(57)【要約】  本開示は、新規抗癌ペプチド；同ペプチドをコードするベクター；前記抗癌ペプチドを含む医薬組成物若しくは免疫原性物質若しくは二重特異性若しくはワクチン；癌を治療するための前記抗癌ペプチド、ベクター、医薬組成物、免疫原性物質、二重特異性、若しくはワクチンの使用；前記抗癌ペプチド、ベクター、医薬組成物、免疫原性物質、二重特異性、又はワクチンを使用する、癌の治療方法；及び癌治療のための、前記抗癌ペプチド、ベクター、医薬組成物、免疫原性物質、二重特異性、又はワクチンを含む組合わせ治療薬に関する。【選択図】図１３
2021529181.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、又は以下からなる群から選択された抗癌ペプチド：
【化１】
2021529181.tif 000061
。
【請求項２】
前記抗癌ペプチドが、
【化２】
2021529181.tif 000062
である、請求項1記載の抗癌ペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドが、請求項1又は2記載のペプチドと少なくとも80%又は90%一致する、請求項1又は2記載の抗癌ペプチド。
【請求項４】
前記抗癌ペプチドが：HLA A、HLA A2、又はHLA 24、又はHLA A1、又はHLA A3を含む群から選択されるヒト白血球抗原（HLA）クラスI分子によって提示される、請求項1〜3のいずれか1項記載の抗癌ペプチド。
【請求項５】
前記分子がHLA A2である、請求項4記載の抗癌ペプチド。
【請求項６】
対象に投与された場合、エフェクターT細胞として働く抗癌T細胞、及び/又は、複数の癌抗原がヒト白血球抗原（HLA）クラスI分子によって同じ癌細胞の細胞表面に提示される際に前記癌抗原を認識する前記TCRを発現するT細胞の産生を刺激する、請求項1〜5のいずれか1項記載の抗癌ペプチドであって、前記抗原が互いに異なり、かつ異なる種類の癌に由来する細胞によって提示される、前記抗癌ペプチド。
【請求項７】
請求項1〜6のいずれか1項記載の抗癌ペプチドを含む、ワクチン。
【請求項８】
請求項1〜6のいずれか1項記載の抗癌ペプチド又は請求項7記載のワクチンを含む、医薬組成物又は免疫原性物質又は二重特異性。
【請求項９】
請求項1〜7のいずれか1項記載の抗癌ペプチド若しくはワクチン若しくはベクター若しくは医薬組成物若しくは免疫原性物質若しくは二重特異性、又はワクチンを、さらなる癌治療剤と組み合わせて含む、癌治療のための組合わせ治療薬。
【請求項１０】
癌治療における使用のための、請求項1〜6のいずれか1項記載の抗癌ペプチド、又は請求項7記載のワクチン、又は請求項8記載の医薬組成物若しくは免疫原性物質若しくは二重特異性、又は請求項9記載の組合わせ治療薬。
【請求項１１】
癌治療のための医薬の製造における、請求項1〜6のいずれか1項記載の抗癌ペプチド又は請求項7記載のワクチン又は請求項8記載の医薬組成物若しくは免疫原性物質若しくは二重特異性、あるいは請求項9記載の組合わせ治療薬の、使用。
【請求項１２】
癌を有する、又は癌を有する疑いのある対象の治療方法であって、前記対象に、請求項1〜6のいずれか1項記載の抗癌ペプチド又は請求項7記載のワクチン又は請求項8記載の医薬組成物若しくは免疫原性物質若しくは二重特異性、又は請求項9記載の組合わせ治療薬を投与することを含む、前記方法。
【請求項１３】
前記癌が：鼻咽頭癌、滑膜癌、肝細胞癌、腎癌、結合組織の癌、黒色腫、肺癌、腸癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、脳癌、咽頭癌、口腔癌、肝癌、骨癌、膵癌、絨毛癌、ガストリノーマ、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、T細胞白血病/リンパ腫、血液、扁桃、脾臓、神経腫、フォンヒッペル・リンダウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、神経膠腫、乏突起神経膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨癌、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原発部位不明の癌、カルチノイド、胃腸管のカルチノイド、線維肉腫、乳癌、筋肉癌、パジェット病、子宮頸癌、直腸癌、食道癌、胆嚢癌、胆管細胞癌、頭部癌、眼癌、鼻咽頭癌、頸部癌、腎癌、ウィルムス腫瘍、肝癌、カポジ肉腫、前立腺癌、精巣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、皮膚癌、中皮腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、内分泌癌、グルカゴノーマ、副甲状腺癌、陰茎癌、下垂体癌、軟部組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、絨毛性癌、胞状奇胎、子宮癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰癌、聴神経腫、菌状息肉腫、インスリノーマ、カルチノイド症候群、ソマトスタチノーマ、歯肉癌、心臓癌、口唇癌、髄膜癌、口癌、神経癌、口蓋癌、耳下腺癌、腹膜癌、咽頭癌、胸膜癌、唾液腺癌、舌癌、及び扁桃癌を含む、又はこれらからなる群から選択される、請求項1〜6及び9のいずれか1項記載の抗癌ペプチド、請求項7及び9記載のワクチン、請求項8及び9記載の医薬組成物若しくは免疫原性物質若しくは二重特異性、請求項9記載の組合わせ治療薬、又は請求項10若しくは11記載の使用、又は請求項12記載の方法。
【請求項１４】
前記癌が、皮膚癌又は黒色腫又は腎細胞癌又は白血病である、請求項13記載の抗癌ペプチド、ワクチン、医薬組成物若しくは免疫原性物質若しくは二重特異性、又は方法、又は使用、又は組合わせ治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本開示は、新規抗癌ペプチド；同ペプチドをコードするベクター；前記抗癌ペプチドを含む医薬組成物若しくは免疫原性物質若しくは二重特異性若しくはワクチン；癌を治療するための前記抗癌ペプチド、ベクター、医薬組成物、免疫原性物質、二重特異性、若しくはワクチンの使用；前記抗癌ペプチド、ベクター、医薬組成物、免疫原性物質、二重特異性、又はワクチンを使用する、癌の治療方法；及び癌治療のための、前記抗癌ペプチド、ベクター、医薬組成物、免疫原性物質、二重特異性、又はワクチンを含む組合わせ治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
本発明者らは、癌治療に有効な新しいクラスのT細胞を発見した。
【０００３】
T細胞は、個々の癌ペプチドをそれらの同系T細胞受容体を介して認識するという考えが、確立されている。従って、単一のTCRは、ヒト白血球抗原（HLA）クラスI又はクラスII分子の状況で細胞表面に提示された際に、典型的に単一の癌抗原ペプチドを認識すると考えられている。
【０００４】
本明細書で提示するこの新しい研究は、注目すべきことに意義深く、一部のT細胞が同一のT細胞受容体（TCR）を用いて（異なる配列の）異なる癌抗原ペプチドを認識し、それにより単一のTCRが複数の異なる癌抗原を認識する能力を有することが示されることを、示す。これは従来の知識に反する独自の知見であり、多面的な疾患であると考えられる癌の治療において意義深く有益な意味を有する。
【０００５】
本発明者らの研究では、これらのT細胞が、同一のヒト白血球抗原（HLA）クラスI分子の状況で細胞表面に提示された際に、異なる癌抗原に由来する複数の異なるペプチドを認識可能であることを示す。多くの場合、ペプチドは同一の癌細胞の表面に提示されるが、このことは過去記述されていない。
【０００６】
従って、一部の希少なT細胞は、様々な個別の癌抗原ペプチドを、それらの同系のT細胞受容体を介して認識可能であるようである。この新しいタイプのT細胞は、同一のT細胞受容体（TCR）を利用して、複数の異なる癌ペプチドを介して癌細胞を認識する。本発明者らは、その同系TCRを用いて2以上の抗原を介して癌細胞を認識し、これを攻撃し、それにより癌細胞の免疫回避（immune escape）の確率を大きく低下させることができるこれらのT細胞を、「多面的T細胞（multipronged T-cell）」と命名した。
【０００７】
