(57)【要約】  抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）についてのシステム及び方法が、微生物の陰イオン電荷における分散を考慮して提供される。陽イオン性界面活性剤は、ポリ陽イオン性抗生剤、例えばポリミキシンに対して、耐性である微生物を感受性にするために、使用され得る。微生物がポリ陽イオン性抗生剤耐性を、表面陰イオン電荷を低下させる突然変異を介して獲得するので、微生物のポリ陽イオン性抗生剤に対する感受性は、その表面電荷の使用であり得る。微生物表面との静電性相互作用を可能にするために、陽イオン性界面活性剤が適用されて、微生物の陰イオン電荷を増大する。
2021530986.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マルチアッセイ迅速抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）シーケンスを実施するための方法であって、以下：
臨床サンプルに由来する微生物を含むサンプルを、試験パネルの複数のウェル内に植菌することであって、前記複数のウェルの少なくとも１つは、疫学上カットオフ値を上回る濃度で陽イオン性抗菌剤を含み、及び前記複数のウェルの少なくとも１つは、抗菌剤を含まない；
一定時間、前記試験パネルをインキュベートすること；
試験パネルの前記陽イオン性抗菌剤を含む少なくとも１つのウェルにおける微生物の増殖の、微生物の増殖に対する比を決定すること；
前記比が、所定の閾値を上回る場合、試験パネルの残りの複数のウェルのうち少なくとも１つのウェルを、界面活性剤と接触させること；及び
試験パネルの残りの複数のウェルのうち少なくとも１つのウェルにおけるサンプルの、少なくとも１つの表面積ベースの測定を実施すること
を含む、方法。
【請求項２】
前記界面活性剤は、臭化セチル−トリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、オクテニジン二塩酸塩、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ジメチルジオクラデシルアンモニウム、塩化メチルトリアルキル（Ｃ８−Ｃ１０）アンモニウム（ａｄｏｇｅｎ４６４）、塩化ベンゼトニウム、臭化セトリモニウム、及び臭化ジオクタデシルジメチルアンモニウムからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つの表面積ベースの測定を実施する前に、前記残りの複数のウェルのうち少なくとも１つのウェルから前記界面活性剤を除去する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１つの表面積ベースの測定を実施することは、残りのウェルのうち少なくとも１つを陽イオン性シグナリング薬剤と接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記陽イオン性シグナリング薬剤は、ランタニドクリプテートであり、少なくとも１つの表面積ベースの測定を実施することは、ランタニドクリプテートと前記サンプル中の微生物の表面との間の結合を検出することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記比が所定の閾値を下回る場合、試験パネルの残りの複数のウェルのうち少なくとも１つのウェルを、脂肪族アルコールエトキシレート、ノノキシノール、オクチルフェノールエトキシレート（ｔｒｉｔｏｎ  ｘ−１００）、エトキシル化アミン、ポロロキサマー、グリセロールモノステアレート、グリセロールモノラウレート、ｓｐａｎ、ｔｗｅｅｎ、アルキルポリグリコシド、アミンオキシド、スルホキシド、及びホスフィンオキシドからなる群から選択される界面活性剤と接触させる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記所定の閾値比が、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５又は０．６である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記所定の閾値比が、０．２〜０．４である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
試験パネルを一定時間インキュベートし、そして任意選択的に、増殖のレベルが所定の増殖閾値に達していない場合に、追加の時間、試験パネルをインキュベートした後で、試験パネルの複数のウェルのうち少なくとも１つにおける増殖レベルを評価する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
マルチアッセイ迅速抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）シーケンスを実施するための方法であって、以下：
微生物を含むサンプルを、試験パネルの複数のウェル内に植菌することであって、前記複数のウェルの少なくとも１つは、疫学上カットオフ値を上回る濃度でポリ陽イオン性抗菌剤を含み、及び前記複数のウェルの少なくとも１つは、抗菌剤を含まない；
一定時間、前記試験パネルをインキュベートすること；
試験パネルの前記陽イオン性抗菌剤を含む少なくとも１つのウェルにおける微生物の増殖の、抗菌剤を含まない少なくとも１つのウェルにおける微生物の増殖に対する比を決定すること；
前記比が、所定の閾値を上回る場合、微生物の細胞膜の陰イオン電荷密度を増大すること；及び
陽イオン性シグナリング薬剤の、試験パネルの残りの複数のウェルのうち少なくとも１つのウェルにおける微生物の細胞壁との結合を測定すること
を含む、方法。
【請求項１１】
微生物の細胞膜の陰イオン電荷密度を増大する前記工程が、残りの複数のウェルのうち少なくとも１つのウェルを界面活性剤と接触させることを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記界面活性剤が、臭化セチル−トリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、オクテニジン二塩酸塩、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ジメチルジオクラデシルアンモニウム、塩化メチルトリアルキル（Ｃ８−Ｃ１０）アンモニウム（ａｄｏｇｅｎ４６４）、塩化ベンゼトニウム、臭化セトリモニウム、及び臭化ジオクタデシルジメチルアンモニウムからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記比が所定の閾値を下回る場合、試験パネルの残りの複数のウェルのうち少なくとも１つのウェルを、脂肪族アルコールエトキシレート、ノノキシノール、オクチルフェノールエトキシレート（ｔｒｉｔｏｎ  ｘ−１００）、エトキシル化アミン、ポロロキサマー、グリセロールモノステアレート、グリセロールモノラウレート、ｓｐａｎ、ｔｗｅｅｎ、アルキルポリグリコシド、アミンオキシド、スルホキシド、及びホスフィンオキシドからなる群から選択される界面活性剤と接触させる工程をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
抗菌剤感受性試験のための試験パネルであって、以下：
各レザバが７５〜２００μｌの液体容量を収容するように構成されている、９６〜３８４の間のレザバを含み、少なくとも１つのレザバは、
（ａ）少なくとも０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、２．５又は３μｇのポリ陽イオン性抗菌剤、又は
（ｂ）少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０μｇのポリ陽イオン性抗菌剤を含む、試験パネル。
【請求項１５】
前記ポリ陽イオン性抗菌剤は、コリスチンである、請求項１４に記載の試験パネル。
【請求項１６】
複数のレザバは、抗菌剤の群から選択される抗菌剤を含み、複数のレザバは、抗菌剤の群のそれぞれについての希釈系列を規定する、請求項１４に記載の試験パネル。
【請求項１７】
抗菌剤を含まない少なくとも１つのレザバを含む、請求項１６に記載の試験パネル。
【請求項１８】
マルチアッセイ迅速抗菌剤感受性試験シーケンスを実施するための方法であって、前記方法は、以下：
臨床サンプルに由来する微生物を含むサンプルを、試験パネルの複数のウェル内に植菌することであって、前記試験パネルは、以下：
抗菌剤を含まない、少なくとも１つの増殖対照ウェル
ポリ陽イオン性抗菌剤を、植菌後に疫学上カットオフ値を超える濃度をもたらすために十分な量で含む、少なくとも１つの陰イオン性試験ウェル；及び
複数の抗菌剤についての複数の希釈系列を規定する複数のウェルを含む；
マルチアッセイ試験シーケンスを実施するための自動化迅速抗菌剤感受性試験システムに試験パネルをローディングすること；及び
試験システムを実行して、以下：
植菌したサンプルをインキュベーションアセンブリ内でインキュベートしそして撹拌すること；
所定の時間後、又は増殖対照ウェル中のサンプルのパラメータに応答して、インキュベーションを止めること；
アニオン性試験ウェル対増殖対照ウェル内の微生物増殖の比を決定し、この比が所定の閾値を超える場合、試験パネルの残りのウェルのうち少なくとも１つを、微生物の実質的な溶解を伴わずに微生物の膜を破壊するために十分な濃度で、界面活性剤と接触させること；及び
１つ以上のエンドポイント細胞表面アッセイを、試験パネル内のインキュベートしたサンプル上で実施すること；
試験パネルの複数のウェル内のサンプルからの光出力を測定することであって、前記光出力は、前記複数のウェルのそれぞれに残る微生物の量に対応すること；及び
前記複数のウェルのそれぞれに残る微生物及び複数の抗菌剤についての、最小阻害濃度及び／又は定性的感受性解釈の、少なくとも１つを報告すること
を含む、方法。
【請求項１９】
マルチアッセイ迅速抗菌剤感受性試験シーケンスを実施するための方法であって、前記方法は、以下：
微生物含有患者物質のサンプル又はサブサンプルを、試験パネルの複数のウェル、陽イオン調整済のミューラー・ヒントン培地（ＭＨＢ）を含む少なくとも１つの試験ウェル、コリスチンを含む少なくとも１つの試験ウェル、及び抗菌剤希釈系列を規定する複数のウェルの内に植菌すること；
代謝指示薬を、陽イオン調整済ＭＨＢ及びコリスチンを含むウェルに添加し、試験パネルを、微生物増殖に好適な条件下でインキュベートすること；
代謝指示薬を、蛍光シグナルＥｘ５６０／Ｅｍ５９０として読み取り、バックグラウンド調整した蛍光シグナルを決定すること；
コリスチン中で増殖したサンプルのバックグラウンドを減算した蛍光シグナルを、ＭＨＢ中で増殖したサンプルのバックグラウンドを減算した蛍光シグナルで除算して、陰イオン比を計算すること；
試験パネルの抗菌剤希釈系列を規定するウェルを事前処理することであって、陰イオン比が所定の閾値を上回る場合、事前処理の工程は、臭化セチルトリメチルアンモニウムで処理することを含み、陰イオン比が所定の閾値を下回る場合、事前処理の工程は、１％  Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）を含むリン酸緩衝化生理食塩水での処理を含むこと；
表面結合試薬を適用すること；
抗菌剤希釈系列の複数のウェルの各々において、時間分解性蛍光シグナルを読み取ること；及び
時間分解性蛍光シグナルに基づき、試験パネル中に存在する抗菌剤について最小阻害濃度（ＭＩＣ）を決定すること、
を含む、方法。
【請求項２０】
前記所定の閾値は、０．０５〜０．３の間である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記所定の閾値は、０．０５、０．１、０．１５、０．２、及び０．２５である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
マルチアッセイ迅速抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）シーケンスを実施するための方法であって、以下：
臨床サンプルに由来する微生物を含むサンプルを、イオン性性質アッセイを含む試験パネルの複数のウェル内に植菌することであって、前記試験パネルは、疫学上カットオフ値又は耐性ブレークポイント以上の濃度で陽イオン性抗菌剤を含む１つ以上のウェル、及び抗菌剤を含まない１つ以上のウェルを含むこと；
一定時間、前記試験パネルをインキュベートすること；
陽イオン性抗菌剤を含む試験パネルの少なくとも１つのウェルにおける微生物増殖の、抗菌剤を含まないウェルにおける微生物増殖に対するイオン性性質比を決定すること；
前記イオン性性質アッセイ比が所定の閾値を上回る場合、試験パネルの残りの複数のウェルのうち少なくとも１つのウェルを界面活性剤と接触させること；及び
試験パネルの残りの複数のウェルのうち少なくとも１つのウェルにおけるサンプルの、少なくとも１つの表面積ベースの測定を実施すること
を含む、方法。
【請求項２３】
マルチアッセイ迅速抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）シーケンスを実施するための方法であって、以下：
臨床サンプルに由来する微生物を含むサンプルを、イオン性性質アッセイを含む試験パネルの複数のウェル内に植菌することであって、前記試験パネルは、疫学上カットオフ値又は耐性ブレークポイント以上の濃度で陽イオン性抗菌剤を含む１つ以上のウェル、及び抗菌剤を含まない１つ以上のウェルを含むこと；
一定時間、前記試験パネルをインキュベートすること；
陽イオン性抗菌剤を含む試験パネルの少なくとも１つのウェルにおける微生物増殖の、抗菌剤を含まないウェルにおける微生物増殖に対するイオン性性質比を決定すること；
前記イオン性性質アッセイ比が、所定の閾値を上回る場合、微生物の細胞膜の陰イオン電荷密度を増大すること；及び
陽イオン性シグナリング薬剤の、試験パネルの残りの複数のウェルのうち少なくとも１つのウェルにおける微生物の細胞壁との結合を測定すること
を含む、方法。
【請求項２４】
微生物の細胞膜の陰イオン電荷密度を増大する前記工程は、残りの複数のウェルのうち少なくとも１つのウェルを界面活性剤と接触させることを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記イオン性性質アッセイにおける前記陽イオン性抗菌剤は、ポリ陽イオン性である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記陽イオン性抗菌剤は、１つ以上のポリミキシンＡ〜Ｅを含むが、これらに限定されない、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記陽イオン性抗菌剤は、１つ以上のコリスチン（ポリミキシンＥ）又はポリミキシンＢである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
イオン性性質アッセイの陽イオン性抗菌剤最低濃度は、２μｇ／ｍＬ以上である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
イオン性性質アッセイの陽イオン性抗菌剤最低濃度は、３６μｇ／ｍＬ以下である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
イオン性性質アッセイは、異なる陽イオン性抗菌剤濃度を有する２つのウェルを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
イオン性性質アッセイは、コリスチンを８μｇ／ｍＬ及び１６μｇ／ｍＬで含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
イオン性性質アッセイにおける微生物増殖は、吸光度及び／又は代謝指示薬によって決定される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
前記代謝指示薬は、レサズリンを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
レサズリン濃度は、１０μＭ〜１００ｍＭの間である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記代謝指示薬は、代謝プローブ製剤をさらに含み、これはさらに、１−メトキシ−５−メチルフェナンジニウム（ｍｅｔｈｌｙｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ）メチルスルフェート（１−メトキシＰＭＳ）を、５０μＭ〜１Ｍの間の濃度で；メチレンブルーを、１００ｎＭ〜５μＭの間の濃度で；そしてフェロシアン化物及びフェリシアン化物のそれぞれを、０．０００１％〜０．１％（ｗ／ｖ）の間の濃度で含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
３０分間〜６時間のインキュベーションを、複数のイオン性性質アッセイウェルへの代謝指示薬の添加の後に行う、請求項３２〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
ａ．培地を含むが抗菌剤及び微生物を含まない１つ以上の対照ウェル；及び
ｂ．培地及び微生物を含むが微生物を含まない１つ以上のアッセイウェル
を含む、十分な増殖アッセイを実施することをさらに含み、
ここで、複数の十分な増殖アッセイウェルに対して、パネルインキュベーションの開始から２時間以内に代謝指示薬が添加され、吸光度及び／又は蛍光のアッセイ対対照ウェルの比が所定の閾値と比較されて、それにより、閾値が達成されている場合は十分な増殖が達成されていることが判定され、閾値が達成されていない場合には、吸光度及び／又は蛍光測定が再度実施される前に、３０分間〜４時間の時間、サンプルがインキュベートされ、十分な増殖閾値が達成されるか又は１２か月が経過するまでこのプロセスを繰り返す、請求項２３に記載の方法。
【請求項３８】
前記十分な増殖アッセイ閾値は、１、１．０５、１．１１、１．１５、１．２である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
代謝指示薬は、レサズリンを含む、請求項３７〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
レサズリン濃度は、１０μＭ〜１００ｍＭの間である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記代謝指示薬は、代謝プローブ製剤をさらに含み、これはさらに、１−メトキシ−５−メチルフェナンジニウム（ｍｅｔｈｌｙｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ）メチルスルフェート（１−メトキシＰＭＳ）を５０μＭ〜１Ｍの間の濃度で；メチレンブルーを１００ｎＭ〜５μＭの間の濃度で；そしてフェロシアン化物及びフェリシアン化物のそれぞれを、０．０００１％〜０．１％（ｗ／ｖ）の間の濃度でさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
イオン性性質アッセイのために使用される代謝指示薬の製剤は、十分な増殖アッセイのために使用されるものとほぼ同じである、請求項３２に記載の方法。
【請求項４３】
