(57)【要約】  本発明は、ニューレグリン（ＮＲＧ）４化合物およびＮＲＧ４化合物による治療方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＮＲＧ４のアミノ酸配列（配列番号１）と比較して、１位のＤ残基のＧ残基への修飾および最大５つの追加の修飾を含む、ＮＲＧ４化合物。
【請求項２】
以下の式を含む化合物であって、
Ｘ０ＧＨＥＥＰＣＧＸ８ＳＨＫＳＦＣＬＮＧＧＬＣＹＸ２２ＩＰＴＸ２６ＰＳＰＦＣＲＣＶＸ３５ＮＹＴＧＡＲＣＥＸ４４ＶＦＬ
式中、
Ｘ０は、Ｔ、ＰＴ、ＭＰＴ、Ｓ、ＧＳ、ＧＧＳ、ＧＧＧＳ、および（ＧＧＧＧＸλ）ｎ（式中、Ｘλは、Ｑ、Ａ、ＥまたはＳであり、ｎ＝１〜５である（配列番号５））からなる群から選択され、または存在せず）、
Ｘ８は、ＥまたはＰであり、
Ｘ２２は、ＱまたはＶであり、
Ｘ２６は、ＦまたはＩであり、
Ｘ３５は、ＥまたはＡであり、
Ｘ４４は、Ｈ、Ｋ、またはＥである、化合物
（配列番号２）。
【請求項３】
Ｘ８はＰであり、Ｘ２２はＶであり、Ｘ２６はＩであり、Ｘ３５はＥであり、Ｘ４４はＥである、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｘ８はＥであり、Ｘ２２はＶであり、Ｘ２６はＩであり、Ｘ３５はＥであり、Ｘ４４はＥである、請求項２に記載の化合物。
【請求項５】
Ｘ８はＰであり、Ｘ２２はＱであり、Ｘ２６はＩであり、Ｘ３５はＥであり、Ｘ４４はＥである、請求項２に記載の化合物。
【請求項６】
Ｘ８はＰであり、Ｘ２２はＶであり、Ｘ２６はＦであり、Ｘ３５はＥであり、Ｘ４４はＥである、請求項２に記載の化合物。
【請求項７】
Ｘ８はＰであり、Ｘ２２はＶであり、Ｘ２６はＩであり、Ｘ３５はＡであり、Ｘ４４はＨまたはＥである、請求項２に記載の化合物。
【請求項８】
Ｘ８はＰであり、Ｘ２２はＶであり、Ｘ２６はＦであり、Ｘ３５はＥであり、Ｘ４４はＫである、請求項２に記載の化合物。
【請求項９】
Ｘ８はＰであり、Ｘ２２はＶであり、Ｘ２６はＦであり、Ｘ３５はＥであり、Ｘ４４はＨである、請求項２に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｘ８はＥであり、Ｘ２２はＶであり、Ｘ２６はＦであり、Ｘ３５はＥであり、Ｘ４４はＥである、請求項２に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｘ８はＰであり、Ｘ２２はＱであり、Ｘ２６はＩであり、Ｘ３５はＥであり、Ｘ４４はＫである、請求項２に記載の化合物。
【請求項１２】
ＩｇＧ  Ｆｃ領域をさらに含む、請求項２〜１１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｘ０が配列番号５であり、ＸλがＳであり、ｎ＝３であり、前記ＩｇＧ  Ｆｃ領域が配列番号６および配列番号７の二量体を含み、Ｘ０のＮ末端アミノ酸が、配列番号７のＣ末端アミノ酸に融合している、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｘ０が配列番号５であり、ＸλがＳであり、ｎ＝３であり、前記ＩｇＧ  Ｆｃ領域が、配列番号８および配列番号９の二量体を含み、Ｘ０のＮ末端アミノ酸が、配列番号９のＣ末端アミノ酸に融合している、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｘ０が配列番号５であり、ＸλがＳであり、ｎ＝１である、請求項２〜１１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１６】
前記化合物が、配列番号４、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２〜１１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１７】
配列番号１８のアミノ酸配列からなる化合物。
【請求項１８】
前記化合物が、天然のヒトＮＲＧ４のものよりも大きく、天然のヒトＮＲＧ１の最大活性の少なくとも７０％である、ＨＥＲ４結合関連活性を有する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１９】
前記化合物がＨＥＲ３結合関連活性を有しない、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の化合物と、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の化合物を含むポンプ装置。
【請求項２２】
ＨＦｒＥＦの治療または予防を必要とする患者においてＨＦｒＥＦを治療または予防する方法であって、ＮＲＧ４化合物を、前記ＮＲＧ４化合物の治療上有効な血清濃度を２４〜９６時間提供するのに十分な量で前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項２３】
有効性対投与比が約２〜約５０の範囲である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＮＲＧ４化合物が、２４〜９６時間の連続皮下注入によってＱ３Ｍで投与される、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＮＲＧ４化合物がパッチポンプによって投与される、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
治療が、少なくとも１年間継続される、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記方法が、ＬＶＥＦの有意な増加をもたらす、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記方法がＧＬＳの有意な減少をもたらす、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記方法が、ＬＶＥＤＶの有意な改善をもたらす、請求項２２〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記方法が、ＣＶ死のリスクの有意な減少をもたらす、請求項２２〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記方法が、入院におけるＨＦ関連のリスクの有意な減少をもたらす、請求項２２〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記患者がＮＹＨＡ  ＩＩまたはＩＩＩの心不全を有する、請求項２２〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＮＲＧ４化合物が、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のＮＲＧ４化合物である、請求項２２〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
ＨＦｒＥＦの治療または予防に使用するためのＮＲＧ４化合物。
【請求項３５】
前記ＮＲＧ４化合物が、２４〜９６時間の連続皮下注入によってＱ３Ｍで投与される、請求項３４に記載の使用のためのＮＲＧ４化合物。
【請求項３６】
有効性対投与比が約２〜約５０の範囲である、請求項３４または３５に記載の使用のためのＮＲＧ４化合物。
【請求項３７】
前記ＮＲＧ４化合物がパッチポンプによって投与される、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の使用のためのＮＲＧ４化合物。
【請求項３８】
前記患者がＮＹＨＡ  ＩＩまたはＩＩＩの心不全を有する、請求項３４〜３７のいずれか１項に記載の使用のためのＮＲＧ４化合物。
【請求項３９】
ＨＦｒＥＦの治療または予防に使用するための請求項１〜１９のいずれか１項に記載のＮＲＧ４化合物であって、４８〜９６時間投与される、ＮＲＧ４化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニューレグリン（ＮＲＧ）４化合物およびＮＲＧ４化合物による治療方法に関する。本発明のＮＲＧ４化合物は、好ましくは、ヒト表皮成長因子受容体（ＨＥＲ）４への強力な結合、およびその結合に関連する強力な活性を有する。好ましいＮＲＧ４化合物は、心機能の改善、および／または駆出率が低下したＨＦ（ＨＦｒＥＦ）を含む心不全（ＨＦ）などのＨＥＲ４結合および結果として生じる活性が顕著な役割を果たす疾患の治療に有用であり得る。
【背景技術】
【０００２】
ＨＦの新しく改善された治療法に対する満たされていない医学的必要性がある。現在利用可能な治療法は、病気の進行を遅らせ、症状を改善することを目的としており、血行力学的変化に依存して、機能不全の心臓の負担を軽減する。これらの治療法には、（ａ）ベータ遮断薬またはイバブラジンなどの心拍数を下げる、（ｂ）アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬（ＡＲＢ）、ミネラルコルチコイド受容体拮抗薬（ＭＲＡ）、およびサクビトリル／バルサルタン（ＥＮＴＲＥＳＴＯ（登録商標））などの血圧を下げる、ならびに／または（ｃ）利尿薬およびＭＲＡなどの体液量過剰を治療または予防する、目的の薬剤が含まれる。ただし、これらの治療法は心臓を直接治療するものではなく、用量漸増および低血圧のモニタリングなどの実際的な制限がある。さらに、これらの既存の治療の選択肢が利用可能であっても、すべてのＨＦ患者は、軽度の症状のある患者でさえ、死亡するリスが高い。例えば、Ａｈｍｅｄ  Ａ，Ａ  ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｙ  ｍａｔｃｈｅｄ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｃｌａｓｓ  ａｎｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｈｉｓｔｏｒｙ  ｅｎｄ  ｐｏｉｎｔｓ  ｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ，Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．２００７；９９（４）：５４９−５５３を参照されたい。したがって、新しく改良されたＨＦ治療が必要である。
【０００３】
新しい治療の選択肢を特定するための研究開発努力が行われている。例えば、ＷＯ２０１４／１８７３４２は、ＮＲＧ１、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３およびＮＲＧ４を含むと述べられているＮＲＧの持続放出によるＨＦの予防、治療、または遅延を説明することを意図している。この公報はまた、慢性心不全患者におけるＮＲＧ−１の長期投与について実施されたとされる臨床研究についても説明している。
【０００４】
それにもかかわらず、既存の治療法と比較して、有効性が改善され、毒性のリスクが低減された治療の選択肢の必要性が残っている。生存率の向上および入院率の低下など、長期的な転帰を改善する治療法が必要である。血行動態の変化以外のメカニズムを通じて、疾患を修正または逆転させる可能性のある心機能を改善する治療法も必要である。特に低血圧、低カリウム血症および腎機能障害などの併存疾患を有する患者の治療に関する治療法を含む、より忍容性の高い治療法の必要性もある。進行性疾患の患者の生活の質（ＱＯＬ）を改善する治療法も必要である。本発明は、これらの重要な、満たされていない必要性のうちの１つ以上を満たすことを目指している。
【発明の概要】
【０００５】
したがって、本発明は、ＨＥＲ４への選択的結合に関連する活性を有するＮＲＧ４化合物を提供する。本発明のＮＲＧ４化合物は、ＨＥＲ３への結合をほとんど持たないかまたは全く持たず、その結果、ＨＥＲ３に関連する毒性および／または忍容性の問題のリスクが低減される。
【０００６】
本発明はまた、特にＨＦを含む、ＣＶＤおよび関連する状態を治療または予防するためのＮＲＧ４化合物を使用する方法を提供する。本発明の好ましいＮＲＧ４化合物および方法は、ＣＶ関連死またはＨＦ関連入院のリスクを低減し、心筋梗塞（ＭＩ）もしくは脳卒中のリスクを低減し、左心補助人工心臓（ＬＶＡＤ）の必要性のリスクもしくは心臓移植を低減し、心臓の機能と構造を改善し、および／またはＨＦに関連する症状と身体的制限の改善により、ＱｏＬの改善につながる。好ましいＮＲＧ４化合物および方法は、滴定またはモニタリングを必要とせずに標準治療（ＳｏＣ）と組み合わせて使用でき、低血圧を増加させない、腎機能を悪化させない、電解質の不均衡を生じさせない、肝機能障害を引き起こさない、腫瘍の発生率を増加させない、および／または持続性精液減少症をもたらさない。
【０００７】
本発明はまた、ヒトＮＲＧ４のアミノ酸配列（配列番号１）と比較して、１位のＤ残基のＧ残基への修飾および最大５つの追加の修飾を含むＮＲＧ４化合物を提供する。
