(57)【要約】１．随意に精子を処置工程へと供する工程；２．工程１の精子を、目的の雌性または雄性精子のいずれかを選択するように雌雄選択工程に供する工程；３．工程２の目的の精子を使って受精工程を実施し、少なくとも１つの卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚を産生する工程；４．工程３の少なくとも１つの卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚を、少なくとも１つの溶解した卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚から細胞性物質を選択的に放出するように、精子の存在下で選択的に溶解させる工程；および５．前記放出された細胞性物質を少なくとも１つの下流用途において使用する工程を含む方法。【選択図】図Ｂ−４Ｂ
2021505191.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程：
１．随意に精子を処置工程へと供する工程；
２．工程１の前記精子を、目的の雌性または雄性精子のいずれかを選択するように雌雄選択工程に供する工程；
３．工程２の目的の前記精子を使って受精工程を実施し、少なくとも１つの卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚を産生する工程；
４．少なくとも１つの溶解した卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚から細胞性物質を選択的に放出するように、工程３の前記少なくとも１つの卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚を、精子の存在下で選択的に溶解させる工程；および
５．前記放出された細胞性物質を少なくとも１つの下流用途において使用する工程
を含む方法。
【請求項２】
前記工程１が、前記精子を実験技術に供し；前記精子を突然変異原または疑いのある突然変異原に供し；前記精子を組換え技術により操作し；前記精子を抗体などの分子に供し；または前記精子を放射線に暴露することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
随意に、工程３の前記少なくとも１つの卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚を、工程１に記載の処置工程に供することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程２が、雄性精子に特異的に結合する抗体を使って実施される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体が、哺乳動物の雄性精子（雄精子細胞）の表面タンパク質に特異的に結合するおよび／またはそれに対して惹起されるモノクローナル抗体またはその断片である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体が雄性精子細胞の表面タンパク質ＤＥＡＤ／ＤＢＹに特異的に結合し；前記抗体が次のＤＢＹのエピトープ：ＳＦＦＦＦＥＭＥＳＨ（配列番号３５３）、ＦＳＩＦＮＲＤＧＶ（配列番号３５４）またはＳＬＮＩＦＬＤＲＷ（配列番号３５５）の１つに特異的に結合し；前記抗体がＣＤＲ１（配列番号３６３）、ＣＤＲ２（配列番号３６４）およびＣＤＲ３（配列番号３６５）のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含みそして／または前記抗体がＣＤＲ１（配列番号３６０）、ＣＤＲ２（配列番号３６１）およびＣＤＲ３（配列番号３６２）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含み；前記抗体が本明細書中に記載のＲＥ５であり；前記抗体が配列番号３５２および８４〜１５９のいずれか１つまたはその部分に対して惹起され；または前記抗体が配列番号３４７のアミノ酸配列に対して惹起される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程２が、哺乳動物の精子を含む精液を、前記抗体が前記精液の雄性精子に特異的に結合するようなモノクローナル抗体またはその断片に供することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程３が、少なくとも１つの卵母細胞を、本質的に同一の培地において（１）洗浄、（２）採取、（３）培養、（４）受精、随意に（５）洗浄、および随意に（６）培養する連続の工程を含み（ただし培地の組成は、工程（１）〜（６）の１つ以上において少なくとも１つのサプリメントで選択的に補足されることによって段階的に変更される）、それにより前記少なくとも１つの受精卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚の生産を改善する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
工程４が、卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚が溶解されそして前記卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚から細胞性物質が放出されるが、精子は溶解されないような溶解溶液に、卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚を供することを含む請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記下流用途が、ポリメラーゼ酵素を使って溶解緩衝液内の放出された物質を選択的に複製することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
遺伝子の変化または遺伝子型に対する変化を特徴づけるために用いられる；または突然変異原を同定するために用いられる；または診断目的に用いられる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
哺乳動物雄精子（雄精子細胞）の表面タンパク質に特異的に結合するおよび／またはそれに対して惹起される、モノクローナル抗体またはその断片。
【請求項１３】
前記雄精子細胞の表面タンパク質がＤＥＡＤ／ＤＢＹである、請求項１２に記載のモノクローナル抗体またはその断片。
【請求項１４】
前記抗体またはその断片が、次のＤＢＹのエピトープ：ＳＦＦＦＦＥＭＥＳＨ（配列番号３５３）、ＦＳＩＦＮＲＤＧＶ（配列番号３５４）またはＳＬＮＩＦＬＤＲＷ（配列番号３５５）の１つに特異的に結合する、請求項１３に記載のモノクローナル抗体またはその断片。
【請求項１５】
前記抗体またはその断片の重鎖可変ドメインが、ＣＤＲ１（配列番号３６３）、ＣＤＲ２（配列番号３６４）およびＣＤＲ３（配列番号３６５）のアミノ酸配列を含み、そして／または前記抗体またはその断片の軽鎖可変ドメインがＣＤＲ１（配列番号３６０）、ＣＤＲ２（配列番号３６１）およびＣＤＲ３（配列番号３６２）のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のモノクローナル抗体またはその断片。
【請求項１６】
前記抗体またはその断片の重鎖可変ドメインが配列番号３５０のアミノ酸配列を含むか、またはその重鎖可変ドメインが配列番号３５０により示されるアミノ酸配列の１個もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失または付加により誘導され、それが配列番号３５０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有し、そして前記抗体またはその断片が表面タンパク質と特異的に結合する活性を有する、請求項１３に記載のモノクローナル抗体またはその断片。
【請求項１７】
前記抗体またはその断片の軽鎖可変ドメインが配列番号３５１のアミノ酸配列を含むか、またはその軽鎖可変ドメインが配列番号３５１により示されるアミノ酸配列の１個もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失または付加により誘導され、それが配列番号３５１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有し、そして前記抗体またはその断片が表面タンパク質と特異的に結合する活性を有する、請求項１３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１８】
前記抗体またはその断片が、ウシおよびブタ種を含む異なる哺乳動物種のＤＥＡＤ／ＤＢＹに結合することができる、請求項１３に記載のモノクローナル抗体またはその断片。
【請求項１９】
請求項１１〜１８のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその断片の有効量と、許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む組成物。
【請求項２０】
医薬組成物の形態、獣医学用途の組成物の形態、または研究目的のための形態である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記許容される担体、希釈剤または賦形剤が精液増量剤である、請求項１９または２０に記載の組成物。
【請求項２２】
請求項１１〜１８のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体もしくはその断片または請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の組成物を含む、試薬、キットまたはチップ。
【請求項２３】
診断薬、試薬または道具として請求項１１〜１８のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体もしくは断片または請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項２４】
前記モノクローナル抗体またはその断片が検出目的のために標識され、またはビーズのような固形担体と結合することができる、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
哺乳動物精子（「精子細胞」）の処置方法であって、抗体が精液の雄性精子（「雄精子細胞」）に特異的に結合するように、精子を含む哺乳動物精液を請求項１１〜１８のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体もしくはその断片または請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の組成物を供する工程を含む方法。
【請求項２６】
生産される雌子孫の確率を高めるための哺乳動物精子（「精子細胞」）の処置方法であって、抗体またはその断片が雄性精子に特異的に結合するように、哺乳動物の精子を請求項１１〜１８のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体もしくはその断片または請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の組成物と接触させる工程を含む方法。
【請求項２７】
哺乳動物の精液の雌雄鑑別方法であって、抗体またはその断片が精液の雄性精子に特異的に結合するように、精液の精子を請求項１１〜１８のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体もしくはその断片または請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の組成物と接触させる工程を含む方法。
【請求項２８】
請求項１１〜１８のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体もしくはその断片または請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の組成物で処置した精液または精子を含有する組成物。
【請求項２９】
生産される雌子孫の確率を高めるために哺乳動物を人工受精させる方法であって、該哺乳動物に、
（ｉ）請求項１１〜１８のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体もしくはその断片の有効量；
（ｉｉ）請求項１９〜２０のいずれか一項に記載の組成物の有効量；または
（ｉｉｉ）請求項２１に記載の組成物の有効量
を投与し、それにより前記哺乳動物を人工受精させる工程を含む方法。
【請求項３０】
請求項１１〜１８のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体もしくはその断片または請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の組成物と雄性精子（「雄精子細胞」）とのコンジュゲート。
【請求項３１】
請求項１１〜１８のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体もしくはその断片と雄性精子とのコンジュゲート、または請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の組成物と雄性精子とのコンジュゲートを含む処置された精子または処置された精液。
【請求項３２】
雄性精子（「雄精子細胞」）選択のための請求項１１〜１８のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体もしくはその断片または請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の組成物の使用であって、前記雄性精子選択が場合により大量の精液において実施される使用。
【請求項３３】
哺乳動物の精液または精子を雌雄鑑別するための、請求項１１〜１８のいずれか一項に記載のモノクロ―ナル抗体もしくはその断片または請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項３４】
精子の量を定量し、次いで雄精子細胞への抗体の結合を最適化するように適当量のモノクローナル抗体またはその断片を添加する工程を含む、請求項２５、２６、２７および２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１１〜１８のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を含むハイブリドーマ細胞。
【請求項３６】
（ｉ）請求項１１〜１８のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体の重鎖可変ドメイン；
（ｉｉ）請求項１１〜１８のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体の軽鎖可変ドメイン；
（ｉｉｉ）請求項１１〜１８のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体の重鎖可変ドメインのＣＤＲ１（配列番号３６３）、ＣＤＲ２（配列番号３６４）およびＣＤＲ３（配列番号３６５）；および／または
（ｉｖ）請求項１１〜１８のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体の軽鎖可変ドメインのＣＤＲ１（配列番号３６１）、ＣＤＲ２（配列番号３６２）およびＣＤＲ３（配列番号３６３）
をコードする、１または複数の単離、精製または組み換え核酸。
【請求項３７】
配列番号３４７のアミノ酸配列に対して惹起された、単離されたモノクローナル抗体。
【請求項３８】
少なくとも１つの受精卵母細胞、着床前胚または胚盤胞の生産方法であって、少なくとも１つの卵母細胞を、本質的に同一の培地において（１）洗浄、（２）採取、（３）培養、（４）受精、随意に（５）洗浄、および随意に（６）培養する連続の工程を含み（ただし培地の組成は、工程（１）〜（６）の１つ以上において少なくとも１つのサプリメントで選択的に補足されることによって段階的に変更される）、それにより前記少なくとも１つの受精卵母細胞または着床前胚または胚盤胞の生産を改善する、方法。
【請求項３９】
少なくとも１つの受精卵母細胞、着床前胚または胚盤胞の生産方法であって、次の連続工程：（１）卵丘・卵母細胞複合体（ＣＯＣ）を洗浄して該ＣＯＣから少なくとも１つの卵母細胞を放出させる工程、（２）工程（１）の少なくとも１つの卵母細胞を採取する工程、（３）工程（２）の少なくとも１つの卵母細胞を培養する工程、（４）工程（３）の少なくとも１つの卵母細胞を精子で受精させ、少なくとも１つの受精卵母細胞、胚または胚盤胞を生産する工程、随意に（５）少なくとも１つの受精卵母細胞または胚を洗浄する工程、および随意に（６）更なる胚の発達のために工程（５）からの少なくとも１つの受精卵母細胞または胚を培養する工程を含み、ここで工程（１）〜（６）において本質的に同じ培地が使用され（ただし培地の組成は、工程（１）〜（６）の１つ以上において少なくとも１つのサプリメントで選択的に補足されることによって段階的に変更される）、それにより前記少なくとも１つの受精卵母細胞、着床前胚または胚盤胞の生産を改善する、方法。
【請求項４０】
少なくとも１つの受精卵母細胞、着床前胚、または胚盤胞の生産方法であって、次の工程：
（１）卵丘・卵母細胞複合体（ＣＯＳ）の調製物を培地で２回、そして培地＋サプリメント１で１回洗浄し、該ＣＯＳから少なくとも１つの卵母細胞を放出させる工程；
（２）工程（１）の前記少なくとも１つの卵母細胞を回収し、そしてその少なくとも１つの卵母細胞を培地＋サプリメント１の中で所定の時間に渡り培養する工程；
（３）工程（２）の前記少なくとも１つの卵母細胞を培地＋サプリメント２の中で所定の時間に渡り培養する工程；
（４）工程（３）の前記少なくとも１つの卵母細胞を、培地＋サプリメント３の中で所定の期間に渡り精子で受精させて少なくとも１つの受精卵母細胞を生産する工程；随意に
（５）前記少なくとも１つの受精卵母細胞または産生した胚を、培地＋サプリメント４で洗浄する工程；および随意に
（６）工程（５）からの前記少なくとも１つの受精卵母細胞または胚を、更なる胚の発達のために培地＋サプリメント４中で培養する工程
を含み、ここで工程（１）〜（６）の各工程で本質的に同じ培地が使用される方法。
【請求項４１】
請求項３８、３９または４０の方法により生産させた、少なくとも１つの受精卵母細胞、胚盤胞または着床前胚。
【請求項４２】
請求項３８、３９または４０に記載の、または請求項３８、３９または４０の方法で使用する培地もしくは培地＋サプリメント。
【請求項４３】
請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の少なくとも１つの着床前受精卵母細胞、胚盤胞または胚を生産するためのハイスループットインビトロ生産（ＩＶＰ）法。
【請求項４４】
精子の存在下で卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚を選択的に溶解させる方法であって、
卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚が溶解され、前記卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚から細胞性物質が溶解されるが、精子は溶解されないように、卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚を溶解溶液に供する工程を含む方法。
【請求項４５】
請求項４４の方法により生産された、放出された細胞性物質。
【請求項４６】
溶解溶液により溶解されない精子の存在下で卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚を選択的に溶解させるため、かつ前記溶解された卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚から細胞性物質を選択的に放出させるための溶解溶液であって、前記細胞性物質と溶解溶液とが下流用途に適合するような溶解溶液。
【請求項４７】
精子の存在下で卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚を選択的に溶解させる方法であって、溶解した卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚からの遺伝物質がポリメラーゼ酵素を使って選択的に複製可能であり、前記方法が
（１）卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚を、その卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚が溶解されそして前記卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚から遺伝物質が放出されるが、精子は溶解されないような溶解溶液に供する工程；および
（２）前記溶解緩衝液中の放出された遺伝物質を、ポリメラーゼ酵素を使って選択的に複製する工程
を含む方法。
【請求項４８】
請求項４７の方法により生産された、放出された遺伝物質。
【請求項４９】
溶解溶液により溶解されない精子の存在下で卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚を選択的に溶解させるため、かつ溶解した卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚から遺伝物質を選択的に放出させるための溶解溶液であって、前記溶解緩衝液内に放出された遺伝物質はポリメラーゼ酵素を使って選択的に複製することが可能である、溶解溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
〔関連出願〕
本出願は、ともに２０１７年１２月４日出願の米国特許出願第６２／５９４１２４号および同第６２／５９４１５３号の優先権を主張し、それらの出願の全内容が相互参照により本明細書中に組み込まれる。
標題１
生殖方法
〔技術分野１〕
【０００２】
本発明は一般に、介助生殖技術に関する。一態様では、本発明は、ブタにおける少なくとも１つの受精卵母細胞、着床前の胚または胚盤胞、好ましくは着床前の受精卵母細胞、着床前の胚または胚盤胞の生産方法に関する。
〔背景技術１〕
【背景技術】
【０００３】
過去30年間の間、再生生理学を研究するためでなく他のバイオテクノロジー的および生物医学的研究の一部として、例えばトランスジェニックブタの生産のために、ブタの体外胚生産（ＩＶＰ）を改良することがかなり着目されている（Gil他、2010; Vajta & Callesen, 2012; Liu他, 2011; Lopes他, 2007; Li他, 2013）。幾つかの研究所で許容可能レベル（３０−３５％）の胚盤胞生産が達成されているが（Kim他、2008; Somfai他, 2005）、例えばウシに比較してブタのＩＶＰの変動性と脆弱性は、鍵となる要因を依然として解決すべきであることを明白に表している。
【０００４】
適切な卵母細胞成熟は、受精の成功の必要条件であり、減数分裂による成熟の一時的中断が最適な細胞質成熟を引き出し、より大きい生産量とその後の胚発生を促進する（Fouladi-Nashta他, 1998）。体外受精（ＩＶＦ）用に新鮮な精液と凍結・融解後の精液との間の差異を減少させるために鋭意努力がなされているが、ＩＶＦの効率は多くのＩＶＦ研究所において４０〜５０％に留まり（Li 他、2003; Alminana他、2005)、精液の最適量はまだ分かっていない。異なるタイプの培地サプリメントおよび培地条件を使用してＩＶＰ法を改善しようとする試みにもかかわらず、成功率はまだ最適以下のままである。伝統的なＩＶＰ法は、卵母細胞の採集から胚培養に至るまで数種類の培地を使用し、それがおそらくその方法の変動性と再現性の欠如を引き起こし得るのであろう。
【０００５】
異なる研究所により使用されるＩＶＰプロトコル間に一貫性がないため、最適化されたＩＶＰシステムが実現されるにはまだほど遠い。
【発明の概要】
【０００６】
〔発明の概要１〕
本発明の一観点では、本発明者らは受精卵母細胞、着床前の胚または胚盤胞の改良生産のための培養技術を開発した。
【０００７】
別の態様では、本発明者らは、受精卵母細胞、着床前胚または胚盤胞の改良生産のための、本質的に単一の培地を使用することによる、簡略化されたＩＶＰ法を開発した。
【０００８】
別の態様では、この改善された胚培養培地および方法は、変動が少なく、高い再現性をもたらし、異なる研究所間を超えて標準として使用することができる。
【０００９】
別の態様では、本発明者らのＩＶＰ法の簡易性は、胚発生および品質を損なうことなくハイスループット（高生産性）を促進し、更なる用途、例えば生物医学研究における用途の可能性がある。
【００１０】
本発明の第一の態様によれば、少なくとも１つの受精卵母細胞、着床前胚または胚盤胞の産生方法であって、次の連続工程：（１）洗浄、（２）採集、（３）培養、（４）受精、随意に（５）洗浄、および（６）培養を含み、ただし、工程（１）〜（６）の１つ以上において少なくとも１つのサプリメントを選択的に補足することによって、培地の組成が工程的に変更され、それにより前記少なくとも１つの受精卵母細胞または着床前胚もしくは胚盤胞の生産を改善する方法が提供される。
【００１１】
好ましくは、次の連続工程：（１）卵丘・卵母細胞複合体（ＣＯＣ）を洗浄してＣＯＣから少なくとも１つの卵母細胞を遊離させる工程、（２）工程（１）の少なくとも１つの卵母細胞を採取する工程、（３）工程（２）  の少なくとも１つの卵母細胞を培養する工程、（４）工程（３）の少なくとも１つの卵母細胞を精子で受精させ、少なくとも１つの受精卵母細胞、胚または胚盤胞を生産する工程、随意に（５）少なくとも１つの受精卵母細胞または胚を洗浄する工程、および随意に（６）更なる胚発生のために工程（５）からの少なくとも１つの受精卵母細胞または胚を培養する工程を含み、ただし、工程（１）〜（６）の１つ以上において少なくとも１つのサプリメントを選択的に補足することによって、培地の組成が工程的に変更され、それにより前記少なくとも１つの受精卵母細胞または着床前胚もしくは胚盤胞の生産を改善する方法が提供される。
