(57)【要約】  超常磁性ナノ粒子に基づく分析方法は、サンプルマトリックスに分析物を有するサンプルを提供するステップと、それぞれが少なくとも１つ以上のセクションを有する固定相である分析領域を有するポイントオブケアチップを提供するステップと、各前記分析物を超常磁性ナノ粒子で標識して、前記標識された分析物を前記固定相に固定するステップと、インビトロで前記超常磁性ナノ粒子を励起するための装置と、前記励起された超常磁性ナノ粒子の応答を感知、受信及び伝送するための装置とを備える分析装置を提供するステップと、前記チップを前記分析装置に配置し、インビトロで前記超常磁性ナノ粒子を励起するステップと、前記超常磁性ナノ粒子の前記応答を感知、受信及び伝送するステップと、前記応答を分析して、前記分析物の特性を決定するステップとを含み、前記超常磁性ナノ粒子の前記応答は高調波を含む。本発明はまた、前記分析方法に使用されるハイブリッドポイントオブケアチップ及び分析装置を提供する。
2021523382.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
超常磁性ナノ粒子に基づく分析方法であって、
サンプルマトリックスに少なくとも１つ以上の分析物を含むサンプルを提供するステップと、
それぞれが少なくとも１つ以上のセクションを有する固定相である少なくとも１つ以上の分析領域を有するポイントオブケアチップを提供するステップと、
前記サンプル中の各前記分析物を超常磁性ナノ粒子で標識して、前記標識された分析物を前記固定相に固定するステップと、
インビトロで前記超常磁性ナノ粒子を励起するための装置と、前記励起された超常磁性ナノ粒子の応答を感知、受信及び伝送するための装置とを備える分析装置を提供するステップと、
前記ポイントオブケアチップと、前記固定相を含む前記分析領域とを前記分析装置に配置し、インビトロで前記超常磁性ナノ粒子を励起するステップと、
前記超常磁性ナノ粒子の前記応答を感知、受信及び伝送するステップと、
前記超常磁性ナノ粒子の前記応答を分析して、前記分析物の特性を決定するステップと、を含み、
前記超常磁性ナノ粒子の前記応答は高調波を含む、
超常磁性ナノ粒子に基づく分析方法。
【請求項２】
前記方法は、さらに、
前記分析装置において、変化する外部磁場と、前記変化する外部磁場内の場のないポイント、又は場のないライン、又は場のないスペースである場のない領域とを提供するステップと、
前記ポイントオブケアチップを前記分析装置に配置し、前記場のない領域は前記分析領域全体を走査して、励起コイルは前記場のない領域において前記固定相上の前記超常磁性ナノ粒子を励起して、前記空間的にエンコードされた応答を生成するステップとをさらに含み、
前記分析領域の前記固定相は２つ以上のセクションを含み、前記セクション中の前記超常磁性ナノ粒子は空間的にエンコードされた応答を生成し、そして、
結合されていない分析物の除去又は再構成が行われるか又は行われないかにかかわらず、いずれも前記空間的にエンコードされた応答に基づいて、前記分析物の前記特性を定量的に決定することができる、
請求項１に記載の超常磁性ナノ粒子に基づく分析方法。
【請求項３】
前記固定相は、１つの単一のセクションからなる、
請求項１に記載の超常磁性ナノ粒子に基づく分析方法。
【請求項４】
前記固定相は、１〜２０種類内の異なるタイプの超常磁性ナノ粒子を固定するために採用される、
請求項１に記載の超常磁性ナノ粒子に基づく分析方法。
【請求項５】
各種類の前記超常磁性ナノ粒子は、各種類の前記標識された分析物に対応して、前記サンプル中の前記標識された分析物上の他の超常磁性ナノ粒子と異なる、
請求項１に記載の超常磁性ナノ粒子に基づく分析方法。
【請求項６】
前記超常磁性ナノ粒子の粒径は１ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲内にある、
請求項１に記載の超常磁性ナノ粒子に基づく分析方法。
【請求項７】
超常磁性ナノ粒子は、Ｆｅ、ＣｏＦｅ、Ｃｏ、Ｃｏ合金、フェライト、窒化コバルト、
酸化コバルト、Ｃｏ−Ｐｄ、Ｃｏ−Ｐｔ、鉄、鉄合金、Ｆｅ−Ａｕ、Ｆｅ−Ｃｒ、Ｆｅ−Ｎ、ＦｅＯ、Ｆｅ−Ｐｄ、Ｆｅ−Ｐｔ、Ｆｅ−Ｚｒ−Ｎｂ−Ｂ、Ｍｎ−Ｎ、Ｎｄ−Ｆｅ−Ｂ、Ｎｄ−Ｆｅ−Ｂ−Ｎｂ−Ｃｕ、Ｎｉ又はＮｉ合金で製造される、
請求項１に記載の超常磁性ナノ粒子に基づく分析方法。
【請求項８】
前記分析領域のアッセイ形式は、ハイブリッドポイントオブケア、側方流動、マイクロ流体ビーズ、又はＥＬＩＳＡ単層である、
請求項１に記載の超常磁性ナノ粒子に基づく分析方法。
【請求項９】
３次元ハイブリッドポイントオブケアチップであって、
少なくとも１つ以上のサンプル導入領域と、
少なくとも１つ以上の分析領域と、
流体吸収領域と、
必要に応じて、試薬リザーバと、を含み、
前記３次元ハイブリッドポイントオブケアチップの構造は１層〜１０層範囲内の積層板であり、そして、
サンプル導入領域、前記試薬リザーバ、前記分析領域及び前記流体吸収領域はマイクロチャネルにより順に接続され、前記マイクロチャネルは、分析物を含むサンプルを分割して前記積層板の前記レベルにガイドすることを可能にする、
３次元ハイブリッドポイントオブケアチップ。
【請求項１０】
切替えカラムをさらに備え
前記積層板は２つ以上のレベルを有し、そして、
前記切替えカラムは、前記サンプル導入領域と前記分析領域との間に位置決めされ、且つ前記積層板の前記レベルを接続して、前記分析物を含む前記サンプルを分割して前記積層板の異なるレベルにガイドすることを可能にする、
請求項９に記載の３次元ハイブリッドポイントオブケアチップ。
【請求項１１】
前記積層板はフィルムの積層層を含み、前記サンプルがその自体で流れ、且つ前記フィルムの表面が必要に応じて修飾される、
請求項９に記載の３次元ハイブリッドポイントオブケアチップ。
【請求項１２】
前記フィルムは、プラスチック、接着剤、紙、木材、繊維、シリコン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ガラス繊維、セルロース、多糖類、タンパク質ポリマー又は圧延された粒子材料で製造される、
請求項１１に記載の３次元ハイブリッドポイントオブケアチップ。
【請求項１３】
前記サンプル導入領域は、前記サンプルの体積を１〜２００マイクロリットルの範囲内に維持することができ、そして、
前記サンプルは、全血、血漿、血清、尿、唾液、涙、汗、便抽出物、ＤＮＡ／ＲＮＡ抽出物、抗原含有溶液、抗体、酵素、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、有機分子、無機分子、バイオマーカ、産業汚染物質、病原体、ウイルス、細胞、細胞培養抽出物又は環境サンプルである、
請求項９に記載の３次元ハイブリッドポイントオブケアチップ。
【請求項１４】
前記分析領域は、一体に組み立てられる１つ以上のセクションを含む固定相であり、
前記分析領域中の前記セクションの数は１〜２０の範囲であり、そして、
各セクションの形態は、粒子、細孔膜、水不溶性ゲル、又はコロイドである、
請求項９に記載の３次元ハイブリッドポイントオブケアチップ。
【請求項１５】
請求項９に記載のハイブリッドポイントオブケアチップを使用した分析方法であって、サンプル導入領域中の試薬、又は試薬リザーバ中の試薬、又は両方中の試薬によって、サンプル中の分析物を識別するステップと、
分析領域中の前記識別された分析物を固定するステップと、
磁気、音響、放射性、蛍光、化学発光検出方法又はそれらの組み合わせである検出方法により、前記分析物の特性を決定するステップと、を含み、
前記試薬は、抗体、タンパク質、ＤＮＡ／ＲＮＡプローブ又はキレート剤で機能化された磁性粒子、蛍光粒子、化学発光粒子、放射性粒子、又はそれらの混合物を含み、磁気、蛍光、化学発光又は放射性標識された抗体、タンパク質、ＤＮＡ／ＲＮＡプローブ又はキレート剤は、前記サンプル中の前記分析物に結合して識別し、
前記試薬を前記試薬リザーバに直接配置し、又は固体支持体に吸収して前記試薬リザーバに配置し、そして、
前記分析領域は１つ以上のセクションを有する固定相であり、前記セクションは、前記識別された分析物を固定する識別試薬で機能化される、
請求項９に記載のハイブリッドポイントオブケアチップを使用した分析方法。
【請求項１６】
前記磁気検出方法は、超常磁性イメージング、磁性粒子の総蓄積、励磁インダクタンス、交流磁気磁化率測定法、ＣＭＯＳ交流磁化率測定法、ホール効果、磁気抵抗、巨大磁気抵抗（ＧＭＲ）、超巨大磁気抵抗（ＣＭＲ）、超伝導量子干渉装置（ＳＱＵＩＤ）、磁気緩和法又は磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）スピン緩和時間である、
請求項１５に記載のハイブリッドポイントオブケアチップを使用した分析方法。
【請求項１７】
超常磁性粒子イメージング分析装置であって、
水平軸に沿って配置され内部容積を有するハウジングと、
前記水平軸に沿って前記ハウジングの前記内部容積に適合され、且つ、その間に場のない領域を形成するために、いずれもマッチングする磁極が互いに向き合うように維持される一対の永久磁石と、
前記水平軸に沿って前記一対の永久磁石の間に配置され、いずれも前記場のない領域に接近して、前記場のない領域に交流電気を生成するための一対の励起コイルと、
前記水平軸に沿って前記一対の励起コイルの間に配置され、いずれも前記場のない領域に接近する一対の受信コイルと、を備え、
分析領域に固定された超常磁性ナノ粒子で標識された分析物を有するサンプルを前記ハウジングの前記内部容積に配置し、前記場のない領域を通過し、前記超常磁性ナノ粒子は、前記場のない領域において励起され常磁性応答を送信し、前記常磁性応答は、分析のために前記一対の受信コイルによって感知および伝送される、
超常磁性粒子イメージング分析装置。
【請求項１８】
前記ハウジングは円筒であり、前記内部容積は円筒状内部容積であり、
前記一対の永久磁石は、円筒状であり、前記ハウジングの前記円筒状内部容積に適合され、
前記一対の励起コイルは、交流変調磁場コイルであり、前記場のない領域において交流電気を形成して前記超常磁性ナノ粒子を励起し、そして、
前記サンプルはハイブリッドポイントオブケアチップにあり、前記チップは前記円筒ハウジングの前記円筒状内部容積において同じ直線で移動する、
請求項１７に記載の超常磁性粒子イメージング分析装置。
【請求項１９】
前記ハウジングは開放式Ｃ字状フレームであり、
前記一対の永久磁石は直線形であり、直線的な場のない領域を形成するために、各前記永久磁石の陽極が互いに向き合うように強制され、
前記一対の励起コイルは、前記超常磁性ナノ粒子を励起するための一対のヘルムホルツ
コイルであり、そして、
固定された超常磁性ナノ粒子で標識された分析物を含む前記サンプルは、複数の方向から移動して前記ハウジング中の前記線形場のない領域に入る、
請求項１７に記載の超常磁性粒子イメージング分析装置。
【請求項２０】
前記一対の励起コイルは、互いに向き合って絶縁体によって分離される一対のＥ字状焼結フェライト磁気コアであり、
前記Ｅ字状磁気コアの各脚はいずれも電磁コイル巻線を有し、それにより、隙間を形成するために短絡されたＥ字状磁気コアの２つの正反対の極に磁場を生成し、
前記一対の永久磁は、前記隙間内に前記場のない領域を生成するために、互いに陽極に向き合うように強制され、そして、
前記サンプルは移動して前記隙間を貫通し、且つ励起及び分析を行う領域に入ることができる、
請求項１７に記載の超常磁性粒子イメージング分析装置。
【請求項２１】
請求項１に記載の分析方法に使用された超常磁性粒子イメージング分析装置であって、２つの同心円状に配置された送信コイルと、
受信コイルと、を備え、
前記分析装置は片面分析装置であり、
前記２つの送信コイルの電流方向が逆であり、磁場線を形成し、場のない領域は前記磁場線と対称的であり、超常磁性ナノ粒子で標識された分析物を有する前記サンプルを前記場のない領域に配置して励起し、且つ前記超常磁性ナノ粒子の常磁性応答は前記受信コイルによって感知されて伝送される、
請求項１に記載の分析方法に使用された超常磁性粒子イメージング分析装置。
【請求項２２】
請求項１に記載の分析方法に使用される超常磁性粒子イメージング分析装置であって、
磁化不可能な中空軸と、
内側に円筒状内部を有し、それを貫通する前記磁化不可能な中空軸によって取り付けられて支持される円筒状の永久磁石と、
バイアスワイヤと信号を有し、前記永久磁石の前記円筒状内部と前記磁化不可能な中空軸に配置されるホールセンサと、を備え、
前記永久磁石は磁力場を形成する理論的な磁力線を有し、前記円筒状永久磁石を離れる前記磁力線は、前記円筒の中心及び磁力場の中心にゼロ領域を生成し、
前記永久磁石は、前記ゼロ領域における前記超常磁性ナノ粒子で標識された分析物を有する前記サンプルに誘導を提供し、そして、
前記ホールセンサは、前記円筒状内部の中心の前記ゼロ領域に配置され、前記超常磁性ナノ粒子の前記常磁性応答を感知および受信し、前記常磁性応答の前記バイアスワイヤと信号を送信して信号処理を行う、
請求項１に記載の分析方法に使用される超常磁性粒子イメージング分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜関連出願の相互参照＞
本願は２０１８年４月１１日に出願された米国仮出願第６２／６５５，８２８号、２０１８年５月１日に出願された米国仮出願第６２／６６４，９４６号、及び２０１９年４月９日に出願された米国正式出願１６／３７９，７４８号の優先権を主張し、該米国正式出願は、２０１８年４月１１日に出願された米国仮出願第６２／６５５，８２８号及び２０１８年５月１日に出願された米国仮出願第６２／６６４，９４６号の権利を主張する。すべての上記米国出願の主題及び内容が援用により本願に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、バイオセンシング技術に関し、特に、超常磁性粒子イメージング又は他の技術を使用してサンプル中の複数種の分析物を同時に測定する、分析方法、及びそこで使用されるチップ及び装置に関する。
【背景技術】
【０００３】
バイオセンシングとは、生物学的要素を検出するためのいかなる方法、及びサンプルの生物学的特性を識別するための関連するソフトウェア又はコンピュータ技術を指し、医療診断、環境監視、及び食品安全保障の不可欠な部分となっている。バイオセンシングシステムは、電気、電子及びフォトニックデバイスに、生物学的物質（例えば組織、酵素及び核酸）及び化学分析を組み込んで、生物学的現象を監視又は識別するための検出可能信号を生成する。バイオセンシングは、生物医学、食品の生産加工、及び細菌、ウイルス、生物毒素の検出にますます適用されており、生物戦争の防御にも適用され、且つ先進的な生物、ナノテクノロジー及び情報技術が著しく融合した新しい科学事例を代表する。
【０００４】
バイオセンシング技術は、光学、電気化学、磁気バイオセンシングに分類できる。第一に、光変換メカニズムに基づいて、光バイオセンシングは、蛍光、燐光、蛍光共鳴エネルギーの移動（ＦＲＥＴ）、化学発光、生物発光、量子ドット、吸収率及び散乱を含む発光方法と、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）及び干渉を含む表面方法とに分類される。一般に、光バイオセンシング法は、感度が高く、多重化しやすい。
【０００５】
第二に、電気化学バイオセンシングは、酵素結合アッセイ、電界効果センサ、電気活性タグ、ナノ粒子に基づくセンサ、及び電気化学発光に基づくセンサを用いる方法を含む。これらの方法とアッセイは本質的には界面であり、識別イベントによって生じた生物識別又は物理的変化が接触材料の電気的特性を直接変化させる。これらのアッセイはシンプルで、感度が高く、界面への結合イベントの局在化により、特定の分析物とバックグラウンド分析物に対する区別が強化される。また、これらのアッセイは、アレイ形式への拡張及びマイクロ流体構造との統合に対応する。
【０００６】
第三に、磁気バイオセンシングは、一般に、交流磁化率測定法、ホール効果測定、巨大磁気抵抗、超伝導量子干渉装置及び励磁インダクタンスに基づく方法を含む。光学及び磁気バイオセンシング法に比べて、磁性粒子に基づくセンシング法は、生体適合性、環境安全性を向上させ、合成コストを低減させる。さらに、生体サンプルからの磁気信号がほとんどまたはまったくないため、磁性粒子ベースのセンシング法ではバックグラウンドノイズが小さい。したがって、バイオセンシングと診断ツールの開発において大きな注目が集められている。Ｉｓｓａｄｏｒｅ，Ｄら、「分子分析用の磁気センシング技術（Magnetic
sensing technology for molecular analyses）」、『チップラボ（Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ』
．１４（１４），２３８５−２３９７（２０１４）を参照のこと。
【０００７】
交流磁化率測定法は、溶液中の磁性ナノ粒子（ＭＮＰ）の拡散特性を利用した精確な検出技術である。Ｐａｒｋ，Ｋら、「コンパクトな交流磁化率計を用いた磁性ナノ粒子のブラウン緩和に基づく多重化センシング（Multiplexed sensing based on Brownian relaxation of magnetic nanoparticles using a compact AC susceptometer）、『ナノテクノロジー（Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ）』．２２（８），０８５５０１（２０１１）を参照のこと。該技術は、印加された磁場の周波数の関数としての集団磁化率を測定することにより決定される磁気ラベル付きセンサのランダムな回転運動を用いるブラン緩和検出方案の原理に基づく。励起周波数が磁気ラベル付きセンサの回転運動の周波数に近づくと、複素磁化率の損失成分は大幅に増加する。この現象は、複素磁化率の虚数成分のピーク周波数（異相９０ｏ：ｘ”）として観察される。生物学的診断のための技術の適用は、標識されたMNPへのターゲットの結合によるｘ”のピーク周波数のシフトに依存する。その後ターゲット分子がセンサ上の特定の受容体と結合すると、センサの流体力学的サイズは効果的に増加し、且つ流体力学的半径との立方関係により、周波数の最大値はより低い値に対して容易に測定可能なシフトがある。交流磁化率計は１ｍｇ／ｍｌの濃度と５μｌ体積で１０μＴの低磁場で高い感度を示したが、該方法の適用は溶液媒体に限定されている。
