(57)【要約】  試料中の分析物についてアッセイする方法、及びアッセイを実行するためのキット。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の分析物についてアッセイする方法であって、
反応混合物を形成すること、及び
トリガー溶液を前記反応混合物に混和することを含み、
前記アッセイされる分析物が前記試料中に存在してもよく、
前記反応混合物は、
第１の特異的結合パートナーに不可逆的に結合した化学発光標識を含む化学発光標識特異的結合パートナーであって、前記分析物に結合して、分析物と結合した化学発光標識特異的結合複合体を形成することができる、前記化学発光標識特異的結合パートナーと、
第２の特異的結合パートナーに不可逆的に結合した活性化剤標識を含む活性化剤標識特異的結合パートナーと、
選択的シグナル阻害剤とを含む水溶液であり、前記方法が、
分析物シグナルを測定すること、及び
前記分析物シグナルを測定した後、グローシグナルを測定することを更に含む、方法。
【請求項２】
前記トリガー溶液が増強剤を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記増強剤が、フェノール化合物、芳香族アミン、ベンゾオキサゾール、ヒドロキシベンゾチアゾール、アリールボロン酸、及びこれらのいずれかの混合物から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記トリガー溶液が、酸化剤又は還元剤を更に含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記トリガー溶液が過酸化物を更に含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記選択的シグナル阻害剤が、アスコルビン酸、イソアスコルビン酸、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸、アスコルビン酸６−パルミテート、５，６−イソプロピリジエン−アスコルビン酸、ブチル化ヒドロキシトルエン、グルタチオン、尿酸、１種以上のトコフェロール、及びカテキンからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記活性化剤標識がペルオキシダーゼ酵素である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記化学発光標識特異的結合パートナーが、特異的結合パートナーに直接又は間接的に接続された化学発光標識を含み、前記化学発光標識が、式
【化１】
2021525375.tif 000016
［式中、
波線は、前記特異的結合パートナーへの、又は前記化合物を前記特異的結合パートナーに接続しているリンカーへの付着部位を示し、
Ｒ１及びＲ２は、置換アルキル、非置換アルキル、置換アルキエニル、非置換アルケニル、置換アルキニル、非置換アルキニル、置換アラルキル、及び非置換アラルキルから独立して選択され、Ｒ１又はＲ２が置換されている場合、Ｒ１又はＲ２は１〜３個の置換基によって置換されており、各置換基は、カルボニル、カルボキシル、トリアルキルシリル、−ＳＯ３、グリコシル、−ＰＯ３、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、アミノ、Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ２、第四級アンモニウム、及び第四級ホスホニウムから独立して選択され、
Ｒ３は、置換アルキル、非置換アルキル、置換アルキエニル、非置換アルケニル、置換アルキニル、非置換アルキニル、置換アラルキル、及び非置換アラルキルから選択され、Ｒ１又はＲ２が置換されている場合、Ｒ１又はＲ２は１〜３個の置換基によって置換されており、各置換基は、カルボニル、カルボキシル、トリアルキルシリル、−ＳＯ３、グリコシル、−ＰＯ３、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、アミノ、Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ２、第四級アンモニウム、及び第四級ホスホニウムから独立して選択される］
を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記化学発光標識特異的結合パートナー及び前記活性化剤標識特異的結合パートナーが、それぞれ前記試料中の前記分析物に結合する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記化学発光標識特異的結合パートナーが、前記分析物の類似体に接続された化学発光標識化合物を含み、更に、前記分析物と前記化学発光標識特異的結合パートナーとが競合して、前記活性化剤標識特異的結合パートナーに結合する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
結合していない化学発光基質が、ルミノール、イソルミノール、ロフィン、アクリジニウムエステル、例えば、ルシゲニン及びアクリダン、フタルヒドラジド、例えば、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン、ルシフェリン、並びに１，２ジオキシエタン含有化合物、例えば、ジオン、３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン（ＡＭＰＰＤ）、及び３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−β−Ｄ’−ガラクトピラノイルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン（ＡＭＰＧＤ）、３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン｝−４−イル）フェニルリン酸二ナトリウム、及び１，２−ジオキセタンジオン、アダマンチリデン−アダマンチル−１，２−ジオキセタンからなる群から選択され、具体的にはルミノール又はイソルミノールであり、より具体的にはルミノールであり、前記方法が、分析物シグナル及びバックグラウンドシグナルを検出することを更に含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
未知量の分析物を含有する試験試料から、前記分析物シグナル及び前記グローシグナルを測定することを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
標準試料の、前記分析物シグナルと前記分析物シグナル及びグローシグナルの合計との商を、標準試料中の分析物の既知濃度と比較する較正曲線を準備することを更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記試験試料からの、前記分析物シグナルと前記分析物シグナル及びグローシグナルとの合計との商を、較正曲線と比較することによって、前記試験試料中の分析物の量を定量することを更に含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記分析物シグナルが、発光強度又は発光強度の曲線下面積であり、更に、前記グローシグナルが、発光強度又は発光強度の曲線下面積である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
溶液相発光アッセイは、例えば国際公開第２０１００９９４８６号において公知である。公知のアッセイは、特異的認識、及び特異的結合パートナーと互いに結合することに基づき、物質の存在又は量を検出する。例えば、イムノアッセイにおいて、抗体は、特異的結合パートナーに結合する。別の例として、核酸結合アッセイにおいては、アプタマーなどの核酸ストランドが、特異的結合パートナーに結合する。いくつかのアッセイは、化学発光を使用してシグナルを生成し、そのシグナルを分析物の量に関連付ける。
【発明の概要】
【０００２】
試料中の分析物をアッセイする方法は、反応混合物を形成すること、及びトリガー溶液と反応混合物とを混和させることを含むことができる。アッセイされる分析物が試料中に存在する場合があり、アッセイの検出の限界を条件として、アッセイによって、分析物の存在又は不存在を判定することができる。
【０００３】
アッセイに使用する反応混合物は、典型的には、化学発光標識特異的結合パートナーを含む水溶液であり、化学発光標識特異的結合パートナーは、第１の特異的結合パートナーに不可逆的に結合した化学発光標識を含み、化学発光標識特異的結合パートナーは、分析物に結合して、分析物と結合した化学発光標識特異的結合複合体を形成することができる。反応混合物は、典型的には、活性化剤標識特異的結合パートナーも含み、活性化剤標識特異的結合パートナーは、第２の特異的結合パートナーに不可逆的に結合した活性化剤標識を含む。反応混合物は、典型的には、選択的シグナル阻害剤を更に含む。
【０００４】
この方法は、分析物シグナルを測定すること、及び分析物シグナルを測定した後、グローシグナルを測定することを更に含む。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
本開示を通じて、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」などの単数形は、しばしば便宜上使用されるが、単数のみであることが明示的に指定されている場合又は文脈によって明確に示されている場合を除いて、単数形は複数を含むよう意図される。単数のみに言及する場合、典型的には「１つ、かつ１つのみ」という用語が使用される。
【０００６】
「通常の」、「通常」、「典型的な」、「典型的には」、「通例の」、及び「通例」などの用語は、本明細書に記載する発明を作製又は実施する通常の、典型的な、又は通例の方法である特徴を指すために使用される。これらの用語は、そのような特徴が先行技術に存在すること、ましてや、先行技術において通常の、典型的な、又は通例のものであることを意味するものと解釈されるべきではない。
【０００７】
本開示におけるいくつかの用語が、以下に定義される。他の用語は、当業者によく知られており、それらの用語には当業者がそれらに割り当ててきた意味を与えるものとする。
【０００８】
