(57)【要約】  本発明は、悪性Ｂ細胞を標的して癌を治療する用途の新規な抗体またはその抗原結合断片、これを含むキメラ抗原受容体及びこれらの用途に関するものである。本発明の抗体は癌細胞（特に、血液癌）で高発現されるＣＤ１９に特異的に結合する抗体であって、従来のＣＤ１９ターゲット抗体のＣＤＲ序列と比較して相同性が非常に低いので、その序列の独特性があり、本発明の抗−ＣＤ１９抗体または抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体を発現する細胞はＣＤ１９を発現する陽性細胞株に反応して免疫細胞活性を誘導するので、ＣＡＲ−免疫細胞治療剤として有用に使用することができる。
2021507922.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次を含む抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片：
（ａ）次の一般式１で表示されるアミノ酸序列からなるＣＤＲＨ２を含む重鎖可変領域（heavy chain variable region、ＶＨ）：
一般式１
ＧＩＹＹＤＸ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３ＳＶＫＧ
ここで、Ｘ６はＧ、Ａ、またはＳであり；Ｘ７はＳ、Ｔ、Ｉ、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｌ、またはＨであり；Ｘ８はＡ、Ｔ、Ｓ、Ｑ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｎ、Ｙ、またはＨであり；Ｘ９はＲ、ＫＳ、Ｖ、Ａ、Ｑ、Ｌ、Ｔ、Ｅ、Ｄ、Ｍ、Ｌ、Ｆ、またはＰであり；Ｘ１０はＹ、Ｇ、Ｓ、またはＴであり；Ｘ１１はＹ、Ｗ、Ｍ、またはＬであり；Ｘ１２はＡ、Ｓ、Ｔ、またはＬであり；Ｘ１３はＤ、Ｓ、Ｇ、Ｎ、またはＰである；及び
（ｂ）次の一般式２で表示されるアミノ酸序列からなるＣＤＲＬ１を含む軽鎖可変領域（light chain variable region、ＶＬ）：
一般式２
Ｘ１ＧＸ３Ｘ４ＳＮＩＧＳＸ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｙ
前記Ｘ１はＶ、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｗ、Ｎ、Ｙ、Ｋ、Ｔ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｅ、またはＤであり；Ｘ３はＧ、Ｈ、Ｄ、Ｌ、Ｔ、Ｑ、Ｋ、Ｎ、Ｓ、またはＭであり；Ｘ４はＶ、Ｙ、Ｉ、Ｐ、Ｖ、Ｍ、Ａ、Ｌ、Ｆ、またはＳであり；Ｘ１０はＮまたはＡであり；Ｘ１１はＡまたはＰであり；Ｘ１２はＶ、Ｔ、またはＬである。
【請求項２】
前記重鎖可変領域は下記の一般式１−１で表示されるアミノ酸序列からなるＣＤＲＨ２を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片：
一般式１−１
ＧＩＹＹＤＸ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＹＹＡＤＳＶＫＧ
ここで、Ｘ６はＧ、Ａ、またはＳであり；Ｘ７はＳ、Ｔ、Ｉ、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｌ、またはＨであり；Ｘ８はＡ、Ｔ、Ｓ、Ｑ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｎ、Ｙ、またはＨであり；Ｘ９はＲ、ＫＳ、Ｖ、Ａ、Ｑ、Ｌ、Ｔ、Ｅ、Ｄ、Ｍ、Ｌ、Ｆ、またはＰである。
【請求項３】
前記軽鎖可変領域は下記の一般式２−１で表示されるアミノ酸序列からなるＣＤＲＬ１を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片：
一般式２−１
Ｘ１ＧＸ３Ｘ４ＳＮＩＧＳＮＡＶＹ
前記Ｘ１はＶ、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｗ、Ｎ、Ｙ、Ｋ、Ｔ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｅ、またはＤであり；Ｘ３はＧ、Ｈ、Ｄ、Ｌ、Ｔ、Ｑ、Ｋ、Ｎ、Ｓ、またはＭであり；Ｘ４はＶ、Ｙ、Ｉ、Ｐ、Ｖ、Ｍ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、またはＳである。
【請求項４】
前記重鎖可変領域（ＶＨ）は序列目録第１序列のＣＤＲＨ１及び序列目録第３序列のＣＤＲＨ３をさらに含み、
前記軽鎖可変領域（ＶＬ）は序列目録第５序列のＣＤＲＬ２及び序列目録第６序列のＣＤＲＬ３をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
前記ＣＤＲＨ２は序列目録第２序列、第７序列乃至第４８序列からなる群より選択されたアミノ酸序列を含むことを特徴とする、請求項４に記載の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
前記ＣＤＲＬ１は序列目録第４序列、第４９序列乃至第９０序列からなる群より選択されたアミノ酸序列を含むことを特徴とする、請求項４に記載の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
前記ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＬ１は各々序列目録第２序列及び第４序列；第７序列及び第４９序列；第８序列及び第５０序列；第９序列及び第５１序列；第１０序列及び第５２序列；第１１序列及び第５３序列；第１２序列及び第５４序列；第１３序列及び第５５序列；第１４序列及び第５６序列；第１５序列及び第５７序列；第１６序列及び第５８序列；第１７序列及び第５９序列；第１８序列及び第６０序列；第１９序列及び第６１序列；第２０序列及び第６２序列；第２１序列及び第６３序列；第２２序列及び第６４序列；第２３序列及び第６５序列；第２４序列及び第６６序列；第２５序列及び第６７序列；第２６序列及び第６８序列；第２７序列及び第６９序列；第２８序列及び第７０序列；第２９序列及び第７１序列；第３０序列及び第７２序列；第３１序列及び第７３序列；第３５序列及び第７４序列；第３３序列及び第７５序列；第３４序列及び第７６序列；第３５序列及び第７７序列；第３６序列及び第７８序列；第３７序列及び第７９序列；第３８序列及び第８０序列；第３９序列及び第８１序列；第４０序列及び第８２序列；第４１序列及び第８３序列；第４２序列及び第８４序列；第４３序列及び第８５序列；第４４序列及び第８６序列；第４５序列及び第８７序列；第４６序列及び第８８序列；第４７序列及び第８９序列；または第４８序列及び第９０序列のアミノ酸序列を含むことを特徴とする、請求項４に記載の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
前記重鎖可変領域（ＶＨ）は序列目録第９１序列乃至第１３３序列からなる群より選択されたアミノ酸序列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
前記軽鎖可変領域（ＶＬ）は序列目録第１３４序列乃至第１７６序列からなる群より選択されたアミノ酸序列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
前記重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）は各々序列目録第９１序列及び第１３４序列；第９２序列及び第１３５序列；第９３序列及び第１３６序列；第９４序列及び第１３７序列；第９５序列及び第１３８序列；第９６序列及び第１３９序列；第９７序列及び第１４０序列；第９８序列及び第１４１序列；第９９序列及び第１４２序列；第１００序列及び第１４３序列；第１０１序列及び第１４４序列；第１０２序列及び第１４５序列；第１０３序列及び第１４６序列；第１０４序列及び第１４７序列；第１０５序列及び第１４８序列；第１０６序列及び第１４９序列；第１０７序列及び第１５０序列；第１０８序列及び第１５１序列；第１０９序列及び第１５２序列；第１１０序列及び第１５３序列；第１１１序列及び第１５４序列；第１１２序列及び第１５５序列；第１１３序列及び第１５６序列；第１１４序列及び第１５７序列；第１１５序列及び第１５８序列；第１１６序列及び第１５９序列；第１１７序列及び第１６０序列；第１１８序列及び第１６１序列；第１１９序列及び第１６２序列；第１２０序列及び第１６３序列；第１２１序列及び第１６４序列；第１２２序列及び第１６５序列；第１２３序列及び第１６６序列；第１２４序列及び第１６７序列；第１２５序列及び第１６８序列；第１２６序列及び第１６９序列；第１２７序列及び第１７０序列；第１２８序列及び第１７１序列；第１２９序列及び第１７２序列；第１３０序列及び第１７３序列；第１３１序列及び第１７４序列；第１３２序列及び第１７５序列；または第１３３序列及び第１７６序列のアミノ酸序列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１１】
前記ＣＤＲＨ２は序列目録第１９０序列のアミノ酸序列を含み、前記ＣＤＲＬ１は序列目録第１９９序列または第２００序列のアミノ酸序列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１２】
序列目録第１９１序列乃至第１９８序列のアミノ酸序列を含むＣＤＲＨ３を追加的に含むことを特徴とする、請求項１１に記載の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１３】
序列目録第１序列のＣＤＲＨ１、序列目録第５序列のＣＤＲＬ２、及び序列目録第６序列のＣＤＲＬ３を追加的に含むことを特徴とする、請求項１１に記載の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１４】
請求項１乃至１３のうち、いずれか一項の抗体またはその抗原結合断片をエンコーディングする核酸分子。
【請求項１５】
請求項１４の核酸分子を含む、再組合せベクター。
【請求項１６】
請求項１５の再組合せベクターに形質転換された宿主細胞。
【請求項１７】
次を含むＣＤ１９特異的キメラ抗原受容体：
（ａ）請求項１乃至１３のうち、いずれか一項の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片を含む細胞外ドメイン（Extracellular domain）；
（ｂ）膜貫通ドメイン（transmembrane domain）；及び
（ｃ）細胞内信号伝達ドメイン。
【請求項１８】
請求項１７のキメラ抗原受容体を発現する効果器細胞。
【請求項１９】
請求項１８の細胞を含むＣＤ１９を発現する細胞と関連した疾患、自家免疫疾患、または炎症疾患の予防または治療用薬剤学的組成物。
【請求項２０】
請求項１乃至１３のうち、いずれか一項の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片を含むＣＤ１９を発現する細胞と関連した疾患、自家免疫疾患、または炎症疾患の予防または治療用薬剤学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は大韓民国多部処の支援下で課題番号９９９１００６２４０によりなされたものであって、前記課題の研究管理専門機関は（財）汎部処新薬開発事業団、研究事業名は“汎部処全周期新薬開発”、研究課題名は“新規ＣＤ１９抗体基盤ＣＡＲ−Ｔ治療剤開発”、主管機関は“アブクロン（株）”、研究期間は２０１８．０２．０１−２０１９．０１．３１である。
【０００２】
本特許出願は２０１７年１２月２２日付で大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０−２０１７−０１７８５５９号に対して優先権を主張し、前記特許出願の開示事項は本明細書に参照として挿入される。
【０００３】
本発明は悪性Ｂ細胞を標的して癌を治療する用途の新規な抗体またはその抗原結合断片、これを含むキメラ抗原受容体及びその用途に関するものである。
【背景技術】
【０００４】
悪性Ｂ細胞（B cell malignancy）は体の兔疫体系を構成する細胞系列のうち、Ｂ細胞で生じる腫瘍をいう。このような悪性Ｂ細胞は正常な兔疫体系を破壊するので、外部から侵入する抗原に対する免疫性を落ちて患者が死亡に至るようにする。例えば、悪性Ｂ細胞のうちの１つである急性リンパ球性白血病はリンパ球系白血球が悪性細胞に変わり、骨髄で増殖し、末梢血液に広がるが、肝、脾臟、リンパ系、大脳、小脳、脊髄などを侵す病気である。急性リンパ球性白血病は２０１５年グローバルＡＬＬ発生数は１６１，０００人、死亡者数は１１０，０００人に予想され、発生及び死亡全て女子より男子でたくさん表れている病気である。このような急性リンパ球性白血病を治療する方法に、化学療法（chemotherapy）、標的治療法（targeted therapy）、同種幹細胞移植（allogeneic stem cell transplantation）が代表的であり、その治療法が向上して小児患者の生存率は８５％を上回っている。しかしながら、相変らず既存の治療剤に未反応する患者または再発患者が発生しており、小児癌死亡の最も大きい原因となっている。
【０００５】
急性リンパ球性白血病だけでなく、悪性Ｂ細胞から発生する大部分のリンパ腫／白血病（lymphoma/leukemia）は細胞の表面にＣＤ１９を発現するので、これに基づいてＣＤ１９を認識する多様な治療法が試みられている。このようなＣＤ１９標的治療剤分野にはＣＡＲ−Ｔ治療剤、二重抗体（bispecific antibody）、抗体薬物複合体（antibody-drug conjugate）、免疫毒素（immunotoxin）、Fc-engineered抗体などがある。このようなＣＤ１９標的治療剤分野のうち、ＣＡＲ−Ｔ治療剤は既存の治療に不応する急性白血病患者を対象に標的細胞の細胞毒性を活性化させることによって細胞死滅を誘導する機作を通じて血液癌治療に活用されて、これを通じて高い完治率（３０人のうち、２７人完治）の臨床試験結果が報告された。
【０００６】
このような背景下に本発明者らは、悪性Ｂ細胞のうち、ＣＤ１９を選択的に認識する抗体断片及びこれを含むキメラ抗原受容体を開発して、このキメラ抗原受容体を発現する細胞毒性Ｔ細胞が細胞毒性活性を保有していることを確認した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは悪性Ｂ細胞を治療するための方法にＣＤ１９に特異的に結合する新規な抗体及びこれを用いたキメラ抗原受容体を開発するために努力した。その結果、本発明のＣＤ１９＿８．１抗体がＣＤ１９抗原に選択的に結合し、この抗体の断片を含むキメラ抗原受容体を発現する細胞毒性Ｔ細胞が細胞毒性活性を保有することを確認し本発明を完成した。
【０００８】
したがって、本発明の目的は新規抗の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片を提供することにある。
【０００９】
