(57)【要約】  メチル修飾酵素に関連する多様な疾患、障害、または状態を治療するのに有用である、式（Ｉ）の新規化合物およびその薬学的に許容される塩が提供される。式（Ｉ）の新規化合物、その薬学的に許容される塩を含む薬学的組成物、およびメチル修飾酵素に関連する１つ以上の疾患、障害、または状態の治療にそれらを使用するための方法も提供される。2021522166.tif 000060
2021522166.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの化合物：
【化１】
2021522166.tif 000046
またはその薬学的に許容される塩であって、式中、
Ｒ１が、ハロ、−Ｓ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、−Ｓ（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキル、または−Ｓ［ハロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル］であり、
Ｘが、ＣＨまたはＮであり、
Ｒ２が、水素、ハロ、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、またはハロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルであり、
Ｒ３が、ハロ、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、またはハロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルであり、
Ｒ４が、（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキルまたは４〜７員のヘテロシクリルであり、それらの各々が、ハロ、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ハロ（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、および−ＮＲａＲｂから選択された１〜３個の基で任意選択的に置換されており、
Ｒａが、水素、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、またはハロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルであり、
Ｒｂが、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、または４〜７員のヘテロシクリルであり、前記ヘテロシクリルが、ハロ、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、およびハロ（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシから選択された１〜３個の基で任意選択的に置換されているか、あるいは、
ＲａおよびＲｂが、それらが結合している窒素原子と一緒になって、ハロ、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、および−ＯＲｃから選択された１〜３個の基で任意選択的に置換されている４〜７員のヘテロシクリルを形成し、
Ｒｃが、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、または（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキルであり、
Ｒ５が、ハロ、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、またはハロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルである、化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
Ｒ１が、ハロまたは−Ｓ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルであり、
Ｒ２が、ハロであり、
Ｒ３が、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルであり、
Ｒ４が、（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキルまたは（Ｃ４−Ｃ７）ヘテロシクリルであり、それらの各々が、ハロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルおよび−ＮＲａＲｂから選択された１〜２個の基で任意選択的に置換されており、
Ｒａが、水素または（Ｃ１−Ｃ４）アルキルであり、
Ｒｂが、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルまたは（Ｃ４−Ｃ７）ヘテロシクリルであり、前記ヘテロシクリルが、ハロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルで任意選択的に置換されているか、あるいは
ＲａおよびＲｂが、それらが結合している窒素原子と一緒になって、ハロおよび−ＯＲｃから選択される１〜３個の基で任意選択的に置換されている４〜７員の窒素含有ヘテロシクリルを形成し、
Ｒｃが、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、または（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキルであり、
Ｒ５が、ハロまたは（Ｃ１−Ｃ４）アルキルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記化合物が、式ＩＩ：
【化２】
2021522166.tif 000047
のもの、またはその薬学的に許容される塩である、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ１が、クロロである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ１が、−ＳＣＨ３である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ４が、シクロヘキシルまたはピペリジニルであり、それらの各々が、ハロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルおよび−ＮＲａＲｂから選択された１〜２個の基で任意選択的に置換されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
前記化合物が、式ＩＩＩ：
【化３】
2021522166.tif 000048
のもの、またはその薬学的に許容される塩であって、式中、Ｒ６が、ハロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
前記化合物が、式ＩＶ：
【化４】
2021522166.tif 000049
のもの、またはその薬学的に許容される塩である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
前記化合物が、式（Ｖ）：
【化５】
2021522166.tif 000050
のもの、またはその薬学的に許容される塩である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
前記化合物が、式：
【化６】
2021522166.tif 000051
のもの、
またはその薬学的に許容される塩である、請求項１〜６および９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
前記化合物が、式：
【化７】
2021522166.tif 000052
のもの、またはその薬学的に許容される塩である、請求項１〜６、９、および１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒｂが、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルまたはオキセタニルであり、前記オキセタニルが、ハロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルで任意選択的に置換されているか、またはＲａおよびＲｂが、それらが結合している窒素原子と一緒になって、ハロもしくは−ＯＲｃで任意選択的に置換されているアゼチジニルを形成する、請求項１〜６および９〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒａが、水素またはメチルであり、Ｒｂが、メチルまたはオキサタニルであり、式中、前記オキセタニルが、−ＣＨ２Ｆまたは−ＣＦ３で任意選択的に置換されている、請求項１〜６および９〜１２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１４】
ＲａおよびＲｂが、それらが結合している窒素原子と一緒になって、１〜２個のフルオロまたは−ＯＲｃで任意選択的に置換されているアゼチジニルを形成し、Ｒｃが、−ＣＨ３、−ＣＨＦ２、またはシクロプロピルである、請求項１〜６および９〜１３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１５】
前記化合物が、式：
【化８−１】
2021522166.tif 000053
【化８−２】
2021522166.tif 000054
【化８−３】
2021522166.tif 000055
【化８−４】
2021522166.tif 000056
のもの、またはその薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１６】
前記
【化９】
2021522166.tif 000057
基およびＮＲａＲｂが、前記シクロヘキシルを中心にトランス配向している、請求項１〜６および９〜１５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１７】
前記
【化１０】
2021522166.tif 000058
基およびＮＲａＲｂが、前記シクロヘキシルを中心にシス配向している、請求項１〜６および９〜１５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１８】
１，３−ジオキソラニルのキラル中心の立体化学的配置が、Ｒである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１９】
１，３−ジオキソラニルのキラル中心の立体化学的配置が、Ｓである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２０】
前記化合物が、式：
【化１１】
2021522166.tif 000059
のもの、またはその薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の化合物。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項２２】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の化合物もしくはその薬学的に許容される塩、または請求項２１に記載の組成物の有効量を対象に投与することを含む、前記対象の癌を治療するための方法。
【請求項２３】
前記癌が、乳癌、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌腫、多形性膠芽腫癌、膀胱癌、黒色腫、気管支癌、リンパ腫、胆管肉腫、多発性骨髄腫、肺癌、卵巣癌、および肝臓癌から選択される、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１８年４月１８日出願の米国仮出願第６２／６５９，４０８号の優先権の利益を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
真核生物のクロマチンは、ヌクレオソームと呼ばれる高分子複合体で構成されている。ヌクレオソームは、ヒストンタンパク質Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４の各々の２つのサブユニットを有するタンパク質オクタマーの周りを包む１４７個の塩基対のＤＮＡを有する。ヒストンタンパク質は翻訳後修飾を受け、次にクロマチン構造および遺伝子発現に影響を与える。ヒストンに見られる翻訳後修飾の１つの種類は、リジンおよびアルギニン残基のメチル化である。ヒストンのメチル化は、真核生物の遺伝子発現の制御に重要な役割を果たしている。メチル化はクロマチン構造に影響を与え、転写の活性化と抑制との両方に関連している（Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｒｅｉｎｂｅｒｇ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：２３４３−２３６０，２００１）。ヒストンからのメチル基の結合および除去を触媒する酵素は、遺伝子サイレンシング、胚出現、細胞増殖、および他のプロセスに関与している。
【０００３】
ヒストンメチラーゼの１つの部類は、約１３０個のアミノ酸を含むＳＥＴドメインの存在を特徴とする。ＥＺＨ２は、ヒトのＳＥＴドメインを含有するメチラーゼの一例である。ＥＺＨ２は、ＥＥＤ（胚性外胚葉の出現）およびＳＵＺ１２（ゼスト１２ホモログの抑制因子）と会合して、ＰＲＣ２（ポリコーム群抑制複合体２）として知られる複合体を形成し、これはリジン２７のヒストンＨ３をトリ−メチル化する能力を有する（Ｃａｏ  ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ１５：５７−６７，２００４）。ＰＲＣ２複合体はまた、ＲＢＡＰ４６およびＲＢＡＰ４８サブユニットを含み得る。別の例は、関連するメチラーゼＥＺＨ１である。
【０００４】
様々な異なる癌の種類に関する多くの研究によって、ＥＺＨ２の発癌活性が示されている。約１５〜２０％のＧＣＢ−ＤＬＢＣＬは、ＥＺＨ２（Ｙ６４１残基）の機能獲得型変異を含み、これらの細胞は、インビトロとインビボとの両方でＥＺＨ２阻害に対して過敏である（ＭｃＣａｂｅ  ｅｔ  ａｌ，２０１２；Ｂｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ，２０１４）。細胞株実験では、ＥＺＨ２の過剰発現は、細胞浸潤、軟寒天での成長、および運動性を誘発し、一方ＥＺＨ２のノックダウンは、細胞増殖および細胞浸潤を阻害する（Ｋｌｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００：１１６０６−１１６１１；Ｖａｒａｍｂａｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２），“Ｔｈｅ  ｐｏｌｙｃｏｍｂ  ｇｒｏｕｐ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＥＺＨ２  ｉｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ，”Ｎａｔｕｒｅ  ４１９，６２４−６２９）。ＥＺＨ２は、とりわけＥ−カドヘリン、ＤＡＢ２ＩＰ、およびＲＵＮＸ３を含むいくつかの腫瘍抑制因子の発現を抑制することが示されている。異種移植モデルでは、ＥＺＨ２ノックダウンは、腫瘍成長および転移を抑制する。マウスモデルにおけるＥＺＨ２の下方調節が、前立腺癌の転移を阻止することが示されている（Ｍｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ−ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｃａｓｃａｄｅ  ｄｒｉｖｅｓ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｙ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｒａｓ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ−ｋａｐｐａＢ，”Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１０  Ｍａｒ；１６（３）：２８６−９４）。最近、ＥＺＨ２が、神経内分泌腫瘍で過剰発現し、マウス腫瘍でのＥＺＨ２の阻害が、アンドロゲン依存性を回復させることが実証された（Ｋｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５５，２０１７）。ＥＺＨ２の過剰発現は、乳癌などのある特定の癌の攻撃性に関連する（Ｋｌｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００：１１６０６−１１６１１，２００３）。最近の研究はまた、前立腺癌特異的発癌性融合遺伝子ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧが、ＥＺＨ２の直接的な活性化を介して抑制的なエピジェネティクス的プログラムを誘発することを示唆している（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ｏｆ  Ａｎｄｒｏｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，Ｐｏｌｙｃｏｍｂ，ａｎｄ  ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ，”Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．２０１０  Ｍａｙ  １８；１７（５）：４４３−４５４）。
【０００５】
多様な生物学的プロセスの制御におけるそれらの役割を考慮すると、メチル修飾酵素、具体的にはＥＺＨ２およびその変異形態は、調節の魅力的な標的である。
【発明の概要】
【０００６】
ここで、本明細書に記載の化合物、およびその薬学的に許容される組成物が、ＥＺＨ２の活性を調節することが見出されている（例えば、表５を参照されたい）。そのような化合物としては、構造式Ｉ：
【化１】
2021522166.tif 000003
のもの、またはその薬学的に許容される塩が挙げられ、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＸの各々が、本明細書で定義されている。
【０００７】
一態様ではまた、本明細書に記載のある特定の化合物は、増加した滞留時間（例えば、＞１００時間）、および向上した透過性を有することが見出されている。滞留時間の増加（すなわち、より遅い解離速度）および／または透過性は、細胞効力の改善と相関することが見出されている。
【０００８】
開示の化合物、薬学的に許容される塩、および薬学的に許容される組成物は、メチル修飾酵素に関連する多様な状態を治療するのに有用である。これらの状態としては、例えば、１種以上の癌が挙げられる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
１．化合物の一般的な説明
式Ｉ：
【化２】
2021522166.tif 000004
の化合物、またはその薬学的に許容される塩であって、式中、
Ｒ１が、ハロ、−Ｓ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、−Ｓ（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキル、または−Ｓ［ハロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル］であり、
Ｘが、ＣＨまたはＮであり、
Ｒ２が、水素、ハロ、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、またはハロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルであり、
Ｒ３が、ハロ、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、またはハロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルであり、
Ｒ４が、（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキルまたは４〜７員のヘテロシクリルであり、それらの各々が、ハロ、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ハロ（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、および−ＮＲａＲｂから選択された１〜３個の基で任意選択的に置換されており、
Ｒａが、水素、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、またはハロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルであり、
Ｒｂが、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、または４〜７員のヘテロシクリルであり、当該ヘテロシクリルが、ハロ、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、およびハロ（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシから選択された１〜３個の基で任意選択的に置換されているか、あるいは、
