(57)【要約】  未加工クリルオイルから高濃度化リン脂質組成物を生成するための方法が提供され、そのような方法は、バッチ式であってもよく、連続的であってもよく、またはバッチ式工程および連続的工程の両方を含んでもよい。本技術は、そのような方法から高品質の高濃度化リン脂質組成物を提供する。さらに、連続的プロセスは、バッチプロセスと比較して著しく高い処理量を提供すると同時に、同等の、またはより高い品質の生成物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
高濃度化リン脂質組成物を生成するための方法であって、
未加工クリルオイル（RKO）を、Ｃ３〜Ｃ８ケトンを少なくとも約８５重量％含む有機溶媒と混合して、水性部分を含有するＲＫＯ含有混合物を提供する工程と；
前記ＲＫＯ含有混合物を第１の低密度層および第１の高密度リン脂質含有層（PCL）に分画し、前記第１のＰＣＬを前記第１の低密度層から分離して、前記高濃度化リン脂質組成物を生成する工程と
を含む方法。
【請求項２】
前記第１のＰＣＬを前記第１の低密度層から分離して、第１の分離ＰＣＬを生成する工程と；
前記第１の分離ＰＣＬを前記有機溶媒と混合して、ＰＣＬ含有混合物を生成する工程と；
前記ＰＣＬ含有混合物を第２の低密度層および第２のＰＣＬに分画する工程と；
前記第２のＰＣＬを前記第２の低密度層から分離して、前記高濃度化リン脂質組成物を生成する工程と
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
高濃度化リン脂質組成物を生成するための方法であって、
未加工クリルオイル（RKO）を、Ｃ３〜Ｃ８ケトンを少なくとも約８５重量％含む有機溶媒と混合して、水性部分を含有するＲＫＯ含有混合物を提供する工程と；
前記ＲＫＯ含有混合物を第１の低密度層および第１の高密度リン脂質含有層（PCL）に分画する工程と；
前記第１のＰＣＬを前記第１の低密度層から分離して、第１の分離ＰＣＬを生成する工程と；
前記第１の分離ＰＣＬを前記有機溶媒と混合して、ＰＣＬ含有混合物を生成する工程と；
前記ＰＣＬ含有混合物を第２の低密度層および第２のＰＣＬに分画する工程と；
前記第２のＰＣＬを前記第２の低密度層から分離して、前記高濃度化リン脂質組成物を生成する工程と
を含む方法。
【請求項４】
前記ＲＫＯ含有混合物の分画の前に、前記ＲＫＯ含有混合物を濾過する工程をさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
高濃度化リン脂質組成物を生成するための方法であって、
未加工クリルオイル（RKO）を、Ｃ３〜Ｃ８ケトンを少なくとも約８５重量％含む有機溶媒と混合して、水性部分を含有するＲＫＯ含有混合物を提供する工程と；
前記ＲＫＯ含有混合物を水と混合し、前記ＲＫＯ含有混合物および水を第１の低密度層および第１の高密度リン脂質含有層（PCL）に分画し、前記第１のＰＣＬを前記第１の低密度層から分離して、前記高濃度化リン脂質組成物を生成する工程と
を含む方法。
【請求項６】
前記第２のＰＣＬを、安定剤、粘度低減剤、またはそれらの組合せと組み合わせる工程をさらに含む、請求項２から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記水性部分が、塩を実質的に含まない、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記水性部分が、炭酸塩、重炭酸塩、またはそれらの組合せを実質的に含まない、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１００ｋｇのＲＫＯを前記有機溶媒と混合する工程を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＲＫＯおよび前記有機溶媒を、有機溶媒の体積：ＲＫＯのｋｇの単位で約５〜約１５の比率にて混合する工程を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＲＫＯおよび前記有機溶媒を混合する前に、前記ＲＫＯを約３０℃〜約７０℃の温度に加熱する工程を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＲＫＯを加熱する工程が、前記ＲＫＯおよび前記有機溶媒を混合する前７２時間以内に行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
未加工クリルオイル（RKO）と前記有機溶媒との混合が、約１５℃〜約４０℃の温度の前記ＲＫＯ含有混合物を提供するように行われる、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＲＫＯ含有混合物が０．４５μｍのフィルタを通して誘導される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＲＫＯ含有混合物が、第１のフィルタおよび第２のフィルタを通して濾過される、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１のフィルタが１０μｍのフィルタであり、前記第２のフィルタが０．４５μｍのフィルタである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＲＫＯ含有混合物が、遠心分離またはデカンテーションにより濾過される、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
水性部分の体積：ＲＫＯのｋｇの単位で、水および前記水性部分に対する前記ＲＫＯ含有混合物の比率約０．１５〜約０．４０にて、前記ＲＫＯ含有混合物を水と混合する工程をさらに含む、請求項２から４および６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１の分離ＰＣＬが、体積比率約２〜約１０にて前記有機溶媒と混合される、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２のＰＣＬが、第２のＰＣＬに対する粘度低減剤の体積比率約０．１〜約０．３を構成するように粘度低減剤と組み合わされる、請求項２から４、６および１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記安定剤がビタミンＥを含む、請求項２から４、６、１８および２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記安定剤が、第２のＰＣＬのｋｇ（第２のPCLの乾燥重量を基準とする）あたり約３ｇ〜約５ｇのビタミンＥを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
連続的プロセスである、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記高濃度化リン脂質組成物が、乾燥重量基準でリン脂質を少なくとも７５％含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記高濃度化リン脂質組成物が、乾燥重量基準でリン脂質を少なくとも８５％含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年５月１６日出願の米国仮特許出願第６２／６７２１８０号の利益を主張し、その内容は、参照することにより全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
