(57)【要約】  本発明は、脂肪シンターゼ阻害剤およびその適用を開示し、医学生物学の技術分野に属する。本発明の脂肪酸シンターゼ阻害剤は、脂肪酸シンターゼの活性を有意に阻害することができ、かつ、正常な発現に影響を与えず、細胞内の脂肪酸の割合を調整することができる。本発明の脂肪酸シンターゼ阻害剤はまた、良好な腫瘍増殖阻害効果を有し、腫瘍細胞の成長サイクルを間期に停止させ、腫瘍細胞分裂を組織化し、腫瘍細胞増殖を阻害し、腫瘍細胞のアポトーシスを促進することができ、腫瘍に対して治療効果を発揮し、腫瘍や代謝関連疾患の治療に使用でき、重要な臨床適用の見通しがある。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪酸シンターゼ阻害剤の調製における一般式（I）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩の適用であって、
2021530439.tif 000023
ここで、
2021530439.tif 000024
は単結合または二重結合であり、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、ヒドロキシル、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルキル、およびＣ１−Ｃ４アルコキシのいずれかから選択される、
環Ａは、
2021530439.tif 000025
であり、Ｕ、Ｖ、Ｚはそれぞれ独立して、ＣＨ、Ｎ、ＮＨから選択され、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アリールオキシ、およびアルコキシのいずれかから選択され、Ｒ３とＲ４は同時に水素ではない、
Ｑは、少なくとも１つのヘテロ原子、またはヘテロ原子を含まないＣ１−５直鎖または分岐炭化水素基であり、前記ヘテロ原子はそれぞれ独立して、窒素、酸素、硫黄から選択される、
Ｌはケト基またはイミノ基である、
Ｗは、−（ＣＨ２）ａ、−（ＣＨ２）ａＣ（Ｏ）−、−（ＣＨ２）ａ−ＯＣ（Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）Ｏ−のいずれかから選択され、ここで、ａは０〜３の自然数である、
Ｘは、−Ｎ（Ｒ）ｍＮ（Ｒ）ｎ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ｎ−または−Ｎ（Ｒ）ｎＣ（Ｏ）−から選択され、ｍとｎはそれぞれ独立して０または１であり、Ｒは独立して、水素、ハロゲンまたはフェニルであり、Ｙは、窒素、酸素または硫黄から選択されることを特徴とする
脂肪酸シンターゼ阻害剤の調製における一般式（I）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩の適用
【請求項２】
前記一般式（I）における環Ａは、単環式アリール、ナフチル、［１，８］ナフチリジニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾトリアゾリル、インドリル、ベンゾ−１，３−ジオキソリル、ベンゾジオキサニル、ベンゾチアジアゾリル、インダゾリル、ベンゾフラニル、キノリニル、イソキノリニル、オキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジルまたはオキサゾロ［５，４−ｃ］ピリジルであることを特徴とする
請求項１に記載の適用。
【請求項３】
前記一般式（I）におけるＱは、末端基が−Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−ＮＲＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、−ＯＣ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）Ｏ−であるＣ１〜５の直鎖または分岐炭化水素基から選択されることを特徴とする
請求項１に記載の適用。
【請求項４】
前記一般式（I）におけるＱは、末端基が−Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−ＮＲＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、−ＯＣ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）Ｏ−であるＣ１〜５の直鎖または分岐炭化水素基から選択されることを特徴とする
請求項２に記載の適用。
【請求項５】
前記一般式（Ｉ）で表される化合物の薬理学的に許容される塩は、乳酸塩、塩酸塩、リン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩またはアスパラギン酸塩を含むことを特徴とする
請求項１〜４のいずれか１項に記載の適用。
【請求項６】
前記一般式（Ｉ）におけるＷは−ＣＨ２−または−Ｃ（Ｏ）−であることを特徴とする
請求項１〜４のいずれか１項に記載の適用。
【請求項７】
前記一般式（Ｉ）におけるＷは−ＣＨ２−または−Ｃ（Ｏ）−であることを特徴とする
請求項５に記載の適用。
【請求項８】
前記医薬組成物は、請求項１に記載の一般式（Ｉ）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を含むことを特徴とする
脂肪酸シンターゼを阻害するための医薬組成物。
【請求項９】
脂肪酸代謝疾患のための治療薬の調製における適用であることを特徴とする
請求項１に記載の一般式（Ｉ）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項１０】
癌または免疫疾患のための治療薬の調製における適用であることを特徴とする
請求項１に記載の一般式（Ｉ）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項１１】
前記治療薬の剤形は、煎じ薬、丸薬、粉末、軟膏、ペレット、薬用ワイン、シロップ、抽出物、錠剤、スティラス、座薬、麹、灸などを含み、さらに、錠剤、顆粒、サシェ、経口溶液、カプセル、滴下丸剤、混合物、チンキ剤、エアロゾル、フィルム、注射、点滴などの現代の剤形を含むことを特徴とする
請求項１または９または１０に記載の適用。
【請求項１２】
前記治療薬はまた、結合剤、充填剤、崩壊剤、潤滑剤、抗酸化剤、矯正剤、香料、共溶媒、乳化剤、可溶化剤、浸透圧調整剤など、他の薬理学的に許容される補助物質を含むことを特徴とする
請求項１または９または１０に記載の適用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療バイオテクノロジーの分野に属し、具体的には、脂肪酸シンターゼ阻害剤およびその適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
人体内の一部の脂肪酸は外界から摂取された外因性脂肪酸に直接由来するものであり、その他は、体内で合成される内因性脂肪酸である。脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳＮ）は、生体内での内因性脂肪酸の合成プロセス中の重要な酵素であり、アセチル−ＣｏＡとマロニル−ＣｏＡを触媒して長鎖脂肪酸を生成する。ＦＡＳＮは、アセチルトランスフェラーゼ（ＡＴ）、マロニルトランスフェラーゼ（ＭＴ）、β−ケトアシルシンターゼ（ＫＳ）、β−ケトアシルレダクターゼ（ＫＲ）、β−ヒドロキシアシルデヒドラターゼ（ＨＤ）、エノイルレダクターゼ（ＥＲ）およびチオエステラーゼ（ＴＥ）などという７つの機能ドメインを含み、タイプＩとタイプＩＩという２つのサブタイプに分けることができる。細菌と植物のＦＡＳＮは、上記の７つの機能ドメインが独立した酵素として集合した多酵素系であるタイプＩＩに属し、ヒトと他の哺乳類のＦＡＳＮは、上記の７つの機能ドメインからなる一本鎖多機能酵素であるタイプＩに属し、単一の遺伝子によってコードされ、相対分子量は２５０ｋｕである。一般に、ＦＡＳＮは、肝臓と脂肪などの様々な組織で発現することができ、炭水化物を脂肪酸に合成してトリグリセリドの形で保存する機能がある。ＦＡＳＮは、いくつかの特別な機能もあり、例えば、授乳中にチオエステラーゼと共存すると、ＦＡＳＮは赤ちゃんが消化しやすい中鎖脂肪酸を生成するように機能している。通常の生理学的条件下では、ＦＡＳＮは食事とホルモンによって調節される。炭水化物の摂取、甲状腺、インスリン、グルココルチコイドはすべて、ＦＡＳＮと脂肪酸合成をアップレギュレートできる一方で、不飽和脂肪酸、ｃＡＭＰ、およびグルカゴンはＦＡＳＮと脂肪酸合成をダウンレギュレートする。
【０００３】
近年、ＦＡＳＮは肥満と密接に関連していることが発見された。ＦＡＳＮは、人間の肝臓と脂肪組織、特に肝臓で高度に発現し、その脂肪酸合成能は脂肪組織の８〜９倍であり、そして発現量は摂取成分とホルモン量の影響を受け、炭水化物含有の食事は、ＦＡＳＮの高発現を刺激することにより、脂肪の生成を誘導する。したがって、ＦＡＳＮ阻害剤の開発は、肥満治療のための新しい方法として期待される。ＦＡＳＮ固有の小分子阻害剤は、ＦＡＳＮを阻害することで脂肪酸の合成を低減でき、そして、脂肪酸合成が阻害されるため、その基質であるマロニル−ＣｏＡの濃度が増加し、視床下部の摂食中枢に直接作用し、摂食を促進する神経ペプチドＹの分泌を阻害し、それにより摂食阻害につながる。同時に、肝臓と脂肪組織などの末梢組織では、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ−１の活性を高めることができ、それにより、脂肪酸の酸化とエネルギー消費を高め、過剰な体脂肪の代償的消費による減量という目標を達成する。動物実験はまた、ＦＡＳＮ阻害剤がインスリン非依存性糖尿病を改善し、高血圧、冠状動脈塞栓症およびその他の肥満合併症の症状を軽減し、発生率を低減できることを示す。
