(57)【要約】本開示は、例えば免疫組織化学（ＩＨＣ）に有用な合成対照、ならびにそれに関連するキット及び製造方法及び使用に関する。いくつかの実施形態では、合成対照は、（例えば、既知の量で）精製抗原と、血清アルブミンタンパク質（例えば、血清アルブミンタンパク質）、卵白タンパク質もしくは卵白タンパク質の混合物、ゼラチン、またはポリリジンなどの担体タンパク質と、を含む固体の抗原／担体タンパク質ゲルを含む。いくつかの実施形態では、精製抗原は、固体の抗原／担体タンパク質ゲル中の担体タンパク質に架橋されている。【選択図】図３−１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫組織化学（ＩＨＣ）染色のための固体の抗原／担体タンパク質ゲルを生成する方法であって：
（ａ）精製抗原をアルブミンタンパク質、卵白タンパク質または卵白タンパク質の混合物、及びゼラチンからなる群から選択される担体タンパク質を含む液体溶液と混合して、抗原／担体タンパク質液体溶液を生成することと；
（ｂ）前記抗原／担体タンパク質液体溶液を加熱して、前記固体の抗原／担体タンパク質ゲルを形成することと、を含む、前記方法。
【請求項２】
（ｂ）の後に：前記固体の抗原／担体タンパク質ゲルを脱水することと、前記脱水した固体の抗原／担体タンパク質ゲルをパラフィンブロックに包埋することと、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記脱水された固体の抗原／担体タンパク質ゲルを前記パラフィンブロックに包埋した後に：前記抗原／担体タンパク質ゲルを含むコアを前記パラフィンブロックからレシピエント組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）ブロックに移すことをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
（ｂ）の後に：前記固体の抗原／担体タンパク質ゲルを液体包埋媒体中でインキュベートすることと、前記固体の抗原／担体タンパク質ゲルを前記包埋媒体中で凍結することとをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
（ｂ）の後に：前記固体の抗原／担体タンパク質ゲルをプラスチック樹脂中に包埋することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
（ｂ）の後に：前記固体の抗原／担体タンパク質ゲルを、約３０ｎｍ〜約５０μｍの厚さを有する１つ以上の固体の抗原／担体タンパク質ゲルの切片に薄切することをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記固体の抗原／担体タンパク質ゲルが、約２μｍ〜約３０μｍの厚さを有する１つ以上の固体の抗原／担体タンパク質ゲルの切片に薄切される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記固体の抗原／担体タンパク質ゲルが、約３０ｎｍ〜約１００ｎｍの厚さを有する１つ以上の固体の抗原／担体タンパク質ゲル切片に薄切される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
（ｂ）の前に、前記抗原／担体タンパク質液体溶液に固定剤を含めることをさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記固定剤がホルムアルデヒドを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗原／担体タンパク質液体溶液が、少なくとも約１％の最終濃度でホルムアルデヒドを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記固定剤が、グルタルアルデヒド、Ｄａｖｉｄｓｏｎの固定剤、Ｂｏｕｉｎの固定剤、１／２強度のＫａｒｎｏｖｓｋｉの固定剤、または亜鉛塩を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記固体の抗原／担体タンパク質ゲルを抗原賦活化に供することをさらに含む、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記固体の抗原／担体タンパク質ゲルを抗原賦活化に供することが、前記固体の抗原／担体タンパク質ゲルを液体溶液中で加熱することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
（ｂ）の前に、前記抗原／担体タンパク質液体溶液に固定剤を含めることと；
（ｂ）の後に、前記固体の抗原／担体タンパク質ゲルを脱水することと；
前記脱水された固体の抗原／担体タンパク質ゲルをパラフィンブロックに包埋することと；
前記包埋された抗原／担体タンパク質ゲルを含む前記パラフィンブロックを、約３０ｎｍ〜約５０μｍの厚さを有する１つ以上の切片に薄切することと；
前記包埋された固体の抗原／担体タンパク質ゲルの前記１つ以上の切片を抗原賦活化に供することと；
抗原賦活化の後に、前記包埋された固体の抗原／担体タンパク質ゲルの前記１つ以上の切片をブロッキングすることと、をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
（ｂ）の後に、前記固体の抗原／担体タンパク質ゲルを液体包埋媒体中でインキュベートすることと；
前記固体の抗原／担体タンパク質ゲルを前記包埋媒体中で凍結することと；
前記凍結した抗原／担体タンパク質ゲルを、約３０ｎｍ〜約５０μｍの厚さを有する１つ以上の切片に薄切することと；
前記凍結した固体の抗原／担体タンパク質ゲルの前記１つ以上の切片をブロッキングすることと、をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗原がポリペプチド抗原である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗原がＮ末端チロシン、Ｃ末端システイン、またはその両方を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
（ｂ）の前に、前記抗原をシステイン反応性試薬を使用して前記担体タンパク質と架橋することをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗原が非ポリペプチド抗原を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記担体タンパク質が血清アルブミンタンパク質である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記血清アルブミンタンパク質が、ウシ、ヤギ、ウマ、またはヒトの血清アルブミンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記担体タンパク質が、卵白タンパク質または卵白タンパク質の混合物である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
（ａ）で生成された前記抗原／担体タンパク質液体溶液が、２％（ｗ／ｖ）以上の濃度の前記担体タンパク質を含む、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
（ａ）で生成された前記抗原／担体タンパク質液体溶液が、約２５％（ｗ／ｖ）以下の最終濃度の前記担体タンパク質を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記担体タンパク質がゼラチンであり、前記方法が、（ｂ）の後に、前記加熱された抗原／担体タンパク質液体溶液を冷却して前記固体の抗原／担体タンパク質ゲルを形成することをさらに含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記方法が、前記加熱された抗原／担体タンパク質液体溶液を冷却した後に：
前記固体の抗原／担体タンパク質ゲルを固定剤と共にインキュベートして固定された抗原／担体タンパク質ゲルを形成することと；
前記固定された抗原／担体タンパク質ゲルを脱水することと、をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
（ａ）で生成された前記抗原／担体タンパク質液体溶液が、約０．５％（ｗ／ｖ）以上の濃度の前記担体タンパク質を含む、請求項２６または請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗原／担体タンパク質液体溶液が、（ｂ）で少なくとも約６５℃まで加熱される、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗原／担体タンパク質溶液が（ｂ）において少なくとも約６５℃に少なくとも６分間加熱される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法によって生成される、固体の抗原／担体タンパク質ゲル。
【請求項３２】
請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法によって生成される、少なくとも第１の固体の抗原／担体タンパク質ゲルと、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法によって生成される、第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルとを含む、組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）。
【請求項３３】
免疫組織化学（ＩＨＣ）染色のための固体の抗原／担体タンパク質ゲルであって、アルブミンタンパク質、卵白タンパク質または卵白タンパク質の混合物、及びゼラチンからなる群から選択される担体タンパク質に架橋された精製抗原を含む、前記固体の抗原／担体タンパク質ゲル。
【請求項３４】
前記固体のゲルが約３０ｎｍ〜約５０μｍの厚さを有する、請求項３３に記載の固体のゲル
【請求項３５】
前記固体のゲルが約２μｍ〜約３０μｍの厚さを有する、請求項３４に記載の固体のゲル。
【請求項３６】
前記固体のゲルが約３０ｎｍ〜約１００ｎｍの厚さを有する、請求項３４に記載の固体のゲル。
【請求項３７】
前記固体のゲルが包埋媒体中で凍結されている、請求項３３〜３６のいずれか１項に記載の固体のゲル。
【請求項３８】
前記固体のゲルがパラフィン中に包埋されている、請求項３３〜３６のいずれか１項に記載の固体のゲル。
【請求項３９】
前記固体のゲルがプラスチック樹脂中に包埋されている、請求項３３〜３６のいずれか１項に記載の固体のゲル。
【請求項４０】
前記固体のゲルが固体基体に固定されている、請求項３３〜３９のいずれか１項に記載の固体のゲル。
【請求項４１】
前記固体のゲルが固定剤中に固定されている、請求項３３〜４０のいずれか１項に記載の固体のゲル。
【請求項４２】
前記固定剤がホルムアルデヒドを含む、請求項４１に記載の固体のゲル。
【請求項４３】
前記固定剤が少なくとも約１％の濃度でホルムアルデヒドを含む、請求項４２に記載の固体のゲル。
【請求項４４】
前記固定剤が、グルタルアルデヒド、Ｄａｖｉｄｓｏｎの固定剤、Ｂｏｕｉｎの固定剤、１／２強度のＫａｒｎｏｖｓｋｉの固定剤、または亜鉛塩を含む、請求項４１に記載の固体のゲル。
【請求項４５】
前記固体のゲルが抗原賦活化に供されている、請求項３３〜４４のいずれか１項に記載の固体のゲル。
【請求項４６】
前記抗原がポリペプチド抗原である、請求項３３〜４５のいずれか１項に記載の固体のゲル。
【請求項４７】
前記抗原がＮ末端チロシン、Ｃ末端システイン、またはその両方を含む、請求項４６に記載の固体のゲル。
【請求項４８】
前記Ｎ末端チロシン及び／またはＣ末端システインは、前記担体タンパク質に架橋されている、請求項４７に記載の固体のゲル。
【請求項４９】
前記抗原が非ポリペプチド抗原を含む、請求項３３〜４５のいずれか１項に記載の固体のゲル。
【請求項５０】
前記担体タンパク質が血清アルブミンタンパク質である、請求項３３〜４９のいずれか１項に記載の固体のゲル。
【請求項５１】
前記血清アルブミンタンパク質が、ウシ、ヤギ、ウマ、またはヒトの血清アルブミンである、請求項５０に記載の固体のゲル。
【請求項５２】
前記担体タンパク質が、卵白タンパク質または卵白タンパク質の混合物である、請求項３３〜４９のいずれか１項に記載の固体のゲル。
【請求項５３】
前記固体のゲルが、２％以上の濃度の前記担体タンパク質を含む、請求項５０〜５２のいずれか１項に記載の固体のゲル。
【請求項５４】
前記固体のゲルが約２５％以下の濃度で前記担体タンパク質を含む、請求項５３に記載の固体のゲル。
【請求項５５】
前記担体タンパク質がゼラチンである、請求項３３〜４９のいずれか１項に記載の固体のゲル。
【請求項５６】
前記固体のゲルが、０．５％以上の濃度の前記担体タンパク質を含む、請求項５５に記載の固体のゲル。
【請求項５７】
前記固体のゲルが、少なくとも約２５ｎＭの濃度の前記抗原を含む、請求項３３〜５６のいずれか１項に記載の固体のゲル。
【請求項５８】
少なくとも第１及び第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルを含む組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）であって、前記第１及び第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルが両方とも、アルブミンタンパク質、卵白タンパク質または卵白タンパク質の混合物、及びゼラチンからなる群から選択される担体タンパク質に架橋された精製抗原を含む、前記組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）。
【請求項５９】
前記第１の固体の抗原／担体タンパク質ゲルが第１の精製抗原を含み、前記第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルが前記第１の精製抗原とは異なる第２の精製抗原を含む、請求項５８に記載のＴＭＡ。
【請求項６０】
前記第１の固体の抗原／担体タンパク質ゲルが第１の濃度で第１の精製抗原を含み、前記第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルが前記第１の濃度とは異なる第２の濃度で前記第１の精製抗原を含む、請求項５８に記載のＴＭＡ。
【請求項６１】
抗原の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色のための方法であって：
請求項３３〜５７のいずれか１項による固体の抗原／担体タンパク質ゲル、または請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法によって生成される固体の抗原／担体タンパク質ゲルを提供することであって、前記固体の抗原／担体タンパク質ゲルは、前記抗原を含有する前記提供すること；
試料を提供することと；
前記固体の抗原／担体タンパク質ゲル及び前記試料を前記抗原に特異的に結合する一次抗体と接触させることと；
前記固体の抗原／担体タンパク質ゲル及び前記試料を前記一次抗体と接触させた後に、前記固体の抗原／担体タンパク質ゲル及び前記試料を前記一次抗体に特異的に結合する二次抗体と接触させることであって、検出可能な部分が前記二次抗体にコンジュゲートされている前記接触させることと；
前記固体の抗原／担体タンパク質ゲルからの前記検出可能な部分のシグナルを検出することと；
前記試料からの前記検出可能な部分のシグナルを検出することと、を含み、前記固体の抗原／担体タンパク質ゲルから検出された前記シグナルと比較した前記試料からのシグナルの検出が、前記試料中の前記抗原の存在を示す、前記方法。
【請求項６２】
前記試料が組織試料である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
対照の抗原の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色のための方法であって：
第１及び第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルを提供することであって、前記第１及び前記第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルの各々が、請求項３３〜５７のいずれか１項によるものであるか、または請求項１〜３０のいずれか１項の方法によって生成されるものであり、前記第１の固体の抗原／担体タンパク質ゲルが、第１の濃度で前記抗原を含み、前記第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルが前記第１の濃度よりも高い第２の濃度で前記抗原を含む、前記提供することと；
前記第１及び前記第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルを前記抗原に特異的に結合する一次抗体と接触させることと；
前記第１及び前記第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルを前記一次抗体と接触させた後に、前記第１及び前記第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルを、前記一次抗体に特異的に結合する二次抗体と接触させることであって、検出可能な部分が前記二次抗体にコンジュゲートされている、前記接触させることと；
前記第１の固体の抗原／担体タンパク質ゲルからの前記検出可能な部分の第１のシグナルを検出することと；
前記第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルからの前記検出可能な部分の第２のシグナルを検出することと、を含み、前記第１のシグナルよりも大きい第２のシグナルの検出が、前記抗原の対照のＩＨＣ染色を示す、前記方法。
【請求項６４】
前記第１の濃度が０ｎＭであり、第１のシグナルの欠如の検出が、前記抗原の対照のＩＨＣ染色を示す、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
試料を提供することと；
前記試料を前記一次抗体と接触させることと；
前記試料を前記一次抗体と接触させた後に、前記試料を前記二次抗体と接触させることと；
前記試料からの前記検出可能な部分の第３のシグナルを検出することと；
前記第３のシグナルを前記第１及び前記第２のシグナルと比較することと、をさらに含み、前記第１及び前記第２のシグナルの量と比較した前記第３のシグナルの量が、前記第１及び前記第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲル中の前記抗原の量と比較した前記試料中の前記抗原の存在量を示す、請求項６３または請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
対照の二次抗体による免疫組織化学（ＩＨＣ）染色のための方法であって：
第１及び第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルを提供することであって、前記第１及び前記第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルの各々が、請求項３３〜５７のいずれか１項によるものであるか、または請求項１〜３０のいずれか１項の方法によって生成されるものであり、前記第１の固体の抗原／担体タンパク質ゲルが、第１のアイソタイプを有する第１の抗体を含み、前記第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルが前記第１のアイソタイプとは異なる第２のアイソタイプを有する第２の抗体を含む、前記提供することと；
前記第１及び前記第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルを前記第１のアイソタイプに特異的に結合する二次抗体と接触させることであって、検出可能な部分が前記二次抗体にコンジュゲートされる、前記接触させることと；
前記第１の固体の抗原／担体タンパク質ゲルからの前記検出可能な部分のシグナルを検出することと；
前記第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルからの前記検出可能な部分の前記シグナルの欠如を検出することと、を含み、前記第１の固体の抗原／担体タンパク質ゲルと関連する前記シグナル及び前記第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルと関連する前記シグナルの前記欠如の検出が、対照の前記二次抗体による染色を示す、前記方法。
【請求項６７】
前記検出可能な部分が酵素を含み、前記検出可能な部分の前記シグナルを検出することが、前記検出可能な部分を前記酵素の発色基質に曝露することと、前記酵素との反応時の前記発色基質からのシグナルを検出することと、を含む、請求項６１〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記検出可能な部分が、フルオロフォア、金属粒子、金属イオン、放射性同位元素、核酸、電気化学発光レポーター、または量子ドットを含む、請求項６１〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
対照の抗原の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色のためのキットであって：
（ａ）アルブミンタンパク質、卵白タンパク質または卵白タンパク質の混合物、及びゼラチンからなる群から選択される担体タンパク質に架橋された精製抗原を含む第１の固体のゲルであって、前記精製抗原が、第１の濃度で前記第１の固体のゲルに存在する、前記第１の固体のゲルと；
（ｂ）前記担体タンパク質に架橋された前記精製抗原を含む第２の固体のゲルであって、前記精製抗原が、前記第１の濃度とは異なる第２の濃度で前記第２の固体のゲルに存在する、前記第２の固体ゲルと、を含む、前記キット。
【請求項７０】
前記第１及び前記第２の固体のゲルが、それぞれ約３０ｎｍ〜約５０μｍの厚さに薄切されている、請求項６９に記載のキット。
【請求項７１】
前記第１及び前記第２の固体のゲルが、１つ以上の固体基体に固定されている、請求項６９または請求項７０に記載のキット。
【請求項７２】
（ｃ）前記担体タンパク質を含む第３の固体のゲルであって、前記精製抗原を含まない前記第３の固体のゲルをさらに含む、請求項６９〜７１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項７３】
前記第３の固体のゲルが、それぞれ約３０ｎｍ〜約５０μｍの厚さに薄切されている、請求項７２に記載のキット。
【請求項７４】
前記第３の固体のゲルが固体基体に固定されている、請求項７２または請求項７３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１２月６日に出願された米国仮出願連続番号６２／５９５，４３４号、及び２０１８年９月１２日に出願された米国仮出願連続番号６２／７３０，４２２号の優先利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルに関する次の提出の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：配列表のコンピューター可読形式（ＣＲＦ）（ファイル名：１４６３９２０４０４４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０１８年１２月５日、サイズ：３ＫＢ）。
【０００３】
本開示は、例えば、免疫組織化学（ＩＨＣ）に有用な合成対照、ならびにそれに関連する製造方法及び使用に関する。いくつかの実施形態では、合成対照は、血清アルブミンタンパク質、卵白タンパク質もしくは卵白タンパク質の混合物、またはゼラチンなどの担体タンパク質に架橋された（例えば、既知の量で）精製抗原を含む固体のゲルを含む。
【背景技術】
【０００４】
ＩＨＣは、研究用途と臨床用途の両方にとって重要なツールである。タンパク質発現を特性評価するために使用される多くの技術の中で、ＩＨＣは、発現レベルと、例えば細胞レベル及び／または組織レベルでの局在化に関する情報を提供する数少ない技術の１つである。したがって、ＩＨＣは研究において目的のタンパク質を特性評価するために使用される重要なツールである。ＩＨＣは、クリニックにおいても重要な診断ツールとなっており、例えば、患者を様々な個別化医療適用に分類するためのものである。一例として、ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（商標）（Ｄａｋｏ  Ｄｅｎｍａｒｋ  Ａ／Ｓ）半定量ＨＥＲ２  ＩＨＣアッセイは、ＨＥＲ２タンパク質の状態の評価に使用するために、ほぼ２０年間ＦＤＡによって承認されている。この検査により、臨床医は腫瘍がＨＥＲ２を過剰発現している患者を同定できる。ＨＥＲ２は多くの種類のがんで過剰発現しているが、乳癌の２５〜３０％がＨＥＲ２を過剰発現していることが示されており、このマーカーは無病期間及び全生存期間の短縮と相関している。これらの患者におけるＨＥＲ２を標的とする治療（例えば、抗ＨＥＲ２抗体治療）では、全生存期間、奏効率、奏効期間、及び疾患進行までの時間を大幅に改善する。例えば、Ｓｌａｍｏｎ，  Ｄ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４４：７８３−７９２を参照されたい。
【０００５】
特定の標的に対して信頼性の高いＩＨＣアッセイを確立することは、複数の課題を提示する。第１に、目的の標的に特異的で、他の標的と交差反応しない抗体を同定する必要がある。これには、既知のレベルで標的を発現する適切な陽性対照と陰性対照を必要とするが、標的の発現が特性評価されていない場合には、同定することが困難である。
【０００６】
第２に、たとえ抗体が利用可能である場合でも、信頼性が高く、容易に利用可能であり、大量生産が容易である、陽性対照及び陰性対照を同定することが困難であり得る。組織試料と細胞株（例えば、細胞ペレット）はどちらもＩＨＣ対照として使用されているが、いずれも大きな制限がある。多くの標的では、適切な組織が利用できない。他の場合では、組織での発現は、変動し、特性評価されていないか、または検出するには弱すぎる場合がある。細胞株は組織試料よりも入手が容易である（ただし、特定の細胞株を工業規模で増殖させることは難しい場合がある）が、組織試料での発現と同様に、細胞株での発現は変動し、特性評価されていないか、または検出するには弱すぎる可能性がある。細胞株を操作して目的の標的を過剰発現させることができるが、過剰発現は実際の組織での発現よりも大幅に高く、人工的な細胞内局在化をもたらす可能性がある。過剰発現はまた、培養細胞の集団内で不均一であり得る。細胞株はバッチで生産することができるが、これらはすぐに使い尽くされる可能性があり、異なる特性を持つ可能性のある新しいバッチの生産が必要となる。
【０００７】