【０００８】
本発明はまた、以下の式を含むＮＲＧ４化合物であって、
Ｘ０ＧＨＥＥＰＣＧＸ８ＳＨＫＳＦＣＬＮＧＧＬＣＹＸ２２ＩＰＴＸ２６ＰＳＰＦＣＲＣＶＸ３５ＮＹＴＧＡＲＣＥＸ４４ＶＦＬ、式中、Ｘ０は、Ｔ、ＰＴ、ＭＰＴ、Ｓ、ＧＳ、ＧＧＳ、ＧＧＧＳ、および（ＧＧＧＧＸλ）ｎ（式中、Ｘλは、Ｑ、Ａ、ＥまたはＳであり、ｎ＝１〜５である（配列番号５））からなる群から選択され、または存在せず）、Ｘ８はＥまたはＰであり、Ｘ２２はＱまたはＶであり、Ｘ２６はＦまたはＩであり、Ｘ３５はＥまたはＡであり、Ｘ４４はＨ、ＫまたはＥである、化合物（配列番号２）を提供する。
【０００９】
別の態様では、本発明は、ＨＦｒＥＦの治療または予防を必要とする患者において、ＨＦｒＥＦを治療または予防する方法であって、治療有効量のＮＲＧ４化合物を２４〜９６時間患者に投与することを含む方法を提供する。
【００１０】
本発明の別の態様は、療法における使用のための本発明のＮＲＧ４化合物を提供する。
【００１１】
本発明の別の実施形態は、ＨＦｒＥＦの治療または予防に使用するためのＮＲＧ４化合物であって、ＮＲＧ４化合物は２４〜９６時間投与される、化合物を提供する。
【００１２】
本発明の別の実施形態は、ＨＦｒＥＦの治療または予防のための薬剤の製造に使用するためのＮＲＧ４化合物であって、ＮＲＧ４化合物は２４〜９６時間投与される、化合物を提供する。
【００１３】
本発明は、本発明のＮＲＧ４化合物、および薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。
【００１４】
本発明の別の実施形態は、本発明のＮＲＧ４化合物を含むポンプ装置を提供する。特定の実施形態では、ポンプはパッチポンプである。
【００１５】
ＮＲＧ４は、ＮＲＧファミリーのタンパク質の４つのメンバーの１つであり、それ自体が上皮成長因子（ＥＧＦ）タンパク質として知られるより大きなタンパク質ファミリーの一部である。ＥＧＦファミリーのタンパク質には、ＥＧＦ自体だけでなく、ＥＧＦ様タンパク質として知られる、ＥＧＦと同様の特定の構造的特徴を共有する他のタンパク質が含まれる。ＥＧＦ様タンパク質には、ＮＲＧ１、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３およびＮＲＧ４、ならびにヘパリン結合性ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、形質転換成長因子−α、アンフィレグリン（ＡＲ）、エピレグリン（ＥＰＲ）、エピジェン、ベータセルリン（ＢＴＣ）およびこれらのタンパク質の様々なアイソフォームが含まれる。これらのリガンドは細胞外膜タンパク質であるが、様々な細胞刺激により細胞メタロプロテアーゼが活性化され、タンパク質のＥＧＦドメインがタンパク質分解により放出され、受容体に自由に結合してシグナル伝達が開始される。ＥＧＦファミリーのタンパク質の様々なメンバーは、正常な発達と、癌を含む多くの疾患の病状との両方に関連する効果を含む、多種多様な発達関連の効果を有する。効果は、受容体のＥｒｂＢファミリーと呼ばれる４つの受容体チロシンキナーゼ：ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ−２）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ−３）、ＨＥＲ４（ＥｒｂＢ−４）のサブファミリー、およびこれらの受容体のアイソフォームとの相互作用によって媒介される。ＮＲＧファミリーのメンバー自体は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４との特定の相互作用によって媒介される様々な効果を有する。ＨＥＲ２はＮＲＧファミリーのメンバーに結合しないが、ＨＥＲ２は、リガンド結合後にＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４とヘテロダイマーを形成することにより、下流のシグナル伝達を促進する。したがって、本明細書でＨＥＲ３（またはＨＥＲ３／２またはＨＥＲ２／３）またはＨＥＲ４（またはＨＥＲ４／２またはＨＥＲ２／４）活性について言及することは、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４のいずれかへのＮＲＧファミリーのメンバーなどのリガンドの結合に続く下流シグナル伝達、および、その結果生じるその結合した受容体とＨＥＲ２とのヘテロ二量体化、から生じる活性として理解されるべきである。
【００１６】
上記のように、ＮＲＧファミリーの様々なメンバーは、様々な受容体親和性および活性プロファイルによって介在される様々な効果を有する。例えば、ＮＲＧ１化合物は、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４の細胞外ドメインと相互作用し、複数の臓器の正常な発達および癌の病因において役割を果たす。ＨＥＲ４結合、およびそれから生じる活性は、心機能および構造の改善に関連しており、一方、ＨＥＲ３結合およびそれから生じる活性は、癌、悪心、下痢および肝毒性に関連している。例えば、Ｏ’Ｓｈｅａ  Ｓ、Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｋ、Ｃｌａｒｋ  Ｒ、Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ  ＭＸ、Ｅｒｉｃｋｓｏｎ  ＳＬを参照されたい。野生型およびＥｒｂＢ遺伝子を標的としたマウスにおけるインビボヘレグリンベータ１治療の効果は、受容体レベルと妊娠に依存する。Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．２００１；１５８（５）：１８７１−８０、Ｍｅｎｄｅｓ−Ｆｅｒｒｅｉｒａ  Ｐ、Ｄｅ  Ｋｅｕｌｅｎａｅｒ  ＧＷ、Ｌｅｉｔｅ−Ｍｏｒｅｉｒａ  ＡＦ、Ｂｒａｓ−Ｓｉｌｖａ  Ｃ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ−１  ｉｎ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ．２０１３；１８（１７−１８）：８３６−４２。考察。一方、ＮＲＧ４はＨＥＲ４に結合して活性化するが、ＨＥＲ３への結合または活性はほとんどないかまたはまったくない。
【００１７】
ＮＲＧ４は、以下の配列番号３に記載の配列を有する１１５個のアミノ酸前駆体タンパク質として発現される：
ＭＰＴＤＨＥＥＰＣＧ  ＰＳＨＫＳＦＣＬＮＧ  ＧＬＣＹＶＩＰＴＩＰ  ＳＰＦＣＲＣＶＥＮＹ  ＴＧＡＲＣＥＥＶＦＬ  ＰＧＳＳＩＱＴＫＳＮ  ＬＦＥＡＦＶＡＬＡＶ  ＬＶＴＬＩＩＧＡＦＹ  ＦＬＣＲＫＧＨＦＱＲ  ＡＳＳＶＱＹＤＩＮＬ  ＶＥＴＳＳＴＳＡＨＨ  ＳＨＥＱＨ
（配列番号３）。発現されるタンパク質は、膜貫通部分、細胞質部分、および細胞刺激時にタンパク質分解的に放出されるＥＧＦ部分を含む細胞外部分を有する膜貫通タンパク質である。本発明のＮＲＧ４化合物は、以下の配列番号１に記載されるように、発現タンパク質の細胞外部分にある、アミノ酸番号４〜５０からの上記の発現タンパク質（配列番号３）の１部分を含む：
ＤＨＥＥＰＣＧＰＳＨ  ＫＳＦＣＬＮＧＧＬＣ  ＹＶＩＰＴＩＰＳＰＦ  ＣＲＣＶＥＮＹＴＧＡ  ＲＣＥＥＶＦＬ
（配列番号１）。誤解を避けるために、本発明のＮＲＧ４化合物の文脈における任意のアミノ酸修飾の本明細書での番号付けは、上記の配列番号１に記載の配列に基づく。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「ＮＲＧ４化合物」という用語は、配列番号１のアミノ酸配列の全部または一部を含むタンパク質またはペプチド、あるいはその変異体またはコンジュゲートを意味する。本明細書で使用される場合、「変異体」という用語は、ヒトタンパク質のアミノ酸配列に１つ以上の修飾を有するアミノ酸配列を指す。そのような修飾には、天然のヒト配列中の１つ以上のアミノ酸の別の天然または非天然アミノ酸による置換、および／または天然のヒト配列中の１つ以上のアミノ酸の欠失または付加が含まれる。本明細書で使用される場合、「コンジュゲート」という用語は、配列番号１の全部または一部を含むタンパク質またはペプチド、またはその変異体を指し、共有結合によってタンパク質、ペプチドまたは他の化学部分に結合している。このような結合物には、例えば、ＩｇＧ  Ｆｃ領域、ヒトアルブミン、グリシンに富むペプチドまたは脂肪酸部分が含まれる。さらに、特に明記しない限り、ＮＲＧ４化合物が実施形態に記載されているか、または本明細書の特許請求の範囲に記載されている場合、化合物は遊離または塩の形態でよいことを理解されたい。
【００１９】
本発明は、配列番号１の式を含み、それに１つ以上の修飾を有し、天然のヒトＮＲＧ４よりも強いＨＥＲ４親和性およびＨＥＲ４結合関連活性を有し、および、天然のヒトＮＲＧ４としてのＨＥＲ３受容体よりもＨＥＲ４受容体への結合において少なくとも選択的である、ＮＲＧ４化合物を提供する。ＨＥＲ４およびＨＥＲ３受容体への親和性および効力は、以下の実施例に記載されるものを含む、当技術分野で知られている技術によって決定され得る。特定の実施形態において、本発明のＮＲＧ４化合物は、天然のヒトＮＲＧ１  ＥＧＦドメインの最大効力の少なくとも５０％であるＨＥＲ４結合から生じる効力を有する。特定の実施形態において、本発明のＮＲＧ４化合物は、天然のヒトＮＲＧ１  ＥＧＦドメインの最大効力の最大９０％であるＨＥＲ４結合に起因する効力を有する。
【００２０】
特定のＮＲＧ４化合物を説明する際に本明細書で使用する場合、「ＨＥＲ３結合関連活性なし」という用語は、以下の実施例に記載するようなインビトロアッセイを使用して試験した場合、それらの化合物が天然のＮＲＧ４の活性よりもＨＥＲ３結合に関連するより大きな活性を有しないことを意味する。
【００２１】
本発明のＮＲＧ４化合物は、少なくとも１位のＤのＧでの置換（すなわち、Ｄ１Ｇ）を含む、配列番号１に記載された上記のアミノ酸配列に対する１つ以上の修飾を含む。Ｄ１Ｇ置換は、野生型ＮＲＧ４アミノ酸配列への追加の修飾を含むＮＲＧ４化合物の文脈を含み、ＨＥＲ３に対する選択性に悪影響を与えることなくＨＥＲ４への結合を大幅に改善することがわかった。本発明の特定の好ましい実施形態において、Ｄ１Ｇと組み合わせて、例えば、ＨＥＲ４結合および／またはＨＥＲ３に対する選択性に関して有益な効果を有することが見出された他のアミノ酸修飾には、位置８、２２、２６、３５および４４のうちの１つ以上での修飾が含まれ、特に以下：Ｐ８Ｅ、Ｖ２２Ｑ、Ｉ２６Ｆ、Ｅ３５Ａ、Ｅ４４ＨおよびＥ４４Ｋのうちの１つ以上が含まれる。本発明のＮＲＧ４化合物の特に好ましい実施形態は、以下のリスト、Ｄ１Ｇ／Ｉ２６Ｆ／Ｅ４４Ｋ、Ｄ１Ｇ／Ｉ２６Ｆ／Ｐ８Ｅ、Ｄ１Ｇ／Ｉ２６Ｆ／Ｅ４４Ｈ、およびＤ１Ｇ／Ｖ２２Ｑ／Ｅ４４Ｋから選択される３つのアミノ酸置換の組み合わせを有する三重変異体である。本発明のＮＲＧ４化合物の最も好ましい実施形態は、配列番号４に示されるような以下の３つのアミノ酸置換Ｄ１Ｇ／Ｖ２２Ｑ／Ｅ４４Ｋを含む：
ＧＨＥＥＰＣＧＰＳＨＫＳＦＣＬＮＧＧＬＣＹＱＩＰＴＩＰＳＰＦＣＲＣＶＥＮＹＴＧＡＲＣＥＫＶＦＬ
（配列番号４）。
【００２２】
本発明のＮＲＧ４化合物はまた、特定の実施形態において、配列番号３に記載の全長発現タンパク質に見出されるであろう、配列番号１に上記の配列のＣ末端またはＮ末端に１つ以上のアミノ酸を含み得る。ただし、そのようなアミノ酸の包含が、ＨＥＲ４へのその天然より強い結合およびＨＥＲ４での活性またはＨＥＲ３と比較した選択性を排除しないことを条件とする。
【００２３】
本発明のＮＲＧ４化合物はまた、特定の実施形態において、配列番号３に示される完全長タンパク質には見られない１つ以上の追加のアミノ酸または他の化学部分を含んでよい。例えば、本発明の特定のＮＲＧ４化合物は、共有結合によってタンパク質、グリシンに富むペプチド、および／または他の化学部分に結合されている。特定の実施形態において、本発明のＮＲＧ４化合物は、ＸλがＱ、Ａ、ＥまたはＳであり、ｎ＝１〜５である配列（ＧＧＧＧＸλ）ｎ（配列番号５）を含むグリシンリッチペプチドを含む。特定の実施形態では、本発明のＮＲＧ４化合物は、配列番号５に記載の配列（ＸλはＳであり、Ｎ末端でｎ＝１である）を含む。
【００２４】
特定の実施形態において、本発明のＮＲＧ４化合物は、以下の式を含み、
Ｘ０ＧＨＥＥＰＣＧＸ８ＳＨＫＳＦＣＬＮＧＧＬＣＹＸ２２ＩＰＴＸ２６ＰＳＰＦＣＲＣＶＸ３５ＮＹＴＧＡＲＣＥＸ４４ＶＦＬ、式中、Ｘ０は、Ｔ、ＰＴ、ＭＰＴ、Ｓ、ＧＳ、ＧＧＳ、ＧＧＧＳ、および（ＧＧＧＧＸλ）ｎ（式中、Ｘλは、Ｑ、Ａ、ＥまたはＳであり、ｎ＝１〜５である（配列番号５））からなる群から選択され、または存在せず）、Ｘ８はＥまたはＰであり、Ｘ２２はＱまたはＶであり、Ｘ２６はＦまたはＩであり、Ｘ３５はＥまたはＡであり、Ｘ４４はＨ、ＫまたはＥである（配列番号２）。