本発明の他の目的は、抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片を含む細胞外ドメイン（extracellular domain）、膜貫通ドメイン（transmembrane domain）、及び細胞内信号伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体を提供することにある。
【００１０】
本発明の更に他の目的は、前記キメラ抗原受容体を発現する細胞を提供することにある。
【００１１】
本発明の更に他の目的は、前記抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片、またはキメラ抗原受容体を発現する細胞を含む薬剤学的組成物を提供することにある。
【００１２】
本発明の更に他の目的は、前記抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片、またはキメラ抗原受容体をエンコーディングする核酸分子を提供することにある。
【００１３】
本発明の更に他の目的は、前記抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片、またはキメラ抗原受容体をエンコーディングする核酸分子を含む再組合せベクターを提供することにある。
【００１４】
本発明の更に他の目的は、前記抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片、または再組合せベクターに形質転換された宿主細胞を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本明細書では、以下の第１項乃至第３５項の発明が請求される。
【００１６】
１．次を含む抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片：
（ａ）次の一般式１で表示されるアミノ酸序列からなるＣＤＲＨ２を含む重鎖可変領域（heavy chain variable region、ＶＨ）：
一般式１
ＧＩＹＹＤＸ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３ＳＶＫＧ
ここで、Ｘ６はＧ、Ａ、またはＳであり；Ｘ７はＳ、Ｔ、Ｉ、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｌ、またはＨであり；Ｘ８はＡ、Ｔ、Ｓ、Ｑ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｎ、Ｙ、またはＨであり；Ｘ９はＲ、ＫＳ、Ｖ、Ａ、Ｑ、Ｌ、Ｔ、Ｅ、Ｄ、Ｍ、Ｌ、Ｆ、またはＰであり；Ｘ１０はＹ、Ｇ、Ｓ、またはＴであり；Ｘ１１はＹ、Ｗ、Ｍ、またはＬであり；Ｘ１２はＡ、Ｓ、Ｔ、またはＬであり；Ｘ１３はＤ、Ｓ、Ｇ、Ｎ、またはＰである；及び
（ｂ）次の一般式２で表示されるアミノ酸序列からなるＣＤＲＬ１を含む軽鎖可変領域（light chain variable region、ＶＬ）：
一般式２
Ｘ１ＧＸ３Ｘ４ＳＮＩＧＳＸ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｙ
前記Ｘ１はＶ、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｗ、Ｎ、Ｙ、Ｋ、Ｔ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｅ、またはＤであり；Ｘ３はＧ、Ｈ、Ｄ、Ｌ、Ｔ、Ｑ、Ｋ、Ｎ、Ｓ、またはＭであり；Ｘ４はＶ、Ｙ、Ｉ、Ｐ、Ｖ、Ｍ、Ａ、Ｌ、Ｆ、またはＳであり；Ｘ１０はＮまたはＡであり；Ｘ１１はＡまたはＰであり；Ｘ１２はＶ、Ｔ、またはＬである。
【００１７】
２．第１項において、
前記重鎖可変領域は下記の一般式１−１で表示されるアミノ酸序列からなるＣＤＲＨ２を含むことを特徴とする、抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片：
一般式１−１
ＧＩＹＹＤＸ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＹＹＡＤＳＶＫＧ
ここで、Ｘ６はＧ、Ａ、またはＳであり；Ｘ７はＳ、Ｔ、Ｉ、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｌ、またはＨであり；Ｘ８はＡ、Ｔ、Ｓ、Ｑ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｎ、Ｙ、またはＨであり；Ｘ９はＲ、ＫＳ、Ｖ、Ａ、Ｑ、Ｌ、Ｔ、Ｅ、Ｄ、Ｍ、Ｌ、Ｆ、またはＰである。
【００１８】
３．第１項において、
前記軽鎖可変領域は下記の一般式２−１で表示されるアミノ酸序列からなるＣＤＲＬ１を含むことを特徴とする、抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片：
一般式２−１
Ｘ１ＧＸ３Ｘ４ＳＮＩＧＳＮＡＶＹ
前記Ｘ１はＶ、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｗ、Ｎ、Ｙ、Ｋ、Ｔ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｅ、またはＤであり；Ｘ３はＧ、Ｈ、Ｄ、Ｌ、Ｔ、Ｑ、Ｋ、Ｎ、Ｓ、またはＭであり；Ｘ４はＶ、Ｙ、Ｉ、Ｐ、Ｖ、Ｍ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、またはＳである。
【００１９】
４．第１項において、前記重鎖可変領域（ＶＨ）は序列目録第１序列のＣＤＲＨ１及び序列目録第３序列のＣＤＲＨ３をさらに含み；前記軽鎖可変領域（ＶＬ）は序列目録第５序列のＣＤＲＬ２及び序列目録第６序列のＣＤＲＬ３をさらに含むことを特徴とする、抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【００２０】
５．第４項において、前記ＣＤＲＨ２は序列目録第２序列、第７序列乃至第４８序列からなる群より選択されたアミノ酸序列を含むことを特徴とする、抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【００２１】
６．第４項において、前記ＣＤＲＬ１は序列目録第４序列、第４９序列乃至第９０序列からなる群より選択されたアミノ酸序列を含むことを特徴とする、抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【００２２】
７．第４項において、前記ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＬ１は各々序列目録第２序列及び第４序列；第７序列及び第４９序列；第８序列及び第５０序列；第９序列及び第５１序列；第１０序列及び第５２序列；第１１序列及び第５３序列；第１２序列及び第５４序列；第１３序列及び第５５序列；第１４序列及び第５６序列；第１５序列及び第５７序列；第１６序列及び第５８序列；第１７序列及び第５９序列；第１８序列及び第６０序列；第１９序列及び第６１序列；第２０序列及び第６２序列；第２１序列及び第６３序列；第２２序列及び第６４序列；第２３序列及び第６５序列；第２４序列及び第６６序列；第２５序列及び第６７序列；第２６序列及び第６８序列；第２７序列及び第６９序列；第２８序列及び第７０序列；第２９序列及び第７１序列；第３０序列及び第７２序列；第３１序列及び第７３序列；第３５序列及び第７４序列；第３３序列及び第７５序列；第３４序列及び第７６序列；第３５序列及び第７７序列；第３６序列及び第７８序列；第３７序列及び第７９序列；第３８序列及び第８０序列；第３９序列及び第８１序列；第４０序列及び第８２序列；第４１序列及び第８３序列；第４２序列及び第８４序列；第４３序列及び第８５序列；第４４序列及び第８６序列；第４５序列及び第８７序列；第４６序列及び第８８序列；第４７序列及び第８９序列；または第４８序列及び第９０序列のアミノ酸序列を含むことを特徴とする、抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【００２３】
８．第１項において、前記重鎖可変領域（ＶＨ）は序列目録第９１序列乃至第１３３序列からなる群より選択されたアミノ酸序列を含むことを特徴とする、抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【００２４】
９．第１項において、前記軽鎖可変領域（ＶＬ）は序列目録第１３４序列乃至第１７６序列からなる群より選択されたアミノ酸序列を含むことを特徴とする、抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【００２５】
１０．第１項において、前記重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）は各々序列目録第９１序列及び第１３４序列；第９２序列及び第１３５序列；第９３序列及び第１３６序列；第９４序列及び第１３７序列；第９５序列及び第１３８序列；第９６序列及び第１３９序列；第９７序列及び第１４０序列；第９８序列及び第１４１序列；第９９序列及び第１４２序列；第１００序列及び第１４３序列；第１０１序列及び第１４４序列；第１０２序列及び第１４５序列；第１０３序列及び第１４６序列；第１０４序列及び第１４７序列；第１０５序列及び第１４８序列；第１０６序列及び第１４９序列；第１０７序列及び第１５０序列；第１０８序列及び第１５１序列；第１０９序列及び第１５２序列；第１１０序列及び第１５３序列；第１１１序列及び第１５４序列；第１１２序列及び第１５５序列；第１１３序列及び第１５６序列；第１１４序列及び第１５７序列；第１１５序列及び第１５８序列；第１１６序列及び第１５９序列；第１１７序列及び第１６０序列；第１１８序列及び第１６１序列；第１１９序列及び第１６２序列；第１２０序列及び第１６３序列；第１２１序列及び第１６４序列；第１２２序列及び第１６５序列；第１２３序列及び第１６６序列；第１２４序列及び第１６７序列；第１２５序列及び第１６８序列；第１２６序列及び第１６９序列；第１２７序列及び第１７０序列；第１２８序列及び第１７１序列；第１２９序列及び第１７２序列；第１３０序列及び第１７３序列；第１３１序列及び第１７４序列；第１３２序列及び第１７５序列；または第１３３序列及び第１７６序列のアミノ酸序列を含むことを特徴とする、抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【００２６】
１１．第１項において、前記ＣＤＲＨ２は序列目録第１９０序列のアミノ酸序列を含み、前記ＣＤＲＬ１は序列目録第１９９序列または第２００序列のアミノ酸序列を含むことを特徴とする、抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【００２７】
１２．第１１項において、序列目録第１９１序列乃至第１９８序列のアミノ酸序列を含むＣＤＲＨ３を追加的に含むことを特徴とする、抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【００２８】
１３．第１１項において、序列目録第１序列のＣＤＲＨ１、序列目録第５序列のＣＤＲＬ２、及び序列目録第６序列のＣＤＲＬ３を追加的に含むことを特徴とする、抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【００２９】
１４．第１項乃至第１３項のうち、いずれか一項の抗体またはその抗原結合断片をエンコーディングする核酸分子。
【００３０】
１５．第１４項の核酸分子を含む、再組合せベクター。
【００３１】
１６．第１５項の再組合せベクターに形質転換された宿主細胞。
【００３２】
１７．次を含むＣＤ１９特異的キメラ抗原受容体：
（ａ）第１項乃至第１３項のうち、いずれか一項の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片を含む細胞外ドメイン（Extracellular domain）；
（ｂ）膜貫通ドメイン（transmembrane domain）；及び
（ｃ）細胞内信号伝達ドメイン。
【００３３】
１８．第１７項において、前記膜横断ドメインはＴ−細胞受容体、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、［００１１］ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８（ＣＤ８α）、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及びＣＤ１５４のアルファ、ベータ、またはゼータ鎖からなる群より選択されたタンパク質の膜横断ドメインであることを特徴とする、ＣＤ１９特異的キメラ抗原受容体。
【００３４】
１９．第１７項において、前記細胞内信号伝達ドメインはＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）鎖から由来したドメインであることを特徴とする、キメラ抗原受容体。
【００３５】
２０．第１７項において、前記細胞内信号伝達ドメインはＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）からなる群より選択された共同刺激分子（costimulatory molecule）を追加的に含むことを特徴とする、キメラ抗原受容体。
【００３６】
２１．第１７項乃至第２０項のうち、いずれか一項のキメラ抗原受容体を発現する細胞。
【００３７】
２２．第２１項において、前記細胞は、樹枝状細胞、キラー樹枝状細胞、肥満細胞、ＮＫ−細胞、Ｂ−細胞、または炎症性Ｔ−リンパ球、細胞毒性Ｔ−リンパ球、調節Ｔ−リンパ球、またはヘルパーＴ−リンパ球からなる群より選択された免疫細胞であることを特徴とする、キメラ抗原受容体を発現する細胞。
【００３８】
２３．第１項乃至第１３項のうち、いずれか一項の抗体またはその抗原結合断片を含むＣＤ１９を発現する細胞と関連した疾患、自家免疫疾患、または炎症疾患の予防または治療用薬剤学的組成物。
【００３９】
２４．第２３項において、前記ＣＤ１９を発現する細胞と関連した疾患は、慢性リンパ球性白血病（chronic lymphocytic leukemia、ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（acute lymphocytic leukemia、ＡＬＬ）、前リンパ球性白血病（pro-lymphocytic leukemia）、毛細胞白血病（hairy cell leukemia）、一般急性リンパ球性白血病（common acute lymphocytic leukemia、ＣＡＬＬＡ）、Null-acute lymphoblastic leukemia、非−ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（diffuse large B cell lymphoma、ＤＬＢＣＬ）、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫（follicular lymphoma）、脾臟リンパ腫（splenic lymphoma）、辺縁帯リンパ腫（marginal zone lymphoma）、マントル細胞リンパ腫（mantle cell lymphoma）、低危険群Ｂ細胞リンパ腫（indolent B cell lymphoma）、及びホジキンリンパ腫（Ｈodgkin lymphoma）からなる群より選択されたＢ細胞悪性腫瘍（Ｂ cell malignancy）であることを特徴とする、薬剤学的組成物。
