(57)【要約】  エレクトロスプレーイオン化質量分析計（ＥＳＩ−ＭＳ）データの品質を向上させるための方法、デバイス、及び、システムについて記載され、化学分離データと質量分析データとの間の相関の向上を達成するための方法、デバイス、及び、システムについても記載される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分離反応を実行している間にエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）チップをグランドに対して一定の電圧に維持するための方法であって、
ａ）分離チャネルの基端部に第１の電圧を印加するステップであって、前記分離チャネルの先端部が前記ＥＳＩチップと流体連通状態にあるとともに電気的通信状態にある、ステップと、
ｂ）補助流体チャネルの基端部に第２の電圧を印加するステップであって、前記補助流体チャネルの先端部が前記分離チャネルの前記先端部と流体連通状態にあるとともに電気的通信状態にある、ステップと、
ｃ）前記分離反応を実行して検体の混合物を分離するステップであって、前記分離反応が前記分離チャネル内で行われる、ステップと、
ｄ）前記分離チャネルの抵抗の変化又は前記ＥＳＩチップにおける電圧の変化をフィードバックループで監視するステップであって、前記フィードバックループが、前記分離チャネルの全体にわたる一定の電圧降下と前記ＥＳＩチップにおける一定の電圧とを維持するように前記第１及び第２の電圧を調整する、ステップと、
を含む方法。
【請求項２】
前記分離チャネルがキャピラリーのルーメンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記キャピラリーがマイクロバイアルスプレーチップを備える、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記分離チャネルがマイクロ流体デバイス内の流体チャネルである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記分離反応が等電点電気泳動反応を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記分離反応が電気泳動分離反応を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の電圧がカソードに印加され、前記第２の電圧がアノードに印加される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＥＳＩチップにおける前記電圧がグランドに保持される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＥＳＩチップにおける前記電圧が前記第２の電圧に保持される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１及び第２の電圧を調整する前記ステップは、前記第１の電圧及び前記第２の電圧から前記ＥＳＩチップで測定される過渡電圧変化を差し引くステップを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＥＳＩチップにおける前記電圧は、前記第１の電圧又は前記第２の電圧を与える電源を使用して測定される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記フィードバックループが少なくとも０．１Ｈｚの周波数で動作する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記フィードバックループが少なくとも１０Ｈｚの周波数で動作する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記フィードバックループが前記ＥＳＩチップにおける前記電圧を予め設定された値の±１０％以内に維持する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記フィードバックループが前記ＥＳＩチップにおける前記電圧を予め設定された値の±１％以内に維持する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記フィードバックループが前記分離チャネルの全体にわたる前記電圧降下を予め設定された値の±１０％以内に維持する、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記フィードバックループが前記分離チャネルの全体にわたる前記電圧降下を予め設定された値の±１％以内に維持する、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ａ）２つ以上の検体の混合物を含むサンプルを用意するステップと、
ｂ）前記２つ以上の検体の混合物から個々の検体ピークを分解するために前記サンプルを含む流体チャネル内で分離を実行するステップと、
ｃ）流体チャネル出口に向かう前記流体チャネルの内容物の動員時に検体ピークの速度を計算するステップと、
ｄ）前記検体ピークの前記速度を使用して、前記検体ピークが前記流体チャネル出口に到達する時間を決定するステップと、
を含む方法。
【請求項１９】
前記流体チャネルがキャピラリーのルーメンである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記流体チャネルがマイクロ流体デバイスの一部である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記分離は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）、キャピラリー等速電気泳動（ＣＩＴＰ）、又は、ミセル動電クロマトグラフィ（ＭＥＫＣ）に基づく、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記検体ピークの前記速度は、前記検体ピークが第１の位置から第２の位置に移動するのに必要な時間間隔から計算される、請求項１８から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１の位置、第２の位置、及び、時間間隔は、前記流体チャネルの一連の２つ以上の画像から決定される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記一連の２つ以上の画像は、紫外光吸収画像、可視光吸収画像、又は、蛍光画像を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記流体チャネル出口が質量分析計とのエレクトロスプレーインタフェースを備える、請求項１８から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記検体ピークが前記流体チャネル出口に到達する前記時間は、質量分析計データを前記検体ピークと相関させるために使用される、請求項１８から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記流体チャネルの内容物の前記動員は、電気浸透流動員技術、化学的動員技術、流体力学的動員技術、又は、これらの任意の組み合わせの使用を含む、請求項１８から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記２つ以上の検体は、タンパク質、タンパク質−薬物複合体、ペプチド、核酸分子、炭水化物分子、脂質分子、代謝産物分子、小有機化合物、又は、これらの任意の組み合わせを含む、請求項１８から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
生物学的薬物候補及び基準薬物のサンプルに関して収集される質量分析計データの比較が生物学的類似性の決定を行うために使用される、請求項２６から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記検体ピークの前記分離又は前記動員のための制御パラメータを調整するために前記検体ピークの前記速度がフィードバックループで使用される、請求項１８から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記制御パラメータが電圧である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記フィードバックループが少なくとも０．１Ｈｚの周波数で動作する、請求項３０又は請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ａ）２つ以上の検体の混合物を含むサンプルを用意するステップと、
ｂ）前記２つ以上の検体の混合物から個々の検体ピークを分解するために前記サンプルを含む流体チャネル内で分離を実行するステップと、
ｃ）質量分析計とのエレクトロスプレーインタフェースを介して前記流体チャネルから放出される前記２つ以上の個々の検体ピークに関して質量分析計データを収集するステップであって、前記質量分析計のためのデータ収集モードが高質量走査と低質量走査との間で交互に行われる、ステップと、
を含む方法。
【請求項３４】
前記質量分析計は、少なくとも０．５Ｈｚの周波数において、前記高質量走査データ収集モードと前記低質量走査データ収集モードとの間で切り換えられる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記流体チャネルがキャピラリーのルーメンである、請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記流体チャネルがマイクロ流体デバイスの一部である、請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記分離は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）、キャピラリー等速電気泳動（ＣＩＴＰ）、又は、ミセル動電クロマトグラフィ（ＭＥＫＣ）に基づく、請求項３３から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記高質量走査が生体高分子に関する質量スペクトルデータを捕捉する、請求項３３から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記生体高分子は、タンパク質、タンパク質−薬物複合体、核酸分子、還元タンパク質、融合タンパク質、タンパク質複合体、又は、これらの任意の組み合わせを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４０】
前記高質量走査に関するｍ／ｚ比が１５００〜６０００の範囲である、請求項３３から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記低質量走査は、等電点電気泳動分離を実行する際に使用される液相両性電解質に関する質量スペクトルデータを捕捉する、請求項３３から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記低質量走査に関するｍ／ｚ比が１５０〜１５００の範囲である、請求項３３から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記高質量走査で特定される生体高分子に関する等電点（ｐＩ）を較正するために１つ以上の液相両性電解質の前記質量スペクトルが使用される、請求項４１又は４２に記載の方法。
【請求項４４】
ａ）サンプルを含む流体チャネル内で分離を実行するステップであって、前記サンプルが２つ以上の検体の混合物を含み、前記分離が前記２つ以上の検体の混合物から個々の検体ピークを分解する、ステップと、
ｂ）前記流体チャネルの内容物を流体チャネル出口に向けて動員するステップであって、前記流体チャネル出口が質量分析計とのエレクトロスプレーインタフェースを備える、ステップと、
ｃ）（ｉ）（ａ）及び（ｂ）の最中に検体ピークの位置を監視するために前記流体チャネルの少なくとも一部を同時に又は交互に撮像するとともに、（ｉｉ）エレクトロスプレー性能を監視するために前記流体チャネル出口と前記質量分析計への入口との間から流出するテイラーコーンを同時に又は交互に撮像するステップと、
を含む方法。
【請求項４５】
前記検体ピークに関する速度を計算するために前記流体チャネルの少なくとも一部の２つ以上の画像における前記検体ピークの前記位置が使用される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記検体ピークが前記流体チャネル出口に到達する時間を決定するために前記検体ピークの前記速度が使用される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記検体ピークが前記流体チャネル出口に到達する前記時間は、質量分析計データを前記検体ピークと相関させるために使用される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
エレクトロスプレー性能を調整するために前記テイラーコーンの撮像から得られるデータがフィードバックループで使用される、請求項４４から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記フィードバックループが少なくとも０．１Ｈｚの周波数で動作する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記流体チャネルがキャピラリーのルーメンである、請求項４４から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記流体チャネルがマイクロ流体デバイスの一部である、請求項４４から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記分離は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）、キャピラリー等速電気泳動（ＣＩＴＰ）、又は、ミセル動電クロマトグラフィ（ＭＥＫＣ）に基づく、請求項４４から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記撮像は、紫外光吸収撮像、可視光吸収撮像、又は、蛍光撮像を含む、請求項４４から５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記流体チャネルの内容物の前記動員は、電気浸透流動員技術、化学的動員技術、流体力学的動員技術、又は、これらの任意の組み合わせの使用を含む、請求項４４から５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記２つ以上の検体は、タンパク質、タンパク質−薬物複合体、ペプチド、核酸分子、炭水化物分子、脂質分子、代謝産物分子、小有機化合物、又は、これらの任意の組み合わせを含む、請求項４４から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
分離反応を実行している間にエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）チップをグランドに対して一定の電圧に維持するためのコンピュータ実装方法であって、
ａ）プロセッサを使用して、前記ＥＳＩチップにおける電圧の第１の測定値を受信するステップであって、前記分離チャネルの先端部が前記ＥＳＩチップと流体連通状態にあるとともに電気的通信状態にある、ステップと、
ｂ）前記プロセッサを使用して、前記ＥＳＩチップにおける前記電圧の第２の測定値を受信するステップと、
ｃ）前記プロセッサを使用して前記第２の測定値と前記第１の測定値とを比較するステップであって、前記第２の測定値が前記第１の測定値と異なる場合には、前記プロセッサにより、前記分離チャネルの基端部における電圧と、前記分離チャネルの前記先端部と流体連通状態にあるとともに電気的通信状態にある先端部を備える補助流体チャネルの基端部における電圧とが、前記ＥＳＩチップにおける前記電圧が前記第１の測定値に戻されるように調整される、ステップと、
ｄ）特定の周波数で前記ステップ（ａ）〜（ｃ）を繰り返すステップと、
を含むコンピュータ実装方法。
【請求項５７】
前記分離チャネルが、キャピラリーのルーメン又はマイクロ流体デバイス内の流体チャネルを備える、請求項５６に記載のコンピュータ実装方法。
【請求項５８】
前記分離反応が等電点電気泳動反応を含む、請求項５６又は５７に記載のコンピュータ実装方法。
【請求項５９】
前記分離反応が電気泳動分離反応を含む、請求項５６又は５７に記載のコンピュータ実装方法。
【請求項６０】
前記ＥＳＩチップにおける前記電圧がグランドに保持される、請求項５６から５９のいずれか一項に記載のコンピュータ実装方法。
【請求項６１】
前記特定の周波数が少なくとも１Ｈｚである、請求項５６から６０のいずれか一項に記載のコンピュータ実装方法。
【請求項６２】
前記ＥＳＩチップにおける前記電圧が特定の値の±５％以内に維持される、請求項５６から６１のいずれか一項に記載のコンピュータ実装方法。
【請求項６３】
ａ）プロセッサを使用して、キャピラリー内又はマイクロ流体デバイス内の分離チャネルの全部又は一部を撮像するように構成される検出器を使用して取得される２つ以上の画像を含む画像データを受信するステップと、
ｂ）前記同じプロセッサ又は異なるプロセッサを使用して前記画像データを処理し、前記２つ以上の画像内における前記分離チャネル内の検体ピークの位置を決定するステップと、
ｃ）前記同じプロセッサ又は異なるプロセッサを使用し、前記２つ以上の画像内における前記検体ピークの前記位置と、前記２つ以上の画像の取得間の既知の時間間隔とに基づいて、前記検体ピークの速度を計算する、ステップと、
ｄ）前記同じプロセッサ又は異なるプロセッサを使用して、前記検体ピークが分離チャネル出口に到達する時間を決定するステップと、
を含むコンピュータ実装方法。
【請求項６４】
前記分離チャネル内で実行される分離反応が、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）、キャピラリー等速電気泳動（ＣＩＴＰ）、又は、ミセル動電クロマトグラフィ（ＭＥＫＣ）を含む、請求項６３に記載のコンピュータ実装方法。
【請求項６５】
前記２つ以上の画像は、紫外光吸収画像、可視光吸収画像、又は、蛍光画像を含む、請求項６３又は６４に記載のコンピュータ実装方法。
【請求項６６】
前記分離チャネル出口は、質量分析計とのエレクトロスプレーインタフェースと流体連通している又は質量分析計とのエレクトロスプレーインタフェースを備える、請求項６３から６５のいずれか一項に記載のコンピュータ実装方法。
【請求項６７】
前記検体ピークが前記流体チャネル出口に到達する前記時間は、質量分析計データを前記検体ピークと相関させるために使用される、請求項６３から６６のいずれか一項に記載のコンピュータ実装方法。
【請求項６８】
前記検体は、混合物から分離されるとともに、タンパク質、タンパク質−薬物複合体、ペプチド、核酸分子、炭水化物分子、脂質分子、代謝物分子、又は、小有機化合物を含む、請求項６３から６７のいずれか一項に記載のコンピュータ実装方法。
【請求項６９】
生物学的薬物候補及び基準薬物のサンプルに関して収集される質量分析計データの比較が生物学的類似性の決定を行うために使用される、請求項６３から６８のいずれか一項に記載のコンピュータ実装方法。
【請求項７０】
前記分離チャネル内で実行される分離反応のための制御パラメータを調整するために前記検体ピークの前記速度がフィードバックループで使用される、請求項６３から６９のいずれか一項に記載のコンピュータ実装方法。
【請求項７１】
前記制御パラメータが電圧である、請求項７０に記載のコンピュータ実装方法。
【請求項７２】
前記フィードバックループが少なくとも０．１Ｈｚの周波数で動作する、請求項７０又は請求項７１に記載のコンピュータ実装方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
この出願は、２０１８年５月３１日に出願された米国仮出願第６２／６７８，２６５号及び２０１８年６月１２日に出願された米国仮出願第６２／６８４，０９０号の利益を主張し、これらの出願はいずれも参照により本願に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
本開示は、化学分析の分野、特に、混合物中の検体の分離及びそれらのその後の質量分析（ＭＳ）による分析に関する。検体の固有の品質に基づいて、より複雑な検体混合物から検体成分を分離するとともに、その品質の状態に関して濃縮される画分のセットを提供することは、分析化学の重要な部分である。このようにして複雑な混合物を単純化すると、ダウンストリーム分析の複雑さが軽減される。しかしながら、既知の濃縮方法及び／又は分析機器を伴うデバイス及び／又は技術をインタフェースしようとする際に問題が生じ得る。
【０００３】
例えば、タンパク質サンプル調製技術と質量分析計などのダウンストリーム検出システムとをインタフェースするために様々な方法が使用されてきた。一般的な方法は、液体クロマトグラフィを使用してサンプルを調製して、質量分析（ＬＣ−ＭＳ）のための画分を収集することである。これは、タンパク質サンプルをペプチド断片へと消化する必要があるという欠点を有し、それにより、分析されなければならない多数のサンプル画分と、実行後の複雑なデータ再構成とがもたらされる。特定の形態の液体クロマトグラフィ、例えばペプチドマップ逆相クロマトグラフィを質量分析計に結合できるが、これらの既知の技術は、無傷のタンパク質ではなく、ペプチド断片を使用することに限られ、そのため、それらの有用性が限られる。
【０００４】
サンプルを質量分析計に導入する他の方法は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）である。ＥＳＩでは、サンプル及び溶液の小さな液滴が、キャピラリーチップ又はエミッタチップと質量分析計のソースプレートとの間の電界の印加によって、エミッタチップ又はオリフィスなどのエレクトロスプレー機能を備えるキャピラリー又はマイクロ流体デバイスの先端から放出される。液滴は、この誘導電界内で伸長及び膨張し、蒸発して更なる分離及び検出のために質量分析計に導入される気相イオンを生成する益々小さい液滴を含む円錐形状の放出（すなわち、「テイラーコーン」）を形成する。一般に、エミッタチップは、ＥＳＩにとって都合の良い液滴量をもたらすキャピラリーから形成される。しかしながら、キャピラリーは、多段サンプル処理を許可しない直線状の流路に限られる。また、ＥＳＩは、分析の全体にわたって一定のままとなるべくＥＳＩチップにおける電圧にも依存し、これは、内部流体抵抗が経時的に変化する可能性があり、それにより、電気回路の様々な部分で電圧降下が変化し、その結果、ＥＳＩチップの電圧が変化する、多くの分析において課題となり得る。
【０００５】
マイクロ流体デバイスに関して他の研究が進められてきた。マイクロ流体デバイスは、様々な既知の技術によって製造可能であり、異なる流体操作を実行するように設計されるチャネルネットワークを構成できる所定の寸法の流体チャネルをもたらす。これらのデバイスは、キャピラリーよりも付加的な制御レベル及び複雑さをもたらし、そのため、サンプル調製にとってより良い選択となる。しかしながら、キャピラリーと同様に、これらのツールは、もしあれば、質量分析計への導入前に分離された検体画分の特性評価を制限することが多い。また、キャピラリーデバイス又はマイクロ流体デバイスを伴うシステムは、一般に、動作中にテイラーコーンを再確立するべくシステムを較正するためのツールをもたらさない。
【０００６】
エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）データの品質を向上させるための方法、デバイス、システム、及び、ソフトウェアについて記載し、化学分離データと質量分析データとの間の相関のより定量的な特性評価及び前記相関の向上を実現するための方法、デバイス、システム、及び、ソフトウェアについても記載する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書中には、分離反応を実行している間にエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）チップをグランドに対して一定の電圧に維持するための方法であって、ａ）分離チャネルの基端部に第１の電圧を印加するステップであって、分離チャネルの先端部がＥＳＩチップと流体連通状態にあるとともに電気的通信状態にある、ステップと、ｂ）補助流体チャネルの基端部に第２の電圧を印加するステップであって、補助流体チャネルの先端部が分離チャネルの先端部と流体連通状態にあるとともに電気的通信状態にある、ステップと、ｃ）分離反応を実行して検体の混合物を分離するステップであって、分離反応が分離チャネル内で行われる、ステップと、ｄ）分離チャネルの抵抗の変化又はＥＳＩチップにおける電圧の変化をフィードバックループで監視するステップであって、フィードバックループが、分離チャネルの全体にわたる一定の電圧降下とＥＳＩチップにおける一定の電圧とを維持するように第１及び第２の電圧を調整する、ステップと、を含む方法が開示される。幾つかの実施形態では、分離チャネルがキャピラリーのルーメンである。幾つかの実施形態では、キャピラリーがマイクロバイアルスプレーチップを備える。幾つかの実施形態では、分離チャネルがマイクロ流体デバイス内の流体チャネルである。幾つかの実施形態では、分離反応が等電点電気泳動反応を含む。幾つかの実施形態では、分離反応が電気泳動分離反応である。幾つかの実施形態では、第１の電圧がカソードに印加され、第２の電圧がアノードに印加される。幾つかの実施形態では、ＥＳＩチップにおける電圧がグランドに保持される。幾つかの実施形態では、ＥＳＩチップにおける電圧が第２の電圧に保持される。幾つかの実施形態において、第１及び第２の電圧を調整するステップは、第１の電圧及び第２の電圧からＥＳＩチップで測定される過渡電圧変化を差し引くステップを含む。幾つかの実施形態において、ＥＳＩチップにおける電圧は、第１の電圧又は第２の電圧を与える電源を使用して測定される。幾つかの実施形態では、フィードバックループが少なくとも０．１Ｈｚの周波数で動作する。幾つかの実施形態では、フィードバックループが少なくとも１０Ｈｚの周波数で動作する。幾つかの実施形態では、フィードバックループがＥＳＩチップにおける電圧を予め設定された値の±１０％以内に維持する。幾つかの実施形態では、フィードバックループがＥＳＩチップにおける電圧を予め設定された値の±１％以内に維持する。幾つかの実施形態では、フィードバックループが分離チャネルの全体にわたる電圧降下を予め設定された値の±１０％以内に維持する。幾つかの実施形態では、フィードバックループが分離チャネルの全体にわたる電圧降下を予め設定された値の±１％以内に維持する。
【０００８】
本明細書中には、ａ）２つ以上の検体の混合物を含むサンプルを用意するステップと、ｂ）２つ以上の検体の混合物から個々の検体ピークを分解するためにサンプルを含む流体チャネル内で分離を実行するステップと、ｃ）流体チャネル出口に向かう流体チャネルの内容物の動員時に検体ピークの速度を計算するステップと、ｄ）検体ピークの速度を使用して、検体ピークが流体チャネル出口に到達する時間を決定するステップとを含む方法が開示される。幾つかの実施形態では、流体チャネルがキャピラリーのルーメンである。幾つかの実施形態では、流体チャネルがマイクロ流体デバイスの一部である。幾つかの実施形態において、分離は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）、キャピラリー等速電気泳動（ＣＩＴＰ）、又は、ミセル動電クロマトグラフィ（ＭＥＫＣ）に基づく。幾つかの実施形態において、検体ピークの速度は、検体ピークが第１の位置から第２の位置に移動するのに必要な時間間隔から計算される。幾つかの実施形態において、第１の位置、第２の位置、及び、時間間隔は、流体チャネルの一連の２つ以上の画像から決定される。幾つかの実施形態において、一連の２つ以上の画像は、紫外光吸収画像、可視光吸収画像、又は、蛍光画像を含む。幾つかの実施形態では、流体チャネル出口が質量分析計とのエレクトロスプレーインタフェースを備える。幾つかの実施形態において、検体ピークが流体チャネル出口に到達する時間は、質量分析計データを検体ピークと相関させるために使用される。幾つかの実施形態において、流体チャネルの内容物の動員は、電気浸透流動員技術、化学的動員技術、流体力学的動員技術、又は、これらの任意の組み合わせの使用を含む。幾つかの実施形態において、２つ以上の検体は、タンパク質、タンパク質−薬物複合体、ペプチド、核酸分子、炭水化物分子、脂質分子、代謝産物分子、小有機化合物、又は、これらの任意の組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、生物学的薬物候補及び基準薬物のサンプルに関して収集される質量分析計データの比較が生物学的類似性の決定を行うために使用される。幾つかの実施形態では、検体ピークの分離又は動員のための制御パラメータを調整するために検体ピークの速度がフィードバックループで使用される。幾つかの実施形態では、制御パラメータが電圧である。幾つかの実施形態では、フィードバックループが少なくとも０．１Ｈｚの周波数で動作する。
【０００９】
本明細書中には、ａ）２つ以上の検体の混合物を含むサンプルを用意するステップと、ｂ）２つ以上の検体の混合物から個々の検体ピークを分解するためにサンプルを含む流体チャネル内で分離を実行するステップと、ｃ）質量分析計とのエレクトロスプレーインタフェースを介して流体チャネルから放出される２つ以上の個々の検体ピークに関して質量分析計データを収集するステップであって、質量分析計のためのデータ収集モードが高質量走査と低質量走査との間で交互に行われる、ステップとを含む方法が開示される。幾つかの実施形態において、質量分析計は、少なくとも０．５Ｈｚの周波数において、高質量走査データ収集モードと低質量走査データ収集モードとの間で切り換えられる。幾つかの実施形態では、流体チャネルがキャピラリーのルーメンである。幾つかの実施形態では、流体チャネルがマイクロ流体デバイスの一部である。幾つかの実施形態において、分離は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）、キャピラリー等速電気泳動（ＣＩＴＰ）、又は、ミセル動電クロマトグラフィ（ＭＥＫＣ）に基づく。幾つかの実施形態では、高質量走査が生体高分子に関する質量スペクトルデータを捕捉する。幾つかの実施形態において、生体高分子は、タンパク質、タンパク質−薬物複合体、核酸分子、還元タンパク質、融合タンパク質、タンパク質複合体、又は、これらの任意の組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、高質量走査に関するｍ／ｚ比が１５００〜６０００の範囲である。幾つかの実施形態において、低質量走査は、等電点電気泳動分離を実行する際に使用される液相両性電解質に関する質量スペクトルデータを捕捉する。幾つかの実施形態では、低質量走査に関するｍ／ｚ比が１５０〜１５００の範囲である。幾つかの実施形態では、高質量走査で特定される生体高分子に関する等電点（ｐＩ）を較正するために１つ以上の液相両性電解質の質量スペクトルが使用される。
【００１０】
本明細書中には、ａ）サンプルを含む流体チャネル内で分離を実行するステップであって、サンプルが２つ以上の検体の混合物を含み、分離が２つ以上の検体の混合物から個々の検体ピークを分解する、ステップと、ｂ）流体チャネルの内容物を流体チャネル出口に向けて動員するステップであって、流体チャネル出口が質量分析計とのエレクトロスプレーインタフェースを備える、ステップと、ｃ）（ｉ）（ａ）及び（ｂ）の最中に検体ピークの位置を監視するために流体チャネルの少なくとも一部を同時に又は交互に撮像するとともに、（ｉｉ）エレクトロスプレー性能を監視するために流体チャネル出口と質量分析計への入口との間から流出するテイラーコーンを同時に又は交互に撮像するステップとを含む方法が開示される。幾つかの実施形態では、検体ピークに関する速度を計算するために流体チャネルの少なくとも一部の２つ以上の画像における検体ピークの位置が使用される。幾つかの実施形態では、検体ピークが流体チャネル出口に到達する時間を決定するために検体ピークの速度が使用される。幾つかの実施形態において、検体ピークが流体チャネル出口に到達する時間は、質量分析計データを検体ピークと相関させるために使用される。幾つかの実施形態では、エレクトロスプレー性能を調整するためにテイラーコーンの撮像から得られるデータがフィードバックループで使用される。幾つかの実施形態では、フィードバックループが少なくとも０．１Ｈｚの周波数で動作する。幾つかの実施形態では、流体チャネルがキャピラリーのルーメンである。幾つかの実施形態では、流体チャネルがマイクロ流体デバイスの一部である。幾つかの実施形態において、分離は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）、キャピラリー等速電気泳動（ＣＩＴＰ）、又は、ミセル動電クロマトグラフィ（ＭＥＫＣ）に基づく。幾つかの実施形態において、撮像は、紫外光吸収撮像、可視光吸収撮像、又は、蛍光撮像を含む。幾つかの実施形態において、流体チャネルの内容物の動員は、電気浸透流動員技術、化学的動員技術、流体力学的動員技術、又は、これらの任意の組み合わせの使用を含む。幾つかの実施形態において、２つ以上の検体は、タンパク質、タンパク質−薬物複合体、ペプチド、核酸分子、炭水化物分子、脂質分子、代謝産物分子、小有機化合物、又は、これらの任意の組み合わせを含む。
【００１１】
本明細書中には、分離反応を実行している間にエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）チップをグランドに対して一定の電圧に維持するためのコンピュータ実装方法であって、ａ）プロセッサを使用して、ＥＳＩチップにおける電圧の第１の測定値を受信するステップであって、分離チャネルの先端部がＥＳＩチップと流体連通状態にあるとともに電気的通信状態にある、ステップと、ｂ）プロセッサを使用して、ＥＳＩチップにおける電圧の第２の測定値を受信するステップと、ｃ）プロセッサを使用して第２の測定値と第１の測定値とを比較するステップであって、第２の測定値が第１の測定値と異なる場合には、プロセッサにより、分離チャネルの基端部における電圧と、分離チャネルの先端部と流体連通状態にあるとともに電気的通信状態にある先端部を備える補助流体チャネルの基端部における電圧とが、ＥＳＩチップにおける電圧が第１の測定値に戻されるように調整される、ステップと、ｄ）特定の周波数でステップ（ａ）〜（ｃ）を繰り返すステップとを含むコンピュータ実装方法が開示される。幾つかの実施形態では、分離チャネルがキャピラリーのルーメン又はマイクロ流体デバイス内の流体チャネルを備える。幾つかの実施形態では、分離反応が等電点電気泳動反応を含む。幾つかの実施形態では、分離反応が電気泳動分離反応である。幾つかの実施形態では、ＥＳＩチップにおける電圧がグランドに保持される。幾つかの実施形態では、特定の周波数が少なくとも１Ｈｚである。幾つかの実施形態では、ＥＳＩチップにおける電圧が特定の値の±５％以内に維持される。
【００１２】
本明細書中には、ａ）プロセッサを使用して、キャピラリー内又はマイクロ流体デバイス内の分離チャネルの全部又は一部を撮像するように構成される検出器を使用して取得される２つ以上の画像を含む画像データを受信するステップと、ｂ）同じプロセッサ又は異なるプロセッサを使用して画像データを処理し、２つ以上の画像内における分離チャネル内の検体ピークの位置を決定するステップと、ｃ）同じプロセッサ又は異なるプロセッサを使用し、２つ以上の画像内における検体ピークの位置と、２つ以上の画像の取得間の既知の時間間隔とに基づいて、検体ピークの速度を計算する、ステップと、ｄ）同じプロセッサ又は異なるプロセッサを使用して、検体ピークが分離チャネル出口に到達する時間を決定するステップとを含むコンピュータ実装方法が開示される。幾つかの実施形態では、分離チャネル内で実行される分離反応が、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）、キャピラリー等速電気泳動（ＣＩＴＰ）、又は、ミセル動電クロマトグラフィ（ＭＥＫＣ）を含む。幾つかの実施形態において、２つ以上の画像は、紫外光吸収画像、可視光吸収画像、又は、蛍光画像を含む。幾つかの実施形態において、分離チャネル出口は、質量分析計とのエレクトロスプレーインタフェースと流体連通している又は質量分析計とのエレクトロスプレーインタフェースを備える。幾つかの実施形態において、検体ピークが流体チャネル出口に到達する時間は、質量分析計データを検体ピークと相関させるために使用される。幾つかの実施形態において、検体は、混合物から分離されるとともに、タンパク質、タンパク質−薬物複合体、ペプチド、核酸分子、炭水化物分子、脂質分子、代謝物分子、又は、小有機化合物を含む。幾つかの実施形態では、生物学的薬物候補及び基準薬物のサンプルに関して収集される質量分析計データの比較が生物学的類似性の決定を行うために使用される。幾つかの実施形態では、分離チャネル内で実行される分離反応のための制御パラメータを調整するために検体ピークの速度がフィードバックループで使用される。幾つかの実施形態では、制御パラメータが電圧である。幾つかの実施形態では、フィードバックループが少なくとも０．１Ｈｚの周波数で動作する。
【００１３】
参照による組み入れ
この明細書中で言及される全ての刊行物、特許、及び、特許出願は、あたかもそれぞれの個々の刊行物、特許、又は、特許出願が参照によりその全体が組み入れられるように具体的に且つ個別に示唆されるかのように同じ程度まで参照によりそれらの全体が本願に組み入れられる。本明細書中の用語と組み入れられた引用文献中の用語との間に矛盾がある場合には、本明細書中の用語が支配する。
【００１４】
本発明の新規の特徴が添付の特許請求の範囲に詳細に記載される。本発明の特徴及び利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明及び添付図面を参照することによって得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本開示の１つの実施形態に係る自動的に取り込まれるサンプルの等電点電気泳動（ＩＥＦ）及びエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）のためのデバイスの概略図を与える。
【図２】分離された検体バンドに関して等電点を計算するためのコンピュータ実装方法のフローチャートの一例を与える。
【図３】１つ以上の分離された検体バンドの速度を決定して流出時間を計算するためのコンピュータ実装方法のためのフローチャートの他の例を与える。
【図４】ＥＳＩ−ＭＳ分析システムのための１つ以上の動作パラメータの撮像に基づくフィードバック及び制御を実施するためのコンピュータ実装方法のためのフローチャートの他の例を与える。
【図５】開示されたシステムの１つの実施形態におけるハードウェアコンポーネントの概略ブロック図を与える。
【図６】開示されたシステムの１つの実施形態におけるソフトウェアコンポーネントの概略ブロック図を与える。
【図７Ａ】本発明の幾つかの実施形態で用いるマイクロ流体デバイスを示し、典型的なマイクロ流体デバイスの流体チャネルネットワークの概略図を与える。
【図７Ｂ】本発明の幾つかの実施形態で用いるマイクロ流体デバイスを示し、組み立てられたマイクロ流体デバイスのコンピュータ支援設計（ＣＡＤ）図面を与える。図７Ａに示される流体チャネル層は、流体チャネルをシールするために２つの透明層間に挟まれる。
【図８】分離されたサンプルの動員中のテイラーコーン及びエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）プルームの画像を与える。
【図９Ａ】等電点電気泳動を使用して検体の混合物中の検体を分離した後のサンプルの動員に関するデータの非限定的な例を与え、ｔ＝０分における吸光度トレースを示す（等電点電気泳動の完了）。
【図９Ｂ】等電点電気泳動を使用して検体の混合物中の検体を分離した後のサンプルの動員に関するデータの非限定的な例を与え、ｔ＝１分における吸光度トレースを示す。
【図９Ｃ】等電点電気泳動を使用して検体の混合物中の検体を分離した後のサンプルの動員に関するデータの非限定的な例を与え、ｔ＝２分における吸光度トレースを示す。
【図９Ｄ】等電点電気泳動を使用して検体の混合物中の検体を分離した後のサンプルの動員に関するデータの非限定的な例を与え、ｔ＝３分における吸光度トレースを示す。
【図９Ｅ】等電点電気泳動を使用して検体の混合物中の検体を分離した後のサンプルの動員に関するデータの非限定的な例を与え、ｔ＝４分における吸光度トレースを示す。
【図９Ｆ】等電点電気泳動を使用して検体の混合物中の検体を分離した後のサンプルの動員に関するデータの非限定的な例を与え、ｔ＝５分における吸光度トレースを示す。
【図１０Ａ】等電点電気泳動を実行して検体を分離した後に分離された検体混合物を動員するように設計されるマイクロ流体デバイスにおける代表的な回路図を与え、ＥＳＩチップがグランド又はグランド付近に保持される場合における、等電点電気泳動中の図７Ａに示されるマイクロ流体デバイスにおける代表的な回路図を与える。
【図１０Ｂ】等電点電気泳動を実行して検体を分離した後に分離された検体混合物を動員するように設計されるマイクロ流体デバイスにおける代表的な回路図を与え、分離された検体混合物の化学的動員中の図７Ａに示されるマイクロ流体デバイスにおける代表的な回路図を示す。この例では、チャネル１１４（図７Ａに示される）の抵抗が無視できると想定される。
【図１１Ａ】ＥＳＩチップを０Ｖに維持しながらの動員における代表的なデータを与え、時間の関数としての電圧のプロットを示す。
【図１１Ｂ】ＥＳＩチップを０Ｖに維持しながらの動員における代表的なデータを与え、時間の関数としての電流のプロットを示す。
【図１２】ＥＳＩチップが＋３０００Ｖに保持される電圧フィードバックループのフローチャートの一例を与える。
【図１３Ａ】本開示のマイクロ流体デバイスにおける代表的な回路図の例を与え、電流をグランドにシンクするために更なるレジスタを使用してＥＳＩチップが正の電圧に保持される、化学的動員中の図７Ａに示されるマイクロ流体デバイスにおける代表的な回路図を与える。
【図１３Ｂ】本開示のマイクロ流体デバイスにおける代表的な回路図の例を与え、電流を第３の電源にシンクするために更なるレジスタを使用してＥＳＩチップが正の電圧に保持される、化学的動員中の図７Ａに示されるマイクロ流体デバイスにおける代表的な回路図を示す。
【図１３Ｃ】本開示のマイクロ流体デバイスにおける代表的な回路図の例を与え、電流をシンクするために電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）を使用してＥＳＩチップが正の電圧に保持される、化学的動員中の図７Ａに示されるマイクロ流体デバイスにおける代表的な回路図を示す。
【図１３Ｄ】本開示のマイクロ流体デバイスにおける代表的な回路図の例を与え、電流をシンクするためにバイポーラ接合トランジスタ（ＢＪＴ）を使用してＥＳＩチップが正の電圧に保持される、化学的動員中の図７Ａに示されるマイクロ流体デバイスにおける代表的な回路図を示す。
【図１３Ｅ】本開示のマイクロ流体デバイスにおける代表的な回路図の例を与え、ＥＳＩチップがグランド又はグランド付近に保持される、分離された検体混合物の化学的動員中の図７Ａに示されるマイクロ流体デバイスにおける代表的な回路図を与える。
【図１４Ａ】キャピラリー接合噴霧器の代表的な図を与える。
【図１４Ｂ】図１４Ａのキャピラリー接合噴霧器図における代表的なレジスタ回路図を示す。
【図１５】ＥＳＩチップが０Ｖに保持されるコンピュータ制御の電圧フィードバックループの典型的なフローチャートを与える。
【図１６】検体分離データ及び分離された検体種の対応する質量分析データの例を与える。図１６Ａは、分離された検体混合物のエレクトロフェログラムを示す。図１６Ｂは、分離された種の酸性ピークの質量スペクトルを示す。図１６Ｃは、図１６Ａのエレクトロフェログラムに存在するメインピークの質量スペクトルを示す。図１６Ｄ及び図１６Ｅは、図１６Ａに示されるエレクトロフェログラムからの基本ピークの質量スペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書中に記載される幾つかの実施形態は、質量分析検出と統合されるキャピラリーとマイクロ流体とに基づく分離システムからのデータを分析して分離システムの動作を指示するための革新的なソフトウェア及びシステムに関する。幾つかの実施形態では、キャピラリー又はマイクロ流体デバイスにおける分離中に検体が撮像され、また、分子量又は質量−電荷比が分離後に質量分析計で測定される。開示される方法、デバイス、システム、及び、ソフトウェアは、分離された検体ピークのより正確な特性評価をもたらすとともに、化学分離データと質量分析（ＭＳ）データとの間の改善された相関の達成をもたらす。エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）データの品質を改善するための方法、デバイス、システム、及び、ソフトウェアも開示される。開示される方法、デバイス、システム、及び、ソフトウェアは、プロテオミクス研究、創薬及び開発、並びに、臨床診断を含むがこれらに限定されない様々な分野において潜在的な用途を有する。例えば、幾つかの実施形態において、開示される方法、デバイス、システム、及び、ソフトウェアは、以下で更に詳しく論じられるように、開発及び／又は製造中の生物学的医薬及びバイオシミラー医薬の特性評価のために利用されてもよい。生物製剤及びバイオシミラーは、例えば、組み換えタンパク質、抗体、ウイルス生ワクチン、ヒト血漿由来タンパク質、細胞ベースの薬剤、天然由来タンパク質、抗体−薬物複合体、タンパク質−薬物複合体、及び、他のタンパク質薬物を含む薬物類である。
【００１７】
様々な化学的分離技術のいずれかを実行するように設計されるとともにダウンストリーム質量分析に基づく分析を実行するためのエレクトロスプレーイオン化インタフェースも備えるマイクロ流体デバイスについて説明する。好ましい実施形態において、開示されるデバイスは、タンパク質又は他の生体高分子の等電点電気泳動を実行するように設計される。他の好ましい実施形態において、開示されるデバイスは、撮像技術と共に使用されるように設計される。撮像されるマイクロ流体分離を質量分析と統合するためのデバイス及び方法は、例えば、公開されたＰＣＴ特許出願公報である国際公開第２０１７／０９５８１３号及び米国特許出願公開第２０１７／０１７６３８６号に既に記載されてしまっており、これらは、全ての目的のために参照により本願に組み入れられる。これらの出願は、とりわけ、ＭＳ分析と併せて撮像分離を実行するためのシステムについて記載する。そのようなマイクロ流体システムは、生物学的特性評価における重要な進歩を象徴する。しかしながら、そのようなシステムが最大の利益を与えるには、本明細書中に開示されるように、これらのシステムの動作及び撮像データとＭＳデータとのダウンストリーム統合を支援する革新的なソフトウェア及びシステムを有することが有益である。
【００１８】
したがって、好ましい実施形態では、例えば、分離チャネル内の検体の混合物から等電点分離されてしまった１つ以上の検体に関して等電点（ｐＩ）の正確な決定を行って実質的に純粋な個々の検体成分（本明細書中では「ピーク」又は「バンド」とも称される）を含む一連の濃縮画分を形成するために、開示されるマイクロ流体デバイスが撮像技術と組み合わせて使用されてもよい。分離チャネルの全部又は一部を撮像することにより、分離されるべきサンプルと共に注入されてしまった２つ以上のｐＩ標準（又はｐＩマーカー）の位置を決定でき、したがって、それぞれの分離された検体のピークごとに外挿によってより正確なｐＩを計算して局所的なｐＨを決定できる。幾つかの実施形態において、分離チャネル内の検体混合物の撮像は、分離が実行されている間に行われ、また、分離されている検体のうちの１つ以上に関する等電点の決定は、分離が実行されている間に行われて繰り返し更新されていてもよい。幾つかの実施形態において、等電点電気泳動されてしまった１つ以上の検体に関する等電点の撮像に基づく決定は、分離が完了した後に行われる。幾つかの実施形態において、等電点電気泳動されてしまった１つ以上の検体に関する等電点の撮像に基づく決定は、分離が完了した後であって、分離された検体混合物がエレクトロスプレーチップに向かって動員される前に行われる。幾つかの実施形態において、本明細書中に開示される撮像に基づく方法は、マイクロ流体デバイスに基づくＥＳＩ−ＭＳシステムではなくキャピラリーに基づくＥＳＩ−ＭＳシステムと共に使用されてもよい。幾つかの実施形態において、１つ以上の検体ピークに関する等電点の決定は、コンピュータ実装方法によって行われてもよい。
【００１９】
他の好ましい実施形態では、分離された検体混合物の動員後に、すなわち、ピークが分離チャネルからエレクトロスプレーチップに向けて移動する際に、分離された検体ピークを撮像するために、開示されるマイクロ流体デバイスが撮像技術と組み合わせて使用されてもよい。幾つかの実施形態において、撮像動員ステップは、キャピラリーゲル電気泳動、キャピラリーゾーン電気泳動、等速電気泳動、キャピラリー界面動電クロマトグラフィ、ミセル動電クロマトグラフィ、フロー平衡キャピラリー電気泳動、又は、差速により検体混合物の成分を分離する任意の他の分離技術を含む分離ステップを実施するときなど、撮像分離ステップと同じステップである。幾つかの実施形態では、撮像分離における濃縮画分を質量スペクトルと相関させるために撮像動員ステップが分析されてもよい。動員された検体ピークの撮像は、例えば、一連の動員画像内のそれらの位置に基づいて１つ以上の検体ピークにおける速度を決定するために利用されてもよく、該速度は、その後、（１又は複数の）検体ピークが分離チャネルから流出する又はエレクトロスプレーチップにより放出される時点を決定するために使用されてもよく、したがって、質量分析計データを特定の検体ピークと相関させるために使用されてもよい。場合によっては、（１又は複数の）検体ピークの速度は、検体ピークが特定の変位値を移動する（例えば、第１の位置から第２の位置に移動する）のに必要な時間間隔から計算される。幾つかの実施形態において、動員される検体ピークの撮像は、それらの検体ピークが流体チャネルを通じて移動してエレクトロスプレーチップにより放出される際に（１又は複数の）ピークの直接的な監視を可能にし、したがって、質量分析計データを特定の検体ピークと直接に相関させるために使用されてもよい。幾つかの実施形態において、本明細書中に開示される撮像に基づく方法は、マイクロ流体デバイスに基づくＥＳＩ−ＭＳシステムではなくキャピラリーに基づくＥＳＩ−ＭＳシステムと共に使用されてもよい。幾つかの実施形態において、１つ以上の検体ピークに関する速度、検体ピークの実際の又は予測される分離チャネル流出時間、及び／又は、検体ピークのエレクトロスプレー放出時間の決定は、コンピュータ実装方法によって行われてもよい。