【００２５】
特定の実施形態では、Ｘ８はＰであり、Ｘ２２はＶであり、Ｘ２６はＩであり、Ｘ３５はＥであり、Ｘ４４はＥである。他の実施形態では、Ｘ８はＥであり、Ｘ２２はＶであり、Ｘ２６はＩであり、Ｘ３５はＥであり、Ｘ４４はＥである。他の実施形態では、Ｘ８はＰであり、Ｘ２２はＱであり、Ｘ２６はＩであり、Ｘ３５はＥであり、Ｘ４４はＥである。他の実施形態では、Ｘ８はＰであり、Ｘ２２はＶであり、Ｘ２６はＦであり、Ｘ３５はＥであり、Ｘ４４はＥである。他の実施形態では、Ｘ８はＰであり、Ｘ２２はＶであり、Ｘ２６はＩであり、Ｘ３５はＡであり、Ｘ４４はＨまたはＥである。他の実施形態では、Ｘ８はＰであり、Ｘ２２はＶであり、Ｘ２６はＦであり、Ｘ３５はＥであり、Ｘ４４はＫである。他の実施形態では、Ｘ８はＰであり、Ｘ２２はＶであり、Ｘ２６はＦであり、Ｘ３５はＥであり、Ｘ４４はＨである。他の実施形態では、Ｘ８はＥであり、Ｘ２２はＶであり、Ｘ２６はＦであり、Ｘ３５はＥであり、Ｘ４４はＥである。好ましい実施形態では、Ｘ８はＰであり、Ｘ２２はＱであり、Ｘ２６はＩであり、Ｘ３５はＥであり、Ｘ４４はＫである。
【００２６】
特定の実施形態において、本発明のＮＲＧ４化合物は、ＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む。本明細書で使用される場合、「ＩｇＧ  Ｆｃ領域」という用語は、ヒトＩｇＧ抗体フラグメントの定常領域を指す。特に、Ｆｃ領域は、抗体のＣＨ２およびＣＨ３定常領域ドメインを含み、またヒンジ領域の一部またはすべてを含んでもよい。本発明の特定のＮＲＧ４化合物に含まれるＩｇＧ  Ｆｃ領域は、非共有相互作用およびジスルフィド結合を介して互いに結合している、ＩｇＧ抗体の１つの重鎖または２つの重鎖のいずれかからの定常領域のフラグメントを含んでよい。本明細書で使用される場合、ＩｇＧ  Ｆｃ領域という用語は、例えば、その効力および／または薬物動態などのＮＲＧ４化合物の特性または特性を変更するために修飾、伸長および／または短縮されたそのような抗体フラグメントの変異体も含む。本発明の融合タンパク質のヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域はまた、ジスルフィド介在性Ｆｃ二量体化を簡素化するために、ヒンジ領域の一部またはすべてが除去されていてもよい。本発明の特定の実施形態におけるＩｇＧ  Ｆｃ領域は、異なるアミノ酸配列を有する２つの重鎖の二量体を含み、これは、当技術分野で知られている技術によって調製することができる。例えば、Ｌｅｗｉｓ  ＳＭ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３２（２）：１９１−８（２０１４）、Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４８（１−２）：７−１５（２００１）、Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．９（７）：６１７−２（１９９６）参照。
【００２７】
１つの好ましいＩｇＧ  Ｆｃ領域は、以下の２つのアミノ酸鎖の二量体である：
ＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号６）、および
ＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号７）。
【００２８】
別の好ましいＩｇＧ  Ｆｃ領域は、以下の２つのアミノ酸鎖の二量体である：
Ｅｃｐｐｃｐａｐｐｖａｇｐｓｖｆｌｆｐｐｋｐｋｄｔｌｍａｓｒｔｐｅｖｔｃｖｖｖｄｖｓｈｅｄｐｅｖｑｆｎｗｙｖｄｇｖｅｖｈｎａｋｔｋｐｒｅｅｑｆｎｓｔｆｒｖｖｓｖｌｔｖｖｈｑｄｗｌｎｇｋｅｙｋｃｋｖｓｎｋｇｌｐａｐｉｅｋｔｉｓｋｔｋｇｑｐｒｅｐｑｖｙｔｌｐｐｓｒｅｅｍｔｋｎｑｖｓｌｗｃｌｖｋｇｆｙｐｓｄｉａｖｅｗｅｓｎｇｑｐｅｎｎｙｋｔｔｐｐｖｌｄｓｄｇｓｆｆｌｙｓｋｌｔｖｄｋｓｒｗｑｑｇｎｖｆｓｃｓｖｍｈｅａｌｈｎａｙｔｑｋｓｌｓｌｓｐｇ（配列番号８）、および
ＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＡＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＡＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号９）。
【００２９】
本発明のＮＲＧ４化合物がＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む特定の実施形態において、ＩｇＧ  Ｆｃ領域は、リンカーを介して結合している。特定の実施形態では、リンカーは、上記の配列番号５（Ｘλは、Ｑ、Ａ、ＥまたはＳであり、ｎ＝１〜５である）に記載の配列を含むペプチドリンカーである特定の実施形態では、リンカーは、配列番号５の配列を含み、ＸλがＳであり、ｎが３である。本発明のＮＲＧ４化合物がペプチドリンカーによって結合されたＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む特定の実施形態において、ペプチドリンカーのＮ末端残基は、ＩｇＧ  Ｆｃ領域の１つの鎖のＣ末端残基に直接融合され、ＮＲＧ４アゴニストのＮ末端残基は、ペプチドリンカーのＣ末端残基に直接融合している。
【００３０】
本発明の特定のＮＲＧ４化合物にＩｇＧ  Ｆｃ領域を含めることは、製造および／または投与に関して利点を有することがある。製造に関して、そのような化合物は、以下の実施例に記載されるものなど、当技術分野で知られている生物学的発現技術を使用して迅速に製造され得る。このような技術を使用した迅速な製造は、特に結合および／または活性のスクリーニングのためのＮＲＧ４変異体の製造を含む、研究開発のすべての段階で効率を提供する。投与に関して、ＩｇＧ  Ｆｃ領域を含むＮＲＧ４化合物は、約１４日間の血清曝露を含む長期の薬物動態プロファイルを有する可能性がある。
【００３１】
しかし、これらの利点にもかかわらず、以下の実子例に示すように、約８日を超える血清曝露を含むＮＲＧ４への長期曝露は、心臓毒性のリスクを生み出す可能性があることも発見された。毒性リスクは、すべての種で排除されるわけではないが、約８日間の血清曝露を含む、薬物動態学的半減期がやや短い化合物を調製することによって（例えば、修飾Ｆｃ領域の使用によって）軽減される可能性があることもわかっている。
【００３２】
上記の８〜１４日間の曝露期間と比較して、ＮＲＧ４化合物への短期曝露を提供することで、上記の段落で説明したＮＲＧ４化合物の心臓毒性リスクなしに十分かつ持続的な有効性を提供できることも発見された。そのような曝露期間の例は、約１日〜約７日、好ましくは２、３または４日である。したがって、特定の実施形態において、本発明は、ＮＲＧ４化合物が、治療有効な血清濃度を約２４〜約１６８時間提供するのに十分な量で投与される、ＨＦｒＥＦを治療または予防する方法を提供する。特定の実施形態において、ＮＲＧ４化合物は、治療上有効な血清濃度を約２４〜約９６時間提供するのに十分な量で投与される。特定の実施形態において、ＮＲＧ４化合物は、治療上有効な血清濃度を約２４時間提供するのに十分な量で投与される。特定の実施形態において、ＮＲＧ４化合物は、治療上有効な血清濃度を約４８時間提供するのに十分な量で投与される。特定の実施形態において、ＮＲＧ４化合物は、治療上有効な血清濃度を約７２時間提供するのに十分な量で投与される。特定の実施形態において、ＮＲＧ４化合物は、治療的に有効な血清濃度を約９６時間提供するのに十分な量で投与される。
【００３３】
上記の段落に記載されている曝露期間は、上記の段落に記載されている期間の血清曝露を可能にする薬物動態プロファイルを有するＮＲＧ４化合物の単回ボーラス注射を提供することによって、または上記の段落で説明した期間の急速にクリアするＮＲＧ４化合物の（例えば、ポンプの使用を通じての）連続投与のいずれかによって達成され得る。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「持続的有効性」という用語は、ＮＲＧ４化合物が投与される期間を超えて及ぶ心不全関連の改善を指す。例えば、ＮＲＧ４化合物が治療的に有効な血清濃度を７２時間提供するのに十分な量で投与される特定の実施形態では、特定の実施形態では、そのような治療レジメンの有効性は、約６日間（投与期間の約２倍）〜約４ヶ月（投与期間の約３０倍）の範囲の期間持続し得る。有効性の期間（すなわち、治療上有効な血清濃度が提供される時間）に対する有効性の期間（すなわち、臨床的利益が見られる時間）は、本明細書の特定の実施形態において「有効性対投与率」として同定される。特定の実施形態において、有効性対投与率は、約２〜約５０の範囲である。特定の実施形態において、有効性対投与率は、約２０〜約４５の範囲である。特定の実施形態において、有効性対投与率は、約２２、約３０、または約４５である。
【００３５】
そのような持続的な有効性は、所望の期間にわたって治療的に有効な血清濃度を提供するのに十分な量のＮＲＧ４化合物の比較的まれな投与を可能にする。特定の実施形態において、ＮＲＧ４化合物は、６ヶ月に１回投与される。特定の実施形態において、ＮＲＧ４化合物は、週に１回以下の頻度で投与される。他の実施形態において、ＮＲＧ４化合物は隔月で投与される。他の実施形態において、ＮＲＧ４化合物は、月に１回投与される。特定の好ましい実施形態において、ＮＲＧ４化合物は、四半期に１回投与される。他の好ましい実施形態では、ＮＲＧ４化合物は、６ヶ月に１回投与される。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療すること（ｔｏ  ｔｒｅａｔ）」という用語は、既存の症状もしくは障害の進行または重症度を制限、減速、停止、または反転させることを含む。本発明による心不全またはＨＦｒＥＦの治療は、例えば、左心室駆出率（ＬＶＥＦ）の増加、収縮末期の左心室腔容積（ＬＶＥＳＶ）の増加、左心室拡張末期圧（ＬＶＥＤＰ）の低下、ＣＶ死亡および／または心不全入院のリスクの低下、総死亡率のリスクの低下、心筋梗塞（ＭＩ）のリスクの低下、脳卒中のリスクの低減、左心補助人工心臓（ＬＶＡＤ）の埋め込みおよび／または心臓移植の必要性のリスクの低減、心不全の症状および身体的制限の改善、および／または生活の質（ＱｏＬ）の改善を含む、心不全に関連する様々な測定の１つ以上に反映されることがある。本発明の実施形態による治療の特定の利点は、少なくとも１ヶ月の治療後に達成され得る。本発明の実施形態による治療の特定の利点は、少なくとも６ヶ月の治療後に達成され得る。本発明の実施形態による治療の特定の利点は、少なくとも１年間の治療後に達成され得る。
【００３７】
特定の実施形態において、本発明によるＮＲＧ４化合物の投与は、ＬＶＥＦの有意な改善をもたらす。特定の実施形態において、本発明によるＮＲＧ４化合物の投与は、ＬＶＥＦにおいて少なくとも５％の改善をもたらす。特定の実施形態において、本発明によるＮＲＧ４化合物の投与は、６ヶ月の治療後にＬＶＥＦの少なくとも５％の改善をもたらす。特定の実施形態において、本発明によるＮＲＧ４化合物の投与は、１年の治療後にＬＶＥＦの少なくとも５％の改善をもたらす。特定の実施形態において、本発明によるＮＲＧ４化合物の投与は、１年の治療後にＬＶＥＳＶの少なくとも５％の改善をもたらす。特定の実施形態において、本発明によるＮＲＧ４化合物の投与は、１年の治療後にＬＶＥＤＰの有意な減少をもたらす。特定の実施形態において、本発明によるＮＲＧ４化合物の投与は、全体的な縦方向のひずみ（ＧＬＳ）の有意な減少をもたらす。特定の実施形態において、本発明によるＮＲＧ４化合物の投与は、ＧＬＳの少なくとも３．５％の減少をもたらす。特定の実施形態において、本発明のＮＲＧ４化合物の投与は、ＣＶ死および／またはＨＦ入院のリスクの少なくとも１５％の減少をもたらす。特定の実施形態において、本発明のＮＲＧ４化合物の投与は、総死亡率、ＭＩ、脳卒中、ＬＶＡＤ移植または心臓移植のうちの１つ以上のリスクの有意な減少をもたらす。特定の実施形態において、本発明のＮＲＧ４化合物の投与は、心不全および／またはＱｏＬの症状および身体的制限の有意な改善をもたらす。
【００３８】
さらに、上記のように、提示の特定の実施形態によるＮＲＧ４化合物の投与は、安全上のリスクを増大させることなく、上記のような心不全関連の措置の改善を提供することができる。したがって、好ましい実施形態では、本発明によるＮＲＧ４化合物の投与は、低血圧の増加、腎機能の悪化、電解質の不均衡、肝機能障害、腫瘍または持続性精液減少症の発生率などの安全性リスクの増加をもたらさない。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、患者に所望の効果を提供するＮＲＧ４化合物の量または用量を指す。拡張された薬物動態プロファイルを有するＮＲＧ４化合物の場合、そのような用量は、単回または複数回投与時に与えられる量でよい。上記のような２４〜９６時間の注入など、ある期間にわたって投与されるより速効性の化合物の場合、用量または量は、その期間中に投与されるＮＲＧ４化合物の総質量、例えば、総ｍｇ、またはその時間中にＮＲＧ４化合物が投与される速度、例えば、ｍｇ／分、または投与期間中のＮＲＧ４化合物の血漿濃度として表すことができる。有効量は、既知技法の使用によって、および類似の状況下で得られた結果を観察することによって、当業者により容易に決定され得る。特定の実施形態において、四半期１回の投与のための投薬量は、投与期間中に約３〜約１００ｎＭの血漿濃度を提供するのに十分な投薬量の範囲内でよい。