【００４０】
２５．第２３項において、前記自家免疫疾患または炎症疾患は、多発性硬化症、リューマチ性関節炎、及び全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythematosus、ＳＬＥ）からなる群より選択された疾患であることを特徴とする、薬剤学的組成物。
【００４１】
２６．第２１項または第２２項の細胞を含むＣＤ１９を発現する細胞と関連した疾患、自家免疫疾患、または炎症疾患の予防または治療用薬剤学的組成物。
【００４２】
２７．第２６項において、前記ＣＤ１９を発現する細胞と関連した疾患は、慢性リンパ球性白血病（chronic lymphocytic leukemia、ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（acute lymphocytic leukemia、ＡＬＬ）、前リンパ球性白血病（pro-lymphocytic leukemia）、毛細胞白血病（hairy cell leukemia）、一般急性リンパ球性白血病（common acute lymphocytic leukemia、ＣＡＬＬＡ）、Null-acute lymphoblastic leukemia、非−ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（diffuse large B cell lymphoma、ＤＬＢＣＬ）、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫（follicular lymphoma）、脾臟リンパ腫（splenic lymphoma）、辺縁帯リンパ腫（marginal zone lymphoma）、マントル細胞リンパ腫（mantle cell lymphoma）、低危険群Ｂ細胞リンパ腫（indolent B cell lymphoma）、及びホジキンリンパ腫（Ｈodgkin lymphoma）からなる群より選択されたＢ細胞悪性腫瘍（Ｂ cell malignancy）であることを特徴とする、薬剤学的組成物。
【００４３】
２８．第２６項において、前記自家免疫疾患または炎症疾患は、多発性硬化症、リューマチ性関節炎、及び全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythematosus、ＳＬＥ）からなる群より選択された疾患であることを特徴とする、薬剤学的組成物。
【００４４】
２９．第１７項乃至第２０項のキメラ抗原受容体をエンコーディングする核酸分子。
【００４５】
３０．第２６項の核酸分子を含む再組合せベクター。
【００４６】
３１．第２７項の再組合せベクターに形質転換された宿主細胞。
【００４７】
３２．第２３項乃至第２８項のうち、いずれか一項の組成物を治療が必要な対象体に投与する段階を含むＣＤ１９を発現する細胞と関連した疾患、自家免疫疾患、または炎症疾患の治療方法。
【００４８】
３３．第３２項において、前記ＣＤ１９を発現する細胞と関連した疾患は、慢性リンパ球性白血病（chronic lymphocytic leukemia、ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（acute lymphocytic leukemia、ＡＬＬ）、前リンパ球性白血病（pro-lymphocytic leukemia）、毛細胞白血病（hairy cell leukemia）、一般急性リンパ球性白血病（common acute lymphocytic leukemia、ＣＡＬＬＡ）、Null-acute lymphoblastic leukemia、非−ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（diffuse large B cell lymphoma、ＤＬＢＣＬ）、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫（follicular lymphoma）、脾臟リンパ腫（splenic lymphoma）、辺縁帯リンパ腫（marginal zone lymphoma）、マントル細胞リンパ腫（mantle cell lymphoma）、低危険群Ｂ細胞リンパ腫（indolent B cell lymphoma）、及びホジキンリンパ腫（Ｈodgkin lymphoma）からなる群より選択されたＢ細胞悪性腫瘍（Ｂ cell malignancy）である、治療方法。
【００４９】
３４．第３２項において、前記自家免疫疾患または炎症疾患は、多発性硬化症、リューマチ性関節炎、及び全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythematosus、ＳＬＥ）からなる群より選択された疾患である、治療方法。
【００５０】
３５．第３２項において、前記対象体は哺乳動物またはヒトである、治療方法。
【００５１】
本明細書で、本発明の一態様に従う抗体は、ＣＤ１９＿８．１抗体及び親和度成熟を経たこれらの変形抗体である。
【００５２】
本発明のＣＤ１９＿８．１抗体、その変形抗体、またはそれらの抗原結合断片は、従来のキメラ抗原受容体に使われる抗体であるＦＭＣ６３と同様にＣＤ１９に対して特異的な結合能を有する。
【００５３】
本明細書で、“ＦＭＣ６３”抗体はミューリン抗−ＣＤ１９単一クローン抗体の一例である（Nicholson et al., Molecular Immunology, 34(16-17): 1157-1165 (1997)）。ＦＭＣ６３単一クローン抗体の可変領域は臨床試験で試験されたＣＡＲに使われてきた（例えば、文献[Kochenderfer et al., Nature Review Clinical Oncol., 10(5); 267-276 (2013); Porter et al., New Eng. J. Med., 365(8): 725-733 (2011); Kalos et al., Science Translational Medicine, 3(95): 95ra73 (2011); Kochenderfer et al., Blood, 116(20): 4099-4102 (2010); and Kochenderfer et al., Blood, 119(12): 2709-2720 (2012)]参照）。
【００５４】
本発明の抗体は、前記ＦＭＣ６３抗体と同一なＣＤ１９のエピトープに特異的に結合する。
【００５５】
本明細書で、用語“抗体（antibody）”はＣＤ１９に対する特異抗体であって、完全な抗体形態だけでなく、抗体分子の抗原結合断片（antigen binding fragment）を含む。
【００５６】
完全な抗体は２つの全体長さの軽鎖及び２つの全体長さの重鎖を有する構造であり、各々の軽鎖は重鎖とジスルフィド結合により連結されている。重鎖不変領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）、及びイプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスに、ガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）、及びアルファ２（α２）を有する。軽鎖の不変領域はキャパ（κ）及びラムダ（λ）タイプを有する。
【００５７】
本明細書で、用語“抗原結合断片（antigen binding fragment）”は抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）、Ｆ（ａｂ'）２、及びＦｖなどを含む。抗体断片のうち、Ｆａｂ（fragment antigen binding）は軽鎖及び重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域及び重鎖の最初の不変領域（ＣＨ１）を有する構造で１つの抗原結合部位を有する。Ｆａｂ'は重鎖ＣＨ１ドメインのＣ−末端に１つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（hinge region）を有するという点でＦａｂと差がある。Ｆ（ａｂ'）２抗体はＦａｂ'のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなしながら生成される。Ｆｖは重鎖可変部位及び軽鎖可変部位のみを有している最小の抗体断片でＦｖ断片を生成する再組合せ技術は、当業界に公知されている。二重鎖Ｆｖ（two-chain Fv）は非共有結合により重鎖可変部位と軽鎖可変部位が連結されており、単鎖Ｆｖ（single-chin variable fragment、ｓｃＦｖ）は一般的にペプチドリンカーを通じて重鎖の可変領域と単鎖の可変領域が共有結合により連結されるか、またはＣ−末端で直ちに連結されているので、二重鎖Ｆｖのようにダイマーのような構造をなすことができる。このような抗体断片はタンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全体抗体をパパインに制限切断すれば、Ｆａｂを得ることができ、ペブシンに切断すれば、Ｆ（ａｂ'）２断片を得ることができる）、または遺伝子再組合せ技術により製作することができる。
【００５８】
したがって、本発明で抗体は具体的に単一クローン抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ'）断片、ジスルフィド−結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、及び抗−イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、そして、前記抗体のエピトープ−結合断片などを含むが、これに限定されるのではない。
【００５９】
本明細書で、用語“重鎖”は抗原に特異性を与えるための充分の可変領域序列を有するアミノ酸序列を含む可変領域ドメインＶＨ及び３個の不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む全体長さ重鎖及びその断片を全て意味する。また、本明細書で、用語“軽鎖”は抗原に特異性を与えるための充分の可変領域序列を有するアミノ酸序列を含む可変領域ドメインＶＬ及び不変領域ドメインＣＬを含む全体長さ軽鎖及びその断片を全て意味する。
【００６０】
本明細書で、用語“可変領域（variable region）”または“可変ドメイン（variable domain）”は、抗体を抗原に結合させることと関連する抗体重鎖または軽鎖のドメインを意味する。Native抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（各々ＶＨ及びＶＬ）は一般的に類似の構造を有し、各ドメインは４個の保存されたフレームワーク領域（frameworkr egions、ＦＲ）及び３個の超可変領域（hyper variable regions、ＨＶＲ）を含む。（Kindt et al., Kuby Immunology、第６版、W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)）。
【００６１】
本明細書で、用語“ＣＤＲ（complementarity determining region）”は、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の高可変領域（hyper variable region）のアミノ酸序列を意味する（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)）。重鎖（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３）及び軽鎖（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）には各々３個のＣＤＲｓが含まれている。ＣＤＲは抗体が抗原またはエピトープに結合することにおける主要な接触残基を提供する。
【００６２】
本明細書で、用語“フレームワーク（Framework）”または“ＦＲ”は超可変領域（hyper variable region、ＨＶＲ）残基の以外の可変ドメイン残基を示す。可変ドメインのＦＲは一般的に４個のＦＲドメインＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４で構成される。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ序列は一般的にＶＨで次の順序で表れる：
ＦＲＨ１（Framework region 1 of Ｈeavy chain）−ＣＤＲＨ１（complementarity determining region 1 of Heavy chain）−ＦＲＨ２−ＣＤＲＨ２−ＦＲＨ３−ＣＤＲＨ３−ＦＲＨ４；
また、ＨＶＲ及びＦＲ序列は一般的にＶＬ（または、Ｖｋ）で次の順序で表れる：
ＦＲＬ１（Framework region 1 of Light chain）−ＣＤＲＬ１（complementarity determining region 1 of Light chain）−ＦＲＬ２−ＣＤＲＬ２−ＦＲＬ３−ＣＤＲＬ３−ＦＲＬ４。
【００６３】
本明細書で、用語“特異的に結合する”またはこのようなことは、抗体またはその抗原結合断片、またはｓｃＦｖのような他の構成物が生理的条件下で比較的安定な抗原と複合体を形成するということを意味する。特異的結合は、少なくとも約１ｘ１０−６Ｍ以下の平衡解離定数（例えば、これより小さなＫＤはより堅い結合を示す）に特性化できる。２つの分子が特異的に結合するか否かを決定する方法は当業界によく知られており、例えば平衡透析、表面プラスモン共鳴などを含む。
【００６４】
本明細書で、用語“親和度（Affinity）”は分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有相互作用の総合の強度を意味する。他の明示のない限り、“結合親和力（binding affinity）”は結合対（例えば、抗体及び抗原）の構成員間の１：１相互作用を反映する内因性（intrinsic）結合親和力を示す。分子ＸとそのパートナーＹの親和度は一般的に解離定数（Ｋｄ）で示すことができる。親和度は本願に記述されているものを含んで当業界に公知された通常的な方法により測定できる。
【００６５】
また、本明細書で、用語、“ヒト抗体（human antibody）”または“ヒト化抗体（humanized antibody）”はヒトまたはヒト細胞により生成された抗体、またはヒト抗体レパートリー（repertoires）または他のヒト抗体コーディング序列を用いる非ヒト根源から由来した抗体のアミノ酸序列に相応するアミノ酸序列を保有する。
【００６６】
本明細書で、用語、“キメラ（chimeric）抗体”は重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定根源（source）または種（species）から由来し、重鎖及び／又は軽鎖の残りが相異する根源または種から由来した抗体を意味する。
