(57)【要約】【解決手段】  本発明は、ＡＳＤ患者における自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）表現型１の診断に使用するプロテインキナーゼＡに関し、プロテインキナーゼＡレベルは患者のサンプルで測定され、測定されたプロテインキナーゼＡレベルが、年齢と性別が一致したコントロールサンプルのプロテインキナーゼＡレベルよりも低い場合にＡＳＤ表現型１が診断される。さらに、本発明は、ＡＳＤ患者のＡＳＤ重症度の変動のモニタリングに使用するプロテインキナーゼＡに関し、プロテインキナーゼＡレベルは患者のサンプルで測定され、患者の以前のサンプルで測定されたプロテインキナーゼＡレベルと比較したプロテインキナーゼＡレベルの減少によってＡＳＤ重症度の増加を特徴とする。さらに、本発明は、ＡＳＤ表現型１を診断する方法、ならびにプロテインキナーゼＡレベルを測定する手段を含むキットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＳＤ患者における自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）表現型１の診断のためのプロテインキナーゼＡの使用であって、プロテインキナーゼＡレベルは前記患者のサンプルで測定され、前記測定されたプロテインキナーゼＡレベルが、年齢と性別が一致したコントロールサンプルのプロテインキナーゼＡレベルよりも低い場合にＡＳＤ表現型１が診断される、プロテインキナーゼＡの使用。
【請求項２】
ＡＳＤ患者のＡＳＤ重症度の変動のモニタリングのためのプロテインキナーゼＡの使用であって、プロテインキナーゼＡレベルは前記患者のサンプルで測定され、前記患者の以前のサンプルで測定されたプロテインキナーゼＡレベルと比較したプロテインキナーゼＡレベルの減少によってＡＳＤ重症度の増加を特徴とする、プロテインキナーゼＡの使用。
【請求項３】
ＡＳＤ表現型１患者におけるＡＳＤ治療の有効性をモニタリングのためのプロテインキナーゼＡの使用であって、プロテインキナーゼＡレベルは前記患者のサンプルで測定され、前記ＡＳＤ治療に対する陽性反応は、治療前の前記患者のベースラインプロテインキナーゼＡレベルと比較したプロテインキナーゼＡレベルの増加を特徴とする、プロテインキナーゼＡの使用。
【請求項４】
前記ＡＳＤ治療に対する不十分な応答は、治療前の前記患者のベースラインプロテインキナーゼＡレベルと比較して前記プロテインキナーゼＡレベルの増加がないことを特徴とする、請求項３に記載のプロテインキナーゼＡの使用。
【請求項５】
前記ＡＳＤ治療に対する応答の停止は、ＡＳＤ治療への陽性反応中に測定されたプロテインキナーゼＡレベルと比較したプロテインキナーゼＡレベルの減少を特徴とし、前記ＡＳＤ治療は強化される、請求項３に記載のプロテインキナーゼＡの使用。
【請求項６】
前記サンプルが、血液サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、唾液サンプル、尿サンプルまたは任意の他の体液サンプルから選択される、請求項１乃至５の何れか１項に記載のプロテインキナーゼＡの使用。
【請求項７】
ＡＳＤ患者のＡＳＤ表現型１を診断する方法であって、前記方法は以下を含む
−前記患者のサンプルの提供、および
−前記サンプル中のプロテインキナーゼＡレベルの測定、および
−前記サンプルで測定された前記プロテインキナーゼＡレベルが、年齢と性別が一致したコントロールサンプルのプロテインキナーゼＡレベルよりも低い場合のＡＳＤ表現型１の診断。
【請求項８】
ＡＳＤ表現型１患者におけるＡＳＤ重症度の変動をモニタリングするための方法であって、前記方法は以下を含む
−前記患者のサンプルの提供、および
−前記サンプル中のプロテインキナーゼＡレベルの測定。
【請求項９】
ＡＳＤ重症度の増加が、前記患者の以前のサンプルで測定されたプロテインキナーゼＡレベルと比較したプロテインキナーゼＡレベルの減少を特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＡＳＤ表現型１患者におけるＡＳＤ治療の有効性をモニタリングするための方法であって、前記方法は以下を含む
−前記患者のサンプルの提供、および
−前記サンプル中のプロテインキナーゼＡレベルの測定。
【請求項１１】
前記ＡＳＤ治療に対する陽性反応は、治療前の前記患者のベースラインプロテインキナーゼＡレベルと比較したプロテインキナーゼＡレベルの増加を特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＡＳＤ治療に対する不十分な応答は、治療前の前記患者のベースラインプロテインキナーゼＡレベルと比較して前記プロテインキナーゼＡレベルの増加がないことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