ＩＨＣ対照を生成するための標準化されたアプローチを確立することを目的とした様々なアプローチが試みられてきた。４５年以上前に、Ｂｒａｎｄｔｚａｅｇは「人工組織」試料、すなわちヒト免疫グロブリン画分または全血清を拡散させたグルタルアルデヒド固定ウサギ血清のミリメートルサイズのブロックを作成する方法を記載した（Ｂｒａｎｄｔｚａｅｇ，  Ｐ．  （１９７２）  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ；２２（１）：１７７−１８３）。この一般的な手法は再考され、拡張されて、今後数十年間で明らかに成功した（Ｍｉｌｌａｒ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  （１９８２）  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｊ．  １４（４）：６０９−６２０；Ｓｃｈｉｐｐｅｒ  ａｎｄ  Ｔｉｌｄｅｒｓ  （１９８３）  Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．  ３１（１）：１２−１８；Ｖａｌｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．  ３３（８）：７５５−６１；Ｖａｌｎｅｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｔｚａｅｇ  （１９８５）  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ８１（４）：３１３−９）が、不均一で非特異的な染色を起こしやすいとも記載されており（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ  （２００５）  Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．  ５３（９）：１１６７−１１７０）、最近の実践ではほとんど使用されていない。より広く使用されているのは、様々に特徴付けられた豊富な標的タンパク質を含むクローン細胞株である（Ｍｏｈｄ  Ｏｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）  Ａｃｔａ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．  １１２（６）：５１９−２８）。これらは多くの設定で非常に貴重であるが、細胞株対照は、個別のサブクローン、１つのクローンの異なる継代、または１つの培養集団内でさえ、特定の標的の著しく異質な発現を示し、均一で再現性のある標準を作成するという目標を失敗させる。
【０００８】
Ｓｏｍｐｕｒａｍ，  Ｓ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ４８：４１０−４２０は、ペプチドをガラススライドに直接スポッティングしたり、ペプチドをガラスビーズにカップリングしたりすることを説明する  （Ｓｏｍｐｕｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｊ．  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  ６３：６８１−６９０もまた参照されたい）。しかしながら、このアプローチの実装は技術的な課題をもたらした。例えば、ペプチドがガラスに塗布されたスポットを技術者が見るのは困難だったため（それらは染色前には見えない）、多くのスライドは、全ての対照をカバーするには不十分な量の試薬で染色され、それにより染色にアーチファクトをもたらした（Ｂｏｇｅｎ，  Ｓ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ａｐｐｌ  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｍｏｒｐｈｏｌ  １７：２３９−２４６を参照されたい）。これらのペプチドスポットは実際の組織切片よりもはるかに薄いため、強い陽性対照染色を達成することは困難であった。他のグループは、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片のように調製できるリゾチーム溶液に対象の標的を混合しようとした（Ｆｏｗｌｅｒ，  Ｃ．Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ  ８７：８３６−８４６を参照されたい）。彼らは、ゲル形成がタンパク質濃度と等電点に依存することを指摘した（Ｆｏｗｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００７）  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ８７（８）：８３６−４６．）。しかしながら、このアプローチは、リゾチームゼラチンから漏れ出す可能性のあるペプチドなどの多くの標的では機能しなかった。アガロースはまた潜在的な組織の代替物として試験された。しかしながら、アガロースに分散したペプチドは均一ではなかった。加えて、これらのアガロースベースのペプチドゲルを、典型的には、アガロースを沸騰して融解させ、それをガラススライド上で分離させることを含む抗原賦活化に供した。
【０００９】
したがって、感度が高く、特異的で、適切な生物学的対照が存在しない標的を含む幅広い標的に適応できる、信頼できる陽性及び陰性のＩＨＣ対照を提供するアプローチが必要である。このようなアプローチは、多数の抗体をスクリーニングして目的の標的に特異的な新しい抗体を同定及び検証する場合、及びＩＨＣ染色プロトコールを最適化する場合に特に有利である、抗体の特異性を決定するための有用なアッセイも提供する。
【００１０】
特許出願、特許公開、非特許文献、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号を含む、本明細書で引用されている全ての参考文献は、あたかも各個別の参考文献が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、その全体が参照によりここに組み込まれる。
【発明の概要】
【００１１】
これらの要求及び他の要求を満たすために、本明細書では、固体の抗原／担体タンパク質ゲルを生成する方法が提供される。これらの固体のゲルは、標準のＩＨＣまたは電子顕微鏡（ＥＭ）処理方法（固定、薄切、抗原賦活化などを含む）に従って、組織試料または他の生体試料のように処理できる。ゲルは既知の量の目的の抗原を含んでいるため、例えば、特異的な抗体での染色を標準化するために、または目的の抗原を特異的に認識し、ＩＨＣ／ＥＭ分析に適している抗体をスクリーニングするために、既知の濃度の抗原を有する一連のゲルを作成するために使用できる。これらの方法は、既知の濃度の抗原を使用して複数のレベルの発現を模倣し、任意の目的の抗原の対照染色を可能とする一般的なプラットフォームを提供すると考えられる。
【００１２】
本開示の特定の態様は、（例えば、ＩＨＣまたはＥＭ分析のための）固体の抗原／担体タンパク質ゲルを生成する方法であって、（ａ）精製抗原をアルブミンタンパク質（例えば、血清アルブミンタンパク質）、卵白タンパク質、または卵白タンパク質の混合物、及びゼラチンからなる群から選択される担体タンパク質を含む液体溶液と混合して、抗原／担体タンパク質液体溶液を生成することと、（ｂ）抗原／担体タンパク質液体溶液を加熱して、固体の抗原／担体タンパク質ゲルを形成することと、を含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）精製抗原をアルブミンタンパク質（例えば、血清アルブミンタンパク質）、卵白タンパク質または卵白タンパク質の混合物、ゼラチン、及びポリリジンからなる群から選択される担体タンパク質を含む液体溶液と混合して、抗原／担体タンパク質液体溶液を生成することと、（ｂ）抗原／担体タンパク質液体溶液を加熱して、固体の抗原／担体タンパク質ゲルを形成することと、を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、（ｂ）の後に：固体の抗原／担体タンパク質ゲルを脱水することと、脱水した固体の抗原／担体タンパク質ゲルをパラフィンブロックに包埋することとをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、脱水された固体の抗原／担体タンパク質ゲルをパラフィンブロックに包埋した後に：抗原／担体タンパク質ゲルを含むコアをパラフィンブロックからレシピエント組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）ブロックに移すことをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、（ｂ）の後に：固体の抗原／担体タンパク質ゲルを液体包埋媒体中でインキュベートすることと、固体の抗原／担体タンパク質ゲルを包埋媒体中で凍結することとをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、（ｂ）の後に：固体の抗原／担体タンパク質ゲルをプラスチック樹脂中に包埋することをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、（ｂ）の後に：固体の抗原／担体タンパク質ゲルを、約３０ｎｍ〜約５０μｍの厚さを有する１つ以上の固体の抗原／担体タンパク質ゲルの切片に薄切することをさらに含む。いくつかの実施形態では、固体の抗原／担体タンパク質ゲルは、約２μｍ〜約３０μｍの厚さを有する１つ以上の固体の抗原／担体タンパク質ゲルの切片に薄切される。いくつかの実施形態では、固体の抗原／担体タンパク質ゲルは、約３０ｎｍ〜約１００ｎｍの厚さを有する１つ以上の固体の抗原／担体タンパク質ゲルの切片に薄切される。いくつかの実施形態では、この方法は、（ｂ）の前に、抗原／担体タンパク質液体溶液に固定剤を含めることをさらに含む。いくつかの実施形態では、固定剤はホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、抗原／担体タンパク質液体溶液は、少なくとも約１％の最終濃度でホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、固定剤はグルタルアルデヒド、Ｄａｖｉｄｓｏｎの固定剤、Ｂｏｕｉｎの固定剤、１／２強度のＫａｒｎｏｖｓｋｉの固定剤、または亜鉛塩を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、固体の抗原／担体タンパク質ゲルを抗原賦活化に供することをさらに含む。いくつかの実施形態では、固体の抗原／担体タンパク質ゲルを抗原賦活化に供することは、固体の抗原／担体タンパク質ゲルを液体溶液中で加熱することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、：（ｂ）の前に、固定剤を抗原／担体タンパク質液体溶液に含めること；（ｂ）の後に、固体の抗原／担体タンパク質ゲルを脱水することと；脱水した固体の抗原／担体タンパク質ゲルをパラフィンブロックに包埋することと；抗原／担体タンパク質ゲルに包埋されたパラフィンブロックを、約３０ｎｍ〜約５０μｍの厚さを有する１つ以上の切片に薄切することと；包埋された固体の抗原／担体タンパク質ゲルの１つ以上の切片を抗原賦活化に供することと；抗原賦活化の後、包埋された固体の抗原／担体タンパク質ゲルの１つ以上の切片をブロッキングすることと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は：（ｂ）の後、固体の抗原／担体タンパク質ゲルを液体包埋媒体中でインキュベートすることと；包埋媒体中で固体の抗原／担体タンパク質ゲルを凍結することと；凍結した抗原／担体タンパク質ゲルを、約３０ｎｍ〜約５０μｍの厚さを有する１つ以上の切片に薄切することと；凍結した抗原／担体タンパク質ゲルの１つ以上の切片をブロッキングすることと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、抗原はポリペプチド抗原である。いくつかの実施形態では、抗原はＮ末端チロシン、Ｃ末端システイン、またはその両方を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、（ｂ）の前に、システイン反応性試薬を使用して抗原を担体タンパク質（例えば、アルブミンタンパク質、卵白タンパク質もしくは卵白タンパク質の混合物、またはゼラチン）と架橋することをさらに含む。いくつかの実施形態では、抗原は非ポリペプチド抗原を含む。いくつかの実施形態では、担体タンパク質は、ウシ、ヤギ、ウマ、またはヒトの血清アルブミンなどのアルブミンタンパク質である。いくつかの実施形態では、担体タンパク質は卵白タンパク質または卵白タンパク質の混合物である。いくつかの実施形態では、（ａ）で生成された抗原／担体タンパク質液体溶液は、２％（ｗ／ｖ）以上の濃度の担体タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、（ａ）で生成された抗原／担体タンパク質液体溶液は、約２５％（ｗ／ｖ）以下の最終濃度の担体タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、担体タンパク質はゼラチンであり、方法は、（ｂ）の後に、加熱された抗原／担体タンパク質液体溶液を冷却して固体の抗原／担体タンパク質ゲルを形成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、加熱された抗原／担体タンパク質液体溶液を冷却した後、固体の抗原／担体タンパク質ゲルを固定剤と共にインキュベートして、固定された抗原／担体タンパク質ゲルを形成することと、固定された抗原／担体タンパク質ゲルを脱水することと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、（ａ）で生成された抗原／担体タンパク質液体溶液は、約０．５％（ｗ／ｖ）以上の濃度の担体タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、抗原／担体タンパク質溶液が（ｂ）において少なくとも約６５℃に加熱される。いくつかの実施形態では、抗原／担体タンパク質溶液が（ｂ）において少なくとも約６５℃に少なくとも６分間加熱される。いくつかの実施形態では、ポリリジンは（ａ）において生成され��抗原／担体タンパク質溶液中に約１４ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。
【００１３】
本明細書でさらに提供されるのは、上述の実施形態のいずれか１つによる方法によって生成された固体の抗原／担体タンパク質ゲルである。
【００１４】
本明細書でさらに提供されるのは、上述の実施形態のいずれか１つによる方法によって生成された少なくとも第１の固体の抗原／担体タンパク質ゲル及び上述の実施形態のいずれか１つによる方法によって生成された第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルを含む組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）である。
【００１５】
本開示の特定の態様は、抗原の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色の方法であって、上述の実施形態のいずれか１つの方法によって生成された固体の抗原／担体タンパク質ゲルを提供することであって、固体の抗原／担体タンパク質ゲルが抗原を含む、提供することと；試料を提供することと；固体の抗原／担体タンパク質ゲル及び試料を、抗原に特異的に結合する一次抗体と接触させることと；固体の抗原／担体タンパク質ゲル及び試料を一次抗体と接触させた後、固体の抗原／担体タンパク質ゲル及び試料を一次抗体に特異的に結合する二次抗体と接触させることであって、検出可能な部分が二次抗体にコンジュゲートされている、接触させることと；固体の抗原／担体タンパク質ゲルからの検出可能な部分のシグナルを検出することと；試料からの検出可能な部分のシグナルを検出することと、を含み、固体の抗原／担体タンパク質ゲルから検出されたシグナルと比較した試料のシグナルの検出は、試料中の抗原の存在を示す、方法に関する。いくつかの実施形態では、検出可能な部分は酵素を含み、検出可能な部分のシグナルを検出することは、検出可能な部分を酵素の発色性、蛍光性、または化学発光性の基質に曝露することと、酵素との反応時の基質からのシグナルを検出することと、を含む。いくつかの実施形態では、検出可能な部分は、フルオロフォア、金属粒子、金属イオン、放射性同位元素、核酸、電気化学発光レポーター、または「量子ドット」（固体、半導体または炭素ベースの蛍光ナノ粒子）を含む。いくつかの実施形態では、試料は組織試料である。
【００１６】
本開示の特定の態様は、対照の抗原の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色の方法であって、第１及び第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルを提供することであって、第１及び第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルのそれぞれは、上述の実施形態のいずれか１つの方法によって生成され、第１の固体の抗原／担体タンパク質ゲルは、第１の濃度で抗原を含み、第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルは、第１の濃度より高い第２の濃度で抗原を含む、提供することと；第１及び第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルを、抗原に特異的に結合する一次抗体と接触させることと；第１及び第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルを一次抗体と接触させた後、第１及び第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルを、一次抗体に特異的に結合する二次抗体と接触させることであって、検出可能な部分が二次抗体にコンジュゲートされている、接触させることと；第１の固体の抗原／担体タンパク質ゲルからの検出可能な部分の第１のシグナルを検出することと；第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルからの検出可能な部分の第２のシグナルを検出することと、を含み、第１のシグナルよりも大きい第２のシグナルの検出は、対照の抗原のＩＨＣ染色を示す、方法に関する。いくつかの実施形態では、検出可能な部分は酵素を含み、検出可能な部分のシグナルを検出することは、検出可能な部分を酵素の発色性、蛍光性、または化学発光性の基質に曝露することと、酵素との反応時の基質からのシグナルを検出することと、を含む。いくつかの実施形態では、検出可能な部分は、フルオロフォア、金属粒子、金属イオン、放射性同位元素、核酸、電気化学発光レポーター、または「量子ドット」（固体、半導体または炭素ベースの蛍光ナノ粒子）を含む。いくつかの実施形態では、第１の濃度が０ｎＭであり、第１のシグナルの欠如の検出は、対照の抗原のＩＨＣ染色を示す。いくつかの実施形態では、この方法は、試料を提供することと；試料を一次抗体と接触させることと；試料を一次抗体と接触させた後に、試料を二次抗体と接触させることであって、検出可能な部分が二次抗体にコンジュゲートされている、接触させることと；試料からの検出可能な部分の第３のシグナルを検出することと；第３のシグナルを第１及び第２のシグナルと比較することと、をさらに含み、第１及び第２のシグナルの量と比較した第３のシグナルの量は、第１及び第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲル中の抗原の量に対する試料中の抗原の存在量を示す。
【００１７】
本開示の特定の態様は、対照の二次抗体による免疫組織化学（ＩＨＣ）染色の方法であって、第１及び第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルを提供することであって、第１及び第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルのそれぞれは、上述の実施形態のいずれか１つの方法によって生成され、第１の固体の抗原／担体タンパク質ゲルは、第１のアイソタイプを有する第１の抗体を含み、第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルは、第１のアイソタイプとは異なる第２のアイソタイプを有する第２の抗体を含む、提供することと；第１及び第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルを、第１のアイソタイプに特異的に結合する二次抗体と接触させることであって、検出可能な部分が二次抗体にコンジュゲートされている、接触させることと；第１の固体の抗原／担体タンパク質ゲルからの検出可能な部分のシグナルを検出することと；第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルからの検出可能な部分のシグナルの欠如を検出することと、を含み、第１の固体の抗原／担体タンパク質ゲルに関連するシグナルの検出及び第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルに関連するシグナルの欠如が、二次抗体による対照の染色を示す、方法に関する。いくつかの実施形態では、検出可能な部分は酵素を含み、検出可能な部分のシグナルを検出することは、検出可能な部分を酵素の発色性、蛍光性、または化学発光性の基質に曝露することと、酵素との反応時の基質からのシグナルを検出することと、を含む。いくつかの実施形態では、検出可能な部分は、フルオロフォア、金属粒子、金属イオン、放射性同位元素、核酸、電気化学発光レポーター、または「量子ドット」（固体、半導体または炭素ベースの蛍光ナノ粒子）を含む。
【００１８】
本開示の特定の態様は、アルブミンタンパク質（例えば、血清アルブミンタンパク質）、卵白タンパク質または卵白タンパク質の混合物、及びゼラチンからなる群から選択される担体タンパク質に架橋された精製抗原を含む、（例えば、免疫組織化学（ＩＨＣ）染色のための）固体の抗原／担体タンパク質ゲルに関する。いくつかの実施形態では、アルブミンタンパク質（例えば、血清アルブミンタンパク質）、卵白タンパク質または卵白タンパク質の混合物、ゼラチン、及びポリリジンからなる群から選択される担体タンパク質に架橋された精製抗原を含む、（例えば、免疫組織化学（ＩＨＣ）染色のための）固体の抗原／担体タンパク質ゲルに関する。いくつかの実施形態では、固体のゲルは約３０ｎｍ〜約５０μｍの厚さを有する。いくつかの実施形態では、固体のゲルは約２μｍ〜約３０μｍの厚さを有する。いくつかの実施形態では、固体のゲルは約３０ｎｍ〜約１００ｎｍの厚さを有する。いくつかの実施形態では、固体のゲルは包埋媒体中で凍結される。いくつかの実施形態では、固体のゲルはパラフィンに包埋されている。いくつかの実施形態では、固体のゲルはプラスチック樹脂に包埋されている。いくつかの実施形態では、固体のゲルは固体基板に固定されている。いくつかの実施形態では、固体のゲルは固定剤中で固定されている。いくつかの実施形態では、固定剤はホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、固定剤は、少なくとも約１％の濃度でホルムアルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、固定剤はグルタルアルデヒド、Ｄａｖｉｄｓｏｎの固定剤、Ｂｏｕｉｎの固定剤、１／２強度のＫａｒｎｏｖｓｋｉの固定剤、または亜鉛塩を含む。いくつかの実施形態では、固体のゲルは抗原賦活化に供されている。いくつかの実施形態では、抗原はポリペプチド抗原である。いくつかの実施形態では、抗原はＮ末端チロシン、Ｃ末端システイン、またはその両方を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ末端チロシン及び／またはＣ末端システインは、担体タンパク質に架橋されている。いくつかの実施形態では、抗原は非ポリペプチド抗原を含む。いくつかの実施形態では、担体タンパク質は、ウシ、ヤギ、ウマ、またはヒトの血清アルブミンなどのアルブミンタンパク質である。いくつかの実施形態では、担体タンパク質は卵白タンパク質または卵白タンパク質の混合物である。いくつかの実施形態では、固体のゲルは２％以上の濃度で担体タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、固体のゲルは約２５％以下の濃度で担体タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、担体タンパク質はゼラチンである。いくつかの実施形態では、固体のゲルは０．５％以上の濃度で担体タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、固体のゲルは少なくとも約２５ｎＭの濃度で抗原を含む。いくつかの実施形態では、固体のゲルは約１４ｍｇ／ｍＬの濃度のポリリジンを含む。
【００１９】
本開示の特定の態様は、少なくとも第１及び第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルを含む組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）に関し、第１及び第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルは両方とも、アルブミンタンパク質、卵白タンパク質または卵白タンパク質の混合物、及びゼラチンからなる群から選択される担体タンパク質に架橋された精製抗原を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも第１及び第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルを含む組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）に関し、第１及び第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルは両方とも、アルブミンタンパク質、卵白タンパク質または卵白タンパク質の混合物、ゼラチン、及びポリリジンからなる群から選択される担体タンパク質に架橋された精製抗原を含む。いくつかの実施形態では、第１の固体の抗原／担体タンパク質ゲルは第１の精製抗原を含み、第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルは第１の精製抗原とは異なる第２の精製抗原を含む。いくつかの実施形態では、第１の固体の抗原／担体タンパク質ゲルは第１の濃度で第１の精製抗原を含み、第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルは第１の濃度とは異なる第２の濃度で第１の精製抗原を含む。
【００２０】
本開示の特定の態様は、抗原の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色の方法であって、上述の実施形態のいずれか１つによる固体の抗原／担体タンパク質ゲルを提供することであって、固体の抗原／担体タンパク質ゲルが抗原を含む、提供することと；試料を提供することと；固体の抗原／担体タンパク質ゲル及び試料を、抗原に特異的に結合する一次抗体と接触させることと；固体の抗原／担体タンパク質ゲル及び試料を一次抗体と接触させた後、固体の抗原／担体タンパク質ゲル及び試料を一次抗体に特異的に結合する二次抗体と接触させることであって、検出可能な部分が二次抗体にコンジュゲートされている、接触させることと；固体の抗原／担体タンパク質ゲルからの検出可能な部分のシグナルを検出することと；試料からの検出可能な部分のシグナルを検出することと、を含み、固体の抗原／担体タンパク質ゲルから検出されたシグナルと比較した試料のシグナルの検出は、試料中の抗原の存在を示す、方法に関する。いくつかの実施形態では、検出可能な部分は酵素を含み、検出可能な部分のシグナルを検出することは、検出可能な部分を酵素の発色性、蛍光性、または化学発光性の基質に曝露することと、酵素との反応時の基質からのシグナルを検出することと、を含む。いくつかの実施形態では、検出可能な部分は、フルオロフォア、金属粒子、金属イオン、放射性同位元素、核酸、電気化学発光レポーター、または「量子ドット」（固体、半導体または炭素ベースの蛍光ナノ粒子）を含む。いくつかの実施形態では、試料は組織試料である。