【００４０】
本発明によるＮＲＧ４化合物の投与は、典型的には非経口的であり、例えば、静脈内（ＩＶ）、皮下（ＳＣ）または腹腔内（ＩＰ）である。したがって、本発明の特定の実施形態では、ＮＲＧ４化合物は静脈内投与される。本発明の他の実施形態では、ＮＲＧ４化合物は腹腔内投与される。他の実施形態では、ＮＲＧ４化合物は皮下投与される。
【００４１】
心臓毒性に対して十分なマージンを持って最適化された持続的な有効性のために曝露期間を制御するために、ＮＲＧ４化合物の非経口投与は、好ましくは、連続的または断続的な注入による。例えば、多くのタイプの注入ポンプが広範囲の薬剤を注入するために使用され、そのようなポンプは、本発明によるＮＲＧ４化合物の投与に使用され得る。ごく最近では、従来の装置よりも小さく、患者の皮膚に直接取り付けられるパッチポンプが開発されたため、患者の日常の活動への干渉が最小限に抑えられている。したがって、特定の実施形態では、ＮＲＧ４化合物は、注入ポンプまたはパッチポンプによって投与される。好ましくは、ＮＲＧ４化合物はパッチポンプによって投与される。
【００４２】
本発明はまた、本発明の化合物の合成に有用な中間体およびプロセスを含む。本発明の中間体およびＮＲＧ４化合物は、以下の実施例に記載されるような、化学合成または生物学的発現を使用するプロセスを含む、当技術分野で知られている様々な手順によって調製することができる。
【００４３】
化学的合成に関して、記載された各経路のための具体的な合成ステップは、本発明のＮＲＧ４化合物を調製するために、異なる方法で組み合わされてもよい。試薬および出発材料は、当業者にとって容易に入手可能である。
【００４４】
生物学的発現に関して、本発明のポリヌクレオチドは、配列が発現制御配列に作動可能に連結された後に宿主細胞において発現される。化合物は、当該技術分野で既知の技法を使用して培養される、ＣＨＯ、ＮＳＯ、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、またはＣＯＳ細胞などの哺乳動物細胞において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、もしくは蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）などの細菌細胞において、昆虫細胞において、または真菌もしくは酵母菌細胞において容易に産生され得る。関心のポリヌクレオチド配列を含有するベクターは、細胞宿主の種類に応じて変化する、周知の方法によって宿主細胞中に移入することができる。タンパク質精製の様々な方法が使用されることができ、そのような方法は当該技術分野で知られている。
【００４５】
上記のように、すべてのＨＦ患者は、軽度の症状のある患者でさえ、死亡するリスクが高くなる。したがって、本明細書で使用される場合、心不全（ＨＦ）の治療を「必要としている患者」への言及は、以下に記載されるような広範囲の疾患重症度を有するものを含む、ＨＦを有する広範囲の個体を指すことがある。ニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）は、以下の表１に要約されているように、ＨＦの程度または重症度の分類スキームを提供している。
【表１】
2021522314.tif 000002
【００４６】
特定の実施形態において、必要としている患者は、心不全ＮＹＨＡクラスＩＩ〜ＩＶにある。特定の実施形態において、必要としている患者は、心不全ＮＹＨＡクラスＩＩにある。特定の実施形態において、必要としている患者は、心不全ＮＹＨＡクラスＩＩＩにある。特定の実施形態において、必要としている患者は、心不全ＮＹＨＡクラスＩＶにある。特定の実施形態において、必要としている患者は、心不全ＮＹＨＡクラスＩＩ〜ＩＩＩにある。
【００４７】
上記のように、現在の標準的なケアを含む心不全の既存の治療の選択肢は、血行力学的メカニズム、例えば、血圧、心拍数、および／または血漿量の低下、を通じて症状を改善し、疾患の進行を遅らせて、心不全の作業負荷を軽減する。対照的に、本発明のＮＲＧ４化合物は、異なる作用機序、すなわち、選択的ＨＥＲ４結合およびそれから生じる活性を介してそれらの効果を達成し、これは、心筋細胞の生存および細胞代謝を直接改善し、心筋再生を促進する。これらの異なる作用機序により、本発明のＮＲＧ４化合物は、滴定またはモニタリングなしで既存のＳｏＣ上に投与することができる。したがって、特定の実施形態において、本発明のＮＲＧ４化合物は、心不全のための１つ以上の追加の治療と組み合わせて投与され得る。特定の実施形態において、心不全に対する１つ以上の追加の治療は、ベータ遮断薬、ＡＣＥ阻害薬、ＡＲＢ、ＭＲＡ、利尿薬、イバブラジンおよびサクビトリル／バルサルタン（ＥＮＴＲＥＳＴＯ（登録商標））からなる群から選択される。特定の実施形態において、本発明のＮＲＧ４化合物は、ＳＧＬＴ２阻害剤またはｓＧＣ活性化因子と組み合わせて投与され得る。
【００４８】
本発明のＮＲＧ４化合物はまた、拡張機能障害（ＨＦｐＥＦ）を伴う心不全、他の心臓関連障害または状態、パーキンソン病、アルツハイマー病、刺激性腸症候群、骨格障害、腎臓病、糖尿病、代謝性疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を含むがこれらに限定されない他の疾患または状態の治療において有用性を有し得る。
【００４９】
追加の実施形態を以下に説明する。
ヒトＮＲＧ４のアミノ酸配列（配列番号１）と比較して、１位のＤ残基のＧ残基への修飾および最大５つの追加の修飾を含むＮＲＧ４化合物。
【００５０】
４つ以下の追加の修飾を有する前の実施形態のＮＲＧ４化合物。１つの実施形態では、ＮＲＧ４化合物は、３つ以下の追加の修飾を有する。１つの実施形態では、ＮＲＧ４化合物は、２つ以下の追加の修飾を有する。
【００５１】
化合物が、８、２２、２６、３５および４４からなる群から選択される位置に少なくとも１つの修飾を含む、上記の実施形態のいずれかのＮＲＧ４化合物。
【００５２】
以下の式を含む化合物であって、
Ｘ０ＧＨＥＥＰＣＧＸ８ＳＨＫＳＦＣＬＮＧＧＬＣＹＸ２２ＩＰＴＸ２６ＰＳＰＦＣＲＣＶＸ３５ＮＹＴＧＡＲＣＥＸ４４ＶＦＬ、式中、Ｘ０は、Ｔ、ＰＴ、ＭＰＴ、Ｓ、ＧＳ、ＧＧＳ、ＧＧＧＳ、および（ＧＧＧＧＸλ）ｎ（式中、Ｘλは、Ｑ、Ａ、ＥまたはＳであり、ｎ＝１〜５であるか（配列番号５））からなる群から選択され、または存在せず）、Ｘ８はＥまたはＰであり、Ｘ２２はＱまたはＶであり、Ｘ２６はＦまたはＩであり、Ｘ３５はＥまたはＡであり、Ｘ４４はＨ、ＫまたはＥであるである、化合物（配列番号２）。
【００５３】
Ｘ８はＰであり、Ｘ２２はＶであり、Ｘ２６はＩであり、Ｘ３５はＥであり、Ｘ４４はＥである、上記の実施形態の化合物。
【００５４】
Ｘ８はＥであり、Ｘ２２はＶであり、Ｘ２６はＩであり、Ｘ３５はＥであり、Ｘ４４はＥである、上記の実施形態のいずれかの化合物。
【００５５】
Ｘ８はＰであり、Ｘ２２はＱであり、Ｘ２６はＩであり、Ｘ３５はＥであり、Ｘ４４はＥである、上記の実施形態のいずれかの化合物。
【００５６】
Ｘ８はＰであり、Ｘ２２はＶであり、Ｘ２６はＦであり、Ｘ３５はＥであり、Ｘ４４はＥである、上記の実施形態のいずれかの化合物。
【００５７】
Ｘ８はＰであり、Ｘ２２はＶであり、Ｘ２６はＩであり、Ｘ３５はＡであり、Ｘ４４はＨまたはＥである、上記の実施形態のいずれかの化合物。
【００５８】
Ｘ８はＰであり、Ｘ２２はＶであり、Ｘ２６はＦであり、Ｘ３５はＥであり、Ｘ４４はＫである、上記の実施形態のいずれかの化合物。
【００５９】
Ｘ８はＰであり、Ｘ２２はＶであり、Ｘ２６はＦであり、Ｘ３５はＥであり、Ｘ４４はＨである、上記の実施形態のいずれかの化合物。
【００６０】
Ｘ８はＥであり、Ｘ２２はＶであり、Ｘ２６はＦであり、Ｘ３５はＥであり、Ｘ４４はＥである、上記の実施形態のいずれかの化合物。
【００６１】
Ｘ８はＰであり、Ｘ２２はＱであり、Ｘ２６はＩであり、Ｘ３５はＥであり、Ｘ４４はＫである、上記の実施形態のいずれかの化合物。
【００６２】
Ｘ０が配列番号５であり、ＸλがＳであり、ｎ＝１である、先行する実施形態の化合物。
【００６３】
配列番号４のアミノ酸配列を含む化合物。
【００６４】
配列番号１０のアミノ酸配列を含む化合物。
【００６５】
配列番号１１のアミノ酸配列を含む化合物。
【００６６】
配列番号１２のアミノ酸配列を含む化合物。
【００６７】
配列番号１３のアミノ酸配列を含む化合物。
【００６８】
配列番号１４のアミノ酸配列を含む化合物。
【００６９】
配列番号１５のアミノ酸配列を含む化合物。
【００７０】
配列番号１６のアミノ酸配列を含む化合物。
【００７１】
配列番号１７のアミノ酸配列を含む化合物。
【００７２】
配列番号１８のアミノ酸配列を含む化合物。
【００７３】
配列番号１９のアミノ酸配列を含む化合物。
【００７４】
配列番号１８のアミノ酸配列からなる化合物。
【００７５】
化合物が共有結合によってタンパク質、ペプチドまたは他の化学部分に結合している、先行する実施形態のいずれかの化合物。化合物が、ＩｇＧ  Ｆｃ領域、ヒトアルブミン、グリシンに富むペプチド、または脂肪酸部分のうちの１つ以上に結合している、先行する実施形態のいずれかの化合物。化合物がＩｇＧ  Ｆｃ領域に結合している、先行する実施形態のいずれかの化合物。ＩｇＧ  Ｆｃ領域が、配列番号６および配列番号７または配列番号８および配列番号９のいずれかの二量体を含む、先行する実施形態の化合物。Ｘ０が配列番号５であり、ＸλがＳであり、ｎ＝３である、先行する実施形態の化合物。
【００７６】
化合物が、天然のヒトＮＲＧ４の活性よりも大きいＨＥＲ４結合関連活性を有する、上記の実施形態のいずれかの化合物。
【００７７】
化合物が、天然のヒトＮＲＧ１の最大活性の少なくとも５０％であるＨＥＲ４結合関連活性を有する、上記の実施形態のいずれかの化合物。
【００７８】
化合物が、天然のヒトＮＲＧ１の最大活性の少なくとも７０％であるＨＥＲ４結合関連活性を有する、上記の実施形態のいずれかの化合物。
【００７９】
化合物が、天然のヒトＮＲＧ１の最大活性の少なくとも９０％であるＨＥＲ４結合関連活性を有する、上記の実施形態のいずれかの化合物。
【００８０】
化合物がＨＥＲ３結合関連活性を有しない、上記の実施形態のいずれかの化合物。
【００８１】
上記の実施形態のいずれかの化合物を含む医薬組成物。
【００８２】
上記の実施形態のいずれかの化合物を含むポンプ装置。
【００８３】
治療有効量のＮＲＧ４化合物を患者に投与することを含む、それを必要とする患者のＨＦを治療または予防する方法。１つの実施形態では、ＮＲＧ４化合物は、上記の実施形態のいずれかの化合物である。
【００８４】
ＨＦｒＥＦの治療または予防に使用するためのＮＲＧ４化合物。１つの実施形態では、ＮＲＧ４化合物は、上記の実施形態のいずれかの化合物である。
【００８５】
ＨＦｒＥＦの治療または予防のための医薬の製造に使用するためのＮＲＧ４化合物。１つの実施形態では、ＮＲＧ４化合物は、上記の実施形態のいずれかの化合物である。
【００８６】
１つの実施形態では、化合物は２４〜１６８時間投与される。１つの実施形態では、化合物は２４〜９６時間投与される。１つの実施形態では、化合物は、２４時間、４８時間、７２時間、または９６時間投与される。１つの実施形態では、化合物は９６時間投与される。
【００８７】
１つの実施形態では、化合物は、月に１回以下の頻度で投与される。１つの実施形態では、化合物は、四半期に１回（Ｑ３Ｍ）以下の頻度で投与される。１つの実施形態では、化合物はＱ３Ｍで投与される。１つの実施形態では、化合物は、９６時間Ｑ３Ｍで投与される。１つの実施形態では、化合物は、６ヶ月に１回投与される。
【００８８】
１つの実施形態では、有効性：投与比は約２〜約５０である。１つの実施形態では、有効性：投与比は約２０〜約４５である。１つの実施形態では、有効性：投与比は、約２２、約３０、または約４５である。
【００８９】
１つの実施形態では、治療は少なくとも６ヶ月間継続される。
【００９０】
１つの実施形態では、治療は少なくとも１年間継続される。
【００９１】
１つの実施形態では、化合物は、ＬＶＥＦの有意な増加をもたらす。１つの実施形態では、化合物は、ＬＶＥＦの少なくとも５％の増加をもたらす。１つの実施形態では、化合物は、１年の治療後にＬＶＥＦの５％の改善をもたらす。
【００９２】
