(57)【要約】無標識細胞（例えば、CD8+T細胞）の生産規模の単離のための可逆的アプタマー選択技術が本明細書に記載される。関心対象の細胞に特異的な細胞表面マーカーに特異的に結合するアプタマーと生物試料を接触させること；アプタマーに結合していない細胞からアプタマー結合細胞を分離すること；および細胞表面マーカーへのアプタマーの結合を破壊することで関心対象の細胞を回収することによって、生物試料から関心対象の細胞を単離するための方法が本明細書に提供される。2021530230.tif 000032
2021530230.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の細胞タイプを含む生物試料から関心対象の細胞を単離するための方法であって、
a. アプタマー結合細胞の形成を可能にする条件下で、関心対象の該細胞に特異的な細胞表面マーカーに特異的に結合するアプタマーと該生物試料を接触させる工程；
b. 該アプタマーに結合していない細胞から該アプタマー結合細胞を分離する工程；および
c. 該細胞表面マーカーへの該アプタマーの結合を破壊することによって、関心対象の該細胞を回収する工程
を含み、それにより、関心対象の該細胞が該生物試料から単離される、方法。
【請求項２】
関心対象の前記細胞が生存可能である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
関心対象の前記細胞が白血球である、請求項1または請求項2記載の方法。
【請求項４】
関心対象の前記細胞がリンパ球または単球である、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
関心対象の前記細胞がT細胞である、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
関心対象の前記細胞がCD3+細胞、CD4+細胞、CD8+細胞である、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
前記アプタマーが標識を含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
分離工程(b)が第1の固体支持体または相変化作用物質の使用を含む、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
前記アプタマーが、(i)第1の固体支持体にコンジュゲートもしくは固定化されている、および／または(ii)親和性対の第1のメンバーで標識されている、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
前記分離工程(b)が、
(i)前記アプタマーを介して前記第1の固体支持体に結合しているアプタマー結合細胞を前記生物試料から取り出すこと、または
(ii)前記親和性対の第2のメンバーを有する第2の固体支持体を加えて、前記親和性対の前記第1および第2のメンバーの相互作用を介して該第2の固体支持体への前記アプタマーの物理的結合を可能にし、アプタマー結合細胞を前記生物試料から取り出すこと
のいずれかを含む、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
前記アプタマーが相変化作用物質にコンジュゲートしている、請求項9または請求項10記載の方法。
【請求項１２】
前記接触工程(a)が、前記相変化作用物質が溶液相にある条件下で行われ、
前記分離工程が、(b)前記相変化作用物質を該溶液から沈殿させ、それにより、アプタマー結合細胞を前記生物試料から取り出すことを含む、
請求項9〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
前記第1および／または第2の固体支持体が磁気応答性ビーズを含む、請求項8〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
前記第1および／または第2の固体支持体が、ポリマー、金属、セラミック、ガラス、ハイドロゲル、または樹脂を含む、請求項8〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
前記分離工程が、前記試料を磁場に供することを含み、それにより、アプタマー結合細胞を含む固体支持体が前記生物試料から分離される、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
拮抗薬が、
ポリアニオン；小分子；または前記アプタマーにハイブリダイズし、それによって、前記細胞表面マーカーへの前記アプタマーの結合を破壊するのに十分なほど前記アプタマーの配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド模倣物
を含む、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
前記アプタマー結合細胞が、前記アプタマーが結合しているマーカーを含む選択されたマーカー対に対して二重陽性である細胞を含む、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
細胞の単離画分が、前記アプタマーが結合しているマーカーを含む選択されたマーカー対に対して二重陽性である細胞を含む、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
複数の細胞画分を生物試料から単離する方法であって、
a. アプタマー結合細胞の形成を可能にする条件下で、複数の異なる関心対象細胞に特異的な細胞表面マーカーに特異的に結合する複数種のアプタマーと生物試料を接触させる工程、
b. 非アプタマー結合細胞からアプタマー結合細胞の集団を分離する工程、
c. 複数種の細胞表面マーカーのうちの1種または複数種への該複数種のアプタマーのうちの1種または複数種の結合を破壊する複数種の拮抗薬を、工程(b)で分離した該アプタマー結合細胞に連続して加え、それにより、連続して加えられた拮抗薬のそれぞれが、工程(b)で分離した細胞の該集団から異なる細胞画分を溶出し、それによって、複数の異なる細胞画分を生物試料から単離する工程
を含む、方法。
【請求項２０】
前記複数種の拮抗薬が、
ポリアニオン；小分子；前記アプタマーにハイブリダイズし、それによって、その細胞表面マーカーへの前記アプタマーの結合を破壊するのに十分なほど前記複数種のアプタマーのうちの1種のアプタマーの配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド模倣物；またはこれらの組み合わせ
を含む、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
前記複数種のアプタマーが1種または複数種の固体支持体または相変化作用物質に結合している、請求項19または20記載の方法。
【請求項２２】
前記固体支持体が磁気応答性ビーズを含む、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
前記固体支持体が、ポリマー、金属、セラミック、ガラス、ハイドロゲル、または樹脂を含む、請求項21または22記載の方法。
【請求項２４】
前記複数の異なるアプタマーに結合している細胞集団を含む前記固体支持体が、前記試料を磁場に供することによって生物試料から分離される、請求項21〜23のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
前記アプタマー結合細胞が白血球である、請求項19〜24のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
前記アプタマー結合細胞がリンパ球である、請求項19〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
前記アプタマー結合細胞がT細胞である、請求項19〜26のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
前記アプタマー結合細胞がCD3、CD8、および／またはCD4を発現する、請求項19〜27のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
1対の標的細胞マーカーに対して二重陽性である細胞について濃縮された細胞画分を生物試料から単離する方法であって、
a. アプタマー結合細胞の形成を可能にする条件下で、第1の標的細胞表面マーカーに特異的に結合する第1のアプタマーと生物試料を接触させる工程；
b. 非アプタマー結合細胞からアプタマー結合細胞の集団を分離する工程；
c. 工程(b)で分離した該細胞への該第1のアプタマーの結合を破壊する第1の拮抗薬と、工程(b)で分離したアプタマー結合細胞の該集団を接触させ、それによって、該第1の標的細胞表面マーカーについて陽性の細胞の集団を単離する工程；