【００２１】
本開示の特定の態様は、対照の抗原の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色の方法であって、上述の実施形態のいずれか１つの方法による第１及び第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルを提供することであって、第１の固体の抗原／担体タンパク質ゲルは、第１の濃度で抗原を含み、第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルは、第１の濃度より高い第２の濃度で抗原を含む、提供することと；第１及び第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルを、抗原に特異的に結合する一次抗体と接触させることと；第１及び第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルを一次抗体と接触させた後、第１及び第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルを、一次抗体に特異的に結合する二次抗体と接触させることであって、検出可能な部分が二次抗体にコンジュゲートされている、接触させることと；第１の固体の抗原／担体タンパク質ゲルからの検出可能な部分の第１のシグナルを検出することと；第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルからの検出可能な部分の第２のシグナルを検出することと、を含み、第１のシグナルよりも大きい第２のシグナルの検出は、対照の抗原のＩＨＣ染色を示す、方法に関する。いくつかの実施形態では、検出可能な部分は酵素を含み、検出可能な部分のシグナルを検出することは、検出可能な部分を酵素の発色性、蛍光性、または化学発光性の基質に曝露することと、酵素との反応時の基質からのシグナルを検出することと、を含む。いくつかの実施形態では、検出可能な部分は、フルオロフォア、金属粒子、金属イオン、放射性同位元素、核酸、電気化学発光レポーター、または「量子ドット」（固体、半導体または炭素ベースの蛍光ナノ粒子）を含む。いくつかの実施形態では、第１の濃度が０ｎＭであり、第１のシグナルの欠如の検出は、対照の抗原のＩＨＣ染色を示す。いくつかの実施形態では、この方法は、試料を提供することと；試料を一次抗体と接触させることと；試料を一次抗体と接触させた後に、試料を二次抗体と接触させることと；試料からの検出可能な部分の第３のシグナルを検出することと；第３のシグナルを第１及び第２のシグナルと比較することと、をさらに含み、第１及び第２のシグナルの量と比較した第３のシグナルの量は、第１及び第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲル中の抗原の量に対する試料中の抗原の存在量を示す。
【００２２】
本開示の特定の態様は、対照の二次抗体による免疫組織化学（ＩＨＣ）染色の方法であって、上述の実施形態のいずれか１つによる第１及び第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルを提供することであって、第１の固体の抗原／担体タンパク質ゲルは、第１のアイソタイプを有する第１の抗体を含み、第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルは、第１のアイソタイプとは異なる第２のアイソタイプを有する第２の抗体を含む、提供することと；第１及び第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルを、第１のアイソタイプに特異的に結合する二次抗体と接触させることであって、検出可能な部分が二次抗体にコンジュゲートされている、接触させることと；第１の固体の抗原／担体タンパク質ゲルからの検出可能な部分のシグナルを検出することと；第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルからの検出可能な部分のシグナルの欠如を検出することと、を含み、第１の固体の抗原／担体タンパク質ゲルに関連するシグナルの検出及び第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルに関連するシグナルの欠如が、対照の二次抗体による染色を示す、方法に関する。いくつかの実施形態では、検出可能な部分は酵素を含み、検出可能な部分のシグナルを検出することは、検出可能な部分を酵素の発色性、蛍光性、または化学発光性の基質に曝露することと、酵素との反応時の基質からのシグナルを検出することと、を含む。いくつかの実施形態では、検出可能な部分は、フルオロフォア、金属粒子、金属イオン、放射性同位元素、核酸、電気化学発光レポーター、または「量子ドット」（固体、半導体または炭素ベースの蛍光ナノ粒子）を含む。
【００２３】
本開示の特定の態様は、（例えば、対照の抗原の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色のための）キットであって、アルブミンタンパク質（例えば、血清アルブミンタンパク質）、卵白タンパク質または卵白タンパク質の混合物、及びゼラチンからなる群から選択される担体タンパク質に架橋された精製抗原を含む第１の固体のゲルであって、精製抗原が、第１の濃度で第１の固体のゲルに存在する第１の固体のゲルと、担体タンパク質に架橋された精製抗原を含む第２の固体のゲルであって、精製抗原が、第１の濃度とは異なる第２の濃度で第２の固体のゲルに存在する第１の固体のゲルと、を含む、キットに関する。いくつかの実施形態では、このキットは、アルブミンタンパク質（例えば、血清アルブミンタンパク質）、卵白タンパク質または卵白タンパク質の混合物、ゼラチン、及びポリリジンからなる群から選択される担体タンパク質に架橋された精製抗原を含む第１の固体のゲルであって、精製抗原が、第１の濃度で第１の固体のゲルに存在する第１の固体のゲルと、担体タンパク質に架橋された精製抗原を含む第２の固体のゲルであって、精製抗原が、第１の濃度とは異なる第２の濃度で第２の固体のゲルに存在する第１の固体のゲルと、を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２の固体のゲルはそれぞれ約３０ｎｍ〜約５０μｍの厚さに薄切される。いくつかの実施形態では、第１及び第２の固体のゲルは、１つ以上の固体基板に固定される。いくつかの実施形態では、キットは、担体タンパク質を含む第３の固体のゲルをさらに含み、第３の固体のゲルは精製抗原を含まない。いくつかの実施形態では、第３の固体のゲルは、約３０ｎｍ〜約５０μｍの厚さに薄切される。いくつかの実施形態では、第３の固体のゲルは固体基板に固定されている。
【００２４】
本明細書に記載の様々な実施形態の特性の１つ、いくつか、または全てを組み合わせて、本発明の他の実施形態を形成できることを理解されたい。本発明のこれら及び他の態様は、当業者に明らかになるであろう。本発明のこれら及び他の実施形態は、以下の詳細な説明によってさらに説明される。
【００２５】
特許または出願ファイルは、カラーで作成される少なくとも１つの図面を含む。カラー図面（複数可）を含むこの特許または特許出願公開のコピーは、請求及び必要な手数料の支払いにより庁によって提供されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】組織試料から得られたスライドを用いるＩＨＣ染色の例示的なワークフローを示す。
【図２−１】図２Ａは、１．５ｍＬマイクロ遠心チューブ中で作成され、そこから取り出されたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）ゲルを示す。図２Ｂ及び２Ｃは、１．５ｍＬマイクロ遠心チューブ中で作成され、そこから取り出されたＢＳＡゲルの切片の様々な図を示す。図２Ｄは、脱水及びパラフィン処理のためにスライスしたゲル部分を示す。図２Ｅは、パラフィン「ドナーブロック」に包埋されたスライスされたゲル部分を示す。スケールバー：１ｃｍ図２Ｆは、は、様々なパラフィンゲルドナーブロックから作成された組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を示す。最も暗いコアは、黒と緑の顔料を含む方向の参照である。
【図２−２】図２Ａは、１．５ｍＬマイクロ遠心チューブ中で作成され、そこから取り出されたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）ゲルを示す。図２Ｂ及び２Ｃは、１．５ｍＬマイクロ遠心チューブ中で作成され、そこから取り出されたＢＳＡゲルの切片の様々な図を示す。図２Ｄは、脱水及びパラフィン処理のためにスライスしたゲル部分を示す。図２Ｅは、パラフィン「ドナーブロック」に包埋されたスライスされたゲル部分を示す。スケールバー：１ｃｍ図２Ｆは、は、様々なパラフィンゲルドナーブロックから作成された組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を示す。最も暗いコアは、黒と緑の顔料を含む方向の参照である。
【図３−１】図３Ａは、パラフィンブロックに包埋された４ミクロン厚のＢＣＬ２ペプチド／ＢＳＡゲルシリンダーの切片のＩＨＣ染色の結果を示す。挿入図は、（左から右に向かって）ペプチドを含まないものから、５×１０−５ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−８Ｍ）のＢＣＬ２ペプチド、５×１０−４ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−７Ｍ）のＢＣＬ２ペプチド、５×１０−３ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−６Ｍ）のＢＣＬ２ペプチド、５×１０−２ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−５Ｍ）のＢＣＬ２ペプチド、または０．５ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−４Ｍ）のＢＣＬ２ペプチドを含む、ＢＣＬ２ペプチド／ＢＳＡゲルから得られた切片を用いる、ＢＣＬ２のＩＨＣ染色の４０倍の倍率を示す。０、１＋、２＋、または３＋（０〜３＋の定性的スケール）に対応する切片のＢＣＬ２染色にラベルを付す。図３Ｂは、図３Ａに示す切片を光学密度（ＯＤ）対ＢＣＬ２ペプチド濃度について分析する６つの独立した実験の結果を示す。図３Ｃは、図３Ａに示す切片を画像強度対ＢＣＬ２ペプチド濃度について分析する６つの独立した実験の結果を示す。図３Ｄ及び３Ｅは、パラフィンブロックに包埋され、抗ＢＣＬ２一次抗体で染色され、蛍光レポーターで検出されたＢＣＬ２ペプチド／ＢＳＡゲルシリンダーの４ミクロン厚の切片の定量的免疫蛍光（ＩＦ）染色の結果を示す（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＯｍｎｉＭＡＰ抗マウスＨＲＰ検出システム、続いてＶｅｎｔａｎａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒｅｄ  ６１０検出システムを使用）。試験試料には、野生型（変異していない）ＢＣＬ２ペプチド、６つの異なる単一アミノ酸置換を含むＢＣＬ２ペプチド、及びＭＣＬ１タンパク質からのペプチド（抗ＢＣＬ２抗体との結合が予想されない陰性対照試料）が含まれる。図３Ｄはレポーターの赤い蛍光を示す。図３Ｅは、ＤＡＰＩフィルターチャネルでイメージングされた同一のＴＭＡの蛍光を示す（ＢＳＡコアの青色の自己蛍光を検出する）。図３Ｆ及び３Ｇは、ナイーブ対照一次抗体で染色された、パラフィンブロックに包埋されたＢＣＬ２ペプチド／ＢＳＡゲルシリンダーの４ミクロン厚の切片の定量的免疫蛍光（ＩＦ）染色の結果を示す。図３Ｆは、レポーターの蛍光を示す。図３Ｇは、ＤＡＰＩフィルターチャネルでイメージングされた同一のＴＭＡの蛍光を示す（ＢＳＡコアの自己蛍光を検出する）。図３Ｈは、図３Ｄに示した結果の定量化を示す（平均光学エミッタンスとして報告）。野生型ＢＣＬ２ペプチドは、各濃度で最も強いシグナルを示し；陰性対照のＭＣＬ１ペプチドは、予想通り、最小のシグナルを示す。単一のアミノ酸置換を含む６つのＢＣＬ２ペプチドは、一般に野生型ＢＣＬ２と陰性対照ＭＣＬ１ペプチドの中間にある可変的なシグナルを示す。図３Ｉは、図３Ｆに示した結果の定量化を示す（平均光学エミッタンスとして報告）。ナイーブ対照抗体は、予想通り、ほとんど検出できないシグナルを示す。図３Ｊは、図３Ｄに示した結果の定量化を示す（平均シグナル強度として報告）。野生型ＢＣＬ２ペプチドは、各濃度で最も強いシグナルを示し；陰性対照のＭＣＬ１ペプチドは、予想通り、最小のシグナルを示す。単一のアミノ酸置換を含む６つのＢＣＬ２ペプチドは、一般に野生型ＢＣＬ２と陰性対照Ｍ���Ｌ１ペプチドの中間にある可変的なシグナルを示す。図３Ｋは、図３Ｆに示した結果の定量化を示す（平均シグナル強度として報告）。ナイーブ対照抗体は、予想通り、ほとんど検出できないシグナルを示す。
【図３−２】図３Ａは、パラフィンブロックに包埋された４ミクロン厚のＢＣＬ２ペプチド／ＢＳＡゲルシリンダーの切片のＩＨＣ染色の結果を示す。挿入図は、（左から右に向かって）ペプチドを含まないものから、５×１０−５ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−８Ｍ）のＢＣＬ２ペプチド、５×１０−４ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−７Ｍ）のＢＣＬ２ペプチド、５×１０−３ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−６Ｍ）のＢＣＬ２ペプチド、５×１０−２ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−５Ｍ）のＢＣＬ２ペプチド、または０．５ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−４Ｍ）のＢＣＬ２ペプチドを含む、ＢＣＬ２ペプチド／ＢＳＡゲルから得られた切片を用いる、ＢＣＬ２のＩＨＣ染色の４０倍の倍率を示す。０、１＋、２＋、または３＋（０〜３＋の定性的スケール）に対応する切片のＢＣＬ２染色にラベルを付す。図３Ｂは、図３Ａに示す切片を光学密度（ＯＤ）対ＢＣＬ２ペプチド濃度について分析する６つの独立した実験の結果を示す。図３Ｃは、図３Ａに示す切片を画像強度対ＢＣＬ２ペプチド濃度について分析する６つの独立した実験の結果を示す。図３Ｄ及び３Ｅは、パラフィンブロックに包埋され、抗ＢＣＬ２一次抗体で染色され、蛍光レポーターで検出されたＢＣＬ２ペプチド／ＢＳＡゲルシリンダーの４ミクロン厚の切片の定量的免疫蛍光（ＩＦ）染色の結果を示す（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＯｍｎｉＭＡＰ抗マウスＨＲＰ検出システム、続いてＶｅｎｔａｎａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒｅｄ  ６１０検出システムを使用）。試験試料には、野生型（変異していない）ＢＣＬ２ペプチド、６つの異なる単一アミノ酸置換を含むＢＣＬ２ペプチド、及びＭＣＬ１タンパク質からのペプチド（抗ＢＣＬ２抗体との結合が予想されない陰性対照試料）が含まれる。図３Ｄはレポーターの赤い蛍光を示す。図３Ｅは、ＤＡＰＩフィルターチャネルでイメージングされた同一のＴＭＡの蛍光を示す（ＢＳＡコアの青色の自己蛍光を検出する）。図３Ｆ及び３Ｇは、ナイーブ対照一次抗体で染色された、パラフィンブロックに包埋されたＢＣＬ２ペプチド／ＢＳＡゲルシリンダーの４ミクロン厚の切片の定量的免疫蛍光（ＩＦ）染色の結果を示す。図３Ｆは、レポーターの蛍光を示す。図３Ｇは、ＤＡＰＩフィルターチャネルでイメージングされた同一のＴＭＡの蛍光を示す（ＢＳＡコアの自己蛍光を検出する）。図３Ｈは、図３Ｄに示した結果の定量化を示す（平均光学エミッタンスとして報告）。野生型ＢＣＬ２ペプチドは、各濃度で最も強いシグナルを示し；陰性対照のＭＣＬ１ペプチドは、予想通り、最小のシグナルを示す。単一のアミノ酸置換を含む６つのＢＣＬ２ペプチドは、一般に野生型ＢＣＬ２と陰性対照ＭＣＬ１ペプチドの中間にある可変的なシグナルを示す。図３Ｉは、図３Ｆに示した結果の定量化を示す（平均光学エミッタンスとして報告）。ナイーブ対照抗体は、予想通り、ほとんど検出できないシグナルを示す。図３Ｊは、図３Ｄに示した結果の定量化を示す（平均シグナル強度として報告）。野生型ＢＣＬ２ペプチドは、各濃度で最も強いシグナルを示し；陰性対照のＭＣＬ１ペプチドは、予想通り、最小のシグナルを示す。単一のアミノ酸置換を含む６つのＢＣＬ２ペプチドは、一般に野生型ＢＣＬ２と陰性対照Ｍ���Ｌ１ペプチドの中間にある可変的なシグナルを示す。図３Ｋは、図３Ｆに示した結果の定量化を示す（平均シグナル強度として報告）。ナイーブ対照抗体は、予想通り、ほとんど検出できないシグナルを示す。
【図３−３】図３Ａは、パラフィンブロックに包埋された４ミクロン厚のＢＣＬ２ペプチド／ＢＳＡゲルシリンダーの切片のＩＨＣ染色の結果を示す。挿入図は、（左から右に向かって）ペプチドを含まないものから、５×１０−５ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−８Ｍ）のＢＣＬ２ペプチド、５×１０−４ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−７Ｍ）のＢＣＬ２ペプチド、５×１０−３ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−６Ｍ）のＢＣＬ２ペプチド、５×１０−２ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−５Ｍ）のＢＣＬ２ペプチド、または０．５ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−４Ｍ）のＢＣＬ２ペプチドを含む、ＢＣＬ２ペプチド／ＢＳＡゲルから得られた切片を用いる、ＢＣＬ２のＩＨＣ染色の４０倍の倍率を示す。０、１＋、２＋、または３＋（０〜３＋の定性的スケール）に対応する切片のＢＣＬ２染色にラベルを付す。図３Ｂは、図３Ａに示す切片を光学密度（ＯＤ）対ＢＣＬ２ペプチド濃度について分析する６つの独立した実験の結果を示す。図３Ｃは、図３Ａに示す切片を画像強度対ＢＣＬ２ペプチド濃度について分析する６つの独立した実験の結果を示す。図３Ｄ及び３Ｅは、パラフィンブロックに包埋され、抗ＢＣＬ２一次抗体で染色され、蛍光レポーターで検出されたＢＣＬ２ペプチド／ＢＳＡゲルシリンダーの４ミクロン厚の切片の定量的免疫蛍光（ＩＦ）染色の結果を示す（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＯｍｎｉＭＡＰ抗マウスＨＲＰ検出システム、続いてＶｅｎｔａｎａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒｅｄ  ６１０検出システムを使用）。試験試料には、野生型（変異していない）ＢＣＬ２ペプチド、６つの異なる単一アミノ酸置換を含むＢＣＬ２ペプチド、及びＭＣＬ１タンパク質からのペプチド（抗ＢＣＬ２抗体との結合が予想されない陰性対照試料）が含まれる。図３Ｄはレポーターの赤い蛍光を示す。図３Ｅは、ＤＡＰＩフィルターチャネルでイメージングされた同一のＴＭＡの蛍光を示す（ＢＳＡコアの青色の自己蛍光を検出する）。図３Ｆ及び３Ｇは、ナイーブ対照一次抗体で染色された、パラフィンブロックに包埋されたＢＣＬ２ペプチド／ＢＳＡゲルシリンダーの４ミクロン厚の切片の定量的免疫蛍光（ＩＦ）染色の結果を示す。図３Ｆは、レポーターの蛍光を示す。図３Ｇは、ＤＡＰＩフィルターチャネルでイメージングされた同一のＴＭＡの蛍光を示す（ＢＳＡコアの自己蛍光を検出する）。図３Ｈは、図３Ｄに示した結果の定量化を示す（平均光学エミッタンスとして報告）。野生型ＢＣＬ２ペプチドは、各濃度で最も強いシグナルを示し；陰性対照のＭＣＬ１ペプチドは、予想通り、最小のシグナルを示す。単一のアミノ酸置換を含む６つのＢＣＬ２ペプチドは、一般に野生型ＢＣＬ２と陰性対照ＭＣＬ１ペプチドの中間にある可変的なシグナルを示す。図３Ｉは、図３Ｆに示した結果の定量化を示す（平均光学エミッタンスとして報告）。ナイーブ対照抗体は、予想通り、ほとんど検出できないシグナルを示す。図３Ｊは、図３Ｄに示した結果の定量化を示す（平均シグナル強度として報告）。野生型ＢＣＬ２ペプチドは、各濃度で最も強いシグナルを示し；陰性対照のＭＣＬ１ペプチドは、予想通り、最小のシグナルを示す。単一のアミノ酸置換を含む６つのＢＣＬ２ペプチドは、一般に野生型ＢＣＬ２と陰性対照Ｍ���Ｌ１ペプチドの中間にある可変的なシグナルを示す。図３Ｋは、図３Ｆに示した結果の定量化を示す（平均シグナル強度として報告）。ナイーブ対照抗体は、予想通り、ほとんど検出できないシグナルを示す。
【図３−４】図３Ａは、パラフィンブロックに包埋された４ミクロン厚のＢＣＬ２ペプチド／ＢＳＡゲルシリンダーの切片のＩＨＣ染色の結果を示す。挿入図は、（左から右に向かって）ペプチドを含まないものから、５×１０−５ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−８Ｍ）のＢＣＬ２ペプチド、５×１０−４ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−７Ｍ）のＢＣＬ２ペプチド、５×１０−３ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−６Ｍ）のＢＣＬ２ペプチド、５×１０−２ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−５Ｍ）のＢＣＬ２ペプチド、または０．５ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−４Ｍ）のＢＣＬ２ペプチドを含む、ＢＣＬ２ペプチド／ＢＳＡゲルから得られた切片を用いる、ＢＣＬ２のＩＨＣ染色の４０倍の倍率を示す。０、１＋、２＋、または３＋（０〜３＋の定性的スケール）に対応する切片のＢＣＬ２染色にラベルを付す。図３Ｂは、図３Ａに示す切片を光学密度（ＯＤ）対ＢＣＬ２ペプチド濃度について分析する６つの独立した実験の結果を示す。図３Ｃは、図３Ａに示す切片を画像強度対ＢＣＬ２ペプチド濃度について分析する６つの独立した実験の結果を示す。図３Ｄ及び３Ｅは、パラフィンブロックに包埋され、抗ＢＣＬ２一次抗体で染色され、蛍光レポーターで検出されたＢＣＬ２ペプチド／ＢＳＡゲルシリンダーの４ミクロン厚の切片の定量的免疫蛍光（ＩＦ）染色の結果を示す（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＯｍｎｉＭＡＰ抗マウスＨＲＰ検出システム、続いてＶｅｎｔａｎａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒｅｄ  ６１０検出システムを使用）。試験試料には、野生型（変異していない）ＢＣＬ２ペプチド、６つの異なる単一アミノ酸置換を含むＢＣＬ２ペプチド、及びＭＣＬ１タンパク質からのペプチド（抗ＢＣＬ２抗体との結合が予想されない陰性対照試料）が含まれる。図３Ｄはレポーターの赤い蛍光を示す。図３Ｅは、ＤＡＰＩフィルターチャネルでイメージングされた同一のＴＭＡの蛍光を示す（ＢＳＡコアの青色の自己蛍光を検出する）。図３Ｆ及び３Ｇは、ナイーブ対照一次抗体で染色された、パラフィンブロックに包埋されたＢＣＬ２ペプチド／ＢＳＡゲルシリンダーの４ミクロン厚の切片の定量的免疫蛍光（ＩＦ）染色の結果を示す。図３Ｆは、レポーターの蛍光を示す。図３Ｇは、ＤＡＰＩフィルターチャネルでイメージングされた同一のＴＭＡの蛍光を示す（ＢＳＡコアの自己蛍光を検出する）。図３Ｈは、図３Ｄに示した結果の定量化を示す（平均光学エミッタンスとして報告）。野生型ＢＣＬ２ペプチドは、各濃度で最も強いシグナルを示し；陰性対照のＭＣＬ１ペプチドは、予想通り、最小のシグナルを示す。単一のアミノ酸置換を含む６つのＢＣＬ２ペプチドは、一般に野生型ＢＣＬ２と陰性対照ＭＣＬ１ペプチドの中間にある可変的なシグナルを示す。図３Ｉは、図３Ｆに示した結果の定量化を示す（平均光学エミッタンスとして報告）。ナイーブ対照抗体は、予想通り、ほとんど検出できないシグナルを示す。図３Ｊは、図３Ｄに示した結果の定量化を示す（平均シグナル強度として報告）。野生型ＢＣＬ２ペプチドは、各濃度で最も強いシグナルを示し；陰性対照のＭＣＬ１ペプチドは、予想通り、最小のシグナルを示す。単一のアミノ酸置換を含む６つのＢＣＬ２ペプチドは、一般に野生型ＢＣＬ２と陰性対照Ｍ���Ｌ１ペプチドの中間にある可変的なシグナルを示す。図３Ｋは、図３Ｆに示した結果の定量化を示す（平均シグナル強度として報告）。ナイーブ対照抗体は、予想通り、ほとんど検出できないシグナルを示す。
【図３−５】図３Ａは、パラフィンブロックに包埋された４ミクロン厚のＢＣＬ２ペプチド／ＢＳＡゲルシリンダーの切片のＩＨＣ染色の結果を示す。挿入図は、（左から右に向かって）ペプチドを含まないものから、５×１０−５ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−８Ｍ）のＢＣＬ２ペプチド、５×１０−４ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−７Ｍ）のＢＣＬ２ペプチド、５×１０−３ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−６Ｍ）のＢＣＬ２ペプチド、５×１０−２ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−５Ｍ）のＢＣＬ２ペプチド、または０．５ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−４Ｍ）のＢＣＬ２ペプチドを含む、ＢＣＬ２ペプチド／ＢＳＡゲルから得られた切片を用いる、ＢＣＬ２のＩＨＣ染色の４０倍の倍率を示す。０、１＋、２＋、または３＋（０〜３＋の定性的スケール）に対応する切片のＢＣＬ２染色にラベルを付す。図３Ｂは、図３Ａに示す切片を光学密度（ＯＤ）対ＢＣＬ２ペプチド濃度について分析する６つの独立した実験の結果を示す。図３Ｃは、図３Ａに示す切片を画像強度対ＢＣＬ２ペプチド濃度について分析する６つの独立した実験の結果を示す。図３Ｄ及び３Ｅは、パラフィンブロックに包埋され、抗ＢＣＬ２一次抗体で染色され、蛍光レポーターで検出されたＢＣＬ２ペプチド／ＢＳＡゲルシリンダーの４ミクロン厚の切片の定量的免疫蛍光（ＩＦ）染色の結果を示す（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＯｍｎｉＭＡＰ抗マウスＨＲＰ検出システム、続いてＶｅｎｔａｎａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒｅｄ  ６１０検出システムを使用）。試験試料には、野生型（変異していない）ＢＣＬ２ペプチド、６つの異なる単一アミノ酸置換を含むＢＣＬ２ペプチド、及びＭＣＬ１タンパク質からのペプチド（抗ＢＣＬ２抗体との結合が予想されない陰性対照試料）が含まれる。図３Ｄはレポーターの赤い蛍光を示す。図３Ｅは、ＤＡＰＩフィルターチャネルでイメージングされた同一のＴＭＡの蛍光を示す（ＢＳＡコアの青色の自己蛍光を検出する）。図３Ｆ及び３Ｇは、ナイーブ対照一次抗体で染色された、パラフィンブロックに包埋されたＢＣＬ２ペプチド／ＢＳＡゲルシリンダーの４ミクロン厚の切片の定量的免疫蛍光（ＩＦ）染色の結果を示す。図３Ｆは、レポーターの蛍光を示す。図３Ｇは、ＤＡＰＩフィルターチャネルでイメージングされた同一のＴＭＡの蛍光を示す（ＢＳＡコアの自己蛍光を検出する）。図３Ｈは、図３Ｄに示した結果の定量化を示す（平均光学エミッタンスとして報告）。野生型ＢＣＬ２ペプチドは、各濃度で最も強いシグナルを示し；陰性対照のＭＣＬ１ペプチドは、予想通り、最小のシグナルを示す。単一のアミノ酸置換を含む６つのＢＣＬ２ペプチドは、一般に野生型ＢＣＬ２と陰性対照ＭＣＬ１ペプチドの中間にある可変的なシグナルを示す。図３Ｉは、図３Ｆに示した結果の定量化を示す（平均光学エミッタンスとして報告）。ナイーブ対照抗体は、予想通り、ほとんど検出できないシグナルを示す。図３Ｊは、図３Ｄに示した結果の定量化を示す（平均シグナル強度として報告）。野生型ＢＣＬ２ペプチドは、各濃度で最も強いシグナルを示し；陰性対照のＭＣＬ１ペプチドは、予想通り、最小のシグナルを示す。単一のアミノ酸置換を含む６つのＢＣＬ２ペプチドは、一般に野生型ＢＣＬ２と陰性対照Ｍ���Ｌ１ペプチドの中間にある可変的なシグナルを示す。図３Ｋは、図３Ｆに示した結果の定量化を示す（平均シグナル強度として報告）。ナイーブ対照抗体は、予想通り、ほとんど検出できないシグナルを示す。
