(57)【要約】本発明は、光活性化可能化合物ならびに結合部位およびＲＮＡ転写産物に関する他の構造情報を決定するためのその使用方法に関する。本発明はまた、化合物に結合するのでドラッガブルであるＲＮＡ転写産物を同定する方法、薬物候補をスクリーニングする方法、ならびに標的ＲＮＡ上の薬物結合部位および／またはアクセス可能もしくは反応性部位を決定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記方法は、サブサイト結合を同定することにより結合部位マップをアセンブルして、生化学的作用様式を詳説することを可能にする。
2021505132.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの化合物：
【化９８】
2021505132.tif 000124
［式中、リガンドは、小分子ＲＮＡバインダーであり；
Ｔ１は、二価テザー基であり；および
Ｒｍｏｄは、光活性化可能基である］またはその薬学的に許容され得る塩。
【請求項２】
式ＩＩの化合物：
【化９９】
2021505132.tif 000125
［式中、
リガンドは、小分子ＲＮＡバインダーであり；
Ｔ１は、二価テザー基であり；
Ｔ２は、共有結合または二価テザー基であり；
Ｒｍｏｄは、光活性化可能基であり；および
ＲＣＧは、クリック可能基またはプルダウン基である］またはその薬学的に許容され得る塩。
【請求項３】
式ＩＩＩの化合物：
【化１００】
2021505132.tif 000126
［式中、
リガンドは、小分子ＲＮＡバインダーであり；
Ｔ１は、三価テザー基であり；
Ｔ２は、二価テザー基であり；
Ｒｍｏｄは、光活性化可能基であり；および
ＲＣＧは、クリック可能基またはプルダウン基である］またはその薬学的に許容され得る塩。
【請求項４】
式ＩＩ−ａの化合物：
【化１０１】
2021505132.tif 000127
［式中、
リガンドは、小分子ＲＮＡバインダーであり；
Ｔ１は、共有結合または二価テザー基であり；
Ｔ２は、共有結合または二価テザー基であり；
Ｒｍｏｄは、光活性化可能基であり；および
ＲＣＧは、クリック可能基またはプルダウン基である］またはその薬学的に許容され得る塩。
【請求項５】
式ＩＩ−ｂまたはＩＩ−ｃの化合物：
【化１０２】
2021505132.tif 000128
［式中、
リガンドは、小分子ＲＮＡバインダーであり；
Ｔ１は、二価テザー基であり；
Ｒｍｏｄは、光活性化可能基であり；および
ＲＣＧは、クリック可能基またはプルダウン基である］またはその薬学的に許容され得る塩。
【請求項６】
リガンドが、ヘテロアリールジヒドロピリミジン（ＨＡＰ）、マクロライド、アルカロイド、アミノグリコシド、テトラサイクリン、ＳＭＮ２リガンド、プレウロムチリン、テオフィリンもしくはその類似体、リボシルもしくはその類似体、置換アントラセン、置換トリプチセン、オキサゾリジノンまたはＣＰＮＱもしくはその類似体から選択され；リガンドが１個またはそれを超える置換基で必要に応じて置換されてもよい、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
リガンドが、必要に応じて置換されたヘテロアリールジヒドロピリミジン（ＨＡＰ）、エリスロマイシン、アジスロマイシン、ベルベリン、パルマチン、パロモマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、ドキシサイクリン、オキシテトラサイクリン、プレウロムチリン、テオフィリンもしくはその類似体、リボシルもしくはその類似体、ＬＭＩ０７０（ＮＶＳ−ＳＭ１）、置換トリプチセン、リネゾリド、テジゾリドまたはＣＰＮＱもしくはその類似体から選択され；リガンドが１、２、３または４個の置換基で必要に応じて置換されてもよい、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
Ｔ１がＣ１−２０二価直鎖状または分枝状炭化水素鎖から選択され、ここで、前記鎖の１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のメチレン単位が独立して、天然もしくは非天然アミノ酸、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＳＯ２−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｓ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）−または−Ｃｙ−で必要に応じて置き換えられており；ならびに前記鎖の１〜２０個の前記メチレン単位が独立して、−ＯＣＨ２ＣＨ２−で必要に応じて置き換えられており；
ここで、各−Ｃｙ−が独立して、二価の必要に応じて置換された３〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式炭素環、必要に応じて置換されたフェニレン、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜３個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された４〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式複素環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された５〜６員単環式ヘテロ芳香環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された８〜１０員二環式もしくは架橋二環式飽和もしくは部分不飽和複素環、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された８〜１０員二環式もしくは架橋二環式ヘテロ芳香環であり；ならびに
各Ｒが独立して水素であるか、またはＣ１−６脂肪族、３〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式炭素環、フェニル、８〜１０員二環式芳香族炭素環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式複素環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員単環式ヘテロ芳香環、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する８〜１０員二環式ヘテロ芳香環から選択される必要に応じて置換された基である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
Ｔ１がＣ１−１０二価直鎖状または分枝状炭化水素鎖から選択され、ここで、前記鎖の１、２、３、４または５個のメチレン単位が独立して、天然もしくは非天然アミノ酸、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＳＯ２−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｓ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）−または−Ｃｙ−で必要に応じて置き換えられており；ならびに前記鎖の１、２、３、４または５個の前記メチレン単位が独立して、−ＯＣＨ２ＣＨ２−で必要に応じて置き換えられている、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｔ２がＣ１−２０二価直鎖状または分枝状炭化水素鎖から選択され、ここで、前記鎖の１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のメチレン単位が独立して、天然もしくは非天然アミノ酸、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＳＯ２−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｓ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）−または−Ｃｙ−で必要に応じて置き換えられており；ならびに前記鎖の１〜２０個の前記メチレン単位が独立して、−ＯＣＨ２ＣＨ２−で必要に応じて置き換えられており；
ここで、各−Ｃｙ−が独立して、二価の必要に応じて置換された３〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式炭素環、必要に応じて置換されたフェニレン、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜３個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された４〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式複素環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された５〜６員単環式ヘテロ芳香環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された８〜１０員二環式もしくは架橋二環式飽和もしくは部分不飽和複素環、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された８〜１０員二環式もしくは架橋二環式ヘテロ芳香環であり；ならびに
各Ｒが独立して水素であるか、またはＣ１−６脂肪族、３〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式炭素環、フェニル、８〜１０員二環式芳香族炭素環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式複素環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員単環式ヘテロ芳香環、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する８〜１０員二環式ヘテロ芳香環から選択される必要に応じて置換された基である、請求項２〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒｍｏｄが、紫外線（ＵＶ）を照射されると、ラジカル、アリールもしくはヘテロアリールカルボカチオン、ニトレンまたはカルベン中間体を生成する官能基から選択され；Ｒｍｏｄが、照射されると、リガンドが結合する標的ＲＮＡと反応して前記標的ＲＮＡとの共有結合をもたらすことができる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒｍｏｄが、必要に応じて置換されたフェニルもしくは８〜１０員二環式芳香族炭素環式アジドもしくは５〜８員ヘテロアリールもしくは８〜１０員二環式ヘテロアリールアジド、必要に応じて置換されたベンゾイルアジドもしくは５〜８員ヘテロアロイルアジドもしくは８〜１０員ヘテロアロイルアジド［ここで、前記環原子の１〜３個の原子は窒素、硫黄または酸素から選択される］、必要に応じて置換されたフェニルもしくは８〜１０員二環式芳香族炭素環式ジアゾニウム塩、必要に応じて置換された５〜８員ヘテロアリールもしくは８〜１０員二環式ヘテロアリールジアゾニウム塩［ここで、前記環原子の１〜３個の原子は窒素、硫黄または酸素から選択される］、必要に応じて置換されたＣ２−６脂肪族ジアゾ官能基、必要に応じて置換されたＣ２−６脂肪族ジアジリン、または必要に応じて置換されたジフェニルもしくは８〜１０員ジヘテロアリールケトン［ここで、前記環原子の１〜３個の原子は窒素、硫黄または酸素から選択される］、必要に応じて置換されたジヒドロピレン、必要に応じて置換されたスピロオキサジン、必要に応じて置換されたアントラセン、必要に応じて置換されたフルギド、または必要に応じて置換されたスピロピランから選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒｍｏｄが、
【化１０３】
2021505132.tif 000129
【化１０４】
2021505132.tif 000130
［式中、Ｙ−は、薬学的に許容され得るアニオンである］から選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１４】
式Ｘ−ａの化合物：
【化１０５】
2021505132.tif 000131
［式中、
Ａｒ１は、必要に応じて置換されたフェニル、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された５〜６員単環式ヘテロ芳香環であり；
Ａｒ２は、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された５〜６員単環式ヘテロ芳香環、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された８〜１０員二環式ヘテロ芳香環であり；
Ｘは、二価Ｃ１−３アルキレン鎖から選択され、ここで、前記鎖の１〜２個のメチレン単位は独立して、−Ｏ−、−ＮＲ６−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＯ２−、−ＣＳ−、−Ｃ（ＮＲ６）−、−Ｓ（Ｏ）−または−Ｓ（Ｏ）２−で必要に応じて置き換えられており；
Ｒ１は、−Ｃ（Ｏ）Ｒ６、−ＣＯ２Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｃ１−６脂肪族、−ＣＮ、−（ＣＨ２）１−３ＯＲ、−（ＣＨ２）１−３ＮＨＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ６、−Ｎ（Ｒ６）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＯＲ、−ＮＨＲ６または−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＮＨＲから選択され；
Ｒ３が非存在である場合には、Ｒ２は、クリック可能基を必要に応じて含む光活性化可能基であり；
Ｒ３は非存在であるか、またはクリック可能基もしくはプルダウン基であり；
各Ｒ６は独立して水素であるか、または１、２、３、４、５もしくは６個のジュウテリウムもしくはハロゲン原子で必要に応じて置換されたＣ１−６アルキルであり；
各Ｒは独立して水素であるか、またはＣ１−６脂肪族、３〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式炭素環、フェニル、８〜１０員二環式芳香族炭素環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式複素環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員単環式ヘテロ芳香環、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する８〜１０員二環式ヘテロ芳香環から選択される必要に応じて置換された基であり；
Ｌ１は、Ｃ１−２０二価、三価または四価直鎖状または分枝状炭化水素鎖であり、ここで、前記鎖の１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のメチレン単位は独立して、天然もしくは非天然アミノ酸、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＳＯ２−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｓ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）−または−Ｃｙ−で必要に応じて置き換えられており；ならびに前記鎖の１〜２０個の前記メチレン単位は独立して、−ＯＣＨ２ＣＨ２−で必要に応じて置き換えられており；
各−Ｃｙ−は独立して、二価の必要に応じて置換された３〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式炭素環、必要に応じて置換されたフェニレン、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜３個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された４〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式複素環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された５〜６員単環式ヘテロ芳香環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された８〜１０員二環式もしくは架橋二環式飽和もしくは部分不飽和複素環、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された８〜１０員二環式もしくは架橋二環式ヘテロ芳香環であり；ならびに
ｎは、０または１である］またはその互変異性体もしくは薬学的に許容され得る塩。
【請求項１５】
式Ｘ−ｂの化合物：
【化１０６】
2021505132.tif 000132
［式中、
Ａｒ１は、必要に応じて置換されたフェニル、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された５〜６員単環式ヘテロ芳香環であり；
Ａｒ２は、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された５〜６員単環式ヘテロ芳香環、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された８〜１０員二環式ヘテロ芳香環であり；
ここで、Ａｒ１またはＡｒ２のうちの一方は、１個のＲ２で置換されており；
Ｘは、二価Ｃ１−３アルキレン鎖から選択され、ここで、前記鎖の１〜２個のメチレン単位は独立して、−Ｏ−、−ＮＲ６−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＯ２−、−ＣＳ−、−Ｃ（ＮＲ６）−、−Ｓ（Ｏ）−または−Ｓ（Ｏ）２−で必要に応じて置き換えられており；
Ｒ１は、−Ｃ（Ｏ）Ｒ６、−ＣＯ２Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｃ１−６脂肪族、−ＣＮ、−（ＣＨ２）１−３ＯＲ、−（ＣＨ２）１−３ＮＨＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ６、−Ｎ（Ｒ６）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＯＲ、−ＮＨＲ６または−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＮＨＲから選択され；
Ｒ３が非存在である場合には、Ｒ２は、クリック可能基を必要に応じて含む光活性化可能基であり；
Ｒ３は非存在であるか、またはクリック可能基もしくはプルダウン基であり；
各Ｒ６は独立して水素であるか、または１、２、３、４、５もしくは６個のジュウテリウムもしくはハロゲン原子で必要に応じて置換されたＣ１−６アルキルであり；
各Ｒは独立して水素であるか、またはＣ１−６脂肪族、３〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式炭素環、フェニル、８〜１０員二環式芳香族炭素環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式複素環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員単環式ヘテロ芳香環、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する８〜１０員二環式ヘテロ芳香環から選択される必要に応じて置換された基であり；
Ｌ１は、Ｃ１−２０二価または三価直鎖状または分枝状炭化水素鎖であり、ここで、前記鎖の１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のメチレン単位は独立して、天然もしくは非天然アミノ酸、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＳＯ２−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｓ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）−または−Ｃｙ−で必要に応じて置き換えられており；ならびに前記鎖の１〜２０個の前記メチレン単位は独立して、−ＯＣＨ２ＣＨ２−で必要に応じて置き換えられており；
各−Ｃｙ−は独立して、二価の必要に応じて置換された３〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式炭素環、必要に応じて置換されたフェニレン、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜３個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された４〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式複素環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された５〜６員単環式ヘテロ芳香環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された８〜１０員二環式もしくは架橋二環式飽和もしくは部分不飽和複素環、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された８〜１０員二環式もしくは架橋二環式ヘテロ芳香環であり；ならびに
ｎは、０または１である］またはその互変異性体もしくは薬学的に許容され得る塩。
【請求項１６】
Ｒ２が、必要に応じて置換されたフェニルもしくは８〜１０員二環式芳香族炭素環式アジドもしくは５〜８員ヘテロアリールもしくは８〜１０員二環式ヘテロアリールアジド、必要に応じて置換されたベンゾイルアジドもしくは５〜８員ヘテロアロイルアジドもしくは８〜１０員ヘテロアロイルアジド［ここで、前記環原子の１〜３個の原子は窒素、硫黄または酸素から選択される］、必要に応じて置換されたフェニルもしくは８〜１０員二環式芳香族炭素環式ジアゾニウム塩、必要に応じて置換された５〜８員ヘテロアリールもしくは８〜１０員二環式ヘテロアリールジアゾニウム塩［ここで、前記環原子の１〜３個の原子は窒素、硫黄または酸素から選択される］、必要に応じて置換されたＣ２−６脂肪族ジアゾ官能基、必要に応じて置換されたＣ２−６脂肪族ジアジリン、または必要に応じて置換されたジフェニルもしくは８〜１０員ジヘテロアリールケトン［ここで、前記環原子の１〜３個の原子は窒素、硫黄または酸素から選択される］、必要に応じて置換されたジヒドロピレン、必要に応じて置換されたスピロオキサジン、必要に応じて置換されたアントラセン、必要に応じて置換されたフルギド、必要に応じて置換されたスピロピラン、必要に応じて置換されたα−ピロンまたは必要に応じて置換されたピリミドンから選択される、請求項１４または１５に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｒ２が、
【化１０７】
2021505132.tif 000133
［式中、Ｙ−は、薬学的に許容され得るアニオンである］から選択される、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１８】
Ｒ３が、アジド、アルキン、４−ジベンゾシクロオクチノール（ＤＩＢＯ）、ｇｅｍ−二フッ化シクロオクチン（ＤＩＦＯまたはＤＦＯ）、ビアリールアザシクロオクチノン（ＢＡＲＡＣ）、ビシクロノニン（ＢＣＮ）、歪みシクロオクチン、オキシム、オキサノルボルナジエンまたはビオチンである、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１９】
前記化合物が、式ＸＩＩＩ：
【化１０８】
2021505132.tif 000134
の化合物である、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の化合物またはその互変異性体もしくは薬学的に許容され得る塩。
【請求項２０】
前記化合物が、式ＸＩＶ：
【化１０９】
2021505132.tif 000135
［式中、Ｘ、Ｌ１、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ６、Ｒ、−Ｃｙ−およびｎはそれぞれ、単独および組み合わせの両方で、上記で定義され、本明細書の実施形態に記載されるとおりである］の化合物である、請求項１４または１６〜１８のいずれか一項に記載の化合物またはその互変異性体もしくは薬学的に許容され得る塩。
【請求項２１】
前記化合物が、式ＸＶ：
【化１１０】
2021505132.tif 000136
の化合物である、請求項１４または１６〜１８のいずれか一項に記載の化合物またはその互変異性体もしくは薬学的に許容され得る塩。
【請求項２２】
前記化合物が、式ＸＶＩ、ＸＶＩＩ、ＸＶＩＩＩまたはＸＩＸ：
【化１１１】
2021505132.tif 000137
の化合物である、請求項１４または１６〜１８のいずれか一項に記載の化合物またはその互変異性体もしくは薬学的に許容され得る塩。
【請求項２３】
表５に記載されているもののうちの１つから選択される、化合物またはその互変異性体もしくは薬学的に許容され得る塩。
【請求項２４】
式ＸＸＶの化合物：
【化１１２】
2021505132.tif 000138
［式中、
Ａｒ１は、必要に応じて置換されたフェニル、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された５〜６員単環式ヘテロ芳香環であり；
Ａｒ３は、必要に応じて置換されたフェニル、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された５〜６員単環式ヘテロ芳香環、必要に応じて置換された８〜１２員二環式芳香環、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された８〜１０員二環式ヘテロ芳香環であり；
Ｘは、二価Ｃ１−３アルキレン鎖から選択され、ここで、前記鎖の１〜２個のメチレン単位は独立して、−Ｏ−、−ＮＲ６−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＯ２−、−ＣＳ−、−Ｃ（ＮＲ６）−、−Ｓ（Ｏ）−または−Ｓ（Ｏ）２−で必要に応じて置き換えられており；
Ｘ２は、二価Ｃ１−３アルキレン鎖から選択され、ここで、前記鎖の１〜２個のメチレン単位は独立して、−Ｏ−、−ＮＲ６−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＯ２−、−ＣＳ−、−Ｃ（ＮＲ６）−、−Ｓ（Ｏ）−または−Ｓ（Ｏ）２−で必要に応じて置き換えられており；
Ｒ３が非存在である場合には、Ｒ２は、クリック可能基を必要に応じて含む光活性化可能基であり；
Ｒ３は非存在であるか、またはクリック可能基もしくはプルダウン基であり；
各Ｒ４は独立して、Ｒ、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒもしくは−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２であるか；または２つの場合のＲ４は、それらが結合している原子と一緒になって、Ｃ４−８部分不飽和炭素環を形成してもよく；
各Ｒ５は独立して、Ｒ、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒもしくは−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２であるか；または２つの場合のＲ５は一緒になって、＝Ｏもしくは＝Ｓを形成してもよく；
各Ｒ６は独立して水素であるか、または１、２、３、４、５もしくは６個のジュウテリウムもしくはハロゲン原子で必要に応じて置換されたＣ１−６アルキルであり；
各Ｒは独立して水素であるか、またはＣ１−６脂肪族、３〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式炭素環、フェニル、８〜１０員二環式芳香族炭素環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式複素環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員単環式ヘテロ芳香環、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する８〜１０員二環式ヘテロ芳香環から選択される必要に応じて置換された基であり；
Ｌ２は、Ｃ１−２０二価または三価直鎖状または分枝状の必要に応じて置換された炭化水素鎖であり、ここで、前記鎖の１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のメチレン単位は独立して、天然もしくは非天然アミノ酸、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＳＯ２−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｓ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）−または−Ｃｙ−で必要に応じて置き換えられており；ならびに前記鎖の１〜２０個の前記メチレン単位は独立して、−ＯＣＨ２ＣＨ２−で必要に応じて置き換えられており；
各−Ｃｙ−は独立して、二価の必要に応じて置換された３〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式炭素環、必要に応じて置換されたフェニレン、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜３個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された４〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式複素環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された５〜６員単環式ヘテロ芳香環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された８〜１０員二環式もしくは架橋二環式飽和もしくは部分不飽和複素環、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された８〜１０員二環式もしくは架橋二環式ヘテロ芳香環であり；
ｍは、０、１、２、３または４であり；ならびに
ｐは、０、１、２、３または４である］またはその薬学的に許容され得る塩。
【請求項２５】
式ＸＸＶＩの化合物：
【化１１３】
2021505132.tif 000139
［式中、
Ａｒ１は、必要に応じて置換されたフェニル、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された５〜６員単環式ヘテロ芳香環であり；
Ａｒ３は、必要に応じて置換されたフェニル、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された５〜６員単環式ヘテロ芳香環、必要に応じて置換された８〜１２員二環式芳香環、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された８〜１０員二環式ヘテロ芳香環であり；
Ｘは、二価Ｃ１−３アルキレン鎖から選択され、ここで、前記鎖の１〜２個のメチレン単位は独立して、−Ｏ−、−ＮＲ６−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＯ２−、−ＣＳ−、−Ｃ（ＮＲ６）−、−Ｓ（Ｏ）−または−Ｓ（Ｏ）２−で必要に応じて置き換えられており；
Ｘ２は、二価Ｃ１−３アルキレン鎖から選択され、ここで、前記鎖の１〜２個のメチレン単位は独立して、−Ｏ−、−ＮＲ６−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＯ２−、−ＣＳ−、−Ｃ（ＮＲ６）−、−Ｓ（Ｏ）−または−Ｓ（Ｏ）２−で必要に応じて置き換えられており；
Ｒ３が非存在である場合には、Ｒ２は、クリック可能基を必要に応じて含む光活性化可能基であり；
Ｒ３は非存在であるか、またはクリック可能基もしくはプルダウン基であり；
各Ｒ４は独立して、Ｒ、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒもしくは−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２であるか；または２つの場合のＲ４は、それらが結合している原子と一緒になって、Ｃ４−８部分不飽和炭素環を形成してもよく；
各Ｒ５は独立して、Ｒ、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒもしくは−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２であるか；または２つの場合のＲ５は一緒になって、＝Ｏもしくは＝Ｓを形成してもよく；
各Ｒ６は独立して水素であるか、または１、２、３、４、５もしくは６個のジュウテリウムもしくはハロゲン原子で必要に応じて置換されたＣ１−６アルキルであり；
各Ｒ７は独立して、Ｒ、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒもしくは−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２であるか；または２つの場合のＲ４は、それらが結合している原子と一緒になって、Ｃ４−８部分不飽和炭素環を形成してもよく；
各Ｒは独立して水素であるか、またはＣ１−６脂肪族、３〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式炭素環、フェニル、８〜１０員二環式芳香族炭素環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式複素環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員単環式ヘテロ芳香環、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する８〜１０員二環式ヘテロ芳香環から選択される必要に応じて置換された基であり；
Ｌ２は、Ｃ１−２０二価または三価直鎖状または分枝状の必要に応じて置換された炭化水素鎖であり、ここで、前記鎖の１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のメチレン単位は独立して、天然もしくは非天然アミノ酸、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＳＯ２−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｓ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）−または−Ｃｙ−で必要に応じて置き換えられており；ならびに前記鎖の１〜２０個の前記メチレン単位は独立して、−ＯＣＨ２ＣＨ２−で必要に応じて置き換えられており；
各−Ｃｙ−は独立して、二価の必要に応じて置換された３〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式炭素環、必要に応じて置換されたフェニレン、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜３個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された４〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式複素環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された５〜６員単環式ヘテロ芳香環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された８〜１０員二環式もしくは架橋二環式飽和もしくは部分不飽和複素環、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された８〜１０員二環式もしくは架橋二環式ヘテロ芳香環であり；
ｍは、０、１、２、３または４であり；ならびに
ｐは、０、１、２、３または４である］またはその薬学的に許容され得る塩。
【請求項２６】
Ａｒ１が、ハロゲン、−Ｃ１−６脂肪族、−ＣＮ、−ＯＲ、−ＮＲ２、−ＣＯ２Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−ＳＲまたは−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２から選択される１、２、３または４個の置換基で必要に応じて置換されたフェニルである、請求項２４または２５に記載の化合物。
【請求項２７】
Ａｒ３が、ハロゲン、−Ｃ１−６脂肪族、−ＣＮ、−ＯＲ、−ＮＲ２、−ＣＯ２Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−ＳＲまたは−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２から選択される１、２、３または４個の置換基で必要に応じて置換されたフェニルである、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２８】
Ｘが二価Ｃ１−３アルキレン鎖であり、ここで、前記鎖の１〜２個のメチレン単位が独立して、−Ｏ−、−ＮＲ６−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＯ２−、−ＣＳ−、−Ｃ（ＮＲ６）−、−Ｓ（Ｏ）−または−Ｓ（Ｏ）２−で必要に応じて置き換えられている、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２９】
Ｘ２が二価Ｃ１−２アルキレン鎖であり、ここで、前記鎖の１個のメチレン単位が、−Ｏ−、−ＮＲ６−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＯ２−、−ＣＳ−、−Ｃ（ＮＲ６）−、−Ｓ（Ｏ）−または−Ｓ（Ｏ）２−で必要に応じて置き換えられている、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３０】
Ｒ４が、水素、Ｃ１−６脂肪族、３〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式炭素環、フェニル、８〜１０員二環式芳香族炭素環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式複素環；窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員単環式ヘテロ芳香環；窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する８〜１０員二環式ヘテロ芳香環；ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−ＯＣ（Ｏ）Ｒまたは−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒである、請求項２４〜２９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３１】
Ｒ５が、水素、Ｃ１−６脂肪族、３〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式炭素環、フェニル、８〜１０員二環式芳香族炭素環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式複素環；窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員単環式ヘテロ芳香環；窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する８〜１０員二環式ヘテロ芳香環；ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−ＯＣ（Ｏ）Ｒまたは−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒである、請求項２４〜３０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３２】
Ｌ２がＣ１−２０二価または三価直鎖状または分枝状の必要に応じて置換された炭化水素鎖であり、ここで、前記鎖の１、２、３、４または５個のメチレン単位が独立して、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−Ｃ（Ｓ）−または−Ｃｙ−で必要に応じて置き換えられており；ならびに前記鎖の１〜２０個の前記メチレン単位が独立して、−ＯＣＨ２ＣＨ２−で必要に応じて置き換えられている、請求項２４〜３１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３３】
Ｒ２が、
【化１１４】
2021505132.tif 000140
［式中、Ｙ−は、薬学的に許容され得るアニオンである］から選択される、請求項２４〜３２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３４】
Ｒ３が、Ｃ１−６アルキルアジド、Ｃ１−６アルキンまたはハプテンである、請求項２４〜３３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３５】
前記化合物が、式ＸＸＩＸ、ＸＸＸ、ＸＸＸＩ、ＸＸＸＩＩまたはＸＸＸＩＩＩ：
【化１１５】
2021505132.tif 000141
の化合物である、請求項２４に記載の化合物またはその薬学的に許容され得る塩。
【請求項３６】
前記化合物が、式ＸＸＸＶＩＩＩ、ＸＸＸＩＸ、ＸＬ、ＸＬＩまたはＸＬＩＩ：
【化１１６】
2021505132.tif 000142
【化１１７】
2021505132.tif 000143
の化合物である、請求項２５に記載の化合物またはその薬学的に許容され得る塩。
【請求項３７】
Ｒ７が、水素、Ｃ１−６脂肪族、３〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式炭素環、フェニル、８〜１０員二環式芳香族炭素環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式複素環；窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員単環式ヘテロ芳香環；窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する８〜１０員二環式ヘテロ芳香環；ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−ＯＣ（Ｏ）Ｒまたは−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒである、請求項２５に記載の化合物。
【請求項３８】
標的ＲＮＡと請求項１〜３７のいずれか一項に記載の化合物とを含むＲＮＡコンジュゲートであって、ＲｍｏｄまたはＲ２が前記標的ＲＮＡと共有結合を形成する、ＲＮＡコンジュゲート。
【請求項３９】
標的核酸におけるヌクレオチドの三次元構造、目的のリガンドの結合部位またはアクセシビリティを決定する方法であって、前記標的核酸を請求項１〜３７のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容され得る塩と接触させること；前記化合物を照射すること；前記核酸のヌクレオチドの共有結合的改変が起こったかを決定すること；および必要に応じて、ヌクレオチド改変のパターン、前記三次元構造、リガンド結合部位または前記核酸に関する他の構造情報を取得することを含む、方法。
【請求項４０】
核酸コンジュゲートを調製する方法であって、標的核酸を請求項１〜３７のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容され得る塩と接触させること；前記化合物を照射すること；および必要に応じて、アフィニティーアッセイ、プルダウン法により、得られた核酸コンジュゲートを単離することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、光活性化可能化合物、ならびにこのような化合物に結合するのでドラッガブル（ｄｒｕｇｇａｂｌｅ）であるＲＮＡ転写産物を同定するためのその使用方法、薬物候補をスクリーニングする方法、ならびに標的ＲＮＡ上の薬物結合部位および／または反応性部位（単数もしくは複数）を決定する方法に関する。本発明はまた、ＲＮＡ転写産物の生物学をモジュレートして様々な疾患および症状を処置するための方法を提供する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条第（ｅ）項目の下で、２０１７年１１月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／５９３，１７５号（この全体は、参照により本明細書に組み込まれる）の利益を主張する。
【０００３】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表であって、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１８年１１月３０日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、３９４４５７＿００３ＷＯ＿１６３９９１＿ＳＬ＿ＳＴ２５．ＴＸＴという名称であり、４６，３２４バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
リボ核酸（ＲＮＡ）は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のタンパク質コードセクションがＲＮＡに転写された後にそれがタンパク質に翻訳される際の、遺伝子とタンパク質との間の一過性の中間物に過ぎないと従来考えられてきた。ＲＮＡは規定の三次構造を欠くと考えられ、たとえ三次構造が存在した場合でも、それは一過性のメッセンジャーとしてのＲＮＡの機能にはほとんど関連しないと考えられていた。この理解は、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）を含むＲＮＡが細胞内で数多くの重要な調節的役割を果たしており、またＲＮＡは複雑な規定された機能的に必須の三次構造を有し得るという認識により疑問を投げかけられている。
【０００５】
すべての内因性哺乳動物疾患は、究極的にはトランスクリプトームにより媒介される。メッセンジャーｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ）はトランスクリプトームの一部分であり、すべてのタンパク質発現はｍＲＮＡに由来するという限りにおいて、関連タンパク質の発現をモジュレートすることにより、そして次に、対応する上流ｍＲＮＡの翻訳をモジュレートすることにより、タンパク質媒介性疾患に介入し得る可能性がある。しかし、ｍＲＮＡは、トランスクリプトームの小さな部分に過ぎない：（限定されないが）ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｃｅＲＮＡおよび偽遺伝子を含む他の転写ＲＮＡもまた、ＲＮＡ構造物（例えば、リボ核タンパク質）の構造および機能により直接的に、ならびにタンパク質の発現および作用を介して、細胞の生物学を調節する。このレベルで介入する薬物は、任意のおよびすべての細胞プロセスをモジュレートする可能性がある。アンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡなどの既存の治療モダリティは、ほとんどの場合、薬物送達、吸収、標的器官への分配、薬物動態および細胞透過などの重大な課題を未だ克服していない。対照的に、小分子は、これらの障壁およびこれらの質を乗り越えるのに成功した長い歴史があるので、それらは薬物として適切であり、このような課題を克服するために一連の類似体を通じて容易に最適化される。全く対照的に、一般には、まして細胞内ではなおのこと、ＲＮＡ標的への結合について小分子をスクリーニングする有効な一般的方法はない。治療利益をもたらすＲＮＡのリガンドとしての小分子の適用は、創薬界からはほとんどまたは全く注目されていない。
【０００６】
小分子モジュレーターによるＲＮＡトランスクリプトームのターゲティングは、様々なＲＮＡ媒介性疾患を処置するための未利用の治療アプローチである。したがって、治療剤として有用な小分子ＲＮＡモジュレーターを開発する必要性が依然として存在する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、テザー基への結合点を有するテオフィリンリガンドの構造を示す。
【０００８】
【図２】図２は、テザー基への結合点を有するテトラサイクリンリガンドの構造を示す。
【０００９】
【図３】図３は、テザー基への結合点を有するトリプチセンリガンドの構造を示す。
【００１０】
【図４】図４は、テザー基への結合点を有するトリプチセンリガンドの構造を示す。Ｘ＝ＣＨ、ＮまたはＣ−ＯＨであり；Ｙ＝ＣＨまたはＮであり；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３＝ハロ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−ＮＨ２、−ＮＨ−（必要に応じて置換されたＣ１−１０脂肪族）、必要に応じて置換されたＣ１−１０脂肪族または他の記載されているテザー基からそれぞれ独立して選択される。改変部分は、Ｒ１、Ｒ２もしくはＲ３上の任意の位置に、または上記構造上の他の官能基に結合され得る。
【００１１】
【図５】図５は、テザー基への結合点を有するアントラセン−マレイミドディールス・アルダー付加物リガンドの構造を示す。注：反対の立体化学的配向にスクシンイミド基を有する対応する構造も調製し得る。各Ｒは、ハロ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−ＮＨ２、−ＮＨ−（必要に応じて置換されたＣ１−１０脂肪族）、必要に応じて置換されたＣ１−１０脂肪族または他の記載されているテザー基から独立して選択される。改変部分は、Ｒ上の任意の位置に、または上記構造上の他の官能基に結合され得る。
【００１２】
【図６】図６は、テザー基への結合点を有するリボシル（ｒｉｂｏｃｉｌ）リガンドの構造を示す。
【００１３】
【図７】図７は、テザー基への結合点を有するＳＭＮ２リガンドの構造を示す。
【００１４】
【図８】図８は、テザー基への結合点を有するリネゾリドおよびテジゾリド（ｔｅｄｉｚｏｌｉｄ）リガンドの構造を示す。
【００１５】
【図９】図９は、例示的なクリック可能基の構造を示す。
【００１６】
【図１０】図１０は、ＲＮＡリガンドと改変部分とを連結するための例示的なテザー基を示す。
【００１７】
【図１１】図１１は、テザー基のさらなる例を示す。
【００１８】
【図１２】図１２は、テザー基のさらなる例を示す。
【００１９】
【図１３】図１３は、テザー基のさらなる例を示す。
【００２０】
【図１４】図１４は、テザー基のさらなる例を示す。
【００２１】
【図１５】図１５は、テザー基のさらなる例を示す。
【００２２】
【図１６】図１６は、テザー基のさらなる例を示す。
【００２３】
【図１７】図１７は、テザー基のさらなる例を示す。
【００２４】
【図１８】図１８は、テザー基への結合点を含むいくつかのテオフィリン小分子リガンドにアクセスするための反応スキームを示す。
【００２５】
【図１９】図１９は、テザー基への結合点を含むいくつかのテオフィリン小分子リガンドにアクセスするための反応スキームを示す。
【００２６】
【図２０】図２０は、テザー基への結合点を含むいくつかのテオフィリン小分子リガンドにアクセスするための反応スキームを示す。
【００２７】
【図２１】図２１は、テザー基への結合点を含むいくつかのテオフィリン小分子リガンドにアクセスするための反応スキームを示す。
【００２８】
【図２２】図２２は、テザー基への結合点を含むいくつかのテトラサイクリン小分子リガンドにアクセスするための反応スキームを示す。
【００２９】
【図２３】図２３は、テザー基への結合点を含むいくつかのテトラサイクリン小分子リガンドにアクセスするための反応スキームを示す。
【００３０】
【図２４】図２４は、テザー基への結合点を含むいくつかのテトラサイクリン小分子リガンドにアクセスするための反応スキームを示す。
【００３１】
【図２５】図２５は、テザー基への結合点を含むいくつかのテトラサイクリン小分子リガンドにアクセスするための反応スキームを示す。
【００３２】
【図２６】図２６は、テザー基への結合点を含むいくつかのトリプチセン小分子リガンドにアクセスするための反応スキームを示す。
