(57)【要約】本発明は、ヒトＢＴＮ３Ａに特異的に結合するヒト化抗体並びにがん及び感染性障害の処置におけるその使用に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の可変重鎖ポリペプチドＶＨ及び配列番号２又は配列番号３の可変軽鎖ポリペプチドＶＬを含む単離された抗ＢＴＮ３Ａ抗体。
【請求項２】
ヒトＢＴＮ３Ａポリペプチドに結合する、請求項１に記載の単離された抗ＢＴＮ３Ａ抗体。
【請求項３】
表面プラズモン共鳴により測定した場合、ヒトＢＴＮ３Ａポリペプチドに１０ｎＭ又はそれ未満のＫＤで、好ましくは５ｎＭ又はそれ未満のＫＤで結合する、請求項１又は２に記載の単離された抗ＢＴＮ３Ａ抗体。
【請求項４】
前記抗体が、脱顆粒アッセイにおいて測定した場合、ＢＴＮ３発現細胞との共培養においてＶγ９Ｖδ２−Ｔ細胞の活性化を、５μｇ／ｍｌ未満の、好ましくは１μｇ／ｍｌ又はそれ未満のＥＣ５０で誘導する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離された抗ＢＴＮ３Ａ抗体。
【請求項５】
変異体又は化学的に改変されたＩｇＧ１定常領域を含み、前記変異体又は化学的に改変されたＩｇＧ１定常領域が、野生型ＩｇＧ１アイソタイプ定常領域を有する対応する抗体と比べた場合、Ｆｃγ受容体に結合しない又は結合が減少している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離された抗ＢＴＮ３Ａ抗体。
【請求項６】
前記変異体ＩｇＧ１定常領域がＩｇＧ１三重変異体Ｌ２４７Ｆ  Ｌ２４８Ｅ及びＰ３５０Ｓである、請求項５に記載の単離された抗ＢＴＮ３Ａ抗体。
【請求項７】
配列番号４の重鎖及び配列番号６の軽鎖を含むｍＡｂ１である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離された抗ＢＴＮ３Ａ抗体。
【請求項８】
（ｉ）治療薬として又は（ｉｉ）診断薬として使用するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離された抗ＢＴＮ３Ａ抗体。
【請求項９】
任意選択で他の活性成分、例えば、抗ＰＤ１若しくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体、又はＩＬ−２若しくはＩＬ−１５などのサイトカイン又はそのペグ化バリアントと組み合わせた、がんの処置において使用するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離された抗ＢＴＮ３Ａ抗体。
【請求項１０】
抗ＢＴＮ３Ａ抗体を、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体のうちの１つ又は複数と組み合わせて含み、任意選択で、他の活性成分、例えば、抗ＰＤ１若しくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体、又はＩＬ−２若しくはＩＬ−１５などのサイトカインを含む医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗ＢＴＮ３Ａ抗体を含む凍結乾燥製剤、プレフィルド注射器又はバイアル。
【請求項１２】
宿主細胞における請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗ＢＴＮ３Ａ抗体の組換え産生のための発現ベクターであって、前記抗ＢＴＮ３Ａ抗体をコードする少なくとも１つの核酸を含む発現ベクター。
【請求項１３】
少なくとも、請求項７に定義されるｍＡｂ１の重鎖及び軽鎖をコードする核酸を含む、請求項１２に記載の発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１２又は１３に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗ＢＴＮ３Ａ抗体の産生のためのプロセスであって、（ｉ）宿主細胞による前記抗体の発現のための請求項１７に記載の宿主細胞を培養するステップ；任意選択で（ｉｉ）前記抗体を精製するステップ；（ｉｉｉ）前記抗体を回収するステップを含むプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
これより、ＢＴＮ３Ａに特異的に結合しＶγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞の細胞溶解機能を活性化する抗ＢＴＮ３Ａ活性化抗体が開示する。そのような抗体は、特に血液がん又は固形腫瘍などのがん障害を処置するのに有用である。本開示はさらに具体的には、対応する親マウス抗体７．２と比べて等価な若しくは改良された特性を有する特定のヒト化抗ＢＴＮ３Ａ活性化抗体、又はＦｃ発現停止されたヒトＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４定常領域を有するそのキメラバージョンに関する。
【背景技術】
【０００２】
白血球は、病原体から身体を防御することに関与している免疫系の細胞である。これらの細胞のうち、特にリンパ球、単球、及び樹状細胞を挙げることができる。単球は血流から他の組織に遊走して、組織常在性マクロファージ又は樹状細胞に分化する。樹状細胞は、リンパ球を活性化する抗原提示細胞（ＡＰＣ）としての役割を果たす。リンパ球のうち、Ｔ細胞はαβ  Ｔ細胞とγδ  Ｔ細胞に分割することができる。γδ  Ｔ細胞のサブセットである、Ｖγ９−Ｖδ２は、免疫防御系の重要なエフェクターである。Ｖγ９−Ｖδ２は、病原体感染した又は異常な細胞を直接溶解する。さらに、Ｖγ９−Ｖδ２は、樹状細胞（ＤＣ）成熟並びにアイソタイプスイッチ及び免疫グロブリン産生を誘導することにより免疫応答を調節する。免疫系のこの重要な細胞サブセットは、表面受容体、ケモカイン及びサイトカインにより厳密に調節されている。
【０００３】
Ｔ細胞のプライミングは、特殊化した細胞の関与及び走化性サイトカインの分泌により調節される。２シグナル仮説は、Ｔ細胞活性化は、２つの相乗的イベントの結果であると仮定している。第１は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面のプロセシングされた抗原と複合体を形成した主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）の間の相互作用である。第２のイベントは、ＣＤ２８及びＢ７分子に関連する共刺激抗原非依存性シグナルである。共刺激シグナルが欠けるとアネルギー及び非応答性が誘動され、Ｔ細胞増殖、サイトカイン分泌、及び細胞傷害活性が存在しなくなる。これらの経路の研究により、自己免疫又はリンパ増殖性障害などの病理学的イベントの始動についての洞察が得られる。Ｂ７ファミリーは共刺激分子の拡張グループである（Ｃｏｙｌｅ  ａｎｄ  Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ−Ｒａｍｏｓ、２００１年；Ｓｈａｒｐｅ  ａｎｄ  Ｆｒｅｅｍａｎ、２００２年）。Ｂ７ファミリーには、リガンドＢ７−１（ＣＤ８０）及びＢ７−２（ＣＤ８６）が属しており：これらリガンドの受容体は、Ｔ細胞活性化をもたらすＣＤ２８、及びＣＤ２８と競合して阻害シグナルを伝達するＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）である（Ａｌｅｇｒｅら、２００１年に概説されている）。Ｔ細胞活性化の負の制御因子としてのＣＤ１５２の極めて重要な役割は、ＣＴＬＡ−４欠損マウスにおけるリンパ増殖性障害の発生により実証されている。ＣＤ１５２により発現される阻害機能に関する重要な知見は、Ｔ細胞プライミング中のナイーブＴリンパ球による増殖又はサイトカイン産生の研究から得られる。特に、ＣＤ１５２はＴリンパ球活性化に続いて発現され、ＰＨＡ刺激又はＡｇ選択に続いて得られるＣＴＬクローンの細胞溶解機能を阻害する。Ｂ７−Ｈ１（ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２７４）及びＢ７−ＤＣ（ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ２７３）は、その受容体がＰＤ−１（ＣＤ２７９）であるが、Ｔ細胞増殖及びサイトカイン分泌を阻害することが判明した（Ｓｈａｒｐｅ  ａｎｄ  Ｐａｕｋｅｎ、２０１８年に概説されている）。他の点では、異なる研究により、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−Ｌ２会合がＴ細胞増殖及びＩＬ−１０又はＩＦＮ−γ産生を増やすことが明らかにされた。他の分子は、Ｂ７−Ｈ２（ＩＣＯＳ−Ｌ）を含む、Ｔ細胞の表面で発現されるＢ７ファミリーに関係しており、さらに最近になって同定されたＢ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ５、Ｂ７−Ｈ６、及びＢ７−Ｈ７も免疫機能のチェックポイント制御因子としての関与が示唆された（Ｎｉ  ａｎｄ  Ｄｏｎｇ、２０１７年に概説されている）。
【０００４】
Ｈｅｎｒｙら、（１９９９）は、ブチロフィリン（ＢＴ）をコードする領域がヒト第６染色体上のＭＨＣクラスＩ領域からテロメア位置にあることを発見した。特に彼らは、Ｉｇスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）に属する共刺激分子の新たなグループ（ＢＴ２．１、ＢＴ２．２、ＢＴ２．３、ＢＴ３．１、ＢＴ３．２及びＢＴ３．３）をコードし（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９２年；Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｂａｒｃｌａｙ、１９８８年）、配列類似性分析によりＢ７ファミリーに関係付けられる２つの遺伝子Ｂｔ２及びＢｔ３を記載しており：特に彼らは、ＣＤ８０とＣＤ８６のＩｇ−Ｖ様細胞外ドメインとの類似性を明らかにしている。
【０００５】
ＢＴ３ファミリーメンバーは異なる名称で文献に現れ：ＢＴ３．１は、ＢＴＦ５（Ｒｕｄｄｙら、１９９７年）、又はＢＴＮ３Ａ１（Ｒｈｏｄｅｓら、２００１年）、又はさらに最近ではＣＤ２７７（Ｂｅｎｓｕｓｓａｎ  ａｎｄ  Ｏｌｉｖｅ、２００５年）とも呼ばれ；ＢＴ３．２は、ＢＴＦ４（Ｒｕｄｄｙら、１９９７年）、又はＢＴＮ３Ａ２とも呼ばれ；最後に、ＢＴ３．３は、ＢＴＦ３（Ｒｕｄｄｙら、１９９７年）、又はＢＴＮ３Ａ３（Ｒｈｏｄｅｓら、２００１年）としても現れる。ＢＴ３はＩｇＳＦを特徴付ける２つのＩｇ様細胞外ドメインを有する。
【０００６】
Ｂ７遺伝子並びにＭＨＣクラスＩ及びＩＩ遺伝子は共通の先祖遺伝子を有し、Ｔ細胞活性化などの類似する機能に関与するタンパク質をコードすることが提唱されていた（Ｒｈｏｄｅｓら、２００１年）。ＢＴ３分子は、Ｔ、Ｂ及びＮＫ細胞、単球及び樹状細胞などの免疫細胞並びに造血前駆体及び一部の新生物細胞株で見い出された。他の共刺激分子に関しては、その構造は、３つのドメイン：リガンドに結合する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及びおそらく細胞内スーパーオキシド濃度の調節に関与しているＢ３０．２と呼ばれる細胞内ドメインにより特徴付けられる。これまでのところ、ＣＤ２７７のリガンド（複数可）はまだ知られていない（Ｇｕら、２０１５年に概説されている）。
【０００７】
今まで、Ｔ細胞の調節を頼りにする種々の治療及びワクチン戦略が提唱されており；ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１に対するいくつかの免疫調節抗体は、世界中の複数の規制機関によりすでに臨床使用を承認されている。これらの薬物はがん療法において大きな前進を表しているが、現在利用可能な処置に応答しないがん患者集団の大部分に対して満たされていない医療ニーズがまだ残っている。
【０００８】
特許国際公開第２０１２／０８０３５１号、欧州特許出願公開第２６５１４４１号、欧州特許出願公開第２９４６７９１号、米国特許出願公開２０１４／０３２２２３５号、国際公開第２０１２／０８０７６９号は、Ｖγ９  Ｖδ２  Ｔ細胞の細胞溶解機能、サイトカイン産生及び増殖を活性化する又は阻害することができるＢＴＮ３Ａに対する種々の抗体に言及している。しかし、これらのマウス抗体は治療応用には適していなかった。実際、ヒト患者への投与では、免疫原性反応を回避するためには抗体をヒト化することが今日では必須である。
【０００９】
ヒト化は、効力を元のマウス抗体の同じレベルに維持する確実性なしでフレームワーク領域においてアミノ酸を改変する必要があることが多い。これは、ＣＤＲ領域にすぐ隣接するアミノ酸を改変する場合に特に当てはまる（例えば、Ｑｕｅｅｎ  ｐａｔｅｎｔ  ＵＳ５，５８５，０８９参照）。
【００１０】
その困難さにもかかわらず、本発明者らは、活性化ｍＡｂ  ７．２の特別なヒト化抗体を今や選択しており、この抗体はｍＡｂ  ７．２親抗体の維持された機能特性をヒトに対して予測される減少した免疫原性と組み合わせるだけではなく、驚くべきことに、親マウス抗体と比べた場合、細胞株生産の改善された収率、さらに高い熱安定性などの優れた開発可能性、並びに酸及び熱ストレスに対する強い抵抗性も示す。さらに、本開示のヒト化抗体ｍＡｂ１は、有利なことにカニクイザルＢＴＮ３Ａに結合し、カニクイザル霊長類において１００ｍｇ／ｋｇ／週の用量まで十分に許容的であり、それによって、ヒト治療における薬物として使用するための優秀な候補を提供する。
【発明の概要】
【００１１】
したがって、本開示は、配列番号１の可変重鎖ポリペプチドＶＨ及び配列番号２又は配列番号３の可変軽鎖ポリペプチドＶＬを含む単離された抗ＢＴＮ３Ａ抗体に関する。そのような抗体は、特にその親マウス抗体に対して予測される減少した免疫原性を有するヒト化抗体である。そのような単離された抗ＢＴＮ３Ａ抗体はヒトＢＴＮ３Ａに結合する。特に、そのような単離された抗ＢＴＮ３Ａ抗体は、表面プラズモン共鳴により測定した場合、ヒトＢＴＮ３Ａに１０ｎＭ又はそれ未満のＫＤで、好ましくは５ｎＭ又はそれ未満のＫＤで結合する。
【００１２】
特定の実施形態では、本開示に従った前記抗体は、脱顆粒アッセイで測定した場合、ＢＴＮ３発現細胞と共培養においてγδ−Ｔ細胞、典型的にはＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞の活性化を、５μｇ／ｍｌ未満の、好ましくは、１μｇ／ｍｌ又はそれ未満のＥＣ５０で誘導する。その結果、前記抗体は、腫瘍標的細胞の殺傷をその組織起源とは無関係に誘導する。
【００１３】
特定の実施形態では、前記単離された抗ＢＴＮ３Ａ抗体は、変異又は化学的に改変されたＩｇＧ１定常領域を含み、前記変異又は化学的に改変されたＩｇＧ１定常領域は、野生型ＩｇＧ１アイソタイプ定常領域を有する対応する抗体と比べた場合、Ｆｃγ受容体に結合しない又は結合が減少している。典型的には、前記変異ＩｇＧ１定常領域はＩｇＧ１三重変異体Ｌ２４７Ｆ  Ｌ２４８Ｅ及びＰ３５０Ｓである。前記単離された抗ＢＴＮ３Ａ抗体の例は、配列番号４の重鎖及び配列番号６の軽鎖を含むｍＡｂ１、又は配列番号４の重鎖及び配列番号７の軽鎖を含むｍＡｂ２である。
【００１４】
他の実施形態では、本開示の前記単離された抗ＢＴＮ３Ａ抗体は、好ましくは、Ｆａｂ又はｓｃＦｖ抗体から選択される一価フォーマット抗体である。
【００１５】
本開示の単離された抗ＢＴＮ３Ａ抗体は、（ｉ）治療薬として又は（ｉｉ）診断薬として使用してもよい。例えば、これらの抗体は、がん、例えば、血液のがん、さらに具体的には、リンパ腫又は白血病の処置において有用である。他の実施形態では、これらの抗体は、固形腫瘍、さらに具体的には、前立腺、卵巣又は子宮内膜がんの処置にも使用することができる。あるいは、これらの抗体は、感染性障害の処置に使用してもよい。
【００１６】
本開示は、上述の抗ＢＴＮ３Ａ抗体を、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体のうちの１つ又は複数と組み合わせて含み、任意選択で他の活性成分を含む医薬組成物にさらに関する。
【００１７】
本開示の別の態様は、上述の抗ＢＴＮ３Ａ抗体を含む凍結乾燥製剤、プレフィルド注射器又はバイアルに関する。
【００１８】
本開示は、宿主細胞、典型的にはＣＨＯ宿主細胞などの哺乳動物宿主細胞における上述の抗ＢＴＮ３Ａ抗体の組換え産生のための発現ベクターであって、前記抗ＢＴＮ３Ａ抗体をコードする少なくとも１つの核酸を含む発現ベクターに関する。そのような発現ベクターの実施形態は、少なくとも、本明細書に開示されるｍＡｂ１の重鎖及び軽鎖をコードする核酸を含む。そのような発現ベクターを含む宿主細胞も本明細書に記載されている。
【００１９】
本開示の抗ＢＴＮ３Ａ抗体の産生のためのプロセスであって、（ｉ）宿主細胞による前記抗体の発現のために上で定義される宿主細胞を培養するステップ；任意選択で（ｉｉ）前記抗体を精製するステップ；（ｉｉｉ）抗体を回収するステップを含む、プロセスも本明細書で開示される。
【００２０】
本開示は、上で定義される抗ＢＴＮ３Ａ抗体のＶＨ及びＶＬを含むＦａｂ又はｓｃＦｖを含む少なくとも１つのアームを含む、二重特異性抗体などの多特異性抗体にさらに関する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】ＰＢＭＣから増やしたヒトＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞は、ｍＡｂ１（又は対応するアイソタイプ対照）の指示された濃度で４時間の間、Ｅ対Ｔ  １対１の比でダウディ細胞株（バーキットリンパ腫）と一緒に共培養した。細胞は、ＣＤ１０７ａ及びＣＤ１０７ｂに対する抗体で染色され、ポジティブ発現についてのゲートは非刺激対照に基づいていた。実験は３人の健康なドナーを用いて行った。
【図１Ｂ】ダウディ細胞は、指示された濃度のｍＡｂ１（又は対応するアイソタイプ対照）で３７℃で１時間プレインキュベートした。徹底的に洗浄後、ｍＡｂパルスされたダウディ細胞は、ダウディでカスパーゼ３／７活性を測定する前に３７℃で、増やしたヒトＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞と一緒に４時間の間、共培養した。Ａ及びＢでは、カーブフィッティングはＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアからシグモイド４ＰＬ方程式を使用して得た。
【図１Ｃ】（Ａ）及び（Ｂ）に前に記載されたのと同じプロトコールを使用して、ダウディ細胞株と比べて他の腫瘍性細胞株（Ｌ−ＩＰＣ：膵管腺癌、ＨＴ２９：結腸直腸腺癌、Ａ５４９：肺癌）に対して１０μｇ／ｍＬで使用されたｍＡｂ１（及び対応するアイソタイプ対照）の有効性を評価した。
【図２Ａ】ｍＡｂ１はＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞によるＢＴＮ３Ａ発現標的細胞殺傷を媒介する。１０，０００ＨＬ６０−ＷＴ又はＢＴＮ３ＡＫＯ細胞（急性骨髄性白血病）を、漸増濃度のｍＡｂ１（又は関連アイソタイプ対照  ｈＩｇＧ１）＋／−ｒＨｕＩＬ−２（２０  ＩＵ／ｍｌ）の存在下で、インビトロ増殖させたＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞と一緒に２４時間共培養した（１対１のＥ対Ｔ比）。細胞生存率は、ＡＴＰレベルを検出する生物発光アッセイを使用して測定した。
【図２Ｂ】ｍＡｂ１はＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞によるＢＴＮ３Ａ発現標的細胞殺傷を媒介する。１０，０００ＨＬ６０−ＷＴ細胞を、漸増濃度のｍＡｂ１（又は関連アイソタイプ対照  ｈＩｇＧ１）＋／−ｒＨｕＩＬ−２（２０  ＩＵ／ｍｌ）の存在下で、インビトロ増殖させたＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞と一緒に４日間共培養した（１対１のＥ対Ｔ比）。細胞生存率は毎日測定した。
【図２Ｃ】ｍＡｂ１はＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞によるＢＴＮ３Ａ発現標的細胞殺傷を媒介する。１０，０００ＨＬ６０−ＷＴ細胞を、漸増濃度のｍＡｂ１＋ｒＨｕＩＬ−２（２０  ＩＵ／ｍｌ）の存在下で、ヒトＰＢＭＣから単離した新鮮なＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞と一緒に４日間共培養した（１対１及び１対５のＥ対Ｔ比）。細胞生存率は毎日測定した。＊シグナル上のマーク。
【図３】異なる組織起源の１０，０００腫瘍性細胞を、異なる濃度のｍＡｂ１の存在下で、インビトロ増殖させたＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞と一緒に２４時間共培養した（１対１のＥ対Ｔ比）。細胞生存率は、ＡＴＰレベルを検出する生物発光アッセイを使用して測定した。生物発光値を示している。４つのバーは左から右に、（１）ｍＡｂなし、（２）ｍＡｂ１  ０．１μｇ／ｍｌ、（３）ｍＡｂ１  １μｇ／ｍｌ、（４）ｍＡｂ１  １０μｇ／ｍｌを指す。
【図４Ａ】ｍＡｂ１はカニクイザルＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞の増殖及び活性化を促進する。３匹の動物由来のカニクイザル全血を、赤血球溶解バッファーを用いて処理した。徹底的に洗浄後、細胞は、２００ＩＵ／ｍＬ  ｒＨｕＩＬ−２及びｍＡｂ１（１０μｇ／ｍＬ）を含有する培地において１．５Ｍ／ｍＬで蒔いた。Ｖγ９＋Ｔ細胞の百分率は、特定の抗体を使用して０、３、６、８及び１０日目にフローサイトメトリーにより評価した。グラフは、生細胞中のＶγ９＋Ｔ細胞百分率の動態を示している。それぞれの曲線は個々の動物を表している。
【図４Ｂ】ｍＡｂ１はカニクイザルＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞の増殖及び活性化を促進する。１０日間の増殖後、それぞれの動物由来の細胞は、培養培地、ｍＡｂ１又はアイソタイプ対照（１０μｇ／ｍＬ）の存在下、標的細胞として使用したダウディ、Ｋ５６２又はラージと一緒に４時間共培養し（１対１のＥ対Ｔ比）、フローサイトメトリーにより脱顆粒（ＣＤ１０７ａ／ｂ）について分析した。
【図５】ＩＣＴ０１投与後指示された時刻に収集されたカニクイザル血液試料は抗体の特定のカクテルで染色して、Ｔ細胞サブセット（ＣＤ４、ＣＤ８、Ｖγ９Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞）、Ｂ細胞、単球、ＮＫ細胞、ｍＤＣ、ｐＤＣ及び顆粒球を定量し、フローサイトメトリーにより分析した。上のパネルは、単回投与動物についてＣＤ３＋Ｔ細胞中のＶγ９δ２  Ｔ細胞の百分率を示した。下のパネルは、繰り返し投与動物についてＣＤ３＋Ｔ細胞中のＶγ９δ２  Ｔ細胞の百分率を示した。データは、それぞれの試料採取時及び群において平均値±ＳＤとして表されている。垂直方向の点線は、ＩＣＴ０１投与の時間を示した。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
定義
本開示がもっと容易に理解されるように、ある特定の用語を先ず定義する。追加の定義は、詳細な説明の全体において表明される。
【００２３】
本明細書で使用される場合、用語「ＢＴＮ３Ａ」は当技術分野でのその一般的な意味を有する。特定の実施形態では、この用語とは、配列番号１８のＢＴＮ３Ａ１、配列番号１９のＢＴＮ３Ａ２又は配列番号２０のＢＴＮ３Ａ３のいずれかを含むヒトＢＴＮ３Ａポリペプチドのことである。
【００２４】
本明細書で使用される用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリンの免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子のことである。したがって、用語抗体は全抗体分子だけではなく、抗体断片並びに抗体のバリアント（誘導体を含む）も包含する。
【００２５】
齧歯類及び霊長類の天然の抗体では、２つの重鎖はジスルフィド結合により互いに連結されており、それぞれの重鎖はジスルフィド結合により軽鎖に連結されている。軽鎖には２種類、ラムダ（λ）及びカッパ（κ）がある。抗体分子の機能活性を決定する５つの主な重鎖クラス（又はアイソタイプ）：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥがある。それぞれの鎖ははっきり異なる配列ドメインを含有する。典型的なＩｇＧ抗体では、軽鎖は２つのドメイン、可変ドメイン（ＶＬ）及び定常ドメイン（ＣＬ）を含む。重鎖は、４つのドメイン、可変ドメイン（ＶＨ）及び３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３、併せてＣＨと呼ばれる）を含む。軽（ＶＬ）と重（ＶＨ）鎖の両方の可変領域は抗原に対する結合認識及び特異性を決定する。軽（ＣＬ）及び重（ＣＨ）鎖の定常領域ドメインは、抗体鎖会合、分泌、経胎盤性移動度、補体結合及びＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合などの重要な生物特性を与える。
【００２６】
Ｆｖ断片は免疫グロブリンのＦａｂ断片のＮ終端部分であり、１つの軽鎖と１つの重鎖の可変部分からなる。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定基の間の構造的相補性に存在する。抗体結合部位は、主に超可変又は相補性決定領域（ＣＤＲ）由来である残基で構成されている。時折、非超可変又はフレームワーク領域（ＦＲ）由来の残基が、抗体結合部位に関与する、又は全体的ドメイン構造、したがって、結合部位に影響を及ぼすことができる。相補性決定領域又はＣＤＲとは、ナイーブ免疫グロブリン結合部位の天然のＦｖ領域の結合親和性及び特異性を一緒に定義するアミノ酸配列のことである。免疫グロブリンの軽及び重鎖はそれぞれが、それぞれＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ３及びＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３と名付けられた３つのＣＤＲを有する。したがって、抗原結合部位は典型的には、重鎖及び軽鎖Ｖ領域のそれぞれ由来のＣＤＲセットを含む、６つのＣＤＲを含む。フレームワーク領域（ＦＲ）とは、ＣＤＲ間に挿入されたアミノ酸配列のことである。したがって、軽及び重鎖の可変領域は典型的には、以下の配列：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の４つのフレームワーク及び３つのＣＤＲを含む。
【００２７】
抗体可変ドメインの残基は従来、Ｋａｂａｔらにより考案された方式に従って番号付けされる。この方式は、Ｋａｂａｔら、１９８７年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ、ＵＳＡ（Ｋａｂａｔら、１９９２年、今後「Ｋａｂａｔら」）に表明されている。この番号付け方式は本明細書において使用されている。Ｋａｂａｔ残基命名は必ずしも、ＳＥＱ  ＩＤ配列でのアミノ酸残基の線形番号付けと直接一致しているわけではない。実際の線形アミノ酸配列は、基本的な可変ドメイン構造のフレームワークであれ相補性決定領域（ＣＤＲ）であれ、構成成分の短縮化又は構成成分中への挿入に対応して厳格なＫａｂａｔ番号付けよりも少ない又は追加されたアミノ酸を含有することがある。残基の正確なＫａｂａｔ番号付けは、所与の抗体について、その抗体の配列中の相同な残基を「標準」Ｋａｂａｔ番号付け配列と整列させることにより決定することができる。重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付け方式に従えば、残基３１〜３５（Ｈ−ＣＤＲ１）、残基５０〜６５（Ｈ−ＣＤＲ２）及び残基９５〜１０２（Ｈ−ＣＤＲ３）に位置している。軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付け方式に従えば、残基２４〜３４（Ｌ−ＣＤＲ１）、残基５０〜５６（Ｌ−ＣＤＲ２）及び残基８９〜９７（Ｌ−ＣＤＲ３）に位置している。
【００２８】
特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、抗体断片、さらに詳細には、本明細書に開示される抗体の抗原結合ドメインを含む任意のタンパク質である。抗体断片は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２及びダイアボディを含むがこれらに限定されない。
【００２９】