１つの実施形態では、化合物は、ＬＶＥＳＶの有意な増加をもたらす。１つの実施形態では、化合物は、ＬＶＥＳＶの５％の改善をもたらす。１つの実施形態では、化合物は、１年の治療後にＬＶＥＳＶの５％の改善をもたらす。
【００９３】
１つの実施形態では、化合物は、ＬＶＥＤＰの有意な減少をもたらす。１つの実施形態では、化合物は、１年の治療後にＬＶＥＤＰの有意な減少をもたらす。
【００９４】
１つの実施形態では、化合物は、全体的な縦ひずみ（ＧＬＳ）の有意な減少をもたらす。１つの実施形態では、化合物は、ＧＬＳの少なくとも３．５％の減少をもたらす。
【００９５】
１つの実施形態では、化合物は、ＬＶＥＤＶの有意な改善をもたらす。
【００９６】
１つの実施形態では、化合物は、ＣＶ死および／またはＨＦ入院のリスクの有意な減少をもたらす。
【００９７】
１つの実施形態では、化合物は、ＣＶ死のリスクの少なくとも１５％の減少をもたらす。
【００９８】
１つの実施形態では、化合物は、ＨＦ入院のリスクの少なくとも１５％の減少をもたらす。
【００９９】
１つの実施形態では、化合物は、総死亡率、ＭＩ、脳卒中、ＬＶＡＤ移植または心臓移植のうちの１つ以上のリスクの有意な減少をもたらす。
【０１００】
１つの実施形態では、化合物は、心不全および／またはＱｏＬの症状および身体的制限の有意な改善をもたらす。
【０１０１】
１つの実施形態では、化合物は、低血圧の増加、腎機能の悪化、電解質の不均衡、肝機能障害、腫瘍または持続性精液減少症の発生率をもたらさない。
【０１０２】
１つの実施形態では、化合物は、非経口的に投与される。
【０１０３】
１つの実施形態では、化合物は、静脈内、皮下、または腹腔内に投与される。
【０１０４】
１つの実施形態では、化合物は、注入ポンプによって投与される。
【０１０５】
１つの実施形態では、化合物は、パッチポンプによって投与される。
【０１０６】
１つの実施形態では、治療有効量は、約３〜約１００ｎＭの血清濃度を提供する化合物の量である。
【０１０７】
１つの実施形態では、化合物は、心不全ＮＹＨＡクラスＩＩ〜ＩＶの患者に投与される。
【０１０８】
１つの実施形態では、化合物は、心不全ＮＹＨＡクラスＩＩ〜ＩＩＩの患者に投与される。
【０１０９】
１つの実施形態では、化合物は、心不全に対する１つ以上の追加の治療と同時または連続して組み合わせて投与される。１つの実施形態では、心不全の１つ以上の追加の治療法は、ベータ遮断薬、ＡＣＥ阻害薬、ＡＲＢ、ＭＲＡ、利尿薬、イバブラジンおよびサクビトリル／バルサルタン（ＥＮＴＲＥＳＴＯ（登録商標））からなる群から選択される。１つの実施形態では、化合物は、ＳＧＬＴ２阻害剤および／またはｓＧＣ活性化因子との同時または連続的な組み合わせで投与される。
【０１１０】
１つの実施形態では、投与されるＮＲＧ４化合物は、本発明のＮＲＧ４化合物である。
【０１１１】
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものとして解釈されない。
【０１１２】
例示的な化合物の調製
本発明のＮＲＧ４化合物の例を以下の表２に記載する。
【表２】
2021522314.tif 000003
【０１１３】
生物学的発現
Ｆｃ領域を含むＮＲＧ４化合物の例は、ＣＨＯ  ＧＳＫＯ細胞株を使用する哺乳動物細胞発現系で産生される。ＧＳ遺伝子ノックアウトは、分泌条件下で低生産性または非生産性の細胞の生存を許容し得る内因性ＧＳ背景活性を排除することによって、厳しい選択厳密性を可能にする。本発明のＦｃ融合ノブ鎖およびホール鎖をコードする遺伝子は、同時トランスフェクションのために個々のグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）含有発現プラスミドにサブクローニングされ得るか、または両方の鎖が単一のＧＳ含有発現プラスミドにサブクローニングされ得る。あるいは、いずれかの鎖の相対的な発現レベルを変更する必要がある場合は、ノブ鎖とホール鎖の異なる比率を組み合わせて、単一のＧＳ含有発現にすることができる。ノブ鎖またはホール鎖をコードするｃＤＮＡ配列は、シグナルペプチドのコード配列（マウスカッパリーダー配列である可能性がある）とインフレームで融合され、細胞培養培地への所望の産物の分泌を増強する。発現はウイルス性サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターによって駆動される。
【０１１４】
ＣＨＯ  ＧＳＫＯ細胞は、一過性または安定的にトランスフェクトすることができる。安定的なトランスフェクションでは、ＣＨＯ  Ｋ１ＳＶ細胞は、エレクトロポレーション、および適切な量の組換えノブ鎖およびホール鎖発現プラスミドを使用して安定してトランスフェクトされ、トランスフェクトされた細胞は適切な細胞密度で浮遊培養において維持される。トランスフェクトされた細胞の選択は、グルタミンなしの、２５μＭメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）含有無血清培地での増殖によって達成され、約３２℃〜３７℃および約５〜７％ＣＯ２でインキュベートされる。Ｆｃ融合物はＣＨＯ細胞から培地に分泌される。
【０１１５】
タンパク質は、以下のいずれかを使用して精製される：（１）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーとそれに続く陽イオン交換または疎水性相互作用クロマトグラフィー（または他の適切な方法）、または（２）マルチモーダルクロマトグラフィーとそれに続く疎水性相互作用クロマトグラフィー（または他の適切な方法）。
【０１１６】
プロテインＡクロマトグラフィーから始まる精製では、採取した培地からのタンパク質をＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｒｅｓｉｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に捕捉する。次に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）などのランニングバッファーまたはＴｒｉｓを含むランニングバッファーで樹脂を簡単に洗浄して、非特異的に結合した物質を除去する。タンパク質を、２０ｍＭ酢酸／５ｍＭ酢酸などの低ｐＨ溶液で樹脂から溶出する。Ｆｃ融合を含む画分をプールする。０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０などの塩基を加えることで、ｐＨを中性化できる。この段階で、Ｆｃ融合物を使用して結合／活性をスクリーニングするか、または、必要に応じて、フェニルセファロースＨＰなどの樹脂を使用した疎水性相互作用クロマトグラフィーによってさらに精製することができる。Ｆｃ融合物は、１０カラム容量を超える、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７）中の硫酸ナトリウムの５００ｍＭ〜０ｍＭの勾配を使用して、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラムから溶出できる。Ｆｃ融合物は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、ＰＢＳ、ｐＨ７．４でアイソクラティック溶出するか、またはバッファーを所望のバッファーに交換することにより、サイズ排除クロマトグラフィーでさらに精製できる。実施例１〜８および１０は、この方法で精製される。
【０１１７】
マルチモーダルクロマトグラフィーから始まる精製では、採取した培地からのタンパク質をＣａｐｔｏＭＭＣ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に捕捉する。次に、樹脂を１００ｍＭクエン酸塩、ｐＨ５．０（「Ａ」バッファー）で簡単に洗浄した後、「Ａ」バッファーと２５ｍＭリン酸ナトリウム、１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５（「Ｂ」バッファー）を８０％／２０％洗浄する。次に、７０％「Ｂ」バッファーで樹脂から所望のタンパク質を溶出する。Ｆｃ融合物は、フェニルセファロースＨＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの樹脂を使用した疎水性相互作用クロマトグラフィーによってさらに精製できる。Ｆｃ融合物は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８中の硫酸ナトリウムの８００ｍＭから０ｍＭの線形勾配を使用して、フェニルセファロースＨＰカラムから溶出できる。Ｆｃ融合物は、Ｑセファロースカラム（ＧＥヘルスケア）を使用することによるイオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製することができる。Ｆｃ融合物は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８で０Ｍ〜１Ｍの塩化ナトリウムグラジエントを使用してカラムから溶出できる。画分はプールされ、保存のために所望のバッファーにバッファー交換される。実施例１１は、この方法で精製される。
【０１１８】
化学合成
ＩｇＧ  Ｆｃ領域を含まないペプチドである本発明のＮＲＧ４化合物（例えば、上記の表２の実施例９）はまた、Ｆｍｏｃ／ｔ−Ｂｕ戦略を使用する固相ペプチド合成によって生成され得る。ペプチドは、ＳｙｍｐｈｏｎｙＸ自動ペプチドシンセサイザー（ＰＴＩ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）で合成される。
【０１１９】
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｗａｎｇ樹脂（０．３〜０．８ミリモル／グラム、２００〜４００メッシュ、Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ）を使用してペプチドを合成する。Ｆｍｏｃ脱保護は、ＤＭＦ中のピペリジンの２０％ｖ／ｖ溶液を使用して実行される。アミノ酸カップリングは、１０当量のＦｍｏｃ−アミノ酸、０．９Ｍジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）および０．９Ｍオキシマ（１：１：１モル比）をＤＭＦ中で使用し、２５℃で２時間行う。洗浄ステップはＤＭＦを使用して実行され、すべてのカップリングおよび脱保護ステップの後に含まれる。データを以下で表３に示す。
【表３】
2021522314.tif 000004
【０１２０】
主な配列で使用されるすべてのアミノ酸はＬアミノ酸である：Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏｔｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏｔｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ。
【０１２１】
上記のペプチド樹脂の伸長が終了した後、最後のＦｍｏｃ基を除去し、樹脂を塩化メチレンで洗浄してから、ペプチドを切断する。１．５ｍＬの水、トリイソプロピルシラン、チオアニソール、１，２エタンジチオール（１：１：１）の溶液を１３ｍＬのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に加え、得られた開裂カクテルを樹脂に加え、反応シリンジで２．５時間混合する。切断されたペプチドを含むＴＦＡ溶液を、冷ジエチルエーテルを含む５０ｍＬコニカルバイアルに移す。沈殿したペプチド溶液をスピンダウンして厚いペレットにし、エーテルをデカントする。エーテル沈殿を２回繰り返して、残りのカクテルを洗浄してから、リフォールディングに進む。
【０１２２】
粗ペプチドを水に溶解し、必要に応じてアセトニトリルを添加する。粗ペプチド濃度は、アセトニトリルと水中で２．５〜３ｍｇ／ｍＬ（２００ｍＬ）に調整される。次に、サンプルは直接リフォールディングにかけられる。リフォールディングバッファーは、酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンを、０．１Ｍトリスバッファー（ｐＨ８）中のＧＳＳＧ：ＧＳＨ（２ｍＭ：１ｍＭ）の比率で添加することにより調製する。粗ペプチド溶液をリフォールディングバッファーに０．１３〜０．１５ｍｇ／ｍＬ（２０倍に希釈）の濃度で添加し、リフォールディング混合物を攪拌せずに４℃に維持した。１日後、ｐＨを３．０にするために、０．２％までのＴＦＡを加えることにより、リフォールディング混合物をクエンチする。次に、急冷した溶液を濾過して精製する。
【０１２３】