治療に対する応答の停止は、治療が有効であるときに測定されたプロテインキナーゼＡレベルと比較したプロテインキナーゼＡレベルの減少を特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記サンプルが、血液サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、唾液サンプル、尿サンプルまたは任意の他の体液サンプルから選択される、請求項７乃至１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ＡＳＤ患者におけるＡＳＤ表現型１の診断に使用するためのキットであって、前記患者のサンプル中のプロテインキナーゼＡレベルを測定するための手段を含むキット。
【請求項１６】
ＡＳＤ表現型１患者のＡＳＤ疾患活性のモニタリングに使用するためのキットであって、前記患者のサンプル中のプロテインキナーゼＡレベルを測定する手段を含むキット。
【請求項１７】
ＡＳＤ表現型１患者におけるＡＳＤ治療の有効性をモニタリングする際に使用するためのキットであって、前記患者のサンプル中のプロテインキナーゼＡレベルを測定する手段を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、特にＡＳＤ表現型１のモニタリングに使用するバイオマーカーアッセイに関する。さらに、本発明のアッセイは、ＡＳＤ表現型１の診断にも有用である。
【背景技術】
【０００２】
ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）は、分子の調節サブユニット（Ｒ）へのｃＡＭＰの結合によって活性化され、アクティブな触媒キナーゼサブユニット（Ｃ）の放出をもたらす。真核生物系におけるｃＡＭＰの影響のほとんどは、ＰＫＡによるセリンまたはスレオニン残基でのタンパク質のリン酸化の結果である。ＰＫＡの両方のサブユニットにはいくつかのアイソフォームがある。ＰＫＡは、ホロ酵素のＲサブユニットに結合するＡＫＡＰとして知られるマルチドメイン足場タンパク質に結合することにより、細胞内に局在する(Pearce, L.R., D. Komander, and D.R. Alessi, The nuts and bolts of AGC protein kinases. Nat Rev Mol Cell Biol, 2010. 11 (1): p.9-22)。ＰＫＡは神経発達において重要な役割を果たす。
【０００３】
自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）は、多くの場合、社会的相互作用の障害、言語及びコミュニケーションの障害、並びに反復的で固執的な行動の存在によって特徴付けられる神経発達障害群である(Abrahams BS, Geschwind DH; Advances in autism genetics: on the threshold of a new neurobiology Nat Rev Genet. 2008 Jun;9(6):493), (Zoghbi HY, Bear MF; Synaptic dysfunction in neurodevelopmental disorders associated with autism and intellectual disabilities, Cold Spring Harb Perspect Biol. 2012 Mar 1;4(3))。ＡＳＤの特徴的な症状または行動的特徴は、通常、最初の３年間に現れ、大多数の患者において一生存在し続ける。症状の強さは患者によって異なり、患者の適応能力が発達するにつれて低下する場合がある。環境的要因、発達（思春期への移行・・・）、またはてんかんなどの併存症も症状の悪化につながる可能性がある。
【０００４】
精神疾患の診断および統計マニュアルの第５版(DSM.5th Edition. Washington, DC: American Psychiatric Association; 2013. American Psychiatric Association. Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders)によると、ＡＳＤは２セットの中核的な障害：社会的コミュニケーションと相互作用の持続的な欠損、および限局的で反復的な行動、興味、活動、を特徴とする。前版(DSM-IV-Text Revision) (DSM-IV-TR4th Edition. Washington, DC: American Psychiatric Association; 2000. American Psychiatric Association. Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders.)と比較すると、ＤＳＭ−５は重要な変更を導入した。診断基準では、社会的コミュニケーションで使用されていない言語能力は重視されていない。さらに、診断のサブカテゴリ、すなわち、自閉症障害、アスペルガー障害、レット障害、小児期崩壊性障害、および特定不能の広汎性発達障害（ＰＤＤ）は、自閉症スペクトラム障害の診断基準に含まれるようになった。さらにＤＳＭ−５では、ＡＳＤの重症度の段階的な３つのレベル（１）（「サポートが必要」）から（２）（「実質的なサポートが必要」）、そして（３）（「非常に重要なサポートが必要」）までに、患者が適合するかどうかを特定する必要がある。