分析物：アッセイにおいて検出又は定量される物質。分析物の検出を推進するために、分析物への特異的結合親和性を有する１種以上の物質、具体的には１種以上の特異的結合パートナーが、アッセイにおいて典型的に使用される。分析物は、特異的結合パートナーが結合することができる、タンパク質、ペプチド、ヌクレオチド、ヌクレオシド、抗体、ハプテン、又は小分子（すなわち、非ポリマー性分子）などであってもよい。例示的な分析物としては、ステロイド、ホルモン、タンパク質、糖タンパク質、ムコタンパク質、核タンパク質、リンタンパク質、オピオッド（opiods）、ビタミン、抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、プリン、抗新生物剤、アンフェタミン、アゼピン、プロステグランジン（prosteglandins）などの薬物、並びに薬物の代謝物だけでなく、ヌクレオシド、有機ヌクレオシド、ヌクレオチド、有機ヌクレオチド、リボシド、ＤＮＡ、ＤＮＡセグメント、ＲＮＡ、ＲＮＡセグメント、ＰＤＮＡ、ＰＤＮＡセグメント、アプタマー、ヘモトキシン、フォトトキシン、神経毒素、シアノトキシン、ジノトキシン（dinotoxins）、ネクロトキシン、ミオトキシン、マイコトキシン、例えばＴ−２マイコトキシン、アフラトキシン、ボツリヌス毒素、リシン、アピトキシン、及び他の環境毒素又は生物毒素などの毒素が挙げられる。分析物は、細胞、ウイルス、細菌、又は真菌であってもよい。
【０００９】
活性化剤：トリガーの存在下で、化学発光化合物が発光するように、化学発光化合物の活性化を行う化合物。
【００１０】
活性化剤標識特異的結合パートナー：分析物についての特異的結合部材と、特異的結合パートナーに直接又は間接的に（例えば、リンカーを介して）結合した活性化剤とを含む反応物質。
【００１１】
化学発光化合物：例えば、電子が励起された状態で形成される別の化合物に変換されることによって、又は電子が励起された状態に変換され、次いで、基底状態に緩和されることによって、光の放出を生じる反応を起こす化合物。励起状態は、一重項励起状態であっても、三重項励起状態であってもよい。励起状態は、基底状態への緩和の際に直接光を放出する場合もあり、又は、フェルスター機構若しくはデクスター機構などによって、まずエネルギーがエネルギー受容体に移動し、次にこれが光を放出する場合もある。
【００１２】
化学発光標識特異的結合パートナー：分析物についての特異的結合部材と、特異的結合パートナーに直接又は間接的に（例えば、リンカーを介して）結合した化学発光化合物とを含む反応物質。
【００１３】
分析物シグナル：試料中に存在する分析物の量に関係する、アッセイからの化学発光出力などのシグナル。分析物シグナルが化学発光出力である場合、それは、指定の波長における発光強度として、又はある時間にわたる発光の積分として測定することができる。
【００１４】
グローシグナル：選択的シグナル低減剤のすべてが消費され、選択的シグナル低減剤が、アッセイにおけるシグナルをもはや低減しなくなった後に出現する、化学発光出力などのシグナル。
【００１５】
バックグラウンドシグナル：試料中に存在する分析物の量に関係しない、化学発光出力などのシグナル。
【００１６】
不可逆結合：本明細書に記載するアッセイを実行している間に破壊されない、２つの部分を、典型的には、特異的結合パートナーと化学発光標識とを、又は特異的結合パートナーと活性化剤標識とを関連付ける結合。不可逆結合は、本明細書に記載するアッセイ中に結合が曝露されない、化学化合物の使用、又は温度などの物理的条件下のような、いくつかの他の手段によって破壊され得る。不可逆結合であり得る典型的な結合としては、共有結合、及びイオン結合などが挙げられる。不可逆結合によって接続される２つの部分は、「不可逆的に結合している」と言われる。不可逆結合は、特異的結合パートナー同士の、又は分析物の特異的結合パートナーへの可逆結合などの、可逆結合の相互作用とは区別される。
【００１７】
先行技術の化学発光に基づくアッセイ、結合アッセイ、例えば、米国特許公開第２０１００２６７０７１号に記載されているイムノアッセイ、及び他のアッセイ、例えば、アプタマー結合に基づくアッセイ等は、未知濃度の分析物を有する試験試料の化学発光シグナルを、既知濃度の分析物を有する複数の試料を使用することによって作成した標準曲線と比較する。
【００１８】
特異的化学発光アッセイにおいては、例えば米国特許公開第２０１００２６７０７１号に記載されているように、未知濃度の分析物を含有する試験試料を、化学発光標識特異的結合パートナーと、活性化剤標識特異的結合パートナーと、選択的シグナル阻害剤とを含有するアッセイ溶液と混和させて、反応混合物を形成する。次いで、トリガー溶液を反応混合物と混和させる。トリガー溶液は、酸化剤又は還元剤、典型的には過酸化物と、多くの場合、増強剤とを含有する。
【００１９】
アッセイは、２つの方式のうちの１つで進む。「競合アッセイ」方式では、活性化剤標識特異的結合パートナーは、複合体において化学発光標識特異的結合パートナーに結合するが、複合体は、予め形成されてもよく、ｉｎ  ｓｉｔｕで形成されてもよい。分析物が存在する場合、分析物と化学発光標識特異的結合パートナーとは競合して化学発光標識特異的結合パートナーに結合する。トリガー溶液の存在下では、活性化剤標識特異的結合パートナーに結合している化学発光標識特異的結合パートナー上の化学発光標識は、活性化剤標識特異的結合パートナーに対して、機能可能な近接度にあり、そのため、これによって活性化されて、発光を生じる。分析物に結合している化学発光標識特異的結合パートナーは、活性化剤標識特異的結合パートナーに対して、機能可能な近接度にはなく、そのため、化学発光標識は活性化されず、発光しない。この方式では、分析物シグナルは発光強度であり、分析物濃度に逆相関する。
【００２０】
別の方法は、「サンドイッチアッセイ」方式であり、活性化剤標識特異的結合パートナーと化学発光標識特異的結合パートナーとの両方が、典型的には分析物の異なる一部において、分析物と結合して、化学発光標識が、活性化剤標識結合パートナーと機能可能な近接度に至る。得られる「サンドイッチ」複合体における、化学発光標識特異的結合パートナーの化学発光標識は、活性化剤標識特異的結合パートナーに対して、機能可能な近接度にあり、そのため、発光する。分析物の非存在下では、活性化剤標識結合パートナーは、活性化剤標識特異的結合パートナーに対して、機能可能な近接度にはなく、そのため、発光しない。この方式では、分析物シグナルは発光強度であり、分析物濃度に直接的に関係する。
【００２１】
いずれの場合においても、試験試料中の分析物シグナルの強度を、ルミノメータにおいて測定し、既知濃度の分析物を有する標準試料によって、同じアッセイを実行することによって構築された、発光強度対濃度の標準曲線と比較する。分析物シグナルを標準曲線に相関させると、分析物の濃度が提供される。
【００２２】
これは、分析される試料が分析物と水のみを含有する場合に許容可能であり得るが、ほとんどの化学発光の商業用途では、分析物以外の他の物質も含有するであろう。例えば、食品物質からの試験試料を、毒素の存在についてアッセイする場合、多くの化学化合物が（そのような残りの化合物は食品物質からのものであるが）、一般に、毒素に加えて存在するであろう。これらの他の化合物は、典型的には、化学発光種を生成する酸化反応又は還元反応に干渉することによって、分析物シグナルの生成に干渉し得る。この場合、これらの他の干渉化合物を含有しない溶液から標準曲線が作成されるため、分析物シグナルと標準曲線との相関は、試験試料中の分析物の正確な濃度を提供しないことになる。このことは、分析物シグナルを標準曲線と比較することが、試験試料中の分析物の濃度を正確に提供しないという相関誤差をもたらす。例えば、使用することができる１つの選択的シグナル阻害剤はアスコルビン酸であるが、アスコルビン酸は、天然に、又は添加された抗酸化剤としてのいずれかで、多くの食品物質にも見出される。有意な量のアスコルビン酸が試験試料中に存在する場合、試験試料からの分析物シグナルの生成を更に阻害する場合があり、分析物シグナルと標準曲線とを相関させることによって得る濃度が、低過ぎるものとなり得る。これは、実際には、食品が安全でないレベルの汚染物質を有する場合に、アッセイが、食品は安全なレベルの汚染物質を有するという正しくない示唆をし得るため、特に有害な食品汚染物質についてアッセイしている場合に、重大な問題となり得る。
【００２３】
より一般的には、アッセイしている試料中の他の化合物の干渉から生じ得る分析物濃度の誤差は、重大となることがあり、いくつかの場合、４０％もの大きさ、又は更に大きいこともある。食品試料を毒素について分析する例では、いくつかの毒素は、５ｐｐｂという低さ、又は更に低いレベルで、動物が消費するには安全ではない。したがって、これらの誤差は、一方では、実際には消費するのに安全な食品試料を廃棄すること、又は他方で、実際には消費した動物に病気若しくは死をもたらし得る、安全でないレベルで毒素が存在する場合に、毒素が安全なレベルで存在するという誤った確信を提供することとの間の相違を意味し得る。
【００２４】
この問題に対する先行技術の解決策は、許容可能なものではない。数千、数万、又は更に多くの、識別情報が未知である各種化合物が試験試料中に存在し得る場合、結合による干渉を防止するために、試験試料から分析物以外の化合物を除去して商業的状況を達成することは、不可能ではないとしても、極めて困難かつ非実用的である。別の許容可能でない先行技術の解決策は、分析物以外の化合物の干渉を無視できるほどに、試験試料を著しく希釈することである。この解決策は、分析物濃度も希釈され、そのため、分析物の最低検出レベル（「ＬＬＤ」）及び最低定量レベル（ＬＬＱ）が低減するため、許容可能ではない。上に示したように、多くの関係する分析物の濃度は、ｐｐｂレベルで決定する必要があるため、ＬＬＱ及びＬＬＤが低減することにより、試験試料の大幅な希釈を伴う解決策は許容可能ではない。
【００２５】
許容可能な解決策は、前述の欠点を回避するだけでなく、すなわち、商業的状況における使用が実用的であり、かつ試験試料の著しい希釈を必要としないだけでなく、多様な結合剤を用いて実行可能であるべきであり、これは、この技術が、結合パートナー（例えば、抗体、アプタマー等）の性質に依存せず、多様な異なる種類の結合アッセイに適用できることを意味する。
【００２６】
本開示は、このような技術的解決策を提供する。簡潔に述べると、以降により詳細に記載する技術的解決策は、分析物からのシグナルがもはや視認できなくなった後、かつ選択的シグナル阻害剤が完全に酸化又は還元されて、選択的シグナル阻害剤が、結合していない化学発光標識された選択的結合剤のシグナルをもはや阻害しなくなった後に、化学発光標識特異的結合パートナーのシグナルを観測することを伴い、この開示においては、このシグナルを「グローシグナル」と称する。較正曲線は、既知濃度の分析物における分析物シグナル及びグローシグナルを決定すること、並びに式：分析物シグナル／（グローシグナル＋分析物シグナル）に対照して、既知濃度の分析物をプロットすることによって構築される。試料を測定する場合、分析物シグナル及びグローシグナルを測定し、試料について、分析物シグナル／（グローシグナル＋分析物シグナル）の値を計算し、次いで、試料中の分析物濃度を得るため、計算された値を較正曲線と比較する。
【００２７】
特異的結合パートナー
２種の標識特異的結合パートナーを用いる。一方は活性化剤標識され、他方は化学発光標識されている。特異的結合パートナーのそれぞれは、別の物質について特異的親和性を有する分子であり、通例は生物学的分子である。例としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、アプタマー、抗原、抗体、抗体−ＤＮＡキメラ、ハプテン、タンパク質、ペプチド、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン、及びビオチンが挙げられる。