【図３−６】図３Ａは、パラフィンブロックに包埋された４ミクロン厚のＢＣＬ２ペプチド／ＢＳＡゲルシリンダーの切片のＩＨＣ染色の結果を示す。挿入図は、（左から右に向かって）ペプチドを含まないものから、５×１０−５ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−８Ｍ）のＢＣＬ２ペプチド、５×１０−４ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−７Ｍ）のＢＣＬ２ペプチド、５×１０−３ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−６Ｍ）のＢＣＬ２ペプチド、５×１０−２ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−５Ｍ）のＢＣＬ２ペプチド、または０．５ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−４Ｍ）のＢＣＬ２ペプチドを含む、ＢＣＬ２ペプチド／ＢＳＡゲルから得られた切片を用いる、ＢＣＬ２のＩＨＣ染色の４０倍の倍率を示す。０、１＋、２＋、または３＋（０〜３＋の定性的スケール）に対応する切片のＢＣＬ２染色にラベルを付す。図３Ｂは、図３Ａに示す切片を光学密度（ＯＤ）対ＢＣＬ２ペプチド濃度について分析する６つの独立した実験の結果を示す。図３Ｃは、図３Ａに示す切片を画像強度対ＢＣＬ２ペプチド濃度について分析する６つの独立した実験の結果を示す。図３Ｄ及び３Ｅは、パラフィンブロックに包埋され、抗ＢＣＬ２一次抗体で染色され、蛍光レポーターで検出されたＢＣＬ２ペプチド／ＢＳＡゲルシリンダーの４ミクロン厚の切片の定量的免疫蛍光（ＩＦ）染色の結果を示す（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＯｍｎｉＭＡＰ抗マウスＨＲＰ検出システム、続いてＶｅｎｔａｎａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒｅｄ  ６１０検出システムを使用）。試験試料には、野生型（変異していない）ＢＣＬ２ペプチド、６つの異なる単一アミノ酸置換を含むＢＣＬ２ペプチド、及びＭＣＬ１タンパク質からのペプチド（抗ＢＣＬ２抗体との結合が予想されない陰性対照試料）が含まれる。図３Ｄはレポーターの赤い蛍光を示す。図３Ｅは、ＤＡＰＩフィルターチャネルでイメージングされた同一のＴＭＡの蛍光を示す（ＢＳＡコアの青色の自己蛍光を検出する）。図３Ｆ及び３Ｇは、ナイーブ対照一次抗体で染色された、パラフィンブロックに包埋されたＢＣＬ２ペプチド／ＢＳＡゲルシリンダーの４ミクロン厚の切片の定量的免疫蛍光（ＩＦ）染色の結果を示す。図３Ｆは、レポーターの蛍光を示す。図３Ｇは、ＤＡＰＩフィルターチャネルでイメージングされた同一のＴＭＡの蛍光を示す（ＢＳＡコアの自己蛍光を検出する）。図３Ｈは、図３Ｄに示した結果の定量化を示す（平均光学エミッタンスとして報告）。野生型ＢＣＬ２ペプチドは、各濃度で最も強いシグナルを示し；陰性対照のＭＣＬ１ペプチドは、予想通り、最小のシグナルを示す。単一のアミノ酸置換を含む６つのＢＣＬ２ペプチドは、一般に野生型ＢＣＬ２と陰性対照ＭＣＬ１ペプチドの中間にある可変的なシグナルを示す。図３Ｉは、図３Ｆに示した結果の定量化を示す（平均光学エミッタンスとして報告）。ナイーブ対照抗体は、予想通り、ほとんど検出できないシグナルを示す。図３Ｊは、図３Ｄに示した結果の定量化を示す（平均シグナル強度として報告）。野生型ＢＣＬ２ペプチドは、各濃度で最も強いシグナルを示し；陰性対照のＭＣＬ１ペプチドは、予想通り、最小のシグナルを示す。単一のアミノ酸置換を含む６つのＢＣＬ２ペプチドは、一般に野生型ＢＣＬ２と陰性対照Ｍ���Ｌ１ペプチドの中間にある可変的なシグナルを示す。図３Ｋは、図３Ｆに示した結果の定量化を示す（平均シグナル強度として報告）。ナイーブ対照抗体は、予想通り、ほとんど検出できないシグナルを示す。
【図３−７】図３Ａは、パラフィンブロックに包埋された４ミクロン厚のＢＣＬ２ペプチド／ＢＳＡゲルシリンダーの切片のＩＨＣ染色の結果を示す。挿入図は、（左から右に向かって）ペプチドを含まないものから、５×１０−５ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−８Ｍ）のＢＣＬ２ペプチド、５×１０−４ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−７Ｍ）のＢＣＬ２ペプチド、５×１０−３ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−６Ｍ）のＢＣＬ２ペプチド、５×１０−２ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−５Ｍ）のＢＣＬ２ペプチド、または０．５ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−４Ｍ）のＢＣＬ２ペプチドを含む、ＢＣＬ２ペプチド／ＢＳＡゲルから得られた切片を用いる、ＢＣＬ２のＩＨＣ染色の４０倍の倍率を示す。０、１＋、２＋、または３＋（０〜３＋の定性的スケール）に対応する切片のＢＣＬ２染色にラベルを付す。図３Ｂは、図３Ａに示す切片を光学密度（ＯＤ）対ＢＣＬ２ペプチド濃度について分析する６つの独立した実験の結果を示す。図３Ｃは、図３Ａに示す切片を画像強度対ＢＣＬ２ペプチド濃度について分析する６つの独立した実験の結果を示す。図３Ｄ及び３Ｅは、パラフィンブロックに包埋され、抗ＢＣＬ２一次抗体で染色され、蛍光レポーターで検出されたＢＣＬ２ペプチド／ＢＳＡゲルシリンダーの４ミクロン厚の切片の定量的免疫蛍光（ＩＦ）染色の結果を示す（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＯｍｎｉＭＡＰ抗マウスＨＲＰ検出システム、続いてＶｅｎｔａｎａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒｅｄ  ６１０検出システムを使用）。試験試料には、野生型（変異していない）ＢＣＬ２ペプチド、６つの異なる単一アミノ酸置換を含むＢＣＬ２ペプチド、及びＭＣＬ１タンパク質からのペプチド（抗ＢＣＬ２抗体との結合が予想されない陰性対照試料）が含まれる。図３Ｄはレポーターの赤い蛍光を示す。図３Ｅは、ＤＡＰＩフィルターチャネルでイメージングされた同一のＴＭＡの蛍光を示す（ＢＳＡコアの青色の自己蛍光を検出する）。図３Ｆ及び３Ｇは、ナイーブ対照一次抗体で染色された、パラフィンブロックに包埋されたＢＣＬ２ペプチド／ＢＳＡゲルシリンダーの４ミクロン厚の切片の定量的免疫蛍光（ＩＦ）染色の結果を示す。図３Ｆは、レポーターの蛍光を示す。図３Ｇは、ＤＡＰＩフィルターチャネルでイメージングされた同一のＴＭＡの蛍光を示す（ＢＳＡコアの自己蛍光を検出する）。図３Ｈは、図３Ｄに示した結果の定量化を示す（平均光学エミッタンスとして報告）。野生型ＢＣＬ２ペプチドは、各濃度で最も強いシグナルを示し；陰性対照のＭＣＬ１ペプチドは、予想通り、最小のシグナルを示す。単一のアミノ酸置換を含む６つのＢＣＬ２ペプチドは、一般に野生型ＢＣＬ２と陰性対照ＭＣＬ１ペプチドの中間にある可変的なシグナルを示す。図３Ｉは、図３Ｆに示した結果の定量化を示す（平均光学エミッタンスとして報告）。ナイーブ対照抗体は、予想通り、ほとんど検出できないシグナルを示す。図３Ｊは、図３Ｄに示した結果の定量化を示す（平均シグナル強度として報告）。野生型ＢＣＬ２ペプチドは、各濃度で最も強いシグナルを示し；陰性対照のＭＣＬ１ペプチドは、予想通り、最小のシグナルを示す。単一のアミノ酸置換を含む６つのＢＣＬ２ペプチドは、一般に野生型ＢＣＬ２と陰性対照Ｍ���Ｌ１ペプチドの中間にある可変的なシグナルを示す。図３Ｋは、図３Ｆに示した結果の定量化を示す（平均シグナル強度として報告）。ナイーブ対照抗体は、予想通り、ほとんど検出できないシグナルを示す。
【図３−８】図３Ａは、パラフィンブロックに包埋された４ミクロン厚のＢＣＬ２ペプチド／ＢＳＡゲルシリンダーの切片のＩＨＣ染色の結果を示す。挿入図は、（左から右に向かって）ペプチドを含まないものから、５×１０−５ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−８Ｍ）のＢＣＬ２ペプチド、５×１０−４ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−７Ｍ）のＢＣＬ２ペプチド、５×１０−３ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−６Ｍ）のＢＣＬ２ペプチド、５×１０−２ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−５Ｍ）のＢＣＬ２ペプチド、または０．５ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−４Ｍ）のＢＣＬ２ペプチドを含む、ＢＣＬ２ペプチド／ＢＳＡゲルから得られた切片を用いる、ＢＣＬ２のＩＨＣ染色の４０倍の倍率を示す。０、１＋、２＋、または３＋（０〜３＋の定性的スケール）に対応する切片のＢＣＬ２染色にラベルを付す。図３Ｂは、図３Ａに示す切片を光学密度（ＯＤ）対ＢＣＬ２ペプチド濃度について分析する６つの独立した実験の結果を示す。図３Ｃは、図３Ａに示す切片を画像強度対ＢＣＬ２ペプチド濃度について分析する６つの独立した実験の結果を示す。図３Ｄ及び３Ｅは、パラフィンブロックに包埋され、抗ＢＣＬ２一次抗体で染色され、蛍光レポーターで検出されたＢＣＬ２ペプチド／ＢＳＡゲルシリンダーの４ミクロン厚の切片の定量的免疫蛍光（ＩＦ）染色の結果を示す（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＯｍｎｉＭＡＰ抗マウスＨＲＰ検出システム、続いてＶｅｎｔａｎａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒｅｄ  ６１０検出システムを使用）。試験試料には、野生型（変異していない）ＢＣＬ２ペプチド、６つの異なる単一アミノ酸置換を含むＢＣＬ２ペプチド、及びＭＣＬ１タンパク質からのペプチド（抗ＢＣＬ２抗体との結合が予想されない陰性対照試料）が含まれる。図３Ｄはレポーターの赤い蛍光を示す。図３Ｅは、ＤＡＰＩフィルターチャネルでイメージングされた同一のＴＭＡの蛍光を示す（ＢＳＡコアの青色の自己蛍光を検出する）。図３Ｆ及び３Ｇは、ナイーブ対照一次抗体で染色された、パラフィンブロックに包埋されたＢＣＬ２ペプチド／ＢＳＡゲルシリンダーの４ミクロン厚の切片の定量的免疫蛍光（ＩＦ）染色の結果を示す。図３Ｆは、レポーターの蛍光を示す。図３Ｇは、ＤＡＰＩフィルターチャネルでイメージングされた同一のＴＭＡの蛍光を示す（ＢＳＡコアの自己蛍光を検出する）。図３Ｈは、図３Ｄに示した結果の定量化を示す（平均光学エミッタンスとして報告）。野生型ＢＣＬ２ペプチドは、各濃度で最も強いシグナルを示し；陰性対照のＭＣＬ１ペプチドは、予想通り、最小のシグナルを示す。単一のアミノ酸置換を含む６つのＢＣＬ２ペプチドは、一般に野生型ＢＣＬ２と陰性対照ＭＣＬ１ペプチドの中間にある可変的なシグナルを示す。図３Ｉは、図３Ｆに示した結果の定量化を示す（平均光学エミッタンスとして報告）。ナイーブ対照抗体は、予想通り、ほとんど検出できないシグナルを示す。図３Ｊは、図３Ｄに示した結果の定量化を示す（平均シグナル強度として報告）。野生型ＢＣＬ２ペプチドは、各濃度で最も強いシグナルを示し；陰性対照のＭＣＬ１ペプチドは、予想通り、最小のシグナルを示す。単一のアミノ酸置換を含む６つのＢＣＬ２ペプチドは、一般に野生型ＢＣＬ２と陰性対照Ｍ���Ｌ１ペプチドの中間にある可変的なシグナルを示す。図３Ｋは、図３Ｆに示した結果の定量化を示す（平均シグナル強度として報告）。ナイーブ対照抗体は、予想通り、ほとんど検出できないシグナルを示す。
【図３−９】図３Ａは、パラフィンブロックに包埋された４ミクロン厚のＢＣＬ２ペプチド／ＢＳＡゲルシリンダーの切片のＩＨＣ染色の結果を示す。挿入図は、（左から右に向かって）ペプチドを含まないものから、５×１０−５ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−８Ｍ）のＢＣＬ２ペプチド、５×１０−４ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−７Ｍ）のＢＣＬ２ペプチド、５×１０−３ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−６Ｍ）のＢＣＬ２ペプチド、５×１０−２ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−５Ｍ）のＢＣＬ２ペプチド、または０．５ｍｇ／ｍＬ（２．５Ｅ−４Ｍ）のＢＣＬ２ペプチドを含む、ＢＣＬ２ペプチド／ＢＳＡゲルから得られた切片を用いる、ＢＣＬ２のＩＨＣ染色の４０倍の倍率を示す。０、１＋、２＋、または３＋（０〜３＋の定性的スケール）に対応する切片のＢＣＬ２染色にラベルを付す。図３Ｂは、図３Ａに示す切片を光学密度（ＯＤ）対ＢＣＬ２ペプチド濃度について分析する６つの独立した実験の結果を示す。図３Ｃは、図３Ａに示す切片を画像強度対ＢＣＬ２ペプチド濃度について分析する６つの独立した実験の結果を示す。図３Ｄ及び３Ｅは、パラフィンブロックに包埋され、抗ＢＣＬ２一次抗体で染色され、蛍光レポーターで検出されたＢＣＬ２ペプチド／ＢＳＡゲルシリンダーの４ミクロン厚の切片の定量的免疫蛍光（ＩＦ）染色の結果を示す（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＯｍｎｉＭＡＰ抗マウスＨＲＰ検出システム、続いてＶｅｎｔａｎａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒｅｄ  ６１０検出システムを使用）。試験試料には、野生型（変異していない）ＢＣＬ２ペプチド、６つの異なる単一アミノ酸置換を含むＢＣＬ２ペプチド、及びＭＣＬ１タンパク質からのペプチド（抗ＢＣＬ２抗体との結合が予想されない陰性対照試料）が含まれる。図３Ｄはレポーターの赤い蛍光を示す。図３Ｅは、ＤＡＰＩフィルターチャネルでイメージングされた同一のＴＭＡの蛍光を示す（ＢＳＡコアの青色の自己蛍光を検出する）。図３Ｆ及び３Ｇは、ナイーブ対照一次抗体で染色された、パラフィンブロックに包埋されたＢＣＬ２ペプチド／ＢＳＡゲルシリンダーの４ミクロン厚の切片の定量的免疫蛍光（ＩＦ）染色の結果を示す。図３Ｆは、レポーターの蛍光を示す。図３Ｇは、ＤＡＰＩフィルターチャネルでイメージングされた同一のＴＭＡの蛍光を示す（ＢＳＡコアの自己蛍光を検出する）。図３Ｈは、図３Ｄに示した結果の定量化を示す（平均光学エミッタンスとして報告）。野生型ＢＣＬ２ペプチドは、各濃度で最も強いシグナルを示し；陰性対照のＭＣＬ１ペプチドは、予想通り、最小のシグナルを示す。単一のアミノ酸置換を含む６つのＢＣＬ２ペプチドは、一般に野生型ＢＣＬ２と陰性対照ＭＣＬ１ペプチドの中間にある可変的なシグナルを示す。図３Ｉは、図３Ｆに示した結果の定量化を示す（平均光学エミッタンスとして報告）。ナイーブ対照抗体は、予想通り、ほとんど検出できないシグナルを示す。図３Ｊは、図３Ｄに示した結果の定量化を示す（平均シグナル強度として報告）。野生型ＢＣＬ２ペプチドは、各濃度で最も強いシグナルを示し；陰性対照のＭＣＬ１ペプチドは、予想通り、最小のシグナルを示す。単一のアミノ酸置換を含む６つのＢＣＬ２ペプチドは、一般に野生型ＢＣＬ２と陰性対照Ｍ���Ｌ１ペプチドの中間にある可変的なシグナルを示す。図３Ｋは、図３Ｆに示した結果の定量化を示す（平均シグナル強度として報告）。ナイーブ対照抗体は、予想通り、ほとんど検出できないシグナルを示す。
【図４−１】図４Ａは、マウスＩｇＧ（左）またはラットＩｇＧ（右）を含むＢＳＡゲルの切片にロバ抗マウス二次抗体を用いた対照のＩＨＣ染色を示す。図４Ｂは、マウスＩｇＧ（左）またはラットＩｇＧ（右）を含むＢＳＡゲルの切片にロバ抗ラット二次抗体を用いた対照のＩＨＣ染色を示す。図４Ｃは、ヒトＢＣＬ２の抗ＢＣＬ２クローン１２４抗体エピトープ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ１０４１５に記載されているヒトＢＣＬ２配列のアミノ酸４１〜５４）に導入された（示されている）アミノ酸置換のＩＨＣ染色に対する影響を示す。この画像は、ＢＣＬ２ペプチド／ＢＳＡゲルシリンダー（それぞれ直径１ｍｍ）を使用して構築され、抗ＢＣＬ２抗体クローン１２４で染色され、発色試薬及び方法で検出されたパラフィン包埋組織マイクロアレイから切り取られた、４ミクロン厚の切片である。図４Ｄは、図４Ｃに示した結果の定量化を示す（光学密度（Ｏ．Ｄ．）として報告）。
【図４−２】図４Ａは、マウスＩｇＧ（左）またはラットＩｇＧ（右）を含むＢＳＡゲルの切片にロバ抗マウス二次抗体を用いた対照のＩＨＣ染色を示す。図４Ｂは、マウスＩｇＧ（左）またはラットＩｇＧ（右）を含むＢＳＡゲルの切片にロバ抗ラット二次抗体を用いた対照のＩＨＣ染色を示す。図４Ｃは、ヒトＢＣＬ２の抗ＢＣＬ２クローン１２４抗体エピトープ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ１０４１５に記載されているヒトＢＣＬ２配列のアミノ酸４１〜５４）に導入された（示されている）アミノ酸置換のＩＨＣ染色に対する影響を示す。この画像は、ＢＣＬ２ペプチド／ＢＳＡゲルシリンダー（それぞれ直径１ｍｍ）を使用して構築され、抗ＢＣＬ２抗体クローン１２４で染色され、発色試薬及び方法で検出されたパラフィン包埋組織マイクロアレイから切り取られた、４ミクロン厚の切片である。図４Ｄは、図４Ｃに示した結果の定量化を示す（光学密度（Ｏ．Ｄ．）として報告）。
【図４−３】図４Ａは、マウスＩｇＧ（左）またはラットＩｇＧ（右）を含むＢＳＡゲルの切片にロバ抗マウス二次抗体を用いた対照のＩＨＣ染色を示す。図４Ｂは、マウスＩｇＧ（左）またはラットＩｇＧ（右）を含むＢＳＡゲルの切片にロバ抗ラット二次抗体を用いた対照のＩＨＣ染色を示す。図４Ｃは、ヒトＢＣＬ２の抗ＢＣＬ２クローン１２４抗体エピトープ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ１０４１５に記載されているヒトＢＣＬ２配列のアミノ酸４１〜５４）に導入された（示されている）アミノ酸置換のＩＨＣ染色に対する影響を示す。この画像は、ＢＣＬ２ペプチド／ＢＳＡゲルシリンダー（それぞれ直径１ｍｍ）を使用して構築され、抗ＢＣＬ２抗体クローン１２４で染色され、発色試薬及び方法で検出されたパラフィン包埋組織マイクロアレイから切り取られた、４ミクロン厚の切片である。図４Ｄは、図４Ｃに示した結果の定量化を示す（光学密度（Ｏ．Ｄ．）として報告）。
【図５−１】図５Ａ〜５Ｄは、（図５ＤでのナイーブマウスＩｇＧでの染色と比較して）タンパク質／ＢＳＡゲルを使用してＩＨＣによりヒトＫＳＲ２で免疫されたマウスから得られた２７の異なる抗体のスクリーニングの結果を示す。それぞれの上の行は、タンパク質を含まないＢＳＡゲル上の各抗体を使用したＩＨＣ染色の結果を示す。下の列は、マウスを免疫するために使用されるヒトＫＳＲ２タンパク質が包埋されたＢＳＡゲルの各抗体を使用したＩＨＣ染色の結果を示す。マウス抗体クローンは、それぞれの列に示されている。チェックマークは、標的タンパク質試料（下の行）の強いシグナルと、陰性対照試料（上の行）の最小のシグナルとから明らかなように、最もパフォーマンスの高いクローンを示す。
【図５−２】図５Ａ〜５Ｄは、（図５ＤでのナイーブマウスＩｇＧでの染色と比較して）タンパク質／ＢＳＡゲルを使用してＩＨＣによりヒトＫＳＲ２で免疫されたマウスから得られた２７の異なる抗体のスクリーニングの結果を示す。それぞれの上の行は、タンパク質を含まないＢＳＡゲル上の各抗体を使用したＩＨＣ染色の結果を示す。下の列は、マウスを免疫するために使用されるヒトＫＳＲ２タンパク質が包埋されたＢＳＡゲルの各抗体を使用したＩＨＣ染色の結果を示す。マウス抗体クローンは、それぞれの列に示されている。チェックマークは、標的タンパク質試料（下の行）の強いシグナルと、陰性対照試料（上の行）の最小のシグナルとから明らかなように、最もパフォーマンスの高いクローンを示す。
【図５−３】図５Ａ〜５Ｄは、（図５ＤでのナイーブマウスＩｇＧでの染色と比較して）タンパク質／ＢＳＡゲルを使用してＩＨＣによりヒトＫＳＲ２で免疫されたマウスから得られた２７の異なる抗体のスクリーニングの結果を示す。それぞれの上の行は、タンパク質を含まないＢＳＡゲル上の各抗体を使用したＩＨＣ染色の結果を示す。下の列は、マウスを免疫するために使用されるヒトＫＳＲ２タンパク質が包埋されたＢＳＡゲルの各抗体を使用したＩＨＣ染色の結果を示す。マウス抗体クローンは、それぞれの列に示されている。チェックマークは、標的タンパク質試料（下の行）の強いシグナルと、陰性対照試料（上の行）の最小のシグナルとから明らかなように、最もパフォーマンスの高いクローンを示す。
【図５−４】図５Ａ〜５Ｄは、（図５ＤでのナイーブマウスＩｇＧでの染色と比較して）タンパク質／ＢＳＡゲルを使用してＩＨＣによりヒトＫＳＲ２で免疫されたマウスから得られた２７の異なる抗体のスクリーニングの結果を示す。それぞれの上の行は、タンパク質を含まないＢＳＡゲル上の各抗体を使用したＩＨＣ染色の結果を示す。下の列は、マウスを免疫するために使用されるヒトＫＳＲ２タンパク質が包埋されたＢＳＡゲルの各抗体を使用したＩＨＣ染色の結果を示す。マウス抗体クローンは、それぞれの列に示されている。チェックマークは、標的タンパク質試料（下の行）の強いシグナルと、陰性対照試料（上の行）の最小のシグナルとから明らかなように、最もパフォーマンスの高いクローンを示す。
【図６】ＢＳＡゲル形成における温度と加熱時間の影響を評価した結果である。温度は、液体の２５％ＢＳＡ溶液が加熱された温度を示す。時間は、ＢＳＡ溶液が加熱され、室温に冷却される前に固液相について試験された時間を示す。Ｓ＝固体；Ｌ＝液体；ｓｅｍｉ−Ｓ＝半固体
【図７】ＢＳＡゲル形成における時間、温度、及びＢＳＡ濃度の影響を評価した結果である。温度は、液体のＢＳＡ溶液が加熱された温度を示す。時間は、ＢＳＡ溶液が加熱され、室温に冷却される前に固液相について試験された時間を示す。パーセンテージは、ＢＳＡ／ＰＢＳ液体溶液中のＢＳＡの濃度を示す。Ｓ＝固体；Ｌ＝液体；ｏ／ｎ＝一晩
【図８】抗ウサギＩｇＧ二次抗体を用いて検出された、ウサギＩｇＧを含む（下の行）か、または含まない（上の行）、ＢＳＡ、卵白タンパク質、またはゼラチンから作製されたゲルのＩＨＣ染色を示す。
【図９】ウサギＩｇＧを含む（下の行）か、または含まない（上の行）、ラクトアルブミン、肝臓タンパク質粉末、または大豆粉から作られた不均一なゲルを示す。
【図１０】ウサギＩｇＧを含む（下の行）か、または含まない（上の行）、カゼインまたは脱脂粉乳から作製されたゲルが、ＩＨＣ染色用のスライドガラスに付着しなかったことを示す。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｄは、ゲル内の抗原分布を調べるための発色アッセイを使用した２つの別々の実験の結果を示す。５×１０−５ＭのＢＣＬ２ペプチドを含む（図１１Ａ及び１１Ｃ）の上の行）か、またはペプチドを含まない（図１１Ａ及び１１Ｃの下の行）ＢＳＡゲルの４ミクロン厚の「ドナーブロック」切片を、２つの別々の実験において抗ＢＣＬ２クローン１２４で染色した（実験１：図１１Ａ及び１１Ｃの左の列；実験２：図１１Ａ及び１１Ｃの右の列）。染色された切片のデジタル画像は、ＩｍａｇｅＪのプロットプロファイル機能を使用して、水平軸（図１１Ａ）と垂直軸（図１１Ｃ）に沿って定量化された。結果をそれぞれ（図１１Ｂ）及び（図１１Ｄ）に示す。実験１と２は、それぞれ黒色と灰色で示す。ＢＣＬ２ペプチド及びＢＳＡのみの対照切片のデータは、それぞれ実線と破線で示す。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｅは、ＢＣＬ２ペプチドＴＭＡを用いたＢＣＬ２のＩＨＣ分析結果である（図１２Ａ）。抗ＢＣＬ２クローン１２４で染色された組織マイクロアレイ切片には、追加ペプチド（ＢＳＡ）を含まない二重のＴＭＡコア、ＢＣＬ２タンパク質のアミノ酸４１〜５４をコードするペプチドの希釈系列、または示された濃度のヒトＭＣＬ１タンパク質由来の陰性対照ペプチドが含まれる。ＢＣＬ２とＭＣＬ１の行の画像は、同一のＴＭＡ切片からの異なる視野である。ＴＭＡコアの直径は１ｍｍである。（図１２Ａ）に記載されたのと同じＴＭＡからの連続切片を、免疫蛍光検出を使用して抗ＢＣＬ２クローン１２４（図１２Ｂ）または発色検出を使用して抗ＢＣＬ２クローンＥＰＲ１７５０９（図１２Ｃ）で染色する。（図１２Ｄ）図１２Ａ〜１２Ｃに示すような、ＢＣＬ２ペプチド（丸）またはＭＣＬ１ペプチド（四角）を含む個々のコアにおけるシグナルの定量化。（図１２Ｅ）（図１２Ｄ）に示す曲線の関連パラメーター。ＨｉｌｌＳｌｏｐｅパラメーターは、曲線の急勾配を伝える。ＡＣＨＭは、最大シグナルの半分の抗原濃度である。
【図１３】図１３Ａは、単一組織マイクロアレイの連続セクションが、ペプチドが追加されていない（ＢＳＡ）、ＢＣＬ２タンパク質のアミノ酸４１〜５４をコードするペプチドを有する、またはヒトＭＣＬ１タンパク質由来の陰性対照ペプチドを有する、ＢＳＡゲルコアを含むことを示す。２枚のスライドを、抗ＢＣＬ２クローンＳＰ６６またはクローンＥ１７を使用してＢＣＬ２抗原について発色染色した。図１３Ｂは、（図１３Ａ）に示す画像の定量化を示す。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｃは、反復切片の再現性を示す。（図１４Ａ）ペプチドが追加されていない（ＢＳＡ）、またはＢＣＬ２タンパク質のアミノ酸４１〜５４をコードするペプチドを有する二重のＴＭＡコアを含む単一組織マイクロアレイの６つの連続切片からの画像。各スライドは、２人のオペレーターによって６日の別々の日にクローン１２４を使用してＢＣＬ２に対して染色された。オペレーター１は実行１を染色し；オペレーター２は実行２〜６を染色した（図１４Ｂ）。図１４Ａに示す画像の定量化。６つのＴＭＡのそれぞれの各ペプチド濃度での重複コアからの平均シグナルが表示される。（図１４Ｃ）表は、図１４Ｂに示される曲線の関連パラメーターを要約する。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｃは、抗原賦活化を伴うものと伴わないもののＢＣＬ２ペプチドのＩＨＣ染色を示す。（図１５Ａ）ＴＭＡは、ペプチドが追加されていない（ＢＳＡ）、または示された濃度のＢＣＬ２タンパク質のアミノ酸４１〜５４をコードするペプチドを有するＢＳＡゲルコアを含んでいた。切片は、抗原賦活化の前に（ＡＲ）を伴って、または伴わず（ＡＲなし）に染色された。（図１５Ｂ）図１５Ａに示す画像の定量化。黒四角：抗原賦活化を伴う；四角形：抗原賦活化を伴わない。各ペプチド濃度での二重のコアからの平均シグナルを示す。（図１５Ｃ）表は、図１５Ｂに示されている曲線の関連パラメーターを要約する。