【００１２】
本発明の第二の態様によれば、少なくとも１つの受精卵母細胞、着床前の胚、または胚盤胞の産生方法であって、次の工程：
（１）卵丘・卵母細胞複合体（ＣＯＳ）の調製物を培地で２回、そして培地＋サプリメント１で１回洗浄し、ＣＯＳから少なくとも１つの卵母細胞を遊離させる工程；
（２）工程（１）の少なくとも１つの卵母細胞を回収し、そして少なくとも１つの卵母細胞を培地＋サプリメント１の中で所定の時間に渡り培養する工程；
（３）工程（２）の少なくとも１つの卵母細胞を培地＋サプリメント２の中で所定の時間に渡り培養する工程；
（４）工程（３）の少なくとも１つの卵母細胞を、培地＋サプリメント３の中で所定の期間に渡り精子で受精させる工程；随意に
（５）少なくとも１つの受精卵母細胞または産生した胚を、培地＋サプリメント４で洗浄する工程；および随意に
（６）工程（５）からの少なくとも１つの受精卵母細胞または胚を、更なる胚の発達のために培地＋サプリメント４中で培養する工程
を含む方法が提供される。
【００１３】
本発明の第三の態様によれば、第一または第二の態様の方法により産生させた時の少なくとも１つの受精卵母細胞、胚盤胞または着床前胚が提供される。
【００１４】
本発明の第四の態様によれば、本発明の第一または第二の態様において記載された培地または培地＋サプリメント（１、２、３または４）が提供される。
【００１５】
本発明の第五の態様によれば、本発明の前の態様のいずれか１つに従って記載された少なくとも１つの着床前の受精卵母細胞、胚盤胞または胚を産生するハイスループットインビトロ産生（ＩＶＰ）法が提供される。
【００１６】
卵母細胞はヒトまたは任意の適当な動物のタイプから供給され得る。動物は哺乳動物であり得る。動物は、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジまたはヤギのような家禽でありうる。動物はコンパニオンアニマル、例えはイヌまたはネコであり得る。動物は実験動物、例えばウサギ、マウスまたはラットでありうる。好ましくは卵母細胞はブタに由来する。
【００１７】
好ましくは複数の受精卵母細胞、胚または胚盤胞が上述の本発明の種々の態様により算出される。より好ましくは、多数の受精卵母細胞、胚盤胞または胚が一度におよび同時に生産される。
【００１８】
任意の適当なタイプの培地を使用できる。本発明者らは体外成熟（ＩＶＭ）培地Ｍ−１９９が、本発明の第一、第二および第四の態様に特に好適に培地であることを発見したが、Ｍ−１９９に類似した性質を有する任意の培地を使用できる。
【００１９】
培地は次のタイプの成分の１つ以上を含むことができる：栄養またはエネルギー（例えばグルコース、タンパク質、アミノ酸）；ミネラル類（例えば塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、リン酸一カリウム、リン酸二水素ナトリウム一水和物、硫酸マグネシウム七水和物、炭酸水素ナトリウム、乳酸ナトリウム、乳酸カルシウム、硝酸鉄九水和物）；ビタミン類（例えばビタミンＡ、チアミン、リボフラビン、ピリドキシン、ピリドキサールＨＣｌ、ＰＡＢＡ、ナイアシンアミド、ナイアシン、アスコルビン酸、ビオチン、Ｄ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、エルゴカルシフェロール、葉酸、ｉ−イノシトール、メナジオン）；ｐＨ指示薬（例えばフェノールレッド）；抗菌剤（例えばペニシリンＧ、ストレプトマイシン）；酸化防止剤（例えばグルタチオン）；および他の適当なサプリメント（例えばブタ卵胞液（ＰＦＦ）、最小必須培地、ウシ胎児血清、妊馬血清ゴナドトロピン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ピルビン酸ナトリウムおよびカフェイン）。
【００２０】
典型的には、Ｍ−１９９は下の表１Ａに示す性質を有するだろう。
【００２１】
表１Ａ．Ｍ−１９９の性質
【表１−１】
2021505191.tif 000003
【表１−２】
2021505191.tif 000004
【表１−３】
2021505191.tif 000005
【表１−４】
2021505191.tif 000006
【００２２】
参考文献： Morgan, J.F. & Campbell, M.E. (1955) J. Natl. Cancer Inst., 16:557; Morgan, J.F., Morton, H.J. & Parker R.C. (1950) Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73:1。
【００２３】
他の好適な培地―すなわち、Ｍ−１９９に類似した性質を有する任意培地―は、下の表２Ａに示す一般的性質を有すると特徴づけることができる。
【００２４】
表２Ａ．Ｍ−１９９以外の好適な培地の一般的性質。
【表２】
2021505191.tif 000007
【００２５】
任意の好適なタイプのサプリメントを使用できる。好ましくは、各サプリメントは、補足した培地が、卵母細胞を入手した卵管環境を模倣もしくは模擬するようにするまたは化学的により類似するようにするのを助ける。１以上のサプリメントは、ホルモン、成長促進因子および／またはエネルギー供給物質（例えばｃＡＭＰ）を含むことができる。卵母細胞がブタに由来する場合、ブタ由来分子を使用できるが、これは必ずしも必要な条件ではない。幾つかの場合、ブタに適合する分子（合成のものまたは別の種に由来する分子）を使用できる。
【００２６】
例えば、洗浄工程のサプリメントはホルモンまたは成長促進因子を含むことができ、回収工程のサプリメントはホルモン、成長促進因子およびエネルギー供給物質を含むことができ、培養工程のサプリメントは成長促進因子を含むことができ、受精工程のサプリメントは成長促進因子を含むことができ、そして／または培養工程のサプリメントは成長促進因子を含むことができる。
【００２７】
本明細書中で言及される「＋サプリメント」の更に好ましい性質が下記の表３Ａに示される。
表３Ａ．＋サプリメントの性質。
【表３】
2021505191.tif 000008
【００２８】
参考文献: Eagle, H. (1959) Science 130:432。
【００２９】
工程（１）では、ＣＯＣの調製物は任意の適当な形態であり得る。好ましくは、均一な卵細胞質と、密集した細胞塊の少なくとも２層を有するＣＯＣが用いられる。
【００３０】
工程（１）では、少なくとも１つの卵母細胞を得るためのＣＯＣの洗浄は任意の好適な方法で実施できる。好ましくは、ＣＯＣは培地＋サプリメント１の中で２回洗浄される。培地＋サプリメント１は、表中に記載の通りであり得る。好ましくは、サプリメント１は１５％（ｖ／ｖ）ブタ卵胞液（ＰＦＦ）、１５ＩＵ／ｍＬのヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）および３０ＩＵ／ｍＬの妊馬血清性ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）を含む。
【００３１】
ＰＦＦは直径約３〜６ｍｍの表層性濾胞から回収することができる。回収されたＰＦＦは０．２０μｍのシリンジフィルターを使ってろ過し、使用まで−２０℃で保存することができる。
【００３２】
この方法は、工程（１）の前に卵巣を回収する工程を含み得る。卵巣は、解体した未経産雌ブタおよび雌ブタから任意の適当な手法で回収することができる。
【００３３】
卵巣は塩溶液中、例えば３０〜３８℃の約０．９％ＮａＣｌ溶液中で、工程（１）による処理まで保存することができる。
【００３４】
工程（２）を実施する前に、ＣＯＣを直径約３〜８ｍｍの濾胞から吸引し、そして３８℃にて数分間静置して沈殿させることができる。
【００３５】
工程（２）において、少なくとも１つの卵母細胞を任意の好適な方法で回収することができる。典型的には、これはピペット型注入器を必要とし、顕微鏡の助けを借りて回収が行われる。
【００３６】
工程（２）において、任意の適当な数の卵母細胞を培養のために回収することができる。好ましくは５〜２００個の卵母細胞、より好ましくは約１０〜７０個の卵母細胞、更により好ましくは約２５〜３０個の卵母細胞が培養のために回収される。
【００３７】
培地＋サプリメント１は、表中に記載の通りであり得る。好ましくは、サプリメント２は１５％（ｖ／ｖ）  ブタ卵胞液（ＰＦＦ）、１５ＩＵ／ｍＬのヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、および３０ＩＵ／ｍＬの妊馬血清性ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）を含有する。
【００３８】
未経産雌ブタより回収された卵母細胞には、約１ｍＭの濃度でＩＶＭ培地にｃＡＭＰ（エネルギー供給用）を添加することができる。
【００３９】
工程（２）において、少なくとも１つの卵母細胞を任意の好適な方法で培養することができる。典型的には、これは３８℃のインキュベーター、例えば二酸化炭素インキュベーター中で少なくとも１つの卵母細胞を培養することを必要とするだろう。これは、少なくとも１つの卵母細胞を少量の培地＋サプリメント１中に置き、そして蒸発を防ぐためにそれを加温したパラフィン油のようなオイルで覆うことを含み得る。
【００４０】
工程（２）において、少なくとも１つの卵母細胞を任意の適当な時間に渡り培養することができる。好ましくは、所定の時間は約２２時間であるが、所定の時間は約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０時間（または更に短くても長くてもよい）であり得る。
【００４１】
工程（２）の後、培地＋サプリメント１を除去し、それを培地＋サプリメント２で置換し、それにより２種のゴナドトロピンを除去することができる。未経産雌ブタより回収された卵母細胞には、ｃＡＭＰを１ｍＭの濃度でＩＶＭ培地に添加することができる。
【００４２】
培地＋サプリメント２は表に記載の通りであり得る。好ましくは、サプリメント２は１ｍＭ  ｃＡＭＰおよび１５％（ｖ／ｖ）ブタ卵胞液  （ＰＦＦ）を含む。
【００４３】
工程（３）において、少なくとも１つの卵母細胞を任意の好適な方法で培養することができる。典型的には、これは工程（２）について記載したような所定の時間に渡り、工程（２）について記載した通りに少なくとも１つの卵母細胞を培養することを伴うだろう。
【００４４】
工程（４）において、少なくとも１つの卵母細胞を任意の好適な方法で精液／精子により受精させ、少なくとも１つの受精卵母細胞、胚盤胞または胚を産生することができる。
【００４５】
工程（４）において、少なくとも１つの卵母細胞を任意の好適な時間に渡り精子と共にインキュベートし、少なくとも１つの受精卵母細胞、胚盤胞または胚を産生させることができる。好ましくは、所定の時間は約３．５〜４時間であるが、所定の時間は約０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５または８時間（または更に短くても長くてもよい）でありうる。
【００４６】
培地＋サプリメント３は、表に記載の通りであり得る。好ましくは、サプリメント３は２ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭカフェイン、６ｍＭ  ＣａＣｌ２、１３ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、０．１％ＢＳＡおよび５．５ｍＭグルコースを含み得る。未経産雌ブタより回収された卵母細胞には、ｃＡＭＰを１ｍＭの濃度で含めることができる。
【００４７】
当該方法は、工程（４）に受精用精液を調製する工程を含むことができる。回収された精液または回収された希釈精液をチューブ中で遠心分離（例えば１５００ｒｐｍで５分間）して上清を取り除く。得られた精子ペレットを随意リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、そして再遠心することができる。得られた精子ペレットを随意、表に記載のような培地＋サプリメント３で洗浄することができる。上清を取り除いた後、精子ペレットを培地＋サプリメント３中に再懸濁することができる。チューブをインキュベーター中に４５度の角度に３０分間入れた後、精子を使用する。精子濃度は血球計を使って測定することができる。
【００４８】
任意の適切な数の精子／精子細胞を工程（４）で使用できる。これは、卵母細胞の総数に依存する。好ましくは、約２０〜３０個の卵母細胞を受精させるのに約６０，０００個の精子を使用することができ、これは約３０００：１の比である。
【００４９】
この方法は、少なくとも１つの卵母細胞を裸出（露出）させる工程を含み、これは任意の適当な方法で実施できる。例えば、卵母細胞を少量の培地中で穏やかに繰り返しピペッティングすることにより裸出させることができる。裸出は培養工程（３）の後、例えばＩＶＦ工程（４）前の成熟培養の約４４時間後に実施することができる。
【００５０】
工程（５）において、少なくとも１つの受精卵母細胞（または産出された胚盤胞または胚）の洗浄は、任意の適当な方法で実施できる。好ましくは、少なくとも１つの受精卵母細胞を培地＋サプリメント４の中で洗浄する。培地＋サプリメント４は、表に記載の通りであり得る。好ましくは、サプリメント４は１５％（ｖ／ｖ）ブタ卵胞液（ＰＦＦ）および０．４％ＢＳＡを含む。例えば、受精卵母細胞は培地＋サプリメント４で２回洗浄することができる。
【００５１】
工程（５）において、少なくとも１つの受精卵母細胞（または胚）を任意の適当な方法で培養することができる。典型的には、これは少なくとも１個の卵母細胞を３７℃または３８．５℃のインキュベーター中で、例えば二酸化炭素インキュベーター中で培養することを伴うだろう。これは、少なくとも１つの受精卵母細胞を、表に記載のような培地＋サプリメント４中に置くことを含み得る。
【００５２】
工程（５）において、少なくとも１つの受精卵母細胞（または胚）を任意の好適な時間に渡り培養することができる。好ましくは、所定の時間は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５日間（または更により長くても短くてもよい）であり得る。好ましくは、所定の時間は約５〜９日間、より好ましくは７日間である。
【００５３】
幾つかの実施形態では、胚は、ＣＯ２インキュベーター中で、培地＋サプリメント４の中で３８．５℃で約７日間、１滴あたり約２５〜３０個の集団にて培養することができる。受精卵母細胞の卵割と胚盤胞形成は、それぞれ培養の開始後２日目および７日目に検査することができる。２、４、８個またはそれ以上の細胞に発達した胚を、更なる下流プロセシングに使用することができる。
【００５４】
卵母細胞の回収、体外成熟、精液の調製、体外受精および体外培養のための一般技術および方法論は、次の参考文献中に見つけることができ、その各々の全内容が相互参照によって本明細書中に組み込まれる(Bagg他、2006; Gil他、2008; Tanihara 他、2013; Hossain他、2007; Nagai, 1996)。 
【００５５】
本明細書中に記載の特徴のいずれも、本発明の範囲内で本明細書中に記載の他の特徴のいずれか１つまたは複数と任意の組み合わせで組み合わせることができる。
【００５６】
本明細書中の任意の従来技術への参照は、その従来技術が通常の一般知識の一部分を構成するという承認としてまたは任意の形の示唆として解釈すべきではない。
〔図面の簡単な説明１〕
【００５７】
本発明の好ましい特徴、実施形態および変形は、次の詳細な説明から明らかであり、この記載は当業者が本発明を実施するのに十分な情報を提供する。この詳細な説明は、決して前述の「発明の概要」の範囲を限定すると見なしてはならない。詳細な説明は次の図面の番号に参照される：
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図Ａ−１Ａ】図１Ａは、本発明の一実施形態に従う、本質的に単一の培地（Ｍ−１９９）を使用する単純化されたハイスループットＩＶＰシステムの略図である。
【図Ｂ−１Ｂ】（本明細書の図１Ｂ（Figure 1B）の説明文を参照。）
【図Ｂ−２Ｂ】（本明細書の図２Ｂ（Figure 2B）の説明文を参照。）
【図Ｂ−３Ｂ】（本明細書の図３Ｂ（Figure 3B）の説明文を参照。）
【図Ｂ−４Ｂ】（本明細書の図４Ｂ（Figure 4B）の説明文を参照。）
【図Ｃ−１Ｃ】（本明細書の図１Ｃ（Figure 1C）の説明文を参照。）
【図Ｃ−２Ｃ】（本明細書の図２Ｃ（Figure 2C）の説明文を参照。）
【図Ｃ−３Ｃ】（本明細書の図３Ｃ（Figure 3C）の説明文を参照。）
【図Ｃ−４Ｃ】（本明細書の図４Ｃ（Figure 4C）の説明文を参照。）
【図Ｃ−５Ｃ】（本明細書の図５Ｃ（Figure 5C）の説明文を参照。）
【図Ｃ−６Ｃ】（本明細書の図６Ｃ（Figure 6C）の説明文を参照。）
【図Ｃ−７Ｃ】（本明細書の図７Ｃ（Figure 7C）の説明文を参照。）
【図Ｃ−８Ｃ】（本明細書の図８Ｃ（Figure 8C）の説明文を参照。）
【図Ｃ−９Ｃ】（本明細書の図９Ｃ（Figure 9C）の説明文を参照。）
【００５９】
〔実施形態の詳細な説明１〕
実施例１−ブタ胚の改良生産に本質的に単一の培地を用いる単純化されたＩＶＰ法
【００６０】
本実施例は、ハイスループットＩＶＰ法における使用に適した着床前の体外ブタ胚発生の単純化方法を記載する。
【００６１】
材料と方法
【００６２】
全ての化学薬品は、他に指摘しない限り、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社より購入した。全ての体外培養物は、各培養ウェル中で４００μＬのミネラルオイルの層で表面を覆った。本実施例で使用する基本培地は、Ｍ−１９９であった。１９５０年代、Ｍｏｒｇａｎは、初めて動物製品および／または組織抽出物を使用しない細胞培養用の既知組成の栄養源を提唱した。この培地を使用する利点は、それが卵子および胚の発生を支持するその成分の適用範囲が多岐に渡る点である。
【００６３】
卵母細胞回収と体外成熟
【００６４】
近隣の食肉処理場（Ｈｉｇｈｃｈｅｓｔｅｒ  Ｍｅａｔｓ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ，  オーストラリア国グレニーグル）より、解体した思春期前の未経産雌ブタおよび雌ブタから卵巣を回収し、そして０．９％ＮａＣｌ溶液中で３０〜３８℃にて研究所に輸送した。直径２〜８ｍｍの卵胞から卵丘・卵母細胞複合体（ＣＯＣ）を吸引し、３８℃にて数分間静置して沈降させた。均一の卵細胞質を有しかつ密集した細胞塊の少なくとも２層を有するＣＯＣを、体外成熟（ＩＶＭ）培地（Ｍ−１９９）中で２回洗浄し、次に１５％（ｖ／ｖ）ブタ卵胞液（ＰＦＦ）、１ｍＭ  ｃＡＭＰ、１５ＩＵ／ｍＬのヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ，  オランダ）および３０ＩＵ／ｍＬの妊馬血清性ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ，  オランダ）が補足されたＭ−１９９培地中で１回洗浄した。直径３〜６ｍｍの表在性ブタ卵胞からＰＦＦを回収した。その後、０．２０μｍシリンジフィルターを使ってＰＦＦをろ過し、そして使用まで−２０℃で保存した。約２５〜３０個の卵母細胞を、ペトリ皿中に４００μＬのＩＶＭ培地の各液滴として入れ、加温したパラフィン油で表面を覆い、ＣＯ２インキュベーター中で３８℃にて２２時間培養した。２２時間培養後、培地を除去し、２種類のゴナドトロピンを含む新鮮なＩＶＭ培地で置換し、次いで更に２２時間培養した。未経産雌ブタより回収した卵母細胞については、ｃＡＭＰを１ｍＭの濃度でＩＶＭ培地に添加した。
【００６５】
精液の調製および体外受精
【００６６】
近隣のＡＩ会社（Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  オーストラリア国ワコール）より希釈精液を収得し、断熱箱の中に入れ約３８℃にて即座に研究室に輸送した。精液を２ｍＬの遠心管の最上部のすぐ下の高さまで注入した後、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を除去した。次いで精子を２ｍＬのＩＶＦ培地（２ｍＭカフェイン、２ｍＭ  ピルビン酸Ｎａ、５０５ｍＭグルコース、０．１％  ＢＳＡ、６ｍＭ  ＣａＣｌ２および２６ｍＭ  ＮａＨＣＯ３が補足されたＭ−１９９培地）中に再懸濁し、そして上記と同様に遠心分離により洗浄した。上清を除去した後、精子ペレットをＩＶＭ培地中に再懸濁した。次いでその試験管を、精子を使用する前に３０分間、インキュベーター中に４５°の角度を付けて静置した。Ｎｅｕｂａｕｅｒ血球計を使って精子の濃度を測定した。合計６０，０００個の精子を用いて１滴中の卵母細胞２０〜３０個を受精させ、そして４〜６時間同時インキュベートして受精を完成させた。
【００６７】
体外培養
【００６８】
ＩＶＦの完了後、受精卵母細胞を体外培養（ＩＶＣ）培地（１５％ブタ卵胞液が補足されたＭ−１９９培地）で２回洗浄した。胚を１滴あたり２５〜３０個の群として、ペトリ皿中で４００μＬの培地中３８．５℃のＣＯ２インキュベーター中で７日間培養した。卵母細胞の卵割と胚盤胞形成をそれぞれ培養の開始後２日目と７日目に調査した。２、４、８またはそれ以上の細胞に発達した胚を、更なる処理のために２μＬの容量で直接２００μＬのＰＣＲチューブに移した。
【００６９】
結果
【００７０】
着床前胚発生に対する単純化された培地（単一の基本ＩＶＭ培地、Ｍ−１９９）の影響を表４Ａ中に示す。
【００７１】
表４Ａ．サプリメントと共に単純化ＩＶＰ法を使った体外雌ブタおよび未経産雌ブタの段階的（ｓｔｅｐ  ｂｙ  ｓｔｅｐ）平均発達。
【表４】
2021505191.tif 000009
【００７２】
雌ブタと未経産雌ブタの両方において有意なレベルの胚発生が観察され、平均卵割率は６５％であった。ＩＶＦ培地中のＮａＨＣＯ３、ＣａＣｌ２およびＢＳＡレベルの調整により、胚生産が変化した。卵割率は平均６２％から６７％に変化した。卵割率は雌ブタに比較して未経産雌ブタの方が低く、結果として胚盤胞発達の速度は未経産雌ブタの方がずっと低かった。しかし、大部分の場合、胚は胚盤胞期までは評価されなかった。相当数の胚、平均で〜３８％が、全ての実験において８細胞期を超えることが観察された。平均胚盤胞発生は〜４１％であり、これは分割した胚の数と一致し、８細胞期を通過していた。
【００７３】
ＩＶＦ培地へのＣａＣｌ２、ＮａＨＣＯ３およびＢＳＡの添加は、高い卵割率をもたらし、かつ全体的な胚生産をより安定なものにするその後の発達を誘導した。
【００７４】
体外成熟（ＩＶＭ）培地に一般的に用いられる化学組成を表５Ａに与える。
【００７５】
表５Ａ．ブタの様々な体外成熟培地の化学組成の比較。
【表５−１】
2021505191.tif 000010
【表５−２】
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【表５−３】
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【００７６】
考察
【００７７】
本実施例の主な所見は表４Ａに与えられ、得られた胚盤胞率が〜４１％であり、変動性がかなり低かった。卵母細胞の起源に関係なく、胚の卵割率は他の研究所の平均（〜５０％）よりも相当高かった（〜６５％）。この結果は、主な効果として各培養工程に単一の基本的な共通培地を使用することによる、本手順の段階的調整のためであると考えられる。本研究は、使用するＩＶＭ培地（異なるサプリメントを含むＭ−１９９）および本研究で従う手順が、雌ブタ胚並びに未経産雌ブタのＩＶＰに理想的に適することも立証した。しかしながら、未経産雌ブタの場合には更に細かい微調整が必要かもしれない。未経産雌ブタの１つの可能なオプションは、卵母細胞ＩＶＭ培地にｃＡＭＰを補足することである。成体雌ブタから得た卵母細胞は、未経産雌ブタから得たものよりも高いｃＡＭＰ含量を有する（Ｂａｇｇ他、２００６）ので、ｃＡＭＰ処置は、それらのｃＡＭＰ含量を一時的に上昇させることにより未経産雌ブタの卵母細胞の発達能力を増強させる。卵母細胞の処置時間の間、精子と卵母細胞の両方がＰＯＳを生産するが、重炭酸塩の添加はそれを相殺することができる。ＩＶＦ培地に更に重炭酸塩、カルシウムおよびＢＳＡを補足した場合、卵割率とその後の胚生産がかなり増加した。
【００７８】
多数の様々な特殊培地（ＴＣＭ−１９９、ＮＣＳＵ−２３、ＰＺＭ−３、ＳＯＦ）がブタ胚の操作に利用可能であるが、それらのほとんどは一貫した結果をもたらさず、よって再現性がない。ブタ胚は通常、大部分の研究所では４ないし５種類の培地中で処理されているので、本発明者らはこれが卵母細胞／胚にストレスを引き起こし（変化する化学的環境に対して調整する際に）、一貫性のない貧弱な収率を生じると仮定した。他方で、Ｍ−１９９培地は広範に利用されている細胞培養培地であるが、今日では哺乳動物の胚培養、特にブタにおいて限定された用途を有する。
【００７９】
結論として、本研究に用いるブタＩＶＰ法は、商業生産および将来のブタ胚研究において重要な役割を果たし得る。提唱される本法の簡易性は、ハイスループットＩＶＦ法におけるそれの適用およびＩＶＰ研究の標準としての適用を促進することができる。
【００８０】
参考文献１
【００８１】
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【００８２】
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【００８３】
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Hossain, M.S., Tareq, K.M.A., Hamano, K. & Tsujii, H. (2007): "The effect of the fatty acids on boar sperm motility, viability and acrosome reaction." Reproductive Medicine and Biology 6, 235-239.