【００２８】
それぞれの特異的結合パートナーは、一般に、２種の特異的結合パートナーが、分析物上の同じ又は重複する結合部分について競合しないという点で、他方のパートナーと同一ではない。活性化剤標識特異的結合パートナーと化学発光標識特異的結合パートナーとの両方の特異的結合パートナー部が抗体である、典型的な場合では、抗体のそれぞれは、相異なる、分析物に関して競合しないエピトープを有する。
【００２９】
組み合わせて使用され得る、すなわち、一方が化学発光標識を有することができ、他方が活性化剤標識を有することができる、特異的結合パートナー同士の例としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びアプタマーなどの相補的なオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、アビジン−ビオチン、ストレプトアビジン−ビオチン、ホルモン−受容体、レクチン−炭水化物、ＩＧタンパク質Ａ−結合タンパク質受容体、核酸−核酸結合タンパク質、アプタマー−アプタマー、並びに核酸−抗核酸抗体が挙げられる。米国特許公開第２０１００２６７０７１号において論じられている特異的結合パートナーが、好適である。
【００３０】
これらのうちの任意のものを、競合アッセイ方式又はサンドイッチアッセイ方式に適合させることができる。特異的結合パートナーの識別情報によって、アッセイの方式が、具体的には、アッセイがサンドイッチアッセイであるか、又は競合アッセイであるかが決定される。いずれの場合においても、化学発光標識特異的結合パートナーに使用される特異的結合パートナーは、分析物に特異的に結合するように選択される。最も通常には抗体が使用されるが、上に論じた特異的結合パートナーのうちのいずれを用いることもできる。競合アッセイ方式に適合させるためには、活性化剤標識特異的結合パートナーは、活性化剤−分析物類似体コンジュゲートとして設計される。この場合、活性化剤は、直接、又は本明細書において論じる補助物質を含むリンカーを経由して、分析物の類似体にコンジュゲートし、類似体は、分析物そのものであっても、分析物に対して十分な構造的類似性を有する化合物であってもよく、類似体は分析物と本質的に同じ方法で、化学発光標識特異的結合パートナーにも結合する。
【００３１】
サンドイッチアッセイ方式に適合させるためには、化学発光標識特異的結合パートナーと活性化剤標識特異的結合パートナーとの両方が、分析物に特異的に結合する。この場合、活性化剤標識特異的結合パートナーに使用される特異的結合パートナーは、典型的には抗体であるが、アプタマー又は上に論じた特異的結合パートナーのいずれかであってもよい。この場合、化学発光標識特異的結合パートナーと活性化剤標識特異的結合パートナーとの両方が、分析物に、典型的には分析物上の異なる結合部分に結合する。
【００３２】
競合アッセイとサンドイッチアッセイとの両方が当技術分野において公知であり、これらの適合を実現する方法は公知である。アッセイの方式及び特異的結合パートナーに関する実施例及び追加の詳細は、米国特許公開第２０１００２６７０７１号に見出すことができる。
【００３３】
化学発光標識特異的結合パートナー
化学発光標識特異的結合パートナーは、典型的には、１０−４Ｍ未満、具体的には１０−６Ｍ未満、最も具体的には１０−１１Ｍ〜１０−７Ｍの濃度で、反応混合物中に存在する。
【００３４】
化学発光標識特異的結合パートナーは、通例では不可逆結合によって、化学発光標識で標識された特異的結合パートナーを含む。典型的には、特異的結合パートナーの各分子は、各分子に不可逆的に結合した少なくとも１つの化学発光標識を有する。いくつかの場合では、各特異的結合パートナーに結合した１０２個もの、又は更に多くの化学発光標識が存在し得る。各特異的結合パートナー分子が、同じ数の化学発光標識を有する必要はない。
【００３５】
１つ以上の化学発光標識は、典型的には不可逆結合によって、特異的結合パートナーに結合することができる、任意の好適な化学発光部分であり得る。結合、典型的には不可逆結合は、直接的な接続であってもよく、間接的な接続であってもよい。直接的な接続では、１つ以上の化学発光標識と特異的結合パートナーとの間に、リンカー又は補助物質を使用することなく、１つ以上の化学発光標識が、特異的結合パートナーに直接接続される。直接的な接続は、典型的には、イオン結合、共有結合、疎水性相互作用、又は水素結合などの不可逆結合によるものであり、最も多くの場合、共有結合である。
【００３６】
間接的な接続が用いられる場合、当技術分野において補助物質と呼ばれることもあるリンカーが使用され、１つ以上の化学発光標識と特異的結合パートナーとを接続する。任意の好適なリンカーを使用することができ、好適なリンカーは、１つ以上の化学発光標識が発光することを妨げず、典型的には、化学発光標識特異的結合パートナーを、水性媒体に不溶性にしない。例示的なリンカーとしては、ストレプトアビジン、アビジン、ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎのようなタンパク質、ビオチン、カチオン化ＢＳＡ、ｆｏｓ、ｊｕｎ、キーホールヘモシアニン、免疫グロブリン（断片又はその一部を含む）、リポソーム、ミセル、ＡＭＡＭのような合成デンドリマー、ポリアクリル酸のような合成ポリマー、多糖類のような天然ポリマー、例えば、官能化デキストラン、ポリヌクレオチド、アプタマー、及びオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。多糖類、具体的にはアミノ−デキストラン又はカルボキシル−デキストラン、及び自己集合タンパク質が最も通常に用いられる。
【００３７】
化学発光標識は、一般式ＣＬ−Ｌ−ＲＧの化合物［式中、ＣＬは化学発光部分を表し、Ｌはリンカー又は共有結合を表し、ＲＧは反応性基を表す］を、特異的結合パートナーと反応させることによって形成される。反応が完了すると、化学発光部分は、化学発光標識特異的結合パートナー上の化学発光標識となる。化学発光標識は、トリガー溶液中の酸化剤若しくは還元剤と、又は活性化剤標識特異的結合パートナーの活性化剤標識と反応して、典型的には化学発光標識の励起状態である、活性化した化学発光化合物を形成する。励起状態は、一重項励起状態、又は三重項励起状態のいずれであってもよい。励起状態は、発光によって緩和するか、又は放出性エネルギー受容体へのエネルギー移動を受け、次にこれが発光するかのいずれであってもよい。詳細な実施形態では、発光は、トリガー溶液を加えた後、非常に急速に起こり、より具体的には、トリガー溶液を加えて２秒以内にピーク強度に達する。しかしながらこのことは必須ではなく、その理由は、十分な時間にわたって分析物シグナルが測定される限り、より遅い反応も正確な結果を与えることができるためである。
【００３８】
抗体又は抗体断片などの特異的結合パートナーへの結合に好適な多種多様な化学発光化合物が、当技術分野において公知である。これらのいずれかを、本明細書に記載するアッセイに用いることができる。
【００３９】
例示的な化学発光部分及び化学発光標識としては、芳香環式ジアシルヒドラジン、例えば、ルミノール、イソルミノール、アミノブチルエチルイソルミノール、アミノヘキシルエチルイソルミノール、７−ジメチルアミノナフタレン−１，２−ジカルボン（dicarboxcylic）酸ヒドラジン、環置換アミノフタルヒドラジド、アントラセン−２，３−ジカルボン酸ヒドラジド、フェナントレセン（phenanthrecene）−１，２−ジカルボン酸ヒドラジド、ピレンジカルボン酸ヒドラジド、５−ヒドロキシフタルヒドラジド、６−ヒドロキシフタルヒドラジド、キサンテン染料、例えば、フルオレセイン、エオシン、ローダミン染料、ロドール（rhodol）染料、化学発光芳香族アミン又は複素環式アミン、ＭＣＬＡ、インドール酢酸、イソブチルアルデヒド、トリヒドロキシ芳香族化合物、例えば、ピロガロール、フロログルシノール、及びプルプロガリン、並びに米国特許第５４２０２７５号及び同第５３２４８３５号に開示されているフタラジンジオン化合物、アクリダンケテンジチオアセタール化合物、並びにこれらの組み合わせが挙げられる。これらの標識のいずれも、放出性エネルギー受容体とともに、又は伴わずのいずれかで使用され得るが、イソブチルアルデヒドは、最も多くの場合、発光エネルギー受容体とともに使用される。
【００４０】
いくつかの化学発光標識は、式Ｉの標識であり得る。
【化１】
2021525375.tif 000002
【００４１】
式Ｉの標識において、Ｒ１及びＲ２のそれぞれは、独立して、Ｈ、又はＣ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ、及びハロゲンから選択される１〜５０個の原子を含有する有機部分であり、非水素原子の原子価を満たすのに十分な水素原子が加わる。最も通常には、Ｒ１及びＲ２のそれぞれは、独立して、特異的結合パートナーへのリンカー、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アラルキル、又は置換アラルキルである。Ｒ１及びＲ２が置換される場合、最も通常には、カルボニル、カルボキシル、トリ（アルキル）シリル、グリコシル、−ＳＯ３−、−ＯＳＯ３−、−ＰＯ３−、−ＯＰＯ３−、ハロゲン、ヒドロキシ、チオール、アミノ、第四級アンモニウム、及び第四級ホスホニウムから選択される、１〜３個の基によって置換される。
【００４２】
式Ｉの標識において、Ｒ３は、Ｈ、又はＣ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ、及びハロゲンから選択される、１〜５０個の原子を、最も通常には１〜２０個の原子を含有する有機部分であり、非水素原子の原子価を満たすのに十分な水素原子が加わる。最も通常には、Ｒ３は、特異的結合パートナーへのリンカー、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アラルキル、又は置換アラルキルである。そのような場合、Ｒ３は、最も多くの場合、１〜２０個の炭素原子を有する。多くの場合、Ｒ３は、１〜４個の炭素原子を有するアルキル、フェニル、ベンジル、置換ベンジル、アルコキシアルキル、カルボキシアルキル、又はアルキルスルホン酸である。Ｒ３がアルキル、置換アルキル、アルケニル、又は置換アルケニルである場合は特にであるが、他の場合にも、Ｒ３がＲ７又はＲ８に共有結合して、環を、典型的には５員環又は６員環を形成することができる。上述の部分のうちの１つ以上が置換される場合、最も通常には、カルボニル、カルボキシル、トリ（アルキル）シリル、グリコシル、−ＳＯ３−、−ＯＳＯ３−、−ＰＯ３−、−ＯＰＯ３−、ハロゲン、ヒドロキシ、チオール、アミノ、第四級アンモニウム、及び第四級ホスホニウムから選択される、１〜３個の基によって置換される。
【００４３】