2015年には、約9050万人が癌を有していた。1年につき約1410万の新規症例が発生している（黒色腫以外の皮膚癌は含まない）。ヒトの死のうち約880万件の死（15.7%）が、癌に起因する。男性における最も一般的な種類の癌は、肺癌、前立腺癌、結腸直腸癌、及び胃癌である。女性においては、最も一般的な種類の癌は、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、及び子宮頸癌である。各年の新規癌件数の合計に黒色腫以外の皮膚癌を含めれば、これは症例のおよそ40%を占めるだろう。アフリカ以外においては、子供について急性リンパ芽球性白血病及び脳腫瘍が最も一般的であり、アフリカにおいては非ホジキンリンパ腫がより高頻度で発生する。2012年には、15歳以下の約165,000人の子供たちが癌と診断された。癌のリスクは年齢とともに顕著に高まり、先進国において多くの癌がより一般的に発生する。比率は、古き時代に対しより人口が増え、発展途上世界における生活様式が変化するにつれ、上昇している。2010年については、癌の財政コストは、年当たり1.16兆ドル、USDと推定された。その結果、この疾患を治療し、又は根絶するより優れた、より安全な方法を提供することが求められている。異常な組織を殺傷する生体の自然防衛システムを使用する免疫療法が化学的介入よりも安全であることが認知されているが、有効性を高めるためには、免疫療法は疾患から回復させることができるものでなくてはならない。さらに、あらゆる種類の癌又は多くの癌に対して有効な免疫療法が発見されれば、多くの異なる種類の癌に罹患する個体に投与することができる（すなわち、汎集団適用を有する）だけでなく、2以上の種類の癌に罹患する単一の個体に投与することもできるため、きわめて有益であろう。
【０００８】
本発明者らが本明細書で同定したT細胞及びそれらの受容体は、それらが2以上の種類の癌に対して有効であり、従って癌が免疫系の有効性から逃れることから防御するという点で、前述の有利な特性を有する。さらに、これらの有利なT細胞及びそれらの受容体の産生は、本明細書に記載の新規抗癌ペプチドの使用によって誘発することができる。
【発明の概要】
【０００９】
（発明の言及）
本発明の第1の態様により、複数の癌ペプチド抗原がヒト白血球抗原（HLA）クラスI分子によって細胞表面に提示された際に前記抗原を認識する、単離抗癌T細胞受容体（TCR) 又はその断片であって、前記抗原が互いに異なり、かつ2以上の種類の癌を代表する、前記抗癌TCRを提供する。
【００１０】
本発明のさらなる態様により、複数の癌抗原を認識する抗癌TCR又は癌特異的TCR又はそれらの断片であって：
【化１】
2021529181.tif 000003
を含む、又はこれらからなる群から選択される相補性決定領域又は前記相補性決定領域のいずれか1以上と少なくとも85%一致する相補性決定領域を有する、前記TCRを提供する。
【００１１】
さらに好ましい実施態様において、前記相補性決定領域は、前記相補性決定領域のいずれか1以上と少なくとも86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、又は99%一致する。
【００１２】
本発明の好ましい実施態様において、前記複数の抗原はヒト白血球抗原（HLA）クラスI分子の状況で細胞表面に提示され、さらにより好ましくは、前記認識は、以下の活動：
前記TCR又は前記TCRを発現するT細胞が、前記抗原の任意の1以上を発現する癌細胞の死を誘発し、又は引き起こすこと；及び/又は
前記TCR又は前記TCRを発現するT細胞が、炎症促進性サイトカイン、例えばTNF及びIFNγの産生を誘発し、又はこれらを合成すること（この特徴は免疫抑制性の腫瘍微小環境を逆転させるのに有用である）；及び/又は
前記TCR又は前記TCRを発現するT細胞が、脱顆粒化を誘発し、又は脱顆粒化を受けること；及び/又は
前記TCR又は前記TCRを発現するT細胞が、CD107a、β-ケモカイン（MIP 1β）、及びサイトカイン、例えばインターフェロンγ（IFNγ）及び腫瘍壊死因子（TNF）のうちの任意の1以上を上方調節することの任意の組合わせを含む、いずれか1以上によって発生し、又は発生することが示される。
【００１３】
本発明の好ましい実施態様において、前記TCRは：
【化２】
2021529181.tif 000004
を含む、又はこれらからなる群から選択される相補性決定領域又は前記相補性決定領域のいずれか1以上と少なくとも85%一致する相補性決定領域を有する。
【００１４】
さらに好ましい実施態様において、前記相補性決定領域は、前記相補性決定領域のいずれか1以上と少なくとも86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、又は99%一致する。
【００１５】
本発明の好ましい実施態様において、前記2以上の種類の癌が：鼻咽頭癌、滑膜癌、肝細胞癌、腎癌、結合組織の癌、黒色腫、肺癌、腸癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、脳癌、咽頭癌、口腔癌、肝癌、骨癌、膵癌、絨毛癌、ガストリノーマ、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、T細胞白血病/リンパ腫、扁桃、脾臓、神経腫、フォンヒッペル・リンダウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、神経膠腫、乏突起神経膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨癌、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原発部位不明の癌、カルチノイド、胃腸管のカルチノイド、線維肉腫、乳癌、筋肉癌、パジェット病、子宮頸癌、卵巣癌、血液癌、結腸癌、直腸癌、食道癌、胆嚢癌、胆管細胞癌（cholangioma cancer）、頭部癌、眼癌、鼻咽頭癌、頸部癌、腎癌、ウィルムス腫瘍、肝癌、カポジ肉腫、前立腺癌、精巣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、皮膚癌、中皮腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、卵巣、内分泌、グルカゴノーマ、副甲状腺癌、陰茎癌、下垂体癌、軟部組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、絨毛性癌、胞状奇胎、子宮癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰癌、聴神経腫、菌状息肉腫、インスリノーマ、カルチノイド症候群、ソマトスタチノーマ、歯肉癌、心臓癌、口唇癌、髄膜癌、口癌、神経癌、口蓋癌、耳下腺癌、腹膜癌、咽頭癌、胸膜癌、唾液腺癌、舌癌、及び扁桃癌を含む、又はこれらからなる群から選択される。
【００１６】
本発明のなおさらに好ましい実施態様において、前記2以上の種類の癌は、膵、血液、卵巣、皮膚、乳、子宮頸、前立腺、骨、肺、肝、結腸、及び腎を含む、又はこれらからなる群から選択される。
【００１７】
本明細書における互いに異なる癌抗原の語は、異なる種類の癌を代表する癌抗原を指し、従ってそれらの配列構造又はそれらに由来する分子、典型的にはタンパク質の観点ではっきりと異なる抗原を指す。
【００１８】
とはいえこの抗原配列の違いにもかかわらず、本発明のTCRはこれらの複数の異なる又は様々な癌抗原を認識することができる。当業者であれば、癌細胞が2以上の異なる癌抗原を介してそれらを標的とするT細胞から逃れることは極めて困難であることを認識するであろう。回避するためには、全ての標的について、全ての同系ペプチドの提示を低下させ、又は除去する突然変異を同時に有することが要求されるためである。
【００１９】
本発明の好ましい実施態様において、前記ヒト白血球抗原（HLA）クラスI分子はMHCクラスI（A、B、又はC）である。より具体的には、前記HLAはHLA A2又はHLA A24又はHLA A1又はHLA A3である。
【００２０】
MHCクラスIは、細胞内部由来のペプチドを提示する。例えば、癌細胞の状況において、HLAシステムは癌発現タンパク質の断片又はペプチドを細胞表面に引き寄せ、その結果その細胞は癌であると認識され、免疫系によって破壊され得る。これらのペプチドは、プロテアソームで分解された消化タンパク質から産生される。一般的に、これらの特定のペプチドは長さ約7-20、例外は認めるものの、典型的には9又は10アミノ酸の低分子ポリマーである。MHCクラスI系によって提示される腫瘍形成性抗原は、癌細胞を破壊するキラーT細胞（CD8陽性又は細胞傷害性T細胞とも呼ばれる）を誘引する。
【００２１】
本発明の好ましい実施態様において、前記TCRはアルファベータ（αβ）TCRである。
【００２２】
なおさらに好ましい実施態様において、前記TCRは可溶性TCR（sTCR）であり、従って膜貫通を、理想的には細胞内ドメインをも有さない。
【００２３】
本発明のなお別の好ましい実施態様において、前記TCRは本明細書に記載の機能性を有するキメラ受容体の部分である。理想的には、前記TCRはTCR定常ドメイン又はTCRシグナル伝達ドメインと融合されている。
【００２４】
あるいは、前記TCRの断片、例えばその単量体部分、理想的には単鎖形態のTCRを提供する。
【００２５】
あるいはさらに、前記TCRの断片、例えばその相補性決定領域を提供する。
【００２６】
本発明のさらなる態様により、理想的には可溶性形態又は膜適合型形態の、すなわち膜貫通領域及び細胞内領域を有する本発明の前記TCRを発現するT細胞を提供する。
【００２７】