【００３３】
【図２７】図２７は、テザー基への結合点を含むいくつかのトリプチセン小分子リガンドにアクセスするための反応スキームを示す。
【００３４】
【図２８】図２８は、テザー基への結合点を含むいくつかのトリプチセン小分子リガンドにアクセスするための反応スキームを示す。
【００３５】
【図２９】図２９は、テザー基への結合点を含むいくつかのトリプチセン小分子リガンドにアクセスするための反応スキームを示す。
【００３６】
【図３０】図３０は、テザー基への結合点を含むいくつかのトリプチセン小分子リガンドにアクセスするための反応スキームを示す。
【００３７】
【図３１】図３１は、テザー基への結合点を含むいくつかのトリプチセン小分子リガンドにアクセスするための反応スキームを示す。
【００３８】
【図３２】図３２は、テザー基への結合点を含むいくつかのトリプチセン小分子リガンドにアクセスするための反応スキームを示す。
【００３９】
【図３３】図３３は、テザー基への結合点を含むいくつかのトリプチセン小分子リガンドにアクセスするための反応スキームを示す。
【００４０】
【図３４】図３４は、テザー基および改変部分を含むいくつかのテトラサイクリン小分子リガンドにアクセスするための反応スキームを示す。
【００４１】
【図３５】図３５は、テザー基および改変部分を含むいくつかのトリプチセン小分子リガンドにアクセスするための反応スキームを示す。
【００４２】
【図３６】図３６は、化合物ＡＲＫ−１３２の合成経路を示す。
【００４３】
【図３７】図３７は、化合物ＡＲＫ−１３４の合成経路を示す。
【００４４】
【図３８】図３８は、化合物ＡＲＫ−１３５およびＡＲＫ−１３６の合成経路を示す。
【００４５】
【図３９】図３９は、化合物ＡＲＫ−１８８の合成経路を示す。
【００４６】
【図４０】図４０は、化合物ＡＲＫ−１９０の合成経路を示す。
【００４７】
【図４１】図４１は、化合物ＡＲＫ−１９１の合成経路を示す。
【００４８】
【図４２】図４２は、化合物ＡＲＫ−１９５の合成経路を示す。
【００４９】
【図４３】図４３は、化合物ＡＲＫ−１９７の合成経路を示す。
【００５０】
【図４４】図４４は、リボシル足場をベースとする化合物の合成経路を示す。
【００５１】
【図４５】図４５は、（ヘテロ）アロイルアジドを含有するＮＡｚ光プローブの光化学反応、およびニトレン中間体とグアノシンとのＣ８改変反応を示す。
【００５２】
【図４６】図４６は、本発明によるアッセイ開発のための陽性対照モデルシステムとして有用ないくつかのリボスイッチ（ｒｉｂｏｓｗｉｔｃｈ）／アプタマー−リガンドペアを示す。ＰｒｅＱ１リガンドおよび配列は、Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １６，３４３−３４４（２００９）（これは、参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。ＴＰＰリガンドおよび配列は、Ｎａｔｕｒｅ  ４４１，１１６７−１１７１（２００６）およびＳｔｒｕｃｔｕｒｅ  １４，１４５９−１４６８（２００６）（これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【００５３】
【図４７】図４７は、リボスイッチ／アプタマーリガンドペアを用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結果を示す。化合物１ｂ（化合物Ｉ−１、ＡＲＫ−１３９）はアプタマー２１に結合するが、それは、突然変異配列アプタマー２１−Ｅに結合しないことが公知である（データは示さず）。
【００５４】
【図４８】図４８は、ＳＰＲによるアプタマー２１へのＡＲＫ−１３９の結合を示す；計算ＫＤ＝ＳＰＲにより５６８ｎＭ。また、ＳＥＣ−ＭＳにより結合を確認した（データは示さず）
【００５５】
【図４９】図４９は、アプタマー２１へのＳＨＡＰＥ−ＭａＰの使用からのＳＨＡＰＥ反応性結果を示す。リガンドＩ−１（ＡＲＫ−１３９）の存在にかかわらず、より高いピーク値は、アプタマーの個々のヌクレオチドの溶媒曝露および反応性の増加を示す。
【００５６】
【図５０】図５０は、アプタマー２１−ＥへのＳＨＡＰＥ−ＭａＰの使用からの結果を示す（下）。リガンドＩ−１（ＡＲＫ−１３９）の存在にかかわらず、より高いピーク値は、アプタマーの個々のヌクレオチドの溶媒曝露および反応性の増加を示す。見られ得るように、Ｉ−１の存在はＳＨＡＰＥ反応性の変化をほとんど引き起こさなかったが、これは、アプタマー２１−ＥへのＩ−１の弱い結合を示唆している。
【００５７】
【図５１】図５１は、アプタマー２１への光プローブＡＲＫ−５４７の予測結合様式を示す。モデルが示すように、予測結合様式は、リンカーおよび光活性化可能基に適合する。
【００５８】
【図５２】図５２は、ＰＥＡＲＬ−ｓｅｑ逆転写酵素停止アッセイのゲル結果を示す。転写酵素は、共有結合的に改変されたヌクレオチドで停止し、短縮配列の蓄積をもたらす。ＡＲＫ−５４７処理は、特定の長さのこのような短縮配列の産生をもたらすが、これは、特定のヌクレオチドが他のものよりも共有結合的に改変される可能性が高いことを示している。ＮＡＩは、より多くのアクセス可能／反応性ヌクレオチドにおける改変をもたらし、より低い選択性をもたらし、多数の短縮配列を産生する。
【００５９】
【図５３】図５３は、アプタマー２１およびＰｒｅＱ１  ＲＮＡを用いた逆転写酵素（ＲＴ）停止結果を示す。アプタマー２１ジアジリンプローブＡＲＫ−５４７は、Ａｐｔ２１  ＲＮＡとの特異的かつＵＶ依存的な架橋を示す；ＰｒｅＱ１プローブは、Ａｐｔ２１またはＰｒｅＱ１  ＲＮＡへの架橋を示さない。条件：１ｕＭ  ＲＮＡ、１０ｕＭプローブ、９ｕＭ  ＰｒｅＱ１プローブ、２０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ８、１００ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３７℃で３０分間、遮光、３つの指示時間にわたり室温でＵＶ照射（約３６０ｎｍ）。
【００６０】
【図５４】図５４は、アプタマー２１の架橋についてのさらなる化合物のスクリーニング結果を示す。条件：１μＭリフォールディングＲＮＡ、１０μＭ化合物、２０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ８、１００ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５％ＤＭＳＯ。遮光して反応物を３７℃で３０分間インキュベートし、続いて、フィッシャー光架橋剤中、室温で３６０ｎｍ光を５分間照射した。
【００６１】
【図５５】図５５は、Ｉ−１へのアプタマー２１対アプタマー２１−Ｅ結合のモデルを示す。
【００６２】
【図５６】図５６は、アプタマー２１へのＩ−１（ＡＲＫ−１３９）結合のＳＰＲデータを示す。ＡＲＫ−１３９はアプタマー２１−Ｅに結合しなかった（データは示さず）。計算Ｋｄは４２０ｎＭであった。
【００６３】
【図５７】図５７は、アプタマー２１およびアプタマー２１−Ｅをビオチン−光親和性二官能性プローブＡＲＫ−６７０と共にインキュベートし、架橋し、次いでストレプトアビジンビーズ上に捕捉したゲルアッセイを示す。アプタマー２１  ＲＮＡのみが有意なプルダウンを示した。位置４３および６０におけるＭａＰシグナルならびに位置６０における選択的ドロップオフを測定した、ＡＲＫ−５４７による処理後の架橋アプタマー２１のシーケンシングの結果を示す。ストレプトアビジン捕捉との組み合わせは、ＲＮＡの混合物から結合部位を同定するであろう。
【００６４】
【図５８Ａ】図５８Ａおよび５８Ｂは、アプタマー２１を用いたＬＣ−ＭＳ結果を示す。ＡＲＫ−５４７およびＡＲＫ−５８１は、それぞれＲＮＡの５％および１０％共有結合的改変を示した。
【図５８Ｂ】図５８Ａおよび５８Ｂは、アプタマー２１を用いたＬＣ−ＭＳ結果を示す。ＡＲＫ−５４７およびＡＲＫ−５８１は、それぞれＲＮＡの５％および１０％共有結合的改変を示した。
【００６５】
【図５９】図５９は、二官能性光活性化可能化合物を使用した逆転写酵素（ＲＴ）停止アッセイ結果を示す。
【００６６】
【図６０】図６０は、ビオチンプルダウン実験結果を示す。工程：ビオチン−ジアジリンプローブ（ＡＲＫ−５７９）をＲＮＡに架橋した；ストレプトアビジン磁気ビーズ上に捕捉した；ビーズに対してＲＴを実施した；ＲＮＡを塩基加水分解してｃＤＮＡを溶出させた；ゲル上で泳動した。
【００６７】
【図６１Ａ】図６１Ａおよび６１Ｂは、ＲＴ停止および突然変異率の結果を示す。アプタマー２１および光プローブＡＲＫ−５４７の光架橋により、ＡＲＫ−５４７は陰性対照アプタマー２１−Ｅに結合せず、光付加物を生じさせないことが明らかになった。予測結合様式と一致して、逆転写酵素（ＲＴ）停止はｎｔ５９で最大であった。正規化突然変異率の部位もまた、ＡＲＫ−５４７結合様式と一致していた。
【図６１Ｂ】図６１Ａおよび６１Ｂは、ＲＴ停止および突然変異率の結果を示す。アプタマー２１および光プローブＡＲＫ−５４７の光架橋により、ＡＲＫ−５４７は陰性対照アプタマー２１−Ｅに結合せず、光付加物を生じさせないことが明らかになった。予測結合様式と一致して、逆転写酵素（ＲＴ）停止はｎｔ５９で最大であった。正規化突然変異率の部位もまた、ＡＲＫ−５４７結合様式と一致していた。
【００６８】
【図６２】図６２は、Ｉ−１４（ＡＲＫ−７２９）およびＩ−１５（ＡＲＫ−８１６）の構造、ならびにこれらの化合物を使用したＣｕフリークリック反応によるＲＮＡ−光プローブ付加物の標識を示す。変性剤およびＣｕフリークリック反応条件の様々な組み合わせで、レーン１〜５を泳動させた。レーン１：変性剤なし／１０ｍＭトリス、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、３７℃クリック条件；レーン２：変性剤なし／１０ｍＭトリス、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、６５℃クリック条件；レーン３：６Ｍ尿素変性剤／１０ｍＭトリス、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、６５℃クリック条件；レーン４：９０％ホルムアミド変性剤／１０ｍＭトリス、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、６５℃クリック条件；レーン５：１×ＴＢＥ−尿素バッファー、６５℃。アプタマー２１をＡＲＫ−７２９またはＡＲＫ−８１６で処理し、次いで、ＵＶ光架橋に供した。次いで、得られた光付加物を指示条件下、Ｃｙ７−ＤＢＣＯコンジュゲートで処理した。いかなる添加剤も用いない６５℃におけるＣｕフリークリック反応の実施は、Ｃｙ７蛍光によるアプタマー２１プローブ光付加物の検出を可能にした。
【００６９】
【図６３】図６３は、アプタマー２１光プローブとＲＮＡ結合リガンドとの間の競合実験の結果を示す。アプタマー２１を、プローブのみ（ＡＲＫ−５８１）またはプローブ＋１０倍過剰のＲＮＡ結合リガンドのいずれかと共にインキュベートした。ＳＰＲ活性化合物ＡＲＫ−１３９およびＡＲＫ−８５２のみが、アプタマー２１へのＡＲＫ−５８１の光架橋を効率的に阻害した。
【００７０】
【図６４】図６４は、アプタマー２１への構造的に異なるアプタマー２１リガンドの光架橋のＲＴ停止結果を示す。
【００７１】
【図６５】図６５は、競合アッセイのＲＴ停止結果を示す。ＡＲＫ−８５２およびＡＲＫ−１３９は両方とも、アプタマー２１へのプローブの光架橋を阻害する。
【００７２】
【図６６】図６６は、アプタマー２１への化学プローブの光架橋に関するＲＴ停止結果を示す。
【００７３】
【図６７Ａ】図６７Ａおよび図６７Ｂは、アプタマー２１、アプタマー２１−Ｅまたはアプタマー２１と４つの他のＲＮＡとの混合物へのＡＲＫ−６７０の光架橋を示す。プローブ付加物からのＲＴ停止シグナルはアプタマー２１に特異的であり、架橋ＲＮＡのビーズ濃縮後に強度が増加した。
【図６７Ｂ】図６７Ａおよび図６７Ｂは、アプタマー２１、アプタマー２１−Ｅまたはアプタマー２１と４つの他のＲＮＡとの混合物へのＡＲＫ−６７０の光架橋を示す。プローブ付加物からのＲＴ停止シグナルはアプタマー２１に特異的であり、架橋ＲＮＡのビーズ濃縮後に強度が増加した。
【００７４】
【図６８】図６８は、他のＲＮＡ配列の存在下におけるＡＲＫ−６７０によるアプタマー２１の選択的濃縮を示す。アプタマー２１と他の４つのＲＮＡとの混合物へのＡＲＫ−６７０の架橋後、架橋ＲＮＡのアビジンビーズ濃縮およびシーケンシングを行った。シーケンシング分析により、ＡＲＫ−６７０によりアプタマー２１のみが濃縮されたことが示されたが、これは、ＡＲＫ−６７０がアプタマー２１に結合し、近接駆動方式で選択的に架橋することを示唆している。
【００７５】
【図６９】図６９は、濃縮後のクリックビオチン化プローブからのＲＴ停止データを示す。ＡＲＫ−７２９（フェニルアジドプローブ）、ＡＲＫ−２０５８（フェニルアジド弾頭（ｗａｒｈｅａｄ）のみ対照）、ＡＲＫ−８１６（ジアジリンプローブ）、ＡＲＫ−２０５９（ジアジリン弾頭のみ対照）またはＤＭＳＯへのアプタマー２１またはアプタマー２１−Ｅの架橋後、アビジンビーズ濃縮およびシーケンシングを行った。プローブＡＲＫ−７２９およびＡＲＫ−８１６は、アプタマー２１に特異的なＲＴ停止ピークを示した。
【００７６】
【図７０】図７０は、ＲＴ停止ピークの位置をアプタマー２１の配列上にマッピングした図を示す。
【００７７】
【図７１】図７１は、ポリＡ＋ＲＮＡ抽出物にスパイクしたアプタマー２１のＲＴ停止を示す。ポリＡ＋ＲＮＡ抽出物にスパイクしたアプタマー２１へのＡＲＫ−８１６（ジアジリンプローブ）またはＡＲＫ−２０５９（ジアジリン弾頭のみ対照）の架橋およびＲＴ停止率をシーケンシングにより測定した。単離されたアプタマー２１と同じ位置において、ＡＲＫ−８１６プローブに特異的なピークが観察された。
【００７８】
【図７２】図７２は、ポリＡ＋ＲＮＡ抽出物からのアプタマー２１の濃縮分析を示す。アプタマー２１をポリＡ＋ＲＮＡ抽出物にスパイクし、次いで、混合物をＡＲＫ−８１６（ジアジリンプローブ）およびＡＲＫ−２０５９（弾頭のみ対照）に架橋し、アビジン捕捉により架橋ＲＮＡを濃縮した。弾頭のみ対照と比較したプローブによる配列の特異的濃縮を次世代シーケンシングにより決定した。アプタマー２１上のプローブ特異的ＲＴ停止部位の濃縮が観察された。
【発明を実施するための形態】
【００７９】
特定の実施形態の詳細な説明
１．本発明の特定の実施形態の概説；定義
ＲＮＡ標的ならびに疾患および障害との関連
治療的に取り組まれている分子標的の大部分はタンパク質である。しかしながら、様々なＲＮＡ分子が、健常細胞および疾患細胞の両方において重要な調節的役割を果たすことが今や理解されている。タンパク質をコードするのはヒトゲノムのわずか１〜２％であるが、ゲノムの大部分が転写されることが現在では公知である（Ｃａｒｎｉｎｃｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９：１５５９−１５６３；２００５）。したがって、非コード転写産物（非コードトランスクリプトーム）は、新たな治療標的の大きなグループである。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）などの非コードＲＮＡは、転写、スプライシング、ｍＲＮＡの安定性／分解および翻訳を調節する。加えて、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、３’ＵＴＲおよびイントロンなどのｍＲＮＡの非コード領域は、ｍＲＮＡの発現レベル、選択的スプライシング、翻訳効率、ならびにｍＲＮＡおよびタンパク質の細胞内局在への影響において調節的役割を果たし得る。ＲＮＡの二次構造および三次構造は、これらの調節活性にとって重要である。
【００８０】
顕著なことに、ＧＷＡＳ研究により、非コードトランスクリプトームにはコード転写産物と比べてヒト疾患に関連するはるかに多くの単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）が存在することが示されている（Ｍａｕｒａｎｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：１１９０−１１９５；２０１２）。したがって、非コードＲＮＡおよびｍＲＮＡの非コード領域の治療的ターゲティングは、以前は難治性であったヒト疾患を処置するための新規薬剤をもたらし得る。
【００８１】
ｍＲＮＡを遮断する現在の治療アプローチは、遺伝子療法（Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１５，５２６，３５１−３６０）、ゲノム編集（Ｃｏｘら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１５，２１，１２１−１３１）または広範なオリゴヌクレオチド技術（アンチセンス、ＲＮＡｉなど）（Ｂｅｎｎｅｔｔ＆Ｓｗａｙｚｅ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２０１０，５０，２５９−２９３）などの方法を必要とする。オリゴヌクレオチドは、標準的な塩基／塩基ハイブリダイゼーションを介してＲＮＡの作用をモジュレートする。このアプローチの魅力は、遮断に供される配列から直接的に、オリゴヌクレオチドの基本的なファーマコフォアを定義し得ることである。これらの治療モダリティはそれぞれ、重大な技術的、臨床的および調節的な課題を抱えている。治療薬としてのオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンス、ＲＮＡｉ）のいくつかの限界としては、好ましくない薬物動態、経口バイオアベイラビリティの欠如および血液脳関門通過の欠如が挙げられ、後者は、神経学的疾患の処置のために、非経口の薬物投与後に脳または脊髄に送達することを不可能にする。加えて、オリゴヌクレオチドは、脂質ナノ粒子などの複雑な送達系を用いなければ、固形腫瘍に有効に取り込まれない。最後に、細胞および組織に取り込まれたオリゴヌクレオチドの大部分は、エンドソームなどの非機能性の区画に留まり、ごくわずかの物質は脱出して、標的が存在するサイトゾルおよび／または核に入る。
【００８２】
「伝統的な」小分子は、腸からの優れた吸収、標的器官への優れた分配および優れた細胞透過を示すように最適化され得る。標的ＲＮＡに結合してその活性をモジュレートする有益な薬物特性を有する「伝統的な」（すなわち、「リピンスキ適合」（Ｌｉｐｉｎｓｋｉら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２００１，４６，３−２６）小分子の使用は、上記問題の多くを解決するであろう。
【００８３】
一態様では、本発明は、小分子が結合する標的ＲＮＡ中の結合部位または活性部位の同一性または構造を同定する方法であって、ｉ）前記標的ＲＮＡを、開示される化合物と接触させる工程、およびｉｉ）必要に応じて計算方法と組み合わせて、本明細書に開示されるアッセイにより結果を分析する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡから選択される。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、アプタマーまたはリボスイッチである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、ＦＭＮリボスイッチ、ＰｒｅＱ１またはアプタマー２１である。いくつかの実施形態では、アッセイは、標的ＲＮＡ上の結合部位（単数または複数）の一次配列における位置を同定する。
ｍＲＮＡのターゲティング
【００８４】
ｍＲＮＡ内の非コード領域は、ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現レベルに影響を与え得る。簡潔に言えば、これらは、翻訳効率に影響するＩＲＥＳおよび上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）、スプライシング効率および選択的スプライシングパターンに影響するイントロン配列、ｍＲＮＡおよびタンパク質の局在性に影響する３’ＵＴＲ配列、ならびにｍＲＮＡの分解および半減期を制御するエレメントを含む。これらのＲＮＡエレメントの治療的モジュレーションは有益な効果を有し得る。また、ｍＲＮＡは、トリヌクレオチドリピートなどの単純反復配列の伸長を含み得る。リピート伸長を含むこれらのＲＮＡは毒性であり得、特に特定の神経学的および筋骨格疾患において、疾患病理を推進することが観察されている（Ｇａｔｃｈｅｌ＆Ｚｏｇｈｂｉ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．２００５，６，７４３−７５５を参照のこと）。加えて、翻訳の間の尚早な終止を軽減するために、スプライシングをモジュレートして終止コドンを導入する突然変異を有するエクソンをスキップし得る。
【００８５】
小分子は、様々な状況下における治療利益のためにプレｍＲＮＡのスプライシングをモジュレートするために使用され得る。一例は脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）である。ＳＭＡは、運動ニューロン（ＳＭＮ）のタンパク質の不十分な生存量の結果である。ヒトは、ＳＭＮ１およびＳＭＮ２という２つのバージョンのＳＭＮ遺伝子を有する。ＳＭＡ患者は突然変異ＳＭＮ１遺伝子を有するため、それらのＳＭＮタンパク質はＳＭＮ２のみに依存する。ＳＭＮ２遺伝子は、非効率的なスプライシングを引き起こすサイレント突然変異をエクソン７に有するため、ＳＭＮ２転写産物の大部分においてエクソン７がスキップされ、細胞内で急速に分解される欠陥タンパク質が生成されて、この遺伝子座から産生されるＳＭＮタンパク質の量が制限される。ＳＭＮ２転写産物のスプライシングの間にエクソン７が効率的に含まれるのを促進する小分子は、ＳＭＡの有効な処置となるであろう（Ｐａｌａｃｉｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２０１５，１１，５１１−５１７）。したがって、一態様では、本発明は、標的プレｍＲＮＡのスプライシングをモジュレートして疾患または障害を処置する小分子を同定する方法であって、前記標的プレｍＲＮＡへの結合について、１つまたはそれを超える開示される化合物をスクリーニングする工程；および本明細書に開示されるＲＮＡ結合アッセイにより結果を分析する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、プレｍＲＮＡはＳＭＮ２転写産物である。いくつかの実施形態では、疾患または障害は脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）である。
【００８６】
スプライシングの欠陥が疾患を引き起こさない場合であっても、スプライシングパターンの変化は、疾患を正すために使用され得る。尚早な翻訳終結につながるナンセンス突然変異は、エクソン配列がインフレームであれば、エクソンスキッピングにより排除され得る。これは、少なくとも部分的に機能的なタンパク質を創出し得る。エクソンスキッピングの使用の一例は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）におけるジストロフィン遺伝子である。ＤＭＤ患者における未熟な終結コドンにつながる様々な異なる突然変異は、オリゴヌクレオチドにより促進されるエクソンスキッピングにより排除され得る（Ｆａｉｒｃｌｏｕｇｈら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．，２０１３，１４，３７３−３７８で概説されている）。ＲＮＡ構造に結合し、スプライシングに影響する小分子は、類似の効果を有することが予測される。したがって、一態様では、本発明は、標的プレｍＲＮＡのスプライシングパターンをモジュレートして疾患または障害を処置する小分子を同定する方法であって、前記標的プレｍＲＮＡへの結合について、１つまたはそれを超える開示される化合物をスクリーニングする工程；および本明細書に開示されるＲＮＡ結合アッセイにより結果を分析する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、プレｍＲＮＡはジストロフィン遺伝子転写産物である。いくつかの実施形態では、小分子は、エクソンスキッピングを促進して尚早な翻訳終結を排除する。いくつかの実施形態では、疾患または障害はデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）である。
【００８７】
最後に、ｍＲＮＡおよびその翻訳産物の発現は、非コード配列をターゲティングすることならびに５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲ内の構造により影響され得る。例えば、５’ＵＴＲ内のＲＮＡ構造は翻訳効率に影響を与え得る。５’ＵＴＲ内のヘアピンなどのＲＮＡ構造は翻訳に影響することが示されている。一般に、ＲＮＡ構造は、ｍＲＮＡの翻訳において重要な役割を果たすと考えられている。これらの２つの例としては、メインオープンリーディングフレームの翻訳レベルに影響し得る内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）および上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）である（Ｋｏｍａｒ  ａｎｄ  Ｈａｔｚｏｇｌｏｕ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  Ｏｎｃｏｌ．５：２３３，２０１５；Ｗｅｉｎｇａｒｔｅｎ−Ｇａｂｂａｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５１：ｐｉｉ：ａａｄ４９３９，２０１６；Ｃａｌｖｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０６：７５０７−７５１２；Ｌｅ  Ｑｕｅｓｎｅら、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２２０：１４０−１５１，２０１０；Ｂａｒｂｏｓａら、ＰＬＯＳ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ９：ｅ１００３５５２９，２０１３）。例えば、すべてのヒトｍＲＮＡの半分近くがｕＯＲＦを有し、これらの多くはメインＯＲＦの翻訳を低下させる。これらのＲＮＡをターゲティングする小分子は、治療利益のために特定のタンパク質レベルをモジュレートするために使用され得る。したがって、一態様では、本発明は、標的プレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの発現または翻訳効率をモジュレートして疾患または障害を処置する小分子を生産する方法であって、前記標的プレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡへの結合について、１つまたはそれを超える開示される化合物をスクリーニングする工程；および本明細書に開示されるＲＮＡ結合アッセイにより結果を分析する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、小分子の結合部位は、５’ＵＴＲ、内部リボソーム進入部位または上流オープンリーディングフレームである。
調節ＲＮＡのターゲティング
【００８８】
ＲＮＡ標的の最大のセットは、転写されるがタンパク質に翻訳されない「非コードＲＮＡ」と称されるＲＮＡである。非コードＲＮＡは高度に保存されており、多くの種類の非コードＲＮＡが広範な調節機能を果たす。本明細書で使用される場合、「非コードＲＮＡ」という用語は、限定されないが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、長鎖遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用性ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、競合内因性ＲＮＡ（ｃｅＲＮＡ）および偽遺伝子を含む。非コードＲＮＡのこれらの下位カテゴリーはそれぞれ、有意な治療的可能性を有する多数のＲＮＡ標的を与える。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、非コードＲＮＡにより媒介される疾患を処置する方法を提供する。いくつかの実施形態では、疾患は、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｃｅＲＮＡまたは偽遺伝子により引き起こされる。別の態様では、本発明は、標的非コードＲＮＡの活性をモジュレートして疾患または障害を処置する小分子を生産する方法であって、前記標的非コードＲＮＡへの結合について、１つまたはそれを超える開示される化合物をスクリーニングする工程；および本明細書に開示されるＲＮＡ結合アッセイにより結果を分析する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、標的非コードＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｃｅＲＮＡまたは偽遺伝子である。
【００８９】
ｍｉＲＮＡは、遺伝子発現を調節する短い二本鎖ＲＮＡである（Ｅｌｌｉｏｔｔ＆Ｌａｄｏｍｅｒｙ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ＲＮＡ，２ｎｄＥｄ．を参照のこと）。各ｍｉＲＮＡは、多くのヒト遺伝子の発現に影響し得る。ヒトでは、２，０００近くのｍｉＲＮＡが存在する。これらのＲＮＡは、細胞分化、細胞運命、運動性、生存および機能を含む多くの生物学的プロセスを調節する。ｍｉＲＮＡ発現レベルは、組織、細胞種および疾患状況ごとに異なる。それらは、正常組織に対して腫瘍中で頻繁に異常発現し、それらの活性はがんにおいて重大な役割を果たし得る（総説については、Ｃｒｏｃｅ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１０：７０４−７１４，２００９；Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７０：６４０１−６４０６，２０１０を参照のこと）。ｍｉＲＮＡは、癌遺伝子および腫瘍抑制因子を調節することが示されており、それら自体が癌遺伝子または腫瘍抑制因子として作用し得る。いくつかは、上皮間葉移行（ＥＭＴ）ならびにがん細胞の侵襲性および転移を促進することが示されている。発癌性ｍｉＲＮＡの場合、それらの阻害は、有効な抗がん処置となり得る。したがって、一態様では、本発明は、標的ｍｉＲＮＡの活性をモジュレートして疾患または障害を処置する小分子を生産する方法であって、前記標的ｍｉＲＮＡへの結合について、１つまたはそれを超える開示される化合物をスクリーニングする工程；および本明細書に開示されるＲＮＡ結合アッセイにより結果を分析する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは癌遺伝子もしくは腫瘍抑制因子を調節するか、または癌遺伝子もしくは腫瘍抑制因子として作用する。いくつかの実施形態では、疾患はがんである。いくつかの実施形態では、がんは固形腫瘍である。
【００９０】
ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１７〜９２、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−１０ｂを含む治療的にターゲティングされ得る多数の発癌性ｍｉＲＮＡが存在する（Ｓｔａｈｌｈｕｔ＆Ｓｌａｃｋ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｅｄ．２０１３，５，１１１を参照のこと）。ｍｉＲ−１５５は、炎症、高血圧、心不全およびがんにおいて病理学的役割を果たす。がんでは、ｍｉＲ−１５５は、発癌カスケードおよびアポトーシス抵抗性、ならびにがん細胞侵襲性の増加を誘起する。多数のがんにおいて、ｍｉＲ−１５５の発現の変化が報告されており、病期、進行および治療転帰を反映している。ｍｉＲ−１５５の過剰発現が報告されているがんは、乳がん、甲状腺癌、結腸がん、子宮頸がんおよび肺がんである。それは、乳がんの薬物耐性において役割を果たすことが報告されている。ｍｉＲ−１７〜９２（Ｏｎｃｏｍｉｒ−１とも称される）は、ｍｉＲ−１７、２０ａ、１８ａ、１９ａ、９２−１および１９ｂ−１を含む多シストロン性の１ｋｂの一次転写産物である。それは、ＭＹＣにより活性化される。ｍｉＲ−１９は、多数の造血細胞において遺伝子発現およびシグナル伝達経路を変化させ、白血病誘発およびリンパ腫発生を誘起する。それは、多様なヒト固形腫瘍および血液がんに関与する。ｍｉＲ−２１は発癌性ｍｉＲＮＡであり、多数の腫瘍抑制因子の発現を低下させる。それはがん細胞の侵襲を刺激し、胸部、卵巣、頸部、結腸、肺、肝臓、脳、食道、前立腺、膵臓および甲状腺の癌を含むヒトの多様ながんに関連する。したがって、上記方法のいくつかの実施形態では、標的ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１７〜９２、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２１またはｍｉＲ−１０ｂから選択される。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、甲状腺癌、結腸がん、肝臓がん、脳のがん、食道がん、前立腺がん、肺がん、白血病またはリンパ節がんから選択される癌である。いくつかの実施形態では、がんは固形腫瘍である。
【００９１】
腫瘍学の他に、ｍｉＲＮＡは、心臓血管疾患および代謝性疾患を含む多くの他の疾患において役割を果たす（Ｑｕｉａｎｔ  ａｎｄ  Ｏｌｓｏｎ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２３：１１−１８，２０１３；Ｏｌｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓ．Ｍｅｄ．６：２３９ｐｓ３，２０１４；Ｂａｆｆｙ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．４：１９７７−１９８８，２０１５）。
【００９２】
多くの成熟ｍｉＲＮＡは長さが比較的短いため、小分子によりターゲティングされるべき十分にフォールディングした三次元構造を欠き得る。しかしながら、このようなｍｉＲＮＡのレベルは、一次転写産物またはプレｍｉＲＮＡに結合して成熟ｍｉＲＮＡの生合成を妨げる小分子により低下され得ると考えられる。したがって、上記方法のいくつかの実施形態では、標的ｍｉＲＮＡは一次転写産物またはプレｍｉＲＮＡである。
【００９３】
ｌｎｃＲＮＡは２００ヌクレオチド（ｎｔ）を上回るＲＮＡであり、タンパク質をコードしない（Ｒｉｎｎ＆Ｃｈａｎｇ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１２，８１，１４５−１６６を参照のこと；（総説については、Ｍｏｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ｍａｔｔｉｃｋ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：４２３−４３７，２０１４；Ｍａｔｔｉｃｋ  ａｎｄ  Ｒｉｎｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ＆Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２：５−７，２０１５；Ｉｙｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４７（：１９９−２０８，２０１５）を参照のこと）。それらは、転写、スプライシングおよびｍＲＮＡの分解のレベルでタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現に影響し得る。かなりの研究により、ｌｎｃＲＮＡはクロマチン構造を変化させることにより転写を増加または低下させるエピジェネティック調節因子を動員することにより転写を調節し得ることが示されている（例えば、Ｈｏｌｏｃｈ  ａｎｄ  Ｍｏａｚｅｄ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６：７１−８４，２０１５）。ｌｎｃＲＮＡは、がん、炎症性疾患、神経学的疾患および心臓血管疾患を含むヒト疾患に関連する（例えば、Ｐｒｅｓｎｅｒ  ａｎｄ  Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  １：３９１−４０７，２０１１；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ４６：２４５−２５４，２０１２；Ｇｕｔｓｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓ，ＲＮＡ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９：７０３−７１９，２０１２；Ｋｕｍａｒら、ＰＬＯＳ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ９：ｅ１００３２０１，２０１３；ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｏｎｄｅｒｖｏｏｒｔら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３；Ｌｉら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．１４：１８７９０−１８８０８，２０１３）。ｌｎｃＲＮＡのターゲティングを行って、治療利益のために特定の遺伝子およびタンパク質の発現をアップレギュレートまたはダウンレギュレートし得る（例えば、Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  １２：４３３−４４６，２０１３；Ｇｕｉｌ  ａｎｄ  Ｅｓｔｅｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ＆Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９：１０６８−１０７５，２０１２）。一般に、ｌｎｃＲＮＡは、ｍＲＮＡと比べて低いレベルで発現される。多くのｌｎｃＲＮＡは、クロマチンと物理的に会合しており（Ｗｅｒｎｅｒら、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １２，１−１０，２０１５）、タンパク質をコードする遺伝子に近接して転写される。それらは、多くの場合、転写の部位において物理的に会合したままであり、シスで局所的に作用して隣接ｍＲＮＡの発現を調節する。ｌｎｃＲＮＡの突然変異および調節異常はヒト疾患に関連するため、治療標的となり得る数多くのｌｎｃＲＮＡが存在する。したがって、上記方法のいくつかの実施形態では、標的非コードＲＮＡはｌｎｃＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｌｎｃＲＮＡは、がん、炎症性疾患、神経学的疾患または心臓血管疾患に関連する。
【００９４】
ｌｎｃＲＮＡは、タンパク質をコードする遺伝子の発現を調節し、多くの異なるレベルで作用して転写、選択的スプライシングおよびｍＲＮＡの分解に影響する。例えば、ｌｎｃＲＮＡは、エピジェネティック調節因子であるＰＲＣ２に結合して遺伝子へのその動員を促進し、次いでこの遺伝子の転写はクロマチン改変を介して抑止されることが示されている。ｌｎｃＲＮＡは、様々な調節タンパク質とのその会合を媒介する複雑な構造を形成し得る。これらのｌｎｃＲＮＡ構造に結合する小分子は、個々のｌｎｃＲＮＡにより通常調節される遺伝子の発現をモジュレートするために使用され得る。
【００９５】
１つの例示的な標的ｌｎｃＲＮＡはＨＯＴＡＩＲであり、これはヒト第１２染色体上のＨｏｘＣ遺伝子座から発現されるｌｎｃＲＮＡである。その発現レベルは低い（細胞あたり約１００ＲＮＡコピー）。多くのｌｎｃＲＮＡとは異なり、ＨＯＴＡＩＲは、トランスで作用して遠位の遺伝子の発現に影響し得る。それは、エピジェネティックリプレッサーＰＲＣ２および別の抑止的エピジェネティック調節因子であるＬＳＤ１／ＣｏＲＥＳＴ／ＲＥＳＴ複合体に結合する（Ｔｓａｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２９，６８９−６９３，２０１０）。ＨＯＴＡＩＲは、高度に構造化されたＲＮＡであり、そのヌクレオチドの５０％より多くが塩基対形成に関与する。それは、様々な種類のがんにおいて頻繁に異常調節されている（多くの場合、アップレギュレートされている）（Ｙａｏら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．１５：１８９８５−１８９９９，２０１４；Ｄｅｎｇら、ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ  ９：ｅ１１００５９，２０１４）。ＨＯＴＡＩＲの高い発現レベルを有するがん患者は、発現レベルが低い患者と比べて、予後が著しく不良である。ＨＯＴＡＩＲは、アポトーシスの制御、増殖、転移、血管新生、ＤＮＡ修復、化学療法抵抗性および腫瘍細胞代謝に関与することが報告されている。それは、転移性乳がんにおいて高発現する。原発性胸部腫瘍における高レベルの発現はその後の転移および死の有意な予測因子である。ＨＯＴＡＩＲはまた、食道扁平上皮癌に関連することが報告されており、また結腸直腸がん、子宮頸がん、胃がんおよび子宮内膜癌における予後予測因子である。したがって、ＨＯＴＡＩＲ結合性小分子は新規の抗がん薬物候補である。したがって、上記方法のいくつかの実施形態では、標的非コードＲＮＡはＨＯＴＡＩＲである。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、乳がん、食道扁平上皮癌、結腸直腸がん、子宮頸がん、胃がんまたは子宮内膜癌である。
【００９６】
ｌｎｃＲＮＡの中で別の潜在的ながん標的は、ＮＥＡＴ２（ｎｕｃｌｅａｒ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ａｂｕｎｄａｎｔ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ２）としても公知のＭＡＬＡＴ−１（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｌｕｎｇ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  １）である（Ｇｕｔｓｃｈｎｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７３：１１８０−１１８９，２０１３；Ｂｒｏｗｎら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ＆Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１：６３３−６４０，２０１４）。それは高度に保存された７ｋｂの核内ｌｎｃＲＮＡであり、核スペックル内に局在化する。それは正常組織内で遍在的に発現されるが、多くのがんにおいてアップレギュレートされている。ＭＡＬＡＴ−１は、肺がんを含めた多数のがんにおいて転移進行の予測マーカーである。それは、遺伝子発現の調節因子として機能して転写および／またはスプライシングに影響する可能性があるようである。ＭＡＬＡＴ−１ノックアウトマウスは表現型を有さないが、これは、ＭＡＬＡＴ−１の正常機能が限られていることを示している。しかしながら、ＭＡＬＡＴ−１欠損がん細胞は遊走に障害があり、マウス異種移植腫瘍モデルにおいて形成する腫瘍がより少ない。ＭＡＬＡＴ−１を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、マウスにおいて腫瘍生着後の転移形成を防止する。いくつかのマウス異種移植腫瘍モデルのデータは、ＡＳＯによるＭＡＬＡＴ−１のノックダウンは原発性腫瘍の成長および転移の両方を阻害し得ることを示す。したがって、ＭＡＬＡＴ−１をターゲティングする小分子は、腫瘍成長および転移の阻害に有効であると予測される。したがって、上記方法のいくつかの実施形態では、標的非コードＲＮＡはＭＡＬＡＴ−１である。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、肺がんなどのＭＡＬＡＴ−１がアップレギュレートされるがんである。
【００９７】
いくつかの実施形態では、本発明は、非コードＲＮＡ（例えば、ＨＯＴＡＩＲまたはＭＡＬＡＴ−１）により媒介される疾患または障害を処置する方法であって、それを必要とする患者に本発明の化合物を投与する工程を含む方法を提供する。このような化合物は、本明細書に詳細に記載されている。
毒性ＲＮＡ（リピートＲＮＡ）のターゲティング
【００９８】
ｍＲＮＡ中の単純反復は、多くの場合、ヒト疾患に関連する。これらは、多くの場合、排他的ではないが、ＣＡＧなどの３ヌクレオチドの反復（「トリプレットリピート」）である（総説については、Ｇａｔｃｈｅｌ  ａｎｄ  Ｚｏｇｈｂｉ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：７４３−７５５，２００５；Ｋｒｚｙｚｏｓｉａｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４０：１１−２６，２０１２；Ｂｕｄｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  ＭｃＭｕｒｒａｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０１０：３−１７，２０１３を参照のこと）。トリプレットリピートはヒトゲノム中に豊富に存在し、世代を経るにつれて伸長する傾向がある。約４０のヒト疾患が反復配列の伸長に関連する。トリプレットの伸長により引き起こされる疾患は、トリプレットリピート伸長疾患（ＴＲＥＤ）として公知である。健常個体は様々な数のトリプレットリピートを有するが、それより多い反復回数になると疾患を引き起こす閾値が存在する。異なる障害では、閾値が変動する。トリプレットリピートは不安定であり得る。遺伝子が引き継がれるにつれて反復回数が増加することがあり、世代が進むにつれて症状がより重症となり得るか、またはより早期に発症し得る。個体が正常範囲内でいくつかの反復を有する場合、次の世代に引き継がれる時に反復は伸長されないと予想される。反復回数が前突然変異範囲内（正常であるが不安定な反復回数）である場合、次の世代への遺伝の際に、反復は伸長するかもしれないしまたは伸長しないかもしれない。前突然変異を有する正常個体は症状を有しないが、完全な突然変異の範囲内にあるトリプレットリピートを受け継ぎ罹患することになる子供を有するリスクがある。ＴＲＥＤは、常染色体顕性、常染色体劣性またはＸ連鎖性であり得る。より一般的なトリプレットリピート障害は常染色体顕性である。
【００９９】
反復は、ｍＲＮＡのコード部分または非コード部分にあり得る。非コード領域内の反復の場合、この反復は、５’ＵＴＲ配列、イントロンまたは３’ＵＴＲ配列内に存在し得る。コード領域内の反復配列により引き起こされる疾患のいくつかの例は、表１に示されている。
【表１】
2021505132.tif 000003
【０１００】
ｍＲＮＡの非コード領域内の反復配列により引き起こされる疾患のいくつかの例は、表２に示されている。
【表２】
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【０１０１】
反復配列に起因する毒性は、毒性ＲＮＡそれ自体の作用の直接の結果であり得るか、またはリピート伸長がコード配列内にある場合、ＲＮＡおよび／もしくは異常タンパク質の毒性に起因し得る。リピート伸長ＲＮＡは、重要なＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）をフォーカス内に隔離することにより作用し得る。隔離されるＲＢＰの一例は、Ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄファミリーのタンパク質ＭＢＮＬ１である。ＲＢＰの隔離は、スプライシングの欠陥ならびにＲＮＡおよびタンパク質の核細胞質輸送の欠陥につながる。ＲＢＰの隔離はまた、ｍｉＲＮＡ生合成に影響し得る。ＲＮＡ生物学におけるこれらの擾乱は、ニューロンの機能および生存に大きく影響して様々な神経学的疾患に繋がり得る。
【０１０２】
ＲＮＡ中の反復配列は、ＲＢＰに結合し、正常なＲＮＡ生物学に影響する二次構造および三次構造を形成する。疾患の１つの具体例は、筋強直性ジストロフィー（ＤＭ１；筋強直性ジストロフィー）であり、これは、筋肉衰弱および収縮後の筋肉の緩慢な弛緩により特徴付けられる一般的な遺伝性筋肉疾患である（Ｍａｃｈｕｃａ−Ｔｚｉｌｉら、Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ  ３２：１−１８，２００５）。それは、筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子の３’ＵＴＲのＣＵＧ伸長により引き起こされる。この反復含有ＲＮＡは、スプライシング調節因子ＭＢＮＬ１およびＣＵＧリピート結合タンパク質（ＣＥＬＦ１）への影響を通じて、いくつもの発生的に調節される転写産物の選択的スプライシングの誤調節を引き起こす（Ｗｈｅｅｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２５：３３６−３３９，２００９）。ＤＭＰＫの転写産物内のＣＵＧリピートに結合する小分子は、ＲＮＡ構造を変化させ、病巣形成を防止し、これらのスプライシング（ｓｐｉｃｉｎｇ）調節因子への影響を軽減するであろう。最も一般的な遺伝性の精神遅滞である脆弱性Ｘ症候群（ＦＸＳ）は、ＦＭＲ１遺伝子の５’ＵＴＲ内のＣＧＧリピート伸長の結果である（Ｌｏｚａｎｏら、Ｉｎｔｒａｃｔａｂｌｅ  Ｒａｒｅ  Ｄｉｓ．Ｒｅｓ．３：１３４−１４６，２０１４）。ＦＭＲＰは、多くのｍＲＮＡの翻訳の調節およびタンパク質輸送に重要であり、シナプス発生および神経可塑性に必須のタンパク質である。したがって、その欠損は神経病理につながる。このＣＧＧリピートＲＮＡをターゲティングする小分子は、ＦＭＲ１  ｍＲＮＡおよびＦＭＲＰタンパク質の発現の抑制を軽減し得る。満たされていない非常に大きな医学上の必要性を有する別のＴＲＥＤは、ハンチントン病（ＨＤ）である。ＨＤは、運動、認知および精神医学的な変化を伴う進行性の神経学的障害である（Ｚｕｃｃａｔｏら、Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ．９０：９０５−９８１，２０１０）。ＨＴＴ遺伝子のコード配列内のＣＡＧリピートは、転写、小胞輸送、ミトコンドリア機能およびプロテアーゼ活性への有害な影響を有するらしいポリグルタミンリピートを有するタンパク質につながるので、ＨＤはポリグルタミンまたはポリＱ障害として特徴付けられる。しかしながら、ＨＴＴのＣＡＧリピートＲＮＡそれ自体もまた、核内封入体内へのＭＢＮＬ１タンパク質の隔離を含む毒性を示す。１つの他の具体例は、Ｃ９ｏｒｆ７２（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ９  ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ  ７２）遺伝子内のＧＧＧＧＣＣリピート伸長であり、これは家族性前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の両方においてよく見られる（Ｌｉｎｇら、Ｎｅｕｒｏｎ  ７９：４１６−４３８，２０１３；Ｈａｅｕｓｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ５０７：１９５−２００，２０１４）。リピートＲＮＡ構造は、重要なＲＮＡ結合タンパク質を隔離する核内フォーカスを形成する。ＧＧＧＧＣＣリピートＲＮＡはまた、ＲａｎＧＡＰ１に結合してそれを隔離して、ＲＮＡおよびタンパク質の核細胞質間輸送を害する（Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ５２５：５６−６１，２０１５）。これらのリピート伸長ＲＮＡのいずれかの選択的なターゲティングは、これらの神経学的疾患における治療利益を与え得る。
【０１０３】