【００２０】
幾つかの実施形態において、分離された検体ピークの動員は、マイクロ流体デバイス内の電界又はフローパラメータの変化によって開始されてもよい。幾つかの実施形態では、コンピュータ実装方法により動員を開始するために、電源をマイクロ流体デバイスに接続する１つ以上の電極が接続され又は切断されてもよい。幾つかの実施形態において、エレクトロスプレーチップで形成されるテイラーコーンは、動員ステップ中に撮像されてもよい。幾つかの実施形態では、安定したエレクトロスプレー動作条件を特定するためにコンピュータにより実施される画像分析が使用されてもよい。幾つかの実施形態では、画像分析がオペレータによって行われてもよい。幾つかの実施形態では、画像分析が自動画像処理ソフトウェアを使用して行われてもよい。幾つかの実施形態では、エレクトロスプレー性能に影響を与えることで知られている１つ以上の動作パラメータが、安定したエレクトロスプレー動作状態を取り戻すべく調整される。調整され得る動作パラメータの例としては、電気泳動電圧、流量、エレクトロスプレーチップからＭＳ入口までの距離、ＭＳ電圧などが挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、エレクトロスプレーパラメータを調整するためにコンピュータ実装方法が使用されてもよい。
【００２１】
幾つかの実施形態では、電気泳動電界を生成するために複数の電源が使用されてもよい。幾つかの実施形態では、プラスの極性を有する２つの電源が使用されてもよい。幾つかの実施形態では、１つ以上の電源がマイナスの極性を有してもよい。幾つかの実施形態では、電気泳動分離のための分離チャネル内で同じ電圧勾配を維持するために電源における電圧設定は一斉に変更されてもよい。幾つかの実施形態では、エレクトロスプレーチップで一定の電圧を維持するために電源における電圧設定が変更されてもよい。幾つかの実施形態では、複数の電源が単一のマルチチャネル電源内の異なるチャネルであってもよい。幾つかの実施形態では、等電点電気泳動が分離チャネル内で行われてもよく、また、チャネル内の抵抗が経時的に増大してもよい。幾つかの実施形態では、化学的動員が分離チャネル内で行われてもよく、また、チャネル内の抵抗が経時的に減少してもよい。幾つかの実施形態では、圧力駆動動員が行われてもよく、また、新しい試薬がチャネル内に押し込まれるにつれてチャネル内の抵抗が経時的に変化してもよい。幾つかの実施形態では、エレクトロスプレーチップがグランドに保持されてもよい。幾つかの実施形態では、エレクトロスプレーチップが質量分析計に対して特定の電圧に保たれてもよい。幾つかの実施形態では、エレクトロスプレーチップがグランドに対して特定の電圧に保たれてもよい。幾つかの実施形態において、コンピュータ実装方法は、分離チャネル内の一定の電界強度（又はアノードとカソードとの間の一定の電圧降下）、及び、エレクトロスプレーチップの一定の電圧を維持するために電圧を調整してもよい。幾つかの実施形態では、チップの電圧が電圧計を使用して測定されてもよい。幾つかの実施形態において、チップの電圧は、チップに位置付けられる又はチップの内部に位置付けられる電極を使用して測定されてもよい。幾つかの実施形態では、更なる電源が、電流制御を使用して０μＡに設定されてもよく、また、チップ電圧を読み取るための電圧計として使用されてもよい。幾つかの実施形態において、コンピュータ実装方法は、チップの電圧の値を読み取るとともに、電圧を調整して分離チャネル内で一定の電界強度（又はアノードとカソードとの間で一定の電圧降下）を維持し、且つ、チップで一定の電圧を維持する。幾つかの実施形態において、コンピュータ実装方法は、分離電界回路を通じた電流の流量に基づいてＥＳＩチップの電圧を計算する。幾つかの実施形態において、分離チャネルの全体にわたる電圧降下は、一定の電力又は最大電力が分離チャネルに印加されるように調整され、この場合、分離チャネルにおいて印加される電力は、以下のように計算される。
［数１］
電力＝分離チャネルの全体にわたる電圧×分離チャネル内の電流
【００２２】
ここで、電流を分離中に絶えず又は定期的に測定でき、また、電流測定を使用して分離チャネルの全体にわたる電圧を調整できる。分離チャネルにおける電力を制御するこの方法は、分離チャネル内の温度効果を管理するのに役立ち得る。
【００２３】
幾つかの実施形態において、分離経路は、酸性陽極液及びプラス電極又は塩基性陰極液及びマイナス電極を収容するバイアル内に挿入される入口を伴う所定長さの直線状のコーティングされた又はコーティングされないキャピラリー、チューブ、又は、ラインである。幾つかの実施形態では、分離経路の出口が接合噴霧器内に挿入される。幾つかの実施形態において、接合噴霧器は、液体を液体電気接点にもたらすキャピラリー出口に他の導電性補給溶液を導入できる二次チューブ、ライン、又は、キャピラリーのためのティーと、エレクトロスプレーをサポートするとともに分離チャネルから出現する検体をエレクトロスプレーイオン化によって質量分析計に導入するためにチップへ輸送するための液体流との両方を収容する。幾つかの実施形態において、システムは、分離経路入口に陽極液及びプラス電極を伴って構成されてもよく、また、分離経路の接合部又は先端部には集束直前に陰極液が充填されてもよい。集束が完了した後、競合する陰イオンを伴う動員物質が流体力学的な又は電気浸透的な力のいずれかによって接合部に導入されてもよい。幾つかの実施形態では、分離経路入口が陰極液及びマイナス電極を伴うバイアル内に浸漬されてもよく、また、キャピラリーの接合部又は先端部には集束直前に陽極液が充填されてもよい。集束が完了した後、競合する陽イオンを伴う動員物質が流体力学的な又は電気浸透的な力のいずれかによって接合部に導入されてもよい。幾つかの実施形態において、分離チャネルは、等電点電気泳動のために一端がキャピラリーをプラス電極に接続する陽極液リザーバ内に挿入されるとともに他端がキャピラリーをマイナス電極に接続する陰極液リザーバ内に挿入される所定長さの直線状のキャピラリーである。幾つかの実施形態では、集束後、キャピラリーの陰極液端部は、陰極液から除去されて、図１４Ａに示されるように、質量分析計付近の接合噴霧器（例えば、マイクロバイアル噴霧器）内に挿入される。幾つかの実施形態において、接合噴霧器は、ＥＳＩ内の検体を帯電させて集束された検体を動員するため所定量の動員材を備えてもよい。幾つかの実施形態において、接合噴霧器は、完全動員回路に対する電気的接続をもたらしてもよい。幾つかの実施形態において、陽極液及び接合噴霧器の電圧は、陽極液と接合噴霧器との間の電圧又は電界の変化（ΔＶ）が一定のままであるとともにＥＳＩチップの電圧が一定のままであるように調整される。
【００２４】
幾つかの実施形態において、分離チャネル（例えば、キャピラリー）は、ＥＳＩへの動員された流出物の移送を容易にし得るマイクロバイアルを備える。マイクロバイアルは、キャピラリーの一部であってもよく、或いは、分離チャネルに追加され及び／又は融合されてもよい。マイクロバイアルは、ＥＳＩチップの一部であってもよい。場合によっては、マイクロバイアルは、接合噴霧器を備えてもよく又は接合噴霧器の一部であってもよい。マイクロバイアルは、チャネルの一部に又はＥＳＩチップに流体流路（例えば、シース流体用）を備えてもよい。
【００２５】
幾つかの実施形態では、電流シンクを形成するために１つの電源がレジスタに接続されてもよい。幾つかの実施形態において、レジスタは、電気泳動回路をグランドに接続することによって電流をシンクしてもよい。幾つかの実施形態において、レジスタは、電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）調整可能レジスタである。幾つかの実施形態において、レジスタは、精密可変レジスタ、リレーレジスタネットワーク、レジスタラダー、又は、電流をシンクするための経路を与えることができる任意の他の抵抗素子であってもよい。幾つかの実施形態では、電流シンクがＦＥＴであってもよく、この場合、ＦＥＴは、それがＦＥＴを通じて流れる定電流をもたらすように制御され、或いは、必要に応じて開回路又は短絡回路として機能するように制御され得る。幾つかの実施形態では、バイポーラ接合トランジスタ（ＢＪＴ）を電流シンク機能のために使用できる。幾つかの実施形態において、レジスタは、電気泳動回路を電流シンク電源に接続することによって電流をシンクしてもよい。幾つかの実施形態において、電流シンク電源の電圧設定は、分離チャネルの抵抗が経時的に変化するにつれて調整される。幾つかの実施形態において、電流シンク電源の電圧は、レジスタの全体にわたって一定の電流を維持するように調整される。幾つかの実施形態では、レジスタ又はレジスタのセット、抵抗回路などが電流シンクとして使用されてもよい。
【００２６】
幾つかの実施形態において、走査されるべき質量−電荷（ｍ／ｚ）比範囲は、動員／ＥＳＩステップ中に変えられてもよい。幾つかの実施形態では、高いｍ／ｚ範囲と低いｍ／ｚ範囲との間を切り換えるためにコンピュータ実装方法が使用されてもよい。幾つかの実施形態では、１ｍ／ｚ範囲の質量スペクトルが異なる質量範囲での検体の分離のための内部標準として使用されてもよい。このスペクトルは、等電点（ｐＩ）の標準として使用されてもよい遊離溶液等電位勾配両性電解質に関するデータを含んでもよく、或いは、このスペクトルは、電気泳動、例えばキャピラリーゾーン電気泳動における標準として使用されてもよい電気泳動移動度標準に関するデータを含んでもよい。場合によっては、このスペクトルは、対象の検体とは異なる質量範囲にある、分離ステップで例えばｐＩ、電荷対質量比、ゲルによる評価、電気泳動移動度などによって分解され得る任意の分子に関するデータを含んでもよい。
【００２７】
本開示のシステムは、（ｉ）検体分離、例えば、質量分析計とのエレクトロスプレーインタフェースをもたらす等電点電気泳動に基づく分離を行うように設計されるキャピラリー又はマイクロ流体デバイス、（ｉｉ）質量分析計、（ｉｉｉ）撮像デバイス又はシステム、（ｉｖ）プロセッサ又はコンピュータ、（ｖ）キャピラリー又はマイクロ流体デバイスに基づく検体分離の動作を画像取得と協調させるためのソフトウェア、（ｖｉ）分離が行われている間、分離が完了した後、又は、エレクトロスプレーチップに向けたｐＩ標準及び検体ピークの動員の後に、画像を処理して分離チャネル内の１つ以上のｐＩ標準又は検体ピークの（１又は複数の）位置を決定するためのソフトウェア、（ｖｉｉ）画像を処理するとともに、１つ以上のｐＩ標準又は検体ピークに関して速度、流出時間、及び／又は、エレクトロスプレー放出時間を決定するためのソフトウェア、（ｖｉｉｉ）分離チャネルの画像を同時に又は交互に取得して、エレクトロスプレーチップと質量分析計への入口との間に存在するテイラーコーン及び検体ピークの位置を監視し、エレクトロスプレー性能を監視するためのソフトウェア、（ｉｘ）テイラーコーンの画像を処理するとともに、質量分析計の入口に対するエレクトロスプレーチップの位置、エレクトロスプレーチップを通じた流体の流量、エレクトロスプレーチップと質量分析計との間の電圧又は、それらの任意の組み合わせのうちの１つ以上を調整して、質量分析計データの品質の変化に影響を与えるためのソフトウェア、（ｘ）エレクトロスプレーインタフェースから放出される個々の検体ピークに関する質量分析計データの収集を制御するためのソフトウェアであって、質量分析計におけるデータ収集モードが高質量走査と低質量走査との間で交互に行われる、ソフトウェア、（ｘｉ）エレクトロスプレーチップの電圧を読み取るとともに、チップの電圧を一定に保ちつつ、分離チャネル電圧を調整して、チャネルの電界強度を一定に保つ（又はアノードとカソードとの間の電圧降下を一定に保つ）ためのソフトウェア、或いは、これらの任意の組み合わせのうちの１つ以上を備えてもよい。幾つかの実施形態において、システムは、これらの機能的構成要素の選択が所定の形態でパッケージ化される一体型システムを構成してもよい。幾つかの実施形態において、システムは、新たな用途のためのシステムを再構成するために機能的構成要素の選択が変えられてもよいモジュールシステムを備えてもよい。幾つかの実施形態において、これらの機能的システム構成要素の幾つか、例えば、キャピラリー又はマイクロ流体デバイスは、交換可能又は使い捨て可能な構成要素である。
【００２８】
前述の一般的な概要及び以下の説明がいずれも、典型的且つ説明的なものにすぎず、本明細書中に記載される方法及びデバイスを限定するものではないことが理解されるべきである。
【００２９】
定義：別段に規定されなければ、本明細書中で使用される全ての技術用語は、この開示が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００３０】
この明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び、「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかにそうでないと示されない限り、複数の指示対象を含む。本明細書中における「又は」への言及は、別段述べられなければ、「及び／又は」を包含することが意図される。同様に、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「備えている」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び、「含んでいる」という句は、限定しようとするものではない。
【００３１】
本明細書中で使用される用語「約」を伴う数は、その数のプラスマイナス１０％の数を指す。「約」という用語は、範囲との関連で使用される場合、その範囲−その最小値の１０％及びその範囲＋その最大値の１０％を指す。
【００３２】
検体：前述したように、開示される方法、デバイス、システム、及び、ソフトウェアは、分離された検体ピークのより正確な特性評価を可能にするとともに、化学分離データと質量分析データとの間の改善された相関を可能にする。場合によっては、これらの検体は、例えば、解放されたグリカン、炭水化物、脂質又はそれらの誘導体（例えば、細胞外小胞、リポソームなど）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、無傷のタンパク質、消化されたタンパク質、タンパク質複合体、抗体薬物複合体、タンパク質−薬物複合体、ペプチド、代謝物、有機化合物、又は、他の生物学的に関連する分子、或いは、これらの任意の組み合わせであってもよい。場合によっては、これらの検体が小分子薬物であってもよい。場合によっては、これらの検体は、タンパク質混合物中のタンパク質分子、例えば、生物学的タンパク質医薬及び／又は培養物から又は体内で単離される細胞から収集される溶解物であってもよい。
【００３３】
サンプル：開示される方法、デバイス、システム、及び、ソフトウェアは、様々な生物学的サンプル又は非生物学的サンプルのいずれかから得られる検体の分離及び特性評価のために使用されてもよい。例としては、組織サンプル、細胞培養サンプル、全血サンプル（例えば、静脈血、動脈血、毛細管血サンプル）、血漿、血清、唾液、間質液、尿、汗、涙、工業用酵素又は生物学的薬物製造プロセスから得られるタンパク質サンプル、環境サンプル（例えば、空気サンプル、水サンプル、土壌サンプル、表面スワイプサンプル）などが挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、サンプルは、統合された化学分離及び質量分析特性評価のための開示された方法及びデバイスを使用する分析の前に当業者に公知の様々な技術のいずれかを使用して処理されてもよい。例えば、幾つかの実施形態において、サンプルは、タンパク質又は核酸を抽出するために処理されてもよい。サンプルは、細菌、ウイルス、植物、動物、又は、ヒトなど、様々なソース又は対象物のいずれかから収集されてもよい。
【００３４】
サンプル量：開示される方法及びデバイスの幾つかの実施形態において、微細加工技術の使用により達成され得る小型化は、非常に少ないサンプル量の処理を可能にする。幾つかの実施形態において、分析のために使用されるサンプル量は、約０．１μｌ〜約１ｍｌの範囲であってもよい。幾つかの実施形態において、分析のために使用されるサンプル量は、少なくとも０．１μｌ、少なくとも１μｌ、少なくとも２．５μｌ、少なくとも５μｌ、少なくとも７．５μｌ、少なくとも１０μｌ、少なくとも２５μｌ、少なくとも５０μｌ、少なくとも７５μｌ、少なくとも１００μｌ、少なくとも２５０μｌ、少なくとも５００μｌ、少なくとも７５０μｌ、又は、少なくとも１ｍｌであってもよい。幾つかの実施形態において、分析のために使用されるサンプル量は、最大１ｍｌ、最大７５０μｌ、最大５００μｌ、最大２５０μｌ、最大１００μｌ、最大７５μｌ、最大５０μｌ、最大２５μｌ、最大１０μｌ、最大７．５μｌ、最大５μｌ、最大２．５μｌ、最大１μｌ、又は、最大０．１μｌであってもよい。この段落に記載される下限値及び上限値のいずれかを組み合わせて、本開示内に含まれる範囲を成してもよく、例えば、幾つかの実施形態では、分析のために使用されるサンプル量が約５μｌ〜約５００μｌの範囲であってもよい。当業者であれば認識できるように、分析のために使用されるサンプル量は、この範囲内の任意の値、例えば、約１０μｌを有してもよい。
【００３５】
分離技術：開示される方法、デバイス、システム、及び、ソフトウェアは、当業者に知られている様々な検体分離技術のいずれかを利用してもよい。例えば、幾つかの実施形態において、撮像分離は、検体混合物から１つ以上の分離された検体画分を生成する、等電点電気泳動、キャピラリーゲル電気泳動、キャピラリーゾーン電気泳動、等速電気泳動、キャピラリー界面動電クロマトグラフィ、ミセル動電クロマトグラフィ、フロー平衡キャピラリー電気泳動、電界勾配集束、動的電界勾配集束などの電気泳動分離であってもよい。
【００３６】
キャピラリー等電点電気泳動（ＣＩＥＦ）：幾つかの実施形態において、分離技術は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、例えば、キャピラリー等電点電気泳動（ＣＩＥＦ）を含んでもよい。等電点電気泳動（又は「焦点電気泳動」）は、分子の等電点（ｐＩ）の違い、つまり分子が正味ゼロ電荷を有するｐＨの違いによって分子を分離するための技術である。ＣＩＥＦは、アノード又はカソードを含む試薬リザーバ間のサンプルチャネルに両性電解質（両性の電解質）溶液を加えて、全体にわたり分離電圧が印加される分離チャネル（つまり、電極を含むウェルを接続する流体チャネル）内にｐＨ勾配を生成することを伴う。両性電解質は、液相であってもよく、或いは、チャネル壁の表面に固定され得る。マイナスに帯電された分子は、媒体中のｐＨ勾配にわたってプラス電極に向けて移動し、一方、プラスに帯電された分子は、マイナス電極に向けて移動する。その等電点（ｐＩ）未満のｐＨ領域にあるタンパク質（又は他の分子）は、プラスに帯電され、そのため、カソード（すなわち、マイナスに帯電された電極）に向けて移動する。タンパク質の全体的な正味電荷は、それがｐＩに対応するｐＨ領域に到達するまで、それが増大するｐＨの勾配にわたって移動するにつれて減少し（例えば、カルボキシル基又は他のマイナスに帯電された官能基のプロトン化に起因する）、ｐＩに対応するｐＨ領域に到達した時点で、正味電荷を有さず、そのため、移動が止まる。結果として、タンパク質の混合物は、酸性及び塩基性の残留物の相対的含有量に基づいて分離し、各タンパク質がそのｐＩに対応するｐＨ勾配のポイントに位置付けられたシャープな固定バンドに集束されるようになる。この技術は、単一の電荷が別個のバンドへと分画されることによって異なるタンパク質を用いて非常に高い分解能が得られる。幾つかの実施形態において、等電点電気泳動は、電気浸透流（ＥＯＦ）を排除するために、例えば中性及び親水性ポリマーコーティングにより恒久的又は動的にコーティングされてしまった分離チャネルで行われてもよい。適切なコーティングの例としては、アミノ改質材、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）及びポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、Ｇｕａｒａｎｔ（登録商標）（Ａｌｃｏｒ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）、線状ポリアクリルアミド、ポリアクリルアミド、ジメチルアクリルアミド、ポリビニルピロリジン（ＰＶＰ）、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、トリエチルアミン、プロイルアミン、モルホリン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジアミノプロパン、エチレンジアミン、キトサン、ポリエチレンイミン、カダベリン、プトレッシン、スペルミジン、ジエチレントリアミン、テトラエチレンペンタミン、セルロース、デキストラン、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、酢酸セルロース、アミロペクチン、エチルピロリジンメタクリレート、ジメチルメタクリレート、ジドデシルジメチルアンモニウムブロミド、Ｂｒｉｊ  ３５、スルホベタイン、１，２−ジラウリルロイルスン−ホスファチジルコリン、１，４−ジデシル−１，４−ジアゾニアビシクロ［２，２，２］オクタンジブロミド、��ガロース、ポリ（Ｎヒドロキシエチルアクリルアミド）、ポール−３２３、ハイパーブランチポリアミノエステル、プララン、グリセロール、吸着コーティング、共有コーティング、動的コーティングなどが挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、等電点電気泳動は、電気浸透流を大幅に減らして、より良いタンパク質可溶化を可能にするとともに、電解質の粘度を上げることによって流体チャネルのキャピラリー内の拡散を制限するために、分離媒体中でメチルセルロース、グリセロール、尿素、ホルムアミド、界面活性剤（例えば、トリトン−Ｘ  １００、ＣＨＡＰＳ、ジギトニン）などの添加剤を使用して（例えば、コーティングされない分離チャネル内で）行われる。
【００３７】
前述したように、キャピラリー等電点電気泳動技術のために使用されるｐＨ勾配は、両性電解質、つまり、酸性基及び塩基性基の両方を含むとともに特定の範囲のｐＨ内で主に両性イオンとして存在する両性分子の使用によって生成される。分離チャネルのアノード側の電解質溶液の部分は、「陽極液」として知られている。分離チャネルのカソード側の電解質溶液のその部分は、「陰極液」として知られている。開示される方法及び装置では、リン酸、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、グルタミン酸、リジン、ギ酸、ジメチルアミン、トリエチルアミン、酢酸、ピペリジン、ジエチルアミン、及び／又は、これらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない様々な電解質が使用されてもよい。電解質は、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％などの任意の適した濃度で使用されてもよい。電解質の濃度は、少なくとも０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％であってもよい。電解質の濃度は、最大で９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、１％、０．１％、０．０１％、０．００１％、０．０００１％であってもよい。所定範囲の電解質の濃度、例えば、０．１％〜２％が使用されてもよい。両性電解質は、任意の市販又は非市販のキャリア両性電解質混合物（例えば、Ｓｅｒｖａｌｙｔ  ｐＨ  ４〜９（Ｓｅｒｖａ、ハイデルベルク、ドイツ）、Ｂｅｃｋｍａｎ  ｐＨ  ３〜１０（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、フラートン、カリフォルニア州、アメリア）、Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ  ３．５〜９．５及びＰｈａｒｍａｌｙｔｅ  ３−１０（いずれも、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅが提供、オルセー、フランス）、ＡＥＳｌｙｔｅｓ（ＡＥＳ）、ＦＬＵＫＡ両性電解質（Ｔｈｏｍａｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、スゥィーズボーロ、ニュージャージー州）、Ｂｉｏｌｙｔｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ヘラクレス、カリフォルニア州））などから選択され得る。キャリア両性電解質混合物は、間隔の狭いｐＩ値と良好な緩衝能力とを有する複数の脂肪族アミノ基とカルボン酸基とを含む小分子（約３００〜１，０００Ｄａ）の混合物を備えてもよい。印加電界の存在下で、キャリア両性電解質は、アノードからカソードに向けて徐々に増増大する滑らかな線形又は非線形のｐＨ勾配に分かれる。