ＲａおよびＲｂが、それらが結合している窒素原子と一緒になって、ハロ、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、および−ＯＲｃから選択された１〜３個の基で任意選択的に置換されている４〜７員のヘテロシクリルを形成し、
Ｒｃが、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、または（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキルであり、
Ｒ５が、ハロ、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、またはハロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルである、化合物またはその薬学的に許容される塩が提供される。
【００１０】
２．定義
複数の結合点を有し得る化学基を説明することに関連して使用されるとき、ハイフン（−）は、定義されている不定のものへのその基の結合点を示す。例えば、−Ｓ（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキルおよび−Ｓ［ハロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル］は、この基の結合点が硫黄原子上にあることを意味する。
【００１１】
本明細書で使用される「ハロ」および「ハロゲン」という用語は、フッ素（フルオロ、−Ｆ）、塩素（クロロ、−Ｃｌ）、臭素（ブロモ、−Ｂｒ）、およびヨウ素（ヨード、−Ｉ）から選択された原子を指す。
【００１２】
本明細書で使用される「アルキル」という用語は、特に明記されない限り、１〜１０個の炭素原子を有する一価の飽和の、直鎖または分岐鎖炭化水素ラジカルを指す。アルキルラジカルの例としては、限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｓｅｃ−ペンチル、イソ−ペンチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、ｓｅｃ−ヘキシルなどが挙げられる。
【００１３】
「ハロアルキル」という用語は、ハロゲンがフッ素、塩素、臭素、およびヨウ素から独立して選択されたモノ、ポリ、およびペルハロアルキル基を含む。
【００１４】
「アルコキシ」は、酸素リンカーを介して別の部分に結合しているアルキル基である（−Ｏ（アルキル））。非限定的な例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、およびブトキシが挙げられる。
【００１５】
「ハロアルコキシ」は、例えば、限定されないが、−ＯＣＨＣＦ２または−ＯＣＦ３などの、酸素原子を介して別の部分に結合しているハロアルキル基である。
【００１６】
「シクロアルキル」という用語は、３〜１２員（例えば、３〜７員）の単環式、二環式（例えば、架橋またはスピロ二環式環）、または多環式（例えば、三環式）の、完全に飽和している炭化水素環系を指す。単環式シクロアルキル基としては、限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルが挙げられる。架橋二環式シクロアルキル基としては、限定されないが、ビシクロ［３．２．１］オクタン、ビシクロ［２．２．１］ヘプタン、ビシクロ［３．１．０］ヘキサン、ビシクロ［１．１．１］ペンタンなどが挙げられる。スピロ二環式シクロアルキル基としては、例えば、スピロ［３．６］デカン、スピロ［４．５］デカンなどが挙げられる。縮合シクロアルキル環としては、例えば、デカヒドロナフタレン、オクタヒドロペンタレンなどが挙げられる。任意選択的に置換されているか、または置換されていると特定される場合、シクロアルキル上の置換基（例えば、任意選択的に置換されているシクロアルキルの場合）は、任意の置換可能な位置に存在し得、これは例えば、シクロアルキル基が結合している位置が挙げられる。
【００１７】
「ヘテロシクリル」という用語は、Ｎ、Ｏ、およびＳから独立して選択された１〜４個のヘテロ原子を含有する３〜１２員（例えば、４、５、６、および７員）の飽和のまたは部分的に不飽和の複素環を意味する。これは、単環式、二環式（例えば、架橋、縮合、またはスピロ二環式環）、または三環式であり得る。「複素環」、「ヘテロシクリル」、「ヘテロシクリル環」、「複素環式基」、「複素環式部分」、および「複素環式ラジカル」という用語は、本明細書では互換的に使用される。ヘテロシクリル環は、安定した構造を生じる、任意のヘテロ原子または炭素原子でそのペンダント基に結合することができる。そのような飽和のまたは部分的に不飽和の複素環式ラジカルの例としては、限定されないが、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、テラヒドロピラニル、ピロリジニル、ピリジノニル、ピロリドニル、ピペリジニル、オキサゾリジニル、ピペラジニル、ジオキサニル、ジオキソラニル、モルホリニル、ジヒドロフラニル、ジヒドロピラニル、ジヒドロピリジニル、テトラヒドロピリジニル、ジヒドロピリミジニル、オキセタニル、アゼチジニル、およびテトラヒドロピリミジニルが挙げられる。ヘテロシクリル基は、単環式または二環式であり得る。「ヘテロシクリル」という用語としてはまた、例えば、テトラヒドロナフチリジン、インドリノン、ジヒドロピロロトリアゾール、イミダゾピリミジン、キノリノン、ジオキサスピロデカンなどの、例えば別の不飽和複素環式ラジカルまたはアリールまたはヘテロアリール環に縮合した不飽和複素環式ラジカルが挙げられる。任意選択的に置換されているか、または置換されていると特定される場合、ヘテロシクリル上の置換基（例えば、任意選択的に置換されているヘテロシクリルの場合）は、任意の置換可能な位置に存在し得、これは例えば、ヘテロシクリル基が結合している位置が挙げられる。
【００１８】
「スピロ」という用語は、１つの環原子（例えば、炭素）を共有する２つの環を指す。
【００１９】
「縮合」という用語は、２つの隣接する環原子を互いに共有する２つの環を指す。
【００２０】
「架橋」という用語は、３つ以上の環原子を互いに共有する２つの環を指す。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「幾何異性体」は、シクロアルキル環との関係で置換基原子の配向が異なる異性体、すなわち、シスまたはトランス異性体を指す。開示の化合物が、特定のシスまたはトランス幾何異性体の形態を示さずに構造によって命名または描写されているとき、名前または構造は、他の幾何異性体を含まない１つの幾何異性体、幾何異性体の混合物、または対応する幾何異性体と比較して１つの幾何異性体が豊富な混合物を包含すると理解されるべきである。
【００２２】
特に明記されない限り、開示の化合物の立体化学が構造によって命名または描写されるとき、その命名または描写された立体異性体は、他のすべての立体異性体と比較して、少なくとも６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％、９９重量％、または９９．９重量％純粋である。単一エナンチオマーが構造によって命名または描写されるとき、その描写または命名されたエナンチオマーは、少なくとも６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％、９９重量％、または９９．９重量％光学的に純粋である。重量での光学純度パーセントは、エナンチオマーの重量とその光学異性体の重量との合計に対するエナンチオマーの重量の比である。エナンチオマーは、当業者に既知の方法によって、例えば、例えば結晶化によって分離することができるジアステレオ異性体の塩の形成によって；例えば結晶化、超臨界流体もしくは液体クロマトグラフィーによって分離することができるジアステレオ異性体誘導体もしくは複合体の形成によって；１つのエナンチオマーとエナンチオマー特異的試薬との選択的反応、例えば酵素的エステル化；または、キラル環境、例えばキラル担体上、例えば、結合したキラル配位子を有するシリカ上で、もしくはキラル溶媒の存在下での超臨界流体もしくは液体クロマトグラフィーによって分割することができる。特定のエナンチオマーはまた、光学活性試薬、基質、触媒、もしくは溶媒を使用する不斉合成によって、または不斉変換によって一方のエナンチオマーを他方に変換することによって合成することができる。
【００２３】
特に明記されない限り、開示の化合物が、立体化学を示さずに構造によって命名または描写され、化合物が、少なくとも１つのキラル中心、または少なくとも１つの幾何異性体、またはそれらの両方を有するとき、その名称または構造は、対応する光学異性体または幾何異性体を含まない化合物の１つのエナンチオマーまたは幾何異性体、化合物のラセミ体混合物、およびその対応する光学異性体または幾何異性体と比較して１つのエナンチオマーまたは幾何異性体が豊富な混合物を包含する。
【００２４】
特に明記されない限り、開示の化合物の立体化学中心の一部のみが構造によって描写または命名されるとき、命名または描写された立体配置は、残りの立体配置と比較して、例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または９９．９％のモル過剰で豊富である。例えば、部分構造：
【化３】
2021522166.tif 000005
は、キラル炭素を中心とする立体配置が、Ｒとして立体化学的に豊富（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または９９．９％のモル過剰）であること、およびシクロヘキシルを中心とする幾何形状が、シスもしくはトランス、またはそれらの混合物であり得ることを意味する。
【００２５】
ある特定の場合では、開示の化合物は、立体化学を示さずに構造によって描写されるが、立体化学的に豊富であると識別される（例えば、幾何異性体が不可能な場合の、「単一エナンチオマー、単一幾何異性体」、または「単一エナンチオマー」）。例えば、特に明記されない限り、
【化４】
2021522166.tif 000006
は、キラルジオキソラニル炭素を中心とする立体配置が、Ｒとして立体化学的に豊富（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または９９．９％のモル過剰）であるか、またはＳとして立体化学的に豊富（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または９９．９％のモル過剰）であり、シクロヘキシル環を中心とする幾何的立体配置が、シスとして豊富（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または９９．９％のモル過剰）であるか、またはトランスとして豊富（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または９９．９％のモル過剰）であることを意味する。
【００２６】
本明細書で使用される「患者」という用語は、哺乳動物など、およびヒトなどの動物を意味する。「対象」および「患者」という用語は、互換的に使用され得る。
【００２７】
「薬学的に許容される担体」という用語は、担体ともに配合される化合物の薬理学的活性を破壊しない非毒性担体、アジュバント、またはビヒクルを指す。本明細書に記載の組成物で使用され得る薬学的に許容される担体、アジュバント、またはビヒクルとしては、限定されないが、イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸などの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、硫酸プロタミンなどの塩または電解質、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、およびウール脂肪が挙げられる。
【００２８】
「治療」、「治療する」、および「治療すること」という用語は、本明細書に記載されるように、疾患もしくは障害、またはそれらの１つ以上の症状の進行を逆転、緩和、または阻害することを指す。症状が回復した後、例えば再発を遅らせるために治療を続けてもよい。
【００２９】
疾患、障害、および状態は、本明細書では互換的に使用される。
【００３０】
「有効量」または「治療的有効量」という用語は、対象の生物学的または医学的応答を誘導するであろう本明細書に記載の化合物の量、例えば、０．０１〜１００ｍｇ／体重ｋｇ／日の投与量を指す。「対象」および「患者」という用語は、互換的に使用され得、治療を必要とする哺乳動物、例えば、コンパニオンアニマル（例えば、イヌ、ネコなど）、家畜（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギなど）、および実験動物（例えば、ラット、マウス、モルモットなど）を意味する。典型的には、対象は、治療を必要とするヒトである。
【００３１】
「阻害する」、「阻害」、または「阻害すること」という用語は、生物学的活性またはプロセスのベースライン活性の減少を含む。
【００３２】
本明細書に記載の化合物は、薬学的に許容される塩の形態で存在し得る。医薬品で使用する場合、本明細書に記載の化合物の塩は、非毒性の「薬学的に許容される塩」を指す。薬学的に許容される塩の形態としては、薬学的に許容される酸性／陰イオン性、または塩基性／陽イオン性の塩が挙げられる。本明細書に記載の化合物の好適な薬学的に許容される酸付加塩としては、例えば、無機酸（塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸、および硫酸など）の塩、および有機酸（酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、メタンスルホン酸、およびｐ−トルエンスルホン酸など）の塩が挙げられる。
【００３３】
３．例示的な化合物の説明
第１の実施形態では、本開示は、式Ｉ：
【化５】
2021522166.tif 000007
の化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供し、式中、不定のものは、式Ｉについて上のとおりである。
【００３４】
第２の実施形態では、式Ｉの化合物の
Ｒ１は、ハロまたは−Ｓ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルであり、
Ｒ２は、ハロであり、
Ｒ３は、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルであり、
Ｒ４は、（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキルまたは（Ｃ４−Ｃ７）ヘテロシクリルであり、それらの各々は、ハロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルおよび−ＮＲａＲｂから選択された１〜２個の基で任意選択的に置換されており、
Ｒａは、水素または（Ｃ１−Ｃ４）アルキルであり、
Ｒｂは、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルまたは（Ｃ４−Ｃ７）ヘテロシクリルであり、当該ヘテロシクリルは、ハロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルで任意選択的に置換されているか、あるいは
ＲａおよびＲｂは、それらが結合している窒素原子と一緒になって、ハロおよび−ＯＲｃから選択された１〜３個の基で任意選択的に置換されている４〜７員の窒素含有ヘテロシクリルを形成し、
Ｒｃは、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、ハロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、または（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキルであり、
Ｒ５は、ハロまたは（Ｃ１−Ｃ４）アルキルである。
【００３５】
第３の実施形態では、式Ｉの化合物は、式ＩＩ：
【化６】
2021522166.tif 000008
のもの、またはその薬学的に許容される塩であり、式中、残りの不定のものは、式Ｉまたは第２の実施形態について上記したとおりである。
【００３６】
第４の実施形態では、式Ｉまたは式ＩＩの化合物のＲ１は、クロロであり、残りの不定のものは、式Ｉまたは第２の実施形態について上記したとおりである。
【００３７】
第５の実施形態では、式Ｉまたは式ＩＩの化合物のＲ１は、−ＳＣＨ３であり、残りの不定のものは、式Ｉまたは第２の実施形態について上記したとおりである。
【００３８】
第６の実施形態では、式Ｉまたは式ＩＩの化合物のＲ４は、シクロヘキシルまたはピペリジニルであり、これらの各々は、ハロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルおよび−ＮＲａＲｂから選択された１〜２個の基で任意選択的に置換されており、残りの不定のものは、式Ｉ、または第２、第４、もしくは第５の実施形態について上記したとおりである。
【００３９】
第７の実施形態では、式Ｉまたは式ＩＩの化合物は、式ＩＩＩ：
【化７】
2021522166.tif 000009
のもの、またはその薬学的に許容される塩であり、式中、Ｒ６は、ハロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルであり、残りの不定のものは、式Ｉ、または第２、第４、もしくは第５の実施形態について上記したとおりである。
【００４０】
第８の実施形態では、式Ｉ、式ＩＩ、または式ＩＩＩの化合物は、式ＩＶ：
【化８】
2021522166.tif 000010
のもの、またはその薬学的に許容される塩であり、式中、残りの不定のものは、式Ｉ、または第２、第４、第５、もしくは第７の実施形態について上記したとおりである。
【００４１】
第９の実施形態では、式Ｉまたは式ＩＩの化合物は、式Ｖ：
【化９】
2021522166.tif 000011
のもの、またはその薬学的に許容される塩であり、式中、残りの不定のものは、式Ｉ、または第２、第４、もしくは第５の実施形態について上記したとおりである。
【００４２】
第１０の実施形態では、式Ｉ、式ＩＩ、または式Ｖの化合物は、式ＶＩもしくはＶＩＩ：
【化１０】
2021522166.tif 000012
のもの、
またはその薬学的に許容される塩であり、式中、残りの不定のものおよび特色は、式Ｉ、または第２、第４、もしくは第５の実施形態について上記したとおりである。
【００４３】
第１１の実施形態では、式Ｉ、式ＩＩ、式Ｖ、式ＶＩ、および式ＶＩＩの化合物のＲｂは、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルまたはオキサタニル（ｏｘａｔａｎｙｌ）であり、当該オキセタニルは、ハロ（Ｃ１−Ｃ４）で任意選択的に置換されているか、またはＲａおよびＲｂは、それらが結合している窒素原子と一緒になって、ハロもしくは−ＯＲｃで任意選択的に置換されているアゼチジニルを形成し、残りの不定のものおよび特色は、式Ｉ、または第２、第４、もしくは第５の実施形態について上記したとおりである。
【００４４】
第１２の実施形態では、式Ｉ、式ＩＩ、式Ｖ、式ＶＩ、および式ＶＩＩの化合物のＲａは、水素またはメチルであり、Ｒｂは、メチルまたはオキサタニルであり、当該オキセタニルが、−ＣＨ２Ｆまたは−ＣＦ３で任意選択的に置換されており、残りの不定のものおよび特色は、式Ｉ、または第２、第４、第５、もしくは第１１の実施形態について上記したとおりである。
【００４５】
第１３の実施形態では、式Ｉ、式ＩＩ、式Ｖ、式ＶＩ、および式ＶＩＩの化合物のＲａおよびＲｂは、それらが結合している窒素原子と一緒になって、１〜２個のフルオロまたは−ＯＲｃで任意選択的に置換されているアゼチジニルを形成し、Ｒｃは、−ＣＨ３、−ＣＨＦ２、またはシクロプロピルであり、残りの不定のものおよび特色は、式Ｉ、または第２、第４、第５、もしくは第１１の実施形態について上記したとおりである。
【００４６】
第１４の実施形態では、１，３−ジオキソラニル、ならびに式Ｉ、ＩＩ、Ｖ、ＶＩ、およびＶＩＩのうちのいずれか１つのＮＲａＲｂ基の立体配置は、シクロヘキシルを中心にトランス配向しており、残りの特色は、式Ｉ、または第２、第４、第５、第６、第１１、第１２、もしくは第１３の実施形態について上記したとおりである。あるいは、１，３−ジオキソラニル、ならびに式Ｉ、ＩＩ、Ｖ、ＶＩ、およびＶＩＩのＮＲａＲｂ基の立体配置は、シクロヘキシルを中心にシス配向しており、残りの特色は、式Ｉ、または第２、第４、第５、第６、第１１、第１２、もしくは第１３の実施形態について上記したとおりである。
【００４７】
第１５の実施形態では、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、およびＶＩＩのうちのいずれか１つの１，３−ジオキソラニルのキラル中心の立体化学的配置はＲであり、残りの特色は、式Ｉ、または第２、第４、第５、第６、第１１、第１２、第１３、もしくは第１４の実施形態について上記したとおりである。あるいは、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、およびＶＩＩのうちのいずれか１つの１，３−ジオキソラニルのキラル中心の立体化学的配置はＳであり、残りの特色は、式Ｉ、または第２、第４、第５、第６、第１１、第１２、第１３、もしくは第１４の実施形態について上記したとおりである。
【００４８】
化合物の特定の例は、例示のセクションに提供されており、本明細書の第１４の実施形態の一部として挙げられる。これらの化合物の中性形態と同様に、薬学的に許容される塩も挙げられる。一態様では、本開示は、本明細書に記載の任意の化合物のラセミ形態を含む。
【００４９】
４．用途、配合、および投与
