(57)【要約】少なくとも１つの粘液透過性質を有する送達ビヒクルおよび粘液透過性ペプチドを含む組成物が提供される。カーゴを含むそのような組成物、およびそれを作製し、使用する方法も開示される。一実施形態は、ペプチド、カーゴおよび送達ビヒクルを含む組成物であって、ペプチドが粘液透過性ペプチドであり、ペプチドが送達ビヒクルと直接または間接的にコンジュゲートしてペプチド−送達ビヒクルコンジュゲートを形成しており、送達ビヒクルが少なくとも１つの粘液透過特徴を含み、かつ送達ビヒクルがカーゴを部分的にまたは完全に包被している、組成物を提供する。
2021523912.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド、カーゴおよび送達ビヒクルを含む組成物であって、前記ペプチドが粘液透過性ペプチドであり、前記ペプチドが前記送達ビヒクルと直接または間接的にコンジュゲートしてペプチド−送達ビヒクルコンジュゲートを形成しており、前記送達ビヒクルが少なくとも１つの粘液透過特徴を含み、かつ前記送達ビヒクルが前記カーゴを部分的にまたは完全に包被している、組成物。
【請求項２】
前記ペプチドまたはその一部が前記ペプチド−送達ビヒクルコンジュゲートの表面に露出している、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ペプチドが、配列番号１〜３５からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
Ｈｏｄｇｅｓスコアによって測定して前記ペプチドのアミノ酸の平均ハイドロパシーが、ｐＨ７において１０未満であるかまたは１０と等しい、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ペプチドが、３個から１００個までのアミノ酸を含み、Ｈｏｄｇｅｓスコアが１０よりも大きいアミノ酸の総数が前記ペプチド内のアミノ酸の総数の約４０％以下を構成し、かつ、前記ペプチドが、隣接するアミノ酸の対であって、前記対の各アミノ酸のＨｏｄｇｅｓスコアが１０よりも大きい、隣接するアミノ酸の対を５つ未満含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ペプチドの正味の電荷が約＋２未満である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ペプチドが１つまたは複数のシステインを含む場合、前記システインが遊離のチオールを含有しない、請求項５または６に記載の組成物。
【請求項８】
ナノ粒子内に含まれている、請求項１から７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
前記ペプチドが前記ナノ粒子と直接コンジュゲートしている、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ナノ粒子が５００ｎｍ以下の直径を有する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ナノ粒子が２００ｎｍ以下の直径を有する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ナノ粒子が１００ｎｍ以下の直径を有する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ナノ粒子が脂質構造体を含む、請求項９から１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
前記脂質が、リポソーム、リポソームポリプレックス、脂質ナノ粒子およびリポプレックスから選択される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記送達ビヒクル粘液透過特徴が、前記送達ビヒクルに対する粘液透過性表面修飾、前記送達ビヒクルの双性イオン性特徴、および前記送達ビヒクルの粘液透過性脂質組成からなる群から選択される特徴の１つまたは複数を含む、請求項１から１４のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
前記表面修飾がポリエチレングリコールである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記表面修飾が、ポリ（２−アルキル−２−オキサゾリン）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、およびポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）、その塩、そのジブロックポリマーおよびトリブロックポリマーのうちの１つまたは複数から選択される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
前記粘液透過性ペプチドが、前記表面修飾と直接コンジュゲートしている、請求項１から１７のいずれかに記載の組成物。
【請求項１９】
前記ペプチドが、前記表面修飾と共有結合によりコンジュゲートしている、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記粘液透過性ペプチドが、前記送達ビヒクルと直接コンジュゲートしている、請求項１から１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項２１】
前記粘液透過性ペプチドが、前記送達ビヒクルに含まれる脂質構造体と直接コンジュゲートしている、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記カーゴが、核酸を含む、請求項１から２１のいずれかに記載の組成物。
【請求項２３】
前記核酸が、疾患または状態の処置を対象とするタンパク質またはタンパク質の生物学的に活性な部分をコードする、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記疾患または状態が、胃腸管に影響を及ぼす疾患または状態である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記疾患または状態が、先天性下痢症、過敏性腸症候群、慢性炎症性腸疾患、微絨毛封入体症候群、家族性ポリポーシス（ＦＡＰ）、軽症型ＦＡＰ、結腸直腸がん、またはこれらの任意の組合せのうちの少なくとも１つである、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記カーゴが、色素を含む、請求項１から２１のいずれかに記載の組成物。
【請求項２７】
前記カーゴが、薬物または治療用分子を含む、請求項１から２１のいずれかに記載の組成物。
【請求項２８】
前記カーゴが、タンパク質を含む、請求項１から２１のいずれかに記載の組成物。
【請求項２９】
前記カーゴが、ナノ粒子を含む、請求項１から２１のいずれかに記載の組成物。
【請求項３０】
前記カーゴが、小さな化学分子を含む、請求項１から２１のいずれかに記載の組成物。
【請求項３１】
前記ペプチドが、配列番号１、４、５、６、７、１４、２０、２１、２２および２９からなる群から選択される、請求項１から３０のいずれかに記載の組成物。
【請求項３２】
粘液透過性コンジュゲートを作製する方法であって、
（ａ）少なくとも１つの細胞透過性質および少なくとも１つの粘液透過性質を有するペプチドを選択するステップと、
（ｂ）少なくとも１つの粘液透過性質を有する送達ビヒクルを選択するステップと、
（ｃ）前記ペプチドと前記送達ビヒクルを間接的にまたは直接コンジュゲートするステップとを含む方法。
【請求項３３】
前記ペプチドが、配列番号１〜３５からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
Ｈｏｄｇｅｓスコアによって測定して前記ペプチドのアミノ酸の平均ハイドロパシーが、ｐＨ７において１０未満であるかまたは１０と等しい、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ペプチドのアミノ酸の平均ハイドロパシーが、ｐＨ７において０．５未満であるかまたは０．５と等しい、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ペプチドが、３個から１００個までのアミノ酸を含み、Ｈｏｄｇｅｓスコアが１０よりも大きいアミノ酸の総数が前記ペプチド内のアミノ酸の総数の約４０％以下を構成し、かつ、前記ペプチドが、隣接するアミノ酸の対であって、前記対の各アミノ酸のＨｏｄｇｅｓスコアが１０よりも大きい、隣接するアミノ酸の対を５つ未満含む、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ペプチドの正味の電荷が約＋２未満である、請求項３４から３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
前記ペプチドが、１つまたは複数の（one of more）システインを含む場合、前記システインが遊離のチオールを含有しない、請求項３４から３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
前記ペプチドまたはその一部が、前記粘液透過性コンジュゲートの表面に露出している、請求項３４から３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
前記コンジュゲートが、ナノ粒子内に含まれている、請求項３４から３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記ナノ粒子が、脂質含有ナノ粒子である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記脂質が、リポソーム、リポソームポリプレックス、脂質ナノ粒子、およびリポプレックスから選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記送達ビヒクル粘液透過性質が、前記送達ビヒクルに対する粘液透過性表面修飾、前記送達ビヒクルの双性イオン性特徴、および前記送達ビヒクルの粘液透過性脂質組成からなる群から選択される１つまたは複数の特徴を含む、請求項３２から４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
前記送達ビヒクルが、粘液透過性表面修飾を含む、請求項３２から４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
前記表面修飾が、ポリエチレングリコールである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記表面修飾が、ポリ（２−アルキル−２−オキサゾリン）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、およびポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）、その塩、そのジブロックポリマーおよびトリブロックポリマーのうちの１つまたは複数から選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記送達ビヒクルがカーゴを部分的にまたは完全に包被している、請求項３２から４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
前記カーゴが、核酸を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記核酸が、胃腸管の疾患または状態の処置を対象とするタンパク質またはタンパク質の生物学的に活性な部分をコードする、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記疾患または状態が、胃腸管に影響を及ぼす疾患または状態である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記疾患または状態が、先天性下痢症、過敏性腸症候群、慢性炎症性腸疾患、微絨毛封入体症候群、家族性ポリポーシス（ＦＡＰ）、軽症型ＦＡＰ、結腸直腸がん、またはこれらの任意の組合せのうちの少なくとも１つである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記核酸が、大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）、デフェンシン（ＨＤ−５）、Ｍｙｏ５Ｂ、ＩＬ−１０およびデフェンシンアルファ６（ＨＤ−６）から選択されるタンパク質またはタンパク質の生物学的に活性な部分をコードする、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記カーゴが、色素を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５４】
前記カーゴが、薬物または治療用分子を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５５】
前記カーゴが、タンパク質を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５６】
前記カーゴが、ナノ粒子を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５７】
前記カーゴが、小さな化学分子を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５８】
ステップ（ａ）に関して、前記ペプチドをまず表１から選択し、前記選択されたペプチドを、粘液透過性質を含むように改変し、この改変を、Ｈｏｄｇｅｓスコアによって測定して前記改変されたペプチドのアミノ酸の平均ハイドロパシーがｐＨ７において１０未満になるかまたは１０と等しくなるように前記ペプチドの１つまたは複数のアミノ酸を変更することにより行う、請求項３２に記載の方法。
【請求項５９】
前記改変されたペプチド内のＨｏｄｇｅｓスコアが１０よりも大きいアミノ酸の総数が、前記改変されたペプチド内のアミノ酸の総数の約４０％以下を構成し、かつ、前記改変されたペプチドが、隣接するアミノ酸の対であって、前記対の各アミノ酸のＨｏｄｇｅｓスコアが１０よりも大きい、隣接するアミノ酸の対を５つ未満含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記改変されたペプチドの正味の電荷が、約＋２未満である、請求項５８または５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記改変されたペプチドが１つまたは複数の（one of more）システインを含む場合、前記システインが遊離のチオールを含有しない、請求項５８から６０のいずれかに記載の方法。
【請求項６２】
前記ペプチドが、配列番号１、４、５、６、７、１４、２０、２１、２２および２９からなる群から選択される、請求項３２から６１のいずれかに記載の方法。
【請求項６３】
請求項１から３１のいずれかに記載の組成物を投与するステップを含む、遺伝子治療を送達する方法。
【請求項６４】
治療の標的となる組織を少なくとも１つ有することを特徴とする疾患または状態を処置する方法であって、前記組織が、粘液の層を含み、前記方法が、請求項１から３１のいずれかに記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項６５】
治療の標的となる前記組織が、眼、胃腸管、結腸、小腸、肺、および子宮頸部の１つまたは複数から選択される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記疾患または状態が、家族性ポリポーシス（ＦＡＰ）、軽症型ＦＡＰ、結腸直腸がん、慢性炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、先天性下痢症、微絨毛封入体症候群、およびこれらの任意の組合せから選択される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記アミノ酸の平均ハイドロパシーが、Ｆａｕｃｈｅｒｅスコアによって測定される、請求項３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年５月１５日出願の米国仮出願第６２／６７１，７０９号の利益を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による支援を受けた研究または開発の下でなされた発明の権利に関する記載
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＮＳＦ）Ｇｒａｎｔ  Ｎｏ．１８４６０７８の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に関して一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
過去５０年にわたる遺伝子治療の進歩にもかかわらず、特に治療送達の標的位置に粘液の層が含まれる場合、従来の方法に不応性の疾患が多く残っている。
【０００４】
参照による組み込み
本明細書における全ての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が、具体的にかつ個別に参照により組み込まれることが示されたのと同程度に、それらの全体が参照により組み込まれる。本明細書における用語と組み込まれた参考文献における用語が矛盾する場合には、本明細書における用語が優先される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一実施形態は、ペプチド、カーゴおよび送達ビヒクルを含む組成物であって、ペプチドが粘液透過性ペプチドであり、ペプチドが送達ビヒクルと直接または間接的にコンジュゲートしてペプチド−送達ビヒクルコンジュゲートを形成しており、送達ビヒクルが少なくとも１つの粘液透過特徴を含み、かつ送達ビヒクルがカーゴを部分的にまたは完全に包被している、組成物を提供する。一部の実施形態では、ペプチドまたはその一部は、ペプチド−送達ビヒクルコンジュゲートの表面に露出している。
【０００６】
一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１〜３５からなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｈｏｄｇｅｓスコアによって測定してペプチドのアミノ酸の平均ハイドロパシーは、ｐＨ７において１０未満であるかまたは１０と等しい。一部の実施形態では、ペプチドは、３個から１００個までのアミノ酸を含み、Ｈｏｄｇｅｓスコアが１０よりも大きいアミノ酸の総数がペプチド内のアミノ酸の総数の約４０％以下を構成し、かつ、ペプチドは、隣接するアミノ酸の対であって、対の各アミノ酸のＨｏｄｇｅｓスコアが１０よりも大きい、隣接するアミノ酸の対を５つ未満含む。一部の実施形態では、ペプチドの正味の電荷は、約＋２未満である。一部の実施形態では、ペプチドが１つまたは複数のシステインを含む場合、システインは、遊離のチオールを含有しない。一部の実施形態では、組成物は、ナノ粒子内に含まれている。一部の実施形態では、ペプチドは、ナノ粒子と直接コンジュゲートしている。一部の実施形態では、ナノ粒子は、５００ｎｍ以下の直径を有する。一部の実施形態では、ナノ粒子は、２００ｎｍ以下の直径を有する。一部の実施形態では、ナノ粒子は、１００ｎｍ以下の直径を有する。
【０００７】
一部の実施形態では、ナノ粒子は、脂質構造体を含む。一部の実施形態では、脂質は、リポソーム、リポソームポリプレックス、脂質ナノ粒子およびリポプレックスから選択される。一部の実施形態では、送達ビヒクル粘液透過特徴は、送達ビヒクルに対する粘液透過性表面修飾（mucus-penetrating surface modification）、送達ビヒクルの双性イオン性特徴、および送達ビヒクルの粘液透過性脂質組成からなる群から選択される特徴の１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、表面修飾（surfacemodification）は、ポリエチレングリコールである。一部の実施形態では、表面修飾は、ポリ（２−アルキル−２−オキサゾリン）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、およびポリ（２−メチル−２−オキサゾリン（oxazaline））、その塩、そのジブロックポリマーおよびトリブロックポリマーのうちの１つまたは複数から選択される。一部の実施形態では、粘液透過性ペプチドは、表面修飾と直接コンジュゲートしている。一部の実施形態では、ペプチドは、表面修飾と共有結合によりコンジュゲートしている。
一部の実施形態では、粘液透過性ペプチドは、送達ビヒクルと直接コンジュゲートしている。一部の実施形態では、粘液透過性ペプチドは、送達ビヒクルに含まれる脂質構造体と直接コンジュゲートしている。一部の実施形態では、カーゴは、核酸を含む。一部の実施形態では、核酸は、疾患または状態の処置を対象とするタンパク質またはタンパク質の生物学的に活性な部分をコードする。一部の実施形態では、疾患または状態は、胃腸管に影響を及ぼす疾患または状態である。一部の実施形態では、疾患または状態は、先天性下痢症、過敏性腸症候群、慢性炎症性腸疾患、微絨毛封入体症候群、家族性ポリポーシス（ＦＡＰ）、軽症型ＦＡＰ、結腸直腸がん、またはこれらの任意の組合せのうちの少なくとも１つである。一部の実施形態では、カーゴは、色素を含む。一部の実施形態では、カーゴは、薬物または治療用分子を含む。一部の実施形態では、カーゴは、タンパク質を含む。一部の実施形態では、カーゴは、ナノ粒子を含む。一部の実施形態では、カーゴは、小さな化学分子を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１、４、５、６、７、１４、２０、２１、２２および２９からなる群から選択される。
【０００８】
一実施形態は、粘液透過性コンジュゲートを作製する方法であって、
（ａ）少なくとも１つの細胞透過性質および少なくとも１つの粘液透過性質を有するペプチドを選択するステップと、
（ｂ）少なくとも１つの粘液透過性質を有する送達ビヒクルを選択するステップと、
（ｃ）ペプチドと送達ビヒクルを間接的にまたは直接コンジュゲートするステップと
を含む方法を提供する。
【０００９】
一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１〜３５からなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｈｏｄｇｅｓスコアによって測定してペプチドのアミノ酸の平均ハイドロパシーは、ｐＨ７において１０未満であるかまたは１０と等しい。一部の実施形態では、ペプチドのアミノ酸の平均ハイドロパシーは、ｐＨ７において０．５未満であるかまたは０．５と等しい。一部の実施形態では、ペプチドのアミノ酸の平均ハイドロパシーは、Ｆａｕｃｈｅｒｅスコアによって測定して、ｐＨ７において０．５未満であるかまたは０．５と等しい。一部の実施形態では、ペプチドは、３個から１００個までのアミノ酸を含み、Ｈｏｄｇｅｓスコアが１０よりも大きいアミノ酸の総数が、ペプチド内のアミノ酸の総数の約４０％以下を構成し、かつ、ペプチドは、隣接するアミノ酸の対であって、対の各アミノ酸のＨｏｄｇｅｓスコアが１０よりも大きい、隣接するアミノ酸の対を５つ未満含む。一部の実施形態では、ペプチドの正味の電荷は、約＋２未満である。一部の実施形態では、ペプチドが１つまたは複数のシステインを含む場合、システインは、遊離のチオールを含有しない。一部の実施形態では、ペプチドまたはその一部は、粘液透過性コンジュゲートの表面に露出している。一部の実施形態では、コンジュゲートは、ナノ粒子内に含まれている。一部の実施形態では、ナノ粒子は、脂質含有ナノ粒子である。一部の実施形態では、脂質は、リポソーム、リポソームポリプレックス、およびリポプレックスから選択される。一部の実施形態では、送達ビヒクル粘液透過性質は、送達ビヒクルに対する粘液透過性表面修飾、送達ビヒクルの双性イオン性特徴、および送達ビヒクルの粘液透過性脂質組成からなる群から選択される特徴の１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、送達ビヒクルは、粘液透過性表面修飾を含む。一部の実施形態では、表面修飾は、ポリエチレングリコールである。一部の実施形態では、表面修飾は、ポリ（２−アルキル−２−オキサゾリン）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、およびポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）、その塩、そのジブロックポリマーおよびトリブロックポリマーのうちの１つまたは複数から選択される。一部の実施形態では、送達ビヒクルがカーゴを部分的にまたは完全に包被している。一部の実施形態では、カーゴは、核酸を含む。
【００１０】
一部の実施形態では、核酸は、胃腸管の疾患または状態の処置を対象とするタンパク質またはタンパク質の生物学的に活性な部分をコードする。一部の実施形態では、疾患または状態は、胃腸管に影響を及ぼす疾患または状態である。一部の実施形態では、疾患または状態は、先天性下痢症、過敏性腸症候群、慢性炎症性腸疾患、微絨毛封入体症候群、家族性ポリポーシス（ＦＡＰ）、軽症型ＦＡＰ、結腸直腸がん、またはこれらの任意の組合せのうちの少なくとも１つである。一部の実施形態では、核酸は、大腸腺腫性ポリポーシス（adenomatous polyposis coli）（ＡＰＣ）、デフェンシン（ＨＤ−５）、Ｍｙｏ５Ｂ、ＩＬ−１０およびデフェンシンアルファ６（ＨＤ−６）から選択されるタンパク質またはタンパク質の生物学的に活性な部分をコードする。一部の実施形態では、カーゴは、色素を含む。一部の実施形態では、カーゴは、薬物または治療用分子を含む。一部の実施形態では、カーゴは、タンパク質を含む。一部の実施形態では、カーゴは、ナノ粒子を含む。一部の実施形態では、カーゴは、小さな化学分子を含む。一部の実施形態では、ステップ（ａ）に関して、ペプチドをまず表１から選択し、選択されたペプチドを、粘液透過性質を含むように改変し、この改変を、Ｈｏｄｇｅｓスコアによって測定して改変されたペプチドのアミノ酸の平均ハイドロパシーがｐＨ７において１０未満になるかまたは１０と等しくなるようにペプチドの１つまたは複数のアミノ酸を変更することにより行う。一部の実施形態では、改変されたペプチド内のＨｏｄｇｅｓスコアが１０よりも大きいアミノ酸の総数が、改変されたペプチド内のアミノ酸の総数の約４０％以下を構成し、かつ、改変されたペプチドは、隣接するアミノ酸の対であって、対の各アミノ酸のＨｏｄｇｅｓスコアが１０よりも大きい、隣接するアミノ酸の対を５つ未満含む。一部の実施形態では、改変されたペプチドの正味の電荷は、約＋２未満である。一部の実施形態では、改変されたペプチドが１つまたは複数の（oneof more）システインを含む場合、システインは、遊離のチオールを含有しない。
【００１１】
一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１、４、５、６、７、１４、２０、２１、２２および２９からなる群から選択される。
【００１２】
一実施形態は、本開示による組成物を投与するステップを含む、遺伝子治療を送達する方法を提供する。一実施形態は、治療の標的となる組織を少なくとも１つ有することを特徴とする疾患または状態を処置する方法であって、組織が、粘液の層を含み、方法が、本開示による組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、治療の標的となる組織は、眼、胃腸管、結腸、小腸、肺、および子宮頸部の１つまたは複数から選択される。一部の実施形態では、疾患または状態は、家族性ポリポーシス（ＦＡＰ）、軽症型ＦＡＰ、結腸直腸がん、慢性炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、先天性下痢症、微絨毛封入体症候群、およびこれらの任意の組合せから選択される。
【００１３】
概要
カーゴを含み、粘液透過性質ならびに細胞透過性質を有する治療用送達ビヒクルが本明細書に開示される。結腸がん、嚢胞性線維症、クローン病および肺がんなどの上皮の疾患は、毎年の罹患率および死亡率のかなり部分の一因になっている。治療目的で核酸、小分子、生物学的製剤および大きな分子などの治療法（therapeutics）を粘膜上皮細胞に送達することは、粘液の物理的関門により困難になっている。したがって、粘液層を透過し、カーゴを標的組織および細胞に運搬するための送達ビヒクルが本明細書に提示される。本明細書に提示される送達ビヒクルは、粘液透過性送達ビヒクル組成および粘液透過性ポリマーコーティングなどの粘液透過特徴を含み、また、標的組織に付随する粘液を通る輸送能が増加するように、粘液透過性ペプチド（ＭＰＰ）とさらにカップリングされる。ＭＰＰと送達ビヒクルの粘液透過特徴の組合せにより、細胞の外側への放出だけをもたらすものである最も多く臨床的に証明されている粘液透過系の現行の適用を用いた場合のようにカーゴを細胞の外側に放出するのではなく、カーゴを細胞内に送達すことが可能になる。
【００１４】
ペプチドおよび送達ビヒクルの両方を有する組成物が本明細書に提示される。組成物のペプチドは、細胞透過性かつ粘液透過性である（これらのペプチドは、本明細書ではＭＰＰと称される）。送達ビヒクルはまた、少なくとも１つの粘液透過特徴も含む。組成物のペプチドは、送達ビヒクルと直接または間接的にコンジュゲートしており、ペプチドまたはその一部は、ペプチド−送達ビヒクルコンジュゲートの表面に露出している。
【００１５】
送達ビヒクルは、ナノ粒子であり得る。一部の場合では、送達ビヒクルは、動的光散乱によって測定して、約１０ｎｍから約１００ｎｍまで、約１００ｎｍから約２００ｎｍまで、約２００ｎｍから約３００ｎｍまで、約３００ｎｍから約４００ｎｍまで、および約４００ｎｍから約５００ｎｍまでの直径を有し得る。ナノ粒子送達ビヒクルは、５００ｎｍ以下、約２００ｎｍ以下または約１００ｎｍ以下の直径を有し得る。一部の実施形態では、送達ビヒクルは直径約１ｎｍから約１５０ｎｍまでであり得る。一部の実施形態では、ナノ粒子は、脂質含有ナノ粒子である。一部の場合では、送達ビヒクルは、脂質ナノ粒子、リポソーム、リポソームポリプレックス、またはリポプレックスなどの脂質構造体を含み得る。
【００１６】
本明細書に提示される組成物は、ナノ粒子を含めた送達ビヒクルを含み、送達ビヒクル自体が少なくとも１つの粘液透過特徴を有する。そのような粘液透過特徴としては、例えば、送達ビヒクルに粘液透過性質を付与する送達ビヒクルの双性イオン性特徴または脂質組成が挙げられる。双性イオン性特徴は、キトサン／キトサネート（ｃｈｉｔｏｓａｎａｔｅ）を有するナノ粒子またはＤＬＰＣ脂質ナノ粒子などの送達ビヒクルの形成を含み得る。
