロチン、セファトリジン、セファクロル、セフォテタン、セファマイシン、セフォキシチン、セフプロジル、セフロキシム、セフロキシムアキセチル、セファマンドール、セフミノクス、セフォニシド、セフォラニド、セフォチアム、セフブペラゾン、セフゾナム、セフメタゾール、カルバセフェム、ロラカルベフ、セフィキシム、セフトリアキソン、抗シュードモナス、セフタジジム、セフォペラゾン、セフジニル、セフカペン、セフダロキシム、セフチゾキシム、セフメノキシム、セフォタキシム、セフピラミド、セフポドキシム、セフチブテン、セフジトレン（ｄｅｆｄｉｔｏｒｅｎ）、セフェタメト、セフォジジム、セフピミゾール、セフスロジン、セフテラム、セフチオレン、オキサセフェム、フロモキセフ、ラタモキセフ、セフェピム、セフォゾプラン、セフピロム、セフキノム、セフタロリンフォサミル、セフトロザン、セフトビプロール、セフチオフル、セフキノム、セフォベシンを含む）、グリコペプチド（例えば、バンコマイシン、オリタバンシン、テラバンシン、テイコプラニン、ダルババンシン、ラモプラニンを含む）、リンコサミド（例えば、クリンダマイシン、リンコマイシンを含む）、リポペプチド（例えばダプトマイシンを含む）、マクロライド（例えば、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、テリスロマイシン、スピラマイシンを含む）、モノバクタム（例えば、アズトレオナム、チゲモナム、カルモナム、ノカルジシンＡを含む）、ニトロフラン（例えば、フラゾリドン、ニトロフラントインを含む）、オキサゾリジノン（ｏｘａｚｏｌｉｄｏｎｏｎｅ）（例えば、リネゾリド、ポジゾリド、ラデゾリド、トレゾリドを含む）、ペニシリン（例えば、ペナム、β−ラクタム、ベンジルペニシリン、ベンザチンベンジルペニシリン、プロカインベンジルペニシリン、フェノキシメチルペニシリン、プロピシリン、フェネチシリン、アジドシリン、クロメトシリン、ペナメシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、オキサシリン、ナフシリン、メチシリン、アモキシシリン、アンピシリン、ピバンピシリン、ヘタシリン、バカンピシリン、メタンピシリン、タランピシリン、エピシリン、チカルシリン、カルベニシリン、カリンダシリン、テモシリン、ピペラシリン、アズロシリン、メズロシリン、メシリナム、ピブメシリナム、スルベ���シリンを含む）、ペネム（例えばファロペネムもしくはリチペネムを含む）、ポリペプチド（例えば、バシトラシン、コリスチン、ポリミキシンＢを含む）、キノロン（例えば、シプロフロキサシン、エノキサシン（ｅｎｏｃａｘｉｎ）、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ナジフロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、トロバフロキサシン、グレパフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシンを含む）、スルホンアミド（例えば、マフェニド、スルファセタミド、スルファジアジン、銀スルファジアジン、スルファジメトキシン、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、スルファニルイミド（ｓｕｌｆａｎｉｌｉｍｄｅ）、スルファサラジン、スルフィソキサゾール、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、コトリモキサゾール、スルホンアミドクリソイジンを含む）、テトラサイクリン（例えば、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリンを含む）、または、例えば、アクロソキサシン、アミフロキサシン、アミカシン、アモキシシリン（ａｍｏｘｙｃｉｌｌｉｎ）、アンピシリン、アルスフェナミン、アスポキシシリン、アジドシリン、アジスロマイシン、アズトレオナム、バロフロキサシン、ビアペネム、ブロジモプリム、カプレオマイシン、セファクロル、セファドロキシル、セファトリジン、セフカペン、セフジニル、セフェタメト、セフォキシチン、セフプロジル、セフロキサジン、セフタロリン（ｃｅｆｔａｒｏｌｉｎ）、セフタジジム、セフチブテン、セフメタゾール（ｃｅｆｔｍｅｔａｚｏｌｅ）、セフトビプロール、セフロキシム、セファレキシン（ｃｅｐｈａｌｅｘｉｎ）、セファロニウム（ｃｅｐｈａｌｏｎｉｕｍ）、セファロリジン、セファマンドール（ｃｅｐｈａｍａｎｄｏｌｅ）、セファゾリン（ｃｅｐｈａｚｏｌｉｎ）、セフラジン、クロラムフェニコール、クロルキナルドール、クロルテトラサイクリン、シクラシリン、シノキサシン、