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の化合物またはその薬学的に許容される誘導体、および薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。提供される組成物中の化合物の量は、生物学的試料または患者の、ヒストンメチル修飾酵素またはその変異体を測定可能に調節するのに有効であるような量である。
【００５０】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、そのような組成物を必要とする患者に投与するために配合される。本明細書に記載の組成物は、経口的に、非経口的に、吸入スプレーにより、局所的に、直腸的に、経鼻的に、口腔的に、経膣的に、またはインプラントリザーバを介して投与することができる。本明細書で使用される「非経口」という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、くも膜下腔内、肝内、病巣内、および頭蓋内注射または注入技術を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、経口、腹腔内、または静脈内に投与される。本明細書に記載の組成物の無菌の注射可能な形態は、水性または油性の懸濁液であり得る。これらの懸濁液は、好適な分散剤または湿潤剤、および懸濁剤を使用して、当技術分野で既知の技術に従って配合され得る。
【００５１】
いくつかの実施形態では、組成物は、経口投与される。
【００５２】
任意の特定の患者用の特定の投与量および治療計画は、用いられる特定の化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食事、投与時間、排泄速度、薬物の組み合わせ、ならびに治療する医師の判断および治療される特定の疾患の重症度を含む、多様な要因に依存するであろう。組成物中の本明細書に記載の化合物の量は、組成物中の特定の化合物にも依存するであろう。
【００５３】
本明細書に記載の化合物および組成物は一般に、エピジェネティック制御に関与する１つ以上の酵素、具体的にはＥＺＨ１およびＥＺＨ２、さらにより具体的にはＥＺＨ２およびその変異形態の活性の調節に有用である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物は、ＥＺＨ２の活性を下方制御または抑制する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物は、ＥＺＨ２活性のアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物は、ＥＺＨ１の活性を下方制御または抑制する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物は、ＥＺＨ１活性のアンタゴニストである。
【００５４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物および組成物は、ＥＺＨ１もしくはＥＺＨ２の過剰発現、および／またはＥＺＨ２基質活性を変化させる変異形態などのＥＺＨ２の変異形態の発現に関連する疾患および／または障害の治療に有用である。ＥＺＨ２の欠失、ミスセンス、およびフレームシフト変異の研究は、ＥＺＨ２が骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）および骨髄性悪性腫瘍などの血液障害の腫瘍抑制因子として機能することを示唆している（Ｅｒｎｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２０１０  Ａｕｇ；４２（８）：７２２−６、Ｎｉｋｏｌｏｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２０１０Ａｕｇ；４２（８）：６６５−７）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物および組成物は、Ｙ６４１Ｎ、Ｙ６４１Ｃ、Ｙ６４１Ｆ、Ｙ６４１Ｈ、Ｙ６４１Ｓ、Ａ６７７Ｇ、またはＡ６８７変異を有するＥＺＨ２の存在に関連する疾患および／または障害の治療に有用である。この実施形態の特定の態様では、ＥＺＨ２は、Ｙ６４１Ｎ変異を有する。
【００５５】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくはその組成物を投与するステップを含む、ＥＺＨ１もしくはＥＺＨ２の過剰発現、および／またはＥＺＨ２の変異形態の発現に関連する疾患および／または障害を患う対象を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、上の方法は、対象が、ＥＺＨ２を過剰発現しているか、またはＥＺＨ２の変異形態を発現しているかどうかを決定する予備ステップを追加的に含む。
【００５６】
いくつかの実施形態では、ＥＺＨ２の変異形態の存在に関連する疾患または障害は、ヒトＢ細胞リンパ腫である。いくつかの実施形態では、Ｙ６４１Ｎ  ＥＺＨ２の存在に関連する疾患および／または障害は、濾胞性リンパ腫またはびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物または組成物は、骨髄異形成症候群、白血病、貧血、および血球減少症などの血液障害の治療に有用である。Ｓｎｅｅｒｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ｐｌｕｓ  ｍｕｔａｎｔ  ＥＺＨ２  ｄｒｉｖｅ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｈｙｐｅｒｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｓｉｎｅ  ２７  ｏｎ  ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ３（Ｈ３Ｋ２７）  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａｓ，”Ｓｎｅｅｒｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２０１０  Ｄｅｃ；１０９（４８）：２０９８０−２０９８５。
【００５７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物および組成物は、細胞増殖に関連する疾患および／または障害の治療に有用である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物および組成物は、細胞周期の誤制御またはＤＮＡ修復に関連する疾患および／または障害の治療に有用である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物および組成物は、癌の治療に有用である。
【００５８】
一態様では、本明細書に記載の化合物、組成物、および方法によって治療され得る癌としては、限定されないが、心臓：肉腫（血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫）、粘液腫、横紋筋腫、線維腫、脂肪腫および奇形腫；肺：気管支癌腫（扁平上皮細胞、未分化小細胞、未分化大細胞、腺癌腫）、肺胞（細気管支）癌腫、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨性過誤腫、中皮腫；胃腸：食道（扁平上皮癌腫、腺癌腫、平滑筋肉腫、リンパ腫）、胃（癌腫、リンパ腫、平滑筋肉腫）、膵臓（管状腺癌腫、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍、ＶＩＰ産生腫瘍）、小腸（腺癌腫、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、線維腫）、大腸（腺癌腫、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫）；泌尿生殖路：腎臓（腺癌腫、ウィルムス腫瘍（腎芽腫）、リンパ腫、白血病）、膀胱および尿道（扁平上皮癌腫、移行上皮癌腫、腺癌腫）、前立腺（腺癌腫、肉腫）、精巣（精上皮腫、奇形腫、胚性癌腫、奇形癌腫、絨毛癌腫、肉腫、間質細胞癌腫、線維腫、線維腺腫、腺腫様腫瘍、脂肪腫）；肝臓：肝癌（肝細胞癌腫）、胆管癌腫、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫；骨：骨原性肉腫（骨肉腫）、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網細胞肉腫）、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫瘍脊索腫、骨軟骨膜軟骨腫（ｏｓｔｅｏｃｈｒｏｎｆｒｏｍａ）（骨軟骨性外骨症）、軟骨腫、軟骨芽腫、軟骨粘液線維腫、類骨骨腫および巨細胞腫瘍；神経系：頭蓋骨（骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎）、髄膜（髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫）、脳（星細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、上衣腫、胚腫（松果体腫）、多形性膠芽腫、乏突起神経膠腫、神経鞘腫、網膜芽腫、先天性腫瘍）、脊髄神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫）；婦人科：子宮（子宮内膜癌腫）、子宮頸部（子宮頸癌腫、腫瘍前の子宮頸部異形成）、卵巣（卵巣癌腫（漿液性嚢胞腺癌腫、粘液性嚢胞腺癌腫、明細胞癌腫、未分類の癌腫）、顆粒膜卵胞膜細胞腫瘍、Ｓｅｒｔｏｌｉ−Ｌｅｙｄｉｇ細胞腫瘍、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫）、外陰部（扁平上皮癌腫、上皮内癌腫、腺癌腫、線維肉腫、黒色腫）、膣（明細胞癌腫、扁平上皮癌腫、ブドウ房状肉腫（胚性横紋筋肉腫）、卵管（癌腫）；血液性：血液（骨髄性白血病（急性および慢性）、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（悪性リンパ腫）；皮膚：悪性黒色腫、基底細胞癌腫、扁平上皮癌腫、カポジ肉腫、ほくろ異形成母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、ケロイド、乾癬、ならびに副腎：神経芽腫が挙げられる。
【００５９】
一態様では、本明細書に記載の化合物、組成物、および方法によって治療される癌は、副腎癌、腺房細胞癌腫、聴神経腫、端黒子型黒色腫、先端汗腺腫、急性好酸球性白血病、急性赤血球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性巨核球性白血病、急性単球性白血病、急性前骨髄球性白血病、腺癌腫、腺様嚢胞癌腫、腺腫、腺様歯原性腫瘍、腺扁平上皮癌腫、脂肪組織新生物、副腎皮質癌腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、アグレッシブＮＫ細胞白血病、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、胞巣型横紋筋肉腫、胞巣状軟部肉腫、エナメル上皮線維腫、未分化大細胞リンパ腫、未分化甲状腺癌、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、血管筋脂肪腫、血管肉腫、星細胞腫、非定型奇形ラブドイド腫瘍、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、基底細胞癌腫、胆道癌、膀胱癌、芽腫、骨癌、ブレンナー腫瘍、褐色腫瘍、バーキットリンパ腫、乳癌、脳癌、癌腫、上皮内癌腫、癌肉腫、軟骨腫瘍、セメント腫、骨髄性肉腫、軟骨腫、脊索腫、絨毛癌腫、脈絡叢乳頭腫、腎臓の淡明細胞肉腫、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、子宮頸癌、結腸直腸癌、デゴス病、線維形成性小円形細胞腫瘍、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、胚芽異形成性神経上皮腫瘍、未分化胚細胞腫、胚性癌腫、内分泌腺新生物、内胚葉性洞腫瘍、消化器系関連Ｔ細胞リンパ腫、食道癌、胎児内胎児、線維腫、線維肉腫、濾胞性リンパ腫、濾胞性甲状腺癌、神経節神経腫、胃腸癌、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛癌腫、巨細胞線維芽腫、骨の巨細胞腫瘍、グリア系腫瘍、多形性膠芽腫、神経膠腫、大脳神経膠腫症、グルカゴノーマ、性腺芽腫、顆粒膜細胞腫瘍、半陰陽性卵巣腫瘍、胆嚢癌、胃癌、有毛細胞白血病、血管芽腫、頭頸部癌、血管周皮腫、悪性血液疾患、肝芽腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、侵襲性小葉癌腫、腸癌、腎臓癌、喉頭癌、悪性黒子、致死正中線癌腫、白血病、ライディッヒ細胞腫瘍、脂肪肉腫、肺癌、リンパ管腫、リンパ管肉腫、リンパ上皮腫、リンパ腫、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、肝臓癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、ＭＡＬＴリンパ腫、悪性線維性組織球腫、悪性末梢神経鞘腫瘍、悪性トリトン腫瘍、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、マスト細胞白血病、縦隔胚細胞腫瘍、乳房の髄様癌腫、甲状腺髄様癌、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、メルケル細胞癌、中皮腫、転移性尿路上皮癌腫、混合ミュラー管腫瘍、粘液性腫瘍、多発性骨髄腫、筋組織新生物、菌状息肉腫、粘液型脂肪肉腫、粘液腫、粘液肉腫、鼻咽頭癌腫、神経鞘腫、神経芽腫、神経線維腫、神経腫、結節型黒色腫、眼癌、乏突起星細胞腫、乏突起膠腫、オンコサイトーマ、視神経鞘髄膜腫、視神経腫瘍、口腔癌、骨肉腫、卵巣癌、パンコースト腫瘍、甲状腺乳頭癌、傍神経節腫、松果体芽腫、松果体細胞腫、下垂細胞腫、下垂体腺腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫、多胚腫、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、原発性腹膜癌、前立腺癌、膵臓癌、咽頭癌、腹膜偽粘液腫、腎細胞癌腫、腎髄質癌腫、網膜芽腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、リヒター形質転換、直腸癌、肉腫、Ｓｃｈｗａｎｎｏｍａｔｏｓｉｓ、精上皮腫、セルトリ細胞腫瘍、性索性腺間質腫瘍、印環細胞癌腫、皮膚癌、青色小細胞腫瘍（ｓｍａｌｌ  ｂｌｕｅ  ｒｏｕｎｄ  ｃｅｌｌ  ｔｕｍｏｒｓ）、小細胞癌腫、軟組織肉腫、ソマトスタチノーマ、煤煙性いぼ、脊髄腫瘍、脾辺縁帯リンパ腫、扁平上皮癌腫、滑膜肉腫、セザリー病、小腸癌、扁平上皮癌腫、胃癌、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、莢膜細胞腫、甲状腺癌、移行細胞癌腫、喉癌、尿膜管癌、泌尿生殖器癌、尿路上皮癌腫、ブドウ膜黒色腫、子宮癌、疣贅性癌腫、視神経膠腫、外陰癌、膣癌、原発性マクログロブリン血症、ワルチン腫瘍、ウィルムス腫瘍から選択される。
【００６０】
一態様では、本明細書に記載の化合物、組成物、および方法によって治療される癌は、腺癌腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、膀胱癌、芽腫、骨癌、乳癌、脳癌、癌腫、骨髄肉腫、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃腸癌、多形性膠芽腫、神経膠腫、胆嚢癌、胃癌、頭頸部癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、腸癌、腎臓癌、喉頭癌、白血病、肺癌、リンパ腫、肝臓癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、中皮腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、眼癌、視神経腫瘍、口腔癌、卵巣癌、下垂体腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、膵臓癌、咽頭癌、腎細胞癌腫、直腸癌、肉腫、皮膚癌、脊髄腫瘍、小腸癌、胃癌、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、甲状腺癌、喉癌、泌尿生殖器癌、尿路上皮癌腫、子宮癌、膣癌、およびウィルムス腫瘍から選択される。
【００６１】
一態様では、本明細書に記載の化合物、組成物、および方法によって治療される癌は、乳癌、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌腫、多形性膠芽腫癌、膀胱癌、黒色腫、気管支癌、リンパ腫、および肝臓癌から選択される。
【００６２】
本明細書に記載の状態を治療するための医薬の製造のための、本明細書に記載の化合物もしくはその薬学的に許容される塩、または開示の化合物もしくはその薬学的に許容される塩を含む組成物の使用も提供される。本明細書に記載の状態の治療に使用するための、本明細書に記載の化合物もしくはその薬学的に許容される塩、または開示の化合物もしくはその薬学的に許容される塩を含む組成物も提供される。
【００６３】
例示
以下の代表的な例は、本発明を説明するのを助けることを意図しており、本発明の範囲を限定することを意図しておらず、限定すると解釈するべきではない。
【００６４】
中間体の調製
中間体１：３−（アミノメチル）−６−メチル−４−（メチルチオ）ピリジン−２（１Ｈ）−オン（塩酸塩）
【化１１】
2021522166.tif 000013
ステップ１：ナトリウム３−オキソブト−１−エン−１，１−ビス（チオラート）の合成
トルエン（３０ｍＬ）中のナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（１６．６ｇ、１７２ｍｍｏｌ）の混合物を真空下で脱気し、窒素でパージした（３サイクル）。次いで、アセトン（５．０ｇ、６．４ｍＬ、８６ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、続いて二硫化炭素（６．６ｇ、５．２４ｍＬ、８６ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。得られた混合物を０℃で４時間撹拌し、次いで濾過した。フィルターケーキを真空下で乾燥させて、表題化合物（１５．４ｇ、粗製）を黄色の固体として得、これをさらに精製することなく次のステップで使用した。
【００６５】
ステップ２：４，４−ビス（メチルチオ）ブタ−３−エン−２−オンの合成
メタノール（９０ｍＬ）中の３−オキソブト−１−エン−１，１−ビス（チオラート）ナトリウム（１５．４ｇ、８６．４ｍｍｏｌ）の溶液に、ヨードメタン（２４．５ｇ、１０．７ｍＬ、１７３ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。混合物を７０℃で１時間撹拌し、次いで濃縮乾固させた。水（３０ｍＬ）を添加し、所望の生成物を酢酸エチル（６０ｍＬ×３ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮して、表題化合物（６．８ｇ、収率４２％）を褐色の油として得、これをさらに精製することなく次のステップで使用した。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：計算値１６３．０、実測値１６３．０。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、クロロホルム−ｄ）  δ  ６．０２（ｓ、１Ｈ）、２．４５（ｓ、３Ｈ）、２．４３（ｓ、３Ｈ）、２．１５（ｓ、３Ｈ）。
【００６６】
ステップ３：６−メチル−４−（メチルチオ）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボニトリルの合成
ｔｅｒｔ−ブタノール（５０ｍＬ）中の４，４−ビス（メチルチオ）ブト−３−エン−２−オン（２．９ｇ、１８ｍｍｏｌ）および２−シアノアセトアミド（１．５ｇ、１８ｍｍｏｌ）の溶液に、ｔｅｒｔ−ブトキシドナトリウム（１．９ｇ、２０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を８０℃で１２時間撹拌した（２つのバッチの反応を実施し、この段階で組み合わせた）。水（２０ｍＬ）を添加し、１０％の塩酸でｐＨを５〜６に調整した。得られた混合物を濾過し、フィルターケーキを石油エーテル（２０ｍＬ×２）で洗浄し、次いでケーキを真空下で乾燥させて、表題化合物（４．８ｇ、収率７４％）をオフホワイトの固体として得、これをさらに精製することなく次のステップで使用した。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：計算値１８１．０、実測値１８１．０。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ジメチルスルホキシド−ｄ６）  δ  ６．２７（ｓ、１Ｈ）、２．５６（ｓ、３Ｈ）、２．２５（ｓ、３Ｈ）。
【００６７】
ステップ４：３−（アミノメチル）−６−メチル−４−（メチルチオ）ピリジン−２（１Ｈ）−オンの合成