【００３８】
分離された検体ピークに関して等電点を計算するための開示された方法及びデバイスでは様々なｐＩ標準のいずれかが使用されてもよい。例えば、ＣＩＥＦ用途で一般的に使用されるｐＩマーカー、例えば、タンパク質ｐＩマーカー及び合成小分子ｐＩマーカーが使用されてもよい。場合によっては、タンパク質ｐＩマーカーは、一般に受け入れられるｐＩ値を有する特定のタンパク質であってもよい。場合によっては、ｐＩマーカーは、例えば、撮像によって検出できてもよい。市販されている様々なタンパク質ｐＩマーカー又は合成小分子ｐＩマーカー又はこれらの組み合わせ、例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｌｔｄから入手可能な小分子ｐＩマーカー（ケンブリッジ、オンタリオ、カナダ）、ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ、Ｓｈｉｍｕｒａにより設計されたペプチドライブラリ、及び、Ｓｌａｉｓ色素（Ａｌｃｏｒ  Ｂｉｏｓｅｐａｒｔｉｏｎｓ）が使用されてもよい。
【００３９】
動員技術：幾つかの実施形態では、例えば、等電点電気泳動が使用される場合、分離された検体バンドが、ダウンストリーム分析デバイス、例えば、質量分析計とのエレクトロスプレーイオン化インタフェースとインタフェースする分離チャネルの端部に向けて動員されてもよい。幾つかの実施形態では、例えば、キャピラリーゲル電気泳動、キャピラリーゾーン電気泳動、等速電気泳動、キャピラリー界面動電クロマトグラフィ、ミセル動電クロマトグラフィ、フロー平衡キャピラリー電気泳動、又は、差速により検体混合物の成分を分離する任意の他の分離技術が使用される場合、分離ステップが動員ステップと見なされてもよい。
【００４０】
幾つかの実施形態において、検体バンドの動員は、分離チャネルの一端部に流体力学的圧力を印加することによって実施されてもよい。幾つかの実施形態において、検体バンドの動員は、重力が使用され得るように分離チャネルを垂直位置に向けることによって実施されてもよい。幾つかの実施形態において、検体バンドの動員は、ＥＯＦ支援動員を使用して実施されてもよい。幾つかの実施形態において、検体バンドの動員は、化学的動員を使用して実施されてもよい。幾つかの実施形態では、これらの動員技術の任意の組み合わせが使用されてもよい。
【００４１】
一実施形態では、等電点電気泳動された検体バンドのための動員ステップが化学的動員を含む。圧力に基づく動員と比べて、化学的動員は、圧力の使用によって引き起こされる流体力学的放物線状の流れプロファイルを克服することによって最小のバンドの広がりを示すという利点を有する。化学的動員は、完全に又は部分的に集束されるｐＨ勾配を含む分離経路の入口又は出口のいずれかを、分離経路内への電気泳動に関してヒドロニウム又はヒドロキシルのいずれかと競合するイオンを伴う導電性溶液に導入することによって実施されてもよい。これは、ほぼゼロの正味電荷状態を破壊することによってｐＨ勾配成分の段階的な界面動電変位をもたらす。陰極化学的動員の場合には、所定量のヒドロキシル陰極液溶液が、競合する陰イオンを含む動員溶液で置き換えられてもよい。競合する陰イオンは、ｐＨ勾配成分で正電荷を発現する分離経路のｐＨの低下を引き起こす可能性があり、それにより、ｐＨ勾配成分がカソードに向けて移動できる。それに対応して、陽極動員では、所定量のヒドロニウム陽極液溶液が、ｐＨ勾配成分の負電荷を発現する分離でｐＨを増大させる競合する陽イオンを含む動員溶液と置き換えられ、それにより、ｐＨ勾配成分がアノードに向けて移動できる。幾つかの実施形態において、陰極動員は、任意の適切な濃度で、ギ酸、酢酸、炭酸、リン酸などの酸性電解質を使用して開始されてもよい。幾つかの実施形態において、陽極動員は、水酸化アンモニウム、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ピペリジン、水酸化ナトリウムなどの塩基性電解質を使用して開始されてもよい。幾つかの実施形態において、化学的動員は、塩化ナトリウムなどの塩又は任意の他の塩を陽極液溶液又は陰極液溶液に加えることによって開始されてもよい。
【００４２】
好ましい実施形態において、化学的動員ステップは、デバイス内の電界を変化させて動員電解質を分離チャネル内へ電気泳動させることによってＣＩＥＦをＥＳＩ−ＭＳと統合するように設計されるマイクロ流体デバイス内で開始されてもよい。幾つかの実施形態において、電界の変化は、１つ以上の電源に取り付けられる１つ以上の電極を接続又は切断することによって実施されてもよく、この場合、１つ以上の電極がデバイス上の試薬ウェル内に配置される又はデバイスの流体チャネルと一体化される。幾つかの実施形態において、１つ以上の電極の接続又は切断は、コンピュータ実装方法及びプログラム可能なスイッチを使用して制御されてもよく、それにより、動員ステップのタイミング及び持続時間を分離ステップ、エレクトロスプレーイオン化ステップ、及び／又は、質量分析データ収集と協調させることができる。幾つかの実施形態において、分離回路からの１つ以上の電極の切断は、電流制御を使用して電流を０μＡに設定することによって実施されてもよい。
【００４３】
キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）：幾つかの実施形態において、分離技術は、キャピラリーゾーン電気泳動、印加電界内で溶液中の荷電検体を分離するための方法を含んでもよい。荷電検体分子の正味速度は、分離システムによって示される電気浸透流（ＥＯＦ）移動度μＥＯＦと、個々の検体に関する電気泳動移動度μＥＰ（分子のサイズ、形状、及び、電荷に依存する）との両方により影響され、それにより、異なるサイズ、形状、又は、電荷を示す検体分子が異なる差分移動速度を示してバンドに分離する。
【００４４】
キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）：幾つかの実施形態において、分離技術は、キャピラリーゲル電気泳動、高分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び、タンパク質）及びそれらの断片を高分子のサイズ及び電荷に基づいて分離して分析するための方法を含んでもよい。この方法は、ゲルが充填された分離チャネルの使用を含み、この場合、ゲルは、印加電界内での荷電検体分子の電気泳動移動中に対流防止媒体及び／又はふるい媒体として作用する。ゲルは、電界の印加によって引き起こされる熱対流を抑制するように機能するとともに、分子の通過を遅らせるふるい媒体としても作用し、それにより、異なるサイズ又は電荷の分子に関して差分移動速度をもたらす。
【００４５】
キャピラリー等速電気泳動（ＣＩＴＰ）：幾つかの実施形態において、分離技術は、キャピラリー等速電気泳動、適した寸法のキャピラリー内又は流体チャネル内の２つの電解質（先行電解質及び終端電解質として知られる）の不連続システムを使用する荷電検体の分離のための方法を含んでもよい。先行電解質は、最高の電気泳動移動度を伴うイオンを含んでもよく、一方、終端電解質は、最低の電気泳動移動度を伴うイオンを含んでもよい。分離されるべき検体混合物（すなわち、サンプル）をこれらの２つの電解質間に挟むことができ、また、電界の印加により、電気泳動移動度を減少させる順序で、キャピラリー内又は流体チャネル内の荷電検体分子が、密接に隣り合うゾーンに分かれる。ゾーンは、検出器、例えば、導電率検出器、光検出器、又は、撮像デバイスを利用して分離チャネルに沿ったゾーンの通過を記録できるように印加電界内において一定速度で移動する。キャピラリーゾーン電気泳動とは異なり、陰イオンアニオン性及び陽イオン性の検体の同時決定又は検出は、キャピラリー等速電気泳動を使用して実行される単一の分析では実現できない。
【００４６】
キャピラリー界面動電クロマトグラフィ（ＣＥＣ）：幾つかの実施形態において、分離技術は、キャピラリー界面動電クロマトグラフィ、液体クロマトグラフィと界面動電分離方法との組み合わせに基づく検体混合物の分離のための方法を含んでもよい。ＣＥＣは、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）の効率と、充填キャピラリー高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）の選択性及びサンプル容量の両方を与える。ＣＥＣで使用されるキャピラリーはＨＰＬＣ充填材料で充填されるため、ＨＰＬＣで利用できる様々な検体選択性がＣＥＣでも利用できる。これらの充填材料の高い表面積により、ＣＥＣキャピラリーは比較的大量のサンプルを受け入れることができ、それにより、その後に溶出される検体の検出は、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）における検出作業よりもやや簡単な作業になる。
【００４７】
ミセル動電クロマトグラフィ（ＭＥＫＣ）：幾つかの実施形態において、分離技術は、ミセル動電クロマトグラフィ、界面活性剤ミセル（疑似固定相）と周囲の水性緩衝液（可動相）との間の差動分配に基づく検体混合物の分離のための方法を含んでもよい。ＭＥＫＣにおいて、緩衝液は、界面活性剤モノマーがミセルと平衡状態になるように、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）よりも高い濃度で界面活性剤を含んでもよい。ＭＥＫＣは、強い電気浸透流を生成するためにアルカリ性条件を使用して開放したキャピラリー内又は流体チャネル内で実行されてもよい。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの様々な界面活性剤がＭＥＫＣ用途で使用されてもよい。例えば、ＳＤＳの陰イオン性硫酸基により、界面活性剤及びミセルは、強い電気浸透流の方向とは逆の電気泳動移動度を有する。結果として、界面活性剤モノマー及びミセルはゆっくりと移動するが、それらの正味の動きは依然として電気浸透流の方向、すなわち、カソードに向かう。ＭＥＫＣ分離中、検体は、ミセルの疎水性内部と親水性緩衝液との間に分布し得る。ミセル内部で不溶性の親水性検体は、電気浸透流速度ｕｏで移動し、緩衝剤の保持時間ｔＭで検出される。ミセル内で完全に可溶化する疎水性検体は、ミセル速度ｕｃで移動し、最終溶出時間ｔｃで溶出する。
【００４８】
フロー平衡キャピラリー電気泳動（ＦＣＣＥ）：幾つかの実施形態において、分離技術は、フロー平衡キャピラリー電気泳動、圧力誘導逆流を利用してキャピラリーを介した検体の動電移動を能動的に遅延、停止、又は、逆行するキャピラリー電気泳動の効率及び分解能を高めるための方法を含んでもよい。検体を検出ウィンドウ全体にわたって遅延、停止、又は、前後に移動することにより、対象の検体が通常の分離条件下よりもはるかに長い時間にわたって分離チャネルに効果的に閉じ込められ、それにより、分離の効率及び分解能の両方が向上されてもよい。
【００４９】
分離時間及び分離分解能：一般に、完全な分離を達成するために必要な分離時間は、特定の分離技術と利用される動作パラメータ（分離チャネル長、マイクロ流体デバイス設計、緩衝剤組成、印加電圧など）とに応じて変化する。幾つかの実施形態において、ソフトウェアは、同時係属中の米国特許出願第１６／２６１，３８２号に記載されるように、検体ピークの撮像に基づく分析に基づいて分離が完了する時期を決定する。幾つかの実施形態では、分離時間が約０．１分〜約３０分の範囲であってもよい。幾つかの実施形態において、分離時間は、少なくとも０．１分、少なくとも０．５分、少なくとも１分、少なくとも５分、少なくとも１０分、少なくとも１５分、少なくとも２０分、少なくとも２５分、又は、少なくとも３０分であってもよい。幾つかの実施形態において、分離時間は、最大で３０分、最大で２５分、最大で２０分、最大で１５分、最大で１０分、最大で５分、最大で１分、最大で０．５分、又は、最大で０．１分であってもよい。この段落に記載される下限値及び上限値のいずれかを組み合わせて、本開示内に含まれる範囲を成してもよく、例えば、幾つかの実施形態では、分離時間が約１分〜約２０分の範囲であってもよい。分離時間は、この範囲内の任意の値、例えば、約７分を有してもよい。
【００５０】
同様に、開示される方法及びデバイスを使用して達成される分離効率及び分解能は、特定の分離技術と利用される動作パラメータ（例えば、分離チャネル長、マイクロ流体デバイス設計、緩衝剤組成、印加電圧など）とに応じて変化し得る。幾つかの実施形態では、達成される分離効率（例えば、理論段数）が約１，０００〜１，０００，０００の範囲であってもよい。場合によっては、分離効率は、少なくとも１，０００、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも３０，０００、少なくとも４０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも６０，０００、少なくとも７０，０００、少なくとも８０，０００、少なくとも９０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも２００，０００、少なくとも３００，０００、少なくとも４００，０００、少なくとも５００，０００、少なくとも６００，０００、少なくとも７００，０００、少なくとも８００，０００、少なくとも９００，０００、又は、少なくとも１，０００，０００であってもよい。効率の分離分解能は、混合物中の検体の１つ以上の特性（例えば、分子量、拡散性、電気泳動又は等電移動度など）に応じて変化し得る。
【００５１】
マイクロ流体デバイスの設計及び製造：開示される方法、デバイス、及び、システムの幾つかの実施形態では、１つ以上のサンプル調製ステップ（例えば、濾過ステップ、事前濃縮ステップ、又は、抽出ステップなど）及び／又はエレクトロスプレーイオン化ステップを伴う分離ステップ（例えば、先に概説したようなステップ）を統合するように設計されるマイクロ流体デバイスを使用して、混合物からの検体の分離が行われてもよく、及び、ＥＳＩ−ＭＳを使用する検体のその後の分析が実行されていてもよい。
【００５２】
幾つかの実施形態において、開示されるマイクロ流体デバイスは、１つ以上のサンプル又は試薬ポート（入口ポート、サンプルウェル、又は、試薬ウェルとも称される）、１つ以上の廃棄物ポート（出口ポートとも称される）、前記入口ポート及び出口ポートを互いに又は中間流体チャネル（例えば、分離チャネル）と接続する１つ以上の流体チャネル、或いは、これらの任意の組み合わせを備えてもよい。幾つかの実施形態において、開示されるマイクロ流体デバイスは、１つ以上の反応チャンバ又は混合チャンバ、１つ以上の微細加工バルブ、１つ以上の微細加工ポンプ、１つ以上の通気構造、１つ以上の膜（例えば、濾過膜）、１つ以上のマイクロカラム構造（例えば、クロマトグラフィ分離媒体が充填された流体チャネル又は改変された流体チャネル）、又は、これらの任意の組み合わせを更に備えてもよい。
【００５３】
好ましい実施形態において、開示されるマイクロ流体デバイスは、質量分析計とのエレクトロスプレーイオン化インタフェースを与えるべくエレクトロスプレーオリフィス又はエレクトロスプレーチップを組み込む。そのようなインタフェースの１つの非限定的な例は、同時係属中の米国特許出願公開第２０１７／０１７６３８６号及び第２０１８／０００３６７４号に記載される。図１は、等電点電気泳動とそれに続くＥＳＩ−ＭＳ特性評価とを実行するように設計されるマイクロ流体デバイスの１つの非限定的な例を示す。図１に示される流体チャネルネットワークは、標準的なフォトリソグラフィエッチング技術を使用して２８０ｎｍの光の非常に低い透過率を有するソーダ石灰ガラスのプレートから製造される。分離（又は濃縮）チャネル４１８の深さは、ガラス層４０２の厚さと同じであり、すなわち、濃縮チャネル４１８は、ガラスプレート４０２の上端から下端までずっと延在する。デバイス４００は、デバイス４００の一方側に配置される光源によって照明されるとともに、デバイス４００の反対側に配置される検出器によって撮像され得る。基板４０２は不透明であるが、濃縮チャネル４１８は光学スリットを画定するため、基板４０２は、濃縮チャネル４１８を通過しない光を遮断することができ、それにより、迷光を遮断して、撮像プロセスの分解能を向上させることができる。ガラス層４０２は、２８０ｎｍの光を透過する（例えば、透明である）２つの石英ガラスプレート間に挟まれる。上端プレートは、機器及びユーザがチャネルネットワークとインタフェースするための貫通穴を含み、一方、下端プレートは中実である。３枚のプレートが３０分間にわたって５２０℃で互いに結合される。入口及び出口のチューブは、チャネルネットワークに結合される劈開されたキャピラリー（１００μｍＩＤ、Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ）から製造される。タンパク質の等電点電気泳動及びその後の質量分析特性評価を実行する際のこのデバイスの動作は、以下の実施例１に記載される。
【００５４】
当業者に知られている様々な流体作動機構のいずれかを使用して、デバイスを通るサンプル及び試薬の流体の流量を制御してもよい。開示される方法、デバイス、及び、システムで用いるのに適した流体作動機構の例としては、１つ以上の入口ポート又は出口ポートに対する正又は負の圧力の印加、重力又は遠心力、界面動電力、エレクトロウェッティング力、又は、これらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、正又は負の圧力は、例えば、流体チャネルを通じたサンプル又は試薬の流れを行わせるために入口ポート及び／又は出口ポートに結合される機械的アクチュエータ又はピストンの使用によって直接に印加されてもよい。幾つかの実施形態において、機械的アクチュエータ又はピストンは、入口ポート及び／又は出口ポートをシールするために使用される可撓性の膜又は隔壁に力を及ぼしてもよい。幾つかの実施形態において、正又は負の圧力は、例えば、１つ以上の入口ポート及び／又は出口ポートに接続される加圧ガスライン又は真空ラインの使用によって間接的に印加されてもよい。幾つかの実施形態では、１つ以上の入口ポート及び／又は出口ポートと接続されるポンプ、例えば、プログラム可能なシリンジポンプ、ＨＰＬＣポンプ、又は、蠕動ポンプを使用して、流体の流れをもたらしてもよい。幾つかの実施形態において、界面動電力及び／又はエレクトロウェッティング力は、電界の使用及びデバイス内の表面特性の制御によって印加されてもよい。電界は、１つ以上の入口ポート及び／又は出口ポートに挿入される電極によって、又は、デバイス内の１つ以上の流体チャネルに組み込まれる電極によって印加されてもよい。電極は、デバイス内の電圧及び／又は電流を制御するために１つ以上のＤＣ又はＡＣ電源と接続されてもよい。
【００５５】
一般に、デバイスの本体を含む、開示されるマイクロ流体デバイスの入口ポート、出口ポート、流体チャネル、又は、他の構成要素は、ガラス、石英ガラス、シリコン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）又は環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、又は、他のエラストマー材料を含むがこれらに限定されない様々な材料のいずれかを使用して製造されてもよい。適切な製造技術は一般に材料の選択に依存し、逆もまた同様である。例としては、ＣＮＣ機械加工、フォトリソグラフィ及び化学エッチング、レーザ光アブレーション、射出成形、ホットエンボス加工、ダイカット、３Ｄ印刷などが挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、マイクロ流体デバイスは、例えば、流体チャネルを備える流体工学層がチャネルをシールするために上層及び／又は下層の間に挟まれる層状構造を備えてもよい。上層及び／又は下層は、流体工学層の流体チャネルと位置合わせして入口ポート及び／又は出口ポートなどを形成する開口を備えてもよい。２つ以上のデバイス層が、分解されてもよいデバイスを形成するために互いにクランプされてもよく、或いは、恒久的に結合されてもよい。適切な結合技術は、一般に、層を製造するために使用される材料の選択に依存する。例としては、陽極接合、熱接合、レーザ溶接、又は、硬化性接着剤（例えば、熱硬化性又は光硬化性の接着剤）の使用が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
幾つかの実施形態において、マイクロ流体デバイス内の入口ポート、出口ポート、又は、流体チャネルの全て又は一部は、電気浸透流特性を変えるために使用される表面コーディング（例えば、ＨＰＣ又はＰＶＡコーティング）及び／又は入口ポート、出口ポート、又は、流体チャネル壁の疎水性／親水性特性を変えるために使用される表面コーティング（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コーティング）を備えてもよい。
【００５７】
開示されるデバイスの入口ポート及び／又は出口ポートは、様々な形状及びサイズで製造され得る。適切な入口ポート及び／又は出口ポートの幾何学的形態としては、球形、円筒形、楕円形、立方体、円錐形、半球形、長方形、又は、多面体（幾つかの平面から構成される３次元の幾何学的形態、例えば、直方体、六角柱、八角柱、逆三角錐、逆四角錐、逆五角錐、逆六角錐、又は、逆角錐台）、又は、これらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
入口ポート及び／又は出口ポートの寸法は、平均の直径及び深さに関して特徴付けられてもよい。本明細書中で使用される入口ポート又は出口ポートの平均直径は、入口ポート及び／又は出口ポートの幾何学的形態の平断面内で内接され得る最大の円を指す。本開示の幾つかの実施形態において、入口ポート及び／又は出口ポートの平均直径は、約０．１ｍｍ〜約１０ｍｍの範囲であってもよい。幾つかの実施形態において、入口ポート及び／又は出口ポートの平均直径は、少なくとも０．５ｍｍ、少なくとも１ｍｍ、少なくとも２ｍｍ、少なくとも４ｍｍ、少なくとも８ｍｍ、又は、少なくとも１０ｍｍであってよい。幾つかの実施形態において、平均直径は、最大１０ｍｍ、最大８ｍｍ、最大６ｍｍ、最大４ｍｍ、最大２ｍｍ、最大１ｍｍ、又は、最大０．５ｍｍであってよい。この段落に記載される下限値及び上限値のいずれかを組み合わせて、本開示に含まれる範囲を成してもよく、例えば、幾つかの実施形態では、平均直径が約２ｍｍ〜約８ｍｍの範囲であってもよい。当業者であれば認識できるように、入口ポート及び／又は出口ポートの平均直径がこの範囲内の任意の値、例えば、約５．５ｍｍを有する。
【００５９】
幾つかの実施形態では、入口ポート及び／又は出口ポート（例えば、サンプル又は試薬ウェル）の深さが約５μｍ〜約５００μｍの範囲であってもよい。幾つかの実施形態において、深さは、少なくとも５μｍ、少なくとも１０μｍ、少なくとも２５μｍ、少なくとも５０μｍ、少なくとも７５μｍ、少なくとも１００μｍ、少なくとも２００μｍ、少なくとも３００μｍ、少なくとも４００μｍ、又は、少なくとも５００μｍであってもよい。幾つかの実施形態において、深さは、最大５００μｍ、最大４００μｍ、最大３００μｍ、最大２００μｍ、最大１００μｍ、最大５０μｍ、最大２５μｍ、最大１０μｍ、又は、最大５μｍであってもよい。この段落に記載される下限値及び上限値のいずれかを組み合わせて、本開示に含まれる範囲を成してもよく、例えば、幾つかの実施形態では、入口及び／又は出口ポートの深さが約５０μｍ〜約２００μｍの範囲であってもよい。当業者であれば認識できるように、深さがこの範囲内の任意の値、例えば、約１３０μｍを有してもよい。幾つかの実施形態では、入口ポート及び／又は出口ポート（例えば、サンプル又は試薬ウェル）の深さが約５００μｍ〜約５０ｍｍの範囲であってもよい。幾つかの実施形態において、深さは、少なくとも１ｍｍ、少なくとも５ｍｍ、少なくとも１０ｍｍ、少なくとも１５ｍｍ、少なくとも２０ｍｍ、又は、少なくとも５０ｍｍであってもよい。幾つかの実施形態において、深さは、最大で５０ｍｍ、最大で２０ｍｍ、最大で１５ｍｍ、最大で１０ｍｍ、最大で５ｍｍ、又は、最大で１ｍｍであってもよい。この段落に記載される下限値及び上限値のいずれかを組み合わせて、本開示に含まれる範囲を成してもよく、例えば、幾つかの実施形態では、入口ポート及び／又は出口ポートの深さが約５０μｍ〜約５ｍｍの範囲であってもよい。
