(57)【要約】本開示は、バイオフィルムの安定性を阻害するための方法であって、バイオフィルムを、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の作用物質と接触させることを含む方法に関する。また、対象においてバイオフィルムを処置するための方法であって、バイオフィルムに感染した対象に、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の作用物質を投与することを含む方法が、本明細書で提供される。全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および／または嚢胞性線維症（ＣＦ）を患う患者においてバイオフィルムを処置するための方法であって、バイオフィルムまたはその局所環境においてＢ−ＤＮＡのＺ−ＤＮＡへの変換に干渉する有効量の作用物質を投与することを含む方法が、本明細書でさらに記載される。
2021529180.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオフィルムの安定性を阻害するための方法であって、前記バイオフィルムを、ポリアミンの前記バイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の作用物質と接触させることを含み、前記作用物質が、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない、方法。
【請求項２】
対象においてバイオフィルムを処置するための方法であって、バイオフィルムに感染した前記対象に、ポリアミンの前記バイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の作用物質を投与することを含み、前記作用物質が、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない、方法。
【請求項３】
バイオフィルムを発生しやすい対象においてバイオフィルムの形成を予防するための方法であって、前記対象に、ポリアミンの前記バイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の作用物質を投与することを含み、必要に応じて、前記作用物質が、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない、方法。
【請求項４】
それを必要とする対象において、バイオフィルムを産生する細菌によって引き起こされる感染を処置するための方法であって、前記対象に、ポリアミンの前記バイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の作用物質と、前記生物の複製を阻害する作用物質とを投与することを含み、必要に応じて、前記作用物質が、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない、方法。
【請求項５】
バイオフィルムの安定性を阻害するための方法であって、前記バイオフィルムを、ポリアミンの前記バイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の１種または複数種の作用物質と接触させることを含み、前記作用物質が、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない、方法。
【請求項６】
対象においてバイオフィルムを処置するための方法であって、バイオフィルムに感染した前記対象に、ポリアミンの前記バイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の１種または複数種の作用物質を投与することを含み、前記作用物質が、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない、方法。
【請求項７】
バイオフィルムを発生しやすい対象においてバイオフィルムの形成を予防するための方法であって、前記対象に、ポリアミンの前記バイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の１種または複数種の作用物質を投与することを含み、必要に応じて、前記作用物質が、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない、方法。
【請求項８】
それを必要とする対象において、バイオフィルムを産生する細菌によって引き起こされる感染を処置するための方法であって、前記対象に、ポリアミンの前記バイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の１種または複数種の作用物質と、前記生物の複製を阻害する作用物質とを投与することを含み、必要に応じて、前記作用物質が、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない、方法。
【請求項９】
前記接触させることが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏである、請求項１または５に記載の方法。
【請求項１０】
ポリアミンの前記バイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する前記作用物質が、ｔＲＮＡである、請求項１、５または９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記作用物質が、ポリアミン合成の阻害剤、または前記ポリアミンの前記ＤＮＡへの結合を阻害する作用物質であり、前記作用物質が、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない、いずれかの前記請求項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリアミンが、プトレシン、スペルミン、カダベリン、１，３−ジアミノプロパンまたはスペルミジンの群から選択される、いずれかの前記請求項に記載の方法。
【請求項１３】
前記作用物質が、ポリアミンアナログであるジフルオロメチルオルニチン、トランス−４−メチルシクロヘキシルアミン、サルドモジド、メチルグリオキサール−ビス［グアニルヒドラゾン］（ＭＧＢＧ）、１−アミノオキシ−３−アミノプロパン、オキサリプラチン、シスプラチン、ジシクロヘキシルアミン、任意のその誘導体、またはその塩を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記作用物質が、前記バイオフィルムからカチオンを枯渇させる作用物質、必要に応じて、カチオン交換樹脂、アミノポリカルボン酸、クラウンエーテル、アザクラウンまたはクリプタンドを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記バイオフィルムからカチオンを枯渇させる前記作用物質が、スルホネート、スルホプロピル、ホスホセルロース、Ｐ１１ホスホセルロース、ヘパリン硫酸またはその誘導体もしくはアナログの群からの作用物質である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
バイオフィルムの安定性を阻害するための方法であって、前記バイオフィルムを、ポリアミンの前記バイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する作用物質とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させることを含み、前記接触させることが、表面を、カチオンを枯渇させる有効量の作用物質でコーティングすることを含み、前記作用物質が、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない、方法。
【請求項１７】
バイオフィルムの安定性を阻害するための方法であって、前記バイオフィルムを、ポリアミンの前記バイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の作用物質とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させることを含み、前記接触させることが、表面を、カチオンを枯渇させる有効量の１種または複数種の作用物質でコーティングすることを含み、前記作用物質が、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない、方法。
【請求項１８】
前記作用物質が、前記バイオフィルムまたはその局所環境においてＢ−ＤＮＡのＺ−ＤＮＡへの変換に干渉する、請求項１〜９または１６もしくは１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記作用物質が、抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体を含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記作用物質が、リボフラビン、エチジウムブロマイド、ビス（メチジウム）スペルミン、ダウノルビシン、ＴＭＰｙＰ４、第四級ベンゾ［ｃ］フェナントリジンアルカロイド、キナクリン、９−アミノアクリジンまたはその誘導体を含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記作用物質が、クロロキンまたはその誘導体を含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
バイオフィルムの安定性を阻害するための方法であって、前記バイオフィルムを、有効量のＨＭＧＢ１タンパク質またはその生物活性断片および抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させることを含み、前記接触させることが、表面を、有効量のＨＭＧＢ１タンパク質またはその生物活性断片および抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体でコーティングすることを含む、方法。
【請求項２３】
バイオフィルムの安定性を阻害するための方法であって、前記バイオフィルムを、有効量のクロロキンおよび抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させることを含み、前記接触させることが、表面を、有効量のクロロキンおよび抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体でコーティングすることを含む、方法。
【請求項２４】
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および／または嚢胞性線維症（ＣＦ）を患う患者においてバイオフィルムを処置するための方法であって、前記バイオフィルムまたはその局所環境においてＢ−ＤＮＡのＺ−ＤＮＡへの変換に干渉する有効量の作用物質を投与することを含み、前記作用物質が、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない、方法。
【請求項２５】
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および／または嚢胞性線維症（ＣＦ）を患う患者においてバイオフィルムを処置するための方法であって、前記バイオフィルムまたはその局所環境においてＢ−ＤＮＡのＺ−ＤＮＡへの変換に干渉する有効量の１種または複数種の作用物質を投与することを含み、前記作用物質が、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない、方法。
【請求項２６】
前記作用物質が、クロロキンまたはその誘導体を含む、請求項２２または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記作用物質が、抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体を含む、請求項２２または２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記作用物質が、リボフラビン、エチジウムブロマイド、ビス（メチジウム）スペルミン、ダウノルビシン、ＴＭＰｙＰ４、第四級ベンゾ［ｃ］フェナントリジンアルカロイド、キナクリン、９−アミノアクリジンまたはその誘導体を含む、請求項２２または２５に記載の方法。
【請求項２９】
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および／または嚢胞性線維症（ＣＦ）を患う患者においてバイオフィルムを処置するための方法であって、有効量のＨＭＧＢ１タンパク質またはその生物活性断片および抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体を投与することを含む方法。
【請求項３０】
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および／または嚢胞性線維症（ＣＦ）を患う患者においてバイオフィルムを処置するための方法であって、有効量のクロロキンおよび抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体を投与することを含む方法。
【請求項３１】
プラチナベースの化学療法を受けているか、または受けた患者において前記化学療法の投与に付随するバイオフィルム産生感染を処置するための方法であって、前記バイオフィルムまたはその局所環境においてＢ−ＤＮＡのＺ−ＤＮＡへの変換に干渉する有効量の作用物質を投与することを含み、前記作用物質が、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない、方法。
【請求項３２】
プラチナベースの化学療法を受けているか、または受けた患者において前記化学療法の投与に付随するバイオフィルム産生感染を処置するための方法であって、前記バイオフィルムまたはその局所環境においてＢ−ＤＮＡのＺ−ＤＮＡへの変換に干渉する有効量の１種または複数種の作用物質を投与することを含み、前記作用物質が、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない、方法。
【請求項３３】
前記作用物質が、クロロキンまたはその誘導体を含む、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記作用物質が、抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体を含む、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記作用物質が、リボフラビン、エチジウムブロマイド、ビス（メチジウム）スペルミン、ダウノルビシン、ＴＭＰｙＰ４、第四級ベンゾ［ｃ］フェナントリジンアルカロイド、キナクリン、９−アミノアクリジンまたはその誘導体を含む、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３６】
プラチナベースの化学療法を受けているか、または受けた患者において前記化学療法の投与に付随するバイオフィルム産生感染を処置するための方法であって、有効量のＨＭＧＢ１タンパク質またはその生物活性断片および抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体を投与することを含む方法。
【請求項３７】
プラチナベースの化学療法を受けているか、または受けた患者において前記化学療法の投与に付随するバイオフィルム産生感染を処置するための方法であって、有効量のクロロキンおよび抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体を投与することを含む方法。
【請求項３８】
前記バイオフィルムを、ｅＤＮＡのＤＮＡ結合タンパク質への結合に干渉する有効量の作用物質および／または抗菌剤と接触させることをさらに含む、請求項１または５に記載の方法。
【請求項３９】
前記ｅＤＮＡの前記ＤＮＡ結合タンパク質への結合に干渉する前記作用物質が、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体、抗ＩＨＦ抗体および／もしくは抗ＨＵ抗体またはその各々の断片のうちの１つまたは複数を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記対象に、前記ｅＤＮＡのＤＮＡ結合タンパク質への結合に干渉する有効量の作用物質および／または抗菌剤を投与することをさらに含む、請求項２〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記ｅＤＮＡの前記ＤＮＡ結合タンパク質への結合に干渉する前記作用物質が、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体、抗ＩＨＦ抗体および／もしくは抗ＨＵ抗体またはその各々の断片のうちの１つまたは複数を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記バイオフィルムからカチオンを枯渇させる前記作用物質が、正味の負電荷を有する、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項４３】
前記バイオフィルムからカチオンを枯渇させる前記作用物質が、正味の中性電荷を有する、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項４４】
前記ｅＤＮＡのＤＮＡ結合タンパク質への結合に干渉する前記作用物質が、正味の負電荷を有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
前記ｅＤＮＡのＤＮＡ結合タンパク質への結合に干渉する前記作用物質が、正味の中性電荷を有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
前記ｅＤＮＡのＤＮＡ結合タンパク質への結合に干渉する前記作用物質が、正味の正電荷を有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４７】
前記方法が、ＤＮアーゼ酵素の投与の非存在下で行われる、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する作用物質、バイオフィルムからカチオンを枯渇させる作用物質、バイオフィルムまたはその局所環境においてＢ−ＤＮＡのＺ−ＤＮＡへの変換に干渉する作用物質、ｅＤＮＡのＤＮＡ結合タンパク質への結合に干渉する作用物質および／または抗菌剤のうちの１、２もしくは３つまたはそれよりも多くを含む組成物。
【請求項４９】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
ポリアミンの前記バイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する前記作用物質が、ポリアミンアナログであるジフルオロメチルオルニチン、トランス−４−メチルシクロヘキシルアミン、サルドモジド、メチルグリオキサール−ビス［グアニルヒドラゾン］（ＭＧＢＧ）、１−アミノオキシ−３−アミノプロパン、オキサリプラチン、シスプラチンおよび／もしくはジシクロヘキシルアミン、任意のその誘導体、またはその塩のうちの１つまたは複数を含む、請求項４８または４９に記載の組成物。
【請求項５１】
前記バイオフィルムからカチオンを枯渇させる前記作用物質が、カチオン交換樹脂、アミノポリカルボン酸、クラウンエーテル、アザクラウンまたはクリプタンド、スルホネート、スルホプロピル、ホスホセルロース、Ｐ１１ホスホセルロースおよび／もしくはヘパリン硫酸またはその誘導体もしくはアナログのうちの１つまたは複数を含む、請求項４８または４９に記載の組成物。
【請求項５２】
前記バイオフィルムまたはその局所環境においてＢ−ＤＮＡのＺ−ＤＮＡへの変換に干渉する前記作用物質が、ＨＭＧＢ１タンパク質、その断片もしくはその各々の等価物、抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体、および／またはクロロキン、または任意のその誘導体のうちの１つまたは複数を含む、請求項４８または４９に記載の組成物。
【請求項５３】
前記ｅＤＮＡのＤＮＡ結合タンパク質への結合に干渉する前記作用物質が、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体、抗ＩＨＦ抗体および／もしくは抗ＨＵ抗体またはその各々の断片のうちの１つまたは複数を含む、請求項４８または４９に記載の組成物。
【請求項５４】
請求項４８〜５３のいずれか一項に記載の組成物と使用のための指示とを含むキットであって、必要に応じて、前記作用物質が、組み合わせられているか、または別々に包装されている、キット。
【請求項５５】
使用のための前記指示が、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の方法を行うための使用法を提供する、請求項５４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）（３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ））の下、２０１８年６月２９日出願の米国仮出願第６２／６９２，５８１号の優先権を主張し、当該出願の内容は、その全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は概して、細菌の細胞外高分子物質（ＥＰＳ：ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）を除去または阻害するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
バイオフィルムは、医療、農業および産業環境において主要な役割を果たす。バイオフィルムは、動物および植物の両方の疾患のかなりの部分、および産業設備の汚損の原因であり、そのため、熱心な研究努力の的となっている。バイオフィルムの根絶または処置は、抗微生物エフェクターに対する物理的障壁を形成する細胞外マトリックスの産生、環境ストレッサーの影響を受けにくい生理機能の変化、およびバイオフィルムの構成要素間の協同的相互作用を含む、複数の要因のために達成することが特に困難である。バイオフィルムマトリックスは不定に、多糖、タンパク質および、おそらく普遍的に、細胞外ＤＮＡ（ｅＤＮＡ：ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ＤＮＡ）からなる。微生物バイオフィルムのｅＤＮＡは、保護を提供する細胞外マトリックスの重要な構成要素である。ＤＮＡ分解または構造を安定化するＤＮＡ結合タンパク質の除去を介してバイオフィルムｅＤＮＡ構造を傷付けると、バイオフィルムの破局的崩壊および常在菌の放出をもたらし、より脆弱な状態になる。
【０００４】
細菌は、天然では２つの別個の状態で見出され；浮遊性細菌は、自由生活であり、一方で、発達して群集アーキテクチャ（ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ）になる細菌は、バイオフィルム（表面上または凝集物としてのいずれか）と呼ばれる。ＣＤＣおよびＮＩＨは、全ての細菌感染の約８０％は、必要なバイオフィルムの状態に関与すると見積もっている。Ｄｏｎｇａｒｉ−Ｂａｇｔｚｏｇｌｏｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ａｎｔｉ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｔｈｅｒ．  ６（２）：２０１−８。これらには、数ある中で、中耳炎（ＯＭ：ｏｔｉｔｉｓ  ｍｅｄｉａ）、慢性副鼻腔炎（ＣＲＳ：ｃｈｒｏｎｉｃ  ｒｈｉｎｏｓｉｎｕｓｉｔｉｓ）、慢性肺感染、慢性創傷感染、歯周炎、膀胱炎、および医療用インプラントおよび留置カテーテルの感染が含まれる。実際に、小児医療を求める最も一般的な理由の１つはＯＭ［分類不能（Ｎｏｎｔｙｐｅａｂｌｅ）Ｈａｅｍｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓにより引き起こされる］であり、成人については、膀胱炎［例えば、尿路病原性Ｅ．  ｃｏｌｉ（ＵＰＥＣ：Ｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅ．  ｃｏｌｉ）］であり；したがって、これらの病訴については抗生物質処方が最も一般的である。米国内では、毎年５００，０００件の死亡が細菌バイオフィルム感染症の直接的結果によると見積もられている。経済への影響は驚異的である［慢性創傷に２５０億ドル、歯周炎に１４０億ドル、ＯＭに５０億ドルおよび膀胱炎に１０億ドル］。バイオフィルム媒介疾患の世界的流行、特に高優先度ＥＳＫＡＰＥ病原体（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）の中の抗生物質抵抗性細菌感染症の増加率、および大きな金融負担により、組織化細菌群集により引き起こされる不応性感染症を処置するための新規手法を開発することへの決定的な必要性が生じる。
したがって、関連付けられる細菌感染症を処置または死滅させ、表面および水系からそれらを取り除くためにバイオフィルムの保護的障壁を切り抜けることへの必要性が存在している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｄｏｎｇａｒｉ−Ｂａｇｔｚｏｇｌｏｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ａｎｔｉ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｔｈｅｒ．  ６（２）：２０１−８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
バイオフィルムは、慢性感染症および再発性感染症を引き起こす細菌の不応性リザーバーとして働くので、バイオフィルム内に常在する細菌を免疫クリアランスおよび抗微生物薬から保護する自己産生細胞外マトリックス（または細胞外高分子物質、ＥＰＳ）は、これらの疾患を引き起こす病原性バイオフィルムに必須である。ＥＰＳ構成要素は、個々の細菌種に特異的であるが、普遍的に、バイオフィルム内に常在する細菌由来の細胞外ＤＮＡ（ｅＤＮＡ）を含有する。実際に、様々な属の細菌は典型的に、多種バイオフィルムの共有群集アーキテクチャに入り、これは、ＥＰＳが、全ての構成要素種にとって構造的に助けになるだけでなく、常在細菌の全てに由来するか、または常在細菌の全てが使用できるＥＰＳ構成成分を含有することも必要とする。この点において、単一種および複数種のバイオフィルムのＥＰＳは、基礎をなす普遍的ＥＰＳの共通構造であるように見えるスキャフォールドｅＤＮＡを含有する。本明細書で開示される通り、出願人は、このｅＤＮＡ依存性構造が、細菌ＤＮＡ結合タンパク質の遍在性ＤＮＡＢＩＩファミリーによって安定化されていることを発見した。出願人は、外因性ＤＮＡおよびＤＮＡＢＩＩタンパク質が、自由生活（浮遊性）細菌をバイオフィルムの群集アーキテクチャに至らせることができることを示したが、これらの２つの構成成分は、シグネチャーｅＤＮＡスキャフォールドを再現するためには不十分である。
【０００７】
出願人は本明細書で、ポリアミンが、普遍的ｅＤＮＡ−ＤＮＡＢＩＩ依存性ＥＰＳの第３の重要な構成成分であることを開示する。ポリアミンは、ＤＮＡに結合すると、ヌクレオチドリン酸のポリアニオン性電荷を中和し、ＤＮＡ分子を富化／凝集させる、細胞内および細胞外の両方に遍在する正に荷電した短い有機分子である。重要なことに、出願人は本明細書で、ポリアミンが、ＤＮＡを最も一般的な右巻きＢ型から、ヌクレアーゼ抵抗性である左巻きＺ型ＤＮＡに至らせることができることを開示する。実際に、ヌクレアーゼは、細菌バイオフィルム形成を予防し得るが、それらは、成熟バイオフィルムを破壊することができない。バイオフィルムが熟成するにつれて、（１）ポリアミンの増加および（２）Ｚ型ＤＮＡの出現の両方に付随して、それらはヌクレアーゼ抵抗性を取得する。
【０００８】
バイオフィルムの安定性を阻害するための方法であって、バイオフィルムを、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の作用物質と接触させることを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、作用物質が、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない、方法が、本明細書で説明される。一態様では、バイオフィルムの安定性を阻害するための方法は、バイオフィルムを、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の１種または複数種の作用物質と接触させることを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる。また、本開示は、バイオフィルムの安定性を阻害するための方法であって、バイオフィルムを、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する作用物質とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させることを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、接触させることが、表面を、カチオンを枯渇させる有効量の作用物質でコーティングすることを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、作用物質が、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない、方法に関する。一態様では、バイオフィルムの安定性を阻害するための方法は、バイオフィルムを、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の作用物質とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させることを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなってもよく、接触させることは、表面を、カチオンを枯渇させる有効量の１種または複数種の作用物質でコーティングすることを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる。接触させることは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏであり得る。
【０００９】
一実施形態では、作用物質は、バイオフィルムまたはその局所環境においてＢ−ＤＮＡのＺ−ＤＮＡへの変換に干渉する。第２の実施形態では、作用物質は、抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体を含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる。第３の実施形態では、作用物質は、リボフラビン、エチジウムブロマイド、ビス（メチジウム）スペルミン、ダウノルビシン、ＴＭＰｙＰ４、第四級ベンゾ［ｃ］フェナントリジンアルカロイド、キナクリン、９−アミノアクリジンまたはその誘導体を含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる。第４の実施形態では、作用物質は、クロロキンまたはその誘導体を含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる。
【００１０】
バイオフィルムの安定性を阻害するための方法であって、バイオフィルムを、有効量のＨＭＧＢ１タンパク質またはその生物活性断片および抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させることを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、接触させることが、表面を、有効量のＨＭＧＢ１タンパク質またはその生物活性断片および抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体でコーティングすることを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる、方法が、本明細書でさらに説明される。また、本開示は、バイオフィルムの安定性を阻害するための方法であって、バイオフィルムを、有効量のクロロキンおよび抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させることを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、接触させることが、表面を、有効量のクロロキンおよび抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体でコーティングすることを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる、方法に関する。接触させることは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏであり得る。
【００１１】
また、対象においてバイオフィルムを処置するための方法であって、バイオフィルムに感染した対象にポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の作用物質を投与することを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、作用物質が、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない、方法が、本明細書で提供される。一態様では、対象においてバイオフィルムを処置するための方法は、バイオフィルムに感染した対象にポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の１種または複数種の作用物質を投与することを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる。
【００１２】
また、本開示は、バイオフィルムを発生しやすい対象においてバイオフィルムの形成を予防するための方法であって、対象にポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の作用物質を投与することを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、作用物質が、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない、方法に関する。一態様では、バイオフィルムを発生しやすい対象においてバイオフィルムの形成を予防するための方法は、対象にポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の１種または複数種の作用物質を投与することを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる。
【００１３】
本開示は、それを必要とする対象においてバイオフィルムを産生する細菌によって引き起こされる感染を処置するための方法であって、対象にポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の作用物質とその生物の複製を阻害する作用物質とを投与することを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、作用物質が、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない、方法にさらに関する。一態様では、それを必要とする対象においてバイオフィルムを産生する細菌によって引き起こされる感染を処置するための方法は、対象にポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の１種または複数種の作用物質を投与することを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる。
【００１４】
上記に説明する方法のいずれかについて、ポリアミンは、プトレシン、スペルミン、カダベリン、１，３−ジアミノプロパンまたはスペルミジンの群から選択され得る。一実施形態では、上記に説明する方法について、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する作用物質は、ｔＲＮＡである。別の実施形態では、作用物質は、ポリアミン合成の阻害剤、またはポリアミンのＤＮＡへの結合を阻害する作用物質である。第２の実施形態では、作用物質は、ポリアミンアナログであるジフルオロメチルオルニチン、トランス−４−メチルシクロヘキシルアミン、サルドモジド（ｓａｒｄｏｍｏｚｉｄｅ）、メチルグリオキサール−ビス［グアニルヒドラゾン］（ＭＧＢＧ：ｍｅｔｈｙｌｇｌｙｏｘａｌ−ｂｉｓ［ｇｕａｎｙｌｈｙｄｒａｚｏｎｅ］）、１−アミノオキシ−３−アミノプロパン、オキサリプラチン、シスプラチン、ジシクロヘキシルアミン、任意のその誘導体、またはその塩を含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる。第３の実施形態では、作用物質は、バイオフィルムからカチオンを枯渇させる作用物質、必要に応じて、カチオン交換樹脂、アミノポリカルボン酸、クラウンエーテル、アザクラウンまたはクリプタンドを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる。第４の実施形態では、バイオフィルムからカチオンを枯渇させる作用物質は、スルホネート、スルホプロピル、ホスホセルロース、Ｐ１１ホスホセルロース、ヘパリン硫酸またはその誘導体もしくはアナログの群から選択される。第５の実施形態では、作用物質は、バイオフィルムまたはその局所環境においてＢ−ＤＮＡのＺ−ＤＮＡへの変換に干渉する。第６の実施形態では、作用物質は、抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体を含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる。第８の実施形態では、作用物質は、リボフラビン、エチジウムブロマイド、ビス（メチジウム）スペルミン、ダウノルビシン、ＴＭＰｙＰ４、第四級ベンゾ［ｃ］フェナントリジンアルカロイド、キナクリン、９−アミノアクリジンまたはその誘導体を含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる。第９の実施形態では、作用物質は、クロロキンまたはその誘導体を含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる。一態様では、バイオフィルムからカチオンを枯渇させる作用物質は、正味の負電荷を有する。別の態様では、バイオフィルムからカチオンを枯渇させる作用物質は、正味の中性電荷を有する。
【００１５】
また、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ：ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）および／または嚢胞性線維症（ＣＦ：ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）を患う患者においてバイオフィルムを処置するための方法であって、バイオフィルムまたはその局所環境においてＢ−ＤＮＡのＺ−ＤＮＡへの変換に干渉する有効量の作用物質を投与することを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、作用物質が、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない、方法が、本明細書で提供される。全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および／または嚢胞性線維症（ＣＦ）および／またはＴＢを患う患者においてバイオフィルムを処置するための方法であって、バイオフィルムまたはその局所環境においてＢ−ＤＮＡのＺ−ＤＮＡへの変換に干渉する有効量の１種または複数種の作用物質を投与することを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、作用物質が、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない、方法が、本明細書で開示される。一態様では、作用物質は、ＤＮアーゼの非存在下で投与される。一実施形態では、作用物質は、バイオフィルムまたはその局所環境においてＢ−ＤＮＡのＺ−ＤＮＡへの変換に干渉する。第２の実施形態では、作用物質は、抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体を含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる。第３の実施形態では、作用物質は、リボフラビン、エチジウムブロマイド、ビス（メチジウム）スペルミン、ダウノルビシン、ＴＭＰｙＰ４、第四級ベンゾ［ｃ］フェナントリジンアルカロイド、キナクリン、９−アミノアクリジンまたはその誘導体を含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる。第４の実施形態では、作用物質は、クロロキンまたはその誘導体を含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる。一態様では、クロロキン誘導体は、ＤＮＡ塩基間に介入する能力を保持する。
【００１６】
また、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および／または嚢胞性線維症（ＣＦ）を患う患者においてバイオフィルムを処置するための方法であって、有効量のＨＭＧＢ１タンパク質またはその生物活性断片および抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体を投与することを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる方法が、本明細書で提供される。一態様では、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および／または嚢胞性線維症（ＣＦ）および／または結核（ＴＢ：ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を患う患者においてバイオフィルムを処置するための方法は、有効量のクロロキンおよび抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体を投与することを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる。また、本開示は、プラチナベースの化学療法を受けているか、または受けた患者において化学療法の投与に付随するバイオフィルム産生感染を処置するための方法であって、バイオフィルムまたはその局所環境においてＢ−ＤＮＡのＺ−ＤＮＡへの変換に干渉する有効量の作用物質を投与することを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、作用物質が、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない、方法に関する。一態様では、方法は、バイオフィルムまたはその局所環境においてＢ−ＤＮＡのＺ−ＤＮＡへの変換に干渉する有効量の１種または複数種の作用物質を投与することを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる。一態様では、作用物質は、ＤＮアーゼの非存在下で投与される。さらなる態様では、作用物質は、クロロキンまたはその誘導体を含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる。特定の一態様では、クロロキン誘導体は、ＤＮＡ塩基間に介入する能力を保持する。またさらなる態様では、作用物質は、抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体を含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる。一実施形態では、作用物質は、リボフラビン、エチジウムブロマイド、ビス（メチジウム）スペルミン、ダウノルビシン、ＴＭＰｙＰ４、第四級ベンゾ［ｃ］フェナントリジンアルカロイド、キナクリン、９−アミノアクリジンまたはその誘導体を含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる。
【００１７】
本開示は、プラチナベースの化学療法を受けているか、または受けた患者において化学療法の投与に付随するバイオフィルム産生感染を処置するための方法であって、有効量のＨＭＧＢ１タンパク質またはその生物活性断片および抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体を投与することを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる方法にさらに関する。また、プラチナベースの化学療法を受けているか、または受けた患者において化学療法の投与に付随するバイオフィルム産生感染を処置するための方法であって、有効量のクロロキンおよび抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体を投与することを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる方法が、本明細書で提供される。
【００１８】
上記に説明する方法は、ｅＤＮＡのＤＮＡ結合タンパク質への結合に干渉する有効量の作用物質および／または抗菌剤を、バイオフィルムと接触させること、またはあるいは、対象に投与することをさらに含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなってもよく、作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない。一態様では、ｅＤＮＡのＤＮＡ結合タンパク質への結合に干渉する作用物質は、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体、抗ＩＨＦ抗体および／もしくは抗ＨＵ抗体またはその各々の断片のうちの１つまたは複数を含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる。一実施形態では、ｅＤＮＡのＤＮＡ結合タンパク質への結合に干渉する作用物質は、正味の負電荷を有する。第２の実施形態では、ｅＤＮＡのＤＮＡ結合タンパク質への結合に干渉する作用物質は、正味の中性電荷を有する。第３の実施形態では、ｅＤＮＡのＤＮＡ結合タンパク質への結合に干渉する作用物質は、正味の正電荷を有する。一態様では、作用物質は、ＤＮアーゼの非存在下で投与される。上記に説明する方法は、ＤＮアーゼ酵素の投与の非存在下で行われ得る。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１Ａ〜図１Ｃは、ポリアミンが、ＤＮＡ構造をモジュレートすることを示す。（図１Ａ）ＮＴＨＩによる急性ＯＭを有するチンチラ中耳に見出される粘膜バイオフィルムＥＰＳの免疫蛍光顕微鏡画像（Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４（６）：６２５−３７から適応）。ＤＮＡＢＩＩタンパク質（灰色の玉）およびｅＤＮＡ（白色の領域）についてプローブした。ＤＮＡＢＩＩは、ｉｎ  ｖｉｖｏでバイオフィルム中のｅＤＮＡ鎖頂点に局在する。（図１Ｂ）一般的なポリアミンの化学構造（Ｄｉ  Ｍａｒｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３０３（８）：４８４−９１から適応）。（図１Ｃ）ＤＮＡ単独、またはポリアミンとのインキュベーション後のＤＮＡの原子間力顕微鏡画像（Ｉａｃｏｍｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．  １２（４）：１１７８−８６から適応）。ポリアミンは、ｅＤＮＡにおける太い繊維の形成および構造的複雑性を誘導する。
【００２０】
【図２】図２Ａ〜図２Ｂは、ポリアミンが、ｅＤＮＡスキャフォールド構造を誘導することを示す図である。（図２Ａ）ＮＴＨＩによる急性ＯＭを有するチンチラ中耳に見出される粘膜バイオフィルムＥＰＳの免疫蛍光ＣＬＳＭ画像。ポリアミン（白色のドット）［プトレシン（Ｐｕｔ）、カダベリン（Ｃａｄ）、スペルミジン（Ｓｐｄ）］およびｅＤＮＡ（白色）についてプローブし、ＤＡＰＩにより対比染色した（灰色の領域）。ポリアミンは、ｉｎ  ｖｉｖｏで形成されたバイオフィルム中のｅＤＮＡ鎖に局在する；スペルミジンは、バイオフィルムＥＰＳにおいて最も多く見られるポリアミンである。（図２Ｂ）ＤＮＡ（５μＭ）およびスペルミジン（７００μＭ）（上）ならびにＤＮＡ（５μＭ）、スペルミジン（７００μＭ）およびＨＵ（５０ｎＭ）（下）の複合体の透過型電子顕微鏡画像（Ｓａｒｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３５（３）：９５１  ６１から適応）。同様の構造が、ＤＮＡ−ポリアミン−ＩＨＦ複合体によって形成される。Ｓａｒｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ４８（４）：６６７−７５。ポリアミンは、ＤＮＡ凝縮を誘導し、ＤＮＡＢＩＩタンパク質と組み合わせて、太い繊維を形成する。
【００２１】
【図３】図３Ａ〜図３Ｃは、ポリアミン合成阻害剤が、バイオフィルム形成を低減させることを示す。（図３Ａ）ジシクロヘキシルアミン（ＤＣＨＡ、５０μＭ）、スペルミジン（Ｓｐｄ）シンターゼ阻害剤、Ｓｐｄ（１ｍＭ）またはその両方の存在下で成長させた、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）染色したＮＴＨＩバイオフィルムのＣＯＭＳＴＡＴ定量。バーは、ＳＥＭを表す。対照と比較した統計的有意性は、対応のないｔ検定によって評価した、＊Ｐ＜０．０５。バイオフィルムの平均の厚さは、ＤＣＨＡによって減少したが、外因性Ｓｐｄの同時添加は、バイオフィルム形成を回復させた。（図３Ｂ）ＤＣＨＡ（５０μＭ）の存在下で３時間成長させたＮＴＨＩ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏバイオフィルム中のｅＤＮＡスキャフォールド構造の免疫蛍光顕微鏡画像。ｄｓＤＮＡについてプローブした（白色の領域）。ｅＤＮＡスキャフォールド構造産生は、ポリアミン合成の阻害によって大幅に低減された。（図３Ｃ）ＤＣＨＡの存在下で４０時間成長させたＮＴＨＩ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏバイオフィルムの免疫蛍光ＣＬＳＭ画像。Ｓｐｄについてプローブし（図３Ｃ下部パネルにおける白色のドット）、ＤＡＰＩにより対比染色した（灰色の領域）。ＤＣＨＡは、バイオフィルムＥＰＳへのポリアミン取り込みを阻害する。
【００２２】
【図４】図４Ａ〜図４Ｂは、抗ＤＮＡＢＩＩが、ＤＮＡＢＩＩ−ポリアミン（ＰＡ）依存性構造を破壊することを示す。（図４Ａ）ＤＮＡ構造は、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ；２μｇ／ｍｌ）を含有する緩衝液中スペルミジン（３００μＭ）およびＨＵ（１μＭ）を４０時間インキュベートすることにより形成された。ＤＮＡＢＩＩ−ポリアミン依存性ＤＮＡ構造の免疫蛍光ＣＬＳＭ画像。ＤＮＡＢＩＩタンパク質についてプローブし（白色；画像の右側に指し示す）、ＤＡＰＩにより対比染色した（白色；画像の左側に指し示す）。ＤＮＡＢＩＩポリアミン依存性ＤＮＡ構造は、ＤＮＡＢＩＩタンパク質を取り込む。（図４Ｂ）ＥＰＳ構造は、（図４Ａ）と同様に２４時間で形成され、ＤＮＡＢＩＩ抗血清の１：５０希釈物でさらに１６時間処置した（画像の下に指し示す）。ＤＡＰＩで染色した蛍光ＣＬＳＭ画像（白色）。ＤＮＡＢＩＩ−ポリアミン依存性ＤＮＡ構造は、ＤＮＡＢＩＩタンパク質を要求する。
【００２３】
【図５】図５は、カチオン交換体ホスホセルロース（Ｐ１１）が、ＮＴＨＩバイオフィルム形成を破壊することを示す。Ｐ１１（１％）を頂端側チャンバーに添加した一方、ＮＴＨＩバイオフィルム成長は、トランスウェルプレートシステムの基底側チャンバーにおいて開始された。スペルミジン（１ｍＭ）およびＨＵ（１μＭ）を、播種時に添加し、１６時間維持した。バイオフィルムをＣＬＳＭにより可視化し、ＣＯＭＳＴＡＴによって解析した。平均の厚さ（図示せず）は、同一の傾向を示した。バーは、ＳＥＭを表す。対照と比較した統計的有意性は、対応のないｔ検定によって評価した、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１。Ｐ１１は、バイオフィルム形成を予防する。外因性スペルミジンおよびＨＵは一緒に、バイオフィルム発達を回復するが、いずれか単独では回復せず（図示せず）、この結果は、Ｐ１１抗バイオフィルム（ａｎｔｉｂｉｏｌｆｉｌｍ）活性が、バイオフィルムＥＰＳ由来の構造成分（ポリアミンおよびＤＮＡＢＩＩタンパク質）の滴定の結果であることを示唆する。
【００２４】
【図６】図６は、成熟バイオフィルムが、ＤＮアーゼによる破壊に対し抵抗性であることを示す。ＤＮアーゼ（プルモザイム（Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ）；５ユニット）を、播種時に（予防）または２４時間目に（破壊）、それぞれのｉｎ  ｖｉｔｒｏで予め形成されたＮＴＨＩおよびＵＰＥＣバイオフィルムへと添加した。総計４０時間後に、バイオフィルムをＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）で染色し、ＣＬＳＭにより可視化し、ＣＯＭＳＴＡＴによって解析した。バーは、ＳＥＭを表す。対照と比較した統計的有意性は、対応のないｔ検定によって評価した、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１。ＤＮアーゼは、バイオフィルムを予防することができるが、現存するバイオフィルムを破壊しない。
【００２５】
【図７】図７Ａ〜図７Ｄは、ＤＮＡＢＩＩタンパク質およびポリアミン（ＰＡ）が、相乗的に相互作用して、ＤＮアーゼ抵抗性を誘導することを示す。（図７Ａ）４０時間成長させたＮＴＨＩ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏバイオフィルムの免疫蛍光ＣＬＳＭ画像。スペルミジン（暗灰色の玉）、ＨＵ（淡灰白の玉）についてプローブし、ＤＡＰＩにより対比染色した（灰色の領域）。ポリアミンおよびＤＮＡＢＩＩタンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでバイオフィルムＥＰＳにおいて共局在する（白色の玉）。（図７Ｂ）ＮＴＨＩによる急性ＯＭを有するチンチラ中耳に見出される粘膜バイオフィルムＥＰＳの免疫蛍光ＣＬＳＭ画像。プトレシン（白色の玉）およびＨＵ（淡灰白の玉）についてプローブし、ＤＡＰＩにより対比染色した（暗灰色の領域）。ポリアミンおよびＤＮＡＢＩＩタンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏでバイオフィルム中のｅＤＮＡ鎖に共局在する（白色の領域）。（図７Ｃ）漸増レベルのスペルミジン（Ｓｐｄ）およびＨＵを、別々にまたは一緒に、ゲノムＤＮＡ（２μｇ／ｍｌ）と共に３７℃で１．５時間インキュベートし、続いてプルモザイム（登録商標）で２０分間処置した。アガロースゲル電気泳動を使用して、ＤＮＡ分解をアッセイした。ＳｐｄおよびＨＵは、ＤＮアーゼ消化からゲノムＤＮＡを相乗的に保護する。（図７Ｄ）Ｓｐｄ（３００μＭ）およびＨＵ（１μＭ）をゲノムＤＮＡ（２μｇ／ｍｌ）と共に４０時間インキュベートし、続いて２０分間プルモザイム（登録商標）処置した。構造をＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）で染色し、ＣＬＳＭによって撮像した（白色）。ＨＵ−Ｓｐｄ依存性ＤＮＡ構造は、ＤＮアーゼ処置に対して抵抗性である。
【００２６】
【図８】図８Ａ〜図８Ｂは、ＤＮＡＢＩＩおよびポリアミンが組み合わさって、Ｂ−ＤＮＡ形態をＺ−ＤＮＡ形態に変換することを示す。（図８Ａ）ＤＮＡＢＩＩ−ポリアミン依存性ＤＮＡ構造は、ゲノムＤＮＡ（２μｇ／ｍｌ）をＨＵ（１μＭ）およびスペルミジン（３００μＭ）と共に１６時間インキュベートすることにより形成された。ＤＮＡＢＩＩ−ポリアミン依存性ＤＮＡ構造の免疫蛍光ＣＬＳＭ画像。Ｚ−ＤＮＡについてプローブし（白色）、ＤＡＰＩで染色した（暗灰色）。ポリアミンおよびＤＮＡＢＩＩタンパク質は、相乗作用して、Ｂ−ＤＮＡからＺ−ＤＮＡへの変換を誘導する。（図８Ｂ）上：漸増濃度のＺ−ＤＮＡ触媒によってＺ−ＤＮＡへと変換されるＢ−ＤＮＡ基質の円二色性スペクトル（Ｊａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．  ５：９９４３から適応）。２５０ｎｍ前後の負のピークおよび２８０ｎｍ前後の正のピークの反転に留意されたい。下：ポリ（ｄＧｄＣ）ＤＮＡ（２０μｇ／ｍｌ）をＨＵ（１５μＭ）と共に２時間インキュベートし、ＣＤスペクトルを収集した。ＨＵは、ポリ（ｄＧｄＣ）のＣＤスペクトルをＺ−ＤＮＡシグネチャーに向かってシフトさせる。
【００２７】
【図９】図９は、Ｚ−ＤＮＡが、複数のヒト病原体のバイオフィルムＥＰＳ内に存在することを示す。上：一次抗体なし（１°なし）またはＺ−ＤＮＡ抗体（白色）でプローブした、指し示された細菌の４０時間バイオフィルムの免疫蛍光ＣＬＳＭ画像。Ｚ−ＤＮＡは、異なる定常状態レベルにおける複数細菌バイオフィルムのＥＰＳの成分である。下：ＨＵ（白色）およびスペルミジン（暗灰色）抗体でプローブした、指し示されたバイオフィルムの免疫蛍光ＣＬＳＭ画像、共局在は（白色）である。ＤＮＡＢＩＩおよびポリアミン成分は、定常状態レベルにおける複数細菌バイオフィルムのＥＰＳにおいて共局在し、これは、Ｚ−ＤＮＡ存在量と相関する。
【００２８】
【図１０】図１０は、ＵＰＥＣおよびＮＴＨＩバイオフィルムが成熟するにつれて、Ｚ−ＤＮＡおよびポリアミンは存在量が増加することを示す。抗Ｚ−ＤＮＡ（白色）または抗スペルミジン（暗灰色）でプローブした、形成の様々なステージにおけるＵＴＩ８９およびＮＴＨＩ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏバイオフィルムの免疫蛍光ＣＬＳＭ画像。成熟バイオフィルムは、経時的にバイオフィルムＥＰＳ内に、Ｚ−ＤＮＡ（白色）およびスペルミジン（暗灰色）の取り込み量を増加せる。
【００２９】
【図１１】図１１は、ＨＵが、Ｂ−ＤＮＡからＺ−ＤＮＡへの変換、およびバイオフィルムＥＰＳへのポリアミンの取り込みに要求されることを示す。スペルミジン（暗灰色）または抗Ｚ−ＤＮＡ（白色）でプローブした、４０時間ＮＴＨＩ野生型およびΔＨＵ変異体ｉｎ  ｖｉｔｒｏバイオフィルムの免疫蛍光ＣＬＳＭ画像。ＨＵの非存在下で、ポリアミンおよびＺ−ＤＮＡは、バイオフィルムＥＰＳ内で存在量が減少する。
【００３０】
【図１２】図１２は、８ウェルチャンバーのカバーガラススライドにおける補充したＢＨＩ培地において、３７℃および５％ＣＯ２で、分類不能Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅバイオフィルムを４０時間成長させたことを示す。バイオフィルムを洗浄し、指し示された一次抗体、蛍光二次抗体でプローブし（暗灰色のドット）、ＤＡＰＩで染色した（灰色の領域）。留意：下の最左部の画像における最小の暗灰色染色は、バックグラウンドを表す。プトレシン、スペルミジンおよびスペルミンは全て、バイオフィルムマトリックス全体にわたって存在した。
【００３１】
【図１３】図１３は、９６ウェルプレートにおける上に指し示す添加物を含有する補充したＢＨＩ培地において、３７℃および５％ＣＯ２で、分類不能Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅを１６時間成長させたことを示す。４９０ｎｍにおける分光光度計吸光度によって（左）、また、コロニー形成単位の計数によって（右）、成長を定量した。スペルミジンシンターゼ阻害剤は、正常な成長に影響を与えなかった。
【００３２】
【図１４】図１４は、８ウェルチャンバーのカバーガラススライドにおける各バーの下に指し示す添加物を含有する補充したＢＨＩ培地において、３７℃および５％ＣＯ２で、分類不能Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅバイオフィルムを４０時間成長させたことを示す。バイオフィルムを洗浄し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）で染色し、固定し、ＣＬＳＭによって撮像した。ＣＯＭＳＴＡＴソフトウェアを使用して、バイオフィルムパラメーターを定量した。ジシクロヘキシルアミンは、バイオフィルム生物発生を阻害したが、外因性スペルミジンは、バイオフィルム成長をレスキューすることができた。
【００３３】
【図１５】図１５は、８ウェルチャンバーのカバーガラススライドにおける上に指し示す添加物を含有する補充したＢＨＩ培地において、３７℃および５％ＣＯ２で、分類不能Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅバイオフィルムを４０時間成長させたことを示す。バイオフィルムを洗浄し、スペルミジンに対する一次抗体、蛍光二次抗体でプローブし（暗灰色のドット）、ＤＡＰＩで染色した（灰色の領域）。スペルミジンシンターゼ阻害剤は、バイオフィルムマトリックスにおけるスペルミジンの存在を低減した。
【００３４】
【図１６】図１６は、フルオロディッシュ（Ｆｌｕｏｒｏｄｉｓｈ）カバーガラスディッシュにおける上に指し示す添加物を含有する補充したＢＨＩ培地において、３７℃および５％ＣＯ２で、表面付着した分類不能Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅを３時間成長させたことを示す。バイオフィルムを洗浄し、二本鎖ＤＮＡに対する一次抗体および蛍光二次抗体でプローブした（白色）。スペルミジンシンターゼ阻害剤は、バイオフィルムマトリックス内の細胞外ＤＮＡ構造の存在および複雑性の両方を低減させる。
【００３５】
【図１７】図１７Ａ〜図１７Ｄは、スペルミジンが、複数のヒト病原体によって形成されたバイオフィルムＥＰＳ内に存在することを示す。（図１７Ａ）ＨＵ抗体（淡灰白）およびスペルミジン（暗灰色）抗体でプローブした、指し示されたバイオフィルムの免疫蛍光ＣＬＳＭ画像、共局在は白色である。ＤＮＡＢＩＩおよびポリアミン成分は、定常状態レベルにおける複数細菌バイオフィルムのＥＰＳにおいて共局在する。（図１７Ｂ）スペルミジン生合成のジシクロヘキシルアミン（ＤＣＨＡ）阻害は、ＩＦシグナルの減少によって指し示される、ＮＴＨＩおよびＵＰＥＣバイオフィルムにおけるスペルミジンレベルを低減させ、ｓＢＨＩ対照と比較して有意に減少した平均の厚さをもたらす（図１７Ｃ）。ＬＢ対照と比較した平均の厚さのパーセント変化として表されるＵＰＥＣ（図１７Ｄ）。
【００３６】
【図１８】図１８Ａ〜図１８Ｂは、ホスホセルロースが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでバイオフィルム形成および予め形成されたＮＴＨＩバイオフィルムの安定性に用量依存性の負の効果を有することを示す。（図１８Ａ）バイオフィルム成長を開始させ、次いで２４時間維持し、次いで０（ＳＢＨＩ対照）、０．１％、１％および５％（ｗ／ｖ）のホスホセルロース（Ｐｈｏｓｈｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（Ｐ１１）で１６時間処置した。（図１８Ｂ）バイオフィルム成長を開始させ、次いで０（ｓＢＨＩ対照）、０．１％、１％および５％（ｗ／ｖ）の（Ｐ１１）の存在下で４０時間維持した。バイオフィルムを食塩水で洗浄し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）染色剤で染色した。画像をＣＯＭＳＴＡＴによって解析して、平均の厚さおよびバイオマスを計算した。全ての画像は、６３×対物レンズを用いてキャプチャーした。
【００３７】