本明細書で使用される場合、用語「特異性」とは、抗体が、ＢＴＮ３Ａなどの抗原上に示されるエピトープに検出できるほどに結合する能力のことである。一部の実施形態では、この用語は、末梢血骨髄細胞（ＰＢＭＣ）上で発現されるヒトＢＴＮ３Ａに、好ましくは、実施例において決定される５０μｇ／ｍｌ未満の、さらに好ましくは１０μｇ／ｍｌよりも下のＥＣ５０で、結合する抗体を指すことが意図されている（表４参照）。他の実施形態では、この抗体は、実施例において決定されるＳＰＲ測定により測定された場合、抗原組換えポリペプチドに、１００ｎＭ若しくはそれ未満、１０ｎＭ若しくはそれ未満、１ｎＭ若しくはそれ未満、１００ｐＭ若しくはそれ未満、又は１０ｐＭ若しくはそれ未満のＫＤで結合する（表４参照）。
【００３０】
「ＢＴＮ３Ａ以外の抗原と交差反応する」抗体とは、ＢＴＮ３Ａ以外のその抗原に１０ｎＭ若しくはそれ未満、１ｎＭ若しくはそれ未満、又は１００ｐＭ若しくはそれ未満のＫＤで結合する抗体を指すことが意図されている。「特定の抗原と交差反応しない」抗体とは、その抗原に１００ｎＭ若しくはそれよりも大きなＫＤ、又は１μＭ若しくはそれよりも大きなＫＤ、又は１０μＭ若しくはそれよりも大きなＫＤで結合する抗体を指すことが意図されている。ある特定の実施形態では、抗原と交差反応しないそのような抗体は、標準結合アッセイにおいてこれらのタンパク質に対して本質的に検出不能な結合を示す。特定の実施形態では、本開示のヒト化抗体、例えば、ｍＡｂ１は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイにおいて測定した場合、それぞれ配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３のカニクイザルＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２及びＢＴＮ３Ａ３と交差反応する（表２１参照）。
【００３１】
「単離された抗体」とは、本明細書で使用される場合、異なる抗原特異性を有する他の抗体が実質的にない抗体のことである（例えば、ＢＴＮ３Ａに特異的に結合する単離された抗体は、ＢＴＮ３Ａ以外の抗原に特異的に結合する抗体が実質的にない）。しかし、ＢＴＮ３Ａに特異的に結合する単離された抗体は、他の種由来の関連するＢＴＮ３Ａ分子などの他の抗原に対して交差反応性を有することがある。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質及び／又は化学物質が実質的にないでもよい。
【００３２】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」とは、単一分子組成の抗体分子の調合剤のことである。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性及び親和性を示す。
【００３３】
語句「抗原を認識する抗体」及び「抗原に対する特異性を有する抗体」は、本明細書では、用語「抗原に特異的に結合する抗体」と互換的に使用される。
【００３４】
用語「Ｋａｓｓｏｃｉ」又は「Ｋａ」とは、本明細書で使用される場合、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を指すことが意図されており、「Ｋｄｉｓ」又は「Ｋｄ」とは、本明細書で使用される場合、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指すことが意図されている。
【００３５】
用語「ＫＤ」とは、本明細書で使用される場合、Ｋａに対するＫｄの比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られる解離定数を指すことが意図されており、モル濃度（Ｍ）として表される。抗体についてのＫＤ値は、当技術分野で確立した方法を使用して決定することができる。
【００３６】
抗体のＫＤを決定するための方法は、表面プラズモン共鳴を使用する、又はＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用することによる。
【００３７】
特異性は、例えば、特定の抗原に結合する対他の無関係な分子への非特異的結合（この場合では、特定の抗原はＢＴＮ３Ａポリペプチドである）での親和性／アビディティーの約１０対１、約２０対１、約５０対１、約１００対１、１０，０００対１又はそれよりも大きな比によりさらに示すことができる。用語「親和性」とは、本明細書で使用される場合、エピトープへの抗体の結合の強さを意味する。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語「アビディティー」とは、抗体−抗原複合体の全体の安定性又は強度についての情報価値のある尺度のことである。アビディティーは、３つの主要な要因：抗体エピトープ親和性；抗原と抗体の両方の結合価；及び相互作用をする部分の構造的配置により制御される。最後に、これらの要因は、抗体の特異性、すなわち、特定の抗体が正確な抗原エピトープに結合している可能性を規定する。
【００３９】
本明細書で使用される場合、用語「活性化抗体」とは、エフェクター細胞の免疫機能を直接的に又は間接的に誘導することができる抗体のことである。特に、本明細書で使用される場合、活性化抗ＢＴＮ３Ａ抗体は、ＢＴＮ３Ａ発現細胞との共培養で、下の実施例に記載される脱顆粒アッセイにおいて測定した場合、５μｇ／ｍｌ未満の、好ましくは、１μｇ／ｍｌ又はそれよりも下のＥＣ５０でγδ  Ｔ細胞、典型的にはＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞の活性化を誘導する能力を少なくとも有する。
【００４０】
本明細書で使用される場合、用語「対象」とは、任意のヒト又は非ヒト動物を含む。用語「非ヒト動物」は、あらゆる脊椎動物、例えば、哺乳動物及び非ヒト霊長類などの非哺乳動物、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類、等を含む。
【００４１】
本明細書で使用される場合、用語「最適化された」とは、ヌクレオチド配列が、産生細胞又は生物、一般には、真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）又はヒト細胞において好まれるコドンを使用してアミノ酸配列をコードするように変更されていることを意味する。最適化されたヌクレオチド配列は、出発ヌクレオチド配列により最初にコードされているアミノ酸配列を完全に又はできるだけ多く保持するように操作される。最適化されたヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列も最適化されたと呼ばれる。
【００４２】
本明細書で使用される場合、２つの配列間のパーセント同一性は、ギャップの数及びそれぞれのギャップの長さを考慮に入れた上での、配列により共有される同一位置の数の関数であり（すなわち、％同一性＝同一の位置の数／位置の全数×１００）、このギャップの数及びそれぞれのギャップの長さは、２つの配列の最適アライメントのために導入される必要がある。配列の比較及び２つの配列間のパーセント同一性の決定は、下に記載されるように、数学アルゴリズムを使用して達成することができる。
【００４３】
２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＰＡＭ１２０残基重み付け表、ギャップ長ペナルティ１２及びギャップペナルティ４を使用して、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）中に組み込まれたＥ．Ｍｅｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、４：１１〜１７頁、１９８８年）のアルゴリズムを使用して決定することができる。あるいは、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックス、並びにギャップ重み１６、１４、１２、１０、８、６又は４及び長さ重み１、２、３、４、５、又は６を使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）中に組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ．４８：４４４〜４５３頁、１９７０年）アルゴリズムを使用して決定することができる。
【００４４】
２つのヌクレオチドアミノ酸配列間のパーセント同一性は、例えば、デフォルトとしてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較を使用する核酸配列についてのＢＬＡＳＴＮプログラムなどのアルゴリズムを使用して決定してもよい。
【００４５】
組換えヒト化抗ＢＴＮ３Ａ活性化抗体
本開示の抗体は、選択されたヒト化組換え抗体ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ４及びｍＡｂ５を含み、これらの抗体は下の表１に記載されるその可変重鎖及び軽鎖アミノ酸配列並びにヒト定常領域（アイソタイプ）により構造的に特徴付けられる。
【表１】
2021533204.tif 000002
【００４６】
ｍＡｂ３及びｍＡｂ６は別の親マウス抗ＢＴＮ３Ａ抗体のヒト化抗体であり、ｍＡｂ２０．１と呼ばれ、国際公開第２０１２／０８０３５１号に記載されており、比較例として使用する。
【００４７】
ｍＡｂ１からｍＡｂ６を作製するために使用されるＩｇＧ１、ＩｇＧ４並びにその変異バージョンＩｇＧ１  Ｌ２４７Ｆ／Ｌ２４８Ｅ／Ｐ３５０Ｓ及びＩｇＧ４  Ｓ２４１Ｐ／Ｌ２４８Ｅの定常アイソタイプ領域の対応するアミノ酸及びヌクレオチドコード配列は当技術分野では周知である（Ｏｇａｎｅｓｙａｎら、２００８年；Ｒｅｄｄｙら、２０００年）。ＩｇＧに見出されるＣ終端リジンは天然に切断されていることがあり、この改変は抗体の特性に影響を与えず、したがって、この残基は、ｍＡｂ１からｍＡｂ６の構築物においてさらに欠失させてもよい。
【００４８】
ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ４及びｍＡｂ５の完全長軽及び重鎖並びに対応するコード配列は、下の表２に示されている。
【表２】
2021533204.tif 000003
【００４９】
本開示に従ったいくつかの抗体のＶＨ  ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１とも呼ばれる）、ＶＨ  ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２とも呼ばれる）、ＶＨ  ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３とも呼ばれる）、ＶＬ  ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１とも呼ばれる）、ＶＬ  ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２とも呼ばれる）、ＶＬ  ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３とも呼ばれる）のアミノ酸配列の例は表３に示されている。
【００５０】
表３では、本開示の抗体のＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔ番号付けを使用して描かれている（Ｋａｂａｔら、１９９２年、今後「Ｋａｂａｔら」）。
【００５１】
読みやすさを目的に、ＣＤＲ領域は今後、それぞれＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３と呼ばれる。
【表３】
2021533204.tif 000004
【００５２】
特定の実施形態では、上で定義される前記組換え抗ＢＴＮ３Ａ抗体は以下の特性：
（ｉ）この抗体は、例えば、下の実施例に記載されるＳＰＲにより測定した場合、１０ｎＭ又はそれ未満のＫＤで、好ましくは、１ｎＭ又はそれ未満のＫＤでＢＴＮ３Ａに結合する；
（ｉｉ）この抗体は、例えば、下の実施例に記載されるＳＰＲにより測定した場合、１００ｎＭ又はそれ未満のＫＤで、好ましくは、１０ｎＭ又はそれ未満のＫＤでカニクイザルＢＴＮ３Ａに交差反応する；
（ｉｉｉ）この抗体は、下の実施例に記載されるフローサイトメトリーアッセイにおいて測定した場合、５０μｇ／ｍｌ又はそれよりも下の、好ましくは、１０μｇ／ｍｌ又はそれよりも下のＥＣ５０でヒトＰＢＭＣに結合する；
（ｉｖ）この抗体は、ＢＴＮ３発現細胞との共培養で、下の実施例に記載される脱顆粒アッセイにおいて測定した場合、５μｇ／ｍｌ未満の、好ましくは、１μｇ／ｍｌ又はそれよりも下のＥＣ５０でγδ  Ｔ細胞、典型的にはＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞の活性化を誘導する、
のうちの１つ又は複数を有する。
【００５３】
前の実施形態と組み合わせてもよいある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、上で定義された抗体の抗体断片である。
【００５４】
抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ユニボディ、及びｓｃＦｖ断片、ダイアボディ、単一ドメイン又はナノボディ及び他の断片を含むがこれらに限定されない。
【００５５】
好ましくは、抗体は、ｓｃＦｖ断片のＦａｂなどの一価抗体である。
【００５６】
用語「ダイアボディ」とは、２つの抗原結合部位を有する小抗体断片のことであり、この断片は同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）中の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を許すには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは別の鎖の相補的ドメインと対合して２つの抗原結合部位を生み出さざるを得なくなる。
【００５７】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべて若しくは一部又は軽鎖可変ドメインのすべて若しくは一部を含む抗体断片である。ある特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ、Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；例えば、米国特許第６，２４８，５１６号参照）。
【００５８】
抗体断片は、無傷の抗体のタンパク質消化並びに本明細書に記載される組換え宿主細胞による産生を含むがこれらに限定されない種々の技法により作製することができる。
【００５９】
本開示の抗体はヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、親非ヒト抗体の少なくとも同じ親和性（又は親よりも優れた親和性）を有するままで、ヒトに対する免疫原性を低減するためにヒト化される。好ましい実施形態では、本開示の抗体は、国際公開第２０１２／０８０３５１号に開示されている親抗体ｍＡｂ７．２のヒト化抗体である。比較例は、国際公開第２０１２／０８０３５１号に開示されている親抗体ｍＡｂ２０．１にヒト化抗体を含む。
【００６０】
一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ（又はその一部）が非ヒト抗体、例えば、マウスｍＡｂ７．２に由来し、ＦＲ（又はその一部）が免疫原性を低減する突然変異のあるマウス抗体配列に由来する１つ又は複数の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、任意選択で、ヒト定常領域の少なくとも一部も含む。
【００６１】
好ましくは、本開示に従った組換え抗体は、ヒト化サイレント抗体、典型的にはヒト化サイレントＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体である。
【００６２】
本明細書で使用される場合、用語「サイレント」抗体とは、実施例に記載されるアッセイなどの結合アッセイにおいて測定される場合、ＦｃγＲ結合及び／若しくはＣ１ｑ結合を示さない又は低いＦｃγＲ結合及び／若しくはＣ１ｑ結合を示す抗体のことである。
【００６３】
一実施形態では、用語「ＦｃγＲ結合及び／若しくはＣ１ｑ結合なし又は低いＦｃγＲ結合及び／若しくはＣ１ｑ結合」とは、サイレント抗体が、野生型ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４アイソタイプを有する対応する抗体を用いて観察されるＦｃγＲ及び／又はＣ１ｑ結合の少なくとも５０％未満、例えば、８０％未満であるＦｃγＲ及び／又はＣ１ｑ結合を示すことを意味する。
【００６４】
フレームワーク又はＦｃ操作
本開示の抗体は、対応するマウス抗体ｍＡｂ７．２と比べて抗体の免疫原性を減らすためにＶＨ及びＶＬ内のフレームワーク残基に加えられた改変を含む。
【００６５】
一特定の実施形態では、本開示の抗体は、親マウス抗体ｍＡｂ７．２のヒト化モノクローナル抗体であり、ＶＨフレームワーク領域に少なくとも以下のアミノ酸変異：Ｖ５Ｑ；Ｖ１１Ｌ；Ｋ１２Ｖ；Ｒ６６Ｋ；Ｓ７４Ｆ；Ｉ７５Ｓ；Ｅ８１Ｑ；Ｓ８２ＡＲ；Ｒ８２ＢＳ；Ｒ８３Ｔ；Ｄ８５Ｅ；Ｔ８７Ｓ；Ｌ１０８Ｓ；及びＶκフレームワーク領域に少なくとも以下のアミノ酸変異：Ｔ５Ｎ；Ｖ１５Ｌ；Ｒ１８Ｔ；Ｖ１９Ｉ；Ｋ４２Ｎ；Ａ４３Ｉ；Ｄ７０Ｇ；Ｆ７３Ｌ；Ｑ１００Ｇを含む。
【００６６】
別の特定の実施形態では、本開示の抗体は、親マウス抗体ｍＡｂ７．２のヒト化モノクローナル抗体であり、ｍＡｂ７．２と比べて、ＶＨフレームワーク領域に少なくとも以下のアミノ酸変異：Ｖ５Ｑ；Ｖ１１Ｌ；Ｋ１２Ｖ；Ｒ６６Ｋ；Ｓ７４Ｆ；Ｉ７５Ｓ；Ｅ８１Ｑ；Ｓ８２ＡＲ；Ｒ８２ＢＳ；Ｒ８３Ｔ；Ｄ８５Ｅ；Ｔ８７Ｓ；Ｌ１０８Ｓ；及びＶκフレームワーク領域に少なくとも以下のアミノ酸変異：Ｔ５Ｎ；Ｖ１５Ｌ；Ｒ１８Ｔ；Ｖ１９Ｉ；Ｋ４２Ｎ；Ａ４３Ｉ；Ｓ６３Ｔ；Ｄ７０Ｇ；Ｆ７３Ｌ；Ｑ１００Ｇを含む。
【００６７】
フレームワーク領域内で加えられた改変に加えて、本開示の抗体は、典型的には、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、及び／又は抗原依存的細胞傷害性などの、抗体の１つ又は複数の機能特性を変更するために、Ｆｃ領域内に改変を含むように操作してもよい。
【００６８】
さらに、本開示の抗体は、抗体の１つ又は複数の機能特性を再び変更するために、化学修飾しても（例えば、１つ又は複数の化学的成分を抗体に結合させることができる）又はそのグリコシル化を変更するように改変してもよい。これらの実施形態のそれぞれが下にさらに詳細に記載されている。
【００６９】
本明細書で使用される場合、用語「アイソタイプ定常領域」又は「Ｆｃ領域」は互換的に使用されて、天然の配列Ｆｃ領域及び変異Ｆｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ終端領域を定義する。ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は一般に、ＩｇＧ抗体のＣ２２６位から又はＰ２３０位からカルボキシル終端までのアミノ酸残基を含むと定義され、ここでの番号付けはＥＵ番号付け方式に従っている。Ｆｃ領域のＣ終端リジン（残基Ｋ４４７）は、例えば、抗体の産生若しくは精製中に取り除く、又はその対応するコドンを組換え構築物で欠失させてもよい。したがって、本開示の抗体の組成物は、Ｋ４４７残基がすべて取り除かれている抗体集団、Ｋ４４７残基が取り除かれていない抗体集団、並びにＫ４４７残基がある抗体とない抗体の混合物を有する抗体集団を含んでいる場合がある。
【００７０】
一特定の実施形態では、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が変更される、例えば、増やされる又は減らされるように改変される。このアプローチは、Ｂｏｄｍｅｒらにより米国特許第５，６７７，４２５号にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域におけるシステイン残基の数は、例えば、軽及び重鎖の組み立てを促進するため、又は抗体の安定性を増やす若しくは減らすために変更される。
【００７１】
別の実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域は、抗体の生物学的半減期を減らすために変異される。さらに具体的には、抗体が、天然のＦｃ−ヒンジドメインＳｐＡ結合と比べて、障害されたブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｙｌ）プロテインＡ（ＳｐＡ）結合を有するように、１つ又は複数のアミノ酸変異がＦｃ−ヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメインインターフェイス領域中に導入される。このアプローチは、Ｗａｒｄらによる米国特許第６，１６５，７４５号にさらに詳細に記載されている。
【００７２】
さらに別の実施形態では、Ｆｃ領域は、少なくとも１つのアミノ酸残基の代わりに異なるアミノ酸残基を使って抗体のエフェクター機能を変更することにより、変更される。例えば、１つ又は複数のアミノ酸は、抗体がエフェクターリガンドに対して変更された親和性を有するが親抗体の抗原結合能力は保持するように、異なるアミノ酸残基で置き換えることができる。対する親和性が変更されるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体又は補体のＣ１構成成分が可能である。このアプローチは、両方ともＷｉｎｔｅｒらによる米国特許第５，６２４，８２１号及び米国特許第５，６４８，２６０号にさらに詳細に記載されている。
【００７３】
別の実施形態では、アミノ酸残基から選択される１つ又は複数のアミノ酸は、抗体が変更されたＣ１ｑ結合及び／又は低減された若しくは消失された補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を有するように異なるアミノ酸残基で置き換えることができる。このアプローチは、Ｉｄｕｓｏｇｉｅらによる米国特許第６，１９４，５５１号にさらに詳細に記載されている。
【００７４】
別の実施形態では、１つ又は複数のアミノ酸残基が変更され、それによって、抗体が補体を固定する能力を変更する。このアプローチは、Ｂｏｄｍｅｒらによる国際出願公開第９４／２９３５１号にさらに記載されている。
【００７５】
他の実施形態では、Ｆｃ領域は、抗体が抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する能力を減らし及び／又は１つ若しくは複数のアミノ酸を改変することによりＦｃγ受容体に対する抗体の親和性を減らすように改変される。エフェクター機能が減少した、特にＡＤＣＣが減少したそのような抗体は、サイレント抗体を含む。
【００７６】
ある特定の実施形態では、ＩｇＧ１アイソタイプのＦｃドメインが使用される。一部の特定の実施形態では、ＩｇＧ１  Ｆｃ断片の変異バリアント、例えば、融合ポリペプチドが抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し及び／又はＦｃγ受容体に結合する能力を低減する又は取り除くサイレントＩｇＧ１  Ｆｃが使用される。
【００７７】
ある特定の実施形態では、ＩｇＧ４アイソタイプのＦｃドメインが使用される。一部の特定の実施形態では、ＩｇＧ４  Ｆｃ断片の変異バリアント、例えば、融合ポリペプチドが抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し及び／又はＦｃγ受容体に結合する能力を低減する又は取り除くサイレントＩｇＧ４  Ｆｃが使用される。
【００７８】
沈黙したエフェクター機能（ｓｉｌｅｎｃｅｄ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）は、抗体のＦｃ定常部分の変異により得ることができ、当技術分野に記載されている（Ｂａｕｄｉｎｏら、２００８年；Ｓｔｒｏｈｌ、２００９年）。サイレントＩｇＧ１抗体の例は、三重変異バリアントＩｇＧ１  Ｌ２４７Ｆ  Ｌ２４８Ｅ  Ｐ３５０Ｓを含む。サイレントＩｇＧ４抗体の例は、二重変異バリアントＩｇＧ４  Ｓ２４１Ｐ  Ｌ２４８Ｅを含む。
【００７９】
ある特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの３１４位でのグリコシル化を妨げるサイレントＦｃ変異体である。例えば、Ｆｃドメインは、３１４位にアスパラギンのアミノ酸置換を含有する。そのようなアミノ酸置換の例は、グリシン又はアラニンによるＮ３１４の置き換えである。
【００８０】
さらに別の実施形態では、抗体のグリコシル化が改変される。例えば、アグリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｌａｔｅｄ）抗体を作製することができる（すなわち、抗体はグリコシル化を欠く）。グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増やすように変更することができる。そのような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内で１つ又は複数のグリコシル化部位を変更することにより達成できる。例えば、１つ又は複数の可変領域フレームワークグリコシル化部位を取り除き、それによって、その部位でのグリコシル化を取り除く１つ又は複数のアミノ酸置換を行うことができる。そのようなアグリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増やしうる。そのようなアプローチは、Ｃｏらによる米国特許第５，７１４，３５０号及び米国特許第６，３５０，８６１号にさらに詳細に記載されている。
【００８１】
本開示により想定されている本明細書の抗体の別の改変は、ペグ化又はｈｅｓ化（ｈｅｓｙｌａｔｉｏｎ）又は関連技術である。抗体は、例えば、抗体の生物学的（例えば、血清）半減期を増やすようにペグ化することができる。抗体をペグ化するためには、抗体又はその断片は典型的には、１つ又は複数のＰＥＧ基が抗体又は抗体断片に結合される条件下で、ＰＥＧの反応性エステル又はアルデヒド誘導体などの、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と反応する。ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（又は類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシルカ反応又はアルキル化反応により実行することができる。本明細書で使用される場合、用語「ポリエチレングリコール」とは、モノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−若しくはアリロキシ−ポリエチレングリコール又はポリエチレングリコール−マレイミドなどの、他のタンパク質を誘導体化するのに使用されてきた形態のＰＥＧのいずれをも包含することが意図されている。ある特定の実施形態では、ペグ化される抗体はアグリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化するための方法は当技術分野では公知であり、本開示の抗体に適用することができる。例えば、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａらによる欧州特許第０  １５４  ３１６号及びＩｓｈｉｋａｗａらによる欧州特許第０  ４０１  ３８４号を参照されたい。
【００８２】
別の可能性は、本開示の抗体の少なくとも抗原結合領域の、得られた分子の半減期を増やすヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質に結合することができるタンパク質への融合である。そのようなアプローチは、例えば、Ｎｙｇｒｅｎらの欧州特許第０  ４８６  ５２５号に記載されている。
【００８３】
ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖定常ドメイン上に広く存在するＣ終端リジンは、製造又は貯蔵中に広く観察されるこの残基の切断に起因する不均一性を低減するように操作される。そのような改変は、これらの分子に安定性という利益を与えつつ、これらの抗体の望ましい機能を知覚できるほど変化させない。
【００８４】
本開示の抗体をコードする核酸分子