【００１７】
粘液透過特徴は、ナノ粒子の粘液透過性表面修飾などの送達ビヒクルの粘液透過性表面修飾であり得る。表面修飾は、ポリエチレングリコール、ポリ（２−アルキル−２−オキサゾリン）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、ポリ（２−ｎ−プロピル−２−オキサゾリン）、およびポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）、その塩、そのジブロックポリマーおよびトリブロックポリマーのうちの１つまたは複数であり得る。一部の実施形態では、ポリエチレングリコール表面修飾は、約２０００Ｄａから約３０００Ｄａまでにわたる平均分子量を有する。一部の実施形態では、表面修飾は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ１７／６１１１１に開示されている式Ｉ：
【化１】
2021523912.tif 000003
の化合物である。一部の実施形態では、送達ビヒクルは、双性イオン性特徴、送達ビヒクルに性質を付与する粘液透過性脂質組成および粘液透過性表面修飾、ならびにこれらの組合せから選択される粘液透過特徴を１つよりも多くを含む。
【００１８】
本明細書の組成物は、ＭＰＰが送達ビヒクルと直接コンジュゲートしている組成物を含む。他の実施形態では、ＭＰＰは、送達ビヒクルと間接的にコンジュゲートしている。ＭＰＰは、表面修飾と直接、共有結合により、または非共有結合によりコンジュゲートしていてよい。
【００１９】
本明細書に提示される組成物および方法に使用するためのＭＰＰは、少なくとも１つの粘液透過特徴をさらに有する細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）である。大部分のＣＰＰはＭＰＰではない。以前から公知のＣＰＰは、一般に、ペプチドの３つの群：カチオン性、両親媒性および疎水性に分かれる。粘液の物性に起因して、これらのＣＰＰは、粘液に接着する。粘液透過および細胞透過という同時の目的のために、粘液透過性ペプチド（ＭＰＰ）と称される新しいクラスのペプチドが本明細書に提示される。具体的には粘液透過性送達系とコンジュゲートした場合、送達系に、生理的に関連する粘液の存在下で下にある上皮細胞に進入する独特の改善された能力が付与される。
【００２０】
本明細書に提示される組成物および方法に使用するためのＭＰＰは、粘液透過性質を付与する特性を有する。一部の実施形態では、本明細書のＭＰＰは、Ｈｏｄｇｅｓスコアによって測定してＭＰＰのアミノ酸配列の平均ハイドロパシーがｐＨ７において１０未満であるかまたは１０と等しい。一部の場合では、Ｆａｕｃｈｅｒｅスコアによって測定してＭＰＰのアミノ酸配列の平均ハイドロパシーは、ｐＨ７において０．５未満であるかまたは０．５と等しいものであり得る。一部の実施形態では、ＭＰＰは、３アミノ酸から１００アミノ酸の間である。一部の実施形態では、ＭＰＰは、ＭＰＰ配列のアミノ酸の４０％以下が、１０よりも大きいＨｏｄｇｅｓスコアを有するようなアミノ酸配列を有する。一部の場合では、ＭＰＰの正味の電荷は、約＋２から約−２までであり得る。一部の場合では、ＭＰＰの正味の電荷は、約＋２未満であり得る。ＭＰＰは、１つまたは複数のシステインを有し得る。一部の場合では、ペプチドが１つまたは複数のシステインを含む場合、システインは、遊離のチオールを含有しない。
【００２１】
一部の実施形態では、ＭＰＰは配列番号１〜３５のうちの１つであり、配列番号３６は、疎水性ペプチドの陽性粘液結合対照を提示する。他の実施形態では、ＭＰＰは、配列番号１〜３５のいずれか１つと少なくとも約８０％相同、９０％相同、９５％相同、９８％相同または９９％相同であるアミノ酸配列を有し、かつ、（ａ）Ｈｏｄｇｅｓスコアによって測定してＭＰＰのアミノ酸配列の平均ハイドロパシーがｐＨ７において１０未満であるかまたは１０と等しいこと；（ｂ）Ｆａｕｃｈｅｒｅスコアによって測定してＭＰＰのアミノ酸配列の平均ハイドロパシーがｐＨ７において０．５未満であるかまたは０．５と等しいこと；（ｃ）３〜１００アミノ酸長であること；（ｄ）１０よりも大きいＨｏｄｇｅｓスコアを有するＭＰＰ配列のアミノ酸が４０％以下であるようなアミノ酸配列であること；（ｅ）ＭＰＰの正味の電荷が約＋２から約−２までであり得ること；（ｆ）１つまたは複数のシステインがあり、システインが遊離のチオールを含有しないことを含めた少なくとも１つの粘液透過性特徴をさらに有する。一部の実施形態では、ＭＰＰは、配列番号１、４、５、６、７、１４、２０、２１、２２および２９のうちの１つである。
【００２２】
本明細書の組成物は、カーゴを含む。カーゴは、ポリ核酸、色素、薬物、タンパク質、脂質ナノ粒子、または化学薬品を含み得る。一部の場合では、カーゴは、これだけに限定することなく、一本鎖、二本鎖または部分的に二本鎖の核酸、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを含めた核酸である。カーゴは、単離され、精製された環状ポリ核酸を含み得る。カーゴの核酸は、タンパク質またはタンパク質の生物学的に活性な部分をコードし得る。一部の実施形態では、タンパク質をコードする核酸などのカーゴは、胃腸（ＧＩ）管を対象とする。一部の実施形態では、タンパク質をコードする核酸などのカーゴは、胃腸（ＧＩ）管の疾患または状態の処置を対象とする。一部の実施形態では、コードされるタンパク質は、大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）、デフェンシン（ＨＤ−５）、またはデフェンシンアルファ６（ＨＤ−６）の全部または一部である。
【００２３】
一部の実施形態では、カーゴは、ナノ粒子などの送達ビヒクル内に完全に含有される。一部の実施形態では、カーゴは、送達ビヒクル内に部分的に含有される。例えば、一部の場合では、カーゴはポリ核酸であり、単離され、精製された環状ポリ核酸を送達ビヒクルに少なくとも部分的に包被させることができる。一部の場合では、単離され、精製された環状ポリ核酸を送達ビヒクルに完全に包被させることができる。一部の場合では、ＤＮＡ、ＲＮＡ、環状または直鎖状核酸などの、単離され、精製されたポリ核酸は、胃腸管において活性なタンパク質またはその活性断片をコードし得る。一部の場合では、タンパク質は、大腸腺腫性ポリポーシス、β−ガラクトシダーゼ、デフェンシンアルファ５、デフェンシンアルファ６、またはこれらの任意の組合せを含む。一部の場合では、ＤＮＡ、ＲＮＡ、環状または直鎖状核酸などの、単離され、精製されたポリ核酸は、胃腸管の外側で活性なタンパク質またはその活性断片をコードし得る。
【００２４】
本明細書に開示される送達ビヒクルおよび賦形剤、希釈剤、または担体のうちの少なくとも１つを含む医薬組成物が本明細書に開示される。
【００２５】
送達ビヒクルを作製する方法が本明細書に開示される。方法は、細胞透過性質および粘液透過性質を有するペプチドを選択するステップと、少なくとも１つの粘液透過性質を有する送達ビヒクルを選択するステップと、ペプチドと送達ビヒクルを間接的にまたは直接コンジュゲートするステップとを含む。
【００２６】
方法の一部の実施形態では、ペプチドは、以下の特徴の１つまたは複数を有するＭＰＰである：ａ）Ｈｏｄｇｅｓスコアによって測定してＭＰＰのアミノ酸配列の平均ハイドロパシーがｐＨ７において１０未満であるかまたは１０と等しいこと；（ｂ）Ｆａｕｃｈｅｒｅスコアによって測定してＭＰＰのアミノ酸配列の平均ハイドロパシーがｐＨ７において０．５未満であるかまたは０．５と等しいこと；（ｃ）３〜１００アミノ酸長であること；（ｄ）１０よりも大きいＨｏｄｇｅｓスコアを有するＭＰＰ配列のアミノ酸が４０％以下であるようなアミノ酸配列であること；（ｅ）ＭＰＰの正味の電荷が約＋２から約−２までであり得ること；（ｆ）１つまたは複数のシステインがあり、システインが遊離のチオールを含有しないこと。一部の実施形態では、ＭＰＰは、配列番号１〜３５のうちの１つまたは複数から選択される。他の実施形態では、ＭＰＰは、配列番号１〜３５のいずれか１つと少なくとも約８０％相同、９０％相同、９５％相同、９８％相同または９９％相同であるアミノ酸配列を有し、かつ、（ａ）Ｈｏｄｇｅｓスコアによって測定してＭＰＰのアミノ酸配列の平均ハイドロパシーがｐＨ７において１０未満であるかまたは１０と等しいこと；（ｂ）Ｆａｕｃｈｅｒｅスコアによって測定してＭＰＰのアミノ酸配列の平均ハイドロパシーがｐＨ７において０．５未満であるかまたは０．５と等しいこと；（ｃ）３〜１００アミノ酸長であること；（ｄ）１０よりも大きいＨｏｄｇｅｓスコアを有するＭＰＰ配列のアミノ酸が４０％以下であるようなアミノ酸配列であること；（ｅ）ＭＰＰの正味の電荷が約＋２から約−２までであり得ること；（ｆ）１つまたは複数のシステインがあり、システインが遊離のチオールを含有しないことを含めた少なくとも１つの粘液透過性特徴をさらに有する。一部の実施形態では、ＭＰＰは、配列番号１、４、５、６、７、１４、２０、２１、２２および２９のうちの１つである。
【００２７】
本明細書で提示される方法では、ＭＰＰまたはその一部は、コンジュゲートの表面に露出している。一部の実施形態では、方法に使用される送達ビヒクルは、ナノ粒子である。ナノ粒子は、リポソーム、リポソームポリプレックス、またはリポプレックスなどの脂質含有ナノ粒子であり得る。方法の一部の実施形態では、ナノ粒子は、粘液透過性表面修飾を含む。一部の実施形態では、表面修飾は、ポリエチレングリコール、ポリ（２−アルキル−２−オキサゾリン）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、ポリ（２−プロピル−２−オキサゾリン）、およびポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）、その塩、そのジブロックポリマーおよびトリブロックポリマーである。一部の実施形態では、ポリエチレングリコール表面修飾は、約２０００Ｄａから約３０００Ｄａまでにわたる平均分子量を有する。一部の実施形態では、表面修飾は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ１７／６１１１１に開示されている式Ｉの化合物である。
【００２８】
本明細書で提示される方法では、送達ビヒクルは、ポリ核酸、色素、薬物、タンパク質、リポソーム、または化学薬品などのカーゴを含み得る。一部の場合では、カーゴは、これだけに限定することなく、一本鎖、二本鎖または部分的に二本鎖の核酸、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを含めた核酸である。カーゴは、単離され、精製された環状ポリ核酸を含み得る。カーゴの核酸は、タンパク質またはタンパク質の生物学的に活性な部分をコードし得る。一部の実施形態では、コードされるタンパク質は、大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）、デフェンシン（ＨＤ−５）、またはデフェンシンアルファ６（ＨＤ−６）の全部または一部である。
【００２９】
本明細書に開示されている組成物を、投与することを必要とする対象に投与するステップを含む処置方法が本明細書に開示される。本明細書に提示される方法は、治療の標的となる組織を少なくとも１つ有することを特徴とする疾患または状態を処置する方法であって、組織が粘液の層を含み、方法が、本明細書に記載の組成物を投与するステップを含む、方法を含む。一部の場合では、処置の標的は、眼、腸、結腸、肺、小腸、腸管、または子宮頸部を含み得る。一部の場合では、対象は、家族性ポリポーシス（ＦＡＰ）、軽症型ＦＡＰ、結腸直腸がん、慢性炎症性腸疾患、慢性炎症性腸疾患、微絨毛封入体病、先天性下痢状態または疾患およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される疾患を有する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
本開示の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲において詳細に記載されている。本開示の原理を利用することができる例示的な実施形態を記載している以下の詳細な説明およびその付属図を参照することにより、本開示の特徴および利点のよりよい理解が得られる。
【００３１】
【図１】図１は、代表的な細胞透過アッセイ（Ｃａｃｏ−２細胞を使用）を示すグラフである。ＦＩＴＣとコンジュゲートした配列番号２８、３６または３７の配列を有するペプチドについて、陰性対照と比較した任意の蛍光単位が示されている。
【００３２】
【図２】図２は、例示的な基剤系（３０／６０／１０のＭＶＬ５／ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ）を使用した、ムチンの存在下または非存在下での細胞透過アッセイ（動的光散乱（ＤＬＳ）測定での％強度）を示すグラフである。
【００３３】
【図３】図３は、例示的な基剤系（５％ＤＳＰＥ−ＳＳ−ＰＥＧ）を使用した、ムチンの存在下または非存在下での細胞透過アッセイ（ＤＬＳ測定での％強度）を示すグラフである。
【００３４】
【図４】図４は、配列番号３６コンジュゲート系を使用した、ムチンの存在下または非存在下での細胞透過アッセイ（ＤＬＳ測定での％強度）を示すグラフである。
【００３５】
【図５】図５は、配列番号１コンジュゲート系を使用した、ムチンの存在下または非存在下での細胞透過アッセイ（ＤＬＳ測定での％強度）を示すグラフである。
【００３６】
【図６】図６は、配列番号２コンジュゲート系を使用した、ムチンの存在下での細胞透過アッセイ（ＤＬＳ測定での％強度）を示すグラフである。
【００３７】
【図７】図７は、配列番号３コンジュゲート系を使用した、ムチンの存在下での細胞透過アッセイ（ＤＬＳ測定での％強度）を示すグラフである。
【００３８】
【図８】図８は、配列番号４コンジュゲート系を使用した、ムチンの存在下または非存在下での細胞透過アッセイ（ＤＬＳ測定での％強度）を示すグラフである。
【００３９】
【図９】図９は、配列番号５コンジュゲート系を使用した、ムチンの存在下または非存在下での細胞透過アッセイ（ＤＬＳ測定での％強度）を示すグラフである。
【００４０】
【図１０】図１０は、配列番号６コンジュゲート系を使用した、ムチンの存在下または非存在下での細胞透過アッセイ（ＤＬＳ測定での％強度）を示すグラフである。
【００４１】
【図１１】図１１は、配列番号７コンジュゲート系を使用した、ムチンの存在下または非存在下での細胞透過アッセイ（ＤＬＳ測定での％強度）を示すグラフである。
【００４２】
【図１２】図１２は、配列番号８コンジュゲート系を使用した、ムチンの存在下または非存在下での細胞透過アッセイ（ＤＬＳ測定での％強度）を示すグラフである。
【００４３】
【図１３】図１３は、配列番号９コンジュゲート系を使用した、ムチンの存在下または非存在下での細胞透過アッセイ（ＤＬＳ測定での％強度）を示すグラフである。
【００４４】
【図１４】図１４は、配列番号１０コンジュゲート系を使用した、ムチンの存在下または非存在下での細胞透過アッセイ（ＤＬＳ測定での％強度）を示すグラフである。
【００４５】
【図１５】図１５は、配列番号１２コンジュゲート系を使用した、ムチンの存在下または非存在下での細胞透過アッセイ（ＤＬＳ測定での％強度）を示すグラフである。
【００４６】
【図１６】図１６は、配列番号１３コンジュゲート系を使用した、ムチンの存在下または非存在下での細胞透過アッセイ（ＤＬＳ測定での％強度）を示すグラフである。
【００４７】
【図１７】図１７は、配列番号１４コンジュゲート系を使用した、ムチンの存在下または非存在下での細胞透過アッセイ（ＤＬＳ測定での％強度）を示すグラフである。
【００４８】
【図１８】図１８は、配列番号１５コンジュゲート系を使用した、ムチンの存在下または非存在下での細胞透過アッセイ（ＤＬＳ測定での％強度）を示すグラフである。
【００４９】
【図１９】図１９は、配列番号１６コンジュゲート系を使用した、ムチンの存在下または非存在下での細胞透過アッセイ（ＤＬＳ測定での％強度）を示すグラフである。
【００５０】
【図２０】図２０は、配列番号１７コンジュゲート系を使用した、ムチンの存在下または非存在下での細胞透過アッセイ（ＤＬＳ測定での％強度）を示すグラフである。
【００５１】
【図２１】図２１は、配列番号１９コンジュゲート系を使用した、ムチンの存在下または非存在下での細胞透過アッセイ（ＤＬＳ測定での％強度）を示すグラフである。
【００５２】
【図２２】図２２は、配列番号２０コンジュゲート系を使用した、ムチンの存在下または非存在下での細胞透過アッセイ（ＤＬＳ測定での％強度）を示すグラフである。
【００５３】
【図２３】図２３は、配列番号２１コンジュゲート系を使用した、ムチンの存在下または非存在下での細胞透過アッセイ（ＤＬＳ測定での％強度）を示すグラフである。
【００５４】
【図２４】図２４は、配列番号２２コンジュゲート系を使用した、ムチンの存在下または非存在下での細胞透過アッセイ（ＤＬＳ測定での％強度）を示すグラフである。
【００５５】
【図２５】図２５は、配列番号２３コンジュゲート系を使用した、ムチンの存在下または非存在下での細胞透過アッセイ（ＤＬＳ測定での％強度）を示すグラフである。
【００５６】
【図２６】図２６は、配列番号２４コンジュゲート系を使用した、ムチンの存在下または非存在下での細胞透過アッセイ（ＤＬＳ測定での％強度）を示すグラフである。
【００５７】
【図２７】図２７は、配列番号２６コンジュゲート系を使用した、ムチンの存在下または非存在下での細胞透過アッセイ（ＤＬＳ測定での％強度）を示すグラフである。
【００５８】
【図２８】図２８は、配列番号３２コンジュゲート系を使用した、ムチンの存在下または非存在下での細胞透過アッセイ（ＤＬＳ測定での％強度）を示すグラフである。
【００５９】
【図２９】図２９は、配列番号３４コンジュゲート系を使用した、ムチンの存在下または非存在下での細胞透過アッセイ（ＤＬＳ測定での％強度）を示すグラフである。
【００６０】
【図３０】図３０は、Ｈｏｄｇｅｓ法を使用したハイドロパシースコアに従って分析したペプチドについての代表的なプロットを示すグラフである。
【００６１】
【図３１】図３１は、配列番号１とカップリングした脂質ナノ粒子の粘液透過を、配列番号１を伴わない脂質ナノ粒子と比較して示すグラフである。
【００６２】
【図３２Ａ】図３２Ａ〜３２Ｃは、腸上皮細胞の表面における脂質ナノ粒子の分布を示す図である。カップリングしたペプチドを含有しない脂質ナノ粒子が図３２Ａに示されており、配列番号３７のペプチドとカップリングした脂質ナノ粒子が図３２Ｂに示されており、配列番号２９のペプチドとカップリングした脂質ナノ粒子が図３２Ｃに示されている。
【図３２Ｂ】図３２Ａ〜３２Ｃは、腸上皮細胞の表面における脂質ナノ粒子の分布を示す図である。カップリングしたペプチドを含有しない脂質ナノ粒子が図３２Ａに示されており、配列番号３７のペプチドとカップリングした脂質ナノ粒子が図３２Ｂに示されており、配列番号２９のペプチドとカップリングした脂質ナノ粒子が図３２Ｃに示されている。
【図３２Ｃ】図３２Ａ〜３２Ｃは、腸上皮細胞の表面における脂質ナノ粒子の分布を示す図である。カップリングしたペプチドを含有しない脂質ナノ粒子が図３２Ａに示されており、配列番号３７のペプチドとカップリングした脂質ナノ粒子が図３２Ｂに示されており、配列番号２９のペプチドとカップリングした脂質ナノ粒子が図３２Ｃに示されている。
【００６３】
【図３３】図３３は、本開示の種々の例示的な粘液透過性ペプチド（配列番号１〜２１）、Ｐｏｓ−Ｔａｔペプチド（配列番号３７）、ビヒクル対照（ＤＭＳＯ）、および陰性対照を使用した大規模スクリーニング細胞透過アッセイの結果を示すグラフである。
【００６４】
【図３４】図３４は、ムチンを使用した細胞透過アッセイを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
開示の詳細な説明
以下の説明および実施例は、本開示の実施形態を詳細に例示するものである。本開示は本明細書に記載されている特定の実施形態に限定されず、したがって、変化し得ることが理解されるべきである。本開示の変形形態および改変が多数存在し、それらは本開示の範囲内に包含されることを当業者であれば認識する。
【００６６】
定義
「約」という用語およびその文法的等価物は、参照数値およびその文法的等価物との関連で本明細書において使用される場合、その値プラスまたはマイナス１０％の値の範囲を含み得る。例えば、「約１０」という量は、９から１１までの量を含む。「約」という用語は、参照数値との関連で、その値からプラスまたはマイナス１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％の値の範囲も含み得る。
【００６７】
「投与すること（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」という用語およびその文法的等価物は、本明細書に記載の構造体を対象に提供する任意の方法を指し得る。そのような方法は、当業者には周知であり、これらに限定されないが、経口投与、経皮投与、吸入による投与、経鼻投与、局所投与、膣内投与、点眼投与、耳内投与、脳内投与、直腸投与、ならびに静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、および皮下投与などの注射剤を含めた非経口投与を含む。投与は連続的または断続的であり得る。種々の態様では、本明細書において開示される構造体を治療的に投与することができる。一部の例では、構造体を、既存の疾患または状態を処置するために投与することができる。さらなる種々の態様では、構造体を、疾患または状態を防止するために予防的に投与することができる。
【００６８】
「生分解性」という用語およびその文法的等価物は、使用中に分解することが意図された、本明細書に記載のものなどのポリマー、組成物および製剤を指し得る。「生分解性」という用語は、「生物侵食性（ｂｉｏｅｒｏｄｉｂｌｅ）」とも称される材料およびプロセスを包含するものとする。
【００６９】
「がん」という用語およびその文法的等価物は、本明細書で使用される場合、その独特の形質−正常な制御の喪失により、調節されない成長、分化の欠如、局部的な組織浸潤、および転移をもたらす細胞の過剰増殖を指し得る。本発明の方法に関して、がんは、急性リンパ球性がん、急性骨髄性白血病、胞巣状横紋筋肉腫、膀胱がん（ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、骨がん、脳がん、乳がん、肛門、肛門管、直腸のがん、眼のがん、肝内胆管のがん、関節のがん、頸部、胆嚢、もしくは胸膜のがん、鼻、鼻腔、もしくは中耳のがん、口腔のがん、外陰部のがん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性がん、結腸がん、食道がん、子宮頸がん、線維肉腫、消化管カルチノイド腫瘍、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎がん（ｋｉｄｎｅｙ  ｃａｎｃｅｒ）、喉頭がん、白血病、液性腫瘍、肝がん、肺がん、リンパ腫、悪性中皮腫、肥満細胞腫、黒色腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、卵巣がん、膵がん、腹膜、網、および腸間膜がん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎がん（ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、皮膚がん、小腸がん、軟部組織がん、固形腫瘍、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、尿管がん、および／または膀胱がん（ｕｒｉｎａｒｙ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）のいずれかを含めたあらゆるがんであり得る。本明細書で使用される場合、「腫瘍」という用語は、例えば悪性型または良性型の細胞または組織の異常な成長を指す。
【００７０】
「カーゴ」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞もしくは組織へのまたは細胞もしくは組織中への送達のために送達ビヒクル中に包含された１つまたは複数の分子または構造物を指し得る。カーゴの非限定的な例としては、核酸、色素、薬物、タンパク質、ナノ粒子、小さな化学分子およびこれらの任意の組合せが挙げられる。
【００７１】
「細胞」という用語およびその文法的等価物は、本明細書で使用される場合、生物体の構造的かつ機能的単位を指し得る。細胞は、顕微鏡レベルのサイズであり得、細胞質および膜に封入された核からなり得る。細胞は、腸陰窩細胞を指し得る。陰窩細胞は、腸内の絨毛の底部を囲む小窩様構造であるリーベルキューンの陰窩を指し得る。細胞は、ヒトまたは非ヒト起源のものであり得る。
【００７２】
「化学療法剤」または「化学療法化合物」およびこれらの文法的等価物は、本明細書で使用される場合、疾患、例えばがんの処置において有用な化学化合物であり得る。
【００７３】
「コンジュゲート」は、本明細書で使用される場合、これだけに限定することなく、粘液透過性ペプチド（ＭＰＰ）などのペプチドと送達ビヒクル、ポリマーおよび／または表面修飾の会合を含めた、２つまたはそれよりも多くの分子または構造物の共有結合または非共有結合による会合を指す。
【００７４】
「機能」という用語およびその文法的等価物は、本明細書で使用される場合、意図された目的を行う、有するまたは果たす能力を指し得る。機能的とは、意図された目的のベースラインから１００％までの任意のパーセントを含み得る。例えば、機能的とは、意図された目的の５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは約１００％までを含み得るまたは約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは約１００％までを含み得る。一部の場合では、機能的という用語は、通常の機能の１００％を超えるまたは約１００％を超える、例えば、意図された目的の１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％または約１０００％までを意味し得る。
【００７５】
「親水性」という用語およびその文法的等価物は、本明細書で使用される場合、水と容易に相互作用する極性基を有する物質または構造を指す。
【００７６】
「疎水性」という用語およびその文法的等価物は、本明細書で使用される場合、水と容易に相互作用しない極性基を有する物質または構造を指す。
【００７７】
「粘液」という用語およびその文法的等価物は、本明細書で使用される場合、これらに限定されないが、呼吸器、鼻、頸腟部、胃腸、直腸、視覚および聴覚系を含めた種々の器官／組織の上皮表面を保護する、主にムチン糖タンパク質および他の材料を含有する粘弾性の天然物質を指し得る。
【００７８】
「構造体」という用語およびその文法的等価物は、本明細書で使用される場合、ナノ粒子またはナノ構造体を指し得る。構造体は、リポソーム構造体であり得る。構造体は、粒子も指し得る。送達ビヒクルは、構造体であり得る。構造体または粒子は、ナノ粒子またはナノ構造体であり得る。粒子または構造体は、約１ｎｍから約１ミクロンまでの直径を有する任意の形状のものであり得る。ナノ粒子またはナノ構造体は、１００〜２００ｎｍであり得る、または約１００〜２００ｎｍであり得る。ナノ粒子またはナノ構造体はまた、最大５００ｎｍにすることができる。球形を有するナノ粒子またはナノ構造体は、「ナノスフェア」と称され得る。
【００７９】
「脂質構造体」という用語は、本明細書で使用される場合、リポソーム、脂質ナノ粒子および核酸リポプレックスを包含する。「リポソーム」は、本明細書で使用される場合、１つまたは複数の同心脂質二重層で構成される合成構造物を指す。「核酸リポプレックス」は、本明細書で使用される場合、リポソームを核酸と混合して、組織化された構造物を形成させたもの（リポプレックスと称される）を指す。「脂質ナノ粒子」は、本明細書で使用される場合、脂質コア中にカーゴが封入された脂質単層を指す。
【００８０】
「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語ならびにこれらの文法的等価物は、互換的に使用することができ、直鎖状または環状コンフォメーションであり一本鎖または二本鎖のいずれかの形態であるデオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドポリマーを指し得る。本開示の目的に関して、これらの用語は、長さに関して限定すると解釈されるべきでない。この用語は、天然のヌクレオチドの公知の類似体、ならびに塩基、糖および／またはリン酸部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）が修飾されているヌクレオチドも包含し得る。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は同じ塩基対合特異性を有し得る、すなわち、アデニン「Ａ」の類似体は、チミン「Ｔ」と塩基対合することができる。
【００８１】
「薬学的に許容される担体」という用語およびこれらの文法的等価物は、滅菌水溶液
または非水溶液、分散液、懸濁液またはエマルション、ならびに使用する直前に滅菌注射用溶液または分散液に復元するための滅菌粉末を指し得る。妥当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料を使用することによって、分散液の場合では必要な粒子サイズを維持することによっておよび界面活性物質を使用することによって維持することができる。これらの溶液、分散液、懸濁液またはエマルションは、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントも含有し得る。微生物の作用の防止は、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などの種々の抗細菌剤および抗真菌剤を含めることによって確実にすることができる。例えば糖、塩化ナトリウムなどの等張化剤を含めることも望ましいことがある。注射可能な医薬形態の長期にわたる吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの、吸収を遅延させる剤を含めることによってもたらすことができる。注射可能なデポ剤の形態は、薬物のポリラクチド−ポリグリコリド、ポリ（オルトエステル）およびポリ（酸無水物）などの生分解性ポリマー中のマイクロカプセルマトリックス（ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌｅ  ｍａｔｒｉｃｅｓ）を形成することによって製造される。
【００８２】
「かかりやすい」という用語は、本明細書で使用される場合、対象が疾患または状態に罹患する確率の上昇（例えば、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、またはそれよりも大きな確率の上昇）を意味するものと理解することができる。