【図１９】図１９は、ヘパリンセファロースが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＮＴＨＩバイオフィルム形成に負の効果を有することを示す。バイオフィルム成長を開始させ、次いで０（ｓＢＨＩ対照）または５％（ｗ／ｖ）のヘパリンセファロース樹脂の存在下で４０時間維持した。バイオフィルムを食塩水で洗浄し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）染色剤で染色した。画像をＣＯＭＳＴＡＴによって解析して、平均の厚さおよびバイオマスを計算した。全ての画像は、６３×対物レンズを用いてキャプチャーした。
【００３８】
【図２０】図２０は、ＨＵの外因性添加が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＮＴＨＩバイオフィルム安定性におけるホスホセルロースの負の効果をレスキューすることを示す。バイオフィルム成長を開始させ、２４時間維持し、次いで指し示される通りに１６時間処置した。バイオフィルムを食塩水で洗浄し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）染色剤で染色した。画像をＣＯＭＳＴＡＴによって解析して、平均の厚さおよびバイオマスを計算し、ｓＢＨＩ対照と比較した。全ての画像は、６３×対物レンズを用いてキャプチャーした。バーは、ＳＥＭを表す。対照と比較した統計的有意性は、対応のないｔ検定によって評価した、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１。
【００３９】
【図２１】図２１は、ＭｇＣｌ２の外因性添加が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＮＴＨＩバイオフィルム安定性におけるホスホセルロースの負の効果をレスキューすることを示す。バイオフィルム成長を開始させ、２４時間維持し、次いで指し示される通りに１６時間処置した。バイオフィルムを食塩水で洗浄し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）染色剤で染色した。画像をＣＯＭＳＴＡＴによって解析して、平均の厚さおよびバイオマスを計算した。全ての画像は、６３×対物レンズを用いてキャプチャーした。
【００４０】
【図２２】図２２は、スペルミジンの外因性添加が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＮＴＨＩバイオフィルム安定性におけるホスホセルロースの負の効果をレスキューすることを示す。バイオフィルム成長を開始させ、次いで２４時間維持し、次いで指し示される通りに１６時間処置した。バイオフィルムを食塩水で洗浄し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）染色剤で染色した。画像をＣＯＭＳＴＡＴによって解析して、平均の厚さおよびバイオマスを計算した。全ての画像は、６３×対物レンズを用いてキャプチャーした。
【００４１】
【図２３】図２３は、Ｐ１１ホスホセルロースのカチオン枯渇効果が、バイオフィルムとの直接的接触を要求しないことを示す。トランスウェルプレートシステムの基底側チャンバーにおいてバイオフィルム成長を開始させた一方、０、０．５、１または１．５％（ｗ／ｖ）Ｐ１１ホスホセルロースを頂端側チャンバーに添加し、１６時間維持した。バイオフィルムを食塩水で洗浄し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）染色剤で染色した。画像をＣＯＭＳＴＡＴによって解析して、平均の厚さおよびバイオマスを計算し、ｓＢＨＩ対照と比較した。全ての画像は、６３×対物レンズを用いてキャプチャーした。バーは、ＳＥＭを表す。対照と比較した統計的有意性は、対応のないｔ検定によって評価した、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１。
【００４２】
【図２４】図２４は、スペルミジンの外因性添加が、バイオフィルムとの直接的接触を要求することなく、Ｐ１１ホスホセルロースのカチオン枯渇効果を低減させることを示す。トランスウェルプレートシステムの基底チャンバー（ｂａｓａｌ  ｃｈａｍｂｅｒ）においてバイオフィルム成長を開始させた一方、０または１．５％（ｗ／ｖ）Ｐ１１ホスホセルロースを頂端側チャンバーに添加し、１００、５００または１０００ｕＭスペルミジンの存在下で１６時間維持した。バイオフィルムを食塩水で洗浄し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）染色剤で染色した。画像をＣＯＭＳＴＡＴによって解析して、平均の厚さおよびバイオマスを計算し、ｓＢＨＩ対照と比較した。全ての画像は、６３×対物レンズを用いてキャプチャーした。バーは、ＳＥＭを表す。対照と比較した統計的有意性は、対応のないｔ検定によって評価した、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１。角括弧は、条件間の統計的比較を指し示す。
【００４３】
【図２５】図２５は、スペルミジンおよびＤＮＡＢＩＩの外因性添加が、バイオフィルムと直接接触することなしに、Ｐ１１ホスホセルロースのカチオン枯渇効果を低減させることを示す。トランスウェルプレートシステムの基底側チャンバーにおいてバイオフィルム成長を開始させた一方、０または１．５％（ｗ／ｖ）Ｐ１１ホスホセルロースを頂端側チャンバーに添加し、１００ｕＭスペルミジンもしくは５００ｎＭ  ＨＵまたはその組合せの存在下で１６時間維持した。バイオフィルムを食塩水で洗浄し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）染色剤で染色した。画像をＣＯＭＳＴＡＴによって解析して、平均の厚さおよびバイオマスを計算し、ｓＢＨＩ対照と比較した。全ての画像は、６３×対物レンズを用いてキャプチャーした。バーは、ＳＥＭを表す。対照と比較した統計的有意性は、対応のないｔ検定によって評価した、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１。角括弧は、条件間の統計的比較を指し示す。
【００４４】
【図２６】図２６Ａ〜図２６Ｂは、カチオン交換樹脂による非生物的表面のコーティングが、用量依存性様式でバイオフィルム形成を予防することを示す。指し示される通りに、Ｐ１１ホスホセルロース（図２６Ａ）またはヘパリンセファロース（図２６Ｂ）溶液でチャンバースライドをコーティングした。バイオフィルム成長を開始させ、コーティングされたスライド上で４０時間維持した。バイオフィルムを食塩水で洗浄し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）染色剤で染色した。画像をＣＯＭＳＴＡＴによって解析して、平均の厚さおよびバイオマスを計算した。全ての画像は、６３×対物レンズを用いてキャプチャーした。バーは、ＳＥＭを表す。
【００４５】
【図２７】図２７は、成熟バイオフィルムが、ＤＮアーゼによる破壊に対して抵抗性であることを示す。ＤＮアーゼ（プルモザイム；５ユニット）を、播種時に（予防）または２４時間目に（破壊）、それぞれのｉｎ  ｖｉｔｒｏで予め形成されたＮＴＨＩまたはＵＰＥＣバイオフィルムに添加した。総計４０時間後に、バイオフィルムをＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）で染色し、ＣＬＳＭにより可視化し、ＣＯＭＳＴＡＴによって解析した。バーは、ＳＥＭを表す。バイオマスについて、同様の傾向が観察された。対照と比較した統計的有意性は、対応のないｔ検定によって評価した、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１。ＤＮアーゼは、バイオフィルムを予防することができるが、現存するバイオフィルムを破壊しない。
【００４６】
【図２８】図２８は、ＵＰＥＣおよびＮＴＨＩバイオフィルムが成熟するにつれて、Ｚ−ＤＮＡおよびポリアミンは存在量が増加することを示す。抗Ｚ−ＤＮＡ（淡灰白）または抗スペルミジン（暗灰色）でプローブした、成熟化の様々なステージにおけるｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成されたＵＰＥＣおよびＮＴＨＩバイオフィルムの免疫蛍光ＣＬＳＭ画像。成熟バイオフィルムは、経時的にバイオフィルムＥＰＳ内に、Ｚ−ＤＮＡ（淡灰白）およびスペルミジン（暗灰色）の取り込み量を増加せる。
【００４７】
【図２９】図２９は、Ｚ−ＤＮＡが、成熟病原性真菌バイオフィルム中に存在することを示す。ＤＡＰＩにより対比染色され、抗Ｂ−ＤＮＡ、抗Ｚ−ＤＮＡまたは一次抗体なし（ｎｏ  ｐｒｉｍａｒｙ）（淡灰白）でプローブされた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓによって形成されたバイオフィルムの免疫蛍光ＣＬＳＭ画像。成熟真菌バイオフィルムは、バイオフィルムＥＰＳ内にＺ−ＤＮＡ（淡灰白）を取り込む。
【００４８】
【図３０】図３０は、抗Ｚ−ＤＮＡ抗体が、バイオフィルム生物発生を刺激することを示す。抗Ｚ−ＤＮＡ抗体（１ｍｇ）を、播種時にＮＴＨＩ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏバイオフィルムに添加した。１６時間後に、バイオフィルムをＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）で染色し、ＣＬＳＭにより可視化し、ＣＯＭＳＴＡＴによって解析した。バーは、ＳＥＭを表す。バイオマスについて、同様の傾向が観察された。対照と比較した統計的有意性は、対応のあるｔ検定によって評価した。抗Ｚ−ＤＮＡ抗体は、バイオフィルム細胞外マトリックスを安定化し、バイオフィルム生物発生を刺激し、一方、Ｂ−ＤＮＡに対する抗体（例えば、抗ｄｓＤＮＡ）は、バイオフィルム生物発生を刺激しない。
【００４９】
【図３１】図３１は、ＤＮアーゼが、バイオフィルム細胞外マトリックス内で、Ｂ−ＤＮＡを分解するが、Ｚ−ＤＮＡを分解しないことを示す。ＤＮアーゼ（プルモザイム；５ユニット）をバイオフィルム播種後２４時間目に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで予め形成されたＮＴＨＩバイオフィルムに添加した。総計４０時間後に、バイオフィルムを、抗Ｚ−ＤＮＡで、抗Ｂ−ＤＮＡで、または一次抗体なしでプローブし、これは、対応する二次蛍光抗体の使用により明らかにされ、ＣＬＳＭにより可視化された。ＤＮアーゼ処置は、バイオフィルム細胞外マトリックス内で、Ｂ−ＤＮＡ形態のｅＤＮＡ構造を分解するが、大規模なＺ−ＤＮＡ形態のｅＤＮＡを明らかにする。
【００５０】
【図３２】図３２は、Ｚ−ＤＮＡ形成が、ヌクレアーゼ分解からＤＮＡを保護することを示す。ポリ（ｄＧ−ｄＣ）基質を、上に指し示される通り、漸増濃度のＮａＣｌ、スペルミンまたはスペルミジンにおいて、塩活性化ヌクレアーゼ（ＳＡＮ）またはＤＮアーゼ  Ｉと共にインキュベートした。分解産物をゲル電気泳動によって可視化した。高塩およびポリアミンは、Ｚ−ＤＮＡ形態への変換により、分解からＤＮＡを保護する。
【００５１】
【図３３】図３３は、ＤＮＡＢＩＩタンパク質およびポリアミンが、バイオフィルム細胞外マトリックス内に共局在することを示す。８ウェルチャンバーのカバーガラススライドにおける補充したＢＨＩ培地において、３７℃および５％ＣＯ２で、分類不能Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅバイオフィルムを成長させた。バイオフィルムを洗浄し、ＤＮＡＢＩＩタンパク質（淡灰白）またはポリアミン（暗灰色）に対する一次抗体、蛍光二次抗体でプローブし、ＤＡＰＩで染色し（灰色の領域）、蛍光顕微鏡法により可視化した。ポリアミンは、バイオフィルムマトリックスにおいて、ＨＵと共局在するが、ＩＨＦとは共局在しない。ＨＵを産生することができないＮＴＨＩ株は、バイオフィルムマトリックスにおけるポリアミンの低減した蓄積を有した。ＤＮＡＢＩＩタンパク質およびポリアミンは相互作用して、バイオフィルム細胞外マトリックスを安定化する。
【００５２】
【図３４】図３４Ａ〜図３４Ｂは、ＤＮＡＢＩＩタンパク質が、Ｚ−ＤＮＡ形態にシフトさせることによりＤＮＡを保護することを示す。（図３４Ａ）ポリ（ｄＧ−ｄＣ）基質を、上に指し示される通り、漸増濃度のＮＴＨｉ  ＨＵにおいてＤＮアーゼ  Ｉと共にインキュベートした。分解産物をゲル電気泳動によって可視化した。ＨＵは、分解からＤＮＡを保護した。（図３４Ｂ）上：漸増濃度のＺ−ＤＮＡ触媒によってＺ−ＤＮＡに変換されるＢ−ＤＮＡ基質の円二色性スペクトル（Ｒａｈｍｏｕｎｉ  （１９９２）  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６（５）：５６９−７２から適応）。２５０ｎｍ前後の負のピークおよび２８０ｎｍ前後の正のピークの反転に留意されたい。下：ポリ（ｄＧｄＣ）ＤＮＡ（５μｇ）をＨＵ（１５μＭ）と共に２時間インキュベートし、ＣＤスペクトルを収集した。ＨＵは、ポリ（ｄＧｄＣ）のＣＤスペクトルをＺ−ＤＮＡシグネチャーに向かってシフトさせる。
【００５３】
【図３５】図３５Ａ〜図３５Ｄは、ＤＮＡＢＩＩタンパク質およびポリアミン（ＰＡ）が相乗的に相互作用して、ＤＮアーゼ抵抗性を誘導することを示す。（図３５Ａ）漸増レベルのスペルミジン（Ｓｐｄ）およびＨＵを、別々にまたは一緒に、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ；２μｇ／ｍｌ）と共に１．５時間３７℃でインキュベートし、続いて、プルモザイム（登録商標）で２０分間処置した。アガロースゲル電気泳動を使用して、ＤＮＡ分解をアッセイした。ＳｐｄおよびＨＵは、ＤＮアーゼ消化からゲノムＤＮＡを相乗的に保護する。（図３５Ｂ）Ｓｐｄ（３００μＭ）およびＨＵ（１μＭ）を、ゲノムＤＮＡ（２μｇ／ｍｌ）と共に４０時間インキュベートし、続いて２０分間のプルモザイム（登録商標）処置を行った。構造をＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）で染色し、ＣＬＳＭによって撮像した（白色）。（図３５Ｃ）ＮＴＨＩによる実験的ＯＭを有するチンチラ中耳に見出される粘膜バイオフィルムＥＰＳの免疫蛍光ＣＬＳＭ画像。プトレシン（暗灰色）およびＨＵ（淡灰白）についてプローブし、ＤＡＰＩにより対比染色した（灰色）。ＨＵ−Ｓｐｄ依存性ＤＮＡ構造は、ＤＮアーゼ処置に対して抵抗性である。ポリアミンおよびＤＮＡＢＩＩタンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏでバイオフィルム中のｅＤＮＡ鎖上に共局在する（白色）。（図３５Ｄ）：漸増濃度のＤＮアーゼを、播種時に（予防）または２４時間目に（破壊）、ＮＴＨＩまたはＵＰＥＣバイオフィルムに１６時間添加した。バイオフィルムを染色し、固定し、ＣＬＳＭにより可視化し、ＣＯＭＳＴＡＴによって解析した。バーは、ＳＥＭを表す。対照（ＤＮアーゼなし）と比較した統計的有意性を対応のないｔ検定によって評価した、＊＊Ｐ＜０．０１。ＤＮアーゼは、バイオフィルムの形成を予防することができるが、現存するバイオフィルムを破壊しない。
【００５４】
【図３６】図３６は、Ｚ−ＤＮＡが、複数のヒト病原体のバイオフィルムＥＰＳ内に存在することを示す。上：一次抗体なし（１°なし）またはＺ−ＤＮＡ特異的抗体（淡灰白）のいずれかでプローブされた、指し示された細菌によって形成された４０時間バイオフィルムの免疫蛍光ＣＬＳＭ画像。Ｚ−ＤＮＡは、異なる定常状態レベルにおける複数細菌バイオフィルムのＥＰＳの成分である。下：ＨＵ（淡灰白）およびスペルミジン（暗灰色）抗体でプローブした、指し示されたバイオフィルムの免疫蛍光ＣＬＳＭ画像、共局在は（白色）である。ＤＮＡＢＩＩおよびポリアミン成分は、定常状態レベルにおける複数細菌バイオフィルムのＥＰＳにおいて共局在し、これは、Ｚ−ＤＮＡ存在量と相関する。
【００５５】
【図３７】図３７は、ＨＭＧＢ１が、バイオフィルム細胞外マトリックス中のＺ−ＤＮＡ構造を不安定化することを示す。８ウェルチャンバーのカバーガラススライドにおける補充したＢＨＩ培地において、３７℃および５％ＣＯ２で、分類不能Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅバイオフィルムを成長させた。２４時間後に、上に指し示される通り、バイオフィルムを処置した。４０時間後に、バイオフィルムを洗浄し、Ｚ−ＤＮＡに対する一次抗体（淡灰白のドット）、蛍光二次抗体でプローブし、ＤＡＰＩで染色し（灰色の領域）、蛍光顕微鏡法により可視化した。ＨＭＧＢ１処置は、バイオフィルムマトリックス中のＺ−ＤＮＡ構造を低減させた。
【００５６】
【図３８】図３８Ａ〜図３８Ｃは、ＨＭＧＢ１が、ＤＮＡＢＩＩタンパク質を押しのけ、これによりＮＴＨＩバイオフィルムを破壊することを示す。８ウェルチャンバーのカバーガラススライドにおける補充したＢＨＩ培地において、３７℃および５％ＣＯ２で、分類不能Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅバイオフィルムを成長させた。２４時間後に、指し示される通りにバイオフィルムを処置した。（図３８Ａ）４０時間後に、バイオフィルムを洗浄し、ＤＮＡＢＩＩタンパク質に対する一次抗体（淡灰白のドット）、蛍光二次抗体でプローブし、ＤＡＰＩで染色し（灰色の領域）、蛍光顕微鏡法により可視化した。（図３８Ｂ）バイオフィルム培養物から培地を収集し、ＤＮＡＢＩＩタンパク質を認識する一次抗体を用いたウエスタンブロットにより解析した。ＨＭＧＢ１処置は、バイオフィルムマトリックスからＤＮＡＢＩＩタンパク質を押しのけた。（図３８Ｃ）ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）で染色し、５ｍｇ／ｍＬ  ＨＭＧＢ１による処置後に共焦点顕微鏡で可視化した、ＣＯＭＳＴＡＴ定量ＮＴＨＩバイオフィルム。ＨＭＧＢ１は、ＤＮＡＢＩＩタンパク質を押しのけることにより、バイオフィルムを破壊する。
【００５７】
【図３９】図３９Ａ〜図３９Ｂは、ＨＭＧＢ１が、ＯＭの実験的モデル（チンチラ宿主）におけるバイオフィルム溶解を促進することを示す。ＮＴＨＩ感染後４および５日目に、希釈剤または５μｇ  ｒＨＭＧＢ１もしくはｍＨＭＧＢ１を、チンチラの中耳に直接的に送達した。動物を２４時間後に屠殺し、その中耳を撮像し（図３９Ａ）、（図３９Ａ）の下に記載されている基準に基づき、盲検的にスコアリングした（図３９Ｂ）。バーは、ＳＥＭを表す。＊＊＊Ｐ＜０．００１。画像およびスコアリングは、ＨＭＧＢ１が、ｉｎ  ｓｉｔｕで既存のＮＴＨＩバイオフィルムのクリアランスを促進したことを実証する。
【００５８】
【図４０】図４０Ａ〜図４０Ｃは、ＨＭＧＢ１が、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａバイオフィルムを破壊することを示す。（図４０Ａ）８ウェルチャンバーのカバーガラススライドにおけるＬＢ培地において、３７℃および５％ＣＯ２で、Ｂ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａバイオフィルムを成長させた。２４時間後に、バイオフィルムを５ｍｇ／ｍＬ  ＨＭＧＢ１で処置した。総計４０時間後に、バイオフィルムをＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）で染色し、ＣＬＳＭにより可視化し、ＣＯＭＳＴＡＴによって解析した。バーは、ＳＥＭを表す。（図４０Ｂ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１０７  ＣＦＵ  ｉ．ｔ．を感染させ、同時に、５ｍｇ  ｒＨＭＧＢ１またはｍＨＭＧＢ１、Ｃ４５Ｓ非炎症性バリアントを与えた。Ｂ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａの凝集物は、α−Ｂ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ抗体でプローブした切片において、蛍光顕微鏡法によって見ることができた（灰色）。１８時間後に、（図４０Ｃ）ＢＡＬにおいてＣＦＵを定量した。バーは、ＳＤを表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１。ＨＭＧＢ１処置は、ｉｎ  ｓｉｔｕでＢ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａバイオフィルムを有意に破壊する。
【００５９】
【図４１】図４１は、ＨＭＧＢ１が、ポリアミン誘導性Ｚ−ＤＮＡをヌクレアーゼ感受性Ｂ−ＤＮＡ状態に戻すことを示す。ポリ（ｄＧ−ｄＣ）基質を、スペルミジンおよびＨＭＧＢ１と共にインキュベートした。分解産物をゲル電気泳動によって可視化した。ＨＭＧＢ１処置は、スペルミジン誘導性Ｚ−ＤＮＡ基質に対するヌクレアーゼ感受性を回復させた。
【００６０】
【図４２】図４２Ａ〜図４２Ｄは、ＤＮＡＢＩＩタンパク質およびポリアミンの両方が、カチオン交換体（Ｐ１１）媒介性バイオフィルム予防をレスキューするために必要とされることを示す。（図４２Ａ）トランスウェルプレートシステムの基底側チャンバーにおける３７℃、５％ＣＯ２で、ＮＴＨＩバイオフィルム成長を開始させ、一方、Ｐ１１樹脂を頂端側チャンバーに添加し、１６時間インキュベートした。（図４２Ｂ）バイオフィルムを染色し、固定し、ＣＬＳＭにより可視化し、ＣＯＭＳＴＡＴによって解析した。バーは、ＳＥＭを表す。対照（Ｐ１１なし）と比較した統計的有意性を対応のないｔ検定によって評価した、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。（図４２Ｃ）スペルミジン（Ｓｐｄ、３００μＭ）およびＨＵ（５００ｎＭ）を、播種時に添加した。（図４２Ｂ）と同様にバイオフィルムを定量した。対照（Ｐ１１なし）と比較して、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１および＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。（図４２Ｄ）（図４２Ｃ）において定量された条件において形成されたバイオフィルムの代表的な画像、平均バイオマスを右上に示す。Ｐ１１添加は、用量依存性様式でバイオフィルム形成を予防する。外因性スペルミジンおよびＨＵは一緒にバイオフィルム発達を回復させるが、いずれか単独では回復させず、このことは、Ｐ１１抗バイオフィルム活性が、直接の接触なしで、バイオフィルムＥＰＳから離れた、構造成分（ポリアミン、ＤＮＡＢＩＩタンパク質）の滴定の結果であることを示唆する。
【００６１】
【図４３】図４３Ａ〜図４３Ｂは、Ｂ−ＤＮＡ抗体およびＺ−ＤＮＡ抗体の特異性を示す。（図４３Ａ）臭素化ゲノムＤＮＡ（２μｇ／ｍＬ）およびポリｄＧｄＣを緩衝液中でインキュベートし、２６０ｎｍおよび２９５ｎｍにおける吸光度の値を測定し、Ａ２６０／２９５比を計算した。比＞８．６は、Ｂ−ＤＮＡ（暗灰色）を指し示すが、３．２付近の値は、Ｚ−ＤＮＡ（白色）を指し示す。（図４３Ｂ）ＥＬＩＳＡプレートを１μｇのポリｄＧｄＣ（Ｂ−ＤＮＡ）または臭素化ポリｄＧｄＣでコーティングし（Ｚ−ＤＮＡ、Ｈｉｎｄｌｅｒ  ａｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ５１（６）：１６７８−８４．）、続いて０．５％ＢＳＡでブロッキングした。次に、ウェルをマウス（ｍｓ）ＩｇＧ１（陰性対照）、マウス抗Ｂ−ＤＮＡまたはマウス抗Ｚ−ＤＮＡでプローブし、二次ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰで検出した。ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）は、ＨＲＰ検出に使用される比色分析基質であった（暗灰色ウェル）。抗Ｂ抗体および抗Ｚ抗体は、それぞれのＤＮＡ形態に特異的であった。
【００６２】
【図４４】図４４は、ＤＮＡＢＩＩタンパク質、ポリアミンおよびｅＤＮＡ（Ｂ−ＤＮＡおよびＺ−ＤＮＡ）が、ＮＴＨＩバイオフィルムのＥＰＳ内に経時的に着実に蓄積することを示す。抗Ｂ−ＤＮＡ抗体（淡灰白；左から１番目）、抗抗スペルミジン（ａｎｔｉ−  ａｎｔｉ−ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）（淡灰白；左から２番目）、抗ＤＮＡＢＩＩ（灰色；左から３番目）または抗Ｚ−ＤＮＡ（白色；左（ｅｌｆｔ）から４番目）でプローブされた、形成の様々なステージにおけるＮＴＨＩバイオフィルムの免疫蛍光ＣＬＳＭ画像。成熟バイオフィルムは、時間の経過と共にＥＰＳ内への各ＴＥＤＳ成分の取り込み量を増加させる。
【００６３】
【図４５】図４５は、ポリアミンおよびＤＮＡＢＩＩタンパク質が、ＤＮアーゼ抵抗性であるＺ−ＤＮＡを刺激することを示す。精製されたゲノムＤＮＡ（２μｇ／ｍｌ）へのＤＮＡＢＩＩタンパク質（ＨＵＮＴＨＩ、５００ｎＭ）およびスペルミジン（３００μＭ）の添加、ならびに３７℃で１６時間のインキュベーションによってｄｅ  ｎｏｖｏ形成された、ＥＰＳスキャフォールド模倣物の免疫蛍光画像。バイオフィルムスキャフォールド模倣物をプルモザイム（登録商標）（ＤＮアーゼ、５Ｕ／ｍｌ）と共に１時間インキュベートし、次いでＢ−ＤＮＡ（暗灰色）およびＺ−ＤＮＡ（白色）についてプローブした。スケールバー１０μｍ。Ｂ−ＤＮＡおよびＺ−ＤＮＡは、模倣物構造内に観察され、ＤＮアーゼ添加は、Ｂ−ＤＮＡを選択的に排除した一方で、Ｚ−ＤＮＡはインタクトなままであった。よって、ポリアミンおよびＤＮＡＢＩＩタンパク質は、Ｂ−ＤＮＡからＺ−ＤＮＡへのｅＤＮＡの変換によって、ＤＮアーゼ抵抗性状況を誘導することができる。
【００６４】
【図４６】図４６は、ＴＥＤＳおよびＺ−ＤＮＡが、複数のヒト病原体によって形成されたバイオフィルムＥＰＳ内に存在することを示す。（Ａ）上：未処理（ｎａｉｖｅ）または抗ＨＵ（灰色）および抗スペルミジン（Ｓｐｄ、淡灰白）抗体でプローブした、指し示されたバイオフィルムの免疫蛍光ＣＬＳＭ画像、共局在は白色である。下：未処理または抗Ｂ−ＤＮＡ（暗灰色）および抗Ｚ−ＤＮＡ抗体（白色）でプローブした、指し示された細菌の４０時間形成されたバイオフィルムの免疫蛍光ＣＬＳＭ画像。十分に特徴付けされたＺ−ＤＮＡ特異的モノクローナル抗体（クローンＺ２２、Ｈｅｙｄｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  ＣＯＭＳＴＡＴ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ；  １４６；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７）  Ｐａｅｄｉａｔｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｒｅｖ．  ２１：６５−７；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ；  ２１（８）．）を使用して、Ｚ−ＤＮＡを検出した。ＤＮＡＢＩＩ、ポリアミン、Ｚ−ＤＮＡおよびＢ−ＤＮＡ成分は全て、複数細菌バイオフィルムのＥＰＳ中に存在する。Ｚ−ＤＮＡは、異なる定常状態レベルにおける複数細菌バイオフィルムのＥＰＳの不可欠な部分である。
【００６５】
【図４７】図４７Ａ〜図４７Ｂは、Ｚ−ＤＮＡが、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏ試料中に存在することを示す。左：（図４７Ａ）実験的ＮＴＨＩ誘発ＯＭ中のＮＴＨＩバイオフィルムおよび（図４７Ｂ）嚢胞性線維症患者由来の痰内のＺ−ＤＮＡ（白色）およびＢ−ＤＮＡ（暗灰色）。挿入図、陰性対照。スケールバー１０μｍ。右：（図４７Ａ）実験的ＮＴＨＩ誘発ＯＭ中のＮＴＨＩバイオフィルムおよび（図４７Ｂ）嚢胞性線維症患者由来の痰内のＤＮＡＢＩＩタンパク質（灰色）およびスペルミジン（Ｓｐｄ、淡灰白）。挿入図、陰性対照。スケールバー１０μｍ。ＤＮＡＢＩＩ、ポリアミン、Ｚ−ＤＮＡおよびＢ−ＤＮＡ成分は全て、ＮＴＨＩバイオフィルムに感染したチンチラ中耳の切片内に存在する。Ｚ−ＤＮＡは、異なる定常状態レベルにおける複数細菌バイオフィルムのＥＰＳの不可欠な部分である。
【００６６】
【図４８】図４８Ａ〜図４８Ｂは、バイオフィルム中のＺ−ＤＮＡが、ヌクレアーゼ抵抗性スキャフォールドを形成することを示す。（図４８Ａ）指し示された細菌（Ｋｐ＝Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）によって２４時間形成されたバイオフィルムを、ＤＮアーゼ（プルモザイム（登録商標）；４０Ｕ／ｍｌ）と共にさらに１６時間インキュベートした。次に、バイオフィルムを抗Ｂ−ＤＮＡ（暗灰色）および抗Ｚ−ＤＮＡ（白色）抗体でプローブし、細菌細胞膜染色剤ＦＭ４−６４（商標）で対比染色した（図示せず）。（図４８Ｂ）ＩｍａｇｅＪを使用して、ＤＮアーゼの非存在下での蛍光強度（対照）で割った、ＤＮアーゼ添加後のＢ−ＤＮＡまたはＺ−ＤＮＡの蛍光強度の比の計算によって、Ｂ−ＤＮＡまたはＺ−ＤＮＡの存在量の変化を定量した。ＦＭ４−６４（商標）染色細胞の蛍光シグナルに対して、蛍光強度を正規化した。バーは、ＳＥＭを表す。対照（ＤＮアーゼなし、点線）と比較した統計的有意性を、対応のあるｔ検定によって評価した、＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。Ｂ−ＤＮＡは、ＤＮアーゼによって分解されるが、Ｚ−ＤＮＡは抵抗性であり、バイオフィルムＥＰＳの構造的統合性を維持するように機能する。
【００６７】
【図４９】図４９は、Ｚ−ＤＮＡ安定化が、バイオフィルム形成を刺激することを示す。１６時間の未処理または抗Ｚ−ＤＮＡ抗体（５ｍｇ／ｍｌ）の存在下において、ＮＴＨＩおよびＵＰＥＣバイオフィルム成長を開始させた。バイオフィルムを染色し、固定し、ＣＬＳＭにより可視化し、ＣＯＭＳＴＡＴによって解析した。バーは、ＳＥＭを表す。対照（抗体なし）と比較した統計的有意性を、対応のあるｔ検定によって評価した、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。抗Ｚ−ＤＮＡ抗体は、用量依存性様式でバイオフィルム形成を刺激し、一方、未処理抗体は刺激しない。
【００６８】
【図５０】図５０Ａ〜図５０Ｂは、Ｂ−ＤＮＡからＺ−ＤＮＡへの変換の平衡シフトが、バイオフィルム形成を変更することを示す。２４時間形成されたＮＴＨＩバイオフィルムを、塩化セリウム（ＣｅＣｌ３）またはクロロキンと共にさらに１６時間インキュベートし、免疫蛍光ＣＬＳＭによって未処理または抗Ｚ−ＤＮＡ（白色）でプローブした。（図５０Ａ）ＮＴＨＩバイオフィルムの代表的な画像は、１ｍＭ  ＣｅＣｌ３の添加後にＺ−ＤＮＡ存在量の増加を指し示した。（図５０Ｂ）ＮＴＨＩバイオフィルムの代表的な画像は、１μＭクロロキンの添加後にＺ−ＤＮＡ存在量の減少を指し示した。
【００６９】
【図５１】図５１Ａ〜図５１Ｂは、Ｂ−ＤＮＡからＺ−ＤＮＡへの変換の平衡シフトが、バイオフィルム形成を変更することを示す。２４時間形成されたＮＴＨＩバイオフィルムを、塩化セリウム（ＣｅＣｌ３）（図５１Ａ）またはクロロキン（図５１Ｂ）と共にさらに１６時間インキュベートした。抗Ｚ−ＤＮＡを使用したＩＦおよびＣＬＳＭによってＺ−ＤＮＡを測定し、細胞を膜染色剤ＦＭ４−６４で染色した。バーは、ＳＥＭを表す。対照と比較した統計的有意性は、対応のあるｔ検定によって評価した、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。ＣｅＣｌ３は、Ｚ−ＤＮＡおよびバイオフィルム形成を増加させ、一方、クロロキンは、Ｚ−ＤＮＡおよびバイオフィルム発達を低減させた。
【００７０】
【図５２】図５２Ａ〜図５２Ｂは、ＲＮＡホメオスタシスが、細菌バイオフィルム発達をモジュレートすることを示す。（図５２Ａ）１６時間のＲＮアーゼ  Ａの存在下において、ＮＴＨＩバイオフィルム成長を開始させた。バイオフィルムを染色し、固定し、ＣＬＳＭにより可視化し、ＣＯＭＳＴＡＴによって解析した。ＲＮアーゼ  Ａの添加は、おそらくは、Ｂ−ＤＮＡからＺ−ＤＮＡへの細胞外変換のための決定的な触媒であるポリアミンの放出によって、用量依存性様式でバイオフィルム形成を刺激した。（図５２Ｂ）１６時間形成されたＮＴＨＩバイオフィルムをｔＲＮＡと共にインキュベートし、（図５２Ａ）と同様に解析した。グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）を陰性対照とした。バーは、ＳＥＭを表す。対照（ＲＮアーゼ  ＡまたはｔＲＮＡ／ＧＭＰなし）と比較した統計的有意性を対応ｔのある検定によって評価した、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。ｔＲＮＡ（ＧＭＰではない）の添加は、おそらくは、バイオフィルムＥＰＳからのポリアミンの除去（ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ）によって、用量依存性様式で初期ＮＴＨＩバイオフィルムを破壊した。
【００７１】
【図５３】図５３は、ＤＮＡＢＩＩおよびポリアミンが相乗作用して、Ｂ−ＤＮＡからＺ−ＤＮＡに変換（ｃｏｖｅｒｔ）することを示す。一態様では、ＤＮアーゼの非存在下で、作用物質が投与される。左：ゲノムＤＮＡ（２μｇ／ｍＬ）を、スペルミジン（ｓｐｄ：３００μＭ）、ＨＵ（５００ｎＭ）、ｓｐｄおよびＨＵの両方の組合せと共に２時間３７℃でインキュベートした。３．６Ｍ  ＮａＣｌとｇＤＮＡとのインキュベーションを陽性Ｚ−ＤＮＡ対照として使用した。中央：ｇＤＮＡ（２μｇ／ｍＬ）を、Ｚ−ＤＮＡを誘導することが公知である、漸増濃度の塩化セリウム（ＣｅＣｌ３）と共にインキュベートした。右：ポリ（ｄＧｄＣ）（１μｇ）を、ＮａＣｌ（３．６Ｍ）、クロロキン（１００μＭ）、またはＮａＣｌおよびクロロキンの両方の組合せのいずれかと共にインキュベートした。クロロキンは、Ｂ−ＤＮＡからＺ−ＤＮＡへの移行を予防する。２６０ｎｍおよび２９５ｎｍにおける吸光度の値を測定し、Ａ２６０／２９５比を計算した。比＞８．６は、Ｂ−ＤＮＡを指し示す一方、３．２付近の値は、Ｚ−ＤＮＡを指し示す。十分に確立および検証された分光学的吸光度比アッセイに合致して、ＤＮＡＢＩＩおよびポリアミンと共にＣｅＣｌ３は相乗作用して、Ｚ−ＤＮＡを誘導した一方で、クロロキンは、Ｚ−ＤＮＡ変換を予防した。
【発明を実施するための形態】
【００７２】
別に定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で提供される全てのヌクレオチド配列は、５’〜３’方向で示される。本明細書で説明する方法および材料と類似または等価の任意の方法および材料は、本開示の実施または試験において使用することができるが、特定の非限定的な例示的方法、デバイスおよび材料をここで説明する。本明細書で引用する全ての技術出版物および特許出版物は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書中のいずれも、先行発明によって、本開示がそのような開示を先行するものとする権利を与えられないことの承認として解釈されるべきではない。
【００７３】
本開示の実施は、別に示されない限り、当該技術分野の技術の範囲内である組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学および組換えＤＮＡの従来技術を使用する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｄｓ，  （２００１）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ；叢書Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．  （２００７）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；叢書Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎ．Ｙ．）；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  ＰＣＲ  １：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  ＰＣＲ  ２：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  ｅｄｓ．  （１９９９）  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ  （２００５）  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，  ５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｇａｉｔ  ｅｄ．  （１９８４）  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；米国特許第４，６８３，１９５号；Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．  （１９８４）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ａｎｄｅｒｓｏｎ  （１９９９）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．  （１９８４）  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  （ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８６））；Ｐｅｒｂａｌ  （１９８４）  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ，  （１９８７）  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍａｋｒｉｄｅｓ  ｅｄ．  （２００３）  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ；Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄｓ．  （１９８７）  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌｏｎｄｏｎ）；およびＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ  （１９９６）  Ｗｅｉｒ’ｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙを参照されたい。
【００７４】
範囲を含む全ての数字表示、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度および分子量は、適宜１．０または０．１の増分で、またはあるいは＋／−１５％、またはあるいは１０％、またはあるいは５％、またはあるいは２％の変動で（＋）または（−）に変動する近似値である。必ずしも明白に示されていないが、全ての数字表示に、「約」という用語が先行することが理解されるべきである。また、必ずしも明白に示されていないが、本明細書で説明する試薬は単に例示であり、かつそのようなものの等価物は当該技術分野で公知であることが理解されるべきである。
【００７５】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別のように規定しない限り、複数の指示物を含む。例えば、「ポリペプチド（ａ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」という用語は、その混合物を含む複数のポリペプチドを含む。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、組成物および方法が、列挙される要素を含むが、その他のものを除外しないことを意味すると意図される。「〜から本質的になる」は、組成物および方法を定義するために使用される場合、意図される使用のための組合せにとって任意の本質的に重要な他の要素を除外することを意味する。したがって、本明細書で定義する要素から本質的になる組成物は、単離および精製方法からの微量夾雑物、および薬学的に許容される担体、例えば、リン酸緩衝食塩水、保存剤等を除外しない。「〜からなる」は、他の成分および本明細書で開示する組成物を投与するための実質的な方法ステップの微量要素より多くのものを除外することを意味する。これらの遷移用語の各々によって定義される実施形態は、本開示の範囲内である。
【００７７】
「バイオフィルム」とは、微生物が分泌および／または放出するＤＮＡ等の高分子と共に、有機または無機であり得る構造表面に付着することもある、組織化された微生物群集を意図する。バイオフィルムは、マイクロバイオティクス（ｍｉｃｒｏｂｉｏｔｉｃｓ）および抗微生物剤に非常に抵抗性である。それらは、歯肉組織、歯および修復物上で生存し、歯周プラーク疾患としても公知の、う歯および歯周病を引き起こす。また、それらは、慢性中耳感染を引き起こす。また、バイオフィルムは、歯科インプラント、ステント、カテーテル系およびコンタクトレンズの表面上に形成し得る。それらは、ペースメーカー、心臓弁置換物、人工関節および他の外科的インプラント上で生育する。疾病管理センター（Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）は、院内（病院内で獲得される）感染の６５％より多くが、バイオフィルムによって引き起こされると見積もっている。それらは、慢性膣感染を引き起こし、免疫系が妨げられている人々において生命を脅かす全身性感染をもたらす。また、バイオフィルムは、多くの疾患に関与する。例えば、嚢胞性線維症患者は、多くの場合抗生物質抵抗性バイオフィルムをもたらすＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ感染を有する。
【００７８】
「阻害すること、競合することまたは滴定すること」という用語は、微生物バイオフィルムの構成成分であるＤＮＡ／タンパク質マトリックスの形成の低減を意図する。
【００７９】
「ＤＮＡＢＩＩポリペプチドまたはタンパク質」は、ＤＮＡ結合ドメインからなり、したがって、微生物ＤＮＡについて特異的または一般的親和性を有するＤＮＡ結合タンパク質またはポリペプチドを意図する。一態様では、それらは、ＤＮＡの副溝（ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｖｅ）に結合する。ＤＮＡＢＩＩタンパク質の非限定的な例は、組込み宿主因子（ＩＨＦ：ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｈｏｓｔ  ｆａｃｔｏｒ）タンパク質およびＥ．  ｃｏｌｉ株Ｕ９３からのヒストン様タンパク質（ＨＵ：ｈｉｓｔｏｎｅ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｅ．  ｃｏｌｉ  ｓｔｒａｉｎ  Ｕ９３）である。バイオフィルムと関連付けられ得る他のＤＮＡ結合タンパク質には、ＤＰＳ（ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）アクセッション番号ＣＡＡ４９１６９）、Ｈ−ＮＳ（ジェンバンクアクセッション番号ＣＡＡ４７７４０）、Ｈｆｑ（ジェンバンクアクセッション番号ＡＣＥ６３２５６）、ＣｂｐＡ（ジェンバンクアクセッション番号ＢＡＡ０３９５０）およびＣｂｐＢ（ジェンバンクアクセッション番号ＮＰ＿４１８８１３）が含まれる。
【００８０】
「組込み宿主因子」または（ｏｆ）「ＩＨＦ」タンパク質は、バクテリオファージによってそれらのＤＮＡを宿主細菌に組み込むために使用される細菌タンパク質である。また、それらは、細胞外微生物ＤＮＡに結合する。Ｅ．  ｃｏｌｉにおいてＩＨＦタンパク質サブユニットをコードする遺伝子は、ｈｉｍＡ（ジェンバンクアクセッション番号ＰＯＡ６Ｘ７．１）およびｈｉｍＤ（ＰＯＡ６Ｙ１．１）遺伝子である。これらの遺伝子のホモログは他の生物において発見されており、他の生物からのこれらの遺伝子に対応するペプチドは当該技術分野で、例えば、米国特許第８，９９９，２９１号の表１０で開示されている。
【００８１】
「ＨＭＧＢ１」は、ＤＮＡの副溝に結合し、これを歪めると報告されており、かつ作用物質の一例である高移動度群ボックス（ＨＭＧＢ：ｈｉｇｈ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ  ｂｏｘ）１タンパク質である。組換えまたは単離されたタンパク質およびポリペプチドは、Ａｔｇｅｎｇｌｏｂａｌ、ＰｒｏＳｐｅｃＢｉｏ、Ｐｒｏｔｅｉｎ１およびＡｂｎｏｖａから市販されている。ＨＭＧＢ１は、３つのドメイン：各々が８０個のアミノ酸から構成される２つの正荷電ドメインＡおよびＢボックス、ならびに約３０個の連続アスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基からなる負荷電カルボシル末端酸性Ｃ尾部からなる２１５個のアミノ酸タンパク質（約３０Ｋｄａ）の小タンパク質である。野生型ＨＭＧＢ１のポリペプチド配列の非限定的な例を、以下に示す。
【化１】
2021529180.tif 000003
太字のアミノ酸（アミノ酸１〜７０）は、Ａボックスドメインを表す。
イタリック体のアミノ酸（アミノ酸８８〜１６４）は、Ｂボックスドメインを表す。
下線のアミノ酸（アミノ酸１８６〜２１５）は、Ｃ尾部ドメインを表す。これらは、断片、例えば、Ａボックスドメイン、Ｂボックスドメイン、ＡおよびＢボックスドメイン（ＡＢボックスドメイン）、Ｃ尾部ドメインおよびＮドメイン（アミノ酸１〜１８５）の非限定的な例である。一態様では、断片は、Ｃ末端ドメイン、またはＢボックスドメインを含むポリペプチドから本質的になる。
【００８２】
「ＨＵ」または「Ｅ．  ｃｏｌｉ株Ｕ９３からのヒストン様タンパク質」とは、典型的にＥ．  ｃｏｌｉに付随するあるクラスのヘテロ二量体タンパク質を指す。ＨＵタンパク質は、ＤＮＡ接合部に結合することが公知である。関連タンパク質が、他の微生物から単離されている。Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＨＵの完全なアミノ酸配列は、Ｌａｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８０）  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １０３（３）４４７−４８１によって報告された。ＨＵタンパク質に対する抗体は、Ａｂｅａｍから市販されている。
【００８３】
「表面抗原」または「表面タンパク質」という用語は、細胞、例えば、細菌細胞の表面上のタンパク質またはペプチドを指す。表面抗原の例は、外膜タンパク質、例えば、ＯＭＰ  Ｐ５（ジェンバンクアクセッション番号ＹＰ＿００４１３９０７９．１）、ＯＭＰ  Ｐ２（ジェンバンクアクセッション番号ＺＺＸ８７１９９．１）、ＯＭＰ  Ｐ２６（ジェンバンクアクセッション番号ＹＰ＿６６５０９１．１）、ｒｓＰｉｌＡまたは組換え可溶型ＰｉｌＡ（ジェンバンクアクセッション番号ＥＦＵ９６７３４．１）およびＩＶ型Ｐｉｌｉｎ（ジェンバンクアクセッション番号Ｙｐ＿００３８６４３５１．１）である。
【００８４】
「Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ」という用語は、多くの様々な感染症、例えば、耳感染症、眼感染症および副鼻腔炎等を引き起こし得る病原性細菌を指す。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの多くの様々な株が単離されており、ＩｈｆＡ遺伝子またはタンパク質を有する。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの様々な株の一部の非限定的な例には、Ｒｄ  ＫＷ２０、８６−０２８ＮＰ、Ｒ２８６６、ＰｉｔｔＧＧ、ＰｉｔｔＥＥ、Ｒ２８４６および２０１９が含まれる。
【００８５】
「微生物ＤＮＡ」とは、バイオフィルムを産生する微生物からの一本鎖または二本鎖ＤＮＡを意図する。
【００８６】
バイオフィルムを「阻害すること、予防することまたは破壊すること」とは、バイオフィルムの構造の予防的または治療的低減を意図する。
【００８７】
「ベントポリヌクレオチド」とは、１つの鎖に他の鎖と対形成しない小ループを含有する二本鎖ポリヌクレオチドを意図する。一部の実施形態では、ループは、１塩基〜約２０塩基の長さ、またはあるいは２塩基〜約１５塩基の長さ、またはあるいは約３塩基〜約１２塩基の長さ、またはあるいは約４塩基〜約１０塩基の長さであるか、またはあるいは約４、５または６、または７、または８、または９、または１０塩基を有する。
【００８８】
診断または処置の「対象」は、細胞または動物、例えば、哺乳動物またはヒトである。診断または処置に供される非ヒト動物は、感染に供される非ヒト動物または動物モデル、例えば、サル類、ネズミ科、例えば、ラット、マウス、チンチラ、イヌ科、例えば、イヌ、ウサギ類、例えば、ウサギ、家畜、競技用動物およびペットである。「対象」、「宿主」、「個体」および「患者」という用語は、本明細書で互換的に使用される場合、動物、典型的に哺乳動物を指すものである。哺乳動物の非限定的な例には、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、類人猿、テナガザル、チンパンジー、オランウータン、サル、マカク等）、飼育動物（例えば、イヌおよびネコ）、家畜動物（例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）および実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）が含まれる。一部の実施形態では、哺乳動物はヒトである。哺乳動物は、任意の年齢または任意の発達段階であってもよい（例えば、成体、青年期、子、幼体または子宮内の哺乳動物）。哺乳動物は、雄または雌であり得る。一部の実施形態では、対象は、ヒトである。
【００８９】
「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は、互換的に、かつそれらの最も広い意味で使用されて、２つまたはそれよりも多いサブユニットアミノ酸、アミノ酸アナログまたはペプチドミメティクスの化合物を指す。サブユニットは、ペプチド結合によって連結され得る。別の実施形態では、サブユニットは、他の結合、例えば、エステル、エーテル等によって連結され得る。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質の配列またはペプチドの配列を構成し得るアミノ酸の最大数に限定は設けられていない。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシンならびにＤおよびＬ光学異性体の両方を含む天然および／もしくは非天然または合成アミノ酸のいずれか、アミノ酸アナログおよびペプチドミメティクスを指す。
【００９０】
「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され、任意の長さのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれかのヌクレオチドまたはそのアナログの重合形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有することができ、公知または未知の任意の機能を行い得る。以下のもの：遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴまたはＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマーは、ポリヌクレオチドの非限定的な例である。ポリヌクレオチドは、改変ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造への改変は、ポリヌクレオチドの組立て前または後に与えられ得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、例えば、標識化構成成分とのコンジュゲーションによって、重合化後にさらに改変してもよい。また、この用語は、二本鎖および一本鎖分子の両方を指す。別に特定または要求されない限り、ポリヌクレオチドである本明細書で開示する任意の実施形態は、二本鎖形態、および二本鎖形態を構成することが公知または予想される２つの相補的一本鎖形態の各々の両方を包含する。
【００９１】
ポリヌクレオチドは、４つのヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；チミン（Ｔ）；およびポリヌクレオチドがＲＮＡである場合チミンの代わりにウラシル（Ｕ）の特定の配列からなる。したがって、「ポリヌクレオチド配列」という用語は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表現である。このアルファベット表現は、中央処理装置を有するコンピュータのデータベースに入力され、バイオインフォマティクス適用、例えば、機能ゲノミクスおよび相同性検索に使用され得る。
【００９２】
「単離された」または「組換え」という用語は、核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡについて本明細書で使用される場合、高分子の天然源に存在する、それぞれ、他のＤＮＡまたはＲＮＡおよびポリペプチドから分離された分子を指す。「単離された、または組換え核酸」という用語は、断片として天然に存在しない、天然状態で見出されない核酸断片を含むことを意味する。また、「単離された」という用語は、他の細胞タンパク質から単離されたポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびタンパク質を指すために本明細書で使用され、精製されたポリペプチドおよび組換えポリペプチドの両方を包含することを意味する。他の実施形態では、「単離された、または組換え」という用語は、細胞の構成要素、およびそうでなければ、通常天然で会合している細胞、組織、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその断片（複数可）から分離されていることを意味する。例えば、単離された細胞は、似ていない表現型または遺伝子型の組織または細胞から分離されている細胞である。単離されたポリヌクレオチドは、それが通常そのネイティブまたは天然環境で、例えば、染色体上で、会合している３’および５’隣接ヌクレオチドから分離されている。当業者に明らかである通り、天然に存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその断片（複数可）は、その天然に存在する相対物からそれを区別するための「単離」を必要としない。
【００９３】
本開示がポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドまたは抗体に関する場合、そのようなものの等価物または生物学的等価物が、本開示の範囲内で意図されることは、明白な列挙なしで、かつ別のように意図されない限り、推測されるべきである。本明細書で使用される場合、「その生物学的等価物」という用語は、参照タンパク質、抗体、断片、ポリペプチドまたは核酸について言及する場合、「その等価物」と同義であると意図され、最小限の相同性を有する一方で、それでも所望の構造または機能性を維持するものを意図する。本明細書で特に列挙されない限り、本明細書で挙げる任意のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質もまたその等価物を含むことが企図される。一態様では、等価なポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下において、説明される方法において使用するための本明細書で説明するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの相補物にハイブリダイズするポリヌクレオチドである。別の態様では、等価な抗体または抗原結合性ポリペプチドは、少なくとも７０％、またはあるいは少なくとも７５％、またはあるいは少なくとも８０％、またはあるいは少なくとも８５％、またはあるいは少なくとも９０％、またはあるいは少なくとも９５％の親和性またはそれよりも高い親和性で、参照抗体または抗原結合性断片に結合する抗体または抗原結合性ポリペプチドを意図する。別の態様では、その等価物は、競合ＥＬＩＳＡアッセイ下で（ｔｉｎｄｅｒ  ａ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＥＬＩＳＡ  ａｓｓａｙ）、抗体または抗原結合性断片の、その抗原への結合と競合する。別の態様では、等価物は、少なくとも約８０％の相同性または同一性、およびあるいは少なくとも約８５％、またはあるいは少なくとも約９０％、またはあるいは少なくとも約９５％、またはあるいは９８％のパーセント相同性または同一性を意図し、参照タンパク質、ポリペプチドまたは核酸に対して実質的に等価な生物活性を示す。
【００９４】
別の配列に対してある特定のパーセンテージ（例えば、８０％、８５％、９０％または９５％）の「配列同一性」を有するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）は、整列した場合、塩基（またはアミノ酸）のそのパーセンテージが、２つの配列の比較において同じであることを意味する。整列およびパーセント相同性または配列同一性は、当該技術分野で公知のソフトウェアプログラム、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．  １９８７）  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３０，  ｓｅｃｔｉｏｎ  ７．７．１８，  Ｔａｂｌｅ  ７．７．１で説明されるソフトウェアプログラムを使用して決定することができる。ある特定の実施形態では、デフォルトパラメーターが整列に使用される。非限定的な例示的整列プログラムは、デフォルトパラメーターを使用する、ＢＬＡＳＴである。特に、例示的なプログラムには、以下のデフォルトパラメーター：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；予測＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記載＝５０個の配列；分類＝高スコア；データベース＝非重複ジェンバンク＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ジェンバンクＣＤＳ翻訳＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲを使用する、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰが含まれる。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレス：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴで見出すことができる。配列同一性およびパーセント同一性は、それらをｃｌｕｓｔａｌＷ（ウェブアドレス：ａｌｉｇｎ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ（最終アクセス２０１１年３月７日）で入手可能）に組み込むことによって決定した。
【００９５】
「相同性」または「同一性」または「類似性」とは、２つのペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較の目的のために整列され得る各配列中の位置を比較することによって決定することができる。比較される配列中の位置が、同じ塩基またはアミノ酸によって占有されている場合、分子はその位置で相同である。配列間の相同性の程度は、配列によって共有される整合位置または相同位置の数の関数である。「非関連」または「非相同」配列は、本開示の配列のうちの１つと４０％未満の同一性、またはあるいは２５％未満の同一性を共有する。
【００９６】
また、「相同性」または「同一性」または「類似性」は、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸分子を指し得る。
【００９７】
「ハイブリダイゼーション」とは、１つまたは複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化される複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン−クリック塩基対形成、フーグスティーン結合によって、または他の任意の配列特異的様式で起こり得る。複合体は、二本鎖構造を形成する２つの鎖、多鎖複合体を形成する３つまたはそれよりも多い鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖、またはこれらの任意の組合せを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、より広範なプロセスのステップ、例えば、ＰＣＲ反応の開始またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素切断を構成し得る。
【００９８】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例には：約２５℃〜約３７℃のインキュベーション温度；約６×ＳＳＣ〜約１０×ＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液濃度；約０％〜約２５％のホルムアミド濃度；および約４×ＳＳＣ〜約８×ＳＳＣの洗浄溶液が含まれる。中程度のハイブリダイゼーション条件の例には：約４０℃〜約５０℃のインキュベーション温度；約９×ＳＳＣ〜約２×ＳＳＣの緩衝液濃度；約３０％〜約５０％のホルムアミド濃度；および約５×ＳＳＣ〜約２×ＳＳＣの洗浄溶液が含まれる。高ストリンジェンシー条件の例には：約５５℃〜約６８℃のインキュベーション温度；約１×ＳＳＣ〜約０．１×ＳＳＣの緩衝液濃度；約５５％〜約７５％のホルムアミド濃度；および約１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣの洗浄溶液または脱イオン水が含まれる。一般的に、ハイブリダイゼーションインキュベーション時間は、５分間〜２４時間であり、１、２回またはそれよりも多い洗浄ステップを伴い、洗浄インキュベーション時間は、約１、２または１５分間である。ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸緩衝液である。他の緩衝液系を使用するＳＳＣの等価物が使用され得ることが理解される。
【００９９】
本明細書で使用される場合、「発現」とは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡが次に、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
【０１００】
「コードする」という用語は、それがポリヌクレオチドに適用されるとき、そのネイティブ状態で、または当業者に周知の方法によって操作された場合、それが転写および／または翻訳されて、ｍＲＮＡそしてポリペプチドおよび／またはその断片を産生することができる場合、ポリペプチドを「コードする」と言われるポリヌクレオチドを指す。アンチセンス鎖は、そのような核酸の相補物であり、コード配列は、それから推定することができる。
【０１０１】
本明細書で使用される場合、「処置する」、「処置」等の用語は、所望の薬理的効果および／または生理的効果を得ることを意味するために本明細書で使用される。効果は、障害および／または障害に起因する有害効果についての部分的または完全な治癒の点で治療的であり得る。本明細書で使用される場合、また、対象における疾患の「処置すること」または「処置」とは、（１）疾患にかかりやすいか、または疾患の症状をまだ示していない対象において症状または疾患が起こることを予防すること；（２）疾患を阻害することまたはその発症を阻止すること；または（３）疾患または疾患の症状を改善することまたはその退縮をもたらすことを指し得る。当該技術分野で理解される通り、「処置」とは、臨床結果を含む、有益な結果または所望の結果を得るための手法である。本技術の目的のために、有益な結果または所望の結果は、１つまたは複数の：１つまたは複数の症状の軽減または改善；状態（疾患を含む）の程度の減弱；状態（疾患を含む）の安定化（すなわち、悪化していない）状況；状態（疾患を含む）の遅延または緩慢化、；状態（疾患を含む）、状況および寛解（部分的であるか、全体的であるかにかかわらず）の進行、改善または緩和を、検出可能であるか、検出不能であるかにかかわらず、含み得るが、これらに限定されない。一態様では、処置は、予防を除外する。疾患がＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）および／または嚢胞性線維症（ＣＦ）である場合、処置の証拠は、炎症の証拠および／または自己免疫活性もしくは症状のレベルの低減を含んだ。
【０１０２】
予防することは、障害または影響（ｅｆｆｅｃｔ）にかかりやすい系または対象において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで障害または影響を予防することを意図する。そのようなことの一例は、バイオフィルムを産生することが公知の微生物に感染した系において、バイオフィルムの形成を予防することである。