テトラヒドロフラン（５０ｍＬ）中の６−メチル−４−（メチルチオ）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボニトリル（３．６ｇ、２０ｍｍｏｌ）の混合物を真空下で脱気し、窒素でパージした（３サイクル）。次いで、０℃のボランジメチルスルフィド錯体（１０Ｍ、８．０ｍＬ、８０ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した後、反応混合物を７０℃に温め、２時間撹拌した。０℃のメタノール（１５ｍＬ）をゆっくりと添加して反応物をクエンチした後、混合物を減圧下で濃縮して、表題化合物（３．８ｇ、粗製）を淡黄色の固体として得、これをさらに精製することなく次のステップで使用した。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：計算値１８５．１、実測値１８５．０。
【００６８】
ステップ５：ｔｅｒｔ−ブチル（（６−メチル−４−（メチルチオ）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）カルバメートの合成
テトラヒドロフラン（８０ｍＬ）中の３−（アミノメチル）−６−メチル−４−（メチルチオ）ピリジン−２（１Ｈ）−オン（３．６ｇ、２０ｍｍｏｌ）の溶液にトリエチルアミン（５．９ｇ、８．１ｍＬ、５９ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を３０分間撹拌した後、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（６．４ｇ、２９ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を２５℃で１２時間撹拌した。次いで反応混合物を減圧下で濃縮乾固させた後、水（３５ｍＬ）を添加し、所望の生成物を石油エーテル／酢酸エチルの５：１混合物（３０ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮して、表題化合物（５．８ｇ、粗製）を白色の固体として得、これをさらに精製することなく次のステップで使用した。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：計算値２８５．１２、実測値２８４．９。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ジメチルスルホキシド−ｄ６）  δ  ６．０５（ｓ、１Ｈ）、４．０３−４．００（ｍ、２Ｈ）、２．４２（ｓ、３Ｈ）、２．１５（ｓ、３Ｈ）、１．３９（ｓ、９Ｈ）。
【００６９】
ステップ６：３−（アミノメチル）−６−メチル−４−（メチルチオ）ピリジン−２（１Ｈ）−オン（塩酸塩）の合成
２５℃の１，４−ジオキサン中の塩化水素の溶液（４Ｍ、１００ｍＬ、４００ｍｍｏｌ）に、ｔｅｒｔ−ブチル（（６−メチル−４−（メチルチオ）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）カルバメート（５．０ｇ、１７．６ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２５℃で２時間撹拌し、次いで減圧下で濃縮乾固させた。残留物をジクロロメタン（３０ｍＬ×２）および酢酸エチル（３０ｍＬ）で洗浄して、表題化合物（４．５ｇ、粗製、ＨＣｌ塩）を黄色の固体として得、これをさらに精製することなく次のステップで使用した。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：計算値１８５．１、実測値１８５．０。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）  δ  ６．３１（ｓ、１Ｈ）、４．０３（ｓ、２Ｈ）、２．４１（ｓ、３Ｈ）、２．１８（ｓ、３Ｈ）。
【００７０】
中間体２：５−（アミノメチル）−２−メチル−６−（メチルチオ）ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（塩酸塩）
【化１２】
2021522166.tif 000014
ステップ１：メチル２−シアノ−３，３−ビス（メチルチオ）アクリレートの合成
テトラヒドロフラン（４００ｍＬ）中の水素化ナトリウム（鉱油中６０％分散）（４．２３ｇ、１０６ｍｍｏｌ）の懸濁液を０℃に冷却した後、シアノ酢酸メチル（８．９０ｍＬ、１０１ｍｍｏｌ）を滴加した。反応混合物を１５分間激しく撹拌した後、反応温度を２０℃未満に保ちながら二硫化炭素（６．１ｍＬ、１０１ｍｍｏｌ）を滴加した（白い半固体が黄色に変わった）。次にヨードメタン（１５．７ｍＬ、２５２ｍｍｏｌ）を滴加し、反応混合物を室温で１５分間撹拌した。次いで反応物を減圧下で濃縮し、残留物を氷水に注いだ。得られた沈殿物を濾過し、真空下で乾燥させて、表題化合物（１１．９ｇ、収率５８％）を黄色／褐色の固体として得、これをさらに精製することなく次のステップで使用した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、クロロホルム−ｄ）  δ  ３．８３（ｓ、３Ｈ）、２．７６（ｓ、３Ｈ）、２．６１（ｓ、３Ｈ）。
【００７１】
ステップ２：２−メチル−４−（メチルチオ）−６−オキソ−１，６−ジヒドロピリミジン−５−カルボニトリルの合成
２−シアノ−３，３−ビス（メチルチオ）アクリル酸メチル（１１．９ｇ、５８．５ｍｍｏｌ）をエタノール（１０００ｍＬ）中に溶解させた。アセトアミジン塩酸塩（５．５３ｇ、５８．５ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（３６．７ｍＬ、２６３ｍｍｏｌ）を混合物に添加し、一晩還流撹拌した。次いで、反応物を減圧下で濃縮し、残留物を１０％の塩酸で洗浄した。沈殿物を濾過し、フィルターケーキを水およびジエチルエーテルで洗浄した後、真空下で乾燥させて、表題化合物（５ｇ、収率４７％）を固体として得、これをさらに精製することなく次のステップで使用した。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：計算値１８２．０３、実測値１８２．１０。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ジメチルスルホキシド−ｄ６）  δ  ２．５７（ｓ、３Ｈ）、２．３７（ｓ、３Ｈ）。
【００７２】
ステップ３：ｔｅｒｔ−ブチル（（２−メチル−４−（メチルチオ）−６−オキソ−１，６−ジヒドロピリミジン−５−イル）メチル）カルバメートの合成
０℃のテトラヒドロフラン（５０ｍＬ）中の２−メチル−４−（メチルチオ）−６−オキソ−１，６−ジヒドロピリミジン−５−カルボニトリル（１．５ｇ、８．２７ｍｍｏｌ）の懸濁液に、テトラヒドロフラン中の水素化アルミニウムリチウムの溶液（２Ｍ、６．２ｍＬ、１２．４ｍｍｏｌ）を添加した。反応物をゆっくりと室温に温め、完了したら、水酸化ナトリウムの水溶液（１Ｍ、３３ｍＬ、３３．１ｍｍｏｌ）でクエンチした。この混合物に、１，４−ジオキサン（５０ｍＬ）およびジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（３．６１ｇ、１６．６ｍｍｏｌ）を順次添加した。アミンが完全に保護されるまで、二相混合物を激しく撹拌した。二相混合物を酢酸で中性ｐＨに酸性化し、分離し、水層をジクロロメタンで抽出した。合わせた有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮乾固させた。残留物をジクロロメタンとともに粉砕し、濾液（所望の生成物を含有する）を減圧下で濃縮乾固させた。得られた固体を、逆相フラッシュクロマトグラフィー（Ｃ１８カラム、０．１％のトリフルオロ酢酸で緩衝した水中に５％〜９５％の勾配のアセトニトリル）によって、次いで順相フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ジクロロメタン中に３０％〜９０％の勾配の酢酸エチル）によって精製して、表題化合物（２．５７ｇ、２６％収率、＞９９％純度）を白色の固体として得た。ＬＣＭＳ［Ｍ−（Ｃ４Ｈ８）＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：計算値２３０．１、実測値２３０．０。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、クロロホルム−ｄ）  δ  １３．２０（ｓ、１Ｈ）、５．３７（ｔ、Ｊ＝５．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．２６（ｄ、Ｊ＝５．６Ｈｚ、２Ｈ）、２．５１（ｓ、３Ｈ）、２．４４（ｓ、３Ｈ）、１．４４（ｓ、９Ｈ）。
【００７３】
ステップ４．５−（アミノメチル）−２−メチル−６−（メチルチオ）ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（塩酸塩）の合成
２３℃の１，４−ジオキサン（７．２ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル（（２−メチル−４−（メチルチオ）−６−オキソ−１，６−ジヒドロピリミジン−５−イル）メチル）カルバメート（３００ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ）の懸濁液に、１，４−ジオキサン中の塩化水素の溶液（４Ｍ、２．１０ｍＬ、８．４０ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を２３℃で３時間撹拌し、次いで１，４−ジオキサン中の塩化水素の溶液（４Ｍ、２．１０ｍＬ、８．４０ｍｍｏｌ）をさらに添加した。１４時間後、次いで反応物を減圧下で濃縮乾固させて、表題化合物（２５４ｍｇ、収率９４％）を白色の固体として得、これをさらに精製することなく次のステップで使用した。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｎａ］＋（遊離塩基）ｍ／ｚ：計算値２０８．１、実測値２０８．１。
【００７４】
中間体３：３−（アミノメチル）−６−クロロ−４−（メチルチオ）ピリジン−２（１Ｈ）−オン（塩酸塩）
【化１３】
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ステップ１：２−（ベンジルオキシ）−６−クロロニコチン酸の合成
テトラヒドロフラン（５００ｍＬ）中の水素化ナトリウム（鉱油中６０％分散）（１１．５ｇ、２８６ｍｍｏｌ）の懸濁液に、０℃のベンジルアルコール（１４ｍＬ、１４３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２０分間撹拌し、次いでテトラヒドロフラン（５００ｍＬ）中の２，６−ジクロロピリジン−３−カルボン酸（２５ｇ、１３０ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、反応混合物を２３℃で４時間撹拌した。次いで反応物を１０％の塩酸（３００ｍＬ）でクエンチし、ｐＨ〜８まで固体のＮａＨＣＯ３で処理し、酢酸（水中５０％）で酸性化し、最後に酢酸エチル（２００ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層をブライン（２００ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮乾固させた。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ジクロロメタン中５％〜５０％の勾配の酢酸エチル）によって精製して、標題化合物（３３．６８ｇ、収率９８％）を得た。
【００７５】
ステップ２：２−（ベンジルオキシ）−６−クロロニコチンアミドの合成
０℃のジクロロメタン（５００ｍＬ）中の２−（ベンジルオキシ）−６−クロロニコチン酸（３３．６８ｇ、１２８．２ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）、続いて塩化オキサリル（１１．９ｍＬ、１４１ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を２３℃で２時間撹拌し、次いで濃縮乾固させた。残留物をジクロロメタン（２００ｍＬ）中に溶解させ、０℃の水酸化アンモニウムの濃縮溶液（５０ｍＬ）にゆっくりと添加した。１時間後、有機層を収集し、水相をジクロロメタン（５０ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮乾固させた。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ジクロロメタン中０％〜５０％の勾配の酢酸エチル）によって精製して、標題化合物（定量収率）を固体として得た。
【００７６】
ステップ３：２−（ベンジルオキシ）−６−クロロ−４−（メチルチオ）ニコチンアミドの合成
−７８℃のテトラヒドロフラン（３００ｍＬ）中の２，２，６，６−テトラメチルピペリジン（２９．４５ｍＬ、１７５．１ｍｍｏｌ）の溶液に、ヘキサン中のｎ−ブチルリチウムの溶液（２．５Ｍ、７０ｍＬ、１７５．１ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を０℃に３０分間温め、次いで−７８℃に冷却して戻した。次いで内部温度を−６０℃未満に保ちながら、テトラヒドロフラン（１００ｍＬ）中の２−（ベンジルオキシ）−６−クロロニコチンアミド（１１．５ｇ、４３．８ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。反応混合物を−７８℃で１時間撹拌し、次いでジメチルジスルフィド（１５．７７ｍＬ、１７５．１ｍｍｏｌ）を添加した。反応を−７８℃でさらに２時間撹拌し、次いで−７８℃の酢酸水溶液（５０％ｖ／ｖ）でクエンチした。所望の生成物を酢酸エチル（１００ｍＬ×３）で抽出し、合わせた有機層を水（２０ｍＬ）、炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液（２０ｍＬ）、ブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮乾固させた。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ジクロロメタン中０％〜２０％の勾配の酢酸エチル）によって精製して、標題化合物（４．８６ｇ、収率３６％）を得た。
【００７７】
ステップ４：（２−（ベンジルオキシ）−６−クロロ−４−（メチルチオ）ピリジン−３−イル）メタンアミンの合成
２３℃のテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）中の２−（ベンジルオキシ）−６−クロロ−４−（メチルチオ）ニコチンアミド（４．８６ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）の溶液に、テトラヒドロフラン中のボランの溶液（１Ｍ、６３ｍＬ、６３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を還流で１５時間撹拌し、次いで室温のメタノールをゆっくりと添加することによってクエンチした。反応混合物を減圧下で濃縮乾固させ、残留物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ジクロロメタン中０％〜３０％の勾配のメタノール）によって精製して、表題化合物（７１０ｍｇ、収率１５％）を白色の固体として得た。
【００７８】
ステップ５：３−（アミノメチル）−６−クロロ−４−（メチルチオ）ピリジン−２（１Ｈ）−オン（塩酸塩）の合成
（２−（ベンジルオキシ）−６−クロロ−４−（メチルチオ）ピリジン−３−イル）メタンアミン（７１０ｍｇ、２．４１ｍｍｏｌ）を収容するフラスコに、濃塩酸（１２Ｍ、５．０ｍＬ、６０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２３℃で２時間撹拌し、次いで減圧下で濃縮乾固させた。残留物をメタノールとジエチルエーテルとの混合物から再結晶させて、表題化合物（４００ｍｇ、６９％収率）を白色の固体として得た。
【００７９】
ステップ６：ｔｅｒｔ−ブチル（（６−クロロ−４−（メチルチオ）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）カルバメートの合成
ジクロロメタン（５０ｍＬ）中の３−（アミノメチル）−６−クロロ−４−（メチルチオ）ピリジン−２（１Ｈ）−オン塩酸塩（１．５７５ｇ、６．５３ｍｍｏｌ）の懸濁液に、室温のジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（２．８５ｇ、１３．１ｍｍｏｌ）、続いてＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３．４ｍＬ、１９．６ｍｍｏｌ）を添加した。（すべてが溶解するまで）反応物を室温で３時間撹拌し、次いで水でクエンチした。有機層を分離し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮乾固させた。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ジクロロメタン中０〜１０％の勾配のメタノール）によって精製して、標題化合物（１．５ｇ、収率７５％）を白色の固体として得た。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：計算値３０５．１、実測値３０５．１。
【００８０】
ステップ７：３−（アミノメチル）−６−クロロ−４−（メチルチオ）ピリジン−２（１Ｈ）−オン（塩酸塩）の合成
１，４−ジオキサン（４．９ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル（（６−クロロ−４−（メチルチオ）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）カルバメート（３００ｍｇ、９８４μｍｏｌ）の懸濁液に、室温の１，４−ジオキサン中の塩化水素の溶液（４Ｍ、１．９６ｍＬ、７．８７ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で３時間撹拌し、次いで１，４−ジオキサン中の塩化水素の溶液（４Ｍ、１．９６ｍＬ、７．８７ｍｍｏｌ）をさらに添加した。１４時間後、反応物を減圧下で濃縮乾固させて、表題化合物（２５３ｍｇ、定量収率）を白色の固体として得、これをさらに精製することなく次のステップで使用した。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｎａ］＋（遊離塩基）ｍ／ｚ：計算値２２７．０、実測値２２７．０。
【００８１】
中間体４：７−クロロ−２，４−ジメチル−２−（４−オキソシクロヘキシル）ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボン酸メチル
【化１４】
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ステップ１：５−クロロ−３，４−ジヒドロキシ−２−メチル安息香酸メチルの合成
−２０℃のテトラヒドロフラン（１９９ｍＬ）中の３，４−ジヒドロキシ−２−メチル安息香酸メチル（５．１１ｇ、２７．９ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化スルフリル（２．４５ｍＬ、３０．６ｍｍｏｌ）を滴加した。反応混合物を−２０℃で３時間撹拌し、次いで塩化アンモニウムの飽和水溶液（５０ｍＬ）でクエンチした。所望の生成物を酢酸エチル（２５ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層をブライン（２５ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮乾固させた。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中０％〜６０％の勾配の酢酸エチル）によって精製して、標題化合物（４．１１７ｇ、収率６８％）をベージュの固体として得た。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：計算値２１７．０、実測値２１７．１（Ｃｌ同位体パターン）。
【００８２】
ステップ２：７−クロロ−２，４−ジメチル−２−（４−オキソシクロヘキシル）−２Ｈ−１，３−ベンゾジオキソール−５−カルボン酸メチルの合成
５−クロロ−３，４−ジヒドロキシ−２−メチル安息香酸メチル（１．２ｇ、５．５３ｍｍｏｌ）、トリルテニウムドデカカルボニル（１７６ｍｇ、２７６μｍｏｌ）、およびトリフェニルホスフィン（１４５ｍｇ、５５３μｍｏｌ）の混合物を真空下で脱気し、窒素でパージした（３サイクル）。トルエン（８．１ｍＬ）を添加し、反応混合物を３０分間加熱還流した。次いで、トルエン（１７ｍＬ）中の４−エチニルシクロヘキサン−１−オン（１．３４ｇ、１１．０ｍｍｏｌ）の溶液を滴加し、反応物を２３時間還流で撹拌した。最後に、反応混合物を室温に冷却し、減圧下で濃縮乾固させた。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中０〜６０％の勾配の酢酸エチル）によって精製して、標題化合物（１．３２７ｇ、収率７０％）を黄色の油として得た。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｎａ］＋ｍ／ｚ：計算値３６１．１、実測値３６１．１（Ｃｌ同位体パターン）。
【００８３】
ステップ３：（Ｒ）−７−クロロ−２，４−ジメチル−２−（４−オキソシクロヘキシル）ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボン酸メチルと、（Ｓ）−７−クロロ−２，４−ジメチル−２−（４−オキソシクロヘキシル）ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボン酸メチルとの分離