イオン性性質アッセイは、前記パネル中の異なる抗菌剤の希釈系列を含む複数のウェル上で実施される生存アッセイと並行して、及びおよそ同じ代謝指示薬を用いて実施される、請求項３２に記載の方法。
【請求項４４】
イオン性性質アッセイ比が所定の閾値と同じか又はこれを上回る場合に添加される界面活性剤が、臭化セチル−トリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、オクテニジン二塩酸塩、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ジメチルジオクラデシルアンモニウム、塩化メチルトリアルキル（Ｃ８−Ｃ１０）アンモニウム（ａｄｏｇｅｎ４６４）、塩化ベンゼトニウム、臭化セトリモニウム、及び臭化ジオクタデシルジメチルアンモニウムからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項４５】
前記界面活性剤は、ＣＴＡＢである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ＣＴＡＢ濃度は、０．００１％〜１％、０．０１％〜０．１％の間である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
ウェルを界面活性剤と接触させる前記工程は、ウェルを界面活性剤及び金属イオンキレーターを含む溶液と接触させることを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項４８】
前記金属イオンキレーターは、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
ＥＤＴＡ濃度は、０．００１〜１Ｍ、０．０１〜０．５Ｍの間である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
イオン性性質アッセイ比が所定の閾値を下回る場合に、試験パネルの残りの複数のウェルのうち少なくとも１つのウェルを、脂肪族アルコールエトキシレート、ノノキシノール、オクチルフェノールエトキシレート（ｔｒｉｔｏｎｘ−１００）、エトキシル化アミン、ポロロキサマー、グリセロールモノステアレート、グリセロールモノラウレート、ｓｐａｎ、ｔｗｅｅｎ、アルキルポリグリコシド、アミンオキシド、スルホキシド及びホスフィンオキシドからなる群から選択される界面活性剤と接触させる工程をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項５１】
前記界面活性剤は、ｔｗｅｅｎ−２０（ポリソルベート２０）である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
Ｔｗｅｅｎ濃度は、０．００１〜１％の間である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
イオン性性質アッセイの所定の閾値比は、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５又は０．６である、請求項２３に記載の方法。
【請求項５４】
前記所定の閾値比は、０．１〜０．３である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
少なくとも１つの表面積ベースの測定を実施する前に、前記残りの複数のウェルのうち少なくとも１つのウェルから前記界面活性剤を除去する工程をさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項５６】
少なくとも１つの表面積ベースの測定を実施することは、残りのウェルのうち少なくとも１つを陽イオン性シグナリング薬剤と接触させることを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記陽イオン性シグナリング薬剤は、ランタニドクリプテートであり、少なくとも１つの表面積ベースの測定を実施することは、ランタニドクリプテートと前記サンプル中の微生物の表面との間の結合を検出することを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記微生物が、グラム陰性である、請求項２３に記載の方法。
【請求項５９】
抗菌剤感受性試験のための試験パネルであって、以下：
各レザバが７５〜２５０μｌの液体容量を収容するように構成されている、９６〜３８４の間のレザバを含み、少なくとも１つのレザバは、
（ａ）少なくとも０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、２．５又は３μｇのポリ陽イオン性抗菌剤、又は
（ｂ）少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０μｇのポリ陽イオン性抗菌剤を含む、試験パネル。
【請求項６０】
前記ポリ陽イオン性抗菌剤は、ポリミキシンである、請求項５９の試験パネル。
【請求項６１】
前記ポリ陽イオン性抗菌剤は、コリスチン及び／又はポリミキシンＢである、請求項５９の試験パネル。
【請求項６２】
少なくとも１つのレザバは、抗菌剤の群から選択される抗菌剤を含み、複数のレザバは、抗菌剤の群のそれぞれについての希釈系列を規定する、請求項５９に記載の試験パネル。
【請求項６３】
抗菌剤を含まない少なくとも１つのレザバを含む、請求項６２に記載の試験パネル。
【請求項６４】
マルチアッセイ迅速抗菌剤感受性試験シーケンスを実施するための方法であって、以下：
臨床サンプルに由来する微生物を含むサンプルを、増殖培地は含むが微生物は含まない１つ以上の陰性対照ウェルを除いて、試験パネルの複数のウェル内に植菌することであって、ここで、試験パネルは、
抗菌剤を含まない少なくとも２つの陽性増殖ウェル；
ポリ陽イオン性抗菌剤を、植菌後、疫学上カットオフ値又は耐性ブレークポイントを超える濃度をもたらすために十分な量で含む少なくとも１つのイオン性性質ウェル；及び
複数の抗菌剤についての複数の希釈系列を規定する複数のウェル
を含む；
マルチアッセイ試験シーケンスを実施するための自動化迅速抗菌剤感受性試験システムに試験パネルをローディングすること；及び
試験システムを実行して、以下：
陰性対照ウェル及び陽性対照ウェルに代謝指示薬を添加することであって、代謝指示薬は：
１０μＭ〜１００ｍＭの間の濃度のレサズリン；
５０μＭ〜１Ｍの間の濃度の１−メトキシ−５−メチルフェナンジニウム（ｍｅｔｈｌｙｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ）メチルスルフェート（１−メトキシＰＭＳ）；
１００ｎＭ〜５μＭの間の濃度のメチレンブルー；
０．０００１％〜０．１％（ｗ／ｖ）の間の濃度のフェロシアン化物及びフェリシアン化物の各々を含む；
植菌したサンプルをインキュベーションアセンブリ内でインキュベートしそして任意選択的に撹拌すること；
所定の時間後、又は陽性増殖対照ウェル対陰性対照ウェルの吸光度及び／又は蛍光として決定した十分な増殖アッセイの１．０、１．０５、１．１、１．１５、１．２の比を達成するか又は超えた後に、イオン性性質アッセイウェル及び十分な増殖アッセイに用いなかった陽性増殖対照ウェルを含む複数のウェル内に代謝指示薬を添加し、インキュベーションを３０分間以上実施することであって、代謝指示薬は、十分な増殖アッセイのために使用される製剤とおよそ同等である製剤を含む；
複数のウェルの吸光度及び／又は蛍光を決定して、イオン性性質アッセイウェル対増殖対照ウェルにおける微生物増殖の比として規定されるイオン性性質アッセイ比を計算し、この比が所定の閾値と同じか又はこれを上回る場合、試験パネルの残りのウェルのうち少なくとも１つを微生物の実質的な溶解を伴わずに微生物の膜を破壊するために十分な濃度で界面活性剤と接触させ、そして、イオン性性質アッセイ比が所定の閾値を下回る場合、試験パネルの残りのウェルのうち少なくとも１つを、異なる濃度の界面活性剤と接触させること；及び
試験パネルにおけるインキュベートしたサンプル上で、１つ以上のエンドポイント細胞表面アッセイを実施すること；
試験パネルの複数のウェル内のサンプルからの光出力を測定することであって、前記光出力は、前記複数のウェルのそれぞれに残る微生物の量に対応すること；及び
前記複数のウェルのそれぞれに残る微生物及び複数の抗菌剤についての、最小阻害濃度及び／又は定性的感受性解釈の、少なくとも１つを報告すること
を含む、方法。
【請求項６５】
マルチアッセイ迅速抗菌剤感受性試験シーケンスを実施するための方法であって、前記方法は、以下：
微生物含有患者物質のサンプル又は培養サンプルを、試験パネルの複数だが全てではないウェルに植菌することであって、植菌したウェルのうち少なくとも２つのウェルがイオン性性質アッセイを規定し、ここで、少なくとも１つの試験ウェルは、ＭＨＢ及びコリスチンを含み、そして少なくとも１つの試験ウェルは、ＭＨＢを含むが抗菌剤を含まず、複数のウェルが、異なる抗菌剤についての多数の抗菌剤希釈系列を規定する；
植菌したサンプルをインキュベーションアセンブリ内でインキュベートしそして任意選択的に撹拌すること；
固定時間後、又は陽性増殖対照ウェル対陰性対照ウェルの吸光度及び／又は蛍光として決定した十分な増殖アッセイの１．０、１．０５、１．１、１．１５、１．２の比を達成するか又は超えた後に、イオン性性質アッセイウェル及び十分な増殖アッセイに用いなかった陽性増殖対照ウェルを含む複数のウェル内に代謝指示薬を添加し、インキュベーションを３０分間以上実施することであって、代謝指示薬は、十分な増殖アッセイのために使用される製剤とおよそ同等である製剤を含み、そしてこれは、以下：
１０μＭ〜１００ｍＭの間の濃度のレサズリン；
５０μＭ〜１Ｍの間の濃度の１−メトキシ−５−メチルフェナンジニウム（ｍｅｔｈｌｙｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ）メチルスルフェート（１−メトキシＰＭＳ）；
１００ｎＭ〜５μＭの間の濃度のメチレンブルー；
０．０００１％〜０．１％（ｗ／ｖ）の間の濃度のフェロシアン化物及びフェリシアン化物の各々を含む；
吸光度を５５０〜６５０ｎｍで読み取って、吸光度シグナル及び／又は代謝指示薬を蛍光シグナルＥｘ５６０／Ｅｍ５９０として決定して、十分な増殖アッセイ閾値の達成後に代謝指示薬が添加された複数のウェルにおいてバックグラウンド調整した蛍光シグナルを決定すること；
イオン性性質アッセイ比を、コリスチンにおいて増殖したサンプルのバックグラウンド減算した蛍光シグナルを、ＭＨＢにおいて増殖したサンプルのバックグラウンド減算した蛍光シグナルによって除算すること、又はコリスチンにおいて増殖したサンプルの吸光度シグナルをＭＨＢにおいて増殖したサンプルのシグナルによって除算することによって計算すること；
試験パネルの抗菌剤希釈系列を規定するウェルを、表面結合アッセイの開始前に事前処理することであって、ここで、イオン性性質アッセイ比が所定の閾値より高い場合、事前処理工程は、ＣＴＡＢによる処理を含み、及びイオン性比が所定の閾値を下回る場合、事前処理工程は、ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝化生理食塩水での処理を含む；
表面結合試薬を適用すること；
抗菌剤希釈系列の複数のウェルのそれぞれにおいて時間分解性蛍光シグナルを読み取ること；及び
時間分解性蛍光シグナルに基づいて、試験パネルに存在する抗菌剤についての最小阻害濃度（ＭＩＣ）を決定すること
を含む、方法。
【請求項６６】
前記所定の閾値が０．１〜０．３の間である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記所定の閾値が、０．０５、０．１、０．１５、０．２、及び０．２５である、請求項６５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年７月１１日出願の米国仮特許出願第６２／６９６，７３２号、表題「ＡＳＳＡＹＳ  ＡＮＤ  ＲＥＡＧＥＮＴＳ  ＦＯＲ  ＡＮＴＩＭＩＣＲＯＢＩＡＬ  ＳＵＳＣＥＰＴＩＢＩＬＩＴＹ  ＴＥＳＴＩＮＧ．」に対する優先権を主張する。この出願は、その全体が全ての目的のために本明細書中に参考として組み込まれる。
【０００２】
分野
本開示は、抗菌剤感受性試験についての方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
抗菌剤耐性の微生物感染は、感染した患者における疾病率の増大、死亡率及び医療費を含む、臨床成績の悪さに結びつく。米国のそのような施設におけるこれらの生物の蔓延は、過去３０年間にわたり増大している。微生物の表現型抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）は、臨床医に適切な治療レジメンを知らせるのに重要である。現行の方法を用いて、ＡＳＴ判定は、代表的に、最短で８時間を要し、多くの臨床的微生物学研究室における交代勤務ゆえに、一晩かかる処理となる。現行のＡＳＴ方法からの判定を待つ間、患者は、多くの場合、広い範囲の抗菌剤を投与され、これは、多くの場合、患者の健康に目立った有害効果を有し、かつ／又は抗菌剤耐性流行を拡大する。さらに、正確な抗菌剤治療情報を得るためのこの時間遅延は、患者が病院にいる時間を延長し、それによって、患者の費用及び不便性が増大する。
【０００４】
この背景に対して、政府及び産業ステークホルダーは、病院における抗菌剤世話役制度（ｓｔｅｗａｒｄｓｈｉｐ）を奨励する規則を提案している。しかし、抗菌剤世話役制度運動は、現行のＡＳＴ方法および抗菌剤処方業務の政変により、複雑化し得る。本発明者らは、以前、迅速なＡＤＴについての方法を開示した。これは、ＡＳＴ判定に必要とされる時間を短縮し得、抗菌剤世話役制度を促進し得る。例えば、微生物表面に結合する蛍光プローブを用いるＡＳＴ系及び方法は、本発明者らに所有される米国特許第９，８３４，８０８号に記載される。これらの系及び方法は、低費用のやり方でこの需要に向き合うために、好都合であり、既存のアッセイハードウェア要素と適合性であり得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第９，８３４，８０８号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
要旨
本開示は、例えば、抗菌剤耐性の獲得に起因して、微生物表面電荷における変動が大きい、迅速ＡＳＴシステム及び方法の改善を提供する。１つの局面において、本開示は、マルチアッセイ迅速抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）シーケンスを実施するための方法に関する。本方法は、臨床サンプルに由来する微生物を含むサンプルを、試験パネルの複数のウェル内に植菌することであって、複数のウェルの少なくとも１つは、疫学上カットオフ値を上回る濃度で陽イオン性抗菌剤を含み、及び複数のウェルの少なくとも１つは、抗菌剤を含まない；一定時間、試験パネルをインキュベートすること；試験パネルの陽イオン性抗菌剤を含む少なくとも１つのウェルにおける微生物の増殖の、微生物の増殖に対する比を決定することであって、比が、所定の閾値を上回る場合、試験パネルの残りの複数のウェルのうち少なくとも１つのウェルを、界面活性剤と接触させること；及び試験パネルの残りの複数のウェルのうち少なくとも１つのウェルにおけるサンプルの、少なくとも１つの表面積ベースの測定を実施することを、含み得る。
【０００７】
種々の実施形態において、界面活性剤は、臭化セチル−トリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、オクテニジン二塩酸塩、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ジメチルジオクラデシルアンモニウム、塩化メチルトリアルキル（Ｃ８−Ｃ１０）アンモニウム（ａｄｏｇｅｎ４６４）、塩化ベンゼトニウム、臭化セトリモニウム、及び臭化ジオクタデシルジメチルアンモニウムからなる群から選択され得る。本方法は、少なくとも１つの表面積ベースの測定を実施する前に、残りの複数のウェルのうち少なくとも１つのウェルから界面活性剤を除去する工程を、さらに含んでもよい。少なくとも１つの表面積ベースの測定を実施することは、残りのウェルのうち少なくとも１つを陽イオン性シグナリング薬剤と接触させることを含んでもよい。陽イオン性シグナリング薬剤は、ランタニドクリプテートであってもよく、少なくとも１つの表面積ベースの測定を実施することは、ランタニドクリプテートとサンプル中の微生物の表面との間の結合を検出することを含む。本方法は、比が所定の閾値を下回る場合、試験パネルの残りの複数のウェルのうち少なくとも１つのウェルを、脂肪族アルコールエトキシレート、ノノキシノール、オクチルフェノールエトキシレート（ｔｒｉｔｏｎ  ｘ−１００）、エトキシル化アミン、ポロロキサマー、グリセロールモノステアレート、グリセロールモノラウレート、ｓｐａｎ、ｔｗｅｅｎ、アルキルポリグリコシド、アミンオキシド、スルホキシド、及びホスフィンオキシドからなる群から選択される界面活性剤と接触させる工程をさらに含んでもよい。所定の比は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５又は０．６であってもよい。所定の比は、０．２〜０．４であってもよい。本方法は、試験パネルを一定時間インキュベートし、そして任意選択的に、増殖のレベルが所定の増殖閾値に達していない場合に、追加の時間、試験パネルをインキュベートした後で、試験パネルの複数のウェルのうち少なくとも１つにおける増殖レベルを評価する工程を、さらに含んでもよい。
【０００８】
別の局面において、本開示は、マルチアッセイ迅速抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）シーケンスを実施するための方法に関する。本方法は、微生物を含むサンプルを、試験パネルの複数のウェル内に植菌することであって、複数のウェルの少なくとも１つは、疫学上カットオフ値を上回る濃度でポリ陽イオン性抗菌剤を含み、及び複数のウェルの少なくとも１つは、抗菌剤を含まない；一定時間、試験パネルをインキュベートすること；試験パネルの陽イオン性抗菌剤を含む少なくとも１つのウェルにおける微生物の増殖の、抗菌剤を含まない少なくとも１つのウェルにおける微生物の増殖に対する比を決定すること；比が、所定の閾値を上回る場合、微生物の細胞膜の陰イオン電荷密度を増大すること；及び陽イオン性シグナリング薬剤の、試験パネルの残りの複数のウェルのうち少なくとも１つのウェルにおける微生物の細胞壁との結合を測定することを、含んでもよい。
【０００９】
種々の実施形態において、微生物の細胞膜の陰イオン電荷密度を増大する工程が、残りの複数のウェルのうち少なくとも１つのウェルを界面活性剤と接触させることを含んでもよい。界面活性剤は、臭化セチル−トリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、オクテニジン二塩酸塩、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ジメチルジオクラデシルアンモニウム、塩化メチルトリアルキル（Ｃ８−Ｃ１０）アンモニウム（ａｄｏｇｅｎ４６４）、塩化ベンゼトニウム、臭化セトリモニウム、及び臭化ジオクタデシルジメチルアンモニウムからなる群から選択され得る。本方法は、比が所定の閾値を下回る場合、試験パネルの残りの複数のウェルのうち少なくとも１つのウェルを、脂肪族アルコールエトキシレート、ノノキシノール、オクチルフェノールエトキシレート（ｔｒｉｔｏｎｘ−１００）、エトキシル化アミン、ポロロキサマー、グリセロールモノステアレート、グリセロールモノラウレート、ｓｐａｎ、ｔｗｅｅｎ、アルキルポリグリコシド、アミンオキシド、スルホキシド、及びホスフィンオキシドからなる群から選択される界面活性剤と接触させる工程をさらに含んでもよい。