【００８３】
「プロモーター」という用語は、本明細書で使用される場合、特定の遺伝子またはその一部の転写を開始するＤＮＡの領域であり得る。
【００８４】
「レシピエント」という用語およびこれらの文法的等価物は、本明細書で使用される場合、対象を指し得る。対象は、ヒトまたは非ヒト動物であり得る。レシピエントは、それを必要とする、例えば、がんなどの疾患に対する処置を必要とする場合もある。一部の場合では、レシピエントは、防止的治療を必要とする場合がある。他の場合では、レシピエントは、それを必要としない場合がある。
【００８５】
「リスク」という用語およびその文法的等価物は、本明細書で使用される場合、特定の期間にわたって事象が起こる確率を指し得、対象の「絶対的」リスクまたは「相対的」リスクを意味し得る。絶対的リスクは、関連性のある時間コホートについての測定後の実際の観察を参照して、または関連性のある期間にわたって追跡されている統計学的に有効な歴史的コホートから生じる指数値を参照してのいずれかで測定することができる。相対的リスクとは、比較される対象の絶対的リスクの、低リスクコホートの絶対的リスクまたは平均集団リスクのいずれかに対する比を指し、これは、臨床的リスクファクターをどのように評価するかによって変動し得る。
【００８６】
「対象」という用語およびその文法的等価物は、本明細書で使用される場合、ヒトまたは非ヒトを指し得る。対象は、哺乳動物であり得る。対象は、男性または女性のヒト哺乳動物であり得る。対象はあらゆる年齢であり得る。対象は胚であり得る。対象は新生児または最高で約１００歳であり得る。対象はそれを必要とし得る。対象はがんなどの疾患を有し得る。
【００８７】
「配列」という用語およびその文法的等価物は、本明細書で使用される場合、ヌクレオチド配列を指し得、これは、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡであり得、直鎖状、環状または分枝であり得、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。配列は任意の長さのもの、例えば、長さが２から１，０００，０００またはそれを超えるヌクレオチド（またはその間もしくはそれを超える任意の整数値）、例えば、約１００から約１０，０００の間のヌクレオチドまたは約２００から約５００の間のヌクレオチドであり得る。
【００８８】
「表面修飾（surface  modification）」とは、本明細書で使用される場合、これらに限定されないが、親水性（例えば、表面をある程度親水性にすることができる）、表面電荷（例えば、表面を中性もしくは中性付近またはより負もしくは正にする）、ならびに／または粘液などの体液および／もしくは組織中へのもしくはそれを通った輸送を増強することを含めた、構造体の表面の１つまたは複数の性質を修飾する剤または材料を指し得る。表面改質剤はポリマーであり得る。
【００８９】
「粘液透過性表面修飾」は、本明細書で使用される場合、表面修飾および表面修飾が修飾する構造物が哺乳動物細胞層または組織の天然に存在する粘液層、例えば、結腸、肺、眼または子宮頸部の粘液を透過することを可能にする１つまたは複数の性質を有する表面修飾を指し得る。
【００９０】
「幹細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、同じ型の細胞を無制限により多く生じさせることができる多細胞性生物体の未分化細胞を指し得る。幹細胞はまた、分化によって他の種類の細胞を生じさせることもできる。幹細胞は、陰窩において見出すことができる。幹細胞は、腸絨毛表面上に見出される上皮細胞の前駆体であり得る。幹細胞は、がん性であり得る。幹細胞は、全能性、単能性または多能性であり得る。幹細胞は、誘導された幹細胞であり得る。
【００９１】
「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語およびこれらの文法的等価物は、疾患、状態または障害を治癒させる、好転させる、安定化する、または防止することが意図された、対象の医学的管理を指し得る。処置は、積極的処置、すなわち、疾患、状態または障害の改善を特に対象とする処置を含み得る。処置は、原因処置、すなわち、関連する疾患、状態または障害の原因を取り除くことを対象とする処置を含み得る。さらに、この処置は、待機的処置、すなわち、疾患、状態または障害を治癒させるのではなく症状を軽減するために設計された処置を含み得る。処置は、防止的処置、すなわち、疾患、状態または障害の発生を最小化するまたは部分的にもしくは完全に阻害することを対象とする処置を含み得る。処置は、支持的処置、すなわち、疾患、状態または障害の改善を対象とする別の特定の治療を補うために使用される処置を含み得る。一部の例では、状態は、病理学的であり得る。一部の例では、処置は、疾患、状態または障害を完全に治癒させる、好転させる、安定化するまたは防止するものでなくてよい。
【００９２】
概要
疾患または状態の処置における使用のためのカーゴの送達に有用な組成物および方法であって、意図された標的組織または細胞への送達が、粘液を透過することを含む、組成物および方法が本明細書に開示される。本明細書の組成物および方法は、例えば、遺伝子治療を送達するため、治療用分子を送達するため、および色素などの診断用分子を送達するために使用することができる。全体を通して記載されている組成物および方法は、細胞透過性質および粘液透過性質を提供するものであり、カーゴを、粘液層を通して標的細胞におよび／または標的細胞中に送達するために使用することができる。本明細書の組成物および方法は、粘液層を有する細胞および組織、例えば、結腸、肺、眼および子宮頸部などに処置をもたらすために使用することができる。例えば、本明細書の組成物および方法を、家族性ポリポーシス（ＦＡＰ）、軽症型ＦＡＰ、結腸直腸がん、慢性炎症性腸疾患、慢性炎症性腸疾患を含めた疾患および状態に対して、腸陰窩細胞などの部位に対する局部的な遺伝子治療などの処置をもたらすために使用することができる。
【００９３】
粘液透過性細胞透過性ペプチド（ＭＰＰ）
細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、薬物の細胞への取り込みの増加を可能にし得る短いポリペプチドであり得る。細胞透過性ペプチドは、細胞質膜を効率的に横断するペプチド配列であり得るが、粘液層を横断し、下にある細胞および組織に到達するそれらの能力は制限される場合がある。
【００９４】
粘液透過性細胞透過性ペプチド（ＭＰＰ）は、細胞透過性質を有し、さらに、結腸、肺、眼および子宮頸部における天然に存在する粘液の層などの粘液の層を透過することを可能にする、ペプチドの新規のクラスである。ＭＰＰはさらに、リポソーム構造体などの構造物を細胞の細胞内構成成分にターゲティングするために使用することができる。ＭＰＰはまた、ある特定の細胞型を特異的に標的とするように設計することもできる。ナノ粒子が粘液層を透過することを可能にするため、および透過の増加または細胞の標的化がもたらされるように細胞と相互作用させるためにも、ＭＰＰをナノ粒子とコンジュゲートすることができる。一部の場合では、ＭＰＰを有する粒子は、ＭＰＰを含有しない同等の粒子と比較して、少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または約１００％までの有効性で細胞に内部移行し得る。
【００９５】
一部の実施形態では、送達ビヒクルは、粘液透過性ペプチド（ＭＰＰ）を含む。ＭＰＰを、ＭＰＰが露出し、したがって、ＭＰＰが粘液層、粘液含有組織、器官または細胞外表面と全体的にまたは部分的に接触するように、送達ビヒクル、送達ビヒクルの表面修飾またはカーゴとコンジュゲートすることができる。ＭＰＰが存在することにより、送達ビヒクルの粘液の透過（拡散および／または移動）の改善が付与される。一部の実施形態では、ＭＰＰを含有しない送達ビヒクルおよび／またはカーゴの送達と比較して、透過が２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、５０倍、１００倍、またはそれよりも大きく改善される。
【００９６】
所与のＭＰＰペプチドの内部移行挙動および／またはトランスフェクション能を判定する多数の方法は当技術分野において確立されており、例えば、検出可能な標識（例えば蛍光色素）をペプチド（および／またはトランスフェクトされるカーゴ）に結合させることによるか、または、ペプチドをレポーター分子と融合し、したがって、ペプチドの細胞内取り込みが起こった際に、例えばＦＡＣＳ分析によってもしくは特異的抗体を介して検出することを可能にすることによる。当業者は、そのような方法に使用されるペプチドおよび該当する場合にはカーゴのそれぞれの濃度範囲をどのように選択するかもよく分かっており、これは、ペプチドの性質、カーゴのサイズ、使用される細胞型などに依存する。
【００９７】
ＭＰＰは、これだけに限定することなく、約３〜５個、５〜１０個、１０〜２０個、２０〜４０個、３０〜６０個、または８０〜１００個のアミノ酸を含め、約３個から１００個までのアミノ酸を有するアミノ酸配列を有し得る。ＭＰＰは、約３個から、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、または約１００個までのアミノ酸を有し得る。
【００９８】
ＭＰＰは、標的細胞または組織を覆っているまたは囲んでいる粘液層を透過する能力を有する。ＭＰＰを使用して、哺乳動物の結腸、肺、眼または子宮頸部などの標的組織の粘液層透過をなすことができる。ＭＰＰを、ナノ粒子を含めた送達ビヒクルの粘液層透過を可能にするため、および、透過の増加または細胞の標的化がもたらされるように細胞と相互作用させるためにも、送達ビヒクルとコンジュゲートすることができる。一部の場合では、ＭＰＰを有する粒子は、ＭＰＰを含有しない同等の粒子と比較して、少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または約１００％までの有効性で粘液層を透過する。粘液層透過を判定する多数の方法を使用して、ＭＰＰまたは送達ビヒクルと直接もしくは間接的にコンジュゲートしたＭＰＰの透過を評価することができる。１つの方法では、蛍光標識されたカーゴを有する送達系とコンジュゲートしたＭＰＰを新鮮なブタの腸の上部に滴下することができる。その腸を、包埋し、凍結させて凍結切片を作製し、蛍光顕微鏡によって粘液透過を分析することができる。
【００９９】
ＭＰＰは、粘液透過をもたらし、かつ細胞透過性質を保持する特性を含むように設計することができる。一部の場合では、ＭＰＰは、親水性を考慮することによって設計することができる。コンピュータによる解析を使用して、タンパク質のアミノ酸の疎水性または親水性の程度を定量することができる。一部の場合では、コンピュータによる解析においてアミノ酸尺度を利用して、アミノ酸の各型に割り当てられる数値を決定することができる。最も頻繁に使用される尺度は、疎水性または親水性尺度および二次構造コンフォメーションパラメータ尺度であるが、アミノ酸の異なる化学的性質および物性に基づく多くの他の尺度が存在する。疎水性または親水性を決定するために、種々の尺度、例えば、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｈｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓ、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、Ｍａｎａｖａｌａｎ、Ｂｌａｃｋ、Ｆａｕｃｈｅｒｅ、Ｊａｎｉｎ、Ｒａｏ  ＆  Ａｒｇｏｓ、Ｔａｎｆｏｒｄ、Ｗｅｌｌｉｎｇ、Ｐａｒｋｅｒ、Ｃｏｗａｎ  Ｒｏｓｅ、Ａｂｒａｈａｍ  ＆  Ｌｅｏ、Ｂｕｌｌ  ＆  Ｂｒｅｅｓｅ、Ｇｕｙ、Ｍｉｙａｚａｗａ、Ｒｏｓｅｍａｎ、Ｗｏｌｆｅｎｄｅｎ、Ｗｉｌｓｏｎ、Ｒｆ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ、Ｃｈｏｔｈｉａ、およびこれらの任意の組合せを利用することができる。
【０１００】
一部の場合では、Ｈｏｄｇｅｓ試験を実施して、適切なＭＰＰを同定することができる。Ｈｏｄｇｅｓ試験では、最近接効果またはコンフォメーション効果の非存在下でのペプチド内のアミノ酸残基の固有の親水性または疎水性を考慮に入れることができる。疎水性効果の顕在化は、ペプチド構造の多くのファセットにおいて明らかになる。これらとしては、溶液中でのタンパク質の球状構造の安定化、脂質環境中のペプチドまたは膜タンパク質において誘導される両親媒性構造の存在、ならびにタンパク質サブユニット集合に関連するタンパク質間相互作用、タンパク質−受容体結合、および他の分子間生物学的認識プロセスが挙げられる。利用することができる手法は、クロマトグラフィーによるものまたはクロマトグラフィーによらないものを含み得る。アッセイは、分配、接触表面積算出、部位特異的変異誘発、物性測定、およびクロマトグラフィーによる技法を含み得る。分配アッセイは、液体−液体分配を含み得る。部位特異的変異誘発アッセイは、タンパク質の表面または内部にアミノ酸置換を含み得る。物性測定は、アミノ酸溶液の表面張力、アミノ酸の溶媒和自由エネルギー、およびペプチドの見かけの熱容量を含み得る。クロマトグラフィーによる技法は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を含み得る。このＲＰ−ＨＰＬＣに基づく手法を使用し、ペプチド疎水性とペプチド保持挙動の関係を示すために、ペプチドをランダムに収集したものに対して回帰分析を実施することができる。一部の場合では、ＲＰ−ＨＰＬＣを、定義されたペプチド配列内にアミノ酸置換をただ１つ有する合成モデルペプチドの混合物の分離に適用することができる。ＲＰ−ＨＰＬＣを、Ｘアミノ酸が天然に存在する全てのアミノ酸ならびにノルバリン、ノルロイシン、およびオルニチンによって置換されていてよい特定の配列を有する新規の設計されたモデルペプチドの混合物の分離に適用することができる。これらのモデルペプチドの観察された保持挙動から、アミノ酸側鎖のｐＨ２、５、および７における固有の親水性／疎水性値を得ることができる（後者は塩の存在下、および非存在下で）。
【０１０１】
一部の場合では、ペプチド／タンパク質内のアミノ酸側鎖について固有の親水性／疎水性値を決定するために、いくつかの基準を考慮に入れることができる：（１）モデルペプチド配列は、いかなる環境（水性または疎水性）においてもＲＰ−ＨＰＬＣ中の移動相と固定相の間のペプチドの分配中に置換部位と疎水性マトリックスの相互作用を制限する可能性があるあらゆる型の二次構造（α−へリックス、β−シート、またはβ−ターン）を形成する傾向が少ないものであるべきである；（２）ペプチドは、多部位結合を確実にするために十分な長さのものであるべきである；（３）ペプチドは、全体的な疎水性が、天然に存在する全てのアミノ酸側鎖の置換を可能にする一方で十分な保持挙動を維持するために十分なものであるべきである；（４）アミノ酸側鎖の分布は、置換アミノ酸側鎖による寄与を最小限にすることができる、疎水性側鎖の密集が低減されるようなものであるべきである；（５）ペプチドは、アミノ酸の置換に際して十分な保持挙動を維持するために十分に長いが、ペプチド保持時間６５に対する鎖長効果（一般に１５残基を超えるペプチドについて）に起因して置換アミノ酸の親水性／疎水性の完全な発現が低減するほどは長くないものであるべきである；（６）置換部位は、サイズおよび疎水性に関して最小の側鎖を有する残基の隣にあり、したがって、置換アミノ酸がその真の固有の親水性／疎水性を発現することが可能になるべきである；および（７）最近接効果（置換残基とのｉとｉ±１の相互作用）は存在すべきでない−そのような効果は、角度ψ（Ｃα−Ｃ）およびφ（Ｃα−Ｎ）によって表される結合の自由回転が存在する場合、すなわち、ｉ位の置換側鎖とｉ±１位のその最近接側鎖の間に立体障害が存在しない場合に排除され得る。
【０１０２】
ペプチド親水性または疎水性のコンピュータによる解析においていくつかのパラメータを考慮に入れることができる。例えば、ウインドウサイズは、プロファイルコンピュータ計算に使用するための区間の長さ、すなわち、疎水性の点を決定する時点で調査したアミノ酸の数であり得る。所与の残基ｉについてのスコアをコンピュータ計算する場合、選択された長さの間にある、残基ｉ付近に集中しているアミノ酸を考慮に入れる。言い換えれば、ウインドウサイズｎについて、残基ｉの両側のｉ−（ｎ−１）／２近接残基を、残基ｉのスコアをコンピュータ計算するために考慮に入れる。残基ｉのスコアは、これらのアミノ酸の尺度値の合計であり、必要に応じてウインドウ内のそれらの位置に従って重み付けされる。調査中の構造モチーフの予測サイズに対応するウインドウを選択すべきである：表面に露出している可能性があり、潜在的に抗原性であり得る親水性領域を見出すためにはウインドウサイズ５〜７が妥当である。ウインドウサイズ１９または２１では、疎水性の膜貫通ドメインがかなり明白に目立つ（一般にはＫｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ尺度で＞１．６）。別のパラメータは、ウインドウの端の相対的な重みであり得る。ウインドウの中央のアミノ酸は１００％の重みを有し得る。デフォルトでは、ウインドウの残りの位置にあるアミノ酸は同じ重みを有するが、区間の末端にある残基に対する重み値を０から１００％の間の値で設定することにより、ウインドウの中央の残基により大きな重みをもたせることができる（他の残基と比較して）。中央と端の間の重みの減少は、重み変動モデル選択肢（weight variation model option）の設定に応じて直線的なものであっても指数関数的なものであってもよい。一部の場合では、尺度を正規化することもできる。値を、その全てが０から１までの範囲内に当てはまるように正規化するために尺度を改変しなくても改変してもよい。正規化は、異なる尺度を用いて得られたプロファイルの結果を比較し、見かけがより均一なプロットを作成したい場合に有用である。
【０１０３】
一部の場合では、ペプチドのハイドロパシーを決定することができる。ハイドロパシーは、ペプチドのアミノ酸配列に基づく定量的評価であり得る。ハイドロパシーは、種々の手段によって決定することができる。一部の場合では、表１のように、Ｆａｕｃｈｅｒｅスコアを使用して、ペプチドの親水性または疎水性を決定することができる。
【表１】
2021523912.tif 000004
【０１０４】
Ｆａｕｃｈｅｒｅスコアは、アミノ酸の残基ごとに決定することもでき、ペプチドごとに決定することもできる。
【０１０５】
一部の場合では、ハイドロパシーをＨｏｄｇｅｓ試験によって決定することができる。Ｈｏｄｇｅｓ試験を利用して、各アミノ酸を１０アミノ酸ペプチド：Ａｃ−Ｘ−Ｇ−Ａ−Ｋ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｖ−Ｇ−Ｌ（配列中、Ｘは試験されるアミノ酸である）内に入れることによってアミノ酸の親水性および疎水性を測定することができる。その後、表２のように、逆相ＨＰＬＣを使用して各ペプチドの保持時間を測定することができる。一部の場合では、Ｈｏｄｇｅｓ試験をｐＨ７で実施することができる。Ｈｏｄｇｅｓ試験をｐＨ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２などの酸性または塩基性条件下で実施することもできる。Ｈｏｄｇｅｓ試験を塩の存在下または非存在下で実施することができる。一部の場合では、Ｈｏｄｇｅｓスコアをグリシンに対して正規化することができる。グリシンは、スコア０を有し得る。例えば、グリシンよりも親水性が大きいアミノ酸に負のＨｏｄｇｅｓスコアを与えることができる。Ｈｏｄｇｅｓスコアをアミノ酸の残基ごとに決定することもでき、ペプチドごとに決定することもできる。
【０１０６】
ペプチドごとのＦａｕｃｈｅｒｅスコアまたはＨｏｄｇｅｓスコアは、総ＦａｕｃｈｅｒｅスコアまたはＨｏｄｇｅｓスコアを配列内に存在するアミノ酸残基の数で割ることによって決定することができる。Ｆａｕｃｈｅｒｅ試験では、疎水性スコアを、分配係数を決定することによって測定することができる。一部の場合では、ペプチドを、残基ごとのハイドロパシースコアの平均（average hydropathy per residue score）について、Ｈｏｄｇｅｓ試験によって測定して１０未満になるかまたは１０と等しくなるようにスクリーニングすることができる。一部の場合では、ペプチドを、残基ごとのハイドロパシースコアの平均について、Ｆａｕｃｈｅｒｅ試験によって測定して０．５未満になるかまたは０．５と等しくなるようにスクリーニングすることができる。例えば、ペプチドは、１０であり得るまたは約１０であり得る残基ごとのハイドロパシーを含有し得る。例えば、ペプチドは、Ｈｏｄｇｅｓ試験またはＦａｕｃｈｅｒｅ試験からの、ｐＨ７において測定して２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５、０．３、０．２、０．１、もしくは０であり得るまたは約２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５、０．３、０．２、０．１、もしくは０であり得る残基ごとのハイドロパシーを含有し得る。一部の場合では、ＭＰＰは、Ｈｏｄｇｅｓスコアが１０よりも大きい隣接残基を４個以下含有し得る。一部の場合では、ＭＰＰは、Ｈｏｄｇｅｓスコアが１０よりも大きい隣接残基を１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、６個以下、７個以下、８個以下、９個以下、１０個以下、１１個以下、１２個以下、１３個以下、１４個以下、１５個以下、１６個以下、１７個以下、１８個以下、１９個以下、または２０個以下含有し得る。一部の場合では、ＭＰＰは、Ｈｏｄｇｅｓスコアが９よりも大きい隣接残基を１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、６個以下、７個以下、８個以下、９個以下、１０個以下、１１個以下、１２個以下、１３個以下、１４個以下、１５個以下、１６個以下、１７個以下、１８個以下、１９個以下、または２０個以下含有し得る。一部の場合では、ＭＰＰは、Ｈｏｄｇｅｓスコアが８よりも大きい隣接残基を１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、６個以下、７個以下、８個以下、９個以下、１０個以下、１１個以下、１２個以下、１３個以下、１４個以下、１５個以下、１６個以下、１７個以下、１８個以下、１９個以下、または２０個以下含有し得る。一部の場合では、ＭＰＰは、Ｈｏｄｇｅｓスコアが７よりも大きい隣接残基を１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、６個以下、７個以下、８個以下、９個以下、１０個以下、１１個以下、１２個以下、１３個以下、１４個以下、１５個以下、１６個以下、１７個以下、１８個以下、１９個以下、または２０個以下含有し得る。一部の場合では、ＭＰＰは、Ｈｏｄｇｅｓスコアが６よりも大きい隣接残基を１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、６個以下、７個以下、８個以下、９個以下、１０個以下、１１個以下、１２個以下、１３個以下、１４個以下、１５個以下、１６個以下、１７個以下、１８個以下、１９個以下、または２０個以下含有し得る。一部の場合では、ＭＰＰは、Ｈｏｄｇｅｓスコアが５よりも大きい隣接残基を１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、６個以下、７個以下、８個以下、９個以下、１０個以下、１１個以下、１２個以下、１３個以下、１４個以下、１５個以下、１６個以下、１７個以下、１８個以下、１９個以下、または２０個以下含有し得る。一部の場合では、ＭＰＰは、Ｈｏｄｇｅｓスコアが４よりも大きい隣接残基を１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、６個以下、７個以下、８個以下、９個以下、１０個以下、１１個以下、１２個以下、１３個以下、１４個以下、１５個以下、１６個以下、１７個以下、１８個以下、１９個以下、または２０個以下含有し得る。一部の場合では、ＭＰＰは、Ｈｏｄｇｅｓスコアが３よりも大きい隣接残基を１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、６個以下、７個以下、８個以下、９個以下、１０個以下、１１個以下、１２個以下、１３個以下、１４個以下、１５個以下、１６個以下、１７個以下、１８個以下、１９個以下、または２０個以下含有し得る。一部の場合では、ＭＰＰは、Ｈｏｄｇｅｓスコアが２よりも大きい隣接残基を１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、６個以下、７個以下、８個以下、９個以下、１０個以下、１１個以下、１２個以下、１３個以下、１４個以下、１５個以下、１６個以下、１７個以下、１８個以下、１９個以下、または２０個以下含有し得る。一部の場合では、ＭＰＰは、Ｈｏｄｇｅｓスコアが１よりも大きい隣接残基を１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、６個以下、７個以下、８個以下、９個以下、１０個以下、１１個以下、１２個以下、１３個以下、１４個以下、１５個以下、１６個以下、１７個以下、１８個以下、１９個以下、または２０個以下含有し得る。一部の場合では、ＭＰＰは、Ｆａｕｃｈｅｒｅスコアが０．５よりも大きい隣接残基を１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、６個以下、７個以下、８個以下、９個以下、１０個以下、１１個以下、１２個以下、１３個以下、１４個以下、１５個以下、１６個以下、１７個以下、１８個以下、１９個以下、または２０個以下含有し得る。一部の場合では、ＭＰＰは、Ｆａｕｃｈｅｒｅスコアが０．４よりも大きい隣接残基を１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、６個以下、７個以下、８個以下、９個以下、１０個以下、１１個以下、１２個以下、１３個以下、１４個以下、１５個以下、１６個以下、１７個以下、１８個以下、１９個以下、または２０個以下含有し得る。一部の場合では、ＭＰＰは、Ｆａｕｃｈｅｒｅスコアが０．３よりも大きい隣接残基を１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、６個以下、７個以下、８個以下、９個以下、１０個以下、１１個以下、１２個以下、１３個以下、１４個以下、１５個以下、１６個以下、１７個以下、１８個以下、１９個以下、または２０個以下含有し得る。一部の場合では、ＭＰＰは、Ｆａｕｃｈｅｒｅスコアが０．２よりも大きい隣接残基を１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、６個以下、７個以下、８個以下、９個以下、１０個以下、１１個以下、１２個以下、１３個以下、１４個以下、１５個以下、１６個以下、１７個以下、１８個以下、１９個以下、または２０個以下含有し得る。一部の場合では、ＭＰＰは、Ｆａｕｃｈｅｒｅスコアが０．１よりも大きい隣接残基を１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、６個以下、７個以下、８個以下、９個以下、１０個以下、１１個以下、１２個以下、１３個以下、１４個以下、１５個以下、１６個以下、１７個以下、１８個以下、１９個以下、または２０個以下含有し得る。一部の場合では、ペプチドを、ＭＰＰの総Ｈｏｄｇｅｓスコアが２００、１９０、１８０、１７０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０を下回るようにスクリーニングすることができる。一部の場合では、ペプチドを、ＭＰＰの総Ｆａｕｃｈｅｒｅスコアが２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１を下回るようにスクリーニングすることができる。
【表２】
2021523912.tif 000005
【０１０７】
ペプチドを、互いに隣接して位置するＨｏｄｇｅｓスコアが１０よりも大きい残基が４個以下になるようにスクリーニングすることができる。ペプチドを、Ｈｏｄｇｅｓスコアが１０よりも大きいアミノ酸の総数がペプチドの全長の４０％よりも多くを占めないようにスクリーニングすることができる。一部の場合では、ＣＰＰを、Ｈｏｄｇｅｓスコアが約１０よりも大きいアミノ酸の総数がＭＰＰペプチドの全長の４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または約１００％までになるように設計することができる。一部の場合では、ＭＰＰがシステインを含有する場合、チオール基は遊離でなくてよい。一部の場合では、ＭＰＰの正味の電荷は、−５から＋５の間であり得るまたは約−５から＋５の間であり得る。一部の場合では、ＭＰＰの正味の電荷は、−４から＋４の間であり得るまたは約−４から＋４の間であり得る。一部の場合では、ＭＰＰの正味の電荷は、−３から＋３の間であり得るまたは約−３から＋３の間であり得る。一部の場合では、ＭＰＰの正味の電荷は、−２から＋２の間であり得るまたは約−２から＋２の間であり得る。一部の場合では、ＭＰＰの正味の電荷は、−１から＋１の間であり得るまたは約−１から＋１の間であり得る。
【０１０８】
一部の場合では、ＭＰＰを、ある特定の特性、例えば：（Ｐ／Ｎ／Ｕ）０−２（Ｕ／Ｈ）３−４（Ｐ／Ｎ／Ｕ）０−２（ここで、−２≦Ｐ−Ｎ≧２であり、Ｈは疎水性残基であり、Ｐは正に荷電した残基であり、Ｕは非荷電極性残基であり、およびＮは負に荷電した残基である）を満たすようにスクリーニングすることができる。
【０１０９】
一部の場合では、ＭＰＰを、ある特定の特性、例えば：（（Ｕ０−１５（Ｈ０−４Ｕ１−１５））０−１５（Ｐ／Ｎ）（Ｕ０−１５（Ｈ０−４Ｕ１−１５）０−１５））１−１５（ここで、−２≦Ｐ−Ｎ≧２であり、長さ＜５０であり、Ｈ０−４は＞４の疎水性ストレッチがないことを示し、また、Ｈは疎水性残基であり、Ｐは正に荷電した残基であり、Ｕは非荷電極性残基であり、Ｎは負に荷電した残基である）を満たすようにスクリーニングすることができる。
【０１１０】
一部の場合では、ＭＰＰを機能アッセイによってスクリーニングし、かつ／または確認することができる。例えば、蛍光標識されたカーゴを有する送達系とコンジュゲートしたＭＰＰを新鮮なブタの腸の上部に滴下することができる。その腸を、包埋し、凍結させて凍結切片を作製し、蛍光顕微鏡によって粘液透過を分析することができる。一部の場合では、ＭＰＰをトランスウェルアッセイなどのベンチトップアッセイによって、またはｉｎ  ｖｉｖｏ粘液透過アッセイによってスクリーニングし、かつ／または確認することができる。
【０１１１】
【表３−１】
2021523912.tif 000006
【表３−２】
2021523912.tif 000007
【０１１２】