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｃは、代替的なＢＣＬ２ペプチドのＮ末端とＣ末端がシグナル強度に影響することを示す。（図１６Ａ）ペプチドを追加していない（ＢＳＡ）、または、示されている代替的なＮ−及びＣ−末端アミノ酸（アセチル−Ｎ、Ｃ−アミド）を有する３つのアミノ酸配列ＧＳＧが隣接するＢＣＬ２タンパク質（行Ｉ〜Ｖ）のアミノ酸４１〜５４をコードする２２アミノ酸を有する、二重ＢＳＡゲルコアを含む単一のＴＭＡセクションからの画像。（図１６Ｂ）図１６Ａに示される画像の定量化。各ペプチド濃度での二重のコアからの平均シグナルを示す。（図１６Ｃ）表は、図１６Ｂに示されている曲線の関連パラメーターを要約する。
【図１７】図１７Ａ〜１７Ｅは、ＢＣＬ２及びＭＹＣペプチドのＩＨＣ染色を示す。（図１７Ａ）示されるように、ヒトＭＹＣ由来の２．５×１０−４Ｍペプチドを含むドナーブロックの切片。スケールバーは１ｍｍである。（図１７Ｂ及び１７Ｃ）抗ＢＣＬ２クローン１２４（図１７Ｂ）または抗ＭＹＣクローンＹ６９（図１７Ｃ）で染色された単一のＴＭＡ切片には、ペプチドを含まない（ＢＳＡ）か、またはＢＣＬ２アミノ酸４１〜５４及びＭＹＣアミノ酸９〜２４をコードするペプチドを含むように調製された二重のコアが含まれる。（図１７Ｄ）図１７Ｂ及び１７Ｃに示される画像の定量化。各ペプチド濃度での二重のコアからの平均シグナルを示す。（図１７Ｅ）図１７Ｄに示されている曲線の関連パラメーター。
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｃは、デュアルＭＹＣ／ＢＣＬ２免疫蛍光（ＩＦ）画像解析を示す。（図１８Ａ）ペプチドを含まない（ＢＳＡ）か、または示された濃度でＢＣＬ２アミノ酸４１〜５４及びＭＹＣアミノ酸９〜２４をコードするペプチドを含むコアを含むＴＭＡからの単一の切片。切片を抗ＢＣＬ２クローン１２４と抗ＭＹＣクローンＹ６９の両方で逐次的に染色し、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＦＡＭ（ＢＣＬ２；緑）またはＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃｙ５（ＭＹＣ；赤）キットで検出した後、各蛍光色素の適切な波長で画像化した。（図１８Ｂ）図１８Ａに示される画像の定量化。各ペプチド濃度での二重のコアからの平均シグナルを示す。エラーバーは、±１標準偏差を示す。（図１８Ｃ）表は、図１８Ｂに示されている曲線の関連パラメーターを要約する。
【図１９】図１９Ａ及び１９Ｂは、抗ＢＣＬ２クローン１２４の集計データを表示する。（図１９Ａ）図１２Ａ〜１２Ｅ及び図１４Ａ〜１７Ｅのデータ（ｎ＝１０の独立したＩＨＣアッセイ、それぞれが各ペプチド濃度の二重のコアを持つ）をグループ化してプロットした。エラーバーは１標準偏差を表す（ｎ＝１０）。（図１９Ｂ）図１９Ａのデータの関連パラメーター。
【図２０−１】図２０Ａ及び２０Ｂは、抗原賦活化を伴う及び伴わない染色について、図５Ａ〜５ＤでスクリーニングしたヒトＫＳＲ２に対する抗体を試験する。図２０Ａの画像は、タンパク質を含まない（ＢＳＡ）または６．３×１０−６Ｍの目的のタンパク質を含むＢＳＡゲルの切片を、事前の抗原賦活化を伴って（ＡＲ）または伴わず（ＡＲなし）に、マウス抗体を選択して染色したものである。図２０Ｂは、図２０Ａに示される結果の定量化を提供する。
【図２０−２】図２０Ａ及び２０Ｂは、抗原賦活化を伴う及び伴わない染色について、図５Ａ〜５ＤでスクリーニングしたヒトＫＳＲ２に対する抗体を試験する。図２０Ａの画像は、タンパク質を含まない（ＢＳＡ）または６．３×１０−６Ｍの目的のタンパク質を含むＢＳＡゲルの切片を、事前の抗原賦活化を伴って（ＡＲ）または伴わず（ＡＲなし）に、マウス抗体を選択して染色したものである。図２０Ｂは、図２０Ａに示される結果の定量化を提供する。
【図２１】図２１Ａ及び２１Ｂは、マウス、ラット、及びウサギのＩｇＧを含むＢＳＡゲルである。（図２１Ａ）ナイーブのウサギ、ラット、またはマウスのＩｇＧ（０．１ミリグラム／ｍｌ；６．７×１０−７Ｍ）のいずれかを含む二重のＢＳＡゲルコアからなるＴＭＡの連続切片を、示された種由来のＩｇＧに特異的なロバ二次抗体で染色した。ＴＭＡコアの直径は１ｍｍである。（図２１Ｂ）図２１Ａに示す画像の定量化：ウサギＩｇＧ抗原（黒色の棒）；ラットＩｇＧ（斜線入りの棒）；マウスＩｇＧ（白色の棒）。各種特異的抗体について、標的ＩｇＧを含むコアのシグナルは、非標的ＩｇＧを含むコアのシグナルよりも有意に高かった（ｐ＜０．０００１）。エラーバーは１ＳＤである。これらのデータも図３Ｃに示していることに留意されたい。
【図２２】図２２Ａ〜２２Ｃは、代替的な固定剤を使用してペプチドゲルを生成した結果を示す。（図２２Ａ）ドナーコアは、１８．５％のホルムアルデヒドまたは５０％の亜鉛固定剤の存在下で８５℃で１０分間加熱することにより、ＢＣＬ２またはＭＹＣペプチドを含んで調製した。ドナーブロックは、ペプチドを含まず（ＢＳＡ）に、またはＢＣＬ２アミノ酸４１〜５４及びＭＹＣアミノ酸９〜２４をコードするペプチドを含むように調製された。切片を抗ＢＣＬ２クローン１２４または抗ＭＹＣクローンＹ６９で適宜染色した。（図２２Ｂ）図２２Ａに示す画像の定量化。（図２２Ｃ）図２２Ｂに示す曲線の関連パラメーター。
【図２３】図２３Ａ及び２３Ｂは、代替的な固定剤の試験結果を示す。（図２３Ａ）ＢＣＬ２ペプチドを含むＢＳＡゲルは、亜鉛含有固定剤（Ｚｎ及び加熱）もしくは濃縮ホルムアルデヒド（３７％ホルムアルデヒド及び加熱）の存在下で８５℃に加熱して調製するか、または固定剤の非存在下で８５℃に加熱して、次いで、亜鉛含有固定剤（加熱、Ｚｎ）、４％ＰＦＡ（加熱、４％ＰＦＡ）、または中性緩衝ホルマリン（加熱、ＮＢＦ）で室温で固定した。（図２３Ｂ）図２３Ａにおける画像の定量化。
【図２４】図２４Ａ〜２４Ｃは、ＢＣＬ２ペプチドＴＭＡのマスサイトメトリー分析の画像を示す。（図２４Ａ）１４６Ｎｄ質量分析タグにコンジュゲートされた抗ＢＣＬ２クローンＥＰＲ１７５０９で染色され、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｈｙｐｅｒｉｏｎ走査型質量分析計で画像化されたＴＭＡ切片の代表的な視野（約１５０ミクロン平方）。二重のＴＭＡコアには、追加のペプチドなし（ＢＳＡ）、示された濃度のＢＣＬ２タンパク質のアミノ酸４１〜５４をコードするペプチド、またはヒトＭＣＬ１タンパク質からの陰性対照ペプチドを含んだ。（図２４Ｂ）図２４Ａに示す画像の定量化。エラーバーは標準偏差を示す。（図２４Ｃ）表は、図２４Ｂに示されている曲線の関連パラメーターを要約する。ＨｉｌｌＳｌｏｐｅパラメーターは、曲線の急勾配を伝える。ＡＣＨＭは、最大シグナルの半分の抗原濃度である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
Ｉ．  定義
全ての特許、出願、出願公開、及びその他の刊行物は、その全体が参照により組み込まれる。別途定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明の所属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。
【００２８】
「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書で互換可能に使用される。ポリマーは、直鎖状または分枝状であってよく、修飾アミノ酸を含み得、そして非アミノ酸により中断されていてもよい。この用語は、天然にまたは介入によって改変されたアミノ酸ポリマーも包含し、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分または毒素とのコンジュゲーションなどの任意の他の操作または修飾を包含する。また、例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸などを含む）の１つ以上の類似体を含むポリペプチド、ならびに当該技術分野で知られている他の修飾も定義に含まれる。本明細書で使用されるとき、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、抗体を具体的に包含する。
【００２９】
本明細書における「抗原」という用語は、最も広い意味で使用され、低分子ペプチド抗原、全長タンパク質抗原、糖鎖抗原、脂質抗原、及び核酸抗原を含むが、これらに限定されない、ポリペプチド及び非ポリペプチドの両方の抗原の様々な形態を含む。
【００３０】
本明細書における「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及びそれらが所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含むがこれらに限定されない様々な抗体構造を包含する。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、本明細書において抗体と互換可能に使用される。
【００３１】
「精製された」抗原は、天然環境に存在するよりも純粋な形で存在するように、及び／または実験室条件下で最初に生成及び／または合成及び／または増幅された場合に、純度が増加した抗原を指す。純度は相対的な用語であり、必ずしも絶対的な純度を意味するものではない。いくつかの実施形態では、抗原は少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の純度に精製される。
【００３２】
ＩＩ．  固体の抗原／担体タンパク質ゲル及び生成方法
本開示の特定の態様は、固体の抗原／担体タンパク質ゲル、ならびに固体の抗原／担体タンパク質ゲルを生成する方法に関する。
【００３３】
いくつかの実施形態では、本開示は、精製抗原及び担体タンパク質を含む固体の抗原／担体タンパク質ゲルを提供する。いくつかの実施形態では、担体タンパク質は、アルブミンタンパク質（例えば、血清アルブミンタンパク質）、卵白タンパク質または卵白タンパク質の混合物、ゼラチン、及びポリリジンから選択される。いくつかの実施形態では、精製抗原は担体タンパク質に架橋されている。以下に記載するように、これらのゲルは、例えば、ＩＨＣ染色またはＥＭ画像分析の対照としての用途を見出すことができる。
【００３４】
本開示は、固体の抗原／担体タンパク質ゲルにおいて複数のタイプの担体タンパク質を使用できることを実証している。いくつかの実施形態では、担体タンパク質はアルブミンタンパク質である。いくつかの実施形態では、担体タンパク質は血清アルブミンタンパク質である。いくつかの実施形態では、血清アルブミンタンパク質は哺乳動物の血清アルブミンタンパク質である。血清アルブミンタンパク質の例には、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、及びヒトの血清アルブミンが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、担体タンパク質は卵白タンパク質である。いくつかの実施形態では、担体タンパク質は２つ以上の卵白タンパク質の混合物である。いくつかの実施形態では、担体タンパク質はゼラチンである。いくつかの実施形態では、担体タンパク質はポリリジンである。
【００３５】
いくつかの実施形態では、固体の抗原／担体タンパク質ゲルは、０．５％、１％、２％、５％、７％、１０％、１５％、または２０％（ｗ／ｖ）以上の濃度で担体タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、固体の抗原／担体タンパク質ゲルは、２５％、２０％、１５％、１０％、７％、５％、２％、または１％（ｗ／ｖ）以下の濃度で担体タンパク質を含む。すなわち、固体の抗原／担体タンパク質ゲルは、２５％、２０％、１５％、１０％、７％、５％、２％、または１％（ｗ／ｖ）の上限と、０．５％、１％、２％、５％、７％、１０％、１５％、または２０％（ｗ／ｖ）の独立して選択された下限と、を有し、下限が上限未満である濃度範囲のうちのいずれかの濃度で、担体タンパク質を含み得る。いくつかの実施形態では、担体タンパク質はアルブミンタンパク質（例えば、血清アルブミンタンパク質）を含み、固体の抗原／担体タンパク質ゲルは２％（ｗ／ｖ）を超える、例えば、２％〜２５％（ｗ／ｖ）の担体タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、担体タンパク質は卵白タンパク質または卵白タンパク質の混合物を含み、固体の抗原／担体タンパク質ゲルは２％（ｗ／ｖ）を超える、例えば、２％〜２５％（ｗ／ｖ）の担体タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、担体タンパク質はゼラチンを含み、固体の抗原／担体タンパク質ゲルは０．５％（ｗ／ｖ）を超える、例えば、０．５％〜２５％（ｗ／ｖ）または約１０％（ｗ／ｖ）の担体タンパク質を含む。
【００３６】
いくつかの実施形態では、固体の抗原／担体タンパク質ゲルは少なくとも約２５ｎＭの濃度で抗原を含む。別の実施形態では、固体の抗原／担体タンパク質ゲルは約２５ｎＭの濃度で抗原を含む。さらに別の実施形態では、固体の抗原／担体タンパク質ゲルは、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７５、８０、９０、もしくは１００ｎＭ、またはそれ以上の濃度で抗原を含む。別の実施形態では、固体の抗原／担体タンパク質ゲルは少なくとも約１０ｎＭ、１５ｎＭ、２０ｎＭ、または２５ｎＭ〜約１００ｎＭの濃度で抗原を含む。本明細書に記載されるように、本開示の固体の抗原／担体タンパク質ゲルは、例えば、検出方法の感度、ゲルの所望の用途などに応じて、広範囲の濃度で抗原を含むことができる。
【００３７】
一実施形態では、方法は、１つ以上の抗原／担体タンパク質ゲルを含む。一実施形態では、各ゲルが必要に応じて異なる濃度の抗原を有する２つのゲルが使用される。別の実施形態では、各ゲルが必要に応じて異なる濃度の抗原を有する３つのゲルが使用される。実際、異なる濃度の抗原を含む複数のゲルは、例えば、ある範囲の抗原濃度を表すためのＩＨＣ染色の対照として有用である可能性がある。
【００３８】
いくつかの実施形態では、抗原は、ポリペプチド抗原（例えば、ペプチド抗原または全長タンパク質抗原）を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチド抗原は、Ｎ末端チロシン、Ｃ末端システイン、またはその両方を含む（例えば、抗原を担体タンパク質に化学的に架橋するため）。いくつかの実施形態では、Ｎ末端チロシン及び／またはＣ末端システインは、担体タンパク質に架橋されている。例えば、Ｃ末端システインを使用して、抗原を担体タンパク質と架橋することができる。様々なシステイン反応性試薬が当該技術分野で知られており、非限定的に、ハロアセチル、マレイミド（例えば、スルホ−ＳＭＣＣ及びその類似体）、アジリジン、アクリロイル、アリール化剤、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、ＴＮＢ−チオール、及びジスルフィド還元剤などのスルフヒドリル反応性架橋剤反応性基が含まれる。
【００３９】
いくつかの実施形態では、固体の抗原／担体タンパク質ゲルは、例えば、以下に説明するように、固定剤で固定されている。いくつかの実施形態では、固定剤は、架橋固定剤（例えば、アルデヒドベースの固定剤）である。いくつかの実施形態では、固定剤は、架橋結合固定剤ではない（例えば、Ｃａｒｎｏｙのものなどの沈殿固定剤）。本明細書に記載されるように、担体タンパク質及び抗原を含む固体のゲルは、担体タンパク質及び／または抗原を加熱により変性及び沈殿させることにより、または沈殿固定剤を混合物に添加し、抗原をタンパク質ゲルに固定化することにより調製され得る。一部の抗原（特に小分子サイズの抗原）の場合、抗原を担体タンパク質に架橋すると（担体タンパク質を変性させてゲルを形成するプロセスの間または後に）、例えば、包埋、薄切、及び／または染色プロセス中に、抗原及び結果として生じる切片をゲルに保持すると考えられている。
【００４０】
いくつかの実施形態では、抗原は非ポリペプチド抗原を含む。非ポリペプチド抗原の例には、非限定的に、糖、脂質、及び核酸が含まれる。
【００４１】
いくつかの実施形態では、固体の抗原／担体タンパク質ゲルは約３０ｎｍ〜約５０μｍの厚さを有する。固体の抗原／担体タンパク質ゲルの適切な厚さは、例えば、用途に依存し得る。いくつかの実施形態では、固体の抗原／担体タンパク質ゲルは、約０．０３、１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、または４８μｍ以上の厚さを有する。いくつかの実施形態では、固体の抗原／担体タンパク質ゲルは、約５０、４８、４６、４４、４２、４０、３８、３６、３４、３２、３０、２８、２６、２４、２２、２０、１８、１６、１４、１２、１０、８、６、４、２、または１μｍ以下の厚さを有する。すなわち、固体の抗原／担体タンパク質ゲルは、５０、４８、４６、４４、４２、４０、３８、３６、３４、３２、３０、２８、２６、２４、２２、２０、１８、１６、１４、１２、１０、８、６、４、２、または１μｍの上限と、０．０３、１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、または４８μｍの独立して選択された下限とを有し、下限は上限未満である、厚さを有し得る。例えば、ＩＨＣ染色に使用される固体の抗原／担体タンパク質ゲルは、例えば、約２μｍ〜約３０μｍの厚さを有し得、一方、ＥＭに使用される固体の抗原／担体タンパク質ゲルは、例えば、約３０ｎｍ〜約５０μｍ、または約３０ｎｍ〜約１００ｎｍの厚さを有し得る。本開示の固体の抗原／担体タンパク質ゲルを薄切する方法を以下に記載する。
【００４２】
いくつかの実施形態では、固体の抗原／担体タンパク質ゲルは、抗原賦活化に供された。抗原賦活化の例示的な方法は、以下により詳細に記載される。
【００４３】
いくつかの実施形態では、固体の抗原／担体タンパク質ゲルは、パラフィン（例えば、パラフィンブロックに包埋されている）；エポキシ、アクリル、もしくはプラスチック樹脂（例えば、ＥＰＯＮ（商標）樹脂、メタクリレート、ＬＲホワイト樹脂、アラルダイト（登録商標）、スパープラスチック、Ｌｏｗｉｃｒｙｌ（登録商標）など）；合成ワックス；パラフィンワックスとプラスチックポリマーのブレンドもしくはコポリマーアロイ；ポリエチレングリコール；またはＧＡＣＨ包埋媒体（グルタルアルデヒド−カルボヒドラジド）などの本開示の媒体に包埋されている。いくつかの実施形態では、固体の抗原／担体タンパク質ゲルは、スライドガラス（例えば、ＩＨＣのため）、支持体、グリッド、またはスタブ（例えば、ＥＭのため）を非限定的に含む固体基板に固定される。
【００４４】
いくつかの実施形態では、固体の抗原／担体タンパク質ゲルを生成する方法は、精製抗原を担体タンパク質を含む液体溶液と混合して抗原／担体タンパク質液体溶液を生成することと、抗原／担体タンパク質液体溶液を加熱して固体の抗原／担体タンパク質ゲルを形成することと、を含む。いくつかの実施形態では、担体タンパク質は、アルブミンタンパク質（例えば、血清アルブミンタンパク質）、卵白タンパク質または卵白タンパク質の混合物、及びゼラチンから選択される。
【００４５】
いくつかの実施形態では、抗原／担体タンパク質液体溶液は、０．５％、１％、２％、５％、７％、１０％、１５％、または２０％（ｗ／ｖ）以上の濃度で担体タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、抗原／担体タンパク質液体溶液は、２５％、２０％、１５％、１０％、７％、５％、２％、または１％（ｗ／ｖ）以下の濃度で担体タンパク質を含む。すなわち、抗原／担体タンパク質液体溶液は、２５％、２０％、１５％、１０％、７％、５％、２％、または１％（ｗ／ｖ）の上限と、０．５％、１％、２％、５％、７％、１０％、１５％、または２０％（ｗ／ｖ）の独立して選択された下限と、を有し、下限が上限未満である濃度範囲のうちのいずれかの濃度で、担体タンパク質を含み得る。いくつかの実施形態では、担体タンパク質はアルブミンタンパク質（例えば、血清アルブミンタンパク質）を含み、抗原／担体タンパク質液体溶液は２％（ｗ／ｖ）を超える、例えば、２％〜２５％（ｗ／ｖ）の担体タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、担体タンパク質は卵白タンパク質または卵白タンパク質の混合物を含み、抗原／担体タンパク質液体溶液は２％（ｗ／ｖ）を超える、例えば、２％〜２５％（ｗ／ｖ）の担体タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、担体タンパク質はゼラチンを含み、抗原／担体タンパク質液体溶液は０．５％（ｗ／ｖ）を超える、例えば、０．５％〜２５％（ｗ／ｖ）または約１０％（ｗ／ｖ）の担体タンパク質を含む。
【００４６】
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、（例えば、抗原／担体タンパク質液体溶液を加熱する前に）システイン反応性試薬を使用して抗原を担体タンパク質と架橋することを含む。様々なシステイン反応性試薬が当該技術分野で知られており、非限定的に、ハロアセチル、マレイミド（例えば、スルホ−ＳＭＣＣ及びその類似体）、アジリジン、アクリロイル、アリール化剤、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、ＴＮＢ−チオール、及びジスルフィド還元剤などのスルフヒドリル反応性架橋剤反応性基が含まれる。
【００４７】
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、抗原を担体タンパク質で固定することを含む。いくつかの実施形態では、固定剤が抗原／担体タンパク質溶液に含まれている。いくつかの実施形態では、固定剤は架橋固定剤である。いくつかの実施形態では、固定剤は非架橋固定剤である。適切な固定剤の例としては、非限定的に、ホルムアルデヒド、ホルマリン、パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）、グルタルアルデヒド、Ｄａｖｉｄｓｏｎの固定剤、Ｂｏｕｉｎの固定剤、Ｋａｒｎｏｖｓｋｉの固定剤（例えば、１／２強度のＫａｒｎｏｖｓｋｉの固定剤）、Ｚｅｎｋｅｒの溶液、Ｈｅｌｌｙの溶液、Ｃａｒｎｏｙの溶液、亜鉛ホルマリン、中性−緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）、過ヨウ素酸−リジン−パラホルムアルデヒド（ＰＬＰ）、ザンボニの固定剤、ジメチルスベリミデート（ＤＭＳ）、アセトン、アルコール（例えば、メタノールまたはエタノール）、亜鉛塩（例えば、酢酸亜鉛、塩化亜鉛、トリフルオロ酢酸亜鉛などが挙げられる。特定の実施形態では、固定剤はホルムアルデヒドを含む（例えば、少なくとも約１％または少なくとも約２％の濃度で）。
【００４８】
いくつかの実施形態では、抗原は、アジド−アルキン付加を非限定的に含む選択的化学反応を使用して担体タンパク質と架橋される。いくつかの実施形態では、選択的化学反応は、非タンパク質抗原、例えば、糖抗原または脂質抗原を担体タンパク質に架橋するために使用される。
【００４９】
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、固体の抗原／担体タンパク質ゲルを脱水することを含む。脱水に適した化合物は、当該技術分野で知られており、例えば、エタノールまたはメタノールなどのアルコールを含み得る。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、固体の抗原／担体タンパク質ゲルを包埋することを含む。いくつかの実施形態では、固体の抗原／担体タンパク質ゲルは脱水後に包埋されている。例えば、いくつかの実施形態では、固体の抗原／担体タンパク質ゲルは、増加するまたは段階的なアルコールの連続（例えば、増加するエタノール濃度の連続）への曝露によって脱水され、アルコールのキシレンとの交換、及びキシレンのパラフィンとの交換が後に続く。非限定的に、パラフィン（例えば、パラフィンブロックに包埋されている）；エポキシ、アクリル、もしくはプラスチック樹脂（例えば、ＥＰＯＮ（商標）樹脂、メタクリレート、ＬＲホワイト樹脂、アラルダイト（登録商標）、スパープラスチック、Ｌｏｗｉｃｒｙｌ（登録商標）など）；合成ワックス；パラフィンワックスとプラスチックポリマーのブレンドもしくはコポリマーアロイ；ポリエチレングリコール；及びＧＡＣＨ包埋媒体（グルタルアルデヒド−カルボヒドラジド）を含む、様々な媒体が当該技術分野で知られており、包埋に使用できる。
【００５０】
いくつかの実施形態では、担体タンパク質はゼラチンを含み、本開示の方法は、加熱された抗原／担体タンパク質液体溶液を冷却して、固体の抗原／担体タンパク質ゲルを形成することを含む。いくつかの実施形態では、方法はさらに、固体の抗原／担体タンパク質ゲルを固定剤とインキュベートすることと、固体の抗原／担体タンパク質ゲルを脱水することと、を含む。いくつかの実施形態では、抗原／担体タンパク質液体溶液は、約０．５％（ｗ／ｖ）以上の濃度の担体タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、抗原／担体タンパク質溶液が少なくとも約６５℃で（例えば、少なくとも６分間）加熱される。
【００５１】
いくつかの実施形態では、担体タンパク質は、例えば約１４ｍｇ／ｍＬの濃度のポリリジンを含む。
【００５２】
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、固体の抗原／担体タンパク質ゲルを包埋媒体（例えば、液体包埋媒体）中でインキュベートすることを含む。様々な包埋媒体が当該技術分野で知られており、非限定的に、Ｏｐｔｉｍｕｍ  Ｃｕｔｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（ＯＣＴ）コンパウンド（例えば、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（登録商標）Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンドまたはＴｉｓｓｕｅ−ｐｌｕｓ（登録商標）Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド）、ＰＥＬＣＯ（登録商標）凍結包埋コンパウンド、ＰｏｌａｒＳｔａｔ（商標）またはＰｏｌａｒＳｔａｔ  Ｐｌｕｓ（商標）包埋媒体、及びＴｉｓｓｕｅ  Ｆｒｅｅｚｉｎｇ  ＭｅｄｉｕｍまたはＴＦＭ（商標）を含み得る。これらの包埋媒体は、例えば、水溶性グリコール及び樹脂を含むことができ；例示的な包埋媒体ＯＣＴコンパウンドは、５〜１５％のポリビニルアルコール及び１〜１０％のポリエチレングリコールを含む。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、（例えば、固体の抗原／担体タンパク質ゲルを包埋媒体中でインキュベートした後に、）固体の抗原／担体タンパク質ゲルを凍結することを含む。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、固定されていない（例えば、固定剤を含まない）固体の抗原／担体タンパク質ゲルの凍結を含み、凍結した未固定の新規調製の組織試料の調製と同様である。
【００５３】