本発明のなおさらなる態様により、理想的には可溶性形態の、従って膜貫通ドメイン及び理想的には細胞内ドメインをも欠く、又は膜適合型形態の、すなわち膜貫通領域及び理想的には、細胞内ドメインをも有する、本発明の前記TCRを発現するT細胞クローンを提供する。
【００２８】
好ましくは、前記クローンは、本明細書に記載のT細胞クローンCR24、GD1、GD2、VB6G4.24、CR1、又はVB10である。
【００２９】
理想的には、前記クローンは複数の抗原性癌ペプチドを認識するCR24であり、最も好ましくはクローンCR24は：メランA由来
【化３】
2021529181.tif 000005
（残基26-35）、BST2由来
【化４】
2021529181.tif 000006
（残基22-31）、及びIMP2由来
【化５】
2021529181.tif 000007
（残基367-376）を含む、又はこれらからなる群から選択される、複数の前記ペプチドを認識する。好ましくは、この認識はHLA A2提示の状況におけるものである。
【００３０】
理想的には、前記クローンGD1又はGD2は複数の抗原性癌ペプチドを認識し、最も好ましくはクローンGD1又はGD2は以下のペプチド：ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）由来
【化６】
2021529181.tif 000008
（残基855-873）及び黒色腫関連抗原C2（MAGE C2）由来
【化７】
2021529181.tif 000009
（残基336-344）を認識する。クローンGD1は、乳癌、血液癌、及び黒色腫細胞株を殺傷する能力を有していた。
【００３１】
理想的には、前記クローンVB6G4.24、CR1、及びVB10は、メランAペプチド：
【化８】
2021529181.tif 000010
を認識するが、BST2ペプチド：
【化９】
2021529181.tif 000011
も、IMP2ペプチド：
【化１０】
2021529181.tif 000012
も、認識しない（外来ペプチドとしても、MOLT3によって発現された形質導入タンパク質由来としても認識しない）。図2において、10種全ての癌細胞株に対するクローン型判定データにおいて、VB6G4.24由来β TCR鎖のCDR3配列が出現していることから、このクローンは複数の癌細胞株に反応するが、IMP2ペプチド又はBST2ペプチドの認識によっては反応しない。
【００３２】
本発明のなおさらなる態様により、本発明の前記TCRをコードするベクターを提供する。
【００３３】
本発明のなおさらなる態様により、本発明の前記TCR又はT細胞又はT細胞クローン又はベクターを含む医薬組成物又は免疫原性物質又は二重特異性又はワクチンを提供する。
【００３４】
好ましい実施態様において、前記医薬組成物又は免疫原性物質又は二重特異性又はワクチンは、癌治療における使用のためのものである。
【００３５】
本発明のなおさらなる態様により、本明細書で開示する癌の治療における使用のための前記TCR又はT細胞又はT細胞クローン又はベクターを提供する。
【００３６】
本発明のなおさらなる態様により、癌を有する、又は癌を有する疑いのある個体における癌の治療方法であって、前記TCR又はT細胞又はT細胞クローン又はベクター又は医薬組成物又は免疫原性物質又は二重特異性又はワクチンを、治療するべき個体に投与することを含む、前記方法を提供する。
【００３７】
理想的には、前記癌はあらゆる種類のものである。最も理想的には、前記癌は：鼻咽頭癌、滑膜癌、肝細胞癌、腎癌、結合組織の癌、黒色腫、肺癌、腸癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、脳癌、咽頭癌、口腔癌、肝癌、骨癌、膵癌、絨毛癌、ガストリノーマ、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、T細胞白血病/リンパ腫、扁桃、脾臓、神経腫、フォンヒッペル・リンダウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、神経膠腫、乏突起神経膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨癌、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原発部位不明の癌、カルチノイド、胃腸管のカルチノイド、線維肉腫、乳癌、筋肉癌、パジェット病、子宮頸癌、卵巣癌、血液癌、結腸癌、直腸癌、食道癌、胆嚢癌、胆管細胞癌、頭部癌、眼癌、鼻咽頭癌、頸部癌、腎癌、ウィルムス腫瘍、肝癌、カポジ肉腫、前立腺癌、精巣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、皮膚癌、中皮腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、卵巣、内分泌、グルカゴノーマ、副甲状腺癌、陰茎癌、下垂体癌、軟部組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、絨毛性癌、胞状奇胎、子宮癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰癌、聴神経腫、菌状息肉腫、インスリノーマ、カルチノイド症候群、ソマトスタチノーマ、歯肉癌、心臓癌、口唇癌、髄膜癌、口癌、神経癌、口蓋癌、耳下腺癌、腹膜癌、咽頭癌、胸膜癌、唾液腺癌、舌癌、及び扁桃癌を含む、又はこれらからなる群から選択される。
【００３８】
最も好ましくは、前記癌は、膵癌、血液癌、卵巣癌、皮膚癌、乳癌、骨癌、腎癌、結腸癌、子宮頸癌、肝癌、前立腺癌、又は肺癌である。
【００３９】
本発明の好ましい方法において、前記TCR、細胞、クローン、又はベクターを、抗癌剤、例えばこれらに限定はされないが、二重特異性抗体と組み合わせて投与する。
【００４０】
本明細書における二重特異性の語は、2つの異なる種類の抗原に同時に結合することができる人工タンパク質である二重特異性モノクローナル抗体（BsMAb、BsAb）を指す。
【００４１】
あるいはなお、前記TCRは、癌細胞表面のそのリガンドと、及び同時にキラーT細胞などの免疫細胞と結合し、従ってこれを活性化させる免疫細胞活性化成分又はリガンドと結合させることを目的とした前記TCRを含む、二重特異性抗体の部分を形成し得る。
【００４２】
本発明のなおさらなる態様により、癌を治療するための医薬の製造における前記TCR又は細胞又はクローン又はベクターの使用を提供する。
【００４３】
本発明のなおさらなる態様により、癌の治療のための組合わせ治療薬であって：
a) 前記TCR又は細胞又はクローン又はベクター又は免疫原性物質又は二重特異性又はワクチンを、 
b) さらなる癌治療薬と組み合わせたものを含む、前記組合わせ治療薬を提供する。
【００４４】
本発明のなおさらなる態様により、抗癌T細胞を誘発することができ、理想的には例外は認めるものの、本発明の前記TCR又はその部分を認識し、かつ対象に投与された際に：エフェクターT細胞として働く抗癌T細胞及び/又は複数の癌ペプチド抗原がヒト白血球抗原（HLA）クラスI分子によって細胞表面に提示される際に前記ペプチド抗原を認識するT細胞の産生を刺激する抗癌ペプチド又はペプチド抗原を提供し、ここで前記癌抗原は互いに異なり、2以上の種類の癌を代表する。
【００４５】
さらなる態様により、又は好ましい実施態様において、抗癌ペプチドは：
【化１１】
2021529181.tif 000013
を含む、又はこれらからなる群から選択される。
【００４６】
最も理想的には、前記抗がんペプチドは
【化１２】
2021529181.tif 000014
である。なおより理想的には、前記ペプチドは前記ペプチドのうちの1つと80%又は90一致し、その結果1つ又は2つの置換、欠失又は付加を含む。
【００４７】
本発明のさらなる態様により、前記抗癌ペプチドを含むワクチンを提供する。
【００４８】
本発明のさらなる態様により、前記抗癌ペプチドを含む医薬組成物又は免疫原性物質又は二重特異性を提供する。
【００４９】
本発明のさらなる態様により、癌の治療方法であって、対象に抗癌ペプチドを、ネイティブな形態で、又はワクチン、医薬組成物、免疫原性物質、若しくは二重特異性として投与することを含む、前記方法を提供する。
【００５０】
本発明のさらなる態様により、癌の治療における使用のための抗癌ペプチドの使用を提供する。
【００５１】
本発明のさらなる態様により、癌を治療するための医薬の製造における抗癌ペプチドの使用を提供する。
【００５２】
本発明の好ましい実施態様において、前記癌は本明細書で開示した癌、特に皮膚癌又は黒色腫から選択される。
【００５３】
以下の特許請求の範囲及び本発明の先行する記述において、文脈により表現言語又は必要な意味のために別段に要求される場合を除き、「含む」という語、又は「含む」、若しくは「含んでいる」などの変形を、非排他的な意味で、すなわち言及された特徴の存在を特定するが、本発明の様々な実施態様におけるさらなる特徴の存在又は追加を排除しないように使用する。
【００５４】
本明細書中で引用するあらゆる特許又は特許出願を含むすべての参考文献は、参照により本明細書に組み込む。任意の参考文献が先行技術を構成することは容認しない。さらに、いずれの先行技術も当技術分野の共通一般知識の部分を構成することは容認しない。