本明細書に記載のＭＰＰは、表３に記載の配列の１つまたは複数を含み得る。ＭＰＰにより、天然に存在する粘液層を透過して、標的組織または細胞に到達する能力がもたらされる。ＭＰＰは、原形質膜を移動し、種々の分子カーゴの標的細胞の細胞質または細胞小器官への送達を容易にする能力を有し得る。ＭＰＰは、細胞膜を直接透過し得る。ＭＰＰは、細胞へのエンドサイトーシス媒介性進入を使用し得る。一部の場合では、ＭＰＰは、一過性の構造の形成を通じた移動を使用し得る。ＭＰＰは、約５アミノ酸から約１０アミノ酸まで、約１０アミノ酸から約２０アミノ酸まで、約２０アミノ酸から約３０アミノ酸まで、約３０アミノ酸から約４０アミノ酸まで、約４０アミノ酸から約６０アミノ酸までのアミノ酸配列を有し得る。一部の場合では、ＭＰＰは、約１アミノ酸から、２、３、４、５、６、７、８、９，１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または約９９アミノ酸またはそれよりも多くまでを有し得る。ＭＰＰは、天然アミノ酸、アミノ酸誘導体、Ｄ−アミノ酸、修飾アミノ酸、β−アミノ酸誘導体、α，α−置換アミノ酸誘導体、Ｎ置換ａ−アミノ酸誘導体、脂肪族または環状アミン、アミノ置換およびカルボキシル置換シクロアルキル誘導体、アミノ置換およびカルボキシル置換芳香族誘導体、γ−アミノ酸誘導体、脂肪族ａ−アミノ酸誘導体、ジアミンおよびポリアミンを含み得ることが好ましい。さらなる修飾アミノ酸は当業者には公知である。
【０１１３】
ＭＰＰのアミノ酸残基は、Ｌ−異性体立体配置であり得る。一部の実施形態では、ＭＰＰの１つまたは複数のアミノ酸残基はＤ−異性体として存在し得る。
【０１１４】
ＭＰＰは、ナノ粒子などの送達ビヒクルの細胞内取り込みを容易にし得る。送達ビヒクルは、小さな化学分子ならびに核酸、ペプチド、タンパク質、薬物、リポソーム、およびこれらの組合せなどの巨大分子を含み得る。ＭＰＰは、送達ビヒクルの表面に全体的にまたは部分的に露出し、ＭＰＰにより粘液層を透過する能力が付与され、したがって、ＭＰＰと直接または間接的にコンジュゲートした送達ビヒクルも粘液層を透過し、標的細胞または組織に到達することができる。
【０１１５】
一部の実施形態では、送達ビヒクルは、表面修飾を通じたものなどの粘液透過特徴を含み、コンジュゲートしたＭＰＰにより、送達ビヒクルの粘液層を透過する能力の改善が付与され、また、意図された治療および／または診断のための細胞または組織へのターゲティングがもたらされる。
【０１１６】
ＭＰＰは、ウイルス供給源に由来するものであり得る。例えば、ポリオウイルスＶＰ１  ＢＣループ由来の配列はＴＶＤＮＰＡＳＴＴＮＫＤＫＬＦＡＶであり、これは、ポリオウイルス受容体と相互作用することが示されており、これを利用することができる、または、細胞を透過する能力を保持し、また本明細書に記載の少なくとも１つの粘液透過特徴を含むように操作もされているペプチドを工学的に作製する（engineer）ための鋳型として利用することもできる。一部の場合では、本明細書の組成物および方法に使用するためのＭＰＰは、表３に開示されている配列、または表３に開示されている配列に対して約５０％から、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは約１００％までの相同性を含む。
【０１１７】
さらなる実施形態では、本発明において使用されるＭＰＰは、内部移行した後、それらのそれぞれの標的細胞に対して有意な細胞傷害性および／または免疫原性の影響を発揮しない、すなわち、細胞の生存能力に干渉しない（少なくとも細胞のトランスフェクションおよび／または透過を媒介するために十分な濃度において）。
【０１１８】
送達ビヒクル
【０１１９】
本明細書の組成物および方法に使用するための送達ビヒクルは、ナノ粒子を含み得る。
【０１２０】
送達ビヒクルは、約４０ｎｍから、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１１０ｎｍ、１２０ｎｍ、１３０ｎｍ、１４０ｎｍ、１５０ｎｍ、１６０ｎｍ、１７０ｎｍ、１８０ｎｍ、１９０ｎｍ、２００ｎｍ、２１０ｎｍ、２２０ｎｍ、２３０ｎｍ、２４０ｎｍ、２５０ｎｍ、または約５５０ｎｍまでの直径を有し得る。本明細書に記載の送達ビヒクルは、リポソーム構造体であり得る。リポソーム構造体は、一部の場合では、小胞であってよい。小胞は、単層であってもよく、多層であってもよい。単層小胞は、脂質二重層を含んでよく、一般に、約５０ｎｍから約２５０ｎｍまでの直径を有する。単層小胞は、脂質二重層を含んでよく、一般に、約５０ｎｍから、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１１０ｎｍ、１２０ｎｍ、１３０ｎｍ、１４０ｎｍ、１５０ｎｍ、１６０ｎｍ、１７０ｎｍ、１８０ｎｍ、１９０ｎｍ、２００ｎｍ、２１０ｎｍ、２２０ｎｍ、２３０ｎｍ、２４０ｎｍ、または約２５０ｎｍまでの直径を有する。
【０１２１】
送達ビヒクルは、リポソーム、核酸リポプレックス、脂質ナノ粒子または他の型の脂質構造体などの脂質構造体を含み得る。
【０１２２】
ナノ粒子は、リポソームを含み得る。リポソームは、エネルギー的に有利な様式で互いと相互作用する脂質の蓄積によって形成し得る小胞構造体であり得る。リポソームは、一般に、それぞれが親水性の頭部基および疎水性の尾部を含有し得る溶解した脂質分子の自己組織化によって形成し得る。リポソームは、天然または合成脂質で構成される１つまたは複数の二重層に閉じ込められた水性コアからなり得る。一部の場合では、リポソームは、高度に反応性かつ免疫原性、または不活性かつ弱く免疫原性であり得る。天然リン脂質で構成されるリポソームは、生物学的に不活性かつ弱く免疫原性であり得、リポソームは、低内因性毒性を有し得る。
【０１２３】
単層小胞は、大きな水性コアを含有し得、薬物を包被するために優先的に使用することができる。一部の場合では、単層小胞により薬物を部分的に包被することができる。多層小胞は、いくつかの同心性脂質二重層をタマネギ皮状配置で含み得、約１〜５μｍの直径を有する。タマネギ皮状配置は、約１μｍから、１．５μｍ、２．０μｍ、２．５μｍ、３μｍ、３．５μｍ、４μｍ、４．５μｍ、もしくは５．０μｍまで、またはそれよりも大きな直径を有し得る。本明細書の組成物および方法に使用するためのリポソーム構造体は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ１７／６１１１１に記載されているリポソーム構造体を含めた、リポソーム、リポプレックス、またはリポポリプレックスを含み得る。
【０１２４】
本明細書の組成物および方法は、送達ビヒクルによって標的細胞または組織に運搬されるカーゴを含み得る。カーゴは、核酸、色素、薬物、タンパク質、ナノ粒子、タンパク質、小さな化学分子、化学薬品またはこれらの任意の組合せを含むカーゴであり得る。一部の場合では、カーゴは、大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）、デフェンシン（ＨＤ−５）、およびデフェンシンアルファ６（ＨＤ−６）などのタンパク質またはタンパク質の生物学的に活性な部分をコードする核酸である。一部の場合では、カーゴは、核酸とプロタミンの複合体などの、ナノ粒子に包含された核酸を含む。
【０１２５】
一部の場合では、核酸などのカーゴは、送達ビヒクルに完全に包被されていてよい。完全包被は、送達ビヒクル中のカーゴが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質などの遊離のカーゴを有意に分解するはずである血清またはヌクレアーゼもしくはプロテアーゼアッセイへの曝露後に有意に分解され得ないことを示し得る。完全に包被された系では、通常は遊離のカーゴの１００％が分解されるはずである処理において、送達ビヒクル中のカーゴの約２５％未満が分解され得ることが好ましく、より好ましくは送達ビヒクル中のカーゴの約１０％未満、および最も好ましくは約５％未満が分解され得る。ポリ核酸に関しては、完全包被は、Ｏｌｉｇｒｅｅｎ（登録商標）アッセイによって決定することができる。Ｏｌｉｇｒｅｅｎ（登録商標）は、溶液中のオリゴヌクレオチドおよび一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを定量するための超高感度蛍光核酸染色である（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．から入手可能）。「完全に包被された」とは、送達ビヒクルが血清に対して安定であること、すなわち、送達ビヒクルがｉｎ  ｖｉｖｏ投与された際にその構成部分に急速に分解しないことも示し得る。
【０１２６】
ある特定の適用では、カーゴが細胞に進入したら部分（カーゴまたはその一部）を放出させることが望ましい場合がある。部分を利用して、カーゴを受けた細胞の数を同定することができる。部分は、２、３挙げると、抗体、色素、ｓｃＦｖ、ペプチド、糖タンパク質、炭水化物、リガンド、ポリマー、核酸であってよい。部分はリンカーと接触していてよい。リンカーは切断不可能なものであり得る。したがって、一部の場合では、リンカーは、切断可能なリンカーであり得る。これにより、標的細胞への接触がなされたら部分を送達ビヒクルから放出させることが可能になり得る。これは、部分が、送達ビヒクルから分離された場合により大きな治療効果を有する場合に望ましい場合がある。一部の場合では、部分は、送達ビヒクルから分離された場合に、腸陰窩細胞または腸陰窩幹細胞などの細胞の細胞内構成成分によって吸収されるより良好な能力を有し得る。一部の場合では、リンカーは、ジスルフィド結合、アシルヒドラゾン、ビニルエーテル、オルトエステル、またはＮ−ＰＯ３を含み得る。
【０１２７】
したがって、部分が細胞内区画に進入することができるように部分を送達ビヒクルから分離させることが必要であるまたは望ましい場合がある。部分を放出するリンカーの切断は、例えば細胞内のｐＨの変化に起因して細胞内の条件が細胞の外側と比較して変化した結果であり得る。ポリ核酸などの薬物が細胞に進入したら、リンカーを切断する酵素が細胞内に存在することに起因してリンカーの切断が起こり得る。あるいは、リンカーの切断は、細胞に適用されるエネルギーまたは化学物質に応答して起こり得る。リンカーの切断をもたらすために使用することができるエネルギーの型の例としては、これらに限定されないが、光、超音波、マイクロ波および高周波エネルギーが挙げられる。一部の場合では、リンカーは、感光性リンカーであってよい。複合体を連結するために使用されるリンカーは、酸不安定リンカーであってもよい。酸不安定リンカーの例としては、シス−アコニット酸、シス−カルボン酸アルカトリエン（cis-carboxylic alkatriene）、ポリマレイン酸無水物を使用することによって形成されるリンカー、および他の酸不安定リンカーが挙げられる。
【０１２８】
送達ビヒクルに使用するための例示的な脂質
本明細書の送達ビヒクルに含めるための脂質は、カチオン性脂質および非カチオン性脂質を含んでよく、また、飽和型および不飽和型のカチオン性脂質および非カチオン性脂質を含んでよい。送達ビヒクルの脂質組成により、粘液を透過することの改善または増加をもたらすことができる。一部の実施形態では、送達ビヒクルは、カチオン性脂質を含む。一部の実施形態では、送達ビヒクルは、非カチオン性脂質を含む。一部の実施形態では、送達ビヒクルは、カチオン性脂質および非カチオン脂質の両方を含む。一部の実施形態では、送達ビヒクルは、飽和型カチオン性脂質および不飽和型カチオン性脂質および非カチオン性飽和型脂質および非カチオン性不飽和型脂質の１つまたは複数から選択される１つ、２つ、３つ、４つまたはそれよりも多くの型の脂質を含む。
【０１２９】
本明細書の送達ビヒクルに使用するための飽和型非カチオン性脂質としては、例えば、ジグリセロールテトラエーテルリン脂質、スフィンゴイド、セラミドおよびスフィンゴリン脂質、例えば、１，２−ジアルキル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジアルキル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジアルキル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルグリセロール、１，２−ジアルキル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルセリン、１，２−ジアルキル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸、モノグリセロールアルキレート、グリセリルヒドロキシアルキレート、ソルビタンモノアルキレート、１，２−ジアルキル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−メチル、１，２−ジアルキル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホメタノール、１，２−ジアルキル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノール、１，２−ジアルキル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ，Ｎ−ジメチル、１，２−ジアルキル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホプロパノール、および１，２−ジアルキル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホブタノールなどが挙げられ、ここで、アルキルは、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、ヘプタデカン酸、ステアリン酸、ラウリン酸、トリデシル酸、ノナデシル酸、アラキジン酸、ヘンイコシル酸、ベヘン酸、トリコシル酸およびリグノセリン酸のコンジュゲート誘導体を意味する。
【０１３０】
本明細書の送達ビヒクルに使用するための不飽和型非カチオン性脂質としては、例えば、グリセロホスホコリン、グリセロホスホエタノールアミン、グリセロホスホセリン、グリセロホスホグリセロール、グリセロホスホグリセロホスフェート、グリセロホスホイノシトール、グリセロホスホイノシトール一リン酸、グリセロホスホイノシトール二リン酸、グリセロホスホイノシトール三リン酸、グリセロリン酸、グリセロピロリン酸、グリセロホスホグリセロホスホグリセロール、シチジン−５’−ジホスフェート−グリセロール、グリコシルグリセロリン脂質、グリセロホスホイノシトールグリカン、ジグリセロールテトラエーテルリン脂質、スフィンゴイド、セラミド、およびスフィンゴリン脂質、例えば、１，２−ジアルキル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジアルキル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジアルキル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルグリセロール、１，２−ジアルキル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルセリン、１，２−ジアルキル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸、モノグリセロールアルキレート、グリセリルヒドロキシアルキレート、ソルビタンモノアルキレート、１，２−ジアルキル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−メチル、１，２−ジアルキル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホメタノール、１，２−ジアルキル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノール、１，２−ジアルキル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ，Ｎ−ジメチル、１，２−ジアルキル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホプロパノールおよび１，２−ジアルキル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホブタノールなどが挙げられ、ここで、アルキルは、オレイン酸、エライジン酸、ゴンドイン酸、エルカ酸、ネルボン酸、ミード酸、パウリン酸、バクセン酸、パルミトレイン酸、ドコサテトラエン酸、アラキドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、γ−リノレン酸、リノールエライジン酸、リノール酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、ステアリドン酸、およびα−リノレン酸のコンジュゲート誘導体を意味する。
【０１３１】
本明細書の送達ビヒクルに使用するための飽和型カチオン性脂質としては、例えば、炭素が１２個よりも多い長さのアルキル鎖を有し、一般に、相転移温度が２０℃よりも高く、約４よりも高いｐＨで正に荷電しているもの、例えば、ジメチルジオクタデシルアンモニウム、１，２−ジアルキル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン、１，２−ジアルキル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン、１，２−ジアルキル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン、１，２−ジ−Ｏ−アルキル−３−トリメチルアンモニウムプロパン、１，２−ジアルキルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム、Ｎ−（４−カルボキシベンジル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（アルキルオキシ）プロパン−１−アミニウム、１，２−ジアルキル−ｓｎ−グリセロ−３−［（Ｎ−（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノ二酢酸）サクシニル］、およびＮ１−［２−（（１Ｓ）−１−［（３−アミノプロピル）アミノ］−４−［ジ（３−アミノ−プロピル）アミノ］ブチルカルボキシアミド）エチル］−３，４−ジ［アルキル］−ベンズアミドなどが挙げられ、ここで、アルキルは、ミリストイル、ペンタデセノイル、パルミトイル、ヘプタデカノイル、ステアロイル、ラウロイル、トリデカノイル、ノナデカノイル、アラキドイル、ヘンエイコサノイル（heneicasnoyl）、ベヘノイル、トリコサノイルおよびリグノセロイルのコンジュゲート誘導体を指し得る。
【０１３２】
本明細書の送達ビヒクルに使用するための不飽和型カチオン性脂質としては、例えば、飽和型ではなく、約４よりも高いｐＨで正に荷電しているカチオン性脂質、例えば、ジメチルジオクタデシルアンモニウム、１，２−ジアルキル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン、１，２−ジアルキル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン、１，２−ジアルキル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン、１，２−ジ−Ｏ−アルキル−３−トリメチルアンモニウムプロパン、１，２−ジアルキルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム、Ｎ−（４−カルボキシベンジル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（アルキルオキシ）プロパン−１−アミニウム、１，２−ジアルキル−ｓｎ−グリセロ−３−［（Ｎ−（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノ二酢酸）サクシニル］、Ｎ１−［２−（（１Ｓ）−１−［（３−アミノプロピル）アミノ］−４−［ジ（３−アミノ−プロピル）アミノ］ブチルカルボキシアミド）エチル］−３，４−ジ［アルキル］−ベンズアミド、１，２−ジアルキルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン、４−（２，２−ジオクタ−９，１２−ジエニル−［１，３］ジオキソラン−４−イルメチル）−ジメチルアミン、Ｏ−アルキルエチルホスホコリン、ＭＣ３、ＭＣ２、ＭＣ４、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロールおよびＮ４−コレステリル−スペルミンなどが挙げられ、ここで、アルキルは、オレイン酸、エライジン酸、ゴンドイン酸、エルカ酸、ネルボン酸、ミード酸、パウリン酸、バクセン酸、パルミトレイン酸、ドコサテトラエン酸、アラキドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、γ−リノレン酸、リノールエライジン酸、リノール酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、ステアリドン酸、およびα−リノレン酸のコンジュゲート誘導体を指し得る。
【０１３３】
他の場合では、他の治療剤を送達するためにアニオン性リポソームを使用することができる。アニオン性リポプレックスは、アニオン性脂質、カチオン、およびＤＮＡを含めた生理的に安全な構成成分で構成され得る。このカテゴリー内で一般に使用される脂質は、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、およびホスファチジルセリンなどの、細胞膜に天然に見出すことができるリン脂質である。
【０１３４】
アニオン性脂質で包む前に、二価カチオンをアニオン性リポソーム系に組み入れて、核酸の凝縮を可能にすることができる。Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、およびＢａ２＋などのいくつかの二価カチオンをアニオン性リポプレックスに使用することができる。一部の場合では、Ｃａ２＋をアニオン性リポソーム系に利用することができる。
【０１３５】
一部の場合では、カチオン性脂質は、極性頭部基に存在する１つまたは複数のアミンを通じて正電荷を獲得することができる。一部の場合では、リポソームは、カチオン性リポソームであり得る。一部の場合では、リポソームは、ＤＮＡなどの負に荷電したポリ核酸を運搬するために使用されるカチオン性リポソームであり得る。一部の場合では、カチオン性（および中性）脂質を遺伝子送達のために使用することができる。
【０１３６】
カチオン性脂質を使用してリポソームを形成することができる。カチオン性脂質は、一般に、極性頭部基に存在する１つまたは複数のアミンを通じて正電荷を獲得することができる。多くの場合に中性ヘルパー脂質を用いて形成されるカチオン性脂質の溶液をＤＮＡと混合してリポプレックスと称される正に荷電した複合体を形成することができる。カチオン性脂質トランスフェクション用の試薬としては、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）、［１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン］（ＤＯＴＡＰ）、３β［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、およびジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）を挙げることができる。中性脂質であるジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）は、エンドリソソーム脱出の助けになり得る低ｐＨでの膜不安定化効果があるので、多くの場合にカチオン性脂質と併せて使用することができる。
【０１３７】
中性ヘルパー脂質を用いてリポソームを形成することができる。リポソームは、コレステロール、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）、［１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３（トリメチルアンモニオ）プロパン］（ＤＯＴＡＰ）、３β［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、Ｎ１−［２−（（１Ｓ）−１−［（３−アミノプロピル）アミノ］−４−［ジ（３−アミノ−プロピル）アミノ］ブチルカルボキシアミド）エチル］−３，４−ジ［オレイルオキシ］−ベンズアミド（ＭＶＬ５）、グリセリルモノオレエート（ＧＭＯ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）、その塩、およびこれらの任意の組合せを使用して生成することができる。本明細書の組成物および方法に使用するためのリポソームは、例えば、全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ１７／６１１１１に見出すことができる。
【０１３８】
送達ビヒクルの例示的な表面修飾
本開示の脂質またはリポソームまたは送達ビヒクルを表面修飾によって修飾することができる。表面修飾は、送達ビヒクルまたはリポソーム構造体が粘液中を移動する平均速度を、同等の送達ビヒクルまたはリポソーム構造体と比較して増強することができる。同等の送達ビヒクルまたはリポソーム構造体は、表面修飾されていなくてもよく、または同等のリポソーム構造体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーで修飾されていてもよい。修飾は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける分解からの保護を容易にすることができる。修飾は、送達ビヒクルまたはリポソームの輸送を補助することもできる。例えば、修飾は、ｐＨ感受性修飾に起因して送達ビヒクルまたはリポソームを酸性ｐＨの胃腸（ＧＩ）管（gastrointestinal (GI) track）内に輸送することを可能にし得る。表面修飾は、送達ビヒクルまたはリポソームが粘液中を移動する平均速度も改善し得る。例えば、修飾は、修飾を伴わない同等の送達ビヒクルまたはリポソーム構造体またはＰＥＧを含む修飾を伴う送達ビヒクルまたはリポソーム構造体と比較して、速度を１×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、２０×、３０×、４０×、５０×、６０×、７０×、８０×、９０×、１００×、３００×、５００×、７００×、９００×、または約１０００×まで増強することができる。一部の場合では、送達ビヒクルに対する修飾は、結合によって生じる。結合は、共有結合、非共有結合、極性結合、イオン結合、水素結合、またはこれらの任意の組合せであり得る。結合は、２つの基または基の一部の会合とみなすことができる。例えば、送達ビヒクルをＰＥＧに共有結合を含むリンカーを介して結合させることができる。一部の場合では、結合は、２つの隣接した基の間で生じ得る。結合は動的であり得る。動的結合は、１つの基が第２の基と一時的に会合する場合に生じ得る。例えば、リポソーム内の懸濁液中のポリ核酸は、それが懸濁している間、脂質二重層の一部と結合し得る。
【０１３９】
一部の場合では、本明細書中での送達ビヒクルへの表面修飾は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の付加であり得る。リポソーム表面をＰＥＧで修飾する方法は、リポソーム表面へのＰＥＧの物理吸着、リポソームへのＰＥＧの共有結合による付着、リポソームへのＰＥＧのコーティング、またはこれらの任意の組合せを含み得る。一部の場合では、ＰＥＧを、リポソームが形成され得る前に脂質粒子に共有結合により付着させることができる。
【０１４０】
種々の分子量のＰＥＧを使用することができる。ＰＥＧは、約１０から約１００単位までのエチレンＰＥＧ構成成分の範囲であってよく、これは、リン脂質と、脂質二重層に含まれる脂質の１重量％〜２０重量％、好ましくは５重量％〜１５重量％、１０重量％、または約１重量％〜約２０重量％、好ましくは約５重量％〜約１５重量％、約１０重量％を構成するアミン基を通じてコンジュゲートすることができる。
【０１４１】
ある特定の場合では、ナノ構造体は、少なくとも１つの標的化剤をさらに含み得る。標的化剤という用語は、特定の型またはカテゴリーの細胞および／または他の特定の型の化合物（例えば、特定の細胞または細胞型を標的とする部分）に特異的に結合する部分、化合物、抗体などを指し得る。標的化剤は、ある特定の標的細胞の表面、標的細胞表面抗原、標的細胞受容体、またはこれらの組合せに対して特異的であってよい（例えば、親和性を有してよい）。一部の場合では、標的化剤は、特定の型またはカテゴリーの物質および／または細胞に曝露した場合に特定の作用を有する（例えば、切断する）薬剤を指し得、この作用により、ナノ構造体を特定の型またはカテゴリーの細胞を標的とするように駆動することができる。したがって、標的化剤という用語は、ナノ構造体の一部であり得、ナノ構造体の標的化機構において役割を果たす薬剤を指し得るが、薬剤自体は特定の型またはカテゴリーの細胞自体に特異的であっても特異的でなくてもよい。ある特定の例では、標的化剤を本ナノ構造体に組み入れることにより、ナノ構造体によって送達されるポリ核酸の細胞内取り込みの効率を増強することおよび／またはより特異的なものにすることができる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のナノ構造体は、１つまたは複数の小分子標的化剤（例えば、炭水化物部分）を含み得る。適切な標的化剤としては、非限定的な例として、抗体、抗体様分子、またはペプチド、例えばインテグリン結合性ペプチドなど、例えばＲＧＤ含有ペプチドなど、または小分子、例えばビタミン、例えば葉酸、ラクトースおよびガラクトースなどの糖、もしくは他の小分子なども挙げられる。細胞表面抗原としては、細胞表面上のタンパク質、糖、脂質または他の抗原などの細胞表面分子が挙げられる。特定の実施形態では、細胞表面抗原は、内部移行を受ける。本ナノ粒子の実施形態の標的化剤によって標的とされる細胞表面抗原の例としては、これらに限定されないが、トランスフェリン受容体１型および２型、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＶＥＧＦ受容体、インテグリン、ＮＧＦ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤＳ、ＣＤＩ９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ４３、ι１）３８、ＣＤ５６、ＣＤ６９、およびロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体５（ＬＧＲ５）が挙げられる。標的化剤は、人工的な親和性分子、例えば、ペプチド模倣体またはアプタマーも含み得る。ペプチド模倣体は、治療用ペプチドなどのペプチドの少なくとも一部分が修飾されており、ペプチド模倣体の三次元構造がペプチドの三次元構造と依然として実質的に同じである化合物を指し得る。ペプチド模倣体（ペプチドおよび非ペプチジル類似体の両方）は、改善された性質（例えば、タンパク質分解の低減、保持の増大または生物学的利用能の増大）を有し得る。ペプチド模倣体は、一般に、改善された経口利用可能性を有し、これにより、ヒトまたは動物における障害の処置に特に適するものになる。ペプチド模倣体は同様の二次元化学構造を有してよく有さなくてもよいが、共通する３次元の構造的特徴および幾何学的形状を共有することに留意するべきである。