【０００４】
１９８０年代以降、研究者らは乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮内膜癌などの他の組織でＦＡＳＮを発見し、そしてＦＡＳＮの発現は正常組織よりもはるかに高くなる。研究により、ＦＡＳＮの阻害またはその発現の減少により、腫瘍細胞の増殖を効果的に制御できるか、またはアポトーシスを誘導できることが示される。現在のところ、ＦＡＳＮが腫瘍を調節するメカニズムは明確ではないが、ＦＡＳＮを阻害して細胞増殖に必要な構造脂質とエネルギーを低減させることが腫瘍細胞アポトーシスの原因であると考えている研究者もいる。細胞内のマロニル−ＣｏＡ濃度の増加が、ＦＡＳＮを阻害して腫瘍細胞のアポトーシスを引き起こす主な原因であると推測している研究者もいる。ＦＡＳＮ阻害剤を使用した後、腫瘍細胞がＧ０期で停滞し、脂肪酸合成が細胞周期に関連していることを示す研究もある。ＦＡＳＮの阻害は、腫瘍細胞のＤＮＡ複製を迅速かつ大幅に阻害でき、Ｓ期を遅延させ、これは、脂肪酸合成経路とＤＮＡ合成の活動が腫瘍細胞の増殖に関連していることを示す。
【０００５】
ＦＡＳＮは肥満患者の肝臓と脂肪細胞、様々な腫瘍患者の腫瘍細胞で高発現し、ＦＡＳＮはそのような疾患を研究するための新しい薬物標的となっている。ＦＡＳＮ阻害剤の研究は、内因性脂肪酸の生合成を阻害し、さらに、腫瘍、肥満および関連する様々なメタボリックシンドロームの発生と発症を効果的に制御することは非常に重要である。
【発明の概要】
【０００６】
上記課題を問題するために、本発明は、下記一般式（Ｉ）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩など、脂肪酸シンターゼ阻害剤の調製における一般式（I）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩の適用を提供し、
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ここで、
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は単結合または二重結合であり、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、ヒドロキシル、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルキル、およびＣ１−Ｃ４アルコキシのいずれかから選択される、
環Ａは、
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であり、Ｕ、Ｖ、Ｚはそれぞれ独立して、ＣＨ、Ｎ、ＮＨから選択され、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、ハロゲン、ヒドロキシル、アリールオキシ、およびアルコキシのいずれかから選択され、破線は、含有または非含有を示し、すなわち、環Ａは置換フェニル基または置換ベンゾ複素環基である、
Ｑは、少なくとも１つのヘテロ原子、またはヘテロ原子を含まないＣ１−５直鎖または分岐炭化水素基であり、前記ヘテロ原子はそれぞれ独立して、窒素、酸素、硫黄から選択される、
Ｌはケト基またはイミノ基である、
Ｗは、−（ＣＨ２）ａ、−（ＣＨ２）ａＣ（Ｏ）−、−（ＣＨ２）ａ−ＯＣ（Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）Ｏ−のいずれかから選択され、ここで、ａは０〜３の自然数である、
Ｘは、−Ｎ（Ｒ）ｍＮ（Ｒ）ｎ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ｎ−または−Ｎ（Ｒ）ｎＣ（Ｏ）−から選択され、ｍとｎはそれぞれ独立して０または１であり、Ｒは独立して、水素、ハロゲンまたはフェニルである、
Ｙは、窒素、酸素または硫黄から選択される。
【０００７】
本発明の一実施形態では、前記環Ａは、単環式アリール、ナフチル、［１，８］ナフチリジニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾトリアゾリル、インドリル、ベンゾ−１，３−ジオキソリル、ベンゾジオキサニル、ベンゾチアジアゾリル、インダゾリル、ベンゾフラニル、キノリニル、イソキノリニル、オキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジルまたはオキサゾロ［５，４−ｃ］ピリジルである。
【０００８】
本発明の一実施形態では、前記Ｑは、末端基が−Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−ＮＲＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−、−Ｎ（Ｒ）  ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−、−ＯＣ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）Ｏ−であるＣ１−５の直鎖または分岐鎖の炭化水素基である。
【０００９】
本発明の一実施形態では、前記Ｑは、少なくとも１つの二重結合を含む。
【００１０】
本発明の一実施形態では、前記一般式（Ｉ）で表される化合物の薬理学的に許容される塩は、乳酸塩、塩酸塩、リン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩またはアスパラギン酸塩を含む。
【００１１】
本発明の一実施形態では、前記一般式（Ｉ）で表される化合物は、以下の構造から選択される、
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本発明により提供される一般式（Ｉ）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩は、脂肪酸シンターゼの活性を阻害し、脂肪酸組成を調節する役割を果たす脂肪酸シンターゼ阻害剤として使用することができる。
【００１２】
本発明の第二目的は、上記一般式（Ｉ）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を、癌、脂肪酸代謝疾患または免疫疾患のための治療薬の調製または開発に適用することである。
【００１３】
本発明の第三目的は、上記一般式（Ｉ）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を含む、脂肪酸代謝疾患のための治療薬の調製または開発を提供することである。
【００１４】
前記脂肪酸代謝疾患は、肥満、心脳血管疾患、高脂血症、原発性肥満、肺高血圧症、ホジキン病、過敏性腸症候群、脳血管障害、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、糸球体腎炎、ウイルス感染症から選択される。
【００１５】
本発明の第四目的は、上記一般式（Ｉ）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を含む、癌治療薬の調製または開発を提供することである。
【００１６】
前記癌は、卵巣癌、乳癌、子宮癌、結腸癌、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌、精巣癌、胸腺癌、皮膚癌、膀胱癌、膵臓癌、白血病、リンパ腫、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、多発性骨腫癌、扁平上皮癌、腎臓癌、尿道癌、気管支癌、食道癌、骨癌、咽頭癌、膀胱癌、甲状腺癌、肝臓癌、頭頸部癌、眼癌、皮膚癌、口腔癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、脳癌および中枢神経系癌から選択される。
【００１７】
本発明の第五目的は、上記一般式（Ｉ）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を含む、免疫疾患のための治療薬の調製または開発を提供することである。
【００１８】
前記免疫疾患は、多発性硬化症、中枢神経系損傷、炎症性腸疾患、関節リウマチ、変形性関節症、乾癬、全身性エリテマトーデス、移植片対宿主病、喘息および慢性閉塞性肺疾患から選択される。
【００１９】
前記治療薬の剤形は、煎じ薬、丸薬、粉末、軟膏、ペレット、薬用ワイン、シロップ、抽出物、錠剤、スティラス、座薬、麹、灸などの従来の剤形を含み、さらに、錠剤、顆粒、サシェ、経口溶液、カプセル、滴下丸剤、混合物、チンキ剤、エアロゾル、フィルム、注射、点滴などの現代の剤形を含む。
【００２０】
前記治療薬はまた、結合剤、充填剤、崩壊剤、潤滑剤、抗酸化剤、矯正剤、香料、共溶媒、乳化剤、可溶化剤、浸透圧調整剤など、他の薬理学的に許容される補助物質を含む。
【００２１】
本発明により提供される技術的解決手段は、以下の利点を有する、
（１）本発明の一般式Ｉで表される構造の化合物またはその薬理学的に許容される塩は、脂肪酸シンターゼ阻害剤を調製するために使用でき、ＦＡＳＮの酵素活性を阻害でき、新しいタイプのＦＡＳＮ阻害剤である。ＦＡＳＮは細胞脂質代謝の主要な酵素として、腫瘍の発生と悪化に関与している。ＦＡＳＮは、腫瘍細胞のエネルギー代謝、細胞周期調節、上皮間葉転換などの制御に重要な役割を果たし、腫瘍診断のマーカーや治療標的となることが期待されている。ＦＡＳＮ阻害剤は、腫瘍細胞における内因性脂肪酸の生合成を阻害することにより、癌の発生と悪化を効果的に制御できる。したがって、本発明の脂肪酸シンターゼ阻害剤は、ＦＡＳＮの酵素活性に対して明らかな阻害効果を有し、腫瘍細胞の成長サイクルを間期に停止させ、組織腫瘍細胞を分裂させ、腫瘍細胞の増殖を抑制し、腫瘍細胞のアポトーシスを促進し、腫瘍に対する治療効果を発揮でき、重要な臨床応用の見通しを有する。