【００６７】
本発明の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片は、通常の技術者が認知するように、ＣＤ１９を特異的に認識することができる範囲内でアミノ酸序列の変異体を含むことができる。例えば、抗体の結合親和度及び／又はその他の生物学的特性を改善させるために、抗体のアミノ酸序列に変化を与えることがある。このような変形は、例えば抗体のアミノ酸序列残基の欠失、挿入、及び／又は置換を含む。
【００６８】
このようなアミノ酸変異は、アミノ酸側鎖置換体の相対的類似性、例えば、疏水性、親水性、電荷、サイズなどに基づいてなされる。アミノ酸側鎖置換体のサイズ、模様、及び種類に対する分析によって、アルギニン、リシンとヒスチジンは全て正電荷を帯びた残基であり；アラニン、グリシンとセリンは類似のサイズを有し；フェニルアラニン、トリプトファンとチロシンは類似の模様を有することが分かる。したがって、このような考慮事項に基づいて、アルギニン、リシンとヒスチジン；アラニン、グリシンとセリン；そして、フェニルアラニン、トリプトファンとチロシンは生物学的に機能均等物ということができる。
【００６９】
変異を導入するに当たって、アミノ酸の疏水性インデックス（hydropathic index）が考慮できる。各々のアミノ酸は疏水性と電荷によって疏水性インデックスが与えられている：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスタイン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタメート（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパルテート（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）。
【００７０】
タンパク質の相互的な生物学的機能（interactive biological function）を与えるに当たって、疏水性アミノ酸インデックスは非常に重要である。類似の疏水性インデックスを有するアミノ酸に置換しなければ類似の生物学的活性を保有できないということは公知の事実である。疏水性インデックスを参照して変異を導入させる場合、好ましくは、±２以内、より好ましくは±１以内、より好ましくは±０．５以内の疏水性インデックス差を示すアミノ酸の間で置換を行う。
【００７１】
一方、類似の親水性値（hydrophilicity value）を有するアミノ酸の間の置換が均等な生物学的活性を有するタンパク質をもたらすということもよく知られている。米国特許第４，５５４，１０１号に開示したように、次の親水性値が各々のアミノ酸残基に与えられている。：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパルテート（＋３．０±１）；グルタメート（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。
【００７２】
親水性値を参照して変異を導入させる場合、好ましくは±２以内、より好ましくは±１以内、より好ましくは±０．５以内の親水性値の差を示すアミノ酸の間で置換を行う。
【００７３】
分子の活性を全体的に変更させないタンパク質でのアミノ酸交換は当該分野に公知されている（H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979）。最も通常的に起こる交換はアミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙの間の交換である。
【００７４】
本発明の一態様によれば、本発明は次を含む抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片を提供する：
（ａ）次の一般式１で表示されるアミノ酸序列からなるＣＤＲＨ２を含む重鎖可変領域（heavy chain variable region、ＶＨ）：
一般式１
ＧＩＹＹＤＸ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３ＳＶＫＧ
ここで、Ｘ６はＧ、Ａ、またはＳであり；Ｘ７はＳ、Ｔ、Ｉ、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｌ、またはＨであり；Ｘ８はＡ、Ｔ、Ｓ、Ｑ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｎ、Ｙ、またはＨであり；Ｘ９はＲ、ＫＳ、Ｖ、Ａ、Ｑ、Ｌ、Ｔ、Ｅ、Ｄ、Ｍ、Ｌ、Ｆ、またはＰであり；Ｘ１０はＹ、Ｇ、Ｓ、またはＴであり；Ｘ１１はＹ、Ｗ、Ｍ、またはＬであり；Ｘ１２はＡ、Ｓ、Ｔ、またはＬであり；Ｘ１３はＤ、Ｓ、Ｇ、Ｎ、またはＰである；及び
（ｂ）次の一般式２で表示されるアミノ酸序列からなるＣＤＲＬ１を含む軽鎖可変領域（light chain variable region、ＶＬ）：
一般式２
Ｘ１ＧＸ３Ｘ４ＳＮＩＧＳＸ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｙ
前記Ｘ１はＶ、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｗ、Ｎ、Ｙ、Ｋ、Ｔ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｅ、またはＤであり；Ｘ３はＧ、Ｈ、Ｄ、Ｌ、Ｔ、Ｑ、Ｋ、Ｎ、Ｓ、またはＭであり；Ｘ４はＶ、Ｙ、Ｉ、Ｐ、Ｖ、Ｍ、Ａ、Ｌ、Ｆ、またはＳであり；Ｘ１０はＮまたはＡであり；Ｘ１１はＡまたはＰであり；Ｘ１２はＶ、Ｔ、またはＬである。
【００７５】
本明細書で使われた“Ｘｎ”及び“Ｘｍ”などの記号は前記定義された一般式で位置ｎ及びｍのアミノ酸を表示するために使用したものである。ここで、ｎ及びｍは前記序列のＮ−末端から計算される前記序列内のアミノ酸位置を表示する正数である。例えば、Ｘ１及びＸ６は前記序列のＮ−末端から各々１番目及び６番目の位置のアミノ酸を表示するものである。
【００７６】
本発明の一具現例の場合、前記一般式内のＸｎまたはＸｍになることができる可能なアミノ酸残基のグループから独立的に選択される。通常の技術者はＸｎが可能な残基の羅列されたグループのいずれか１つから選択できるということと、このような選択がＸｍのアミノ酸の選択とは独立的になされて、ここで、ｎとｍは異なるということを理解することができる。したがって、前記一般式で、Ｘｎ位置で羅列された可能なアミノ酸残基のうちのどんなものでも他の多様な位置（Ｘｍ位置）で羅列された可能なアミノ酸残基のうちの他のものと独立的に組み合わせることができる。
【００７７】
下記の実施例で詳細に記載したように、本発明のＣＤ１９に特異的に結合する抗−ＣＤ１９抗体、その変形抗体、またはそれらの抗原結合断片のＣＤＲＨ２及びＣＤＲＬ１は、各々前記一般式１または１−１、２、または２−１で表示され、前記一般式は数多いランダム変形抗体を統計的に分析した結果に基づいて作成されたものである。前記ＣＤ１９に特異的に結合するＣＤ１９＿８．１抗体または抗原結合断片とこれらの変形抗体は反復的な選抜試験によりＣＤ１９との相互作用が確認されて選択された。
【００７８】
本発明の具体的な具現例で、本発明の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片が含む重鎖可変領域は、下記の一般式１−１で表示されるアミノ酸序列からなるＣＤＲＨ２を含む：
一般式１−１
ＧＩＹＹＤＸ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＹＹＡＤＳＶＫＧ
ここで、Ｘ６はＧ、Ａ、またはＳであり；Ｘ７はＳ、Ｔ、Ｉ、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｌ、またはＨであり；Ｘ８はＡ、Ｔ、Ｓ、Ｑ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｎ、Ｙ、またはＨであり；Ｘ９はＲ、ＫＳ、Ｖ、Ａ、Ｑ、Ｌ、Ｔ、Ｅ、Ｄ、Ｍ、Ｌ、Ｆ、またはＰである。
【００７９】
本発明の他の具体的な具現例で、本発明の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片が含む軽鎖可変領域は、下記の一般式２−１で表示されるアミノ酸序列からなるＣＤＲＬ１を含む：
一般式２−１
Ｘ１ＧＸ３Ｘ４ＳＮＩＧＳＮＡＶＹ
前記Ｘ１はＶ、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｗ、Ｎ、Ｙ、Ｋ、Ｔ、Ｈ、Ｒ、Ｑ、Ｅ、またはＤであり；Ｘ３はＧ、Ｈ、Ｄ、Ｌ、Ｔ、Ｑ、Ｋ、Ｎ、Ｓ、またはＭであり；Ｘ４はＶ、Ｙ、Ｉ、Ｐ、Ｖ、Ｍ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、またはＳである。
【００８０】
本発明の実施例で、本発明の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片が含む前記重鎖可変領域（ＶＨ）は序列目録第１序列のＣＤＲＨ１及び序列目録第３序列のＣＤＲＨ３をさらに含み；前記軽鎖可変領域（ＶＬ）は序列目録第５序列のＣＤＲＬ２及び序列目録第６序列のＣＤＲＬ３をさらに含む。
【００８１】
本発明の実施例で、前記一般式で示したＣＤＲＨ２のアミノ酸序列は、序列目録第２序列、第７序列乃至第４８序列からなる群より選択されたアミノ酸序列に対応する。
【００８２】
また、本発明の実施例で、前記一般式で示したＣＤＲＬ１のアミノ酸序列は、序列目録第４序列、第４９序列乃至第９０序列からなる群より選択されたアミノ酸序列に対応する。
【００８３】
本発明の一実施例で、本発明の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片の前記ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＬ１は、各々序列目録第２序列及び第４序列；第７序列及び第４９序列；第８序列及び第５０序列；第９序列及び第５１序列；第１０序列及び第５２序列；第１１序列及び第５３序列；第１２序列及び第５４序列；第１３序列及び第５５序列；第１４序列及び第５６序列；第１５序列及び第５７序列；第１６序列及び第５８序列；第１７序列及び第５９序列；第１８序列及び第６０序列；第１９序列及び第６１序列；第２０序列及び第６２序列；第２１序列及び第６３序列；第２２序列及び第６４序列；第２３序列及び第６５序列；第２４序列及び第６６序列；第２５序列及び第６７序列；第２６序列及び第６８序列；第２７序列及び第６９序列；第２８序列及び第７０序列；第２９序列及び第７１序列；第３０序列及び第７２序列；第３１序列及び第７３序列；第３５序列及び第７４序列；第３３序列及び第７５序列；第３４序列及び第７６序列；第３５序列及び第７７序列；第３６序列及び第７８序列；第３７序列及び第７９序列；第３８序列及び第８０序列；第３９序列及び第８１序列；第４０序列及び第８２序列；第４１序列及び第８３序列；第４２序列及び第８４序列；第４３序列及び第８５序列；第４４序列及び第８６序列；第４５序列及び第８７序列；第４６序列及び第８８序列；第４７序列及び第８９序列；または第４８序列及び第９０序列のアミノ酸序列を含む。
【００８４】
本発明の他の実施例で、本発明の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域（ＶＨ）は、序列目録第９１序列乃至第１３３序列からなる群より選択されたアミノ酸序列を含み、及び／又は前記軽鎖可変領域（ＶＬ）は序列目録第１３４序列乃至第１７６序列からなる群より選択されたアミノ酸序列を含むが、これに限定されるのではない。
【００８５】
本発明の更に他の実施例で、本発明の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片の前記重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）は、各々序列目録第９１序列及び第１３４序列；第９２序列及び第１３５序列；第９３序列及び第１３６序列；第９４序列及び第１３７序列；第９５序列及び第１３８序列；第９６序列及び第１３９序列；第９７序列及び第１４０序列；第９８序列及び第１４１序列；第９９序列及び第１４２序列；第１００序列及び第１４３序列；第１０１序列及び第１４４序列；第１０２序列及び第１４５序列；第１０３序列及び第１４６序列；第１０４序列及び第１４７序列；第１０５序列及び第１４８序列；第１０６序列及び第１４９序列；第１０７序列及び第１５０序列；第１０８序列及び第１５１序列；第１０９序列及び第１５２序列；第１１０序列及び第１５３序列；第１１１序列及び第１５４序列；第１１２序列及び第１５５序列；第１１３序列及び第１５６序列；第１１４序列及び第１５７序列；第１１５序列及び第１５８序列；第１１６序列及び第１５９序列；第１１７序列及び第１６０序列；第１１８序列及び第１６１序列；第１１９序列及び第１６２序列；第１２０序列及び第１６３序列；第１２１序列及び第１６４序列；第１２２序列及び第１６５序列；第１２３序列及び第１６６序列；第１２４序列及び第１６７序列；第１２５序列及び第１６８序列；第１２６序列及び第１６９序列；第１２７序列及び第１７０序列；第１２８序列及び第１７１序列；第１２９序列及び第１７２序列；第１３０序列及び第１７３序列；第１３１序列及び第１７４序列；第１３２序列及び第１７５序列；または第１３３序列及び第１７６序列のアミノ酸序列を含む。
【００８６】
本発明者らは前述した抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片の他にＣＤ１９抗原に対する親和度が増進した追加的な抗体を開発するために、既存に開発したＣＤ１９＿８．１＿２Ｆ１に基づいてＣＤＲＨ２、ＣＤＨＲ３、及びＣＤＲＬ１を変形させたサブライブラリを製作した。その結果、親和度が向上した８種の抗体を追加的に導出しており、各抗体のアミノ酸序列を本発明の実施例及び序列目録に収録した。
【００８７】
前記８種の追加抗体はＣＤ１９＿８．１＿２Ｆ１に基づいて導出されたので、序列目録第１序列のＣＤＲＨ１、序列目録第５序列のＣＤＲＬ２、及び序列目録第６序列のＣＤＲＬ３を含むことを特徴とする。
【００８８】
本発明の一具現例によれば、前記抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片は序列目録第１９０序列のアミノ酸序列を含むＣＤＲＨ２を含み；序列目録第１９９序列または第２００序列のアミノ酸序列を含むＣＤＲＬ１を含む。
【００８９】
本発明の他の具現例によれば、前記抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片は序列目録第１９１序列乃至第１９８序列のうちから選択されるアミノ酸序列を含むＣＤＲＨ３を含む。
【００９０】
本発明の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片は前述したアミノ酸序列に対して小幅の変化、即ち、３次構造及び抗体の機能にほとんど影響を及ぼさない変形を含む抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片を含む。したがって、ある具現例の場合、前述した序列と一致しなくても、少なくとも９０％、９３％、９５％、または９８％以上の類似性を有することができる。