本開示の抗ＢＴＮ３Ａ抗体をコードする核酸分子も本明細書で開示される。可変軽鎖及び重鎖ヌクレオチド配列の例は、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ４及びｍＡｂ５のいずれか１つの可変軽鎖及び重鎖アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であり、アミノ酸配列は表１及び表２から容易に引き出され、遺伝コードを使用し、任意選択で、宿主細胞種に応じてコドンバイアスを考慮に入れる。
【００８５】
本開示は、哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞株におけるタンパク質発現用に最適化されているアミノ酸配列に由来する核酸分子にも関する。
【００８６】
核酸は、全細胞に、細胞可溶化物に存在していてもよく、又は部分的に精製されている若しくは実質的に純粋な形態の核酸でもよい。核酸は、アルカリ性／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング（ｂａｎｄｉｎｇ）、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動及び当技術分野で周知である他の技法を含む標準技法により、他の細胞成分又は他の混入物、例えば、他の細胞核酸若しくはタンパク質から精製された場合、「単離され」ている又は「実質的に純粋になって」いる（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８８年）。本開示の核酸は、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡが可能であり、イントロン配列を含有していてもよく含有していなくてもよい。実施形態では、核酸は、ファージディスプレイベクターなどのベクターに、又は組換えプラスミドベクターに存在していてもよい。
【００８７】
本開示の核酸は、標準分子生物学技法を使用して得ることができる。例えば、ＶＨ及びＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られた後、これらのＤＮＡ断片は、例えば、可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子に、Ｆａｂ断片遺伝子に、又はｓｃＦｖ遺伝子に変換するため、標準組換えＤＮＡ技法によりさらに操作することができる。これらの操作では、ＶＬ−又はＶＨ−コードＤＮＡ断片（例えば、表１に定義されているＶＬ及びＶＨ）は、別のＤＮＡ分子に、又は抗体定常領域若しくは柔軟なリンカーなどの別のタンパク質をコードする断片に作動可能に連結される。用語「作動可能に連結される」は、この文脈で使用される場合、２つのＤＮＡ断片が、例えば、２つのＤＮＡ断片によりコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように、又はタンパク質が所望のプロモーターの制御下で発現されるように、機能的方法で結合されることを意味するよう意図されている。
【００８８】
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨコードＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することにより完全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野では公知であり（Ｋａｂａｔら、１９９２年）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準ＰＣＲ増幅により得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域が可能である。一部の実施形態では、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１アイソタイプ、例えば、ヒトＩｇＧ１アイソタイプの中から選択される。他の実施形態では、重鎖定常領域は、ＩｇＧ４アイソタイプ、例えば、ヒトＩｇＧ４アイソタイプの中から選択される。他の実施形態では、重鎖定常領域は、ＩｇＧ４アイソタイプ、例えば、ヒトＩｇＧ４アイソタイプの中から選択される。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子では、ＶＨコードＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することができる。
【００８９】
ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＬコードＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することにより完全長軽鎖遺伝子に（並びに、Ｆａｂ軽鎖遺伝子に）変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野では公知であり（Ｋａｂａｔら、１９９２年）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準ＰＣＲ増幅により得ることができる。軽鎖定常領域は、カッパ又はラムダ定常領域が可能である。
【００９０】
ｓｃＦｖ遺伝子を作製するためには、ＶＨ及びＶＬ配列が連続一本鎖タンパク質として発現でき、ＶＬ及びＶＨ領域が柔軟なリンカーにより結合されるように、ＶＨ−及びＶＬコードＤＮＡ断片は、柔軟なリンカーをコードする、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードする別の断片に作動可能に連結される（Ｂｉｒｄら、１９８８年；Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８年；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０年）。
【００９１】
モノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマ（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａｓ）の作製
本開示の抗体は、例えば、当技術分野で周知である組換えＤＮＡ技法と遺伝子トランスフェクション法の組合せを使用して宿主細胞トランスフェクトーマにおいて産生することができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、１９８５年）。
【００９２】
例えば、抗体、又はその抗体断片を発現するために、部分的又は完全長軽及び重鎖をコードするＤＮＡは、標準分子生物学又は生化学技法（例えば、ＤＮＡ化学合成、ＰＣＲ増幅又は目的の抗体を発現するハイブリドーマを使用するｃＤＮＡクローニング）により得ることができ、そのＤＮＡは、遺伝子が転写及び翻訳制御配列に作動可能に連結されるように、発現ベクター中に挿入することができる。この文脈では、用語「作動可能に連結される」とは、ベクター内の転写及び翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節するその意図された機能を果たすように、抗体遺伝子がベクター中にライゲートされていることを意味するように意図されている。発現ベクター及び発現制御配列は、使用される発現宿主細胞に適合するように選択される。抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子は別々のベクター中に挿入することができ、又は、さらに典型的には、両方の遺伝子は同じ発現ベクター中に挿入される。抗体遺伝子は標準法（例えば、抗体遺伝子断片及びベクター上の相補的制限部位のライゲーション、又は制限部位が存在しない場合は平滑末端ライゲーション）により発現ベクター中に挿入される。本明細書に記載される抗体の軽及び重鎖可変領域を使用すれば、ＶＨセグメントはベクター内のＣＨセグメント（複数可）に作動可能に連結され、ＶＬセグメントはベクター内のＣＬセグメントに作動可能に連結されるように、所望のアイソタイプの重鎖定常及び軽鎖定常領域をすでにコードする発現ベクター中にこれらの可変領域を挿入することにより任意の抗体アイソタイプの完全長抗体遺伝子を作製することができる。さらに又はあるいは、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ終端にインフレームで連結されるように、ベクター中にクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）が可能である。
【００９３】
抗体鎖遺伝子に加えて、本明細書で開示される組換え発現ベクターは、宿主細胞において抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を担持する。用語「調節配列」は、抗体鎖遺伝子の転写又は翻訳を制御するプロモーター、エンハンサー及び他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図されている。そのような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ’ｓ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ（Ｇｏｅｄｄｅｌ、１９９０年）に記載されている。調節配列の選択を含む、発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベル、等などの要因に依存しうることは当業者に認識される。哺乳動物宿主細胞発現のための調節配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルスメイジャー後期プロモーター（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｍａｊｏｒ  ｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）（ＡｄＭＬＰ））、及びポリオーマ由来のプロモーター及び／又はエンハンサーなどの、哺乳動物細胞において高レベルのタンパク質発現を指示するウイルスエレメントを含む。あるいは、ユビキチンプロモーター又はＰ−グロビンプロモーターなどの、非ウイルス調節配列を使用してもよい。さらに、調節エレメントは、ＳＶ４０初期プロモーター及びヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長末端反復由来の配列を含有するＳＲａプロモーター系などの異なる供給源由来の配列で構成されている（Ｔａｋｅｂｅら、１９８８年）。
【００９４】
抗体鎖遺伝子及び調節配列に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞においてベクターの複製を調節する配列などの追加の配列（例えば、複製起点）及び選択可能マーカー遺伝子を担持していてもよい。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を促進する（例えば、すべてＡｘｅｌらによる、米国特許第４，３９９，２１６号、米国特許第４，６３４，６６５号、及び米国特許第５，１７９，０１７号参照）。例えば、典型的には、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を与える。選択可能マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅の場合ｄｈｆｒ−宿主細胞において使用するため）及びｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）を含む。
【００９５】
軽及び重鎖の発現では、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクター（複数可）は標準技法により宿主細胞中にトランスフェクトされる。用語「トランスフェクション」の種々の形態は、外因性ＤＮＡを原核又は真核宿主細胞中に導入するために広く使用される多種多様の技法、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクション及び同類のものを包含することが意図されている。本開示の抗体を原核又は真核宿主細胞で発現することは理論的に可能である。真核細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞、酵母又は糸状菌における抗体の発現が考察されるのは、そのような真核細胞、特に、哺乳動物細胞が、原核細胞よりも正しく折り畳まれ免疫学的に活性な抗体を組み立て分泌する可能性が高いからである。
【００９６】
一特定の実施形態では、本開示に従ったクローニング又は発現ベクターは、適切なプロモーター配列に作動可能に連結されたｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ４及びｍＡｂ５のうちのいずれか１つの重鎖及び軽鎖のコード配列の１つを含む。
【００９７】
本開示の組換え抗体を発現するための哺乳動物宿主細胞は、ＤＨＦＲ選択可能マーカー（Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ、１９８２年に記載される）と一緒に使用されるｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ、１９８０年に記載される）、ＣＨＯＫ１  ｄｈｆｒ＋細胞株、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞、例えば、ＧＳ  Ｘｃｅｅｄ（商標）遺伝子発現系（Ｌｏｎｚａ）と一緒のＧＳ  ＣＨＯ細胞株を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）を含む。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞中に導入されると、宿主細胞における抗体の発現、及び、任意選択で宿主細胞を増殖させている培養培地中への抗体の分泌に十分な期間宿主細胞を培養することにより抗体は産生される。抗体は、例えば、抗体の分泌後培養培地から回収し、標準タンパク質精製法を使用して精製することができる（Ｓｈｕｋｌａら、２００７年）。
【００９８】
一特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、適切なプロモーター配列に作動可能に連結された、それぞれｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ４及びｍＡｂ５の発現に適したコード配列を有する発現ベクターをトランスフェクトされている宿主細胞である。
【００９９】
例えば、本開示は、ｍＡｂ１の重鎖及び軽鎖をそれぞれコードする配列番号８及び１０の核酸を少なくとも含む宿主細胞に関する。
【０１００】
次に、後者の宿主細胞は、それぞれｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ４及びｍＡｂ５からなる群から選択される本開示の抗体の発現及び産生に適した条件下でさらに培養してもよい。
【０１０１】
あるいは、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ４及びｍＡｂ５のいずれかの産生のために無細胞発現系を使用してもよい。典型的には、タンパク質又は抗体の無細胞発現の方法はすでに記載されている（Ｓｔｅｃｈら、２０１７年）。
【０１０２】
免疫コンジュゲート
別の態様では、本開示は、細胞毒、薬物（例えば、免疫抑制剤）又は放射性毒などの治療部分にコンジュゲートされた本明細書で開示される抗ＢＴＮ３Ａ抗体、又はその断片を特徴とする。そのようなコンジュゲートは、本明細書では「免疫コンジュゲート」と呼ばれる。１つ又は複数の細胞毒を含む免疫コンジュゲートは、「免疫毒素」と呼ばれる。細胞毒又は細胞傷害性薬物は、細胞に有害である（例えば、殺傷する）任意の作用物質を含む。例は、タクソン、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ｔ．コルヒチン（ｔ．ｃｏｌｃｈｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ａｎｔｈｒａｃｉｎ  ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミスラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン並びにその類似体又は相同体を含む。治療剤は、例えば、代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルダカルバジン）、アブレーティング剤（ａｂｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）（例えば、メクロレタミン、チオテパクロラムブシル（ｔｈｉｏｅｐａ  ｃｈｌｏｒａｘｎｂｕｃｉｌ）、メルファラン（ｍｅｉｐｈａｌａｎ）、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ））、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミスラマイシン及びアントラマイシン（ＡＭＣ））、モノメチルオーリスタチンＥ及び有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）も含む。
【０１０３】
細胞毒は、当技術分野で利用可能なリンカー技術を使用して本開示の抗体にコンジュゲートすることができる。細胞毒を抗体にコンジュゲートするのに使用されてきたリンカータイプの例は、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィド及びバリン−シトルリンリンカーなどのペプチド含有リンカーを含むがこれらに限定されない。例えば、リソソームコンパートメント内での低ｐＨにより切断されやすい又はカテプシン（例えば、カテプシンＢ、Ｃ、Ｄ）などの腫瘍組織において優先的に発現されるプロテアーゼなどのプロテアーゼにより切断されやすいリンカーを選択することが可能である。
【０１０４】
細胞毒の種類、リンカー及び治療薬を抗体にコンジュゲートするための方法のさらなる考察では、抗体薬物コンジュゲートに関する概説はＰａｎｏｗｓｋｉら、２０１３年も参照されたい。
【０１０５】
本開示の抗体は、放射性免疫コンジュゲートとも呼ばれる細胞傷害性放射性医薬品を作製するために放射性同位元素にコンジュゲートすることもできる。診断用に又は治療用に使用するために抗体にコンジュゲートすることができる放射性同位元素の例は、ヨウ素１３１、インジウム１１１、イットリウム９０、及びルテチウム１７７を含むがこれらに限定されない。放射性免疫コンジュゲートを調製するための方法は当技術分野では確立している。
【０１０６】
二重特異性又は多特異性分子
別の態様では、本開示の抗ＢＴＮ３Ａ抗体を含む二重特異性又は多特異性分子が本明細書でさらに開示される。抗体は、少なくとも２つの異なる結合部位又は標的分子に結合する二重特異性分子を作製するために誘導体化する又は別の機能的分子、例えば、別のペプチド又はタンパク質（例えば、別の抗体又は受容体に対するリガンド）に連結することができる。抗体は、実際、２つよりも多い異なる結合部位及び／又は標的分子に結合する多特異性分子を作製するために誘導体化する又は１つよりも多い他の機能的分子に連結してもよく、そのような多特異性分子は本明細書で使用される用語「二重特異性分子」により包含されることも意図されている。二重特異性分子を作製するために、本発明の抗体は、二重特異性分子が得られるように、別の抗体、抗体断片、ペプチド又は結合部分などの、１つ又は複数の他の結合分子に機能的に連結する（例えば、化学カップリング、遺伝子融合、非共有会合又は他の方法により）ことができる。
【０１０７】
したがって、本開示は、ＢＴＮ３Ａに対して少なくとも１つの第１の結合特異性、例えば、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ４及びｍＡｂ５のいずれか１つの１つの抗原結合部分並びに第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性を含む二重特異性分子を含む。
【０１０８】
さらに、二重特異性分子が多特異性である実施形態では、分子は、第１及び第２の標的エピトープに加えて、第３の結合特異性をさらに含むことができる。
【０１０９】
一実施形態では、本明細書で開示される二重特異性分子は、結合特異性として、少なくとも１つの抗体、又はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ユニボディ又は一本鎖Ｆｖを含むその抗体断片を含む。抗体は、軽鎖若しくは重鎖ダイマー、又はＦｖ若しくはＬａｄｎｅｒらの米国特許第４，９４６，７７８号に記載される一本鎖構築物などのその任意の最小断片でもよい。
【０１１０】
本明細書で開示される二重特異性分子に用いることができる他の抗体は、マウス、キメラ及びヒト化モノクローナル抗体である。
【０１１１】
本開示の二重特異性分子は、当技術分野で公知の方法を使用して、構成要素の結合特異性体をコンジュゲートすることにより調製することができる。例えば、二重特異性分子のそれぞれの結合特異性体は、別々に作製し、その後互いにコンジュゲートすることができる。結合特異性体がタンパク質又はペプチドである場合、種々のカップリング又は架橋剤を共有結合コンジュゲーションに使用することができる。架橋剤の例は、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−サクシニミジル−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマェイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−サクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、及びスルホサクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）を含む（Ｋａｒｐｏｖｓｋｙら、１９８４年；Ｌｉｕら、１９８５年）。他の方法は、Ｂｒｅｎｎａｎら、１９８５年；Ｇｌｅｎｎｉｅら、１９８７年；Ｐａｕｌｕｓ、１９８５年に記載される方法を含む。
【０１１２】
あるいは、両方の結合特異性体は同じベクターにコードされ、同じ宿主細胞において発現され組み立てられることが可能である。この方法は、二重特異性分子がｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２又はリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に特に有用である。本開示の二重特異性分子は、１つの一本鎖抗体及び結合決定基を含む一本鎖分子、又は２つの結合決定基を含む一本鎖二重特異性分子が可能である。
【０１１３】
二重特異性分子のその特異的標的への結合は、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＥＡ）、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ（例えば、増殖阻害及びアポトーシス）、又はウェスタンブロットアッセイにより確かめることができる。これらのアッセイのそれぞれが一般的に、目的の複合体に特異的である標識試薬（例えば、抗体）を用いることにより特定の目的のタンパク質−抗体複合体の存在を検出する。
【０１１４】
本開示の抗体は、人工的Ｔ細胞受容体（キメラＴ細胞受容体又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）としても知られる）を調製するのにも使用しうる。例えば、抗体の可変領域は、膜貫通ドメイン（典型的にはＣＤ８アルファの膜貫通ドメイン）及びＴＣＲ（例えば、ＣＤ３ゼータ）のシグナル伝達エンドドメイン、及び任意選択で共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、４−１ＢＢ又はＣＤ２８由来の）にスペーサーを介して連結されているＦａｂ又はｓｃＦｖを形成するのに使用してもよく、Ｔ細胞の表面で産生されてもよい。そのようなＣＡＲは、例えば、増殖性障害を処置するため養子移植療法において使用してもよい。
【０１１５】
医薬組成物
別の態様では、本開示は、組成物、例えば、本明細書で開示される抗体のうちの１つ又は組合せ、例えば、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ４及びｍＡｂ５からなる群から選択される１つの抗体又はその抗原結合部分を含有し、薬学的に許容される担体と合わせて処方される医薬組成物を提供する。そのような組成物は、上記の（例えば、２つ又はそれよりも多い異なる）抗体、又は免疫コンジュゲート又は二重特異性分子のうちの１つ又は組合せを含んでいてもよい。
【０１１６】
本明細書で開示される医薬組成物は、組合せ療法で、すなわち、他の薬剤と組み合わせて投与することも可能である。例えば、組合せ療法は、本開示の抗ＢＴＮ３Ａ抗体、例えば、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ４及びｍＡｂ５からなる群から選択される１つの抗体又はその抗原結合部分を、少なくとも１つの抗ウイルス、抗炎症又は別の抗増殖剤と組み合わせて含むことができる。組合せ療法で使用することができる治療薬の例は、下の本開示の抗体の使用に関するセクションにはるかに詳細に記載されている。
【０１１７】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、生理的に適合するありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤、並びに同様のものを含む。担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は表皮投与（例えば、注射又は注入により）に適しているべきである。一実施形態では、担体は皮下経路又は腫瘍内注射に適しているべきである。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち、抗体、免疫コンジュゲート、又は二重特異性分子は、化合物を酸の作用及び化合物を不活化する場合がある天然の条件から保護する物質で被覆されてもよい。
【０１１８】
無菌リン酸緩衝食塩水は、薬学的に許容される担体の一例である。他の適切な担体は当業者には周知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｎａｒｏ、１９９５年）。製剤は、１つ又は複数の賦形剤、保存剤、可溶化剤、緩衝剤、バイアル表面上でのタンパク質損失を防ぐためのアルブミン、等をさらに含んでもよい。
【０１１９】
医薬組成物の形態、投与経路、投与量及びレジメンは、当然のことながら、処置される状態、疾患の重症度、患者の年齢、体重、及び性別、等に依存する。
【０１２０】
本開示の医薬組成物は、局所的、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下又は眼球内投与及び同類のもの用に処方することができる。
【０１２１】
好ましくは、医薬組成物は、注射することができる製剤用の薬学的に許容されるビヒクルを含有する。これらの組成物は、特に、等張、無菌、生理食塩水（一ナトリウム若しくは二ナトリウムリン酸塩、ナトリウム、カリウム、カルシウム若しくはマグネシウムクロライド及び同類のもの又はそのような塩の混合物）又は、場合により、減菌水若しくは生理食塩水を添加すると、注射可能液の構成を可能にする乾燥、特に凍結乾燥組成物でもよい。
【０１２２】
投与用に使用される用量は、種々のパラメータの関数として、特に、使用される投与様式の、関連する病理学の、又はあるいは所望の処置期間の関数として適応させることができる。
【０１２３】
医薬組成物を調製するためには、有効量の抗体を、薬学的に許容される担体又は水性媒体に溶解させる又は分散させてもよい。
【０１２４】
注射可能な使用に適した医薬品形態は、無菌水溶液又は分散液；ゴマ油、落花生油又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び無菌注射可能液又は分散液の即時調剤用の無菌粉末又は凍結乾燥物（ｌｙｏｐｈｉｌｉｓａｔｅｓ）を含む。あらゆる場合に、形態は無菌でなければならないし、容易な注入可能性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）が存在するほど流動性でなければならない。形態は、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならないし、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。
