(57)【要約】  本発明は、クルクミノイドを含む組成物；とりわけ、高度に水溶性のクルクミノイドを含む組成物に関する。本発明はまた、かかる組成物を提供するためのプロセスおよびかかる組成物の使用に関する。
2021533750.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
（ｉ）組成物の少なくとも約２０重量％のクルクミノイド；
（ｉｉ）アラビアガム；および
（ｉｉｉ）キラヤから得られたまたは得られ得る抽出物
を含む組成物であって、当該組成物が約１００ｎｍ〜約１００００ｎｍの平均直径を有する粒子を含む、前記組成物。
【請求項２】
粒子が約１００ｎｍ〜約７００ｎｍの平均直径を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
さらに、植物および／または野菜油を含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
キラヤ抽出物が、組成物の約０．１〜約５重量％の量で存在する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
アラビアガムが、組成物の約４０〜約６０重量％の量で存在する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
キラヤ抽出物が少なくとも５０％のサポニンを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
キラヤ抽出物が固体の形態である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
栄養補助製剤、ヒトまたは動物用の食事製品または食品（機能性食品製剤、すなわち、食物、飲料、飼料またはペットフードあるいは食物、飲料、飼料またはペットフードサプリメントなど）、栄養補助サプリメント、フレグランスまたはフレーバー剤、医薬または獣医学組成物、ワイン学または化粧品製剤としての請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項９】
栄養補助製剤、ヒトまたは動物用の食事製品または食品（機能性食品製剤、すなわち、食物、飲料、飼料またはペットフードあるいは食物、飲料、飼料またはペットフードサプリメントなど）、栄養補助サプリメント、フレグランスまたはフレーバー剤、医薬または獣医学組成物、ワイン学または化粧品製剤の調製における、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物からなる、本質的にそれからなる、またはそれを含む、栄養補助製剤、ヒトまたは動物用の食事製品または食品（機能性食品製剤、すなわち、食物、飲料、飼料またはペットフードあるいは食物、飲料、飼料またはペットフードサプリメントなど）、栄養補助サプリメント、フレグランスまたはフレーバー剤、医薬または獣医学組成物、ワイン学または化粧品製剤。
【請求項１１】
栄養補助製剤、ヒトまたは動物用の食事製品または食品（機能性食品製剤、すなわち、食物、飲料、飼料またはペットフードあるいは食物、飲料、飼料またはペットフードサプリメントなど）、栄養補助サプリメント、フレグランスまたはフレーバー剤、医薬または獣医学組成物、ワイン学または化粧品製剤が、さらに、必要に応じた、賦形剤または担体または（機能性）食物に許容され得る成分などの薬学的／獣医学的成分、およびそれらの混合物を含む、請求項８または９に記載の使用。
【請求項１２】
さらに、必要に応じた、賦形剤または担体または（機能性）食物に許容され得る成分などの薬学的／獣医学的成分、およびそれらの混合物を含む、請求項９に記載の栄養補助製剤、ヒトまたは動物用の食事製品または食品（機能性食品製剤、すなわち、食物、飲料、飼料またはペットフードあるいは食物、飲料、飼料またはペットフードサプリメントなど）、栄養補助サプリメント、フレグランスまたはフレーバー剤、医薬または獣医学組成物、ワイン学または化粧品製剤。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物の調製プロセスであって、当該プロセスが、以下のステップ：
（ｉ）クルクミノイドの水溶液を調製すること；
（ｉｉ）（ｉ）からの水溶液を水性のアラビアガム溶液およびキラヤから得られたまたは得られ得る抽出物、および任意に植物および／または野菜油と混合して、エマルションを提供すること；および任意に
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の生成物を乾燥させて、約１００ｎｍ〜約１０００ｎｍの平均直径を有する粒子を含む組成物を提供すること、
を含む、
前記調製プロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、クルクミノイドを含む組成物；とりわけ、高度に水溶性のクルクミノイドを含む組成物に関する。本発明はまた、かかる組成物を提供するためのプロセスおよびかかる組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
本明細書における明らかに以前に公開された文書のリストまたは議論は、その文書が技術水準の一部であるか、または一般的な知識であることの承認として必ずしも解釈されるべきではない。
【０００３】
ターメリック、およびクルクミンを包含するクルクミノイドなどのターメリックから単離された化合物は、様々な疾患および状態を処置するために長い間使用されてきた。クルクミノイドは、天然の黄橙色の色素であり、ハーブのCurcuma longaの根茎に由来する疎水性ポリフェノールである。それらは一般的に香辛料および食物着色剤ターメリックから単離される。
【０００４】
ターメリック抽出物は、およそ７５〜８０％クルクミン、１５〜２０％デメトキシクルクミン（ＤＭＣ）、および０〜１０％ビスデメトキシクルクミン（ＢＤＭＣ）を含有している（図１参照）。クルクミノイドは、ユニークな共役構造、ビス−α，β−不飽和β−ジケトン（一般的にジフェルロイルメタンと呼ばれる）を有し、これは、酸性および中性溶液では優勢なケト型、アルカリ性媒体では安定なエノール型を有するケト−エノール互変異性を示す（Hoehle SI, Pfeiffer E, Solyom AM, Metzler M. Metabolism of curcuminoids in tissue slices and subcellular fractions from rat liver. J Agric Food Chem. 2006 Feb 8;54(3):756-64）。
【０００５】
クルクミンが貴重な健康上の利益を授けることができる正確なメカニズムは不明なままであるが、全体的なプラスの効果はいくつかのケースにおいて非常に顕著である。
【０００６】
クルクミンは、１９４９年に抗菌活性を示すことが最初に示された高多面発現性分子（highly pleiotropic molecule）である。それ以来、このポリフェノールは、抗炎症、低血糖、抗酸化、創傷治癒、および抗微生物活性を持つことが示されてきた。過去３０年間にわたる豊富な前臨床研究および臨床試験は、広範なヒトの疾患に対するクルクミンの治療可能性を示している(Gupta SC, Sung B, Kim JH, Prasad S, Li S, Aggarwal BB. Multitargeting by turmeric, the golden spice: From kitchen to clinic. Mol Nutr Food Res. 2013 Sep;57(9):1510-28)。
【０００７】
クルクミンは多くのヒトの障害に対して有効性を示しているが、不十分な吸収、迅速な代謝、および迅速な全身的排出（systemic elimination）のため、制限されたバイオアベイラビリティを有することもまた知られている。
【０００８】
クルクミンが経口投与されるときの低い血清レベル、ならびに制限された組織分布および迅速な代謝が報告されている。例えば、最大で１２ｇの経口投与後でも、クルクミンの血清レベルは低マイクロモルレベルを超えなかったことが実証されている。４〜８ｇのクルクミンでの１つの臨床研究において、観察された最大血清濃度は１．３μｇ／ｍＬであったが、他のいくつかの臨床および動物研究は、より低いミリリットルあたりナノグラムの範囲で血清レベルを報告した(Anand P, Kunnumakkara AB, Newman RA, Aggarwal BB. Bioavailability of curcumin: problems and promises. Mol Pharm. 2007 Nov-Dec;4(6):807-18)。
【０００９】
クルクミンは水に難溶性であることが見出されている。例えば、水性緩衝液（ｐＨ５．０）へのクルクミンの最大溶解度は１１ｎｇ／ｍｌと低いことが報告されている(Tonnesen HH, Masson M, Loftsson T. Studies of curcumin and curcuminoids. XXVII. Cyclodextrin complexation: solubility, chemical and photochemical stability. Int J Pharm. 2002 Sep 5;244(1-2):127-35)。
【００１０】
クルクミンは酸性ｐＨで相対的に安定しているが、中性より上のｐＨで急速に分解し、フェルラ酸およびフェルロイメタンを形成し、次いで後者がバニリンをもたらす(FAO 2004. CURCUMIN Chemical and Technical Assessment (CTA) First draft prepared by Ivan Stankovic. Chemical and Technical Assessment 61st JECFA)。
【００１１】
クルクミンはまた、極めて低い腸吸収を示す。クルクミンの見掛けの透過係数は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのヒト腸細胞モデル（Ｐａｐｐ値：０．１×１０−６ｃｍ／ｓ）において極度に低いことが見出され、これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＣａｃｏ−２細胞において測られたＰａｐｐ値と、ｉｎ  ｖｉｖｏでのヒト吸収との相関関係に従えば、ヒトにおける低い（０−２０％）吸収を予測することができた(Dempe JS, Scheerle RK, Pfeiffer E, Metzler M. Metabolism and permeability of curcumin in cultured Caco-2 cells. Mol Nutr Food Res. 2013 Sep;57(9):1543-9)。
【００１２】
吸収されると、クルクミンは第Ｉ相および第ＩＩ相の両方の代謝を受ける（図２参照）。
第Ｉ相代謝において、クルクミンおよびその２つのデメトキシ同族体は、肝臓においてならびに腸粘膜において、それらのジヒドロ−、テトラヒドロ−、ヘキサヒドロ−、オクタヒドロ−の代謝物へと連続的な還元を受ける。第ＩＩ相代謝において、クルクミンとその還元性代謝物の両方がグルクロン酸およびスルファートで抱合され、第ＩＩ相代謝物を形成する。
【００１３】
還元および抱合は、ラットおよびヒトの肝臓および腸の組織で起こるクルクミノイドの一般の代謝経路であると思われる。よって、何人かの著者によって、胃腸管以外の組織においてクルクミンによって誘発される生物学的効果は、クルクミン代謝物による可能性が高いと考えられている。
【００１４】
クルクミンはまた、腸内微生物によって代謝されることも示されている（図３参照）。
クルクミンの微生物代謝は、ＮＡＤＰＨ依存性クルクミン／ジヒドロクルクミンレダクターゼ（CurA）によってクルクミンが連続的にジヒドロクルクミンに変換され、次いでテトラヒドロクルクミンに変換されるという、２段階の還元を含むことが見出された(Hassaninasab et al., 2011)。
【００１５】
最近の研究は、クルクミンではなくテトラヒドロキシクルクミンがラットの組織に蓄積することができたことを報告しており、微生物叢もまたクルクミン代謝およびバイオアベイラビリティの潜在的なアクターと見なすことができることを示唆している(Neyrinck AM, Alligier M, Memvanga PB, Nevraumont E, Larondelle Y, Preat V, Cani PD, Delzenne NM. Curcuma longa extract associated with white pepper lessens high fat diet-induced inflammation in subcutaneous adipose tissue. PLoS One. 2013 Nov 19;8(11):e81252)。
【００１６】
迅速な代謝、不十分な水溶性、中性ｐＨでの不安定性ならびに光および／または酸素への曝露時の不安定性、ならびに組織による不十分な取り込みは、癌などの状態の処置におけるクルクミンなどのクルクミノイドの潜在的な使用を包含する、クルクミノイドの潜在的な実用性を大幅に制限する。
【００１７】
いくつかの第Ｉ相および第ＩＩ相臨床試験では、追加の化学療法の有無にかかわらず、結腸直腸腫瘍、進行膵臓癌および乳癌の患者における経口クルクミン投与の有望な効果が実証されている。より具体的には、クルクミンは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏの両方で抗黒色腫効率を示す。
【００１８】
様々な癌（黒色腫を包含する）におけるクルクミンの大きな治療可能性にもかかわらず、その臨床応用は、以下：迅速な代謝、不十分な水溶性、中性ｐＨでの不安定性ならびに光および／または酸素への曝露時の不安定性、ならびに組織による不十分な取り込みを包含する、多くの制限特性に起因して強く妨げられている。上記の特性が、癌などの症状の処置におけるクルクミンの利用を大幅に制限する。
【００１９】
不十分な水溶性および吸収特性に起因して、典型的には、クルクミンなどのクルクミノイドを溶解するために有機溶媒が使用される。例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの溶媒。しかしながら、かかる溶媒の使用はクルクミンを可溶化し、入手可能性を改善するのに役立つが、ビヒクルとしての有機溶媒の使用は、特に天然成分に対する消費者の需要が高まっている時代では物議を醸し、望ましくない。
【００２０】
クルクミンの水溶性を補助する別の可能性は、乳化によるものである。しかしながら、天然有機グレード乳化剤は希少であり、ポリソルベート８０などの合成乳化剤とデンプンベース乳化剤などの天然乳化剤の両方は、典型的には、低レベル（＜７％）のクルクミンを水に分散させることしかできない。
【００２１】
上記の欠点に対処し、およびクルクミンの治療有効性を改善するために探求されてきた他のストラテジーは、ポリマーナノ粒子、ポリマーミセルおよび親水性ポリマーへのクルクミンの移植を包含する方法の使用を包含する。
【００２２】
本発明は、クルクミノイドの水への不十分な可溶性に関連する上述の問題に対処すること、および水に高度に可溶性の、生理学的ｐＨで安定の両方であるクルクミノイドを含む組成物を提供することに努める。
【発明の概要】
【００２３】
発明の開示
組成物
本発明者らは、驚くべきことに、組成物の少なくとも約２０重量％クルクミノイド、アラビアガム、およびキラヤから得られたまたはキラヤから得られ得る抽出物を含む組成物であって、当該組成物が約１００ｎｍ〜約１００００ｎｍの平均直径を有する粒子を含む、前記組成物が高度に水溶性で、生理学的ｐＨで安定であることを見出した。
【００２４】
本発明によれば、以下：
（ｉ）組成物の少なくとも約２０重量％クルクミノイド；
（ｉｉ）アラビアガム；および
（ｉｉｉ）キラヤから得られたまたは得られ得る抽出物、
を含む組成物であって、当該組成物が約１００ｎｍ〜約７００ｎｍまたは約１０００ｎｍ〜約６０００ｎｍなどの約１００ｎｍ〜約１００００ｎｍの平均直径を有する粒子を含む、前記組成物が提供される。
【００２５】
本発明によれば、以下：
（ｉ）組成物の少なくとも約２０重量％クルクミノイド；
（ｉｉ）アラビアガム；および
（ｉｉｉ）キラヤから得られたまたは得られ得る抽出物、
を含む組成物であって、当該組成物が約１００ｎｍ〜約７００ｎｍの平均直径を有する粒子を含む、前記組成物が提供される。
【００２６】
かかる組成物は、以下、「本発明の組成物」と称され得る。
本発明の組成物はエマルションの形態であってもよく、または本発明の組成物は固体の形態、例えば、粉末の形態であってもよい。
【００２７】
本明細書に使用されるとき、用語「エマルション」は、大抵は混合しない２つの液体を組み合わせることによって形成されるタイプのコロイドを指す。典型的には、液体の１つが他の液体の分散体を含有する。
【００２８】
ときには、用語「コロイド」および「エマルション」は互換的に使用されるが、本明細書に使用されるときは、用語エマルションは、混合物の両方の相が液体である場合に適用する。コロイド中の粒子は、任意の物質の相であることができる。そのため、エマルションはコロイドのタイプであるが、すべてのコロイドがエマルションであるとは限らない。
時折、コロイド懸濁液として識別されるコロイド溶液は、物質が定期的に流体に懸濁されている混合物である。
【００２９】
本発明の組成物はフェヌグリークを含まない、例えば、いくつかの本発明の組成物はフェヌグリーク繊維（すなわち、フェヌグリークから得られたまたは得られ得る繊維）を含まない。
【００３０】
本発明の組成物は、組成物の５重量％未満または組成物の２．５重量％未満などの、少量のポリオールおよび／または好ましくは１または２の単糖単位を有する低分子量糖を含んでいてもよい。代替的に、本発明の組成物は、ポリオールおよび／または１または２の単糖単位を有するものなどの低分子量糖を含まなくてもよい、すなわち、いくつかの組成物は、ポリオールおよび／または１または２の単糖単位を有するものなどの低分子量糖を全く含有しない。
【００３１】
本発明の組成物において、粒子は、約２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、６００ｎｍ、７００ｎｍ、８００ｎｍ、９００ｎｍ、１０００ｎｍ、１１００ｎｍ、１２００ｎｍ、１３００ｎｍ、１４００ｎｍまたは１５００ｎｍ〜約９０００ｎｍ、８０００ｎｍ、７０００ｎｍ、６０００ｎｍ、５０００ｎｍ、４０００ｎｍ、３０００ｎｍまたは２０００ｎｍ、例えば、約１０００ｎｍ〜約６０００ｎｍの平均直径を有し得る。粒子はまた、約２００ｎｍ〜約６００ｎｍ、または約３００ｎｍ〜約５００ｎｍまたは約４００ｎｍの平均直径を有し得る。
【００３２】
例えば、組成物がエマルションの形態である場合、組成物は、例えば、約５５０ｎｍ〜約７００ｎｍの平均直径を有する粒子および約１００ｎｍ〜約２５０ｎｍの平均直径を有する粒子を含んでいてもよく、平均直径は約４００ｎｍになる。
組成物が粉末などの固体の形態である場合、組成物は、例えば、約２０００ｎｍ〜約４０００ｎｍなどの約１０００ｎｍ〜約６０００ｎｍの平均直径を有する粒子を含んでいてもよい。
【００３３】
本発明の組成物中の粒子は、ミセルの形態であってもよい。
本発明の組成物において、例えば、組成物が固体の形態である場合、粒子は、噴霧乾燥などの当技術分野において知られているかかる技法を使用して形成されてもよい。
粒子の形成後（例えば、噴霧乾燥などの乾燥後）、粒子をすりつぶすおよび／または粉砕（ボールミルなど）して、より均一なサイズを提供してもよい。
【００３４】
ロードされたクルクミンミセルのサイズおよび形態は、動的光散乱（ＤＬＳ）、およびゼータ電位（Ｚ−電位）、および走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）によって分析された。ＤＬＳおよびゼータ電位分析については、（２５±０．１℃）の温度で９０°の固定散乱角でＨｅ／Ｎｅレーザー（λ＝６３３ｎｍ）を備えたZetasizer Nano ZS（NanoZS90、Malvern Instrument Ltd.、英国）。例えば、粒子のサイズは、下の例において定義されるとおりのCQ-MO-304法によって測定してもよい。
【００３５】
本発明の組成物において、クルクミノイドは、任意の供給源から得られ得る。しかしながら、クルクミノイドは天然源から得られることが好ましい、すなわち、クルクミノイドは合成ではなく、植物ベースである。
【００３６】
本発明の組成物は、組成物の少なくとも約２５重量％クルクミノイドまたは少なくとも約３０重量％クルクミノイドを含み得る。