【０１０３】
「組成物」とは、活性剤と、不活性（例えば、検出可能な剤または標識）または活性な、別の化合物または組成物、例えば、アジュバント、希釈剤、結合剤、安定剤、緩衝液、塩、親油性溶媒、保存剤、アジュバントなどとの組合せを意味することを意図し、薬学的に許容される担体を含む。また、担体は、医薬賦形剤および添加剤、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質および炭水化物（例えば、単糖、ジ、トリ、テトラ−オリゴ糖およびオリゴ糖を含む糖；誘導体化糖、例えば、アルジトール、アルドン酸、エステル化糖等；および多糖または糖高分子）を含み、それらは、単独または１〜９９．９９重量％または体積％の組合せを含む、単独で、または組合せで存在し得る。例示的なタンパク質賦形剤には、血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ：ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）、組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ：ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ａｌｂｕｍｉｎ）、ゼラチン、カゼイン等が含まれる。緩衝能においても機能し得る代表的なアミノ酸／抗体構成成分には、アラニン、アルギニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテーム等が含まれる。また、炭水化物賦形剤は、この技術の範囲内で意図され、その例には、単糖、例えば、果糖、麦芽糖、ガラクトース、ブドウ糖、Ｄ−マンノース、ソルボース等；二糖、例えば、乳糖、ショ糖、トレハロース、セロビオース等；多糖、例えば、ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプン等；およびアルジトール、例えば、マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール  ソルビトール（グルシトール）およびミオイノシトールが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０４】
「医薬組成物」とは、活性剤と、組成物をｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの診断的または治療的使用に好適にする不活性または活性な担体との組合せを含むことを意図する。
【０１０５】
「薬学的に許容される担体」とは、本明細書で開示される組成物において使用され得る任意の希釈剤、賦形剤または担体を指す。薬学的に許容される担体には、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えば、ホスフェート、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、蝋、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が含まれる。好適な医薬担体は、この分野の標準の参考教本であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙで説明されている。それらは、意図される剤形、すなわち、経口錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、シロップ剤等に関して、かつ従来の医薬実務と一致して選択され得る。
【０１０６】
本開示に従って使用される組成物は、投与の容易さおよび投与量の均一性のために投与単位形態で包装され得る。「単位用量」または「投与量」という用語は、対象における使用に好適な物理的に別個の単位を指し、各単位は、その投与、すなわち、適切な経路およびレジメンに付随して所望の応答をもたらすように計算された所定の量の組成物を含有する。処置の回数および単位用量の両方による、投与されるべき量は、所望される結果および／または保護に依存する。また、組成物の正確な量は、実施者の判断に依存し、各個体に特有である。用量に影響を与える因子には、対象の身体的および臨床的状態、投与経路、意図される処置の目的（症状の軽減対治癒）ならびに特定の組成物の効力、安定性および毒性が含まれる。製剤化に際して、液剤は、投与用製剤と適合性の様式で、かつ治療的または予防的に有効な量で投与される。製剤は、様々な剤形、例えば、本明細書で説明する注射用液剤のタイプで容易に投与される。
【０１０７】
「接触させること」という用語は、２つまたはそれよりも多くのものの間の直接的または間接的結合または相互作用を意味する。直接的相互作用の特定の例は、結合である。間接的相互作用の特定の例は、１つの実体が中間の分子に作用し、次にそれが第２の参照実体に作用する場合である。接触させることは、本明細書で使用される場合、溶液中、固相中、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ｅｘ  ｖｉｖｏで、細胞で、およびｉｖ  ｖｉｖｏで接触させることを含む。ｉｖ  ｖｉｖｏで接触させることは、投与することまたは投与と呼ばれ得る。
【０１０８】
「生物活性剤」または本明細書で開示される活性剤とは、単離された、もしくは組換えポリペプチド、単離された、もしくは組換えポリヌクレオチド、ベクター、単離された宿主細胞または抗体のうちの１つまたは複数、およびこれらのうちの１つまたは複数を含む組成物を意図する。
【０１０９】
「投与」は、１つの用量で、処置の過程全体を通して連続的または断続的にもたらされ得る。投与の最も有効な手段および投与量を決定する方法は、当業者に公知であり、治療に使用される組成物、治療の目的、処置される標的細胞および処置される対象によって変動する。単回または複数回の投与は、処置する医師によって選択される用量レベルおよびパターンで行われ得る。好適な投与用製剤およびその作用物質を投与する方法は、当該技術分野で公知である。また、投与経路を決定することができ、最も有効な投与経路を決定する方法は、当業者に公知であり、処置に使用される組成物、処置の目的、処置される対象の健康状態または疾患段階および標的細胞または組織によって変動する。投与経路の非限定的な例には、経口投与、経鼻投与、注射および局所適用が含まれる。
【０１１０】
本開示の作用物質は、任意の好適な投与経路によって治療のために投与され得る。また、最適な経路は、レシピエントの状態および年齢ならびに処置される疾患によって変動することが理解される。
【０１１１】
「有効量」という用語は、所望の効果を達成するために十分な量を指す。治療または予防適用に関して、有効量は、問題の状態のタイプおよび重症度、ならびに個体対象の特徴、例えば、健康全般、年齢、性別、体重および医薬組成物に対する耐容性に依存する。免疫原性組成物に関して、一部の実施形態では、有効量は、病原体に対する保護的応答をもたらすために十分な量である。他の実施形態では、免疫原性組成物の有効量は、抗原に対する抗体生成をもたらすために十分な量である。一部の実施形態では、有効量は、それを必要とする対象に対して受動免疫を与えるために必要な量である。免疫原性組成物について、一部の実施形態では、有効量は、上記に説明する因子に加えて、意図される使用、特定の抗原性化合物の免疫原性の程度および対象の免疫系の健康／応答性に依存する。当業者は、これらおよび他の因子に依存して適切な量を決定することができる。
【０１１２】
ｉｖ  ｖｉｔｒｏ適用の場合、一部の実施形態では、有効量は、問題の適用のサイズおよび性質に依存する。また、それは、ｉｖ  ｖｉｔｒｏ標的の性質および感度ならびに使用における方法に依存する。当業者は、これらおよび他の考慮事項に基づいて有効量を決定することができる。有効量は、実施形態に依存して組成物の１回または複数回の投与を含み得る。
【０１１３】
「ペプチドコンジュゲート」とは、１つまたは複数のポリペプチドと別の化学的または生物学的化合物との共有または非共有結合による会合を指す。非限定的な例では、ポリペプチドと化学的化合物との「コンジュゲーション」は、ポリペプチドの意図される目的について改善されたポリペプチドの安定性または有効性をもたらす。一実施形態では、ペプチドは担体とコンジュゲートされ、担体はリポソーム、ミセルまたは薬学的に許容される高分子である。
【０１１４】
「リポソーム」とは、同心円状の脂質二重層からなる微視的小胞である。構造的に、リポソームは、大きさおよび形状が長管〜球に及び、寸法が数百オングストローム〜数分の１ミリメートルに及ぶ。小胞形成脂質は、外層の脂質組成を提供する最終複合体の特定された程度の流動性または剛性を達成するように選択される。これらは、中性（コレステロール）または双極性であり、リン脂質、例えば、ホスファチジルコリン（ＰＣ：ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ：ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ：ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）およびスフィンゴミエリン（ＳＭ：ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ）、ならびに１４〜２２の範囲の炭化水素鎖長を有し、かつ飽和であるか、または１つまたは複数の二重Ｃ＝Ｃ結合を有する、非限定的に、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ：ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）を含む他のタイプの双極性脂質を含む。単独で、または他の脂質構成成分との組合せで、安定なリポソームを生成することができる脂質の例は、リン脂質、例えば、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ：ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ  ｓｏｙ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノール−アミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジステアロイルホスファチジルエタノールミン（ＤＳＰＥ：ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎ−ｏｌａｍｉｎｅ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ：ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ：ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ：  ｐａｌｍｉｔｏｙｌｏｔｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ：ｐａｌｍｉｔｏｙｌｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミド−トリエチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ：ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ  ４−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏ−ｔｒｉｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）である。リポソームに組み込むことができる追加のリン非含有脂質には、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、イソプロピルミリステート、トリエタノールアミン−ラウリルサルフェート、アルキル−アリールサルフェート、アセチルパルミテート、グリセロールリシノレエート、ヘキサデシルステレエート（ｈｅｘａｄｅｃｙｌ  ｓｔｅｒｅａｔｅ）、両性アクリルポリマー、ポリエチルオキシル化脂肪酸アミドおよび上記に挙げるカチオン性脂��（ＤＤＡＢ、ＤＯＤＡＣ、ＤＭＲＩＥ、ＤＭＴＡＰ、ＤＯＧＳ、ＤＯＴＡＰ（ＤＯＴＭＡ）、ＤＯＳＰＡ、ＤＰＴＡＰ、ＤＳＴＡＰ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ）が含まれる。負荷電脂質には、ホスファチジン酸（ＰＡ：ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ：ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ：  ｄｉｏｔｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）および小胞を形成することができるジセチルホスフェートが含まれる。典型的に、リポソームは、それらの全体的なサイズおよび層状構造の性質に基づいて３つのカテゴリーに分けることができる。１９７７年１２月のニューヨークアカデミー科学会議「Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」によって展開された３つの分類は、多層小胞（ＭＬＶ：ｍｕｌｔｉ−ｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）、小型単層小胞（ＳＵＶ：ｓｍａｌｌ  ｕｎｉ−ｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）および大型単層小胞（ＬＵＶ：ｌａｒｇｅ  ｕｎｉ−ｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）である。生物活性剤は、本明細書で説明する方法に従う投与のためにそのようなものに被包され得る。
【０１１５】
「ミセル」は、液体コロイド中に分散した界面活性分子の凝集物である。水溶液中の典型的なミセルは、親水性の「頭部」領域を周囲の溶媒と接触させ、疎水性尾部領域をミセル中心に隔離した凝集物を形成する。このタイプのミセルは、順相ミセル（水中油ミセル）として公知である。逆ミセルは、中心に頭部基を有し、尾部を外に向けている（油中水ミセル）。ミセルは、本明細書で説明するポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体または組成物を結合して、標的細胞または組織への効率的な送達を促進するために使用され得る。
【０１１６】
「薬学的に許容される高分子」という句は、本明細書で説明する１つまたは複数のポリペプチドにコンジュゲートされ得る化合物の群を指す。高分子のポリペプチドへのコンジュゲーションは、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでのポリペプチドの半減期を延長することができることが企図される。非限定的な例には、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、セルロース誘導体、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、糖、ポリオールおよびその混合物が含まれる。生物活性剤は、本明細書で説明する方法に従う投与のために薬学的に許容される高分子にコンジュゲートされ得る。
【０１１７】
「遺伝子送達媒体」は、挿入されたポリヌクレオチドを宿主細胞に運搬することができる任意の分子として定義される。遺伝子送達媒体の例は、リポソーム；ミセル；天然高分子および合成高分子を含む生物適合性高分子；リポタンパク質；ポリペプチド；多糖；リポ多糖；人工ウイルスエンベロープ；金属粒子；ならびに細菌またはウイルス、例えば、バキュロウイルス、アデノウイルスおよびレトロウイルス、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌ベクター、および様々な真核および原核宿主における発現について説明されており、遺伝子治療および単純なタンパク質発現に使用され得る当該技術分野で典型的に使用される他の組換え媒体である。
【０１１８】
本明細書で開示するポリヌクレオチドは、遺伝子送達媒体を使用して細胞または組織に送達され得る。「遺伝子送達」、「遺伝子導入」、「形質導入」等は、本明細書で使用される場合、導入に使用される方法にかかわりなく、外因性ポリヌクレオチド（ときには「導入遺伝子」と呼ばれる）の宿主細胞への導入について言及する用語である。そのような方法には、様々な周知の技術、例えば、ベクター媒介遺伝子導入（例えば、ウイルス感染／トランスフェクション、または様々な他のタンパク質ベースまたは脂質ベースの遺伝子送達複合体による）および「ネイキッド」ポリヌクレオチドの送達を促進する技術（例えば、電気穿孔、「遺伝子銃」送達、およびポリヌクレオチドの導入に使用される様々な他の技術）が含まれる。導入されたポリヌクレオチドは、宿主細胞において安定に、または一過性に維持され得る。安定な維持は、典型的に、導入されたポリヌクレオチドが、宿主細胞と適合性の複製起点を含有するか、または宿主細胞のレプリコン、例えば、染色体外レプリコン（例えば、プラスミド）または核染色体もしくはミトコンドリア染色体に統合することのいずれかを必要とする。当該技術分野で公知かつ本明細書で説明される通り、いくつかのベクターは、遺伝子の哺乳動物細胞への移入を媒介することができることが公知である。
【０１１９】
本明細書で使用される場合、「ｅＤＮＡ」という用語は、病原性バイオフィルムの構成成分として見出される細胞外ＤＮＡを指す。
【０１２０】
「プラスミド」は、染色体ＤＮＡとは独立して複製することができる、染色体ＤＮＡから分離している染色体外ＤＮＡ分子である。多くの場合、それは環状かつ二本鎖である。プラスミドは、微生物の集団内で水平方向の遺伝子導入のための機構を提供し、典型的に、所与の環境状態下で選択的利益を提供する。プラスミドは、競合的環境ニッチにおいて天然に存在する抗生物質に対する抵抗性を提供する遺伝子を運搬し得るか、またはあるいは、産生されるタンパク質は、同様の条件下で毒素として作用し得る。
【０１２１】
遺伝子工学において使用される「プラスミド」は、「プラスミドベクター」と呼ばれる。多くのプラスミドは、そのような使用のために市販されている。複製するべき遺伝子を、細胞を特定の抗生物質に対して抵抗性にする遺伝子と、いくつかの一般的に使用される制限部位を含有し、この場所でのＤＮＡ断片の容易な挿入を可能にする短い領域であるマルチクローニングサイト（ＭＣＳ：ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｉｔｅ、またはポリリンカー）とを含有するプラスミドのコピーに挿入する。プラスミドの別の主要な使用は、大量のタンパク質を製造することである。この場合、研究者らは、目的の遺伝子を宿すプラスミドを含有する細菌を成長させる。細菌が、その抗生物質抵抗性を与えるタンパク質を産生するのと同じように、それはまた挿入された遺伝子から大量のタンパク質を産生するように誘導され得る。これは、遺伝子またはそして遺伝子がコードするタンパク質を大量産生する安価で容易な方法である。
【０１２２】
「酵母人工染色体」または「ＹＡＣ（ｙｅａｓｔ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）」とは、大きなＤＮＡ断片（１００ｋｂよりも大きく、最大で３０００ｋｂ）をクローニングするために使用されるベクターを指す。それは、人工的に構築された染色体であり、酵母細胞における複製および保存に必要とされるテロメア配列、セントロメア配列および複製起点配列を含有する。初期環状プラスミドを使用して組み立てると、それらを、制限酵素を使用することによって直鎖状にし、その後ＤＮＡリガーゼにより、付着末端の使用によって直鎖分子内に目的の配列または遺伝子を付加することができる。酵母発現ベクター、例えば、ＹＡＣ、ＹＩｐ（酵母組込みプラスミド：ｙｅａｓｔ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ  ｐｌａｓｍｉｄ）およびＹＥｐ（酵母エピソームプラスミド：ｙｅａｓｔ  ｅｐｉｓｏｍａｌ  ｐｌａｓｍｉｄ）は、酵母はそれ自体、真核細胞であるため、翻訳後改変を有する真核生物タンパク質生成物を得ることができるので、非常に有用であるが、しかしながら、ＹＡＣは、ＢＡＣよりも不安定であり、キメラ効果を生ずることが分かっている。
【０１２３】
「ウイルスベクター」は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかで、宿主細胞に送達されるべきポリヌクレオチドを含む組換え産生ウイルスまたはウイルス粒子として定義される。ウイルスベクターの例には、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アルファウイルスベクター等が含まれる。感染性タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ：ｔｏｂａｃｃｏ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）ベースのベクターは、タンパク質を製造する（ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒ）ために使用される場合があり、タバコ葉においてグリフィスシン（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓｉｎ）を発現することが報告されている（Ｏ’Ｋｅｅｆｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０６（１５）：６０９９−６１０４）。また、アルファウイルスベクター、例えば、セムリキ森林ウイルスベースのベクターおよびシンドビスウイルスベースのベクターは、遺伝子治療および免疫療法における使用のために開発されている。Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ  ＆  Ｄｕｂｅｎｓｋｙ  （１９９９）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ５：４３４−４３９およびＹｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ５（７）：８２３−８２７を参照されたい。遺伝子導入がレトロウイルスベクターによって媒介される態様では、ベクター構築物とは、レトロウイルスゲノムまたはその部分と治療用遺伝子とを含むポリヌクレオチドを指す。
【０１２４】
本明細書で使用される場合、「レトロウイルス媒介遺伝子導入」または「レトロウイルス形質導入」は、同じ意味を有し、細胞に入り、ウイルスのゲノムを宿主細胞ゲノムに組み込むウイルスによって、遺伝子または核酸配列が宿主細胞に安定に移入されるプロセスを指す。ウイルスは、その正常な感染機構を介して宿主細胞に入ってもよく、ウイルスが異なる宿主細胞表面受容体またはリガンドに結合して細胞に入るように改変されてもよい。本明細書で使用される場合、レトロウイルスベクターとは、ウイルスまたはウイルス様侵入機構を通して外因性核酸を細胞に導入することができるウイルス粒子を指す。
【０１２５】
レトロウイルスは、それらの遺伝子情報をＲＮＡの形態で運搬する；しかしながら、ウイルスが細胞に感染すると、ＲＮＡは、ＤＮＡ形態に逆転写され、それは感染した細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれる。組み込まれたＤＮＡ形態は、プロウイルスと呼ばれる。
【０１２６】
遺伝子導入がＤＮＡウイルスベクター、例えば、アデノウイルス（Ａｄ：ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ：ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）によって媒介される態様では、ベクター構築物とは、ウイルスゲノムまたはその部分と導入遺伝子とを含むポリヌクレオチドを指す。アデノウイルス（Ａｄ）は、比較的十分に特徴付けられているウイルスの同種の群であり、５０個を超える血清型を含む。例えば、ＰＣＴ国際出願公開番号ＷＯ９５／２７０７１号を参照されたい。Ａｄは、宿主細胞ゲノムへの組込みを必要としない。組換えＡｄ由来ベクター、特に組換えおよび野生型ウイルスの生成の潜在性を低減した組換えＡｄ由来ベクターもまた、構築されている。ＰＣＴ国際出願公開番号ＷＯ９５／００６５５号およびＷＯ９５／１１９８４号を参照されたく、野生型ＡＡＶは、宿主細胞ゲノムへ組み込まれる高感染力および特異性を有する。Ｈｅｒｍｏｎａｔ  ＆  Ｍｕｚｙｃｚｋａ  （１９８４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１：６４６６−６４７０およびＬｅｂｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ８：３９８８−３９９６を参照されたい。
【０１２７】
ポリヌクレオチドが作動可能に連結され得るプロモーターおよびクローニングサイトの両方を含有するベクターは、当該技術分野で周知である。そのようなベクターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでＲＮＡを転写することができ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）およびＰｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）等の供給元から市販されている。発現および／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を最適化するために、クローンの５’および／または３’非翻訳部分を除去、付加または変更して、余分の潜在的で不適切な選択的翻訳開始コドン、または転写または翻訳レベルのいずれかで発現に干渉するか、またはこれを低減し得る他の配列を削除することが必要であり得る。あるいは、コンセンサスリボソーム結合部位は、開始コドンのすぐ５’に挿入されて発現を向上し得る。
【０１２８】
また、遺伝子送達媒体には、ＤＮＡ／リポソーム複合体、ミセルおよび標的とされたウイルスタンパク質−ＤＮＡ複合体が含まれる。また、ターゲティング抗体またはその断片を含むリポソームは、本明細書で開示する方法で使用することができる。ポリヌクレオチドの細胞または細胞集団への送達に加えて、本明細書で説明するタンパク質の細胞または細胞集団への直接的導入は、タンパク質トランスフェクションの非限定的な技術によって行ってもよく、あるいは、本明細書で開示するタンパク質の発現の向上および／または活性の促進を可能にする培養条件は、他の非限定的な技術である。
【０１２９】
本明細書で使用される場合、「抗体」、「複数の抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、抗体全体および任意の抗原結合性断片またはその単一の鎖を含む。したがって、「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含む任意のタンパク質またはペプチド含有分子を含む。また、「抗体」、「複数の抗体」および「免疫グロブリン」という用語には、任意のアイソタイプの免疫グロブリン；非限定的に、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆｄ断片、ｄＡｂ、ＶＨ、ＶＬ、ＶｈＨおよびＶ−ＮＡＲドメインを含む抗原への特異的結合を保持する抗体の断片；ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディおよびカッパボディ；抗体断片および１つまたは複数の単離されたものから形成された多重特異性抗体断片が含まれる。そのようなものの例には、重鎖もしくは軽鎖またはそのリガンド結合性部分の相補性決定領域（ＣＤＲ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）、重鎖または軽鎖可変領域、重鎖または軽鎖定常領域、フレームワーク（ＦＲ：ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）領域、またはその任意の部分、結合性タンパク質の少なくとも一部分、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、および抗体の抗原結合性部分と非抗体タンパク質とを含む融合タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。免疫グロブリン分子の重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体（Ａｂ）の定常領域は、免疫グロブリンの宿主組織への結合を媒介し得る。「抗〜」という用語は、例えば、抗ＤＮＡＢＩＩ、抗ＩＨＦ、抗ＨＵ、抗ＯＭＰ  Ｐ５のように、タンパク質名称の前に使用される場合、特定のタンパク質への結合および／または特定のタンパク質への親和性の所有を示すモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を指す。例えば、「抗ＩＨＦ」とは、ＩＨＦタンパク質に結合する抗体を指す。特異的抗体は、タンパク質であってその抗体がそれに対して産生されたタンパク質以外のタンパク質への親和性を有するか、または結合し得る。例えば、抗ＩＨＦは、ＩＨＦタンパク質に対して特異的に産生されたものであるが、配列相同性を通じて、または構造相同性を通じて関連する他のタンパク質にも結合し得る。
【０１３０】
抗体は、それらが、所望の生物活性を示す限り、ポリクローナル、モノクローナル、多特異性（例えば、二重特異性抗体）および抗体断片であり得る。抗体は、任意の好適な生物学的供給源、例えば、ネズミ科、ラット、ヒツジおよびイヌ科から単離することができる。
【０１３１】
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体を指す。各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して向けられているので、モノクローナル抗体は、高度に特異的である。抗体は、例えば、放射性同位体、検出可能な生成物を生成する酵素、蛍光タンパク質等で検出可能に標識され得る。抗体は、他の部分、例えば、特異的結合対のメンバー、例えば、ビオチン（ビオチン−アビジン特異的結合対のメンバー）等にさらにコンジュゲートされ得る。また、抗体は、非限定的に、ポリスチレンプレートまたはビーズ等を含む固体支持体に結合され得る。
【０１３２】
モノクローナル抗体は、当該技術分野で公知のハイブリドーマ技術または組換えＤＮＡ法を使用して生成され得る。ハイブリドーマは、抗体産生リンパ球と抗体非産生がん細胞、通常、骨髄腫またはリンパ腫との融合から研究室で産生される細胞である。ハイブリドーマは増殖し、特異的モノクローナル抗体の連続試料を産生する。抗体を生成または選択するための代替の技術には、リンパ球の目的の抗原へのｉｎ  ｖｉｔｒｏ曝露、および細胞、ファージまたは同様の系における抗体ディスプレイライブラリーのスクリーニングが含まれる。
【０１３３】
「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有する抗体を含むことを意図する。本明細書で開示するヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでランダムまたは部位特異的変異誘発によって、またはｉｎ  ｖｉｖｏで体細胞変異によって導入された変異）を含み得る。しかしながら、「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、別の哺乳動物種、例えば、マウスの生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上にグラフトされた抗体を含むことを意図しない。したがって、本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、タンパク質の実質的にどの部分（例えば、ＣＤＲ、フレームワーク、ＣＬ、ＣＨドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）、ヒンジ、（ＶＬ、ＶＨ））も、ヒトにおいて実質的に非免疫原性であり、少ない配列変化または変動のみを伴う抗体を指す。同様に、霊長類（サル、ヒヒ、チンパンジー等）、げっ歯類（マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター等）および他の哺乳動物指定の抗体は、そのような種、亜属、属、亜科、科特異的抗体を指定する。さらに、キメラ抗体は、上記の任意の組合せを含む。そのような変化または変動は、必要に応じて、非改変抗体と比較してヒトまたは他の種において免疫原性を保持または低減する。したがって、ヒト抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体とは別個である。ヒト抗体は、機能的に再配置されたヒト免疫グロブリン（例えば、重鎖および／または軽鎖）遺伝子を発現することができる非ヒト動物または原核細胞もしくは真核細胞によって産生され得ることが指摘される。さらに、ヒト抗体が単鎖抗体である場合、それは、ネイティブヒト抗体で見られないリンカーペプチドを含み得る。例えば、Ｆｖは、リンカーペプチド、例えば、２〜約８個のグリシンまたは他のアミノ酸残基を含む場合があり、それは、重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域とを接続する。そのようなリンカーペプチドは、ヒト起源のものと考えられる。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、抗体が、ヒト免疫グロブリン配列を使用する系から、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスを免疫することによって、またはヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることによって得られる場合、ヒト抗体は特定の生殖細胞系列配列に「由来」する。ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に「由来」するヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖細胞系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較することによってそれ自体特定することができる。典型的に、選択されたヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列において少なくとも９０％同一であり、他の種の生殖細胞系列免疫グロブリンアミノ酸配列（例えば、ネズミ科生殖細胞系列配列）と比較した場合、ヒト抗体をヒト抗体であると特定するアミノ酸残基を含有する。ある特定の場合、ヒト抗体は、生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列において少なくとも９５％、またはさらに、少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であり得る。典型的に、特定のヒト生殖細胞系列配列に由来するヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と１０個以下のアミノ酸の相違を示す。ある特定の場合、ヒト抗体は、生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と５個以下、またはさらに、４、３、２もしくは１個以下のアミノ酸の相違を示し得る。
【０１３５】
「ヒトモノクローナル抗体」とは、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する単一の結合特異性を示す抗体を指す。また、この用語は、組換えヒト抗体を意図する。これらの抗体を製造する方法は、本明細書で説明される。
【０１３６】
「組換えヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、組換え手段によって調製、発現、作出または単離された全てのヒト抗体、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックまたは染色体導入動物（例えば、マウス）またはそれから調製されたハイブリドーマから単離された抗体；抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から、例えば、トランスフェクトーマから単離された抗体；組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体；およびヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングに関与する他の任意の手段によって調製、発現、作出または単離された抗体を含む。そのような組換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。しかしながら、ある特定の実施形態では、そのような組換えヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異誘発（またはヒトＩｇ配列についてトランスジェニックな動物が使用される場合、ｉｎ  ｖｉｖｏ体細胞変異誘発）に供される場合があり、したがって、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し、かつ関連している一方、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内に天然に存在しない場合がある配列である。これらの抗体を製造する方法は、本明細書で説明される。
【０１３７】
本明細書で使用される場合、キメラ抗体は、異なる種に属する抗体可変領域および定常領域遺伝子から、典型的に遺伝子工学によって、軽鎖および重鎖遺伝子が構築された抗体である。
【０１３８】
本明細書で使用される場合、「ヒト化抗体」または「ヒト化免疫グロブリン」という用語は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限配列を含有するヒト／非ヒトキメラ抗体を指す。ほとんどの部分について、ヒト化抗体は、レシピエントの可変領域からの残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する非ヒト種、例えば、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類の可変領域（ドナー抗体）からの残基によって置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ヒト化抗体は、レシピエント抗体で、またはドナー抗体で見出されない残基を含み得る。また、ヒト化抗体は、必要に応じて、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分；フレームワーク領域、定常領域またはＣＤＲ中に、ヒト抗体からの、対応して位置付けられるアミノ酸で置換された１つまたは複数のアミノ酸を含有する非ヒト抗体を含み得る。一般的に、ヒト化抗体は、同じ抗体の非ヒト化バージョンと比較して、ヒト宿主において免疫応答の低減をもたらすことが予測される。ヒト化抗体は、抗原結合または他の抗体機能に実質的に影響を有しない保存的アミノ酸置換を有し得る。保存的置換分類には、グリシン−アラニン、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、セリン−トレオニンおよびアスパラギン−グルタミンが含まれる。
【０１３９】
「ポリクローナル抗体」または「ポリクローナル抗体組成物」という用語は、本明細書で使用される場合、様々なＢ細胞系に由来する抗体の調製物を指す。それらは、特定の抗原に対して分泌された免疫グロブリン分子の混合物であり、各々は異なるエピトープを認識する。
【０１４０】
本明細書で使用される場合、「抗体誘導体」という用語は、アミノ酸のうちの１つまたは複数が、例えば、抗体を第２の分子に連結するために、アルキル化、ペグ化、アシル化、エステル形成またはアミド形成などによって化学改変されている全長抗体または抗体の断片を含む。これは、ペグ化抗体、システイン−ペグ化抗体およびそのバリアントを含むが、これらに限定されない。
【０１４１】
本明細書で使用される場合、「標識」という用語は、「標識された」組成物を生成するために、検出するべき組成物に直接的または間接的にコンジュゲートされた直接的または間接的検出可能化合物または組成物、例えば、Ｎ末端ヒスチジンタグ（Ｎ−Ｈｉｓ）、磁気的旋光同位体、例えば、１１５Ｓｎ、１１７Ｓｎおよび１１９Ｓｎ、非放射性同位体、例えば、１３Ｃおよび１５Ｎ、ポリヌクレオチドまたはタンパク質、例えば、抗体を意図する。また、この用語は、挿入された配列の発現に際してシグナルを提供する、ポリヌクレオチドにコンジュゲートされた配列、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ：ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）等を含む。標識は、それ自体で検出可能であってもよく（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）、酵素標識の場合、検出可能な基質化合物または組成物の化学変化を触媒してもよい。標識は、小スケール検出に好適であっても、ハイスループットスクリーニングにより好適であってもよい。よって、好適な標識には、磁気的旋光同位体、非放射性同位体、放射性同位体、蛍光色素、化学発光化合物、染料、および酵素を含むタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。標識は単純に検出してもよく、標識は定量してもよい。単純に検出される応答は、一般的に、存在が単に確認される応答を含み、一方で、定量される応答は、一般的に、定量可能な（例えば、数字で報告可能な）値、例えば、強度、分極および／または他の特性を有する応答を含む。発光または蛍光アッセイにおいて、検出可能な応答は、実際に結合に関与するアッセイ構成成分と会合した発光団または蛍光団を使用して直接的に、または別の（例えば、レポーターまたはインジケーター）構成成分と会合した発光団または蛍光団を使用して間接的に生成され得る。シグナルを産生する発光標識の例には、生物発光および化学発光が含まれるが、これらに限定されない。検出可能な発光応答は、一般的に、発光シグナルの変化、または発光シグナルの発生を含む。アッセイ構成成分を発光標識するために好適な方法および発光団は、当該技術分野で公知であり、例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ，  Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｐ．  （１９９６）  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  （６ｔｈ  ｅｄ）で説明されている。発光プローブの例には、エクオリンおよびルシフェラーゼが含まれるが、これらに限定されない。
【０１４２】
本明細書で使用される場合、「イムノコンジュゲート」という用語は、第２の作用物質、例えば、細胞傷害剤、検出可能な剤、放射性剤、ターゲティング剤、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、合成抗体、半合成抗体または多重特異性抗体と会合した、または連結した抗体または抗体誘導体を含む。
【０１４３】
好適な蛍光標識の例には、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチル−クマリン、ピレン、マラカイトグリーン（Ｍａｌａｃｉｔｅ  ｇｒｅｅｎ）、スチルベン、ルシファーイエロー、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ（商標）およびテキサスレッドが含まれるが、これらに限定されない。他の好適な光学染料は、Ｈａｕｇｌａｎｄ，  Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｐ．  （１９９６）  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  （６ｔｈ  ｅｄ．）で説明されている。
【０１４４】
別の態様では、蛍光標識は、細胞表面マーカーのように、細胞もしくは組織内、または細胞表面もしくは組織表面上に存在している細胞構成成分への共有結合を促進するように官能化される。好適な官能基には、イソチオシアネート基、アミノ基、ハロアセチル基、マレイミド、スクシンイミジルエステルおよびスルホニルハライドが含まれるが、これらに限定されず、これらの全ては、蛍光標識を第２の分子に結合するために使用され得る。蛍光標識の官能基の選択は、リンカー、作用物質、マーカーまたは第２の標識剤のいずれかへの結合部位に依存する。
【０１４５】
「真核細胞」は、モネラ界を除く全ての生命界を含む。それらは、膜結合核によって容易に区別することができる。動物、植物、真菌および原生生物は、真核生物、または細胞が内部膜および細胞骨格によって複合体構造に組織化されている生物である。最も特徴的な膜結合構造は、核である。特に列挙しない限り、「宿主」という用語は、例えば、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞を含む真核生物宿主を含む。真核細胞または宿主の非限定的な例には、サル類、ウシ属、ブタ、ネズミ科、ラット、鳥類、爬虫類およびヒトが含まれる。
【０１４６】
「原核細胞」は、通常、核または他の任意の膜結合オルガネラを欠き、２つのドメイン、細菌および古細菌に分けられる。染色体ＤＮＡに加えて、これらの細胞は、エピソームと呼ばれる環状ループ内の遺伝子情報も含有し得る。細菌細胞は、非常に小さく、およそ動物ミトコンドリアのサイズ（直径約１〜２μｍおよび１０μｍの長さ）である。原核細胞は、３つの主要な形状：桿状、球状およびらせん状を特徴とする。真核生物のような精巧な複製プロセスを経る代わりに、細菌細胞は、二分裂によって分裂する。例には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ細菌、Ｅ．  ｃｏｌｉ細菌およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細菌が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４７】
「ネイティブ」または「天然」抗原は、天然の生物学的供給源から単離され、かつ対象において抗原受容体、特に、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ：Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に特異的に結合し得る、エピトープを含有するポリペプチド、タンパク質または断片である。
【０１４８】
「抗原」および「抗原性」という用語は、抗体によって認識される能力、またはそうでなければ、抗体−リガンド対のメンバーとして作用する能力を有する分子を指す。「特異的結合」とは、抗原と免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変領域との相互作用を指す。抗体−抗原結合は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで起こり得る。当業者は、タンパク質、核酸、脂肪酸、脂質、リポ多糖および多糖を含む巨大分子は、抗原として作用する潜在性を有することを理解する。当業者は、抗体リガンドとして作用する潜在性を有するタンパク質をコードする核酸は、必然的に抗原をコードすることをさらに理解する。当業者は、抗原は、全長分子に限定されず、部分的分子も含み得ることをさらに理解する。「抗原性」という用語は、抗原の特性を有する分子についての形容詞的言及である。この用語は、免疫原性である物質、すなわち、免疫原、および免疫学的不応答性またはアネルギーを誘導する物質、すなわち、アナジェン（ａｎｅｒｇｅｎ）を包含する。
【０１４９】
「変更された抗原」とは、対応する野生型抗原の一次配列とは異なる一次配列を有する抗原である。変更された抗原は、合成または組換え法によって製造することができ、例えば、リン酸化；グリコシル化；架橋結合；アシル化；タンパク質分解切断；抗体分子、膜分子または他のリガンドへの連結によって、翻訳中または翻訳後に差次的に改変される抗原性ペプチドを含むが、これらに限定されない。（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５７：２８５−３２０）。本明細書で開示する合成抗原または変更された抗原は、天然エピトープと同じＴＣＲに結合することを意図する。
【０１５０】
「免疫応答」とは、リンパ球の外来性物質への抗原特異的応答を広範に指す。「免疫原」および「免疫原性」という用語は、免疫応答を誘導する能力を有する分子を指す。全ての免疫原は抗原であるが、しかしながら、全ての抗原が免疫原性というわけではない。本明細書で開示する免疫応答は、体液性（抗体活性を介する）または細胞媒介性（Ｔ細胞活性化を介する）であり得る。応答は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで起こり得る。当業者は、タンパク質、核酸、脂肪酸、脂質、リポ多糖および多糖を含む様々な巨大分子は、免疫原性である潜在性を有することを理解する。当業者は、免疫応答を誘導することができる分子をコードする核酸は、必然的に免疫原をコードすることをさらに理解する。当業者は、免疫原は、全長分子に限定されず、部分的分子を含み得ることをさらに理解する。
【０１５１】
「受動免疫」という用語は、抗体の移入を通した１つの対象から別の対象への免疫の移入を指す。受動免疫は、母体の抗体が胎児に移入した場合、天然に起こり得る。また、受動免疫は、抗体組成物が非免疫対象に投与された場合、人工的に起こり得る。抗体ドナーおよびレシピエントは、ヒトまたは非ヒト対象であり得る。実施形態に依存して、抗体は、ポリクローナルであっても、モノクローナルであってもよく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成しても、ｉｎ  ｖｉｖｏで生成してもよく、精製しても、部分精製しても、非精製であってもよい。本明細書で説明する一部の実施形態では、受動免疫は、特定の抗原を特異的に認識するか、またはそれに結合する抗体または抗原結合性断片の投与を通して、それを必要とする対象に与えられる。一部の実施形態では、受動免疫は、特定の抗原を特異的に認識するか、またはそれに結合する抗体または抗原結合性断片をコードする単離された、または組換えポリヌクレオチドの投与を通して与えられる。
【０１５２】
本開示の文脈において、「リガンド」とは、ポリペプチドである。一態様では、「リガンド」という用語は、本明細書で使用される場合、別の分子上の特定の部位に結合する任意の分子を指す。換言すれば、リガンドは、免疫エフェクター細胞またはタンパク質に対する抗体またはタンパク質に対するＤＮＡとの反応においてそのタンパク質の特異性を付与する。一態様では、免疫エフェクター細胞上の相補的結合部位と直接的に組み合わさるものは、タンパク質内のリガンド部位である。
【０１５３】
本明細書で使用される場合、「対象において免疫応答を誘導すること」という用語は、当該技術分野で十分に理解されている用語であり、対象への抗原（またはエピトープ）の導入前の免疫応答（もしあれば）と比較して、対象への抗原（またはエピトープ）の導入後に抗原（またはエピトープ）への免疫応答における少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約５００倍もしくは少なくとも約１０００倍またはそれよりも大きな増加が、検出または測定され得ることを意図する。抗原（またはエピトープ）への免疫応答には、抗原特異的（またはエピトープ特異的）抗体の産生、および表面上に抗原（またはエピトープ）に特異的に結合する分子を発現する免疫細胞の産生が含まれるが、これらに限定されない。所与の抗原（またはエピトープ）への免疫応答が誘導されたかどうかを決定する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、抗原特異的抗体は、非限定的に、例えば、試料中の抗体の固定化抗原（またはエピトープ）への結合が、検出可能に標識された二次抗体（例えば、酵素標識マウス抗ヒトＩｇ抗体）で検出されるＥＬＩＳＡを含む、当該技術分野で公知の様々なイムノアッセイのいずれかを使用して検出することができる。
【０１５４】
本明細書で使用される場合、互換的に使用される「固相支持体」または「固体支持体」は、特定のタイプの支持体に限定されない。むしろ、多数の支持体が使用可能であり、当業者に公知である。固相支持体には、シリカゲル、樹脂、誘導体化プラスチックフィルム、ガラスビーズ、綿、プラスチックビーズ、アルミナゲルが含まれる。また、本明細書で使用される場合、「固体支持体」には、合成抗原提示マトリックス、細胞およびリポソームが含まれる。好適な固相支持体は、所望の最終使用、および様々なプロトコールについての好適性に基づいて選択され得る。例えば、ペプチド合成について、固相支持体は、樹脂、例えば、ポリスチレン（例えば、Ｂａｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．、Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ等から得られるＰＡＭ−樹脂）、ＰＯＬＹＨＩＰＥ（登録商標）樹脂（Ａｍｉｎｏｔｅｃｈ、Ｃａｎａｄａから得られる）、ポリアミド樹脂（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得られる）、ポリエチレングリコールとグラフトしたポリスチレン樹脂（ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）、Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ、Ｔｕｂｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）またはポリジメチルアクリルアミド樹脂（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ｃａｌｉｆ．から得られる）を指し得る。
【０１５５】
固相支持体の例には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および改変セルロース、ポリアクリルアミド、斑レイ岩ならびにマグネタイトが含まれる。担体の性質は、ある程度まで可溶性、または不溶性のいずれかであり得る。支持体材料は、結合した分子がポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは抗体に結合することができる限り、事実上、任意の可能な構造的配置を有し得る。したがって、支持体配置は、ビーズにおけるように球状、または試験管の内側表面または棒の外部表面におけるように円柱状であり得る。あるいは、表面は、平面、例えば、シート、試験紙等、またはあるいはポリスチレンビーズであり得る。当業者は、抗体または抗原を結合させるための多くの他の好適な担体を知っているか、またはルーチン実験の使用によってこれを確認することができる。
【０１５６】
「免疫応答をモジュレートする」という用語は、免疫応答を誘導すること（増加させること、誘発すること）、および免疫応答を低減すること（抑制すること）を含む。免疫調節法（またはプロトコール）は、対象において免疫応答をモジュレートする方法である。
本開示を行うための様式
Ｉ．バイオフィルム構造および疾患
【０１５７】
慢性および再発性細菌感染症を維持する細菌のリザーバーは、表面に付着し、かつこの状態では宿主免疫系によるクリアランスおよび抗微生物薬によるクリアランスに抵抗し得る細菌の群集であるバイオフィルム内に常在する。実際に、バイオフィルム状態内の細菌は、典型的に、自由生活状態または浮遊状態（ｐｌａｎｋｔｏｎｉｃ  ｓｔａｔｅ）の同じ細菌よりも抗生物質に対して１０００倍を超える抵抗性である。Ｃｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３７（６）：１７７１−６。バイオフィルム細菌のクリアランスに抵抗する能力は、大部分は、環境ハザードへの物理的障壁として作用し、かつこの抵抗性状態を増強するために代謝を制限する変更された生理機能のための条件を作り出す半浸透性の自作マトリックスまたは細胞外高分子物質（ＥＰＳ）によるものである。ＥＰＳの構成要素は、各細菌に特異的であり、タンパク質、多糖、脂質および核酸を含むが、ＥＰＳの性質は、生産的に（例えば、代謝パートナーとして）相互作用するために全体として細菌属に十分に資するものである必要がある。この目的のために、いくつかの最近の発見により、全ての真正細菌に共通する基礎をなす普遍的ＥＰＳ構造の可能性がもたらされた。Ｗｈｉｔｃｈｕｒｃｈおよび共同研究者ら（Ｗｈｉｔｃｈｕｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２９５（５５５９））は、細胞外ＤＮＡ（ｅＤＮＡ）が共通ＥＰＳ構成要素であること、および細菌のＤＮアーゼによる処理はバイオフィルム形成を妨げるのに十分であることを示した。この結果は複数の属について再現された一方で、ｅＤＮＡがバイオフィルムの生活環全体を通してバイオフィルム内で明らかであるという事実にもかかわらず、ＤＮアーゼの使用は、バイオフィルム播種後、１日または２日よりも長く現存するバイオフィルムを処置することができなかった。別に、出願人らは、以前に、全ての真正細菌に共通する唯一の核様体タンパク質（ＮＡＰ：ｎｕｃｌｅｏｉｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のファミリーであるＤＮＡＢＩＩタンパク質を、ｅＤＮＡ依存性ＥＰＳの必要構成成分であると特定した。実際に、ＤＮＡＢＩＩタンパク質に対して向けられた抗体は、バルク培地からＤＮＡＢＩＩタンパク質を滴定し、それによって、ＤＮＡＢＩＩタンパク質の平衡をｅＤＮＡ結合状態から非結合状態にシフトさせ、このことは今までに試験した全ての細菌バイオフィルムの破局的崩壊をもたらし、これには混合種バイオフィルムを含む。Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４（６）：６２５−３７；Ｎｏｖｏｔｎｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ８（６）：ｅ６７６２９；Ｄｅｖａｒａｊ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ９６（６）：１１１９−３５；Ｒｏｃｃｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７）  Ｍｏｌ  Ｏｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３２（２）：１１８−３０；Ｇｕｓｔａｖｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｊ  Ｃｙｓｔ  Ｆｉｂｒｏｓ．  １２（４）：３８４−９；Ｎｏｖｏｔｎｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ．  １０：３３−４４。重要なことに、ＤＮアーゼとは異なり���ＤＮＡＢＩＩタンパク質に対して向けられた抗体による処理は、バイオフィルム発達の全ての段階において有効であり、このことは、ｅＤＮＡ依存性ＥＰＳがバイオフィルムの時期にかかわらず重要構造であることを実証する。Ｂｒｏｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ９３（６）：１２４６−５８。ｅＤＮＡおよびＤＮＡＢＩＩファミリーのメンバーがＥＰＳの必須構成成分であることが分かっているにもかかわらず、完全なＥＰＳ構造の理解ははっきりしないことが判明しており、ＤＮＡＢＩＩタンパク質およびＤＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで機能的ＥＰＳ構造を再現するのに不十分である。出願人らは、複数のヒト病原体について、バイオフィルムが成熟するにつれて、ｅＤＮＡ依存性ＥＰＳは、ＤＮＡＢＩＩタンパク質およびポリアミンの両方に依存し、そのため、ｅＤＮＡは、Ｂ−ＤＮＡからＺ−ＤＮＡコンフォメーションにシフトすることを本明細書で説明している。この後者の結果は、ＤＮアーゼが成熟バイオフィルムを破壊することができなかったことを説明する可能性があるので、それは特に興味深く、ヌクレアーゼは、より古典的なＢ型のＤＮＡのみを切断する。
細胞内細菌核様体
【０１５８】
細菌内のＤＮＡは、高度に構造化されており、ＤＮＡ複製、修復、転写および組換えを含む全ての型の核酸プロセスの調節を促進する。真核細胞とは異なり、細菌は、ヒストンを欠く。その代わりに、細菌ＤＮＡは、一部には、核様体タンパク質（ＮＡＰ）と呼ばれるあるクラスのタンパク質によって構造化されている。ＮＡＰは、集合的に、ＤＮＡに結合して、機能的構造を作り出す。Ｄｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ８（３）：１８５−９５。属全体にわたり存在する多数のＮＡＰメンバーの中で、ＤＮＡＢＩＩファミリーのみが、全ての真正細菌の中で遍在性である。Ｄｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７）  Ｍｏｌ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔ  Ｅｖｏｌ．  １０７：３５６−６６。ＤＮＡＢＩＩファミリーのタンパク質は、二量体（種によってホモ二量体またはヘテロ二量体）として機能し、ヒストン様タンパク質ＨＵおよびＩＨＦを含む。ＨＵは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ：ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ）に弱く、かつ非特異的に結合し、それを曲げるが、事前に曲げられた、または構造化されたｄｓＤＮＡ３についてかなり高い親和性を有する。ＩＨＦは、ＨＵと同様に、事前に曲げられた／構造化ＤＮＡについて強い優先度でＤＮＡに結合し、それを曲げる。ＨＵとは異なり、ＩＨＦは、プロテオバクテリアによってのみ発現され、また特異的ＤＮＡコンセンサス配列について優先度を有する。Ｓｗｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．  １４（１）：２８−３５。
細胞外細菌核様体（ｎｕｃｌｅｏｉ）
【０１５９】
細胞外ＤＮＡ（ｅＤＮＡ）は、「形質転換原理」はＤＮＡの結果であるという発見以来、生物学的役割を有することが公知である。Ａｖｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９４４）  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．  ７９（２）：１３７−５８。また、実際に、ｅＤＮＡは、細菌バイオフィルムの細胞外マトリックス（細胞外高分子物質、ＥＰＳ）にとって重要である。Ｇｕｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２９１（２４）：１２５３８−４６。しかしながら、バイオフィルムｅＤＮＡ構造およびｅＤＮＡ機能のためのその構造の重要性は、今までのところ、調査されていない。
慢性および再発性感染症は、細菌バイオフィルムの結果である
【０１６０】
バイオフィルムは、細胞間連通および輸送系によって浮遊性細菌とはさらに区別されるが、それらの最も特有の特色は、半浸透性障壁として作用することおよび変更／緩慢化された代謝のための環境を作り出すことの両方により常在バイオフィルム細菌を保護するそれらの自作ＥＰＳであり；実際に、バイオフィルム細菌は、それらの浮遊性相対物よりも抗生物質に対して１０００倍を超える抵抗性である。Ｃｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３７（６）：１７７１−６。興味深いことに、各細菌のＥＰＳは、特徴的であり、様々なタンパク質、脂質、多糖および核酸からなる。Ｇｕｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２９１（２４）：１２５３８−４６。しかしながら、バイオフィルムが単一の種からなり得る一方で、一般的に慢性感染症において、および常に環境において、それらは多数の属からなり、よって、生産的に相互作用することができる必要がある（例えば、特定の代謝パートナーとの共凝集  Ｓｔａｃｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １４（２）：９３−１０５；Ｗｏｌｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｎｆｅｃｔ．  １９（２）：１０７−１２）。この群集概念は、様々なＥＰＳ組成にもかかわらず、各ＥＰＳは、多様な細菌がバイオフィルム内で相互作用することを可能にするように十分に収容性でなければならないことを意味し、かつさらに、バイオフィルムＥＰＳは、普遍的な基礎をなす構造を有するようであることを示唆する。