【０００８】
ホール効果測定に基づくホールセンサは、フォトリソグラフィ法とアルゴンイオンミルによるドライエッチングにより、アーム幅ｗが約１μｍのクロスとして定義される。Ｍｉｈａｊｌｏｖｉｃ，Ｇｎ、「ＩｎＡｓ量子井戸マイクロホールセンサを使用して生物学的適用における単一の磁気ビーズの検出（Detection of single magnetic bead for biological applications using an InAs quantum-well micro-Hall sensor）」『応用物理学速報（Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓ  Ｌｅｔｔ．）』８７，１１２５０２（２００５）、及びＬａｎｄｒｙ，Ｇら、「ＩｎＡｓ量子井戸ホールデバイスを使用した単一磁性粒子の特性評価（Characterization of single magnetic particles with InAs quantum-well Hall devices）」『応用物理学速報（Ａｐｐｌｅ．Ｐｈｉｓ  Ｌｅｔｔ．）』８５，４６９３（２００４）を参照のこと。いくつかのクロスは、５００、６００、および７００ｎｍのアーム幅を持つ集束イオンビームミリングでさらに定義される。各センサはファンデルポーとホールの測定値により特徴付けられる。処理後、ホール係数とシート抵抗の値はそれぞれ０．０３１＜ＲＨ＜０．０４６Ω／Ｏｅと１５０＜ＲＨ＜６００Ω／Ｏｅの範囲にある。センサチップが周波数ｆ０で変化する垂直交流励起磁場~Ｂ０に置かれると、センサは直流電流Ｉ０によってバイアスされ、ホール電圧はロックインアンプを使用して周波数ｆ０で測定される。ビーズは超常磁性であるため、その磁化はランジュバン（Ｌａｎｇｅｖｉｎ）挙動に従う。交流信号は実質的にランジュバン曲線の傾きを測定するため、ビーズの直流磁気状態に依存する。したがって、ビーズが直流磁場Ｂ１にさらされると、その磁気状態は低い磁化率方向にシフトし、ビーズ中に誘導される交流磁化が低下し、それによりクロスがセンシングしたビーズの平均交流浮遊磁場を減少させ、自身は交流ホール電圧信号の低下として示される。ホールセンサの線形性は、Ｂ１が上部にビーズがない場合に、空のホールクロスにおいて交流ホール信号のいかなる変化も起こさないことを保証する。したがって、この低下は、ホールクロスにビーズの存在を示す決定的な信号である。この方法の欠点は、交流励起磁場に対する直接センサのホール応答によって生じる大きなシフトであり、通常はビーズからの小さな信号より数桁大きくなる。
【０００９】
巨大磁気抵抗（ＧＭＲ）は交互の強磁性と非磁性導電層からなる多層で観測された量子力学的磁気抵抗効果である。Ｈａｌｌ，Ｄら、「ＧＭＲバイオセンサアレイ−システムの展望（GMR biosensor arrays-a system perspective）」、『バイオセンサとバイオエレクトロニクス（Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ.）』２５（９），２０５１−２０５７（２０１０）、及びＢａｓｅｌｔ，Ｄ、「磁気抵抗技術に基づくバイオセンサ（A biosensor based on magnetoresistance technology）」、『バイオセンサーとバイオ
エレクトロニクス（Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．）』，１３，７３１−７３９（１９９８）を参照のこと。観測された効果は、抵抗の著しい変化が、隣接する強磁性層の磁化が平行に整列しているか、逆平行に整列しているかに依存する。平行に整列している場合、総抵抗は相対的に低いが、逆平行に整列している場合、総抵抗は高くなる。磁化方向は例えば外部磁場を印加することによって制御することができる。この効果は電子散乱のスピン配向への依存性に基づく。磁気抵抗材料の開発により、高感度マイクロメータスケールの磁場センサの光パターン化は可能になる。磁気抵抗材料は、一般に、磁場に応答して抵抗が変化するフィルム金属多層構造を有する。いくつかの全く異なるタイプの磁気抵抗材料が開示されており、異方性磁気抵抗材料と巨大磁気抵抗材料を含む。磁気抵抗センサは商業上に、磁気テープ又は磁気ディスクの読み取り、携帯型磁場センサ、及び位置センサに用いられる。磁気抵抗材料を使用することにより、磁気ビーズアッセイ用の小型検出器を製造することができる。そのような検出器はアッセイ基質に埋め込まれて、自身の近傍にあるビーズを検出することができる。光学又はマイクロメカニカル検出に対して、この方法の主な利点は、一辺の長さが約１ｃｍの単一のチップに数千の検出器を製造できることである。ＧＭＲセンサの欠点はその非線形性と単層特性である。物体の表面と、磁気ビーズとセンサの間の距離に非常に敏感である。
【００１０】
超伝導量子干渉装置（ＳＱＵＩＤ）は、ジョセフソン接合（Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を含む超伝導ループに基づいて非常に微小な磁場を測定することに用いられる感度が非常に高い磁力計である。Ｋｏｔｉｔｚ，Ｒら、「磁性ナノ粒子の緩和測定によるアビジンとビオチンとの結合反応の確定（Determination of the binding reaction between avidin and biotin by relaxation measurements of magnetic nanoparticles）、『磁気学と磁性材料雑誌（J. Magn. Magn. Mater.）』，１９４，６２−６８（１９９９）；Ｈａｔｈａｗａｙ  ＨＪ、「標的磁性ナノ粒子と超高感度の磁場センサを使用した乳癌細胞の検出（Detection of breast cancer cells using targeted magnetic nanoparticles and ultra-sensitive magnetic field sensors）」『乳癌研究（Breast Cancer Research）』，１３，Ｒ１０８（２０１１）、及びＤｅ  Ｈａｒｏａ．Ｌら、「高感度のがんの検出と位置決めに適用される磁気緩和法（Magnetic relaxometry as applied to sensitive cancer detection and localization）」、『生物医学工程：生物医学技術（Biomed. Eng.-Biomed. Tech.）』，６０（５），４４５−４５５（２０１５）、及びＰｅｒｅｚ．Ｊら、「分子の相互作用を感知できる磁気緩和スイッチ（Magnetic relaxation switches capable of sensing molecular interactions）」『ネイチャー バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）』，２０，８１６−８２０（２００２）を参照のこと。ＳＱＵＩＤの感度は、数日間の平均測定で５ａＴ（５×１０−１８Ｔ）の低磁場を測定することに十分な感度がある。それらのノイズレベルは３ｆＴ・Ｈｚ−1/2まで低い。比較のために、一般的な冷蔵庫の磁石は０．０１テスラ（１０−２Ｔ）を生成し、動物のいくつかのプロセスは１０−９Ｔと１０−６Ｔの間の非常に小さな磁場を生成する。ＳＱＵＩＤには、直流（ＤＣ）と無線周波数（ＲＦ）の２つの主なタイプがある。ＲＦ  ＳＱＵＩＤは１つのみのジョセフソン接合（超伝導トンネル接合）と一緒に作動することできる。ＳＱＵＩＤは非常に敏感であるが、低温条件と高価な装置が必要であり、それにより日常的な分析には適切ではない。
【００１１】
励磁インダクタンスとは、コイルを通過する際に、磁性粒子が比透磁率の変化によりコイルのインダクタンスが変化する現象を指す。Ｍaｋｉｒａｎｔａ．Ｊら、「分子の相互作用を感知できる磁気緩和スイッチ（Magnetic relaxation switches capable of sensing molecular interactions）」、第２８回ＩＥＥＥ生物医学工程学会国際年会、米国ニューヨーク，Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc.４５９８−４１１（２００６）を参照のこと。インダクタの変化はコイルに入る磁性粒子の量を定量化するために使用できる。この方法は体外診断のための多くの装置に適用されたが、この方法は多重化できず、再現性も低い。
【００１２】
磁性粒子イメージング（ＭＰＩ）は、米国特許第７，７７８，６８１Ｂ２号に開示されているように、新たな非侵襲性で高感度の断層撮影技術である。ＭＰＩ走査装置の第一プロトタイプはＧｌｅｉｃｈ・Ｂの「磁性粒子の非線形応答を使用したトモグラフィーイメージング（Tomographic imaging using the nonlinear response of magnetic particles）」、『ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）』，４３５（７０４６），１２１４−１２１７（２００５）に公開される。ＭＰＩは変化する外部磁場に対する磁性粒子の非線形応答を利用し、その基本理論はＰａｕｌ  Ｌａｎｇｅｖｉｎによって１９０８年に最初に発明されたランジュバン理論（Ｌｅｍｏｎｓ，Ｄ，「Ｐａｕｌ  Ｌａｎｇｅｖｉｎが１９０８年に発表した論文『ブラウン運動に関する理論』（Paul Langevin’s 1908 paper ‘On the Theory of Brownian Motion’）」『米国物理学雑誌（Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｉｓ）』６５，１０７９（１９９７）である。交流磁場中の磁性粒子（トレーサー）の磁化によって生成された信号は空間的にエンコードされ、トレーサーの濃度とその位置に比例する信号を組み合わせることによって、空間的にエンコードされた信号を再構成した後ファントムの画像化に成功することが開示される。ＭＰＩの主な適用は生体内イメージングである（Ｗｅｉｚｅｎｃｋｅｒ，Ｊ，「三次元リアルタイム生体内磁性粒子イメージング（Three dimensional real-time in vivo magnetic particle imaging）」、『医学と生物学における物理学（Ｐｈｙｓ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．）』５４（５），Ｌ１−Ｌ１０（２００９）、及びＺｈｏｕ，Ｘ，の「ラットの肺灌流の最初の生体内磁性粒子イメージング（First in vivo magnetic particle imaging of lung perfusion in rats）」『医学と生物学における物理学（Ｐｈｙｓ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．）』６２（９），３５１０−３５２２（２０１７）」、癌診断（Ｙｕ，Ｙｕ）Ｅら、「磁性粒子イメージング：がん検出用の新型の体内イメージングプラットフォーム（Magnetic Particle Imaging：A Novel in Vivo Imaging Platform for Cancer Detection）」、『ナノ通信（Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．）』１７（３）１６４８−６５４（２０１７）、及び細胞追跡（Ｚｈｅｎｇ，Ｂら、「定量的磁性粒子イメージングによる生体内の幹細胞の移植、生物分布及び除去の監視（Quantitative Magnetic Particle Imaging Monitors the Transplantation，Biodistribution，and Clearance of Stem Cells In Vivo）」、『治療診断学（Ｔｈｅｒａｏｓｔｉｃｓ）』６（３），２９１−３０１（２０１６））。ＭＰＩの原理と一般的なＭＰＩ機器の構築方法について、Ｋｎｏｐｐら、「磁性粒子イメージング−イメージング原理とスキャナー機器の紹介（Magnetic Particle Imaging - An Introduction to Imaging Principles and Scanner Instrumentation）」）、（シュプリンガー・サイエンス・アンド・ビジネス・メディア（Springer Science＆Business Media），（２０１２）、及びＢｕｇｚ，Ｔら、「磁性ナノ粒子−粒子科学、イメージング技術及び臨床適用（Magnetic Nanoparticles-Particle Science，Imaging Technology，and Clinical Applications）」、世界科学出版社（World Scientific Publishing）（２０１０）に詳述される。
【００１３】
磁気バイオセンシング法及び技術には、例えば、人体サンプルが自然に強磁性材料に欠けているため、干渉物が少ない（干渉物が大量に存在する電子と光学技術とは異なる）など、多くの利点がある。ＭＮＰは、生物医学的分離技術とイメージングに用いられる。現在の磁気バイオセンシングの利点と欠点についての詳細な議論は、Ｌｅｅ，Ｈら、「磁気診断システムの最新の発展（Recent Developments in Magnetic Diagnostic Systems）」、『化学概要（Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．』１１５（１９），１０６９０−１０７２４（２０１５）を参照のこと。これまでのところ、光学センシング法と異なり、診断に用いられる既存の磁気センシング法の主な欠点は複数の解析物を同時に測定できないことである。磁気センシング法が直面するもう一つの問題は、通常均質な媒体又は単層を処理することである。
【００１４】
近年、臨床需要の増加に伴い、様々なポイントオブケア（ＰＯＣＴ）センシング法が爆発的に増加している。Ｃｈｅｎｇ，Ｍら、「生体分子検出及び医学診断に用いられるナノ
テクノロジー（Nanotechnologies for Biomolecular Detection and Medical Diagnostics）、『化学生物学新見（Curr. Opin. Chem. Biol.）』１０（１），１１−１９（２００６）、及びＧｉｌｊｏｈａｎｎ，Ｄら、「生物診断発展の推進要因（Drivers of Biodiagnostic Development）」、『ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）』４６２（７２７２）  ４６１−４６４（２００９）を参照のこと。これらのポイントオブケア方法は、電気インピーダンス、比色、光学的、及び磁気センシング戦略に基づくことが多く、特に細胞、分子及び遺伝子テストにおいて、感度と特異性のさらなる向上、テストの複雑さの増加、複雑な初期段階の純粋化（貴重なサンプルが失われる可能性がある）、小バッチテストに関連する特定の問題、より高いトレーニングのニーズ、より高い品質の管理コスト、規制上の負担及び費用を含む多くの課題に直面している。
【００１５】
側方流動アッセイ（ＬＦＩＡ）は、ポイントオブケア装置において最も広く使用されている形態の１つである。側方流動アッセイは、多孔質膜、抗体（モノクローナル及び／又はポリクローナル）を使用し、通常、可視信号生成システムを使用して高感度で、使い捨て、使いやすいテストを行う。この技術は、妊娠、受精率、薬物乱用、伝染病及びＤＮＡ検出の迅速な診断テストに使われている。一般用医薬品とポイントオブケアの両方は同様のテストを行うことができる。使いやすくて安いため、ポイントオブケアアッセイにおいて最も広く使用されている形式の１つとなっている。しかし、その設計と構造のため、ＬＦＩＡのサンプルの結合が非効率的であり、セクション間の接続が不十分であり、フィルムが一致せず、サンプルが漏れ、捕獲エリアが可変であるなどとなる（Ｗａｎｇ，Ｒら、「側方流動アッセイ（Ｌａｔｅｒａｌ  Ｆｌｏｗ   Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）」、ヒューマナ出版社（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ），２００９）。これらの問題は大きな変動係数（ＣＶ）をもたらし、ＬＦＩＡを主に定性分析に制限する。ＬＦＩＡの変動係数が大きいのは、主に各セクション間の接続が不十分で、捕獲材料の固定とサンプル輸送に用いられるフィルムが一致せず、サンプルがテストストリップのエッジから漏れ、可変の捕獲材料は分析領域にバンド化されることが原因である。多くの場合、手動による読み取りは不明瞭である。
【００１６】