例えば、本発明の組成物において、クルクミノイドは、組成物の約２５重量％〜約５０重量％、または約２８重量％〜約４８重量％などの約２０重量％〜約６０重量％の量で存在し得る。
【００３７】
クルクミノイドは、ターメリック(Curcuma longa)の根（根茎）、オレオレジンターメリック根、脱脂オレオレジンターメリック根およびそれらの混合物からの抽出および任意の精製によって提供されてもよく、すなわち（ｉ）クルクミノイドは、抽出物中の総クルクミノイドのパーセンテージに基づいて、約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％〜約９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％または４５％のクルクミノイドなどの約３０％〜約１００％クルクミノイドを含むターメリックの抽出物または精製抽出物の形態であってもよい。
【００３８】
クルクミノイドがターメリックの抽出物として提供される場合、ターメリックは、水／アルコール混合物またはアルコールなどのアルコールベース抽出溶媒を使用して抽出してもよい。例えば、アルコールベース抽出溶媒は、水／メタノール（すなわち、水とメタノールの混合物）または水／エタノール（すなわち、水とエタノールの混合物）またはメタノールまたはエタノールであってもよい。
【００３９】
抽出溶媒が水／アルコール混合物を含む場合、水対アルコールの比は、約２０：８０〜約５：９５または約１０：９０などの約２５：７５〜約１：９９であってもよい。例えば、抽出溶媒は、約２０：８０〜約５：９５または約１０：９０などの約２５：７５〜約１：９９の比の水／エタノールであってもよい。
【００４０】
次いで、ターメリック抽出物をさらに精製して、抽出物中の総クルクミノイドのパーセンテージに基づいて、約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％から約９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％または４５％のクルクミノイドなどの約３０％から約１００％のクルクミノイド含むクルクミノイドの抽出物を提供してもよい。
【００４１】
抽出物の精製は、当技術分野において知られているかかる技法を使用して実施してもよい。典型的には、抽出物は、１００％メタノールまたは１００％エタノールなどのアルコールベース溶媒を使用して精製される。
ターメリック抽出物を任意に乾燥させて、過剰な溶媒を除去してもよい。
【００４２】
クルクミノイドが先に定義したターメリック抽出物の形態で提供される場合、組成物は、組成物の約３５重量％〜約４５重量％などの約３０重量％〜約５０重量％ターメリック抽出物を含んでいてもよい。例えば、組成物は、組成物の約３５重量％（すなわち、３５％）〜約４５重量％ターメリック抽出物を含んでいてもよく、ここで、ターメリック抽出物は、ターメリック抽出物の約８５重量％〜約９５重量％クルクミノイドを含み、組成物の約３０重量％（すなわち３０％）〜約４３重量％クルクミノイドを含む組成物を提供する。
【００４３】
クルクミノイドは、液体または粉末などの粉末として提供されてもよい。例えば、粉末のターメリック抽出物。
本明細書に使用されるとき、用語「クルクミノイド」は、クルクミン、デメトキシクルクミン（ＤＭＣ）、およびビスデメトキシクルクミン（ＢＤＭＣ）を包含する。例えば、ターメリック抽出物は、約７０％〜約８５％クルクミン（約７５％〜約８０％など）、約１０％〜約２５％ＤＭＣ（約１５％〜約２０％など）および約０％〜約１０％ＢＤＭＣを含んでいてもよい。
【００４４】
本発明の組成物中のアラビアガムは、組成物の約５０〜約６０重量％または約５８重量％などの組成物の約４０重量％〜約６５重量％の量で存在していてもよい。
本発明の組成物中のキラヤから得られたまたは得られ得る抽出物は、組成物の約０．５重量％〜約３重量％または約２重量％などの約０．１重量％〜約５重量％の量で存在していてもよい。
【００４５】
当業者には当然なことながら、本明細書に使用されるとき、用語「から得られ得る」は、キラヤ抽出物がキラヤ属の植物（Quillaja Saponaria Molinaなど）から得られ得るか、またはキラヤ属の植物から単離され得るか、または代替源から、例えば化学合成または酵素的産生によって得られ得ることを意味する。本明細書に使用されるときの用語「得られた」は、抽出物がキラヤ属の植物に直接由来することを意味する。
【００４６】
本発明の組成物においてキラヤから得られたまたは得られ得る抽出物は、キラヤ抽出物の少なくとも６０重量％のサポニンまたは少なくとも６５重量％のサポニンなどの少なくとも５０％重量％のサポニンを含んでいてもよい。例えば、本発明の組成物に使用されるキラヤは、キラヤ抽出物の約５０重量％〜約８０重量％または約６０重量％〜約７５重量％のサポニンを含んでいてもよい。
【００４７】
本発明のプロセスにおいて使用されるキラヤから得られたまたは得られ得る抽出物は、液体または固体などの任意の形態であってよい。例えば、キラヤ抽出物は、粉末などの固体の形態で使用してもよい。
本発明の組成物中に存在する場合、キラヤ水および／またはアルコールなどの他の溶媒を、固体または液体のキラヤに添加してもよい。例えば、キラヤは、水溶液として本発明の組成物中に存在していてもよい。
【００４８】
本発明の組成物は、任意に、植物および／または野菜油（plant and/or vegetable oil）を含んでいてもよい。例えば、本発明の組成物は、ココナッツ油、トウモロコシ油、綿実油、オリーブ油、パーム油、ピーナッツ油（落花生油）、カノーラ油を包含する菜種油、サフラワー油、ゴマ油、大豆油、ヒマワリ油、およびそれらの混合物からなる群から選択される植物および／または野菜油を含んでいてもよい。
本発明の組成物中に存在する植物および／または野菜油は、組成物の約２．５重量％〜約１０重量％または約５重量％などの約１重量％〜約２０重量％の量で存在していてもよい。
本明細書に別段の記載がない限り、記されている重量パーセントは、得られた（乾燥）組成物の総重量に基づいている。
【００４９】
誤解の回避のために、本発明の所与の側面、特色またはパラメータに対する選好、選択肢、具体的な特色などは、文脈が別段示さない限り、本発明の同じまたは他の側面、特色およびパラメータについて示されるような他の任意のおよび全ての選好、選択肢、具体的な特徴などと組み合わせて開示されたと見なされるべきである。
【００５０】
本明細書に使用されるときの用語「約」は、例として、測定可能な値（反応混合物中の具体的な構成要素の量または重量など）を指す場合、特定された量に対して±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、または具体的に±０．１％の変動を指す。例えば、本発明の組成物中の成分のパーセンテージに関して±０．５％の変動は、与えられたパーセンテージに対して０．５％の変動を意味し、すなわち、１０％の±０．５％は、９．５％〜１０．５％の変動を意味する。
【００５１】
本発明の組成物は、固体または液体の形態、好ましくは粉末などの固体形態で提供され得る。固体形態には、化合物がアモルファス固体として、あるいは結晶性または部分結晶性固体として提供され得ることを包含する。
【００５２】
本発明の組成物は、典型的には、高度に水溶性であり、および／またはｐＨ約４〜約７などのｐＨ４以上で安定である。
用語水溶性は、組成物の少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％または９５％などの少なくとも約５０％が室温、すなわち約２５℃の温度で水に溶解するであろうことを意味する。
【００５３】
組成物および投与
本発明によれば、本発明の組成物は、栄養補助製剤、ヒトまたは動物用の食事製品または食品（機能性食品製剤、すなわち、食物、飲料、飼料またはペットフードあるいは食物、飲料、飼料またはペットフードサプリメントなど）、除草剤、栄養補助サプリメント、フレグランスまたはフレーバー剤、医薬または獣医学製剤、ワイン学または化粧品製剤の形態で提供されてもよく、または栄養補助製剤、ヒトまたは動物用の食事製品または食品（機能性食品製剤、すなわち、食物、飲料、飼料またはペットフードあるいは食物、飲料、飼料またはペットフードサプリメントなど）、栄養補助サプリメント、フレグランスまたはフレーバー剤、医薬または獣医学製剤、ワイン学または化粧品製剤の一部を形成する。
【００５４】
例えば、本発明は、本発明の組成物からなる、本質的にそれからなる（すなわち、少なくとも９０％ｗ／ｗの栄養補助製剤、ヒトまたは動物用の食事製品または食品（機能性食品製剤、すなわち、食物、飲料、飼料またはペットフードあるいは食物、飲料、飼料またはペットフードサプリメントなど）、栄養補助サプリメント、フレグランスまたはフレーバー剤、医薬または獣医学製剤、ワイン学または化粧品製剤が本発明の組成物である、例えば少なくとも９５％または９９％または９９．５％など）、または、本発明の組成物を含む、栄養補助製剤、ヒトまたは動物用の食事製品または食品（機能性食品製剤、すなわち、食物、飲料、飼料またはペットフードあるいは食物、飲料、飼料またはペットフードサプリメントなど）、栄養補助サプリメント、フレグランスまたはフレーバー剤、医薬または獣医学製剤、ワイン学または化粧品製剤を提供する。
【００５５】
本発明はまた、栄養補助製剤、ヒトまたは動物用の食事製品または食品（機能性食品製剤、すなわち、食物、飲料、飼料またはペットフードあるいは食物、飲料、飼料またはペットフードサプリメントなど）、栄養補助サプリメント、フレグランスまたはフレーバー剤、医薬または獣医学製剤、ワイン学または化粧品製剤における本発明の組成物の使用を提供する。
【００５６】
本発明の組成物が、栄養補助製剤、ヒトまたは動物用の食事製品または食品（機能性食品製剤など、すなわち、食物、飲料、飼料またはペットフードあるいは食物、飲料、飼料またはペットフードサプリメントなど）、除草剤、栄養補助サプリメント、フレグランスまたはフレーバー剤、医薬または獣医学製剤、ワイン学または化粧品製剤であるか、または栄養補助製剤、ヒトまたは動物用の食事製品または食品（機能性食品製剤など、すなわち、食物、飲料、飼料またはペットフードあるいは食物、飲料、飼料またはペットフードサプリメントなど）、栄養補助サプリメント、フレグランスまたはフレーバー剤、医薬または獣医学製剤、ワイン学または化粧品製剤の一部を形成し得る場合、必要に応じた、賦形剤または担体または（機能性）食品に許容し得る成分およびそれらの混合物などの薬学的／獣医学的成分を任意にさらに含んでいてもよい。
【００５７】
誤解の回避のために、本明細書において用語「含む（comprising）」または「含む（comprises）」を使用する場合、記載される抽出物または組成物は、列挙された成分（単数または複数）を含有しなければならないが、任意に追加の成分を含み得ることを意味する。用語「本質的にからなる（consisting essentially of）」または「本質的にからなる（consists essentially of）」を使用する場合、記載されている抽出物または組成物は、列挙された成分（単数または複数）を含有しなければならず、少しの（たとえば、５重量％まで、あるいは１重量％または０．１重量％まで）他の成分を含有することがあることを意味するが、ただし、いずれの追加の成分も抽出物または組成物の本質的な特性に影響を与えない。用語「からなる（consisting oｆ）」または「からなる（consists of）」を使用する場合、記載されている抽出物または組成物は、列挙されている成分（単数または複数）のみを含有しなければならないことを意味する。
また、必要に応じ、「含む（comprise）」または「含む（comprises）」または「含む（comprising）」という用語は、出願全体を通して「からなる（consist）」または「からなる（consisting）」または「からなる（consisting essentially of）」に置き換えられてもよいこともまた意図されている。
【００５８】
本明細書に使用されるとき、薬学的に許容し得る賦形剤への言及は、当業者に知られているような薬学的に許容し得るアジュバント、希釈剤および／または担体を指し得る。
食品に許容し得る成分は、当技術分野で知られているもの（本明細書では薬学的に許容し得る賦形剤とも称されるものを包含する）を包含し、天然または非天然であることができ、すなわち、それらの構造は自然界で発生することも、しないこともある。ある例では、それらは天然化合物から生じることができ、使用前に改変することができる（例えば、マルトデキストリン）。
【００５９】
「薬学的／栄養学的に許容し得る」とは、組成物の追加成分が滅菌でパイロジェンフリーであることを意味する。かかる成分は、本発明の組成物と適合性があり、およびそのレシピエントに有害ではないという意味で「許容し得る」でなければならない。よって、「薬学的に許容し得る」は、単に賦形剤として作用することを意図する、すなわちそれ自体が生物学的活性を有することを意図しない、製剤の一部を形成するのに使用される任意の化合物を包含する。よって、薬学的に許容し得る賦形剤は、一般に安全で、非毒性であり、および生物学的にも他においても望ましくないものではない。
【００６０】
本発明の組成物が、栄養補助製剤、ヒトまたは動物用の食事製品または食品（機能性食品製剤など、すなわち、食物、飲料、飼料またはペットフードあるいは食物、飲料、飼料またはペットフードサプリメントなど）、栄養補助サプリメント、フレグランスまたはフレーバー剤、医薬または獣医学製剤、ワイン学または化粧品製剤の一部を形成する場合、本発明の組成物は、栄養補助製剤、ヒトまたは動物用の食事製品または食品（機能性食品製剤など、すなわち、食物、飲料、飼料またはペットフードあるいは食物、飲料、飼料またはペットフードサプリメントなど）、栄養補助サプリメント、フレグランスまたはフレーバー剤、医薬または獣医学製剤、ワイン学または化粧品製剤の約１〜約９９重量％の量で、栄養補助製剤、ヒトまたは動物用の食事製品または食品（機能性食品製剤など、すなわち、食物、飲料、飼料またはペットフードあるいは食物、飲料、飼料またはペットフードサプリメントなど）、栄養補助サプリメント、フレグランスまたはフレーバー剤、医薬または獣医学製剤、ワイン学または化粧品製剤中に存在する、例えば、栄養補助製剤、ヒトまたは動物用の食事製品または食品（機能性食品製剤など、すなわち、食物、飲料、飼料またはペットフードあるいは食物、飲料、飼料またはペットフードサプリメントなど）、栄養補助サプリメント、フレグランスまたはフレーバー剤、医薬または獣医学製剤、ワイン学または化粧品製剤の約１０重量％、２０重量％、３０重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、７０重量％、８０重量％、または９０重量％〜約９０重量％、８０重量％、７０重量％、６０重量％、５０重量％、４０重量％、３０重量％、または２０重量％など。
【００６１】
投与
当業者は、本発明の組成物は、当該組成物が栄養補助製剤、ヒトまたは動物用の食事製品または食品（機能性食品製剤など、すなわち、食物、飲料、飼料またはペットフードあるいは食物、飲料、飼料またはペットフードサプリメントなど）、栄養補助サプリメント、フレグランスまたはフレーバー剤、医薬または獣医学製剤、ワイン学または化粧品製剤の形態である場合、または栄養補助製剤、ヒトまたは動物用の食事製品または食品（機能性食品製剤など、すなわち、食物、飲料、飼料またはペットフードあるいは食物、飲料、飼料またはペットフードサプリメントなど）、栄養補助サプリメント、フレグランスまたはフレーバー剤、医薬または獣医学製剤、ワイン学または化粧品製剤が本発明の組成物を含む場合のいずれも、経口、直腸、経鼻、肺、頬側、舌下、経皮、嚢内、腹腔内、および非経口（皮下、筋肉内、髄腔内、静脈内および皮内を包含する）ルートなどの任意の好適なルートによって、患者または対象（例として、ヒトまたは動物の患者または対象）に投与し得ることを理解するであろう。
【００６２】
とりわけ、本発明の組成物および本発明の組成物を含む栄養補助製剤、ヒトまたは動物用の食事製品または食品（機能性食品製剤など、すなわち、食物、飲料、飼料またはペットフードあるいは食物、飲料、飼料またはペットフードサプリメントなど）、栄養補助サプリメント、フレグランスまたはフレーバー剤、医薬または獣医学製剤、ワイン学または化粧品製剤は、経口投与され得る。かかる場合において、本発明による医薬組成物は、経口ルートによる投与のために特別に処方され得る。
【００６３】
経口投与用の医薬製剤は、ハードまたはソフトカプセル、錠剤、トローチ、糖衣錠、丸薬、トローチ剤、粉末および顆粒などの固体剤形を包含する。適切な場合、それらは、腸溶性コーティングなどのコーティングで調製することができ、または当技術分野において周知である方法に従って、持続的な放出または延長された放出などの活性成分の制御放出を提供するように処方することができる。
経口投与用の液体剤形は、溶液、エマルション、水性のまたは油性の／油ベースの懸濁液、シロップおよびエリキシル剤を包含する。
【００６４】
本明細書に記載の栄養補助製剤、ヒトまたは動物用の食事製品または食品（機能性食品製剤など、すなわち、食物、飲料、飼料またはペットフードあるいは食物、飲料、飼料またはペットフードサプリメントなど）、栄養補助サプリメント、フレグランスまたはフレーバー剤、医薬または獣医学製剤、ワイン学または化粧品製剤、経口投与を意図したものなどは、組成物の構成要素を混合することによるなど当業者に知られている方法に従って調製してもよい。
【００６５】
本明細書に記載のかかる栄養補助製剤、ヒトまたは動物用の食事製品または食品（機能性食品製剤など、すなわち、食物、飲料、飼料またはペットフードあるいは食物、飲料、飼料またはペットフードサプリメントなど）、栄養補助サプリメント、フレグランスまたはフレーバー剤、医薬または獣医学製剤、ワイン学または化粧品製剤は、甘味料、フレーバー剤、着色剤および保存剤などの食品成分からなる群から選択される１以上の追加の成分を含有していてもよい。錠剤は、錠剤の製造に好適である非毒性の薬学的に許容し得る賦形剤（または成分）と混合された活性成分（単数または複数）を含有し得る。これらの賦形剤（または成分）は、例えば、以下のものであり得る：炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムなどの不活性希釈剤；造粒および崩壊剤、例えば、コーンスターチ、マルトデキストリンまたはアルギン酸；結合剤、例えば、デンプン、ゼラチンまたはアカシア；および潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルク。錠剤は、コーティングされていなくてもよく、または既知の技法によってコーティングされて、胃腸管での崩壊および吸収を遅延させ、およびそれによって長期間にわたって持続的な作用を提供してもよい。例えば、グリセリルモノステアラートまたはグリセリルジステアラートなどの時間遅延材料を使用してもよい。
【００６６】
好適な医薬担体は、不活性な固体希釈剤または充填剤、滅菌水溶液、および様々な有機溶媒を包含する。固体担体の例は、ラクトース、テラアルバ、スクロース、シクロデキストリン、マルトデキストリン、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、アラビアガム、加工デンプンおよびセルロースの低級アルキルエーテルである。液体担体の例は、シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油、リン脂質、脂肪酸、脂肪酸アミン、ポリオキシエチレンおよび水である。その上、担体または希釈剤は、グリセリルモノステアラートまたはグリセリルジステアラートなどの当技術分野で知られている任意の持続放出材料を、単独で、またはワックスと混合して包含し得る。
【００６７】
処置される障害および対象、ならびに投与ルートに応じて、本発明の組成物は、様々な用量（すなわち、それを必要とする患者に投与される治療有効用量）で投与することができる。これに関して、当業者は、本発明の文脈において哺乳動物、具体的にヒトに投与される用量は、合理的な時間枠にわたって哺乳動物の治療反応に影響を与えるのに十分であるべきであることを理解するであろう。当業者は、正確な用量および組成の選択ならびに最も適切な送達レジメンは、なかでも、製剤の薬理学的特性、処置される状態の性質および重症度、およびレシピエントの身体的状態および精神的鋭敏さ、ならびに特定の化合物の効能、処置を受ける患者の年齢、状態、体重、性別および反応、および疾患の病期／重症度によっても影響を受けることを認識するであろう。