【０１２５】
遊離塩基又は薬学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した水で調製することができる。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物で並びに油で調製することもできる。貯蔵及び使用の通常の条件下では、これらの製剤は微生物の増殖を予防する保存剤を含有する。
【０１２６】
本開示の抗体は、中性又は塩の形態で組成物に処方することができる。薬学的に許容される塩は酸付加塩（タンパク質の遊離のアミノ基で形成される）を含み、酸付加塩は、例えば、塩酸若しくはリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸、及び同類のものなどの有機酸で形成される。遊離のカルボキシル基で形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄などの無機塩基、並びにイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン及び同類のものなどの有機塩基に由来することもできる。
【０１２７】
担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール並びに同類のもの）、それらの適切な混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散媒も可能である。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散の場合に必要な粒子径の維持により、及び界面活性剤の使用により維持することが可能である。微生物の作用の予防は、種々の抗菌及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、及び同類のものによりもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましくなる。注射可能組成物の長期の吸収は、組成物中での、吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によりもたらすことができる。
【０１２８】
無菌注射可能液は、必要に応じ、上に列挙した種々のその他の成分と一緒に活性化合物を必要量で適切な溶媒に取込み、続いて無菌濾過することにより調製される。一般に、分散液は、種々の無菌化活性成分を、基本の分散媒及び上に列挙した成分由来の必要な他の成分を含有するビヒクル中に取り込むことにより調製される。無菌注射可能液の調製用の無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技法であり、これらの技法により活性成分プラスその前もって無菌濾過した溶液由来である任意の追加の所望される成分の粉末が得られる。
【０１２９】
直接注射用のさらに、又は高度に濃縮された溶液の調製も検討されており、その場合、極めて迅速に浸透し、小さな腫瘍領域に高濃度の活性成分を送達するように溶媒としてＤＭＳＯの使用が想定される。
【０１３０】
処方すると、溶液は、投与製剤と適合する方法で、治療的に有効な量で投与される。製剤は、上記のようなタイプの注射可能液などの種々の剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセル及び同類のものも用いることが可能である。
【０１３１】
水溶液での非経口投与では、例えば、溶液は、必要ならば、適切に緩衝するべきであり、液体希釈剤は先ず十分な生理食塩水又はグルコースで等張にするべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に特に適している。この点について、用いることができる無菌水性媒体は、本開示を考慮すれば当業者にはわかるであろう。例えば、一投与量は、１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶解し、１０００ｍｌの皮下注入液に添加する又は提唱される注入部位に注射することができると考えられる（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１５版、１０３５〜１０３８頁及び１５７０〜１５８０頁参照）。処置を受ける対象の条件に応じて、投与量のある程度の変動は必ず起こる。投与の責任者が、いずれにしても、個々の対象にとり適切な用量を決定することになる。
【０１３２】
本開示の抗体は、用量あたり約０．０００１〜１．０ミリグラム、又は約０．００１〜０．１ミリグラム、又は約０．１〜１．０若しくは１．０〜約１０ミリグラムさえも含むように治療混合物内に処方してもよい。複数用量も投与することができる。
【０１３３】
抗体の注入又は皮下注射用の溶液に適した処方は、当技術分野に記載されてきており、例えば、Ｃｕｉら、（Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  Ｉｎｄ  Ｐｈａｒｍ  ２０１７年、４３（４）：５１９〜５３０頁）に概説されている。
【０１３４】
静脈内又は筋肉内注射などの非経口投与用に処方される化合物に加えて、他の薬学的に許容される形態は、例えば、経口投与用の錠剤又は他の固体；持効性カプセル；及び現在使用されている他の任意の形態を含む。
【０１３５】
ある特定の実施形態では、宿主細胞中への抗体の導入のためにリポソーム及び／又はナノ粒子の使用が検討されている。リポソーム及び／又はナノ粒子の形成及び使用は当業者には公知である。
【０１３６】
ナノカプセルは一般に、化合物を安定した再現可能な方法で封入することができる。細胞内ポリマー過負荷に起因する副作用を回避するため、そのような超微細な粒子（約０．１μｍのサイズ）は一般に、インビボで分解することができるポリマーを使用して設計される。本開示において使用するため、これらの必要条件を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリレートナノ粒子が検討されており、そのような粒子は容易に作製しうる。
【０１３７】
リポソームは、水性媒体中に分散し、多層同心円状二分子膜小胞（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃ  ｂｉｌａｙｅｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ）（多層小胞（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を自然に形成するリン脂質から形成される。ＭＬＶは一般に、２５ｎｍ〜４μｍの径を有する。ＭＬＶを超音波処理すると、２００〜５００Åの範囲の径を有し、核に水溶液を含有する小単層小胞（ＳＵＶ）が形成される。リポソームの物理特性は、ｐＨ、イオン強度及び二価カチオンの存在に依存する。
【０１３８】
本開示の抗体の使用及び方法
本開示の抗体は、インビトロ及びインビボ診断用及び治療用有用性がある。例えば、これらの分子は、種々の障害を処置する、予防する又は診断するために、例えば、インビトロで、エクスビボで若しくはインビボで培養中の細胞に、又は対象において、例えば、インビボで投与することができる。
【０１３９】
本明細書で使用される場合、用語「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」又は「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、（１）疾患を阻害する；例えば、疾患、状態又は障害の病態又は総体症状を経験している又は示している個人において疾患、状態又は障害を阻害する（すなわち、病態及び／又は総体症状のさらなる進行を停止させ）；及び（２）疾患を軽快させる；例えば、疾患の重症度を減少する又は疾患の１つ又は複数の症状を低減する若しくは軽減するなどの、疾患、状態又は障害の病態又は総体症状を経験している又は示している個人において疾患、状態又は障害を軽快させる（すなわち、病態及び／又は総体症状を元に戻す）のうちの１つ又は複数のことである。特に、腫瘍の処置に関しては、用語「処置」は、腫瘍の成長の阻害、又は腫瘍のサイズの低減のことでもよい。
【０１４０】
本開示の抗体は抗ＢＴＮ３Ａ活性化抗体であり、Ｖγ９  Ｖδ２  Ｔ細胞の細胞溶解機能、サイトカイン産生及び／又は増殖を活性化することができ、それによって、がん患者で及び慢性感染中に観察される免疫抑制機構を克服するのに使用しうる。
【０１４１】
本明細書で使用される場合、用語「がん」、「過剰増殖」及び「新生物」とは、自律増殖、すなわち、急速に増殖する細胞増殖を特徴とする異常な状態又はコンディションをもたらす能力がある細胞のことである。過剰増殖及び新生物疾患状態は、病態、すなわち、疾患状態を特徴付ける若しくは構成するとして分類されてもよく、又は非病態、すなわち、正常からの逸脱であるが疾患状態と関連はないとして分類されてもよい。この用語は、組織病理学的タイプ又は侵襲性の段階とは無関係に、あらゆるタイプのがん腫又は発がん過程、転移性組織又は悪性形質転換（ｍａｌｉｇｎａｎｔｌｙ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）細胞、組織、又は器官を含むことが意図されている。
【０１４２】
用語「がん」又は「新生物」は、肺、乳房、甲状腺、リンパ球、胃腸、及び尿生殖器管を冒すなどの種々の臓器系の悪性腫瘍並びに大半の結腸がん、腎細胞癌、前立腺がん及び／又は精巣腫瘍、肺の非小細胞癌、小腸のがん及び食道のがんなどの悪性腫瘍を含む腺癌を含む。
【０１４３】
がんの例は、Ｂ細胞リンパ球新生物、Ｔ細胞リンパ球新生物、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、Ｂ−ＮＨＬ、Ｔ−ＮＨＬ、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ＮＫ細胞リンパ球新生物及び急性骨髄性白血病を含む骨髄細胞系列新生物などの血液系腫瘍を含むがこれらに限定されない。
【０１４４】
非血液系（ｎｏｎ−ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ）がんの例は、結腸がん、乳がん、肺がん、脳がん、前立腺がん、頭頚部がん、膵臓がん、膀胱がん、結腸直腸がん、骨がん、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、口腔がん、食道がん、甲状腺がん、腎臓がん、胃がん、卵巣がん及び皮膚がんを含むがこれらに限定されない。
【０１４５】
慢性感染症の例は、慢性肝炎、肺感染症、下気道感染症、気管支炎、インフルエンザ、肺炎（ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及び性行為感染症などのウイルス、細菌、寄生虫又は真菌感染症を含むがこれらに限定されない。
【０１４６】
ウイルス感染症の例は、肝炎（ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ）、単純ヘルペス（ＨＳＶ）、帯状疱疹、ＨＰＶ、インフルエンザ（Ｆｌｕ）、ＡＩＤＳ及びＡＩＤＳ関連症候群、水痘（水痘）、感冒、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染症、天然痘（痘瘡）、コロラドダニ熱、デング熱、エボラ出血熱、口蹄疫、ラッサ熱、麻疹、マールブルグ出血熱、伝染性単核球症、流行性耳下腺炎、ノロウイルス、灰白髄炎、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、狂犬病、風疹、ＳＡＲＳ、ウイルス性脳炎、ウイルス性胃腸炎、ウイルス性髄膜炎、ウイルス肺炎、西ナイル病及び黄熱病を含むがこれらに限定されない。細菌感染症の例は、肺炎、細菌性髄膜炎、コレラ、ジフテリア、結核、炭疽病、ボツリヌス中毒、ブルセラ症、カンピロバクター症、チフス、淋病、リステリア症、ライム病、リウマチ熱、百日咳（百日咳）、ペスト、サルモネラ症、猩紅熱、細菌性赤痢、梅毒、破傷風、トラコーマ、野兎病、腸チフス、及び尿路感染症を含むがこれらに限定されない。例は、コクシエラ菌（Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉ）、ウシ流産菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）、トロフェリマ・ウィッペリ（Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ  ｗｈｉｐｐｌｅｉ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）及びマイクロバクテリウム・カネッティ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｎｅｔｔｉｉ）により引き起こされる細菌感染症も含む。
【０１４７】
寄生虫感染症の例は、マラリア、リーシュマニア症、トリパノソーマ症、シャーガス病、クリプトスポリジウム症、肝蛭症、フィラリア症、アメーバ感染症、ジアルジア症、蟯虫感染症、住血吸虫症、条虫症、トキソプラズマ症、旋毛虫症、及びトリパノソーマ症を含むがこれらに限定されない。真菌感染症の例は、カンジダ症、アスペルギルス症、コクシジオイデス症、クリプトコッカス症、ヒストプラスマ症及び足白癬を含むがこれらに限定されない。
【０１４８】
したがって、本開示は、上で開示される障害のうちの１つの処置を、それを必要とする対象において行うための方法であって、前記対象に、上で開示される治療有効量の抗ＢＴＮ３Ａ抗体、典型的には、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ４又はｍＡｂ５のうちの１つを投与することを含む前記方法に関する。
【０１４９】
ある特定の実施形態では、前記対象は、ＢＴＮ３Ａ発現腫瘍を有する患者の中で選択されている。
【０１５０】
上で開示される使用のための抗体は、例えば、上記の疾患の処置又は予防のために、唯一の活性成分として又は他の薬物、例えば、サイトカイン、抗ウイルス、抗炎症薬又は細胞傷害性、抗増殖、化学療法若しくは抗腫瘍薬、細胞療法製品（例えば、γδ  Ｔ細胞組成物）と併せて、例えば、このアジュバンドとして又はこれと組み合わせて投与してもよい。
【０１５１】
例えば、上で開示される使用のための抗体は、細胞療法、特に、γδ  Ｔ細胞療法、化学療法、抗悪性腫瘍薬、又は免疫療法薬と組み合わせて使用してもよい。
【０１５２】
本明細書で使用される場合、「細胞療法」とは、少なくとも治療有効量の細胞組成物をそれを必要とする対象にインビボ投与することを含む療法のことである。患者に投与される細胞は同種間又は自家性でもよい。用語「γδ  Ｔ細胞療法」とは、細胞組成物が有効成分としてγδ  Ｔ細胞、特にＶγ９／Ｖδ２  Ｔ細胞を含む細胞療法のことである。
【０１５３】
細胞療法製品とは、治療目的で前記患者に投与される細胞組成物のことである。前記細胞療法製品は、治療有効用量の細胞及び任意選択で、追加の賦形剤、アジュバンド又は他の薬学的に許容される担体を含む。
【０１５４】
適切な抗悪性腫瘍薬は、限定せずに、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、メクロレタミン、クロラムブシル、メルファラン、ニトロソウレア、テモゾロミド）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、バルルビシン）、タキサン（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル）、エポチロン、トポイソレラーゼＩの阻害剤（例えば、イリノテカン又はトポテカン）、トポイソレラーゼＩＩの阻害剤（例えば、エトポシド、テニポシド、又はタフルポシド（Ｔａｆｌｕｐｏｓｉｄｅ））、ヌクレオチド類似体及び前駆物質類似体（例えば、アザシチジン、アザチオプリン、カペシタビン、シタラビン、フルオロウラシル、ゲミシタビン、ヒドロキシウレア、メルカプトプリン、メトトレキサート、又はチオグアニン）、ペプチド抗生物質（例えば、カルボプラチン、シスプラチン及びオキサリプラチン）、レチノイド（例えば、トレチノイン、アリトレチノイン、ベキサロテン）、ビンカアルカロイド及び誘導体（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン）、キナーゼ阻害剤などの標的療法（例えば、イブルチニブ、イデラリシブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ベムラフェニブ、ビスモデギブ）、プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ）、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（例えば、ボリノスタット又はロミデプシン）を含んでもよい。
【０１５５】
免疫療法薬の例は、限定せずに、ホスホ抗原（ｐｈｏｓｐｈｏａｎｔｉｇｅｎｓ）（例えば、ゾレドロン酸又は他のビスホスホネート）、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体及びサイトカイン（例えば、インターロイキン２（ＩＬ−２）（Ｃｈｏｕｄｈｒｙ  Ｈら、２０１８年、Ｂｉｏｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｉｎｔ．２０１８年５月６日）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）（Ｐａｔｉｄａｒ  Ｍら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．２０１６年１０月；３１：４９〜５９頁）、インターロイキン２１（ＩＬ−２１）（Ｃａｃｃａｍｏ  Ｎ．ら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１２年；７（７）：ｅ４１９４０）、又はインターロイキン３３（ＩＬ−３３）（Ｄｕａｕｌｔ  Ｃら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６年１月１日；１９６（１）：４９３〜５０２頁）、又はその組換え形態及びその誘導体、又はリンパ球活性（例えば、増殖又はサイトカイン産生又は代謝変化）を誘導することができる任意のサイトカインを含む。用語誘導体は、ＰＥＧ化（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖へのコンジュゲーション）、アミノ酸欠失、置換若しくは挿入などの変異、又は増強剤との会合（例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃに融合されたＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ複合体、そこではＩＬ−１５がさらに変異されて（ａｓｎ７２ａｓｐ）この複合体をＩＬ−２及びＩＬ−１５Ｒβγスーパーアゴニストにする生物活性をさらに増やす（Ｒｈｏｄｅ  ＰＲら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ．２０１６年；４（１）：４９〜６０頁））に頼ることができる任意のサイトカイン改変のために使用される（Ｂａｒｒｏｓｏ−Ｓｏｕｓａ  Ｒら、Ｃｕｒｒ  Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐ．２０１８年１１月１５日；２１（１）：１頁）。
【０１５６】
用語「ＩＬ−２」はその一般的な意味を有し、ヒトインターロイキン−２のことである。ＩＬ−２は身体の天然の免疫応答の一部である。ＩＬ−２は、ＩＬ−２受容体に結合することによりリンパ球活性を主に調節する。
【０１５７】
用語「ＩＬ−１５」はその一般的な意味を有し、ヒトインターロイキン−１５のことである。ＩＬ−２と同様に、ＩＬ−１５は、ＩＬ−２／ＩＬ−１５受容体ベータ鎖（ＣＤ１２２）と共通のガンマ鎖（ガンマ−Ｃ、ＣＤ１３２）で構成された複合体に結合しこれを通じてシグナルを送る。ＩＬ−１５はＴ及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化及び増殖を調節する。
【０１５８】
用語「ＩＬ−２１」はその一般的な意味を有し、ヒトインターロイキン−２１のことである。ＩＬ−２１は、ＮＫ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞細胞傷害性を増強する、プラズマ細胞分化を調節する及びＴｒｅｇ細胞を阻害することを含むがこれらに限定されない多面的特性を有すると報告されている。
【０１５９】
用語「ＩＬ−３３」はその一般的な意味を有し、ヒトインターロイキン−３３のことである。ＩＬ−３３は、組織ストレス又は損傷により放出されるアラーミンと見なされており、ＩＬ−１ファミリーのメンバーであり、ＳＴ２受容体に結合する。ＩＬ−３３は、ＴＨ１免疫細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ｉＮＫＴ細胞、及びＣＤ８  Ｔリンパ球の効果的な刺激因子として知られている。
【０１６０】
用語「ＰＤ−１」は当技術分野でのその一般的な意味を有し、プログラム死−１受容体のことである。用語「ＰＤ−１」は、Ｉ型膜貫通タンパク質のことでもあり、これはＣＤ２８、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ−４）、誘導性共刺激分子（ＩＣＯＳ）、並びにＢ−及びＴリンパ球アテニュエータ（ＢＴＬＡ）を含む受容体のＣＤ２８−Ｂ７シグナル伝達ファミリーに属する（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ  ＲＪら、２００５年、Ｒｉｌｅｙ  ＪＬら、２００５年）。
【０１６１】
用語「ＢＴＬＡ」は当技術分野でのその一般的な意味を有し、Ｂ及びＴリンパ球アテニュエータのことである。用語「ＢＴＬＡ」はＣＤ２７２のことでもあり、これはＣＤ２８、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ−４）、誘導性共刺激分子（ＩＣＯＳ）、及びプログラム死−１受容体（ＰＤ−１）を含む受容体のＣＤ２８−Ｂ７シグナル伝達ファミリーのメンバーである（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ  ＲＪら、２００５年、Ｒｉｌｅｙ  ＪＬら、２００５年）。
【０１６２】
用語「抗ＰＤ−１抗体」又は「抗ＰＤ−Ｌ１」は当技術分野でのその一般的な意味を有し、それぞれＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１に対する結合親和性、及びＰＤ−１に対するアンタゴニスト活性を有する抗体のことであり、すなわち、この抗体はＰＤ−１に関係するシグナル伝達カスケードを阻害し、ＰＤ−１リガンド結合（ＰＤ−Ｌ１；ＰＤ−Ｌ２）を阻害する。そのような抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、受容体のＣＤ２８−Ｂ７シグナル伝達ファミリー（ＣＤ２８；ＣＴＬＡ−４；ＩＣＯＳ；ＢＴＬＡ）のその他のサブタイプ又はアイソフォームとのその相互作用よりもそれぞれ大きな親和性及び効力でＰＤ−１を優先的に不活化する。化合物がＰＤ−１アンタゴニストであるかどうかを判定するための試験及びアッセイは当業者に周知であり、例えば、Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら、２００５年；Ｒｉｌｅｙら、２００５年に記載されている。
【０１６３】
そのような抗ＰＤ−１又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体の例は、限定せずに、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、セミプリマブ、又はアテゾリズマブを含む。
【０１６４】
そのようなＣＴＬＡ４抗体の例は、限定せずに、イピリムマブを含む。
【０１６５】
用語「抗ＢＴＬＡ抗体」は当技術分野でのその一般的な意味を有し、ＢＴＬＡに対する結合親和性及びアンタゴニスト活性を有する抗体のことであり、すなわち、この抗体は、ＢＴＬＡに関係するシグナル伝達カスケードを阻害することができる。化合物がＢＴＬＡアンタゴニストであるかどうかを判定するための試験及びアッセイは当業者に周知であり、例えば、（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら、２００５年；Ｒｉｌｅｙら、２００５年）に記載されている。
【０１６６】
一部の実施形態では、抗ＢＴＬＡ抗体は、国際公開第２０１０／１０６０５１号、国際公開第２０１１／０１４４３８号、国際公開第２０１７／１４４６６８号に記載される抗体から選択される。
【０１６７】
一部の実施形態では、抗ＢＴＬＡ抗体は、国際公開第２０１０／１０６０５１号に開示されるなどのＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−４１２３の下で利用できるハイブリドーマから入手可能であるＢＴＬＡ抗体（ＢＴＬＡ８．２）である。
【０１６８】
一部の実施形態では、抗ＢＴＬＡ抗体は、国際公開第２０１１／０１４４３８号に開示される４Ｃ７  ｍＡｂである。
【０１６９】
一部の実施形態では、抗ＢＴＬＡ抗体は、国際公開第２０１７／１４４６６８号に開示される６２９．３  ｍＡｂ、又はそのヒト化バージョン若しくはそのバリアントである。
【０１７０】
前述のことに従えば、本開示はさらなる態様において：本開示の治療有効量の抗ＢＴＮ３Ａ抗体と少なくとも１つの第２の原薬を、例えば、同時に又は順次に同時投与することを含み、前記第２の原薬が抗ウイルス若しくは抗増殖薬又は免疫療法薬（例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１抗体）、又はサイトカイン、例えば、ＩＬ−２若しくはＩＬ−１５、又は、例えば、上で指示されている細胞療法製品（例えば、γδ  Ｔ細胞）である、上で定義される方法を提供する。
【０１７１】
一実施形態では、本開示の抗体を使用すれば、可溶性ＢＴＮ３Ａのレベル、又はＢＴＮ３Ａを発現する細胞のレベルを検出することができる。これは、例えば、試料（例えば、インビトロ試料）及び対照試料を、抗体とＢＴＮ３Ａ（例えば、血液試料中細胞又は可溶性ＢＴＮ３Ａの表面で発現される）の間での複合体の形成を可能にする条件下で抗ＢＴＮ３Ａ抗体に接触させることにより達成することができる。抗体とＢＴＮ３Ａの間で形成されるいかなる複合体も検出され、試料及び対照において比較される。例えば、ＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリーアッセイなどの当技術分野で周知である標準検出法は、本開示の組成物を使用して実施することができる。
【０１７２】
したがって、一態様では、本開示は、試料中でＢＴＮ３Ａ（例えば、ヒトＢＴＮ３Ａ抗原）の存在を検出する、又はＢＴＮ３Ａの量を測定するための方法であって、試料及び対照試料を、抗体又はその部分とＢＴＮ３Ａの間での複合体の形成を可能にする条件下で、ＢＴＮ３Ａに特異的に結合する本開示の抗体若しくはタンパク質、又はその抗原結合領域に接触させるステップを含む方法をさらに提供する。次に、複合体の形成が検出され、対照試料と比べた試料間の複合体形成の違いが試料中のＢＴＮ３Ａの存在を示している。
【０１７３】
本開示の範囲内には、本明細書で開示される組成物（例えば、ヒト化抗体、コンジュゲート抗体及び多特異性分子）及び使用のための説明書からなるキットも存在する。キットは、少なくとも１つの追加の試薬、又は１つ若しくは複数の追加の抗体若しくはタンパク質をさらに含有することができる。キットは典型的には、キットの内容物の意図される使用を示すラベルを含む。用語ラベルは、キット上に若しくは一緒に与えられる、又は他の方法でキットに添付される任意の書面又は記録された資料を含む。キットは、上で定義されるように、患者が抗ＢＴＮ３Ａ抗体処置に応答する群に属するかどうかを診断するためのツールをさらに含んでもよい。
【０１７４】
別の治療戦略は、ヒト対象の試料から単離されたＶγ９  Ｖδ２  Ｔ細胞を選択的に増殖する及び／又は活性化する作用物質としての本明細書で開示されるヒト化抗体の使用に基づいている。
【０１７５】
したがって、本開示は、処置をそれを必要とする対象に施すための方法であって、
（ａ）Ｖγ９  Ｖδ２  Ｔ細胞を含む血液細胞、例えば、対象の血液試料由来のＰＢＭＣを単離するステップと、
（ｂ）ｍＡｂ１、２、４及び５のいずれか１つの存在下でＶγ９  Ｖδ２  Ｔ細胞をインビトロで増殖するステップと、