ｅＤＮＡ依存性ＥＰＳは、普遍的な基礎をなすアーキテクチャの質を有する
【０１６１】
ヒトおよび生態学的属の両方からの細菌バイオフィルムと関連付けられるｅＤＮＡを、多数のグループが調べ、スキャフォールド構造を観察した（図１Ａ）。Ｊｕｒｃｉｓｅｋ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １１４（３２）：Ｅ６６３２−Ｅ４１；Ｓｅｎａ−Ｖｅｌｅｚ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  １１（６）：ｅ０１５６６９５；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｐ．  ７（２）：３３０−４０。Ｗｈｉｔｃｈｕｒｃｈおよび共同研究者らは、Ｐ．  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａバイオフィルムが、デオキシヌクレアーゼＩ（ＤＮアーゼ）処理によって妨げられ得ることを最初に示し（Ｗｈｉｔｃｈｕｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２９５（５５５９））、これは、ｅＤＮＡが、ＥＰＳの重要な構造構成成分であることを示す。ＤＮアーゼは、多くの属において初期バイオフィルム形成を阻害し得る（Ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ａｃｔａ  Ｐａｅｄｉａｔｒ．  ９５（９）：１０７０−４；Ｍａｒｔｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｍｙｃｏｓｅｓ．  ５５（１）：８０−５；Ｈｙｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．  ２０７（１０）：１４９１−７））が、バイオフィルムが成熟するにつれて、ｅＤＮＡが明らかに存続しているという事実にもかかわらず、バイオフィルムは経時的にＤＮアーゼに不応性になる。Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４（６）：６２５−３７；Ｈａｌｌ−Ｓｔｏｏｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ８：１７３；Ｉｚａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｐａｔｈｏｇ．  ４６（４）：２０７−１３；Ｋａｐｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｊ  Ａｎｔｉｂｉｏｔ  （Ｔｏｋｙｏ）．  ６５（２）：７３−７；Ｎｏｖｏｔｎｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ８（６）：ｅ６７６２９；Ｔｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２９（８）：３９９−４０５。この成果は多くの場合、ｅＤＮＡがＥＰＳの構造的完全性にもはや重要でないことを意味すると解釈されたが、出願人らは、ｅＤＮＡが存続するだけでなく、それが主要な基礎をなすＥＰＳ構造になることを示した。Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４（６）：６２５−３７；Ｎｏｖｏｔｎｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ８（６）：ｅ６７６２９；Ｄｅｖａｒａｊ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ９６（６）：１１１９−３５；Ｒｏｃｃｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７）  Ｍｏｌ  Ｏｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３２（２）：１１８−３０；Ｂｒｏｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ９３（６）：１２４６−５８。
ＤＮＡＢＩＩファミリーのタンパク質は、バイオフィルムｅＤＮＡ−スキャフォールド化ＥＰＳの構造的完全性を維持する要である
【０１６２】
出願人らはこれまで、遍在性ＤＮＡＢＩＩタンパク質は、ｅＤＮＡの構造的構成要素であり、おそらく他のＮＡＰは構造的構成要素ではないこと（Ｄｅｖａｒａｊ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７）  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙｏｐｅｎ．）、および、一旦除去すると、ｅＤＮＡ構造が破壊されることを示した。Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４（６）：６２５−３７；Ｎｏｖｏｔｎｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ８（６）：ｅ６７６２９；Ｄｅｖａｒａｊ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ９６（６）：１１１９−３５；Ｒｏｃｃｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７）  Ｍｏｌ  Ｏｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３２（２）：１１８−３０。実際に、ＤＮＡＢＩＩタンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏで形成されるバイオフィルムのｅＤＮＡスキャフォールドの頂点（事前に曲げられたＤＮＡ）に特異的に結合することが分かり、一方で、ＤＮＡＢＩＩタンパク質に対して向けられた抗体は、ｅＤＮＡ−スキャフォールド化ＥＰＳの構造を傷つけるのに十分であり、結果として、バイオフィルム成熟にかかわらず、出願人らが調査したどの種についても単一種および多種バイオフィルムの両方の破局的崩壊を引き起こす（Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４（６）：６２５−３７；Ｎｏｖｏｔｎｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ８（６）：ｅ６７６２９；Ｄｅｖａｒａｊ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ９６（６）：１１１９−３５；Ｒｏｃｃｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７）  Ｍｏｌ  Ｏｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３２（２）：１１８−３０）。Ｂｒｏｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ９３（６）：１２４６−５８。この破壊は、常在細菌を放出して浮遊性にし、したがって、抗微生物薬感受性および免疫感受性状態にし（Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４（６）：６２５−３７；Ｎｏｖｏｔｎｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ８（６）：ｅ６７６２９；Ｂｒｏｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ９３（６）：１２４６−５８）、このことは、バイオフィルム構造内のこのファミリーのタンパク質の重要性および普遍性を実証する。ＤＮＡＢＩＩファミリーのＤＮＡとの公知の相互作用を仮定すれば、出願人らがＤＮＡとＤＮＡＢＩＩタンパク質だけで細菌バイオフィルムにおいて観察される３次元スキャフォールド様構造を再現する条件を作り出すことができないことは予想外であった。
ポリアミンは、細胞内外で遍在性であり、バイオフィルムのｅＤＮＡ−スキャフォールド化ＥＰＳ構造に必要とされる
【０１６３】
ポリアミンは、典型的に、中性ｐＨで正に荷電し（塩基性）、かつ一般にアミノ酸の脱炭酸によって派生する多数の第１級アミンを含有する短い有機分子である（図１Ｂ）。Ｍｉｃｈａｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．  ４７３（１５）：２３１５−２９。ポリアミンは、天然で遍在性であり、細胞内および細胞外の両方でｍＭ濃度の高さで見出され（Ｔａｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．  ４９（１）：８１−９９）、スペルミジン、スペルミンおよびプトレシンは、最も豊富である。ポリアミンは、細菌生理機能において多数のプロセスに関与するが、それらは、おそらく、５つの理由のためにｅＤＮＡ−スキャフォールド化ＥＰＳにとって最も重要である。第１に、それらは、ＤＮＡに結合し、リン酸骨格の負電荷を中和し、結果として、ＤＮＡ構造を変更する。Ｂａｃｈｒａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ  Ｓｃｉ．  ６（６）：５５９−６６；Ｐａｓｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ．  ４６（３）：５９５−６０３。第２に、ポリアミンは、低濃度（ｍＭ）でタンパク質−ＤＮＡ相互作用を促進する傾向がある一方で、それらは、より高濃度（ｍＭ）では干渉する傾向があるが、唯一の例外は、ＤＮＡに厚い繊維を形成させるＤＮＡＢＩＩ−ＤＮＡ相互作用である。Ｓａｒｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ４８（４）：６６７−７５；Ｓａｒｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３５（３）：９５１  ６１。第３に、ポリアミン合成は、バイオフィルム形成中に誘導されること、およびこれらの効果の一部は、細胞外で起こること（今まで細菌膜について調べられたのみであるが）が分かっている。Ｗｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ６０（１）：５４４−５３。第４に、ポリアミンとＤＮＡとの混合物を可視化する原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ：ａｔｏｍｉｃ  ｆｏｒｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）による実験により、バイオフィルムｅＤＮＡスキャフォールドと高度に類似する構造が明らかになっている（図１Ｃ）。最後に、ポリアミンは、生理的濃度（１００μＭ）で傾向配列（ｐｒｏｎｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）においてネイティブＢ型ＤＮＡのＺ型ＤＮＡへの変換を誘導し得る。Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４（１６）：６７２１−３３；Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２０１（２）：４６３−７。
Ｂ−ＤＮＡのＺ−ＤＮＡへの変換は、ｅＤＮＡ−スキャフォールド化ＥＰＳをヌクレアーゼ抵抗性にし、安定な構造材料を作り出すための新規手段であり得る
【０１６４】
Ｂ−ＤＮＡおよびＺ−ＤＮＡは、ｄｓＤＮＡの、平衡で存在する別個のコンフォメーションであり、Ｂ−ＤＮＡは、ほとんどの生理的条件下で優勢である。交互のプリンおよびピリミジン（特にｄＧｄＣ）は、高塩（モル濃度の一価または二価カチオン）において、または負の超らせん下において、よりＺ−ＤＮＡとして存在する傾向がある。Ｐｏｈｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８３）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｓｙｍｐ  Ｑｕａｎｔ  Ｂｉｏｌ．  ４７  Ｐｔ  １：１１３−７；Ｐｏｈｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ８３（１４）：４９８３−７。後者の場合、Ｚ−ＤＮＡを形成する傾向のある領域は、負の超らせんが一過性に誘導される場合、転写中に一時的にＢ−ＤＮＡの隣に並置され得る。Ｒａｈｍｏｕｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６（５）：５６９−７２。Ｂ−ＤＮＡ塩基は右巻きヘリックス（１０ｂｐ／ターン）を採用するが、Ｚ−ＤＮＡは左巻きヘリックス（１２ｂｐ／ターン）を形成する。Ｊｏｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ．  ３８：５２１−６０。Ｂ−ＤＮＡは２つの溝（主溝および副溝）を有し、ほとんどの相互作用するタンパク質は、より大きなサイズのために主溝を認識／結合し、各ヌクレオチド塩基の水素結合ドナーおよびアクセプターを識別する。対照的に、Ｚ−ＤＮＡでは主溝は非存在であり、それらの結合接触のほとんどは、凸面で見出される。Ｊｏｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ．  ３８：５２１−６０。Ｚ−ＤＮＡは、Ｂ−ＤＮＡの副溝に対応する単一の溝を所有する。興味深いことに、ＤＮＡＢＩＩタンパク質は、副溝に結合するほんの少数のＤＮＡ結合タンパク質のうちの１つであり（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．  ７０（Ｐｔ  １２）：３２７３−８９）、それらがＺ−ＤＮＡに結合し得ることを示唆する。ｅＤＮＡのＢ−ＤＮＡからＺ−ＤＮＡへのシフトは、ｅＤＮＡ−スキャフォールド化ＥＰＳの４つの観察と一致する。第１に、Ｚ−ＤＮＡへのシフトは、バイオフィルムＥＰＳに存在する条件下で起こり；傾向配列は、生理的濃度（１００ｍＭ）の一部のポリアミン（スペルミジンおよびスペルミン）の存在下でＺ−ＤＮＡにシフトする。第２に、Ｚ−ＤＮＡは、凝集し、繊維を形成する傾向がある。Ｃｈａｉｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｄｙｎ．  ５（６）：１１８７−２０７。Ｚ−ＤＮＡ骨格中のホスフェートは、Ｂ−ＤＮＡ中のホスフェートよりも緊密にまとめられるので、リン酸骨格の強い負電荷の中和（例えば、ポリアミン）は、Ｚ−ＤＮＡを好むが、ＤＮＡ凝集にも許容的である。第３に、Ｚ−ＤＮＡは、Ｂ−ＤＮＡよりも硬く、出願人らがｅＤＮＡスキャフォールドで観察している直線繊維と一致する、持続長のほぼ３倍の増加を有する（Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８３）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １１（６）：１９１９−３０）（図１Ａ、図２、図３）。そして最後に、Ｚ−ＤＮＡは、ヌクレアーゼ抵抗性である。標準的なＢ−ＤＮＡ結���タンパク質とは異なり、Ｚ−ＤＮＡを認識する公知のタンパク質は、ほんの少数である（Ａｔｈａｎａｓｉａｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｓｅｍｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．  ２３（３）：２７５−８０）（しかしながら、Ｚ−ＤＮＡ対Ｂ−ＤＮＡ識別抗体は利用可能である）。Ｂｅｒｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３９（３）：７４３−８。興味深いことに、Ｚ−ＤＮＡ結合タンパク質は、相同であり、Ｂ−ＤＮＡよりもＺ−ＤＮＡに１，０００〜１０，０００倍高い親和性で結合し（Ｈｅｒｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２７１（２０）：１１５９５−８）、傾向配列においてＺ−ＤＮＡコンフォメーションを誘導し、少なくともＺＢＰ１の場合、微生物ＤＮＡの存在を検出する自然免疫系の部分である。Ａｔｈａｎａｓｉａｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｓｅｍｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．  ２３（３）：２７５−８０。重要なことに、ワトソンクリック塩基対形成が保存されているという事実にもかかわらず、Ｂ−ＤＮＡを基質として使用するタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ）は、Ｚ配置の同じＤＮＡ配列を認識することができず、したがって、これに対して機能することができない。
ＩＩ．３部構成のアプローチ
【０１６５】
出願人らは、以前に、ｅＤＮＡ−ＤＮＡＢＩＩ相互作用は、バイオフィルムＥＰＳの構造的完全性を維持するために働くこと（Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４（６）：６２５−３７；Ｎｏｖｏｔｎｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ８（６）：ｅ６７６２９；Ｄｅｖａｒａｊ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ９６（６）：１１１９−３５；Ｒｏｃｃｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７）  Ｍｏｌ  Ｏｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３２（２）：１１８−３０；Ｄｅｖａｒａｊ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７）  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙｏｐｅｎ．；Ｂｒｏｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ９３（６）：１２４６−５８）、およびこれらの相互作用を破壊することは、ｅｘ  ｖｉｖｏで（Ｇｕｓｔａｖｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｊ  Ｃｙｓｔ  Ｆｉｂｒｏｓ．  １２（４）：３８４−９）、およびｉｎ  ｖｉｖｏで（Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４（６）：６２５−３７；Ｎｏｖｏｔｎｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ．  １０：３３−４４；Ｆｒｅｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７）  Ｍｏｌ  Ｏｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３２（１）：７４−８８）正の成果をもたらすことを示した。ＤＮＡおよびＤＮＡＢＩＩタンパク質の両方が必要であることが示されたが、それらは、ＥＰＳスキャフォールドアーキテクチャを再現するために十分ではない。（１）ｅＤＮＡ、（２）ＤＮＡＢＩＩタンパク質および新しく発見されたＥＰＳ構成要素（３）ポリアミンの存在および相対的場所に依拠する、ｅＤＮＡ−ＤＮＡＢＩＩ依存性ＥＰＳの３部構成のｅＤＮＡ依存性スキャフォールド（ＴＥＤＳ：ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  ｅＤＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）が、本明細書で開示される。
【０１６６】
一態様では、出願人らは、ｅＤＮＡおよびＤＮＡＢＩＩタンパク質に加えて、ポリアミンは、細菌バイオフィルムのＴＥＤＳ構造の必須構成成分であることを示す。第２に、出願人らは、合わせて、これらの構成成分のうちの全ての３つは、保護的バイオフィルム状態において細菌属の中で生産的相互作用を育成し得る普遍的ＥＰＳの形成を促進することを示す。第３に、これらの構成成分を使用して、出願人らは、この普遍的構造を定義、かつ再現し、厚い二本鎖ＤＮＡ繊維の観察と一致する証拠、ヌクレアーゼ抵抗性状態（ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｓｔａｔｅ）の誘導を提供し、この状態が構造的エンドポイントとしてＺ−ＤＮＡを必要とするかどうかを実証する。最後に、このことは、介入のための標的としてＴＥＤＳ構造それ自体に焦点を当てる診断および治療介入を提供する。
Ａ．ポリアミン
ポリアミンはＤＮＡＢＩＩタンパク質と共同して機能して、ｅＤＮＡスキャフォールドのアセンブリーを方向付ける
【０１６７】
ＮＴＨＩにより引き起こされた急性中耳炎のチンチラモデルは、ヒト疾患の過程および病態生理を忠実に再現し（Ｂａｋａｌｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．  ８（８）：１０６３−８２）、中耳における不応性バイオフィルムに依存する。このモデルを使用して、出願人らは、以前に、ＤＮＡＢＩＩタンパク質がｅＤＮＡと会合し、それがｅＤＮＡ鎖の頂点に局在すること（図１Ａ）（Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４（６）：６２５−３７）、およびこれらのｅＤＮＡ鎖は、ＡＦＭによってＤＮＡで可視化されたポリアミンに著しく類似しているようであること（図１Ｃ）を示した。Ｉａｃｏｍｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．  １２（４）：１１７８−８６。ＤＮＡＢＩＩタンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｍＭ濃度のスペルミジンの存在下においてＤＮＡに結合し（図２Ｂ）、このことから、バイオフィルムｅＤＮＡスキャフォールド構造を産生するＤＮＡＢＩＩタンパク質とポリアミンとの間の潜在的相互作用を調査した。出願人らは、固定包埋中耳粘膜バイオフィルムの切片について免疫蛍光共焦点レーザー走査顕微鏡法（ＣＬＳＭ：ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｌａｓｅｒ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を行って、出願人らが以前にＤＮＡＢＩＩタンパク質について観察したように、バイオフィルムＥＰＳ内のｅＤＮＡと相互作用するポリアミンを可視化した。免疫蛍光画像により、ｅＤＮＡとポリアミンとは、粘膜バイオフィルム内に存在する繊維に沿って共局在し（図２Ａ）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＤＮＡＢＩＩタンパク質およびポリアミンについてＨｕｄおよび共同研究者らによって観察されたものと視覚的に類似することが示される（Ｓａｒｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ４８（４）：６６７−７５；Ｓａｒｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３５（３）：９５１  ６１）（図２Ｂ）。
ポリアミン生合成は、バイオフィルム構造に必要とされる
【０１６８】
出願人らは、広範囲作用ポリアミン生合成阻害剤であるジシクロヘキシルアミン（ＤＣＨＡ：ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｅ）が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＮＴＨＩバイオフィルムバイオジェネシスを変更し得るかどうかを調査した。ＤＣＨＡは、プトレシンのスペルミジンへの変換を触媒する酵素であるスペルミジンシンターゼを阻害する（Ｐａｕｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  Ａｎｔｏｎｉｅ  Ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ．  ５２（６）：４８３−９０；Ｐｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８３）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  １５５（２）：１９２−６）。ＤＣＨＡはＮＴＨＩ成長に影響を及ぼさなかったが（データは示さず）、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）染色したＮＴＨＩバイオフィルムのＣＬＳＭ画像のＣＯＭＳＴＡＴ分析（Ｈｅｙｄｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．  １４６  （Ｐｔ  １０）：２３９５−４０７）によって決定される通り、ＤＣＨＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでバイオフィルムバイオジェネシスを阻害し、平均の厚さおよびバイオマスを減少させた（図３Ａ）。さらに、出願人らは、ＤＣＨＡが、初期バイオフィルム発達においてｅＤＮＡスキャフォールドの産生を阻害すること（図３Ｂ）を発見し、このことは、ポリアミン生合成がバイオフィルム形成に必要なステップであることを示唆する。これらの発見を支持して、出願人らは、免疫蛍光によって、ＤＣＨＡが細胞外ポリアミンのバイオフィルムＥＰＳへの組込みを低減すること（図３Ｃ）、およびバイオフィルムバイオジェネシスの欠陥は外因性スペルミジンの添加によって補われ得ること（図３Ａ）を観察した。合わせて、これらの結果は、ポリアミンのＥＰＳへの組込みは、強固なバイオフィルム成長の支持におけるｅＤＮＡスキャフォールドの発達および機能に重要であることを明らかにする。
抗ＤＮＡＢＩＩは、ＤＮＡＢＩＩ−ポリアミン依存性ＤＮＡ構造を破壊する
【０１６９】
免疫蛍光を使用して、ＤＮＡＢＩＩタンパク質がＥＰＳミメティック構造に組み込まれるかどうかを決定した。スペルミジン（３００μＭ）およびＨＵ（１μＭ）を、ゲノムＤＮＡ（２μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。その後、ＥＰＳミメティック構造を、ナイーブ（対照）または抗ＤＮＡＢＩＩ  ＩｇＧ、蛍光二次抗体でプローブし、ＤＡＰＩで染色し、ＣＬＳＭによって画像化した。ＤＮＡＢＩＩタンパク質は、ＥＰＳ構造に完全に組み込まれた（図４Ａ）。次に、ＥＰＳミメティック構造を形成させ、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体で処理し、ＤＡＰＩで染色し、ＣＬＳＭによって画像化した。抗ＤＮＡＢＩＩ抗体による、ＤＮＡＢＩＩタンパク質のＥＰＳミメティックからの隔離は、凝集構造の存在量およびサイズを劇的に低減し（図４Ｂ）、このことにより、ＤＮＡＢＩＩ組込み、およびＤＮＡ構造安定性のためのその重要性をさらに確認した。
カチオン交換体Ｐ１１によるＮＴＨＩバイオフィルム破壊は、外因性ＤＮＡＢＩＩ（ＨＵ）およびスペルミジン添加によって妨げられ得る
【０１７０】
ホスホセルロース（Ｐ１１）は、正荷電分子、例えば、ポリアミンおよびＤＮＡＢＩＩタンパク質について高親和性を有する負荷電樹脂である。細菌バイオフィルム形成に対するこれらの分子のＰ１１による隔離の効果を決定するために、出願人らは、トランスウェル系を利用した。ＮＴＨＩ成長を基底側チャンバーで開始し、一方で、Ｐ１１（１％  ｗ／ｖ）を、播種時に頂端側チャンバーに添加した。１６時間で、バイオフィルムを洗浄し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）で染色し、ＣＬＳＭを使用して画像化し、ＣＯＭＳＴＡＴにより分析した。Ｐ１１は、平均の厚さおよびバイオマスを有意に低減させた（図５）。Ｐ１１によるカチオン枯渇がポリアミンおよび／またはＤＮＡＢＩＩタンパク質を含んだかどうかを決定するために、基底側チャンバーにおいてＮＴＨＩ成長を、１ｍＭスペルミジンおよび１μＭ  ＨＵの外因性添加を伴って開始し、一方で、Ｐ１１を頂端側チャンバーに１％  ｗ／ｖで添加した。スペルミジンおよびＨＵの両方は、バイオフィルムマトリックスの構造構成成分に必要とされ、共に存在するときにのみＰ１１によるバイオフィルム破壊を妨げ（図５）；個々では、ＨＵおよびスペルミジンは不十分であった（データは示さず）。
ＤＮアーゼは、成熟病原性細菌バイオフィルムを破壊することができない
【０１７１】
出願人らは、肺機能を改善するために嚢胞性線維症（ＣＦ）患者の管理のための標準療法と共に使用される組換えヒトＤＮアーゼであるＰｕｌｍｏｚｙｍｅ（登録商標）の抗バイオフィルム効果を評価した。Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７）  Ｐａｅｄｉａｔｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｒｅｖ．  ２１：６５−７。播種時（バイオフィルム予防）または事前に形成されたバイオフィルム（バイオフィルム破壊）のいずれかに、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ（登録商標）を添加した（図６）。結果として生じるバイオフィルムを、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）で染色し、ＣＬＳＭおよびＣＯＭＳＴＡＴ分析を使用して評価した。播種時のＤＮアーゼの添加は、非処理のバイオフィルムと比較して、ＮＴＨＩおよびＵＰＥＣバイオフィルムの平均の厚さおよびバイオマスの有意な低減をもたらした（図６）。しかしながら、ＤＮアーゼは、成熟バイオフィルムを破壊することができず（図６）、このことは、バイオフィルムが発達するにつれてｅＤＮＡはヌクレアーゼ消化に対する感受性を失うことを示唆する。出願人らは、バイオフィルムが成熟するにつれて、ｅＤＮＡがヌクレアーゼから立体的に保護されること、および／またはｅＤＮＡがヌクレアーゼ消化に対して不応性になる新規の構造をとるかのいずれかであることを提案する。
ＤＮＡＢＩＩタンパク質およびポリアミンは、相乗的に相互作用してＤＮＡにヌクレアーゼ抵抗性を与える
【０１７２】
抗ＤＮＡＢＩＩおよび抗スペルミジン抗体でプローブしたＮＴＨＩバイオフィルムの免疫蛍光は、ポリアミンがｉｎ  ｖｉｔｒｏ（図７Ａ）およびｉｎ  ｖｉｖｏ（図７Ｂ）でＤＮＡＢＩＩタンパク質と共に共局在することを示した。出願人らは、ＤＮＡＢＩＩおよびポリアミンはｅＤＮＡと相乗的に相互作用して、成熟バイオフィルムにＤＮアーゼ抵抗性を与えると仮定した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの相乗作用を試験するために、出願人らは、ＨＵ（５０または１００ｎＭ）およびＤＮアーゼ（０．５ユニット）の存在下または非存在下でＮＴＨＩゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）をスペルミジン（１０、２０、５０または１００μＭ）とインキュベートした。アガロースゲル電気泳動およびＵＶ照射によって分解を評価した。スペルミジン（１００μＭを超える）およびＨＵ（１μＭ）は個々にｇＤＮＡを保護した一方で、混合した、より低レベルのスペルミジン（５０μＭ未満）およびＨＵ（１００ｎＭ未満）はｇＤＮＡ消化を相乗的に阻害し（図７）、ヌクレアーゼ抵抗性は、バイオフィルムマトリックス内のＤＮＡＢＩＩタンパク質とポリアミンとの組合せのためであることを示唆した。次に、出願人らは、ＥＰＳミメティック構造がＤＮアーゼに抵抗性であるかどうかを試験することにした。ＨＵ（１μＭ）およびスペルミジン（３００ｍＭ）を、ｇＤＮＡ（２μｇ／ｍｌ）と４０時間インキュベートして、ＥＰＳスキャフォールドミメティックを作製し、次にＤＮアーゼ（５ユニット）で処理した。ＣＬＳＭによって示される通り、これらのＤＮＡＢＩＩ−ポリアミン依存性ＤＮＡ構造は、成熟バイオフィルムと同様に、ＤＮアーゼに抵抗性であった（図７Ｄ）。
Ｂ．ＤＮＡＢＩＩ、ポリアミンおよびＤＮＡはｉｎ  ｖｉｔｒｏでＺ−ＤＮＡを形成する
【０１７３】
ポリアミンは、結合に際して、Ｚ−ＤＮＡ傾向配列を、Ｂ−Ｚ平衡からＺ−ＤＮＡ配置にシフトさせ（Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４（１６）：６７２１−３３；Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２０１（２）：４６３−７）、一方で、ＤＮＡＢＩＩタンパク質は、ＤＮＡを曲げ、凝縮させる。出願人らのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＤＮアーゼ分解アッセイ（図７）におけるＨＵおよびスペルミジン結合による阻害の相乗作用、およびＺ−ＤＮＡのＤＮアーゼに抵抗する能力のために、出願人らは、ＥＰＳミメティック構造がＺ−ＤＮＡを含有し得ると仮定した。ＥＰＳ構造を、図４および図７のようにｇＤＮＡで１６時間形成させた。抗Ｚ−ＤＮＡ抗体でプローブして免疫蛍光ＣＬＳＭを行い、これにより、Ｚ−ＤＮＡの存在を確認した（白色に留意されたい；図８Ａ）。ＤＮＡＢＩＩタンパク質がＢ−Ｚ平衡に影響を及ぼすかどうかを決定するために、出願人らは、円二色性（ＣＤ：ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ）を使用した。ＨＵおよびポリ（ｄＧｄＣ）ＤＮＡ基質の混合物は、特徴的なＺ−ＤＮＡスペクトルと類似する、Ｂ−ＤＮＡ単独楕円率ピーク（２５０および２８０ｎｍ）の反転を示す（Ｊａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．  ５：９９４３）（図８Ｂ）。
細菌バイオフィルム中のＥＰＳはＺ−ＤＮＡおよびポリアミンを含有する
【０１７４】
Ｚ−ＤＮＡとポリアミンとの会合をさらに特徴付けるために、出願人らは、４０時間のバイオフィルムについて免疫蛍光を行った。示される細菌病原体のバイオフィルムを、抗ＤＮＡＢＩＩおよび抗スペルミジン、または抗Ｚ−ＤＮＡ抗体でプローブした後にＣＬＳＭによって画像化すると；Ｚ−ＤＮＡが、細菌病原体の各々のバイオフィルムＥＰＳ内で検出された（図９）一方で、明らかに種間で階層が存在した（ＵＰＥＣ＝Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ＜Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ＜ＮＴＨＩ）。全ての場合で、ＤＮＡＢＩＩ（ＨＵ）とスペルミジンとの間で広範な共局在が存在し（白色に留意されたい）、かつＺ−ＤＮＡの存在量に対応した。出願人らは、ＮＴＨＩおよびＵＰＥＣバイオフィルムをバイオフィルム形成の様々な段階（２４、４０および９０時間）でさらに調べ、スペルミジンおよびＺ−ＤＮＡが、バイオフィルムの熟成と共にバイオフィルムＥＰＳ内で併せて増加することを観察した（図１０）。これらのデータは、Ｚ−ＤＮＡおよびスペルミジンが、実際に、バイオフィルムＥＰＳの不可欠な部分であり、その構造およびＤＮアーゼ抵抗性状態に寄与するようであることを示唆する。
ＨＵ欠損ＮＴＨＩはネイティブバイオフィルムを形成すること、ポリアミンを組み込むこと、およびＢ−ＤＮＡからＺ−ＤＮＡへのシフトを誘導することができない
【０１７５】
ポリアミンは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（図７Ａおよび図９）およびｉｎ  ｖｉｖｏ（図７Ｂ）でＮＴＨＩバイオフィルムＥＰＳ内においてＨＵと共局在するので、出願人らは、ＮＴＨＩバイオフィルムＥＰＳ内でのポリアミンおよびＺ−ＤＮＡの組込みにおけるＨＵの役割を評価した。免疫蛍光により、ＨＵ欠損ＮＴＨＩ（ｈｕｐＡ欠損；ＤＨＵ）を、ポリアミンおよびＺ−ＤＮＡの存在についてＷＴ  ＮＴＨＩバイオフィルムと比較した。ＨＵの欠損は、ＷＴと比較してバイオフィルムＥＰＳ内のポリアミンおよびＺ−ＤＮＡの有意な低減をもたらし（図１１）、このことは、ＨＵがＮＴＨＩバイオフィルムＥＰＳ内でポリアミンおよびＺ−ＤＮＡの存在に必要とされることを示唆する。
ＩＩＩ．診断方法および治療方法
【０１７６】
対象においてバイオフィルムを処置するための方法であって、バイオフィルムに感染した対象に、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の作用物質を投与することを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる方法が、本明細書で提供される。一態様では、作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない。別の態様では、作用物質は、ＤＮアーゼの非存在下で提供される。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質の投与に続いて投与される。特定の一態様では（Ｉｎ  ｏｎｅ  ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  ａｓｐｅｃｔ）、投与されるＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。一態様では、対象においてバイオフィルムを処置するための方法は、バイオフィルムに感染した対象に、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の１種または複数種の作用物質を投与することを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる。一態様では、作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない。別の態様では、作用物質は、ＤＮアーゼの非存在下で提供される。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質の投与に続いて投与される。特定の一態様では、投与されるＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。別の態様では、対象においてバイオフィルムを処置するための方法は、バイオフィルムに感染した対象に、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の２種またはそれよりも多くの種の作用物質を投与することを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、一態様では、作用物質は、ＤＮアーゼの非存在下で投与される。別の態様では、作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質の投与に続いて投与される。特定の一態様では、投与されるＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。さらなる態様では、対象においてバイオフィルムを処置するための方法は、バイオフィルムに感染した対象に、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の３種またはそれよりも多くの種の作用物質を投与することを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、一態様では、作用物質は、ＤＮアーゼの非存在下で投与される。別の態様では、作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質の投与に続いて投与される。特定の一態様では、投与されるＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。またさらなる態様では、対象においてバイオフィルムを処置するための方法は、バイオフィルムに感染した対象に、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の４種もしくはそれよりも多くの種の、またはあるいは、５種もしくはそれよりも多くの種の、またはあるいは、６種もしくはそれよりも多くの種の、またはあるいは、７種もしくはそれよりも多くの種の、またはあるいは、８種もしくはそれよりも多くの種の、またはあるいは、９種もしくはそれよりも多くの種の、またはあるいは、１０種もしくはそれよりも多くの種の作用物質を投与することを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、一態様では、作用物質は、ＤＮアーゼの非存在下で投与される。別の態様では、作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質の投与に続いて投与される。特定の一態様では、投与されるＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。
【０１７７】
また、本開示は、バイオフィルムを発生しやすい対象においてバイオフィルムの形成を予防するための方法であって、対象に、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の作用物質を投与することを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、一態様では、作用物質が、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもなく、別の態様では、作用物質が、ＤＮアーゼの非存在下で投与される、方法に関する。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質の投与に続いて投与される。特定の一態様では、投与されるＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。一態様では、バイオフィルムを発生しやすい対象においてバイオフィルムの形成を予防するための方法は、対象に、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の１種または複数種の作用物質を投与することを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもなく、別の態様では、作用物質は、ＤＮアーゼの非存在下で投与される。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質の投与に続いて投与される。特定の一態様では、投与されるＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。別の態様では、バイオフィルムを発生しやすい対象においてバイオフィルムの形成を予防するための方法は、対象に、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の２種またはそれよりも多くの種の作用物質を投与することを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、一態様では、作用物質は、ＤＮアーゼの非存在下で投与される。別の態様では、作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質の投与に続いて投与される。特定の一態様では、投与されるＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。さらなる態様では、バイオフィルムを発生しやすい対象においてバイオフィルムの形成を予防するための方法は、対象に、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の３種またはそれよりも多くの種の作用物質を投与することを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、一態様では、作用物質は、ＤＮアーゼの非存在下で投与される。別の態様では、作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質の投与に続いて投与される。特定の一態様では、投与されるＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。またさらなる態様では、バイオフィルムを発生しやすい対象においてバイオフィルムの形成を予防するための方法は、対象に、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の４種もしくはそれよりも多くの種の、またはあるいは、５種もしくはそれよりも多くの種の、またはあるいは、６種もしくはそれよりも多くの種の、またはあるいは、７種もしくはそれよりも多くの種の、またはあるいは、８種もしくはそれよりも多くの種の、またはあるいは、９種もしくはそれよりも多くの種の、またはあるいは、１０種もしくはそれよりも多くの種の作用物質を投与することを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、一態様では、作用物質は、ＤＮアーゼの非存在下で投与される。別の態様では、作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質の投与に続いて投与される。特定の一態様では、投与されるＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。
【０１７８】
本開示は、それを必要とする対象において、バイオフィルムを産生する細菌によって引き起こされる感染を処置するための方法であって、対象に、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の作用物質と、その生物の複製を阻害する作用物質とを投与することを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、一態様では、作用物質が、ＤＮアーゼの非存在下で投与される、方法にさらに関する。別の態様では、作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質の投与に続いて投与される。特定の一態様では、投与されるＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。一態様では、それを必要とする対象において、バイオフィルムを産生する細菌によって引き起こされる感染を処置するための方法は、対象に、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の１種または複数種の作用物質を投与することを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる。別の態様では、それを必要とする対象において、バイオフィルムを産生する細菌によって引き起こされる感染を処置するための方法は、対象に、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の２種またはそれよりも多くの種の作用物質と、その生物の複製を阻害する作用物質とを投与することを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる。一態様では、作用物質は、ＤＮアーゼの非存在下で投与される。別の態様では、作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質の投与に続いて投与される。特定の一態様では、投与されるＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。さらなる態様では、それを必要とする対象において、バイオフィルムを産生する細菌によって引き起こされる感染を処置するための方法は、対象に、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の３種またはそれよりも多くの種の作用物質と、その生物の複製を阻害する作用物質とを投与することを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、一態様では、作用物質は、ＤＮアーゼの非存在下で投与される。別の態様では、作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質の投与に続いて投与される。特定の一態様では、投与されるＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。またさらなる態様では、それを必要とする対象において、バイオフィルムを産生する細菌によって引き起こされる感染を処置するための方法は、対象に、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の４種もしくはそれよりも多くの種の、またはあるいは、５種もしくはそれよりも多くの種の、またはあるいは、６種もしくはそれよりも多くの種の、またはあるいは、７種もしくはそれよりも多くの種の、またはあるいは、８つもしくはそれよりも多くの種の、またはあるいは、９種もしくはそれよりも多くの種の、またはあるいは、１０種もしくはそれよりも多くの種の作用物質と、その生物の複製を阻害する作用物質とを投与することを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、一態様では、作用物質は、ＤＮアーゼの非存在下で投与される。別の態様では、作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質の投与に続いて投与される。特定の一態様では、投与されるＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。
【０１７９】
上記に説明する方法のうちのいずれかについて、ポリアミンは、プトレシン、スペルミン、カダベリン、１，３−ジアミノプロパンまたはスペルミジンの群から選択され得る。一実施形態では、上記に説明する方法について、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する作用物質は、ｔＲＮＡである。別の実施形態では、作用物質は、ポリアミン合成の阻害剤、またはポリアミンのＤＮＡへの結合を阻害する作用物質である。第２の実施形態では、作用物質は、ポリアミンアナログであるジフルオロメチルオルニチン、トランス−４−メチルシクロヘキシルアミン、サルドモジド、メチルグリオキサール−ビス［グアニルヒドラゾン］（ＭＧＢＧ）、１−アミノオキシ−３−アミノプロパン、オキサリプラチン、シスプラチン、ジシクロヘキシルアミン、任意のその誘導体、またはその塩を含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる。一態様では、これらの化合物の誘導体は、同じ質量対電荷比を維持する。第３の実施形態では、作用物質は、バイオフィルムからカチオンを枯渇させる作用物質、必要に応じて、カチオン交換樹脂、アミノポリカルボン酸、クラウンエーテル、アザクラウンまたはクリプタンドを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる。第４の実施形態では、バイオフィルムからカチオンを枯渇させる作用物質は、スルホネート、スルホプロピル、ホスホセルロース、Ｐ１１ホスホセルロース、ヘパリン硫酸またはその誘導体もしくはアナログの群から選択される。一態様では、バイオフィルムからカチオンを枯渇させる作用物質の誘導体またはアナログは、正味の負電荷を有する樹脂である。第５の実施形態では、作用物質は、バイオフィルムまたはその局所環境においてＢ−ＤＮＡのＺ−ＤＮＡへの変換に干渉する。第６の実施形態では、作用物質は、抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体を含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる。一態様では、ポリクローナルまたはモノクローナル抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体は、Ｚ型ＤＮＡよりもＢ型ＤＮＡを、少なくとも１０倍の親和性／結合活性で認識する。第７の実施形態では、作用物質は、リボフラビン、エチジウムブロマイド、ビス（メチジウム）スペルミン、ダウノルビシン、ＴＭＰｙＰ４、第四級ベンゾ［ｃ］フェナントリジンアルカロイド、キナクリン、９−アミノアクリジンまたはその誘導体を含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる。第８の実施形態では、作用物質は、クロロキンまたはその誘導体を含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる。一態様では、化合物の誘導体は、ＤＮＡ塩基間に介入する能力を保持する。一態様では、作用物質は、ＨＧＭＢ１タンパク質でもその断片でもない。一態様では、バイオフィルムからカチオンを枯渇させる作用物質は、正味の負電荷を有する。別の態様では、バイオフィルムからカチオンを枯渇させる作用物質は、正味の中性電荷を有する。
【０１８０】
また、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および／または嚢胞性線維症（ＣＦ）を患う患者においてバイオフィルムを処置するための方法であって、バイオフィルムまたはその局所環境においてＢ−ＤＮＡのＺ−ＤＮＡへの変換に干渉する有効量の作用物質を投与することを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、一態様では、作用物質が、ＤＮアーゼの非存在下で投与される、方法が、本明細書で提供される。別の態様では、作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質の投与に続いて投与される。特定の一態様では、投与されるＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および／または嚢胞性線維症（ＣＦ）および／またはＴＢを患う患者においてバイオフィルムを処置するための方法であって、バイオフィルムまたはその局所環境においてＢ−ＤＮＡのＺ−ＤＮＡへの変換に干渉する有効量の１種または複数種の作用物質を投与することを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、一態様では、作用物質が、ＤＮアーゼの非存在下で投与される、方法が、本明細書で開示される。別の態様では、作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質の投与に続いて投与される。特定の一態様では、投与されるＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。一態様では、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および／または嚢胞性線維症（ＣＦ）および／またはＴＢを患う患者においてバイオフィルムを処置するための方法であって、バイオフィルムまたはその局所環境においてＢ−ＤＮＡのＺ−ＤＮＡへの変換に干渉する有効量の２種またはそれよりも多くの種の作用物質を投与することを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、一態様では、作用物質が、ＤＮアーゼの非存在下で投与される、方法が、本明細書で開示される。別の態様では、作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質の投与に続いて投与される。特定の一態様では、投与されるＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。別の態様では、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および／または嚢胞性線維症（ＣＦ）および／またはＴＢを患う患者においてバイオフィルムを処置するための方法であって、バイオフィルムまたはその局所環境においてＢ−ＤＮＡのＺ−ＤＮＡへの変換に干渉する有効量の３種またはそれよりも多くの種の作用物質を投与することを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる方法が、本明細書で開示される。さらなる態様では、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および／または嚢胞性線維症（ＣＦ）および／またはＴＢを患う患者においてバイオフィルムを処置するための方法であって、バイオフィルムまたはその局所環境においてＢ−ＤＮＡのＺ−ＤＮＡへの変換に干渉する有効量の４種もしくはそれよりも多くの種の、またはあるいは、５種もしくはそれよりも多くの種の、またはあるいは、６種もしくはそれよりも多くの種の、またはあるいは、７種もしくはそれよりも多くの種の、またはあるいは、８種もしくはそれよりも多くの種の、またはあるいは、９種もしくはそれよりも多くの種の、またはあるいは、１０種もしくはそれよりも多くの種の作用物質を投与することを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、一態様では、作用物質が、ＤＮアーゼの非存在下で投与される、方法が、本明細書で開示される。別の態様では、作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質の投与に続いて投与される。特定の一態様では、投与されるＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。一実施形態では、作用物質は、バイオフィルムまたはその局所環境においてＢ−ＤＮＡのＺ−ＤＮＡへの変換に干渉する。第２の実施形態では、作用物質は、抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体を含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる。一態様では、ポリクローナルまたはモノクローナル抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体は、Ｚ型ＤＮＡよりもＢ型ＤＮＡを、少なくとも１０倍の親和性／結合活性で認識する。第３の実施形態では、作用物質は、リボフラビン、エチジウムブロマイド、ビス（メチジウム）スペルミン、ダウノルビシン、ＴＭＰｙＰ４、第四級ベンゾ［ｃ］フェナントリジンアルカロイド、キナクリン、９−アミノアクリジンまたはその誘導体を含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる。第４の実施形態では、作用物質は、クロロキンまたはその誘導体を含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる。一態様では、化合物の誘導体は、ＤＮＡ塩基間に介入する能力を保持する。作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でもその断片でもない。
【０１８１】
また、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および／または嚢胞性線維症（ＣＦ）および／またはＴＢを患う患者においてバイオフィルムを処置するための方法であって、有効量のＨＭＧＢ１タンパク質またはその生物活性断片および抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体を投与することを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、一態様では、タンパク質および抗体が、ＤＮアーゼの非存在下で投与される、方法が、本明細書で提供される。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質の投与に続いて投与される。特定の一態様では、投与されるＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。一態様では、ポリクローナルまたはモノクローナル抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体は、Ｚ型ＤＮＡよりもＢ型ＤＮＡを、少なくとも１０倍の親和性／結合活性で認識する。ＨＭＧＢ１の生物活性断片は、Ａボックス、Ｂボックスおよび／もしくはＡＢボックス、Ｃ末端断片またはＮ末端断片のうちの１つまたは複数を含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる場合がある。特定の実施形態では、ＨＭＧＢ１の生物活性断片は、ＤＮＡを結合することができるＢボックスドメインを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる場合がある。一態様では、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および／または嚢胞性線維症（ＣＦ）および／またはＴＢを患う患者においてバイオフィルムを処置するための方法は、有効量のクロロキンおよび抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体を投与することを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、一態様では、クロロキンおよび抗体は、ＤＮアーゼの非存在下で投与される。別の態様では、作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質の投与に続いて投与される。特定の一態様では、投与されるＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。また、本開示は、プラチナベースの化学療法を受けているか、または受けた患者において化学療法の投与に付随するバイオフィルム産生感染を処置するための方法であって、バイオフィルムまたはその局所環境においてＢ−ＤＮＡのＺ−ＤＮＡへの変換に干渉する有効量の作用物質を投与することを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、一態様では、作用物質が、ＤＮアーゼの非存在下で投与される、方法に関する。別の態様では、作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質の投与に続いて投与される。特定の一態様では、投与されるＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。一態様では、本方法は、バイオフィルムまたはその局所環境においてＢ−ＤＮＡのＺ−ＤＮＡへの変換に干渉する有効量の１種または複数種の作用物質を投与することを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、一態様では、作用物質は、ＤＮアーゼの非存在下で投与される。別の態様では、作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質の投与に続いて投与される。特定の一態様では、投与されるＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。さらなる態様では、作用物質は、クロロキンまたはその誘導体を含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる。またさらなる態様では、作用物質は、抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体を含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる。一態様では、ポリクローナルまたはモノクローナル抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体は、Ｚ型ＤＮＡよりもＢ型ＤＮＡを、少なくとも１０倍の親和性／結合活性で認識する。一実施形態では、作用物質は、リボフラビン、エチジウムブロマイド、ビス（メチジウム）スペルミン、ダウノルビシン、ＴＭＰｙＰ４、第四級ベンゾ［ｃ］フェナントリジンアルカロイド、キナクリン、９−アミノアクリジンまたはその誘導体を含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる。特定の一態様では、化合物の誘導体は、ＤＮＡ塩基間に介入する能力を保持する。