d. アプタマー結合細胞の形成を可能にする条件下で、第2の標的細胞表面マーカーに特異的に結合する第2のアプタマーと、工程(c)で単離した該集団を接触させる工程；
e. 工程(d)で形成したアプタマー結合細胞の集団を非アプタマー結合細胞から分離する工程；および
f. 工程(e)で分離した該細胞への該第2のアプタマーの結合を破壊する第2の拮抗薬と、工程(e)で分離したアプタマー結合細胞の該集団を接触させ、それによって、該第1および第2の標的細胞表面マーカーに陽性の細胞の集団を単離する工程
を含む、方法。
【請求項３０】
前記拮抗薬が、
小分子；ポリアニオン；前記アプタマーにハイブリダイズし、それによって、前記細胞表面マーカーへの前記アプタマーの結合を破壊するのに十分なほどそれぞれのアプタマーの配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド模倣物；またはこれらの組み合わせ
を含む、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
前記第1および／または第2のアプタマーが、1種または複数種の固体支持体または相変化作用物質に固定化されているか、またはコンジュゲートしている、請求項29または請求項30記載の方法。
【請求項３２】
前記固体支持体が、磁気応答性ビーズ、ポリマー、金属、セラミック、ガラス、ハイドロゲル、または樹脂を含む、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
前記固体支持体が磁気応答性ビーズを含み、前記第1および／または第2のアプタマーに結合している細胞集団が、該細胞集団を磁場に供することによって分離される、請求項31または請求項32記載の方法。
【請求項３４】
前記アプタマー結合細胞がリンパ球を含む、請求項29〜33のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
前記アプタマー結合細胞がT細胞を含む、請求項29〜34のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６】
工程(f)で単離した前記細胞が、CD3+T細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、CD3+CD4+T細胞、またはCD3+CD8+T細胞を含む、請求項29〜35のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７】
細胞表面マーカーの発現の程度に基づいて生物試料中の関心対象の細胞を分離する方法であって、
a. アプタマー結合細胞の形成を可能にする条件下で、関心対象の該細胞に特異的な細胞表面マーカーに特異的に結合するアプタマーと該生物試料を接触させる工程；
b. 該アプタマーに結合していない細胞から該アプタマー結合細胞を分離する工程；および
c. 該細胞表面マーカーへの該アプタマーの結合を破壊する漸増濃度の拮抗薬と、段階的にまたは勾配としてのいずれかで、工程(b)で分離した該アプタマー結合細胞を接触させる工程
を含み、
それにより、該細胞表面マーカーの発現の程度に基づいて該生物試料中の関心対象の該細胞が分離され、その結果、マーカー発現がより低い（マーカーlo）該試料中の細胞が、より低い濃度の拮抗薬で該アプタマーから溶出され、マーカー発現がより高い（マーカーhi）集団中の細胞が、より高い濃度の拮抗薬で溶出される、方法。
【請求項３８】
前記拮抗薬が、
ポリアニオン；小分子；前記アプタマーにハイブリダイズし、それによって、前記細胞表面マーカーへの前記アプタマーの結合を破壊するのに十分なほどアプタマーの配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド模倣物；またはそれらの組み合わせ
を含む、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
細胞表面マーカーの発現の程度に基づいて生物試料中の関心対象の細胞を分離する方法であって、
a. アプタマー結合細胞の形成を可能にする条件下で、関心対象の該細胞に特異的な細胞表面マーカーに特異的に結合するアプタマーと該生物試料を接触させる工程；
b. 該アプタマーに結合していない細胞からアプタマー結合細胞を分離する工程；および
c. 置換のキネティクスまたはアプタマー親和性が異なる複数種の拮抗薬と工程(b)で分離した該アプタマー結合細胞を連続して接触させる工程であって、置換の相対的キネティクスまたは相対的アプタマー親和性が増大する順で拮抗薬を加える、工程
を含み、
それにより、該細胞表面マーカーの発現の程度に基づいて該生物試料中の関心対象の該細胞が分離され、その結果、マーカー発現がより低い（マーカーlo）該試料中の細胞が、置換の相対的キネティクスがより遅い、または相対的アプタマー親和性がより低い拮抗薬によって、該アプタマーから溶出され、マーカー発現がより高い（マーカーhi）該集団中の細胞が、置換の相対的キネティクスがより速い、または相対的アプタマー親和性がより高い拮抗薬によって溶出される、方法。
【請求項４０】
前記拮抗薬が、
ポリアニオン；小分子；前記アプタマーにハイブリダイズし、それによって、前記細胞表面マーカーへの前記アプタマーの結合を破壊するのに十分なほど前記アプタマーの配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド模倣物；またはそれらの組み合わせ
を含む、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
関心対象の前記細胞が白血球である、請求項37〜40のいずれか一項記載の方法。
【請求項４２】
関心対象の前記細胞がリンパ球である、請求項37〜41のいずれか一項記載の方法。
【請求項４３】
関心対象の前記細胞がT細胞である、請求項37〜42のいずれか一項記載の方法。
【請求項４４】
関心対象の前記細胞がCD8発現細胞である、請求項37〜43のいずれか一項記載の方法。
【請求項４５】
前記アプタマーが、1種または複数種の固体支持体または相変化作用物質に結合している、請求項37〜44のいずれか一項記載の方法。
【請求項４６】
前記1種または複数種の固体支持体または相変化作用物質が磁気応答性ビーズを含む、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
前記1種または複数種の固体支持体が、ポリマー、金属、セラミック、ガラス、ハイドロゲル、または樹脂を含む、請求項45または46記載の方法。
【請求項４８】
前記分離工程(b)が、前記試料を磁場に供することを含み、それにより、前記複数の異なるアプタマーに結合している細胞集団を含む前記固体支持体が前記生物試料から分離される、請求項45〜47のいずれか一項記載の方法。
【請求項４９】
SEQ ID NO:1〜6、10〜14、17〜22、27〜30、33〜48、または52〜77のいずれか1つの配列を含む核酸分子であって、ヒトCD8ポリペプチドに選択的に結合する、核酸分子。
【請求項５０】
ヌクレオチド3および75、4および74、5および73、6および72、7および71、8および70、9および69、10および68、13および54、14および53、15および52、16および51、17および50、18および49、19および48、25および47、26および46、27および45、28および44、29および43、30および42、31および41、32および40、33および39、または34および38からなる群より選択されるヌクレオチド対に代償性変化を含み、SEQ ID NO:1の核酸分子と比較して、CD8ポリペプチドへの選択的結合を保持する、請求項49記載の核酸分子。
【請求項５１】
ヌクレオチド3および75、4および74、5および73、6および72、7および71、8および70、9および69、10および68、13および54、14および53、15および52、16および51、17および50、18および49、19および48、25および47、26および46、27および45、28および44、29および43、30および42、31および41、32および40、33および39、または34および38からなる群より選択される2つ以上のヌクレオチド対に代償性変化を含み、SEQ ID NO:3の核酸分子と比較して、CD8ポリペプチドへの選択的結合を保持する、請求項49記載の核酸分子。
【請求項５２】
DNA分子、RNA分子、またはPNA分子である、請求項49記載の核酸分子。
【請求項５３】
修飾ヌクレオシドを含む、請求項49〜52のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項５４】
前記修飾ヌクレオシドが表1より選択される、請求項53記載の核酸分子。
【請求項５５】
請求項49〜54のいずれか一項記載の核酸分子を含む、固体支持体。
【請求項５６】