（ｃ）増殖したＶγ９  Ｖδ２  Ｔ細胞を収集するステップと、
（ｄ）任意選択で、増殖したＶγ９  Ｖδ２  Ｔ細胞を処方し、治療有効量の前記Ｖγ９  Ｖδ２  Ｔ細胞を対象に投与するステップと
を含む方法に関する。
【０１７６】
本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｖγ９  Ｖδ２  Ｔ細胞を選択的に増殖する作用物質としての本明細書で開示されるヒト化抗体（例えば、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ４又はｍＡｂ５）の使用にさらに関する。ＣＡＲ  γδ  Ｔ細胞と養子Ｔ細胞がん免疫療法におけるその使用は、例えば、Ｍｉｒｚａｅｉら、（Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ  ２０１６年、３８０（２）：４１３〜４２３頁）に記載されている。
【０１７７】
本開示は、γδ  Ｔ細胞療法でそれを必要とする、典型的にはがんに罹っている対象において腫瘍細胞の増強剤としてインビボで使用するための抗ＢＴＮ３Ａ抗体にも関する。
【０１７８】
本明細書で使用される場合、用語γδ  Ｔ細胞療法とは、それを必要とする対象に少なくとも有効量のγδ  Ｔ細胞を投与することを含む療法のことである。そのようなγδ  Ｔ細胞は同種である又は自家性でもよい。特定の実施形態では、γδ  Ｔ細胞は、特定の遺伝子の欠失若しくはノックアウト又は挿入若しくはノックインにより遺伝子操作することができる。特定の実施形態では、前記γδ  Ｔ細胞はキメラ抗原受容体を発現するγδ  Ｔ細胞を含む。γδ  Ｔ細胞は、エクスビボで増殖され及び／又は精製されていてもよい。あるいは、γδ  Ｔ細胞は、他の血液細胞、例えば、免疫系の他の細胞を含む細胞組成物に含まれていてもよい。γδ  Ｔ細胞療法に関する参考文献については、Ｐａｕｚａ  ＣＤ．ら、Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１８年６月８日；９：１３０５．ｄｏｉ：１０．３３８９、Ｓａｕｄｅｍｏｎｔ  Ａ．ら、Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１８年２月５日５；９：１５３．ｄｏｉ：１０．３３８９．を参照されたい。
【０１７９】
実際、いかなる特定の理論にも縛られずに、本開示の抗ＢＴＮ３Ａ抗体の提唱された作用機序は、抗ＢＴＮ３Ａ抗体が腫瘍細胞の表面で発現されるＢＴＮ３Ａに結合すると立体構造変化の引き金を引き、これによりＶγ９  Ｖδ２  Ｔ細胞上の対抗受容体へのそのシグナル伝達が可能になるというものである。
【０１８０】
したがって、本開示は、がん、例えば、血液系腫瘍、特に、急性骨髄性白血病などの白血病に罹っており、腫瘍細胞、例えば、血液腫瘍細胞を有する対象の処置の方法であって、
（ｉ）前記対象において、本明細書で開示される有効量の抗ＢＴＮ３Ａ抗体、典型的には、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ４又はｍＡｂ５を投与するステップと、
（ｉｉ）前記対象において有効量のγδ  Ｔ細胞組成物を投与するステップと
を含み、前記有効量の抗ＢＴＮ３Ａ抗体が、前記腫瘍細胞に対して前記γδ  Ｔ細胞組成物により媒介される抗腫瘍細胞溶解を増強する能力を有する前記方法に関する。
【０１８１】
本開示は、固形腫瘍細胞、例えば、卵巣がん細胞のあるがんに罹っている対象を処置するための方法であって、
（ｉ）前記対象において、本明細書で開示される有効量の抗ＢＴＮ３Ａ抗体、典型的には、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ４又はｍＡｂ５を投与するステップと、
（ｉｉ）前記対象において有効量のγδ  Ｔ細胞組成物を投与するステップと
を含み、前記有効量の抗ＢＴＮ３Ａ抗体が、前記腫瘍細胞に対して前記γδ  Ｔ細胞組成物により媒介される抗腫瘍細胞溶解を増強する能力を有する前記方法にさらに関する。
【０１８２】
本開示は、処置をそれを必要とする対象に施すための方法であって、ＣＡＲ  Ｔ細胞、例えば、ＣＡＲ  γδ  Ｔ細胞と本明細書で開示されるヒト化抗体（例えば、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ４又はｍＡｂ５）の併用（同時又は順次）投与を含む前記方法にも関する。
【０１８３】
十分に説明された本発明は、この時点で、以下の例によりさらに図解されるが、これらの例は説明的なものにすぎず、さらに限定的であることを意図されていない。
【実施例】
【０１８４】
ヒト化バリアントの選択
１．ヒト化戦略の説明
ａ．複合ヒト抗体（商標）可変領域配列の設計
マウス７．２及び２０．１抗体Ｖ領域の構造モデルを、Ｓｗｉｓｓ  ＰＤＢを使用して作製し、抗体の結合特性に不可欠である可能性があるＶ領域中の重要な「拘束」アミノ酸（“ｃｏｎｓｔｒａｉｎｉｎｇ”  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）を同定するために分析した。ＣＤＲ内に含有される大半の残基（ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａ定義の両方を使用して）はいくつかのフレームワーク残基と共に重要であると見なされた。上記の分析から、７．２及び２０．１抗体の複合ヒト配列が生み出された。
【０１８５】
ｂ．ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ回避
構造分析に基づいて、７．２及び２０．１ヒト化バリアントを作り出すのに使用することができる大きな予備セットの配列セグメントを選択し、ヒトＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子に結合するペプチドのインシリコ分析のためのｉＴｏｐｅ（商標）技術（Ｐｅｒｒｙら、２００８年）を使用して、及び公知の抗体配列関連Ｔ細胞エピトープのＴＣＥＤ（商標）（Ｂｒｙｓｏｎら、２０１０年）を使用して分析した。ヒトＭＨＣクラスＩＩへの有意な非ヒト生殖系列バインダーとして同定された又はＴＣＥＤ（商標）に対して有意なヒットのスコアを示した配列セグメントは廃棄した。これによりセグメントのセットは減少し、これらのセグメントの組合せを上記と同じように再び分析し、セグメント間の接合部が潜在的なＴ細胞エピトープを含有しないことを確かめた。選択された配列セグメントは、有意なＴ細胞エピトープを欠くと予測される完全Ｖ領域配列に組み立てた。次に、いくつかの重鎖及び軽鎖配列を、ｍＡｂ７．２及び２０．１についての哺乳動物細胞での遺伝子合成及び発現用に選択した。
【０１８６】
２．ヒト化バリアントの作製及び予備的特徴づけ
ａ．ヒト化バリアントプラスミドの構築
７．２及び２０．１ヒト化バリアントは、ヒトＩｇＧ４（Ｓ２４１Ｐ、Ｌ２４８Ｅ）重及びカッパ軽鎖用の発現ベクター系中にクローニングするため隣接する制限酵素部位を用いて合成した。すべての構築物は塩基配列決定により確かめた。
【０１８７】
ｂ．抗体の発現
キメラ７．２及び２０．１（ＶＨ０／Ｖκ０）、２つの対照組合せ（ＶＨ０／Ｖκ１、ＶＨ１／Ｖκ０）並びにヒト化重鎖及び軽鎖の組合せは、対応するエンドトキシンフリーＤＮＡからＭａｘＣｙｔｅ  ＳＴＸ（登録商標）エレクトロポレーションシステム（ＭａｘＣｙｔｅ  Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＵＳＡ）を使用してＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＣＨＯ−Ｓ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＵＫ）中に一過性でトランスフェクトした。トランスフェクションは、ＯＣ−４００プロセスアセンブリー（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ）を使用してそれぞれの抗体において着手した。細胞回収に続いて、細胞は、８ｍＭのＬ−グルタミン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＵＫ）及び１×ヒポキサンチン−チミジン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＵＫ）を含有するＣＤオプティ−ＣＨＯ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＵＫ）中に３×１０６細胞／ｍＬまで希釈した。トランスフェクションの２４時間後、培養温度は３２℃まで下げ、１ｍＭの酪酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ）を添加した。培養物は、３．６％（開始容積の）のフィード（２．５％のＣＨＯ  ＣＤエフィシエントフィードＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＵＫ）、０．５％のイーストレート（Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）、０．２５ｍＭのグルタマックス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＵＫ）及び２ｇ／Ｌグルコース（Ｓｉｇｍａ、Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ））の添加により毎日養った。ＩｇＧ上澄みタイターは、ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡによりモニターし、トランスフェクション物は、上澄みを収穫する前に１４日間まで培養した。
【０１８８】
ｃ．予備的親和性測定：ＢＴＮ３Ａに結合するヒト化バリアントのシングルサイクル動態解析
すべての７．２及び２０．１複合ヒト抗体（商標）バリアントの結合を評価し、ＢＴＮ３Ａに対して最も高い親和性を有する抗体を選択するため、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウェアＶ２．０．１（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を実行するＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（製造番号１９０９９１３）を使用してトランスフェクトされた細胞培養物由来の上澄みでシングルサイクル動態解析を実施した。
【０１８９】
抗体は、ＥＬＩＳＡにより力価を滴定した（ｔｉｔｅｒｅｄ）上澄みから得た濃度に基づいて２％のＢＳＡ／ＰＢＳで２μｇ／ｍｌの最終濃度まで希釈した。それぞれのサイクルの開始時、抗体は、プロテインＡチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、ＵＫ）のＦｃ２、Ｆｃ３及びＦｃ４上にロードした。ＩｇＧは１０μｌ／分の流速で捕捉され、約５０ＲＵのＲＭａｘを得るための理論値である約１４６．５ＲＵの固定化レベル（ＲＬ）を与えた。次に、表面を安定化させておいた。シングルサイクル動態データは、いかなる潜在的な物質移動効果も最小限に抑えるために流速６０μｌ／分で分析物としてＢＴＮ３Ａ１−Ｈｉｓ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  カタログ番号１５９７３−Ｈ０８Ｈ）を用いて、並びに泳動用バッファーとしてＨＢＳ−Ｐ＋（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、ＵＫ）を使用して得た。キメラ抗体を用いた複数回繰り返しを実施して、動態解析での表面及び分析物の安定性を調べた。参照チャネルＦｃ１（抗体なし）からのシグナルは、Ｆｃ２、Ｆｃ３及びＦｃ４のシグナルから引き算して、参照表面への非特異的結合の差を補正した。それぞれの濃度間の再生なしでの１．５６ｎＭ〜２５ｎＭのＢＴＮ３Ａ１の３点４倍希釈範囲を使用した。漸増濃度のＢＴＮ３Ａ１の３回注射についての会合期は毎度２４０秒間モニターし、シングル解離期はＢＴＮ３Ａ１の最後の注射に続いて２０００秒間モニターした。プロテインＡ表面の再生は、１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ  ｐＨ１．５の２回注射を使用して実行し、続いて２４０秒の間安定化させた。
【０１９０】
それぞれの抗体空実験（ＣＤ２７７なし）からのシグナルを引き算して、表面安定性の差を補正した。シングルサイクル動態により、すべてのヒト化バリアントがＢＴＮ３Ａに結合したことが示された。
【０１９１】
ｄ．抗体の精製
Ｂｉａｃｏｒｅ、並びにｉＴｏｐｅ（商標）スコア及びそれぞれのヒト化バリアントのヒト性（ｈｕｍａｎｎｅｓｓ）の百分率に基づいて、最良の親和性及び最良のｉＴｏｐｅ（商標）スコアを有する７．２及び２０．１ヒト化バリアントがさらなる分析のために選択された。
【０１９２】
選択されたヒト化バリアントは、そのキメラバージョン及び最も保存的にヒト化されたバリアント（ＶＨ１／Ｖκ１）と共に、さらなるアッセイ試験のために精製を受けた。抗体は、プロテインＡセファロースカラム、続いて移動相として１０ｍＭの酢酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５及び最終処方バッファーを使用するサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、ＵＫ）上で細胞培養上澄みから精製した。試料は、予測されるアミノ酸配列に基づいて消衰係数（Ｅｃ（０．１％））を使用してＯＤ２８０ｎｍにより定量化した。
【０１９３】
抗体は、２μｇのそれぞれの抗体をゲル状にロードすることによりＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分析し、典型的な抗体のプロファイルに対応するバンドが観察された。
【０１９４】
ｅ．結合特性の検証：ヒト化とキメラ７．２及び２０．１ｍＡｂの間の競合ＥＬＩＳＡ分析
精製されたバリアントは、対応するマウス抗体に対して競合する一方での組換えＢＴＮ３Ａ１−Ｈｉｓ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  カタログ番号１５９７３−Ｈ０８Ｈ）へのその結合について試験した。キメラ（ＶＨ０／Ｖκ０）及び無関係なヒトＩｇＧ４（Ｓ２４１Ｐ、Ｌ２４８Ｅ）は比較のためにそれぞれのプレート上で試験した。
【０１９５】
ＢＴＮ３Ａ１は１×ＰＢＳに０．５μｇ／ｍｌまで希釈し、１００μｌ／ウェルを４℃で９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上に被覆した。次の日、プレートは１×ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄し、２００μｌの２％乳／ＰＢＳを用いて室温で１時間ブロックした。希釈９６ウェルプレートでは、固定した濃度の７．２又は２０．１（０．１５μｇ／ｍｌ最終濃度）を等容積で４倍滴定シリーズの試験抗体に添加した（ブロッキングバッファーに希釈した８０μｇ／ｍｌから開始する（４０μｇ／ｍｌ最終濃度））。Ｎｕｎｃ  ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、１００μｌのマウス／試験抗体混合物をＥＬＩＳＡプレートに添加した。室温での１時間インキュベーション後、プレートはＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ブロッキングバッファーに１対１０００で希釈した抗マウスＦｃ  ＨＲＰ−標識二次抗体（Ｓｉｇｍａ、Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ）１００μｌを室温で１時間適用して、結合したマウス抗体を検出した。発色現象では、プレートはＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、これに続いて１００μｌのＴＭＢ基質を添加し、室温で５分間インキュベートした。反応は１００μｌの３．０Ｍの塩酸で停止させ、Ｄｙｎｅｘプレートリーダーを４５０ｎｍで使用して吸光度を直ちに読取った。
【０１９６】
ＩＣ５０値はそれぞれのバリアントにおいて計算し、相対的ＩＣ５０値は、ヒト化バリアントのＩＣ５０を同じプレート上でアッセイしたキメラ抗体のＩＣ５０で割ることにより計算した。
【０１９７】
３．ヒト化候補の選択
ａ．マルチサイクル動態解析
競合ＥＬＩＳＡ及び熱安定性評価から生まれたデータに基づいて、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウェアＶ２．０．１（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を実行するＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（製造番号１９０９９１３）機器を使用してＶＨ０／Ｖκ０キメラ抗体と共にヒト化７．２及び２０．１バリアントの大半でマルチサイクル動態解析を実施した。
【０１９８】
精製された抗体は２％ＢＳＡ／ＰＢＳ中２μｇ／ｍｌの濃度まで希釈した。それぞれのサイクルの開始時、それぞれの抗体はプロテインＡ上で約１４６．５ＲＵ（約５０ＲＵのＲＭａｘを得るための理論値）の密度（ＲＬ）で捕捉された。捕捉に続いて、表面は、ＢＴＮ３Ａ１抗原（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  カタログ番号１５９７３−Ｈ０８Ｈ）の注射前に安定化させておいた。ＢＴＮ３Ａ１は、０．１％のＢＳＡ／ＨＢＳ−Ｐ＋（ランニングバッファー）において２５〜０．７８ｎＭの２倍希釈範囲で力価を滴定した。会合期は約４００秒間、解離期は３５分（２１００秒）間モニターした。動態データは、いかなる潜在的な物質移動効果も最小限に抑えるために流速５０μｌ／分を使用して得た。プロテインＡ表面の再生は、それぞれのサイクルの終了時に１０ｍＭのグリシン−ＨＣＬ  ｐＨ１．５の２回注射を使用して実行した。２つの空（ＢＴＮ３Ａなし）及び単一濃度の分析物の繰り返しは、動態サイクルでの表面及び分析物の安定性を点検するためにそれぞれの試験した抗体において実施した。参照チャネルＦｃ１からのシグナルをＦｃ２、Ｆｃ３及びＦｃ４のシグナルから引き算して参照表面への非特異的結合の差を補正した。さらに、空試験をそれぞれのＦｃにおいて引き算して、ドリフトなどのいかなる抗原非依存性シグナル変動も補正した。センサーグラム（Ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍｓ）は、グルーバルＲＭａｘパラメータがありバルクシグナルのない１対１結合数学モデルを使用してフィットさせた（定常ＲＩ＝０ＲＵ）。
【０１９９】
ｂ．ヒトＰＢＭＣ上でのフローサイトメトリーによる結合アッセイ
７．２及び２０．１ヒト化バリアントを、健康なドナーの血液から単離したヒトＰＢＭＣへのその結合について特徴付けた。ＰＢＭＣは、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ−ｓｈｉｅｌｄ、Ｄｕｎｄｅｅ、ＵＫ）密度遠心分離を使用して、軟膜から単離した。次に、ＰＢＭＣは凍結し、必要になるまで−８０℃で又は液体窒素中で保存した。
【０２００】
１×１０６細胞／ｍｌで１００μｌの細胞を新しいＵ字型底９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに移し、次に、プレートは遠心分離して上澄みを廃棄した。
【０２０１】
抗体の段階希釈、０．００１μｇ／ｍｌ〜１５０μｇ／ｍｌをＰＢＳ  ２ｍＭ  ＥＤＴＡで調製した。ヒトＰＢＭＣは、調製した希釈試験抗体滴定系列の５０μｌに再懸濁した。
【０２０２】
暗所での４℃、３０分間のインキュベーション後、プレートは遠心分離し、１５０μｌ／ウェルのＰＢＳ  ２ｍＭ  ＥＤＴＡで２回洗浄し、これに続いてウェルは、ＰＢＳ  ２ｍＭ  ＥＤＴＡ中１／１００に希釈したヤギ抗ヒト抗体（ＰＥ標識されている）及び１／５００に希釈したＬｉｖｅ／ｄｅａｄ  ｎｅａｔ  ＩＲで構成された混合物の５０μｌに再懸濁した。
【０２０３】
暗所での４℃、１５分間のインキュベーション後、プレートは遠心分離し、１５０μｌ／ウェルのＰＢＳ  ２ｍＭ  ＥＤＴＡで１回洗浄し、これに続いてウェルは２００μｌのＰＢＳ  ２ｍＭ  ＥＤＴＡに再懸濁した。細胞は、ＢＤ  ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ血球計数器上で分析した。データは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（バージョン１０、ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＵＳＡ）を使用して解析した。（データは示さず）。
【０２０４】
カニクイザルＰＢＭＣとダウディバーキットリンパ腫細胞株では同じプロトコールを実施した。
【０２０５】
ｃ．インビトロ機能的有効性：γδ−Ｔ細胞脱顆粒アッセイ
アッセイは、ダウディバーキットリンパ腫細胞株に対するγδ−Ｔ細胞脱顆粒への７．２及び２０．１ヒト化バリアント及びそのキメラバージョンの活性化又は阻害効果を測定することからなる（Ｈａｒｌｙら、２０１２年）。γδ−Ｔ細胞は、ゾレドロン酸（１μＭ）及びＩＬ２（２００Ｕｉ／ｍｌ）を用いて１１〜１３日間培養することにより、健康なドナーのＰＢＭＣから増殖した。ＩＬ２は５日目、８日目及びその後２日ごとに添加される。γδ−Ｔ細胞の百分率は、培養開始時に決定され、フローサイトメトリーにより少なくとも８０％に達するまで培養時間の間評価した。次に、凍結又は新鮮なγδ−Ｔ細胞を、ダウディ細胞株に対する脱顆粒アッセイにおいて使用し（１対１のＥ対Ｔ比）、細胞は、１０μｇ／ｍｌの７．２及び２０．１ヒト化バリアント及びそのキメラバージョンの存在下、３７℃で４時間共培養した。ＰＭＡ（２０ｎｇ／ｍｌ）プラスイオノマイシン（１μｇ／ｍｌ）の活性化はγδ−Ｔ細胞脱顆粒について正の対照として働き、培地単独は負の対照として働いた。４時間の共インキュベーションの終了時、細胞はフローサイトメトリーにより分析し、ＣＤ１０７ａ（ＬＡＭＰ−１、リソソーム膜タンパク質−１）＋ＣＤ１０７ｂ（ＬＡＭＰ−２）に陽性であるγδ−Ｔ細胞の百分率を評価した。活性化誘導顆粒開口放出に続いてＣＤ１０７は細胞表面に集結し、したがって、表面ＣＤ１０７の測定は、最近脱顆粒した細胞溶解Ｔ細胞を特定するための高感度マーカーである。結果は試験された候補間でいかなる有意な変動も示さず、これにより、脱顆粒アッセイにおいてキメラ７．２又は２０．１抗体と類似する活性化効果が示された。
【０２０６】
ダウディ細胞の代わりに標的細胞として患者から単離したＡＭＬ芽細胞を使用して同じプロトコールを実施した。
【０２０７】
ｄ．熱安定性分析
選択された７．２及び２０．１複合ヒト抗体（商標）バリアントの熱安定性を評価するため、融解温度（タンパク質ドメインの５０％がアンフォールドされる温度）を蛍光ベースの熱シフトアッセイを使用して決定した。
【０２０８】
すべての精製されたヒト化抗体、及びキメラ（ＶＨ０／Ｖκ０）抗体を、１０００中１の希釈度でＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＵＫ）を含有する製剤バッファー（１０ｍＭの酢酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５）中０．１ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで希釈し、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＵＫ）上５６分間の時間をかけて２５℃〜９９℃の温度勾配にかけた。１０ｍＭの酢酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５を負の対照として使用した。融解曲線は、タンパク質熱安定性ソフトウェア（バージョン１．２）を使用して分析した。
【０２０９】
ｅ．ヒト化候補の選択
上記の実験について得られたすべての結果に基づいて、３５（７．２について作製された１５のヒト化バリアント；２０．１について作製された２０のヒト化バリアント）から３つのバリアント：７．２（ＶＨ２／Ｖκ１）、７．２（ＶＨ２／Ｖκ２）及び２０．１（ＶＨ３／Ｖκ１）をさらなる特徴付けのために選択した。
【０２１０】
ｍＡｂ７．２及び２０．１についての上記の異なる実験の結果は、３つのバリアント及びそのキメラバージョンについて表４及び表５に報告されている。
【表４】
2021533204.tif 000005
【表５】
2021533204.tif 000006
ヒト化プロセスにより免疫原性の減少が予測される複数の７．２及び２０．１バリアントが作製される。
【０２１１】
３つのバリアント（７．２  ＶＨ２／Ｖκ１、７．２  ＶＨ２／Ｖκ２及び２０．１  ＶＨ３／Ｖκ１）の選択されたセットは、親和性、結合及び機能アッセイにおける有効性の点でそのキメラバージョンと等価な特性を示した。免疫原性を低減するためにバリアント配列に加えられた改変は抗体機能を変えなかった。
【０２１２】
驚くべきことに、選択されたヒト化バリアント７．２  ＶＨ２／Ｖκ１、７．２  ＶＨ２／Ｖκ２の熱安定性はキメラ抗体と比べて改善されており、そのような改善された熱安定性はヒト化のこのプロセスでは予想外であった。
【０２１３】
抗体の定常領域：サイレントＦｃ断片の比較
抗体のエフェクター機能を沈黙させる又は低減するために、いくつかのＦｃ部分を試験した。異なるＦｃγ受容体へのこれらのＦｃ断片の結合は、Ｂｉａｃｏｒｅを使用して評価し、Ｃ１ｑ複合体上でのその結合はＥＬＩＳＡアッセイにより評価した。
【０２１４】
１．Ｂｉａｃｏｒｅを使用しての異なるＦｃγ受容体への操作されたＦｃ部分の結合
キメラ抗体２０．１の異なるアイソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ１［Ｎ３１４Ａ］、ＩｇＧ１［Ｌ２４７Ｆ、Ｌ２４８Ｅ  Ｐ３５０Ｓ］、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４［Ｓ２４１Ｐ］及びＩｇＧ４［Ｓ２４１Ｐ  Ｌ２４８Ｅ］）が異なるＦｃγ受容体に結合する能力は、精製された抗体及びシングルサイクルＢｉａｃｏｒｅ分析を使用して判定した。ヒトＦｃ受容体、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ（Ａｒｇ１６７多型）及びＩＩＢ、並びにＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｐｈｅ１７６多型）及びＩＩＩＢはＳｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから入手した。
【０２１５】
Ｆｃγ受容体は、ＨＢＳ−Ｐ＋（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、ＵＫ）に最終濃度０．５又は１．０μｇ／ｍｌまで希釈した。それぞれのサイクルの開始時、Ｆｃγ受容体を抗Ｈｉｓ  ＣＭ５チップのＦｃ２、ＦＣ３及びＦｃ４（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、ＵＫ）上にロードした。Ｆｃγ受容体は、流速５μｌ／分で捕捉して、Ｆｃγ受容体の分子量に応じて３０〜１８０  ＲＵの固定化レベルを得た。次に、表面を安定化させておいた。シングルサイクル動態データは、いかなる潜在的な物質移動効果も最小限に抑えるために流速３０μｌ／分で分析物としてキメラ抗体を使用して得た。参照チャネルＦｃ１（抗体なし）からのシグナルをＦｃ２、ＦＣ３及びＦｃ４のシグナルから引き算して、参照表面への非特異的結合の差を補正した。５点３倍希釈範囲をそれぞれのキメラ抗体において使用し、この濃度範囲は親和性の予測される差のせいでそれぞれ個々のＦｃγ受容体において変動した。それぞれの空試験（抗体なし）からのシグナルを引き算して、表面安定性の差を補正した。漸増濃度のキメラ抗体の５回注射のそれぞれについての会合期を、２５〜１８０秒（Ｆｃγ受容体リガンドに応じて）間モニターし、シングル解離期は、抗体の最後の注射に続いて２５〜３００秒間測定した。抗Ｈｉｓ表面の再生は、それぞれ３０μｌ／分で１５秒間、１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ  ｐＨ１．５の２回注射を使用して実行し、続いて１８０秒間安定化させた。
【０２１６】