【０１４２】
一部の実施形態では、標的化剤は、タンパク質性標的化剤（例えば、ペプチド、および抗体、抗体断片）であり得る。一部の特定の実施形態では、ナノ構造体は、複数の異なる
標的化剤を含み得る。本明細書の実施形態では、組成物および方法は、組成物に粘液透過能をもたらし、細胞透過ももたらし得るＭＰＰを含む。一部の実施形態では、ＭＰＰは、標的化剤としても作用し得る。他の実施形態では、ＭＰＰに加えて標的化剤を組成物中に含める。
【０１４３】
一部の実施形態では、１つまたは複数の標的化剤（ＭＰＰ、別の標的化剤またはＭＰＰと別の標的化剤の組合せであってよい）を、ナノ構造体を形成するポリマーにカップリングすることができる。一部の場合では、標的化剤を、ナノ構造体をコーティングするポリマーに結合させることができる。一部の例では、標的化剤をポリマーに共有結合によりカップリングすることができる。一部の場合では、標的化剤を、ポリマーに、標的化剤が結果として生ずるナノ構造体の実質的に表面または表面近くになり得るように結合させることができる。ある特定の実施形態では、標的化剤残基（例えば、ペプチドの（アルキル）アクリル酸誘導体などの標的化剤の重合可能な誘導体）を含む単量体を共重合させて、本明細書に提示されるナノ構造体を形成する共重合体を形成することができる。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の標的化剤を本ナノ粒子のポリマーに連結部分を通じてカップリングすることができる。一部の実施形態では、標的化剤を膜不安定化ポリマーにカップリングする連結部分は、切断可能な連結部分であり得る（例えば、切断可能な結合を含む）。一部の実施形態では、連結部分は、切断可能であり得、かつ／または、エンドソーム条件で切断可能であり得る結合を含む。一部の実施形態では、連結部分は、切断可能であり得、かつ／または、特定の酵素（例えば、ホスファターゼまたはプロテアーゼ）によって切断することが可能な結合を含み得る。一部の実施形態では、連結部分は、切断可能であり得、かつ／または、細胞内パラメータ（例えば、ｐＨ、酸化還元電位）の変化で切断可能であり得る結合を含み得、一部の実施形態では、連結部分は、切断可能であり得、かつ／または、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）（例えば、ＭＭＰにより切断可能なペプチド連結部分）に曝露させると切断することが可能な結合を含み得る。
【０１４４】
ある特定の場合では、ナノ粒子の標的化機構は、ポリマー内の切断可能なセグメントの切断に依存し得る。例えば、本ポリマーは、切断するとナノ粒子および／またはナノ粒子のコアが露出する切断可能なセグメントを含み得る。一部の実施形態では、切断可能なセグメントは、本ポリマーの末端のいずれかまたは両方に位置していてよい。一部の実施形態では、切断可能なセグメントは、ポリマーの長さに沿って位置し、必要に応じて、ポリマーのブロック間に位置していてよい。例えば、ある特定の実施形態では、切断可能なセグメントは、ポリマーの第１のブロッと第２のブロックの間に位置していてよく、ナノ粒子を特定の切断物質に曝露させることができる場合に、第１のブロックを第２のブロックから切断することができる。特定の実施形態では、切断可能なセグメントは、ＭＭＰに曝露させると切断することが可能である、ＭＭＰにより切断可能なペプチドであり得る。
【０１４５】
抗体などの標的化剤のポリマーへの結合は、任意の適切な様式で、例えば、これらに限定されないが、アミン−カルボキシルリンカー、アミン−スルフヒドリルリンカー、アミン−炭水化物リンカー、アミン−ヒドロキシルリンカー、アミン−アミンリンカー、カルボキシル−スルフヒドリルリンカー、カルボキシル−炭水化物リンカー、カルボキシル−ヒドロキシルリンカー、カルボキシル−カルボキシルリンカー、スルフヒドリル−炭水化物リンカー、スルフヒドリル−ヒドロキシルリンカー、スルフヒドリル−スルフヒドリルリンカー、炭水化物−ヒドロキシルリンカー、炭水化物−炭水化物リンカー、およびヒドロキシル−ヒドロキシルリンカーを含めた、いくつかのコンジュゲーション化学手法のいずれか１つによって実現することができる。特定の実施形態では、標的化剤を本明細書に提示されるナノ粒子のポリマーに結合させるために、「クリック」化学を使用することができる。多種多様なコンジュゲーション化学反応が必要に応じて利用され、一部の実施形態では、標的化剤を単量体に結合させることができ、次いで、得られた化合物を、本明細書に記載のナノ粒子に利用するポリマー（例えば、共重合体）の重合合成に使用することができる。一部の実施形態では、標的化剤を、ナノ粒子のポリマーに結合したｓｉＲＮＡのセンスまたはアンチセンス鎖に結合させることができる。ある特定の実施形態では、標的化剤を、センスまたはアンチセンス鎖の５’または３’末端に結合させることができる。
【０１４６】
化合物を連結するための方法は、これらに限定されないが、ヌクレオチドに対する、タンパク質、標識、および他の化学実体を含み得る。ｎ−マレイミドブチリルオキシ−スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）およびスルホ−ＧＭＢＳなどの架橋試薬は、免疫原性が低減している。予め構築されたオリゴヌクレオチドの５’末端には、アミダイトまたはＨ−ホスホン酸化学を使用して置換基が結合されている。置換基は、オリゴマーの３’末端に結合させることもできる。この最後の方法では、固体支持体に結合させた２，２’−ジチオエタノールを利用して、アクリジン部分を有する３’ホスホネートからジイソプロピルアミンを外し、その３’ホスホネートは、その後、リンの酸化後に除去される。あるいは、オリゴヌクレオチドは、リンカーアームを介して塩基に結合した基を有する１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含み得る。例えば、ｄＵＴＰのＣ−５位へのビオチンのアリルアミンリンカーアームによる結合を利用することができる。ピリミジンの５位へのビオチンおよび他の基のリンカーアームを介した結合を行うこともできる。
【０１４７】
化学的架橋は、スペーサーアーム、すなわち、リンカーまたはテザーの使用を含み得る。スペーサーアームにより、分子内柔軟性がもたらされるまたはコンジュゲートした部分間の分子内距離が調整され、それにより、生物活性の保存に役立ち得る。スペーサーアームは、スペーサーアミノ酸を含むペプチド部分の形態であってよい。あるいは、スペーサーアームは、「長鎖ＳＰＤＰ」などの架橋試薬の一部であってよい。
【０１４８】
プロテインＡ、カルボジイミド、ジマレイミド、ジチオ−ビス−ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−５−アセチル−チオ酢酸（ＳＡＴＡ）、およびＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ（pyrid-yldithio））プロピオン酸（ＳＰＤＰ）、６−ヒドラジノニコチミド（ＨＹＮＩＣ）、Ｎ３ＳおよびＮ２Ｓ２などの種々のカップリング剤または架橋剤を、標的化構築物を合成するための周知の手順において使用することができる。例えば、ビオチンをオリゴヌクレオチドに、二環式無水物方法を使用してＤＴＰＡを介してコンジュゲートすることができる。さらに、スルホスクシンイミジル６−（ビオチンアミド）ヘキサン酸（ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．から購入することができる）、「ビオシチン」、ビオチンのリシンコンジュゲートは、第一級アミンの利用可能性に起因して、ビオチン化合物を作製するのに有用であり得る。さらに、対応するビオチン酸塩化物または酸前駆物質を治療剤のアミノ誘導体と公知の方法によってカップリングすることができる。ビオチン部分を粒子の表面にカップリングすることにより、別の部分をアビジンにカップリングし、次いで、粒子に強力なアビジン−ビオチン親和性によってカップリングすることができる、または逆もまた同じである。ポリマー粒子が粒子の表面にＰＥＧ部分を含むある特定の実施形態では、ＰＥＧの遊離のヒドロキシル基を、追加的な分子または部分を粒子に連結または結合（例えば、共有結合による付着）させるために使用することができる。
【０１４９】
実施形態では、リポソーム修飾は、生体適合性をもたらすことができ、また、例えば、抗体、アプタマー、ポリエチレン、またはこれらの組合せを含めた標的化ペプチドを含めた標的化種を有するように修飾することができる。標的化種は受容体であってもよい。一部の場合では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはこれらの組合せが使用される。
【０１５０】
粘液透過性粒子および粒子処置
粘液透過性粒子は、本明細書で使用される場合、粘膜透過増強性コーティングでコーティングされた粒子を指し得る。一部の場合では、粒子は、粘膜透過増強性コーティングでコーティングすることができる治療剤、診断剤、予防剤、および／または栄養補助剤（ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｇｅｎｔ）などの活性薬剤の粒子（すなわち、薬物粒子）であり得るまたはそれを送達することができる。他の場合では、粒子は、ポリマー材料などのマトリックス材料で形成されてよく、その中に治療剤、診断剤、予防剤、および／または栄養補助剤を包被する、分散させる、および／または会合させることができる。コーティング材料は、薬物粒子またはポリマー粒子ＩＩに共有結合により、または非共有結合により会合させることができる。
【０１５１】
さらに、他の送達ビヒクル、例えば修飾されていない送達ビヒクルよりも高速度で、粘膜関門を通過することができる送達ビヒクルを本明細書に提示することができる。送達ビヒクルは、例えば、同様のサイズの修飾されていない送達ビヒクルの少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍またはそれよりも大きな倍数の速度で粘膜関門を通過することができる。一部の場合では、ＰＥＧで修飾されていない送達ビヒクルは、トランスウェル遊走アッセイによって測定して、ＰＥＧで修飾された送達ビヒクルよりも効率的に粘膜関門を透過することができる。
【０１５２】
本明細書中の組成物および方法とともに使用するための送達ビヒクルは、ポリマーを含有し得る。ポリマーは、任意のポリマー粒子であってよい。任意の数の生体適合性ポリマーを使用してナノ粒子などの送達ビヒクルを調製することができる。一実施形態では、生体適合性ポリマーは生分解性であってよい。別の実施形態では、粒子は非分解性でなくてよい。他の実施形態では、粒子は、分解性粒子と非分解性粒子の混合物であってよい。
【０１５３】
本明細書中の組成物および方法の送達ビヒクルは、約−１００ｍＶから約１００ｍＶまでの中性付近のゼータ電位を有し得る。ＭＰＰは、約−５０ｍＶから約５０ｍＶまで、約−３０ｍＶから約３０ｍＶまで、約−２０ｍＶから約２０ｍＶまで、約−１０ｍＶから約１０ｍＶまで、約−５ｍＶから約５ｍＶまでのゼータ電位を有し得る。
【０１５４】
生分解性ポリマーは、一般には、使用中に分解し得るという点で非生分解性ポリマーとは異なる。ある特定の実施形態では、そのような使用は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける治療などのｉｎ  ｖｉｖｏにおける使用を伴い、他のある特定の実施形態では、そのような使用は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける使用を伴う。一般に、生分解性に起因する分解は、生分解性ポリマーのその構成成分サブユニットへの分解、または、例えば生化学的プロセスによる、ポリマーのより小さな非ポリマーサブユニットへの消化を伴う。ある特定の実施形態では、２つの異なる型の生分解を一般に識別することができる。例えば、１つの型の生分解は、ポリマー骨格内の結合（共有結合性であるかそうでないかにかかわらず）の切断を伴い得る。そのような生分解では、一般には単量体およびオリゴマーが結果として生じ、さらにより一般的には、そのような生分解は、ポリマーのサブユニットのうちの１つまたは複数を接続している結合の切断によって起こる。対照的に、別の型の生分解は、側鎖の内部の、または側鎖をポリマー骨格に接続する結合（共有結合性であるかそうでないかにかかわらず）の切断を伴い得る。例えば、ポリマー骨格に側鎖として結合した治療剤または他の化学的部分を生分解によって放出させることができる。ある特定の実施形態では、一般的な型の生分解の一方または他方または両方がポリマーの使用中に起こり得る。生分解性ポリマーの分解速度は、多くの場合、任意の分解に関与する連結の化学的同一性、分子量、結晶化度、生体内安定性、およびそのようなポリマーの架橋の程度、埋込物の物理的特性（例えば、形状およびサイズ）、ならびに投与の様式および場所を含めた種々の因子に一部依存する。例えば、分子量が大きいほど、結晶化度の程度が大きいほど、かつ／または生体内安定性が高いほど、任意の生分解性ポリマーの生分解が、通常、遅くなる。
【０１５５】
ある特定の実施形態では、生分解性ポリマーは、治療剤またはそれに会合した他の材料も有し得、そのようなポリマーの生分解速度は、そのような材料の放出速度によって特徴付けることができる。例えば、生分解速度は、ポリマーの化学的同一性および物理的特性だけでなく、それに組み入れられている材料（複数可）の同一性にも依存し得る。一部の場合では、本発明のポリマー製剤は、所望の適用において許容される期間内に生分解する。ｉｎ  ｖｉｖｏにおける治療などのある特定の実施形態では、そのような分解は、通常、２５から３７℃の間の温度を有し、ｐＨ６から８の間の生理溶液に曝露して約５年、１年、６カ月、３カ月、１カ月、１５日、５日、３日未満、またはさらには１日もしくはそれ未満（例えば、４〜８時間）の期間で起こる。他の実施形態では、ポリマーは、所望の適用に応じて約１時間から数週間の間の期間で分解する。
【０１５６】
本明細書の組成物および方法に使用するためのポリマーは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ１７／６１１１１に提示されているものなどのポリマーである。
【０１５７】
一部の場合では、治療剤、診断剤、予防剤、および／または栄養補助剤などのカーゴを含有する送達ビヒクルを粘膜透過増強性コーティングでコーティングすることができる。送達ビヒクルは、微小粒子またはナノ粒子であり得る。コーティングは、任意の手段、技法、供給品、またはこれらの組合せを使用して適用することができる。粘膜透過増強性コーティングは、脂質、ポリマー、または任意の組合せと、共有結合により、または非共有結合により会合させることができる。一部の実施形態では、粘膜透過増強性コーティングを非共有結合により会合させることができる。他の実施形態では、脂質またはポリマーは、反応性官能基を含有し得る、または粘膜透過増強性コーティングを共有結合させることができる反応性官能基を組み入れることができる。
【０１５８】
ナノ粒子は、１つまたは複数の表面改質剤でコーティングされていてよいまたはそれを含有してよい。一部の場合では、表面改質剤により、直接的な治療効果、例えば、炎症の低減をもたらすことができる。ナノ粒子を、ナノ粒子に中性付近のゼータ電位をもたらすコーティングなどでコーティングすることができる。コーティングは、ＰＥＧ化であり得る。コーティングは、部分コーティングであっても完全コーティングであってもよい。表面改質剤の例としては、これらに限定されないが、アニオン性タンパク質（例えば、アルブミン）を含めたタンパク質、界面活性物質、糖または糖誘導体（例えば、シクロデキストリン）、治療剤、およびポリマーが挙げられる。ポリマーは、ヘパリン、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）およびポロキサマー（poloxomer）（ポリエチレンオキシドブロック共重合体）も含み得る。ポリマーは、ＰＥＧ、ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ１２７（登録商標）、ＰＥＧ２０００、または任意の誘導体、その改変バージョン、またはこれらの組合せであり得る。
【０１５９】
表面改質剤により、送達ビヒクルもしくはリポソーム粒子の電荷もしくは親水性を増大させること、または代わりに粒子と粘液との間の相互作用を低減し、それにより、粘液を通る運動性を促進することができる。表面改質剤により、ポリマー粒子またはリポソーム粒子、または粒子の画分が粘液中に移動するまたは粘液を通って移動する平均速度を増強することができる。適切な表面改質剤の例としては、これらに限定されないが、アニオン性タンパク質（例えば、血清アルブミン）、核酸、カチオン性界面活性物質（例えば、ジメチルジオクタデシル−アンモニウムブロミド）などの界面活性物質、糖または糖誘導体（例えば、シクロデキストリン）、ポリエチレングリコール、粘液溶解剤、または他の非粘膜接着剤が挙げられる。ある特定の薬剤、例えば、シクロデキストリンは、他の分子と包接錯体を形成することができ、追加的な部分への結合を形成するため、ならびに粒子表面および／または結合した分子もしくは部分の官能化を容易にするために使用することができる。一部の場合では、表面改質剤により、表面修飾を引き起こすことができる。表面改質剤はＰＥＧであり得、ＰＥＧは、送達ビヒクルに使用されるポリマーであり得る。表面修飾は修飾と交換可能である。一部の場合では、修飾とは、表面修飾を指し得る。他の場合では、修飾とは、表面修飾を指さない場合がある。
【０１６０】
一部の場合では、粘液破壊剤を粒子に送達することができるまたは粒子に見出すことができる。粘液は、気道、ＧＩ管、眼および生殖器官などの外部環境に通常曝露される組織表面をコーティングする生物学的ゲルであり得る。粘液は、異物および病原性細菌を捕捉するまたは基礎をなす細胞に到達し、損傷または疾患を引き起こすことから遮断する防御的な関門を形成し得る。粘液は、水（約９５％）、糖タンパク質（２〜５％）、脂質、および塩から主に構成される。グリコシル化タンパク質は、ＭＵＣファミリーに由来し得る。経口、経鼻、肺または膣などの薬物投与の一部の経路では粘液が関門として作用し得る。ポリ核酸または他のカーゴを有する送達ビヒクルを、それらが粘液クリアランスによって除去される前に粘膜層を透過するように特別に設計する必要があり得る。したがって、捕捉および粘膜関門からの排出を回避するため、ならびにナノ粒子に基づく薬物送達の利益を十分に活用するためには、粘膜透過および浸透を増強することが必須である。
【０１６１】
粘液破壊剤は、ＮＳＡＩＤ、Ｂ−カテニンに対するｍｉＲＮＡまたは粘液を破壊することが知られている可能性がある薬剤であってよい。粘液破壊剤は、表面改質剤であってよい。一部の場合では、粘液を破壊することとは、粘液産生の排除であってよい。他の場合では、粘液を破壊することとは、粘液産生の低減であってよい。例えば、粘液の減少とは、粘液を生成する細胞を標的とすることによって粘液産生を低減することを意味し得る。粘液の破壊とは、粘液の粘性を調整することも意味し得る。例えば、粘液の破壊は、粘液の粘性を緩めることを意味し得る。
【０１６２】
一部の場合では、ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でコーティングされていてよいまたはそれを含有してよい。あるいは、ＰＥＧはナノ粒子を形成するために使用された脂質と共有結合した（例えば、内部でまたは一方もしくは両方の末端で）ブロックの形態であり得る。特定の実施形態では、ナノ粒子は、ＰＥＧを含有するブロック共重合体から形成することができる。ナノ粒子は、ＰＥＧを含有するブロック共重合体から調製することもでき、ここで、ＰＥＧは、ベースの脂質の末端に共有結合していてよい。代表的なＰＥＧ分子量は、３００Ｄａ、６００Ｄａ、１ｋＤａ、２ｋＤａ、３ｋＤａ、４ｋＤａ、６ｋＤａ、８ｋＤａ、１０ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、２００ｋＤａ、５００ｋＤａ、および１ＭＤａおよび３００ダルトン〜１ＭＤａの範囲内の全ての値を含み得る。一部の場合では、ＰＥＧは、約２ｋＤａであり得る。任意の所与の分子量のＰＥＧは、長さ、密度、および分枝などの他の特性が変動し得る。
【０１６３】
ＰＥＧコーティングは、任意の濃度で適用することができる。一部の場合では、脂質とＰＥＧの間の濃度は、５〜１０％であり得る。濃度は、少なくとも５％または多くて１０％であり得る。一部の場合では、濃度は、１０％を上回ってよい。濃度は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％であってよいもしくは１０％を上回ってよい、または約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％であってよいもしくは１０％を上回ってよい。一部の実施形態では、ナノ粒子をＰＥＧ化粒子と非ＰＥＧ化粒子の混合物から調製することにより、ＰＥＧ表面密度を制御することができる。例えば、粒子をポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）とポリ（エチレングリコール）の混合物（ＰＬＧＡ−ＰＥＧ）から調製することにより、ナノ粒子上のＰＥＧの表面密度を正確に制御することができる。
【０１６４】
一部の場合では、ＰＥＧコーティングを、ナノ粒子上の密度について測定することができる。定量的１Ｈ核磁気共鳴（ＮＭＲ）を使用して、ナノ粒子上の表面ＰＥＧ密度を測定することができる。一部の場合では、密度は、１００ｎｍ２当たり１０〜１６本のＰＥＧ鎖であってよいまたは１００ｎｍ２当たり約１０〜１６本のＰＥＧ鎖であってよい。一部の場合では、密度は、１００ｎｍ２当たり１０〜１６本のＰＥＧ鎖を上回ってよい。この密度閾値は、ナノ粒子のリポソーム、粒子サイズ、および／またはＰＥＧの分子量を含めた種々の因子に応じて変動し得る。リポソームに適用することができるコーティングの密度は、表面改変材料および粒子の組成を含めた種々の因子に基づいて変動し得る。一実施形態では、１Ｈ  ＮＭＲによって測定される、ＰＥＧなどの表面改変材料の密度は、１ｎｍ２当たり０．１本、０．２本、０．５本、０．８本、１本、２本、５本、８本、１０本、１５本、２０本、２５本、４０本、５０本、６０本、７５本、８０本、９０本、もしくは１００本の鎖であってよい、または１ｎｍ２当たり約０．１本、０．２本、０．５本、０．８本、１本、２本、５本、８本、１０本、１５本、２０本、２５本、４０本、５０本、６０本、７５本、８０本、９０本、もしくは１００本の鎖であってよい。上記の範囲は、１ｎｍ２当たり０．１から１００単位までの全ての値を含み得る。一部の場合では、ＰＥＧなどの表面改変材料の密度は、１ｎｍ２当たり１〜２５本の鎖であってよいもしくは１ｎｍ２当たり約１〜約２５本の鎖であってよい、１ｎｍ２当たり１〜２０本の鎖であってよいもしくは１ｎｍ２当たり約１〜約２０本の鎖であってよい、１ｎｍ２当たり５〜２０本の鎖であってよいもしくは１ｎｍ２当たり約５〜約２０本の鎖であってよい、１ｎｍ２当たり５〜１８本の鎖であってよいもしくは１ｎｍ２当たり約５〜約１８本の鎖であってよい、１ｎｍ２当たり５〜１５本の鎖であってよいもしくは１ｎｍ２当たり約５〜約１５本の鎖であってよい、または１ｎｍ２当たり１０〜１５本の鎖であってよいもしくは１ｎｍ２当たり約１０〜約１５本の鎖であってよい。他の場合では、密度は、１ｎｍ２当たり０．０５〜０．５本のＰＥＧ鎖であってよいまたは１ｎｍ２当たり約０．０５〜約０．５本のＰＥＧ鎖であってよい。ＰＥＧは、１００ｎｍ２当たり１０〜２０本の鎖であってよい。
【０１６５】
ＰＥＧなどの表面改変材料の濃度も変動し得る。特定の実施形態では、表面改変材料の密度（例えば、ＰＥＧ）は、表面改変材料（例えば、ＰＥＧ）が伸長したブラシ配置をとるようなものであってよい。他の実施形態では、表面変質部分の質量は、ナノ粒子の質量の少なくとも１／１０，０００、１／７５００、１／５０００、１／４０００、１／３４００、１／２５００、１／２０００、１／１５００、１／１０００、１／７５０、１／５００、１／２５０、１／２００、１／１５０、１／１００、１／７５、１／５０、１／２５、１／２０、１／５、１／２、もしくは９／１０であってよい、または少なくとも約１／１０，０００、１／７５００、１／５０００、１／４０００、１／３４００、１／２５００、１／２０００、１／１５００、１／１０００、１／７５０、１／５００、１／２５０、１／２００、１／１５０、１／１００、１／７５、１／５０、１／２５、１／２０、１／５、１／２、もしくは９／１０であってよい。上記の範囲は、１／１０，０００から９／１０までの全ての値を含み得る。
【０１６６】
ＰＥＧまたはＰＯＺなどのポリマーは、密度が約０．０５μｇ／ｎｍ２から約０．２５μｇ／ｎｍ２までであってよい。ポリマーは、密度が約０．０１μｇ／ｎｍ２から、０．０２μｇ／ｎｍ２、０．０３μｇ／ｎｍ２、０．０４μｇ／ｎｍ２、０．０５μｇ／ｎｍ２、０．０６μｇ／ｎｍ２、０．０７μｇ／ｎｍ２、０．０８μｇ／ｎｍ２、０．０９μｇ／ｎｍ２、０．１μｇ／ｎｍ２、０．１５μｇ／ｎｍ２、０．２μｇ／ｎｍ２、０．２５μｇ／ｎｍ２、０．３μｇ／ｎｍ２、０．３５μｇ／ｎｍ２、０．４μｇ／ｎｍ２、０．４５μｇ／ｎｍ２、０．５μｇ／ｎｍ２、０．５５μｇ／ｎｍ２、０．６μｇ／ｎｍ２、０．６５μｇ／ｎｍ２、０．７μｇ／ｎｍ２、０．７５μｇ／ｎｍ２、０．８μｇ／ｎｍ２μｇ／ｎｍ２、０．８５μｇ／ｎｍ２、０．９μｇ／ｎｍ２、０．９５μｇ／ｎｍ２、または１μｇ／ｎｍ２までであってもよい。一部の実施形態では、μｇ／ｎｍ２は、密度に関しては、送達ビヒクルまたはリポソーム構造体表面１ｎｍ２当たりのポリマーのμｇ数を指し得る。一部の実施形態では、μｇは、マイクログラムを指す。一部の実施形態では、ｎｍは、ナノメートルを指す。
【０１６７】
一部の場合では、ポリマーは、ポリ（２−アルキル−２−オキサゾリン）付加であってよい。ＰＥＧと同様に、ポリ（２−アルキル−２−オキサゾリン）は、「ステルス」性を有し、無毒性かつ生体適合性であり、さらなる官能化のためのペンダント基を有し、腎クリアランスの程度が高く生体内蓄積が少ない。ポリ（２−アルキル−２−オキサゾリン）により、構造体の粘膜透過を増大させることができる。一部の場合では、非ＰＥＧでコーティングされた構造体は、ＰＥＧでコーティングされた構造体に対して粘膜透過の増大を有し得る。粘膜透過の増大は、トランスウェル遊走アッセイによって測定することができる。粘膜透過を測定するために利用することができる追加的なアッセイは、多粒子追跡（ＭＰＴ）、チャンバーの使用（Ussing chamber）、またはこれらの組合せを含み得る。一部の場合では、粘膜透過アッセイにより、光退色（ＦＲＡＰ）後の蛍光回収および多粒子追跡（ＭＰＴ）など、蛍光顕微鏡法を使用して粘液中の送達ビヒクルの動的移行を記録することができる。ＦＲＡＰは、蛍光標識された送達ビヒクルをレーザー光に曝露させて浮遊白色スポットを形成するものであり得る。蛍光強度の回収によって拡散係数を得ることができ、これは、送達ビヒクルの流れがある領域への蛍光標識された分子の拡散後に生じ得る。
【０１６８】
粒子の最終結果およびヒトではどのように結果が変換されるかをよりよく理解するために、粘膜透過試験に動物モデルを採用して送達ビヒクルの治療効果または薬物動態学を調査することができ、これは、単離された腸の実験、ｉｎ  ｓｉｔｕ実験およびｉｎ  ｖｉｖｏ実験を主に含む。例えば、粘膜透過のｉｎ  ｓｉｔｕ実験では、小腸の一部を腹腔から切除し、その後、両端で結紮して隔離された「ループ」を作製することができ、送達ビヒクルをループ中に直接注射することができる。選択された期間後、動物を屠殺することができ、腸ループをさらなる形態または定量的分析のために体腔から取り出すことができる。
【０１６９】
一部の場合では、コーティングは、腸溶コーティングであってよい。腸溶コーティングを利用して、胃内での溶解は防止するまたは最小限にするが、小腸での溶解は可能にすることができる。一部の実施形態では、コーティングは、腸溶コーティングを含み得る。腸溶コーティングは、薬が小腸に到達する前に放出されることを防止する、経口薬に適用される関門であり得る。腸溶コーティングなどの遅延放出製剤によって、医薬の投与による胃に対する刺激的影響を、医薬が胃内で溶解するのを防ぐことにより低減することができる。そのようなコーティングはまた、酸不安定薬物を胃の酸性曝露から保護し、その代わりに、それらが分解しない可能性がある塩基性ｐＨ環境（腸のｐＨ５．５およびそれを上回る）に送達するために使用することもできる。
【０１７０】
溶解は、器官内で起こり得る。例えば、溶解は、十二指腸、空腸、腸骨、および／もしくは結腸内、またはこれらの任意の組合せで起こり得る。一部の場合では、溶解は、十二指腸、空腸、腸骨、および／または結腸の近傍で起こり得る。一部の腸溶コーティングは、胃内で見出される高度に酸性のｐＨでは安定であるが、より酸性度が低い（比較的より塩基性の）ｐＨでは急速に壊れる表面を提供することによって作用する。したがって、腸溶コーティングされた丸剤は、胃の酸性環境では溶解し得ないが、小腸に存在するアルカリ性環境では溶解し得る。腸溶コーティング材料の例としては、これらに限定されないが、メチルアクリレート−メタクリル酸共重合体、酢酸コハク酸セルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、酢酸コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース（酢酸コハク酸ヒプロメロース）、酢酸フタル酸ポリビニル（ＰＶＡＰ）、メタクリル酸メチル−メタクリル酸共重合体、アルギン酸ナトリウムおよびステアリン酸が挙げられる。
【０１７１】