【００６０】
幾つかの実施形態において、開示されるデバイスの流体チャネルは、正方形、長方形、円形などの様々な断面形状のいずれかを有してもよい。一般に、流体チャネルの断面形状は、それらを形成するために使用される製造技術に依存し、逆もまた同様である。幾つかの実施形態では、流体チャネルの断面寸法（例えば、非長方形断面の流体チャネルに関する高さ、幅、又は、平均直径であり、ここで、平均直径は、流体チャネルの断面形状内で内接され得る最大円の直径として定義される）が約５μｍ〜約５００μｍの範囲であってもよい。幾つかの実施形態において、流体チャネルの寸法は、少なくとも５μｍ、少なくとも１０μｍ、少なくとも２５μｍ、少なくとも５０μｍ、少なくとも７５μｍ、少なくとも１００μｍ、少なくとも２００μｍ、少なくとも３００μｍ、少なくとも４００μｍ、少なくとも５００μｍ、又は、少なくとも１０００μｍであってもよい。幾つかの実施形態において、流体チャネルの寸法は、最大で１０００μｍ、最大で５００μｍ、最大で４００μｍ、最大で３００μｍ、最大で２００μｍ、最大で１００μｍ、最大で５０μｍ、最大で２５μｍ、最大で１０μｍ、又は、最大で５μｍであってもよい。この段落に記載される下限値及び上限値のいずれかを組み合わせて、本開示に含まれる範囲を成してもよく、例えば、幾つかの実施形態では、流体チャネルの寸法が約７５μｍ〜約３００μｍの範囲であってもよい。当業者であれば認識できるように、寸法がこの範囲内の任意の値、例えば、約９５μｍを有してもよい。幾つかの実施形態では、流体チャネルの深さがデバイスの入口ポート及び／又は出口ポートの深さに等しくてもよい。
【００６１】
撮像技術：開示される方法及びデバイスの幾つかの実施形態において、検体分離ステップ及び／又は動員ステップの撮像は、紫外（ＵＶ）光吸収、可視光吸収、蛍光、フーリエ変換赤外分光法、フーリエ変換近赤外分光法、ラマン分光法、光学分光法などの光学検出技術を使用して実行されてもよい。幾つかの実施形態では、分離（又は濃縮）チャネルの全部又は一部、分離チャネルの端部とダウンストリーム分析機器又はエレクトロスプレーオリフィス又はチップ、エレクトロスプレーオリフィス又はチップ自体を接続する接合部又は接続チャネル、或いは、これらの任意の組み合わせが撮像されてもよい。幾つかの実施形態では、分離（又は濃縮）チャネルがキャピラリーのルーメンであってもよい。幾つかの実施形態では、分離（又は濃縮）チャネルがマイクロ流体デバイス内の流体チャネルであってもよい。
【００６２】
分離された検体バンドの検出のために使用される（１又は複数の）波長範囲は、一般に、撮像技術の選択と、デバイス又はその一部を製造するための材料とに依存する。例えば、ＵＶ光吸光度が分離チャネルの全部又は一部或いはマイクロ流体デバイスの他の部分を撮像するために使用される場合には、約２２０ｎｍ（ペプチド結合の本来の吸収度に起因する）及び／又は約２８０ｎｍ（芳香族アミノ酸残留物の本来の吸光度に起因する）での検出により、デバイスの少なくとも一部、例えば分離チャネルがこれらの波長の光を透過するならば、分離中及び／又は動員中にタンパク質バンドを視覚化できる。幾つかの実施形態において、ＥＳＩ−ＭＳを介して分離及び特徴付けられるべき検体は、分離前に、例えば、蛍光プローブ、化学発光タグ、又は、他の適切な標識で標識化されてもよく、それにより、蛍光撮像又は他の適した撮像技術を使用して検体を撮像できる。幾つかの実施形態では、例えば、検体が商業的製造プロセスによって生成されるタンパク質を含む実施形態では、タンパク質が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ドメイン又はその変異体を組み込むように遺伝子操作されてもよく、それにより、蛍光を使用してタンパク質を撮像できる。幾つかの実施形態では、タンパク質がタグ付け又は標識化されてもよい。標識化されたタンパク質は、選択された分離技術が基づいている検体特性を標識が妨げない又は混乱させないように構成されてもよい。
【００６３】
開示される方法、デバイス、及び、システムを実装する目的で、様々な撮像システム構成要素のいずれかが利用されてもよい。例としては、１つ以上の光源（例えば、発光ダイオード（ＬＥＤ）、ダイオードレーザ、ファイバレーザ、ガスレーザ、ハロゲンランプ、アークランプなど）、集光レンズ、対物レンズ、ミラー、フィルタ、ビームスプリッタ、プリズム、画像センサ（例えば、ＣＣＤ画像センサ又はカメラ、ＣＭＯＳ画像センサ又はカメラ、ダイオードアレイ、熱画像センサ、ＦＴＩＲなど）、又は、これらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。利用される撮像モードに応じて、光源及び画像センサは、例えば、吸光度に基づく画像を取得できるように、マイクロ流体デバイスの両側に位置付けられてもよい。幾つかの実施形態において、光源及び画像センサは、例えば、落射蛍光画像を取得できるように、マイクロ流体デバイスの同じ側に位置付けられてもよい。
【００６４】
画像は、分離中、動員中、及び／又は、エレクトロスプレーのステップ中に連続的に取得されてもよく、又は、ランダムに又は特定の時間間隔で取得されてもよい。幾つかの実施形態では、一連の１つ以上の画像が、連続的に、ランダムな時間間隔で、又は、特定の時間間隔で取得される。幾つかの実施形態では、一連の１つ以上の画像がビデオ画像を含んでもよい。
【００６５】
エレクトロスプレー前のタンパク質等電点の決定のためのｐＩマーカーの撮像：幾つかの実施形態では、前述したように、ＣＩＥＦに晒されてしまった分離された検体混合物を含む分離チャネルの画像中の２つ以上のｐＩマーカーの位置を使用して、１つ以上の個々の検体ピーク（タンパク質検体ピークなど）の等電点を決定してもよい。幾つかの実施形態において、１つ以上の検体ピークに関する等電点は、局所的なｐＨと分離チャネルに沿う位置との間の想定された線形関係に基づいて２つ以上のｐＩマーカーの位置から計算される。幾つかの実施形態において、１つ以上の検体ピークに関する等電点は、局所的なｐＨと分離チャネルに沿う位置との間の関係を表す非線形フィッティング関数（例えば、非線形多項式）に基づいて３つ以上のｐＩマーカーの位置から計算される。幾つかの実施形態において、１つ以上の検体に関する等電点は、分離チャネルの画像から決定される２、３、４、５、６、７、８、９、又は、１０以上のｐＩ標準の位置に基づいて計算される。
【００６６】
幾つかの実施形態において、２つ以上のｐＩマーカーの位置を決定するために使用される画像は、検体混合物が分離されているときに取得され、また、各検体バンドのｐＩの計算は、分離が続くにつれて繰り返し更新される。幾つかの実施形態において、２つ以上のｐＩマーカーの位置を決定するために使用される画像は、分離が完了した後、動員ステップの開始前に取得される。幾つかの実施形態において、２つ以上のｐＩマーカーの位置を決定するために使用される画像は、分離された混合物が動員されてエレクトロスプレーチップ又はオリフィスを通じて排出されるときに取得される。幾つかの実施形態において、２つ以上のｐＩマーカーの位置を決定するために使用される画像は、分離された混合物が動員されて分離チャネルをダウンストリーム分析機器に接続する流体チャネルを通じて排出されるときに取得される。
【００６７】
幾つかの実施形態において、２つ以上のｐＩマーカーの位置及び分離された混合物中の（１又は複数の）検体バンドの位置を決定するために使用される画像は、コンピュータ実装方法（例えば、ソフトウェアパッケージ）を使用して取得される。幾つかの実施形態において、２つ以上のｐＩマーカー並びに（１又は複数の）検体バンドの位置は、自動化された画像処理を含むコンピュータ実装方法を使用して決定される。幾つかの実施形態において、コンピュータ実装方法は、自動化された画像処理から得られる位置データに基づいて１つ以上の検体バンドの等電点の計算を実行することを更に含む。
【００６８】
図２は、分離チャネル（又はマイクロ流体デバイスの他の部分）の（１又は複数の）画像を取得し、（１又は複数の）画像中のｐＩマーカー及び検体バンドの位置を決定する（すなわち、分離ステップがＣＩＥＦを含む場合）とともに、検体の分離された混合物中の１つ以上の検体バンドに関するｐＩを計算するコンピュータ実装方法のためのプロセスフローチャートの一例を与える。幾つかの実施形態において、コンピュータ実装方法は、一連の１つ以上の画像の取得を制御することを含んでもよく、これらの画像は、その後、ｐＩマーカー及び分離された検体バンドの位置を特定するために処理される。適切な自動画像処理アルゴリズムの例については以下でより詳しく説明する。幾つかの実施形態において、ｐＩマーカーの予測位置、例えば、ｐＩマーカーのみを含む「対照」サンプルの画像から決定されるｐＩマーカーの位置に関する所定の知識を使用して、ｐＩマーカーに対応するバンドと分離された検体に対応するバンドとの間を区別してもよい。幾つかの実施形態において、ｐＩマーカーの画像は、分離された検体バンドの画像を取得するために使用されるものとは異なる波長で又は異なる撮像モードを使用して取得されてもよい。図２に示されるように、画像処理ステップが既知の数のｐＩマーカーに関する及び／又は分離された検体バンドに関する位置を決定できない場合、システムは、画像処理ステップを繰り返すことができるように（１又は複数の）新たな画像を取得するように指示されてもよい。ｐＩマーカー及び分離された検体バンドの位置が決定された時点で、ｐＩマーカーの位置に関するデータが、ｐＨ勾配に関してユーザが選択したモデル（例えば、線形又は非線形のモデル）に対して適合され、その後、局所的なｐＨと分離チャネルに沿う位置との間の結果として得られる適合関係を使用して、１つ以上の検体バンドに関する等電点が計算される。
【００６９】
幾つかの実施形態において、コンピュータ実装方法は、ｐＩマーカー及び検体バンドの位置を検出するステップ、ｐＨ勾配モデルに対して位置データを適合させるステップ、及び、１つ以上の検体バンドに関して等電点を計算するステップが繰り返されることにより等電点が連続的に更新されて精緻化される（例えば、幾つかの決定の平均化によって）反復プロセスであってもよい。幾つかの実施形態では、画像を取得して処理するステップ、ｐＩマーカー及び検体バンドの位置を検出するステップ、ｐＨ勾配モデルに対してｐＩマーカー位置データを適合させるステップ、及び、１つ以上の検体バンドに関する等電点を計算するステップを含むサイクルが、等電点の計算を少なくとも０．０１Ｈｚ、０．１Ｈｚ、０．２Ｈｚ、０．３Ｈｚ、０．４Ｈｚ、０．５Ｈｚ、０．６Ｈｚ、０．７Ｈｚ、０．８Ｈｚ、０．９Ｈｚ、１Ｈｚ、１０Ｈｚ、１００Ｈｚ、又は、１，０００Ｈｚの速度又は任意の他の関連する速度で、例えば、少なくともナイキストレートの速度で更新して精緻化できる十分短い時間で完了されてもよい。
【００７０】
速度を決定するための検体バンドの撮像：幾つかの実施形態において、前述したように、１つ以上の検体バンドの位置は、１つ以上の検体バンドに関する速度を２つ以上の画像中の検体バンドの相対位置の差と２つ以上の画像に関する取得時間同士の間の既知の時間間隔とから計算できるように、分離チャネル（又はマイクロ流体デバイスの他の部分）の一連の２つ以上の画像から決定されてもよい。幾つかの実施形態では、分離ステップが実行されている間に、分離チャネルの少なくとも一部の２つ以上の画像を取得されてもよい。幾つかの実施形態では、２つ以上の画像が動員ステップ中に取得されてもよい。幾つかの実施形態において、２つ以上の画像は、分離チャネルの端部をダウンストリーム分析機器に接続する流体チャネルを通じて分離されたサンプルが排出されている間に取得されてもよい。幾つかの実施形態において、２つ以上の画像は、テイラーコーンを形成するべく分離されたサンプルがエレクトロスプレーチップ又はオリフィスを通じて排出されている間に取得されてもよい。幾つかの実施形態では、所定の検体バンドが分離チャネルから流出する時間を計算するために、１つ以上の検体バンドに関して決定される速度が使用されてもよい。幾つかの実施形態では、例えば、分離チャネルの端部を出口ポート、例えば、エレクトロスプレーオリフィス又はチップと接続する１つ以上の相互接続する流体接合部又は流体チャネルが存在するときに、１つ以上の検体バンドに関して決定される速度を使用して、所定の検体バンドが出口ポートに到達してデバイスから流出する時間を計算してもよい。幾つかの実施形態では、１つ以上の検体バンドに関して決定される速度を使用して、所定の検体バンドがエレクトロスプレーチップ又はエレクトロスプレーオリフィスから流出してエレクトロスプレーチップ又はオリフィスと質量分析計の入口との間に形成されるテイラーコーンに入る時間を計算してもよい。
【００７１】
幾つかの実施形態において、１つ以上の検体バンドに関する速度を決定するために使用される画像のシーケンスは、コンピュータ実装方法（例えば、ソフトウェアパッケージ）を使用して取得されてもよい。幾つかの実施形態において、１つ以上の検体バンドの速度は、自動画像処理を含むコンピュータ実装方法を使用して決定される。幾つかの実施形態において、コンピュータ実装方法は、所定の検体バンドが分離チャネルから流出する時間の計算を実行することを更に含む。幾つかの実施形態において、コンピュータ実装方法は、所定の検体バンドが出口ポートに到達してデバイスから流出する時間の計算を実行することを更に含む。幾つかの実施形態において、コンピュータ実装方法は、所定の検体バンドがエレクトロスプレーチップ又はエレクトロスプレーオリフィスから流出してエレクトロスプレーチップ又はオリフィスと質量分析計の入口との間に形成されるテイラーコーンに入る時間の計算を実行することを更に含む。幾つかの実施形態において、１つ以上の検体バンドに関して決定される（１又は複数の）流出時間は、特定の検体バンドを質量分析データ又は他の分析機器を使用して収集されるデータと相関させるために使用される。
【００７２】
図３は、分離チャネル（又はマイクロ流体デバイスの他の部分）の（１又は複数の）画像を取得し、１つ以上の検体バンドの速度を決定するとともに、所定の検体バンドがデバイス内の特定のポイント、例えば、分離チャネルの端部、分離チャネルと二次流体チャネルとの間の接合点、デバイスの出口ポート、又は、エレクトロスプレーチップ又はオリフィスの出口に達する時間を計算するためのコンピュータ実装方法に関するプロセスフローチャートの他の例を与える。幾つかの実施形態において、コンピュータ実装方法は、一連の１つ以上の画像の取得を制御することを含んでもよく、これらの画像は、その後、分離された検体バンドの位置を特定するために処理される。適切な自動画像処理アルゴリズムの例については以下でより詳しく説明する。図３に示されるように、画像処理ステップが分離された検体バンドに関する位置を決定できない場合、システムは、画像処理ステップを繰り返すことができるように（１又は複数の）新たな画像を取得するように指示されてもよい。分離された検体バンドの位置が一連の２つ以上の画像に関して決定された時点で、２つ以上の画像中の検体バンドの相対位置と２つ以上の画像の取得時間同士の間の既知の（１又は複数の）時間間隔とに基づいて検体ピークのうちの１つ以上に関して速度が計算される。幾つかの実施形態では、一連の画像における１つの画像から次の画像までの１つ以上の検体バンドの追跡を使用して、幾つかの分離された検体バンド間を区別するとともに、速度計算を精緻化してもよい（例えば、一連の画像における画像の幾つかの対から計算される速度値を平均化することによって）。幾つかの実施形態では、選択された撮像モードを使用して検出され得るｐＩマーカー又は他の内部標準が「速度標準」として使用されてもよい。このようにして決定される検体バンド速度を使用して、所定のバンドがデバイス内のユーザ指定ポイント、例えば、分離チャネルの出口端部、デバイス内の特定の流体接合部、デバイスの出口ポート、検体がテイラーコーンに入るエレクトロスプレーイオン化チップ又はオリフィスなどに到達する時間を計算してもよい。
【００７３】
幾つかの実施形態において、コンピュータ実装方法は、検体バンド位置を検出するステップ、検体バンド速度を決定するステップ、及び、流出時間を計算するステップが繰り返されることにより流出時間予測が連続的に更新されて化学分離データと質量分析データ（又は他のタイプのダウンストリーム分析データ）との相関が更に改善される反復プロセスであってもよい。幾つかの実施形態において、画像取得及び処理ステップ、速度計算ステップ、及び、（１又は複数の）流出時間予測ステップを含むサイクルは、（１又は複数の）流出時間予測が少なくとも０．０１Ｈｚ、０．１Ｈｚ、０．２Ｈｚ、０．３Ｈｚ、０．４Ｈｚ、０．５Ｈｚ、０．６Ｈｚ、０．７Ｈｚ、０．８Ｈｚ、０．９Ｈｚ、１Ｈｚ、１０Ｈｚ、１００Ｈｚ、又は、１，０００Ｈｚの速度で、又は任意の他の関連する速度で、例えば少なくともナイキストレートの速度で更新され得る十分短い時間で完了されてもよい。
【００７４】
分離データと質量分析データとの相関：幾つかの実施形態では、等電点電気泳動される検体バンドに関する正確な等電点の撮像に基づく決定を実行するための前述のコンピュータ実装方法により、等電点データを質量分析データ（又は他の分析データ）における特定のｍ／ｚピークと相関させることができ、それにより、データセットの情報内容が改善される（実験の単一実行の場合でも）とともに、検体サンプルのより定量的な特性評価が可能になる。
【００７５】
幾つかの実施形態では、画像から得られるデータを使用して分離された検体バンドに関して速度を計算して流出時間を予測するための前述したコンピュータ実装方法（様々な異なる分離技術のいずれかを使用する）により、化学分離データ（例えば、保持時間、電気泳動移動度、等電点など）と質量分析データ（又は他の分析データ）における特定のｍ／ｚピークとの間の時間相関を改善することができ、それにより、データセットの情報内容が改善される（実験の単一実行の場合でも）とともに、分離時間の実験ごと又は機器ごとの変動を補正できるため、異なるサンプル実行、異なるサンプルに関して収集されたデバイスと異なる機器で収集されたデータとのより定量的な比較が可能となる。したがって、開示される方法、デバイス、及び、システムは、様々なメタボロミクス、プロテオミクス、及び、薬物開発又は製造用途にとって特に有利となり得る。
【００７６】
幾つかの実施形態（例えば、ＣＩＥＦステップを含む実施形態）において、本開示のコンピュータ実装方法は、正確な等電点の撮像に基づく決定、及び、分離された検体バンドの速度の撮像に基づく決定の両方を実行してもよい。
【００７７】
質量分析及びエレクトロスプレーイオン化：幾つかの実施形態において、本開示の方法、デバイス、及び、システムは、分離された検体混合物のエレクトロスプレーイオン化及びその質量分析計への注入を実行するように構成されてもよい。質量分析（ＭＳ）は、サンプル中の検体分子をイオン化してそれらの質量−電荷（ｍ／ｚ）比に基づいて得られたイオンを選別することによって検体分子の「質量」を測定する分析技術である。先行の液相又は気相サンプル分離システムと組み合わせて、質量分析は、例えば生物学的サンプルにおいて、一般的であるように、複数の少量の検体を含む複合サンプルを分析するために利用できる最も効果的な手段のうちの１つを与える。
【００７８】
全ての質量分析計は、質量分析器への導入前にイオンが気相にあるという要件を共有する。マトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）及びエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を含むがこれらに限定されない様々なサンプルイオン化モードが開発されてきた。ＭＡＬＤＩ技術において、サンプル（例えば、タンパク質の混合物を含む生物学的サンプル）は、シナピン酸又はα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸などのエネルギー吸収マトリックス（ＥＡＭ）と混合されて、金属プレート上で結晶化される。表面増強レーザ脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）は、特定のクラスのタンパク質の特異的結合を促進するために金属プレート上に更なる界面化学を組み込む技術の一般的な変形である。プレートが真空チャンバ内へ挿入され、また、マトリックス結晶には窒素レーザから光パルスが当て付けられる。マトリックス分子によって吸収されるエネルギーがタンパク質に伝達され、それにより、タンパク質が、脱離、イオン化し、気相でイオンのプルームを生成し、これらのイオンは、電界の存在下で加速されて、フライトチューブに引き込まれ、該フライトチューブで、これらのイオンは、飛行時間を記録する検出器にイオンが衝突するまで漂流する。引き続き、飛行時間を使用して、イオン化された種のｍ／ｚ比を計算してもよい。開示されるデバイスの幾つかの実施形態において、デバイスの出口ポートは、例えば、特定の検体バンドのための等電点をＭＡＬＤＩ質量分析計データと相関させるために、質量分光分析に備えて分離された検体バンド（又はその一部）をＭＡＬＤＩプレート上に堆積するために使用されるキャピラリー又は他の機能部を備えてもよい。
【００７９】
エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ；本明細書中では単に「エレクトロスプレー」とも称される）は、液体クロマトグラフィ又は動電クロマトグラフィ分離技術を質量分析計とインタフェースするためのその固有の互換性に起因して幅広く使用される他の技術である。前述したように、エレクトロスプレーイオン化では、サンプル及び溶液の小さな液滴が、チップ又はオリフィスと質量分析計のソースプレートとの間の電界の印加により、エレクトロスプレー機能（例えば、エミッタチップ又はオリフィス）を備えるキャピラリー又はマイクロ流体デバイスの先端部から放出される。その後、液滴は、この誘導電界内で伸長及び膨張し、蒸発して更なる分離及び検出のために質量分析計に導入される気相イオンを生成する益々小さい液滴を含む円錐形状の放出（すなわち、「テイラーコーン」）を形成する。ＥＳＩにとって都合の良い液滴量を与えるマイクロ流体チップ形態に組み込まれたキャピラリー又はコーナー又はＥＳＩチップからエミッタチップが形成されてもよい。ラッピングホイール、ヤスリ、機械加工工具、ＣＮＣ機械加工工具、ウォータージェット切断、或いは、小さい表面量等を与えるようにＥＳＩチップを形成するための他の工具又はプロセスなどを使用して、エミッタチップが小さい表面及び滴量をもたらすべく鋭利にされてもよい。幾つかの実施形態において、チップは、チップのチップ部を加熱して伸長することによって引き出されてもよい。幾つかの実施形態では、その後、チップが所望の長さ又は直径まで切断されてもよい。幾つかの実施形態において、エレクトロスプレーチップは、チップ上に形成される液滴のサイズを最小にし得る疎水性コーティングでコーティングされてもよい。幾つかの実施形態において、システムは、検体がデバイスから溶出されていないときに、分離ステップ中に動員材、陰極液、又は、任意の他の液体をエレクトロスプレーしてもよい。
【００８０】
開示される方法、デバイス、及び、システムの幾つかの実施形態では、誘導結合レーザイオン化、高速原子衝撃、ソフトレーザ脱離、大気圧化学イオン化、二次イオン質量分析、スパークイオン化、熱イオン化、及び、同様のものなどの他のイオン化方法が使用される。
【００８１】
エレクトロスプレーイオン化に関して、幾つかの実施形態では、開示されるマイクロ流体デバイスは、図１に示されるように、効率的なエレクトロスプレーイオン化及びダウンストリーム質量分析との都合の良いインタフェースを促進させるようになっている機能を備える。マイクロ流体デバイスから排出されて（例えば生物学的又はバイオシミラー）質量分析計に導入される検体に関する質量−電荷比（又は「質量」）は、様々な異なる質量分析計形態のいずれかを使用して測定され得る。例としては、飛行時間〜質量分析、四重極質量分析、イオントラップ又はオービトラップ質量分析、飛行距離型質量分析、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴、共鳴質量測定、及び、ナノメカニカル質量分析が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８２】
幾つかの実施形態において、マイクロ流体デバイスのエレクトロスプレー機能部は、分離チャネルと一直線になっていてもよい。幾つかの実施形態において、マイクロ流体デバイスのエレクトロスプレー機能部は、分離チャネルに対して直角又は中間角度に向けられてもよい。開示される方法の幾つかの実施形態では、キャピラリー又はマイクロ流体デバイスで実行される最終分離又は濃縮ステップからの分離及び／又は濃縮された検体画分の実質的に全てが、連続した流れでエレクトロスプレーチップ又はエレクトロスプレー機能部から排出される。幾つかの実施形態において、検体混合物の一部（例えば、対象の画分）は、質量分析計又はサンプルの少なくとも一部を分画する及び／又は濃縮するように構成される別のデバイスなどの分析機器とインタフェースするように構成される出口を介してマイクロ流体デバイスから排出されてもよい。検体混合物の他の部分（例えば、対象の画分以外の画分を含む）を廃棄物チャネルにより排出できる。