【００９１】
本発明の一具現例によれば、本発明の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片は前述した序列のＣＤＲを含む重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ'）断片、ジスルフィド−結合Ｆｖｓ（ｓｄＦＶ）、及び抗−イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、そして、前記抗体のエピトープ−結合断片などを含むが、これに限定されるのではない。
【００９２】
本発明の他の具現例で、本発明の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片は抗−ＣＤ１９  ｓｃＦｖである。本発明の具体的な具現例で、前記抗体またはその抗原結合断片に含まれる重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ、（Ｇｌｙ２−Ｓｅｒ）ｎ、（Ｇｌｙ３−Ｓｅｒ）ｎ、または（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎなどのリンカーにより連結される。ここで、ｎは１乃至６の正数であり、具体的には３乃至４であるが、これに限定されるのではない。前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、例えば次の配向に存在することができる：軽鎖可変領域−リンカー−重鎖可変領域または重鎖可変領域−リンカー−軽鎖可変領域。
【００９３】
一方、本発明の抗体ＣＤＲ序列は、従来の抗−ＣＤ１９抗体またはこれらを含むキメラ抗原受容体のＣＤＲ序列と比較して相同性（similarity）が非常に低いので、その序列の独特性がある。例えば、本発明のＣＤ１９＿８．１抗体に対してＢＬＡＳＴ検索した結果、相同性が最も高く出た米国特許公開公報第２０１６／００９０４２７  Ａ１号に開示された抗体（序列目録第１７３序列）は、本発明のＣＤ１９＿８．１抗体とＣＤＲ序列の相同性が８８．５％に過ぎず、さらに前記米国特許公開公報に記載された抗体はＶＥＧＦ、Ｃ−ＭＥＴ、またはＶＥＧＦとＣ−ＭＥＴに特異的に結合する二重特異的抗体（bispecific antibody）であって、本発明の抗体とそのターゲット及び類型が相異する。
【００９４】
本発明の他の一態様によれば、本発明は前記の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片をエンコーディングする核酸分子を提供する。
【００９５】
本明細書で、用語“核酸分子”はＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）、そして、ＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸分子で基本構成単位であるヌクレオチドは自然のヌクレオチドだけでなく、糖または塩基部位が変形された類似体（analogue）も含む（Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman及び Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)）。
【００９６】
本発明の前記抗体またはその抗原結合断片、または前記キメラ抗原受容体ポリペプチドをエンコーディングするヌクレオチド序列は、前記キメラ抗原受容体分子を構成するアミノ酸序列をエンコーディングするヌクレオチド序列であればよく、ある特定ヌクレオチド序列に限定されないということは当業者に自明である。
【００９７】
これは、ヌクレオチド序列の変異が発生しても変異されたヌクレオチド序列をタンパク質で発現すればタンパク質序列で変化をもたらさない場合もあるためである。これをコドンの縮退性という。したがって、前記ヌクレオチド序列は機能的に均等なコドンまたは同一なアミノ酸をコーディングするコドン（例えば、コドンの縮退性により、アルギニンまたはセリンに対するコドンは６個である）、または生物学的に均等なアミノ酸をコーディングするコドンを含むヌクレオチド序列を含む。
【００９８】
本発明の具体的な具現例によれば、前記本発明のＣＤ１９に対する抗体またはその抗原結合断片の重鎖ＣＤＲ、軽鎖ＣＤＲ、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖、または軽鎖をなすポリペプチドの序列は、本明細書の添付の序列目録に収録されている。
【００９９】
抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片をエンコーディングする本発明の核酸分子は、前記のヌクレオチド序列に対して実質的な同一性を示すヌクレオチド序列も含むことと解析される。前記の実質的な同一性は、前記の本発明のヌクレオチド序列と任意の他の序列を最大限対応するようにアラインし、当業界で通常的に用いられるアルゴリズムを用いてアラインされた序列を分析した場合に、最小８０％の相同性、より好ましくは最小９０％の相同性、最も好ましくは最小９５％の相同性を示すヌクレオチド序列を意味する。
【０１００】
前述した生物学的均等活性を有する変異を考慮すると、本発明の抗体または抗原結合断片；またはキメラ抗原受容体ポリペプチドをエンコーディングする核酸分子は序列目録に記載された序列と実質的な同一性（substantial identity）を示す序列も含むことと解析される。前記の実質的な同一性は、前記の本発明の序列と任意の他の序列を最大限対応するようにアラインし、当業界で通常的に用いられるアルゴリズムを用いてアラインされた序列を分析した場合に、最小６１％の相同性、より好ましくは７０％の相同性、より好ましくは８０％の相同性、最も好ましくは９０％の相同性を示す序列を意味する。序列比較のためのアラインメント方法は当業界に公知されている。アラインメントに対する多様な方法及びアルゴリズムは、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)に開示されている。 NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))はＮＢＣＩ（National Center for Biological Information）などで接近可能であり、インターネット上でｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、及びｔｂｌａｓｔｘのような序列分析プログラムと連動して用いることができる。ＢＬＡＳＴはｎｃｂｉウェブサイトのＢＬＡＳＴページを通じて接続可能である。このプログラムを用いた序列相同性比較方法はｎｃｂｉウェブサイトのＢＬＡＳＴ  ｈｅｌｐページで確認することができる。
【０１０１】
本発明の更に他の態様によれば、本発明は前記抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片をエンコーディングする核酸分子を含む再組合せベクターを提供する。
【０１０２】
本発明の更に他の一態様によれば、本発明は前記再組合せベクターに形質転換された宿主細胞を含む。
【０１０３】
本発明のベクターを安定し、かつ連続してクローニング及び発現させることができる宿主細胞は当業界に公知されて、如何なる宿主細胞も用いることができ、例えば、前記ベクターの適合した真核細胞宿主細胞は猿の腎臟細胞７（ＣＯＳ７：monkey kidney cells）、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ：Chinese hamsterovary）細胞、Ｗ１３８、幼いハムスター腎臟（ＢＨＫ：baby hamster kidney）細胞、ＭＤＣＫ、骨髄腫細胞株、ＨｕＴ７８細胞及びＨＥＫ−２９３細胞を含むが、これに限定されない。
【０１０４】
本発明の更に他の態様によれば、本発明は次を含むＣＤ１９特異的キメラ抗原受容体を提供する：
（ａ）前記の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片を含む細胞外ドメイン（Extracellular domain）；
（ｂ）膜貫通ドメイン（transmembrane domain）；及び
（ｃ）細胞内信号伝達ドメイン。
【０１０５】
本明細書で、用語“キメラ抗原受容体（chimeric antigen receptor、ＣＡＲ）”はＴ−細胞信号伝達またはＴ−細胞活性化ドメインに連結された抗体の抗原結合ドメイン（例えば、単一鎖可変断片（ｓｃＦｖ））を含有する人工的に製作されたハイブリッドタンパク質またはポリペプチドである。キメラ抗原受容体はモノクローナル抗体の抗原−結合性質を用いて非−ＭＨＣ−制限方式により選択された標的に対するＴ−細胞特異性及び反応性を再誘導する能力を有する。非−ＭＨＣ−制限された抗原認識はＣＡＲを発現するＴ−細胞に抗原処理にかかわらず抗原を認識する能力を提供して、腫瘍逃避の主要メカニズムを回避させる。また、ＣＡＲはＴ−細胞で発現される時、有利には内在性Ｔ−細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及びベータ鎖と二量体化されない。
【０１０６】
本発明のキメラ抗原受容体はＢリンパ球抗原として知られたＣＤ１９に対して誘導された抗体またはその抗原結合断片を含む細胞外ドメインを含む。本発明で、前記ＣＤ１９に対して誘導された抗体またはその抗原結合断片は前述した抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片である。
【０１０７】
本発明の一具現例によれば、本発明のキメラ抗原受容体は細胞の表面で発現される。したがって、膜貫通ドメインを含むことができる。前記膜貫通ドメインは当該分野で公知の天然供給源から、または合成供給源から由来できる。前記膜貫通ドメインは、例えばＴ−細胞受容体、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、［００１１］ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８（ＣＤ８α）、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及びＣＤ１５４のアルファ、ベータ、またはゼータ鎖からなる群より選択されたタンパク質の膜貫通ドメインでありえるが、これに限定されるのではない。
【０１０８】
本発明の具体的な具現例によれば、前記膜貫通ドメインは、序列目録第１７７序列を含むヌクレオチド序列によりエンコーディングされるＣＤ８由来ヒンジ／膜貫通ドメインである。
【０１０９】
本明細書で、用語“細胞内信号伝達ドメイン”は二次伝令（2nd messenger）を生成するか、または前記２次伝令に反応してエフェクターとして機能することによって、規定された信号伝達経路を通じての細胞活性を調節するために情報を細胞内に伝達することによって作用するタンパク質の機能性部分を意味する。
【０１１０】
本発明の他の具現例によれば、本発明のキメラ抗原受容体は細胞内信号伝達ドメインを含むことができる。前記細胞内信号伝達ドメインは免疫細胞及び免疫反応の活性化を引き起こすターゲット（例えば、ＣＤ１９）に前記細胞外ドメインを結合させた後、細胞内信号伝達の原因となる。即ち、細胞内信号伝達ドメインは免疫細胞の正常エフェクター（effector）機能のうち、少なくとも１つの活性化の原因となる。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能はサイトカインの分泌を含む細胞毒性活性またはヘルパー活性でありえる。キメラ抗原受容体で使用するための信号変換ドメインの好ましい例は、抗原受容体結合（engagement）後、信号変換を開示するために協力して作用するＴ細胞受容体及び共同−受容体の細胞質序列、だけでなく同一な機能的能力を有する、このような序列の任意誘導体または変形体及び任意合成序列でありえる。
【０１１１】
本発明の具体的な具現例によれば、前記キメラ抗原受容体の細胞内信号伝達ドメインはＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）鎖から由来したドメインである。
【０１１２】
本発明のより具体的な具現例によれば、前記ＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）鎖から由来したドメインは序列目録第１８０序列を含む塩基序列によりエンコーディングされるＣＤ３ζドメインである。
【０１１３】
本発明の他の具体的な具現例によれば、前記キメラ抗原受容体の細胞内信号伝達ドメインは、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１a／ＣＤ１８）、及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）からなる群より選択された共同刺激分子（costimulatory molecule）を追加的に含む。前記細胞内信号伝達ドメインは前述したドメインの他にも当該分野で公知された他の細胞内信号伝達分子から収得または由来することができ、細胞内信号伝達ドメインが由来する分子の全体またはその断片を含むことができる。
【０１１４】
本発明の具体的な一具現例によれば、前記共同刺激分子（ドメイン）はＣＤ２８、ＯＸ４０、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、及び／又はＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）からなる群より選択されたタンパク質から収得された機能的信号伝達ドメインでありえ、より具体的にはＣＤ２８及び／又はＯＸ４０の機能的信号伝達ドメインでありえる。
【０１１５】
本発明の他の一具現例によれば、前記細胞内信号伝達ドメインは４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＣＤ３ゼータの機能的信号伝達ドメイン、またはこれらの組合せである。前記細胞内信号伝達ドメインは最も具体的にはＣＤ３ゼータの機能的信号伝達ドメインである。
【０１１６】
本発明のより具体的な具現例によれば、前記ＣＤ１３７を含む共同刺激分子は序列目録第１７９序列を含む塩基序列によりエンコーディングされるＣＤ３ζドメインである。
本発明のキメラ抗原受容体の膜貫通ドメイン及び細胞内信号伝達ドメインは、前述した具体的な膜貫通ドメイン及び細胞内信号伝達ドメインのうち、１以上選択された組合せで含まれることができる。例えば、本発明のキメラ抗原受容体はＣＤ８α膜貫通ドメイン及びＣＤ２８及びＣＤ３ζの細胞内信号伝達ドメインを含むことができる。
【０１１７】
本発明の他の一態様によれば、本発明は前述したキメラ抗原受容体をエンコーディングする核酸分子を提供する。
【０１１８】