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Vajta, G., Callesen, H., 2012. "Establishment of an efficient somatic cell nuclear transfer system for production of transgenic pigs." Theriogenology 77:1263-1274.
標題２
溶解方法
〔技術分野２〕
【００９４】
本発明は一般に、精子の存在下で卵母細胞、未分化胚芽／胚盤胞、卵子、胚細胞または胚を選択的に溶解させることに関する。好ましい実施形態では、本発明は、遺伝物質および他の細胞成分が、精子を無傷に維持しながら、溶解された卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚からのみ放出されるように、精子の存在下で卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚を選択的に溶解させることに関する。
背景技術２
【００９５】
卵母細胞または胚の遺伝子構造に生じる変化は、様々な源に起因し、それらの変化を同定し特徴づけることができることが望ましい。例えば、遺伝子編集などの技術（Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) および Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALEN)) を用いて卵母細胞／胚のゲノムを意図的に改変するために使用することができ、意図した遺伝子編集だけが達成されたことを確証できることが望ましい。精液処置を用いて胚に対する化学薬品の変異誘発効果を調べることができ、ゲノムに起こったあらゆる変化を同定できることが望ましい。精液の雌雄選択処置（フローサイトメトリー、マイクロ流体装置、抗体処置など）並びに受精卵母細胞／胚の雌雄選択処置は、潜在的に受精卵母細胞／胚の遺伝子組換えを引き起こし得るので、ゲノムに生じたあらゆる変化を同定できることが望ましい。
【００９６】
ポリメラーゼ酵素、より特定的にはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術は、胚の遺伝子組換えを同定し特徴づけるために利用されている。しかしながら、この技術はその目的で使用する時には問題点がある。例えば、該技術が高感度であるために、非胚由来ＤＮＡ汚染物（例えば精子由来または上皮細胞由来）の存在が誤った結果を容易に引き起こしうる。例えば、卵母細胞／胚のための洗浄溶液、溶解溶液および懸濁溶媒は、ＰＣＲ技術の性能を悪化させたり、完全な阻害を引き起こすことがあり、または汚染遺伝物質の混入を引き起こすことがある。例えば、卵母細胞／胚の過剰操作／多工程操作は、最適以下の（suboptimal）ＰＣＲ増幅用遺伝物質をもたらしうる。
【００９７】
上述した通り、胚のゲノムに対する潜在的変化を同定し特徴づける時、誤った結果（偽陰性／偽陽性）の確率を注意深く除外する必要がある。例えば、誤った結果は、混入したＤＮＡ、卵子の受精後に持ち越し（キャリー・オーバー）得る、低レベルの精子ＤＮＡまたは雄体細胞ＤＮＡに起因しうる。
【００９８】
DNAの汚染／持ち越し（キャリーオーバー）を減少させる従来技術は、卵母細胞を６ないし７回まで洗浄することにより透明体（Zona Pellucida；ZP）を除去することを伴う (Pomp, 1995)。初回の洗浄はＣａ２＋およびＭｇ２＋不含有のダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）中で行われる。卵母細胞をタイロード液（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．２ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１２ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、５．５ｍＭ  Ｄ−グルコース）に移し、続いてＣａ２＋およびＭｇ２＋不含有のＤＰＢＳ中で４回以上洗浄する。次いで卵母細胞をこの工程で保存する。ＰＣＲ技術での使用前に、卵母細胞をプロテイナーゼＫで一晩消化し、次いでプロテイナーゼＫを９８℃で１０分間失活させる（Tor 2013）。
【００９９】
この多工程従来技術の欠点は、卵母細胞を実体顕微鏡下で細いピペットを使って繰り返しピペッティングし、続いて適当な洗浄溶液中に入れなければならない等々という点で該技術が面倒であることである。この従来技術は、それ自体がハイスループットアッセイの開発に役立つものではない。（好適なハイスループットアッセイは、できるかぎり少ない工程を必要とし、その上同時にロバスト（頑健）でかつ一貫性のある結果をもたらすものである。）
【０１００】
選択的溶解は、混入したＤＮＡがＰＣＲ増幅されないようにするための別の選択肢である。選択的溶解法は、新しいものではないが、犠牲者（上皮細胞）と精子（加害者の細胞）とを鑑別する必要がある、性的暴行サンプルで主に利用されている（Ｎｏｒｒｉｓ，  ２００７）。現在利用されている好ましい方法は、Ｇｉｌｌ（１９８５）およびＹｏｓｈｉｄａ（１９９５）により開発された手法の変形である。サンプルをまず溶解溶液  （ＴＮＥ緩衝液：  １０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および１００ｐｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫを含む）中で７０℃にて１〜３時間処理して上皮細胞を溶解させる。これを数回繰り返し、例えば綿棒のような基材から上皮を遊離させる。次の工程は、０．０４％ジチオトレイトール（ＤＴＴ）が添加された同溶解溶液を使用して、振盪湯浴中５６℃にて８時間超に渡り精子を溶解させることである。
【０１０１】
この方法をハイスループット体外受精（ＨＴ  ＩＶＦ）システムで使用することの問題点は、卵母細胞を選択的に溶解できる一方で、上皮細胞用のＴＮＥ溶解緩衝液はＰＣＲ阻害剤を含有することである（Ｒｏｓｓｅｎ他、１９９２）。それらの阻害剤は、フェノール抽出と、３  Ｍ酢酸ナトリウムと氷冷無水エタノールを使ったＤＮＡ沈澱によって後で除去する必要がある。更に、この溶解方法は１〜４時間かかることがある。
【０１０２】
Ｑｉａｇｅｎ社からのＳｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ＲＥＰＬＩｇ（登録商標）キットがＰＣＲによる予備増幅に使用されている。その溶解緩衝液はキットに含まれているが、それはＤＴＴとＫＯＨ（両成分ともＰＣＲ阻害性でない）を含み、随伴する精子の望ましくない溶解を引き起こす。Ｑｉａｇｅｎプロトコルは６５℃で１０分間のインキュベーション後に停止溶液の添加を必要とする。この工程は、停止溶液を導入するために試験管を開封するという追加の処理を必要とするので、汚染（コンタミネーション）する危険性がある。
【０１０３】
遺伝的局面とは別に、何故精子または体細胞の存在下で卵母細胞を選択的に溶解させることが望ましいかに関して別の理由がある。その理由は、卵母細胞が目的の別の細胞性物質を含有するからである〔例えば下流用途、特に “オミクス（Omics）”: ゲノミクス、トランスクリプトミクス、エピゲノミクスおよびプロテオミクスの総称のための物質［Wang & Bodovitz, Trends Biotechnol. 2010 June; 28 (6): 281-290を参照されたい］〕。上皮細胞は精子または卵母細胞と比較して非常にもろい。体細胞と上皮細胞の溶解に用いられる比較的穏和な条件は、卵母細胞を溶解させるには適さない。
〔発明の概要２〕
【０１０４】
本発明の一態様では、本発明者らは、精子の存在下で卵母細胞、未分化胚芽／胚盤胞、卵子、胚細胞または胚を選択的に溶解させるためおよび溶解した卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚からのみ細胞性物質を選択的に遊離させるための溶解溶液を開発した。
【０１０５】
本発明の別の態様では、本発明者らは、精子の存在下で卵母細胞、未分化胚芽／胚盤胞、卵子、胚細胞または胚を選択的に溶解させるためおよび溶解した卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚のみから細胞性物質を選択的に放出させるための溶解溶液であって、溶解溶液内部の放出された細胞性物質が下流用途に適合するものである、溶解溶液を開発した。
【０１０６】
本発明の更に別の観点では、本発明者らは、精子の存在下で卵母細胞、未分化胚芽／胚盤胞、卵子、胚細胞または胚を選択的に溶解させる方法であって、溶解した卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚からの細胞性物質と溶解溶液とが下流用途に適合するものである方法を開発した。
【０１０７】
本発明の第１態様によれば、精子の存在下で卵母細胞、未分化胚芽／胚盤胞、卵子、胚細胞または胚を選択的に溶解させる方法であって、次の工程：
【０１０８】
卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚が溶解されそしてその卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚から細胞性物質が放出されるが、精子は溶解されないように、卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚を溶解溶液に供する工程
を含む方法が提供される。
【０１０９】
本発明の第２態様によれば、第１態様の方法によって生産させた時の放出された細胞性物質が提供される。
【０１１０】
本発明の第３態様によれば、精子の存在下で卵母細胞、未分化胚芽／胚盤胞、卵子、胚細胞または胚を選択的に溶解させるため、かつ溶解された卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚から細胞性物質を選択的に溶解させるための溶解溶液であって、精子は該溶解溶液によって溶解されず、前記細胞性物質および溶解溶液が下流用途に適合するような溶解溶液が提供される。
【０１１１】
好ましくは、「細胞性物質」は、溶解しなければ他の方法では放出されないであろう実質的に細胞内にある物質である。「細胞性物質」という用語は、他の方法では膜に結合した形で保持されるだろう物質も包含する。
【０１１２】
「細胞性物質」は、その範囲内に遺伝物質（核酸、ポリヌクレオチドおよびより具体的にはゲノム、遺伝子、遺伝子転写物、遺伝子産物およびＲＮＡをはじめとする、それのあらゆる形態）、タンパク様物質（ポリペプチド、タンパク質、ペプチドおよびアミノ酸をはじめとするそれのあらゆる形態）、脂質物質（脂肪および脂質をはじめとするそれのあらゆる形態）および炭水化物（それのあらゆる形態）を包含する。
【０１１３】
「細胞性物質」は、その範囲内に、細胞系の中の構成成分または構造体の全てを包含する。
【０１１４】
下流用途は、あらゆる分子ベースの方法と手順を包含する。そのような方法と手順は定量的、定性的、選択的特徴付け、修飾、単離または増幅などのためであり得る。下流用途は、卵母細胞、未分化胚芽／胚盤胞、卵子、胚細胞、胚または精子の細胞性物質に対する任意の変化を同定または確証するための、スクリーニング試験または診断試験であり得る。
【０１１５】
下流用途は、細胞性物質を、少なくとも１つの外来的に添加された酵素、例えばタンパク質ベースの酵素またはＲＮＡベースの酵素の作用に供することを含み得る。
【０１１６】
下流用途は、例えば、遺伝子（ゲノミクスおよびエピゲノミクス）、転写産物（トランスクリプトミクス）、タンパク質（プロテオミクス）、代謝産物（メタボロミクス）、脂質（リピドミクス）または相互作用（インタラクトミクス）の研究のためであり得る。
【０１１７】
細胞性物質の可能な下流用途は、Wang & Bodovitz, Trends Biotechnol. 2010 June; 28 (6): 281-290中に記載されており、その全内容が相互参照により本明細書中に組み込まれる。別の可能な下流用途は、本明細書中の他の箇所に記載される。
【０１１８】
「下流用途に適合する」という用語は、好ましくは、下流用途が当該溶解溶液それ自体の中で実施されうること、または当該溶解溶液の最小の改変を伴って実施されうることを意味する。この用語は、好ましくは、当該溶解溶液が、下流用途に使用される１以上の酵素の機能に対して阻害性でないことを意味する。
【０１１９】
本発明の別の態様では、本発明者らは、精子の存在下で卵母細胞、未分化胚芽／胚盤胞、卵子、胚細胞または胚を選択的に溶解させるため、および溶解した卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚から遺伝物質を選択的に放出させるための溶解溶液であって、該溶解溶液内に放出された遺伝物質をポリメラーゼ酵素を使って選択的に複製させることができる溶解溶液を開発した。
【０１２０】
本発明の更に別の態様では、本発明者らは、精子の存在下で卵母細胞、未分化胚芽／胚盤胞、卵子、胚細胞または胚を選択的に溶解させる方法であって、溶解した卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚からの遺伝物質を溶解溶液中でポリメラーゼ酵素を使って選択的に複製させることができる方法を開発した。
【０１２１】
本発明の別の態様では、本発明者らは、卵母細胞、未分化胚芽／胚盤胞、卵子、胚細胞または胚の操作と洗浄をほとんど必要とせず、かつポリメラーゼ酵素による複製を施すことができる方法を開発した。これは、精子を無傷のまま維持しながら、精子の存在下で卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚を差次的に溶解させることにより達成される。単一の溶解した卵母細胞、胚盤胞、胚細胞または胚からのＤＮＡは、次いで例えば下流用途において複製させることができ、多種多様な下流用途のための十分な量の全ゲノムＤＮＡを生成させることができる。幾つかの実施形態では、当該方法は、ロバストで、一貫性があり、高感度であり、全ゲノム増幅、ｑＰＣＲ、マイクロアレイまたはシークエンシングなどの下流用途に対して非阻害性である。
【０１２２】
本発明の第４態様によれば、精子の存在下で卵母細胞、未分化胚芽／胚盤胞、卵子、胚細胞または胚を選択的に溶解する方法であって、溶解した卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚からの遺伝物質がポリメラーゼ酵素を使って選択的に複製可能であり、前記方法が
【０１２３】
（１）  前記卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚が溶解されそして前記卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚から遺伝物質が放出されるが、精子は溶解されないような溶解溶液に供する工程；および
【０１２４】
（２）  前記溶解緩衝液中の放出された遺伝物質を、ポリメラーゼ酵素を使って選択的に複製する工程
を含む方法が提供される。
【０１２５】
本発明の第５態様によれば、第１態様の方法により生産された、放出された遺伝物質が提供される。
【０１２６】
本発明の第６態様によれば、精子の存在下で卵母細胞、未分化胚芽／胚盤胞、卵子、胚細胞または胚を選択的に溶解させるためのおよび溶解した卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚から遺伝物質を選択的に放出させるための溶解溶液であり、精子は該溶解溶液により溶解されず、前記溶解緩衝液内に放出された遺伝物質をポリメラーゼ酵素を使って選択的に複製することが可能である、溶解溶液が提供される。
【０１２７】
卵母細胞、未分化胚芽／胚盤胞、卵子、胚細胞、胚または精子は、以前に（故意にまたは知らないうちに）遺伝子操作または突然変異を生じさせていてもいなくてもよい。
【０１２８】
当該方法は、卵母細胞、未分化胚芽／胚盤胞、卵子、胚細胞、胚または精子の遺伝物質に対する任意の変化を同定または確認するために、下流用途のスクリーニング試験または診断試験として利用することができる。
【０１２９】
可能な用途としては、体外受精からまたは胚の雌雄鑑別から得られるトランスジェニック動物または受精卵の遺伝子型を変更する、試験レジメンまたは処置法の能力を決定することが挙げられる。検出することが可能な遺伝子としては、ＳＲＹ、染色体Ｉ、１２Ｓ、ＧＡＰＤＨ、ＡＣＴＢ、染色体Ｙ、または治療薬を高価な動物試験へと進める前の任意の所望の遺伝子産物が挙げられる。全ゲノム解析（例えばマイクロアレイ）および集団調査などの下流用途を本方法を使って実施することができる。
【０１３０】
遺伝子産物の変化または欠損は、CRISPR (Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats遺伝子編集技術); SMGT (Sperm-Mediated Gene Transfer) (Rodriques 2013); TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nucleases); 精子上のドッキング部位をブロックする抗体；卵母細胞上のドッキング部位をブロックする抗体；日焼け止め、洗剤、タルク等の任意の化学薬品；および変異誘発効果を有しうる化学薬品で処理することによって引き起こすことができる。
【０１３１】
下流用途に関しては、任意の適当な種類のポリメラーゼ酵素を使用することができる。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼ酵素が用いられるが、ＲＮＡポリメラーゼ酵素も場合により使用可能である。適当なＤＮＡポリメラーゼ酵素の例としては、以下が挙げられる：φ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、耐熱性Ｔａｑポリメラーゼ  （テルミス・アクアティクスＴｈｅｒｍｉｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来）（生来または組換え型）、高忠実度のＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（ピロコッカス・フリオサスＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来）、２組以上のプライマーを用いる場合に非特異的な生成物増幅を抑制するためのホットスタートＤＮＡポリメラーゼ、プルーフリーディング活性を有する高忠実度ポリメラーゼ（Ｈｉ−Ｆｉ）。プライマーは、ポリＴ（真核ＲＮＡを標的とする場合）、ランダムヘキサマー、ランダムペンタマーまたはランダムオキサマーを含み得る。プライマーは、エキソヌクレアーゼ耐性またはエンドヌクレアーゼ耐性といった特異的な特性を有するように選択することもできる。
【０１３２】
使用する実際のポリメラーゼ酵素は、遺伝物質を複製すべきである理由、すなわち後続の下流用途に依存するだろう。更に、後続の下流用途は、次世代シークエンシング、マイクロアレイ、一重鎖、二重鎖もしくは多重鎖ＰＣＲ、またはリアルタイム一重鎖、二重鎖もしくは多重鎖ＰＣＲでありうる。多種多様な後続の下流用途のために、遺伝物質を予備増幅させて多量の完全ゲノムＤＮＡを産生することができる。
【０１３３】
当該方法を用いて、ＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）用にＤＮＡを溶解させ増幅させ、単一の未受精または受精卵子から２、４、８、１６細胞またはそれ以上の細胞期に発達した胚へと増幅させることができる。好ましくは、該方法はロバストであり、一貫性があり、高感度であり、多重置換増幅（ＭＤＡ）、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）、ｑＰＣＲ、マイクロアレイ、またはシークエンシングのような下流用途に対して阻害性でない。
【０１３４】
