(57)【要約】  標的ＤＮＡ結合に対して代替プロトスペーサー隣接モチーフを利用する操作されたＣａｓ９システム、該操作されたＣａｓ９システムをコードする核酸、および真核細胞における標的染色体配列を修飾するための該操作されたＣａｓ９システムを使用する方法。
2021505180.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
操作されたＣａｓ９タンパク質および操作されたガイドＲＮＡを含むシステムであって、操作されたガイドＲＮＡは、操作されたＣａｓ９タンパク質と複合体を形成するように設計され、操作されたガイドＲＮＡは、二本鎖配列において標的配列とハイブリダイズするように設計された５’ガイド配列を含み、標的配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に対して５’であり、ＰＡＭは、表Ａに列挙されている配列を有する、システム。
【請求項２】
操作されたＣａｓ９タンパク質が、その野生型対応物と比較して少なくとも１つの修飾を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
少なくとも１つの修飾が、少なくとも１つの異種ドメインの付加を含む、請求項２に記載のシステム。
【請求項４】
少なくとも１つの異種ドメインが、核局在化シグナル、細胞膜透過ドメイン、マーカードメイン、クロマチン調節モチーフ、エピジェネティック修飾ドメイン、転写制御ドメイン、ＲＮＡアプタマー結合ドメイン、またはそれらの組合せである、請求項２または３に記載のシステム。
【請求項５】
少なくとも１つの修飾が、１つ以上のアミノ酸の置換、１つ以上のアミノ酸の挿入、１つ以上のアミノ酸の欠失、またはそれらの組合せを含む、請求項２に記載のシステム。
【請求項６】
少なくとも１つの修飾が、ＲｕｖＣドメイン、ＨＮＨドメイン、ＲＥＣドメイン、ＰＡＭ相互作用ドメイン、またはそれらの組合せ内にある、請求項５に記載のシステム。
【請求項７】
操作されたＣａｓ９タンパク質が、ヌクレアーゼであり二本鎖配列の両方の鎖を切断するか、ニッカーゼであり二本鎖配列の一本鎖を切断するか、または、ヌクレアーゼまたはニッカーゼ活性を有さない、請求項１から６のいずれかに記載のシステム。
【請求項８】
操作されたガイドＲＮＡが、単一の分子である、請求項１から７のいずれかに記載のシステム。
【請求項９】
操作されたガイドＲＮＡ配列が、操作されたガイドＲＮＡ内で塩基対形成を容易にするように最適化される、操作されたガイドＲＮＡ内で塩基対形成を最小限にする、操作されたガイドＲＮＡの安定性を増加させる、真核細胞において操作されたガイドＲＮＡの転写を容易にする、またはそれらの組合せである、請求項１から８のいずれかに記載のシステム。
【請求項１０】
操作されたＣａｓ９タンパク質が、バチルス・スミスイ（Bacillus smithii）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、パラサテレラ・エクスクレメンティホミニス（Parasutterella excrementihominis）、マイコプラズマ・カニス（Mycoplasma canis）、マイコプラズマ・ガリセプティカム（Mycoplasma gallisepticum）、アッカーマンシア・グリカニフィラ（Akkermansia glycaniphila）、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）、オエノコッカス・キタハラエ（Oenococcus kitaharae）、ビフィドバクテリウム・ボンビ（Bifidobacterium bombi）、アシッドサーマス・セルロリティカス（Acidothermus cellulolyticus）、アリサイクロバチラス・ヘスペリダム（Alicyclobacillus hesperidum）、ウォリネラ・サクシノゲネス（Wolinella succinogenes）、ニトラティフラクター・サルスギニス（Nitratifractor salsuginis）、ラルストニア・シジギ（Ralstonia syzygii）、またはコリネバクテリウム・ジフテリア（Corynebacterium diphtheria）に由来する、請求項１から９のいずれかに記載のシステム。
【請求項１１】
操作されたＣａｓ９タンパク質がバチルス・スミスイに由来し、それが認識するＰＡＭ配列が５’−ＮＮＮＮＣＡＡＡ−３’である、操作されたＣａｓ９タンパク質がラクトバチルス・ラムノサスに由来し、それが認識するＰＡＭ配列が５’−ＮＧＡＡＡ−３’である、操作されたＣａｓ９タンパク質がパラサテレラ・エクスクレメンティホミニスに由来し、それが認識するＰＡＭ配列が５’−ＮＧＧ−３’である、操作されたＣａｓ９タンパク質がマイコプラズマ・カニスに由来し、それが認識するＰＡＭ配列が５’−ＮＮＧＧ−３’である、操作されたＣａｓ９タンパク質がマイコプラズマ・ガリセプティカムに由来し、それが認識するＰＡＭ配列が５’−ＮＮＡＡＴ−３’である、操作されたＣａｓ９タンパク質がアッカーマンシア・グリカニフィラに由来し、それが認識するＰＡＭ配列が５’−ＮＮＮＲＴＡ−３’である、操作されたＣａｓ９タンパク質がアッカーマンシア・ムシニフィラに由来し、それが認識するＰＡＭ配列が５’−ＭＭＡＣＣＡ−３’である、操作されたＣａｓ９タンパク質がオエノコッカス・キタハラエに由来し、それが認識するＰＡＭ配列が５’−ＮＮＧ−３’である、操作されたＣａｓ９タンパク質がビフィドバクテリウム・ボンビに由来し、それが認識するＰＡＭ配列が５’−ＮＮＮＮＧＲＹ−３’である、操作されたＣａｓ９タンパク質がアシッドサーマス・セルロリティカスに由来し、それが認識するＰＡＭ配列が５’−ＮＧＧ−３’である、操作されたＣａｓ９タンパク質がアリサイクロバチラス・ヘスペリダムに由来し、それが認識するＰＡＭ配列が５’−ＮＧＧ−３’である、操作されたＣａｓ９タンパク質がウォリネラ・サクシノゲネスに由来し、それが認識するＰＡＭ配列が５’−ＮＧＧ−３’である、操作されたＣａｓ９タンパク質がニトラティフラクター・サルスギニスに由来し、それが認識するＰＡＭ配列が５’−ＮＲＧＮＫ−３’である、操作されたＣａｓ９タンパク質がラルストニア・シジギに由来し、それが認識するＰＡＭ配列が５’−ＧＧＧＲＧ−３’である、または、操作されたＣａｓ９タンパク質がコリネバクテリウム・ジフテリアに由来し、それが認識するＰＡＭ配列が５’−ＮＮＡＭＭＭＣ−３’である、ここでＫはＧまたはＴであり；ＭはＡまたはＣであり：ＮはＡ、Ｃ、Ｇ、またはＴであり；ＲはＡまたはＧであり；ＹはＣまたはＴである、請求項１から１０のいずれかに記載のシステム。
【請求項１２】
操作されたＣａｓ９タンパク質が、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、または１２４に対して少なくとも約９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１から１１のいずれかに記載のシステム。
【請求項１３】
操作されたＣａｓ９タンパク質が、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、または１２４に示されているアミノ酸配列を有する、請求項１から１２のいずれかに記載のシステム。
【請求項１４】
複数の核酸が、操作されたＣａｓ９タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸、および操作されたガイドＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸を含む、請求項１から１３のいずれかに記載のシステムをコードする複数の核酸。
【請求項１５】
操作されたＣａｓ９タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸がＲＮＡである、請求項１４に記載の複数の核酸。
【請求項１６】
操作されたＣａｓ９タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸がＤＮＡである、請求項１４に記載の複数の核酸。
【請求項１７】
操作されたＣａｓ９タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸が、真核細胞における発現のために最適化されたコドンである、請求項１４から１６のいずれかに記載の複数の核酸。
【請求項１８】
真核細胞が、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、植物細胞、または単細胞真核生物である、請求項１７に記載の複数の核酸。
【請求項１９】
操作されたガイドＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸がＤＮＡである、請求項１４に記載の複数の核酸。
【請求項２０】
操作されたＣａｓ９タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸が、インビトロＲＮＡ合成または細菌細胞におけるタンパク質発現のためのファージプロモーター配列に作動可能に連結しており、操作されたガイドＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸が、インビトロＲＮＡ合成のためのファージプロモーター配列に作動可能に連結している、請求項１４から１９のいずれかに記載の複数の核酸。
【請求項２１】
操作されたＣａｓ９タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸が、真核細胞における発現のための真核プロモーター配列に作動可能に連結しており、操作されたガイドＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸が、真核細胞における発現のための真核プロモーター配列に作動可能に連結している、請求項１４から１９のいずれかに記載の複数の核酸。
【請求項２２】
請求項１４から２１のいずれかに記載の複数の核酸を含む、少なくとも１つのベクター。
【請求項２３】
プラスミドベクター、ウイルスベクター、または自己複製ウイルスＲＮＡレプリコンである、請求項２２に記載の少なくとも１つのベクター。
【請求項２４】
請求項１から１３のいずれかに定義された操作されたＣａｓ９タンパク質および操作されたガイドＲＮＡを含む少なくとも１つのシステム、請求項１４から２１のいずれかに定義された少なくとも１つの核酸、または請求項２２または２３に定義された少なくとも１つのベクター、を含む真核細胞。
【請求項２５】
ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、植物細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、または単細胞真核生物である、請求項２４に記載の真核細胞。
【請求項２６】
インビボ、エキソビボ、またはインビトロである、請求項２４または２５に記載の真核細胞。
【請求項２７】
真核細胞に、請求項１から１３のいずれかに定義された操作されたＣａｓ９タンパク質および操作されたガイドＲＮＡを含む少なくとも１つのシステム、請求項１４から２１のいずれかに定義された少なくとも１つの核酸、または請求項２２または２３に定義された少なくとも１つのベクター、および所望により、少なくとも１つのドナーポリヌクレオチドを導入することを含む、真核細胞における染色体配列を修飾するための方法であって、少なくとも１つの操作されたガイドＲＮＡは、染色体配列の修飾が起こるように染色体配列における標的部位に少なくとも１つの操作されたＣａｓ９タンパク質をガイドする、方法。
【請求項２８】
修飾が、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、少なくとも１つのヌクレオチドの変換、少なくとも１つのヌクレオチドの修飾、少なくとも関連したヒストンタンパク質の修飾、またはそれらの組合せを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
操作されたＣａｓ９タンパク質がヌクレアーゼまたはニッカーゼ活性を有し、少なくとも１つのドナーポリヌクレオチドが細胞に導入されず、修飾が少なくとも１つのインデルを含む、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
修飾が染色体配列の不活性化を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
操作されたＣａｓ９タンパク質がヌクレアーゼまたはニッカーゼ活性を有し、少なくとも１つのドナーポリヌクレオチドが細胞に導入され、修飾が染色体配列における少なくとも１つのヌクレオチドの変化を含む、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３２】
少なくとも１つのドナーポリヌクレオチドが、染色体配列における標的部位付近の配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチド変化を有するドナー配列である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
少なくとも１つのドナーポリヌクレオチドが、外因性配列に対応するドナー配列を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
ドナー配列が、染色体配列における標的部位の上流および下流に位置する配列に対して実質的な配列同一性を有する配列に隣接している、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
ドナー配列が、少なくとも１つの操作されたＣａｓ９タンパク質により生成されるオーバーハングと適合性のある短いオーバーハングに隣接している、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３６】
真核細胞が、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、植物細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、または単細胞真核生物である、請求項２７から３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
真核細胞がインビボ、エキソビボ、またはインビトロである、請求項２７から３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
少なくとも１つのクロマチン調節モチーフに連結したＣａｓ９タンパク質を含む融合タンパク質であって、Ｃａｓ９タンパク質は、バチルス・スミスイ、ラクトバチルス・ラムノサス、パラサテレラ・エクスクレメンティホミニス、マイコプラズマ・カニス、マイコプラズマ・ガリセプティカム、アッカーマンシア・グリカニフィラ、アッカーマンシア・ムシニフィラ、オエノコッカス・キタハラエ、ビフィドバクテリウム・ボンビ、アシッドサーマス・セルロリティカス、アリサイクロバチラス・ヘスペリダム、ウォリネラ・サクシノゲネス、ニトラティフラクター・サルスギニス、ラルストニア・シジギ、またはコリネバクテリウム・ジフテリアのＣａｓ９タンパク質である、融合タンパク質。
【請求項３９】
少なくとも１つのクロマチン調節モチーフが、高移動度グループ（ＨＭＧ）ボックス（ＨＭＧＢ）ＤＮＡ結合ドメイン、ＨＭＧヌクレオソーム結合（ＨＭＧＮ）タンパク質、ヒストンＨ１変異体に由来する中央球状ドメイン、クロマチンリモデリング複合体タンパク質に由来するＤＮＡ結合ドメイン、またはそれらの組合せである、請求項３８に記載の融合タンパク質。
【請求項４０】
少なくとも１つのクロマチン調節モチーフが、ＨＭＧＢ１ボックスＡドメイン、ＨＭＧＮ１タンパク質、ＨＭＧＮ２タンパク質、ＨＭＧＮ３ａタンパク質、ＨＭＧＮ３ｂタンパク質、ヒストンＨ１中央球状ドメイン、模倣スイッチ（ＩＳＷＩ）タンパク質ＤＮＡ結合ドメイン、クロモドメイン−ヘリカーゼ−ＤＮＡタンパク質１（ＣＨＤ１）ＤＮＡ結合ドメイン、またはそれらの組合せである、請求項３８または３９に記載の融合タンパク質。
【請求項４１】