シングルサイクル動態定数は、可能な場合には、標準１対１分析モデルを使用して決定した。強い相互作用では、動態実験を経て親和性を決定するほうが一般的に適切であった。しかし、いくつかのＦｃγ受容体では、相互作用は非常に弱く、このシナリオでは、データは安定した状態の親和性分析（これは弱い〜中程度の相互作用の測定に特に適している）を使用して解析した。Ｆｃγ受容体とキメラ抗体の相互作用についてのセンサーグラムを得た（データは示さず）。
【０２１７】
予想通り、高親和性ＦｃγＲＩ受容体は非改変ＩｇＧ１及びＩｇＧ４（Ｓ２４１Ｐ）に良好な親和性で結合した。改変ＩｇＧ１アイソタイプは、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４（Ｓ２４１Ｐ、Ｌ２４８Ｅ）と共に、ＦｃγＲＩに結合できなかった。残りのＦｃγ受容体は、ＦｃγＲＩと比べて異なるキメラ抗体に対してはるかに低い親和性相互作用を示した。予想通り、非改変ＩｇＧ１は比較的低い親和性受容体の４つすべてへの最も強い結合を示し、ＩｇＧ１の改変バージョンはこれらの受容体への有意に減少した結合を示した。ＩｇＧ２及びＩｇＧ４（Ｓ２４１Ｐ）は、ＦｃγＲＩＩＡ及びＢへのある程度の結合を示したが、ＦｃγＲＩＩＩＡ及びＢへの結合はわずかでしかなかった。
【０２１８】
２．ＥＬＩＳＡアッセイによるＣ１ｑ複合体への操作されたＦｃ部分の結合
キメラ抗体２０．１を、Ｃ１ｑ複合体への結合について異なるＩｇＧアイソタイプとして試験して、補体系を活性化するその能力を判定した。
【０２１９】
Ｕ字型底９６ウェルプレートでは、異なるアイソタイプでの精製されたキメラ２０．１の２．５倍希釈系列（１０μｇ／ｍｌ〜０．０４μｇ／ｍｌ）を２％ＢＳＡ／ＤＰＢＳで調製した。Ｎｕｎｃ  Ｉｍｍｕｎｏ  ＭａｘｉＳｏｒｐ  ９６ウェル平底マイクロタイタープレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＵＫ）は、１００μｌ／ウェルのこの滴定系列でプレコートし、４℃で一晩インキュベートした。次の日、プレートをＰＢＳＴで２回洗浄し、２％ＢＳＡ／ＤＰＢＳを用いて室温で１時間ブロックし、その後ＰＢＳＴで５回洗浄した。２％ＢＳＡ／ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌまで希釈した精製された補体タンパク質Ｃ１ｑ（Ｐａｔｈｗａｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｌｔｄ、Ｄｏｒｋｉｎｇ、ＵＫ）をプレートに添加し（１００μｌ／ウェル）、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄後、Ｃ１ｑ複合体の結合は、室温で１時間、抗Ｃ１ｑ−ＨＲＰ（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）（１００μｌ／ウェル、２％のＢＳＡ／ＤＰＢＳにおいて１００中１に希釈）を用いて検出した。ＰＢＳＴで５回洗浄後、結合は、ＴＭＢ基質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＵＫ）を用いて検出し、これに続いて反応は３Ｍ  ＨＣＬで停止させ、吸光度はＤｙｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＭＲＸ  ＴＣ  ＩＩプレートリーダー上４５０ｎｍで読取り、結合曲線をプロットした。
【０２２０】
予測通り、非改変ＩｇＧ１アイソタイプのみがＣ１ｑへの良好な結合を示し、他のアイソタイプは最小の結合、乃至は結合なしを示した（データは示さず）。
【０２２１】
３．操作されたＦｃ断片の選択
Ｆｃγ受容体及びＣ１ｑ複合体上でのすべての試験したアイソタイプの相対的結合は表６に記載されている。
【表６】
2021533204.tif 000007
２つの操作されたＩｇＧ１  Ｌ２４７Ｆ、Ｌ２４８Ｅ、Ｐ３５０Ｓ及びＩｇＧ４  Ｓ２４１Ｐ、Ｌ２４８Ｅ  Ｆｃ断片はＦｃγＩ受容体及びＣ１ｑ複合体上での結合の全損失を示す唯一の断片であった。
【０２２２】
得られた結果に基づいて、２つの操作されたＩｇＧ１  Ｌ２４７Ｆ、Ｌ２４８Ｅ、Ｐ３５０Ｓ及びＩｇＧ４  Ｓ２４１Ｐ、Ｌ２４８Ｅアイソタイプはさらなる特徴付けのために選択された。
【０２２３】
６つのヒト化抗体の作製
３つの選択されたヒト化バリアントをクローニングして、２つの選択され操作されたＦｃ断片に融合させ、６つの異なる候補：ｍＡｂ１〜ｍＡｂ６を作製した。
【０２２４】
表１に記載される例ｍＡｂ１〜ｍＡｂ６は、従来の抗体組換え産生及び精製プロセスを使用して産生することができる。
【０２２５】
例えば、コード配列は、哺乳動物産生細胞株において組換え発現用の産生ベクター中にクローニングされている。
【０２２６】
以下の表７及び表８は、本発明を実行するのに、特に、核酸、発現ベクター及び本開示のマウス７．２由来のヒト化抗体を産生するのに有用な詳細なアミノ酸及びヌクレオチド配列を提供する。
【表７】
2021533204.tif 000008
【表８】
2021533204.tif 000009
2021533204.tif 000010
2021533204.tif 000011
2021533204.tif 000012
2021533204.tif 000013
2021533204.tif 000014
【０２２７】
６つのヒト化バリアントの開発可能性特性
１．細胞株の作製
ａ．発現ベクター構築
重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子配列をベクター中にクローニングした。遺伝子系を使用してＣＨＯ細胞において抗体を発現した。抗体発現は、ＥＦ１アルファプロモーターの制御下であった。発現ベクターは、トランス遺伝子を周囲のクロマチンのサイレンシング効果から遮蔽する独特な遺伝子エレメントを帯びる（Ｇｉｒｏｄら、２００７年）。転写は最高レベルで維持され、トランス遺伝子組込み部位とは無関係であり、安定した高レベルのタンパク質発現がもたらされる。
【０２２８】
ｂ．細胞株開発
ＣＨＯ宿主細胞株は、アメリカ１２４培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）のＣＨＯ−Ｋ１  ＣＣＬ−６１細胞由来であり、既成組成のＢａｌａｎＣＤ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ培養培地（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中浮遊状態で増殖するように適応させている。細胞はＮｅｏｎトランスフェクションシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。
【０２２９】
ｃ．ＣｌｏｎｅＰｉｘ  ＦＬ装置を使用する単細胞クローニング
全手順を通じてずっと細胞の環境を変化させないでおくため、同じ培地（ＢａｌａｎＣＤ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ、Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、トランスフェクション、単細胞クローニング、及び産生のための基本培地として使用した。それぞれのベクターのトランスフェクションに続いて、ピューロマイシン選択圧を適用して安定なプールを作製した。希釈した細胞は半固体培地（ＣｌｏｎｅＭｅｄｉａ（著作権）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）中に蒔き、プレートは加湿インキュベーターにおいて３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。増殖したコロニーは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ製のＣｌｏｎｅＰｉｘ（商標）ＦＬ  Ｉｍａｇｅｒを使用して選び取り、９６ウェルプレートに移し、次に、最初の２４ウェル、次に６ウェルＴＣプレートで増殖した。
【０２３０】
ｄ．フェドバッチ性能評価
個々のクローンの増殖及び産生能力は、Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ７  Ａ＋７Ｂフィード（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＳＡ）を使用して１０日フェドバッチプロセスで細胞増殖能力及び生産力の基準により最良のクローンを選択するために、１２５ｍｌの振盪フラスコにおいて評価した。フェドバッチ培養は０．３×１０６細胞／ｍｌの細胞濃度で開始した。
【０２３１】
細胞増殖及び生産力について得られた結果は表９にまとめている。
【０２３２】
２．製造可能性評価のための試料調製
それぞれの候補抗体は、澄ませたＣＨＯ細胞上澄みプールからプロテインＡ捕捉により精製し、試験用に十分な材料を確保するためにそれぞれのバリアントにおいて２つのプールが必要であった。タンパク質濃度はＵＶ法によりすべての捕捉後試料について決定した。試料回収及び収率は大多数の試料について８９％よりも大きく、すべてのバリアントが類似する収率を示した。次に、それぞれの抗体は、フロースルー物質が製剤用の標的ｐＨに到達するまで、３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ遠心分離フィルターユニットを使用して２５ｍＭのヒスチジン、１２５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０中にバッファー交換した。交換ステップ中、バリアントのいずれについても交換中タンパク質沈澱又は遅くなった流れの徴候となるものはなかった。バッファー交換完了後、それぞれのバリアント試料の濃度は製剤バッファーを用いて１．０ｍｇ／ｍｌに調整し、１０％のＰＳ−８０を０．０２％のＰＳ−８０の最終濃度まで添加した。
【０２３３】
３．熱安定性評価
示差走査蛍光定量（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ）分析を実施して、試験された抗体バリアントの熱安定性を評価し比較した。それぞれのバリアントは３通り分析し、それぞれの観察された熱転移において平均Ｔｏｎｓｅｔ、Ｔａｇｇ及びＴｍを決定した（データは示さず）。
【０２３４】
すべての試験したバリアントについて得られたＴｏｎｓｅｔとＴｍ値の間では有意差は観察されなかった。すべての抗体についての決定されたＴｍ１値は６１℃であり、Ｔｏｎｓｅｔについての決定された値はすべての抗体で５４〜５５℃であった。コロイド安定性についてのプロットに基づいて決定されたＴａｇｇ値は７１〜７８℃の範囲に及んだ。
【０２３５】
全体として、４つの選択されたバリアントすべてが同等の熱安定性を示しており、観察された変動は試験された抗体間で熱安定性に有意な変化を生じない。
【０２３６】
４．強制分解研究
ａ．攪拌
それぞれのバリアントにおける試料は、５００ｒｐｍに設定されたオービタルシェイカー上、室温で攪拌ストレスを受けさせた。それぞれのバリアントにおいて１つの試料は２４時間攪拌し、別の試料は４８時間攪拌した。それぞれのバリアントの１つのバイアルは対照として４８時間まで室温で保存した。攪拌した試料は対照と比べて外見上の変化は観察されず、すべての試料が澄んでおり、無色で眼に見える微粒子がないことが観察された（データは示さず）。さらに、ＵＶ法で決定した場合、全タンパク質含有量に有意な変化はなかった（データは示さず）。
【０２３７】
バリアントのパネルの安定性に対する攪拌ストレスの効果は、ＳＥＣ、還元ＣＧＥ、非還元ＣＧＥ、及びｉｃＩＥＦ法により評価された（データは示されず）。室温で保存された攪拌対照試料と攪拌ストレス試料の間では、試験した抗体の安定性の有意な変化も、分解物の蓄積における経時的な識別可能な傾向も観察されなかった。ＳＥＣ分析において決定された％主ピークは、すべての対照及び攪拌試料について≧９９．２％であった。Ｒ−ＣＧＥ分析では、すべての対照及び攪拌試料について≧９８．５％であった。ＮＲ−ＣＧＥ分析では、対照とストレスを与えられた試料の間では％主ピークに有意な傾向も変化も明らかにされなかった。結論として、すべての候補バリアント間で安定性の有意差は観察されなかった。
【０２３８】
ｂ．凍結−解凍ストレス
それぞれの候補の３つの試料をエッペンドルフチューブ中に等分し、凍結−解凍ストレスを受けさせた。試料は−７５±１０℃で保存し、次に、室温で解凍した。それぞれの候補において１つの試料に３つの凍結−解凍サイクルを受けさせ、別の試料は６つの凍結−解凍サイクルを受けさせ、第３の試料は１０サイクルを受けさせた。すべてのストレスを与えられた試料は、澄んでおり、無色で眼に見える微粒子がないことが観察され（データは示さず）、ＵＶ法で決定した場合、全タンパク質含有量に有意な変化はなかった（データは示さず）。
【０２３９】
バリアントのパネルの安定性に対する凍結−解凍ストレスの効果は、ＳＥＣ、還元ＣＧＥ、非還元ＣＧＥ、及びｉｃＩＥＦ法により評価された（データは示されず）。凍結−解凍ストレスは、ＳＥＣ、Ｒ−ＣＧＥ及びＮＲ−ＣＧＥ分析に基づけば、抗体の安定性に何の影響も与えなかった。
【０２４０】
ｉｃＩＥＦ分析により、試験された抗体の電荷不均質の顕著な変化が明らかになった。塩基性バリアントの濃度は連続的Ｆ／Ｔサイクルで減少し、一般的対照と比べて１０×Ｆ／Ｔサイクルで塩基性バリアントの濃度は最低であった。唯一の例外はバリアントＩｇＧ１  ７．２  ＶＨ２／Ｖκ１であり、これについては、塩基性バリアントの濃度の減少はすべての試験したＦ／Ｔサイクルについて同じレベルであった（表９参照）。バリアントｍＡｂ１、ｍＡｂ２、及びｍＡｂ３では、１０×Ｆ／Ｔサイクル後、塩基性種はそれぞれ１．０、１．３、及び３．４％減少した。塩基性種の濃度の減少は、主ピークの％の増加と関係している。バリアントｍＡｂ４、ｍＡｂ５及びｍＡｂ６では、塩基性種の減少はそれぞれ４．８、２．８及び４．７％である。バリアントｍＡｂ４の変化は大部分、％主ピークの増加に関係しており、バリアントｍＡｂ５及びｍＡｂ６の変化は、％主ピークと％酸性バリアントの両方の増加に関係している。
【０２４１】
全体として、凍結−解凍ストレスからの変化に対する最も高い抵抗性はバリアントｍＡｂ１（ＩｇＧ１  ７．２  ＶＨ２／Ｖκ１）及びｍＡｂ２（ＩｇＧ１  ７．２  ＶＨ２／Ｖκ２）で観察されることが確定された。
【０２４２】
ｃ．酸性ｐＨストレス
それぞれの候補における試料は室温で酸性ｐＨストレスを受けさせ、それぞれの試料はＨＣｌでｐＨ３．５に調整し、室温で２時間、４時間、及び２４時間維持し、その後試料は、１ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．０で中和した。すべての試料は、澄んでおり、無色で眼に見える微粒子がないことが観察され（データは示さず）、ＵＶ法で決定した場合、タンパク質濃度に有意な変化はなかった（データは示さず）。
【０２４３】
バリアントのパネルに対する酸性ｐＨストレスの効果は、ＳＥＣ、還元ＣＧＥ、非還元ＣＧＥ、及びｉｃＩＥＦ法により評価された（データは示されず）。Ｒ−ＣＧＥ又はＮＲ−ＣＧＥ分析により、４８時間ＲＴ対照と比べた場合、低ｐＨに曝露された試料について分解物の蓄積に有意な変化は経時的に検出されなかった。電荷不均質分析では、塩基性バリアントの濃度は酸性ｐＨストレスを受けたすべての試料において減少したが、経時的に明白な傾向は観察されなかった。
【０２４４】
塩基性バリアントの減少に対する酸性ストレスの全体的な最も低い影響は、バリアントｍＡｂ１（ＩｇＧ１  ７．２  ＶＨ２／Ｖκ１）及びｍＡｂ２（ＩｇＧ１  ７．２  ＶＨ２／Ｖκ２）について観察された。この結果は、凍結−解凍研究においてｉｃＩＥＦにより得られた結果とよく一致している。ＳＥＣ分析では、すべてのバリアントが、酸性ストレスに曝露されるといくつかの凝集物を蓄積するのが観察され、これは％主ピークの減少と関係していたが、経時的に明白な傾向は観察されなかった。一般的に、凝集物の蓄積はＩｇＧ１バリアントと比べた場合、ＩｇＧ４バリアントについては約９倍であった。ＩｇＧ１バリアントについての凝集物の蓄積は、すべての酸性ストレス試料についての０．３〜１．０％であり、ＩｇＧ４バリアントについては蓄積はストレス試料についての４．３〜７．８％であり、これは有意に高い（表９参照）。
【０２４５】
結論として、酸性ストレスに対する最も高い抵抗性は、バリアントｍＡｂ１（ＩｇＧ１  ７．２  ＶＨ２／Ｖκ１）及びｍＡｂ２（ＩｇＧ１  ７．２  ＶＨ２／Ｖκ２）で観察されることが確定された。
【０２４６】
ｄ．熱ストレス
それぞれのバリアントにおける試料は、熱ブロックにおいて５０℃で３日間、１週間、及び２週間、熱ストレスを受けさせ、次に、２〜８℃で保存した一般対照試料のセットと比較した。試料の外観検査を定期的に実施し、相分離、不透明度の変化、又は沈澱の証拠は観察されなかった。すべての試料は、すべての時点で、澄んでおり、無色で眼に見える微粒子がないことが観察された（データは示さず）。さらに、ＵＶ法で決定した場合、タンパク質濃度に有意な変化はなかった（データは示さず）。
【０２４７】
バリアントのパネルに対する熱ストレスの効果は、ＳＥＣ、Ｒ−ＣＧＥ、ＮＲ−ＣＧＥ、及びｉｃＩＥＦ法により評価した。その結果により、すべてのバリアントが熱ストレスの影響を受けやすいことが明らかになった。
【０２４８】
ＳＥＣ分析では、すべての試験されたバリアントについて、凝集物濃度の増加の明白な傾向が、時間の関数として観察された。ＩｇＧ１と比べてＩｇＧ４バリアントでは凝集物の有意に高い蓄積が観察された。２週間後、％全凝集物の増加はＩｇＧ４バリアントについては３３．７〜４４．７％の範囲に及んだが、ＩｇＧ１バリアントについては１３．０〜１８．２％だけであった（表９参照）。さらに、ｍＡｂ１（ＩｇＧ１  ７．２  ＶＨ２／Ｖκ１）及びｍＡｂ２（ＩｇＧ１  ７．２  ＶＨ２／Ｖκ２）バリアントが蓄積した凝集物は、対照ｍＡｂ３（ＩｇＧ１  ２０．１  ＶＨ３／Ｖκ１）よりも少なかった。
【０２４９】
Ｒ−ＣＧＥ分析では、すべての試験されたバリアントについて、純度が減少する明白な傾向（ＬＣ＋ＨＣの％の減少として定義される）が、時間の関数として観察されたが、すべての試験されたバリアント間では安定性の有意差は観察されなかった。試料分解のレベルはすべての試験された抗体について同等であった（データは示さず）。同様に、ＮＲ−ＣＧＥデータは、すべての試験されたバリアントについて時間の関数として純度が減少する明白な傾向（主ピークの減少として定義される）を明らかにした。ＩｇＧ１と比べてＩｇＧ４バリアントでは有意に低い純度が観察された（データは示さず）。２週間後、％純度はＩｇＧ４バリアントでは３４．８〜４１．７％減少していたが、ＩｇＧ１バリアントでは２０．０〜３０．０％だけであった（データは示さず）。さらに、ｍＡｂ１（ＩｇＧ１  ７．２  ＶＨ２／Ｖκ１）及びｍＡｂ２（ＩｇＧ１  ７．２  ＶＨ２／Ｖκ２）バリアントは、ｍＡｂ３  ＩｇＧ１  ２０．１  ＶＨ３／Ｖκ１よりも低い分解を示した。ＩｇＧ１抗体では、主ピークの減少は、フロント主ピーク不純物（断片）の増加を主に伴っていた。しかし、ＩｇＧ４抗体では、フロント主ピーク不純物（断片）とバック主ピーク不純物（凝集物）の両方の蓄積が、減少する主ピークの関数として観察された（データは示さず）。この結果は、ＩｇＧ１と比べてＩｇＧ４抗体では凝集物の有意に高い濃度が観察されたＳＥＣデータとよく一致している。
【０２５０】
ＩｇＧ４バリアントについての１週目の試料は、ｉｃＬＥＦによる分析にはひどく分解しすぎており、すべてのバリアントについての２週目の試料は分析にはひどく分解しすぎていた。したがって、３日間データのみを使用して、試験された抗体間の電荷不均質性の変化を評価した。％主ピークにより決定する場合の純度の差は、ＩｇＧ１試料では１２．４〜１４．４％差であり、ＩｇＧ４試料では１６．０〜１６．６％であった（データは示さず）。
【０２５１】
全体として、熱ストレスによる分解は、ＩｇＧ４バリアントではＩｇＧ１バリアントと比べて大きく、これはすべての時点で観察されることが確定された。分析により、ｍＡｂ１（ＩｇＧ１  ７．２  ＶＨ２／Ｖκ１）及びｍＡｂ２（ＩｇＧ１  ７．２  ＶＨ２／Ｖκ２）バリアントは、熱ストレスに最も影響を受けにくいことが示されており、この結果は、凍結−解凍及び酸性ｐＨストレスについて得られたデータと一致している。
開発可能性特性の観点から最良の候補の選択
細胞株における生産力に関して、最良の結果はヒト化バリアントｍＡｂ１（７．２  ＶＨ２／Ｖκ１）を用いて得られ、生存細胞密度はｍＡｂ１については１０日目で５４×１０６生存細胞／ｍｌ上がった。
【０２５２】
熱安定性研究では、試料はＤＳＦ分析により標準マトリックスにおいて評価し、それぞれの候補においてＴｏｎｓｅｔ、Ｔｍ及びＴａｇｇを決定した。Ｔｏｎｓｅｔ及びＴｍ１では変動は観察されず、Ｔａｇｇはすべてのバリアントについて７０℃よりも大きかった。結果は、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ４、及びｍＡｂ５が同等の熱安定性を実証していることを示している。
【０２５３】
強制分解研究では、試料は攪拌、凍結−解凍、酸性ｐＨ及び熱ストレスに曝露された。結果は、適切なストレス条件下で、候補バリアントのパネルの分解されやすさの程度が異なっていたことを示している：
攪拌ストレスに対する有意な応答は分析方法のいずれによっても観察されなかった。
【０２５４】
凍結−解凍ストレスに対する有意な応答はＳＥＣ又はＣＧＥ法によって観察されなかったが、ｉｃＩＥＦ分析は試験されたバリアント間で電荷不均質性の差を明らかにし、ｍＡｂ１（ＩｇＧ１  ７．２  ＶＨ２／Ｖκ１）及びｍＡｂ２（ＩｇＧ１  ７．２  ＶＨ２／Ｖκ２）バリアントが凍結−解凍ストレスにより引き起こされる変化に対して最も高い抵抗性を示すことを明らかにした。
【０２５５】
酸性ｐＨストレスに対する応答はｉｃＩＥＦ及びＳＥＣにより観察され、すべての候補が曝露するといくつかの不純物を蓄積した。ｍＡｂ１（ＩｇＧ１  ７．２  ＶＨ２／Ｖκ１）及びｍＡｂ２（ＩｇＧ１  ７．２  ＶＨ２／Ｖκ２）バリアントは酸性ｐＨストレスに対して最も高い抵抗性を示した。
【０２５６】
観察された最も有意なストレス応答は５０℃での試料貯蔵に対してであった。ＳＥＣ、ＮＲ−ＣＧＥ、及びｉｃＩＥＦ分析は、経時的に試料純度が減少する有意な傾向を明らかにした。観察される純度の減少は、ＩｇＧ１バリアントと比べた場合、ＩｇＧ４バリアントでは一貫して大きかった。ＩｇＧ１バリアントの群では、ｍＡｂ１（７．２  ＶＨ２／Ｖκ１）及びｍＡｂ２（ＩｇＧ１  ７．２  ＶＨ２／Ｖκ２）が酸性熱ストレスに対して最も高い抵抗性を示した。
【０２５７】
異なるヒト化候補の開発可能性特性の結果は下の表９にまとめている。
【表９】
2021533204.tif 000015
【０２５８】
結論として、ｍＡｂ１バリアントは、開発可能性という観点からは最良の結果を示し、主力候補として選択された。
一価及び二価分子としてのヒト化ｍＡｂ７．２バリアントの機能特性
１．Ｆａｂ及びＦａｂ２断片の調製
ａ．Ｆ（ａｂ’）２作製のためのペプシン消化
５０％スラリー中の固定化したペプシン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃキット、カタログ番号Ｎ°４４９８８）を、スラリーを５０００ｇで２分間、遠心沈澱させることにより消化バッファー（２０ｍＭの酢酸ナトリウム  ｐＨ４．４）中にバッファー交換した。上澄みは廃棄し、スラリーは１ｍＬの消化バッファーに再懸濁し、続いて５０００ｇで２分間さらに回転させた。このステップはさらに４回繰り返した（全部で５回の樹脂洗浄）。次に、樹脂は、最初のスラリー容積まで消化バッファーに再懸濁した。
【０２５９】
ｍＡｂ４、ｍＡｂ５及びｍＡｂ６（７．２  ＶＨ２／Ｖκ１、７．２  ＶＨ２／Ｖκ２又は２０．１  ＶＨ３／Ｖκ１  ＩｇＧ４バリアント）は、５又は１０ｍＬのＺｅｂａ  Ｓｐｉｎカラム（スケール依存的）を使用して消化バッファー中にバッファー交換し、Ｖｉｖａｓｐｉｎ濃縮器（１０，０００  ＭＷＣＯ）を製造業者のプロトコールに従って３ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。
【０２６０】
３ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ４、５及び６（前もって消化バッファーにバッファー交換されている）は樹脂上に固定化されたペプシンと混合され、３７℃で回転させながら１．５〜２時間インキュベートした。
【０２６１】
消化混合物は５０００ｇで２分間遠心沈殿させた。上澄みは取り除いて、適切な注射器及び０．２２μｍの小型フィルター（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｍｉｌｌｅｘ  カタログ番号ｎ°ＳＬＧＶ００４ＳＬ）を使用して新しいチューブ中に濾過した。樹脂は１ｍＬのＰＢＳで洗浄し、５０００ｇで１分間回転させた。上澄みは取り除き、濾過して、以前の上澄みと一緒にプールした。洗浄ステップを繰り返した。
【０２６２】
消化し濾過した上澄みは、移動相として１０ｍＭの酢酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５を使用するＨｉＬｏａｄ  １６／６００  ２００ｐｇサイズ排除カラムを使用して精製した。溶出したＦ（ａｂ’）２断片に対応する画分はプールし、濃縮して無菌濾過する。
【０２６３】
Ｆ（ａｂ’）２断片は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、分析ＳＥＣ及びＯＤ２８０ｎｍ読取り
により分析した。
【０２６４】
ｂ．Ｆａｂ作製のためのパパイン消化
５０％スラリー中の固定化したペプシン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃキット、カタログ番号Ｎ°２０３４１）を、スラリーを５０００ｇで２分間、遠心沈澱させることにより消化バッファー（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのシステイン  ｐＨ７．０）中にバッファー交換した。上澄みは廃棄し、スラリーはもっと大きな容積の消化バッファーに再懸濁し、続いて５０００ｇで２分間さらに回転させた。このステップはさらに４回繰り返した（全部で５回の樹脂洗浄）。次に、樹脂は、最初のスラリー容積まで消化バッファーに再懸濁した。
【０２６５】
ｍＡｂ４、ｍＡｂ５及びｍＡｂ６（７．２  ＶＨ２／Ｖκ１、７．２  ＶＨ２／Ｖκ２又は２０．１  ＶＨ３／Ｖκ１  ＩｇＧ４バリアント）は、５又は１０ｍＬのＺｅｂａ  Ｓｐｉｎカラム（スケール依存性）を使用して消化バッファー中にバッファー交換し、Ｖｉｖａｓｐｉｎ濃縮器（１０，０００  ＭＷＣＯ）を製造業者のプロトコールに従って３ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。
【０２６６】
３ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ４、５及び６（前もって消化バッファーにバッファー交換されている）は樹脂上に固定化されたパパインと混合され、３７℃で回転させながら４２時間インキュベートした。
【０２６７】
消化混合物は５０００ｇで２分間遠心沈殿させた。上澄みは取り除いて、適切な注射器及び０．２２μｍの小型フィルター（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｍｉｌｌｅｘ  カタログ番号ｎ°ＳＬＧＶ００４ＳＬ）を使用して新しいチューブ中に濾過した。樹脂はＰＢＳで３回洗浄し、５０００ｇで１分間回転させ、それぞれのサイクルで上澄みを収集しプールした。次に、プールした画分は、適切な注射器及び０．２２μｍの小型フィルターを使用して新しいチューブ中に濾過した。
【０２６８】
消化し濾過した上澄みは先ず、１×ＤＰＢＳ、ｐＨ７．４中にバッファー交換し、次に、第１にプロテインＡカラムを使用して精製してＦｃ及び未消化ｍＡｂを取り除き、続いて、移動相として１０ｍＭの酢酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５を有するサイズ排除（ＳＥＣ）カラムを使用して研磨ステップを行った。溶出したＦａｂ断片に対応する画分はプールし、濃縮して無菌濾過した。
【０２６９】
Ｆａｂ断片は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、分析ＳＥＣ及びＯＤ２８０ｎｍ読取りにより分析した。
【０２７０】
２．Ｂｉａｃｏｒｅを使用するヒト化７．２及び２０．１Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２断片並びにＩｇＧフォーマットの親和性測定
