(57)【要約】  本発明は、Ｉ型IFN依存性病態を処置するためのグアナベンズ又はその誘導体の使用に関する。本発明者らは、本明細書において、eIF2α-P経路への薬理学的干渉が、免疫の病的状態の処置にとってどれほど有益であり得るかについて調べる。マウス及びヒトの両方のDC及びＢ細胞を使用して、本発明者らは、GBZが、CpG ODN又はDNA−免疫グロブリン複合体によるエンドソームＴｏｌｌ様受容体９（TLR9）の活性化、並びにRNA又は小化合物によるTLR3、TLR7、及びRIG-I様受容体（RLR、RIG-I、又はMDA5）のそれを防ぐことを示す。インビボでは、GBZ処置は、マウスをCpG依存性サイトカインショックから保護し、TMPD誘導全身性エリテマトーデスモデルにおいて抗核酸自己抗体産生を減少させる。したがって、本発明は、グアナベンズ又はその誘導体を被験体に投与することを含む、該被験体におけるＩ型IFN依存性病態を処置する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
処置的に有効な量のグアナベンズ又はその誘導体を、それを必要としている被験体に投与することを含む、前記被験体におけるＩ型IFN依存性病態を処置する方法。
【請求項２】
前記被験体が、ヒトである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記Ｉ型IFN依存性病態が、全身性エリテマトーデス（SLE）、シェーグレン症候群、筋炎、全身性強皮症（SSc）、アイカルディ・グティエール症候群、Ａ型インフルエンザウイルス（IAV）により誘導される重症疾患、若年性特発性関節炎、関節リウマチ、HIV感染症、移植拒絶反応、移植片対宿主病（GVHD）、１型糖尿病、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎及びクローン病）、グレーブス病、顕微鏡的多発性血管炎、ヴェゲナー肉芽腫症、自己免疫性甲状腺疾患、糸球体腎炎、巨細胞性動脈炎、歯周病からなる群から選択される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記Ｉ型IFN依存性病態が、全身性エリテマトーデスである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
前記グアナベンズの誘導体が、モノハロゲン化（ヘテロ）アリール誘導体である、請求項１〜４のいずれか記載の方法。
【請求項６】
前記グアナベンズの誘導体が、式（Ｉ）：
【化４】
2021529729.tif 000015
（式中、
Ｈａｌ＝Ｆ、ＣＩ、Ｂｒ、Ｉ
Ｘは、−ＣＲ１＝又は−Ｎ＝のいずれかであり、
Ｙは、−ＣＲ２＝又は−Ｎ＝のいずれかであり、
Ｚは、−ＣＲ３＝又は−Ｎ＝のいずれかであり、
Ｗは、−ＣＲ４＝又は−Ｎ＝のいずれかであり、
Ｒ１は、Ｈ、Ｈａｌ、アルキル、及びＯ−アルキルから選択され；
Ｒ２は、Ｈ、Ｈａｌ、アルキル、Ｏ−アルキル、及びＣ（０）Ｒ６から選択され；
Ｒ３は、Ｈ、Ｈａｌ、アルキル、及びＯ−アルキルから選択され；
Ｒ４は、Ｈ、ＣＩ、Ｆ、Ｉ、又はＢｒであり；
Ｒ５は、Ｈ、又はアルキル、シクロアルキイ（cycloalkyi）、アラルキイ（aralkyi）、アルケニル、シクロアルケニル、ヘテロシクリル、アリール、Ｃ（０）−アルキル、及びＣ（０）−アリールであり、これらはそれぞれ、場合により１つ以上のＲ７基で置換されており；Ｒ６は、ＯＨ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、アラルキイ、ＮＨ２、ＮＨ−アルキル、Ｎ（アルキル）２、ＮＨ−アリール、ＣＦ３、アルキル、及びアルコキシから選択され；
各Ｒ７は、独立して、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、ＣＯＯ−アルキル、アラルキイ、ヘテロシクリル、Ｓ−アルキル、ＳＯ−アルキル、Ｓ０２−アルキル、Ｓ０２−アリール、ＣＯＯＨ、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＮＨ２、ＮＨ−アルキル、Ｎ（アルキル）２、ＣＦ３、アルキル、及びアルコキシから選択され、
ＨａｌがＣＩであり且つＲ４がＣＩである場合、Ｒ５はＨではない）
の化合物である、請求項１〜５のいずれか記載の方法。
【請求項７】
前記グアナベンズの誘導体が、式（II）：
【化５】
2021529729.tif 000016
（式中、
Ｈａｌ＝Ｆ、ＣＩ、Ｂｒ、Ｉ
Ｘは、−ＣＲ１＝又は−Ｎ＝のいずれかであり、
Ｙは、−ＣＲ２＝又は−Ｎ＝のいずれかであり、
Ｚは、−ＣＲ３＝又は−Ｎ＝のいずれかであり、
Ｗは、−ＣＲ４＝又は−Ｎ＝のいずれかであり、
Ｒ１は、Ｈ、Ｈａｌ、アルキル、及びＯ−アルキルから選択され；
Ｒ２は、Ｈ、Ｈａｌ、アルキル、Ｏ−アルキル、及びＣ（０）Ｒ６から選択され；
Ｒ３は、Ｈ、Ｈａｌ、アルキル、及びＯ−アルキルから選択され；
Ｒ４は、Ｈ、ＣＩ、Ｆ、Ｉ、又はＢｒであり；
Ｒ５は、Ｈ、又はアルキル、シクロアルキイ、アラルキイ、アルケニル、シクロアルケニル、ヘテロシクリル、アリール、Ｃ（０）−アルキル、及びＣ（０）−アリールであり、これらはそれぞれ、場合により１つ以上のＲ７基で置換されており；
Ｒ６は、ＯＨ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、アラルキイ、ＮＨ２、ＮＨ−アルキル、Ｎ（アルキル）２、ＮＨ−アリール、ＣＦ３、アルキル、及びアルコキシから選択され；
各Ｒ７は、独立して、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、ＣＯＯ−アルキル、アラルキイ、ヘテロシクリル、Ｓ−アルキル、ＳＯ−アルキル、Ｓ０２−アルキル、Ｓ０２−アリール、ＣＯＯＨ、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＮＨ２、ＮＨ−アルキル、Ｎ（アルキル）２、ＣＦ３、アルキル、及びアルコキシから選択される）
の化合物である、請求項１〜６のいずれか記載の方法。
【請求項８】
前記グアナベンズの誘導体が、
【表３】
2021529729.tif 000017
2021529729.tif 000018
2021529729.tif 000019
からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか記載の方法。
【請求項９】
前記グアナベンズ又はその誘導体が、Ｉ型IFN依存性病態の標準的な処置と組み合わせて投与される、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｉ型IFN依存性病態を処置するためのグアナベンズ又はその誘導体の使用に関する。
【０００２】
背景技術：
樹状細胞（DC）は、細胞障害関連又は病原体関連の分子パターン（DAMP及びPAMP）の検出後に、抗原提示等のその免疫調節機能が著しく増強される、免疫応答の制御因子である。Ｔｏｌｌ様受容体（TLR）は、PAMPの認識に主要な役割を果たしており、ほとんどのTLRは、エンドソームでみられるTLR3、TLR7、TLR8、及びTLR9を除いて、細胞表面でそのリガンドを検出する。それぞれ非メチル化シトシン−リン酸−グアニン（CpG）モチーフを有するssRNA及びDNAがそのリガンドであるTLR7及びTLR9は、Ｉ型インターフェロン（IFN）の産生に特化したＢ細胞又は形質細胞様DC（pDC）のような、限られた数の免疫細胞で発現する。病的な状況では、自己核酸による細胞内TLRの不適切な刺激が、正のフィードフォワード炎症性増幅ループを駆動し、その間に、自己抗体のＢ細胞依存性分泌及びNA-免疫グロブリン（Ig）複合体によるpDC活性化が、病原性レベルのＩ型IFNの連続放出を加速する。したがって、TLR7及びTLR9を発現しているpDC及びＢ細胞は、全身性エリテマトーデス（SLE）等の幾つかのＩ型IFN依存性疾患の確立及び進行における重要な細胞プレーヤーである。
【０００３】
ERの恒常性を制御し、細胞の生存を促進するシグナル伝達カスケードは、まとめて統合ストレス応答（ISR）として知られている。最近、TLRシグナル伝達経路とISRとの間のクロストークが解明されてきている。このクロストークに関与するISRシグナル伝達モジュールの中でも、真核生物翻訳開始因子−２のαサブユニット（eIF2α）のSer51におけるリン酸化が特に重要である（G. Clavarino, et al, Induction of GADD34 is necessary for dsRNA-dependent interferon-beta production and participates in the control of Chikungunya virus infection. PLoS Pathog 8, e1002708 (2012)）。このリン酸化はグアニンヌクレオチド交換因子eIF2Bを阻害し、その結果、翻訳開始が減少し、新たに合成されるタンパク質の産生が減少する。増殖停止及びDNA損傷誘導性タンパク質３４（GADD34/PPP1R15A）は、ホスファターゼ１触媒サブユニット（PP1c）との会合を通してeIF2αのリン酸化を元に戻し、eIF2キナーゼ活性化によって開始された翻訳停止後に正常なタンパク質合成を回復させる、重要なISR誘導性コファクターである。
【０００４】
グアナベンズ（GBZ）は、PP1cとの相互作用を妨害することにより、特異的なGADD34阻害活性を示すことが提唱されており（P. Tsaytler, et al., Selective inhibition of a regulatory subunit of protein phosphatase 1 restores proteostasis. Science 332, 91-94 (2011)、致死的なタンパク質のミスフォールディングから細胞を保護し、筋萎縮性側索硬化症のような疾患を処置するためのモデル化合物として導入されている（I. Das et al, Preventing proteostasis diseases by selective inhibition of a phosphatase regulatory subunit. Science 348, 239-242 (2015)。GBZはまた、多発性硬化症を含む様々な病的状況において、幾つかの抗炎症特性を示すことが報告されている。ごく最近、処理した細胞でのeIF2αリン酸化の増加及び明らかなタンパク質恒常性活性が示されているにもかかわらず、GBZ及びその誘導体であるセフィン１の、GADD34−ホロホスファターゼ複合体を特異的に阻害する能力が強く検証されている（A. Crespillo-Casado et al. PPP1R15A-mediated dephosphorylation of eIF2alpha is unaffected by Sephin1 or Guanabenz. Elife 6, (2017), and A Sephin1-insensitive tripartite holophosphatase dephosphorylates translation initiation factor 2α. J Biol Chem. (2018)）。