腸溶コーティングは、機能的濃度で適用することができる。腸溶コーティングは、酢酸フタル酸セルロース、酢酸フタル酸ポリビニル、酢酸コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリ（メタクリル酸−ｃｏ−アクリル酸エチル）１：１、ポリ（メタクリル酸−ｃｏ−アクリル酸エチル）１：１、ポリ（メタクリル酸−ｃｏ−メタクリル酸メチル）１：１、ポリ（メタクリル酸−ｃｏ−メタクリル酸メチル）１：１、ポリ（メタクリル酸−ｃｏ−メタクリル酸メチル）１：２、ポリ（メタクリル酸−ｃｏ−メタクリル酸メチル）１：２、ポリ（メチルアクリレート−ｃｏ−メタクリル酸メチル−ｃｏ−メタクリル酸）７：３：１、またはこれらの任意の組合せであってよい。腸溶コーティングは、約６ｍｇ／（ｃｍ２）から約１２ｍｇ／（ｃｍ２）まで適用することができる。腸溶コーティングは、構造体に、約１ｍｇ／（ｃｍ２）から、２ｍｇ／（ｃｍ２）、３ｍｇ／（ｃｍ２）、４ｍｇ／（ｃｍ２）、５ｍｇ／（ｃｍ２）、６ｍｇ／（ｃｍ２）、７ｍｇ／（ｃｍ２）、８ｍｇ／（ｃｍ２）、９ｍｇ／（ｃｍ２）、１０ｍｇ／（ｃｍ２）、１１ｍｇ／（ｃｍ２）、１２ｍｇ／（ｃｍ２）、１３ｍｇ／（ｃｍ２）、１４ｍｇ／（ｃｍ２）、１５ｍｇ／（ｃｍ２）、１６ｍｇ／（ｃｍ２）、１７ｍｇ／（ｃｍ２）、１８ｍｇ／（ｃｍ２）、１９ｍｇ／（ｃｍ２）、約２０ｍｇ／（ｃｍ２）まで適用することもできる。
【０１７２】
一部の実施形態では、医薬組成物を、遅延放出をもたらすように設計された種々の薬物製剤から経口投与することができる。遅延経口剤形としては、例えば、錠剤、カプセル剤、カプレットが挙げられ、また、包被されていてもされていなくてもよい複数の顆粒剤、ビーズ剤、散剤またはペレット剤も含み得る。錠剤およびカプセル剤は、経口剤形であり得、その場合、固体医薬担体を使用することができる。遅延放出製剤では、１つまたは複数の関門コーティングをペレット剤、錠剤、またはカプセル剤に適用して、薬物の遅い溶解および腸への付随的放出を容易にすることができる。一般には、関門コーティングは、治療用組成物または活性コア周囲の層または膜を包む、囲む、または形成する１つまたは複数のポリマーを含有し得る。一部の実施形態では、ポリ核酸などの活性薬剤を、投与後所定の時間で遅延放出をもたらすための製剤として送達することができる。遅延は、約１０分、約２０分、約３０分、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間まで、または１週間までの長さであり得る。一部の場合では、粒子をコーティングするために腸溶コーティングを使用しなくてもよい。
【０１７３】
腸内放出を実現するために使用することができるポリマーまたはコーティングは、一部の場合では、アニオン性ポリメタクリレート（メタクリル酸とメタクリル酸メチルまたはアクリル酸エチルのいずれかの共重合生成物（ｃｏｐｏｌｙ−ｍｅｒｉｓａｔｅ）（Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標））、セルロースベースのポリマー、例えば、酢酸フタル酸セルロース（Ａｑｕａｔｅｒｉｃ（登録商標））またはポリビニル誘導体、例えば、酢酸フタル酸ポリビニル（Ｃｏａｔｅｒｉｃ（登録商標））であり得る。
【０１７４】
ポリ核酸のポリマーに対する比および使用する特定のポリマーの性質に応じて、ミニサークルＤＮＡなどのポリ核酸の放出の速度を制御することができる。一部の場合では、デポ注射製剤を、ポリ核酸を体組織と適合性のリポソームまたはマイクロエマルションに閉じ込めることによって調製することができる。注射製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通して濾過することによってまたは使用する直前に滅菌水もしくは他の滅菌注射用媒体に溶解もしくは分散させることが可能な滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を組み込むことによって滅菌することができる。
【０１７５】
ナノ粒子は、種々の形状および断面の幾何学的形状を有してよく、これは、ナノ粒子を作製するために使用されるプロセスに一部依存し得る。ある場合では、ナノ粒子は、球体、棒、管、薄片、繊維、プレート、針金、立方体、またはひげであり得る形状を有してよい。ナノ粒子は、上述の形状のうちの２つまたはそれよりも多くを有する粒子を含み得る。別の場合には、粒子の断面の幾何学的形状は、環状、楕円体、三角形、長方形、または多角形のうちの１つまたは複数であり得る。一実施形態では、ナノ粒子は、非球状粒子であり得る。例えば、ナノ粒子は、長さが異なる主要な軸を全部で３つ有し得る楕円体の形態を有し得る、または扁平もしくは扁長（prelate）回転楕円体であり得る。あるいは、非球状ナノ粒子は、層状の形態であり得、層状とは、１つの軸に沿った最大寸法が他の２つの軸のそれぞれに沿った最大の寸法よりも実質的に小さい可能性がある粒子を指す。非球状ナノ粒子は、角錐台もしくは錐台、または長い棒の形状を有してもよい。一実施形態では、ナノ粒子は、形状が不規則であり得る。一実施形態では、複数のナノ粒子は、球状ナノ粒子から本質的になり得る。
【０１７６】
送達ビヒクルのカーゴ
【０１７７】
カーゴを含む、粘液透過特徴（ＭＰＰを伴うことを含む）を有する送達ビヒクルが本明細書に提示される。一部の場合では、カーゴは、例えば、核酸、色素、薬物、タンパク質、ナノ粒子、または化学薬品であり得る。カーゴは、例えば、化学化合物、治療剤、小分子薬物、生物学的薬物、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ミニサークルＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを含む）、ＲＮＡおよびタンパク質を発現させるための核酸ベクター、色素、蛍光色素、多糖、糖類、脂質、ペプチド模倣体、またはこれらの組合せを含み得る。カーゴは、治療的機能、診断機能、局在化またはタグ付け機能を有し得る。カーゴは、目的の細胞および組織に存在するまたはそこに送達された他の分子と協調して作用し得る。
【０１７８】
一部の実施形態では、カーゴは核酸であり得る。核酸はベクターあり得る。核酸はＤＮＡまたはＲＮＡに基づくものであり得る。ＤＮＡに基づくベクターは、非ウイルス性であり得、プラスミド、ミニサークル、閉鎖型直鎖ＤＮＡ（ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ）、直鎖ＤＮＡ、および一本鎖ＤＮＡなどの分子を含む。脂質−核酸粒子中に存在し得る核酸は、公知である任意の形態の核酸を含む。本明細書で使用される核酸は、一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであり得る。二本鎖ＤＮＡの例としては、構造遺伝子、制御領域および終結領域を含む遺伝子、ならびにウイルスまたはプラスミドＤＮＡなどの自己複製系が挙げられる。二本鎖ＲＮＡの例としては、ｓｉＲＮＡおよび他のＲＮＡ干渉試薬が挙げられる。一本鎖核酸としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、マイクロＲＮＡ、および三重鎖形成オリゴヌクレオチドが挙げられる。脂質−核酸粒子中に存在する核酸は、下記のオリゴヌクレオチド修飾のうちの１つまたは複数を含み得る。核酸は、一般に、核酸の特定の形態に応じて、種々の長さのものであり得る。例えば、特定の実施形態では、プラスミドまたは遺伝子は、約１，０００から１００，０００ヌクレオチド残基までの長さであり得る。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約１０から１００ヌクレオチドまでの長さの範囲であり得る。種々の関連する実施形態では、一本鎖、二本鎖、および三本鎖のオリゴヌクレオチドは、約１０から約５０ヌクレオチドまでの長さ、約２０から約５０ヌクレオチドまで、約１５から約３０ヌクレオチドまで、約２０から約３０ヌクレオチドまでの長さの範囲であり得る。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約２ヌクレオチドから１０ヌクレオチドまでの長さの範囲であり得る。
【０１７９】
ＤＮＡに基づくベクターは、ウイルス性であってもよく、それらとして、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスなどが挙げられる。ベクターは、ＲＮＡであってもよい。ＲＮＡベクターは、修飾されていないＲＮＡの直鎖形態であっても環状形態であってもよい。ＲＮＡベクターは、半減期が増大するように、免疫原性が低下するように、および／または翻訳のレベルが上昇するように設計された種々のヌクレオチド修飾を含んでもよい。ベクターは、本明細書で使用される場合、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかで構成されてよい。一部の実施形態では、ベクターは、ＤＮＡで構成されてよい。ベクターは、成長のために使用するＥ．ｃｏｌｉなどの原核生物において自律複製することが可能であってよい。一部の実施形態では、ベクターを生物体のゲノム中に安定に組み込むことができる。他の場合では、ベクターは、細胞質または核のいずれかに分離したままにすることができる。一部の実施形態では、ベクターは、標的化配列を含有し得る。一部の実施形態では、ベクターは、抗生物質耐性遺伝子を含有し得る。ベクターは、遺伝子発現を調節するための調節エレメントを含有し得る。一部の場合では、ミニサークルをリポソーム内に封入することができる。
【０１８０】
カーゴは、遺伝子、高分子量ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド、ペプチド模倣体、リボザイム、ペプチド核酸、化学療法用分子などの化学薬剤、または、これらに限定されないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルス粒子、成長因子  サイトカイン、免疫モジュレート剤、および発現すると免疫系を刺激するまたは抑制する抗原を提示するタンパク質を含めた他のタンパク質を含めた任意の大きな分子であり得る。
【０１８１】
カーゴは、例えば、小分子薬物、ペプチド、タンパク質、抗体、ＤＮＡ（例えばミニサークルＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを含む（リポソーム内にカーゴとして組み入れられるプラスミドＤＮＡによって発現させることもできる）、アシクロビル、ジドブジンおよびインターフェロンなどの抗ウイルス剤；アミノグリコシド、セファロスポリンおよびテトラサイクリンなどの抗菌剤；ポリエン抗生物質、イミダゾールおよびトリアゾールなどの抗真菌剤；葉酸、ならびにプリン類似体およびピリミジン類似体などの代謝拮抗剤；アントラサイクリン抗生物質および植物アルカロイドなどの抗新生物剤；コレステロールなどのステロール；炭水化物、例えば、糖およびデンプン；アミノ酸、ペプチド、タンパク質、例えば、細胞受容体タンパク質、免疫グロブリン、酵素、ホルモン、神経伝達物質および糖タンパク質；放射性同位元素および放射性同位元素で標識された化合物などの放射標識；放射線不透過性化合物；蛍光化合物；散瞳化合物；気管支拡張薬；局部麻酔薬；色素、リポソーム内に組み入れられたＤＮＡによって発現させることができる蛍光色素ペプチドを含めた蛍光色素、またはこれらの任意の組合せを含み得る。
【０１８２】
一部の場合では、カーゴは、核酸によって発現させることができる遺伝子の一部であり得る。遺伝子の一部は、３ヌクレオチドから全ゲノム配列全体までであり得る。例えば、遺伝子の一部は、内在性ゲノム配列の約１％から約１００％までであり得る。遺伝子の一部は、遺伝子の全ゲノム配列の約１％から、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または約１００％までであり得る。
【０１８３】
ミニサークル（ＭＣ）ＤＮＡとプラスミドＤＮＡは、どちらも、送達の直後に導入遺伝子産物が高レベルで作られることを可能にし得る発現カセットを含有し得るので、ミニサークル（ＭＣ）ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡと同様であり得る。一部の場合では、ＭＣは、ＭＣ  ＤＮＡが原核生物配列エレメント（例えば、細菌複製開始点および抗生物質耐性遺伝子）を欠き得るという点で異なり得る。骨格プラスミドＤＮＡからの原核生物配列エレメントの除去は、エピソームＤＮＡ単離前にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおける部位特異的組換えによって実現することができる。原核生物配列エレメントの欠如により、ＭＣサイズがその親の全長（ＦＬ）プラスミドＤＮＡよりも縮小し得、これにより、トランスフェクション効率の増強がもたらされ得る。結果は、それらのＦＬプラスミドＤＮＡ対応物と比較した場合に、ＭＣの方が多くの細胞にトランスフェクトすることができ、送達された際の高レベルの導入遺伝子発現の持続を可能にすることができるというものであり得る。
【０１８４】
一部の場合では、ミニサークルＤＮＡは、細菌複製開始点を含まなくてよい。例えば、ミニサークルＤＮＡまたは閉鎖型直鎖ＤＮＡは、細菌複製開始点配列の約５０％から細菌複製開始点の１００％までの細菌複製開始点を含まなくてよい。一部の場合では、細菌複製開始点は短縮型または不活性である。ポリ核酸は、細菌複製開始点を最初にコードしたベクターに由来し得る。細菌複製開始点全体またはその一部を除去し、細菌複製開始点を含まないポリ核酸を残すための方法を利用することができる。一部の場合では、細菌複製開始点は、アデニンおよびチミン含有量が高いことによって同定することができる。
【０１８５】
ミニサークルＤＮＡベクターは、非ウイルス遺伝子治療およびワクチン接種において使用するためのｉｎ  ｖｉｖｏでのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおける部位特異的組換えによって従来のプラスミドＤＮＡから得られる高次コイルの最小発現カセットであり得る。ミニサークルＤＮＡは、抗生物質耐性遺伝子、複製開始点、および／または細菌ＤＮＡに固有の炎症性配列などの細菌の骨格配列を欠くまたはそれが減少している可能性がある。ミニサークルは、それらの改善された安全性プロファイルに加えて、導入遺伝子発現の効率を大きく上昇させ得る。
【０１８６】
一部の場合では、核酸は、異種配列をコードし得る。異種配列により、細胞内局在化がもたらされ得る（例えば、核を標的とするための核局在化シグナル（ＮＬＳ）；ミトコンドリアを標的とするためのミトコンドリア局在化シグナル；葉緑体を標的とするための葉緑体局在化シグナル；ＥＲ保持シグナルなど）。一部の場合には、ミニサークルＤＮＡまたは閉鎖型直鎖ＤＮＡなどのポリ核酸は、核局在化配列（ＮＬＳ）を含み得る。
【０１８７】
一部の実施形態では、ベクターは、ＡＰＣなどのタンパク質をコードする。ベクターは、１つまたは複数の核局在化配列（ＮＬＳ）を含み得る。いくつかのＮＬＳ配列は、約１から、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多くのＮＬＳであり得る。一部の実施形態では、ベクターは、アミノ末端またはアミノ末端付近に、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくはそれよりも多くのＮＬＳまたは約１よりも多く、約２よりも多く、約３よりも多く、約４よりも多く、約５よりも多く、約６よりも多く、約７よりも多く、約８よりも多く、約９よりも多く、約１０よりも多く、もしくはそれよりも多くのＮＬＳを含み、カルボキシ末端またはカルボキシ末端付近に、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくはそれよりも多くのＮＬＳまたは約１よりも多く、約２よりも多く、約３よりも多く、約４よりも多く、約５よりも多く、約６よりも多く、約７よりも多く、約８よりも多く、約９よりも多く、約１０よりも多く、もしくはそれよりも多くのＮＬＳを含む、あるいはこれらの組合せを含む（例えば、アミノ末端に１つまたは複数のＮＬＳを含み、カルボキシ末端に１つまたは複数のＮＬＳを含む）。１つよりも多くのＮＬＳが存在する場合、それぞれを他とは独立して選択することができ、したがって、単一のＮＬＳが１つよりも多くのコピーで存在し得る、かつ／または１つもしくは複数のコピーに存在する１つもしくは複数の他のＮＬＳと組み合わせて存在し得る。
【０１８８】
ＮＬＳの非限定的な例としては、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶを有するＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミン由来のＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫを有する、２つの部分からなるヌクレオプラスミンＮＬＳ）；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤまたはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰを有するｃ−ｍｙｃ  ＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹを有するｈＲＮＰＡ１  Ｍ９  ＮＬＳ；インポーチン−アルファ由来のＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ；筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰおよびＰＰＫＫＡＲＥＤ；ヒトｐ５３の配列ＰＯＰＫＫＫＰＬ；マウスｃ−ａｂｌ  ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲおよびＰＫＱＫＫＲＫ；肝炎ウイルスデルタ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ；マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ；ヒトポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ；およびステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫに由来するＮＬＳ配列を挙げることができる。一般に、１つまたは複数のＮＬＳは、真核細胞の核内におけるミニサークルＤＮＡベクターまたは短い直鎖ＤＮＡベクターの検出可能な量での蓄積を駆動するのに十分な強度のものであり得る。真核細胞は、ヒト腸陰窩細胞であり得る。
【０１８９】
核内の蓄積の検出は、任意の適切な技法によって実施することができる。例えば、検出可能なマーカーをベクターに融合することができ、その結果、例えば、核の場所を検出するための手段（例えば、ＤＡＰＩなどの核に特異的な染色）と組み合わせて、細胞内の場所を可視化することができる。細胞核を細胞から単離することもでき、次いで、その内容物を、免疫組織化学的検査、ウエスタンブロット、または酵素活性アッセイなどの、タンパク質を検出するための任意の適切なプロセスによって分析することができる。本明細書のある実施形態は、リポソームカーゴの標的部位への時間依存的なｐＨにより誘発される放出を示し得る。本明細書のある実施形態は、複雑な多数のカーゴの細胞への送達を含有および提供し得る。追加的なカーゴは、小分子、抗体、ＤＮＡｓｅ阻害剤またはＲＮＡｓｅ阻害剤などの阻害剤であり得る。
【０１９０】
一部の場合では、粒子は、ＤＮＡｓｅ阻害剤を含有し得る。ＤＮＡｓｅ阻害剤は、粒子内または粒子上に局在していてよい。他の場合では、阻害剤をコードするポリ核酸を粒子内に封入することができる。他の場合では、阻害剤は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤−２（ＤＭＩ−２）などのＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤であってよい。ＤＭＩ−２は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．株番号５６０により産生させることができる。ＤＭＩ−２の構造は、４’’’Ｒ，６ａＲ，１０Ｓ，１０ａＳ−８−アセチル−６ａ，１０ａ−ジヒドロキシ−２−メトキシ−１２−メチル（mefhyl）−１０−［４’−［３’’−ヒドロキシ−３’’，５’’−ジメチル−４’’（Ｚ−２’’’，４’’’−ジメチル−２’’’−ヘプテノイルオキシ）テトラヒドロピラン−１’’−イルオキシ］−５’−メチルシクロヘキサン−１’−イルオキシ］−１，４，６，７，９−ペンタオキソ−１，４，６，６ａ，７，８，９，１０，１０ａ，１１−デカヒドロナフタセンであってよい。クロロキンなどの他の阻害剤も粒子内または粒子上、例えば粒子の表面上に封入することができる。
【０１９１】
本明細書の組成物および方法の１つとして、腸管の細胞に送達することができる核酸のカーゴを有する組成物が挙げられる。例えば、ポリ核酸を、送達ビヒクルおよびＭＰＰを伴う送達ビヒクルなどの本明細書の粘液透過性組成物によって腸陰窩幹細胞などの胃腸管内の細胞に送達することができる。例えば、送達されるポリ核酸は、（１）腸上皮幹細胞において通常は見出されないもの；（２）腸上皮幹細胞において通常見出されるが、生理的に有意なレベルでは発現しないもの；（３）腸上皮幹細胞において通常見出され、幹細胞またはそれらの後代において所望の生理的レベルで通常発現するもの；（４）腸上皮幹細胞において発現するように改変することができる任意の他のＤＮＡ；および（５）上記の任意の組合せであってよい。一部の場合では、本明細書の粘液透過性組成物により、核酸などのカーゴを胃腸管の細胞に送達することができ、ここで、核酸によってコードされるタンパク質産物は分泌されるかまたは他のやり方で他の細胞および組織に輸送される。
【０１９２】
代謝障害および内分泌障害を処置するためのタンパク質を含めた種々のタンパク質およびポリペプチドを腸陰窩幹細胞などのＧＩ管の細胞に送達することができる。タンパク質の例は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、インスリン、抗利尿ホルモンおよび成長ホルモンである。障害としては、フェニルケトン尿症、糖尿病、有機酸性尿症、チロシン血症、尿素サイクル異常症、家族性抗コレステロール血症が挙げられる。フェニルケトン尿症、糖尿病、有機酸性尿症、チロシン血症、尿素サイクル異常症、家族性抗コレステロール血症における欠陥を補正することができるタンパク質またはペプチドのいずれかの遺伝子を幹細胞に導入し、その結果、タンパク質またはペプチド産物は腸上皮によって発現される。抗血友病因子（第ＶＩＩＩ因子）、クリスマス因子（第ＩＸ因子）および第ＶＩＩ因子などの凝固因子も同様に腸上皮において産生させることができる。循環タンパク質の欠損を処置するために使用することができるタンパク質を腸上皮において発現させることもできる。循環タンパク質の欠損を処置するために使用することができるタンパク質は、例えば、アルブミン血症を処置するためのアルブミン、アルファ−１−抗トリプシン、ホルモン結合性タンパク質であり得る。さらに、正常な嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子の遺伝子を腸上皮の幹細胞に挿入することにより、嚢胞性線維症の腸の症状を処置することができる。アポリポタンパク質Ｂを挿入することにより、無ベータリポ蛋白血症を処置することができる。スクラーゼ−イソマルトース、ラクターゼ−フロリジンヒドロラーゼおよびマルターゼ−グルコアミラーゼを挿入することにより、二糖分解酵素不耐性を処置することができる。ビタミンＢ１２の吸収のための内因子またはビタミンＢ１２の吸収のための内因子／コバラミン複合体の受容体、ならびに胆汁酸の輸送体の挿入を腸上皮に挿入することができる。さらに、がんの処置のために、核酸によりコードされ得る任意の薬物を、局在化され、高濃度で分泌されるように腸上皮の幹細胞に挿入することができる。この点において、がんの処置のために、アンチセンスＲＮＡを幹細胞にコードさせることができ、アンチセンスの産生後、それをがん性細胞に組み入れることができることを当業者であれば容易に認識するで。送達の他の例としては、先天性下痢症を処置するためのタンパク質をコードする核酸、例えば、Ｍｙｏ５Ｂによる微絨毛封入体病およびＩＬ−１０による炎症性腸疾患が挙げられる。
【０１９３】
一部の場合では、送達ビヒクル内に含まれる核酸によりコードされるタンパク質を測定し、定量することができる。一部の場合では、改変された細胞を単離し、改変された細胞に対してウエスタンブロットを実施して、タンパク質産生の存在および相対量を改変されていない細胞と比較して決定することができる。他の場合では、フローサイトメトリーを利用するタンパク質の細胞内染色を実施して、タンパク質産生の存在および相対量を決定することができる。追加的なアッセイを実施して、ＡＰＣなどのタンパク質が機能的であるかどうかを決定することもできる。例えば、ＡＰＣ導入遺伝子を発現する改変された細胞を細胞質ゾルのβ−カテニン発現について測定し、改変されていない細胞と比較することができる。改変された細胞の細胞質ゾルにおいて改変されていない細胞と比較してβ−カテニンの発現が低減することにより、機能的なＡＰＣ導入遺伝子が示され得る。他の場合では、ＦＡＰのマウスモデルを利用して、ＡＰＣタンパク質をコードする導入遺伝子の機能性を決定することができる。例えば、ＦＡＰを有するマウスを、ＡＰＣをコードする改変された細胞を用いて処置することができ、無処置のマウスに対してＦＡＰ疾患の低減を測定することができる。
【０１９４】
ある特定の実施形態では、本明細書中の組成物および方法は、検出可能な標識（例えば、標識は、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素または酵素の補因子であり得る）にさらに結合させることができるイメージング剤を含み得るカーゴを含む。活性部分は、鉄キレート、ガドリニウムまたはマンガンの放射性キレート、酸素、窒素、鉄、炭素、またはガリウムの陽電子放射体、４３Ｋ、５２Ｆｅ、５７Ｃｏ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３２Ｉ、または９９Ｔｃなどの放射性重金属などの放射性薬剤であり得る。そのような部分を含む送達ビヒクルをイメージング剤として使用し、ヒトなどの哺乳動物における診断への使用に有効な量で投与することができる。このように、イメージング剤の局在化および蓄積を検出することができる。イメージング剤の局在化および蓄積は、放射性シンチグラフィ、核磁気共鳴イメージング、コンピュータ断層撮影法、または陽電子放出断層撮影法によって検出することができる。当業者には明らかになる通り、投与される放射性同位元素の量は、放射性同位元素に依存する。当業者は、活性部分として使用される所与の放射性核種の特異的活性およびエネルギーに基づいて、投与されるイメージング剤の量を容易に処方することができる。一般には、用量当たり０．１〜１００ミリキュリーのイメージング剤、１〜１０ミリキュリー、および２〜５ミリキュリーを投与することができる。したがって、イメージング剤として有用な組成物は、０．１〜１００ミリキュリー、一部の実施形態では、好ましくは１〜１０ミリキュリー、一部の実施形態では、好ましくは２〜５ミリキュリー、一部の実施形態では、より好ましくは１〜５ミリキュリーを含み得る放射性部分とコンジュゲートした標的化部分を含み得る。標識を検出するために使用される検出の手段は、使用される標識の性質および使用される生体試料の性質に依存し、蛍光偏光、高速液体クロマトグラフィー、抗体捕捉、ゲル電気泳動、示差沈殿、有機抽出、サイズ排除クロマトグラフィー、蛍光顕微鏡法、または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）アッセイも含み得る。標的化部分とは、タンパク質、核酸、核酸類似体、炭水化物、または小分子も指し得る。実体は、例えば、小分子などの治療用化合物、または検出可能な標識などの診断用実体であり得る。場所は、組織、特定の細胞型、または細胞内区画であり得る。一実施形態では、標的化部分により、活性な実体の局在化を方向付けることができる。活性な実体は、小分子、タンパク質、ポリマー、または金属であり得る。核酸を含むリポソームなどの活性な実体は、治療、予防、または診断目的で有用であり得る。一部の場合では、部分により、送達ビヒクルが血液脳関門を透過することが可能になり得る。
【０１９５】
他の場合では、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）または磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を選択することができる。ＣＴは、５ｍｍまたはそれ未満のスライス厚で行うことができる。ＣＴスキャンが５ｍｍを超えるスライス厚を有する場合、測定可能な病変の最小サイズはスライス厚の２倍にすべきである。一部の場合では、ＦＤＧ−ＰＥＴスキャンを使用することができる。ＦＤＧ−ＰＥＴは、新しい病変を評価するために使用することができる。ベースライン時にＦＤＧ−ＰＥＴ陰性であり、経過観察時にＦＤＧ−ＰＥＴ陽性であることは、新しい病変に基づいて、進行性疾患（ＰＤ）の徴候である。ベースライン時にＦＤＧ−ＰＥＴを行っておらず経過観察時にＦＤＧ−ＰＥＴ陽性の場合：経過観察時のＦＤＧ−ＰＥＴ陽性がＣＴによって確認された新しい疾患部位に対応する場合、これはＰＤである。経過観察時のＰＤＧ−ＰＥＴ陽性がＣＴでの既存の疾患部位に対応する場合、これは解剖学的推測（anatomic imagines）に基づいて進行していない可能性があり、これは、ＰＤではない可能性がある。一部の場合では、残留Ｘ線検査異常が線維症または瘢痕を示すと考えられる場合に生検と同様の様式で応答をＣＲにアップグレードするためにＦＤＧ−ＰＥＴを使用することができる。ＦＤＧ−ＰＥＴ陽性スキャン病変は、ＦＤＧ要求性が高く、減衰補正画像において取り込みが周囲組織の２倍を超えて大きい病変を意味する。
【０１９６】
一部の場合では、病変の評価を実施することができる。完全奏効（ＣＲ）は、全ての標的病変の消失であり得る。任意の病理学的リンパ節（標的または非標的）は、短軸に１０ｍｍ未満までの縮小を有し得る。部分奏効（ＰＲ）は、ベースラインの径和を参照として、標的病変の径和の少なくとも３０％の減少であり得る。進行性疾患（ＰＤ）は、最小の合計を参照として、標的病変の径和の少なくとも２０％の増大であり得る。２０％の相対的増大に加えて、合計から少なくとも５ｍｍの絶対的増大も実証されなければならない。安定疾患（ＳＤ）は、最小の径和を参照として用いて、ＰＲの質への十分な縮小でも、ＰＤの質への十分な増加でもあり得ない。
【０１９７】
一部の場合では、非標的病変を評価することができる。非標的病変の完全奏効は、腫瘍マーカーレベルの消失および正常化であり得る。全てのリンパ節が非病理学的サイズ（短軸が１０ｍｍ未満）でなければならない。腫瘍マーカーが最初に正常な上限を超えている場合、患者が臨床的完全奏効とみなされるにはそれらが正常化しなければならない。非ＣＲ／非ＰＤは、１つまたは複数の非標的病変の持続および／または正常の限界を超えた腫瘍マーカーレベルの維持である。進行性疾患は、１つもしくは複数の新しい病変の出現および／または既存の非標的病変の明らかな進行であり得る。明らかな進行は、通常、標的病変の状態を凌ぐべきではない。
【０１９８】