【００１０】
別の局面において、本開示は、抗菌剤感受性試験のための試験パネルに関する。試験パネルは、各レザバが７５〜２００μｌの液体容量を収容するように構成されている、９６〜３８４の間のレザバを含んでもよく、少なくとも１つのレザバは、（ａ）少なくとも０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、２．５又は３μｇのポリ陽イオン性抗菌剤、又は（ｂ）少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０μｇのポリ陽イオン性抗菌剤を含んでもよい。ポリ陽イオン性抗菌剤は、コリスチンであってもよい。複数のレザバは、抗菌剤の群から選択される抗菌剤を含み得、複数のレザバは、抗菌剤の群のそれぞれについての希釈系列を規定し得る。少なくとも１つのレザバは、抗菌剤を含まなくてもよい。
【００１１】
別の局面において、本開示は、マルチアッセイ迅速抗菌剤感受性試験シーケンスを実施するための方法に関する。本方法は、臨床サンプルに由来する微生物を含むサンプルを、試験パネルの複数のウェル内に植菌することであって、試験パネルは、抗菌剤を含まない少なくとも１つの増殖対照ウェル、植菌後に疫学上カットオフ値を超える濃度をもたらすために十分な量でポリ陽イオン性抗菌剤を含む少なくとも１つの陰イオン性試験ウェル、及び複数の抗菌剤についての複数の希釈系列を規定する複数のウェルを含む；マルチアッセイ試験シーケンスを実施するための自動化迅速抗菌剤感受性試験システムに試験パネルをローディングすること；及び試験システムを実行して、植菌したサンプルをインキュベーションアセンブリ内でインキュベートしそして撹拌すること、所定の時間後、又は増殖対照ウェル中のサンプルのパラメータに応答して、インキュベーションを止めること、アニオン性試験ウェル対増殖対照ウェル内の微生物増殖の比を決定し、この比が所定の閾値を超える場合、試験パネルの残りのウェルのうち少なくとも１つを、微生物の実質的な溶解を伴わずに微生物の膜を破壊するために十分な濃度で、界面活性剤と接触させること、及び１つ以上のエンドポイント細胞表面アッセイを、試験パネル内のインキュベートしたサンプル上で実施すること、試験パネルの複数のウェル内のサンプルからの光出力を測定することであって、光出力は、複数のウェルのそれぞれに残る微生物の量に対応すること、及び複数のウェルのそれぞれに残る微生物及び複数の抗菌剤についての、最小阻害濃度及び／又は定性的感受性解釈の、少なくとも１つを報告することを、含んでもよい。
【００１２】
別の局面において、本開示は、マルチアッセイ迅速抗菌剤感受性試験シーケンスを実施するための方法に関する。本方法は、微生物含有患者物質のサンプル又はサブサンプルを、試験パネルの複数のウェル、陽イオン調整済のミューラー・ヒントン培地（ＭＨＢ）を含む少なくとも１つの試験ウェル、コリスチンを含む少なくとも１つの試験ウェル、及び抗菌剤希釈系列を規定する複数のウェルの内に植菌すること；代謝指示薬を、陽イオン調整済ＭＨＢ及びコリスチンを含むウェルに添加し、試験パネルを、微生物増殖に好適な条件下でインキュベートすること；代謝指示薬を、蛍光シグナルＥｘ５６０／Ｅｍ５９０として読み取り、バックグラウンド調整した蛍光シグナルを決定すること；コリスチン中で増殖したサンプルのバックグラウンドを減算した蛍光シグナルを、ＭＨＢ中で増殖したサンプルのバックグラウンドを減算した蛍光シグナルで除算して、陰イオン比を計算すること；試験パネルの抗菌剤希釈系列を規定するウェルを事前処理することであって、陰イオン比が所定の閾値を上回る場合、事前処理の工程は、臭化セチルトリメチルアンモニウムで処理することを含み、陰イオン比が所定の閾値を下回る場合、事前処理の工程は、１％  Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）を含むリン酸緩衝化生理食塩水での処理を含むこと；表面結合試薬を適用すること；抗菌剤希釈系列の複数のウェルの各々において、時間分解性蛍光シグナルを読み取ること；及び時間分解性蛍光シグナルに基づき、試験パネル中に存在する抗菌剤について最小阻害濃度（ＭＩＣ）を決定することを、含んでもよい。
【００１３】
種々の実施形態において、所定の閾値は、０．０５〜０．３の間であってもよい。所定の閾値は、０．０５、０．１、０．１５、０．２、及び０．２５であってもよい。
【００１４】
別の局面において、本開示は、マルチアッセイ迅速抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）シーケンスを実施するための方法に関する。本方法は、臨床サンプルに由来する微生物を含むサンプルを、イオン性性質アッセイを含む試験パネルの複数のウェル内に植菌することであって、試験パネルは、疫学上カットオフ値又は耐性ブレークポイント以上の濃度で陽イオン性抗菌剤を含む１つ以上のウェル、及び抗菌剤を含まない１つ以上のウェルを含むこと；一定時間、試験パネルをインキュベートすること；陽イオン性抗菌剤を含む試験パネルの少なくとも１つのウェルにおける微生物増殖の、抗菌剤を含まないウェルにおける微生物増殖に対するイオン性性質比を決定すること；イオン性性質アッセイ比が所定の閾値を上回る場合、試験パネルの残りの複数のウェルのうち少なくとも１つのウェルを界面活性剤と接触させること；及び試験パネルの残りの複数のウェルのうち少なくとも１つのウェルにおけるサンプルの、少なくとも１つの表面積ベースの測定を実施することを、含んでもよい。
【００１５】
別の局面において、本開示は、マルチアッセイ迅速抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）シーケンスを実施するための方法に関する。本方法は、臨床サンプルに由来する微生物を含むサンプルを、イオン性性質アッセイを含む試験パネルの複数のウェル内に植菌することであって、試験パネルは、疫学上カットオフ値又は耐性ブレークポイント以上の濃度で陽イオン性抗菌剤を含む１つ以上のウェル、及び抗菌剤を含まない１つ以上のウェルを含むこと；一定時間、試験パネルをインキュベートすること；陽イオン性抗菌剤を含む試験パネルの少なくとも１つのウェルにおける微生物増殖の、抗菌剤を含まないウェルにおける微生物増殖に対するイオン性性質比を決定すること；イオン性性質アッセイ比が、所定の閾値を上回る場合、微生物の細胞膜の陰イオン電荷密度を増大すること；及び陽イオン性シグナリング薬剤の、試験パネルの残りの複数のウェルのうち少なくとも１つのウェルにおける微生物の細胞壁との結合を測定することを、含んでもよい。
【００１６】
種々の実施形態において、微生物の細胞膜の陰イオン電荷密度を増大する工程は、残りの複数のウェルのうち少なくとも１つのウェルを界面活性剤と接触させることを含んでもよい。イオン性性質アッセイにおける陽イオン性抗菌剤は、ポリ陽イオン性であってもよい。陽イオン性抗菌剤は、１つ以上のポリミキシンＡ〜Ｅを含んでもよいが、これらに限定されない。陽イオン性抗菌剤は、１つ以上のコリスチン（ポリミキシンＥ）又はポリミキシンＢであってもよい。イオン性性質アッセイの陽イオン性抗菌剤最低濃度は、２μｇ／ｍＬ以上であってもよい。イオン性性質アッセイの陽イオン性抗菌剤最低濃度は、３６μｇ／ｍＬ以下であってもよい。イオン性性質アッセイは、異なる陽イオン性抗菌剤濃度を有する２つのウェルを含んでもよい。イオン性性質アッセイは、コリスチンを８μｇ／ｍＬ及び１６μｇ／ｍＬで含んでもよい。イオン性性質アッセイにおける微生物増殖は、吸光度及び／又は代謝指示薬によって決定され得る。代謝指示薬は、レサズリンを含み得る。レサズリン濃度は、１０μＭ〜１００ｍＭの間であってもよい。代謝指示薬は、代謝プローブ製剤をさらに含み得、これはさらに、１−メトキシ−５−メチルフェナンジニウム（ｍｅｔｈｌｙｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ）メチルスルフェート（１−メトキシＰＭＳ）を、５０μＭ〜１Ｍの間の濃度で；メチレンブルーを、１００ｎＭ〜５μＭの間の濃度で；そしてフェロシアン化物及びフェリシアン化物のそれぞれを、０．０００１％〜０．１％（ｗ／ｖ）の間の濃度で含む。３０分間〜６時間のインキュベーションを、複数のイオン性性質アッセイウェルへの代謝指示薬の添加の後に行ってもよい。
【００１７】
種々の実施形態において、本方法は、培地を含むが抗菌剤及び微生物を含まない１つ以上の対照ウェル、ならびに培地及び微生物を含むが微生物を含まない１つ以上のアッセイウェルを含む、十分な増殖アッセイを実施することをさらに含んでもよく、ここで、複数の十分な増殖アッセイウェルに対して、パネルインキュベーションの開始から２時間以内に代謝指示薬が添加されてもよく、吸光度及び／又は蛍光のアッセイ対対照ウェルの比が所定の閾値と比較されて、それにより、閾値が達成されている場合は十分な増殖が達成されていることが判定され、閾値が達成されていない場合には、吸光度及び／又は蛍光測定が再度実施される前に、３０分間〜４時間の時間、サンプルがインキュベートされ、十分な増殖閾値が達成されるか又は１２か月が経過するまでこのプロセスを繰り返す。十分な増殖アッセイ閾値は、１、１．０５、１．１１、１．１５、１．２であり得る。代謝指示薬は、レサズリンを含んでもよい。レサズリン濃度は、１０μＭ〜１００ｍＭの間であってもよい。代謝指示薬は、代謝プローブ製剤をさらに含み、これはさらに、１−メトキシ−５−メチルフェナンジニウム（ｍｅｔｈｌｙｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ）メチルスルフェート（１−メトキシＰＭＳ）を５０μＭ〜１Ｍの間の濃度で；メチレンブルーを１００ｎＭ〜５μＭの間の濃度で；そしてフェロシアン化物及びフェリシアン化物のそれぞれを、０．０００１％〜０．１％（ｗ／ｖ）の間の濃度でさらに含んでもよい。イオン性性質アッセイのために使用される代謝指示薬の製剤は、十分な増殖アッセイのために使用されるものとほぼ同じであってもよい。イオン性性質アッセイは、パネル内の異なる抗菌剤の希釈系列を含む複数のウェル上で実施される生存アッセイと並行して、及びおよそ同じ代謝指示薬を用いて実施されてもよい。イオン性性質アッセイ比が所定の閾値と同じか又はこれを上回る場合に、添加される界面活性剤は臭化セチル−トリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、オクテニジン二塩酸塩、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ジメチルジオクラデシルアンモニウム、塩化メチルトリアルキル（Ｃ８−Ｃ１０）アンモニウム（ａｄｏｇｅｎ４６４）、塩化ベンゼトニウム、臭化セトリモニウム、及び臭化ジオクタデシルジメチルアンモニウムからなる群から選択されてもよい。界面活性剤は、ＣＴＡＢであってもよい。ＣＴＡＢ濃度は、０．００１％〜１％、例えば、０．０１％〜０．１％の間であってもよい。界面活性剤を含む配合物は、金属イオンキレート剤をさらに含み得る。金属イオンキレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ)であり得る。ＥＤＴＡ濃度は、０．００１〜１Ｍ、０．０１〜０．５Ｍの間であってもよい。
【００１８】
種々の実施形態において、本方法は、イオン性性質アッセイ比が所定の閾値を下回る場合に、試験パネルの残りの複数のウェルのうち少なくとも１つのウェルを、脂肪族アルコールエトキシレート、ノノキシノール、オクチルフェノールエトキシレート（ｔｒｉｔｏｎｘ−１００）、エトキシル化アミン、ポロロキサマー、グリセロールモノステアレート、グリセロールモノラウレート、ｓｐａｎ、ｔｗｅｅｎ、アルキルポリグリコシド、アミンオキシド、スルホキシド及びホスフィンオキシドからなる群から選択される界面活性剤と接触させる工程を、さらに含んでもよい。界面活性剤は、ｔｗｅｅｎ−２０（ポリソルベート２０）であってもよい。Ｔｗｅｅｎ濃度は、０．００１〜１％の間であってもよい。イオン性性質アッセイの所定の閾値比は、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５又は０．６であってもよい。所定の閾値比は、０．１〜０．３であってもよい。本方法は、少なくとも１つの表面積ベースの測定を実施する前に、残りの複数のウェルのうち少なくとも１つのウェルから界面活性剤を除去する工程をさらに含んでもよい。少なくとも１つの表面積ベースの測定を実施することは、残りのウェルのうち少なくとも１つを陽イオン性シグナリング薬剤と接触させることを含んでもよい。陽イオン性シグナリング薬剤は、ランタニドクリプテートであってもよく、少なくとも１つの表面積ベースの測定を実施することは、ランタニドクリプテートとサンプル中の微生物の表面との間の結合を検出することを含んでもよい。微生物は、グラム陰性であってもよい。
【００１９】
別の局面において、本開示は、抗菌剤感受性試験のための試験パネルに関する。このパネルは、各レザバが７５〜２５０μｌの液体容量を収容するように構成されている、９６〜３８４の間のレザバを含んでもよく、少なくとも１つのレザバは、（ａ）少なくとも０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、２．５又は３μｇのポリ陽イオン性抗菌剤、又は（ｂ）少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０μｇのポリ陽イオン性抗菌剤を含んでもよい。ポリ陽イオン性抗菌剤は、ポリミキシンである。ポリ陽イオン性抗菌剤は、コリスチン及び／又はポリミキシンＢであってもよい。複数のレザバは、抗菌剤の群から選択される抗菌剤を含んでもよく、複数のレザバは、抗菌剤の群のそれぞれについての希釈系列を規定してもよい。少なくとも１つ試験パネルは、抗菌剤を含まなくてもよい。
【００２０】
別の局面において、本開示は、マルチアッセイ迅速抗菌剤感受性試験シーケンスを実施するための方法に関する。本方法は、臨床サンプルに由来する微生物を含むサンプルを、増殖培地は含むが微生物は含まない１つ以上の陰性対照ウェルを除いて、試験パネルの複数のウェル内に植菌することであって、ここで、試験パネルは、抗菌剤を含まない少なくとも２つの陽性増殖ウェル；ポリ陽イオン性抗菌剤を、植菌後、疫学上カットオフ値又は耐性ブレークポイントを超える濃度をもたらすために十分な量で含む少なくとも１つのイオン性性質ウェル；及び複数の抗菌剤についての複数の希釈系列を規定する複数のウェルを含む。マルチアッセイ試験シーケンスを実施するための自動化迅速抗菌剤感受性試験システムに試験パネルをローディングすること；及び試験システムを実行して、以下：陰性対照ウェル及び陽性対照ウェルに代謝指示薬を添加することであって、代謝指示薬は：１０μＭ〜１００ｍＭの間の濃度のレサズリン；５０μＭ〜１Ｍの間の濃度の１−メトキシ−５−メチルフェナンジニウム（ｍｅｔｈｌｙｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ）メチルスルフェート（１−メトキシＰＭＳ）；１００ｎＭ〜５μＭの間の濃度のメチレンブルー；０．０００１％〜０．１％（ｗ／ｖ）の間の濃度のフェロシアン化物及びフェリシアン化物の各々を含む；植菌したサンプルをインキュベーションアセンブリ内でインキュベートしそして任意選択的に撹拌すること；所定の時間後、又は陽性増殖対照ウェル対陰性対照ウェルの吸光度及び／又は蛍光として決定した十分な増殖アッセイの１．０、１．０５、１．１、１．１５、１．２の比を達成するか又は超えた後に、イオン性性質アッセイウェル及び十分な増殖アッセイに用いなかった陽性増殖対照ウェルを含む複数のウェル内に代謝指示薬を添加し、インキュベーションを３０分間以上実施することであって、代謝指示薬は、十分な増殖アッセイのために使用される製剤とおよそ同等である製剤を含む；複数のウェルの吸光度及び／又は蛍光を決定して、イオン性性質アッセイウェル対増殖対照ウェルにおける微生物増殖の比として規定されるイオン性性質アッセイ比を計算し、この比が所定の閾値と同じか又はこれを上回る場合、試験パネルの残りのウェルのうち少なくとも１つを微生物の実質的な溶解を伴わずに微生物の膜を破壊するために十分な濃度で界面活性剤と接触させ、そして、イオン性性質アッセイ比が所定の閾値を下回る場合、試験パネルの残りのウェルのうち少なくとも１つを、異なる濃度の界面活性剤と接触させること；及び試験パネルにおけるインキュベートしたサンプル上で、１つ以上のエンドポイント細胞表面アッセイを実施すること；試験パネルの複数のウェル内のサンプルからの光出力を測定することであって、光出力は、複数のウェルのそれぞれに残る微生物の量に対応すること；及び複数のウェルのそれぞれに残る微生物及び複数の抗菌剤についての、最小阻害濃度及び／又は定性的感受性解釈の、少なくとも１つを報告することを、含んでもよい。別の局面において、本開示は、マルチアッセイ迅速抗菌剤感受性試験シーケンスを実施するための方法に関する。本方法は、微生物含有患者物質のサンプル又は培養サンプルを、試験パネルの複数だが全てではないウェルに植菌することであって、植菌したウェルのうち少なくとも２つのウェルがイオン性性質アッセイを規定し、ここで、少なくとも１つの試験ウェルは、ＭＨＢ及びコリスチンを含み、そして少なくとも１つの試験ウェルは、ＭＨＢを含むが抗菌剤を含まず、複数のウェルが、異なる抗菌剤についての多数の抗菌剤希釈系列を規定する；植菌したサンプルをインキュベーションアセンブリ内でインキュベートしそして任意選択的に撹拌すること；固定時間後、又は陽性増殖対照ウェル対陰性対照ウェルの吸光度及び／又は蛍光として決定した十分な増殖アッセイの１．０、１．０５、１．１、１．１５、１．２の比を達成するか又は超えた後に、イオン性性質アッセイウェル及び十分な増殖アッセイに用いなかった陽性増殖対照ウェルを含む複数のウェル内に代謝指示薬を添加し、インキュベーションを３０分間以上実施することであって、代謝指示薬は、十分な増殖アッセイのために使用される製剤とおよそ同等である製剤を含み、そしてこれは、以下：１０μＭ〜１００ｍＭの間の濃度のレサズリン；５０μＭ〜１Ｍの間の濃度の１−メトキシ−５−メチルフェナンジニウム（ｍｅｔｈｌｙｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ）メチルスルフェート（１−メトキシＰＭＳ）；１００ｎＭ〜５μＭの間の濃度のメチレンブルー；０．０００１％〜０．１％（ｗ／ｖ）の間の濃度のフェロシアン化物及びフェリシアン化物の各々を含む；吸光度を５５０〜６５０ｎｍで読み取って、吸光度シグナル及び／又は代謝指示薬を蛍光シグナルＥｘ５６０／Ｅｍ５９０として決定して、十分な増殖アッセイ閾値の達成後に代謝指示薬が添加された複数のウェルにおいてバックグラウンド調整した蛍光シグナルを決定すること；イオン性性質アッセイ比を、コリスチンにおいて増殖したサンプルのバックグラウンド減算した蛍光シグナルを、ＭＨＢにおいて増殖したサンプルのバックグラウンド減算した蛍光シグナルによって除算すること、又はコリスチンにおいて増殖したサンプルの吸光度シグナルをＭＨＢにおいて増殖したサンプルのシグナルによって除算することによって計算すること；試験パネルの抗菌剤希釈系列を規定するウェルを、表面結合アッセイの開始前に事前処理することであって、ここで、イオン性性質アッセイ比が所定の閾値より高い場合、事前処理工程は、ＣＴＡＢによる処理を含み、及びイオン性比が所定の閾値を下回る場合、事前処理工程は、ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝化生理食塩水での処理を含む；表面結合試薬を適用すること；抗菌剤希釈系列の複数のウェルのそれぞれにおいて時間分解性蛍光シグナルを読み取ること；及び時間分解性蛍光シグナルに基づいて、試験パネルに存在する抗菌剤についての最小阻害濃度（ＭＩＣ）を決定することを、含んでもよい。種々の実施形態において、所定の閾値は、０．１〜０．３の間であってもよい。所定の閾値は、０．０５、０．１、０．１５、０．２、及び０．２５であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ユーロピウムクリプテートジアミンプローブを示す。