（２）本発明の脂肪酸シンターゼ阻害剤は、脂肪酸の組成と比率を調整でき、脂肪酸代謝疾患または免疫系疾患の治療に適用することができる。
（３）本発明の脂肪酸シンターゼ阻害剤により調製される医薬組成物は、脂肪酸酵素に対して明らかな阻害効果を有し、腫瘍細胞の細胞周期停止を引き起こし、そして、生きているマウスのエンドソームの移植腫瘍を大幅に低減させ、脂肪滴の形成を阻害できる。したがって、上記の医薬組成物は、重要な腫瘍治療の見込みのある薬物であり、癌または脂肪酸代謝疾患のための新しい治療アプローチを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、前立腺癌細胞ＰＣ３におけるＦＡＳＮの発現に対する式Ｉによって表される化合物の効果を示す。
【図２】図２は、様々な腫瘍細胞の増殖に対する式Ｉによって表される化合物の効果を示す。
【図３】図３は、前立腺癌細胞ＰＣ３の成長サイクルに対する式Ｉによって表される化合物の効果を示す。
【図４】図４は、前立腺癌細胞ＰＣ３の分裂に対する式Ｉによって表される化合物の効果を示す。
【図５】図５は、様々な癌細胞の脂肪酸組成に対する式Ｉによって表される化合物の効果を示す。
【図６】図６は、前脂肪細胞ｏｐ９における脂肪滴の合成に対する式Ｉによって表される化合物の効果を示す。
【図７】図７は、線虫の脂肪滴の蓄積に対する式Ｉによって表される化合物の効果を示す。
【図８】図８は、マウス前立腺癌細胞ＰＣ３の移植腫瘍に対する式Ｉによって表される化合物の効果を示す。
【図９】図９は、式Ｉ−１によって表される脂肪酸シンターゼ阻害剤の水素核磁気スペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
実施例１  式Ｉ−１の化合物の合成
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具体的な合成方法は次のとおりであり、
（１）中間体１である化合物５−（４−ブロモフェニルアミノ）−５−カルボニル吉草酸の合成：
５−エトキシ−５−カルボニル吉草酸（２ｇ，１２．５ｍＭ）、塩化メチレン（３０ｍＬ）を１００ｍＬのシングルネックフラスコに加え、氷浴で０°Ｃに冷却して塩化チオニル（３ｇ，２５ｍＭ）をゆっくりと加え、室温まで温めた後、加熱して還流させた。反応溶液を急冷し、スピン乾燥させて４４．９％の収率で中間体１生成物１ｇを得た。
（２）中間体２である化合物５−（４−ブロモフェニルアミノ）−５−カルボニルバレレートエチルの合成：
ｐ−ブロモアニリン（１．１５ｇ，６．７ｍｍｏｌ）、ジクロロメタン（１５ｍＬ）、およびトリエチルアミン（０．８５ｇ，８．４ｍｍｏｌ）を１００ｍＬのシングルネックフラスコに加え、温度を０℃に下げ、中間体１（１ｇ，５．６ｍｍｏｌ）をゆっくりと滴下して室温で一晩撹拌した後、ＴＬＣは反応の終了を示し、反応液をオレフィン塩酸（１５ｍＬ）、炭酸水素ナトリウム水溶液（１５ｍＬ）で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸留して、６８％の収率で１．２ｇの中間体２を得た。
（３）中間体３である化合物Ｎ−（４−ブロモフェニル）−５−ヒドラジノ−５−カルボニルペンタンアミドの合成：
中間体２（０．５ｇ，１．６ｍｍｏｌ）、ヒドラジン水和物（８０％，０．６ｇ，９．５ｍｍｏｌ）、エタノール（５ｍＬ）を２０ｍＬのリザーバーフラスコに加え、９０℃に加熱して２時間還流する。ＴＬＣは反応の終了を示し、溶媒を減圧下で蒸発させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル＝１００：１〜３：１）を使用して、８３％の収率で０．４ｇの中間体３を得た。
（４）化合物Ｉ−１の合成：
中間体３（０．４ｇ，１．３ｍｍｏｌ）、５−ブロモ−２−ヒドロキシベンズアルデヒド（０４ｇ，１．９５ｍｍｏｌ）、水酸化ナトリウム（０．５２ｇ，１３ｍｍｏｌ）、およびメタノール（５ｍＬ）を２０ｍＬのリザーバーフラスコに加え、室温で３日間撹拌した。反応溶液を濾過し、スピン乾燥させて粗生成物を得て、これをＤＭＦでスラリー化して８０％の収率で０．５ｇの生成物を得た。
【００２４】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，４００ＭＨｚ）δ：１．８５（ｔ，２Ｈ）、２．２７（ｄ，１Ｈ）、２．３５（ｔ，２Ｈ）、２．６４（ｔ，１Ｈ）、６．８３（ｍ，１Ｈ）、７．４０（ｍ，２Ｈ）、７．５４（ｍ，２Ｈ）、７．２３（ｄ，１Ｈ）、１０．０３（ｄ，２Ｈ）、１０．３４（ｓ，１Ｈ）、１１．２４（ｄ，１Ｈ）、１１．６９（ｓ，１Ｈ）、マススペクトル（ＭＳ＋）：４８２、４８３ｍ／ｚ：［Ｍ＋１，Ｍ＋２］。
【００２５】
実施例２  式Ｉ−２の化合物の合成
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（１）４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ブタン酸の合成：
４−アミノ酪酸（２ｇ，１９．４ｍｍｏｌ，１．０  ｅｑ）、ＴＨＦ（１５ｍＬ）、水（１５ｍＬ）、水酸化ナトリウム（１．６ｇ，３８．８ｍｍｏｌ）を１００ｍＬのシングルネックフラスコに加え、０°Ｃに冷却し、（Ｂｏｃ）２Ｏ（５．１ｇ，２３．３ｍｍｏｌ）をゆっくりと滴下し、滴下後、２５°Ｃで１２時間撹拌した。反応が完了した後、回転蒸発させてＴＨＦを除去し、１５ｍＬの水を加え、酢酸エチル（１０ｍＬ）で抽出して過剰な（Ｂｏｃ）２Ｏを除去し、水相をクエン酸または二塩酸でｐＨを２〜３に調整し、酢酸エチル（１５ｍＬ）で抽出し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、スピン乾燥させて８８％の収率で３．５ｇの生成物を得た。
（２）Ｎ−（４−ブロモフェニル）−４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ブタンアミドの合成：
ｐ−ブロモアニリン（１ｇ，５．８ｍｍｏｌ）、ジクロロメタン（１５ｍＬ）、およびトリエチルアミン（０．７６ｇ，７．４ｍｍｏｌ）を１００ｍＬのシングルネックフラスコに加え、０℃に冷却し、中間体１（１ｇ，５．６ｍｍｏｌ）をゆっくりと滴下し、室温で一晩撹拌し、ＴＬＣは反応の終了を示し、反応溶液をオレフィン性塩酸（１５ｍＬ）、重炭酸ナトリウム水溶液（１５ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸留して、６１％の収率で１．２ｇの生成物Ｎ−（４−ブロモフェニル）−４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ブタンアミドを得た。
（３）４−アミノ−Ｎ−（４−ブロモフェニル）−ブチルアミドの合成：
中間体２（０．５ｇ，１．４ｍｍｏｌ）、ジクロロメタン（５ｍＬ）を１００ｍＬのシングルネックフラスコに加え、０°Ｃに冷却し、トリフルオロ酢酸（１．５ｍＬ）をゆっくりと滴下し、室温で３時間撹拌した。ＴＬＣは反応の終了を示し、飽和重炭酸ナトリウムで反応溶液のｐＨを７に調整し、層を分離し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、スピン乾燥させて６９．４％の収率で０．２５ｇの生成物４−アミノ−Ｎ−（４−ブロモフェニル）−ブタンアミドを得た。
（４）化合物Ｉ−２の合成：
トリホスゲン（１１４ｍｇ、０．３８５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５  ｍＬ）に溶解し、温度を−１０°Ｃに下げ、２−メトキシ−５−ブロモベンジルアミン（２３８ｍｇ，１．１  ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（３ｍＬ）溶液をゆっくりと滴下し、その後、−１０℃で３０分間撹拌した。次に、温度を０℃に上げ、４−アミノ−Ｎ−（４−ブロモフェニル）−ブタンアミド（２８０ｍｇ，１．１ｍｍｏｌ）のＤＣＭ−ＴＨＦ溶液を加えた。加えた後、室温で一晩放置した。ＴＬＣは反応の終了を示し、飽和炭酸水素ナトリウムで反応溶液のｐＨを７に調整し、層を分離し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、スピン乾燥させて粗生成物を得て、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル＝１００：１〜３：１）で精製して、３７％の収率で０．２ｇのＩ−２を得る。
【００２６】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，４００ＭＨｚ）δ：１．６４（ｍ，２Ｈ）、２．３１（ｔ，２Ｈ）、３．０４（ｔ，２Ｈ）、３．８０（ｓ，３Ｈ）４．１４（ｄ，２Ｈ）、６．１６（ｔ，１Ｈ）、６．２６（ｔ，１Ｈ）、６．９１（ｄ，１Ｈ）、７．２２（ｓ，１Ｈ）、７．３６（ｄ，１Ｈ）、７．４０（ｍ，２Ｈ）、７．６２（ｍ，２Ｈ）、１０．１１（ｓ，１Ｈ）。マススペクトル（ＭＳ＋）：４９９、５０１、ｍ／ｚ：［Ｍ＋２，Ｍ＋４］。
【００２７】
実施例３  式Ｉ−３の化合物の合成
化合物Ｉ−３の構造は以下のとおりであり、
2021530439.tif 000009
化合物Ｉ−２（０．６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解し、温度を−２０°Ｃに下げ、ＢＢｒ３（０．９ｍｍｏｌ）をゆっくりと加える。その後、室温で３時間撹拌した。ＴＬＣは反応の終了を示した。水（１５ｍＬ）でクエンチし、ＤＣＭ（１５ｍＬ）で抽出し、有機相を乾燥させた後、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、スピン乾燥させて粗生成物を得て、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル＝１００：１〜３：１）で精製して６９％の収率で２００ｍｇのＩ−３化合物を得た。