標識式Ｉにおいて、Ｒ４〜Ｒ１１のそれぞれは、独立して、Ｈ、又はＣ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ、及びハロゲンから選択される１〜５０個の原子を含有する有機部分であり、非水素原子の原子価を満たすのに十分な水素原子が加わる。最も通常には、Ｒ１及びＲ２のそれぞれは、独立して、特異的結合パートナーへのリンカー、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アラルキル、置換アラルキル、アルコキシ、アリールオキシ、ハロゲン、アミノ、置換アミン、カルボキシル、カルボアルコキシ、カルボキシアミド、シアノ、又はスルホネートである。Ｒ４とＲ５、Ｒ８とＲ９等のような近接するＲ４〜Ｒ１１部分の対は、共有結合して環を形成することができる。この場合、環は典型的には５〜７員環であり、最も典型的には５員環又は６員環である。環は、炭素環式又は複素環式であってもよく、後者の場合、Ｎ、Ｏ、又はＳなどの複素原子を含有することができ、非置換であってもよく、１個以上の炭素原子上又は１個以上の複素原子上のいずれかで置換されていてもよい。上述の部分のうちの１つ以上が置換される場合、最も通常には、カルボニル、カルボキシル、トリ（アルキル）シリル、グリコシル、−ＳＯ３−、−ＯＳＯ３−、−ＰＯ３−、−ＯＰＯ３−、ハロゲン、ヒドロキシ、チオール、アミノ、第四級アンモニウム、及び第四級ホスホニウムから選択される、１〜３個の基によって置換される。
【００４４】
最も通常には、式Ｉにおいて、Ｒ４〜Ｒ１１のそれぞれはＨである。
【００４５】
最も通常には、用いられる式Ｉの標識は、式ＩＩの標識であり、
【化２】
2021525375.tif 000003
式中、波線は、特異的結合パートナーへの付着箇所を示す。このような場合、Ｒ３は、典型的には、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アラルキル、又は置換アラルキルである。このような場合、Ｒ３は、最も多くの場合、１〜２０個の炭素原子を、具体的には、１〜４個の炭素原子を有するアルキル、フェニル、ベンジル、置換ベンジル、アルコキシアルキル、カルボキシアルキル、又はアルキルスルホン酸を有する。上述の部分のうちの１つ以上が置換される場合、最も通常には、カルボニル、カルボキシル、トリ（アルキル）シリル、グリコシル、−ＳＯ３−、−ＯＳＯ３−、−ＰＯ３−、−ＯＰＯ３−、ハロゲン、ヒドロキシ、チオール、アミノ、第四級アンモニウム、及び第四級ホスホニウムから選択される、１〜３個の基によって置換される。
【００４６】
式ＩＩの特定の標識において、波線は、特異的結合パートナーへの、又は化合物を特異的結合パートナーに接続しているリンカーへの付着部位を示し、Ｒ１及びＲ２は、置換アルキル、非置換アルキル、置換アルキエニル（alkyenyl）、非置換アルケニル、置換アルキニル、非置換アルキニル、置換アラルキル、及び非置換アラルキルから独立して選択され、Ｒ１又はＲ２が置換されている場合、Ｒ１又はＲ２は１〜３個の置換基によって置換されており、各置換基は、カルボニル、カルボキシル、トリアルキルシリル、−ＳＯ３、グリコシル、−ＰＯ３、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、アミノ、Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ２、第四級アンモニウム、及び第四級ホスホニウムから独立して選択され、Ｒ３は、置換アルキル、非置換アルキル、置換アルキエニル、非置換アルケニル、置換アルキニル、非置換アルキニル、置換アラルキル、及び非置換アラルキルから選択され、Ｒ１又はＲ２が置換されている場合、Ｒ１又はＲ２は１〜３個の置換基によって置換されており、各置換基は、カルボニル、カルボキシル、トリアルキルシリル、−ＳＯ３、グリコシル、−ＰＯ３、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、アミノ、Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ２、第四級アンモニウム、及び第四級ホスホニウムから独立して選択される。
【００４７】
式ＩＩの標識は、特異的結合パートナーと式ＩＩＩの化合物との反応によって、特異的結合パートナーに結合される。
【化３】
2021525375.tif 000004
［式中、Ｌ及びＲＧは、上に記載するとおりである。］
【００４８】
用いることができる式ＩＩＩの化合物の例は、米国特許公開第２０１００２６７０７１号の表８に提供されている。一般に式Ｉの化合物、具体的には式ＩＩＩの化合物は、米国特許公開第２００７０１７２８７８号に開示されている方法によって、調製することができる。例えば、市販のアクリダン又はＮ−置換アクリダンを強塩基で、続いて二硫化炭素で処理して、アクリダンジチオカルボキシレートを形成し、次に、従来のエステル化方法によって、エステル化又は部分エステル化して、置換基Ｒ１を導入することができる。Ｒ２は、残りのチオールを、ブチルリチウム又は水素化ナトリウムなどの強塩基によって脱プロトン化し、次いで、適当な求電子体によって処理して、Ｒ２を付着させることによって、加えることができる。置換基Ｒ１及びＲ２は、式ＩＩＩの所望の化合物を達成するために、Ｒ１及びＲ２上の官能基を操作する更なる反応を受けてもよい。
【００４９】
化学発光標識はまた、芳香族環式ジアルヒドラジド（dialhydrazides）、トリヒドロキシ芳香族化合物、アクリダンケテンジチオアセタール化合物、アクリダンエステル、アクリダンチオエステル、アクリダンエノール、及び式
【化４】
2021525375.tif 000005
［式中、
Ｒ１は、１〜２０個の炭素の、アルイル（alyl）基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、及びアラルキル基、又はカルボニル、トリアルキルシリル、ＳＯ３−、−ＯＳＯ３、グリコシル、ＰＯ３−、−ＯＰＯ３、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、アミノ、第四級アンモニウム、若しくは第四級ホスホニウムから独立して選択される１〜３個の基部分によって置換された、これらのもののいずれかから選択され、Ｘは、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、アリール、アラルキル、１〜２０個の炭素原子を有するアルキル若しくはアルキルカルボニル、トリアルキルシリル、ＳＯ３−、グリコシル、及びＰＯ（ＯＲ’）（ＯＲ’’）［式中、Ｒ’及びＲ’’は、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、シアノアルキル、シアノアリール、シアノアラルキル、トリアルキルシリル、アルカリ金属カチオン、アルカリ土類カチオン、アンモニウムカチオン、及びトリアンルキル（anlkyl）ホスホニウムカチオンから独立して選択される］から選択され、Ｚ１及びＺ２は、Ｏ及びＳ原子から独立して選択され、Ｒ２及びＲ３は、Ｈ及びＣ１〜Ｃ８アルキルから独立して選択される］を有する化合物から選択することもできる。
【００５０】
いっそう更なる化学発光標識は、米国特許第５４９７０７２、同第５２３２１２号、同第５５９３８４５号、同第５９２２５８８号、同第６０１３０８０３号、同第６６９６５６９号、同第６８９１０５７号、及び米国特許公開第２０１００２６７０７１号に開示されている。これらのいずれか、又は他の化学発光標識を用いることができる。特に好適な化学発光標識及び化学発光標識特異的結合パートナーとしては、米国特許公開第２０１００２６７０７１号に開示されているものが挙げられる。
【００５１】
活性化剤標識特異的結合パートナー
活性化剤標識特異的結合パートナーは、典型的には、１０−４Ｍ未満、具体的には１０−６Ｍ未満、最も具体的には１０−１１Ｍ〜１０−７Ｍの濃度で、反応混合物中に存在する。
【００５２】
活性化剤標識特異的結合パートナーは、特異的結合パートナーに結合している、典型的には不可逆的に結合している、活性化剤標識を含む。任意の好適な活性化剤標識を使用することができる。化合物は、２つの要件を満たす場合、活性化剤標識であることに好適であり得る。第１に、酸化剤若しくは還元剤から、又はこれらに電子を、いくつかの稀な場合には複数の電子を、受容又は供与することができ、ラジカル、イオン−ラジカル、又は通常でない場合ではイオンを形成できることであり得る。このようなラジカル、イオン−ラジカル、又はイオンは、ときとして、活性化した活性化剤標識と呼ばれ、活性化した活性化剤標識の形成は、ときとして、活性化剤標識を活性化すると呼ばれる。第２に、活性化した活性化剤標識が形成されると、化学発光標識特異的結合パートナー上の化学発光標識を、及び適用可能な場合、結合していない化学発光基質を活性化することができ、化学発光標識を、及び適用可能な場合、結合していない化学発光基質を発光させるであろう。
【００５３】
典型的な活性化剤標識は、ペルオキシダーゼ、又はペルオキシダーゼ様活性を有する化合物である。例としては、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、バナジウムブロモペルオキシダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、真菌ペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、Ｍｎ依存性ペルオキシダーゼ、ダイズペルオキシダーゼ、及びＭｎ−ＴＰＰＳ４のような、酵素ではないがペルオキシダーゼ様活性を有する、ペルオキシダーゼ模倣化合物が挙げられる。
【００５４】
活性化剤標識特異的結合パートナーとしては、ペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼ様活性を有する化合物と、生物学的分子とのコンジュゲート又は複合体を挙げることができる。このような場合、用いることができる典型的な生物学的分子としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、抗体、抗体断片、抗体ＤＮＡキメラ、抗原、ハプテン、タンパク質、ペプチド、レクチン（lechtins）、アビジン、ストレプトアビジン、及びビオチンが挙げられる。
【００５５】
１つ以上の活性化剤標識が、典型的には不可逆結合によって、特異的結合パートナーに結合する。結合、典型的には不可逆結合は、直接的な接続であってもよく、間接的な接続であってもよい。直接的な接続では、１つ以上の化学発光標識と特異的結合パートナーとの間に、リンカー又は補助物質を使用することなく、１つ以上の化学発光標識が、特異的結合パートナーに直接接続される。直接的な接続は、典型的には、イオン結合、共有結合、疎水性相互作用、又は水素結合などの不可逆結合によるものであり、最も多くの場合、共有結合である。
【００５６】