【図２】それぞれ、ミューラー・ヒントン培地（ＭＨＢ）又は生理食塩水中のいずれかで培養された、標準的表面陰イオン電荷を有する微生物であるＥ．コリ（Ｅ  ｃｏｌｉ）について、及び低陰イオン電荷を有する微生物であるＰ．ミラビリス（Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）についての、３３０／６１５ｎｍにおける時間分解性蛍光（ＴＲＦ）シグナルを示す。Ｅ．コリは、ユーロピウムプローブによって十分に結合されており、したがって、最近が増殖する条件（ＭＨＢ）において、細菌が存在しない条件（生理食塩水）に対し、高いシグナルを示す。しかし、低陰イオン電荷生物であるＰ．ミラビリスは、ＭＨＢ及び生理食塩水の両条件において低いＴＲＦシグナルを示し、このことは、ユーロピウムプローブの結合が乏しいことを示す。
【図３】ＭＨＢ又は生理食塩水中でインキュベートし、ユーロピウムクリプテートプローブの適用の前に臭化セチル−トリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）で事前処理した、Ｐ．ミラビリスサンプルについてのＴＲＦシグナルを示す。グラフが示す通り、ＣＴＡＢ処理は、ユーロピウムクリプテートプローブの結合を示すＭＨＢ条件における増殖を明らかにする。
【図４】ＣＴＡＰ処理したＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）バンコマイシン（ＶＡＮ）希釈系列についてのＴＲＦシグナルを示す。１つの条件において、ＣＴＡＢを、ユーロピウムクリプテートプローブの適用前に除去した；他の条件において、ＣＴＡＢを、除去しなかった。ＶＡＮで処理した場合、Ｓ．アウレウスは、２μｇ／ｍｌの最小阻害濃度（ＭＩＣ）を有した。右に示すＣＴＡＢ除去条件において、シグナルの用量依存的減少が観察され、最小シグナルは、２μｇ／ｍｌ及び最低濃度において観察された。同じ関係性は、ＣＴＡＢが除去されなかった条件では観察されず、残留したＣＴＡＢが、ユーロピウムクリプテートプローブの結合又はシグナル発生に干渉した場合があることを示す。
【図５】ピペラシリンータゾバクタム（ＴＺＰ）及びアジスロマイシン（ＡＴＭ）のＥ．コリ希釈系列についてのＴＲＦシグナルを示す。各希釈系列は、ＭＨＢ（抗菌剤なし）及び生理食塩水の条件を含み、各抗菌剤については、２つの条件を評価した：ＣＴＡＢによる事前処理及びリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳＴ）による事前処理。ＴＺＰについてのＭＩＣ値は、一般に、試験したＥ．コリ株について１〜４μｇ／ｍｌの間に及び、他方で、ＡＴＭ  ＭＩＣ値は、一般に、０．２５μｇ／ｍｌ以下である。ユーロピウムクリプテートプローブシグナルにおける用量依存的減少が、ＰＢＳＴで事前処理したＴＺＰ希釈系列について観察される；希釈系列をＣＴＡＢで事前処理した場合、効果は、はっきりしない。ＡＴＭ希釈系列において、最低のＡＴＭ濃度は、ＭＩＣ値以上であるが、類似のユーロピウムクリプテートプローブシグナルは、ＰＢＳＴ事前処理条件において全ての濃度で観察される；ｓｉｇｎａｌｓｉｎｔｈｅＣＴＡＢ条件におけるシグナルは、識別可能な用量関係性がなく、より変動的であった。
【図６】本開示の例示的ＡＳＴ方法を図示し、これは、サンプル中の微生物の相対的陰イオン電荷（例えば、「陰イオン比」）を、陽イオン性プローブ、例えばユーロピウムクリプテートジアミンを用いる表面積アッセイ前の、決定、ＣＴＡＢ選択、又は他の事前処理に基づき、決定する工程を含む。
【図７】Ｐ．ミラビリス及びＫ．ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）におけるゲンタマイシン（ＧＥＮ）及びシプロフラキシン（ｃｉｐｒｏｆｌａｘｉｎ）（ＣＩＰ）希釈系列についてのＴＲＦシグナル発生を示す。各微生物についての事前処理条件を、４μｇ／ｍｌコリスチン中で増殖したサンプルのバックグラウンド減算した蛍光シグナル（Ｅｘ５６０／Ｅｍ５９０）をＭＨＢ中で増殖した細菌のバックグラウンド減算した蛍光シグナルで除算して計算した陰イオン比に基づいて、選択した。Ｐ．ミラビリスは、０．９６の陰イオン比を有しており、低コリスチン感受性を示していて、低い表面陰イオン電荷を示唆している。Ｋ．ニューモニエについての陰イオン比は、−０．０８であり、高い陰イオン電荷を示唆している。これらの比に基づき、Ｐ．ミラビリスのサンプルを、ＣＴＡＢで前処理し、他方で、Ｋ．ニューモニエのサンプルはしなかった。希釈系列は、各抗菌剤についての既知のＭＩＣ値と一致する用量関係性を示した。このことは、それぞれの場合において、事前処理条件が、プローブの結合及び検出のために適切であったことを示す。
【図８】ユーロピウムクリプテートによる表面結合後の、示した通りＣＴＡＢ又はＰＢＳＴによる処理後の、示した生物を含むウェルからのシグナル対陰性対照の植菌なしのウェルとの比を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
説明
概説
本発明者らは、図１に示す、以前に記載した、陽イオン性の表面結合シグナリング薬剤、例えばユーロピウムクリプテートジアミンを使用する迅速ＡＳＴのためのシステム及び方法を有する。いかなる理論にもとらわれることを望まないが、これらのシグナリング薬剤は、好適な条件下で、化学両論的に微生物細胞膜と結合し得、微生物増殖の測定を、細胞分裂対フィラメント形成又は膨張などの異なる増殖様式間での相違に対する十分な正確さをもって、可能にし得る。
【００２３】
当業者らは、特定の微生物、例えばＰ．ミラビリスが、例えば、Ｅ．コリなどと比較して、比較的低い表面陰イオン電荷を示すことを、理解する。さらに、特定の突然変異、例えば陽イオン性抗菌剤、例えばコリスチンに対する耐性を付与する突然変異は、表面アニオン性電荷を低下させ得る。これらの設定のそれぞれにおいて、微生物細胞膜のアニオン電荷における変化は、陽イオン性シグナリング薬剤の結合のレベルにおいて変化をもたらし、そして結果として、このような結合に関するシグナルにおける変化をもたらし、これは、陽イオン性シグナリング薬剤を用いるＡＳＴ方法を、複雑化する場合がある。
【００２４】
再び、いかなる理論にもとらわれることなく、本発明者らは、特定の陽イオン性界面活性剤が、微生物細胞膜の陰イオン電荷を増大することができ、迅速なＡＳＴのために、陽イオン性シグナリング薬剤の結合を容易にする。しかし、全ての陽イオン性界面活性剤が迅速ＡＳＴに適合性ではなく、いくつかの場合、陽イオン性界面活性剤の使用は、陽イオン性シグナリング薬剤の結合に干渉し得る。陽イオン性界面活性剤が、全体的に例示として使用されるが、陽イオン性及び／又は陰イオン性の界面活性剤もまた、使用され得る。
【００２５】
本開示の特定の実施形態にしたがう迅速ＡＳＴ方法は、以下の工程を含み、図６に模式的に示される：まず、（ａ）抗菌剤を含まない少なくとも１つのレザバ、又は増殖対照レザバ、及び（ｂ）微生物の陰イオン表面電荷に依存して微生物の増殖に異なった影響を及ぼす試薬（例えば、低い陰イオン表面電荷を有する微生物と比較してより高い陰イオン電荷を有する微生物の増殖を低減する）を含む、少なくとも１つの試験レザバを含めた複数のレザバを含む、ＡＳＴ試験パネル上に、微生物含有サンプルを植菌する。
【００２６】
試験パネルはまた、代表的に、複数の抗菌剤についての希釈系列を規定する複数のレザバを含み、そして本開示のＡＳＴ方法は、一般に、希釈系列にわたって各抗菌剤における微生物増殖を評価し、各抗菌剤についての最小阻害濃度及び、任意選択的に、ブレークポイント濃度を決定することを含む。抗菌剤希釈系列について微生物増殖を評価する前に、試験パネルを、一定時間、微生物増殖について適切な条件下（例えば、２５度、３０度、３５度、３７度などの温度（摂氏））でインキュベートし、任意選択的に、インキュベーション時間の少なくとも一部の間、撹拌する。インキュベーション後、微生物増殖を、少なくとも１つの増殖対照レザバにおいて評価する。増殖が、所定の最小レベルを満たしているか又は超えている場合、試験レザバ内の増殖のレベルを増殖対照レザバ内の増殖のレベルと比較することにより、微生物の陰イオン電荷の評価を行う。この比較に基づき、サンプル調製手順を選択する；低陰イオン電荷を有することが判明したサンプルについて、サンプル調製手順は、試験パネルの残りのレザバを陽イオン性界面活性剤で処理してレザバ内で界面活性剤を微生物細胞膜に結合させる工程、及び、陽イオン性検出試薬によりレザバを処理する前に、過剰なイオン性界面活性剤を除去する工程を、含む。
【００２７】
陰イオン表面電荷に依存して微生物の増殖に異なった影響を及ぼす試薬としては、陽イオン性抗菌剤、例えばコリスチンが、挙げられ得る。コリスチン耐性の特定の形態は、細胞膜の陰イオン電荷における低下をもたらし、コリスチンの有効性を低下させて、同じ株のコリスチン感受性微生物について規定されたコリスチンの臨床ブレークポイント濃度を上回る濃度への曝露に対して、その微生物が生存することを可能にする。本開示のいくつかの実施形態において、患者サンプルにおける微生物が既知である場合、試験ウェルは、この既知の微生物についてのブレークポイント濃度を上回るコリスチンの量を含む。微生物が未知である場合、試験ウェルは、例えば、最も高い既知の又は最も高い受容可能なブレークポイント濃度及び／又は最も低い既知の又は最も低い受容可能なブレークポイント濃度を上回る量のコリスチンを含む。あるいは、試験パネルは、既知の又は受容可能なブレークポイント濃度の範囲をわたるコリスチンの希釈系列を規定する複数の試験ウェルを含む。陰イオン表面電荷に基づいて微生物増殖に異なった影響を及ぼし得る他の試薬としては、ポリミキシンＢ、ポリミキシンＥ、陽イオン性抗菌剤ペプチド、でフェンシン及び／又はカテリシジンが挙げられる。
【００２８】
いくつかの場合、試薬に応答して異なる微生物増殖に基づいて陰イオン電荷を評価するよりもむしろ、陰イオン電荷を、微生物の別の既知の特性から推論する。特定のグラム陰性微生物は、例えば、グラム陽性微生物よりもコリスチン耐性が起きやすい場合があり、したがって、グラム染色に陰性であることが既知の微生物は、本開示のいくつかの実施形態において、ＣＴＡＢ前処理決定の目的で、低い陰イオン電荷微生物であると推定される。他の実施形態において、微生物の陰イオン電荷は、ＡＴＰ、ＮＡＤ、ＮＡＤＨ、遺伝物質及び／又は酵素活性のアッセイ、又はこれらについてのアッセイから、推察される。
【００２９】
本開示の方法において使用される陽イオン性界面活性剤は、臭化セチル−トリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、オクテニジン二塩酸塩、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ジメチルジオクラデシルアンモニウム、塩化メチルトリアルキル（Ｃ８−Ｃ１０）アンモニウム（ａｄｏｇｅｎ４６４）、塩化ベンゼトニウム、臭化セトリモニウム、又は臭化ジオクタデシルジメチルアンモニウムであってもよい。いくつかの場合、高い濃度のこれらの界面活性剤への曝露は、細胞溶解をもたらし得、そして遊離の界面活性剤は、陽イオン性シグナル発生試薬に結びつき得る。したがって、本開示のいくつかの実施形態において、陽イオン性界面活性剤は、限られた時間にわたって、及び／又は有意な細胞溶解が観察される濃度未満で、ＡＳＴ試験パネルに適用される。本開示の方法はまた、陽イオン性界面活性剤が除去された後かつ陽イオン性シグナリング薬剤が試験パネルのレザバに適用される前に、１回以上のすすぎを含んでもよい。
【００３０】
微生物
感染は、微生物（例えば、細菌、真菌、古細菌及び原生動物）起源の任意の感染病原体を含み得る。いくつかの実施例において、感染病原体は、細菌、例えばグラム陽性菌、グラム陰性菌、及び不定形細菌である。抗菌剤耐性微生物は、抗菌剤（すなわち、抗細菌薬、抗真菌薬、抗古細菌薬及び抗原生動物薬）に耐性の微生物であり得る。
【００３１】
微生物（例えば、微生物の液体懸濁剤）はまた、１つの株の微生物を含んでもよい。微生物は、１つの種の微生物を含んでもよい。微生物は、１つを超える株の微生物を含んでもよい。微生物は、１つの目の微生物を含んでもよい。微生物は、１つの綱の微生物を含んでもよい。微生物は、１つの科の微生物を含んでもよい。微生物は、１つの界の微生物を含んでもよい。
【００３２】
微生物（例えば、微生物の液体懸濁剤）はまた、１つを超える株の微生物を含んでもよい。微生物は、１つを超える種の微生物を含んでもよい。微生物は、１つを超える属の微生物を含んでもよい。微生物は、１つを超える目の微生物を含んでもよい。微生物は、１つを超える綱の微生物を含んでもよい。微生物は、１つを超える科の微生物を含んでもよい。微生物は、１つを超える界の微生物を含んでもよい。
【００３３】
微生物は、細菌であってもよい。細菌の例としては、限定されないが、以下が挙げられる：アセトバクタ―・アウランティウス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｕｒａｎｔｉｕｓ）、アシネトバクター・ビツメン（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂｉｔｕｍｅｎ）、アシネトバクターｓｐｐ．、アクチノミセス・イスラエリ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｉｉ）、アクチノミセスｓｐｐ．、アエロコッカスｓｐｐ．（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、アグロバクテリウム・ラジオバクタ―（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム・ツイメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、アナプラズマ（Ａｎａｐｌａｓｍａ）、アナプラズマ・ファゴサイトフィラム（Ａｎａｐｌａｓｍａ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ）、アゾリゾビウム・カウリノダンス（Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｃａｕｌｉｎｏｄａｎｓ）、アゾトバクター・ビンラジ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、バシラス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、バシラス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バシラス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バシラス・フシフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ）、バシラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バシラス・ミコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｙｃｏｉｄｅｓ）、バシラスｓｐｐ．、バシラス・ステアロテルモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バシラス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシラス・サリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、バクテロイデス・ジンジバリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、バクテロイデス・メラニノゲニカス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ）（プレボテラ・メラニノゲニカ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ）としても知られる）、バルトネラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）、バルトネラ・ヘンセラエ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｈｅｎｓｅｌａｅ）、バルトネラ・クインタナ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｑｕｉｎｔａｎａ）、バルトネラｓｐｐ．、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ボルデテラ・ブロンキセプティカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、ボルデテラ・ペルツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボルデテラｓｐｐ．、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、ブルセラ・アボルツス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）、ブルセラ・メリテンシス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）、ブルセラｓｐｐ．、ブルセラ・スイス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ）、ブルクホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉ）、ブルクホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）、ブルクホルデリア・マレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ）、ブルクホルデリア・シュードマレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、カリマトバクテリウム・グラヌロマティス（Ｃａｌｙｍｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｌｉ）、カンピロバクター・フェタス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｔｕｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・ピロリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、カンピロバクターｓｐｐ．