【０００５】
発明の概要：
本発明は、Ｉ型IFN依存性病態を処置するためのグアナベンズ又はその誘導体の使用に関する。具体的には、本発明は、特許請求の範囲によって定義される。
【０００６】
発明を実施するための形態：
小胞体ストレス後のeIF2α-P脱リン酸化を選択的に媒介する、誘導性のホスファターゼ１コファクターであるGADD34/PPP1R15Aは、樹状細胞（DC）における炎症促進性サイトカイン及びインターフェロンの発現を制御することが示されている。最近、グアナベンズ（GBZ）等の幾つかのアミノ−グアニジン化合物が、eIF2αリン酸化−脱リン酸化サイクルを混乱させ得ることが示され、タンパク質のミスフォールディング及び神経変性に対して保護効果を発揮することが提唱されている。本発明者らは、本明細書において、eIF2α-P経路への薬理学的干渉が、Ｉ型インターフェロン依存性自己炎症疾患等の免疫の病的状態の処置にとってどれほど有益であり得るかについて調べる。マウス及びヒトの両方のDC及びＢ細胞を使用して、本発明者らは、GBZが、CpG ODN又はDNA−免疫グロブリン複合体によるエンドソームＴｏｌｌ様受容体９（TLR9）の活性化、並びにRNA又は小化合物によるTLR3、TLR7、及びRIG-I様受容体（RLR、RIG-I、又はMDA5）のそれを防ぐことを示す。インビボでは、GBZ処置は、マウスをCpG依存性サイトカインショックから保護し、TMPD誘導全身性エリテマトーデスモデルにおいて抗核酸自己抗体産生を減少させる。
【０００７】
したがって、本発明の第１の目的は、処置的に有効な量のグアナベンズ又はその誘導体を、それを必要としている被験体に投与することを含む、該被験体におけるＩ型IFN依存性病態を処置する方法に関する。
【０００８】
本明細書で使用するとき、用語「被験体」は、げっ歯類、ネコ、イヌ、及び霊長類等の哺乳類を意味する。好ましくは、本発明に係る被験体は、ヒトである。
【０００９】
本明細書で使用するとき、用語「処置」又は「処置する」とは、疾患に罹患するリスクがあるか、又は疾患に罹患していたと疑われる患者、並びに病気であるか、又は疾患若しくは病状を患っていると診断された患者の処置を含む、予防的又は防止的処置と治癒的又は疾患修飾性処置との両方を指し、臨床的再発の抑止を含む。処置は、障害若しくは再発障害の１つ以上の症状を予防する、治癒させる、発症を遅延させる、重篤度を低減する、若しくは寛解させるために、又はこのような処置を行わない場合に予測される生存期間を超えて被験体の生存期間を延長するために、医学的障害を有するか、又は最終的に該障害に罹患する可能性のある被験体に施してよい。「治療レジメン」とは、病気の処置パターン、例えば、治療中に用いられる投薬パターンを意味する。治療レジメンは、導入レジメン及び維持レジメンを含み得る。語句「導入レジメン」又は「導入期間」とは、疾患の初期処置に用いられる治療レジメン（又は治療レジメンの一部）を指す。導入レジメンの一般的な目的は、治療レジメンの初期期間中に高レベルの薬物を患者に与えることである。導入レジメンは、維持レジメン中に医師が使用するであろう用量よりも高用量で薬物を投与すること、維持レジメン中に医師が薬物を投与するであろう頻度よりも高頻度で薬物を投与すること、又はこれらの両方を含み得る「負荷レジメン」を（部分的に又は全体的に）使用し得る。語句「維持レジメン」又は「維持期間」とは、病気の処置中に患者を維持するため、例えば、長期間（数ヶ月間又は数年間）にわたって患者の寛解状態を保つために用いられる治療レジメン（又は治療レジメンの一部）を指す。維持レジメンは、連続療法（例えば、毎週、毎月、毎年等の一定間隔で薬物を投与する）又は間欠療法（例えば、断続処置、間欠処置、再発時の処置、又は特定の所定基準［例えば、疾患の顕在化等］を満たしたときの処置）を使用し得る。
【００１０】
本明細書で使用するとき、用語「Ｉ型インターフェロン」又は「Ｉ型IFN」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、Ｉ型インターフェロンファミリーの分子のメンバーを指す。Ｉ型インターフェロンの例は、インターフェロンα１、２ａ、２ｂ、４、５、６、７、８、１０、１３、１４、１６、１７、２１、インターフェロンβ、及びインターフェロンωである。
【００１１】
用語「Ｉ型IFN媒介病態」とは、任意のＩ型IFN誘導性疾患の病態、すなわち、インターフェロンの過剰産生及び／又はインターフェロン下流遺伝子の過剰活性化によって引き起こされる病態を指す。Ｉ型インターフェロン経路は、全身性エリテマトーデス（SLE）、シェーグレン症候群、筋炎、全身性強皮症（SSc）、アイカルディ・グティエール症候群、Ａ型インフルエンザウイルス（IAV）により誘導される重症疾患、若年性特発性関節炎、及び関節リウマチを含む、多数のリウマチ性疾患の病態形成に関連付けられている。更に、Ｉ型インターフェロンの発現増加は、HIV感染症、移植拒絶反応、移植片対宿主病（GVHD）、１型糖尿病、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎及びクローン病）、グレーブス病、顕微鏡的多発性血管炎、ヴェゲナー肉芽腫症、自己免疫性甲状腺疾患、糸球体腎炎、及び巨細胞性動脈炎でも記述されている。また、病態の他の例は、歯周病（例えば、歯周炎）を含む。該病態の診断は、当技術分野において周知の任意の方法によって実施することができる。血清中又は血漿中のＩ型IFNが容易には測定されない場合であっても、改善された感度及び特異性の診断検査でＩ型IFN誘導性遺伝子を便利に測定することができる（Bengtsson et al., Lupus 9:664-671 (2000)；Dall'era et al., Ann. Rheum. Dis. 64:1692-1697 (2005)；Kirou et al., Arthritis Rheum. 50:3958-3967 (2004)）。Ｉ型IFN活性をSLE又はSScの疾患病態形成（Eloranta et al., Ann. Rheum. Dis. 69:1396-1402 (2010)）及び疾患活動性（Bilgic et al., Arthritis Rheum. 60:3436-3446 (2009))と相関させるために、幾つかの明確に定義されたＩ型IFNシグネチャーが使用されている。SLE及びSScの両方における、末梢血と疾患罹患組織の間での、Ｉ型IFN経路の活性化及び一致（concordance）の両方を示すサブ集団を同定するためのＩ型IFNシグネチャーの開発（Higgs et al., Ann. Rheum. Dis. 70:2029-2036 (2011)）により、両疾患におけるマーカーとしてＩ型IFNシグネチャーを使用することの潜在的な有用性が実証されている。幾つかの実施態様では、Ｉ型IFN媒介病態は、炎症を特徴とする神経変性疾患ではない。幾つかの実施態様では、Ｉ型IFN媒介病態は、多発性硬化症ではない。幾つかの実施態様では、Ｉ型IFN依存性病態は、全身性エリテマトーデスである。
【００１２】
特に、グアナベンズ及びその誘導体は、エンドソームにおける、RNA、CpGオリゴデオキシヌクレオチド、又はDNA−免疫グロブリン複合体を含む天然及び合成のアゴニストによるＴｏｌｌ様受容体３、７及び９（TLR3、7、及び9）の活性化を防止するのに特に好適である。更に、グアナベンズ及びその誘導体は、自己抗体、特に抗核酸自己抗体の力価を低下させるのに特に好適である。特に、グアナベンズ及びその誘導体は、脂肪肉芽腫の形成を防止するのに特に好適である。更に、グアナベンズ及びその誘導体は、Ｉ型インターフェロン、TNF-ａ、及び／又はIL-6サイトカインの量を減少させるのに特に好適である。グアナベンズ及びその誘導体は、炎症性徴候において免疫調節的な役割を果たすIL-10の量を増加させるのに特に好適である。
【００１３】
本明細書で使用するとき、用語グアナベンズ（又はGBZ）は、式（Ｉ）：
【化１】
2021529729.tif 000002
の２−（２，６−ジクロロベンジリデン）−ヒドラジンカルボキシイミドアミドを指す。
【００１４】
本明細書で使用するとき、用語「グアナベンズ誘導体」は、グアナベンズ式に由来する化合物を指すが、好ましくは、グアナベンズ等の先行技術の化合物と比べて、アドレナリン作動性a2A受容体に対する活性を示さない化合物である（すなわち、該化合物は降圧性ではない）。
【００１５】
一実施態様では、本発明の方法で使用されるグアナベンズ誘導体は、モノハロゲン化（ヘテロ）アリール誘導体である。
【００１６】
一実施態様では、本発明の方法で使用されるグアナベンズ誘導体は、国際公開公報第２０１６／００１３９０号に記載されている。
【００１７】
一実施態様では、グアナベンズ誘導体は、式（Ｉ）：
【化２】
2021529729.tif 000003
（式中、
Ｈａｌ＝Ｆ、ＣＩ、Ｂｒ、Ｉ
Ｘは、−ＣＲ１＝又は−Ｎ＝のいずれかであり、
Ｙは、−ＣＲ２＝又は−Ｎ＝のいずれかであり、
Ｚは、−ＣＲ３＝又は−Ｎ＝のいずれかであり、
Ｗは、−ＣＲ４＝又は−Ｎ＝のいずれかであり、
Ｒ１は、Ｈ、Ｈａｌ、アルキル、及びＯ−アルキルから選択され；
Ｒ２は、Ｈ、Ｈａｌ、アルキル、Ｏ−アルキル、及びＣ（０）Ｒ６から選択され；
Ｒ３は、Ｈ、Ｈａｌ、アルキル、及びＯ−アルキルから選択され；
Ｒ４は、Ｈ、ＣＩ、Ｆ、Ｉ、又はＢｒであり；
Ｒ５は、Ｈ、又はアルキル、シクロアルキイ（cycloalkyi）、アラルキイ（aralkyi）、アルケニル、シクロアルケニル、ヘテロシクリル、アリール、Ｃ（０）−アルキル、及びＣ（０）−アリールであり、これらはそれぞれ、場合により１つ以上のＲ７基で置換されており；Ｒ６は、ＯＨ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、アラルキイ、ＮＨ２、ＮＨ−アルキル、Ｎ（アルキル）２、ＮＨ−アリール、ＣＦ３、アルキル、及びアルコキシから選択され；