本発明は、タンパク質の発現の仲介またはタンパク質の発現の調節を通じて作用するのではなく、異常なＲＮＡそれ自体が病原性効果を引き起こす疾患または障害を処置する方法を企図する。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、上記のものまたは表１および２に記載されているものなどのリピートＲＮＡにより媒介される。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、反復がｍＲＮＡのコード領域内にあるリピート伸長疾患である。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、反復がｍＲＮＡの非コード領域内にあるリピート伸長疾患である。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、ハンチントン病（ＨＤ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）またはＳＣＡ１、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６、ＳＣＡ７もしくはＳＣＡ１７から選択される脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）から選択される。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、脆弱性Ｘ症候群、筋強直性ジストロフィー（ＤＭ１または筋強直性ジストロフィー）、フリードライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）、ＳＣＡ８、ＳＣＡ１０もしくはＳＣＡ１２から選択される脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）またはＣ９ＦＴＤ（筋萎縮性側索硬化症もしくはＡＬＳ）から選択される。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病（ＨＤ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、筋強直性ジストロフィー（ＤＭ１もしくは筋強直性ジストロフィー）または脆弱性Ｘ症候群である。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、本発明は、リピートＲＮＡにより媒介される疾患または障害を処置する方法であって、それを必要とする患者に本発明の化合物を投与する工程を含む方法を提供する。このような化合物は、本明細書に詳細に記載されている。
【０１０６】
標的リピート伸長ＲＮＡの活性をモジュレートして疾患または障害を処置する小分子を生産する方法であって、前記標的リピート伸長ＲＮＡへの結合について、１つまたはそれを超える開示される化合物をスクリーニングする工程；および本明細書に開示されるＲＮＡ結合アッセイにより結果を分析する工程を含む方法も提供される。いくつかの実施形態では、リピート伸長ＲＮＡは、ＨＤ、ＤＲＰＬＡ、ＳＢＭＡ、ＳＣＡ１、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６、ＳＣＡ７またはＳＣＡ１７から選択される疾患または障害を引き起こす。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、脆弱性Ｘ症候群、ＤＭ１、ＦＲＤＡ、ＳＣＡ８、ＳＣＡ１０、ＳＣＡ１２またはＣ９ＦＴＤから選択される。
他の標的ＲＮＡおよび疾患／症状
【０１０７】
多数のさらなるＲＮＡと疾患または症状との間に関連があることが知られており、そのいくつかは以下の表３に示されている。したがって、上記方法のいくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは表３のものから選択される。いくつかの実施形態では、疾患または障害は表３のものから選択される。
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【表３−７】
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【表４】
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２．化合物およびその使用
【０１０８】
本発明の化合物およびその薬学的に許容され得る組成物は、創薬において使用するための、および創薬に有用な核酸コンジュゲートを調製するための薬剤として有効であることが今回見出された。例えば、本発明の化合物およびその医薬組成物は、標的ＲＮＡの活性部位もしくはアロステリック部位の位置および／もしくは構造ならびに／または三次構造の決定において有用である。
【０１０９】
一態様では、開示される化合物は、診断またはアッセイ試薬として有用である。いくつかの実施形態では、本発明は、標的核酸におけるヌクレオチドの三次元構造、目的のリガンドの結合部位またはアクセシビリティを決定する方法であって、前記標的核酸を、開示される化合物と接触させること；前記化合物を照射すること；前記核酸のヌクレオチドの共有結合的改変が起こったかを決定すること；および必要に応じて、ヌクレオチド改変のパターン、前記三次元構造、リガンド結合部位または前記核酸に関する他の構造情報を取得することを含む方法を提供する。
【０１１０】
別の態様では、本発明は、核酸コンジュゲートを調製する方法であって、標的核酸を、開示される化合物と接触させること；前記化合物を照射すること；および必要に応じて、アフィニティーアッセイ、プルダウン法または当技術分野で公知の他の手段により、得られた核酸コンジュゲートを単離することを含む方法を提供する。このような核酸コンジュゲートは、コンジュゲートに含まれる標的核酸に関する構造情報であって、インビボで標的核酸に結合して、疾患、障害または症状、例えば本明細書に開示されるものを処置する小分子薬を当業者が設計することを可能にする構造情報を決定するために有用である。いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書に記載される疾患を引き起こすＲＮＡなどのＲＮＡである。
【０１１１】
別の態様では、本発明は、薬物候補のトランスクリプトームにわたる選択性を評価する方法であって、２つまたはそれを超えるＲＮＡ転写産物を含む生物学的サンプルを、前記薬物候補にテザーされた開示される光活性化可能基を含む薬物候補と接触させること；前記薬物候補を照射すること；およびＲＮＡ転写産物の共有結合的改変を決定することを含む方法を提供する。
【０１１２】
別の態様では、本発明は、薬物候補の細胞中標的占有率を決定する方法であって、標的ＲＮＡを含む生物学的サンプルを、開示される化合物、または前記薬物候補にテザーされた開示される光活性化可能基を含む薬物候補と接触させること；前記化合物または薬物候補を照射すること；および前記標的ＲＮＡの共有結合的改変を決定することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記方法は、標的係合（ｔａｒｇｅｔ  ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）を確認し、結合を細胞生物学と相関させる。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、前記方法は、サブサイト結合を同定することにより結合部位マップをアセンブルして、生化学的作用様式を詳説することを可能にする。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、前記方法は、標的係合を標的突然変異および細胞機能に関連付けることをさらに可能にする。これは、細胞における薬物候補の分子機構を理解するために有用である。
【０１１５】
別の態様では、本発明は、標的ＲＮＡに関連するＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）の存在を決定する方法であって、前記標的ＲＮＡを、開示される化合物と接触させること；前記化合物を照射すること；および前記ＲＢＰのアミノ酸の共有結合的改変が起こったかを決定することを含む方法を提供する。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、本発明は、
（ａ）標的ＲＮＡ上の１つまたはそれを超える結合部位に選択的に結合する小分子リガンド；
（ｂ）前記小分子リガンドに共有結合的にコンジュゲートされた光活性化可能基（または「弾頭」）であって、可視光または紫外線を照射されると、前記標的ＲＮＡへの共有結合を形成する光活性化可能基（または「弾頭」）；
（ｃ）必要に応じて、クリック可能基；
（ｄ）必要に応じて、プルダウン基；ならびに
（ｅ）必要に応じて、前記小分子リガンドおよび前記光活性化可能基および必要に応じて前記クリック可能基を共有結合的に連結する１つまたは２つのテザー基
を含む化合物を提供する。
【０１１７】
いかなる特定の理論にも縛られるものではないが、本発明の化合物は、標的ＲＮＡ上の１つもしくはそれを超える活性部位もしくはアロステリック部位、または小分子リガンドと標的ＲＮＡの構造との間の結合相互作用により決定される他の部位に選択的に結合し；照射されると、標的ＲＮＡの１つまたはそれを超える位置、例えばアデノシンもしくはグアノシンヌクレオチドのＣ８炭素または標的ＲＮＡの２’−ＯＨ基を共有結合的に改変し；改変パターンはリガンドをＲＮＡ弾頭に接続するテザーの長さおよびコンフォメーションにより拘束されるので、改変ヌクレオチドの分布のシーケンシングまたは他の解析により活性部位または他の結合部位を同定するためにその後に使用され得ると考えられる。標的ＲＮＡは、化合物との接触前に細胞内、細胞溶解物中、または単離された形態で存在し得る。開示される化合物のライブラリーのスクリーニングは、標的ＲＮＡの活性の非常に強力な小分子モジュレーターを同定するであろう。このようなスクリーニングにより同定されるこのような小分子は、それを必要とする患者において疾患または症状を処置し、予防しまたは改善するための標的ＲＮＡのモジュレーターとして使用され得ると理解される。
【０１１８】
一態様では、本発明は、一般式Ｉの化合物：
【化１】
2021505132.tif 000013
（式中、リガンドは、小分子ＲＮＡバインダーであり；
Ｔ１は、二価テザー基であり；および
Ｒｍｏｄは、光活性化可能基であり；ここで、各変数は、以下で定義されるとおりである）またはその薬学的に許容され得る塩を提供する。
【０１１９】
別の態様では、本発明は、一般式ＩＩの化合物：
【化２】
2021505132.tif 000014
（式中、
リガンドは、小分子ＲＮＡバインダーであり；
Ｔ１は、二価テザー基であり；
Ｔ２は、共有結合または二価テザー基であり；
Ｒｍｏｄは、光活性化可能基であり；および
ＲＣＧは、クリック可能基またはプルダウン基である）またはその薬学的に許容され得る塩を提供する。
【０１２０】
別の態様では、本発明は、一般式ＩＩＩの化合物：
【化３】
2021505132.tif 000015
（式中、
リガンドは、小分子ＲＮＡバインダーであり；
Ｔ１は、三価テザー基であり；
Ｔ２は、二価テザー基であり；
Ｒｍｏｄは、光活性化可能基であり；および
ＲＣＧは、クリック可能基またはプルダウン基であり；ここで、各変数は、以下で定義されるとおりである）またはその薬学的に許容され得る塩を提供する。
【０１２１】
別の態様では、本発明は、一般式ＩＩ−ａの化合物：
【化４】
2021505132.tif 000016
（式中、
リガンドは、小分子ＲＮＡバインダーであり；
Ｔ１は、共有結合または二価テザー基であり；
Ｔ２は、共有結合または二価テザー基であり；
Ｒｍｏｄは、光活性化可能基であり；および
ＲＣＧは、クリック可能基またはプルダウン基であり；ここで、各変数は、以下で定義されるとおりである）またはその薬学的に許容され得る塩を提供する。
【０１２２】
別の態様では、本発明は、一般式ＩＩ−ｂまたはＩＩ−ｃの化合物：
【化５】
2021505132.tif 000017
（式中、
リガンドは、小分子ＲＮＡバインダーであり；
Ｔ１は、二価テザー基であり；
Ｒｍｏｄは、光活性化可能基であり；および
ＲＣＧは、クリック可能基またはプルダウン基であり；ここで、各変数は、以下で定義されるとおりである）またはその薬学的に許容され得る塩を提供する。
【０１２３】
別の態様では、本発明は、標的ＲＮＡと式Ｉ、ＩＩ、ＩＩ−ａまたはＩＩＩのいずれかの化合物とを含むＲＮＡコンジュゲート（式中、Ｒｍｏｄは、可視光または紫外線の照射後に前記標的ＲＮＡへの共有結合を形成する）を提供する。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、本発明は、式ＩＶのＲＮＡコンジュゲート：
【化６】
2021505132.tif 000018
（式中、
リガンドは、標的ＲＮＡに結合する小分子であり；
ＲＮＡは、標的ＲＮＡを表し；
Ｔ１は、二価テザー基であり；および
Ｒｍｏｄは、光活性化可能基であり；
各変数は、以下で定義されるとおりである）を提供する。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、本発明は、式ＶのＲＮＡコンジュゲート：
【化７】
2021505132.tif 000019
（式中、
リガンドは、標的ＲＮＡに結合する小分子であり；
ＲＮＡは、標的ＲＮＡを表し；
Ｔ１は、三価テザー基であり；
Ｔ２は、二価テザー基であり；
Ｒｍｏｄは、光活性化可能基であり；および
ＲＣＧは、クリック可能基またはプルダウン基であり；
各変数は、以下で定義されるとおりである）を提供する。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、本発明は、式ＶＩのＲＮＡコンジュゲート：
【化８】
2021505132.tif 000020
（式中、
リガンドは、標的ＲＮＡに結合する小分子であり；
ＲＮＡは、標的ＲＮＡを表し；
Ｔ１は、二価テザー基であり；
Ｔ２は、共有結合または二価テザー基であり；
Ｒｍｏｄは、光活性化可能基であり；および
ＲＣＧは、クリック可能基またはプルダウン基であり；
各変数は、以下で定義されるとおりである）を提供する。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、本発明は、式ＶＩ−ａのＲＮＡコンジュゲート：
【化９】
2021505132.tif 000021
（式中、
リガンドは、標的ＲＮＡに結合する小分子であり；
ＲＮＡは、標的ＲＮＡを表し；
Ｔ１は、二価テザー基であり；
Ｔ２は、共有結合または二価テザー基であり；
Ｒｍｏｄは、光活性化可能基であり；および
ＲＣＧは、クリック可能基またはプルダウン基であり；
各変数は、以下で定義されるとおりである）を提供する。
【０１２８】
別の態様では、本発明は、標的ＲＮＡと式ＩＩまたはＩＩＩの化合物とプルダウン基とを含むコンジュゲート（式中、Ｒｍｏｄは、前記標的ＲＮＡへの共有結合を形成する）を提供する。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、本発明は、式ＶＩＩのＲＮＡコンジュゲート：
【化１０】
2021505132.tif 000022
（式中、
リガンドは、標的ＲＮＡに結合する小分子であり；
ＲＮＡは、標的ＲＮＡを表し；
Ｔ１は、三価テザー基であり；
Ｔ２は、二価テザー基であり；
Ｒｍｏｄは、光活性化可能基であり；
ＲＣＰは、クリック可能基とＲＰＤ上の適切な官能基との間のクリック反応から生じる反応生成物であり；および
ＲＰＤは、プルダウン基であり；
各変数は、以下で定義されるとおりである）を提供する。いくつかの実施形態では、ＲＣＰは、
【化１１】
2021505132.tif 000023
である。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、本発明は、式ＶＩＩＩのＲＮＡコンジュゲート：
【化１２】
2021505132.tif 000024
（式中、
リガンドは、標的ＲＮＡに結合する小分子であり；
ＲＮＡは、標的ＲＮＡを表し；
Ｔ１は、二価テザー基であり；
Ｔ２は、共有結合または二価テザー基であり；
Ｒｍｏｄは、光活性化可能基であり；
ＲＣＰは、クリック可能基とＲＰＤ上の適切な官能基との間のクリック反応から生じる反応生成物であり；および
ＲＰＤは、プルダウン基であり；
各変数は、以下で定義されるとおりである）を提供する。いくつかの実施形態では、ＲＣＰは、
【化１３】
2021505132.tif 000025
である。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、本発明は、式ＶＩＩＩ−ａのＲＮＡコンジュゲート：
【化１４】
2021505132.tif 000026
（式中、
リガンドは、標的ＲＮＡに結合する小分子であり；
ＲＮＡは、標的ＲＮＡを表し；
Ｔ１は、二価テザー基であり；
Ｔ２は、共有結合または二価テザー基であり；
Ｒｍｏｄは、光活性化可能基であり；
ＲＣＰは、クリック可能基とＲＰＤ上の適切な官能基との間のクリック反応から生じる反応生成物であり；および
ＲＰＤは、プルダウン基であり；
各変数は、以下で定義されるとおりである）を提供する。いくつかの実施形態では、ＲＣＰは、
【化１５】
2021505132.tif 000027
である。
【０１３２】
一態様では、本発明は、式Ｘ−ａの化合物：
【化１６】
2021505132.tif 000028
（式中、
Ａｒ１は、必要に応じて置換されたフェニル、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された５〜６員単環式ヘテロ芳香環であり；
Ａｒ２は、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された５〜６員単環式ヘテロ芳香環、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された８〜１０員二環式ヘテロ芳香環であり；
Ｘは、二価Ｃ１−３アルキレン鎖から選択され、ここで、前記鎖の１〜２個のメチレン単位は独立して、−Ｏ−、−ＮＲ６−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＯ２−、−ＣＳ−、−Ｃ（ＮＲ６）−、−Ｓ（Ｏ）−または−Ｓ（Ｏ）２−で必要に応じて置き換えられており；
Ｒ１は、−Ｃ（Ｏ）Ｒ６、−ＣＯ２Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｃ１−６脂肪族、−ＣＮ、−（ＣＨ２）１−３ＯＲ、−（ＣＨ２）１−３ＮＨＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ６、−Ｎ（Ｒ６）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＯＲ、−ＮＨＲ６または−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＮＨＲから選択され；
Ｒ３が非存在である場合には、Ｒ２は、クリック可能基を必要に応じて含む光活性化可能基であり；
Ｒ３は非存在であるか、またはクリック可能基もしくはプルダウン基であり；
各Ｒ６は独立して水素であるか、または１、２、３、４、５もしくは６個のジュウテリウムもしくはハロゲン原子で必要に応じて置換されたＣ１−６アルキルであり；
各Ｒは独立して水素であるか、またはＣ１−６脂肪族、３〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式炭素環、フェニル、８〜１０員二環式芳香族炭素環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式複素環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員単環式ヘテロ芳香環、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する８〜１０員二環式ヘテロ芳香環から選択される必要に応じて置換された基であり；
Ｌ１は、Ｃ１−２０二価、三価または四価直鎖状または分枝状炭化水素鎖であり、ここで、前記鎖の１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のメチレン単位は独立して、天然もしくは非天然アミノ酸、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＳＯ２−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｓ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）−または−Ｃｙ−で必要に応じて置き換えられており；ならびに前記鎖の１〜２０個の前記メチレン単位は独立して、−ＯＣＨ２ＣＨ２−で必要に応じて置き換えられており；
各−Ｃｙ−は独立して、二価の必要に応じて置換された３〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式炭素環、必要に応じて置換されたフェニレン、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜３個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された４〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式複素環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された５〜６員単環式ヘテロ芳香環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された８〜１０員二環式もしくは架橋二環式飽和もしくは部分不飽和複素環、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された８〜１０員二環式もしくは架橋二環式ヘテロ芳香環であり；ならびに
ｎは、０または１である）またはその互変異性体もしくは薬学的に許容され得る塩を提供する。
【０１３３】
別の態様では、本発明は、式Ｘ−ｂの化合物：
【化１７】
2021505132.tif 000029
（式中、
Ａｒ１は、必要に応じて置換されたフェニル、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された５〜６員単環式ヘテロ芳香環であり；
Ａｒ２は、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された５〜６員単環式ヘテロ芳香環、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された８〜１０員二環式ヘテロ芳香環であり；
ここで、Ａｒ１またはＡｒ２のうちの一方は、１個のＲ２で置換されており；
Ｘは、二価Ｃ１−３アルキレン鎖から選択され、ここで、前記鎖の１〜２個のメチレン単位は独立して、−Ｏ−、−ＮＲ６−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＯ２−、−ＣＳ−、−Ｃ（ＮＲ６）−、−Ｓ（Ｏ）−または−Ｓ（Ｏ）２−で必要に応じて置き換えられており；
Ｒ１は、−Ｃ（Ｏ）Ｒ６、−ＣＯ２Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｃ１−６脂肪族、−ＣＮ、−（ＣＨ２）１−３ＯＲ、−（ＣＨ２）１−３ＮＨＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ６、−Ｎ（Ｒ６）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＯＲ、−ＮＨＲ６または−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＮＨＲから選択され；
Ｒ３が非存在である場合には、Ｒ２は、クリック可能基を必要に応じて含む光活性化可能基であり；
Ｒ３は非存在であるか、またはクリック可能基もしくはプルダウン基であり；
各Ｒ６は独立して水素であるか、または１、２、３、４、５もしくは６個のジュウテリウムもしくはハロゲン原子で必要に応じて置換されたＣ１−６アルキルであり；
各Ｒは独立して水素であるか、またはＣ１−６脂肪族、３〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式炭素環、フェニル、８〜１０員二環式芳香族炭素環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式複素環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員単環式ヘテロ芳香環、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する８〜１０員二環式ヘテロ芳香環から選択される必要に応じて置換された基であり；
Ｌ１は、Ｃ１−２０二価または三価直鎖状または分枝状炭化水素鎖であり、ここで、前記鎖の１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のメチレン単位は独立して、天然もしくは非天然アミノ酸、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＳＯ２−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｓ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）−または−Ｃｙ−で必要に応じて置き換えられており；ならびに前記鎖の１〜２０個の前記メチレン単位は独立して、−ＯＣＨ２ＣＨ２−で必要に応じて置き換えられており；
各−Ｃｙ−は独立して、二価の必要に応じて置換された３〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式炭素環、必要に応じて置換されたフェニレン、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜３個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された４〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式複素環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された５〜６員単環式ヘテロ芳香環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された８〜１０員二環式もしくは架橋二環式飽和もしくは部分不飽和複素環、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された８〜１０員二環式もしくは架橋二環式ヘテロ芳香環であり；ならびに
ｎは、０または１である）またはその互変異性体もしくは薬学的に許容され得る塩を提供する。
【０１３４】
上記で一般に定義されるように、Ａｒ１は、必要に応じて置換されたフェニル、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された５〜６員単環式ヘテロ芳香環である。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、Ａｒ１は、必要に応じて置換されたフェニルである。いくつかの実施形態では、Ａｒ１は、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された５〜６員単環式ヘテロ芳香環である。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、Ａｒ１は、ハロゲン、−Ｃ１−６脂肪族、−ＣＮ、−ＯＲ、−ＮＲ２、−ＣＯ２Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−ＳＲまたは−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２から選択される１、２、３または４個の置換基で必要に応じて置換されたフェニルである。いくつかの実施形態では、必要に応じた置換基は、ハロゲン、−ＣＮ、−Ｃ１−６アルキルまたは−ＯＭｅから選択される。いくつかの実施形態では、必要に応じた置換基はハロゲンである。いくつかの実施形態では、１または２個の置換基が存在する。いくつかの実施形態では、Ａｒ１は、以下の表５に示されているものから選択される。
【０１３７】
上記で一般に定義されるように、Ａｒ２は、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された５〜６員単環式ヘテロ芳香環、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された８〜１０員二環式ヘテロ芳香環である。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、Ａｒ２は、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された５〜６員単環式ヘテロ芳香環である。いくつかの実施形態では、Ａｒ２は、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された８〜１０員二環式ヘテロ芳香環である。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、Ａｒ２は、必要に応じて置換されたピリジニル、ピリミジニル、イミダゾリルまたはピロリルである。いくつかの実施形態では、Ａｒ２は、必要に応じて置換されたピリジニルである。いくつかの実施形態では、Ａｒ２はピリジニルである。いくつかの実施形態では、Ａｒ２は３−または４−ピリジニルである。いくつかの実施形態では、Ａｒ２は、以下の表５に示されているものから選択される。
【０１４０】
上記で一般に定義されるように、Ｘは二価Ｃ１−３アルキレン鎖であり、ここで、その鎖の１〜２個のメチレン単位は独立して、−Ｏ−、−ＮＲ６−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＯ２−、−ＣＳ−、−Ｃ（ＮＲ６）−、−Ｓ（Ｏ）−または−Ｓ（Ｏ）２−で必要に応じて置き換えられている。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、Ｘは、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−ＮＲ６−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＯ２−、−ＣＳ−、−Ｃ（ＮＲ６）−、−Ｓ（Ｏ）−または−Ｓ（Ｏ）２−である。いくつかの実施形態では、ＸはＣ２アルキレン鎖であり、ここで、その鎖の１〜２個のメチレン単位は独立して、−Ｏ−、−ＮＲ６−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＯ２−、−ＣＳ−、−Ｃ（ＮＲ６）−、−Ｓ（Ｏ）−または−Ｓ（Ｏ）２−で必要に応じて置き換えられている。いくつかの実施形態では、ＸはＣ３アルキレン鎖であり、ここで、その鎖の１〜２個のメチレン単位は独立して、−Ｏ−、−ＮＲ６−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＯ２−、−ＣＳ−、−Ｃ（ＮＲ６）−、−Ｓ（Ｏ）−または−Ｓ（Ｏ）２−で必要に応じて置き換えられている。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、Ｘは、−ＣＨ２Ｏ−、ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ６）−、−ＣＨ２Ｎ（Ｒ６）−または−Ｎ（Ｒ６）Ｃ（Ｏ）−から選択される。いくつかの実施形態では、Ｘは、−ＯＣＨ２−または−ＣＨ２Ｏ−である。いくつかの実施形態では、Ｘは、以下の表５に示されているものから選択される。
【０１４３】
上記で一般に定義されるように、Ｒ１は、−Ｃ（Ｏ）Ｒ６、−ＣＯ２Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｃ１−６脂肪族、−ＣＮ、−（ＣＨ２）１−３ＯＲ、−（ＣＨ２）１−３ＮＨＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ６、−Ｎ（Ｒ６）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＯＲ、−ＮＨＲ６または−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＮＨＲから選択される。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、Ｒ１は−Ｃ（Ｏ）Ｒ６である。いくつかの実施形態では、Ｒ１は−ＣＯ２Ｒである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２である。いくつかの実施形態では、Ｒ１は−Ｃ１−６脂肪族である。いくつかの実施形態では、Ｒ１は−ＣＮである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は−（ＣＨ２）１−３ＯＲである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は−（ＣＨ２）１−３ＮＨＲである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ６である。いくつかの実施形態では、Ｒ１は−Ｎ（Ｒ６）Ｃ（Ｏ）Ｒである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は−ＯＣ（Ｏ）Ｒである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は−ＯＲである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は−ＮＨＲ６である。いくつかの実施形態では、Ｒ１は−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＮＨＲである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、以下の表５に示されているものから選択される。
【０１４５】
上記で一般に定義されるように、Ｒ３が非存在である場合には、Ｒ２は、クリック可能基を必要に応じて含む光活性化可能基である。いくつかの実施形態では、Ｒ２は光活性化可能基である。いくつかの実施形態では、Ｒ２は、クリック可能基でさらに置換された光活性化可能基である。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、Ｒ２は、紫外線（ＵＶ）を照射されると、ラジカル、アリールもしくはヘテロアリールカルボカチオン、ニトレンまたはカルベン中間体を生成する官能基であって、Ｒ３が非存在である場合には、クリック可能基またはプルダウン基で必要に応じて置換された官能基である。いくつかの実施形態では、Ｒ２は、必要に応じて置換されたフェニルもしくは８〜１０員二環式芳香族炭素環式アジドもしくは５〜８員ヘテロアリールもしくは８〜１０員二環式ヘテロアリールアジド、必要に応じて置換されたベンゾイルアジドもしくは５〜８員ヘテロアロイルアジドもしくは８〜１０員ヘテロアロイルアジド（ここで、前記環原子の１〜３個の原子は窒素、硫黄または酸素から選択される）、必要に応じて置換されたフェニルもしくは８〜１０員二環式芳香族炭素環式ジアゾニウム塩、必要に応じて置換された５〜８員ヘテロアリールもしくは８〜１０員二環式ヘテロアリールジアゾニウム塩（ここで、前記環原子の１〜３個の原子は窒素、硫黄または酸素から選択される）、必要に応じて置換されたＣ２−６脂肪族ジアゾ官能基、必要に応じて置換されたＣ２−６脂肪族ジアジリン、または必要に応じて置換されたジフェニルもしくは８〜１０員ジヘテロアリールケトン（ここで、前記環原子の１〜３個の原子は窒素、硫黄または酸素から選択される）、必要に応じて置換されたジヒドロピレン、必要に応じて置換されたスピロオキサジン、必要に応じて置換されたアントラセン、必要に応じて置換されたフルギド、必要に応じて置換されたスピロピラン、必要に応じて置換されたα−ピロンまたは必要に応じて置換されたピリミドンであり；クリック可能基またはプルダウン基で必要に応じて置換されている。いくつかの実施形態では、クリック可能基は、Ｃ１−６アルキルアジドまたはアルキンである。いくつかの実施形態では、Ｒ２は、
【化１８】
2021505132.tif 000030
から選択され；ここで、Ｙ−は、薬学的に許容され得るアニオンである。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、Ｒ２は、以下の表５に示されているものから選択される。
【０１４８】
上記で一般に定義されるように、Ｒ３は非存在であるか、またはクリック可能基もしくはプルダウン基である。いくつかの実施形態では、Ｒ３は非存在である。いくつかの実施形態では、Ｒ３はクリック可能基である。いくつかの実施形態では、Ｒ３はプルダウン基である。いくつかの実施形態では、Ｒ３は、Ｃ１−６アルキルアジド、Ｃ１−６アルキンまたはビオチンである。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、Ｒ３は、以下の表５に示されているものから選択される。
【０１５０】
上記で一般に定義されるように、各Ｒ６は独立して水素であるか、または１、２、３、４、５もしくは６個のジュウテリウムもしくはハロゲン原子で必要に応じて置換されたＣ１−６アルキルである。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、Ｒ６は水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ６は、１、２、３、４、５または６個のジュウテリウムまたはハロゲン原子で必要に応じて置換されたＣ１−６アルキルである。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、Ｒ６は、１、２または３個のハロゲン原子で必要に応じて置換されたＣ１−３アルキルである。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、Ｒ６は、以下の表５に示されているものから選択される。
【０１５４】
上記で一般に定義されるように、Ｌ１はＣ１−２０二価または三価直鎖状または分枝状炭化水素鎖であり、ここで、その鎖の１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のメチレン単位は独立して、天然もしくは非天然アミノ酸、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＳＯ２−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｓ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）−または−Ｃｙ−で必要に応じて置き換えられており；鎖の１〜２０個のメチレン単位は独立して、−ＯＣＨ２ＣＨ２−で必要に応じて置き換えられている。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、Ｌ１はＣ１−１０二価または三価直鎖状または分枝状炭化水素鎖であり、ここで、その鎖の１、２、３、４または５個のメチレン単位は独立して、天然もしくは非天然アミノ酸、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＳＯ２−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｓ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）−または−Ｃｙ−で必要に応じて置き換えられており；鎖の１〜５個のメチレン単位は独立して、−ＯＣＨ２ＣＨ２−で必要に応じて置き換えられている。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、１〜３個の天然アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、プロリン、リジン、グリシンまたはアラニンから選択される。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、１，２，３−トリアゾリレンまたは１，２，４−トリアゾリレンから選択される１〜２個の−Ｃｙ−基を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、１〜１０、１〜８、１〜６、１〜４、１〜３、１〜２、１、２または３個の−ＯＣＨ２ＣＨ２−単位を含む。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、以下の表５に示されているものから選択される。
【０１５７】
上記で一般に定義されるように、各−Ｃｙ−は独立して、二価の必要に応じて置換された３〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式炭素環、必要に応じて置換されたフェニレン、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜３個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された４〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式複素環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された５〜６員単環式ヘテロ芳香環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された８〜１０員二環式もしくは架橋二環式飽和もしくは部分不飽和複素環、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された８〜１０員二環式もしくは架橋二環式ヘテロ芳香環である。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、−Ｃｙ−は、二価の必要に応じて置換された３〜８員飽和または部分不飽和単環式炭素環である。いくつかの実施形態では、−Ｃｙ−は、必要に応じて置換されたフェニレンである。いくつかの実施形態では、−Ｃｙ−は、窒素、酸素または硫黄から独立して選択される１〜３個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された４〜８員飽和または部分不飽和単環式複素環である。いくつかの実施形態では、−Ｃｙ−は、窒素、酸素または硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された５〜６員単環式ヘテロ芳香環である。いくつかの実施形態では、−Ｃｙ−は、窒素、酸素または硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された８〜１０員二環式または架橋二環式飽和または部分不飽和複素環である。いくつかの実施形態では、−Ｃｙ−は、窒素、酸素または硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された８〜１０員二環式または架橋二環式ヘテロ芳香環である。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、−Ｃｙ−は、フェニレン、ピリジニレン、ピリミジニレン、１，２，３−トリアゾリレンまたは１，２，４−トリアゾリレンである。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、−Ｃｙ−は、以下の表５に示されているものから選択される。
【０１６１】
上記で一般に定義されるように、ｎは０または１である。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、ｎは０である。いくつかの実施形態では、ｎは１である。
【０１６３】
別の態様では、本発明は、式ＸＸＶの化合物：
【化１９】
2021505132.tif 000031
（式中、
Ａｒ１は、必要に応じて置換されたフェニル、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された５〜６員単環式ヘテロ芳香環であり；
Ａｒ３は、必要に応じて置換されたフェニル、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された５〜６員単環式ヘテロ芳香環、必要に応じて置換された８〜１２員二環式芳香環、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された８〜１０員二環式ヘテロ芳香環であり；
Ｘは、二価Ｃ１−３アルキレン鎖から選択され、ここで、前記鎖の１〜２個のメチレン単位は独立して、−Ｏ−、−ＮＲ６−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＯ２−、−ＣＳ−、−Ｃ（ＮＲ６）−、−Ｓ（Ｏ）−または−Ｓ（Ｏ）２−で必要に応じて置き換えられており；
Ｘ２は、二価Ｃ１−３アルキレン鎖から選択され、ここで、前記鎖の１〜２個のメチレン単位は独立して、−Ｏ−、−ＮＲ６−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＯ２−、−ＣＳ−、−Ｃ（ＮＲ６）−、−Ｓ（Ｏ）−または−Ｓ（Ｏ）２−で必要に応じて置き換えられており；
Ｒ３が非存在である場合には、Ｒ２は、クリック可能基を必要に応じて含む光活性化可能基であり；
Ｒ３は非存在であるか、またはクリック可能基もしくはプルダウン基であり；
各Ｒ４は独立して、Ｒ、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒもしくは−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２であるか；または２つの場合のＲ４は、それらが結合している原子と一緒になって、Ｃ４−８部分不飽和炭素環を形成してもよく；
各Ｒ５は独立して、Ｒ、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒもしくは−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２であるか；または２つの場合のＲ５は一緒になって、＝Ｏもしくは＝Ｓを形成してもよく；
各Ｒ６は独立して水素であるか、または１、２、３、４、５もしくは６個のジュウテリウムもしくはハロゲン原子で必要に応じて置換されたＣ１−６アルキルであり；
各Ｒは独立して水素であるか、またはＣ１−６脂肪族、３〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式炭素環、フェニル、８〜１０員二環式芳香族炭素環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式複素環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員単環式ヘテロ芳香環、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する８〜１０員二環式ヘテロ芳香環から選択される必要に応じて置換された基であり；
Ｌ２は、Ｃ１−２０二価または三価直鎖状または分枝状の必要に応じて置換された炭化水素鎖であり、ここで、前記鎖の１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のメチレン単位は独立して、天然もしくは非天然アミノ酸、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＳＯ２−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｓ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）−または−Ｃｙ−で必要に応じて置き換えられており；ならびに前記鎖の１〜２０個の前記メチレン単位は独立して、−ＯＣＨ２ＣＨ２−で必要に応じて置き換えられており；
各−Ｃｙ−は独立して、二価の必要に応じて置換された３〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式炭素環、必要に応じて置換されたフェニレン、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜３個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された４〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式複素環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された５〜６員単環式ヘテロ芳香環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された８〜１０員二環式もしくは架橋二環式飽和もしくは部分不飽和複素環、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された８〜１０員二環式もしくは架橋二環式ヘテロ芳香環であり；
ｍは、０、１、２、３または４であり；ならびに
ｐは、０、１、２、３または４である）またはその薬学的に許容され得る塩を提供する。
【０１６４】
別の態様では、本発明は、式ＸＸＶＩの化合物：
【化２０】
2021505132.tif 000032
（式中、
Ａｒ１は、必要に応じて置換されたフェニル、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された５〜６員単環式ヘテロ芳香環であり；
Ａｒ３は、必要に応じて置換されたフェニル、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された５〜６員単環式ヘテロ芳香環、必要に応じて置換された８〜１２員二環式芳香環、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された８〜１０員二環式ヘテロ芳香環であり；
Ｘは、二価Ｃ１−３アルキレン鎖から選択され、ここで、前記鎖の１〜２個のメチレン単位は独立して、−Ｏ−、−ＮＲ６−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＯ２−、−ＣＳ−、−Ｃ（ＮＲ６）−、−Ｓ（Ｏ）−または−Ｓ（Ｏ）２−で必要に応じて置き換えられており；
Ｘ２は、二価Ｃ１−３アルキレン鎖から選択され、ここで、前記鎖の１〜２個のメチレン単位は独立して、−Ｏ−、−ＮＲ６−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＯ２−、−ＣＳ−、−Ｃ（ＮＲ６）−、−Ｓ（Ｏ）−または−Ｓ（Ｏ）２−で必要に応じて置き換えられており；
Ｒ３が非存在である場合には、Ｒ２は、クリック可能基を必要に応じて含む光活性化可能基であり；
Ｒ３は非存在であるか、またはクリック可能基もしくはプルダウン基であり；
各Ｒ４は独立して、Ｒ、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒもしくは−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２であるか；または２つの場合のＲ４は、それらが結合している原子と一緒になって、Ｃ４−８部分不飽和炭素環を形成してもよく；
各Ｒ５は独立して、Ｒ、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒもしくは−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２であるか；または２つの場合のＲ５は一緒になって、＝Ｏもしくは＝Ｓを形成してもよく；
各Ｒ６は独立して水素であるか、または１、２、３、４、５もしくは６個のジュウテリウムもしくはハロゲン原子で必要に応じて置換されたＣ１−６アルキルであり；
各Ｒ７は独立して、Ｒ、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒもしくは−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２であるか；または２つの場合のＲ４は、それらが結合している原子と一緒になって、Ｃ４−８部分不飽和炭素環を形成してもよく；
各Ｒは独立して水素であるか、またはＣ１−６脂肪族、３〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式炭素環、フェニル、８〜１０員二環式芳香族炭素環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式複素環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員単環式ヘテロ芳香環、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する８〜１０員二環式ヘテロ芳香環から選択される必要に応じて置換された基であり；
Ｌ２は、Ｃ１−２０二価または三価直鎖状または分枝状の必要に応じて置換された炭化水素鎖であり、ここで、前記鎖の１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のメチレン単位は独立して、天然もしくは非天然アミノ酸、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＳＯ２−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｓ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）−または−Ｃｙ−で必要に応じて置き換えられており；ならびに前記鎖の１〜２０個の前記メチレン単位は独立して、−ＯＣＨ２ＣＨ２−で必要に応じて置き換えられており；