ＢＴＮ３Ａに対する主力ヒト化７．２及び２０．１抗体の親和性をその異なるフォーマット（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２及びＩｇＧ）で評価するため、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  ＣｏｎｔｒｏｌソフトウェアＶ２．０．１を実行するＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（製造番号１９０９９１３）装置及びＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアＶ３．０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、シングルサイクル動態解析を実施した。すべてのシングルサイクル動態実験は、０．１％のＢＳＡを含有するＨＢＳ−Ｐ＋ランニングバッファー（ｐＨ７．４）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、ＵＫ）を用いて２５℃で実行した。
【０２７１】
ＢＮＴ３Ａ  Ｈｉｓタグ付き抗原（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａ）を、０．４μｇ／ｍｌの最終濃度までランニングバッファーに希釈した。それぞれのサイクル開始時に、ＢＮＴ３Ａ−Ｈｉｓは、標準アミン化学反応とＨｉｓ捕捉キットを使用してプレ連結されたＣＭ５センサーチップのＦｃ２（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、ＵＫ）上に１０μｌ／分の流速で捕捉させた。約５０ＲＵのＲＭａｘを得るための異なる理論値である、約３４ＲＵ、１６ＲＵ又は１１ＲＵの固定化レベル（ＲＬ）をそれぞれ分析物Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２及びＩｇＧに使用した。次に、表面は安定化させておいた。シングルサイクル動態データは、いかなる潜在的な物質移動効果も最小限に抑えるために流速４０μｌ／分で精製された試料（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２及びＩｇＧ）を用いて得た。参照チャネルＦｃ１（抗原捕捉なし）からのシグナルは、Ｆｃ２のシグナルから引き算して、参照表面への非特異的結合の差を補正した。ＢＴＮ３Ａ−Ｈｉｓ空試験（分析物なし）についてのシグナルを引き算して、表面安定性の差を補正した。漸増濃度のＢＴＮ３Ａ１の５回注射についての会合期は毎度２４０秒間モニターし、シングル解離期はＢＴＮ３Ａ１の最後の注射に続いて２０００秒間モニターし、シングル解離期は分析物の最後の注射に続いて１４００秒間測定した。チップ表面の再生は、１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ  ｐＨ１．５の２回注射を使用して実行し、続いて２４０秒の間安定化させた。生のセンサーグラムは、分析物の異なる原子価と一致して、Ｆａｂ試料では１対１モデルで、Ｆ（ａｂ’）２及びＩｇＧ試料では二価分析物モデルでフィットさせた。動態定数はそれぞれのバリアントにおいて計算した（表１０、１１及び１２参照）。
【表１０】
2021533204.tif 000016
【表１１】
2021533204.tif 000017
【表１２】
2021533204.tif 000018
３．親和性特性の観点からの最良候補の選択
【０２７２】
及びＦ（ａｂ’）２フォーマットを用いるとこれらの差を観察することができるが、そのギャップはＦａｂ断片を用いるとはるかに高くなり、実際、２０．１は２０．３０の平均ＫＤを示し、７．２は３．２２（ＶＨ２／Ｖκ１）又は３．０１（ＶＨ２／Ｖκ２）の平均ＫＤを示した。
【０２７３】
４．一次Ｔ細胞及び他の細胞株へのｍＡｂ１結合アビディティー
次に、ｍＡｂ１結合アビディティーは、ヒト一次Ｔ細胞で並びにＷＴ及びＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２又はＢＴＮ３Ａ３アイソフォームを用いて個々に再構成されたＢＴＮ３Ａノックアウトを含む種々の細胞株でフローサイトメトリーにより評価してきた（データは示さず）。それぞれの試験された細胞型において得られたＥＣ５０値は表１３にまとめている。
【０２７４】
ＢＴＮ３Ａ  ＫＯ細胞において得られたデータは、ｍＡｂ１がその標的に特異的に結合することを明白に示した。さらに、個々のアイソフォームでの再構成により、ｍＡｂ１がＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２、及びＢＴＮ３Ａ３を同等のアビディティーで認識することが確かめられた。他のすべての試験された細胞は、バーキットリンパ腫ダウディ細胞株についての９．６ｎＭから結腸直腸腺癌細胞株ＨＴ２９についての１１２．３ｎＭに及ぶＥＣ５０値の範囲でｍＡｂ１結合について陽性なようであった。
【表１３】
2021533204.tif 000019
５．ｍＡｂ１はオフターゲット結合がない
他の非ＢＴＮ３Ａ分子でのｍＡｂ１のオフターゲット結合の可能性をＲｅｔｒｏｇｅｎｉｘ技術により評価した。この研究は、＞５０００ヒト膜受容体を発現する細胞アレイ又はＨＥＫ２９３細胞の表面で発現される分泌タンパク質をスクリーニングすることによりオフターゲット結合が存在しないことを実証することを目標にしていた（Ｒｅｔｒｏｇｅｎｉｘプラットフォーム）。
【０２７５】
細胞固定前又は後での非トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞への、及びＢＴＮ３Ａを過剰発現している細胞へのｍＡｂ１の結合のレベル調べると、固定された細胞上で５μｇ／ｍｌが適切なスクリーニング条件であることを示した。この条件下で、ｍＡｂ１を、細胞表面膜タンパク質、及び細胞表面に繋ぎ留められた分泌タンパク質を含む、５５２８のヒトタンパク質を個々に発現するヒトＨＥＫ２９３細胞に対する結合についてスクリーニングした。これにより１０の主要なヒットが明らかにされた。
【０２７６】
それぞれの主要なヒットは、２つの対照受容体（ＣＤ２０及びＥＧＦＲ）と一緒に再発現され、５μｇ／ｍｌのｍＡｂ１、５μｇ／ｍｌのアイソタイプ対照抗体、並びに他の正の及び負の対照処置で再試験された。５つの非特異的ヒットを取り除いたのち、試験抗体について５つの特異的相互作用が残った。５つすべての特異的ヒットはＢＴＮ３Ａ関係であり、ＢＴＮ３Ａ１の２つのアイソフォーム、ＢＴＮ３Ａ２の２つのアイソフォーム及びＢＴＮ３Ａ３の１つのアイソフォームであった。
【０２７７】
研究結論は、ｍＡｂ１についてのオフターゲット相互作用は確かめられず、そのＢＴＮ３Ａエピトープに対するｍＡｂ１の高い特異性を示していたことである。
【０２７８】
６．ｍＡｂ１はＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞活性化及び腫瘍細胞殺傷を媒介する
もともと、マウス抗ＢＴＮ３Ａ  ｍＡｂは、Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞によるＢＴＮ３Ａ認識の引き金を引いて、（ｉ）ヒトＰＢＭＣにおけるこの特定のサブセットの増殖、（ｉｉ）サイトカイン（ＩＦＮγ及びＴＮＦα）の産生、及び（ｉｉｉ）感染した又は形質転換された標的細胞の細胞溶解（例えば、パーフォリン、グランザイム、ＴＲＡＩＬによる）をもたらす活性化を媒介することが明らかにされていた（Ｈａｒｌｙら、Ｂｌｏｏｄ、２０１２年  ＆  Ｂｅｎｙａｍｉｎｅ、Ａ．ら、２０１６年、Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５、ｅ１１４６８４３）。
【０２７９】
いかなる特定の理論にも縛られずに、ｍＡｂ１の提唱される作用機序は、腫瘍標的細胞の表面で発現されるＢＴＮ３ＡにｍＡｂ１が結合すると立体構造変化の引き金を引き、これによりＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞上の対抗受容体へのそのシグナル伝達が可能になるというものである。抗ＢＴＮ３Ａ抗体の活性は、腫瘍細胞株（標的）とｒＨｕＩＬ−２（２００ＵＩ／ｍＬ）及びアミノビスホスホネート（Ｚｏｍｅｔａ、１μＭ）の存在下で、１０〜１４日間健康なドナーのＰＢＭＣから前もって増殖した一次ヒトＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞（エフェクター）の共培養に基づくインビトロアッセイを使用してルーチンに評価する。増殖期の終了時、Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞の純度はフローサイトメトリーにより評価し、次に、これらの細胞は将来の使用のため凍結させる。実験前日、増殖したＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞は解凍し、２００ＵＩ／ｍＬのｒＨｕＩＬ−２で一晩培養してインビトロ生存を維持する。共培養後、Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞活性化は、γδ  Ｔ細胞上でのＣＤ１０７ａ／ｂ発現のフローサイトメトリー検出により、又は標的細胞殺傷の尺度としてカスパーゼ３／７活性化を定量化することによりモニターされる。
【０２８０】
先ず、３つの異なる健康なドナーＰＢＭＣから増殖されたヒトＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞を、漸増濃度のｍＡｂ１を用いてダウディ細胞株（ＡＴＣＣ−ＣＣＬ２１３；バーキットリンパ腫）と共培養した。４時間後、細胞は、フローサイトメトリーによりＣＤ１０７ａ／ｂのＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞発現について分析した。結果は、ＣＤ１０７ａ／ｂを発現するＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞の百分率の濃度関連増加を示し、平均ＥＣ５０は０．８９ｎＭ（＋／−０．３９）であった（図１Ａ）。並行して、本発明者らは、ｍＡｂ１パルスダウディ細胞に対するＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞細胞溶解活性を評価した。図１Ｂに示されるように、ｍＡｂ１は標的細胞アポトーシスを濃度依存的方法で誘導し、ＥＣ５０は０．３５ｎＭであった。さらに、Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞活性化（ＣＤ１０７ａ／ｂ；図１Ｃ上パネル）及び腫瘍細胞溶解（カスパーゼ３／７；図１Ｃ下パネル）は、異なる組織起源由来の腫瘍細胞株を使用して試験し、ダウディ細胞と比較した。結果は、Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞活性化、及びそれに続く腫瘍細胞溶解は、ｍＡｂ１が、Ｌ−ＩＰＣ（膵管腺癌）、Ａ５４９（肺癌上皮細胞）及びＨＴ２９（結腸直腸腺癌）細胞株に結合することにより誘導されることを明らかにした。
【０２８１】
７．ｍＡｂ１は、細胞の組織起源とは無関係に、幅広いＢＴＮ３Ａ発現ヒト細胞株のＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞殺傷を増強する
ａ．材料及び方法
腫瘍細胞培養
ＨＬ−６０は、急性前骨髄球性白血病由来のヒト前骨髄芽球（ｐｒｏｍｙｅｌｏｂｌａｓｔ）細胞株である。ダウディは、バーキットリンパ腫由来のヒトＢリンパ芽球細胞株である。ジャーカットは急性Ｔ細胞白血病細胞株である。
【０２８２】
ＨＴ−２９及びＨＣＴ１１６は、結腸直腸腺癌由来のヒト上皮細胞である。
【０２８３】
ＰＣ３及びＤＵ１４５は、前立腺癌（転移部、それぞれ骨及び脳）由来であった。
【０２８４】
ＳＵＭ１５９及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）細胞株である。
【０２８５】
ＨＬ６０、ダウディ、ジャーカット、ＤＵ１４５及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、ＲＰＭＩ  Ｇｌｕｔａｍａｘ、１０％のＦＢＳ；１ｍＭのピルビン酸ナトリウムにおいて３７℃／５％ＣＯ２で培養した。ＰＣ３及びＨＴ−２９は、ＤＭＥＭ  １０％のＦＢＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムにおいて３７℃／５％ＣＯ２で培養した。ＨＣＴ１１６は、ＭｃＣｏｙ  ５ａ培地  １０％のＳＶＦにおいて培養した。ＳＵＭ１５９は、培地Ｆ１２  Ｎｕｔ  Ｍｉｘ  １×＋Ｇｌｕｔａｍａｘ、５％のＳＶＦ、ヒドロコルチゾン２ｍｇ／ｍｌ、インスリンヒューマログ２ｍｇ／ｍｌ及び可欠アミノ酸において培養した。
【０２８６】
インビトロＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞増殖
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ  Ｆｒａｎｃａｉｓ  ｄｕ  Ｓａｎｇ  Ｐｒｏｖｅｎｃｅ  Ａｌｐｅｓ  Ｃｏｔｅ  ｄ’Ａｚｕｒ（Ｆｒａｎｃｅ）から得た末梢血のフィコール密度勾配遠心分離により単離した。Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞を増殖するため、５０．１０６ＰＢＭＣを、ｒＨｕＩＬ−２（２００ＵＩ／ｍＬ）及びアミノビスホスホネート（Ｚｏｌｅｄｒｏｎａｔｅ、１μＭ）の存在下、１０〜１４日間、７５ｃｍ２フラスコにおいて１０％のＦＢＳ及び１％のピルビン酸ナトリウムを補充したＲＰＭＩ１６４０中１．５×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。５日目から、ｒＨｕＩＬ−２は２日又は３日ごとに更新し、細胞は１×１０６／ｍｌに保った。増殖期の終了時、Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞の純度はフローサイトメトリーにより評価し、Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞の数が生細胞の８０％に到達した場合は、これらの細胞は将来使用するためにＦＢＳ２０％ＤＭＳＯに凍結した。
【０２８７】
ヒトＰＢＭＣからのＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞の精製
新鮮なヒトＰＢＭＣを、ＰＢＳ＋２％のＦＢＳ＋１ｍＭのＥＤＴＡにおいて５０．１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。Ｖγ９Ｖδ２は、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトガンマ／デルタ  Ｔ細胞単離キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  ♯１９２５５）を製造業者の説明書に従って使用して単離した。手順の終了時、細胞純度はフローサイトメトリーにより測定した。生ＣＤ３＋Ｖγ９＋細胞は８０％を超えていた。
【０２８８】
Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞殺傷アッセイ
１０，０００の増殖した又は新鮮なＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞を、ｍＡｂ１又は適切なアイソタイプ対照の存在下、ＲＰＭＩ  １６４０＋ｇｌｕｔａｍａｘ、１０％のＦＢＳ＋１ｍＭのＮａＰｙにおいて指示された比（Ｅ対Ｔ  １対１又は１対５）で９６ウェルプレートで腫瘍性細胞株と共培養した。共培養物に添加する場合、ｒＨｕＩＬ−２は２０ＩＵ／ｍｌで使用した。指示された時間の後、ＡＴＰを、生細胞の数に比例する発光シグナルを生じるＧｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  ♯Ｇ７５７２）を使用して測定した。
【０２８９】
ｂ．結果
Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞との共培養による殺傷をモニターするための標的細胞のカスパーゼ３／７染色に基づく方法に加えて、本発明者らは、代謝活性細胞の指標である存在するＡＴＰの定量化に基づいて、培養中の生存細胞の数の評価に基づく補完的アプローチを開発した。
【０２９０】
このアッセイを用いて、本発明者らは、ｍＡｂ１又は適切なアイソタイプ対照＋／−ｒＨｕＩＬ−２（２０ＩＵ／ｍｌ）の存在下で増殖させたＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞との共培養（比Ｅ対Ｔ  １対１）の２４時間後、急性骨髄性白血病細胞株ＨＬ６０−ＷＴ、又は−ＢＴＮ３Ａ−ＫＯの生存をモニターした（図Ａ）。結果は、ｍＡｂ１の存在下でのＨＬ６０−ＷＴ生存の濃度依存性減少を示し、活性化されたＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞による標的腫瘍細胞の効率的ＢＴＮ３Ａ依存性殺傷を示していた。類似する実験を、インビトロで増殖させた、又は新たに単離されたＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞を用いて実施し（それぞれ図Ｂ及びＣ）、細胞生存率を４日間の期間にわたり測定した。
【０２９１】
図Ｂは、インビトロで増殖したＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞がＨＬ６０−ＷＴ増殖を濃度依存的方法で制御することを示した。ｒＨｕ−ＩＬ２の添加は、おそらく、一次Ｔ細胞のインビトロ培養に必要な生存シグナルを提供することによりエフェクター細胞殺傷能力を経時的に改善する。類似の結果は、１対１及び１対５のＥ対Ｔ比でＨＬ６０−ＷＴと４日間共培養した、ヒトＰＢＭＣから単離した新鮮なＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞を用いて得られた。これらの結果は、個々のＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞が、ｍＡｂ１媒介により活性化されると複数の腫瘍標的に繰り返し結合して殺傷する能力を示している（図２Ｃ）。
【０２９２】
次に、本発明者らはこのアッセイを使用して、異なる組織起源（結腸、乳房、前立腺、Ｔリンパ腫及びバーキットリンパ腫）由来のＢＴＮ３Ａ発現細胞株に対するｍＡｂ１媒介Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞殺傷活性をモニターした。ＨＴ２９、ＰＣ３、ＤＵ１４５、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨＣＴ１１６、ＳＵＭ１５９、ジャーカット及びダウディ細胞を、漸増濃度のｍＡｂ１の存在下で、インビトロで増殖したＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞と一晩共培養し、細胞生存率を測定した。結果によれば、ｍＡｂ１が、その組織起源とは無関係に、幅広いＢＴＮ３Ａ発現ヒト細胞株のＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞殺傷を増強することが確証された（Ｅｒｒｅｕｒ！  Ｓｏｕｒｃｅ  ｄｕ  ｒｅｎｖｏｉ  ｉｎｔｒｏｕｖａｂｌｅ．及び図）。
【表１４】
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８．ｍＡｂ１はヒトＡＭＬ細胞株を移植されたマウスモデルにおいてＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞療法を改善する
ｍＡｂ１標的ＢＴＮ３Ａは齧歯類では発現されず、Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞亜集団は霊長類に特有なので、Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞抗腫瘍活性という概念の実験証明は、通常、ＢＴＮ３Ａを発現するヒト腫瘍細胞株を移植し、健康なヒトドナー由来のＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞（そのような再構成におけるＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞は腫瘍細胞株とは同種である）を養子移入した免疫無防備状態ＮＳＧマウスにおいて試験される。これらのモデルは、広範囲の固形、並びに血液系腫瘍においてＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞の抗腫瘍治療可能性を検証するのに広く使用されてきた（Ｐａｕｚａ、Ｃ．Ｄ．ら、２０１８年、Ｉｍｍｕｎｏｌ．９）。
【０２９３】
さらに、ヒトＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞を受けていたマウスに投与されたマウス抗ヒトＢＴＮ３Ａ抗体、ｍ２０．１は、ＡＭＬを帯びるＮＳＧマウスの血液及び骨髄において、動物生存を増強し、白血病負荷（ｌｅｕｋｅｍｉｃ  ｂｕｒｄｅｎ）を減らすと記載されていた（Ｂｅｎｙａｍｉｎｅら、２０１６年、上記参照）。このモデルでは、ｍ２０．１を、抗腫瘍リンパ球サブセットを増やし、マウスにおいてその生存を改善し、移入されたヒトＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞の抗腫瘍活性を向上させることが明らかにされているｒＨｕＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質であるＲＬＩと組み合わせて注射した。
【０２９４】
インビボマウスモデルにおけるｍＡｂ１の有効性のさらなる特徴付けでは、本発明者らは、ｍＡｂ１と組み合わせたヒトＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞移入がＡＭＬを帯びるＮＳＧマウスで腫瘍成長を遅らせ動物生存を改善する可能性を調べた。
【０２９５】
ａ．Ｕ９３７モデル
健康な生後６〜８週のメスのマウス（ｎ＝３０）は、Ｇｅｒｔｎｅｒ−Ｄａｒｄｅｎｎｅ、Ｊ．ら、２０１２年．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８８、４７０１〜４７０８頁に記載される通りに、０日目に０．２×１０６ルシフェラーゼ形質導入Ｕ９３７細胞を受けた。１日目、腫瘍負荷は生物発光イメージングを使用して評価し、マウスは、１日目にインビトロで増やしたヒトＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞（３×１０６細胞）の静脈注射を単独で又は抗ＢＴＮ３Ａ  ｍＡｂ１若しくは関連するアイソタイプ対照（１０ｍｇ／ｋｇ、２００μｇ／マウス）と組み合わせて受ける６つの群に無作為に割り当てられた。処置は７日目に繰り返された。群２及び４では、抗体は４日目及び１０日目にも投与された。ｒＨｕＩＬ−１５／ｒＨｕＩＬ−１５Ｒαの複合体はヒトＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞の増殖を可能にするので（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００６）１７、６０７２〜６０８頁）、これらの複合体はＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞と一緒に投与された。
【０２９６】
すべての群は表１６に記載されている。
【０２９７】
ｈＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒ−Ｆｃ複合体は注射前の３０分間室温（ＲＴ）でプレ複合体化し（マウスあたり０．２μｇのｈＩＬ−１５＋１．２μｇのＩＬ−１５Ｒ−Ｆｃ）、注射に先立ってＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞と混合した。それぞれの注射における最終容積は１００μｌであった。処置ｍＡｂは、Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞移植の４時間前に注射した。
【０２９８】
本発明者らの結果により、Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞プラスｒＨｕＩＬ−１５／ｒＨｕＩＬ−１５Ｒα注入が腫瘍量を減少することが確かめられた。この効果のほうがはるかに印象的であり、抗ＢＴＮ３Ａ  ｍＡｂ１がＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞と共に添加された場合の生存の有意な増加と関連していた（表１６及び１７）。重要なことに、この極めて侵襲性のマウスモデルで使用される、急性骨髄性白血病の処置に最も効果的な薬物の１つであるシタラビン（Ａｒａ−Ｃ）（Ｕ９３７腫瘍を帯びるＮＳＧマウス中１０ｍｇ／ｋｇ）は、ｍＡｂ１をヒトＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞移入と組み合わせて観察した場合、２〜３日（約１０％）マウスの生存を改善した。
【０２９９】
これらのデータは、インビボでＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞免疫療法と組み合わせた抗ＢＴＮ３Ａ  ｍＡｂにより発揮される強力な抗白血病効果に光を当てている。
【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【０３００】
ｂ．ＭＯＬＭ１４モデル
ＡｒａＣ抵抗性ヒトＡＭＬ由来細胞株である、ＭＯＬＭ１４に対するｍＡｂ１のインビボ有効性を、ヒト腫瘍細胞株及びヒトＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞を移植したＮＳＧマウスを使用する異種移植片モデルにおいて評価した。この研究の目標は、腫瘍成長に対する及びマウス生存に対する、ｍＡｂ１と組み合わせたヒトＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞の繰り返し静脈注射の効果を確かめることであった。
【０３０１】
生後６〜８週のメスのＮＳＧマウスに、１００μｌの容積中マウスあたり０．２×１０６のルシフェラーゼを発現するＭＯＬＭ１４（ＣＶＣＬ＿７９１６）細胞（ｌｕｃ２）を０日目に尾部静脈を介して静脈（ｉｖ）注射した。生物発光アッセイは、エンドトキシンフリーのルシフェリン（３０ｍｇ／ｋｇ）の添加に続いてＰｈｏｔｏｎＩＭＡＧＥＲ（Ｂｉｏｓｐａｃｅ  Ｌａｂ）を使用して０日目に実施し、マウスは、生物発光シグナルの強度に基づいて７マウスの均一な群に無作為化した。３×１０６のヒトインビトロ増殖Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞及びｈＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒ複合体は、１、８、１５、２２及び２９日目に静脈注射した。ｍＡｂ１又はｈｌｇＧ１は、１、５、８、１２、１５、１９、２２、２６及び２９日目に静脈注射した。
【０３０２】
異なる実験群は表１９にまとめている。
【０３０３】
ｈＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒ−Ｆｃ複合体は、注射前に室温で３０分間プレ複合体化し（マウスあたり０．２μｇのｈＩＬ−１５＋１．２μｇのＩＬ−１５Ｒ−Ｆｃ）、注射に先立ってＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞と混合した。それぞれの注射における最終容積は１００μｌであった。処置ｍＡｂは、Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞移植の４時間前に注射した。
【０３０４】
ＭＯＬＭ１４細胞が発する生物発光シグナルは、腫瘍成長を追跡するための細胞注射後０、７、１４、２１及び２８日目に測定した。血液採取は１９日目に実行して、フローサイトメトリーにより循環するＭＯＬＭ１４細胞の数を評価した。赤血球溶解は染色前に実施した。ｍＣＤ４５＋マウス細胞は分析から排除し、ＭＯＬＭ１４腫瘍細胞はそのＧＦＰ発現により検出した。取得はＬＳＲＩＩ  ＳＯＲＰ血液計数器（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上で実施し、分析はＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して実施した。疾患の症状（著しい体重減少、皺のよった毛皮、猫背、衰弱、及び低下した可動性）についてのマウスの毎日モニタリングにより、苦痛の徴候のある注射された動物について殺傷時間が決定された。