間接的な接続が用いられる場合、当技術分野において補助物質と呼ばれることもあるリンカーが使用され、１つ以上の化学発光標識と特異的結合パートナーとを接続する。任意の好適なリンカーを使用することができ、好適なリンカーは、１つ以上の化学発光標識が発光することを妨げず、典型的には、化学発光標識特異的結合パートナーを、水性媒体に不溶性にしない。例示的なリンカーとしては、ストレプトアビジン、アビジン、ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎのようなタンパク質、ビオチン、カチオン化ＢＳＡ、ｆｏｓ、ｊｕｎ、キーホールヘモシアニン、免疫グロブリン（断片又はその一部を含む）、リポソーム、ミセル、ＡＭＡＭのような合成デンドリマー、ポリアクリル酸のような合成ポリマー、多糖類のような天然ポリマー、例えば、官能化デキストラン、ポリヌクレオチド、アプタマー、及びオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。多糖類、具体的にはアミノ−デキストラン又はカルボキシル−デキストラン、及び自己集合タンパク質が最も通常に用いられる。
【００５７】
好適な活性化剤標識特異的結合パートナーとしては、米国特許公開第２０１００２６７０７１号に開示されているものが挙げられる。
【００５８】
選択的シグナル阻害剤
選択的シグナル阻害剤は、反応混合物中に存在するが本明細書に記載するアッセイに関与しない、過剰な化学発光標識特異的結合パートナーによって生じるノイズシグナルを低減する。その機能は、米国特許公開第２０１００２６７０７１号に、より詳細に記載されている。
【００５９】
典型的には、１種以上の選択的シグナル阻害剤が、反応混合物中に、１０−６Ｍ〜１０−１Ｍ、最も多くの場合１０−５Ｍ〜１０−４Ｍの濃度で存在する。詳細な濃度としては、５×１０−６Ｍ〜５×１０−４Ｍ、より具体的には５×１０−５Ｍ〜５×１０−４Ｍが挙げられる。
【００６０】
選択的シグナル阻害剤としての使用に好適な化合物としては、抗酸化剤、具体的には犠牲型抗酸化剤、及び活性化剤標識選択的結合パートナー上の活性化剤標識と相互作用する酸化剤又は還元剤によって形成される、ラジカル、イオン−ラジカル、若しくはいくつかの場合ではイオンと、又はいくつかの場合では酸化剤若しくは還元剤と反応することができる、他の分子が挙げられる。この開示の目的については、選択的シグナル阻害剤の様々な選択肢が同じ方法で機能するため、任意の抗酸化剤を用いることができる。具体的には、通例では過酸化物である、酸化剤若しくは還元剤と反応して、又は活性化剤標識特異的結合パートナー上の活性化した活性化剤標識と反応して、過酸化物ラジカル又は活性化した活性化剤標識をクエンチする。
【００６１】
選択的シグナル阻害剤として用いることができるいくつかの具体的な抗酸化剤は、米国特許公開第２０１００２６７０７１号に記載されている。例としては、グルタチオン、アスコルビン酸、具体的にはＬ−アスコルビン酸、アスコルビン酸の塩、具体的にはＬ−アスコルビン酸の塩、尿酸、Ｌ−アスコルビン酸−６−パルミテート、トコフェロール、５，６−イソプロピリデン−Ｌ−アスコルビン（acobic）酸、Ｄ−イソアスコルビン酸、Ｌ−イソアスコルビン（isoasocrbic）酸、又は両方を含めたイソアスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、ジエチルヒドロキシルアミン、ＢＨＴ、
【化５】
2021525375.tif 000006
【化６】
2021525375.tif 000007
及びこれらの組み合わせが挙げられる。最も通常には、トコフェロール又はアスコルビン酸、具体的にはアスコルビン酸が使用される。
【００６２】
使用の際、１種以上の選択的シグナル阻害剤を、任意の好適な方法で提供することができる。例えば、選択的シグナル阻害剤をトリガー溶液の成分として提供することができ、この場合、トリガー溶液を加えた時点で、反応混合物が形成される。選択的シグナル阻害剤はまた、化学発光標識特異的結合パートナー若しくは活性化剤標識特異的結合パートナーの一方若しくは両方とともに提供することもでき、又は固体として、若しくは適当な濃度の溶液として、単独で加えることもできる。最も通常には、１種以上の選択的シグナル阻害剤は、反応混合物に、具体的にはトリガー溶液の添加後に、提供される濃度よりも１０倍高い濃度で、又はいくつかの場合では、１０倍より更に高い濃度で、作動溶液中に提供される。作動溶液は典型的には水性であり、多くの場合、緩衝水などの水であってもよいが、十分に高い濃度の１種以上の選択的シグナル阻害剤を提供するために、いくつかの場合、界面活性剤、エタノール、グリコールなども含有することができる。いずれの状況においても、反応混合物中で好適な濃度を達成するために、適当な量で加える。
【００６３】
トリガー溶液
トリガー溶液は、化学発光標識特異的結合パートナーからの、いくつかの場合、バックグラウンド剤からの発光を生じるために必要な、１種以上の酸化剤又は還元剤を提供する。１種以上の酸化剤又は還元剤は、化学発光標識と直接反応することによってこの機能を実行する場合もあるが、適用可能な場合、バックグラウンド剤、より通常には１種以上の酸化剤又は還元剤は、活性化剤標識特異的結合パートナー上の活性化剤標識と反応して、活性化剤標識と化学発光標識との作用を推進する。
【００６４】
１種以上の酸化剤又は還元剤は、活性化剤標識特異的結合パートナー上の活性化剤標識を活性化する、任意の化合物であり得る。最も通常には、１種以上の酸化剤又は還元剤は、活性化剤標識と相互作用する１種以上の過酸化物であり、典型的には、ペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼ様活性を有する化合物であり、活性化剤標識を活性化する。ペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼ様活性を有する化合物と反応する任意の過酸化物を使用することができるが、通常使用される過酸化物としては、過酸化アルキル、ヒドロ過酸化アルキル、過酸化水素、過酸化尿素、過酸化カルバメート、及び過ホウ酸塩が挙げられる。過酸化物の濃度は変動し得るが、典型的には１０−８Ｍ〜３Ｍ、最も通常には１０−３Ｍ〜１０−１Ｍである。
【００６５】
必須ではないが、トリガー溶液の成分として、増強剤が典型的に使用される。増強剤は、活性化剤標識、典型的にはペルオキシダーゼ酵素の反応性を促進する、アッセイにおけるノイズシグナルを低減する、又はその両方を行う、任意の化合物であり得る。典型的な増強剤としては、フェノール系化合物、芳香族アミン、フェノキサジン又はフェノチジン（phenothizine）とインドフェノール又はインドアニリンとの混合物、置換ヒドロキシベンゾオキサゾール、置換又は非置換アリールボロン酸、並びにこれらのエステル及び無水物などが挙げられる。いくつかの好適な増強剤は、米国特許公開第２０１００２６７０７１号、米国特許第５１７１６６８号、同第５２０６１４９号、及び同第５５１２４５１号に開示されている。用いる場合、増強剤は、典型的には、１０−５Ｍ〜１０−１Ｍの濃度で存在する。
【００６６】
上に論じたように、酸化剤又は還元剤、及び用いる場合は増強剤に加えて、１種以上の選択的シグナル阻害剤が、トリガー溶液中に存在してもよい。
【００６７】
トリガー溶液は、典型的には、記載する様々な溶質を、水性溶媒中に含有する。水性溶媒は、典型的には、緩衝水である。十分な分析物シグナルを生成することができないほどに、化学発光標識の発光又はアッセイに干渉しない限り、生物学的系に有用な任意の緩衝剤を用いることができる。最も有用な緩衝剤は、５〜１０．５のｐＨを維持することになる。特に有用な緩衝剤は、６．０〜９．０、例えば６５．〜８．５、最も具体的には７．０〜８．０のｐＨを維持する。
【００６８】
使用することができる例示的な緩衝剤は、米国特許公開第２０１００２６７０７１号に開示されている。最も通常には、緩衝剤は、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、トリス（ヒドロキシ−メチルアミン）メタン、グリシン、トリシン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、ジエタノールアミン、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、及びＭＥＳなどから選択される。
【００６９】
１種以上の洗浄剤又はポリマー性界面活性剤を使用して、発光を増強すること、又はノイズシグナルを減少させることができる。例としては、ポリオキシエチレン化アルキルフェノール、ポリオキシエチレン化（polyoxyethhylenated）アルコール、ポリオキシエチレン化エーテル、ポリオキシエチレン化ソルビトールエステル、ＣＴＡＢなどの第四級アンモニウム塩、及び第四級ホスホニウム塩が挙げられる。特に有用な例は、ポリマー性カチオン性界面活性剤、最も具体的には第四級アンモニウム塩及び第四級ホスホニウム塩である。
【００７０】
上に論じたように、１種以上の選択的シグナル阻害剤が、トリガー溶液中に任意に存在してもよい。
【００７１】
一例として、トリガー溶液は、水性緩衝剤、１０−５Ｍ〜１Ｍの濃度の過酸化物、及び１０−５Ｍ〜１０−１Ｍの濃度の増強剤を含有することができる。別の例として、トリガー溶液は、水性緩衝剤、１０−５Ｍ〜１Ｍの濃度の過酸化物、１０−５Ｍ〜１０−１Ｍの濃度の増強剤、及び反応混合物中で１０−６Ｍ〜１０−１Ｍの濃度を有するような濃度の１種以上の選択的シグナル阻害剤を含有することができる。
【００７２】
シグナル
競合方式又はサンドイッチ方式のいずれにおいても、分析物シグナルは、例えば蛍光シグナルのような発光シグナルとして測定することができる。最も通常には、分析物シグナルは、トリガー溶液を加えたほぼ直後に測定可能である。分析物シグナルの持続時間は、典型的には、トリガー溶液を加えた後、２０秒以下、１０秒以下、５秒以下、３秒以下、２秒以下、又は更には１秒以下のような、短い時間に過ぎない。その時間の後は、分析物シグナルはもはや検出可能ではない。分析物シグナルがもはや検出可能ではなくなった直後、バックグラウンドシグナルも典型的には、選択的シグナル低減剤の存在のために、検出可能ではないか、ほとんど検出可能ではない。
【００７３】
上に論じたように、選択的シグナル低減剤は、典型的には酸化剤又は還元剤であり、最も通常には、バックグラウンドシグナルを低減するために、犠牲的に酸化又は還元される低減剤である。選択的シグナル低減剤のすべてが酸化又は還元によって消費されると、化学発光標識選択的結合パートナーからのシグナルはもはや低減せず、グローシグナルが検出可能となる。典型的には、グローシグナルは、分析物シグナルがもはや検出可能ではなくなった後に検出可能となるが、それでも、トリガー溶液の添加後の短い時間内である。分析物シグナルの持続時間に応じて、多くの場合、グローシグナルは、トリガー溶液を加えた後、２分以下、９０秒以下、７５秒以下、６０秒以下、４５秒以下、３０秒以下、又は更には２０秒以下で検出可能となる。グローシグナルは、典型的には分析物シグナルと同じ種類のシグナル、最も通常には発光、通例は蛍光であり、そのため、分析物シグナルと同じ方法で検出することができる。