各Ｒ７は、独立して、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、ＣＯＯ−アルキル、アラルキイ、ヘテロシクリル、Ｓ−アルキル、ＳＯ−アルキル、Ｓ０２−アルキル、Ｓ０２−アリール、ＣＯＯＨ、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＮＨ２、ＮＨ−アルキル、Ｎ（アルキル）２、ＣＦ３、アルキル、及びアルコキシから選択され、
ＨａｌがＣＩであり且つＲ４がＣＩである場合、Ｒ５はＨではない）
の化合物である。
【００１８】
本明細書で使用するとき、用語「アルキル」は、飽和の直鎖及び分枝鎖のアルキル基の両方を含む。好ましくは、アルキル基は、Ｃ１−２Ｏアルキル基であり、より好ましくはＣＭＳであり、より更に好ましくはＣ１−１２アルキル基であり、より更に好ましくはＣ１−６アルキル基であり、より好ましくはＣ１−３アルキル基である。特に好ましいアルキル基は、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、tert−ブチル、ペンチル、及びヘキシルを含む。
【００１９】
本明細書で使用するとき、用語「シクロアルキル」は、環状アルキル基を指す。好ましくは、シクロアルキル基は、Ｃ３−１２シクロアルキル基である。
【００２０】
本明細書で使用するとき、用語「アルケニル」は、分岐していてもよく、分岐していなくてもよい、１つ以上の炭素−炭素二重結合を含有する基を指す。好ましくは、アルケニル基は、Ｃ２．２０アルケニル基、より好ましくはＣ２−ｉ５アルケニル基、より更に好ましくはＣ２−ｉ２アルケニル基、又は好ましくはＣ２．６アルケニル基、より好ましくはＣ２．３アルケニル基である。用語「環状アルケニル」は、それに応じて解釈されるべきである。
【００２１】
本明細書で使用するとき、用語「アリール」は、Ｃ６−ｉ２芳香族基を指す。典型例は、フェニル及びナフチル等を含む。
【００２２】
本明細書で使用するとき、用語「複素環」（本明細書では「ヘテロシクリル」及び「複素環式」とも呼ばれる）は、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を含有し、場合により１つ以上のＣＯ基を更に含有する、４〜１２員、好ましくは４〜６員の飽和、不飽和、又は部分的に不飽和の環状基を指す。用語「複素環」は、以下に定義するヘテロアリール基及びヘテロシクロアルキル基の両方を包含する。
【００２３】
本明細書で使用するとき、用語「ヘテロアリール」は、１つ以上のヘテロ原子を含む４〜１２員の芳香族を指す。好ましくは、ヘテロアリール基は、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を含む４〜６員芳香族基である。好適なヘテロアリール基は、ピロール、ピラゾール、ピリミジン、ピラジン、ピリジン、キノリン、チオフェン、１，２，３−トリアゾール、１，２，４−トリアゾール、チアゾール、オキサゾール、イソチアゾール、イソオキサゾール、イミダゾール、フラン等を含む。
【００２４】
本明細書で使用するとき、用語「ヘテロシクロアルキル」は、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を含有する３〜１２員、好ましくは４〜６員の環状脂肪族基を指す。Ｎ含有５〜６員ヘテロシクロアルキルが好ましい。好ましいヘテロシクロアルキル基は、ピペリジニル、ピロリジニル、ピペラジニル、チオモルホリニル、及びモルホリニルを含む。より好ましくは、ヘテロシクロアルキル基は、Ｎ−ピペリジニル、Ｎ−ピロリジニル、Ｎ−ピペラジニル、Ｎ−チオモルホリニル、及びＮ−モルホリニルから選択される。
【００２５】
本明細書で使用するとき、用語「アラルキル」は、アリール官能基及びアルキル官能基の両方を有する基を含むが、これらに限定されない。例として、この用語は、アルキル基の水素原子のうちの１つがアリール基、例えばフェニル基によって置換されている基を含む。典型的なアラルキル基は、ベンジル、フェネチル等を含む。
【００２６】
一実施態様では、グアナベンズ誘導体は、式（II）：
【化３】
2021529729.tif 000004
（式中、
Ｈａｌ＝Ｆ、ＣＩ、Ｂｒ、Ｉ
Ｘは、−ＣＲ１＝又は−Ｎ＝のいずれかであり、
Ｙは、−ＣＲ２＝又は−Ｎ＝のいずれかであり、
Ｚは、−ＣＲ３＝又は−Ｎ＝のいずれかであり、
Ｗは、−ＣＲ４＝又は−Ｎ＝のいずれかであり、
Ｒ１は、Ｈ、Ｈａｌ、アルキル、及びＯ−アルキルから選択され；
Ｒ２は、Ｈ、Ｈａｌ、アルキル、Ｏ−アルキル、及びＣ（０）Ｒ６から選択され；
Ｒ３は、Ｈ、Ｈａｌ、アルキル、及びＯ−アルキルから選択され；
Ｒ４は、Ｈ、ＣＩ、Ｆ、Ｉ、又はＢｒであり；
Ｒ５は、Ｈ、又はアルキル、シクロアルキイ、アラルキイ、アルケニル、シクロアルケニル、ヘテロシクリル、アリール、Ｃ（０）−アルキル、及びＣ（０）−アリールであり、これらはそれぞれ、場合により１つ以上のＲ７基で置換されており；
Ｒ６は、ＯＨ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、アラルキイ、ＮＨ２、ＮＨ−アルキル、Ｎ（アルキル）２、ＮＨ−アリール、ＣＦ３、アルキル、及びアルコキシから選択され；
各Ｒ７は、独立して、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、ＣＯＯ−アルキル、アラルキイ、ヘテロシクリル、Ｓ−アルキル、ＳＯ−アルキル、Ｓ０２−アルキル、Ｓ０２−アリール、ＣＯＯＨ、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＮＨ２、ＮＨ−アルキル、Ｎ（アルキル）２、ＣＦ３、アルキル、及びアルコキシから選択される）
の化合物である。
【００２７】
一実施態様では、グアナベンズ誘導体は、
【表１】
2021529729.tif 000005
2021529729.tif 000006
2021529729.tif 000007
及びこれらの薬学的に許容し得る塩からなる群から選択される。
【００２８】
一実施態様では、本発明の方法で使用されるグアナベンズ誘導体は、以下の特許出願に記載されている：米国特許第３，９８２，０２０号；米国特許出願公開第２００４／００６８０１７号；国際公開公報第２００８／０６１６４７号；同第２００５／０３１０００号；欧州特許第１９０８４６４号；米国特許第７９３２４２２号；欧州特許第２０７６２５３号；国際公開公報第２００８／０４１１３４号；米国特許出願公開第２０１７０２４７３４４号；同第２０１７０１５１１９６号；同第２０１７０１５２２２０号；国際公開公報第２００７０６０３４２号；同第２００８０４１１３３号；米国特許出願公開第２００９０３０６４３０号。
【００２９】
幾つかの実施態様では、グアナベンズ又はその誘導体は、処置的に有効な量で被験体に投与される。
【００３０】
用語「投与する」又は「投与」とは、例えば、粘膜、皮内、静脈内、皮下、筋肉内への送達、及び／又は本明細書に記載されているか若しくは当技術分野において公知である任意の他の物理的送達方法によって、体外に存在する物質（例えば、グアナベンズ又はその誘導体）を被験体に注射又は他の方法で物理的に送達する行為を指す。疾患又はその症状を処置するとき、物質の投与は、典型的には、疾患又はその症状の発生後に行われる。疾患又はその症状を予防するとき、物質の投与は、典型的には、疾患又はその症状の発生前に行われる。
【００３１】
「処置的に有効な量」とは、任意の医学的処置に適用可能な合理的なベネフィット／リスク比で自己免疫疾患を処置する方法において使用するのに十分なグアナベンズ又はその誘導体の量を意味する。本発明の化合物及び組成物の合計１日用量は、適切な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることが理解されるであろう。任意の特定の被験体についての具体的な処置的に有効な用量レベルは、被験体の年齢、体重、一般的健康状態、性別、及び食生活；使用される具体的な化合物の投与時間、投与経路、及び排出速度；処置期間；使用される具体的なポリペプチドと組み合わせて又は同時に使用される薬物；並びに医学分野で周知の類似要因を含む、様々な要因に依存する。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要な用量よりも低いレベルの化合物の用量で開始し、該所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させることは、当技術分野の技能の範囲内で周知である。しかし、生成物の１日用量は、成人１人当たり１日当たり０．０１〜１，０００mgという広範囲にわたって変動し得る。典型的には、処置される被験体に対する投与量を症状に合わせて調整するために、組成物は活性成分 ０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０、及び５００mgを含有する。医薬は、典型的には、活性成分 約０．０１mg〜約５００mg、典型的には、活性成分 １mg〜約１００mgを含有する。有効量の薬物は、通常、１日当たり０．０００２mg/kg（体重）〜約２０mg/kg（体重）、特に、１日当たり約０．００１mg/kg（体重）〜７mg/kg（体重）の投与量レベルで供給される。
【００３２】