【００６８】
典型的には、本発明の組成物または栄養補助製剤、ヒトまたは動物用の食事製品または食品（機能性食品製剤など、すなわち、食物、飲料、飼料またはペットフードあるいは食物、飲料、飼料またはペットフードサプリメントなど）、栄養補助サプリメント、フレグランスまたはフレーバー剤、医薬または獣医学製剤、ワイン学または化粧品製剤は、約３００ｍｇ／日〜約１０００ｍｇ／日などの、約１００ｍｇ／日〜約２０００ｍｇ／日、または約５００ｍｇ／日〜約１５００ｍｇ／日、または約１０００ｍｇ／日の量のクルクミノイドを提供するように投与される。例えば、組成物または栄養補助製剤、ヒトまたは動物用の食事製品または食品（機能性食品製剤など、すなわち、食物、飲料、飼料またはペットフードあるいは食物、飲料、飼料またはペットフードサプリメントなど）、栄養補助サプリメント、フレグランスまたはフレーバー剤、医薬または獣医学製剤、ワイン学または化粧品製剤は約２．５〜約７．５ｍｇ／ｋｇ体重または約５ｍｇ／ｋｇ体重などの約１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の量のクルクミノイドを提供し得る。
【００６９】
いずれにせよ、医師または他の当業者は、個々の患者に最も好適な実際の投与量を日常的に特定することができるであろう。上述の投与量は、平均的なケースの例示である；もちろん、より高いまたはより低い投与量範囲がメリットとなる個々の場合があり得るし、そのようなものは本発明の範囲内である。
【００７０】
本発明の組成物の調製プロセス
本発明は、先に定義した本発明の組成物の調製プロセスを提供し、当該プロセスは、以下のステップ：
（ｉ）クルクミノイドの水溶液を調製すること；
（ｉｉ）（ｉ）からの水溶液を水性のアラビアガム溶液、およびキラヤから得られたまたは得られ得る抽出物、および任意に植物および／または野菜油を混合して、エマルションを提供すること；および任意に
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の生成物を乾燥させて、約１００ｎｍ〜約７００ｎｍまたは約１０００ｎｍ〜約６０００ｎｍなどの約１００ｎｍ〜約１００００ｎｍの平均直径を有する粒子を含む組成物を提供すること、
を含む。
【００７１】
例えば、本発明は、先に定義した本発明の組成物の調製プロセスを提供し、当該プロセスは、以下のステップ：
（ｉ）クルクミノイドの水溶液を調製すること；
（ｉｉ）（ｉ）からの水溶液を水性のアラビアガム溶液、およびキラヤから得られたまたは得られ得る抽出物、および任意に植物および／または野菜油を混合して、エマルションを提供すること；および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の生成物を乾燥させて、約１００ｎｍ〜約７００ｎｍまたは約１０００ｎｍ〜約６０００ｎｍなどの約１００ｎｍ〜約１００００ｎｍの平均直径を有する粒子を含む組成物を提供すること、
を含む。
かかるプロセスは、以下、本発明のプロセスと称される。
【００７２】
本発明のプロセスにおいて、アラビアガムの水溶液は、キラヤから得られたまたは得られ得る抽出物、および任意に植物および／または野菜油と混合する前に、クルクミノイドの水溶液と混合してもよく、すなわち、本発明のプロセスは、以下；
（ｉ）クルクミノイドの水溶液を調製すること；
（ｉｉ）（ｉ）からの水溶液を水性のアラビアガム溶液と混合すること；
（ｉｉｉ）キラヤから得られたまたは得られ得る抽出物、および任意に植物および／または野菜油を、（ｉｉ）の生成物に混合して、エマルションを提供すること；および任意に
（ｉｖ）（ｉｉｉ）の生成物を乾燥させて（噴霧乾燥によってなど）、約１００ｎｍ〜約７００ｎｍまたは約１０００ｎｍ〜約６０００ｎｍなどの約１００ｎｍ〜約１００００ｎｍの平均直径を有する粒子を含む組成物を提供すること、
を含んでいてもよい。
乾燥後（噴霧乾燥など）、粒子をすりつぶすおよび／または粉砕（ボールミルなど）して、より均一なサイズを提供してもよい。
【００７３】
本発明のプロセスにおいて、粒子は、約１０００ｎｍ〜約６０００ｎｍなどの、約２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、６００ｎｍ、７００ｎｍ、８００ｎｍ、９００ｎｍ、１０００ｎｍ、１１００ｎｍ、１２００ｎｍ、１３００ｎｍ、１４００ｎｍまたは１５００ｎｍ〜から約９０００ｎｍ、８０００ｎｍ、７０００ｎｍ、６０００ｎｍ、５０００ｎｍ、４０００ｎｍ、３０００ｎｍまたは２０００ｎｍの平均直径を有し得る。粒子はまた、約２００ｎｍ〜約６００ｎｍ、または約３００ｎｍ〜約５００ｎｍまたは約４００ｎｍの平均直径を有し得る。
【００７４】
例えば、本発明の組成物がエマルションの形態である場合（すなわち、乾燥ステップの前）、組成物は、約５５０ｎｍ〜約７００ｎｍの平均直径を有する粒子および約１００ｎｍ〜約２５０ｎｍの平均直径を有する粒子を含んでいてもよく、平均直径は約４００ｎｍになる。
本発明の組成物が固体の形態である場合（すなわち、乾燥ステップの後）、組成物は、約２０００ｎｍ〜約４０００ｎｍなどの約１０００ｎｍ〜約６０００ｎｍの平均直径を有する粒子を含んでいてもよい。
組成物中の粒子はミセルの形態であってもよい。
【００７５】
本発明のプロセスにおいて、クルクミノイドの水溶液中に存在するクルクミノイドは、本発明の組成物に関して先に定義した任意の供給源からのものであり得る。
典型的には、本発明のプロセスにおいて、クルクミノイドは、クルクミノイド源の約５重量％〜約１００重量％の純度（総クルクミノイドに基づく）を有し得る、すなわち、ターメリックまたはクルクミノイド抽出物は、抽出物中の総クルクミノイドのパーセンテージに基づいて約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％〜約９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％または４５％のクルクミノイドなどの、約３０％〜約１００％のクルクミノイドを含み得る。
【００７６】
本発明のプロセスにおいて、クルクミノイドは、約３：１などの、約２：１（クルクミノイド：水）〜約４：１の重量比で水と混合されて、クルクミノイドの水溶液を提供し得る。
典型的には、本発明のプロセスにおいて、水溶液中のクルクミノイドの重量濃度は、約５％〜約８０％または約７％〜約４０％などの、約１％〜約９５％であり得る。
【００７７】
本発明のプロセスにおいて、水性のアラビアガム溶液は、約３：１などの、約２：１〜約４：１のアラビアガム：水の比率でアラビアガムを水と混合することによって調製され得る。
水性のアラビアガム溶液は、約４０％〜約６０％などの、約３０％〜約７０％のアラビアガムの重量濃度を有し得る。
典型的には、水性のクルクミノイド溶液および水性のアラビアガム溶液は、攪拌を使用して混合される。
【００７８】
本発明のプロセスにおいて、植物および／または野菜油は、任意の植物および／または植物源からのものであり得る。例えば、植物および／または野菜油はヒマワリ油であってもよい。
典型的には、本発明のプロセスにおいて、植物および／または野菜油は、約２．５％〜約７．５％または約５％などの、約１％〜約１０％の量で存在し得る。
【００７９】
本発明のプロセスにおいて、キラヤから得られたまたは得られ得る抽出物は、本発明の組成物に関して先に定義したとおりであり得る。
本発明のプロセスにおいて使用されるキラヤから得られたまたは得られ得る抽出物は、液体または固体などの任意の形態であり得る。例えば、キラヤ抽出物は、粉末などの固体の形態で使用してもよい。
典型的には、本発明のプロセスにおいて、キラヤは、約１％〜約３％、または約２％などの、約０．５％〜約５％の量で存在し得る。
【００８０】
本発明のプロセスにおいて、植物および／または野菜油ならびにキラヤ抽出物は、攪拌を使用して混合してもよい。
クルクミノイドの水溶液、水性のアラビアガム溶液、植物および／または野菜油ならびに上に定義されるとおりのキラヤを混合することにより、エマルションが提供される。
【００８１】
その結果得られるエマルションを、当技術分野で知られているような技法を使用して乾燥させて、約１０００ｎｍから約６０００ｎｍなどの、約２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、６００ｎｍ、７００ｎｍ、８００ｎｍ、９００ｎｍ、１０００ｎｍ、１１００ｎｍ、１２００ｎｍ、１３００ｎｍ、１４００ｎｍまたは１５００ｎｍ〜約９０００ｎｍ、８０００ｎｍ、７０００ｎｍ、６０００ｎｍ、５０００ｎｍ、４０００ｎｍ、３０００ｎｍまたは２０００ｎｍの平均直径を有する粒子（ミセルなど）を含む組成物を提供してもよい。粒子はまた、約３００ｎｍ〜約５００ｎｍ、または約４００ｎｍなどの、約１００ｎｍ〜約７００ｎｍ、または約２００ｎｍ〜約６００ｎｍの平均直径を有し得る。通常、エマルションは噴霧乾燥される。
【００８２】
本発明のプロセスは、実質的に乾燥した生成物、すなわち、存在する水の少なくとも９５％または９９％などの、少なくとも９０％が除去された生成物を提供するために、必要に応じて追加の溶媒を除去するステップを任意に包含してもよい。
【００８３】
方法および使用
本発明の組成物の高い水溶性および安定性は、本発明の組成物を使用して、哺乳動物におけるクルクミノイドのバイオアクセシビリティ、バイオアベイラビリティ、生物有効性および／または生物活性を改善できることを意味する。
クルクミノイドの改善されたバイオアクセシビリティ、バイオアベイラビリティ、生物有効性および／または生物活性は、本発明の組成物を、過去にクルクミノイドの不十分な水溶性および安定性が問題であった疾患を予防および／または処置するために使用することを可能にする。
よって、本発明は、先に定義した本発明の組成物の形態での前記クルクミノイドの投与を含む、哺乳動物におけるクルクミノイドのバイオアクセシビリティ、バイオアベイラビリティ、生物有効性および／または生物活性を改善するための方法を提供する。
本方法は、以下、「本発明の方法」と称され得る。
【００８４】
本発明はまた、哺乳動物におけるクルクミノイドのバイオアクセシビリティ、バイオアベイラビリティ、生物有効性および／または生物活性を改善するための先に定義した本発明の組成物の使用を提供する。
本使用は、以下、「本発明の使用」と称され得る。
【００８５】
本明細書に記載の方法または使用において、哺乳動物におけるクルクミノイドのバイオアクセシビリティ、バイオアベイラビリティ、生物有効性および／または生物活性の改善は、改善されたクルクミノイドの胃腸耐性および／または改善された腸細胞によるクルクミノイドの吸収および／または改善された血液循環を提供する組成物に起因し得る。
【００８６】
本明細書に記載の方法または使用において、哺乳動物におけるクルクミノイドのバイオアクセシビリティ、バイオアベイラビリティ、生物有効性および／または生物活性の改善は、約４〜約７のｐＨで改善された水溶性および／または改善された安定性を提供する組成物に起因し得る。
【００８７】
よって、本発明は、クルクミノイドの水溶性および／またはｐＨ安定性を改善するための方法であって、当該方法が先に定義した本発明の組成物の形態での前記クルクミノイドの投与を含む、前記方法を提供する。
本発明はまた、クルクミノイドの水溶性および／またはｐＨ安定性を改善するための先に定義した組成物の使用を提供する。
【００８８】
本明細書に記載の方法または使用において、クルクミノイドは、クルクミンおよびその第Ｉ相または第ＩＩ相代謝物、ビスデメトキシクルクミンおよびその第Ｉ相または第ＩＩ相代謝物およびそれらの混合物からなる群から選択されてもよい。例えば、第Ｉ相および／または第ＩＩ相代謝物は、クルクミングルクロニド、クルクミンスルファート、ＤＭＣグルクロニド、ＤＭＣスルファート、ＢＤＭＣグルクロニド、ＢＤＭＣスルファート、テトラヒドロクルクミン（ＴＨＣ）、ＴＨＣグルクロニド、ＴＨＣスルファート、ヘキサヒドロクルクミン（ＨＨＣ）、ＨＨＣグルクロニド、ＨＨＣスルファートおよびそれらの混合物からなる群から選択されてもよい。
【００８９】
本明細書に記載の組成物、方法または使用において、クルクミノイドは、それらの代謝されない形態、例えば、グルクロニドまたはスルファートの付加を受けていない形態またはクルクミン、ＤＭＣおよびＢＤＭＣであり得る。
本明細書に記載の方法および使用において、哺乳動物はヒトであってもよい。
【００９０】
本明細書に使用されるとき、用語「バイオアベイラビリティ」は、正常な生理学的機能で利用するために作用部位で利用可能な摂取された構成要素の画分として定義することができ、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを介して測られる(Guerra A, Etienne-Mesmin L, Livrelli V et al (2012) Relevance and challenges in modeling human gastric and small intestinal digestion. Trends Biotechnol 30:591-600)。バイオアベイラビリティは、３つの主要なステップ：胃腸管における元素の消化性と可溶性；腸細胞による元素の吸収および循環への輸送;および機能的実体または標的への組み込みの結果である(Wienk KJH, Marx JJM, Beynen AC (1999) The concept of iron bioavailability and its assessment. Eur J Nutr 38:51-75; Etcheverry P, Grusak MA, Fleige LE (2012) Application of in vitro bioaccessibility and bioavailability methods for calcium, carotenoids, folate, iron, magnesium, polyphenols, zinc, and vitamins B6, B12, D, and E. Front Physiol 3:1-21)。
【００９１】
本明細書に使用されるとき、用語「バイオアクセシビリティ」は、胃腸管内のその食物マトリックスから放出され、よって腸管吸収に利用できるようになる化合物の画分として定義することができる（典型的には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ手順から確立される）。それは、潜在的にバイオアクセス可能な物質への転換のために食物消化中に発生する一連の事象を包含するが、上皮組織およびプレシステミック代謝（腸と肝臓の両方）を介した吸収／同化は除外する。(Alegria A., Garcia-Llatas G., Cilla A. (2015) Static Digestion Models: General Introduction. In: Verhoeckx K. et al. (eds) The Impact of Food Bioactives on Health. Springer, Cham)
【００９２】
本明細書に使用されるとき、用語「生物活性」は、栄養素または生物活性化合物がどのように輸送されて標的組織に到達するか、それが生体分子とどのように相互作用するか、それが経験し得る代謝または生体内変化、ならびに誘発されるバイオマーカーおよび生理学的応答の生成として定義することができる(Alegria A., Garcia-Llatas G., Cilla A. (2015) Static Digestion Models: General Introduction. In: Verhoeckx K. et al. (eds) The Impact of Food Bioactives on Health. Springer, Cham)。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】図１−ターメリックからのクルクミノイドの化学構造
【図２】図２−クルクミンの第Ｉ相および第ＩＩ相代謝物
【図３】図３−クルクミンの細菌代謝物
【図４】図４−脱塩水（０．４％）に溶解した本発明の組成物の色に対するｐＨの効果。
【図５】図５−ロードされた本発明の組成物のＤＬＳプロファイル。
【００９４】
【図６】図６−異なるｐＨにおける本発明の組成物および組成物の個々の構成要素のＺ電位
【図７】図７−×３００での本発明の組成物の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像。
【図８】図８−×１３００での本発明の組成物の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像。
【図９】図９−×９２００での本発明の組成物の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像。
【００９５】
【図１０】図１０−４ｈのインキュベーション後に異なる胃腸管コンパートメントからの試料で処理されたＣａｃｏ−２細胞から収集された頂端上清で測定されたＬＤＨ活性、標準的なクルクミン抽出物からのデータ。棒は平均±ＳＥＭを表現している。ＰＰ：純粋な製品；ＳＩ：小腸；ＳＴ：胃；ＴＢ：トランスポートバッファ。（＊）、（＊＊）および（＊＊＊）は、それぞれＴＢ＋結腸４８ｈと比較したｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１およびｐ＜０．００１での有意性に対応する。
【図１１】図１１−４ｈのインキュベーション後に異なる胃腸管コンパートメントからの試料で処理されたＣａｃｏ−２細胞から収集された頂端上清で測定されたＬＤＨ活性、ＴＢ＋結腸４８試料（１００％）に正規化されたデータを有する標準クルクミン抽出物からのデータ。棒は平均±ＳＥＭを表現している。ＰＰ：純粋な製品；ＳＩ：小腸；ＳＴ：胃；ＴＢ：トランスポートバッファ。（＊）、（＊＊）および（＊＊＊）は、それぞれＴＢ＋結腸４８ｈと比較したｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１およびｐ＜０．００１での有意性に対応する。
【００９６】
【図１２】図１２−４ｈのインキュベーション後に異なる胃腸管コンパートメントからの試料で処理されたＣａｃｏ−２細胞から収集された頂端上清で測定されたＬＤＨ活性、ターメリックフィトソーム製剤からのデータ。棒は平均±ＳＥＭを表現している。ＰＰ：純粋な製品；ＳＩ：小腸；ＳＴ：胃；ＴＢ：トランスポートバッファ。（＊）、（＊＊）および（＊＊＊）は、それぞれＴＢ＋結腸４８ｈと比較したｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１およびｐ＜０．００１での有意性に対応する。
【図１３】図１３−４ｈのインキュベーション後に異なる胃腸管コンパートメントからの試料で処理されたＣａｃｏ−２細胞から収集された頂端上清で測定されたＬＤＨ活性、ＴＢ＋結腸４８ｈ試料（１００％）に正規化されたデータを有するターメリックフィトソーム製剤からのデータ。棒は平均±ＳＥＭを表現している。ＰＰ：純粋な製品；ＳＩ：小腸；ＳＴ：胃；ＴＢ：トランスポートバッファ。（＊）、（＊＊）および（＊＊＊）は、それぞれＴＢ＋結腸４８ｈと比較したｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１およびｐ＜０．００１での有意性に対応する。
【００９７】
【図１４】図１４−４ｈのインキュベーション後に異なる胃腸管コンパートメントからの試料で処理されたＣａｃｏ−２細胞から収集された頂端上清で測定されたＬＤＨ活性、キラヤベース製剤からのデータ。棒は平均±ＳＥＭを表現している。ＰＰ：純粋な製品；ＳＩ：小腸；ＳＴ：胃；ＴＢ：トランスポートバッファ。（＊）、（＊＊）および（＊＊＊）は、それぞれＴＢ＋結腸４８ｈと比較したｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１およびｐ＜０．００１での有意性に対応する。
【図１５】図１５−４ｈのインキュベーション後に異なる胃腸管コンパートメントからのサンプルで処理されたＣａｃｏ−２細胞から収集された頂端上清で測定されたＬＤＨ活性、ＴＢ＋結腸４８ｈ試料（１００％）に正規化されたデータを有するキラヤベース製剤からのデータ。棒は平均±ＳＥＭを表現している。ＰＰ：純粋な製品；ＳＩ：小腸；ＳＴ：胃；ＴＢ：トランスポートバッファ。（＊）、（＊＊）および（＊＊＊）は、それぞれＴＢ＋結腸４８ｈと比較したｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１およびｐ＜０．００１での有意性に対応する。