【０１８２】
本開示は、プラチナベースの化学療法を受けているか、または受けた患者において化学療法の投与に付随するバイオフィルム産生感染を処置するための方法であって、有効量のＨＭＧＢ１タンパク質またはその生物活性断片および抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体を投与することを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、一態様では、タンパク質および抗体が、ＤＮアーゼの非存在下で投与される、方法にさらに関する。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質の投与に続いて投与される。特定の一態様では、投与されるＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。一態様では、ポリクローナルまたはモノクローナル抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体は、Ｚ型ＤＮＡよりもＢ型ＤＮＡを、少なくとも１０倍の親和性／結合活性で認識する。ＨＭＧＢ１の生物活性断片は、Ａボックス、Ｂボックスおよび／もしくはＡＢボックス、Ｃ末端断片またはＮ末端断片のうちの１つまたは複数を含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる場合がある。特定の実施形態では、ＨＭＧＢ１の生物活性断片は、ＤＮＡを結合することができるＢボックスドメインを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる場合がある。また、プラチナベースの化学療法を受けているか、または受けた患者において化学療法の投与に付随するバイオフィルム産生感染を処置するための方法であって、有効量のクロロキンおよび抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体を投与することを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、一態様では、クロロキンおよび抗体が、ＤＮアーゼの非存在下で投与される、方法が、本明細書で提供される。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質の投与に続いて投与される。特定の一態様では、投与されるＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。一態様では、ポリクローナルまたはモノクローナル抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体は、Ｚ型ＤＮＡよりもＢ型ＤＮＡを、少なくとも１０倍の親和性／結合活性で認識する。
【０１８３】
上記に説明する方法は、対象に、ｅＤＮＡのＤＮＡ結合タンパク質への結合に干渉する有効量の作用物質および／または抗菌剤を投与することをさらに含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる場合があり、一態様では、作用物質は、ＤＮアーゼの非存在下で投与される。別の態様では、作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質の投与に続いて投与される。特定の一態様では、投与されるＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。一態様では、本方法は、対象に、ｅＤＮＡのＤＮＡ結合タンパク質への結合に干渉する有効量の作用物質および／または抗菌剤を投与することをさらに含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、一態様では、作用物質は、ＤＮアーゼの非存在下で投与される。別の態様では、作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質の投与に続いて投与される。特定の一態様では、投与されるＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。別の態様では、ｅＤＮＡのＤＮＡ結合タンパク質への結合に干渉する作用物質は、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体、抗ＩＨＦ抗体および／もしくは抗ＨＵ抗体またはその各々の断片のうちの１つまたは複数を含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる。一実施形態では、ｅＤＮＡのＤＮＡ結合タンパク質への結合に干渉する作用物質は、正味の負電荷を有する。第２の実施形態では、ｅＤＮＡのＤＮＡ結合タンパク質への結合に干渉する作用物質は、正味の中性電荷を有する。第３の実施形態では、ｅＤＮＡのＤＮＡ結合タンパク質への結合に干渉する作用物質は、正味の正電荷を有する。
【０１８４】
バイオフィルムの安定性を阻害するための方法であって、バイオフィルムを、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の作用物質と接触させることを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、一態様では、作用物質が、ＤＮアーゼの非存在下で接触させられる、方法が、本明細書で説明される。別の態様では、作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質との接触に続いて接触させられる。特定の一態様では、ＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。一態様では、バイオフィルムの安定性を阻害するための方法は、バイオフィルムを、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の１種または複数種の作用物質と接触させることを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、一態様では、作用物質は、ＤＮアーゼの非存在下で接触させられる。別の態様では、作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質との接触に続いて接触させられる。特定の一態様では、ＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。別の態様では、バイオフィルムの安定性を阻害するための方法は、バイオフィルムを、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の２種またはそれよりも多くの種の作用物質と接触させることを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、一態様では、作用物質は、ＤＮアーゼの非存在下で接触させられる。別の態様では、作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質との接触に続いて接触させられる。特定の一態様では、ＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。さらなる態様では、バイオフィルムの安定性を阻害するための方法は、バイオフィルムを、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の３種またはそれよりも多くの種の作用物質と接触させることを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、一態様では、作用物質は、ＤＮアーゼの非存在下で接触させられる。別の態様では、作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質との接触に続いて接触させられる。特定の一態様では、ＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。またさらなる態様では、バイオフィルムの安定性を阻害するための方法は、バイオフィルムを、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の４種もしくはそれよりも多くの種の、またはあるいは、５種もしくはそれよりも多くの種の、またはあるいは、６種もしくはそれよりも多くの種の、またはあるいは、７種もしくはそれよりも多くの種の、またはあるいは、８種もしくはそれよりも多くの種の、またはあるいは、９種もしくはそれよりも多くの種の、またはあるいは、１０種もしくはそれよりも多くの種の作用物質と接触させることを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、一態様では、作用物質は、ＤＮアーゼの非存在下で接触させられる。別の態様では、作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質との接触に続いて接触させられる。特定の一態様では、ＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。接触させることは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏであり得る。
【０１８５】
また、本開示は、バイオフィルムの安定性を阻害するための方法であって、バイオフィルムを、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する作用物質とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させることを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、接触させることが、表面を、カチオンを枯渇させる有効量の作用物質でコーティングすることを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、一態様では、作用物質が、ＤＮアーゼの非存在下で接触させられ、一方で、別の態様では、ＤＮアーゼが、本方法に従って接触させられる、方法に関する。別の態様では、作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質との接触に続いて接触させられる。特定の一態様では、ＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。一態様では、バイオフィルムの安定性を阻害するための方法は、バイオフィルムを、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の作用物質とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させることを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる場合があり、接触させることは、表面を、カチオンを枯渇させる有効量の１種または複数種の作用物質でコーティングすることを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、一態様では、作用物質は、ＤＮアーゼの非存在下で接触させられ、一方で、別の態様では、ＤＮアーゼは、本方法に従って接触させられる。別の態様では、作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質との接触に続いて接触させられる。特定の一態様では、ＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。
【０１８６】
別の態様では、バイオフィルムの安定性を阻害するための方法は、バイオフィルムを、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の作用物質とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させることを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる場合があり、接触させることは、表面を、カチオンを枯渇させる有効量の２種またはそれよりも多くの種の作用物質でコーティングすることを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、一態様では、作用物質は、ＤＮアーゼの非存在下で接触させられ、一方で、別の態様では、ＤＮアーゼは、本方法に従って接触させられる。別の態様では、作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質との接触に続いて接触させられる。特定の一態様では、ＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。
【０１８７】
さらなる態様では、バイオフィルムの安定性を阻害するための方法は、バイオフィルムを、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の作用物質とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させることを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる場合があり、接触させることは、表面を、カチオンを枯渇させる有効量の３種またはそれよりも多くの種の作用物質でコーティングすることを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、一態様では、作用物質は、ＤＮアーゼの非存在下で接触させられ、一方で、別の態様では、ＤＮアーゼは、本方法に従って接触させられる。別の態様では、作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質との接触に続いて接触させられる。特定の一態様では、ＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。またさらなる態様では、バイオフィルムの安定性を阻害するための方法は、バイオフィルムを、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の作用物質とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させることを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる場合があり、接触させることは、表面を、カチオンを枯渇させる有効量の４種もしくはそれよりも多くの種の、またはあるいは、５種もしくはそれよりも多くの種の、またはあるいは、６種もしくはそれよりも多くの種の、またはあるいは、７種もしくはそれよりも多くの種の、またはあるいは、８種もしくはそれよりも多くの種の、またはあるいは、９種もしくはそれよりも多くの種の、またはあるいは、１０種もしくはそれよりも多くの種の作用物質でコーティングすることを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる。一実施形態では、作用物質は、バイオフィルムまたはその局所環境においてＢ−ＤＮＡのＺ−ＤＮＡへの変換に干渉し、一態様では、作用物質は、ＤＮアーゼの非存在下で接触させられ、一方で、別の態様では、ＤＮアーゼは、本方法に従って接触させられる。別の態様では、作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質との接触に続いて接触させられる。特定の一態様では、ＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。第２の実施形態では、作用物質は、抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体を含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる。一態様では、ポリクローナルまたはモノクローナル抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体は、Ｚ型ＤＮＡよりもＢ型ＤＮＡを、少なくとも１０倍の親和性／結合活性で認識する。第３の実施形態では、作用物質は、リボフラビン、エチジウムブロマイド、ビス（メチジウム）スペルミン、ダウノルビシン、ＴＭＰｙＰ４、第四級ベンゾ［ｃ］フェナントリジンアルカロイド、キナクリン、９−アミノアクリジンまたはその誘導体を含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる。第５の実施形態では、作用物質は、クロ��キンまたはその誘導体を含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる。特定の一態様では、化合物の誘導体は、ＤＮＡ塩基間に介入する能力を保持する。作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でもその断片でもない。
【０１８８】
バイオフィルムの安定性を阻害するための方法であって、バイオフィルムを、有効量のＨＭＧＢ１タンパク質またはその生物活性断片および抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させることを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、接触させることが、表面を、有効量のＨＭＧＢ１タンパク質またはその生物活性断片および抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体でコーティングすることを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、一態様では、タンパク質および抗体が、ＤＮアーゼの非存在下で接触させられ、一方で、別の態様では、ＤＮアーゼが、本方法に従って接触させられる、方法が、本明細書でさらに説明される。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質との接触に続いて接触させられる。特定の一態様では、ＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。
【０１８９】
一態様では、ポリクローナルまたはモノクローナル抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体は、Ｚ型ＤＮＡよりもＢ型ＤＮＡを、少なくとも１０倍の親和性／結合活性で認識する。ＨＭＧＢ１の生物活性断片は、Ａボックス、ＡＢボックス、Ｂボックス、Ｃ末端断片および／またはＮ末端断片のうちの１つまたは複数を含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる場合がある。特定の実施形態では、ＨＭＧＢ１の生物活性断片は、ＤＮＡを結合することができるＢボックスドメインを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる場合がある。また、本開示は、バイオフィルムの安定性を阻害するための方法であって、バイオフィルムを、有効量のクロロキンおよび抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させることを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、接触させることが、表面を、有効量のクロロキンおよび抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体でコーティングすることを含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、一態様では、クロロキンおよび抗体が、ＤＮアーゼの非存在下で接触させられる、方法に関する。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質との接触に続いて接触させられる。特定の一態様では、ＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。一態様では、ポリクローナルまたはモノクローナル抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体は、Ｚ型ＤＮＡよりもＢ型ＤＮＡを、少なくとも１０倍の親和性／結合活性で認識する。
【０１９０】
上記に説明する方法は、バイオフィルムを、ｅＤＮＡのＤＮＡ結合タンパク質への結合に干渉する有効量の作用物質および／または抗菌剤と接触させることをさらに含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなる場合があり、一態様では、作用物質は、ＤＮアーゼの非存在下で接触させられ、一方で、別の態様では、ＤＮアーゼは、本方法に従って接触させられる。別の態様では、作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質との接触に続いて接触させられる。特定の一態様では、ＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。一態様では、ｅＤＮＡのＤＮＡ結合タンパク質への結合に干渉する作用物質は、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体、抗ＩＨＦ抗体および／もしくは抗ＨＵ抗体またはその各々の断片のうちの１つまたは複数を含むか、またはあるいは、それから本質的になるか、またはまたさらに、それからなり、一態様では、作用物質は、ＤＮアーゼの非存在下で接触させられる。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質との接触に続いて接触させられる。特定の一態様では、ＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。別の態様では、作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない。一実施形態では、ｅＤＮＡのＤＮＡ結合タンパク質への結合に干渉する作用物質は、正味の負電荷を有し、一態様では、作用物質は、ＤＮアーゼの非存在下で接触させられる。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質との接触に続いて接触させられる。特定の一態様では、ＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。第２の実施形態では、ｅＤＮＡのＤＮＡ結合タンパク質への結合に干渉する作用物質は、正味の中性電荷を有し、一態様では、作用物質は、ＤＮアーゼの非存在下で接触させられ、一方で、別の態様では、ＤＮアーゼは、本方法に従って接触させられる。別の態様では、作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質との接触に続いて接触させられる。特定の一態様では、ＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。第３の実施形態では、ｅＤＮＡのＤＮＡ結合タンパク質への結合に干渉する作用物質は、正味の正電荷を有する。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質との接触に続いて接触させられる。特定の一態様では、ＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。
【０１９１】
バイオフィルムの安定性を阻害するための方法であって、バイオフィルムを、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する作用物質と接触させることを含み、一態様では、作用物質が、ＤＮアーゼの非存在下で接触させられ、一方で、別の態様では、ＤＮアーゼが、本方法に従って接触させられる、方法が、本明細書で提供される。別の態様では、作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質との接触に続いて接触させられる。特定の一態様では、ＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。接触させることは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏであり得る。
【０１９２】
また、対象においてバイオフィルムを処置するための方法であって、バイオフィルムに感染した対象に、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の作用物質を投与することを含み、一態様では、作用物質が、ＤＮアーゼの非存在下で投与され、一方で、別の態様では、ＤＮアーゼが、投与される、方法が、提供される。別の態様では、作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質の投与に続いて投与される。特定の一態様では、ＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。
【０１９３】
バイオフィルムを発生しやすい対象においてバイオフィルムの形成を予防するための方法であって、対象に、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の作用物質を投与することを含み、一態様では、作用物質が、ＤＮアーゼの非存在下で投与され、一方で、別の態様では、ＤＮアーゼが、投与される、方法が、さらに提供される。別の態様では、作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質の投与に続いて投与される。特定の一態様では、ＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。
【０１９４】
それを必要とする対象において、バイオフィルムを産生する細菌によって引き起こされる感染を処置するための方法であって、対象に、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する有効量の作用物質と、その生物の複製を阻害する作用物質とを投与することを含み、一態様では、作用物質が、ＤＮアーゼの非存在下で投与され、一方で、別の態様では、ＤＮアーゼが、投与される、方法が、またさらに提供される。別の態様では、作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質の投与に続いて投与される。特定の一態様では、ＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。
【０１９５】
一態様では、作用物質は、ポリアミン合成の阻害剤、またはポリアミンのＤＮＡへの結合を阻害する作用物質である。別の態様では、作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない。ポリアミンの非限定的な例には、プトレシン、スペルミン、カダベリン、１，３−ジアミノプロパンまたはスペルミジンが含まれる。別の態様では、作用物質は、ポリアミンアナログであるジフルオロメチルオルニチン、トランス−４−メチルシクロヘキシルアミン、サルドモジド（Ｂｏｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、メチルグリオキサール−ビス［グアニルヒドラゾン］（メチル−ＧＡＧ）、１−アミノオキシ−３−アミノプロパン（ＡＫｏｓ  Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ  ＆  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）、オキサリプラチン、シスプラチン、ジシクロヘキシルアミン、任意のその誘導体、またはその塩を含む（この段落の全ての作用物質は、別に示されない限り、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｉｇｍａから市販されている）。一態様では、これらの化合物の誘導体は、同じ質量対電荷比を維持する。
【０１９６】
さらなる態様では、作用物質は、バイオフィルムからカチオンを枯渇させる作用物質、必要に応じて、カチオン交換樹脂、アミノポリカルボン酸、クラウンエーテル、アザクラウンまたはクリプタンドを含む（各クラスの作用物質の様々な代表的化合物はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｉｇｍａから入手可能である）。別の態様では、作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない。カチオン交換樹脂の非限定的な例には、スルホネート、スルホプロピル、ホスホセルロース、Ｐ１１ホスホセルロース、ヘパリン硫酸、またはその誘導体またはアナログを含有する樹脂が含まれる。一実施形態では、バイオフィルムからカチオンを枯渇させる作用物質は、正味の負電荷を有する。一実施形態では、バイオフィルムからカチオンを枯渇させる作用物質は、正味の中性電荷を有する。
【０１９７】
一実施形態では、バイオフィルムの安定性を阻害するための方法であって、バイオフィルムを、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する作用物質とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させることを含み、接触させることが、表面を、カチオンを枯渇させる作用物質でコーティングすることを含み、一態様では、作用物質が、ＤＮアーゼの非存在下で投与され、一方で、別の態様では、ＤＮアーゼが、投与される、方法が、本明細書で提供される。別の態様では、作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質の投与に続いて投与される。特定の一態様では、ＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。
【０１９８】
上記の方法の一態様では、作用物質は、バイオフィルムまたはその局所環境においてＢ−ＤＮＡのＺ−ＤＮＡへの変換に干渉し、一態様では、作用物質は、ＤＮアーゼの非存在下で投与され、一方で、別の態様では、ＤＮアーゼは、投与される。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質の投与に続いて投与される。特定の一態様では、ＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。そのようなものの例には、抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体が含まれる。さらなる態様では、作用物質は、リボフラビン、エチジウムブロマイド、ビス（メチジウム）スペルミン、（Ｄｅｒｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７８）  １００（６）：１９６８−１９７０）ダウノルビシン、ＴＭＰｙＰ４、第四級ベンゾ［ｃ］フェナントリジンアルカロイド、（Ｒａｊｅｃｋｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）；Ｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  ６９（８）：２７６８−２７７２）キナクリン、９−アミノアクリジンまたはその誘導体の群からの作用物質を含む（このさらなる態様の全ての作用物質は、別に示されない限り、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｉｇｍａから市販されている）。作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でもその断片でもない。
【０１９９】
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および／または嚢胞性線維症（ＣＦ）を患う患者においてバイオフィルムを処置するための方法であって、バイオフィルムまたはその局所環境においてＢ−ＤＮＡのＺ−ＤＮＡへの変換に干渉する有効量の作用物質を投与することを含み、一態様では、作用物質が、ＤＮアーゼの非存在下で投与され、一方で、別の態様では、ＤＮアーゼが、投与される、方法が、さらに提供される。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質の投与に続いて投与される。特定の一態様では、ＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。そのようなものの例には、抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体が含まれる。さらなる態様では、作用物質は、リボフラビン、エチジウムブロマイド、ビス（メチジウム）スペルミン、ダウノルビシン、ＴＭＰｙＰ４、第四級ベンゾ［ｃ］フェナントリジンアルカロイド、キナクリン、９−アミノアクリジンまたはその誘導体の群からの作用物質を含む。一態様では、本方法は、ＤＮアーゼの非存在下で行われ、一態様では、ＣＦの処置は、ＤＮアーゼの非存在下で行われる。作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でもその断片でもはない。
【０２００】
別の態様では、プラチナベースの化学療法を受けているか、または受けた患者において化学療法の投与に付随するバイオフィルム産生感染を処置するための方法であって、バイオフィルムまたはその局所環境においてＢ−ＤＮＡのＺ−ＤＮＡへの変換に干渉する有効量の作用物質を投与することを含み、一態様では、作用物質が、ＤＮアーゼの非存在下で投与され、一方で、別の態様では、ＤＮアーゼが、投与される、方法が、本明細書で提供される。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質の投与に続いて投与される。特定の一態様では、ＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。そのようなものの例には、抗Ｂ−ＤＮＡ抗体またはその断片もしくは誘導体が含まれる。さらなる態様では、作用物質（ｔｈｅ  ｇｅｎｔ）は、リボフラビン、エチジウムブロマイド、ビス（メチジウム）スペルミン、ダウノルビシン、ＴＭＰｙＰ４、第四級ベンゾ［ｃ］フェナントリジンアルカロイド、キナクリン、９−アミノアクリジンまたはその誘導体の群からの作用物質を含む。作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でもその断片でもない。
【０２０１】
上記に示される方法は、ｅＤＮＡのＤＮＡ結合タンパク質への結合に干渉する有効量の作用物質および／または抗菌剤を、バイオフィルムと接触させること（ｉｎ  ｖｉｔｒｏの場合）、または対象に投与することをさらに含む場合があり、一態様では、作用物質は、ＤＮアーゼの非存在下で投与され、一方で、別の態様では、ＤＮアーゼは、投与される。別の態様では、作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質でも、その断片でも、その各々の等価物でもない。さらなる態様では、ＤＮアーゼは、作用物質の投与に続いて投与される。特定の一態様では、ＤＮアーゼは、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅである。一実施形態では、ｅＤＮＡのＤＮＡ結合タンパク質への結合に干渉する作用物質は、正味の正電荷を有する。一実施形態では、ｅＤＮＡのＤＮＡ結合タンパク質への結合に干渉する作用物質は、正味の負電荷を有する。一実施形態では、ｅＤＮＡのＤＮＡ結合タンパク質への結合に干渉する作用物質は、正味の中性電荷を有する。
【０２０２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される場合、本方法は、本明細書で開示するポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、宿主細胞、小分子および組成物と同じ、同様の、または反対の能力を有する作用物質をスクリーニングまたは確認するために有用である。あるいは、それらは、どの作用物質が微生物感染を処置するために最も適しているか、または処置が有効であったかどうかを特定するために使用され得る。例えば、例えばＤＮＡＢＩＩポリペプチドおよび微生物ＤＮＡならびに試験されるべき作用物質を含有する２つの試料を有することによって、新しい作用物質または組合せ治療をスクリーニングすることができる。第２の試料は、ＤＮＡＢＩＩポリペプチドおよび微生物ＤＮＡ、ならびに陽性対照としてはたらくための、活性であることが公知の作用物質、例えば、抗ＩＨＦ抗体または小分子を含有する。さらなる態様では、いくつかの試料が提供され、臨床環境における対象の処置において有効である可能性がある最適用量を決定するために、作用物質を、希釈を増やしながら系に添加する。当業者に明らかである通り、ＤＮＡＢＩＩポリペプチドおよび微生物ＤＮＡを含有する陰性対照を提供してもよい。さらなる態様では、ＤＮＡＢＩＩポリペプチドおよび微生物ＤＮＡは、検出可能に、例えば、互いに緊密に接触した場合にシグナルを放出する発光分子で、標識される。試料を、作用物質が、ＤＮＡＢＩＩポリペプチドと微生物ＤＮＡとの間の相互作用を阻害、競合または滴定するために有効な時間の間、同様の条件下で含有し、その後、試料を、発光分子からのシグナルの放出についてアッセイする。試料がシグナルを放出する場合、作用物質は、結合を阻害するために有効ではない。
【０２０３】
別の態様では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法は、感染を引き起こす微生物（例えば、細菌）分離菌がヒト／動物から単離され、その後、培養されて、それがｉｎ  ｖｉｔｒｏでバイオフィルムとして増殖することを可能にし得る小型化チャンバースライド系で実施される。作用物質（例えば、抗ＤＮＡＢＩＩまたはＩＨＦ抗体）または試験作用物質もしくは潜在的作用物質を、潜在的作用物質または作用物質、例えば、抗ＤＮＡＢＩＩまたはＩＨＦ（または他の抗体、小分子、作用物質等）の希釈を増やしながら、または増やさずに、培養物に単独で、または別の作用物質と組み合わせて添加して、感染が存在した対象に送達された場合にその患者を処置することにおいて有効であり得るような最適用量を見出す。当業者に明らかである通り、陽性対照および陰性対照を同時に行ってもよい。
【０２０４】
さらなる態様では、本方法は、フローセル中の作用物質（例えば、抗ＤＮＡＢＩＩまたはＩＨＦ抗体）および／または潜在的作用物質（単独で、または別の作用物質と組み合わせて）を伴うハイスループットプラットホームにおいて実施される。作用物質（例えば、抗ＤＮＡＢＩＩまたはＩＨＦ抗体）または潜在的作用物質バイオフィルムを、潜在的作用物質または作用物質、例えば、抗ＤＮＡＢＩＩまたはＩＨＦ（または他の抗体、小分子、作用物質等）の希釈を増やしながら、または増やさずに、培養物に単独で、または別の作用物質と組み合わせて添加して、感染が存在した対象に送達された場合にその患者を処置することにおいて有効であり得るような最適用量を見出す。バイオフィルム分離菌を超音波処理して、微生物ＤＮＡに結合したＤＮＡＢＩＩポリペプチド、例えば、ＩＨＦからバイオフィルム細菌を分離する。ＤＮＡＢＩＩポリペプチド−ＤＮＡ複合体は、プラットホーム上の抗ＤＮＡＢＩＩまたはＩＨＦ抗体によって分離される。その後、微生物ＤＮＡを、例えば、塩洗浄で放出させ、添加されたバイオフィルム細菌を同定するために使用する。その後、遊離したＤＮＡを、例えば、ＰＣＲ配列決定することによって同定する。ＤＮＡが遊離しない場合、作用物質（複数可）が、微生物ＤＮＡにうまく作用したか、または微生物ＤＮＡにうまく結合した。ＤＮＡが試料中に見られる場合、作用物質は、ＤＮＡＢＩＩポリペプチド−微生物ＤＮＡ結合に干渉しなかった。当業者に明らかである通り、陽性対照および／または陰性対照を同時に行ってもよい。
【０２０５】
また、所与の細菌種は、別の作用物質よりもある作用物質によるそのバイオフィルムの破棄に対してよりよく応答する可能性があるので、上記の方法は、診断試験として使用することができ、この迅速なハイスループットアッセイ系は、当業者が、可能性のある抗ＤＮＡＢＩＩまたはＩＨＦ様作用物質の集団をアッセイして、群のうちの最も効果的なものを特定することを可能にし得る。
【０２０６】
これらの方法の利点は、ほとんどの院内臨床微生物検査室は、既に、液体培養で（または浮遊性で）成長している細菌を使用するこれらの種類のアッセイ（すなわち、ＭＩＣ、ＭＢＣ値の決定）を行うための備えがあることである。当業者に明らかである通り、細菌は、一般的に、それらが疾患を引き起こしている場合、浮遊性で成長しない。その代わりに、それらは安定なバイオフィルムとして成長しており、これらのバイオフィルムは、抗生物質、抗体または他の治療薬による処置に対して有意により抵抗性である。この抵抗性は、ほとんどのＭＩＣ／ＭＢＣ値が正確にｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性を予測することができないことの理由である。したがって、どの「用量」の作用物質が（上記に説明されるように）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細菌バイオフィルムを逆転し得るかを決定することによって、出願人らの前臨床アッセイは、個別化医療の適用としてでさえも、臨床有効性のより信頼できる予測因子になり得る。
【０２０７】
臨床環境に加えて、本方法は、産業的環境において感染を引き起こす微生物を特定することおよび／または有効な作用物質を確認することのために使用することができる。したがって、産業的環境において、作用物質を使用して、バイオフィルムを処置、阻害または滴定することができる。
【０２０８】
上記の方法のさらなる態様では、基礎をなす感染の成長を阻害することが公知の抗生物質または抗微生物薬を、順次、または併せて添加して、感染が阻害され得るかどうかを決定する。また、作用物質を微生物ＤＮＡまたはＤＮＡＢＩＩポリペプチドに添加し、その後、欠損した複合体を添加して、バイオフィルム阻害についてアッセイすることが可能である。
【０２０９】
非ヒト動物、例えば、チンチラにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで実施される場合、本方法は、前臨床スクリーニングを提供して、バイオフィルムを破壊するために単独で、または他の作用物質と組み合わせて使用され得る作用物質を特定する。
【０２１０】
別の態様では、対象に、有効量の作用物質を投与し、それによって、微生物バイオフィルムを阻害、予防または破壊することによる、対象においてバイオフィルムを阻害、予防または破壊する方法が、本明細書で提供される。そのような対象の非限定的な例には、哺乳動物、例えば、ペットおよびヒト患者が含まれる。
【０２１１】
本明細書で開示する作用物質および組成物は、他の抗微生物剤および／または表面抗原と共に併せて、または順次投与され得る。特定の一態様では、投与は、例えば、直接注射によって、または吸入によって、感染の部位について局所である。投与の他の非限定的な例には、経皮に、尿道に、舌下に、直腸に、膣に、眼に、皮下、筋内に、腹腔内に、鼻内に、吸入による、または経口に、を含む１つまたは複数の方法による投与が含まれる。
【０２１２】
本明細書で開示する方法によって処置され得る微生物感染および疾患には、生物であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍｅｓ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍｅｓ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａまたはＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉによる感染が含まれる。一態様では、微生物感染は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（分類不能）、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのうちの１つまたは複数である。これらの微生物感染は、上気道、中気道および下気道に存在し得る（耳炎、副鼻腔炎、気管支炎、それだけでなく、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ：ｃｈｒｏｎｉｃ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）の増悪、慢性咳嗽、嚢胞性線維症（ＣＦ）の合併症および／またはＣＦの主因ならびに市中感染性肺炎（ＣＡＰ：ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ））。したがって、本明細書で開示するｉｎ  ｖｉｖｏ法を実施することによって、これらの疾患およびこれらの感染からの合併症もまた、予防または処置され得る。
【０２１３】
また、感染症は、口腔（う歯、歯周炎）で起こり、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｖｃｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓによって引き起こされ得る。また、感染症は、皮膚に局在し（膿瘍、「ブドウ球菌」感染、膿痂疹、熱傷の二次感染、ライム病）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＢｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｄｏｒｆｅｒｉによって引き起こされ得る。尿路感染症（ＵＴＩ：Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｔｒａｃｔ）もまた処置することができ、典型的に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉによって引き起こされる。胃腸管感染症（ＧＩ：Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｒａｃｔ）（下痢、コレラ、胆石、胃潰瘍）は、典型的に、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅおよびＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉによって引き起こされる。生殖器感染症は、典型的に、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅを含み、これによって引き起こされる。感染症は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓによって引き起こされる膀胱の感染症または留置デバイスの感染症であり得る。典型的に、様々な細菌によって引き起こされる、埋入された補綴デバイス、例えば、人工臀部もしくは膝置換物、または歯科インプラント、または医療デバイス、例えば、ポンプ、カテーテル、ステントもしくはモニタリング系と関連付けられる感染症は、本明細書で開示する方法によって処置することができる。これらのデバイスは、本明細書で説明する作用物質でコーティングするか、またはこれにコンジュゲートすることができる。したがって、本明細書で開示するｉｎ  ｖｉｖｏ法を実施することによって、これらの疾患およびこれらの感染症からの合併症もまた予防または処置することができる。
【０２１４】
また、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅによって引き起こされる感染は、本明細書で開示する方法によって処置することができ、それは、新生児における細菌性敗血症の主原因である。髄膜炎を引き起こし得るＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓによって引き起こされる感染もまた、処置することができる。
【０２１５】
したがって、本明細書で開示する方法に適用可能な投与経路には、鼻内、筋内、尿道、気管内、皮下、皮内、経皮、局所適用、静脈内、直腸、鼻、経口、吸入ならびに他の経腸および非経口投与経路が含まれる。投与経路は、作用物質および／または所望の効果に依存して、所望の場合、組み合わせられ、または調整され得る。活性剤は、単回用量で、または複数回用量で投与され得る。これらの方法および送達に好適な経路の実施形態には、全身性経路または局部経路が含まれる。概して、本明細書で開示する方法に好適な投与経路には、直接注射、経腸、非経口または吸入経路が含まれるが、これらに限定されない。
【０２１６】
吸入投与以外の非経口投与経路には、局所、経皮、皮下、筋内、眼窩内、嚢内、脊髄内、胸骨内および静脈内経路、すなわち、消化管を通る経路以外の任意の投与経路が含まれるが、これらに限定されない。非経口投与は、阻害する作用物質（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）の全身性または局所送達をもたらすように行われ得る。全身送達が所望される場合、投与は、典型的に、医薬調節物の浸潤性または全身吸収性の局所投与または粘膜投与を含む。
【０２１７】
また、本明細書で開示する作用物質は、経腸投与によって対象に送達され得る。経腸投与経路には、経口および直腸（例えば、坐剤を使用する）送達が含まれるが、これらに限定されない。
【０２１８】
皮膚または粘膜を通した活性剤の投与の方法には、好適な医薬調製物の局所適用、経皮的伝達、経皮伝達、注射および上皮投与が含まれるが、これらに限定されない。経皮伝達のために、吸収促進剤またはイオン導入は、好適な方法である。イオン導入伝達は、製品を、壊れていない皮膚を通して電気パルスを介して連続的に数日間またはそれよりも長い期間の間送達する市販の「パッチ」を使用して達成することができる。
【０２１９】
本明細書で開示する方法の様々な実施形態では、作用物質は、連続して毎日のように、少なくとも１日１回（ＱＤ）および様々な実施形態では、１日２回（ＢＩＤ）、３回（ＴＩＤ）またはさらに４回、吸入により、注射により、または経口で投与される。典型的に、治療有効１日量は、少なくとも約１ｍｇ、または少なくとも約１０ｍｇ、または少なくとも約１００ｍｇ、または約２００〜約５００ｍｇ、およびときには、化合物に依存して、最大で約１ｇ〜約２．５ｇほどであり得る。
【０２２０】
投与（Ｄｏｓｉｎｇ  ｏｆ）は、カプセル剤、錠剤、経口懸濁剤、筋内注射用懸濁剤、静脈内点滴用懸濁剤、局所適用用ゲル剤（ｇｅｔ）もしくはクリーム剤、または関節内注射用懸濁剤を使用して、本明細書で開示する方法に従って達成することができる。
【０２２１】
本明細書で説明する組成物の投与量、毒性および治療的有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養物または実験動物における標準の薬学的手順によって決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、それは、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。ある特定の実施形態では、組成物は、高い治療指数を示す。毒性副作用を示す化合物が使用され得る一方で、非感染細胞への潜在的損傷を最小限にし、それによって、副作用を低減するために、そのような化合物を、罹患組織部位を標的とする送達系を設計するように注意を払うべきである。
【０２２２】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得たデータは、ヒトにおける使用のためのある範囲の投与量を製剤化するために使用され得る。そのような化合物の投与量は、ある特定の実施形態では、毒性をほとんどまたは全く有しないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、使用される剤形および利用される投与経路に依存して、この範囲内で変動し得る。本方法において使用される任意の化合物について、治療有効用量は、最初に細胞培養アッセイから見積もることができる。用量は、細胞培養物において決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量の阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように動物モデルにおいて製剤化され得る。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって、測定され得る。
【０２２３】
一部の実施形態では、治療効果または予防効果を達成するために十分な組成物の有効量は、１投与当たり体重１キログラム当たり約０．０００００１ｍｇ〜１投与当たり体重１キログラム当たり約１０，０００ｍｇに及ぶ。好適には、投与量範囲は、１投与当たり体重１キログラム当たり約０．０００１ｍｇ〜１投与当たり体重１キログラム当たり約１００ｍｇである。投与は、初期用量として提供され、続いて１つまたは複数の「ブースター」用量が提供され得る。ブースター用量は、初期用量の１日、２日、３日、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月または１２ヶ月後に提供され得る。一部の実施形態では、ブースター用量は、前の投与に対する対象の応答の評価後に投与される。
【０２２４】
当業者は、非限定的に、疾患または障害の重症度、以前の処置、対象の健康全般および／または年齢ならびに存在する他の疾患を含む、ある特定の因子が、対象を有効に処置するために必要とされる投与量および時間調整に影響を及ぼし得ることを理解する。さらに、治療有効量の本明細書で説明する治療組成物による対象の処置は、単回処置または一連の処置を含み得る。
抗体およびその誘導体
【０２２５】
本開示は、また、本明細書に開示される方法における使用のための、Ｂ  ＤＮＡに結合する、および／またはこれを特異的に認識して結合する抗体を提供する。抗体は、本明細書に記載される様々な抗体のいずれかとなることができ、そのようなものの非限定的な例は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ベニア化（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、ヒト化抗体、抗体誘導体、組換えヒト化抗体、またはその各々の誘導体もしくは断片を含む。一態様では、断片は、抗体のＣＤＲを含む、またはあるいは、これから本質的になる、またはさらになお、これからなる。一態様では、抗体は、検出可能に標識される、またはこれにコンジュゲートされた検出可能な標識をさらに含む。本明細書に開示されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系も提供される。上述の実施形態のうちの１つまたは複数を含む、またはあるいは、これから本質的になる、またはさらになお、これからなる組成物が、本明細書にさらに提供される。抗体および断片のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、ならびに抗体ポリペプチドおよびその断片を組換えにより産生するまたは化学合成する方法がさらに提供される。抗体ポリペプチドは、真核もしくは原核細胞において、または当技術分野で公知であり本明細書に記載される他の方法によって産生することができる。
【０２２６】
本方法論の変形形態は、最適な産生および動物の人道的な扱いのための、アジュバント、投与の経路および部位、部位当たりの注射体積、ならびに動物当たりの部位の数の改変を含む。例えば、アジュバントは典型的に、抗原に対する免疫応答の改善または増強に使用される。大部分のアジュバントは、流入領域リンパ節への抗原の緩徐放出（ｓｔｏｗ  ｒｅｌｅａｓｅ）を可能にする、注射部位抗原デポーを提供する。他のアジュバントは、大規模な表面積および免疫賦活性分子にわたるタンパク質抗原分子の富化を促進する界面活性物質を含む。ポリクローナル抗体生成のためのアジュバントの非限定的な例は、フロイントアジュバント、ＲｉｂｉアジュバントシステムおよびＴｉｔｅｒｍａｘを含む。当技術分野で公知の方法を使用して、ポリクローナル抗体を生成することができ、そのうちいくつかは、米国特許第７，２７９，５５９号；同第７，１１９，１７９号；同第７，０６０，８００号；同第６，７０９，６５９号；同第６，６５６，７４６号；同第６，３２２，７８８号；同第５，６８６，０７３号；および同第５，６７０，１５３号に記載されている。
【０２２７】
当技術分野で公知であり文献において十分に記載されている従来のハイブリドーマ技法を使用して、モノクローナル抗体を生成することができる。例えば、適した不死細胞系（例えば、Ｓｐ２／０、Ｓｐ２／０−ＡＧ１４、ＮＳＯ、ＮＳ１、ＮＳ２、ＡＥ−１、Ｌ．５、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８，６５３、Ｓｐ２  ＳＡ３、Ｓｐ２  ＭＡＩ、Ｓｐ２  ＳＳ１、Ｓｐ２  ＳＡ５、Ｕ３９７、ＭＩＡ  １４４、ＡＣＴ  ＩＶ、ＭＯＬＴ４、ＤＡ−１、ＪＵＲＫＡＴ、ＷＥＨＩ、Ｋ−５６２、ＣＯＳ、ＲＡＪＩ、ＮＩＨ  ３１３、ＨＬ−６０、ＭＬＡ  １４４、ＮＡＭＡＩＷＡ、ＮＥＵＲＯ  ２Ａ、ＣＨＯ、ＰｅｒＣ．６、ＹＢ２／Ｏ等が挙げられるがこれらに限定されない、ミエローマ細胞系）などまたはヘテロミエローマ（ｈｅｔｅｒｏｍｙｅｌｏｍａ）、その融合産物、またはそれに由来するいずれかの細胞もしくは融合細胞、または当技術分野で公知の他のいずれかの適した細胞系（次のウェブアドレス、例えば、ａｔｃｃ．ｏｒｇ，  ｌｉｆｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ、最終アクセス２００７年１１月２６日における細胞系を参照）を、内因性もしくは異種核酸として、組換えもしくは内因性の、ウイルスの、細菌の、藻類の、原核生物の、両生類の、昆虫の、爬虫類の、魚類の、哺乳動物の、齧歯類の、ウマの、ヒツジの、ヤギの、羊の、霊長類の、真核生物の、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｒＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡもしくはＲＮＡ、葉緑体ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、一本、二本もしくは三本鎖の、ハイブリダイズしたものなど、またはこれらのいずれかの組合せとして、重鎖または軽鎖定常または可変またはフレームワークまたはＣＤＲ配列を発現する、単離されたまたはクローニングされた脾臓、末梢血、リンパ、扁桃腺または他の免疫もしくはＢ細胞含有細胞、または他のいずれかの細胞等が挙げられるがこれらに限定されない抗体産生細胞と融合することにより、ハイブリドーマが産生される。抗体産生細胞を、目的の抗原で免疫されたヒトまたは他の適した動物の、末梢血から、または特定の実施形態では、脾臓もしくはリンパ節から得て、次いで、目的の活性に関してスクリーニングすることもできる。本開示の抗体、その指定の断片またはバリアントをコードする異種または内因性核酸を発現させるために、他のいずれかの適した宿主細胞を使用することもできる。融合された細胞（ハイブリドーマ）または組換え細胞を、選択的培養条件または他の適した公知方法を使用して単離し、限界希釈もしくは細胞選別、または他の公知方法によってクローニングすることができる。
【０２２８】
当技術分野で公知の方法を使用して、ペプチドまたはタンパク質ライブラリー（例えば、バクテリオファージ、リボソーム、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、またはその他のディスプレイライブラリーが挙げられるがこれらに限定されない；例えば、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ（Ｍａｒｔｉｎｓｒｅｉｄ／Ｐｌａｎｅｇｇ、Ｄｅｌ．）、ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ（Ｌｕｎｄ、Ｓｗｅｄｅｎ）、Ａｆｆｉｔｅｃｈ（Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）等の様々な商業的ベンダーから入手できるような）から組換え抗体を選択する方法を含むがこれらに限定されない、必要な特異性の抗体を産生または単離する他の適した方法を使用することができる。当技術分野の公知方法は、特許文献に記載されており、そのうちいくつかは、米国特許第４，７０４，６９２号；同第５，７２３，３２３号；同第５，７６３，１９２号；同第５，８１４，４７６号；同第５，８１７，４８３号；同第５，８２４，５１４号；および同第５，９７６，８６２号を含む。代替方法は、当技術分野で公知の通り、および／または本明細書に記載される通り、ヒト抗体のレパートリーを産生することができる、トランスジェニック動物（例えば、ＳＣＩＤマウス、Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７７）  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４１：９０１−９０７  （１９９７）；Ｓａｎｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｃｒｉｔ，  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １６：９５−１１８；Ｅｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｍｕｍｍａ  ９３：１５４−１６１）の免疫に依拠する。斯かる技法は、リボソームディスプレイ（Ｗａｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９４：４９３７−４９４２；Ｈａｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：１４１３０−１４１３５）；単一細胞抗体産生技術（例えば、選択されたリンパ球抗体方法（ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｅｔｈｏｄ）（「ＳＬＡＭ」）（米国特許第５，６２７，０５２号；Ｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７：８８７−８９２；Ｂａｂｃｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：７８４３−７８４８）；ゲル微小液滴およびフローサイトメトリー（Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ８：３３３−３３７；Ｏｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．）；Ｇｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｊ．  Ｉｍｍ．  Ｍｅｔｈ．  １８２：１５５−１６３；およびＫｅｎｎｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｂｉｏ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  １３：７８７−７９０）；Ｂ細胞選択（Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １９：１２５−１３４）を含むがこれらに限定されない。
【０２２９】
本開示の抗体誘導体は、本明細書に開示される抗体をコードするポリヌクレオチドを適した宿主に送達して、例えば、斯かる抗体をその乳汁中に産生する、例えばヤギ、ウシ、馬、羊などのトランスジェニック動物または哺乳動物を用意することにより調製することもできる。このような方法は、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第５，８２７，６９０号；同第５，８４９，９９２号；同第４，８７３，３１６号；同第５，８４９，９９２号；同第５，９９４，６１６号；同第５，５６５，３６２号；および同第５，３０４，４８９号に記載されている。
【０２３０】
用語「抗体誘導体」は、抗体または断片の線形ポリペプチド配列に対する翻訳後改変を含む。例えば、米国特許第６，６０２，６８４（Ｂ１）号は、増強されたＦｅ媒介性細胞毒性を有する、抗体全体の分子、抗体断片、または免疫グロブリンのＦｃ領域と等価の領域を含む融合タンパク質を含む、改変されたグリコール形態の抗体の生成のための方法と、そのようにして生成された糖タンパク質について記載する。
【０２３１】