製薬業界における使用のために未加工クリルオイル(raw krill oil)から高品質のリン脂質高濃度化組成物を生成するための、安定で柔軟な精製プロセスが提供される。
【背景技術】
【０００３】
未加工クリルオイルの一般的な精製方法はすでに説明されている。Ｕ．Ｓ．２０１７／０１０１６００および９，６５０，５９０は、塩およびトリメチルアミンＮ−オキシドを除去し、中性脂質、極性脂質およびアスタキサンチンを含む生成物を回収するために、吸着およびクロマトグラフィー分離に基づく一連の分離プロセスによりクリルオイル抽出物を純化するための連続的プロセスを説明している。ＵＳ２０１６／０３４５６１には、溶媒を用いた抽出により、脂質に富む甲殻類を処理して、リン脂質、タンパク質栄養素および油を含む、フッ化物、トリエチルアミンおよびトリメチルアミドオキシドが低い組成物を生成するための方法が記載されている。これらの方法は、不純物の除去および特定分子の単離を目的としている。したがって、これらの方法によって、高トリグリセリド血症等の病状を処置するための製薬業界における用途の高品質の高濃度化リン脂質組成物を生成することはできない。
【０００４】
濃縮リン脂質クリルオイル組成物を作製するための抽出方法もまた説明されている。ＵＳ２０１７／００２０９２８は、小分子有機溶媒（すなわちアセトンもしくはエタノール）／水抽出混合物および／または亜臨界もしくは超臨界流体抽出物を低温で使用し、続いて乾燥プロセスを使用することにより形成され得る、濃縮リン脂質クリルオイル組成物の作製を開示している。ＵＳ２０１６／０２２８４６１および２０１６／０２２８４６２は、アルコール分画を使用した粗オキアミ脂質組成物の高効率および高収率抽出方法を説明している。これらの方法は、いかなる濃縮もなしに海洋バイオマスから脂質成分を抽出することを可能にする。経済的に実行可能となるため、および医薬製品の規制要件を満たすためには、製造プロセスは、いくつかの変動性（すなわち出発材料等の変動性）を考慮する必要があり、商業的な量の高純度生成物を一貫した効率的な様式で生成することを可能にするべきである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、製薬業界における用途のために、一貫した効率的な方法で高い純度を示す未加工クリルオイルに由来する商業的で経済的に通用し得る成分および組成物を提供する、より高い全体的処理量を有するプロセスが、極めて必要とされている。これらの高濃度化リン脂質組成物は、対象における高トリグリセリド血症または他の適応症を処置するために使用され得る。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
高濃度化リン脂質組成物を生成するための方法であって、未加工クリルオイル（RKO）を、Ｃ３〜Ｃ８ケトンを少なくとも約８５重量％含む有機溶媒と混合して、水性部分を含有するＲＫＯ含有混合物を提供する工程と；ＲＫＯ含有混合物を第１の低密度層および第１の高密度リン脂質含有層（PCL）に分画し、第１のＰＣＬを第１の低密度層から分離して、高濃度化リン脂質組成物を生成する工程とを含む方法が提供される。
【０００７】
一実施形態において、本明細書に記載の方法は、第１のＰＣＬを第１の低密度層から分離して、第１の分離ＰＣＬを生成する工程と；第１の分離ＰＣＬを有機溶媒と混合して、ＰＣＬ含有混合物を生成する工程と；ＰＣＬ含有混合物を第２の低密度層および第２のＰＣＬに分画する工程と；第２のＰＣＬを第２の低密度層から分離して、高濃度化リン脂質組成物を生成する工程とをさらに含む。
【０００８】
また、高濃度化リン脂質組成物を生成するための方法であって、未加工クリルオイル（RKO）を、Ｃ３〜Ｃ８ケトンを少なくとも約８５重量％含む有機溶媒と混合して、水性部分を含有するＲＫＯ含有混合物を提供する工程と；ＲＫＯ含有混合物を第１の低密度層および第１の高密度リン脂質含有層（PCL）に分画する工程と；第１のＰＣＬを第１の低密度層から分離して、第１の分離ＰＣＬを生成する工程と；第１の分離ＰＣＬを有機溶媒と混合して、ＰＣＬ含有混合物を生成する工程と；ＰＣＬ含有混合物を第２の低密度層および第２のＰＣＬに分画する工程と；第２のＰＣＬを第２の低密度層から分離して、高濃度化リン脂質組成物を生成する工程とを含む方法も提供される。
【０００９】
別の実施形態において、本明細書に記載の方法は、ＲＫＯ含有混合物の分画の前に、ＲＫＯ含有混合物を濾過する工程をさらに含む。
【００１０】
さらに、高濃度化リン脂質組成物を生成するための方法であって、未加工クリルオイル（RKO）を、Ｃ３〜Ｃ８ケトンを少なくとも約８５重量％含む有機溶媒と混合して、水性部分を含有するＲＫＯ含有混合物を提供する工程と；ＲＫＯ含有混合物を水と混合し、ＲＫＯ含有混合物および水を第１の低密度層および第１の高密度リン脂質含有層（PCL）に分画し、第１のＰＣＬを第１の低密度層から分離して、高濃度化リン脂質組成物を生成する工程とを含む方法が提供される。
【００１１】
追加の実施形態において、本明細書に記載の方法は、第２のＰＣＬを、安定剤、粘度低減剤、またはそれらの組合せと組み合わせる工程をさらに含む。
【００１２】
一実施形態において、水性部分は、塩を実質的に含まない。
【００１３】
別の実施形態において、水性部分は、炭酸塩、重炭酸塩、またはそれらの組合せを実質的に含まない。
【００１４】
別の実施形態において、本明細書に包含される方法は、少なくとも１００ｋｇのＲＫＯを有機溶媒と混合する工程を含む。
【００１５】
さらなる実施形態において、本明細書に記載の方法は、ＲＫＯおよび有機溶媒を、有機溶媒の体積：ＲＫＯのｋｇの単位で約５〜約１５の比率にて混合する工程を含む。
【００１６】
一実施形態において、方法は、ＲＫＯおよび有機溶媒を混合する前に、ＲＫＯを約３０℃〜約７０℃の温度に加熱する工程を含む。
【００１７】
さらなる実施形態において、ＲＫＯを加熱する工程は、ＲＫＯおよび有機溶媒を混合する前７２時間以内に行われる。
【００１８】
追加の実施形態において、未加工クリルオイル（RKO）と有機溶媒との混合は、約１５℃〜約４０℃の温度のＲＫＯ含有混合物を提供するように行われる。
【００１９】
さらなる実施形態において、方法は、ＲＫＯ含有混合物を０．４５μｍのフィルタを通して誘導する工程をさらに含む。
【００２０】
一実施形態において、ＲＫＯ含有混合物は、第１のフィルタおよび第２のフィルタを通して濾過される。
【００２１】
別の実施形態において、第１のフィルタは１０μｍのフィルタであり、第２のフィルタは０．４５μｍのフィルタである。
【００２２】
さらなる実施形態において、ＲＫＯ含有混合物は、遠心分離またはデカンテーションにより濾過される。
【００２３】
一実施形態において、方法は、水性部分の体積：ＲＫＯのｋｇの単位で、水および水性部分に対するＲＫＯ含有混合物の比率約０．１５〜約０．４０にて、ＲＫＯ含有混合物を水と混合する工程をさらに含む。
【００２４】
一実施形態において、第１の分離ＰＣＬは、体積比率約２〜約１０にて有機溶媒と混合される。
【００２５】