【００２８】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，４００ＭＨｚ）δ：１．６５（ｍ，２Ｈ）、２．３１（ｔ，２Ｈ）、３．０５（ｔ，２Ｈ）、４．１３（ｄ，２Ｈ）、６．２２（ｔ，１Ｈ）、６．４６（ｔ，１Ｈ）、６．７４（ｔ，１Ｈ）、７．２０（ｍ，２Ｈ）、７．５２（ｍ，２Ｈ）、７．６０（ｍ，２Ｈ）、１０．０５（ｓ，１Ｈ）、１０．１２（ｓ，１Ｈ）。マススペクトル（ＭＳ＋）：４８５、４８７、ｍ／ｚ：［Ｍ＋２、Ｍ＋４］。
【００２９】
実施例４  式Ｉ−４の化合物の合成
2021530439.tif 000010
具体的な合成は、次のステップを含み、
（１）２−ホルミルオキシ−５−ブロモ安息香酸の合成：
５−ブロモ−２−ヒドロキシフェニル酢酸（４．６ｍｍｏｌ）、無水酢酸（９．２ｍｍｐｌ）を５０ｍＬのシングルネックフラスコに加え、濃硫酸を１滴加えた。室温で３時間反応させた。反応終了後、反応液を氷水に注ぎ、固体を分離し、濾過し、乾燥させて、８３．３％の収率で１ｇの２−ホルミルオキシ−５−ブロモ安息香酸を得た。
（２）２−クロロホルミルベンゼン−４−ブロモ安息香酸メチルエステルの合成：
２−ホルミルオキシ−５−ブロモ安息香酸（３．８６ｍｍｏｌ）、ジクロロメタン（１０ｍＬ）を５０ｍＬのシングルネックフラスコに加え、温度を０°Ｃに下げ、塩化チオニル（４．６４ｍｍｏｌ）をゆっくりと滴下し、還流して２時間撹拌し、反応が完了した後、反応溶液をスピン乾燥させて、８３．３％の収率で１ｇの２−クロロホルミルベンゼン−４−ブロモ安息香酸メチルを得た。
（３）以下の中間体４である化合物の合成：
実施例１の中間体３化合物（０．６４ｇ，２．１２ｍｍｏｌ）、テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）、およびトリエチルアミン（２５７ｍｇ，２．５４ｍｍｏｌ）を５０ｍＬのシングルネックフラスコに加え、温度を０°Ｃに下げ、２−クロロホルミルベンゼン−４−ブロモ安息香酸メチル（５９３ｍｇ，１．９２ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（６ｍＬ）をゆっくりと滴下し、室温で一晩撹拌した。反応が完了した後、２５ｍＬの水を加え、ＨＣｌ（１Ｎ）で反応溶液のｐＨを４に調整し、酢酸エチルで抽出し、有機相を廃棄した。炭酸ナトリウムで水相のｐＨを９に調整し、酢酸エチル（３×１０  ｍＬ）を使用し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、スピン乾燥させて粗生成物を得て、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール＝１００：１〜５：１）で精製し、６０％の収率で７６３ｍｇの中間体４である化合物を得た。
（４）化合物Ｉ−４の合成
中間体４（７６３ｍｇ，１．４ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（１ｇ，７．２ｍｍｏｌ）、メタノール（１０ｍＬ）を５０ｍＬのシングルネックフラスコに加え、室温で一晩撹拌した。反応が完了した後、反応溶液を濾過し、窒素でブロー乾燥させ、１５ｍＬの水を加え、酢酸エチル（３×１０ｍＬ）で抽出し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、スピン乾燥させて粗生成物を得て、この粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール＝１００：１〜５：１）で精製し、８０％の収率で５６５ｍｇの化合物Ｉ−４を得た。
【００３０】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，４００ＭＨｚ）δ：１．８１（ｍ，２Ｈ）、２．２５（ｍ，２Ｈ）、２．４４（ｍ，２Ｈ）、６．８５（ｍ，１Ｈ）、７．４８（ｍ，２Ｈ）、７．５３（ｍ，３Ｈ）、８．０１（ｓ，１Ｈ）、１０．０５（ｄ，１Ｈ）、１０．３２（ｓ，１Ｈ）、１０．５〜１１．８（１Ｈ）。マススペクトル（ＭＳ＋）：４９９、５０１、ｍ／ｚ：［Ｍ＋２，Ｍ＋４］。
【００３１】
実施例５  式Ｉ−５の化合物の合成
2021530439.tif 000011
具体的な合成は、次のステップを含み、
（１）５−ブロモ−２−ベンジルオキシフェニル酢酸メチルの合成：
５−ブロモ−２−ヒドロキシフェニル酢酸メチルエステル（１ｇ，４．３２ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（１．２ｇ，８．６４ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（１０ｍＬ）を５０ｍＬのシングルネックフラスコに加え、室温で１０分間撹拌した後、臭化ベンジル（０．７４ｍｇ，４．３２ｍｍｏｌ）を加えた。室温で２時間撹拌し、ＴＬＣは、反応の終了を示した。反応溶液に２０ｍＬの水を加え、１ｎ塩酸でｐＨを４に調整し、酢酸エチル（２×１０ｍＬ）で抽出し、有機相を廃棄した。水相を炭酸ナトリウムでｐＨを８に調整し、酢酸エチル（３×１０ｍＬ）で抽出し、有機相を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、スピン乾燥させて１．１ｇの５−ブロモ−２−ベンジルオキシフェニル酢酸メチルエステルを８０％の収率で得た。
（２）５−ブロモ−２−ベンジルオキシベンジルアルコールの合成：
中間体１（１．１ｇ，３．４ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ（１１ｍＬ）、およびＬｉＯＨ水溶液（５ｍＬ）を５０ｍＬのシングルネックフラスコに加えた。室温で一晩撹拌し、ＴＬＣは反応の終了を示した。反応液中のＴＨＦ溶液をスピン乾燥させて、水相を酢酸エチルで洗浄し、ｐＨを２〜３に調整し、濾過して乾燥させて、８０％の収率で０．８４ｇの５−ブロモ−２−ベンジルオキシベンジルアルコールを得た。
（３）５−ブロモ−２−ベンジルオキシクロロメチルベンゼンの合成：
５−ブロモ−２−ベンジルオキシベンジルアルコール（１ｇ，３．８６ｍｍｏｌ）、ジクロロメタン（１０ｍＬ）を５０ｍＬのシングルネックフラスコに加え、温度を０℃に下げ、塩化チオニル（５６０ｍｇ，４．６４ｍｍｏｌ）をゆっくりと滴下し、還流して２時間撹拌し、反応が完了した後、反応溶液をスピン乾燥させて、８５％の収率で０．７６ｇの生成物５−ブロモ−２−ベンジルオキシクロロメチルベンゼンを得た。
（４）化合物Ｉ−５の合成：
実施例１の中間体３（０．７ｇ，２．５８ｍｍｏｌ）、テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）、およびトリエチルアミン（２５７ｍｇ，２．５４ｍｍｏｌ）を５０ｍＬのシングルネックフラスコに加え、温度を０°Ｃに下げ、５−ブロモ−２−ベンジルオキシクロロメチルベンゼン（０．７６ｇ，２．３４ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（８ｍＬ）をゆっくりと滴下した。室温で一晩撹拌した。反応が完了した後、２５ｍＬの水を加え、ＨＣｌ（１ｎ）で反応溶液のｐＨを４に調整し、酢酸エチルで抽出して有機相を廃棄した。炭酸ナトリウムで水相のｐＨを９に調整し、酢酸エチル（３×１０ｍＬ）で抽出し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、スピン乾燥させて粗生成物を得て、この粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール＝１００：１〜５：１）で精製して７５％の収率で１．０３ｇのＩ−５を得た。
【００３２】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，４００ＭＨｚ）δ：１．８６（ｍ，２Ｈ）、２．２５（ｍ，２Ｈ）、２．３７（ｍ，２Ｈ）、５．２７（ｓ，２Ｈ）、７．１０（ｍ，１Ｈ）、７．３８（ｍ，１Ｈ）、７．４５（ｍ，２Ｈ）、７．５０（ｍ，４Ｈ）、７．５９（ｍ，２Ｈ）、７．６４（ｍ，１Ｈ）、７．７０（ｍ，１Ｈ）、１０．０７（ｓ，２Ｈ）、１０．１４（ｓ，１Ｈ）。マススペクトル（ＭＳ＋）：５８９、５９１、ｍ／ｚ：［Ｍ＋２，Ｍ＋４］。
【００３３】
実施例６  式Ｉ−６の化合物の合成
2021530439.tif 000012
具体的な合成は、次のステップを含み、
（１）４−カルボニル−４−（フェニルアミノ）酪酸メチルの合成：
５．８ｍｍｏｌのアニリンと８．４ｍｍｏｌの２−ヒドロ−３ヒドロ−ピラン−２，６−ジオン（ｃａｓ番号１０８−５５−４）を２５０ｍｌの３ネックフラスコに加え、１５ｍＬの有機溶媒ＡｃＯＨの存在下で、中間体５−（４−ブロモフェニルアミノ）−５−カルボニル吉草酸を合成した。０〜２０℃の温度で、中間体１を８０％の反応収率で生成した。
（２）４−カルボニル−４−（フェニルアミノ）酪酸の合成：
２０ｍｌのメタノール、４−カルボニル−４−（フェニルアミノ）酪酸メチル（１ｇ）、ＮａＯＨ（０．８ｇ）を５０ｍｌのフラスコに加え、７０℃で５時間加熱還流し、室温に冷却し、１Ｍ希塩酸を加えてＰｈを４に調整し、酢酸エチルで抽出し、有機相を分離して乾燥させ、減圧下で濃縮すると、４−カルボニル−４−（フェニルアミノ）酪酸を得た。
（３）４−カルボニル−４−（フェニルアミノ）ブタンアミドの合成：
２０ｍｌのＤＭＦ、４−カルボニル−４−（フェニルアミノ）酪酸（０．５ｇ）、ＨＯＢＴ（０．３ｇ）、ＥＤＣ（０．３ｇ）を５０ｍｌのフラスコに加え、室温で５時間撹拌し、塩化アンモニウム（０．２５ｇ）を加え、室温で２４時間撹拌し、２０ｍｌの水を加え、酢酸エチルで抽出し、有機相を分離して乾燥させ、減圧下で濃縮すると、４−カルボニル−４−（フェニルアミノ）ブタンアミド生成物を得た。
（４）式Ｉ−６の化合物の合成：