本明細書で前述した抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片（ポリペプチド）とこれをエンコーディングする核酸分子、抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体及びこれをエンコーディングする核酸分子は単離された状態である。
【０１１９】
本明細書で、用語“単離された”は自然／天然状態から変形または除去されることを意味する。例えば、生きている動物に自然的に存在する核酸またはペプチドは“単離された”ものではないが、それから部分的にまたは完全に分離された同一な核酸またはペプチドは“単離された”ものである。単離された核酸またはタンパク質は実質的に精製された形態に存在できるか、または例えば宿主細胞のような非−天然環境に存在することができる。
【０１２０】
本発明の更に他の態様によれば、本発明は前述した核酸分子を含む再組合せベクターを提供する。本明細書で後述する“ベクター”に対しては前述した抗体またはその抗原結合断片、またはキメラ抗原受容体をエンコーディングする核酸分子と関連して共通的に適用される。
【０１２１】
本明細書で、用語“ベクター”は伝達ベクターと発現ベクターを含む。
【０１２２】
本明細書で、用語“伝達ベクター”は単離された核酸を含み、単離された核酸を細胞内部に伝達することに使われることができる物質の組成を称する。線形ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と連結されたポリヌクレオチド、プラスミド及びウイルスを含むが、これに限定されるのではない。より具体的に、前記伝達ベクターは自家複製性プラスミドまたはウイルスを含む。前記用語は細胞内への核酸の転移を促進させる非−プラスミド及び非−ウイルス性化合物、例えばポリリシン化合物、リポソームなどを追加的に含むことができるものとして解析されなければならない。ウイルス性伝達ベクターはアデノウイルスベクター、アデノ−関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターを含むが、これに限定されるのではない。
【０１２３】
本明細書で、用語“発現ベクター”は宿主細胞で目的遺伝子を発現させるために、発現させるヌクレオチド序列に作動可能に連結された発現制御序列を含む再組合せヌクレオチドを含むベクターを称する。発現ベクターは発現のための充分のシス作用因子（cis-acting element）を含み、発現のための他の要素は宿主細胞または試験管内発現システムにより提供できる。前記発現ベクターは、再組合せポリヌクレオチドを含むプラスミドベクター；コスミドベクター；そしてバクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルス、レトロウイルスベクター、及びアデノ−関連ウイルスベクターのようなウイルスベクターを含む。本発明の具体的な具現例によれば、本発明のベクターで前記スイッチ分子をコーディングする核酸分子は、前記ベクターのプロモーターと作動的に結合（operatively linked）されている。本明細書で、用語“作動的に結合された”は、核酸発現調節序列（例：プロモーター、シグナル序列、または転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸序列との間の機能的な結合を意味し、これにより前記調節序列は前記他の核酸序列の転写及び／又は解読を調節するようになる。
【０１２４】
本発明の再組合せベクターシステムは、当業界に公知の多様な方法により構築されることができ、これに対する具体的な方法はSambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)に開示されており、この文献は本明細書に参照として挿入される。
【０１２５】
本発明のベクターは遺伝子クローニングのためのベクター、タンパク質の発現のためのベクター、または遺伝子の伝達のためのベクターとして構築できる。また、本発明のベクターは元核細胞または真核細胞を宿主にして構築できる。
【０１２６】
例えば、本発明のベクターが発現ベクターであり、真核細胞を宿主にする場合には、哺乳動物細胞のゲノムから由来したプロモーター（例：メタロチオニンプロモーター、β−アクチンプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーター、及びヒト筋肉クレアチンプロモーター）または哺乳動物ウイルスから由来したプロモーター（例：アデノウイルス後期プロモーター、ワクチニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニウイルスのプロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）のプロモーター、及びラウスサルコーマウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）が用いられることができ、これらは一般的に転写終結序列としてポリアデニル化序列を有する。
【０１２７】
本発明の一具現例によれば、前記ベクターが伝達ベクターである場合、“レトロウイルスベクター”でありえる。レトロウイルスは遺伝子伝達システムのための便利なプラットフォームを提供する。遺伝子伝達のために選択された遺伝子はレトロウイルスベクター内に挿入され、レトロウイルス粒子内にパッケージングできる。次に、再組合せされたレトロウイルスはインビボ、またはインビトロで目的とする宿主細胞に伝達できる。多いレトロウイルスベクターが関連技術分野に知られており、本発明の具体的な具現例で前記レトロウイルスベクターはＭＬＶ−基盤のレトロウイルスベクターであるｐＭＴレトロウイルスベクターであるが、これに限定されるのではない。
【０１２８】
本発明の他の一具現例によれば、前記ベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターである。
【０１２９】
本発明のベクターはそれから発現されるポリペプチドまたはタンパク質の精製を容易にするために、他の序列と融合されることもできる。融合される序列は、例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Pharmacia、ＵＳＡ）、マルトース結合タンパク質（ＮＥＢ、ＵＳＡ）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ、ＵＳＡ）、及び６ｘＨｉｓ（hexahistidine；Quiagen、ＵＳＡ）などがある。一方、本発明の発現ベクターは本発明の抗体またはその抗原結合断片、及びこれを含むＣＡＲポリペプチドの発現を評価するための選択標識として選択可能マーカー遺伝子及び／又はレポーター遺伝子を含むことができる。選択可能マーカー遺伝子には、当業界で通常的に用いられる抗生剤耐性遺伝子を含み、例えばアンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネティシン、ネオマイシン、及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子がある。レポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、または緑色蛍光タンパク質遺伝子を含む。
【０１３０】
本発明の再組合せベクターを細胞内に導入し発現させる方法は、関連技術分野によく知られている。ベクターは当業界に公知された方法により宿主細胞、例えば哺乳動物、バクテリア、酵母、または昆虫細胞内に容易に導入できる。例えば、ベクターは物理的、化学的、または生物学的手段により宿主細胞内に伝達できる。前記物理的手段は、燐酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子爆撃（particle bombardment）、微細注入、電気穿孔などを含む。前記化学的手段は、コロイド分散液システム、例えば巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスピア、ビード、及び水中油エマルジョン、マイセル（micelle）、混合されたマイセル、及びリポソームを含む脂質−基盤システムを含む。また、前記生物学的手段は、前述したレンチウイルス、レトロウイルスなど、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターの使用を含む。
【０１３１】
本発明の他の一態様によれば、本発明は前述したキメラ抗原受容体を発現する細胞を提供する。
【０１３２】
本発明の一具現例によれば、前記細胞は免疫細胞として先天性及び／又は後天性免疫反応の開示及び／又は実行を担当する造血起源の細胞を称する。
【０１３３】
本発明に従う前記免疫細胞は、幹細胞から由来できる。幹細胞は、成体幹細胞、非−ヒト胚芽幹細胞、臍帯血由来幹細胞、骨髄由来幹細胞、誘導万能幹細胞、または造血幹細胞でありえる。より具体的には、前記免疫細胞は、樹枝状細胞、キラー樹枝状細胞、肥満細胞、ＮＫ−細胞、Ｂ−細胞または炎症性Ｔ−リンパ球、細胞毒性Ｔ−リンパ球、調節Ｔ−リンパ球、またはヘルパーＴ−リンパ球からなる群より選択された免疫細胞でありえるが、これに制限されるのではない。
【０１３４】
本発明で、前記キメラ抗原受容体を発現する細胞は効果器細胞（effector cell）とも称される。前記効果器細胞は自家細胞または同種異型細胞の集団を含む。即ち、前記効果器細胞は本ＣＤ１９に特異的なＣＡＲを発現する自家細胞または同種異型細胞の集団を含む。
【０１３５】
また、本発明の一具現例によれば、前記効果器細胞はＣＤ１９特異的ＣＡＲをコーディングする核酸分子を含むベクターに形質感染または形質導入された細胞の集団を含む。前記形質感染または形質導入は前述したように当業界に知られた多様な手段により制限無しでなされることができる。
【０１３６】
したがって、本発明の具体的な具現例によれば、本発明の効果器細胞、例えばＴリンパ球、または自然殺害細胞に伝達され、ＣＤ１９特異的ＣＡＲコーディング核酸分子はｍＲＮＡに転写され、前記ｍＲＮＡからＣＤ１９特異的ＣＡＲポリペプチドが翻訳されて効果器細胞の表面に発現される。
【０１３７】
また、本発明の更に他の一態様によれば、本発明は抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片を含む薬剤学的組成物、または前記キメラ抗原受容体を発現する細胞を含む薬剤学的組成物を提供する。
【０１３８】
前記薬剤学的組成物は前述した本発明の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片、または本発明の前記キメラ抗原受容体を発現する細胞；及び薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物の形態に提供できる。
【０１３９】
本発明のキメラ抗原受容体を発現する細胞が薬剤学的組成物の形態に投与される場合、前記細胞は投与される対象体（subject）に対して同種動物由来または自家由来細胞でありえる。
【０１４０】
本発明の薬剤学的組成物は、本発明のキメラ抗原受容体を発現する細胞の集団を含むことができる。
【０１４１】
本発明の薬剤学的組成物は、前述した本発明の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片、または本発明のキメラ抗原受容体を発現する細胞を有効性分に用いるので、この両者に共通した内容は本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
【０１４２】
下記の実施例で立証されたように、本発明のＣＤ１９＿８．１抗体断片を含むキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＤ１９＿８．１  ＣＡＲ−Ｔ  ｃｅｌｌ）はＣＤ１９抗原を発現する細胞株（ＲａＪｉ）と同時培養する場合、ＣＤ１９陽性細胞株（ＲａＪｉ）表面のＣＤ１９抗原を認識することによって、キメラ抗原受容体細胞の活性化を誘導するので、ＣＤ１９抗原と関連した疾患の治療に有用に使用できることと期待される。
【０１４３】
本発明の薬剤学的組成物により予防または治療できる疾患には、ＣＤ１９を発現する細胞と関連したヒト及び哺乳動物の疾患として、慢性リンパ球性白血病（chronic lymphocytic leukemia、ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（acute lymphocytic leukemia、ＡＬＬ）、前リンパ球性白血病（pro-lymphocytic leukemia）、毛細胞白血病（hairy cell leukemia）、一般急性リンパ球性白血病（common acute lymphocytic leukemia、ＣＡＬＬＡ）、Null-acute lymphoblastic leukemia、非−ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（diffuse large B cell lymphoma、ＤＬＢＣＬ）、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫（follicular lymphoma）、脾臟リンパ腫（splenic lymphoma）、辺縁帯リンパ腫（marginal zone lymphoma）、マントル細胞リンパ腫（mantle cell lymphoma）、低危険群Ｂ細胞リンパ腫（indolent B cell lymphoma）、ホジキンリンパ腫（Ｈodgkin lymphoma）からなる群より選択されたＢ細胞悪性腫瘍（Ｂ cell malignancy）を含む。
【０１４４】
また、前記疾患は不適切であるか、または増強したＢ細胞数及び／又は活性化と関連した自家免疫疾患及び炎症疾患を含む。前記自家免疫疾患及び炎症疾患の例には、多発性硬化症、リューマチ性関節炎、及び全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythematosus、ＳＬＥ）を含む。
【０１４５】
本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、燐酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアル酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるのではない。本発明の薬剤学的組成物は前記成分の以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などを追加で含むことができる。適合した薬剤学的に許容される担体及び製剤は Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)に詳細に記載されている。
【０１４６】
本発明の薬剤学的組成物は経口または非経口で投与することができ、例えば静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、胸骨内注入、腫瘍内注入、局所投与、鼻内投与、肺内投与、及び直腸内投与などにより投与することができる。
【０１４７】