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、クラブラン酸、クリンダマイシン、クロファジミン、クロファジミン、クロキサシリン、コリスチン、サイクロセリン、ダルホプリスチン、ダノフロキサシン、ダプソン、ダプトマイシン、デメクロサイクリン、ジクロキサシリン、ジフロキサシン、ドリペネム、ドキシサイクリン、エノキサシン、エンロフロキサシン、エリスロマイシン、エタンブトール、エチオナミド、フレロキサシン、フロモキセフ、フルクロキサシリン、フルメキン、ホスホマイシン、フシジン酸、ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ）、イミペネム、イソニアジド、カナマイシン、ｌｃベンジルペニシリン、レボフロキサシン、リネゾリド、マンデル酸、メシリナム、メロペネム、メトロニダゾール、ミノサイクリン、モキサラクタム、ムピロシン、ナジフロキサシン、ナリジクス酸、ネチルマイシン（ｎｅｔｉｌｍｙｃｉｎ）、ネトロマイシン、ニフルトイノール（ｎｉｆｕｉｒｔｏｉｎｏｌ）、ニトロフラントイン、ニトロキソリン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、オキシテトラサイクリン、パニペネム、ペフロキサシン���フェノキシメチルペニシリン、ピペミド酸、ピロミド酸、ピバンピシリン、ピブメシリナム、プラテンシマイシン、プルリフロキサシン、ピラジナミド、キヌプリスチン、リファブチン、リファンピシン、リファペンチン、ルフロキサシン、スパルフロキサシン、ストレプトマイシン、スルバクタム、スルファベンズアミド、スルファシチン、スルファメトピラジン、スルファセタミド（ｓｕｌｐｈａｃｅｔａｍｉｄｅ）、スルファジアジン（ｓｕｌｐｈａｄｉａｚｉｎｅ）、スルファジミジン、スルファメチゾール（ｓｕｌｐｈａｍｅｔｈｉｚｏｌｅ）、スルファメトキサゾール（ｓｕｌｐｈａｍｅｔｈｏｘａｚｏｌｅ）、スルファニルアミド、スルファソミジン、スルファチアゾール、テイコプラニン、テイクソバクチン、テマフロキサシン（ｔｅｍａｆｉｏｘａｃｉｎ）、テトラサイクリン、テトロキソプリム、チアンフェニコール、チゲサイクリン（ｔｉｇｅｃｙｃｌｉｎ）、チニダゾール、トブラマイシン、トスフロキサシン、トリメトプリム、もしくはバンコマイシン、およびそれらの薬学的に許容される塩またはエステルが挙げられる。
【００５９】
例示的な抗真菌剤としては、これらに限定されないが、５−フルシトシン、アミノカンジン、アムホテリシンＢ、アニデュラファンギン、ビホナゾール、ブトコナゾール、カスポファンギン、クロルダントイン、クロルフェネシン、シクロピロクスオラミン、クロトリマゾール、エベルコナゾール、エコナゾール、フルコナゾール、フルトリマゾール、イサブコナゾール、イソコナゾール、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ミカファンギン、ミコナゾール、ニフロキシム、ポサコナゾール、ラブコナゾール、チオコナゾール、テルコナゾール、ウンデセン酸、およびそれらの薬学的に許容される塩またはエステルが挙げられる。
【００６０】
例示的な抗原虫剤としては、これらに限定されないが、アセタルゾール、アザニダゾール、クロロキン、メトロニダゾール、ニフラテル、ニモラゾール、オミダゾール、プロペニダゾール、セクニダゾール、シネフンギン、テノニトロゾール、テミダゾール、チニダゾール、およびそれらの薬学的に許容される塩またはエステルが挙げられる。
例示的な抗ウイルス剤としては、これらに限定されないが、アシクロビル、ブリブジン、シドフォビル、クルクミン、デスシクロビル、１−ドコサノール、エドクスジン、ｇＱファムシクロビル（Ｆａｍｅｙｃｌｏｖｉｒ）、フィアシタビン、イバシタビン、イミキモド、ラミブジン、ペンシクロビル、バラシクロビル、バルガンシクロビル、およびそれらの薬学的に許容される塩またはエステルが挙げられる。
【００６１】
本明細書に記載される実施形態、方法、システム、または形態のいずれにおいても、抗菌剤は、アモキシシリン／クラブラネート、アミカシン、アンピシリン、アズトレオナム、セフタジジム（ｃｅｆｔｒａｚｉｄｉｍｅ）、セファロチン、クロラムフェニコール、シプロフロキサシン、クリンダマイシン、セフトリアキソン、セフォタキシム、セフロキシム、エリスロマイシン、セフェピム、ゲンタマイシン、イミペネム、レボフロキサシン、リネゾリド、メロペネム、ミノサイクリン、ニトロフラントイン、オキサシリン、ペニシリン、ピペラシリン、アンピシリン／スルバクタム、トリメトプリム／スルファメトキサゾールもしくはコトリモキサゾール、テトラサイクリン、トブラマイシン、バンコマイシン、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択され得る。