【００９８】
【図１６】図１６−同じ時点でサクリファイスしたマウスのグループの順応および馴化期間にわたる食物摂取量の進化。順応（Ｊ０−Ｊ７）および馴化（Ｊ８−Ｊ１４）期間中の異なる実験グループの１日あたりの平均食物摂取量（ｇ）。
【図１７】図１７−同じ時点でサクリファイスしたマウスのグループの順応および馴化期間にわたる体重の進化。同じ期間中の異なる実験グループの平均体重（ｇ）。データは平均±ＳＥＭとして表される。
【００９９】
【図１８】図１８−３００ｍｇ／ｋｇのクルクミノイドを含有する標準ターメリック抽出物に対するターメリックフィトソーム製剤の単回経口投与後のマウス血漿における、総クルクミノイドレベル（クルクミン、ＤＭＣ、ＢＤＭＣならびにそれらの関連する代謝物クルクミングルクロニドおよびスルファート、ＤＭＣグルクロニドおよびスルファート、ＢＤＭＣグルクロニドおよびスルファート、ＴＨＣ、ＴＨＣグルクロニドおよびスルファート、ＨＨＣ、ＨＨＣグルクロニドおよびスルファートの和）の経時変化。＊、＊＊、＊＊＊：各時点での標準ターメリック抽出物と有意に異なるターメリックフィトソーム製剤（事後t検定）（それぞれｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１）。
【図１９】図１９−３００ｍｇ／ｋｇのクルクミノイドを含有する標準ターメリック抽出物に対する本発明の方法／使用に使用される組成物の単回経口投与後のマウス血漿における、総クルクミノイドレベル（クルクミン、ＤＭＣ、ＢＤＭＣならびにそれらの関連する代謝物、クルクミングルクロニドおよびスルファート、ＤＭＣグルクロニドおよびスルファート、ＢＤＭＣグルクロニドおよびスルファート、ＴＨＣ、ＴＨＣグルクロニドおよびスルファート、ＨＨＣ、ＨＨＣグルクロニドおよびスルファートの和）の経時変化。＊、＊＊、＊＊＊：各時点での標準ターメリック抽出物と有意に異なる本発明の方法／使用に使用される組成物（事後t検定）（それぞれｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１）。
【０１００】
【図２０】図２０：異なる製剤（製剤あたりｎ＝７２）の摂取後の時間（ｈ）の関数としての総クルクミノイドおよび代謝物（クルクミン、ＤＭＣ、ＢＤＭＣならびにそれらの関連する代謝物、クルクミングルクロニドおよびスルファート、ＤＭＣグルクロニドおよびスルファート、ＢＤＭＣグルクロニドおよびスルファート、ＴＨＣ、ＴＨＣグルクロニドおよびスルファート、ＨＨＣ、ＨＨＣグルクロニドおよびスルファートの和）濃度（ｐｐｍ）。□、□□：各時点での標準ターメリック抽出物と有意に異なるターメリックフィトソーム（それぞれｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１）。＊、＊＊、＊＊＊：標準ターメリック抽出物と有意に異なる本発明の方法／使用に使用される組成物（それぞれｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１）。
【０１０１】
【図２１】図２１−異なる製剤の曲線の下の対応する面積ＡＵＣ（０−８ｈ）。
【図２２】図２２−異なる製剤の曲線の下の対応する面積ＡＵＣ（０−∞）。
【図２３】図２３−異なる製剤のＣｍａｘ（Ｔｍａｘでの濃度）。
【図２４】図２４−ＩＴＴ集団についての投与量で正規化したＡＵＣ０−２４ｈのグラフ表示。
【図２５】図２５−ＩＴＴ集団についての投与量で正規化したＡＵＣ０−８ｈのグラフ表示。
【０１０２】
【図２６】図２６−ＩＴＴ集団についての投与量で正規化したＡＵＣ０−∞のグラフ表示。
【図２７】図２７−ＩＴＴ集団についてのＡＵＣ０−２４ｈのグラフ表示。
【図２８】図２８−ＩＴＴ集団についてのＡＵＣ０−８ｈのグラフ表示。
【図２９】図２９−ＩＴＴ集団についてのＡＵＣ０−∞のグラフ表示。
【図３０】図３０−ＩＴＴ集団についての正規化されたＣｍａｘのグラフ表示。
【０１０３】
【図３１】図３１−ＩＴＴ集団についてのＣｍａｘのグラフ表示。
【図３２】図３２−ＩＴＴ集団についての０〜２４時間の相対的バイオアベイラビリティのグラフ表示。
【図３３】図３３−ＩＴＴ集団についての０〜８時間の相対的バイオアベイラビリティのグラフ表示。
【図３４】図３４−ＩＴＴ集団についての０〜無限大の相対的バイオアベイラビリティのグラフ表示。
【図３５】図３５−ＩＴＴ集団についての半減期のグラフ表示。
【図３６】図３６−ＩＴＴ集団についての終末相における消失速度定数（terminal elimination rate constant）のグラフ表示。
【図３７】図３７−ＩＴＴ集団についてのＴｍａｘのグラフ表示。
【０１０４】
例
本発明は、以下の非限定的な例を参照することによってさらに記載される。
例１−アルカリ性有機クルクミン溶液の調製。
水中のクルクミノイドの混合物を、蒸留水中の有機精製クルクミノイド抽出物（少なくとも１０％だが、好ましくは９５％の純度（総クルクミノイド））を使用して調製した（３体積の粉末重量／水）。
【０１０５】
例２−本発明の組成物の調製。
蒸留水（３体積の粉末重量／水）を使用して、５８％アラビアガム混合物（基質）を調製した。５００ｍｌの水性アラビアガム溶液に、５００ｍｌの例１で調製したクルクミノイド溶液を撹拌下（５０００ｒｐｍ）で添加し、これに５％の有機ヒマワリ油およびサポニンで標準化された２％有機キラヤを添加した。
その結果得られた混合物を５０００ｒｐｍで１０分間撹拌した。次いで、その結果得られたエマルションを噴霧乾燥した。
【０１０６】
例３−本発明の組成物の特徴付け
本発明の組成物のサイズおよび形態は、動的光散乱（ＤＬＳ）、およびゼータ電位（Ｚ−電位）、および走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）によって分析された。ＤＬＳおよびゼータ電位分析については、（２５±０．１℃）の温度で９０°の固定散乱角でＨｅ／Ｎｅレーザー（λ＝６３３ｎｍ）を備えたZetasizer Nano ZS（NanoZS90、Malvern Instrument Ltd.、英国）を使用した。
使用した試料は液体エマルションの形態であった（乾燥前の最後のステップ）。試料を０．４％の体積濃度で脱塩水に懸濁し、１分間の超音波を適用した。ＤＬＳ分析をこれらの試料で即時に行った（測定時間＝６０秒）。ゼータ電位の分析を広いｐＨ範囲（２〜１１）で行った。
試料を、０．１ＭＨＣｌおよび０．１ＭＮａＯＨ溶液の使用によって、次のとおり異なるｐＨで調製および分析した。得られた１０個のサンプル（ｐＨ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０、および１１）を室温（２３℃）で保存した（図４）。
【０１０７】
図４に示されるとおりに、水中の本発明の組成物の色は、ｐＨによって引き起こされる。ケト型（黄色）は、ｐＨ範囲が酸性から中性（２〜７）に変化する場合に溶液中に存在する優勢な形態である。ｐＨ８および９では、色の溶液はオレンジ色に変わり、およびｐＨ１０および１１では、半透明の赤みを帯びた色が優勢になる。色の変化は、クルクミンにより高い可溶性および不安定性を与えるｐＨの上昇によって引き起こされる、クルクミン分子のヒドロキシル基の連続的な脱プロトン化によるものである。
ＤＬＳ分析結果を図５に示す。２つのグループの粒子サイズ個体がある。１つは６１６±１６０ｎｍ（全個体の２０．８％）に集中し、最も興味深いものは１８８±４２ｎｍ（全個体の７９．２％）に集中した。
水溶液（ｐＨ５．４）にロードされたクルクミンの平均流体力学的粒子サイズは０．３３７のＰＤＩ（多分散度指数）で４７６．５ｎｍであることがわかった。
【０１０８】
図６は、異なるｐＨ（２〜１１）での本発明の組成物のＺ電位を示している。Ｚ電位高いほど、混合物は不安定になる。本発明の組成物は、ｐＨ２とｐＨ１１の間で負のＺ電位を有する。粒子は水相で負に帯電している。ｐＨ２では、Ｚ電位は０に近く（等電点：電位がゼロのｐＨ）、エマルションの不安定ゾーンがある。ｐＨ２とｐＨ４の間では、Ｚ電位は相対的に低く（＜２５ｍＶ）、ｐＨが４以上では、試料は安定ゾーンに入る。この安定性は、ｐＨ５から強く確認される。等電点の迅速なシフトがｐＨ８．０で観察され、ロードされたクルクミンのゼータ電位は２〜７のｐＨ範囲で驚くほど高かった。ｐＨ＜４．０の水相において、ロードされたクルクミンは大抵、最低の表面エネルギー状態にある。ｐＨ８．０では、ロードされたクルクミンはその低電荷側をアラビアガムに向き、その高電荷側を露出させて水と相互作用しやすく、これは上昇したゼータ電位をもたらす。
図６は、クレームされた組成物が４を超えるｐＨで水溶液に分散された場合に安定していることを明確に示している。
【０１０９】
例４−CQ-MO-304を使用した本発明の組成物の粒子サイズ分布（ＰＳＤ）
材料および試薬
材料      −Malvern InstrumentからのMastersizer 3000、または等価物
−Hydro 2000SM試料分散ユニット、または等価物（液相用）、
−Malvern AERO S試料分散ユニット、または等価物（固体相用）。
試薬      −水
【０１１０】
手順
分析パラメータ
−バックグラウンド時間：１０秒
−測定時間＠１０秒
−蒸留水の屈折率：１．３３
−結果の計算：汎用
−ポンプ／攪拌速度：１８００ＲＰＭ
−液体分散剤：水
−固体分散剤：環境大気
特定のパラメータ
−１００７０５（屈折率：１、吸収：１）
−１０００１９（屈折率：１、吸着：２）
−３ＣＡＡ００７５および３ＣＡＡ００７６（本発明の組成物）
本発明の組成物の試料を蒸留水と混合し、試料をHydro 2000SMユニットまたはMastersizer 3000（Scirocco 2000ユニットを使用）のいずれかを使用して試験した。
【０１１１】
結果
乾燥および粉砕後に得られた本発明の組成物のいくつかのバッチを、上述の方法に従って試験した。結果を下の表１に示す。
【０１１２】
表１  本発明の組成物の粒子サイズ分布（ここで、（Ｄ９０）は粒子サイズ集団の９０％に対応し、および（Ｄ４：３）は粒子サイズ集団の体積モーメント平均に対応する）。
【表１−１】
2021533750.tif 000003
【表１−２】
2021533750.tif 000004
【表１−３】
2021533750.tif 000005
【０１１３】
例５-本発明の組成物の形態（走査型電子顕微鏡、ＳＥＭによる）
ＳＥＭ分析のために、試料を以下のように調製した：粉末形態の本発明の組成物を、単にダスティングすることによって試料ホルダー上に堆積させた。その後、プラチナ／パラジウムの堆積物を金属化し、次いでエネルギー分散型のＸ線検出器を備えた走査型電子顕微鏡で観察および撮影した。
図７、８および９に示されるＳＥＭ画像は、本発明の組成物の可視化を提供する。
【０１１４】
本発明の組成物は、＋／−１７０ｎｍのサイズを有する球状ミセルに自己組織化された抱合体を示す。ＳＥＭ分析における大まかに球状の形態は、動的光散乱法によって行われたサイズ測定分析を裏付けた。
ＳＥＭから、本発明の組成物中の粒子は、コーティングされていないレシチンナノ粒子には存在しなかったキトサンの外皮を明確に示していることを見ることができる。クルクミンは、ナノ粒子のレシチンコアによく分散していることがわかった。ＳＥＭ測定はまた、大まかに球状の形状の証拠を裏付け、表面粗さは表面吸収を示している。このタイプの吸着の推進力は、直接的な静電相互作用またはイオン−イオン相互作用のいずれかであることを示唆している。
【０１１５】
例６−ヒト胃腸管および腸吸収細胞のＩｎ−Ｖｉｖｏモデルにおけるクルクミノイドのバイオアベイラビリティを増強する本発明の組成物の効果の試験
ヒトの胃腸管（ＧＩＴ）は、人体への主要なエントリーの１つである。食物、飲料、または医薬を経口摂取すると、腸は摂取した製品と宿主との間の最初の接触部位になる。それらの生物活性を発揮するために、化合物は、酸性環境および消化酵素の存在が化学的または酵素的改変をもたらし得る胃を最初に通過しなければならない。胃を出た後、摂取された化合物は小腸に到達し、そこで宿主の代謝酵素の大部分が分泌され、おそらくさらなる酵素改変を引き起こす。化合物は、元の形態または改変された形態で、続いて吸収されて循環に入るか、またはさらに腸を通過し得る。ここで、食物化合物は、回腸末端（小腸の最後の部分）および結腸に存在する複雑な微生物群集と接触していくことにより、局部の生物活性を有し得る(Alegria et al, 2015)。
【０１１６】
ヒトの研究は確かに、異なる腸プロセスを研究するための最も代表的な方法の１つである。しかしながら、それらは高度に労力と時間がかかり、極めてコストがかかり、機械的な研究を可能にしない。
ヒトにおいて、腸はインプットおよびアウトプットを定量化することを可能にするブラックボックスと見なすことができるが、サンプリングの問題に起因して、異なるコンパートメントにおいて基礎となる腸のプロセスを調査することは困難である。その上、倫理的制約がヒト試験の一般的な適用を制限する。
【０１１７】
したがって、十分に設計されたｉｎ  ｖｉｔｒｏシミュレーション技術は、ヒトおよび動物の研究に極めて有用な代替手段を提供する。特定のプロセスを代表するかかるモデルは、倫理的制約なしに、これらのプロセスの再現性のある綿密な研究を可能にする。より簡単なセットアップおよびサンプリングは、低コストでミディアム〜ハイスループットの研究を可能にする。それでもなお、生理学的な宿主環境の欠如は、これらのモデルの最も重要な制限である。しかしながら、ヒト由来の細胞株を使用する標準化されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養の使用は、腸粘膜に対する化合物の最終的な効果を研究するための速いおよび再現性のある方法を提供する。さらにまた、豊富なｉｎ  ｖｉｔｒｏ調査により、続く動物またはヒトの研究を慎重に設計でき、それによって時間と費用を節約できる。
【０１１８】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏアプローチにおいて、慎重に設計されたＧＩＴをシミュレーションすることは、選択された食物成分の推定代謝運命（putative metabolic fate）を異なる濃度で評価するための優れたハイスループットスクリーニングセットアップを提供する。かかる成分は、腸において改変されるかまたは細菌群集を改変し得、したがって、無傷で、または改変された副産物の形態で腸粘膜に到達する。食事化合物（dietary compound）の経口バイオアベイラビリティは、腸細胞によって吸収することができ、使用または保管に利用できる投与量の画分として定義される。
【０１１９】
食事化合物のバイオアベイラビリティは、多くの因子、つまり、個々の栄養的および生理学的状態、他の栄養素および／または胆汁塩との化合物の抱合、消化酵素による化合物の酵素分解、およびそれを代謝する腸関連細菌の能力に依存している。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ胃腸モデルは、短期間の実験において、迅速および費用効果の高い方法で、分子の大規模なセットをスクリーニングする可能性を提示する。
【０１２０】
以下のアプローチは、消化および結腸発酵の際の食事化合物の腸での運命（intestinal fate）を迅速に査定することができる。これは、ヒトの腸上皮をシミュレーションするｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞モデルに関連しており、無傷および改変された化合物のバイオアベイラビリティを調査することを可能にし、それによって科学的アウトプットと商業的関連の両方を増加させる。
【０１２１】
最初に、異なる可溶性特性を有するクルクミンベース製剤の消化運命を評価するためのツールとして、短期間のスクリーニングアッセイを実施した。
次いで、これらの実験の結果をｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣａｃｏ−２細胞に適用して、異なる製剤の生物学的に利用可能な画分を、未改変／未消化の形態と比較して調査した。
加えて、異なる消化画分の推定細胞毒性効果を比較するために、細胞毒性を測定した。
【０１２２】
短期間のスクリーニングアッセイは、代表的な細菌接種物を用いた大腸のシミュレーション条件下での、選択されたリード化合物の代表的な用量（単数または複数）の逐次的なインキュベーション（胃、小腸、結腸）からなっていた。
ヒト腸内微生物生態系シミュレータ（ＳＨＩＭＥ）の上行結腸コンパートメントから収集した腸懸濁液を使用した(Van de Wiele et al, 2015)。
この接種材料は、構造と活性の両方で、近位結腸に存在する環境条件に適応した安定した微生物群集からなる。
【０１２３】
以下のクルクミンベース製剤／組成物を評価した：
１．  標準クルクミン抽出物（Curcuma longa）−３つのクルクミノイド（クルクミン−７５％、デメトキシクルクミン（ＤＭＣ）−１５〜２０％およびビデメトキシクルクミン（ＢＤＭＣ）−５〜１０％）の混合物を含有する。
２．  対照製剤（Meriva（登録商標）のターメリックフィトソームThorne製品、この製剤は１８〜２２％クルクミノイドを含み、存在するクルクミンおよび大豆レシチンは１：２の重量比（フィトソーム）で配合され、次いで２部の微結晶性セルロースが流動性を改善するために追加され、最終製品のクルクミンの全体的な含有量はほぼ２０％。）
３．  ８．６％ターメリック抽出物（６％を超えるクルクミノイドを有する）、１５．９％ヒマワリ油、２％キラヤ抽出物、および７３．５％加工デンプンを含む本発明の方法／使用において使用される組成物（本明細書中、Ｉ型とも称される）。
【０１２４】
短期間のスクリーニングアッセイは、胃、小腸、および結腸条件下での３つの製剤の逐次的なインキュベーションからなった。
製剤／組成物は、胃のコンパートメントにおいて０．５ｇ／Ｌのクルクミノイド濃度を達成するように試験した（ｍｇの実際の量は、各製品内のクルクミノイドの％に基づいて計算した−表２に示すとおり）。
次いで、異なる製剤／組成物を、ペプシンの存在下、３７℃、ｐＨ２．０で１時間（ｈ）インキュベートした。
次いで、膵臓酵素および胆汁塩を添加することによって小腸をシミュレーシヨンし、試料を３７℃で３ｈの全持続時間でインキュベートした。
【０１２５】
最終的に、第３インキュベーションステージにおいて、ＳＨＩＭＥから収集した代表的な糞便接種材料および豊かな栄養培地を添加することによって結腸をシミュレーシヨンした。結腸インキュベーションを、３７℃で振とうしながら、嫌気状態下で、合計４８ｈにわたって行った。
各製剤／組成物は、生物学的変動性を制御するために３回試験した。
これらの実験は、胃腸管における食物成分の特定の滞留時間を尊重するために設計されたことに注意されたい。各コンパートメント内の体積を考慮すると、試験したクルクミノイドの濃度は、胃において０．５ｇ／Ｌ、小腸において０．３５ｇ／Ｌ、結腸において０．１ｇ／Ｌであった。細胞輸送実験では、これらの試料を１０倍以上に希釈した。
【０１２６】
表２：試験したクルクミンベース製剤／組成物および製剤／組成物中のそれぞれのクルクミノイドパーセンテージ。胃コンパートメントに添加するｍｇの量を計算するために、クルクミノイドのパーセンテージが考慮された。太字で天然型を示す。
【表２】
2021533750.tif 000006
【０１２７】
各製剤／組成物の試料を以下の時点で収集した。
−  胃：３０分および６０分
−  小腸：６０、１２０および１８０分
−  結腸：２、４、６、２４および４８時間
次いで、質量分析と組み合わせた高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して、サンプルのクルクミノイド含有量（クルクミン、ＤＭＣ、およびＢＤＭＣ）を分析した。
【０１２８】
３つの各クルクミノイド(Phytolab, Vestenbergsgreuth、ドイツ)に対して２〜１０００ｎｇ／ｍＬの範囲で検量線を作成し、内部標準として５４ｐｐｂのクルクミン−ｄ６（TLC pharmachem、オンタリオ、カナダ）を添加して保持時間の安定性および器械補正のバリエーションを確保した。各溶液の希釈剤としてアセトニトリルを使用した。遊離クルクミノイド特定のために、正確に４５０μＬの内部標準溶液（６０ｎｇ／ｍＬ）を５０μＬの血漿試料を介してCaptiva 96ウェルプレート（AgilentからのND脂質）にロードした。混合およびろ過後、溶出液をＬＣ／ＭＳシステムに注入する準備ができている。Captiva ND脂質プレートは、血漿からリン脂質を効果的に除去するように設計されている。総抱合されたクルクミノイド代謝物（グルクロニドおよびスルファート代謝物）の特定のために、１００μＬの血漿試料を１００μＬの酵素溶液（グルクロニダーゼ１０００ユニット／ｍＬ、Sigma＃G7017；またはスルファターゼ、Sigma＃S9626、１００ユニット／ｍＬのいずれか）と３７℃で２時間混合した。この加水分解ステップの後、同様に５０μＬの溶液を４５０μＬのアセトニトリルとCaptiva96ウェルプレート上で混合する。試料手順は、遊離クルクミノイドと同じで、注入前に混合およびろ過する。