メチル−７−クロロ−２，４−ジメチル−２−（４−オキソシクロヘキシル）ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボキシレート（４．４ｇ、１３ｍｍｏｌ）のラセミ混合物を、分取ＳＦＣ［カラム：Ｄａｉｃｅｌ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓからのＣｈｉｒａｌＰａｋ  ＡＹ（内径２５０ｍｍ×５０ｍｍ、１０μｍ）。移動相Ａ：ＣＯ２／移動相Ｂ：メタノール中０．１％のＮＨ４ＯＨ。無勾配（移動相Ａ８５％および移動相Ｂ１５％）。流量：８０ｍＬ／分。カラム温度：４０℃］によって分離した。中間体４（ピーク１）（不要なエナンチオマー／ジストマー）：保持時間＝６．２分。回収＝１．４ｇ、４．０５ｍｍｏｌ、収率３１％、９０％ｅｅ、純度９８％（黄色の固体）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、クロロホルム−ｄ）  δ  ７．４８（ｓ、１Ｈ）、３．７８（ｓ、３Ｈ）、２．４４−２．３６（ｍ、２Ｈ）、２．３５−２．２５（ｍ、６Ｈ）、２．１９（ｔｄｄ、Ｊ＝２．８、５．６、１３．１Ｈｚ、２Ｈ）、１．７０−１．５７（ｍ、５Ｈ）。中間体４（ピーク２）（所望のエナンチオマー／ユートマー）：保持時間＝７．０分。回収＝１．１ｇ、３．０８ｍｍｏｌ、収率２３．７５％、９９％ｅｅ、純度９５％（黄色の固体）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、クロロホルム−ｄ）  δ  ７．４９（ｓ、１Ｈ）、３．７８（ｓ、３Ｈ）、２．４４−２．３６（ｍ、２Ｈ）、２．３６−２．２５（ｍ、６Ｈ）、２．２０（ｔｄｄ、Ｊ＝２．８、５．６、１３．１Ｈｚ、２Ｈ）、１．７２−１．５９（ｍ、５Ｈ）。ＳＦＣ分析方法：［カラム：ＣｈｉｒａｌＰａｋＡＹ−３（内径１５０×４．６ｍｍ、３μｍ）。移動相Ａ：ＣＯ２／移動相Ｂ：ｉＰｒＯＨ中０．０５％のＥｔ２ＮＨ。勾配：移動相Ｂ５〜４０％（５．５分以上）。流量：２．５ｍＬ／分。カラム温度：４０℃］。中間体４（ピーク１−不要なエナンチオマー／ジストマー）：保持時間＝２．８５３分。中間体４（ピーク２−所望のエナンチオマー／ユートマー）：保持時間＝２．９７９分。
【００８４】
中間体５：７−クロロ−２，４−ジメチル−２−（トランス−４−（（３−（トリフルオロメチル）オキセタン−３−イル）アミノ）シクロヘキシル）ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボン酸メチル
【化１５】
2021522166.tif 000017
ジクロロエタン（９．５４ｍＬ）中の１−クロロ−Ｎ−［３−（トリフルオロメチル）オキセタン−３−イル］水素アミン（６７８ｍｇ、３．８２ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６９８μＬ、４．０１ｍｍｏｌ）との混合物を室温で３０分間撹拌した後、酢酸（２１８μＬ、３．８２ｍｍｏｌ）、続いてメチル−７−クロロ−２，４−ジメチル−２−（４−オキソシクロヘキシル）ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボキシレート（６５０ｍｇ、１．９１ｍｍｏｌ）をこの反応混合物に添加した。室温で５分後、混合物は透明（黄色／褐色）になり、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（４０４ｍｇ、１．９１ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で３時間撹拌し、次いで炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液（３０ｍＬ）でクエンチした。所望の生成物をジクロロメタン（３０ｍＬ×３）で抽出し、合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮乾固させた。残留物を、逆相フラッシュクロマトグラフィー（Ｃ１８カラム、０．１％のトリフルオロ酢酸とともにアセトニトリル／水１：１）によって精製して、２つの幾何異性体（シスおよびトランス）を得た。最初に溶出するピークは、幾何異性体１に対応する。
【００８５】
分析ＬＣＭＳ方法（幾何異性体用）
［カラム：Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ｃ８（内径７５×４．６ｍｍ、３．５μｍ）。移動相Ａ：アセトニトリル中０．１％のトリフルオロ酢酸／移動相Ｂ：水中のトリフルオロ酢酸。勾配：移動相Ｂの５〜１００％（３．０分以上）、続いて移動相Ｂの１００％（４．５分）。流量：１．５ｍＬ／分。カラム温度：２０℃。］幾何異性体１（所望）：保持時間＝４．０７３分（２７８ｍｇ、３１％）。幾何異性体２（不要）：保持時間＝４．２７７分（２５３ｍｇ  ２９％）。
【００８６】
幾何異性体１のエナンチオマー（ＬＣＭＳ方法に基づいて所望）を分取ＳＦＣ［カラム：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＸ−Ｈ（内径２５０×２１ｍｍ）によって分離した。移動相Ａ：ＣＯ２／移動相Ｂ：１：１のイソプロパノール／ヘキサン混合物中０．２５％のイソプロピルアミン。無勾配（移動相Ａ８５％および移動相Ｂ１５％）。流量：８０ｇ／分。カラム温度：２５℃］。中間体５（ピーク１）：保持時間＝１．８４分。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：計算値４６４．１５、実測値４６４。中間体５（ピーク２）：保持時間＝２．１分。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：計算値４６４．１５、実測値４６４．２。
【００８７】
中間体６：３−（アミノメチル）−４−クロロ−６−メチルピリジン−２（１Ｈ）−オン
【化１６】
2021522166.tif 000018
ステップ１：２，４−ジクロロ−６−メチルニコチノニトリルの合成
オキシ塩化リン（１５０ｍＬ）中の２，４−ジヒドロキシ−６−メチルニコチノニトリル（８０ｇ、５３３．３ｍｍｏｌ）の溶液を１２０℃で２時間撹拌し、次いで炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液（ｐＨ＝８まで）でクエンチした。それを水（２０００ｍＬ）と酢酸エチル（１０００ｍＬ）とに分配し、有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮乾固させて、表題化合物（８５ｇ、収率８６％）を褐色の固体として得、これをさらに精製することなく次のステップで使用した。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：計算値１８６．９８、実測値１８６．６。
【００８８】
ステップ２：２−クロロ−４−ヒドロキシ−６−メチルニコチノニトリルの合成
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５０ｍＬ）中の２，４−ジクロロ−６−メチルニコチノニトリル（１０ｇ、５３ｍｍｏｌ）の溶液に、室温の酢酸セシウム（３０．８ｇ、１６０ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を８０℃で一晩撹拌し、次いで水（８００ｍＬ）でクエンチした。所望の生成物を酢酸エチル（８００ｍＬ）で抽出し、有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮乾固させた。標題化合物（８．８ｇ、収率９８％）を褐色の固体として得、さらに精製することなく次のステップで使用した。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：計算値１６９．０１、実測値１６８．８。
【００８９】
ステップ３：４−ヒドロキシ−２−メトキシ−６−メチルニコチノニトリルの合成
メタノール（５０ｍＬ）中の２−クロロ−４−ヒドロキシ−６−メチルニコチノニトリル（８．８ｇ、５２．２ｍｍｏｌ）とナトリウムメトキシド（１４．１ｇ、２６１ｍｍｏｌ）との混合物を６０℃で一晩撹拌した。ｐＨ＝５になるまで、混合物を塩酸の１Ｍ溶液でクエンチした。それを水（５００ｍＬ）と酢酸エチル（５００ｍＬ）とに分配し、有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮して、表題化合物（８．０ｇ、収率９３％）を褐色の固体として得、これをさらに精製することなく次のステップで使用した。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：計算値１６５．１、実測値１６４．８。
【００９０】
ステップ４：４−クロロ−２−メトキシ−６−メチルニコチノニトリル
クロロホルム（１００ｍＬ）中の４−ヒドロキシ−２−メトキシ−６−メチルニコチノニトリル（８．０ｇ、４８．７ｍｍｏｌ）、五塩化リン（２０．３ｇ、９７．５ｍｍｏｌ）、オキシ塩化リン（１４．９ｇ、９．０９ｍＬ、９７．５ｍｍｏｌ）、およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）の混合物を６０℃で３０分間撹拌した。反応物を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液でクエンチした（ｐＨ＝８まで）。それを水（１０００ｍＬ）と酢酸エチル（１０００ｍＬ）とに分配し、有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮乾固させて、表題化合物（８．０ｇ、収率９０％）を褐色の固体として得、これをさらに精製することなく次のステップで直接使用した。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：計算値１８３．０、実測値１８２．８。
【００９１】
ステップ５：（４−クロロ−２−メトキシ−６−メチルピリジン−３−イル）メタンアミンの合成
テトラヒドロフラン（５０ｍＬ）中の４−クロロ−２−メトキシ−６−メチルニコチノニトリル（８．０ｇ、４３．８ｍｍｏｌ）の溶液に、ボランジメチルスルフィド錯体（１０Ｍ、５．３ｍＬ、５３ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を６０℃で２時間撹拌し、次いで０℃のメタノール（１０ｍＬ）でクエンチした。混合物を減圧下で濃縮乾固させて、表題（７．０ｇ、収率９３％）を褐色の固体として得、これをさらに精製することなく次のステップで直接使用した。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：計算値１８７．１、実測値１８７．１。
【００９２】
ステップ６：ｔｅｒｔ−ブチル（（４−クロロ−２−メトキシ−６−メチルピリジン−３−イル）メチル）カルバメート
テトラヒドロフラン（５０ｍＬ）中の（４−クロロ−２−メトキシ−６−メチルピリジン−３−イル）メタンアミン（７．０ｇ、３７．５ｍｍｏｌ）、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（１５．２ｇ、７５．０ｍｍｏｌ）、およびトリエチルアミン（１１．４ｇ、１５．７ｍＬ、１１３ｍｍｏｌ）の混合物を２０℃で１６時間撹拌し、次いで水（５００ｍＬ）でクエンチした。所望の生成物を酢酸エチル（５００ｍＬ）で抽出し、有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮乾固させた。残留物をフラッシュカラム（シリカゲルカラム、石油エーテル：酢酸エチル４０：１）によって精製して、標記化合物（３．０ｇ、２８％収率）を無色の油として得た。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：計算値２８７．１、実測値２８６．９。
【００９３】
ステップ７：３−（アミノメチル）−４−クロロ−６−メチルピリジン−２（１Ｈ）−オン
水中の塩化水素の溶液（４Ｍ、１０ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）に、室温のｔｅｒｔ−ブチル（（４−クロロ−２−メトキシ−６−メチルピリジン−３−イル）メチル）カルバメート（３．０ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を１００℃で２時間加熱し、次いで減圧下で濃縮乾固させて、表題化合物（１．７ｇ、９４％収率）を黄色の固体として得た。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：計算値１７３．０４、実測値１７３．１。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、メタノール−ｄ４）：δ  ６．３８（ｓ、１Ｈ）、４．１５（ｓ、２Ｈ）、２．３２（ｓ、３Ｈ）。
【００９４】
中間体７：７−クロロ−２−（４−（３，３−ジフルオロアゼチジン−１−イル）シクロヘキシル）−２，４−ジメチルベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボン酸メチル
【化１７】
2021522166.tif 000019
ステップ１：７−クロロ−２−（４−（３，３−ジフルオロアゼチジン−１−イル）シクロヘキシル）−２，４−ジメチルベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボン酸メチルの合成
メタノール（５ｍＬ）およびテトラヒドロフラン（５ｍＬ）中の７−クロロ−２，４−ジメチル−２−（４−オキソシクロヘキシル）ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボン酸メチル（中間体４−ラセミ混合物）５５０ｍｇ、１．６２ｍｍｏｌ）、３，３−ジフルオロアゼチジン塩酸塩（８３９ｍｇ、６．４８ｍｍｏｌ）、およびトリエチルアミン（８９５μＬ、６．６４ｍｍｏｌ）の溶液を室温で一晩撹拌した。翌日、反応物を−７８℃に冷却し、水素化ホウ素リチウムの溶液（テトラヒドロフラン中２Ｍ、１．２１ｍＬ、２．４３ｍｍｏｌ）を滴加した。濃い黄色の混合物を徐々に室温に温め、次いで０℃の炭酸ナトリウムの飽和水溶液でクエンチした。所望の生成物をジクロロメタンで抽出し（３回）、合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮乾固させた。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲルＫＰ−ＮＨカラム、ヘプタン中０〜２０％の勾配の酢酸エチル）によって２回精製して、標題化合物（３５４ｍｇ、５３％収率）を単一幾何異性体（ｃｉｓまたはトランス）のラセミ混合物として得た。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：計算値４１６．９、実測値４１６．２。
【００９５】
ステップ２：（２Ｒ）−７−クロロ−２−（４−（３，３−ジフルオロアゼチジン−１−イル）シクロヘキシル）−２，４−ジメチルベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボン酸メチルと（２Ｓ）−７−クロロ−２−（４−（３，３−ジフルオロアゼチジン−１−イル）シクロヘキシル）−２，４−ジメチルベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボン酸メチルとの分離
７−クロロ−２−（４−（３，３−ジフルオロアゼチジン−１−イル）シクロヘキシル）−２，４−ジメチルベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボン酸メチル（５６０ｍｇ）のラセミ混合物を分取ＳＦＣ［カラム：Ｄａｉｃｅｌ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓからのＣｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ−Ｈ。移動相Ａ：ＣＯ２／移動相Ｂ：ヘキサンおよびエタノール（１：１）の混合物中０．２５％のイソプロピルアミン。無勾配（移動相Ａ９０％および移動相Ｂ１０％）。流量：８０ｇ／分。カラム温度：２５℃］によって分離した。ＳＦＣ分析方法：カラム：Ｄａｉｃｅｌ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓからのＣｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ−Ｈ（１００ｍｍ×４．６ｍｍ。移動相Ａ：ＣＯ２／移動相Ｂ：ヘキサンとエタノールとの混合物中（３：１）０．１％のイソプロピルアミン。無勾配（移動相Ａの８５％および移動相Ｂの１５％）。流量：４ｍＬ／分。カラム温度：４０℃。中間体７（ピーク１）：保持時間＝１．０２分（ＳＦＣ分析方法）。回収＝１７３ｍｇ、収率１５％、９６％ｅｅ。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、クロロホルム−ｄ）  δ  ７．４８（ｓ、１Ｈ）、３．７８（ｓ、３Ｈ）、２．４４−２．３６（ｍ、２Ｈ）、２．３５−２．２５（ｍ、６Ｈ）、２．１９（ｔｄｄ、Ｊ＝２．８、５．６、１３．１Ｈｚ、２Ｈ）、１．７０−１．５７（ｍ、５Ｈ）。中間体７（ピーク２）：保持時間＝１．１６分（ＳＦＣ分析方法）。回収＝１５０ｍｇ、収率１３％、９７％ｅｅ。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：計算値４１６．８６、実測値４１６．２。
【００９６】
中間体８：ペルフルオロフェニル７−クロロ−２，４−ジメチル−２−（１−（２，２，２−トリフルオロエチル）ピペリジン−４−イル）ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボキシレート
【化１８】
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ステップ１：ｔｅｒｔ−ブチル４−（７−クロロ−５−（メトキシカルボニル）−２，４−ジメチルベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−２−イル）ピペリジン−１−カルボキシラトの合成
凝縮器を備えた１００ｍＬナシフラスコ内で、５−クロロ−３，４−ジヒドロキシ−２−メチル安息香酸メチル（１．２１９ｇ、５．５８ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（１４６ｍｇ、０．５５８ｍｍｏｌ）、およびトリルテニウムドデカカルボニル（１７８ｍｇ、０．２７９ｍｍｏｌ）の混合物を、窒素／真空サイクル（４サイクル）でパージし、次いでトルエン（１２ｍＬ）を添加し、窒素／真空サイクルでパージし、次いで１２０℃で３０分間撹拌した。トルエン（１０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル４−エチニルピペリジン−１−カルボキシレート（２．３２ｇ、１１．１ｍｍｏｌ）の混合物を暗色の混合物に添加した。得られたオレンジ色の溶液を１２０℃でさらに２時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、次いでフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中０〜１００％の勾配の酢酸エチル）によって精製して、表題化合物（２．３３ｇ、９８％）を黄色の油として得た。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｎａ］＋ｍ／ｚ：計算値４４８．２、実測値４４８．２。
【００９７】
ステップ２：７−クロロ−２，４−ジメチル−２−（ピペリジン−４−イル）ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボン酸メチル（トリフルオロ酢酸塩）の合成
ジクロロメタン（２ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル４−［７−クロロ−５−（メトキシカルボニル）−２，４−ジメチル−２Ｈ−１，３−ベンゾジオキソール−２−イル］ピペリジン−１−カルボキシレート（２．３３ｇ、５．４７ｍｍｏｌ）の黄色の溶液に、ＴＦＡ（１ｍＬ）を添加した。３０分後、反応混合物を減圧下で濃縮して、表題化合物（２．４０ｇ、定量的）をガムとして得、これをさらに精製することなく次のステップで使用した。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：計算値３２６．７９、実測値３２６．２。
【００９８】
ステップ３：７−クロロ−２，４−ジメチル−２−（１−（２，２，２−トリフルオロエチル）ピペリジン−４−イル）ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボン酸メチルの合成
トルエン（２０ｍＬ）およびアセトニトリル（１０ｍＬ）中の７−クロロ−２，４−ジメチル−２−（ピペリジン−４−イル）−２Ｈ−１，３−ベンゾジオキソール−５−カルボン酸メチル、トリフルオロ酢酸塩（２．４０ｇ、５．４５ｍｍｏｌ）の溶液に、トリエチルアミン（８ｍＬ、５７．６ｍｍｏｌ）および２，２，２−トリフルオロエチルトリフルオロメタンスルホネート（３．０ｇ、１２．９ｍｍｏｌ）を添加した。３時間後、反応混合物を減圧下で濃縮した。水（５０ｍＬ）を添加し、混合物をＥｔＯＡｃ（３０ｍＬｘ３）で抽出した。合わせた有機層をブライン（５０ｍＬｘ２）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、次いでフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中０〜５０％の勾配の酢酸エチル）によって精製して、表題化合物（２．０４ｇ、９２％）を黄色がかった油として得た。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：計算値４０８．８１、実測値４０８．２。
【００９９】