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、固体の抗原／担体タンパク質ゲルを１つ以上の固体の抗原／担体タンパク質ゲルの切片に薄切することを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の固体の抗原／担体タンパク質ゲルの切片は約３０ｎｍ〜約５０μｍの厚さを有する。いくつかの実施形態では、１つ以上の固体の抗原／担体タンパク質ゲルの切片は、約０．０３、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、または４８μｍ以上の厚さを有する。いくつかの実施形態では、１つ以上の固体の抗原／担体タンパク質ゲルの切片は、約５０、４８、４６、４４、４２、４０、３８、３６、３４、３２、３０、２８、２６、２４、２２、２０、１８、１６、１４、１２、１０、８、６、４、２、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、または０．１μｍ以下の厚さを有する。すなわち、１つ以上の固体の抗原／担体タンパク質ゲルの切片は、５０、４８、４６、４４、４２、４０、３８、３６、３４、３２、３０、２８、２６、２４、２２、２０、１８、１６、１４、１２、１０、８、６、４、２、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、または０．１μｍの上限と、０．０３、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、または４８μｍの独立して選択された下限とを有し、下限は上限未満である、厚さを有し得る。例えば、ＩＨＣ染色に使用される固体の抗原／担体タンパク質ゲルの切片は、例えば、約２μｍ〜約３０μｍの厚さを有し得、一方、ＥＭに使用される固体の抗原／担体タンパク質ゲルの切片は、例えば、約３０ｎｍ〜約５０μｍ、または約３０ｎｍ〜約１００ｎｍの厚さを有し得る。本開示の固体の抗原／担体タンパク質ゲルを薄切するための器具は、当該技術分野で知られており、非限定的に、ミクロトーム、クライオスタット（凍結ゲル用）、ナイフ（例えば、ダイヤモンド、ガラス、またはサファイア）などを含み得る。いくつかの実施形態では、固体の抗原／担体タンパク質ゲルは、薄切の前に脱水、包埋、固定、凍結、またはそれらの組み合わせが行われる。
【００５４】
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、固体の抗原／担体タンパク質ゲルを抗原賦活化に供することを含む。様々な抗原賦活化法が当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、固体の抗原／担体タンパク質ゲルを抗原賦活化に供することは、沸騰などによって固体の抗原／担体タンパク質ゲルを液体溶液中で加熱すること（例えば、熱誘導エピトープ賦活化）を含む。いくつかの実施形態では、液体溶液はＴｒｉｓ／ＥＤＴＡまたはクエン酸ナトリウムなどの緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、固体の抗原／担体タンパク質ゲルを抗原賦活化に供することは、１つ以上のタンパク質分解酵素（例えば、トリプシン、プロテイナーゼＫ、ペプシン、フィシン、もしくはプロナーゼ）、または抗原賦活化試薬（例えば、塩酸、ギ酸、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、クエン酸緩衝液、ＥＤＴＡ、クエン酸ＥＤＴＡ、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水、もしくは無水シトラコン酸）による処理を含む。抗原賦活化の詳細については、例えば、Ｓｈｉ，  Ｓ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｊ．  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．  ５９：１３−３２を参照されたい。
【００５５】
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、固体の抗原／担体タンパク質ゲルをブロッキングすることを含む。当該技術分野で知られているように、（例えば、ＩＨＣ染色の前の）ブロッキングは、特異的な抗原：抗体相互作用に関連しない部位への結合を妨げることにより、抗原との非特異的相互作用を低減する。様々な適切なブロッキング試薬が当該技術分野で知られており、非限定的に、血清またはタンパク質溶液（例えば、血清アルブミンタンパク質、ゼラチン、脱脂粉乳などを含む）を含む。
【００５６】
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、固体の抗原／担体タンパク質ゲルを固定すること（例えば、固定剤を抗原／担体タンパク質溶液に含めることにより）と、固体の抗原／担体タンパク質ゲルを脱水することと、脱水された固体の抗原／担体タンパク質ゲルを包埋することと、包埋した固体の抗原／担体タンパク質ゲルを含むパラフィンブロックを１つ以上の切片に薄切することと、１つ以上の切片を抗原賦活化に供することと、抗原賦活化の後に、１つ以上の切片をブロッキングすることと、を含む。他の実施形態では、本開示の方法は、固体の抗原／担体タンパク質ゲルを液体包埋媒体中でインキュベートすることと、固体の抗原／担体タンパク質ゲルを包埋媒体中で凍結することと、凍結した抗原／担体タンパク質ゲルを１つ以上の切片の薄切することと、１つ以上の切片をブロッキングすることと、を含む。
【００５７】
本開示の他の態様は、本開示の１つ、２つ、またはそれ以上の固体の抗原／担体タンパク質ゲル（複数可）を含む組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）に関する。例えば、本開示のＴＭＡは、本開示の固体の抗原／担体タンパク質ゲル（例えば、上述のようにパラフィンブロック中に包埋する）を調製し、固体の抗原／担体タンパク質ゲルを含むコアを打ち抜き、コアをレシピエントＴＭＡに移すことによって調製し得る。いくつかの実施形態では、コアは約１ｍｍの直径を有する。ＴＭＡを調製するための例示的な方法は、以下に記載され、例えば、コア（複数可）をドナーパラフィンブロックからレシピエントＴＭＡブロックに移し、次いで加熱（例えば、３７℃で一晩、次いで７０℃で１０分）、冷却、及びレシピエントＴＭＡブロックの薄切によるものである。いくつかの実施形態では、ＴＭＡには、異なる抗原を含む本開示の２つ以上の固体の抗原／担体タンパク質ゲルが含まれる。いくつかの実施形態では、ＴＭＡには、異なる濃度の同一の抗原を含む本開示の２つ以上の固体の抗原／担体タンパク質ゲルが含まれる。いくつかの実施形態では、ＴＭＡは、１つ以上の方向の参照（複数可）をさらに含み、例えば、識別のために着色顔料を含む。いくつかの実施形態では、ＴＭＡは組織学スライドのＴＭＡ切片である。理論に拘束されることは望まないが、本開示の固体の抗原／担体タンパク質ゲルは、例えば、一定範囲のエピトープ濃度及び／またはタイプを提供するために、ＴＭＡでの使用に特に有利であると考えられる。この範囲は、組織切片に隣接して提供することもできるため、定量分析の参照に便利となり得る。
【００５８】
ＩＩＩ．  固体の抗原／担体タンパク質ゲルのための使用
固体の抗原／担体タンパク質ゲル（例えば、上述のセクションＩＩに記載されている、及び／または以下の実施例に例示されている）は、ＩＨＣまたはＥＭ分析のための対照を含むがこれらに限定されない、様々なアプリケーションで使用できる。
【００５９】
いくつかの実施形態では、対照の抗原の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色のための方法は、目的の抗原の異なる濃度を表す本開示の複数の固体の抗原／担体タンパク質ゲル（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上など）を提供することを含む。例えば、この方法は、異なる濃度の精製抗原で作製された２つの固体の抗原／担体タンパク質ゲルを提供することを含み得る。いくつかの実施形態では、この方法は、固体の抗原／担体タンパク質ゲルを、抗原に特異的に結合し、検出可能な部分に結合する一次抗体と接触させることを含む。他の実施形態では、この方法は、固体の抗原／担体タンパク質ゲルを、抗原に特異的に結合する一次抗体と接触させることと、次いで固体の抗原／担体タンパク質ゲルを一次抗原に特異的に結合し、検出可能な部分に結合する二次抗体に接触させつことと、を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、複数の固体の抗原／担体タンパク質ゲルの１つ以上から検出可能な部分のシグナル（複数可）を検出することを含む。次いで、複数の固体の抗原／担体タンパク質ゲルから検出されたシグナルの量を検出し、必要に応じて、複数の固体の抗原／担体タンパク質ゲルのそれぞれに存在する抗原の量または濃度と比較して、様々なレベルの対照の抗原のＩＨＣ染色提供することができる。
【００６０】
いくつかの実施形態では、抗原／担体タンパク質ゲルの１つに抗原が含まれておらず（例えば、０ｎＭ）、このゲルのＩＨＣ染色からの検出可能なシグナルの欠如は、試料の陰性対照またはバックグラウンドＩＨＣ染色を示す。いくつかの実施形態では、方法は、試料を、抗原に特異的に結合し、検出可能な部分に結合する一次抗体と、または抗原に特異的に結合する一次抗体及び一次抗体に特異的に結合する二次抗体と接触させることと、試料からの検出可能な部分のシグナルを検出することと、を含む。次いで、試料から検出されたシグナルの量を、固体の抗原／担体タンパク質ゲル（複数可）から検出されたシグナル（複数可）の量と比較でき、例えば、試料に存在する抗原の量を、固体の抗原／担体タンパク質ゲル（複数可）に存在する既知の抗原の濃度または量と比較できる。
【００６１】
いくつかの実施形態では、対照の二次抗体による免疫組織化学（ＩＨＣ）染色のための方法は、異なる抗体アイソタイプを表す本開示の複数の固体の抗原／担体タンパク質ゲル（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上など）を提供することを含む。例えば、この方法は、異なる抗体アイソタイプを表す抗体で作製された２つの固体の抗原／担体タンパク質ゲルを提供することを含み得る。いくつかの実施形態では、この方法は、固体の抗原／担体タンパク質ゲルを、抗体アイソタイプの１つに特異的に結合し、検出可能な部分にコンジュゲートした二次抗体と接触させることを含む。対照の二次抗体の染色では、複数の固体の抗原／担体タンパク質ゲルからシグナルを検出できる。この例では、二次抗体は同族抗体アイソタイプに特異的に結合し、同族抗体アイソタイプを欠くゲルから検出されたシグナルはバックグラウンド染色を示す。したがって、同族抗体アイソタイプを含む固体の抗原／担体タンパク質ゲルに関連するシグナル、及び同族抗体アイソタイプを欠く固体の抗原／担体タンパク質ゲルに関連するシグナルの欠如の検出は、対照の二次抗体による染色を示す。
【００６２】
いくつかの実施形態では、抗原の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色の方法は、抗原及び試料を含む１つ以上の固体の抗原／担体タンパク質ゲルを提供することと；固体の抗原／担体タンパク質ゲル及び試料を、抗原に特異的に結合し、検出可能な部分に結合する一次抗体と接触させるか、または固体の抗原／担体タンパク質ゲル及び試料を、抗原に特異的に結合する一次抗体と接触させ、固体の抗原／担体タンパク質ゲル及び試料を、一次抗体に特異的に結合し、検出可能な部分に結合する二次抗体と接触させることと、固体の抗原／担体タンパク質ゲルから検出可能な部分のシグナルを検出することと、試料からの検出可能な部分のシグナルを検出することと、を含む。したがって、１つ以上の固体の抗原／担体タンパク質ゲルは、試料のＩＨＣ染色の陽性対照として使用できる。
【００６３】
試料及び本開示の固体の抗原／担体タンパク質ゲル（試料の抗原の染色の対照として使用される）中の抗原などの抗原のＩＨＣ染色のプロセス１００の例示的なフローチャートを、図１に示す。ブロック１０２において、分析のための試料を提供するために組織が収集され、及び／または本開示の固体の抗原／担体タンパク質ゲルが生成される（例えば、上述のセクションＩＩに記載されるように）。いくつかの実施形態では、固体の抗原／担体タンパク質ゲルは、試料に存在する場合と存在しない場合がある、目的の抗原（例えば、精製抗原）を含む。必要に応じて、ブロック１０４において、試料及び／または固体の抗原／担体タンパク質ゲルが固定される（例えば、上述のセクションＩＩで説明されているように）。いくつかの実施形態では、固体の抗原／担体タンパク質ゲルは、固定剤と共にインキュベートされる。他の実施形態では、固体のゲルを作製するために使用される抗原／担体タンパク質液体溶液は、固定剤を含む。必要に応じて、ブロック１０６において、試料及び／または固体の抗原／担体タンパク質ゲルが包埋される（例えば、上述のセクションＩＩで説明されているように）。ブロック１０４の必要に応じた代替として、ブロック１０６において、試料及び／または固体の抗原／担体タンパク質ゲルを包埋媒体中で凍結することができる。必要に応じて、ブロック１０８において、試料及び／または固体の抗原／担体タンパク質ゲルが薄切される（例えば、上述のセクションＩＩで説明されているように）。必要に応じて、ブロック１１０において、試料及び／または固体の抗原／担体タンパク質ゲルが抗原賦活化及びブロッキングに供される（例えば、上述のセクションＩＩで説明されているように）。
【００６４】
いくつかの実施形態では、ブロック１１２に示すように、試料と固体の抗原／担体タンパク質ゲルを、抗原に特異的に結合する一次抗体と接触させる。いくつかの実施形態では、一次抗体は検出可能な部分を含む。他の実施形態では、ブロック１１４に示すように、試料と固体の抗原／担体タンパク質ゲルを、一次抗体に特異的に結合する二次抗体と接触させる。いくつかの実施形態では、二次抗体は二次抗体にコンジュゲートした検出可能な部分（この例ではビオチン）を含む。
【００６５】
いくつかの実施形態では、検出可能な部分のシグナルが固体の抗原／担体タンパク質ゲル及び／または試料から検出される。以下に記載されるように、様々な検出可能な部分が企図される。この例では、発色検出法を使用する。ブロック１１６において、試料と固体の抗原／担体タンパク質ゲルを、二次抗体に結合する酵素複合体（例えば、ビオチン化二次抗体に結合するストレプトアビジンコンジュゲート酵素複合体）と接触させる。ブロック１１８において、試料と固体の抗原／担体タンパク質ゲルを、酵素複合体とのインキュベーション時に、固体の抗原／担体タンパク質ゲル中に、及び抗原が存在する場合は試料中に抗原が存在することを示す着色沈殿物を形成する、発色基質または色素原溶液と接触させる。
【００６６】
いくつかの実施形態では、本開示の固体の抗原／担体タンパク質ゲル中の抗原の存在は、直接検出によって、例えば、抗原に特異的に結合し、検出可能な部分に結合する抗体または他の抗原結合部分とのゲルのインキュベーションによって検出される。他の実施形態では、本開示の固体の抗原／担体タンパク質ゲル中の抗原の存在は、間接検出によって、例えば、抗原と特異的に結合する一次抗体または他の抗原結合部分、及び一次抗体または他の抗原結合部分に特異的に結合する二次抗体または他の抗原結合部分であって、二次抗体または他の抗原結合部分が検出可能な部分に結合する、二次抗体または他の抗原結合部分とのゲルのインキュベーションによって検出される。
【００６７】
本開示の固体の抗原／担体タンパク質ゲルと共に使用するために、様々な検出可能な部分が企図される。いくつかの実施形態では、検出可能な部分は、酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＰ）を含む。次いで、検出可能な部分を酵素の発色性基質に曝露し、酵素との反応時に発色性基質からのシグナルを検出することによりシグナルを検出する（例えば、ブロック１１６及び１１８について上述したように）。発色基質の例には、非限定的に、ＨＲＰによって茶色の生成物に変換される３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、及びＡＰによって赤色の生成物に変換される３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）が含まれる。代替的に、ペルオキシダーゼは、いくつかのレポーターの１つ（例えば、蛍光分子）にコンジュゲートしたチラミド部分を化学的に活性化でき；活性化されたチラミドコンジュゲートは、試料中の近接する分子と共有結合し、ペルオキシダーゼの位置に検出可能なシグナルを生成する。間接検出は発色染色にも使用できる。例えば、ビオチン化二次抗体をアビジンまたはストレプトアビジン標識酵素複合体とインキュベートしたり、デキストランなどのポリマーを１つ以上の二次抗体及び１つ以上の酵素複合体と結合したり、または酵素複合体を二次抗体に直接重合したりできる。いくつかの実施形態では、検出可能な部分は、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、ローダミンまたはその誘導体、ＴＲＩＴＣ、シアニン（Ｃｙ３）、フィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ）、ＣＦ（商標）などのフルオロフォアを含む。例えば、フルオロフォアは、一次抗体または二次抗体にコンジュゲートすることができ、またはペルオキシダーゼにより活性化された後に試料に共有結合することができるチラミド部分にコンジュゲートすることができる。いくつかの実施形態では、検出可能な部分は金などの金属粒子を含む。例えば、金粒子は、一次抗体または二次抗体に、コンジュゲートされ得、例えば、免疫ＥＭによって画像化され得る。いくつかの実施形態では、検出可能な部分は３５Ｓ、１２５Ｉ、または１３１Ｉなどの放射性同位元素を含み、例えば、放射免疫検出によって画像化される。例えば、放射性同位元素は、一次抗体または二次抗体にコンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態では、検出可能な部分は、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸を含む。例えば、核酸は、一次抗体または二次抗体にコンジュゲートされ得る。一次抗体または二次抗体は、質量分析計または質量サイトメーターで検出可能な金属イオンに結合できる［ＣＹＴＯＦ  ａｎｄ  ＭＩＢＩ；ｓｅｅ  Ｇｉｅｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２０１４  Ａｐｒ；１１（４）：４１７−２２、及びＡｎｇｅｌｏ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．  ２０１４  Ａｐｒ；２０（４）：４３６−４２に従って］。一次抗体または二次抗体は、固体状態、半導体、または炭素ベースのナノ粒子（例えば、「量子ドット」）に結合でき、蛍光イメージングで検出できる［Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００３  Ｊａｎ；２１（１）：４１−６を参照されたい］。一次抗体または二次抗体は、化学発光基質とのインキュベーションによって検出される西洋ワサビペルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼに結合できる。一次抗体または二次抗体を電気化学発光レポーターに結合できる（例えば、ルテニウム；Ｖａｌｅｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．  ２０１７  Ｎｏｖ  ８を参照されたい）。
【００６８】
ＩＶ．  キット及び製品
本開示の特定の態様は、固体の抗原／担体タンパク質ゲルを含むキットまたは製品に関する。
【００６９】
いくつかの実施形態では、本開示のキットは、精製抗原を含む本開示の第１の固体の抗原／担体タンパク質ゲルと、第１の固体の抗原／担体タンパク質ゲルとは異なる濃度で精製抗原を含む本開示の第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲルとを含む。
【００７０】
いくつかの実施形態では、第１及び／または第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲル（複数可）は、例えば、上述のセクションＩＩで説明したように、薄切される。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２の固体の抗原／担体タンパク質ゲル（複数可）は、例えば、上述のセクションＩＩで説明したように、固体基体に固定される。
【００７１】
いくつかの実施形態では、本開示のキットは、精製抗原を含まない、本開示の第３の固体の抗原／担体タンパク質ゲルをさらに含む（例えば、陰性対照として使用するため）。いくつかの実施形態では、第３の固体の抗原／担体タンパク質ゲルは、例えば、上述のセクションＩＩで説明したように、薄切される。いくつかの実施形態では、第３の固体の抗原／担体タンパク質ゲルは、例えば、上述のセクションＩＩで説明したように、固体基体に固定される。
【００７２】
いくつかの実施形態では、キットは、例えば、上述のセクションＩＩＩで説明した方法のいずれかに従って、キットを使用するための指示書をさらに含むことができる。
【実施例】
【００７３】
本開示は、以下の実施例を参照することにより、より完全に理解されるであろう。しかしながら、実施例は、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に記載される実施例及び実施形態は例示のみを目的とするものであり、それを考慮した様々な修正または変更が当業者に示唆され、それらは本出願及び添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲内に含まれることは理解されよう。
【００７４】
実施例１：ＩＨＣ対照へのプラットフォームアプローチとしてＢＳＡゲルを検証する
図１は、組織試料におけるＩＨＣ染色の例示的なワークフロー１００を示す。重要なことに、ＩＨＣ染色は、標的の発現レベルだけでなく、その細胞内及び組織分布も示す。
【００７５】
次の実施例では、幅広いターゲットに適応できるＩＨＣ対照を生成するための新しいプラットフォームアプローチについて記載する。このアプローチは、３＋陽性対照組織を同定できる標的であるヒトＢＣＬ２を使用して検証された（例えば、このアッセイでは、ヒト慢性リンパ性白血病の腫瘍試料はしばしば３＋としてスコア付けされる）が、入手が困難であるか、染色対照として日常的に使用するための倫理的考慮事項によって制限される。このアプローチの一般性は、マウスとラットのＩｇＧと目的のヒトタンパク質を使用して実証された。
【００７６】
方法
約０〜１０−４Ｍの標的エピトープを含む約０〜０．５ｍｇの抗原を、１．５ｍＬマイクロ遠心チューブ内で０．５ｍＬのＰＢＳ中の２５％ＢＳＡと混合した。０．５ｍＬの３７％ホルムアルデヒドをチューブに加えた。チューブを８５℃で１０分間加熱し、固定剤（例えば、ホルマリン）が含まれている場合は、室温で一晩放置して固化させた。得られたゲルをチューブから取り出し、１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）に入れた。続いて、キシレンへの段階的なアルコールを介してゲルを脱水し、温パラフィンワックスを浸透させ、パラフィンブロック中に包埋し、ミクロトームで薄切し、標準的なＩＨＣ法に従って、一次マウスモノクローナル抗ＢＣＬ２抗体１２４及びホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）発色酵素／基質システムを使用して染色した。
【００７７】
ＩＦ検出アッセイは、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｕｌｔｒａ自動染色装置で発色した。標的ＢＳＡ／ペプチド試料を含む４ミクロンの切片を切り取り、脱パラフィンし、ＣＣ１細胞調整溶液で前処理した。一次マウスモノクローナル抗ＢＣＬ２抗体１２４を１６分間３７℃でインキュベートし、ＯｍｎｉＭＡＰ抗マウスＨＲＰ検出システムで８分間検出した後、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒｅｄ６１０検出システムで１６分間検出した。
【００７８】
スライド全体の明視野及び免疫蛍光画像は、２０×０．７５のＮＡ対物レンズと蛍光モジュールを備えたＨａｍａｍａｔｓｕ  Ｎａｎｏｚｏｏｍｅｒ−ＸＲデジタルスライドスキャナーを使用して、０．４６ミクロン／ピクセルのスキャン解像度で取得された。明視野イメージングが実行され、焦点合わせに使用された。適用されるとき、免疫蛍光シグナルは、１倍の露光（３．４ｍｓ光子収集）と１倍のゲインでＴＲＩＴＣフィルターを使用して取得した。自家蛍光は、ＤＡＰＩ（２倍露光、６．８ｍｓ光子収集、２倍のゲイン）及びＣＦＰフィルター（４倍露光、１３．６ｍｓ光子収集、２倍のゲイン）を使用してキャプチャした。全ての免疫蛍光取得について、光力を５０％に設定した。画像解析はＭａｔｌａｂバージョン９．３を使用して実行された。関心領域（ＲＯＩ）は手動でマークアップ（明視野スキャンのみ）するか、自己蛍光チャネルでしきい値処理と形態学的フィルタリングを使用して生成し、強度測定のためにＴＲＩＴＣチャネルに転送した。平均グレースケール強度は、８ビットの深さで計算された。平均光学吸光度（明視野ＤＡＢ標識）またはエミッタンス（蛍光標識）は、ＲＯＩ内の全てのピクセル吸光度またはエミッタンス値（以下のそれぞれの自然対数式で計算）を合計して計算され、総ＲＯＩピクセル数に正規化された。全てのゼロピクセルグレースケール強度値は、１の値を使用して概算された。明視野ピクセル吸光度＝ｌｏｇ（２５５／ピクセルグレースケール強度）。蛍光ピクセルのエミッタンス＝ｌｏｇ（ピクセルグレースケール強度）。
【００７９】
検証実験では、ＢＳＡゲル試料を上述のようにマイクロ遠心チューブで生成し、パラフィンブロックに包埋し、パラフィンブロックから切り取られた６００ミクロン直径のシリンダーの組織マイクロアレイを作成し、標準的な組織マイクロアレイ技術を使用してアレイに再包埋した。
【００８０】
ＢＣＬ２実験のために、配列Ａｃ−
2021505878.tif 000003
−アミド（配列番号１）を含むペプチドを使用した。下線が付されたアミノ酸は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ１０４１５に記載されているように、ヒトＢＣＬ２配列の野生型（変異していない）アミノ酸４１〜５４に対応する。このペプチドには、アルデヒド（例えば、ホルムアルデヒド）との結合を可能にするアセチル−Ｙ（チロシン）を含むアミノ末端リンカー配列（Ａｃ−ＹＧＳＧ）（配列番号６）、及び様々な架橋試薬、例えばマレイミド、ハロアセチル、またはピリジルジスルフィド含有化合物と反応性であるＣ（システイン）−アミドを含むカルボキシ末端リンカー配列（ＧＳＧＣ−アミド）（配列番号７）が含まれる。
【００８１】
結果
ＢＳＡ／ペプチドゲルは上記のように調製された。ゲルを生成する前に、抗原（例えば、ペプチド）をＢＳＡと溶液中で混合することにより、ペプチドを均一に混合することができた。得られたゲル（図２Ａ）は、任意の所望の形状で構築することができる（この例では、ゲルは、１．５ｍＬのマイクロ遠心チューブの形状で製造された）。ゲルを薄切して（図２Ｂ及び２Ｃ）、抗原賦活化、ブロッキング、一次／二次抗体のインキュベーション、及び検出（例えば、酵素／基質アプローチを使用）などの典型的なＩＨＣ処理ステップに供することもできる。例えば、図２Ｄは、脱水及びパラフィン処理のために準備されたスライスされたゲル部分を示し、図２Ｅは、パラフィンドナーブロックに包埋された、スライスされたゲル部分を示す。図２Ｆは、様々なパラフィンゲルドナーブロックから作成されたＴＭＡを、方向基準のための黒色と緑色の顔料を含むコアと共に示す。ペプチド抗原は、リゾチームよりも効率的にＢＳＡに架橋できるため、ＩＨＣ処理及び検出中に抗原をＢＳＡゲルに保持する。
