(57)【要約】  歯の着色防止及び／又は除去を検出する方法であって、ペリクル被覆ヒドロキシアパタイト粒子を提供する工程と、この粒子を第１の溶液と、次いで第２の溶液と接触させる工程であって、第１の溶液は、試験溶液又は着色溶液のいずれかであり、第２の溶液は、その試験溶液又は着色溶液の他方である、工程と、得られた粒子から、接触工程ｂ）で導入された着色物質を含む液体を分離する工程と、分離された液体のＵＶ−Ｖｉｓ吸光度を測定して、その液体中の着色物質の量を判定する工程とを含む、方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
歯の着色防止又は除去を検出する方法であって、
ａ．ペリクル被覆ヒドロキシアパタイト粒子を提供する工程と、
ｂ．前記粒子を第１の溶液と、次いで第２の溶液と接触させる工程であって、前記第１の溶液が試験溶液又は着色溶液のいずれかであり、前記第２の溶液が前記試験溶液又は着色溶液の他方である、工程と、
ｃ．前記粒子から、前記接触工程ｂ）で導入された着色物質を含む液体を分離する工程と、
ｄ．工程ｃ）で分離された前記液体のＵＶ−Ｖｉｓ吸光度を測定して、かかる液体中の着色物質の量を判定する工程と、を含む、方法。
【請求項２】
前記提供する工程ａが、ヒドロキシアパタイト粒子を唾液と混合し、前記混合物をインキュベートして、ペリクル被覆ヒドロキシアパタイト粒子を形成することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法が、試験溶液の着色除去を判定するためのものであり、前記接触工程ｂ）が、前記粒子を着色溶液と接触させて、着色した粒子を形成し、次いで前記着色した粒子を前記試験溶液と接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
分離工程が、工程ｂ）において前記粒子と接触させるために使用された前記試験溶液を前記着色した粒子から分離することを含み、前記測定工程が、前記分離された試験流体のＵＶ−Ｖｉｓ吸光度を測定して、前記着色した粒子から除去された前記試験溶液中の着色物質の量を判定することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ａ．ペリクル被覆ヒドロキシアパタイト粒子を提供する工程と、
ｂ．前記粒子を着色溶液と接触させて、着色したペリクル被覆ＨＡｐ粒子及び着色溶液の懸濁液を形成し、前記着色溶液から前記着色したペリクル被覆ＨＡｐ粒子をろ過して、前記着色したペリクル被覆ＨＡｐ粒子を試験溶液と接触させて、着色物質を除去する工程と、
ｃ．着色物質を含む前記試験溶液を、前記着色したペリクル被覆ＨＡｐ粒子から分離する工程と、
ｄ．工程ｃ）で分離された前記試験溶液のＵＶ−Ｖｉｓ吸光度を測定して、かかる液体中の着色物質の量を判定する工程と、を含む、請求項１に記載方法。
【請求項６】
前記方法が、試験溶液の着色防止を判定するためのものであり、前記接触工程ｂ）が、前記粒子を試験溶液と接触させて前処理された粒子を形成し、次いで前記前処理された粒子を着色溶液と接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
工程ｂ）より得られた前記粒子から着色溶液を除去して、前記粒子を洗浄して、着色した前処理された粒子を単離する工程を更に含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記分離工程が、着色物質を前記着色した前処理された粒子から溶出させて、分析のために着色物質を含む溶出液を回収することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ａ．ペリクル被覆ヒドロキシアパタイト粒子を提供する工程と、