磁気応答性ビーズである、請求項55記載の固体支持体。
【請求項５７】
前記固体支持体が、ポリマー、金属、セラミック、ガラス、ハイドロゲル、または樹脂を含む、請求項56記載の固体支持体。
【請求項５８】
前記核酸分子を介してCD8+T細胞に結合している、請求項55〜57のいずれか一項記載の固体支持体。
【請求項５９】
標識を含む、請求項49〜54のいずれか一項記載の核酸。
【請求項６０】
前記標識がビオチン標識および蛍光標識より選択される、請求項59記載の核酸。
【請求項６１】
請求項49〜54のいずれか一項記載の核酸に結合したCD8+ヒトT細胞を含む組成物。
【請求項６２】
それぞれ、請求項49〜54のいずれか一項記載の核酸の少なくとも8つの連続的なヌクレオチドに相補的な配列を含む核酸を含む拮抗薬にハイブリダイズする、請求項49〜54のいずれか一項記載の核酸。
【請求項６３】
請求項49〜54のいずれか一項記載の核酸に相補的な少なくとも8つの連続的なヌクレオチドを含む配列を含む核酸分子を含む拮抗薬であって、それぞれ、ヒトCD8ポリペプチドへの請求項49〜54のいずれか一項記載の核酸の結合を阻害する、拮抗薬。
【請求項６４】
前記核酸分子が、請求項49〜54のいずれか一項記載の核酸に相補的な少なくとも8つの連続的なヌクレオチドを含む配列を含む、請求項63記載の拮抗薬。
【請求項６５】
請求項49〜54のいずれか一項記載の核酸と、または請求項55〜57のいずれか一項記載の固体支持体と、ヒトCD8+T細胞を含む生物試料を接触させる工程を含む、生物試料からCD8+T細胞を単離する方法であって、該接触が該核酸へのCD8+T細胞の選択的結合を可能にする、方法。
【請求項６６】
前記生物試料が、全血、バフィーコート、または単離された単核細胞を含む、請求項65記載の方法。
【請求項６７】
請求項49〜54のいずれか一項記載の核酸または請求項55〜57のいずれか一項記載の固体支持体と前記生物試料を接触させる工程の後に、請求項49〜54のいずれか一項記載の核酸に相補的な少なくとも8つの連続的なヌクレオチドの配列を含む核酸分子を含む拮抗薬と前記試料を接触させる工程をさらに含み、
前記拮抗薬が、ヒトCD8ポリペプチドへの請求項49〜54のいずれか一項記載の前記核酸の結合を阻害し、それによって、前記CD8+T細胞の放出を可能にする、
請求項65記載の方法。
【請求項６８】
請求項55〜57のいずれか一項記載の固体支持体と前記試料を接触させ、前記試料をさらに磁場に供し、それによって、前記試料中の他の細胞から前記固体支持体に結合したCD8+T細胞を分離することを可能にする、請求項67記載の方法。
【請求項６９】
関心対象の標的細胞タイプまたはクラスの細胞の集団を生物試料から調製する方法であって、
a. アプタマー結合細胞の形成を可能にする条件下で、関心対象の該標的細胞またはクラスの細胞に特異的な細胞表面マーカーに特異的に結合するアプタマーと該生物試料を接触させる工程；
b. 該アプタマーに結合していない細胞からアプタマー結合細胞を分離する工程；および
c. 関心対象の該細胞への該アプタマーの結合を破壊することによって、関心対象の細胞の該集団を回収する工程
を含む、方法。
【請求項７０】
関心対象の特定の細胞タイプまたはクラスの細胞に結合するアプタマー配列を選択する方法であって、
i. 関心対象のタイプまたはクラスの細胞を20〜85ヌクレオチドの所与の長さのランダム化配列を含む一本鎖DNAライブラリーとともにインキュベートする工程；
ii. 関心対象の該細胞に結合した一本鎖DNAを単離する工程；
iii. 工程iiからの単離した一本鎖DNA配列を関心対象のタイプまたはクラスの細胞を含む細胞タイプの混合物とともにインキュベートする工程；
iv. 抗体および抗体特異的支持カラムを用いて工程iiiの該インキュベーションから関心対象のタイプまたはクラスの細胞を単離する工程；
v. 工程ivで単離した細胞から結合一本鎖DNAを抽出する工程；
vi. 工程vからの結合一本鎖DNA配列をPCR増幅する工程；
vii. 工程viからの一本鎖DNA配列を関心対象の表面受容体を欠く細胞タイプとともにインキュベートする工程；
viii. 非結合一本鎖DNAを工程viiの該細胞から分離する工程；
ix. 工程viiiからの非結合一本鎖DNA配列をPCR増幅する工程；
x. 工程iii〜ixを少なくとも2回反復する工程；および
xi. 残存一本鎖DNAをシークエンシングする工程
を含む、方法。
【請求項７１】
関心対象のタイプまたはクラスの細胞が白血球である、請求項70記載の方法。
【請求項７２】
関心対象のタイプまたはクラスの細胞がリンパ球である、請求項70または71記載の方法。
【請求項７３】
関心対象のタイプまたはクラスの細胞が、CD2+T細胞、CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞またはCD28+T細胞である、請求項70〜72のいずれか一項記載の方法。
【請求項７４】
関心対象のタイプまたはクラスの細胞が、請求項73に記載の2種以上の細胞表面マーカーの組み合わせを発現する、請求項70〜72のいずれか一項記載の方法。
【請求項７５】
関心対象のタイプまたはクラスの細胞が造血幹細胞である、請求項70〜72のいずれか一項記載の方法。
【請求項７６】
前記方法が、関心対象の細胞集団の大規模選択に使用されるか、または複数の関心対象の細胞が単離される、請求項1、19、29、37、39、69、または70のいずれか一項記載の方法。
【請求項７７】
請求項1、16、25、26、55、または56のいずれか一項記載の方法によって単離した細胞の組成物を投与する工程を含む、疾患または障害を処置する方法であって、細胞の該組成物が疾患の少なくとも1つの症状を少なくとも10％低減する、方法。
【請求項７８】
前記疾患または障害が癌である、請求項77記載の方法。
【請求項７９】
前記疾患または障害が免疫疾患である、請求項77記載の方法。
【請求項８０】
前記疾患または障害がHIV感染症である、請求項77記載の方法。
【請求項８１】
請求項1〜18のいずれか一項記載の方法によって単離された、細胞の組成物。
【請求項８２】
請求項19〜28のいずれか一項記載の方法によって単離された、細胞画分の組成物。
【請求項８３】
請求項29〜36のいずれか一項記載の方法によって単離された、細胞画分の組成物。
【請求項８４】
請求項37〜38のいずれか一項記載の方法によって分離された、細胞の組成物。
【請求項８５】
請求項39〜48のいずれか一項記載の方法によって分離された、細胞の組成物。
【請求項８６】
請求項65〜68のいずれか一項記載の方法によって単離された、CD8+T細胞の組成物。
【請求項８７】
請求項69記載の方法によって調製された、細胞の組成物。
【請求項８８】
請求項70記載の方法によって選択されたアプタマーに特異的に結合する細胞の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、35 U.S.C. § 119(e)の下で、2018年7月17日に出願された米国特許仮出願第62/699,438号、および2018年12月14日に出願された米国特許仮出願第62/779,946号の恩恵を主張し、これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
配列表
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出され、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる配列表を含む。2019年7月12日に作成された該ASCIIの複製物は、034186-092710WOPT_SL.txtという名前であり、32,467バイトのサイズである。
【０００３】
本発明の分野
本開示は細胞の単離に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
細胞療法の臨床的影響は、急性リンパ性白血病（ALL）およびびまん性大細胞B細胞リンパ腫を処置するキメラ抗原受容体（CAR）T細胞療法に対する最近の2つのFDA承認、ならびに臨床パイプラインにおける多くの有望な試験により、急速に実現されている。癌に加えて、CAR T細胞は、抗HIV療法などの他の細胞療法のために生成されている。細胞療法適用（例えば、CAR T細胞療法、樹状細胞ワクチンなど）のための現在の手順は、標的細胞（例えば、T細胞の特定のサブセット、単球など）を採取および単離すること、ならびにそれらまたはそれらの後代を患者中に再導入して戻す前に、それらを操作すること（例えば、それらを刺激すること、および／またはそれらを遺伝子改変すること）を含むことができる。特定の細胞サブセット（例えば、T細胞）を単離するために、無標識タンパク質ベースの単離技術が開発されたが、これらの方法の残りの課題には、必要とされる連続的な正の選択の数が理由で、低い細胞収率および高い費用が含まれる。
【発明の概要】
【０００５】