【０００５】
自閉症の定義に基づく他の関連する行動は、ＷＨＯ−ＩＣＤ−１０自閉性障害の定義を含む他の診断マニュアルおよび分類システムにおいてさまざまな用語で提案されている(2017/18 ICD-10-CM Diagnosis Code F84.0)(World Health Organization. (1992). The ICD-10 classification of mental and behavioral disorders: Clinical descriptions and diagnostic guidelines. Geneva: World Health Organization.)。
【０００６】
増え続けるＡＳＤ感受性遺伝子が実際には限られた数の分子経路に集中する可能性がある、という理論を支持する証拠が最近蓄積されてきた。シナプスおよび回路形成またはシナプス伝達を媒介する遺伝子は、適応および自然免疫応答の変調を含む他の生理学的プロセスにも関与しているため、この増大する仮定は重要な変換の機会を提供する(Myka L. Estes ML, McAllister AK (2015), Nature Reviews Neuroscience 16, 469-486), cell proliferation, survival and protein synthesis (Subramanian M, Timmerman CK, Schwartz JL, Pham DL and Meffert MK (2015), Front. Neurosci. 9:313. Tang G. et al. (2014), Neuron. 83, 1131-1143.)。
【０００７】
ただし、ＡＳＤの行動ベースのＤＳＭ−５診断では、分子的および遺伝的変化に関して合理的な分類ができず、むしろさまざまな病因を持つ障害の大規模なグループの行動ベースの包括的な用語として機能する、という科学コミュニティによる認識が高まっている。これらの違いは、遺伝的変化と遺伝子発現パターンの特定のバリエーションによって引き起こされる。
【０００８】
以前に、特定の遺伝的シグネチャー(Bernier et al; Disruptive CHD8 mutations define a phenotype of autism early in development; Cell 2014 Jul 17; 158 (2): 263-276.)、または行動的および臨床的エンドフェノタイプ(Eapen V. and Clarke R.A.; Autism Spectrum Disorder: From genotypes to phenotypes; Front Hum Neurosci. 2014;8:914) を利用することにより、ＡＳＤ患者をより小さく、より均質なサブグループに階層化する試みが行われた。ただし、これらの戦略はＡＳＤの遺伝的および表現型の不均一性を包含する困難に直面しており、疾患の根底にある特定の神経生物学的経路の同定を支援しない可能性がある。
【０００９】
分子ベースのアッセイは、ＡＳＤ患者を分類したり、疾患の経過をモニタリングする方法を提供する可能性がある。ただし、ＡＳＤの本質的な複雑さのために、および遺伝的要因と環境的要因の複雑な絡み合いのため、そのようなアッセイを確立するために使用できるＡＳＤの特有のバイオマーカーはまだ特定されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、解決すべき問題は、ＡＳＤ患者の表現型を効率的かつ簡単に識別し、使いやすいバイオマーカーアッセイを使用して疾患の活動をモニタリングする手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ＡＳＤ患者における自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）表現型１の診断にプロテインキナーゼＡを使用することを提供することによりこの課題を解決する。プロテインキナーゼＡレベルは患者のサンプルで測定され、測定されたプロテインキナーゼＡレベルが、年齢と性別が一致したコントロールサンプルのプロテインキナーゼＡレベルよりも低い場合にＡＳＤ表現型１が診断される。
【００１２】
同様に、ＡＳＤ患者のＡＳＤ重症度の変動のモニタリングにプロテインキナーゼＡを使用することによって課題は解決される。プロテインキナーゼＡレベルは患者のサンプルで測定され、患者の以前のサンプルで測定されたプロテインキナーゼＡレベルと比較したプロテインキナーゼＡレベルの減少によってＡＳＤ重症度の増加が特徴付けられる。
【００１３】