ｂ．前記粒子を試験溶液と接触させて、前処理された粒子を形成し、前記前処理された粒子をろ過し、次いでろ過された前記前処理された粒子を着色溶液と接触させて、前記ろ過された前処理された粒子を着色して、着色した前処理された粒子を形成する工程と、
ｃ．前記着色した前処理された粒子から前記着色物質を溶出する工程と、
ｄ．溶出液をろ過して、回収する工程と、
ｅ．回収された溶出液のＵＶ−Ｖｉｓ吸光度を測定する工程と、を含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、歯の外因的な着色を防止及び／又は除去する分子を特定するためのハイスループットアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
歯の着色には、多くの原因がある。これらには、食品、飲料（コーヒー、茶、コーラ、ワイン）などの着色化学物質若しくは着色体を含有する製品の通常の使用、又はタバコの使用が挙げられる。他の場合では、薬物、疾患、及び不良な歯科衛生が、歯の着色につながり得る。着色は、歯の美的外観に影響を与え、歯のう蝕及び欠損に寄与する要因ともなり得る。
【０００３】
歯から着色を防止又は除去するために多くの製品製剤が開発されてきた。これらには、漂白剤若しくは酸化剤、又は酸化剤を含まない製剤が挙げられる。これらの製剤の開発において、製剤の有効性を示すためには、かなりの試験が必要とされる。
【０００４】
開発された有効性試験の手順のいくつかは、ウシ若しくはヒトの歯、又はセラミックディスク若しくはパウダー標本を使用する。これらの手順では、歯科用分光光度計を使用して、着色溶液（例えば、茶）に液浸前及び液浸後の両方の標本の色を評価する。国際照明委員会（Commission Internnationale de l’eclairage、ＣＩＥ）のＬ＊ａ＊ｂ＊色空間値を記録し、色の変化（ΔＥ＊）を計算する。着色は、着色防止又は除去製剤で標本を処理する前又は後のいずれかで行われる。着色除去試験の場合、標本を着色除去製剤で処理する前に、標本を着色溶液に液浸する。着色防止試験の場合、標本を着色防止製剤で処理した後、標本を着色溶液に液浸する。
【０００５】
別の試験手順では、セラミックパウダーを、処理溶液に入れる前（除去試験）又は後（防止試験）のいずれかで着色溶液に入れる。次いで、パウダーを、酸を使用して溶解させ、溶出液の色変化を測定する。
【０００６】
上記の方法は労働集約的であり、したがって、歯の着色防止又は除去について試験されている製剤の有効性をスクリーニングするためのハイスループット方法ではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
必要とされるのは、歯の着色防止又は除去製剤の有効性を検出するためのハイスループット方法の開発である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一態様によれば、本発明は、歯の着色防止及び／又は除去を検出する方法を提供し、方法は、ペリクル被覆ヒドロキシアパタイト粒子を提供する工程と、粒子を第１の溶液と、次いで第２の溶液と接触させる工程であって、第１の溶液が、試験溶液又は着色溶液のいずれかであり、第２の溶液が、上記試験溶液又は着色溶液の他方である工程と、得られた粒子から、接触工程ｂ）で導入された着色物質を含む液体を分離する工程と、分離された液体のＵＶ−Ｖｉｓ吸光度を測定して、液体中の着色物質の量を判定する工程と、を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】１分又は２分間の処理のために一連のポリリン酸溶液にさらされた後の、コーヒー着色したペリクル被覆ヒドロキシアパタイト粒子から除去された着色物質の吸光度値を示す。