本発明の薬剤学的組成物の適合した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因により多様であり、普通に熟練した医者は所望の治療または予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。本発明の好ましい具現例によれば、本発明の薬剤学的組成物の１日投与量は０．０００１−１００ｍｇ／ｋｇである。本明細書で、用語“薬剤学的有効量”は前述した疾患の予防または治療に十分な量を意味する。
【０１４８】
本明細書で、用語“予防”は疾患または疾患状態の防止または保護的な治療を意味する。本明細書で、用語“治療”は、疾患状態の減少、抑制、鎮静、または根絶を意味する。
【０１４９】
本発明の薬剤学的組成物は、当該発明が属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施することができる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することにより単位容量形態に製造されるか、または多用量容器内に内入させて製造できる。この際、剤形はオイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液、または乳化液形態、またはエキス剤、散剤、坐剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、またはカプセル剤形態でありえ、分散剤または安定化剤を追加的に含むことができる。
【０１５０】
また、本発明の薬剤学的組成物は前述したキメラ抗原受容体を発現する細胞の以外に他の薬剤学的活性薬剤または薬物、例えば、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキサート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチンなどの化学治療剤；ベバシズマブ （bevacizumab）、オラパリブ（olaparib）などの標的治療剤；またはニボルマブ （nivolumab）、ペムブロリズマブ（pembrolizumab）のような免疫関門抑制剤を含むか、またはこれらと共に併用投与できる。
【０１５１】
本発明の更に他の一態様によれば、本発明は前述したＣＤ１９に対する抗体またはその抗原結合断片を含む組成物；または前記のＣＤ１９特異的キメラ抗原受容体を発現する効果器細胞を含む組成物を治療が必要な対象体に投与する段階を含むＣＤ１９を発現する細胞と関連した疾患、自家免疫疾患、または炎症疾患の治療方法を提供する。
【０１５２】
本発明の治療方法の対象疾病であるＣＤ１９を発現する細胞と関連した疾患、自家免疫疾患、または炎症疾患は、前記薬学的組成物の治療対象疾病と関連して定義したことと同一である。
【０１５３】
本発明の一具現例で、前記対象体は哺乳動物またはヒトである。
【０１５４】
本発明の癌または炎症性疾患の治療方法は有効性分として前述した抗体または抗原結合断片；またはキメラ抗原受容体を発現する効果器細胞を共通的に使用する方法であるので、重複する内容に対しては本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
【発明の効果】
【０１５５】
本発明の抗体は癌細胞（特に、血液癌）で高発現されるＣＤ１９に特異的に結合する抗体であって、従来のＣＤ１９ターゲット抗体のＣＤＲ序列と比較して相同性が非常に低いので、その序列の独特性があり、本発明の抗−ＣＤ１９抗体または抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体を発現する細胞はＣＤ１９を発現する陽性細胞株に反応して免疫細胞活性を誘導するので、ＣＡＲ−免疫細胞治療剤として有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】ＣＤ１９＿８．１抗体断片に対するＣＤ１９−ＥＣＤ  Ｆｃタンパク質に対する結合をＥＬＩＳＡで分析した結果を示す図である。
【図２】第２重鎖と第１軽鎖ＣＤＲ部位を変更して親和度が増進した抗体を確保するために、ＣＤ１９−ＥＣＤ  Ｆｃタンパク質に対する結合を変更されたＥＬＩＳＡ方法により分析した結果を示す図である。
【図３】親和度が増進した１０種抗体に対するＣＤ１９−ＥＣＤ  Ｆｃタンパク質に対する結合をＥＬＩＳＡで分析した結果を示す図である。
【図４】親和度が増進した３種抗体に対するＣＤ１９陽性細胞株であるＲａＪｉ細胞株に対する結合能を流細胞分析器を通じて分析した結果を示す図である。
【図５】開発された抗体断片が連結されたキメラ抗原受容体の発現を特殊タンパク質検出検査方法を用いて分析した結果を示す図である。
【図６】開発された抗体断片が連結されたキメラ抗原受容体を発現する細胞毒性Ｔ細胞の活性をインターフェロンガンマ分泌量で分析した結果を示す図である。
【図７】親和度が増進した８種抗体に対するＣＤ１９−ＥＣＤ  Ｆｃタンパク質に対する結合をＥＬＩＳＡで分析した結果を示す図である。
【図８】親和度が増進した３種抗体に対するＣＤ１９陽性細胞株であるＲａＪｉ細胞株に対する結合能を流細胞分析器を通じて分析した結果を示す図である。
【図９】ＣＤ１９＿８．１＿３Ｃ１２のキメラ抗原受容体が発現される細胞毒性Ｔ細胞の活性をインターフェロンガンマの量で確認した結果である。標的細胞にＣＤ１９陽性細胞であるＲａＪｉとＣＤ１９陰性細胞であるJurkatを使用したものであり、細胞毒性Ｔ細胞と１：５の割合で共同培養してインターフェロンガンマを測定した。
【図１０】ＣＤ１９陽性細胞株であるＲａＪｉ−Ｌｕｃ細胞と細胞毒性Ｔ細胞を共同培養した後、生き残ったＲａＪｉ−Ｌｕｃ細胞のluciferaseを測定して細胞毒性を確認した結果である。
【発明の実施のための形態】
【０１５７】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これら実施例は本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨に従って本発明の範囲がこれら実施例により制限されないということは当業界で通常の知識を有する者において自明である。
【０１５８】
実施例
実施例１：ＣＤ１９に対する抗体開発
抗体開発のためにヒトＣＤ１９タンパク質の細胞外部ドメイン（Extracellular domain、ＥＣＤ）を動物細胞を用いて生産した後、抗原に用いた。ＥＣＤのＣ−末端にヒトＩｇＧ１のヒンジ及びＦｃ部位（ＣＨ２−ＣＨ３）が結合された形態のＤＮＡをｐＣＥＰ４ベクター（Invitrogen、米国）にクローニングした。次に、FreeStyleTM293F（Invitrogen、米国）細胞に前記クローニングされたベクターを一時的に形質転換させて、ＣＤ１９−ＥＣＤ  Ｆｃ融合タンパク質を確保した。前記ＣＤ１９−ＥＣＤ  Ｆｃ融合タンパク質とオパールライブラリを用いてファージバイオ−パンニング（bio-panning）を実施した。抗体ライブラリはＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（helper phage）を用いてファージ形態に収得してパンニングに用いた。初めて抗原と結合させるライブラリファージの数は１０１３を用いた。パンニングラウンド（panning round）は４ラウンドまで実施したものであり、親和度の高いファージが選択的によく選別できるパンニング戦略でパンニングラウンド回数が増えるにつれて抗原の量を減らし、洗浄回数は増やす方法を適用した。ターゲット抗原に結合したファージの数はＥＲ２５３７Ｅ．ｃｏｌｉを用いて下記のように適正した。バイオ−パンニング各ラウンドで得たバインダーファージ（binder phage）をｐＨ２．２グリシン緩衝液に湧出した。ＳＢ培養液で一夜間培養したＥＲ２５３７を新たなＳＢ培養液を用いて１／２００で希薄して継代した。次に、３時間の間３７℃で追加培養してログファージ（log phage）に到達するようにした。１００μｌの新鮮なＥＲ２５３７と１０μｌの希釈されたファージを１．５ｍｌチューブで混合した後、３０分間培養した後、アンピシリン（ampicillin）ＬＢプレートに塗抹した。次に、３７℃で一夜間培養して生成されたコロニー（colony）数と希釈因子を適用してファージ数を測定した。バイオ−パンニング各ラウンドで得たバインダーファージはＥＲ２５３７に感染させてコロニー形態に維持した状態でＥＬＩＳＡ方法により各抗原に対する結合有無を確認した。バインダーファージを感染させて得たコロニーをＳＢ培養液に接種した後、ＯＤ６００で０．５になるまで培養した。次に、０．５ｍＭのＩＰＴＧを入れて３０℃でシェーキング（shaking）培養して抗体断片タンパク質が過発現されるようにした。ＢＢＳ緩衝液を用いてｓｃＦｖタンパク質を精製した。精製された抗体断片をＣＤ１９−ＥＣＤ  Ｆｃタンパク質がコーティングされたプレートとＣＤ１９過発現細胞株であるＲａＪｉに処理した。２次抗体を処理した後、ＴＭＢで発色反応を発生させてＥＬＩＳＡリーダ器（Victor X3 PerkinElmer）を用いてＯＤ４５０値を測定した。ＣＤ１９に特異的に結合するものとして選別された抗体クローンはファージミド（phagemid）プラスミドと公知されたプライマセット（Phage display: a laboratory manual, Carlos Barbas III, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press）を用いてシーケンシング（sequencing）分析を通じて可変部位の塩基序列を確認した。選別された抗体のうち、ＣＤ１９に対する結合能に優れるＣＤ１９＿８．１を選別したものであり、選別されたＣＤ１９＿８．１抗体の可変部位の塩基序列は表１の通りである。
【０１５９】
【表１】
2021507922.tif 000003
【０１６０】
選別されたＣＤ１９＿８．１抗体の結合を定量的に確認するために抗体断片を動物細胞を用いて生産した。抗体断片のＣ−末端にヒトキャパ軽鎖部位が結合された形態のＤＮＡをｐＣＥＰ４ベクターにクローニングした。次に、FreeStyleTM293F細胞に前記クローニングされたベクターを一時的に形質転換させて、キャパ軽鎖融合タンパク質形態の抗体を確保した。選別された抗体の結合能を測定するためにＣＤ１９−ＥＣＤ  Ｆｃを用いたＥＬＩＳＡを進行した。ＣＤ１９−ＥＣＤ  Ｆｃタンパク質がコーティングされたプレートに精製された抗体断片を濃度依存的に処理したものであり、２次抗体を処理した後、ＴＭＢで発色反応を発生させてＥＬＩＳＡリーダ器（Victor X3 PerkinElmer）を用いてＯＤ４５０値を測定した（図１）。
【０１６１】
実施例２．開発された抗体断片に対する親和度増進
ＣＤ１９に対してＣＤ１９＿８．１対比優れる結合力を有する抗体断片を確保するために重鎖と軽鎖ライブラリを組合せて新たなサブライブラリを製作した。サブライブラリを生成するために、ＮＮＫ同意コドン（degenerate codons）を含有するオリゴヌクレオチドが使われた。ＣＤ１９＿８．１抗体断片はtemplate DNAに使われた。無作為コドンはＰＣＲによりＨＣＤＲ３のみを除いて５個のＣＤＲに導入された。増幅された抗体断片は QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN、米国）により精製された。抗体断片及びｐＣｏｍｂ３ＸＳＳベクターはｓｆｉＩ制限酵素に切断され、ライゲーション後、ＥＲ２５３７に形質注入してファージライブラリを製作した。製作されたファージライブラリに基づいて実施例１と同一な方法により抗体を選別した。
【０１６２】
選別された抗体のうち、親和度がより向上した抗体を選別するためにＣＤ１９がコーティングされたプレートを用いたＥＬＩＳＡを進行した。ＥＬＩＳＡ遂行時、抗体断片の結合後、３７℃で２時間の間追加培養して親和度が向上した抗体を選別しようとした。培養が終わって洗浄を遂行した後、２次抗体反応及びＴＭＢ発色を進行して親和度が増進した抗体を最終選別した。ＥＬＩＳＡ遂行結果、第２重鎖ＣＤＲと第１軽鎖ＣＤＲが親和度に重要であるということを確認した。これによって、第２重鎖ＣＤＲと第１軽鎖ＣＤＲ部位を変更するサブライブラリを製作して前記と同一な方法により親和度が向上した抗体を選別した（図２）。選別されたコロニーで発現される抗体の序列を塩基分析を通じて確認した。選別された抗体の可変部位である第２重鎖ＣＤＲと第１軽鎖ＣＤＲ部位の塩基序列は表２の通りである。
【０１６３】
【表２】
2021507922.tif 000004
2021507922.tif 000005
【０１６４】
選別された抗体のうち、親和度が向上した１０種抗体に対する定量実験のために抗体断片に対する生産を実施例２に言及された方法と同一に進行した。その結果、親和度が向上した抗体に対して、キャパ軽鎖融合タンパク質形態の抗体に確保した。選別された抗体の結合能を測定するためにＣＤ１９−ＥＣＤ  Ｆｃを用いたＥＬＩＳＡを進行した。ＣＤ１９−ＥＣＤ  Ｆｃタンパク質がコーティングされたプレートに精製された抗体断片を濃度依存的に処理し、２次抗体を処理した後、ＴＭＢで発色反応を発生させてＥＬＩＳＡリーダ器（Victor X3 PerkinElmer）を用いてＯＤ４５０値を測定した（図３）。測定されたＯＤ４５０値を用いてＣＤ１９−ＥＣＤ  Ｆｃに対する結合能をGraphpad Prismで分析した（表３）。
【０１６５】
【表３】
2021507922.tif 000006
【０１６６】
選別された抗体のうち、ＣＤ１９−ＥＣＤ  Ｆｃに対する結合能に優れるＥ３、２Ｆ１抗体と相対的に低いＣ２抗体に対してＣＤ１９陽性細胞株であるＲａＪｉ細胞株に対する結合能を確認した。精製された抗体断片をＣＤ１９陽性細胞株であるＲａＪｉに濃度依存的に処理し、ＣＤ１９陽性細胞株であるＲａＪｉに結合した抗体断片は抗−ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣを用いて染色した。ＲａＪｉ細胞株に結合した抗体断片に対する分析は流細胞分析器を通じて測定し（図４）、結合能の分析はGraphpad Prismで遂行した（表４）。これを通じてＣＤ１９＿８．１対比結合能が向上した抗体を確保した。
【０１６７】
【表４】
2021507922.tif 000007
【０１６８】
実施例３：開発された抗体断片が連結されたキメラ抗原受容体を含むレンチウイルスの製作
開発された抗体ＣＤ１９＿８．１を用いてキメラ抗原受容体を開発した。キメラ抗原受容体はＣＤ８リーダ、ｓｃＦｖ形態のＣＤ１９＿８．１、ＣＤ８ヒンジ領域、ＣＤ１３７膜貫通領域及び細胞質領域、及びＣＤ３ゼータの細胞質領域をコドン最適化した後、ｐＬｅｎｔｉ６−Ｖ５／ＤＥＳＴレンチウイルスベクター（Invitrogen、米国）にＳｐｅＩ／ＸｈｏＩに切断及び結紮させた。製造されたコンストラクト（序列目録第１８１序列）は塩基序列分析を通じて確認した。
【０１６９】
製造されたレンチウイルスコンストラクトをウイルス外皮タンパク質であるＶＳＶ−Ｇ（vesicular stomatitis indiana virus G protein）をコーディングする核酸とｇａｇ、ｐｏｌ、及びｒｅｖ遺伝子を含むプラスミドであるｐＣＭＶ−ｄＲ８．９１と共にＬｅｎｔｉ−Ｘ２９３Ｔ（Takara Bio Inc., 日本）細胞株に形質導入させた。形質導入はリポフェクタミン２０００（Invitrogen、米国）を使用して製造社のプロトコルの通り遂行した。７２時間後、レンチウイルスが含まれた培養液を遠心分離型フィルタ装置（Ｍillipore、米国）を使用して１０倍濃縮して保管した。