無標識細胞（例えば、CD8+T細胞）の生産規模の単離のための可逆的アプタマー選択技術が本明細書に記載される。
【０００６】
一局面では、数ある中でも、複数の細胞タイプを含む生物試料から関心対象の細胞を単離するための方法であって、以下の工程を含む方法が本明細書に記載される：(i)アプタマー結合細胞の形成を可能にする条件下で、関心対象の細胞に特異的な細胞表面マーカーに特異的に結合するアプタマーと生物試料を接触させる工程；(ii)アプタマーに結合していない細胞からアプタマー結合細胞を分離する工程；および(iii)細胞表面マーカーへのアプタマーの結合を破壊し、それにより、関心対象の細胞を生物試料から単離することによって、関心対象の細胞を回収する工程。
【０００７】
一態様では、関心対象の細胞は生存可能である。
【０００８】
別の態様では、関心対象の細胞は、白血球、リンパ球、単球、T細胞、またはCD3+細胞、CD4+細胞、もしくはCD8+細胞である。
【０００９】
別の態様では、アプタマーは標識を含む。
【００１０】
別の態様では、アプタマーに結合していない細胞からアプタマー結合細胞を分離する工程は、第1の固体支持体または相変化作用物質の使用を含む。
【００１１】
別の態様では、アプタマーは、(i)第1の固体支持体にコンジュゲートもしくは固定化されている、および／または(ii)親和性対の第1のメンバーで標識されている。
【００１２】
別の態様では、分離工程(ii)は、以下のいずれかを含む：(i)アプタマーを介して第1の固体支持体に結合しているアプタマー結合細胞を生物試料から取り出すこと、または(ii)親和性対の第2のメンバーを有する第2の固体支持体を加えて、親和性対の第1および第2のメンバーの相互作用を介して第2の固体支持体へのアプタマーの物理的結合を可能にし、アプタマー結合細胞を生物試料から取り出すこと。
【００１３】
別の態様では、アプタマーは相変化作用物質にコンジュゲートしている。
【００１４】
別の態様では、接触工程(i)は、相変化作用物質が溶液相にある条件下で行われ、分離工程(ii)は、相変化作用物質を溶液から沈殿させ、それにより、アプタマー結合細胞を生物試料から取り出すことを含む。
【００１５】
別の態様では、第1および／または第2の固体支持体は磁気応答性ビーズを含む。
【００１６】
別の態様では、第1および／または第2の固体支持体は、ポリマー、金属、セラミック、ガラス、ハイドロゲル、または樹脂を含む。
【００１７】
別の態様では、分離工程は、試料を磁場に供し、それにより、アプタマー結合細胞を含む磁気応答性ビーズまたは固体支持体を生物試料から分離する工程を含む。
【００１８】
別の態様では、拮抗薬は、ポリアニオン；小分子；またはアプタマーにハイブリダイズし、それによって、細胞表面マーカーへのアプタマーの結合を破壊するのに十分なほどアプタマーの配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド模倣物を含む。
【００１９】
別の態様では、アプタマー結合細胞は、アプタマーが結合しているマーカーを含む選択されたマーカー対に対して二重陽性である細胞を含む。
【００２０】
別の態様では、細胞の単離画分は、アプタマーが結合しているマーカーを含む選択されたマーカー対に対して二重陽性である細胞を含む。
【００２１】
別の局面では、複数の細胞画分を生物試料から単離する方法であって、以下の工程を含む方法が本明細書に記載される：(i)アプタマー結合細胞の形成を可能にする条件下で、複数の異なる関心対象細胞に特異的な細胞表面マーカーに特異的に結合する複数種のアプタマーと生物試料を接触させる工程；(ii)非アプタマー結合細胞からアプタマー結合細胞の集団を分離する工程；(iii)複数種の細胞表面マーカーのうちの1種または複数種への複数種のアプタマーのうちの1種または複数種の結合を破壊する複数種の拮抗薬を工程(ii)で分離したアプタマー結合細胞に連続して加え、それにより、連続して加えられた拮抗薬が、工程(ii)で分離した細胞の集団から異なる細胞画分を溶出し、それによって、複数の異なる細胞画分を生物試料から単離する工程。
【００２２】
一態様では、複数種の拮抗薬は、ポリアニオン；小分子；アプタマーにハイブリダイズし、それによって、その細胞表面マーカーへのアプタマーの結合を破壊するのに十分なほど、複数種のアプタマーのうちの1種のアプタマーの配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド模倣物；またはこれらの組み合わせを含む。
【００２３】
別の態様では、複数種のアプタマーは1種または複数種の固体支持体または相変化作用物質に結合している。
【００２４】
別の態様では、固体支持体は磁気応答性ビーズを含む。
【００２５】
別の態様では、固体支持体は、ポリマー、金属、セラミック、ガラス、ハイドロゲル、または樹脂を含む。
【００２６】
別の態様では、分離工程は、試料を磁場に供し、それにより、複数の異なるアプタマーに結合している細胞集団を含む磁気応答性ビーズまたは固体支持を試料から分離する工程を含む。
【００２７】
いくつかの態様では、複数の異なるアプタマーに結合している細胞集団が、試料を磁場に供することによって生物試料から分離される。
【００２８】
一態様では、アプタマー結合細胞は白血球、リンパ球、T細胞、またはCD3、CD8および／もしくはCD4発現細胞である。
【００２９】
別の局面では、1対の標的細胞マーカーに対して二重陽性である細胞について濃縮された細胞画分を生物試料から単離する方法であって、以下の工程を含む方法が本明細書に記載される：(i)アプタマー結合細胞の形成を可能にする条件下で、第1の標的細胞表面マーカーに特異的に結合する第1のアプタマーと生物試料を接触させる工程；(ii)非アプタマー結合細胞からアプタマー結合細胞の集団を分離する工程；(iii)工程(ii)で分離した細胞への第1のアプタマーの結合を破壊する第1の拮抗薬と工程(ii)で分離したアプタマー結合細胞の集団を接触させ、それによって、第1の標的細胞表面マーカーについて陽性の細胞の集団を単離する工程；(iv)アプタマー結合細胞の形成を可能にする条件下で、第2の標的細胞表面マーカーに特異的に結合する第2のアプタマーと工程(iii)で単離した集団を接触させる工程；(v)工程(iv)で形成したアプタマー結合細胞の集団を非アプタマー結合細胞から分離する工程；および(vi)工程(v)で分離した細胞への第2のアプタマーの結合を破壊する第2の拮抗薬と工程(v)で分離したアプタマー結合細胞の集団を接触させ、それによって、第1および第2の標的細胞表面マーカーに陽性の細胞の集団を単離する工程。
【００３０】
二重陽性細胞を単離するために、他のアプローチを使用することができる。例えば、CD3+CD8+細胞を単離するためのアプタマーの同時添加を使用するアプローチは、CD3、CD4、およびCD8に結合する3種のアプタマーを使用することができる。細胞に結合させ、それをカラムに載せた後に、CD8拮抗薬で最初に溶出して、CD3陰性／CD8lo単球／NK細胞を剥離するであろう。次いで、CD3拮抗薬を加えて、CD3+CD8+二重陽性細胞をカラムから剥離するであろう。CD4アプタマーは、CD4 T細胞をカラムに保つために含まれ、これは、CD3アプタマーはPBMCにおいてこの細胞にも結合すると考えられるからである。CD3およびCD8アプタマーのみを使用したい場合は、上述したように連続して行うのが最もよい。あるいは、1つはCD4用であり、もう1つはCD3用である2種のアプタマーを有するカラム中で空間的に離れた樹脂を使用することができる。上部層は、例えば、CD4+細胞を捕捉するCD4アプタマーを有する樹脂を有するであろう。下部層は、例えば、CD3+CD4-細胞（これは、事実上CD3+CD8+二重陽性細胞である）を捕捉するCD3アプタマーを有する樹脂を有するであろう。次いで、CD3拮抗薬を加えて、CD3+CD8+二重陽性細胞を溶出するであろう。
【００３１】
CD3+CD4+二重陽性細胞の単離も可能である。PBMCに多くのCD4lo単球が存在するので、CD4 T細胞のみを捕捉するためには、CD3+CD4+二重陽性細胞を単離することが重要であると考えられる。1つのアプローチは、CD3アプタマーとCD8アプタマーを同時に使用することである。このアプローチでは、最初にCD3拮抗薬で溶出して、カラムのCD3+CD4+二重陽性T細胞を取り去るであろう（CD8アプタマーがCD8 T細胞をカラムに保つ）。次に、CD8拮抗薬で溶出して、CD8陽性T細胞を取り出す。CD4アプタマーのみを用いる他の代替法は、T細胞のみであるCD4高発現体のみが結合するように、使用するCD4アプタマーの量を漸減することである。または、（最初に、CD4低単球を取り出すために低濃度で、次いで、CD4高発現体を取り出すために高濃度で）異なる濃度のCD4拮抗薬を連続的に加えることができる。慎重なカラム設計および拮抗薬の選択（添加の濃度およびタイミングの両方）によって、二重陽性細胞の効率的な単離を可能にすることができる。