【０１２９】
ＬＣ／ＭＳ条件は次のとおりであった。使用したオートサンプラー（５℃）およびＬＣシステムは、Agilent Infinity1290統合システムであった。研究の間、Agilent 6420トリプル四重極質量分析計をエレクトロスプレイイオン化とともに使用した。代謝物は、BEH Shield RP 18カラム（１００ｘ２．１、１．７μｍ；Waters）から、ＨＰＬＣグレードの水中０．１％ギ酸（溶媒Ａ）およびアセトニトリル中０．１％ギ酸（溶媒Ｂ）からなる移動相で、０．５ｍＬ／分の流速で溶離した。溶離は、０〜６分で４０〜８０％Ｂからのグラジエントであった。標準および試料の注入量は２μＬであった。各参照化合物について、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードを利用して、プリカーサからプロダクトイオンへの関連する推移を検出した。３つのアナライトのそれぞれについて、ＭＳ１フルスキャン試験で特定し、ＭＳ／ＭＳ実験でプロダクトイオンを特定した。各アナライトのＭＲＭ推移は、直接注入およびOptimizer B.08.00ワークステーションソフトウェアソリューション（Agilent technologies, Santa Clara, CA, USA）を使用して最適化した。最適な選択条件については、表２ａを参照。質量分析計のパラメータを次のとおりに設定した：ネガティブとポジティブモードの両方のＥＳＩソース；乾燥ガス（Ｎ２）流量、１０Ｌ／分；ガス温度、３５０℃；ネブライザー、４０ｐｓｉ；およびキャピラリー、４．０ｋＶ。製造業者のガイドラインに従って実行する前に完全に較正されたＭＳシステム。データ分析は、Agilent MassHunter定量／定性分析B.07.00で行った（Agilent technologies, Santa Clara, CA, USA）。
【０１３０】
表２ａ：３つのクルクミノイドおよび内部標準の保持時間（Ｔｒ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）推移、および最適化されたタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）検出パラメータ。
【表３】
2021533750.tif 000007
【０１３１】
表３は、消化中に腸管コンパートメント間で得られたクルクミノイドの濃度を示している。
驚くべきことに、本発明の方法／使用で使用される組成物についての６０分後の胃および１２０分および１８０分後の小腸での消化後の濃度は、標準ターメリック粉末抽出物について得られたものよりも優れており、標準抽出物と比較した本発明の方法／使用において使用される組成物のより良好な消化に対する耐性を実証した。また、本発明の方法／使用において使用される組成物についての６０分後の胃および１２０分および１８０分後の小腸での消化後の濃度は、比較対象のターメリックフィトソーム製剤のものよりも高く、ターメリックフィトソーム比較対象と比較した、本発明の方法／使用において使用される組成物のより良好な消化に対する耐性を実証した。
【０１３２】
表４は、初期濃度（０．５ｇ／ｌまたは５００ｍｇ／ｌの実験開始時の胃コンパートメント内のクルクミノイド）による消化後に腸コンパートメントに残存したクルクミノイドのパーセンテージを示す。驚くべきことに、結果は、本発明の方法／使用において使用される組成物からのクルクミノイドが、標準ターメリック抽出物からのクルクミノイドと比較して、胃および小腸における消化に対してはるかに良好な耐性を有したこと、および本発明の方法／使用において使用される組成物は、標準抽出物またはターメリックフィトソーム製剤からのクルクミノイドよりも、経口摂取後の消化中の分解から保護されていること、ならびに本発明の方法／使用において使用される組成物の経口摂取後の小腸コンパートメントにおける吸収にアクセス可能なクルクミノイドは、標準抽出物またはターメリックフィトソーム製剤の経口摂取よりもはるかに多いことを明確に示している。
【０１３３】
【表４−１】
2021533750.tif 000008
【表４−２】
2021533750.tif 000009
【０１３４】
表４：胃腸（ＧＩＴ）消化に対する耐性：初期濃度による消化後の腸コンパートメントに残存したクルクミノイドのパーセンテージ
【表５】
2021533750.tif 000010
データは、初期濃度と比較した、異なるコンパートメントおよび消化後の異なる時間におけるクルクミノイド濃度のパーセンテージの平均±ＳＤを示している。
【０１３５】
Ｃａｃｏ−２細胞での輸送実験のために、以下の試料も収集した。
−  小腸：１２０分および１８０分
細胞に適用する試料のｐＨは、使用前に６．５に調整した。
【０１３６】
Ｃａｃｏ−２細胞は、培養中に腸細胞様細胞に自発的に分化することができるため、腸機能の細胞モデルとして広く使用されている。半透性の支持体において培養されると、これらの細胞は、頂端刷子縁酵素（apical brush-border enzymes）および微絨毛の存在下で、腸上皮に似た機能的な分極単層（monolayer）に発達する。したがって、それらは成熟腸細胞の形態学的および機能的特徴を培養で獲得するため、輸送実験の「絶対的基準」モデルと見なされている(Sambuy et al, 2002)。
【０１３７】
Ｃａｃｏ−２細胞（ＡＴＣＣ）を、１×１０５細胞／インサートに対応する０．９×１０５細胞／ｃｍ２の密度で１２トランスウェルインサート（０．４μｍ）に播種した。機能的な単層に達するまで細胞を分化させた（２１日）；頂端（６００μＬ）および側底（１５００μＬ）培地を週に３回補給した。実験当日、単層の経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を測定することによりバリア機能を評価した。細胞をＨＢＳＳで洗浄して微量の培地を除去し、および２ｍＬの輸送バッファ（ＴＢ）を側底側に添加した。短期間の実験から収集された試料を、輸送バッファで１：１０（ｖ／ｖ）の比率で希釈し、細胞に頂端に与えた（６００μＬ）。すべての製品も未処理で試験され、および粉末は０．０２５ｍｇ／ｍＬの濃度でＴＢで希釈した（すべての製剤について試験したクルクミノイドの最終理論濃度は表２ａに見ることができる）。これらの希釈液は、その不十分な可溶性のためにＤＭＳＯに溶解した標準ターメリック抽出物を除いて、ＨＢＳＳで調製したストック溶液（２５０ｍｇ／ｍＬ）から調製した。対照ウェルとして、短期間の実験中にブランク（クルクミンなし）を実行して得られた、ＴＢで１：１０（ｖ／ｖ）に希釈した結腸試料（４８ｈインキュベーション）を使用した。輸送バッファー（ＴＢ）は、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、２５ｍＭＤ−グルコース、および１×抗生物質−抗真菌剤を補充したＨＢＳＳ（ｐＨ７．４）からなった。細胞を３７℃で総持続時間４ｈインキュベートした。
【０１３８】
以下の試料を収集した：
１．  細胞を刺激するために使用した希釈された試料（５００μＬ）。それは細胞に与えられる前に希釈された試料を含有するため、これらは０ｈの時点に対応し、０．０２５ｍｇ／ｍＬの濃度でＴＢに希釈された未処理の製剤も出荷された。
２．  ２ｈおよび４ｈのインキュベーション後に収集した頂端側からの試料（各２５０μＬ）。
３．  ２ｈ（８００μＬ）および４ｈ（１０００μＬ）のインキュベーション後に収集された側底側からの試料。
４．  ４ｈのインキュベーション後の細胞からの試料。これらは、細胞内部に取り込まれた画分に対応する。手短に言えば、氷冷したＰＢＳ１Ｘを細胞に添加して、輸送を停止させた。次いで、細胞をもう一度ＰＢＳ１Ｘで洗浄して、内在化されていない微量の生成物を除去し、細胞を２０％エタノールおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（６００μＬ）を含有するＰＢＳ１Ｘの溶液で透過処理した；２０分後のこの溶液において、細胞を１．５ｍＬ管に収集し、シリンジおよび２１Ｇ針を用いて破壊および均質化した。
５．  チューブを遠心分離し、上清を新しい管（４５０μＬ）に移した。
すべての試料をＨＰＬＣ分析まで−２０℃で保存した。
【０１３９】
Ｃａｃｏ−２細胞に適用した異なる試料の細胞毒性を評価するために、頂端側のＣａｃｏ−２細胞によって放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）（４ｈのインキュベーション後）をLDH-Activity Kitを使用して評価した。ＬＤＨは、膜傷害時に細胞によって上清に放出され、したがって細胞死のマーカーである。
統計分析は、one-way ANOVAおよびこれに続くダネットの事後多重比較検定を使用して行った。（＊）、（＊＊）および（＊＊＊）は、それぞれｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１およびｐ＜０．００１での有意性に対応する。
【０１４０】
図１０〜１５に示すとおり、対照ウェル（ＴＢ＋結腸４８ｈ）はほぼ１．０のＬＤＨ活性を示す。見ることができるように、すべての製品について、未消化の形態も６０分後に収集された胃の試料も両方とも、対照と比較すると最も高いＬＤＨ活性を示した。
対照的に、小腸と結腸の両方の試料は、対照に匹敵するかまたはより低いレベルを示している。これらの結果は、胃からの試料を除いて、すべての試料がＣａｃｏ−２細胞に対して毒性を示さず、およびＣａｃｏ−２細胞の試料からのクルクミノイドの輸送およびバイオアベイラビリティを試験したアッセイの結果は、生存細胞上に得られているから、有効として活用および判断できることを実証した。
【０１４１】
Ｃａｃｏ−２細胞はＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼおよびスルホトランスフェラーゼを発現することが知られているので（(Siissalo S, Zhang H, Stilgenbauer E, Kaukonen AM, Hirvonen J, Finel M）、未消化生成物または小腸からの試料（１２０分または１８０分）のいずれかとインキュベートしたＣａｃｏ−２細胞の頂端、側底および細胞内コンパートメントからの試料を、それらのクルクミノイド含有量（クルクミン、ＤＭＣ、およびＢＤＭＣ）およびそれらの関連する代謝物含有量（クルクミンスルファート、クルクミングルクロニド、ＤＭＣスルファートおよびＤＭＣグルクロニド、ＢＤＭＣスルファートおよびＢＤＭＣグルクロニド）についてさらに分析した。ほとんどのＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴｓ）の発現は、Ｃａｃｏ−２細胞の分化中に有意に増加するが、UGT1A6は未分化細胞でも高度に発現し、Drug Metab Dispos. 2008 Nov;36(11):2331-6)、したがって、クルクミン、ＤＭＣ、およびＢＤＭＣをそれらのグルクロニドまたはスルファート代謝物に代謝することができる（Dempe JS, Scheerle RK, Pfeiffer E, Metzler M. Metabolism and permeability of curcumin in cultured Caco-2 cells. Mol Nutr Food Res. 2013 Sep;57(9):1543-9）。
【０１４２】
頂端から側底への移行の見掛けの透過係数（Ｐａｐｐ）値は、ArturssonおよびKarlssonに従って、以下の式：
【数１】
2021533750.tif 000011
式中、
Ｖａｐｉは頂端コンパートメントの体積（０．６ｍＬ）であり、Ａは単層の表面積（１．１３１ｃｍ２）であり、ｔは時間（ｓ）であり、Ｃｂａｓｏは、側底コンパートメント中の総クルクミノイドおよびその代謝物の濃度（ｐｐｍ）（親化合物と代謝物の和）であり、およびＣａｐｉは、頂端コンパートメント内の総クルクミノイドの初期濃度（ｐｐｍ）である、
を使用して計算した。
【０１４３】
表５は、Ｃａｃｏ−２細胞を標準抽出物または２つの異なる製剤（ターメリックフィトソームまたは本発明の方法／使用において使用される組成物）に頂端曝露（apical exposure）した後の異なる時間間隔のＰａａｐ値を示す。
【０１４４】
表５：標準抽出物または２つの異なる製剤へのＣａｃｏ−２細胞の頂端曝露後の異なる時間間隔で計算された総クルクミノイドおよびそれらの代謝物のＰａｐｐ値（１０−７ｃｍ／ｓとして表される）
【表６】
2021533750.tif 000012
データは平均±ＳＤを示している。標準抽出物と比べたＰａｐｐの倍増は括弧（）内に示されている。ターメリックフィトソーム製剤と比べたＰａｐｐの倍増は角括弧［］内に示されている。
【０１４５】
表５に示されるとおり、頂端から側底への推移の見掛けの透過係数（Ｐａａｐ）値は、本発明の方法／使用において使用される組成物で、標準ターメリック抽出物よりも驚くほど高く、２ｈおよび４ｈでそれぞれ標準ターメリック抽出物と比べたＰａｐｐ値で１９．３および２０．３倍の倍増であった。
側底への推移の見掛けの透過係数（Ｐａａｐ）値もまた、増強されたバイオアベイラビリティ製剤に対するポジティブ対照として使用されたターメリックフィトソーム製剤で高く、２ｈおよび４ｈでそれぞれ標準ターメリック抽出物と比べたＰａｐｐ値で４．７および４．８の倍増であった。しかし、結果は、Ｃａｃｏ−２吸収細胞によるクルクミノイドの吸収が、本発明の方法／使用において使用される組成物の方が、比較対象のターメリックフィトソーム製剤と比較してより大きいことを示している（２ｈおよび４ｈでそれぞれ４．１倍および４．２倍優れたＰａｐｐ値）。
【０１４６】
表６は、小腸コンパートメントにおける１２０分または１８０分でのクルクミノイドの定量化した濃度をＣａｐｉとして使用した、Ｃａｃｏ−２細胞を標準抽出物または２つの異なる製剤（ターメリックフィトソームまたは本発明の方法／使用において使用される組成物）の小腸消化試料（１２０または１８０分）に頂端曝露した後のＰａｐｐ値を示す。それは、細胞による消化された製剤からのクルクミノイドの吸収能力を反映する。標準抽出物または製剤が胃および小腸のコンパートメントで消化され、したがって小腸からの試料（１２０分または１８０分）がＣａｃｏ−２細胞によるクルクミノイドの吸収を測定するために使用される場合、Ｃａｃｏ−２吸収性細胞によるクルクミノイドの吸収は、ターメリックフィトソーム製剤と比較して、本発明の方法／使用において使用される組成物の方がより大きかった（小腸試料について１２０分または１８０分それぞれでＰａｐｐ値は１．８倍および１６．４倍高い）ことが実証された。
【０１４７】
表７は、細胞の吸収能力だけでなく消化過程への耐性も考慮に入れるために、小腸コンパートメントにおける１２０分または１８０分でのクルクミノイドの理論濃度をＣａｐｉとして使用した、Ｃａｃｏ−２細胞を標準抽出物または２つの異なる製剤（ターメリックフィトソームまたはその方法／使用法でにおいて使用される組成物）の小腸消化試料（１２０または１８０分）に頂端曝露した後のＰａｐｐ値を示す。これらのデータから、Ｃａｃｏ−２細胞による吸収および消化の後に胃腸コンパートメント（血液循環を模倣する）に到達できるクルクミノイドのレベルは、本発明の方法／使用において使用される組成物の方が、標準的なターメリック抽出物ターメリックと比較して（Ｐａｐｐ値は１２０分または１８０分で小腸試料についてそれぞれ２．０倍および１．８倍高い）、およびフィトソーム製剤と比較して（Ｐａｐｐ値は１２０分または１８０分で小腸試料についてそれぞれ３．４倍および７．１倍高い）、はるかに高いことが実証された。
【０１４８】
表６：Ｃａｃｏ−２細胞を標準抽出物または２つの異なる製剤の小腸消化試料に頂端曝露（１２０または１８０分）した後の総クルクミノイドおよびそれらの代謝物のＰａｐｐ値
【表７】
2021533750.tif 000013
データは平均±ＳＤを示している。ターメリックフィトソームと比べたＰａｐｐの倍増は括弧（）に示されている。Ｐａｐｐ値は、Ｃａｐｉとして１２０分または１８０分での小腸コンパートメントにおけるクルクミノイドの定量化された濃度を使用して計算されている。
【０１４９】
表７：Ｃａｃｏ−２細胞を標準抽出物または２つの異なる製剤の小腸消化試料に頂端曝露（１２０または１８０分）した後の総クルクミノイドおよびそれらの代謝物のＰａｐｐ値
【表８】
2021533750.tif 000014
データは平均±ＳＤを示している。標準抽出物と比べたＰａｐｐの倍増は括弧（）内に示されている。ターメリックフィトソーム製剤と比べたＰａｐｐの倍増は角括弧［］内に示されている。Ｐａｐｐ値は、Ｃａｐｉとして１２０分または１８０分での小腸コンパートメントにおけるクルクミノイドの理論濃度を使用して計算されている。
【０１５０】
例６−マウスにおけるＩｎ−Ｖｉｖｏでの比較薬物動態研究を通したクルクミノイドのバイオアベイラビリティを増強する本発明の組成物の効果
本発明の方法／使用において使用される組成物が胃腸消化に対するより良好な耐性および腸細胞を通じたより良好な吸収を示すことを示したｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルで得られた結果の観点から、本発明の方法／使用において使用される組成物（すなわち、８．６％ターメリック抽出物（６％を超えるクルクミノイドを含む）、１５．９％ヒマワリ油、２％キラヤ抽出物、および７３．５％加工デンプンを含む組成物）は、マウスにおいて、標準ターメリック抽出物と比較して、クルクミノイドのバイオアベイラビリティを改善するであろうことが想定される。
したがって、比較薬物動態研究をマウスにおいて実施した。
【０１５１】
Janvier Labs（St-Berthevin、フランス）からの成体雄C57Bl / 6J Rjマウスは、受領時に５週齢で、標準のプラスチックケージ（ｎ＝４／ケージ）にまとめて飼育した。すべての動物は、水および標準的なペレット食物（ペレットAO4; SAFE、Villemoisson-sur-Orge、フランス）に自由にアクセスでき、温度−（２４．０〜２６．０℃）および湿度−（４０．０〜５０．０％）制御された１２−ｈ明るい（０７：００ＡＭ−０７：００ＰＭ）／１２−ｈ暗いサイクルの部屋に維持された。
【０１５２】
すべての動物は、受領後１週間、それらの新しい環境に順応した。正しい順応と標準的な成長曲線の両方を確保するために、全食物摂取量および動物の体重を週に２回評価した。この順応期間に続いて、マウスを、処置前の６日間、ビヒクル（室温で蒸留水に溶解させたカルボキシメチルセルロースナトリウム塩１％（ｗ／ｖ）、ＣＭＣ； Ref# C4888、バッチナンバー：SLBB5612V, SIGMA ALDRICH, St Quentin Fallavier、フランス）の毎日の経口投与を受けるのに馴化させた。この馴化期間中、全食物摂取量および動物の体重を毎日測定した。これらの手段は、実験者による注射手順および操作の両方に対する動物の最適な馴化を確保することを可能にした。
【０１５３】
順応および馴化期間中、マウスは、事前に計量された量の生鮮食物ペレットへの自由なアクセスが許された（pellet AO4; SAFE, Villemoisson-sur-Orge、フランス）。残りの食物は、測定の翌日に計量した。精密スケール（THB-600G、PMC Millot；精度±０．０１ｇ）を使用して、ケージあたりの全食物摂取量（０８：４０−０９：２０ＡＭ）は、事前に計量された食物の量から残存する食物を差し引くことによって特定した。１日の平均食物摂取量を、この値を２つの手段を分離する日数および各ケージの動物の数で割ることによって得た。各体重測定で、朝（０８：４０−０９：２０ＡＭ）にマウスの体重を測定した。
【０１５４】
処置の前日（馴化期間の最終日）、１２０匹のマウスを夕方（１７：４０−１８：２０ＰＭ）に絶食させた。翌日、マウス（製剤あたりｎ＝４０）に、朝（０８：００−０９：５０ＡＭ）に、標準ターメリック粉末抽出物、比較対象としてのターメリックフィトソーム製剤または本発明の方法／使用において使用される組成物（すなわち、８．６％ターメリック抽出物（６％を超えるクルクミノイドを有する）、１５．９％ヒマワリ油、２％キラヤ抽出物、および７３．５％加工デンプンを含む組成物）で、強制経口投与（３０ｍｌ／ｋｇ）による急性処置を受けさせた。