各−Ｃｙ−は独立して、二価の必要に応じて置換された３〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式炭素環、必要に応じて置換されたフェニレン、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜３個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された４〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式複素環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された５〜６員単環式ヘテロ芳香環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された８〜１０員二環式もしくは架橋二環式飽和もしくは部分不飽和複素環、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された８〜１０員二環式もしくは架橋二環式ヘテロ芳香環であり；
ｍは、０、１、２、３または４であり；ならびに
ｐは、０、１、２、３または４である）またはその薬学的に許容され得る塩を提供する。
【０１６５】
上記で一般に定義されるように、Ａｒ１は、必要に応じて置換されたフェニル、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された５〜６員単環式ヘテロ芳香環である。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、Ａｒ１は、必要に応じて置換されたフェニルである。いくつかの実施形態では、Ａｒ１は、窒素、酸素または硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された５〜６員単環式ヘテロ芳香環である。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、Ａｒ１は、ハロゲン、−Ｃ１−６脂肪族、−ＣＮ、−ＯＲ、−ＮＲ２、−ＣＯ２Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−ＳＲまたは−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２から選択される１、２、３または４個の置換基で必要に応じて置換されたフェニルである。いくつかの実施形態では、必要に応じた置換基は、ハロゲン、−ＣＮ、−Ｃ１−６アルキルまたは−ＯＭｅから選択される。いくつかの実施形態では、必要に応じた置換基のうちの少なくとも１個はＣ１−６アルキルである。いくつかの実施形態では、１、２または３個の置換基が存在する。いくつかの実施形態では、Ａｒ１は、以下の表５に示されているものから選択される。
【０１６８】
上記で一般に定義されるように、Ａｒ３は、必要に応じて置換されたフェニル、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された５〜６員単環式ヘテロ芳香環、必要に応じて置換された８〜１２員二環式芳香環、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された８〜１０員二環式ヘテロ芳香環である。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、Ａｒ３は、必要に応じて置換されたフェニルである。いくつかの実施形態では、Ａｒ３は、窒素、酸素または硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された５〜６員単環式ヘテロ芳香環である。いくつかの実施形態では、Ａｒ３は、必要に応じて置換された８〜１２員二環式芳香環である。いくつかの実施形態では、Ａｒ３は、窒素、酸素または硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された８〜１０員二環式ヘテロ芳香環である。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、Ａｒ３は、必要に応じて置換されたピリジニル、ピリミジニル、イミダゾリルまたはピロリルである。いくつかの実施形態では、Ａｒ３は、必要に応じて置換されたピリジニルである。いくつかの実施形態では、Ａｒ３はピリジニルである。いくつかの実施形態では、必要に応じた置換基は、ハロゲン、−Ｃ１−６脂肪族、−ＣＮ、−ＯＲ、−ＮＲ２、−ＣＯ２Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−ＳＲまたは−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２から選択される。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、Ａｒ３は、ハロゲン、−Ｃ１−６脂肪族、−ＣＮ、−ＯＲ、−ＮＲ２、−ＣＯ２Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−ＳＲまたは−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２から選択される１、２、３または４個の置換基で必要に応じて置換されたフェニルである。いくつかの実施形態では、必要に応じた置換基は、ハロゲン、−ＣＮ、−Ｃ１−６アルキルまたは−ＯＭｅから選択される。いくつかの実施形態では、必要に応じた置換基のうちの少なくとも１個はハロゲンである。いくつかの実施形態では、１、２または３個の置換基が存在する。いくつかの実施形態では、Ａｒ３は、ハロゲン、−Ｃ１−６脂肪族および−ＯＲから選択される３個の置換基で置換されたフェニルである。いくつかの実施形態では、Ａｒ３は、以下の表５に示されているものから選択される。
【０１７２】
上記で一般に定義されるように、Ｘは二価Ｃ１−３アルキレン鎖から選択され、ここで、その鎖の１〜２個のメチレン単位は独立して、−Ｏ−、−ＮＲ６−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＯ２−、−ＣＳ−、−Ｃ（ＮＲ６）−、−Ｓ（Ｏ）−または−Ｓ（Ｏ）２−で必要に応じて置き換えられている。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、Ｘは二価Ｃ１−３アルキレン鎖であり、ここで、その鎖の１〜２個のメチレン単位は独立して、−Ｏ−、−ＮＲ６−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＯ２−、−ＣＳ−、−Ｃ（ＮＲ６）−、−Ｓ（Ｏ）−または−Ｓ（Ｏ）２−で必要に応じて置き換えられている。いくつかの実施形態では、Ｘは、−Ｏ−、−ＮＲ６−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＯ２−、−ＣＳ−、−Ｃ（ＮＲ６）−、−Ｓ（Ｏ）−または−Ｓ（Ｏ）２−である（すなわち、メチレン単位が−Ｏ−、−ＮＲ６−などで置き換えられたＣ１アルキレン）。いくつかの実施形態では、Ｘは二価Ｃ１−２アルキレン鎖であり、ここで、その鎖の１個のメチレン単位は、−Ｏ−、−ＮＲ６−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＯ２−、−ＣＳ−、−Ｃ（ＮＲ６）−、−Ｓ（Ｏ）−または−Ｓ（Ｏ）２−で必要に応じて置き換えられている。いくつかの実施形態では、Ｘは、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−である。いくつかの実施形態では、Ｘは、以下の表５に示されているものから選択される。
【０１７４】
上記で一般に定義されるように、Ｘ２は二価Ｃ１−３アルキレン鎖から選択され、ここで、その鎖の１〜２個のメチレン単位は独立して、−Ｏ−、−ＮＲ６−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＯ２−、−ＣＳ−、−Ｃ（ＮＲ６）−、−Ｓ（Ｏ）−または−Ｓ（Ｏ）２−で必要に応じて置き換えられている。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、Ｘ２は二価Ｃ１−３アルキレン鎖であり、ここで、その鎖の１〜２個のメチレン単位は独立して、−Ｏ−、−ＮＲ６−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＯ２−、−ＣＳ−、−Ｃ（ＮＲ６）−、−Ｓ（Ｏ）−または−Ｓ（Ｏ）２−で必要に応じて置き換えられている。いくつかの実施形態では、Ｘ２は、−Ｏ−、−ＮＲ６−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＯ２−、−ＣＳ−、−Ｃ（ＮＲ６）−、−Ｓ（Ｏ）−または−Ｓ（Ｏ）２−である（すなわち、メチレン単位が−Ｏ−、−ＮＲ６−などで置き換えられたＣ１アルキレン）。いくつかの実施形態では、Ｘ２は二価Ｃ１−２アルキレン鎖であり、ここで、その鎖の１個のメチレン単位は、−Ｏ−、−ＮＲ６−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＯ２−、−ＣＳ−、−Ｃ（ＮＲ６）−、−Ｓ（Ｏ）−または−Ｓ（Ｏ）２−で必要に応じて置き換えられている。いくつかの実施形態では、Ｘ２は、−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＯＣＨ２−、−ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−である。いくつかの実施形態では、Ｘ２は、以下の表５に示されているものから選択される。
【０１７６】
上記で一般に定義されるように、Ｒ３が非存在である場合には、Ｒ２は、クリック可能基を必要に応じて含む光活性化可能基である。いくつかの実施形態では、Ｒ２は光活性化可能基である。いくつかの実施形態では、Ｒ２は、クリック可能基でさらに置換された光活性化可能基である。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、Ｒ２は、紫外線（ＵＶ）を照射されると、ラジカル、アリールもしくはヘテロアリールカルボカチオン、ニトレンまたはカルベン中間体を生成する官能基であって、Ｒ３が非存在である場合には、クリック可能基またはプルダウン基で必要に応じて置換された官能基である。いくつかの実施形態では、Ｒ２は、必要に応じて置換されたフェニルもしくは８〜１０員二環式芳香族炭素環式アジドもしくは５〜８員ヘテロアリールもしくは８〜１０員二環式ヘテロアリールアジド、必要に応じて置換されたベンゾイルアジドもしくは５〜８員ヘテロアロイルアジドもしくは８〜１０員ヘテロアロイルアジド（ここで、前記環原子の１〜３個の原子は窒素、硫黄または酸素から選択される）、必要に応じて置換されたフェニルもしくは８〜１０員二環式芳香族炭素環式ジアゾニウム塩、必要に応じて置換された５〜８員ヘテロアリールもしくは８〜１０員二環式ヘテロアリールジアゾニウム塩（ここで、前記環原子の１〜３個の原子は窒素、硫黄または酸素から選択される）、必要に応じて置換されたＣ２−６脂肪族ジアゾ官能基、必要に応じて置換されたＣ２−６脂肪族ジアジリン、または必要に応じて置換されたジフェニルもしくは８〜１０員ジヘテロアリールケトン（ここで、前記環原子の１〜３個の原子は窒素、硫黄または酸素から選択される）、必要に応じて置換されたジヒドロピレン、必要に応じて置換されたスピロオキサジン、必要に応じて置換されたアントラセン、必要に応じて置換されたフルギド、必要に応じて置換されたスピロピラン、必要に応じて置換されたα−ピロンまたは必要に応じて置換されたピリミドンであり；クリック可能基またはプルダウン基で必要に応じて置換されている。いくつかの実施形態では、クリック可能基は、Ｃ１−６アルキルアジドまたはアルキンである。いくつかの実施形態では、Ｒ２は、
【化２１】
2021505132.tif 000033
【化２２】
2021505132.tif 000034
から選択され；ここで、Ｙ−は、薬学的に許容され得るアニオンである。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、Ｒ２は、以下の表５に示されているものから選択される。
【０１７９】
上記で一般に定義されるように、Ｒ３は非存在であるか、またはクリック可能基もしくはプルダウン基である。いくつかの実施形態では、Ｒ３は非存在である。いくつかの実施形態では、Ｒ３はクリック可能基である。いくつかの実施形態では、Ｒ３はプルダウン基である。いくつかの実施形態では、Ｒ３は、Ｃ１−６アルキルアジド、Ｃ１−６アルキンまたはハプテン、例えばビオチンである。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、Ｒ３は、以下の表５に示されているものから選択される。
【０１８１】
上記で一般に定義されるように、各Ｒ４は独立して、Ｒ、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒもしくは−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２であるか；または２つの場合のＲ４は、それらが結合している原子と一緒になって、Ｃ４−８部分不飽和炭素環を形成してもよい。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、Ｒ４はＲである。いくつかの実施形態では、Ｒ４はハロゲンである。いくつかの実施形態では、Ｒ４は−ＣＮである。いくつかの実施形態では、Ｒ４は−ＮＯ２である。いくつかの実施形態では、Ｒ４は−ＯＲである。いくつかの実施形態では、Ｒ４は−ＳＲである。いくつかの実施形態では、Ｒ４は−ＮＲ２である。いくつかの実施形態では、Ｒ４は−Ｓ（Ｏ）２Ｒである。いくつかの実施形態では、Ｒ４は−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２である。いくつかの実施形態では、Ｒ４は−Ｓ（Ｏ）Ｒである。いくつかの実施形態では、Ｒ４は−Ｃ（Ｏ）Ｒである。いくつかの実施形態では、Ｒ４は−Ｃ（Ｏ）ＯＲである。いくつかの実施形態では、Ｒ４は−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２である。いくつかの実施形態では、Ｒ４は−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲである。いくつかの実施形態では、Ｒ４は−ＯＣ（Ｏ）Ｒである。いくつかの実施形態では、Ｒ４は−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２である。いくつかの実施形態では、Ｒ４は−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲである。いくつかの実施形態では、Ｒ４は−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒである。いくつかの実施形態では、Ｒ４は−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＮＲ２である。いくつかの実施形態では、Ｒ４は−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒである。いくつかの実施形態では、Ｒ４は−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２である。いくつかの実施形態では、２つの場合のＲ４は、それらが結合している原子と一緒になって、Ｃ４−８部分不飽和炭素環を形成する。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、Ｒ４は、水素、Ｃ１−６脂肪族、３〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式炭素環、フェニル、８〜１０員二環式芳香族炭素環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式複素環；窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員単環式ヘテロ芳香環；窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する８〜１０員二環式ヘテロ芳香環；ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−ＯＣ（Ｏ）Ｒまたは−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒである。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、Ｒ４は、水素、１、２、３、４、５もしくは６個のジュウテリウムもしくはハロゲン原子で必要に応じて置換されたＣ１−６アルキル；３〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式炭素環、フェニル、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式複素環；窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員単環式ヘテロ芳香環；ハロゲン、−ＣＮ、−ＯＲ、−ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−ＯＣ（Ｏ）Ｒまたは−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒである。いくつかの実施形態では、Ｒ４は、水素、Ｃ１−６アルキル、フェニル、ハロゲン、−ＣＮ、−ＯＲまたは−ＮＲ２である。いくつかの実施形態では、Ｒ４は、以下の表５に示されているものから選択される。
【０１８５】
上記で一般に定義されるように、各Ｒ５は独立して、Ｒ、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒもしくは−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２であるか；または２つの場合のＲ５は一緒になって、＝Ｏもしくは＝Ｓを形成してもよい。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、Ｒ５はＲである。いくつかの実施形態では、Ｒ５はハロゲンである。いくつかの実施形態では、Ｒ５は−ＣＮである。いくつかの実施形態では、Ｒ５は−ＮＯ２である。いくつかの実施形態では、Ｒ５は−ＯＲである。いくつかの実施形態では、Ｒ５は−ＳＲである。いくつかの実施形態では、Ｒ５は−ＮＲ２である。いくつかの実施形態では、Ｒ５は−Ｓ（Ｏ）２Ｒである。いくつかの実施形態では、Ｒ５は−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２である。いくつかの実施形態では、Ｒ５は−Ｓ（Ｏ）Ｒである。いくつかの実施形態では、Ｒ５は−Ｃ（Ｏ）Ｒである。いくつかの実施形態では、Ｒ５は−Ｃ（Ｏ）ＯＲである。いくつかの実施形態では、Ｒ５は−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２である。いくつかの実施形態では、Ｒ５は−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲである。いくつかの実施形態では、Ｒ５は−ＯＣ（Ｏ）Ｒである。いくつかの実施形態では、Ｒ５は−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２である。いくつかの実施形態では、Ｒ５は−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲである。いくつかの実施形態では、Ｒ５は−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒである。いくつかの実施形態では、Ｒ５は−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＮＲ２である。いくつかの実施形態では、Ｒ５は−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒである。いくつかの実施形態では、Ｒ５は−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２である。いくつかの実施形態では、２つの場合のＲ５は一緒になって、＝Ｏまたは＝Ｓを形成する。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、Ｒ５は、水素、Ｃ１−６脂肪族、３〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式炭素環、フェニル、８〜１０員二環式芳香族炭素環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式複素環；窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員単環式ヘテロ芳香環；窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する８〜１０員二環式ヘテロ芳香環；ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−ＯＣ（Ｏ）Ｒまたは−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒである。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、Ｒ５は、水素、１、２、３、４、５もしくは６個のジュウテリウムもしくはハロゲン原子で必要に応じて置換されたＣ１−６アルキル；３〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式炭素環、フェニル、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式複素環；窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員単環式ヘテロ芳香環；ハロゲン、−ＣＮ、−ＯＲ、−ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−ＯＣ（Ｏ）Ｒまたは−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒである。いくつかの実施形態では、Ｒ５は、水素、Ｃ１−６アルキル、フェニル、ハロゲン、−ＣＮ、−ＯＲまたは−ＮＲ２である。
【０１８９】
上記で一般に定義されるように、各Ｒ６は独立して水素であるか、または１、２、３、４、５もしくは６個のジュウテリウムもしくはハロゲン原子で必要に応じて置換されたＣ１−６アルキルである。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、Ｒ６は水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ６は、１、２、３、４、５または６個のジュウテリウムまたはハロゲン原子で必要に応じて置換されたＣ１−６アルキルである。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、Ｒ６は、１、２または３個のハロゲン原子で必要に応じて置換されたＣ１−３アルキルである。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、Ｒ６は、以下の表５に示されているものから選択される。
【０１９３】
上記で一般に定義されるように、各Ｒ７は独立して、Ｒ、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒもしくは−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２であるか；または２つの場合のＲ７は、それらが結合している原子と一緒になって、Ｃ４−８部分不飽和炭素環を形成してもよい。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、Ｒ７はＲである。いくつかの実施形態では、Ｒ７はハロゲンである。いくつかの実施形態では、Ｒ７は−ＣＮである。いくつかの実施形態では、Ｒ７は−ＮＯ２である。いくつかの実施形態では、Ｒ７は−ＯＲである。いくつかの実施形態では、Ｒ７は−ＳＲである。いくつかの実施形態では、Ｒ７は−ＮＲ２である。いくつかの実施形態では、Ｒ７は−Ｓ（Ｏ）２Ｒである。いくつかの実施形態では、Ｒ７は−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２である。いくつかの実施形態では、Ｒ７は−Ｓ（Ｏ）Ｒである。いくつかの実施形態では、Ｒ７は−Ｃ（Ｏ）Ｒである。いくつかの実施形態では、Ｒ７は−Ｃ（Ｏ）ＯＲである。いくつかの実施形態では、Ｒ７は−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２である。いくつかの実施形態では、Ｒ７は−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲである。いくつかの実施形態では、Ｒ７は−ＯＣ（Ｏ）Ｒである。いくつかの実施形態では、Ｒ７は−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２である。いくつかの実施形態では、Ｒ７は−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲである。いくつかの実施形態では、Ｒ７は−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒである。いくつかの実施形態では、Ｒ７は−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＮＲ２である。いくつかの実施形態では、Ｒ７は−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒである。いくつかの実施形態では、Ｒ７は−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２である。いくつかの実施形態では、２つの場合のＲ７は、それらが結合している原子と一緒になって、Ｃ４−８部分不飽和炭素環を形成する。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、Ｒ７は、水素、Ｃ１−６脂肪族、３〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式炭素環、フェニル、８〜１０員二環式芳香族炭素環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式複素環；窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員単環式ヘテロ芳香環；窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する８〜１０員二環式ヘテロ芳香環；ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−ＯＣ（Ｏ）Ｒまたは−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒである。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、Ｒ７は、水素、１、２、３、４、５もしくは６個のジュウテリウムもしくはハロゲン原子で必要に応じて置換されたＣ１−６アルキル；３〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式炭素環、フェニル、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式複素環；窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員単環式ヘテロ芳香環；ハロゲン、−ＣＮ、−ＯＲ、−ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−ＯＣ（Ｏ）Ｒまたは−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒである。いくつかの実施形態では、Ｒ７は、水素、Ｃ１−６アルキル、フェニル、ハロゲン、−ＣＮ、−ＯＲまたは−ＮＲ２である。いくつかの実施形態では、Ｒ７は、以下の表５に示されているものから選択される。
【０１９７】
上記で一般に定義されるように、Ｌ２は、Ｃ１−２０二価または三価直鎖状または分枝状の必要に応じて置換された炭化水素鎖であり、ここで、その鎖の１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のメチレン単位は独立して、天然もしくは非天然アミノ酸、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＳＯ２−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｓ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）−または−Ｃｙ−で必要に応じて置き換えられており；鎖の１〜２０個のメチレン単位は独立して、−ＯＣＨ２ＣＨ２−で必要に応じて置き換えられている。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、Ｌ２は、Ｃ１−１０二価または三価直鎖状または分枝状の必要に応じて置換された炭化水素鎖であり、ここで、その鎖の１、２、３、４または５個のメチレン単位は独立して、天然もしくは非天然アミノ酸、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＳＯ２−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｓ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）−または−Ｃｙ−で必要に応じて置き換えられており；鎖の１〜５個のメチレン単位は独立して、−ＯＣＨ２ＣＨ２−で必要に応じて置き換えられている。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、１〜３個の天然アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、プロリン、リジン、グリシンまたはアラニンから選択される。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、１，２，３−トリアゾリレンまたは１，２，４−トリアゾリレンから選択される１〜２個の−Ｃｙ−基を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、１〜１０、１〜８、１〜６、１〜４、１〜３、１〜２、１、２または３個の−ＯＣＨ２ＣＨ２−単位を含む。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、Ｌ２は、Ｃ１−２０二価または三価直鎖状または分枝状の必要に応じて置換された炭化水素鎖であり、ここで、その鎖の１、２、３、４または５個のメチレン単位は独立して、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−（Ｒ）ＮＣ（Ｏ）−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−Ｃ（Ｓ）−または−Ｃｙ−で必要に応じて置き換えられており；鎖の１〜２０個のメチレン単位は独立して、−ＯＣＨ２ＣＨ２−で必要に応じて置き換えられている。
【０２００】
いくつかの実施形態では、Ｌ２は、Ｃ１−２０二価または三価直鎖状の必要に応じて置換された炭化水素鎖であり、ここで、その鎖の１、２、３、４または５個のメチレン単位は独立して、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）−または−Ｃｙ−で必要に応じて置き換えられており；鎖の１〜２０個のメチレン単位は独立して、−ＯＣＨ２ＣＨ２−で必要に応じて置き換えられている。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、鎖の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のメチレン単位は、−ＯＣＨ２ＣＨ２−で置き換えられている。いくつかの実施形態では、鎖の１、２、３、４、５、６、７もしくは８個；または１、２、３、４もしくは５個のメチレン単位は、−ＯＣＨ２ＣＨ２−で置き換えられている。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、Ｌ２は、以下の表５に示されているものから選択される。
【０２０３】
上記で一般に定義されるように、各−Ｃｙ−は独立して、二価の必要に応じて置換された３〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式炭素環、必要に応じて置換されたフェニレン、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜３個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された４〜８員飽和もしくは部分不飽和単環式複素環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された５〜６員単環式ヘテロ芳香環、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された８〜１０員二環式もしくは架橋二環式飽和もしくは部分不飽和複素環、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された８〜１０員二環式もしくは架橋二環式ヘテロ芳香環である。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、−Ｃｙ−は、二価の必要に応じて置換された３〜８員飽和または部分不飽和単環式炭素環である。いくつかの実施形態では、−Ｃｙ−は、必要に応じて置換されたフェニレンである。いくつかの実施形態では、−Ｃｙ−は、窒素、酸素または硫黄から独立して選択される１〜３個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された４〜８員飽和または部分不飽和単環式複素環である。いくつかの実施形態では、−Ｃｙ−は、窒素、酸素または硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された５〜６員単環式ヘテロ芳香環である。いくつかの実施形態では、−Ｃｙ−は、窒素、酸素または硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された８〜１０員二環式もしくは架橋二環式飽和または部分不飽和複素環である。いくつかの実施形態では、−Ｃｙ−は、窒素、酸素または硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する必要に応じて置換された８〜１０員二環式または架橋二環式ヘテロ芳香環である。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、−Ｃｙ−は、フェニレン、ピリジニレン、ピリミジニレン、１，２，３−トリアゾリレンまたは１，２，４−トリアゾリレンである。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、−Ｃｙ−は、以下の表５に示されているものから選択される。
【０２０７】
上記で一般に定義されるように、ｍは０、１、２、３または４である。いくつかの実施形態では、ｍは０である。いくつかの実施形態では、ｍは１である。いくつかの実施形態では、ｍは２である。いくつかの実施形態では、ｍは３である。いくつかの実施形態では、ｍは４である。いくつかの実施形態では、ｍは０、１、２または３である。いくつかの実施形態では、ｍは０、１または２である。いくつかの実施形態では、ｍは１または２である。
【０２０８】
上記で一般に定義されるように、ｐは０、１、２、３または４である。いくつかの実施形態では、ｐは０である。いくつかの実施形態では、ｐは１である。いくつかの実施形態では、ｐは２である。いくつかの実施形態では、ｐは３である。いくつかの実施形態では、ｐは４である。いくつかの実施形態では、ｐは０、１、２または３である。いくつかの実施形態では、ｐは０、１または２である。いくつかの実施形態では、ｐは１または２である。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、本発明は、式Ｘ−ｃ、Ｘ−ｄ、Ｘ−ｅまたはＸ−ｆの化合物：
【化２３】
2021505132.tif 000035
（式中、Ａｒ１、Ａｒ２、Ｘ、Ｌ１、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ６、Ｒ、−Ｃｙ−およびｎはそれぞれ、単独および組み合わせの両方で、上記で定義され、本明細書の実施形態に記載されるとおりである）またはその互変異性体もしくは薬学的に許容され得る塩を提供する。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、本発明は、式ＸＩまたはＸＩＩの化合物：
【化２４】
2021505132.tif 000036
（式中、Ａｒ１、Ａｒ２、Ｘ、Ｌ１、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ６、Ｒ、−Ｃｙ−およびｎはそれぞれ、単独および組み合わせの両方で、上記で定義され、本明細書の実施形態に記載されるとおりである）またはその互変異性体もしくは薬学的に許容され得る塩を提供する。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、本発明は、式ＸＩＩＩの化合物：
【化２５】
2021505132.tif 000037
（式中、Ａｒ１、Ａｒ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ６、Ｒおよび−Ｃｙ−はそれぞれ、単独および組み合わせの両方で、上記で定義され、本明細書の実施形態に記載されるとおりである）またはその互変異性体もしくは薬学的に許容され得る塩を提供する。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、本発明は、式ＸＩＶの化合物：
【化２６】
2021505132.tif 000038
（式中、Ｘ、Ｌ１、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ６、Ｒ、−Ｃｙ−およびｎはそれぞれ、単独および組み合わせの両方で、上記で定義され、本明細書の実施形態に記載されるとおりである）またはその互変異性体もしくは薬学的に許容され得る塩を提供する。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、本発明は、式ＸＶの化合物：
【化２７】
2021505132.tif 000039
（式中、Ｘ、Ｌ１、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ６、Ｒ、−Ｃｙ−およびｎはそれぞれ、単独および組み合わせの両方で、上記で定義され、本明細書の実施形態に記載されるとおりである）またはその互変異性体もしくは薬学的に許容され得る塩を提供する。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、本発明は、式ＸＶＩ、ＸＶＩＩ、ＸＶＩＩＩまたはＸＩＸの化合物：
【化２８】
2021505132.tif 000040
【化２９】
2021505132.tif 000041
（式中、Ｌ１、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ６、Ｒ、−Ｃｙ−およびｎはそれぞれ、単独および組み合わせの両方で、上記で定義され、本明細書の実施形態に記載されるとおりである）またはその互変異性体もしくは薬学的に許容され得る塩を提供する。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、本発明は、式ＸＸ、ＸＸＩ、ＸＸＩＩ、ＸＸＩＩＩまたはＸＸＩＶの化合物：
【化３０】
2021505132.tif 000042
【化３１】
2021505132.tif 000043
（式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ６、Ｒ、−Ｃｙ−およびｎはそれぞれ、単独および組み合わせの両方で、上記で定義され、本明細書の実施形態に記載されるとおりである）またはその互変異性体もしくは薬学的に許容され得る塩を提供する。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、本発明は、式ＸＸＶＩＩまたはＸＸＶＩＩＩの化合物：
【化３２】
2021505132.tif 000044
（式中、Ａｒ１、Ａｒ３、Ｘ、Ｘ２、Ｌ２、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ、−Ｃｙ−、ｍおよびｐはそれぞれ、単独および組み合わせの両方で、上記で定義され、本明細書の実施形態に記載されるとおりである）またはその薬学的に許容され得る塩を提供する。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、本発明は、式ＸＸＩＸ、ＸＸＸ、ＸＸＸＩ、ＸＸＸＩＩまたはＸＸＸＩＩＩの化合物：
【化３３】
2021505132.tif 000045
【化３４】
2021505132.tif 000046
（式中、Ｘ、Ｘ２、Ｌ２、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ、−Ｃｙ−およびｍはそれぞれ、単独および組み合わせの両方で、上記で定義され、本明細書の実施形態に記載されるとおりである）またはその薬学的に許容され得る塩を提供する。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、本発明は、式ＸＸＸＩＶ、ＸＸＸＶ、ＸＸＸＶＩまたはＸＸＸＶＩＩの化合物：
【化３５】
2021505132.tif 000047
【化３６】
2021505132.tif 000048
（式中、Ａｒ１、Ａｒ３、Ｘ、Ｘ２、Ｌ２、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ、−Ｃｙ−、ｍおよびｐはそれぞれ、単独および組み合わせの両方で、上記で定義され、本明細書の実施形態に記載されるとおりである）またはその薬学的に許容され得る塩を提供する。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、本発明は、式ＸＸＸＶＩＩＩ、ＸＸＸＩＸ、ＸＬ、ＸＬＩまたはＸＬＩＩの化合物：
【化３７】
2021505132.tif 000049
【化３８】
2021505132.tif 000050
（式中、Ｘ、Ｌ２、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ、−Ｃｙ−、ｍおよびｐはそれぞれ、単独および組み合わせの両方で、上記で定義され、本明細書の実施形態に記載されるとおりである）またはその薬学的に許容され得る塩を提供する。
【０２２０】
本発明の例示的な化合物は、以下の表５に示されている。
【表５−１】
2021505132.tif 000051
【表５−２】
2021505132.tif 000052
【表５−３】
2021505132.tif 000053
【表５−４】
2021505132.tif 000054
【表５−５】
2021505132.tif 000055
【表５−６】
2021505132.tif 000056
【表５−７】
2021505132.tif 000057
【表５−８】
2021505132.tif 000058
【表５−９】
2021505132.tif 000059
【０２２１】
いくつかの実施形態では、本発明は、上記表１に示されている化合物またはそれらの薬学的に許容され得る塩を提供する。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、化合物またはコンジュゲートは、図１〜４４に示されている式またはその薬学的に許容され得る塩、立体異性体もしくは互変異性体から選択される。
小分子ＲＮＡリガンド
【０２２３】
ＲＮＡに結合することができる新規小分子リガンドの設計および合成は、ほとんど未利用の治療可能性を示す。いくつかの実施形態では、小分子リガンドは、ＲＮＡに結合することが公知の化合物、例えばヘテロアリールジヒドロピリミジン（ＨＡＰ）、マクロライド（例えば、エリスロマイシン、アジスロマイシン）、アルカロイド（例えば、ベルベリン、パルマチン）、アミノグリコシド（例えば、パロモマイシン、ネオマイシンＢ、カナマイシンＡ）、テトラサイクリン（例えば、ドキシサイクリン、オキシテトラサイクリン）、テオフィリン、リボシル、クリンダマイシン、クロラムフェニコール、ＬＭＩ０７０、トリプチセン系足場、オキサゾリジノン（例えば、リネゾリド、テジゾリド）またはＣＰＮＱから選択される。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、小分子リガンドは、以下の構造を有するリボシル：
【化３９】
2021505132.tif 000060
またはその薬学的に許容され得る塩である。リボシルは、ＦＭＮリボスイッチ（ＰＤＢ５ＫＸ９）に結合し、リボスイッチ機能を阻害する薬物様リガンドである（Ｎａｔｕｒｅ  ２０１５，５２６，６７２−６７７）。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、小分子リガンドは、オキサゾリジノン、例えばリネゾリド、テジゾリド、エペレゾリドまたはＰＮＵ１７６７９８である。例示的なオキサゾリジノン系光プローブは、例えば、Ｍａｔａｓｓｏｖａ，Ｎ．Ｂら、ＲＮＡ（１９９９），５：９３９−９４６；Ｌｅａｃｈ，Ｋ．Ｌら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ２００７，２６，３９３−４０２；Ｃｏｌｃａ，Ｊ．Ｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００３，２７８（２４），２１９７２−２１９７９に記載されており、これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。このようなオキサゾリジノンとしては、以下のものが挙げられる：
【化４０】
2021505132.tif 000061
【化４１】
2021505132.tif 000062
【化４２】
2021505132.tif 000063
前述のオキサゾリジノンは、光活性化可能基をオキサゾリジノンと連結するテザーを必要に応じて用いて、任意の利用可能な位置において、本明細書に記載される光活性化可能基で置換されてもよい。アジド光活性化可能基は、本明細書に記載される他の光活性化可能基で必要に応じて置き換えられている。アスタリスク（＊）は、元の参考文献で使用される１２５Ｉまたは１４Ｃ放射性リガンドの位置を示し、本発明におけるプルダウン基としての使用については、必要に応じてである。
【０２２６】
アリールジアゾニウム塩、例えばＬ−５−カルボキシスペルミンおよびＬ−２−カルボキシプトレシンのｐ−ジアゾニウムアニリドもまた、ＲＮＡマッピングおよびＲＮＡ／タンパク質相互作用のフットプリンティングのための光活性化可能プローブとして有用であることが示されている。例えば、Ｇａｒｃｉａ，Ａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９０，１８（１），８９−９５を参照のこと。
【０２２７】
さらに、キノリンコアを含む特定の化合物（そのうちの１つがＣＰＮＱである）は、ＲＮＡに結合することができる。ＣＰＮＱは、以下の構造：
【化４３】
2021505132.tif 000064
を有する。
【０２２８】
したがって、いくつかの実施形態では、小分子リガンドは、ＣＰＮＱまたはその薬学的に許容され得る塩から選択される。他の実施形態では、リガンドは、ＣＰＮＱに関連するキノリン化合物、例えば図３６または３９〜４３のいずれか１つに提供されている化合物；またはそれらの薬学的に許容され得る塩から選択される。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、ＣＰＮＱまたはＣＰＮＱに関連するキノリンは、本明細書に記載されるそれぞれの実施形態にしたがって、テザー（−Ｔ１−および／または−Ｔ２−）、クリック可能基（−ＲＣＧ）または弾頭（−Ｒｍｏｄ）で水素を置き換えるように、１つまたはそれを超える利用可能な位置において改変される。例えば、ＣＰＮＱまたはＣＰＮＱに関連するキノリンは、以下の式：
【化４４】
2021505132.tif 000065
（式中、Ｒｍｏｄは、−ＲＣＧまたは−Ｔ２−ＲＣＧで必要に応じて置換され、プルダウン基でさらに必要に応じて置換されている）のうちの１つまたはその薬学的に許容され得る塩を有し得る。式ＩＸ−ａまたはＩＸ−ｂの化合物は、１個またはそれを超える以下で定義される必要に応じた置換基、例えば１または２個の必要に応じた置換基でさらに必要に応じて置換されてもよい。
【０２３０】
有機色素、アミノ酸、生物学的補因子、金属錯体およびペプチドもまた、ＲＮＡ結合能力を示す。リボスイッチ、伸長ヌクレオチドリピートを有するＲＮＡ分子およびウイルスＲＮＡエレメントなどのＲＮＡをモジュレートすることが可能である。
【０２３１】
本明細書で使用される場合、「標的ＲＮＡに結合する小分子」、「小分子ＲＮＡバインダー」、「親和性部分」、「リガンド」または「リガンド部分」という用語は、開示される方法における使用のために、または標的ＲＮＡに関連する疾患を処置、予防もしくは改善するために、十分な親和性および特異性で標的ＲＮＡに結合することができる小分子と一般に分類されるすべての化合物を含む。本発明において使用するためのＲＮＡに結合する小分子は、標的ＲＮＡの１つまたはそれを超える二次または三次構造エレメントに結合し得る。これらの部位としては、ＲＮＡトリプレックス、ヘアピン、バルジループ、シュードノット、内部ループ、ジャンクションおよび本明細書に記載または参照される他のより高次のＲＮＡ構造モチーフが挙げられる。
【０２３２】
したがって、いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡに結合する小分子（例えば、上記式Ｉ〜ＶＩＩＩのリガンド）は、ヘテロアリールジヒドロピリミジン（ＨＡＰ）、マクロライド、アルカロイド、アミノグリコシド、テトラサイクリンファミリーのメンバー、オキサゾリジノン、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡリガンド、例えばＬＭＩ０７０（ＮＶＳ−ＳＭ１）、リボシルもしくはその類似体、クリンダマイシン、クロラムフェニコール、アントラセン、トリプチセン、テオフィリンもしくはその類似体またはＣＰＮＱもしくはその類似体から選択される。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡに結合する小分子は、パロモマイシン、ネオマイシン（例えば、ネオマイシンＢ）、カナマイシン（例えば、カナマイシンＡ）、リネゾリド、テジゾリド、プレウロムチリン、リボシル、アントラセン、トリプチセンまたはＣＰＮＱもしくはその類似体から選択され；ここで、各小分子は、１個またはそれを超える以下で定義される「必要に応じた置換基」、例えば１、２、３または４個、例えば１または２個の必要に応じた置換基で必要に応じて置換されてもよい。いくつかの実施形態では、小分子は、図１〜８もしくは１８〜４４に示されているものまたはそれらのその薬学的に許容され得る塩、立体異性体もしくは互変異性体から選択される。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、リガンドは、
【化４５】
2021505132.tif 000066
【化４６】
2021505132.tif 000067
またはそれらの薬学的に許容され得る塩から選択される。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、リガンドは、標的ＲＮＡ中のジャンクション、ステムループまたはバルジに結合する。いくつかの実施形態では、リガンドは、核酸の三方向ジャンクション（３ＷＪ）に結合する。いくつかの実施形態では、３ＷＪは、２つのＲＮＡ分子間のトランス３ＷＪである。いくつかの実施形態では、３ＷＪは、ｍｉＲＮＡとｍＲＮＡとの間のトランス３ＷＪである。いくつかの実施形態では、リガンドは、ＤＮＡ、例えばＤＮＡループまたはジャンクションに結合する。
【０２３５】