別の実施形態において、第２のＰＣＬは、第２のＰＣＬに対する粘度低減剤の体積比率約０．１〜約０．３を構成するように粘度低減剤と組み合わされる。
【００２６】
一実施形態において、安定剤はビタミンＥを含む。
【００２７】
一実施形態において、安定剤は、第２のＰＣＬのｋｇ（第２のPCLの乾燥重量を基準とする）あたり約３ｇ〜約５ｇのビタミンＥを含む。
【００２８】
さらなる実施形態において、方法は、連続的プロセスである。
【００２９】
一実施形態において、高濃度化リン脂質組成物は、乾燥重量基準でリン脂質を少なくとも７５％含む。
【００３０】
一実施形態において、高濃度化リン脂質組成物は、乾燥重量基準でリン脂質を少なくとも８５％含む。
【００３１】
ここで、添付の図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本明細書に包含される連続的プロセスの一実施形態によるフロー図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
未加工クリルオイルから高濃度化リン脂質組成物を生成するための方法が提供され、そのような方法は、バッチ式であってもよく、連続的であってもよく、またはバッチ式工程および連続的工程の両方を含んでもよい。
【００３４】
本明細書において使用される場合、「約」は、当業者に理解され、それが使用される文脈に応じてある程度変動する。その用語が使用される文脈を考慮して当業者に明確でないその使用法が存在する場合、「約」は、特定の用語のプラスまたはマイナス５％までを意味する。
【００３５】
「未加工クリルオイル」は、本明細書において使用される場合、例えば米国特許第９，４７５，８３０号、第９，６５０，５９０号および第９，０６８，１４２号、ならびにＵ．Ｓ．２００４／０２３４５８７、２００９／００７４８５７、２００８／０２７４２０３、２０１３／０２７４４９６、２０１７／００２０９２８、および２０１７／０１０１６００に記載の方法によってオキアミから単離された油を指し、そのそれぞれの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００３６】
本明細書において使用される場合、「リン脂質」は、グリセロールのｓｎ−１もしくはｓｎ−２位で結合した１つの脂肪酸部分、またはグリセロールのｓｎ−１およびｓｎ−２位で結合した２つの脂肪酸部分を有し、グリセロールのｓｎ−３位でホスフェート残基により結合した頭部基を含む有機化合物を指す。例示的な頭部基部分は、コリン、エタノールアミン、セリンおよびイノシトールを含む。リン脂質は、ホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、およびリゾホスファチジン酸を含む。脂肪酸部分は、例えばエステルまたはエーテル結合によりｓｎ−１またはｓｎ−２位で結合した脂肪酸分子の部分である。脂肪酸部分が脂肪酸アシルである場合、脂肪酸アシルの脂肪族鎖はエステル結合を介して結合し、脂肪酸部分が脂肪酸の脂肪族鎖である場合、脂肪族鎖はエーテル結合を介して結合している。したがって、特定の脂肪酸が本明細書に記載のリン脂質と関連して言及されている場合（例えばEPAまたはDHA）、それは、関連する脂肪酸アシル基またはその脂肪族鎖を指すものであるとみなされるべきである。
【００３７】
本明細書において使用される場合、「エーテルリン脂質」という用語は、ｓｎ−１位またはｓｎ−２位のうちの１つにおける脂肪酸部分が、エーテル結合を介して結合した脂肪酸の脂肪族鎖であるリン脂質を指す。エーテルリン脂質は、例えば、アルキルアシルホスファチジルコリン、アルキルアシルホスファチジルエタノールアミン、およびアルキルアシルホスファチジルセリンを含む。
【００３８】
本明細書において使用される場合、「オメガ−３脂肪酸」という用語は、分子のメチル末端から３番目および４番目の炭素原子の間の炭化水素鎖に二重結合を有する多価不飽和脂肪酸を指す。オメガ−３脂肪酸の非限定的な例は、５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸（EPA）、４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸（DHA）および７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸（DPA）を含む。
【００３９】
本明細書において使用される場合、「高濃度化リン脂質組成物」という用語は、乾燥重量基準でリン脂質濃度を少なくとも７５ｗｔ．％、好ましくは８５ｗｔ．％有する混合物を指す。
【００４０】
したがって、未加工クリルオイル（「RKO」）含有混合物（「第３の混合物」）を第１の低密度層および第１の高密度リン脂質含有層（「PCL」）に分画する工程（「第１の分画工程」）と；第１のＰＣＬを第１の低密度層から分離する工程（「第１の分離工程」）とを含む方法が提供され、ＲＫＯ含有混合物は、ＲＫＯ、Ｃ３〜Ｃ８ケトンの溶媒を少なくとも約８５重量％含む第１の有機溶媒、および水性部分を含む。
【００４１】
本明細書に包含される場合、方法は、未加工クリルオイルを第１の有機溶媒と混合して、第１の混合物を生成する工程（「第１の混合工程」）と；任意選択により、第１の混合物を、フィルタを通して誘導し、第２の混合物を提供する工程（「第１の誘導工程」）と；第１の混合物または第２の混合物（存在する場合）を水性部分と混合して、ＲＫＯ含有混合物を提供する工程（「第２の混合工程」）とを任意選択によりさらに含む。
【００４２】
方法は、（上記の任意選択の工程に加えて、またはその代わりに）第１のＰＣＬを第３の混合工程に誘導する工程であって、第３の混合工程は、第１のＰＣＬを、Ｃ３〜Ｃ８ケトンの溶媒を少なくとも約８５重量％含む第２の有機溶媒と混合して、第４の混合物を提供すること含む工程（「第２の誘導工程」）と；第４の混合物を第２の低密度層および第２のＰＣＬに分画する工程（「第２の分画工程」）と；第２のＰＣＬを第２の低密度層から分離する工程（「第２の分離工程」）とを含んでもよい。
【００４３】
関連した態様において、本明細書に包含される方法は、未加工クリルオイル（「RKO」）含有混合物（「第３の混合物」）を第１の低密度層および第１の高密度リン脂質含有層（「PCL」）に分画する工程（「第１の分画工程」）と；第１のＰＣＬを第１の低密度層から分離する工程（「第１の分離工程」）と；第１のＰＣＬを第３の混合工程に誘導する工程であって、第３の混合工程は、第１のＰＣＬを、Ｃ３〜Ｃ８ケトンの溶媒を少なくとも約８５重量％含む第２の有機溶媒と混合して、第４の混合物を提供すること含む工程（「第２の誘導工程」）と；第４の混合物を第２の低密度層および第２のＰＣＬに分画する工程（「第２の分画工程」）と；第２のＰＣＬを第２の低密度層から分離する工程（「第２の分離工程」）とを含み、ＲＫＯ含有混合物は、ＲＫＯ、Ｃ３〜Ｃ８ケトンの溶媒を少なくとも約８５重量％含む第１の有機溶媒、および水性部分を含む。
【００４４】
方法は、未加工クリルオイルを第１の有機溶媒と混合して、第１の混合物を生成する工程（「第１の混合工程」）と；任意選択により、第１の混合物を、フィルタを通して誘導し、第２の混合物を提供する工程（「第１の誘導工程」）と；第１の混合物または第２の混合物（存在する場合）を水性部分と混合して、ＲＫＯ含有混合物を提供する工程（「第２の混合工程」）とをさらに含んでもよい。
【００４５】