本発明に係る組成物は、非経口、経皮、経口、直腸内、肺内、皮下、舌下、局所、又は鼻腔内への投与用に製剤化される。好適な単位投与形態は、錠剤、ゲルカプセル剤、散剤、顆粒剤、及び経口用の懸濁剤又は液剤等の経口経路形態、舌下及びバッカルの投与形態、エアゾール、インプラント、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮下、経皮、くも膜下腔内、及び鼻腔内の投与形態、並びに直腸内投与形態を含む。一実施態様では、本発明に係る組成物は、経口投与用に製剤化される。一実施態様では、本発明に係る組成物は、静脈内投与用に製剤化される。一実施態様では、本発明に係る組成物は、局所投与用に製剤化される。典型的には、本発明の活性成分（すなわち、グアナベンズ又はその誘導体）を薬学的に許容し得る賦形剤及び任意で徐放性マトリクス（例えば、生分解性ポリマー）と合わせて、医薬組成物を形成する。用語「薬学的に」又は「薬学的に許容し得る」とは、必要に応じて、哺乳類、特にヒトに投与したとき、副作用、アレルギー反応、又は他の有害反応を生じさせない分子実体及び組成物を指す。薬学的に許容し得る担体又は賦形剤とは、非毒性の固体、半固体又は液体の充填剤、希釈剤、封入材料、又は任意の種類の製剤補助剤を指す。また、担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、これらの好適な混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散媒であってもよい。例えば、レシチン等のコーティングを使用することによって、分散液の場合は必要な粒径を維持することによって、及び界面活性剤を使用することによって、適切な流動性を維持することができる。微生物の作用は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等の様々な抗菌剤及び抗真菌剤によって阻止することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン等の吸収を遅延させる薬剤を該組成物中で使用することによって持続的に吸収させることができる。本発明の医薬組成物では、本発明の活性成分は、単位投与形態で、従来の医薬担体との混合物として投与することができる。
【００３３】
幾つかの実施態様では、グアナベンズ又はその誘導体は、別の活性成分と組み合わせて被験体に投与される。幾つかの実施態様では、本発明のグアナベンズ又はその誘導体は、考慮される自己免疫疾患の標準的な処置と組み合わせて被験体に投与される。
【００３４】
本発明は、更に、グアナベンズ又はその誘導体を含む医薬組成物に関する。
【００３５】
以下の図面及び実施例によって本発明を更に説明する。しかし、これら実施例及び図面は、いかなる形でも、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１Ａ】グアナベンズは、マウスFlt3-L DC及びヒト血液pDCにおいて、TLR3及びTLR9の活性化を阻害する。Ａ）１０μg/mL ポリI:C LMW（DC1中のTLR3）又は１μM ODN 1585（pDC中のTLR9）で、ソートされた骨髄由来のFlt3L-DCを６時間活性化した。GBZは５０μMで添加され、活性化された細胞におけるIFN-β及びインターロイキン−６(IL-6）の産生を阻害した。
【図１Ｂ】グアナベンズは、マウスFlt3-L DC及びヒト血液pDCにおいて、TLR3及びTLR9の活性化を阻害する。Ｂ）レポーターHEK-Blue（商標）細胞において発現したhTLR4、hTLR3、hTLR9、及びhTLR7は、GBZによって阻害される。TLR発現HEK-Blue（商標）細胞を、それぞれ１００ng/mL LPS、１０μg/mL ポリI:C LMW、２．５μM ODN 2006、又は５μg/mL イミキモドでそれぞれ活性化した。GBZは５０μMで添加した。４０５nmにおける吸光度として、SEAP活性を通して間接的にTLR活性を測定した。GBZは、ヒトTLR3、TLR7、及びTLR9のシグナル伝達を阻害したが、TLR4は阻害しなかった。
【図１Ｃ】グアナベンズは、マウスFlt3-L DC及びヒト血液pDCにおいて、TLR3及びTLR9の活性化を阻害する。Ｃ）ヒト初代pDCを血液から単離し、３μM CpG ODN 2216（上）又は２％ 抗DNA IgGを含有するループス患者由来の血清（下）で活性化した。GBZは５０μMで添加した。分泌されたIFN-α及びTNF-αのタンパク質濃度を、示されている時点又は１６時間で測定した。少なくともｎ＝３の独立した実験において両側ｔ検定を用いて統計的有意性を決定した（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００５；＊＊＊ｐ＜０．０００５）。
【図２Ａ】グアナベンズで処理したWT及びGadd34欠損の胎仔線維芽細胞（MEF）における、細胞質dsRNA（ポリI:C）に応答したインターフェロンβ（IFNb)産生。  （Ａ）グアナベンズ（GBZ）による処理後に、リポフェクトされたdsRNA（ポリI:C）に応答したIFNb発現をqPCR（mRNA）により測定した。
【図２Ｂ】グアナベンズで処理したWT及びGadd34欠損の胎仔線維芽細胞（MEF）における、細胞質dsRNA（ポリI:C）に応答したインターフェロンβ（IFNb)産生。  （Ｂ）グアナベンズ（GBZ）による処理後に、リポフェクトされたdsRNA（ポリI:C）に応答したIFNb発現をELISA（分泌されたタンパク質）により測定した。
【図２Ｃ】グアナベンズで処理したWT及びGadd34欠損の胎仔線維芽細胞（MEF）における、細胞質dsRNA（ポリI:C）に応答したインターフェロンβ（IFNb)産生。  （Ｃ）GBZの存在下でリポフェクトされたポリI:Cに応答した、IFN-β mRNA発現を駆動する、リン酸化による転写IRF3の活性化を、WT及びGadd34欠損の動物(ΔC/ΔC、KO、又は-/-)においてウエスタンブロットによってモニタリングした。
【図２Ｄ】グアナベンズで処理したWT及びGadd34欠損の胎仔線維芽細胞（MEF）における、細胞質dsRNA（ポリI:C）に応答したインターフェロンβ（IFNb)産生。  （Ｄ）eIF2α A/A突然変異体MEF（GADD34が標的とするセリン５２においてeIF2αをリン酸化することができず、タンパク質合成を阻害することができない）も、IFN-β産生及びIRF3活性化について試験した。この結果は、グアナベンズが、RIG-I様（RLR）dsRNA感知経路を阻害し、IRF3活性化、並びに転写及び翻訳のレベルの両方においてインターフェロンβ発現を阻害することができ、これは、GADD34活性とは無関係であることを示す。
【図３Ａ】グアナベンズは、TLR9依存性サイトカインショックからマウスを救助する。  WT及びGADD34ΔC/ΔCのマウスに、D-galN（２０mg/マウス）、CpG ODN 1826又は対照マウスについてはPBS（５０μg/２０ｇ）、GBZ又はクロニジン（２mg/kg）を注射した。（Ａ）C57/BL6マウスの生存を、４８時間後の全生存率として、又はカプランマイヤープロットにおいて表す。
【図３Ｂ】グアナベンズは、TLR9依存性サイトカインショックからマウスを救助する。  WT及びGADD34ΔC/ΔCのマウスに、D-galN（２０mg/マウス）、CpG ODN 1826又は対照マウスについてはPBS（５０μg/２０ｇ）、GBZ又はクロニジン（２mg/kg）を注射した。（Ｂ）FVB（WT）及びFVB GADD34ΔC/ΔCのマウスの生存を、４８時間後の全生存率として、又はカプランマイヤープロットにおいて表す。
【図３Ｃ】グアナベンズは、TLR9依存性サイトカインショックからマウスを救助する。  WT及びGADD34ΔC/ΔCのマウスに、D-galN（２０mg/マウス）、CpG ODN 1826又は対照マウスについてはPBS（５０μg/２０ｇ）、GBZ又はクロニジン（２mg/kg）を注射した。（Ｃ）C57/BL6マウスにおける循環TNF-α、IL-10、及びIL-6の濃度を、CpG ODN 1826の１時間後及び／又は３時間後に測定した。
【図３Ｄ】グアナベンズは、TLR9依存性サイトカインショックからマウスを救助する。  WT及びGADD34ΔC/ΔCのマウスに、D-galN（２０mg/マウス）、CpG ODN 1826又は対照マウスについてはPBS（５０μg/２０ｇ）、GBZ又はクロニジン（２mg/kg）を注射した。（Ｄ）肝組織の損傷及び組織学的スコアを、専門の解剖病理学者によって盲検的に決定した。一元配置分散分析、続いて、チューキー範囲検定によるサンプル比較において、またログランク検定、続いて、ベンジャミン−エキュティエリ補正を使用した生存曲線において、統計的有意性を決定した（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００５；＊＊＊ｐ＜０．０００５）。
【図４Ａ】グアナベンズはプリスタン注射モデルにおいてループス様症状を減少させる。  ７日目に、マウスにCpG ODN 1585（５０μg/２０ｇ）を注射した。循環自己抗体レベルを投与するために月１回血液を採取した。疾患誘導後２４週目にマウスを殺処分した。（Ａ）１４日目における腹膜浸出細胞集団（PEC）のフローサイトメトリー分析。
【図４Ｂ】グアナベンズはプリスタン注射モデルにおいてループス様症状を減少させる。  ７日目に、マウスにCpG ODN 1585（５０μg/２０ｇ）を注射した。循環自己抗体レベルを投与するために月１回血液を採取した。疾患誘導後２４週目にマウスを殺処分した。（Ｂ）２４週目にマウスを殺処分し、ISG及びサイトカイン（TNF-α）の遺伝子発現をPEC細胞に対するqPCRによって求めた。両側スチューデントｔ検定を用いて統計的有意性を決定した（＊ｐ＜０．０５）。
【図４Ｃ】グアナベンズはプリスタン注射モデルにおいてループス様症状を減少させる。  ７日目に、マウスにCpG ODN 1585（５０μg/２０ｇ）を注射した。循環自己抗体レベルを投与するために月１回血液を採取した。疾患誘導後２４週目にマウスを殺処分した。（Ｃ）２４週目における循環抗RNA抗体のレベル（対照マウスに対して正規化）、抗核抗体のレベル（任意の単位）、腹腔における脂肪肉芽腫の存在（任意のスコア）、及び糸球体症の存在（解剖病理学者によって盲検的に決定された組織学的スコア）。一元配置分散分析、続いて、チューキー範囲検定によって、統計的有意性を決定した（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００５；＊＊＊ｐ＜０．０００５）。N.S.、有意でない、図中のｎ値はマウスの数を示す。
【００３７】
実施例：
材料及び方法
細胞培養