【００３２】
一態様では、拮抗薬は、小分子；ポリアニオン；アプタマーにハイブリダイズし、それによって、細胞表面マーカーへのアプタマーの結合を破壊するのに十分なほどそれぞれのアプタマーの配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド模倣物；またはこれらの組み合わせを含む。
【００３３】
別の態様では、第1および／または第2のアプタマーは、1種または複数種の固体支持体または相変化作用物質に固定化されているか、またはコンジュゲートしている。
【００３４】
別の態様では、固体支持体は、磁気応答性ビーズ、ポリマー、金属、セラミック、ガラス、ハイドロゲル、または樹脂を含む。
【００３５】
別の態様では、固体支持体は磁気応答性ビーズを含み、第1および／または第2のアプタマーに結合している細胞集団が、細胞集団を磁場に供することによって分離される。
【００３６】
一態様では、アプタマー結合細胞は、白血球、リンパ球、T細胞、CD3+T細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、CD3+CD4+T細胞、またはCD3+CD8+T細胞を含む。
【００３７】
別の局面では、細胞表面マーカーの発現の程度に基づいて生物試料中の関心対象の細胞を分離する方法であって、以下の工程：(i)アプタマー結合細胞の形成を可能にする条件下で、関心対象の細胞に特異的な細胞表面マーカーに特異的に結合するアプタマーと生物試料を接触させる工程；(ii)アプタマーに結合していない細胞からアプタマー結合細胞を分離する工程；および(iii)細胞表面マーカーへのアプタマーの結合を破壊する漸増濃度の拮抗薬と、段階的にか、勾配としてかのいずれかで、工程(ii)で分離したアプタマー結合細胞を接触させる工程を含み、それにより、細胞表面マーカーの発現の程度に基づいて生物試料中の関心対象の細胞が分離され、その結果、マーカー発現がより低い（マーカーlo）、試料中の細胞が、拮抗薬のより低い濃度でアプタマーから溶出され、マーカー発現がより高い（マーカーhi）、集団中の細胞が、拮抗薬のより高い濃度で溶出される方法が本明細書に記載される。
【００３８】
一態様では、拮抗薬は、ポリアニオン；小分子；アプタマーにハイブリダイズし、それによって、細胞表面マーカーへのアプタマーの結合を破壊するのに十分なほど、アプタマーの配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド模倣物；またはそれらの組み合わせを含む。
【００３９】
別の局面では、細胞表面マーカーの発現の程度に基づいて生物試料中の関心対象の細胞を分離する方法であって、以下の工程：(i)アプタマー結合細胞の形成を可能にする条件下で、関心対象の細胞に特異的な細胞表面マーカーに特異的に結合するアプタマーと生物試料を接触させる工程；(ii)アプタマーに結合していない細胞からアプタマー結合細胞を分離する工程；および(iii)置換のキネティクスまたはアプタマー親和性が異なる複数種の拮抗薬と工程(ii)で分離したアプタマー結合細胞を連続して接触させる工程であって、拮抗薬を置換の相対的キネティクスまたは相対的アプタマー親和性が増える順で加える工程を含み、それにより、細胞表面マーカーの発現の程度に基づいて生物試料中の関心対象の細胞が分離され、その結果、マーカー発現がより低い（マーカーlo）、試料中の細胞が、置換の相対的キネティクスがより遅い、または相対的アプタマー親和性がより低い拮抗薬によってアプタマーから溶出され、マーカー発現がより高い（マーカーhi）、集団中の細胞が、置換の相対的キネティクスがより速い、または相対的アプタマー親和性がより高い拮抗薬によって溶出される方法が本明細書に記載される。
【００４０】
一態様では、拮抗薬は、ポリアニオン；小分子；アプタマーにハイブリダイズし、それによって、細胞表面マーカーへのアプタマーの結合を破壊するのに十分なほど、アプタマーの配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド模倣物；またはそれらの組み合わせを含む。
【００４１】
別の態様では、関心対象の細胞は、白血球、リンパ球、T細胞、またはCD3、CD8、および／またはCD4発現細胞である。
【００４２】
別の態様では、アプタマーは、1種または複数種の固体支持体または相変化作用物質に結合している。
【００４３】
別の態様では、固体支持体または相変化作用物質は磁気応答性ビーズを含む。
【００４４】
別の態様では、固体支持体は、ポリマー、金属、セラミック、ガラス、ハイドロゲル、または樹脂を含む。
【００４５】
別の態様では、分離工程は、試料を磁場に供し、それにより、複数の異なるアプタマーに結合している細胞集団を含む磁気応答性ビーズまたは固体支持体を生物試料から分離する工程を含む。
【００４６】
別の局面では、ヒトCD8ポリペプチドに選択的に結合する、SEQ ID NO:1〜6、10〜14、17〜22、27〜30、33〜48、または52〜66の配列を含む核酸分子が本明細書に記載される。
【００４７】
一態様では、核酸分子は、ヌクレオチド3および75、4および74、5および73、6および72、7および71、8および70、9および69、10および68、13および54、14および53、15および52、16および51、17および50、18および49、19および48、25および47、26および46、27および45、28および44、29および43、30および42、31および41、32および40、33および39、または34および38からなる群より選択されるヌクレオチド対に代償性変化を含み、核酸分子は、SEQ ID NO:1の核酸分子と比較して、CD8ポリペプチドへの選択的結合を保持する。
【００４８】
別の態様では、核酸分子は、ヌクレオチド3および75、4および74、5および73、6および72、7および71、8および70、9および69、10および68、13および54、14および53、15および52、16および51、17および50、18および49、19および48、25および47、26および46、27および45、28および44、29および43、30および42、31および41、32および40、33および39、または34および38からなる群より選択される2つ以上のヌクレオチド対に代償性変化を含み、核酸分子は、SEQ ID NO:3の核酸分子と比較して、CD8ポリペプチドへの選択的結合を保持する。
【００４９】
別の態様では、核酸分子は、DNA分子、RNA分子、またはPNA分子である。
【００５０】
別の態様では、核酸分子は修飾ヌクレオシドを含む。
【００５１】
例えば、インビボでの安定性を強化または改変するために、またはアプタマーの二次構造を安定化もしくは不安定化するために、アプタマーがその標的に結合する能力を維持する任意の修飾ヌクレオシドを組み込むことができる。
【００５２】
別の態様では、例えば表1のものから、アプタマーのヌクレオシドまたは修飾ヌクレオシドを選択することができる。
【００５３】
別の態様では、固体支持体は、本明細書に記載されるアプタマー核酸のいずれか1つまたは複数の核酸分子を含む。
【００５４】
別の態様では、固体支持体は磁気応答性ビーズである。
【００５５】
別の態様では、固体支持体は、ポリマー、金属、セラミック、ガラス、ハイドロゲル、または樹脂を含む。
【００５６】
別の態様では、固体支持体は核酸分子を介してCD8+T細胞に結合している。
【００５７】
別の態様では、核酸は標識も含む。
【００５８】
別の態様では、核酸はビオチン標識および／または蛍光標識を有する。
【００５９】
別の局面では、本明細書に記載される核酸に結合したCD8+ヒトT細胞を含む組成物が本明細書に記載される。
【００６０】
一態様では、本明細書に記載されるアプタマー核酸は、アプタマーの少なくとも8つの連続的なヌクレオチドに相補的な配列を含む核酸を含む拮抗薬にハイブリダイズする。
【００６１】
別の局面では、本明細書に記載されるアプタマーに相補的な少なくとも8つの連続的なヌクレオチドを含む核酸分子を含む拮抗薬が本明細書において記載され、拮抗薬は、それぞれ本明細書に記載されるCD8結合アプタマーのいずれか1つの、ヒトCD8ポリペプチドへの結合を阻害する。
【００６２】
一局面では、生物試料からCD8+T細胞を単離する方法であって、CD8に結合する本明細書に記載されるアプタマーまたはそのようなアプタマーを含む固体支持体とヒトCD8+T細胞を含む生物試料を接触させる工程を含み、接触がアプタマーへのCD8+T細胞の選択的結合を可能にする方法が、本明細書に記載される。
【００６３】
一態様では、生物試料は、全血、バフィーコート、または単離された単核細胞を含む。
【００６４】
別の態様では、方法は、アプタマーまたはアプタマーを含む固体支持体と生物試料を接触させた後に、アプタマーに相補的な少なくとも8つの連続的なヌクレオチドの配列を含む核酸分子を含む拮抗薬と試料を接触させる工程を含み、拮抗薬は、ヒトCD8ポリペプチドへの核酸の結合を阻害し、それによって、CD8+T細胞の放出を可能にする。