第３に、ＡＳＤ患者のＡＳＤ表現型１を診断する方法によって課題は解決され、この方法は以下を含む
−患者のサンプルの提供、および
−サンプル中のプロテインキナーゼＡレベルの測定、および
−サンプルで測定されたプロテインキナーゼＡレベルが、年齢と性別が一致したコントロールサンプルのプロテインキナーゼＡレベルよりも低い場合のＡＳＤ表現型１の診断。
【００１４】
さらに、ＡＳＤ表現型１患者におけるＡＳＤ重症度の変動をモニタリングするための方法によって課題は解決され、この方法は以下を含む
−患者のサンプルの提供、および
−サンプル中のプロテインキナーゼＡレベルの測定。
【００１５】
最後に、ＡＳＤ表現型１患者におけるＡＳＤ治療の有効性をモニタリングする方法によって課題は解決され、この方法は以下を含む
−患者のサンプルの提供、および
−サンプル中のプロテインキナーゼＡレベルの測定。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
一態様では、本発明は、ＡＳＤ患者の自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）表現型１の診断にプロテインキナーゼＡを使用することに関し、プロテインキナーゼＡレベルは患者のサンプルで測定され、ＡＳＤ表現型１は以下の場合に診断される。測定されたプロテインキナーゼＡレベルは、年齢と性別が一致したコントロールサンプルのプロテインキナーゼＡレベルよりも低い。
【００１７】
本明細書で使用される場合、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）という用語は、社会的コミュニケーションと相互作用の欠損、および行動、興味または活動の限局的で反復的なパターンを特徴とする神経発達障害のファミリーを網羅すると理解される。以下では、「自閉症スペクトラム障害」、「自閉症」および「ＡＳＤ」という用語は互換的に使用される。
【００１８】
当業者は、患者がどのようにしてＡＳＤと診断され得るかについてよく認識している。例えば、当業者は、「米国精神医学会、精神疾患の診断および統計マニュアル（ＤＳＭ−５）第５版」に設定された基準に従って、対象にＡＳＤの診断を下してもよい。同様に、ＡＳＤ患者は、ＤＳＭ  ＩＶ、ＩＣＤ−９、ＩＣＤ−１０、ＤＩＳＣＯ、ＡＤＩ−Ｒ、ＡＤＯＳ、ＣＨＡＴなどの標準化された評価ツールに従って診断されてもよい。
【００１９】
他のケースにおいて患者は、自閉症障害、アスペルガー障害、または特定不能の広汎性発達障害（ＰＤＤ−ＮＯＳ）の確立されたＤＳＭ−ＩＶ診断を有し得る。
【００２０】
プロテインキナーゼＡは、２つの触媒サブユニットと２つの調節サブユニットからなるｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼのファミリーである。本明細書で理解されるように、「プロテインキナーゼＡ」という用語は、この酵素ファミリーの任意のメンバーをカバーする。特に、この用語は、哺乳動物プロテインキナーゼＡの２つの主要なタイプ、タイプＩおよびタイプＩＩ（ＰＫＡ  ＩおよびＰＫＡ  ＩＩ）を指すと理解されている。これらのキナーゼは、ＲＩおよびＲＩＩと呼ばれる異なるＲサブユニットの存在によって区別される。生化学的研究と遺伝子クローニングにより、Ｃサブユニットの３つのアイソフォーム、Ｃα、Ｃβ、Ｃγ、およびＲサブユニットの４つのアイソフォーム、ＲＩα、ＲＩβ、ＲＩＩα、およびＲＩＩβが同定された。本発明は、プロテインキナーゼＡのホロ酵素の測定だけでなく、各サブユニットの測定も想定している。好ましい実施形態において、血清中に存在するイソ酵素プロテインキナーゼＡが測定される。
【００２１】
プロテインキナーゼＡの測定は、当業者に知られている任意の方法を使用して行うことができる。測定方法の例には、イムノアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラテラルフローアッセイ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および磁気イムノアッセイ（ＭＩＡ）が含まれる。好ましい実施形態において、プロテインキナーゼＡレベルは、改変されたＭＥＳＡＣＵＰプロテインキナーゼＡ活性アッセイを使用して測定される。別の好ましい実施形態において、プロテインキナーゼＡレベルは、抗プロテインキナーゼＡ抗体を使用するＥＬＩＳＡによって測定される。
【００２２】
患者のサンプルは、体液の任意のサンプルであってよい。好ましい実施形態において、サンプルは、血液サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、唾液サンプル、尿サンプルから選択される。全血サンプルの場合、例えば、精製により、または個々の成分の分離により、プロテインキナーゼＡの測定を容易にするためにサンプルは処理されてもよい。
【００２３】