【００５５】
本発明の各態様の好ましい特徴は、いずれかの他の態様と関連して説明することができる。
【００５６】
本発明の他の特徴は、以下の実施例から明らかとなる。一般的に、本発明は、本明細書（添付の特許請求の範囲及び図面を含む）に開示された特徴の任意の新規なもの、又は任意の新規な組合わせに拡張する。従って、本発明の特定の態様、実施態様、又は実施例と関連して記載される特徴、整数、特性、化合物又は化学成分は、本明細書に記載される任意の他の態様、実施態様又は実施例に不適合ではない限り、それに適用可能であると理解すべきである。
【００５７】
さらに、別段に言及しない限り、本明細書で開示する任意の特徴は、同じ又は同様の目的に役立つ代替の特徴によって置換することができる。
【００５８】
本明細書の記載及び特許請求の範囲の全体を通じて、文脈により別段に要求されない限り、単数形は複数を包含する。特に、不明確な冠詞が使用される場合、文脈により別段に要求されない限り、本明細書は複数形並びに単数形を意図するものとして理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
本発明の実施態様は、ここで以下を参照してのみ例として記載される：
【図１】転移性黒色腫のHLA A2+患者MM909.24の治療に使用される腫瘍浸潤性リンパ球（TIL）が、複数のHLA A2+癌細胞種を認識できることを示す。(A) TILは、異なる組織起源の自己黒色腫及び癌細胞株に対して試験した。(B) 自己黒色腫及びHLA A2+癌細胞株を用いたクロム放出細胞傷害性アッセイを表示する。細胞株は、それらの起源組織に応じて色分けされている（A)。インキュベーションから18時間後に比溶解率を表示する。(C) TILを示されたHLA A2+癌細胞株とともに5時間インキュベートし、活性化をモノクローナル抗体を用いたTNF及びCD107aの検出により評価するTAPI-0アッセイ。活性化ゲート（TNF+及び/又はCD107a+）をTIL単独対照に基づいて設定した。反応性T細胞をフローサイトメトリーで選別し、T細胞受容体（TCR）のα及びβ鎖の次世代配列決定に使用した。
【図２】癌細胞株並びに自己由来黒色腫（MM909.24）に反応することができるHLA A2+患者MM909.24のTIL由来機能性T細胞のT細胞受容体（TCR）β鎖のクローン型を示す。細胞は、示されているHLA A2+癌細胞株（図1）との5時間のインキュベーションの後に、機能に基づいて（CD107a及びTNF抗体を用いたTAPI-0アッセイ）選別し、TCR鎖のハイスループットIllumina配列決定に使用した。(A) TCR β鎖CDR3は左側に表示され、チャートの各網掛けされた青色のセグメントは、CDR3がチャートの上部に示されている癌細胞株に反応する集団中に存在していることを示す。5つのTCRは全ての癌に反応することが認められる。（B) 各セグメントの横に示す数の癌細胞株を認識したCDR3の比率を示す。例えば；2細胞株＝自己由来黒色腫＋1つの他の癌細胞株；10細胞株＝自己由来黒色腫＋9つの他の癌細胞株。HLA A2+自己由来黒色腫に反応するクローン型の50%超が、4以上の他の癌種にも反応する。
【図３】癌エピトープ発見のパイプラインを示す。この図は、複数の癌細胞種に反応するT細胞により認識されるペプチドを発見するために使用する戦略を示す。(A) CD8 T細胞を限界希釈法によりTIL MM909.24からクローニングし、続いて自己由来MM909.24黒色腫に対する細胞傷害性についてスクリーニングした。いくつかの事例において、他の癌細胞種もスクリーニング中に使用した。関心対象とするクローンを増殖させ、さらなるアッセイに使用した。(B) 重要なCD8 T細胞クローンについてコンビナトリアルペプチドライブラリスクリーニングを実施し、ペプチドの各位置におけるそれらのアミノ酸残基の選好性を明らかにした。模式図は、ペプチドサブライブラリで構成されるCPLライブラリの設計を示す；各サブライブラリは、ペプチドの定義位置に固定されたアミノ酸残基（白抜きの円）（20個のタンパク質生成アミノ酸のうち1個）を有し、同じサブライブラリの他の全ての位置は、ランダムに混合された残基とする（灰色の四角形）。（C) CPL データ（図5に例を示す）は、癌タンパク質データベース（草稿を準備中）をスクリーニングして、クローンが認識すると予測される候補ペプチドを選抜リスト化するために使用した。（D) CD8クローンによって認識される癌ペプチドを明らかにするための候補癌ペプチドの機能試験。
【図４】T細胞クローンCR24は、異なる組織を起源とする複数のHLA A2+癌細胞株を認識することができることを示す。TAPI-0アッセイを使用して、示されている癌細胞株に対するCR24の反応性を評価した。反応率（CD107a+及び/又はTNF+）を表示する。(A) CR24はHLA A2+黒色腫を認識するが、HLA A2陰性黒色腫を認識しない。(B) HLA A2を発現させると、白血病細胞株CIRを認識した。(C) 異なる組織を起源とする非黒色腫 HLA A2+細胞株の認識（キー）。
【図５】CD8 T細胞クローンCR24のコンビナトリアルペプチドライブラリ（CPL）スクリーニングを示す。デカマーCPLスクリーニングの各サブライブラリを二連でCR24とともにインキュベートし、抗原提示細胞としてTAP（抗原プロセシング関連トランスポーター）欠損細胞株T2を使用した。CR24のペプチド長選好性（10 mer）は、サイジングスキャンアッセイを用いて既に決定されていた（データは示さない）。終夜のインキュベーション後、上清を収集し、クローンの活性化をMIP1-β ELISAにより評価した。各グラフはCPLスクリーニングの1つのペプチド位置を示し、特定位置の固定アミノ酸（一文字コード）をx軸上に示す。緑色のバーは、CR24によって認識されるペプチドの1つ、メランA由来の
【化１３】
2021529181.tif 000015
のアミノ酸残基（残基26-35）を示す。CPLデータをカスタマイズ癌抗原ウェブツールを介して実行し、CR24によって認識される可能性が最も高い候補ペプチドを得た（図6）。
【図６】T細胞クローンCR24が異なる癌タンパク質由来の3つの異なるペプチドを認識することを示す。図4で実施したコンビナトリアルペプチドライブラリスクリーニングにより同定された候補ペプチドのうち、3つのペプチド：
【化１４】
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（T細胞によって認識される黒色腫抗原1/メラノサイト抗原（MART-1/メランA、残基26-35） http://www.iedb.org/epId/10987）、
【化１５】
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（骨髄間質抗原2（BST2、残基22-31）、及びインスリン様増殖因子2 mRNA結合タンパク質2（IMP2、残基367-376）由来の
【化１６】
2021529181.tif 000018
がCR24 によって認識された。3つのペプチド全てに共通する2つのアミノ酸残基は、キー中赤で示す。メランAペプチドは、黒色腫を認識するT細胞の標的として十分に記述されている。BST2ペプチドの9アミノ酸長バージョンは、過去記述されている（10： https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16569595）。IMP2ペプチドは、過去記述されていない新規エピトープである（草稿を準備中）。(A) CR24及び各ペプチドの滴定を用いた活性化アッセイ、終夜インキュベートし、上清をMIP-1β ELISAに使用した。(B) CR24をHLA A2四量体で染色し、各ペプチドについて同系TCRがこれらの抗原と結合できることを確認した。最適化された染色プロトコルを使用した。対照四量体は、HLA A2
【化１７】
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（プレプロインスリン残基15-24）とする。(C) CR24及び3つの癌ペプチドの由来となるタンパク質を発現する抗原提示細胞を用いた活性化アッセイ。細胞株MOLT3（自然のままHLA-A2陰性、メランA陰性、BST2陰性、及びIMP2陰性）に、HLA A2、メランA、BST2、IMP2、コラーゲンIV型のα2サブユニット、及びジカウイルス由来アンカーキャプシドタンパク質の発現用に遺伝子を形質導入した。コラーゲン及びジカタンパク質は、形質導入/無関係タンパク質対照として働かせた。CR24は、TNF ELISA用に収集したMOLT3細胞株及び上清の各々とともに終夜インキュベートした。
【図７】T細胞クローンCR24が少なくとも2つの抗原を介して自己由来黒色腫を認識することを示す。(A) 自己由来MM909.24黒色腫のメランA遺伝子をガイド（g）RNA及びCRISPR-Cas9を用いた除去の標的とした。
【化１８】
2021529181.tif 000020