本発明の化合物は、本明細書に一般に記載されるものを含み、本明細書に開示されるクラス、サブクラスおよび種によりさらに例示される。本明細書で使用される場合、特に指示がない限り、以下の定義が適用される。本発明の目的のために、化学元素は、Ｐｅｒｉｏｄｉｃ  Ｔａｂｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ，ＣＡＳ  ｖｅｒｓｉｏｎ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，７５ｔｈＥｄにしたがって特定される。加えて、有機化学の一般原則は、“Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，Ｔｈｏｍａｓ  Ｓｏｒｒｅｌｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｏｏｋｓ，Ｓａｕｓａｌｉｔｏ：１９９９、および“Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，５ｔｈＥｄ．，Ｅｄ．：Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｂ．ａｎｄ  Ｍａｒｃｈ，Ｊ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：２００１（これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０２３６】
本明細書で使用される場合、「脂肪族」または「脂肪族基」という用語は、完全に飽和しているかもしくは１つもしくはそれを超える不飽和単位を含有する直鎖状（すなわち、非分枝状）もしくは分枝状置換もしくは非置換炭化水素鎖、または完全に飽和しているかもしくは１つもしくはそれを超える不飽和単位を含有するが芳香族ではない単環式炭化水素もしくは二環式炭化水素（本明細書では「炭素環」、「脂環式」または「シクロアルキル」とも称される）であって、分子の残部への単一の結合点を有するものを意味する。特に指定がない限り、脂肪族基は、１〜６個の脂肪族炭素原子を含有する。いくつかの実施形態では、脂肪族基は、１〜５個の脂肪族炭素原子を含有する。他の実施形態では、脂肪族基は、１〜４個の脂肪族炭素原子を含有する。また他の実施形態では、脂肪族基は１〜３個の脂肪族炭素原子を含有し、さらに他の実施形態では、脂肪族基は１〜２個の脂肪族炭素原子を含有する。いくつかの実施形態では、「脂環式」（または「炭素環」もしくは「シクロアルキル」）は、完全に飽和しているかもしくは１つもしくはそれを超える不飽和単位を含有するが、芳香族ではなく、分子の残部への単一の結合点を有する、単環式Ｃ３−Ｃ６炭化水素を指す。適切な脂肪族基としては、限定されないが、直鎖状または分枝状置換または非置換アルキル基、アルケニル基、アルキニル基およびこれらのハイブリッド（（シクロアルキル）アルキル、（シクロアルケニル）アルキルまたは（シクロアルキル）アルケニルなど）が挙げられる。
【０２３７】
本明細書で使用される場合、「架橋二環式」という用語は、任意の二環式環系、すなわち、少なくとも１つの架橋を有する炭素環式または複素環式飽和または部分不飽和のものを指す。ＩＵＰＡＣにより定義されるように、「架橋」は、２つの橋頭を接続する複数の原子の非分枝鎖または１つの原子もしくは原子価結合であり、ここで、「橋頭」は、３個またはそれを超える骨格原子（水素を除く）に結合した環系の任意の骨格原子である。いくつかの実施形態では、架橋二環式基は、７〜１２個の環員と、窒素、酸素または硫黄から独立して選択される０〜４個のヘテロ原子とを有する。このような架橋二環式基は当技術分野で周知であり、任意の置換可能な炭素原子または窒素原子において各基が分子の残部に結合した以下に記載されている基が挙げられる。特に指定がない限り、架橋二環式基は、脂肪族基について記載されている１個またはそれを超える置換基で必要に応じて置換されている。加えてまたはあるいは、架橋二環式基の任意の置換可能な窒素は、必要に応じて置換されている。例示的な架橋二環式としては、
【化４７】
2021505132.tif 000068
が挙げられる。
【０２３８】
「低級アルキル」という用語は、Ｃ１−４直鎖状または分枝状アルキル基を指す。例示的な低級アルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチルおよびｔｅｒｔ−ブチルである。
【０２３９】
「低級ハロアルキル」という用語は、１個またはそれを超えるハロゲン原子で置換されたＣ１−４直鎖状または分枝状アルキル基を指す。
【０２４０】
「ヘテロ原子」という用語は、酸素、硫黄、窒素、リンまたはケイ素（窒素、硫黄、リンもしくはケイ素の任意の酸化形態；任意の塩基性窒素の４級化形態または；複素環式環の置換可能な窒素、例えば（３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピロリルのような）Ｎ、（ピロリジニルのような）ＮＨまたは（Ｎ−置換ピロリジニルのような）ＮＲ＋を含む）の１つまたはそれよりも多くを意味する。
【０２４１】
本明細書で使用される場合、「不飽和」という用語は、部分が１つまたはそれを超える不飽和単位を有することを意味する。
【０２４２】
本明細書で使用される場合、「二価Ｃ１−８（またはＣ１−６）飽和または不飽和直鎖状または分枝状炭化水素鎖」という用語は、本明細書で定義される直鎖状または分枝状の二価アルキレン、アルケニレンおよびアルキニレン鎖を指す。
【０２４３】
「アルキレン」という用語は、二価アルキル基を指す。「アルキレン鎖」は、ポリメチレン基、すなわち−（ＣＨ２）ｎ−（ｎは、正の整数、好ましくは１〜６、１〜４、１〜３、１〜２または２〜３である）である。置換アルキレン鎖は、１個またはそれを超えるメチレン水素原子が置換基で置き換えられたポリメチレン基である。適切な置換基としては、置換脂肪族基について以下に記載されているものが挙げられる。
【０２４４】
「アルケニレン」という用語は、二価アルケニル基を指す。置換アルケニレン鎖は、少なくとも１つの二重結合を含有するポリメチレン基であって、１個またはそれを超える水素原子が置換基で置き換えられたポリメチレン基である。適切な置換基としては、置換脂肪族基について以下に記載されているものが挙げられる。
【０２４５】
「ハロゲン」という用語は、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩを意味する。
【０２４６】
単独でまたは「アラルキル」、「アラルコキシ」もしくは「アリールオキシアルキル」のようにより大きな部分の一部として使用される「アリール」という用語は、合計５〜１４個の環員を有する単環式または二環式環系であって、系における少なくとも１つの環が芳香族であり、系における各環が３〜７個の環員を含有する単環式または二環式環系を指す。「アリール」という用語は、「アリール環」という用語と互換的に使用され得る。本発明の特定の実施形態では、「アリール」は、限定されないが、１個またはそれを超える置換基を有し得るフェニル、ビフェニル、ナフチル、アントラシルなどを含む芳香環系を指す。本明細書で使用される場合、芳香環が１つまたはそれを超える非芳香環に縮合した基、例えばインダニル、フタルイミジル、ナフトイミジル、フェナントリジニルまたはテトラヒドロナフチルなども「アリール」という用語の範囲に含まれる。
【０２４７】
単独でまたはより大きな部分、例えば「ヘテロアラルキル」もしくは「ヘテロアラルコキシ」の一部として使用される「ヘテロアリール」および「ヘテロアラ−」という用語は、５〜１０個の環原子、好ましくは５個、６個または９個の環原子を有し；環状配置で共有される６個、１０個または１４個のπ電子を有し；炭素原子に加えて１〜５個のヘテロ原子を有する基を指す。「ヘテロ原子」という用語は、窒素、酸素または硫黄を指し、窒素または硫黄の任意の酸化形態および塩基性窒素の任意の４級化形態を含む。ヘテロアリール基としては、限定されないが、チエニル、フラニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、インドリジニル、プリニル、ナフチリジニルおよびプテリジニルが挙げられる。本明細書で使用される場合、「ヘテロアリール」および「ヘテロアラ−」という用語はまた、ヘテロ芳香環が１つまたはそれを超えるアリール環、脂環式環またはヘテロシクリル環に縮合した基であって、ラジカルまたは結合点がヘテロ芳香環上にある基を含む。非限定的な例としては、インドリル、イソインドリル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、ジベンゾフラニル、インダゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、キノリル、イソキノリル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、４Ｈ−キノリジニル、カルバゾリル、アクリジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニルおよびピリド［２，３−ｂ］−１，４−オキサジン−３（４Ｈ）−オンが挙げられる。ヘテロアリール基は、単環式または二環式であり得る。「ヘテロアリール」という用語は、「ヘテロアリール環」、「ヘテロアリール基」または「ヘテロ芳香族」という用語と互換的に使用され得、これらの用語はいずれも、必要に応じて置換された環を含む。「ヘテロアラルキル」という用語は、ヘテロアリールで置換されたアルキル基であって、アルキル部分およびヘテロアリール部分が独立して必要に応じて置換されたアルキル基を指す。
【０２４８】
本明細書で使用される場合、「複素環」、「ヘテロシクリル」、「複素環式ラジカル」および「複素環式環」という用語は互換的に使用され、飽和または部分不飽和の安定な５〜７員単環式または７〜１０員二環式複素環式部分であって、炭素原子に加えて、１個またはそれを超える、好ましくは１〜４個の上記で定義されるヘテロ原子を有する安定な５〜７員単環式または７〜１０員二環式複素環式部分を指す。複素環の環原子に関して使用される場合、「窒素」という用語は、置換窒素を含む。一例として、酸素、硫黄または窒素から選択される０〜３個のヘテロ原子を有する飽和または部分不飽和環では、窒素は、（３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピロリルのような）Ｎ、（ピロリジニルのような）ＮＨまたは（Ｎ−置換ピロリジニルのような）＋ＮＲであり得る。
【０２４９】
複素環式環は、安定な構造をもたらす任意のヘテロ原子または炭素原子において、そのペンダント基に結合され得、環原子はいずれも必要に応じて置換されてもよい。このような飽和または部分不飽和複素環式ラジカルの例としては、限定されないが、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピロリニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、デカヒドロキノリニル、オキサゾリジニル、ピペラジニル、ジオキサニル、ジオキソラニル、ジアゼピニル、オキサゼピニル、チアゼピニル、モルホリニルおよびキヌクリジニルが挙げられる。「複素環」、「ヘテロシクリル」、「ヘテロシクリル環」、「複素環式基」、「複素環式部分」および「複素環式ラジカル」という用語は本明細書では互換的に使用され、ヘテロシクリル環が１つまたはそれを超えるアリール環、ヘテロアリール環または脂環式環に縮合した基、例えばインドリニル、３Ｈ−インドリル、クロマニル、フェナントリジニルまたはテトラヒドロキノリニルなども含む。ヘテロシクリル基は、単環式または二環式であり得る。「ヘテロシクリルアルキル」という用語は、ヘテロシクリルで置換されたアルキル基であって、アルキル部分およびヘテロシクリル部分が独立して必要に応じて置換された基を指す。
【０２５０】
本明細書で使用される場合、「部分不飽和」という用語は、少なくとも１つの二重結合または三重結合を含む環部分を指す。「部分不飽和」という用語は、複数の不飽和部位を有する環を包含することを意図するが、本明細書で定義されるアリール部分またはヘテロアリール部分を含むことを意図しない。
【０２５１】
本明細書に記載される場合、本発明の化合物は、「必要に応じて置換された」部分を含有し得る。一般に、「置換された」という用語は、「必要に応じて」という用語が先行するか否かにかかわらず、指定部分の１個またはそれを超える水素が適切な置換基で置き換えられていることを意味する。特に指示がない限り、「必要に応じて置換された」基は、基の置換可能な各位置において適切な置換基（「必要に応じた置換基」）を有し得、任意の所定の構造における１つを超える位置が特定の基から選択される１個を超える置換基で置換されてもよい場合、置換基は、あらゆる位置において同じものまたは異なるものであり得る。本発明により想定される置換基の組み合わせは、好ましくは、安定なまたは化学的に実現可能な化合物の形成をもたらすものである。本明細書で使用される場合、「安定な」という用語は、化合物の生産、検出、ならびに特定の実施形態では回収、精製および本明細書に開示される１つまたはそれを超える目的のための使用を可能にする条件に供された場合に、実質的に変化しない化合物を指す。
【０２５２】
「必要に応じて置換された」基の置換可能な炭素原子上の適切な一価置換基は独立して、ハロゲン；−（ＣＨ２）０−４Ｒ○；−（ＣＨ２）０−４ＯＲ○；−Ｏ（ＣＨ２）０−４Ｒ○、−Ｏ−（ＣＨ２）０−４Ｃ（Ｏ）ＯＲ○；−（ＣＨ２）０−４ＣＨ（ＯＲ○）２；−（ＣＨ２）０−４ＳＲ○；−（ＣＨ２）０−４Ｐｈ（これはＲ○で置換されてもよい）；−（ＣＨ２）０−４Ｏ（ＣＨ２）０−１Ｐｈ（これはＲ○で置換されてもよい）；−ＣＨ＝ＣＨＰｈ（これはＲ○で置換されてもよい）；−（ＣＨ２）０−４Ｏ（ＣＨ２）０−１−ピリジル（これはＲ○で置換されてもよい）；−ＮＯ２；−ＣＮ；−Ｎ３；−（ＣＨ２）０−４Ｎ（Ｒ○）２；−（ＣＨ２）０−４Ｎ（Ｒ○）Ｃ（Ｏ）Ｒ○；−Ｎ（Ｒ○）Ｃ（Ｓ）Ｒ○；−（ＣＨ２）０−４Ｎ（Ｒ○）Ｃ（Ｏ）ＮＲ○２；−Ｎ（Ｒ○）Ｃ（Ｓ）ＮＲ○２；−（ＣＨ２）０−４Ｎ（Ｒ○）Ｃ（Ｏ）ＯＲ○；−Ｎ（Ｒ○）Ｎ（Ｒ○）Ｃ（Ｏ）Ｒ○；−Ｎ（Ｒ○）Ｎ（Ｒ○）Ｃ（Ｏ）ＮＲ○２；−Ｎ（Ｒ○）Ｎ（Ｒ○）Ｃ（Ｏ）ＯＲ○；−（ＣＨ２）０−４Ｃ（Ｏ）Ｒ○；−Ｃ（Ｓ）Ｒ○；−（ＣＨ２）０−４Ｃ（Ｏ）ＯＲ○；−（ＣＨ２）０−４Ｃ（Ｏ）ＳＲ○；−（ＣＨ２）０−４Ｃ（Ｏ）ＯＳｉＲ○３；−（ＣＨ２）０−４ＯＣ（Ｏ）Ｒ○；−ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ２）０−４ＳＲ−、ＳＣ（Ｓ）ＳＲ○；−（ＣＨ２）０−４ＳＣ（Ｏ）Ｒ○；−（ＣＨ２）０−４Ｃ（Ｏ）ＮＲ○２；−Ｃ（Ｓ）ＮＲ○２；−Ｃ（Ｓ）ＳＲ○；−ＳＣ（Ｓ）ＳＲ○、−（ＣＨ２）０−４ＯＣ（Ｏ）ＮＲ○２；−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＯＲ○）Ｒ○；−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ○；−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ○；−Ｃ（ＮＯＲ○）Ｒ○；−（ＣＨ２）０−４ＳＳＲ○；−（ＣＨ２）０−４Ｓ（Ｏ）２Ｒ○；−（ＣＨ２）０−４Ｓ（Ｏ）２ＯＲ○；−（ＣＨ２）０−４ＯＳ（Ｏ）２Ｒ○；−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ○２；−（ＣＨ２）０−４Ｓ（Ｏ）Ｒ○；−Ｎ（Ｒ○）Ｓ（Ｏ）２ＮＲ○２；−Ｎ（Ｒ○）Ｓ（Ｏ）２Ｒ○；−Ｎ（ＯＲ○）Ｒ○；−Ｃ（ＮＨ）ＮＲ○２；−Ｐ（Ｏ）２Ｒ○；−Ｐ（Ｏ）Ｒ○２；−ＯＰ（Ｏ）Ｒ○２；−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ○）２；ＳｉＲ○３；−（Ｃ１−４直鎖状または分枝状アルキレン）Ｏ−Ｎ（Ｒ○）２；または−（Ｃ１−４直鎖状または分枝状アルキレン）Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｎ（Ｒ○）２であり、ここで、各Ｒ○は、以下で定義されるように置換されてもよく、独立して、水素、Ｃ１−６脂肪族、−ＣＨ２Ｐｈ、−Ｏ（ＣＨ２）０−１Ｐｈ、−ＣＨ２−（５〜６員ヘテロアリール環）、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される０〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員飽和、部分不飽和もしくはアリール環であるか、または上記定義にかかわらず、独立して存在する２個のＲ○は、それらの介在原子（単数または複数）と一緒になって、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される０〜４個のヘテロ原子を有する３〜１２員飽和、部分不飽和もしくはアリール単環式環または二環式環（これは、以下で定義されるように置換されてもよい）を形成する。
【０２５３】
Ｒ○（または独立して存在する２個のＲ○がそれらの介在原子と一緒になって形成された環）上の適切な一価置換基は独立して、ハロゲン、−（ＣＨ２）０−２Ｒ●、−（ハロＲ●）、−（ＣＨ２）０−２ＯＨ、−（ＣＨ２）０−２ＯＲ●、−（ＣＨ２）０−２ＣＨ（ＯＲ●）２；−Ｏ（ハロＲ●）、−ＣＮ、−Ｎ３、−（ＣＨ２）０−２Ｃ（Ｏ）Ｒ●、−（ＣＨ２）０−２Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−（ＣＨ２）０−２Ｃ（Ｏ）ＯＲ●、−（ＣＨ２）０−２ＳＲ●、−（ＣＨ２）０−２ＳＨ、−（ＣＨ２）０−２ＮＨ２、−（ＣＨ２）０−２ＮＨＲ●、−（ＣＨ２）０−２ＮＲ●２、−ＮＯ２、−ＳｉＲ●３、−ＯＳｉＲ●３、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ●、−（Ｃ１−４直鎖状または分枝状アルキレン）Ｃ（Ｏ）ＯＲ●または−ＳＳＲ●であり、ここで、各Ｒ●は非置換であるか、または「ハロ」が先行する場合には、１個もしくはそれを超えるハロゲンのみで置換され、独立して、Ｃ１−４脂肪族、−ＣＨ２Ｐｈ、−Ｏ（ＣＨ２）０−１Ｐｈ、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される０〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員飽和、部分不飽和もしくはアリール環から選択される。Ｒ○の飽和炭素原子上の適切な二価置換基としては、＝Ｏおよび＝Ｓが挙げられる。
【０２５４】
「必要に応じて置換された」基の飽和炭素原子上の適切な二価置換基としては、以下のもの：＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＮＮＲ＊２、＝ＮＮＨＣ（Ｏ）Ｒ＊、＝ＮＮＨＣ（Ｏ）ＯＲ＊、＝ＮＮＨＳ（Ｏ）２Ｒ＊、＝ＮＲ＊、＝ＮＯＲ＊、−Ｏ（Ｃ（Ｒ＊２））２−３Ｏ−または−Ｓ（Ｃ（Ｒ＊２））２−３Ｓ−が挙げられ、ここで、それぞれ独立して存在するＲ＊は、水素、Ｃ１−６脂肪族（これは、以下で定義されるように置換されてもよい）、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される０〜４個のヘテロ原子を有する非置換５〜６員飽和、部分不飽和もしくはアリール環から選択される。「必要に応じて置換された」基の置換可能なビシナル炭素に結合した適切な二価置換基としては、−Ｏ（ＣＲ＊２）２−３Ｏ−が挙げられ、ここで、それぞれ独立して存在するＲ＊は、水素、Ｃ１−６脂肪族（これは、以下で定義されるように置換されてもよい）、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される０〜４個のヘテロ原子を有する非置換５〜６員飽和、部分不飽和もしくはアリール環から選択される。
【０２５５】
Ｒ＊の脂肪族基上の適切な置換基としては、ハロゲン、−Ｒ●、−（ハロＲ●）、−ＯＨ、−ＯＲ●、−Ｏ（ハロＲ●）、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ●、−ＮＨ２、−ＮＨＲ●、−ＮＲ●２または−ＮＯ２が挙げられ、ここで、各Ｒ●は非置換であるか、または「ハロ」が先行する場合には、１個もしくはそれを超えるハロゲンのみで置換され、独立して、Ｃ１−４脂肪族、−ＣＨ２Ｐｈ、−Ｏ（ＣＨ２）０−１Ｐｈ、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される０〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員飽和、部分不飽和もしくはアリール環である。
【０２５６】
「必要に応じて置換された」基の置換可能な窒素上の適切な置換基としては、−Ｒ†、−ＮＲ†２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ†、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ†、−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ†、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ†、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ†、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ†２、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ†２、−Ｃ（ＮＨ）ＮＲ†２または−Ｎ（Ｒ†）Ｓ（Ｏ）２Ｒ†が挙げられ、ここで、各Ｒ†は独立して、水素、Ｃ１−６脂肪族（これは、以下で定義されるように置換されてもよい）、非置換−ＯＰｈ、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される０〜４個のヘテロ原子を有する非置換５〜６員飽和、部分不飽和もしくはアリール環であるか、または上記定義にかかわらず、独立して存在する２個のＲ†は、それらの介在原子（単数または複数）と一緒になって、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される０〜４個のヘテロ原子を有する非置換３〜１２員飽和、部分不飽和もしくはアリール単環式環もしくは二環式環を形成する。
【０２５７】
Ｒ†の脂肪族基上の適切な置換基は独立して、ハロゲン、−Ｒ●、−（ハロＲ●）、−ＯＨ、−ＯＲ●、−Ｏ（ハロＲ●）、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ●、−ＮＨ２、−ＮＨＲ●、−ＮＲ●２または−ＮＯ２であり、ここで、各Ｒ●は非置換であるか、または「ハロ」が先行する場合には、１個もしくはそれを超えるハロゲンのみで置換され、独立して、Ｃ１−４脂肪族、−ＣＨ２Ｐｈ、−Ｏ（ＣＨ２）０−１Ｐｈ、または窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される０〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員飽和、部分不飽和もしくはアリール環である。
【０２５８】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容され得る塩」という用語は、妥当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などを伴わずにヒトおよび下等動物の組織と接触させて使用するために適切な塩であって、合理的な利益／リスク比に見合う塩を指す。薬学的に許容され得る塩は当技術分野で周知である。例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅらは、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９７７，６６，１−１９（これは、参照により本明細書に組み込まれる）において、薬学的に許容され得る塩を詳細に説明している。本発明の化合物の薬学的に許容され得る塩としては、適切な無機および有機の酸および塩基に由来する塩が挙げられる。薬学的に許容され得る非毒性の酸付加塩の例は、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸および過塩素酸もしくは有機酸、例えば酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸もしくはマロン酸を用いて、または当技術分野で使用される他の方法、例えばイオン交換を使用することにより形成されるアミノ基の塩である。他の薬学的に許容され得る塩としては、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。
【０２５９】
適切な塩基に由来する塩としては、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩およびＮ＋（Ｃ１−４アルキル）４塩が挙げられる。代表的なアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどが挙げられる。さらなる薬学的に許容され得る塩としては、適切である場合、ハロゲン化物イオン、水酸化物イオン、カルボン酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、硝酸イオン、低級アルキルスルホン酸イオン、およびアリールスルホン酸イオンなどの対イオンを使用して形成される非毒性アンモニウム、第４級アンモニウムおよびアミンカチオンが挙げられる。
【０２６０】
特に記述がない限り、本明細書に示される構造はまた、その構造のすべての異性体（例えば、エナンチオマー、ジアステレオマーおよび幾何（または配座））形態（例えば、各不斉中心についてＲ配置およびＳ配置、Ｚ体およびＥ体の二重結合異性体、ならびにＺ体およびＥ体の配座異性体）を含むことを意図する。したがって、本発明の化合物の単一の立体化学的異性体ならびにエナンチオマー、ジアステレオマーおよび幾何（または配座）混合物は、本発明の範囲内である。特に記述がない限り、本発明の化合物のすべての互変異性形態は、本発明の範囲内である。加えて、特に記述がない限り、本明細書に示される構造はまた、１つまたはそれを超える同位体が濃縮された原子の存在のみが異なる化合物を含むことを意図する。例えば、ジュウテリウムもしくはトリチウムによる水素の置き換え、または１３Ｃもしくは１４Ｃ濃縮炭素による炭素の置き換えを含む本発明の構造を有する化合物は、本発明の範囲内である。このような化合物は、例えば、分析ツールとして、生物学的アッセイにおけるプローブとして、または本発明による治療剤として有用である。特定の実施形態では、提供される化合物の弾頭部分Ｒ１は、１個またはそれを超えるジュウテリウム原子を含む。
【０２６１】
本明細書で使用される場合、「阻害剤」という用語は、測定可能な親和性で標的ＲＮＡに結合し、および／または標的ＲＮＡをモジュレートしもしくは阻害する化合物と定義される。特定の実施形態では、阻害剤は、約１００μＭ未満、約５０μＭ未満、約１μＭ未満、約５００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満または約１ｎＭ未満のＩＣ５０および／または結合定数を有する。
【０２６２】
本明細書で使用される場合、「測定可能な親和性」および「測定可能に阻害する」という用語は、本発明の化合物もしくはその組成物および標的ＲＮＡを含むサンプルと、前記化合物もしくはその組成物の非存在下で標的ＲＮＡを含む同等のサンプルとの間における下流生物学的効果における測定可能な変化を意味する。
【０２６３】
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ」（リボ核酸）という用語は、供給源（例えば、ＲＮＡは、ヒト、動物、植物、ウイルスもしくは細菌により産生され得るか、または合成起源であり得る）、生物学的状況（例えば、ＲＮＡは、核内、血液循環中、インビトロもしくは細胞溶解物中にあり得るか、または単離されたもしくは純粋な形態であり得る）または物理形態（例えば、ＲＮＡは、一本鎖、二本鎖もしくは三本鎖形態（ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを含む）であり得るか、エピジェネティック改変、ネイティブ転写後修飾、（例えば、化学的またはインビトロ改変により得られる）人工改変もしくは他の改変を含み得るか、例えば、金属イオン、小分子、タンパク質シャペロンもしくは補因子に結合し得るか、または任意のネイティブもしくは非天然二次もしくは三次構造、例えばジャンクション（例えば、シスまたはトランスの三方向ジャンクション（３ＷＪ））、四重鎖、ヘアピン、トリプレックス、ヘアピン、バルジループ、シュードノットおよび内部ループなど、ならびにＲＮＡにより採用される任意の一時的な形態または構造を含む変性、部分変性もしくはフォールディング状態であり得る）とは無関係に、天然に存在するまたは合成のオリゴリボヌクレオチドを意味する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、１００ヌクレオチドまたはそれを超える長さである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、２５０ヌクレオチドまたはそれを超える長さである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、３５０、４５０、５００、６００、７５０または１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、７，５００、１０，０００、１５，０００、２５，０００、５０，０００ヌクレオチドまたはそれを超える長さである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、２５０〜１，０００ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、プレＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡまたはプレ転写産物である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、リボスイッチ、ｌｎｃＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｃｅＲＮＡ、偽遺伝子、ウイルスＲＮＡまたは細菌ＲＮＡである。本明細書で使用される場合、「標的ＲＮＡ」という用語は、本明細書に記載される小分子リガンドに結合することができる二次または三次構造を有する任意の種類のＲＮＡを意味する。化合物との接触前に、標的ＲＮＡは、細胞内にあり得るか、細胞溶解物中にあり得るか、または単離された形態であり得る。
光活性化可能基
【０２６４】
本発明において使用するための適切な共有改変部分（例えば、上記式Ｉ〜ＶＩＩＩに示されているＲｍｏｄ）は、一般に、可視光または紫外線を照射されると反応中間体を生成する光活性化可能基を含む。いくつかの実施形態では、光活性化可能基は、紫外線（ＵＶ）を照射されると、炭素（または酸素）中心ラジカル、アリールもしくはヘテロアリールカルボカチオン、ニトレンまたはカルベン中間体を生成する官能基であり；Ｒｍｏｄは、リガンドが結合する標的ＲＮＡと反応して標的ＲＮＡとの共有結合をもたらすことができる。例示的な光活性化可能発色団および照射後に生成される反応種は、以下に示されている。
【化４８】
2021505132.tif 000069
【化４９】
2021505132.tif 000070
【化５０】
2021505132.tif 000071
【０２６５】
活性化前に弾頭は非反応性であるので、光活性化改変の成功のためには、非共有結合ＲＮＡ−リガンド相互作用が必要である。適切に配置された高分子が存在しない場合、反応性カルベン／ニトレン中間体は、水により迅速にクエンチされる。
【０２６６】
α−ピロンおよびピリミドンもまた、本発明において使用され得る光活性化可能基である。例えば、Ｂａｔｔｅｎｂｅｒｇ，Ｏ．Ａら、（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１１，７６，６０７５−６０８７）には、光プローブ、例えば以下のもの：
【化５１】
2021505132.tif 000072
が開示されている。
いくつかの実施形態では、光活性化可能基は、ピロンまたはピリミドン、例えば上記のものから選択される。
【０２６７】
他の実施形態では、光活性化可能基（ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖａｂｌｅ  ｇｒｏｕｐ）は、照射および標的ＲＮＡとの共有結合の形成後、その元の状態への復帰を必要に応じて含む平衡プロセスを受ける。異なる波長の光照射下で可逆的に異性化可能な合成分子であって、光活性化可能基として使用され得る合成分子としては、ジアゾベンゼン、ジヒドロピレン、スピロオキサジン、アントラセン、フルギドおよびスピロピランが挙げられる。例示的なスピロピランおよびその照射誘導平衡プロセスは、以下のスキームに示されている。
【化５２】
2021505132.tif 000073
ここでＲ＝−（ＣＨ２）２Ｏ２Ｃ（ＣＨ２）２ＮＨ２であり、上記１は必要に応じて置換されてもよい；スピロピランは、本明細書に記載される共有結合またはテザーにより、小分子リガンドおよび必要に応じたプルダウン基に連結され得る。３６５ｎｍのＵＶ光に曝露されると７０〜９０％ｃｉｓの光定常状態に達するジアゾベンゼンとは異なり、１（３５０ｎｍ）および２ａ（５６３ｎｍ）の吸収極大は明確に異なるので、他の可逆的な系と比較したスピロピラン１の１つの特徴は、その光化学的な切り替えが事実上完全である（３６５ｎｍのＵＶ照射後、＞９５％の２ａ）ことである。２ａおよび２ｂの平衡もまた、ｐＨにより影響され得る。例えば、Ｙｏｕｎｇ，Ｄ．Ｄら、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ２００８，９，１２２５−１２２８を参照のこと。
【０２６８】
いくつかの実施形態では、光活性化可能基は、必要に応じて置換されたフェニルもしくは８〜１０員二環式芳香族炭素環式アジドもしくは５〜８員ヘテロアリールもしくは８〜１０員二環式ヘテロアリールアジド、必要に応じて置換されたベンゾイルアジドもしくは５〜８員ヘテロアロイルアジドもしくは８〜１０員ヘテロアロイルアジド（ここで、前記環原子の１〜３個の原子は窒素、硫黄または酸素から選択される）、必要に応じて置換されたフェニルもしくは８〜１０員二環式芳香族炭素環式ジアゾニウム塩、必要に応じて置換された５〜８員ヘテロアリールもしくは８〜１０員二環式ヘテロアリールジアゾニウム塩（ここで、前記環原子の１〜３個の原子は窒素、硫黄または酸素から選択される）、必要に応じて置換されたＣ２−６脂肪族ジアゾ官能基、必要に応じて置換されたＣ２−６脂肪族ジアジリン、または必要に応じて置換されたジフェニルもしくは８〜１０員ジヘテロアリールケトン（ここで、前記環原子の１〜３個の原子は窒素、硫黄または酸素から選択される）、必要に応じて置換されたジヒドロピレン、必要に応じて置換されたスピロオキサジン、必要に応じて置換されたアントラセン、必要に応じて置換されたフルギド、必要に応じて置換されたスピロピラン、必要に応じて置換されたα−ピロンまたは必要に応じて置換されたピリミドンから選択される。
【０２６９】
いくつかの実施形態では、光活性化可能基は、例えば、
【化５３】
2021505132.tif 000074
から選択される。
【０２７０】
光活性化可能基は、当業者に公知であり本明細書に記載される従来のカップリング反応により、小分子リガンドまたはテザーにコンジュゲートされ得る。例えば、光活性化可能アミノ酸、例えばＤ−またはＬ−フォトロイシン、フォトメチオニン、フォトリジン、パラ−ベンゾイルフェニルアラニンなどは、本発明にしたがって光活性化可能基を化合物に導入する便利な手段として機能し得る。
【０２７１】
いくつかの実施形態では、光活性化可能基は、アロイルまたはヘテロアロイルアジド、例えばニコチノイルアジド（ＮＡｚ）である。このような化合物は、照射されるとニトレン中間体を形成し、細胞における核酸、例えばＳＡＭ−１リボスイッチおよびｒＲＮＡの溶媒アクセシビリティを研究するために使用されている。ＮＡｚプローブは、例えば、アクセス可能なプリンのＣ８位と反応する。
【０２７２】
本明細書で使用される場合、「共有改変部分」または「弾頭」という用語は、可視光またはＵＶ光の照射後、ＲＮＡの利用可能なヌクレオチドと共有結合を形成して改変ＲＮＡ（例えば、Ｃ８改変プリンまたは２’−Ｏ改変ＲＮＡ）を生成することができる任意の光活性化可能基を意味する。
【０２７３】
光活性化可能基を活性化するための可視光またはＵＶ光の波長は、一般に、調査中の生物系を実質的に分解せずに、またはオフターゲット反応性を引き起こさずに、ニトレンなどの反応中間体を生成するように選択される。波長は、一般に、特定の各光活性化可能基の反応中間体を生成するように機能することが既知である波長である。いくつかの実施形態では、波長は、約２５２ｎｍ、３０２ｎｍもしくは３６５ｎｍ；または２５４ｎｍ、２６５〜２７５ｎｍ、３６５ｎｍ、３００〜４６０ｎｍもしくは約２５０ｎｍ〜約３５０ｎｍである。
【０２７４】
アリールアジドは、ＵＶ光（２５０〜３５０ｎｍ）に曝露されると、二重結合との付加反応、Ｃ−ＨおよびＮ−Ｈ部位への挿入、またはその後の環拡大を開始させて、求核試薬（例えば、第１級アミン）と反応し得るニトレン基を形成する。後者の反応経路は、第１級アミンがサンプル中に存在する場合に優位である。
【０２７５】
チオール含有還元剤（例えば、ＤＴＴまたは２−メルカプトエタノール）は、アジド官能基をアミンに還元して光活性化を防止するので、光活性化の前およびその間のすべての工程において、サンプル溶液中で回避されなければならない。反応は、様々なアミンフリーバッファー条件で実施され得る。ヘテロ二官能性光反応性架橋剤を用いる場合、関連する両方の反応性化学物質と適合性のバッファーを使用する。一般に、実験は、光反応が意図されるまで、薄明かりの中で、および／またはホイルで覆われた反応容器中で実施される。典型的には、光活性化は、反応溶液の近くに配置された携帯ＵＶランプであって、数分間にわたってその上を直接照らす（すなわち、ガラスもポリプロピレンも介さない）携帯ＵＶランプを用いて達成される。
【０２７６】
アリールアジドの例としては、単純なフェニルアジド、ヒドロキシフェニルアジドおよびニトロフェニルアジドが挙げられる。一般に、単純なフェニルアジドを効率的に活性化するためには、短波長ＵＶ光（例えば、２５４ｎｍ；２６５〜２７５ｎｍ）が必要であるが、ニトロフェニルアジドの場合には、長波長ＵＶ光（例えば、３６５ｎｍ；３００〜４６０ｎｍ）が十分である。
【化５４】
2021505132.tif 000075
ＲＢＰタンパク質および他の近接生体分子の共有結合的改変
【０２７７】
いくつかの実施形態では、光活性化可能基は、標的ＲＮＡ上の小分子リガンド結合部位に近接するタンパク質と反応する。ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）は、目的の標的ＲＮＡに頻繁に会合する。いくつかの場合では、ＲＢＰは、開示される光活性化可能化合物が結合するターゲティングされたＲＮＡ部分構造に会合するか、または別様に近接する。したがって、光親和性弾頭の利点は、それらが、小分子リガンドに結合された光活性化可能基に近位のＲＮＡまたはタンパク質、例えばＲＢＰの共有結合的改変に依存しないことである。したがって、いくつかの実施形態では、開示される化合物は、標的ＲＮＡまたは標的ＲＮＡに会合したＲＢＰのいずれかを共有結合的に改変する。そして、これは、どのＲＢＰが標的ＲＮＡに結合しているか、生物のどの細胞または組織か、およびＲＢＰ結合に対する小分子結合の効果に関する洞察をもたらす。
【０２７８】
したがって、一態様では、本発明は、ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）の存在またはそれと標的ＲＮＡとの会合／結合を決定する方法であって、前記標的ＲＮＡを、開示される化合物と接触させる工程、および可視光またはＵＶ光で前記化合物を照射する工程、および必要に応じて、１つまたはそれを超えるアッセイを実施して、前記化合物の光活性化可能基によりＲＢＰが共有結合的に改変されたかを決定する工程を含む方法を提供する。
【０２７９】
したがって、高反応性であるため比較的無差別のカルベン、ニトレン、ジラジカル、および光親和性弾頭の活性化により生成される他の中間体は、以前に公知の方法とは異なり、標的ＲＮＡまたは近接の任意の生体分子を共有結合的に改変するという利点を有する。
テザー基（リンカー）
【０２８０】
本発明は、標的ＲＮＡの結合部位の近位にあるヌクレオチドまたはＲＢＰに対する最適な結合および反応性を提供するための、多様なテザー基（テザー、例えば上記式Ｉ〜ＶＩＩＩに示されているような変数Ｔ１およびＴ２）の使用を企図する。いくつかの実施形態では、Ｔ１およびＴ２は、図１０〜１７に示されているものから選択される。例えば、いくつかの実施形態では、Ｔ１および／またはＴ２は、例えば、１〜１０個のエチレングリコールサブユニットのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基である。いくつかの実施形態では、Ｔ１および／またはＴ２は、必要に応じて置換されたＣ１−１２脂肪族基、または１〜８個のアミノ酸を含むペプチドである。
【０２８１】
いくつかの実施形態では、Ｔ１およびＴ２はそれぞれ、Ｌ１またはＬ２から独立して選択され、Ｌ１およびＬ２は、本明細書の実施形態で定義される。
【０２８２】
いくつかの実施形態では、テザーの長さ、剛性、疎水性および／または他の特性などの物理的特性は、標的ＲＮＡまたは関連ＲＢＰと光活性化可能基（弾頭）との間の近接誘発性共有結合形成のパターンを最適化するように選択される。いくつかの実施形態では、テザーの物理的特性（例えば、上記のもの）は、標的ＲＮＡの活性部位またはアロステリック部位に化合物が結合すると、改変部分が、標的ＲＮＡの利用可能な官能基、例えば活性部位またはアロステリック部位の近位にある標的ＲＮＡのプリンＣ８炭素または２’−ＯＨ基と選択的に反応するか、あるいはＲＢＰの近位アミノ酸と反応するように選択される。
クリック可能基
【０２８３】
様々な生体直交型反応パートナー（例えば、上記式Ｉ〜ＶＩＩＩにおけるＲＣＧまたは上記式におけるＲ２）は、本明細書に記載される化合物をプルダウン部分とカップリングさせるために本発明において使用され得る。本明細書で使用される場合、「生体直交型化学」または「生体直交型反応」という用語は、天然の生化学プロセスを妨害せずに生体系内で起こり得る任意の化学反応を指す。したがって、「生体直交型反応パートナー」は、適切な反応パートナーと生体直交型反応を起こして本明細書に記載される化合物をプルダウン部分にカップリングされ得る化学的部分である。いくつかの実施形態では、生体直交型反応パートナーは、化学改変部分またはテザー基と共有結合的に結合する。いくつかの実施形態では、生体直交型反応パートナーは、クリック可能基またはニトロン／シクロオクチン反応、オキシム／ヒドラゾン形成、テトラジンライゲーション、イソシアニドベースのクリック反応もしくはクアドリシクランライゲーションを起こし得る基から選択される。
【０２８４】
いくつかの実施形態では、生体直交型反応パートナーはクリック可能基である。「クリック可能基」という用語は、アジドまたはアルキンなどのクリック反応を起こし得る化学的部分を指す。
【０２８５】
クリック反応は、広範囲の選択的結合形成事象を生じる十分に定義された反応座標を有する高エネルギーの（「ばね付勢された」）試薬を伴う傾向がある。例としては、歪み環の求電子剤（エポキシド、アジリジン、アジリジニウムイオン、エピスルホニウムイオン）の求核的捕捉、特定のカルボニル反応性（例えば、アルデヒドとヒドラジンまたはヒドロキシルアミンとの反応）およびいくつかの環化付加反応が挙げられる。アジド−アルキン１，３−双極子環化付加およびディールス・アルダー環化付加は２つのこのような反応である。
【０２８６】
このようなクリック反応（すなわち、双極子環化付加）は、高い活性化エネルギーを伴い、したがって熱または触媒を必要とする。実際、銅触媒の使用がクリック反応において慣用的に用いられている。しかしながら、クリック化学が特に有用な特定の例では（例えば、バイオコンジュゲーション反応において）、銅の存在は有害であり得る（Ｗｏｌｂｅｒｓ，Ｆら；Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２００６，２７，５０７３を参照のこと）。したがって、金属触媒を使用せずに双極子環化付加反応を行う方法が開発された。このような「金属フリー」クリック反応は、環化付加を促進するために、活性化部分を利用する。したがって、本発明は、金属フリークリック化学に適切なクリック可能基を提供する。
【０２８７】
特定の金属フリークリック部分が文献で公知である。例としては、４−ジベンゾシクロオクチノール（ＤＩＢＯ）（Ｎｉｎｇら；Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ，２００８，４７，２２５３より）、ｇｅｍ−二フッ素化シクロオクチン（ＤＩＦＯまたはＤＦＯ）（Ｃｏｄｅｌｌｉら；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００８，１３０，１１４８６−１１４９３．より）、ビアリールアザシクロオクチノン（ＢＡＲＡＣ）（Ｊｅｗｅｔｔら；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１０，１３２，３６８８．より）またはビシクロノニン（ＢＣＮ）（Ｄｏｍｍｅｒｈｏｌｔら；Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ，２０１０，４９，９４２２−９４２５より）が挙げられる。
【０２８８】
本明細書で使用される場合、「金属フリークリック化学に適切な部分」という語句は、金属触媒を使用せずに双極子環化付加が可能な官能基を指す。このような部分としては、アジドにカップリングして環化付加生成物（例えば、トリアゾールまたはイソオキサゾール）を形成するための、活性化アルキン（例えば、歪みシクロオクチン）、オキシム（例えば、ニトリルオキシド前駆体など）またはオキサノルボルナジエンが挙げられる。
【０２８９】
したがって、特定の実施形態では、クリック可能基は、アジド、アルキン、４−ジベンゾシクロオクチノール（ＤＩＢＯ）、ｇｅｍ−二フッ化シクロオクチン（ＤＩＦＯまたはＤＦＯ）、ビアリールアザシクロオクチノン（ＢＡＲＡＣ）、ビシクロノニン（ＢＣＮ）、歪みシクロオクチン、オキシムまたはオキサノルボルナジエンから選択される。
【０２９０】
いくつかの実施形態では、クリック可能基は、図９に示されているものから選択される。
プルダウン基
【０２９１】
いくつかのプルダウン基（例えば上記式Ｉ〜ＶＩＩＩにおけるＲＰＤ）が本発明において使用され得る。いくつかの実施形態では、プルダウン基は、クリック可能基と反応してプルダウン基を化合物の残部に結合させる生体直交型反応パートナー、ならびにプルダウンされた化合物の選択的な単離または検出を可能にする適切な官能基または親和性基、例えばハプテン（例えば、ビオチン）または放射性標識を含む。例えば、プルダウン基と相互作用するアビジンまたはストレプトアビジンの使用は、以下にさらに詳細に説明されているように、共有結合的に改変されたＲＮＡのみの単離を可能にする。
【０２９２】
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡへの結合前に、および光活性化可能基を活性化するための照射前に、プルダウン基は、上記のおよび本明細書に記載される式の開示される化合物に共有結合的に結合される。他の実施形態では、光活性化可能基に照射し、標的ＲＮＡの共有結合的改変を行った後に、プルダウン基は、化合物またはＲＮＡコンジュゲートに結合される。いくつかの実施形態では、このような結合は、化合物またはＲＮＡコンジュゲート上のクリック可能基と、プルダウン基の一部である適切な反応パートナーとの間の生体直交反応により達成される。したがって、いくつかの実施形態では、プルダウン基は、（本明細書の他の箇所に記載される）テザーを介して、親和性基または生体直交官能基に結合されたクリック可能基を含む。いくつかの実施形態では、親和性基または生体直交官能基は、ハプテン（例えば、ビオチン）または放射性標識、例えば１２５Ｉ、１４Ｃ、３２Ｐまたは３Ｈである。
３．本化合物を提供する一般的方法
【０２９３】
本発明の化合物は、一般に、類似化合物について当業者に公知の合成および／または半合成の方法により、ならびに本明細書中の実施例および図面に詳細に記載する方法により調製または単離され得る。
【０２９４】
特定の保護基（「ＰＧ」）、脱離基（「ＬＧ」）または変換条件を示す詳細な説明、実施例および図面に示されているスキームおよび化学反応において、他の保護基、脱離基および変換条件も適切であり、企図されることを当業者は理解するであろう。このような基および変換は、Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｂ．Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｊ．Ｍａｒｃｈ，５ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，２００１、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，Ｒ．Ｃ．Ｌａｒｏｃｋ，２ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９９、およびＰｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，３ｒｄｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９９（これらの全体はそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されている。
【０２９５】
本明細書で使用される場合、「脱離基」（ＬＧ）という語句は、限定されないが、ハロゲン（例えば、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物）、スルホネート（例えば、メシレート、トシレート、ベンゼンスルホネート、ブロシレート、ノシレート、トリフレート）、ジアゾニウムなどを含む。
【０２９６】
本明細書で使用される場合、「酸素保護基」という語句は、例えば、カルボニル保護基、ヒドロキシル保護基などを含む。ヒドロキシル保護基は当技術分野で周知であり、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，３ｒｄｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９９（この全体は、参照により本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されているものが挙げられる。適切なヒドロキシル保護基としては、限定されないが例えば、エステル、アリルエーテル、エーテル、シリルエーテル、アルキルエーテル、アリールアルキルエーテルおよびアルコキシアルキルエーテルが挙げられる。このようなエステルの例としては、ホルメート、アセテート、カルボネートおよびスルホネートが挙げられる。具体例としては、ホルメート、ベンゾイルホルメート、クロロアセテート、トリフルオロアセテート、メトキシアセテート、トリフェニルメトキシアセテート、ｐ−クロロフェノキシアセテート、３−フェニルプロピオネート、４−オキソペンタノエート、４，４−（エチレンジチオ）ペンタノエート、ピバロエート（トリメチルアセチル）、クロトネート、４−メトキシ−クロトネート、ベンゾエート、ｐ−ベンジルベンゾエート、２，４，６−トリメチルベンゾエート、カーボネート（例えば、メチル、９−フルオレニルメチル、エチル、２，２，２−トリクロロエチル、２−（トリメチルシリル）エチル、２−（フェニルスルホニル）エチル、ビニル、アリルおよびｐ−ニトロベンジルなど）が挙げられる。このようなシリルエーテルの例としては、トリメチルシリル、トリエチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、トリイソプロピルシリルおよび他のトリアルキルシリルエーテルが挙げられる。アルキルエーテルとしては、メチル、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル、３，４−ジメトキシベンジル、トリチル、ｔ−ブチル、アリルおよびアリルオキシカルボニルエーテルまたは誘導体が挙げられる。アルコキシアルキルエーテルとしては、例えば、メトキシメチル、メチルチオメチル、（２−メトキシエトキシ）メチル、ベンジルオキシメチル、ベータ−（トリメチルシリル）エトキシメチルおよびテトラヒドロピラニルエーテルなどのアセタールが挙げられる。アリールアルキルエーテルの例としては、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル（ＭＰＭ）、３，４−ジメトキシベンジル、Ｏ−ニトロベンジル、ｐ−ニトロベンジル、ｐ−ハロベンジル、２，６−ジクロロベンジル、ｐ−シアノベンジル、ならびに２−および４−ピコリルが挙げられる。
【０２９７】
アミノ保護基は当技術分野で周知であり、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，３ｒｄｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９９（この全体は、参照により本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されているものが挙げられる。適切なアミノ保護基としては、限定されないが、アラルキルアミン、カルバメート、環状イミド、アリルアミン、アミドなどが挙げられる。このような基の例としては、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、エチルオキシカルボニル、メチルオキシカルボニル、トリクロロエチルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、ベンジルオキソカルボニル（ＣＢＺ）、アリル、フタルイミド、ベンジル（Ｂｎ）、フルオレニルメチルカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ホルミル、アセチル、クロロアセチル、ジクロロアセチル、トリクロロアセチル、フェニルアセチル、トリフルオロアセチル、ベンゾイルなどが挙げられる。