【００７４】
グローシグナルが検出可能となる時間は、少なくとも２つの方法で調節することができる。第１に、選択的シグナル低減剤の濃度を変化させることができる。選択的シグナル低減剤の量が増加することによって、グローシグナルを測定することができるまでに経過しなければならない時間は増加し、一方、選択的シグナル低減剤の量が減少することによって、グローシグナルを測定することができるまでの時間の量は減少することになる。第２に、活性化剤標識特異的結合パートナーの量を調節することができる。化学発光標識特異的結合パートナーの量が増加することによって、グローシグナルを測定することができるまでに経過しなければならない時間の量は減少し、一方、化学発光標識特異的結合パートナーの量が減少することによって、グローシグナルを測定することができるまでに経過しなければならない時間の量は増加することになる。
【００７５】
検出
グローシグナル及び分析物シグナルなどの様々なシグナルは、当技術分野において公知の任意の装置によって検出することができる。装置の種類は、シグナルの種類に依存し得る。シグナルが発光シグナルである場合、ルミノメータ又はＣＣＤカメラが典型的に使用される。他の有用な検出器としては、写真フィルム、Ｘ線フィルム、シンチレーションカウンター、光量計、並びにＵＶ／Ｖｉｓ及びＩＲ検出器のような透過率検出器などが挙げられる。最も通常には、検出は、ルミノメータ中又はＣＣＤカメラの前で、試験管内又はマルチウェルプレート内で実行される。マルチウェルプレートとＣＣＤカメラとを使用することは、この場合、マルチウェルプレートの異なるウェルのそれぞれにおいて、複数の試験試料及び標準試料のアッセイ及び検出を同時に実行することができる場合があるため、便利であり得る。検出は、多数の市販されている、又は当技術分野において公知のルミノメータ、ＣＣＤカメラ等のいずれかによって、実行することができる。
【００７６】
グローシグナル、分析物シグナル、又はその両方は、それぞれのシグナルの最大波長（λｍａｘ）の強度であり得る。あるいは、グローシグナル、分析物シグナル、又はその両方は、グロー蛍光及び分析物蛍光に関連するスペクトルピークの積分であってもよい。
【００７７】
定量
国際公開第２０１００９９４８６号に記載されているものなどの先行技術のアッセイでは、既知濃度の分析物を有する複数の標準試料の分析物シグナルを使用して、較正曲線を作成する。定量は、試験試料の分析物シグナルを、較正曲線と比較することによって達成される。本発明者らは、この先行技術の定量は不適当であり、特に試料が高度に希釈されない場合には、大量の誤差を与え得ることを初めて認識した。
【００７８】
既知濃度の分析物を有する複数の標準試料の分析物シグナルとグローシグナルとを測定することによって、より低レベルの希釈において、正確な定量を達成することができる。標準試料の分析物シグナルとグローシグナルとを測定すること、及び式：分析物シグナル／（グローシグナル＋分析物シグナル）に対照して、分析物濃度をプロットすることによって、較正曲線を作成する。
【００７９】
未知の分析物濃度を有する試料中の分析物濃度を決定するためには、分析物シグナルと試験シグナルとを測定し、次いで、分析物濃度を決定するために、分析物シグナル／（グローシグナル＋分析物シグナル）の数量を、較正曲線と比較する。この方法は、較正曲線を作成するためにグローシグナルを使用しない非補正法よりも正確な結果を提供するだけでなく、いくつかの場合、特に干渉化合物を有する試料について、及び分析物自体が分析物シグナルをクエンチし得る試料においても、高度に希釈されていないＥＬＩＳＡアッセイよりも正確であり得る。
【００８０】
使用
本明細書に記載するアッセイは、様々な系における使用を見出すことができる。ＥＬＩＳＡ系は１つの使用であるが、本明細書における手引及び当業者の知識に従って、アプタマー結合及び他の非免疫原特異的結合パートナーを伴うアッセイも用いることができる。例としては、溶液ハイブリダイゼーションアッセイ、サザンブロット法におけるＤＮＡ検出、ノーザンブロット法におけるＲＮＡ検出、ＤＮＡ又はＲＮＡの配列決定、ＤＮＡ又はＲＮＡのフィンガープリント法、コロニーハイブリダイゼーション、及びプラークアッセイが挙げられ、これらはすべて当技術分野において公知である。少なくとも１種の特異的結合パートナーを作製することができる任意の分析物を、分析することができる。例としては、抗原、毒素、毒物、核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、薬物、ステロイド、ハプテン、抗体、ペプチド、ペプチド断片、ホルモン、受容体、プライマー、及び小分子などが挙げられる。
【００８１】
例示的な実施形態の列挙
この実施形態の列挙は、本発明の特定の態様の理解を助けることを意図している。限定を目的とするものではない。
１．試料中の分析物についてアッセイする方法であって、
反応混合物を形成すること、及び
トリガー溶液を反応混合物に混和することを含み、
アッセイされる分析物が試料中に存在してもよく、
この反応混合物は、
第１の特異的結合パートナーに不可逆的に結合した化学発光標識を含む化学発光標識特異的結合パートナーであって、分析物に結合して、分析物と結合した化学発光標識特異的結合複合体を形成することができる、化学発光標識特異的結合パートナーと、
第２の特異的結合パートナーに不可逆的に結合した活性化剤標識を含む活性化剤標識特異的結合パートナーと、
選択的シグナル阻害剤とを含む水溶液であり、この方法が、
分析物シグナルを測定すること、及び
分析物シグナルを測定した後、グローシグナルを測定することを更に含む、方法。
２．反応混合物が増強剤を更に含む、実施形態１に記載の方法。
３．トリガー溶液が増強剤を更に含む、実施形態１に記載の方法。
４．選択的シグナル阻害剤によって、分析物を有する複合体において、化学発光標識特異的結合パートナーと活性化剤標識特異的結合パートナーとの間の反応によって生成するシグナルの割合が、分析物を有する複合体が存在しない場合の、化学発光標識特異的結合パートナーと活性化剤標識特異的結合パートナーとの間の反応からのシグナルを超える、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
５．選択的シグナル阻害剤が、オルト又はパラ配向性において少なくとも２つのヒドロキシル基を有する芳香族化合物、少なくとも１つのヒドロキシル基と、この少なくとも１つのヒドロキシル基のうちの１つ以上に対して、オルト又はパラであるアミノ基とを有する芳香族化合物、エチレン性不飽和基上で置換された少なくとも２つのヒドロキシル基を有する化合物、及び窒素複素環式基を有する化合物からなる群から選択される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
６．選択的シグナル阻害剤が、アスコルビン酸、イソアスコルビン酸、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸、アスコルビン酸６−パルミテート、５，６−イソプロピリジエン（isopropylidiene）−アスコルビン酸、ブチル化ヒドロキシトルエン、グルタチオン、尿酸、１種以上のトコフェロール、及びカテキンからなる群から選択される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
７．選択的シグナル阻害剤がアスコルビン酸である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
８．化学発光標識特異的結合パートナーが、特異的結合対部材に直接又は間接的に接続された化学発光標識を含み、化学発光標識が、芳香族環式ジアルヒドラジド、トリヒドロキシ芳香族化合物、アクリダンケテンジチオアセタール化合物、アクリダンエステル、アクリダンチオエステル、アクリダンエノール、及び式
【化７】
2021525375.tif 000008
［式中、
Ｒ１は、１〜２０個の、炭素のアルイル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、及びアラルキル基、又はカルボニル、トリアルキルシリル、ＳＯ３−、−ＯＳＯ３、グリコシル、ＰＯ３−、−ＯＰＯ３、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、アミノ、第四級アンモニウム、若しくは第四級ホスホニウムから独立して選択される１〜３個の基部分によって置換された、これらのもののいずれかから選択され、
Ｘは、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、アリール、アラルキル、１〜２０個の炭素原子を有するアルキル若しくはアルキルカルボニル、トリアルキルシリル、ＳＯ３−、グリコシル、及びＰＯ（ＯＲ’）（ＯＲ’’）［式中、Ｒ’及びＲ’’は、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、シアノアルキル、シアノアリール、シアノアラルキル、トリアルキルシリル、アルカリ金属カチオン、アルカリ土類カチオン、アンモニウムカチオン、及びトリアンルキルホスホニウムカチオンから独立して選択される］から選択され、
Ｚ１及びＺ２は、Ｏ及びＳ原子から独立して選択され、
Ｒ２及びＲ３は、Ｈ及びＣ１〜Ｃ８アルキルから独立して選択される］
を有する化合物から選択される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
９．化学発光標識特異的結合パートナーが、特異的結合パートナーに直接又は間接的に接続された化学発光標識を含み、化学発光標識が、式
【化８】
2021525375.tif 000009
［式中、
波線は、特異的結合パートナーへの、又は化合物を特異的結合パートナーに接続しているリンカーへの付着部位を示し、
Ｒ１及びＲ２は、置換アルキル、非置換アルキル、置換アルキエニル、非置換アルケニル、置換アルキニル、非置換アルキニル、置換アラルキル、及び非置換アラルキルから独立して選択され、Ｒ１又はＲ２が置換されている場合、Ｒ１又はＲ２は１〜３個の置換基によって置換されており、各置換基は、カルボニル、カルボキシル、トリアルキルシリル、−ＳＯ３、グリコシル、−ＰＯ３、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、アミノ、Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ２、第四級アンモニウム、及び第四級ホスホニウムから独立して選択され、