【０１７０】
実施例４．開発された抗体断片が連結されたキメラ抗原受容体が表面に提示された細胞毒性Ｔ細胞の製造
実施例３で製造されたウイルスを用いて、ＣＤ１９＿８．１抗体断片が連結されたキメラ抗原受容体が表面に提示された細胞毒性Ｔ細胞を製造した。
【０１７１】
まず、ヒトのｎａｉｖｅ  Ｔ細胞を分離してDynabeadsTM Human T-Activator CD3/CD28（Thermofisher scientific、米国）で２４時間の間刺激し、ポリブレン（Sigma-Aldrich、米国）が含まれたレンチウイルスを前記細胞に添加して２４時間の間培養しながら形質導入させる。以後、インタルキン−２（Gibco、米国）が含まれた培地に交替して５％  ＣＯ２、３７℃の条件で培養した。その後、ＣＤ１９＿８．１断片が連結されたキメラ抗原受容体の形質導入をキメラ抗原受容体を構成するＣＤ３ｚ抗体（ＢＤ、米国）と特殊タンパク質検出検査（Ｗestern blot）方法を用いて分析した（図５）。このように製造されたＣＤ１９＿８．１抗体断片が連結されたキメラ抗原受容体が表面に提示されたＴ細胞は、製造後２４時間以内に以後の実験に使用した。
【０１７２】
実施例５．開発された抗体断片が連結されたキメラ抗原受容体が表面に提示された細胞毒性Ｔ細胞の活性確認
実施例３で製造したキメラ抗原受容体が表面に提示された細胞毒性Ｔ細胞を使用して、前記Ｔ細胞が細胞の表面のＣＤ１９を認識することによって、キメラ抗原受容体細胞の活性化を誘導するか否かを確認した。具体的に、実験はＣＤ１９陽性細胞株であるＲａＪｉとＣＤ１９陰性細胞株であるＪｕｒｋａｔ  Ｅ６１細胞株を１０％ウシ胎児血清及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンが添加されたＲＰＭＩ−１６４０培地に培養して使用した。まず、ＣＤ１９陽性または陰性細胞株を底の丸い形態の９６−ウェルプレートにウェル当たり３ｘ１０４個になるように株分けした。培養上等液を除去した後、ウェル当たり処理割合に合うように製造したキメラ抗原受容体Ｔ細胞を添加し、５％のＣＯ２及び３７℃の条件で２４時間の間培養した。その結果、培地に分泌されたインターフェロンガンマの量をＥＬＩＳＡキットを使用して製造社のプロトコルの通り測定し、その結果を図６に示した。この際、対照群として細胞を培養しないプレートにキメラ抗原受容体Ｔ細胞を添加した群（Effector T cell only）、細胞を培養したプレートに何も添加しない群（Target cell only）を使用した。
【０１７３】
図６に示すように、ＣＤ１９＿８．１抗体断片が連結されたキメラ抗原受容体Ｔ細胞とＣＤ１９陽性細胞株でインターフェロンガンマの分泌が有意的に増加することを確認した。
【０１７４】
実施例６．開発された抗体断片に対する親和度増進抗体開発
ＣＤ１９＿８．１＿２Ｆ１に基づいて第２、３重鎖と第１軽鎖ライブラリを組合せて新たなサブライブラリを製作した。サブライブラリを生成するために、ＮＮＫ同意コドン（degenerate codons）を含有するオリゴヌクレオチドが使われており、この際、ＣＤ１９＿８．１＿２Ｆ１の序列が７０％以上維持されるようにした。ＣＤ１９＿８．１＿２Ｆ１抗体断片をtemplate DNAに使用した。同意コドンを用いた多様性はＰＣＲにより３個のＣＤＲに導入された。増幅した抗体断片はQIAquick Gel Extraction Kit （ＱＩＡＧＥＮ、米国）により精製された。抗体断片及びｐＣｏｍｂ３ＸＳＳベクターはｓｆｉＩ制限酵素に切断されており、ライゲーション後、ＥＲ２５３７に形質注入してファージライブラリを製作した。製作されたファージライブラリに基づいて実施例１と同一な方法により抗体を選別した。開発された抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸序列は表５の通りである。
【０１７５】
【表５】
2021507922.tif 000008
【０１７６】
開発された抗体断片をキャパ軽鎖融合タンパク質形態にFreeStyleTM 293F細胞株を用いて生産し、実施例２と同一な方法によりＣＤ１９−ＥＣＤ−Ｆｃに対する結合能を確認し（図７）、結合能の分析はGraphpad Prismで遂行した（表６）。
【０１７７】
【表６】
2021507922.tif 000009
【０１７８】
親和度増進がなされた抗体断片に対してＣＤ１９陽性細胞株であるＲａＪｉ細胞株に対する結合能を流細胞分析法により確認した。精製された抗体断片をＣＤ１９陽性細胞株であるＲａＪｉに濃度依存的に処理し、結合した抗体断片は抗−ヒトキャパ軽鎖−ＦＩＴＣ（BD bioscience、米国）を用いて染色した。ＲａＪｉ細胞株に結合した抗体断片のうち、細胞結合能に優れる３種に対する分析は流細胞分析器を通じて測定し（図８）、結合能の分析はGraphpad Prismで遂行した（表７）。これを通じてＣＤ１９＿８．１対比結合能が向上した抗体を確保した。
【０１７９】
【表７】
2021507922.tif 000010
【０１８０】
実施例７：親和度増進がなされた抗体断片が連結されたキメラ抗原受容体を含むレンチウイルスの製作
開発された抗体のうち、親和度が向上したＣＤ１９＿８．１＿３Ｃ１２を用いてキメラ抗原受容体を開発した。キメラ抗原受容体はＣＤ８リーダ、ｓｃＦｖ形態の開発された抗体、ＣＤ８ヒンジ及び膜貫通領域、ＣＤ１３７細胞質領域、及びＣＤ３ゼータの細胞質領域をGeneOptimizer（Invitrogen）アルゴリズムを用いてコドン最適化した後、プロモーターがＥＦ−１ alphaに変更されたｐＬｅｎｔｉ６．３／Ｖ５−ＴＯＰＯレンチウイルスベクター（Invitrogen、米国）にＳｐｅＩ／ＰａｃＩに切断及び結紮させた。製造されたコンストラクトは塩基序列分析を通じて確認した。
【０１８１】
製造されたレンチウイルスコンストラクトをウイルス外皮タンパク質であるＶＳＶ−Ｇ（vesicular stomatitis indiana virus G protein）をコーディングする核酸とｇａｇ、ｐｏｌ、及びｒｅｖ遺伝子を含むプラスミドであるｐＣＭＶ−ｄＲ８．９１と共にＬｅｎｔｉ−Ｘ  ２９３Ｔ（Takara Bio Inc.,日本）細胞株に形質導入させた。形質導入はリポフェクタミン２０００（Invitrogen、米国）を使用して製造社のプロトコルの通り遂行した。レンチウイルスが含まれた培養液をLenti-X concentrator（Takara Bio Inc.,日本）を使用して濃縮して保管した。
【０１８２】
実施例８．親和度増進がなされた抗体断片を含むキメラ抗原受容体が表面に提示された細胞毒性Ｔ細胞の製造及び活性確認
実施例７で製造されたレンチウイルスを用いて、ＣＤ１９＿８．１＿３Ｃ１２抗体断片（ｓｃＦｖ）を含むキメラ抗原受容体が表面に提示された細胞毒性Ｔ細胞を製造した。これを通じてキメラ抗原受容体が表面に提示された細胞毒性Ｔ細胞を使用して、前記Ｔ細胞が細胞表面のＣＤ１９を認識することによって、キメラ抗原受容体細胞の活性化を誘導するか否かを確認した。
【０１８３】
具体的に、ＣＤ１９陽性細胞株であるＲａＪｉにGFP-Luciferaseが発現されるようにレンチウイルスを導入して遺伝子導入細胞株であるＲａＪｉ−Ｌｕｃ細胞株を構築して実験に使用した。まず、ＲａＪｉ−Ｌｕｃ細胞株を底の丸い形態の９６−ウェルプレートにウェル当たり３ｘ１０４個になるように株分けした。ＲａＪｉ−Ｌｕｃ細胞株が株分けされたプレートにウェル当たり処理割合に合うように製造した細胞毒性Ｔ細胞を添加し、５％のＣＯ２及び３７℃の条件で２４時間の間共に培養した。培養後、培地に分泌されたインターフェロンガンマの量をＥＬＩＳＡキットを使用して製造社のプロトコルの通り測定し、細胞毒性Ｔ細胞の毒性効果を luciferase測定（Bio-Glo Luciferase assay system、Promega、米国）を通じて確認した。
【０１８４】
図９に示すように、本発明の抗体断片を含む細胞毒性Ｔ細胞とＲａＪｉ−Ｌｕｃが１：５の割合で処理された実験群でインターフェロンガンマの分泌が有意的に増加することを確認した。本発明の抗体断片を含むキメラ抗原受容体の細胞毒性効果は細胞毒性Ｔ細胞とＲａＪｉ−Ｌｕｃの培養後、残っているＲａＪｉ−Ｌｕｃ細胞株を３Ｘ  Lysis buffer（７５  ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、３０％ glycerol、３％ Triton Ｘ１００）で破砕して湧き出るluciferaseをsubstrateと反応させて確認した。Ｒａｊｉ−Ｌｕｃ細胞のみ培養したwellから出るsignalを１００％にしてlysis割合を決定した。本発明の抗体断片が含まれたキメラ抗原受容体Ｔ細胞では処理割合によって細胞毒性効果が示されることを確認することができた（図１０）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年6月30日(2020.6.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
序列目録第１序列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及び序列目録第３序列のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域（heavy chain variable region、ＶＨ）；並びに、ＣＤＲＬ１、序列目録第５序列のＣＤＲＬ２、及び序列目録第６序列のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域（light chain variable region、ＶＬ）、を含む抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片であり、
前記ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＬ１は各々序列目録第２序列及び第４序列；第７序列及び第４９序列；第８序列及び第５０序列；第９序列及び第５１序列；第１０序列及び第５２序列；第１１序列及び第５３序列；第１２序列及び第５４序列；第１３序列及び第５５序列；第１４序列及び第５６序列；第１５序列及び第５７序列；第１６序列及び第５８序列；第１７序列及び第５９序列；第１８序列及び第６０序列；第１９序列及び第６１序列；第２０序列及び第６２序列；第２１序列及び第６３序列；第２２序列及び第６４序列；第２３序列及び第６５序列；第２４序列及び第６６序列；第２５序列及び第６７序列；第２６序列及び第６８序列；第２７序列及び第６９序列；第２８序列及び第７０序列；第２９序列及び第７１序列；第３０序列及び第７２序列；第３１序列及び第７３序列；第３２序列及び第７４序列；第３３序列及び第７５序列；第３４序列及び第７６序列；第３５序列及び第７７序列；第３６序列及び第７８序列；第３７序列及び第７９序列；第３８序列及び第８０序列；第３９序列及び第８１序列；第４０序列及び第８２序列；第４１序列及び第８３序列；第４２序列及び第８４序列；第４３序列及び第８５序列；第４４序列及び第８６序列；第４５序列及び第８７序列；第４６序列及び第８８序列；第４７序列及び第８９序列；または第４８序列及び第９０序列のアミノ酸序列を含む、前記抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
前記重鎖可変領域（ＶＨ）は序列目録第９１序列乃至第１３３序列からなる群より選択されたアミノ酸序列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
前記軽鎖可変領域（ＶＬ）は序列目録第１３４序列乃至第１７６序列からなる群より選択されたアミノ酸序列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
前記重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）は各々序列目録第９１序列及び第１３４序列；第９２序列及び第１３５序列；第９３序列及び第１３６序列；第９４序列及び第１３７序列；第９５序列及び第１３８序列；第９６序列及び第１３９序列；第９７序列及び第１４０序列；第９８序列及び第１４１序列；第９９序列及び第１４２序列；第１００序列及び第１４３序列；第１０１序列及び第１４４序列；第１０２序列及び第１４５序列；第１０３序列及び第１４６序列；第１０４序列及び第１４７序列；第１０５序列及び第１４８序列；第１０６序列及び第１４９序列；第１０７序列及び第１５０序列；第１０８序列及び第１５１序列；第１０９序列及び第１５２序列；第１１０序列及び第１５３序列；第１１１序列及び第１５４序列；第１１２序列及び第１５５序列；第１１３序列及び第１５６序列；第１１４序列及び第１５７序列；第１１５序列及び第１５８序列；第１１６序列及び第１５９序列；第１１７序列及び第１６０序列；第１１８序列及び第１６１序列；第１１９序列及び第１６２序列；第１２０序列及び第１６３序列；第１２１序列及び第１６４序列；第１２２序列及び第１６５序列；第１２３序列及び第１６６序列；第１２４序列及び第１６７序列；第１２５序列及び第１６８序列；第１２６序列及び第１６９序列；第１２７序列及び第１７０序列；第１２８序列及び第１７１序列；第１２９序列及び第１７２序列；第１３０序列及び第１７３序列；第１３１序列及び第１７４序列；第１３２序列及び第１７５序列；または第１３３序列及び第１７６序列のアミノ酸序列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
前記ＣＤＲＨ２は序列目録第１９０序列のアミノ酸序列を含み、前記ＣＤＲＨ３は序列目録第１９１序列乃至第１９８序列からなる群より選択されたアミノ酸序列で置換されており；前記ＣＤＲＬ１は序列目録第１９９序列または第２００序列のアミノ酸序列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
請求項１乃至５のうち、いずれか一項の抗体またはその抗原結合断片をエンコーディングする核酸分子。
【請求項７】
請求項６の核酸分子を含む、再組合せベクター。
【請求項８】
請求項７の再組合せベクターに形質転換された宿主細胞。
【請求項９】
次を含むＣＤ１９特異的キメラ抗原受容体：
（ａ）請求項１乃至５のうち、いずれか一項の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片を含む細胞外ドメイン（Extracellular domain）；
（ｂ）膜貫通ドメイン（transmembrane domain）；及び
（ｃ）細胞内信号伝達ドメイン。
【請求項１０】
請求項９のキメラ抗原受容体を発現する効果器細胞。
【請求項１１】
請求項１０の効果器細胞を含む薬剤学的組成物。
【請求項１２】
請求項１乃至５のうち、いずれか一項の抗−ＣＤ１９抗体またはその抗原結合断片を含むＣＤ１９を発現する細胞と関連した疾患、自家免疫疾患、または炎症疾患の予防または治療用薬剤学的組成物。
【国際調査報告】
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