【０２９８】
当業者は、例えば、脂肪族基、アルコール、カルボン酸、エステル、アミド、アルデヒド、ハロゲンおよびニトリルなどの本発明の化合物中に存在する様々な官能基は当技術分野で周知の技術（限定されないが、還元、酸化、エステル化、加水分解、部分酸化、部分還元、ハロゲン化、脱水、部分水和および水和を含む）により相互変換され得ることを認識するであろう。“Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”５ｔｈＥｄ．，Ｅｄ．：Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｂ．ａｎｄ  Ｍａｒｃｈ，Ｊ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：２００１（この全体は、参照により本明細書に組み込まれる）。このような相互変換は、上述の技術の１つまたはそれよりも多くを必要とし得、本発明の化合物を合成するための特定の方法は、以下の実施例および図面に記載されている。
４．使用、製剤化、および投与
薬学的に許容され得る組成物
【０２９９】
別の実施形態によれば、本発明は、本発明の化合物またはその薬学的に許容され得る誘導体と、薬学的に許容され得る担体、アジュバントまたはビヒクルとを含む組成物を提供する。本発明の組成物中の化合物の量は、生物学的サンプル中または患者中の標的ＲＮＡまたはその変異体を測定可能に阻害またはモジュレートするために有効な量である。特定の実施形態では、本発明の組成物中の化合物の量は、生物学的サンプル中または患者中の標的ＲＮＡを測定可能に阻害またはモジュレートするために有効である。特定の実施形態では、本発明の組成物は、このような組成物を必要とする患者に投与するために製剤化されている。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、患者に経口投与するために製剤化されている。
【０３００】
本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。
【０３０１】
「薬学的に許容され得る担体、アジュバントまたはビヒクル」という用語は、共に製剤化した化合物の薬理活性を壊さない非毒性の担体、アジュバントまたはビヒクルを指す。本発明の組成物において使用され得る薬学的に許容され得る担体、アジュバントまたはビヒクルとしては、限定されないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミンなど）、緩衝物質（例えば、ホスフェートなど）、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩または電解質（例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩など）、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられる。
【０３０２】
「薬学的に許容され得る誘導体」は、本発明の化合物の非毒性の塩、エステル、エステルの塩または他の誘導体のいずれかであって、レシピエントに投与されると、直接的または間接的に、本発明の化合物またはその阻害活性代謝産物もしくは残留物を与え得るものを意味する。
【０３０３】
本発明の組成物は、経口的に、非経口的に、吸入噴霧により、局所的に、直腸内に、経鼻的に、口腔内に、経膣的にまたは埋め込み式リザーバーを介して投与され得る。本明細書で使用される場合、「非経口」という用語には、皮下の、静脈内の、筋肉内の、関節内の、滑膜内の、胸骨内の、髄腔内の、肝内の、病巣内のおよび頭蓋内の注射または注入技術が包含される。好ましくは、組成物は、経口的に、腹腔内にまたは静脈内に投与される。本発明の組成物の滅菌注射形態は、水性または油性懸濁液であり得る。これらの懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して、当技術分野で公知の技術にしたがって製剤化され得る。滅菌注射調製物はまた、非毒性の非経口的に許容され得る希釈剤または溶媒中の滅菌注射溶液または懸濁液（例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液など）であり得る。用いられ得る許容され得るビヒクルおよび溶媒の中で、水、リンガー溶液および等張性塩化ナトリウム溶液がある。加えて、滅菌固定油は、溶媒または懸濁媒として従来どおりに用いられる。
【０３０４】
この目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含む任意のブランド固定油が用いられ得る。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体などの脂肪酸は、天然の薬学的に許容され得る油（例えば、オリーブ油またはヒマシ油、特にこれらのポリオキシエチレン化されたバージョンなど）と同様に、注射物質の調製において有用である。これらの油性溶液または油性懸濁物はまた、長鎖アルコールの希釈剤または分散剤（例えば、カルボキシメチルセルロースまたは薬学的に許容され得る剤形（エマルジョンおよび懸濁液が挙げられる）の製剤化において一般的に使用される類似の分散剤など）を含有し得る。他の一般的に使用される界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、Ｓｐａｎ（登録商標）など）、および薬学的に許容され得る固体、液体または他の剤形の製造において一般的に使用される他の乳化剤またはバイオアベイラビリティ増強剤もまた、製剤化の目的のために使用され得る。
【０３０５】
本発明の薬学的に許容され得る組成物は、限定されないが、カプセル、錠剤、水性懸濁液または溶液を含む任意の経口的に許容され得る剤形として経口投与され得る。経口使用のための錠剤の場合、一般的に使用される担体としては、ラクトースおよびコーンスターチが挙げられる。典型的には、ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤もまた添加される。カプセル形態の経口投与では、有用な希釈剤としては、ラクトースおよび乾燥コーンスターチが挙げられる。経口使用のために水性懸濁液が必要な場合、活性成分は乳化剤および懸濁化剤と合わせられる。所望により、特定の甘味料、香味料または着色剤を加えてもよい。
【０３０６】
あるいは、本発明の薬学的に許容され得る組成物は、直腸投与のための坐薬の形態で投与され得る。これらは、室温で固体であるが直腸の温度で液体であるため直腸内で溶けて薬物を放出する適切な非刺激性の賦形剤と薬剤を混合することにより調製され得る。このような物質としては、ココアバター、ビーズワックスおよびポリエチレングリコールが挙げられる。
【０３０７】
眼、皮膚または下部腸管の疾患を含む局所適用により容易に接近可能な領域または器官を治療標的が含む場合には特に、本発明の薬学的に許容され得る組成物はまた局所投与され得る。これらの領域または器官のそれぞれのために適切な局所製剤は容易に調製される。
【０３０８】
下部腸管のための局所適用は、直腸坐薬製剤（上記を参照のこと）または適切な浣腸製剤において行われ得る。局所経皮パッチも使用され得る。
【０３０９】
局所適用では、提供される薬学的に許容され得る組成物は、１つまたはそれを超える担体中に懸濁または溶解された活性成分を含有する適切な軟膏として製剤化され得る。本発明の化合物の局所投与のための担体としては、限定されないが、鉱油、液体ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックスおよび水が挙げられる。あるいは、提供される薬学的に許容され得る組成物は、１つまたはそれを超える薬学的に許容され得る担体中に懸濁または溶解された活性成分を含有する適切なローションまたはクリームとして製剤化され得る。適切な担体としては、限定されないが、鉱油、ソルビタンモノステアレート、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水が挙げられる。
【０３１０】
眼科的用途では、提供される薬学的に許容され得る組成物は、等張の、ｐＨ調整した滅菌食塩水中の微細化懸濁液として、または好ましくは、塩化ベンジルアルコニウムなどの保存剤を含むもしくは含まない等張の、ｐＨ調整した滅菌食塩水中の溶液として、製剤化され得る。あるいは、眼科的用途では、薬学的に許容され得る組成物は、ワセリンなどの軟膏中に製剤化され得る。
【０３１１】
本発明の薬学的に許容され得る組成物はまた、鼻エアロゾルまたは吸入により投与され得る。このような組成物は、医薬製剤化の技術分野で周知の技術にしたがって調製され、ベンジルアルコールまたは他の適切な保存剤、バイオアベイラビリティを増進するための吸収促進剤、フルオロカーボンおよび／または他の従来用いられる可溶化剤もしくは分散剤を用いて、食塩水中の溶液として調製され得る。
【０３１２】
最も好ましくは、本発明の薬学的に許容され得る組成物は、経口投与のために製剤化される。このような製剤は、食品と共にまたは食品を伴わずに投与され得る。いくつかの実施形態では、本発明の薬学的に許容され得る組成物は、食品を伴わずに投与される。他の実施形態では、本発明の薬学的に許容され得る組成物は、食品と共に投与される。
【０３１３】
単一剤形中の組成物を生産するために担体材料と組み合わせられ得る本発明の化合物の量は、処置される宿主、具体的な投与方式に応じて様々である。好ましくは、提供される組成物は、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の投与量の阻害剤をこれらの組成物が与えられる患者に投与され得るように製剤化されるべきである。
【０３１４】
任意の特定の患者のための具体的な投与量および治療レジメンは、用いられる特定の化合物の活性、年齢、体重、全身の健康、性別、食事、投与時間、排泄速度、薬物の組み合わせ、治療医の判断および処置される具体的な疾患の重症度を含む様々な要因に依存することも理解すべきである。組成物中の本発明の化合物の量は、組成物中の具体的な化合物にも依存する。
化合物および薬学的に許容され得る組成物の使用
【０３１５】
本明細書に記載される化合物および組成物は、一般に、標的ＲＮＡをモジュレートしてＲＮＡ媒介性疾患または症状を再処置するために有用である。
【０３１６】
標的ＲＮＡをモジュレートするために本発明において利用される化合物の活性は、インビトロ、インビボまたは細胞株においてアッセイされ得る。インビトロアッセイとしては、標的ＲＮＡのモジュレーションを決定するアッセイが挙げられる。代替的なインビトロアッセイは、標的ＲＮＡに結合する化合物の能力を定量する。標的ＲＮＡをモジュレートするために本発明において利用される化合物をアッセイするための詳細な条件は、以下の実施例に記載されている。
【０３１７】
本明細書で使用される場合、「処置」、「処置する」および「処置すること」という用語は、本明細書に記載される疾患もしくは障害または１つもしくはそれを超えるその症候を反転させ、軽減し、その発症を遅延させ、またはその進行を阻害することを指す。いくつかの実施形態では、処置は、１つまたはそれを超える症候が発症した後に施され得る。他の実施形態では、処置は、症候の非存在下で施され得る。例えば、処置は、（例えば、症候の病歴を考慮して、および／または遺伝因子もしくは他の感受性因子を考慮して）症候の発症前に感受性個体に投与され得る。処置はまた、例えば再発を予防しまたは遅延させるために、症候の解消後に継続され得る。
【０３１８】
提供される化合物は標的ＲＮＡのモジュレーターであり、したがって標的ＲＮＡ（例えばその下流）に関連するまたはそれが影響する１つまたはそれを超える障害を処置するために有用である。したがって、特定の実施形態では、本発明は、本発明の化合物またはその薬学的に許容され得る組成物をそれを必要とする患者に投与する工程を含む、ＲＮＡ媒介性の障害を処置するための方法を提供する。
【０３１９】
本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「ＲＮＡ媒介性」障害、疾患および／または症状という用語は、過剰発現、過少発現、変異体、ミスフォールディング、病原性または発癌性ＲＮＡなどのＲＮＡが役割を果たすことが既知である任意の疾患または他の有害な症状を意味する。したがって、本発明の別の実施形態は、過剰発現、過少発現、変異体、ミスフォールディング、病原性または発癌性ＲＮＡなどのＲＮＡが役割を果たすことが既知である１つまたはそれを超える疾患の処置またはその重症度の軽減に関する。
【０３２０】
いくつかの実施形態では、本発明は、限定されないが、細胞増殖性障害を含む１つまたはそれを超える障害、疾患および／または症状を処置するための方法を提供する。
細胞増殖性障害
【０３２１】
本発明は、標的ＲＮＡをモジュレートすることによる、細胞増殖性障害（例えば、がん）の診断および予後予測ならびにこれらの障害の治療のための方法および組成物を特徴とする。本明細書に記載される細胞増殖性障害としては、例えば、がん、肥満症および増殖依存性の疾患が挙げられる。このような障害は、当技術分野で公知の方法を使用して診断され得る。
癌
【０３２２】
一実施形態では、がんとしては、限定されないが、白血病（例えば、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病）、真性多血症、リンパ腫（例えば、ホジキン病または非ホジキン病）、ワルデンストレームマクログロブリン血症、多発性骨髄腫、重鎖病および固形腫瘍が挙げられ、固形腫瘍としては、例えば肉腫および癌腫（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、ヘパトーマ、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、子宮がん、精巣がん、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、神経鞘腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫および網膜芽腫）が挙げられる。いくつかの実施形態では、がんは黒色腫または乳がんである。
【０３２３】
別の実施形態では、がんとしては、限定されないが、中皮腫、肝胆道（肝臓および胆管）、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部のがん、皮膚または眼内の黒色腫、卵巣がん、結腸がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん、胃腸のがん（胃がん、結腸直腸がんおよび十二指腸がん）、子宮がん、卵管の癌、子宮内膜の癌、頸部の癌、膣の癌、外陰部の癌、ホジキン病、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、前立腺がん、精巣がん、慢性または急性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱のがん、腎臓のまたは尿管のがん、腎細胞癌、腎盂の癌、非ホジキンリンパ腫、脊髄軸の腫瘍、脳幹部神経膠腫、下垂体腺腫、副腎皮質がん、胆嚢がん、多発性骨髄腫、胆管癌、線維肉腫、神経芽腫、網膜芽腫または前述のがんの１つまたはそれよりも多くの組み合わせが挙げられる。
【０３２４】
いくつかの実施形態では、本発明は、腫瘍の処置を必要とする患者における腫瘍を処置するための方法であって、前記患者に、本明細書に記載される化合物、塩または医薬組成物のいずれかを投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、腫瘍は、本明細書に記載されるがんのいずれかを含む。いくつかの実施形態では、腫瘍は黒色腫がんを含む。いくつかの実施形態では、腫瘍は乳がんを含む。いくつかの実施形態では、腫瘍は肺がんを含む。いくつかの実施形態では、腫瘍は小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）を含む。いくつかの実施形態では、腫瘍は非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を含む。
【０３２５】
いくつかの実施形態では、腫瘍は、腫瘍のさらなる成長を阻むことにより処置される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、腫瘍の大きさ（例えば、体積または質量）を処置前の腫瘍の大きさと比べて少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、９０％または９９％減少させることにより処置される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、患者における腫瘍の量を処置前の腫瘍の量と比べて少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、９０％または９９％減少させることにより処置される。
他の増殖性疾患
【０３２６】
他の増殖性疾患としては、例えば、肥満症、良性前立腺過形成、乾癬、異常角質化、リンパ増殖性障害（例えば、リンパ系の細胞が異常増殖する障害）、慢性関節リウマチ、動脈硬化症、再狭窄および糖尿病性網膜症が挙げられる。参照により本明細書に組み込まれる増殖性疾患としては、米国特許第５，６３９，６００号および米国特許第７，０８７，６４８号に記載されているものが挙げられる。
炎症性障害および疾患
【０３２７】
本発明の化合物はまた、皮膚の炎症性またはアレルギー性症状、例えば乾癬、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、円形脱毛症、多形紅斑、疱疹状皮膚炎、強皮症、白斑、過敏性血管炎、蕁麻疹、水疱性類天疱瘡、紅斑性狼瘡、全身性エリテマトーデス、尋常性天疱瘡、落葉性天疱瘡、腫瘍随伴性天疱瘡、後天性表皮水疱症、尋常性ざ瘡および皮膚の他の炎症性またはアレルギー性症状の処置において有用である。
【０３２８】
本発明の化合物はまた、他の疾患または症状、例えば炎症性要素を有する疾患または症状の処置、例えば、眼の疾患および症状、例えば眼のアレルギー、結膜炎、乾性角結膜炎および春季結膜炎、鼻に影響する疾患（アレルギー性鼻炎が挙げられる）および自己免疫反応が関与するまたは自己免疫の要素もしくは病因を有する炎症性疾患（自己免疫性血液障害（例えば、溶血性貧血、再生不良性貧血、赤芽球癆および特発性血小板減少症）、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、多発軟骨炎、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、皮膚筋炎、慢性活動性肝炎、重症筋無力症、スティーヴンス・ジョンソン症候群、突発性スプルー、自己免疫性炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎およびクローン病）、過敏性腸症候群、セリアック病、歯周炎、肺硝子膜症、腎臓病、糸球体疾患、アルコール性肝臓病、多発性硬化症、内分泌性眼症、グレーブス病、サルコイドーシス、肺胞炎、慢性過敏性肺炎、多発性硬化症、原発性胆汁性胆管炎、ぶどう膜炎（前部および後部）、シェーグレン症候群、乾性角結膜炎および春季角結膜炎、間質性肺線維症、乾癬性関節炎、全身型若年性特発性関節炎、クリオピリン関連周期性症候群、腎炎、血管炎、憩室炎、間質性膀胱炎、糸球体腎炎（ネフローゼ症候群を伴うものおよび伴わないもの、例えば、突発性ネフローゼ症候群または微小変化型腎症が挙げられる）、慢性肉芽腫性疾患、子宮内膜症、レプトスピラ腎疾患、緑内障、網膜疾患、加齢、頭痛、痛み、複合性局所疼痛症候群、心臓肥大、筋肉消耗、異化障害、肥満症、胎児発育遅延、高コレステロール血症、心臓病、慢性心不全、中皮腫、無汗型外胚葉異形成症、ベーチェット病、色素失調症、パジェット病、膵炎、遺伝性周期熱症候群、喘息（アレルギー性および非アレルギー性、軽度、中等度、重症、気管支炎および運動誘発性）、急性肺傷害、急性呼吸窮迫症候群、好酸球増加症、過敏症、アナフィラキシー、副鼻腔炎、眼のアレルギー、シリカ誘発性疾患、ＣＯＰＤ（損傷の減少、気道炎症、気管支過敏症、再構築または疾患進行）、肺疾患、嚢胞性繊維症、酸誘発性肺傷害、肺高血圧症、多発性神経障害、白内障、全身性硬化症を伴う筋肉の炎症、封入体筋炎、重症筋無力症、甲状腺炎、アジソン病、扁平苔癬、１型糖尿病または２型糖尿病、虫垂炎、アトピー性皮膚炎、喘息、アレルギー、眼瞼炎、細気管支炎、気管支炎、滑液包炎、子宮頚管炎、胆管炎、胆嚢炎、慢性移植片拒絶、大腸炎、結膜炎、クローン病、膀胱炎、涙腺炎、皮膚炎、皮膚筋炎、脳炎、心内膜炎、子宮内膜炎、腸炎、全腸炎、上顆炎、精巣上体炎、筋膜炎、結合組織炎、胃炎、胃腸炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、肝炎、化膿性汗腺炎、免疫グロブリンＡ腎症、間質性肺疾患、喉頭炎、乳腺炎、髄膜炎、脊髄炎、心筋炎、筋炎、腎炎、卵巣炎、睾丸炎、骨炎、中耳炎、膵炎、耳下腺炎、心膜炎、腹膜炎、咽頭炎、胸膜炎、静脈炎、肺臓炎、肺炎、多発性筋炎、直腸炎、前立腺炎、腎盂腎炎、鼻炎、卵管炎、副鼻腔炎、口内炎、滑膜炎、腱炎、扁桃炎、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、膣炎、血管炎または外陰炎が挙げられる）の処置のために使用され得る。
【０３２９】
いくつかの実施形態では、本発明の方法にしたがって処置され得る炎症性疾患は皮膚疾患である。いくつかの実施形態では、炎症性皮膚疾患は、接触性皮膚炎、アトピー性（ａｔｏｍｐｉｃ）皮膚炎、円形脱毛症、多形紅斑、疱疹状皮膚炎、強皮症、白斑、過敏性血管炎、蕁麻疹、水疱性類天疱瘡、尋常性天疱瘡、落葉性天疱瘡、腫瘍随伴性天疱瘡、後天性表皮水疱症および皮膚の他の炎症性またはアレルギー性の症状から選択される。
【０３３０】
いくつかの実施形態では、本発明の方法にしたがって処置され得る炎症性疾患は、急性および慢性痛風、慢性痛風性関節炎、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身型若年性特発性関節炎（ＳＪＩＡ）、クリオピリン関連周期性症候群（ＣＡＰＳ）および変形性関節症から選択される。
【０３３１】
いくつかの実施形態では、本発明の方法にしたがって処置され得る炎症性疾患は、ＴＨ１７媒介性疾患である。いくつかの実施形態では、ＴＨ１７媒介性疾患は、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症および炎症性腸疾患（クローン病または潰瘍性大腸炎が挙げられる）から選択される。
【０３３２】
いくつかの実施形態では、本発明の方法にしたがって処置され得る炎症性疾患は、シェーグレン症候群、アレルギー性障害、変形性関節症、眼の症状（例えば、眼のアレルギー、結膜炎、乾性角結膜炎および春季結膜炎など）および鼻に影響する疾患（例えば、アレルギー性鼻炎など）から選択される。
代謝性疾患
【０３３３】
いくつかの実施形態では、本発明は、代謝性疾患を処置する方法を提供する。いくつかの実施形態では、代謝性疾患は、１型糖尿病、２型糖尿病、メタボリックシンドロームまたは肥満症から選択される。
【０３３４】
本発明の方法によれば、化合物および組成物は、がん、自己免疫疾患、増殖性障害、炎症性障害、神経変性または神経学的障害、統合失調症、骨関連の障害、肝臓病または心臓障害を処置するまたはその重症度を小さくするために有効な任意の量および任意の投与経路を使用して投与され得る。必要とされる正確な量は、被験体の種、年齢および全身の状態、感染の重症度、具体的な剤、その投与方式などに応じて、被験体ごとに様々である。本発明の化合物は、好ましくは、投与を容易にしかつ投薬量を均一にするために単位剤形に製剤化される。本明細書で使用される場合、「単位剤形」という表現は、処置がなされる患者に適切な剤の物理的に切り離された単位を指す。しかしながら、本発明の化合物および組成物の１日あたりの総使用量は、妥当な医学的判断の範囲内で主治医により決定されると理解されよう。任意の特定の患者または生物に特定の有効用量レベルは様々な要因に依存し、要因としては、処置されている障害および障害の重症度；用いられる特定の化合物の活性；用いられる特定の組成物；患者の年齢、体重、全身の健康、性別および食事；用いられる特定の化合物の投与時間、投与経路および排出速度；処置の継続期間；用いられる特定の化合物と組み合わせてまたは同時に使用される薬物および医療分野で周知の同様の要因が挙げられる。本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。
【０３３５】
本発明の薬学的に許容され得る組成物は、処置される感染の重症度に応じて、経口的に、直腸内に、非経口的に、嚢内に、膣内に、腹腔内に、局所的に（粉末、軟膏またはドロップ剤による）、口腔内に、経口または経鼻スプレーなどとして、ヒトおよび他の動物に投与され得る。特定の実施形態では、本発明の化合物は、所望の治療効果を得るために、１日に１回または複数回、１日あたり、被験体の体重の約０．０１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１ｍｇ／ｋｇから約２５ｍｇ／ｋｇの投与量レベルで経口的または非経口的に投与され得る。
【０３３６】
経口投与のための液体剤形としては、限定されないが、薬学的に許容され得る乳剤、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシル剤が挙げられる。活性化合物に加えて、液体剤形は、当技術分野で通常使用される不活性希釈剤（例えば、水または他の溶媒）、可溶化剤および乳化剤（例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（具体的には、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物など）を含有し得る。不活性希釈剤の他に、経口組成物はまた、アジュバント（例えば、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤など）、甘味料、香味料および芳香剤を含み得る。
【０３３７】
注射調製物、例えば滅菌注射のための水性または油性懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して公知の技術にしたがって製剤化され得る。滅菌注射調製物はまた、非毒性の非経口的に許容され得る希釈剤または溶媒中の滅菌注射溶液、懸濁液または乳濁液、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液であり得る。用いられ得る許容され得るビヒクルおよび溶媒の中で、水、リンガー溶液，Ｕ．Ｓ．Ｐ．および等張性塩化ナトリウム溶液がある。加えて、滅菌固定油は、溶媒または懸濁媒として従来どおりに用いられる。この目的のために、任意のブランド固定油（合成モノまたはジグリセリドが挙げられる）が用いられ得る。加えて、オレイン酸などの脂肪酸が注射物質の調製において使用される。
【０３３８】
注射製剤は、使用前に、例えば、細菌保持フィルターを通した濾過により、あるいは滅菌水または他の滅菌注射媒体に溶解または分散させ得る滅菌固体組成物の形態の滅菌剤を組み込むことにより滅菌され得る。
【０３３９】
本発明の化合物の効果を延長させるために、皮下または筋肉内注射からの化合物の吸収を遅くすることが、多くの場合、望ましい。これは、水溶性に乏しい結晶質または非晶質材料の液体懸濁液を使用することにより達成され得る。化合物の吸収速度はその溶解速度に依存し、溶解速度は結晶サイズおよび結晶形態に依存し得る。あるいは、非経口的に投与される化合物形態の遅延吸収は、油性ビヒクルへの化合物の溶解または懸濁により達成される。注射デポ形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中に化合物のマイクロカプセル封入マトリックスを形成することにより作製される。化合物のポリマーに対する比および用いられる特定のポリマーの性質に応じて、化合物の放出速度は制御され得る。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（酸無水物）が挙げられる。デポ注射製剤はまた、体組織に適合するリポソームまたはマイクロエマルジョン内に化合物を捕捉することにより調製される。
【０３４０】
直腸または膣投与のための組成物は好ましくは坐薬であり、坐薬は、適切な非刺激性の賦形剤または担体（例えば、周囲温度で固体であるが体温で液体であるため、直腸または膣腔内で溶けて活性化合物を放出する、ココアバター、ポリエチレングリコールまたは坐剤ワックスなど）と本発明の化合物を混合することにより調製され得る。
【０３４１】
経口投与のための固体剤形としては、カプセル、錠剤、丸剤、粉末および顆粒が挙げられる。このような固体剤形では、活性化合物は、少なくとも１つの不活性の、薬学的に許容され得る賦形剤または担体（例えば、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムなど）および／または、ａ）充填剤または増量剤（例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよびケイ酸など）、ｂ）バインダー（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよびアカシアなど）、ｃ）保湿剤（例えば、グリセロールなど）、ｄ）崩壊剤（例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のシリケートおよび炭酸ナトリウムなど）、ｅ）溶解遅延剤（例えば、パラフィンなど）、ｆ）吸収促進剤（例えば、第４級アンモニウム化合物など）、ｇ）湿潤剤（例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールなど）、ｈ）吸収剤（例えば、カオリンおよびベントナイトクレイなど）およびｉ）滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムおよびこれらの混合物など）と混合されている。カプセル、錠剤および丸剤の場合、剤形は緩衝剤も含み得る。
【０３４２】
同様の種類の固体組成物はまた、ラクトースや乳糖などの賦形剤ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどを使用した軟質および硬質充填ゼラチンカプセル内の充填剤として用いられ得る。錠剤、糖衣錠、カプセル、丸剤および顆粒の固体剤形は、腸溶性コーティングおよび医薬品製剤化の技術分野で周知の他のコーティングなどの、コーティングおよびシェルを用いて調製され得る。それらは、必要に応じて乳白剤を含有してもよく、また、腸管の特定の部分において、必要に応じて遅延的様式で、活性成分（単数または複数）のみを、または優先的に、放出する組成のものであり得る。使用され得る埋め込み組成物の例としては、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。同様の種類の固体組成物は、ラクトースや乳糖などの賦形剤ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどを使用する、軟質および硬質充填ゼラチンカプセルの充填剤としても用いられ得る。
【０３４３】
活性化合物はまた、上述の１つまたはそれを超える賦形剤を有するマイクロカプセル化形態であり得る。錠剤、糖衣錠、カプセル、丸剤および顆粒の固体剤形は、腸溶性コーティング、放出制御コーティングおよび医薬品製剤化の分野で周知の他のコーティングなどの、コーティングおよびシェルを用いて調製され得る。このような固体剤形では、活性化合物は、スクロース、ラクトースまたはデンプンなどの少なくとも１つの不活性希釈剤と混合されていてもよい。このような剤形はまた、通常の実施と同様に、不活性希釈剤以外のさらなる物質、例えば、錠剤成形滑沢剤および他の錠剤成形助剤（ステアリン酸マグネシウムおよび微結晶性セルロースなど）を含み得る。カプセル、錠剤および丸剤の場合、剤形は緩衝剤も含み得る。それらは、必要に応じて乳白剤を含有してもよく、また、腸管の特定の部分において、必要に応じて遅延的様式で、活性成分（単数または複数）のみを、または優先的に、放出する組成のものであり得る。使用され得る埋め込み組成物の例としては、例えば、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。
【０３４４】
本発明の化合物の局所または経皮投与用剤形としては、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉末、溶液、スプレー、吸入剤またはパッチが挙げられる。活性成分は、滅菌条件下で、薬学的に許容され得る担体および任意の必要とされる保存剤またはバッファーと、必要に応じて混合される。眼科用製剤、点耳薬および点眼薬もまた本発明の範囲内にあると企図される。加えて、本発明は、経皮パッチの使用を企図し、これは身体への化合物の制御された送達を提供するというさらなる利点を有する。このような剤形は、適切な媒体中に化合物を溶解しまたは分散させることにより作製され得る。吸収促進剤もまた、皮膚を通過する化合物の流れを増加させるために使用され得る。速度は、速度制御膜を設けることにより、またはポリマーマトリックスもしくはゲル中に化合物を分散させることにより制御され得る。
【０３４５】
一実施形態によれば、本発明は、生物学的サンプル中の標的ＲＮＡの活性をモジュレートする方法であって、前記生物学的サンプルを本発明の化合物または前記化合物を含む組成物と接触させる工程を含む方法に関する。
【０３４６】
別の実施形態によれば、本発明は、生物学的サンプル中の標的ＲＮＡの活性をモジュレートする方法であって、前記生物学的サンプルを本発明の化合物または前記化合物を含む組成物と接触させる工程を含む方法に関する。特定の実施形態では、本発明は、生物学的サンプル中の標的ＲＮＡの活性を不可逆的に阻害する方法であって、前記生物学的サンプルを本発明の化合物または前記化合物を含む組成物と接触させる工程を含む方法に関する。
【０３４７】
本明細書で使用される場合、「生物学的サンプル」という用語は、限定されないが、細胞培養物またはその抽出物、哺乳動物から得られた生検材料またはその抽出物および血液、唾液、尿、糞便、精液、涙液、脳脊髄液もしくは他の体液またはその抽出物を含む。
【０３４８】
本発明の別の実施形態は、患者における標的ＲＮＡの活性をモジュレートする方法であって、前記患者に、本発明の化合物または前記化合物を含む組成物を投与する工程を含む方法に関する。
【０３４９】
別の実施形態によれば、本発明は、患者における標的ＲＮＡの活性を阻害する方法であって、前記患者に、本発明の化合物または前記化合物を含む組成物を投与する工程を含む方法に関する。特定の実施形態によれば、本発明は、患者における標的ＲＮＡの活性を不可逆的に阻害する方法であって、前記患者に、本発明の化合物または前記化合物を含む組成物を投与する工程を含む方法に関する。他の実施形態では、本発明は、標的ＲＮＡにより媒介される障害の処置を必要とする患者における標的ＲＮＡにより媒介される障害を処置するための方法であって、前記患者に、本発明の化合物またはその薬学的に許容され得る組成物を投与する工程を含む方法を提供する。このような障害は、本明細書に詳細に記載されている。
【実施例】
【０３５０】
例証
以下の実施例に示されているように、例示的な化合物は以下の一般的手順にしたがって調製され、本明細書に一般に記載される生物学的アッセイおよび他の手順において使用される。一般的方法は特定の本発明の化合物の合成を示すが、以下の一般的方法および当業者に公知の他の方法は、本明細書に記載されるすべての化合物ならびにこれらの化合物のそれぞれのサブクラスおよび種に適用され得ることが認識されよう。同様に、アッセイおよび他の分析は当業者の知識にしたがって適応させ得る。
実施例１：ＲＮＡ中の改変の部位を位置決定および定量するための光プローブの適用
【０３５１】
上記のように、様々なＲＮＡ分子が、細胞における重要な調節的役割を果たす。ＲＮＡ二次および三次構造は、これらの調節活性に重要である。ＲＮＡ構造を決定するために、様々なツールが利用可能である。最も有効な方法の１つは、ＳＨＡＰＥ（選択的２’−ヒドロキシルアシル化およびプライマー伸長）である。この方法論は、すべてのＲＮＡ中のリボース基が２’−ヒドロキシルを有し、その反応性が局所的なヌクレオチドフレキシビリティおよび溶媒へのアクセシビリティにより影響されるという特徴を利用する。この２’−ヒドロキシルは、一本鎖のフレキシブルなＲＮＡの領域では反応性であるが、塩基対形成したヌクレオチドでは非反応性である。換言すれば、ＳＨＡＰＥ反応性は、ヌクレオチドがＲＮＡ二次構造内で塩基対形成する確率に反比例する。この２’−ヒドロキシルにおいてＲＮＡを化学的に改変する試薬は、ＲＮＡ構造を識別するプローブとして使用され得る。ＳＨＡＰＥ試薬は、フレキシブルなヌクレオチドの２’−ヒドロキシル基と反応して２’−Ｏ−付加物を形成する小分子、例えば１−メチル−７−ニトロイサト酸無水物（１Ｍ７）およびベンゾイルシアニド（ＢｚＣＮ）を含む。他のアシル化求電子試薬、例えば２−メチルニコチン酸イミダゾリド（ＮＡＩ）および２−メチル−３−フロ酸イミダゾリド（ＦＡＩ）を利用し得る。
【０３５２】
本発明の１つの有用な態様は、光プローブへのＲＮＡ結合小分子リガンドのテザーである。これは、光プローブが、リガンドの結合部位に近位の（例えば空間内で近くの）ＲＮＡの一部と反応する可能性が最も高いように、光活性化媒介性共有結合的改変事象をリガンド結合事象と関連付ける。したがって、光活性化可能薬剤の活性は、ＲＮＡ上のリガンド結合ポケットに近位のヌクレオチドに拘束されるので、ＲＮＡの改変パターンは決定的に変化されるであろう。したがって、シーケンシングなどの適切な分析方法において明らかにされるように、反応性パターンの変化からリガンド結合ポケットの存在および位置を推測し得る。
【０３５３】
ＳＨＡＰＥ−ＭａＰアプローチは、逆転写酵素にＳＨＡＰＥ改変ヌクレオチドを誤って読み取らせ、元の配列に非相補的なヌクレオチドを、新たに合成されたｃＤＮＡに組み込ませる条件を利用する。ＳＨＡＰＥ付加物の位置および相対頻度は、ｃＤＮＡ一次配列における突然変異として記録される。ＳＨＡＰＥ−ＭａＰ実験では、ＲＮＡをＳＨＡＰＥ試薬で処理するか、または溶媒のみで処理し、ＲＮＡを改変する。各実験条件からのＲＮＡを逆転写し、次いで、得られたｃＤＮＡをシーケンシングする。未処理サンプルについて得られたデータから処理サンプルのデータを差し引き、変性（アンフォールディング）対照ＲＮＡのデータに対して正規化することにより、反応位置を同定する。
【０３５４】
ＳＨＡＰＥ−ＭａＰは、詳細に公開されている方法にしたがって実施および分析され得る（Ｍａｒｔｉｎら、ＲＮＡ  ２０１２；１８：７７−８７；ＭｃＧｕｉｎｎｅｓｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２；１３４：６６１７−６６２４；Ｓｉｅｇｆｒｉｅｄら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１４；１１：９５９−９６５；Ｌａｖｅｎｄｅｒら、ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．２０１５；１１（５）ｅ１００４２３０；ＭｃＧｕｉｎｎｅｓｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２０１５；１１２：２４２５−２４３０）。ＳＨＡＰＥ−ＭａＰ配列データは、ＳｈａｐｅＦｉｎｄｅｒ（Ｖａｓａら、ＲＮＡ  ２００８；１４：１９７９−１９９０）またはＳｈａｐｅＭａｐｐｅｒ（Ｓｉｅｇｆｒｉｅｄら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１４；１１：９５９−９６５）または他のソフトウェアを使用して分析され得る。前述の刊行物はそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。
【０３５５】
ＰＥＡＲＬ−ｓｅｑ（Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｖｉａ  ＲＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）は、リガンド結合ポケットに近位のリボースのみがアシル化されるので、テザーを使用してアシル化事象をリガンド結合事象に関連付けて、シーケンシングで「突然変異」として観察されるアシル化パターンを決定的に変化させるという点において、ＳＨＡＰＥおよびＳＨＡＰＥ−ＭａＰとは異なる。このことから、ターゲティングされたＲＮＡ上の小分子結合部位の存在およびトランスクリプトームにわたってのこれらのリガンド結合部位の位置を推定する。クリック官能基も有するＲＮＡリガンド／テザー／弾頭構築物（「フック」）は、クリック可能なビオチンにクリックした後、ビーズ上のストレプトアビジンと複合体化させることによりプルダウンされ得る。このクリック／プルダウンプロトコールにより、「フック」により共有結合的に改変されたＲＮＡのみをシーケンシングすることが可能となる。ターゲティングされたＲＮＡ上で別々に実行されるＳＨＡＰＥ−ＭａＰおよびＲＩＮＧ−ＭａＰのプロトコールにより、「共有結合親和性トランスクリプトミクス」の配列データの解釈を促進する枠組みとして、ターゲティングされたＲＮＡの構造モデルの構築が可能となる。成功は、細胞における遊離リガンドの生物活性により測定される。
【０３５６】
本発明において使用するためのライブラリーは、標的ＲＮＡ中の結合部位に近位のヌクレオチドと共有結合を選択的に形成する求電子性弾頭にテザーされた小分子（「ＲＮＡリガンド」）を含有するであろう。ライブラリーの多様性は、ＲＮＡリガンド構造、テザー構造および弾頭構造のバリエーションを包含する。
【０３５７】
ＲＮＡ親和性の構造決定因子に関する仮説に基づいてＲＮＡリガンドを設計し、次いで、合成し、テザーおよび弾頭に結合させる。例として、Ｌａｕおよび共同研究者らは、ＳＥＬＥＸ（試験管内進化法（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ））を使用して、以下のヘテロアリールジヒドロピリミジン構造化合物１ｂ（本明細書ではＩ−１）：
【化５５】
2021505132.tif 000076
に対する高親和性ＲＮＡアプタマー（Ｋｄ＝５０ｎＭ）として、アプタマー−２１と称される短いＲＮＡ配列を進化させた（Ｌａｕ，Ｊ．Ｌ．；Ｂａｋｓｈ，Ｍ．Ｍ．；Ｆｉｅｄｌｅｒ，Ｊ．Ｄ．；Ｂｒｏｗｎ，Ｓ．Ｄ．；Ｋｕｓｓｒｏｗ，Ａ．；Ｂｏｒｎｈｏｐ，Ｄ．Ｊ．；Ｏｒｄｏｕｋｈａｎｉａｎ，Ｐ．；Ｆｉｎｎ，Ｍ．Ｇ．ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，２０１１，５，７７２２−７７２９；ＳＥＬＥＸに関するさらなる情報については、例えば、ａ）Ｓ．Ｅ．Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ａ．Ｄ．Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９７，９７，３４９−３７０；ｂ）Ｌ．Ｇｏｌｄ，Ｄ．Ｂｒｏｗｎ，Ｙ．Ｙ．Ｈｅ，Ｔ．Ｓｈｔａｔｌａｎｄ，Ｂ．Ｓ．Ｓｉｎｇｅｒ，Ｙ．Ｗｕ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９７，９４，５９−６４；ｃ）Ｌ．Ｇｏｌｄ，Ｂ．Ｐｏｌｉｓｋｙ，Ｏ．Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，Ｍ．Ｙａｒｕｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９５，６４，７６３−７９７も参照のこと）。この構造は、哺乳動物または細菌細胞との交差反応性を有しない代表的な薬物様分子として選択された。著者らはまた、アプタマー２１、その弱い結合変異体、およびテオフィリンに対する公知のアプタマーを、発現技術により、ウイルス様粒子内にカプシド化されたより長いＲＮＡ配列に包埋した。これらの核タンパク質粒子は、後方散乱干渉法により、遊離（非カプシド化）アプタマーのものと同様の親和性で小分子リガンドに結合することが示された。化合物Ｉ−１は水溶性であり、非毒性であり、オフターゲット結合を最小化するためにネイティブ生体分子とは構造が十分に異なる。それは、銅触媒アジド−アルキン環化付加（ＣｕＡＡＣ）化学反応で導入された１，４−トリアゾール結合（これは、他の目的の分子へのリガンドの便利な接続を可能にする）を特徴とする。本明細書に記載される他のＨＡＰ変異体は、同様に有利な特性を有すると予想される。さらに、開始点としてのアプタマー２１  ＲＮＡの使用は、既知の構造の十分に特徴付けられたＲＮＡの利点を提供し、Ｉ−１とのその結合様式は、元の刊行物を参照して確認され得る。アプタマー２１は、以下の配列：ＧＧＧＵＡＧＧＣＣＡＧＧＣＡＧＣＣＡＡＣＵＡＧＣＧＡＧＡＧＣＵＵＡＡＡＵＣＵＣＵＧＡＧＣＣＣＧＡＧＡＧＧＧＵＵＣＡＧＵＧＣＵＧＣＵＵＡＵＧＵＧＧＡＣＧＧＣＵ（配列番号２５）を有する。
【０３５８】
あるいは、ＲＮＡリガンドは、既知のＲＮＡリガンドへの類似性またはＲＮＡ結合性ポケットへの相補性に基づいて市販の供給元から選択し、購入し、さらなる合成に供してテザーおよび弾頭に結合させる。例としては、限定されないが、テトラサイクリン抗生物質、アミノグリコシド抗生物質、テオフィリンおよび類似の構造（例えば、キサンチン）、リボシルおよび類似の構造、リネゾリドおよび類似の構造が挙げられる。第３の相補的なアプローチでは、コンビナトリアル化学技術を使用してＲＮＡリガンドのライブラリーを調製する。具体的には、選択したテザーを有機合成を支持するポリマーに取り付け、そして一連の合成化学工程を通じて、化合物を１ビーズ１化合物の形式で作製する。これらの工程は、最終のＲＮＡリガンドにおける、広範な官能基により接続された広範な断片および反応物の組み込みにつながる。これらの化合物を放出し、最後のオフビーズ工程はＲＮＡ弾頭の結合である。
【０３５９】
ライブラリーの機能的帰結の鍵となる要素として、各ＲＮＡリガンドおよびＲＮＡ弾頭について、テザーの長さ、テザーのフレキシビリティおよびさらなる機能性（特に、クリック官能基）を許容する能力を最適化するために、いくつかの構造的に多様なテザーを組み込む。研究されている具体的なテザーとしては、１〜６個のエチレン単位を含むオリゴエチレングリコール、非常にフレキシブルな（例えば、１〜６個のアミノ酸を含むオリゴグリシンもしくはオリゴ−Ｎ−メチルグリシン）またはより剛性の（例えば、１〜６個のアミノ酸を含むオリゴプロリンまたはオリゴ−４−ヒドロキシプロリン）オリゴペプチドが挙げられる。オリゴエチレングリコールテザー中へのクリック官能基の組み込みは、ＲＮＡリガンドまたはテザーのＲＮＡ弾頭末端のいずれかにおいて、クリック可能な官能基を有するアミノ酸を挿入することを必要とする。オリゴペプチドテザー中へのクリック官能基の組み込みは、アミノ酸残基のいずれか１つを、クリック可能な官能基を有するアミノ酸と置き換えることを単純に必要とする。
【０３６０】
ＲＮＡ弾頭は、公知のまたは改変された光活性化可能官能基から選択される。さらなる弾頭は、（１）ＲＮＡ弾頭の構造／活性関係を立証するための前述の弾頭への合成改変、および（２）市販の光活性化可能基のスクリーニングにより同定される。
【０３６１】
クリック官能基は、公開されているクリック試薬および反応物の標準的な「ツールキット」から選択される。本研究は、アジド、アルキン（末端および歪みの両方）、ジエン、テトラジンおよびジエノフィルに焦点を当てている。
【０３６２】
代替試薬、条件およびデータ分析を含むＳＨＡＰＥ、ＳＨＡＰＥ−ＭａＰおよびＰＥＡＲＬ−ｓｅｑ法のさらなる詳細は、国際公開第２０１７／１３６４５０号、国際公開第２０１５／０５４２４７号、米国特許出願公開第２０１４／０１５４６７３号、米国特許第７，７４５，６１４号および米国特許第８，３１３，４２４号（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
実施例２：ＣＰＮＱ類似体および他のキノリン系リガンドの調製
【０３６３】
ＣＰＮＱおよび他のキノリン足場をベースとする例示的な小分子リガンドは、国際公開第２０１７／１３６４５０号（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に示されている合成スキームに基づいて調製され得る。
実施例３：例示的な光プローブ化合物の合成
【０３６４】
一般：特に注釈がない限り、すべての反応はＮ２雰囲気下で行った。すべての溶媒と試薬は、さらに精製せずに受領したまま使用した。化合物１は、Ｌａｕ，Ｊ．Ｌ．；Ｂａｋｓｈ，Ｍ．Ｍ．；Ｆｉｅｄｌｅｒ，Ｊ．Ｄ．；Ｂｒｏｗｎ，Ｓ．Ｄ．；Ｋｕｓｓｒｏｗ，Ａ．；Ｂｏｒｎｈｏｐ，Ｄ．Ｊ．；Ｏｒｄｏｕｋｈａｎｉａｎ，Ｐ．；Ｆｉｎｎ，Ｍ．Ｇ．ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，２０１１，５，７７２２−７７２９に以前に記載されているように合成した。３−アジド−５−（アジドメチル）安息香酸は、Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｓ．；Ｍｉｓａｗａ，Ｙ．；Ｈｏｓｏｙａ，Ｔ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２０１４，１９，３９９１−３９９５に以前に記載されているように調製した。回転蒸発は、４０℃未満のバス温度、３０ｔｏｒｒ下で実施した。分析ＬＣ−ＭＳデータは、２．３分で９０：１０Ａ：Ｂから４０：６０Ａ：Ｂ（Ａ＝水中０．１％ギ酸およびＢ＝アセトニトリル中０．１％ギ酸）への溶出勾配および０．８０ｍＬ／分の流量を用いて、Ａｃｑｕｉｔｙ  ＢＥＨ  １．７μｍ  Ｃ１８カラム（２．１×５０ｍｍ）を備えるＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣシステムにより取得した。カラムクロマトグラフィーは、プレパックＲｅｄｉＳｅｐ  Ｒｆ＋Ｇｏｌｄシリカゲル（Ｔｅｌｅｄｙｎｅ  Ｉｓｃｏ）または４０〜６０μｍ球状Ｃ１８シリカゲルカラム（Ａｇｅｌａ）を使用するＴｅｌｅｄｙｎｅ  Ｉｓｃｏ  Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈ（登録商標）Ｒｆ＋システムにより実施した。ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  ４００ＭＨｚ分光計により取得した；化学シフトは、溶媒の残存モノ−１Ｈ−アイソトポマーを基準とする：ＣＨＤ２ＯＤ＝３．３１ｐｐｍ；ＣＤ３ＳＯＣＤ２Ｈ＝２．４９ｐｐｍ；ＣＨＣｌ３＝７．２６ｐｐｍ。
【化５６】
2021505132.tif 000077
【０３６５】
化合物２：ＭｅＯＨ（４ｍＬ）およびＨ２Ｏ（１ｍＬ）の溶液に、室温で、１（１００ｍｇ、２４２μｍｏｌ、１当量）、２−［２−（２−アジドエトキシ）エトキシ］エチルアミン（４２ｍｇ、２４２μｍｏｌ、１．０当量）、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（６０ｍｇ、２４２μｍｏｌ、１．０当量）およびアスコルビン酸ナトリウム（９６ｍｇ、４８３μｍｏｌ、２．０当量）を添加した。混合物を２０℃で０．５時間撹拌した。混合物をＮａＨＣＯ３の飽和水溶液（３０ｍＬ）で希釈し、次いで、混合物をＥｔＯＡｃ（３×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた抽出物を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、次いで、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。固体を濾過し、濾液を減圧下で濃縮して、粗生成物を黄色の固体として得た。残渣を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｓｙｎｅｒｇｉ  Ｃ１８カラム（１５０×２５×１０μｍ）を使用して、０．０５％ＨＣｌを含有する水中１０〜３０％ＣＨ３ＣＮの勾配で溶出させる分取ＨＰＬＣにより精製して、２を黄色の固体（ＨＣｌ塩、６５ｍｇ、収率４３％）として得た。ＬＣＭＳ：ｔＲ：１．７４９分；（Ｍ＋Ｈ）＝５８８．２．
1H  NMR  (400  MHz,  メタノール-d4)  ppm  =  9.12  (br  s,  2H),  8.21  (br  d,  J=17.1  Hz,  3H),  7.76  (dd,  J=6.0,  8.7  Hz,  1H),  7.42  (dd,  J=2.4,  8.6  Hz,  1H),  7.26  (dt,  J=2.6,  8.3  Hz,  1H),  6.42  (s,  1H),  5.02  -  4.93  (m,  2H),  4.84  (s,  2H),  4.65  (t,  J=5.0  Hz,  2H),  3.94  (t,  J=5.0  Hz,  2H),  3.75  -  3.55  (m,  9H),  3.10  (t,  J=4.8  Hz,  2H).  