マイクロ流体はポイントオブケア装置で広く使用される別の形態である。マイクロ流体チップは、成形又は彫刻されたマイクロチャネルのパターンである。マイクロチャネル内の流体をガイド、混合、分離又は操作することによって、多重化、自動化、ハイスループットシステムを実現する。チップ実験室、病原体検出、電気泳動、ＤＮＡ分析などの所望の機能を実現するために、マイクロチャネルネットワーク設計を正確で詳細に説明する必要がある。化学又は生物学的分析に使用されるマイクロ流体技術は、試薬の消費量を低減し、分析時間が短く、規模が小さく、汎用性と高感度を有する。過去の３０年間で、化学分析、生物学的分析及び臨床診断に使用されるマイクロ流体に基づく小型分析システムと技術は爆発的な増加している。しかし、マイクロ流体を化学及び生物学的分析に用いることは、複雑で厳密なサンプルの前処理及び処理、困難で複雑な設計と製造などのかなりの大きな課題に直面している。マイクロ流体チップで測定した分析物は通常溶液中にあり、分析物を検出するための方法、及び開発と製造のコストと複雑さを制限する（Ｎｏｈ，Ｊら、『現代化学の特定テーマ（Ｔｏｐ．Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．）』３０４、１１７−１５２（２０１１））。複雑のために、該プロセスを完了するために常に外部の駆動力が必要として、より高価になる傾向がある。
【００１７】
ＥＩＳＡ形式は、ポイントオブケア装置においてめったに使用されない。酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、ペプチド、タンパク質、抗体、及びホルモンなどの物質を検出及び定量するために、設計されたプレートベースのアッセイ技術である。ＥＬＩＳＡでは、抗原を固体表面に固定し、酵素に接続された抗体と複合体化する必要がある。検出は、基質とのインキュベートを介して共役酵素の活性を評価し、測定可能な生成物を生成することによって行われる。検出戦略において最も重要な要素は、非常に特異的な抗体
‐抗原の相互作用である。ＥＩＳＡ形式の制限は、マルチステップで操作し、試薬の処理が困難で設備が大きいことである。これはポイントオブケアの用途に適用しない。この形式の制限のため、ＥＩＳＡは高感度と特異性を有するが、通常に、ポイントオブケア装置ではなく、大型の臨床分析装置に用いられる。
【００１８】
使い捨て且つ生体分解可能なアッセイ形式の構築及び設計は、通常分析対象のサンプルのタイプと形式に制限される。その制限は、大規模の生産設備の技術だけではなく、分析環境、分析物、材料、測定に用いられる分析方法の物理的条件によって課され、これらはすべて市場価格、競争及びパフォーマンスによって駆動される。
【００１９】
ほとんどのポイントオブケア装置は線形である。例えば、早期妊娠検査（ＥＰＴ）などののＬＦＴを保持するために一般的なプラスチックカセットが使用される。これらは、バッキングカード、側方流動メンブレン（ニトロセルロース）、サンプル導入パッド、フィルタ、及び吸収膜の異なる配置で構成される。いくつかの既知の設計のプラスチックケースは部品を保持するため、液体サンプルを適用し、現像してから結果を読み取るのに便利である。このようなテストを使用する際の最新の問題の１つは、使用されたテスト設備の廃棄である。過去２年間で、アフリカ大陸だけでマラリア、ＨＩＶ、デング熱について６．５億回以上のアッセイが行われた。これは生物学的廃棄物の処理能力が限られた発展途上国で問題になっている。生物分解可能な材料で製造される装置は強く求められている。
【発明の概要】
【００２０】
本発明は、超常磁性粒子イメージング技術とハイブリッドポイントオブケア（ＨＹ−ＰＯＣ）チップを組み合わせて、磁気バイオセンシング技術の利点を維持し拡大しながら、すべての問題に対する解決策を提供する。さらに、本発明のハイブリッドポイントオブケアチップは、従来の形式の問題を解決するだけでなく、超常磁性粒子イメージング技術の利点を最大限に利用する。また、本発明は、分析方法及びチップに関して使用される分析装置を提供する。
【００２１】
本発明の超常磁性ナノ粒子に基づく分析方法は、サンプルマトリックスに少なくとも１つ以上の分析物を含むサンプルを提供するステップと、それぞれが少なくとも１つ以上のセクションを有する固定相である少なくとも１つ以上の分析領域を有するポイントオブケアチップを提供するステップと、前記サンプル中の各前記分析物を超常磁性ナノ粒子で標識して、前記標識された分析物を前記固定相に固定するステップと、インビトロで前記超常磁性ナノ粒子を励起するための装置と、前記励起された超常磁性ナノ粒子の応答を感知、受信及び伝送するための装置とを備える分析装置を提供するステップと、前記ポイントオブケアチップと、前記固定相を含む前記分析領域とを前記分析装置に配置し、インビトロで前記超常磁性ナノ粒子を励起するステップと、前記超常磁性ナノ粒子の前記応答を感知、受信及び伝送するステップと、前記超常磁性ナノ粒子の前記応答を分析して、前記分析物の特性を決定するステップとを含み、前記超常磁性ナノ粒子の前記応答は高調波を含む。
【００２２】
本発明では、前記超常磁性ナノ粒子に基づく分析方法は、前記分析装置において、変化する外部磁場と、前記変化する外部磁場内の場のないポイント、又は場のないライン、又は場のないスペースであってもよい場のない領域とを提供するステップと、前記ポイントオブケアチップを前記分析装置に配置し、前記場のない領域は前記分析領域全体を走査して、励起コイルは前記場のない領域において前記固定相上の前記超常磁性ナノ粒子を励起して、前記空間的にエンコードされた応答を生成するステップとをさらに含み、前記分析領域の前記固定相は２つ以上のセクションを含み、前記セクション中の前記超常磁性ナノ粒子は空間的にエンコードされた応答を生成し、前記分析物の前記特性は、結合されていない分析物の除去又は再構成が行われるか又は行われないかにかかわらず、いずれも前記
空間的にエンコードされた応答から定量的に決定される。
【００２３】
本発明では、前記固定相中のセクションの数は１〜２０の範囲であり、且つ好ましくは、前記固定相は、１つの単一のセクションからなる。
本発明では、前記固定相は、１〜２０範囲内の少なくとも１つ以上の異なる超常磁性ナノ粒子を固定するために採用されてもい。
【００２４】
本発明では、前記超常磁性ナノ粒子のそれぞれは、前記標識された分析物のそれぞれに対応してもよく、前記サンプルマトリックス中の前記標識された分析物上の他の超常磁性ナノ粒子と異なってもよい。
本発明では、前記超常磁性ナノ粒子の粒径は１ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲であってもよい。超常磁性ナノ粒子は、Ｆｅ、ＣｏＦｅ、Ｃｏ、Ｃｏ合金、フェライト、窒化コバルト、酸化コバルト、Ｃｏ−Ｐｄ、Ｃｏ−Ｐｔ、鉄、鉄合金、Ｆｅ−Ａｕ、Ｆｅ−Ｃｒ、Ｆｅ−Ｎ、ＦｅＯ、Ｆｅ−Ｐｄ、Ｆｅ−Ｐｔ、Ｆｅ−Ｚｒ−Ｎｂ−Ｂ、Ｍｎ−Ｎ、Ｎｄ−Ｆｅ−Ｂ、Ｎｄ−Ｆｅ−Ｂ−Ｎｂ−Ｃｕ、Ｎｉ又はＮｉ合金材料で製造されてもよく。さらに、前記超常磁性ナノ粒子は、球形、楕円形、扁平状又は管状の形状であってもよく、且つ、前記外部磁場に対する前記超常磁性ナノ粒子の応答を変化する材料はコーティングされてもよい。
【００２５】
本発明では、サンプルは、液体、固体抽出物、液体、空気サンプル、又はそれらの混合物であってもよいサンプルマトリックス中にある。さらに、前記サンプルマトリックスは、全血、血清、血漿、尿、唾液、糞便、涙又は汗であってもよい。
【００２６】
本発明では、前記分析物は、有機分子、生体分子、ペプチド、ポリマー、アミノ酸、タンパク質、酵素、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルス、細胞、細菌、病原体、無機分子、薬物、又はそれらの混合物であってもよい。
本発明では、前記分析領域は、ハイブリッドポイントオブケア、側方流動、マイクロ流体ビーズ、又はＥＬＩＳＡ単層であるアッセイ形式であってもよい。
【００２７】
本発明はさらに、少なくとも１つ以上のサンプル導入領域と、少なくとも１つ以上の分析領域と、流体吸収領域と、必要に応じて、試薬リザーバとを含む３次元ハイブリッドポイントオブケアチップを提供する。前記３次元ハイブリッドポイントオブケアップの構造は１層〜１０層範囲内の積層板であり、そして、サンプル導入領域、前記試薬リザーバ、前記分析領域及び前記流体吸収領域は、分析物を含むサンプルを分割して前記積層板の前記レベルにガイドすることを可能にするマイクロチャネルにより順に接続される。
【００２８】
本発明では、前記３次元ハイブリッドポイントオブケアチップはさらに、前記積層板に２つ以上のレベルを有する場合、切替えカラムを備えてもよく、そして、前記切替えカラムは、前記サンプル導入領域と前記分析領域との間に位置決めされ、前記積層板の前記レベルを接続して、前記分析物を含む前記サンプルを分割して前記積層板の異なるレベルにガイドすることを可能にする。
【００２９】
本発明では、前記３次元ハイブリッドポイントオブケアチップはさらに、前記サンプル導入領域に接続されたダイアフラムポンプなどの液体駆動機構を備えてもよい。
本発明では、前記積層板の少なくとも１つ以上のレベルは、前記分析物を含む前記サンプルがその自体で流れるフィルムの積層層であり、前記フィルムの表面は必要に応じて修飾される。前記フィルムは、プラスチック、接着剤、紙、木材、繊維、シリコン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ガラス繊維、セルロース、多糖類、タンパク質ポリマー又は圧延された粒子材料で製造される。
【００３０】
本発明では、前記サンプル導入領域の数は１〜５の範囲であってもよい。前記サンプル導入領域は、Ａｕｎｅｔに説明された装置（Ａｕｎｅｔ，ＤのＵＳ４９３３０９２、１９９０）などの赤血球分離機構をさらに備えてもよい。さらに、前記サンプル導入領域は、標識された分析物の識別材料及び／又はサンプルがマイクロチャネルに流れるのを助け、サンプルのｐＨを制御し、分析領域中の分析物と識別材料又は捕獲材料との間の反応を強化する試薬をさらに含み得る。一般に、前記サンプル導入領域は、体積が１〜２００マイクロリットル範囲内の前記サンプルを収容することができ、且つ前記サンプルは、全血、血漿、血清、尿、唾液、涙、汗、便抽出物、ＤＮＡ／ＲＮＡ抽出物、抗原含有溶液、抗体、酵素、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、有機分子、無機分子、バイオマーカ、産業汚染物質、病原体、ウイルス、細胞、細胞培養抽出物又は環境サンプルであってもよい。
【００３１】
本発明では、前記チップ中の前記切替えカラムの数は１〜５の範囲であってもよい。
【００３２】
本発明では、前記チップ中の前記試薬リザーバの数は０〜１０の範囲であってもよい。前記試薬リザーバは、前記サンプル中の前記分析物を識別して固定するために必要な１つ以上の試薬を収容することができる。
【００３３】
本発明では、前記チップ中の前記分析領域の数は１〜２０の範囲であってもよい。前記分析領域は、一体に組み立てられる１つ又は複数のセクションを含む固定相であり、前記分析領域中の前記セクションの数は１〜２０の範囲であり、且つ各セクションの形態は、粒子、細孔膜、水不溶性ゲル、又はコロイドである。前記固定相の粒子は、プラスチック、シリカ、ガラス、酸化アルミニウム、有機ポリマー、無機ポリマー、又は生分解性ポリマーで製造されてもよい。
【００３４】
本発明では、前記細孔膜は、プラスチック、繊維、ポリマー、多糖類、セルロース、紙、木材、生物学的構築物、生体足場、ガラス繊維、生分解性ポリマー、又はタンパク質ポリマーから構成されてもよく、且つ前記細孔膜は、織られた、織られない又は圧延された粒子である。
【００３５】
本発明では、前記固定相は、物理的吸着、又は前記サンプル中の前記分析物に特異的な識別試薬との共有結合によって機能化されてもよい。
本発明では、前記固定相は、前記分析領域に直接配置又は分配されるために、適切な形状及びサイズに予め形成されてもよい。且つ、前記分析領域は、前記積層板の１つのレベル内、又は複数のレベルにわたって構造されてもよい。
【００３６】
本発明では、前記チップ中の前記流体吸収領域の数は１〜５の範囲である。前記流体吸収領域は流体吸収パッドを有するチャンバを備えてもよい。前記流体吸収パッドは、ヒドロゲル、粒子、圧延された粒子、又は細孔膜で製造されてもよく、そして、前記細孔膜は、プラスチック、繊維、ポリマー、多糖類、セルロース、紙、木材、生物学的構築物、生体足場、ガラス繊維、生分解性ポリマー、又はタンパク質ポリマーから構成されてもよい。
【００３７】
本発明はまた、本発明のハイブリッドポイントオブケアチップを使用した分析方法を提供し、試薬リザーバ中の試薬によってサンプル中の分析物を識別するステップと、分析領域中の前記識別された分析物を固定するステップと、磁気、音響、放射性、蛍光、化学発光検出方法又はそれらの組み合わせである検出方法により、前記分析物の特性を決定するステップと、を含む。前記試薬は、抗体、タンパク質、ＤＮＡ／ＲＮＡプローブ又はキレート剤で機能化された磁性粒子、蛍光粒子、化学発光粒子、放射性粒子、又はそれらの混合物を含んでもよく、磁気、蛍光、化学発光又は放射性標識された抗体、タンパク質、Ｄ
ＮＡ／ＲＮＡプローブ又はキレート剤は、前記サンプル中の前記分析物に結合して識別し、前記試薬を前記試薬リザーバに直接配置し、又は固体支持体に吸収して前記試薬リザーバに配置し、そして、前記分析領域には、前記識別された分析物を固定する識別試薬で機能化される固定相のセクションがある。
【００３８】
本発明では、ハイブリッドポイントオブケアチップは、円弧に沿って設けられる複数の分析領域を有してもよい。前記複数のハイブリッドポイントオブケアチップは、アレイを形成し且つ同じサンプル導入領域を共有するように配置される。
【００３９】
本発明では、ハイブリッドポイントオブケアチップは、毛細管により機能する外部からの支援なしにサンプルを自動的に実行するように設計される。
【００４０】
本発明では、前記磁気検出方法は、超常磁性イメージング、磁性粒子の総蓄積、励磁インダクタンス、交流磁気磁化率測定法、相補型金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）交流磁化率測定法、ホール効果、磁気抵抗、巨大磁気抵抗（ＧＭＲ）、超巨大磁気抵抗（ＣＭＲ）、超伝導量子干渉装置（ＳＱＵＩＤ）、磁気緩和法、又は磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）スピン緩和時間を含んでもよい。
【００４１】
本発明はさらに超常磁性粒子イメージング分析装置を提供し、水平軸に沿って配置され内部容積を有するハウジングと、前記水平軸に沿って前記ハウジングの前記内部容積に適合され、且つ、その間に場のない領域を形成するために、いずれもマッチングする磁極が互いに向き合うように維持される一対の永久磁石と、前記水平軸に沿って前記一対の永久磁石の間に配置され、いずれも前記場のない領域に接近して、前記場のない領域に交流電気を生成するための一対の励起コイルと、前記水平軸に沿って前記一対の励起コイルの間に配置され、いずれも前記場のない領域に接近する一対の受信コイルと、を備える。分析領域に固定された超常磁性ナノ粒子で標識された分析物を有するサンプルは、前記ハウジングの前記内部容積に配置されて、超常磁性ナノ粒子が励起され、分析のために受信コイルのペアによって検出および送信される常磁性応答を送信する場のない領域を通過する。
【００４２】
本発明では、前記永久磁石はＮｄＦｅＢで製造されてもよい。
本発明の分析装置の一実施形態では、前記ハウジングは円筒であり、且つ前記内部容積は円筒状内部容積であり、前記一対の永久磁石は、円筒状であり、前記ハウジングの前記円筒状内部容積に適合され、前記一対の励起コイルは、前記場のない領域において交流電気を形成して前記超常磁性ナノ粒子を励起する交流変調磁場コイルであり、そして、前記サンプルは、前記円筒ハウジングの前記円筒状内部容積において同じ直線で移動するハイブリッドポイントオブケアチップにある。
【００４３】
本発明の分析装置の別の実施形態では、前記ハウジングは辺が開いたＣ字状フレームであり、前記一対の永久磁石は直線形であり、直線的な場のない領域を形成するために、各前記永久磁石の陽極が互いに向き合うように強制され、前記一対の励起コイルは、前記超常磁性ナノ粒子を励起するための一対のヘルムホルツコイルであり、且つ固定された超常磁性ナノ粒子で標識された分析物を含む前記サンプルは、複数の方向から移動して前記ハウジング中の前記線形場のない領域に入る。
【００４４】
本発明の分析装置のさらなる別の実施形態では、前記一対の励起コイルは、互いに向き合って絶縁体によって分離される一対のＥ字状焼結フェライト磁気コアであり、前記Ｅ字状磁気コアの各脚はいずれも電磁コイル巻線を有し、それにより、隙間を形成するために短絡されたＥ字状磁気コアの２つの正反対の極に磁場を生成し、前記一対の永久磁石は、前記隙間内に前記場のない領域を生成するために、互いに陽極に向き合うように強制され、そして、前記サンプルは、励起と分析のために隙間とアクセス可能な領域を通って移動
する。
【００４５】
本発明の分析装置のさらなる別の実施形態では、前記分析装置は、永久磁石なしの片面分析装置であり、且つ２つの同心円状に配置された送信コイルと受信コイルを備える。前記２つの送信コイルの電流方向は逆であり、磁場線を形成し、場のない領域は前記磁場線と対称的であり、超常磁性ナノ粒子で標識された分析物を有する前記サンプルは、前記場のない領域に配置して励起され、且つ前記超常磁性ナノ粒子の常磁性応答は前記受信コイルによって感知されて伝送される。
【００４６】
本発明の分析装置のさらなる別の実施形態では、前記分析装置は、ホールセンサ分析装置であり、磁化不可能な中空軸と、内側に円筒状内部を有し、それを貫通する前記磁化不可能な中空軸によって取り付けられて支持される円筒状の永久磁石と、バイアスワイヤと信号を有し、前記永久磁石の前記円筒状内部と前記磁化不可能な中空軸に配置されるホールセンサとを備える。本実施形態では、前記永久磁石は磁力場を形成する理論的な磁力線を有し、前記円筒状永久磁石を離れる前記磁力線は、前記円筒の中心及び磁力場の中心にゼロ領域を生成する。前記永久磁石は、前記ゼロ領域における前記超常磁性ナノ粒子で標識された分析物を有する前記サンプルに誘導を提供する。前記ホールセンサは、前記円筒状内部の中心の前記ゼロ領域に配置され、前記超常磁性ナノ粒子の前記常磁性応答を感知して受信し、前記常磁性応答の前記バイアスワイヤと信号は信号処理のために送信される。