「年齢および性別が一致した対照サンプル」という用語は、ＡＳＤ患者に対応する年齢および性別を有する個人または健康な対象のグループから採取されたサンプルを指す。本発明を実施するために、本発明が実施されるたびに、対照サンプルのプロテインキナーゼＡレベルを新たに測定する必要はない。代わりに、本発明は、それぞれのＡＳＤ患者のプロテインキナーゼＡレベルの測定値を、大規模コホートグループについて決定された平均参照値を意味するものと比較する可能性を想定している。
【００２４】
本発明は、ＡＳＤ患者におけるＡＳＤ表現型１を診断するために有用である。ＡＳＤ表現型１の患者は、次の臨床的徴候および症状によって定義できる：1）少なくとも1つの必須の特徴：コントロールの母集団に対して、２４か月の平均頭囲（ＨＣ）を超える少なくとも１つの標準偏差を特徴とする拡大した頭部サイズ、および/または正式な大頭症（ＨＣ＞一般集団の９７％）、および/または感染症の期間、乳歯の喪失、心的外傷後の損傷、内因性および外因性の温度変化によって増強される中核または補助的な自閉症の症状の周期的な悪化;２）および以下の２０の特徴のうちの少なくとも２つ、最も好ましくは少なくとも３つ：コントロールの母集団に対して毛髪および爪の成長の加速；同じ民族の人と比較して、肌や目の色が薄くなる傾向の増加；同じ民族の対照被験者よりも実質的に長いまつ毛；特に患者の背中に現れる、少なくとも５つの隣接しない領域の色素沈着のない皮膚；感染症、乳歯喪失、心的外傷後の損傷、または体温を変化させる内因性および外因性の要因の期間中の浮腫の兆候;より具体的には、眼窩周囲および額領域にある顔面浮腫；同じ年齢と民族の一般的に発達している個人と比較して、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）の血中濃度の上昇；先天性泌尿生殖器奇形および/または排尿を開始する機能障害;膝蓋骨の形成不全;特に５歳未満で下痢が頻繁に発生する；耳鳴りの頻繁に発生する；脳梁の薄化；特に骨髄腫と急性前骨髄球性白血病に限定されないが、血液悪性腫瘍の陽性家族歴;関節リウマチの陽性の家族歴、すなわち連続した２世代で少なくとも２人の第１度近親者が罹患している；アセチルサリチル酸またはその誘導体に反応する有害事象;片側性または両側性の虹彩欠損；特に新生児、幼児および小児における睡眠多汗症（特に乳児期および小児期の寝汗の増加−親類からベッドリネンの交換が必要と報告されることが多い）;Ｔｈ１／Ｔｈ２比の増加（すなわち、インターロイキン１ベータ、インターロイキン６、ＴＮＦ−アルファ、インターフェロンガンマのレベルの上昇）;先天性アクセサリーまたは重複脾臓;先天性乳腺の先天性欠如;妊娠中のウイルスまたは細菌感染症に罹患している母親、および/または妊娠中に生物学的に確認された母親の免疫活性化について報告されている病歴。
【００２５】
同様に、ＡＳＤ表現型１患者は、Ｎｒｆ２転写因子のアップレギュレーションと、増殖関連経路の発現亢進の臨床徴候によって特徴付けられる。同時に、これらの患者は、ストレス、アポトーシスまたは細胞分化、細胞増殖、細胞周期進行、細胞分裂および分化への適応に関与する経路のアップレギュレーションを示す（特に、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ｍＴＯＲ／ＭＡＰＫ、ＥＲＫ／ＪＮＫ−Ｐ３８などだが限定しない）。
【００２６】
この表現型の患者では、炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２２及びＧＭ−ＣＳＦ）、Ｔｈ１サイトカイン（ＩＮＦ−γ）およびケモカイン（ＩＬ−８）が、健康な対照患者と比較して脳内で有意に増加する可能性がある。Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１０）は、有意な差を示さない場合がある。Ｔｈ１／Ｔｈ２比は、表現型１の患者で大幅に増加する可能性がある。
【００２７】
上記の臨床徴候および症状は、ＡＳＤ患者におけるＡＳＤ表現型１の存在のヒントを提供するが、本発明は、ＡＳＤ患者におけるＡＳＤ表現型１を同定および/または診断するために使用できるバイオマーカーを初めて提供する。結果として、本発明は、ＡＳＤ表現型１患者を同定するための迅速かつ簡便な方法を提供する。
【００２８】
別の実施形態では、本発明はまた、ＡＳＤ患者のＡＳＤ重症度の変動をモニタリングする際にプロテインキナーゼＡを使用することに関する。プロテインキナーゼＡレベルは患者のサンプルで測定され、ＡＳＤ重症度の増加は、患者の以前のサンプルで測定されたプロテインキナーゼＡレベルと比較したプロテインキナーゼＡレベルの減少によって特徴づけられる。
【００２９】
好ましい実施形態において、本発明は、ＡＳＤ表現型１患者におけるＡＳＤ重症度の変動をモニタリングする際にプロテインキナーゼＡを使用することを提供する。本発明による方法に加えて、ＡＳＤ表現型１患者はまた、ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０８０３７２に記載されているようなチャレンジテストの助けを借りて特定されてもよい。簡単に言うと、チャレンジテストの概念は、ＡＳＤ患者へＮｒｆ２活性化因子の投与に基づいている。すでにそれぞれの経路のアップレギュレーションを示しているＡＳＤ表現型１の患者では、Ｎｒｆ２のさらなる活性化が中核症状の悪化につながる。その結果、ＡＳＤ表現型１患者は、チャレンジテストで否定的な応答によって識別される場合がある。