FLT3リガンド又はGM-CSFのいずれかを用いて、６〜８週齢の雄マウスの骨髄からBM由来のDCをインビトロで分化させた。Flt3L-DCを６日目と７日目との間に実験に使用した。B16-Flt3Lハイブリドーマ細胞を用いてFlt3Lを生成した。骨髄前駆細胞を６ウェルプレートに１．５ １０６細胞/mL、４mL/ウェルでプレーティングし、RPMI（GIBCO）、１０％ FCS（Sigma Aldrich）、１００ユニット/mL ペニシリン及び１００μg/mL ストレプトマイシン（GIBCO）、５０μM ｂ−メルカプトエタノール（VWR）、並びにFlt3Lと共に培養した。ソートされたFlt3L-DCについては、７日目に冷PBS ２％ FCSを用いて細胞を穏やかに収集し、４℃にて５分間１２００rpmで遠心分離し、計数し、４℃で３０分間染色した。細胞をFACS ARIASorpでソートした。細胞は常に氷上で維持した。ソーティング後、補充したFlt3L-DC培地に０．２．１０６細胞/ウェルの濃度で細胞を再懸濁させ、９６ウェルＵ底プレートにプレーティングした。GM-CSF DCを生成し、分化６日目で実験に使用した。
【００３８】
試薬及び分子生物学
ODN 2006、2216、1585及び1826、Poly I:C（高分子量及び低分子量）は、InvivoGen, San Diego, CA製；リポ多糖（Escherichia coli O55:B5）、クロニジン、クロロキン、D-(+)-ガラクトサミン塩酸塩、及び25-HCは、Sigma Aldrich製；グアナベンズはTocris Bioscience製である。定量PCRについては、RNeasy Mini Kit（Qiagen）を用いて全RNAを抽出し、精製した。全RNA １００ng〜１μgを、SuperScript IIを用いて逆転写に供した。7500Fast（Applied Biosystems）を用いて、SYBRグリーン法により各遺伝子転写物を定量した。内部ハウスキーピング遺伝子の発現に対して正規化することにより、各転写物の相対量を求めた。
【００３９】
マウス脾臓細胞
脾細胞をLiberase TLを注入して解離させ、続いて、３７℃で２５分間インキュベートした。MACSバッファ（１×PBS＋１％ FBS＋２mM EDTA）を用いて細胞を洗浄し、セルストレーナー７０μmに通し、次いで、４５０RCF、４℃で５分間遠心分離した。eBioscience製の市販バッファを用いて赤血球を溶解させた。Miltenyi製のCD11c+ポジティブセレクションキットを用いて樹状細胞を精製した。次いで、脾臓DCをFlt3L-DCと同じ培地に１．１０６細胞/mLで再懸濁させ、２mL×ウェルで１２ウェルプレートにプレーティングした。Miltenyi製のネガティブセレクションキットであるＢ細胞分離キットを用いてＢリンパ球を精製した。次いで、RPMI（GIBCO）、１０％ FCS（Sigma Aldrich)、１×グルタミン、１×非必須アミノ酸、１０mM HEPES（以上全てGIBCO製）、５０μM ｂ−メルカプトエタノール（VWR）で構成される培地にＢ細胞を再懸濁させた。９６ウェル平底プレートに１×１０＾６細胞／ウェルで細胞をプレーティングした。
【００４０】
ヒトpDC及びＢ細胞
Ficoll-Paque PLUS（GE Healthcare）を用いた密度勾配により、全血からヒトPBMCを単離し、続いて、Percoll PLUS（GE Healthcare）の密度勾配により、pDCを含有する単球系統画分から、Ｂ細胞を含有するリンパ球画分を分離した。Miltenyi製のネガティブセレクションキットを用いて両細胞型を単離した：B cell isolation II human（Ｂ細胞用）及びplasmacytoid dendritic cells isolation II human（pDC用）。１０％FCSを含有し、１０ng/mL IL-3を補充したRPMI 1640培地中において０．５ １０＾６細胞/mLでpDCを培養した。１０％ FCSを含有し、１００ユニット/mL ペニシリン及び１００μg/mL ストレプトマイシン（GIBCO）、並びに１×Ｌ−グルタミン（GIBCO）を補充したRPMI 1640培地中において０．５ １０＾６細胞/mLでＢリンパ球を培養した。両細胞型を９６ウェルＵ底プレートにプレーティングした。
【００４１】
細胞株
１０％FCS（Sigma Aldrich）及び適切な選択抗生物質を添加したDMEM中で、HEK 293 hTLRを増殖させた。RPMI（GIBCO）、１０％ FCS（Sigma Aldrich）、５０μM ｂ−メルカプトエタノール（VWR）中でA20細胞を増殖させた。RPMI（GIBCO）、１０％ FCS（Sigma Aldrich）、２mM Ｌ−グルタミン、１×非必須アミノ酸、１０mM HEPES、１mM ピルビン酸ナトリウム（以上全てGIBCO製）中でCal-1を増殖させた。実験を行うために、１％ FCSを含む完全培地中、１×１０＾６細胞/mL、１mL×ウェルで、１６時間前に細胞を１２ウェルプレートにプレーティングした。全ての細胞株はマイコプラズマを含んでおらず、３７℃及び５％ ＣＯ２で維持された。
【００４２】
フローサイトメトリー
冷FACSバッファ（PBS、２％ FCS、２mM EDTA）で希釈した抗体カクテルと共に、細胞懸濁液を４℃で３０分間インキュベートした。細胞内染色のために、細胞をFix & Permキット（BD Biosciences）で透過処理した。LSR 561マシン（BD Biosciences）を用いてフローサイトメトリーを行い、FlowJo（Tree Star）を用いてデータを解析した。
【００４３】
共焦点顕微鏡観察及びPLAアッセイ
Cal-1細胞を収集し、４℃で５分間１２００RPMで遠心分離し、次いで、予め加温しておいた無血清培地に再懸濁させ、１％ アルシアンブルーで被覆した１２mmカバーガラス上に滴下した。次いで、カバーガラスを３７℃で２０分間インキュベートし、３％ パラホルムアルデヒドで固定した。次いで、Sigma Aldrich Duolinkキットを使用し、製造元の指示に従って、近接ライゲーションアッセイを実施した。使用した一次抗体は、抗TLR9（H-100）Santa Cruz、ウサギポリクローナル（１：５０）；抗Vamp3（N-12）、Santa Cruz、ヤギポリクローナル（１：１００）；抗ヒトMyD88、R&D system、ヤギポリクローナル（１：１００）；抗ヒトIRF7（G-8）、Santa Cruz、マウスIgG2a（１：１００）である。二次抗体として、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートさせたDuolink PLAプローブ（ウサギのPLUS及びヤギ又はマウスのMINUS）を使用した。Duolink Ligation原液（１：５）及びDuolink Ligase（１：４０）からなるライゲーション溶液中でサンプルをインキュベートした。Duolink Detection Kit Orangeを用いて、増幅されたプローブの検出を行った。共焦点顕微鏡LSM580（Carl Zeiss）、６３×対物レンズ、及び付属のイメージングソフトウェアを用いて画像を撮影した。
【００４４】
遺伝子発現解析
RNeasyキット（Qiagen）で全RNAを単離した。ランダムヘキサマー及びsupcript II逆転写酵素（Invitrogen）を用いてcDNAを合成した。Applied Biosystems PRISM 7700 Sequence Detection Systemを用いて定量的リアルタイムPCR解析を行った。Affymetrixマイクロアレイ解析のために、５％ FCS、５０μM β-メルカプトエタノール、及びGM-CSFを補充したRPMI中でGM-CSF DCを培養した。６日間分化させた細胞を微生物刺激で８時間処理し、収集の後溶解した。細菌の増殖を避けるために、対照及びプロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）処理したDCを静菌性クロラムフェニコールと共にインキュベートした。グアナベンズは５０μMで使用した。Affymetrix Expression Analysis Technical Manualに従って、アレイ（Affymetrix GeneChip Mouse Gene 1.0ST）へのハイブリダイゼーション及びイメージスキャニングを行った。limmaGUIソフトウェア（R/Bioconductor, Boston, MA, USA）を用いて、遺伝子発現マイクロアレイの生データを正規化した。データには、GEOリポジトリアクセッション番号GSE90831を通してアクセスすることができる。
【００４５】
翻訳強度測定
翻訳の強度を測定するためにピューロマイシン標識を行った。ピューロマイシン（Sigma、最低９８％ TLC、細胞培養試験済み、P8833、PBSで希釈）を２．５μg/mLで培養培地に添加し、３７℃及び５％ ＣＯ２で１５分間細胞をインキュベートした。細胞を固定し、cytofix/cytopermバッファ（BD Biosciences）で透過処理し、Perm/Washバッファ（BD Biosciences）で希釈した、Alexa 488と直接結合している抗ピューロマイシン12D10抗体で染色した。LSR 561マシン（BD Biosciences）を用いてフローサイトメトリーを行い、FlowJo（Tree Star）を用いてデータを解析した。
【００４６】
イムノブロッティング
Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail Tablets（Roche）を補充した、１％ Triton X-100、５０mM Hepes、１０mM NaCl、２．５mM MgCl2、２mM EDTA、１０％ グリセロールで細胞を溶解させた。BCAプロテインアッセイ（Pierce）を用いてタンパク質の定量を行った。Triton X-100可溶性物質 ２０〜２５μgを１０％ SDS-PAGEにロードした後、免疫ブロッティング及び化学発光検出（SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate、Pierce）を行った。eIF2αに対するウサギポリクローナル抗体（D7D3）は、Cell Signalling Technologiesから購入した。P-eIF2α（Ser 51）に対するウサギポリクローナル抗体は、Abcam製であった。β−アクチンに対するマウスモノクローナル抗体は、それぞれ、Sigma及びUpstate製であった。二次抗体は、Jackson ImmunoResearch Laboratoriesから購入した。
【００４７】
サイトカイン測定
Mouse Interferon Beta ELISAキット（PBL InterferonSource）を用いて培養上清中のマウスIFN-βの定量を行った；製造元の指示に従って、それぞれ、ELISAキット（eBioscience）を用いて、マウスのIL-6、TNFα、IL-10、ヒトTNFα、及びヒトIFNαを定量した。