溶解した卵母細胞、未分化胚芽／胚盤胞、卵子、胚細胞または胚から遊離される遺伝子物質は、好ましくはゲノムのデオキシ核酸（ＤＮＡ）であるが、他の型のポリヌクレオチド／核酸、例えばリボ核酸（ＲＮＡ）も同様に遊離させることができる。
【０１３５】
当該方法は、卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞、胚または精子を、溶解溶液に適用する前にそれを遺伝子組み換えする工程を含み得る。この方法は、受精前に精子／精液を突然変異原のような化学薬品に暴露する工程を含むことができる。当該方法は、卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞、胚または精子をIVF技術に供する工程を含み、潜在的に遺伝物質の改変を引き起こすことができる。
【０１３６】
卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞、胚または精子は、例えば、遺伝子編集技術であるクリスパー技術（CRISPER；Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats）およびタレン技術（TALEN；Transcription Activator-Like Effector Nucleases）を使って遺伝子操作することができる。例えば、精子／精液は、既知のまたは疑いのある突然変異原などの化学薬品に暴露することができる。精子の雌雄選択処置並びに胚の雌雄選択処置は、潜在的に受精卵母細胞、胚盤胞、卵子または胚の遺伝子組換えをもたらし得る。
【０１３７】
幾つかの実施形態では、当該方法は下記に要約される通り、ハイスループット体外受精（ＨＴ−ＩＶＦ）に用いることができる：
・ブタ（または他の）卵巣からの卵母細胞を新たに開発した培地（ＩＶＰを処置するための培地は本明細書の第一セクションに記載）で処置する。
・新鮮な放出されたブタ（または他の）精液で受精させる。
・８〜１６細胞成熟期に発達させる―新しい方法では卵母細胞の＞６５％が成熟し成長する（工業標準は約４０％）。
・新規溶解溶液を用いて卵母細胞と残りの精液を差次的に溶解させ、卵母細胞ＤＮＡを抽出させて精子を無傷なまま維持するようにする。
・ＲＥＰＬＩ  ｇ  キットのＳＣポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ製）によりｑＰＣＲを使って卵母細胞ＤＮＡを増幅させる。
・ＤＮＡを希釈し、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）による一定範囲の遺伝子型形質を検出する。
・下記による精子および／または卵母細胞の処置により、遺伝子産物の変化または欠損を引き起こすことができる：
ＣＲＩＳＰＲ（Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats gene editing）
ＳＭＧＴ（Sperm-Mediated Gene Transfer) (Rodriques 2013)
ＴＡＬＥＮ（Transcription Activator-Like Effector Nucleases）
精子上のドッキング部位をブロックする抗体
卵母細胞上のドッキング部位をブロックする抗体
日焼け止め、洗剤、タルク等の任意の化学薬品
変異原性効果を有しうる化学薬品
・用途：
遺伝子型を変更させる試験計画または処置の能力を決定する
トランスジェニック動物
体外受精
胚の雌雄鑑別。
【０１３８】
処置方法を高価な動物実験に進める前に、検出される遺伝子または遺伝子領域：ＳＲＹ、染色体Ｉ、１２Ｓ、ＧＡＰＤＨ、ＡＣＴＢ、染色体Ｙ、任意の所望の遺伝子産物。この方法を用いて、全ゲノム解析（例えばマイクロアレイ）および集団調査を実施することができる。
【０１３９】
卵母細胞、未分化胚芽／胚盤胞、卵子、胚細胞または胚は、ヒトまたは任意の適当な動物種に由来することができる。動物はブタ、ウシ、ウマ、ヒツジまたはヤギなどの家禽であり得る。動物はイヌまたはネコのようなコンパニオンアニマル（ペット動物）であり得る。動物はウサギ、マウスまたはラットなどの実験動物であり得る。
【０１４０】
任意の適当な種類の溶解溶液を使用できる。適当な溶解溶液は下記成分の種類の１以上を含むことができる：塩；溶解酵素；不安定化剤；金属キレート剤；還元剤；界面活性剤；緩衝液；およびｐＨ調整剤。適当な溶解溶液の一般的性質を下記の表１Ｂに示す。
【０１４１】
表１Ｂ．適当な溶解溶液の性質。
【表６】
2021505191.tif 000013
【０１４２】
典型的には、溶解溶液は下の表２Ｂに示される性質を有するだろう。
【０１４３】
表２Ｂ．好ましい溶解溶液の性質。
【表７】
2021505191.tif 000014
【０１４４】
一般的な参考文献：ALCARAZ, C., DE DIEGO, M., PASTOR, M. J. & ESCRIBANO, J. M. 1990. "Comparison of a radioimmunoprecipitation assay to immunoblotting and ELISA for detection of antibody to African swine fever virus." J Vet Diagn Invest, 2, 191-6を参照のこと。
【０１４５】
卵母細胞、未分化胚芽／胚盤胞、卵子、胚細胞または胚は、溶解溶液の前に任意の適当な種類の溶液中に懸濁させることができる。幾つかの実施形態では、卵母細胞、未分化胚芽／胚盤胞、卵子、胚細胞または胚は、Ｍ−１９９、水、ＰＢＳのような培地または本明細書中の「生殖方法」という表題のセクション１において別に記載されるような培地中に懸濁させることができる。それは任意の適当な容量で懸濁させることができるが、その容量は典型的にはマイクロリットル範囲であるだろう。
【０１４６】
工程（１）または本明細書に記載の他の同様な方法工程において、溶解は任意の適当な時間に渡りおよび任意の適当な温度にて行われ得る。例えば、適当な時間は５秒から５時間までの間のいずれかであり得る。例えば、適当な温度は１４℃と１００℃の間のいずれかであり得るが、好ましくは約３８℃で１０分間、５５℃で１０分間、および９５℃で５分間であり得る。
【０１４７】
該方法は、工程（１）または本明細書中に記載の他の同様な方法工程の混合物を、該混合物中に存在する酵素を選択的に活性化および不活性化するような高温に加熱することを含み得る。適当な温度は１４℃と１００℃の間のいずれかであり得る。好ましくは温度は約８５℃である。好ましくは工程（１）または本明細書中に記載の他の同様な方法工程の混合物は、約３８℃で１０分間、５５℃で１０分間および９５℃で５分間加熱される。
【０１４８】
工程(1)または本明細書中に記載の他の同様な方法工程では、溶解および不活性化後、工程(2)または本明細書中に記載の他の同様な方法工程が行われるまで、混合物を氷上で冷却することができる。
【０１４９】
工程（２）または本明細書中に記載の他の同様な方法工程では、条件は目的の１または複数のポリメラーゼ技術−すなわち後続の１または複数の下流用途に依存するだろう。例えば、下流用途は次世代シークエンシング、マイクロアレイ、一重鎖、二重鎖もしくは多重鎖ＰＣＲ、またはリアルタイム一重鎖、二重鎖もしくは多重鎖ＰＣＲでありうる。遺伝物質は予備増幅させて多様な下流用途のために大量の全ゲノムＤＮＡを産生することができる。
【０１５０】
工程（２）または本明細書中に記載の他の同様な方法工程は、単一の未受精または受精卵子から２、４、８、１６またはそれ以上の細胞期へと発達した胚まで、ＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）用にＤＮＡを溶解させそして増幅させるために用いることができる。
【０１５１】
卵母細胞の取り扱い、精子の取り扱い、体外受精、胚の取り扱いのための一般技術および方法論は、次の参考文献中に見つけることができ、その全内容が相互参照として本明細書中に組み込まれる：Flechon他、2003；Bahnak他、1988；Mao他、2013；Garcia-Vazquez他、2016、Garcia-Vazquez他、2015；Hennekens他、2013；Rodriguez-Martines、2016；Romar他、2016；Broekhuijse他、2012；Lopez Rodriguez他、2017；Briedbacka他、1995；Wieczorek他、2015。
【０１５２】
着目の適当なポリメラーゼ技術の一般的技術と方法論は、次の参考文献中に見つけることができ、その各々の全内容が相互参照により本明細書中に組み込まれる：Jiang他、2005；Chen & Kuo, 2011；Martin他、2009；Khamlor他、2014；Li他、2011；Bredbacka他、1995；Hirayama他、2004；Kirkpatrick & Monson, 1993；Pomp他、1995；およびTorner他、2013。
【０１５３】
本明細書に記載の特徴のいずれも、本発明の範囲内で本明細書中に記載の他の特徴のいずれか１つ以上との任意組み合わせにおいて組み合わせることができる。
【０１５４】
本明細書中の任意の先行技術への参照は、先行技術が一般的な技術常識の部分を形成するという承認またはいずれかの形の示唆として解釈されないし、解釈すべきでもない。
〔図面の簡単な説明２〕
【０１５５】
本発明の好ましい特徴、実施形態および変形は、本発明を実施するのに十分な情報を当業者に提供する下記の詳細な説明から理解されるだろう。この詳細な説明は先の発明の概要の範囲を限定するものと見なしてはならない。詳細な説明は次の通り幾つかの図面を参照にする。
【０１５６】
図１Ｂ。染色体Ｙの増幅プロット。閾値と染色体Ｙアンプリコンを含むウェルを示す。
【０１５７】
図２Ｂ。染色体１２Ｓの増幅プロット。閾値と染色体１２Ｓアンプリコンを有するウェルを示す。
【０１５８】
図３Ｂ。染色体１２ＳとＣｈｒ  Ｙの組み合わせた増幅プロット。閾値と染色体１２ＳおよびＣｈｒ  Ｙアンプリコンを有するウェルを示す。
〔実施形態の詳細な説明２〕
【０１５９】
実施例１−ポリメラーゼ酵素増幅のための、精子または精液の存在下での胚または卵子の差次的溶解。
【０１６０】
本実施例は、精子または精液の存在下での胚または卵子の差次的溶解のための新規溶解緩衝液／溶液の、ＰＣＲ増幅への使用を記載する。単一の溶解した胚または卵子由来のＤＮＡは、次いでＰＣＲにより予備増殖させて様々な下流用途のための大量の全ゲノムＤＮＡを生産させることができる。
【０１６１】
本例に記載するハイスループット法は、精子の存在下で卵母細胞を選択的に溶解させるのに十分なほど精巧な、２５分の迅速なワンチューブ法であり、かつ同時に、２、４、８、１６またはそれ以上の細胞期へと発達した単一の未受精卵子および胚からＤＮＡを溶解させ予備増幅させるのに十分なほど高感度である。更に、予備増幅または下流用途にとって阻害性となりうる物質は１つも導入されない。当該方法は単細胞ＲＥＰＬＩｇキット並びに更なるｑＰＣＲ用途にも適合する。
【０１６２】
材料と方法：
【０１６３】
予備増幅
【０１６４】
２μＬの容量での単一の受精胚（２細胞期以上）含有培地を、２００μＬのＰＣＲチューブに移した。表２Ｂに示される溶解溶液／緩衝液（４μＬ）は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５中の５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０μｇ／ｍＬヒアルロニダーゼ、０．０００５％トリプシン−ＥＤＴＡ、２０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ、１００ｍＭショ糖、０．１２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００からなり、その溶液を前記チューブに添加し、３８℃で１０分間、次いで５５℃で１０分間、次いで９５℃で５分間加熱し、そして氷上で冷却した。７．２５μＬのＲＥＰＬＩｇ  ｓｃ反応緩衝液と０．５μＬのＲＥＰＬＩｇ  ｓｃポリメラーゼから成るＲＥＰＬＩｇ  マスターミックス（７．７５μＬ）を、同じチューブ中の溶解細胞に直接添加した。チューブを十分に渦動攪拌し、スピンダウンしてチューブの底に全ての物質を回収し、３０℃で８時間、次いで６５℃で３分間インキュベートしてｓｃポリメラーゼを変性させた。各回の実験の対照は、未受精の卵子、鋳型なしの対照、１μＬの精液、および試薬なしの対照を含んだ。
【０１６５】
予備増殖した全ゲノムＤＮＡは、この時点で様々な用途、例えばＰＣＲ、ｑＰＣＲまたはマイクロアレイに用いることができる。
【０１６６】
溶解した卵母細胞およびゲノム物質は、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲのための鋳型として直接利用することもできる。９μＬのマスターミックス〔２×ＴａｑＭａｎ（登録商標）  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、各々０．４μＭの染色体Ｙの正方向および逆方向プライマー、０．２５μＭの染色体ＹのＦＡＭプローブ、各々０．４μＭの染色体１２Ｓまたは染色体１の正方向および逆方向プライマー、並びに０．２５μＭの染色体１または染色体１２Ｓ（Ｍａｒｔｉｎ  ２００９）ＶＩＣプローブから成る〕を、全量の溶解物に添加した。染色体１２Ｓは内部標準として使用した。アッセイは、次の条件を使って実施した：５０℃で２：００分の保持期間、続いて９５℃で１０：００分の加熱、次いで９５℃で１５秒と６０℃で６０秒の４０サイクル。予備増幅のための対照ウェル（未受精卵子、鋳型なし対照（ＮＴＣ）、１μＬの精液、および試薬なし対照）とは別に、更なるゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）およびＮＴＣを加えた。表３Ｂを参照のこと。
【０１６７】
リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
【０１６８】
予備増幅からのｓｃＤＮＡを１／１００希釈し、そして１μＬを鋳型として１０μＬのＰＣＲ反応液中で使用した。マスターミックスは２×ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）、各々０．４μＭ  の染色体Ｙ正方向および逆方向プライマー、０．２５μＭの染色体ＹのＦＡＭプローブ、各々０．４μＭの染色体１２Ｓまたは染色体１の正方向および逆方向プライマー、並びに０．２５μＭの染色体１または染色体１２Ｓ（Ｍａｒｔｉｎ  ２００９）ＶＩＣ  プローブを含んだ。染色体１２Ｓは内部標準として使用した。アッセイは次の条件を使って行った：５０℃で２：００分間に続いて９５℃で１０：００分間の維持、次いで９５℃で１５秒と６０℃で６０秒の４０サイクル。予備増幅のための対照ウェル（未受精の卵子、鋳型なしの対照（ＮＴＣ）、１μＬの精液、および試薬なしの対照）とは別に、更にゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）およびＮＴＣを加えた。表３Ｂ参照。
【０１６９】
表３Ｂ．ＰＣＲプライマー／プローブ
【表８】
2021505191.tif 000015
【０１７０】
結果：
【０１７１】
正しい結果として受け入れることのできるアッセイ結果では、未受精の卵子が、Ｃｈｒ  １または１２Ｓに関して陽性シグナルを有し、Ｃｈｒ  Ｙシグナルを欠いているはずである。精液対照、鋳型なし対照および試薬なし対照については、陰性反応（Ｃｈｒ  １、１２ＳまたはＣｈｒ  Ｙシグナルなし）が予想される。ゲノムＤＮＡは、Ｃｈｒ  Ｙ  とＣｈｒ  １または１２Ｓとの両者に関して陽性であるだろう。３５．５未満のＣｔ値（＜３５．５）は、陽性と見なされ、そしてＣｔ値が３５．５より大きい場合は（＞３５．５）結果は陰性として棄却された。チューブ中にアンプリコンがない場合、または１２Ｓが非存在でＣｈｒ  Ｙが存在する場合は、複製が不成功であることを示した。
【０１７２】
図１Ｂは染色体Ｙの増幅プロットを示し、閾値と染色体Ｙアンプリコンを有するウェルを示す。図２Ｂは、１２Ｓの増幅プロットを示し、閾値と染色体１２Ｓが陽性であるウェルを示す。図３Ｂは、染色体１２Ｓと染色体Ｙを組み合わせた増幅プロットを示し、閾値および染色体１２ＳとＣｈｒ  Ｙアンプリコンを有するウェルを示す。
【０１７３】
処置済の精液で受精させた卵母細胞からのデータを、表４Ｂに与える。標的遺伝子は、受精卵母細胞を効率的に雌雄鑑別する１２ＳとＣｈｒ  Ｙであった。対照（ｎ＝８）は５８％雌および４２％雌であり；チューブの上層からの精液で受精させた卵母細胞（ｎ＝１６）は８４％雌および１６％雄であった。チューブの下層からの精液で受精させた卵母細胞（ｎ＝８）は、７５％雌および２５％雄であった。
【０１７４】
表４Ｂ．処置済みの精液で受精させた卵母細胞からのデータ例。
２つの遺伝子、１２Ｓ（内部標準）およびＣｈｒ  Ｙが検出された。２つの結果の組み合わせを用いて胚の性別を決定した。
【表９−１】
2021505191.tif 000016
【表９−２】
2021505191.tif 000017
【表９−３】
2021505191.tif 000018
【表９−４】
2021505191.tif 000019
【０１７５】
考察
【０１７６】
Ｃｈｒ  １または１２Ｓは、未受精卵子のみからシグナルが検出された。精液に対する陰性反応（Ｃｈｒ  １、１２ＳまたはＣｈｒ  Ｙシグナル無し）は、精液サンプルから全く溶解が起こらないことを示し、従って受精卵子ウェルにおいて任意の可能性ある残留精子から全く遺伝子構成物が抽出されないことを示した。Ｃｈｒ  １と１２Ｓは内部標準（コントロール）であり、Ｃｈｒ  Ｙアンプリコンの存在下であっても、このアンプリコンの不在は、増幅の不成功として無視した。
【０１７７】
ゲノムＤＮＡは１２ＳとＣｈｒ  Ｙについて溶液であったが、一方でＮＴＣ、精液およびＲＥＰＬＩｇからのＮＴＣは、いずれのアンプリコンも不在であることによって明白であるように、全くＤＮＡが検出されなかった。未受精の卵母細胞対照（ＵＦＯ）は、ブタゲノム物質から予想される通り、１２Ｓについて陽性であるが、偶発的に溶解された精液からもたらされた可能性があるＣｈｒ  Ｙは全く検出されなかった。この結果は「雌性」として解釈された。
【０１７８】
このハイスループット体外受精（ＨＴ  ＩＶＦ）法は、様々な用途を有するだろう。図４Ｂを参照のこと。卵子は、ＳＭＧＴ (Sperm-Mediated Gene Transfer) (Rodriques 2013)、フローサイトメトリー、抗体または任意の化学薬品、例えば日焼け止め、洗剤、タルク、または既知のもしくは疑いのある突然変異原により処理された精液によって受精させることができる。受精が行われる時に導入することができる精液に対する処置の効果は、本実施例でのChr Yのような、単一遺伝子に関して試験することができる。当該方法は全ゲノム複製を用いるため、精液の処置の効果は、子孫の全ゲノムに対して決定することができる。更に、多数の卵母細胞が同時処置を受けることができるため、子孫の全集団に対する効果を調べることができる。
【０１７９】
同効果について、未処置の精液を、クリスパー（CRISPR ；Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats）（遺伝子編集）またはタレン（TALEN；Transcription Activator-Like Effector Nucleases)のような技術により遺伝子操作されている卵子に対して使用することができる。抗体または日焼け止め、洗剤、タルク、または既知のもしくは疑いのある突然変異原のような化学薬品の卵子への添加の影響を、単一の胚または胚の集団に対して試験することができる。
【０１８０】
引用文献２
【０１８１】
米国特許出願公開US 20160222375 A1 ："Method, apparatus and kit for human identification using polymer filter means for separation of sperm cells from biological samples that include other cell types."