【００６２】
本明細書に記載される実施形態、方法、システム、または形態のいずれにおいても、新たに開発された抗菌剤は、新たに開発された抗菌剤の有効性を決定するため、または微生物の新たに開発された抗菌剤に対する感受性の決定のために、微小液滴に組み込まれ得るか、または微小液滴に曝露され得る。
【００６３】
本明細書に記載される実施形態、方法、システム、または形態のいずれにおいても、本明細書に提供されるＡＳＴにおける抗菌剤の濃度は、感受性範囲を決定するために様々な濃度において提供され得る。一部の実施形態では、抗菌薬の濃度は、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を決定するために様々な濃度において提供される。本明細書に提供される広い範囲の抗菌薬は、様々な濃度で提供され、様々な有効性を有し得る。したがって、抗菌薬の濃度は、選択される抗菌薬に応じて変更することができる。任意の所与の抗菌薬のＭＩＣは、抗菌薬感受性検査に有用であり得る任意の所与の抗菌薬の範囲を含め、当業者に公知である。抗菌薬の濃度は、本明細書により詳細に記載されるように、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）であるかまたはＭＩＣであると思われる抗菌薬の濃度を含む、ある範囲の抗菌薬の濃度を含むように選択される。一部の他の実施形態では、抗菌薬の濃度範囲は、臨床的または生理的に関連のある濃度範囲を網羅するが、ＭＩＣの決定を可能にし得る濃度を含まなくてもよい。一部の実施形態では、試料の１つまたは複数の部分は、例えば対照を目的として、いかなる抗菌薬にも曝露されない（０の抗菌薬濃度）。したがって、例えば、微小液滴が抗菌薬に曝露される場合（または抗菌薬が微小液滴の形成時に微小液滴に組み込まれる場合）、抗菌薬の濃度は、約０．００１μｇ／ｍｌ〜約５０００μｇ／ｍｌ、例えば０．００１、０．０１、０．１、１、１０、１００、１０００、もしくは５０００μｇ／ｍｌ、または前述した値のいずれかによって定義される量以内の範囲であり得る。一部の実施形態では、抗菌薬濃度は、０．００１μｇ／ｍｌ〜５０００μｇ／ｍｌ、０．００１μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌ、０．００１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、０．００１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ〜５０００μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ〜５０００μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌ、または１０００μｇ／ｍｌ〜５０００μｇ／ｍｌである。一部の実施形態では、抗菌薬濃度は、ＭＩＣを決定するための段階希釈である。段階希釈は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、１０００、もしくは１００００倍希釈の量の希釈、または前述した値のいずれかによって定義される範囲内の希釈であり得る。一部の実施形態では、希釈は、１〜１００００倍、１〜１０００倍、１〜１００倍、１〜１０倍、１０〜１００００倍、１０〜１０００倍、１０〜１００倍、１００〜１００００倍、または１００〜１０００倍の量である。一部の実施形態では、抗菌薬の濃度は０であり（例えば抗菌薬は存在せず）、それにより、あらゆる抗菌薬の非存在下における、正常な微生物による成長を示す対照を提供する。
【００６４】
一部の実施形態では、微生物を封入する微小液滴の試料は、微小液滴の１つまたは複数の部分に分けられ、第１の部分は第１の濃度の抗菌薬に曝露され得、第２の部分は第２の濃度の抗菌薬に曝露され得、第３の部分は第３の濃度の抗菌薬に曝露され得、所望の数の抗菌薬濃度に曝露される所望の数の部分に関しても同様である。したがって、例えば、微小液滴の試料において、微小液滴の第１の部分に曝露される抗菌薬の第１の濃度は０．００１μｇ／ｍｌであり得、微小液滴の第２の部分に曝露される抗菌薬の第２の濃度は０．００５μｇ／ｍｌであり得、微小液滴の第３の部分に曝露される抗菌薬の第３の濃度は０．０１μｇ／ｍｌであり得、所望の数の異なる濃度の特定の抗菌薬または複数種の抗菌薬に曝露される所望の数の部分に関しても同様である。一部の実施形態では、各部分は、抗菌薬の所望の数の希釈の代わりに抗菌薬の段階希釈に曝露され得る。濃度の範囲および微小液滴の部分の数は、例えば抗菌薬の最小発育阻止濃度を含む、ある範囲の抗菌薬の濃度を網羅するために、試験されている抗菌薬、その臨床的もしくは生理的に関連のある濃度範囲、疑われる微生物、または実行されている特定のアッセイに基づいて確認され得る。