ペプチド溶液をＨＰＬＣカラムにロードし、グラジエントをトリガーする前にバッファーＡで平衡化する。バッファーＡ：水中０．１％ＴＦＡ、バッファーＢ：１００％アセトニトリル。勾配：１００分で１０％Ｂから２５％Ｂ。流量：１８ｍＬ／分、２２０ｎｍでの検出（Ｗａｔｅｒｓ  ２４８９検出器）。カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８カラム、７μｍ、１９ｘ３００ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ部品番号ＷＡＴ０６６２４５）。画分はＵＶによって自動トリガーされ、Ｗａｔｅｒｓ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ  ＩＩＩを使用して収集される。
【０１２４】
所望のペプチドを含むプールされた画分を合わせて凍結乾燥する。
【０１２５】
インビボ研究
結合の改善のためにＮＲＧ４変異体をスクリーニングするためのＨＥＲ４／ＮＲＧ−Ｆｃ結合アッセイ
結合アッセイを利用して、ＨＥＲ４受容体に対するＮＲＧ４変異体Ｆｃ融合タンパク質のハイスループットスクリーニングを実行し、受容体の活性化とシグナル伝達を増加させる可能性のある親和性駆動型変異体を特定する。ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ中２μｇ／ｍｌの抗Ｈｉｓタグ抗体でコーティングし、プレートを１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０（５μｇ／ｍｌのＨＥＲ４  ＥＣＤ）でブロックした後、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＨＥＲ４受容体細胞外ドメイン（ＥＣＤ）コンストラクトの標準化された捕捉を促進する。発現培地中の飽和量の未精製ＮＲＧ４−Ｆｃ変異体（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０で段階希釈して１０μｇ／ｍｌから開始）を、捕捉した受容体とともに１時間インキュベートする。洗浄後、結合した変異体ＮＲＧ４−Ｆｃを抗ヒトＦｃ特異的アルカリホスファターゼ二次検出試薬で比色分析して検出し、結合を定量化する。受容体に結合する変異体のインキュベーション時間またはその後の洗浄ステップの期間を変化させて、それぞれ親和性のオンレートおよびオフレートによって駆動される結合変異体をさらに同定する。このスクリーニングプロセスは、以下の表４のデータに示されるように、実施例１に含まれるように、受容体の活性化およびシグナル伝達を増加させる高い親和性および可能性を有するものとしてＤ１Ｇ修飾を特定する。
【表４】
2021522314.tif 000005
【０１２６】
表４に見られるように、Ｄ１Ｇ修飾を含む実施例１は、同様の用量でＷＴ  ＮＲＧ１に同様のＨＥＲ４結合を有し、この研究において同様の用量でＷＴ  ＮＲＧ４よりも有意に大きいＨＥＲ４結合を有する。
【０１２７】
ＣＨＯヒトおよびラットＨＥＲ２〜４およびＨＥＲ２〜３細胞株の作製
ヒトまたはラットのＨＥＲ受容体を過剰発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を利用する細胞ベースのアッセイを使用して、ＮＲＧ４化合物の活性を測定する。ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ）は、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４０μｇ／ｍＬ  Ｌ−プロリン、１ｘ抗生物質を含む５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２  ３：１で増殖させ、ＴｒｉｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｇｉｂｃｏ）で２〜３日ごとに１：５に分割した。細胞は、製造元の指示に従って、Ｆｕｇｅｎｅ  ６（Ｐｒｏｍｅｇａ）とペアでＨＥＲ受容体をコードするプラスミドＤＮＡ（ｈＨＥＲ２〜３、ｈＨＥＲ２〜４、ｒＨＥＲ２〜３、およびｒＨＥＲ２〜４）でトランスフェクトする。この受容体はリガンドに結合しないが、下流のシグナル伝達のためのＨＥＲ受容体の好ましい二量体化パートナーであるため、ＨＥＲ２が含まれている。トランスフェクトされた細胞は、ピューロマイシン（１２ｕｇ／ｍｌ）とハイグロマイシン（１ｍｇ／ｍｌ）で３〜４週間選択され、クローン系統は９６ウェルプレートへの限定希釈クローニングによって得られた。クローン系統は、Ｔａｑｍａｎ法によるＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４の適切な遺伝子発現によって選択される。適切な受容体発現を示す系統は、ＮＲＧ１が誘導するホスホ−ＥＲＫ１／２応答によって確認される。クローンは成長し、収穫され、クライオバイアルに分注され、液体窒素下で凍結されて長期保存される。
【０１２８】
ヒトＨＥＲ２−ＨＥＲ４を介したＥＲＫ１／２リン酸化インビトロによる分子のスクリーニング
ホスホ−ＥＲＫ１／２活性アッセイは、ＮＲＧ４化合物の効力を決定するために使用される。ＷＴヒトＮＲＧ１および／またはヒトＮＲＧ４と比較した実施例１〜８および１０の効力は、ヒトＨＥＲ２−ＨＥＲ４介在ＥＲＫ１／２リン酸化の刺激を測定する研究で分析される。このアッセイは、ヒトＨＥＲ２およびＨＥＲ４を発現するＣＨＯ−Ｋ１安定株を含む。ＣＨＯ−ｈＨＥＲ２−ｈＨＥＲ４（クローン１Ｈ６）細胞は、ＤＭＥＭ：Ｆ１２（３：１）、５％ＦＢＳ、４０μｇ／ｍＬ  Ｌ−プロリン、１０μｇ／ｍＬピューロマイシンおよび１ｍｇ／ｍＬハイグロマイシンで、３７℃、５％ＣＯ２で日常的に培養される。細胞は、１×ＰＢＳで２回洗浄し、０．０５％トリプシン／０．５３μＭ  ＥＤＴＡで解離し、３００ｘｇで１０分間遠心分離して回収する。細胞は維持培地に再懸濁される。３０μＬの２０，０００細胞／ウェルを３８４ウェルのポリ−Ｄ−リジン細胞培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、カタログ番号７８１９４６）に播種する。プレートを、製造者の蓋で覆い、５％ＣＯ２、８０％＋湿度で３７℃の組織培養インキュベーターに移動して付着させる。２４時間後、培地をプレートから取り除き、Ｂｉｏｍｅｋ  ＦＸ液体ハンドラーを使用して３０μＬの無血清飢餓培地（０．１％ＢＳＡを含む低グルコースＤＭＥＭ）と交換する。プレートは２４時間インキュベーターに戻される。
【０１２９】
２９３Ｆ上清として一時的に発現するｈＦｃＮＲＧ４変異体は、飢餓培地で透明な３８４Ｗプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、カタログ番号７８１１８５）で４ｐｔ  １：８段階希釈（平均投与量範囲２５０ｐＭ〜１４００００ｐＭ）として調製される。細胞培養プレートから培地を除去し、３０ｕＬ／ウェルに調製した変異体をＢｉｏｍｅｋ  ＦＸ液体ハンドラーを使用してプレートに押し付ける（ｓｔａｍｐ）。プレートをホイルシールで密封し、オービタルシェーカー上で、室温で１５分間刺激する。次に細胞を５０ｕＬの冷ＰＢＳで１回洗浄する。３０ｕＬの溶解バッファーを細胞に加え、オービタルシェーカー上で、ＲＴで１０分間振動させる。
【０１３０】
ＥＲＫ１／２のリン酸化の検出は、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＩｇＧ検出キット（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、カタログ番号６７６０６１７）と一緒に、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ  ＳｕｒｅＦｉｒｅホスホ−ＥＲＫ１／２キット（Ｔ２０２／Ｙ２０４）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号ＴＧＲＥＳ）、またはＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）ＳｕｒｅＦｉｒｅ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（商標）ｐ  ＥＲＫ１／２アッセイキットのいずれかを使用して実行される。ＣＨＯ−Ｋ１細胞の溶解後、４μＬのライセートを３８４Ｗ  Ｂｉｏｍｅｋ  ＦＸを備えた３８４Ｗ  Ａｌｐｈａ  Ｐｒｏｘｉｐｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号６００８２８０）に移す。４ｕＬのポジティブおよびネガティブライセート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ＴＧＲＥＳ−Ｌ）を対照として利用可能なウェルに追加する。５ｕＬ／ウェルのアクセプターミックス（抗リン酸化Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４抗体およびプロテインＡコンジュゲートアクセプタービーズを含む）をＦｏｒｕｍｌａｔｒｉｘ  Ｍａｎｔｉｓとともにプレートに添加する。プレートを密封し、３００ｘｇで１分間スピンダウンし、オービタルシェーカー上で、室温で２時間インキュベートする。２μＬ／ウェルのドナーミックス（ストレプトアビジンでコーティングされたドナービーズおよび遠位ＥＲＫ１／２エピトープに対するビオチン化抗体を含む）をＭａｎｔｉｓによって分配する。プレートを密封し、３００ｘｇで１分間スピンダウンし、オービタルシェーカー上で、室温で２時間インキュベートしてから、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  ２１０３マルチラベルリーダー（ＨＴＳ  Ａｌｐｈａモード、励起時間：４０ｍｓ、合計測定時間：１３０ｍｓ）で読み取る。
【０１３１】
各サンプルを、ＸＬＦｉｔで複製されたすべてのプレートに含まれる、親のｈＦｃＮＲＧ４用量反応に対してプロットする。このデータを、４つのパラメーターを当てはめてＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍにプロットし、ＥＣ５０効力値を抽出する。結果を表５および表６に示す。
【表５】
2021522314.tif 000006
【０１３２】
表５のデータに見られるように、ＨＥＲ４への親和性の増加と一致して、この研究では、Ｄ１Ｇ修飾は、追加のアミノ酸修飾を含む例を含め、野生型ＮＲＧ４と比較してＨＥＲ４およびＨＥＲ２での活性も大幅に増加させる。
【表６】
2021522314.tif 000007
【０１３３】
表６のデータに見られるように、この研究では、それぞれＤ１Ｇ修飾および追加の修飾を含む実施例６〜８および１０は、ＷＴ  ＮＲＧ４と比較してＨＥＲ４およびＨＥＲ２での活性の増加、およびＷＴ  ＮＲＧ１と比較して同様の活性を示す。
【０１３４】
精製タンパク質の試験のためのヒトおよびラットＨＥＲ２−４またはＨＥＲ２−３ホスホ−ＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）アッセイ
ホスホ−ＥＲＫ１／２活性アッセイは、ヒトまたはラットのＨＥＲ受容体を過剰発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞で利用され、精製されたＮＲＧ４化合物の効力と選択性を決定する。ヒトまたはラットのＨＥＲ受容体を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞株を選択培地（ＤＭＥＭ−Ｆ１２  ３：１、５％ＦＢＳ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４０μｇ／ｍＬ  Ｌ−プロリン、１ｘ抗生物質、１２μｇ／ｍＬピューロマイシン、１ｍｇ／ｍＬハイグロマイシンＢ）で培養する。１日目（ホスホ−ＥＲＫ１／２アッセイの前日）に、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、酵素を含まない細胞解離溶液（ＧＩＢＣＯカタログ番号１３１５１−０１４）で剥離し、プレーティング培地（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｘ抗生物質、０．２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２  ３：１）に再懸濁する。細胞を９６ウェルのポリ−Ｄ−リジンコーティングプレート（ＢＤカタログ番号３５４６４０）に、ウェルあたり０．１ｍＬあたり１０，０００細胞でプレーティングする。細胞は組織培養インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養される。１日目（ｐＥＲＫ１／２アッセイの日）に、プレートを室温で３０分間インキュベートする。培地を除去した後、ＰＢＳ−２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−０．００５％ＢＳＡで希釈した様々な濃度の５０μＬリガンドを添加する。