【００３０】
ＡＳＤ表現型１の患者を特定する別の方法は、Ｎｒｆ２のアップレギュレーションをチェックすることである。当業者は、Ｎｒｆ２などの特定の遺伝子のアップレギュレーションをどのようにチェックできるかをよく認識している。たとえば、ｑＰＣＲやＲＴ−ｑＰＣＲなどの定量的ＰＲＣ手法を使用して、ｍＲＮＡレベルで確認することができる。同様に、遺伝子のアップレギュレーションは、ウエスタンブロットや定量的ドットブロットなどのタンパク質定量技術を使用して、タンパク質レベルで決定することができる。アップレギュレーションは、健康な被験者からのサンプルと比較したときに、ｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルが少なくとも２０％増加することを意味すると理解されている。
【００３１】
ＡＳＤ重症度の変動は、本明細書では、発熱、温度変化などの環境要因、感染症、またはアレルギー症状によって引き起こされる可能性がある、患者のＡＳＤ中核および補助症状の両方の重症度の変動として定義される。ＡＳＤの主な症状には、社会的相互作用の困難、コミュニケーションの課題、反復的な行動をする傾向などがあるが、これらに限定されない。ＡＳＤ補助症状には、知的障害、学習障害、泌尿生殖器の機能不全（すなわち、排尿を開始する障害）、下痢のエピソードが含まれるが、これらに限定されない。
【００３２】
ＡＳＤ表現型１の患者では、ＡＳＤの重症度の増加に伴い、場合によってはプロテインキナーゼＡレベルの減少が先行する。その結果、本発明は、患者のサンプル中のプロテインキナーゼＡレベルを測定することにより、ＡＳＤ患者、好ましくはＡＳＤ表現型１患者におけるＡＳＤ重症度の変動をモニタリングするのに有用である。ここで、ＡＳＤ重症度の増加は、患者の以前のサンプルで測定されたプロテインキナーゼＡレベルと比較して、プロテインキナーゼＡレベルが低いことを特徴とする。好ましい実施形態において、本発明によるＡＳＤ重症度の変動のモニタリングは、ＡＳＤまたはＡＳＤ表現型１患者の少なくとも２つのサンプルにおけるプロテインキナーゼレベルを測定することを含む。
【００３３】
さらに別の実施形態では、本発明は、ＡＳＤ表現型１患者におけるＡＳＤ治療の有効性をモニタリングする際にプロテインキナーゼＡを使用することに関する。プロテインキナーゼＡレベルは患者のサンプルで測定され、ＡＳＤ治療に対する陽性反応は、治療前の患者のベースラインプロテインキナーゼＡレベルと比較したプロテインキナーゼＡレベルの増加を特徴とする。
【００３４】
本発明は、ＡＳＤ表現型１患者におけるＡＳＤ治療の有効性をモニタリングするために有用である。ＡＳＤ表現型１の患者では、ＡＳＤの成功した効果的な治療により、プロテインキナーゼＡレベルが上昇する。その結果、治療に対する肯定的な反応は、治療前の患者のベースラインプロテインキナーゼＡレベルと比較して、プロテインキナーゼＡレベルが上昇することによって特徴付けられる。不十分な応答は、増加の欠如によって特徴付けられ、応答の停止は、陽性応答中に患者において測定されたプロテインキナーゼＡのレベルと比較したプロテインキナーゼＡレベルの減少によって特徴付けられる。患者において、肯定的な反応か不十分な反応か反応の停止が決定されたかどうかに応じて、陽性反応の場合は治療を維持することができ、不十分な反応または反応の停止の場合は治療を強化することができる。不十分な反応または反応の停止の場合、治療は別の治療に置き換えてもよい。
【００３５】
本明細書で使用する場合、「ＡＳＤ治療」という用語は、当業者に知られているＡＳＤの任意の治療を指す。ＡＳＤ治療の例としては、リスペリドン、アリピプラゾール、クロザピン、ハロペリドール、セルトラリン、オキシトシン、セクレチン、メチルフェニデート、ベンラファキシン、フルオキセチン、シタロプラム、ブメタニド、メマンチン、リバスチグミン、ミルタザピン、メラトニン、アカンプロセート、アトモキセチン、髄腔内バクロフェン、ＤＭＸＢ−Ａ（ネメルチン毒素アナバセインの誘導体）、ＥＰＩ−７４３：ビンセリノン、ＲＧ７３１４：Ｖ１Ａバソプレッシン受容体の拮抗薬、スルフォラファン、スラミンの投与が含まれる。さらに、本発明を用いてモニタリングされるべき可能な治療は、ＥＰ１８２０４７６３．９に見出すことができる。
【００３６】
別の実施形態では、本発明は、ＡＳＤ患者のＡＳＤ表現型１を診断するための方法に関しこの方法は以下を含む
−患者のサンプルの提供、および
−サンプル中のプロテインキナーゼＡレベルの測定、および
−サンプルで測定されたプロテインキナーゼＡレベルが、年齢と性別が一致したコントロールサンプルのプロテインキナーゼＡレベルよりも低い場合のＡＳＤ表現型１の診断。
【００３７】