【図２】着色防止前処理にさらされた後のヒドロキシアパタイト粒子から遊離した着色物質の吸光度値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書において、歯の着色を防止及び／又は除去する分子を特定するための新規のハイスループット方法を記載する。
【００１１】
本発明の方法は、その方法で使用するためのペリクル被覆ヒドロキシアパタイト粒子を提供する工程を含む。任意の好適なペリクル被覆ヒドロキシアパタイト粒子は、市販のもの、又は本明細書に記載されるように製造されたものどちらでもよく、本発明に適するように提供され得る。
【００１２】
特定の実施形態によれば、ペリクル被覆ヒドロキシアパタイト粒子は、ヒドロキシアパタイト粒子（hydroxyapatite particle、「ＨＡｐ」）を唾液で被覆して、ペリクル（タンパク質コート）を形成することによって形成される。好ましくは、この工程は、ヒドロキシアパタイト粒子を唾液製剤と混合すること、及びＨＡｐ／唾液懸濁液を十分な時間インキュベートして、ヒドロキシアパタイト粒子上にペリクル被覆を形成すること、を含む。
【００１３】
任意の好適なヒドロキシアパタイト粒子及び唾液を使用してもよい。好適なヒドロキシアパタイト粒子は、サイズ（直径）が約３マイクロメートル超〜約２００マイクロメートル、又は１０マイクロメートル〜約５０マイクロメートルの範囲、又は約２０マイクロメートルであり得る。様々なヒドロキシアパタイト粒子が市販されており、例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄから入手可能なヒドロキシアパタイト粒子が挙げられる。唾液は、天然由来であっても人工的であってもよい。例えば、好適な人工唾液は、Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｅｒｌｉｎ，ＣＴ）Ｔ０３００）から購入してもよい。
【００１４】
ペリクル被覆ＨＡｐは、任意の好適な量のＨＡｐ及び唾液を使用して形成することができる。特定の実施形態では、形成のための唾液中のＨＡｐの濃度範囲は約０．１〜約２５０ミリグラム／ミリリットルであり、唾液中約０．５〜約２００、約１〜約１５０、約１０〜約１５０、約５０〜約１５０、及び約１００ミリグラム／ミリリットルのＨＡｐを含む。ＨＡｐ／唾液混合物は、任意の十分な時間、好ましくは少なくとも５分間インキュベートすることができ、少なくとも１０分又は少なくとも１５分が含まれ、及び任意の十分な温度でインキュベートすることができ、約２０〜約６０℃を含み、約３０〜約５０、約３０〜約４０、及び約３７℃が含まれる。
【００１５】
特定の実施形態によれば、インキュベーション後に得られるペリクル被覆ＨＡｐ粒子／唾液懸濁液をろ過し、唾液上清を廃棄する。次いで、ペリクル被覆ＨＡｐ粒子／唾液懸濁液を、大型バッチフィルター容器に移してもよい。フィルター容器の孔径は、ＨＡｐ粒子のサイズよりも小さくなければならない。フィルター容器は、遠心分離又は真空ろ過のいずれかによって、上清からの固体ＨＡｐ粒子の分離を容易にする。一実施形態では、フィルター容器は、マイクロチューブフィルターシステムでもよく、比較的に不活性な膜で、小さくて０．２２μｍ及び大きくて５μｍの孔径を有し、遠心分離によって上清を粒子から分離する。別の実施形態では、フィルター容器は、９６ウェルフィルタープレートでもよく、比較的に不活性な膜で、０．２２μｍから大きくて５μｍの範囲の孔径を有し、真空ろ過によって上清を粒子から分離する。
【００１６】