一部の場合では、最良の全体的な応答は、処置の開始から疾患の進行／再発までに記録された最良の応答であり得る。
【０１９９】
医薬組成物および製剤
全体を通して記載されている組成物を医薬品に製剤化し、疾患または状態を有すると診断された、それを必要とするヒトまたは哺乳動物、特にその粘膜の層を通って治療剤が送達されなければならない粘膜の層と関連する組織および細胞を処置するために使用することができる。医薬品は、任意の追加的な治療薬と共投与することができる。
【０２００】
送達ビヒクルを用いて処置することができる疾患は、がん性または非がん性であり得る。疾患は、家族性腺腫性ポリポーシス（ＦＡＰ）、軽症型ＦＡＰ、がん、慢性炎症性腸疾患、慢性炎症性腸疾患、回腸クローン病またはこれらの任意の組合せであり得る。一部の場合では、疾患は、遺伝子スクリーニングによって同定することができる。例えば、遺伝子スクリーニングにより、対象において当該対象を乳がんにかかりやすくし得るＢＣＲＡ変異を同定することができる。他の場合では、遺伝子スクリーニングにより、ＦＡＰをもたらし得るＡＰＣ遺伝子の変異を同定することができる。疾患はまた、例えば、眼の疾患、生殖疾患、胃腸疾患であり得る。疾患は、遺伝子疾患であり得る。疾患は、胃腸管内にポリープを生じさせ得る。一部の場合では、疾患は、ＦＡＰである。ＦＡＰはがんに進行する可能性がある。胃腸疾患は遺伝性であり得る。例えば、遺伝性胃腸疾患は、ジルベール症候群、毛細血管拡張症、ムコ多糖症（mucopolysaccaride）、オースラー・ウェーバー・ランデュ病、膵炎、角化棘細胞腫、胆道閉鎖症、モルキオ症候群、ハーラー症候群、ハンター症候群、クリグラー・ナジャー、ローター、ポイツ・ジェガース症候群、デュビン・ジョンソン、骨軟骨症、骨軟骨異形成症、ポリポーシス、またはこれらの組合せであり得る。
【０２０１】
経口投与に関しては、賦形剤として、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、ゼラチン、スクロース、炭酸マグネシウムなどを挙げることができる。所望であれば、リポソーム組成物は、微量の無毒性の補助物質、例えば、湿潤剤、乳化剤、または緩衝剤も含有してよい。
【０２０２】
組成物は、経口的に、皮下注射もしくは他の注射によって、静脈内に、脳内に、筋肉内に、非経口的に、経皮的に、経鼻的にまたは直腸に投与することができる。化合物または組成物が投与される形態は、化合物が投与される経路に少なくとも一部依存する。一部の場合では、リポソーム組成物を経口投与用の固体調製物の形態で使用することができる；調製物は、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などであり得る。錠剤製剤では、組成物は、一般には、添加剤、例えば、糖類またはセルロース調製物などの賦形剤、デンプンペーストまたはメチルセルロースなどの結合剤、充填剤、崩壊剤、および医療用調製物の製造に一般に使用される他の添加剤を用いて製剤化される。そのような剤形を調製するための方法は当業者には明らかであり得る。投与されるリポソーム組成物は、患者または対象を含めた生物系における治療的使用のための薬学的有効量の分量のナノ粒子を含有し得る。医薬組成物は、毎日投与することもでき、必要に応じて投与することもできる。ある特定の実施形態では、医薬組成物を対象に就寝前に投与することができる。一部の実施形態では、医薬組成物を就寝の直前に投与することができる。一部の実施形態では、医薬組成物を就寝前の約２時間以内、好ましくは就寝前の約１時間以内に投与することができる。別の実施形態では、医薬組成物を就寝の約２時間前に投与することができる。さらなる実施形態では、医薬組成物を就寝の少なくとも２時間前に投与することができる。別の実施形態では、医薬組成物を就寝の約１時間前に投与することができる。さらなる実施形態では、医薬組成物を就寝の少なくとも１時間前に投与することができる。またさらなる実施形態では、医薬組成物を就寝の１時間未満前に投与することができる。さらに別の実施形態では、医薬組成物を就寝の直前に投与することができる。医薬組成物は経口的にまたは直腸に投与される。
【０２０３】
組成物中の活性薬剤（複数可）の妥当な投与量（「治療有効量」）は、例えば、状態の重症度および経過、投与形式、特定の薬剤（複数可）の生物学的利用能、対象の年齢および体重、対象の臨床歴および活性薬剤（複数可）への応答、医師の自由裁量、またはこれらの任意の組合せに依存し得る。対象に投与される組成物中の活性薬剤（複数可）の治療有効量は、１回の投与によるか複数回の投与によるかにかかわらず、１日当たり体重１ｋｇ当たり約１００μｇ〜１日当たり体重１ｋｇ当たり約１０００ｍｇの範囲内であり得る。一部の実施形態では、毎日投与される各活性薬剤の範囲は、１日当たり体重１ｋｇ当たり約１００μｇ〜１日当たり体重１ｋｇ当たり約５０ｍｇまで、１日当たり体重１ｋｇ当たり１００μｇ〜１日当たり体重１ｋｇ当たり約１０ｍｇ、１日当たり体重１ｋｇ当たり１００μｇ〜１日当たり体重１ｋｇ当たり約１ｍｇ、１日当たり体重１ｋｇ当たり１００μｇ〜１日当たり体重１ｋｇ当たり約１０ｍｇ、１日当たり体重１ｋｇ当たり５００μｇ〜１日当たり体重１ｋｇ当たり約１００ｍｇ、１日当たり体重１ｋｇ当たり５００μｇ〜１日当たり体重１ｋｇ当たり約５０ｍｇ、１日当たり体重１ｋｇ当たり５００μｇ〜１日当たり体重１ｋｇ当たり約５ｍｇ、１日当たり体重１ｋｇ当たり１ｍｇ〜１日当たり体重１ｋｇ当たり約１００ｍｇ、１日当たり体重１ｋｇ当たり１ｍｇ〜１日当たり体重１ｋｇ当たり約５０ｍｇ、１日当たり体重１ｋｇ当たり１ｍｇ〜１日当たり体重１ｋｇ当たり約１０ｍｇ、体重１ｋｇ当たり５ｍｇ／用量〜１日当たり体重１ｋｇ当たり約１００ｍｇ、体重１ｋｇ当たり５ｍｇ／用量〜１日当たり体重１ｋｇ当たり約５０ｍｇ、１日当たり体重１ｋｇ当たり１０ｍｇ〜１日当たり体重１ｋｇ当たり約１００ｍｇ、および１日当たり体重１ｋｇ当たり１０ｍｇ〜１日当たり体重１ｋｇ当たり約５０ｍｇであり得る。
【０２０４】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤、甘味料、塩、緩衝剤などを含む。薬学的に許容される担体は、これらに限定されないが、香味剤、甘味剤ならびに特定の治療用組成物を調製するために必要になり得る緩衝剤および吸収剤などの種々雑多な材料を含めた広範囲の材料から調製することができる。
【０２０５】
本明細書中に記載の組成物は、投与前の妥当な時間内に滅菌条件下で製剤化することができる。一部の場合では、二次治療を施行することもできる。例えば、化学療法または放射線療法などの別の治療を、複合体の投与前または投与後、例えば、１２時間〜７日以内に施行することができる。化学療法および放射線療法の両方などの治療の組合せを複合体の投与に加えて使用することができる。本明細書の組成物および方法と共に使用するための他の治療としては、化学療法剤、細胞傷害／抗新生物剤、抗血管新生剤ならびに他の公知のがん治療法、小分子および生物学的製剤の使用が挙げられる。
【０２０６】
使用方法
本明細書の組成物を、治療および診断への適用に使用することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物を、粘液層を有する細胞または組織に影響を及ぼす疾患または状態に対する治療をモニタリングするための診断薬として使用する。本明細書の組成物および方法は、診断剤を、粘液層を通して送達して標的細胞または組織に到達させるための手段を提供する。そのような診断薬の例として、本明細書の組成物を患者における家族性腺腫性ポリポーシス（ＦＡＰ）または他の病態に対する診断薬として使用することができる。患者に、粘液透過性送達ビヒクルならびにＭＰＰを含む組成物を有効量で投与することができ、診断方法は、細胞ゲノム中に組み入れられたカーゴのレベルを決定することを含んでよく、そこで、患者における治療開始前と治療中および／または治療後のカーゴレベルの差異により、患者が治療を完了したかどうかまたは病態が阻害もしくは排除されたかどうかを含めた、患者における治療の効果が証明される。
【０２０７】
他の場合では、本明細書に記載の組成物を対象に予防措置として投与することができる。例えば、対象は、診断された疾患を有さなくてもよく、影響を受ける細胞または組織が粘液層を有するがん、例えば結腸がんなどの疾患にかかりやすいと考えられていてもよい。本明細書の組成物および方法は、予防剤（preventative agent）を、粘液層を通して送達して標的細胞または組織に到達させるための手段を提供する。一部の場合では、本明細書に記載の組成物を対象に、特に治療的送達の標的となる細胞または組織が粘液層を有する既存の疾患または状態を処置するために投与することができる。
【０２０８】
一部の場合では、使用される組成物はカーゴを含有し、このカーゴは、細胞に送達され、次いで、標的細胞（複数可）を遺伝子改変し得る。例えば、ポリ核酸により、それが接触する細胞に形質導入することができる。本明細書に記載のポリ核酸を用いた形質導入またはトランスフェクションの効率は、例えば、接触させた細胞の総数の２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、もしくは９９．９％よりも多くであり得る、または約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、もしくは９９．９％よりも多くであり得る。粘液透過性ＭＰＰを伴う送達ビヒクルを有する本明細書に記載の組成物などの構造体を用いた細胞内取り込みの効率は、標的細胞への粘液層を通った効率的な透過および移行を可能にし得るものであり、それにより、標的細胞（複数可）による効率的な取り込みを有し、例えば、取り込みは、接触させた細胞の総数の２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、もしくは９９．９％よりも多くであり得る、または約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、もしくは９９．９％よりも多くであり得る。一部の場合では、組成物は、ＭＰＰを含まない同等の送達ビヒクルと比較して高いパーセントの細胞内取り込みを有し得る。ＭＰＰを含有しない組成物と比べた改善は、約１０％から、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または約８０％までより良いものであり得る。一部の場合では、ＭＰＰを含有する送達ビヒクル組成物によって細胞に送達されるポリ核酸カーゴのトランスフェクションまたは組込みの効率は、ＭＰＰを含まない同等の送達ビヒクルよりも約５％から、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％までより良いものであり得る。
【０２０９】
カーゴを送達するための本明細書に提示される組成物は、導入を必要とする対象への導入後少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００日または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００日にわたって機能的であり得る。構造体は、対象への導入後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２カ月または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２カ月にわたって機能的であり得る。リポソームなどの構造体は、対象への導入後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、もしくは３０年または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、もしくは３０年にわたって機能的であり得る。一部の場合では、リポソームは、最大、レシピエントの寿命まで機能的であり得る。さらに、リポソームなどの構造体は、その正常な意図された働きの１００％で機能し得る。リポソームはまた、それらの正常な意図された働きの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％で機能し得る。リポソームの機能は、送達の効率、リポソームの持続性、リポソームの安定性、またはこれらの任意の組合せを指し得る。
【０２１０】
本明細書に提示される組成物は、ミニサークルＤＮＡベクターなどのカーゴを標的細胞に送達することができる。一部の場合では、機能は、送達ビヒクル組成物からミニサークルＤＮＡベクターを受け取った細胞のパーセントを含み得る。他の場合では、機能は、ポリ核酸からのタンパク質生成の頻度または効率を指し得る。例えば、送達ビヒクル組成物により、ＡＰＣなどの遺伝子の少なくとも一部分をコードするベクターを細胞に送達することができる。ベクターからのＡＰＣ生成の頻度または効率（frequency of efficiency）により、ベクターまたはリポソームの機能性について記述することができる。
【０２１１】
ミニサークルベクター濃度は、０．５ナノグラムから５０マイクログラムまでであり得る。ミニサークルベクター濃度は、約０．５ｎｇから、１ｎｇ、２ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、５０ｎｇ、１００ｎｇ、１５０ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、５００ｎｇ、６００ｎｇ、７００ｎｇ、８００ｎｇ、９００ｎｇ、１０００ｎｇ、１μｇ、２μｇ、５μｇ、１０μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇ、５０μｇ、６０μｇ、または５０μｇまでであり得るもしくはそれを超え得る。一部の場合では、構造体によって細胞に導入することができる核酸（例えば、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ＲＮＡ）の量を変動させて、トランスフェクション効率および／または細胞生存能力を最適化することができる。一部の場合では、約１００ピコグラム未満の核酸を対象に導入することができる。一部の場合では、少なくとも約１００ピコグラム、少なくとも約２００ピコグラム、少なくとも約３００ピコグラム、少なくとも約４００ピコグラム、少なくとも約５００ピコグラム、少なくとも約６００ピコグラム、少なくとも約７００ピコグラム、少なくとも約８００ピコグラム、少なくとも約９００ピコグラム、少なくとも約１マイクログラム、少なくとも約１．５マイクログラム、少なくとも約２マイクログラム、少なくとも約２．５マイクログラム、少なくとも約３マイクログラム、少なくとも約３．５マイクログラム、少なくとも約４マイクログラム、少なくとも約４．５マイクログラム、少なくとも約５マイクログラム、少なくとも約５．５マイクログラム、少なくとも約６マイクログラム、少なくとも約６．５マイクログラム、少なくとも約７マイクログラム、少なくとも約７．５マイクログラム、少なくとも約８マイクログラム、少なくとも約８．５マイクログラム、少なくとも約９マイクログラム、少なくとも約９．５マイクログラム、少なくとも約１０マイクログラム、少なくとも約１１マイクログラム、少なくとも約１２マイクログラム、少なくとも約１３マイクログラム、少なくとも約１４マイクログラム、少なくとも約１５マイクログラム、少なくとも約２０マイクログラム、少なくとも約２５マイクログラム、少なくとも約３０マイクログラム、少なくとも約３５マイクログラム、少なくとも約４０マイクログラム、少なくとも約４５マイクログラム、または少なくとも約５０マイクログラムの核酸を各細胞試料に添加することができる（例えば、１つまたは複数の細胞に電気穿孔する）。一部の場合では、最適なトランスフェクション効率および／または細胞生存能力に必要な核酸（例えば、ｄｓＤＮＡ）の量は細胞型に特異的であり得る。
【０２１２】
一部の場合では、構造体の有効量とは、処置前の対象では低下している可能性がある少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを上昇させるのに十分な量またはがんの１つもしくは
複数の症状を緩和するのに十分な量を意味し得る。例えば、有効量は、胃腸分化遺伝子、細胞周期阻害遺伝子、および腫瘍抑制因子遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを、いかなる化合物での処置も伴わない参照値または発現レベルと比較して少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００％、１５００％、またはそれよりも大きく上昇させるのに十分な量であり得る。
【０２１３】
一部の実施形態では、有効量とは、処置前の対象では上昇する可能性がある少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを低下させるために十分な量またはがんの１つもしくは複数の症状を緩和するために十分な量を意味する。例えば、有効量は、遺伝子の発現レベルを、いかなる化合物での処置も伴わない参照値または発現レベルと比較して少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００％、１５００％、またはそれよりも大きく低下させるために十分な量であり得る。
【０２１４】
対象に対する有効量は、対象の体重、サイズ、および健康；状態の性質および程度；ならびに投与のために選択される治療薬に依存する。所与の状況に対する有効量は、臨床医の技能および判断の範囲内に入り得る常套的な実験によって決定することができる。有効量とは、本明細書で使用される場合、測定可能な生物学的応答（例えば、細胞内のカーゴおよび／またはカーゴ生物学的活性の存在）を生じさせるのに十分な送達ビヒクル組成物の量を指し得る。送達ビヒクル組成物の実際の投与量レベルは、特定の対象および／または適用に関する所望の応答を実現するために有効であり得る量が投与されるように変動させることができる。選択される投与量レベルは、対処される組織の型、細胞の型、他の薬物または処置との組合せ、処置される状態の重症度、ならびに処置される対象の健康状態および以前の病歴を含めた種々の因子に依存する。最小の用量を投与することができ、用量制限毒性がない場合、最小限有効な量まで用量を漸増させることができることが好ましい。
【０２１５】
送達ビヒクル組成物によって送達されるポリ核酸カーゴは、腫瘍抑制因子遺伝子をコードし得る。腫瘍抑制因子遺伝子は、一般に、様々な方法を使って細胞増殖を阻害することができるタンパク質をコードし得る。これらの「ブレーキ」の１つまたは複数の喪失が、がんの発生の一因となり得る。一部の場合では、タンパク質をコードする腫瘍抑制因子遺伝子を導入することにより、対象における疾患を好転させる、疾患を防止する、または疾患を処置することができる。
【０２１６】
一部の場合では、腫瘍抑制因子遺伝子であるＡＰＣの変異体対立遺伝子を遺伝によって受け継ぐ対象は、結腸がんが発生する高いリスクを有する可能性がある。別の腫瘍抑制因子遺伝子の変異体対立遺伝子を１つ遺伝によって受け継ぐことにより、対象に特定の腫瘍が発生する確率がほぼ１００パーセントまで上昇する。一部の場合では、ＡＰＣの変異体対立遺伝子、または腫瘍抑制因子遺伝子を遺伝によって受け継いだ対象は、本明細書に記載の送達ビヒクル組成物を受けることができる。一部の場合では、送達ビヒクル組成物は、対象に遺伝によって受け継がれた変異体対立遺伝子によって産生されるタンパク質をコードするカーゴポリ核酸を含有し得る。変異体対立遺伝子は、ＡＰＣなどの腫瘍抑制因子タンパク質であり得る。タンパク質は、ＧＬＢ１、ＤＥＦＡ５、ＷＡＣ、ＤＥＦＡ６、またはこれらの組合せであってもよい。追加的な腫瘍抑制因子遺伝子を送達することができる。一部の場合では、腫瘍抑制因子は、コイルドコイル（ＷＡＣ）遺伝子を有するＷＷドメイン含有アダプターであり得る。
【０２１７】
適切な製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、殺菌性抗生物質および製剤を意図されたレシピエントの体液と等張にする溶質を含有し得る水性および非水性滅菌注射液剤；ならびに懸濁化剤および増粘剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁剤を含み得る。適切な不活性担体は、ラクトースなどの糖を含み得る。一部の場合では、組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルションのような形態をとってよく、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤化剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）を含有し得る。あるいは、活性成分は、使用前に適切なビヒクル、例えば滅菌パイロジェンフリー水を用いて構成するための粉末の形態であり得る。
【０２１８】
担体は、例えば、水、エタノール、１つまたは複数のポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、植物油（例えば、ピーナッツ油、トウモロコシ油、ゴマ油など）などの油、およびこれらの組合せを含有する溶媒または分散媒であり得る。妥当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散の場合では必要な粒子サイズを維持することによっておよび／または界面活性物質を使用することによって維持することができる。多くの場合、等張化剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。遊離酸または塩基または薬理学的に許容されるその塩としての活性化合物の溶液および分散液を、これらに限定されないが、界面活性物質、分散剤、乳化剤、ｐＨ変更剤、およびこれらの組合せを含めた１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と適切に混合した水または別の溶媒または分散媒中に調製することができる。適切な界面活性物質は、アニオン性、カチオン性、両性または非イオン性表面活性剤であり得る。適切なアニオン性界面活性物質としては、これらに限定されないが、カルボン酸イオン、スルホン酸イオンおよび硫酸イオンを含有するものが挙げられる。アニオン性界面活性物質の例としては、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムなどの長鎖スルホン酸アルキルおよびスルホン酸アルキルアリール；ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムなどのスルホコハク酸ジアルキルナトリウム；スルホコハク酸ビス−（２−エチルチオキシル）ナトリウムなどのスルホコハク酸ジアルキルナトリウム；およびラウリル硫酸ナトリウムなどの硫酸アルキルのナトリウム、カリウム、アンモニウムが挙げられる。カチオン性界面活性物質としては、これらに限定されないが、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、臭化セトリモニウム（cetrimoniuni  bromide）、塩化ステアリルジメチルベンジルアンモニウム、ポリオキシエチレンおよびココナッツアミンなどの四級アンモニウム化合物が挙げられる。非イオン性界面活性物質の例としては、モノステアリン酸エチレングリコール、ミリスチン酸プロピレングリコール、モノステアリン酸グリセリン、ステアリン酸グリセリル、ポリグリセリル−４−オレイン酸、アシル化ソルビタン、アシル化スクロース、ＰＥＧ−１５０ラウレート、ＰＥＧ−４００モノラウレート、ポリオキシエチレンモノラウレート、ポリソルベート、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ＰＥＧ−１０００セチルエーテル、ポリオキシエチレントリデシルエーテル、ポリプロピレングリコールブチルエーテル、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ（登録商標）４０１、ステアロイルモノイソプロパノールアミド、およびポリオキシエチレン水素化獣脂アミドが挙げられる。両性界面活性物質の例としては、Ｎ−ドデシル−ベータ−アラニンナトリウム、Ｎ−ラウリル−ベータ−イミノジプロピオン酸ナトリウム、ミリストアンフォアセテート、ラウリルベタインおよびラウリルスルホベタインが挙げられる。製剤は、微生物の成長を防止するための防腐剤を含有し得る。適切な防腐剤としては、これらに限定されないが、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、およびチメロサールが挙げられる。製剤は、活性薬剤（複数可）の分解を防止するための抗酸化剤も含有し得る。製剤は、一般には、復元時に非経口投与用にｐＨ３〜８に緩衝処理される。適切なバッファとしては、これらに限定されないが、リン酸バッファ、酢酸バッファ、およびクエン酸バッファが挙げられる。多くの場合、非経口投与用の製剤には水溶性ポリマーを使用することができる。適切な水溶性ポリマーとしては、これらに限定されないが、ポリビニルピロリドン、デキストラン、カルボキシメチルセルロース、およびポリエチレングリコールが挙げられる。
【０２１９】
滅菌注射液剤は、必要量の活性化合物を妥当な溶媒または分散媒中に、必要に応じて上に列挙されている賦形剤のうちの１つまたは複数と共に組み入れ、その後、濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液剤は、種々の滅菌活性成分を、基本的な分散媒および上に列挙されているものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み入れることによって調製することができる。滅菌注射液剤を調製するための滅菌粉末の場合では、調製の方法は活性成分とそれに加えて任意の追加的な所望の成分の粉末が予め滅菌濾過したその溶液から得られる、真空乾燥およびフリーズドライ技法であってよい。粉末は、粒子が、粒子の溶解を増大させ得る多孔質の性質になるような様式で調製することができる。多孔質粒子を作製するための方法は当技術分野で周知である。
【０２２０】
製剤は、眼用製剤または局所用形態であってよい。眼投与のための医薬製剤は、１つまたは複数のポリマー−薬物コンジュゲートから形成された粒子の滅菌水溶液または懸濁液の形態であってよい。許容される溶媒としては、例えば、水、リンゲル液、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、および等張食塩水が挙げられる。製剤は、１，３−ブタンジオールなどの非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌液剤、懸濁剤、またはエマルションであってもよい。さらに他の実施形態では、送達ビヒクル組成物を粘膜への局所投与用に製剤化することができる。局所投与用の適切な剤形としては、クリーム剤、軟膏剤、膏薬、噴霧剤、ゲル剤、ローション剤、エマルション、液体、および経皮パッチが挙げられる。製剤を経粘膜、経上皮、経内皮、または経皮投与用に製剤化することができる。組成物は、１つまたは複数の化学的透過エンハンサー、膜透過性剤、膜輸送剤、皮膚軟化剤、界面活性物質、安定剤、およびこれらの組合せを含有する。一部の実施形態では、送達ビヒクル組成物を液剤もしくは懸濁剤などの液体製剤として、ローション剤もしくは軟膏剤などの半固形製剤として、または固形製剤として投与することができる。一部の実施形態では、送達ビヒクル組成物を、眼または膣または直腸などの粘膜への局所的適用のために、点眼剤などの液剤および懸濁剤を含めた液体として、または軟膏剤もしくはローション剤などの半固形製剤として製剤化することができる。製剤は、皮膚軟化剤、界面活性物質、乳化剤、および透過エンハンサーなどの１つまたは複数の賦形剤を含有し得る。
【０２２１】
一部の場合では、製剤は、単位用量または複数用量容器、例えば、密閉アンプルおよびバイアル中に入れて提供することができ、使用する直前に滅菌液体担体を添加するだけでよい凍結またはフリーズドライ（凍結乾燥）した状態で保管することができる。経口投与に関しては、組成物は、例えば、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンもしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、結晶セルロースもしくはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクもしくはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンもしくはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容される賦形剤を用い、従来の技法によって調製された錠剤またはカプセル剤の形態をとってよい。一部の場合では、錠剤をコーティングすることができる。経口投与用の液体調製物は、例えば、液剤、シロップ剤もしくは懸濁剤の形態をとってよい、または、使用前に水または他の適切なビヒクルを用いて構成するための乾燥品として提供することができる。そのような液体調製物は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ剤、セルロース誘導体または水素化された食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴム）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性のエステル、エチルアルコールまたは精留植物油）；および防腐剤（例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸）などの薬学的に許容される添加剤を用い、従来の技法によって調製することができる。調製物は、必要に応じて、緩衝塩、香味料、着色剤および甘味剤も含有し得る。経口投与用の調製物は、活性化合物の徐放がもたらされるように適切に製剤化することができる。頬側投与に関しては、組成物は、従来の様式で製剤化された錠剤またはロゼンジの形態をとってよい。一部の場合では、組成物を埋め込みまたは注射用の調製物として製剤化することもできる。したがって、例えば、構造体を、適切なポリマー材料、水性材料、および／もしくは親水性材料、または樹脂と共に、あるいはやや難溶性の誘導体として（例えば、やや難溶性の塩として）製剤化することができる。化合物は、直腸組成物、クリーム剤またはローション剤、または経皮パッチに製剤化することもできる。
【０２２２】