【化５７】
2021505132.tif 000078
【０３６６】
一般的な手順Ａ−ＨＡＴＵ媒介性酸−アミンカップリング反応：カルボン酸（１．２当量）を含むＤＭＦ（０．０５Ｍ）の撹拌溶液に、室温で、ＨＡＴＵ（２．０当量）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４．０当量）および第１級アミン（１当量）を添加した。得られた溶液を室温で２〜１６時間インキュベートし、次いで、反応混合物を精製のためにプレパックＣ１８シリカゲルカラムに直接ロードした。所望の生成物を含有する画分を合わせ、−７８℃（アセトン／ＣＯ２）で凍結し、凍結乾燥させて、最終光プローブ化合物を固体として得た。
【化５８】
2021505132.tif 000079
【０３６７】
化合物３：上記一般手順Ａにしたがって、２（３０ｍｇ、５１μｍｏｌ）および４−ベンゾイル安息香酸から化合物３を調製した。粗生成物混合物を、０．１％ギ酸を含有する水中０〜１００％ＣＨ３ＣＮで溶出させるＣ１８シリカゲルでの逆相クロマトグラフィーにより精製した。プローブ３を淡褐色の固体（ギ酸塩、３９ｍｇ、収率８３％）として単離した。ＬＣ−ＭＳ：ｔＲ：１．４９分；［Ｍ＋Ｈ］＋７９６．２．
【化５９】
2021505132.tif 000080
【０３６８】
化合物４：上記一般手順Ａにしたがって、２（３０ｍｇ、５１μｍｏｌ）および４−［３−（トリフルオロメチル）−３Ｈ−ジアジリン−３−イル］安息香酸から化合物４を調製した。粗生成物混合物を、０．１％ギ酸を含有する水中０〜１００％ＣＨ３ＣＮで溶出させるＣ１８シリカゲルでの逆相クロマトグラフィーにより精製した。化合物４を鮮黄色の固体として（ギ酸塩、１９ｍｇ、収率４４％）単離した。ＬＣ−ＭＳ：ｔＲ：１．５６分；［Ｍ＋Ｈ］＋８００．２．
【化６０】
2021505132.tif 000081
【０３６９】
化合物５：上記一般手順Ａにしたがって、２（５０ｍｇ、８５μｍｏｌ）および４−アジド安息香酸（メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル中０．２Ｍ溶液として）から化合物５を調製した。室温で３時間撹拌した後、粗生成物混合物を部分的に濃縮してメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルを除去し、次いで、得られた生成物溶液（ＤＭＦ中）を、０．１％ギ酸を含有する水中０〜１００％ＣＨ３ＣＮで溶出させるＣ１８シリカゲルでの逆相クロマトグラフィーにより精製した。化合物５を鮮黄色の固体として（ギ酸塩、３２ｍｇ、収率４９％）単離した。ＬＣ−ＭＳ：ｔＲ：１．４５分；［Ｍ＋Ｈ］＋７３３．２．
【化６１】
2021505132.tif 000082
【０３７０】
化合物６：２（３０ｍｇ、５１μｍｏｌ、１当量）を含むＤＭＦ（２．０ｍＬ）の撹拌溶液に、室温で、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２７μＬ、１５３μｍｏｌ、３．０当量）および２，５−ジオキソピロリジン−１−イル３−（３−メチル−３Ｈ−ジアジリン−３−イル）プロパノエート（１２ｍｇ、５４μｍｏｌ、１．０５当量）を添加した。得られた鮮黄色の反応混合物を室温で２時間撹拌し、次いで、０．１％ギ酸を含有する水中０〜６０％ＣＨ３ＣＮで溶出させるＣ１８シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより直ぐに精製した。所望の生成物を含有する画分を減圧下で濃縮してＣＨ３ＣＮを除去し、次いで、−７８℃で凍結し、凍結乾燥させて、所望の生成物６を鮮黄色の固体（ギ酸塩、１６．０ｍｇ、収率４２％）として得た。ＬＣ−ＭＳ：ｔＲ：１．４０分；［Ｍ＋Ｈ］＋６９８．３．
【化６２】
2021505132.tif 000083
【０３７１】
化合物７：１（３２１ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ、１当量）を含むｔ−ＢｕＯＨ（４．０ｍＬ）および水（４．０ｍＬ）の撹拌懸濁液に、３−アジドプロピルアミン（９３ｍｇ、０．９３ｍｍｏｌ、１．２当量）およびＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（１５ｍｇ、６２μｍｏｌ、０．０８当量）を添加した。得られた懸濁液に、アスコルビン酸ナトリウム（４６ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ、０．３０当量）を含む水（１．０ｍＬ）の溶液を添加した。得られた懸濁液を室温で激しく２時間撹拌し、次いで、減圧下で濃縮して、ｔ−ＢｕＯＨを除去した。残った粗生成物溶液を、０．１％ＮＨ３を含有する水中０〜３０％ＣＨ３ＣＮで溶出させるＣ１８シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより直接精製した。所望の生成物を含有する画分を−７８℃で凍結し、凍結乾燥させて、化合物７を鮮黄色の固体（３０５ｍｇ、収率７７％）として得た。ＬＣＭＳ：ｔＲ：１．１９分；［Ｍ＋Ｈ］＋５１４．２．
【化６３】
2021505132.tif 000084
【０３７２】
化合物８：７（３０ｍｇ、５８μｍｏｌ、１当量）を含むＤＭＦ（２．０ｍＬ）の撹拌溶液に、室温で、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４１μＬ、２３３μｍｏｌ、４．０当量）および２，５−ジオキソピロリジン−１−イル３−（３−メチル−３Ｈ−ジアジリン−３−イル）プロパノエート（１４ｍｇ、６４μｍｏｌ、１．１０当量）を添加した。得られた鮮黄色の反応混合物を室温で２時間撹拌し、次いで、０．１％ギ酸を含有する水中０〜１００％ＣＨ３ＣＮで溶出させるＣ１８シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより直ぐに精製した。所望の生成物を含有する画分を減圧下で濃縮してＣＨ３ＣＮを除去し、次いで、−７８℃で凍結し、凍結乾燥させて、所望の生成物を鮮黄色の固体（ギ酸塩、１７．０ｍｇ、収率４４％）として得た。ＬＣ−ＭＳ：ｔＲ：１．４０分；［Ｍ＋Ｈ］＋６２４．２．
【化６４】
2021505132.tif 000085
【０３７３】
化合物９：４−［３−（トリフルオロメチル）−３Ｈ−ジアジリン−３−イル］安息香酸（２７ｍｇ、１１６μｍｏｌ、１．２当量）を含むＣＨ２Ｃｌ２（２．０ｍＬ）の撹拌懸濁液に、室温で、ＤＭＦ（約１０μＬ）と、塩化オキサリルを含むＣＨ２Ｃｌ２の２．０Ｍ溶液（４９μＬ、９８μｍｏｌ、１．０当量）とを添加した。得られた透明無色の混合物を室温で１時間撹拌し、次いで、７（５０ｍｇ、９７μｍｏｌ、１当量）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６８μＬ、０．３９ｍｍｏｌ、４．０当量）を添加した。混合物を室温で３時間撹拌し、次いで、減圧下で濃縮した。粗生成物を、０．１％ギ酸を含有する水中０〜１００％ＣＨ３ＣＮで溶出させるＣ１８シリカゲルでの逆相フラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。所望の生成物を含有する画分を合わせ、部分的に蒸発させ、次いで、−７８℃で凍結し、凍結乾燥させて、所望の生成物を黄色の固体（ギ酸塩、３２ｍｇ、収率４７％）として得た。ＬＣ−ＭＳ：ｔＲ：１．５７分；［Ｍ＋Ｈ］＋７２６．０．
【０３７４】
一般手順Ｂ−アミノ酸、カルボン酸ＮＨＳエステルおよびアミンの３成分カップリング：アミノ酸（１当量）を含むＤＭＦ（２．０ｍＬ）の懸濁液に、室温で、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４．０当量）およびカルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（１．０５当量）を添加した。得られた懸濁液を室温で１２〜４８時間撹拌した。アミドの形成が完了したら（ＬＣ−ＭＳ分析による決定）、１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム３−オキシドヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）（２．０当量）およびアミン（１．２当量）を添加し、得られた鮮黄色の混合物を室温で３時間撹拌した。混合物を、Ｃ１８シリカゲルでのカラムクロマトグラフィーにより直接精製した。所望の生成物を含有する画分を合わせ、部分的に蒸発させてＣＨ３ＣＮを除去し、次いで、−７８℃で凍結し、凍結乾燥させて、所望の生成物を固体として得た。
【化６５】
2021505132.tif 000086
【０３７５】
化合物１０：上記一般手順Ｂにしたがって、Ｌ−フォトロイシン（２５ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ、１当量）、ビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（６２ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ、１．０５当量）および２（１２２ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ、１．２当量）から化合物１０を調製した。混合物を、０．１％ギ酸を含有する水中０〜１００％ＣＨ３ＣＮで溶出させるＣ１８シリカゲルでのカラムクロマトグラフィーにより直接精製した。所望の生成物を含有する画分を合わせ、部分的に蒸発させてＣＨ３ＣＮを除去し、次いで、−７８℃で凍結し、凍結乾燥させて、所望の生成物を黄色の固体（ギ酸塩、９７ｍｇ、収率５７％）として得た。ＬＣ−ＭＳ：ｔＲ：１．３５分；［Ｍ＋Ｈ］＋９３９．３．
【化６６】
2021505132.tif 000087
【０３７６】
化合物１１：上記一般手順Ｂにしたがって、Ｎα−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−リジン（５０ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ、１当量）、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル３−（３−メチル−３Ｈ−ジアジリン−３−イル）プロパノエート（４８ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ、１．０５当量）および２（１４２ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ、１．２当量）から化合物１１を調製した。混合物を、０．１％ギ酸を含有する水中０〜５０％ＣＨ３ＣＮで溶出させるＣ１８シリカゲルでのカラムクロマトグラフィーにより直接精製した。所望の生成物を含有する画分を合わせ、部分的に蒸発させてＣＨ３ＣＮを除去し、次いで、−７８℃で凍結し、凍結乾燥させて、所望の生成物を黄色の固体（ギ酸塩、１２０ｍｇ、収率６１％）として得た。ＬＣ−ＭＳ：ｔＲ：１．４６分；［Ｍ＋Ｈ］＋９２６．４．
【化６７】
2021505132.tif 000088
【０３７７】
化合物１２：上記一般手順Ｂにしたがって、Ｎα−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−リジン（５０ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ、１当量）、ビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（７２ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ、１．０５当量）および２（１４２ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ、１．２当量）から化合物１２を調製した。混合物を、０．１％ギ酸を含有する水中０〜５０％ＣＨ３ＣＮで溶出させるＣ１８シリカゲルでのカラムクロマトグラフィーにより直接精製した。所望の生成物を含有する画分を合わせ、部分的に蒸発させてＣＨ３ＣＮを除去し、次いで、−７８℃で凍結し、凍結乾燥させて、所望の生成物を黄色の固体（ギ酸塩、１０５ｍｇ、収率４８％）として得た。ＬＣ−ＭＳ：ｔＲ：１．３８分；［Ｍ＋Ｈ］＋１０４２．４．
【化６８】
2021505132.tif 000089
【０３７８】
化合物１３：１１（４０ｍｇ、４１μｍｏｌ、１当量）を含むＣＨ２Ｃｌ２（１．０ｍＬ）の撹拌溶液を、０℃で、ニートトリフルオロ酢酸（２５０μＬ）の滴下により処理した。得られた混合物を室温に温め、次いで、室温で１５分間撹拌した。混合物を減圧下で濃縮乾固して、粗第１級アミンを得た。粗アミンをＤＭＦ（１．０ｍＬ）に再懸濁し、次いで、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（７２μＬ、０．４１ｍｍｏｌ、１０．０当量）、ビオチン（１５ｍｇ、６２μｍｏｌ、１．５当量）およびＨＡＴＵ（３１ｍｇ、８２μｍｏｌ、２．０当量）で処理した。得られた鮮黄色の混合物を室温で２時間維持し、次いで、Ｃ１８シリカゲルカラムに直ぐにロードし、０．１％ギ酸を含有する水中０〜７０％ＣＨ３ＣＮで溶出させた。所望の生成物を含有する画分を合わせ、減圧下で部分的に蒸発させてＣＨ３ＣＮを除去し、次いで、凍結し、凍結乾燥させて、所望の生成物を黄色の固体（ギ酸塩、２７ｍｇ、収率６０％）として得た。ＬＣ−ＭＳ：ｔＲ：１．３８分；［Ｍ＋Ｈ］＋１０５２．４．
【化６９】
2021505132.tif 000090
【０３７９】
化合物１４：１２（４０ｍｇ、３７μｍｏｌ、１当量）を含むＣＨ２Ｃｌ２（１．０ｍＬ）の撹拌溶液を、０℃で、ニートトリフルオロ酢酸（２５０μＬ）の滴下により処理した。得られた混合物を室温に温め、次いで、室温で５５分間撹拌した。混合物を減圧下で濃縮乾固して、粗第１級アミンを得た。粗アミンをＤＭＦ（１．０ｍＬ）に再懸濁し、次いで、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６４μＬ、０．３７ｍｍｏｌ、１０．０当量）および２，５−ジオキソピロリジン−１−イル３−（３−メチル−３Ｈ−ジアジリン−３−イル）プロパノエート（１０ｍｇ、４４μｍｏｌ、１．２当量）で処理した。得られた鮮黄色の混合物を室温で１６時間維持し、次いで、Ｃ１８シリカゲルカラムに直ぐにロードし、０．１％ギ酸を含有する水中０〜７０％ＣＨ３ＣＮで溶出させた。所望の生成物を含有する画分を合わせ、減圧下で部分的に蒸発させてＣＨ３ＣＮを除去し、次いで、凍結し、凍結乾燥させて、所望の生成物を黄色の固体（ギ酸塩、２２ｍｇ、収率５４％）として得た。ＬＣ−ＭＳ：ｔＲ：１．３７分；［Ｍ＋Ｈ］＋１０５２．４．
【化７０】
2021505132.tif 000091
【０３８０】
化合物１５：上記一般手順Ｂにしたがって、Ｎε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−リジン（１７５ｍｇ、０．７１ｍｍｏｌ、１当量）、ビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（２５２ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ、１．０５当量）および２（５００ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ、１．２当量）を使用して化合物１５を調製した。反応の完了後（ＬＣ−ＭＳ分析による決定）、反応混合物をＥｔＯＡｃ（１５０ｍＬ）で希釈し、４×４０ｍＬ部分の水で洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、固体を濾過し、濾液を濃縮して、粗生成物を黄色のゴム状物質として得た。粗生成物をジエチルエーテル：ペンタン（１：１、１０ｍＬ）で１回トリチュレートし、次いで、得られた固体をメタノール（５ｍＬ）に溶解させ、−５０℃に冷却した。ジエチルエーテル（２０ｍＬ）を添加し、次いで、得られた固体を濾過により収集して、１５を黄色の固体（３８０ｍｇ、収率４３％）として得た。ＬＣ−ＭＳ：ｔＲ：１．４０分；［Ｍ＋Ｈ］＋１０４２．１．
【化７１】
2021505132.tif 000092
【０３８１】
化合物１６：出発アミノ酸としてＮε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−リジンに代えてＮε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｄ−リジン（９００ｍｇ、１．９０ｍｍｏｌ、１当量）を使用したことを除いて化合物１５と同様に、化合物１６を調製した。化合物１６を黄色の固体（１．０３ｇ、収率５２％）として得た。ＬＣ−ＭＳ：ｔＲ：１．４０分；［Ｍ＋Ｈ］＋１０４２．１．
【化７２】
2021505132.tif 000093
【０３８２】
化合物１７：１５（５５ｍｇ、５３μｍｏｌ、１当量）を含むＣＨ２Ｃｌ２（１．０ｍＬ）の溶液を、０℃で、トリフルオロ酢酸（０．２５ｍＬ）で処理した。得られた混合物を１５分間かけて室温に温めた。この後、混合物を減圧下で濃縮乾固した。得られた粗アミンをＤＭＦ（２．０ｍＬ）に溶解させ、次いで、４−アジド安息香酸を含むメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルの０．２Ｍ溶液（０．５３ｍＬ、０．１１ｍｍｏｌ、２．０当量）、ＨＡＴＵ（４０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、２．０当量）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３７μＬ、０．２１ｍｍｏｌ、４．０当量）で処理した。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、次いで、部分的に濃縮してメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルを除去した。得られた生成物溶液（ＤＭＦ中）を、０．１％ギ酸を含有する水中０〜１００％ＣＨ３ＣＮで溶出させるＣ１８シリカゲルでのカラムクロマトグラフィーにより直接精製した。所望の生成物を含有する画分を合わせ、部分的に蒸発させてＣＨ３ＣＮを除去し、次いで、−７８℃で凍結し、凍結乾燥させて、１７を黄色の固体（ギ酸塩、３５ｍｇ、収率５８％）として得た。ＬＣ−ＭＳ：ｔＲ：１．４１分；［Ｍ＋Ｈ］＋１０８７．４．
【化７３】
2021505132.tif 000094
【０３８３】
化合物１８：１６（５５ｍｇ、５３μｍｏｌ、１当量）を含むＣＨ２Ｃｌ２（１．０ｍＬ）の溶液を、０℃で、トリフルオロ酢酸（０．２５ｍＬ）で処理した。得られた混合物を１５分間かけて室温に温めた。この後、混合物を減圧下で濃縮乾固した。得られた粗アミンをＤＭＦ（２．０ｍＬ）に溶解させ、次いで、４−アジド安息香酸を含むメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルの０．２Ｍ溶液（０．５３ｍＬ、０．１１ｍｍｏｌ、２．０当量）、ＨＡＴＵ（４０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、２．０当量）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３７μＬ、０．２１ｍｍｏｌ、４．０当量）で処理した。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、次いで、部分的に濃縮してメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルを除去した。得られた生成物溶液（ＤＭＦ中）を、０．１％ギ酸を含有する水中０〜１００％ＣＨ３ＣＮで溶出させるＣ１８シリカゲルでのカラムクロマトグラフィーにより直接精製した。所望の生成物を含有する画分を合わせ、部分的に蒸発させてＣＨ３ＣＮを除去し、次いで、−７８℃で凍結し、凍結乾燥させて、１８を黄色の固体（ギ酸塩、３８ｍｇ、収率６３％）として得た。ＬＣ−ＭＳ：ｔＲ：１．４１分；［Ｍ＋Ｈ］＋１０８７．４．
【化７４】
2021505132.tif 000095
【０３８４】
化合物１９：１５（５５ｍｇ、５３μｍｏｌ、１当量）を含むＣＨ２Ｃｌ２（１．０ｍＬ）の溶液を、０℃で、トリフルオロ酢酸（０．２５ｍＬ）で処理した。得られた混合物を１５分間かけて室温に温めた。この後、混合物を減圧下で濃縮乾固した。得られた粗アミンをＤＭＦ（２．０ｍＬ）に溶解させ、次いで、４−［３−（トリフルオロメチル）−３Ｈ−ジアジリン−３−イル］安息香酸（２４ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、２．０当量）、ＨＡＴＵ（４０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、２．０当量）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３７μＬ、０．２１ｍｍｏｌ、４．０当量）で処理した。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、次いで、得られた生成物溶液（ＤＭＦ中）を、０．１％ギ酸を含有する水中０〜１００％ＣＨ３ＣＮで溶出させるＣ１８シリカゲルでのカラムクロマトグラフィーにより直接精製した。所望の生成物を含有する画分を合わせ、部分的に蒸発させてＣＨ３ＣＮを除去し、次いで、−７８℃で凍結し、凍結乾燥させて、１９を黄色の固体（ギ酸塩、１５ｍｇ、収率２４％）として得た。ＬＣ−ＭＳ：ｔＲ：１．４８分；［Ｍ＋Ｈ］＋１１５５．６．
【化７５】
2021505132.tif 000096
【０３８５】
化合物２０：１５（５５ｍｇ、５３μｍｏｌ、１当量）を含むＣＨ２Ｃｌ２（１．０ｍＬ）の溶液を、０℃で、トリフルオロ酢酸（０．２５ｍＬ）で処理した。得られた混合物を１５分間かけて室温に温めた。この後、混合物を減圧下で濃縮乾固した。得られた粗アミンをＤＭＦ（２．０ｍＬ）に溶解させ、次いで、４−ベンゾイル安息香酸（２４ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、２．０当量）、ＨＡＴＵ（４０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、２．０当量）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３７μＬ、０．２１ｍｍｏｌ、４．０当量）で処理した。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、次いで、得られた生成物溶液（ＤＭＦ中）を、０．１％ギ酸を含有する水中０〜１００％ＣＨ３ＣＮで溶出させるＣ１８シリカゲルでのカラムクロマトグラフィーにより直接精製した。所望の生成物を含有する画分を合わせ、部分的に蒸発させてＣＨ３ＣＮを除去し、次いで、−７８℃で凍結し、凍結乾燥させて、２０を黄色の固体（ギ酸塩、３２ｍｇ、収率５２％）として得た。ＬＣ−ＭＳ：ｔＲ：１．４３分；［Ｍ＋Ｈ］＋１１５１．７．
【化７６】
2021505132.tif 000097
【０３８６】
化合物２１：上記一般手順Ａにしたがって、２（３７ｍｇ、６３μｍｏｌ）および４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロ安息香酸から化合物２１を調製した。室温で３時間撹拌した後、粗生成物混合物を、０．１％ギ酸を含有する水中０〜１００％ＣＨ３ＣＮで溶出させるＣ１８シリカゲルでの逆相クロマトグラフィーにより精製した。化合物２１を鮮黄色の固体（ギ酸塩、２６ｍｇ、収率５２％）として単離した。ＬＣ−ＭＳ：ｔＲ：１．５１分；［Ｍ＋Ｈ］＋８０６．６．
【化７７】
2021505132.tif 000098
【０３８７】
化合物２２：上記一般手順Ａにしたがって、２（３７ｍｇ、６３μｍｏｌ）および３−アジド−５−（アジドメチル）安息香酸から化合物２２を調製した。室温で３時間撹拌した後、粗生成物混合物を、０．１％ギ酸を含有する水中０〜１００％ＣＨ３ＣＮで溶出させるＣ１８シリカゲルでの逆相クロマトグラフィーにより精製した。化合物２２を鮮黄色の固体（ギ酸塩、２６ｍｇ、収率５２％）として単離した。ＬＣ−ＭＳ：ｔＲ：１．５１分；［Ｍ＋Ｈ］＋７８９．５．
実施例４：Ｉ−１（ＡＲＫ−１３９）エナンチオマーのＳＦＣ分離および活性異性体の絶対立体化学の決定
【０３８８】
ラセミＩ−１（ＡＲＫ−１３９）をＳＦＣキラル分離（ＣｈｉｒａｌＰａｋ  ＡＤカラム、７０％Ａ／３０％Ｂのアイソクラティック溶出、相Ａとは超臨界ＣＯ２であり、相ＢとはＭｅＯＨであり、６０ｇ／分の総流量、サイクルタイム３分）し、２つのピークを分離し、収集した。
【化７８】
2021505132.tif 000099
【０３８９】
Ｉ−１の２つのエナンチオマーの分離により、表５および実施例３の化合物ならびに本明細書に開示される他のＨＡＰ化合物のそれぞれの非ラセミバージョンの調製が可能になる。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、ＨＡＰ立体中心でエナンチオ濃縮されたこのような化合物を提供する。
【０３９０】
（Ｒ）−メチル４−（２−クロロ−４−フルオロフェニル）−６−（（（１−（２−（２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ）エチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メトキシ）メチル）−２−（ピリジン−４−イル）−１，４−ジヒドロピリミジン−５−カルボキシレート（上記Ｉ−１ｂ）。黄色の油状物。
1H  NMR:  (400  MHz,  CDCl3)  δ  8.68  (q,  J  =  1.6,  3.2  Hz,  2  H),  8.54  (br  s,  1H),  7.87  (s,  1H),  7.70  (q,  J  =  1.6,  3.2  Hz,  2H),  7.31  (dd,  J  =  6.0,  2.4  Hz,  1H),  7.13  (dd,  J  =  2.4,  6.0  Hz,  1H),  6.95-6.90  (dt,  J  =  4.2,  8.4  Hz,  1H),  6.21  (s,  1H),  4.98  (d,  J  =  1.0,  2H),  4.83  (s,  2H),  4.59  (t,  J  =  4.8  Hz,  2H),  3.90  (t,  J  =  4.8  Hz,  2H),  3.71  (t,  J  =  4.8  Hz,  2H),  3.65-3.60  (m,  7H),  3.56  (t,  t,  J  =  4.8  Hz,  1H),  2.70  (br  s,  1H).
ＬＣＭＳ、Ｃ２７Ｈ３０ＣｌＦＮ６Ｏ６（Ｍ＋Ｈ）の計算値＝５８９．０２、実測値＝５８９．４．キラルＬＣＭＳの保持時間：１．７４分、旋光度：［α］Ｄ２５＋５７．４（ｃ０．７，ＭｅＯＨ）．
【０３９１】
（Ｓ）−メチル４−（２−クロロ−４−フルオロフェニル）−６−（（（１−（２−（２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ）エチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メトキシ）メチル）−２−（ピリジン−４−イル）−１，４−ジヒドロピリミジン−５−カルボキシレート（上記Ｉ−１ａ）。黄色の油状物。
1H  NMR:  (400  MHz,  CDCl3)  δ  8.68  (q,  J  =  1.6,  3.2  Hz,  2  H),  8.54  (br  s,  1H),  7.87  (s,  1H),  7.70  (q,  J  =  1.6,  3.2  Hz,  2H),  7.31  (dd,  J  =  6.0,  2.4  Hz,  1H),  7.13  (dd,  J  =  2.4,  6.0  Hz,  1H),  6.95-6.90  (dt,  J  =  4.2,  8.4  Hz,  1H),  6.21  (s,  1H),  4.98  (s,  2H),  4.83  (s,  2H),  4.59  (t,  J  =  4.8  Hz,  2H),  3.90  (t,  J  =  4.8  Hz,  2H),  3.71  (t,  J  =  4.8  Hz,  2H),  3.65-3.60  (m,  7H),  3.56  (t,  t,  J  =  4.8  Hz,  1H),  2.62  (br  s,  1H).
ＬＣＭＳ、Ｃ２７Ｈ３０ＣｌＦＮ６Ｏ６（Ｍ＋Ｈ）の計算値＝５８９．０２、実測値＝５８９．４．キラルＬＣＭＳの保持時間：１．９３分、旋光度：［α］Ｄ２５−６０．７（ｃ０．７，ＭｅＯＨ）．
ＳＦＣ分離条件
【表５Ａ】
2021505132.tif 000100
【０３９２】
さらなる実験（ＳＰＲ）により、ＡＲＫ−７０２（Ｉ−１ａ）は、１０ｕＭでアプタマー２１に結合しなかったことが示された。他方、ＡＲＫ−７０１（Ｉ−１ｂ）は結合したので、唯一の活性異性体である。ＳＦＣを使用して、以下に示されているように、絶対立体化学を決定した。
【化７９】
2021505132.tif 000101
実施例５：ＳＥＣ／ＭＳ分析の手順
【０３９３】
オンラインＳＥＣ−ＬＣＭＳを使用して、アプタマー２１  ＲＮＡへのＩ−１（ＡＲＫ−１３９）の結合を研究した。
【０３９４】
ＲＮＡ濃度は１μＭであり、リガンド濃度は、適切なバッファー（トリス−ＨＣｌ  ２０ｍＭ  ｐＨ８．０、ＭｇＣｌ２３ｍＭ、ＫＣｌ  １００ｍＭ）中で０．１μＭ〜１０μＭの範囲であった。
【０３９５】
ＲＮＡ／リガンド混合物を９６ウェルプレートフォーマット中、室温で２０分間インキュベートし、次いで、未結合コンポーネントからの標的／リガンド複合体の迅速な分離のために、このプレートを、再使用可能なＳＥＣカラムが取り付けられたクロマトグラフィーシステムに連結されたオートサンプラーにロードした。ＵＶ検出により、ＳＥＣ溶離液中のＲＮＡ／リガンド複合体をモニタリングし、自動バルブシステムは、解離、脱塩、および同定用ＥＳＩ−ＭＳシステムへのリガンドの溶出のためにＲＮＡピークを逆相クロマトグラフィーカラムに送った。
【０３９６】
すべての液体クロマトグラフィーコンポーネントはＨＰ１２００モジュールであった。質量分析計は、ポジティブエレクトロスプレー（ＥＳ＋）ＴＯＦ−ＭＳモードで動作するＷａｔｅｒｓ  ＬＣＴプレミア機器であった。取得された質量範囲は、０．２５秒で８０〜１０００ｍ／ｚであった。ＳＥＣカラムは、５０×４．６ｍｍポリヒドロキシエチルカラムであった。ＳＥＣ移動相は、２００ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ＝７．０であった。ＬＣカラムは、２．１×５０ｍｍ  Ｃ１８  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘカラムであった。勾配ＬＣ移動相Ａは水中０．１％ギ酸であり、Ｂは、０．１％ギ酸を含むアセトニトリル／水であった。実行時間は７．９分であった。
【０３９７】
ＳＥＣ／ＬＣＭＳのさらなる情報については、例えば、Ｂｌｏｍ，Ｋ．Ｆら、Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．１９９９，１，８２−９０を参照のこと。
結果
【０３９８】
アプタマー２１へのＩ−１の結合を測定した。この実験のＳＥＣ／ＬＣＭＳ条件は、［Ｉ−１］＝５ｕＭ、［ＲＮＡ］＝１ｕＭ、バッファー＝トリス−ＨＣｌ  ２０ｍＭ、ＫＣｌ  １００ｍＭ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２であった。
【表６】
2021505132.tif 000102
【０３９９】
実験は２連であり、２回の実験間で良好な再現性が示された。飽和の開始は１〜３μＭであった。また、ＳＥＣ／ＬＣＭＳを使用して、アプタマー２１−ＥへのＩ−１結合を測定した。ＳＰＲデータおよび公開されている文献と一致して、Ｉ−１はアプタマー２１−Ｅに結合しない。ＳＥＣ／ＬＣＭＳは、親和性を評価するための有望な均一法である。
実施例６：ＰＥＡＲＬ−ｓｅｑ光プローブアッセイ
一般的な方法
シーケンシング
【０４００】
本明細書に記載されるアッセイでは、以下の配列を使用した。
【表７】
2021505132.tif 000103
【表８】
2021505132.tif 000104
ＲＮＡのフォールディング
【０４０１】
２〜５μＭのＲＮＡを含むヌクレアーゼフリー水の溶液を３分間かけて９５℃に加熱し、次いで、氷上で２分間冷却した。この溶液を１／２容量の３×ＲＮＡフォールディングバッファー（６０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ８、３００ｍＭ  ＫＣｌ、９ｍＭ  ＭｇＣｌ２）で希釈し、３７℃で２０分間インキュベートした。各実験におけるＲＮＡの使用直前に、フォールディングを行った。ＲＮＡ分子の混合物をインビトロで使用した場合、ＲＮＡを別々にフォールディングし、プロービング実験前に合わせた。
逆転写ドロップオフゲルアッセイ
架橋
【０４０２】
２．５％ＤＭＳＯを含む合計２５μＬのバッファー（２０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ８、１００ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中で、フォールディングＲＮＡ（１μＭ）を光親和性プローブ（１０μＭ）と共に３７℃で３０分間インキュベートして、結合を平衡化させた。次いで、ＵＶクロスリンカー（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、長波ＵＶ光（約３６５ｎｍ）をサンプルに３０分間照射した。
逆転写
【０４０３】
３．７５μＬアリコートの１０μＭ逆転写プライマーを架橋ＲＮＡサンプルに添加し、次いで、これを６５℃で５分間インキュベートし、次いで、氷上で冷却した。次いで、サンプルを６０μＬの最終容量に希釈し、最終バッファー濃度は、１×Ｐｒｏｔｏｓｃｒｉｐｔ−ＩＩバッファー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、０．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．４Ｕ／μＬ  ＲＮａｓｅ阻害剤（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）および１０Ｕ／μＬ  Ｐｒｏｔｏｓｃｒｉｐｔ−ＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）であった。反応物を４５℃で２時間、６５℃で２０分間、次いで４℃でインキュベートした。
ｃＤＮＡの単離
【０４０４】
４．８μＬの２．５Ｍ  ＮａＯＨを添加し、９５℃で５分間加熱することにより、ＲＮＡを加水分解した。０．９μＬの酢酸の添加により、反応をクエンチした。６．６μＬの３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５および１８１μＬのエタノールを添加することにより、ｃＤＮＡを沈殿させ、１時間かけて−８０℃に冷却し、次いで、２０，５００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離した。ｃＤＮＡペレットを５００μＬの７０％エタノールで２回洗浄し、次いで、５分間風乾した。
ポリアクリルアミドゲル分析
【０４０５】
ｃＤＮＡペレットを１２μＬの１×ＴＢＥ−尿素サンプルローディングバッファー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に再懸濁し、５分間かけて９５℃に加熱した。次いで、ゲルの底に達するブロモフェノールブルー色素がより少なくなるまで、プレキャスト８．６×６．７ｃｍ  ＴＢＥ−尿素１０％ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上でサンプルを１２０Ｖで泳動させた。１×ＴＢＥバッファー中１×ＳＹＢＲ−ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ゲルを遮光して室温で２０分間染色した。Ａｚｕｒｅ  ｃ６００機器により、ゲル蛍光をイメージングした。
架橋ＲＮＡのＬＣ−ＭＳ分析
架橋ＲＮＡの生成
【０４０６】
２％ＤＭＳＯを含む合計１００μＬのバッファー（２０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ８、１００ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中で、フォールディングＲＮＡ（１．３３μＭ）を光親和性プローブ（２０μＭ）と共にまたはなしで３７℃で３０分間インキュベートして、結合を平衡化させた。次いで、ＵＶクロスリンカー（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、長波ＵＶ光（約３６５ｎｍ）をサンプルに３０分間照射した。
【０４０７】
次いで、１０μＬの３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５および２７５μＬのエタノールを添加することにより、ＲＮＡを沈殿させ、１時間かけて−８０℃に冷却し、２０，５００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離した。ＲＮＡペレットを５００μＬの７０％エタノールで洗浄し、５分間風乾し、次いで、１２０μＬの水に再懸濁した。
ＬＣ−ＭＳ分析
【０４０８】
５０μＬのＲＮＡサンプルをＣｌａｒｉｔｙ  ２．６μｍ  Ｏｌｉｇｏ  Ｘ−Ｔ  ｃｏｌｕｍｎ（５０×２．１ｍｍ、６０℃）に注入し、勾配および流量は以下のとおりであった：５分で９５％Ａ／５％Ｂから７５％Ａ／２５％Ｂ、流量：４００μＬ／分；１分で７５％Ａ／２５％Ｂから３０％Ａ／７０％Ｂ、流量：４００μＬ／分；１分で１００％Ｄ、流量：５００μＬ／分；２分で９５％Ａ／５％Ｂ、流量：５００μＬ／分（Ａ：Ｈ２Ｏ中１％ＨＦＩＰＡ（ヘキサフルオロイソプロピルアルコール）、０．１％ＤＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）、１μＭ  ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）；Ｂ：６５／３５  ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ中０．０７５％ＨＦＩＰＡ、０．０３７５％ＤＩＥＡ、１μＭ  ＥＤＴＡ；Ｄ：４０／４０／２０％ＭｅＯＨ／ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ）；ＬＣＭＳ機器はＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＴＱであり、Ｘｃａｌｉｂｅｒと組み合わせたＰｒｏＭａｓｓデコンボリューションソフトウェアをすべてのデータ処理に使用した。
ＡＲＫ−５４７架橋ＲＮＡの次世代シーケンシング分析
架橋ＲＮＡの生成
【０４０９】
バッファー（２０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ８、１００ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中フォールディングＲＮＡ（２．６μＭ）の９．５μＬサンプルを、０．５μＬアリコートのＤＭＳＯ中１ｍＭ  ＡＲＫ−５４７に添加した。反応物を３７℃で１０分間インキュベートし、ＵＶクロスリンカー（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で長波ＵＶ光（約３６５ｎｍ）を３０分間照射し、次いで、氷上で保存した。
リンカーライゲーション
【０４１０】
架橋ＲＮＡのサンプルを２０μＬの最終容量に希釈し、最終反応条件は、１×Ｔ４  ＲＮＡリガーゼバッファー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、５Ｕ／μＬ  Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２短縮型ＫＱ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、１６．５％ＰＥＧ−８０００および０．５μＭユニバーサルｍｉＲＮＡクローニングリンカー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）であった。サーマルサイクラー中、１６℃で５分間および２５℃で３分間のサイクルで反応物を２．５時間インキュベートした。次いで、製造業者の標準プロトコールを使用して、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、ＲＮＡを精製した。２０μＬのヌクレアーゼフリー水でＲＮＡを溶出させた。
逆転写
１０μＬアリコートの溶出ＲＮＡサンプルを１μＬアリコートの２μＭ  ＰＥＡＲＬｖ２＿ＲＴプライマーと混合し、５分間かけて６５℃に加熱し、次いで、氷上で冷却した。２．５×突然変異誘発逆転写バッファー（１２５ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ８、１８７．５ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＤＴＴ、１．２５ｍＭ  ｄＮＴＰ）の８μＬサンプルをサンプルに添加し、それを２分間かけて４２℃に加熱し、続いて、１μＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ酵素（Ｔｈｅｒｍｏ）を添加し、次いで、４２℃で３時間および７０℃で１５分間インキュベートした。
【０４１１】
過剰なプライマーを除去するために、サンプルを４．５μＬのＥｘｏＳＡＰ−ＩＴと混合し、３７℃で１５分間インキュベートし、次いで、１μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８でクエンチした。次いで、２．０８μＬの２．５Ｍ  ＮａＯＨを添加することにより、ＲＮＡを分解させ、９５℃で５分間インキュベートし、３．２５μＬの１０％酢酸でクエンチした。製造業者の標準プロトコールを使用してＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）により、残ったｃＤＮＡを精製し、３０μＬのヌクレアーゼフリー水で溶出させた。２６０ｎｍの吸光度により、濃度を決定した。
第２のアダプターライゲーション
【０４１２】
ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ｓｓＤＮＡリガーゼシステム（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用して、第２のアダプターライゲーションを行った。０．８ｐｍｏｌアリコートの精製ｃＤＮＡを２０μＬの最終容量にし、最終濃度は、８３．５μＭ  ＰＥＡＲＬｖ２＿２ｎｄ＿アダプターオリゴ、１×ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅバッファー、５０μＭ  ＡＴＰ、２．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２および５Ｕ／μＬ酵素であった。反応物を６０℃で２時間、次いで８０℃で１０分間インキュベートした。製造業者の標準プロトコールを使用してＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）により、アダプターライゲーションｃＤＮＡを精製し、３０μＬのヌクレアーゼフリー水で溶出させた。
ポリメラーゼ連鎖反応
【０４１３】
Ｑ５高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してアダプターライゲーションｃＤＮＡをＰＣＲ増幅して、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター配列をインストールした。５μＬアリコートのアダプターライゲーションｃＤＮＡを５０μＬの最終容量にし、最終濃度は、０．２μＭ  ＰＥＡＲＬｖ２＿ｆｏｒ＿ｐｒｉプライマー、０．２μＭ  ＰＥＡＲＬｖ２＿ｒｅｖ＿ｐｒｉプライマーおよび１×Ｑ５  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘであった。９８℃で３０秒間加熱；９８℃で１０秒間、６０℃で３０秒間および７２℃で３０秒間を５サイクル；９８℃で１０秒間および７２℃で３０秒間を１５サイクル；７２℃で２分間により、ポリメラーゼ連鎖反応を行った。フォワードプライマーを介して、異なるＩｌｌｕｍｉｎａバーコードを各ＰＣＲ産物にインストールした。製造業者の標準プロトコールを使用してＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、ＰＣＲ産物を精製し、３０μＬのヌクレアーゼフリー水で溶出させた。
次世代シーケンシング
【０４１４】
Ｄｅｎｏｖｉｘ  ｄｓＤＮＡ蛍光定量キット（Ｄｅｎｏｖｉｘ）を使用して、異なるＰＣＲ産物の濃度を測定し、２０％ＰｈｉＸ  ｓｐｉｋｅ−ｉｎを用いて同じ濃度で多重化した。製造業者の標準プロトコールを使用して、１５０ｂｐペアエンドリードのＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑにより、シーケンシングを実施した。
規定のＲＮＡ混合物からのアプタマー２１の捕捉
架橋ＲＮＡの生成
【０４１５】
フォールディングバッファー（２０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ８、１００ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中各１μＭのＭｙｃ＿ＨＰ＿ＰＡ、アプタマー２１、ＦＭＮ、ＭＹＣ＿３ＷＪ−ＨＰ＿Ｎ３ＧおよびＰｒｅＱ１  ＲＮＡを含有するフォールディングＲＮＡのサンプルを調製した。この溶液の９５μＬサンプルを５μＬアリコートのＤＭＳＯ中０．２ｍＭ  ＡＲＫ−６７０（プローブ）またはＡＲＫ−１３９（対照）に添加した。反応物を３７℃で３０分間インキュベートし、ＵＶクロスリンカー（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で長波ＵＶ光（約３６５ｎｍ）を３０分間照射し、次いで、氷上で冷却した。次いで、製造業者のプロトコールにしたがって、サンプルをＩｌｌｕｓｔｒａ  ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ  Ｇ−２５スピンカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通すことにより、過剰なプローブおよびバッファーを除去した。
アビジンビーズ捕捉
【０４１６】
各処理では、７５μＬアリコートの架橋ＲＮＡを０．７５μＬの１０％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０および０．４５μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８溶液と混合した。５０μＬアリコートのＭｙＯｎｅストレプトアビジンＣ１  Ｄｙｎａｂｅａｄスラリー（Ｔｈｅｒｍｏ）を磁石で捕捉し、５０μＬの１×結合／洗浄バッファー（２０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ７、１００ｍＭ  ＫＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０）で２回洗浄し、次いで、５０μＬの架橋ＲＮＡサンプルに再懸濁した。ビーズ懸濁液を室温で６０分間回転させ、次いで、１００μＬの１×結合／洗浄溶液で２回洗浄した。結合ＲＮＡを溶出させるために、５０μＬの溶出バッファー（９５％ホルムアミド、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ）にビーズを再懸濁し、５分間かけて９５℃に加熱し、次いで、上清を除去した。５０μＬの水、２ｕＬの５ｍｇ／ｍＬグリコーゲン、１０μＬの３Ｍ  ＮａＯＡｃ  ｐＨ５および２５０μＬのエタノールを添加することにより、ＲＮＡをエタノール沈殿させ、−８０℃で１時間インキュベートし、２０，０００ｇで３０分間遠心分離し、ペレットを５００μＬの７０％エタノールで２回洗浄し、ペレットを風乾し、次いで、ペレットを１６μＬのヌクレアーゼフリー水に再懸濁させた。
リンカーライゲーション
【０４１７】
ビーズ溶出ＲＮＡのサンプルを２０μＬの最終容量に希釈し、最終反応条件は、１×Ｔ４  ＲＮＡリガーゼバッファー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、５Ｕ／μＬ  Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２短縮型ＫＱ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、１６．５％ＰＥＧ−８０００および０．５μＭユニバーサルｍｉＲＮＡクローニングリンカー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）であった。サーマルサイクラー中、１６℃で５分間および２５℃で３分間のサイクルで反応物を２．５時間インキュベートした。次いで、製造業者の標準プロトコールを使用して、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、ＲＮＡを精製した。１１μＬのヌクレアーゼフリー水でＲＮＡを溶出させた。
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩによる逆転写
【０４１８】
リンカーライゲーションからの１１μＬのＲＮＡサンプルに、１μＬの２μＭ  ＰＥＡＲＬｖ２＿ＲＴプライマーおよび１μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘを添加した。サンプルを５分間かけて６５℃に加熱し、氷上で１分間冷却した。次いで、サンプルを４μＬの５×ファーストストランドバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ）、１μＬの０．１Ｍ  ＤＴＴ、１μＬのＲＮａｓｅＯＵＴ（Ｔｈｅｒｍｏ）および１μＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ酵素（Ｔｈｅｒｍｏ）と混合した。反応物を５５℃で４５分間、７０℃で１５分間インキュベートし、次いで、４℃に冷却した。
【０４１９】
過剰なプライマーを除去するために、サンプルを４．５μＬのＥｘｏＳＡＰ−ＩＴと混合し、３７℃で１５分間インキュベートし、次いで、１μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８でクエンチした。次いで、２．０８μＬの２．５Ｍ  ＮａＯＨを添加し、９５℃で５分間インキュベートし、３．２５μＬの１０％酢酸でクエンチすることにより、ＲＮＡを分解させた。製造業者の標準プロトコールを使用してＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）により、残ったｃＤＮＡを精製し、１５μＬのヌクレアーゼフリー水で溶出させた。２６０ｎｍの吸光度により、濃度を決定した。
第２のアダプターライゲーション
【０４２０】
ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ｓｓＤＮＡリガーゼシステム（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用して、第２のアダプターライゲーションを行った。０．８ｐｍｏｌアリコートの精製ｃＤＮＡを２０μＬの最終容量にし、最終濃度は、８３．５μＭ  ＰＥＡＲＬｖ２＿２ｎｄ＿アダプターオリゴ、１×ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅバッファー、５０μＭ  ＡＴＰ、２．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２および５Ｕ／μＬ酵素であった。反応物を６０℃で２時間、次いで８０℃で１０分間インキュベートした。製造業者の標準プロトコールを使用してＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）により、アダプターライゲーションｃＤＮＡを精製し、３０μＬのヌクレアーゼフリー水で溶出させた。
ポリメラーゼ連鎖反応
【０４２１】
Ｑ５高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してアダプターライゲーションｃＤＮＡをＰＣＲ増幅して、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター配列をインストールした。５μＬアリコートのアダプターライゲーションｃＤＮＡを５０μＬの最終容量にし、最終濃度は、０．２μＭ  ＰＥＡＲＬｖ２＿ｆｏｒ＿ｐｒｉプライマー、０．２μＭ  ＰＥＡＲＬｖ２＿ｒｅｖ＿ｐｒｉプライマーおよび１×Ｑ５  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘであった。９８℃で３０秒間加熱；９８℃で１０秒間、６０℃で３０秒間および７２℃で３０秒間を５サイクル；９８℃で１０秒間および７２℃で３０秒間を１５サイクル；７２℃で２分間により、ポリメラーゼ連鎖反応を行った。フォワードプライマーを介して、異なるＩｌｌｕｍｉｎａバーコードを各ＰＣＲ産物にインストールした。製造業者の標準プロトコールを使用してＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、ＰＣＲ産物を精製し、３０μＬのヌクレアーゼフリー水で溶出させた。
次世代シーケンシング
【０４２２】
Ｄｅｎｏｖｉｘ  ｄｓＤＮＡ蛍光定量キット（Ｄｅｎｏｖｉｘ）を使用して、異なるＰＣＲ産物の濃度を測定し、２０％ＰｈｉＸ  ｓｐｉｋｅ−ｉｎを用いて同じ濃度で多重化した。製造業者の標準プロトコールを使用して、１５０ｂｐペアエンドリードのＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑにより、シーケンシングを実施した。
クリックビオチン化プローブによるアプタマー２１の捕捉
架橋およびクリックビオチン化ＲＮＡの生成
【０４２３】
フォールディングバッファー（２０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ８、１００ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中１μＭフォールディングアプタマー２１またはアプタマー２１−Ｅ溶液の５０μＬサンプルを０．５μＬアリコートのＤＭＳＯ中０．５ｍＭ  ＡＲＫ−７２９、ＡＲＫ−２０５８、ＡＲＫ−８１６もしくはＡＲＫ−２０５９またはＤＭＳＯのみ対照に添加した。溶液を３７℃で１時間インキュベートし、次いで、ＵＶクロスリンカー（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で長波ＵＶ光（約３６５ｎｍ）を３０分間照射した。この溶液に、０．５μＬの１０ｍＭ  ＤＢＣＯ−ビオチン（Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｏｏｌｓ，ｃａｔ．＃  Ａ１０５）および２μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８を添加し、溶液を６５℃で２時間インキュベートした。３５μＬの水、２ｕＬの５ｍｇ／ｍＬグリコーゲン、１０μＬの３Ｍ  ＮａＯＡｃ  ｐＨ５および２５０μＬのエタノールを添加することにより、ＲＮＡをエタノール沈殿させ、−８０℃で１時間インキュベートし、２００００×ｇで３０分間遠心分離し、ペレットを５００μＬの７０％エタノールで２回洗浄し、次いで、ペレットを風乾した。
ストレプトアビジンビーズ捕捉
【０４２４】
ＲＮＡペレットを５０μＬの１×結合／洗浄バッファー（２０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ７、１００ｍＭ  ＫＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０）に再溶解した。５０μＬアリコートのＭｙＯｎｅストレプトアビジンＣ１  Ｄｙｎａｂｅａｄスラリー（Ｔｈｅｒｍｏ）を磁石で捕捉し、５０μＬの１×結合／洗浄バッファーで２回洗浄し、次いで、５０μＬの架橋ＲＮＡサンプルに再懸濁した。ビーズ懸濁液を室温で３０分間回転させ、次いで、１００μＬの１×結合／洗浄溶液で２回洗浄した。
オンビーズ脱リン酸化
【０４２５】
ＲＮＡを捕捉した磁気ビーズを、１×ＦａｓｔＡＰバッファーおよび０．０８Ｕ／μＬ  ＦａｓｔＡＰ酵素（Ｔｈｅｒｍｏ）を含有する５０μＬの溶液に再懸濁し、１２００ｒｐｍで撹拌しながらスラリーを３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、１×ＰＮＫバッファー、１ｍＭ  ＤＴＴおよび０．２５Ｕ／μＬ  Ｔ４  ＰＮＫ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）の１５０μＬの溶液を混合物に添加し、１２００ｒｐｍで撹拌しながらスラリーを３７℃で２０分間インキュベートした。次いで、ビーズを４００μＬの１×結合／洗浄溶液で３回洗浄した。