したがって、本明細書の任意の実施形態において、方法は、未加工クリルオイル（「RKO」）を、Ｃ３〜Ｃ８ケトンの溶媒を少なくとも約８５重量％含む有機溶媒と混合し、第１の混合物を生成する工程（「第１の混合工程」）と；任意選択により、第１の混合物を、フィルタを通して誘導し、第２の混合物を提供する工程（「第１の誘導工程」）と；第１の混合物または第２の混合物（存在する場合）を水性部分と混合して、第３の混合物を提供する工程（「第２の混合工程」）と；第３の混合物を第１の低密度層および第１の高密度リン脂質含有層（「PCL」）に分画する工程（「第１の分画工程」）と；第１のＰＣＬを第１の低密度層から分離する工程（「第１の分離工程」）とを含んでもよい。
【００４６】
方法は、第１のＰＣＬを第３の混合工程に誘導する工程であって、第３の混合工程は、第１のＰＣＬを、Ｃ３〜Ｃ８ケトンの溶媒を少なくとも約８５重量％含む第２の有機溶媒と混合して、第４の混合物を提供すること含む工程（「第２の誘導工程」）と；第４の混合物を第２の低密度層および第２のＰＣＬに分画する工程（「第２の分画工程」）と；第２のＰＣＬを第２の低密度層から分離する工程（「第２の分離工程」）とを任意選択により含んでもよい。
【００４７】
本明細書の任意の実施形態において、方法は、未加工クリルオイル（「RKO」）を、Ｃ３〜Ｃ８ケトンの溶媒を少なくとも約８５重量％含む第１の有機溶媒と混合し、第１の混合物を生成する工程（「第１の混合工程」）と；任意選択により、第１の混合物を、フィルタを通して誘導し、第２の混合物を提供する工程（「第１の誘導工程」）と；第２の混合物を水性部分と混合して、第３の混合物を提供する工程（「第２の混合工程」）と；第３の混合物を第１の低密度層および第１のリン脂質含有層（「PCL」）に分画する工程（「第１の分画工程」）と；第１のＰＣＬを第１の低密度層から分離する工程（「第１の分離工程」）と；第１のＰＣＬを第３の混合工程に誘導する工程であって、第３の混合工程は、第１のＰＣＬを、Ｃ３〜Ｃ８ケトンの溶媒を少なくとも約８５重量％含む第２の有機溶媒と混合して、第４の混合物を提供すること含む工程（「第２の誘導工程」）と；第４の混合物を第２の低密度層および第２のＰＣＬに分画する工程（「第２の分画工程」）と；第２のＰＣＬを第２の低密度層から分離する工程（「第２の分離工程」）とを含んでもよい。
【００４８】
本明細書の任意の実施形態の第１の「低密度層」は、第１のＰＣＬ（高密度層）より低密度であると理解されるべきであり、第２の低密度層は、第２のＰＣＬより低密度である。代替として、そのような低密度層および高密度層は、本明細書においてそれぞれ互いに対して「軽質相」および「重質相」と呼ばれる。
【００４９】
本明細書の任意の実施形態において、方法は、バッチ式プロセス、連続的プロセス、またはそれらの組合せであってもよい。したがって、本明細書に記載の方法は安定で柔軟であり、その脂質含有量およびプロファイルに影響し得、高濃度化リン脂質組成物の品質に重大な影響を有する未加工クリルオイルに関連する変動性（すなわち、季節、種、齢、保存および処理）の制御を可能にする。さらに、連続的プロセスは、バッチプロセスと比較して著しく高い処理量を提供すると同時に、同等の、またはより高い品質の生成物を提供する動的プロセスである。
【００５０】
したがって、方法の各工程はバッチ式プロセスの一部として行われてもよく、方法の各工程は連続的プロセスの一部であってもよく、または、いくつかの工程はバッチ式で行われる一方、他の工程は連続的プロセスの一部として行われてもよい。好ましくは、第１の混合工程、第１の誘導工程（存在する場合）、第２の混合工程、第１の分画工程、第１の分離工程、第２の誘導工程、第２の分画工程、および第２の分離工程は、それぞれ連続的プロセスの一部として行われる。第１の分画工程は、第３の混合物を水平沈降槽内に導入することを含んでもよい。第１の分離工程は、第１の低密度層を水平沈降槽の第１のポートを介して水平沈降槽から迂回させ、第１のＰＣＬを水平沈降槽の第２のポートから迂回させることを含んでもよい。第２の分画工程は、第４の混合物を垂直沈降槽内に導入することを含んでもよい。第２の分離工程は、低密度層を垂直沈降槽の第１のポートを介して垂直沈降槽からポンピングすると同時に、第２のＰＣＬを垂直沈降槽の第２のポートを介して垂直沈降槽からポンピングすることを含んでもよい。
【００５１】
図１に示されるように、一実施形態において、本明細書に記載の方法は、連続的プロセスであってもよい。ＲＫＯ１０およびアセトン１２がまず混合される１４。得られるＲＫＯ／アセトン混合物は、限定されるものではないが、例えば、細孔サイズ１０μｍおよび０．４５μｍのフィルタを使用して濾過される１６。
【００５２】
濾過されたＲＫＯ／アセトン供給物は、軟水供給物２０と共に静的ミキサー１８に誘導され、そこで各供給物は、水の流速および濾過されたＲＫＯ／アセトン供給物の流速を確実にするために較正済みのポンプで利用され得る。静的ミキサー１８は、水平沈降槽２２に投入し、そこで軽質相２４および重質相２６（リン脂質を含有する）がそれぞれ連続的に水平沈降槽２２の末端で収集される。
【００５３】
次いで、重質相２６は第２のミキサー２８に誘導され、一実施形態では同時にそこにアセトン３０の供給物もまた誘導される。重質相２６の静的ミキサー２８への流速およびアセトン３０の流速を確実にするために、ポンプが使用される。得られた混合物はミキサー２８から垂直沈降槽３２に流動し、軽質相２４’および重質リン脂質含有相４０の提供が維持される。各相は、垂直沈降槽３２から継続的に引き出される。
【００５４】
エタノールおよびビタミンＥの添加、ならびに重質（リン脂質含有）相に関連する一般的保存条件は、バッチプロセスで説明されたように行うことができ、または連続的手順により行うことができる。
【００５５】
第１のＰＣＬおよび第２のＰＣＬは、リン脂質を含む。第１のＰＣＬおよび第２のＰＣＬは、それぞれ独立して、リン脂質を少なくとも７５ｗｔ．％（乾燥重量基準）含んでもよい。したがって、リン脂質の量（乾燥重量基準）は、約７５ｗｔ．％、約７６ｗｔ．％、約７７ｗｔ．％、約７８ｗｔ．％、約７９ｗｔ．％、約８０ｗｔ．％、約８１ｗｔ．％、約８２ｗｔ．％、約８３ｗｔ．％、約８４ｗｔ．％、約８５ｗｔ．％、約８６ｗｔ．％、約８７ｗｔ．％、約８８ｗｔ．％、約８９ｗｔ．％、約９０ｗｔ．％、約９１ｗｔ．％、約９２ｗｔ．％、約９３ｗｔ．％、約９４ｗｔ．％、約９５ｗｔ．％、またはこれらの値のいずれか２つを含む、および／もしくはそれらの間の任意の範囲であってもよい。第１のＰＣＬおよび第２のＰＣＬは、それぞれ独立して、遊離脂肪酸を約０ｗｔ．％〜約１５ｗｔ．％（乾燥重量基準）含んでもよく；したがって、遊離脂肪酸の量は、約０ｗｔ．％、約０．１ｗｔ．％、約０．２ｗｔ．％、約０．３ｗｔ．％、約０．４ｗｔ．％、約０．５ｗｔ．％、約０．６ｗｔ．％、約０．７ｗｔ．％、約０．８ｗｔ．％、約０．９ｗｔ．％、約１ｗｔ．％、約２ｗｔ．％、約３ｗｔ．％、約４ｗｔ．％、約５ｗｔ．％、約６ｗｔ．％、約７ｗｔ．％、約８ｗｔ．％、約９ｗｔ．％、約１０ｗｔ．％、約１１ｗｔ．％、約１２ｗｔ．％、約１３ｗｔ．％、約１４ｗｔ．％、約１５ｗｔ．％、またはこれらの値のいずれか２つを含む、および／もしくはそれらの間の任意の範囲であってもよい。第１のＰＣＬおよび第２のＰＣＬは、それぞれ独立して、トリグリセリドを約０ｗｔ．％〜約５ｗｔ．