天然のヒトＮＲＧ１およびＮＲＧ４ペプチドは、Ｒｅｐｒｏｋｉｎｅ（Ｔａｍｐａ、ＦＬ）から購入する。刺激時間は３０分である（１５分が刺激に使用されるｈＨＥＲ２−４  １Ｈ６ラインを除く）。刺激の最後に、リガンドを除去し、７０μＬの溶解バッファー（製造者のレシピに従って作成、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒカタログ番号ＡＬＳＵ−ＰＥＲＫ−Ａ１０Ｋ）を追加する。プレートを３５０ｒｐｍで攪拌しながらプレート上で、室温で１０分間インキュベートし、次に氷上で１時間振とうせずにインキュベートする。３０μＬの細胞溶解を９６ウェルのホワイトＯｐｔｉｐｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒカタログ番号６００２２９０）に移し、ホスホ−ＥＲＫ１／２アッセイを行う。簡単に説明すると、７．５μＬのアクセプタービーズをＯｐｔｉｐｌａｔｅの３０μＬの溶解液に加える。プレートをアルミホイルで覆い、３５０ｒｐｍで攪拌しながらプレートシェーカー上で、室温で１時間インキュベートする。次に、７．５μＬのドナービーズを加え、プレートをアルミホイルで覆い、３５０ｒｐｍで攪拌しながらプレートシェーカー上で、室温で２時間、または４℃で一晩インキュベートする（読み取る前にプレートを室温で２時間ウォームアップする）。アルファ信号データは、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ機器（Ａｌｐｈａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ互換のプレートリーダー）で取得される。ドナービーズとアクセプタービーズは、アッセイプロトコルに従って作成される。示されているデータは、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ  ＳｕｒｅＦｉｒｅ  ｐ−ＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）アッセイキット（カタログ番号ＴＧＲＥＳ５０ｋ）またはＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）ＳｕｒｅＦｉｒｅ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（商標）ｐ−ＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）アッセイキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ｃａｔ＃ＡＬＳＵ−ＰＥＲＫ−Ａ１０Ｋ）のいずれかを使用して作成���れる。ＮＲＧ１ペプチドの活性は両方のタイプのアッセイで類似していた。Ｅｎｖｉｓｉｏｎ機器から取得した生データは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン７）にインポートされる。ＥＣ５０値は、可変勾配−４パラメーター用量反応曲線によって生成される。最大ＮＲＧ１活性データの％は、プレートあたりのネイティブヒトＮＲＧ１の平均最大生データに対するＮＲＧ４化合物の平均最大生データを表し、１００を掛けることによって生成される。データを以下に表７〜９に示す。Ｎ値は、実行された独立したアッセイの数を反映する。
【表７】
2021522314.tif 000008
【表８】
2021522314.tif 000009
【０１３５】
表７に見られるように、野生型ヒトＮＲＧ１ペプチドは、ヒトＨＥＲ４およびＨＥＲ２受容体で強力な活性を示すが、野生型ヒトＮＲＧ４ペプチドは弱い部分アゴニストとして作用する。実施例９〜１１は、野生型ヒトＮＲＧ１よりもわずかに強力なＥＣ５０値、および野生型ヒトＮＲＧ４ペプチドよりも大きく、ヒトＮＲＧ１のそれに近い最大活性％を有する強力な活性を示す。表８に見られるように、同様の結果がラットＨＥＲ４  ＨＥＲ２受容体で得られ、ヒトＮＲＧ１と比較して効力がわずかに増加し、最大活性はヒトＮＲＧ１の活性に近づく。結論として、ＮＲＧ４化合物の例は、天然のヒトＮＲＧ４と比較して、ヒトとラットの両方のＨＥＲ４  ＨＥＲ２受容体で、より大きなｐｈｏｓｈｏ−ＥＲＫ１／２活性を示し、天然のヒトＮＲＧ１の活性に近づく。
【表９】
2021522314.tif 000010
【０１３６】
表９に見られるように、野生型ヒトＮＲＧ１ペプチドは、ヒトＨＥＲ３  ＨＥＲ２受容体で強力な活性を示すが、野生型ヒトＮＲＧ４ペプチドおよびすべての実施例は、この受容体ペアで活性を示さず、ＨＥＲ４  ＨＥＲ２受容体ペアに対する異なる選択性を示す。結論として、ＮＲＧ４化合物の例は、ＨＥＲ３  ＨＥＲ２受容体でｐｈｏｓｈｏ−ＥＲＫ１／２活性を示さないため、野生型ＮＲＧ４ペプチドのＨＥＲ４およびＨＥＲ２受容体選択性の維持を示す。
【０１３７】
インビボ研究
ラットＭＩモデルの心臓機能および構造に対する実施例９の効果
実施例９の血漿濃度および曝露期間を研究するために、駆出率が低下した心不全（ＨＦｒＥＦ）のラットモデルにおいて、２つの非臨床的有効性薬理学研究が実施される。どちらの研究も、外科的に誘発された心筋梗塞のオスのスプラーグドーリーラットの心機能と構造への影響を測定する。
【０１３８】
同様の方法論が両方の研究に使用される。外科的に誘発された心筋梗塞を有する雄のスプラーグドーリーラットを購入し、麻酔をかけ、手順全体を通して積極的に換気する。４番目と５番目の肋骨の間を切開し、心臓を露出させる。左冠状動脈は永久に結紮されている。偽手術された動物は、絹の縫合糸が結ばれることなく左冠状動脈の周りに配置されることを除いて、同じ手順を受ける。すべてのラットは、温度と湿度が制御された部屋に個別に収容され、１２時間の明／暗サイクルで維持される。手術の２〜３週間後、ラットはＶｅｖｏ  ２１００超音波システムを使用して駆出率（ＥＦ％）と左心室寸法（ＬＶＤ）を決定するために経胸壁心エコー検査を受ける。ラットは、ＥＦ％とＬＶＤに従って治療グループ間でランダム化される。
【０１３９】
ＥＦ％とＬＶＤの測定値は、平均値±標準誤差（ＳＥ）として表される。統計分析はＪＭＰ（登録商標）１３ソフトウェア（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．、Ｃａｒｙ，ＮＣ）を使用して実行され、ダネット検定は治療グループ間の統計比較に使用される。統計的有意性はＰ＜０．０５で受け入れられる。
【０１４０】
非臨床的有効性のための実施例９血漿濃度を決定するための研究デザイン。１０μｌ／時間の注入速度で、実施例９またはビヒクル（１Ｘダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水￥［ＤＰＢＳ］）をＡｌｚｅｔ（登録商標）ポンプ（Ｍｏｄｅｌ  ２ＭＬ１、Ａｌｚｅｔ（登録商標）Ｏｓｍｏｔｉｃ  Ｐｕｍｐｓ、Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）で４日間連続的に皮下（ＳＣ）投与される。実施例９のために投与される用量レベルは、ポンプ注入を使用して、０．２２、０．７３、２．１８、および７．２８ｍｇ／ｋｇ／日である。４日目に、血漿濃度を測定するために血液サンプルが収集され、輸液ポンプが取り外される。投与開始から７日後、すべての動物の心機能（ＥＦ％）と構造（ＬＶＤ）を評価する。投与開始から１４日後、ＥＦ％とＬＶＤをビヒクル投与群と２つの最高用量群について評価する。
【０１４１】
結果。実施例９の治療は、浸透圧ポンプを使用して９６時間投与された場合の心機能（ＥＦ％）の用量依存的改善を実証している（表１０）。２．１８および７．２８ｍｇ／ｋｇ／日を投与された高用量群は、注入開始後２週間、心機能の改善を示す（表１０）。これらの用量は、それぞれ２９．６２および７２．２４ｎＭの定常状態血漿濃度を達成する（表１１）。処理されたすべてのＭＩ動物は、ビヒクル群と比較して、より少ないＬＶＤ拡張を示す（表１０）。
【表１０】
2021522314.tif 000011
【表１１】
2021522314.tif 000012
【０１４２】
非臨床的有効性のための注入期間を決定するための研究デザイン。１０μｌ／時間の注入速度で、実施例９の２．１８ｍｇ／ｋｇ／日またはビヒクル（ＤＰＢＳ）は、Ａｌｚｅｔ（登録商標）ポンプを介して４８、７２、または９６時間ＳＣ投与される。指定された注入フェーズの終わりに、血漿濃度を決定するために血液サンプルが収集され、注入ポンプが取り外される。投与開始から７日後、すべての動物の心機能（ＥＦ％）と構造（ＬＶＤ）を評価する。
【０１４３】
結果。表１２に見られるように、本研究では、実施例９の処置は、Ａｌｚｅｔ（登録商標）ポンプを用いて４８〜９６時間投与した場合に心機能の輸液持続時間依存性の改善を実証する。実施例９の７２時間および９６時間の注入は、投薬開始後７日目に有意なＥＦの改善をもたらす。処置されたすべてのＭＩ動物は、ビヒクル群と比較して、より少ないＬＶＤ拡張を示す。
【表１２】
2021522314.tif 000013
【表１３】
2021522314.tif 000014
【０１４４】
非臨床データは、実施例９の血漿濃度が７２〜９６時間、３〜１００ｎＭに維持された場合、ＨＦｒＥＦのラットモデルにおいてＬＶＥＦが改善したことを示した。
【０１４５】
ラットＭＩモデルの心臓機能および構造に対する実施例１０の効果
カプトプリル治療、実施例１０処置または併用処置後の心機能および構造変化を評価するために、駆出率が低下した心不全（ＨＦｒＥＦ）のラットモデルで非臨床的有効性薬理学研究が実施される。
【０１４６】
方法。外科的に誘発された心筋梗塞を有する雄のスプラーグドーリーラットを購入し、麻酔をかけ、手順全体を通して積極的に換気する。４番目と５番目の肋骨の間を切開し、心臓を露出させる。左冠状動脈は永久に結紮されている。すべてのラットは、温度と湿度が制御された部屋に個別に収容され、１２時間の明／暗サイクルで維持される。手術の２〜３週間後、ラットはＶｅｖｏ  ２１００超音波システムを使用して駆出率（ＥＦ％）と左心室寸法（ＬＶＤ）を決定するために経胸壁心エコー検査を受ける。ラットは、ＥＦ％とＬＶＤに従って治療グループ間でランダム化される。
【０１４７】
ＥＦ％とＬＶＤの測定値は、平均値±標準誤差（ＳＥ）として表される。統計分析はＪＭＰ（登録商標）１３ソフトウェア（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．、Ｃａｒｙ，ＮＣ）を使用して実行され、ダネット検定は治療グループ間の統計比較に使用される。統計的有意性はＰ＜０．０５で受け入れられる。
【０１４８】
研究デザイン。ＭＩ手術の３週間後、ＥＦ％とＬＶＤに従って、動物を２つの治療グループ（プラセボまたはカプトプリル、飲料水中２ｇ／Ｌ、アドリブ）にランダム化する。投与開始から３週間後と４週間後、経胸壁心エコー検査により心機能（ＥＦ％）と構造（ＬＶＤ）を評価する。動物はさらに、心機能（ＥＦ％）および構造（ＬＶＤ）に基づいて、以下のグループ：プラセボ、実施例１０、カプトプリルおよび実施例１０＋カプトプリルへの追加のグループにランダム化される。実施例１０の動物群は、２回目の無作為化後４週目に単回注射を受ける。心機能（ＥＦ％）と構造（ＬＶＤ）は５週目と６週目に評価される。
【０１４９】
結果。結果を表１４に示す。
【表１４】
2021522314.tif 000015
【０１５０】
表１４に見られるように、カプトプリル処置は６週間の処置の過程で心機能の低下を遅らせたが（統計的に有意ではない）、実施例１０の処置は心機能（ＥＦ％）を有意に改善し、１回の処置後のＬＶ拡張を減少させた。
【０１５１】
ラットＭＩモデルの心臓機能および構造に対する実施例１１の効果
非臨床的有効性薬理学研究は、駆出率が低下した心不全（ＨＦｒＥＦ）のラットモデルで実施され、実施例１１の用量反応関係を特定する。
【０１５２】
方法。外科的に誘発された心筋梗塞を有する雄のスプラーグドーリーラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから購入する。手短に言えば、ラットは、手順全体を通して麻酔され、積極的に換気される。４番目と５番目の肋骨の間を切開し、心臓を露出させる。左冠状動脈は永久に結紮されている。偽手術された動物は、絹の縫合糸が結ばれることなく左冠状動脈の周りに配置されることを除いて、同じ手順を受ける。すべてのラットは、温度と湿度が制御された部屋に個別に収容され、１２時間の明／暗サイクルで維持される。手術の３週間後、ラットはＶｅｖｏ  ２１００超音波システムを使用して駆出率（ＥＦ％）と左心室寸法（ＬＶＤ）を決定するために経胸壁心エコー検査を受ける。ラットは、ＥＦ％とＬＶＤに従って治療グループ間でランダム化される。
【０１５３】