提供されたペリクル被覆ＨＡｐ粒子は、第１の溶液及び第２の溶液と連続して接触され、第１の溶液は試験溶液又は着色溶液のいずれかであり、第２の溶液は、試験溶液又は着色溶液の他方である。容易に分かるように、試験溶液の着色除去特性を測定することを意図した方法では、ペリクル被覆ＨＡｐを、最初に着色溶液と接触させて粒子を着色し、次いで試験溶液と接触させて、かかる着色物質を粒子から除去する能力を判定する。一方、着色を防止する試験溶液の能力を判定する方法では、粒子を最初に試験溶液と接触させ、続いて着色溶液と接触させる。
【００１７】
着色除去
特定の好ましい実施形態によると、着色除去を判定する方法の接触工程は、ペリクル被覆ＨＡｐを、着色溶液である第１の溶液と接触させる工程を含んでもよい。結果として、ペリクル被覆ＨＡｐ粒子及び着色物質の懸濁液を得る。様々な着色物質は、購入するか、又は着色工程の前に、例えば、コーヒー、茶、ワイン、コーラ、ポリフェノール、鉄、これらの２つ又はそれ以上の混合物などを調製するか、いずれでもよい。着色溶液中の着色物質の濃度は、着色物質の種類に基づいて変化し得る。例えば、インスタントコーヒーの場合、典型的な範囲は約０．１〜約２０％ｗ／ｖである。茶の場合、典型的な範囲は約０．１〜約１０％ｗ／ｖである。ワインは、１００％で使用することができ、又は水で希釈してもよい。着色におけるＨＡｐ粒子の濃度範囲は、約０．１〜約１０ミリグラム／ミリリットル、又は約１ミリグラム／ミリリットルである。粒子／着色物質懸濁液をインキュベートして、着色粒子を生成する。ＨＡｐ粒子と着色溶液との混合物は、約２０℃〜約６０℃、又は約３０℃〜約５０℃、又は約３７℃の温度で、少なくとも１分間、又は約１５分間、又は約３０分間インキュベートすべきである。
【００１８】
着色したＨＡｐ粒子の溶液をろ過し、好ましくは着色上清を廃棄する。一実施形態では、着色溶液中の着色したＨＡｐ粒子は、次いで、大規模なバッチフィルター容器に移される。前述したように、フィルター容器の孔径は、ＨＡｐ粒子のサイズよりも小さくなければならない。上清からの固体ＨＡｐ粒子の分離は、遠心分離又は真空ろ過のいずれかによって行うことができる。着色した粒子は、好ましくは溶出液中により緩く結合した着色物質が観察されなくなるまで水ですすいでもよい。好ましくは、着色したペリクル被覆ＨＡｐ粒子が、フィルター容器内に残る。
【００１９】
特定の実施形態では、着色したペリクル被覆ＨＡｐ粒子を試験溶液と接触させて、着色物質を除去するための試験溶液の有効性を判定する。特定の実施形態では、着色したペリクル被覆ＨＡｐ粒子は、試験溶液と接触させる前に、脱イオン水中に約０．１〜約２５０ミリグラム／ミリリットル、又は約１０〜約１５０ミリグラム／ミリリットル、又は約１００ミリグラム／ミリリットルの濃度に再懸濁される。特定の実施形態では、懸濁ＨＡｐは、短時間内に、試験溶液と接触されるが、他の実施形態では、懸濁液は、着色除去試験に必要とされるまで、容器、例えば５０ミリリットルのコニカルチューブに保管され得る。
【００２０】
接触工程は、ペリクル被覆着色ＨＡｐ粒子を、着色除去組成又は溶液を含む試験溶液と接触させることを更に含む。着色除去溶液の濃度は、着色除去組成及びその除去成分に依存する。試料当たり使用される処理体積は、約５０マイクロリットル〜約３００マイクロリットル、又は約１００マイクロリットル〜約２５０マイクロリットル、又は約２００マイクロリットルである。ＨＡｐ粒子を、好ましくは処理中に撹拌しながら、着色除去溶液中に懸濁させて、ＨＡｐ粒子／着色除去懸濁液を得る。処置時間は、少なくとも１０秒、又は約３０秒超、又は約１分超、又は約２分超であるべきである。インキュベーション温度は、約２０℃〜約６０℃、又は約２５℃である。
【００２１】