ペプチドを含む野生型メランAアミノ酸配列を青で示す。メランA遺伝子座の配列決定により、両方の対立遺伝子での
【化１９】
2021529181.tif 000021
配列の下流のアーリーストップコドンに起因する遺伝子破壊が確認された。(B) 非コンジュゲート抗メランA抗体及びPEコンジュゲート二次抗体を用いたメランAの細胞内染色により、メランAタンパク質が存在しないことが確認された。(C&D) 野生型及びメランAノックアウト（KO）自己由来黒色腫を用いたTIL MM909.24（C）及びCR24（D）の活性化アッセイ（TNF及びCD107a抗体を用いたTAPI-0）。メランAペプチド
【化２０】
2021529181.tif 000022
をCR24の陽性対照として使用した。CR24は依然としてメランAの発現を欠き、従って
【化２１】
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の提示を欠いた自己由来黒色腫を認識することができ、このことから少なくとも1つの他のペプチド、最も可能性が高いのはBST2及び/又はIMP2由来のペプチドがCR24によって認識されたことが示唆される。
【図８】
【化２２】
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ペプチドに交叉反応するT細胞を健常ドナーから作製することができることを示す。(A) 2名のHLA A2+ドナー由来CD8 T細胞（一方のドナーからの代表的なデータを示す）を、メランA、BST2、又はIMP2ペプチドを含む、別個の培養物として刺激した（1）。刺激後2週間で各培養物を対照（プレプロインスリン15-24由来の
【化２３】
2021529181.tif 000025
）、メランA、BST2、及びIMP2四量体で染色した（2）。各試料の細胞染色率を示す。(B) 刺激したT細胞株の各々を、癌細胞株：MDA-MB-231（乳房）、MM909.24（黒色腫）、及びSaos-2（骨）を用いた終夜のIFNγ ELISpotアッセイで使用した。また、T細胞を単独でインキュベートした。50,000細胞当たりのスポット形成細胞（SFC）の数を示す。
【図９】多面的T細胞に対するスーパーアゴニストペプチドにより、野生型ペプチドよりも多くの癌ペプチド特異的T細胞が刺激されることを示す。候補のスーパーアゴニストは、CR24のCPLデータ（図5）及び予測アルゴリズム（ http://wsbc.warwick.ac.uk/wsbcToolsWebpage/user_cases.php);を使用して設計された。このアルゴリズムは、CPLデータ（2:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22952231）によって明らかにされたアミノ酸選好性に基づいて、スーパーアゴニストとして働く可能性が最も高いペプチドを同定する。ペプチドは、野生型ペプチドとは異なる配列であり、変化したペプチドリガンドと呼ばれる。上位10個のペプチドを(A)に示し、野生型のペプチド
【化２４】
2021529181.tif 000026
と位置6のグリシン（変化したペプチドリガンド（APL）1、3、4、6、7、8、及び10）又は位置6及び7のそれぞれグリシン及びイソロイシン（APL ペプチド2、5、及び9）を共有する（太字で示す）。(B) スーパーアゴニスト特性についてAPLを試験するために、WT及びAPLペプチドの各々を使用してHLA A2+健常ドナー由来CD8+ T 細胞を刺激した。各々のペプチドに対する反応の大きさは、
【化２５】
2021529181.tif 000027
の四量体でT細胞を染色することにより評価した。総じて、APL 5
【化２６】
2021529181.tif 000028
は試験した3名全てのドナーにわたりメランA、BST2、及びIMP2 T細胞の刺激時に最も効果的なスーパーアゴニストであるようであった。APL 2
【化２７】
2021529181.tif 000029
も、各ドナーにわたり効果を示した。
【図１０】スーパーアゴニストペプチド5番
【化２８】
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が、
【化２９】
2021529181.tif 000031
を認識することができる転移性黒色腫患者由来CD8 T細胞をより強く刺激したことを示す。患者37及び12から入手可能なPBMCの数が限られていたため、メランAペプチドのみをペプチド番号5との比較に使用した。患者37は現在、従来の治療又はTIL治療に反応せず、死亡している。患者12は治療を受けていた。(A) 
【化３０】
2021529181.tif 000032
（5番）ペプチドによるCD8+ T細胞の刺激後の
【化３１】
2021529181.tif 000033
四量体染色データ。無関係の
【化３２】
2021529181.tif 000034
四量体を無関係対照として使用した。(B) 自己由来黒色腫を使用して、患者37由来T細胞株について実施したクロム放出細胞傷害性アッセイ。表示するT細胞株対黒色腫細胞の比は、T細胞の総数に基づく。患者12由来の細胞は十分に利用できなかったため、殺傷アッセイは実施しなかった。(C) 
【化３３】
2021529181.tif 000035
の両方で刺激されるT細胞株について、Bと同様であるが、(A)に示す
【化３４】
2021529181.tif 000036
四量体陽性に従って細胞数を調整した細胞毒性アッセイより、3つの黒色腫細胞当たり2つの
【化３５】
2021529181.tif 000037
四量体+細胞を得た。P値は、対応のない片側t-検定結果について表示する。
【図１１】他の潜在的な多面的T細胞からの要約された予備データを示す。TIL患者MM909.24から増殖させたT細胞クローン（VB6G4.24、CR1、VB10）も、メランAペプチド
【化３６】
2021529181.tif 000038
を認識するが、BST2ペプチド
【化３７】
2021529181.tif 000039
も、IMP2ペプチド
【化３８】
2021529181.tif 000040
も、認識しない（外来ペプチドとしても、MOLT3によって発現させた形質導入タンパク質からも）。図2において、10種全ての癌細胞株に対するクローン型判定データにおいて、VB6G4.24由来β TCR鎖のCDR3配列が出現していることから、このクローンは複数の癌細胞株に反応するが、IMP2ペプチド又はBST2ペプチドの認識によっては反応しないことが示唆される。
【図１２】他の多面的T細胞のペプチド交差反応性を示す。クローンGD1及びGD2は、クローンCR24とは異なるペプチドを認識する。(A) 異なるドナーから増殖させたHLA A2により拘束されるクローンGD1及びGD2は、異なるT細胞受容体を発現するが、示されているように、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）及びMAGE C2由来の同じペプチドを認識する。赤のアミノ酸残基のみが各ペプチドに共通する。各ペプチドの濃度を下げることによる、各クローンを用いた終夜の活性化アッセイ。上清を収集し、MIP-1β ELISAに使用した。(B) 異なる組織を起源とする癌細胞株の認識のためのGD1の予備的スクリーニング。終夜の活性化アッセイ及びMIP-1β ELISA。(C) GD1 の優れた標的となる(B)で同定された細胞株を用いたクロム放出細胞傷害性アッセイ。4時間後及び終夜インキュベーション後に、評価した比溶解率。
【図１３】多面的癌特異的T細胞及びT細胞受容体は、正常な抗癌T細胞と異なることを示す。(A) 従来説では、抗癌T細胞は、TCRがAに示すように癌抗原由来のペプチドに結合するときに癌細胞を認識する。これらのT細胞は他の癌由来ペプチドに反応しない。(B) 従来説と異なり、多面的抗癌T細胞は、複数の異なる癌ペプチドを認識するTCRを有する。癌細胞及び発達過程の腫瘍が多面的T細胞から逃れることは、はるかに困難である。そのため、多面的TCRの使用は癌免疫療法戦略において望ましい。
【図１４】スーパーアゴニストペプチドである
【化３９】
2021529181.tif 000041
がより多くの比率の癌特異的T細胞を刺激し、自己由来癌を殺傷する能力が増強されたことを示す。(A) 腎細胞癌（RCC）及び慢性リンパ球性白血病（CLL）患者由来のCD8 T細胞は、28日間にわたり
【化４０】
2021529181.tif 000042
ペプチドを用いて刺激しないままとするか、刺激する。TAPI-0アッセイ（RCC患者）又は四量体染色（CLL患者）により、
【化４１】
2021529181.tif 000043
特異的T細胞の存在を実証した。
【化４２】
2021529181.tif 000044
で刺激したCD8は、刺激されていないT細胞よりも多くの自己由来癌細胞を殺傷した。(B) 急性骨髄性白血病（AML）患者及び2名のCLL患者由来のCD8 T細胞を刺激しないままとしたか、又は28日間にわたり野生型IMP-2
【化４３】
2021529181.tif 000045
ペプチドを用いて刺激した。IMP-2四量体を用いた解析より、
【化４４】