ＥＦ％とＬＶＤの測定値は、平均値±標準誤差（ＳＥ）として表される。統計分析はＪＭＰ（登録商標）１３ソフトウェア（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．、Ｃａｒｙ，ＮＣ）を使用して実行され、ダネット検定は治療グループ間の統計比較に使用される。統計的有意性はＰ＜０．０５で受け入れられる。
【０１５４】
研究デザイン。ＭＩ手術の２〜３週間後、動物を治療群に割り当て、ビヒクル（ＤＰＢＳ）の単回注射または実施例１１の３つの用量レベル（０．３、１、３ｍｇ／ｋｇ）のうちの１つで処置する。投与後７日、１４日、２１日で、すべての動物の心機能（ＥＦ％）と構造（ＬＶＤ）を評価する。
【０１５５】
結果。結果を表１５に示す。
【表１５】
2021522314.tif 000016
【０１５６】
表１５に見られるように、実施例１１の処置は、心機能（ＥＦ％）の用量依存的な改善を示す。高用量群は、治療後２週間、心機能の改善を示す。研究の過程で、グループ間でＬＶＤ拡張の違いは観察されない（データは示していない）。
【０１５７】
心臓毒性に対する実施例９〜１１の影響
毒性試験は、ラットおよび／またはカニクイザルの実施例９〜１１で実施される。実施例１０は、０．３ｍｇ／ｋｇの単回皮下注射でラットに投与され、これは、１６８時間より長く検出可能な血漿濃度をもたらす。ラットは犠牲にされ、組織の検査は心臓の変性と壊死を明らかにする。実施例１１は、３０ｍｇ／ｋｇの単回皮下注射でラットに投与される。血漿中濃度は９６時間で検出できなかった。ラットは犠牲にされ、組織の検査は心臓の変性および／または壊死の証拠を明らかにしない。実施例１１は、ＳＣボーラス注射により、雄および雌のサルに３ｍｇ／ｋｇの単回投与で投与される。ラットでの薬物動態とは対照的に、サルでの単回注射は、１６８時間以上かかる検出可能な血漿濃度をもたらす。サルは犠牲にされ、組織の検査は心臓の変性と壊死を明らかにする。ラットにおける１時間未満のＳＣ投与後の半減期を示す実施例９は、皮下（ＳＣ）移植ポンプによって９６〜１６８時間にわたって３〜３００ｎＭの範囲の血漿濃度をもたらす用量で投与される。ラットは犠牲にされ、組織の検査は心臓の変性および／または壊死の証拠を明らかにしない。サルに５時間未満のＳＣ投与後の半減期を有する実施例９は、外科的に配置されたＳＣまたは静脈内（ＩＶ）カテーテルによって雄および雌のサルに９６時間３０〜１０００ｎＭの範囲の血漿濃度をもたらす用量で投与される。サルは犠牲にされ、組織の検査は心臓毒性および／または壊死の証拠を明らかにしない。これらのデータは、ＮＲＧ４化合物への曝露期間を制限することにより、心臓毒性を引き起こすことなくＮＲＧ４化合物を投与できることを示している。
配列
配列番号１−ヒトＮＲＧ４
ＤＨＥＥＰＣＧＰＳＨ  ＫＳＦＣＬＮＧＧＬＣ  ＹＶＩＰＴＩＰＳＰＦ  ＣＲＣＶＥＮＹＴＧＡ  ＲＣＥＥＶＦＬ
配列番号２−ＮＲＧ４化合物
Ｘ０ＧＨＥＥＰＣＧＸ８ＳＨＫＳＦＣＬＮＧＧＬＣＹＸ２２ＩＰＴＸ２６ＰＳＰＦＣＲＣＶＸ３５ＮＹＴＧＡＲＣＥＸ４４ＶＦＬ
（式中、
Ｘ０は、Ｔ、ＰＴ、ＭＰＴ、Ｓ、ＧＳ、ＧＧＳ、ＧＧＧＳ、および（ＧＧＧＧＸλ）ｎ（式中、Ｘλは、Ｑ、Ａ、ＥまたはＳであり、ｎ＝１〜５である（配列番号５））からなる群から選択され、または存在せず）、
Ｘ８はＥまたはＰであり、
Ｘ２２はＱまたはＶであり、
Ｘ２６はＦまたはＩであり、
Ｘ３５はＥまたはＡであり、
Ｘ４４はＨ、ＫまたはＥである）。
発現された配列番号３ヒトＮＲＧ４完全配列
ＭＰＴＤＨＥＥＰＣＧ  ＰＳＨＫＳＦＣＬＮＧ  ＧＬＣＹＶＩＰＴＩＰ  ＳＰＦＣＲＣＶＥＮＹ  ＴＧＡＲＣＥＥＶＦＬ  ＰＧＳＳＩＱＴＫＳＮ  ＬＦＥＡＦＶＡＬＡＶ  ＬＶＴＬＩＩＧＡＦＹ  ＦＬＣＲＫＧＨＦＱＲ  ＡＳＳＶＱＹＤＩＮＬ  ＶＥＴＳＳＴＳＡＨＨ  ＳＨＥＱＨ
配列番号４−ＮＲＧ４化合物
ＧＨＥＥＰＣＧＰＳＨ  ＫＳＦＣＬＮＧＧＬＣ  ＹＱＩＰＴＩＰＳＰＦ  ＣＲＣＶＥＮＹＴＧＡ  ＲＣＥＫＶＦＬ
配列番号５−グリシンに富むペプチドまたはリンカー
（ＧＧＧＧＸλ）ｎ
（式中、
ＸλはＱ、Ａ、Ｅ、またはＳであり、および
ｎは１〜５である）。
配列番号６−ＩｇＧ  Ｆｃ領域
ＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
配列番号７−ＩｇＧ  Ｆｃ領域
ＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
配列番号８−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域
ＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＡＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＡＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
配列番号９−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域
ＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＡＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＡＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
配列番号１０−ＮＲＧ４化合物
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧｈｅｅｐｃｇｐｓｈ  ｋｓｆｃｌｎｇｇｌｃ  ｙｖｉｐｔｉｐｓｐｆ  ｃｒｃｖｅｎｙｔｇａ  ｒｃｅｅｖｆｌ
配列番号１１−ＮＲＧ４化合物
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧｈｅｅｐｃｇＥｓｈ  ｋｓｆｃｌｎｇｇｌｃ  ｙｖｉｐｔｉｐｓｐｆ  ｃｒｃｖｅｎｙｔｇａ  ｒｃｅｅｖｆｌ
配列番号１２−ＮＲＧ４化合物
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧｈｅｅｐｃｇｐｓｈ  ｋｓｆｃｌｎｇｇｌｃ  ｙＱｉｐｔｉｐｓｐｆ  ｃｒｃｖｅｎｙｔｇａ  ｒｃｅｅｖｆｌ
配列番号１３−ＮＲＧ４化合物
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧｈｅｅｐｃｇｐｓｈ  ｋｓｆｃｌｎｇｇｌｃ  ｙｖｉｐｔＦｐｓｐｆ  ｃｒｃｖｅｎｙｔｇａ  ｒｃｅｅｖｆｌ
配列番号１４−ＮＲＧ４化合物
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧｈｅｅｐｃｇｐｓｈ  ｋｓｆｃｌｎｇｇｌｃｙｖｉｐｔｉｐｓｐｆｃｒｃｖＡｎｙｔｇａ  ｒｃｅｅｖｆｌ
配列番号１５−ＮＲＧ４化合物
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧｈｅｅｐｃｇｐｓｈｋｓｆｃｌｎｇｇｌｃｙｖｉｐｔＦｐｓｐｆｃｒｃｖｅｎｙｔｇａｒｃｅＫｖｆｌ
配列番号１６−ＮＲＧ４化合物
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧｈｅｅｐｃｇｐｓｈｋｓｆｃｌｎｇｇｌｃｙｖｉｐｔＦｐｓｐｆｃｒｃｖｅｎｙｔｇａｒｃｅＨｖｆｌ
配列番号１７−ＮＲＧ４化合物
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧｈｅｅｐｃｇＥｓｈｋｓｆｃｌｎｇｇｌｃｙｖｉｐｔＦｐｓｐｆｃｒｃｖｅｎｙｔｇａｒｃｅｅｖｆｌ
配列番号１８−ＮＲＧ４化合物
ＧＧＧＧＳＧＨＥＥＰＣＧＰＳＨＫＳＦＣＬＮＧＧＬＣＹＱＩＰＴＩＰＳＰＦＣＲＣＶＥＮＹＴＧＡＲＣＥＫＶＦＬ
配列番号１９−ＮＲＧ４化合物
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧｈｅｅｐｃｇｐｓｈｋｓｆｃｌｎｇｇｌｃｙＱｉｐｔｉｐｓｐｆｃｒｃｖｅｎｙｔｇａｒｃｅＫｖｆｌ
配列番号２０
ＧＧＧＳ
【配列表】
2021522314000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年12月28日(2020.12.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＮＲＧ４のアミノ酸配列（配列番号１）と比較して、１位のＤ残基のＧ残基への修飾および最大５つの追加の修飾を含む、ＮＲＧ４化合物。
【請求項２】
以下の式を含む化合物であって、
Ｘ０ＧＨＥＥＰＣＧＸ８ＳＨＫＳＦＣＬＮＧＧＬＣＹＸ２２ＩＰＴＸ２６ＰＳＰＦＣＲＣＶＸ３５ＮＹＴＧＡＲＣＥＸ４４ＶＦＬ
式中、
Ｘ０は、Ｔ、ＰＴ、ＭＰＴ、Ｓ、ＧＳ、ＧＧＳ、ＧＧＧＳ、および（ＧＧＧＧＸλ）ｎ（式中、Ｘλは、Ｑ、Ａ、ＥまたはＳであり、ｎ＝１〜５である（配列番号５））からなる群から選択され、または存在せず）、
Ｘ８は、ＥまたはＰであり、
Ｘ２２は、ＱまたはＶであり、
Ｘ２６は、ＦまたはＩであり、
Ｘ３５は、ＥまたはＡであり、
Ｘ４４は、Ｈ、Ｋ、またはＥである、化合物
（配列番号２）。
【請求項３】
Ｘ８はＰであり、Ｘ２２はＶであり、Ｘ２６はＩであり、Ｘ３５はＥであり、Ｘ４４はＥである、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｘ８はＥであり、Ｘ２２はＶであり、Ｘ２６はＩであり、Ｘ３５はＥであり、Ｘ４４はＥである、請求項２に記載の化合物。
【請求項５】
Ｘ８はＰであり、Ｘ２２はＱであり、Ｘ２６はＩであり、Ｘ３５はＥであり、Ｘ４４はＥである、請求項２に記載の化合物。
【請求項６】
Ｘ８はＰであり、Ｘ２２はＶであり、Ｘ２６はＦであり、Ｘ３５はＥであり、Ｘ４４はＥである、請求項２に記載の化合物。
【請求項７】
Ｘ８はＰであり、Ｘ２２はＶであり、Ｘ２６はＩであり、Ｘ３５はＡであり、Ｘ４４はＨまたはＥである、請求項２に記載の化合物。
【請求項８】
Ｘ８はＰであり、Ｘ２２はＶであり、Ｘ２６はＦであり、Ｘ３５はＥであり、Ｘ４４はＫである、請求項２に記載の化合物。
【請求項９】
Ｘ８はＰであり、Ｘ２２はＶであり、Ｘ２６はＦであり、Ｘ３５はＥであり、Ｘ４４はＨである、請求項２に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｘ８はＥであり、Ｘ２２はＶであり、Ｘ２６はＦであり、Ｘ３５はＥであり、Ｘ４４はＥである、請求項２に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｘ８はＰであり、Ｘ２２はＱであり、Ｘ２６はＩであり、Ｘ３５はＥであり、Ｘ４４はＫである、請求項２に記載の化合物。
【請求項１２】
ＩｇＧ  Ｆｃ領域をさらに含む、請求項２〜１１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｘ０が配列番号５であり、ＸλがＳであり、ｎ＝３であり、前記ＩｇＧ  Ｆｃ領域が配列番号６および配列番号７の二量体を含み、Ｘ０のＮ末端アミノ酸が、配列番号７のＣ末端アミノ酸に融合している、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｘ０が配列番号５であり、ＸλがＳであり、ｎ＝３であり、前記ＩｇＧ  Ｆｃ領域が、配列番号８および配列番号９の二量体を含み、Ｘ０のＮ末端アミノ酸が、配列番号９のＣ末端アミノ酸に融合している、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｘ０が配列番号５であり、ＸλがＳであり、ｎ＝１である、請求項２〜１１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１６】
前記化合物が、配列番号４、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２〜１１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１７】
配列番号１８のアミノ酸配列からなる化合物。
【請求項１８】
前記化合物が、天然のヒトＮＲＧ４のものよりも大きく、天然のヒトＮＲＧ１の最大活性の少なくとも７０％である、ＨＥＲ４結合関連活性を有する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１９】
前記化合物がＨＥＲ３結合関連活性を有しない、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の化合物と、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の化合物を含むポンプ装置。
【請求項２２】
ＨＦｒＥＦの治療または予防に使用するための請求項１〜１９のいずれか１項に記載のＮＲＧ４化合物であって、４８〜９６時間投与される、ＮＲＧ４化合物。
【国際調査報告】
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