さらに別の実施形態では、本発明は、ＡＳＤ表現型１患者におけるＡＳＤ重症度の変動をモニタリングするための方法に関し、この方法は以下を含む
−患者のサンプルの提供、および
−サンプル中のプロテインキナーゼＡレベルの測定。
【００３８】
さらに別の実施形態では、本発明は、ＡＳＤ表現型１患者におけるＡＳＤ治療の有効性をモニタリングする方法に関し、この方法は以下を含む
−患者のサンプルの提供、および
−サンプル中のプロテインキナーゼＡレベルの測定。
【００３９】
別の実施形態では、本発明は、ＡＳＤ患者におけるＡＳＤ表現型１の診断に使用するためのキットを提供し、キットは、患者のサンプル中のプロテインキナーゼＡレベルを測定するための手段を含む。
【００４０】
さらに別の実施形態では、本発明は、ＡＳＤ表現型１患者のＡＳＤ疾患活性のモニタリングに使用するためのキットを提供し、キットは患者のサンプル中のプロテインキナーゼＡレベルを測定する手段を含む。
【００４１】
別の実施形態では、本発明は、ＡＳＤ表現型１患者におけるＡＳＤ治療の有効性をモニタリングする際に使用するためのキットを提供し、キットは、患者のサンプル中のプロテインキナーゼＡレベルを測定する手段を含む。
【００４２】
サンプル中のプロテインキナーゼＡレベルを測定するための手段は、例えば、抗プロテインキナーゼＡ抗体を含んでもよい。さらに、本発明によるキットはまた、適切な緩衝液、検出剤および参照値を伴うチャートを含んでもよい。
【実施例】
【００４３】
３人のＡＳＤ患者（ＤＳＭ−５基準に基づいて診断）の血清サンプルを２つの異なる時点で収集した。血清サンプルの１回目のラウンドは、治療前に収集され、治療前のベースライン値を表している。２回目のラウンドの血清サンプルは、イブジラスト０．６ｍｇ／ｋｇを１日３回、ブメタニド１日２回の総摂取量０．０８ｍｇ／ｋｇと組み合わせて投与した１か月の治療後に収集した。
【００４４】
血清サンプルのプロテインキナーゼＡレベルは、ＭＥＳＡＣＵＰプロテインキナーゼアッセイキット(Medical & Biological laboratories CO., LTD)を使用して測定した。アッセイは、製造元から提供された仕様に従って実施した。
【００４５】
３人の患者がＡＳＤ表現型１として分類され、以下を示した：
・少なくとも１つの必須の特性：
・コントロールの母集団に対して、２４か月の平均頭囲を超える少なくとも１つの標準偏差を特徴とする拡大した頭部サイズ、および/または正式な大頭症（ＨＣ＞一般集団の９７％）
・感染症の期間、乳歯の喪失、心的外傷後の損傷、内因性および外因性の温度変化によって増強される中核または補助自閉症の症状の周期的な悪化
そして
・以下の２０の特徴のうちの少なくとも２つ、最も好ましくは少なくとも３つ
・コントロールの母集団に対して毛髪および爪の成長の加速
・同じ民族の人と比較して、肌や目の色が薄くなる傾向の増加
・同じ民族の対照被験者よりも実質的に長いまつ毛
・特に患者の背中に現れる、少なくとも５つの隣接しない領域の色素沈着のない皮膚
・感染症、乳歯喪失、心的外傷後の損傷、または体温を変化させる内因性および外因性の要因の期間中の浮腫の兆候;より具体的には、眼窩周囲と額領域にある顔面浮腫
・同じ年齢と民族の一般的に発達している個人と比較して、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）の血中濃度の上昇
・先天性泌尿生殖器奇形および/または排尿を開始する機能障害
・膝蓋骨の形成不全
・特に５歳未満で下痢が頻繁に発生する
・耳鳴りが頻繁に発生する
・脳梁の薄化
・特に骨髄腫および急性前骨髄球性白血病に限定されないが、血液悪性腫瘍の陽性家族歴
・関節リウマチの陽性の家族歴、すなわち連続した２世代で少なくとも２人の第１度近親者が罹患している
・アセチルサリチル酸またはその誘導体に反応する有害事象
・片側性または両側性の虹彩欠損
・特に新生児、幼児および小児における睡眠多汗症（特に乳児期および小児期の寝汗の増加−親類からベッドリネンの交換が必要と報告されることが多い）
・Ｔｈ１／Ｔｈ２比の増加（すなわち、インターロイキン１ベータ、インターロイキン６、ＴＮＦ−アルファ、インターフェロンガンマのレベルの上昇）
・先天性アクセサリーまたは重複脾臓
・先天性乳腺の先天性欠如
・妊娠中のウイルスまたは細菌感染症に罹患している母親、および/または妊娠中に生物学的に確認された母親の免疫活性化について報告されている病歴
【００４６】
以下の表２に測定結果を示す。
【表２】
2021505847.tif 000002
表２：イブジラスト０．６ｍｇ／ｋｇを１日３回、ブメタニド１日２回の総摂取量０．０８ｍｇ／ｋｇと組み合わせて投与した治療前後のＰＫＡ測定
【手続補正書】
【提出日】令和2年9月29日(2020.9.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＳＤ患者における自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）表現型１の診断のためのキットの製造のためのプロテインキナーゼＡの使用であって、プロテインキナーゼＡレベルは前記患者のサンプルで測定され、前記測定されたプロテインキナーゼＡレベルが、年齢と性別が一致したコントロールサンプルのプロテインキナーゼＡレベルよりも低い場合にＡＳＤ表現型１が診断される、プロテインキナーゼＡの使用。