特定の実施形態によれば、分離工程は、使用された試験流体とその中の除去された着色物質すべてを、測定のために粒子から分離することを含む。特定の実施形態では、上記工程から得られるＨＡｐ粒子及び試験溶液／着色除去流体の懸濁液をろ過して、かかる液体を粒子から分離し、更なる分析のために回収する。当業者に認識されるように、分離された流体中の着色物質の量は、試験溶液によって着色した粒子から除去された着色物質に対応する。
【００２２】
測定工程に従ったＵＶ−Ｖｉｓ吸光度測定が、分離工程で分離された流体に対して実施される。任意の好適なＵＶ−Ｖｉｓ装置及び機器を使用することができる。例えば、波長２３０〜１０００ｎｍの吸光度をスキャンするために、マルチモードプレートリーダーを利用してもよい。除去アッセイでは、４５０ｎｍでのより高い吸光度値は、より多くの着色除去を示し、４５０ｎｍでの低い吸光度値は、着色除去が最小限から皆無であることを示している。
【００２３】
着色防止
特定の好ましい実施形態によれば、着色防止を判定するための方法の接触工程は、ペリクル被覆ＨＡｐを、試験／着色防止溶液である第１の溶液と接触させる工程を含んでもよい。着色防止溶液の濃度は、着色防止組成及びその防止成分に依存する。試料当たり使用される処理体積は、例えば、約５０マイクロリットル〜約３００マイクロリットル、又は約１００マイクロリットル〜約２５０マイクロリットル、又は約２００マイクロリットルであってもよい。ＨＡｐ粒子を、処理中に撹拌しながら着色防止溶液中に懸濁させて、ＨＡｐ粒子／着色防止懸濁液を得る。処置時間は、少なくとも１０秒、又は約３０秒超、又は約２分超、又は約１０分超であるべきである。インキュベーション温度は、約２０℃〜約６０℃、又は約２０℃〜約４０℃、又は約２５℃である。
【００２４】
次に、処理されたペリクル被覆ＨＡｐ粒子／唾液懸濁液をろ過して、処理上清を除去する。上に記載したように、上清からの固体ＨＡｐ粒子の除去は、遠心分離又は真空ろ過のいずれかによって行うことができる。処理された粒子は、フィルター容器内に残っているものが前処理されたペリクル被覆ＨＡｐ粒子になるまで、水ですすいでもよい。
【００２５】
次に、前処理されたペリクル被覆ＨＡｐ粒子を、着色物質を含む第２の溶液と接触させる。結果として、処理されたペリクル被覆ＨＡｐ粒子及び着色物質の懸濁液を得る。着色除去のために、上に記載の任意の様々な着色物質及び着色／インキュベート条件を使用して、接触工程で粒子を着色することができる。着色したＨＡｐ粒子の溶液をろ過して、好ましくは粒子から上清着色流体を除去して、前処理されたペリクル被覆ＨＡｐ粒子から緩く結合した着色物質をすべて洗い落とすと、着色した前処理されたペリクル被覆ＨＡｐ粒子が得られる。
【００２６】
着色防止の実施形態によると、更なる分析のために、着色物質を含む流体を分離する工程は、着色した前処理されたペリクル被覆ＨＡｐ粒子から着色物質を溶出させ、分析のために着色物質を含む溶出液を回収する工程を含む。接触工程及びろ過後、粒子上に残っている着色物質は、例えば、高濃度ポリリン酸溶液を含む任意の好適な溶出液で溶出される。ポリリン酸の例としては、ピロリン酸、トリポリリン酸、フィチン酸、トリメタホスフェート、ヘキサメトラホスフェートが挙げられる。一部の実施形態では、水に溶解したピロリン酸が使用される。溶出液を、着色した前処理されたペリクル被覆ＨＡｐ粒子と混合して、ＨＡｐ粒子／ポリリン酸懸濁液を作製する。ポリリン酸の濃度範囲は、水中で１％〜１０％ｗ／ｖ又は５％ｗ／ｖであり得る。溶液のｐＨは、ｐＨ６〜１３、例えば約１２であり得る。５０マイクロリットル〜３００マイクロリットルの体積範囲、又は２００マイクロリットルを使用して、着色物質を溶出することができる。溶離液のインキュベーション時間は、少なくとも約３０秒、又は約１分、又は約５分、又は約１０  １０分である。
【００２７】