【００６５】
＜微生物（ｍｉｃｒｏｂｅｓ）＞
本明細書に提供される実施形態は、微生物生存率を測定する工程に関する。本明細書に記載される実施形態、方法、システム、または形態のいずれにおいても、微生物は、微小液滴の形成中に微小液滴内に封入され得る。例えば、一部の実施形態では、微生物を含有する試料は、油中水型微小液滴を生成する条件において界面活性剤を含有する連続疎水性油相に分散される。一部の実施形態では、微生物を含有する試料は、処理された臨床試料である。一部の実施形態では、試料は、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、喀痰、唾液、骨髄、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液（前立腺液を含む）、カウパー液もしくは射精前液、女性射精液、汗、糞便、毛、涙、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心嚢液、リンパ、粥状液、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌物、粘膜分泌物、便中水分、膵液、副鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液もしくは他の洗浄液、胞胚腔、臍帯血、または胎児起源であっても母体起源であってもよい母体循環のうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、試料は、ヒト、１匹もしくは複数匹の伴侶動物、または１匹もしくは複数匹の商業的に重要な動物から収集される。一部の実施形態では、ヒト、１匹もしくは複数匹の伴侶動物、または１匹もしくは複数匹の商業的に重要な動物は、細菌感染症等の微生物感染症を有する。
【００６６】
本明細書に記載される実施形態、方法、システム、または形態のいずれにおいても、試料は、ヒト対象から取得され得る臨床試料であり得、目的の微生物集団を試料の１つまたは複数の成分から単離するために処理され得る。試料は、例えば、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、喀痰、唾液、骨髄、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液（前立腺液を含む）、カウパー液もしくは射精前液、女性射精液、汗、糞便、毛、涙、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心嚢液、リンパ、粥状液、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌物、粘膜分泌物、便中水分、膵液、副鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液もしくは他の洗浄液、胞胚腔、臍帯血、または胎児起源であっても母体起源であってもよい母体循環として取得され得る。
【００６７】
本明細書に記載される実施形態、方法、システム、または形態のいずれにおいても、試料は、環境源から取得される流体または検体であり得る。例えば、環境源から取得される流体または検体は、食料品、食物、家禽肉、肉、魚、飲料、乳製品、水（廃水を含む）、池、川、貯水池、水泳用プール、土壌、食品加工および／もしくは包装工場、農地、水耕栽培（水耕食品農場を含む）、医薬品製造工場、動物コロニー施設、またはそれらの任意の組合せから取得されてもそれらに由来してもよい。一部の実施形態では、試料は、細胞培養または微生物コロニーから収集されるかまたはそれらに由来する流体または検体である。
【００６８】
本明細書に記載される実施形態、方法、システム、または形態のいずれにおいても、微小液滴への微生物封入前に試料を処理することが必要であり得るかまたは所望され得る。処理が必要でない場合であっても、処理は、便宜上（例えば商業用プラットフォームに関するレジメンの一部として）行われてもよい。処理試薬は、本明細書に記載される方法での使用に適切ないかなる試薬であってもよい。試料処理ステップは、例えば１種または複数種の試薬を試料に添加することを含み得る。この処理は、血液細胞等の細胞を溶血させること、試料の希釈等を含むがこれらに限定されないいくつかの異なる目的に役立ち得る。処理試薬としては、これらに限定されないが、界面活性剤および洗浄剤、塩、細胞溶解試薬、抗凝固薬、分解酵素（例えば、プロテアーゼ、リパーゼ、ヌクレアーゼ、リパーゼ、コラゲナーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ等）、ならびに緩衝溶液等の溶媒が挙げられ得る。一部の実施形態では、処理試薬は界面活性剤または洗浄剤である。一部の実施形態では、試料は対象から直接取得された臨床試料であり、試料は、臨床試料の１つもしくは複数の成分を除去すること、および／または１種もしくは複数種の薬剤を臨床試料に添加することによって処理されている。例えば、試料は、試料内の微生物または微生物集団を試料の１つまたは複数の成分から単離するために、濾過、精製、清浄、除染、遠心分離、またはその他の方法で処理され得る。