【０１８２】
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【０１８３】
米国特許US 6,548,741 B2 ："DEVELOPMENTAL COMPETENCE FOR ASSISTED REPRODUCTION AND NUCLEAR TRANSFER IN PIGS"
【０１８４】
米国特許出願公開US 20150232917 A1 "Differential lysis with aid of Alkali and pressure"
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標題３
雌雄選別のためのモノクローナル抗体
〔発明の分野３〕
【０２１７】
本発明は、Ｙ染色体を保有する精子に特異的に結合するモノクローナル抗体、並びに性別特異的精子選択のために該抗体を使用する方法に関する。一実施形態では、本発明は、雄性精子細胞の精子表面タンパク質ＤＢＹ／ＤＥＡＤに特異的に結合するモノクローナル抗体に関する。別の実施形態では、本発明は、雌子孫を獲得する尤度（確率）を高めるために、人工受精前に精子を含有する精液を回収しそして処理する方法に関する。
〔発明の背景３〕
【０２１８】
哺乳動物の子孫の性別は、精子細胞によって決定される。Ｘ染色体を有する精子（「雌性精子細胞」）は、受精すると、雌（ＸＸ）の子孫になり、一方でＹ染色体を有する精子（「雄性精子」）は、受精すると、雄（ＸＹ）の子孫になる。
【０２１９】
受精は、雄性または雌性精子細胞が卵子に貫通することで起こる。卵子との結合は、主として精子の表面タンパク質によって媒介される。それらのタンパク質は独特で、細胞特異的であり、免疫原性であり、抗体に接近しやすい。雌性と雄性の精子細胞は、表面タンパク質のレパートリーの点で異なっている。雄性精子細胞にユニークである表面タンパク質には、ＭＥＡ  １、ＭＥＡ  ２、ＳＲＹ、ＴＳＰＹおよびＤＢＹ／ＤＥＡＤがある。例えば、国際公開ＷＯ  ２００８／０６７６５１号および米国特許出願公開ＵＳ  ２００９／０２０８９７７号明細書を参照のこと。これらは本明細書中に参考により援用される。
【０２２０】
「雌雄選択」は、雄または雌の子孫について意図的に選択する能力であり、それは長年に渡り畜産業において熱心に追求されてきた。特に、雌のブタおよびウシ子孫を選択する能力が追求されており、様々なタイプの技術が提唱されている。以前に提唱された技術の幾つかを下記で取り扱うが、それらは哺乳動物の精子（「精子細胞」）の表面上の性別特異的エピトープに対する抗体（ポリクローナル、モノクローナルまたは部分）が標的とされている。
【０２２１】
米国特許第３，６８７，８０６号明細書は、雄性または雌性のいずれかの精子細胞と反応する抗体の使用を記載しており、未反応の抗体から結合した抗体を分離する凝集工程を使用している。
【０２２２】
米国特許第４，１９１，７４９号明細書は、雄性精子細胞を選択的に結合する一方で、雌性精子細胞を未結合のまま維持する固相免疫吸着材に連結された雄特異的抗体の使用を記載している。  
【０２２３】
米国特許第５，０２１，２４４号明細書は、雄性または雌性精子細胞に富んだ集団を生産させるための特異的膜タンパク質に向けられた抗体の使用を記載している。
【０２２４】
米国特許第６，１５３，３７３号と同第６，４８９，０９２号明細書は、雄性および雌性精子の分離のための磁気粒子に結合された抗体の使用を記載している。
【０２２５】
米国特許出願公開第２０１８／０２０１６６７号明細書は、フローサイトメトリーに供する時に雄性および雌性精子細胞を分離する、ウシ精子に対する抗体を記載している。
【０２２６】
カナダ国特許出願第ＣＡ  ２６１０２９５号明細書は、雄性および雌性ウシ精子細胞を浮遊（ｓｗｉｍ−ｕｐ）およびフローサイトメトリーにより分離する、ポリクローナルウサギ抗体を記載している。
【０２２７】
しかしながら、それらの技術は各々、適切な再現性のある雌雄選択結果をもたらすことができない等といった欠点を有している。
〔発明の詳細な説明３〕
【０２２８】
本発明者らは、雄性精子細胞（精子）に選択的に結合することのできる抗体を開発した。本発明者らは、精子を処置しそして雌性精子細胞から雄性精子細胞を分離する方法を開発した。本発明者らは、その抗体で処置後、生存可能な雌性精子細胞を見出し、それを哺乳動物での人工授精に使用し、雌子孫を産出できることを見出した。よって、当該方法は、該抗体で処置した精子を使った人工授精により、所望の性別の哺乳動物子孫を産生する確率を増大させる。
【０２２９】
一般的方法は、雄ドナー（例えば実証済みの人工授精牡牛または雄ブタ）から精液を回収し、該精液（すなわち「処置済みの精液」）中のまたは該精液から、望ましくない雄性精子細胞を所有する精子の不活性化、凝集、除去または致死を可能にするような比率で、抗体を精子に添加する工程を含む。次いで哺乳動物をその処置済みの精液で人工授精させて雌性子孫を産生させることができる。
【０２３０】
本発明の第一態様によれば、哺乳動物の雄性精子（雄精子）の表面タンパク質に特異的に結合するおよび／または該表面タンパク質に対して惹起される、モノクローナル抗体またはその断片が提供される。
【０２３１】
抗体は非天然型のものである。抗体は組換え手段により作製される。抗体は任意の適当な形態、例えば単離された形、精製された形、または実質的に純粋な形であり得る。
【０２３２】
本明細書中で用いる場合の「モノクローナル抗体（単数）」及び「モノクローナル抗体（複数）」なる用語は、単一分子組成の抗体の製剤を指す。モノクローナル抗体は、単一の結合特異性を示し、かつ標的抗原の特定のエピトープに対する特異性を示す。
【０２３３】
本明細書中の「抗体」は、必要な特異性を持つ結合ドメインを有する任意の特異的結合因子を包含するものと解釈すべきである。従って、この用語は、相同抗体セグメント、誘導体およびそれのヒト化抗体、並びに抗体の機能的等価体および相同体を包含し、そして天然または合成のいずれかの抗原結合ドメインを有する任意のポリペプチドも包含する。抗体の例は、免疫グロブリンサブタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＡ）並びにそれのサブタイプおよびサブクラスであり；それは更に、抗原結合ドメイン、例えばＦａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂおよびＦｄといった抗原結合ドメインを含むセグメント；およびダイアボディであってもよい。
【０２３４】
本発明のモノクローナル抗体は、例えば、一価または一本鎖抗体、二本鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、並びに前記抗体の誘導体、機能的等価体および相同体であってよく、抗体セグメントおよび抗原結合ドメインを含む任意のポリペプチドも更に包含する。
【０２３５】
抗体は、様々な方法を通して改変することができ、そしてＤＮＡ組換え技術を利用して元の抗体の特異性を保持している別の抗体またはキメラ分子を作製することができる。この技術は、抗体の免疫グロブリン可変ドメインまたはＣＤＲをコードするＤＮＡを、異なる免疫グロブリンの定常ドメインまたは定常ドメイン＋フレームワーク領域中に導入することができる。遺伝子の突然変異または他の変更は、抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞に対して実施でき、それは産生される抗体の結合特異性を変更しても変更しなくてもよい。
【０２３６】
重鎖および軽鎖中の超可変ドメインＣＤＲｌ、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３並びにリンカー配列以外の、本発明のモノクローナル抗体の残りの部分はフレームワーク領域である。フレームワーク領域は、結合に必要とされる三次元構造に影響を与えない限りにおいて、別の配列によって置き換えることが可能である。抗体の特異性の分子基盤は、主にその超可変領域ＣＤＲｌ、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３から来るものであり、それらは抗原と結合するのに重要な位置である。好ましい結合特異性を維持するために、ＣＤＲ配列はできる限り保持されるべきである。しかしながら、結合特異性を最適化するために幾つかのアミノ酸を変更する必要があるかもしれない。当業者は、標準的技法を通してこの目的を達成することができる。
【０２３７】
標的抗体はヒト化されてもよい。一般的に言えば、ヒト化抗体は、親抗体のフレームワーク領域中にアミノ酸置換を行うことによって修飾された抗体であり、親抗体と比較すると、ヒト化抗体は免疫原性が低い。抗体は、当業界で周知の多数の技術を使ってヒト化することができる。一般的に言えば、そのようなヒト化方法は、同一の抗原を結合することができる抗体配列を比較することを通して適当な位置を同定すること、および類似アミノ酸の同一部位で、異なるアミノ酸によって前記部位上のアミノ酸を置換することを含む。これらの方法によれば、親抗体のアミノ酸配列が別の関連抗体と比較され（例えば配列アラインメント）、それによって変化に寛容な位置が同定される。親抗体の可変ドメインのアミノ酸配列は、典型的にはヒト抗体データベース中のアミノ酸配列と比較され、そして親抗体に類似したアミノ酸配列を有するヒト化抗体が選択される。親抗体の配列とヒト化抗体との配列が比較され（例えば配列アラインメント）、そして親抗体の１つ以上の変化に寛容性の位置のアミノ酸が、ヒト化抗体中の対応する位置のアミノ酸によって置換される。
【０２３８】
上記に考察した、変化に寛容な位置の置換法は、任意の既知のヒト化法と容易に組み合わせることができ、そしてＣＤＲを含むヒト化抗体の作出に容易に適用することができ、前記抗体のＣＤＲは親抗体のＣＤＲに対する忠実性を維持しながら改変される。従って、本発明は更に、親抗体の改変形由来の複数のＣＤＲを含むヒト化モノクローナル抗体を提供する。
【０２３９】
抗体は様々な方法を通して改変することができ、ＤＮＡ組換え技術を利用して、元の抗体の特異性を保持している別の抗体またはキメラ抗体を作出することができる。この技術は、抗体の免疫グロブリン可変ドメインまたはＣＤＲをコードするＤＮＡを、異なる免疫グロブリンの定常ドメインまたは定常ドメイン＋フレームワーク領域中に導入することができる。遺伝子突然変異または他の変更は、抗体を産生するハイブリドーマまたは別の細胞に実施することができるが、それが結果として産生される抗体の結合特異性を変更しても変更しなくてもよい。
【０２４０】
本発明において用いられるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法を使って調製することもできる。本発明に係るヒト化抗体をコードするＤＮＡ配列は、当業者に既知の常用手段を通して、例えば本発明に公表されたアミノ酸配列の人工合成またはＰＣＲ増幅によって得ることができ、従って、前記配列は組換えＤＮＡ法を用いておよび多数の当業界で既知の方法を用いて適当な発現キャリア中に連結させることもできる。最終的に、本発明に係る抗体の発現に適した条件下で、得られた宿主細胞を培養し形質転換させ、次いで当業者は周知の従来の分離・精製手段を使用して、本発明のモノクローナル抗体を精製することができる。
【０２４１】
モノクローナル抗体を調製する場合、免疫グロブリン分子を精製するための当業界で既知の任意方法を用いて、例えばクロマトグラフィー（例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、特にプロテインＡを通した特異抗原のためのアフィニティークロマトグラフィー、および他のカラムクロマトグラフィー）により、遠心分離、溶解度の差、またはタンパク質を精製するための他の任意の標準技術を用いて、それを精製することができる。多くの実施形態では、抗体は細胞から培地中に分泌され、培地を回収し精製することを通して抗体が得られる。
【０２４２】
用語「抗体」または「免疫グロブリン」は本明細書中で互換的に用いることができる。それらの用語は当業者に周知であり、具体的には、抗原と特異的に結合することのできる１または複数のポリペプチドから成るタンパク質を指す。抗体の１形態は、四量体である抗体の基本的構造単位を構成する。それは完全に同一の２対の抗体鎖から成り、その各対は軽鎖と重鎖を有する。抗体鎖の各対において、軽鎖と重鎖の可変ドメインが一緒に連結されて抗原との結合を担い、一方で定常ドメインは抗体のエフェクター機能を担う。
【０２４３】
現在既知の免疫グロブリンポリペプチドは、κおよびλ軽鎖、並びにα、γ（ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、δ、εおよびμ重鎖、またはそれの他の等価体を有する。免疫グロブリン「軽鎖」（約２５ｋＤａまたは約２１４アミノ酸）はその全長において、ＮＨ２末端の約１１０アミノ酸からなる可変ドメインと、ＣＯＯＨ末端のκまたはλ定常ドメインとを含む。同様に、免疫グロブリン「重鎖」（約５０ｋＤａまたは約４４６アミノ酸）はその全長において可変ドメイン（約１１６アミノ酸）および重鎖定常ドメインの１つ、例えばγ（約３３０アミノ酸）を含む。
【０２４４】
用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、任意のアイソフォーム抗体または免疫グロブリン、または抗原との特異的結合能をまだ保持している抗体セグメント、例えば限定されないが、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖおよびＦｄセグメント、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、並びに抗体の抗原結合部分を有する融合タンパク質および非抗体タンパク質を包含する。前記用語は更にＦａｂ’、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２および／または他の抗体セグメント並びに抗原と特異的に結合することができるモノクローナル抗体を包含する。
【０２４５】
抗体は、様々な形態で、例えばＦｖ、Ｆａｂおよび（Ｆａｂ’）２、並びに二価性ハイブリッド抗体（例えばLanzavecchia他, Eur. J. Immunol, 1987; 17, 105）並びに一本鎖の形態（例えばHuston他、Proc. NatL Acad. Sci. U.S.A., 1988; 85, 5879 およびBird他、Science, 1988; 242, 423, これは本明細書中に参考文献として引用される）で存在することもできる。免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の可変ドメインは、３つの超可変領域（「相補性決定領域」またはＣＤＲとも呼ばれる）から成る。それらの超可変領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）により隔てられて置かれる。ＦＲおよびＣＤＲの範囲は以前に定義されている（"Sequences of Proteins of Immunological Interest," E. Kabat他、U.S. Department of Health and Human Services, 1991を参照のこと）。本明細書中で論じられる全ての抗体のアミノ酸配列は、Ｋａｂａｔシステムを参照することによって分類される。同一種の異なる軽鎖と重鎖のＦＲ配列は比較的保存されている。抗体ＦＲはＣＤＲの位置決定およびキャリブレーションに用いられる。ＣＤＲは主に抗原エピトープとの結合を担っている。
【０２４６】
キメラ抗体は、構築された重鎖と軽鎖遺伝子を有する抗体、特に、遺伝子操作されておりかつ異なる種に属する可変ドメインと定常ドメイン遺伝子を有する抗体である。例えば、マウスモノクローナル抗体遺伝子の可変ドメインセグメントは、ヒト抗体の定常ドメインセグメント、例えばγ１およびγ３に連結される。キメラ抗体は別の哺乳動物種由来の遺伝子を使用することもできる。
【０２４７】
用語「ヒト化抗体」と「ヒト化免疫グロブリン」は同じ意味を有する。抗体の非ヒト化形と比較して、そのヒト化抗体は典型的にはヒト宿主において免疫反応を低減させる。
【０２４８】
本発明に従って設計され作出された抗体は、幾つかの保存的アミノ酸で置換することが可能である。該保存的アミノ酸は、抗体の抗原結合性または別の機能に実質的に全く影響を及ぼさない。言い換えれば、アミノ酸はｇｌｙおよびａｌａ；ｖａｌ，  ｉｌｅおよびｌｅｕ；ａｓｐおよびｇｌｕ；ａｓｎおよびｇｌｎ；ｓｅｒおよびｔｈｒ；ｌｙｓおよびａｒｇ；ｐｈｅおよびｔｙｒの組み合わせで相互に置換することができる。同じ群にないアミノ酸は「実質的に異なる」アミノ酸である。
【０２４９】
幾つかの実施形態では、抗体とそれの標的スポットとの間の親和性は、Ｋｄ（解離定数）によって表され、それは１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ未満、または約１０−１２Ｍ未満である。
【０２５０】
抗体の重鎖または軽鎖の「可変ドメイン」は、前記鎖のＮ末端に位置する成熟領域である。全てのドメイン、ＣＤＲｓ  および残基番号は、配列アラインメントを通しておよび現存の構造知見に基づいて定められる。ＦＲおよびＣＤＲ残基の決定および番号付け法は、Chothia他が記載したもの（Chothia, Structural determinants in the sequences of immunoglobulin variable domain. J Mol Biol. 1998; 278, 457）に基づく。
【０２５１】
ＶＨは抗体重鎖の可変ドメインである。ＶＬは抗体軽鎖の可変ドメインであり、それはκおよびλアイソタイプを含み得る。Ｋ−１抗体にはκ−１アイソタイプがあり、一方でＫ−２抗体にはκ−２アイソタイプがあり、そしてＶλは可変λ軽鎖である。
【０２５２】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書中では互換的に用いることができる。それらのいずれも任意長さの重合アミノ酸を指し、コードアミノ酸と非コードアミノ酸、化学的にもしくは生化学的に修飾または誘導化されたアミノ酸、および修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを包含しうる。前記用語には、融合タンパク質、例えば限定されないが、非相同アミノ酸配列を有する融合タンパク質、Ｎ末端メチオニン残基を有するかまたは持たない、非相同および相同リーダー配列を有する融合タンパク質；免疫学的タグ（ラベル）を有するタンパク質；検出可能な融合パートナーを有する融合タンパク質、例えば融合パートナーとして機能しうる融合タンパク質、例えば蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、フルオレセイン等を含む融合タンパク質が含まれる。一例として、融合パートナーアミノ酸配列は、単離された融合タンパク質の検出および／または精製を助けることができる。非限定例として、金属結合（例えばポリヒスチジン）融合パートナー、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、プロテインＡ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、蛍光タンパク質配列（例えばＧＦＰ）、ｍｙｃ、ＦＬＡＧおよび血球凝集素タグなどのエピトープタグが挙げられる。
【０２５３】
この点については、当業者は、タンパク質の化学修飾に関するより広範囲の方法論に関して、Colign他編のCURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCEの第１５章（John Wiley & Sons NY 1995-2008）を参照することができる。
【０２５４】
ポリペプチドは任意の長さのものであることができ、「ペプチド」という用語は８〜５０残基（例えば８〜２０残基）の長さのポリペプチドを指す。
【０２５５】
「対応するアミノ酸」は、２以上のアミノ酸配列を比較した時に同じ位置にある（すなわちそれらが互いに一致する）アミノ酸残基を言う。抗体配列の比較および番号付け法は、Ｃｈｏｔｈｉａ（上記参照）、Ｋａｂａｔ（上記参照）、その他により詳細に記載されている。当業者は、場合により１、２もしくは３個のギャップを作出し、そして／または１、２、３もしくは４個の残基または最大で約１５個の残基（特にＬ３およびＨ３  ＣＤＲ中に）を１または２個のアミノ酸中に挿入し、それによって比較を完成させることができることを知っている (例えば、Kabat 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, DHHS, Washington, DCを参照のこと)。
【０２５６】
「置換可能な位置」とは、抗体の結合活性を有意に減少させることなく、異なるアミノ酸により置換することができる抗体の特定の位置を指す。置換可能な位置を決定する方法およびそれらをいかにして置換できるかは、下記により詳細に記載することにする。置換可能な位置は「変化に寛容な位置」とも称されることがある。
【０２５７】
抗原性タンパク質もしくはペプチドおよび／またはそれの任意断片、変異体もしくは誘導体は、当業界で既知の任意手段により、例えば限定されないが、化学的（ペプチド）合成、組換えＤＮＡ技術およびペプチド断片を生成するタンパク質分解開裂によって作出することができる。
【０２５８】
化学合成は、固相および液相ペプチド合成を包含する。そのような方法は当業界で周知であるが、Nicholson編のSYNTHETIC VACCINESの第９章（Blackwell Scientific Publications）およびColigan他編のCURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCEの第１５章（John Wiley & Sons, Inc. NY USA 1995-2008）に提供されるような化学合成技術の例が参照される。これに関して、国際公開第ＷＯ  ９９／０２５５０号および国際公開第ＷＯ  ９７／４５４４４号も参照される。
【０２５９】
組換え抗原性タンパク質またはペプチドは、例えば、Sambrook他、MOLECULAR CLONING. A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 1989)、特に16節と17節；Ausubel他編のCURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (John Wiley & Sons, Inc. NY USA 1995-2008)、特に第10章と第16章；およびColigan他編のCURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE (John Wiley & Sons, Inc. NY USA 1995-2008)、特に第１章、第５章および第６章に記載されるような、標準プロトコルを使って当業者により好都合に調製することができる。
【０２６０】
雄性精子細胞の表面タンパク質は、任意の適当な種類の表面タンパク質であり得る。例えば、表面タンパク質はＤＢＹ／ＤＥＡＤ（Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ）ボックスポリペプチド３（「ＤＥＡＤ」）、雄強化抗原（「ＭＥＡ」）１およびＭＥＡ  ２、性別決定領域Ｙ（「ＳＲＹ」）。雄性精子細胞に特異的な更なる抗原の非限定例は、ＷＯ２００８／０６７６５１およびＵＳ２００９／０２０８９７７に見出すことができ、それらは本明細書中に参照により組み込まれる。