【００４８】
動物試験
野生型C57BL/6マウスは、Jackson Laboratoriesから購入した。GADD34ΔC/ΔCマウス（FVBバックグラウンド）及び野生型同腹仔は、元々L. Wrabetz（San Raffaele Institute, Milan）から入手され、特定病原体除去条件下においてCIMLの動物施設で維持された。この試験は、フランス農務省及び欧州連合の実験動物の管理と使用に関する指針における推奨に厳密に従って実施した。生存マウスに対して実験を行うために、フランス農務省によって認定されたCIML動物施設に動物を収容した。全ての動物実験は、Direction Departementale des Services Veterinaires des Bouches du Rhone（承認番号A13-543）により承認された。動物の苦痛を最小限に抑えるためにあらゆる努力を行った。
【００４９】
TMPDモデル
６週齢の野生型雌マウスC57BL/6に、TMPD(Sigma Aldrich)又はPBS ５００μLをi.p.注射した。１日目から１３日目まで、２mg/kg GBZ又はPBS/DMSOを２日ごとにマウスにi.p.注射した。７日目に５０μg／２０ｇ（マウス） ODN 1585又はPBSをマウスにi.p.注射した。１４日目又は６ヶ月後にマウスを殺処分した。１４日目に、フローサイトメトリー分析のために腹腔滲出細胞（PEC）を採取した。６ヶ月後に、免疫組織化学的検査のために腎臓を摘出した。６ヶ月の間、TMPDの注射後２ヶ月目から動物の殺処分の１週間前まで月１回血清採取を行った。循環自己抗体の濃度を評価するために血清を使用した。抗RNA ELISA。RNAに対する自己抗体の評価を、PBS中５μg/mL マウスRNA又はDNAを５０μL／ウェルでELISAプレートにコーティングし、４℃で一晩インキュベートすることによって行った。翌日、作業溶液（PBS＋０．０５％ Tween20＋１％BSA）中の１：５０又は１：１００希釈された血清サンプルと共にプレートをインキュベートし、HRP標識ヤギ抗マウスIgG（Southern Biotech）を用いて試料（assay）を現像した。
【００５０】
サイトカインショックモデル
８週齢の野生型雌マウスC57BL/6に、２mg/kg GBZ、クロニジン、又はPBS/DMSOをi.p.注射した。１時間後、該マウスに２０mg/マウス d-GalN及び５０μg/２０ｇ ODN 1826（又はPBS）をi.p.注射した。１２時間ごとに最長４８時間までマウスの生存率をチェックした。幾つかの実験では、D-galN注入の１時間及び３時間後に血清を回収した。循環サイトカイン（TNFα、IL-6、IFNβ、IL-10、IL-12）を測定するために血清を使用した。幾つかの実験では、２日後に免疫組織化学的検査のために肝臓を摘出した。i.p.注射には、１mLの注射器と２５ゲージの針を使用した。１８ゲージの針で頬から血液を採取した；TMPDモデルでは、倫理規定を尊重して毎回２００μLを超えないように採取した。
【００５１】
組織の組織学
マウスの腎臓及び肝臓を１０％ 緩衝ホルマリンで２４時間固定し、次いで、組織を脱水し、パラフィンに包埋した。ミクロトームLeica RM2245を用いて３．５μmの組織切片を切り出した。LeicaオートステイナーXLを用いてヘマトキシリン−エオシン染色を自動で行った。最後に、スライドをエンテランを用いてマウントし、室温で維持した。解剖病理学者が生検を分析し、盲検的に臨床スコアを決定した。Nikon Eclipseで写真を撮影した。
【００５２】
肝損傷についての解剖病理学的スコアリングシステム
ａ）小葉炎
０−炎症なし、１−軽度の小葉炎（肝実質の＜１０％）、２−中等度の小葉炎（肝実質の１０〜５０％）、３−重度の小葉炎（肝実質の＞５０％）。
ｂ）門脈炎
０−門脈炎なし、１−軽度の門脈炎（門脈路の＜１／３）、２−中等度の門脈炎（門脈路の約５０％）、３−重度の門脈炎（門脈路の＞２／３）。
門脈炎スコアと小葉炎スコアを加算＝炎症スコア
ｃ）壊死
０−壊死なし、１−肝実質の＜１０％が壊死、２−肝実質の１０〜２５％が壊死、３−肝実質の＞２５％が壊死
炎症スコアと壊死スコアを加算＝合計組織学的スコア
【００５３】
統計解析
GraphPad Prismソフトウェアを用いて統計解析を行った。幾つかの条件を比較する場合、条件のペア間の有意性を評価するために、一元配置分散分析を行い、続いて、チューキー範囲検定を行った。検定する条件が２つだけの場合、スチューデントのｔ検定又はウエルチのｔ検定を行った（等分散性仮説の妥当性に応じて）。生存曲線の統計解析は、ログランク検定を用いて行い、続いて、必要に応じてベンジャミン−エキュティエリ補正を行った。
【００５４】
結果
グアナベンズ処理は、DCにおけるGADD34遺伝子の不活性化を部分的に表現型コピーする
本発明者らは、GADD34ΔC/ΔCマウス由来のGM-CSF誘導骨髄由来DCが示す、dsRNA模倣物のポリリボイノシン：ポリリボシチジン酸（ポリ（I:C））に応答してIFNβ及びIL-6を発現させる能力が限定的であることを以前に示した。この所見を他のDCサブセット及びTLRリガンドにも広げることができるかどうかを調べた。脾臓から直接単離した、又はFlt3L-若しくはGM-CSFによって誘導された分化のいずれかを用いて骨髄前駆細胞からインビトロで生成した、WT及びGADD34ΔC/ΔCのDCを、LPS、poly(I:C)、又はCpG ODNによる刺激に供し、IFN-β及びIL-6の産生について分析した（データは示さない）。Flt3L-DCは、インビボでみられる主なDCサブセット（DC1、DC2、及びpDC）を全て包含し、TLR3、TLR4、又はTLR9のいずれかを優先的に発現するので、これらインビトロ実験によく適している。ポリ(I:C)で刺激した後、Flt3L-DCは、機能的GADD34の非存在下でIFN-β及びIL-6の産生の減少を示し（データは示さない）、このことから、GADD34ΔC/ΔCGM-CSF-DCで観察されたサイトカイン欠損が確認された（データは示さない）。興味深いことに、GM-DCにおけるGADD34欠損によって影響を受けなかった、LPSに応答するIFN-β産生は、GADD34ΔC/ΔCFlt3L-DCにおいて増強され（データは示さない）、IL-6分泌については逆の状況が当てはまった（データは示さない）。インビトロで生成された細胞と比較すると、マウス脾臓から直接単離されたCD11c+ DCもGADD34の不活性化に対して感受性であった（データは示さない）が、IL-6産生の阻害はより効率が低かったことから、GADD34の影響は、試験する細胞型及び使用する刺激又は分化条件によって異なることが示唆される。
【００５５】
次に、GADD34/PP1c相互作用を阻害することが既に記述されている小さなタンパク質恒常性化合物であるグアナベンズ（GBZ、５０μM）による薬理学的処理が、DCにおけるGadd34遺伝子の不活性化の影響を再現できるかどうかを試験した（データは示さない）。IL-6産生については、ほとんどの場合、GBZは、GADD34欠損と重ね合わせ可能な（superimposable）活性を有していた。しかし、本発明者らは、GBZは、Gadd34遺伝子の不活性化よりもはるかに強い、TLR9刺激に応答したIFN-β産生を阻害する能力を有することを見出した。この効果は、GADD34ΔC/ΔCFlt3L-DCをCpG ODNで刺激した際に特に強く（GBZ処理時にはIFN-βもIL-6も産生することができなかった）、これはまた、機能のあるGADD34の欠如と相乗的に作用した。最近Crespillo-Casado及び共同研究者によって提唱された通り、これら相加的効果はまた、GBZがGADD34/PP1c結合とは無関係にタンパク質の恒常性に干渉することを示唆した。
【００５６】
グアナベンズは、ポリ(I:C)及びCpG ODNによるDCの活性化の強力な阻害剤である
GBZによって引き起こされるTLR3及びTLR9の阻害の強さが特に顕著であったので、この効果について更に調べることにした。マウスのDCサブセットの中で、TLR3とTLR9の最高発現は、それぞれ、CD8+様古典的DC（cDC1）及びpDCでみられる。Flt3Lで処理した骨髄培養物由来のマウスCD11c+/MHCII+ DCを、cDC1（CD24+/Sirpα-）、cDC2（CD11b+/Sirpα+）、及びpDC（BST2+/Siglec H+/B220+）としてソートした(データは示さない)。次いで、ソートされたTLR3発現cDC1を低分子量（LMW）ポリ（I:C）で活性化し、一方、TLR9発現pDCは、GBZの存在下又は非存在下においてCpG-A ODNで刺激した。いずれの場合も、GBZ処理は、細胞の適応度に全く影響を与えることなく、pDCによるサイトカイン産生、特にIFN-β及びIL-6の分泌をほぼ消失させた（図１Ａ）。ifna4、Tnfa、isg15、及びIl12を含むpDCにおける重要な遺伝子発現（全てqPCRによってモニタリング）の喪失によって判断されるように、GBZは、CpG ODNに対する転写応答も完全に阻害した（データは示さない）。
【００５７】
マウスのTLR3及びTLR9に対するGBZの効率に鑑みて、本発明者による所見の妥当性を広げるために、ヒトのTLRに目を向けた。まず、TLR3、TLR4、TLR7、TLR9を発現しているHEK-293細胞における分泌アルカリホスファターゼ（SEAP）レポーターレベルをモニタリングすることにより、NF-κBシグナル伝達におけるGBZに媒介される阻害を評価した（図１Ｂ）。予想通り、５０μM GBZによる処理は、SEAPレポーターのTLR3-、TLR7-、及びTLR9-依存性の活性化を阻害したが、TLR4では阻害しなかった。次に、ループス患者由来のCpG-A ODN又はDNA-ICのいずれかを含有する血清で活性化された、新たに単離したBDCA4+/CD123+ヒト初代血液pDCを処理した（図１Ｃ）。GBZは、使用したリガンドとは無関係に、刺激されたヒトpDCによるＩ型IFN及びTNF-αの産生を阻止した。本発明者らは、これら所見を、マウス（データは示さない）又はヒト起源（データは示さない）のいずれかから、ヒトCAL-1 pDC細胞株（データは示さない）及び初代Ｂ細胞の両方に広げることができた。次に、LPS又はウイルスによるTLR活性化の下流の十分に特性評価された早期シグナル伝達事象である、40Sリボソームタンパク質S6（rpS6）のリン酸化のphospho-flow検出を用いることによって、TLR9伝達経路の機能を評価した。GBZで処理したCAL-1及びヒトＢ細胞の両方が、通常１５分〜１時間のCpG曝露後に誘導されるrpS6リン酸化の大きな減少を示し（データは示さない）、このことは、GBZがTLR9シグナル伝達経路の上流工程を阻害することを示唆している。