、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、クラミジアｓｐｐ．、クラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クラミドフィラ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）、クラミドフィラ・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（かつては、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と呼ばれていた）、クラミドフィラ・シタッシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）（かつてはクラミジア・シタッシ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）と呼ばれていた）、クラミドフィラｓｐｐ．、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、クロストリジウム・ボツリナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、クロストリジウム・ペルフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）（かつては、クロストリジウム・ウェルチ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｗｅｌｃｈｉｉ）と呼ばれていた）、クロストリジウムｓｐｐ．、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム・ジフテリアエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コリネバクテリウム・フシホルメ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｅ）、コリネバクテリウムｓｐｐ．、コキセラ・ブルネティ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉ）、エーリキア・カフェンシス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ）、エーリキアｓｐｐ．、エンテロバクター・クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、エンテロバクターｓｐｐ．、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス・アビウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｖｉｕｍ）、エンテロコッカス・デュランス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｕｒａｎｓ）、エンテロコッカス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・ファエシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・マロラタス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｌｏｒａｔｕｓ）、エンテロコッカスｓｐｐ．、エシエリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、フランシセラｓｐｐ．（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、ガルデネレラｓｐｐ．（Ｇａｒｄｅｎｅｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ガルデネレラ・バジナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、ヘモフィラスｓｐｐ．（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｕｓ  ｓｐｐ．）、ヘモフィラス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ヘモフィラス・デュクレイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ）、ヘモフィラス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィラス・パラインフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィラス・ペルツシス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、へモフィラス・バジナリス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、ヘリコバクターｓｐｐ．、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラｓｐｐ．、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバシラス・アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバシラス・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバシラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバシラスｓｐｐ．、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、レジオネラｓｐｐ．、レプトスピラｓｐｐ．（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐｐ．）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリアｓｐｐ．、メタノバクテリウム・エクストロクエンス（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｒｏｑｕｅｎｓ）、マイクロバクテリウム・マルチホルム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ）、マイクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）、モラクセラ・カタリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、マイコバクテリウム・ジフテリアエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、マイコバクテリウム・イントラセルラレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバクテリウム・レプラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）、マイコバクテリウム・レプラエムリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅｍｕｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム・フレイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｌｅｉ）、マイコバクテリウム・スメグマティス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、マイコバクテリウムｓｐｐ．、マイコバクテリウム・ツベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃ��ｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、マイコプラズマ・ゲニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、マイコプラズマ・ホルミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・ペネトランス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｅｎｅｔｒａｎｓ）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、マイコプラズマｓｐｐ．、ネイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ネイセリア・ゴノロホエアエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ネイセリア・メニンギチティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ネイセリアｓｐｐ．、ノカルジアｓｐｐ．（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｓｐｐ．）、パステウレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、パステウレラ・ムルコシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄ）、パステウレラｓｐｐ．、パステウレラ・ツラレンシス（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、ペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、プレボテラ・メラニノゲニカ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ）（かつては、バクテロイデス・メラニノゲニカス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ）と呼ばれていた）、プロテウスｓｐｐ．（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｓｐｐ．）、シュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナスｓｐｐ．、リゾビウム・ラジオバクタ―（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、リケッチア・プロワゼキ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、リケッチア・シタッシ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）、リケッチア・クインタナ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｑｕｉｎｔａｎａ）、リケッチア・リケッチ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、リケッチアｓｐｐ．、リケッチア・トラコマエ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｅ）、ロカリマエア（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ）、ロカリマエア・ヘンセラエ（Ｒｏｃｈａ
ｌｉｍａｅａ  ｈｅｎｓｅｌａｅ）、ロカリマエア・クインタナ（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ  ｑｕｉｎｔａｎａ）、ロチア・デントカリオサ（Ｒｏｔｈｉａ  ｄｅｎｔｏｃａｒｉｏｓａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、サルモネラ・エンテリチディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、サルモネラｓｐｐ．、サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、サルモネラ・・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、シゲラ・ディセンテリアエ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、シゲラｓｐｐ．、スピリラム・ボルタンス（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｖｏｌｕｔａｎｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピダーミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカスｓｐｐ．、ステノトロホモナス・マルトフィラ（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、ステノトロホモナスｓｐｐ．、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・アビウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｖｉｕｍ）、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｕｓ）、ストレプトコッカス・フェシウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｃｅｉｕｍ）、ストレプトコッカス・ファエカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・フェラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｅｒｕｓ）、ストレプトコッカス・ガリナラム（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、ストレプトコッカス・ラクチス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ストレプトコッカス・ミチオル（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｏｒ）、ストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ）、ストレプトコッカス・ムタンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・オラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ラタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｔｔｕｓ）、ストレプトコッカス・サリバリアス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・サンギス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｓ）、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｂｒｉｎｕｓ）、ストレプトコッカスｓｐｐ．、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、トレポネーマ・デンチコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、トレポネーマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、トレポネーマｓｐｐ．、ウレアプラズマｓｐｐ．（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、ビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ビブリオ・コマ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｏｍｍａ、）ビブリオ・パラヘモリチカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ビブリオｓｐｐ．、ビブリオ・バルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）、ビリダンス・ステレプトコッシ（ｖｉｒｉｄａｎｓ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、ボルバキア（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、エルシニア・ぺスティス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、エルシニア・シュードツベルクロシス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．）及びエルシニアｓｐｐ．。
【００３４】
微生物は、真菌であってもよい。真菌の例としては、限定されないが、以下が挙げられる：アスペルギルスｓｐｐ．（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、ブラストマイシスｓｐｐ．（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、カンジダｓｐｐ．（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．）、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コッシドイデスｓｐｐ．（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｓｐｐ．）、クリプトコッカスｓｐｐ．（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、エキセロヒラム（Ｅｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍ）、フサリウム（ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ヒストプラズマｓｐｐ．（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．）、イサチェンキアｓｐｐ．（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ  ｓｐｐ．）、ムコルマイセテス（ｍｕｃｏｒｍｙｃｅｔｅｓ）、ニューモシスティス（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐｐ．）、白癬、スケドスポリウム（ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）、スポロトリクス（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ）、及びスタキボトリスｓｐｐ．（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｓｐｐ．）が挙げられる。微生物は、原生動物であってもよい。原生動物の例としては、限定されないが、以下が挙げられる：エントアメーバ・ヒストリカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、プラスモディウムｓｐｐ．（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｐｐ．）、ジアルジア・ランブリア（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ）、及びトリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）。