本明細書に開示される抗体は、共有結合による付着が、抗体が抗イディオタイプ応答を生成することを妨げないような、抗体へのいずれかの種類の分子の共有結合による付着によって改変された誘導体も含む。抗体誘導体は、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／遮断基による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への連結等によって改変された抗体を含むがこれらに限定されない。その上、誘導体は、１つまたは複数の非古典的アミノ酸を含有することができる。
【０２３２】
抗体誘導体は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを送達して、植物部分またはそれから培養された細胞において斯かる抗体、指定の部分またはバリアントを産生するトランスジェニック植物および培養された植物細胞（例えば、タバコ、トウモロコシおよびウキクサが挙げられるがこれらに限定されない）を用意することにより調製することもできる。例えば、Ｃｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｍｉｃｒｏｂｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２４０：９５−１１８およびその中で引用されている参考文献は、例えば、誘導性プロモーターを使用した、大量の組換えタンパク質を発現するトランスジェニックタバコ葉の産生について記載する。トランスジェニックトウモロコシを使用して、他の組換え系において産生されたまたは天然の供給源から精製されたものと等価の生物活性を有する哺乳動物タンパク質を商業的産生レベルで発現させた。例えば、Ｈｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ａｄｖ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．  ４６４：１２７−１４７およびその中で引用されている参考文献を参照されたい。抗体誘導体は、また、タバコ種子およびジャガイモ塊茎を含む、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）等の抗体断片を含むトランスジェニック植物種子から大量に産生された。例えば、Ｃｏｎｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３８：１０１−１０９およびその中で引用されている参考文献を参照されたい。よって、公知（ｋｎｏｗ）方法に従ってトランスジェニック植物を使用して、抗体を産生することもできる。
【０２３３】
抗体誘導体は、例えば、外因性配列を付加して、免疫原性を改変する、または結合、親和性、オンレート（ｏｎ−ｒａｔｅ）、オフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）、アビディティー、特異性、半減期もしくは他のいずれかの適した特徴を低減、増強もしくは改変することにより産生することもできる。一般に、非ヒトまたはヒトＣＤＲ配列の一部または全体が維持される一方で、可変および定常領域の非ヒト配列が、ヒトまたは他のアミノ酸または他のアイソタイプ由来の可変もしくは定常領域に置き換えられる。
【０２３４】
一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合性への影響に直接的にかつ最も実質的に関与する。抗体のヒト化または操作は、米国特許第５，７２３，３２３号；同第５，９７６，８６２号；同第５，８２４，５１４号；同第５，８１７，４８３号；同第５，８１４，４７６号；同第５，７６３，１９２号；同第５，７２３，３２３号；同第５，７６６，８８６号；同第５，７１４，３５２号；同第６，２０４，０２３号；同第６，１８０，３７０号；同第５，６９３，７６２号；同第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，２２５，５３９号；および同第４，８１６，５６７号に記載されている方法等が挙げられるがこれらに限定されない、いずれか公知の方法を使用して行うことができる。
【０２３５】
本開示のキメラ、ヒト化または霊長類化（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）抗体は、標準分子生物学技法を使用して調製された参照モノクローナル抗体の配列に基づき調製することができる。標準分子生物学技法を使用して、重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡを目的のハイブリドーマから得て、非参照（例えば、ヒト）免疫グロブリン配列を含有するように操作することができる。例えば、キメラ抗体を作製するために、当技術分野で公知の方法（米国特許第４，８１６，５６７号）を使用して、マウス可変領域をヒト定常領域に連結することができる。ヒト化抗体を作製するために、当技術分野で公知の方法（米国特許第５，２２５，５３９号ならびに米国特許第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６２号；および同第６，１８０，３７０号）を使用して、マウスＣＤＲ領域をヒトフレームワークに挿入することができる。同様に、霊長類化抗体を作製するために、当技術分野で公知の方法（ＷＯ９３／０２１０８およびＷＯ９９／５５３６９）を使用して、マウスＣＤＲ領域を霊長類フレームワークに挿入することができる。
【０２３６】
部分的〜完全にヒト抗体を作製するための技法は、当技術分野で公知であり、いかなる斯かる技法を使用することもできる。一実施形態において、完全にヒト抗体配列は、ヒト重鎖および軽鎖抗体遺伝子を発現するように操作されたトランスジェニックマウスにおいて作製される。異なるクラスの抗体を産生することができる、斯かるトランスジェニックマウスの複数の系統が作製された。望ましい抗体を産生しているトランスジェニックマウス由来のＢ細胞を融合させて、所望の抗体の持続的産生のためのハイブリドーマ細胞系を作製することができる（例えば、Ｒｕｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  Ａｐｒｉｌ  ２０００：１８２０−１８２６；Ｇａｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎ．  ３０：５３４−５４０；Ｇｒｅｅｎ  （１９９９）  Ｊ．  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１−２３；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９Ａ）  Ｊ．  ｏｆ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６６：４０１−４１０；Ｙａｎｇ  （１９９９Ｂ）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５９（６）：１２３６−１２４３；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  （１９９８）  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ３１：３３−４２；Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  （１９９８）  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８８（３）：４８３−４９５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  （１９９８）  Ｅｘｐ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｒｕｇｓ  ７（４）：６０７−６１４；Ｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４２：４１３−４２１；Ｓｈｅｒｍａｎ−Ｇｏｌｄ  （１９９７）  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ  １７（１４）；Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  （１９９６）  Ｗｅｉｒ’ｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｖｏｌ．  ＩＶ，  １９４．１−１９４．７；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  （１９９５）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：５６１−５６６；Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２６：２９４−３０７；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  （１９９４）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４（８）：７６１−７６３；Ａｒｂｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １（４）：２４７−２６０；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  （１９９３）  Ｎａｔｕｒｅ  ３６２（６４１７）：２５５−２５８；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０（６）：２５５１−２５５５；および米国特許第６，０７５，１８１号を参照）。
【０２３７】
本明細書に開示される抗体を改変して、キメラ抗体を作製することもできる。キメラ抗体は、抗体の重鎖および軽鎖の様々なドメインが、２つ以上の種由来のＤＮＡによってコードされた抗体である。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい。
【０２３８】
あるいは、本明細書に開示される抗体を改変して、ベニア化抗体を作製することもできる。ベニア化抗体は、第１の種の抗体が、第２の種において免疫原性とならず、これにより抗体の免疫原性を低減させるように、ある１つの種の抗体の外面アミノ酸残基が、第２の種のアミノ酸残基に賢明に置き換えられたまたは「ベニア化された」抗体である。タンパク質の抗原性は、その表面の性質に主に依存するため、別の哺乳動物種の抗体において通常見出される残基と異なる露出した残基を置き換えることにより、抗体の免疫原性を低減させることができる。このような賢明な外面残基置き換えは、内側ドメインまたはドメイン間接触に対して影響を殆どまたは全く与えないはずである。よって、可変領域フレームワーク残基に限定される変更の帰結として、リガンド結合特性は影響を受けないはずである。抗体の外表面または外皮（ｓｋｉｎ）のみが変更され、支持的残基は乱されないままであるため、このプロセスは、「ベニア化（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）」と称される。
【０２３９】
「ベニア化」のための手順は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ４ｔｈ  ｅｄ．，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによってコンパイルされたヒト抗体可変ドメインのための利用できる配列データ、このデータベースのアップデート、ならびに他のアクセス可能な米国および外国のデータベース（核酸およびタンパク質の両方）を活用する。ベニア化抗体（ｖｅｎｅｅｒｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）の生成に使用される方法の非限定的な例は、ＥＰ５１９５９６；米国特許第６，７９７，４９２号を含み；Ｐａｄｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２８（４−５）：４８９−４９８に記載されている。
【０２４０】
用語「抗体誘導体」は、２個の抗原結合性部位を有する小型の抗体断片である「ダイアボディ」も含み、この断片は、同じポリペプチド鎖において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む（例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８を参照）。同じ鎖における２個のドメインの間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対形成することを余儀なくされ、２個の抗原結合性部位を作り出す（親抗体の超可変領域に挿入された１つまたは複数のアミノ酸を有し、抗原に対する親抗体の結合親和性よりも少なくとも約２倍強い、標的抗原に対する結合親和性を有する抗体バリアントを開示する、米国特許第６，６３２，９２６号、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．も参照）。
【０２４１】
用語「抗体誘導体」は、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ、ナノボディ、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ユニボディ（Ｕｎｉｂｏｄｙ）およびアフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）等、操作された抗体分子、断片および単一ドメインをさらに含む（＆  Ｈｕｄｓｏｎ  （２００５）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２３（９）：１１２６−３６；米国特許出願公開第２００６／０２１１０８８号；ＰＣＴ国際出願公開番号ＷＯ２００７／０５９７８２；米国特許第５，８３１，０１２号）。
【０２４２】
用語「抗体誘導体」は、「線形抗体」をさらに含む。線形抗体を作製するための手順は、当技術分野で公知であり、Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  ８（１０）：１０５７−１０６２に記載されている。簡潔に説明すると、このような抗体は、一対の抗原結合性領域を形成する一対のタンデムＥｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。線形抗体は、二特異性または単一特異性となることができる。
【０２４３】
本明細書に開示される抗体は、プロテインＡ精製、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない公知の方法によって、組換え細胞培養物から回収および精製することができる。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）を精製に使用することもできる。
【０２４４】
本開示の抗体は、天然で精製された産物、化学合成手順の産物、ならびに例えば、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞を含む真核生物宿主からまたはあるいは、上述の通り原核生物宿主から組換え技法によって産生された産物を含む。いくつかの抗体産生系が、Ｂｉｒｃｈ  ＆  Ｒａｄｎｅｒ  （２００６）  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．  ５８：  ６７１−６８５に記載されている。
【０２４５】
検査されている抗体が、タンパク質またはポリペプチドと結合する場合、検査されている抗体と本開示によって提供される抗体は、等価物である。検査されている抗体によって、本明細書に開示される抗体が、この抗体が正常に反応するタンパク質またはポリペプチドに結合することができなくなるかを決定することにより、過度の実験法を行わずに、抗体が、本明細書に開示される抗体と同じ特異性を有するかを決定することも可能である。本明細書に開示されるモノクローナル抗体による結合の減少によって示される通り、検査されている抗体が、本明細書に開示される抗体と競合する場合、この２種の抗体が、同じまたは密接に関係しているエピトープに結合する可能性がある。あるいは、本明細書に開示される抗体を、それが正常に反応するタンパク質と共にプレインキュベートし、検査されている抗体が、抗原に結合するその能力において阻害されるかを決定することができる。検査されている抗体が阻害される場合、ほぼ確実に、これは、本明細書に開示される抗体と同じまたは密接に関係しているエピトープ特異性を有する。
【０２４６】
用語「抗体」はまた、あらゆる免疫グロブリンアイソタイプおよびサブクラスの抗体を含むことも意図する。特定のアイソタイプのモノクローナル抗体は、初期融合物から選択することにより直接的に調製することができる、またはｓｉｂ選択技法を使用することにより異なるアイソタイプのモノクローナル抗体を分泌する親ハイブリドーマから二次的に調製して、Ｓｔｅｐｌｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２：８６５３またはＳｐｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７４：３０７に記載の手順を使用してクラススイッチバリアントを単離することができる。あるいは、組換えＤＮＡ技法を使用することができる。
【０２４７】
本明細書に記載されるモノクローナル抗体の特異性を有する他のモノクローナル抗体の単離は、当業者によって、抗イディオタイプ抗体を産生することにより達成することもできる。Ｈｅｒｌｙｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：１００。抗イディオタイプ抗体は、目的のモノクローナル抗体に存在する特有の決定基を認識する抗体である。
【０２４８】
本明細書に開示される一部の態様では、抗体を検出可能にまたは治療的に標識することが有用である。適した標識は、上に記載されている。これらの作用物質に抗体をコンジュゲートするための方法は、当技術分野で公知である。単なる説明目的で、抗体は、例えば放射性原子、発色団、フルオロフォアなどの検出可能な部分で標識することができる。斯かる標識された抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、または単離された検査試料において、診断技法に使用することができる。
【０２４９】
低分子量ハプテンへの抗体のカップリングは、アッセイにおける抗体の感度を増加させることができる。次いで、ハプテンは、第２の反応を用いて特異的に検出することができる。例えば、アビジンと反応するビオチン、または特異的抗ハプテン抗体と反応することができるジニトロフェノール、ピリドキサールおよびフルオレセイン等のハプテンを使用することが一般的である。Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  （１９８８）上記、を参照されたい。
【０２５０】
本開示の抗体の可変領域は、ＶＨおよび／またはＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を変異させて、抗体の１つまたは複数の結合特性（例えば、親和性）を改善することにより改変することができる。変異は、部位特異的変異誘発またはＰＣＲ媒介性変異誘発によって導入することができ、目的の抗体結合または他の機能特性における効果を適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおいて評価することができる。ある特定の実施形態では、保存的改変が導入され、典型的に、ＣＤＲ領域内の１、２、３、４または５残基以下が変更される。変異は、アミノ酸置換、付加または欠失であってよい。
【０２５１】
例えば、１つまたは複数のフレームワーク残基を対応する生殖系列配列へと「戻し変異（ｂａｃｋｍｕｔａｔｉｎｇ）」させることにより、フレームワーク改変を抗体に為して、免疫原性を減少させることができる。
【０２５２】
加えて、本明細書に開示される抗体は、Ｆｃ領域内に改変を含むように操作して、血清半減期（ｈａｌｆ−ｆｉｆｅ）、補体固定、Ｆｃ受容体結合および／または抗原依存性細胞性細胞傷害等の抗体の１つまたは複数の機能特性を変更することができる。斯かる改変は、軽鎖および重鎖のアセンブリーを容易にするためまたは抗体の安定性を増加もしくは減少させるためのヒンジ領域におけるシステイン残基の数の変更（米国特許第５，６７７，４２５号）、および抗体の生物学的半減期を減少させるためのＦｃヒンジ領域におけるアミノ酸変異（米国特許第６，１６５，７４５号）を含むがこれらに限定されない。
【０２５３】
その上、本明細書に開示される抗体は、化学的に改変することができる。抗体のグリコシル化は、例えば、抗体配列内のグリコシル化の１つまたは複数の部位を改変して、抗原に対する抗体の親和性を増加させることにより変更することができる（米国特許第５，７１４，３５０号および同第６，３５０，８６１号）。あるいは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害を増加させるために、変更されたグリコシル化機構を有する宿主細胞において抗体を発現させることにより、低減された量のフコシル残基を有する低フコシル化（ｈｙｐｏｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体、または増加されたバイセクト型ＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体を得ることができる（Ｓｈｉｅｌｄｓ，  Ｒ．  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７：２６７３３−２６７４０；Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １７：１７６−１８０）。
【０２５４】
１つまたは複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基が抗体または抗体断片に結合されるようになる条件下で、抗体またはその断片をＰＥＧまたはＰＥＧの反応性エステルもしくはアルデヒド誘導体と反応させることにより、本明細書に開示される抗体をペグ化して、生物学的半減期を増加させることができる。抗体ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応によって実行することができる。本明細書で使用される場合、用語「ポリエチレングリコール」は、モノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−もしくはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミド等、他のタンパク質を誘導体化するのに使用されたことがあるＰＥＧ形態のいずれかを包含することを意図する。ペグ化されるべき抗体は、無グリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体となることができる。タンパク質をペグ化するための方法は、当技術分野で公知であり、本明細書に開示される抗体に適用することができる（ＥＰ０１５４３１６およびＥＰ０４０１３８４）。
【０２５５】
その上、抗体は、ヒト血清アルブミン等の血清タンパク質に抗体の抗原結合性領域をコンジュゲートまたは融合することにより化学的に改変して、結果として生じる分子の半減期を増加させることができる。斯かるアプローチは、例えば、ＥＰ０３２２０９４およびＥＰ０４８６５２５に記載されている。
【０２５６】
本開示の抗体またはその断片は、診断剤にコンジュゲートし、診断的に使用して、例えば、疾患の発症または進行をモニターし、所与の処置レジメンの有効性を決定することができる。診断剤の例は、酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射性材料、様々なポジトロン放出断層撮影を使用したポジトロン放出金属、および非放射性常磁性金属イオンを含む。検出可能な物質は、当技術分野で公知の技法を使用して、抗体もしくはその断片に直接的に、またはリンカーを介して間接的に、カップリングまたはコンジュゲートすることができる。適した酵素の例は、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼを含む。適した補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含む。適した蛍光材料の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｙｌａｍｉｎｅ）フルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンを含む。発光材料の例は、ルミノールを含む。生物発光材料の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンを含む。適した放射性材料の例は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、インジウム−１１１、ルテチウム−１７１、ビスマス−２１２、ビスマス−２１３、アスタチン−２１１、銅−６２、銅−６４、銅−６７、イットリウム−９０、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、リン−３２、リン−３３、スカンジウム−４７、銀−１１１、ガリウム−６７、プラセオジム−１４２、サマリウム−１５３、テルビウム−１６１、ジスプロシウム−１６６、ホルミウム−１６６、レニウム−１８６、レニウム−１８８、レニウム−１８９、鉛−２１２、ラジウム−２２３、アクチニウム−２２５、鉄−５９、セレニウム−７５、ヒ素−７７、ストロンチウム−８９、モリブデン−９９、ロジウム−１１０５、パラジウム−１０９、プラセオジム−１４３、プロメチウム−１４９、エルビウム−１６９、イリジウム−１９４、金−１９８、金−１９９および鉛−２１１を含む。モノクローナル抗体は、抗体に共有結合により連結された二官能性キレート化剤の使用により、放射性金属イオンと間接的にコンジュゲートすることができる。キレート化剤は、アミノ基（ａｍｉｔｉｅｓ）（Ｍｅａｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １４２：６８−７８）；アミノ酸残基のスルフヒドリル（ｓｕｌｆｈｙｄｒａｌ）基（Ｋｏｙａｍａ  （１９９４）  Ｃｈｅｍ．  Ａｂｓｔｒ．  １２０：２１７−２６２）および炭水化物基（Ｒｏｄｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８３：２６３２−２６３６；Ｑｕａｄｒｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．  ２０：５５９−５７０）を介して結合することができる。
【０２５７】
さらに、本開示の抗体またはその断片は、治療剤にコンジュゲートすることができる。適した治療剤は、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ａｎｔｈｒａｃｉｎ  ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシン、代謝拮抗薬（メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎ）、５−フルオロウラシル、ダカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、ヒドロキシウレア、アスパラギナーゼ、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｃ）、クラドリビン等）、アルキル化剤（メクロレタミン、チオテパ（ｔｈｉｏｅｐａ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｈｕｃｉｌ）、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、プロカルバジン、マイトマイシンＣ、シスプラチン、およびカルボプラチン等の他の白金誘導体等）、抗生物質（ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）等）、ジフテリア毒素および関連分子（ジフテリアＡ鎖およびその活性断片、ならびにハイブリッド分子等）、リシン毒素（リシンＡまたは脱グリコシル化リシンＡ鎖毒素等）、コレラ毒素、志賀毒素様毒素（ＳＬＴ−Ｉ、ＳＬＴ−ＩＩ、ＳＬＴ−ＩＩＶ）、ＬＴ毒素、Ｃ３毒素、志賀毒素、百日咳毒素、破傷風毒素、大豆ボウマン・バークプロテアーゼインヒビター、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素、アロリン（ａｌｏｒｉｎ）、サポリン、モデクシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）、ゲラニン（ｇｅｌａｎｉｎ）、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、アルファ−サルシン（ｓａｒｃｉｎ）、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａインヒビター、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、Ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓインヒビター、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリエトシン（ｒｅｓｔｒｉｅｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）毒素および混合毒素を含む。
【０２５８】
追加の適したコンジュゲートされた分子は、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼ  Ｉ、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ分子等の阻害性ＲＮＡ分子、免疫賦活性核酸、アプタマー、リボザイム、三重鎖形成分子、および外部ガイド配列を含む。アプタマーは、ステム・ループまたはＧ−カルテット等、定義された二次および三次構造へと折り畳む、１５〜５０塩基の長さに及ぶ小型の核酸であり、ＡＴＰ（米国特許第５，６３１，１４６号）およびテオフィリン（ｔｈｅｏｐｈｉｌｉｎｅ）（米国特許第５，５８０，７３７号）等の小分子、ならびに逆転写酵素（米国特許第５，７８６，４６２号）およびトロンビン（米国特許第５，５４３，２９３号）等の大分子に結合することができる。リボザイムは、分子内または分子間のいずれかで、化学反応を触媒することができる核酸分子である。リボザイムは典型的に、標的基質の認識および結合と、その後の切断により、核酸基質を切断する。３本のＤＮＡ鎖が、ワトソン・クリックおよびフーグスティーン塩基対形成の両方に依存する複合体を形成する、三重鎖を形成することにより、三重鎖形成機能核酸分子は、二本鎖または一本鎖核酸と相互作用することができる。三重鎖分子は、高い親和性および特異性で、標的領域に結合することができる。
【０２５９】
機能的核酸分子は、標的分子によって保有される比活性のエフェクター、インヒビター、モジュレーターおよび刺激因子として作用することができる、または機能的核酸分子は、他のいかなる分子からも独立したｄｅ  ｎｏｖｏ活性を保有することができる。
【０２６０】
治療剤は、多数の利用できる方法のいずれかを使用して、直接的にまたは間接的に抗体に連結することができる。例えば、作用物質は、還元した抗体成分のヒンジ領域において、Ｎ−スクシニル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）等の架橋剤を使用したジスルフィド結合形成を介して、または抗体のＦｃ領域における炭水化物部分を介して、結合することができる（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ５６：  ２４４；Ｕｐｅｓｌａｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，”  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｂｉｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  ｐａｇｅｓ  １８７−２３０  （Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．  １９９５）；Ｐｒｉｃｅ，  ”Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，  Ｒｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  ｐａｇｅｓ  ６０−８４  （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５））。
【０２６１】
治療剤を抗体にコンジュゲートするための技法は、周知されている（Ａｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  ”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，”  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ；  Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  ｐｐ．  ２４３−５６  （Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．  １９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．  ”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”  ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  （２ｎｄ  Ｅｄ．）；  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  ｐｐ．  ６２３−５３  （Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．  １９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ  ”Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：  Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ，”  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  ｐｐ．  ４７５−５０６  （１９８５）；”Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｒｅｓｕｌｔｓ，  Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，”  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  ｐｐ．  ３０３−１６  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）およびＴｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．  ”Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，”  （１９８２）  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．  ６２：１１９−５８）。
【０２６２】
本明細書に開示される抗体またはその抗原結合性領域は、別の抗体または受容体のリガンド等、別の機能的分子に連結して、少なくとも２種またはそれよりも多くの種の異なる結合部位または標的分子に結合する二特異性または多特異性分子を生成することができる。別の抗体、抗体断片、ペプチドまたは結合模倣物等、１つまたは複数の他の結合分子への抗体の連結は、例えば、化学的カップリング、遺伝的融合または非共有結合的会合によって為すことができる。多特異性分子は、第１および第２の標的エピトープに加えて、第３の結合特異性をさらに含むことができる。
【０２６３】
二特異性および多特異性分子は、当技術分野で公知の方法を使用して調製することができる。例えば、二特異的分子（ｈｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の各結合単位を別々に生成し、次いで互いにコンジュゲートすることができる。結合分子がタンパク質またはペプチドである場合、種々のカップリング剤または架橋剤を共有結合コンジュゲーションに使用することができる。架橋剤の例は、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸（ｎｉｔｒｏｂｅｒｉｚｏｉｃ  ａｃｉｄ））（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン（ｃｙｃｌｏｈａｘａｎｅ）−Ｉ−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）を含む（Ｋａｒｐｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １６０：１６８６；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２：８６４８）。結合分子は、抗体である場合、２個の重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合によってコンジュゲートすることができる。
【０２６４】
本開示の抗体またはその断片は、抗体が結合される細胞に対して毒性がある部分に連結して、「枯渇」抗体を形成することができる。
【０２６５】
本明細書に開示される抗体は、標的抗原のイムノアッセイまたは精製に特に有用な固体支持体に結合することもできる。斯かる固体支持体は、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンを含むがこれらに限定されない。
【０２６６】
抗体は、多くの異なる担体に結合させることもできる。よって、本開示はまた、抗体と、活性または不活性の別の物質とを含有する組成物を提供する。周知の担体の例は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ（ａｍｙｌａｓｅ）、天然および改変セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、ならびにマグネタイトを含む。担体の性質は、本明細書に開示される目的のため、可溶性または不溶性のいずれかとなることができる。当業者であれば、モノクローナル抗体の結合のための他の適した担体について知っている、またはルーチンの実験法を使用して、そのようなものを確かめることができる。
【０２６７】
本明細書に提供される抗体の態様の一部では、抗体は、全長抗体である。
【０２６８】
本明細書に提供される抗体の態様の一部では、抗体は、モノクローナル抗体である。
【０２６９】
本明細書に提供される抗体の態様の一部では、抗体は、キメラまたはヒト化である。
【０２７０】
本明細書に提供される抗体の態様の一部では、抗体は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖおよびＦｖからなる群から選択される。
【０２７１】
本明細書に提供される抗体の態様の一部では、抗体は、Ｆｃドメインを含む。本明細書に提供される抗体の態様の一部では、抗体は、非ヒト動物、例えば、ラット、羊、ウシ、イヌ、ネコまたはウサギ抗体である。本明細書に提供される抗体の態様の一部では、抗体は、ヒトもしくはヒト化抗体である、またはヒトにおいて非免疫原性である。
【０２７２】
本明細書に提供される抗体の態様の一部では、抗体は、ヒト抗体フレームワーク領域を含む。
【０２７３】
他の態様では、本明細書に提供される抗体のＣＤＲにおける１つまたは複数のアミノ酸残基は、別のアミノ酸で置換される。置換は、同じアミノ酸ファミリー内の置換であるという意味で「保存的」となることができる。天然に存在するアミノ酸は、次の４つのファミリーに分けることができ、保存的置換は、これらのファミリー内で行われる。
【０２７４】
１）塩基性側鎖を有するアミノ酸：リシン、アルギニン、ヒスチジン。
【０２７５】
２）酸性側鎖を有するアミノ酸：アスパラギン酸、グルタミン酸
【０２７６】
３）無電荷極性側鎖を有するアミノ酸：アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン。
【０２７７】
４）非極性側鎖を有するアミノ酸：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン。
【０２７８】
別の態様では、１つまたは複数のアミノ酸残基が、抗体の１つまたは複数のＣＤＲに付加されるまたはこれから欠失される。斯かる付加または欠失は、ＣＤＲのＮもしくはＣ末端でまたはＣＤＲ内の位置で起こる。
【０２７９】
アミノ酸の付加、欠失または置換によって抗体のＣＤＲのアミノ酸配列を変動させることにより、標的抗原に対する結合親和性増加等、様々な効果を得ることができる。
【０２８０】
斯かる変動されたＣＤＲ配列を含む本開示の抗体が、依然として、開示されている抗体と同様の特異性および感度プロファイルで、ＤＮＡＢＩＩタンパク質に結合することを十分に理解するべきである。このことは、結合アッセイによって検査することができる。
【０２８１】
さらなる態様では、抗体は、適切なアッセイおよびスクリーニングを使用して決定される通り、免疫優性および免疫保護の両方であることによって特徴付けされる。
抗体による機能解析
【０２８２】
本明細書に開示される抗体を使用して、本明細書に開示されるポリペプチドを精製し、生物学的に等価なポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドを同定することができる。本明細書に開示される抗体を使用して、本明細書に開示されるポリペプチドの機能を改変する作用物質を同定することもできる。このような抗体は、当業者にとって馴染みがあり上に記載されている、ポリクローナル抗血清、モノクローナル抗体、およびこのような調製物に由来する様々な試薬を含む。
【０２８３】
同定された遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を中和する抗体をｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ検査システムに斯かる中和抗体を添加することにより、機能を実証することもできる。抗体は、本明細書に開示されるポリペプチドの活性をモジュレートするための医薬品としても有用である。
【０２８４】
ＥＬＩＳＡアッセイまたはウエスタンブロット等の解析方法において様々な抗体調製物を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、検査細胞による、同定された遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を実証することもできる。適切なポリクローナル抗血清と実験的試料に由来する試料を使用することにより、代謝においてプロテアーゼ分解によって生成された斯かるタンパク質の断片を同定することもできる。
【０２８５】
本明細書に開示される抗体は、単独で、またはペプチドもしくはタンパク質に基づくワクチンまたは樹状細胞に基づくワクチンと組み合わせて、ワクチン接種にまたはワクチン接種のブーストに使用することができる。
組成物
【０２８６】
本開示は、さらに、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する作用物質、バイオフィルムからカチオンを枯渇させる作用物質、バイオフィルムもしくはその局所環境においてＢ−ＤＮＡのＺ−ＤＮＡへの変換に干渉する作用物質、ｅＤＮＡのＤＮＡ結合タンパク質への結合に干渉する作用物質、および／または抗菌剤のうちの１つ、２つまたはそれよりも多く、３つまたはそれよりも多くを含む、またはあるいは、これから本質的になる、またはさらになお、これからなる組成物を提供する。一態様では、組成物は、ＨＭＢ１タンパク質、その断片およびその等価物を含まない、これから本質的にならない、さらになお、これからならない。別の態様では、組成物は、ＤＮアーゼを含む、これから本質的になる、またはさらになお、これからなる。さらなる態様では、組成物は、ＤＮアーゼを含まない、これから本質的にならない、さらになお、これからならない。一実施形態では、組成物は、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する作用物質、およびバイオフィルムまたはその局所環境においてＢ−ＤＮＡのＺ−ＤＮＡへの変換に干渉する作用物質を含む、またはあるいは、これから本質的になる、またはさらになお、これからなる。第２の実施形態では、組成物は、バイオフィルムからカチオンを枯渇させる作用物質、バイオフィルムまたはその局所環境においてＢ−ＤＮＡのＺ−ＤＮＡへの変換に干渉する作用物質、およびｅＤＮＡのＤＮＡ結合タンパク質への結合に干渉する作用物質を含む、またはあるいは、これから本質的になる、またはさらになお、これからなる。第３の実施形態では、組成物は、バイオフィルムまたはその局所環境においてＢ−ＤＮＡのＺ−ＤＮＡへの変換に干渉する作用物質、およびｅＤＮＡのＤＮＡ結合タンパク質への結合に干渉する作用物質を含む、またはあるいは、これから本質的になる、またはさらになお、これからなる。第４の実施形態では、組成物は、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する作用物質（ａｎ  ａｇｅｎｔ  ａｎ  ａｇｅｎｔ）、およびｅＤＮＡのＤＮＡ結合タンパク質への結合に干渉する作用物質を含む、またはあるいは、これから本質的になる、またはさらになお、これからなる。第５の実施形態では、組成物は、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する作用物質（ａｎ  ａｇｅｎｔ  ａｎ  ａｇｅｎｔ）、およびｅＤＮＡのＤＮＡ結合タンパク質への結合に干渉する作用物質、および／または抗菌剤を含む、またはあるいは、これから本質的になる、またはさらになお、これからなる。第６の実施形態では、組成物は、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する作用物質（ａｎ  ａｇｅｎｔ  ａｎ  ａｇｅｎｔ）、バイオフィルムからカチオンを枯渇させる作用物質、およびｅＤＮＡのＤＮＡ結合タンパク質への結合に干渉する作用物質を含む、またはあるいは、これから本質的になる、またはさらになお、これからなる。第７の実施形態では、組成物は、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する作用物質（ａｎ  ａｇｅｎｔ  ａｎ  ａｇｅｎｔ）、バイオフィルムからカチオンを枯渇させる作用物質、およびバイオフィルムまたはその局所環境においてＢ−ＤＮＡのＺ−ＤＮＡへの変換に干渉する作用物質を含む、またはあるいは、これから本質的になる、またはさらになお、これからなる。
【０２８７】
本開示の組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む、またはあるいは、これから本質的になる、またはさらになお、これからなることができる。
【０２８８】
一態様では、ポリアミンのバイオフィルム中のＤＮＡへの結合に干渉する作用物質は、ポリアミンアナログであるジフルオロメチルオルニチン、トランス−４−メチルシクロヘキシルアミン、サルドモジド、メチルグリオキサール−ビス［グアニルヒドラゾン］（ＭＧＢＧ）、１−アミノオキシ−３−アミノプロパン、オキサリプラチン、シスプラチンおよび／またはジシクロヘキシルアミン、任意のその誘導体、またはその塩のうちの１つまたは複数を含む。別の態様では、バイオフィルムからカチオンを枯渇させる作用物質は、カチオン交換樹脂、アミノポリカルボン酸、クラウンエーテル、アザクラウン、またはクリプタンド、スルホネート、スルホプロピル、ホスホセルロース、Ｐ１１ホスホセルロースおよび／またはヘパリン硫酸、またはその誘導体もしくはアナログのうちの１つまたは複数を含む。さらに別の態様では、バイオフィルムまたはその局所環境においてＢ−ＤＮＡのＺ−ＤＮＡへの変換に干渉する作用物質は、ＨＭＧＢ１タンパク質、その断片もしくはその各々の等価物、抗Ｂ−ＤＮＡ抗体、またはその断片もしくは誘導体、および／またはクロロキン、または任意のその誘導体のうちの１つまたは複数を含む。特定の一態様では、ｅＤＮＡのＤＮＡ結合タンパク質への結合に干渉する作用物質は、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体、抗ＩＨＦ抗体および／または抗ＨＵ抗体、またはその各々の断片のうちの１つまたは複数を含む。
【０２８９】
組成物がさらに提供される。組成物は、担体と、本明細書に開示される単離されたポリペプチド、本明細書に開示される単離されたポリヌクレオチド、本明細書に開示されるベクター、本明細書に開示される単離された宿主細胞、本明細書に開示される小分子または抗体のうちの１つまたは複数とを含む。担体は、固体支持体または薬学的に許容される担体のうちの１つまたは複数となることができる。組成物は、アジュバントまたはワクチンとしての投与に適した他の成分をさらに含むことができる。一態様では、組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、担体および／またはアジュバントと共に製剤化される。加えて、本開示の組成物の実施形態は、１つまたは複数の薬学的に許容される物質と共に製剤化された、本明細書に開示される単離されたポリペプチド、本明細書に開示される単離されたポリヌクレオチド、本明細書に開示されるベクター、本明細書に開示される小分子、単離された宿主細胞または本開示の抗体のうちの１つまたは複数を含む。
【０２９０】
経口調製物のため、本明細書に記載される単離されたまたは組換えポリペプチド、本明細書に記載される単離されたまたは組換えポリヌクレオチド、本明細書に記載されるベクター、本明細書に記載される単離された宿主細胞、本明細書に記載される小分子または抗体のうちいずれか１つまたは複数を、単独で使用するか、または錠剤、散剤、顆粒剤またはカプセル剤を作製するための適切な添加物と組み合わせて、例えば、ラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプンまたはジャガイモデンプン等の従来の添加物と；結晶性セルロース、セルロース誘導体、アカシア、トウモロコシデンプンまたはゼラチン等の結合剤と；トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプンまたはカルボキシメチルセルロースナトリウム等の崩壊剤と；タルクまたはステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤と；および所望であれば、希釈剤、緩衝剤、保湿剤、保存剤および香味剤と、組み合わせて化合物を含むもしくはこれから本質的になる本明細書に開示される医薬製剤において使用することができる。薬学的に適合性な結合剤（ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）および／またはアジュバント材料が、組成物の一部として含まれてよい。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、次の成分または同様の性質の化合物のいずれかを含有することができる：微結晶性セルロース、トラガカントゴムもしくはゼラチン等の結合剤（ｂｉｎｄｅｒ）；デンプンもしくはラクトース等の賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌもしくはトウモロコシデンプン等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはＳｔｅｒｏｔｅｓ等の滑沢剤；コロイド性二酸化ケイ素等の滑剤（ｇｌｉｄａｎｔ）；スクロースもしくはサッカリン等の甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジ香味料等の香味剤。
【０２９１】
経口投与に適した医薬製剤および単位用量形態は、慢性状態、感染症の処置、および患者が薬物を自己投与する治療法において特に有用である。一態様では、製剤は、小児投与に特異的である。
【０２９２】
本開示は、医薬製剤を提供し、この医薬製剤において、本明細書に開示される単離されたポリペプチド、本明細書に開示される単離されたポリヌクレオチド、本明細書に開示されるベクター、本明細書に開示される単離された宿主細胞、または本明細書に開示される抗体のうちの１つまたは複数は、これらを、植物油もしくは他の同様の油、合成脂肪族酸グリセリド、高級脂肪族酸のエステル、またはプロピレングリコール等の水性または非水性溶媒に溶解、懸濁または乳化することにより、本開示に従って注射用調製物へと、所望であれば、可溶化剤、等張剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤および保存剤または他の抗微生物剤等の従来の添加物と共に、製剤化され得る。そのようなものの非限定的な例は、表面抗原、例えば、ＯＭＰ  Ｐ５、ＯＭＰ  ２６、ＯＭＰ  Ｐ２またはＩＶ型ピリンタンパク質（Ｊｕｒｃｉｓｅｋ  ａｎｄ  Ｂａｋａｌｅｔｚ  （２００７）  Ｊ．  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １８９（１０）：３８６８−３８７５およびＭｕｒｐｈｙ，  Ｔ  Ｆ，  Ｂａｋａｌｅｔｚ，  Ｌ  Ｏ  ａｎｄ  Ｓｍｅｅｓｔｅｒｓ，  Ｐ  Ｒ  （２００９）  Ｔｈｅ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  ２８：Ｓ１２１−Ｓ１２６を参照）等の他のワクチン成分、および抗菌剤等の抗微生物剤である。静脈内投与のため、適した担体は、生理的静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む。全ての事例において、非経口投与のための組成物は、滅菌されていなければならず、容易に注射できる程度まで流動性があるべきである。
【０２９３】
本開示によって提供されるエアロゾル製剤は、吸入により投与することができ、噴射剤または非噴射剤ベースとなることができる。例えば、本明細書に開示される医薬製剤の実施形態は、例えばジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧された許容される噴射剤中に製剤化された本明細書に開示される化合物を含む。吸入による投与のため、化合物は、適した噴射剤、例えば、二酸化炭素等のガスを含有する加圧された容器もしくはディスペンサーまたはネブライザーからエアロゾルスプレーの形態で送達することができる。非噴射剤の非限定的な例は、機械力（すなわち、指でピストンを押し下げること、または容器の壁に加えられる圧縮力もしくは壁それ自体によって、例えば、弾性嚢によって及ぼされる弾性力等、容器の圧縮による）を用いて閉鎖容器から駆出されるポンプスプレーである。
【０２９４】
本明細書に開示される坐剤は、本明細書に開示される化合物を、乳化基剤または水溶性基剤等の種々の基剤のいずれかと混合することにより調製することができる。本明細書に開示される化合物のこのような医薬製剤の実施形態は、坐剤により直腸投与することができる。坐剤は、体温で融解するが室温で凝固する、カカオバター、カルボワックス（ｃａｒｂｏｗａｘ）およびポリエチレングリコール等の媒体を含むことができる。
【０２９５】
シロップ剤、エリキシル剤および懸濁剤等、経口または直腸投与のための単位剤形を提供することができ、各投薬量単位、例えば、茶匙１杯（ｔｅａｓｐｏｏｎｆｕｌ）、食匙１杯（ｔａｂｌｅｓｐｏｏｎｆｕｌ）、錠剤または坐剤は、本明細書に開示される１つまたは複数の化合物を含有する組成物の所定の量を含有する。同様に、注射または静脈内投与のための単位剤形は、滅菌水、生理的食塩水（ｎｏｒｍａｌ  ｓａｌｉｎｅ）または別の薬学的に許容される担体中の液剤としての組成物中に本明細書に開示される化合物を含むことができる。
【０２９６】
本明細書に開示される医薬製剤の実施形態は、本明細書に開示される単離されたポリペプチド、本明細書に開示される単離されたポリヌクレオチド、本明細書に開示されるベクター、本開示における使用のための小分子、本明細書に開示される単離された宿主細胞または本明細書に開示される抗体のうちの１つまたは複数が、注射用組成物中に製剤化される実施形態を含む。本明細書に開示される注射用医薬製剤は、液体の液剤もしくは懸濁剤として；または注射に先立つ液体媒体への溶解もしくは懸濁に適した固体形態として調製される。本明細書に開示される医薬製剤の他の実施形態に従って、調製物は、乳化することもできる、またはリポソーム媒体に被包された活性成分となることもできる。
【０２９７】
ある実施形態では、本明細書に開示される単離されたポリペプチド、本明細書に開示される単離されたポリヌクレオチド、本明細書に開示されるベクター、本明細書に開示される単離された宿主細胞または本明細書に開示される抗体のうちの１つまたは複数は、持続的送達系による送達のために製剤化される。用語「持続的送達系」は、「制御された送達系」と互換的に本明細書で使用され、そのうち多種多様なものが当技術分野で公知である、カテーテル、注射デバイスなどと組み合わせた、持続的（例えば、制御された）送達デバイス（例えば、ポンプ）を包含する。
【０２９８】
機械的または電気機械的注入ポンプも、本開示による使用に適する場合がある。斯かるデバイスの例は、例えば、米国特許第４，６９２，１４７号；同第４，３６０，０１９号；同第４，４８７，６０３号；同第４，３６０，０１９号；同第４，７２５，８５２号；同第５，８２０，５８９号；同第５，６４３，２０７号；同第６，１９８，９６６号などに記載されているデバイスを含む。一般に、本明細書に開示される化合物の送達は、種々の詰め替え可能なポンプシステムのいずれかを使用して達成することができる。ポンプは、経時的に一貫した制御放出をもたらす。一部の実施形態では、本明細書に開示される化合物は、薬物不透過性リザーバー内の液体製剤中に存在し、持続的様式で個体に送達される。
【０２９９】
一実施形態では、薬物送達系は、少なくとも部分的に植込み型デバイスである。植込み型デバイスは、当技術分野で周知の方法およびデバイスを使用して、いずれか適した植込み部位に植え込むことができる。植込み部位は、薬物送達デバイスが導入され置かれる、対象の身体内の部位である。植込み部位は、真皮下、皮下、筋肉内、または対象の身体内の他の適した部位を含むが、これらに必ずしも限定されない。皮下植込み部位は、一部の実施形態では、薬物送達デバイスの植込みおよび除去における便宜のために使用される。
【０３００】
本開示における使用に適した薬物放出デバイスは、種々の操作機序のいずれかに基づくことができる。例えば、薬物放出デバイスは、拡散システム、対流システムまたは侵食性システム（例えば、侵食に基づくシステム）に基づくことができる。例えば、薬物放出デバイスは、電気化学的ポンプ、浸透圧ポンプ、電気浸透圧ポンプ、蒸気圧ポンプまたは浸透圧バーストマトリックスとなることができ、この場合、例えば、薬物は、ポリマーに取り込まれ、ポリマーは、薬物含浸ポリマー材料（例えば、生分解性、薬物含浸ポリマー材料）の分解に付随して薬物製剤の放出をもたらす。他の実施形態では、薬物放出デバイスは、電気拡散システム、電解ポンプ、発泡ポンプ、圧電ポンプ、加水分解システム等に基づく。
【０３０１】
機械的または電気機械的注入ポンプに基づく薬物放出デバイスも、本開示による使用に適する場合がある。斯かるデバイスの例は、例えば、米国特許第４，６９２，１４７号；同第４，３６０，０１９号；同第４，４８７，６０３号；同第４，３６０，０１９号；同第４，７２５，８５２号などに記載されているデバイスを含む。一般に、対象処置方法は、種々の詰め替え可能で交換不可能なポンプシステムのいずれかを使用して達成することができる。ポンプおよび他の対流システムは、それらには、経時的に一般的により一貫性のある制御放出があるという理由から利用することができる。浸透圧ポンプは、一部の実施形態では、それらには、より一貫性のある制御放出と比較的小さいサイズという複合的利点があるという理由から使用される（例えば、ＰＣＴ国際出願公開番号ＷＯ９７／２７８４０ならびに米国特許第５，９８５，３０５号および同第５，７２８，３９６号を参照）。本開示における使用に適した例示的な浸透圧により駆動されるデバイスは、米国特許第３，７６０，９８４号；同第３，８４５，７７０号；同第３，９１６，８９９号；同第３，９２３，４２６号；同第３，９８７，７９０号；同第３，９９５，６３１号；同第３，９１６，８９９号；同第４，０１６，８８０号；同第４，０３６，２２８号；同第４，１１１，２０２号；同第４，１１１，２０３号；同第４，２０３，４４０号；同第４，２０３，４４２号；同第４，２１０，１３９号；同第４，３２７，７２５号；同第４，６２７，８５０号；同第４，８６５，８４５号；同第５，０５７，３１８号；同第５，０５９，４２３号；同第５，１１２，６１４号；同第５，１３７，７２７号；同第５，２３４，６９２号；同第５，２３４，６９３号；同第５，７２８，３９６号などに記載されているデバイスを含むが、これらに必ずしも限定されない。本開示に適応され得るさらに例示的なデバイスは、Ｓｙｎｃｈｒｏｍｅｄ注入ポンプ（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ）である。
【０３０２】
一部の実施形態では、薬物送達デバイスは、植込み型デバイスである。薬物送達デバイスは、当技術分野で周知の方法およびデバイスを使用して、いずれか適した植込み部位に植え込むことができる。本明細書に記述される通り、植込み部位は、薬物送達デバイスが導入され置かれる、対象の身体内の部位である。植込み部位は、真皮下、皮下、筋肉内、または対象の身体内の他の適した部位を含むが、これらに必ずしも限定されない。
【０３０３】
本明細書に開示される化合物に適した賦形剤媒体は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびこれらの組合せである。加えて、所望であれば、媒体は、湿潤剤または乳化剤またはｐＨ緩衝剤等、少量の補助的物質を含有することができる。斯かる剤形を調製する方法は、公知である、または本開示を考慮することにより、当業者には明らかとなる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．，  １７ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９８５を参照されたい。投与されるべき組成物または製剤は、いかなる場合であっても、処置されている対象における所望の状態の達成に適切な化合物の含量を含有する。
【０３０４】
本開示の組成物は、徐放性マトリックスまたは制御放出マトリックスを含む組成物を含む。加えて、本開示の実施形態は、徐放性製剤を使用する他の処置と併せて使用することができる。本明細書で使用される場合、徐放性マトリックスは、酵素によるもしくは酸に基づく加水分解または溶解によって分解可能な材料、通常、ポリマーから作られたマトリックスである。身体内に挿入されると、マトリックスは、酵素および体液の作用を受ける。徐放性マトリックスは、望ましくは、リポソーム、ポリラクチド（ポリ乳酸）、ポリグリコリド（グリコール酸のポリマー）、ポリラクチドｃｏ−グリコリド（乳酸およびグリコール酸のコポリマー）、ポリ酸無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリペプチド、ヒアルロン酸、コラーゲン、コンドロイチンサルフェート、カルボン酸（ｃａｒｂｏｘｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、脂肪酸、リン脂質、多糖、核酸、ポリアミノ酸、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｔａｎｉｎｅ）、チロシン、イソロイシン等のアミノ酸、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドンおよびシリコーン等の生体適合性材料から選択される。説明目的の生分解性マトリックスは、ポリラクチドマトリックス、ポリグリコリドマトリックスおよびポリラクチドｃｏ−グリコリド（乳酸およびグリコール酸のコポリマー）マトリックスを含む。
【０３０５】