【請求項２】
ＡＳＤ患者のＡＳＤ重症度の変動のモニタリングのためのキットの製造のためのプロテインキナーゼＡの使用であって、プロテインキナーゼＡレベルは前記患者のサンプルで測定され、前記患者の以前のサンプルで測定されたプロテインキナーゼＡレベルと比較したプロテインキナーゼＡレベルの減少によってＡＳＤ重症度の増加を特徴とする、プロテインキナーゼＡの使用。
【請求項３】
ＡＳＤ表現型１患者におけるＡＳＤ治療の有効性をモニタリングのためのキットの製造のためのプロテインキナーゼＡの使用であって、プロテインキナーゼＡレベルは前記患者のサンプルで測定され、前記ＡＳＤ治療に対する陽性反応は、治療前の前記患者のベースラインプロテインキナーゼＡレベルと比較したプロテインキナーゼＡレベルの増加を特徴とする、プロテインキナーゼＡの使用。
【請求項４】
前記ＡＳＤ治療に対する不十分な応答は、治療前の前記患者のベースラインプロテインキナーゼＡレベルと比較して前記プロテインキナーゼＡレベルの増加がないことを特徴とする、請求項３に記載のプロテインキナーゼＡの使用。
【請求項５】
前記ＡＳＤ治療に対する応答の停止は、ＡＳＤ治療への陽性反応中に測定されたプロテインキナーゼＡレベルと比較したプロテインキナーゼＡレベルの減少を特徴とし、前記ＡＳＤ治療は強化される、請求項３に記載のプロテインキナーゼＡの使用。
【請求項６】
前記サンプルが、血液サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、唾液サンプル、尿サンプルまたは任意の他の体液サンプルから選択される、請求項１乃至５の何れか１項に記載のプロテインキナーゼＡの使用。
【請求項７】
ＡＳＤ患者のＡＳＤ表現型１を診断するためのキットであって、
−前記サンプル中のプロテインキナーゼＡレベルの測定、および
−前記サンプルで測定された前記プロテインキナーゼＡレベルが、年齢と性別が一致したコントロールサンプルのプロテインキナーゼＡレベルよりも低い場合のＡＳＤ表現型１の診断、
がされるように用いられることを特徴とするキット。
【請求項８】
ＡＳＤ表現型１患者におけるＡＳＤ重症度の変動をモニタリングするためのキットであって、
−前記サンプル中のプロテインキナーゼＡレベルの測定、
がされるように用いられることを特徴とするキット。
【請求項９】
ＡＳＤ重症度の増加が、前記患者の以前のサンプルで測定されたプロテインキナーゼＡレベルと比較したプロテインキナーゼＡレベルの減少を特徴とされるように用いられる、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
ＡＳＤ表現型１患者におけるＡＳＤ治療の有効性をモニタリングするためのキットであって、
−前記サンプル中のプロテインキナーゼＡレベルの測定、
がされるように用いられることを特徴とするキット。
【請求項１１】
前記ＡＳＤ治療に対する陽性反応は、治療前の前記患者のベースラインプロテインキナーゼＡレベルと比較したプロテインキナーゼＡレベルの増加を特徴とされるように用いられる、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
前記ＡＳＤ治療に対する不十分な応答は、治療前の前記患者のベースラインプロテインキナーゼＡレベルと比較して前記プロテインキナーゼＡレベルの増加がないことを特徴とされるように用いられる、請求項１０に記載のキット。
【請求項１３】
治療に対する応答の停止は、治療が有効であるときに測定されたプロテインキナーゼＡレベルと比較したプロテインキナーゼＡレベルの減少を特徴とされるように用いられる、請求項１０に記載のキット。
【請求項１４】
前記サンプルが、血液サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、唾液サンプル、尿サンプルまたは任意の他の体液サンプルから選択される、請求項７乃至１３の何れか１項に記載のキット。
【請求項１５】
ＡＳＤ患者におけるＡＳＤ表現型１の診断に使用するためのキットであって、前記患者のサンプル中のプロテインキナーゼＡレベルを測定するための手段を含むキット。
【請求項１６】
ＡＳＤ表現型１患者のＡＳＤ疾患活性のモニタリングに使用するためのキットであって、前記患者のサンプル中のプロテインキナーゼＡレベルを測定する手段を含むキット。
【請求項１７】
ＡＳＤ表現型１患者におけるＡＳＤ治療の有効性をモニタリングする際に使用するためのキットであって、前記患者のサンプル中のプロテインキナーゼＡレベルを測定する手段を含むキット。
【国際調査報告】
2021505847.tif 000003
2021505847.tif 000004
2021505847.tif 000005