【０１５５】
適切な体積のビヒクル（蒸留水に溶解したＣＭＣ１％）を好適なレシピエントに攪拌下で添加し、およびｐＨを５．５に調整した。適切な量の事前に計量した製剤を、一定の攪拌下でビヒクルに徐々に添加した。均一になったら、得られた懸濁液のｐＨを測定し、必要とあれば５．５に調整した。クルクミノイドの分解を避けるために、最終懸濁液は調製後１ｈで体系的に投与した。３００ｍｇ／ｋｇの総クルクミノイドが与えられる動物への用量を計算した（表８を参照）。マウスでのこの投与量は、(アメリカ合衆国保健福祉省、アメリカ食品医薬品局、医薬品評価研究センター(CDER). Guidance for Industry Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers. 2005)からの式；ヒト等価用量（ｍｇ／ｋｇ）＝動物用量ｍｇ／ｋｇ×（動物の体重ｋｇ／ヒトの体重ｋｇ）0.33から、ヒトで２１．３７ｍｇ／ｋｇ、および６０ｋｇのヒトを想定すると１２８２ｍｇに相当する。投与量は、絶食直前に測定された体重に調整した。製剤による強制経口投与後の腸管吸収に対する摂食および飲水挙動の衝撃を回避するために、処置後の最初の１２ｈの間、水および食物を与えなかった。
【０１５６】
表８：標準ターメリック抽出物および２つの製剤のクルクミノイド含有量および第１のｉｎ  ｖｉｖｏ研究で３００ｍｇ／ｋｇ体重のクルクミノイドでマウスに製品を投与するために使用された懸濁液のそれぞれの濃度
【表９】
2021533750.tif 000015
【０１５７】
麻酔をかけたマウスに心臓穿刺により、投与後０．５−、１ｈ−、２ｈ−、４ｈ−、６ｈ−、８ｈ−、１２ｈ−または２４ｈで血液をサンプリングした（ｎ＝５／時点／製剤）。ケタミン／キシラジンの混合物（それぞれ１００ｍｇ／ｋｇおよび１５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によって麻酔を行った。心臓穿刺について、左心室を直接貫通するために、２６Ｇシリンジを８番目と１０番目の胸骨肋骨の間に動物の体によって形成される縦軸に対して４５°の角度で挿入した。次いで、血液を穏やかに引いて、０．６〜１ｍｌの最終体積を得た。生物分析法の利益のために、その後、血液をエッペンドルフ管に移し、ヘパリンスルファート（２００Ｕ．Ｉ／ｍｌ血液）と混合し、穏やかに攪拌した。すべての試料を、血液採取後３０分以内に３０００ｇおよび４℃で１５分間遠心分離し、血漿を分離した。血漿（上清）を新しい０．５ｍｌエッペンドルフに分注した。血漿のアリコートを遠心分離後１時間以内に−８０℃で凍結した。
【０１５８】
親クルクミノイド（クルクミン、ＤＭＣまたはＢＤＭＣ）およびそれらの関連する代謝物（クルクミングルクロニドおよびスルファート、ＤＭＣグルクロニドおよびスルファート、ＢＤＭＣグルクロニドおよびスルファート、ＴＨＣ、ＴＨＣグルクロニドおよびスルファート、ＨＨＣ、ＨＨＣグルクロニドおよびスルファート）の血漿投与量は、ＬＣ−ＭＳ−ＭＳ方法によって実施した。各５つのクルクミノイド（Phytolab、Vestenbergsgreuth、ドイツ）に２〜１０００ｎｇ／ｍＬの範囲で検量線を作成し、内部標準として５４ｐｐｂのクルクミン−ｄ６（TLC pharmachem、オンタリオ、カナダ）を添加して保持時間の安定性および機器補正のバリエーションを確保した。各溶液の希釈剤としてアセトニトリルを使用した。遊離クルクミノイドの特定のために、正確に４５０μＬの内部標準溶液（６０ｎｇ／ｍＬ）を５０μＬの血漿試料を介してCaptiva 96ウェルプレート（AgilentからのＮＤ脂質）にロードした。混合およびろ過後、溶出液をＬＣ／ＭＳシステムに注入する準備ができている。Captiva ND脂質プレートは、血漿からリン脂質を有効に除去するように設計されている。総抱合されたクルクミノイド代謝物（グルクロニドおよびスルファート代謝物）の特定のために、１００μＬの血漿試料を１００μＬの酵素溶液（グルクロニダーゼ１０００ユニット／ｍＬ、Sigma＃G7017またはスルファターゼ、Sigma＃S9626、１００ユニット／ｍｌのいずれか）と３７℃で２時間混合した。この加水分解ステップの後、５０μＬの溶液も４５０μＬのアセトニトリルとCaptiva96ウェルプレート上で混合する。試料手順は、遊離クルクミノイドの場合と同じで、注入前に混合およびろ過する。
【０１５９】
次いで、ＬＣ／ＭＳ条件は次のとおりであった。使用したオートサンプラー（５℃）およびＬＣシステムは、Agilent Infinity1290統合システムであった。研究の間、Agilent 6420トリプル四重極質量分析計をエレクトロスプレイイオン化とともに使用しました。代謝物は、BEH Shield RP 18カラム（１００×２．１、１．７μｍ；Waters）から、ＨＰＬＣグレードの水中０．１％ギ酸（溶媒Ａ）およびアセトニトリル中０．１％ギ酸（溶媒Ｂ）からなる移動相で、０．５ｍＬ／分の流量で溶離した。溶離は、０〜６分で４０〜８０％Ｂからのグラジエントであった。標準および試料の注入量は２μＬであった。各参照化合物について、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードを利用して、プリカーサからプロダクトイオンへの関連する推移を検出した。５つのアナライトのそれぞれについて、ＭＳ１フルスキャン試験で特定し、ＭＳ／ＭＳ実験でプロダクトイオンを特定した。各アナライトのＭＲＭ推移は、直接注入およびOptimizer B.08.00ワークステーションソフトウェアソリューション（Agilent technologies, Santa Clara, CA, USA）を使用して最適化した。最適な選択条件については、表９を参照。質量分析計のパラメータを次のとおりに設定した：ネガティブとポジティブモードの両方のＥＳＩソース；乾燥ガス（Ｎ２）流量、１０Ｌ／分；ガス温度、３５０℃；ネブライザー、４０ｐｓｉ；およびキャピラリー、４．０ｋＶ。製造業者のガイドラインに従って実行する前に完全に較正されたＭＳシステム。データ分析は、Agilent MassHunter定量／定性分析B.07.00で行った（Agilent technologies, Santa Clara, CA, USA）。
【０１６０】
試験した３つの製剤／組成物について、各クルクミノイド化合物の血漿濃度の動態は、血液採取の各時点での平均±ＳＥＭ血漿濃度を計算することにより、処置後０．５〜１２ｈで特定した。薬物動態パラメータＴ１／２（半減期）、Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、ＡＵＣ（０−１２ｈ）およびＡＵＣ（０−∞）は、PKSolverを使用した非コンパートメント分析によって０〜１２ｈ動態から特定した。PKSolverは、薬物動態の問題を解決するために、Visual Basic for Applications（VBA）で記述されたMicrosoftExcel用のメニュー方式のアドインプログラムである(Zhang et al., 2010)。データ全体は平均±ＳＥＭとして表される。統計分析は、Statview 5.0.1（Statview software, Cary, NC, USA）およびExcel2013プログラムを使用して行った。データは、各時点でスチューデントのｔ検定によって分析した。リスクαは０．０５に固定した。
【０１６１】
表９：クルクミノイド、テトラヒドロクルクミンおよびヘキサヒドロクルクミンおよび内部標準の保持時間（Ｔｒ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）推移、および最適化されたタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）検出パラメータ。
【表１０】
2021533750.tif 000016
【０１６２】
順応（Ｊ１〜Ｊ７）と馴化（Ｊ８〜Ｊ１４）の２つの連続する期間中、処置前の正しい順応と標準的な成長曲線の両方を確保するために、２４ｈ−食物摂取量およびマウスの体重を定期的に測定した。本研究のために、マウスをケージごとに４匹ずつ飼育し、３つの製剤のいずれかで処置した後、同じ時点で各々を血液採取に使用した。結果として、食物摂取量および体重のデータを、同じ時点でサクリファイスした１５匹のマウスのグループごとに最初に分析した（８グループ；５匹のマウス／時点／製剤）。図１６および１７は、それぞれ、処置投与前の順応および馴化期間中のマウスの食物摂取量および体重を示しており；異なるグループは、処置前に古典的な体重曲線および食物摂取量を示した。Ｊ１５ですべてのグループで観察された体重の大幅な減少（図１７）は、処置の前夜に実施した終夜の絶食の結果として生じたことに注意されたい。これらの結果は、この実験で使用されたすべてのマウスが同じ挙動をし、予想どおりに比較できることを確認した。
【０１６３】
図１８は、ターメリックフィトソーム製剤および標準抽出物製剤の経口投与（３００ｍｇ／ｋｇｂｗのクルクミノイド）後のマウスの各時点で得られた、総クルクミノイド（クルクミン、ＤＭＣ、ＢＤＭＣおよびそれらの関連する代謝物、クルクミングルクロニドスルファート、ＤＭＣグルクロニドおよびスルファート、ＢＤＭＣグルクロニドおよびスルファート、ＴＨＣ、ＴＨＣグルクロニドおよびスルファート、ＨＨＣ、ＨＨＣグルクロニドおよびスルファートの和）の薬物動態プロファイルを示す。ターメリックフィトソーム製剤は総クルクミノイドの血漿濃度が３０分後に４１．５ｐｐｍ（μｇ／ｍｌ）に達することを可能にし、２４ｈを除く各時点で、標準で得られたものよりも有意に優れていたが、標準ターメリック抽出物の総クルクミノイドの血漿濃度は、１ｈで最大１２．９ｐｐｍにしか達さず、他のすべての時点では１０ｐｐｍ未満であった。ターメリックフィトソームは、標準ターメリック抽出物と比較して、総クルクミノイドＣｍａｘの３．２倍の増加、ＡＵＣの３．９倍の増加を実証した。これらの結果は、クルクミノイドのバイオアベイラビリティを増強するための陽性対照としてのターメリックフィトソーム製剤の使用を確証し、および標準ターメリック抽出物に対するクルクミノイドのバイオアベイラビリティを増強するための異なる製剤の能力を試験するためのｉｎ  ｖｉｖｏモデルの妥当性を確証した。
【０１６４】
表１０として示される各時点の平均値±ＳＥＭを含有する表。これらの値の横に位置付けられた括弧内の数字は、試料の総数に対して正の値を示した試料の数を示している。統計的比較の結果も同じ表に示す。表１１は、PKSolverソフトウェアを使用した非コンパートメント分析から得られたＰＫパラメータを含有する。グループ間のバリエーションのパーセンテージも示す（％Ｖａｒ°）。データは平均±ＳＥＭとして表す。
【０１６５】
【表１１】
2021533750.tif 000017
表１０および１１：図１８に示す各時点でPKSolverソフトウェアを使用した非コンパートメント分析から得られた平均値±ＳＥＭおよびＰＫパラメータを示している。
【０１６６】
図１９は、クルクミン、キラヤ油および加工デンプンを含む混合物（例２  １型）および標準抽出物製剤の経口投与（３００ｍｇ／ｋｇｂｗのクルクミノイド）後の各時点でマウス中に得られた、総クルクミノイド（クルクミン、ＤＭＣ、ＢＤＭＣならびにそれらの関連する代謝物、クルクミングルクロニドスルファート、ＤＭＣグルクロニドおよびスルファート、ＢＤＭＣグルクロニドおよびスルファート、ＴＨＣ、ＴＨＣグルクロニドおよびスルファート、ＨＨＣ、ＨＨＣグルクロニドおよびスルファートの和）の濃度で薬物動態のプロファイルを示している。結果は、本発明の方法／使用において使用される組成物が、標準ターメリック抽出物と比較して、０．５ｈ〜２４ｈに総クルクミノイド濃度を有意に増加させることができることを示していた。本発明の方法／使用において使用される組成物は、総クルクミノイドＣｍａｘの１．８倍の増加およびＡＵＣの２．２倍の増加を実証した。
【０１６７】
各時点の平均値±ＳＥＭを含有する表を表１２として示す。これらの値の横に位置付けられた括弧内の数字は、試料の総数に対して正の値を示した試料の数を示している。統計的比較の結果も同じ表に示す。PKSolverソフトウェアを使用した非コンパートメント分析から得られたＰＫパラメータを含有する表を表１３に示す。グループ間のバリエーションのパーセンテージも示す（％Ｖａｒ°）。データは平均±ＳＥＭとして表す。
【０１６８】
【表１２】
2021533750.tif 000018
表１２および１３：図１９に示す各時点で、PKSolverソフトウェアを使用した非コンパートメント分析から得られた平均値±ＳＥＭおよびＰＫパラメータを示している。
【０１６９】
標準ターメリック抽出物、ターメリックフィトソームまたは本発明の方法／使用において使用される組成物からの３００ｍｇ／ｋｇのクルクミノイドを摂取した後の各時点での親クルクミノイドの血漿濃度を与える表１４に示されているとおり、親化合物を具体的に見ると（天然型、すなわち代謝されていないクルクミン、ＤＭＣおよびＢＤＭＣ）、本発明の方法／使用において使用される組成物は、投与後最初の４ｈの間に検出可能な量の親クルクミノイドを定量化することができ、したがってＡＵＣ（０−１２ｈ）およびＡＵＣ（０−∞）を計算することができた唯一のものであった（表１５）。標準ターメリック抽出物と比較して、本発明の方法／使用において使用される組成物について、親クルクミノイドのＣｍａｘの１０．９倍の増加が得られた。
【０１７０】
標準ターメリック抽出物、ターメリックフィトソームまたは本発明の方法／使用において使用される組成物からの３００ｍｇ／ｋｇ摂取後の各時点での親クルクミンの血漿濃度を与える表１６に示すとおり、親化合物を具体的に見ると（天然型、すなわち代謝されていないクルクミン）、本発明の方法／使用において使用される組成物は、投与後最初の４ｈの間に検出可能な量の親クルクミノイドを定量化することができ、したがってＡＵＣ（０−１２ｈ）およびＡＵＣ（０−∞）を計算することができた唯一のものであった（表１６）。標準ターメリック抽出物と比較して、本発明の方法／使用において使用される組成物について、親クルクミンのＣｍａｘの５２１．８倍の増加が得られた。その上、本発明の方法／使用において使用される組成物は、ターメリックフィトソーム製剤よりも高い親クルクミンの血漿レベルを誘導した（Ｃｍａｘの１．８倍の増加）。
【０１７１】
この最初のｉｎ  ｖｉｖｏ実験から、６％を超えるクルクミノイドを有し、８．６％ターメリック抽出物、１５．９％ヒマワリ油、２％キラヤ抽出物、および７３．５％加工デンプンで得られ、および１型に従って調製された本発明の方法／使用において使用される組成物は、標準ターメリック抽出物と比較して、総クルクミノイドおよびそれらの代謝物のバイオアベイラビリティだけでなく、親化合物のバイオアベイラビリティも増強できると結論付けることができる。
また本発明の方法／使用において使用される組成物は、ターメリックフィトソーム製剤よりも天然クルクミンのバイオアベイラビリティをより良好に改善することができると結論付けることもできる。
【０１７２】
したがって、本発明の方法／使用において使用される組成物は、ターメリックフィトソーム製剤とは反対に、製剤中に大豆由来レシチンを使用することなく、親クルクミンのバイオアベイラビリティを増強する魅力的な方法を表す。また、クルクミンは、ＤＭＣおよびＢＤＭＣおよびそれらの関連する還元型、グルクロニドまたはスルファート代謝物と比較して、ターメリックの最も強力な活性物質の１つと見なされるため（reson C, Orr S, Jones DJ, Verschoyle R, Lim CK, Luo JL, Howells L, Plummer S, Jukes R, Williams M, Steward WP, Gescher A. Characterization of metabolites of the chemopreventive agent curcumin in human and rat hepatocytes and in the rat in vivo, and evaluation of their ability to inhibit phorbol ester-induced prostaglandin E2 production. Cancer Res. 2001 Feb 1;61(3):1058-64; Anand P, Thomas SG, Kunnumakkara AB, Sundaram C, Harikumar KB, Sung B, Tharakan ST, Misra K, Priyadarsini IK, Rajasekharan KN, Aggarwal BB. Biological activities of curcumin and its analogues (Congeners) made by man and Mother Nature. Biochem Pharmacol. 2008 Dec 1;76(11):1590-611; Pal A, Sung B, Bhanu Prasad BA, Schuber PT Jr, Prasad S, Aggarwal BB, Bornmann WG. Curcumin glucuronides: assessing the proliferative activity against human cell lines. Bioorg Med Chem. 2014 Jan 1;22(1):435-9）、本発明の方法／使用において使用される組成物は、関節の健康、炎症、関節炎、アテローム性動脈硬化症、脂肪肝、肝線維症、糖尿病、認知、軽度認知障害、過敏性腸症候群などの異なる健康状態に対するクルクミンの生物学的有効性を改善するための良好な解決策を表す。
【０１７３】
表１４：標準ターメリック抽出物、ターメリックフィトソームまたは第１のｉｎ  ｖｉｖｏ研究で本発明の方法／使用において使用される組成物から３００ｍｇ／ｋｇのクルクミノイドを摂取した後の各時点での親クルクミノイド（クルクミン、ＤＭＣおよびＢＤＭＣの和）の濃度。
【表１３】
2021533750.tif 000019
これらの値の横に位置付けられた括弧内の数字は、試料の総数に対して正の値を示した試料の数を示している。
【０１７４】
表１５：標準ターメリック抽出物、ターメリックフィトソームまたは第１のｉｎ  ｖｉｖｏ研究で本発明の方法／使用において使用される組成物から３００ｍｇ／ｋｇのクルクミノイドを摂取した後、親クルクミノイドについてPKSolverソフトウェアを使用した非コンパートメント分析から得られたＰＫパラメータ
【表１４】
2021533750.tif 000020
【０１７５】
表１６：標準ターメリック抽出物、ターメリックフィトソーム、または第１のｉｎ  ｖｉｖｏ研究で本発明の方法／使用において使用される組成物から３００ｍｇ／ｋｇクルクミノイドを摂取した後の各時点での親クルクミンの濃度。
【表１５】
2021533750.tif 000021
これらの値の横に位置付けられた括弧内の数字は、試料の総数に対して正の値を示した試料の数を示している。
【０１７６】
表１７：標準ターメリック抽出物、ターメリックフィトソームまたは第１のｉｎ  ｖｉｖｏ研究で本発明の方法／使用において使用される組成物から３００ｍｇ／ｋｇのクルクミノイドを摂取した後のクルクミンについてPKSolverソフトウェアを使用した非コンパートメント分析から得られたＰＫパラメータ
【表１６】
2021533750.tif 000022
【０１７７】
総クルクミノイドおよび親クルクミノイドおよびクルクミンのより良好なバイオアベイラビリティを示している、マウスでの第１のｉｎ  ｖｉｖｏ研究で得られた結果を考慮して、１４．４％ターメリック抽出物、２６．８％ヒマワリ油、２％キラヤ抽出物、および５６．８％加工デンプンで２型に従って調製されたより高いクルクミノイド含有量（１２％クルクミノイド）で最適化された製剤を、その標準ターメリック抽出物と比較したクルクミノイドのバイオアベイラビリティを改善する能力について、マウスでの第２の比較薬物動態研究において試験することにした。
【０１７８】