【００８２】
ＩＨＣ対照としてのペプチド／ＢＳＡゲルの実現可能性を調べるために、様々な濃度のＢＣＬ２ペプチドをＢＳＡゲルに混合し、標準的なＩＨＣ手法に従って薄切及び調製した。ＢＣＬ２は、ヒトＢＣＬ２タンパク質に対するＢＣＬ２一次抗体（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓの「ＣＯＮＦＩＲＭ抗ｂｃｌ−２（１２４）マウスモノクローナル一次抗体」ＢＣＬ２）、ビオチン化二次抗体、発色性レポーターとしてのアビジンコンジュゲートＨＲＰ、及び発色基質としてのＤＡＢを使用して検出された。図３Ａに示すように、０から０．５ｍｇ／ｍＬ（２．５×１０−４Ｍ）までの連続的に増加したＢＣＬ２レベルにより、ＩＨＣ染色強度が段階的に増加した。ＢＣＬ２ペプチドは５×１０−５ｍｇ／ｍＬ（２５ｎＭペプチド濃度に対応）から０．５ｍｇ／ｍＬ（２．５×１０−４Ｍペプチド濃度に対応）までの試験範囲全体で解像可能であったのに対し、ペプチドを欠く陰性対照は染色をもたらさなかった。重要なことに、１＋、２＋、及び３＋のＢＣＬ２染色レベルは、それぞれ異なるペプチド濃度で達成された。一貫して均一な３＋ＢＣＬ２染色は、典型的には、すぐに入手できる組織試料で見つけるのが困難であるため、この代替的なアプローチは、様々な種類の組織をアッセイするよりも簡単でより標準化された方法でＢＣＬ２発現対照の勾配を取得できる。
【００８３】
染色の一貫性を調べるために、上述のようにＢＣＬ２ペプチド／ＢＳＡゲルを染色し、得られた画像をＭＡＴＬＡＢを使用して分析することにより、６つの独立した実験を行った。ペプチド濃度の関数としての光学密度（ＯＤ；図３Ｂ）と画像強度（図３Ｃ）の両方の分析は、染色が実験間で一貫していることを示した。
【００８４】
ＢＣＬ２ペプチド／ＢＳＡゲルはまた、定量的な免疫蛍光染色に供された。発色染色を使用して得られた結果と同様に、ＩＦ分析は、ペプチド濃度の関数として染色強度の段階的増加を示した（図３Ｄ）。光学エミッタンス（図３Ｈ）及びシグナル強度（図３Ｊ）の分析は、染色の一貫した段階的な増加を再び示した。ナイーブ対照一次抗体による陰性対照染色（図３Ｆ、３Ｉ、及び３Ｋ）またはゲルの自己蛍光（図３Ｅ及び３Ｇ）は、予想通り、強度の増加を示さなかった。
【００８５】
二次抗体対照も調べられた。ロバ抗マウス二次抗体を使用すると、ＢＳＡゲルに包埋されたマウスＩｇＧが容易に検出されたが、図４Ａに示すように、ラットＩｇＧは検出可能なシグナルをもたらさなかった。同様に、ロバ抗ラット二次抗体を使用すると、ＢＳＡゲルに包埋されたラットＩｇＧが容易に検出されたが、マウスＩｇＧは検出可能なシグナルをもたらさなかった（図４Ｂ）。これにより、ＢＳＡゲルアプローチの特異性が確認され、二次抗体が抗体の標的を欠くペプチド／ＢＳＡゲルに非特異的に結合しないことが示される。
【００８６】
染色の特異性を調べるために、抗ＢＣＬ２クローン１２４抗体エピトープに臨床的に関連のある単一アミノ酸置換を持つ６つのペプチドを合成し、上述のようにＢＳＡに包埋し、染色した。図４Ｃに示すように（及び図３Ｄ、３Ｈ、３Ｊに見られるように）、これらの変異はＩＨＣ染色に明確な影響（すなわち、特定のアミノ酸置換に応じて、シグナル強度の様々な程度の減少）を示し、染色強度に対する特定のアミノ酸置換の影響を定量化することの実用性を実証した。
【００８７】
続いて、ペプチド／ＢＳＡゲルプラットフォームの一般性を、目的の標的を特異的に検出するためにいくつかの特性評価されていない抗体をスクリーニングすることによって調べた。ヒトＫＳＲ２で免疫されたマウスから単離された２７の抗体クローンを、陽性及び陰性の対照の検出のためにＩＨＣによってスクリーニングした（図５Ａ〜５Ｄ）。陰性対照には、タンパク質またはペプチドを追加していないＢＳＡゲルを使用した。陽性対照のために、ＢＳＡゲルは、マウスを免疫するために使用されたヒトＫＳＲ２タンパク質で生成された。予想通り、候補抗体クローンは未固定のヒト標的タンパク質を結合するための別のプロセスで選択されていたため、ほとんどの抗体クローンはタンパク質／ＢＳＡゲルでヒトタンパク質を検出することができた（バックグラウンドを超える強度のＤＡＢシグナルで証明される）。しかしながら、ＩＨＣアッセイでの使用に最も適した抗体は、陰性対照ではほとんどまたはまったく検出可能なシグナルを示さないと同時に、陽性対照では強い染色を示す。試験された抗体の中で、クローン５、６、７、１１、１２、１５、及び２３が、標的抗原の特異的染色対陰性対照試料における非特異的染色の比率が最も高いため、最も有望であった。対照的に、クローン４、１３、２６、及び２７は標的抗原の効果のない染色を示したが、抗体１０及び２０は陰性対照試料の弱いが顕著な非特異的染色を示した。これらの結果は、未固定状態で目的の標的に結合できる全ての抗体がＩＨＣ染色での使用に適しているわけではないという問題を示すのに役立った。ここで記載するペプチド対照試薬及びプロセスは、ＩＨＣ用途での使用に最も適した抗体の同定に役立ち得る。
【００８８】
まとめると、これらの結果は、抗原／ＢＳＡゲルアプローチが、多くの標的抗原に適用可能なＩＨＣ対照を生成するための堅牢なプラットフォームを提供することを示す。このアプローチにより、標的濃度の範囲と相関するＩＨＣ染色の勾配を表す対照が得られ、標的／ＢＳＡゲルの定量の可能性が示される。組織や細胞株からのＩＨＣ対照とは異なり、ペプチド／ＢＳＡゲルは、必要に応じて、実験室で簡単に作成でき、一貫性があり、再現可能で、安価で、用途が広く、抗原特異的である。二次抗体対照は、アプローチの特異性を示した。さらに、このアプローチは、少数（例えば、２〜５）のリードをさらなる特性評価のために同定するための、目的の標的のＩＨＣ分析に適した抗体を同定する、典型的に数百から数千の候補抗体をスクリーニングするプロセスで理想的である。
【００８９】
実施例２：ゲル形成の条件を調べる
次の実施例では、ゲル形成への影響について様々な条件を試験することについて記載する。
【００９０】
方法
ＢＳＡゲル形成の評価のために、ＰＢＳ中のＢＳＡ溶液１ｍＬを２５〜８５℃の範囲の温度で加熱した。ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液にはホルムアルデヒドは含まれていなかった。溶液を連続的に加熱し、加熱条件下で液／固相の様々な時点で観察した。溶液は、ＢＳＡ濃度２５％、２０％、１５％、１０％、５％、及び２％で試験された。
【００９１】
ゲルを作製するための他のタンパク質源の評価のために、ＰＢＳで次のものの２５％溶液を生成した：カゼイン、ラクトアルブミン、大豆粉、及び脱脂粉乳。３７％ホルムアルデヒド５００μＬをそれぞれ２５％タンパク質／ＰＢＳ溶液５００μＬと混合し、８５℃で１０分間インキュベートした。
【００９２】
固定剤の評価のために、５００μＬの固定剤をＰＢＳ中の５００μＬの２５％ＢＳＡ溶液と混合し、８５℃で１０分間インキュベートした。試験された固定剤には、１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）、１／２強度のＫａｒｎｏｖｓｋｉ（グルタルアルデヒド／パラホルムアルデヒド）、Ｍｅｔｈａｃａｒｎ、Ｃａｒｎｏｙの溶液、及びＢｏｕｉｎのものが含まれていた。
【００９３】
ホルムアルデヒド濃度の評価のために、５００μＬのホルムアルデヒド溶液をＰＢＳ中の５００μＬの２５％ＢＳＡ溶液と混合し、８５℃で１０分間インキュベートした。ホルムアルデヒド溶液は、次の濃度で試験された（濃度は、ＢＳＡ溶液で希釈する前の元の濃度を指す）：１％、２％、４．５％、９％、及び１８％。具体的には、３７％のホルムアルデヒド原液を蒸留水と混合して、１％、２％、４．５％、９％、または１８％のホルムアルデヒドを含む５００マイクロリットルの最終容量を作成し、次いで、これらの溶液（それぞれ別のマイクロチューブ中）を等量（５００マイクロリットル）の２５％ＢＳＡ溶液と混合し、上述のように加熱した。
【００９４】
結果
図６は、２５％ＢＳＡゲル形成に対する加熱温度と時間の影響を示す。２５℃または４５℃で加熱しても、一晩加熱した後でもゲルは形成されなかった。５５℃では、ゲル形成は一晩加熱した後にのみ観察された。しかしながら、６５℃または８５℃に加熱すると、固体のゲル形成がそれぞれ６分以内及び２分以内に観察された。これらの結果は、ＢＳＡゲル形成に対する加熱温度と時間の影響を示す。
【００９５】
続いて、ゲル形成に対するＢＳＡ濃度の影響を試験した。ＢＳＡは次の濃度でＰＢＳに溶解した：２５％、２０％、１５％、１０％、５％、及び２％。図７に示すように（２５％ＢＳＡの結果を図６に示す）、８５℃に加熱すると全ての濃度でゲル形成が観察された。５％以上のＢＳＡ濃度では、ゲル形成が１０分以内に観察されたが、２％ＢＳＡ溶液は２０分後にゲルを形成した。４５℃または５５℃に加熱した後、ゲルの形成は全ての時間で観察されなかった。これらの結果は、広範なＢＳＡ濃度が適切な加熱条件下でＢＳＡゲルを生成できることを示す。
【００９６】
続いて、カゼイン、ラクトアルブミン、大豆粉、及び脱脂粉乳を、それらのゲルを形成する能力について試験した。上述のように、ホルムアルデヒド（最終濃度：１８．５％）と混合した後、ＰＢＳ中の最終濃度１２．５％のそれぞれを試験した。これらの条件下では、大豆粉のみがゲルを形成することが観察されたが、得られた固体は均一ではなかった。これらのデータは、ゲル形成の促進における血清アルブミンの独自の特性を示す。
【００９７】
次いで、１０％ＮＢＦ、１／２強度Ｋａｒｎｏｖｓｋｉ（グルタルアルデヒド／パラホルムアルデヒド）、Ｍｅｔｈａｃａｒｎ、Ｃａｒｎｏｙの溶液、及びＢｏｕｉｎを含む様々な固定剤を、ＢＳＡゲルを形成する能力について試験した。これらのうち、１０％ＮＢＦとＭｅｔｈａｃａｒｎは固体を形成できなかった。Ｃａｒｎｏｙは混合される前に固体を形成した。１／２ＫａｒｎｏｖｓｋｉとＢｏｕｉｎの固定剤は明確な固体を形成した。
【００９８】
ゲル形成に対するホルムアルデヒド濃度の影響もまた試験した。ホルムアルデヒドの全ての濃度は、１％を除いて、固体のゲル形成を促進することができた。これらの結果は、ゲル形成に対する固定剤の効果を示す。
【００９９】
実施例３：ゲル形成のための他の基質の評価
次の例では、ＩＨＣ染色に適したゲルを形成する能力について、追加のタンパク質を評価することについて記載する。
【０１００】
方法
ＢＳＡ（最終濃度２５％で使用）、卵白タンパク質または卵白タンパク質の混合物（最終濃度２５％で使用）、ゼラチン（最終濃度１０％で使用）、ラクトアルブミン（最終濃度２５％で使用）、肝臓タンパク質粉末、大豆粉（最終濃度２５％で使用）、カゼイン（最終濃度１０％で使用）、及び脱脂粉乳（最終濃度２５％で使用）は、ＩＨＣ染色に適した固体のゲルを生成する能力について評価された。タンパク質溶液を３７％ホルムアルデヒドと混合し、８５℃で１０分間加熱した。
【０１０１】
各タイプのゲルは、０．１ｍｇ／ｍＬの正常ウサギＩｇＧ（ＤＡ１Ｅ）を伴って、または伴わずに作成された。切片をロバ抗ウサギビオチン化二次抗体５μｇ／ｍＬで染色した後、ＡＢＣ−ＨＲＰで検出した。
【０１０２】
ゼラチンゲルの場合、１０％溶融ゼラチンを０．１ｍｇ／ｍＬの正常ウサギＩｇＧ（ＤＡ１Ｅ）と混合し、次いで４℃で１時間冷却し、１０％ＮＢＦに一晩移し、７０％エタノールに２日間移し、組織のようにＩＨＣ染色のために処理した。ラクトアルブミン及び肝臓タンパク質粉末ゲルの場合、Ｈｉｓｔｏｇｅｌ（商標）がゲルを固化するために追加された。カゼインゲルの場合、溶液を形成するために必要に応じて攪拌しながら、１００ｍＭのＮａＯＨを滴下してｐＨを８．０にした。
【０１０３】
ゲルのイメージングでは、スライドをＨａｍａｍａｔｓｕ  Ｎａｎｏｚｏｏｍｅｒでスキャンし、デジタル画像は画像表示ソフトウェアを使用してキャプチャした。
【０１０４】
結果
例えば、ＩＨＣ染色を可能にし、ガラスＩＨＣスライドに付着する均一なゲルを形成することにより、ＩＨＣ染色に適したゲルを形成する能力について、追加の基質タンパク質を試験した。図８に示すように、ＢＳＡに加えて、卵白タンパク質または卵白タンパク質の混合物、及びゼラチンは、低い非特異的染色（ウサギＩｇＧを含まないゲルを抗ウサギ二次抗体で染色した後）で、特異的なＩＨＣ染色を示すゲルを形成した（この場合、ウサギＩｇＧ抗体試料を含むゲルを抗ウサギ二次抗体で染色した後）。対照的に、ラクトアルブミン、肝臓タンパク質粉末、または大豆粉から生成されたゲルは、均一なゲルを生成できなかった（図９）。カゼインまたは脱脂粉乳から生成されたゲルは、ＩＨＣスライドに付着できなかった（図１０）。各ゲル基質の記載及び試みられたゲル形成から生じる物質は表Ａに提供されている。
【０１０５】
表Ａ  様々な基質から作られたタンパク質ゲル。
2021505878.tif 000004
【０１０６】
要約すると、ＢＳＡ、卵白タンパク質（複数可）、及びゼラチンは、特異的なＩＨＣ染色に適したゲルを提供しました。他のタンパク質基質は、均一なゲルを形成できなかったか、またはＩＨＣ処理中にスライドに接着できなかった。
【０１０７】
実施例４：ゲル中の抗原の検出
上述の合成ＩＨＣ対照コンセプトは、ＩＨＣアッセイのキャリブレーション及び品質管理を含む、研究及び臨床での使用に関連する概念実証アプリケーションを使用してさらに分析された。
【０１０８】
方法
ペプチド及びタンパク質
ペプチドは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  （Ｇａｒｄｎｅｒ，  ＭＡ）によって＞９５％の純度で合成された。ヒトＢＣＬ２タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ１０４１５）のアミノ酸４１〜５４は、ホルムアルデヒドとの架橋を促進するためのアセチル化チロシンを含む４つのアミノ酸及びスペーサー配列ＧＳＧによってＮ末端で延長された。Ｃ末端にはＧＳＧスペーサー配列が含まれ、その後にホルムアルデヒド（Ｍｅｔｚ，  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７９：６２３５−６２４３）；Ｔｏｅｗｓ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  （２００８）  Ａｎａｌ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ  ６１８：１６８−１８３）またはスルフヒドリル反応性試薬との架橋を容易にするシステインアミドが含まれる。２２アミノ酸のペプチド配列全体は、Ａｃ−ＹＧＳＧＧＡＡＰＡＰＧＩＦＳＳＱＰＧＧＳＧＣ−アミド（配列番号１）である。ヒトＭＹＣタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０１１０６）由来の配列を含む追加のペプチドを合成した：Ａｃ−ＹＧＳＧＮＲＮＹＤＬＤＹＤＳＶＱＰＹＦＹＧＳＧＣ−アミド（アミノ酸９〜２４；配列番号２）；Ａｃ−ＹＧＳＧＤＳＶＱＰＹＦＹＣＤＥＥＥＮＦＹＧＳＧＣ−アミド（アミノ酸１７〜３２；配列番号３）；Ａｃ−ＹＧＳＧＱＱＱＳＥＬＱＰＰＡＰＳＥＤＩＷＧＳＧＣ−アミド（アミノ酸３５〜５０；配列番号４）；Ａｃ−ＹＧＳＧＦＥＬＬＰＴＰＰＬＳＰＳＲＲＳＧＧＳＧＣ−アミド（アミノ酸５３〜６８；配列番号５）。ヒトＭＣＬ１（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ０７８２０）の第１エクソン由来の１３アミノ酸を含む陰性対照ペプチドを、上述と同じＮ末端及びＣ末端の配列延長を含んで合成した。いくつかの実験では、アルギニン、セリン、またはチロシンが、上記のペプチドのＮ末端及びＣ末端のアミノ酸を置き換えた。凍結乾燥したペプチドを、最小量の蒸留水、ＤＭＳＯ、またはジメチルホルムアミドに溶解した。ＲＡＳ２のキナーゼ抑制因子（ＫＳＲ２；Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ６ＶＡＢ６）のＣ末端の３０１アミノ酸（アミノ酸６５０〜９５０）は、７０１アミノ酸のＮ末端［Ｈｉｓ］６タグ付きマルトース結合タンパク質（アミノ酸９〜３９９）融合コンストラクトとして発現した。融合タンパク質は、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉＴｎｉ  Ｐｒｏ昆虫細胞（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｄａｖｉｓ、ＣＡ）でバキュロウイルスコンストラクトとして発現され、その後、ニッケルニトリロ三酢酸親和性、アミロース親和性、及びＳｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｓ２００サイズ排除クロマトグラフィーで逐次的に精製された。精製されたマウスＩｇＧ１クローンＭＯＰＣ−３１Ｃ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ）、ラットＩｇＧ１クローンＲ３−３４（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ）、及びウサギＩｇＧクローンＤＡ１Ｅ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）は市販のものを入手した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｕｌｔｒａ  Ｐｕｒｅ）はＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）から購入した。食品グレードのゼラチンと乾燥卵白は、それぞれＫｎｏｘ（Ｏａｋｂｒｏｏｋ，  ＩＬ）及びＪｕｄｅｅｓ  Ｇｌｕｔｅｎ  Ｆｒｅｅ（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，  ＯＨ）からのものであった。
【０１０９】
タンパク質マトリックスゲル
特に明記しない限り、２５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に所望の抗原を含む０．５ｍＬの溶液を１．５ｍｌのマイクロチューブで等量の３７％ホルムアルデヒドと混合し（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｈａｔｆｉｅｌｄ，  ＰＡ）、８５℃で１０分間加熱して溶液を凝固させ、室温で一晩固定した。試薬の最終濃度は１２．５％（１．８ｍＭ）ＢＳＡ及び１８．５％（６．２Ｍ）ホルムアルデヒドであった。ペプチド抗原は、固定ゲルで２．５×１０−８Ｍ〜２．５×１０−４Ｍの最終濃度を有した。ナイーブのマウス、ラット、ウサギのＩｇＧを含むゲルは０．１ｍｇ／ｍｌ（６．７×１０−７Ｍ）ＩｇＧの最終濃度を有した。ヒト［Ｈｉｓ］６−ＭＢＰ−ＫＳＲ２融合タンパク質は、０．５ｍｇ／ｍｌ（６．３×１０−６Ｍ）の最終ゲル濃度を有した。
【０１１０】
代替的な固定プロトコールの試験では、ホルマリンを含まない亜鉛固定剤（カタログ番号５５２６５８、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ）を３７％ホルムアルデヒドとＮＢＦの代わりに上述のプロトコールで使用した。他の実験では、ＰＢＳ中の２５％ＢＳＡ中の抗原は、ホルムアルデヒドの非存在下で８５℃で１０分間加熱することにより固化した。次いで、固化したゲルを１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ；ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  ＬＬＣ，  Ｒａｄｎｏｒ，  ＰＡ）、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ；ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  ＬＬＣ，  Ｒａｄｎｏｒ，  ＰＡ）、または亜鉛固定剤に移し、室温で一晩固定した。
【０１１１】
組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）の構築
組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）は、ＴＭＡ  Ｇｒａｎｄ  Ｍａｓｔｅｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｅｒ  （３ＤＨＩＳＴＥＣＨ，  Ｂｕｄａｐｅｓｔ，  Ｈｕｎｇａｒｙ）を使用して構築された。直径１ｍｍの二重のコアを、所望のタンパク質ゲルを含むドナーパラフィンブロックから打ち抜き、次いでレシピエントパラフィンブロックに移した。完成したレシピエントのＴＭＡブロックを３７℃で一晩加熱し、次いで７０℃で１０分間加熱した後、冷却して薄切した。
【０１１２】
ＩＨＣ染色
使用した一次抗体は、マウス抗ヒトＢＣＬ２クローン１２４（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｔｕｃｓｏｎ，  ＡＺ）、ウサギ抗ヒトＢＣＬ２クローンＥＰＲ１７５０９（Ａｂｃａｍ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ）、ウサギ抗ヒトＢＣＬ２クローンＳＰ６６（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｔｕｃｓｏｎ，  ＡＺ）、ウサギ抗ヒトＢＣＬ２クローンＥ１７（Ａｂｃａｍ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ）、ウサギ抗ヒトＭＹＣクローンＹ６９（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｔｕｃｓｏｎ，  ＡＺ））、及びウサギ抗ヒトＭＣＬ１クローンＳＰ１４３（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｔｕｃｓｏｎ，  ＡＺ）であった。Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  ＥＰＲ１７５０９−１４６Ｎｄ抗体は、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  ＣＡ）から購入した。［Ｈｉｓ］６−ＭＢＰ−ヒト融合タンパク質に対する２７個のマウスハイブリドーマ抗体のパネルがＣｈｅｍｐａｒｔｎｅｒ（Ｓｈａｎｇｈａｉ，  Ｃｈｉｎａ）で生成された。ビオチン化ロバ抗ウサギ、ラット、及びマウス二次抗体は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。染色プロトコールの詳細を表１にまとめる。
【０１１３】
表Ｂ  ＩＨＣプロトコール
2021505878.tif 000005
2021505878.tif 000006
【０１１４】
４ミクロンのパラフィン切片を脱パラフィンし、キシレン及び段階的アルコールで再水和した。染色は、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  ＸＴ、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＸＴ、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  Ｕｌｔｒａ  ＸＴ機器（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｔｕｃｓｏｎ，  ＡＺ）またはＤａｋｏ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ，  Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，  ＣＡ）で行った。最適化された抗体プロトコールに応じて、切片をＣｅｌｌ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １（ＣＣ１）（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｔｕｃｓｏｎ，  ＡＺ）またはＴａｒｇｅｔ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ｐＨ６（使用準備済）（Ｄａｋｏ  −  Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，  ＣＡ）で前処理した。Ｖｅｎｔａｎａ機器で染色されたスライドは、Ｖｅｎｔａｎａヘマトキシリンとブルーイング試薬（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｔｕｃｓｏｎ，  ＡＺ）でそれぞれ４分間対比染色された。Ｄａｋｏ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒで染色されたスライドは、Ｍａｙｅｒのヘマトキシリン（Ｒｏｗｌｅｙ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，  Ｄａｎｖｅｒｓ，  ＭＡ）及びＲｉｃｈａｒｄ−Ａｌｌｅｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｂｌｕｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ）でそれぞれ１分間対比染色された。染色された切片は、封入の前に段階的アルコールでキシレンに脱水された。免疫蛍光スライドは、Ｐｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄマウンティングメディア（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）で封入された。
【０１１５】
Ｆｌｕｉｄｉｇｍ染色手順
切片を７０℃で３０分間ベイクし、脱パラフィンし、降順のＥｔＯＨ連続段階で再水和し、Ｔａｒｇｅｔ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ｐＨ６（Ｄａｋｏ  −  Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，  ＣＡ）で前処理し、ＰＢＳ中の１０％ロバ血清、３％ＢＳＡで３０分間ブロッキングし、次いでブロッキング緩衝液中の１４６Ｎｄ−ＥＰＲ１７５０９とインキュベートした。スライドを封入なしで加湿密閉容器内で４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳで３回リンスし、２％グルタルアルデヒド／ＰＢＳで２０℃スライドで５分間後固定し、ｄｄＨ２Ｏでリンスし、ＥｔＯＨ連続段階で脱水し、風乾し、イメージングまで２０℃で保管した。
【０１１６】
イメージング質量分析
１４６Ｎｄ標識ＥＰＲ１７５０９で染色されたＴＭＡコアは、各ＴＭＡコアに１５０ミクロン四方のアブレーション関心領域（ＲＯＩ）を定義することにより、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｈｙｐｅｒｉｏｎイメージング質量分析計（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  ＣＡ）で分析された。各ＲＯＩの積分されたイオン数は、下記の抗体標準データを使用して抗体質量に変換された。
【０１１７】
１、５、及び１０マイクログラム／ｍｌの１４６Ｎｄ標識ＥＰＲ１７５０９の対照アリコートを、ＰＢＳ中の３％ＢＳＡ中の１０％ロバ血清で調製した。各抗体試料の１マイクロリットルをスライドガラスにスポットし、Ｈｙｐｅｒｉｏｎマシンでアブレーション（ＵＶレーザー強度＝３）する前に風乾した。各抗体スポットの積分されたイオン数を使用して、染色されたＴＭＡコアからのＲＯＩで測定されたイオン数を較正した。
【０１１８】
デジタル画像の取得及び分析