【００８３】
幾つかの実施形態において、キャピラリー又はマイクロ流体デバイスからの排出は、圧力、電気力、イオン化、又は、これらの任意の組み合わせを使用して実行される。幾つかの実施形態では、排出が前述のような動員ステップと一致する。幾つかの実施形態において、エレクトロスプレーイオン化のために使用されるシース液は、電気泳動分離のための電解質として使用される。幾つかの実施形態において、噴霧ガスは、検体画分を微細なスプレーにまで減らすように供給される。
【００８４】
エレクトロスプレーイオン化性能の撮像に基づくフィードバック：キャピラリー又はマイクロ流体デバイスを使用する従来のＥＳＩ−ＭＳシステムは、一般に、動作中にテイラーコーンを再確立するべくシステムを較正するためのツールを備えない。安定したテイラーコーンの維持は、マイクロ流体デバイス内又はキャピラリー内の分離チャネルの全体にわたって印加される電気泳動電界によって複雑化され得る。実行間又は実行中の試薬の導電率の変化は、質量分析計とのインタフェースにおける電位を変化させる可能性がある。インタフェースでの電位の変化は、テイラーコーンに悪影響を及ぼす場合があり、エレクトロスプレーイオン化効率の損失をもたらし得る。本明細書中に開示されるのは、エレクトロスプレーイオン化性能を向上させるための方法及びシステムであり、したがって、キャピラリーに基づく又はマイクロ流体デバイスに基づくＥＳＩ−ＭＳシステムに関して収集される質量分析データの品質である。幾つかの実施形態では、例えば、テイラーコーンの形状、密度、又は、他の特性が特定の範囲内に維持されるように１つ以上の動作パラメータのフィードバック制御を行うべく、エレクトロスプレーイオン化セットアップにおけるテイラーコーンの撮像がコンピュータ実装方法で使用されてもよい。幾つかの実施形態において、そのようなフィードバックプロセスによって制御され得る動作パラメータとしては、エレクトロスプレーチップ又はオリフィスと質量分析計の入口との位置合わせ、エレクトロスプレーチップと質量分析計の入口との間の距離（例えば、プログラム可能な精密Ｘ−Ｙ−Ｚ変換ステージ上に一体型エレクトロスプレー機能部を備えるキャピラリーチップ又はマイクロ流体デバイス装着することによって）、エレクトロスプレーチップを通じた検体サンプルの流量（例えば、検体サンプルの排出をもたらすために使用される圧力、電界強度、又は、これらの組み合わせを調整することによって）、例えばチャネルの基端部、例えば、エレクトロスプレーチップ又はオリフィスと質量分析計の入口との間で印加される電圧、排出される検体サンプルの周囲のシース液体又はシースガスの体積流量、又は、これらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８５】
図４は、（ｉ）テイラーコーンの画像を取得する（様々な画像センサ、例えば、ＣＣＤ画像センサ又はＣＭＯＳ画像センサのいずれかを使用する）、（ｉｉ）画像を処理してテイラーコーンの形状、密度、又は、他の特性を決定する、（ｉｉｉ）テイラーコーンの形状、密度、又は、他の特性を指定値又は目標値のセットと比較する、及び、（ｉｖ）前記比較に基づき、テイラーコーンの形状、密度、又は、他の特性を１つ以上の動作パラメータに関連付ける数学アルゴリズムを使用して、１つ以上の動作パラメータに適した調整を決定し、テイラーコーンを指定値又は目標値に回復させるために使用されるコンピュータ実装方法のためのプロセスフローチャートの一例を与える。幾つかの実施形態では、テイラーコーンの画像から得られるデータに加えて、質量分析計から取得されるデータ（例えば、総イオン電流データ）を使用して、システム性能を監視するとともに、１つ以上の動作パラメータに対して調整を行ってもよい。
【００８６】
幾つかの実施形態において、画像を取得して処理するステップ、テイラーコーン特性を特定するステップ、前記テイラーコーン特性と目標値のセットとを比較するステップ、及び、１つ以上のＥＳＩ−ＭＳシステムの動作パラメータに必要な調整を計算するステップを含む図４に示される周期的プロセスは、１つ以上の動作パラメータを少なくとも０．０１Ｈｚ、０．１Ｈｚ、０．２Ｈｚ、０．３Ｈｚ、０．４Ｈｚ、０．５Ｈｚ、０．６Ｈｚ、０．７Ｈｚ、０．８Ｈｚ、０．９Ｈｚ、１Ｈｚ、１０Ｈｚ、１００Ｈｚ、又は、１，０００Ｈｚの速度で、又は、任意の他の関連する速度で、例えば少なくともナイキストレートの速度で更新できるのに十分短い時間で完了されてもよい。
【００８７】
交互に行う高質量／低質量走査：開示される方法、デバイス、及び、システムの幾つかの実施形態において、質量分析計は、高質量走査範囲（例えば、約１５００〜６０００のｍ／ｚ範囲）又は「高質量走査」と低質量走査範囲（例えば、約１５０〜１５００のｍ／ｚ範囲）又は「低質量走査」の間で交互に行うように設定されてもよく、これにより、低質量走査を使用して低質量マーカー、例えば、等電点電気泳動分離ステップが実行された場合には遊離溶液両性電解質を特定することができ、低質量マーカーは、質量分析データで特定され得るとともに、低質量マーカーによって示される特性（例えば、遊離溶液両性電解質が検出される場合の等電点の特定の範囲、ペプチド、小分子マーカー）に関してそれを較正するために使用され得る。高質量走査と低質量走査との間の切り換え及び走査速度は、エレクトロスプレーインタフェースからの検体サンプルの流出に比べて高速でなければならない。場合によっては、高質量走査と低質量走査との間の切り換え速度が約０．５Ｈｚ〜約５０Ｈｚの範囲であってもよい。場合によっては、切り換え速度は、少なくとも０．５Ｈｚ、少なくとも１Ｈｚ、少なくとも５Ｈｚ、少なくとも１０Ｈｚ、少なくとも２０Ｈｚ、少なくとも３０Ｈｚ、少なくとも４０Ｈｚ、又は、少なくとも５０Ｈｚであってもよい。
【００８８】
ＥＳＩチップ電圧を一定に保つための高分離／動員動電圧及び低分離／動員動電圧の変更：幾つかの実施形態において、質量分析計のＥＳＩイオン源は、質量分析計に関して負電圧を設定できる調整可能な電源を有する。幾つかの実施形態において、質量分析計のＥＳＩイオン源は、質量分析計に関して正電圧を設定できる調整可能な電源を有する。幾つかの実施形態では、質量分析計のＥＳＩイオン源がグランドに保持される。幾つかの実施形態において、キャピラリー又はマイクロ流体デバイスにおけるＥＳＩチップは、ＥＳＩチップと質量分析計の帯電したＥＳＩイオン源との間に電界を生成するためにグランド又はその付近に保持される。幾つかの実施形態において、キャピラリー又はマイクロ流体デバイスにおけるＥＳＩチップは、正又は負の電圧に保持されて、ＥＳＩチップと質量分析計の接地されたＥＳＩイオン源との間に電界を生成する。
【００８９】
図１５は、動員中にＥＳＩチップ電圧を０Ｖに維持しつつアノードとカソードとの間で３０００Ｖの一定の電圧降下を維持するためのコンピュータ制御フィードバックループの典型的なフローチャートを与える。幾つかの実施形態において、このフィードバックループは、質量分析計のＥＳＩイオン源がグランドに対して正電圧又は負の電圧（例えば、−３５００Ｖ）に設定されるときに実施されてもよい。この例では、図７Ａにおいて最初に陽極液ポート１１０を＋３０００Ｖに設定するとともに動員材ポート１０４を０Ｖに設定することによって陽極液ポート１１０と動員材ポート１０４との間のΔＶが３０００Ｖに維持される。幾つかの実施形態において、異なるΔＶは、陽極液ポート１１０を異なる値に設定することによって設定されてもよい。幾つかの実施形態では、陽極動員が使用されてもよく、また、ポート１１０が例えば−３０００Ｖに設定される陰極液ポートである。図１５に概説された例では、動員中に、分離チャネル１１２内の抵抗が、電荷を回復する分離において検体及び両性電解質に起因して低下している。これにより、チャネル１１２の全体にわたる電圧降下が低下し、その結果、式１にしたがって、ＥＳＩチップ１１６の電圧の増大がもたらされる。
【００９０】
Ｖ１１６＝（ΔＶ１１０−１０４）＊（Ｒ１０５）／（Ｒ１０９＋Ｒ１１２＋Ｒ１０５）
しかしながら、ＥＳＩチップ電圧１１６を測定又は計算することにより、陽極液ポート１１０及び動員材ポート１０４の電圧設定を調整できる。陽極液ポート１１０及び動員材ポート１０４の両方の設定からＥＳＩチップ電圧１１６を差し引くことにより、ΔＶ１１０−１０４が３０００Ｖのままであり、それにより、動員は影響されないが、式２にしたがってＥＳＩチップ１１６の電圧が０に設定される。
【００９１】
Ｖ１１６＝（ΔＶ１１０−１０４）＊（Ｒ１０５）／（Ｒ１０９＋Ｒ１１２＋Ｒ１０５）＋Ｖ１０４
このフィードバックループは、動員が完了するまで動作し続け、それにより、ＥＳＩチップ１１６の電圧が通常の周波数で、例えばナイキストレート又は約０．２Ｈｚで０に調整される。場合によっては、ＥＳＩチップ１１６の電圧は、少なくとも０．０１Ｈｚ、０．１Ｈｚ、０．２Ｈｚ、０．３Ｈｚ、０．４Ｈｚ、０．５Ｈｚ、０．６Ｈｚ、０．７Ｈｚ、０．８Ｈｚ、０．９Ｈｚ、１Ｈｚ、１０Ｈｚ、１００Ｈｚ、又は、１，０００Ｈｚの速度で０に調整されてもよい。ＥＳＩチップ１１６で一定の安定した電圧を維持することは、動員プロセス中に安定したエレクトロスプレーを維持するために重要となり得る。
【００９２】
場合によっては、フィードバックループは、ＥＳＩチップの電圧を予め設定された値の特定のパーセンテージ内に維持するように動作する。例えば、場合によっては、フィードバックループは、ＥＳＩチップの電圧を予め設定された値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、又は、０．１％内に維持するように動作する。場合によっては、フィードバックループは、ＥＳＩチップ電圧を１０００Ｖ、５００Ｖ、１００Ｖ、７５Ｖ、５０Ｖ、２５Ｖ、１０Ｖ、５Ｖ、又は、１Ｖの予め設定された値の範囲に維持するように動作する。
【００９３】
幾つかの実施形態では、質量分析計のＥＳＩイオン源がグランドに保持され、また、ＥＳＩチップ１１６と質量分析計との間に電界を生成するためにＥＳＩチップ１１６が一定の正電圧又は負電圧に保たれる必要がある。幾つかの実施形態において、ＥＳＩチップ電圧（例えば、予め設定された値）は、約＋５０００Ｖ、約＋４０００Ｖ、約＋３５００Ｖ、約＋３０００Ｖ、約＋２５００Ｖ、約＋２０００Ｖ、約＋１５００Ｖ、約＋１０００Ｖ、約＋５００Ｖ、又は、約−５０００Ｖ、約−４０００Ｖ、約−３５００Ｖ、約−３０００Ｖ、約−２５００Ｖ、約−２０００Ｖ、約−１５００Ｖ、約−１０００Ｖ、又は、約−５００Ｖであってもよい。図１２は、動員中にＥＳＩチップ電圧を３０００Ｖに維持しつつアノードとカソードとの間で３０００Ｖの一定の電圧降下を維持するためのコンピュータ制御フィードバックループのフローチャートの一例を与える。コンピュータ制御フィードバックループの動作は、陽極液ポート１１０及び動員材ポート１０４の電圧が＋３０００Ｖだけオフセットされ、それにより、ＥＳＩチップ１１６の電圧が＋３０００Ｖにオフセットされ、依然として式２にしたがうことを除き、図１５と同じである。幾つかの実施形態では、電界強度の制御をアナログ回路を使用して達成できる。幾つかの実施形態において、キャピラリーに基づく又はマイクロ流体デバイスに基づく分離システムと接触する１つ以上の電極における電圧の制御は、１つ、２つ、３つ、又は、４つ以上の独立した高電圧電源を使用することによって行われてもよい。場合によっては、キャピラリーに基づく又はマイクロ流体デバイスに基づく分離システムと接触する１つ以上の電極における電圧の制御は、例えば、単一の多重化された高電圧電源を使用することによって行われてもよい。
【００９４】
場合によっては、フィードバックループは、分離チャネル内の電界強度又はアノードとカソードとの間の電圧降下を予め設定された値の特定のパーセンテージ内に維持するように動作する。例えば、場合によっては、フィードバックループは、分離チャネル内の電界強度又はアノードとカソードとの間の電圧降下を予め設定された値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、又は、０．０１％内に維持するように動作する。場合によっては、フィードバックループは、分離チャネル内の電界強度又はアノードとカソードとの間の電圧降下を１０００Ｖ、５００Ｖ、１００Ｖ、７５Ｖ、５０Ｖ、２５Ｖ、１０Ｖ、５Ｖ、又は、１Ｖの予め設定された値の範囲内に維持するように動作する。
【００９５】
システムハードウェア：図５は、開示される方法、デバイス、及び、システムの１つの実施形態におけるシステムハードウェアブロック図の概略図を与える。図示のように、本開示のシステムは、以下のハードウェア構成要素、すなわち、（ｉ）化学分離システム（例えば、検体分離、例えば、等電点電気泳動に基づく分離を実行するように設計されるキャピラリー又はマイクロ流体デバイス、及び、１つ以上の高電圧電源）、（ｉｉ）場合によっては（破線により示されるように）分離システムと直接に一体化されてもよい質量分析計用のエレクトロスプレーインタフェース、（ｉｉｉ）質量分析計、（ｉｖ）撮像デバイス又はシステム、（ｖ）プロセッサ又はコンピュータ、及び、（ｖｉ）コンピュータメモリデバイス、又は、これらの任意の組み合わせのうちの１つ以上を備えてもよい。幾つかの実施形態において、システムは、１つ以上のキャピラリー又はマイクロ流体デバイスフローコントローラ（例えば、プログラム可能なシリンジポンプ、蠕動ポンプ、ＨＰＬＣポンプなど）、キャピラリー又はマイクロ流体デバイスの全部又は一部に関して特定の温度を維持するように構成される温度コントローラ、更なるフォトセンサ又は画像センサ（例えば、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、ＣＭＯＳ画像センサ及びカメラ、ＣＣＤ画像センサ及びカメラなど）、光源（例えば、発光ダイオード（ＬＥＤ）、ダイオードレーザ、ファイバレーザ、ガスレーザ、ハロゲンランプ、アークランプなど）、他のタイプのセンサ（例えば、温度センサ、流量センサ、ｐＨセンサ、導電率センサなど）、コンピュータメモリデバイス、コンピュータディスプレイデバイス（例えば、グラフィカルユーザインタフェースを備える）、デジタル通信デバイス（例えば、イントラネット、インターネット、ＷｉＦｉ、ブルートゥース（登録商標）、又は、他の有線又は無線通信ハードウェア）などを更に備えてもよい。
【００９６】
幾つかの実施形態において、システムは、機能的なハードウェアコンポーネントの選択が所定の形態でパッケージ化される一体型システムを備えてもよい。幾つかの実施形態において、システムは、新たな用途のためにシステムを再構成するべく機能的なハードウェアコンポーネントの選択が変更されてもよいモジュールシステムを備えてもよい。幾つかの実施形態において、これらの機能的システム構成要素の幾つか、例えば、キャピラリー又はマイクロ流体デバイスは、交換可能又は使い捨て可能な構成要素である。
【００９７】
前述したように、様々な異なる質量分析計のいずれかが、飛行時間型質量分析計、四重極質量分析計、イオントラップ又はオービトラップ質量分析計、飛行距離型分析計、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴分光計、共鳴質量測定分光計、及び、ナノメカニカル質量分析計を含むがこれらに限定されない開示されるシステムの異なる実施形態で利用されてもよい。
【００９８】
システム及びアプリケーションソフトウェア：図６に示されるように、本開示のシステムは、複数のソフトウェアモジュールを備えてもよい。例えば、システムは、システム制御ソフトウェアモジュール、データ取得ソフトウェアモジュール、データ処理ソフトウェアモジュール、又は、これらの任意の組み合わせを備えてもよい。一般に、これらのソフトウェアモジュールは、コンピュータプロセッサによってホストされるオペレーティングシステム内又は環境内で動作するように構成されるとともに、互いに及び／又はオペレーティングシステムと通信してデータを共有してもよい。
【００９９】
幾つかの実施形態において、システム制御ソフトウェアモジュールは、（ｉ）キャピラリー又はマイクロ流体デバイスに基づく検体分離システムの動作を撮像システムによる画像取得と協調させる、（ｉｉ）キャピラリー又は又はマイクロ流体デバイスに基づく検体分離システムの動作を質量分析計システムによるデータ取得と協調させる、（ｉｉｉ）撮像システムによる画像取得をキャピラリー又はマイクロ流体デバイスに基づく検体分離システム及び／又は質量分析計システムの動作と協調させる、（ｉｖ）分離チャネル及び／又はテイラーコーンの撮像から得られるデータに基づいてエレクトロスプレーイオン化セットアップ及び／又は質量分析計の１つ以上の動作パラメータのフィードバック制御を行う、（ｖ）高質量走査範囲と低質量走査範囲の間を交互態様に切り換えつつ質量分析計によるデータ取得を制御する、（ｖｉ）ＥＳＩチップの電圧を監視して分離回路の電圧を調整し、一定の分離電界強度（又はアノードとカソードとの間の電圧降下）とＥＳＩチップでの一定の電圧を維持する、又は、これらの任意の組み合わせのためのソフトウェアを備えてもよい。
【０１００】
幾つかの実施形態において、データ取得モジュールは、（ｉ）１つ以上の画像センサ又は撮像システムによる画像取得を制御し、前記画像データを記憶するとともに、システム制御及び／又はデータ処理ソフトウェアモジュールとのソフトウェアインタフェースを与える、（ｉｉ）１つ以上の質量分析計システムによるデータ取得を制御し、前記質量分析計データ（又は他のダウンストリーム分析機器）を記憶するとともに、システム制御及び／又はデータ処理ソフトウェアとのソフトウェアインタフェースを与える、又は、これらの任意の組み合わせのためのソフトウェアを備えてもよい。
【０１０１】
幾つかの実施形態において、データ処理モジュールは、（ｉ）分離が実行されている間、分離が完了した後、又は、分離チャネル出口又はエレクトロスプレーチップに向かうｐＩ標準及び検体ピークの動員後に、画像を処理して、分離チャネル内の１つ以上のｐＩ標準又は検体ピークの（１又は複数の）位置を決定する、（ｉｉ）画像を処理して、１つ以上のｐＩ標準又は検体ピークに関して速度、流出時間、及び／又は、エレクトロスプレー放出時間を決定する、（ｉｉｉ）分離チャネルの画像を処理して、検体ピークの位置及びテイラーコーンの画像を監視し、エレクトロスプレー性能を監視する、この場合、分離チャネル及びテイラーコーンの画像が同時に又は交互に取得される、（ｉｖ）テイラーコーンの画像を処理し、テイラーコーンの形状、密度、又は、他の特性を決定するとともに、質量分析計の入口に対するエレクトロスプレーチップ又はオリフィスの位置（すなわち、位置合わせ及び／又は分離距離）、エレクトロスプレーチップ又はオリフィスを通じた流体の流量、エレクトロスプレーチップ又はオリフィスと質量分析計との間の電圧など、又は、これらの任意の組み合わせを含む１つ以上の動作パラメータに対して行われるべき調整を計算して、質量分析計データの品質の変化に影響を与える、又は、これらの任意の組み合わせのためのソフトウェアを備えてもよい。
【０１０２】
開示されるシステム及びアプリケーションソフトウェアは、当業者に知られている様々な又はプログラミング言語及び環境のいずれかを使用して実装されてもよい。例としては、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、ＰＬ／Ｉ、ＰＬ／Ｓ、ＰＬ／８、ＰＬ−６、ＳＹＭＰＬ、Ｐｙｔｈｏｎ、Ｊａｖａ、ＬａｂＶｉｅｗ、Ｖｉｓｕａｌ  Ｂａｓｉｃ、．ＮＥＴなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０３】
画像処理ソフトウェア：幾つかの実施形態では、前述したように、データ処理モジュールは、テイラーコーン機能などの形状、密度、又は、他の視覚的指標を特徴付けるために、ｐＩマーカー又は分離された検体バンドの位置を決定するための画像処理ソフトウェアを備えてもよい。開示される方法及びシステムを実施する際に画像前処理又は画像処理のために当業者に知られている様々な画像処理アルゴリズムのいずれかが利用されてもよい。例としては、Ｃａｎｎｙエッジ検出方法、Ｃａｎｎｙ−Ｄｅｒｉｃｈｅエッジ検出方法、１次勾配エッジ検出法（例えば、Ｓｏｂｅｌ演算子など）、２次微分エッジ検出方法、位相一致（位相コヒーレンス）エッジ検出法、他の画像セグメンテーションアルゴリズム（例えば、強度閾値化、強度クラスタリング法、強度ヒストグラムベース法など）、特徴及びパターン認識アルゴリズム（例えば、任意の形状を検出するための一般化されたハフ変換、円形ハフ変換など）、及び、数学的分析アルゴリズム（例えば、フーリエ変換、高速フーリエ変換、ウェーブレット分析、自動相関、Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ平滑化、Ｅｉｇｅｎ分析など）、又は、これらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０４】
プロセッサ及びコンピュータシステム：１つ以上のプロセッサ又はコンピュータを使用して、本明細書中で開示される方法を実施してもよい。１つ以上のプロセッサは、中央処理ユニット（ＣＰＵ）、グラフィック処理装置（ＧＰＵ）、汎用処理ユニット、又は、コンピューティングプラットフォームなどのハードウェアプロセッサを備えてもよい。１つ以上のプロセッサは、様々な適切な集積回路（深層学習ネットワークアーキテクチャを実装するために特別に設計された（特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、又は、計算時間を加速するため等及び／又は配備を容易にするためのフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ））、マイクロプロセッサ、新興の次世代マイクロプロセッサ形態（例えば、メモリスタベースのプロセッサ）、論理デバイスなどのいずれかから構成されてもよい。本開示はプロセッサに関連して説明されているが、他のタイプの集積回路及び論理デバイスも適用可能となり得る。プロセッサは、任意の適切なデータ操作能力を有することができる。例えば、プロセッサは、５１２ビット、２５６ビット、１２８ビット、６４ビット、３２ビット、又は、１６ビットのデータ操作を実行できる。１つ以上のプロセッサは、シングルコア又はマルチコアプロセッサ、或いは、並列処理用に構成された複数のプロセッサであってもよい。
【０１０５】
開示される方法を実施するために使用される１つ以上のプロセッサ又はコンピュータは、より大きなコンピュータシステムの一部であってもよく、及び／又は、データの送信及びデータの共有を容易にするために通信インタフェースを用いてコンピュータネットワーク（「ネットワーク」）に動作可能に結合されてもよい。ネットワークは、ローカルエリアネットワーク、イントラネット及び／又はエクストラネット、インターネットと通信しているイントラネット及び／又はエクストラネット、或いは、インターネットであってもよい。場合によっては、ネットワークは電気通信及び／又はデータネットワークである。ネットワークは、場合によってはクラウドコンピューティングなどの分散コンピューティングを可能にする１つ以上のコンピュータサーバを含んでもよい。ネットワークは、場合によってはコンピュータシステムを用いて、ピアツーピアネットワークを実装してもよく、これにより、コンピュータシステムに結合されるデバイスがクライアント又はサーバとして振る舞うことができてもよい。
【０１０６】
また、コンピュータシステムは、メモリ又は記憶場所（例えば、ランダムアクセスメモリ、リードオンリーメモリ、フラッシュメモリ、Ｉｎｔｅｌ（登録商標）Ｏｐｔａｎｅ（商標）テクノロジー）、電子記憶ユニット（例えば、ハードディスク）、１つ以上の他のシステムと通信するための通信インタフェース（例えば、ネットワークアダプタ）、及び、キャッシュ、他のメモリ、データストレージ、及び／又は、電子ディスプレイアダプタなどの周辺機器を含んでもよい。メモリ、記憶ユニット、インタフェース、及び、周辺機器は、例えばマザーボード上に見られるように、通信バスを介して、１つ以上のプロセッサ、例えば、ＣＰＵと通信してもよい。（１又は複数の）記憶ユニットは、データを記憶するための（１又は複数の）データ記憶ユニット（又はデータリポジトリ）であってもよい。
【０１０７】
１つ以上のプロセッサ、例えば、ＣＰＵは、プログラム（又はソフトウェア）に具現化される一連の機械可読命令を実行する。命令は記憶場所に記憶される。命令は、ＣＰＵに向けられ、その後、ＣＰＵは、本開示の方法を実施するようにＣＰＵをプログラムする或いはさもなければ構成する。ＣＰＵによって実行される動作の例としては、フェッチ、デコード、実行、及び、ライトバックが挙げられる。ＣＰＵは、集積回路などの回路の一部であってもよい。システムの他の１つ以上の他の構成要素が回路に含まれてもよい。場合によっては、回路が特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）である。
【０１０８】