【００３５】
抗菌剤
微生物が細菌である場合、例示的な抗菌剤としては、以下が挙げられる：アミカシン、アミノグリコシド、アミノグリコシドアモキシリン、アミノグリコシド類、アモキシリン、アモキシリン／クラブラネート、アンピシリン、アンピシリン／スルバクタム、抗毒素、アルスフェナミン、アジスロマイシン、アズロシリン、アズトレオナム、βーラクタム、バシトラシン、カプレオマイシン、カルバペネム、カルベニシリン、セファクロル、セファドキシル、セファレキシン、セファロシン、セファロチン、セファマンドール、セファゾリン、セフジニル、セフジトレン、セフェピム、セフィキシム、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフォキシチン、セフポドキシム、セフプロジル、セフタロリン、セフタロリン  フォサミル、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトビプロール、セフトリアキソン、セフロキシム、セファロスポリン、クロラムフェニコール、クロラムフェニコール（Ｂｓ）、シプロフラキシン、クラリスロマイシン、クリンダマイシン、クロファジミン、クロキサシリン、コリスチン、コトリモキサゾール、シクロセリン、ダルババンシン、ダプソン、ダプトマイシン、デメクロサイクリン、ジクロキサシリン、ジリスロマイシン、ドリペネム、ドキシサイクリン、エノキサシン、エルタペネム、エリスロマイシン、エタンブトール、エタンブトール（Ｂｓ）、エチオナミド、フルクロキサシリン、フルオロキノロン、フルオロキノロン系、ホスホマイシン、フラゾリドン、フシジン酸、ガチフロキサシン、ゲルダナマイシン、ゲミフロキサシン、ゲンタマイシン、グレパフロキサシン、ハービマイシン、イミペネム／シラスタチン、イソニアジド、カナマイシン、レボフロキサシン、リンコマイシン、リネゾリド、ロメフロキサシン、ロラカルベフ、マクロライド系、マフェナイド、メロペネム、メチシリン、メトロニダゾール、メズロシリン、ミノサイクリン、モキシフロキサシン、ムピロシン、ナフシリン、ナフシリン、ナリジクス酸、ネオマイシン、ネチルマイシン、ニトロフラントニン（Ｂｓ）、ノルフロキサシン、オフロキサシン、オリタバンシン、オキサシリン、オキシテトラサイクリン、パロモマイシン、ペニシリン、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、ピペラシリン、ピペラシリン／タゾバクタム、プラテンシマイシン、ポリミキシンＢ、ポジゾリド、ピラジンアミド、キヌプリスチン／ダルホプリスチン、ラデゾリド（Ｒａｄｅｚｏｌｉｄ）、ラキシバクマブ、リファブチン、リファンピシン、リファンピン、リファペンチン、リファキシミン、ロキシスロマイシン、スルファジアジン銀、スパルフロキサシン、スペクチノマイシン、スペクチノマイシン（Ｂｓ）、スピラマイシン、ストレプログラミン、ストレプトマイシン、スルバクタム、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファジメトキシン、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、スルファニリミド（Ｓｕｌｆａｎｉｌｉｍｉｄｅ）、スルファサラジン、スルフィソキサゾール、スルホンアミドクリソイジン、テジゾリド、テイコプラニン、テイクソバクチン、テラバンシン、テリスロマイシン、テマフロキサシン、テモシリン、テトラサイクリン、チアンフェニコール、チカルシリン、チカルシリン��クラブラネート、チカルシリン／クラブラン酸、チゲサイクリン、チゲサイクリン（Ｂｓ）、チニダゾール、ＴＭＰ／ＳＭＸ、トブラマイシン、トレゾリド、トリメトプリム（Ｂｓ）、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、トロレアンドマイシン、トロバフロキサシン、バンコマイシン、及びこれらのジェネリック又はこれらのバリアント。
【００３６】
微生物との相互作用が微生物表面上の負電荷に影響を与えそして影響を与えられる抗菌剤としては、以下が挙げられ得る：細胞表面に結合する際、脂質膜構成要素に架橋しているＭｇ２＋イオンを退かすことによって、外膜を破壊して薬物取り込みを増大する、ポリ陽イオン性アミノグリコシド類；微生物細胞への結合が膜の負電荷に依存していて、突然変異型かつプラスミド媒介性の両方である耐性が、膜の負電荷を低減することによって起こる、陽イオン性ポリミキシン類（コリスチン及びポリミキシンＢ）；ならびに、宿主の先天的な免疫応答陽イオン性抗菌ペプチドに似ていて、かつＣａ２＋及びホスファチジルグリセロールをその膜破壊作用メカニズムのために必要とし、そしてまた、耐性も、細胞表面電荷に変化を伴い得るリポペプチドである、ダプトマイシン。
【００３７】
微生物が真菌である場合、例示的な抗菌剤としては、５−フルオロシトシン、アバフンジン（Ａｂａｆｕｎｇｉｎ）、アルバコナゾール、アリルアミン類、アンホテリシンＢ、アンコボン（Ａｎｃｏｂｏｎ）、アニデュラファンギン、アゾール、ペルーバルサム、安息香酸、ビホナゾール、ブトコナゾール、カンジシジン、カスポファンギン、シクロピロックス、クロトリマゾール、クレセンバ、クリスタルバイオレット、ジフルカン、エキノカンジス、エコナゾール、エフィナコナゾール、エポキシコナゾール、フェンチコナゾール、フィリピン、フルコナゾール、フルシトシン、グリフルビンＶ、グリセオフルビン、Ｇｒｉｓ−Ｐｅｇ、ハロプロギン、ハマイシン、イミダゾール類、イサブコナゾール、イサブコナゾニウム、イソコナゾール、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ラミシル、ルリコナゾール、ミカファンギン、ミコナゾール、ナタマイシン、ノキサフィル、二スタチン、オモコナゾール、オンメル（Ｏｎｍｅｌ）、オラビグ、オキシコナゾール、ポサコナゾール、プロピコナゾール、ラブコナゾール、リモシジン、セルタコナゾール、スポラノックス、スルコナゾール、テルビナフィン、テルコナゾール、チアゾール類、チオカルバメート抗真菌剤、チオコナゾール、トルナフテート、トリアゾール類、ウンデシレン酸、ブイフェンド、ボリコナゾール、及びこれらのジェネリック又はこれらのバリアント。
【００３８】
微生物が原生動物である場合、例示的な抗菌剤としては、以下が挙げられる：８−アミノキノリン、アセタルソール、アメーバ動物に対する薬剤、愛ラントン、アモジアキン、アンホテリシンＢ、アンプロリウム、抗トリコモナス薬、アプラスモマイシン、アスチノール、アルテリン酸（Ａｒｔｅｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、アーテメータ、アーテメータ／ルメファントリン、アルテミシニン、アルテモチル、アルテロラン、アーテスネート、アーテスネート／アモジアキン、アトバコン、アトバコン／プログナニル、アザニダゾール、アジスロマイシン、ベンズニダゾール、ブロキシキノリン、ブパラバコン（Ｂｕｐａｒｖａｑｕｏｎｅ）、カルバルゾン、カルニダゾール、キニオホン、クロロキン、クロルプログアニル、／ダプソン、クロルプログアニル／ダプソン／アーテスネート、クロルキナルドール、クロムアルベオレート抗寄生虫薬、キナノキ、シパルガミン（Ｃｉｐａｒｇａｍｉｎ）、クラズリル（Ｃｌａｚｕｒｉｌ）、クレファミド、クリオキノール、抗コクシジウム、コジナエオポシン（Ｃｏｄｉｎａｅｏｐｓｉｎ）、コトリファジド（Ｃｏｔｒｉｆａｚｉｄ）、クリプトレピン、シクログアニル、デヒドロエメチン、ジフェタルソン、ジヒドロアルテミシニン、ジロキサニド、ジミナゼン（Ｄｉｍｉｎａｚｅｎ）、ジスルフィラム、ドキシサイクリン、エフロルニチン、ＥＬＱ−３００、エメチン、エトファミド、エクスカバータ抗寄生虫薬、フマギリン、フラゾリドン、グリコビアルソル、ＧＮＦ６７０２、ハロファントリン、ヒドロキシクロロキン、イミドカルブ、イプロニダゾール、キナ皮（Ｊｅｓｕｉｔ’ｓ  ｂａｒｋ）、ＫＡＦ１５６、ルメファントリン、マデュラマイシン、メフロキン、メガゾール、メグルミンアンチモン酸塩、メラルソプロール、メパクリン、メトロニダゾール、ミルテホシン、ニューロレニンＢ、ニカルバジン、ニフルチモックス、ニモラゾール、ニタルゾン、ニチジン、ニトロフラル、オリバシン、オルニダゾール、オロイジン、パマキン、パロモマイシン、ペンタミジン、５価アンチモン、ファンキノン、フェナミジン、ピペラキン、プリマキン、プログナニル、プロジェクト５２３、プロペニダゾール、ピリメタミン、ピロナリジン、キンファミド、キニン、ロニダゾール、スケデュラ・ロマーナ（Ｓｃｈｅｄｕｌａ  Ｒｏｍａｎａ）、ＳＣＹＸ−７１５８、セクニダゾール、セマピモド、スチボグルコン酸ナトリウム、スピロインドロン、スルファドキシン、スルファドキシン−ピリメタミン、スルファレン、スラミン、タファノキン、テクロザン、テノニトロゾール、チルブロキノール、チニダゾール、トリメトレキサート、殺トリパノソーマ薬、ワールブルグチンキ、及びこれらのジェネリック又はこれらのバリアント。
【００３９】
抗菌剤は、本明細書中で挙げた薬物に類似のメカニズムによって作動する薬物であってもよい。当該分野で公知の他の抗菌薬物が、本明細書中で記載される方法において、使用されてもよい。
【００４０】
液体懸濁剤
液体は、陽イオン調整済ミューラー・ヒントン培地などの増殖培地を含んでもよい。この培地は、微生物増殖及び安定性を促進することが当業者に公知の添加剤を含んでもよい。異なる抗菌剤に加えて、異なる試験ウェルは、特定の抗菌剤のためにＡＳＴ正確性を改善することが公知の添加剤を含み得る。例えば、追加の塩化ナトリウムは、オキサシリンを含む試験に追加されてもよく、追加のカルシウムが、ダプトマイシンを含む試験に追加されてもよい。
【００４１】
生物学的サンプル
本明細書中で記載される微生物は、生物学的サンプルに由来し得る。いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは、微生物、例えば、細菌細胞及び真菌細胞を含む、任意のサンプルである。生物学的サンプルは、臨床サンプルに由来してもよい。
【００４２】
例示的な生物学的サンプルとしては、限定されないが、以下が挙げられる：全血、血漿、血清、痰、尿、便、白血球、赤血球、バフィーコート、涙、粘膜、唾液、精液、膣液、リンパ液、羊水、髄液又は脳脊髄液、腹膜浸出液、胸水貯留、浸出液、穿刺液、上皮スメア、生研、骨髄サンプル、包嚢又は膿瘍からの液、滑液、ガラス体液又は眼房水、眼洗浄液又は吸引液、気管支肺胞洗浄液、気管支洗浄液、又は肺洗浄液、肺吸引液、ならびに限定されないが肝臓、脾臓、腎臓、肺、腸、脳、心臓、筋肉、膵などを含む器官及び組織、スワブ（非限定で、創傷スワブ、頬スワブ、喉スワブ、鼻スワブ、膣スワブ、尿道スワブ、子宮頸部スワブ、直腸スワブ、病変スワブ、膿瘍スワブ、鼻咽頭スワブ、などが挙げられる）、及びこれらの任意の組み合わせ。また、細菌培養物もしくは細菌単離物、真菌培養物又は真菌単離物が、含まれる。当業者は、単離物、抽出物又は上記生物学的サンプルの例のいずれかから得られた材料もまた、本発明の範囲内であることを理解する。
【００４３】
生物学的サンプルから得られた微生物は、培養されるか、又は当該分野で慣用的に行われる他の処理を受けてもよい。
【００４４】
ＡＳＴ方法において使用される対照
対照は、微生物が感受性ではない抗菌剤を含んでもよい。例として、アッセイが、グラム陽性細菌の感受性を決定するために使用される場合、対照（及び試験インキュベーション）は、グラム陰性細菌を標的する１つ以上の抗菌剤を含んでもよく、そして、アッセイが、真核微生物の感受性を決定するために使用される場合、対照（及び試験インキュベーション）は、１つ以上の抗細菌性の抗菌剤を含んでもよい。
【００４５】
いくつかの実施形態において、対照は、微生物から、抗菌剤を含まないか又はこの微生物が感受性ではない１つ以上の抗菌剤を含む、それ以外は同一な条件下で測定される、陽性対照である。いくつかの実施形態において、対照は、微生物から、栄養を含まないことを除いては同一な条件下で、測定される。いくつかの実施形態において、対照は、微生物から、微生物の増殖を阻害することが知られる１つ以上の毒を含むことを除いては同一な条件下で、測定される。
【００４６】
対照は、歴史的な対照であってもよい。いくつかの実施形態において、試験インキュベーションは、対照のインキュベーションが行われた後で実施される。いくつかの実施形態において、対照は、試験インキュベーションを含むカートリッジとは異なったカートリッジにおいて行われる。
【００４７】
カートリッジ
カートリッジは、微生物の液体懸濁剤を保持し、その増殖を可能にする容器であってもよい。カートリッジの非限定の例としては、培養フラスコ、培養皿、ペトリ皿、生物アッセイ皿、培養チューブ、試験管、微小遠心管、瓶、マイクロチャンバープレート、多チャンバープレート、マイクロタイタープレート、マイクロプレートが挙げられ得る。カートリッジは、１つのチャンバーを含み得る。カートリッジは、複数のチャンバーを含んでもよく、各チャンバーは、別の空間から物理的に隔離された液体懸濁剤を保持可能な空間である；チャンバーの例は、マルチウェルプレートのチャンバーである。カートリッジは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、２４、４８、９６、１９２、３８４、１５３６、以上のチャンバーを含んでもよく、その間の任意の数のチャンバーでもよい。カートリッジチャンバーの底は、平底でも、丸底でも、Ｖ字型でもよい。
【００４８】
カートリッジの複数のチャンバー内に存在する抗菌剤は、培地中に懸濁されてもよい。いくつかの実施形態において、抗菌剤は、抗菌フィルムの形態で存在する。特定の実施形態において、抗菌剤は、固体形態である。いくつかの実施形態において、固体の抗菌剤は、凍結乾燥状態であるか、及び／又は乾燥状態である。特定の実施形態は、１つ以上のカートリッジチャンバーに、１つ以上の抗菌剤が、抗菌フィルムとして、固体形態で、凍結乾燥状態で、又は乾燥状態で、微生物の懸濁剤を導入する前から、存在する。
【００４９】
抗菌剤希釈系列は、サンプルによるプレート植菌の前に、凍結されていても、凍結乾燥されていても、又は新鮮に調製されていてもよい。いくつかの場合、カートリッジの植菌は、手動で、又は自動化システムの、いずれかを用いて、行われ得る。いくつかの例において、例えば、新鮮な抗菌剤プレートの場合、自動化液体取扱システムが使用されて、抗菌剤希釈系列を含むカートリッジが調製されてもよい。植菌プロセスは、当該分野で公知であり得る任意の種々のプロセスを含み得る。
【００５０】
本明細書中で記載される場合、カートリッジは、多数の試験シーケンス、例えば、チェックポイントアッセイ及び複数の異なる増殖アッセイを実施するために、液体の種々の組み合わせを含むように使用され得る。いくつかの実施形態において、カートリッジは、１つ以上のチェックポイントアッセイを容易にするように使用されるチャンバーのセット及び１つ以上の増殖アッセイを容易にするために使用されるチャンバーのセットを有する。例として、カートリッジは、行及び列に並べられた、チャンバーのアレイを含んでもよい。カートリッジは、対照チャンバーのセット及び抗菌剤試験チャンバーのセットを含んでもよい。対照チャンバーのセットは、２つのチャンバーを含んでもよく、試験チャンバーのセットは、プレートに沿った残りのチャンバーを含んでもよい。いくつかの実施形態において、対照チャンバーのセットは、少なくとも２つのチャンバーを含み、１つのチャンバーは増殖チャンバーであり、他方のチャンバーは、増殖しないチャンバーである。いくつかの実施形態において、増殖チャンバーは、ブロスと患者サンプルとの組み合わせを含むか、又はこれを含むように植菌されて、患者サンプル中の微生物が、インキュベーション時間中にブロスによって増殖することができる。特定の実施形態において、抗菌剤は、チェックポイントアッセイチャンバーに加えられない。ところが、いくつかの実施形態において、増殖しないチャンバーは、患者サンプルを含まないブロスを含んでもよく、又は患者サンプルを含まないブロスを含むように、植菌されてもよい（すなわち、患者サンプル由来の微生物がブロス中に存在しない）。いくつかの実施形態において、抗菌剤はまた、増殖しないチャンバーに添加されない。したがって、インキュベーション時間の間、増殖しないチャンバーが、微生物が増殖し得る増殖チャンバーと比較するための基線として寄与する。
【００５１】
いくつかの実施形態において、各カートリッジは、複数の抗菌剤が、各抗菌剤についての規定された希釈系列（例えば、２倍希釈系列、１０倍希釈系列など）で、多数のウェルにわたって分布している、「試験パネル」を含む。加えて、各カートリッジ又は試験パネルは、増殖対照チャンバー、増殖なし（夾雑物）対照チャンバー及び／又は生理食塩水対照チャンバーなどの、対照チャンバーを含んでもよい。生理食塩水対照チャンバーは、カラムにおける微生物の初期濃度とおよそ同等であるＦＩＴ対照を表し得る。カートリッジは、多数のチャンバー（例えば、９６チャンバーカートリッジ又は３８４チャンバーカートリッジ）を、カバー（例えば、取り外し可能な蓋）及び識別子（例えば、バーコード）と共に含み得、これは、抗生剤構成及び独自コード（プレートを規定し、かつＨＩＰＡＡに即した独自の患者サンプルに関連し得る）を独自に規定する。
【００５２】
試験チャンバーは、患者サンプルと感受性が分析され得る抗菌剤の種々のタイプ及び濃度との種々の組み合わせのいずれかを含み得る。チャンバーの列は、特定の抗菌剤の専用にして、その抗菌剤の濃度が同じ列の行の間で変動し得るようにしてもよい。例えば、カートリッジは、ペニシリンを含むチャンバーの列を有し得、この列では、左から右までの各チャンバーは、増大する濃度のペニシリンを含む。
【００５３】
もちろん、他の例も可能である。例えば、異なるちゃんば―及びチャンバーのセットは、カートリッジに従う任意の種々の配置で置かれてもよい。さらに、チャンバーの異なるセット（例えば、対照チャンバー及び試験チャンバー）が、カートリッジに従う個々のチャンバーをより多く又は少なく含み得る。さらに、ある場合では、試験の間、全てのチャンバーが使用され／占められていなくてもよい。
【００５４】
自動化ＡＳＴ方法
本明細書中で記載される方法は、市販の装置、カスタムメイドの装置又はその組み合わせを用いて、自動化様式で実施され得る。方法の自動化は、より多くの回数のアッセイ及びアッセイの間の一貫性を可能にする。自動化は、これらの方法の速度及び解像度をも増大し得る。