ペリクル被覆着色したＨＡｐ粒子／ポリリン酸懸濁液は、ここで上に記載したようにろ過され、１つの変化は、溶出上清が更なる分析のために回収されることである。
【００２８】
最後に、溶出上清に対してＵＶ−Ｖｉｓ吸光度測定を行う。マルチモードプレートリーダーを利用して、波長２３０〜１０００ｎｍの吸光度をスキャンすることができる。防止アッセイでは、４５０ｎｍでのより低い吸光度値は、より多くの着色防止を示し、４５０ｎｍでの高い吸光度値は、着色防止が最小限から皆無であることを示唆している。
【実施例】
【００２９】
実施例１：着色除去試験
次の一般的な手順を使用し、以下でより詳細に説明する。
【００３０】
着色除去試験手順：
１．粒子を唾液と混合し、混合物をインキュベートすることにより、ヒドロキシアパタイト（ＨＡｐ）粒子上にペリクル被覆を形成する。
２．ＨＡｐ粒子／唾液懸濁液を大型バッチフィルター容器に移す。
３．唾液上清をろ過して廃棄する。
４．着色溶液をフィルター容器に直接添加することによって粒子を着色し、インキュベートする。
５．着色したペリクル被覆ＨＡｐ粒子懸濁液をフィルター容器に移す。
６．着色したペリクル被覆ＨＡｐ粒子をろ過し、上清を廃棄する。
７．着色したペリクル被覆ＨＡｐ粒子を水に再懸濁し、任意選択的に将来の試験のために貯蔵する。
８．処理のために、着色したペリクル被覆ＨＡｐ粒子を調製する。
９．着色したＨＡｐ粒子を処理する。
１０．上清をろ過し、回収する。
１１．回収された上清についてＵＶ−Ｖｉｓ吸光度測定を行う。
【００３１】
１グラムのヒドロキシアパタイトパウダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ、カタログ１５７００２０）塊を、人工唾液（Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｎｓｌｏｗ，ＭＥ、カタログ番号Ｔ０３００）に１０ミリグラム／１００マイクロリットルの濃度で懸濁し、３７℃で１５分間インキュベートしてペリクル被覆を形成した。上清を粒子からろ過して除いた。粒子を、１０％インスタントコーヒー着色溶液中に、１０ミリグラム／１００マイクロリットルの濃度で再懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートした。ろ過によってコーヒー溶液を除去し、粒子を洗浄して、緩く結合した着色物質をすべて除いた。ここで、コーヒー着色したペリクル被覆ヒドロキシアパタイト粒子を、１０ミリグラム／１００マイクロリットルの濃度で水に懸濁した。試料当たり１００マイクロリットルの量を、それぞれのろ過小胞（９６ウェルフィルタープレート又はフィルターチューブ）に分注し、粒子から上清をろ過して除いた（試料当たりｎ＝３）。処理溶液として、水中０％〜２％の範囲でポリリン酸溶液を調製した。原液２％ｗ／ｖ溶液を水で１：１に連続的に希釈して、１％、０．５％、０．２５％、０．１２５％、０．０６２５％、及び０．０３１２５％ｗ／ｖのポリリン酸の処理濃度を得た。０％溶液を、水対照とした。その後、着色したヒドロキシアパタイト粒子を、撹拌しながら（１２０ｒｐｍ）室温で１分間又は２分間、各２００マイクロリットルの処理にさらした。ポリリン酸処理溶液は、０．０３１％〜２％ｗ／ｖの範囲とした。処理溶液として蒸留水を使用した陰性対照を、ポリリン酸処理溶液と比較して試験した。処理が完了すると、溶液中に除去された着色物質を粒子から分離し、９６ウェルプレートで回収した。続いて、２３０〜１０００ｎｍで吸光度測定（Ｔｅｃａｎ、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００  Ｐｒｏ）を行い、測定間のステップ増加を１０ｎｍとした。４５０ｎｍでの吸光度を、除去された着色物質の測定値として使用したが、より高い吸光度値は、より多くの着色物質がヒドロキシアパタイト粒子から遊離されたことを示した。