2021529181.tif 000046
が寛容を破り、より多くの比率のIMP-2細胞を誘導したのに反し、非刺激条件及びIMP-2刺激条件により、同程度の比率のIMP-2特異的T細胞が得られることが明らかとなった。CLL患者3由来のT細胞を殺傷アッセイにおいて使用し、
【化４５】
2021529181.tif 000047
により刺激されたT細胞はIMP-2で刺激されたCD8よりも多くのCLL細胞を殺傷した。
【図１５】多面的T細胞が、同じ癌細胞の表面の異なる癌特異的抗原由来の複数の異なるペプチドを認識する方法の模式図を示す。
【図１６】多面的T細胞がペプチドを追加的かつ低濃度で認識することを示す。多面的T細胞クローンCR24は
【化４６】
2021529181.tif 000048
由来のペプチドを認識する。CR24は3つ全ての個別のペプチドと10-6 Mで反応したが、ペプチドを10-8 Mとすると反応は低下した。しかしながら、CR24は、各ペプチドがペプチド混合物中で10-8 Mで存在するときに良好な活性化を示した。このことは、同一細胞により発現される異なるタンパク質由来の複数ペプチドの認識により、多面的T細胞が癌細胞を高感度で標的化することが可能となる仕組みを実証する。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
（詳細な説明）
（方法及び材料）
（一般的な細胞培養試薬及び細胞株）
2 mM L-グルタミン、100 U/mLペニシリン、及び100 μg/mLストレプトマイシンを含むRMPI-1640（R0と呼ぶ）に5%（R5）又は10%（R10）ウシ胎仔血清を補充した。T細胞培地は10 mM HEPES緩衝液、0.5×非必須アミノ酸、1 mMピルビン酸ナトリウム、20〜200 IU/mLのIL-2（Aldesleukin, Proleukin, Prometheus, San Diego, CA, USA）、及び25 ng/mLのIL-15（Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA）を加えたR10とした。R10についてのD10-F12培地を、DMEM-F12を使用して作製した。別途明記しない限り、組織培養試薬はLife Technologies社製（Carlsband, CA, USA）とした。細胞株C1R、T2、及びIM9はR10中浮遊細胞として培養した。悪性黒色腫細胞株Mel-526、Mel-624、FM-2、FM-56、SK-MEL-37、及びA-375は、R10中接着細胞として培養した。黒色腫MM909.24及び腎細胞癌RCC17は、CCITで治療された患者から得たものであり、それぞれR10及びD10-F12中で浮遊細胞として培養した。他の癌細胞株；乳腺癌MDA-MB-231（ATCC（登録商標）HTB-26（商標））及びMCF-7（ATCC（登録商標）HTB-22（商標））；前立腺癌 LnCAP（ATCC（登録商標）CRL-1740（商標））；結腸直腸癌COLO 205（ATCC（登録商標）CCL-222（商標））及びHCT116 (ATCC（登録商標）CCL-247（商標）；肺癌H69（ATCC（登録商標）HTB-119（商標））、肝細胞癌HepG2（ATCC（登録商標）HB-8065（商標））、子宮頸癌MS751（ATCC（登録商標）HTB-34（商標））、急性リンパ芽球性白血病MOLT3（ATCC（登録商標）CRL-1552（商標））、慢性骨髄性白血病K562（ATCC（登録商標）CRL-3344（商標））；骨髄腫/形質細胞腫U266（ATCC（登録商標）TIB-196（商標））、骨肉腫U-2 OS（ATCC（登録商標）HTB-96（商標））Saos-2（ ATCC（登録商標）HTB-85（商標））及びTK143（ATCC（登録商標）CRL-8303（商標））； HEK293T胎児腎細胞（ATCC（登録商標）CRL-1573（商標））、急性単球性白血病THP-1 (ATCC（登録商標）TIB-202（商標）)；並びに腎癌A-498（ATCC（登録商標）HTB-44（商標））は、ATCCによって記述されている通りに維持した。
【００６１】
（黒色腫腫瘍浸潤性リンパ球は、複数の癌細胞種を認識する）
ステージIV転移性黒色腫患者MM909.24は、Herlev病院、Copenhagenの癌免疫療法センター（Centre for Cancer Immunotherapy）（CCIT）で、短期腫瘍浸潤療法を受けた [1] 。これまで、この患者は持続的な寛解を経験している。クロム放出細胞傷害性アッセイを使用して、癌細胞株：自己由来黒色腫（MM909.24）、MDA-MB-231、MCF-7、LnCAP、及びRCC17に対する反応性を評価した。細胞株（1×106細胞）を30 μCiのクロム酸ナトリウム（51Cr）（Perkin Elmer、Waltham、MA、USA）で1時間標識し、1時間濾過し、続いてTILとともに終夜培養した。10:1のTIL対標的細胞（ウェル当たり2000細胞）比を使用した。終夜インキュベートした後、上清を収集し、シンチラントと混合し、かつmicrobetaカウンターを使用して読み取り、かつ比溶解能を計算した[2]。さらに、TNFプロセシング阻害剤-0（TAPI-0）アッセイを使用して癌細胞株を試験し[3]；TILをROで洗浄した培養物から収集し、R5培地中で終夜寝かせた。活性化アッセイの日に、細胞を収集し、続いて計数し、100,000個を96穴U底ウェルプレートのウェルで30 μM TAPI-0（Sigma-Aldrich）、抗TNF-PE-Vio770（商標）（クローンcA2、Miltenyi Biotech）抗体及び抗CD107a-PE（クローンH4A3、BD Biosciences）抗体とともにインキュベートした。癌細胞株を追加して、TIL対標的細胞比1：2を得た。上記の癌細胞株に加えて、以下：COLO 205、H69、HepG2、MS751、及びSaos-2も使用した。細胞を37℃で4-5時間インキュベートし、PBSを使用して1:40に希釈した2 μLのLIVE/DEAD固定可能死細胞染色液ViVid（Life Technologies）を用いてRTで5分間染色した。表面マーカーを検出するため、洗浄せずに抗体を各サンプルに直接追加した；抗CD8-APC（クローンBW135/80、Miltenyi Biotech）及び抗CD3-ペリジニンクロロフィル（PerCP）（クローンBW264/56、Miltenyi Biotech）。データをBD FACS Canto II（BD Biosciences）上で取得し、FlowJoソフトウェア（TreeStar Inc., Ashland, OR, USA）で解析した。活性化されたTIL（CD107a+及び/又はTNF+）は、BD FACS Aria（BD Biosciences、San Jose、CA、USA）により選別し、過去の記述の通りT細胞受容体（TCR）鎖の次世代配列決定に使用した[4]。
【００６２】
（オーファンCD8クローンによって認識されるペプチドを同定するための戦略） 
ペプチド特異性が不明なT細胞クローン（オーファンクローンと呼ぶ）を、T細胞培地中3名のドナー由来の50,000個の放射線照射された（3000-3100 cGy）同種異系の末梢血単核球（PBMC）及び1〜2 μg/mLのファイトヘマグルチニン（PHA）の入った96穴U底ウェルプレート中0.5細胞/ウェルで培養することにより、作製した。PBMCを、標準的な密度勾配遠心分離により血液から分離した。必要に応じて、塩化アンモニウム溶液を使用して赤血球を溶解した。血液はWelsh Blood Service（Pontyclun, Wales, UK）製の「バフィーコート」として入手した。全てのヒト組織は、英国ヒト組織法2004に準拠するCardiff大学のガイドラインに従って取得し、かつ取り扱った。自己由来黒色腫（MM909.24）及び場合によっては異なる組織を起源とする癌細胞株に対するT細胞クローンをスクリーニングした。関心対象とするクローンは、上記のPBMC及びPHA法を使用して、T25フラスコ中で多数に増殖させた。オーファンクローンが認識するペプチドを見つけるために、コンビナトリアルペプチドライブラリ（CPL）及び癌抗原データベースのスクリーニングを実施した。コンビナトリアルペプチドライブラリは、過去記述された通りに合成し、使用した[5,6]。簡潔に説明すると、長期保存は20 mM DMSOストックとして-80℃で行い、1 mMのワーキング希釈液はR0（血清を含まないR10）の入った密閉可能な（シリコーンシーリングマット、AxyGen（登録商標）AxyMat（商標）、Corning、New York 、US）2 mLの深い丸底ウェルプレート（AxyGen（登録商標）、Corning）中で作製し、これを4℃で保存し、続いて使用前に1300 rpmで1分間ボルテックスにかけ（MixMate（登録商標）, Eppendorf（登録商標）, Hamburg, Germany）、続いて遠心分離した（400g、5分）。各サブライブラリは、総ペプチド濃度に関して100 μMの濃度で使用した。CPL データは、癌に発現するタンパク質のアミノ酸配列を含むデータベースを介して実行した（草稿を準備中）。癌抗原データベースは、Warwick大学のシステム生物学センター（Systems Biology Centre）が運営するPI CPL（ペプチド同定コンビナトリアルペプチドライブラリ）ウェブツール（http://wsbc.warwick.ac.uk/wsbcToolsWebpage/user_cases.php）の部分としてオンラインで利用可能となる。データベースの候補ペプチドは、クローンに認識されるそれらの可能性に基づいて自動的にランク付けされ、上位20個をペプチド滴定アッセイで試験した。