Ｒ３は、置換アルキル、非置換アルキル、置換アルキエニル、非置換アルケニル、置換アルキニル、非置換アルキニル、置換アラルキル、及び非置換アラルキルから選択され、Ｒ１又はＲ２が置換されている場合、Ｒ１又はＲ２は１〜３個の置換基によって置換されており、各置換基は、カルボニル、カルボキシル、トリアルキルシリル、−ＳＯ３、グリコシル、−ＰＯ３、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、アミノ、Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ２、第四級アンモニウム、及び第四級ホスホニウムから独立して選択される］
を有する、実施形態１〜７のいずれかに記載の方法。
１０．活性化剤標識特異的結合パートナーが、特異的結合対部材に直接又は間接的に接続された活性化剤標識化合物を含み、活性化剤標識が、遷移金属塩、遷移金属複合体、及び酵素から選択され、活性化剤標識がペルオキシダーゼ活性を有する、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１１．活性化剤標識がペルオキシダーゼ酵素である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１２．活性化剤標識がセイヨウワサビペルオキシダーゼである、実施形態１１に記載の方法。
１３．化学発光標識特異的結合パートナーと活性化剤標識特異的結合パートナーとのうちの少なくとも１つが、可溶性タンパク質、ストレプトアビジン、アビジン、ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ、ビオチン、カチオン化ＢＳＡ、ｆｏｓ、ｊｕｎ、可溶性合成デンドリマー、可溶性合成ポリマー、多糖類、デキストラン、有機ヌケオチド（organonuceotide）、ヌクレオチド、ヌクレオシド、アプタマー、リポソーム、及びミセルから選択される補助物質を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１４．増強剤が、ペルオキシダーゼ活性を有する活性化剤の触媒回転を促進する１種以上の化合物である、実施形態２〜１２のいずれかに記載の方法。
１５．増強剤が、フェノール化合物、芳香族アミン、ベンゾオキサゾール、ヒドロキシベンゾチアゾール、アリールボロン酸、及びこれらのいずれかの混合物から選択される、実施形態１３に記載の方法。
１６．トリガー溶液が、酸化剤又は還元剤を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１７．トリガー溶液が過酸化物を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１８．過酸化化合物が、過酸化アルキル、ヒドロ過酸化アルキル、過酸化水素、過酸化尿素、過酸化カルバメート、及び過ホウ酸塩からなる群から選択される、実施形態１７に記載の方法。
１９．過酸化物が、過酸化水素、過酸化アルキル、又はアルキル過酸化水素（alkyl hydrogen peroxide）である、実施形態１８に記載の方法。
２０．トリガー溶液が、フェノール化合物、芳香族アミン、ベンゾオキサゾール、ヒドロキシベンゾチアゾール、アリールボロン酸、及びこれらのいずれかの混合物から選択される増強剤を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
２１．トリガー溶液及び反応混合物の成分のすべて、並びに分析物が水溶性である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
２２．トリガー溶液、アッセイ溶液、又は反応混合物のいずれも、固相物質に直接又は間接的にコンジュゲートされる材料を含有しない、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
２３．選択的シグナル剤が、オルト又はパラ配向性において少なくとも２つのヒドロキシル部分を有する芳香族化合物、オルト又はパラ配向性において、ヒドロキシル部分とアミネオ（amineo）部分とを有する芳香族化合物（comnpounds）、少なくとも２つのビニルヒドロキシル基を有する化合物、及び窒素複素環からなる群から選択される化合物を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
２４．選択的シグナル阻害剤がアスコルビン酸を含み、アスコルビン酸が、具体的にはＬ−アスコルビン酸である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
２５．選択的シグナル阻害剤が、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチル（mehtyl）クロマン−２−カルボン酸を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
２６．選択的シグナル阻害剤が２−アミネオフェノールを含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
２７．選択的シグナル阻害剤が、３−アミネオ−チロシン、具体的には３−アミノ−Ｌ−チロシンを含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
２８．選択的シグナル阻害剤が４−クロロカテコールを含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
２９．選択的シグナル阻害剤がフェノキサジンを含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
３０．選択的シグナル阻害剤が２−ブロモベンゼン（benzne）−１，４−ジオールを含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
３１．選択的シグナル阻害剤が５，６−イソプロピリジン（isopropylidine）アスコルビン酸を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
３２．選択的シグナル阻害剤が６−パルミテートを含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
３３．化学発光標識特異的結合パートナー及び活性化剤標識特異的結合パートナーが、それぞれ試料中の分析物に結合する、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
３４．化学発光標識特異的結合パートナーが、分析物の類似体に接続された化学発光標識化合物を含み、更に、分析物と化学発光標識特異的結合パートナーとが競合して、活性化剤標識特異的結合パートナーに結合する、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
３５．試料が、既知濃度の分析物を含む標準試料である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
３６．既知濃度の分析物を含む複数の標準試料から、分析物シグナル及びグローシグナルを測定することを更に含む、実施形態３５に記載の方法。
３７．未知量の分析物を含有する試験試料から、分析物シグナル及びグローシグナルを測定することを含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
３８．標準試料の、分析物シグナルと分析物シグナル及びグローシグナルの合計との商を、標準試料中の分析物の既知濃度と比較する較正曲線を準備することを更に含む、実施形態３６に記載の方法。
３９．試験試料からの、分析物シグナルと分析物シグナル及びグローシグナルとの合計との商を、較正曲線と比較することによって、試験試料中の分析物の量を定量することを更に含む、実施形態３８に記載の方法。
４０．分析物シグナルが、発光強度又は発光強度の曲線下面積である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
４１．グローシグナルが、発光強度又は発光強度の曲線下面積である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
【実施例】
【００８２】
材料
エチレンジアミン四酢酸二カリウム塩（ＥＤＴＡ−二カリウム塩）、パラ−クマル酸、ＴＷＥＥＮ  ２０、トリス塩基、トリス塩酸塩、及びアスコルビン酸ナトリウムは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。
過酸化水素（３０％、ＢＡＫＥＲ  ａｎａｌｙｚｅｄ）は、ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ）から入手した。
エタノール（２００プルーフ）は、Ｄｅｃｏｎ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ）から入手した。
ＰＶＰ３６０［３６０，０００の平均分子量を有するポリ（ビニルピロリジノン）］及びＰＥＧ−６０００［６０００の平均分子量を有するポリ（エチレングリコール）］は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手した。
アフラトキシンＢ１（ＡＦＢ１）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（カタログ番号Ａ６６３６）から入手した。使用前に、ＡＦＢ１のメタノール中２０ｐｐｍ（百万分率）溶液を調製した。
ＰＢＳ中の界面活性剤Ａは、表１に記載する溶液配合に従って調製した。
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から入手した。
界面活性剤Ｂは、ＰＢＳ中のＭＡＫＯＮ−１０界面活性剤（Ｓｔｅｐａｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｎｏｒｔｈｆｉｅｌｄ，ＩＬ））の３％溶液（体積による）として調製した。
抗アフラトキシンＢ１モノクローナル抗体（抗ＡＦＢ１）は、Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｓｈｉｒｌｅｙ，ＮＹ）（カタログ番号ＤＭＡＢ２９４８）から入手した。
（抗ＡＦＢ１）−アクリダン［アクリダンにコンジュゲートされた抗ＡＦＢ１］は、Ｌｉｆｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）によって調製され、安定化緩衝剤中の６４マイクログラム／ｍＬ溶液として供給された。使用前に、（抗ＡＦＢ１）−アクリダン溶液を、ＰＢＳによって１：１０希釈した（体積による）。
ＡＦＢ１−ＨＲＰ［セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートしたＡＦＢ１］は、ＰＢＳ中の７．０５ｍｇ／ｍＬ溶液（カタログ番号ＤＡＧＡ−００９Ｈ）として、Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから入手した。使用前に、ＡＦＢ１−ＨＲＰ溶液を、ＰＢＳによって６００ｎｇ／ｍＬに希釈した。
【００８３】
【表１】
2021525375.tif 000010