【００４７】
さらに、前記サンプルはサンプル用の複数の分析領域を含むハイブリッドポイントオブケアチップにあってもよく、前記分析領域は円弧に沿って前記チップに配置される。本発明では、円弧に沿った複数の分析領域の構成を有するハイブリッドポイントオブケアチップは、本発明の片面分析装置及びホールセンサ分析装置に特にうまく動作する。
本発明はさらに、超常磁性粒子イメージング分析装置を使用する方法を提供し、超常磁性ナノ粒子で標識された分析物を有するサンプルを提供するステップと、前記サンプルを分析装置の場のない領域に配置するステップと、前記場のない領域に前記超常磁性ナノ粒子を励起して、前記超常磁性ナノ粒子の常磁性応答からの信号を取得するステップと、前記信号を感知して伝送するステップと、前記信号を分析して前記分析物の特性を取得するステップとを含む。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１は、１つの区画室を有する１つの分析領域が使用され、前記区画室に分析物が固定される、本発明の分析方法の第１実施形態を示す。
【図２】図２は、１つの区画室を有する１つの分析領域が使用され、前記区画室に複数種の分析物が固定される、本発明の分析方法の第２実施形態を示す。
【図３】図３は、複数の区画室を有する１つの分析領域が使用され、各区画室に異なる分析物が固定される、本発明の分析方法の第３及び第４実施形態を示す。
【図４】図４は、複数の区画室を有する１つの分析領域が使用され、各区画室に複数種の分析物が固定される、本発明の分析方法の第５及び第６実施形態を示す。
【図５】図５は、それぞれ１つの区画室を有する複数の分析領域が使用され、各区画室に異なる分析物が固定される、本発明の分析方法の第７実施形態を示す。
【図６】図６は、それぞれ１つの区画室を有する複数の分析領域が使用され、各区画室に複数種の分析物が固定される、本発明の分析方法の第８実施形態を示す。
【図７】図７は、それぞれ複数の区画室を有する複数の分析領域が使用され、各区画室に異なる分析物が固定される、本発明の分析方法の第９及び第１０実施形態を示す。
【図８】図８は、それぞれ複数の区画室を有する複数の分析領域が使用され、各区画室に複数種の分析物が固定される、本発明の分析方法の第１１及び第１２実施形態を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、本発明のハイブリッドポイントオブケアチップの構造の対応する平面図及び側面図であり、平面図が上部に、側面図が下部にある。
【図９Ｂ】図９Ｂは、本発明のハイブリッドポイントオブケアチップを構成する層及び部材の構造を示す分解図である。
【図９Ｃ】図９Ｃは、本発明の非線形ハイブリッドポイントオブケアチップの実施形態の構造を示す。
【図９Ｄ】図９Ｄは、本発明のハイブリッドポイントオブケアチップアレイの実施形態の構造を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、本発明の超常磁性粒子イメージング分析装置の第１実施形態の構造を示し、前記分析装置は共線形分析装置である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、図１０Ａの点線で示される中央の正方形の拡大図であり、本発明のハイブリッドポイントオブケアチップの構造を示し、前記チップは使い捨て部材として前記位置に位置し分析装置に適合される。
【図１１Ａ】図１１Ａは、本発明の超常磁性粒子イメージング分析装置の第２実施形態の構造を示す正面図であり、前記分析装置は開放式分析装置である。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、同じ分析装置の構造を示す側面図である。
【図１２Ａ】図１２Ａは、本発明の超常磁性粒子イメージング分析装置の第３実施形態の「Ｅ」字状磁気コアの励起場の構造を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、本発明のハイブリッドポイントオブケアチップを示す局所拡大図であり、前記チップは、分析装置に適合された分析装置の使い捨て部材である。
【図１３Ａ】図１３Ａは、本発明の超常磁性粒子イメージング分析装置の第４実施形態の構造を示す平面図であり、前記分析装置は、２つの同心円状に配置された送信コイルと分離された受信コイルとを有する片面分析装置である。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、本発明のハイブリッドポイントオブケアチップの構造を示す局所拡大図であり、前記チップは、分析装置の使い捨て部材として、分析装置の送信コイル及び受信コイルと一緒に使用される。
【図１４】図１４は、本発明の超常磁性粒子イメージング分析装置中の信号チェーンを示す図である。
【図１５Ａ】図１５Ａは、本発明の超常磁性粒子イメージング分析装置の第５実施形態に使用される永久磁石の構造を示す局所側面図であり、前記分析装置はホールセンサ分析装置である。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、本発明の永久磁石及びハイブリッドポイントオブケアチップを示す局所平面図であり、前記チップは分析装置の使い捨て部材として、永久磁石に関連して使用される。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、本発明の分析装置の構造を示す側面図である。
【図１５Ｄ】図１５Ｄは、本発明の分析装置の構造を示す平面図である。
【図１６】図１６は、本発明の非線形ハイブリッドポイントオブケアチップと一緒に使用される超常磁性粒子イメージング分析装置の第６実施形態の構造を示す。
【図１７】図１７は、ホールセンサに基づく本発明の超常磁性粒子イメージング分析装置中の信号チェーンを示す図である。
【図１８】図１８は、実施例１に使用される本発明のハイブリッドポイントオブケアチップを示す。
【図１９】図１９は、実施例１における第１、第２及び第３分析領域の縦軸としての磁気応答（Ｍｏｘ）に対する横軸としてのＳＰＮＰ濃度（ｎｇ／ｍｌ）の実験結果を示す。
【符号の説明】
【００４９】
１０−アッセイ形式の分析領域（１０’又は１０ａ’は連続的に配置された異なる分析領域を表す）、１１−区画室（１１’、１１ａ、１１ａ’、１１ｚはは連続的に配置された異なる分析領域を表す）、１２−分析物、１３−分析物１２を標識するための超常磁性ナノ粒子、本発明では、超常磁性粒子、超常磁性ナノ粒子標識物又は超常磁性粒子標識物とも呼称される。
２０−ハイブリッドポイントオブケアチップ又はチップアレイ（２０ａ、２０ｂ、２０ｃ、２０ｄ、２０ｅ、２０ｆ、２０ｇ、及び２０ｈはチップアレイ中の各チップを表す）、２１０−チップ２０中の分析領域（２１０ａ、２１０ｂ、２１０ｃ、２１０ｄ、及び２１０ｅは続的に配置された第１、第２、第３、第４及び第５分析領域を表す）、２１−サンプル口、２２−試薬、２３−マイクロチャネル（２３ａ、２３ｂ、２３ｃ、２３ｄ、２３ｅはチップの異なるセクションを接続するための異なるマイクロチャネル）、２４−切替えカラム、２５−切替えカラム２４中の充填材料、２６−吸収室、２７−吸収パッド、２８−通気口。
３０−ＳＰＩ分析装置、３１−ハウジング、３１０−円筒、３１１−フレーム、３２−永久磁石、３３−内部円筒容積、３３ａ−永久磁石の内部円筒、３４−締め具、３５−励起コイル、３６−受信コイル、３７−場のないポイント（ＦＦＰ）又は場のない領域（ＦＦＲ）、３７’−領域の線形場のないポイント（ＦＦＬ）、３７ｂ−ゼロフリー非磁化領域、３８−視野（ＦＯＶ）、３９−選択場を示す矢印。
４０−信号チェーン、４１−シールド、４２−交流駆動場、４３−直流駆動場、４４−信号前置増幅ユニット、４５−ローパスフィルタ、４６−アナログデジタル変換、４７−信号増幅器、４８−バーコードリーダー、４９−中央プロセッサ（ＣＰＵ）、５０−ブルートゥース(登録商標）、５１−無線信号出力（ＷＩＦＩ）、５２−ディスプレイ、５３−（無線）印刷機、５４−グラフィカルユーザーインタフェース（ＧＵＩ）、５５−モバイルアプリケーション、５６−外部１２−２４０Ｖ壁式変圧器。
６０−ホール磁気センサ、６０’−ホール素子、６１−中空軸、６２−バイアスワイヤ及び信号出力、６３−生成された磁力線表現（均一な磁気量子のファントム）、６４−支持ベース、６５−サーミスター、６６−フィルタ（オフセット／削除用）、６７−ホール信号前置増幅ステージ。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本発明において、「形式」又は「アッセイ形式」という用語は、分析方法を行う時に必要であり、且つ該分析方法に使用される部材、装置及び試薬の集まりを指す。
【００５１】
本発明の分析方法は、ランジュバン（Ｌａｎｇｅｖｉｎ）理論に基づく超常磁性粒子イメージング技術を使用して、変化する外部磁場に対する超常磁性ナノ粒子（ＳＰＮＰ）、主にその高調波の非線形応答を検出して分析する。磁性粒子イメージング技術による溶液中の遊離磁性粒子の測定とは対照的に、固定相に固定された超常磁性ナノ粒子で標識された分析物の濃度を測定する。結果として、本発明の方法は、トレーサーの分布を測定する必要とせずに、分析領域における分析物の総濃度を測定するだけでよい。分析領域が既知であるため、濃度を測定するために再構成する必要はない。
【００５２】
本発明の方法は、変化する外部磁場に対する超常磁性ナノ粒子の空間的にエンコードされた非線形応答を使用することで、チップの分析領域における複数種の分析物を同時に定量的にアッセイする超常磁性粒子イメージング技術を使用する。
【００５３】
本発明では、超常磁性粒子イメージング技術はインビトロ診断に適用される。超常磁性ナノ粒子の製造に用いられる材料の選択範囲はインビボ診断に使用されるものよりはるかに広く、Ｃｏ、Ｆｅ、ＣｏＦｅ、Ｃｏ合金、フェライト、窒化コバルト、酸化コバルト、Ｃｏ−Ｐｄ、Ｃｏ−Ｐｔ、鉄、鉄合金、Ｆｅ−Ａｕ、Ｆｅ−Ｃｒ、Ｆｅ−Ｎ、ＦｅＯ、Ｆｅ−Ｐｄ、Ｆｅ−Ｐｔ、Ｆｅ−Ｚｒ−Ｎｂ−Ｂ、Ｍｎ−Ｎ、Ｎｄ−Ｆｅ−Ｂ、Ｎｄ−Ｆｅ−Ｂ−Ｎｂ−Ｃｕ、Ｎｉ又はＮｉ合金であってもよい。
【００５４】
本発明では、異なる形状を有する粒子は異なる高調波を与えるために用いられる。超常磁性ナノ粒子は、球形、楕円形及び扁平状を含むがこれに限定されない様々な幾何学的形状に製造することができる。一部の粒子は、分析のために異なる高調波を生成するために
異なる塗料でコーティングされる。
【００５５】
本発明では、異なる粒径の粒子が異なる高調波を与えるため、超常磁性ナノ粒子のサイズは１〜１０００ｎｍの間である。
本発明では、固定粒子と遊離粒子は異なる高調波を与える。このため、固定された超常磁性ナノ粒子から信号を分離する方法は提供される。その結果、分析領域を洗浄し非結合の超常磁性ナノ粒子を除去する必要とせずに、アッセイ開始の後分析物を直接測定することができる。
本発明では、分析物は、超常磁性ナノ粒子で標識し固定相に固定できる物質であってもよく、有機分子、生体分子、ペプチド、ポリマー、アミノ酸、タンパク質、酵素、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルス、細菌、細胞、無機分子、及び薬物を含むがこれに限定されない。
本発明では、測定可能なサンプルは、全血、血清、血漿、尿、唾液、糞便、涙、汗などの体液を含むがこれに限定されない。液体、固体、及び気体の抽出物であってもよい。
【００５６】
本発明の分析方法は、以下の実施形態では図面を参照しながら更に説明される。図１に示される本発明の分析方法の第１実施形態では、分析を行うアッセイ形式は、超常磁性ナノ粒子１３で標識された分析物１２を固定する１つの区画室１１からなる１つの分析領域１０を含む。
【００５７】
アッセイ形式が本発明の超常磁性粒子イメージング分析装置に配置されると、変化する励起場が分析領域１０に適用され、且つ分析領域１０と区画室１１中の超常磁性ナノ粒子１３は応答して、分析装置の受信コイルに高調波信号を生成する。生成された高調波信号は、区画室１１中の超常磁性ナノ粒子の濃度に正比例し、
【数１】
2021523382.tif 000003
【００５８】
ここで、
2021523382.tif 000004
は区画室１１から受信した信号、
2021523382.tif 000005
は区画室１１のシステム関数、且つ、
2021523382.tif 000006
は超常磁性ナノ粒子の濃度、又は区画室１１中の分析物の濃度である。システム関数は、既知の濃度
2021523382.tif 000007
のサンプルの応答（
2021523382.tif 000008
）を測定することにより取得できる：
【数２】
2021523382.tif 000009
【００５９】
システム関数が取得されたら、受信コイル中の信号を測定することにより形式中の分析物の濃度を決定することができる。
図２に示される本発明の分析方法の第２実施形態では、変化する外部磁場に対する超常磁性ナノ粒子の非線形応答を使用して、アッセイ形式で複数種の分析物を定量化する。アッセイ形式は、１つの区画室１１からなる１つの分析領域１０を含む。区画室１１には、総数Ｚの分析物（１番目の分析物を１２、Ｚ番目の分析物を１２’として示す）が固定されている。数字Ｚは、１〜２０の整数である。各分析物は超常磁性ナノ粒子で標識できる（それぞれ分析物１２及び１２’を標識するための超常磁性ナノ粒子１３及び１３’が示される）。
【００６０】
アッセイ形式が本発明の超常磁性粒子イメージング分析装置に配置されると、変化する励起場が分析領域１０及び区画室１１に適用され、且つ区画室１１中のすべての超常磁性ナノ粒子はいずれも応答し、分析装置の受信コイルに高調波信号を生成する。磁性粒子の濃度はその高調波に正比例する。区画室１１において測定されたｎ次高調波
2021523382.tif 000010
の振幅は、区画室１１内のすべての粒子のｎ次高調波
の振幅
2021523382.tif 000011
の合計である（Ｒａｕｗｅｒｄｉｎｋ，Ａ、「複数種の磁性ナノ粒子の同時定量（Simultaneous quantification of multiple magnetic nanoparticles）」、『ナノテクノロジー（Nanotechnology）』、２１（４５），４５５１０１  （２０１０）を参照）、
【数３】
2021523382.tif 000012
粒子ｉのｎ次高調波の振幅
2021523382.tif 000013
は粒子ｉの濃度
2021523382.tif 000014
に正比例する、
【数４】
2021523382.tif 000015
2021523382.tif 000016
は、濃度（
2021523382.tif 000017
）が既知の粒子ｉの溶液のｎ次高調波を測定することにより取得できる定数である、
【数５】
2021523382.tif 000018
【００６１】
粒子のすべての高調波の比率は濃度と関係がないため（Ｒａｕｗｅｒｄｉｎｋ，Ａ，２０１０を参照）、以式で区画室１１中の各粒子の濃度を解くことができる、
【数６】
2021523382.tif 000019
ここで、
【数７】
2021523382.tif 000020
式において、高調波は低次から高次まで使用され、こらは、いずれの高調波を使用して計算できるが、高調波の振幅は、次数が高くなることにつれて迅速に減少するためである。区画室１１の３番目から（２Ｚ＋１）番目の高調波を測定することにより、全てのＺ種の分析物の濃度を式で決定する。最大限、１（分析領域）・１（区画室）・Ｚ（ＳＰＮＰ）分析物を同時に分析することができ、この場合、１（分析領域）・１（区画室）×２０（ＳＰＮＰ）＝２０分析物である。
【００６２】
図３に示される本発明の分析方法の第３実施形態では、変化する外部磁場に対する空間的にエンコードされた区画室中の超常磁性ナノ粒子の非線形応答は、アッセイ形式で複数種の分析物を定量化することに使用される。アッセイ形式は、Ｙ個の区画室（第１区画室１１及び第Ｙ区画室１１’が示される）からなる１つの分析領域１０を含む。Ｙは１〜２０範囲内の整数である。各区画室は、異なる分析物（区画室１１中の１番目の分析物１２及び区画室１１’中のＹ番目の分析物１２’が示される）を固定する。各種類の分析物は、いずれも超常磁性ナノ粒子で標識される（区画室１１中の分析物１２の粒子標識１３及び区画室１１’中の分析物１２’の粒子標識１３’が示される）。
【００６３】
アッセイ形式が本発明の超常磁性粒子イメージング分析装置に配置されると、収束場コイルは、区画室１１の大きさの場のないスペース（ＦＦＳ）を生成する。分析領域１０の構造（区画室の数、形状及び位置を含む）が既知であるため、区画室の位置に基づいてＦＦＳを移動して、１つの区画室に適用することができる。ＦＦＳが区画室１１に適用されると、駆動場コイルによって生成された変化する励起場が区画室に適用される。場のない区画室１１中の超常磁性ナノ粒子１３は応答し、分析装置の受信コイルに高調波信号を生成する。第１実施形態で説明された方式で、区画室１１中に固定された分析物１２を分析する。区画室１１を分析した後、ＦＦＳを次の区画室に移動して次の区画室に固定される分析物を分析する。分析領域１０中の全てのＹ個の区画室が分析されるまで、同じプロセスを繰り返して実行する。このようにして、全てのＹ種の分析物（１番目の分析物１２及びＹ番目の分析物１２’のみが示される）はすべて定量化される。最大限、１（分析領域
）・Ｙ（区画室）・１（ＳＰＮＰ）分析物を同時に分析することができ、この場合、１（分析領域）・２０（区画室）・１（ＳＰＮＰ）＝２０分析物である。
【００６４】
本発明の分析方法の第４実施形態では、変化する外部磁場に対するＳＰＮＰの空間的にエンコードされた非線形応答は、アッセイ形式で複数種の分析物を同時に定量化することに使用される。アッセイ形式は図３に示される第３実施形態と同じであるが、構成で異なる分析方法が使用される。