【００６５】
一態様では、CD8に結合する本明細書に記載されるアプタマーを含む固体支持体と試料を接触させ、試料をさらに磁場に供し、それによって、試料中の他の細胞から固体支持体に結合したCD8+T細胞を分離することを可能にする。
【００６６】
一局面では、関心対象の標的細胞タイプまたはクラスの細胞の集団を生物試料から調製する方法であって、以下の工程を含む方法が本明細書に記載される：(i)アプタマー結合細胞の形成を可能にする条件下で、関心対象の標的細胞またはクラスの細胞に特異的な細胞表面マーカーに特異的に結合するアプタマーと生物試料を接触させる工程、(ii)アプタマーに結合していない細胞からアプタマー結合細胞を分離する工程、(iii)その結合標的へのアプタマーの結合を破壊することによって、関心対象の細胞の集団を回収する工程。一態様では、(iv)回収された関心対象の細胞を改変するさらなる工程が行われる。
【００６７】
一態様では、改変は、細胞を活性化または刺激するための遺伝子改変または処理を含む。
【００６８】
一態様では、細胞は、T細胞、B細胞、単球、樹状細胞、またはナチュラルキラー細胞である。
【００６９】
一局面では、関心対象の特定の細胞タイプまたはクラスの細胞に結合するアプタマー配列を選択する方法であって、以下の工程を含む方法が本明細書に記載される：(i)関心対象のタイプまたはクラスの細胞を20〜85ヌクレオチドの所与の長さのランダム化配列を含む一本鎖DNAライブラリーとともにインキュベートする工程、(ii)関心対象の細胞に結合した一本鎖DNAを単離する工程、(iii)工程iiからの単離した一本鎖DNA配列を関心対象の細胞を含む細胞タイプの混合物とともにインキュベートする工程、(iv)抗体および抗体特異的支持カラムを用いて工程iiiのインキュベーションから関心対象の細胞を単離する工程、(v)工程ivで単離した細胞から結合一本鎖DNAを抽出する工程、(vi)工程vからの結合一本鎖DNA配列をPCR増幅する工程、(vii)工程viからの一本鎖DNA配列を関心対象の表面受容体を欠く細胞タイプとともにインキュベートする工程、(viii)非結合一本鎖DNAを工程viiの細胞から分離する工程、(ix)工程viiiからの非結合一本鎖DNA配列をPCR増幅する工程、(x)工程iii〜ixを少なくとも2回反復する工程、ならびに(xi)残存一本鎖DNAをシークエンシングする工程。
【００７０】
一態様では、関心対象の細胞は、白血球、リンパ球、T細胞、またはCD8+T細胞、またはCD3+T細胞、またはCD2+T細胞、またはCD4+T細胞、またはCD28+T細胞、またはB細胞、または単球、または樹状細胞、または幹細胞（例えば、造血幹細胞）である。
【００７１】
一態様では、関心対象の細胞は、本明細書に記載される2種以上の細胞表面マーカーの組み合わせを含む。
【００７２】
別の態様では、本明細書に記載される方法は、関心対象の細胞集団の大規模選択に使用される。
【００７３】
別の局面では、本明細書に記載される方法によって単離した細胞またはそれらの後代の組成物を投与すること含む、疾患または障害を処置する方法であって、細胞の組成物が疾患の少なくとも1つの症状を少なくとも10％低減する方法が本明細書に記載される。
【００７４】
一態様では、疾患または障害は癌、自己免疫疾患、またはHIV感染症である。
【００７５】
別の局面では、本明細書に記載される方法によって単離された細胞の組成物が本明細書に記載される。
【００７６】
別の局面では、本明細書に記載される方法によって単離された細胞画分の組成物が本明細書に記載される。
【００７７】
別の局面では、本明細書に記載される方法によって分離された細胞の組成物が本明細書に記載される。
【００７８】
別の局面では、本明細書に記載される方法によって単離されたCD8+T細胞の組成物が本明細書に記載される。
【００７９】
別の局面では、本明細書に記載される方法によって調製された細胞の組成物が本明細書に記載される。
【００８０】
別の局面では、本明細書に記載される方法によって選択されたアプタマーに特異的に結合する細胞の組成物が本明細書に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図1は、PBMCからの磁気枯渇を用いた競合的細胞-SELEXの概略図である。DNAアプタマーライブラリーを低ストリンジェンシーで混合T細胞に対して1ラウンドの正の選択にかけ、続いて、次第にストリンジェントな条件下で、それぞれPBMCおよびCD4loCD8-J.RT3-T3.5細胞に対して、4ラウンドの連続した競合的選択および負の選択にかけた。競合的選択のために、T細胞特異的アプタマーを濃縮し、非T細胞リンパ球、単球、および樹状細胞への結合体（binders）を枯渇させるためのアプタマーライブラリー暴露の後に、陰性画分としてT細胞をPBMCから単離した。競合的選択の後、Pan T細胞単離キットを使用して非標的細胞を枯渇させることによって、元のままの（untouched）T細胞および結合アプタマーをPMBCから単離した。
【図２】図2A〜2Bは、T細胞SELEXの異なるラウンドからのアプタマープールのT細胞およびJ.RT3-T3.5細胞への結合を示す。図2Aは、連続したラウンドのSELEX後の正の選択の混合T細胞および負の選択のJ.RT3-T3.5細胞に結合するアプタマープールのフローサイトメトリーヒストグラムを示す。図2Bは、異なるラウンドからのアプタマープールで陽性に染色された細胞の対応するパーセンテージを示す。それぞれのデータ点は技術的反復を示し、水平なバーは平均を示す。
【図３】図3は、T細胞SELEXの連続したラウンドの上位100のアプタマーの系統樹およびコンセンサスモチーフの出現を示す。系統樹は、FigTreeソフトウェア（tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/におけるhttpに従ってワールドワイドウェブで利用可能）で生成し、結合モチーフは、MEME解析（www.MEME-suite.orgにおけるhttpに従ってワールドワイドウェブで利用可能）を使用して予測した。
【図４】図4は、A1、A2、A3、A7、およびA8アプタマーの予測される最小自由エネルギー（MFE）二次構造を示す。アプタマーはそれらのラウンド5のランクに従って名付けた。構造は、NUPACKソフトウェア（温度=4C；Na+=137mM；Mg++=5.5mM）を使用して計算した。
【図５】図5A〜5Bは、T細胞およびJ.RT3-T3.5細胞への、ラウンド5の配列の上位10から選択された個々のアプタマーの結合を示す。図5Aは、ランダム（RN）アプタマー、ならびにA1、A3、およびA8アプタマー（ラウンド5のランクに従って名付けた）で陽性に染色された混合T細胞およびJ.RT3-T3.5細胞のパーセンテージのフローサイトメトリー解析を示す。それぞれのデータ点は技術的反復を示す。図5Bは、混合T細胞およびJ.RT3-T3.5細胞への、RN、A2、およびA7アプタマーの結合の蛍光強度の中央値（MFI）のフローサイトメトリー解析を示す。それぞれのデータ点は技術的反復（n=3）を示し、水平なバーは平均を示す。
【図６】図6A〜6Eは、アプタマー1、3、および8がCD8a糖タンパク質に結合することを示す。図6Aは、混合T細胞集団中のCD4+T細胞およびCD8+T細胞への50nMのランダム（RN）、A1、A3、およびA8アプタマーの結合のフローサイトメトリープロットを示す。図6Bは、非特異的（NS）siRNAまたはCD8 siRNA二本鎖を細胞にヌクレオフェクトしてから24時間後に3日間活性化したCD8+T細胞へのCD8a抗体（CD8a Ab）ならびに10nMのRN、A1、A3、およびA8アプタマーの結合のフローサイトメトリー解析を示す。ヒストグラムは、技術的三連を用いた3回の独立実験を代表する。チャートは、NS siRNA処理対照と比較した、CD8 siRNA処理細胞への結合を示す。データは、平均±s.d.、n=3、*P<0.05、および**P<0.01（Bonferroni補正を用いた一元配置ANOVA）である。図6Cは、GFPレポーターを有するCD8aプラスミドで細胞をヌクレオフェクトしてから24時間後のCD8-Jurkat細胞へのCD8a Abならびに10nMのRN、A1、A3、およびA8アプタマーの結合のフローサイトメトリー解析を示す。プロットは技術的三連を用いた3回の生物学的反復を代表する。チャートは、抗体またはアプタマーの結合にも陽性であったGFP+Jurkatのパーセンテージを示す。データは、平均±s.d.、n=3、*P<0.05、***P<0.001、および****P<0.0001（Dunnett検定を用いた対応のある一元配置ANOVA）である。図6Dは、固定化したA1、A3、およびA8アプタマーへの段階希釈したCD8aタンパク質の結合の、BLIで測定した結合および解離キネティクスを示す。結合相は0〜1200秒まで図示され、一方で解離は1200〜1800秒まで示される。KDは、1:1結合モデルに対して、CD8aタンパク質の異なる濃度での速度論的データの全体的適合を行うことによって計算した。データは、平均±s.d.、n=3〜4である。図6Eは、200nMのA8結合に対して正規化した、CD8+T細胞へのA1、A3、およびA8アプタマーのフローサイトメトリー結合曲線を示す。曲線は、技術的三連を用いた3回の独立実験の1部位の全結合を仮定した、非線形回帰を示す。KDは、独立実験の個々の回帰値を平均することによって計算した。データは、平均±s.d.、n=3である。