％（乾燥重量基準）含んでもよく；したがって約０ｗｔ．％、約０．１ｗｔ．％、約０．２ｗｔ．％、約０．３ｗｔ．％、約０．４ｗｔ．％、約０．５ｗｔ．％、約０．６ｗｔ．％、約０．７ｗｔ．％、約０．８ｗｔ．％、約０．９ｗｔ．％、約１ｗｔ．％、約２ｗｔ．％、約３ｗｔ．％、約４ｗｔ．％、約５ｗｔ．％、またはこれらの値のいずれか２つを含む、および／もしくはそれらの間の任意の範囲の量で含んでもよい。第１のＰＣＬおよび第２のＰＣＬは、それぞれ独立して、モノグリセリドを約２ｗｔ．％未満（乾燥重量基準）含んでもよい。第１のＰＣＬおよび第２のＰＣＬは、それぞれ独立して、約１．９ｗｔ．％、約１．８ｗｔ．％、約１．７ｗｔ．％、約１．６ｗｔ．％、約１．５ｗｔ．％、約１．４ｗｔ．％、約１．３ｗｔ．％、約１．２ｗｔ．％、約１．１ｗｔ．％、約１．０ｗｔ．％、約０．９ｗｔ．％、約０．８ｗｔ．％、約０．７ｗｔ．％、約０．６ｗｔ．％、約０．５ｗｔ．％、約０．４ｗｔ．％、約０．３ｗｔ．％、約０．２ｗｔ．％、約０．１ｗｔ．％、またはこれらの値のいずれか２つを含む、および／もしくはそれらの間の任意の範囲、またはこれらの値のいずれか１つ未満の任意の範囲でモノグリセリド（乾燥重量基準）を含んでもよい。第１のＰＣＬおよび第２のＰＣＬは、それぞれ独立して、ジグリセリドを約２ｗｔ．％未満（乾燥重量基準）含んでもよい。第１のＰＣＬおよび第２のＰＣＬは、それぞれ独立して、約１．９ｗｔ．％、約１．８ｗｔ．％、約１．７ｗｔ．％、約１．６ｗｔ．％、約１．５ｗｔ．％、約１．４ｗｔ．％、約１．３ｗｔ．％、約１．２ｗｔ．％、約１．１ｗｔ．％、約１．０ｗｔ．％、約０．９ｗｔ．％、約０．８ｗｔ．％、約０．７ｗｔ．％、約０．６ｗｔ．％、約０．５ｗｔ．％、約０．４ｗｔ．％、約０．３ｗｔ．％、約０．２ｗｔ．％、約０．１ｗｔ．％、またはこれらの値のいずれか２つを含む、および／もしくはそれらの間の任意の範囲、またはこれらの間のいずれか１つ未満の任意の範囲でジグリセリド（乾燥重量基準）を含んでもよい。第１のＰＣＬおよび第２のＰＣＬは、それぞれ独立して、コレステロールを約０ｗｔ．％〜約３ｗｔ．％（乾燥重量基準）含んでもよく；したがって、乾燥重量基準のコレステロールの量は、約０ｗｔ．％、約０．１ｗｔ．％、約０．２ｗｔ．％、約０．３ｗｔ．％、約０．４ｗｔ．％、約０．５ｗｔ．％、約０．６ｗｔ．％、約０．７ｗｔ．％、約０．８ｗｔ．％、約０．９ｗｔ．％、約１ｗｔ．％、約１．１ｗｔ．％、約１．２ｗｔ．％、約１．３ｗｔ．％、約１．４ｗｔ．％、約１．５ｗｔ．％、約１．６ｗｔ．％、約１．８ｗｔ．％、約１．９ｗｔ．％、約２．０ｗｔ．％、約２．１ｗｔ．％、約２．２ｗｔ．％、約２．３ｗｔ．％、約２．４ｗｔ．％、約２．５ｗｔ．％、約２．６ｗｔ．％、約２．８ｗｔ．％、約２．９ｗｔ．％、約３．０ｗｔ．％、またはこれらの値のいずれか２つを含む、および／もしくはそれらの間の任意の範囲であってもよい。
【００５６】
上述のように、任意の実施形態において、方法は、第１の誘導工程を任意選択により含んでもよい。そのような任意選択の工程は、第１の混合工程の実行において、第１の混合物が視認され得る不溶性成分を含むことが判明した場合に使用され得る。そのような不溶性成分は、０．４５μｍ以下のフィルタを通過することができない種である。方法における使用に好適なフィルタは、当業者に良く理解されており、（限定されるものではないが）ポリエステル、ナイロン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ガラスマイクロファイバー、またはそれらの２つ以上の組合せを含む。第１の混合物を、フィルタを通して誘導し、第２の混合物を提供する工程は、第１の混合物を少なくとも０．４５μｍのフィルタを通して誘導することを含んでもよい。第１の混合物を、フィルタを通して誘導して、第２の混合物を提供する工程は、第１の混合物を直列の少なくとも第１のフィルタおよび第２のフィルタを通して誘導することを含んでもよい。例として、第１のフィルタは１０μｍのフィルタであってもよく、第２のフィルタは０．４５μｍのフィルタであってもよい。第１の混合物は、０．４５μｍのフィルタを通過する前に、２つ以上の１０μｍのフィルタを通過してもよく、フィルタは直列である。代替として、遠心分離法またはデカンテーション等の当技術分野において知られた固体／液体内容物の任意の分離方法もまた包含される。
【００５７】
第１の有機溶媒、第２の有機溶媒、または第１および第２の有機溶媒の両方のＣ３〜Ｃ８ケトンは、アセトン、ブタノン、２−ペンタノン、３−ペンタノン、メチルｉｓｏ−ブチルケトン、２−ヘキサノン、３−ヘキサノン、アセチルアセトン、またはそれらの任意の２つ以上の組合せであってもよい。第１の有機溶媒、第２の有機溶媒、または第１および第２の有機溶媒の両方におけるＣ３〜Ｃ８ケトンの総濃度（各有機溶媒のｗｔ．％として表現される）は、約８５ｗｔ．％、約９０ｗｔ．％、約９５ｗｔ．％、約９６ｗｔ．％、約９７ｗｔ．％、約９８ｗｔ．％、約９９ｗｔ．％、約１００ｗｔ．％、またはこれらの値のいずれか２つを含む、および／もしくはそれらの間の任意の範囲であってもよい。したがって、非限定的な例として、本明細書の任意の実施形態において、第１の有機溶媒は、少なくとも約９９ｗｔ．％アセトンであってもよい。別の非限定的な例として、第２の有機溶媒は、少なくとも約９９ｗｔ．％アセトンであってもよい。第１の有機溶媒、第２の有機溶媒、または第１および第２の有機溶媒の両方は、Ｃ３〜Ｃ８ケトンに加えて共溶媒を含んでもよくまたは含まなくてもよい。例示的な共溶媒は、アルコール（例えば、メタノール（ＣＨ３ＯＨ）、エタノール（ＥｔＯＨ）、イソプロパノール（ｉＰｒＯＨ）、トリフルオロエタノール（TFE）、ブタノール（ＢｕＯＨ）、エチレングリコール、プロピレングリコール）、カルボン酸（例えば、ギ酸、酢酸、プロパン酸、ブタン酸、ペンタン酸、ラウリン酸、ステアリン酸、デオキシコール酸、グルタミン酸、グルクロン酸）、エーテル（例えば、テトラヒドロフラン（THF）、２−メチルテトラヒドロフラン（2Me-THF）、ジメトキシエタン（DME）、ジオキサン）、エステル（例えば、酢酸エチル、酢酸イソプロピル）、ニトリル（例えば、アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）、プロピオニトリル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＮ））、またはそれらの任意の２つ以上の混合物、またはそれらの任意の２つ以上の混合物を含む。
【００５８】
連続的プロセスを含む本明細書の任意の実施形態において、方法は、少なくとも毎時約４ｋｇの未加工クリルオイルを第１の有機溶媒と混合する工程を含んでもよい。１時間毎に第１の有機溶媒と混合されるＲＫＯの量は、毎時約４ｋｇ、毎時約５ｋｇ、毎時約６ｋｇ、毎時約７ｋｇ、毎時約８ｋｇ、毎時約９ｋｇ、毎時約１０ｋｇ、毎時約１５ｋｇ、毎時約２０ｋｇ、毎時約２５ｋｇ、毎時約３０ｋｇ、毎時約３５ｋｇ、毎時約４０ｋｇ、毎時約４５ｋｇ、毎時約５０ｋｇ、毎時約６０ｋｇ、毎時約７０ｋｇ、毎時約８０ｋｇ、毎時約９０ｋｇ、毎時約１００ｋｇ、毎時約１１０ｋｇ、毎時約１２０ｋｇ、毎時約１３０ｋｇ、毎時約１４０ｋｇ、毎時約１５０ｋｇ、毎時約１６０ｋｇ、毎時約１７０ｋｇ、毎時約１８０ｋｇ、毎時約１９０ｋｇ、毎時約２００ｋｇ、毎時約２２０ｋｇ、毎時約２４０ｋｇ、毎時約２６０ｋｇ、毎時約２８０ｋｇ、毎時約３００ｋｇ、毎時約３２０ｋｇ、毎時約３４０ｋｇ、毎時約３６０ｋｇ、毎時約３８０ｋｇ、毎時約４００ｋｇ、毎時約４２０ｋｇ、毎時約４４０ｋｇ、毎時約４６０ｋｇ、毎時約４８０ｋｇ、毎時約５００ｋｇ、またはこれらの値のいずれか２つ以上を含む、および／もしくはそれらの間の任意の範囲、またはこれらの値のいずれか１つを含む、およびそれらの値を超える任意の範囲であってもよい。