ステップ４：７−クロロ−２，４−ジメチル−２−（１−（２，２，２−トリフルオロエチル）ピペリジン−４−イル）ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボン酸の合成
メタノール（３ｍＬ）中の７−クロロ−２，４−ジメチル−２−［１−（２，２，２−トリフルオロエチル）ピペリジン−４−イル］−２Ｈ−１，３−ベンゾジオキソール−５−カルボン酸メチル（６９１ｍｇ、１．６９ｍｍｏｌ）の溶液に、水中６Ｍの水酸化ナトリウム（１ｍＬ、６．００ｍｍｏｌ）を添加し、６０℃で加熱した。２５分後、反応混合物を減圧下で濃縮して、ほとんどのメタノールを除去した。次いで混合物を水で希釈し、０℃に冷却し、次いで１Ｍの塩酸でｐＨ＝７に中和した。混合物をジクロロメタンで抽出し（３回）、合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、表題化合物を白色の固体として得、これをさらに精製することなく次のステップで使用した。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：計算値３９４．７９、実測値３９４．２。
【０１００】
ステップ５：ペルフルオロフェニル７−クロロ−２，４−ジメチル−２−（１−（２，２，２−トリフルオロエチル）ピペリジン−４−イル）ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボキシレートの合成
ジクロロメタン（５ｍＬ）中の７−クロロ−２，４−ジメチル−２−［１−（２，２，２−トリフルオロエチル）ピペリジン−４−イル］−２Ｈ−１，３−ベンゾジオキソール−５−カルボン酸（６６５ｍｇ、１．６８ｍｍｏｌ）の撹拌した溶液に、ピリジン（１ｍＬ、１２．４ｍｍｏｌ）を添加し、続いて２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニル２，２，２−トリフルオロアセテート（５００μＬ、２．９０ｍｍｏｌ）を添加した。２０分後、反応混合物を減圧下で濃縮して、表題化合物を得、これをさらに精製することなく次のステップで使用した。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：計算値５６０．８４、実測値５６０．２。
【０１０１】
中間体９：７−クロロ−２−（４−（３−（メトキシアゼチジン−１−イル）シクロヘキシル）−２，４−ジメチルベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボン酸
【化１９】
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ステップ１：７−クロロ−２−（４−（３−（メトキシアゼチジン−１−イル）シクロヘキシル）−２，４−ジメチルベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボン酸メチルの合成
メタノール（３０ｍＬ）中の３−メトキシアゼチジン塩酸塩（８ｇ、６４．７５ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１２ｍＬ、６８．９ｍｍｏｌ）の溶液を室温で３０分間撹拌した後、テトラヒドロフラン（３０ｍＬ）中の７−クロロ−２，４−ジメチル−２−（４−オキソシクロヘキシル）−１，３−ベンゾジオキソール−５−カルボン酸メチル（中間体４−ピーク２）（４．１ｇ、１２．１０ｍｍｏｌ）の別の溶液の溶液を添加した。反応混合物を室温で１時間撹拌し、次いで−７０℃に冷却した。水素化ホウ素リチウム（５００ｍｇ、２２．９６ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を−７０℃で３０分間［または出発物質の完全な消費がＴＬＣ、酢酸エチル／メタノール５：１によって観察されるまで］撹拌した。次に、反応物の２つのバッチを合わせ、０℃の塩化アンモニウムの飽和水溶液（１２０ｍＬ）でクエンチし、所望の生成物をジクロロメタン（２００ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮乾固させた。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ジクロロメタン中０〜１４％の勾配のメタノール）によって精製して、表題化合物（８．０５ｇ、６７％収率、８３％純度）を淡黄色の油として得た。分取薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル：メタノール１５：１）によって、試料（５０ｍｇ）をさらに精製した。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：計算値４１０．２、実測値４１０．１。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、メタノール−ｄ４）  δ  ７．３９（ｓ、１Ｈ）、３．９５−３．９１（ｍ、１Ｈ）、３．７３（ｓ、３Ｈ）、３．５９−３．５１（ｍ、２Ｈ）、３．１６（ｓ、３Ｈ）、２．９７（ｂｒ  ｄｄ、Ｊ＝６．４、８．０Ｈｚ、２Ｈ）、２．２６（ｓ、３Ｈ）、２．１１−２．０２（ｍ、１Ｈ）、１．９１−１．７３（ｍ、５Ｈ）、１．５４（ｓ、３Ｈ）、１．２２−１．１２（ｍ、２Ｈ）、０．９８−０．８６（ｍ、２Ｈ）。
【０１０２】
ステップ２：７−クロロ−２−（４−（３−（メトキシアゼチジン−１−イル）シクロヘキシル）−２，４−ジメチルベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボン酸の合成
メタノール（４８ｍＬ）中の７−クロロ−２−（４−（３−メトキシアゼチジン−１−イル）シクロヘキシル）−２，４−ジメチルベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボン酸メチル（４ｇ、９．７５ｍｍｏｌ）の溶液に、水（１２ｍＬ）中の水酸化リチウム水和物（４．０３ｇ、９６．０６ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。反応物を７０℃で２時間撹拌し、次いで２つのバッチを合わせ、減圧下で濃縮した。水（５０ｍＬ）を添加し、０℃のクエン酸の飽和水溶液でｐＨを６に調整した。所望の生成物を、ジクロロメタンとイソプロパノールとの３：１混合物（３００ｍＬ×５）で抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮乾固させて、表題化合物（６．１ｇ、粗製）をオフホワイトの固体として得、これをさらに精製することなく次のステップで使用した。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：計算値３９６．２、実測値３９６．１。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、メタノール−ｄ４）  δ  ７．０７（ｓ、１Ｈ）、４．０５−４．１０（ｍ、２Ｈ）、３．７６−３．８８（ｍ、１Ｈ）、３．６７（ｂｒ  ｄｄ、Ｊ＝１０、３．６Ｈｚ、２Ｈ）、３．２２（ｓ、３Ｈ）、２．７１−２．８１（ｍ、１Ｈ）、２．１９（ｓ、３Ｈ）、１．９１−１．９９（ｍ、４Ｈ）、１．７５−１．８５（ｍ、１Ｈ）、１．５２（ｓ、３Ｈ）、１．１８−１．２８（ｍ、２Ｈ）、１．０６−１．１４（ｍ、２Ｈ）。
【０１０３】
実施例＃１：７−クロロ−２−（４−（３−（ジフルオロメトキシ）アゼチジン−１−イル）シクロヘキシル）−２，４−ジメチル−Ｎ−（（６−メチル−４−（メチルチオ）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボキサミド
【化２０】
2021522166.tif 000022
ステップ１：７−クロロ−２−（４−（３−（ジフルオロメトキシ）アゼチジン−１−イル）シクロヘキシル）−２，４−ジメチルベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボン酸メチルの合成
メタノール（２ｍＬ）とテトラヒドロフラン（２ｍＬ）との混合物中の、７−クロロ−２，４−ジメチル−２−（４−オキソシクロヘキシル）ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボン酸メチル（中間体４−ピーク２）（２２４ｍｇ、０．６６１ｍｍｏｌ）、３−（ジフルオロメトキシ）アゼチジン（３３６ｍｇ、２．７２ｍｍｏｌ）、およびトリエチルアミン塩酸塩（３７３ｍｇ、２．７１ｍｍｏｌ）の溶液を、室温で１．５時間撹拌し、次いで−７８℃に冷却した。−７８℃のテトラヒドロフラン中の水素化ホウ素リチウム溶液（２Ｍ、５００μＬ、１ｍｍｏｌ）を滴加した後、反応物を室温まで１５分間温めた。次に、混合物を０℃に冷却し、次いで炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液でクエンチし、ジクロロメタンで希釈し、室温に温めた。所望の生成物をジクロロメタンで水層から抽出し（３回）、疎水性フィルターを使用して合わせた有機層を乾燥させ、減圧下で濃縮乾固させた。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中１０〜１００％の勾配の酢酸エチル、次いで酢酸エチル中０〜１００％の勾配のエタノール）によって精製して、標題化合物（２０５ｍｇ、収率７０％）の単一幾何異性体（シスまたはトランス）を得た。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：計算値４４５．９、実測値４４６．２。
【０１０４】
ステップ２：７−クロロ−２−（４−（３−（ジフルオロメトキシ）アゼチジン−１−イル）シクロヘキシル）−２，４−ジメチルベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボン酸の合成
メタノール（３ｍＬ）中の７−クロロ−２−（４−（３−（ジフルオロメトキシ）アゼチジン−１−イル）シクロヘキシル）−２，４−ジメチルベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボン酸メチル（２０５ｍｇ、０．４６０ｍｍｏｌ）の溶液に、水酸化ナトリウムの水溶液（６Ｍ、１ｍＬ、６．００ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を６０℃で２０分間加熱し、次いで水で希釈し、０℃に冷却し、１Ｍの塩酸でｐＨ＝２に酸性化し、次いで１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ＝７に中和した。所望の生成物をジクロロメタンで抽出し（３回）、疎水性フィルターを使用して乾燥させ、減圧下で濃縮乾固させて、表題化合物（１７６ｍｇ、８９％収率）を白色の固体として得、これをさらに精製することなく次のステップで使用した。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：計算値４３１．９、実測値４３２．２。
【０１０５】
ステップ３：ペルフルオロフェニル７−クロロ−２−（（１ｒ，４Ｒ）−４−（３−（ジフルオロメトキシ）アゼチジン−１−イル）シクロヘキシル）−２，４−ジメチルベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボキシレートの合成
ジクロロメタン（０．５ｍＬ）中の７−クロロ−２−（４−（３−（ジフルオロメトキシ）アゼチジン−１−イル）シクロヘキシル）−２，４−ジメチルベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボン酸（１７６ｍｇ、０．４０８ｍｍｏｌ）の溶液に、室温のピリジン（１．０ｍＬ、１２．４ｍｍｏｌ）を添加し、続いて２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニル２，２，２−トリフルオロアセテート（１５０μＬ、０．８７１ｍｍｏｌ）を添加した。２０分後、反応混合物を減圧下で濃縮乾固させて、標題化合物（１００％理論収量＝２４３ｍｇ）と副生成物との混合物を得た。粗混合物をさらに精製することなく次のステップで使用した。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：計算値５９７．９１、実測値５９８．２。
【０１０６】
ステップ４：７−クロロ−２−（４−（３−（ジフルオロメトキシ）アゼチジン−１−イル）シクロヘキシル）−２，４−ジメチル−Ｎ−（（６−メチル−４−（メチルチオ）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボキサミドの合成
ジメチルスルホキシド（１ｍＬ）中のペルフルオロフェニル７−クロロ−２−（４−（３−（ジフルオロメトキシ）アゼチジン−１−イル）シクロヘキシル）−２，４−ジメチルベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボキシレート（≦２４３ｍｇ、≦０．４０６ｍｍｏｌ）の溶液に、３−（アミノメチル）−６−メチル−４−（メチルチオ）ピリジン−２（１Ｈ）−オン（塩酸塩）（中間体１）（２２２ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．３０ｍＬ、１．７１ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を６０℃で１時間撹拌し、次いで強い窒素流下で一晩濃縮乾固させた。残留物を逆相フラッシュクロマトグラフィー（Ｃ１８カラム、０．１％のトリフルオロ酢酸とともに水中０〜１００％の勾配のアセトニトリル）によって２回精製した。残留物をジクロロメタンおよび炭酸水素ナトリウムの飽和溶液で希釈した。水層をジクロロメタンで洗浄した。合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮して、標題化合物（１６６ｍｇ、２段階で収率６８％）を単一幾何異性体（シスまたはトランス）として得た。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：計算値５９８．１、実測値５９８．３。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、メタノール−ｄ４）  δ  ６．８８（ｓ、１Ｈ）、６．２６（ｓ、１Ｈ）、６．３８（ｔ、Ｊ＝７４．３Ｈｚ、２Ｈ）、４．７１（五重線、Ｊ＝６．０Ｈｚ、１Ｈ）、４．４８（ｓ、２Ｈ）、３．６９−３．６０（ｍ、２Ｈ）、３．１８−３．１１（ｍ、２Ｈ）、２．５２（ｓ、３Ｈ）、２．２９（ｓ、３Ｈ）、２．１８（ｓ、３Ｈ）、２．１０（ｔｔ、Ｊ＝３．５、１１．２Ｈｚ、１Ｈ）、１．９８−１．８６（ｍ、４Ｈ）、１．８５−１．７８（ｍ、１Ｈ）、１．６０（ｓ、３Ｈ）、１．３２−１．２１（ｍ、２Ｈ）、１．０６−０．９２（ｍ、２Ｈ）。
【表１】
2021522166.tif 000023
【０１０７】
実施例＃３：（Ｒ）−７−クロロ−Ｎ−（（６−クロロ−４−（メチルチオ）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−２−（トランス−４−（ジメチルアミノ）シクロヘキシル）−２，４−ジメチルベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボキサミド
【化２１】
2021522166.tif 000024
ジメチルスルホキシド（０．５ｍＬ）中の（Ｒ）−７−クロロ−２−（トランス−４−（ジメチルアミノ）シクロヘキシル）−２，４−ジメチルベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボン酸（特許出願第ＵＳ２０１７／００７３３３５Ａ１号に記載の手順に従って調製）（４８ｍｇ、０．１３５６ｍｍｏｌ）の溶液に、室温のトリエチルアミン（５６．６μＬ、０．４０７ｍｍｏｌ）およびＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（４１．２ｍｇ、０．１０８ｍｍｏｌ）を添加した。ＬＣＭＳ（［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：３６８．２）による５分後の活性化エステルの形成は不完全であったので、追加のジメチルスルホキシド（１ｍＬ）中のＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ヘキサフルオロリン酸テトラメチルウロニウム（１６ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ）を２回添加した。酸の活性化が完了した後、室温のジメチルスルホキシド（０．５ｍＬ）中の３−（アミノメチル）−６−クロロ−４−（メチルスルファニル）−１，２−ジヒドロピリジン−２−オン塩酸塩（６５．３ｍｇ、０．２７１ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（５６．６μＬ、０．４０７ｍｍｏｌ）の懸濁液を添加した。反応混合物を６０℃で４５分間加熱し、次いでジクロロメタンおよび水で希釈した。疎水性フィルターを使用して有機層を乾燥させ、減圧下で濃縮乾固させた。残留物をフラッシュクロマトグラフィー［シリカゲルＫＰ−ＮＨカラム、ヘプタン中０〜１００％の勾配の酢酸エチル、次いでジクロロメタン中０〜１００％のエタノール、次いで酢酸エチル中０〜１００％メタノール（２０％の水酸化アンモニウムとともに）］によって精製して、表題化合物（３０ｍｇ、収率４１％）を白色の固体として得た。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：計算値５４０．５、実測値５４０．２。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、メタノール−ｄ４）  δ  ６．８９（ｓ、１Ｈ）、６．６８（ｓ、１Ｈ）、４．５０（ｓ、２Ｈ）、３．２０（ｔｔ、Ｊ＝３．２、１１．９Ｈｚ、１Ｈ）、２．８３（ｓ、６Ｈ）、２．５３（ｓ、３Ｈ）、２．１８（ｓ、３Ｈ）、２．１６−２．０８（ｍ、４Ｈ）、２．０２−１．９４（ｍ、１Ｈ）、１．６２（ｓ、３Ｈ）、１．５４（ｄｑ、Ｊ＝３．４、１２．４Ｈｚ、２Ｈ）、１．４７−１．３７（ｍ、２Ｈ）。
【表２】
2021522166.tif 000025
【０１０８】
実施例６（エナンチオマー１）：７−クロロ−Ｎ−（（６−クロロ−４−（メチルチオ）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−２−（４−（ジメチルアミノ）シクロヘキシル）−２，４−ジメチルベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボキサミド
【化２２】
2021522166.tif 000026
ステップ１：７−クロロ−２，４−ジメチル−２−（４−（（３−（トリフルオロメチル）オキセタン−３−イル）アミノ）シクロヘキシル）ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボン酸の合成
メタノール（１ｍＬ）中の７−クロロ−２，４−ジメチル−２−［４−｛［３−（トリフルオロメチル）オキセタン−３−イル］アミノ｝シクロヘキシル］−２Ｈ−１，３−ベンゾジオキソール−５−カルボン酸メチル（中間体５−ピーク１）（８１ｍｇ、０．１７４ｍｍｏｌ）の溶液に、水酸化ナトリウム（７２ｍｇ、１．７９ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を６０℃で２０分間加熱し、０℃に冷却し、次いで１Ｍの塩酸でｐＨ＝２に酸性化した。次いで、所望の生成物をジクロロメタンで抽出し（３回）、疎水性フィルターを使用して合わせた有機層を乾燥させた。濾液を減圧下で濃縮乾固させて、表題化合物（７０ｍｇ、８９％収率）を白色の固体として得、これをさらに精製することなく次のステップで使用した。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：計算値４５０．１、実測値４５０．２。
【０１０９】
ステップ２：ペルフルオロフェニル７−クロロ−２，４−ジメチル−２−（４−（（３−（トリフルオロメチル）オキセタン−３−イル）アミノ）シクロヘキシル）ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボキシレートの合成
ジクロロメタン（０．５ｍＬ）中の７−クロロ−２，４−ジメチル−２−（４−（（３−（トリフルオロメチル）オキセタン−３−イル）アミノ）シクロヘキシル）ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボン酸（７０ｍｇ、１５５μｍｏｌ）の溶液に、室温のピリジン（２４．９μＬ、３１０μｍｏｌ）および２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニル２，２，２−トリフルオロアセテート（３９．８μＬ、２３２μｍｏｌ）を添加した。１５分後、反応物を減圧下で濃縮して、表題化合物と副産物との混合物（６８ｍｇ、粗製）を得た。粗混合物をさらに精製することなく次のステップで使用した。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：計算値６１６．１、実測値６１６．２。
【０１１０】
ステップ３：７−クロロ−２，４−ジメチル−Ｎ−（（６−メチル−４−（メチルチオ）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−２−（４−（（３−（トリフルオロメチル）オキセタン−３−イル）アミノ）シクロヘキシル）ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボキサミドの合成