【００６９】
本明細書に記載される実施形態、方法、システム、または形態のいずれにおいても、試料は、１つまたは複数の処理試薬を試料に添加して、試料に存在する望まない分子を分解する、および／または試料をさらなる処理のために希釈することによってさらに処理され得る。これらの処理試薬としては、これらに限定されないが、界面活性剤および洗浄剤、塩、細胞溶解試薬、抗凝固薬、分解酵素（例えば、プロテアーゼ、リパーゼ、ヌクレアーゼ、リパーゼ、コラゲナーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、ヘパリナーゼ等）、ならびに緩衝溶液等の溶媒が挙げられる。添加される処理試薬の量は、分析される特定の試料、試料分析のために必要とされる時間、検出される微生物の同一性、または分析される試料に存在する微生物の量に依存し得る。
必要ではないが、１種または複数種の試薬が添加されることになる場合、試薬は適切な濃度の混合物において（例えば溶液、すなわち「処理緩衝液」において）提示することができる。処理緩衝液の様々な成分の量は、試料、検出される微生物、試料における微生物の濃度、または分析に関する時間制限に応じて変更することができる。
【００７０】
処理緩衝液は、当業者に公知の任意の好適な緩衝溶液中で作製することができる。そのような緩衝溶液としては、これらに限定されないが、ＴＢＳ、ＰＢＳ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳプロパン、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＥＳナトリウム塩、ＭＥＳ、ＭＥＳナトリウム塩、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳナトリウム塩、塩化ナトリウム、酢酸アンモニウム溶液、ギ酸アンモニウム溶液、リン酸二水素アンモニウム溶液、酒石酸二アンモニウム溶液、ＢＩＣＩＮＥ緩衝溶液、バイカーボネート緩衝溶液、シトレート濃縮溶液、ギ酸溶液、イミダゾール緩衝溶液、ＭＥＳ溶液、酢酸マグネシウム溶液、ギ酸マグネシウム溶液、酢酸カリウム溶液、酢酸カリウム溶液、酢酸カリウム溶液、クエン酸三カリウム溶液、ギ酸カリウム溶液、リン酸二カリウム溶液、リン酸二カリウム溶液、酒石酸ナトリウムカリウム溶液、プロピオン酸溶液、ＳＴＥ緩衝溶液、ＳＴＥＴ緩衝溶液、酢酸ナトリウム溶液、ギ酸ナトリウム溶液、リン酸二水素ナトリウム溶液、リン酸一水素ナトリウム溶液、酒石酸ナトリウム二水和物溶液、ＴＮＴ緩衝溶液、ＴＲＩＳグリシン緩衝溶液、ＴＲＩＳアセテート−ＥＤＴＡ緩衝溶液、リン酸トリエチルアンモニウム溶液、酢酸トリメチルアンモニウム溶液、リン酸トリメチルアンモニウム溶液、トリス−ＥＤＴＡ緩衝溶液、ＴＲＩＺＭＡ（登録商標）塩基、およびＴＲＩＺＭＡ（登録商標）ＨＣＬが挙げられる。あるいは、処理緩衝液は水中で作製されてもよい。
【００７１】
処理試薬の添加後、試料はある時間の期間、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、３０、４５、または６０分間インキュベートすることができる。そのようなインキュベーションは、任意の適切な温度、例えば、約１６℃〜約３０℃、室温（例えば約２０℃〜約２５℃）、低温（例えば約０℃〜約１６℃）、または高温（例えば約３０℃〜約９５℃）であり得る。一部の実施形態では、試料は室温で約１５分間インキュベートされる。
【００７２】
本明細書に記載される実施形態、方法、システム、または形態のいずれにおいても、微生物は、細菌、真菌、ウイルス、寄生虫、原虫、または微生物胞子であり得る。