アッセイ形式が本発明の超常磁性粒子イメージング分析装置に配置されると、収束場コイルは場のないポイント（ＦＦＰ）を生成する。（区画室（１１、１１’……）の数、それらの形状及びそれらの位置を含む分析領域１０の構造は既知であるため、ＦＦＰは、分析領域１０内に所定のルートで移動する。変化する励起場がＦＦＰに適用されると、ＦＦＰ内部のＳＰＮＰ１３、１３’……の磁化を引き起こす。ＦＦＰは空間的及び時間的にエンコードされるため、ＦＦＰから生成された信号も空間的及び時間的にエンコードされる。誘導された磁化の長さは磁性粒子１３、１３’……の濃度に正比例する。磁性粒子の濃度（
2021523382.tif 000021
）と該位置（
2021523382.tif 000022
）及び時点での信号（
2021523382.tif 000023
）との間の関係は、
【数８】
2021523382.tif 000024
であり、
2021523382.tif 000025
はシステム関数である。これは、濃度が既知の磁性粒子溶液を配置し、同じ位置で高調波応答を測定することにより決定できる。既知のシステム関数を使用すると、下式で各ＦＦＰでの磁性粒子の濃度
2021523382.tif 000026
を決定することができる（Ｒａｈｍｅｒ，Ｊら、「３Ｄリアルタイム磁性粒子イメージング：エンコード及び再構成について（3D Real-time Magnetic Particle Imaging: Encoding and Reconstruction Aspects）」、『磁性粒子イメージングに関する第１回の国際討論会議事録（Proceedings of the First International Workshop on Magnetic Particle
Imaging）』、２０１４、１２６−１３１頁）、
【数９】
2021523382.tif 000027
2021523382.tif 000028
は、第Ｙ区画室１１’中のサンプリング位置（
2021523382.tif 000029
）での磁性粒子の濃度である。走査が完了する際、信号は、生成された位置に基づいて処理される。同じ区画室からの信号を一緒に処理する。理想的な状況で、第Ｙ区画室１１’中の磁性粒子の総濃度は区画室中の各位置の濃度の合計に比例する：
【数１０】
2021523382.tif 000030
2021523382.tif 000031
は第Ｙ区画室１１’中の磁性粒子の総濃度である。
2021523382.tif 000032
は、標準溶液を測定することにより取得できる定数である。非理想的な状況で、信号合計と総濃度の間の検量線を作成することができる。第１区画室１１〜第Ｙ区画室１１’を分析することにより、１番目の分析物１２〜Ｙ番目の分析物１２’を定量化する。最大限、１（分析領域）・Ｙ（区画室）・１（ＳＰＮＰ）分析物を同時に分析することができる、この場合、１（分析領域）・２０（区画室）・１（ＳＰＮＰ）＝２０分析物である。
【００６５】
図４に示される本発明の分析方法の第５実施形態では、変化する外部磁場に対する空間的にエンコードされた区画室中の超常磁性ナノ粒子の非線形応答は、アッセイ形式で複数種の分析物を定量化することに使用される。アッセイ形式は、Ｙ個の区画室（第１区画室１１及び第Ｙ区画室１１’が示される）からなる１つの分析領域１０を含む。Ｙは１〜２０範囲内の整数である。各区画室は、Ｚ種の分析物（１番目の分析物１２及びＺ番目の分析物１２’が示される）を固定する。Ｚは２〜２０範囲内の整数である。Ｚ種の分析物はそれぞれＺ種の超常磁性ナノ粒子で標識される（１番目のＳＰＮＰ標識１３及びＺ番目のＳＰＮＰ標識１３’が示される）。
【００６６】
アッセイ形式が本発明の超常磁性粒子イメージング分析装置に配置されると、収束場コ
イルは区画室の大きさの場のないスペース（ＦＦＳ）を生成する。分析領域１０の構造（区画室１１、１１’……の数Ｙ、それらの形状及びそれらの位置を含む）が既知であるため、区画室の位置に応じてＦＦＳを移動し、１つの区画室に一回で適用することができる。ＦＦＳが第１区画室１１に適用されると、駆動場コイルによって生成された変化する励起場が区画室に適用される。場のない区画室１１中のＳＰＮＰは応答して、受信コイルに高調波信号を生成する。
【００６７】
区画室１１中に固定された分析物は、第２実施形態で説明された方式で分析する。第１区画室１１中の分析物１２、１２’……（分析物の合計がＺである）を定量化する。第１区画室１１を分析した後、ＦＦＳを第２区画室に移動して該区画室を分析し、分析領域１０中の第Ｙ区画室１１’が分析されるまで続ける。各区画室の分析方式はすべて区画室１１と同じである。最大限、１（分析領域）・Ｙ（区画室）・Ｚ（ＳＰＮＰ）分析物を同時に分析することができ、この場合、１（分析領域）・２０（区画室）・２０（ＳＰＮＰ）＝４００分析物である。
【００６８】
本発明の分析方法の第６実施形態では、変化する外部磁場に対するＳＰＮＰの空間的にエンコードされた非線形応答は、アッセイ形式で複数種の分析物を同時に定量化することに使用される。本実施形態は、図４に示されるアッセイ形式を分析する別の方法である。
【００６９】
アッセイ形式が本発明の超常磁性粒子イメージング分析装置に配置されると、収束場コイルは場のないポイント（ＦＦＰ）を生成する。分析領域１０の構造（区画室の数、それらの形状及びそれらの位置を含む）が既知であるため、ＦＦＰは分析領域内に所定のルートで移動する。変化する励起場がＦＦＰに適用されると、ＦＦＰ内部のＳＰＮＰの磁化を引き起こす。ＦＦＰが空間的及び時間的にエンコードされるため、ＦＦＰから生成された信号も空間的及び時間的にエンコードされる。同じ区画室からの信号を一緒に処理する。
【００７０】
区画室において測定されたｎ次高調波の振幅
2021523382.tif 000033
は、次のように該区画室中のすべての粒子のｎ次高調波の振幅
2021523382.tif 000034
の合計である（Ｒａｕｗｅｒｄｉｎｋ，Ａ、「複数種の磁性ナノ粒子の同時定量」、『ナノテクノロジー』、２１（４５），４５５１０１  （２０１０））：
【数１１】
2021523382.tif 000035
【００７１】
実験で測定された第ｎ振幅（
2021523382.tif 000036
）及び第２実施形態で説明された方法を使用することにより、各粒子ｉの振幅
2021523382.tif 000037
を決定する。区画室中の粒子ｉのｎ次高調波の振幅はＦＦＰで生成された粒子ｉの総濃度
2021523382.tif 000038
に正比例する、
【数１２】
2021523382.tif 000039
2021523382.tif 000040
は、濃度が既知の粒子ｉの溶液のｎ次高調波を測定することにより取得できる定数である。既知の
2021523382.tif 000041
及び
2021523382.tif 000042
に基づいて、ＦＦＰで生成された粒子ｉの総濃度
2021523382.tif 000043
を取得することができる。
【数１３】
2021523382.tif 000044
理想的な状況で、磁性粒子ｉの濃度又は分析物ｉの濃度（
2021523382.tif 000045
）はＦＦＰで生成された粒子ｉの総濃度
2021523382.tif 000046
に正比例する、
【数１４】
2021523382.tif 000047
2021523382.tif 000048
は、濃度が既知の標準物によって実験的に決定できる粒子
2021523382.tif 000049
の定数である。非理想的な状況で、対象の濃度範囲内の一連の標準物で、
2021523382.tif 000050
と
2021523382.tif 000051
の間の検量線を作成することができる。１つの区画室中の分析物を決定した後、同じ方式で他の区画室中のすべての分析物を決定することができる。これまでのところ、最大限、１（分析領域）・Ｙ（区画室）・Ｚ（ＳＰＮＰ）の濃度を同時にアッセイし、この場合、１（分析領域）・２０（区画室）・２０（ＳＰＮＰ）＝４００分析物である。
【００７２】
図５に示される本発明の分析方法の第７実施形態では、変化する外部磁場に対するＳＰＮＰの非線形応答は、アッセイ形式で複数種の分析物を同時に定量化することに使用される。アッセイ形式は、Ｘ個の分析領域（第１分析領域１０及び第Ｘ分析領域１０’が示される）を含み、且つＸは１〜２０範囲の整数である。各分析領域は１つの区画室（第１分析領域１０中の第１区画室１１及び第Ｘ分析領域１０’中の第Ｘ区画室１１’が示される）からなる。各区画室は、ＳＰＮＰ（第１区画室１１中の第１ＳＰＮＰ１３及び第Ｘ区画室１１’中の第Ｘ  ＳＰＮＰ１３’が示される）で標識された異なる分析物（区画室１１中の第１分析物１２及び第Ｘ区画室１１’中の第Ｘ分析物１２’が示される）を固定する。分析方法の第７実施形態は第１実施形態と同じであり、相違点はＸ回で繰り返し実行されることである。最大限、Ｘ（分析領域）・１（区画室）・１（ＳＰＮＰ）分析物を同時に分析することができ、この場合、２０（分析領域）・１（区画室）×１（ＳＰＮＰ）＝２０分析物である。
【００７３】
図６に示される本発明の分析方法の第８実施形態では、変化する外部磁場に対するＳＰＮＰの非線形応答は、アッセイ形式で複数種の分析物を同時に定量化することに使用される。アッセイ形式は、Ｘ個の分析領域（第１分析領域１０及び第Ｘ分析領域１０’が示される）からなり、且つＸは１〜２０範囲内の整数である。各分析領域は１つの区画室（第１分析領域１０中の区画室１１及び第Ｘ分析領域１０’中の区画室１１’が示される）からなる。各区画室は、Ｚ種の分析物（区画室１１と１１’中の第１分析物１２及び第Ｚ分析物１２’の両方が示される）を固定し、且つＺは１〜２０範囲内の整数である。１つの区画室中の各種類の分析物は、いずれも異なるＳＰＮＰ（それぞれ１番目の分析物のために使用される第１標識ＳＰＮＰ１３及びＺ番目の分析物のために使用される第Ｚ標識ＳＰＮＰ１３’が示される）で標識される。
【００７４】
第８実施形態に使用される分析方法は第２実施形態と同じであり、相違点はＸ回で繰り返し実行されることである。最大限、Ｘ（分析領域）・１（区画室）・１（ＳＰＮＰ）分析物を同時に分析することができ、この場合、２０（分析領域）・１（区画室）×１（ＳＰＮＰ）＝２０分析物である。
【００７５】
図７に示される本発明の分析方法の第９実施形態では、変化する外部磁場に対する空間的にエンコードされた区画室中のＳＰＮＰの非線形応答は、アッセイ形式で複数種の分析物を定量化することに使用される。アッセイ形式は、Ｘ個の分析領域（第１分析領域１０及び第Ｘ分析領域１０’が示される）を含み、且つＸは１〜２０範囲内の整数である。各分析領域はＹ個の区画室（第１分析領域１０中の第１区画室１１及び第Ｙ区画室１１’、第Ｘ分析領域１０’中の第１区画室１１ａ及び第Ｙ区画室１１ａ’が示される）からなり、且つＹは１〜２０範囲内の整数である。各区画室は、ＳＰＮＰ（分析領域１０の第１区画室１１中の分析物１２のために使用されるＳＰＮＰ標識１３、分析領域１０の第Ｙ区画室１１’中の分析物１２’のために使用されるＳＰＮＰ標識１３’、第１分析領域１０’の第１区画室１１ａ中の分析物１２ａのために使用されるＳＰＮＰ標識１３ａ、及び第Ｘ分析領域１０’の第Ｙ区画室１１ａ’中の分析物１２ａ’のために使用されるＳＰＮＰ標識１３ａ’が示される）で標識された異なる分析物（分析領域１０の第１区画室１１中の１番目の分析物１２及び第Ｙ区画室１１’中のＹ番目の分析物１２’、及び分析領域１０’の第１区画室１１ａ中の１番目の分析物１２ａ及び第Ｙ区画室１１ａ’中のＹ番目の分析物１２ａ’が示される）を固定する。
【００７６】
第９実施形態に使用される分析方法は第３実施形態と同じであり、相違点はＸ回で繰り返し実行されることである。最大限、Ｘ（分析領域）・Ｙ（区画室）・１（ＳＰＮＰ）分析物を同時に分析することができ、この場合、２０（分析領域）・２０（区画室）・１（ＳＰＮＰ）＝４００分析物である。
【００７７】
本発明の第１０実施形態では、変化する外部磁場に対するＳＰＮＰの空間的にエンコードされた非線形応答は、アッセイ形式で複数種の分析物を同時に定量化することに使用される。アッセイ形式は図７に示される第９実施形態と同じであるが、本実施形態は構成を分析する異なる方法である。
第１０実施形態に使用される分析方法は第４実施形態と同じであり、相違点はＸ回で繰り返し実行されることである。最大限、Ｘ（分析領域）・Ｙ（区画室）・１（ＳＰＮＰ）分析物を同時に分析することができ、この場合、２０（分析領域）・２０（区画室）×１（ＳＰＮＰ）＝４００分析物である。
【００７８】
図８に示される本発明の分析方法の第１１実施形態では、変化する外部磁場に対する空間的にエンコードされた区画室中のＳＰＮＰの非線形応答は、アッセイ形式で複数種の分析物を定量化することに使用される。アッセイ形式は、Ｘ個の分析領域（第１分析領域１０及び第Ｘ分析領域１０’が示される）を含み、且つＸは１〜２０範囲内の整数である。各分析領域はＹ個の区画室（第１分析領域１０中の第１区画室１１及び第Ｙ区画室１１’、第Ｙ分析領域１０’中の第１区画室１１ａ及び第Ｙ区画室１１ａ’が示される）からなり、且つＹは１〜２０範囲内の整数である。各区画室は、Ｚ種の分析物（第１分析領域１０の区画室１１中の１番目の分析物１２及びＺ番目の分析物１２、区画室１１’中の１番目の分析物１２’及びＺ番目の分析物１２ｚ’、第Ｘ分析領域１０’の区画室１１ａ中の１番目の分析物１２ａ及びＺ番目の分析物１２ｂ、区画室１１ａ’中の１番目の分析物１２ａ’及びＺ番目の分析物１２ｂ’が示さえる）を固定し、Ｚは１〜２０範囲内の整数であってもよい。各分析物はそれぞれ異なるＳＰＮＰで標識される（それぞれ分析領域１０の区画室１１中の分析物１２及び１２ｚのために使用されるＳＰＮＰ１３及び１３ｚ、区画室１１’中の分析物１２’及び１２ｚ’のために使用されるＳＰＮＰ１３’及び１３ｚ
’、及び、それぞれ分析領域１０’の区画室１１ａ中の分析物１２ａ及び１２ｂのために使用されるＳＰＮＰ１３ａ及び１３ｂ、区画室１１ａ’中の分析物１２ａ’及び１２ｂ’のために使用されるＳＰＮＰS１３ａ’及び１３ｂ’が示される）。
【００７９】
第１１実施形態に使用される分析方法は第３実施形態と同じであり、相違点はＸ回で繰り返し実行されることである。最大限、Ｘ（分析領域）・Ｙ（区画室）・Ｚ（ＳＰＮＰ）分析物を同時に分析することができ、この場合、２０（分析領域）・２０（区画室）・２０（ＳＰＮＰ）＝８，０００分析物である。
【００８０】
本発明の分析方法の第１２実施形態では、変化する外部磁場に対するＳＰＮＰの空間的にエンコードされた非線形応答は、アッセイ形式で複数種の分析物を同時に定量化することに使用される。アッセイ形式は図８に示される第１１実施形態と同じであるが、本実施形態は構成を分析する異なる方法である。本実施形態に使用される分析方法は第６実施形態と同じであり、相違点はＸ回で繰り返し実行されることである。最大限、Ｘ（分析領域）・Ｙ（区画室）・Ｘ（ＳＰＮＰ）分析物を同時に分析することができ、この場合、２０（分析領域）・２０（区画室）・２０（ＳＰＮＰ）＝８，０００分析物である。
【００８１】
これらの実施形態に示されるように、本発明の分析方法は、超常磁性粒子イメージング技術を使用して、固定相に固定された分析物を定量的的に測定する。該分析方法は、磁性標識の磁化によって引き起こされた磁束量の変化を測定することにより、マルチプレックスアッセイで３次元固定相に固定される分析サンプル中の複数種の磁性標識分析物の濃度を同時に測定する。
【００８２】
本発明では、超常磁性粒子イメージング技術は、本発明の３次元ハイブリッドポイントオブケアチップと良好に協働でき、且つ、側方流動テスト、マイクロ流体アッセイ、「チップ実験室」装置及び独立したバイオセンサなどの他のアッセイ形式にも適用できる。化学的及び生物学的試薬のためのハイスループットでコスト効果が良好な検出プラットフォームに対する需要はまだ満たされていない。これらのプラットフォームは、薬物開発、毒性研究、ポイントオブケア診断、及び環境監視に用いられる化学ライブラリーのスクリーニングを含む、多くの分析及び診断の用途に適用できる。通常のセンサは、一般的に、化学的、光学的、分光学的、電気インピーダンス又は質量に基づく検出を用いて生化学的現象を解釈する。超常磁性粒子イメージングは、大きさ、形状及び成分が異なる磁性標識又は磁性ナノ粒子を使用する。
【００８３】
超常磁性粒子イメージング技術を使用する本発明の分析方法は、多くの医療診断アッセイ及び薬物監視試験に従って直接且つ正確な検出を実行する新しいパラダイムを表す。超常磁性粒子イメージング技術は、磁気に基づく診断アッセイの有効性及び感度を拡張するだけでなく、磁気に基づく他のアッセイの主な欠点も克服し、すなわち、単一の測定で複数種の分析物を同時に検出し、光学に基づくアッセイの利点を有する。本発明により、高価な現代の分析実験室の関連費用なしに迅速で感度の高い装置を必要とする分析方法の開発は可能になる。現在、ＤＮＡ／ＲＮＡ分析、環境テスト、化学及び生物戦争の検出、薬物乱用のスクリーニング、食品供給の品質検出などのテストは、超常磁性粒子イメージング技術を利用し、及び生分解性で使い捨てのアッセイチップを有する小型のポータブルハンドヘルドデバイスを生産することにより改良することができる。
【００８４】
本発明はまた、本発明の超常磁性ナノ粒子に基づく分析方法と組み合わせて使用することができるハイブリッドポイントオブケアチップを提供する。
【００８５】
本発明のハイブリッドポイントオブケアチップは、サンプルが導入されるサンプル導入領域と、サンプルの流れがチップの異なるレベルにガイドされる切替えカラムと、分析物
が捕獲され、濃縮され、クリーニングされる分析領域と、過剰なサンプル及び洗浄液を収集する廃棄物チャンバと、チップ上の異なる元素が互いに連通するマイクロチャネルとを備える。この設計では、液体サンプルは、毛管力によってサンプル導入領域から吸収室に自動的に流れることができる。それはまた、サンプル分散チャネル、試薬貯蔵タンク、混合ポート、及びポンプを備えてもよい。
【００８６】