少なくとも１つのクロマチン調節モチーフが、Ｃａｓ９タンパク質に、化学結合を介して直接的に、リンカーを介して間接的に、またはそれらの組合せで連結している、請求項３８から４０のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項４２】
少なくとも１つのクロマチン調節モチーフが、Ｃａｓ９タンパク質に、そのＮ−末端、Ｃ−末端、内部位置、またはそれらの組合せで連結している、請求項３８から４１のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項４３】
少なくとも１つの核局在化シグナルをさらに含む、請求項３８から４２のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項４４】
少なくとも１つの、少なくとも１つの細胞膜透過ドメイン、少なくとも１つのマーカードメイン、またはそれらの組合せをさらに含む、請求項３８から４３のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項４５】
融合タンパク質が、配列番号：１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、または１２４に対して少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項３８から４４のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項４６】
融合タンパク質が、配列番号：１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、または１２４に示されているアミノ酸配列を有する、請求項３８から４５のいずれかに記載の融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本願は、２０１８年２月１５日に提出された米国仮出願番号６２／６３１，３０４、および２０１８年８月２１日に提出された米国仮出願番号６２／７２０，５２５の利益を請求し、各記載をその全体において出典明示によりここに包含させる。
【０００２】
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体において出典明示によりここに包含させる。２０１９年２月１２日に作成された該ＡＳＣＩＩコピーは、Ｐ１８＿０２３ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ３７０，３０５バイトサイズである。
【０００３】
分野
本開示は、操作されたＣａｓ９システム、該システムをコードする核酸、およびゲノム修飾のための該システムを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
ゲノム編集ツールとしての細菌クラス２  クラスター化反復短回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）およびＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの最近の開発は、真核ゲノム修飾のための部位特異的エンドヌクレアーゼを操作する前例のない簡単さおよび単純さを提供している。しかしながら、各ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは標的ＤＮＡ結合のための特定のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を必要とするため、各システムはあるゲノム部位に限定される。現在最も広く採用されている化膿連鎖球菌Ｃａｓ９（ＳｐｙＣａｓ９）は、頻繁に発生するＰＡＭ（５’−ＮＧＧ−３’）を標的化のために使用するが、真核のゲノム、とりわけ哺乳動物のゲノムおよび植物が、ＤＮＡ配列において非常に複雑であり不均一であるため、このようなモチーフを欠いている多くのゲノム部位から未だ除外される。さらに、相同組み換え修復（ＨＤＲ）または塩基エディター、例えばｄＣａｓ９／シチジンデアミナーゼおよびｄＣａｓ９／アデノシンデアミナーゼを使用する正確な遺伝子編集は、しばしば、最適な編集結果をなし遂げるために、単一の塩基対の分解能（resolution）でさえ、正確なＤＮＡ結合位置を必要とする。したがって、ゲノムのカバレッジ密度を増加させるために標的化のための新規なＰＡＭを使用する新規なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを開発する必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００５】
概要
本開示の種々の局面の中には、操作されたＣａｓ９タンパク質および操作されたガイドＲＮＡを含む操作されたＣａｓ９システムであって、各操作されたガイドＲＮＡは、操作されたＣａｓ９タンパク質と複合体を形成するように設計され、操作されたガイドＲＮＡは、二本鎖配列において標的配列とハイブリダイズするように設計された５’ガイド配列を含み、標的配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に対して５’であり、ＰＡＭは、表Ａに列挙されている配列を有する、操作されたＣａｓ９システムを含む。
【０００６】
本開示の別の局面は、該操作されたＣａｓ９システムをコードする複数の核酸および複数の該核酸を含む少なくとも１つのベクターを含む。
【０００７】
さらなる局面は、少なくとも１つの操作されたＣａｓ９システムおよび／または該操作されたＣａｓ９システムをコードする少なくとも１つの核酸を含む真核細胞を含む。
【０００８】
本開示のさらに別の局面は、真核細胞における染色体配列を修飾するための方法を含む。方法は、真核細胞に、操作されたＣａｓ９タンパク質および操作されたガイドＲＮＡを含む少なくとも１つの操作されたＣａｓ９システムおよび／または該操作されたＣａｓ９システムをコードする少なくとも１つの核酸、および所望により、少なくとも１つのドナーポリヌクレオチドを導入することを含み、少なくとも１つの操作されたガイドＲＮＡは、染色体配列の修飾が起こるように染色体配列における標的部位に少なくとも１つの操作されたＣａｓ９タンパク質をガイドする。
【０００９】
本開示の他の局面および特徴は、以下に詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、Ｃａｓ９オルソログによるインビトロ標的ＤＮＡ切断のために必要とされるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）のＷｅｂＬｏｇｏ分析を示す。横軸の数字は、ＰＡＭ配列におけるヌクレオチドの位置を示す。
【００１１】
【図２Ａ】図２Ａは、ＭｃａＣａｓ９、ＭｃａＣａｓ９−ＨＮ１ＨＢ１融合物（すなわち、アミノ末端でＨＭＧＮ１およびカルボキシル末端でＨＭＧＢ１ボックスＡ）、およびＭｃａＣａｓ９−ＨＮ１Ｈ１Ｇ融合物（すなわち、アミノ末端でＨＭＧＮ１およびカルボキシル末端でヒストンＨ１中央球状モチーフ）の切断効率（インデルのパーセントとして）を示す。各遺伝子座の標的部位は、表６において示される。エラーバーは平均±ＳＤ（ｎ＝３  生物学的再現）を示す。
【００１２】
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＰｅｘＣａｓ９、ＰｅｘＣａｓ９−ＨＮ１ＨＢ１融合物（すなわち、アミノ末端でＨＭＧＮ１およびカルボキシル末端でＨＭＧＢ１ボックスＡ）、およびＰｅｘＣａｓ９−ＨＮ１Ｈ１Ｇ融合物（すなわち、アミノ末端でＨＭＧＮ１およびカルボキシル末端でヒストンＨ１中央球状モチーフ）の切断効率（インデルのパーセントとして）を示す。各遺伝子座の標的部位は、表６において示される。エラーバーは平均±ＳＤ（ｎ＝３  生物学的再現）を示す。
【００１３】
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＢｓｍＣａｓ９、ＢｓｍＣａｓ９−ＨＮ１ＨＢ１融合物（すなわち、アミノ末端でＨＭＧＮ１およびカルボキシル末端でＨＭＧＢ１ボックスＡ）、およびＢｓｍＣａｓ９−ＨＮ１Ｈ１Ｇ融合物（すなわち、アミノ末端でＨＭＧＮ１およびカルボキシル末端でヒストンＨ１中央球状モチーフ）の切断効率（インデルのパーセントとして）を示す。各遺伝子座の標的部位は、表６において示される。エラーバーは平均±ＳＤ（ｎ＝３  生物学的再現）を示す。
【００１４】
【図２Ｄ】図２Ｄは、ＬｒｈＣａｓ９、ＬｒｈＣａｓ９−ＨＮ１ＨＢ１融合物（すなわち、アミノ末端でＨＭＧＮ１およびカルボキシル末端でＨＭＧＢ１ボックスＡ）、およびＬｒｈＣａｓ９−ＨＮ１Ｈ１Ｇ融合物（すなわち、アミノ末端でＨＭＧＮ１およびカルボキシル末端でヒストンＨ１中央球状モチーフ）の切断効率（インデルのパーセントとして）を示す。各遺伝子座の標的部位は、表６において示される。エラーバーは平均±ＳＤ（ｎ＝３  生物学的再現）を示す。
【００１５】
【図３】図３は、コントロールＣａｓ９およびＣａｓ９−ＣＭＭ融合ヌクレアーゼのオフターゲット活性（インデルのパーセントとして）を示す。エラーバーは平均±ＳＤ（ｎ＝３  生物学的再現）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
詳細な説明
本開示は、標的ＤＮＡ結合のために代替ＰＡＭを使用し、それによりゲノムのカバレッジ密度を増加させるオーソロガスＣａｓ９システムを提供する。例えば、これらの代替ＰＡＭのいくつかはＡおよび／またはＴ残基を含み、他の代替ＰＡＭＳはＧＣリッチである。そのため、これらの代替ＰＡＭを利用する操作されたＣａｓ９システムは、以前にアクセスできなかったゲノム遺伝子座の標的化ゲノム編集またはゲノム修飾を可能にする。
【００１７】
（Ｉ）操作されたＣａｓ９システム
本開示の１つの局面は、操作されたＣａｓ９タンパク質および操作されたガイドＲＮＡを含む操作されたＣａｓ９システムであって、各操作されたガイドＲＮＡは、特定の操作されたＣａｓ９タンパク質と複合体を形成するように設計されている、操作されたＣａｓ９システムを提供する。各操作されたガイドＲＮＡは、二本鎖配列において標的配列とハイブリダイズするように設計された５’ガイド配列を含み、標的配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に対して５’であり、ＰＡＭは、表Ａに列挙されている配列を有する。これらの操作されたＣａｓ９システムは、天然に起こらない。
【００１８】
（ａ）操作されたＣａｓ９タンパク質
操作されたＣａｓ９タンパク質は、その野生型対応物と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換、挿入、または欠失を含む。Ｃａｓ９タンパク質は、種々の細菌に存在するタイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲシステムにおける単一のエフェクタータンパク質である。本願明細書に記載されている操作されたＣａｓ９タンパク質は、アカリオクロリス（Acaryochloris）種、アセトハロビウム（Acetohalobium）種、アシダミノコッカス（Acidaminococcus）種、アシドチオバシラス（Acidithiobacillus）種、アシドサーマス（Acidothermus）種、アッカーマンシア（Akkermansia）種、アリシクロバチルス（Alicyclobacillus）種、アロクロマチウム（Allochromatium）種、アモニフィックス（Ammonifex）種、アナベナ（Anabaena）種、アルトロスピラ（Arthrospira）種、バチルス（Bacillus）種、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）種、バークホルデリア（Burkholderiales）種、カルジセルロシルプター（Caldicelulosiruptor）種、カンピロバクター（Campylobacter）種、カンジダタス（Candidatus）種、クロストリジウム（Clostridium）種、コリネバクテリウム（Corynebacterium）種、クロコスフェラ（Crocosphaera）種、シアノテス（Cyanothece）種、エキシグオバクテリウム（Exiguobacterium）種、フィネゴルディア（Finegoldia）種、フランシセラ（Francisella）種、クテドノバクテル（Ktedonobacter）種、ラクノスピラ（Lachnospiraceae）種、ラクトバチルス（Lactobacillus）種、リングビア（Lyngbya）種、マリノバクター（Marinobacter）種、メタノハロビウム（Methanohalobium）種、ミクロシラ（Microscilla）種、ミクロコレウス（Microcoleus）種、ミクロキスティス（Microcystis）種、マイコプラズマ（Mycoplasma）種、ナトラナエロビウス（Natranaerobius）種、ナイセリア（Neisseria）種、ニトラティフラクター（Nitratifractor）種、ニトロソコッカス（Nitrosococcus）種、ノカルジオプシス（Nocardiopsis）種、ネンジュモ（Nodularia）種、ネンジュモ（Nostoc）種、オエノコッカス（Oenococcus）種、オスキラトリア（Oscillatoria）種、パラサテレラ(Parasutterella)種、ペロトマキュルム（Pelotomaculum）種、ペトロトーガ（Petrotoga）種、ポラロモナス（Polaromonas）種、プレボテーラ（Prevotella）種、シュードアルテロモナス（Pseudoalteromonas）種、ラルストニア（Ralstonia）種、スタフィロコッカス（Staphylococcus）種、ストレプトコッカス（Streptococcus）種、ストレプトマイセス（Streptomyces）種、ストレプトスポランギウム（Streptosporangium）種、シネココッカス（Synechococcus）種、サーモシフォ（Thermosipho）種、ベルコミクロビア（Verrucomicrobia）種、およびウォリネラ（Wolinella）種に由来してよい。
【００１９】
１つの態様において、本願明細書に記載されている操作されたＣａｓ９タンパク質は、アシドサーマス種、アッカーマンシア種、アリシクロバチルス種、バチルス種、ビフィドバクテリウム種、バークホルデリア種、コリネバクテリウム種、ラクトバチルス種、マイコプラズマ種、ニトラティフラクター種、オエノコッカス種、パラサテレラ種、ラルストニア種、またはウォリネラ種に由来する。
【００２０】
特定の態様において、本願明細書に記載されている操作されたＣａｓ９タンパク質は、アシッドサーマス・セルロリティカス（Acidothermus cellulolyticus）（Ａｃｅ）、アッカーマンシア・グリカニフィラ（Akkermansia glycaniphila）（Ａｇｌ）、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）（Ａｍｕ）、アリサイクロバチラス・ヘスペリダム（Alicyclobacillus hesperidum）（Ａｈｅ）、バチルス・スミスイ（Bacillus smithii）（Ｂｓｍ）、ビフィドバクテリウム・ボンビ（Bifidobacterium bombi）（Ｂｂｏ）、コリネバクテリウム・ジフテリア（Corynebacterium diphtheria）（Ｃｄｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）（Ｌｒｈ）、マイコプラズマ・カニス（Mycoplasma canis）（Ｍｃａ）、マイコプラズマ・ガリセプティカム（Mycoplasma gallisepticum）（Ｍｇａ）、ニトラティフラクター・サルスギニス（Nitratifractor salsuginis）（Ｎｓａ）、オエノコッカス・キタハラエ（Oenococcus kitaharae）（Ｏｋｉ）、パラサテレラ・エクスクレメンティホミニス（Parasutterella excrementihominis）（Ｐｅｘ）、ラルストニア・シジギ（Ralstonia syzygii）（Ｒｓｙ）、またはウォリネラ・サクシノゲネス（Wolinella succinogenes）（Ｗｓｕ）に由来する。
【００２１】