別の実施形態では、作用物質（および組合せ組成物）は、制御放出システムにおいて送達される。例えば、本明細書に開示される化合物は、静脈内注入、植込み型浸透圧ポンプ、経皮パッチ、リポソームまたは他の投与機序を使用して投与することができる。一実施形態では、ポンプを使用することができる（Ｓｅｆｔｏｎ  （１９８７）  ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｆ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｅｎｇ．  １４：２０１；Ｂｕｃｈｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８０）  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７；Ｓａｕｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３２１：５７４）。別の実施形態では、ポリマー材料が使用される。さらに別の実施形態では、制御放出システムは、治療標的、すなわち、肝臓に近接して配置され、よって、全身性用量のごく一部しか要求しない。さらに別の実施形態では、制御放出システムは、治療標的に近接して配置され、よって、全身性用量のごく一部しか要求しない。他の制御放出システムは、Ｌａｎｇｅｒ  （１９９０）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３による概説において考察されている。
【０３０６】
別の実施形態では、本開示の組成物（および別々のまたは一緒の組合せ組成物）は、組成物を送達するために、縫合糸、包帯およびガーゼ等の吸収性材料への本明細書に記載される阻害する作用物質の含浸によって形成された組成物、または手術用ステープル、ジッパーおよびカテーテル等の固相材料の表面にコーティングされた組成物を含む。この種の他の送達系は、当業者には、本開示を考慮して容易に明らかとなる。
【０３０７】
本開示は、微生物感染の処置のための、作用物質のうちの１つまたは複数の宿主（例えば、ヒト）への投与のための方法および組成物を提供する。様々な実施形態では、本明細書に開示されるこのような方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏ方法、ならびに全身性および局部投与経路を含む、薬物送達に適したほぼ全ての利用できる方法および経路に及ぶ。
スクリーニングアッセイ
【０３０８】
本開示は、本明細書に記載されるポリクローナル抗体と等価なモノクローナル抗体等の等価な作用物質、および活性剤の活性をモジュレートする様々な作用物質、および本明細書に開示される医薬組成物、または本明細書に開示されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドもしくはペプチド産物の機能に関してスクリーニングするための方法を提供する。本開示の目的のため、「作用物質」は、単純もしくは複雑な有機もしくは無機分子、ペプチド、タンパク質（例えば、抗体）、ポリヌクレオチド（アンチセンス）、またはリボザイム等の生物学的または化学的な化合物を含むが、これらに限定されないことを意図する。広範囲の化合物、例えば、ポリペプチドおよびポリヌクレオチド等のポリマー、ならびに様々なコア構造に基づく合成有機化合物を合成することができ、これらもまた、用語「作用物質」に含まれる。加えて、例えば植物または動物抽出物など、様々な天然の供給源が、スクリーニングのための化合物をもたらすことができる。必ずしも明確に記述されているとは限らないが、作用物質が、単独で、または発明に関するスクリーニングによって同定される作用物質と同じもしくは異なる生物活性を有する別の作用物質と組み合わせて使用されることを理解されたい。
【０３０９】
当業者には明らかなように、マイクロタイタープレートにおいて適した細胞を培養することができ、遺伝子型変化、表現型変化または微生物力価の低減に注目することにより、いくつかの作用物質を同時にアッセイすることができる。
【０３１０】
作用物質が、上述の通り、小分子等、ＤＮＡまたはＲＮＡ以外の組成物である場合、作用物質は、細胞培養物に直接的に添加することができる、または添加のための培養培地に添加することができる。当業者には明らかなように、経験的に決定することができる「有効」量（ａ  ｍｏｕｎｔ）が添加されなければならない。
【０３１１】
作用物質が、抗体または抗原結合性断片である場合、作用物質は、競合的ＥＬＩＳＡを行うための条件下で、標的抗原および本明細書に記載されるポリクローナル抗体と接触させるまたはこれと共にインキュベートすることができる。斯かる方法は、当業者にとって公知である。
【０３１２】
アッセイは、対象において行うこともできる。対象が、ラット、チンチラ、マウスまたはサル等の動物である場合、本方法は、ヒト患者における作用物質の臨床検査に先立ち使用することができる簡便な動物モデルシステムを提供する。このシステムにおいて、疾患または微生物感染の症状が、同じ感染を有する無処置動物とそれぞれ比較して低減または排除される場合、候補作用物質は、潜在的な薬物である。比較のための基礎を提供する、健康で処置されない細胞または動物の別々の陰性対照群を有することは有用であり得る。
【０３１３】
作用物質および組成物は、医薬組成物における活性成分等、医薬の製造において、また、従来の手順に従った投与によるヒトおよび他の動物の処置のために使用することができる。
併用療法
【０３１４】
本開示の組成物および関連方法は、他の療法の投与と組み合わせて使用することができる。これらは、ＤＮアーゼ酵素、抗生物質、抗微生物薬または他の抗体の投与を含むがこれらに限定されない。一態様では、作用物質は、ＤＮアーゼ酵素の非存在下で投与される。
【０３１５】
他の実施形態では、方法および組成物は、抗生物質および／または抗微生物薬と組み合わせることができる。抗微生物薬は、細菌、真菌または原生動物等の微生物の成長を死滅させるまたは阻害する物質である。バイオフィルムは一般に、抗生物質の作用に対し抵抗性であるが、本明細書に記載される組成物および方法を使用して、バイオフィルムが関与する感染を、感染を処置するための従来の治療方法に対して感受性にすることができる。他の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物と組み合わせた抗生物質または抗微生物薬の使用は、抗微生物薬および／またはバイオフィルム低減剤の有効量の低減を可能にする。本開示の方法と組み合わせて有用な抗微生物薬および抗生物質の一部の非限定的な例は、アモキシシリン、アモキシシリン・クラブラン酸塩、セフジニル、アジスロマイシンおよびスルファメトキサゾール・トリメトプリムを含む。バイオフィルム低減剤と組み合わせた抗微生物薬および／または抗生物質の治療有効用量は、従来の方法によって容易に決定することができる。一部の実施形態では、バイオフィルム低減剤と組み合わせた抗微生物剤の用量は、他の細菌感染、例えば、感染の病因がバイオフィルムを含まない細菌感染において有効であることが示された平均有効用量である。他の実施形態では、用量は、平均有効用量の０．１、０．１５、０．２、０．２５、０，３０、０，３５、０．４０、０．４５、０．５０、０．５５、０．６０、０．６５、０．７０、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５、３．０または５倍である。抗生物質または抗微生物薬は、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体の添加の前に、それと同時にまたはその後に添加することができる。
【０３１６】
他の実施形態では、方法および組成物は、細菌感染を処置する抗体と組み合わせることができる。本明細書に記載される方法および組成物と組み合わせて有用な抗体の一例は、無関係の外膜タンパク質（すなわち、ＯＭＰ  Ｐ５）に対する抗体である。この抗体単独による処置は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでバイオフィルムを減量しない。この抗体およびバイオフィルム低減剤による組み合わせた治療法は、同じ濃度で単独で使用されたいずれかの試薬によって達成され得る効果よりも大きい効果をもたらす。バイオフィルム低減剤またはバイオフィルムを低減するための方法と組み合わせたときに相乗効果を生じさせることができる他の抗体は、抗ｒｓＰｉｌＡ、抗ＯＭＰ２６、抗ＯＭＰ  Ｐ２および抗ＯＭＰ全体調製物を含む。
【０３１７】
本明細書に記載される組成物および方法を使用して、バイオフィルムが関与する細菌感染を、バイオフィルムによらない細菌感染の処置において有効であるが、他の面では、バイオフィルムが関与する細菌感染の処置において無効な一般的治療モダリティに対して感受性にすることができる。他の実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法は、バイオフィルムが関与する細菌感染の処置において有効な治療モダリティと組み合わせて使用することができるが、斯かる追加の治療法およびバイオフィルム低減剤または方法の組合せは、バイオフィルム低減剤または追加の治療剤のいずれかの有効用量が低減され得るような相乗効果を生じさせる。他の実例では、斯かる追加の治療法およびバイオフィルム低減剤または方法の組合せは、処置が増強されるような相乗効果を生じさせる。処置の増強は、より短い時間量が感染の処置に要求されることによって証明することができる。
【０３１８】
追加の治療的処置は、バイオフィルムの低減に使用される方法または組成物の前に、それと同時にまたはその後に添加することができ、同じ製剤（ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）内にまたは別々の製剤として含有され得る。
キット
【０３１９】
本明細書に開示される組成物と、使用のための指示とを含む、またはあるいは、これから本質的になる、またはさらになお、これからなるキットが本明細書に提供される。一態様では、使用のための指示は、本明細書に開示される方法のいずれかを行うための使用法（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）を提供する。一態様では、開示される方法における使用のための作用物質のうちの１つもしくは複数、２つもしくはそれよりも多くまたは３つもしくはそれよりも多くは、キット内に独立してまたは一緒に包装される。
【０３２０】
本明細書に記載されるｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ方法を行うために必要な作用物質および指示を含有するキットも請求される。したがって、本開示は、これらの方法を実施するためのキットを提供し、そのキットは、本明細書に開示されるもの、ならびに、組織収集および／またはスクリーニング実施および／または結果解析および／または本明細書に定義される有効量の作用物質の投与等の本明細書に開示される方法を実行するための指示を含むことができる。これらは、単独で、または他の適した抗微生物剤と組み合わせて使用することができる。
【０３２１】
次の実施例は、説明を意図し、本明細書に開示される実施形態を限定するものではない。
【実施例】
【０３２２】
（実施例１）
実験番号１
ポリアミンは、殆ど全ての生物によって産生および利用される、遍在性で小型の脂肪族ポリカチオンである。Ｍｉｃｈａｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２９１（２９）：１４８９６−９０３；Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  ＦＥＢＳ  Ｊ．  ２７２（１５）：３７７７−８７。ポリアミンは、アミノ酸から得られ、転写、翻訳、転写調節、オートファジーおよびストレス抵抗性を含む、成長および増殖の中心となる数多くの細胞機能において役割を果たす。Ｍｉｌｌｅｒ−Ｆｌｅｍｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４２７（２１）：３３８９−４０６。ポリアミン合成のための複数の経路が存在し、代謝レパートリーにおけるその存在は、種間で変動する。Ｍｉｃｈａｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．  ４７３（１５）：２３１５−２９。その静電媒介性相互作用の非特異的性質のため、ポリアミン合成は、転写、翻訳およびタンパク質分解機構の組合せにより密接に調節される。Ｍｉｌｌｅｒ−Ｆｌｅｍｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４２７（２１）：３３８９−４０６。
【０３２３】
生物によって産生される、５種の主要ポリアミン分子が存在する；スペルミン、スペルミジン、プトレシン、カダベリンおよび１，３−ジアミノプロパン。Ｍｉｌｌｅｒ−Ｆｌｅｍｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４２７（２１）：３３８９−４０６。追加の種類のポリアミンは、より種特異的な様式で産生される。各ポリアミンは、カチオン性性状および電荷分布を規定するアミン基の長さおよび数の差のため、僅かに異なる特質を有する。Ｍｉｃｈａｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２９１（２９）：１４８９６−９０３。この変動は、ポリアミン活性におけるある程度の特異性レベルを可能にすると共に、ポリアミン凝集物のアセンブリーを方向付ける。Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  ＦＥＢＳ  Ｊ．  ２７２（１５）：３７７７−８７；Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  ＩＵＢＭＢ  Ｌｉｆｅ  ５８（２）：７５−８２。
【０３２４】
ポリアミン機能は、ポリアミン濃度の調節不全と相関する複数の疾患状態によって証明される通り、濃度依存性である。Ｍｉｌｌｅｒ−Ｆｌｅｍｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４２７（２１）：３３８９−４０６。全般的代謝プロセスは、ポリアミンのレベル変更により破壊することができ、特異的プロセスは、ポリアミンのレベルの特異的または全体的変化によって変更することができる。例えば、特異的ポリアミン濃度は、微生物バイオフィルム産生の異なる成果を媒介することができる。複数の種において、細胞内ポリアミンレベルが、バイオフィルム生物発生を調節し、この調節が、特異的ポリアミンの細胞内感知によるものである可能性があることが実証された。Ｋａｒａｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．  ３５（１１）：１７１５−７；ＭｃＧｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．  ２９９（２）：１６６−７４；Ｗｏｒｔｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １２（７）：２０３４−４７。いずれのポリアミンがこれらの表現型を媒介するかは、種特異的である可能性がある。特異的ポリアミンを産生する能力を欠く変異体株において、合成できない当該ポリアミンの外因性添加は、バイオフィルム形成を回復させたが、他のポリアミンの添加は、回復させなかった。その上、文献には、内因性または高濃度の外因性特異的ポリアミンおよびこれらの誘導体によって阻害される細菌バイオフィルム形成の例が豊富にあるが、他のポリアミンには効果がない。Ｋａｒａｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．  ３５（１１）：１７１５−７；Ｇｏｙｔｉａ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．  ３４３（１）：６４−９；Ｃａｒｄｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７）  Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．  ９７３：５３−７０；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １９８（１９）：２６８２−９１；Ｑｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙｏｐｅｎ．  ５（３）：４０２−１２；Ｋｏｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．  ２６（１２）：２４４２−５３；Ｓｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ９９（２４）：１０８６１−７０；Ｄｅｗａｎｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ５８（９）：５４３５−４７；Ｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ８０（４）：１４９８−５０６；Ｐｌａｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  ＭＢｉｏ．  ４（６）：ｅ００８８９−１３。しかし、ある種を阻害する同じポリアミンは、バイオフィルム生物発生を阻害しない場合があり、さらには、他の細菌種において、バイオフィルム産生に必要となる場合がある。Ｋａｒａｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．  ３５（１１）：１７１５−７；ＭｃＧｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．  ２９９（２）：１６６−７４；Ｗｏｒｔｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １２（７）：２０３４−４７；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １９８（１９）：２６８２−９１；Ｈｏｂｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２９２（２９）：１２０４１−５３；Ｏｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７）  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  Ｒｅｐ．  １５（１）：２１−２０；Ｎｅｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ８１（６）：２２２６−３２；Ｒａｍｏｎ−Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｐａｔｈｏｇ．  ７９：８−１６；Ｈｏｂｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ｃｅｌｌ．  １５６（４）：８４４−５４；Ｓａｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ４４（１１）：１８７７−８６；Ｂｕｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２８５（５０）：３９２２４−３８；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２８４（１５）：９８９９−９０７；Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８８（７）：２３５５−６３。さらに、真菌バイオフィルム発達におけるポリアミンの役割は、十分に定義されていないが、ポリアミン合成におけるＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ変異体は、バイオフィルム産生が欠損しており、ポリアミン合成阻害剤によるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの処置は、バイオフィルム成長に否定的に影響する。Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｓｙｓｔ．  １０（１）：７４−８５；Ｌｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｉｎｔ  Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ．  ４６（１）：４５−５２。
【０３２５】
ｅＤＮＡ安定化の潜在的な供給源の１つは、バイオフィルムマトリックスにおけるポリアミンの存在である。ポリアミンは、ＤＮＡ構造をモジュレートし（Ｐａｓｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ．  ４６（３）：５９５−６０３）、外部改変剤または危険な条件からＤＮＡを保護することが観察された。Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  ＦＥＢＳ  Ｊ．  ２７２（１５）：３７７７−８７；Ｂａｅｚａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｏｒｉｇ  Ｌｉｆｅ  Ｅｖｏｌ  Ｂｉｏｓｐｈ．  ２１（４）：２２５−４２；Ｎａｙｖｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．  １１（１）：９７−１０５。細胞内クロマチン安定化におけるポリアミンの役割は、十分に実証されている。Ｐａｓｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ．  ４６（３）：５９５−６０３。そこで、出願人らは、細胞外ポリアミンが、細菌バイオフィルムのｅＤＮＡ構造を安定化すると仮定し、細菌バイオフィルム群集を破壊する手段として、ポリアミン含量および細胞外でバイオフィルムマトリックス中のｅＤＮＡに結合するポリアミンの能力を変更することを示す。出願人らは、ポリアミンの合成阻害またはアンタゴニズムが、確立された細菌バイオフィルムを破壊し、ポリアミン枯渇細菌の補充が、ｅＤＮＡ構造を回復させたことを観察した。
ポリアミンは細菌バイオフィルムの細胞外マトリックスに存在する
【０３２６】
ポリアミンがバイオフィルムマトリックスに存在するかどうかを決定するために、モデルヒト病原体として、出願人らは、分類不能Ｈａｅｍｏｐｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨｉ）バイオフィルムをｉｎ  ｖｉｔｒｏで成長させ、プトレシン、スペルミンまたはスペルミジンに対する抗体により免疫蛍光を行った。共焦点レーザー走査顕微鏡法（ＣＬＳＭ；図１２）を使用して、バイオフィルム細胞外マトリックス内のポリアミン局在を可視化した。バイオフィルム全体にわたり、免疫蛍光顕微鏡法によって全３種のポリアミンが検出された。
ポリアミン合成阻害またはポリアミンアンタゴニズムは細菌バイオフィルムを破壊する
【０３２７】
ジシクロヘキシルアミンは、競合的阻害機構を介して、スペルミジンシンターゼを、すなわち、そのタンパク質上のプトレシン基質が結合する部位と同じ部位に結合することにより、阻害する。したがって、出願人らは、ジシクロヘキシルアミンが、ＮＴＨｉバイオフィルム発達を阻害するであろうと仮定した。先ず、出願人らは、ジシクロヘキシルアミンが、最大１０ｍＭまでＮＴＨｉ成長に影響を与えないことを確認した（図１３）。しかし、５０μＭジシクロヘキシルアミンの添加は、ＣＯＭＳＴＡＴ解析によって評価される通り、ＮＴＨｉバイオフィルム形成を有意に阻害し、バイオフィルムの厚さおよびバイオマスをおよそ４０％低減させた一方で、バイオフィルムの粗さを増加させた（図１４）。ジシクロヘキシルアミンで処置した残存ＮＴＨｉバイオフィルムにおけるスペルミジンの存在に関するその後の免疫蛍光顕微鏡法は、バイオフィルムマトリックスに存在するスペルミジンの統計的に有意な対応する減少を明らかにした（図１５）。ジシクロヘキシルアミンは、初期バイオフィルム形成中に産生されたｅＤＮＡスキャフォールド構造の量および複雑性も低減させた（図１６）。ジシクロヘキシルアミン処置ＮＴＨｉバイオフィルムへの１ｍＭスペルミジンの外因性添加は、正常なバイオフィルムの厚さ、バイオマスおよび粗さを回復させ（図１４）、ジシクロヘキシルアミンが、バイオフィルム細胞外マトリックスにおけるスペルミジンシンターゼおよび／または外因性スペルミジンのいずれかの競合的阻害剤として機能していたことを指し示す。これらのデータは、ポリアミン合成の阻害またはポリアミン結合部位へのアンタゴニスト性の結合により、バイオフィルムマトリックスにおいてｅＤＮＡに結合する細胞外ポリアミンに向けられた化合物が、バイオフィルム生物発生の予防および確立されたバイオフィルムの破壊のための潜在力を有することを明らかにする。
（実施例２）
実験番号２
【０３２８】
疾病管理予防センター（Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）によると、全ての細菌感染性疾患の＞８０％の病理発生が、疾患経過の病理発生において必要なバイオフィルム状態を含むことが推定される。バイオフィルムは、核酸、タンパク質、脂質、バイオポリマー（Ｄａｖｉｅｓ  （２００３）  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  ２（２）：１１４−２２）および二価カチオン（Ｃａｖａｌｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１４）  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ．  ３（４）：５５７−５６７）を含む、細胞外ポリマー物質（ＥＰＳ）内に包埋された構造化集団へと進行した、非生物的および生物的表面に付着した細菌細胞で構成される。ＥＰＳは、厳しい環境および抗生物質等の抗微生物剤および宿主免疫エフェクターに対する防護壁として作用する（Ｄｅｖａｒａｊ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１３）、上記参照）。バイオフィルムマトリックスの決定的な構造成分およびアーキテクチャ成分は、細胞外ＤＮＡ（ｅＤＮＡ）およびＤＮＡＢＩＩファミリーのＤＮＡ結合タンパク質（ＩＨＦおよびＨＵ）である。ＤＮＡＢＩＩタンパク質は、高い親和性でｅＤＮＡに結合し、これにより、バイオフィルムの安定化が可能となる。ＤＮＡＢＩＩを標的とする抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで常在性細菌の放出によるバイオフィルムの崩壊を誘導する（Ｎｏｖｏｔｎｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ．  （１０）：３３−４４）；およびＧｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．  ４  （６）：  ６２５−６３７）。ＤＮアーゼ処置は、細菌種がバイオフィルムを形成することを予防することができるが、既存のバイオフィルムには効果が殆どないまたは全くない（Ｆｌｅｍｍｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｎｇｅｎｄｅｒ，  （２０１０）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．  ８：６２３−６３３）。正電荷を有する二価カチオン（Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｕ２＋およびＣａ２＋）は、隣接する負電荷を有するＤＮＡ分子の間の分子間架橋を媒介する。この相互作用は、ＤＮＡ構造およびその後のＤＮＡ−タンパク質相互作用を安定化する（Ｇｕｅｒｏｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  ＰＬＯＳ  ＯＮＥ．  （７）−７−ｅ４１７０４；およびＴａｎ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，  （２００６）  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ．  （９０）：  １１７５−１１９０；Ｈａｃｋｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ３５：１７５−１９１）。さらに、バイオフィルムからのＭｇ２＋カチオンの除去は、抗生物質処置に対する分類不能Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨｉ）の感受性を増加させる（Ｃａｖａｌｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ．  ３（４）：５５７−５６７）。最後に、ポリアミン（短いポリカチオン性生体アミン）も、複数の細菌種によるバイオフィルム形成に重要である（Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ��  ２３５５−２３６３；およびＨｏｂｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１７）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ２９２（２９）：  １２０４１−１２０５３）。スペルミジンの存在についてプローブした場合、多くの病原性細菌によって形成されたバイオフィルムの免疫蛍光ＣＬＳＭ（ＩＦ）画像は、ポリアミンが、細菌バイオフィルムのＥＰＳの一部であり、さらには、ＤＮＡＢＩＩタンパク質ＨＵと共局在することを指し示す（図１７Ａ）。酵素阻害剤ジシクロヘキシルアミン（ＤＣＨＡ）によるＮＴＨＩにおけるスペルミジン生合成経路の阻害は、ＩＦによって測定される通りのスペルミジンレベルの全体的な減少、およびバイオフィルムの平均の厚さの有意な減少をもたらし、よって、ポリアミンが、バイオフィルムの安定性に決定的であることを指し示す（図１７Ｂおよび図１７Ｃ）。
【０３２９】
微生物がバイオフィルムを形成する能力は、広範囲の産業の間で非常に問題であり至る所にある。例えば、機械心臓弁、尿路カテーテルおよび静脈カテーテルの院内のデバイス関連感染は、バイオフィルムの形態の細菌汚染の結果である（Ｄｏｎｌａｎ，  （２００１）  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．  ７（２）：２７７−２８１）。農業および食品加工施設におけるバイオフィルム形成の制御も、疾患および大規模な食品ロスの防止に重要である。Ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｋ  （２００６）  Ｃｏｍｐｒ  Ｒｅｖ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ  Ｆ  ２：２２−３２。廃水処理施設も、適切な膜濾過を妨げて水質汚染をもたらす、ＥＰＳおよび微生物の蓄積である生物汚染等、バイオフィルム媒介性の問題を生じさせる（Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１６）  ＰＮＡＳ．  Ｅ２８０２−Ｅ２８１１）。
【０３３０】
カチオン交換樹脂（スルホネート、スルホプロピル、ホスホセルロースまたはヘパリンセファロース）によるバイオフィルムの表面コーティングおよび／または処置は、ＥＰＳの正電荷を有する成分（すなわち、ポリアミン、二価金属カチオンおよびＤＮＡＢＩＩタンパク質）を標的とする、負電荷を有する樹脂化学の特性を利用する。これは、生物的および非生物的表面の両方におけるバイオフィルム破壊および予防をもたらす。そこで、出願人らは、カチオン交換樹脂Ｐ１１ホスホセルロースおよびヘパリンセファロースが、バイオフィルム形成を予防し、予め形成されたバイオフィルムを破壊することができることを実証する。
カチオン交換樹脂は、分類不能Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）による予め形成されたバイオフィルムおよびバイオフィルム形成に負の効果を有する
【０３３１】
出願人らは、バイオフィルムに浸透することができない負電荷を有する樹脂が、細菌バイオフィルム形成に普遍的に要求される正電荷を有する分子（すなわち、ポリアミン、二価金属カチオンおよびＤＮＡＢＩＩタンパク質）の排除（ｔｉｔｒａｔｅ  ｏｕｔ）に作用することができるかを問題にした。２種の樹脂、例えば、ホスホセルロース（Ｐ１１）およびヘパリンセファロースを選択し、これらは両者共に、イオン交換クロマトグラフィーに使用されるカチオン交換体であるが、ＤＮＡＢＩＩタンパク質の親和性精製にも使用される（Ｎａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．  ４１２４−４１２７；およびＶｏｒｇｉａｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ，  （１９９１）  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｃａｔｉｏｎ．  ２（５−６）：３１７−２０）。
【０３３２】
予め形成されたバイオフィルムにおけるカチオン交換樹脂の抗バイオフィルム活性（すなわち、現存するバイオフィルムを破壊する能力）を決定するために、ＮＴＨＩ成長を開始させ、２４時間維持し、次いで、０（ｓＢＨＩ対照）、０．１、１または５％（ｗ／ｖ）のＰ１１ホスホセルロースで１６時間処置した（図１８Ａ）。バイオフィルム形成を予防するカチオン交換樹脂の抗バイオフィルム活性を決定するために、ＮＴＨＩ成長を開始させ、０（ｓＢＨＩ対照）、０．１、１および５％ｗ／ｖのＰ１１ホスホセルロース（図１８Ｂ）または５％（ｗ／ｖ）ヘパリンセファロース（図１９）の存在下で維持した。バイオフィルムを食塩水で洗浄し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）で染色し、共焦点走査顕微鏡法（ＣＳＬＭ）で可視化し、ＣＯＭＳＴＡＴによって解析して、平均の厚さおよびバイオマスを決定した。図１８に指し示す通り、Ｐ１１ホスホセルロースは、予め形成されたバイオフィルム（これを破壊することができた）およびバイオフィルム形成（これを予防することができた）の両方に負の効果を有し、このことは、平均の厚さおよびバイオマスの減少によって明らかにされた。ヘパリンセファロースも、バイオフィルム形成に負の効果を有し、この場合、平均の厚さおよびバイオマスの減少が観察された（図１８）。これらのデータは、カチオン交換樹脂が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでバイオフィルム形成の破壊および予防の両方が可能であることを示唆する。
ＤＮＡＢＩＩ（ＨＵ）は、カチオン枯渇された予め形成されたＮＴＨｉバイオフィルムを部分的に回復した
【０３３３】
ＤＮＡＢＩＩタンパク質の除去が、観察されたバイオフィルム破壊および予防の原因の一部となったかを決定するために、ＮＴＨＩ成長を開始させ、２４時間の０（ｓＢＨＩ対照）または１％Ｐ１１ホスホセルロース（ｗ／ｖ）と、１６時間の１または５ｕｇ／ｍＬのＨＵタンパク質の外因性添加の存在下で維持した。バイオフィルムを食塩水で洗浄し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）で染色し、ＣＳＬＭで可視化し、ＣＯＭＳＴＡＴによって解析して、平均の厚さおよびバイオマスを決定した。図１９に示す通り、ＨＵは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでホスホセルロースの負の効果を部分的に補償することができる。これらのデータは、ＨＵが、カチオン交換樹脂によって標的とされることを示唆する。
二価金属は、カチオン枯渇された予め形成されたＮＴＨＩバイオフィルムを部分的に回復する
【０３３４】
Ｍｇ２＋が、カチオン枯渇されたバイオフィルムを回復させることができるかどうかを決定するために、ＮＴＨＩ成長を開始させ、２４時間の０（ｓＢＨＩ対照）または１％Ｐ１１ホスホセルロース（ｗ／ｖ）と、１６時間のＭｇＣｌ２（０〜１０ｍＭ）の外因性添加の存在下で維持した。バイオフィルムを食塩水で洗浄し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）で染色し、ＣＳＬＭで可視化し、ＣＯＭＳＴＡＴによって解析して、平均の厚さおよびバイオマスを決定した。図２０に示す通り、ＭｇＣｌ２は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでホスホセルロースの破壊効果を部分的に補償することができる。これらのデータは、Ｐ１１ホスホセルロースが、バイオフィルムマトリックスから二価金属を枯渇させることを示唆する。
スペルミジンは、カチオン枯渇された予め形成されたＮＴＨＩバイオフィルムを部分的に回復する
【０３３５】
スペルミジンが、カチオン枯渇されたバイオフィルムを回復させることができるかどうかを決定するために、ＮＴＨＩ成長を開始させ、２４時間の０（ｓＢＨＩ対照）または１％Ｐ１１ホスホセルロース（ｗ／ｖ）と、１６時間のスペルミジン（０〜５ｍＭ）の外因性添加の存在下で維持した。バイオフィルムを食塩水で洗浄し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）で染色し、ＣＳＬＭで可視化し、ＣＯＭＳＴＡＴによって解析して、平均の厚さおよびバイオマスを決定した。図２１に示す通り、スペルミジンは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでホスホセルロースの負の効果を部分的に補償することができる。これらのデータは、Ｐ１１ホスホセルロースが、バイオフィルムマトリックスからポリアミンを枯渇させることを示唆する。
Ｐ１１ホスホセルロースのカチオン枯渇効果は、バイオフィルムとの直接的接触を要求しない
【０３３６】
バイオフィルム形成の減少が、直接的細胞接触に依存したかどうかを決定するために、頂端側および基底側チャンバーを隔てる膜内に０．４μｍポアサイズを含有するトランスウェルプレートシステムの基底チャンバーにおいて、ＮＴＨＩ成長を開始させた。これは、２個のチャンバー間で小型の分子、例えば、タンパク質（ＤＮＡＢＩＩ）、ポリアミンおよび二価金属カチオンの拡散を可能にするが、細菌細胞は拡散できない。頂端側チャンバーは、播種時に０（ｓＢＨＩ対照）、０．５、１または１．５％（ｗ／ｖ）Ｐ１１ホスホセルロースを含有し、１６時間維持した。バイオフィルムを食塩水で洗浄し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）で染色し、ＣＳＬＭで可視化し、ＣＯＭＳＴＡＴによって解析して、平均の厚さおよびバイオマスを決定した。図２２に指し示す通り、バイオフィルムの平均の厚さおよびバイオマスの用量依存性減少は、カチオン交換樹脂との直接的接触と無関係である。
スペルミジンの外因性添加は、トランスウェルシステムにおけるＰ１１ホスホセルロースのカチオン枯渇効果を補償する
【０３３７】
ポリアミン（スペルミジン）が、トランスウェルシステムにおいて直接的接触せずにＰ１１ホスホセルロースによって枯渇されるかどうかを決定するために、０、１００、５００または１０００μＭスペルミジンを含有する基底側チャンバーにおいて、ＮＴＨＩ成長を開始させ、一方、０（ｓＢＨＩ対照）または１．５％（ｗ／ｖ）Ｐ１１ホスホセルロースを頂端側チャンバーに添加し、１６時間維持した。バイオフィルムを食塩水で洗浄し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）で染色し、ＣＳＬＭで可視化し、ＣＯＭＳＴＡＴによって解析して、平均の厚さおよびバイオマスを決定した。図２３に指し示す通り、スペルミジン単独は、用量依存性様式でカチオン枯渇されたバイオフィルムを回復させることができる。
スペルミジンおよびＤＮＡＢＩＩは、相乗的に作用して、非接触媒介性Ｐ１１ホスホセルロースによりカチオン枯渇されたバイオフィルムを回復させる。
【０３３８】
Ｐ１１ホスホセルロースによりカチオン枯渇されたバイオフィルムは、用量依存性様式でＨＵ（図２０）およびスペルミジン（図２２および図２４）の外因性添加によって回復させることができる。図１７Ａに示す通り、免疫蛍光ＣＳＬＭは、スペルミジンおよびＤＮＡＢＩＩ（ＨＵ）も、複数の病原性細菌種によって形成されたバイオフィルムに共局在することを指し示す。これによって、出願人らは、ＨＵおよびスペルミジンが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで相乗的に作用するかどうかを決定することを必要とした。１００μＭスペルミジンもしくは５００ｎＭ  ＨＵのいずれかまたは両方の成分の組合せを含有するトランスウェルシステムの基底側チャンバーにおいて、ＮＴＨＩ成長を開始させた。一方、０または１．５％Ｐ１１ホスホセルロースを頂端側チャンバーに添加し、１６時間維持した。バイオフィルムを食塩水で洗浄し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）で染色し、ＣＳＬＭで可視化し、ＣＯＭＳＴＡＴによって解析して、平均の厚さおよびバイオマスを決定した。図２５に指し示す通り、最適に満たない濃度のスペルミジンおよびＨＵの両方の組合せは、ｓＢＨＩ対照バイオフィルムと比較して、相乗的様式でカチオン枯渇されたバイオフィルムを回復させる。
カチオン交換樹脂でコーティングされた非生物的表面は、用量依存性様式でバイオフィルム形成を予防する
【０３３９】
ガラスチャンバースライドを、０、０．１、１または５％Ｐ１１ホスホセルロースおよび５％ヘパリンセファロース（ｗ／ｖ）の溶液でコーティングした。ＮＴＨＩ成長を開始させ、コーティングされたスライド上で４０時間維持した。バイオフィルムを食塩水で洗浄し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）で染色し、ＣＳＬＭで可視化し、ＣＯＭＳＴＡＴによって解析して、平均の厚さおよびバイオマスを決定した。図２６は、Ｐ１１ホスホセルロースおよびヘパリンセファロースの両方が、用量依存性様式でバイオフィルム形成を予防することを指し示す。これらのデータは、カチオン交換樹脂による表面のコーティングが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細菌付着およびその後のバイオフィルム形成を予防し得ることを示唆する。
（実施例３）
実験番号３
【０３４０】
バイオフィルムは、もっぱら細菌、もっぱら酵母またはその両方の微生物の群集からなる。細菌病原体のため、抗生物質が、処置の第一選択である。バイオフィルム内に常在性の細菌は、全細菌感染のおよそ８０％の病理発生に有意に寄与し、感染性疾患の慢性および反復性の性質に寄与することが公知である。また、バイオフィルム内に常在性の細菌は、抗生物質に対し、その自由生活対応物よりも最大で１０００倍抵抗性である。この抵抗性は、大部分は、敵対的環境から常在性微生物を保護する細胞外マトリックスによるものである。バイオフィルム媒介性細菌感染の慢性および反復性の性質は、抗生物質の過剰使用を要求し、これは次いで、世界的に多抗生物質耐性菌の驚異的な出現をもたらしたことがある。この高まりつつある抗生物質抵抗性表現型は、抗生物質療法の失敗をもたらす。また、抗生物質の主要な副作用は、共生微生物叢に否定的に影響し、これにより、宿主に、複数の副作用および二次感染に対する易罹患性のいずれかを残し得ることである。以前に、出願人らは、現在までに研究した全ての細菌バイオフィルムマトリックス内の普遍的な標的として、ＤＮＡおよびＤＮＡＢＩＩファミリーのタンパク質を同定した。出願人らは、治療抗体によりＤＮＡＢＩＩタンパク質を除去し、バイオフィルムの構造崩壊および常在性細菌の放出をもたらすことができることを示した。対照的に、酵母バイオフィルムは、ＤＮＡＢＩＩタンパク質を発現しないが、依然として、そのマトリックスの一部でもある細胞外ＤＮＡ（ｅＤＮＡ）を含有する。この新たなアプローチは、抵抗性機構を発達するように細菌に圧をかける殺菌活性を有する化合物に頼らず、むしろ、バイオフィルム細胞外マトリックス構造それ自体を標的とし、これにより、バイオフィルムの破壊および脆弱でアクセス可能な状態への常在性細菌の放出をもたらすという点において、現在の治療技術を上回る改善である。あらゆるバイオフィルムは、構成物の細菌または酵母に関係なく、ＤＮＡ依存性構造を作り出すが、Ｂ−ＤＮＡ（細胞内で優勢である標準の形態）として存在するこれらの構造よりもむしろ、バイオフィルムマトリックス内に存在する最も重要な構造ｅＤＮＡは、Ｚ−ＤＮＡとして存在する。重要なことに、Ｚ−ＤＮＡは、より強固であり、これにより、より優れた構造材料となり、Ｚ−ＤＮＡは、Ｂ−ＤＮＡを分解する酵素であるヌクレアーゼに対し完全に抵抗性である。したがって、いずれかの潜在的治療法の標的は、変更（すなわち、Ｂ−ＤＮＡに戻す）または破壊される場合に、現在の治療法の有効性を強めるであろう、バイオフィルムマトリックスの以前に認識されなかった構造エレメントである。重要なことに、Ｚ−ＤＮＡに結合するタンパク質も、Ｚ−ＤＮＡを安定化する。Ｚ−ＤＮＡは、バイオフィルムの天然の構成物であるため、Ｚ−ＤＮＡに結合する抗体は、バイオフィルム成長を容易にする。逆に、Ｂ  ＤＮＡに結合する分子は、Ｂ  ＤＮＡを安定化し、Ｂ−ＤＮＡからＺ−ＤＮＡへの変換を防止し、よって、バイオフィルムを予防する。重要なことに、Ｚ−ＤＮＡに対する抗体の形成を天然に誘導する疾患状態、例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および／または嚢胞性線維症（ＣＦ）は、バイ��フィルム形成を容易にする。よって、ＳＬＥ患者において発症する慢性感染は、一部には、ＳＬＥ由来Ｚ−ＤＮＡ抗体の結果である。加えて、ＤＮＡを損傷する一部の化学療法剤、例えば、プラチナベースの化学療法も、ＤＮＡをＺ形態にシフトさせる。したがって、これらの作用物質は、バイオフィルム成長の安定化またはこれを容易にすることに寄与する。Ｚ−ＤＮＡを破壊する治療法を対象とすることは、ＳＬＥおよび／または嚢胞性線維症（ＣＦ）、ならびに慢性感染の化学療法による増悪に対する新たな治療アプローチである。
【０３４１】
バイオフィルムは、群集アーキテクチャおよび挙動（群集内シグナル伝達、輸送、分業等）を呈する、表面に凝集または接着した微生物の集合体である。この群集アーキテクチャは、一部には、宿主において免疫系および抗微生物薬を含む、危険な条件から常在性微生物を保護する自作の細胞外マトリックスによって区別される。バイオフィルムは、動物および植物の両方における疾患の相当な部分、ならびに工業的、例えば、工業機器の汚損の原因となり、そのため、医学、農業および工業状況におけるその重要性から、集中的な研究努力の焦点となる。Ｖｉｓｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １９８（１９）：２５５３−６３；Ｈｏｉｂｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７）  ＡＰＭＩＳ．  １２５（４）：２７２−５。病原性バイオフィルムの根絶または処置は、保護的細胞外マトリックスの産生を含む複数の要因のため、達成が特に困難である。Ｈｏｉｂｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７）  ＡＰＭＩＳ．  １２５（４）：２７２−５。バイオフィルムマトリックスは、多糖、タンパク質および細胞外ＤＮＡ（ｅＤＮＡ）で様々に構成されている。細菌バイオフィルムのｅＤＮＡは、普遍的であり、細胞外マトリックスの安定性および保護機能に必須である。Ｏｋｓｈｅｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４１（３）：３４１−５２；Ｗｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ６０（１）：５４４−５３。ＤＮＡ分解、または構造を安定化するＤＮＡ結合タンパク質の除去による、バイオフィルムｅＤＮＡ構造の弱体化は、バイオフィルムの壊滅的な崩壊およびより脆弱な状態への常在性細菌の放出をもたらす。Ｂｒａｎｄｓｔｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｎａｓｏｐｏｒｅ．  Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ．  １２３（１１）：２６２６−３２；Ｂｒｏｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ９３（６）：１２４６−５８；Ｄｅｖａｒａｊ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ９６（６）：１１１９−３５；Ｆｒｅｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７）  Ｍｏｌ  Ｏｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３２（１）：７４；Ｇｕｓｔａｖｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｊ  Ｃｙｓｔ  Ｆｉｂｒｏｓ．  １２（４）：３８４−９；Ｎｏｖｏｔｎｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７）  Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２４（６）；Ｎｏｖｏｔｎｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ．  １０：３３−４４；Ｒｏｃｃｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７）  Ｍｏｌ  Ｏｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３２（２）：１１８−３０；Ｎｏｖｏｔｎｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ８（６）：ｅ６７６２９；Ｂａｅｌｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ．  ２０９：１５０−８；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｆｒｏｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６：６９９；Ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ａｃｔａ  Ｐａｅｄｉａｔｒ．  ９５（９）：１０７０−４；Ｍａｒｔｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｍｙｃｏｓｅｓ．  ５５（１）：８０−５；Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４（６）：６２５−３７。
【０３４２】
バイオフィルム統合性におけるｅＤＮＡの中心的役割に基づくと、ヌクレアーゼ処置は、明らかな治療潜在力を保有する。実際に、多くの細菌は、内因性分泌ヌクレアーゼを利用して、バイオフィルム構造をモジュレートし、バイオフィルムからの分散を媒介する。Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  ８３（３）：９５０−７；Ｋｉｅｄｒｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ６（１１）：ｅ２６７１４；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７）  Ｆｒｏｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ７：９７；Ｓｔｅｉｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  ７９（４）：１５０４−１１。しかし、外因性ヌクレアーゼは典型的に、バイオフィルム形成の開始時に投与されたときに、有効なバイオフィルム予防活性しか示さず、確立されたバイオフィルムは、いずれか中程度のバイオフィルム破壊を観察するためには高濃度のヌクレアーゼを要求する。Ｈａｌｌ−Ｓｔｏｏｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ８：１７３；Ｉｚａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｐａｔｈｏｇ．  ４６（４）：２０７−１３；Ｋａｐｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｊ  Ａｎｔｉｂｉｏｔ  （Ｔｏｋｙｏ）．  ６５（２）：７３−７；Ｔｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２９（８）：３９９−４０５。慢性肺感染が罹患率および死亡率の主な原因である、嚢胞性線維症患者において、治療ヌクレアーゼは、バイオフィルム群集を形成するために細菌によって産生されたｅＤＮＡよりもむしろ、宿主由来ｅＤＮＡによって作製された閉塞に対して標的とする粘液溶解剤として主に使用され、このようなヌクレアーゼ（すなわち、プルモザイム）は、慢性感染が確立する前の非常に早い時期に投与されたときにのみ、微生物群集を変化させることが観察された。Ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ａｃｔａ  Ｐａｅｄｉａｔｒ．  ９５（９）：１０７０−４。細菌バイオフィルムｅＤＮＡがヌクレアーゼ分解に対して抵抗性となる理由は、未決問題のままである。
【０３４３】
細菌バイオフィルムｅＤＮＡが、外因性ヌクレアーゼによって不十分に分解される理由については、複数の仮説が存在する。これらの仮説のうち、細菌が、ヌクレアーゼに対して非感受性の形態へとｅＤＮＡの構造を活発に変更する可能性が挙げられる。ヌクレアーゼ抵抗性である斯かるＤＮＡ構造エレメントの１つは、代替の左巻きヘリックス形態であるＺ−ＤＮＡである。Ｚ−ＤＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの特異的条件およびｉｎ  ｖｉｖｏでの限定された細胞内条件下でのみ記載されたが、特に、様々な細胞内プロセスを調節するＺ−ＤＮＡ結合タンパク質の同定により、正常細胞生理学におけるＺ−ＤＮＡの役割に関する証拠は増えつつある。Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．  １２：４４２４−３８；Ｂａｒｒａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３５３：３５−６０。標準的なＢ−ＤＮＡからＺ−ＤＮＡ形態へと平衡をシフトさせるために、二重らせんの負のスーパーコイル形成、負電荷を有するリン酸−デオキシリボース骨格の反発を相殺するための高いカチオン濃度、および構造を安定化するためのＺ−ＤＮＡ結合タンパク質相互作用を含む、追加の要因が必要とされる（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｒｅｖ．  ４０（１２）：５８９３−９０９；Ｙａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．  ２０１２；１９（４）：５５７−６８）。金属カチオンおよびポリカチオン性ポリアミンは両者共に、特に、ポリ（ｄＧ−ｄＣ）トラクトにおいて、Ｚ−ＤＮＡ形成を誘導することができる（Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  ＩＵＢＭＢ  Ｌｉｆｅ．  ５８（２）：７５−８２；Ｂａｌａｓｕｎｄａｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １００（２）：１２９−４０）。Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２６６（１０）：６１３７−４１。他方では、Ｂ−ＤＮＡに戻るＺ−ＤＮＡ移行は、挿入剤（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ．  ３３（１１）：１６７７−８６；Ｍｉｒａｕ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８３）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １１（６）：１９３１−４１）および潜在的には、真核生物クロマチンタンパク質、ＨＭＧＢ１によって触媒される。Ｗａｇａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  １５３（１）：３３４−９。
【０３４４】
バイオフィルムマトリックスは、ＤＮＡＢＩＩファミリーの細菌クロマチンタンパク質によって安定化される。このようなタンパク質は、ｅＤＮＡスキャフォールドにおける屈曲したＤＮＡ構造を占有し、その除去は、バイオフィルムの崩壊および常在性細菌の放出をもたらす。Ｂｒａｎｄｓｔｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｎａｓｏｐｏｒｅ．  Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ．  １２３（１１）：２６２６−３２；Ｂｒｏｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ９３（６）：１２４６−５８；Ｄｅｖａｒａｊ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ９６（６）：１１１９−３５；Ｆｒｅｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７）  Ｍｏｌ  Ｏｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３２（１）：７４−８８；Ｇｕｓｔａｖｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｊ  Ｃｙｓｔ  Ｆｉｂｒｏｓ．  １２（４）：３８４−９；Ｎｏｖｏｔｎｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７）  Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２４（６）；Ｎｏｖｏｔｎｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ．  １０：３３−４４；Ｒｏｃｃｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７）  Ｍｏｌ  Ｏｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３２（２）：１１８−３０；Ｎｏｖｏｔｎｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ８（６）：ｅ６７６２９；Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４（６）：６２５−３７。その上、ポリアミンは、ＤＮＡ構造をモジュレートし（Ｐａｓｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ．  ４６（３）：５９５−６０３）、これを外部改変剤から保護することが観察された。Ｂａｅｚａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｏｒｉｇ  Ｌｉｆｅ  Ｅｖｏｌ  Ｂｉｏｓｐｈ．  ２１（４）：２２５−４２；Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  ＦＥＢＳ  Ｊ．  ２７２（１５）：３７７７−８７；Ｎａｙｖｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．  １１（１）：９７−１０５。そこで、出願人らは、細胞外ポリアミンが、ＤＮＡＢＩＩタンパク質と協力して、細菌バイオフィルム内のｅＤＮＡにおけるＺ−ＤＮＡ構造を誘導することを示し、Ｚ−ＤＮＡからＢ−ＤＮＡへの復帰が、細菌バイオフィルム構造を弱体化して、それを従来の治療法に対し感受性にするか、またはそれ自体が、バイオフィルムを破壊するかどうかについて確立する。
細菌バイオフィルムは、Ｚ−ＤＮＡが蓄積するにつれて、ヌクレアーゼ破壊に対して抵抗性になる
【０３４５】
分類不能Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨｉ）は、急性および慢性気道感染の一般的な原因であり、この生物によって引き起こされる疾患は、その慢性化のためにバイオフィルム形成に依拠する。Ｄｕｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ５９０（２１）：３８４０−５３。同様に、尿路病原性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＵＰＥＣ）は、尿路感染の主要病原因子であり、これもまた、慢性膀胱炎を引き起こすその能力のためにバイオフィルム産生に依拠する。Ｂｌａｎｇｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ５４（５）：１８５５−６３。ヌクレアーゼの非存在または存在下でｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて成長したＮＴＨｉおよびＵＰＥＣバイオフィルムは、ヌクレアーゼが存在した場合、バイオフィルム生物発生の有意な機能障害を示した（図２７）。対照的に、このようなヌクレアーゼによる予め確立されたバイオフィルムの処置は、バイオフィルムの厚さまたはバイオマスを縮小せず、ヌクレアーゼに対するバイオフィルムマトリックスにおけるｅＤＮＡの抵抗性が、バイオフィルムが成熟するにつれて確立されることを指し示す。
【０３４６】
出願人らは、Ｚ−ＤＮＡに対する抗体を使用して、ＮＴＨｉおよびＵＰＥＣバイオフィルムをｉｎ  ｖｉｔｒｏで、それらが発達したときにプローブした。抗体染色および免疫蛍光顕微鏡法は、Ｚ−ＤＮＡが、バイオフィルムが成熟するにつれてバイオフィルムマトリックスの底部に蓄積することを明らかにし（図２８）、これは成熟バイオフィルムにおけるヌクレアーゼ抵抗性増加と対応する。主要な真菌病原体Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓも、そのバイオフィルム細胞外マトリックス内にＺ−ＤＮＡを含有することが見出された（図２９）。さらに、Ｚ−ＤＮＡに特異的に結合する（したがって、これを安定化する）抗体による新生バイオフィルムの処置は、ＮＴＨｉバイオフィルム生物発生を刺激したが、Ｂ−ＤＮＡに対する抗体は刺激しなかったため、Ｚ−ＤＮＡの蓄積は、バイオフィルム構築プロセスの中心である（図３０）。Ｚ−ＤＮＡは、ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性をバイオフィルム細胞外マトリックスに付与する可能性があり、このことは、ヌクレアーゼで処置したバイオフィルムに存在するｅＤＮＡ含量およびＤＮＡの形態を試験することによって実証される。ヌクレアーゼ処置は、ＮＴＨｉバイオフィルム細胞外マトリックスにおけるＢ−ＤＮＡ可視化を大幅に低減させる一方、Ｚ−ＤＮＡ存在は、より明らかになる（図３１）。
ポリアミンおよびＤＮＡＢＩＩタンパク質は協同して、バイオフィルムマトリックスにおけるＺ−ＤＮＡ構造を安定化する
【０３４７】
ポリ（ｄＧ−ｄＣ）で構成されたオリゴヌクレオチド基質は、Ｚ−ＤＮＡを形成する傾向があることが公知であり（すなわち、高いＮａＣｌ濃度またはポリアミンの存在のため）、そのため、ヌクレアーゼによる分解から保護される（図３２）。したがって、出願人らは、λ２９５／λ２６０吸光度比の分光光度的測定により、ポリアミンが、この基質のＺ−ＤＮＡ形成を誘導することも観察した（データ図示せず）。ポリアミン媒介性ｅＤＮＡ安定化に加えて、出願人らは既に、バイオフィルム構造の補強におけるＤＮＡＢＩＩ細菌クロマチンタンパク質の重要性を実証した。ここで、出願人らは、ポリアミンおよびＤＮＡＢＩＩタンパク質が、一緒に機能して、ｅＤＮＡスキャフォールドを安定化するかどうかを決定しようと試みた。２種の関連ポリアミンであるスペルミジンおよびスペルミンに対する抗体、ならびに２種のＤＮＡＢＩＩファミリータンパク質であるＩＨＦおよびＨＵを認識する抗体を使用して、出願人らは先ず、免疫蛍光顕微鏡法によってバイオフィルムマトリックスにおけるポリアミンおよびＤＮＡＢＩＩタンパク質の分布を可視化した。出願人らは、ＤＮＡＢＩＩタンパク質（主にＨＵ）が、ＮＴＨｉバイオフィルム細胞外マトリックス内でポリアミンと共局在したことを見出した（図３３）。さらに、ポリアミン特異的抗体でプローブした、ＨＵを発現できなくなるように操作されたＮＴＨｉ株によって形成されたバイオフィルムの免疫蛍光顕微鏡検査は、ＨＵが、バイオフィルムにおける正常ポリアミン分布に要求されることを実証した（図３３）。
【０３４８】