【００５５】
表面結合プローブアッセイ
表面結合アッセイ（表面結合プローブアッセイとも呼ばれる）は、シグナリング薬剤を使用してもよい。シグナリング薬剤は、代表的に、微生物に結合可能な部分（例えば、微生物表面に結合する抗体及び／又はレクチン、微生物表面に非特異的に結合する荷電部分及び／又は官能性部分）、ならびに、シグナルを提供するか又はシグナルの産生に寄与することが可能な化学的部分（例えば、ケミルミノフォア（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｏｐｈｏｒｅ）酵素、及びランタニドキレート）を含む。例示的な酵素としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ベータ−ラクタマーゼ、及びこれらの組み合わせが、挙げられる。
【００５６】
シグナル発生体としては、１つ以上の微生物のレセプターに結合する１つ以上の化学的部分が挙げられ得る。シグナル発生体としては、以下が挙げられ得るが、これらに限定されない：１つ以上の触媒（酵素、金属酸化物、ナノ粒子、有機金属（ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ）触媒、シグナル増幅のために設計されたナノ粒子（例えば、本出願が優先権を主張しそしてその全体が本出願によって参考として組み込まれる米国仮特許出願に記載されるものなど）、シグナル発生エレメントを含むバクテリオファージ、フルオロフォア（有機フルオロフォア、ユーロピウム又はルテニウム（ＩＩ）、レニウム（Ｉ）、パラジウム（ＩＩ）、白金（ＩＩ）含有有機金属）、及び／又は発色染料（有機色素を含む）。上記の組み合わせ、例えば、ナノ粒子、デンドリマー及び／又は他のナノ粒子構造と、酵素、フルオロフォア及び／又は有機金属分子との組み合わせが、使用されてもよい。
【００５７】
化学的部分は、シグナリング薬剤が微生物に接触する前に、シグナリング薬剤に結合されてもよく、他方で、シグナリング薬剤がまず微生物に接触してからすなわちシグナリング薬剤が微生物に接触された後に、シグナリング薬剤に結合されてもよい。
【００５８】
シグナリング薬剤が微生物を含むＡＳＴ希釈物に加えられる場合、シグナリング薬剤レセプター（例えば、微生物に特異的に又は非特異的に結合し得る部分）は、微生物表面に結合し得る。したがって、より無傷（ｉｎｔａｃｔ）な微生物であるほど、例えば溶液中で、より多くの数の、細菌に結合するシグナリング薬剤が存在する。結果として、無傷な細菌の数と溶液中で遊離の（無傷の細菌に結合していないことによって定義される）シグナリング薬剤との間の逆相関が、存在する。遊離のシグナリング薬剤は、可溶性の微生物構成成分、例えば、抗菌剤処理に応答した微生物溶解物に結合し得ることに、留意されたい。
【００５９】
微生物表面に結合するか及び／又は間に介入するシグナリング薬剤の数は、微生物表面積に比例する。微生物表面積は、真に抵抗性である微生物に協力に結合する。詳細には、抗菌剤のＭＩＣ濃度及びサブＭＩＣ濃度（例えば、フィラメント形成細菌）に応答して膨潤するか又は伸長する微生物の場合、代謝及び／又は容量同定は、迅速ＡＳＴ時点（６時間未満として定義される）について偽感受性プロフィールを与えることが公知である。この制限を克服するために、本発明は、（容量よりもむしろ）微生物表面積を、測定可能なシグナル（例えば、光学シグナル）に翻訳する。本明細書中で記載される方法は、６時間未満の微生物抵抗性プロフィールを正確に決定することができる。
【００６０】
微生物表面に結合するか及び／又は間に介入するシグナリング薬剤を遊離のシグナリング薬剤から分離するために、１つ以上の分離工程及び／又は競合的結合工程を行う必要がある場合がある。このような工程としては、限定されないが、遠心分離（例えば、５００×ｇを超えるＧ力）、濾過（例えば、０．４５ミクロン以下の孔又は０．２ミクロン以下の孔を有するフィルターを介して）、電気泳動、及び／又は磁気捕捉が挙げられる；このような工程は、当業者に周知である。
【００６１】
シグナリング薬剤結合を促進するか及び／又はバックグラウンドを低減するために、シグナリング薬剤を添加する前に、インキュベーションの間に懸濁していた液体から微生物を分離することが、さらに有益であり得る。そのような分離としては、限定されないが、遠心分離、濾過、電気泳動及び／または磁気捕捉が挙げられ得る。
【００６２】
シグナリング薬剤は、微生物及び／又は抗菌剤と共に添加されて、これらが、全ＡＳＴインキュベーション時間にわたって存在してもよい。この全時間は、２４時間までであっても、又は８時間以内であっても、又は５時間以内であってもよい。あるいは、シグナリング薬剤は、規定のインキュベーション時間の後で微生物及び抗菌剤に添加されてもよい。この時間は、２４時間までであっても、又は８時間以内であっても、又は４時間以内であってもよい。
【００６３】
シグナリング薬剤は、壁及び／又は膜を含む微生物表面に結合するか及び／又は介入するように設計される。結合のために設計されたシグナリング薬剤は、以下が挙げられるがこれらに限定されない、結合部分を含む：１つ以上の抗体、レクチン、他のタンパク質、１つ以上の荷電基を有する低分子、１つ以上の官能化学基を有する低分子、ファージ、糖タンパク質、ペプチド、アプタマー、荷電低分子、固定電荷を有する低分子、荷電ポリマー、固定電荷を有する荷電ポリマー、疎水性低分子、荷電ペプチド、固定電荷を有する荷電ペプチド、疎水性領域と親水性領域とを変更させたペプチド及び／又は低分子リガンドであり、これらは、有機金属錯体であってもなくてもよい。微生物結合のために設計された分子は、当業者に周知である。シグナリング薬剤は、微生物に結合し続けてもよく、及び／又は内在化してもよく、したがって、全ての結合が含まれる。介入のために設計されたシグナリング薬剤としては、以下が挙げられ得るが、これらに限定されない：疎水性低分子、疎水性ペプチド、及び／又は疎水性領域と親水性領域とを変更させたペプチド。微生物介入のために設計された分子は、当業者に周知である。シグナリング薬剤は、さらに、１種以上の微生物に特異的であってもよい。シグナリング薬剤は、多重レセプターを有し得る。これらは、結合を増強してもよく、及び／又は２以上の微生物への同時結合を可能にしてもよく、さらに、細菌の凝集に寄与してもよい。シグナリング薬剤の添加の前に、またはこれと同時に、溶液ｐＨを調整することが、有益であり得る。微生物とシグナリング薬剤との間の電荷−電荷相互作用を増強することが、有益であり得る。微生物の陰イオン性電荷は、溶液ｐＨを中性より高く（より塩基性に）決定することによって、増大され得る。したがって、１つ以上の固定陽イオン電荷を有する部分を使用することが、有益である場合がある。
【００６４】
シグナリング薬剤は、微生物に特異的に結合しても（例えば、微生物種又は微生物株に特異的に結合する抗体）、又は微生物に非特異的に結合しても（例えば、一般的な共有結合又は非共有結合及び当該分野で公知の別の非特異的化学結合によって）よいことは、注目すべきである。
【００６５】
あるいは、シグナリング薬剤と結合可能である化学物質及び／又は生化学物質が、増殖の間に微生物が懸濁される液体に添加されてもよく、それにより、化学物質及び／又は生化学物質は、インキュベーションの間に微生物の中に組み込まれる。このことは、シグナリング薬剤の微生物への結合を増強するために寄与し得る。代替の実施形態において、シグナリング薬剤自体は、インキュベーションの間に微生物が懸濁されている液体中に存在してもよく、そして増殖の間に微生物中に組み込まれてもよい。
【００６６】
シグナリング薬剤は、シグナル発生体（増幅基）を含み、それにより、無傷な微生物のそれぞれからのシグナルは、各微生物に関連するシグナリング薬剤の数を超えて増大し得る。例えば、酵素ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は、シグナルを１×１０４倍を超えて増幅することが可能である。したがって、１００分子のＨＲＰタンパク質が各微生物表面に結合している場合、１０６の増幅が、達成され得る。これは、微生物濃度の識別を可能にすることによってＡＳＴ決定の速度を増大し得る。同様に、ユーロピウム製剤の使用は、シグナル増幅を提供する。
【００６７】
あるいは、シグナリング薬剤は、細胞膜などの疎水性領域、例えば細胞膜への介入の際に蛍光放出を大いに増大させるように設計された膜組織として、当業者に公知の光学色素前駆体を含んでもよい。これらのシグナリング薬剤によって設計されたアッセイは、微生物をより小さな容積に、平面に近づけて濃縮することを必要とし、それにより、容易に光学的に測定可能な十分なシグナルを産生することができる。干渉種は、ＩＲ近辺のフルオロフォアを使用することを必要とする。
【００６８】
例示的な増幅基は、例えば、国際公開ＷＯ２０１６／０１５０２７及び国際公開ＷＯＰＣＴ／ＵＳ１６／４２５８９、に記載されるものが挙げられ、これらはその全体が参考として組み込まれる。増幅基は、触媒、フルオロフォア、比色色素、酵素、触媒、又はナノ粒子を含み得る。例示的なフルオロフォアは、ＰＣＴ／ＵＳ１６／４２５８９（その全体が参考として組み込まれる）の図１、表１に記載のものが挙げられる。増幅基は、ランタニドを含み得る。ランタニドとしては、ユーロピウム、ストロンチウム、サマリウム又はジスプロシウムが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
増幅基は、有機フルオロフォア、例えば配位錯体を含み得る。配位錯体は、ユーロピウム配位錯体、ルテニウム配位錯体、レニウム配位錯体、パラジウム配位錯体、白金配位錯体を含み得る。増幅基は、ケミルミノフォア、量子ドット、酵素、鉄配位触媒、ユーロピウム配位錯体、ルテニウム配位錯体、レニウム配位錯体、パラジウム配位錯体、白金配位錯体、サマリウム配位錯体、テルビウム配位錯体、又はジスプロシウム配位錯体を含み得る。
【００７０】
いくつかの実施形態において、増幅基は、以下の部分を含む：
【００７１】
【化１】
2021530986.tif 000003
【００７２】
いくつかの実施形態において、増幅基は、以下の部分を含む：
【００７３】
【化２】
2021530986.tif 000004
2021530986.tif 000005
【００７４】
増幅基は、フルオロフォア又は比色色素を含み得る。好適なフルオロフォア及び比色色素は、当業者に周知であり、Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）Ｈａｎｄｂｏｏｋ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１１ｔｈ  Ｅｄ．（２０１０）  ａｎｄ  Ｇｏｍｅｓ、Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ、ａｎｄ  Ｌｉｍａ  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６５（２００５）ｐｐ  ４５−８０（その全体が本明細書中で記載される）に記載されている。例示的なフルオロフォアはまた、例えば、国際公開ＷＯ２０１６／０１５０２７及び国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１６／４２５８９（その全体が本明細書中で記載される）に記載のものを含む。
【００７５】
好適なフルオロフォア又は比色色素の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム、ＳＹＴＯＸ  ｇｒｅｅｎ、フェナントリジン、アクリジン、インドール、イミダゾール、シアニン、ＴＯＴＯ、ＴＯ−ＰＲＯ、ＳＹＴＯ、５−カルボキシ−２、７−ジクロロフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、５−カルボキシナフトフルオレセイン、５−カルボキシテトラメチルローダミン（５−ＴＡＭＲＡ）、５−ＦＡＭ（５−カルボキシフルオレセイン）、５−ＨＡＴ（ヒドロキシトリプタミン）、５−ＲＯＸ（カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、６−カルボキシローダミン６Ｇ、７−アミノ−４−メチルクマリン、７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン、９−アミノ−６−クロロ−２−メトキシアクリジン、ＡＣＭＡ（９−アミノ−６−クロロ−２−メトキシアクリジン）、アクリジン類、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｓ、アリザリン、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＡＭＣＡ（アミノメチルクマリン）、ボディパイ、カルボキシ−Ｘ−ローダミン、カテコールアミン、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、ヒドロキシクマリン、リサミンローダミン、モノブロモビマン、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ、フィコエリトリン、ＳＹＴＯ、チアジカルボシアニン（ＤｉＳＣ３）、チオフラビン、Ｘ−ローダミン、Ｃ又はテトラメチルローダミンイソチオシアネート。
【００７６】
増幅基は、有機金属化合物、遷移金属錯体、又は配位錯体を含み得る。このような増幅基の例として、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＥＰ０１８０４９２、ＥＰ０３２１３５３、ＥＰ０５３９４３５、ＥＰ０５３９４７７、ＥＰ０５６９４９６、ＥＰ１３９６７５、ＥＰ６４４８４、ＵＳ４，２８３，３８２、ＵＳ４，５６５，７９０、ＵＳ４，７１９，１８２、ＵＳ４，７３５，９０７、ＵＳ４，８０８，５４１、ＵＳ４，９２７，９２３、ＵＳ５，１６２，５０８、ＵＳ５，２２０，０１２、ＵＳ５，３２４，８２５、ＵＳ５，３４６，９９６、ＵＳ５，３７３，０９３、ＵＳ５，４３２，１０１、ＵＳ５，４５７，１８５、ＵＳ５，５１２，４９３、ＵＳ５，５２７，６８４、ＵＳ５，５３４，６２２、ＵＳ５，６２７，０７４、ＵＳ５，６９６，２４０、ＵＳ６，１００，３９４、ＵＳ６，３４０，７４４、ＵＳ６，５２４，７２７、ＵＳ６，７１７，３５４、ＵＳ７，０６７，３２０、ＵＳ７，３６４，５９７、ＵＳ７，３９３，５９９、ＵＳ７，４５６，０２３、ＵＳ７，４６５，７４７、ＵＳ７，６２５，９３０、ＵＳ７，８５４，９１９、ＵＳ７，９１０，０８８、ＵＳ７，９５５，８５９、ＵＳ７，９６８，９０４、ＵＳ８，００７，９２６、ＵＳ８，０１２，６０９、ＵＳ８，０１７，２５４、ＵＳ８，０１８，１４５、ＵＳ８，０４８，６５９、ＵＳ８，０６７，１００、ＵＳ８，１２９，８９７、ＵＳ８，１７４，００１、ＵＳ８，１８３，５８６、ＵＳ８，１９３，１７４、ＵＳ８，２２１，７１９、ＵＳ８，２８８，７６３、ＵＳ８，３６２，６９１、ＵＳ８，３８３，２４９、ＵＳ８，４９２，７８３、ＵＳ８，６３２，７５３、ＵＳ８，６６３，６０３、ＵＳ８，７２２，８８１、ＵＳ８，７５４，２０６、ＵＳ８，８９０，４０２、ＵＳ８，９６９，８６２、ＵＳ９，０１２，０３４、ＵＳ９，０５６，１３８、ＵＳ９，１１８，０２８、ＵＳ９，１３３，２０５、ＵＳ９，１８７，６９０、ＵＳ９，１９３，７４６、ＵＳ９，３１２，４９６、ＵＳ９，３３７，４３２、ＵＳ９，３４３，６８５、ＵＳ９，３９１，２８８、及びＵＳ９，５３７，１０７（その全体が参考として組み込まれる）に記載のもの。例示的な有機金属化合物、遷移金属錯体、又は配位錯体もまた、例えば、国際公開ＷＯ２０１６／０１５０２７及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１６／４２５８９（その全体が参考として組み込まれる）に記載のものを含む。
【００７７】
いくつかの実施形態において、増幅基は、ランタニド配位錯体であり、例えば、ランタニド（例えば、Ｅｕ又はＴｂ）と四座配位子リガンドとの間の錯体、又はランタニド（例えば、Ｅｕ又はＴｂ）とクリプテートリガンドとの間の錯体である。いくつかの実施形態において、増幅基は、ランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ネオジム（Ｐｍ）、サマリウム（Ｓｍ）、ユーロピウム（Ｅｕ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、テルビウム（Ｔｂ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、ホルミウム（Ｈｏ）、エルビウム（Ｅｒ）、ツリウム（Ｔｍ）、イッテルビウム（Ｙｂ）、ルテチウム（Ｌｕ）、ルテニウム（Ｒｕ）、ロジウム（Ｒｈ）、パラジウム（Ｐｄ）、オスミウム（Ｏｓ）、イリジウム（Ｉｒ）、又は白金（Ｐｔ）の配位錯体である。いくつかの実施形態において、増幅基は、希土類金属の配位錯体であり、集合的に、元素番号５７のランタンから元素番号７１のルテニウムまでの１５エレメントの群（ランタニド）からなる１７エレメント、及び元素番号２１のスカンジウム及び元素番号３９のイッテリウムからなる２つのさらなるエレメントを意味する。希土類金属の特定の例としては、ユーロピウム、テルビウム、ランタン、セリウム、プラセオジニウム、ネオジムミウム、プロメチウム、サマリウム、ガドリナム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウム、ルテニウム、スカンジウム及びイッテリウムが挙げられる。いくつかの実施形態において、増幅基は、ジエチレントリアミンテトラ酢酸又はクリプテートリガンドとのランタニド（例えば、ユーロピウム又はテルビウム）配位錯体である。
【００７８】
シグナリング薬剤の特定の例としては、以下を含む部分が挙げられるが、これらに限定されない：
【００７９】
【化３】
2021530986.tif 000006
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2021530986.tif 000008
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【００８０】
シグナリング薬剤は、高い発光量子効率及び長い発光減衰時間（１００ｎｓを超える）特徴とするルミノフォア（ドナー）を含み得る。例示的なルミノフォアは、パラジウム、ロジウム、白金、ルテニウム、オスミウム、希土類（詳細には、ユーロピウム及びランタン）の陽イオン性、有機金属（ｍｅｔａｌｏｒｇａｎｉｃ）錯体である。これらの有機金属錯体の有機部分は、例えば、ポルフィリン、ビピリジル、フェナントロリン又は他の複素環式（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃａｌ）化合物から構成され得る。
【００８１】
いくつかの実施形態において、微生物表面に結合可能なシグナリング薬剤は、抗体（例えば、モノクローナル又はポリクローナル）、改変抗体（例えば、ビオチン化モノクローナル抗体、ビオチン化ポリクローナル抗体、ユーロピウムキレート抗体、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗体）、抗体バリアント（例えば、Ｆａｂ：断片、抗原−結合（一腕）；Ｆ（ａｂ’）２：断片、抗原−結合、ヒンジ領域を含む（両腕）；Ｆａｂ’：断片、抗原−結合、ヒンジ領域を含む（一腕）；ｓｃＦｖ：一本鎖可変断片；ｄｉ−ｓｃＦｖ：二量体一本鎖可変断片；ｓｄＡｂ：一ドメイン抗体；二重特異性モノクローナル抗体；三官能性抗体；及びＢｉＴＥ：二重特異性Ｔ細胞係合体）、ＷＧＡ−ビオチン、ポリミキシンＢ−ビオチン、レクチン、天然ペプチド、合成ペプチド、合成及び／又は天然のリガンド、合成及び／又は天然のポリマー、合成及び／又は天然の糖ポリマー、炭化水素−結合タンパク質及び／又はポリマー、糖タンパク質−結合タンパク質及び／又はポリマー、荷電低分子、他のタンパク質、バクテリオファージ、及び／又はアプタマーを含む。