【００６３】
（CR24 は複数の癌細胞種を認識する） 
HLA A2+黒色腫、MM909.24（自己由来）、Mel-526、Mel-624、及びHLA A2+非黒色腫、CIR-HLA A2、MDA-MB-231、Saos-2、U2OS、A498、TK143、HEK293T、COLO 205、HCT116、HeLa、HepG2、及びTHP1を、上記TAPI-0アッセイにおける標的細胞として使用した。HLA A2neg黒色腫FM-2及びFM-56、並びに野生型C1R（HLA A2neg）を対照として使用した。
【００６４】
（クローンCR24についてのコンビナトリアルペプチドライブラリ（CPL）及び癌抗原データベーススクリーニング）
CR24をR0中終夜おいた後、ウェル当たり30,000個をデカマーCPLのスクリーニングに使用した（詳細は上記を参照）。CR24のペプチド長選好性は、サイジングスキャンアッセイを用いて過去確立されている[7]（データは示さない）。T2細胞（ウェルあたり60,000個）を抗原提示細胞として使用した。アッセイをR5中で実施して、製造業者の指示書に従って、MIP-1β酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）用に上清を収集した（R&D Systems, Minneapolis, MN, USA）。
【００６５】
（CR24は、異なる癌タンパク質由来の3つのHLA A2に拘束されたペプチドを認識する）
CR24はR5中で終夜培養し、漸減濃度のペプチドが入った96穴U底ウェルプレートのウェルあたり30,000個を使用した。終夜インキュベートした後、製造業者の指示書に従いMIP-1β ELISA（R&D Systems、Minneapolis、MN、USA）に上清を使用した。四量体解析について、CR24（試料当たり20,000〜50,000個）をフローサイトメトリーに適した5 mLポリプロピレンチューブ中で染色した。細胞を50 nMダサチニブ（タンパク質キナーゼ阻害剤）を含む100 μLのFACS緩衝液（PBS+2% FBS）中37℃で30分間処理し、フィコエリスリン（PE）コンジュゲート四量体（0.5 μg）を試料に直接追加した後、氷上に移してさらに30分間おいた[8]。四量体を3 mLのFACS緩衝液で洗浄し（700 g、5分）、続いて0.5 μg（10 μg/mL）マウス抗PE非コンジュゲート抗体（クローンPE001, BioLegend, London, UK）で標識し、さらに20分間氷上においた[8]。CR24が内在の発現抗原を認識し得るかどうかを試験するために、MOLT3細胞を使用して様々なタンパク質を発現させた。コドン最適化された全長ヒトHLA A2（IMGT/HLA受託番号：HLA00005）、MLANA（メランA）（UniProtKB Q16655）、BST2（UniProtKB Q10589）、IGF2BP2（IMP2）（UniProtKB Q9Y6M1）、COL6A2（コラーゲンVI型のα2サブユニット）（UniProtKB P12110）、及びジカウイルス（Rio-U1）ancC（GenBank KU926309.2）遺伝子を合成し（Genewiz, South Plainfield, NJ, USA）、第三世代レンチウイルス形質導入ベクターpELNS（親切にもPennsylvania大学, PA, USAのJames Riley博士に提供いただいた）にクローニングした。pELNSベクターは自己切断2A配列により関心対象とする遺伝子から隔てられたラットCD2（rCD2）マーカー遺伝子を含む。過去に記述されているように、レンチウイルス粒子の生産、塩化カルシウムトランスフェクション、及びrCD2ベースの細胞精製を実施した[9]。
【００６６】
（クローンCR24は、メランAの発現を欠く自己由来黒色腫を認識することができる）
CR24が複数の抗原を介して自己由来黒色腫を標的化し得ることを実証するため、CRISPR/Cas9を使用してメランAの発現を除去するためのガイドRNAを、cripsr.mit.eduウェブツールを使用して設計し、適用し、かつメランA遺伝子を配列決定して破壊されたことを確認した（データは示さない）。メランAの細胞内染色を、製造業者の指示書に従いCytofix/Cytoperm（商標）試薬（BD Biosciences）を使用して実施した。非コンジュゲートウサギ抗メランA一次抗体（クローンEP1422Y）（Abcam, Cambridge, UK）を、PEコンジュゲートヤギ抗ウサギ二次抗体とともに使用した。野生型及びメランA KO MM909.24黒色腫を、TIL及びCR24の両方とともに上記の通り、TAPI-0アッセイに使用した。
【００６７】
（CR24と同じ3つのペプチドを認識するT細胞が健常HLA A2+ドナーに存在する）
T細胞ペプチドラインを作製するために、製造業者の指示書に従いCD8マイクロビーズ（Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany）を使用して、CD8 T細胞をHLA A2+ドナーのPBMCから精製した。精製されたCD8細胞（3×106）を、2 mL T細胞培地が入っているが、IL-15は含まない24ウェルプレート中自己由来CD8neg細胞（6〜8×106）とともに共インキュベートした。25 μMの各ペプチドを使用した。培養物は週に3回、培地の50%を交換された。四量体染色は上記の通り、チューブ当たり500,000細胞を用いて実施した。各T細胞株は、細胞株MDA-MB-231、黒色腫MM909.24及びSaos-2とのIFNγ酵素結合免疫吸着スポット（ELISpot）アッセイで使用した。ウェルあたり50,000個のT細胞及び15,000個の癌細胞を使用した。インキュベーションを48時間実施し、アッセイを製造業者の指示書に従って発色させた（Mabtech, Nacka Strand, Sweden）。
【００６８】
（スーパーアゴニストペプチドは、多面的T細胞を刺激して癌細胞認識能を向上させる）
CR24のCPLアッセイは上記の通り実施した。候補ペプチドアゴニストを、CR24 CPL及びオンラインアルゴリズム（ http://wsbc.warwick.ac.uk/wsbcToolsWebpage/user_cases.php）を使用して設計した。健常ドナー由来CD8 T細胞の刺激、四量体染色、及びクロム放出細胞傷害性アッセイを上記の通り実施した。
【００６９】
（他のメランAクローンはCR24によって認められたBST2及びIMP2ペプチドを認識しない）
CR24について先に記載したように、TAPI-0及び活性化アッセイ（ELISA）をVB6G4.24、CR1及びVB10について実施した。データを表形式で要約した。
【００７０】
（癌抗原hTERT及びMAGE C2由来ペプチドのクローン認識）
クローンGD1及びGD2を、異なるHLA A2+健常ドナーの末梢血から増殖させた。クローンを、漸減濃度のそれぞれのペプチドを用いて終夜活性化アッセイに使用し、上清を上記の通りMIP-1β ELISAに使用した。GD1及び標的細胞；K562、K562 HLA A2、CIR、CIR HLA A2、HEK 293T、MCF-7、COLO 205、U266、HCT116、Mel-526、Mel-624、SK-MEL-37、A375、IM9、及びLnCAPを用いて、終夜の活性化を実施した。上清を収集し、MIP-1β ELISAに使用した。細胞株MCF-7、U266、及びMEL-624を用いたクロム放出細胞傷害性アッセイを上記の通り実施した。インキュベーション時間を4時間及び終夜とし、様々なT細胞対標的細胞比を使用した。
【００７１】
（結果） 
1. 免疫療法に成功した転移性黒色腫患者由来の腫瘍浸潤性リンパ球（TIL）は、自己由来黒色腫並びに様々な癌：乳房、結腸、肺、肝臓、前立腺、子宮頸部、骨、及び腎臓を起源とするHLA A2+癌細胞株を殺傷し、かつ認識することができる（図1）。
【００７２】
2. 癌反応性TILのT細胞受容体クローン型判定から、同じT細胞が複数のHLA A2+癌細胞株を認識したことが明らかになった（図2）。50%のT細胞（TCR）は4種超の癌細胞株を認識し、かつ8.6%のT細胞（5つのTCR）は試験した10種全ての細胞株を認識した。汎癌細胞株認識を理解するためのさらなる実験より、単一のT細胞が異なる癌タンパク質を起源とする複数のペプチドを認識し得ることが発見された。
【００７３】