一部の実施形態では、細菌は、以下の門：アシドバクテリア門（Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）、アクチノバクテリア門（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、アクウィフェクス門（Ａｑｕｉｆｉｃａｅ）、アルマティモナス門（Ａｒｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ）、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、カルディセリクム門（Ｃａｌｄｉｓｅｒｉｃａ）、クラミジア門（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ）、クロロビウム門（Ｃｈｌｏｒｏｂｉ）、クロロフレクサス門（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｉ）、クリシオゲネス門（Ｃｈｒｙｓｉｏｇｅｎｅｔｅｓ）、シアノバクテリア門（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、デフェリバクター門（Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ）、デイノコッカス門（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ディクチオグロムス門（Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｉ）、エルシミクロビウム門（Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉａ）、フィブロバクター門（Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｅｓ）、フィルミクテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、フソバクテリア門（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ゲンマティモナス門（Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ）、レンティスファエラ門（Ｌｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａｅ）、ニトロスピラ門（Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａｅ）、プランクトミセス門（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）、プロテオバクテリア門（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、スピロヘータ門（Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ）、シネルギステス門（Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｔｅｓ）、テネリクテス門（Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ）、テルモデスルフォバクテリア門（Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉａ）、テルモミクロビウム門（Ｔｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｂｉａ）、テルモトガ門（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｅ）、もしくはウェルコミクロビウム門（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）のうちのいずれか１つ、または微生物種のいずれかの変異体および誘導体、例えば遺伝子および／もしくは組換え技法によって作製される変異体および誘導体由来のものである。
【００７３】
本明細書に記載される実施形態、方法、システム、または形態のいずれにおいても、細菌は、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌であり得る。一部の実施形態では、細菌は、好気性細菌または嫌気性細菌である。一部の実施形態では、細菌は、独立栄養細菌または従属栄養細菌である。一部の実施形態では、細菌は、中温菌、好中菌、極限環境微生物、好酸菌、好アルカリ菌、好熱菌、好冷菌、好塩菌、または好濃菌である。
【００７４】