野生型Ｃａｓ９タンパク質は、２つのヌクレアーゼドメイン、すなわち、ＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインを含み、これらそれぞれは二本鎖配列の一本鎖を切断する。Ｃａｓ９タンパク質はまた、ガイドＲＮＡ（例えば、ＲＥＣ１、ＲＥＣ２）またはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖（例えば、ＲＥＣ３）と相互作用するＲＥＣドメイン、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）（すなわち、ＰＡＭ相互作用ドメイン）と相互作用するドメインを含む。
【００２２】
Ｃａｓ９タンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質が改変された活性、特異性、および／または安定性を有するように１つ以上の修飾（すなわち、少なくとも１つのアミノ酸の置換、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、少なくとも１つのアミノ酸の挿入）を含むように操作されてもよい。
【００２３】
例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、ヌクレアーゼドメインの１つまたは両方を不活性化するように１つ以上の変異および／または欠失により操作されてもよい。１つのヌクレアーゼドメインの不活性化は、二本鎖配列の一本鎖を切断するＣａｓ９タンパク質（すなわち、Ｃａｓ９ニッカーゼ）を産生する。ＲｕｖＣドメインは、変異、例えばＤ１０Ａ、Ｄ８Ａ、Ｅ７６２Ａ、および／またはＤ９８６Ａにより不活性化されてもよく、ＨＮＨドメインは、変異、例えばＨ８４０Ａ、Ｈ５５９Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８５６Ａ、および／またはＮ８６３Ａ（化膿連鎖球菌Ｃａｓ９、ＳｐｙＣａｓ９の番号制を基準にして）により不活性化されてもよい。両方のヌクレアーゼドメインの不活性化は、切断活性を有さないＣａｓ９タンパク質（すなわち、触媒的に不活性な、または不活性型（dead）Ｃａｓ９）を産生する。
【００２４】
Ｃａｓ９タンパク質はまた、改善された標的化特異性、改善された忠実性、改変されたＰＡＭ特異性、減少したオフターゲット効果、および／または増加した安定性を有するように１つ以上のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入により操作されてよい。標的化特異性を改善する、忠実性を改善する、および／またはオフターゲット効果を減少させる１つ以上の変異の非限定的な例は、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｋ８１０Ａ、Ｋ８４８Ａ、Ｋ８５５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａ、および／またはＤ１１３５Ｅ（ＳｐｙＣａｓ９の番号制を基準にして）を含む。
【００２５】
（ｉ）異種ドメイン
Ｃａｓ９タンパク質は、少なくとも１つの異種ドメインを含むように操作されてよい、すなわち、Ｃａｓ９は、１つ以上の異種ドメインに融合される。２つ以上の異種ドメインがＣａｓ９と融合される状況において、２つ以上の異種ドメインは同じであってよく、またはそれらは異なっていてよい。１つ以上の異種ドメインは、Ｎ末端、Ｃ末端、内部位置、またはそれらの組合せに融合されてよい。融合は化学結合を介して直接的であってよく、または結合は１つ以上のリンカーを介して間接的であってよい。種々の態様において、異種ドメインは、核局在化シグナル、細胞膜透過ドメイン、マーカードメイン、クロマチン破壊ドメイン、エピジェネティック修飾ドメイン（例えば、シチジンデアミナーゼドメイン、ヒストンアセチルトランスフェラーゼドメインなど）、転写制御ドメイン、ＲＮＡアプタマー結合ドメイン、または非Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインであってよい。
【００２６】
いくつかの態様において、１つ以上の異種ドメインは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）であってよい。核局在化シグナルの非限定的な例は、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号：７８）、ＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号：７９）、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号：８０）、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号：８１）、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号：８２）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号：８３）、ＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号：８４）、ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号：８５）、ＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号：８６）、ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号：８７）、ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号：８８）、ＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号：８９）、ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号：９０）、ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号：９１）、ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号：９２）、ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号：９３）、ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号：９４）、およびＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号：９５）を含む。
【００２７】
他の態様において、１つ以上の異種ドメインは、細胞膜透過ドメインであってよい。適当な細胞膜透過ドメインの例は、限定はしないが、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号：９６）、ＰＬＳＳＩＦＳＲＩＧＤＰＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号：９７）、ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号：９８）、ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号：９９）、ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号：１００）、ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号：１０１）、ＴＨＲＬＰＲＲＲＲＲＲ（配列番号：１０２）、ＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲ（配列番号：１０３）、ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号：１０４）、ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号：１０５）、ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ（配列番号：１０６）、およびＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号：１０７）を含む。
【００２８】
代替態様において、１つ以上の異種ドメインは、マーカードメインであってよい。マーカードメインは、蛍光タンパク質および精製またはエピトープタグを含む。適当な蛍光タンパク質は、限定することなく、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＧＦＰ−２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＢＦＰ、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン色蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ  ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、橙色蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、またはそれらの組合せを含む。マーカードメインは、１つ以上の蛍光タンパク質のタンデムリピート（例えば、Ｓｕｎｔａｇ）を含んでよい。適当な精製またはエピトープタグの非限定的な例は、６ｘＨｉｓ（配列番号：１３４）、ＦＬＡＧ（登録商標）、ＨＡ、ＧＳＴ、Ｍｙｃ、ＳＡＭなどを含む。ＣＲＩＳＰＲ複合体の検出または濃縮を容易にする異種融合の非限定的な例は、ストレプトアビジン（Kipriyanov et al., Human Antibodies, 1995, 6(3):93-101.）、アビジン（Airenne et al., Biomolecular Engineering, 1999, 16(1-4):87-92）、アビジンの単量体形態（in (Laitinen et al., Journal of Biological Chemistry, 2003, 278(6):4010-4014）、組み換え生産中にビオチン化を容易にするペプチドタグ（Cull et al., Methods in Enzymology, 2000, 326:430-440）を含む。
【００２９】
さらに他の態様において、１つ以上の異種ドメインは、クロマチン調節モチーフ（ＣＭＭ）であってよい。ＣＭＭの非限定的な例は、高移動度グループ（ＨＭＧ）タンパク質（例えば、ＨＭＧＢ１、ＨＭＧＢ２、ＨＭＧＢ３、ＨＭＧＮ１、ＨＭＧＮ２、ＨＭＧＮ３ａ、ＨＭＧＮ３ｂ、ＨＭＧＮ４、およびＨＭＧＮ５タンパク質）、ヒストンＨ１変異体の中央球状ドメイン（例えば、ヒストン  Ｈ１．０、Ｈ１．１、Ｈ１．２、Ｈ１．３、Ｈ１．４、Ｈ１．５、Ｈ１．６、Ｈ１．７、Ｈ１．８、Ｈ１．９、およびＨ．１．１０）、またはクロマチンリモデリング複合体のＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＳＷＩ／ＳＮＦ（スイッチ／スクロース非発酵性（SWItch/Sucrose Non-Fermentable））、ＩＳＷＩ（模倣スイッチ（Imitation SWItch））、ＣＨＤ（クロモドメイン−ヘリカーゼ−ＤＮＡ結合（Chromodomain-Helicase-DNA binding））、Ｍｉ−２／ＮｕＲＤ（ヌクレオソームリモデリングおよびデアセチラーゼ）、ＩＮＯ８０、ＳＷＲ１、およびＲＳＣ複合体に由来するヌクレオソーム相互作用ペプチドを含む。他の態様において、ＣＭＭはまた、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、またはウイルスタンパク質に由来してよい。ＣＭＭの供給源は、変化してもよく、変化するであろう。ＣＭＭは、ヒト、動物（すなわち、脊椎動物および無脊椎動物）、植物、藻類、または酵母であってよい。特定のＣＭＭの非限定的な例は、以下の表に列挙されている。当業者は、他の種におけるホモログおよび／またはそれとの関連融合モチーフを容易に同定することができる。
【表ａ】
2021505180.tif 000003
【００３０】
さらに他の態様において、１つ以上の異種ドメインは、エピジェネティック修飾ドメインであってよい。適当なエピジェネティック修飾ドメインの非限定的な例は、ＤＮＡ脱アミノ化（例えば、シチジンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、グアニンデアミナーゼ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性（例えば、シトシンメチルトランスフェラーゼ）、ＤＮＡデメチラーゼ活性、ＤＮＡアミノ化、ＤＮＡ酸化活性、ＤＮＡヘリカーゼ活性、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）活性（例えば、Ｅ１Ａ結合タンパク質ｐ３００に由来するＨＡＴドメイン）、ヒストンデアセチラーゼ活性、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性、ヒストンデメチラーゼ活性、ヒストンキナーゼ活性、ヒストンホスファターゼ活性、ヒストンユビキチンリガーゼ活性、ヒストン脱ユビキチン化活性、ヒストンアデニル化活性、ヒストン脱アデニル化活性、ヒストンＳＵＭＯ化活性、ヒストン脱ＳＵＭＯ化活性、ヒストンリボシル化活性、ヒストン脱リボシル化活性、ヒストンミリストイル化活性、ヒストン脱ミリストイル化活性、ヒストンシトルリン化活性、ヒストンアルキル化活性、ヒストン脱アルキル化活性、またはヒストン酸化活性を有するものを含む。特定の態様において、エピジェネティック修飾ドメインは、シチジンデアミナーゼ活性、アデノシンデアミナーゼ活性、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性、またはＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を含んでよい。
【００３１】
他の態様において、１つ以上の異種ドメインは、転写制御ドメイン（すなわち、転写活性化ドメインまたは転写リプレッサードメイン）であってよい。適当な転写活性化ドメインは、限定することなく、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６ドメイン、ＶＰ６４（すなわち、ＶＰ１６の４つのタンデムコピー）、ＶＰ１６０（すなわち、ＶＰ１６の１０個のタンデムコピー）、ＮＦκＢ  ｐ６５活性化ドメイン（ｐ６５）、エプスタイン−バー・ウイルスＲ転写活性化因子（Ｒｔａ）ドメイン、ＶＰＲ（すなわち、ＶＰ６４＋ｐ６５＋Ｒｔａ）、ｐ３００−依存性転写活性化ドメイン、ｐ５３活性化ドメイン１および２、ヒートショック因子１（ＨＳＦ１）活性化ドメイン、Ｓｍａｄ４活性化ドメイン（ＳＡＤ）、ｃＡＭＰ応答要素結合タンパク質（ＣＲＥＢ）活性化ドメイン、Ｅ２Ａ活性化ドメイン、活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）活性化ドメイン、またはそれらの組合せを含む。適当な転写リプレッサードメインの非限定的な例は、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）リプレッサードメイン、Ｍｘｉリプレッサードメイン、誘導ｃＡＭＰ初期リプレッサー（ＩＣＥＲ）ドメイン、ＹＹ１グリシンリッチリプレッサードメイン、Ｓｐ１様リプレッサー、Ｅ（ｓｐｌ）リプレッサー、ＩκＢリプレッサー、Ｓｉｎ３リプレッサー、メチル−ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）リプレッサー、またはそれらの組合せを含む。転写活性化または転写リプレッサードメインは、Ｃａｓ９タンパク質に遺伝的に融合されてよく、または非共有タンパク質−タンパク質、タンパク質−ＲＮＡ、またはタンパク質−ＤＮＡ相互作用を介して結合されてよい。
【００３２】