【００５９】
本明細書の任意の実施形態において、方法は、未加工クリルオイルおよび第１の有機溶媒を、有機溶媒の体積：ＲＫＯのｋｇの単位で約５〜約１５の比率にて混合する工程を含んでもよい。したがって、ＲＫＯのｋｇに対する第１の有機溶媒の体積の比率は、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、またはこれらの値のいずれか２つを含む、および／もしくはそれらの間の任意の範囲であってもよい。未加工クリルオイルを第１の有機溶媒と混合する工程は、約１５℃〜約４０℃、例えば約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２２℃、約２４℃、約２６℃、約２８℃、約３０℃、約３２℃、約３４℃、約３６℃、約３８℃、約４０℃、またはこれらの値のいずれか２つを含む、および／もしくはそれらの間の任意の範囲で行われてもよい。連続的プロセスを含む任意の実施形態において、混合は、第１の有機溶媒を約２５Ｌ／時〜約７，５００Ｌ／時の流速で組み合わせることを含んでもよく；したがって、第１の有機溶媒の流速は、約２５Ｌ／時、約３０Ｌ／時、約３５Ｌ／時、約４０Ｌ／時、約４５Ｌ／時、約５０Ｌ／時、約５５Ｌ／時、約６０Ｌ／時、約６５Ｌ／時、約７０Ｌ／時、約７５Ｌ／時、約８０Ｌ／時、約８５Ｌ／時、約９０Ｌ／時、約９５Ｌ／時、約１００Ｌ／時、約１１０Ｌ／時、約１２０Ｌ／時、約１３０Ｌ／時、約１４０Ｌ／時、約１５０Ｌ／時、約２００Ｌ／時、約２５０Ｌ／時、約３００Ｌ／時、約３５０Ｌ／時、約４００Ｌ／時、約４５０Ｌ／時、約５００Ｌ／時、約５５０Ｌ／時、約６００Ｌ／時、約６５０Ｌ／時、約７００Ｌ／時、約７５０Ｌ／時、約８００Ｌ／時、約８５０Ｌ／時、約９００Ｌ／時、約１，０００Ｌ／時、約１，２００Ｌ／時、約１，４００Ｌ／時、約１，６００Ｌ／時、約１，８００Ｌ／時、約２，０００Ｌ／時、約２，２００Ｌ／時、約２，４００Ｌ／時、約２，６００Ｌ／時、約２，８００Ｌ／時、約３，０００Ｌ／時、約３，２００Ｌ／時、約３，４００Ｌ／時、約３，６００Ｌ／時、約３，８００Ｌ／時、約４，０００Ｌ／時、約４，２００Ｌ／時、約４，４００Ｌ／時、約４，６００Ｌ／時、約４，８００Ｌ／時、約５，０００Ｌ／時、約５，５００Ｌ／時、約６，０００Ｌ／時、約６，５００Ｌ／時、約７，０００Ｌ／時、約７，５００Ｌ／時、またはこれらの値のいずれか２つを含む、および／もしくはそれらの間の任意の範囲であってもよい。
【００６０】
ＲＫＯおよび第１の有機溶媒を混合する前に、方法は、ＲＫＯを約３０℃〜約７０℃の温度、例えば約３０℃、約３５℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、またはこれらの値のいずれか２つを含む、および／もしくはそれらの間の任意の範囲の温度に加熱することを含んでもよい。本明細書の任意の実施形態において、ＲＫＯの加熱は、ＲＫＯおよび第１の有機溶媒を混合する前７２時間（例えば約２４時間〜約４８時間）以内、例えば約６０時間以内、約４８時間以内、約３６時間以内、約２４時間以内、約１２時間以内、約６時間以内、約１時間以内、約３０分以内、またはこれらの値のいずれか２つを含む、および／もしくはそれらの間の任意の範囲以内に行われてもよい。本明細書の任意の実施形態において、ＲＫＯはまず上述の１つの温度に加熱され、混合工程に向かう途中で上述の第２のより高い温度にさらに加熱されてもよく、したがってＲＫＯが第２のより高い温度にある期間が最小限となる。
【００６１】
第２の混合物を水性部分と混合して、第３の混合物を提供する工程において、水性部分は、塩を実質的に含まなくてもよい。本明細書の任意の実施形態において、水性部分は、塩基を実質的に含まなくてもよい。例示的な塩基は、アンモニア、塩基性アミノ酸（例えばアルギニン、リシンおよびオルニチン）、炭酸塩（例えばＫ２ＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３、（ＮＨ４）２ＣＯ３）、重炭酸塩（例えばＫＨＣＯ３、ＮａＨＣＯ３）、水酸化物塩（例えばＫＯＨ、ＮａＯＨ）、またはそれらの任意の２つ以上の組合せを含む。例えば、本明細書の任意の実施形態において、水性部分は、炭酸塩、重炭酸塩、またはそれらの組合せを実質的に含まなくてもよく；本明細書の任意の実施形態において、水性部分は、ＫＨＣＯ３およびＫＯＨを実質的に含まなくてもよい。本明細書の任意の実施形態において、水性部分は、酸を実質的に含まなくてもよい。例示的な酸は、無機酸（例えば塩酸、ヒドロホウ酸（hydroboric acid）、硝酸、硫酸およびリン酸）、有機酸（例えばアルギネート、ギ酸、酢酸、安息香酸、グルコン酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、乳酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸およびｐ−トルエンスルホン酸）、酸性アミノ酸（例えばアスパラギン酸およびグルタミン酸）、またはそれらの任意の２つ以上の組合せを含む。本明細書の任意の実施形態において、水性部分は、脱塩水、脱イオン水または蒸留水であってもよい。例として、脱イオン水は、ＡＳＴＭ  Ｄ１１９３−９１に従い、２５℃で少なくとも０．２ＭΩ・ｃｍ、好ましくは少なくとも約１ＭΩ・ｃｍの抵抗率を示し、タイプＩＶ、ＩＩＩ、ＩＩまたはＩであってもよい。
【００６２】
本明細書において使用される場合、組成物が示された成分を「実質的に含まない」場合、これはその成分が全参照組成物の０．１ｗｔ．％未満、好ましくは０．０１ｗｔ．％未満で存在することを意味する。
【００６３】
方法は、ＲＫＯのｋｇに対する水性部分の体積の単位で約０．１０〜約０．４０の比率にて、第２の混合物を水性部分と混合する工程を含んでもよい。ＲＫＯのｋｇとは、第１の混合工程におけるＲＫＯのｋｇを基準とすることが理解されるべきである。そのような決定は、方法の性質に照らして行われる。ＲＫＯのｋｇに対する水性部分の体積は、約０．１０、約０．１１、約０．１２、約０．１３、約０．１４、約０．１５、約０．１６、約０．１７、約０．１８、約０．１９、約０．２０、約０．２２、約０．２４、約０．２６、約０．２８、約０．３０、約０．３２、約０．３４、約０．３５、約０．３６、約０．３７、約０．３８、約０．３９、約０．４０、またはこれらの値の任意の２つを含む、および／もしくはそれらの間の任意の範囲であってもよい。第２の混合工程は、約６℃、約８℃、約１０℃、約１２℃、約１４℃、約１６℃、約１８℃、約２０℃、約２２℃、約２４℃、約２６℃、約２８℃、約３０℃、約３２℃、約３４℃、約３６℃、約３８℃、またはこれらの値の任意の２つを含む、および／もしくはそれらの間の任意の範囲の温度で行われてもよい。
【００６４】