同じ方法論（マウスの飼育、順応期間、馴化期間、ＬＣ／ＭＳ法を使用したクルクミノイドおよびそれらの代謝物の定量化）を、この例において前に記載したとおりに使用したが、グループおよび時間あたりの動物数はより多く（ｎ＝１２／時点／製剤）、および標準ターメリック抽出物（それぞれ７９．５、１５．０、３．０ｇ／１００ｇのクルクミン、ＤＭＣおよびＢＤＭＣならびに合計９７．５ｇクルクミノイド／１００ｇ）、ターメリックフィトソーム製剤（それぞれ１８．６、２．６および０．２ｇ／１００ｇのクルクミン、ＤＭＣおよびＢＤＭＣならびに合計２１．５ｇクルクミノイド／１００ｇ）または２型に従って調製された本発明の方法／使用において使用される組成物（それぞれ９．８、１．６および０．２ｇ／１００ｇのクルクミン、ＤＭＣおよびＢＤＭＣならびに合計１１．６ｇクルクミノイド／１００ｇ）からのクルクミノイドの経口摂取後（３００ｍｇ／ｋｇ体重）の最も初期のフェーズでの動態プロファイルを明確にするために、投与後０．２５−、０．５−、０．７５−、１ｈ−、２ｈ−、または８ｈで血液をサンプリングした。
【０１７９】
図２０は、異なる製剤を摂取した後の時間の関数としての総クルクミノイドおよび代謝物濃度を示している（製剤あたりｎ＝７２）。結果は、標準ターメリック抽出物と比較して、ターメリックフィトソームおよび本発明の方法／使用において使用される組成物のクルクミノイドおよび代謝物濃度の有意な増加を明確に示した。総クルクミノイド濃度は、ターメリックフィトソーム製剤と比較して、本発明の方法／使用において使用される組成物の摂取後０．５ｈおよび０．７５ｈでより高く、驚くべきことに、ターメリックフィトソーム製剤と比較して、総クルクミノイドおよび代謝物のバイオアベイラビリティの改善の点で、本発明の方法／使用において使用される組成物のより良好な性能を示している。
【０１８０】
このことは、曲線ＡＵＣ（０−８ｈ）、ＡＵＣ（０−∞）、およびＣｍａｘ（それぞれ図２１、２２、および２３）の下の対応する面積を計算する間に確認された、これらは標準抽出物と比較した本発明の方法／使用において使用される組成物の、それぞれ２８０％高い、３００％高い、３３７％高い、およびターメリックフィトソーム製剤と比較して本発明の方法／使用において使用される組成物のそれぞれ６．５％高い、３０％高いおよび６３％高かった（表１８）。また、本発明の方法／使用において使用される組成物からのクルクミノイドおよび代謝物が、標準抽出物と比較してＴｍａｘの１．５倍の低減（０．５ｈ対０．７５ｈ）およびターメリックフィトソーム製剤（０．５ｈ対１ｈ）と比較してＴｍａｘで２倍の低減でそれぞれより迅速に吸収されることも示した（表１８）。驚くべきことに、結果はまた、本発明の方法／使用において使用される組成物からのクルクミノイドおよび代謝物は、ターメリックフィトソーム製剤と比較して、より長い半減期（３．８ｈ対２．８ｈ）でより迅速に排泄されなかったことも示した。
【０１８１】
標準ターメリック抽出物、ターメリックフィトソームまたは本発明の方法／使用において使用される組成物からの３００ｍｇ／ｋｇのクルクミノイドを摂取した後の親クルクミノイドのＰＫパラメータを与える表１９に示すとおり、親化合物を具体的に見ると（天然型、すなわち代謝されていないクルクミン、ＤＭＣおよびＢＤＭＣ）、驚くべきことに、本発明の方法／使用において使用される組成物は、親クルクミンについてＡＵＣ（０−８ｈ）を計算することができた唯一のものであった。標準ターメリック抽出物と比較して、本発明の方法／使用において使用される組成物について、親クルクミノイドのＣｍａｘの３．２倍の増加が得られた。ターメリックフィトソーム製剤の摂取後の血漿試料に親クルクミンを見つけることができなかったため、クルクミンのＣｍａｘは計算できなかった。
【０１８２】
この第２のｉｎ  ｖｉｖｏ実験から、１４．４％ターメリック抽出物、２６．８％ヒマワリ油、２％キラヤ抽出物、および５６．８％加工デンプンで２型に従って調製されたより高いクルクミノイド含有量（１２％クルクミノイド）を有する本発明の方法／使用において使用される組成物は、標準ターメリック抽出物およびターメリックフィトソーム製剤と比較して、総クルクミノイドおよびそれらの代謝物だけでなく、親クルクミンのバイオアベイラビリティを予想外に増強することができると結論付けられる。
したがって、本発明の方法／使用において使用される組成物は、ターメリックフィトソーム製剤とは反対に、製剤中に大豆由来レシチンを使用することなく、クルクミノイドのバイオアベイラビリティを増強する魅力的な方法を表す。
【０１８３】
表１８：標準ターメリック抽出物、ターメリックフィトソームまたは第２のｉｎ  ｖｉｖｏ研究で本発明の方法／使用において使用される組成物から３００ｍｇ／ｋｇのクルクミノイドを摂取した後の総クルクミノイドおよび代謝物について、PKSolverソフトウェアを使用した非コンパートメント分析から得られたＰＫパラメータ
【表１７】
2021533750.tif 000023
標準抽出物と比べたＡＵＣまたはＣｍａｘの倍増は括弧（）内に示されている。
ターメリックフィトソーム製剤と比べたＡＵＣまたはＣｍａｘの倍増は角括弧［］内に示されている。
【０１８４】
表１９：標準ターメリック抽出物、ターメリックフィトソームまたは第２のｉｎ  ｖｉｖｏ研究で本発明の方法／使用において使用される組成物から３００ｍｇ／ｋｇのクルクミノイドを摂取した後の親クルクミノイドについて、PKSolverソフトウェアを使用した非コンパートメント分析から得られたＰＫパラメータ
【表１８】
2021533750.tif 000024
【０１８５】
例７−クルクミノイドのバイオアベイラビリティを増強する本発明の組成物の能力を評価するための健康なボランティアにおける比較薬物動態研究。
この研究は２つの目的を有していた：
１．第１目的
３００ｍｇの本発明の組成物（Turmipure GOLDTMクルクミノイド製剤）の単回投与後２４時間で、１５００ｍｇ標準ターメリックパウダー抽出物９５％クルクミノイドと比較した、総クルクミノイド（クルクミン、デメトキシクルクミン（ＤＭＣ）、ビスデメトキシクルクミン（ＤＢＭＣ）およびそれらの代謝物）の血漿濃度プロファイルを評価すること。
【０１８６】
２．第２目的
１４２５ｍｇ（標準ターメリックパウダー抽出物９５％クルクミンドイド、Curcumin C3 complex California Gold Nutrition）、２００ｍｇ（Curcuma Platinum MannaVital）、９０ｍｇの本発明の組成物（Turmipure GOLDTM 30% curcuminoids）または６０ｍｇ（Curcumin Cell’Innov）の活性物質のいずれかを含有する５つの研究製品の単回摂取後の以下のパラメータの血漿濃度プロファイルを評価すること：
・総クルクミノイド；
・親化合物（クルクミン、ＤＭＣ、ＢＤＭＣ）およびそれらの代謝物：クルクミングルクロニドおよびスルファート；ＤＭＣグルクロニドおよびスルファート；ＢＤＭＣグルクロニドおよびスルファート；テトラヒドロクルクミン（ＴＨＣ）天然、グルクロニドおよびスルファート；ヘキサヒドロクルクミン（ＨＨＣ）天然、グルクロニドおよびスルファート。
この研究は、モノセントリック、ランダム化、クロスオーバー、およびオープン臨床試験であった。
【０１８７】
研究は、スクリーニング／組み入れ（inclusion）ビジット（Ｖ０）で始まり、５つの実験セッション（Ｖ１〜Ｖ５）が続き、その間に研究された製品が被験者によって摂取された（各ランダム化された対象に各セッションで１つの異なる製品）。Ｖ１ビジットは、Ｖ０の最大３週間後に行われ、ランダム化ビジットを構成することもできる。
各実験セッション（Ｖ１〜Ｖ５）は、最小１週間と最大２週間で区切られていた。各実験セッション中に、対象は８時間の間に動態採血（kinetic blood sampling）を受けた。最後の動態血液試料は、各実験セッションの翌日、動態開始の２４時間後に採取した。バイオバンキングのためにこれらのビジットの間、採尿も実施した。
【０１８８】
被験者の最初の排尿を各実験ビジットの朝に収集した（この最初の排尿の全体）、動態採血中その場で０〜８時間、および帰宅した８〜２４時間に追加の収集あり。最後の採尿は、実験ビジットの翌日（動態採血の最後の血液試料、Ｔ２４Ｈ、のために戻ったとき）に返却した。
標準的な食事を、各実験セッションの前のダイナーのためにおよび各活動（朝食、昼食、午後の軽食）のすべての期間の間に、ボランティアに提供した。
研究の終了は、最後の実験セッションＶ５（Ｖ５−２４Ｈ）の翌日であった。
【０１８９】
以下の主な選択および除外基準に従って、３０人の対象をこの研究のために採用した：
■  Ｉ１：１８〜４５歳（限界を包含する）；
■  Ｉ２：１９〜２５ｋｇ／ｍ２のＢＭＩ（限界を包含する）；
■  Ｉ３：安定した体重、過去３か月で±３ｋｇ内；
■  Ｉ４：正常範囲内にあるルーチン血液化学値；
【０１９０】
■  Ｉ５：女性の場合：閉経しておらず、研究開始の少なくとも３サイクル前から同じ信頼できる避妊法を行っており、研究の全期間の間それを維持することに同意する（殺精子ゲルを有するコンドームおよびエストロゲン／プロゲスチンの組み合わせ避妊薬を受け入れる）、またはホルモン補充療法（３ヶ月未満から開始されたエストロゲン補充療法を除く）の有無にかかわらず閉経している；
■  Ｉ６：禁煙またはタバコ摂取量≦５タバコ／日およびすべての実験セッション（Ｖ１〜Ｖ５）の間は喫煙しないことに同意する；
■  Ｉ７：研究の全期間中、クルクミンまたは他のクルクミノイド（ＤＭＣ、ＢＤＭＣ）を含有する食物、飲料および調味料を摂取しないことに同意する；
■  Ｉ８：治験責任医師の意見による、良好な一般的および精神的健康：病歴または身体検査の臨床的に有意なおよび関係のある異常がない；
【０１９１】
■  Ｅ１：糖尿病、制御不能または制御された甲状腺障害、またはその他の代謝障害などの代謝または内分泌障害を患っている；
■  Ｅ２：重度の慢性疾患（例として、癌、ＨＩＶ、腎不全、進行中の肝障害または胆道障害、慢性炎症性消化器疾患、関節炎または他の慢性呼吸器障害など）または胃腸障害を患っている、または治験責任医師による研究の実施と矛盾していることが判明した胃腸障害（例として、セリアック病）；
■  Ｅ３：肝疾患を患っている；
■  Ｅ４：食事補給のある対象に禁忌となる現在の病状：慢性下痢、便秘または腹痛、炎症性腸疾患（クローン病または潰瘍性大腸炎）、肝硬変、慢性の下剤使用．．．；
■  Ｅ５：医師によって診断され、慢性薬で処置された過敏性腸症候群（ＩＢＳ）を患っている；
【０１９２】
■  Ｅ６：治験責任医師によると、研究結果に影響を及ぼす、または対象を追加のリスクにさらし得る現在の病的状態の病歴を有する；
■  Ｅ７：最近の胃腸炎または確認された食中毒などの食物経由の病気（１か月未満）；
■  Ｅ８：Ｖ０ビジットの３か月前に献血した人、または３か月以内に献血するつもりの人。
■  Ｅ９：治験責任医師の意見によると、血液試料の動態を実行することができない、低い静脈キャピタル（venous capital）を有する；
■  Ｅ１０：研究製品の成分および／または標準的な食事のいずれかに対して、既知または疑いのある食物アレルギーまたは不耐性または過敏症（グルテン不耐性、セリアック病など）を有する；
■  Ｅ１１：妊娠中または授乳中の女性、または３か月以内に妊娠するつもりである女性；
【０１９３】
■  Ｅ１２：アルコールまたは薬物依存を呈する；
■  Ｅ１３：経口および局所避妊薬を除く、あらゆる慢性薬物処置（例えば、抗凝固薬、降圧薬処置、甲状腺の処置、喘息処置、抗不安薬、抗うつ薬、脂質低下処置、コルチコステロイド、静脈緊張剤（phlebotonic）、静脈強壮剤（veinotonic）、血液循環に影響を与える薬物．．．）。
■  Ｅ１４：目下（および過去３か月間に）植物からの任意のサプリメントを採取している；
■  Ｅ１５：クルクミン含有フードサプリメント（クルクミン、ターメリックおよびカレー）または食物（クルクミン、ターメリック、Ｅ１００およびカレー）を、試験前の２週間、少なくとも週に３回摂取した；
■  Ｅ２７：治験責任医師によると、臨床的に有意な異常を有するコントロールレコード（control record）（血糖、ＧＧＴ、ＡＳＡＴ、ＡＬＡＴ、尿素、クレアチニンおよび全血球計算）。
【０１９４】
この研究の一環として、カプセルの形状の食事性サプリメントである５つの製品を試験した：
１．カプセルとして摂取される標準ターメリックパウダー抽出物９５％クルクミノイド１５００ｍｇ（４カプセル；カプセルあたり３７５ｍｇパウダー）（ＳＴＥ）、
２．市販製品Curcumin C3 complex California Gold Nutritionとして摂取されるC3 complex（登録商標）９５％クルクミノイド（１５００ｍｇ）+BioPerine（登録商標）９５％ピペリン（１５ｍｇ）（３キャップ；カプセルあたり５００ｍｇC3 complexパウダー＋５ｍｇバイオペリンパウダー）（ＴＥＰ）、
３．市販製品として摂取されるMeriva（登録商標）（１０００ｍｇ）Curcuma Platinum Mannavital２０％クルクミノイド（２キャップ；カプセルあたり５００ｍｇ粉末）（ＰＨＹＴ）、
４．市販製品として摂取されるNovasol（登録商標）（１０００ｍｇ）Curcumin Cell innov６％クルクミノイド（２キャップ；カプセルあたり５００ｍｇ液体）（ＮＯＶ）、
５．カプセルとして摂取されるターメリック抽出物、ヒマワリ油、キラヤ抽出物、およびアラビアガムを含む、本明細書で定義される組成物（１カプセル；カプセルあたり３００ｍｇの粉末）（TURMIPURE GOLD）。
【０１９５】
対象の健康状態を確保し、適格基準を確認するために、Ｖ０ビジット中に血液試料を採取し、非閉経期の女性のコントロールレコード分析および妊娠検査を行った（βhCG投与量）。
試料を、身体検査および適格基準の検証の後に採取した。最大１０ｍＬが収集された。
血圧の測定は、電子血圧モニター（Carescape Dinamap（登録商標）V100）を使用して、身体検査の間に各ビジットで実施した。
心拍数（ＨＲ、ｂｐｍ）、収縮期血圧（ＳＢＰ、ｍｍＨｇ）、拡張期血圧（ＤＢＰ、ｍｍＨｇ）も評価した。
すべての対象は１２時間の絶食状態で参加した。
Ｖ１〜Ｖ５のビジットに備えて、臨床検査後、対象の肘のしわに静脈カテーテルを取り付けた。このカテーテルは、追加の刺し傷なしで動態のための採血を可能にした。
【０１９６】
動態試料はおよそ８時間続き、すべての対象が臨床治験センターに滞在した。以下のスケジュールに従って、１０回の採血を行った：
−  Ｔ−１０（ベースライン）、
−  Ｔ１５＞Ｔ３０＞Ｔ４５＞Ｔ６０＞Ｔ９０＞Ｔ１２０＞Ｔ２４０＞Ｔ３６０＞Ｔ４８０、
Ｔ１５に対して±３０秒、Ｔ３０およびＴ４５に対して±１分、Ｔ６０およびＴ９０に対して±２分、Ｔ１２０〜Ｔ４８０に対して±５分のマージンを認めた。
Ｔ０の時点は、研究製品の摂取に対応する。
【０１９７】
ボランティアは、研究製品摂取の約４時間後（Ｔ２４０時点の直後）に標準的な昼食を、および研究製品摂取の約８時間後に標準的な午後の食事を摂取することを許された。昼食は最大３０分で摂取された。製品投与の１ｈ前と１ｈ後に水は許可されなかった。最後の時点、Ｔ４８０の後にカテーテルを取り外した。
【０１９８】
次いで、ボランティアには、動態の最後の採血、Ｔ２４Ｈのためのビジットの翌日、１２時間の絶食状態で臨床治験施設に再度来るように求めた。古典的な静脈血試料材料を使用した（単一の刺し傷）。これらのサンプリングで評価された生物学的パラメータは、血漿中で分析され、よって、ＥＤＴＡ管のみが使用される（サンプリングあたり５ｍＬ）。
【０１９９】
検量線は、各５つのクルクミノイド（Phytolab、Vestenbergsgreuth、ドイツ）について１０〜６００ｎｇ／ｍＬの範囲で作成し、保持時間の安定性と器械補正バリエーションを確保するために、内部標準として５０ｐｐｂの標識クルクミン（TLC pharmachem、オンタリオ、カナダ）を添加して調製した。各溶液の希釈剤としてアセトニトリルを使用した。遊離クルクミノイド特定のために、内部標準溶液（５０ｎｇ／ｍＬ）を含有する正確に５００μＬの冷メタノール：アセトニトリル（１５：８５）混合物を、１００μＬの血漿試料を介してCaptiva 96ウェルプレート（AgilentからのＥＭＲ脂質、図１８参照）にロードした。混合および濾過後、クルクミンを冷水：アセトニトリル（１：４）混合物で溶離し、溶出液をＬＣ／ＭＳシステムに注入した。Captiva EMR脂質プレートは、血漿からリン脂質を効果的に除去するように設計されていた。抱合されたクルクミノイド代謝物（グルクロニドおよびスルファート代謝物）の合計の特定のために、６０μＬの血漿試料を６０μＬの酵素溶液（１ｍｇ／ｍＬのグルクロニダーゼ、１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．８またはスルファターゼ１０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５．０のいずれか）、３７℃で１時間、絶えず攪拌して（Eppendorf、Thermomixer C、４００ｒｐｍ）、混合した。この加水分解ステップ後、プロトコルは、Captiva 96ウェルプレートＥＭＲ脂質を使用した遊離クルクミノイドの場合と同じであった。
【０２００】
注射前のヒト血漿処置のためのＥＭＲ−脂質プロトコルは下のとおりである。
【表１９】
2021533750.tif 000025
【０２０１】
ＬＣ／ＭＳ条件は次のとおりであった。使用したオートサンプラー（５℃）およびＬＣシステムは、Agilent Infinity1290統合システムであった。研究の間、Agilent 6420トリプル四重極質量分析計をエレクトロスプレイイオン化とともに使用した。代謝物は、BEH Shield RP 18カラム（１００ｘ２．１、１．７μｍ；Waters）から、ＨＰＬＣグレードの水中０．１％ギ酸（溶媒Ａ）およびアセトニトリル中０．１％ギ酸（溶媒Ｂ）からなる移動相で、０．４ｍＬ／分の流速で溶離した。溶離は、０〜３分で４０〜６０％Ｂからのグラジエントであった。標準および試料の注入量は２μＬであった。各参照化合物について、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードを利用して、プリカーサからプロダクトイオンへの関連する推移を検出した。５つのアナライトのそれぞれについて、ＭＳ１フルスキャン試験で特定し、ＭＳ／ＭＳ実験でプロダクトイオンを特定した。各アナライトのＭＲＭ推移は、直接注入およびOptimizer B.08.00ワークステーションソフトウェアソリューション（Agilent technologies, Santa Clara, CA, USA）を使用して最適化した。最適な選択条件については、表２０を参照。質量分析計のパラメータを次のとおりに設定した：ネガティブとポジティブモードの両方のＥＳＩソース；乾燥ガス（Ｎ２）流量、１０Ｌ／分；ガス温度、３５０℃；ネブライザー、４０ｐｓｉ；およびキャピラリー、４．０ｋＶ。製造業者のガイドラインに従って実行する前に完全に較正されたＭＳシステム。データ分析は、Agilent MassHunter定量／定性分析B.07.00で行った（Agilent technologies, Santa Clara, CA, USA）。
【０２０２】
表２０：５つのクルクミノイドおよび内部標準の保持時間（Ｔｒ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）推移、および最適化されたタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）検出パラメータ。
【表２０】
2021533750.tif 000026
【０２０３】
分析集団
■  ＩＴＴ集団：少なくとも１用量の製品を摂取した研究においてランダム化されたすべての対象（ｎ＝３０）
■  ＰＰ集団：主要なプロトコルの逸脱を示さない研究を完了したＩＴＴ集団に包含される対象（ｎ＝３０）。以下の対象はＰＰ集団から除外された：
■すべてのパラメータについて対象SN01-040-V5
■  安全性集団：少なくとも１用量の製品を摂取した研究においてランダム化されたすべての対象（ｎ＝３０）
■  
【表２１】
2021533750.tif 000027
表２１：平均および標準偏差を示しているベースラインでの研究集団の記載。
【０２０４】
ソフトウェア環境
■  統計分析は、SAS（登録商標）software version 9.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)を使用してBiofortisによって実施した。
■  有意レベル
■  すべての統計的検定（両側（two-tailed））では、０．０５レベルの有意性を使用して、統計的に有意な効果の主張を正当化した。
【０２０５】
■  動態の欠測データを処理する方法
■  動態で２を超える値または２つの連続する値が欠測している場合、ＡＵＣ計算を実施することができず、統計分析において動態は欠測していると見なされた（欠測データの置き換えは実施されなかった）；