【００３２】
図１は、１分間及び２分間処理の両方に対するポリリン酸溶液の濃度の関数として、コーヒー着色したペリクル被覆ヒドロキシアパタイト粒子から除去された着色物質の４５０ｎｍ吸光度値を示す。図は、ポリリン酸溶液に対する明らかな用量応答を示す。ポリリン酸溶液の濃度が０．０３１％から０．５００％に増加すると、着色除去が増加する。着色除去のレベルは、０．５００％〜２．００％において一定であった。また、この図は、１又は２分間処理の間に有意差がないことを示す。
【００３３】
実施例２−着色防止試験
次の一般的な手順を使用し、以下でより詳細に説明する。
【００３４】
着色防止試験手順：
１．粒子を唾液と混合し、混合物をインキュベートすることにより、ヒドロキシアパタイト（ＨＡｐ）粒子上にペリクル被覆を形成する。
２．ＨＡｐ粒子／唾液懸濁液を大型バッチフィルター容器に移す。
３．唾液上清をろ過して廃棄する。
４．ペリクル被覆ＨＡｐ粒子を処理し、上清を廃棄する。
５．処理されたペリクル被覆ＨＡｐ粒子をろ過し、上澄みを廃棄する。
６．前処理されたペリクル被覆ＨＡｐ粒子を、フィルター容器に着色溶液を直接添加し、インキュベートする。
７．前処理されたペリクル被覆ＨＡｐ粒子から、緩く結合した着色をすべて洗い落とす。
８．着色した前処理されたペリクル被覆ＨＡｐ粒子から、着色物質を、５％ＰＰｉ溶液に溶出する。
９．上清をろ過し、回収する。
１０．回収された上清についてＵＶ−Ｖｉｓ吸光度測定を行う。
【００３５】
１グラムのヒドロキシアパタイト粒子（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ、カタログ１５７００２０）塊を、１０ミリグラム／１００マイクロリットルの濃度で人工唾液中に懸濁し、３７℃で１５分間インキュベートして、ペリクル被覆を形成した。試料当たり１００マイクロリットルの量を、それぞれのフィルター小胞（９６ウェルフィルタープレート又はフィルターチューブ）に分注し、上清を粒子からろ過して除いた（試料処理当たりｎ＝３）。処理溶液を、水中０％〜２％の範囲内のポリリン酸溶液で調製した。原液２％ｗ／ｖ溶液を水で１：１に連続的に希釈して、１％、０．５％、０．２５％、０．１２５％、０．０６２５％、及び０．０３１２５％ｗ／ｖのポリリン酸の処理濃度を得た。０％溶液を、水対照とした。ペリクル被覆ヒドロキシアパタイト粒子を、撹拌しながら（１２０ｒｐｍ）、室温で少なくとも１分間、２００マイクロリットルのポリリン酸の処理溶液にさらした。処理をろ過によって除去し、粒子を１００マイクロリットルの１０％インスタントコーヒー着色溶液にさらし、３７℃で３０分間インキュベートした。ろ過によってコーヒーを除去し、粒子に緩く結合した着色物質をすべて洗い落とした。粒子上の残留着色を、２００マイクロリットルのアルカリ性５％ピロリン酸溶液を用いて、室温で１０分間インキュベートすることにより、遊離させた。遊離した着色物質を９６ウェルプレートに回収し、２３０〜１０００ｎｍで吸光度測定（Ｔｅｃａｎ、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００  Ｐｒｏ）を行い、測定間のステップ増加を１０ｎｍとした。４５０ｎｍでの吸光度を、着色防止の指標として使用し、より低い吸光度値は、より多くの着色物質がヒドロキシアパタイト粒子に付着することから防止されたことを示す。
【００３６】
図２は、１、２、及び１０分間の着色防止前処理のためのポリリン酸溶液の濃度の関数として、コーヒー着色したペリクル被覆ヒドロキシアパタイト粒子から遊離された着色物質の４５０ｎｍ吸光度値を示す。図は、ポリリン酸溶液に対する明らかな用量応答を示す。ポリリン酸溶液の濃度が増加すると、０．０３１％〜０．５００％において着色防止が増加した。着色除去のレベルは、０．５００％〜２．００％において一定であった。また、この図は、１、２、及び１０分間の着色防止前処理について有意差がないことを示す。