２０ｍＬのリザーバーフラスコに４−カルボニル−４−（フェニルアミノ）ブタンアミド（１．３ｍｍｏｌ）、ベンズアルデヒド（１．９５ｍｍｏｌ）、水酸化ナトリウム（０．５２ｇ，１３ｍｍｏｌ）、メタノール（５ｍＬ）を加え、室温で３日間撹拌した。反応溶液を濾過し、スピン乾燥させて粗生成物を得て、ＤＭＦでパルプ化して８５％の収率で０．３ｇの生成物を得た。  得られた生成物の水素ＮＭＲスペクトルデータは以下のとおりであり、
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，４００ＭＨｚ）δ：２．６０（ｔ，２Ｈ）、２．７８（ｔ，２Ｈ）、７．０７（ｔ，１Ｈ）、７．３０（ｔ，２Ｈ）、７．５５（ｔ，２Ｈ）、７．５６（ｄ，２Ｈ）  ）、７．７６（ｄ，２Ｈ）、９．２４（ｓ，１Ｈ）、９．９７（ｓ，１Ｈ）。
【００３４】
実施例７  式Ｉ−７の化合物の合成：
2021530439.tif 000013
具体的な合成ステップについては実施例６を参照し、ステップ（４）のベンズアルデヒドを塩化ベンゾイルに置き換えて、Ｉ−７化合物を得た。収率は８１％であった。
【００３５】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，４００ＭＨｚ）δ：２．５５（ｔ，２Ｈ）、２．６０（ｔ，２Ｈ）、７．０７（ｔ，１Ｈ）、７．３０（ｔ，２Ｈ）、７．５５（ｔ，２Ｈ）、７．５６（ｄ，２Ｈ）、７．９９（ｄ，２Ｈ）、９．９７（ｓ，１Ｈ）、１１．６９（ｓ，１Ｈ）。
【００３６】
実施例８  式Ｉ−８の化合物の合成：
2021530439.tif 000014
具体的な合成ステップについては実施例６を参照し、ステップ（４）のベンズアルデヒドのみをフェニルアセトアルデヒドに置き換えた。収率は８３％であった。
【００３７】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，４００ＭＨｚ）δ：２．６０（ｔ，２Ｈ）、２．７８（ｔ，２Ｈ）、３．３９（ｓ，２Ｈ）、７．０７（ｔ，１Ｈ）、７．２２（ｔ，１Ｈ）、７．２４（ｄ，２Ｈ）、７．２７（ｔ，２Ｈ）、７．３０（ｔ，２Ｈ）、７．５６（ｄ，２Ｈ）、８．５０（ｔ，１Ｈ）、９．９１（ｓ，１Ｈ）。
【００３８】
実施例９  式Ｉ−９の化合物の合成：
2021530439.tif 000015
尿素を１００ｍｌのシングルネックフラスコに加え、１３．５ｍｍｏｌの４−カルボニル−４−（フェニルアミノ）ブチリルクロリドと１．５ｇのＮａＯＨを加え、フラスコの口をシーリングし、１時間反応させ、次に６．８ｍｍｏｌの塩化ベンゾイルを加えて１時間反応させた。反応溶液に２０ｍｌの水を加え、酢酸エチルで抽出し、有機相を乾燥させ、減圧下で蒸発乾固させ、粗生成物をカラムクロマトグラフィーに通して、８３％の収率で最終生成物を得た。
【００３９】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，４００ＭＨｚ）δ：２．５５（ｔ，２Ｈ）、２．６０（ｔ，２Ｈ）、７．０７（ｔ，１Ｈ）、７．３０（ｔ，２Ｈ）、７．５５（ｔ，２Ｈ）、７．５６（ｄ，２Ｈ）、７．９９（ｄ，２Ｈ）、９．９７（ｓ，１Ｈ）、１０．９１（ｓ，２Ｈ）。
【００４０】
実施例１０  式Ｉ−１０の化合物の合成：
2021530439.tif 000016
具体的な合成ステップについては実施例６を参照し、ステップ（４）のベンズアルデヒドのみを２−ヒドロキシ−５−ブロモフェニルアセトアルデヒドに置き換え、収率は８４％であった。
【００４１】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，４００ＭＨｚ）δ：２．６０（ｔ，２Ｈ）、２．７８（ｔ，２Ｈ）、６．８１（ｄ，１Ｈ）、７．３８（ｄ，１Ｈ）、７．５２（ｄ，４Ｈ）、７．５９（ｓ，１Ｈ）、９．２４（ｓ，１Ｈ）、９．９７（ｓ，１Ｈ）、１２．７２（ｓ，１Ｈ）。
【００４２】
実施例１１  式Ｉ−１１の化合物の合成：
2021530439.tif 000017
６．７ｍｍｏｌの４−（（４−ブロモフェニル）アミノ）−４−カルボニルブチリルクロリドを１００ｍｌのシングルネックフラスコに加え、８．４ｍｍｏｌの５−ブロモ−２−ヒドロキシベンゼン（ホルム）アミドと０．８５ｇのトリエチルアミンを加え、反応溶液に２０ｍｌの水を加え、酢酸エチルで抽出し、有機相を乾燥させ、減圧下で蒸発乾固させ、粗生成物をカラムクロマトグラフィーに通して式Ｉ−１１の最終生成物を得た。収率は８３％であった。
【００４３】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，４００ＭＨｚ）δ：２．５５（ｔ，２Ｈ）、２．６０（ｔ，２Ｈ）、６．８８（ｄ，１Ｈ）、７．５２（ｄ，４Ｈ）、７．６６（ｄ，１Ｈ）、８．００（ｓ，２Ｈ）、９．９７（ｓ，１Ｈ）、１１．１１（ｓ，１Ｈ）、１１．６９（ｓ，１Ｈ）。
【００４４】
実施例１２  式Ｉ−１２の化合物の合成：
2021530439.tif 000018
２．２ｍｍｏｌのＮ−（４−ブロモフェニル）−５−ヒドラジノ−５−カルボニルペンタンアミドを１００ｍｌのシングルネックフラスコに加え、１３ｍｍｏｌの５−ブロモ−２−ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドと１．５ｇのＮａＯＨを加え、フラスコをシーリングし、３日間反応させ、生成物を濾過し、減圧下で蒸発乾固させて、最終生成物を得た。収率は８３％であった。
【００４５】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，４００ＭＨｚ）δ：２．６０（ｔ，２Ｈ）、２．７８（ｔ，２Ｈ）、３．３９（ｄ，２Ｈ）、７．２５（ｄ，１Ｈ）、７．４３（ｓ，１Ｈ）、７．５２（ｄ，４Ｈ）、８．５０（ｔ，１Ｈ）、９．６８（ｓ，１Ｈ）、９．９７（ｓ，１Ｈ）。
【００４６】
実施例１３  式Ｉ−１３の化合物の合成：
2021530439.tif 000019
化合物Ｉ−１３の合成ステップは化合物Ｉ−９と同じであり、塩化ベンゾイルのみを２−ヒドロキシ−５−ブロモベンゾイルクロリドで置き換えて８１％の収率で化合物Ｉ−１３を得た。
【００４７】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，４００ＭＨｚ）δ：２．５５（ｔ，２Ｈ）、２．６０（ｔ，２Ｈ）、６．８８（ｄ，１Ｈ）、７．５２（ｄ，４Ｈ）、７．６６（ｄ，１Ｈ）、８．００（ｓ，１Ｈ）、８．９２（ｄ，２Ｈ）、９．９７（ｓ，１Ｈ）、１０．９１（ｓ，１Ｈ）、１１．１１（ｓ，１Ｈ）、１１．７７（ｓ，１Ｈ）。
【００４８】
実施例１４  式Ｉ−１４の化合物の調製：
2021530439.tif 000020
１．９ｍｍｏｌのＮ−（４−ブロモフェニル）−５−ヒドラジノ−５−カルボニルバレルアミドを１００ｍｌのシングルネックフラスコに加え、４．３２ｍｍｏｌの５−ブロモ−２−ヒドロキシベンズアルデヒド、３ｇのＮａＯＨを追加し、フラスコの口をシーリングし、３日間反応させ、生成物を濾過し、減圧下で蒸発乾固させて、７３％の収率で最終生成物を得た。
【００４９】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，４００ＭＨｚ）δ：２．１３（ｍ，２Ｈ）、２．３４（ｔ，２Ｈ）、２．３９（ｔ，２Ｈ）、６．９０（ｄ，１Ｈ）、７．３８（ｄ，１Ｈ）、７．５２（ｄ，４Ｈ）、７．８０（ｓ，１Ｈ）、８．７８（ｓ，１Ｈ）、１０．０５（ｓ，１Ｈ）、１１．０７（ｓ，１Ｈ）、１１．１９（ｓ，１Ｈ）。
【００５０】
実施例１５
2021530439.tif 000021
１ｍｍｏｌの化合物Ｉ−３と１．９２ｍｍｏｌのトリエチルアミンを１００ｍｌのシングルネックフラスコに加え、２．１６ｍｍｏｌの臭化ベンジルを氷浴で加え、室温で２時間撹拌し、生成物を濾過し、減圧下で蒸発乾固させて８５％の収率で最終生成物を得た。
【００５１】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，４００ＭＨｚ）δ：２．０１（ｍ，２Ｈ）、２．４４（ｔ，２Ｈ）、３．３８（ｔ，２Ｈ）、４．４３（ｄ，２Ｈ）、５．１８（ｍ，２Ｈ）、６．０２（ｓ，２Ｈ）、６．８６（ｍ，１Ｈ）、７．１９（ｍ，１Ｈ）、７．３５（ｍ，４Ｈ）、７．４８（ｍ，２Ｈ）、７．５６（ｍ，２Ｈ）、７．８７（ｍ，１Ｈ）、７．７０（ｍ，２Ｈ）。
【００５２】
実施例１６
結腸癌細胞ＨＣＴ１１６中のＦＡＳＮ活性に対する以下の式Ｉ−１で表される化合物の効果を検出し、
ＦＡＳＮ酵素活性の検出：
（１）対数期の細胞を収集し、細胞懸濁液の濃度を調整し、２×１０６細胞／皿あたり直径６ｃｍのペトリ皿を使用することが適切であった。
（２）５％のＣＯ２、３７°Ｃでインキュベートし、細胞が完全に付着した後、元の培地を廃棄し、２０μＭの化合物Ｉ−１を含む６ｍｌの１％ＦＢＳ培地を細胞の各皿に加え、２０μＭのセルレニンを含む６ｍｌの１％ＦＢＳ培地を陽性対照として加えた。
（３）４時間インキュベートした後、上澄みを廃棄し、トリプシンで２分間消化し、トリプシンの２〜４倍量の完全培地で消化を停止し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄みを廃棄し、細胞を５ｍｌのＤＰＢＳに再懸濁し、５００μｌを取って１．５ｍｌのＥＰチューブでタンパク質を定量化し、残りを遠心分離して上澄みを廃棄した。
（４）細胞をｐＨ６．５である１ｍｌの１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／ＫＯＨのバッファー（４ｍＭ  ＤＴＴ、０．３ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、２．５Ｍｍ  ＥＤＴＡを含む）に再懸濁し、ＮＡＤＰＨ、アセチルコエンザイムＡおよびマロニルコエンザイムＡをそれぞれ０．１４ｍＭ、０．１８ｍＭ、０．０９ｍＭの最終濃度になるように加え、３４０ｎｍでその吸光度値を測定し、測定時間は１分であった。
【００５３】
ＦＡＳＮ酵素活性の定義：活性単位の定義：３７℃で１分間にタンパク質１ミリグラムあたり１μｍｏｌのＮＡＤＰＨ酸化は１Ｕである。