本発明のハイブリッドポイントオブケアチップの分析領域は、分析物捕獲材料が装填される３次元の多区画室固定相を収容する。サンプル流体は、自体が３次元の領域である分析領域の固定相へ、およびそれを通って３次元ルートで流れる。それらの大きさ及び位置が既知であるため、再構成を必要とせずに分析物の濃度を測定することができる。
【００８７】
本発明のハイブリッドポイントオブケアの形式は、液体サンプルの流路中の固定相で構成される。固定相は、孔に直接分配するか、生物学的方法で成長させるか、または自己組織化プラスチックとポリマー、シリカ又は同等物（有機/非有機構造など）で製造された材料のプリフォームからなる。例としては、自然界で生物学的に製造されるストロマトライト、温泉で無機的に形成される瑪瑙やオパールゲル等のコロイド鉱物、タケノコ又はバナナの木の茎葉におけるハニカム状の壁及び区画室がある。すべての自然構造は、ＤＮＡ／ＲＮＡ生物学的活性の設計図によって制御され、いずれも本発明に適用できる。
【００８８】
ブロック状又はキャスト構造が本発明の構造の製造に使用できるが、これらの構造は、好ましい積層構造内に形成された隙間に配置される。本発明において、カラム、捕獲領域、又は分析領域と呼ばれ，それらは、実際には非常に大きな表面積を有する多孔質材料である機能的「固定相」を通過するサンプル液体の流れを可能にする。分析領域は、サンドイッチ又は競合免疫アッセイ又は本分野で既知のＤＮＡ／ＲＮＡバイオチップの類似の化学的方法で機能化される。免疫アッセイ法の抗体又は抗原、又は磁性ナノ粒子で標識された小型ＤＮＡプローブを使用することにより、これらの領域に対象の分析物を捕獲する。又は、競合アッセイにおいて、分析物は、機能化された固定相の表面構造上の結合部位を競合する。導入されたサンプル全体は、親水性／疎水性フィルムが積層して組み合わせ形成された３次元チャネルから、直線領域又は円柱のそれぞれの垂直ルートを流れる。
【００８９】
好ましい形態において、カラム隙間は、紙、ポリマー、プラスチック、又は金属化プラスチック又は金属材料であってもよい多重積層のフィルムによって形成される。これらのフィルムは、Ａｄｈｅｓｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３Ｍ、ＤｕＰｏｎｔ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｐａｌｌ、Ｃｏｖｅｍｅ及びＴｅｓａから購入できる。フィルムは、異なるコーティング及び特性を有し、例えば、一部が親水性又は疏水性である。それらの厚さが．００１”〜．０２０”の間にあってもよく、好ましくは．００２”〜．０１５”の間であり、最も好ましくは．００２”〜．００９”の間である。磁気読み取りシステムの要件に応じて、すべてのこれらの積層は所要の形式に変換できる。バージョンは、分散サンプル導入装置、捕獲又は分析領域、及び最終的な貯蔵コアを有する多重線形の形式、より高速な円筒形式及び部分的なディスク（ｐａｒｔｉａｌ  ｄｉｓｋ）である。
【００９０】
各カラムは互いに液体連通し、液体はカラムの底部から最上部に流れ、次に隣接するカラムの最上部から底部に流れ、且つ次の隣接するカラムの底部から最上部に流れ、（分析領域の数に応じて）最終的にコア部材に流れる。チャネル及びカラムのそれぞれ又は全ては、運ばれる空気を遮断してエアポケットを形成し、液体の流れをブロッキングする可能性がある。遮断された空気が問題になると、各カラムの最上部に小さな通気口を設けることにより解決することができる。この通気口により、遮断された空気が流体チャネルとカラムから漏れることができ、それにより液体の流れへのブロッキングを防止し、しかし、該通気口は、液体が漏れないように十分に小さい。これらの通気口には、液体と接触する際に閉じ又は液体サンプルの表面張力が液体の漏れを防止するために十分に小さく製造さ
れる多孔質プラスチックが配置されてもよく、これは本分野において既知である。このサイズは、０．１〜１０ミクロンの範囲であってもよく、且つ好ましくは約５ミクロンである。他の方法としては、毛細管力が、運ばれる空気を流体が流れる前に移動させるのに十分であることを確保することによって、この状況の発生を防止し、これは、チャネル中の材料又は塗膜を選択することによって実現される。
【００９１】
サンプル導入領域と、所要の分析領域の流れ、速度及び３次元レベルを制御する連通チャネルとの間には、流体チャネルに流れる液体サンプルの流れを所要の第１分析カラムに切り替える小さなカラムがある。本発明における「切替えカラム」は、フィルタ、ブロッキング剤又は複合体（複合体は、磁気的に標識された識別元素であり、例えばサンドイッチアッセイにおいて、分析カラムに捕獲され測定できる抗体又はタンパク質である）を有しても有さなくてもよい。これらの搭載試薬により、サンプル導入領域に適用される前にサンプルを複合体と予め混合する必要がない。したがって、保存期間を延ばして感度を向上させ、且つアッセイの変動係数を低減させる。
【００９２】
本発明におけるサンプル導入装置は、赤血球を分離する装置を備えてもよい。該装置は、赤血球の形状を変化する能力、及び／又は内部流体を放出する能力が溶血プロセスで分析領域の捕獲化学物質への干渉を引き起こす可能性があるため、カラムのブロッキングを防止する。
【００９３】
各カラムは互いに液体連通し、同じ平面においても、又はサンプルの流れを異なる領域に分離することで分析領域を意図的に分離しても、化学的干渉を回避し又は得られる測定の分析をより正確にすることができる。例としては、測定されるサンプル中の分析物が、同じサンプルからの低濃度の分析物に比べて、高い濃度を有する場合、得られる測定結果として、常に低濃度の分析物の読み取り値を不明瞭にする。サンプルの流れを異なる３次元レベルのサンプルの流れに変更することにより、この２種類の分析物からのいかなる干渉を最小化することができる。
【００９４】
本発明のハイブリッドポイントオブケアチップは、固定相分析領域を有する３次元マルチレベル構造である。フィルムの層を一体に積層することによって製造される。積層する前に、ハイブリッドポイントオブケアチップのある特性をフィルムに組み合わせる。積層後に他の特性を作成する。サンプルが流れる層がレベルと呼ばれる。各チップは１〜２０個のレベルを有してもよく、１〜１０個のレベルが好ましい。
【００９５】
ハイブリッドポイントオブケアチップは、１〜５つのサンプル導入領域、１〜５つの切替えカラム、０〜１０個の試薬リザーバ、１〜２０個の分析領域、及び１〜５つの液体吸収部位からなる。サンプル導入領域、試薬リザーバ、分析領域及び流体吸収領域は、マイクロ流体チャネル及び貫通穴（垂直で互いに接続されるチャネル）によって接続され、それにより、サンプルを分割して異なるレベルにガイドすることができる。ハイブリッドポイントオブケアチップは、サンプル導入領域に接続されるダイアフラムポンプなどの液体駆動機構を有しても有さなくもよい。
【００９６】
ハイブリッドポイントオブケアチップに使用されるフィルムは、プラスチック、接着剤、紙、木材、繊維、シリコン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ガラス繊維、セルロース、多糖類、タンパク質ポリマー、圧延された粒子で製造される。フィルムの表面は、疎水性及び親水性を含む所要の特性を有するように変性することができる。各サンプル導入領域は、赤血球分離装置を有しても有さなくてもよい。サンプル中の対象の分析物を識別して固定するために必要な試薬をさらに含むことができる。サンプル導入領域は、１〜２００マイクロリットルのサンプルを収容することができる。
【００９７】
サンプルは、全血、血漿、血清、尿、唾液、涙、汗、便抽出物、ＤＮＡ／ＲＮＡ抽出物、抗原含有溶液、抗体、酵素、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、有機及び無機分子、バイオマーカ、産業汚染物質、病原体、ウイルス、細胞、細胞培養抽出物及び環境サンプルであってもよい。
試薬リザーバには、磁性粒子、蛍光粒子、化学発光粒子及び放射性粒子、抗体、タンパク質、ＤＮＡ／ＲＮＡプローブ又はキレート剤で機能化された磁性粒子、蛍光粒子、化学発光粒子及び放射性粒子、蛍光、化学発光又は放射性標識された抗体、タンパク質、ＤＮＡ／ＲＮＡプローブ及びキレート剤を含む、対象の分析物を識別して固定するために必要な試薬を含む。試薬リザーバは、同じ又は異なるサンプルルートに配置されてもよい。試薬を試薬リザーバに直接配置し又は固体支持体に吸着することができる。
各分析領域は固定相の１〜２０個のセクションによって組み合わせて形成される。分析領域の異なるセクションは同じ又は異なる固定相からなってもよい。固定相は、プラスチック、シリカ、ガラス、酸化アルミニウム、有機ポリマー、無機ポリマー及び生分解性ポリマーで製造される粒子、プラスチック、繊維、ポリマー、多糖類、セルロース、紙、木材、生物学的構築物、生体足場、ガラス繊維、生分解性ポリマー及びタンパク質ポリマーで製造される細孔膜、水不溶性ゲル、コロイドであってもよい。膜は、織られた、織られない又は圧延された粒子であってもよい。固定相は、物理的吸着、又は対象の分析物に特異的な識別試薬との共有結合によって機能化される。固定相は、分析領域の形状及び大きさで予め成形された後領域に配置されてもよく、又は領域に直接分配されてもよい。分析領域は、１つのレベル内、又は複数のレベルにわたって構造され得る。
【００９８】
各吸収部位はいずれも流体吸収パッドを有するチャンバ室からなる。パッドは、プラスチック、繊維、ポリマー、多糖類、セルロース、紙、木材、生物学的構築物、生体足場、ガラス繊維、生分解性ポリマー及びタンパク質ポリマーで構造される細孔膜、ヒドロゲル、圧延された粒子である粒子で製造される。
【００９９】
積層材料は、生分解性であり、且つ迅速に分解でき環境に悪影響を与えない複数種のポリマー、繊維、セルロイド及び紙で製造できる。例としては、テスト構造を支持する従来のプラスチックカセットがないものが挙げられ、支持が積層板のテスト設計に統合され、且つ自己支持型である。
図９Ａ〜９Ｄに示すように、本発明のハイブリッドポイントオブケアチップの構造を、以下の実施形態で更に説明する。図９Ａに示される本発明のハイブリッドポイントオブケアチップの一実施形態では、本発明の３次元ハイブリッドポイントオブケアチップ２０は、１つのサンプル導入領域２１の形式のサンプル導入領域と、３つの分析領域２１０ａ、２１０ｂ及び２１０ｃと、切替えカラム２４と、通気口２８を有する吸収室２６の形式の流体吸収領域とを備える。続いて、サンプル導入領域２１及び切替えカラム２４はマイクロチャネル２３ａによって接続され、切替えカラム２４及び第１分析領域２１０ａはマイクロチャネル２３ｂによって接続され、第１分析領域２１０ａ及び第２分析領域２１０ｂはマイクロチャネル２３ｃによって接続され、第２分析領域２１０ｂ及び第３分析領域２１０ｃはマイクロチャネル２３ｄによって接続される。第１分析領域２１０ａは、第１区画室２１１ａ、第２区画室２１１ｂ及び第３区画室２１１ｃを有する多区画室分析領域である。図９Ａにおける矢印は、チップ中のサンプルの流れを示す。
【０１００】
チップで発生するアッセイの化学的及び生物学的反応に必要な試薬２２は、サンプル導入領域２１に予め充填される。分析サンプルの量は１〜５００マイクロリットルであり、通常、１〜１００マイクロリットルであり、好ましくは５〜１０マイクロリットルである。サンプルは、血清、血漿、唾液、汗、涙、痰、尿、および綿棒で抽出された表面ワイプ、さらに細胞培養物、糞便物、全血などの半固形物（全血分析のために、サンプル導入領域２１の構造には、赤血球分離機構が組み込まれる場合）を含むがこれに限定されない、
前処理されても又は処理されなくてもよい。
【０１０１】
サンプルをサンプル導入領域２１に加えて試薬２２に迅速に溶解する。サンプルは試薬２２と混合して、マイクロチャネル２３ａを通過し、切替えカラム２４に入る。切替えカラム２４の機能は、サンプルを異なるレベルにガイドすることである。本実施形態では、切替えカラム２４は、マイクロチャネル２３ｂを介してサンプルをチップ２０の分析領域２１０ａの上位レベルにガイドする（必要に応じて、サンプルの流れを下位のレベルに切り替えることもできる）。本発明のマルチレベルの設計では、切替えカラム２４は、必要に応じてサンプルを任意のレベルに切り替えることができる。切替えカラム２４中の充填材料２５はさらに、サンプル中の固体不純物を除去してクリーニングされたサンプルを分析領域に輸送するフィルタとして機能する。サンプルは、切替えカラム２４を通過した後、マイクロチャネル２３ｂを通過して第１分析領域２１０ａに入る。
【０１０２】
一般的に、本発明のハイブリッドポイントオブケアチップ中の分析領域は、１〜２０個の区画室を有するように製造されてもよく、通常は１〜１０個の区画室であり、好ましくは１〜５つの区画室である。本実施形態では、３つの区画室２１１ａ、２１１ｂ及び２１１ｃがある。
各区画室は、アッセイに応じて同じ又は異なる固定相を有するように製造されてもよい。固定相は、プラスチック、シリカ、ガラス、酸化アルミニウム、有機ポリマー、無機ポリマー及び生分解性ポリマーで製造される粒子、プラスチック、繊維、ポリマー、多糖類、セルロース、紙、木材、生物学的構築物、生体足場、ガラス繊維、生分解性ポリマー及びタンパク質ポリマーで製造される細孔膜、水不溶性ゲル、コロイドであってもよい。膜は、織られた、織られない又は圧延された粒子であってもよい。固定相は、物理的吸着、又は対象の分析物に特異的な識別試薬との共有結合によって機能化される。固定相は、分析領域の形状及び大きさで予め成形された後領域に配置されてもよく、又は領域に直接分配されてもよい。分析領域は、１つのレベル内、又は複数のレベルにわたって構造され得る。各区画室は異なる分析物を固定することができる。
【０１０３】
サンプルが第１分析領域２１０ａを通過する時、対象の分析物が捕獲される。他のサンプルは第１分析領域２１０ａを離れる。該プロセスで、分析物は、選択的固定相を有する区画室によって分離される。該分析物も区画室に濃縮され、通過するサンプル液体によってクリーニングされる。本発明の多区画室の設計により、多重化は可能になる。
【０１０４】
マイクロチャネル２３ｃを通過した後、サンプルは第２分析領域２１０ｂに入る。分析領域２１０ｂは、第１分析領域２１０ａと同様に、区画室の数、固定相の材料及び区画室に装填される異なる捕獲材料の数を含む同じ構造を有してもよい。第２分析領域２１０ｂを通過した後、第２セットの分析物は分離されて捕獲される。サンプルは移動し続けてマイクロチャネル２３ｄを通過し、第３分析領域２１０ｃに入る。第３セットの分析物は第３分析領域２１０ｃに分離される。余剰のサンプル流体及び過剰な試薬は、吸収室２６中の流体吸収パッド２７によって吸収される。吸収パッド２７は、プラスチック、繊維、ポリマー、多糖類、セルロース、紙、木材、生物学的構築物、生体足場、ガラス繊維、生分解性ポリマー及びタンパク質ポリマーで構造される細孔膜、ヒドロゲル、粒子又は圧延された粒子で製造される。
【０１０５】
本発明では、ハイブリッドポイントオブケアチップは、１〜２０個の分析領域を有するように製造されてもよく、通常、１〜１０個の分析領域であり、且つ好ましくは１〜６つの分析領域である。
図９Ｂは、本発明のハイブリッドポイントオブケアチップの構造を示す。本発明のハイブリッドポイントオブケアチップ２０は、固定相分析領域２１０ａ、２１０ｂ及び２１０ｃを有する３次元マルチレベル構造である。本実施形態では、チップ２０は、フィルムの
層（底層２０１を含む）を一体に積層することによって構成される。
【０１０６】
本発明では、積層する前に、ハイブリッドポイントオブケアチップのある特徴をフィルムに組み合わせる。積層後に他の特徴を作成する。サンプルが流れる層がレベルと呼ばれる。各チップは１〜２０個のレベルを有してもよく、１〜１０個のレベルが好ましい。
【０１０７】
本発明では、ハイブリッドポイントオブケアチップは、１〜５つのサンプル導入領域、０〜１０個の試薬リザーバ、１〜２０個の分析領域、及び１〜５つの流体吸収領域からなる。サンプル導入領域、試薬リザーバ、分析領域及び流体吸収領域は、マイクロ流体チャネル及び貫通穴（垂直で互いに接続されるチャネル）によって接続され、それにより、サンプルを分割して異なるレベルにガイドすることができる。ハイブリッドポイントオブケアチップは、液体駆動機構を有しても有さなくもよい。
ハイブリッドポイントオブケアチップに使用されるフィルムは、プラスチック、接着剤、紙、木材、繊維、シリコン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ガラス繊維、セルロース、多糖類、タンパク質ポリマー、圧延された粒子で製造される。疎水性及び親水性などの所要の特性を有するように、フィルムの表面を変性することができる。
【０１０８】
図９Ｂに示されるチップ２０の構造では、チップ２０は５層のフィルム、すなわち、底層２０１、底層チャネル層２０２、中間層２０３、最上層チャネル層２０４及び最上層２０５からなる。設計の要件に基づいてフィルムの厚さを調整する。マイクロチャネルはチャネル層２０２及び２０４によって形成される。層２０１、２０２及び２０３を組み立てる時、サンプル導入領域２１を切替えカラム２４に接続するマイクロチャネル２３ａ、第１分析領域２１０ａを第２分析領域２１０ｂに接続するマイクロチャネル２３ｃ、及び第３分析領域２１０ｃを吸収室２６に接続するマイクロチャネル２３ｅを形成する。層２０４と２０５を追加した後、切替えカラム２４を第１分析領域２１０ａに接続するマイクロチャネル２３ｂ、第２分析領域２１０ｂを第３分析領域２１０ｃに接続するマイクロチャネル２３ｄを形成する。同時に、切替えカラム２４と分析領域が構造される。該構造により、サンプルがマイクロチャネルを通過して位置の間に水平に移動し、且つ切替えカラムと分析領域を通過してレベルの間に垂直に移動することは可能になる。チップの構造を完了するために層２０４及び２０５を追加する前に、粒子を分配し又は予め成形された膜を配置することにより固定相材料を切替えカラムと分析領域に配置する必要がある。