方法の第３の混合工程は、第１のＰＣＬ：第２の有機溶媒の体積比率約２〜約１０にて、第１のＰＣＬを第２の有機溶媒と混合することを含んでもよく；第１のＰＣＬに対する第２の有機溶媒の体積比率は、約２、約２．２、約２．４、約２．６、約２．８、約３．０、約３．２、約３．４、約３．６、約３．８、約４．０、約４．２、約４．４、約４．６、約４．８、約５．０、約５．２、約５．４、約５．６、約５．８、約６．０、約６．２、約６．４、約６．６、約６．８、約７．０、約７．２、約７．４、約７．６、約７．８、約８．０、約８．２、約８．４、約８．６、約８．８、約９．０、約９．２、約９．４、約９．６、約９．８、約１０．０、またはこれらの値の任意の２つを含む、および／もしくはそれらの間の任意の範囲であってもよい。第３の混合工程は、約１５℃〜約４０℃、例えば約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２２℃、約２４℃、約２６℃、約２８℃、約３０℃、約３２℃、約３４℃、約３６℃、約３８℃、約４０℃、またはこれらの値の任意の２つを含む、および／もしくはそれらの間の任意の範囲の温度で行われてもよい。
【００６５】
本明細書の任意の実施形態において、方法は、第１のＰＣＬまたは第２のＰＣＬを、安定剤、粘度低減剤、またはその両方と組み合わせて、リン脂質高濃度化分画（「PLEF」）を生成する工程をさらに含んでもよい。安定剤は、限定されるものではないが、酸化防止剤を含む。例示的な酸化防止剤は、ビタミンＡ、ビタミンＥ、アスタキサンチン、カンタキサンチン、β−カロテン、オールトランスレチノールおよびフラボノイド、例えばナリンギン、ナリンゲニン、ヘスペレチン／ケンフェロール、ルチン、ルテオリン、ネオヘスペリジン、およびケセルチン（quecertin）を含む。本明細書の任意の実施形態において、酸化防止剤はビタミンＥを含んでもよく、ビタミンＥは、第２のＰＣＬのｋｇあたり約３ｇ〜第２のＰＣＬのｋｇあたり約５ｇで含まれる。第２のＰＣＬのｋｇ（第２のPCLの乾燥重量を基準とする）あたり含まれ得るビタミンＥの量（グラム）は、約３、約３．２、約３．４、約３．６、約３．８、約４．０、約４．２、約４．４、約４．６、約４．８、約５、またはこれらの値のいずれか２つを含む、および／もしくはそれらの間の任意の範囲であってもよい。粘度低減剤は、限定されるものではないが、エタノール、アセトン、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール（例えばPEG 300、PEG 400）、落花生油、ココナツ油、ヒマシ油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、大豆油、ヒマワリ油、カプリル／カプリン酸トリグリセリド、カプリル／カプリン酸のプロピレングリコールジエステル、プロピレングリコールモノラウレート、プロピレングリコールモノカプリレート、カプリル／カプリン／ジグリセリルスクシネート、プロピレングリコールの中鎖脂肪酸エステル、エアロゾル、セトステリルアルコール、セチルアルコール、フリセリル（flyceryl）ベヘネート、グリセリルトリオクタノエート、グリセリルパルミトステアレート、カプリル／カプリン／ステアリン酸トリグリセリド、ビス−ジグリセリル／カプリレート／カプレート／ステアレート／アジペート、ステアリン酸、ステリルアルコール、ラウリン酸、オレイン酸、ポリグリコール化グリセリド、ポリオキシル−４０水素化ヒマシ油、グリセリルモノカプリレート、グリセリルココエート／シトレート／ラクテート、グリセリルモノ−ジ−カプリレート／カプレート、イソステリルジグリセリルスクシネート、グリセリルココエート、グリセリルカプリレート、オレイルマクロゴール−８グリセリド、リノレオイルマクロゴールグリセリド、ＰＥＧ−８カプリル／カプリン酸グリセリド、プロピレングリコールラウレート、ポリグリセロールジオレエート、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー、ＰＥＧ−６カプリル／カプリン酸グリセリド、ポリオキシエチレングリセリルトリオレエート、およびポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート、ならびに米国特許出願公開第２０１７／０１８２０７３号および第２０１７／００２０９２８号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載のものを含む。第１のＰＣＬに対する粘度低減剤（または２種以上の粘度低減剤の合計）の体積比率は、約０．１〜約０．３、例えば約０．１、約０．１２、約０．１４、約０．１６、約０．１８、約０．２０��約０．２２、約０．２４、約０．２６、約０．２８、約０．３、またはこれらの値のいずれか２つを含む、および／もしくはそれらの間の任意の範囲であってもよい。第２のＰＣＬに対する粘度低減剤（または２種以上の粘度低減剤の合計）の体積比率は、約０．１〜約０．３、例えば約０．１、約０．１２、約０．１４、約０．１６、約０．１８、約０．２０、約０．２２、約０．２４、約０．２６、約０．２８、約０．３、またはこれらの値のいずれか２つを含む、および／もしくはそれらの間の任意の範囲であってもよい。
【００６６】
方法が連続的プロセスである本明細書の任意の実施形態において、連続的プロセスは、少なくとも毎時約４ｋｇの未加工クリルオイルの速度で、ＲＫＯから第２のＰＣＬおよび／またはＰＬＥＦへ進行してもよく；したがって、速度は、毎時約４ｋｇ、毎時約５ｋｇ、毎時約６ｋｇ、毎時約７ｋｇ、毎時約８ｋｇ、毎時約９ｋｇ、毎時約１０ｋｇ、毎時約１５ｋｇ、毎時約２０ｋｇ、毎時約２５ｋｇ、毎時約３０ｋｇ、毎時約３５ｋｇ、毎時約４０ｋｇ、毎時約４５ｋｇ、毎時約５０ｋｇ、毎時約６０ｋｇ、毎時約７０ｋｇ、毎時約８０ｋｇ、毎時約９０ｋｇ、毎時約１００ｋｇ、毎時約１１０ｋｇ、毎時約１２０ｋｇ、毎時約１３０ｋｇ、毎時約１４０ｋｇ、毎時約１５０ｋｇ、毎時約１６０ｋｇ、毎時約１７０ｋｇ、毎時約１８０ｋｇ、毎時約１９０ｋｇ、毎時約２００ｋｇ、毎時約２２０ｋｇ、毎時約２４０ｋｇ、毎時約２６０ｋｇ、毎時約２８０ｋｇ、毎時約３００ｋｇ、毎時約３２０ｋｇ、毎時約３４０ｋｇ、毎時約３６０ｋｇ、毎時約３８０ｋｇ、毎時約４００ｋｇ、毎時約４２０ｋｇ、毎時約４４０ｋｇ、毎時約４６０ｋｇ、毎時約４８０ｋｇ、毎時約５００ｋｇ、またはこれらの値のいずれか２つ以上を含む、および／もしくはそれらの間の任意の範囲、またはこれらの値のいずれか１つを含む、およびこれらの値を超える任意の範囲であってもよい。
【００６７】
関連した態様において、リン脂質高濃度化組成物を生成するためのプロセスの本明細書の任意の実施形態により生成されたＰＬＥＦの第１の有機溶媒、第２の有機溶媒および水を実質的に除去する工程を含む方法が提供される。例えば、そのような除去工程は、掃引不活性ガス（例えば窒素）有りまたは無しで、ＰＬＥＦの薄層が真空下で加熱される薄膜蒸発器により行われてもよい。方法は、除去工程の前または除去工程の後に、１種または複数種の脂肪酸を、プロセスの本明細書の任意の実施形態により生成されたＰＬＥＦと組み合わせる工程をさらに含んでもよい。方法は、除去工程の前または除去工程の後に、脂肪酸に富む混合物を、プロセスの本明細書の任意の実施形態により生成されたＰＬＥＦと組み合わせる工程をさらに含んでもよい。
【００６８】