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）中の２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニル７−クロロ−２，４−ジメチル−２−［４−｛［３−（トリフルオロメチル）オキセタン−３−イル］アミノ｝シクロヘキシル］−２Ｈ−１，３−ベンゾジオキソール−５−カルボキシレート（≦６８ｍｇ、≦１１０μｍｏｌ）の溶液に、室温の３−（アミノメチル）−６−メチル−４−（メチルスルファニル）−１，２−ジヒドロピリジン−２−オン（遊離塩基）（３０．４ｍｇ、０．１６５ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１ｍＬ、５７４μｍｏｌ）を添加した。反応物を５０℃で３０分間撹拌し、次いで逆相フラッシュクロマトグラフィー（Ｃ１８カラム、０．１％のトリフルオロ酢酸とともに水中５〜５０％の勾配のアセトニトリル）による精製のために、Ｃ１８カラムに直接添加して、表題化合物のトリフルオロ酢酸塩を得た。塩をジクロロメタン中に溶解させ、有機層を炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液で洗浄した。最後に、有機層を減圧下で濃縮乾固させて、表題化合物（遊離塩基）（４２ｍｇ、収率６２％）を白色の固体として得た。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：計算値６１６．１９、実測値６１６．３。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、クロロホルム−ｄ）  δ  １２．６２−１２．４４（ｍ、１Ｈ）、７．１６（ｔ、Ｊ＝５．１Ｈｚ、１Ｈ）、６．９１（ｓ、１Ｈ）、６．０４（ｓ、１Ｈ）、４．７６（ｓ、３Ｈ）、４．６２−４．４６（ｍ、４Ｈ）、２．７２−２．６３（ｍ、１Ｈ）、２．４９（ｓ、３Ｈ）、２．３２（ｓ、３Ｈ）、２．２７（ｓ、３Ｈ）、１．９２（ｄ、Ｊ＝５．９Ｈｚ、４Ｈ）、１．８０（ｂｒ．ｓ．、１Ｈ）、１．６０（ｓ、３Ｈ）、１．３６−１．１０（ｍ、６Ｈ）。
【表３】
2021522166.tif 000027
【０１１１】
実施例８：７−クロロ−Ｎ−（（４−クロロ−６−メチル−２−オコソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−２−（４−（３−シクロプロポキシアゼチジン−１−イル）シクロヘキシル）−２，４−ジメチルベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボキサミド
【化２３】
2021522166.tif 000028
ステップ１：７−クロロ−２−（４−（３−シクロプロポキシアゼチジン−１−イル）シクロヘキシル）−２，４−ジメチルベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボン酸メチルの合成
メタノール（１０ｍＬ）中の３−（シクロプロポキシ）アゼチジン塩酸塩（１．９ｇ、１２．７ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２．７ｍＬ、１５．５ｍｍｏｌ）の溶液を室温で１時間撹拌した後、テトラヒドロフラン（３０ｍＬ）中の７−クロロ−２，４−ジメチル−２−（４−オキソシクロヘキシル）−１，３−ベンゾジオキソール−５−カルボン酸メチル（中間体４−ピーク２）（８６０ｍｇ、２．５４ｍｍｏｌ）の別の溶液の溶液を添加した。反応混合物を室温で１．５時間撹拌し、次いで−７０℃に冷却した。水素化ホウ素リチウム（１２０ｍｇ、５．５１ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を−７０℃で３０分間［または出発物質の完全な消費がＴＬＣ、酢酸エチル／メタノール５：１によって観察されるまで］撹拌した。次に、反応物を塩化アンモニウムの飽和水溶液（１００ｍＬ）でクエンチし、所望の生成物を酢酸エチル（５０ｍＬ×２）で抽出した。合わせた有機層をブライン（３０ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮乾固させた。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、石油エーテル中５０〜１００％の勾配の酢酸エチル）によって精製して、表題化合物（７６０ｍｇ、収率６５％、純度９５％）を黄色の油として得た。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：計算値４３６．１、実測値４３６．０。
【０１１２】
ステップ２：７−クロロ−２−（４−（３−シクロプロポキシアゼチジン−１−イル）シクロヘキシル）−２，４−ジメチルベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボン酸の合成
メタノール（１５ｍＬ）および水（３ｍＬ）中の７−クロロ−２−（４−（３−シクロプロポキシアゼチジン−１−イル）シクロヘキシル）−２，４−ジメチルベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボン酸メチル（７６０ｍｇ、１．７４ｍｍｏｌ）の溶液に、水酸化リチウム水和物（９６２ｍｇ、２２．９３ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を７０℃で１５時間撹拌し、次いで減圧下で濃縮した。水（１５ｍＬ）を添加し、０℃のクエン酸の飽和水溶液でｐＨを６に調整した。所望の生成物を、ジクロロメタンとイソプロパノールとの１０：１混合物（３０ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層をブライン（１５０ｍＬ×２）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮乾固させて、表題化合物（７２０ｍｇ、粗製）を黄色の固体として得、これをさらに精製することなく次のステップで使用した。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：計算値４２２．１、実測値４２２．０。
【０１１３】
ステップ３：７−クロロ−Ｎ−（（４−クロロ−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−２−（４−（３−シクロプロポキシアゼチジン−１−イル）シクロヘキシル）−２，４−ジメチルベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボキサミドの合成
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４ｍＬ）中の７−クロロ−２−［４−［３−（シクロプロポキシ）アゼチジン−１−イル］シクロヘキシル］−２，４−ジメチル−１，３−ベンゾジオキソール−５−カルボン酸（３６０ｍｇ、０．８５３ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（５００ｍｇ、１．３１ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１ｍＬ、５．７４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を１５℃で３０分間撹拌した後、３−（アミノメチル）−４−クロロ−６−メチル−１Ｈ−ピリジン−２−オン塩酸塩（中間体６）（２５０ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１５℃でさらに４時間撹拌し、次いで濾過した。濾液を分取ＨＰＬＣ［カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｂｒｉｄｇｅ（１５０ｍｍ×２５ｍｍ、５μｍ）。移動相Ａ：水（０．０５％の水酸化アンモニウムｖ／ｖ／移動相Ｂ：アセトニトリル。勾配（移動相Ａの６５〜５５％／移動相Ｂの３５〜６５％、９．５分以上）。カラム温度：３０℃］によって精製して、表題化合物（２０９ｍｇ、収率４２％）を白色の固体として得た。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：計算値５７６．２、実測値５７６．２。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、メタノール−ｄ４）  δ  ６．９０（ｓ、１Ｈ）、６．３０（ｓ、１Ｈ）、４．５２（ｓ、２Ｈ）、４．２２（五重線、Ｊ＝６．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．６１（ｄｄ、Ｊ＝６．４、８．６Ｈｚ、２Ｈ）、３．３１−３．２５（ｍ、１Ｈ）、２．９９（ｄｄ、Ｊ＝６．３、８．４Ｈｚ、２Ｈ）、２．２８（ｓ、３Ｈ）、２．２０（ｓ、３Ｈ）、２．１２−２．０４（ｍ、１Ｈ）、１．９９−１．８５（ｍ、５Ｈ）、１．６２（ｓ、３Ｈ）、１．３３−１．２４（ｍ、２Ｈ）、１．０６−０．９５（ｍ、２Ｈ）、０．５６−０．５１（ｍ、２Ｈ）、０．５１−０．４４（ｍ、２Ｈ）。
【表４−１】
2021522166.tif 000029
【表４−２】
2021522166.tif 000030
【０１１４】
実施例１４：（Ｒ）−７−クロロ−２，４−ジメチル−Ｎ−（（６−メチル−４−（メチルチオ）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−２−（１−（２，２，２−トリフルオロエチル）ピペリジン−４−イル）ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボキサミドおよび（Ｓ）−７−クロロ−２，４−ジメチル−Ｎ−（（６−メチル−４−（メチルチオ）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−２−（１−（２，２，２−トリフルオロエチル）ピペリジン−４−イル）ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボキサミド
【化２４】
2021522166.tif 000031
ステップ１：７−クロロ−２，４−ジメチル−Ｎ−（（６−メチル−４−（メチルチオ）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−２−（１−（２，２，２−トリフルオロエチル）ピペリジン−４−イル）ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボキサミドの合成
ジメチルスルホキシド（４ｍＬ）中の２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニル７−クロロ−２，４−ジメチル−２−［１−（２，２，２−トリフルオロエチル）ピペリジン−４−イル］−２Ｈ−１，３−ベンゾジオキソール−５−カルボキシレート（中間体８）（７５２ｍｇ、１．３４ｍｍｏｌ）の溶液に、３−（アミノメチル）−６−メチル−４−（メチルスルファニル）−１，２−ジヒドロピリジン−２−オン（中間体１）（７４０ｍｇ、４．０２ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（９３２μＬ、５．３６ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を６０℃で加熱し、１時間後、精製のためにＣ１８カラムに添加した。所望の生成物を逆相フラッシュクロマトグラフィー（Ｃ１８カラム、０．１％のトリフルオロ酢酸とともに水中０％〜１００％の勾配のアセトニトリル）によって２回精製して、表題化合物（２８９ｍｇ、収率３８％）をガムとしてのラセミ混合物として得た。
【０１１５】
ステップ２：（Ｒ）−７−クロロ−２，４−ジメチル−Ｎ−（（６−メチル−４−（メチルチオ）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−２−（１−（２，２，２−トリフルオロエチル）ピペリジン−４−イル）ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボキサミドと、（Ｓ）−７−クロロ−２，４−ジメチル−Ｎ−（（６−メチル−４−（メチルチオ）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−２−（１−（２，２，２−トリフルオロエチル）ピペリジン−４−イル）ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボキサミドとの分離
７−クロロ−２，４−ジメチル−Ｎ−（（６−メチル−４−（メチルチオ）−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−２−（１−（２，２，２−トリフルオロエチル）ピペリジン−４−イル）ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボキサミド（２８９ｍｇ）のラセミ混合物を分取ＳＦＣ［カラム：ＥＳ  ＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓからのＣｈｒｏｍｅｇａＣｈｉｒａｌ  ＣＣ４（内径２５０ｍｍ×２０ｍｍ）。移動相Ａ：ＣＯ２／移動相Ｂ：メタノール中０．２５％のイソプロピルアミン。無勾配（移動相Ａ５５％および移動相Ｂ４５％）。流量：８０ｇ／分。カラム温度：２５℃］によって分離した。ＳＦＣ分析方法：カラム：Ｃｈｉｒａｌ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＣｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＸ−Ｈ（内径１００ｍｍ×４．６ｍｍ）。移動相Ａ：ＣＯ２／移動相Ｂ：メタノール中０．１％のイソプロピルアミン。無勾配（移動相Ａ７５％および移動相Ｂ２５％）。流量：４ｍＬ／分。カラム温度：４０℃。実施例１６（エナンチオマー１）（所望のエナンチオマー／ユートマー）：保持時間＝３．７４分（ＳＦＣ分析方法）。回収＝９０ｍｇ、収率１２％、９９％ｅｅ（黄色の固体）。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：計算値５６０．２、実測値５６０．２。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、メタノール−ｄ４）  δ  ６．８９（ｓ、１Ｈ）、６．２７（ｓ、１Ｈ）、４．４９（ｓ、２Ｈ）、３．０８−２．９８（ｍ、４Ｈ）、２．５２（ｓ、３Ｈ）、２．３４（ｂｒ  ｔ、Ｊ＝１１．０Ｈｚ、２Ｈ）、２．２９（ｓ、３Ｈ）、２．２０（ｓ、３Ｈ）、１．９３−１．８４（ｍ、１Ｈ）、１．８３−１．７６（ｍ、２Ｈ）、１．６２（ｓ、３Ｈ）、１．６０−１．４７（ｍ、２Ｈ）。実施例１６（エナンチオマー２）（不要なエナンチオマー／ジストマー）：保持時間＝４．２５分（ＳＦＣ分析方法）。回収＝１０１ｍｇ  ｇ、収率１３％、９８％ｅｅ、（黄色の固体）。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：計算値５６０．２、実測値５６０．２。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、メタノール−ｄ４）  δ  ６．８９（ｓ、１Ｈ）、６．２７（ｓ、１Ｈ）、４．４９（ｓ、２Ｈ）、３．０８−２．９８（ｍ、４Ｈ）、２．５２（ｓ、３Ｈ）、２．３４（ｂｒ  ｔ、Ｊ＝１１．０Ｈｚ、２Ｈ）、２．２９（ｓ、３Ｈ）、２．２０（ｓ、３Ｈ）、１．９３−１．８４（ｍ、１Ｈ）、１．８３−１．７６（ｍ、２Ｈ）、１．６２（ｓ、３Ｈ）、１．６０−１．４７（ｍ、２Ｈ）。
【０１１６】
実施例１５：７−クロロ−Ｎ−（（４−クロロ−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−２−（４−（３−メトキシアゼチジン−１−イル））シクロヘキシル）−２，４−ジメチルベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボキサミド
【化２５】
2021522166.tif 000032
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）中の７−クロロ−２−（４−（３−（メトキシアゼチジン−１−イル）シクロヘキシル）−２，４−ジメチルベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボン酸（９００ｍｇ、２．２７ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（１．０４ｇ、２．７３ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２．３８ｍＬ、１３．６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を２５℃で３０分間撹拌した後、３−（アミノメチル）−４−クロロ−６−メチル−１Ｈ−ピリジン−２−オン塩酸塩（中間体６）（７１０ｍｇ、３．４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温でさらに１．５時間撹拌し、次いで濾過した。濾液を分取ＨＰＬＣ［カラム：ＹＭＣ−Ａｃｔｕｓ  Ｔｒｉａｒｔ  Ｃ１８（１００ｍｍ×３０ｍｍ、５μｍ）。移動相Ａ：水（０．０５％塩酸）／移動相Ｂ：アセトニトリル。勾配（移動相Ａの８５〜５５％／移動相Ｂの１５〜４５％、１０分以上）。カラム温度：３０℃およびカラム：Ｘｔｉｍａｔｅ  Ｃ１８（１５０ｍｍ×２５ｍｍ、５μｍ）。移動相Ａ：水（０．０５％の水酸化アンモニウムｖ／ｖ）／移動相Ｂ：アセトニトリル。勾配（移動相Ａの６９〜３９％／移動相Ｂの３１〜６１％、７分以上）。カラム温度：３０℃］によって２回精製して、表題化合物（５３３ｍｇ、４３％収率、＞９９％純度）を白色の固体として得た。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：計算値５５０．２、実測値５５０．１。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、クロロホルム−ｄ）  δ  １１．９７（ｂｒ、１Ｈ）、７．０６−７．０３（ｍ、１Ｈ）、６．８８（ｓ、１Ｈ）、６．１９（ｓ、１Ｈ）、４．６５（ｄ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、２Ｈ）、４．０５−４．０１（ｍ、１Ｈ）、３．６６−３．６２（ｍ、２Ｈ）、３．２５（ｓ、３Ｈ）、２．９３−２．９０（ｍ、２Ｈ）、２．２８（ｓ、３Ｈ）、２．２５（ｓ、３Ｈ）、１．９３−１．８１（ｍ、６Ｈ）、１．６０（ｓ、３Ｈ）、１．２５−１．０２（ｍ、４Ｈ）。
【０１１７】
実施例１６：（Ｒ）−７−クロロ−Ｎ−（（４−クロロ−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−２，４−ジメチル−２−（１−（２，２，２−トリフルオロエチル）ピペリジン−４−イル）ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボキサミドおよび（Ｓ）−７−クロロ−Ｎ−（（４−クロロ−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−２，４−ジメチル−２−（１−（２，２，２−トリフルオロエチル）ピペリジン−４−イル）ベンゾ［ｄ］［１、３］ジオキソール−５−カルボキサミド
【化２６】
2021522166.tif 000033
ステップ１：７−クロロ−Ｎ−（（４−クロロ−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−２，４−ジメチル−２−（１−（２，２，２−トリフルオロエチル）ピペリジン−４−イル）ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボキサミドの合成
ジメチルスルホキシド（１ｍＬ）中の２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニル７−クロロ−２，４−ジメチル−２−［１−（２，２，２−トリフルオロエチル）ピペリジン−４−イル］−２Ｈ−１，３−ベンゾジオキソール−５−カルボキシレート（中間体８）（１８８ｍｇ、０．３３５８ｍｍｏｌ）の溶液に、３−（アミノメチル）−４−クロロ−６−メチル−１，２−ジヒドロピリジン−２−オン塩酸塩（中間体６）（７０．２ｍｇ、０．３３６ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２３３μＬ、１．３４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を６０℃で加熱し、１時間後、精製のためにＣ１８カラムに添加した。所望の生成物を逆相フラッシュクロマトグラフィー（Ｃ１８カラム、０．１％のトリフルオロ酢酸とともに水中０％〜１００％の勾配のアセトニトリル）によって２回精製して、表題化合物（１８０ｍｇ、収率９８％）をガムとしてのラセミ混合物として得た。
【０１１８】
ステップ２：（Ｒ）−７−クロロ−Ｎ−（（４−クロロ−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−２，４−ジメチル−２−（１−（２，２，２−トリフルオロエチル）ピペリジン−４−イル）ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボキサミドと、（Ｓ）−７−クロロ−Ｎ−（（４−クロロ−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−２，４−ジメチル−２−（１−（２，２，２−トリフルオロエチル）ピペリジン−４−イル）ベンゾ［ｄ］［１、３］ジオキソール−５−カルボキサミドとの分離