図９Ｂに示されるチップ２０は説明するためのものだけである。付加的な機能、例えばより多くの分析領域又は試薬リザーバをチップに追加することができる。レベルの数はより多くのフィルム層を追加することにより増加することができる。
【０１０９】
図９Ｃは、本発明のハイブリッドポイントオブケアチップの別の実施形態を示し、それは、本発明のハイブリッドポイントオブケアチップがマイクロチャネルを使用して位置の間に通信するという柔軟性を利用し、従って、チップ上の特徴は、直線的に配置する必要がなく、これは側方流動の設計と異なる。本実施形態におけるチップ２０の構造は、図９Ａ及び９Ｂに説明されるものと同じであり、相違点は、分析領域２１０ａ、２１０ｂ、２１０ｃ、２１０ｄ及び２１０ｅが円弧に沿って設けられることである。該配置により、チップ２０又は検出器が円周運動して移動することは可能になり、それにより、設計及び製造コストを著しく低減させることができる。
【０１１０】
本発明のハイブリッドポイントオブケアチップの別の実施形態は、図９Ｄに示されるチップアレイの形式であり、ここで、チップ２０は８つの個別のチップ２０ａ、２０ｂ、２０ｃ、２０ｄ、２０ｅ、２０ｆ、２０ｇ及び２０ｈを有するチップアレイの形式である。これらの個別の構造は図９Ａ及び９Ｂに説明されるものと同じであり、相違点は、フィルムの各層がいずれも複数セットのチップ特徴を有し、且つ同じディスクでのすべてのチッ
プが図９Ｄに示される集中された位置で１つのサンプル導入領域２１を混合することである。本実施形態では、各個別のチップは３つの順にソートされた分析領域２１０ａ、２１０ｂ及び２１０ｃを有する。該配置により、単一のサンプルからマルチセットの分析物をテストすることは可能になる。各個別のチップはチップアレイ２０中の他のチップから完全に独立している。従って、一回の実行で、複数の化学的及び／又は生体適合性の分析を行うことができる。
【０１１１】
構造に応じて、本発明のハイブリッドポイントオブケアチップは、異なるタイプの検出システムと一緒に使用することができる。好ましくは、ハイブリッドポイントオブケアチップに使用される検出方法は、分析領域の透明性に依存しないため、磁気、音響又は放射性に基づく検出方法である。それらは、表面だけでなく３次元の固定相物体全体からの信号を測定することができる。
【０１１２】
より好ましい方法は、磁気に基づく検出であり、超常磁性粒子イメージング（ＳＰＩ）、磁性粒子イメージング（ＭＰＩ）、磁性粒子分光法（ＭＰＳ）、磁性粒子の総蓄積、励磁インダクタンス、交流磁気磁化率測定法、ＣＭＯＳ交流磁化率測定法、ホール効果、磁気抵抗、巨大磁気抵抗（ＧＭＲ）、超巨大磁気抵抗（ＣＭＲ）、超伝導量子干渉装置（ＳＱＵＩＤ）、磁気緩和法、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）スピン緩和時間を含む。
より好ましい磁気検出方法は、超常磁性粒子イメージング（ＳＰＩ）、磁性粒子イメージング（ＭＰＩ）、磁性粒子分光法（ＭＰＳ）、磁性粒子の総蓄積、励磁インダクタンス、ホール効果である。
【０１１３】
最も好ましい磁気検出方法は、超常磁性粒子イメージング、磁性粒子分光法（ＭＰＳ）、磁性粒子の総蓄積、励磁インダクタンスである。
さらに、分析領域中の固定相が透光性材料（ガラス、セキエイ、透明プラスチック）で製造されると、蛍光、ＵＶ−Ｖｉｓ、レーザ、化学発光を含む光学に基づく検出方法を使用することができる。
【０１１４】
本発明のハイブリッドポイントオブケアチップは、マイクロ流体装置の汎用性及び柔軟性、側方流動テストの低コスト及び簡単性、Ｅｌｉｓａアッセイの低バックグラウンド及び高感度などの利点を有し、また、多重化できる。ハイブリッドポイントオブケアチップと他の設計との相違点は、マルチレベル及び多区画室の分析領域には、固定相が充填される。多区画室構造により、それぞれ異なる捕獲材料が装填される複数の区画室を一体に積み重ねることが可能にし、追加される次元の多重化を実現する。分析領域中の固定相は、適切なレポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）で標識された分析物を固定し、例えば、磁性粒子、放射性材料、音響活性材料である。表面積が非常に大きいため、固定相はサンプル中の分析物を濃縮し、感度を著しく向上させる。その不均一な性質のため、干渉物質が吸い流され、他のアッセイ設計よりもはるかに低いバックグラウンドを有する。
【０１１５】
本発明のハイブリッドポイントオブケアチップは、側方流動の形式に関するすべての問題を解決する。マイクロ流体チャネルでサンプル導入領域を分析領域と直接接続することにより、側方流動の形式で存在する全ての交差部分を削除する。サンプルが分析領域に直接送られるため、サンプル導入領域と側方流動の形式のテストラインとの間の一致しないフィルムによって引き起こされる変化を著しく減少させる。マイクロ流体チャネルが密閉されるため、側方流動のストリップの開いたエッジに起因する漏れの問題が存在しない。側方流動の形式では、捕獲材料がフィルムにバンド化される。フィルム、バンド化条件及びバンド化装置の変化により、分析領域は非常に一致しない。ハイブリッドポイントオブケアの形式では、分析領域には、高度に組織化された材料で製造される３次元固定相が充填される。固定相の間の変化は０．１％未満である。ハイブリッドポイントオブケアの形式は、側方流動の形式のすべての問題を克服するとともに、側方流動の形式に持たされる
使用しやすくコストが低いという利点を保持する。
【０１１６】
本発明のハイブリッドポイントオブケアの形式はさらに、マイクロ流体の形式におけるこれらの課題に答えを提供する。マイクロチャネルのルートに浸透可能名３次元固定相を配置することにより、分析物のみを捕獲して蓄積し、他のすべての物質を通過させる。該プロセスで、分析物を濃縮し、それにより感度を著しく向上させる。同時に、分析物に関係がない全てのものを除去して、ノイズを著しく減少させる。この設計により、サンプルの前処理が不要になり、サンプルの精製プロセスを装置に追加する必要もない。マイクロ流体を利用して多区画室固定相を設計した。各区画室は異なる分析物を固定することができる。ハイブリッドポイントオブケアの形式と超常磁性粒子イメージング技術を組み合わせることにより、複数種の分析物の同時検出を完了することができる。ハイブリッドポイントオブケアの形式のマルチレベル設計により、化学的及び／又は生物学的に互換性のない分析物を異なるルート及び／又は異なるレベルにガイドして、同時に分析することは可能になる。ハイブリッドポイントオブケアの形式は、積層板で製造されるため、側方流動の形式に比べて、自動化の大規模の生産及び生産コストの低減に適する。
【０１１７】
さらに、使用される材料に応じて、ハイブリッドポイントオブケアの形式の固定相で発生する化学的及び生物学的プロセスの表面積は、一般的なＥＬＩＳＡアッセイの形式の３００〜１０，０００倍であり、これは、感度を極めて向上させ、試薬処理、操作が不要であり、長い間待っているのも必要としない。
【０１１８】
本発明のハイブリッドポイントオブケアは、新規で革新的な形式であり、少量の生物学的、環境的又は化学的流体を使用して、感度の高く、定量的で、迅速な診断アッセイを完了する。それは、各種の溶液、コロイド又は浮遊粒子（磁性粒子を含む）を用いて対象の分析物を標識し又は標識物の還元を測定する結合部位と競合することができる。それは、固定相及び積層板（生分解性材料で製造される積層板を含む）を使用し、従来の医療用プラスチックカセットを使用しない３次元の異種設計及び機能を有する。血清、血漿、唾液、汗、涙、痰、尿、綿棒で抽出された表面ワイプ、さらに半固形物（例えば細胞培養物及び糞便物）の一般的なサンプル量は１０マイクロリットル以下である。さらに、統合された赤血球分離技術及び装置を使用して最小限の溶血を分離し防止することができ、且つハイブリッドポイントオブケアの形式では、分析のために全血を１滴も必要とせず、分析時間が５分間未満である。
【０１１９】
本発明は、一桁分の実行時間で定量分析の迅速な発展を実現し、これに反対する通常の側方流動のテストは、実行時間が２０分間以上であり、且つ任意の必要な正規化を行う必要がある。実行時間が著しく減少するのは、サンプル量の減少及び表面動力学と流体動力学の相互作用の最小化によるものである。
【０１２０】
本発明のハイブリッドポイントオブケアの形式及びチップは、通常のアッセイの変動係数が、検出限界（ＬＯＤ）（一般的にはピコグラムレベルである）で１０％以下であることを可能にする。
【０１２１】
本発明は、超常磁性粒子イメージング技術に基づいて設計される超常磁性粒子イメージング分析装置を更に提供し、場のないポイント（ＦＦＰ）及び／又は場のないライン（ＦＦＬ）を作成し、超常磁性ナノ粒子が生成した信号を空間的及び時間的にエンコードして、信号を記録し、一回の測定でのチップ全体上の分析物の濃度に信号を変換するために用いられる。
本発明の一態様によれば、別の超常磁性粒子イメージング分析装置は、各区画室をカバーする場のないスペース（ＦＦＳ）を作成し、各区画室が生成した総信号を記録し、且つ一回の測定でのチップ全体上の分析物の濃度に信号を変換するために用いられる。
【０１２２】
本発明の一態様によれば、別の超常磁性粒子イメージング分析装置は、異なるＳＰＮＰで標識された複数種の分析物を同時に分析するために用いられる。
【０１２３】
図１０Ａに示される本発明の超常磁性粒子イメージング分析装置の第１実施形態では、装置は、共線形超常磁性粒子イメージング分析装置である。分析装置３０は、ハウジング３１、一対の永久磁石３２及び３２’、一対の励起コイル３５及び３５’、及び一対の受信コイル３６及び３６’を備える。
【０１２４】
本実施形態では、ハウジング３１は円筒３１０の形状であり、且つ円筒３１０の内部に、各永久磁石は内部円筒容積３３を有する円筒状である。永久磁石３２及び３２’は希土類合金（例えばＮｄＦｅＢ）で製造され、且つ固定装置及び締め具３４により、それに一致する磁極と互いに向き合うように機械的に強制されて（すなわち、第１磁石の北極が第２磁石の北極に向き合い、又は第１磁石の南極が第２磁石の南極に向き合う）、このプロセスで、中性磁場が存在する場所に場のないポイント（ＦＦＰ）又は場のない領域（ＦＦＲ）３７を形成する。理論的には、単一のポイントであるが、実際には、それは、競合する磁力場が磁場線に衝突することによって形成された領域である。（Ｇｌｅｉｃｈ，Ｂ，２００５，Ｋｎｏｐｐ，Ｔ，２０１２参照）。構造及び配置は、安定した均一な直流（ＤＣ）場のない領域（ＦＦＲ）を形成し、これは直流増幅器に駆動される一対のヘルムホルツコイルによって完了することもできる。一対の永久磁石３２及び３２’により、複雑でなく高価でないプラットフォームの組み立ては可能になるが、いかなる調整可能性がない。
【０１２５】
図１Ｂに示すように、本発明のハイブリッドポイントオブケアチップは、単一の多重化装置２０において、サンプル処理、収集（サンプル導入領域２１として機能する）、分散、捕獲（分析領域（対象の領域（ＲＯＩ）とも呼ばれる）２１０として機能する）、及び廃棄物収集（流体吸収領域２６として機能する）の機能メカニズムを含み、且つ本発明の超常磁性粒子イメージング分析装置３０の使い捨て部材である。
【０１２６】
一対のヘルムホルツ励起コイル３５及びｂ３５’を形成する交流駆動場を提供することにより、場のない領域３７内の交流電気（ＡＣ）の形成を完了する。通常、２０ＫＺ〜３０ＫＺで駆動し、本実施形態では２５ＫＺである。
【０１２７】
「励起」という用語は、磁場及び「駆動場」、「変調場」を説明するために用いられ、この磁場内のいかなる磁気材料は、ヘルムホルツ駆動周波数の周波数で振動するため、変調又は駆動される。
【０１２８】
周囲の磁場内のいかなる応答を測定するために、一対の受信コイル３６及び３６’（平面又は円形である）を簡単に取り付け、それにより、定量対象の影響される材料に最大限に物理的に接近する。本実施形態では、常磁性標識の生体分子の場合、対象の領域２１０又は複数の領域を、一対の永久磁石３２及び３２’と、一対の励起コイル３５及び３５’と、一対の受信コイル３６及び３６’とを備える円筒３１０に移動して、円筒３１０中の常磁性応答及びその高調波を測定する。場のない領域３７は、このような領域であり、常磁性粒子が磁気的に飽和していない（すなわち磁化されていない）が、振動してブラウン及びニール緩和を克服し、２５ＫＺの基本励起周波数を放出するだけでなく、該周波数の高調波（粒子サイズ及び材料の識別子）もさらに放出する。該信号は粒子の数及びその空間的位置の線形定量化である。
【０１２９】
図１１Ａ及び１１Ｂに示される本発明の超常磁性粒子イメージング分析装置の第２実施形態では、分析装置は開放式分析装置である。
磁気共鳴イメージングと同様に、超常磁性粒子イメージングには均一な磁場が必要である。磁気共鳴イメージング中のイメージングにおいて、検出器又は検出器アレイからの視野（ＦＯＶ）情報を一体に組み合わせ（断層撮影と呼ばれる）、造影剤又は組織自体から生成される３次元画像として表示する。磁気共鳴イメージングには、これらの磁場の重心に接近することにマッチングするために、大きな磁場及び無線周波数（ＲＦ）コイルが必要である。比較すると、本発明の超常磁性粒子イメージング分析装置では、超常磁性標識の挙動は非常に大きな相違点がある：それは、ＲＦ磁場によって干渉される陽子アレイを測定せず、場のない領域中の常磁性粒子の非線形磁化を定量化し、該場のない領域に、ブラウン及びニール緩和のみは各粒子の場の方向を制御する。特定の周波数（例えば約２５ＫＺ）の励起コイルの交流場は、該基本レートＭ（ｔ）で粒子の磁極を＋から−に急激に切り替える。励起の基本周波数は、誘導場を生成するだけでなく、粒子材料の特性及びサイズの関数である高調波も生成する。高調波スペクトルは各磁性標識の指紋及び位置である。（Ｇｌｅｉｃｈ，Ｂ．，２００５、Ｇｏｏｄｗｉｌｌ，Ｐ．ら、「多次元Ｘ空間の磁性粒子イメージング（Multidimensional X-Space Magnetic Particle Imaging）」、『ＩＥＥＥ医学的イメージング刊行物（ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓ  Ｍｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ）』，３０（９）：１５８１−１５９０  （２０１１）、Ｋｎｏｐｐ，Ｔ．ら，２０１２）を参照のこと。
【０１３０】
図１１Ａ及び１１Ｂに示される本発明の超常磁性粒子イメージング分析装置の第２実施形態では、以下に開示されている小動物及び人間に用いられる３次元イメージング装置の一般的な幾何学的形状（Gleich, B., 2005、Goodwill, P., 2011、Konkle J.，「先進的な断層再構成法を有する磁性粒子イメージング（Magnetic Particle Imaging with Advanced Tomographic Reconstruction Methods）」、カリフォルニア大学バークレー校博士論文（２０１４））を改良し、新たな方法（本発明のハイブリッドポイントオブケアチップ）と組み合わせる。図１０Ａ及び１０Ｂに示される実施形態の場のないポイント又は領域（ＦＦＰ又はＦＦＲ）３７の代わり、ＦＦＬ３７’と呼ばれる、中性の場のない領域の線形部位は作成される。機械的配置、定量化、及びイメージングに用いられる円筒状の中点の拡張される設計に比べて、第２実施形態は、ＦＦＬ３７’への通路を改良する。ＦＦＬ３７’は、共線形円筒における対象の領域以外の他の箇所にいずれもアクセスすることができ、これは、すべての軸の機械的動きを制限する。
【０１３１】
図１１Ａに示されるように、ハウジング３１は本発明の超常磁性粒子イメージング分析装置３０の機械的支持であり、且つＣ字状フレーム３１１からなり、該Ｃ字状フレームは、線形場のない領域を限定し−一対のＮｄＦｅＢ永久磁石３２及び３２’を形成し、各磁石の陽極又は陰極が互いに向き合って線形場のない領域を形成するように機械的に強制する。
【０１３２】
第２実施形態では、磁石は直線形であり、それによりＦＦＬ３７’も直線形になる。次にヘルムホルツで構成される一対のヘルムホルツコイル３５及び３５’、及び一対の平行な受信コイル３６及び３６’は、基本励起領域内の分析領域２１０の常磁性標識から誘導磁場及びｂ生成された高調波を感知する。図１４に示されるように、本発明のハイブリッドポイントオブケアチップ２０の分析領域２１０は、誘導コイル（励起コイルとも呼ばれる）３５及び３５’に密着して伝送し、それにより測定可能な信号を生成する。ハイブリッドポイントオブケアチップ２０は、サンプルと試薬処理能力（サンプル導入領域２１）を有し、切替えカラム２４によって捕獲分析カラム２１０及び流体吸収領域に分配する（図９Ａを参照）。
【０１３３】
第２実施形態の分析装置及び分析方法は、側方流動及びマイクロ流体装置のポイントオブケア設計の限界を超える。ほとんどの一般的なアッセイに必要な直線性は、本発明の分析装置に対して不要であるため、本発明の分析装置はこのような制限がなく、これは図１
１Ａ及び１１Ｂに示される実施形態によって完了され、ここで、迅速に移動するＦＦＬ又はＦＦＬ空間における対象の領域の機械的走査に接近することにより、常磁性標識の数、状態（結合又は非結合）及びその対象の領域内の位置に対するメトリックを生成することができる。
【０１３４】