【０２６１】
抗体は表面タンパク質の任意の適当な位置に結合しそして／またはそれに対して惹起させることができる。適当な配列の例は表１Ｃに示される。
【０２６２】
表１Ｃ．抗原ＤＢＹ／ＤＥＡＤ、ＭＥＡ  １、ＭＥＡ  ２およびＳＲＹに基づいたまたはそれから誘導されたペプチド配列。
【表１０−１】
2021505191.tif 000020
【表１０−２】
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【表１０−３】
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【表１０−４】
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【表１０−５】
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【表１０−６】
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【表１０−７】
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【表１０−８】
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【表１０−９】
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【表１０−１０】
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【表１０−１１】
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【表１０−１２】
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【表１０−１３】
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【表１０−１４】
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【表１０−１５】
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【表１０−１６】
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【表１０−１７】
2021505191.tif 000036
【０２６３】
幾つかの実施形態では、表面タンパク質はＤＢＹ／ＤＥＡＤである。
【０２６４】
幾つかの実施形態では、抗体はＤＢＹ／ＤＥＡＤに特異的に結合する。
【０２６５】
幾つかの実施形態では、抗体はＤＢＹ／ＤＥＡＤまたはその抗原性部分に対して惹起される。
【０２６６】
幾つかの実施形態では、抗体は配列番号３４７、３５２および８４〜１５９のいずれか１つのアミノ酸配列またはその一部分に対して惹起される。
【０２６７】
幾つかの実施形態では、抗体は配列番号３４７、３５２、３５３、３５４、３５５および８４〜１５９のいずれか１つのアミノ酸配列のエピトープに結合する。
【０２６８】
幾つかの実施形態では、抗体は配列番号３５３、３５４および３５５のいずれか１つ、好ましくは配列番号３５３のアミノ酸配列のエピトープに結合する。
【０２６９】
幾つかの実施形態では、抗体は配列番号３５３、３５４および３５５のいずれか１つのアミノ酸配列のエピトープに、または１もしくは複数のアミノ酸置換を有するエピトープに結合する。
【０２７０】
幾つかの実施形態では、抗体は、コア配列ＥＭＥＳＨ（配列番号３５３由来）を有するエピトープ、または１もしくは複数のアミノ酸置換を有するエピトープに結合する。
【０２７１】
幾つかの実施形態では、抗体重鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１（配列番号３６３）、ＣＤＲ２（配列番号３６４）およびＣＤＲ３（配列番号３６５）のアミノ酸配列を含む。
【０２７２】
幾つかの実施形態では、抗体軽鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１（配列番号３６０）、ＣＤＲ２（配列番号３６１）およびＣＤＲ３（配列番号３６２）のアミノ酸配列を含む。
【０２７３】
幾つかの実施形態では、抗体重鎖可変ドメインは、配列番号３５０のアミノ酸配列を含み、その重鎖可変ドメインは配列番号３５０に示されるアミノ酸配列の１個または数個のアミノ酸の置換、欠失または付加により誘導される。それは配列番号３５０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有し、そして前記抗体は表面タンパク質と特異的に結合する活性を有する。
【０２７４】
幾つかの実施形態において、抗体重鎖可変ドメインは配列番号３４８のヌクレオチド配列によってコードされる。
【０２７５】
幾つかの実施形態において、抗体軽鎖可変ドメインは、配列番号３５１のアミノ酸配列を含み、またはその軽鎖可変ドメインは配列番号３５１に示されるアミノ酸配列の１個もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失または付加により誘導され、それは配列番号３５１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有し、前記抗体は表面タンパク質と特異的に結合する活性を有する。
【０２７６】
幾つかの実施形態では、抗体軽鎖可変ドメインは配列番号３４９のヌクレオチド配列によってコードされる。
【０２７７】
ＤＢＹ／ＤＥＡＤはヒト起源であるが、それは異なる哺乳動物種を超えて高度に保存されているタンパク質であるため、抗体はウシおよびブタ種をはじめとする異なる哺乳動物種のＤＢＹ／ＤＥＡＤに結合することができる。
【０２７８】
用語「哺乳動物」には、限定されないが、ヒト、家禽、家禽類、実験動物、コンパニオンアニマル、およびペットが含まれる。この用語には、限定されないが、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、イルカ、モルモット、ハムスター、マウス、ラット、イヌおよびネコが含まれる。好ましくは哺乳動物はブタまたはウシである。
【０２７９】
本発明の第２態様によれば、有効量の第１態様のモノクローナル抗体と許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む組成物が提供される。
【０２８０】
組成物は、例えば、医薬組成物の形態、獣医用途の組成物の形態、または研究目的のための形態（例えば試薬または研究ツール）であり得る。
【０２８１】
許容される担体、希釈剤または賦形剤は、精液に有害であったり害を与えたりするものではない。許容される担体、希釈剤および賦形剤を記載している有用な参考文献は、
Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. N.J. USA, 1991)であり、それは参考により本明細書中に組み込まれる。
【０２８２】
幾つかの実施形態では、許容される担体、希釈剤または賦形剤は精液増量剤である。精液増量剤または希釈剤は、典型的には、哺乳動物の射精液の量を増加させるために用いられる水溶液である。精液増量剤は典型的には、精子細胞の代謝維持のための栄養素を供給する（例えばグルコース）、冷感刺激に対する保護を提供する（例えばＢＳＡ）、培地のｐＨ（例えば重炭酸塩、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ）および浸透圧（例えばＮａＣｌ、ＫＣｌ）を維持する、および微生物の繁殖を抑制する（例えば抗生物質）だろう。精液増量剤は、当業界で既知であるもののいずれか、例えば市販の精液増量剤（例えばＭｉｎｉｔｕｂｅ社製のＡｎｄｒｏｓｔａｒ  Ｂｏａｒ  Ｓｅｍｅｎ  Ｅｘｔｅｎｄｅｒ（ＢＳＥ））を含み得る。精液増量剤は典型的には、精子の由来である特定の種に適するようにまたは適合するように処方される。
【０２８３】
本発明の第３態様によれば、第１態様のモノクローナル抗体または第２態様の組成物を含有する試薬、キットまたはチップが提供される。
【０２８４】
前記試薬、キットまたはチップは次の１または複数を含むことができる：モノクローナル抗体、前記抗体をコードする核酸、前記抗体を含有する真核細胞、原核細胞およびウイルス。
【０２８５】
試薬、キットまたはチップの別のオプション成分は、抗体活性アッセイの実験を行うための、制限エンドヌクレアーゼ、プライマーおよびプラスミド、緩衝液等を含む。前記試薬、キットまたはチップの核酸は、非ウサギ抗体核酸との連結のために、制限エンドヌクレアーゼ部位、多重クローニング部位、プライマー部位等を更に含んでもよい。前記試薬、キットまたはチップの全ての構成成分は、別々の容器中に個別に保管することができ、あるいは必要であれば単一容器中に事前に統合してもよい。
【０２８６】
本発明の第４態様によれば、診断剤、診断試薬または道具としての第１態様のモノクローナル抗体または第２態様の組成物の使用が提供される。
【０２８７】
これに関して、モノクローナル抗体は、例えば放射性同位体、検出可能な物質を生成することのできる酵素、蛍光タンパク質およびビオチンにより、標識しそして検出することができる。更に、モノクローナル抗体は、固相担体、例えば限定されないが、（ポリスチレン）プレートまたはビーズと結合することができる。
【０２８８】
本発明の第５態様によれば、哺乳動物の精子（「精子細胞」）を処置する方法であって、精子を含む哺乳動物の精液を、該抗体が精液の雄性精子（「雄性精子細胞」）に特異的に結合するように、第１態様のモノクローナル抗体または第２態様の組成物と接触させる工程を含む方法が提供される。
【０２８９】
精液をモノクローナル抗体と接触させると、「処置済みの精液」、「処置済みの精子」または「処置済みの精子細胞」を生成する。
【０２９０】
本発明の第６態様によれば、産生される雌子孫の確率を増加させるために哺乳動物の精子（「精子細胞」）を処置する方法であって、抗体が雄性精子に特異的に結合するように哺乳動物の精子を第１態様のモノクローナル抗体または第２態様の組成物と接触させる工程を含む方法が提供される。
【０２９１】
本発明の第７態様によれば、哺乳動物の精液の雌雄鑑別方法が提供され、抗体が精液の雄性精子に特異的に結合するように精子を第１態様のモノクローナル抗体または第２態様の組成物と接触させる工程を含む。
【０２９２】
本発明の第８態様によれば、第１態様のモノクローナル抗体または第２態様の組成物で処置した時の精液または精子を含む組成物が提供される。
【０２９３】
本発明の第９態様によれば、産まれる雌子孫の確率を高めるために哺乳動物を人工授精させる方法であって、該哺乳動物に以下：
【０２９４】
（ｉ）有効量の第１態様のモノクローナル抗体；
【０２９５】
（ｉｉ）有効量の第２態様の組成物；または
【０２９６】
（ｉｉｉ）有効量の第８態様の組成物
【０２９７】
を投与し、それにより前記哺乳動物を人工受精させる方法が提供される。
【０２９８】
本発明の第１０態様によれば、第１態様のモノクローナル抗体または第２態様の組成物と雄性精子（「雄性精子細胞」）とのコンジュゲートが提供される。
【０２９９】
本発明の第１１態様によれば、第１態様のモノクローナル抗体と雄性精子とのコンジュゲートまたは第２態様の組成物と雄性精子とのコンジュゲートを含む、処置済みの精子または処置済みの精液が提供される。
【０３００】
本発明の第１２態様によれば、雄性精子（「雄性精子細胞」）選択のための第１態様のモノクローナル抗体または第２態様の組成物の使用であって、前記雄性精子選択が場合により大量の精液中で実施される使用が提供される。
【０３０１】
本発明の第１３態様によれば、哺乳動物の精液または精子を雌雄鑑別するための、第１態様のモノクローナル抗体または第２態様の組成物の使用が提供される。
【０３０２】
精子または精液は、モノクローナル抗体または組成物と複数の雄性精子細胞との間でコンジュゲートを形成させるのに十分な時間に渡り、モノクローナル抗体または組成物と接触させた後、得られた前記処置済みの精子または処置済みの精液を用いて１または複数の雌対象を人工授精させる。説明の目的上、５〜６００分の範囲が言及されるが、受精前の接触時間はより短時間、例えば１、２、３もしくは４分であるか、またはより長時間、例えば７００、８００、９００もしくは１０００分間であり得る。５〜６００分の範囲は、もちろん、６、７、８分並びに５〜６００の間の全１分増分を包含する。
【０３０３】
精液または精子は、新しく収得されたものであるかまたは以前に凍結され続いて解凍されたものであるかいずれでもよい。好ましくは、精液または精子は新しく収得されたものである。
【０３０４】
典型的には、排他的でないけれども、精液または精子はモノクローナル抗体または組成物と接触させる前に洗浄されていない。
【０３０５】
当該方法または使用は、モノクローナル抗体または組成物と処置すべき精液とを、前記精液とモノクローナル抗体または組成物との間で１または複数のコンジュゲートを形成させるのに十分な接触時間を確保するように、精液サンプル中で体外（インビトロ）的にまたは雌動物の生殖器官へ体内（インビボ）的のいずれかで、同時もしくは連続的に導入することにより実施することができる。
【０３０６】
上述した本発明の態様の幾つかの実施形態では、モノクローナル抗体および／または組成物が雄性精子の運動性および／または活性を低下させるまたは阻害する。これを達成するには任意の適当な方法が使用できる。適当な方法としては、磁気ビーズ分離、凝集、ろ過およびサイトメトリーが挙げられる。好ましくは、そのような方法は、残った雌性精子の運動性、生存力および／または活性を低下させたり阻害したりしない。
【０３０７】
本明細書中で雄性精子細胞の運動性および／または活性を記載するために用いられる用語「低下させる」および「阻害する」とは、対照サンプルまたは被験体からの別の生物学的サンプルに比較した場合に、そのような運動性および／または活性の量および／またはレベルの減少を指す。幾つかの実施形態では、雄性精子細胞の運動性および／または活性のレベルが約９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％または１０％未満に減少する場合に、その雄性精子細胞の運動性および／または活性が低下し、または対照サンプルまたは被験体からの別の生物学的サンプルにおける雄性精子細胞の運動性および／または活性のレベルの約５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０１％、０．００１％または０．０００１％未満にさえも低下する。
【０３０８】
精子の運動性および／または活性の測定は、当業界で既知の任意方法またはその組み合わせを含み得る。そのような方法の非限定例としては、光学顕微鏡法、位相差顕微鏡法、コンピューター支援精子分析法（例えばＨｏｂｓｏｎ精子トラッカー）、スイムアップ法および遊走／沈降チャンバー法が挙げられる。これに関して、精子の運動性の尺度は定量的または定性的尺度であり得る。
【０３０９】
上記の本発明の態様の幾つかの実施形態では、方法または使用は、処置済みの精液または精子から、抗体に結合した雄性精子を除去することを含む。抗体に結合した雄性精子を取り除くためには任意の適当な方法が使用できる。適当な例としては、磁気ビーズ分離、凝集、ろ過およびフローサイトメトリーが挙げられる。好ましくは、そのような方法は、残りの雌性精子の運動性、生存力および／または活性を低下させたり変更したりしない。
【０３１０】
幾つかの実施形態では、フローサイトメトリー、体外受精、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）アッセイ、蛍光抗体、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）および／またはプロテインＧ被覆磁気ビーズを使用して、処置済みの精液を抗体結合した雄性精子について確認することができ、または処置済みの精液が、抗体結合した雄性精子を含まないかまたはほとんど含まないかどうか、または処置済みの精液が雌性精子に富んでいるかどうかを調べることができる。
【０３１１】
雌性精子の選択または精液の雌雄鑑別は、大量に実施することができる。上記方法または使用の幾つかの実施形態では、種のタイプや産生される精液の量に対する制限はない。例えば、ブタ、イルカおよびウマは２５０ｍＬから数リットルまでに及ぶ大量／多量の精液を産生するが、イヌ、ネコおよび他の反芻動物はミリリットル量を産生する。
【０３１２】
特定の実施形態では、モノクローナル抗体または組成物は、収集された精子もしくは精液におよび／または受精させる予定の雌動物の生殖器官に、場合により雄性精子細胞を標的とする１もしくは複数の抗体または薬剤と共に、直接添加することのできる処置溶液の中に含めることができる。
【０３１３】
加えて、第１態様のモノクローナル抗体は、例えば、コーティング収集装置、保管装置および他の人工授精装置により、体外で使用することができる。
【０３１４】
適切には、精液製剤は、哺乳動物の人工授精にとって生物学的許容濃度および／または生存度で複数の精液を含む。当業者により認識される通り、これは例えば、人工授精させようとする哺乳動物の年齢および／または種によってかなり変動しうる。この濃度は、複数の精子の形態学および／または運動性に従って、使用者により変更可能である。
【０３１５】
（ｉ）の文脈において、「有効量」とは、複数の精子に対して所望の薬理学的、生理学的および／または治療的効果を惹起させ、前記哺乳動物の人工授精の際に産まれる雌子孫の確率を増加させるのに十分な位の、上記に記載のモノクローナル抗体および／または組成物の量または濃度を意味する。よって、実質的に純粋な抗体または組成物の有効量は、精子中の多数の雌精子細胞上にある関連表面タンパク質に結合しかつそれに対して阻害効果、例えば結合した雄精子の活性、機能および／または運動性に対して阻害効果を付与し、それにより処置済みの精子／処置済みの精液の人工授精から産生される雌子孫の確率の増加を促進するのに十分な量である。（ｉｉ）の文脈において、「有効量」とは、雌哺乳動物の人工授精によって子孫を生産するのに十分である精液製剤の量または濃度を意味する。
【０３１６】
有効量は、哺乳動物の年齢、品種、種、体重、生殖能力および一般的健康状態、精子の状態、並びにモノクローナル抗体、組成物および／または精液製剤を投与する方法といった因子に依存して異なり得る。
【０３１７】
適切には、モノクローナル抗体および／または組成物と複数の精子とは、同時にまたは連続して添加される。この点に関しては、モノクローナル抗体および／または組成物が最初に哺乳動物に投与され、続いて複数の精子が投与される。あるいは、複数の精子が哺乳動物に投与された後、モノクローナル抗体および／または組成物が投与されてもよい。
【０３１８】
適切には、モノクローナル抗体および／または組成物と複数の精子は、ａ）  安全である；ｂ）  生殖能力を害さない；ｃ）  いかなる催奇形効果も引き起こさない；および  ｄ）  雌の健康に有害でないような量で雌に投与される。
【０３１９】
使用される複数の精子は、新しく収穫されたものであるか、または以前に凍結されその後解凍されたものでもよいことは理解されるだろう。好ましくは、精子は新しく収得されたものである。
【０３２０】
人工授精は、精子／精液が雄の哺乳動物から採取され、続いて適切な時期に、器具の助けを借りて雌の哺乳動物の生殖器官中に導入される技術であることは十分理解されている。本発明の方法に関して、モノクローナル抗体および／または組成物と精子とは、当業界で既知の任意の人工授精方法によって哺乳類に投与することができる。典型的には、モノクローナル抗体および／または組成物と、精子／精液または処置済みの精子／処置済みの精液とは、その一部を機械的方法により、適当な時期（例えば雌哺乳動物が発情期にある時）に、衛生状況の下で、子宮頸部および／または子宮中に導入することにより、雌哺乳動物へ受精させる。
【０３２１】
上記方法または使用の幾つかの実施形態では、精子細胞選択または精液の雌雄鑑別は、大量に実施することができる。上記方法または使用の幾つかの実施形態では、生産される精液の量および種のタイプに制限はない。例えば、ブタ、イルカおよびウマは、２５０  ｍＬから数リットルに及ぶ大量／多量の精液を産生するが、一方でイヌ、ネコおよび他の反芻動物はミリリットル量を生産する。本発明の幾つかの実施形態はその両方のシナリオに適用することができる。
【０３２２】
本発明の第１４態様によれば、第１態様のモノクローナル抗体を含むハイブリドーマ細胞が提供される。
【０３２３】
本発明の第１５態様によれば、次のものをコードする、１または複数の単離された核酸、精製された核酸または組換え核酸が提供される：
【０３２４】
（ｉ）第１態様のモノクローナル抗体の重鎖可変ドメイン；
【０３２５】
（ｉｉ）第１態様のモノクローナル抗体の軽鎖可変ドメイン；
【０３２６】
（ｉｉｉ）第１態様のモノクローナル抗体の重鎖可変ドメインのＣＤＲ１（配列番号３６３）、ＣＤＲ２（配列番号３６４）およびＣＤＲ３（配列番号３６５）；および／または
【０３２７】
（ｉｖ）第１態様のモノクローナル抗体の軽鎖可変ドメインのＣＤＲ１（配列番号３６０）、ＣＤＲ２（配列番号３６１）およびＣＤＲ３（配列番号３６２）。
【０３２８】
本発明の第１７態様によれば、配列番号３４７のアミノ酸配列に対して惹起されたモノクローナル抗体が提供される。
【０３２９】
本明細書中に記載の特徴のいずれも、本発明の範囲内で、本明細書中に記載の別の特徴の１つまたは複数と任意の組み合わせで組み合わせることができる。
【０３３０】
明細書全体を通して、本発明の好ましい実施形態を、いずれか１つの実施態様または特別な特徴の集合体に限定することなく記載することを目指してきた。従って、本開示に照らして、特定の実施形態に様々な改良および変更を成し得ることは当業者により理解されるだろう。
【０３３１】
本発明をより容易に理解できかつ実用的効果を得るように、当業者は次の非限定例を参考にする。
〔図面の簡単な説明３〕
【０３３２】
図１Ｃ。モノクローナル抗体ＳｄＷ１  ＲＥ５．Ｂ７．Ｆ９ｂ（「クローンＲＥ５」または「ＲＥ５抗体」とも称される）の、フレームワーク（ＦＷＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）を示す注釈付きＶＨおよびＶＬアミノ酸配列。
【０３３３】
図２Ｃ。抗体ｍＡｂ７３５（ＰＤＢ  ３ｗｂｄ）を鋳型として使用しそしてＲＥ５抗体を標的として使用して構築した相同性モデル。
【０３３４】
図３Ｃ。抗体ＲＥ５の推定３Ｄ構造。ＣＤＲループは、構造の中で円で囲まれた部分である。
【０３３５】
図４Ｃ。Ｎ／Ｃ末端に従って着色したＤＢＹ表面タンパク質（雄性精子細胞上）の推定３Ｄ構造。Ｎ末端領域は青色で、そしてＣ末端領域は赤色で示される。２２ｍｅｒのペプチドが白色で示される。
【０３３６】
図５Ｃ。ＲＥ５抗体のＣＤＲ領域の周辺の３つの代表的な基（ベンゼン、酢酸イオンおよびＭｇｕａ）のＭＣＳＳ  Ｍｉｎｉｍａの分布。
【０３３７】
図６Ｃ。官能基とその対応するアミノ酸（括弧内）を示すＭＣＳＳ  ｍｉｎｉｍａの分布：ＢＥＮＺ（Ｐｈｅ）、ＰＨＥＮ（ＴＹＲ）、ＩＭＩＡ（Ｈｉｓ）、ＡＣＥＴ（ＧＬＵ／ＡＳＰ）、およびＭＧＵＡ（ＡＲＧ）。
【０３３８】
図７Ｃ。オレンジ色に着色した推定結合ペプチドと共に示す、ＲＥ５抗体とＤＢＹタンパク質の複合体構造。抗体は白色で表面に示される。ＲＥ５抗体を作出するのに使用したペプチドは青色で示される。
【０３３９】