【図７】図7A〜7Bは、マウス脾臓T細胞およびアカゲザルPBMCへのA1、A3、およびA8アプタマーの結合を示す。図7Aは、フローサイトメトリープロットがCD3+CD8+マウス（mu）脾臓T細胞へのCD8a Abならびに50nMのRN、A1、A3、およびA8の結合を示すことを示す。プロットは3回の生物学的反復を代表する。図7Bは、CD3+CD8+アカゲザル（rh）PBMCへのアプタマーの結合についての同様のプロットを示す。
【図８】図8A〜8Bは、固定濃度のA1、A3、およびA8アプタマーとの異なるCD8a抗体濃度の競合的結合を示す。図8Aは、0〜40nMの対照CD3e抗体または競合的CD8a抗体の存在下における、CD8+T細胞への10ナノモル濃度（nM）のA1、A3 & A8の結合のフローサイトメトリーヒストグラムを示す。ヒストグラムは1回の生物学的反復を代表する。図8Bは、アプタマー結合の対応するMFIを示す。データは、n=1の生物学的反復である。
【図９】図9は、A3アプタマーと文献で以前に報告されたCD8 DNAアプタマーとの結合比較を示す。チャートは、記載される結合条件（T-BB）および発表されたアプタマーの結合条件（A-BB）下における、様々な濃度のCD8+T細胞へのRN、発表されたCD8Ap17s、およびA3の結合のMFIを示す。結合条件は、使用される緩衝液およびアニーリング条件を考慮する。データは、平均±s.d.、n=3の技術的反復である（エラーバーは小さすぎて可視化できない）。
【図１０】図10A〜10Bは、改変されたトーホールドを有するA3アプタマーの結合を妨げるように設計されている相補的拮抗薬を示す。図10Aは、UNPACKソフトウェア（温度=4C；Na+=137mM；Mg++=5.5mM）を使用した、変えられたA3アプタマーの予測される最小自由エネルギー（MFE）二次構造を示す。A3アプタマーは、（円で示すように）2塩基対（bp）を5’末端から除去し、（円で示すように）2bpを3’末端に加えることによって改変し、3’の8bpトーホールドを有するA3アプタマー（A3t）を作製した。灰色の線は、相補的拮抗薬（RA）がアニールするように設計された36bp領域を示す。図10AはSEQ ID NO:6を開示する。図10Bは、RAを用いた鎖置換後のA3tアプタマーの予測されるMFE二次構造を示す（温度=20C；Na+=137mM；Mg++=5.5mM）。図10Bは、出現順にそれぞれSEQ ID NO 6〜7を開示する。
【図１１】図11A〜11Bは、相補的拮抗薬を使用したA3tアプタマーの溶出の最適化を示す。図11Aは、拮抗薬（RA）の様々な倍数過剰濃度ならびに拮抗薬（RA）とのインキュベーションの時間および温度における、CD8+T細胞から溶出されたA3tアプタマー（5nM）のパーセンテージのフローサイトメトリー解析を示す。溶出は、所与の条件のMFIを使用し、それを所定の温度での拮抗薬を用いない染色のMFIで割ることによって計算した。データは、平均±s.d.、n=3技術的反復（エラーバーは小さすぎて可視化できない）である。図11Bは、異なる温度での100倍過剰の拮抗薬との10分間のインキュベーション後のA3t結合のフローサイトメトリーヒストグラムを示す。ヒストグラムは技術的三連を代表する。各ペイン中の陽性パーセント、または重複は、Overton減算を使用して計算する。
【図１２】図12A〜12Bは、PBMC内の異なる細胞タイプへのRNおよびA3tアプタマーの結合を示す。図12Aは、フローサイトメトリープロットがPBMCへのCD3、CD14、CD19、およびCD56抗体ならびに5nMのRNおよびA3tアプタマーの結合を示すことを示す。プロットは3回の生物学的反復を代表する。図12Bは、PBMC集団のおおよそ92％を占める異なる細胞タイプへのRNおよびA3tアプタマーの結合の対応する統計量を示す。アプタマーで陽性に染色された各細胞タイプのパーセンテージは、親集団の統計量であり、全PBMCではない。アプタマー陰性および陽性細胞を線引きする（delineate）ために使用した蛍光値を差し引くことによって、MFI値を正規化した。データは、平均±s.d.、n=3回の生物学的反復である。
【図１３】図13A〜13Fは、可逆的な、アプタマーベースの選択ストラテジーを使用する、PBMCからの無標識CD8+T細胞の単離を示す。図13Aは、A3tアプタマーを使用する、CD8+T細胞のトレースのない（traceless）選択の概略図を示す。Miltenyi抗ビオチンミクロビーズ上にプレロードしたビオチン化アプタマー（5nM）をPBMCとともにインキュベートして、CD8+T細胞を磁気により標識した。細胞懸濁液を磁場の下でLSカラムにアプライし、非標識細胞をフロースルー（FT）画分中に除去した。カラムに残存するミクロビーズ標識CD8+T細胞を100×過剰の相補的なRAとともにインキュベートし、放出されたCD8+T細胞をカラムからRA溶出（RAE）画分中に洗い流した。カラム上の残存細胞は、磁場の非存在下でプランジャーカラムフラッシュ（CF）を使用して取り出した。図13Bは、標準、抗体ベースのMiltenyi CD8ミクロビーズ単離、およびトレースのないアプタマーベースの単離の異なる画分におけるCD8発現のフローサイトメトリーヒストグラムを示す。ヒストグラムは、技術的三連を用いた3回の独立実験を代表する。図13Cは、CD3+CD16-T細胞とCD3-CD16+単球とNK細胞を区別するための、CD8+抗体で単離されたCF細胞画分およびアプタマーで単離されたRAE細胞画分におけるCD3およびCD16の発現のフローサイトメトリープロットを示す。プロットは技術的三連を用いた3回の独立実験を代表する。図13D〜Fは、抗体ベースの単離およびアプタマーベースの単離の異なる画分のCD3+CD8+CD16-T細胞の収率、純度、およびCD8 MFIのフローサイトメトリー解析を示す。記号は、別々の単離実験からの異なるドナーを示し、すべてのデータは技術的三連で収集した。データは、平均±s.d.、n=3、ns>0.05、および*P<0.05である（図13Dおよび13F、Tukey検定を用いた対応のある一元配置ANOVA；e、両側の対応のあるt検定）。
【図１４】図14A〜14Bは、収率、純度、およびフェノタイプ解析のためのフローサイトメトリーゲーティングストラテジーを示す。図14Aは、試料中のCD8+T細胞のパーセンテージを決定し、それにより、単離画分の純度および収率を決定するためのゲーティングスキームを示す。CD8+T細胞のパーセンテージは、CD8loCD3-CD16+細胞が単球およびNK細胞を示すので、生細胞のCD8+CD3+CD16-細胞のパーセンテージを使用して決定した。予め選択されたPBMCをこの例で示す。図14Bは、PBMCまたは新しく単離された細胞画分のいずれかにおいてCD8+T細胞のフェノタイプを決定するためのゲーティングスキームを示す。CD45RAおよびCD45ROの発現を使用して、ナイーブ／エフェクター（N/E）細胞をセントラル／エフェクターメモリー（CM/EM）細胞とそれぞれ区別し、CD62LおよびCCR7の発現（単一または二重）を一緒に使用して、非発現E/EM細胞からN/CM細胞を特定した。CD45RA/RO二重陽性であり、ゲートされていない細胞は、移行中の細胞として特定した。予め選択されたPBMCをこの例で示す。
【図１５】図15A〜15Bは、新しく抗体で単離されたCD8+T細胞および新しくアプタマーで単離されたCD8+T細胞のフローサイトメトリーフェノタイプおよびNanoString（商標）遺伝子発現プロファイリングを示す。図15Aは、PBMC、抗体で単離された細胞画分、およびトレースのないアプタマーで単離された細胞画分中の新しいCD8+T細胞の異なるフェノタイプのフローサイトメトリー解析を示す。棒グラフ（左上）は、3回の独立実験のフェノタイプの平均パーセンテージ（加えて100になるように正規化した）を示す。グループ化したチャート（右下）は、異なるフェノタイプの対応する個々の値を示し、記号は別々の単離実験からの異なるドナーを示す。データは、平均±s.d.、n=3、*P<0.05、および***P<0.001である（Dunnett検定を用いた対応のある二元配置ANOVA）。図15Bは、nCounter（登録商標）ヒト免疫学v2パネルにおいてバックグラウンドを上回って発現しているとして特定された292遺伝子のNanoString（商標）差次的発現解析を示す。倍数変化値は、抗体で単離された細胞と比較した、トレースのないアプタマーで単離された細胞の発現を示し、3回の生物学的反復を代表する。データは、平均±s.d.、n=3である（Benjamini-Yekutieli補正を用いた両側の対応のあるt検定）。