■  Ｔ−１０の時点でデータが欠側している場合、ＡＵＣ計算を実施することができず、統計分析において動態は欠測していると見なされた（欠測データの置き換えは実施されなかった）；
■  値（ベースライン値と最後の時点での値を除く）が動態に欠測している場合、Genoliniによって開発されたCopyMean方法を使用して得られた値に置き換えられた（Genolini, 2013）。
■  動態の最後の時点（Ｔ１４４０＝Ｔ２４ｈ）での値が欠測している場合、欠測しているデータの置換は実施されなかった。
■  データ処理が欠測した後に動態が不完全の場合において、ＡＵＣは計算できない。
→この方法をＩＴＴおよびＰＰ集団に適用した。
【０２０６】
派生変数
■  総クルクミノイド＝クルクミン＋ＤＭＣ＋ＢＤＭＣ＋ＴＨＣ＋ＨＨＣ＋クルクミングルクロニド＋ＤＭＣグルクロニド＋ＢＤＭＣグルクロニド＋ＴＨＣグルクロニド＋ＨＨＣグルクロニド＋クルクミンスルファート＋ＤＭＣスルファート＋ＢＤＭＣスルファート＋ＴＨＣスルファート＋ＨＨＣスルファート
これらの１５の要素すべてが欠測している場合、総クルクミノイドを計算することはできない。これらの１５の要素の少なくとも１つが定量化されている場合、総クルクミノイドは計算された。
■  総親化合物＝クルクミン＋ＤＭＣ＋ＢＤＭＣの和
■  総親化合物およびそれらの関連するスルファートおよびグルクロニド代謝物＝クルクミン＋クルクミングルクロニド＋クルクミンスルファート＋ＤＭＣ＋ＤＭＣグルクロニド＋ＤＭＣスルファート＋ＢＤＭＣ＋ＢＤＭＣグルクロニド＋ＢＤＭＣスルファート
【０２０７】
■  クルクミンおよびその関連するスルファートおよびグルクロニド代謝物＝クルクミン＋クルクミングルクロニド＋クルクミンスルファート
■  ＤＭＣおよびその関連するスルファートおよびグルクロニド代謝物＝ＤＭＣ＋ＤＭＣグルクロニド＋ＤＭＣスルファート
■  ＢＤＭＣおよびその関連するスルファートおよびグルクロニド代謝物＝ＢＤＭＣ＋ＢＤＭＣグルクロニド＋ＢＤＭＣスルファート
■  クルクミンおよびすべてのその関連する代謝物＝クルクミン＋クルクミングルクロニド＋クルクミンスルファート＋ＴＨＣ＋ＴＨＣグルクロニド＋ＴＨＣスルファート＋ＨＨＣ＋ＨＨＣグルクロニド＋ＨＨＣスルファート
【０２０８】
■  ０〜２４時間の相対的バイオアベイラビリティ＝リファレンス製品（ターメリック抽出物９５％クルクミノイド）について得られた用量正規化ＡＵＣ０−２４ｈに対する、異なる試験製剤についての用量正規化ＡＵＣ０−２４ｈの比率
■  ０〜無限大の相対的バイオアベイラビリティ＝リファレンス製品（ターメリック抽出物９５％クルクミノイド）について得られた用量正規化ＡＵＣ０−∞に対する、異なる試験製剤についての用量正規化ＡＵＣ０−∞の比率
【０２０９】
検出限界（ＬＯＤ）未満の値のデータ処理
■  データベースで《０．６２》として表現されるクルクミン（天然、グルクロニド、スルファート）について、検出限界（ＬＯＤ）を下回るいくつかの値が識別された。
→ＬＯＤの下の値の数およびパーセンテージは、各パラメータおよびビジットに対して与えられた。
【０２１０】
グラフ表示の作成
■  観測された平均の定量的変数：ＡＵＣパラメータの箱ひげ図（下の図に例示する）
【表２２】
2021533750.tif 000028
【０２１１】
統計的検定の仮定の確認
■  正規性および等分散性の仮定は、統計モデルによって生成された残余のグラフ表示によって調査された。正規性および／または等分散性からの強い逸脱の場合、研究エンドポイントの対数変換（ｌｏｇ１０）が考慮された。
結果の作成についての注記：
■   ＳＴＥ＝標準ターメリック粉末抽出物９５％クルクミノイド１５００ｍｇ
■   ＴＥＰ＝Curcumin C3 complex California Gold Nutrition（１５００ｍｇC3 complex（登録商標））
■   ＮＯＶ＝Curcumin Cell’Innov (1000 mg Novasol（登録商標）)
■   ＰＨＹＴ＝Curcuma Platinum MannaVital（１０００ｍｇ  Meriva（登録商標）)
■   Turmipure GOLDTM＝Turmipure Gold 30% curcuminoids３００ｍｇ
【０２１２】
統計的方法論
■  プライマリーエンドポイント：０〜２４時間の用量正規化ＡＵＣは、反復測定用の以下の混合モデル（SAS（登録商標）PROCMIXED、統計モデルｎ°１）を使用して分析した：
Ｙ＝製品＋ビジット＋ベースライン＋対象ランダム
以下と共に：
■   Ｙ：アナライト血漿濃度の０〜２４時間の用量正規化ＡＵＣ；
■   製品: Turmipure GoldTM、ＳＴＥ、ＴＥＰ、ＮＯＶ、ＰＨＹＴ；
■   ビジット：ビジットＶ１〜Ｖ５；
■   ベースライン：Ｔ−１０時点でのパラメータの値（ＡＵＣ計算の場合はＴ０）；
■   対象ランダム: ランダム因子。
■   有意なビジット効果（ｐ＜０．０５）の場合：製品効果を評価するために、第１の期間（ビジット）に実現された第２分析。
■   関心のある製品間の比較→ＳＴＥと比較したTurmipure GoldTM
【０２１３】
追加分析：ジェンダー効果の調査
■   この研究では、反復測定するために以下の混合モデル（SAS（登録商標）PROCMIXED、統計モデルｎ°２）を使用してジェンダー効果を調査した：
Ｙ＝製品＋ビジット＋ジェンダー＋製品＊ジェンダー＋ベースライン＋対象ランダム
以下と共に：
■   Ｙ：エンドポイント；
■   製品: Turmipure GoldTM、ＳＴＥ、ＴＥＰ、ＮＯＶ、ＰＨＹＴ；
■   ビジット：ビジットＶ１〜Ｖ５；
■   ジェンダー：女性または男性；
■   製品＊ジェンダー：製品とジェンダーの間の相互作用;
■   ベースライン：Ｔ−１０時点でのパラメータの値（ＡＵＣ計算の場合はＴ０）；
■   対象ランダム: ランダム因子。
■   関心のある製品間の比較；
■   ＳＴＥと比較したTurmipure GoldTM
【０２１４】
■   ＳＴＥと比較したＴＥＰ；
■   ＳＴＥと比較したＮＯＶ；
■   ＳＴＥと比較したＰＨＹＴ；
■   Turmipure GoldTMと比較したＴＥＰ；
■   Turmipure GoldTMと比較したＮＯＶ；
■   Turmipure GoldTMと比較したＰＨＹＴ。
■   有意なビジット効果（ｐ＜０．０５）の場合：製品効果を評価するために、第１の期間（ビジット）に実現された第２分析。
■   有意な製品＊ジェンダー相互作用効果（ｐ＜０．０５）の場合：男性と女性で別々に調査された処置効果（記述統計およびグラフ表示の作成を伴う）
■   有意な製品＊ジェンダー相互作用効果（ｐ＜０．０５）の場合：全体（女性および男性一緒に）で調査された処置効果
【０２１５】
第２エンドポイントの統計的方法論（相対的バイオアベイラビリティを除く）
■   第２エンドポイントは、反復測定するために以下の混合モデル（SAS（登録商標）PROCMIXED、統計モデルｎ°１）を使用して分析した：
Ｙ＝製品＋ビジット＋ベースライン＋対象ランダム
■  有意なビジット効果（ｐ＜０．０５）の場合：製品効果を評価するために、第１の期間（ビジット）に実現された第２分析。
■   関心のある製品間の比較；
■   ＳＴＥと比較したTurmipure GoldTM
■   ＳＴＥと比較したＴＥＰ；
■   ＳＴＥと比較したＮＯＶ；
■   ＳＴＥと比較したＰＨＹＴ；
■   Turmipure GoldTMと比較したＴＥＰ；
■   Turmipure GoldTMと比較したＮＯＶ；
■   Turmipure GoldTMと比較したＰＨＹＴ。
【０２１６】
■  相対的バイオアベイラビリティの統計的方法論
■   第２エンドポイントは、反復測定するために以下の混合モデル（SAS（登録商標）PROCMIXED、統計モデルｎ°１）を使用して分析した：
Ｙ＝製品＋ビジット＋ベースライン＋対象ランダム
■  有意なビジット効果（ｐ＜０．０５）の場合：製品効果を評価するために、第１の期間（ビジット）に実現された第２分析。
■   関心のある製品間の比較；
■   Turmipure GoldTMと比較したＴＥＰ；
■   Turmipure GoldTMと比較したＮＯＶ；
■   Turmipure GoldTMと比較したＰＨＹＴ。
【０２１７】
プライマリーエンドポイントの結果の要約
表２２および２３：ＩＴＴおよびＰＰ集団の初期分析
【表２３】
2021533750.tif 000029
【０２１８】
表２４および２５：ＩＴＴおよびＰＰ集団の追加分析（ジェンダー効果の調査）
【表２４】
2021533750.tif 000030
【０２１９】
【表２５】
2021533750.tif 000031
【０２２０】
上記の分析から、ＩＴＴ集団については次のように結論付けられた：
グループ間分析（すべてのジェンダーをまとめたもの）
■  有意なビジットは確認されていない→その結果として、分析はすべてのビジットで実施した。
■   有意な製品効果（ｐ＜０．０００１）：
■  プライマリーエンドポイント：Turmipure GOLDTMとＳＴＥの間には統計的に有意な違いがある（調整されたｐ＜０．０００１；ｄｉｆｆ［（調整されたＣＩ９５％］＝１．３２［１．１８；１．４６］）．
■  その他の比較：
■  ＴＥＰｖｓＳＴＥ（調整されたｐ＝０．６９４８）
■  ＮＯＶｖｓＳＴＥ（調整されたｐ＜０．０００１；ｄｉｆｆ［調整されたＣＩ９５％］＝１．６２［１．４８；１．７６］）→ＮＯＶ＞ＳＴＥ
■  ＰＨＹＴｖｓＳＴＥ（調整されたｐ＜０．０００１；ｄｉｆｆ［調整されたＣＩ９５％］＝０．４８［０．３４；０．６２］）→ＰＨＹＴ＞ＳＴＥ
■  ＴＥＰｖｓTurmipure GOLDTM（調整されたｐ＜０．０００１；  ｄｉｆｆ［調整されたＣＩ９５％］＝−１．３９［−１．５３；−１．２５］）→ＴＥＰ＜Turmipure GOLDTM
■  ＮＯＶｖｓTurmipure GOLDTM（調整されたｐ＜０．０００１；ｄｉｆｆ［調整されたＣＩ９５％］＝０．２９［０．１５；０．４３］）→ＮＯＶ＞Turmipure GOLDTM
■  ＰＨＹＴｖｓTurmipure GOLDTM（調整されたｐ＜０．０００１；ｄｉｆｆ［調整されたＣＩ９５％］＝−０．８４［−０．９９；−０．７０］）→ＰＨＹＴ＜Turmipure GOLDTM
【０２２１】
■  追加分析：ジェンダー効果の調査
■  有意なビジット（ｐ＝０．２４５６）および製品＊ジェンダーの相互作用（ｐ＝０．３８０４）効果なし：分析はすべてのジェンダーをまとめておよびすべてのビジットで実施した。
■   有意な製品効果（ｐ＜０．０００１）：
■  ＴＥＰｖｓＳＴＥ（調整されたｐ＝０．７０９１）
■  ＮＯＶｖｓＳＴＥ（調整されたｐ＜０．０００１；ｄｉｆｆ［調整されたＣＩ９５％］＝１．６１［１．４７；１．７５］）→ＮＯＶ＞ＳＴＥ
■  ＰＨＹＴｖｓＳＴＥ（調整されたｐ＜０．０００１；ｄｉｆｆ［調整されたＣＩ９５％］＝０．４８［０．３４；０．６２］）→ＰＨＹＴ＞ＳＴＥ
■  Turmipure GOLDTMｖｓＳＴＥ（調整されたｐ＜０．０００１；ｄｉｆｆ［調整されたＣＩ９５％］＝１．３２［１．１８；１．４６］）→Turmipure GOLDTM＞ＳＴＥ
■  ＴＥＰｖｓTurmipure GOLDTM（調整されたｐ＜０．０００１；ｄｉｆｆ［調整されたＣＩ９５％］＝−１．３９［−１．５２；−１．２５］）→ＴＥＰ＜Turmipure GOLDTM
■  ＮＯＶｖｓTurmipure GOLDTM（調整されたｐ＜０．０００１；ｄｉｆｆ［調整されたＣＩ９５％］＝０．２９［０．１５；０．４３］）→ＮＯＶ＞Turmipure GOLDTM
■  ＰＨＹＴｖｓTurmipure GOLDTM（調整されたｐ＜０．０００１；ｄｉｆｆ［調整されたＣＩ９５％］＝−０．８４［−０．９８；−０．７０］）→ＰＨＹＴ＜Turmipure GOLDTM
【０２２２】
ＰＰ集団について：
■  グループ間分析（すべてのジェンダーをまとめたもの）
■  結果はＩＴＴ集団で観察された結果と同様である。
■  追加分析：ジェンダー効果の調査
■  結果はＩＴＴ集団で観察された結果と同様である。
【０２２３】
セカンダリーエンドポイントの結果の要約
セカンダリーエンドポイントの結果を、ＩＴＴ（表２７〜４３）およびＰＰ（表４４〜６０）集団の両方についてそれぞれ下の表に示す。データのグラフ表示を図２４〜３７に提供する。
以下のキー(key)が各表に適用され、各結果の統計的有意性を示している。
【表２６】
2021533750.tif 000032

【０２２４】
【表２７】
2021533750.tif 000033
【０２２５】
【表２８】
2021533750.tif 000034
【０２２６】
【表２９】
2021533750.tif 000035
【０２２７】
【表３０】
2021533750.tif 000036
【０２２８】
【表３１】
2021533750.tif 000037
【０２２９】
【表３２】
2021533750.tif 000038
【０２３０】
【表３３】
2021533750.tif 000039
【０２３１】
【表３４】
2021533750.tif 000040
【０２３２】
【表３５】
2021533750.tif 000041
【０２３３】
【表３６】
2021533750.tif 000042
【０２３４】
【表３７】
2021533750.tif 000043
【０２３５】
【表３８】
2021533750.tif 000044
【０２３６】
【表３９】
2021533750.tif 000045
【０２３７】
【表４０】
2021533750.tif 000046
【０２３８】
【表４１】
2021533750.tif 000047
【０２３９】
【表４２】
2021533750.tif 000048
【０２４０】
【表４３】
2021533750.tif 000049
【０２４１】
【表４４】
2021533750.tif 000050
【０２４２】
【表４５】
2021533750.tif 000051
【０２４３】
【表４６】
2021533750.tif 000052
【０２４４】
【表４７】
2021533750.tif 000053
【０２４５】
【表４８】
2021533750.tif 000054
【０２４６】
【表４９】
2021533750.tif 000055
【０２４７】
【表５０】
2021533750.tif 000056
【０２４８】
【表５１】
2021533750.tif 000057
【０２４９】
【表５２】
2021533750.tif 000058
【０２５０】
【表５３】
2021533750.tif 000059
【０２５１】
【表５４】
2021533750.tif 000060
【０２５２】
【表５５】
2021533750.tif 000061
【０２５３】
【表５６】
2021533750.tif 000062
【０２５４】
【表５７】
2021533750.tif 000063
【０２５５】
【表５８】
2021533750.tif 000064
【０２５６】
【表５９】
2021533750.tif 000065
【０２５７】
【表６０】
2021533750.tif 000066
【０２５８】
重篤な有害事象：
■  対象ＳＮ０１−００９：頸部の痛み／Ｖ０〜Ｖ１ビジットの交通事故（研究製品なし下）（運動能力のある／リウマチ体組織、病歴とは関係のない事象、中程度の強度、研究製品に対するアクションなし、調査および研究製品に関係のない事象、矯正処置に関連しない事象、後遺症のない回復）。
【０２５９】
■  重度の強度を伴う緊急ＡＥの処置：
■  対象ＳＮ０１−００７：Ｖ２〜Ｖ３ビジットの腰痛（Turmipure GOLDTM製品下）（運動能力のある／リウマチ体組織、病歴とは関係のない事象、重度の強度、研究製品に対するアクションなし、調査および研究製品に関係のない事象、矯正処置に関連しない事象、後遺症のない回復）。
【０２６０】
■  研究製品に関するＡＥ：
■  対象ＳＮ０１−００８：Ｖ３ビジット当日の頭痛（Turmipure GOLDTM製品下）（神経学的/精神医学的体組織、病歴とは関係のない事象、中程度の強度、研究製品に対するアクションなし、調査および研究製品に関係のない事象、矯正処置に関連しない事象、後遺症のない回復）。
■  対象ＳＮ０１−０３０：Ｖ３ビジット当日の頭痛（Turmipure GOLDTM製品下）（神経学的/精神医学的体組織、病歴とは関係のない事象、中程度の強度、研究製品に対するアクションなし、調査および研究製品に関係する可能性のある事象、矯正処置（パラセタモール）に関連しない事象、後遺症のない回復）。
■  対象ＳＮ０１−０３２：Ｖ２ビジット当日の頭痛（NOV製品下）（神経学的/精神医学的体組織、病歴とは関係のない事象、中程度の強度、研究製品に対するアクションなし、調査および研究製品に関係する可能性のある事象、矯正処置に関連しない事象、後遺症のない回復）。
【０２６１】
ＰＰ集団で観察された結果は、ＩＴＴ集団のものと同様である。
総クルクミノイドについての平均±ＳＤ（ＩＴＴ集団）を下に示す。
【０２６２】
【表６１】
2021533750.tif 000067
【０２６３】
結論
結果は、ＴＥＰおよびＳＴＥに見られる化合物のバイオアベイラビリティにほとんど違いがないことを実証している（わずか５つの違い）。
本発明の範囲内の組成物（Turmipure GOLDTM）は、ＳＴＥ、ＴＥＰおよびＰＨＹＴよりも化合物のより良好なバイオアベイラビリティを提供することが見出され、低用量（１０００ｍｇと比較して３００ｍｇ）で投与されたにもかかわらず、ＮＯＶと同様のバイオアベイラビリティを提供することができ、および合成担体（ポリソルベート８０など）を含まない天然成分のみを使用している。
より具体的には、Novasolは１０００ｍｇで使用されたが、本発明（Turmipure GOLDTM）の組成物は３００ｍｇであった。Turmipureは３００ｍｇで６５２０（ｎｇ．ｈ／ｍＬのＡＵＣ）の効果をもたらすため、Novasol（１０００ｍｇ）と同じ投与量で使用した場合、２１７３３（ｎｇ．ｈ／ｍＬのＡＵＣ）の効果をもたらし、これは同じ投与量でのNovasolの効果（８５３９）よりもはるかに高い。
【図１】
2021533750.tif 000068
【図２】
2021533750.tif 000069
【図３】
2021533750.tif 000070
【図４】
2021533750.tif 000071
【図５】
2021533750.tif 000072
【図６】
2021533750.tif 000073
【図７】
2021533750.tif 000074
【図８】
2021533750.tif 000075
【図９】
2021533750.tif 000076
【図１０】
2021533750.tif 000077
【図１１】
2021533750.tif 000078
【図１２】
2021533750.tif 000079
【図１３】
2021533750.tif 000080
【図１４】
2021533750.tif 000081
【図１５】
2021533750.tif 000082
【図１６】
2021533750.tif 000083
【図１７】
2021533750.tif 000084
【図１８】
2021533750.tif 000085
【図１９】
2021533750.tif 000086
【図２０】
2021533750.tif 000087
【図２１】
2021533750.tif 000088
【図２２】
2021533750.tif 000089
【図２３】
2021533750.tif 000090
【図２４】
2021533750.tif 000091
【図２５】
2021533750.tif 000092
【図２６】
2021533750.tif 000093
【図２７】
2021533750.tif 000094
【図２８】
2021533750.tif 000095
【図２９】
2021533750.tif 000096
【図３０】
2021533750.tif 000097
【図３１】
2021533750.tif 000098
【図３２】
2021533750.tif 000099
【図３３】
2021533750.tif 000100
【図３４】
2021533750.tif 000101
【図３５】
2021533750.tif 000102
【図３６】
2021533750.tif 000103
【図３７】
2021533750.tif 000104
【国際調査報告】
2021533750.tif 000105
2021533750.tif 000106
2021533750.tif 000107