さらなる関連した態様において、方法のそのような任意の実施形態により生成されたリン脂質高濃度化組成物が提供される。リン脂質高濃度化組成物は、対象における高トリグリセリド血症の処置に使用され得る。リン脂質高濃度化組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含んでもよい。「薬学的に許容される担体」という用語は、一般に、担体および賦形剤の両方を含み、本明細書においてさらに説明される。
【００６９】
さらなる関連した態様において、本明細書の任意の実施形態のリン脂質高濃度化組成物を含む単位剤形が提供される。単位剤形は、液体中に含まれたまたはカプセル内に含まれた、液体単位用量であってもよい。カプセルは、ゼラチン、カラギーナンおよびヒプロメロースの１つまたは複数を含んでもよい。本明細書の任意の実施形態の単位剤形は、有効量のリン脂質高濃度化組成物を含み得る。
【００７０】
「有効量」は、対象において望ましい効果を生じさせるために必要な組成物の量を指す。有効量の一例は、治療（例えば製薬）用途において許容され得る毒性およびバイオアベイラビリティレベルを生じる量または用量を含む。本明細書において使用される場合、「対象」または「患者」は、哺乳動物である。典型的には、対象は人間であり、例えば関節痛または高トリグリセリド血症に罹患しているまたは罹患していることが疑われる人間である。「対象」および「患者」という用語は、同義的に使用され得る。
【００７１】
したがって、本発明の技術は、本明細書に開示される高濃度化リン脂質組成物のいずれか、および任意選択により薬学的に許容される担体または１種もしくは複数種の賦形剤もしくは充填剤を含む組成物および医薬を提供する。組成物は、本明細書に記載の方法および処置において使用され得る。そのような組成物および医薬は、治療有効量の本明細書に記載の任意のリン脂質高濃度化組成物を含む。組成物は、単位剤形内に封入されてもよい。
【００７２】
本明細書における例は、本開示の態様をより十分に例示するために示されている。例は、本開示の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００７３】
実施例１
バッチプロセス
以下の代表的なバッチプロセスは、出発材料としてＲＫＯ  ５ｋｇを利用した。ＲＫＯを秤で秤量し、すでにアセトン約１０Ｌが入った槽内に撹拌下で移す。次いで、全体で５０Ｌのアセトンとなるように追加のアセトンを槽に加える。次いで、混合物を３０℃の温度で撹拌する。次いで、ＲＫＯ／アセトン混合物を、細孔度１０μｍのプレフィルタおよび細孔度０．４５μｍの最終フィルタを含む耐溶媒性濾過列を通して容器にポンピングし、ＲＫＯ／アセトンの濾過混合物を提供する。
【００７４】
ＲＫＯ／アセトンの濾過混合物に、２０〜２５℃で少なくとも５分間かけて一定撹拌下で水１Ｌを加える。撹拌を停止し、軽質上相（すなわち低密度層）および重質下相（すなわち高密度層）が観察され、軽質相が透明であり、清浄な中間相が軽質相と重質相との間に観察されるまで、混合物を処理槽内で沈降させる。この段階に達したら、重質相を別の槽に移し、体積を計算する。
【００７５】
次いで、重質相の体積の半分を一定撹拌下で槽に加え、続いて重質相の全体積あたり７体積のアセトンを加え、その後重質相の残りの半分を同じ槽に移した。２０〜２５℃で少なくとも５分間撹拌を継続する。次いで撹拌を停止し、２つの相が存在し（低密度軽質相および高密度重質相）、軽質相が透明であり、清浄な中間相が軽質相と重質相との間に観察されるまで、得られた混合物を処理槽内で沈降させる。そのような沈降が達成されたら、次いで重質相（純化されたリン脂質を含有する）を容器内に移す。
【００７６】
次いで、重質相の重量を決定する。エタノール０．１７５Ｌ／重質相１Ｌの比率を使用して、無水エタノールを粘度低減剤として一定撹拌下でガラス槽内に加える。混合物の試料を採取し、分析して相の乾燥重量を決定する。そのアッセイ結果に基づき、ビタミンＥ  ４ｇ／乾燥重質相１ｋｇの比率を使用して、ビタミンＥ調製物（α−トコフェロール）を酸化防止剤として手作業で重質相に加える。次いで、混合物を１５〜２５℃で少なくとも５分間撹拌し、リン脂質高濃度化分画を提供する。ＲＫＯからリン脂質高濃度化分画までのバッチプロセスの全期間は約２４時間以内であるが、相分離のためにより長い期間を提供すること、および／またはより大きなサイズの槽を考慮することが望ましい場合には、延長してもよい。
【００７７】
保存のために、リン脂質高濃度化分画を、窒素ブランケット下で容器に移し、密封し、２〜８℃で保存する。リン脂質高濃度化分画の平均収率は、ＲＫＯ  ５ｋｇから出発して、乾燥基準で（すなわちリン脂質高濃度化分画を乾燥した後）３０％である。
【００７８】
実施例２
連続的プロセス
ＲＫＯが予熱され（３０℃〜６５℃の間）、２つの較正済みのポンプを使用してアセトンが供給され、ＲＫＯおよびアセトンの混合が混合ポンプを使用して行われる連続的プロセスを行った。プロセス実行の期間中、アセトンの流速は５６〜６４Ｌ／時であり、ＲＫＯの流速は５．７５〜６．２５ｋｇ／時であった。得られるＲＫＯ／アセトン混合供給物は、３２．５±２．５℃の温度に維持し、細孔サイズ１０μｍおよび０．４５μｍのフィルタを通してインラインで濾過した。
【００７９】
濾過されたＲＫＯ／アセトン供給物は、軟水供給物と共に静的ミキサーに誘導され、そこで各供給物は、１．０〜１．４Ｌ／時の水の流速および６２〜６８Ｌ／時の濾過されたＲＫＯ／アセトン供給物の流速を確実にするために、２つの較正済みのポンプで利用された。静的ミキサーは、水平沈降槽に投入し、そこで軽質相および重質相（リン脂質を含有する）がそれぞれ連続的に沈降槽の末端で収集される。水平沈降槽は、２０〜２５℃の温度で維持される。
【００８０】
次いで、重質相は第２の静的ミキサーに誘導され、同時にそこにアセトンの供給物もまた誘導される。２つの較正済みのポンプは、静的ミキサーへの重質相の流速が２．２〜２．６Ｌ／時であり、アセトンの流速が１６〜１８Ｌ／時であることを確実にする。得られた混合物は、静的ミキサーから２０〜２５℃の温度で維持された垂直沈降槽に流動し、垂直沈降槽は、軽質相および重質リン脂質含有層を提供する。各相は、垂直沈降槽から継続的に引き出される。
【００８１】
エタノールおよびビタミンＥの添加、ならびに重質（リン脂質含有）相に関連する一般的保存条件は、バッチプロセスで説明されたように行うことができ、または連続的手順により行うことができる。ＲＫＯからリン脂質高濃度化分画までの連続的プロセスの全期間は、約８時間である。
【００８２】
上記で説明されたバッチプロセスと比較して、連続的プロセスは、同じ機器設置面積で３〜５倍多くの（同様に高い品質の）材料を生成し、自動化がより容易であり、必要な操作がより少ないことが判明した。
【００８３】
本開示は、その特定の実施形態に関連して説明してきたが、本開示はさらなる改変が可能であり、本出願は、あらゆる変形、使用または翻案を網羅することを意図し、それらには、当技術分野内で公知のもしくは慣例的な作業に包含され、本明細書において以上に記載した本質的特徴に適用することができ、添付の特許請求の範囲に従うような、本開示からの変更を含むものとしてすることが理解される。
【図１】
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【国際調査報告】
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