一部の場合では、医薬組成物は、塩を含み得る。塩は、比較的無毒性であってよい。薬学的に許容される塩の例としては、塩酸および硫酸などの鉱酸に由来するもの、ならびに、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などの有機酸に由来するものが挙げられる。塩を形成するための適切な無機塩基の例としては、アンモニア、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム、亜鉛などの水酸化物、炭酸塩、および炭酸水素塩が挙げられる。塩は、無毒性かつそのような塩を形成するのに十分強力であるものを含めた適切な有機塩基と形成することもできる。例示目的で、そのような有機塩基のクラスとして、モノアルキルアミン、ジアルキルアミン、およびトリアルキルアミン、例えば、メチルアミン、ジメチルアミン、およびトリエチルアミン；モノヒドロキシアルキルアミン、ジヒドロキシアルキルアミンまたはトリヒドロキシアルキルアミン、例えば、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、およびトリエタノールアミン；アミノ酸、例えば、アルギニンおよびリシン；グアニジン；Ｎ−メチルグルコサミン；Ｎ−メチルグルカミン；Ｌ−グルタミン；Ｎ−メチルピペラジン；モルホリン；エチレンジアミン；Ｎ−ベンジルフェネチルアミン；（トリヒドロキシメチル）アミノエタンなどを挙げることができる。
【０２２３】
一部の場合では、送達ビヒクル組成物は、約６時間、１２時間、１８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４２時間、または４８時間の対象における循環半減期を有し得る。一部の実施形態では、ナノ粒子は、約４８時間よりも長い循環半減期を含み得る。一部の実施形態では、ポリマーの疎水性単量体の濃度を上昇させ、それによってナノ構造体を脱集合させるために必要な力を増大させることにより、循環半減期を増強することができる。
【０２２４】
一部の場合では、疾患のレベルを送達ビヒクル組成物レジームと順番にまたはそれと併せて決定することができる。標的病変に関する疾患のレベルは完全奏効（ＣＲ）：全ての標的病変の消失、部分奏効（ＰＲ）：ベースラインの合計ＬＤを参照として、標的病変の最長直径（ＬＤ）の合計の少なくとも３０％の減少、進行（ＰＤ）：処置が開始されてからまたは１つもしくは複数の新しい病変が出現してから記録された最小の合計ＬＤを参照として、標的病変のＬＤの合計の少なくとも２０％の増大、安定疾患（ＳＤ）：最小の合計ＬＤを参照として用いて、ＰＲについて適格であるとするのに十分な縮小もなくＰＤについて適格であるとするのに十分な増大もない、として測定され得る。他の場合では、非標的病変を測定することができる。非標的病変の疾患のレベルは、完全奏効（ＣＲ）：全ての非標的病変の消失および腫瘍マーカーレベルの正常化、非完全奏効：１つまたは複数の非標的病変の持続、進行（ＰＤ）：１つまたは複数の新しい病変の出現であり得る。既存の非標的病変の明らかな進行。
【０２２５】
キット
送達ビヒクル組成物を含むキットを本明細書において開示することができる。一部の場合では、キットは、有効量のカーゴを単位剤形で含有する治療用または予防用送達ビヒクル組成物を含み得る。一部の場合では、キットは、カーゴを含む送達ビヒクル組成物を含有し得る滅菌容器を含み、そのような容器は、箱、アンプル、ビン、バイアル、チューブ、袋、パウチ、ブリスター包装、または当技術分野で公知の他の適切な容器形態であり得る。そのような容器は、プラスチック製、ガラス製、ラミネート紙製、金属箔製、または医薬品の保持に適した他の材料製であり得る。一部の場合では、内容物の実質的な部分が保持されるように、送達ビヒクル組成物を脱水、保管、次いで、復元することができる。
【実施例】
【０２２６】
（実施例１）
細胞透過アッセイ
配列番号２８（ＴＶＤＮＰＡＳＴＴＮＫＤＫＬＦＡＶ）、配列番号３６（ＬＩＩＹＲＤＬＩＳＨ）のペプチドおよび配列番号３７（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＱ）のＴａｔを、蛍光イメージングのためにそれらのＮ末端にＰＥＧ２−ＦＩＴＣ修飾を伴って合成した。Ｃａｃｏ−２細胞を２４ウェルプレートにプレーティングし、１０μＭの各ペプチドと一緒に３連でインキュベートし、インキュベートは３７℃で１時間行った。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、Ｋｅｙｅｎｃｅ  ＢＺ−Ｘ７００蛍光顕微鏡を使用してイメージングした。画像を使用して、各ウェルからの蛍光を定量した。データを図１に示す。
【０２２７】
３種のペプチド全てが陰性対照よりも高い透過を有することが見出された。
【０２２８】
（実施例２）
ペプチドスクリーニング：Ｆａｕｃｈｅｒｅ試験およびＨｏｄｇｅｓ試験
【０２２９】
Ｆａｕｃｈｅｒｅ試験：
【０２３０】
候補ペプチドをＦａｕｃｈｅｒｅ試験により、塩の非存在下、ｐＨ７において０．５を下回る残基ごとのハイドロパシースコアの平均についてスクリーニングした（Ｆａｕｃｈｅｒｅ試験）。候補ペプチドをこの分析に使用した。Ｆａｕｃｈｅｒｅスコアを、ペプチドの各アミノ酸残基の表１に記載されている残基ごとのＦａｕｃｈｅｒｅスコアを合計することによって算出した。
【０２３１】
Ｆａｕｃｈｅｒｅスコア＝残基ごとのＦａｕｃｈｅｒｅスコアの合計。配列ＭＡＴＫＧＧＴＶＫＡは、例えば、合計：１．２３０＋０．３１０＋０．２６０＋−０．９９０＋０＋０＋０．２６０＋１．２２０＋−０．９９０＋０．３１０＝１．６１に対応する。
【０２３２】
残基ごとのＦａｕｃｈｅｒｅスコアは、Ｆａｕｃｈｅｒｅスコアをアミノ酸残基の総数で割ったものに対応する。ＭＡＴＫＧＧＴＶＫＡについての残基ごとのＦａｕｃｈｅｒｅスコアは、１．６１／１０＝０．１６１である。
【０２３３】
Ｈｏｄｇｅｓ試験：
【０２３４】
候補ペプチドを、Ｈｏｄｇｅｓ試験により、塩の非存在下、ｐＨ７において１０を下回る残基ごとのハイドロパシースコアの平均についてスクリーニングした。候補ペプチドをこの分析に使用した。Ｈｏｄｇｅｓスコアを、ペプチドの各アミノ酸残基の表２に記載されている残基ごとのＨｏｄｇｅｓスコアを加えることによって算出した。
【０２３５】
Ｈｏｄｇｅｓスコア＝残基ごとのＨｏｄｇｅｓスコアの合計。配列ＭＡＴＫＧＧＴＶＫＡは、例えば、合計：１６．３＋３．９＋３．９＋−１．１＋０＋０＋３．９＋１４．４＋−１．１＋３．９＝４４．１に対応する。
【０２３６】
残基ごとのＨｏｄｇｅｓスコアは、Ｈｏｄｇｅｓスコアをアミノ酸残基の総数で割ったものに対応する。ＭＡＴＫＧＧＴＶＫＡについての残基ごとのＨｏｄｇｅｓスコアは、４４．４／１０＝４．４１である。
【０２３７】
（実施例３）
送達ビヒクル調製：表面修飾を有するリポソームビヒクル
マレイミドで修飾されたＰＥＧ２０００の末端基を有するＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（Ｎ−（メチルポリオキシエチレンオキシカルボニル）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）を使用して、ペプチドをシステインアミノ酸の形態で添加したチオールとコンジュゲートすることができる。あるいは、クリックまたはアミド化学反応などの別の共有結合性コンジュゲーション法を使用することができる。
【０２３８】
粘液透過性送達ビヒクルを生成するために、ＭＶＬ５（Ｎ１−［２−（（１Ｓ）−１−［（３−アミノプロピル）アミノ］−４−［ジ（３−アミノ−プロピル）アミノ］ブチルカルボキシアミド）エチル］−３，４−ジ［オレイルオキシ］−ベンズアミド）／ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ペプチドを、クロロホルム中、５０／４３／９／１％比で組み合わせることができる。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ペプチドなし、および１０％ｍｏｌのＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を用いて別の対照ビヒクル（ＭＰＰ−対照）を作製することができる。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００は、ＰＥＧにより粘液透過性質がもたらされる１０％ｍｏｌ比で「ブラシ」配置にある。ペプチドは表面に露出したＰＥＧに付随している。脂質溶液をメタノール：クロロホルム溶液中に混合した後、混合物を真空中で乾燥させて薄膜にすることができる。適量の滅菌高抵抗率（１８．２ＭΩｃｍ）水を使用して、１ｍＭの脂質の最終濃度を実現することができる。得られた混合物を摂氏３７度で１２時間インキュベートしてリポソームを形成することができる。インキュベーション後、リポソーム溶液を、２００ｎｍのポリカーボネートポアを２０回通過させることで押出し成形することができる。
【０２３９】
動的光散乱を使用し、ナノ粒子サイズを決定することができ、表面を十分にＰＥＧ化できていることを示す理想的な中性付近のゼータ電位をレーザードップラ流速測定によって測定することができる。
【０２４０】
（実施例４）
カーゴローディング
ＤＮＡおよび送達ビヒクルをＯＰＴＩ−ＭＥＭまたは水とエタノール混合物などの適切な溶媒中に希釈し、ＤＮＡを送達ビヒクル液滴に添加し、その溶液を２０分間静置することにより、ＥＧＦＰ  ＤＮＡをカーゴにローディングすることができる。電荷比＋５を担体対ＤＮＡ比に使用することができる。
【０２４１】
（実施例５）
動的光散乱およびゼータ電位
ＤＮＡビヒクルナノ粒子のサイズおよび有効な電荷測定値を、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏｓｉｚｅｒ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して測定することができる。ナノ粒子を、光散乱バイアル中、電荷比１０で調製し、妥当な緩衝液１ｍＬに懸濁させ、室温で２０分インキュベートすることができる。
【０２４２】
（実施例６）
Ｃａｃｏ−２細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクション
ヒト結腸直腸腺癌、Ｃａｃｏ−２細胞（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ−３７）を、１０％ウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Streptomyocin）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充した、ＡＴＣＣにより調合されたＥａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ中で培養することができる。細胞を、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中、３７℃で保持することができ、半集密度を維持するために７２時間毎に再播種することができる。トランスフェクション試験のために、細胞を２４ウェルプレートにトランスフェクショ時に集密度を６０〜８０％にすることが可能なように播種することができる。ＤＮＡ  １μｇおよび適量のリポソーム溶液を、Ｏｐｔｉｍｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてそれぞれ２５０μＬまで希釈し、混合することにより、ＥＧＦＰ−ＤＮＡナノ構造体を形成することができる。ナノ構造体を室温で２０分インキュベートした後、細胞に添加することができる。その後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、次いで、複合体懸濁液（ウェル当たり０．４μｇのＤＮＡ）２００μＬと一緒に６時間インキュベートすることができる。６時間後に、トランスフェクション培地を取り除くことができ、細胞をＰＢＳで１回すすぎ、次いで、補充されたＤＭＥＭ中で１８時間インキュベートすることができる。蛍光顕微鏡を使用してトランスフェクション効率を測定し、画像を解析して蛍光強度およびＧＦＰ陽性細胞の数を評価することができる。ペプチドコンジュゲートナノ粒子のトランスフェクション効率がナノ粒子の蛍光強度よりも高い場合には、ペプチドを、細胞透過性質を有するものとみなす。
【０２４３】
（実施例７）
粘液透過
新鮮なブタの腸を屠殺場で得ることができる。腸から２ｃｍ×２ｃｍの正方形の切片を切り取り、蛍光標識されたＤＮＡ（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからの、Ｃｙ５で標識された６０ｍｅｒのＤＮＡなど）４マイクログラムを保有するナノ粒子を当該切片に滴下することができる。６０分インキュベートした後、腸スライスをＯＣＴに包埋し、凍結（ｃｒｙｏｆｒｏｚｅｎ）させ、切片を作製することができる。蛍光顕微鏡法を使用して、粘液中をナノ粒子が移動する距離を定量し、決定することができる。ペプチドコンジュゲートナノ粒子が対照ビヒクルと同じまたはより大きな粘液中の透過を有する場合には、ペプチドを粘液透過性であるとみなす。
【０２４４】
（実施例８）
大規模スクリーニング細胞透過アッセイ
ペプチドを合成し、蛍光イメージングのためにそれらのＮ末端にＰＥＧ２−ＦＩＴＣ修飾をコンジュゲートした。Ｃａｃｏ−２細胞を２４ウェルプレートにプレーティングし、１０μＭ濃度の各ペプチドと一緒に３連でインキュベートし、インキュベートは３７℃で１時間行った。細胞を、ＰＢＳ洗浄において０．５ｍｇ／ｍＬのヘパリン硫酸を使用して３回洗浄した。ＢｉｏＴｅｋ  Ｃｙｔａｔｉｏｎ  ３イメージャーを使用して細胞をイメージングし、イメージャーのソフトウェアを使用してＦＩＴＣ陽性細胞の数および強度を解析した。結果を図３２に示す。
【０２４５】
（実施例９）
ペプチドムチン相互作用アッセイ
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２ｋ−ＤＢＣＯ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）を水中で水和させ、撹拌して透明な溶液を形成させた。それを、Ｎ末端にリシン含有アジドを有する合成ペプチドとコンジュゲートした。２．５×モルのアジドペプチドを脂質ミックスに添加し、終夜反応させた。１０×モルのアジ化ナトリウムを反応物に添加して、それをクエンチした。
【０２４６】
薄膜水和法を使用して、ＭＶＬ５／ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ（３０／６０／１０％ｍｏｌ）で構成される脂質基剤系を作製した。簡単に述べると、脂質をクロロホルム：メタノール（９：１）中に溶解させ、混合した。次いで、脂質を、ｒｏｔｏｖａｐを使用して乾燥させ、ＨＥＰＥＳ−グルコース緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２３０ｍＭのグルコース、ｐＨ７．４）中、最終濃度を１ｍＭに水和させた。脂質懸濁液を、ＮａｎｏＳｉｚｅｒ  ＭＩＮＩ（Ｔ＆Ｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅ）を使用し、孔径２００ｎｍのフィルターを２０回通過させて押出し成形した。適量のＤＮＡを脂質基剤系に電荷比＋３（ＭＶＬ５が中性ｐＨで電荷比＋３を有すると仮定する）で添加し、溶液を徹底的に混合し、２０分間静置した。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２ｋ−ＤＢＣＯとコンジュゲートしたペプチドを基剤系に添加し、最終脂質濃度を０．０８％ｍｏｌにした。ＤＳＰＥ−ＳＳ−ＰＥＧ２ｋを基剤系に添加し、最終脂質濃度を５％ｍｏｌにした。溶液を６０℃で１時間インキュベートした。
【０２４７】
各試料に対して、０．５ｍｇ／ｍＬの精製されたブタ胃由来ムチン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を試料に試料：ムチン体積比５：２で添加した。動的光散乱を使用して、各試料についてムチンの存在下およびムチンなしでの光散乱の変化を測定した。ムチンの存在下で、ＰＥＧを伴わない脂質基剤系（図２）はシフトを有するが、５％ｍｏｌのＤＳＰＥ−ＳＳ−ＰＥＧを含有する系（図３）はピークのシフトを有さないことによって実証された通り、光強度ピークのシフトがムチンとの相互作用に起因すると決定された。試験した各ペプチドについてのデータが図１〜２９に示されており、図３４は、ムチン単独でのＤＬＳデータを示す。具体的には、図２は、基剤系（３０／６０／１０のＭＶＬ５／ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ）ＤＬＳムチン相互作用試験について示す。基剤系では強度ピークのシフトが示され、これにより、ムチン相互作用が実証された。図３は、５％ＤＳＰＥ−ＳＳ−ＰＥＧを含有する基剤系について示す。この系ではムチンの存在下でピークシフトは示されず、これにより、ムチン相互作用の欠如が実証された。図４は、配列番号３６コンジュゲート系について示す。この系のピークの消失が観察され、これにより、ムチン相互作用が実証された。図５は、配列番号１コンジュゲート系について示す。ムチンの存在下でピークシフトは観察されなかった。したがって、配列番号１は、ムチンと相互作用しないことが見出された。図６は、配列番号２コンジュゲート系について示す。ムチンの存在下でピークシフトが観察された。したがって、配列番号２は、ムチンと相互作用することが見出された。図７は、配列番号３コンジュゲート系について示す。ムチンの存在下でピークシフトが観察された。したがって、配列番号３は、ムチンと相互作用することが見出された。図８は、配列番号４コンジュゲート系について示す。ムチンの存在下でピークシフトは観察されなかった。したがって、配列番号４は、ムチンと相互作用しないことが見出された。図９は、配列番号５コンジュゲート系について示す。ムチンの存在下でピークシフトは観察されなかった。したがって、配列番号５は、ムチンと相互作用しないことが見出された。図１０は、配列番号６コンジュゲート系について示す。ムチンの存在下でピークシフトは観察されなかった。したがって、配列番号６は、ムチンと相互作用しないことが見出された。図１１は、配列番号７コンジュゲート系を示す。ムチンの存在下でピークシフトは観察されなかった。したがって、配列番号７は、ムチンと相互作用しないことが見出された。図１２は、配列番号８コンジュゲート系について示す。ムチンの存在下でピークシフトが観察された。したがって、配列番号８は、ムチンと相互作用することが見出された。図１３は、配列番号９コンジュゲート系について示す。ムチンの存在下でピークのシフトが観察された。したがって、配列番号９は、ムチンと相互作用することが見出された。図１４は、配列番号１０コンジュゲート系について示す。ムチンの存在下でピークシフトが観察された。したがって、配列番号１０は、ムチンと相互作用することが見出された。図１５は、配列番号１２コンジュゲート系について示す。ムチンの存在下でピークシフトが観察さ���た。したがって、配列番号１２は、ムチンと相互作用することが見出された。図１６は、配列番号１３コンジュゲート系を示す。ムチンの存在下でピークシフトが観察された。したがって、配列番号１３は、ムチンと相互作用することが見出された。図１７は、配列番号１４コンジュゲート系について示す。ムチンの存在下でピークシフトは観察されず、これにより、ムチンとの相互作用の欠如が実証された。図１８は、配列番号１５コンジュゲート系が、ムチンの存在下でピークがシフトし、したがって、粘液と相互作用することが見出されたことを示す。図１９は、配列番号１６コンジュゲート系が、ムチンの存在下でピークがシフトし、したがって、ムチンと相互作用することが見出されたことを示す。図２０は、配列番号１７コンジュゲート系が、ムチンの存在下でピークがシフトすることが見出され、したがって、ムチンと相互作用することが見出されたことを示す。図２１は、配列番号１９コンジュゲート系が、ムチンの存在下でピークがシフトすることが見出され、したがって、ムチンと相互作用することが見出されたことを示す。図２２は、配列番号２０コンジュゲート系が、ムチンの存在下でピークがシフトせず、したがって、ムチンと相互作用することが見出されなかったことを示す。図２３は、配列番号２１コンジュゲート系が、ムチンの存在下でピークがシフトせず、したがって、ムチンと相互作用しないことが見出されたことを示す。図２４は、配列番号２２コンジュゲート系が、ムチンの存在下でピークがシフトせず、したがって、ムチンと相互作用しないことが見出されたことを示す。図２５は、配列番号２３コンジュゲート系が、ムチンの存在下でピークがシフトし、従って、ムチンと相互作用することが見出されたことを示す。図２６は、配列番号２４コンジュゲート系が、ムチンの存在下でピークがシフトし、したがって、ムチンと相互作用することが見出されたことを示す。図２７は、配列番号２６コンジュゲート系が、ムチンの存在下でピークがシフトし、したがって、ムチンと相互作用することが見出されたことを示す。図２８は、配列番号３２コンジュゲート系が、ムチンの存在下でピークがシフトし、したがって、ムチンと相互作用することが見出されたことを示す。図２９は、配列番号３４コンジュゲート系が、ムチンの存在下でピークがシフトし、したがって、ムチンと相互作用することが見出されたことを示す。
【０２４８】
このアッセイを使用して粘液透過性であることが見出されたペプチドの要約表を以下に示す：
【表４】
2021523912.tif 000008
【０２４９】
（実施例１０）
ハイドロパシースコア
本開示の種々の例示的な粘液透過性ペプチドを、Ｈｏｄｇｅｓ法を使用してそれらのハイドロパシースコアに従って分析した。さらに、粘液は疎水性環境にあるので、ペプチドがアルファへリックスを形成し、したがって、それらの残基を内部に隠す傾向が高い可能性がある。したがって、残基ごとの平均アルファヘリックスペナルティスコアも、Pace and Scholtz (1998) A helix propensity scale based onexperimental studies of peptides and proteins Biophys J. 1998 Jul;75(1):422-7からの実験的に決定された値を使用して算出した。図３０において、ムチンと相互作用しなかったペプチド（上の表、配列番号１、４〜７、１４、および２０〜２２を参照されたい）がハイドロパシーおよびアルファヘリックスペナルティの両方に上限を有することが見出された（ペナルティが高いほど、アルファへリックスを形成する可能性が低くなる）ことが示されている。粘液と相互作用するペプチドについてはそのような限度は見出されなかった（上の表、配列番号３６、２〜３、８〜１０、１２〜１３、１５〜１７、１９、２３〜２４、２６、３２、および３４を参照されたい）。
【０２５０】
（実施例１１）
ｅｘ−ｖｉｖｏ試験
核酸の包被：脂質をエタノールまたは任意の有機溶媒中に溶解させ、脂質の相転移温度を上回るまで加熱した。脂質の相転移温度を上回るまで加熱した水性緩衝液中に核酸を溶解させた。水性緩衝剤のｐＨを胆汁酸塩およびカチオン性脂質のｐＫａ未満に設定した。このように、脂質は、核酸と共に製剤化される場合は強力にカチオン性である。マイクロ流体チャネルを使用して脂質と核酸を混合した。あるいは、他の形態の混合を使用することができる。ｐＨを中性まで上昇させ、試料を濃縮し、産業界で公知の透析または他の方法を使用してエタノールを除去した。
【０２５１】
プロトコール：
【０２５２】
材料：ＤＯＤＭＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＤＯＰＥ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）、ＤＭＧ−ＰＥＧ  ２０００（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）、ＤｉＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
【０２５３】
製剤
【０２５４】
ＣＭＶプロモーターの下でＧａｕｓｓｉａ  ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅをコードするプラスミドＤＮＡ  ３００μｇを最終体積３ｍＬの水に溶解させた。ＤＯＤＭＡ、ＤＯＰＥ、ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００をそれらのモルおよびカチオン性脂質：核酸比に従ってエタノール中で混合した。カチオン性脂質：ヌクレオチドモル比を１２で一定に保った。脂質をＤｉＩで蛍光標識する場合、総脂質モルの０．５％ｍｏｌにした。エタノール体積を１ｍＬまで増加させた。試料をＮａｎｏａｓｓｅｍｂｌｒ  Ｂｅｎｃｈｔｏｐ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ，ＢＣ）上でシリンジ中に封入した。試料を、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ  Ｂｅｎｃｈｔｏｐマイクロ流体チップシステムを毎分６ｍＬの流速で使用して混合した。終夜の透析を使用してエタノールを除去した。
以下の製剤を作製した：
【表５】
2021523912.tif 000009
【０２５５】
粘液透過
【０２５６】
新鮮なブタの腸から取得した精製された粘液をＰＢＳと混合し、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）Ｐｅｒｍｅａｂｌｅ  Ｓｕｐｐｏｒｔ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ、ＮＹ）の微多孔膜上に塗布した。ＰＢＳを下部のアクセプター区画にも添加した。十分な量のＤｉＩ標識された脂質ナノ粒子を粘液に塗布し、インキュベートした。３０分ごとに試料をアクセプター区画から取得し、それらの相対的な蛍光強度を、５１０ｎｍにおいて励起させ、５６５ｎｍにおける放出を測定することによって取得した。同じ実験からなるが粘液を用いない非粘液対照実験を行った。試料収集で失われた蛍光強度を相殺し、非粘液試料の蛍光強度を用いて粘液試料の蛍光強度を正規化した後、脂質ナノ粒子のパーセント粘液透過を算出した。示されているデータは、９０分インキュベートした後の粘液透過を表す（図３１参照）。配列番号１とカップリングした脂質ナノ粒子では、配列番号１を伴わない脂質ナノ粒子と同様かまたはそれよりもわずかに高い粘液透過が示され、これにより、ムチン相互作用アッセイでなされた観察が確認される。
【０２５７】
（実施例１２）
ｉｎ−ｖｉｖｏ分布アッセイ
３種の別々の脂質ナノ粒子製剤を調製した。１つの脂質ナノ粒子製剤は配列番号２９とカップリングしたものであり、別の脂質ナノ粒子製剤は転写ペプチドのトランス活性化因子（ＴＡＴ；配列番号３７）とカップリングしたものであり、最後の脂質ナノ粒子製剤は、いかなるカップリングも伴わないものであり、全てがプラスミドＤＮＡを保有し、０．５％ｍｏｌのＤｉＩおよびＤｉＯ標識を含んだ。ＤｉＩ／ＤｉＯ脂質ナノ粒子に包被されたＤＮＡ  ３０μｇを１〜３％イソフルランの下で麻酔したＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＭＡ）の直腸内に投与した。４時間後に、マウスを２５％ＣＯ２の下で安楽死させ、結腸を取り出し、最適切断温度（ＯＣＴ）媒体中に包埋する。ＯＣＴ媒体切片を摂氏−８０度で急速冷凍し、腸切片を取得してクリオスタットに入れる。５３１ｎｍでの励起、５９３ｎｍでの放出の下で陰窩の落射蛍光画像を取得し、明視野照明を用いてオーバーレイする。図３２Ａ〜３２Ｂ。図３２Ａは、ペプチドがカップリングしていない脂質ナノ粒子製剤の画像を示す（上のパネルは明視野画像であり、中央のパネルは色素チャネル画像であり、下のパネルは色素チャネルと明視野を併せた画像である）。図３２Ｂは、ＴＡＴペプチド（配列番号３７）を伴う脂質ナノ粒子製剤の画像を示す（上のパネルは明視野画像であり、中央のパネルは色素チャネル画像であり、下のパネルは色素チャネルと明視野を併せた画像である）。図３３Ｃは、配列番号２９を伴う脂質ナノ粒子製剤の画像を示す（上のパネルは明視野画像であり、中央のパネルは色素チャネル画像であり、下のパネルは色素チャネルと明視野を併せた画像である）。
【０２５８】
画像で実証される通り、ＴＡＴでは、ベースの脂質ナノ粒子と比較して腸上皮細胞の表面における粒子の分布が減少し、これは、粘液に接着したことに起因する可能性が高い。配列番号２９はより強力なシグナルを有し、腸上皮の表面における分布がより大きく広がった。図３３Ａ〜Ｃ。
【０２５９】
一部の実施形態が本明細書において示され、記載されているが、そのような実施形態は、単に例として提供されている。当業者であれば、本発明から逸脱することなく多数の変形、変化および置換をここで想起するはずである。本明細書に記載の発明の実施形態に対する種々の代替を本発明の実施に使用することができることが理解されるべきである。
【図１】
2021523912.tif 000010
【図２】
2021523912.tif 000011
【図３】
2021523912.tif 000012
【図４】
2021523912.tif 000013
【図５】
2021523912.tif 000014
【図６】
2021523912.tif 000015
【図７】
2021523912.tif 000016
【図８】
2021523912.tif 000017
【図９】
2021523912.tif 000018
【図１０】
2021523912.tif 000019
【図１１】
2021523912.tif 000020
【図１２】
2021523912.tif 000021
【図１３】
2021523912.tif 000022
【図１４】
2021523912.tif 000023
【図１５】
2021523912.tif 000024
【図１６】
2021523912.tif 000025
【図１７】
2021523912.tif 000026
【図１８】
2021523912.tif 000027
【図１９】
2021523912.tif 000028
【図２０】
2021523912.tif 000029
【図２１】
2021523912.tif 000030
【図２２】
2021523912.tif 000031
【図２３】
2021523912.tif 000032
【図２４】
2021523912.tif 000033
【図２５】
2021523912.tif 000034
【図２６】
2021523912.tif 000035
【図２７】
2021523912.tif 000036
【図２８】
2021523912.tif 000037
【図２９】
2021523912.tif 000038
【図３０】
2021523912.tif 000039
【図３１】
2021523912.tif 000040
【図３２Ａ】
2021523912.tif 000041
【図３２Ｂ】
2021523912.tif 000042
【図３２Ｃ】
2021523912.tif 000043
【図３３】
2021523912.tif 000044
【図３４】
2021523912.tif 000045
【国際調査報告】
2021523912.tif 000046
2021523912.tif 000047