さらなる態様において、１つ以上の異種ドメインは、ＲＮＡアプタマー結合ドメイン（Konermann et al., Nature, 2015, 517(7536):583-588; Zalatan et al., Cell, 2015, 160(1-2):339-50）であってよい。適当なＲＮＡアプタマータンパク質ドメインの例は、ＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）、ＰＰ７バクテリオファージコートタンパク質（ＰＣＰ）、ＭｕバクテリオファージＣｏｍタンパク質、ラムダバクテリオファージＮ２２タンパク質、ステムループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ）、脆弱性Ｘ精神遅滞症候群−関連タンパク質１（ＦＸＲ１）、バクテリオファージに由来するタンパク質、例えばＡＰ２０５、ＢＺ１３、ｆ１、ｆ２、ｆｄ、ｆｒ、ＩＤ２、ＪＰ３４／ＧＡ、ＪＰ５０１、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、Ｍ１２、ＭＸ１、ＮＬ９５、ＰＰ７、ΦＣｂ５、ΦＣｂ８ｒ、ΦＣｂ１２ｒ、ΦＣｂ２３ｒ、Ｑβ、Ｒ１７、ＳＰ−β、ＴＷ１８、ＴＷ１９、およびＶＫ、それらのフラグメント、またはそれらの誘導体を含む。
【００３３】
さらに他の態様において、１つ以上の異種ドメインは、非Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインであってよい。適当なヌクレアーゼドメインは、あらゆるエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。ヌクレアーゼドメインが由来することができるエンドヌクレアーゼの非限定的な例は、限定はしないが、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼを含む。いくつかの態様において、ヌクレアーゼドメインは、タイプＩＩ−Ｓ制限エンドヌクレアーゼに由来してよい。タイプＩＩ−Ｓエンドヌクレアーゼは、典型的に認識／結合部位から数塩基対離れた部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合および切断ドメインを有する。これらの酵素は、一般的に、一時的に会合し、二量体を形成し、互い違いの位置でＤＮＡの各鎖を切断する、単量体である。適当なタイプＩＩ−Ｓエンドヌクレアーゼの非限定的な例は、ＢｆｉＩ、ＢｐｍＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＦｏｋＩ、ＭｂｏＩＩ、およびＳａｐＩを含む。いくつかの態様において、ヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインまたはその誘導体であってよい。タイプＩＩ−Ｓヌクレアーゼドメインは、２つの異なるヌクレアーゼドメインの二量化を容易にするように修飾されてよい。例えば、ＦｏｋＩの切断ドメインは、特定のアミノ酸残基を変異することによって修飾されてよい。非限定的な例として、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインの位置４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７、および５３８でのアミノ酸残基が、修飾のための標的である。特定の態様において、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインは、Ｑ４８６Ｅ、Ｉ４９９Ｌ、および／またはＮ４９６Ｄ変異を含む第１のＦｏｋＩハーフドメイン、およびＥ４９０Ｋ、Ｉ５３８Ｋ、および／またはＨ５３７Ｒ変異を含む第２のＦｏｋＩハーフドメインを含んでよい。
【００３４】
１つ以上の異種ドメインは、Ｃａｓ９タンパク質に、１つ以上の化学結合（例えば、共有結合）を介して直接的に連結されてよく、または１つ以上の異種ドメインは、Ｃａｓ９タンパク質に、１つ以上のリンカーを介して間接的に連結されてよい。
【００３５】
リンカーは、少なくとも１つの共有結合を介して１つ以上の他の化学基に連結する化学基である。適当なリンカーは、アミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、核酸、有機リンカー分子（例えば、マレイミド誘導体、Ｎ−エトキシベンジルイミダゾール、ビフェニル−３，４’，５−トリカルボン酸、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル、など）、ジスルフィドリンカー、およびポリマーリンカー（例えば、ＰＥＧ）を含む。リンカーは、限定はしないが、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アラルケニル、アラルキニルなどを含む、１つ以上のスペーサー（spacing）基を含んでよい。リンカーは、中性であってよく、または正または負の電荷を有してもよい。さらに、リンカーは、リンカーを別の化学基に連結するリンカーの共有結合が、ｐＨ、温度、塩濃度、光、触媒、または酵素を含む特定の条件下で破壊または切断することができるように切断可能であってよい。いくつかの態様において、リンカーは、ペプチドリンカーであってよい。ペプチドリンカーは、フレキシブルな(flexible)アミノ酸リンカー（例えば、小さい非極性または極性アミノ酸を含む）であってよい。フレキシブルな(flexible)リンカーの非限定的な例は、ＬＥＧＧＧＳ（配列番号：１０８）、ＴＧＳＧ（配列番号：１０９）、ＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号：１１０）、（ＧＧＧＧＳ）１−４（配列番号：１１１）、および（Ｇｌｙ）６−８（配列番号：１１２）を含む。あるいは、ペプチドリンカーは、硬い（rigid）アミノ酸リンカーであってよい。かかるリンカーは、（ＥＡＡＡＫ）１−４（配列番号：１１３）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）２−５Ａ（配列番号：１１４）、ＰＡＰＡＰ（配列番号：１１５）、および（ＡＰ）６−８（配列番号：１１６）を含む。適当なリンカーのさらなる例は当分野でよく知られており、リンカーを設計するプログラムは容易に利用できる（Crasto et al., Protein Eng., 2000, 13(5):309-312）。
【００３６】
いくつかの態様において、操作されたＣａｓ９タンパク質は、無細胞システム、細菌細胞、または真核細胞において組換え的に生産されてよく、標準精製手段を使用して精製されてよい。他の態様において、操作されたＣａｓ９タンパク質は、操作されたＣａｓ９タンパク質をコードする核酸から興味ある真核細胞においてインビボで生産される（以下のセクション（ＩＩ）参照）。
【００３７】
操作されたＣａｓ９タンパク質がヌクレアーゼまたはニッカーゼ活性を含む態様において、操作されたＣａｓ９タンパク質は、少なくとも１つの核局在化シグナル、細胞膜透過ドメイン、および／またはマーカードメイン、ならびに少なくとも１つのクロマチン破壊ドメインをさらに含んでよい。操作されたＣａｓ９タンパク質がエピジェネティック修飾ドメインに連結される態様において、操作されたＣａｓ９タンパク質は、少なくとも１つの核局在化シグナル、細胞膜透過ドメイン、および／またはマーカードメイン、ならびに少なくとも１つのクロマチン破壊ドメインをさらに含んでよい。さらに、操作されたＣａｓ９タンパク質が転写制御ドメインに連結される態様において、操作されたＣａｓ９タンパク質は、少なくとも１つの核局在化シグナル、細胞膜透過ドメイン、および／またはマーカードメイン、ならびに少なくとも１つのクロマチン破壊ドメインおよび／または少なくとも１つのＲＮＡアプタマー結合ドメインをさらに含んでよい。
【００３８】
（ｉｉ）特定の操作されたＣａｓ９タンパク質
特定の態様において、操作されたＣａｓ９タンパク質は、バチルス・スミスイ、ラクトバチルス・ラムノサス、パラサテレラ・エクスクレメンティホミニス、マイコプラズマ・カニス、マイコプラズマ・ガリセプティカム、アッカーマンシア・グリカニフィラ、アッカーマンシア・ムシニフィラ、オエノコッカス・キタハラエ、ビフィドバクテリウム・ボンビ、アシッドサーマス・セルロリティカス、アリサイクロバチラス・ヘスペリダム、ウォリネラ・サクシノゲネス、ニトラティフラクター・サルスギニス、ラルストニア・シジギ、またはコリネバクテリウム・ジフテリアに由来し、少なくとも１つのＮＬＳに連結される。いくつかの反復において、操作されたＣａｓ９タンパク質は、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、または３０と少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％配列同一性を有してよい。１つの態様において、操作されたＣａｓ９タンパク質は、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、または３０と少なくとも約９５％配列同一性を有してよい。他の反復において、操作されたＣａｓ９タンパク質は、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、または３０のアミノ酸配列を有する。
【００３９】
他の態様において、操作されたＣａｓ９タンパク質は、少なくとも１つのクロマチン調節モチーフ（ＣＭＭ）に連結された、バチルス・スミスイ、ラクトバチルス・ラムノサス、パラサテレラ・エクスクレメンティホミニス、マイコプラズマ・カニス、マイコプラズマ・ガリセプティカム、アッカーマンシア・グリカニフィラ、アッカーマンシア・ムシニフィラ、オエノコッカス・キタハラエ、ビフィドバクテリウム・ボンビ、アシッドサーマス・セルロリティカス、アリサイクロバチラス・ヘスペリダム、ウォリネラ・サクシノゲネス、ニトラティフラクター・サルスギニス、ラルストニア・シジギ、またはコリネバクテリウム・ジフテリアのＣａｓ９タンパク質であってよい。Ｃａｓ９タンパク質およびＣＭＭ間の結合は、直接的に、またはリンカーを介してであってよい。Ｃａｓ９−ＣＭＭ融合タンパク質は、少なくとも１つのＮＬＳをさらに含んでよい。特定の態様において、Ｃａｓ９−ＣＭＭ融合タンパク質は、配列番号：１１７、１１８、１１９、１２００、１２１、１２２、１２３、または１２４と少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％配列同一性を有してよい。１つの態様において、Ｃａｓ９−ＣＭＭ融合タンパク質は、配列番号：１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、または１２４と少なくとも約９５％配列同一性を有してよい。特定の反復において、Ｃａｓ９−ＣＭＭ融合タンパク質は、配列番号：１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、または１２４のアミノ酸配列を有する。
【００４０】
（ｂ）操作されたガイドＲＮＡ
操作されたガイドＲＮＡは、特定の操作されたＣａｓ９タンパク質と複合体を形成するように設計される。ガイドＲＮＡは、（ｉ）標的配列とハイブリダイズする５’末端でガイド配列を含むＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）および（ｉｉ）Ｃａｓ９タンパク質を動員するトランス作用ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列を含む。各ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡガイド配列は、異なっている（すなわち、配列特異的である）。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、一般的に、特定の細菌種に由来するＣａｓ９タンパク質と複合体を形成するように設計されたガイドＲＮＡにおいて同じである。
【００４１】
ｃｒＲＮＡガイド配列は、二本鎖配列において標的配列（すなわち、プロトスペーサー）とハイブリダイズするように設計される。一般的に、ｃｒＲＮＡおよび標的配列間の相補性は、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％である。特定の態様において、相補性は完全である（すなわち、１００％）。種々の態様において、ｃｒＲＮＡガイド配列の長さは、約１５ヌクレオチドから約２５ヌクレオチドの範囲であってよい。例えば、ｃｒＲＮＡガイド配列は、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長であってよい。特定の態様において、ｃｒＲＮＡは、約１９、２０、または２１ヌクレオチド長である。１つの態様において、ｃｒＲＮＡガイド配列は、２０ヌクレオチドの長さを有する。
【００４２】
ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質と相互作用する少なくとも１つのステムループ構造を形成するリピート配列、および一本鎖のままである３’配列を含む。各ループおよびステムの長さは変化してよい。例えば、ループは約３から約１０ヌクレオチド長の範囲であってよく、ステムは約６から約２０塩基対の長さの範囲であってよい。ステムは、１から約１０ヌクレオチドの１つ以上の突出部を含んでよい。一本鎖３’領域の長さは変化してよい。操作されたガイドＲＮＡにおけるｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、一般的に、興味ある細菌種における野生型ｔｒａｃｒＲＮＡをコード配列に基づく。野生型配列は、二次構造の形成を容易にするように、二次構造の安定性を増加させるように、真核細胞における発現を容易にするなどのように修飾されてよい。例えば、１つ以上のヌクレオチド変化は、ガイドＲＮＡコード配列に導入されてよい（以下の実施例３参照）。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約５０ヌクレオチドから約３００ヌクレオチドの長さの範囲であってよい。種々の態様において、ｔｒａｃｒＲＮＡは、約５０から約９０ヌクレオチド、約９０から約１１０ヌクレオチド、約１１０から約１３０ヌクレオチド、約１３０から約１５０ヌクレオチド、約１５０から約１７０ヌクレオチド、約１７０から約２００ヌクレオチド、約２００から約２５０ヌクレオチド、または約２５０から約３００ヌクレオチドの長さの範囲であってよい。
【００４３】
一般的に、操作されたガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ配列がｔｒａｃｒＲＮＡ配列に連結されている単一の分子（すなわち、単一のガイドＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）である。いくつかの態様において、しかしながら、操作されたガイドＲＮＡは、２つの別々の分子であってよい。第１の分子は、第２の分子の５’末端と塩基対合することができる３’配列（約６から約２０ヌクレオチドを含む）を含むｃｒＲＮＡを含み、第２の分子は、第１の分子の３’末端と塩基対合することができる５’配列（約６から約２０ヌクレオチドを含む）を含むｔｒａｃｒＲＮＡを含む。
【００４４】
いくつかの態様において、操作されたガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、１つ以上のアプタマー配列を含むように修飾されてよい（Konermann et al., Nature, 2015, 517(7536):583-588; Zalatan et al., Cell, 2015, 160(1-2):339-50）。適当なアプタマー配列は、ＭＣＰ、ＰＣＰ、Ｃｏｍ、ＳＬＢＰ、ＦＸＲ１、ＡＰ２０５、ＢＺ１３、ｆ１、ｆ２、ｆｄ、ｆｒ、ＩＤ２、ＪＰ３４／ＧＡ、ＪＰ５０１、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、Ｍ１２、ＭＸ１、ＮＬ９５、ＰＰ７、ΦＣｂ５、ΦＣｂ８ｒ、ΦＣｂ１２ｒ、ΦＣｂ２３ｒ、Ｑβ、Ｒ１７、ＳＰ−β、ＴＷ１８、ＴＷ１９、ＶＫ、それらのフラグメント、またはそれらの誘導体から選択されるアダプタータンパク質を結合するものを含む。当業者は、アプタマー配列の長さが変化してよいことを理解する。
【００４５】