【００５８】
興味深いことに、GBZは、マウス胎仔線維芽細胞のポリ(I:C)を用いたリポフェクションの際にも、IRF3の活性化とその後のＩ型IFN-βの転写を阻害し、このことは、GBZが核酸による細胞質RIG I様受容体の活性化も阻害することを示す（図２）。
【００５９】
グアナベンズは、GADD34とは無関係に、CpGに誘導されるサイトカインショックからマウスを保護する
ヒト病態についての低血圧適応症に加えて、マウスで試験されているように、ミスフォールドタンパク質ストレス関連の疾患についても、グアナベンズで処置できる可能性がある。これら実験の主な焦点は、神経細胞の変性及び炎症の両方を特徴とする神経変性疾患に対するGBZの影響を評価することであった。対照的な結果にもかかわらず、マウスにおけるこれら実験から、１．８時間の血漿半減期及び２mg/kgを腹腔内（i.p.）に単回ボーラス注射した数時間後における約７μMの脊髄への蓄積を含む、GBZに関する重要な薬物動態データが得られた。Ｄ−ガラクトサミン（D-galN）肝感作モデルを利用し、続いてCpG ODNを注射することによって、インビボにおけるTLR9に対するGBZの阻害活性を試験することにした（図３Ａ）。CpGを注射した動物の生存率は、４８時間後で２０％に満たなかった。GADD34阻害活性を有さない別のα２アドレナリン作動性受容体アゴニストであるクロニジン（Ｎ−（２，６−ジクロロフェニル）−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール−２−アミン）を動物に同時注射しても、この値は実質的に変化しなかった。そこで、D-galN及びCpGの注射によって誘導される一般毒性に対するα２−アドレナリン作動性阻害性受容体シグナル伝達及び低血圧の影響を評価するために、本研究全体を通して、対照化合物としてクロニジンを使用した。GBZ（２mg/kg）をCpGと同時注射した場合、動物の生存率の劇的な回復が観察され、４８時間後の生存率が最高７０％に達した。重要なことに、GADD34ΔC/ΔCマウスを調べたところ、D-galN及びCpGの注射に対してWT動物と同じ感受性を示し、GADD34の不活性化にもかかわらず、同様にGBZの送達によって死から保護された（図３Ｂ）。したがって、GBZはインビボにおいてTLR9に対して強力な阻害活性を発揮し、これはGADD34とは無関係であるが、効率は低下する（−２８％）。それでもこのことは、GBZに誘導されるタンパク質恒常性とGADD34の不活性化との間に、この病理学的モデルでの生存に有利な何らかのクロストークが存在することを示唆している。
【００６０】
WT動物では、CpG注入の１時間後にモニタリングした循環TNF-α及びIL-6の血漿濃度が、GBZ処理により強く減衰した（図３Ｃ）。興味深いことに、循環Ｉ型IFNは検出されないままであったが、抗炎症性サイトカインIL-10の産生は大きく増加しており、このことは、インビボにおいて二次的な抗炎症反応を強化することでも、GBZの保護効果が発揮される可能性があることを示唆している（図３Ｃ）。GBZよりもはるかに効率が低かったものの、クロニジンは、TNF-α及びIL-6の産生に対して、１時間後にはある程度の抑制効果を有していたが、この無力化は３時間後には観察されなかった（図３Ｃ）ことから、低血圧が注射後短期間だけ炎症性サイトカインの拡散低減に寄与している可能性が示唆された。D-galNモデルでは、LPSに誘導される致死性は、全身的な炎症反応から直接にではなく、TNF-αの過剰産生によって誘導されるカスパーゼ依存性の劇症性アポトーシス性肝炎によって誘発されることが示されている。しかし、このCpG誘導致死モデルでは、肝臓の検査及び組織学的スコアから、GBZは肝細胞の生存に対する直接的な保護効果をほとんど有さず（図３Ｄ）、その活性は、肝細胞ではなく免疫細胞による炎症促進性サイトカインの放出を阻害することによって発揮される可能性が最も高いことが示された。
【００６１】
グアナベンズはTMPDにより誘導される自己免疫からマウスを保護する
テトラメチルペンタデカン（TMPD又はプリスタン）の腹腔内注射は、マウスにおいて全身性エリテマトーデス（SLE）様疾患を誘導するために使用される。この病理学的モデルでは、糸球体腎炎及び自己抗体産生は、Ｉ型IFN受容体（IFNAR）を介したシグナル伝達と、「脂肪肉芽腫」（TMPDに対する慢性炎症応答を表し、自己抗体産生の部位である）の形成とに厳密に依存している。炎症を起こした腹腔に動員された単球、並びに内因性TLR7（及び潜在的にTLR9）のリガンドによるその活性化は、このモデルにおけるＩ型IFNの主要な供給源であり、３〜４ヶ月の期間の後に、試験したマウスの遺伝的背景に特有の様々な自己免疫徴候をもたらす。したがって、TMPD誘導性SLEモデルは、誘導性であり、Ｉ型IFN依存性であり、ヒトSLEの特徴の一部を模倣することから、インビボにおいてエンドソームTLRに対するGBZの阻害活性を試験するのに特に適していると考えられる。TLR9依存性活性化を促進して、GBZ処理によって妨げられるはずのＩ型IFN産生を増強するために、CpG ODNのi.p.注射を追加することによって、TMPDにより誘導されるSLEの元のプロトコールを変更した。CpG注射単独で、様々な炎症性細胞集団、特にLy6G+好中球及びLy6C+単球（１４日目には腹腔滲出細胞（PEC）に富んでいた）の動員に対して、TMPDと同等の効果を有しており（データは示さない）、このことは、CpG注射直後に観察されるＩ型IFNシグネチャーの増加によって示される通り、２つの処理が相乗作用を与える可能性を示唆している（データは示さない）。
【００６２】
GBZで処理したか又はしていない、TMPD/CpGを注射したC57BL/6マウス由来のPECをフローサイトメトリーで分析した（図４Ａ）。予想通り、TMPD/CpG処理は腹腔Ｂ細胞数（CD11bdim/-/CD19+）を減少させたが、同時に好中球（Ly6G+/CD11b+）及び炎症性単球（Ly6C+）の動員を増加させた。GBZ注射は、腹腔内への、又は腹膜腔からの免疫細胞の移動を妨げず、このことは、TMPDにより誘導される病態におけるこの重要な工程に薬物が影響を与えないことを示す（データは示さない、図４Ａ）。次に、２種類の異なるマウスコホートの腹腔細胞における、Ｉ型IFNの発現及び関連する転写シグネチャーの測定を試みた（図４Ｂ）。IFN-α又はIFN-α mRNAの一貫した誘導を直接検出することはできなかったが、対照同腹仔と比較して、TMPD＋CpGを注射したマウスから単離したPECでは、TNF-α並びにＩ型IFN誘導性のISG 15及びCH25Hの遺伝子の明らかな転写アップレギュレーションが観察された。しかし、進行中の炎症及びＩ型IFN産生の両方を示すこれら転写反応は、GBZを繰り返し注射することによって強く抑制された（図４Ｂ）。TMPD処理したC57BL/6マウスが、長期的には、抗DNA自己抗体ではなく抗リボ核タンパク質（RNP）又はRNA自己抗体を生成するという強い先入観があることに鑑みて、TMPD注射後２２週目に、循環抗核及び抗RNAの免疫グロブリン（Ig）の血漿濃度を測定した。両方の抗体価は、TMPD及びCpGのみを注射した動物よりも、GBZ処理マウスにおいて実質的に低かった（図４Ｃ）。これらのデータと一致して、GBZ処理したマウスの腹腔内にみられる血漿細胞含有脂肪肉芽腫の数は顕著に少なく、これにより、循環自己抗体濃度が低いことが説明され、細胞内TLR活性に対するGBZの阻害活性が確認された（図４Ｃ）。C57BL/6バックグラウンドで予想された通り、また追加のCpG ODN処理にもかかわらず、本発明者らは、対照動物及びGBZ処理動物の腎臓におけるIg複合体沈着物のレベルに有意な差が観察されるほどに、全体的に十分な糸球体腎炎を誘導することができなかった。全体的にみて、これらデータは、インビボにおいてTLRの核酸活性化を阻害する化合物としてのグアナベンズの有効性を裏付ける。
【００６３】
考察
誘導時、GADD34は、プロテインホスファターゼ1（PP1c）の触媒サブユニットを動員してeIF2αを脱リン酸化し、UPRシグナル伝達を終了させる負のフィードバックループにおいて、タンパク質合成を再開させる。本発明者らは、GADD34が、転写レベル及び翻訳レベルの両方で、炎症促進性サイトカイン及びＩ型IFNの発現も制御していることを証明した。したがって、GADD34は、ストレスシグナル伝達カスケードを利用して自然免疫応答を増強する「抗微生物ストレス応答」（MSR）として説明されているものの一部である。GADD34/PP1c複合体は、セリン４１２（Ser412）でTGF-β活性化キナーゼ１（TAK1）を脱リン酸化することにより、MAPK及びNF-κBシグナル伝達に直接作用し、その結果、TLR活性化の際にTNF-α及びIL-6の産生を阻害することが提唱されている。これらデータはその後確認されていないが、代わりに、マクロファージにおけるLPS活性化を制御するための代替手段として、GADD34/PP1によるキナーゼIKKの不活性化が提案された。また、マクロファージにおけるGADD34発現は、LPS刺激とアミノ酸欠乏とが組み合わさった際に、mTORシグナル伝達経路の制御を通してオートファジーを強化し、アポトーシスを抑制する。このように、試験した免疫刺激及び細胞型に応じて、Gadd34欠損の細胞及び動物の応答において大きなばらつきが観察される場合がある可能性がある。
【００６４】