ＮＴＨｉ  ＤＮＡＢＩＩタンパク質は、バイオフィルムマトリックス統合性において中心的役割を果たすため、Ｂｒｏｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ９３（６）：１２４６−５８；Ｎｏｖｏｔｎｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７）  Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２４（６）；Ｎｏｖｏｔｎｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ．  １０：３３−４４；Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４（６）：６２５−３７、出願人らは、ＮＴＨｉ  ＤＮＡＢＩＩタンパク質が、ＤＮＡヌクレアーゼ抵抗性に寄与し得ると推論した。実際に、ＮＴＨｉ  ＨＵは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでポリ（ｄＧ−ｄＣ）基質にヌクレアーゼ抵抗性を付与し、ポリ（ｄＧｄＣ）基質をＺ−ＤＮＡ形態にシフトさせることができた（図３４）Ｊａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．  ５：９９４３。バイオフィルムマトリックスにおけるＮＴＨｉ  ＨＵおよびポリアミンの共局在の観察のため、出願人らは、ＮＴＨｉ  ＨＵおよびポリアミンが、ヌクレアーゼ分解を阻害するそれらの能力において相乗作用を呈するか検査した。単独ではポリ（ｄＧ−ｄＣ）基質を保護しなかったポリアミンおよびＨＵの濃度において、両者の組合せは、ヌクレアーゼ抵抗性を付与する相乗的能力を実証した（図３５）。ポリアミンおよびＤＮＡＢＩＩタンパク質の共局在ならびにしたがって、結果としてのヌクレアーゼ抵抗性表現型は、ＮＴＨＩによる実験的中耳炎における中耳にｉｎ  ｖｉｖｏで形成されたバイオフィルムにおいても観察された（図３５）。さらに、バイオフィルム細胞外マトリックスへのＤＮＡＢＩＩおよびポリアミン取り込みのレベルは、種間で変動し、免疫蛍光によるＺ−ＤＮＡ検出のレベルと相関する（図３６）。まとめると、これらの結果は、細菌ＤＮＡＢＩＩタンパク質および内因性ポリアミンが一緒に相互作用して、潜在的に、バイオフィルムのｅＤＮＡスキャフォールド内のＺ−ＤＮＡ構造エレメントへの変換およびその安定化により、細菌バイオフィルムマトリックスを維持することを示唆する。
Ｚ−ＤＮＡからＢ−ＤＮＡへの復帰は、ヌクレアーゼ感受性を回復する
【０３４９】
Ｚ−ＤＮＡが細菌バイオフィルムにおいて経時的に蓄積し、このことが、成熟バイオフィルムがヌクレアーゼ破壊に対して抵抗性である理由を説明することができるという出願人らの新規知見を活用するために、出願人らは、Ｚ−ＤＮＡからＢ−ＤＮＡへと平衡をシフトさせることができる分子が、バイオフィルムをモジュレートすることができるかどうか検査に努めた。真核生物クロマチンタンパク質ＨＭＧＢ１は、Ｚ−ＤＮＡをＢ−ＤＮＡに変換することが報告された、Ｗａｇａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  １５３（１）：３３４−９。そのため、ＨＭＧＢ１で処置したＮＴＨｉバイオフィルムの免疫蛍光顕微鏡検査は、縮小されたＺ−ＤＮＡ含量を明らかにした（図３７）。ＤＮＡＢＩＩタンパク質は、ＨＭＧＢ１処置によってバイオフィルムから放出され（図３８）、ＤＮＡＢＩＩ媒介性Ｚ−ＤＮＡ安定化の非存在下で、Ｚ−ＤＮＡをＢ−ＤＮＡに復帰させることによりｅＤＮＡ構造を不安定化し、有意なバイオフィルム破壊をもたらす。したがって、ＨＭＧＢ１または非炎症性ＨＭＧＢ１バリアントによる、チンチラ中耳におけるＮＴＨＩによって誘発された急性中耳炎の処置は、接着性バイオフィルムの効率的溶解をもたらした（図３９）。ＨＭＧＢ１は、嚢胞性線維症肺バイオフィルム感染に関連する致命的日和見性病原体であるＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成されたバイオフィルムの破壊においても有効であった一方、ＨＭＧＢ１の予防的投与は、マウスの肺においてＢ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ凝集物バイオフィルム形成を予防した（図４０）。保護的濃度のポリアミンの存在下におけるポリ（ｄＧ−ｄＣ）基質へのＨＭＧＢ１の添加は、ヌクレアーゼ感受性を回復させた（図４１）。
【０３５０】
これらの組み合わせたデータは、ポリアミンおよびＤＮＡＢＩＩタンパク質によるＤＮＡの一部のＺ−高次構造への変換が、バイオフィルムの細胞外マトリックスにおける構造的材料のための基礎を作り出すのみならず、成熟バイオフィルムを破壊する従来のヌクレアーゼに対するその抵抗性を説明することも実証する。Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  ８３（３）：９５０−７。まとめると、したがってこれらのデータは、Ｚ−ＤＮＡをＢ−ＤＮＡにまたはＺ−ＤＮＡ立体配置のバイオフィルムｅＤＮＡをＢ−ＤＮＡに変換することができる方法および物質（例えば、ＤＮＡＢＩＩタンパク質またはポリアミンを除去または阻害することにより）が、ヌクレアーゼ感受性を回復させることができ、潜在的に、ｉｎ  ｖｉｖｏで成熟不応性バイオフィルムに対するヌクレアーゼの活性を強めることができる作用物質の開発を可能にすることを指し示す。これは、微生物バイオフィルムを、そのＺ−ＤＮＡ含量によって特定することができ、Ｚ−ＤＮＡ定量が、バイオフィルム感染に特徴的な潜在的に有用なバイオマーカーとなることも示す。
（実施例４）
実験番号４
【０３５１】
本実験は、嚢胞性線維症を処置するための薬物、作用物質および方法の前臨床検査のためのブタモデルを提供する。Ｓｔｏｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２（２９）：２９−３１を参照されたい。嚢胞性線維症は、ＣＦ膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲと呼ばれる）アニオンチャネルをコードする遺伝子における変異による常染色体劣性疾患である。このモデルにおいて、「ＣＦＴＲ」と呼ばれる遺伝子に欠損を保有するように特異的に育種された豚は、ＣＦ豚と呼ばれ、複数の細菌種による下気道の感染を含むＣＦ肺疾患の特徴的なフィーチャを自発的に発症する。豚は、ポリペプチドまたは他の免疫原性作用物質等の作用物質で免疫され、これにより、肺における細菌バイオフィルムを根絶する抗体の形成を誘導する。本実験は、実験番号１に示す通り、能動免疫後のチンチラの中耳内に常在性のバイオフィルムを根絶するためのＩＨＦへの抗体の送達と同様である。抗ＩＨＦ（または他の作用物質）抗体を吸入投与によってこのような豚の肺に送達して、疾患の徴候の寛解および関連する病状を評価することができる。
（実施例５）
実験番号５
ＴＥＤＳの形成に寄与するＵＰＥＣポリアミン合成遺伝子を同定する
【０３５２】
単一変異体のＥ．ｃｏｌｉ  Ｋｅｉｏコレクションを使用して、Ｂａｂａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｍｏｌ  Ｓｙｓｔ  Ｂｉｏｌ．  ２：２００６  ０００８、ｓｐｅＡ（アルギニンをプトレシン前駆体アグマチンに変換するのに要求されるアルギニンデカルボキシラーゼ）、ｓｐｅＣ（オルニチンをプトレシンに変換するのに要求されるオルニチンデカルボキシラーゼ）、ｓｐｅＤ（Ｓ−アデノシルメチオニンをＳｐｅＥ活性のためのプロピルアミンドナーに変換するのに要求されるアデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ）およびｓｐｅＥ（プトレシンをスペルミジンに、スペルミジンをスペルミンに変換するのに要求されるアミノプロピルトランスフェラーゼ）遺伝子、Ｔａｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．  ４９（１）：８１−９９、のＰ１ファージ形質導入によって変異をＵＰＥＣ  ＵＴＩ８９株へと、先ず単独で、次いで組み合わせて移動させる。ポリアミンを産生することができる複数の経路のため、これらの変異を組み合わせて、バイオフィルム表現型を観察することができる（例えば、ＳｐｅＡおよびＳｐｅＤは、プトレシン生合成の２種の別々の経路における初期酵素である；ｓｐｅＡおよびｓｐｅＤにおける二重変異は、プトレシン合成の抑止に必要とされる）。変異は、ＰＣＲによって、正確な染色体位置における挿入について確認される。ＵＰＥＣ株は、定義された時間（８、２４、４８時間）に、生理的濃度（０、０．１、０．５、１および５ｍＭ）の添加されたポリアミン（スペルミジン、スペルミンまたはプトレシン）の存在または非存在下で、出願人らのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅＤＮＡスキャフォールドアッセイおよびバイオフィルム形成アッセイにおいて確立される。Ｔａｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．  ４９（１）：８１−９９。富栄養培地には残存ポリアミンが存在する可能性があるため、これらのアッセイは、富栄養培地（ＬＢ）および既知組成培地（ＣＤＭ；Ｍ９）の両方で行われる。初期ｅＤＮＡ構造は、ｄｓＤＮＡ、ＤＮＡＢＩＩタンパク質およびポリアミン（抗スペルミジン、抗プトレシン、抗カダベリン）についてプローブされた免疫蛍光顕微鏡法によって評価され、構造の複雑性は、ＩｍａｇｅＪにおけるＦｒａｃＬａｃ解析プラグインによって定量される。Ｋａｒｐｅｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９−２０１３）  ＦｒａｃＬａｃ  ｆｏｒ  ＩｍａｇｅＪ。バイオフィルム形成は、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）染色されたバイオフィルムのＣＬＳＭによって評価され、バイオフィルムの平均の厚さ、バイオマスおよび粗さは、ＣＯＭＳＴＡＴ解析によって定量される。ｄｓＤＮＡ、ＤＮＡＢＩＩタンパク質およびポリアミンについてプローブされたバイオフィルムにおけるｅＤＮＡ構造は、免疫蛍光ＣＬＳＭによって評価される。全真正細菌がＨＵを有し、ＨＵ枯渇は普遍的にバイオフィルム機能障害をもたらすため、保存されたエピトープに対する抗ＨＵ抗体が使用され、ＤＮＡＢＩＩ検出のための属にわたるＨＵの包括的認識を可能にする。図４６は、未処理または抗ＨＵ（灰色）および抗スペルミジン（Ｓｐｄ、淡灰白）抗体でプローブした、指し示されたバイオフィルムの免疫蛍光ＣＬＳＭ画像を示し、共局在は白色である。
ＴＥＤＳの形成に寄与するＵＰＥＣポリアミン搬出遺伝子を同定する
【０３５３】
Ｋｅｉｏコレクションを使用して、ｐｏｔＥ（プトレシン−オルニチンアンチポーター）、Ｋａｓｈｉｗａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ８９（１０）：４５２９−３３、ｃａｄＢ（カダベリン−リシンアンチポーター）、Ｓｏｋｓａｗａｔｍａｅｋｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ５１（５）：１４０１−１２、ｍｄｔＪおよびｍｄｔＩ（スペルミジン搬出に重要な多剤エクスポーター）、Ｈｉｇａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １９０（３）：８７２−８、ならびにｓａｐＢ、ｓａｐＣ、ｓａｐＤおよびｓａｐＦ（プトレシン搬出に重要なＡＢＣトランスポーターをコードする）、Ｓｕｇｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２９１（５１）：２６３４３−５１、遺伝子の変異をＵＰＥＣ  ＵＴＩ８９へと、先ず単独で、次いで組み合わせて移動する（エクスポーター活性の冗長性を克服するために）。欠乏性バイオフィルム表現型を呈する変異を組み合わせることができる。ＵＰＥＣは、定義された時間に、添加されたポリアミン（スペルミジン、スペルミン、プトレシン）の存在または非存在下で、出願人らのｅＤＮＡスキャフォールドおよびバイオフィルム形成アッセイにおいて確立される。
【０３５４】
ＴＥＤＳおよびバイオフィルム発達におけるポリアミンの役割は、ポリアミンが、ｅＤＮＡおよびＤＮＡＢＩＩタンパク質と協調して機能して、ＴＥＤＳを作り出すことを示すことにより決定される。図４２Ａ〜図４２Ｄは、ＤＮＡＢＩＩタンパク質およびポリアミンの両方が、カチオン交換体（Ｐ１１）媒介性バイオフィルム予防のレスキューに要求されることを示す。図４４は、ＤＮＡＢＩＩタンパク質、ポリアミンおよびｅＤＮＡ（Ｂ−ＤＮＡおよびＺ−ＤＮＡ）が、ＮＴＨＩバイオフィルムのＥＰＳ内に経時的に着実に蓄積することを示す。さらに、図４６に示す通り、ＤＮＡＢＩＩ、ポリアミン、Ｚ−ＤＮＡおよびＢ−ＤＮＡ成分は全て、複数細菌バイオフィルムのＥＰＳ中に存在する。
【０３５５】
出願人らは、図４７Ａ〜図４７Ｂにおいて、ポリアミン、Ｚ−ＤＮＡおよびＢ−ＤＮＡ成分が全て、ＮＴＨＩバイオフィルムに感染したチンチラ中耳の切片内に存在することも見出した。加えて、出願人らは、ＲＮアーゼ  Ａの添加が、おそらくは、Ｂ−ＤＮＡからＺ−ＤＮＡへの細胞外変換のための決定的な触媒であるポリアミンの放出によって、用量依存性様式でバイオフィルム形成を刺激し（図５２Ａ）、ｔＲＮＡ（ＧＭＰではない）の添加が、おそらくは、バイオフィルムＥＰＳからのポリアミンの隔絶によって、用量依存性様式で初期ＮＴＨＩバイオフィルムを破壊した（図５２Ｂ）ことを示した。
馴化培地におけるポリアミンを定量する
【０３５６】
馴化培地を細菌バイオフィルムから収集して、ポリアミン（プトレシン、カダベリン、スペルミジン、スペルミン）の濃度を決定する。ポリアミン放出は、８種の不応性バイオフィルム形成病原体、これは以降、標準８株と称される；ＥＳ＊ＫＡＰＥ病原体、ＮＴＨＩおよびＵＰＥＣ（＊は、代表的病原性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｂａｔｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７）  Ｆｒｏｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ８：１４０１としてのＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの使用を指し示し、これはＳ．ａｕｒｅｕｓが、免疫蛍光アッセイを混乱させ得る抗体結合性プロテインＡを産生することを考慮する；扱いやすい場合、この解析は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに適用される）の臨床分離株、ならびに変更されたバイオフィルムＥＰＳ構造を示す変異体バリアントについて定量されて、細胞外ポリアミン濃度とバイオフィルム表現型を相関させる。バイオフィルムは、富栄養培地およびＣＤＭにおいて成長させ、様々な時間（０、４、８、１６および２４時間）に馴化培地を収集する。無細胞馴化培地（濾過）および培地試料は、貯蔵のために液体Ｎ２中で瞬間（ｓｎａｐ）凍結する。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるＯＡＲＤＣ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｌｕｓｔｅｒによって解析を行う。Ｈａｋｋｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ａｎａｌｙｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ９４１：８１−９；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ａｎａｌ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ．  ７９１：３６−４５；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．  ２１（８）。
ＴＥＤＳにおけるポリアミンの定常状態レベルの役割を確立する
【０３５７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでバイオフィルム発達を通していずれのポリアミンが存在するかどうかを決定した後に、検査を行って、これらのポリアミンがｅＤＮＡ構造に影響を与えるか区別する。出願人らは、播種時に添加されると、バイオフィルム形成を予防する（プルモザイム（登録商標）と同様のまたはこれよりも優れた）が、スペルミジンに対する感受性が異なる一連のヌクレアーゼを同定した（表１）。経時的なｅＤＮＡスキャフォールドおよびバイオフィルム形成アッセイを用いて、出願人らは、ポリアミン濃度の定性的プローブとしてこれらの酵素を利用して、ヌクレアーゼ活性のポリアミン媒介性阻害またはヌクレアーゼ活性のｅＤＮＡ構造媒介性阻害の間を区別する（すなわち、Ｚ−ＤＮＡ等のヌクレアーゼ抵抗性形態への変換）。各事例において、ヌクレアーゼによる処置前に指定の時間（０、４、８、１６および２４時間）バイオフィルムを成長させ、４０時間の最終時間までインキュベートする。バイオフィルム環境におけるヌクレアーゼ活性のための対照として、バイオフィルム由来の馴化培地においてインキュベートした（０、４、８、１６および２４時間）プラスミド基質に対するヌクレアーゼ活性を決定し、これに対し、出願人らは、ポリアミン構成物およびそれぞれの濃度を決定した。標準８株のバイオフィルム破壊は、以前に記載されと通りに評価および解析する。図３５Ａ〜図３５Ｄにおいて、出願人らは、ＤＮＡＢＩＩタンパク質が、ポリアミンと相乗作用して、ＤＮアーゼ抵抗性を誘導することを示す。
表１．バイオフィルム形成を予防するヌクレアーゼおよびそのスペルミジン感受性
【表１】
2021529180.tif 000004
＊プルモザイム：＃スペルミジンを１０μＭ〜１０ｍＭに用量設定して、各ヌクレアーゼが、ゲノムＤＮＡにおいて＜１０％活性に低減された濃度を決定した。
細菌バイオフィルムにおけるＤＮＡ、ＤＮＡＢＩＩおよびポリアミンの定常状態レベルの割合の頑強性の検査
【０３５８】
出願人らは、ｅＤＮＡ、ＤＮＡＢＩＩタンパク質およびポリアミンがそれぞれ、バイオフィルムのＴＥＤＳの維持に必須であることを示したが、バイオフィルム形成を生産的に最大化するように相互作用する各成分の割合を決定することができる。細菌がバイオフィルムを形成する場合、浮遊性細菌／バイオフィルム細菌の平衡が達成される。実際に、出願人らは、ＤＮＡＢＩＩタンパク質が、ＵＰＥＣバイオフィルムを制限しており（Ｄｅｖａｒａｊ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ９６（６）：１１１９−３５）、漸増濃度のＤＮＡＢＩＩタンパク質が、用量依存性様式で浮遊性細菌をバイオフィルム状態に至らせることを以前に示した。Ｄｅｖａｒａｊ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ９６（６）：１１１９−３５。ＨＵを欠乏するＵＰＥＣは、より小型のバイオフィルムを産生するが、バイオフィルム状態への浮遊性細菌の駆動において、外因性ＤＮＡＢＩＩに対しより応答性である。Ｄｅｖａｒａｊ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ９６（６）：１１１９−３５。同時に、ｅＤＮＡが枯渇された（ＤＮアーゼにより）ＵＰＥＣバイオフィルムは、外因性ＤＮＡＢＩＩ添加によりバイオフィルムバイオマスをもはや増加させない。対照的に、外因性ＤＮＡＢＩＩタンパク質またはＤＮＡを添加するいかなる試みも、ＮＴＨＩバイオフィルムに負に影響する（データ図示せず）。出願人らは、バイオフィルムＥＰＳが、ＤＮＡ、ＤＮＡＢＩＩタンパク質およびポリアミンを、これら３種の成分が互いに関して最適未満で存在するように欠乏する場合、細菌が、浮遊性状態へと優先的に分配されると仮定する。同様に、ＵＰＥＣと同様に、その最適な割合への制限成分（複数可）の補充は、バイオフィルム状態への細菌の分配を改善する筈である。対照的に、全３種の成分が、ＮＴＨＩにおいて出願人らが考える適切な割合である場合、これらの成分のいずれかの補充は、適切な比を破壊し、バイオフィルム形成に負の影響を有することができる。そこで、ネイティブＵＰＥＣバイオフィルムに対して外因性ＤＮＡＢＩＩタンパク質を滴定し、バイオフィルムおよび浮遊性細菌の割合を測定する。バイオフィルムが、外因性ＤＮＡＢＩＩタンパク質で飽和されると、ポリアミンおよび染色体ＤＮＡの両方が変動して、細菌をバイオフィルム状態へとさらに分配する。
【０３５９】
同定された優勢ポリアミンのそれぞれ（またはこれらの組合せ）は、ＣＤＭにおいてバイオフィルムを成長させたときに細胞外環境において測定された濃度から最大１０倍少ないおよび多い様々な濃度で検査する。出願人らは、ＤＮＡ、ポリアミンおよびＤＮＡＢＩＩタンパク質が、それらの適切な割合で添加される場合、浮遊性細菌をバイオフィルムへと至らせるであろうと仮定する。したがって、ＷＴ  ＵＰＥＣおよびＮＴＨＩならびにそれらの同質遺伝子的ＨＵ欠乏性株（残っているＩＨＦの存在にもかかわらず、ＨＵ欠乏性株は依然として、バイオフィルム欠乏性表現型を有する）も、ＨＵ、ＤＮＡおよびポリアミンの最適な割合について検査する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏバイオフィルム形成アッセイによるコンビナトリアルバイオフィルム成分添加の効果は、希釈プレーティングによって、浮遊生物相（ｐｌａｎｋｔｏｎｉｃ  ｐｈａｓｅ）対バイオフィルム相に存在する細菌の相対的な割合の決定により評価される。Ｄｅｖａｒａｊ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ９６（６）：１１１９−３５。出願人らは、図４２Ａ〜図４２Ｄにおいて、Ｐ１１添加が、用量依存性様式でバイオフィルム形成を予防することを示す。外因性スペルミジンおよびＨＵは一緒になって、バイオフィルム発達を回復させるが、いずれか単独では回復させず、このことは、Ｐ１１抗バイオフィルム活性が、直接の接触なしで、バイオフィルムＥＰＳから離れた、構造成分（ポリアミン、ＤＮＡＢＩＩタンパク質）の滴定の結果であることを示唆する。
ＴＥＤＳに好まれるポリアミンが存在するかどうかを決定する
【０３６０】
上に示す通り、物理的に隔てられたチャンバー内のバイオフィルムは、カチオン交換体Ｐ１１によって破壊することができる。重要なことに、この破壊を相殺するためには、ポリアミンおよびＤＮＡＢＩＩタンパク質の両方をバイオフィルムチャンバーに添加する必要があるが、各成分それ自体は無効である。スペルミンおよびスペルミジンは、プトレシンまたはカダベリンよりも有効にＤＮＡ構造をモジュレートするため（Ｋａｂｉｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ８（７）：ｅ７０５１０）、ポリアミンを、単独でおよび組み合わせて、上述の通り様々な濃度で検査して、特異的ポリアミンが、ＴＥＤＳ産生を容易にするのに必要とされるかどうかを決定する。ＨＵは、本実験を通して定義された濃度（上述の通りならびに５倍低いおよび高い）で添加される。本実験は、上述の通り標準８株により行われ、上述のｉｎ  ｖｉｔｒｏバイオフィルムアッセイを使用して、バイオフィルム形成における様々なポリアミンの効果を定量する。
成果および代替
【０３６１】
遺伝的アプローチを適用して、ＵＰＥＣポリアミン合成の欠損および細胞外ポリアミンの定常状態レベルにおける搬出遺伝子の寄与を試験することにより、ＴＥＤＳ形成を研究することができる。欠乏性バイオフィルム表現型を生じる変異の単一および組合せが同定され、これは外因性ポリアミンにより補完される。バイオフィルム表現型の試験はないものの（他の細菌におけるバイオフィルム表現型のあまり包括的でない遺伝的解析は、大部分は、ポリアミンの細胞内の役割に着目した）、モデルシステムとしてのＵＰＥＣの選択は、その臨床重要性（Ｓｕｂａｓｈｃｈａｎｄｒａｂｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｓｐｅｃｔｒ．  ３（４））、ｅＤＮＡ−ＤＮＡＢＩＩ依存性ＥＰＳの発表された特徴付け（Ｄｅｖａｒａｊ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ９６（６）：１１１９−３５）、およびＥ．ｃｏｌｉポリアミン経路の広範囲のな発表された理解（Ｔａｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．  ４９（１）：８１−９９）に基づく。Ｄｉ  Ｍａｒｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３０３（８）：４８４−９１；Ｋａｒａｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．  ３５（１１）：１７１５−７。バイオフィルム発達においていずれのポリアミンが存在するか、また、いずれの組合せで存在するか、また、臨床的に重要なバイオフィルム形成病原体が決定される。バイオフィルム発達に天然に寄与するポリアミンが明らかになる。バイオフィルム形成を予防するが、ポリアミンによって様々な程度で阻害されるヌクレアーゼを使用して、構成物ポリアミンが、ｅＤＮＡ構造に単純に結合しているか、またはこれに結合して変化しているかを決定する。ポリアミンが、ＤＮＡ構造に影響していない場合、ポリアミンが時間と共に蓄積するにつれて、ポリアミンに対するこれらのヌクレアーゼ（表１）の感受性に関係するバイオフィルム破壊の階層が存在するであろう。新たなヌクレアーゼ抵抗性ＤＮＡ構造が形成される場合、許容的濃度のポリアミンであるにもかかわらずヌクレアーゼが機能しない、バイオフィルム成熟の年齢が存在するであろう。無処置バイオフィルムおよび最も強いバイオフィルム表現型（バイオフィルム状態に分配された最大量の細菌）を有するバイオフィルムの、ｑＲＴ−ＰＣＲによる生合成遺伝子の発現、およびポリアミンの定常状態レベル、およびウエスタン解析によるＤＮＡＢＩＩタンパク質を試験する。最後に、内因性ポリアミンを、ポリアミンの特異的組合せに置き換えて、ＴＥＤＳにおけるポリアミンの頑健性を検査して、全てのポリアミンがバイオフィルム発達において等しく効果的であるかを決定する。
３部構成ｅＤＮＡ依存性スキャフォールドの発達におけるＺ−ＤＮＡの役割を決定する
【０３６２】
バイオフィルムが成熟するにつれ、バイオフィルムＥＰＳ内のｅＤＮＡはＤＮアーゼ抵抗性になる。Ｚ−ＤＮＡは、ＤＮアーゼ抵抗性であり、バイオフィルムが成熟するにつれてＴＥＤＳ中に蓄積することが公知である。
【０３６３】
他の病原体は、単独で、定義された混合バイオフィルムにおいて、およびヒト試料において試験されて、どの程度まで、細菌バイオフィルムの間でＺ−ＤＮＡが普遍的であるかを決定する。
単一種バイオフィルムにおけるＺ−ＤＮＡの存在量を明らかにし、Ｚ−ＤＮＡが、ポリアミンおよび／またはＤＮＡＢＩＩタンパク質と共局在するかどうかを決定する
【０３６４】
後述する二重種バイオフィルムを使用することができ、各バイオフィルムが加齢するときに（０、４、１６、２４、４８および９６時間）抗Ｚ−ＤＮＡ抗体を使用した免疫蛍光を行うことができる、１１種のバイオフィルム形成病原体を試験する｛標準８種およびさらに３種［Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ（ＯＭにおける一般的共病原体（ｃｏ−ｐａｔｈｏｇｅｎ））、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（歯周病原体）およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ（口腔日和見性病原体）］｝。試料をＺ−ＤＮＡ特異的抗体でプローブし、未処理抗体陰性対照およびＢ−ＤＮＡ特異的抗体と比較して、Ｚ−ＤＮＡ存在を厳密に同定する。ＩｇＧ富化抗ポリアミンおよび抗ＤＮＡＢＩＩ抗血清、ならびにこれらそれぞれの未処理ＩｇＧ対照を用いて並列実験を行って、全３種の成分が、バイオフィルムＥＰＳ内で共局在するかどうかを決定する。バイオフィルムを、ＦＭ４−６４等の細菌外膜染色剤で対比染色し、一般的な供給源から得た高度に交差吸着した（ｃｒｏｓｓ−ａｄｓｏｒｂｅｄ）二次抗体で抗体標識を検出し、ＣＬＳＭによって撮像する。ＩｍａｇｅＪにおけるＣｏｌｏｃ  ２解析プラグインを使用して、共局在の程度を定量する。Ｚ−ＤＮＡの蔓延が、バイオフィルム状態への細菌の分配と相関するか試験するために、本明細書に記載される種毎に浮遊性細菌／バイオフィルム細菌の比を定量する。
二重種バイオフィルムにおけるＺ−ＤＮＡの存在量を決定し、Ｚ−ＤＮＡが、ポリアミンおよび／またはＤＮＡＢＩＩタンパク質と共局在するかどうかを決定する
【０３６５】
二重種バイオフィルムを試験して、Ｚ−ＤＮＡ含量、分布、ならびにポリアミンおよびＤＮＡＢＩＩタンパク質との相互作用が、多微生物性環境の文脈において、バイオフィルムの年齢と共にどのように変化するかを決定する。疾患において起こることが公知であり、出願人らがｉｎ  ｖｉｔｒｏで経験がある多微生物性組合せは、ＮＴＨＩ＋Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ（多微生物性ＯＭバイオフィルムに代表的）、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ＋Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ（多微生物性歯周バイオフィルムに代表的）２９、およびＮＴＨＩ＋Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（多微生物性ＣＦおよび慢性化膿性ＯＭバイオフィルムに代表的）を含む。臨床観察に指示される通りに、多微生物性バイオフィルム培養物を播種する；例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａは一般的に、ＮＴＨＩ感染の部位において二次感染菌であるため、ＮＴＨＩバイオフィルムは、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ播種に先立ち確立される。結果としての多微生物性バイオフィルムは、以前に記載された通り免疫蛍光によって、バイオフィルムＥＰＳにおけるＺ−ＤＮＡ含量ならびにポリアミンおよびＤＮＡＢＩＩタンパク質の存在に関して解析される。
一方のパートナーが、ｅＤＮＡ、ポリアミンおよびＨＵに寄与することができない場合の、二重種バイオフィルムにおけるＺ−ＤＮＡの程度、ならびにＺ−ＤＮＡが、ポリアミンおよび／またはＤＮＡＢＩＩタンパク質と共局在するかについて確立する
【０３６６】
ＨＵ欠乏性ＮＴＨＩ株は、ポリアミンおよびｅＤＮＡを欠くマット様バイオフィルムを形成する。この株を、一般的共感染病原体、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓならびにＷＴ  ＮＴＨＩ（ｇｆｐ発現遺伝子を保有して、これをＨＵ変異体から区別する）と対にして、ＷＴ細菌のそれぞれのｅＤＮＡ、ＨＵおよびポリアミンが、Ｚ−ＤＮＡの形成を含むＮＴＨＩ変異体における欠乏を補完することができるかについての決定に使用する。バイオフィルム形成は、上述の通りＣＬＳＭによって定量され、ＥＰＳ成分および構造は、免疫蛍光ＣＬＳＭによって解析される。図４６Ａにおいて、未処理または抗ＨＵ（灰色）および抗スペルミジン（Ｓｐｄ、淡灰白）抗体でプローブした、指し示されたバイオフィルムの免疫蛍光ＣＬＳＭ画像を示し、共局在は白色で指し示す。
ヒト試料におけるＺ−ＤＮＡの検出
【０３６７】
出願人らが、ＤＮＡＢＩＩタンパク質およびポリアミンについて以前に行った通り（Ｇｕｓｔａｖｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｊ  Ｃｙｓｔ  Ｆｉｂｒｏｓ．  １２（４）：３８４−９；Ｉｄｉｃｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ．  １２６（８）：１９４６−５１）、ＯＭを有する小児から回収された滲出液（Ｉｄｉｃｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ．  １２６（８）：１９４６−５１）、ＣＦ痰（Ｇｕｓｔａｖｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｊ  Ｃｙｓｔ  Ｆｉｂｒｏｓ．  １２（４）：３８４−９）、およびＣＲＳを有する成人由来の吸引液を含む、ヒトバイオフィルム関連疾患由来の臨床試料を試験し、Ｚ−ＤＮＡが存在するかを免疫蛍光顕微鏡法によって決定する。出願人らは、出願人らが対応する微生物学的データを有する、上述のそれぞれに由来する性別混合臨床試料にアクセスした。それぞれの切片（同数の男性および女性供給臨床試料を検査）を、未処理抗体対照と免疫蛍光を比較しつつ、様々な濃度のＺ−ＤＮＡ特異的抗体でプローブする。以前に記載された通り免疫蛍光によって、Ｚ−ＤＮＡ検出が、ポリアミンおよびＤＮＡＢＩＩタンパク質と空間的にどのように関係するかについても調査する。図４６Ａにおいて、出願人らは、未処理または抗Ｂ−ＤＮＡ（暗灰色）および抗Ｚ−ＤＮＡ抗体（白色）でプローブした、指し示された細菌の４０時間形成されたバイオフィルムの免疫蛍光ＣＬＳＭ画像を示す。十分に特徴付けされたＺ−ＤＮＡ特異的モノクローナル抗体（クローンＺ２２５８，５９，７８）を使用して、Ｚ−ＤＮＡを検出した。ＤＮＡＢＩＩ、ポリアミン、Ｚ−ＤＮＡおよびＢ−ＤＮＡ成分は全て、複数細菌バイオフィルムのＥＰＳ中に存在する。Ｚ−ＤＮＡは、異なる定常状態レベルにおける複数細菌バイオフィルムのＥＰＳの不可欠な部分である。
ＴＥＤＳの発達におけるＺ−ＤＮＡの機能を調査する
【０３６８】
そこで、出願人らは、どの程度まで、Ｚ−ＤＮＡが、ＴＥＤＳにおいて不可欠な構造的役割を果たすかを決定する。
Ｚ−ＤＮＡに特異的なヌクレアーゼを使用してＴＥＤＳをプローブする
【０３６９】
文献および出願人らのデータに基づき、Ｚ−ＤＮＡは、加齢バイオフィルム内に蓄積するが、相当なＢ形態ＤＮＡが残る可能性があり（データ図示せず）、バイオフィルム全体にわたってＢ−Ｚ界面が存在することを意味する。Ｒｉｃｈおよび共同研究者らは、ヒトＺ−ＤＮＡ結合タンパク質ＡＤＡＲ１のＮ末端Ｚα  Ｚ−ＤＮＡ結合ドメインを、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼＦｏｋＩのＣ末端触媒ＦＮドメインに融合させることにより、Ｚ−ＤＮＡ特異的ヌクレアーゼを作製し（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ９４（２４）：１２８７５−９）、この場合、Ｚ−ＤＮＡ結合ドメインは、Ｂ−特異的ヌクレアーゼをＢ−Ｚ接合部に置く。二重ｈＡＤＡＲ１  Ｚａドメイン（残基１３３〜２０９）融合（Ｚａａ）により、より高いＺ−ＤＮＡ特異性を呈するこの酵素の改善バージョンが構築され、＞９５％純度までの精製し、スーパーコイル形成したプラスミドにおけるＺ−ＤＮＡ挿入物の消化により、Ｚ−ＤＮＡ切断活性を確認する（Ｓｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  ＤＮＡ  Ｒｅｓ．に記載されている通り）。補完的アプローチとして、Ｂ−Ｚ接合部における機能亢進を呈する酵素であるＳ１ヌクレアーゼを使用する。Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２７１（１６）：９３４０−６。Ｚ−ＤＮＡが、ＴＥＤＳの構造的統合性の維持に重要である場合、これらのヌクレアーゼの使用は、バイオフィルムを破壊する筈である。これらの酵素は、機能にＺ−ＤＮＡを要求するため、バイオフィルム発達の経過にわたりＺ−ＤＮＡについてのプローブとなることができ、Ｚ−ＤＮＡの存在を測定するための並行手段として機能することができる（免疫蛍光に加えて）。以前に記載された通り、ｉｎ  ｖｉｔｒｏバイオフィルムアッセイを使用して、発達の経過（０、８、１６、２４、４８および９６時間）にわたりバイオフィルム形成を阻害する上述のＢ−Ｚ接合部特異的ヌクレアーゼの能力を試験する。Ｚ−ＤＮＡトラクトの分解が、バイオフィルムおよび浮遊性細菌の変更された分配をもたらすかについて上述通りに決定する。標準８株と共に、出願人らがＺ−ＤＮＡ検出の相対的蔓延を観察するいずれか追加の種に対するこれらのヌクレアーゼの抗バイオフィルム活性を評価する。
Ｂ形態へのＤＮＡの駆動がＴＥＤＳに影響を与えるかを決定する
【０３７０】
挿入剤（例えば、エチジウムブロマイド、クロロキン、ＤＡＰＩ（Ｋｗａｋｙｅ−Ｂｅｒｋｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．  ３９（２）：２７５−８；Ｓｈａｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １２（１１）：４６７９−９０；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ．  ３３（１１）：１６７７−８６）またはＤＮＡ結合分子（例えば、ネトロプシン、分枝ポリアミン）の添加により、Ｂ−ＤＮＡおよびＺ−ＤＮＡの間の平衡をＢ形態へとさらに至らせることができる。Ｍｕｒａｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  Ｊ  Ｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓ．  １４５（２３）：２３５１０３；Ｚｉｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８３）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  １５４（１）：１５６−６０。Ｚ−ＤＮＡがＴＥＤＳの構造的統合性のための基礎である場合、これらの剤は、バイオフィルムを破壊する筈である。この仮説を検査するために、出願人らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏバイオフィルムアッセイを使用して、Ｚ−ＤＮＡからＢ−ＤＮＡへの触媒の添加が、バイオフィルム形成を妨害するかを評価し、ＣＬＳＭによりバイオフィルム阻害を、希釈プレーティングにより浮遊生物／バイオフィルム分配（ｐｌａｎｋｔｏｎｉｃ／ｂｉｏｆｉｌｍ  ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ）のシフトを、免疫蛍光顕微鏡法によりＺ−ＤＮＡ含量の変化を評価する。マイクロプレート希釈により、化合物毎の最小阻害濃度（ＭＩＣ）を決定することができ、次いでＭＩＣに満たない濃度におけるバイオフィルム破壊およびＺ−ＤＮＡ復帰の用量依存を決定することができる。これらの分子を８種の標準株に対して検査し、最良の抗バイオフィルム活性を有する３種の分子を、出願人らがＺ−ＤＮＡ検出の相対的蔓延を観察するいずれか追加の種によりさらに調査する。
Ｚ形態へのＤＮＡの駆動がＴＥＤＳに影響を与えるかを決定する
【０３７１】
Ｂ−ＤＮＡおよびＺ−ＤＮＡの間の平衡は、Ｚ−ＤＮＡ傾向配列をＺ−ＤＮＡへと至らせるタンパク質（ＡＤＡＲタンパク質、ＺＢＰタンパク質、ポックスウイルスＥ３タンパク質）のＺαドメインファミリーのメンバーに由来する外因性組換えＺαドメインを添加することにより（Ａｔｈａｎａｓｉａｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｓｅｍｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．  ２３（３）：２７５−８０）、または交互プリンピリミジントラクトにおけるシトシンのＣ５をメチル化することにより（例えば、ＨｈａＩ、Ｍ．ＳｓｓＩおよびＭ．ＣｖｉＰＩメチルトランスフェラーゼ）、ポリカチオン（例えば、ポリアミン）のレベルを増加させることにより（Ｊｏｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ．  ３８：５２１−６０）、Ｚ−ＤＮＡに向かって駆動することができる９０。バイオフィルム形成の程度は変化しない可能性があるが、バイオフィルム形成の動態および全体的構造は変化する可能性がある。ＦｏｋＩヌクレアーゼ融合がないだけの、上述の通りのｈＡＤＡＲ１由来の組換えＺａａドメインが産生され、組換えタンパク質のＺ−ＤＮＡ結合活性が、ＣＤによって確認される。Ｚａａドメイン（０、０．５、５または５０μＭ）またはメチルトランスフェラーゼ（例えば、０、０．１、１または１０Ｕ／ｍＬのＨｈａＩおよびＳ−アデノシルメチオニン）が、バイオフィルム播種時に添加され、標準８株および他の面では同質遺伝子的なＨＵ欠乏性ＮＴＨＩ（そのバイオフィルムに有意なｅＤＮＡを含有しない陰性対照）における播種後４、８、１６、２４、４８および９６時間目におけるバイオフィルム形成を、ＣＬＳＭを使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏバイオフィルムアッセイにより評価し、浮遊生物／バイオフィルム分配のシフトを希釈プレーティングにより評価し、Ｚ−ＤＮＡ蓄積を免疫蛍光によって観察する。
【０３７２】
特異的にＺ−ＤＮＡに結合するＤＮＡＢＩＩの能力を決定する。出願人らは、ＨＵが、ＤＮＡをＺ−ＤＮＡに至らせることを示したが、追加の解析を行って、ＤＮＡＢＩＩタンパク質、ポリアミンおよびＤＮＡが相乗的に作用して、Ｚ−ＤＮＡを形成するかを決定することを行う。
ＩＨＦおよびＨＵがポリアミン誘導性Ｚ−ＤＮＡの存在下でＤＮＡに結合するかを決定する
【０３７３】
Ｈｕｄおよび共同研究者らによる大規模研究（Ｓａｒｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ４８（４）：６６７−７５；Ｓａｒｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３５（３）：９５１−６１）は、ＩＨＦおよびＨＵの両方が、スペルミジンの存在下でＤＮＡに結合し、その構造を太い繊維に変化させることを示した。定義されるＤＮＡ基質［ホリデイジャンクションＤＮＡ、ＩＨＦコンセンサス配列（ＷＡＴＣＡＡＮＮＮＮＴＴＲ、式中、ＷはＡまたはＴであり、Ｎはいずれかのヌクレオチドであり、Ｒはプリンである）を含有する３５ｂｐ二重鎖、同じ配列のスクランブルバージョン、Ｚ−ＤＮＡ変換する傾向がある３５ｂｐ（ｄＧｄＣ）、およびその傾向がない３５ｂｐ（ｄＡｄＴ）］が、ポリアミン（０、０．１、０．５、１および５ｍＭの次に挙げるもの：プトレシン、スペルミジン、スペルミン、カダベリン、または上で決定された組合せ）の存在または非存在下で、Ｚ−ＤＮＡを形成するかについて決定する。２５０および２８０ｎｍにおける特徴的反転を予測するＣＤ分光測定による楕円率測定によるＺ−ＤＮＡ変換を先ず決定する。次に、サウスウェスタン解析（ＥＭＳＡと、それに続く抗Ｚ−ＤＮＡおよび抗ＤＮＡＢＩＩ抗体によるイムノブロット解析）によって判定される、各基質へのＤＮＡＢＩＩタンパク質の結合を調査する。Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ．  ３４１（６２３９）：２５１−４。ＣＤで確認されるＺ−ＤＮＡ変換を有する基質（０．２ｎＭ）を、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．０において２５〜５００ｎＭ  ＤＮＡＢＩＩタンパク質と共に３０分間室温でインキュベートする。６％非変性ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動によって反応混合物を分離する。ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを使用して、バンド強度を定量する。平衡解離定数（Ｋｄ）を測定する。Ｈｕｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １９３（１４）：３６４２−５２。ＤＮＡ基質は同位体標識されているため、上に記す同じ細菌株由来のポリアミンおよび／またはＤＮＡＢＩＩタンパク質（その後の反応混合物の０、０．０５、０．１、０．２および０．５ｖ／ｖ）の供給源としてのバイオフィルム由来の無細胞馴化培地を検査することもできる。
ＩＨＦおよびＨＵがＺ−ＤＮＡに結合するかを決定する
【０３７４】
ＩＨＦおよびＨＵが、直接的にＺ−ＤＮＡに結合するかを決定する。ＤＮＡＢＩＩタンパク質および安定Ｚ−ＤＮＡコンフォマーである３５ｂｐ臭素化（ｄＧｄＣ）ＤＮＡ基質によるＥＭＳＡを行う。Ｈｅｒｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２１（１１）：２６６９−７２。臭素化ＤＮＡ基質は、Ｚ−ＤＮＡ状態を安定化するためにポリアミンを要求しないため、本実験は、前の知見を拡張する。基質ＤＮＡは、記載されたα３２Ｐ−ｄＧＴＰ、５−ブロモｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）とのインキュベーションによって標識および調製される。Ｈｅｒｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２１（１１）：２６６９−７２。２５〜５００ｎＭ  ＤＮＡＢＩＩタンパク質を、０．２ｎＭ標識ＤＮＡ基質と共にインキュベートし、６％非変性ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動によって反応混合物を分離し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアによってバンド強度を定量し、平衡解離定数（Ｋｄ）を測定する。
細菌バイオフィルム破壊におけるＥＰＳ成分および構造を標的とする作用物質の有効性を決定する
【０３７５】
ｅＤＮＡおよびＤＮＡＢＩＩは、バイオフィルム破壊のための公知標的であるが、そこで、出願人らは、従来の抗微生物薬の存在または非存在下でのポリアミンおよびＺ−ＤＮＡの両方に着目する。出願人らは、ＴＥＤＳ成分および構造に対して向けられた作用物質が、従来の抗微生物薬と相乗的に作用すると仮定する。
ＥＰＳ  ｅＤＮＡスキャフォールドの以前に発見された成分を標的とする作用物質（抗ＤＮＡＢＩＩ抗体およびヌクレアーゼ）が、新たに発見されたＴＥＤＳ成分／構造を標的とする作用物質（すなわち、ポリアミンおよびＺ−ＤＮＡ）と相乗的であるかどうかを決定する
【０３７６】
バイオフィルム破壊のためのアプローチとして、ＴＥＤＳの全３種の成分または構造を、単独でまたは組み合わせて、標的とする。出願人らは、ＴＥＤＳ内の複数の標的を処置することにより、出願人らが、相乗作用を、よって、１つの標的を単独で標的とするよりも潜在的により優れた有効性があることを実証することができると仮定する。
ポリアミン、ＤＮＡＢＩＩタンパク質および／またはＢ形態ｅＤＮＡの標的化
【０３７７】
公知の細菌ポリアミン合成阻害剤［ジシクロヘキシルアミン（ＤＣＨＡ）（Ｍａｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．  ２２３（３）：８２３−３０）、ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）（Ｍｕｔｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．  ５７（２）：３４８−６３）、メチルグリオキサール−ビス（シクロペンチルアミジノヒドラゾン）（ＭＧＢＣＰ）（Ｔａｋａｊｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｌｅｔｔ  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２５（３）：１７７−８０）］を使用して、別個の成熟化の年齢（０、８、２４および４８時間）に標準８株によって形成されたバイオフィルムを破壊するそれぞれの能力を検査する。病原体毎にＤＣＨＡ、ＤＦＭＯおよびＭＧＢＣＰのＭＩＣを決定し、ＭＩＣを下回る１００倍希釈系列を破壊活性について検査する。各阻害剤は、個々に、およびＤＮアーゼ（プルモザイム（登録商標）；０、０．１、１Ｕ／ｍｌ）またはＨＵに対するＩｇＧ富化抗血清（０、１５０、３００μｇ／ｍｌ）と組み合わせて検査する。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）染色およびＣＬＳＭおよび以前に定量されたバイオフィルムパラメーターによって、バイオフィルムを解析する。個々の処置および処置なし対照と比較した各処置組合せの有効性を評価する。加えて、常在性細菌のいずれかの殺滅または単純にバイオフィルムの破壊が存在するかを決定するための、バイオフィルムおよび浮遊生物（ｐｌａｎｋｔｏｎｉｃ）に残るＣＦＵの分配を試験する。次に、不応性痰バイオマスを破壊する能力について、１０名の患者由来のＣＦ（ヒト多微生物性バイオフィルム様群集の例として（Ｇｕｓｔａｖｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｊ  Ｃｙｓｔ  Ｆｉｂｒｏｓ．  １２（４）：３８４−９））試料における全８種の病原体のための５種の最も有効な組合せを検査する。Ｇｕｓｔａｖｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｊ  Ｃｙｓｔ  Ｆｉｂｒｏｓ．  １２（４）：３８４−９。簡潔に説明すると、痰試料を２４時間処置し、撮像する。以前に記載された通り、無処置対照と比較した濁度の増加によって判定される痰試料の破壊を使用して、処置有効性を定量する。Ｇｕｓｔａｖｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｊ  Ｃｙｓｔ  Ｆｉｂｒｏｓ．  １２（４）：３８４−９。
Ｚ−ＤＮＡ、ＤＮＡＢＩＩタンパク質および／またはＢ形態ｅＤＮＡの標的化
【０３７８】
決定された最良のＺ−ＤＮＡ阻害剤／破壊因子（またはこれらの最良の組合せ）を使用して、成熟の様々な年齢で、標準８株によって形成されたバイオフィルムを破壊する、個々のおよび抗ＤＮＡＢＩＩ抗体またはＤＮアーゼと組み合わせたＭＩＣに満たない濃度でのそれぞれの能力を検査する。上で利用されたＺ−ＤＮＡ特異的ヌクレアーゼが、バイオフィルム形成を阻害する場合、これらのヌクレアーゼを、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体またはＤＮアーゼと共投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｓｉｔｅｒ）する。バイオフィルム破壊活性およびＣＦ痰破壊活性に最も有効な組合せを解析する。
ポリアミン、Ｚ−ＤＮＡ、ＤＮＡＢＩＩタンパク質およびＢ形態ｅＤＮＡの標的化
【０３７９】
ポリアミン合成阻害剤およびＺ−ＤＮＡ阻害剤を使用して、成熟の様々な年齢（０、８、２４および４８時間）で標準８株のそれぞれによって形成されたバイオフィルムを破壊する、組み合わせたそれぞれの能力を検査する。抗ＤＮＡＢＩＩ抗体またはＤＮアーゼによる、ポリアミン阻害剤およびＺ−ＤＮＡ阻害剤の最良の二重処置も検査する。処置組合せ毎のバイオフィルム破壊を評価する。上位３つの組合せをＣＦ痰に対して検査する。
ＴＥＤＳに対する処置および抗微生物薬の相乗作用を決定する
【０３８０】
抗微生物薬と組み合わせた場合の、バイオフィルム破壊に対するＴＥＤＳの全３種の成分または構造の標的化の有効性を試験する。
抗微生物薬とＴＥＤＳの標的化との相乗作用
【０３８１】
最も有効なバイオフィルム破壊組合せを使用して、残っている常在性バイオフィルム細菌およびそれらそれぞれの浮遊性細菌の両方を、抗微生物薬の共投与によって死滅させることができるかどうかを決定する。上で決定された抗ＤＮＡＢＩＩ抗体、ＤＮアーゼ、ポリアミン阻害剤およびＺ−ＤＮＡコンバーターの様々な濃度および組合せを使用して、標準８株に対するバイオフィルム破壊および殺滅のための適切な抗生物質の添加を検査する。ＭＩＣを１０倍上回るおよび下回る、病原体毎に臨床的に指示される抗生物質を共投与する（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ−０．１、１、１０μｇ／ｍｌアンピシリン（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３９（７）：２７２９−３１）；Ｓ．ａｕｒｅｕｓ−０．０２５、０．２５、２．５μｇ／ｍｌクリンダマイシン（ＬａＰｌａｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ５２（６）：２１５６−６２）；Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ−０．２、２、２０ｍｇ／ｍｌバンコマイシン（Ｐｉｎｈｅｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔ．  ２２（４）：２８３−９３）；Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ−０．４、４、４０μｇ／ｍｌセフタジジム／アビバクタム（Ｓａｄｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７）  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ６１（９））；Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ−０．３、３、３０μｇ／ｍｌメロペネム（Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｎｆｅｃｔ．  ４４（５）：３５８−６３）；Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ−０．４、４、４０μｇ／ｍｌコリスチン（Ｈｉｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ５１（６）：１６７８−８４）；Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ−０．４、４、４０μｇ／ｍｌセフェピム（Ｒｉｖｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ６０（６）：３８５４−５）、ＮＴＨＩ−０．１／０．０５、１／０．５、１０μｇ／ｍｌ／５ｍｇ／ｍｌアモキシシリン／クラブラン酸リチウム３１）。処置組合せ毎のバイオフィルム破壊および残っている生存可能分配を評価し、組合せをＣＦ痰に対して検査する。
【０３８２】
このようなより十分な普遍的ＴＥＤＳ理解により、出願人らは、スタンドアロンアプローチとしてバイオフィルムを処置する潜在力を想定する、またはこのアプローチを種特異的バイオフィルム成分（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ多糖、アルギン酸塩、ＰｅｌおよびＰｓｌ（Ｇｕｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２９１（２４）：１２５３８−４６））を標的とする戦略と組み合わせて、特異的病原体に対するバイオフィルム破壊の外科的有効性を最適化する。
【０３８３】
出願人らは、結核（ＴＢ）のための前臨床モデルも提供する。Ｏｒｄｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ａｎｔｉ．  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ５４：１８２０を参照されたい。微生物Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓは、増大している世界的流行の原因となる。現在の数字は、年間で、ＴＢのおよそ８００万例の新たな症例およびＴＢによる約２７０万名の死亡が存在することを示唆する。ＨＩＶを有する個体の共感染としてのこの微生物の役割に加えて（ＨＩＶに感染したほぼ４５００万名のうち、ほぼ１／３が、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓにも共感染したことが推定される）、分離株が複数の薬物に対して高度に抵抗性になったことが特に厄介であり、ＴＢのための新たな薬物は四半世紀を超えて導入されていない。この動物モデルにおいて、バリアコロニーにおいてＳＰＦモルモットを維持し、ほぼ２０ｃｆｕのＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ株Ｅｒｄｍａｎ  Ｋ０１桿菌をその肺に送達するためのエアロゾル化スプレーにより感染させる。細菌負荷および病理組織学的評価のための組織の回収の決定により、曝露後日数２５、５０、７５、１００、１２５および１５０日目に動物を屠殺する。ＴＢの古典的徴候を発症しないマウスとは異なり、この様式で曝露したモルモットは、ヒト疾患の特質である中心の壊死を有するよく組織化された肉芽腫を発症する。さらに、ヒトと同様に、モルモットは、一次病変複合体の一部として、重症化膿性肉芽腫性（ｓｅｖｅｒｅ    ｐｙｏｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｕｓ）および流入領域リンパ節の壊死性リンパ節炎を発症する。このモデルの使用は、治療法を確認および同定するための前臨床スクリーニング、ならびに曝露後にこれらの動物の肺に形成することが観察され、疾患の病理発生および慢性化の両方に寄与することが考えられる、結果として生じるＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓバイオフィルムの低減および／または排除のための予防戦略を提供する。
（実施例６）
実験番号６
【０３８４】
カテーテル／留置デバイスバイオフィルム感染の複数の動物モデルが公知である。Ｏｔｔｏ  （２００９）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７：５５５を参照されたい。正常皮膚細菌叢と典型的に考慮されるが、微生物Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓは、多くの者が、院内感染の原因因子の中でも第１位の、肝要な日和見性病原体として配慮するものになった。主に、この細菌は、留置医療デバイスにおいて発症する感染の大部分の原因となり、留置医療デバイスは、デバイス挿入の際にこの一般的な皮膚生着菌によって汚染される。これは典型的に生命を脅かすものではないが、このようなバイオフィルム感染の処置に関連した困難は、その頻度と組み合わせて、重篤な公衆衛生上の負担となる。Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓによる血管カテーテル関連血流感染単独の処置に関連した現在のコストは、米国において年間＄２０億に達する。Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓに加えて、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓおよびＳ．ａｕｒｅｕｓも、留置医療デバイスに見出される汚染である。ウサギ、マウス、モルモットおよびラットを含む、カテーテル関連のＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ感染のいくつかの動物モデルが存在し、これらは全て、病理発生の分子機構の研究に使用されており、予防および／または治療法の研究に役立つ。ラット頸静脈カテーテルが使用されて、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓバイオフィルム形成に干渉する治療法を評価した。バイオフィルム低減は、３つの仕方で測定されることが多い−（ｉ）カテーテルを超音波処理し、ＣＦＵを計算する、（ｉｉ）カテーテルを薄切りにするもしくは単純にプレート上に置き、スコア化する、または（ｉｉｉ）バイオフィルムは、クリスタルバイオレットまたは別の色素で染色し、溶出させ、ＣＦＵの代理としてＯＤ測定することができる。
（実施例７）
実験番号７
【０３８５】
本明細書に記載される方法を使用して、非免疫対象に受動免疫を付与することができる。所与の抗原に対する受動免疫は、特定の抗原を特異的に認識するまたはこれに結合する抗体または抗原結合性断片の移入により付与することができる。抗体ドナーおよびレシピエントは、ヒトまたは非ヒト対象となることができる。その上またはあるいは、抗体組成物は、特定の抗原を特異的に認識するまたはこれに結合する抗体または抗原結合性断片をコードする単離されたまたは組換えポリヌクレオチドを含むことができる。
【０３８６】
免疫原性組成物の投与がレシピエント対象にリスクを課す、レシピエント対象が免疫低下状態である、またはレシピエント対象が即時免疫を要求する場合に、受動免疫を付与することができる。免疫原性組成物は、選択された投与機序と一貫した様式で調製することができる。組成物は、抗体全体、抗原結合性断片、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ｉｎ  ｖｉｖｏで生成された抗体、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成された抗体、精製されたもしくは部分的に精製された抗体、または全血清を含むことができる。投与は、単一用量の抗体組成物、または初期投与とそれに続く１つもしくは複数のブースター用量を含むことができる。ブースター用量は、初期用量後１日、２日、３日、１週間、２週間、３週間、１、２、３、６もしくは１２ヶ月に、または他のいずれかの時点に提供することができる。ブースター用量は、対象の抗体力価の評価後に投与することができる。
等価物
【０３８７】
上述の実施形態と併せて本開示について記載してきたが、前述の記載および実施例が、説明を意図し、本開示の範囲を限定するものではないことを理解されたい。本開示の範囲内の他の態様、利点および改変は、本開示が属する技術分野の当業者には明らかとなる。
【０３８８】
他に規定がなければ、本明細書で使用されるあらゆる技術および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意義を有する。本明細書に提供されるあらゆるヌクレオチド配列は、５’から３’の方向で提示される。
【０３８９】
説明目的で本明細書に記載される実施形態は、特に本明細書に開示されていないいかなるエレメント（単数または複数）、限定（単数または複数）の非存在下であっても、適切に実施することができる。よって、例えば、用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「を含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」等は、拡大的に限定することなく読むべきである。その上、本明細書で用いられる用語および表現は、限定ではなく記載の用語として使用しており、斯かる用語および表現の使用において、示され記載された特色またはその部分のいかなる等価物を除外する意図もないが、本開示の範囲内で様々な改変が可能であることが認識される。
【０３９０】
よって、特異的な実施形態および必要に応じた特色によって本開示を特に開示してきたが、本明細書に開示されるその中の実施形態の改変、改善および変形形態は、当業者によって用いることができ、斯かる改変、改善および変形形態が、本開示の範囲内にあると考慮されることを理解されたい。本明細書に提供される材料、方法および実施例は、特定の実施形態を代表し、例示的であり、本開示の範囲における限定として意図するものではない。
【０３９１】
本開示の範囲（ｓｃｏｐｅｄ）を、本明細書で広く包括的に記載してきた。包括的な開示に含まれるより狭い種および亜属のグループ分けのそれぞれもまた、本開示の一部を形成する。これは、切り取られた材料が本明細書に特に列挙されているか否かに関係なく、属からいずれかの主題を除去する、条件付きの包括的な記載または否定的な制限を含む。
【０３９２】
加えて、本開示の特色または態様が、マーカッシュ群の観点から記載されている場合、当業者であれば、これにより、本開示の実施形態を、マーカッシュ群のいずれか個々のメンバーまたはメンバーのサブグループの観点から記載できることも認識する。
【０３９３】
本明細書に言及されているあらゆる刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、あたかもそれぞれが個々に参照により本明細書に組み込まれるのと同じ程度まで、それらの全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる。矛盾が生じる場合、定義を含めて本明細書が優先するものとする。
参考文献
【化２−１】
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【図１９】
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【図４７】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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