他の態様において、ガイドＲＮＡは、少なくとも１つの検出可能な標識をさらに含んでよい。検出可能な標識は、フルオロフォア（例えば、ＦＡＭ、ＴＭＲ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｓ、Ｈａｌｏ  ｔａｇｓ、または適当な蛍光色素）、検出タグ（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニンなど）、量子ドット、または金粒子であってよい。
【００４６】
ガイドＲＮＡは、標準リボヌクレオチドおよび／または修飾リボヌクレオチドを含んでよい。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、標準または修飾デオキシリボヌクレオチドを含んでよい。ガイドＲＮＡが酵素的に合成される（すなわち、インビボまたはインビトロ）態様において、ガイドＲＮＡは、一般的に、標準リボヌクレオチドを含む。ガイドＲＮＡが化学的に合成される態様において、ガイドＲＮＡは、標準または修飾リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドを含んでよい。修飾リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドは、塩基修飾（例えば、プソイドウリジン、２−チオウリジン、Ｎ６−メチルアデノシンなど）および／または糖修飾（例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−アミノ、ロックド核酸（ＬＮＡ）など）を含む。ガイドＲＮＡの骨格はまた、ホスホロチオエート結合、ボラノホスフェート結合、またはペプチド核酸を含むように修飾されてよい。
【００４７】
特定の態様において、操作されたガイドＲＮＡは、配列番号：３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、または４５と少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％配列同一性を有する。いくつかの態様において、操作されたＣａｓ９ガイドＲＮＡは、配列番号：３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、または４５の配列を有する。
【００４８】
（ｃ）ＰＡＭ配列
上記詳細な操作されたＣａｓ９システムは、新規なＰＡＭ配列の上流に位置する二本鎖ＤＮＡにおける特定の配列を標的とする。操作されたＣａｓ９システムによって好ましいＰＡＭ配列は、縮重ＰＡＭＳのライブラリーを使用してインビトロで同定され（実施例１および図１参照）、ゲノム編集実験後の配列決定により確認した（実施例２参照）。本願明細書に記載されている操作されたＣａｓ９システムのそれぞれについてのＰＡＭは、以下の表Ａに示されている。
【表Ａ】
2021505180.tif 000004
＊  ＫはＧまたはＴであり；ＭはＡまたはＣであり；ＲはＡまたはＧであり；ＹはＣまたはＴであり；ＮはＡ、Ｃ、Ｇ、またはＴである。
【００４９】
（ＩＩ）          核酸
本開示のさらなる局面は、セクション（Ｉ）において上記の操作されたＣａｓ９システムをコードする核酸を提供する。システムは、単一の核酸または複数の核酸によってコードされてよい。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、線状または環状、一本鎖または二本鎖であってよい。ＲＮＡまたはＤＮＡは、興味ある真核細胞においてタンパク質への効率的な翻訳のために最適化されたコドンであってよい。コドン最適化プログラムは、フリーウェアとしてまたは市販の供給源から利用できる。
【００５０】
いくつかの態様において、核酸は、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、または３０のアミノ酸配列と少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％配列同一性を有するタンパク質をコードする。１つの態様において、操作されたＣａｓ９タンパク質をコードする核酸は、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、または２９のＤＮＡ配列と少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％配列同一性を有してよい。１つの態様において、操作されたＣａｓ９タンパク質をコードするＤＮＡは、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、または２９のＤＮＡ配列を有する。さらなる態様において、核酸は、配列番号：１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、または１２４のアミノ酸配列と少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％配列同一性を有するタンパク質をコードする。
【００５１】
いくつかの態様において、操作されたＣａｓ９タンパク質をコードする核酸はＲＮＡであってよい。ＲＮＡは、インビトロで酵素的に合成されてよい。このため、操作されたＣａｓ９タンパク質をコードするＤＮＡは、インビトロＲＮＡ合成のためのファージＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーター配列に作動可能に連結されてよい。例えば、プロモーター配列は、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６プロモーター配列またはＴ７、Ｔ３、またはＳＰ６プロモーター配列の変異体であってよい。操作されたタンパク質をコードするＤＮＡは、以下に詳細に説明されているとおりベクターの一部であってよい。このような態様において、インビトロで転写されたＲＮＡは、精製、キャップド、および／またはポリアデニル化されてよい。他の態様において、操作されたＣａｓ９タンパク質をコードするＲＮＡは、自己複製ＲＮＡの一部であってよい（Yoshioka et al., Cell Stem Cell, 2013, 13:246-254）。自己複製ＲＮＡは、限られた数の細胞分裂のために自己複製を可能にする一本鎖プラス鎖ＲＮＡであり、興味あるタンパク質をコードするように修飾することができる、非感染性の自己複製のベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルスＲＮＡレプリコンに由来してもよい（Yoshioka et al., Cell Stem Cell, 2013, 13:246-254）。
【００５２】
他の態様において、操作されたＣａｓ９タンパク質をコードする核酸はＤＮＡであってよい。ＤＮＡコード配列は、興味ある細胞における発現のための少なくとも１つのプロモーターコントロール配列に作動可能に連結されてよい。１つの態様において、ＤＮＡコード配列は、細菌（例えば、大腸菌）細胞または真核（例えば、酵母、昆虫、または哺乳動物）細胞における操作されたＣａｓ９タンパク質の発現のためのプロモーター配列に作動可能に連結されてよい。適当な細菌プロモーターは、限定することなく、Ｔ７プロモーター、ｌａｃオペロンプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター（ｔｒｐおよびｌａｃプロモーターのハイブリッドである）、前記いずれかの変異、および前記いずれかの組合せを含む。適当な真核プロモーターの非限定的な例は、構成的、調節、または細胞もしくは組織特異的なプロモーターを含む。適当な真核構成的プロモーターコントロール配列は、限定はしないが、サイトメガロウイルス前初期プロモーター（ＣＭＶ）、シミアンウイルス（ＳＶ４０）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、延長因子（ＥＤ１）−アルファプロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、チューブリンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、それらのフラグメント、または前記いずれかの組合せを含む。適当な真核調節プロモーターコントロール配列の例は、限定することなく、熱ショック、金属、ステロイド、抗生物質、またはアルコールによって調節されるものを含む。組織特異的なプロモーターの非限定的な例は、Ｂ２９プロモーター、ＣＤ１４プロモーター、ＣＤ４３プロモーター、ＣＤ４５プロモーター、ＣＤ６８プロモーター、デスミンプロモーター、エラスターゼ−１プロモーター、エンドグリンプロモーター、フィブロネクチンプロモーター、Ｆｌｔ−１プロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、ＧＰＩＩｂプロモーター、ＩＣＡＭ−２プロモーター、ＩＮＦ−βプロモーター、Ｍｂプロモーター、ＮｐｈｓＩプロモーター、ＯＧ−２プロモーター、ＳＰ−Ｂプロモーター、ＳＹＮ１プロモーター、およびＷＡＳＰプロモーターを含む。プロモーター配列は野生型であってよく、またはそれはより効率的または有効な発現のために修飾されてよい。いくつかの態様において、ＤＮＡコード配列はまた、ポリアデニル化シグナル（例えば、ＳＶ４０  ｐｏｌｙＡシグナル、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ｐｏｌｙＡシグナルなど）および／または少なくとも１つの転写終結配列に連結されてよい。いくつかの状況において、操作されたＣａｓ９タンパク質は、細菌または真核細胞から精製されてよい。
【００５３】
さらに他の態様において、操作されたガイドＲＮＡはＤＮＡによってコードされてよい。場合によっては、操作されたガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、インビトロＲＮＡ合成のためのファージＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーター配列に作動可能に連結されてよい。例えば、プロモーター配列は、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６プロモーター配列またはＴ７、Ｔ３、またはＳＰ６プロモーター配列の変異体であってよい。他の例では、操作されたガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、興味ある真核細胞における発現のためのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩＩ）により認識されるプロモーター配列に作動可能に連結されてよい。適当なＰｏｌ  ＩＩＩプロモーターの例は、限定はしないが、哺乳動物Ｕ６、Ｕ３、Ｈ１、および７ＳＬ  ＲＮＡプロモーターを含む。
【００５４】
種々の態様において、操作されたＣａｓ９タンパク質をコードする核酸は、ベクターにおいて存在してよい。いくつかの態様において、ベクターは、操作されたガイドＲＮＡをコードする核酸をさらに含んでよい。適当なベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、および自己複製ＲＮＡを含む（Yoshioka et al., Cell Stem Cell, 2013, 13:246-254）。いくつかの態様において、複合または融合タンパク質をコードする核酸は、プラスミドベクターにおいて存在してよい。適当なプラスミドベクターの非限定的な例は、ｐＵＣ、ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、およびそれらの変異体を含む。他の態様において、複合または融合タンパク質をコードする核酸は、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクターなど）の一部であってよい。プラスミドまたはウイルスベクターは、さらなる発現コントロール配列（例えば、エンハンサー配列、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列など）、選択可能なマーカー配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、複製起点などを含んでよい。ベクターおよびその使用についてのさらなる情報は、“Current Protocols in Molecular Biology” Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 2003 or “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 3rd edition, 2001に見ることができる。
【００５５】
（ＩＩＩ）真核細胞
本開示の別の局面は、セクション（Ｉ）において詳細に説明されている少なくとも１つの操作されたＣａｓ９システム、および／または、セクション（ＩＩ）において詳細に説明されている操作されたＣａｓ９タンパク質および／または操作されたガイドＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸を含む真核細胞を含む。
【００５６】
真核細胞は、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、植物細胞、または単細胞真核生物であってよい。適当な真核細胞の例は、セクション（ＩＶ）（ｃ）において詳細に説明されている。真核細胞は、インビトロ、エキソビボ、またはインビボであってよい。
【００５７】
（ＩＶ）染色体配列を修飾するための方法
本開示のさらなる局面は、真核細胞における染色体配列を修飾するための方法を含む。一般的に、方法は、興味ある真核細胞に、セクション（Ｉ）において詳細に説明されている少なくとも１つの操作されたＣａｓ９システム、および／または、セクション（ＩＩ）において詳細に説明されている該操作されたＣａｓ９タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸を導入することを含む。
【００５８】
操作されたＣａｓ９タンパク質がヌクレアーゼまたはニッカーゼ活性を含む態様において、染色体配列修飾は、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入を含んでよい。いくつかの反復において、方法は、操作されたＣａｓ９単数のシステムまたは複数のシステムが染色体配列における標的部位の二本鎖破壊を導入し、細胞性ＤＮＡ修復プロセスによる二本鎖破壊の修復が少なくとも１つのヌクレオチド変化（すなわち、インデル）を導入し、それにより染色体配列を不活性化する（すなわち、遺伝子ノックアウト）ように、真核細胞に、ヌクレアーゼ活性を含む１つの操作されたＣａｓ９システムまたはニッカーゼ活性を含みドナーポリヌクレオチドを含まない２つの操作されたＣａｓ９システムを導入することを含む。他の反復において、方法は、操作されたＣａｓ９単数のシステムまたは複数のシステムが染色体配列における標的部位の二本鎖破壊を導入し、細胞性ＤＮＡ修復プロセスによる二本鎖破壊の修復が染色体配列における標的部位へのドナーポリヌクレオチドにおける配列の挿入または交換（すなわち、遺伝子修正または遺伝子ノックイン）をもたらすように、真核細胞に、ニッカーゼ活性を含む１つの操作されたＣａｓ９システム、またはニッカーゼ活性ならびにドナーポリヌクレオチドを含む２つの操作されたＣａｓ９システムを導入することを含む。
【００５９】
操作されたＣａｓ９タンパク質がエピジェネティック的修飾活性または転写制御活性を含む態様において、染色体配列修飾は、標的部位内または付近で少なくとも１つのヌクレオチドの変換、標的部位内または付近で少なくとも１つのヌクレオチドの修飾、標的部位内または付近で少なくとも１つのヒストンタンパク質の修飾、および／または染色体配列における標的部位内または付近で転写の変化を含んでよい。
【００６０】
（ａ）細胞への導入
上記のとおり、方法は、真核細胞に、少なくとも１つの操作されたＣａｓ９システムおよび／または該システムをコードする核酸（および所望のドナーポリヌクレオチド）を導入することを含む。少なくとも１つのシステムおよび／または核酸／ドナーポリヌクレオチドは、種々の手段により興味ある細胞に導入されてよい。
【００６１】