ＦＡＳＮ（Ｕ／ｍｇタンパク質）＝［（ΔＡ測定チューブ−ΔＡブランクチューブ）］÷ε÷ｄ×Ｖ合計×１０６］÷（Ｃｐｒ×Ｖサンプル）÷Ｔ＝１．１６×（ΔＡ測定チューブ−ΔＡブランクチューブ）÷Ｃｐｒ、
ＦＡＳＮ酵素活性（阻害率）に対する阻害剤の効果は、ＦＡＳＮ（％）＝［１−（ＦＡＳＮ阻害剤÷ＦＡＳＮ対照）］×１００％として定義され、
ここで、εはＮＡＤＰＨモル吸光係数６．２２×１０３ｌ／ｍｏｌ／ｃｍで、ｄはキュベット光路１ｃｍで、Ｖ合計は反応システムの総容量１０００μＬ＝０．００１Ｌで、Ｃｐｒは上澄みタンパク質濃度ｍｇ／ｍｌで、Ｖサンプルは反応系に加えた上澄みの量１００μｌ＝０．１ｍｌで、Ｔは反応時間１分で、ＦＡＳＮ阻害剤は各阻害剤で治療した細胞のＦＡＳＮ酵素活性で、ＦＡＳＮ対照は阻害剤治療なしの細胞ＦＡＳＮ酵素活性である。
【００５４】
ＩＣ５０値の測定
ＩＣ５０（最大阻害濃度の半分）は、測定されたアンタゴニストの半分の阻害濃度を指す。これは、特定の濃度の特定の薬物または物質（阻害剤）が腫瘍細胞のアポトーシスを５０％誘導することを示すことができ、該濃度は５０％の阻害濃度と呼ばれ、すなわち、細胞の総数に対するアポトーシス細胞の比率が５０％に等しい場合に対応する濃度である。ＩＣ５０の値は、薬物がアポトーシスを誘導する能力を測定するために使用でき、すなわち、誘導能力が強いほど、値は低くなり、特定の細胞の薬物に対する耐性の程度を示すこともできる。
（１）対数期の細胞を回収し、細胞懸濁液の濃度を調整し、９６ウェルプレートでは、ウェルあたり１００μｌを使用するのが適切であり、シードプレートでは、測定されるべき細胞の密度を１０００〜１００００細胞／ウェルに調整し、エッジウェルを滅菌ＰＢＳで満たした。
（２）３７°Ｃで５％のＣＯ２の中で細胞をインキュベートし、細胞が完全に付着した後、元の培地を廃棄し、０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、５μＭおよび１０μＭの化合物Ｉ−１またはセルレニン（Ｃｅｒｕｌｅｎｉｎ）を含む２００μｌの１ｗｔ％ＦＢＳ培地を各ウェルに加え、ウェルの数は6であった。陰性対照として等量のＤＭＳＯを加えた。
（３）７２時間インキュベートした後、写真を撮って細胞の状態を記録し、元の培地を廃棄し、０．５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド、商品名はチアゾールブルー）を含む無血清培地１００μｌを各ウェルに加えた。
（４）２〜４時間インキュベートした後、元の培地を廃棄し、各ウェルに１５０μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加え、３００ｒｐｍで１０分間振とうして紫色の結晶を完全に溶解させた。
（５）酵素結合免疫測定法で各ウェルのＯＤ５７０ｎｍでの吸光度を測定し、そしてＯＤ６３０ｎｍでの吸光度を参照として、二波長測定を行い、生存率の結果は、次の式で計算され、
細胞生存率＝（ＯＤ５７０−ＯＤ６３０）／（ＯＤ５７０陰性対照−ＯＤ６３０陰性対照）
ここで、ＯＤ５７０は各治療グループのＯＤ５７０値で、ＯＤ６３０は各治療グループのＯＤ６３０値で、ＯＤ５７０対照は陰性対照グループのＯＤ５７０値で、ＯＤ６３０対照は陰性対照グループのＯＤ６３０値である。
（６）生存率の結果は、濃度勾配に従ってｇｒａｐｈｐａｄ６．０ソフトウェアで処理され、分析モードはｌｏｇ（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）  ｖｓ．  Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  （ｃｕｒｖｅ  ｆｉｔ）であり、計算されたＩＣ５０値はｘ±ＳＤとして表される。
【００５５】
ＦＡＳＮ発現量の検出：
Ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔ検出では、化合物Ｉ−１で治療した結腸癌細胞ＨＣＴ１１６でのＦＡＳＮタンパク質発現の変化を検出し、セルレニンで治療した結腸癌細胞でのタンパク質発現の変化を陽性対照とした。Ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔの具体的なステップは次のとおりであり、
Ａ．溶液の調製
（１）１０％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウムＳＤＳ溶液：０．１ｇのＳＤＳ、１ｍＬのＨ２Ｏ脱イオン水で調製し、室温で保管した。
（２）分離ゲルバッファー：１８．１５ｇのＴｒｉｓを量り、８０ｍｌの水で溶解した後、ＨＣｌでｐＨを８．８に調整し、水で最終容量１００ｍＬに希釈し、１．５ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）溶液を得た。
（３）濃縮ゲルバッファー：６．０５ｇのＴｒｉｓを８０ｍＬの水に溶解し、約ＨＣｌでｐＨ６．８に調整し、水で希釈して最終容量を１００ｍｌにし、０．５ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）溶液を得た。
（４）ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファー：８ｍＬのｐＨ６．８である０．５ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓバッファー、６．４ｍＬのグリセロール、１２．８ｍＬの１０ｗｔ％のＳＤＳ、３．２ｍＬのメルカプトエタノール、１．６ｍＬの０．０５ｗｔ％のブロモフェノールブルー、３２ｍＬのＨ２Ｏを後で使用するために混合した。
（５）Ｔｒｉｓ−グリシンランニングバッファー：３０．３ｇのＴｒｉｓ、１８８ｇのグリシンおよび１０ｇのＳＤＳを量り、蒸留水で１０００ｍｌに溶解し、使用前に１０倍に希釈した。
（６）トランスファーメンブレンバッファー：１４．４ｇのグリシン、６．０４ｇのＴｒｉｓを量り、その中に２００ｍｌのメタノールを加え、最後に総量を１ｌにするために水を加えた。
（７）Ｔｒｉｓ緩衝塩溶液（ＴＢＳ）：２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）と５００ｍＭのＮａＣｌを含む。
【００５６】
Ｂ、ＰＢＳで癌細胞を３回洗浄し、ライセートを加え、直接５分間沸騰させ、氷上で冷却した後、１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上澄みを取り、後で使用するために−２０℃で保存した。
【００５７】
Ｃ、ＢＣＡ方法でタンパク質の濃度を測定した。
ウェルプレートに０．５ｍｇ／ｍｌ標準タンパク質勾配を加え、２０μｌになるようにＰＢＳを加えた。適切な量（３μｌ）のタンパク質サンプルをウェルプレートに加え、２０μｌになるようにＰＢＳを加えた。２００μｌの（毎回の使用前に調製された）ＢＣＡ作業溶液を各ウェルに加え、３７°Ｃで３０分間インキュベートした。５６２ｎｍでの吸光度を測定し、検量線とサンプル量からタンパク質の濃度を計算した。
【００５８】
Ｄ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動
（１）洗浄後の２枚のガラス板を位置合わせしてクリップに入れて固定し、棚に垂直に固定して接着剤を充填した。
（２）１０ｗｔ％分離ゲルの充填：ＴＥＭＥＤ（テトラメチルエチレンジアミン）を分離ゲルバッファーに加えた後、すぐによく振って、２枚のガラスプレートの隙間に充填した後、エタノールで密封し、接着剤が完全に固まったら、接着剤上層のエタノールを流し出し、そして吸収紙で拭き取った。
（３）５ｗｔ％の濃縮ゲルの充填：ＴＥＭＥＤ（テトラメチルエチレンジアミン）を濃縮ゲルバッファーに加えた後、すぐによく振って、分離ゲルの上層に充填し、残りのスペースを濃縮ゲルで満たした後、コームを濃縮ゲルに挿入した。ゲル濃縮物が固まったら、上向きに引き上げて静かに引き出した。
（４）ゲル充填後のガラスプレートを電気泳動タンクに入れ、十分な電気泳動溶液を加えたサンプルローディングの準備を始めた。タンパク質サンプルのタンパク質含有量を測定した後、５×ＳＤＳローディングバッファーを加え、沸騰水中で３分間沸騰させ、よく混合してからサンプルをローディングすると、サンプルをローディングした総タンパク質含有量は３５μｇであった。
（５）定電圧８０Ｖの電気泳動でゲルを流し、サンプルをゲルの下層に入れたら、ブロモフェノールブルーがゲルの底に到達するまで１２０Ｖの定電圧で電気泳動を行い、メンブレンを転写した。
【００５９】
Ｅ、メンブレン転写
（１）接着剤の切断：ガラスプレートをこじ開け、小さなガラスプレートを取り外し、濃縮された接着剤をこすり落とし、Ｍａｒｋｅｒを対照として実験の必要に応じてタンパク質の分子量に応じて接着剤を切断した。
（２）メンブレンの準備：ＰＶＤＦメンブレンと濾紙をカットし、カットしたＰＶＤＦを８０％のメタノール溶液に入れて３０秒間アクティブにした。
（３）メンブレンの装填：転写メンブレン用のクリップを開いて、黒い面（負極）を水平に保持させた。その上にスポンジパッドを乗せ、転写液を加えて浸し、浸した濾紙をパッドの上に置き、次に、ゲル−ニトロセルロースメンブレン−濾紙−スポンジパッドの順に積み重ねた。最後に、白いプレート（正極）をカバーして転写タンクに入れた。
（４）メンブレン転写：クリップの黒い面がタンクの黒い面に向き、クリップの白い面がタンクの赤い面に向くように、クリップを転送タンクに入れた。４℃でメンブレンを転写し、定電流４００ｍＡにした。
（５）転写後、メンブレンを取り外し、あるコーナーをマークした。
【００６０】
Ｆ、免疫反応
（１）シーリング：ＴＢＳＴで毎回５分間、メンブレンを３回洗浄した。洗浄後、ニトロセルロースメンブレンを５％の脱脂粉乳に入れ、室温で１時間振とうした。