【０３０５】
表２０に示されるように、無関係な対照アイソタイプ（ｈｌｇＧ１）を注射されたＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞は腫瘍成長を有意に制御しない。これとは対照的に、もっと低い生物発光シグナルにより示されるように、腫瘍成長は、抗ＢＴＮ３Ａ  ｍＡｂ１がヒトＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞と順次に投与されると強く低減された。結果は、プロトコールの１９日目に循環芽細胞の数（末梢血においてフローサイトメトリーにより評価される）の有意な減少も示した（表２０）。重要なことに、腫瘍成長の抗ＢＴＮ３Ａ  ｍＡｂ依存性減少は、マウス生存における４５％の有意な改善をもたらす（それぞれのアイソタイプ対照と比べた場合）（表２２）。
【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【０３０６】
９．ｍＡｂ１はヒト卵巣がん細胞株ＳＫＯＶ−３を移植されたマウス固形腫瘍モデルにおいてＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞療法を改善する
ａ．材料及び方法
インビボＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞増殖
同種ヒトＶγ９Ｖδ２  Ｔリンパ球は、Ｅｔａｂｌｉｓｓｍｅｎｔ  Ｆｒａｎｃａｉｓ  ｄｕ  Ｓａｎｇ（ＥＦＳ、Ｎａｎｔｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）により、フィコール密度遠心分離（Ｅｕｒｏｂｉｏ、Ｌｅｓ  Ｕｌｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）後に提供された健康なドナー血液試料から得られた末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から増幅された。先ず、末梢同種ヒトＶγ９Ｖδ２  Ｔリンパ球の特定の増殖では、１０％の熱失活したウシ胎仔血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００ＩＵ／ｍＬのペニシリン（すべてＧｉｂｃｏ製）、及び１００ＩＵ／ｍＬの組換えヒトＩＬ−２（ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ、Ｂａｌｅ、Ｓｕｉｓｓｅ）を補充したＲＰＭＩ培地において、ＰＢＭＣを、Ｉｎｎａｔｅ  Ｐｈａｒｍａ（Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）より寄贈された３μＭのブロモヒドリンピロホスフェート（ＢｒＨＰＰ）と一緒にインキュベートした。４日後、培養物は３００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２を補充した。２１日目、純度をフローサイトメトリーにより測定した（純度＞９０％）。純粋なヒトＶγ９Ｖδ２  Ｔリンパ球は、１０％の熱失活したウシ胎仔血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００ＩＵ／ｍＬのペニシリン（すべてＧｉｂｃｏ製）、及び１００ＩＵ／ｍＬの組換えヒトＩＬ−２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を補充したＲＰＭＩ培地において、フィーダー細胞（混合された及び３５Ｇｙ照射エプスタインバーウイルス形質転換Ｂリンパ球及びＰＢＭＣ）及びＰＨＡ−Ｌを使用してさらに増殖させた。３週間後、静止エクスビボ増殖Ｖγ９Ｖδ２  Ｔリンパ球をインビボ実験のために使用した。
【０３０７】
マウスモデル
０日目、生後６〜８週のＮＳＧマウスに、無菌ＰＢＳ１００μＬの容積中マウスあたり１×１０６のルシフェラーゼを発現するＳＫＯＶ−３細胞（卵巣がん細胞株、ＳＫＯＶ−３−ｌｕｃ−Ｄ３、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を腹腔内（ｉｐ）に注射した。７日後、マウスは、５〜６マウスの均一な群に無作為化した。７日目及び１４日目に、ｍＡｂ処置、マウスあたり２００μｇのｍＡｂ１又は適切なアイソタイプ対照（ｈｌｇＧ１）を無菌ＰＢＳの１００μＬでｉｐに注射した。４時間後、マウスあたり無菌ＰＢＳの１００μＬ中５×１０６のヒトインビトロ増殖Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞もｉｐに注射した。
【０３０８】
ＳＫＯＶ−３細胞が発する生物発光シグナルは、腫瘍細胞移植後１６、２３及び３０日目に測定し、腫瘍成長を追跡した。生物発光イメージングは、イソフルラン２％でマウスを麻酔すると、Ｂｉｏｓｐａｃｅイメージャー（Ｂｉｏｓｐａｃｅ  Ｌａｂ、Ｎｅｓｌｅｓ−ｌａ−Ｖａｌｌｅｅ、Ｆｒａｎｃｅ）上で、１．５ｍｇのＤ−ルシフェリン（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）のｉｐ注射の８分後に実現させた。実験エンドポイントは、マウスがその最初の体重の１０％を失ったときに到達した。
【０３０９】
ｂ．結果
卵巣がんに対するｍＡｂ１のインビボ有効性は、ヒト卵巣がん細胞株ＳＫＯＶ−３、及びヒトＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞を移植したＮＳＧマウスを使用する異種移植片モデルにおいて評価した。この研究の目標は、腫瘍成長に対する及びマウス生存に対するｍＡｂ１と組み合わせたヒトＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞の２回のｉｐ注射の効果を評価することであった。
【０３１０】
ＮＳＧマウスは、０日目にＳＫＯＶ−３を腹腔内に（ｉｐ）注射した。７日後、マウスは処置に従って均一な群に無作為化された。群は表２３に記載されている。
【表２２】
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【０３１１】
結果は、ｍＡｂ１と一緒に移入されたヒトＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞が腫瘍成長を有意に遅らせ（表２４）、動物生存が有意に改善されること（表２５）を示していた。注目すべきことに、この効果は、ＩＬ−２又はＩＬ−１５などのプロＶγ９Ｖδ２  Ｔ生存サイトカインの非存在下で観察された。
【表２３】
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【表２４】
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【０３１２】
１０．カニクイザルＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞に対するインビボ効果
齧歯類にはＢＴＮ３Ａ及びＶγ９Ｖδ２  Ｔサブセットが存在しないため、並びにカニクイザルマカクにおいてインビトロ及びインビボＰＡｇ媒介Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞活性化を記録した以前のデータに基づいて、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）をｍＡｂ１の非臨床的安全評価のための唯一の関連種として選択した。
【０３１３】
ａ．材料及び方法
Ｂｉａｃｏｒｅ
ｍＡｂ１は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（製造番号１９０９９１３）器械を使用するＢｉａｃｏｒｅマルチサイクル動態分析を介して、組換えヒト又はカニクイザルＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２及びＢＴＮ３Ａ３タンパク質（それぞれ配列番号２１、２２及び２３）への結合について評価してきた。ｍＡｂ１は２％ＢＳＡ／ＰＢＳ中２μｇ／ｍｌの濃度まで希釈した。それぞれのサイクルの開始時、抗体は約１５０ＲＵの密度（ＲＬ）（約５０ＲＵのＲＭａｘを得るための理論値）でプロテインＡ表面で捕捉した。捕捉に続いて、ＢＴＮ３Ａ抗原の注射前に表面は安定化させておいた。ＢＴＮ３Ａは、２５〜０．７８ｎＭの２倍希釈範囲において０．１％のＢＳＡ／ＨＢＳ−Ｐ＋（ランニングバッファー）で滴定した。会合期は４２０秒間モニターし、解離期は２０００秒間モニターした。動態データは、いかなる潜在的質量移動効果も最小限に抑えるため５０μｌ／分の流速を使用して得た。得たデータは１対１結合モデルを使用してフィットさせた。
【０３１４】
ＥＬＩＳＡ
ヒト及びカニクイザルＢＴＮ３Ａ１に対するｍＡｂ１の見かけの親和性をＥＬＩＳＡにより試験した。手短に言えば、標的上でのｍＡｂ１の結合は、リン酸バッファー（１×ＰＢＳ）中１μｇ／ｍｌでプレートに固定された組換えＢＴＮ３Ａ１、続いてブロックバッファー（２％乳／ＰＢＳ）を用いた飽和ステップを使用して評価した。ｍＡｂ１は、０．００１２２〜２０μｇ／ｍｌの４倍希釈範囲においてブロックバッファーで力価を滴定した。二次抗体（ヤギ抗ヒトｌｇｋ鎖、ＨＲＰコンジュゲート抗体、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＡＰ５０２Ｐ、ブロックバッファー中１対４０００に希釈）及びＴＭＢ溶液を検出用に使用した。見かけの親和性はＥＣ５０％（シグナルプラトーの５０％を得るのに必要な抗体濃度）として表した。
【０３１５】
ヒト及びカニクイザルＣＤ３＋細胞へのｍＡｂ１の結合アビディティー
赤血球溶解後、ヒト又はカニクイザルＰＢＬは、４℃で３０分間、漸増濃度のｍＡｂ１又はアイソタイプ対照と一緒にインキュベートし、２回洗浄して、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＰＥコンジュゲート二次抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）♯１２−４９９８−８２））で染色した。２回洗浄後、細胞は、抗ＣＤ３−ＰＣ３  ｍＡｂ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ♯５５７７４９）及びｌｉｖｅ／ｄｅａｄ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ♯Ｌ１０１１９）で染色した。洗浄後、細胞は２００μＬのＦｌｏｗバッファーに再懸濁した。次に、細胞はＣｙｔｏｆｌｅｘ細胞計数器（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）上で分析した。データは、生存ＣＤ３＋集団でゲート開閉するＦｌｏｗＪｏソフトウェア（バージョン１０、ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＵＳＡ）を使用して解析した。次に、ＰＥチャネルからのＭＦＩ値を計算し、濃度に対してプロットした。カーブフィッティングは、ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰｒｉｓｍソフトウェアからのＳ字型４ＰＬ方程式を使用して得た。
【０３１６】
ヒト及びカニクイザル循環細胞上でのＢＴＮ３Ａ表面発現
白血球上でのＢＴＮ３Ａ表面発現では、１００μｌのカニクイザル及びヒト全血を、特定の抗体のカクテル（Ａｑｕａ  ｌｉｖｅ  Ｄｅａｄ試薬、ＣＤ２０−Ｖ４５０、ＣＤ８−ＢＶ６０５、ＣＤ４−ＢＶ６５０、Ｖｇ９  ＴＣＲ−ＦＩＴＣ、抗ＢＴＮ３Ａ−ＰＥ（クローン２０．１）（又はアイソタイプ対照ではｍＩｇＧ１−ＰＥ）、ＣＤ３−ＰｅＣｙ７、ＣＤ４５−ＡＦ７００及びＣＤ１４−ＡＰＣ−Ｈ７）と一緒に９６ウェルプレートに蒔き、ＲＴで１５分間、光から保護してインキュベートした。次に、赤血球細胞は、９００μｌの溶解試薬（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ♯３４９２０２）を製造業者の説明書に従って用いて溶解した。細胞は洗浄し、マルチパラメータフローサイトメトリーを使用して分析した。赤血球細胞及び血小板上でのＢＴＮ３Ａ表面発現では、１００μｌのカニクイザル又はヒト全血を１００μｌのＰＢＳで希釈し、抗体の特定のカクテル（Ａｑｕａ  ｌｉｖｅ  ｄｅａｄ、ＣＤ４１−ＡＰＣ、ＣＤ４５−ＡＦ７００及び抗ＢＴＮ３Ａ（クローン２０．１）（又はアイソタイプ対照ではｍＩｇＧ１−ＰＥ））と一緒にＲＴで１５分間、光から保護してインキュベートした。洗浄後、細胞はマルチパラメータフローサイトメトリーを使用して分析した。ＢＴＮ３Ａ表面発現の相対的定量化を得るため、較正ビーズ（ＣｅｌｌＱｕａｎｔ  Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ  Ｂｉｏｃｙｔｅｘ  ♯７２０８）及びヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＰＥを製造業者の説明書に従って並行して使用した。すべての細胞サブセットでは、抗ＢＴＮ３Ａ及びアイソタイプ対照についてはＰＥチャネルのＭＦＩが報告された。分析は、抗ＢＴＮ３Ａ染色のＭＦＩからアイソタイプ対照のＭＦＩを引き算することにより実施し、相対的表面発現は較正ビーズを用いて得られた標準曲線に基づいて計算した。
【０３１７】
カニクイザルＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞インビトロ増殖及び活性化
３動物からのカニクイザル全血は、赤血球溶解バッファーで処理した。広範囲な洗浄後、白血球はｒＨｕＩＬ−２（２００ＩＵ／ｍｌ）及びｍＡｂ１（１０μｇ／ｍｌ）の存在下、１．５Ｍ／ｍｌのＲＰＭＩ  １０％ＳＶＦで６ウェルプレートに蒔いた。機能アッセイを実施するのに十分な数の細胞を入手するため、ｒＨｕＩＬ−２を６日目及び８日目に添加して、ヒトＰＢＭＣの場合に使用される通常の細胞増殖プロトコールを模倣し、Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞長期インビトロ生存を改善した。Ｖγ９＋Ｔ細胞の百分率は、特定の抗体のカクテル及びフローサイトメトリー分析（ＣＤ３−ＰＣ７  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ♯５５７７４９、Ｖｇ９  ＴＣＲ−ＦＩＴＣクローン７Ａ５  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ♯ＴＣＲ２７２０、Ｌｉｖｅ  Ｄｅａｄ近ＩＲ  ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ♯Ｌ１０１１９）を使用して０、６、８及び１０日目に評価した。
【０３１８】
１０日目、増殖Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞は計数し、ヒト腫瘍細胞株と１対１のＥ対Ｔ比で共培養した。１００，０００標的腫瘍細胞株（ラージ、ダウディ及びＫ５６２）は、９６ウェルプレートにおいて、ｍＡｂ１若しくはｈＩｇＧ１アイソタイプ対照（１０μｇ／ｍｌ）又は正の対照として使用されるＰＭＡ（２０ｎｇ／ｍｌ）／イオノマイシン（１μｇ／ｍｌ）の存在下で、１００，０００カニクイザルＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞と混合した。Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞脱顆粒は、ＣＤ１０７ａ／ｂ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ♯５５５８００）染色及びフローサイトメトリー分析を使用して４時間後にモニターした。
【０３１９】
カニクイザルインビボ研究
インライフ研究（ｉｎ  ｌｉｆｅ  ｓｔｕｄｙ）
ベトナム起源の４〜６歳、３〜５ｋｇのカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）をこの研究では使用した。すべての動物は、ＧＬＰ動物施設の施設内動物管理使用委員会の指針に従って維持され使用された。繁殖動物健康手順として、すべての動物は結核について検査され、予防処置は繁殖動物記録に記述された。到着後、動物は、少なくとも２週間の期間、研究手順に順化させた。体調不良についての臨床検査及び試験が実施された。すべての動物の研究に対する適合性を確かめるため、前服用段階の開始前に動物健康評価を獣医が実施した。
【０３２０】
ｍＡｂ１は、非絶食動物の皮膚を消毒した後、静脈内に投与した（椅子に拘束され、１５分間かけて注入）。群１、４、及び５の動物は１、８、１５、及び２２日目に投与された。群２及び３の動物は１日目に１回投与された。
【０３２１】
薬物動態
カニクイザル血清でのｍＡｂ１の定量化のために条件付き薬物動態アッセイを開発した。手短に言えば、ｍＡｂ１は、分光光度法によりＥＬＩＳＡを使用して定量した。ストレプトアビジンプレ被覆プレートを使用してヒトＩｇＧ−Ｆｃ  ＰＫビオチンコンジュゲートを捕捉する。次に、ｍＡｂ１はプレートの表面で捕捉され、結合した分析物は、ペルオキシダーゼ標識抗種抗体であるヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｆｃ特異的）抗体を使用して検出される。定量化の標的範囲は、生の血清中９０ｎｇ／ｍＬ〜１００００ｎｇ／ｍＬである。
【０３２２】
免疫表現型検査
血液試料（１．０ｍＬ）は、すべての動物から、橈側正中皮静脈又は小伏在静脈からＬｉヘパリンチューブ中に取り出した。免疫表現型検査は、特定のモノクローナル抗体のカクテルを用いて実行した。相対的細胞数（リンパ球／白血球の百分率）の分析を実施した。全顆粒球／リンパ球／白血球数はヘモアナライザー（ｈｅｍｏａｎａｌｙｓｅｒ）により同じ日に決定し、絶対数の計算用に使用した。リンパ球亜群の絶対数は相対数からコンピュータ処理した。
【０３２３】
受容体占有
血液試料（４００μＬ）は、すべての動物から、橈側正中皮静脈又は小伏在静脈からＬｉヘパリンチューブ中に取り出した。細胞上でＢＴＮ３Ａ（クローン１０３．２）に非競合的に結合する標識抗体は、過剰なＩＣＴ０１と一緒にプレインキュベートされ、ＣＤ３＋Ｔ細胞及びＣＤ１９＋Ｂ細胞上での全表面ＢＴＮ３Ａ発現を決定するのに使用された。遊離のＢＴＮ３Ａ結合部位の検出では、ＣＤ３＋Ｔ細胞及びＣＤ１９＋Ｂ細胞上での蛍光色素標識抗ＢＴＮ３Ａ抗体（ｍＡｂ１）の結合を阻害するＢＴＮ３Ａへの非標識ｍＡｂ１の競合的結合を使用した。ｍＡｂ１によりブロックされたＢＴＮ３Ａの量に応じて、コンジュゲートｍＡｂ１の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、幾何平均が減少すると測定された。その結果、アイソタイプ抗体の染色強度に近いＡｂ７．２の染色強度は完全な飽和を示していた。
【０３２４】
ｂ．結果
ｍＡｂ１はカニクイザルＢＴＮ３Ａに結合する
３つのＢＴＮ３Ａアイソフォーム遺伝子の差示的識別は公共のデータベースからは可能ではなかったので、ＩｍＣｈｅｃｋは、適切なプライマーを設計するために膜貫通ドメインに接する高度に保存されたｃＤＮＡ配列を使用して、カニクイザルＰＢＭＣから単離されたｃＤＮＡで標的ＰＣＲを実施した。ＰＣＲ産物の塩基配列決定によりカニクイザルＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２、及びＢＴＮ３Ａ３についての外部ドメイン配列の同定が可能になった。６×Ｈｉｓタグに融合されたカニクイザルＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２及びＢＴＮ３Ａ３アイソフォームの組換え外部ドメインは、これら配列（それぞれ配列番号２１、２２及び２３）に基づいてＣＨＯ細胞において作製した。
【０３２５】
組換えタンパク質はＢＩＡｃｏｒｅ及びＥＬＩＳＡによりｍＡｂ１結合について試験した（表２６）。ＢＩＡｃｏｒｅ結果により、ｍＡｂ１は、有利なことに、３つのカニクイザル組換えＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２及びＢＴＮ３Ａ３に結合するが、ＢＴＮ３Ａ１アイソフォームについては親和性は比較的低いことが示された。ＥＬＩＳＡは、ＢＴＮ３Ａ１アイソフォームで実施した。興味深いことに、表２６は、組換えヒト又はカニクイザルＢＴＮ３Ａ１でのｍＡｂ１結合については同等のＥＣ５０を示している。
【表２５】
2021533204.tif 000032
【０３２６】
並行して、カニクイザルＰＢＭＣ上でのｍＡｂ１結合はフローサイトメトリーにより評価した。カニクイザルＣＤ３＋Ｔ細胞へのｍＡｂ１結合の平均ＥＣ５０は、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞へのｍＡｂ１結合のＥＣ５０に匹敵していた（表２７）。カニクイザル対ヒトの健康なドナー全血由来の異なる免疫細胞亜群上での標的発現には、ＰＥコンジュゲート抗ＢＴＮ３Ａ  ｍＡｂ（クローン２０．１）を、ヒト及びカニクイザルマカク細胞表面マーカーに対する既知の交差反応性を有する表現型抗体のパネルと一緒に使用して、マルチパラメータフローサイトメトリーにより取り組んだ（データは示さず）。これらの結果により、ＢＴＮ３Ａは両方の種で末梢血細胞集団の広いパネルにおいて発現されるが、カニクイザルマカクでは見かけ上の一般的により低い発現が観察されたことが示される。
【表２６】
2021533204.tif 000033
ｍＡｂ１はカニクイザルＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞増殖及び活性化をインビトロで促進する
次に、ｍＡｂ１の機能活性をカニクイザルＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞上インビトロで評価した。先ず、本発明者らは、ｍＡｂ１が、カニクイザルＰＢＭＣと一緒に１０日間インキュベートした場合、カニクイザルＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞増殖を促進するかどうかを評価した。図４Ａに示されるように、ｍＡｂ１は試験された３動物すべてにおいてＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞増殖を促進し、この集団は１０日後に６０％に達し、これはヒト細胞について観察されたレベルに匹敵するレベルであった。１０日間の増殖後、細胞は、ｍＡｂ１の存在下で標的細胞として使用されるダウディ、Ｋ５６２又はラージ細胞株と４時間共培養し、フローサイトメトリーによりＣＤ１０７ａ／ｂについて分析した。この実験により、ｍＡｂ１は、３つの腫瘍細胞株すべてと共培養した場合、有意なＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞を誘導することが明らかにされた（図４Ｂ）。
【０３２７】
結論として、結果は、（ｉ）ｍＡｂ１はヒト細胞に対するのと類似する結合アビディティーでカニクイザル細胞に結合する、（ｉｉ）ＢＴＮ３Ａは、ヒト及びカニクイザルにおいて同じ血液細胞上で発現されるが、後者の種のほうが観察された発現レベルは低かった、及び（ｉｉｉ）ｍＡｂ１は、カニクイザルＰＢＭＣにおいてＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞サブセット増殖を促進し、増殖した細胞はｍＡｂ１パルス腫瘍標的細胞に対して反応性であることを明らかにしている。
【０３２８】
ｍＡｂ１はカニクイザルＶγ９Ｖδ２  Ｔ細胞コンパートメントにインビボで影響を与える
インビボ研究は、４〜６歳の健康なメスカニクイザルにおいて実行し、このサルはｍＡｂ１の単回又は繰り返し静脈内注入を受けた（表２８）。
【０３２９】
投与の静脈経路は、それが意図しているヒト治療経路であるという理由で選んだ。動物は、時差漸増用量デザイン（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ  ｅｓｃａｌａｔｉｎｇ  ｄｏｓｅ  ｄｅｓｉｇｎ）に従ってｍＡｂ１を用いて処置した。
【表２７】
2021533204.tif 000034
以下のエンドポイント：臨床徴候、体重、臨床病理（血液学、臨床化学及び凝固）、末梢血白血球集団についての免疫表現型検査、活性化／増殖／分化マーカー、薬物動態及び薬力学（循環Ｔ及びＢ細胞上のＢＴＮ３Ａ受容体占有）を評価した。
【０３３０】
ｍＡｂ１の単回又は４回繰り返し１５分注入を受けた後、すべての動物が研究２９日目の予定された剖検まで生存した。体重又は摂食量に対する試験物関連効果（ｔｅｓｔ  ａｒｔｉｃｌｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｅｆｆｅｃｔｓ）は見られなかった。臨床徴候は、研究室収容状況でのカニクイザルで見られる知見と一致しており、したがって、試験物に起因していなかった。
【０３３１】
薬物動態
ｍＡｂ１は、用量範囲０．１〜１００ｍｇ／ｋｇにわたる静脈内（ＩＶ）投与に続いて凡その用量比例薬物動態（データは示さず）、及び標的媒介クリアランスの非存在下でＩｇＧ  ｍＡｂに特有である長い排出半減期を示した。４回投与についての１０又は１００ｍｇ／ｋｇ／週の繰り返し投与に（データは示さず）続いて、曝露はすべての動物において処置期間を通して維持され、４週間処置期間を通して最小の蓄積のみであった。漸増毎週投与レジメンにおける１及び１０ｍｇ／ｋｇ  ＩＶの投与に続く歩哨動物についての薬物動態プロファイルは、毎週投与間隔の終了頃にクリアランスが増加しているある証拠を示しており、これはｍＡｂ１に対するＡＤＡの形成の結果である可能性があるが、１００ｍｇ／ｋｇの最後のＩＶ投与後はクリアランスが増加した証拠はなかった。
【０３３２】
受容体占有（ＲＯ）
血液でのＢＴＮ３Ａ発現プロファイル及び細胞集団表示に従って、ｍＡｂ１  ＲＯをＣＤ３＋Ｔ細胞及びＣＤ２０＋Ｂ細胞上で測定した。
【０３３３】
結果は、ＢＴＮ３ＡがＣＤ３＋Ｔ細胞とＣＤ２０＋Ｂ細胞の両方の上でｍＡｂ１注射後急速に占有されることを示している（データは示さず）。１００ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ１での繰り返し投与は、毎週投与間隔を通してずっと完全受容体占有に必要とされるようであった。
【０３３４】
免疫表現型検査
それぞれの投与後選択された時点で、ｍＡｂ１を受けた動物の血液は、Ｔ細胞サブセット（ＣＤ４、ＣＤ８、Ｖγ９  Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞）、Ｂ細胞、単球、ＮＫ細胞、ｍＤＣ、ｐＤＣ及び顆粒球並びに関連活性化マーカー（ＣＤ６９、ＣＤ８６、ＣＤ９５、グランザイムＢ、Ｋｉ６７）を定量化するために特定のｍＡｂのカクテルで染色されて、フローサイトメトリーにより分析された。分析は、それぞれの集団における相対的細胞数（リンパ球／白血球の百分率）を、同時に収穫され血液試料から決定され血液学的細胞計数装置を使用して分析された全リンパ球／白血球数から外挿した絶対細胞数と共に含んでいた。
【０３３５】
この広範な分析からの主な知見は：
Ｖδ９＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋中の％）は、ｍＡｂ１を受けたすべての動物において投与後有意に低下し、単回投与動物では漸進的に上に戻ってくる。この効果は、ＣＤ４及びＣＤ８  αβ  Ｔ細胞では観察されないので、特異的だと思われ、サル及びヒトにおいてＣＤ３エンゲージャー二重特異性抗体について観察されるように、γδ  Ｔ細胞活性化及び組織における辺縁趨向を示唆している（Ｓｍｉｔｈら、２０１５年  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．２０１５年１２月１１日；５：１７９４３頁．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ１７９４３．）。結果は図５に示されている。
【０３３６】
本研究は、ｍＡｂ１が、ＩＶ経路により投与されると、１００ｍｇ／ｋｇ／週までの用量では十分に許容的なようであることを示している。さらに、Ｔ細胞サブセット間では、Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ細胞がｍＡｂ１により特異的に有意に影響を受ける。
【０３３７】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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