本明細書に記載される実施形態、方法、システム、または形態のいずれにおいても、細菌は、炭疽病菌、抗生物質耐性菌、病原菌、食中毒菌、感染菌、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）菌、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）菌、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）菌、または破傷風菌であり得る。一部の実施形態では、細菌は、マイコバクテリウム（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、エルシニア・ペスティス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、バチルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）、またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）であり得る。一部の実施形態では、細菌は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）であり得る。一部の実施形態では、細菌は、大腸菌、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）である。
【００７５】
本明細書に記載される実施形態、方法、システム、または形態のいずれにおいても、微生物は、マラリア、睡眠病、またはトキソプラズマ症等の疾患を引き起こす原虫；白癬、カンジダ症、またはヒストプラズマ症等の疾患を引き起こす真菌であり得る。「微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）」または「微生物（ｍｉｃｒｏｂｅｓ）」という用語は、非病原性微生物、例えば産業用途において使用される微生物を包含することもできる。
【００７６】
本明細書で使用する場合、節の見出しは、整理を目的としたものに過ぎず、いかなる点においても記載された主題を限定するものと解釈されるべきではない。特許、特許出願、論文、書籍、専門書、およびインターネットウェブページを含むがこれらに限定されない、本出願に引用された全ての文献および同様の資料は、それらの全体があらゆる目的のために参照によって明示的に組み込まれる。組み込まれた参考文献における用語の定義が本教示において提供される定義と異なるようである場合は、本教示において提供される定義が優先するものとする。本教示において議論される温度、濃度、時間等の前には、わずかで実質的でない逸脱が本明細書における本教示の範囲内となるような、含意された「約」が存在することが理解されるだろう。
【００７７】
本出願において、単数形の使用は、別段の記述が具体的にない限り、複数形を含む。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、限定することを意図しない。
本明細書および特許請求の範囲で使用する場合、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、内容上別段の指示が明確にない限り、複数の指示対象を含む。
【００７８】
本発明はある特定の実施形態および例の文脈において開示されたが、当業者は、本発明が、具体的に開示された実施形態を越えて、本発明の他の代替的な実施形態および／または使用、ならびにそれらの明白な修正形態および均等物にまで及ぶことを理解するだろう。加えて、本発明のいくつかの変更は詳細に示され、記載されたが、本発明の範囲内である他の修正形態は、当業者には本開示に基づいて容易に明らかとなるだろう。実施形態の具体的な特徴および態様の様々な組合せまたは部分的組合せが作られ、依然として本発明の範囲内となり得ることもまた企図される。開示された実施形態の様々な特徴および態様は、開示された発明の多様な形態または実施形態を形成するために、互いに組み合わせることも置換することもできることが理解されるべきである。したがって、開示された本明細書における発明の範囲は上に記載した特定の開示された実施形態によって限定されるべきではないということが意図される。
しかしながら、本発明の趣旨および範囲内の様々な変化および修正は当業者に明らかになると考えられるため、この詳細な説明は、本発明の好ましい実施形態を示す一方で、例証としてのみ与えられていることが理解されるべきである。
【００７９】
本明細書に提示される説明で使用される用語は、いかなる限定的または制限的な形で解釈されることも意図されていない。むしろ、用語は単に、システム、方法および関連する成分の実施形態の詳細な説明と共に利用されているに過ぎない。さらに、実施形態はいくつかの新規な特徴を含む場合があるが、そのいずれも、単独で望ましい属性を担うわけでも、記載された本明細書における発明を実践するのに不可欠であると考えられているわけでもない。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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