【００８４】
実施例１のためのトリガー溶液は、表２に列挙する成分の水溶液として調製した。
【００８５】
【表２】
2021525375.tif 000011
【００８６】
計算
式１：
商算出分数＝分析物シグナル／［グローシグナル＋分析物シグナル］
【００８７】
実施例１．
乾燥飼料トウモロコシをＲｏｍｅｒ  Ｓｅｒｉｅｓ  ＩＩミル（Ｒｏｍｅｒ  Ｌａｂｓ，Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ）を使用して粉砕し、＃２０篩を通過させた。篩にかけたトウモロコシ（１０ｇ）を、５０ｍＬの界面活性剤Ｂに加え、５分間振盪することによって混合した。試料の上澄みを、０．４５ミクロンシリンジフィルタ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手した＃Ｆ２５０２９ポリプロピレンフィルタ）を通して濾過した。ＡＦＢ１ストック試料（上に記載した、メタノール中２０ｐｐｍ）を濾過液によって希釈して、２０ｐｐｂ、５ｐｐｂ、２．５ｐｐｂ、１．２５ｐｐｂ、０．６ｐｐｂ、及び０．１ｐｐｂ（ｐｐｂ＝十億分率）のＡＦＢ１濃度を有する６種の試験試料を調製した。対応する一連の６種の標準試料は、ＡＦＢ１ストック試料を界面活性剤Ｂで希釈することによって調製した。各ＡＦＢ１濃度において、３つの複製を調製した。
【００８８】
競合方式アッセイについては、まずＡＦＢ１添加試料（１０マイクロリットル）をストリップ中のウェルに加えることによって、マイクロウェルストリップ（カタログ番号７０２００７５６１０７、３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍａｐｌｅｗｏｏｄ，ＭＮ）から入手）中に試料を調製した。各ウェルは、単一の試験試料又は標準試料を含有した。次に、界面活性剤Ａ（３０マイクロリットル）、ＡＦＢ１−ＨＲＰ溶液（２０マイクロリットル）、及びアスコルビン酸ナトリウム溶液（１マイクロリットルのＰＢＳ中４ｍＭ溶液）を、各ウェルに順次加えた。マイクロウェルストリップを、ＩＫＡ  ＭＳ１振盪機（ＩＫＡ  Ｗｏｒｋｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ））によって、６００ｒｐｍで１０秒間振盪した。次いで、（抗ＡＦＢ１）−アクリダン溶液（２０マイクロリットル）を各ウェルに加え、マイクロウェルストリップを６００ｒｐｍで５分間振盪した。
【００８９】
３Ｍ  ＭＬＳ  ＩＩ注入ルミノメータ（３Ｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能）を使用して、各ウェルに８０マイクロリットルのトリガー溶液を加えた。この機器は、注入と発光シグナル測定との間に、時間遅延がないように設定した。発光は、発光量（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔ、ＲＬＵ）において測定した。
【００９０】
初期分析物発光シグナル（フラッシュシグナル）は、トリガー溶液の注入直後の３秒間を積分することによって測定した。
【００９１】
グローシグナルは、トリガー溶液の注入後、２０秒時点〜３００秒時点の１秒積分を集約することによって測定した。これらのＲＬＵ値を合計し、３／２８０（０．０１０７）の係数で倍率変更して、フラッシュシグナルと同じ規模となるように、グロー積分シグナルを調整した。
【００９２】
表３において、試験試料の平均分析物シグナル（ＲＬＵ）及び標準試料の平均分析物シグナル（ＲＬＵ）の値を、各試料について報告する。
【００９３】
表４において、各試料（試験試料及び標準試料）について、平均商算出分数（式１から計算）を計算した。値は表３に報告されている。
【００９４】
表５及び６において、試験試料及び標準試料それぞれについての、測定した分析物（フラッシュ）シグナル及びグローシグナルを報告する。
【００９５】
【表３】
2021525375.tif 000012
【表４】
2021525375.tif 000013
【表５】
2021525375.tif 000014
【表６】
2021525375.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】令和3年1月12日(2021.1.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の分析物についてアッセイする方法であって、
反応混合物を形成すること、及び
トリガー溶液を前記反応混合物に混和することを含み、
前記アッセイされる分析物が前記試料中に存在してもよく、
前記反応混合物は、
第１の特異的結合パートナーに不可逆的に結合した化学発光標識を含む化学発光標識特異的結合パートナーであって、前記分析物に結合して、分析物と結合した化学発光標識特異的結合複合体を形成することができる、前記化学発光標識特異的結合パートナーと、
第２の特異的結合パートナーに不可逆的に結合した活性化剤標識を含む活性化剤標識特異的結合パートナーと、
選択的シグナル阻害剤とを含む水溶液であり、前記方法が、
分析物シグナルを測定すること、及び
前記分析物シグナルを測定した後、グローシグナルを測定することを更に含む、方法。
【請求項２】
前記トリガー溶液が、フェノール化合物、芳香族アミン、ベンゾオキサゾール、ヒドロキシベンゾチアゾール、アリールボロン酸、及びこれらのいずれかの混合物から選択される増強剤を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記トリガー溶液が、酸化剤又は還元剤を更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記選択的シグナル阻害剤が、アスコルビン酸、イソアスコルビン酸、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸、アスコルビン酸６−パルミテート、５，６−イソプロピリジエン−アスコルビン酸、ブチル化ヒドロキシトルエン、グルタチオン、尿酸、１種以上のトコフェロール、及びカテキンからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記活性化剤標識がペルオキシダーゼ酵素である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記化学発光標識特異的結合パートナーが、特異的結合パートナーに直接又は間接的に接続された化学発光標識を含み、前記化学発光標識が、式
【化１】
2021525375.tif 000017
［式中、
波線は、前記特異的結合パートナーへの、又は前記化合物を前記特異的結合パートナーに接続しているリンカーへの付着部位を示し、
Ｒ１及びＲ２は、置換アルキル、非置換アルキル、置換アルキエニル、非置換アルケニル、置換アルキニル、非置換アルキニル、置換アラルキル、及び非置換アラルキルから独立して選択され、Ｒ１又はＲ２が置換されている場合、Ｒ１又はＲ２は１〜３個の置換基によって置換されており、各置換基は、カルボニル、カルボキシル、トリアルキルシリル、−ＳＯ３、グリコシル、−ＰＯ３、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、アミノ、Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ２、第四級アンモニウム、及び第四級ホスホニウムから独立して選択され、
Ｒ３は、置換アルキル、非置換アルキル、置換アルキエニル、非置換アルケニル、置換アルキニル、非置換アルキニル、置換アラルキル、及び非置換アラルキルから選択され、Ｒ１又はＲ２が置換されている場合、Ｒ１又はＲ２は１〜３個の置換基によって置換されており、各置換基は、カルボニル、カルボキシル、トリアルキルシリル、−ＳＯ３、グリコシル、−ＰＯ３、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、アミノ、Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ２、第四級アンモニウム、及び第四級ホスホニウムから独立して選択される］
を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記化学発光標識特異的結合パートナーが、前記分析物の類似体に接続された化学発光標識化合物を含み、更に、前記分析物と前記化学発光標識特異的結合パートナーとが競合して、前記活性化剤標識特異的結合パートナーに結合する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
結合していない化学発光基質が、ルミノール、イソルミノール、ロフィン、アクリジニウムエステル、例えば、ルシゲニン及びアクリダン、フタルヒドラジド、例えば、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン、ルシフェリン、並びに１，２ジオキシエタン含有化合物、例えば、ジオン、３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン（ＡＭＰＰＤ）、及び３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−β−Ｄ’−ガラクトピラノイルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン（ＡＭＰＧＤ）、３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン｝−４−イル）フェニルリン酸二ナトリウム、及び１，２−ジオキセタンジオン、アダマンチリデン−アダマンチル−１，２−ジオキセタンからなる群から選択され、具体的にはルミノール又はイソルミノールであり、より具体的にはルミノールであり、前記方法が、分析物シグナル及びバックグラウンドシグナルを検出することを更に含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
未知量の分析物を含有する試験試料から、前記分析物シグナル及び前記グローシグナルを測定することと、
標準試料の、前記分析物シグナルと前記分析物シグナル及びグローシグナルの合計との商を、標準試料中の分析物の既知濃度と比較する較正曲線を準備することと、
前記試験試料からの、前記分析物シグナルと前記分析物シグナル及びグローシグナルとの合計との商を、較正曲線と比較することによって、前記試験試料中の分析物の量を定量することと
を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記分析物シグナルが、発光強度又は発光強度の曲線下面積であり、更に、前記グローシグナルが、発光強度又は発光強度の曲線下面積である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【国際調査報告】
2021525375.tif 000018
2021525375.tif 000019