第１のリンカーライゲーション
【０４２６】
ビーズを４００μＬのリンカー洗浄バッファー（５０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ８、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）で２回洗浄し、次いで、２μＭのＰＥＡＲＬｖ３＿１ｓｔ＿リンカーオリゴ、１×ＲＮＡリガーゼ１バッファー、１ｍＭ  ＡＴＰ、２．９％ＤＭＳＯ、１６％ＰＥＧ８０００および２．７Ｕ／μＬ  ＲＮＡリガーゼ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，ｃａｔ  ＃  Ｍ０４３７）を含有する２７．５μＬのライゲーション反応混合物に再懸濁した。１２００ｒｐｍで撹拌しながらスラリーを２２℃で７５分間インキュベートし、次いで、ビーズを１００μＬの１×結合／洗浄バッファーで２回洗浄した。
逆転写
【０４２７】
ビーズを２００μＬの１×ファーストストランドバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ）で２回洗浄し、次いで、１４．７５μＬの水、１．２５μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰおよび０．２５μＬの１０μＭ  ＰＥＡＲＬｖ３＿ＲＴオリゴを含有する溶液に再懸濁した。スラリーを５分間かけて６５℃に加熱し、氷上で冷却し、次いで、５μＬの５×ファーストストランドバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ）、１．２５μＬの１００ｍＭ  ＤＴＴ、１．２５μＬのＲＮａｓｅＯＵＴ（Ｔｈｅｒｍｏ）および１．２５μＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ）を含有する溶液を添加した。スラリーを混合し、５０℃で５０分間インキュベートし、５分間かけて８５℃に加熱し、次いで、氷上で冷却した。
【０４２８】
ｃＤＮＡを溶出させるために、２．５μＬの２．５Ｍ水酸化ナトリウムをスラリーに添加し、それを５分間かけて９５℃に加熱し、氷上で冷却し、次いで、３．６μＬの１．７４Ｍ酢酸溶液を添加して、ｐＨをクエンチした。上清をビーズから除去し、ヌクレアーゼフリー水で最終容量を５０μＬにし、次いで、製造業者の標準プロトコールを使用してＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して精製し、１５μＬのヌクレアーゼフリー水で溶出させた。
第２のアダプターライゲーション
【０４２９】
１４μＬアリコートのＡＭＰｕｒｅ溶出ｃＤＮＡを、１×ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅバッファー、８０ｎＭ  ＰＥＡＲＬｖ３＿２ｎｄ＿アダプターオリゴ、５０μＭ  ＡＴＰ、２．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２および５Ｕ／μＬ  ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ｓｓＤＮＡリガーゼ（ＥｐｉＣｅｎｔｒｅ）の最終濃度を有する２０μＬの反応混合物にし、６０℃で２時間、次いで８０℃で１０分間インキュベートした。製造業者の標準プロトコールを使用してＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、ライゲーションｃＤＮＡを精製し、２５μＬのヌクレアーゼフリー水で溶出させた。
ポリメラーゼ連鎖反応
【０４３０】
Ｑ５高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してアダプターライゲーションｃＤＮＡをＰＣＲ増幅して、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター配列をインストールした。５μＬアリコートのアダプターライゲーションｃＤＮＡを５０μＬの最終容量にし、最終濃度は、０．２μＭ  ＰＥＡＲＬｖ３＿ｆｏｒ＿ｐｒｉプライマー、０．２μＭ  ＰＥＡＲＬｖ３＿ｒｅｖ＿ｐｒｉプライマーおよび１×Ｑ５  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘであった。９８℃で３０秒間加熱；９８℃で１０秒間、６０℃で３０秒間および７２℃で３０秒間を５サイクル；９８℃で１０秒間および７２℃で３０秒間を１５サイクル；７２℃で２分間により、ポリメラーゼ連鎖反応を行った。フォワードプライマーを介して、異なるＩｌｌｕｍｉｎａバーコードを各ＰＣＲ産物にインストールした。製造業者の標準プロトコールを使用してＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、ＰＣＲ産物を精製し、３０μＬのヌクレアーゼフリー水で溶出させた。
次世代シーケンシング
【０４３１】
Ｄｅｎｏｖｉｘ  ｄｓＤＮＡ蛍光定量キット（Ｄｅｎｏｖｉｘ）を使用して、異なるＰＣＲ産物の濃度を測定し、２０％ＰｈｉＸ  ｓｐｉｋｅ−ｉｎを用いて同じ濃度で多重化した。製造業者の標準プロトコールを使用して、１５０ｂｐペアエンドリードのＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑにより、シーケンシングを実施した。
ポリＡ＋ＲＮＡ抽出物からのアプタマー２１の捕捉
細胞からのポリＡ＋ＲＮＡの単離
【０４３２】
製造業者の標準プロトコールにしたがってＲｅｌｉａＰｒｅｐ  ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、５ｘ１０６個のＨｅｐＧ２細胞のペレットから全ＲＮＡを抽出した。４５０μＬの溶解バッファーおよび１００μＬのビーズを使用して、製造業者の標準プロトコールにしたがって磁気ｍＲＮＡ分離キット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，ｃａｔ  ＃  Ｓ１５５０）を使用して、４５４ｎｇ／μＬ全ＲＮＡの５０μＬサンプルからポリＡ＋ＲＮＡ画分を単離した。
架橋およびクリックビオチン化ＲＮＡの生成
【０４３３】
フォールディングアプタマー２１  ＲＮＡのサンプルを、１ｎＭアプタマー２１および３ｎｇ／μＬポリＡ＋ＲＮＡの最終濃度で、ポリＡ＋ＲＮＡ抽出物のサンプルにスパイクした。次いで、このＲＮＡ混合物の５０μＬサンプルを０．５μＬアリコートのＤＭＳＯ中１００μＭ  ＡＲＫ−８１６もしくはＡＲＫ−２０５９またはＤＭＳＯ対照に添加し、混合物を３７℃で２０分間インキュベートした。次いで、溶液を５０μＬの１×フォールディングバッファーで希釈し、次いで、ＵＶクロスリンカー（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で長波ＵＶ光（約３６５ｎｍ）を３０分間照射した。この溶液に、１μＬの５ｍＭ  ＤＢＣＯ−ビオチン（Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｏｏｌｓ，ｃａｔ．＃  Ａ１０５）および１μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８を添加し、次いで、溶液を６５℃で２時間インキュベートした。３５μＬの水、２ｕＬの５ｍｇ／ｍＬグリコーゲン、１０μＬの３Ｍ  ＮａＯＡｃ  ｐＨ５および２５０μＬのエタノールを添加することにより、ＲＮＡをエタノール沈殿させ、−８０℃で１時間インキュベートし、２０，０００ｇで３０分間遠心分離し、ペレットを５００μＬの７０％エタノールで２回洗浄し、次いで、ペレットを風乾させた。
断片ＲＮＡ
【０４３４】
Ａｍｂｉｏｎ断片化キット（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して、ＲＮＡサンプルを断片化した。ＲＮＡペレットを５０μＬの１×断片化バッファーに再懸濁し、７０℃で１５分間インキュベートし、次いで、５μＬの停止液の添加によりクエンチした。次いで、５０μＬの水、１０μＬの３Ｍ  ＮａＯＡｃ  ｐＨ５、２μＬの５ｍｇ／ｍＬグリコーゲンおよび２８０μＬのエタノールを添加することにより、サンプルをエタノール沈殿させ、−８０℃で１時間インキュベートし、２０，０００ｇで３０分間遠心分離し、ペレットを５００μＬの７０％エタノールで２回洗浄し、次いで、ペレットを風乾させた。
アビジンビーズ濃縮およびシーケンシングライブラリー調製
【０４３５】
上記「クリックビオチン化プローブによるアプタマー２１の捕捉」セクションにしたがって、アビジンビーズ捕捉、脱リン酸化、第１のリンカーライゲーション、逆転写、第２のアダプターライゲーションおよびポリメラーゼ連鎖反応を実施した。
シーケンシングライブラリーのサイズ選択
【０４３６】
プライマーダイマーを除去し、シーケンシングライブラリーをサイズ選択するために、１×ＳＹＢＲ−ｇｏｌｄを含む３％アガロースゲル上でＰＣＲ産物を泳動させた。２７５〜４００ｂｐの領域を切り取り、製造業者の推奨プロトコールにしたがってＺｙｍｏｃｌｅａｎ  Ｇｅｌ  ＤＮＡ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用してＤＮＡを抽出し、１２μＬのヌクレアーゼフリー水に溶出させた。
次世代シーケンシング
【０４３７】
製造業者の標準プロトコールを使用して、１５０ｂｐペアエンドリードのシングルＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ４０００レーンにより、シーケンシングを実施した。
ＰＥＡＲＬ−ｓｅｑインフォマティクス
ゲノム参照
【０４３８】
すべての分析は、ＧＲＣｈ３８ヒトゲノムアセンブリおよびアプタマー２１を付加したＧＥＮＣＯＤＥリリース２８転写産物アノテーション（ＡＧＧＧＧＴＡＧＧＣＣＡＧＧＣＡＧＣＣＡＡＣＴＡＧＣＧＡＧＡＧＣＴＴＡＡＡＴＣＴＣＴＧＡＧＣＣＣＧＡＧＡＧＧＧＴＴＣＡＧＴＧＣＴＧＣＴＴＡＴＧＴＧＧＡＣＧＧＣＴＴＧＡＴ；配列番号２５）を基準とした。
リードステッチング
【０４３９】
高品質で一致したリードペアのみを使用して突然変異および逆転写酵素ストールを定義することを保証するために、最初に、少なくとも１０ヌクレオチド（ｎｔ）の最小アセンブル長を必要とするＰａｉｒｅｄ−Ｅｎｄ  ｒｅＡｄ  ｍｅｒｇｅＲ（ＰＥＡＲ）（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３％２Ｆｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ％２Ｆｂｔｔ５９３）を用いて、リードをステッチした。
単一転写産物リードアライメント（ＳＨＡＰＥｗａｒｅ）
【０４４０】
すべてのＳＨＡＰＥｗａｒｅ分析では、以前に記載されているように（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｉｔｂｕｃｋｅｔ．ｏｒｇ／ａｒｒａｋｉｓｔｘ／ｓｈａｐｅｗａｒｅ／ｓｒｃ）、それぞれＴｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ（ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｕ１７０）およびｂｗａ−ｍｅｍ（ｈｔｔｐｓ：／／ａｒｘｉｖ．ｏｒｇ／ａｂｓ／１３０３．３９９７）を使用して、リードをアダプタートリミングしてアライメントした。
ＳＨＡＰＥ反応性計算（ＳＨＡＰＥｗａｒｅ）
【０４４１】
ｂａｍ−ｒｅａｄｃｏｕｎｔ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｇｅｎｏｍｅ／ｂａｍ−ｒｅａｄｃｏｕｎｔ）を使用して、突然変異（置換、挿入および欠失）を表にした。次いで、所定の転写産物位置に明確に関連付けられ得るもののみを保持するように、突然変異をフィルタリングした（不明瞭な突然変異は、複数の位置から生じ得る）。未処理サンプルと比較したＳＨＡＰＥ試薬処理サンプル中の過剰な突然変異に基づいてＳＨＡＰＥ反応性を定義し、アンフォールディング対照に対して正規化した。
【数１】
2021505132.tif 000105
次いで、Ｄｅｉｇａｎら、（ＰＮＡＳ  Ｊａｎｕａｒｙ  ６，２００９，１０６（１）９７−１０２）に記載されているように、各転写産物内で反応性をさらに正規化した。
トランスクリプトームワイドリードアライメント（ＰＥＡＲＬ−ｓｅｑ）
【０４４２】
次いで、少なくとも５ｎｔのオーバーラップおよび最大２０％のミスマッチでＣｕｔａｄａｐｔ（ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１４８０６／ｅｊ．１７．１．２００）を用いて、ステッチリードを処理し、同時に、１）正しいアダプターコンテキスト（ＡＴＡＴＡＧＧＮ６ＡＧＡＴＣＧＧ）（配列番号３５）中のユニークな６ｎｔユニーク分子識別子（ＵＭＩ）を定義し、２）アダプターをトリミングして、断片末端のより正確な定義を可能にした。ＵＭＩにリード名を追加し、多くとも１０％のミスマッチでＳＴＡＲ  ａｌｉｇｎｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｓ６３５）を使用して、ゲノムおよびトランスクリプトーム参照（＋アプタマー２１）に対してリードをマッピングした。次いで、デフォルトパラメータでＵＭＩツール（ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／ｇｒ．２０９６０１．１１６）のＤｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  Ａｄｊａｃｅｎｃｙ法を使用して、同一またはほぼ同一のＵＭＩを有するリードのグループを除いた。その結果、データからＰＣＲ重複が削除されて、バイアスまたは分散を導入し得る可能性があるアーチファクトが回避された。
ＲＴ失速部位の定義
【０４４３】
逆転写酵素（ＲＴ）失速部位により、プローブと転写産物との間の相互作用の部位を定義した。トリミングリードの５’末端のマッピング位置に基づいて、ＲＴ失速部位を定義した。アプタマー２１などの短い規定の転写産物では、正確な転写産物末端にマッピングした３’末端を有するリードから、高信頼性ＲＴ失速部位を定義した。アプタマー２１における各位置について、高信頼性失速部位の頻度をプロットする。
ピークコーリング（ＰＥＡＲＬ−ｓｅｑ）
【０４４４】
弾頭のみ対照と比較した、ＰＥＡＲＬ−ｓｅｑプローブにおける失速部位の有意な濃縮に基づいて、小分子−転写産物相互作用の真の部位を定義した。ＲＴ失速部位の単一ヌクレオチド分解能に基づいて、これらのピークは非常に狭いと予想される。したがって、本発明者らは、これらの狭いピークを検出し、弾頭のみ対照と比較した場合にプローブ中のＲＴ部位が濃縮された部位を特定するために最適化されたピークコーリング法を開発した。簡潔に言えば、ユニークにマッピングしたリードを、それらの最も５’側のヌクレオチドのみを保持するようにトリミングした。次いで、カスタムスクリプトと組み合わせてＤｅｅｐｔｏｏｌｓ（ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｗ２５７）を使用して、ゲノム全体にわたって１０ｎｔビンで、これらの５末端をカウントした。ベンジャミニ・ホッホバーグ多重仮説修正を使用するＥｍｐｉｒｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｄａｔａ  ｉｎ  Ｒ（ｅｄｇｅＲ）パイプライン（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／ｄｏｉ：１０．１８１２９／Ｂ９．ｂｉｏｃ．ｅｄｇｅＲ）を用いて、有意な濃縮について、検出可能なリード５’末端を有する各ビンを試験した。対照に対するプローブのポジティブ濃縮およびＦＤＲ＜０．０１の両方を有するピークは、プローブ−転写産物相互作用に対応するプローブ誘導性ＲＴ失速事象を含有するとみなした。
実施例７：アプタマー２１の表面プラズモン共鳴アッセイ
【０４４５】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、目的の標的ＲＮＡへの結合について、リガンドならびにフックおよびクリック構築物をスクリーニングし得る。ＳＰＲは、生体分子の相互作用をリアルタイムにモニタリングするために特に有用である。典型的には、標的種および無関係な対照をセンサーチップ上に固定化し、次いで、分析物（化合物／断片）を表面に流す。標的種への化合物の結合は、ＳＰＲシグナルの増加をもたらす（会合段階）。結合した化合物をバッファーで洗い流すことにより、ＳＰＲシグナルが減少する（解離段階）。異なる化合物濃度で記録されたセンサーグラムのフィッティングを、適切な相互作用モデルに対して実施する。前記方法は、動態パラメータの抽出を可能にする（ｋａ、ｋｄ→ＫＤ）。要件／制限としては、ｋａ／ｋｄ値が妥当な範囲内であり、標的サイズが過度に大きくないこと（＜１００ｋＤａ）が挙げられる。それは、断片をスクリーニングし、ヒットをプロファイリングまたは検証するための優れた方法である。ＢＣ４０００は、一次スクリーニングに使用され得る（最大４，０００個のデータポイント／週）。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００は、ヒットのプロファイリングおよび検証に適切である。
【０４４６】
コデイン結合のアプタマー進化が達成され、ＳＰＲの使用により、アプタマーの結合定数が決定された。Ｗｉｎ，Ｎ．Ｍら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００６，３４（１９），５６７０−５６８２。例えば、Ｃｈａｎｇ，Ａ．Ｌら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０１４，８６，３２７３−３２７８を参照のこと。
【０４４７】
ＰＥＡＲＬ−ｓｅｑの状況では、ＳＰＲは、ＤＮＡ／ＲＮＡアプタマーへの「フック」の結合のモニタリングを可能にする。標的種をセンサーチップ上に固定化し、分析物（すなわち、フック）を表面上に流し（会合段階）、ＤＮＡ／ＲＮＡアプタマーを表面上に流し（プラトー段階）、競合化合物を表面上で洗浄して（解離段階）、結合データを得る。
センサーチップ表面の調製
【０４４８】
ＭＡＳＳ−２（Ｓｉｅｒｒａ  Ｓｅｎｓｏｒｓ）により、実験を２５℃で実施した。高容量アミンチップをＰＢＳで平衡化した。１Ｍ  ＮａＣｌ中１０ｍＭ  ＨＣｌおよび１０ｍＭ  ＮａＯＨの交互注入により、チップを調整した。１：１の体積比の０．４Ｍ  １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（Ｓｉｅｒｒａ）および０．１Ｍ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｓｉｅｒｒａ）を使用して、１０μＬ／分の流量で、アミンチップの表面のカルボキシメチル化デキストランを７分間活性化した。ニュートラアビジン（７０μｇ／ｍＬ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を、１０μｌ／分の流量で活性化表面に１０分間注入した。１ＭエタノールアミンｐＨ８．５（Ｓｉｅｒｒａ）を１０μｌ／分の流量で７分間注入することにより、過剰な活性化基をブロッキングした。１０μｌ／分による７分間にわたる１Ｍ  ＮａＣｌ中１０ｍＭ  ＮａＯＨの最終注入を使用して、チップへの未結合物質を除去した。固定化反応は、典型的には、約１２，０００共鳴単位（ＲＵ）のニュートラアビジンをもたらした。チャネル内の少なくとも１つのスポットにはＲＮＡを注入せず、バックグラウンド対照として使用した。バックグラウンド対照として無関係なＲＮＡも使用した。
ＲＮＡの調製
【０４４９】
ＲＮＡｓｅフリー水中でビオチン−アプタマー２１の１μＭサンプルを調製し、３分間かけて９５℃に加熱し、氷上で４分間冷却し、等容量の２×フォールディングバッファー（４０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００ｍＭ  ＫＣｌ）で希釈し、３７℃で３０分間インキュベートした。ＲＮＡの最終濃度は０．５μＭであった。
ＲＮＡ表面捕捉
【０４５０】
２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＫＣｌ（Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｂｕｆｆｅｒ）でＭＡＳＳ−２を２回プライミングした。ＲＮＡをニュートラアビジン表面に１０μｌ／分の流量で７分間注入した。捕捉レベルは、典型的には、約３５００〜４５００共鳴単位のアプタマー２１に達した。
化合物試験
【０４５１】
５００μＭの開始濃度で、化合物を１００％ＤＭＳＯで２倍希釈した。１：１００の化合物対バッファーの希釈は、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１％ＤＭＳＯ中化合物溶液をもたらした。
【０４５２】
２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１％ＤＭＳＯ（ランニングバッファー）でＭＡＳＳ−２を２回プライミングした。化合物を試験する前に、ランニングバッファーの３回注入を使用して、センサー表面を平衡化した。０．６％〜１．８％ＤＭＳＯの範囲のＤＭＳＯ補正溶液を３０μｌ／分の流量で表面に３０μｌ注入して、データ分析のためのＤＭＳＯ補正曲線を作成した。２４０秒の解離時間で、化合物（１２０μＬ）を１０μｌ／分の流量でＲＮＡ表面に注入した。
データ分析
【０４５３】
Ｓｉｅｒｒａ分析ソフトウェア（Ｓｉｅｒｒａ  Ｓｅｎｓｏｒｓ）を使用して、データ処理および分析を行った。二重参照法を実施してすべてのデータセットを処理し、ＤＭＳＯ補正曲線を適用して、サンプルとランニングバッファーとの間のバルク屈折率変化の差異を説明した。動態分析のために、１：１結合モデルに対して二重参照データをフィッティングした。これらの条件下では、計算ＫＤは約０．８ｎＭであった。
実施例８：ＰｒｅＱ１ＲＮＡ光プローブの調製
【化８０】
2021505132.tif 000106
【０４５４】
ＰｒｅＱ１リボスイッチの使用およびそのための小分子リガンドの調製は、Ｒｏｔｈ，Ａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００７，１４（４），３０８−３１７（これは、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０４５５】
化合物２４：２３（５００ｍｇ、１．１９ｍｍｏｌ、１当量）およびｔｅｒｔ−ブチル（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）カルバメート（３５４ｍｇ、１．４３ｍｍｏｌ、１．２当量）を含むメタノール（１４．０ｍＬ）の懸濁液に、硫酸ナトリウム（１４ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ、０．０８当量）を室温で添加した。得られた懸濁液を室温で２時間撹拌した。次いで、水素化ホウ素ナトリウム（１３５ｍｇ、３．５７ｍｍｏｌ、３．０当量）を反応混合物に少しずつ添加し、次いで、室温による撹拌をさらに４時間維持した。反応混合物を酢酸エチル（２５０ｍＬ）で希釈し、次いで、５０ｍＬ部分の水（３回）および飽和ＮａＣｌ溶液で順次洗浄した。生成物溶液をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濾液を減圧下で濃縮した。得られた粗物質を、Ｃ１８シリカゲルを使用する逆相クロマトグラフィー（水中１０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３中４２〜４５％ＣＨ３ＣＮ）により精製して、２４を灰白色の固体（３０２ｍｇ、収率３９％）として得た。
1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6,  δ):  10.61  (s,  1  H),  10.32  (br  s,1  H),  7.38  (s,  1  H),  7.31  -  7.28  (m,  12  H),  7.24  -  7.19  (m,  3  H),  6.82  (t,  J  =  5.6  Hz,  1  H),  6.31  (d,  J  =  2  Hz,  1  H),  3.56  (s,  2  H),  3.46  -  3.35  (m,  11  H),  3.08  -  3.03  (m,  2  H),  1.36  (s,  9  H).
ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：Ｃ３７Ｈ４４Ｎ６Ｏ５［ＭＨ］＋のｍ／ｚ計算値６５３．３４；実測値６５３．１４．
【化８１】
2021505132.tif 000107
【０４５６】
化合物２５（Ｉ−２３）：２４（２１ｍｇ、３２μｍｏｌ、１当量）を含むＣＨ３ＯＨ（１．０ｍＬ）の撹拌溶液を、室温で、ＨＣｌの１．２５Ｍ  ＣＨ３ＯＨ溶液（５８３μＬ、０．７３ｍｍｏｌ、２３当量）の滴下により処理した。得られた混合物を室温で２４時間撹拌し、次いで、沈殿した固体を濾過により収集した。得られた粗固体を、１０ｍＬ部分のペンタン（２回）およびジエチルエーテル（２回）で順次トリチュレートして、中間体第１級アミンを白色の固体として得た。第１級アミン（１０ｍｇ、３２μｍｏｌ、１当量）をＤＭＦ（１．０ｍＬ）に再懸濁し、次いで、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２２μＬ、０．１３ｍｍｏｌ、４．０当量）および２，５−ジオキソピロリジン−１−イル３−（３−メチル−３Ｈ−ジアジリン−３−イル）プロパノエート（７．６ｍｇ、３４μｍｏｌ、１．０５当量）で処理した。得られた混合物を室温で１６時間維持し、次いで、Ｃ１８シリカゲルカラムに直ぐにロードし、０．１％ギ酸を含有する水中０〜７０％ＣＨ３ＣＮで溶出させた。所望の生成物を含有する画分を合わせ、減圧下で部分的に蒸発させてＣＨ３ＣＮを除去し、次いで、凍結し、凍結乾燥させて、所望の生成物Ｉ−２３を白色の固体（ギ酸塩、９ｍｇ、収率６０％）として得た。
実施例９：さらなる例示的な光プローブ化合物の合成
【化８２】
2021505132.tif 000108
【０４５７】
化合物２６：３−アミノ−４−メチル安息香酸（４．００ｇ、２６．５ｍｍｏｌ、１当量）を含む酢酸（８０ｍＬ）の溶液に、２，６−ジフルオロ−３−ヒドロキシベンズアルデヒド（５．０１ｇ、３１．７ｍｍｏｌ、１．２当量）を０℃で添加した。反応物を室温にゆっくりと温め、室温で３時間撹拌した。反応混合物を０℃に再び冷却した。ＮａＣＮＢＨ３（３．３２ｇ、５２．９ｍｍｏｌ、２．０当量）を少しずつ添加した。反応混合物を室温に温め、次いで、室温で１６時間撹拌した。得られた反応混合物を氷冷水（５００ｍＬ）に注いだ。生じた沈殿物を濾過により収集し、水（３×２５ｍＬ）で洗浄した。得られた固体を高真空下で乾燥させて、２６を白色の固体として得た（６．００ｇ、収率６２％）。
1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ  12.48  (br  s,  1H),  9.74  (s,  1  H),  7.22  (d,  J  =  1.2  Hz,  1  H),  7.13  (dd,  J  =  7.6,  1.6  Hz,  1  H),  7.05  (d,  J  =  8.0  Hz,  1  H),  6.86  -  6.83  (m,  2H),  5.38  (t,  J  =  5.6  Hz,  1  H),  4.36  (d,  J  =  5.2  Hz,  2  H),  2.11  (s,  3H).
ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：Ｃ１５Ｈ１３Ｆ２ＮＯ３＋のｍ／ｚ計算値＝２９４．０９、実測値２９４．１６．
【化８３】
2021505132.tif 000109
【０４５８】
化合物２７：一般手順Ａにしたがって、２６（２．００ｇ、６．８２ｍｍｏｌ）およびメチル（Ｓ）−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシレートヒドロクロリドを含むＤＭＦ（２０ｍＬ）から室温で化合物２７を合成した。室温で３時間撹拌した後、反応混合物を水で希釈し、生じた固体を濾過により収集した。粗生成物を、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィー（４０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して、２７を紅梅色の固体（１．６０ｇ、収率３４％）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：Ｃ２６Ｈ２４Ｆ２Ｎ２Ｏ４＋のｍ／ｚ計算値＝４６７．１７、実測値４６７．２２．
【化８４】
2021505132.tif 000110
【０４５９】
化合物２８：２７（１．６０ｇ、３．９３ｍｍｏｌ、１当量）を含むＴＨＦ：ＭｅＯＨ：水（４：２：１、１１．２ｍＬ）の撹拌溶液に、ＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ（０．４３ｇ、１０．３ｍｍｏｌ、３．０当量）を室温で添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、次いで、真空下で蒸発させた。得られた粗製物を水で希釈し、ジエチルエーテルで洗浄した。水層を分離し、１Ｎ  ＨＣｌを使用して酸性化し、酢酸エチル（４×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をブライン溶液（１５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。得られた粗製物をシリカゲルでのカラムクロマトグラフィー（７％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）により精製して、２８を灰白色の固体（１．５５ｇ、収率１００％）として得た。
1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ  12.79 (br  s,  1  H),  9.76 (s,  1  H), 7.26  -  7.13  (m,  3  H), 7.07 -  7.03  (m, 1 H),  6.96 - 6.78 (m,  3  H),  6.63 (d, J = 8.8 Hz,  1  H), 6.58 - 6.52 (m, 1 H), 5.39  -  5.38 (m,  1  H), 5.13  -  4.42  (m,  3  H),  4.32 - 4.30 (m,  2  H), 3.18 - 3.11 (m,  2  H), 2.10 (d, J = 8.4 Hz, 3 H).
ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：Ｃ２５Ｈ２２Ｆ２Ｎ２Ｏ４＋のｍ／ｚ計算値＝４５３．１６、実測値４５３．２７．
【化８５】
2021505132.tif 000111
【０４６０】
化合物２９：一般手順Ａにしたがって、２６（１００ｍｇ、３５１μｍｏｌ）および（Ｓ）−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキサミドを含むＤＭＦ（２ｍＬ）から室温で化合物２９（ＡＲＫ−８５２）を合成した。得られた暗色の混合物を室温で６０分間撹拌し、次いで、Ｃ１８シリカゲルでの逆相フラッシュカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸を含有する水中０〜１００％アセトニトリルで溶出させるＣ１８−シリカゲル）により精製して、２９を灰白色の固体（ギ酸塩、２１ｍｇ、収率１２％）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｔＲ＝１．５４分；Ｃ３０Ｈ２７Ｆ２Ｎ３Ｏ３＋のｍ／ｚ計算値＝４９８．１、実測値５２０．１（［Ｍ＋Ｎａ］＋）．
【化８６】
2021505132.tif 000112
【０４６１】
化合物３０：一般手順Ａにしたがって、２６（３．００ｇ、１０．２ｍｍｏｌ）および（Ｓ）−４−フェニルフェニルアラニンメチルエステルヒドロクロリドから化合物３０を調製した。室温で４時間撹拌した後、反応混合物を氷冷水（２５０ｍＬ）に注いだ。生じた固体を濾過により収集し、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィー（３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して、３０を白色の固体（４．２０ｇ、収率７７％）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：Ｃ３１Ｈ２８Ｆ２Ｎ２Ｏ４＋のｍ／ｚ計算値＝５３１．０４、実測値５３１．２７．
【化８７】
2021505132.tif 000113
【０４６２】
化合物３１：上記２８と同様に、３０（４．２０ｇ、７．９１ｍｍｏｌ）から化合物３１を調製した。粗生成物を、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中７％ＭｅＯＨ）により精製して、３１を白色の固体（１．７０ｇ、収率４２％）として得た。
1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ  12.77  (br  s,  1  H),  9.76  (s,  1  H),  8.42  (s,  1  H),  7.60  -  7.54  (m,  4  H),  7.40-  7.33  (m,  5  H),  7.08  -  7.01  (m,  3  H),  6.86  -  6.84  (m,  2  H),  5.21  -  5.19  (m,  1  H),  4.56  (s,  1  H),  4.33  (s,  2  H),  3.18  -  3.10  (m,  2  H),  2.07  (s,  3  H).
ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：Ｃ３０Ｈ２６Ｆ２Ｎ２Ｏ４＋のｍ／ｚ計算値５１７．１９、実測値５１７．０７．
【化８８】
2021505132.tif 000114
【０４６３】
化合物３２：一般手順Ａにしたがって、２６（１００ｍｇ、３５１μｍｏｌ）および（Ｓ）−４−フェニルフェニルアラニンアミドを含むＤＭＦ（２ｍＬ）から室温で化合物３２（ＡＲＫ−８５０）を合成した。得られた暗色の混合物を室温で３０分間撹拌し、次いで、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（３０ｍＬ）と酢酸エチル（３０ｍＬ）との間で分配した。水相を３０ｍＬのＥｔＯＡｃで抽出し、次いで、合わせた抽出物を３０ｍＬの水および３０ｍＬの飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄した。生成物溶液をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮して、粗生成物を褐色の油状物質として得た。粗生成物を、Ｃ１８シリカゲルでの逆相フラッシュカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸を含有する水中０〜１００％ＣＨ３ＣＮ）により精製した。３２を含有する画分を合わせ、部分的に蒸発させてＣＨ３ＣＮを除去し、次いで、得られた懸濁液を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（３０ｍＬ）とＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）との間で分配した。水相を３０ｍＬのＥｔＯＡｃで抽出し、次いで、合わせた抽出物を３０ｍＬの水および３０ｍＬの飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄した。生成物溶液をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮して、３２を灰白色の泡状物質（６２ｍｇ、収率４０％）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｔＲ＝１．６７分；Ｃ３０Ｈ２７Ｆ２Ｎ３Ｏ３＋のｍ／ｚ計算値＝５１６．１、実測値４９９．１（［Ｍ＋Ｈ−ＮＨ３］＋．
【化８９】
2021505132.tif 000115
【０４６４】
化合物３３：一般手順Ａにしたがって、２８（３０ｍｇ、６６μｍｏｌ）およびＮＨ２−ＰＥＧ１−ＣＯ２ｔＢｕから化合物３３を合成した。反応混合物を室温で１時間撹拌し、次いで、カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸を含有する水中０〜１００％ＣＨ３ＣＮで溶出させるＣ１８シリカゲル）により精製して、３３を無色の膜状物質（４０ｍｇ、収率９８％）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：Ｃ３４Ｈ４０Ｆ２Ｎ３Ｏ６＋のｍ／ｚ計算値＝６２４．３、実測値６２４．３．
【０４６５】
化合物３４：一般手順Ａにしたがって、２８（３０ｍｇ、６６μｍｏｌ）およびＮＨ２−ＰＥＧ２−ＣＯ２ｔＢｕから化合物３４を合成した。反応混合物を室温で１時間撹拌し、次いで、カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸を含有する水中０〜１００％ＣＨ３ＣＮで溶出させるＣ１８シリカゲル）により精製して、３４を無色の膜状物質（４１ｍｇ、収率９３％）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：Ｃ３６Ｈ４４Ｆ２Ｎ３Ｏ７＋のｍ／ｚ計算値＝６６８．３、実測値６６８．３．
【０４６６】
化合物３５：一般手順Ａにしたがって、２８（３０ｍｇ、６６μｍｏｌ）およびＮＨ２−ＰＥＧ４−ＣＯ２ｔＢｕから化合物３５を合成した。反応混合物を室温で１時間撹拌し、次いで、カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸を含有する水中０〜１００％ＣＨ３ＣＮで溶出させるＣ１８シリカゲル）により精製して、３５を無色の膜状物質（４７ｍｇ、収率９４％）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：Ｃ４０Ｈ５２Ｆ２Ｎ３Ｏ９＋のｍ／ｚ計算値＝７５６．４、実測値７５６．４．
【０４６７】
化合物３６：一般手順Ａにしたがって、２８（３０ｍｇ、６６μｍｏｌ）およびＮＨ２−ＰＥＧ１−ＮＨＢｏｃから化合物３６を合成した。反応混合物を室温で１時間撹拌し、次いで、カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸を含有する水中０〜１００％ＣＨ３ＣＮで溶出させるＣ１８シリカゲル）により精製して、３６を無色の膜状物質（３５ｍｇ、収率８２％）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：Ｃ３４Ｈ４１Ｆ２Ｎ４Ｏ６＋のｍ／ｚ計算値＝６３９．３、実測値６３９．３．
【０４６８】
化合物３７：一般手順Ａにしたがって、２８（１００ｍｇ、２２１μｍｏｌ）およびＮＨ２−ＰＥＧ２−ＮＨＢｏｃから化合物３７を合成した。反応混合物を室温で１時間撹拌し、次いで、カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸を含有する水中０〜１００％ＣＨ３ＣＮで溶出させるＣ１８シリカゲル）により精製して、３７を無色の膜状物質（１２６ｍｇ、収率８４％）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：Ｃ３６Ｈ４５Ｆ２Ｎ４Ｏ７＋のｍ／ｚ計算値＝６８３．３、実測値６８３．３．
【０４６９】
化合物３８：一般手順Ａにしたがって、２８（３０ｍｇ、６６μｍｏｌ）およびＮＨ２−ＰＥＧ４−ＮＨＢｏｃから化合物３３を合成した。反応混合物を室温で１時間撹拌し、次いで、カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸を含有する水中０〜１００％ＣＨ３ＣＮで溶出させるＣ１８シリカゲル）により精製して、３８を無色の膜状物質（３７ｍｇ、収率７２％）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：Ｃ４０Ｈ５３Ｆ２Ｎ４Ｏ９＋のｍ／ｚ計算値＝７７１．４、実測値７７１．４．
【化９０】
2021505132.tif 000116
【化９１】
2021505132.tif 000117
【０４７０】
一般的な手順Ｃ−  Ｂｏｃ−またはｔｅｒｔ−ブチルエステル保護リガンドからの光プローブの合成：Ｂｏｃ−またはｔｅｒｔ−ブチルエステル保護リガンド（１当量）をニートトリフルオロ酢酸（２ｍＬ）で処理した。混合物を室温で５分間撹拌し、次いで、減圧下で濃縮乾固した。次いで、残渣をＤＭＦ（２ｍＬ）に再懸濁し、ＤＩＥＡ（１０当量）、ＨＡＴＵ（２．０当量）および光反応性弾頭（遊離アミン、アミン塩酸塩またはカルボン酸として）で処理した。ＬＣ−ＭＳ分析により反応が完了したことが示されるまで、得られた混合物を室温で撹拌し、次いで、光プローブを逆相フラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。所望の生成物を含有する画分を合わせ、濃縮してＣＨ３ＣＮを除去し、次いで、凍結し、凍結乾燥させて、最終光プローブを白色の固体として得た。
【化９２】
2021505132.tif 000118
【０４７１】
化合物３９：一般手順Ｃにしたがって、３３（３３ｍｇ、５３μｍｏｌ）および２−（３−（２−アジドエチル）−３Ｈ−ジアジリン−３−イル）エタン−１−アミンから化合物３９（Ｉ−２４）を合成した。Ｐａｎ，Ｓ．；Ｊａｎｇ，Ｓ．；Ｗａｎｇ，Ｄ．；Ｌｉｅｗ，Ｓ．；Ｌｉ，Ｚ．；Ｌｅｅ，Ｊ．；Ｙａｏ，Ｓ．Ｑ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２０１７，３９，１１８１６−１１８２１を参照のこと。室温で１時間撹拌した後、混合物を、Ｃ１８シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、３９を白色の固体（１７ｍｇ、収率４６％）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：Ｃ３５Ｈ４０Ｆ２Ｎ９Ｏ５＋のｍ／ｚ計算値＝７０４．３、実測値７０４．３．
【０４７２】
化合物４０：一般手順Ｃにしたがって、３４（２２ｍｇ、３３μｍｏｌ）および２−（３−（２−アジドエチル）−３Ｈ−ジアジリン−３−イル）エタン−１−アミンから化合物４０（Ｉ−２５）を合成した。室温で１時間撹拌した後、混合物を、Ｃ１８シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、４０を白色の固体（１５ｍｇ、収率６２％）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：Ｃ３７Ｈ４４Ｆ２Ｎ９Ｏ６＋のｍ／ｚ計算値＝７４８．３、実測値７４８．３．
【０４７３】
化合物４１：一般手順Ｃにしたがって、３５（３２ｍｇ、４３μｍｏｌ）および２−（３−（２−アジドエチル）−３Ｈ−ジアジリン−３−イル）エタン−１−アミンから化合物４１（Ｉ−２６）を合成した。室温で１時間撹拌した後、混合物を、Ｃ１８シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、４１を白色の固体（１６ｍｇ、収率４５％）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：Ｃ４１Ｈ５２Ｆ２Ｎ９Ｏ８＋のｍ／ｚ計算値＝８３６．４、実測値８３６．４．
【化９３】
2021505132.tif 000119
【０４７４】
化合物４２：一般手順Ｃにしたがって、３３（３３ｍｇ、５３μｍｏｌ）および４−アジドアニリンヒドロクロリドから化合物４２（Ｉ−２７）を合成した。室温で１時間撹拌した後、混合物を、Ｃ１８シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、４２を白色の固体（１４ｍｇ、収率３９％）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：Ｃ３６Ｈ３６Ｆ２Ｎ７Ｏ５＋のｍ／ｚ計算値＝６８４．３、実測値６８４．３．
【０４７５】
化合物４３：一般手順Ｃにしたがって、３４（２２ｍｇ、３３μｍｏｌ）および４−アジドアニリンヒドロクロリドから化合物４３（Ｉ−２８）を合成した。室温で１時間撹拌した後、混合物を、Ｃ１８シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、４３を白色の固体（１１ｍｇ、収率４３％）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：Ｃ３８Ｈ４０Ｆ２Ｎ７Ｏ６＋のｍ／ｚ計算値＝７２８．４、実測値７２８．４．
【０４７６】
化合物４４：一般手順Ｃにしたがって、３５（３２ｍｇ、４３μｍｏｌ）および４−アジドアニリンヒドロクロリドから化合物４４（Ｉ−２９）を合成した。室温で１時間撹拌した後、混合物を、Ｃ１８シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、４４を白色の固体（１７ｍｇ、収率４９％）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：Ｃ４２Ｈ４８Ｆ２Ｎ７Ｏ８＋のｍ／ｚ計算値＝８１６．４、実測値８１６．４．
【化９４】
2021505132.tif 000120
【０４７７】
化合物４５：一般手順Ｃにしたがって、３６（１１ｍｇ、１７μｍｏｌ）および４−アジド安息香酸から化合物４５（Ｉ−３０）を合成した。室温で１時間撹拌した後、混合物を、Ｃ１８シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、４５を白色の固体（１０ｍｇ、収率８５％）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：Ｃ３６Ｈ３６Ｆ２Ｎ７Ｏ５＋のｍ／ｚ計算値＝６８４．３、実測値６８４．３．
【０４７８】
化合物４６：一般手順Ｃにしたがって、３７（１４ｍｇ、２１μｍｏｌ）および４−アジド安息香酸から化合物４６（Ｉ−３１）を合成した。室温で１時間撹拌した後、混合物を、Ｃ１８シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、４６を白色の固体（１１ｍｇ、収率７１％）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：Ｃ３８Ｈ４０Ｆ２Ｎ７Ｏ６＋のｍ／ｚ計算値＝７２８．４、実測値７２８．４．
【０４７９】
化合物４７：一般手順Ｃにしたがって、３８（２１ｍｇ、２７μｍｏｌ）および４−アジド安息香酸から化合物４７（Ｉ−３２）を合成した。室温で１時間撹拌した後、混合物を、Ｃ１８シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、４７を白色の固体（１２ｍｇ、収率５４％）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：Ｃ４２Ｈ４８Ｆ２Ｎ７Ｏ８＋のｍ／ｚ計算値＝８１６．４、実測値８１６．４．
【化９５】
2021505132.tif 000121
【０４８０】
化合物４８：一般手順Ｃにしたがって、３７（１２６ｍｇ、１８４μｍｏｌ）および３−アジド−５−（アジドメチル）安息香酸から化合物４８（Ｉ−３３）を合成した。室温で１６時間撹拌した後、混合物を、Ｃ１８シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、４８を白色の固体（２６ｍｇ、収率１８％）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：Ｃ３９Ｈ４１Ｆ２Ｎ１０Ｏ６＋のｍ／ｚ計算値＝７８３．４、実測値７８３．４．
【化９６】
2021505132.tif 000122
【０４８１】
化合物４９：一般手順Ａにしたがって、３１（３０ｍｇ、５８μｍｏｌ）およびＮＨ２−ＰＥＧ１−ＮＨＢｏｃから化合物４９を合成した。反応混合物を室温で１時間撹拌し、次いで、カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸を含有する水中０〜１００％ＣＨ３ＣＮで溶出させるＣ１８シリカゲル）により精製して、４９を無色の膜状物質（２７ｍｇ、収率６５％）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：Ｃ３９Ｈ４５Ｆ２Ｎ４Ｏ６＋のｍ／ｚ計算値＝７０３．３、実測値７０３．３．
【０４８２】
化合物５０：一般手順Ａにしたがって、３１（３０ｍｇ、５８μｍｏｌ）およびＮＨ２−ＰＥＧ２−ＮＨＢｏｃから化合物５０を合成した。反応混合物を室温で１時間撹拌し、次いで、カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸を含有する水中０〜１００％ＣＨ３ＣＮで溶出させるＣ１８シリカゲル）により精製して、５０を無色の膜状物質（３１ｍｇ、収率６９％）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：Ｃ４１Ｈ４９Ｆ２Ｎ４Ｏ７＋のｍ／ｚ計算値＝７４７．３、実測値７４７．３．
【０４８３】
化合物５１：一般手順Ａにしたがって、３１（３０ｍｇ、５８μｍｏｌ）およびＮＨ２−ＰＥＧ４−ＮＨＢｏｃから化合物５１を合成した。反応混合物を室温で１時間撹拌し、次いで、カラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸を含有する水中０〜１００％ＣＨ３ＣＮで溶出させるＣ１８シリカゲル）により精製して、５１を無色の膜状物質（４１ｍｇ、収率８４％）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：Ｃ４５Ｈ５７Ｆ２Ｎ４Ｏ９＋のｍ／ｚ計算値＝８３５．３、実測値８３５．３．
【化９７】
2021505132.tif 000123
【０４８４】
化合物５２：一般手順Ｃにしたがって、４９（２５ｍｇ、３６μｍｏｌ）および４−アジド安息香酸から化合物５２（Ｉ−３４）を合成した。室温で１時間撹拌した後、混合物を、Ｃ１８シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、５２を白色の固体（９ｍｇ、収率３４％）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：Ｃ４１Ｈ４０Ｆ２Ｎ７Ｏ５＋のｍ／ｚ計算値＝７４８．３、実測値７４８．３．
【０４８５】
化合物５３：一般手順Ｃにしたがって、５０（３０ｍｇ、４０μｍｏｌ）および４−アジド安息香酸から化合物５３（Ｉ−３５）を合成した。室温で１時間撹拌した後、混合物を、Ｃ１８シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、５３を白色の固体（６ｍｇ、収率１９％）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：Ｃ４３Ｈ４４Ｆ２Ｎ７Ｏ６＋のｍ／ｚ計算値＝７９２．３、実測値７９２．３．
【０４８６】
化合物５４：一般手順Ｃにしたがって、５１（３１ｍｇ、３７μｍｏｌ）および４−アジド安息香酸から化合物５４（Ｉ−３６）を合成した。室温で１時間撹拌した後、混合物を、Ｃ１８シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、５４を白色の固体（２３ｍｇ、収率７１％）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：Ｃ４７Ｈ５２Ｆ２Ｎ７Ｏ８＋のｍ／ｚ計算値＝８８０．４、実測値８８０．４．
【０４８７】
本発明者らは、本発明のいくつかの実施形態を説明したが、本発明者らの基本的な実施例を変更して、本発明の化合物および方法を利用する他の実施形態を提供し得ることは明らかである。したがって、本発明の範囲は、例として表されている特定の実施形態ではなく、添付の特許請求の範囲により規定されるべきであると認識されよう。
【図１】
2021505132.tif 000144
【図２】
2021505132.tif 000145
【図３】
2021505132.tif 000146
【図４】
2021505132.tif 000147
【図５】
2021505132.tif 000148
【図６】
2021505132.tif 000149
【図７】
2021505132.tif 000150
【図８】
2021505132.tif 000151
【図９】
2021505132.tif 000152
【図１０】
2021505132.tif 000153
【図１１】
2021505132.tif 000154
【図１２】
2021505132.tif 000155
【図１３】
2021505132.tif 000156
【図１４】
2021505132.tif 000157
【図１５】
2021505132.tif 000158
【図１６】
2021505132.tif 000159
【図１７】
2021505132.tif 000160
【図１８】
2021505132.tif 000161
【図１９】
2021505132.tif 000162
【図２０】
2021505132.tif 000163
【図２１】
2021505132.tif 000164
【図２２】
2021505132.tif 000165
【図２３】
2021505132.tif 000166
【図２４】
2021505132.tif 000167
【図２５】
2021505132.tif 000168
【図２６】
2021505132.tif 000169
【図２７】
2021505132.tif 000170
【図２８】
2021505132.tif 000171
【図２９】
2021505132.tif 000172
【図３０】
2021505132.tif 000173
【図３１】
2021505132.tif 000174
【図３２】
2021505132.tif 000175
【図３３】
2021505132.tif 000176
【図３４】
2021505132.tif 000177
【図３５】
2021505132.tif 000178
【図３６】
2021505132.tif 000179
【図３７】
2021505132.tif 000180
【図３８】
2021505132.tif 000181
【図３９】
2021505132.tif 000182
【図４０】
2021505132.tif 000183
【図４１】
2021505132.tif 000184
【図４２】
2021505132.tif 000185
【図４３】
2021505132.tif 000186
【図４４】
2021505132.tif 000187
【図４５】
2021505132.tif 000188
【図４６】
2021505132.tif 000189
【図４７】
2021505132.tif 000190
【図４８】
2021505132.tif 000191
【図４９】
2021505132.tif 000192
【図５０】
2021505132.tif 000193
【図５１】
2021505132.tif 000194
【図５２】
2021505132.tif 000195
【図５３】
2021505132.tif 000196
【図５４】
2021505132.tif 000197
【図５５】
2021505132.tif 000198
【図５６】
2021505132.tif 000199
【図５７】
2021505132.tif 000200
【図５８Ａ】
2021505132.tif 000201
【図５８Ｂ】
2021505132.tif 000202
【図５９】
2021505132.tif 000203
【図６０】
2021505132.tif 000204
【図６１Ａ】
2021505132.tif 000205
【図６１Ｂ】
2021505132.tif 000206
【図６２】
2021505132.tif 000207
【図６３】
2021505132.tif 000208
【図６４】
2021505132.tif 000209
【図６５】
2021505132.tif 000210
【図６６】
2021505132.tif 000211
【図６７Ａ】
2021505132.tif 000212
【図６７Ｂ】
2021505132.tif 000213
【図６８】
2021505132.tif 000214
【図６９】
2021505132.tif 000215
【図７０】
2021505132.tif 000216
【図７１】
2021505132.tif 000217
【図７２】
2021505132.tif 000218
【配列表】
2021505132000001.app
【国際調査報告】
2021505132.tif 000219
2021505132.tif 000220
2021505132.tif 000221