【００３７】
〔実施の態様〕
（１）  歯の着色防止又は除去を検出する方法であって、
ａ．ペリクル被覆ヒドロキシアパタイト粒子を提供する工程と、
ｂ．前記粒子を第１の溶液と、次いで第２の溶液と接触させる工程であって、前記第１の溶液が試験溶液又は着色溶液のいずれかであり、前記第２の溶液が前記試験溶液又は着色溶液の他方である、工程と、
ｃ．前記粒子から、前記接触工程ｂ）で導入された着色物質を含む液体を分離する工程と、
ｄ．工程ｃ）で分離された前記液体のＵＶ−Ｖｉｓ吸光度を測定して、かかる液体中の着色物質の量を判定する工程と、を含む、方法。
（２）  前記提供する工程ａが、ヒドロキシアパタイト粒子を唾液と混合し、前記混合物をインキュベートして、ペリクル被覆ヒドロキシアパタイト粒子を形成することを含む、実施態様１に記載の方法。
（３）  前記方法が、試験溶液の着色除去を判定するためのものであり、前記接触工程ｂ）が、前記粒子を着色溶液と接触させて、着色した粒子を形成し、次いで前記着色した粒子を前記試験溶液と接触させることを含む、実施態様１に記載の方法。
（４）  分離工程が、工程ｂ）において前記粒子と接触させるために使用された前記試験溶液を前記着色した粒子から分離することを含み、前記測定工程が、前記分離された試験流体のＵＶ−Ｖｉｓ吸光度を測定して、前記着色した粒子から除去された前記試験溶液中の着色物質の量を判定することを含む、実施態様３に記載の方法。
（５）  ａ．ペリクル被覆ヒドロキシアパタイト粒子を提供する工程と、
ｂ．前記粒子を着色溶液と接触させて、着色したペリクル被覆ＨＡｐ粒子及び着色溶液の懸濁液を形成し、前記着色溶液から前記着色したペリクル被覆ＨＡｐ粒子をろ過して、前記着色したペリクル被覆ＨＡｐ粒子を試験溶液と接触させて、着色物質を除去する工程と、
ｃ．着色物質を含む前記試験溶液を、前記着色したペリクル被覆ＨＡｐ粒子から分離する工程と、
ｄ．工程ｃ）で分離された前記試験溶液のＵＶ−Ｖｉｓ吸光度を測定して、かかる液体中の着色物質の量を判定する工程と、を含む、実施態様１に記載方法。
【００３８】
（６）  前記方法が、試験溶液の着色防止を判定するためのものであり、前記接触工程ｂ）が、前記粒子を試験溶液と接触させて前処理された粒子を形成し、次いで前記前処理された粒子を着色溶液と接触させることを含む、実施態様１に記載の方法。
（７）  工程ｂ）より得られた前記粒子から着色溶液を除去して、前記粒子を洗浄して、着色した前処理された粒子を単離する工程を更に含む、実施態様６に記載の方法。
（８）  前記分離工程が、着色物質を前記着色した前処理された粒子から溶出させて、分析のために着色物質を含む溶出液を回収することを含む、実施態様７に記載の方法。
（９）  ａ．ペリクル被覆ヒドロキシアパタイト粒子を提供する工程と、
ｂ．前記粒子を試験溶液と接触させて、前処理された粒子を形成し、前記前処理された粒子をろ過し、次いでろ過された前記前処理された粒子を着色溶液と接触させて、前記ろ過された前処理された粒子を着色して、着色した前処理された粒子を形成する工程と、
ｃ．前記着色した前処理された粒子から前記着色物質を溶出する工程と、
ｄ．溶出液をろ過して、回収する工程と、
ｅ．回収された溶出液のＵＶ−Ｖｉｓ吸光度を測定する工程と、を含む、実施態様１に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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