図１２Ａ及び１２Ｂに示される本発明の超常磁性粒子イメージング分析装置の第３実施形態では、分析装置３０は、超常磁性粒子イメージング分析装置に用いられる「Ｅ」字状の磁気コア励起場を有する。図１１Ａ及び１１Ｂに示される第２実施形態における励起コイル３５及び３５’を簡略化し、極めて均一な交流送信又は変調場を生成するために、分析装置３０は、互いに向き合って且つセラミック絶縁体（図示せず）によって分離される一対のＥ字状焼結フェライト磁気コア３５ａ及び３５ａ’を使用する。Ｅ字状の磁気コアの各カラム上の電磁コイル巻線３５ｂ及び３５ｂ’は、隙間を形成するために短絡されたＥ字状磁気コア３５ａ及び３５ａ’の２つの正反対の極に磁場を生成する。電磁巻線３５ｂ及び３５ｂ’は交流電気周波数で動作し、駆動電子機器へのフィードバック回路がある（同様に、図１４を参照）。図６Ａに示されるように、これは、ハイブリッドポイントオブケアチップの磁性標識を励起し振動するための変調場である。一対の重ね合わされた永久磁石３２及び３２’が、互いに陽極に向き合うように強制され、それにより、Ｅ字状磁気コアの隙間内にＦＦＲ又はＦＦＰ３７を生成する。ＦＦＲ３７の中性領域以外に、直流場内のすべての材料はいずれも磁化される。ハイブリッドポイントオブケアチップ２０は移動して隙間及び接近可能な領域を通過する。常磁性標識の交流誘導により、交流場の基本周波数及び得られる高調波を生成し、これらが受信コイル３６及び３６’によって測定されて信号チェーンの電子機器に伝達される。Ｅ字状磁気コアの設計と本発明のハイブリッドポイントオブケアチップを組み合わせて使用する第３実施形態は、交流励起及び受信コイルに接近することが優れたＳＮＲ（信号対雑音比）を与えるため、改良される設計である。
【０１３５】
図１３Ａ及び１３Ｂに示される本発明の超常磁性粒子イメージング分析装置の第４実施形態では、分析装置は、２つの同心円状に配置された送信コイルと分離された受信コイルとを有する片面超常磁性粒子イメージング分析装置である。他の実施形態と異なり、本実施形態では永久磁石は使用されていない。本実施形態では、分析装置３０は、一対の片面ヘルムホルツコイルを有し、ハイブリッドポイントオブケアチップ２０の有効性を実現して、形成される１Ｄ視野（ＦＯＶ）３８と相互作用する。円形の外部直流駆動場は交流場のヘルムホルツペアにより囲まれている。図１３Ａにおける矢印３９は、反対方向の直流電流によって生成された選択場を示す。それは、反対の場を生成して且つ対称的なＦＦＲ３７を形成する。ハイブリッドポイントオブケアチップ２０が受信コイル３６の視野を越えると、ＦＦＲ３７の分析領域中のＳＰＮＰが励起されて信号を生成する。ヘルムホルツコイルを使用する利点は、同時に励起コイル及び受信コイルとして機能する。分析領域２１０は、勾配計の方式でセンサを越え、又は単一の位置にもたらされて測定される。
【０１３６】
図１４は、図１０、１１及び１２に示される実施形態などの本発明の交流コイルに基づく超常磁性粒子イメージング分析装置及びハイブリッドポイントオブケア技術の信号チェーン及びエンドユーザーとの通信を示す。図１４に示されるように、シールド４１は、磁気遮蔽場駆動を提供するために用いられ、交流駆動場４２及び直流駆動場４３を含む。交流駆動場４２と直流駆動場４３の両方である。受信コイル３６において磁気共鳴信号を感知して送信し、且つ信号の１つ以上の基本周波数を処理する。信号前置増幅ユニット４４において高調波を送信信号から分離して、該信号前置増幅ユニットにおいて、電圧が非常に小さい高調波は、ノッチフィルタ及びロックイン増幅器を備える前置増幅器を使用することによって変換される。現在、これらの装置のうち多くの装置は、個別のチップパッケージとして購でき、それにより個別の回路基板を減少させる。通常、ローパスフィルタ４５を介して信号ノイズ減少とクロストークステップで１／ｆ熱ノイズを減少し、且つ前置
増幅された電圧はアナログデジタル変換回路４６によって変換され、信号増幅器４７によって線形増幅され、且つ外部中央プロセッサ（ＣＰＵ）４９に送信される。
【０１３７】
バーコードリーダー４８によって読み取られた２次元バーコードは、ハイブリッドポイントオブケアのタイプ、製造日、ユーザー、且つ重要なところ、各製造ロットに基づくロックインアンプを識別し、且つハイブリッドポイントオブケアアッセイの品質及び感度を決める。これらの定量的結果は、ブルートゥース(登録商標）５０又は無線信号出力５１の情報とすることができ、グラフィカルユーザーインタフェース（ＧＵＩ）５４への有線信号（オペレーター及び病院情報システム（ＨＩＳ）に使用される）として使用されてもよい。グラフィカルユーザーインタフェース５４は、車載ＧＰＳ、アッセイ実行時間、記録及びデータ管理などの、ポータブルストレージデバイス又はデータベースへの入力を処理する。
【０１３８】
グラフィカルユーザーインタフェース５４はタッチスクリーンパネル上の従来ディスプレイ５２を制御し、印刷機５３は結果及びデータベースのハードコピーを無線で印刷し、さらに、結果、位置、推奨される解釈、及びデータ履歴を提供する成熟したモバイルアプリケーション５５と通信する。該特徴により、モバイルアプリケーション５５のリアルタイムのモバイル環境で複数のデータポイントのグラフィカル管理を行うことは可能になる。
【０１３９】
本発明の超常磁性粒子イメージング分析装置の第５実施形態は、図１５Ａ〜１５Ｄに示され、ここで、分析装置はホールセンサを有するＮｄＦｅＢ永久磁石である。分析装置３０では、ＮｄＦｅＢ円筒状永久磁石３２が取り付けられ（例示のために、仮想磁場線６３を有する）。力線６３は、任意の磁気源によって取り囲まれ形成された量子エネルギーの均一な場に位置し、重力場のように、観測できず、図１５Ａ及び１５Ｂのみにこれらの場及びその分布を説明する。
【０１４０】
ＮｄＦｅＢ磁石３２は、磁石の南極を離れ、且つ永久磁石の北極において折り畳んで取り囲む磁力線６３を有する。これらの極は、通常の目的でのみ命名される。ホールプローブセンサ６０は、ゼロフリー領域３７ｂに配置され、円形磁石３２を離れる磁力線６３は、円筒３３ａ及び力場の正確な中心で理論上のゼロ領域に達する。ホールプローブを円筒３３ａ内及び磁化不可能な中空軸７１に取り付けることにより、バイアスワイヤ及び信号６２が図１４と同様にルートに応じて信号処理電子機器に送信されることは可能になり、駆動場が不要であり、永久磁石はコイルセットに対応する直流磁場を提供し、それにより、装置の設計及び製造を大幅に簡略化させる。該場が場のない領域３７を形成する駆動直流場に類似するため、高調波は生成しない。ゼロ領域３７ｂにおいて、理論的な磁気領域が非常に小さく又は理論的な磁気領域がなく、狭い散乱場のみがある。
【０１４１】
本発明では、勾配計の方式で又は単一の測定として、チップ２０及び分析領域２１０をセンサ６０の上に輸送し、超常磁性粒子イメージング分析装置はハイブリッドポイントオブケアチップと一緒に動作する。ゼロ磁場３７ｂを減衰させて、ホール磁気センサ６０への誘導信号を生成することにより、分析領域の磁性標識を磁化する。該信号を定量化し又は処理し画像を生成することができる。
【０１４２】
図１５Ｃ及び１５Ｄは、本発明のハイブリッドポイントオブケアチップを有する超常磁性粒子イメージング分析装置の構造画像を示す。永久磁石３２は、中空の非磁性ホールセンサ軸である中空軸６１によって支持されるＮｄＦｅＢ磁石であり、且つ磁石３２の円筒３３ａには、図１５Ａ及び１５Ｂの線６３によって説明された力場は形成される。超常磁性粒子イメージング分析装置３０の機器の外部支持及びシールド４１は、中空軸６１を収容する。中空軸６１は、ホール磁気センサー６０の電圧および出力信号をルーティングし、同時に、永久磁石３２のゼロ磁場３７ｂ内のプローブのマウントである。
【０１４３】
図９Ａ〜９Ｄに詳細に説明された本発明のハイブリッドポイントオブケアチップ２０は側面図及び平面図で図１５Ｃ及び１５Ｄに示され、ホール磁気センサ６０上で送信され、勾配計又は空間的にエンコードされた信号を生成し、次に、図１４に示されるように、該勾配計又は空間的にエンコードされた信号はＣＰＵ４９によって処理されてＧＵＩ５４によって表示される。図１５Ｄの平面図は、分析領域２１０ａ、２１０ｂ及び２１０ｃがホール磁気センサ６０を超え又はその上方で静的に測定される時の関係を説明する。
【０１４４】
本発明の非線形ハイブリッドポイントオブケアチップ２０と一緒に動作する超常磁性粒子イメージング分析装置３０の第６実施形態は、図１６に示される。第６実施形態では、分析装置３０は支持ベース６４に支持される。チップ２０の分析領域２１０ａ〜２１０ｅは、図１５Ａ及び１５Ｂに説明された接近可能な超常磁性粒子イメージング永久磁石３２及びホール磁気センサ６０に対して、円弧の方式で順に移動してゼロ領域３７ｂに入る。生成された信号は、ホールプローブバイアスワイヤ及び出力信号６２を通過する。永久磁石３２及び非線形分析チップ２０の形式は、総コストを低減させ、分析領域２１０は空間構築の事前知識を使用して多重化してイメージングする。コンピュータ断層撮影に使用される再構成技術は、ホール磁気センサ６０又はゼロ領域３７ｂ中の複数のセンサを使用した可能な３Ｄイメージングを示し、各センサは、数学モデルに寄与する視野（ＦＯＶ）を有する。分析装置３０の支持ベース６４は、一次非磁性材料であり、該材料はＮｄＦｅＢ磁石３２の磁力線を誘導し分配し、ホールプローブバイアスワイヤ及び出力信号６２は支持ベース６４を通過する。
【０１４５】
図１７に示されるように、磁場からのセンサ信号を測定するための一例を示す信号チェーン４０が概説される。信号チェーン４０では、１２０−２４０交流壁電源又は内部電池５７からのプラグイン変圧器５６が直流バイアス電圧をホールセンサ６０’に提供する。サーミスター６５は機器の環境温度を校正し、追加されるホールセンサ６０は、地球磁場を含む機器の周りの全ての磁場を校正する。ホールセンサが信号又は電圧を生成すると、フィルタ６６のオフセット補正集積回路フィードバック回路は、それをフィルタリングし、線形増幅器４７に緊密に結合される前置増幅器６７に伝達する。増幅された信号はゲートドライバ６８及び過電流保護（ＯＣＰ）にマッチングする低電力であり、グラフィカルユーザーインタフェース（ＧＵＩ）５４又はユーザー入力を管理する中央プロセッサ（ＣＰＵ）４９に入力する。ＧＵＩ５４は、ホール素子６０’から測定された磁気信号をアプリケーションプログラム又はプログラム５５、印刷機５３、ディスプレイ５２、ブルートゥース（登録商標）５０又は無線通信５１、例えばインターネット又はクラウドに送信するよう指示するヒューマンインタフェースである。
【０１４６】
実施例１．本発明のＨＹ−ＰＯＣチップ上のウサギＩｇＧ結合ＳＰＮＰの用量反応
材料：
本実施例では、使用される材料は、ウサギＩｇＧ  １５０Ｋ（Ａｒｉｓｔａ  Ｂｉｏ、ＡＧＲＩＧ−０１００、ロット０９１３２５５５１、２．８８ｍｇ／ｍｌ）、精製されるヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）抗体（ＢｉｏＳｐａｃｉｆｉｃ：Ｇ−３０１−Ｃ−ＡＢＳ、ロットＷＥＢ０８、６．３９ｍｇ／ｍｌ）、磁気ビーズ（ＭｉｃｒｏＭｏｄ、０９−０２−１３２、１３０ｎｍ、１０ｍｇ／ｍｌ）、シリカビーズ（ＣＯＲＰＵＳＣＵＬＡＲ  Ｃ−ＳｉＯ−１０ＣＯＯＨ、１０ミクロン球、１０ｍｇ／ｍｌ）、ニトロセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＨＦ１８０ＵＢＸＳＳ、ロットＲ６ＥＡ６２１９８Ｃ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム（Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）（Ｃｏｍｂｉ−Ｂｌｏｃｋｓカテゴリ：ＯＲ−６９４１、ＣＡＳ番号１０６６２７−５４−７）、１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（ＡＫ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカテゴリ番号９６５２９９）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリソルベート２０、カップリングバッファー：１０  ｍＭ  ＰＢＳ  ｐＨ  ７．４、保存バッファー（１
０  ｍＭ  ＰＢＳ、０．６ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．０５％  ＮａＮ３）、サンプル実行バッファー（１０  ｍＭ  ＰＢＳ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．１％ポリソルベート２０）を含む。
【０１４７】
方法：
１．磁気ビーズで標識されたウサギＩｇＧ（Ｒ−ＩｇＧ−ＳＰＮＰ）の調製：０．１ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌ  １３０ｎｍ磁気ビーズを１．５ｍｌチューブに加え、続いて０．２ｍｌのＰＢＳカップリングバッファーを加え、次に０．０１ｍｌのＥＤＣ（１０ｍｇ／ｍｌ）と０．０１ｍｌのＮＨＳ−Ｓｕｌｆｏ（１０ｍｇ／ｍｌ）を上記溶液に加えた。連続的に混合しながら混合物を室温で２０分間反応させた。次に、０．５７ｍｌのウサギＩｇＧ（２．８８ｍｇ／ｍｌ）を混合物に加え、且つ混合物を室温で２時間回転させた。その後、ビーズを磁気セパレーターで引き下げ、２×０．５ｍｌのＰＢＳで洗浄し、１ｍｌの保存バッファーに浮遊させ、Ｒ−ＩｇＧ−ＳＰＮＰを得た。
【０１４８】
２．固定相の調製：抗ウサギＩｇＧ（ＧＡＲ）抗体に共有結合されたシリカビーズ：０．１ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌ  １０ミクロンカルボン酸シリカビーズを１．５ｍｌチューブに加え、続いて０．２ｍｌのＰＢＳカップリングバッファーと０．０１ｍｌのＥＤＣ（１０ｍｇ／ｍｌ）及び０．０１ｍｌのＮＨＳ−Ｓｕｌｆｏ（１０ｍｇ／ｍｌ）を上記溶液に加え、混合物を形成した。連続的に混合しながら混合物を室温で２０分間反応させた。次に、０．１５６ｍｌヤギ抗ウサギ−ＩｇＧ（６．３９ｍｇ／ｍｌ）を混合物に加えた。混合物を室温で２時間回転させ、続いて１３，０００ＲＰＭで３分間遠心分離して上清を除去した。その後、２×０．５ｍｌのＰＢＳでシリカビーズを洗浄し、３５℃で１２時間乾燥させた。
【０１４９】
３．抗ウサギＩｇＧ（ＧＡＲ）抗体吸着シリカビーズの調製：０．１ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌ  １０ミクロンカルボン酸シリカビーズを１．５ｍｌチューブに加え、続いて０．２ｍｌのＰＢＳカップリングバッファーと０．００５ｍｌのヤギ抗ウサギＩｇＧ（６．３９ｍｇ／ｍｌ）を加えた。混合物を室温で１２時間回転させ、１３，０００ＲＰＭで３分間遠心分離された。次に、上清を除去し、２×０．５ｍｌのＰＢＳでシリカビーズを洗浄し、３５℃で１２時間乾燥させた。
【０１５０】
４．抗ウサギＩｇＧ（ＧＡＲ）抗体吸着ニトロセルロースディスクの調製：０．２ｍｌのＰＢＳを１．５ｍｌチューブに加え、続いて０．００３ｍｌヤギ抗ウサギＩｇＧ（６．３９ｍｇ／ｍｌ）と予備成形されたニトロセルロースディスクを加えた。混合物を室温で２時間回転させ、溶液を除去した。ニトロセルロースディスクを３５℃で１２時間乾燥させた。
【０１５１】
５．ウサギＩｇＧハイブリッドポイントオブケアチップの調製：図１８に示されるように、本発明のハイブリッドポイントオブケアチップ２０を組み立てた。チップ２０では、切替えカラム２４には普通の１０ミクロンカルボン酸シリカビーズが充填された。第１分析領域２１０ａには、ＧＡＲ抗体に共有結合されたシリカビーズが固定相として充填された。第２分析領域２１０ｂには、ＧＡＲ抗体吸着シリカビーズが固定相として充填された。第３分析領域２１０ｃには、ＧＡＲ抗体吸着ニトロセルロースディスクが固定相として充填された。
【０１５２】
このチップの構造は、固定相を製造する２種の異なる方法を示す：第１分析領域２１０ａ及び第２分析領域２１０ｂ中の粒子を分配し、又は第３分析領域２１０ｃ中の予め成形された材料を配置する。固定化マトリックスを固定相にロードする２種の異なる方法をさらに示す：第１分析領域２１０ａの場合は共有結合であり、又は第２分析領域２１０ｂ及び第３分析領域２１０ｃの場合は物理的吸着である。
【０１５３】
６．サンプル実行溶液の調製：サンプル実行バッファーを使用して１３０ｎｍの磁気ビーズで標識されたウサギＩｇＧ（１ｍｇ／ｍｌ）を適切な濃度に希釈した。サンプル濃度は、０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｎｇ／ｍｌである。
【０１５４】
７．アッセイの実行：０．０１ｍｌのサンプル実行溶液をピペットで取り、溶液をサンプル導入領域に加えた。サンプル導入領域が空になるまで待った（３〜５分間）。次に、０．０１ｍｌのサンプル実行バッファーを加えた。サンプル導入領域が空になるまで待った（３〜５分間）、次にＳＰＩ装置でチップを読み取った。
【０１５５】
８．ハイブリッドポイントオブケアチップの読み取り：ＳＰＩ分析装置でハイブリッドポイントオブケアチップを分析した。１７秒間以内に一回の走査ですべての３つの分析領域２１０ａ、２１０ｂ及び２１０ｃを分析した。
【０１５６】
＜実験結果及び検討＞
実験結果が図１９に示され、異なる濃度のＳＰＮＰ標識ウサギＩｇＧサンプル（Ｒ−ＩｇＧ−ＳＰＮＰ）が本発明のハイブリッドポイントオブケアチップで分析されることを示した。図１９の結果から分かるように、ウサギＩｇＧはすべての３個の分析領域にいずれも捕獲され、且つ磁気信号がＳＰＮＰ濃度に比例する。サンプルはハイブリッドポイントオブケアチップ２０を自動的に流れ、任意のポンプが必要としない。アッセイ時間が１０分間より少ない。サンプル量は１０マイクロリットル未満であってもよく。異なる材料（シリカビーズとニトロセルロース膜）を、分析物（ウサギＩｇＧ）を固定する固定相として使用できる。固定相の機能化の異なる方法（共有結合と物理的吸着）は、捕獲材料のロードに使用できる。且つ、異なる固定相充填方法（原位置充填と予備成形）を使用してハイブリッドポイントオブケアチップを製造することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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