いくつかの態様において、細胞は、適当な分子（すなわち、タンパク質、ＤＮＡ、および／またはＲＮＡ）でトランスフェクトされてよい。適当なトランスフェクション方法は、ヌクレオフェクション(nucleofection)（またはエレクトロポレーション）、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、陽イオン性ポリマートランスフェクション（例えば、ＤＥＡＥ−デキストランまたはポリエチレンイミン）、ウイルス形質導入、ビロゾームトランスフェクション、ビリオントランスフェクション、リポソームトランスフェクション、陽イオン性リポソームトランスフェクション、免疫リポソームトランスフェクション、非リポソーム脂質トランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、熱ショックトランスフェクション、マグネトフェクション、リポフェクション、遺伝子銃送達、インペールフェクション(impalefection)、ソノポレーション、光学的トランスフェクション、および核酸のプロプライエタリー(proprietary)剤で増強された摂取を含む。トランスフェクション方法は、当分野でよく知られている（例えば、“Current Protocols in Molecular Biology” Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 2003または“Molecular Cloning: A Laboratory Manual” Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 3rd edition, 2001参照）。他の態様において、分子は、微量注入により細胞に導入されてよい。例えば、分子は、興味ある細胞の細胞質または核に注入されてよい。細胞に導入される各分子の量は変動してよいが、当業者は適当な量を決定するための手段をよく知っている。
【００６２】
種々の分子は、同時にまたは連続して細胞に導入されてよい。例えば、操作されたＣａｓ９システム（またはそのコードする核酸）およびドナーポリヌクレオチドは、同時に導入されてよい。あるいは、細胞に、一方が最初に導入されてよく、次に他方が後に導入されてよい。
【００６３】
一般的に、細胞は、細胞成長および／または維持のために適当な条件下で維持される。適当な細胞培養条件は、当分野でよく知られており、例えば、Santiago et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2008, 105:5809-5814; Moehle et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2007, 104:3055-3060; Urnov et al., Nature, 2005, 435:646-651; およびLombardo et al., Nat. Biotechnol., 2007, 25:1298-1306に記載されている。当業者は、細胞を培養するための方法は、当分野で知られており、細胞型に依存して変化してよく、変化するであろうことを理解している。すべての場合において、日常的な最適化が使用されて、特定の細胞型のための最適な技術を決定することができる。
【００６４】
（ｂ）所望のドナーポリヌクレオチド
操作されたＣａｓ９タンパク質がヌクレアーゼまたはニッカーゼ活性を含む態様において、方法は、少なくとも１つのドナーポリヌクレオチドを細胞に導入することをさらに含んでよい。ドナーポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖、線状または環状、および／またはＲＮＡまたはＤＮＡであってよい。いくつかの態様において、ドナーポリヌクレオチドは、ベクター、例えば、プラスミドベクターであってよい。
【００６５】
ドナーポリヌクレオチドは、少なくとも１つのドナー配列を含む。いくつかの局面において、ドナーポリヌクレオチドのドナー配列は、内因性または天然の染色体配列の修飾バージョンであってよい。例えば、ドナー配列は、操作されたＣａｓ９システムによって標的化される配列でまたは付近で染色体配列の一部と本質的に同一であってよいが、少なくとも１つのヌクレオチド変化を含む。したがって、天然配列での組み込みまたは交換時に、標的化される染色体位置での配列は少なくとも１つのヌクレオチド変化を含む。例えば、変化は、１つ以上のヌクレオチドの挿入、１つ以上のヌクレオチドの欠失、１つ以上のヌクレオチドの置換、またはそれらの組合せであってよい。修飾される配列の「遺伝子修正」組み込みの結果として、細胞は、標的化された染色体配列から修飾された遺伝子産物を生産することができる。
【００６６】
他の局面において、ドナーポリヌクレオチドのドナー配列は外因性配列であってよい。本願明細書において使用される「外因性」配列は、細胞に対して天然でない配列、または天然の位置が細胞のゲノムにおける異なる位置である配列を指す。例えば、外因性配列は、ゲノムへの組み込み時に、細胞が組み込まれる配列によってコードされるタンパク質を発現することができるように、外因性プロモーターコントロール配列に作動可能に連結されてよいタンパク質コード配列を含んでよい。あるいは、外因性配列は、その発現が内因性プロモーターコントロール配列によって調節されるように、染色体配列に組み込まれてよい。他の反復において、外因性配列は、転写コントロール配列、別の発現コントロール配列、ＲＮＡコード配列などであってよい。上記のとおり、染色体配列への外因性配列の組み込むは、「ノックイン」と称される。
【００６７】
当業者によって理解されることができるように、ドナー配列の長さは、変化してよく、変化するであろう。例えば、ドナー配列は、長さにおいて数ヌクレオチドから数百ヌクレオチドから数十万ヌクレオチドで変化してよい。
【００６８】
典型的に、ドナーポリヌクレオチドにおけるドナー配列は、操作されたＣａｓ９システムによって標的化される配列の上流および下流それぞれに位置する配列に対して実質的な配列同一性を有する上流配列および下流配列に隣接している。これらの配列類似性のため、ドナーポリヌクレオチドの上流および下流配列は、ドナー配列が染色体配列に組み込まれて（またはと交換されて）よいように、ドナーポリヌクレオチドおよび標的化される染色体配列間の相同組換えを可能にする。
【００６９】
本願明細書において使用される上流配列は、操作されたＣａｓ９システムによって標的化される配列の上流の染色体配列と実質的な配列同一性を共有する核酸配列を指す。同様に、下流配列は、操作されたＣａｓ９システムによって標的化される配列の下流の染色体配列と実質的な配列同一性を共有する核酸配列を指す。本願明細書において使用される「実質的な配列同一性」なるフレーズは、少なくとも約７５％配列同一性を有する配列を指す。したがって、ドナーポリヌクレオチドにおける上流および下流配列は、標的配列に対する上流または下流配列と約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％配列同一性を有してよい。例示的な態様において、ドナーポリヌクレオチドにおける上流および下流の配列は、操作されたＣａｓ９システムによって標的化される配列に対する上流または下流の染色体配列と約９５％または１００％配列同一性を有してよい。
【００７０】
いくつかの態様において、上流配列は、操作されたＣａｓ９システムによって標的化される配列のすぐ上流に位置する染色体配列と実質的な配列同一性を共有する。他の態様において、上流配列は、標的配列から上流に約百（１００）ヌクレオチド内に位置される染色体配列と実質的な配列同一性を共有する。したがって、例えば、上流配列は、標的配列から上流に約１から約２０、約２１から約４０、約４１から約６０、約６１から約８０、または約８１から約１００ヌクレオチドに位置される染色体配列と実質的な配列同一性を共有してよい。いくつかの態様において、下流配列は、操作されたＣａｓ９システムによって標的化される配列のすぐ下流に位置する染色体配列と実質的な配列同一性を共有する。他の態様において、下流配列は、標的配列から下流に約百（１００）ヌクレオチド内に位置される染色体配列と実質的な配列同一性を共有する。したがって、例えば、下流配列は、標的配列から下流に約１から約２０、約２１から約４０、約４１から約６０、約６１から約８０、または約８１から約１００ヌクレオチドに位置される染色体配列と実質的な配列同一性を共有してよい。
【００７１】
各上流または下流配列は、長さにおいて約２０ヌクレオチドから約５０００ヌクレオチドの範囲であってよい。いくつかの態様において、上流および下流配列は、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２８００、３０００、３２００、３４００、３６００、３８００、４０００、４２００、４４００、４６００、４８００、または５０００ヌクレオチドを含んでよい。特定の態様において、上流および下流配列は、長さにおいて約５０から約１５００ヌクレオチドの範囲であってよい。
【００７２】
（ｃ）細胞型
種々の真核細胞は、本願明細書に記載されている方法における使用のために適当である。例えば、細胞は、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞、または単細胞真核生物であってよい。いくつかの態様において、細胞は、１つの細胞胚であってよい。例えば、非ヒト哺乳動物胚は、ラット、ハムスター、齧歯動物、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、および霊長類胚を含む。さらなる他の態様において、細胞は、幹細胞、例えば、胚幹細胞、ＥＳ様幹細胞、胎児幹細胞、成体幹細胞などであってよい。１つの態様において、幹細胞は、ヒト胚幹細胞ではない。さらに、幹細胞は、その内容をここに包含されるＷＯ２００３／０４６１４１またはＣｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （Cell Stem Cell, 2008, 2:113-117）に記載されている技術によって作られるものを含んでよい。細胞は、インビトロで（すなわち、培養物において）、エキソビボで（すなわち、生物体から単離された組織内で）、またはインビボで（すなわち、生物体内で）あってよい。例示的な態様において、細胞は、哺乳動物細胞または哺乳動物細胞系である。特定の態様において、細胞は、ヒト細胞またはヒト細胞系である。
【００７３】
適当な哺乳動物細胞または細胞系の非限定的な例は、ヒト胚腎臓細胞（ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ）；ヒト頸部癌腫細胞（ＨＥＬＡ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）；ヒトＵ２−ＯＳ骨肉腫細胞、ヒトＡ５４９細胞、ヒトＡ−４３１細胞、およびヒトＫ５６２細胞；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベイビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞；マウス骨髄腫ＮＳ０細胞、マウス胎児繊維芽細胞３Ｔ３細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）、マウスＢリンパ腫Ａ２０細胞；マウス黒色腫Ｂ１６細胞；マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２細胞；マウス骨髄腫ＳＰ２／０細胞；マウス胎児間葉性Ｃ３Ｈ−１０Ｔ１／２細胞；マウス癌腫ＣＴ２６細胞、マウス前立腺ＤｕＣｕＰ細胞；マウス乳房ＥＭＴ６細胞；マウス肝臓癌Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞；マウス骨髄腫Ｊ５５８２細胞；マウス上皮性ＭＴＤ−１Ａ細胞；マウス心筋ＭｙＥｎｄ細胞；マウス腎臓ＲｅｎＣａ細胞；マウス膵臓ＲＩＮ−５Ｆ細胞；マウス黒色腫Ｘ６４細胞；マウスリンパ腫ＹＡＣ−１細胞；ラットグリア芽腫９Ｌ細胞；ラットＢリンパ腫ＲＢＬ細胞；ラット神経芽腫Ｂ３５細胞；ラット肝臓癌細胞（ＨＴＣ）；ｂｕｆｆａｌｏラット肝臓ＢＲＬ  ３Ａ細胞；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；イヌ乳房（ＣＭＴ）細胞；ラット骨肉腫Ｄ１７細胞；ラット単球／マクロファージＤＨ８２細胞；サル腎臓ＳＶ−４０形質転換繊維芽細胞（ＣＯＳ７）細胞；サル腎臓ＣＶＩ−７６細胞；アフリカミドリザル腎臓（ＶＥＲＯ−７６）細胞を含む。哺乳動物細胞系の広範なリストは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション  カタログ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）において見つけることができる。
【００７４】
（Ｖ）適用
本願明細書に記載されている組成物および方法は、種々の治療、診断、産業、および研究用途において使用することができる。いくつかの態様において、本開示は、遺伝子の機能をモデル化および／または研究する、興味ある遺伝的またはエピジェネティック状態を研究する、または種々の疾患または障害に関与する生化学的経路を研究するために、細胞、動物、または植物における興味ある染色体配列を修飾するために使用することができる。例えば、疾患または障害と関連する１つ以上の核酸配列の発現が改変されている疾患または障害をモデル化するトランスジェニック生物を、作成することができる。疾患モデルは、生物体における変異の効果を研究する、疾患の発症および／または進行を研究する、疾患における薬学的に活性な化合物の効果を研究する、および／または起こりうる遺伝子治療戦略の有効性を評価するために使用することができる。
【００７５】
他の態様において、組成物および方法は、特定の生物学的プロセスに関与する遺伝子の機能およびどのような遺伝子発現における変化が生物学的プロセスに影響することができるかを研究するために使用することができる、効率的なおよびコスト的に有効な機能性ゲノムスクリーニングを実施する、または細胞表現型と共にゲノム遺伝子座のサチュレイティング(saturating)またはディープスキャニング(deep scanning)突然変異誘発を実施するために使用することができる。サチュレイティングまたはディープスキャニング突然変異誘発は、例えば、遺伝子発現、薬剤耐性、および疾患の反転のために必要な機能要素の重要な最小限の特徴および別々の脆弱性を決定するために使用することができる。
【００７６】
さらなる態様において、本願明細書に記載されている組成物および方法は、疾患または障害の存在を確立するための診断試験のために、および／または処置選択肢を決定することにおける使用のために使用することができる。適当な診断試験の例は、癌細胞における特定の変異の検出（例えば、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２などにおける特定の変異）、特定の疾患と関連する特定の変異の検出（例えば、トリヌクレオチドリピート、鎌状細胞疾患と関連するβ−グロブリンにおける変異、特定のＳＮＰなど）、肝炎の検出、ウイルスの検出（例えば、Ｚｉｋａ）などを含む。
【００７７】
さらなる態様において、本願明細書に記載されている組成物および方法は、特定の疾患または障害と関連する遺伝子変異を正す、例えば、鎌状赤血球疾患またはサラセミアと関連するグロブリン遺伝子変異を正す、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）と関連するアデノシンデアミナーゼ遺伝子における変異を正す、ハンチントン病の原因遺伝子であるＨＴＴの発現を低下させる、または網膜色素変性の処置のためのロドプシン遺伝子における変異を正すために使用することができる。かかる修飾は、エキソビボで細胞において作られてよい。
【００７８】
さらに他の態様において、本願明細書に記載されている組成物および方法は、改善された特性または環境ストレスに対する耐性の増加を有する作物植物を生成するために使用することができる。本開示はまた、改善された特性を有する家畜または生産動物を生成するために使用することができる。例えば、ブタは、とりわけ再生医療または異種移植において、生物医学モデルとして魅力的な多くの機能を有する。
【００７９】
定義