（２）一次抗体（ＦＡＳＮ）の追加：シーリングしたニトロセルロースメンブレンをＴＢＳＴ含有の洗浄タンクに入れ、シェーカーで３回、それぞれ５分間洗浄した。一次抗体が加えられたプレートで４℃で一晩インキュベートした。
（３）二次抗体（マウス抗体またはウサギ抗体）の追加：一次抗体を回収し、ニトロセルロースメンブレンをＴＢＳＴ洗浄タンクにおいて室温シェーカーで３回、毎回５分間洗浄し、次に、洗浄したニトロセルロースメンブレンを二次抗体の入ったプレートに入れ、室温で暗所で４５分間インキュベートした。インキュベート後、ニトロセルロースメンブレンをＴＢＳＴ洗浄タンクで３回、各回５分間洗浄した。
【００６１】
Ｇ、化学発光
発色試薬を小さな遠心チューブに入れ、発光キットの指示に従ってそれらを混合し、ニトロセルロースメンブレンに加え、化学発光イメージャーで発色した。
【００６２】
テーブル１は、結腸癌細胞ＨＣＴ１１６中の脂肪酸シンターゼＦＡＳＮの活性に対する化合物Ｉ−１〜Ｉ−８および２つの中間生成物の影響を示し、対照グループと比較して、多種の化合物およびセルレニンは、結腸癌細胞のＦＡＳＮ活性を低減させる可能性があり、かつ、セルレニンと比較して、化合物Ｉ−１〜Ｉ−８の阻害効果は、セルレニンの阻害効果よりも大幅に高くなった。
【００６３】
図１は、結腸癌細胞ＨＣＴ１１６中のＦＡＳＮ発現の変化に対する化合物Ｉ−１〜Ｉ−８の影響を示し、結果は、化合物Ｉ−１〜Ｉ−８またはセルレニンの添加に関係なく、ＦＡＳＮの発現が有意に変化しないことを示し、化合物Ｉ−１〜Ｉ−８はＦＡＳＮの酵素活性を阻害できるが、ＦＡＳＮの通常発現には影響しないことを示した。
【００６４】
記の結果は、式Ｉ−１〜Ｉ−８で表される化合物が、ＦＡＳＮの効果的阻害を形成する、新しいタイプの脂肪酸シンターゼ阻害剤として使用できることを示した。式Ｉ−１で表される化合物は、腫瘍、肥満および他の関連する代謝性疾患の治療薬として使用して、疾患の発生と発症を予防および／または治療できることを示した。
【００６５】
実施例１７
腫瘍細胞（２２ＲＶ１、ＰＣ−３、ＨＴ−２９、Ｈｅｌａ、Ｈｅｐ  Ｇ２およびＣａＣｏ−２）の増殖に対する式Ｉ−１で表される化合物の影響の検出：
（１）対数期の細胞を回収し、細胞懸濁液の濃度を調整し、９６ウェルプレートでは、ウェルあたり１００μｌを使用するのが適切であり、シードプレートでは、測定されるべき細胞の密度を１０００〜１００００細胞／ウェルに調整し、エッジウェルを滅菌ＰＢＳで満たした。
（２）３７°Ｃで、５％のＣＯ２で細胞をインキュベートし、細胞が完全に付着した後、元の培地を廃棄し、１０μＭの化合物Ｉ−１を含む１μ％のＦＢＳ培地２００μｌを各ウェルに加え、ウェルの数は６であった。同じ濃度の脂肪酸シンターゼ阻害剤Ｃ７５、セルレニン（Ｃｅｒｕｌｅｎｉｎ）およびＧＳＫ２１９４０６９（以下、ＧＳＫと呼ぶ）を陽性対照として加え、等量のＤＭＳＯを陰性対照として加えた。
（３）７２時間インキュベートした後、写真を撮って細胞の状態を記録し、かつ、元の培地を廃棄し、０．５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド、商品名：チアゾールブルー）を含む無血清培地１００μｌを各ウェルに加えた。
（４）２〜４時間インキュベートした後、元の培地を廃棄し、各ウェルに１５０μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加え、３００ｒｐｍで１０分間振とうして、紫色の結晶を完全に溶解させた。
（５）各ウェルの吸光度を酵素結合イムノアッセイにおいてＯＤ５７０ｎｍで測定し、そしてＯＤ６３０ｎｍでの吸光度を基準として、二波長測定を行い、結果は次の式で計算され、
細胞生存率＝（ＯＤ５７０−ＯＤ６３０）／（ＯＤ５７０陰性対照−ＯＤ６３０陰性対照）
ここで、ＯＤ５７０は各治療グループのＯＤ５７０値で、ＯＤ６３０は各治療グループのＯＤ６３０値で、ＯＤ５７０対照は陰性対照グループのＯＤ５７０値で、ＯＤ６３０対照は陰性対照グループのＯＤ６３０値であった。
【００６６】
図２は、脂肪酸シンターゼ阻害剤Ｃ７５、セルレニンとＧＳＫ、および化合物Ｉ−１が２２ＲＶ１、ＰＣ−３、ＨＴ−２９、Ｈｅｌａ、Ｈｅｐ  Ｇ２、ＣａＣｏ−２、およびＨＣＴ１１６という合計７つの異なる腫瘍細胞の増殖に及ぼす影響を示す。図２から、脂肪酸シンターゼ阻害剤としてのＣ７５、セルレニン、およびＧＳＫは腫瘍細胞の増殖を阻害する効果があるが、その効果は腫瘍細胞の種類によってまったく異なり、一部の腫瘍細胞の増殖には大きな影響を与えず、安定性が低いことがわかった。上記の３つの阻害剤と比較して、化合物Ｉ−１の腫瘍増殖に対する阻害効果は大幅に改善され、かつ、多種の腫瘍細胞を効果的に阻害できる。
【００６７】
実施例１８
前立腺癌細胞ＰＣ−３の成長サイクルに対する式Ｉ−１で表される化合物の影響に対する検出：
（１）対数増殖期にある癌細胞を６ｃｍペトリ皿に接種し、皿あたりの接種量は２×１０６細胞であり、５％のＣＯ２、３７℃でインキュベートした。
（２）細胞が完全に付着した後、それらを血清なしで１２時間飢餓状態にし、異なる濃度勾配（４μＭ、８μＭおよび１０μＭ）を有する式Ｉで表される構造化合物を含む６ｍｌの２％ＦＢＳ培地を加えた。
（３）２４時間のインキュベートした後、上澄みを廃棄し、トリプシンで２分間消化し、２〜４倍容量のトリプシンの完全培地で消化を停止し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄みを廃棄し、１ｍｌのＤＰＢＳで２回洗浄し、上澄みを廃棄した。
（４）１ｍｌの７０％エタノール溶液に細胞を再懸濁し、４℃で１８時間以上保存して細胞を固定させた。
（５）遠心分離して上澄みを廃棄し、ＤＰＢＳで２回洗浄して残留エタノールを除去した。
（６）遠心分離して上澄みを廃棄し、１ｍｌのＰＩ染色溶液に室温で１５分間暗所でインキュベートし、フローサイトメーターで１時間以内に検出した。
【００６８】
図３は、前立腺癌細胞ＰＣ−３の成長サイクルに対する式Ｉで表される構造化合物の異なる濃度の影響を示した。図３は、Ｇ０／Ｇ１フェーズ、Ｓフェーズ（Ｓ−Ｐｈａｓｅ）およびＧ２／Ｍフェーズで、阻害剤治療なしの対照グループの前立腺癌細胞ＰＣ−３と、それぞれ４μＭ、６μＭ、８μＭおよび１０μＭの化合物Ｉ−１で治療された前立腺癌細胞ＰＣ−３の割合関係の統計結果グラフを示す。図３から、Ｓフェーズ細胞における式Ｉで表される構造化合物で治療されたＰＣ３細胞の割合が大幅に増加し、対照グループの１０．３４％から１０μＭ治療グループの１９．１０％に増加し、それにより、分裂フェーズ（Ｍフェーズ）およびＧ０／Ｇ１フェーズに入る腫瘍細胞の割合が減少し、前立腺癌細胞ＰＣ３の有糸分裂が阻害され、Ｓフェーズサイクルブロックになり、そして、薬物濃度の増加に伴い、ブロックが大幅に増加していることがわかった。
【００６９】
したがって、式Iで表される構造の化合物は、ＰＣ−３に明らかなＳフェーズサイクルを出現させ、腫瘍細胞の増殖を阻害し、腫瘍細胞のアポトーシスを促進でき、かつ、該化合物は腫瘍細胞の増殖サイクルの濃度依存性阻害を示した。式Ｉで示される構造の化合物は、腫瘍の発生と発症を阻害でき、腫瘍の臨床治療のための新しいタイプの治療薬として使用されることを示した。
【００７０】
実施例１９
前立腺癌細胞ＰＣ３の細胞分裂に対する式Ｉ−１で表される化合物の影響に対する検出
（１）対数増殖期にある癌細胞を取り、培地を廃棄し、２分間トリプシンで消化し、トリプシン完全培養液の２〜４倍の容量で消化を停止し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄みを廃棄した。
（２）１ｍｌの無血清培地で１回洗浄し、遠心分離して上澄みを廃棄した。
（３）４ｍｌの無血清培地に細胞を再懸濁し、それらを数えた。
（４）１：１（ｖ：ｖ）で１０μｍのＣＦＳＥ作業液を加え、３７℃で１５分間、暗所でインキュベートした。
（５）最終濃度が４０％になるように血清を加え、氷上で１０分間インキュベートして染色を停止した。
（６）遠心分離して上澄みを廃棄し、細胞を完全培地に再懸濁し、６ｃｍのペトリ皿に播種し、ペトリ皿あたり２×１０６細胞であり、５％のＣＯ２で、３７℃でインキュベートした。
（７）細胞が完全に付着した後、式Ｉで表される構造の化合物１０μＭを含む２％のＦＢＳ培地６ｍｌを加えた。
（８）２４時間インキュベートした後、培地を廃棄し、２分間トリプシンで消化し、完全培地の２〜４倍量のトリプシンで消化を停止し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄みを廃棄し、細胞を１ｍｌのＤＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメーターで検出した。
【００７１】
図４は、式Ｉで表される化合物が前立腺癌細胞ＰＣ−３の細胞分裂に及ぼす影響を示し、図面から、化合物Ｉ−１を含まない化合物と比較して、式Ｉで表される化合物で治療された前立腺癌細胞ＰＣ３の分裂ピークの数が大幅に減少し、化合物が効果的に細胞分裂を阻害し、細胞分裂の数を減らすことができ、それによって癌細胞の増殖に影響を及ぼし、腫瘍増殖を阻害することがわかった。式Ｉ−１で示される構造を有する化合物は、腫瘍の発生と発症を阻害でき、腫瘍の臨床治療のための新しいタイプの治療薬として適用されることを示した。
【００７２】
実施例２０
式Ｉ−１で表される構造の化合物が、腫瘍細胞（前立腺癌細胞ＰＣ−３および結腸癌癌細胞ＨＣＴ１１６）によって合成される脂肪酸含有量と組成に及ぼす影響に対する検出：
（１）対数増殖期の癌細胞を取り、６ｃｍのペトリ皿に接種し、接種密度は２×１０６細胞であり、５％のＣＯ２、３７℃でインキュベートした。
（２）細胞が完全に付着した後、式Ｉで表される化合物２０μＭを含む１％ＦＢＳ培地６ｍｌを各ペトリ皿に加え、培地を陰性対照とし、セルレニンを陽性対照とした。
（３）２４時間インキュベートした後、培地を廃棄し、トリプシンで２分間消化し、完全培地の２〜４倍量のトリプシンで消化を停止し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄みを廃棄した。
（４）１０ｍｌのＤＰＢＳに再懸濁し、タンパク質定量のために１ｍｌ細胞懸濁液を１．５ｍｌのｅｐチューブに移し、残りの９ｍｌを再度遠心分離して上澄みを廃棄し、適量の内部標準物を加え、凍結乾燥させた。
（５）１ｍｌの０．５Ｍ  ＮａＯＨ−メタノール溶液を加え、窒素で満たし、３０秒間ボルテックスし、１００℃で５分間固浴し、室温まで冷却させた。
（６）１ｍｌの４０％三フッ化ホウ素−メタノール溶液を加え、窒素で満たし、３０秒間ボルテックスし、１００℃で５分間固浴し、室温まで冷却させた。
（７）４ｍｌのｎ−ヘキサン、２ｍｌの飽和塩化ナトリウム溶液を加え、ボルテックスし、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄みを取り、窒素を吹き込んで、５００μｌのｎ−ヘキサンに再懸濁し、サンプルバイアルに移し、ＧＣ−ＭＳで検出した。
【００７３】
図５は、式Ｉで表される化合物が前立腺癌細胞ＰＣ−３と結腸癌細胞ＨＣＴ１１６の脂肪酸含有量と組成に及ぼす影響を示し、脂肪酸のタイプには、１８：２、１８：１、１８：０、１６：１、１６：０と１４：０がある。図５から、式Ｉで表される化合物で治療されたＰＣ−３とＨＣＴ１１６細胞の総脂肪酸含有量は対照グループより大幅に低く、かつ、１６：０の脂肪酸含有量も対照グループより低いことが分かり、式Ｉで表される化合物がＰＣ−３とＨＣＴ１１６における脂肪酸の合成を阻害し、腫瘍細胞内の脂肪酸の分布を変化させ、それにより腫瘍細胞の代謝に影響を与えることができることを示した。脂肪酸の合成を阻害すると、細胞増殖に必要な構造脂質とエネルギーを低減させ、これは、腫瘍の増殖を阻害し、腫瘍細胞のアポトーシスを引き起こす重要な理由となり、したがって、化合物Ｉ−１は、腫瘍の発生と発症を抑制することができ、重要な臨床応用の見通しがある。
【００７４】
実施例２１
前脂肪細胞ＯＰ９に対する式Ｉ−１で表される構造を有する化合物の影響に対する検出：
（１）対数増殖期にある癌細胞を取り、６ｃｍのペトリ皿に接種し、接種密度は２×１０６細胞であり、５％のＣＯ２、３７℃でインキュベートした。
（２）細胞が完全に付着した後、２０μＭの式Ｉで表される化合物を含む６ｍｌの１％ＦＢＳ培地を各ペトリ皿に加え、培地を陰性対照とし、セルレニンを陽性対照とした。
（３）２４時間インキュベートした後、培地を廃棄し、トリプシンで２分間消化し、完全培地の２〜４倍量のトリプシンで消化を停止し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄みを廃棄した。
（４）１０ｍｌのＤＰＢＳに再懸濁し、タンパク質定量のために１ｍｌの細胞懸濁液を１．５ｍｌのｅｐチューブに移し、残りの９ｍｌを再度遠心分離して上澄みを廃棄し、適量の内部標準物を加え、凍結乾燥させた。
（５）１ｍｌの０．５Ｍ  ＮａＯＨ−メタノール溶液を加え、窒素で満たし、３０秒間ボルテックスし、１００℃で５分間固浴し、室温まで冷却させた。
（６）１ｍｌの４０％三フッ化ホウ素−メタノール溶液を加え、窒素で満たし、３０秒間ボルテックスし、１００℃で５分間固浴し、室温まで冷却させた。
（７）４ｍｌのｎ−ヘキサン、２ｍｌの飽和塩化ナトリウム溶液を加え、ボルテックスし、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄みを取り、窒素を吹き込んで、５００μｌのｎ−ヘキサンに再懸濁し、サンプルバイアルに移し、ＧＣ−ＭＳで検出した。
【００７５】
図６Ａは、顕微鏡下で式Ｉの化合物で治療されたｏｐ９細胞の脂肪滴オイルレッド染色、およびｎ−ヘキサン溶解後に測定されたＯＤ５１０値である。図６Ａから、対照グループと比較して、式Ｉで表される化合物で治療されたＯＰ９細胞の脂肪滴の数は大幅に減少し、かつ、セルレニンで治療された実験グループよりも減少が大きかったことがわかり、図６Ｂで得られたＯＤ５１０値も同じ結果を証明し、式Ｉで表される構造が前脂肪細胞ＯＰ９における脂肪滴の蓄積を阻害できることを示した。
【００７６】
実施例２２
線虫における脂肪滴の蓄積に対する式Iで表される構造を有する化合物の影響に対する検出：
線虫を取り、Ｍ９バッファーに再懸濁し、３ｍｌの線虫懸濁液を各試験チューブに加え、式Ｉで表される化合物を実験グループに加えて最終濃度を１０μＭにし、式Ｉで表される化合物のないものを対照とし、シェーカーで２００ｒｐｍ ／分で振とう培養し、９日後にオイルレッド染色を行い、顕微鏡でガラススライド上に脂肪滴を観察した。
【００７７】
図７は、式Ｉで表される化合物で９日間治療された線虫体内の脂肪滴の蓄積を示す。図に示すように、式Iで表される化合物で治療された線虫の色は、オイルレッド染色後に対照グループよりも明らかに明るく、明らかな白い領域が見られるが、対照グループの線虫全体は、白い領域のない暗い色を示し、式Ｉで表される化合物で治療された線虫における脂肪滴の蓄積は対照グループのそれより有意に少なく、式Ｉで表される化合物が線虫における脂質滴の合成と蓄積を効果的に阻害できることがわかった。脂質小滴の合成と蓄積に対する化合物I-1の阻害効果は、それが肥満などの代謝性疾患の治療に有効であり得ることを示した。
【００７８】
実施例２３
マウスの移植された腫瘍の成長に対する式Ｉで表される構造の化合物の影響に対する検出：
（１）癌細胞を８０％（対数増殖期）の密度まで培養し、細胞継代実験に従って続行し、ＰＢＳで洗浄し、消化し、遠心分離して上澄みを除去し、その後、無血清培地で細胞を再懸濁して２回洗浄した。無血清培地で細胞懸濁液の濃度を２×１０７細胞／ｍｌに調整した。一晩で4度溶かした等量のマトリゲルを加え、振って均一に混合した（マトリゲルを含むすべてのステップは氷上で操作した）。
（２）各ヌードマウスに１００μｌの細胞とマトリゲルの混合物を皮下接種し、接種後、毎日定期的に腫瘍の成長を観察し、移植された腫瘍モデルが成功するかどうかを判断し、腫瘍の体積が約２００ｍｍ３になったら、薬物治療を開始した。
（３）実験では、移植された腫瘍モデルが成功したヌードマウスを選択し（腫瘍形成率１００％）、ヌードマウスを７日間飼育し、皮下癌細胞移植実験を行い、腫瘍が肉眼で見えた後、２日ごとに1回の腹腔内注射を行い、注射量は５ｍｇ／ｋｇの化合物Ｉ−１で、注射溶媒グループを対照として、各グループ５匹であった。投与の４週間後、腫瘍を取って秤量した（図９Ａ）。
（４）腫瘍体積の計算式：
Ｖ＝ａｂ２／２、ここで、Ｖは体積（ｍｍ３）、ａは長さ（ｍｍ）で、ｂは幅（ｍｍ）である。
（５）腫瘍をスライスした後、Ｈ＆Ｅ染色を行い、マウス腫瘍組織の変化を観察した。
【００７９】
図８は、マウスにおけるＰＣ３移植腫瘍に対する式Ｉ−１で表される化合物の影響を示す。図８Ａは、化合物Ｉ−１治療後のマウス腫瘍の質量変化を示し、図８Ｂは、化合物Ｉ−１治療後の移植腫瘍のＨＥ染色効果を示す。図８Ａに示すように、式Ｉ−１で表される化合物で４週間治療したマウスの腫瘍の質は、対照グループのそれより有意に減少した。図８Ｂは腫瘍ＨＥ染色切片であり、式Ｉで表される化合物で治療されたマウス腫瘍組織は明るい色の広い領域を有し、点状の深い領域が大幅に減少し、式Ｉ−１で表される化合物が腫瘍細胞の増殖を阻害し、腫瘍組織内の浮腫の広い領域につながる可能性があることを示した。
【００８０】
上記の結果から、化合物Ｉ−１はマウス腫瘍に対して明らかな阻害効果を有し、化合物Ｉ−１は新しいタイプの抗腫瘍薬として重要な適用の見通しがあることがわかった。
【００８１】
実施例２４
化合物Ｉ−１〜化合物Ｉ−８および中間体１と中間体２がＨＣＴ１１６中のＦＡＳＮ活性に対する阻害効果、および腫瘍細胞（ＰＣ−３とＨＣＴ１１６）の増殖に対する影響を検出した。
【００８２】
実験例１８に示すＦＡＳＮ酵素活性測定法で、ＦＡＳＮ酵素活性に対する異なる物質の影響を検出し、実験例１９に示す方法で、腫瘍細胞の増殖に対する異なる物質の影響を検出し、そしてセルレニンを対照として、ＦＡＳＮ酵素活性に対する異なる物質の阻害率（％）と腫瘍増殖の阻害率（ＩＣ５０ｎＭ）を計算した。検出結果を以下の表１に示し、
2021530439.tif 000022
【００８３】
上記表１から分かるように、本発明の化合物Ｉ−１〜Ｉ−８は、脂肪酸合成酵素活性を効果的に阻害でき、このうち、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳＮ）に対する化合物Ｉ−１の阻害率は５８．６３％と最高で、陽性対照のセルレニン阻害率２１．３２％よりも有意に高かった。ＩＣ５０の結果によると、化合物Ｉ−１の有効濃度はセルレニンの有効濃度よりも著しく低く、９±１．１ｎＭは前立腺癌細胞ＰＣ３の５０％の死亡率を引き起こす可能性があるが、１３±１．７ｎＭは結腸癌細胞ＨＣＴ１１６の５０％の死亡率を引き起こす可能性がある。脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳＮ）は、腫瘍の脂肪酸代謝と細胞周期プロセスに関与し、腫瘍の成長、浸潤と移動に重要な役割を果たし、本発明によって提供される一般式Ｉ−１で表される構造を有する化合物は、ＦＡＳＮ阻害剤として、腫瘍細胞における脂肪酸の合成と分布に影響を与え、細胞周期を間期に停止させ、腫瘍細胞の有糸分裂を組織化し、腫瘍増殖に対する阻害を達成できる。したがって、新しいタイプの脂肪酸シンターゼ阻害剤として、一般式Ｉで表される構造を有する化合物は、腫瘍の臨床治療および肥満などの代謝性疾患の治療において重要な適用の見通しを有する。
【００８４】
以上、本発明を好適な実施形態により開示したが、本発明はこれに限定されるものではなく、当業者であれば、本発明の精神と範囲から逸脱することなく様々な変更と修正を加えることができるため、本発明の保護範囲は特許請求の範囲によって定義されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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