記憶ユニットは、ドライバ、ライブラリ、保存されたプログラムなどのファイルを記憶する。記憶ユニットは、ユーザデータ、例えば、ユーザ指定の好み及びユーザ指定のプログラムを記憶する。コンピュータシステムは、場合によっては、イントラネット又はインターネットを介してコンピュータシステムと通信しているリモートサーバ上に位置付けられるなど、コンピュータシステムの外部にある１つ以上の付加的なデータ記憶ユニットを含んでもよい。
【０１０９】
本明細書中で提供される方法及びシステムの幾つかの態様は、例えば、メモリ内又は電子記憶ユニット内など、コンピュータシステムの電子記憶場所に記憶される機械（例えば、プロセッサ）実行可能コードによって実装される。機械実行可能コード又は機械読み取り可能コードは、ソフトウェアの形式で設けられる。使用中、コードは１つ以上のプロセッサによって実行される。場合によっては、コードは記憶ユニットから取り出され、１つ以上のプロセッサがいつでもアクセスできるようにメモリに記憶される。場合によっては、電子記憶ユニットが排除され、また、機械実行可能な命令がメモリに記憶される。コードは、コードを実行するようになっている１つ以上のプロセッサを有する機械と共に使用するように予めコンパイルされて構成されてもよく、或いは、実行時にコンパイルされてもよい。コードは、コードが予めコンパイルされた又はコンパイルされる態様で実行できるようにするべく選択されるプログラミング言語で供給されてもよい。
【０１１０】
開示される方法及びデバイスの様々な態様は、「製品」又は「製造品」、例えば、一般にある種の機械可読媒体に記憶される機械（又はプロセッサ）実行可能コード及び／又は関連データの形態の「コンピュータプログラム又はソフトウェアプロダクト」と考えられてもよく、この場合、実行可能コードは、本明細書中に開示される１つ以上の方法を実行する際にコンピュータ又はコンピュータシステムを制御するための複数の命令を含む。機械実行可能コードは、光ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、又は、ブルーレイディスクなどの光学的に読み取り可能な媒体を含む光学記憶ユニットに記憶されてもよい。機械実行可能コードは、メモリ（例えば、リードオンリーメモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）などの電子記憶ユニットに又はハードディスクに記憶されてもよい。「記憶」タイプの媒体は、コンピュータ、プロセッサなどの有形メモリのいずれか又は全て、或いは、それらの関連モジュール、例えば、様々な半導体メモリチップ、光学ドライブ、テープドライブ、ディスクドライブなどを含み、これらは、本明細書中に開示される方法及びアルゴリズムをエンコードするソフトウェアのためにいつでも一時的な記憶を行うことができる。
【０１１１】
ソフトウェアコードの全部又は一部は、インターネット又は他の様々な電気通信ネットワークを介して通信される場合がある。そのような通信は、例えば、あるコンピュータ又はプロセッサから他のコンピュータへの、例えば管理サーバ又はホストコンピュータからアプリケーションサーバのコンピュータプラットフォームへのソフトウェアのロードを可能にする。したがって、ソフトウェアエンコードされた命令を伝えるために使用される他のタイプの媒体としては、ローカルデバイス間の物理インタフェースの全体にわたって、有線及び光学固定電話ネットワークを介して、及び、様々な大気リンクにわたって使用されるものなど、光学、電気、及び、電磁波が挙げられる。有線又は無線リンク、光リンクなどのそのような波を伝える物理的要素もまた、本明細書中に開示される方法を実行するためのソフトウェアエンコードされた命令を伝える媒体と見なされる。本明細書中で使用されるコンピュータ又は機械「読み取り可能媒体」などの用語は、持続性の有形な「記憶」媒体に限定されなければ、実行のためにプロセッサに命令を与えることに関与する任意の媒体を指す。
【０１１２】
コンピュータシステムは、一般に、例えば、マシンビジョンシステムによって捕捉される画像を与えるための電子ディスプレイを含む又は電子ディスプレイと通信してもよい。ディスプレイは、一般に、ユーザインタフェース（ＵＩ）を与えることもできる。ＵＩの例としては、グラフィカルユーザインタフェース（ＧＵＩ）、ウェブベースのユーザインタフェースなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１３】
用途：開示される方法、デバイス、システム、及び、ソフトウェアは、プロテオミクス研究、創薬及び開発、並びに、臨床診断を含むがこれらに限定されない様々な分野において潜在的な用途を有する。例えば、開示される方法を使用する検体サンプルの分離に基づくＥＳＩ−ＭＳ分析のために達成され得る改善された情報内容及びデータ品質は、開発中及び／又は製造中の生物学的及びバイオシミラー医薬の特性評価にとって非常に有益となり得る。他の用途としては、環境汚染物質、農薬、小分子、代謝物、ペプチド、変換後改質、グリコフォーム、抗体−薬物複合体、融合タンパク質、ウイルス、アレルガン、単細胞生物、及び、他の用途の分析を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１１４】
生物製剤及びバイオシミラーは、例えば、組み換えタンパク質、抗体、ウイルス生ワクチン、ヒト血漿由来タンパク質、細胞ベースの薬剤、天然由来タンパク質、抗体−薬物複合体、タンパク質−薬物複合体、及び、他のタンパク質薬物を含む薬物類である。ＦＤＡ及びその他の規制当局は、構造、機能、動物毒性、ヒト薬物動態（ＰＫ）、及び、薬力学（ＰＤ）に関する提案製品と基準製品との比較、臨床免疫原性、及び、臨床安全性と有効性（「基準製品との生物学的類似性を実証する際の科学的考慮事項：産業向けガイダンス」、米国食品医薬品局、２０１５年４月を参照）を含んでもよい、生物学的類似性を実証するための段階的アプローチの使用を要求する。タンパク質製品に関して求められ得る構造特性データの例としては、一次構造（つまり、アミノ酸配列）、二次構造（つまり、アルファヘリックス又はベータシート構造を形成するためのフォールディングの程度）、三次構造（つまり、ポリペプチド骨格と二次構造ドメインの折りたたみによって生成されるタンパク質の３次元形状）、及び、四次構造（例えば、活性タンパク質複合体を形成するために必要なサブユニットの数、又はタンパク質の凝集状態））が挙げられる。多くの場合、この情報は、Ｘ線結晶学などの面倒で時間のかかる高価な技術を使用しないと利用できない場合がある。したがって、候補生物学的薬物と基準薬物との間の生物学的類似性を確立する目的で、タンパク質構造の都合の良いリアルタイムな比較的ハイスループットの特性評価を可能にする実験技術が必要である。
【０１１５】
幾つかの実施形態において、開示される方法、デバイス、及び、システムは、生物学的類似性を確立する目的で生物学的薬物候補（例えば、モノクローナル抗体（ｍＡｂ））及び基準生物学的薬物に関する構造比較データを与えるために使用されてもよい。例えば、幾つかの例において、薬物候補及び基準薬物に関する等電点データ及び／又は質量分析データは、生物学的類似性の実証を支持する重要な証拠を与え得る。幾つかの実施形態において、同一の反応条件下においていずれも部位特異的プロテアーゼで処理された薬物候補及び基準薬物に関する等電点データ及び／又は質量分析データは、生物学的類似性の実証を支持する重要な証拠を与え得る。幾つかの実施形態では、開示される方法、デバイス、及び、システムを使用して、生物学的薬物製造プロセスを監視し、製造プロセスの異なる時点で採取されたサンプル又は異なる製造実行から採取されたサンプルを分析することによって製品の品質及び一貫性を確保してもよい。幾つかの実施形態では、開示される方法、デバイス、及び、システムを使用して、製剤緩衝液の安定性を評価してもよい。幾つかの実施形態において、開示される方法、デバイス、及びシステムは、生物学的薬物候補の産生及び品質に関してクローン化された細胞株を評価するために使用されてもよい。
【０１１６】
［実施例］
これらの例は、単なる例示目的で与えられているにすぎず、本明細書中で与えられる特許請求の範囲を限定するものではない。
【０１１７】
実施例１−質量分析を実行する前のチップ上のタンパク質電荷の特性評価
図１に示されるマイクロ流体デバイスの製造については前述した。動作させるために、デバイスは、窒素ガス源、ヒータ、陽圧ポンプ（例えば、Ｐａｒｋｅｒ、Ｔ５−１ＩＣ−０３−１ＥＥＰ）、２つのプラチナ−イリジウム電極（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、３５７３８３）で終端する電気泳動電源（Ｇａｍｍ  Ｈｉｇｈ  Ｖｏｌｔａｇｅ、ＭＣ３０）、ＵＶ光源（例えば、ＬＥＤ、ｑｐｈｏｔｏｎｉｃｓ、ＵＶＴＯＰ２８０）、ＣＣＤカメラ（例えば、ＴｈｏｒＬａｂｓ、３４０ＵＶ−ＧＥ）、及び、サンプルをデバイスへ取り込むためのオートサンプラを含む機器上に装着される。電源は、質量分析計と共通のアースグランドを共有する。機器はソフトウェア（例えば、Ｌａｂ  Ｖｉｅｗ）によって制御される。
【０１１８】
タンパク質サンプルは、バイアル内に配置してオートサンプラに取り込む前に、両性電解質ｐＨ勾配及びｐＩマーカーと予め混合される。タンパク質サンプルは、オートサンプラから入口４１２により濃縮チャネル４１８を通じてマイクロ流体デバイス４００に連続的に取り込まれるとともに、デバイスから出口４３４を介して廃棄物４３０に送られる。
【０１１９】
シース／陰極液（５０％  ＭｅＯＨ，Ｎ４０Ｈ／Ｈ２０）が２つの陰極液ウェル４０４，４３６に取り込まれ、陽極液（１０ｍＭ  Ｈ３Ｐ０４）が陽極液ウェル４２６に取り込まれるとともに、加熱された窒素ガスの供給源が２つのガスウェル４０８，４４０に取り付けられる。
【０１２０】
全ての試薬が取り込まれた後、電極を陽極液ウェル４２６及び陰極液ウェル４０４，４３６に接続することによって＋６００Ｖ／ｃｍの電界が陽極液ウェル４２６から陰極液ウェル４０４，４３６に印加され、等電点電気泳動が開始される。ＵＶ光源が濃縮チャネル４１８下に位置合わせされ、濃縮チャネル４１８を通過する光を測定するためにカメラが濃縮チャネル４１８の上方に配置され、それにより、集束タンパク質をそれらの吸光度によって検出する。ソーダ石灰ガラスから構成されるガラス板４０２がカメラからの任意の迷光を遮断するように作用し、そのため、濃縮チャネル４１８を通過しない光がカメラに到達するのが妨げられ、それにより、測定の感度が高まる。
【０１２１】
集束タンパク質の画像は、ＩＥＦ中に連続的及び／又は定期的に捕捉され得る。集束が完了すると、低圧が入口４１２から印加され、それにより、ｐＨ勾配がオリフィス４２４に向けて動員される。この時点で電界を維持して、高分解能のＩＥＦ分離を維持することができる。ＥＳＩプロセス中に濃縮チャネル４１８を撮像し続けることにより、各タンパク質のｐＩをタンパク質がオリフィス４２４から排出される際に決定することができる。
【０１２２】
濃縮されたタンパク質画分が濃縮チャネル４１８から合流部４２０へ移動する際、濃縮されたタンパク質画分はシース流体と混合し、該シース流体は、陰極液ウェル４０４，４３６からシース／陰極液チャネル４０６，４３８を介して合流部４２０に流れることができる。濃縮されたタンパク質画分をシース流体と混合することにより、タンパク質画分を質量分析互換性溶液中に入れることができるとともに、集束タンパク質への電荷を回復させることができ（ＩＥＦがタンパク質を非荷電状態へともたらす）、それにより、イオン化が改善される。
【０１２３】
その後、濃縮されたタンパク質画分がオリフィス４２４へと進み続け、オリフィス４２４はガラス板４０２の皿表面４２２によって画定され得る。濃縮されたタンパク質画分は、シース流体ウェルグランドと質量分析計の負極との間の電界内に補足された時点でテイラーコーンを形成できる。
【０１２４】
溶液が濃縮チャネル４１８からテイラーコーンを押し続ける際、流体の小さい液滴が、テイラーコーンから排出され、質量分析計の入口に向かって飛ぶ。窒素ガス（例えば、１５０℃）は、ガスウェル４０８，４４０からガスチャネル４１０，４３２を下って流れて、マイクロ流体デバイスを離れる前にテイラーコーンから生じる液滴を微細な霧に変換することができるテイラーコーンの両側に位置する窒素ガスジェットを形成することができ、これは質量分析計での検出に役立ち得る。入口４１２からの圧力を調整することにより、必要に応じてテイラーコーンのサイズを調整でき、質量分析計での検出を改善できる。
【０１２５】
実施例２−検体ピークがマイクロ流体チップを出て質量分析計に入るときの速度の追跡
この例の場合、図７Ａのマイクロ流体チャネルネットワーク１００が不透明な環状オレフィンポリマーの２５０ミクロン厚の層中に形成される。チャネル１１２の深さは２５０ミクロンであり、そのため、チャネルは２５０ミクロンの層を完全に貫通する。他の全てのチャネルが５０ミクロンの深さである。チャネル層は、図７Ｂの場合のように環状オレフィンポリマーの２つの透明な層間に挟まれて、平面マイクロ流体デバイスを製造する。ポート１０２，１０４，１０６，１０８，１１０が、外部リザーバ及び電気接点からの試薬導入のためのチャネルネットワークへのアクセスを与える。ポート１０２は真空源に接続され、それにより、チャネル１０３が廃棄物チャネルとして作用することができ、その結果、チャネルネットワークを介した他の試薬のプライミングが「廃棄物」となり得る。酸（１％ギ酸）が、ポート１０８を介してチャネル１０９，１１２，１１４，１０３にプライミングされ、ポート１０２に排出される。サンプル（４％Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ  ３−１０、１２．５ｍＭ  ｐＩ標準３．３８（精製ペプチド、配列：Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ）、１２．５ｍＭ  ｐＩ標準１０．１７（精製ペプチド、配列：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ）、ＮＩＳＴモノクローナル抗体標準（部品番号８６７１、ＮＩＳＴ））が、ポート１０６を介してチャネル１０７，１１２，１１４，１０３にプライミングされ、ポート１０２に排出される。これにより、サンプル検体を含むチャネル１１２が残る。塩基（１％ジメチルアミン）が、ポート１０４を介してチャネル１０５，１１４，１０３にプライミングされ、ポート１０２に排出される。動員材（１％ギ酸、４９％メタノール）が、ポート１１０を介してチャネル１１１，１１４，１０３にプライミングされ、チャネル１０３からポート１０２に排出される。
【０１２６】
チャネル１１２内の検体サンプルの電気泳動は、ポート１０８に４０００Ｖを印加してポート１１０をグランドに接続することによって実行される。検体サンプル中の両性電解質は、チャネル１１２に及ぶｐＨ勾配を確立する。分離の吸光度撮像は、チャネル１１２に位置合わせされる２８０ｎｍ光源を使用し、ＣＣＤカメラによりチャネル１１２を通過する２８０光の透過率を測定することで実行される。ソフトウェアが、分離中又は動員中の光透過率を、検体が実行される前に集束された検体がない場合に行われる「ブランク」基準測定と比較することによって吸光度を計算し、その後、チャネル１１２の長さにわたってピクセルごとに吸光度を表示する。図９Ａ〜図９Ｆに示されるように、標準又は検体が集束された場所がピークとして表示される。
【０１２７】
検体が集束を完了した時点で、最終的な集束吸光度画像が捕捉される。ソフトウェアは、ｐＩマーカーの空間位置を特定して、マーカー間で補間し、集束検体画分ピークのｐＩを計算する。この時点で、制御ソフトウェアがリレーをトリガし、リレーは、ポート１１０でグランドを切断して、ポート１０４をグランドに接続するとともに、ポート１０４に接続される動員材リザーバに作用する圧力を設定して、ポート１０４を通じてチャネル１０５，１１４に入ってオリフィス１１６でチップから出る１００ｎＬ／分の動員材溶液の流れを確立する。オリフィス１１６は、入口電圧が−３５００Ｖ〜−４５００Ｖである質量分析計のＥＳｌ入口から２ｍｍ離れて位置付けられる。
【０１２８】
圧力駆動流が動員材をポート１０４からオリフィス１１６へ方向付ける一方で、動員材試薬中のギ酸の一部がチャネル１０５からチャネル１１２を通ってポート１０８のアノードにギ酸塩の形態で電気泳動する。ギ酸塩がチャネル１１２を通って移動するにつれて、ギ酸塩は、等電ｐＨ勾配を乱し、それにより、両性電解質、標準、及び、検体サンプルは、電荷を増大させるとともに、電気泳動的にチャネル１１２からチャネル１１４へ移動し、ここで、ポート１１０からの圧力駆動流がそれらをオリフィス１１６からＥＳＩスプレーに運ぶ。
【０１２９】
動員が発生している間、ソフトウェアは、吸光度画像を捕捉し続けてピークを特定し、それにより、撮像チャネル１１２からチャネル１１４へのピークの移動を追跡する。各ピークが撮像チャネル１１２から離れる時間、その速度、及び、チャネル１１４内の流量を追跡することにより、ソフトウェアは、ピークがチャネル１１４を横切ってオリフィス１１６を介して質量分析計に導入される時間を計算し、それにより、当初の集束ピークと結果として生じる質量スペクトルとの間の直接的な相関が可能となる。
【０１３０】
図９Ａ〜図９Ｆは、１分間隔で取得された一連の吸光度トレースの例を与え、分離チャネルの画像から決定された等電点（ｐＩ）標準の動員を示している。図９Ａは、動員前の５つのｐＩ標準（ピーク９１５，９２０，９２５，９３０，９３５）の等電点電気泳動が完了した後におけるチャネル距離９０５に応じた吸光度９１０のプロットを示す。図９Ｂに示されるように、１分の動員後、ｐＩ＝９．９９標準に対応するピーク９１５が、撮像システムの視野の縁にある。図９Ｃに示されるように、２分の動員後、ピーク９１５（ｐＩ＝９．９９標準）は撮像されているチャネルの部分から出た。図９Ｄに示されるように、３分の動員後、ピーク９２０（ｐＩ＝８．４０標準）が撮像されているチャネルの部分から出た。図９Ｅに示されるように、４分の動員後、ピーク９２５（ｐＩ＝７．００標準）が撮像されているチャネルの部分から出た。図９Ｆに示されるように、５分の動員後、ピーク９３０（ｐＩ＝４．０５標準）が撮像されているチャネルの部分から離れた。
【０１３１】
実施例３−フィードバックを使用してＭＳパラメータ及びＥＳＩパラメータを調整する
実施例３では、チップ、機器、及び、ソフトウェアが実施例２の場合と同じ手順を全て実行する。更に、図８に示されるように、ＥＳＩ中にテイラーコーンを撮像するために第２のＣＣＤカメラが使用される。これらの画像は、テイラーコーンの品質及び一貫性を評価するために使用される。質量分析計で画像及び／又は合計数を評価することにより、ＥＳＩテイラーコーンの不具合の特定及び原因の診断が可能となる。
【０１３２】
ＥＳＩでのテイラーコーンの形成は、蒸発及びＥＳＩに失われている流体の速度と一致するコーンへの入力流を維持することに依存する。テイラーコーンのサイズは、流量、マイクロ流体デバイスとＭＳとの間の電圧勾配、マイクロ流体デバイスとＭＳとの間の距離、並びに、マイクロ流体デバイスのＥＳＩチップ及び局所環境の微妙な変化に依存する。
【０１３３】
テイラーコーンの撮像により、ＥＳＩの不具合の原因を診断できる。例えば、テイラーコーンの損失は十分な流れがないことを示しており、また、ソフトウェアはマイクロ流体デバイスへの動員材の流れを増大させることができる。同様に、コロナ放電は電圧が高すぎることを示し、また、ソフトウェアは電圧を下げることができる。ＥＳＩクラウドの拡大は電圧が高すぎることを示し、一方、テイラーコーンではなく液滴を形成することは電圧が低すぎることを示す。これらの違い及び他の視覚的違いを画像中で特定でき、また、ソフトウェアは、テイラーコーンを再確立するように自動的に補償できる。
【０１３４】
実施例４−分離のマーカーとしての低質量走査
実施例４では、チップ、機器、及び、ソフトウェアが実施例２の場合と同じ手順を全て実行する。更に、動員が発生して検体ピークがＭＳへ移動し始めた時点で、ＭＳは、１５００〜６０００及び１５０〜１５００のｍ／ｚ範囲間を交互に切り換えるように設定される。１５００〜６０００の範囲は、ＮＩＳＴ抗体検体画分ピークをそれらがＭＳに導入される際に特定するために使用される。１５０〜１５００ｍ／ｚ範囲走査は、遊離溶液の両性電解質（Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅｓ）をそれらがＭＳに導入される際に特定するために使用される。特定の両性電解質の存在は任意の時点でＭＳで分析されている等電点ｐＨ勾配の一部を規定するため、両性電解質は、質量走査で特定され、ＭＳからの全イオンクロマトグラフを較正するために使用され得る。
【０１３５】
実施例５−チップにおける電界強度及び一定の電圧を維持するために高電圧及び低電圧を変更する。
【０１３６】
この例の場合、図７Ａのマイクロ流体チャネルネットワーク１００が不透明な環状オレフィンポリマーの２５０ミクロン厚の層中に形成される。チャネル１１２の深さは２５０ミクロンであり、そのため、チャネルは２５０ミクロンの層を完全に貫通する。他の全てのチャネルが５０ミクロンの深さである。チャネル層は、図７Ｂの場合のように環状オレフィンポリマーの２つの透明な層間に挟まれて、平面マイクロ流体デバイスを製造する。ポート１０２，１０４，１０６，１０８，１１０が、外部リザーバ及び電気接点からの試薬導入のためのチャネルネットワークへのアクセスを与える。ポート１０２は真空源に接続され、それにより、チャネル１０３が廃棄物チャネルとして作用することができ、その結果、チャネルネットワークを介した他の試薬のプライミングが「廃棄物」となり得る。酸（１％ギ酸）が、ポート１０８を介してチャネル１０９，１１２，１１４，１０３にプライミングされ、ポート１０２に排出される。サンプル（４％Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ  ３−１０、１２．５ｍＭ  ｐＩ標準３．３８（精製ペプチド、配列：Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ）、１２．５ｍＭ  ｐＩ標準１０．１７（精製ペプチド、配列：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ）、ＮＩＳＴモノクローナル抗体標準（部品番号８６７１、ＮＩＳＴ））が、ポート１０６を介してチャネル１０７，１１２，１１４にプライミングされ、ポート１０２に排出される。これにより、サンプル検体を含むチャネル１１２が残る。塩基（１％ジメチルアミン）が、ポート１０４を介してチャネル１０５，１１４，１０３にプライミングされ、ポート１０２に排出される。動員材（１％ギ酸、４９％メタノール）が、ポート１１０を介してチャネル１１０，１１４，１０３にプライミングされ、チャネル１０２からポート１０２に排出される。圧力がベースリザーバに印加されて、ポート１０４を通じてチャネル１０５，１１４に入ってオリフィス１１６から出る１００ｎＬ／分の流れが生成される。
【０１３７】
チャネル１１２における検体サンプルの等電点電気泳動は、電源１００５を使用してポート１０８に２０００Ｖを印加するとともにポート１１０を高電圧電源１０１０に接続して−２０００Ｖを印加することによって開始される。これは、高電圧電源１００５及び高電圧電源１０１０（場合によっては、電源１００５及び電源１０１０が単一の多重化された高電圧電源の２つのチャネルを備えてもよい）を含んでアノードとカソードとの間に４０００Ｖの電圧降下を生み出す図１０Ａに表される回路を確立する。チャネルの電気抵抗は、チャネルの寸法と試薬の導電率とに依存する。この例では、チャネル１０９（図７Ａ参照）に対応する酸チャネルの電気抵抗Ｒ１０９が１０メガオームであり、チャネル１１２（図７Ａ参照）に対応するサンプルチャネルの電気抵抗Ｒ１１２が４０メガオームで始まり、また、チャネル１１１（図７Ａ参照）に対応するチャネルにおけるベースの抵抗Ｒ１１１が５０メガオームである。オリフィス１１６（図７Ａ参照）と質量分析計１０１５との間のエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）インタフェースの抵抗Ｒ１１３は２ギガオームである。チャネル１０９，１１２，１１１（図７Ａ参照）間の全電圧降下は４０００Ｖであり、また、これらのチャネルは直列の３つの抵抗に相当するため、チップ（Ｖ１１６）の電圧は式１にしたがって計算される。
【０１３８】
Ｖ１１６＝ΔＶ１０８−１１０＊（Ｒ１１１）／（Ｒ１０９＋Ｒ１１２＋Ｒ１１１）＋（高電圧−電源１０１０電圧設定）。
【０１３９】
等電点電気泳動の開始時には、Ｖ１１６＝０ボルトである。オリフィス１１６（図７Ａ参照）は、質量分析計のＥＳＩ入口から２ｍｍ離れて位置付けられ、この場合、テイラーコーンを形成するために入口電圧は−３５００Ｖ〜−４５００Ｖである。図１０Ｂは、チャネル１０５の抵抗Ｒ１０５を含む、図１０Ａに表される回路の他の実施形態を示す。
【０１４０】
検体サンプル中の両性電解質は、チャネル１１２に及ぶｐＨ勾配を確立する。分離の吸光度撮像は、チャネル１１２に位置合わせされる２８０ｎｍ光源を使用し、ＣＣＤカメラによりチャネル１１２を通過する２８０ｎｍ光の透過率を測定することで実行される。ソフトウェアが、分離中又は動員中の光透過率を、検体が実行される前に集束された検体がない場合に行われる「ブランク」基準測定と比較することによって吸光度を計算し、その後、チャネル１１２の長さにわたってピクセルごとに吸光度を表示する。図９Ａ〜図９Ｆに示されるように、標準又は検体が集束された場所がピークとして表示される。