図８Ｃ。モノクローナル抗体ＲＥ５についての３つの推定ペプチドバインダー／エピトープ／ドッキング部位が下線で示される。
【０３４０】
図９Ｃ。モノクローナル抗体の産生、選択および特徴付けのための方法を示す流れ図。このプロセスは、次の工程を含む：  １．抗体の産生；  ２．凝集、蛍光二次抗体、ＦＩＳＨまたは磁気ビーズ技術による精子に対する抗体の効果の評価；  ３．ハイスループット体外受精（ＨＴ  ＩＶＦ）または選択的溶解とｑＰＣＲを使った、精子に対する抗体の効果の検定；および４．シーケンシング、３Ｄ構造の構築およびエピトープの決定による、抗体の特徴づけ。
【０３４１】
表２Ｃ．配列番号の一覧表。
【表１１−１】
2021505191.tif 000037
【表１１−２】
2021505191.tif 000038
【表１１−３】
2021505191.tif 000039
【表１１−４】
2021505191.tif 000040
〔実施形態の説明３〕
【０３４２】
本発明の好ましい特徴、実施形態および変形は、この実施形態の記載から理解されるだろう。それは本発明を実施するのに十分な情報を当業者に提供する。この実施形態の記載は先行する本発明の詳細な説明の範囲をいかなる形でも限定するものと見なしてはならない。
【０３４３】
抗原の調製
【０３４４】
幾つかのペプチドを定法により合成し、キーホールリンペット・ヘモシアニン（ＫＨＬ−ぺプチド）に結合させた。ＫＬＨは、キーホールリンペット（Ｍｅｇａｔｈｕｒａ  ｃｒｅｎｕｌａｔａ；アオガイ）の血リンパ中に見つかる金属タンパク質である。このタンパク質は大型で、複数のサブユニットにより酸素を担持し、そのためペプチドの理想的なキャリアになる。
【０３４５】
モノクローナル抗体の作製
【０３４６】
免疫処置および血清力価：２体のロバートソンマウスを、皮下経路により５０μｇの抗原（配列番号３４７）とメチル化ＣｐＧと共に免疫アジュバント（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、カタログＮｏ．Ｓ６３２２）の組み合わせを用いて２週間間隔で３回免疫処置した。血清サンプルを免疫処置マウスから収集し、１：２５０と１：１２５０の希釈度でＥＬＩＳＡにより抗原に対する反応性を調べ、それを免疫処置前サンプルと比較した。両動物とも陽性の抗体価を示し、融合用に選択した。
【０３４７】
ハイブリドーマ融合：ハイブリドーマ細胞を作製するために、マウス脾臓を切除し、単細胞懸濁液中に解離させ、ポリエチレングリコールを使ってＳＰ２／０−Ａｇ１４ミエローマ細胞に融合させた。生じたハイブリドーマ細胞を２０×９６ウェルの組織培養プレート中のアザセリン・ヒポキサンチン含有培地中で増殖させた。
【０３４８】
スクリーニング：ハイブリドーマ細胞を１０日間増殖させ、その時点で陽性のハイブリドーマコロニーの数を計測し、さらに３日間のインキュベーション後、抗体上清のアリコートをスクリーニング用に採取した。その上清を、抗原ＳｄＷ１ａ（遊離ペプチド―配列番号３４７）およびＳｄＷ１ｂ（ＫＬＨ−ペプチド）に対する反応性についてアッセイし、最初にＩｇＧ特異的二次抗体を使った抗原マイクロアレイ法により、次に上清のＥＬＩＳＡによりアッセイし、陽性の抗体産生クローンを確認した。
【０３４９】
繁殖と凍結：次に最大反応性のＥＬＩＳＡ陽性クローンを２４ウェルの組織培養プレート中で３〜４日間増殖させ、その時点でそれらを６ウェルの組織培養プレートに拡大した。細胞は１：５（上清ウェル）および１：２５（細胞ウェル）の比で播種した。細胞が８０％密集度に達したら、細胞を収集し、１０％ＤＭＳＯ中で凍結保存し、液体窒素中で保存した。各クローンからの上清も収得し、−２０℃で凍結した。
【０３５０】
サブクローニング：ＥＬＩＳＡ陽性クローンの１つである、ＳｄＷ１ＲＥ５．Ｂ７．Ｆ９ｂ（「クローンＲＥ５」）をサブクローニング用に選択し、それを２ラウンドの工程希釈に供した。各希釈工程の後、細胞を４〜５日間増殖させ、抗原に対して陽性の抗体を産生する単一のコロニーを上清ＥＬＩＳＡにより決定し、そして上位２クローンを更なるラウンドにより増殖させた。最終のモノクローナル細胞系を６ウェルの細胞培養プレート中に４〜５日間増殖させ、上清を抽出し、細胞と一緒に凍結させた。
【０３５１】
アイソタイプ決定：サブクローニングした細胞系の上清を、市販のアッセイキットにより試験し、産生されているモノクローナル抗体のアイソタイプを決定した。５種の抗体アイソタイプのうち、最も一般的な２種はＩｇＧとＩｇＭである。ＩｇＧ  ｍＡｂの中には、５つの考えられ得るサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃおよびＩｇＧ３）が存在する。更に、各ｍＡｂはカッパ（κ）またはラムダ（λ）軽鎖のいずれかを有しうる。クローンＲＥ５と命名された特定の目的のモノクローナル抗体は、アイソタイプマウスＩｇＧ２ａ，κ（ＩｇＧ２ａ  Ｋ）を有した。
【０３５２】
モノクローナル抗体クローンＲＥ５’、アイソタイプ：マウスＩｇＧ２ａ，κの配列決定
【０３５３】
モノクローナル抗体クローンＲＥ５’の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を配列決定した。簡単に言えば、抗体シークエシング（配列決定）は次の工程を含んだ：細胞系の細胞を増殖させる工程；それらの細胞から全ＲＮＡを精製する工程；メッセンジャーＲＮＡを全ＲＮＡから更に精製する工程；ＶＨおよびＶＬ遺伝子特異的反応を使ってｃＤＮＡ合成を実施する工程；ｃＤＮＡのｄＧＴＰテール付加（ｔａｉｌｉｎｇ）を実施する工程；ＶＨおよびＶＬ  ｃＤＮＡ生産物をＰＣＲ増幅させる工程；ＰＣＲ生産物をゲル精製しそしてｐＣＲＴＭ２．１中にクローニングする工程；コロニースクリーニングをＰＣＲを使って行う工程；目的のＰＣＲ生産物またはプラスミドをＤＮＡシークエンシングに供する工程；および。ＤＮＡシークエシング結果を分析する工程。
【０３５４】
モノクローナル抗体クローンＲＥ５の重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号３４８のヌクレオチド配列を有する。
【０３５５】
モノクローナル抗体クローンＲＥ５の軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号３４９のヌクレオチド配列を有する。
【０３５６】
モノクローナル抗体クローンＲＥ５の重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号３５０のポリペプチド配列を有する。
【０３５７】
モノクローナル抗体クローンＲＥ５の軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号３５１のポリペプチド配列を有する。
【０３５８】
モノクローナル抗体クローンＲＥ５の重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲは、それぞれ配列番号３６３、３６４および３６５のポリペプチド配列を有する。
【０３５９】
モノクローナル抗体クローンＲＥ５の軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲは、それぞれ配列番号３６０、３６１および３６２のポリペプチド配列を有する。
【０３６０】
重鎖および軽鎖抗体可変領域遺伝子配列の分析は、ＩＭＧＴ／Ｖ−Ｑｕｅｓｔプログラム（The International Immunogenetics Information System; http://www.imgt.org/IMGT_vquest)を使って実施した。（未整列の）生殖細胞系列マウス抗体遺伝子に対するクローンＲＥ５のＶＨおよびＶＬ配列の類似性は下記の表３Ｃに示される。
【０３６１】
表３Ｃ．未整列の生殖細胞系列マウス抗体配列に対するクローンＲＥ５  ＶＨおよびＶＬの類似性（ＩＭＧＴ／Ｖ−Ｑｕｅｓｔプログラムを使用）。Ｎ／Ａ＝不適用。
【表１２】
2021505191.tif 000041
【０３６２】
フレームワーク領域（ＦＷＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）を示す抗体ＲＥ５の注釈付きＶＨおよびＶＬアミノ酸配列が、図１Ｃに示される。
【０３６３】
抗体ＲＥ５の３Ｄ構造
【０３６４】
抗体ＲＥ（標的）の配列に基づいて、図２Ｃに示される通り、鋳型として抗体ｍＡｂ７３５  （ＰＤＢ  ３ｗｂｄ）を使って相同性モデルを構築した。
【０３６５】
抗体ＲＥ５の３Ｄ構造
【０３６６】
抗体ＲＥ５の３Ｄ構造は、図３Ｃに示される通り好結果に構築された。注記：標的の配列は鋳型とはわずかに異なり、そしてＲＥ５抗体の正確な３Ｄ構造は、様々なアミノ酸の側鎖を手動で作製することにより構築された。
【０３６７】
抗体へのＤＢＹのエピトープの結合の推定
【０３６８】
ＲＥ５  ＶＨおよびＶＬ領域の配列を特徴づけた後、タンパク質ＤＢＹへの抗体の結合領域を決定した。抗体と結合する抗原のエピトープは、(Zhang, W, Zeng, X, Zhang, L, Peng, H, Jiao, Y, Zeng, J, Treutlein, HR, (2013) “Computational identification of epitopes in the glycoproteins of novel bunyavirus (SFTS virus) recognized by a human monoclonal antibody (Mab 4-5)”, J. Comput. Aided Mol. Des. 27:539-550)中に発表された方法を使って決定した。
【０３６９】
簡単に言えば、次の工程を用いてＤＢＹの潜在的結合領域／エピトープを同定した。
【０３７０】
１）  ＲＥ５モノクローナル抗体配列を解いた。その配列を使って、抗体の相同性モデルを作製した。
【０３７１】
２）  ＤＢＹタンパク質の３Ｄ構造をモデル化した。
【０３７２】
３）  抗体上の官能基のＭＣＳＳマッピングを実行した。
【０３７３】
４）  ＭＣＳＳ  ｍｉｎｉｍａからの結合ペプチド配列パターンを同定し、タンパク質ＤＢＹの配列全体のパターンを検索し、該タンパク質の抗体への結合領域を同定した。
【０３７４】
５）  ＤＢＹタンパク質への抗体の結合を実施した。
【０３７５】
６）  水中での抗体−ＤＢＹ複合体の分子動力学シミュレーションを推定した。
【０３７６】
ＤＢＹタンパク質−タンパク質の３Ｄ構造
【０３７７】
タンパク質ＤＢＹ（ＤＢＹ２  Ｈｕｍａｎ  ｍａｌｅ  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＳＴＳ  ｇｅｎｏｍｉｃ，  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇｇｅｄ  ｓｉｔｅ；６８９  ｂｐゲノムＤＮＡ。性別：雄。Ｃｌｏｎｅ＿ｌｉｂ：  Ｈｕｍａｎｅ  ｍａｌｅ；  受入番号：Ｇ４９４６９．１；ＧＩ：  ５１１４０２８）。ＮＩＨからのヌクレオチド配列（Ｇｅｎｅ  ＩＤ  Ｇ４９４６９）を使って、配列番号３５２に見られる通り、それをまずタンパク質配列へと翻訳した。
【０３７８】
ＤＢＹは本質的に高度に保存されている。そのアミノ酸配列は、ヒト、ウシおよびブタ種を含む異なる哺乳動物種間で高度に保存されている。結果として、モノクローナル抗体ＲＥ５は、全てではないが大部分の哺乳動物種のＤＢＹに結合すると予測される。
【０３７９】
ＤＢＹのタンパク質配列に基づいて、ＩｎＦｏｌｄアルゴリズムを使って、タンパク質構造のモデル化を実施した〔McGuffin, L.J., Shuid, A.M., Kempster, R., Maghrabi, A.H.A., Nealon J.O., Salehe, B.R., Atkins, J.D. & Roche, D.B. (2017) "Accurate Template Based Modelling in CASP12 using the IntFOLD4-TS, ModFOLD6 and ReFOLD methods." Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 86 Suppl 1, 335-344, doi: 10.1002/prot.25360; McGuffin, L.J., Atkins, J., Salehe, B.R., Shuid, A.N. & Roche, D.B. (2015) "IntFOLD: an integrated server for modelling protein structures and functions from amino acid sequences." Nucleic Acids Research, 43, W169-73; Buenavista, M. T., Roche, D. B. & McGuffin, L. J. (2012) "Improvement of 3D protein models using multiple templates guided by single-template model quality assessment." Bioinformatics, 28, 1851-1857; Zhang, W, Zeng, X, Zhang, L, Peng, H, Jiao, Y, Zeng, J, Treutlein, HR, (2013) "Computational identification of epitopes in the glycoproteins of novel bunyavirus (SFTS virus) recognized by a human monoclonal antibody (Mab 4-5)", J. Comput. Aided Mol. Des. 27:539-550). 
【０３８０】
図４Ｃは、ＤＢＹタンパク質の結果として得られた３Ｄ構造を示す。
【０３８１】
ＲＥ５抗体の表面上のＭＣＳＳ  ｍｉｎｉｍａ
【０３８２】
図５Ｃは、ＲＥ５抗体のＣＤＲ領域の周辺の３つの代表的基（ベンゼン、酢酸イオンおよびＭｇｕａ）のＭＣＳＳ  ｍｉｎｉｍａの分布を示す。ＭＣＳＳ  ｍｉｎｉｍａの分布全体が更に図６Ｃに示される。アミノ酸Ｐｈｅの側鎖に相当するＢＥＮＺ  ｍｉｎｉｍａは、Ｂ１にのみ存在する。同様な特徴は基ＭＧＵＡ（Ａｒｇ）およびＰＨＥＮ（Ｔｙｒ）についても認められた。アミノ酸ＡＳＰまたはＧＬＵの側鎖に相当する、負に帯電した基ＡＣＥＴについて、２つのクラスターがＢ１およびＢ２のそれぞれにおいて同定された。官能基ＩＭＩＡ（Ｈｉｓ）についても同様な特徴が認められた。部位Ｂ１とＢ２の間に深い空洞があり、ＭＣＳＳ  ｍｉｎｉｍａの大部分が認められることに注目すべきである。この空洞は、おそらく抗体の相同性モデル化によるアーチファクトであると考えられ、よってこの空洞の内側のｍｉｎｉｍａは無視した。
【０３８３】
ＲＥ５抗体へのＤＢＹのペプチドの結合
【０３８４】
ＭＣＳＳ  ｍｉｎｉｍａに基づいて、Ｘ−Ｚの配列パターンを用いてＤＢＹタンパク質の配列を検索した。ここでＸ＝Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｈ、Ｄ／ＥおよびＺ＝Ｙ、Ｄ／Ｅとした。図７Ｃは、抗体とＤＢＹとのドッキングしたコンホメーションにおいて、ＤＢＹ中ペプチドバインダー（オレンジ色）およびそれらの位置を示す。
【０３８５】
モノクローナル抗体ＲＥ５についての３つの推定ペプチドバインダー／エピトープ／ドッキング部位が図８Ｃ中の下線部分および配列番号３５３〜３５５に示される。実際の結合部位／エピトープはＳＦＦＦＥＭＥＳＨ（配列番号３５３）である。他の２つのエピトープ（配列番号３５４および３５５）は、更なる抗体産生のための最有力候補である。
【０３８６】
抗体の検証
【０３８７】
モノクローナル抗体クローンを産生した後、凝集またはその欠損を調べるための位相差顕微鏡法、蛍光二次抗体染色、ＦＩＳＨおよび磁気ビーズ分離を使うことにより精子に対する抗体の効果を調べた。
【０３８８】
精液に対するＩｇＧの滴定
【０３８９】
精製済みＩｇＧまたは培養上清を、Ａｎｄｒｏｓｔａｒ  Ｂｏａｒ  Ｓｅｍｅｎ  Ｅｘｔｅｎｄｅｒ（ＢＳＥ）を使って２５ｍｇ／ｍＬの標準値に希釈した。抗体を更に１０倍希釈し、ＥＬＩＳＡプレート中のウェルに各希釈液につき１００μＬ容量を加えた。ＢＳＥ中の新鮮な（５日齢以内）の雄ブタ精液の標準量（２００μＬ）を１０７細胞／ｍＬの密度（１回量あたり１０９細胞に等しい）の密度で抗体希釈液に添加し、３７℃で維持した。各サンプルを、３０分から４時間の期間に渡り、倍率１００×で視覚的に確認し、次いでクランピングの比率を決定した。精子の凝集０（凝集なし）、１＋（＜５０％）、２＋（５０％）および３＋（１００％）の主観的スコアを開発した。
【０３９０】
蛍光抗体試験
【０３９１】
抗体が精子に結合したことを証明するために、蛍光（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８）ヤギ抗マウス二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｓ製）を使って一次抗体を追跡した。一次抗体での処置後、精液をＰＢＳで３回洗浄した。二次抗体を１／２０希釈率で添加し、３７℃で６０分間インキュベートし、続いてＰＢＳで３回洗浄した。Ｔｕｃｓｏｎカメラとソフトウェア（Ｓｃｏｐｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｂｒｉｓｂａｎｅ）を使って、日光と蛍光の両条件の下で精子を計数した。蛍光精子数対精子の総数の比を用いて、各処置についてのＹ−ＣＣＳＰ（雄精子）およびＸ−ＣＣＳＰ（雌精子）の％を算出した。可能であれば、各サンプルについて合計７５０個の精子を計数した。
【０３９２】
蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
【０３９３】
ＦＩＳＨを用いて蛍光抗体結果を確認し、蛍光精子がＹ染色体を有していることを証明した（雄精子細胞）。この方法はＰａｒｉｌｌａ他、２００３により記載された方法の変形であった。手短に言うと、ブタ筋肉、血液および精子からＤＮＡを抽出した。ＰＣＲを用いて、それぞれ２４４ｂｐと３７７ｂｐの染色体Ｉと染色体Ｙに相当する２つの生成物を増幅させた。プライマー配列は表４Ｃおよび配列表中に見つかる。
【０３９４】
表４Ｃ．染色体１および染色体Ｙのプライミングオリゴヌクレオチド配列
【表１３】
2021505191.tif 000042
【０３９５】
ＰＣＲ反応用のマスターミックスは、０．４μＬの４種のｄＮＴＰの混合物（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ  各々２ミリモル／Ｌ）、それぞれ染色体１およびＹのための２．５μＬ（１原液あたり１０ピコモルμｌから）のプライマー、５０−５００ｎｇのブタＤＮＡ、５μＬの１０×ＰＣＲ緩衝液（１００ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣＬ  ｌ／１、ｐＨ  ８．３、５００ミリモルのＫＣＬ  ｌ−１、１５ミリモルのＭｇＣｌ２  ｌ−１、０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン）  および０．５μＬの５Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼμｌ／１から成った。反応液の総容量をＤＮアーゼ不含有の水で５０μＬに調整した。９５℃で５分間の初期変性の後、３工程の増幅、続いて変性（９５℃で１５秒）、アニーリング（６０℃で１分）および伸長（７２℃で１５秒）の３５サイクルを実施した。最後に、伸長工程（７２℃で７分）でそのサイクルを終えた。
【０３９６】
ＰＣＲ生成物をプールし、ＰｉｃｏＰｕｒｅ（登録商標）ＰＣＲカラム（Ｑｕｉａｇｅｎ製）を使って清澄化し、ＤＮＡ濃度を決定し、ニックトランスレーションに使用した。Ａｂｂｏｔニックトランスレーションキットを使用して、ＰＣＲ生成物中に修飾デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）を取り込んだ。ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎＴＭ  ｄＵＴＰを用いて染色体１プローブを標識し、そしてＳｐｅｃｔｒｕｍＲｅｄＴＭ  ｄＵＴＰを染色体Ｙプローブ中に取り込んだ。これは、染色体１に緑色蛍光シグナルを付与し、そして染色体Ｙに赤色蛍光シグナルを付与した。各成分をニックトランスレーションについて列挙した順序でチューブに加え、その後、そのチューブを手短に遠心分離し、渦動攪拌した後、酵素（最終成分）：すなわち（１７．５−ｘ）μＬのヌクレアーゼフリーの水；ｘμＬの１μｇ  抽出ＤＮＡ；  ２．５μＬの０．２ｍＭ  ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ、ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅまたはＳｐｅｃｔｒｕｍＲｅｄ  ｄＵＴＰ；  ５  μＬの０．１ｍＭ  ｄＴＴＰ；１０μＬのｄＮＴＰミックス；  ５μＬの１０×ニックトランスレーション緩衝液；１０μＬのニックトランスレーション酵素を加え、全量５０μＬにした。
【０３９７】
サンプルを１５℃で一晩インキュベートした。１０分間の８０℃工程が反応を停止させた。生成物をもう一度ＰｉｃｏＰｕｒｅ  ＰＣＲカラム（Ｑｕｉａｇｅｎ製）を使って清澄化し、ここで最終溶出緩衝液は５μＬのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ（０．２ミリモルｌ／ｌ）および５μＬのＦＩＳＨハイブリダイゼーション緩衝液から成った。
【０３９８】
ＦＩＳＨ用の精液サンプルをＫＣｌ（７５ｍＭ）で２回洗浄し、次いでＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ（１Ｍ）で１回洗浄した。３μＬの精液懸濁液を、透明なスライドガラス上にカーバイドペンシルで描いた直径７ｍｍの円の中に塗布した。そのスライドを風乾し、氷冷メタノール：氷酢酸（３：１）中で固定した。ハイブリダイゼーション前に、スライドを２×生理食塩水−クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）緩衝液中に浸漬することにより、余分な固定液を除去し、次いでそれを一連のエタノール浴（７０％、８０％および１００％）に通すことにより脱水し、そして風乾した。スライドを１Ｍ  ＮａＯＨ溶液に３分間浸水し、２×ＳＳＣで洗浄し、脱水し、風乾した。各々の円の上に２μＬのハイブリダイゼーション緩衝液（Ｖｙｓｉｓ、Ａｂｂｏｔｔ）を滴下することにより変性を行い、カバーガラスで覆い、７５℃で５分間インキュベートした。
【０３９９】