高血圧の処置に用いられるα２アドレナリン作動性受容体アゴニストであるグアナベンズ（GBZ）は、関連するCReP−ホスファターゼ複合体には影響を与えることなく、GADD34/PP1によるeIF2αのストレス誘導性脱リン酸化を選択的に阻害することが提唱されている。本発明者らは、タンパク質恒常性干渉薬GBZが、インビトロにおいてエンドソームTLRシグナル伝達を非常に効率的に阻害し、細胞内TLR刺激後のサイトカインの発現を制御することによって、GADD34遺伝子の不活性化を部分的に模倣することを示した。しかし、Crespillo-Casado及び共同研究者による最近の所見と一致して、本発明者らは、GBZがGADD34の機能とは無関係にTLR9に対して阻害活性を発揮することを実証することができた。自己免疫の２つの主要な細胞主体であるpDC及びＢ細胞の両方において細胞内TLRをブロックするGBZの能力は、様々な急性炎症性疾患の処置にもこの薬物を使用できることを示唆している。GBZの降圧活性は、TLRシグナル伝達に対する薬物の有効性に明らかに関与しておらず、一方では、多くの潜在的な新規適応症についての臨床上のハンディキャップを全体的に構成している可能性がある。他方、SLE患者の５０％は、一般的に肥満、腎臓疾患、及び重要なことにステロイドの長期使用によって引き起こされる高血圧を経験する。したがって、高血圧に対するGBZの効果は、TLR9及び時にはTLR7を阻害する能力と合わさると、長期的には、SLE、又は反復する炎症（flair）を伴う類似の病態を示す他の特定のIFN依存性疾患の患者にとって非常に有益である可能性がある。
【００６５】
α２−アドレナリン作動性受容体アゴニスト活性を欠くように設計された新規のGBZ様薬物（国際公開公報第２０１６／００１３９０号）が現在利用可能になりつつあり、神経変性疾患の処置について現在試験されている。タンパク質恒常性及び免疫の両方に干渉するこれら薬物の複合能力は、組織損傷を更に誘発し、疾患進行に寄与する急性炎症を伴う、ミスフォールドされたタンパク質の蓄積による神経細胞死の増加と共に生じることが多い神経変性疾患の処置において両刃の利点となる可能性がある。また、このような二重の効果は、炎症性サイトカインの放出及び上皮細胞のストレス応答の両方に関与する、マウスのDSS誘導性大腸炎及び潰瘍性大腸炎誘導におけるGBZ処置の保護的役割を説明するものである。
【００６６】
したがって、グアナベンズは、Ｉ型インターフェロン依存性疾患を処置するための新たな薬理学的選択肢となる。ストレス時のタンパク質合成の回復を低減し、免疫細胞におけるTLRのシグナル伝達能力を変化させることによって、GBZ様化合物は、自己免疫及び神経変性の重要な特徴であるタンパク質毒性及び関連する炎症反応の両方を処置する能力を有している可能性がある。しかし、GBZがGADD34とは無関係に活性を発揮するという本発明者らの知見は、サイトカイン産生及びタンパク質恒常性を変化させるための新薬の開発につながるような標的としてのGADD34/PP1cの魅力を損なうものではなく、小さくかつ特異的な薬理学的阻害化合物を単離することができれば、将来的には自己炎症性疾患の処置に更に別の代替案を提供できる可能性がある。
【００６７】
参照文献：
本願全体を通して、本発明が関連する技術分野の状況について様々な参照文献によって説明されている。これら参照文献の開示は、参照により本開示に組み入れられる。
【表２】
2021529729.tif 000008
2021529729.tif 000009
2021529729.tif 000010
2021529729.tif 000011
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2021529729.tif 000013
2021529729.tif 000014
【図１Ａ】
2021529729.tif 000020
【図１Ｂ】
2021529729.tif 000021
【図１Ｃ】
2021529729.tif 000022
【図２Ａ】
2021529729.tif 000023
【図２Ｂ】
2021529729.tif 000024
【図２Ｃ】
2021529729.tif 000025
【図２Ｄ】
2021529729.tif 000026
【図３Ａ】
2021529729.tif 000027
【図３Ｂ】
2021529729.tif 000028
【図３Ｃ】
2021529729.tif 000029
【図３Ｄ】
2021529729.tif 000030
【図４Ａ】
2021529729.tif 000031
【図４Ｂ】
2021529729.tif 000032
【図４Ｃ】
2021529729.tif 000033
【手続補正書】
【提出日】令和3年4月26日(2021.4.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
処置的に有効な量のグアナベンズ又はその誘導体を含む、被験体におけるＩ型IFN依存性病態を処置するための医薬組成物。
【請求項２】
前記被験体が、ヒトである、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記Ｉ型IFN依存性病態が、全身性エリテマトーデス（SLE）、シェーグレン症候群、筋炎、全身性強皮症（SSc）、アイカルディ・グティエール症候群、Ａ型インフルエンザウイルス（IAV）により誘導される重症疾患、若年性特発性関節炎、関節リウマチ、HIV感染症、移植拒絶反応、移植片対宿主病（GVHD）、１型糖尿病、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎及びクローン病）、グレーブス病、顕微鏡的多発性血管炎、ヴェゲナー肉芽腫症、自己免疫性甲状腺疾患、糸球体腎炎、巨細胞性動脈炎、歯周病からなる群から選択される、請求項１又は２記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記Ｉ型IFN依存性病態が、全身性エリテマトーデスである、請求項１又は２記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記グアナベンズの誘導体が、モノハロゲン化（ヘテロ）アリール誘導体である、請求項１〜４のいずれか記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記グアナベンズの誘導体が、式（Ｉ）：
【化１】
2021529729.tif 000034
（式中、
Ｈａｌ＝Ｆ、ＣＩ、Ｂｒ、Ｉ
Ｘは、−ＣＲ１＝又は−Ｎ＝のいずれかであり、
Ｙは、−ＣＲ２＝又は−Ｎ＝のいずれかであり、
Ｚは、−ＣＲ３＝又は−Ｎ＝のいずれかであり、
Ｗは、−ＣＲ４＝又は−Ｎ＝のいずれかであり、
Ｒ１は、Ｈ、Ｈａｌ、アルキル、及びＯ−アルキルから選択され；
Ｒ２は、Ｈ、Ｈａｌ、アルキル、Ｏ−アルキル、及びＣ（０）Ｒ６から選択され；
Ｒ３は、Ｈ、Ｈａｌ、アルキル、及びＯ−アルキルから選択され；
Ｒ４は、Ｈ、ＣＩ、Ｆ、Ｉ、又はＢｒであり；
Ｒ５は、Ｈ、又はアルキル、シクロアルキイ（cycloalkyi）、アラルキイ（aralkyi）、アルケニル、シクロアルケニル、ヘテロシクリル、アリール、Ｃ（０）−アルキル、及びＣ（０）−アリールであり、これらはそれぞれ、場合により１つ以上のＲ７基で置換されており；Ｒ６は、ＯＨ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、アラルキイ、ＮＨ２、ＮＨ−アルキル、Ｎ（アルキル）２、ＮＨ−アリール、ＣＦ３、アルキル、及びアルコキシから選択され；
各Ｒ７は、独立して、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、ＣＯＯ−アルキル、アラルキイ、ヘテロシクリル、Ｓ−アルキル、ＳＯ−アルキル、Ｓ０２−アルキル、Ｓ０２−アリール、ＣＯＯＨ、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＮＨ２、ＮＨ−アルキル、Ｎ（アルキル）２、ＣＦ３、アルキル、及びアルコキシから選択され、
ＨａｌがＣＩであり且つＲ４がＣＩである場合、Ｒ５はＨではない）
の化合物である、請求項１〜５のいずれか記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記グアナベンズの誘導体が、式（II）：
【化２】
2021529729.tif 000035
（式中、
Ｈａｌ＝Ｆ、ＣＩ、Ｂｒ、Ｉ
Ｘは、−ＣＲ１＝又は−Ｎ＝のいずれかであり、
Ｙは、−ＣＲ２＝又は−Ｎ＝のいずれかであり、
Ｚは、−ＣＲ３＝又は−Ｎ＝のいずれかであり、
Ｗは、−ＣＲ４＝又は−Ｎ＝のいずれかであり、
Ｒ１は、Ｈ、Ｈａｌ、アルキル、及びＯ−アルキルから選択され；
Ｒ２は、Ｈ、Ｈａｌ、アルキル、Ｏ−アルキル、及びＣ（０）Ｒ６から選択され；
Ｒ３は、Ｈ、Ｈａｌ、アルキル、及びＯ−アルキルから選択され；
Ｒ４は、Ｈ、ＣＩ、Ｆ、Ｉ、又はＢｒであり；
Ｒ５は、Ｈ、又はアルキル、シクロアルキイ、アラルキイ、アルケニル、シクロアルケニル、ヘテロシクリル、アリール、Ｃ（０）−アルキル、及びＣ（０）−アリールであり、これらはそれぞれ、場合により１つ以上のＲ７基で置換されており；
Ｒ６は、ＯＨ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、アラルキイ、ＮＨ２、ＮＨ−アルキル、Ｎ（アルキル）２、ＮＨ−アリール、ＣＦ３、アルキル、及びアルコキシから選択され；
各Ｒ７は、独立して、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、ＣＯＯ−アルキル、アラルキイ、ヘテロシクリル、Ｓ−アルキル、ＳＯ−アルキル、Ｓ０２−アルキル、Ｓ０２−アリール、ＣＯＯＨ、ＣＯ−アルキル、ＣＯ−アリール、ＮＨ２、ＮＨ−アルキル、Ｎ（アルキル）２、ＣＦ３、アルキル、及びアルコキシから選択される）
の化合物である、請求項１〜６のいずれか記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記グアナベンズの誘導体が、
【表１】
2021529729.tif 000036
2021529729.tif 000037
2021529729.tif 000038
からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記グアナベンズ又はその誘導体が、Ｉ型IFN依存性病態の標準的な処置と組み合わせて投与される、請求項１〜８のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項１０】
被験体におけるＩ型IFN依存性病態を処置するための医薬の製造における、グアナベンズ又はその誘導体の使用。
【国際調査報告】
2021529729.tif 000039
2021529729.tif 000040
2021529729.tif 000041