3. TIL由来T細胞のペプチド特異性をマッピングするために、まずT細胞をクローニングし、続いて様々な癌細胞株に対する反応性をスクリーニングした。クローンCR24は、自己由来黒色腫及び乳房、骨、腎臓、血液、結腸、子宮頸部、及び肝臓由来の癌細胞株に対する反応性を示した（図4）。HLA A2neg黒色腫及び野生型CIR細胞（HLA A2neg）が認識されなかったため、この反応性はHLA A2に仲介されたものである。
【００７４】
4. CR24のコンビナトリアルペプチドライブラリ及び癌抗原データベーススクリーニング（図3に記載）（図5）により、CR24によって認められると予測される複数のペプチドが明らかとなり（データは示さない）、そのうちの3つが外因性ペプチドとして試験した場合に認識される（図6）。また、CR24には、3つのペプチドを含むHLA A2四量体で染色された（図6）。ペプチド：メランA（残基26-35）由来
【化４７】
2021529181.tif 000049
、BST2（残基22-31）由来
【化４８】
2021529181.tif 000050
、及びIMP2（残基367-376）由来
【化４９】
2021529181.tif 000051
。これらのデータは、CR24が異なる癌タンパク質由来の異なるペプチドに対して交叉反応性を有することを実証する。
【００７５】
5. CR24は、メランA、BST2、又はIMP2のいずれかを安定的に発現させた抗原提示細胞（MOLT3）を認識することができるため（図6）、CR24によって認識されたペプチドは内在に発現するタンパク質からプロセシングされ、提示される。
【００７６】
6. 癌細胞が2以上の異なる癌抗原を介してそれらを標的とするT細胞から逃れることは極めて困難である。逃れるためには、全ての標的について、全ての同系ペプチドの提示を低下させ、又は除去する突然変異を同時に有することが要求されるためである。これを実証するために、本発明者らは自己由来黒色腫（MM909.24）を標的化してメランA遺伝子を除去した。このことは、メランAタンパク質発現を欠く抗体染色結果により確認された（メランAノックアウト（KO）（図7）。患者MM909.24由来TIL及びクローンCR24の両方が、メランAノックアウト黒色腫を認識した（図7）。野生型自己由来腫瘍に対する反応率は、CR24について71%であり、メランA KOについては55%であった。CR24がBST2及び/又はIMP2ペプチドを介してメランA KO黒色腫を認識している可能性が高く、そのために黒色腫の破壊を仲介することができる。
【００７７】
7. CR24によって認められるメランA、BST2、及びIMP2ペプチドを認識可能なCD8 T細胞は、健常HLA A2+ドナーの末梢血から作製することができる（図8）。
【００７８】
8. 多面的T細胞用に設計されたスーパーアゴニストは、WTペプチドを用いた並行刺激と比較して、
【化５０】
2021529181.tif 000052
ペプチドを認識可能なCD8 T細胞をより大きな比率で刺激した。スーパーアゴニスト
【化５１】
2021529181.tif 000053
（ペプチド5）は、試験した全てのドナー（n＝3）において、メランA、BST2、IMP2反応性T細胞を誘導したため、このペプチドは候補スーパーアゴニストの中で刺激時に最も有効なペプチドであるようだった（図9B）。さらに、
【化５２】
2021529181.tif 000054
は、転移性黒色腫患者由来のメランA
【化５３】
2021529181.tif 000055
T細胞の刺激について、また腎細胞癌（RCC）及び慢性リンパ球性白血病（CLL）患者（図14A）、及び急性骨髄性白血病（AML）患者（図14B）においても、
【化５４】
2021529181.tif 000056
と比較して優れていた。重要なのは、
【化５５】
2021529181.tif 000057
スーパーアゴニストペプチドで刺激されたT細胞は、WTメランAペプチドで刺激されたT細胞よりも優れた自己由来黒色腫細胞の溶解を示すことである（図10B及び10C）。
【００７９】
9. 2名の健常HLA A2+ドナーの末梢血から増殖させたクローン（GD1及びGD2）は、CR24により認識されるペプチドとは異なるペプチドと交叉反応する。これらのペプチドは、 CR24 T 細胞クローンにより認識されるタンパク質とは異なるタンパク質に由来する：ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）由来
【化５６】
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（残基855-873）及び黒色腫関連抗原C2（MAGE C2）（残基336-344）由来
【化５７】
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。GD1は乳癌、血液癌、及び黒色腫の癌細胞株を殺傷した（図9）。
【００８０】
（結論）
現在の統一的見解では、癌特異的T細胞は、細胞表面でHLAと会合したペプチドとして提示された単一ペプチド抗原を介して癌細胞を認識することとされている（図10A）。本発明者らは、一部の希少なT細胞が2以上のアミノ酸によって配列が異なり、かつ異なる癌抗原に由来する複数のペプチドエピトープを介して癌細胞を認識することができることを発見した（図10B）。癌がこの種の多面的T細胞から逃れることは、非常に困難であるものと見込まれる。
【００８１】
（参考文献）
【化５８】
2021529181.tif 000060
【図１Ａ−Ｂ】
2021529181.tif 000063
【図１Ｃ】
2021529181.tif 000064
【図２Ａ】
2021529181.tif 000065
【図２Ｂ】
2021529181.tif 000066
【図３】
2021529181.tif 000067
【図４】
2021529181.tif 000068
【図５−１】
2021529181.tif 000069
【図５−２】
2021529181.tif 000070
【図６】
2021529181.tif 000071
【図７Ａ−Ｂ】
2021529181.tif 000072
【図７Ｃ−Ｄ】
2021529181.tif 000073
【図８】
2021529181.tif 000074
【図９Ａ】
2021529181.tif 000075
【図９Ｂ】
2021529181.tif 000076
【図１０Ａ】
2021529181.tif 000077
【図１０Ｂ−Ｃ】
2021529181.tif 000078
【図１１】
2021529181.tif 000079
【図１２Ａ】
2021529181.tif 000080
【図１２Ｂ−Ｃ】
2021529181.tif 000081
【図１３】
2021529181.tif 000082
【図１４Ａ】
2021529181.tif 000083
【図１４Ｂ】
2021529181.tif 000084
【図１５】
2021529181.tif 000085
【図１６】
2021529181.tif 000086
【手続補正書】
【提出日】令和3年4月19日(2021.4.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021529181000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年4月19日(2021.4.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１Ａ−Ｂ】
2021529181.tif 000087
【図１Ｃ】
2021529181.tif 000088
【図２Ａ】
2021529181.tif 000089
【図２Ｂ】
2021529181.tif 000090
【図３】
2021529181.tif 000091
【図４】
2021529181.tif 000092
【図５−１】
2021529181.tif 000093
【図５−２】
2021529181.tif 000094
【図６】
2021529181.tif 000095
【図７Ａ−Ｂ】
2021529181.tif 000096
【図７Ｃ−Ｄ】
2021529181.tif 000097
【図８】
2021529181.tif 000098
【図９Ａ】
2021529181.tif 000099
【図９Ｂ】
2021529181.tif 000100
【図１０Ａ】
2021529181.tif 000101
【図１０Ｂ−Ｃ】
2021529181.tif 000102
【図１１】
2021529181.tif 000103
【図１２Ａ】
2021529181.tif 000104
【図１２Ｂ−Ｃ】
2021529181.tif 000105
【図１３】
2021529181.tif 000106
【図１４Ａ】
2021529181.tif 000107
【図１４Ｂ】
2021529181.tif 000108
【図１５】
2021529181.tif 000109
【図１６】
2021529181.tif 000110
【国際調査報告】
2021529181.tif 000111
2021529181.tif 000112
2021529181.tif 000113