他に定義されていない限り、本願明細書において使用される全ての専門および科学用語は、本願発明が属する当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の文献は、本願発明において使用される多くの用語の一般的な定義を当業者に提供する：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd Ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991);およびHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本願明細書において使用される以下の用語は、別段の指定がない限り、それらに帰する意味を有する。
【００８０】
本開示またはその好ましい態様の要素を紹介するとき、冠詞「a」、「an」、「the」および「said」は、要素の１つ以上が存在することを意味することを意図する。「含む」、「含有する」および「有する」なる用語は、包括的であることを意図し、リストされた要素以外の追加の要素があってもよいことを意味する。
【００８１】
「約」なる用語は、数値、例えばｘに関して使用されるとき、ｘ±５％を意味する。
【００８２】
本願明細書において使用される「相補的」または「相補性」なる用語は、特定の水素結合を介する塩基対合による二本鎖核酸の会合を指す。塩基対合は、標準のワトソンクリック塩基対合（例えば、相補的配列３’−Ｔ  Ｃ  Ａ  Ｇ−５’との５’−Ａ  Ｇ  Ｔ  Ｃ−３’対）であり得る。塩基対合はまた、フーグスティーン型(Hoogsteen)または逆フーグスティーン型水素結合であってよい。相補性は、典型的に二本鎖領域に対して測定され、したがって例えばオーバーハングを除く。二本鎖領域の２つの鎖間の相補性は、部分的であってよく、塩基の一部（例えば、７０％）のみが相補的であるとき、パーセンテージ（例えば、７０％）として表現されてよい。相補的でない塩基は「不一致」である。相補性はまた、二本鎖領域における全ての塩基が相補的であるとき、完全（すなわち、１００％）であってよい。
【００８３】
本願明細書において使用される「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム」または「Ｃａｓ９システム」なる用語は、Ｃａｓ９タンパク質（すなわち、ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、または触媒的に不活性型のタンパク質）およびガイドＲＮＡを含む複合体を指す。
【００８４】
本願明細書において使用される「内因性配列」なる用語は、細胞に対して天然の染色体配列を指す。
【００８５】
本願明細書において使用される「外因性」なる用語は、細胞に対して天然でない配列、または細胞のゲノムにおける天然の位置が異なる染色体位置である染色体配列を指す。
【００８６】
本願明細書において使用される「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（エクソンおよびイントロンを含む）、ならびに調節配列がコードおよび／または転写配列に隣接しているか否かにかかわらず、遺伝子産物の生産を調節する全てのＤＮＡ領域を指す。したがって、遺伝子は、必ずしも限定されないが、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えばリボソーム結合部位および内部リボソーム侵入部位、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター(insulator)、境界要素（boundary element）、複製起点、マトリックス付着部位(matrix attachment site)、および遺伝子座調節領域を含む。
【００８７】
「異種」なる用語は、興味ある細胞に対して内因性または天然でない実体(entity)を指す。例えば、異種タンパク質は、外因性に導入された核酸配列のような外因性供給源に由来するかまたは当初由来されたタンパク質を指す。場合によっては、異種タンパク質は、通常、興味ある細胞によって産生されない
【００８８】
「ニッカーゼ」なる用語は、二本鎖核酸配列の一本鎖を切断する（すなわち、二本鎖配列にニックを入れる）酵素を指す。例えば、二本鎖切断活性を有するヌクレアーゼは、ニッカーゼとして機能し、二本鎖配列の一本鎖のみを切断するように、変異および／または欠失によって修飾されてよい。
【００８９】
本願明細書において使用される「ヌクレアーゼ」なる用語は、二本鎖核酸配列の両方の鎖を切断する酵素を指す。
【００９０】
「核酸」および「ポリヌクレオチド」なる用語は、線状または環状構造における、および一本鎖または二本鎖形態のいずれかにおけるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに対して限定するとして解釈されるべきではない。この用語は、天然ヌクレオチドの既知のアナログ、ならびに塩基、糖、および／またはリン酸部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）で修飾されているヌクレオチドを包含してよい。一般的に、特定のヌクレオチドのアナログは、同じ塩基対特異性を有する；すなわち、ＡのアナログはＴと塩基対を形成する。
【００９１】
「ヌクレオチド」なる用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを指す。ヌクレオチドは、標準ヌクレオチド（すなわち、アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン、およびウリジン）、ヌクレオチド異性体、またはヌクレオチドアナログであってよい。ヌクレオチドアナログは、修飾されたプリンまたはピリミジン塩基または修飾されたリボース部分を有するヌクレオチドを指す。ヌクレオチドアナログは、天然ヌクレオチド（例えば、イノシン、プソイドウリジンなど）または非天然ヌクレオチドであってよい。ヌクレオチドの糖または塩基部分における修飾の非限定的な例は、アセチル基、アミノ基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、ヒドロキシル基、メチル基、ホスホリル基、およびチオール基の付加（または除去）、ならびに塩基の炭素および窒素原子の他の原子（例えば、７−デアザプリン）での置換を含む。ヌクレオチドアナログはまた、ジデオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、およびモルホリノを含む。
【００９２】
「ポリペプチド」および「タンパク質」なる用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すように互換的に使用される。
【００９３】
「標的配列」、「標的染色体配列」および「標的部位」なる用語は、操作されたＣａｓ９システムが標的とする染色体ＤＮＡにおける特定の配列、および操作されたＣａｓ９システムがＤＮＡまたはＤＮＡと関連するタンパク質を修飾する部位を指すように互換的に使用される。
【００９４】
核酸およびアミノ酸配列同一性を決定するための技術は、当分野で知られている。典型的には、かかる技術は、遺伝子に対するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定することおよび／またはそれによりコードされるアミノ酸配列を決定すること、およびこれらの配列と第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列とを比較することを含む。ゲノム配列もまた、この様式において決定し、比較してもよい。一般的に、同一性は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列のそれぞれの正確なヌクレオチド−対−ヌクレオチドまたはアミノ酸−対−アミノ酸対応を指す。２つ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、これらの同一性パーセントを決定することによって比較してもよい。核酸またはアミノ酸配列のいずれであれ、２つの配列の同一性パーセントは、２つの整列された配列間の正確な一致の数を、より短い方の配列の長さで割り、１００を掛けたものである。核酸配列のおおよそのアラインメントは、Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)の局所相同性アルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USAによって開発され、Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)によって正規化されるスコアリングマトリックスを使用することによってアミノ酸配列に適用することができる。配列の同一性パーセントを決定するためのこのアルゴリズムの例示的な実施は、「ＢｅｓｔＦｉｔ」有用性用途においてGenetics Computer Group (Madison, Wis.)により提供される。配列間の同一性または類似性パーセントを計算するための他の適当なプログラムは、一般的に当分野で知られている、例えば、別のアラインメントプログラムはデフォルトパラメーターで使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、次のデフォルトパラメーターを使用して使用することができる：genetic code=standard; filter=none; strand=both; cutoff=60; expect=10; Matrix=BLOSUM62; Descriptions=50 sequences; sort by=HIGH SCORE; Databases=non-redundant, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR。これらのプログラムの詳細は、ＧｅｎＢａｎｋウェブサイトにて見ることができる。
【００９５】
本願発明の範囲から逸脱することなく、上記細胞および方法に様々な変更を行うことができるため、上記の説明および以下に示す実施例に含まれるすべての事項は、例示的として解釈され、限定的な意味ではないと解釈されることを意図する。
【実施例】
【００９６】
実施例
以下の実施例は、本開示の特定の局面を説明する。
【００９７】
実施例１：Ｃａｓ９オルソログによる標的ＤＮＡ切断のためのＰＡＭ要件の決定
バチルス・スミスイ、ラクトバチルス・ラムノサス、パラサテレラ・エクスクレメンティホミニス、マイコプラズマ・カニス、マイコプラズマ・ガリセプティカム、アッカーマンシア・グリカニフィラ、アッカーマンシア・ムシニフィラ、オエノコッカス・キタハラエ、ビフィドバクテリウム・ボンビ、アシッドサーマス・セルロリティカス、アリサイクロバチラス・ヘスペリダム、ウォリネラ・サクシノゲネス、ニトラティフラクター・サルスギニス、ラルストニア・シジギ、およびコリネバクテリウム・ジフテリア由来のＣａｓ９オルソログは、ヒト細胞において発現のために最適化され、Ｃ末端にてＳＶ４０大型Ｔ抗原核局在化（ＮＬＳ）でタグ化されたコドンであった（配列番号：１−３０；以下の表６参照）。各オルソログの発現は、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサーおよびプロモーターによって駆動された。各オルソログのためのＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）および推定トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を、単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を形成するように互いに結合させた（配列番号：３１−４５；以下の表６参照）。各ｓｇＲＮＡの発現は、ヒトＵ６プロモーターによって駆動された。インビトロで転写されたｓｇＲＮＡは、インビトロ消化用のサプリメントとしてＴ７プロモータータグ付きＰＣＲ鋳型から調製された。
【００９８】
ヒトＫ５６２細胞を、ヌクレオフェクション(nucleofection)によりＣａｓ９をコードするプラスミドおよびｓｇＲＮＡ発現プラスミドでトランスフェクトした。各トランスフェクションは、２００万の細胞、５μｇのＣａｓ９をコードするプラスミドＤＮＡ、および３μｇのｓｇＲＮＡ発現プラスミドＤＮＡからなった。細胞をトランスフェクションの約２４時間後に回収し、氷冷ＰＢＳバッファーで洗浄し、４℃冷室で３０分間一定攪拌しながら１５０μＬの溶解溶液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５；１００ｍＭ  ＫＣｌ；５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、５％  グリセロール、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｘ  プロテアーゼインヒビター）に溶解した。４℃で１６，０００  ｘ  ｇで２分間遠心分離して残留細胞残屑を除去することによって上清を調製し、プラスミドＤＮＡ  ＰＡＭライブラリーのインビトロ消化のためのＣａｓ９  ＲＮＰの供給源として使用した。ライブラリーは、以下の配置：５’−ＧＴＡＣＡＡＡＣＧＧＣＡＧＡＡＧＣＴＧＧＮＮＮＮＮＮＮＮ−３’（配列番号：４６）でのプロトスペーサーによりそれぞれすぐに始まる４８の縮退ＰＡＭを含んだ。各インビトロ消化は、２０μＬの反応容量において、１０μＬの細胞溶解物上清、２μＬの５ｘ  消化バッファー（１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５；５００ｍＭ  ＫＣｌ；２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；５ｍＭ  ＤＴＴ；２５％  グリセロール）、８００ｎｇのＰＡＭライブラリーＤＮＡ、および２０ｐｍｏｌのインビトロで転写されたｓｇＲＮＡサプリメントからなった。反応を３７℃で３０分間維持し、次にＰＣＲ精製キットで精製した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ配列決定ライブラリーを消化された生成物から調製し、ディープシーケンスに付した。ディープシーケンスデータをＷｅｂｌｏｇｏプログラムを使用して分析し、各Ｃａｓ９オルソログのためのＰＡＭ要件を推測した。
【００９９】
結果は、図１において要約されている。結果は、インビトロ標的ＤＮＡ切断のためのＡおよび／またはＴを含むＰＡＭを使用するいくつかのＣａｓ９オルソログを明らかにした。これらのＣａｓ９オルソログは、ＡＴリッチゲノム部位を標的とする手段を提供することができた。結果はまた、ＧＣリッチゲノム部位を標的とするために適当なＰＡＭを使用するいくつかのＣａｓ９オルソログを明らかにした。これらのＣａｓ９オルソログは、ＧＣリッチゲノム部位におけるＳｐｙＣａｓ９に代替の標的スキームを提供し、標的化の分解能および特異性を向上させることができた。
【０１００】
実施例２：バチルス・スミスイＣａｓ９（ＢｓｍＣａｓ９）およびラクトバチルス・ラムノサスＣａｓ９（ＬｒｈＣａｓ９）を使用するゲノム修飾
図１および表Ａ（上記）に示されるとおり、小さなＢｓｍＣａｓ９（１０９５ａａ）（配列番号：２）およびＬｒｈＣａｓ９（配列番号：４）は、標的ＤＮＡ結合のために、それぞれ５’−ＮＮＮＮＣＡＡＡ−３’ＰＡＭおよび５’−ＮＧＡＡＡ−３’ＰＡＭを使用する。これらの新規なＰＡＭの使用は、ＡＴリッチゲノム部位を標的とする手段を提供する。遺伝子編集を実証するために、ヒトＫ５６２細胞（１ｘ１０６）に５μｇのＣａｓ９をコードするプラスミドＤＮＡおよび３μｇのｓｇＲＮＡ発現プラスミドＤＮＡをヌクレオフェクトした。標的化ゲノム部位は、ヒトチロシン−タンパク質ホスファターゼ非受容体型２（ＰＴＮ２）遺伝子座、ヒトの空のスピラクル(spiracles)ホメオボックス１（ＥＭＸ１）遺伝子座、ヒトプログラム細胞死１リガンド１（ＰＤ１Ｌ１）遺伝子座、ヒトＡＡＶＳ１セーフハーバー遺伝子座、ヒトシトクロムｐ４５０酸化還元酵素（ＰＯＲ）遺伝子座、およびヒト核受容体サブファミリー１グループＩメンバー３（ＣＡＲ）遺伝子座を含む。ゲノムＤＮＡをトランスフェクションの３日後にＤＮＡ抽出溶液（ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔＴＭ）を使用して調製し、標的化ゲノム領域をそれぞれＰＣＲ増幅した（ＪｕｍｐＳｔａｒｔ  ＴａｑＴＭ  ＲｅａｄｙＭｉｘＴＭ）。ＰＣＲプライマーは、表１に列挙される。