【０１４１】
サンプルが集束するにつれて、両性電解質、抗体アイソフォーム、及び、標準がそれらの等電点に到達してそれらの電荷を失うため、サンプルチャネル１１２の抵抗が増大し、一方、チャネル１０９，１１１及びＥＳＩインタフェースにおける抵抗は不変のままである。コンピュータ実装方法は、電源１００５における電流を監視し、チャネル１１２内の任意の時点での抵抗を計算できる。コンピュータ実装方法は、この情報を使用して電源１００５，１０１０を調整する。例えば、チャネル１１２の抵抗が１４０メガオームまで上昇した場合、電源が調整されていなければ、オリフィス１１６の電圧が−１０００Ｖになり、テイラーコーンが乱れる。しかしながら、電源１００５を＋３０００Ｖに調整するとともに電源１０１０を−１０００Ｖに調整することにより、チップが０Ｖのままになり、チャネル１０９，１１２，１１１にわたる全電圧降下は４０００Ｖのままである。これらの調整は、チャネル１１２の抵抗が変化する際にオンザフライで行われる。
【０１４２】
検体が集束を完了した時点で、最終的な集束吸光度画像が捕捉される。ソフトウェアは、ｐＩマーカーの空間位置を特定して、マーカー間で補間し、集束検体画分ピークのｐＩを計算する。この時点で、制御ソフトウェアがリレーをトリガし、リレーは、ポート１１０で電源１０１０を切断して、ポート１０４を電源１０１０に接続するとともに、ポート１０４に接続される動員材リザーバに作用する圧力を設定して、ポート１０４を通じてチャネル１０５，１１４に入ってオリフィス１１６でチップから出る１００ｎＬ／分の動員材溶液の流れを確立する（図７Ａのチップ概略図及び図１０Ｂに示される電気回路を参照）。オリフィス１１６は、入口電圧が−３５００Ｖ〜−４５００Ｖである質量分析計のＥＳｌ入口から２ｍｍ離れて位置付けられる。
【０１４３】
圧力駆動流が動員材をポート１０４からオリフィス１１６へ方向付ける一方で、動員材試薬中のギ酸の一部がチャネル１０５からチャネル１１２を通ってポート１０８のアノードにギ酸塩の形態で電気泳動する。ギ酸塩がチャネル１１２を通って移動するにつれて、ギ酸塩は、等電ｐＨ勾配を乱し、それにより、両性電解質、標準、及び、検体サンプルは、電荷を増大させるとともに、電気泳動的にチャネル１１２からチャネル１１４へ移動し、ここで、ポート１１０からの圧力駆動流がそれらをオリフィス１１６からＥＳＩスプレーに運ぶ。
【０１４４】
動員が発生している間、チャネル１１２の抵抗が低下する。図１１Ａ〜図１１Ｂは、チャネルの抵抗を導出するために使用されてもよい、チャネル１１２に関する電圧及び電流データの例を示す。図１１Ａは、時間の関数としての電圧のプロットを示す。図１１Ｂは、時間の関数としての電流のプロットを示す。ソフトウェアは、図１５に示されるように、電流の変化を監視して、電源を調整し、アノードとカソードとの間の電圧降下を３０００Ｖに維持するとともに、チップ１１６で０Ｖを維持する。電圧変化は一時的であってもよく又は安定していてもよい。
【０１４５】
動員が発生している間、ソフトウェアは、吸光度画像を捕捉し続けてピークを特定し、それにより、撮像チャネル１１２からチャネル１１４へのピークの移動を追跡する。各ピークが撮像チャネル１１２から離れる時間、その速度、及び、チャネル１１４内の流量を追跡することにより、ソフトウェアは、ピークがチャネル１１４を横切ってオリフィス１１６を介して質量分析計に導入される時間を計算し、それにより、当初の集束ピークと結果として生じる質量スペクトルとの間の直接的な相関が可能となる。
【０１４６】
図１３Ａは、電流をグランドにシンクするために更なるレジスタＲ１２０を使用してＥＳＩチップが正の電圧に保持される、化学的動員中の図７Ａに示されるマイクロ流体デバイスにおける代表的な回路図を与える。回路は、アノードとカソードとの間に特定の電圧降下（例えば、４０００Ｖ）を生み出すために、１００５と実質的に同様であってもよい高電圧電源１３０５と、１０１０と実質的に同様であってもよい高電圧電源１３１０とを備えてもよい。回路は、第３の高電圧電源１３０７を更に備えてもよい。チャネルの電気抵抗は、チャネルの寸法と試薬の導電率とに依存する。回路には、チャネル１０９（図７Ａ参照）に対応する酸チャネルの電気抵抗Ｒ１０９、チャネル１１２（図７Ａ参照）に対応するサンプルチャネルの電気抵抗Ｒ１１２、及び、チャネル１１１（図７Ａ参照）に対応するチャネルにおけるベースの抵抗Ｒ１１１、並びに、実質的に１０１５と同様であってもよい、オリフィス１１６（図７Ａ参照）と質量分析計１３１５の電圧源との間のエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）のインタフェースの抵抗Ｒ１１３も組み込まれる。また、回路は、チャネル１０５の電気抵抗Ｒ１０５を含んでもよい。電源１３０７は、チャネル１１１に接続されて（図７Ａ参照）、動員中に０μＡに設定された電流制御を使用できる。この電源は、チップの電圧を読み取って、コンピュータ制御のフィードバックループを実施してチップの電圧を一定に維持するために使用されてもよい。
【０１４７】
図１３Ｂは、電流を電源１３２０にシンクするためにレジスタＲ１２０を使用してＥＳＩチップが正の電圧に保持される、化学的動員中の図７Ａに示されるマイクロ流体デバイスにおける代表的な回路図を示す。図１３Ｃは、電流をシンクするために電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）１３２５を使用してＥＳＩチップが正の電圧に保持される、化学的動員中の図７Ａに示されるマイクロ流体デバイスにおける代表的な回路図を示す。電気回路は、増幅器１３３０、電圧基準１３３５、及び、更なるレジスタＲ２００を更に備えてもよい。図１３Ｄは、電流をシンクするためにバイポーラ接合トランジスタ（ＢＪＴ）１３４０を使用してＥＳＩチップが正の電圧に保持される、化学的動員中の図７Ａに示されるマイクロ流体デバイスにおける代表的な回路図を示す。電源１３０７は、チャネル１１１に接続されて（図７Ａ参照）、０μＡに設定された電流制御を使用できる。この電源は、チップの電圧を読み取って、コンピュータ制御のフィードバックループを実施してチップの電圧を一定に維持するために使用されてもよい。図１３Ｅは、ＥＳＩチップがグランド又はグランド付近に保持される、分離された検体混合物の化学的動員中の図７Ａに示されるマイクロ流体デバイスにおける代表的な回路図を与える。電源１３０７は、チャネル１１１に接続されて（図７Ａ参照）、０μＡに設定された電流制御を使用できる。この電源は、チップの電圧を読み取って、コンピュータ制御のフィードバックループを実施してチップの電圧を一定に維持するために使用されてもよい。
【０１４８】
実施例６−チップ電圧の測定に基づいてチップにおける電界強度及び一定の電圧を維持するために高電圧及び低電圧を変更する
この例の場合、図７Ａのマイクロ流体チャネルネットワーク１００が不透明な環状オレフィンポリマーの２５０ミクロン厚の層中に形成される。チャネル１１２の深さは２５０ミクロンであり、そのため、チャネルは２５０ミクロンの層を完全に貫通する。他の全てのチャネルが５０ミクロンの深さである。チャネル層は、図７Ｂの場合のように環状オレフィンポリマーの２つの透明な層間に挟まれて、平面マイクロ流体デバイスを製造する。ポート１０２，１０４，１０６，１０８，１１０が、外部リザーバ及び電気接点からの試薬導入のためのチャネルネットワークへのアクセスを与える。ポート１０２は真空源に接続され、それにより、チャネル１０３が廃棄物チャネルとして作用することができ、その結果、チャネルネットワークを介した他の試薬のプライミングが「廃棄物」となり得る。酸（１％ギ酸）が、ポート１０８を介してチャネル１０９，１１２，１１４，１０３にプライミングされ、ポート１０２に排出される。サンプル（４％Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ  ３−１０、１２．５ｍＭ  ｐＩ標準３．３８（精製ペプチド、配列：Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ）、１２．５ｍＭ  ｐＩ標準１０．１７（精製ペプチド、配列：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ）、ＮＩＳＴモノクローナル抗体標準（部品番号８６７１、ＮＩＳＴ））が、ポート１０６を介してチャネル１０７，１１２，１１４にプライミングされ、ポート１０２に排出される。これにより、サンプル検体を含むチャネル１１２が残る。塩基（１％ジメチルアミン）が、ポート１０４を介してチャネル１０５，１１４，１０３にプライミングされ、ポート１０２に排出される。動員材（１％ギ酸、４９％メタノール）が、ポート１１０を介してチャネル１１０，１１４，１０３にプライミングされ、チャネル１０２からポート１０２に排出される（図７Ａのチップ概略図及び図１３Ｅに示される電気回路を参照）。
【０１４９】
チャネル１１２における検体サンプルの電気泳動は、電源１３０５を使用してポート１０８に１５００Ｖを印加するとともにポート１１０を０Ｖに設定される電源１３０７に接続することによって開始される。５分後、集束を完了するために電源１３０５が３分間にわたって３０００Ｖまで増大される。
【０１５０】
検体サンプル中の両性電解質は、チャネル１１２に及ぶｐＨ勾配を確立する。分離の吸光度撮像は、チャネル１１２に位置合わせされる２８０ｎｍ光源を使用し、ＣＣＤカメラによりチャネル１１２を通過する２８０光の透過率を測定することで実行される。ソフトウェアが、分離中又は動員中の光透過率を、検体が実行される前に集束された検体がない場合に行われる「ブランク」基準測定と比較することによって吸光度を計算し、その後、チャネル１１２の長さにわたってピクセルごとに吸光度を表示する。図９Ａ〜図９Ｆに示されるように、標準又は検体が集束された場所がピークとして表示される。
【０１５１】
検体が集束を完了した時点で、最終的な集束吸光度画像が捕捉される。ソフトウェアは、ｐＩマーカーの空間位置を特定して、マーカー間で補間し、集束検体画分ピークのｐＩを計算する。この時点で、制御ソフトウェアがリレーをトリガし、リレーは、ポート１０４を電源１３１０に接続するとともに、ポート１０４に接続される動員材リザーバに作用する圧力を設定して、ポート１０４を通じてチャネル１０５，１１４に入ってオリフィス１１６でチップから出る１００ｎＬ／分の動員材溶液の流れを確立する。オリフィス１１６は、入口電圧が−３５００Ｖ〜−４５００Ｖである質量分析計のＥＳＩ入口１３１５から２ｍｍ離れて位置付けられる。電源１３０７が電流制御を使用して０μＡに設定され、電源１３０５が３０００Ｖに設定され、電源１３１０が０Ｖに設定され、また、ＭＳ  ＥＳＩイオン源が−３５００Ｖ〜−４５００Ｖに設定される。
【０１５２】
圧力駆動流が動員材をポート１０４からオリフィス１１６へ方向付ける一方で、動員材試薬中のギ酸の一部がチャネル１０５からチャネル１１２を通ってポート１０８のアノードにギ酸塩の形態で電気泳動する。ギ酸塩がチャネル１１２を通って移動するにつれて、ギ酸塩は、等電ｐＨ勾配を乱し、それにより、両性電解質、標準、及び、検体サンプルは、電荷を増大させるとともに、電気泳動的にチャネル１１２からチャネル１１４へ移動し、ここで、ポート１１０からの圧力駆動流がそれらをオリフィス１１６からＥＳＩスプレーに運ぶ。
【０１５３】
動員が発生している間、チャネル１１２の抵抗が低下する。チャネル１１１の全体にわたる電圧降下がこの時点で０であるため（ΔＶ＝ＩＲ＝０＊Ｒ１１１＝０Ｖ）、０μＡに設定される電源１３０７は図１３ＥにおけるＶ１１６の電圧に等しい。図１１Ａ〜図１１Ｂのデータに示されるように、集束が完了してから８分（４８０秒）で、ソフトウェアは、図１５に記載されるように、電流の変化を監視し、電源を調整して、アノードとカソードとの間で３０００Ｖの一定の電圧降下を維持するとともにチップ１１６で０ボルトを維持する。チップの電圧（Ｖ１１６）は式２によって表される。
【０１５４】
Ｖ１１６＝ΔＶ１０８−１１０＊（Ｒ１１１）／（Ｒ１０９＋Ｒ１１２＋Ｒ１０５）＋（電源１３１０電圧設定）。
【０１５５】
動員が発生している間、ソフトウェアは、吸光度画像を捕捉し続けてピークを特定し、それにより、撮像チャネル１１２からチャネル１１４へのピークの移動を追跡する。各ピークが撮像チャネル１１２から離れる時間、その速度、及び、チャネル１１４内の流量を追跡することにより、ソフトウェアは、ピークがチャネル１１４を横切ってオリフィス１１６を介して質量分析計に導入される時間を計算し、それにより、当初の集束ピークと結果として生じる質量スペクトルとの間の直接的な相関が可能となる。
【０１５６】
実施例７−チップ電圧及びレジスタの測定に基づいてチップにおける電界強度及び一定の電圧を維持するために高電圧及び低電圧を変更する
この例の場合、図７Ａのマイクロ流体チャネルネットワーク１００が不透明な環状オレフィンポリマーの２５０ミクロン厚の層中に形成される。チャネル１１２の深さは２５０ミクロンであり、そのため、チャネルは２５０ミクロンの層を完全に貫通する。他の全てのチャネルが５０ミクロンの深さである。チャネル層は、図７Ｂの場合のように環状オレフィンポリマーの２つの透明な層間に挟まれて、平面マイクロ流体デバイスを製造する。ポート１０２，１０４，１０６，１０８，１１０が、外部リザーバ及び電気接点からの試薬導入のためのチャネルネットワークへのアクセスを与える。ポート１０２は真空源に接続され、それにより、チャネル１０３が廃棄物チャネルとして作用することができ、その結果、チャネルネットワークを介した他の試薬のプライミングが「廃棄物」となり得る。酸（１％ギ酸）が、ポート１０８を介してチャネル１０９，１１２，１１４，１０３にプライミングされ、ポート１０２に排出される。サンプル（４％Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ  ３−１０、１２．５ｍＭ  ｐＩ標準５．５２（精製ペプチド、配列：Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ）、１２．５ｍＭ  ｐＩ標準８．４（精製ペプチド、配列：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ）、インフリキシマブバイオシミラーモノクローナル抗体標準（部品番号ＭＣＡ６０９０、Ｂｉｏ−ｒａｄ））が、ポート１０６を介してチャネル１０７，１１２，１１４にプライミングされ、ポート１０２に出力される。これにより、サンプル検体を含むチャネル１１２が残る。塩基（１％ジメチルアミン）が、ポート１０４を介してチャネル１０５，１１４，１０３にプライミングされ、ポート１０２に排出される。動員材（１％ギ酸、４９％メタノール）が、ポート１１０を介してチャネル１１０，１１４，１０３にプライミングされ、チャネル１０２からポート１０２に排出される（図７Ａのチップ概略図及び図１３Ｂに示される電気回路を参照）。
【０１５７】
チャネル１１２における検体サンプルの電気泳動は、電源１３０５を使用してポート１０８に１５００Ｖを印加するとともにポート１１０を０Ｖに設定される電源１３０７に接続することによって開始される。５分後、電源１３０５が３０００Ｖまで増大される。
【０１５８】
検体サンプル中の両性電解質は、チャネル１１２に及ぶｐＨ勾配を確立する。分離の吸光度撮像は、チャネル１１２に位置合わせされる２８０ｎｍ光源を使用し、ＣＣＤカメラによりチャネル１１２を通過する２８０ｎｍ光の透過率を測定することで実行される。ソフトウェアが、分離中又は動員中の光透過率を、検体が実行される前に集束された検体がない場合に行われる「ブランク」基準測定と比較することによって吸光度を計算し、その後、チャネル１１２の長さにわたってピクセルごとに吸光度を表示する。図９Ａ〜図９Ｆに示されるように、標準又は検体が集束された場所がピークとして表示される。
【０１５９】
検体が集束を完了した時点で、インフリキシマブの電荷変異体が図１６Ａに示されるように分離され、最終的な集束吸光度画像が捕捉される。ソフトウェアは、ｐＩマーカーの空間位置を特定して、マーカー間で補間し、集束検体画分ピークのｐＩを計算する。この時点で、制御ソフトウェアがリレーをトリガし、リレーは、ポート１０４を電源１３１０に接続するとともに、ポート１０４に接続される動員材リザーバに作用する圧力を設定して、ポート１０４を通じてチャネル１０５，１１４に入ってオリフィス１１６でチップから出る１００ｎＬ／分の動員材溶液の流れを確立する。オリフィス１１６は、質量分析計のＥＳＩ注入口１３１５から２ｍｍ離れて位置付けられる。電源１３０７が電流制御を使用して０μＡに設定され、電源１３０５が７０００Ｖに設定され、電源１３１０が４０００Ｖに設定され、また、ＭＳ  ＥＳＩイオン源１３１５がグランドに保持される。図１３Ｂに示されるように、更なるレジスタＲ１２０が電源１３１０とチャネル１０５（Ｒ電流シンク）との間の系に接続され、また、レジスタＲ１２０の反対側が電源１３２０に接続される。電源１３２０は、電流シンクとして作用するために電源１３１０よりも最低４０００Ｖ低く設定される。レジスタＲ１２０は、代わりに、図１３Ａの場合のように電気回路をグランドに接続することができ、図１３Ｃに示されるように電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）となることができ、図１３Ｄに示されるようにバイポーラ接合トランジスタ（ＢＪＴ）となることができ、又は、機能する電気泳動回路を形成するべく電源１３１０から電流をシンクすることができる任意の他の抵抗素子となり得る。
【０１６０】
圧力駆動流が動員材をポート１０４からオリフィス１１６へ方向付ける一方で、動員材試薬中のギ酸の一部がチャネル１０５からチャネル１１２を通ってポート１０８のアノードにギ酸塩の形態で電気泳動する。ギ酸塩がチャネル１１２を通って移動するにつれて、ギ酸塩は、等電ｐＨ勾配を乱し、それにより、両性電解質、標準、及び、検体サンプルは、電荷を増大させるとともに、電気泳動的にチャネル１１２からチャネル１１４へ移動し、ここで、ポート１１０からの圧力駆動流がそれらをオリフィス１１６からＥＳＩスプレーに運ぶ。
【０１６１】
動員が発生している間、チャネル１１２の抵抗が低下する。チャネル１１１の全体にわたる電圧降下がこの時点で０であるため（ΔＶ＝ＩＲ＝０＊Ｒ１１１＝０Ｖ）、０μＡに設定される電源１３０７はＶ１１６の電圧に等しい。図１１Ａ〜図１１Ｂのデータに示されるように、ソフトウェアは、図１２に記載されるように、電流の変化を監視し、電源を調整して、アノードとカソードとの間で３０００Ｖの一定の電圧降下を維持するとともにチップ１１６で３０００ボルトを維持する。チップの電圧（Ｖ１１６）は式２によって表される。
【０１６２】
Ｖ１１６＝ΔＶ１０８−１１０＊（Ｒ１１１）／（Ｒ１０９＋Ｒ１１２＋Ｒ１０５）＋（電源１３１０電圧設定）。
【０１６３】
動員が発生している間、ソフトウェアは、吸光度画像を捕捉し続けてピークを特定し、それにより、撮像チャネル１１２からチャネル１１４へのピークの移動を追跡する。各ピークが撮像チャネル１１２から離れる時間、その速度、及び、チャネル１１４内の流量を追跡することにより、ソフトウェアは、ピークがチャネル１１４を横切ってオリフィス１１６を介して質量分析計に導入される時間を計算でき、それにより、当初の集束ピークと結果として生じる質量スペクトルとの間の直接的な相関が可能となる。例えば、図１６Ｂは、図１６Ａに示されるエレクトロフェログラムの酸性ピークに含まれた、質量分析計にエレクトロスプレーされるグリコフォームの質量を示す。図１６Ｃは、図１６Ａからの主要なインフリキシマブピークにおけるグリコフォームの質量を示す。図１６Ｄ及び図１６Ｅは、図１６Ａに示されるエレクトロフェログラムからの基本ピークの質量を示す。
【０１６４】
実施例８−２ステップキャピラリーＩＥＦで電界強度及び一定電圧を維持するために高電圧及び低電圧を変更する
実施例８では、図１４Ａに概説されるように、２ステップＩＥＦ（等電点電気泳動とそれに続く動員）が、６０ｃｍキャピラリーで実行され、接合噴霧器を介してＥＳＩ−ＭＳへ動員される。分離キャピラリー１８０８が陽極液バイアル１８０６中に浸漬される。高電圧電源１８０２が電極１８０４を介して陽極液バイアル１８０６に接続される。キャピラリー１８０８の他端部は、ティーユニオン１８１２を介して接合噴霧器１８１４に接続される。キャピラリー１８０８は、キャピラリー出口がＥＳＩチップ１８２４に近接するように接合噴霧器１８１４に挿入される。ティーユニオン１８１２の第３のアームは、加圧された動員材バイアル１８１８中に浸漬される動員材キャピラリー１８１６に接続される。また、加圧された動員材バイアル１８１８は、それが電流シンクとして作用するように電極１８１７を介して接地される。更に、接合噴霧器１８１４は、噴霧器１８１４の外側に接続する配線１８２０を介して電源１８１０に接続される。この例では、質量分析計のイオン源がグランドに保持される。
【０１６５】
試薬は以下のように調製される。陽極液バイアル１８０６には水中に１％ギ酸が充填され、分離キャピラリー１８０８には水性サンプル（２５０μｇ／ｍＬ  ＮＩＳＴ  ｍＡｂ、１．５％Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ  ５−８両性電解質、１．５％Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ  ８−１０．５、５  ｍｇ／ｍＬ  ｐＩ標準７．００及び１０．１７）が充填され、接合噴霧器チャンバ１８２６及び動員材キャピラリー１８１６には水中に１％ジエチルアミンが充填され、加圧動員材バイアル１８１８には１％ギ酸、５０％アセトニトリル、及び、４９％水が充填される。
【０１６６】
この例では、質量分析計のイオン源がグランドに保持される。集束を開始するために、電源１８０２が＋３０ｋＶに設定され、電源１８１０が４ｋＶに設定される。そして、動員材バイアル１８１８からの圧力駆動流が１００ｎＬ／分で開始される。このようにして、ＥＳＩが接合噴霧器キャビティ１８２６でジエチルアミンを使用して開始され、ジエチルアミンは等電点電気泳動ステップのための陰極液としても作用する。
【０１６７】
キャピラリー１８０８で集束が進行するにつれて、サンプルは電荷運搬能力を失い、キャピラリー１８０８で抵抗が増大する。ＥＳＩチップがキャピラリー１８０８とチャンバ１８２６内のジエチルアミンとの間に電気的に位置付けられると（図１４Ｂ参照）、ＥＳＩチップ電圧（Ｖ１８２４）は式３にしたがって低下する。
【０１６８】
Ｖ１８２４＝ΔＶ１８０６−１８１４＊Ｒ１８２６／（Ｒ１８０８＋Ｒ１８２６）＋Ｖ１８１４
更に、キャピラリー１８０８の抵抗が増大するにつれて、電源１８０２で測定され得るキャピラリーを通過する電流が減少する。増大した電流は、式４によってキャピラリー１８０８の抵抗変化に直接に関連付けられる。
【０１６９】
Ｉ１８０６＝ΔＶ１８０６−１８１４／（Ｒ１８０８＋Ｒ１８２６）
図１２に記載されるようなコンピュータ制御フィードバックループを使用して、システムは、キャピラリー１８０８の抵抗の変化（したがって、ＥＳＩチップ１８２４における電圧を規定するキャピラリー１８０８の全体にわたる電圧降下の変化）を計算することができ、システムは、２６ｋＶのΔＶを保持するとともに４０００ｋＶのＥＳＩチップ電圧を維持するべく電源１８０２，１８１０を調整できる。
【０１７０】
集束が完了した後（約３０分）、加圧動員材バイアル１８１８内の動員材溶液は接合噴霧器チャンバ１８２６内のジエチルアミンに取って代わってしまっており、それにより、キャピラリー１８０８内のＮＩＳＴ  ｍＡｂタンパク質アイソフォームの動員が開始される。同様の態様であるが等電点電気泳動とは反対に、動員が進むにつれて、キャピラリー１８０８の抵抗が低下し、それにより、ＥＳＩチップ１８２４の電圧に影響が及ぶ。この場合も、コンピュータ制御のフィードバックループは、式３及び式４を使用して、ＥＳＩチップ１８２４の電圧を４ｋＶに維持しつつ２６ｋＶの電界を維持するために電源１８０２，１８１０に必要な変化を計算する。
【０１７１】
本発明の好ましい実施形態について図示して本明細書中で説明してきたが、当業者に明らかなように、そのような実施形態は単なる一例として提供されている。本発明から逸脱することなく、数多くの変形、変更、及び、置換が当業者に想起され得る。本明細書中に記載される本発明の実施形態の様々な代替物を本発明を実施する際に任意に組み合わせて使用できることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を規定し、それによって、これらの特許請求の範囲内の方法及び構造並びにそれらの均等物が網羅されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
2021525861.tif 000014
【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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