７−クロロ−Ｎ−（（４−クロロ−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−２，４−ジメチル−２−（１−（２，２，２−トリフルオロエチル）ピペリジン−４−イル）ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボキサミド（１８０ｍｇ）のラセミ混合物を分取ＳＦＣ［カラム：ＥＳ  ＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓからのＣｈｒｏｍｅｇａＣｈｉｒａｌ  ＣＣ４（内径２５０ｍｍ×２０ｍｍ）。移動相Ａ：ＣＯ２／移動相Ｂ：メタノール中０．２５％のイソプロピルアミン。無勾配（移動相Ａ６５％および移動相Ｂ３５％）。流量：８０ｇ／分。カラム温度：２５℃］によって分離した。ＳＦＣ分析方法：カラム：Ｃｈｉｒａｌ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＣｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＺ−Ｈ（内径１００ｍｍ×４．６ｍｍ、ｘｘμｍ）。移動相Ａ：ＣＯ２／移動相Ｂ：メタノール中０．１％のイソプロピルアミン。無勾配（移動相Ａの６５％および移動相Ｂの３５％）。流量：４ｍＬ／分。カラム温度：４０℃。実施例１７（エナンチオマー１）（所望のエナンチオマー／ユートマー）：保持時間＝０．７３分（ＳＦＣ分析方法）。回収＝６１ｍｇ、収率３３％、１００％ｅｅ（黄色の固体）。実施例１７（エナンチオマー２）（不要なエナンチオマー／ジストマー）：保持時間＝０．９８分（ＳＦＣ分析方法）。回収＝６３ｍｇ、収率３４％、９７％ｅｅ（黄色の固体）。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：計算値５４８．１、実測値５４８．２。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、メタノール−ｄ４）  δ  ６．８９（ｓ、１Ｈ）、６．２９（ｓ、１Ｈ）、４．５２（ｓ、２Ｈ）、３．０４（ｑ、Ｊ＝９．８Ｈｚ、４Ｈ）、２．３５（ｂｒ  ｔ、Ｊ＝１１．０Ｈｚ、Ｈ）、２．２７（ｓ、３Ｈ）、２．１９（ｓ、３Ｈ）、１．９５−１．８５（ｍ、１Ｈ）、１．８５−１．７５（ｍ、２Ｈ）、１．６３（ｓ、３Ｈ）、１．６２−１．５０（ｍ、２Ｈ）。
【０１１９】
実施例１７：７−クロロ−２−（４−（３−メトキシアゼチジン−１−イル）シクロヘキシル）−２，４−ジメチル−Ｎ−（（６−メチル−４−（メチルチオ）−２−オキソ−１、２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボキサミド
【化２７】
2021522166.tif 000034
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５０ｍＬ）中の７−クロロ−２−（４−（３−（メトキシアゼチジン−１−イル）シクロヘキシル）−２，４−ジメチルベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−カルボン酸（中間体９−単一エナンチオマーおよび幾何異性体）（５ｇ、１２．６３ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（５．７ｇ、１４．９９ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１１ｍＬ、６３．１５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を２０℃で３０分間撹拌した後、３−（アミノメチル）−６−メチル−４−（メチルチオ）ピリジン−２（１Ｈ）−オン塩酸塩（中間体１）（４．２ｇ、１９．０３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温でさらに１．５時間撹拌し、次いで濾過した。濾液を分取ＨＰＬＣ［カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  Ｃ１８（２５０ｍｍ×５０ｍｍ、１０μｍ）。移動相Ａ：水（０．０４％の水酸化アンモニウムｖ／ｖおよび１０ｍＭの炭酸水素アンモニウム）／移動相Ｂ：アセトニトリル。勾配（移動相Ａの７５〜４４％／移動相Ｂの２５〜５６％、２３分以上）。カラム温度：３０℃］によって精製して、表題化合物（４．４ｇ、収率６０％、純度９６％）を白色の固体として得た。ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ：計算値５６２．２、実測値５６２．２。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、メタノール−ｄ４）  δ  ６．９１（ｓ、１Ｈ）、６．２９（ｓ、１Ｈ）、４．５０（ｓ、２Ｈ）、４．０１（五重線、Ｊ＝６Ｈｚ、１Ｈ）、３．５８（ｄｄ、Ｊ＝８．８、６．４Ｈｚ、２Ｈ）、３．２６（ｓ、３Ｈ）、２．９２−３．０２（ｍ、２Ｈ）、２．５４（ｓ、３Ｈ）、２．３１（ｓ、３Ｈ）、２．２１（ｓ、３Ｈ）、２．０１−２．１１（ｍ、１Ｈ）、１．７９−２．００（ｍ、５Ｈ）、１．６２（ｓ、３Ｈ）、１．１９−１．３４（ｍ、２Ｈ）、０．９１−１．０８（ｍ、２Ｈ）。
【０１２０】
ＥＺＨ２アッセイ
ＥＺＨ２を使用する阻害剤のＩＣ５０測定
ＥＺＨ２生化学アッセイ（ＩＣ５０）：化合物の効力は、３Ｈ−ＳＡＭをビオチン化Ｈ３ペプチドに組み込むことによって評価した。具体的には、ｗｔ  ＥＺＨ２（社内で調製した五量体複合体）を含有する３０ｐＭのＰＲＣ２を、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．５）、１ｍＭのＤＴＴ、０．０７ｍＭのＢｒｉｊ−３５、０．１％のＢＳＡ、および０．８％ＤＭＳＯの総量１２．５μｌ中で、４５０ｎＭのＳＡＭ、４５０ｎＭの３Ｈ−ＳＡＭ、２μＭのＨ３Ｋ２７ｍｅ３活性化ペプチド（Ｈ２Ｎ−ＲＫＱＬＡＴＫＡＡＲ（Ｋｍｅ３）ＳＡＰＡＴＧＧＶＫＫＰ−アミド）、および化合物（ＤＭＳＯ中１０ポイントの二重用量反応滴定（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ  ｄｏｓｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）、最終アッセイ０．８％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ））とともに事前に３〜５時間インキュベートした。反応は、２μＭストックとしてビオチン化Ｈ３基質ペプチド（Ｈ２Ｎ−ＲＫＱＬＡＴＫＡＡＲ（Ｋｍｅ１）ＳＡＰＡＴＧＧＶＫＫＰ−ＮＴＰＥＧＢｉｏｔ）を１２．５μｌの緩衝液中で開始し、室温で１８〜２２時間反応させた。２０μｌのＳＴＯＰ溶液（５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．５）、２００ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのＳＡＨ）を添加することによって、クエンチを完了した。３５μｌのクエンチした溶液をストレプトアビジンでコーティングしたＦｌａｓｈＰｌａｔｅｓ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に移し、１〜２時間インキュベートし、洗浄し、ＴｏｐＣｏｕｎｔ  Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で読み取った。ＩＣ５０は、非線形最小二乗法４パラメーターフィットを使用するＧｅｎｅｄａｔａ  Ｓｃｒｅｅｎｅｒで計算し、４つのパラメーターが、ＩＣ５０、Ｈｉｌｌ  ｓｌｏｐｅ、移行前のベースライン（０％のＩＮＨ）、および移行後のベースライン（１００％のＩＮＨ）であった。
【０１２１】
ＨｅＬａ細胞アッセイにおける阻害剤のＥＣ５０測定
Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３アルファＨｅｌａアッセイ（ＡｌｐｈａＬＩＳＡ）。各試験化合物の１０腫の異なる用量（一連の３倍希釈）を、３８４ウェルの組織培養処理プレート２枚（カタログ＃６００７６８０、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））にプレーティングした。培養で成長させたＨｅｌａ細胞をトリプシン処理し、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）セルカウンター（カタログ＃Ｃ１０２８１、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ））を使用してカウントした。細胞を１０％のＤＭＥＭ（カタログ＃１０５６９−０１０、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ））中１ｍＬあたり６７，０００個の細胞に希釈し、１５μＬ（１，０００細胞）を、ＢｉｏｔｅｋＭｉｃｒｏＦｌｏ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ  Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．（Ｖｅｒｍｏｎｔ，ＵＳＡ））の３８４ウェルプレートを使用して各ウェルにプレーティングした。プレートを３７℃／５％のＣＯ２で７２時間インキュベートした。２つのプレートのうちの１つは、ＨｅＬａアッセイ用に処理し、もう１つは、生存率用に処理した。１ウェルあたり５μＬのＣｅｌｌ−Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｌｙｓｉｓ緩衝液（１Ｘ）（カタログ＃ＡＬ００９Ｆ１  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））をＡｌｐｈａＬＩＳＡ用に処理したプレートに添加し、プレートを低速のプレートシェーカー（モデル＃４６２５−Ｑ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））を用いてＲＴで３０分間インキュベートした。次いで、１ウェルあたり１０μＬのＨｉｓｔｏｎｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ緩衝液（カタログ＃ＡＬ００９Ｆ２、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））を添加し、プレートを低速のプレートシェーカーを用いてＲＴで２０分間さらにインキュベートした。次に、抗Ｋ２７ｍｅ３アクセプタービーズとビオチン化抗ヒストンＨ３（Ｃ−ｔｅｒ）抗体（最終的に３ｎＭに希釈）（カタログ＃ＡＬ１１８  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））との５Ｘ混合液１０μＬを各ウェルに添加した。アクセプタービーズおよび抗ヒストンＨ３の希釈は、提供された１０Ｘストックを希釈することによって生成した１ＸＨｉｓｔｏｎｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ緩衝液（カタログ＃ＡＬ００９Ｆ３  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））で行った。プレートをアルミニウムプレートシーラーで密封し、２３℃で６０分間インキュベートした。次に、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｄｏｎｏｒビーズの５Ｘ溶液１０μＬ（カタログ＃６７６０００２  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）（１ＸＨｉｓｔｏｎｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ緩衝液中最終２０μｇ／ｍＬ）を添加し、＝プレートをアルミニウムプレートシーラーで密封し、２３℃で３０分間インキュベートした。次いでＥｎＶｉｓｉｏｎ−Ａｌｐｈａ  Ｒｅａｄｅｒ（モデル＃２１０４  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））を使用してプレートを読み取った。
培地を含む細胞とともに１５μＬのＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（（カタログ＃Ｇ９２４１  ＰｒｏｍｅｇａＭａｄｉｓｏｎ（ＷＩ））を各ウェルに添加することによって、細胞生存率をアッセイした。プレートを低速のプレートシェーカーを用いてＲＴで１５〜２０分間インキュベートした。次いで、ＥｎＶｉｓｉｏｎ−Ａｌｐｈａ  Ｒｅａｄｅｒ（モデル＃２１０４  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））を使用してプレートを読み取った。
【０１２２】
Ｋａｒｐａｓ−４２２生存率アッセイにおける阻害剤のＧＩ５０測定
Ｋａｒｐａｓ−４２２細胞株は、ＤＳＭＺ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手し、ＲＰＭＩ−１６４０培地で成長させた。すべての培地は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有した。１ウェルあたり２０Ｋの細胞を、化合物でコーティングされた９６ウェルプレートにプレーティングした。細胞を分割し、元のプレーティング密度（ＤＭＳＯウェル数に基づく）で４日ごとに新鮮なＥＺＨ２阻害剤を含有するプレートに播種した。相対細胞数は、８日目にＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって評価した。カーブフィッティングにＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５を使用し、ＧＩ５０値を報告した。データを表５に示す。
【表５−１】
2021522166.tif 000035
【表５−２】
2021522166.tif 000036
【表５−３】
2021522166.tif 000037
【表５−４】
2021522166.tif 000038
【表５−５】
2021522166.tif 000039
【０１２３】
滞留時間測定
ＥＺＨ２滞留時間アッセイ：事前に形成された酵素阻害剤複合体の１００倍希釈後の酵素活性の回復（希釈反応）を監視し、それをすべての試薬の同じ最終濃度の未希釈対照の活性と比較（対照反応）することによって、化合物滞留時間を評価した。酵素活性は、３Ｈ−ＳＡＭをビオチン化Ｈ３ペプチドに組み込むことによって測定した。希釈反応では、ｗｔ  ＥＺＨ２（社内で調製した五量体複合体）を含有する２０ｎＭのＰＲＣ２を、１μＭの活性化ペプチド（Ｈ２Ｎ−ＲＫＱＬＡＴＫＡＡＲ（Ｋｍｅ３）ＳＡＰＡＴＧＧＶＫＫＰ−アミド）およびそのＫｉの６００倍の化合物とともに、４０μＬの緩衝液（５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．５、４ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０７ｍＭのＢｒｉｊ−３５、および０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ）中で２時間事前にインキュベートし、次いで１００倍に希釈し、１μＭの活性化ペプチド、５．０５μＭの基質ペプチド（Ｈ２Ｎ−ＲＫＱＬＡＴＫＡＡＲＫＳＡＰＡＴＧＧＶＫＫＰ−ＮＴＰＥＧｂｉｏｔ）、１．０１μＭのＳＡＭ、および１．０１μＭの３Ｈ−ＳＡＭを含有する緩衝液１３８．６μＬ体積に反応物１．４μＬを移すことによって開始した。対照反応用に、０．２０２ｎＭのＰＲＣ２を、１３８．６μＬの緩衝液中で２時間、１μＭの活性化ペプチド、１．０１μＭのＳＡＭ、１．０１μＭ３のＨ−ＳＡＭ、およびそのＫｉの６．０６倍の化合物とともに事前にインキュベートし、次いで１．４μＬの５００μＭ基質ペプチドを水に添加することによって反応を開始した。１０時間までの様々な時点で、８μＬのアリコートを反応容器から１ウェルあたり８μＬのＳＴＯＰ溶液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．５、２００ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのＳＡＨ）を含有するプレートに移すことによって反応物をクエンチした。最終時点の後、１２μＬのクエンチした溶液を、１ウェルあたり４０μＬのＳＴＯＰ溶液を含有するストレプトアビジンでコーティングしたＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に移し、１〜８時間インキュベートし、洗浄し、ＴｏｐＣｏｕｎｔプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で読み取った。
【０１２４】
カスタムスクリプトを使用して、対照反応の進行状況データを直線および希釈反応の進行状況データにフィッティングした。
【数１】
2021522166.tif 000040
ｙが形成された生成物であり、ｔが反応時間であり、ｖｉが初期速度であり、ｖｓが定常状態の速度であり、ｋｏｂｓが曲線の初期速度フェーズから曲線の定常状態の速度フェーズへ移行する速度定数である。希釈反応進行状況データのフィッティングでは、ｖｓは、対照反応進行状況データにフィッティングした線の傾きに制約した。次いで、ｋｏｂｓのフィッティングした値を滞留時間に変換した。
【数２】
2021522166.tif 000041
ｔが滞留時間であり、Ｋｉが阻害定数であり、［ＥＩ］が酵素阻害剤複合体の計算された平衡濃度であり、［Ｅ］が遊離酵素の計算された平衡濃度であり、［Ｉ］が遊離阻害剤の計算された平衡濃度である。
【０１２５】
ＭＤＣＫアッセイにおける阻害剤の細胞透過性測定
細胞培養：ＭＤＣＫ  ＩＩ細胞（Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＰｉｅｔ  Ｂｏｒｓｔから入手）を、９６ウェルＢＤインサートシステムのポリエチレン膜（ＰＥＴ）上に２．５ｘ１０５細胞／ｍＬで播種し、集密的な細胞単層を形成するまでに４〜７日かけた。
【０１２６】
実験手順：試験および参照化合物（ナドロール、メトプロロール、およびジゴキシン）をストック溶液からの輸送緩衝液（１０ｍＭのＨｅｐｅｓを含むＨＢＳＳ、ｐＨ７．４）で２μＭ（＜１％ＤＭＳＯ）の濃度に希釈し、細胞単層の頂端部（Ａ）または基底外側（Ｂ）に適用した。ＡからＢ方向またはＢからＡ方向への試験化合物の透過を、Ｐ−ｇｐ阻害剤（ＧＦ１２０９１８、１０μＭ）で２回測定した。Ｐ−ｇｐ阻害剤（ＧＦ１２０９１８、１０μＭ）あり／なしで、同様にジゴキシンをＡからＢ方向またはＢからＡ方向に１０μＭで試験し、ナドロールおよびメトプロロールをＰ−ｇｐ阻害剤（ＧＦ１２０９１８、１０μＭ）なしでＡからＢ方向に２μＭで２回試験した。３７±１℃、５％のＣＯ２、飽和湿度のＣＯ２インキュベーター内で、振盪せずに２．５時間プレートをインキュベートした。加えて、各化合物の流出率も決定した。分析物／ＩＳのピーク面積比に基づくＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析によって、試験化合物および参照化合物を定量化した。輸送アッセイ後、細胞単層の一体性を決定するために、ルシファーイエロー拒絶アッセイを適用する。頂端部チャンバおよび基底外側チャンバの両方から緩衝液を除去し、続いて頂端部チャンバおよび基底外側チャンバそれぞれに、輸送緩衝液中１００μＭのルシファーイエロー７５μＬ、および２５０μＬの輸送緩衝液を添加した。３７℃、５％のＣＯ２、９５％の相対湿度で、振盪せずにプレートを３０分間インキュベートする。３０分のインキュベーション後、２０μＬのルシファーイエロー試料を頂端部側から採取し、続いて６０μＬの輸送緩衝液を添加する。次いで、８０μＬのルシファーイエロー試料を基底外側から採取する。ルシファーイエローの相対蛍光単位（ＲＦＵ）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＤｅｖｉｃｅＭ２ｅプレートリーダーを用いて４２５／５２８ｎｍ（励起／発光）で測定する。
【０１２７】
データ分析：見かけの透過係数Ｐａｐｐ（ｃｍ／秒）は、次の等式を使用して計算した。
Ｐａｐｐ＝（ｄＣｒ／ｄｔ）ｘＶｒ／（ＡｘＣ０）
式中、ｄＣｒ／ｄｔが、時間と相関するレシーバーチャンバ内の化合物の累積濃度（μＭ／秒）であり、Ｖｒが、レシーバーチャンバ内の溶液体積（頂端部側で０．０７５ｍＬ、基底外側で０．２５ｍＬ）であり、Ａが、輸送の表面積、すなわち、単層面積０．０８０４ｃｍ２であり、Ｃ０が、ドナーチャンバ内の初期濃度（μＭ）である。
【０１２８】
流出率は、次の等式を使用して計算した。
流出率＝Ｐａｐｐ（ＢＡ）／Ｐａｐｐ（ＡＢ）
回復パーセントは、次の等式を使用して計算した。
回復率％＝１００ｘ［（ＶｒｘＣｒ）＋（ＶｄｘＣｄ）］／（ＶｄｘＣ０）
式中、Ｖｄが、ドナーチャンバの体積（頂端部側で０．０７５ｍＬ、基底外側で０．２５ｍＬ）であり、ＣｄおよびＣｒが、それぞれドナーおよびレシーバーチャンバ内の輸送化合物の最終濃度である。
【０１２９】
基底外側ウェルのルシファーイエローのパーセントは、次の等式を使用して計算する。
【数３】
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ＲＦＵ頂端部およびＲＦＵ基底外側はそれぞれ、頂端部ウェルおよび基底外側ウェルにおけるルシファーイエローの相対蛍光単位値であり、Ｖ頂端部およびＶ基底外側はそれぞれ、頂端部および基底外側ウェルの体積（０．０７５ｍＬおよび０．２５ｍＬ）である。ルシファーイエローのパーセントは、２未満であるべきである。データを表６に示す。
【表６−１】
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【表６−２】
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【表６−３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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