【表１】
2021505180.tif 000005
【０１０１】
増幅は、以下の条件を使用して実施した：最初の変性のための９８℃で２分の１サイクル；９８℃で１５秒、６２℃で３０秒、および７２℃で４５秒の３４サイクル；７２℃で５分の１サイクル；および４℃で保持。ＰＣＲ産物をＣｅｌ−１ヌクレアーゼで消化し、１０％アクリルアミドゲルで分離した。標的化変異率を、ＩｍａｇｅＪを使用して測定し、パーセント挿入および／または欠失（％インデル）として示した。結果は、表２において要約されている。これらの結果は、両方のＣａｓ９オルソログが５’−ＮＮＮＮＣＡＡＡ−３’ＰＡＭ（ＢｓｍＣａｓ９）または５’−ＮＧＡＡＡ−３’ＰＡＭ（ＬｒｈＣａｓ９）を使用してヒト細胞における内因性ゲノム部位を編集することができたということを証明する。
【表２】
2021505180.tif 000006
【０１０２】
実施例３：クロマチン調節モチーフとの融合によるパラサテレラ・エクスクレメンティホミニスＣａｓ９（ＰｅｘＣａｓ９）の改善
パラサテレラ・エクスクレメンティホミニスＣａｓ９（ＰｅｘＣａｓ９−ＮＬＳ）（配列番号：６）を、ＴＧＳＧリンカー（配列番号：１０９）を使用してＮ末端でヒトＨＭＧＮ１ペプチド（配列番号：７２）とおよびＬＥＧＧＧＳリンカー（配列番号：１０８）を使用してＣ末端でヒトＨＭＧＢ１ボックスＡペプチド（ＰｅｘＣａｓ９−ＨＮ１ＨＢ１融合物；配列番号：１１７）またはヒトヒストンＨ１中央球状ドメインペプチド（ＰｅｘＣａｓ９−ＨＮ１Ｈ１Ｇ；配列番号：１１８）のいずれかとの融合によって修飾した。
【表３】
2021505180.tif 000007
【０１０３】
ヒトＫ５６２細胞（１ｘ１０６）を、モル当量（それぞれ５および５．４μｇ）においてＰｅｘＣａｓ９−ＮＬＳ、ＰｅｘＣａｓ９−ＨＮ１ＨＢ１融合物、またはＰｅｘＣａｓ９−ＨＮ１Ｈ１Ｇ融合物をコードするプラスミドＤＮＡおよびヒトシトクロムｐ４５０酸化還元酵素（ＰＯＲ）遺伝子座においてゲノム部位を標的化するための３μｇのｓｇＲＮＡプラスミドでトランスフェクトした。ゲノムＤＮＡをトランスフェクションの３日後にＤＮＡ抽出溶液（ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔＴＭ）を使用して調製し、標的化ゲノム領域をフォワードプライマー５’−ＣＴＣＣＣＣＴＧＣＴＴＣＴＴＧＴＣＧＴＡＴ−３’（配列番号：５５）およびリバースプライマー５’−ＡＣＡＧＧＴＣＧＴＧＧＡＣＡＣＴＣＡＣＡ−３’（配列番号：５６）を使用してＰＣＲ増幅した。増幅は、以下の条件を使用して実施した：最初の変性のための９８℃で２分の１サイクル；９８℃で１５秒、６２℃で３０秒、および７２℃で４５秒の３４サイクル；７２℃で５分の１サイクル；および４℃で保持。ＰＣＲ産物をＣｅｌ−１ヌクレアーゼで消化し、１０％アクリルアミドゲルで分離した。標的化変異率を、ＩｍａｇｅＪを使用して測定し、パーセント挿入および／または欠失（％インデル）として示した。結果は、表４において要約されている。結果は、少なくとも１つのクロマチン調節モチーフとのＣａｓ９融合物がヒト細胞において内因性標的に対するその遺伝子編集効率を増強するということを証明する。
【表４】
2021505180.tif 000008
＊ＰＡＭの決定因子ヌクレオチドは下線を引かれている。
【０１０４】
実施例４．ｓｇＲＮＡ修飾によるマイコプラズマ・カニスＣａｓ９（ＭｃａＣａｓ９）システムの改善
ＭｃａＣａｓ９の野生型ｃｒＲＮＡコード配列は、リピート領域における４つの連続したチミジン残基を含み、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが共にｓｇＲＮＡを形成するように結合されるとき、４つのチミジン残基のうち３つが推定ｔｒａｃｒＲＮＡ配列において３つのアデノシン残基と対を形成することが予期される。ヒトＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ）ＩＩＩは、転写終結シグナルとしてコードＲＮＡ鎖上に４つ以上の連続したチミジン残基を使用することが知られている。ヒト細胞においてＭｃａＣａｓ９  ｓｇＲＮＡの早期の転写終結を防止するため、ＴからＣへの変異および対応するＡからＧへの変異が、以下の配列を有する修飾されたｓｇＲＮＡスカフォールドを形成するように、ｓｇＲＮＡスカフォールドに導入された：５’−ＧＵＵＣＵＡＧＵＧＵＵＧＵＡＣＡＡＵＡＵＵＵＧＧＧＵＧＡＡＡＡＣＣＣＡＡＡＵＡＵＵＧＵＡＣＡＵＣＣＵＡＧＡＵＣＡＡＧＧＣＧＣＵＵＡＡＵＵＧＣＵＧＣＣＧＵＡＡＵＵＧＣＵＧＡＡＡＧＣＧＵＡＧＣＵＵＵＣＡＧＵＵＵＵＵＵＵ−３’（配列番号：７６）、ここで、変異されたヌクレオチドは下線を引かれている。この修飾はまた、ｓｇＲＮＡスカフォールド熱力学的安定性を増加させることが予期された。
【０１０５】
ヒトＫ５６２細胞（１ｘ１０６）を、Ｎ末端上にＨＭＧＮ１ペプチドおよびＣ末端上にヒストンＨ１球状ドメインペプチドを含むＭｃａＣａｓ９融合タンパク質をコードする５．５μｇのプラスミドＤＮＡ、およびコントロールｓｇＲＮＡスカフォールドまたは修飾されたｓｇＲＮＡスカフォールドをコードする３μｇのｓｇＲＮＡプラスミドＤＮＡでトランスフェクトされた。ゲノムＤＮＡをトランスフェクションの３日後にＤＮＡ抽出溶液（ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔＴＭ）を使用して調製し、標的化ゲノム領域をフォワードプライマー５’−ＣＴＣＣＣＣＴＧＣＴＴＣＴＴＧＴＣＧＴＡＴ−３’（配列番号：５５）およびリバースプライマー５’−ＡＣＡＧＧＴＣＧＴＧＧＡＣＡＣＴＣＡＣＡ−３’（配列番号：５６）を使用してＰＣＲ増幅した。増幅は、以下の条件を使用して実施した：最初の変性のための９８℃で２分の１サイクル；９８℃で１５秒、６２℃で３０秒、および７２℃で４５秒の３４サイクル；７２℃で５分の１サイクル；および４℃で保持。ＰＣＲ産物をＣｅｌ−１ヌクレアーゼで消化し、１０％アクリルアミドゲルで分離した。標的化変異率を、ＩｍａｇｅＪを使用して測定し、パーセント挿入および／または欠失（％インデル）として示した。結果は、表５において要約されている。結果は、哺乳動物細胞におけるＣａｓ９オルソログの活性がそのｓｇＲＮＡスカフォールドを修飾することによって増強することができるということを証明する。
【表５】
2021505180.tif 000009
＊ＰＡＭの決定因子ヌクレオチドは下線を引かれている。
【０１０６】
実施例５．クロマチン調節モチーフとの融合によるＭｃａＣａｓ９、ＢｓｍＣａｓ９、ＰｅｘＣａｓ９、およびＬｒｈＣａｓ９活性の改善
ＭｃａＣａｓ９−ＮＬＳ、ＢｓｍＣａｓ９−ＮＬＳ、およびＬｒｈＣａｓ９−ＮＬＳタンパク質を、アミノ末端でＨＭＧＮ１（ＨＮ１）およびカルボキシル末端でＨＭＧＢ１ボックスＡ（ＨＢ１）またはヒストンＨ１中央球状モチーフ（Ｈ１Ｇ）のいずれかと連結して、ＭｃａＣａｓ９−ＨＮ１ＨＢ１（配列番号：１２３）、ＭｃａＣａｓ９−ＨＮ１Ｈ１Ｇ（配列番号：１２４）、ＢｓｍＣａｓ９−ＨＮ１ＨＢ１（配列番号：１１９）、Ｂｓｍ−ＨＮ１Ｈ１Ｇ（配列番号：１２０）、Ｌｒｈ−ＨＮ１ＨＢ１（配列番号：１２１）、ＬｒｈＣａｓ９−ＨＮ１Ｈ１Ｇ（配列番号：１２２）を産生することによって、さらなるＣａｓ９−ＣＭＭ融合タンパク質を調製した。実施例３において上記説明されたこれらの融合物およびＰｅｘＣａｓ９−ＣＭＭ融合物のヌクレアーゼ活性を、実施例２および３において本質的に上記説明された対応する操作されたＣａｓ９タンパク質の活性と比較した。表６は、各Ｃａｓ９ヌクレアーゼに対する特定の遺伝子座における標的部位（すなわち、下線が引かれた決定的なヌクレオチドを有する太字で示される、プロトスペーサー＋ＰＡＭ）を示す。
【表６】
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【０１０７】
各条件下でのインデルのパーセントは、図２Ａ−Ｄにプロットされている。ＨＮ１ＨＢ１およびＨＮ１Ｈ１Ｇの組合せの両方が、少なくとも１つの部位で４つのＣａｓ９オルソログが有意に強化された。倍率変化の大きさに基づいて、ＣＭＭ融合修飾は、試験された２つの部位でその活性を少なくとも５倍増加させるＭｃａＣａｓ９に関して最大の増強を提供した（図２Ａ）。ＣＭＭ融合は、ＰｅｘＣａｓ９に関して２倍を超える増強を提供した（図２Ｂ）。ＢｓｍＣａｓ９活性は、１つの部位に関して３倍以上増強されたが、第２の部位に関して２０％の増加のみであり、第３の部位に関して影響がなかった（図２Ｃ）。しかしながら、全３つのＢｓｍＣａｓ９ヌクレアーゼが非常に効率的であった（＞３５％インデル）ことに留意すべきである。ＬｒｈＣａｓ９は、融合修飾なしでさえ、試験された２つの部位（２２％および３３％インデル）に関して非常に効率的であった（図２Ｄ）。しかしながら、ＨＮ１Ｈ１Ｇの組合せもなお、活性の７０％および２８％増加で、両方の部位に関して有意な増強を提供した。これらの結果は、ＣＭＭ融合戦略が遺伝子編集効率を増強させるということを証明する。
【０１０８】
実施例６．Ｃａｓ９−ＣＭＭ融合物のオフターゲット効果
Ｃａｓ９−ＣＭＭ融合物のオフターゲット活性を評価するために、それぞれの標的部位についての１から５個のトップランクの可能性のあるオフターゲット部位をSurveyor Nucleaseアッセイを使用して分析した。実施例５に上記説明されたＣａｓ９およびＣａｓ９−ＣＭＭ融合データに加えて、化膿連鎖球菌Ｃａｓ９（ＳｐｙＣａｓ９）、ＳｐｙＣａｓ９−ＣＭＭ融合物、ストレプトコッカス・パステウリアヌス（Streptococcus pasteurianus）Ｃａｓ９（ＳｐａＣａｓ９）、Ｓｐａ−ＣＭＭ融合物、カンピロバクター・ジェジュニＣａｓ９（ＣｊｅＣａｓ９）、およびＣｊｅＣａｓ９−ＳＭＭ融合物からのデータもまた分析した。アッセイされた合計６４の可能性のあるオフターゲット部位から、オフターゲット切断が試験された計２１のガイド配列のうちの９のガイド配列によって寄与される１１部位にて検出された。１１のオフターゲット部位において、オフターゲット切断がコントロールＳｐｙＣａｓ９において検出されなかったＰＯＲ  Ｓｐｙ  １−ＯＴ１部位を除いて、コントロールＣａｓ９および融合ヌクレアーゼが同時に存在した。概して、融合ヌクレアーゼおよびコントロールＣａｓ９間の有意な差異はなかった（図３）。例えば、全１１のオフターゲット部位にわたって、ＨＮ１Ｈ１Ｇ融合組合せは平均８．０±６．０％インデルであり、コントロールＣａｓ９は平均７．５±５．１％インデルであった。同様に、ＨＮ１ＨＢ１融合組合せに関連する１０のオフターゲット部位にわたって、融合組合せおよびコントロールＣａｓ９（６．９±５．７％  対  ６．５±５．４％インデル）間の有意な差異はなかった。総合すれば、これらの結果は、ＨＮ１Ｈ１ＢおよびＨＮ１Ｈ１Ｇ融合組合せによるオンターゲット活性増強は、一般的に、オフターゲット活性における増加をもたらさないことを示す。
【０１０９】
操作されたＣａｓ９システム(Engineered Cas9 Systems)
表７は、操作されたＣａｓ９／ＮＬＳタンパク質のヒトコドン最適化ＤＮＡおよびタンパク質(protein)配列(sequence)（配列番号(SEQ ID NO)：１−３０、ここで、ＮＬＳ配列は下線が引かれている）および操作されたｓｇＲＮＡ（配列番号：３１−４５；５’末端でのＮ残基はプログラム可能型標的配列を示す）のＤＮＡ配列を示す。Ｃａｓ９−ＣＭＭ融合物(fusion)（配列番号：１１７−１２４）も示される。
【表７−１】
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【表７−２】
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【表７−３】
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【表７−４】
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【表７−５】
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【表７−６】
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【表７−７】
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【表７−８】
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【表７−９】
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【表７−１０】
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【表７−１１】
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【表７−１２】
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【表７−１３】
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【表７−１４】
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【表７−１５】
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【表７−１６】
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【表７−１７】
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【表７−１８】
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【表７−１９】
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【表７−２０】
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【表７−２１】
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【表７−２２】
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【表７−２３】
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【表７−２４】
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【表７−２５】
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【表７−２６】
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【表７−２７】
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【表７−２８】
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【表７−２９】
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【表７−３０】
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【表７−３１】
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【表７−３２】
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【表７−３３】
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【表７−３４】
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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