【００８２】
いくつかの実施形態において、微生物表面に結合可能なシグナリング薬剤は、抗体、レクチン、天然ペプチド、合成ペプチド、合成及び／又は天然のリガンド、合成及び／又は天然のポリマー、合成及び／又は天然の糖ポリマー、炭化水素−結合タンパク質及び／又はポリマー、糖タンパク質−結合タンパク質及び／又はポリマー、荷電低分子、他のタンパク質、バクテリオファージ、及び／又はアプタマーを含む構造を含むか、又はこれらから形成される。
【００８３】
いくつかの実施形態において、微生物表面に結合可能なシグナリング薬剤は、ランタニド配位錯体、及び／又は酵素及びストレプトアビジン及び／又は抗体及び／又はアプタマーを含む増幅基を含む。いくつかの実施形態において、微生物表面に結合可能なシグナリング薬剤は、ポリクローナル及び／又はモノクローナル抗体を含む結合部分を含む。
【００８４】
いくつかの実施形態において、微生物表面に結合可能なシグナリング薬剤は、改変抗体を含む結合部分を含む。例示的な改変抗体としては、ビオチン化モノクローナル抗体ビオチン化ポリクローナル抗体、ユーロピウムキレート抗体、及びホースラディッシュペルオキシダーゼ−結合抗体が挙げられる。いくつかの実施形態において、微生物表面に結合可能なシグナリング薬剤は、抗体バリアントを含む結合部分を含む。例示的な抗体バリアントとしては、Ｆａｂ：断片、抗原−結合（一腕）；Ｆ（ａｂ’）２：断片、抗原−結合、ヒンジ領域を含む（両腕）；Ｆａｂ’：断片、抗原−結合、ヒンジ領域を含む（一腕）；ｓｃＦｖ：一本鎖可変断片；ｄｉ−ｓｃＦｖ：二量体一本鎖可変断片；ｓｄＡｂ：一ドメイン抗体；二重特異性モノクローナル抗体；三官能性抗体；及びＢｉＴＥ：二重特異性Ｔ細胞係合体）が挙げられる。
【００８５】
いくつかの実施形態において、微生物表面に結合可能なシグナリング薬剤は、ＷＧＡ−ビオチン又はポリミキシンＢ−ビオチンを含む。いくつかの実施形態において、微生物表面に結合可能なシグナリング薬剤は、合成及び／又は天然のリガンド及び／又はペプチドを含む結合部分を含む。いくつかの実施形態において、リガンド及び／又はペプチドは、ビス（亜鉛−ジピコリルアミン）、ＴＡＴペプチド、セリンプロテアーゼ、カテリシジン、陽イオン性デキストリン、陽イオン性シクロデキストリン、サリチル酸、リシン、及びこれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態において、微生物表面に結合可能なシグナリング薬剤は、合成及び／又は天然のポリマー及び／又は糖ポリマーを含む結合部分を含む。実施形態において、天然及び／又は合成のポリマーは、直鎖状又は分枝鎖状であり、アミロペクチン、ポリ（Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］メタクリルアミド）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ［２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート］、及びこれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態において、天然及び／又は合成のポリマー及び／又は糖ポリマーは、以下が挙げられるがこれらに限定されない部分を含む：キトサン、ゼラチン、デキストラン、トレハロース、セルロース、マンノース、陽イオン性デキストラン及びシクロデキストラン、４量体アミン、三臭化ピリミジウム、ヒスチジン、リシン、システイン、アルギニン、スルホニウム、ホスホニウム、又はこれらの組み合わせであって、共ブロックポリマー、グラフトポリマー、及び改変ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、微生物表面に結合可能なシグナリング薬剤は、マンノース−結合レクチン、他のレクチン、アネキシン、及びこれらの組み合わせから選択される糖タンパク質を含む結合部分を含む。
【００８６】
いくつかの実施形態において、微生物表面に結合可能なシグナリング薬剤は、抗体；及びユーロピウム配位錯体を含む。いくつかの実施形態において、微生物表面に結合可能なシグナリング薬剤は、ＮＨ２−ＰＥＧ−ビオチン（２Ｋ）、ＮＨ２−ＰＥＧ−ビオチン（４Ｋ）、ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ビオチン、ＷＧＡ−ビオチン、又はポリミキシンＢ−ビオチンを含むリンカー基Ｌを含む。いくつかの実施形態において、ａシグナリング薬剤微生物表面に結合可能なシグナリング薬剤は、以下を含むユーロピウム錯体を含む：
【００８７】
【化４】
2021530986.tif 000010
【００８８】
いくつかの実施形態において、微生物表面に結合可能なシグナリング薬剤は、以下を含むユーロピウム錯体を含む：
【００８９】
【化５】
2021530986.tif 000011
【００９０】
あるいは、シグナリング薬剤は、ペア、例えば、ＦＲＥＴ／ＴＲ−ＦＲＥＴドナー及びアクセプター又は光増感剤及び検出剤からなる一重項酸素対の、一部であってもよい。これらのシグナリング薬剤によって設計されたアッセイは、シグナリング試薬の添加より前に、初期増殖培地からの微生物の分離と、それに伴う所望の反応緩衝液へのその後の再懸濁とを必要とする場合がある。反対に、これらのシグナリング薬剤によって設計されたアッセイは、シグナルを生成するために必要な相対距離に起因して、分離工程を必要としない場合がある。
【００９１】
ＦＲＥＴ／ＴＲ−ＦＲＥＴドナーの例としては、限定されないが、ランタニド（Ｅｕ、Ｓｍ、Ｄｙ、又はＴｂ）−含有クリプテート有機金属（ＣｉｓＢｉｏ）、Ｌａｎｃｅ  Ｅｕ−Ｗ１０２４（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、Ｌａｎｃｅ  Ｅｕ−Ｗ８０４４（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、また、任意の有機蛍光対ドナーが挙げられる。
【００９２】
ＦＲＥＴ／ＴＲ−ＦＲＥＴアクセプターの例としては、限定されないが、互角の有機色素、例えば、ＵＬｉｇｈｔ色素（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、ＳｕｒｅＬｉｇｈｔ  ＡＰＣ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、アロフィコシアニン、Ｃｙ５、ｄ２色素（ＣｉｓＢｉｏ）、また、任意の有機蛍光対アクセプターが、挙げられる。
【００９３】
一重項酸素光増感剤の例としては、限定されないが、メトセラＧｒｅｅｎ  Ｃａｒｂｏｘｙ（Ｕｒｓａ  Ｂｉｏ）、Ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ  Ｂｌｕｅ（Ｕｒｓａ  Ｂｉｏ）、ｒｏｓｅ  Ｂｅｎｇａｌ、エリスロシンＢ、メチレンブルー、クロロフィル、ＡｌｐｈａＢｅａｄドナー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）が、挙げられる。
【００９４】
一重項酸素検出剤の例としては、限定されないが、一重項酸素検出剤グリーン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、トランス−１−（２’−メトキシビニル）ピレン、Ｓｉ−ＤＭＡ（Ｄｏｊｉｎｄｏ）、ＡｌｐｈａＢｅａｄアクセプター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）が、挙げられる。
【００９５】
インコーポレーターの例としては、限定されないが、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．２０１２  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ７；５１（５０）：１２５１９ー１２５２３に記載される、エチニル−Ｄ−アラニン（ＥＤＡ）、アジド−Ｄ−アラニン（ＡＤＡ）、蛍光Ｄ−アラニンｈ￥が、挙げられる。
【実施例】
【００９６】
実施例１：低陰イオン電荷生物は、ユーロピウムクリプテート−ジアミンプローブによって結合されない
【００９７】
細菌−Ｅコリ及びＰ．ミラビリス−を、栄養ブロス（ＭＨＢ）又は生理食塩水（陰性対照）中で増殖させ、ユーロピウムプローブによって結合させた。細菌を、コロニーを生理食塩水によって０．５のＭｃＦａｒｌａｎｄ値に達するまで希釈して分光光度計によって検証し、希釈し、そして陽イオン調整済ミューラー・ヒントン培地又は生理食塩水を含む９６ウェルプレート内に植菌することによって調製した。プレートを、３５℃で、１５０ｒｐｍにて振とうしながら３時間にわたってインキュベートし、その後、１０μｌのＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅを各ウェルに添加して、プレートをさらに１時間インキュベートした。このインキュベーション後、１００μｌの１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を各ウェルに加えた。プレートをシェーカー上に４５０ＲＰＭにて１０分間置き、その後、２５００×ｇにて２．５分間遠心分離した。ウェルを吸引し、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）を含む１００μＬ  ＰＢＳを、ウェルに再び加えた。１０マイクロリットルのＥｕ−クリプテート−ジアミン（５ｎｇ／ウェル）を、可ウェルに加え、そしてプレートを、１０分間振とうした。次いで、このプレートを、遠心分離し、ウェルを吸引し、そして２００μＬ１×ＰＢＳＴを各ウェルに添加した。これらの工程を、２回繰り返した。最終洗浄の後、全てのウェルについての時間分解性蛍光を、３３０／６１５ｎｍにて読み取った。
【００９８】
図２に示されるとおり、Ｅ．コリは、ユーロピウムプローブによって十分に結合され、したがって、細菌増殖（ＭＨＢ）条件下で、増殖の起こらない（生理食塩水）条件下と比較して、高いシグナルを示す。しかし、低陰イオン荷電生物であるＰ．ミラビリスは、ＭＨＢ条件及び生理食塩水条件の両方において低ＴＲＦシグナルであることを示し、ユーロピウムプローブの貧弱な結合を示した。
【００９９】
実施例２：陽イオン性界面活性剤ＣＴＡＢは、低陰イオン荷電生物をユーロピウムクリプテート−ジアミンによって結合可能にする
【０１００】
Ｐ．ミラビリス細菌を、コロニーを生理食塩水によって０．５のＭｃＦａｒｌａｎｄ値に達するまで希釈して分光光度計によって検証し、希釈し、そして陽イオン調整済ミューラー・ヒントン培地又は生理食塩水を含む９６ウェルプレート内に植菌することによって調製した。プレートを、３５℃で、１５０ｒｐｍにて振とうしながら３時間にわたってインキュベートし、その後、１０μｌのＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅを各ウェルに添加して、プレートをさらに１時間インキュベートした。このインキュベーション後、１００μｌの０．１Ｍ  ＥＤＴＡ溶液を含む０．０３％臭化セチルトリメチルアンモニウムを各ウェルに加えた。プレートをシェーカー上に４５０ＲＰＭにて１０分間置き、その後、２５００×ｇにて２．５分間遠心分離した。ウェルを吸引し、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）を含む１００μＬ  ＰＢＳを、ウェルに再び加えた。１０マイクロリットルのＥｕ−クリプテート−ジアミン（５ｎｇ／ウェル）を各ウェルに加え、そしてこのプレートを、１０分間にわたって振とうした。次いで、このプレートを、遠心分離し、ウェルを吸引し、２００μＬ  １×ＰＢＳＴを、各ウェルに加えた。これらの工程を、２回繰り返した。最終洗浄の後、全てのウェルについての時間分解性蛍光（ＴＲＦ）を、３３０／６１５ｎｍにて読み取った。
【０１０１】
図３は、生理食塩水条件下でのＴＲＦシグナルは予測通り低いが、ＭＨＢ条件下でのシグナルが増大したことを示し、このことは、ＣＴＡＢ前処理後のユーロピウムクリプテートプローブの結合を示している。
【０１０２】
実施例３：陽イオン性界面活性剤ＣＴＡＢの除去は、ユーロピウムクリプテート−ジアミン結合を改善する
【０１０３】
Ｓ．アウレウスを、コロニーを生理食塩水によって０．５のＭｃＦａｒｌａｎｄ値に達するまで希釈して分光光度計によって検証し、希釈し、そして陽イオン調整済ミューラー・ヒントン培地及びバンコマイシンの倍加希釈物を含む９６ウェルプレート内に植菌することによって調製した。プレートを、３５℃で、１５０ｒｐｍにて振とうしながら３時間にわたってインキュベートし、その後、１０μｌのＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅを各ウェルに添加して、プレートをさらに１時間インキュベートした。インキュベーション後、１００μｌの０．１Ｍ  ＥＤＴＡ溶液を含む０．０３％臭化セチルトリメチルアンモニウムを各ウェルに加えた。プレートをシェーカー上に４５０ＲＰＭにて１０分間置き、その後、２５００×ｇにて２．５分間遠心分離した。ウェルを吸引し、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）を含む１００μＬ  ＰＢＳ又は０．１Ｍ  ＥＤＴＡ溶液を含む０．０３％臭化セチルトリメチルアンモニウムを、ウェルに再び加えた。１０マイクロリットルのＥｕ−クリプテート−ジアミン（５ｎｇ／ウェル）を各ウェルに加え、そしてこのプレートを、１０分間にわたって振とうした。次いで、このプレートを、遠心分離し、ウェルを吸引し、２００μＬ  １×ＰＢＳＴを、各ウェルに加えた。これらの工程を、２回繰り返した。最終洗浄の後、全てのウェルについての時間分解性蛍光（ＴＲＦ）を、３３０／６１５ｎｍにて読み取った。
【０１０４】
図４に示すように、ＣＴＡＢが再び追加されない条件において、ＶＡＮに対する用量依存性応答が観察され、ＶＡＮ処理したＳ．アウレウスサンプルは、２μｇ／ｍｌのＭＩＣを有することを明らかにした。しかし、ＣＴＡＢが再び加えられた場合用量関係性は観察されず、このことは、ＣＴＡＢが、ＥＵ−クリプテート−ジアミンプローブの結合又はシグナリングに干渉し得ることを示す。
【０１０５】
実施例４：標準的陰イオン電荷を有する生物のＣＴＡＢ前処理は、ユーロピウムクリプテート−ジアミン結合を低減する
【０１０６】
Ｅ．コリを、コロニーを生理食塩水によって０．５のＭｃＦａｒｌａｎｄ値に達するまで希釈して分光光度計によって検証し、希釈し、そして陽イオン調整済ミューラー・ヒントン培地及び２種の抗生物質、ピペラシリンータゾバクタム（ＴＺＰ）及びアジスロマイシン（ＡＴＭ）の倍加希釈物を含む９６ウェルプレート内に植菌することによって調製した。プレートを、３５℃で、１５０ｒｐｍにて振とうしながら３時間にわたってインキュベートし、その後、１０μｌのＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅを各ウェルに添加して、プレートをさらに１時間インキュベートした。インキュベーション後、１００μｌの、１％  Ｔｗｅｅｎ−２０又は０．１Ｍ  ＥＤＴＡを含む０．０３％臭化セチルトリメチルアンモニウムを各ウェルに加えた。プレートをシェーカー上に４５０ＲＰＭにて１０分間置き、その後、２５００×ｇにて２．５分間遠心分離した。ウェルを吸引し、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）を含む１００μＬ  ＰＢＳを、ウェルに再び加えた。１０マイクロリットルのＥｕ−クリプテート−ジアミン（５ｎｇ／ウェル）を各ウェルに加え、そしてこのプレートを、１０分間にわたって振とうした。次いで、このプレートを、遠心分離し、ウェルを吸引し、２００μＬ  １×ＰＢＳＴを、各ウェルに加えた。これらの工程を、２回繰り返した。最終洗浄の後、全てのウェルについての時間分解性蛍光（ＴＲＦ）を、３３０／６１５ｎｍにて読み取った。
【０１０７】
実施例５：陰イオン比は、適切な界面活性剤処理条件を予測する
【０１０８】
Ｐ．ミラビリス及びＫ．ニューモニエを、コロニーを生理食塩水によって０．５のＭｃＦａｒｌａｎｄ値に達するまで希釈して分光光度計によって検証し、希釈し、そして陽イオン調整済ミューラー・ヒントン培地及びゲンタマイシン（ＧＥＮ）及びシプロフラキシン（ＣＩＰ）の倍加希釈物を含む９６ウェルプレート内に植菌することによって調製した。プレートを、３５℃で、１５０ｒｐｍにて振とうしながら３時間にわたってインキュベートし、その後、１０μｌのＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅを各ウェルに添加して、プレートをさらに１時間インキュベートした。インキュベーション後、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅシグナルを、蛍光シグナルＥｘ５６０／Ｅｍ５９０として読み取った。したがって、１００μＬの洗浄液（１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝化生理食塩水又は０．１Ｍ  ＥＤＴＡを含む０．０３％臭化セチルトリメチルアンモニウムのどちらかを、各ウェルに加えた。プレートをシェーカー上に４５０ＲＰＭにて１０分間置き、その後、２５００×ｇにて２．５分間遠心分離した。ウェルを吸引し、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）を含む１００μＬ  ＰＢＳを、ウェルに再び加えた。１０マイクロリットルのＥｕ−クリプテート−ジアミン（５ｎｇ／ウェル）を各ウェルに加え、そしてこのプレートを、１０分間にわたって振とうした。次いで、このプレートを、遠心分離し、ウェルを吸引し、２００μＬ  １×ＰＢＳＴを、各ウェルに加えた。これらの工程を、２回繰り返した。最終洗浄の後、全てのウェルについての時間分解性蛍光（ＴＲＦ）を、３３０／６１５ｎｍにて読み取った。
【０１０９】
陰イオン比を、バックグラウンド減算した４μｇ／ｍｌコリスチン中の細菌増殖の蛍光シグナル（Ｅｘ５６０／Ｅｍ５９０）をバックグラウンド減算したＭＨＢ中細菌増殖の蛍光シグナルで除算することにより、計算した。Ｐ．ミラビリスは、陰０．９６のイオン比を有し、このことは、コリスチンによる阻害がほとんどなかったかまたは全くなかったこと及び低い陰イオン電荷を示した。他方で、Ｋ．ニューモニエは、−．０８の陰イオン比を有し、このことは、高度な増殖阻害及び標準的陰イオン電荷を示した。したがって、Ｐ．ミラビリスサンプルを、ＣＴＡＢで前処理し、他方で、Ｋ．ニューモニエサンプルには、ＰＢＳＴを与えた。ＴＲＦシグナルを、図７に示す。これは、用量関係性が、各生物における各抗菌剤についての既知のＭＩＣ値と一致することを示し、このことは、正しい前処理条件が、陰イオン比に基づいて選択されたことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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