スライド全体の明視野画像は、２０×０．７５のＮＡ対物レンズを備えたＨａｍａｍａｔｓｕ（Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，  ＮＪ）Ｎａｎｏｚｏｏｍｅｒ−ＸＲデジタルスライドスキャナーを使用して、０．４６ミクロン／ピクセルのスキャン解像度で取得された。明視野イメージングは半自動バッチモードで実行された。スキャン領域とフォーカスポイントは、自動化された高解像度の全スライドイメージングの前に、各スライドに対して手動で作成された。Ｎａｎｏｚｏｏｍｅｒ−ＸＲまたは３Ｄ  Ｈｉｓｔｅｃｈ  Ｐａｎｎｏｒａｍｉｃ  ２５０スキャナー（０．３３ミクロン／ピクセルの解像度の２０倍０．８ＮＡ対物レンズを使用）を使用して、免疫蛍光の全スライド画像を取得した。Ｎａｎｏｚｏｏｍｅｒ−ＸＲシステムでは、蛍光モジュールの光力を５０％に設定し、ＴＲＩＴＣ（１倍露光での抗体シグナル、３．４ｍｓ光子収集、１倍のゲイン）、ＤＡＰＩ（２倍露光での自己蛍光、６．８ｍｓ光子収集、２倍のゲイン）及びＣＦＰフィルター（４倍露光での自家蛍光、１３．６ｍｓ光子収集、２倍のゲイン）を使用して免疫蛍光シグナルをキャプチャした。Ｐａｎｎｏｒａｍｉｃ  ２５０システムでの取得は、ＣＹ５（１０ｍｓ露光での抗体シグナル）、ＦＩＴＣ（２ｍｓ露光での抗体シグナル）、ＤＡＰＩ（４０ｍｓ露光での自家蛍光）、及びＣＦＰフィルター（２００ｍｓ露光での自家蛍光）を使用して行われた。画像解析はＭａｔｌａｂバージョン９．３を使用して実行された。明視野画像の関心領域（ＲＯＩ）を手動で作成及び編集して、アーチファクトを有するか、または裂けたゲルの領域を除外した。ＲＯＩ内の小さな穴や裂け目は、手動の色閾値を使用して除外された。免疫蛍光画像のＲＯＩは、手動で作成するか、あるいは閾値（ＤＡＰＩまたはＣＦＰチャネルのいずれか）と形態学的フィルタリングによって自己蛍光画像からゲルのバックグラウンドを超える十分なシグナルが得られたときには自動的に生成した。ＲＯＩは、強度測定用の抗体−蛍光色素チャネルで取得した画像に転送された。明視野画像と蛍光画像の両方について、平均グレースケール強度が８ビット深度で計算された。平均明視野ピクセル強度のプロットされたＹ軸値は、２５５から平均ピクセルグレースケール強度を引いたものである。デジタルスライドスキャン画像は、元の強度またはコントラストを変更せずに表示される。ドナーブロック切片を横切って引かれた線の染色強度プロファイルの定量化は、ＩｍａｇｅＪの分析／プロットプロファイル機能を使用して評価された（バージョン１．５２ａ；Ｗａｙｎｅ  Ｒａｓｂａｎｄ，  ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ）。
【０１１９】
統計学的分析
Ｐｒｉｓｍ  ＧｒａｐｈＰａｄ（バージョン７）でグラフ化が行われた。ガラススライドのバックグラウンドを補正したシグナル強度データを、配合された抗原濃度のｌｏｇ１０に対してプロットした。曲線の当てはめは、当てはめられた曲線の下部が各アッセイの非抗原コアの平均強度に等しくなるように拘束された可変勾配４パラメーターモデルを使用し、各グラフに関連する表で「下部」として報告される。表に報告されている他のパラメーター［シグナルの最大値、スパン、最大値の半分での抗原濃度（ＡＣＨＭ）、及びＨｉｌｌＳｌｏｐｅ］は、ソフトウェアによって計算された。
【０１２０】
結果
実施例１〜３で実証されているように、タンパク質ゲルに組み込まれた場合、抗体標的エピトープをコードする合成ペプチドは、通常の免疫組織化学的及び免疫蛍光手順を使用して検出することができる。標的ペプチドを含むドナーブロックは、発色アッセイにより評価するとき、比較的均一な抗原分布を有していた（図１１Ａ〜１１Ｄ）。組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）は、様々な抗原濃度で所望の抗原を含むように構築できる。図１２Ａ〜１２Ｅは、ペプチドを加えない、ヒトＭＣＬ１タンパク質由来の陰性対照ペプチドの連続希釈、またはＢＣＬ２タンパク質のアミノ酸４１〜５４をコードするペプチドの希釈のいずれかを含む二重のコアからなるＴＭＡを示す。このＴＭＡの並行切片を４つの抗ＢＣＬ２抗体：標的ペプチドで使用されているのと同じペプチド配列に対して作成されたクローン１２４；いずれも試薬中の配列に対してＣ末端のペプチド抗原に対して作製されたＳＰ６６とＥ１７（Ａｄａｍ，  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ４４：１８１７−１８２６；ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ／ｂｃｌ２−ａｌｐｈａ−ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｓｐ６６−ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ−ａｂ９３８８４．ｈｔｍｌ）；及び、非開示のＢＣＬ２ペプチド抗原に対して作製されたＥＰＲ１７５０９（ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ／ＢＣＬ２−ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｅｐｒ１７５０９−ｈｒｐ−ａｂ２０９０３９．ｈｔｍｌ）で染色した。発色性（すべての抗体）及び免疫蛍光法（クローン１２４のみ）の方法を使用して、個別のスライドを染色した。
【０１２１】
予想通り、ＳＰ６６及びＥ１７は、このＴＭＡのいずれかの切片のコアと検出可能な反応をしなかった（図１３Ａ及びＢ）。クローン１２４とＥＰＲ１７５０９の両方で、ＴＭＡコアのシグナルはＢＣＬ２ペプチドの濃度の増加に伴って増加し（図１２Ａ〜１２Ｃ）、コア内の抗体と抗原間の特異的な相互作用と一致する。
【０１２２】
デジタル画像定量化により、データのより正確な評価が可能になった（図１２Ｄ）。図１２Ｅに報告されている適合された曲線及び関連するパラメーターは、最小及び最大のシグナル強度、ダイナミックレンジ、シグナルが半分最大になる抗原濃度（ＡＣＨＭ）、及びこの範囲の抗原濃度対シグナル強度曲線の急勾配（ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ）を定量化する。ここで試験した条件では、追加ペプチドを含まないコアの非特異的シグナルは、クローン１２４の発色アッセイで検出可能な最大シグナルの２．７％、蛍光クローン１２４アッセイでこれより１０００倍低く、ＥＰＲ１７５０９アッセイで２３％であった。一方、ＥＰＲ１７５０９の場合、アッセイの相対感度を反映するＡＣＨＭ値は、発色クローン１２４アッセイのＡＣＨＭよりも約８倍低く（すなわち、より感度が高く）、蛍光クローン１２４アッセイよりも５０倍を超えて低くなった。免疫蛍光クローン１２４アッセイは、どちらの発色アッセイよりも５０〜７５％急な勾配を有し、検出の閾値と最大シグナルの間のより狭い範囲の抗原濃度を反映する。
【０１２３】
反復アッセイでのペプチド対照の再現性を評価するために、図１２Ａ〜１２ＥでＴＭＡを構築するために使用されたものと同一の標的ＢＣＬ２ペプチド濃度を持つように調製された新しいドナーパラフィンブロックを使用して、第２のＢＣＬ２ペプチドのＴＭＡを構築した。この第２のＴＭＡの反復切片は、図１２Ａ〜１２Ｅで使用されたのと同一の抗ＢＣＬ２クローン１２４発色ＩＨＣプロトコールを使用して、６ヶ月の間隔で６日の別々の日で２人のオペレーターにより染色された。染色された切片の定量的デジタル画像分析は、各コアのシグナル強度が非常に再現可能であることを示した（図１４Ａ〜１４Ｃ；図３Ｂ及び３Ｃも参照）。
【０１２４】
並行実験では、クローン１２４を使用して、事前の抗原賦活化を伴って、または伴わず、ＢＣＬ２ペプチドを含むＴＭＡを染色した。結果は、抗原賦活化がシグナル強度を約６倍改善したが、染色には必要なかったことを示した（図１５Ａ〜１５Ｃ）。
【０１２５】
実施例５：ゲルマトリックスにおけるペプチド架橋の安定性
理論に拘束されることは望まないが、抗体を結合するために利用できるペプチドの濃度は、３つのパラメーター：ペプチドをタンパク質マトリックスに架橋する効率、ペプチドの生化学的完全性、及び抗体への架橋ペプチドの接近性によって配合された値から減少すると考えられているホルムアルデヒドは、ペプチド配列に含まれるＮ末端チロシン及びＣ末端システインとの反応により、ＢＳＡ側鎖を標的ペプチドに架橋することを目的としていた。ＢＣＬ２ペプチドの内部アミノ酸（Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｐ、Ｑ、Ｓ）のうち、グルタミンのみがホルムアルデヒドと反応することが報告されている（Ｍｅｔｚ，  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７９：６２３５−６２４３）。
【０１２６】
シグナル強度に対する代替的なＮ及びＣ末端アミノ酸の影響を評価するために、ＢＣＬ２ペプチドの４つのバリアントを試験した。Ｎ末端チロシンは、ホルマリンとの反応性が最小限であると予想されるセリン、またはチロシンよりも５０％高い反応性が報告されているアルギニンで置き換えられた（（Ｍｅｔｚ，  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７９：６２３５−６２４３）。他のバリアントには、Ｎ末端とＣ末端の両方にチロシンまたはアルギニンが含まれていた。各ペプチドの段階希釈を含むＴＭＡコアを調製し、上述のように染色した。
【０１２７】
結果は、Ｎ末端アルギニンを有するペプチドについて大幅に高いシグナルを示した（「Ｒ−Ｃ」、図１６Ａ〜１６Ｃ）。このバリアントのＡＣＨＭは、４．４３×１０−７Ｍペプチドであり、元のＹ−Ｃバリアントの対応する値よりも６倍低かった。他のバリアントは、元のＹ−Ｃバリアントと同様（Ｓ−Ｃ）またはそれよりも弱い（Ｒ−Ｒ、Ｙ−Ｙ）強度の範囲を示した。特に、Ｎ末端にアルギニンまたはチロシンとＣ末端にシステインを含むバリアントは、両端にアルギニンまたはチロシンを含むペプチドよりも強く反応した。
【０１２８】
実施例６：合成ＩＨＣ対照の一般化可能性
次に、ＢＣＬ２以外のタンパク質のエピトープを含むペプチドが同様に反応するかどうかを確認する実験が行われた。抗ＭＹＣ抗体Ｙ６９は、ヒトＭＹＣタンパク質のＮ末端１００アミノ酸のエピトープに結合すると報告されている（ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ／ｃ−ＭＹＣ−ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｙ６９−ａｂ３２０７２．ｈｔｍｌ）。この領域の候補エピトープを上述のようにＢＳＡゲルに組み込み、Ｙ６９結合を試験した。
【０１２９】
ＭＹＣアミノ酸９〜２４を含むペプチドは抗体と強く反応したが、他のペプチドはわずかしか反応しない（ａａ１７−３２）か、まったく反応しなかった（ａａ３５−５０及びａａ５３−６８）（図１７Ａ）。前述の濃度範囲で、ＭＹＣのａａ９−２４ペプチドとＢＣＬ２ペプチドの両方の二重のコアを含むＴＭＡが構築された。抗ＢＣＬ２クローン１２４及び抗ＭＹＣクローンＹ６９を使用する発色検出は、非標的ペプチドに対する交差反応性なしに、一定の範囲のシグナル強度を示した（図１７Ｂ及び１７Ｃ）。得られたデータの定量化（図１７Ｄ）は、ＭＹＣプロトコールがＢＣＬ２プロトコールよりも４倍低いＡＣＨＭを有し、同様のダイナミックレンジ及びＨｉｌｌＳｌｏｐｅパラメーターを有していたことを示した（図１７Ｅ）。
【０１３０】
図１７Ａ〜１７Ｅで使用したのと同じＴＭＡでのデュアル免疫蛍光検出は、抗ＢＣＬ２と抗ＭＹＣの両方の一次抗体の適切な検出試薬との連続インキュベーションを使用して行われた（図１８Ａ〜１８Ｃ）。定性的な結果（図１８Ａ及び１８Ｂ）は、いずれかの抗体と非標的ペプチドとの間に交差反応性がなく、予想される特異性を示した。抗原特異的一次抗体の代わりに使用されたアイソタイプ対照はシグナルを生じなかった。得られた蛍光データの定量化は、発色プロトコールと比較して、試験された条件下での増加したＨｉｌｌＳｌｏｐｅパラメーターの増加した複製のばらつきを示す。
【０１３１】
これらの結果は、多様なエピトープと検出プロトコールを使用したＩＨＣ対照としてのペプチド抗原の幅広い適用性を確認する。
【０１３２】
実施例７：検出限界（ＬＯＤ）と再現性
得られた定量的データにより、クローン１２４  ＢＣＬ２  ＩＨＣアッセイの検出限界（ＬＯＤ）及び再現性を決定することができた。
【０１３３】
図１２Ａ、１４Ａ〜１４Ｃ、１５Ａ、及び１７Ｂに示される実験は、１０の独立した分析を表し、各々は、標的ペプチドを含まない（ブランク）、及び６つの濃度のＢＣＬ２ペプチドを含む、二重のＴＭＡコアを有する。図１９Ａ及び１９Ｂならびに表Ｃはデータをまとめる。各実験では、各ペプチド濃度での二重のＴＭＡコアの平均を計算に使用した。値は、スライドガラスのバックグラウンド強度（１９．２＋／−０．５単位）に対して補正されたＴＭＡコアのピクセル強度である。
【０１３４】
表Ｃ  ＢＣＬ２クローン１２４  ＩＨＣアッセイ集計データ
2021505878.tif 000007
【０１３５】
承認された臨床検査規則（Ａｒｍｂｒｕｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｐｒｙ，  ２００８）によると、これらのデータのブランク限界（ＬＯＢ；＝平均ブランク＋１．６４５×ＳＤブランク）は８．０単位であり、検出制限（（ＬＯＤ；＝ＬＯＢ＋１．６４５×ＳＤ低陽性試料）は１６単位で、２．３×１０−７Ｍペプチドに相当する。この濃度は、ゲルの立方ミクロンあたり約１４０分子の配合された抗原密度に相当する。
【０１３６】
これらの計算と一致して、ＢＣＬ２ペプチド濃度の増加に伴うコアのデータの両側ｔ検定比較の結果（表Ｃ）は、２．５×１０−８Ｍペプチド（計算されたＬＯＤ未満）のコアは、ペプチドを欠くコアと有意差がないことを示したのに対し、２．５×１０−７Ｍペプチド以上のコア（計算されたＬＯＤを超える）は、統計的に異なる隣接コアである。特に、２つの最高のペプチド濃度を含むコアのシグナルは、これらのコアの主観的な強度が類似しているという事実にもかかわらず、統計的に異なる。
【０１３７】
実施例８：抗体検証のための合成ＩＨＣ対照の使用
上述の実施例１に記載されているように（図５Ａ〜５Ｄを参照されたい）、別のタンパク質をＢＳＡゲルに組み込み、ハイブリドーマクローンから生成された抗体を評価するために使用した。この場合、ヒトＫＳＲ２のＣ末端の３０１アミノ酸（すなわち、アミノ酸６５０〜９５０）を含むペプチドが使用された。上述の結果は、合成ＩＨＣ対照アプローチは、少数（例えば、２〜５）のリードをさらなる特性評価のために同定するための、目的の標的のＩＨＣ分析に適した抗体を同定する、典型的に数百から数千の候補抗体をスクリーニングするプロセスで有用な方法を提供する。
【０１３８】
候補抗体は、事前の抗原賦活化を伴わずに、抗原に対する反応性についてさらに試験された。各抗体について、検出可能な反応性のために抗原賦活化が必要であった（図２０Ａ及び２０Ｂ）。これは、抗原賦活化によりシグナル強度が約６倍改善されたが、検出可能な反応性には必要でなかった実施例４に記載されたＢＣＬ２ペプチドによる結果と対照的である（図１５Ａ〜１５Ｃ）。
【０１３９】
全長タンパク質の試験として、ＢＳＡゲルに組み込まれたウサギ、ラット、及びマウスの全長免疫グロブリン（ＩｇＧ；（０．１ｍｇ／ｍｌ；６．７×１０−７Ｍ））が調製され、検出ステップにおいてビオチン化ロバ抗ウサギ、抗ラット、及び抗マウス二次抗体を使用するＩＨＣアッセイの技術的対照として使用された。結果は、抗ウサギ、抗マウス、及び抗ラット二次抗体の予想されるシグナル及び特異性を示す（図２１Ａ及び２１Ｂ）。図２１Ａ及び２１Ｂに示すように、ロバ抗ウサギＩｇＧ二次抗体で検出された組み込まれたウサギＩｇＧは、１３６単位のピクセル強度を示す。追加されたウサギＩｇＧの定量的な保持を仮定すると、この試料の１立方ミクロン（１０−１５Ｌ）には、６．７×１０−２２モル、または約４００検出可能な分子のウサギＩｇＧが含まれる。
【０１４０】
実施例９：ゲルを作製するための代替的な固定剤の試験
いくつかのエピトープはホルマリン含有固定剤によって非反応性になるため、以前の実験で使用した３７％ホルムアルデヒドの代替として、市販のホルマリンを含まない亜鉛固定剤を試験した。
【０１４１】
ＢＳＡゲル中にＢＣＬ２及びＭＹＣペプチドを含むドナーブロックを、８５℃に加熱しながらホルマリンまたは亜鉛ベースの固定剤で固定した（図２２Ａ〜２２Ｃ）。ＢＣＬ２ペプチドとＭＹＣペプチドの両方で、加熱中の亜鉛固定よりもホルムアルデヒド固定の方がシグナルが約１０倍強かった。シグナル強度の損失は、亜鉛の存在下での加熱と相関していた。
【０１４２】
ＢＳＡ−抗原混合物を固定剤の非存在下で８５℃に加熱した後、様々な固定剤（４％パラホルムアルデヒド、中性緩衝ホルマリン、亜鉛含有ホルマリンフリー固定剤）で室温で固定した代替的な手順では、上述の標準的なプロトコールと同等の結果が得られた（図２３Ａ及び２３Ｂ）。これは、この手法が様々な固定剤に対応できることを示しており、使用できるエピトープと抗体の範囲が広がる可能性がある。
【０１４３】
実施例１０：イメージング質量分析
上述の実験では、結合した抗体の分子ごとに沈着した色素原分子または蛍光色素分子の数は不明であるため、検出されたエピトープの絶対濃度を計算できない。この制限を回避するために、Ｈｙｐｅｒｉｏｎ質量分析ベースのイメージャーを使用したより定量的な直接検出手順が試験された。
【０１４４】
ＢＣＬ２ペプチドＴＭＡの切片を１４６Ｎｄ標識抗ＢＣＬ２抗体ＥＰＲ１７５０９で染色し、紫外線レーザーアブレーションと定量質量分析で分析した。定量化されたＴＭＡ試料は、典型的には、１５０平方ミクロン×４ミクロン厚の領域で、９×１０４立方ミクロンを含む。結果は、標的中のＢＣＬ２ペプチド濃度が増加するにつれて増加する段階的なシグナルを示した（図２４Ａ〜２４Ｃ）。ペプチドを含まないコアまたは陰性対照ＭＣＬ１ペプチドを含むコアにおけるＥＰＲ１７５０９抗体シグナルは、最大シグナルの３％未満であった。
【０１４５】
測定されたイオン数と抗体濃度の間の相関関係は、ガラススライド上に直接スポットされた既知量の１４６Ｎｄ標識抗体を分析することによって判定された。得られた較正データ（表Ｄ）は、検出された１４６Ｎｄイオンあたり約３４０の抗体分子の比率を示した。
【０１４６】
表Ｄ  抗体イオンの定量化
2021505878.tif 000008
【０１４７】
各ＴＭＡコア試料に配合されたＢＣＬ２ペプチドの量を、測定された１４６Ｎｄ標識抗ＢＣＬ２抗体の量と比較することにより、ＴＭＡコアで検出可能なＢＣＬ２ペプチドの割合を決定した。結果（表Ｅ）は、予想通り、検出可能なＢＣＬ２ペプチドの量がペプチド濃度の増加とともに増加したことを示した。
【０１４８】
表Ｅ．  ＢＣＬ２ペプチド含有コアが結合した抗体
2021505878.tif 000009
【０１４９】
結果はまた、検出可能な添加されたＢＣＬ２ペプチドの割合が、抗原濃度が増加するにつれて減少することも示し；２．５×１０−７Ｍにおいては添加したペプチドの１．４％が検出可能であったが、２．５×１０−４Ｍにおいては添加したペプチドの約０．１４％が検出された。
【０１５０】
結論
まとめると、実施例１〜１０の結果は、抗原含有ゲルは、組織学実験室で利用可能な材料と方法を使用して作成でき、均一に染色された試料を生成するために包埋して薄切できることを示す。これらの例は、方法が様々な固定剤、ならびに発色法、免疫蛍光法、及び質量分析ベースのメソッドを使用した検出と互換性があることを示す。可能な抗原の選択は、標的タンパク質の利用可能性または直鎖状エピトープ配列の知識によってのみ制限される。既知の組成の合成対照を作製する能力は、不均一な組織試料及び主観的な人間の解釈に固有の複雑な要因とは無関係に、日常的に使用される免疫組織化学プロトコールをより正確に特性評価及び管理する機会を提供する。
【０１５１】
これらの結果は、各タンパク質に特異的な抗体を使用したＢＣＬ２、ＭＹＣ、及びＭＣＬ１からの直鎖状ペプチドエピトープの概念実証検出を提供し、さらに全長ＩｇＧ及び３０１アミノ酸のヒトタンパク質の検出を実証する。ここで配合され、試験された標的エピトープの濃度は、２．５×１０−８Ｍ〜２．５×１０−４Ｍの４桁にわたり、組織で見られるタンパク質濃度の範囲の上限にまで及ぶ。この範囲の上限では、平均分子間距離は２０ｎＭ未満であり、全長ＩｇＧ分子の２つのアーム間の距離（約１４ｎＭ）に近づく。非常に豊富なタンパク質だけがこの密度に達する。この手順で使用されるタンパク質濃度は、多くの組織で見られる範囲（７−２５％）であり（Ｃｏｌｅ，  Ｊ．  （２０１７）  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ７：４４７０７）、そのため、いくつかの機械的及び生化学的組織特性を再現する。
【０１５２】
これらの結果は、組織内のＩＨＣアッセイの性能に関連する定量的パラメーター、すなわち非特異的バックグラウンド、検出限界、ダイナミックレンジ、最大の半分のシグナルでの抗原濃度、及びＨｉｌｌ  Ｓｌｏｐｅが、デジタルスライドスキャナーと基本的な画像分析機能にアクセス可能な任意のラボで客観的に定義可能な精度で評価できることをさらに示す。結果は、１つの抗原抗体ペアを使用する場合、異なる抗体が同一の抗原を検出する場合、及び異なる抗体／抗原ペアを使用する場合での、異なる実験条件においてこれらのパラメーターが変化し得ることを示している。例えば、測定されたＡＣＨＭ値は、図１２Ａ〜１２Ｅに示される３つのアッセイにおいて５０倍を超えて異なっていた。クローン１２４のＢＣＬ２アッセイを使用した一連の１０回の反復実験では、最大シグナル、ダイナミックレンジ、ｌｏｇ（ＡＣＨＭ）、ＨｉｌｌＳｌｏｐｅの計算されたデータパラメーターは、１０％未満の変動係数を有するが、より高い精度を可能にすることができる。これらの実験では、生理学的範囲（２．５×１０−８〜２．５×１０−４Ｍ）にわたる抗原の連続１０倍希釈を使用したが、ＡＣＨＭと勾配の定量化の精度は、アッセイのダイナミックレンジの１０％〜９０％のより多くの試料を含めることで改善できる可能性がある。組織または細胞ペレットの主観的な人間の評価よりも客観的かつ正確にアッセイの性能を評価できるため、アッセイの性能を臨床的ニーズにより正確に調整し、より厳密に管理される。
【０１５３】
様々な抗原濃度の合成対照により、再現性のある標準を使用して、ＩＨＣ染色プロトコールを最適化、定量化、及び管理することができる。ここで記載するコンセプトは、管理されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下で精製された抗体と抗原間の相互作用を評価することと、実験的最適化によって組織試料の抗体反応性を評価することとの両極端の中間レベルでＩＨＣアッセイの品質管理を可能にする。
【０１５４】
進行中の定量的免疫組織化学分析へのこの方法の適用が企図されている。合成抗原ゲル試料は均質で、均一な厚さを有し、既知の数のエピトープ分子が含まれているため、シグナル強度と抗原濃度の相関を可能にする。有用な範囲のエピトープ濃度を含むスライド上のＴＭＡ切片は、診断組織切片に隣接して簡単にフィットでき、アッセイの技術的妥当性、または定量的な画像分析を任意のスライドで評価できるようにする。この方法で使用されるコンポーネントと手順は完全に定義されているため、異なる実験室で作製された試薬は、原則として機能的に類似しているはずである。このアプローチにより、調査担当者は、異なる実験室で使用されるプロトコールを比較及び調整し、定性的な染色評価項目を記載するときにより明確に伝達し、最終的に、研究と患者ケアの意思決定の両方で使用されるＩＨＣアッセイのより正確な管理を可能にする。
【０１５５】
実施例１１：ポリリジンで作製された合成抗原ゲル
上述の実施例（例えば、実施例３を参照されたい）は、例えば、ＩＨＣ染色を可能にし、ガラスＩＨＣスライドに付着する均一なゲルを形成することにより、ＩＨＣ染色に適したゲルを形成する能力について試験された基質タンパク質を記載する。この実施例は、抗原／ゲルマトリックス形成についてポリリジンを試験することを記載する。
【０１５６】
ポリリジンは複数のホルムアルデヒド反応性側鎖を提供し、１〜４ｋＤａから最大３００ｋＤａまでの範囲の様々な分子量で市販されている。ポリリジンモノマーの式量は１２８Ｄａ（塩の対イオンがないと仮定する）であるため、市販のポリリジン分子には、８〜３０個のリジンモノマーから２，３００個を超えるリジンモノマーの範囲のポリマーが含まれる。
【０１５７】
上述のように、１２．５％（最終濃度）のＢＳＡは、熱変性とホルムアルデヒドとの反応により、標的抗原を包埋して架橋できる有用なマトリックスを生成する。６９，２９３Ｄａの式量を仮定すると、１２．５％のＢＳＡは１．８ｍＭの濃度である。各ＢＳＡ分子には６０個のリジン側鎖が含まれてる。リジンに加えて、ＢＳＡの各分子には、２６個のアルギニンと２１個のチロシンの側鎖も含まれており、そのそれぞれがホルムアルデヒドとある程度の効率で反応できる。したがって、１２．５％ＢＳＡゲルには、６０×１．８ｍＭ、または１０８ｍＭのリジン側鎖がある。
【０１５８】
したがって、同様の計算に基づくポリリジンゲルマトリックスの試料には、最終的なゲルに約１０８ｍＭのリジン側鎖が含まれている。１２８Ｄａのポリリジンポリマーにおける単一のリジン側鎖の式量を仮定すると、ゲル中のポリリジンの最終濃度は約１４ｍｇ／ｍＬである。市販のポリリジンに対イオン塩が含まれている場合は、体積あたりの重量が高くなる。例えば、ポリリジン＊ＨＢｒ塩の式量は２０９ｇ／ｍｏｌである。ポリリジンの望ましい最終濃度は、等量の２１６ｍＭポリリジン溶液（約２８ｍｇ／ｍＬ純粋、ＨＢｒ塩として４５ｍｇ／ｍＬ）を濃縮ホルムアルデヒドストック（３７％）と混合することで得られる。理論に拘束されることは望まないが、試料中のリジン側鎖は、ポリリジン鎖内及び／またはポリリジン鎖間で互いに架橋してゲルを形成すると考えられている。
【０１５９】
上述の濃度（複数可）のポリリジン溶液を３７％ホルムアルデヒド（及び必要に応じて目的の抗原）と混合し、８５℃で１０分間加熱した後、上述のようにゲル形成と抗原結合を試験する。異なるポリマー長のポリリジンをホルムアルデヒド処理によるゲル形成について試験する。いくつかの実施形態では、ポリリジンは、Ｌ−エナンチオマー、Ｒ−エナンチオマー、またはＬ−エナンチオマーとＲ−エナンチオマーの両方の混合物を含む。様々な濃度の抗原を含むポリリジンゲルを、抗原を含まないポリリジンゲル、または非特異的タンパク質もしくは他の抗原を含むポリリジンゲルなどの陰性対照、及び／または、実施例１〜１０に記載されているゲル（例えば、同一の抗原を含む１２．５％ＢＳＡゲル）のような陽性対照と比較する。これらのゲルは、例えば、実施例１〜１０に記載されるような発色性または免疫蛍光結合アッセイによってアッセイされるＩＨＣスライド上またはＴＭＡで抗原結合についてアッセイされる。
【０１６０】
前述の開示は、理解を明確にする目的で、例証及び例としていくらか詳細に説明されてきたが、説明及び例は、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に引用された全ての特許及び科学文献の開示は、参照によりその全体が明示的に組み込まれている。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図３−７】
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【図３−８】
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【図３−９】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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