プローブ混合物は、等量での緑（染色体１）、赤（染色体Ｙ）およびハイブリダイゼーション緩衝液から成った。これを７５℃で５分間変性させた。スライドガラスを２×食塩水−クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）緩衝液中での浸漬により再洗浄し、それを一連のエタノール浴（７０％、８０％および１００％）中に通すことにより脱水し、風乾した。変性したプローブ混合物を加え（サンプルあたり１．２μＬ）、カバーガラスで覆い、縁をゴムセメントで密封して乾燥を防いだ。そのスライドを再び７５℃で５分間加熱し、その後それを暗い湿潤容器の中で３７℃にて一晩インキュベートした。ハイブリダイゼーション後、スライドを０．４×ＳＳＣ＋０．１％ＮＰ−４０溶液中で７５℃で２分間洗浄し、次いで２×ＳＳＣ＋（０．３％ＮＰ−４０）中で室温にて洗浄した。連続エタノール浴を通した脱水と風乾により、この工程を終了した。スライドを５μＬの４’，６’−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）褪色防止溶液（Ｖｙｓｉｓ）で対比染色し、３枚のフィルターを装備した蛍光顕微鏡下で検査した。（キューブ形で搭載する、ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣおよびテキサスレッド用に最適化したＢｒｉｇｈｔｌｉｎｅ多重バンドフィルター一式セット）。全ての細胞は染色体１の存在を示す緑色シグネチャーを含んだ。これをポジティブコントロール（陽性対照）として使用した。追加の赤色（染色体Ｙに対する）シグナルを含む細胞は、Ｙ−ＣＣＳＰ（雄性精子細胞）と見なした。緑色シグナルのみを含む細胞はＸ−ＣＣＳＰ（雌性精子細胞）と見なした。
【０４００】
精液サンプルを抗体と混合し、雄精子を沈降させた。凝集した精子を底部に沈降させた時、上部の自由に遊泳している精子を回収し、それを処理して個々の精子の性別を決定した。各サンプルにつき、平均７５０細胞が計測された。
【０４０１】
抗体の特異性を評価するための磁気ビーズの使用
【０４０２】
プロテインＧ磁気ビーズは、小スケールでの抗体の単離と精製のための親和性母材である。当該抗体は、抗ウマまたはマウス蛍光抗体により検出すると精子の５０％に結合したことが分かった。本試験の目的は、磁気ビーズの助けをかりて抗体が結合した精子を単離すること、および異なるモノクローナル抗体クローンの雄型特異性を決定することであった。磁気ビーズ上に保持された抗体処置精子に対してＦＩＳＨを実施し、雌精子よりも雄精子の方がより磁気ビーズにより取り除かれる（捕捉される）かどうかを調べた。
【０４０３】
手順は次の工程を含んだ：
【０４０４】
１．２体の雄ブタより新鮮な精液を回収する。
【０４０５】
２．精子の数を計数し、添加すべき抗体の量を決定する。
【０４０６】
３．２  ｍＬの精液に抗体を添加し、３７℃で１時間インキュベートする。
【０４０７】
４．精液をＰＢＳで３回洗浄し、未結合の抗体を除去する。
【０４０８】
５．５０μＬのビーズ懸濁液を５００μＬの結合緩衝液と混合する。渦動攪拌し、磁気ビーズを添加し、上清を除去し、この手順を再び繰り返す。
【０４０９】
６．５０μＬの洗浄済精液に１６０μＬの結合緩衝液を添加する。
【０４１０】
７．４℃で３０分間混合し保持する。
【０４１１】
８．磁石をあて、上清を取り除く。
【０４１２】
９．５００μＬの結合緩衝液を加え、十分混合し、上清を取り除く；この手順を２回繰り返す。
【０４１３】
１０．サンプルの半量をＦＩＳＨ分析用のものとして保存する。
【０４１４】
１１．サンプルの残り半量について、抗体／精液結合を次の方法で破壊することにより精液を素体にする：１１番のビーズペレットに、１００μＬの溶出緩衝液を加え、渦動攪拌し、４℃で５分間インキュベートする。磁石を用いて、精子を新しいチューブへと移し、この手順を繰り返し、溶出させた精液をプールする。４０μＬの１Ｍ  トリス−ＨＣｌ  （ｐＨ  ９）を加えた後、翌朝回収した精液にＦＩＳＨを続行する。
【０４１５】
クローンＲＥ５についての精液処理後の性比の歪度に対する抗体の効果を評価するためのＨＴ  ＩＶＦの使用
【０４１６】
合計８２８個の卵母細胞を受精させた（対照群の数＝３７６および処理群の数＝４５２）。胚を溶解させ、各々の性別を決定した。
【０４１７】
精液に添加すべき抗体の量の計算
【０４１８】
精液１用量あたりの精子と抗体の正確な比を決定するためのやり方を開発した。ドナー動物の１回射精量は運動性、生存力および容量あたりの精子の総数に関して異なるので、Ｙ精子の凝集を最適化するために１用量あたりの精液量を標準化する方法を開発する必要があった。
【０４１９】
抗体対精液の最適比は、次の式を使って確立した：用量あたりの精子の総数を、１または０．１または０．０９、または０．０８または０．０７５または０．０６または０．０５または０．０４５または０．０３または０．０２５または０．０１５または０．０１の因数で割り、用量あたりの抗体のｍｇを求めた。次いでこれを量／ｍＬ／用量に直した。必要量を２２℃または２３℃または２５℃または２７℃または３０℃または３２℃または３３℃または３５℃または３７℃または３８．５℃または３９℃にて精子に添加した。この温度で精液を５〜２４０分間維持した後、ゆっくり室温に放冷し、ろ過し、包装し、農場（受精のため）に１５℃〜１７℃で輸送した。
【０４２０】
上述のことを念頭に入れると、本発明を実際に実施できる方法の一例は次の通りであると理解されるだろう。
【０４２１】
雄ブタでの試験
【０４２２】
精子の５０％を凝集させる抗体対精子の比を用いて、雄ブタを受精させた。異なる数の精子量／１容量（１×１０９、２×１０９、３×１０９および４×１０９）を試行した。雄ブタ精液を採取し、即座に予熱した（２２℃または２３℃または２５℃または２７℃または３０℃または３２℃または３３℃または３５℃または３７℃または３８．５℃または３９℃）Ａｎｄｒｏｓｔａｒ  雄ブタ精液増量剤と混合した。精液を更にＡｎｄｒｏｓｔａｒ  Ｂｏａｒ  Ｓｅｍｅｎ  Ｅｘｔｅｎｄｅｒ中に予め希釈しておいた抗体と混合し、全て２２℃または２３℃または２５℃または２７℃または３０℃または３２℃または３３℃または３５℃または３７℃または３８．５℃または３９℃で維持した。抗体と精液を２２℃または２３℃または２５℃または２７℃または３０℃または３２℃または３３℃または３５℃または３７℃または３８．５℃または３９℃で５〜２４０分間反応させておいた。精液を８０  ｍＬ量に分割し、室温に放置して２２℃または２３℃または２５℃または２７℃または３０℃または３２℃または３３℃または３５℃または３７℃または３８．５℃または３９℃からゆっくり放冷した。サンプルを１５℃で農場に輸送し、そこで雄ブタ１匹当たり２回分量を投与した。精液サンプルは収集後５日以内に使用した。
【０４２３】
磁気ビーズ
【０４２４】
異なるクローン（モノクローナル抗体の）は磁気ビーズに対する親和性が異なる。ビーズ上に保持されたサンプルの７４．５％〜３０．５％が、試験したクローンに依存して雄であった。精子の性別はＦＩＳＨを使って決定した。１３クローンについての結果を表５Ｃに示す。
【０４２５】
表５Ｃ．２種の異なる雄ブタ精液サンプルを各クローンからの抗体で処理した後に磁気ビーズにより捕捉された雄性精子の割合。
【表１４】
2021505191.tif 000043
【０４２６】
蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
【０４２７】
各精子の性別の決定は、ＦＩＳＨによって行った。雄は赤色（Ｙ染色体）および緑色（染色体１）マーカーを有した。雌は緑色マーカーのみを有し、Ｙ染色体を欠いていた。凝集している蛍光精子は、ほとんどが雄精子を示した（緑色＋赤色シグナル）。精液を様々な抗体で処理した後の上清中の雌精子の割合を、表６Ｃに示す。
【０４２８】
表６Ｃ．精液を異なるクローンに由来する抗体で処理した後の上清中の雌精子の割合。各精子の性別の決定はＦＩＳＨにより行った。
【表１５】
2021505191.tif 000044
【０４２９】
ハイスループット体外受精
【０４３０】
２５の卵母細胞群についての処置群の雌精子の割合：対照群の雌精子の割合を表７Ｃに与える（総数＝８２８、対照群の数＝３７６、処置群の数＝４５２）。処置あたりの雌の平均％は７１％であり、対照の雌の平均％は４５％であった。対照からの平均シフトは２５％であった。処置群の９５％ＣＩは０．６４〜０．７８であり、対照群のそれは０．１７〜３２であった。
【０４３１】
表７Ｃ．２５種の卵母細胞群についての処置群のＩＶＦで産生した雌胚の割合：対照群での雌胚の割合。受精前に抗体を添加した精子を用いて、処置群の卵母細胞を受精させた。対照群は受精前にＰＢＳを添加した。変化率（％）は、対照群と処置群の間の雌への％増加を示す。
【表１６】
2021505191.tif 000045
標題４
雌雄選択を含む材料と方法
〔発明の分野４〕
【０４３２】
本発明は、他の事物の中でも特に、前のセクション（標題１〜３のセクションの発明）に記載された材料と方法を（互いに組み合わせることを含む）、精子の雌雄鑑別、雌雄選択、ＨＴ−ＩＶＦのために、生まれた子孫を遺伝子学的に特徴づけるためにおよび／または所望の子孫を取得する尤度を増加させるために利用することに関する。
〔発明の背景４〕
【０４３３】
従来の精子の雌雄鑑別への免疫学的アプローチの批判の１つは、「一貫性の欠如」である。事実、精子の雌雄鑑別、雌雄選択（産み分け）、ＨＩＴ−ＩＶＦ、生まれた子孫の遺伝子学的特徴付けおよび／または所望の子孫を取得する尤度の増加のための既知技術には、多数の課題が存在している。
〔発明の詳細な説明４〕
【０４３４】
今から上述した課題の少なくとも１つを最小にするための新たに開発した材料と方法を説明することにする。
【０４３５】
本発明の一態様によれば、次の工程を含む方法が提供される：
【０４３６】
１．随意に精子を処置工程へと供する工程；
【０４３７】
２．工程１の精子を、目的の雌性または雄性精子のいずれかを選択するように性別選択工程に供する工程；
【０４３８】
３．工程２の着目の精子を使って受精工程を実施し、少なくとも１つの卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚を産生する工程；
【０４３９】
４．工程３の少なくとも１つの卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚を、少なくとも１つの溶解した卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚から細胞性物質を選択的に放出するように、精子の存在下で選択的に溶解させる工程；および
【０４４０】
５．少なくとも１つの下流用途において前記放出された細胞性物質を使用する工程。
【０４４１】
精子は任意の適当な精製された形、半精製された形または未精製の形であり得る。例えば、精子は精液の中にあってよく、または精液から部分的にもしくは完全に分離されてもよい。精子または精液は、例えば精液増量剤と混合することができる。精子は本特許明細書の別のセクションに記載された通りであり得る。
【０４４２】
工程１は、例えば、処置工程に供しても供さなくてもよい。工程１は、精子が必ずしも処置される必要はないという点で任意選択的である。幾つかの実施形態では、工程１の未処置の精子に由来する放出された細胞性物質が、少なくとも１つの下流用途―例えば遺伝子変異について確認すること―を用いて特徴づけられる。
【０４４３】
任意の適当な処置工程または処置工程の組み合わせを工程１で使用することができる。
【０４４４】
幾つかの実施形態では、処置は、フローサイトメトリー、冷蔵、凍結、長期保存などの実験技術に精子を供することを含み得る。すなわち、そのような処置を受けた精子は、遺伝子学的にまたは他の形で変化する可能性があり、それらの変化は下流用途を使って確認または特徴づけることができる。
【０４４５】
幾つかの実施形態では、処置は、性質が化学的であるか非化学的であるかどうかに関係なく、突然変異原または疑わしい突然変異原に精子を供することを含み得る。幾つかの実施形態では、突然変異原または潜在的突然変異原は、化学薬品、例えば日焼け止め、洗剤、タルク等、あるいは変異誘発作用を有するかまたは変異誘発作用を有する疑いのある他の任意の化学薬品であり得る。
【０４４６】
幾つかの実施形態では、処置工程が、ＣＲＩＳＰＲ (Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats 遺伝子編集)技術、SMGT (Sperm-Mediated Gene Transfer)技術、ＴＡＬＥＮ (Transcription Activator-Like Effector Nucleases) 技術または他の組換え技術を使って精子を遺伝子操作すること、または精子を生物学的分子、特に結合分子、例えば抗体に供することを含み得る。
【０４４７】
幾つかの実施形態では、処置工程は、精子を１つ以上の形態の放射線、例えば紫外線放射線、マイクロ波放射線または熱に暴露することを含み得る。
【０４４８】
処置工程は、本特許明細書の他の任意のセクションに記載された通りであり得ることは理解すべきである。
【０４４９】
本方法は場合により、工程３の少なくとも１つの卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚を処置工程に供する工程を含む。処置工程は工程１について記載したのと同じであるかまたは工程１について記載したものと異なってもよい。
【０４５０】
工程２の雌雄選択工程は、任意の適当な方法で実施することができる。幾つかの実施形態では、精子特異的抗体を使用できる。例えば、本特許明細書の別のセクションに記載したような抗体を雌雄選択に使用できる。同様に、本特許明細書の別のセクションに記載した雌雄選択法を使用できる。
【０４５１】
工程２は、雄性精子または雌性精子のいずれかを選択するために用いることができる。好ましくは、雄特異的抗体は、本特許明細書の別のセクションに記載の通り、雄性精子細胞に結合させそれを不活性化するために用いられる。
【０４５２】
受精工程３は、任意の適当な方法で実施できる。好ましくは、工程３は、本特許明細書の別のセクションに記載されたようにＨＴ−ＩＶＦを使って実施できる。この工程は、必要であれば、本特許明細書の別のセクションに記載されたように受精細胞を培養することを含む。
【０４５３】
工程４の少なくとも１つの卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚を精子の存在下で選択的に溶解させてその少なくとも１つの溶解した卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚から細胞性物質を選択的に放出させることは、任意の適当な方法で実施することができる。好ましくは、工程４は、本特許出願の別のセクションにおいて記載したような溶解緩衝液と方法論を使って実施される。
【０４５４】
本明細書中の他の箇所に言及した通り、「細胞性物質」は、好ましくは、溶解しなければ他の方法で放出されなかったであろう実質的に細胞内にある物質である。「細胞性物質」という用語は、他の方法では膜に結合したままである物質も包含する。
【０４５５】
本明細書中の他の箇所に言及した通り、「細胞性物質」はそれの遺伝物質（核酸、ポリヌクレオチドおよび更に具体的にはゲノム、遺伝子、遺伝子転写物、遺伝子産物およびRNAをはじめとする、そのあらゆる形態）、タンパク様物質（ポリペプチド、タンパク質、ペプチドおよびアミノ酸をはじめとするそれのあらゆる形態）、および炭水化物物質（それのあらゆる形態）、脂質物質（脂肪および脂質をはじめとするそれのあらゆる形態）をその範囲内に包含する。本明細書中の他の箇所に言及した通り、「細胞性物質」はその範囲内に細胞系のあらゆる成分または構造体を包含する。
【０４５６】
工程５において、任意の好適な下流用途を用いることができる。本明細書中の他の箇所に言及した通り、下流用途はあらゆる分子ベースの方法と手順を包含する。そのような方法および手順は定量的、定性的、選択的な特性決定、修飾、単離または増幅などのためであり得る。下流用途は、卵母細胞、未分化胚芽細胞／胚盤胞、卵子、胚細胞、胚または精子の細胞性物質への何らかの変化を同定または検証するための、スクリーニング試験または診断試験であり得る。
【０４５７】
下流用途は、前記細胞性物質に、少なくとも１つの外来的に添加された酵素、例えばタンパク質ベースの酵素またはＲＮＡベースの酵素の作用を受けさせることを含み得る。
【０４５８】
下流用途は、例えば、いずれも１または複数の、遺伝子（ゲノミクスおよびエピゲノミクス）、転写産物（トランスクリプトミクス）、タンパク質（プロテオミクス）、代謝産物（メタボロミクス）、脂質（リピドミクス）または相互作用（インタラクトミクス）の研究であり得る。
【０４５９】
細胞材料についての可能な下流用途は、Wang & Bodovitz, Trends Biotechnol. 2010 June; 28 (6): 281-290中に記載されており、その全内容が相互参照により本明細書中に組み込まれる。別の可能な下流用途は本明細書中の他の箇所に記載される。
【０４６０】
本発明の第二の観点によれば、遺伝的変異を特徴づける方法であって、次の工程：
【０４６１】
１．  随意に精子を処置工程に供する工程；
【０４６２】
２．  工程１の精子を、目的の雌または雄精子について選択するための雌雄選択工程に供する工程；
【０４６３】
３．  工程２の精子を使って受精工程を実施し、少なくとも１つの卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚を産生する工程；
【０４６４】
４．  工程３の卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚を精子の存在下で選択的に溶解させ、その少なくとも１つの溶解された卵母細胞、胚盤胞、卵子、胚細胞または胚から細胞性遺伝物質を選択的に放出させる工程；および
【０４６５】
５．  遺伝的変異を特徴づけるために、前記放出された細胞性遺伝物質に関して少なくとも１つの下流用途を使用する工程。
【０４６６】
本発明の第一態様について言及した通り、第二態様の特徴は、本特許明細書の任意の他の部分から収集することができる。
【０４６７】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、任意のヒトまたは非ヒト動物または哺乳動物に適用可能であり、ここでＭＥＡ  １、ＭＥＡ  ２、ＳＲＹ、ＤＢＹ／ＤＥＡＤおよび／またはＴＳＰＹがそのＹ染色体精子により選択的にまたは特異的に発現されうる。特定の実施形態では、用語「哺乳動物」は、限定されないが、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、イヌおよびネコを含む。好ましくは、哺乳動物の種はブタまたはウシである。
【０４６８】
上記方法または用途の幾つかの実施形態では、精子細胞選択または精子の雌雄鑑別を大量に実施することができる。
【０４６９】
上述の方法または用途の幾つかの実施形態では、種のタイプおよび産生される精液の量に全く限界がない。例えば、ブタ、イルカおよびウマは２５０ｍＬから数リットルまでの大量の精液を生産し、一方でイヌ、畜牛および他の反芻動物は数ミリリットル量を産生する。
【０４７０】
本発明の幾つかの好ましい実施形態は、本明細書のパート２の図４Ｂに例示される。
【０４７１】
幾つかの実施形態では、当該方法は、下記に要約するように、ハイスループット体外受精（ＨＴ−ＩＶＦ）に利用することができる：
【０４７２】
ブタ（または他の）卵子からの卵母細胞を、新規に開発した培地（ＩＶＰを処置するための本明細書の別のセクションに記載の通り）中で処理して成熟を増強する。
【０４７３】
新鮮な放出されたブタ（または他種）精液で受精させる。
【０４７４】
８〜１６細胞に増殖させる―卵母細胞の≧７０％が新規手法で成熟し成長する。業界の標準は約４０％である。
【０４７５】
新規溶解溶液を用いて卵母細胞および残余の精液を差次的に溶解させ、卵母細胞ＤＮＡを抽出し、精子を完全な状態に残す。
【０４７６】
ＲＥＰＬＩ  ｇキットＳＣポリメラーゼ（Ｑｕｉａｇｅｎ製）によりｑＰＣＲを使って卵母細胞ＤＮＡを増幅させる。
【０４７７】
ＤＮＡを希釈し、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によりある範囲の遺伝子型形質を検出する。
【０４７８】
以下の方法による精子および／または卵母細胞の処理により、遺伝子産物の変化または欠損を引き起こすことができる：
【０４７９】
CRISPR (Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats遺伝子編集）；
【０４８０】
SMGT (Sperm-Mediated Gene Transfer) (Rodriques 2013); TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nucleases); 
【０４８１】
精子上のドッキング部位をブロックする抗体；卵母細胞上のドッキング部位をブロックする抗体；
【０４８２】
日焼け止め、洗剤、タルク等の任意の化学薬品；または
【０４８３】
変異誘発効果を有しうる化学薬品。
【０４８４】
用途：
【０４８５】
遺伝子型を変化させる試験計画または処置の能力を決定する；
【０４８６】
トランスジェニック動物；
【０４８７】
体外受精；または
【０４８８】
胚の雌雄鑑別。
【０４８９】
本明細書全体を通して「一実施形態」または「実施形態」への言及は、その実施形態との関連で記載される特定の特徴、構造または性質が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。よって、本明細書全体の様々な箇所において「一実施形態では」または「ある実施形態では」という表現は、必ずしも全てその実施形態に関するものであるわけではない。更に、特定の特徴、構造または性質は１または複数の組み合わせで任意の適当な様式で組み合わせることが可能である。
【０４９０】
法規に従い、本発明を構造または方法上の特徴に多かれ少なかれ特別な言語で説明してきた。本明細書中に記載される意味は本発明を効果的に利用する好ましい形態を含むため、表示または記載された特定の特徴に限定されないと理解すべきである。従って、本発明は、当業者により適切に解釈される、添付の特許請求の範囲の適切な範囲の中でその形態または変形のいずれかで主張される。
【０４９１】
先行技術の刊行物が本明細書中に引用される場合、この引用は、その刊行物がオーストラリア国または任意の他国において当業界の一般的知識の部分を形成するという承認にはならないことが明白に理解されるだろう。
。
【０４９２】
本明細書中で用いる場合、文脈が別のものを要求する場合を除き、「含む」という用語およびその用語の変形、例えば「含んでいる」、「含む」および「含まれる」は、言及されていない１または複数の更なる要素、成分、整数または工程を除外するつもりではなく、言及されていない１または複数の更なる要素、成分、整数または工程を含み得る。
【０４９３】
第１節から第４節の本発明の好ましい実施形態が、下記の特許請求の範囲に定義される。
【図Ａ−１Ａ】
2021505191.tif 000046
【図Ｂ−１Ｂ】
2021505191.tif 000047
【図Ｂ−２Ｂ】
2021505191.tif 000048
【図Ｂ−３Ｂ】
2021505191.tif 000049
【図Ｂ−４Ｂ】
2021505191.tif 000050
【図Ｃ−１Ｃ】
2021505191.tif 000051
【図Ｃ−２Ｃ】
2021505191.tif 000052
【図Ｃ−３Ｃ】
2021505191.tif 000053
【図Ｃ−４Ｃ】
2021505191.tif 000054
【図Ｃ−５Ｃ】
2021505191.tif 000055
【図Ｃ−６Ｃ】
2021505191.tif 000056
【図Ｃ−７Ｃ】
2021505191.tif 000057
【図Ｃ−８Ｃ】
2021505191.tif 000058
【図Ｃ−９Ｃ】
2021505191.tif 000059
【国際調査報告】
2021505191.tif 000060
2021505191.tif 000061
2021505191.tif 000062
2021505191.tif 000063
2021505191.tif 000064