【図１６】図16A〜16Hは、抗体で単離された細胞およびアプタマーで単離された細胞から生成されたCD19 CAR T細胞の特性評価を示す。図16Aは、単離されたT細胞をレトロウイルスによって形質導入するために使用される、EGFRtレポーターを有する第2世代のCD19 CAR T細胞コンストラクトを示す。図16Bは、最初のビーズ刺激後9日目（S1D9）および照射されたCD19+TM-LCL細胞を用いた急速拡大プロトコール後13日目（REP、S1R1D13）の、抗体で単離されたT細胞およびアプタマーで単離されたT細胞におけるEGFRt発現のフローサイトメトリー解析を示す。細胞拡大のタイムラインは図17に示す。チャートは、図13D〜Fと同様の記号を用いて、S1R1D13におけるEGFRtレポーターのMFIを示す。データは、平均±s.d.、n=3、ns>0.05である（両側の対応のあるt検定）。図16Cは、ビーズ刺激後の形質導入していないモックT細胞の増殖を示す。記号は図13D〜Fと同様であり、n=3、ns>0.05である（Bonferroni補正を用いた対応のある二元配置ANOVA）。曲線は、指数増殖方程式に対する最小二乗適合を示す。図16Dは、S1D14 REP直前のモックおよびCD19 CAR T細胞におけるKi-67発現のフローサイトメトリー解析を示す。個々のドナー値は図19に見出すことができる。記号は図13D〜Fと同様である。データは、平均±s.d.、n=3、ns>0.05である（Sidak補正を用いた対応のある二元配置ANOVA）。図16Eは、REP直前のS1D14のモックおよびCD19 CAR T細胞におけるPD1/TIM3/LAG3発現のフローサイトメトリー解析を示す。円グラフは細胞の平均フェノタイプを示し、n=3、*P<0.05である（Bonferroni補正を用いた対応のある二元配置ANOVA）。図16Fは、REP直前のS1D14および機能アッセイ直前のS1R1D14のモックおよびCD19 CAR T細胞におけるCD62L/CD45RA発現のフローサイトメトリー解析を示す。個々のドナー値は図20に見出すことができる。円グラフは細胞の平均フェノタイプを示し、n=3、*P<0.05である（Bonferroni補正を用いた対応のある二元配置ANOVA）。図16G〜Hは、モックおよびCD19 CAR T細胞のインビトロでの抗腫瘍細胞毒性およびサイトカイン放出を示す。図16Hについては、記号は図13D〜Fと同様である。データは、平均±s.d.、n=3、ns>0.05である（図16G、Bonferroni補正を用いた対応のある二元配置ANOVA；図16H、Sidak補正を用いた対応のある二元配置ANOVA）。
【図１７】図17は、CAR T細胞の生成、増殖、および特性評価のタイムラインを示す。3健常ドナーからの抗体で単離されたCD8+T細胞およびトレースのないアプタマーで単離されたCD8+T細胞を保存したものを解凍し、3.3e6個の細胞の2つの群に分け、アクチベータービーズで刺激した。刺激媒介性増殖を2週間行い、2日目（S1D2）に、群のうちの1つをレトロウイルスによってCD19 CARで形質導入し、細胞をビーズから取り出し、9日目（S1D9）に、EGFRt形質導入レポーターについて染色し、12日目（S1D12）に、EGFRt+細胞を磁気により濃縮し、最後に、14日目（S1D14）に、分化、活性化／増殖、および消耗（exhaustion）について細胞を特性評価した。S1D14に、次いで、各試料からの1.5e6個の細胞を2週間の急速拡大プロトコール（REP）に置き、この細胞を照射されたフィーダー細胞と共培養した。13日目またはREP（S1R1D13）に、EGFRt染色を介してCAR+T細胞の濃縮を評価した。最後に、REPの14日目（S1R1D14）に、細胞を抗腫瘍細胞毒性およびサイトカイン放出アッセイを使用して機能的に特性評価し、分化および遺伝子発現についてフェノタイプ的に特性評価した。
【図１８】図18は、REP後の形質導入していないモックおよび形質導入したCD19 CAR T細胞の増殖を示す。記号は図15Aと同様である。n=3、P>0.05である（Bonferroni補正を用いた対応のある二元配置ANOVA）。曲線は、指数増殖方程式に対する最小二乗適合を示す。
【図１９】図19は、S1D14の抗体で単離されたモックおよびCD19 CAR T細胞ならびにアプタマーで単離されたモックおよびCD19 CAR T細胞におけるPD1/TIM3/LAG3発現の個々の値を示す。データは図16Eの円グラフを代表する。記号は図15Aと同様である。データは、平均±s.d.、n=3、P>0.05、*P<0.05、および**P<0.01である（Bonferroni補正を用いた対応のある二元配置ANOVA）。抗体で単離された細胞とアプタマーで単離された細胞の間のすべての他のペアワイズ比較はP>0.999を有する。
【図２０】図20は、S1D14およびS1R1D14の抗体で単離されたモックおよびCD19 CAR T細胞ならびにアプタマーで単離されたモックおよびCD19 CAR T細胞におけるCD62L/CD45RA発現の個々の値を示す。データは図16Fの円グラフを代表する。記号は図15Aと同様である。データは、平均±s.d.、n=3、およびP>0.05および*P<0.05である（Bonferroni補正を用いた対応のある二元配置ANOVA）。
【図２１】図21は、S1R1D14の抗体で単離されたモックおよびCD19 CAR T細胞ならびにアプタマーで単離されたモックおよびCD19 CAR T細胞のNanoString（商標）遺伝子発現プロファイリングを示す。それぞれモックおよびCD19 CAR T細胞について、nCounterヒト免疫学v2パネルにおいてバックグラウンドを上回って発現しているとして特定された331個および335個の遺伝子に対して、差次的発現解析を行った。倍数変化値は、抗体で単離された細胞と比較した、トレースのないアプタマーで単離された細胞の発現を示し、3回の生物学的反復を代表する。データは、平均±s.d.、n=3である（Benjamini-Yekutieli補正を用いた両側の対応のあるt検定）。
【図２２】図22は、T細胞の機能研究に使用される標的細胞株における腫瘍抗原の発現を示す。ヒストグラム（左）は、K562親（陰性対照）、K562+CD19、およびCARによって標的にされるRaji親細胞における、細胞外CD19発現を示す。ヒストグラム（右）は、K562親およびTCR/CD3によって標的にされるK562+OKT3（陽性対照）細胞における細胞外OKT3 Fab発現を示す。
【図２３】図23A〜23Bは、抗体で単離されたCD8+CD19 CAR T細胞およびアプタマーで単離されたCD8+CD19 CAR T細胞を用いた腫瘍ストレス試験を示す。5×105個のCD19+Raji細胞をNSGマウスに静脈内（i.v.）接種し、7日後に、このマウスを抗体で単離されたドナー細胞またはアプタマーで単離されたドナー細胞からの107個のCD8+モックまたはCD19 CAR T細胞で処置した。図23Aは全身的腫瘍の流束を示す。記号「†」は、個々のマウスの安楽死を示す。細い曲線は個々のマウス（3匹のマウス／ドナー／群）についての腫瘍流束値であり、一方で太い曲線は、それぞれのCD19 CAR T細胞処置群についての経時的な平均流束値である。図23Bは、Kaplan-Meier生存曲線を示す。CD19 CAR T細胞処置群の生存期間中央値（日）は以下の通りであった；抗体：55；アプタマー：55。n=9（3匹のマウス／ドナー）、ns>0.05（ログランク検定）。
【図２４】図24A〜24Bは、様々な長さのアプタマーと拮抗薬の対およびA3拮抗薬の最適化を示す。図24Aは、A1（40bp）、A3（42bp）、およびA8（37bp）に対する拮抗薬の配列を示し、各拮抗薬間の相同配列に下線を引く（上部）。選択された拮抗薬とアプタマーの結合を示す（下部）。図24Aは、出現順にそれぞれSEQ ID NO 49〜51を開示する。図24Bは、20〜85塩基対の長さのA3拮抗薬の長さの最適化を示し、左に配列、右に結合研究を示す。図24Bは、出現順にそれぞれSEQ ID NO 53〜59、54、61〜62、および55を開示する。
【図２５】図25は、拮抗薬による鎖置換の向上のために4つまたは6つのグアニン（G）を有する8bp延びたトーホールドを有するさらなるA3アプタマーの配列（上部）および二次構造（下部）を示す。図25は、出現順にそれぞれSEQ ID NO 65〜66を開示する。
【図２６】図26は、鎖置換の向上のために様々な量のグアニンを有する理論上のトランケートされたA3tアプタマーを示す。図26は、出現順にそれぞれSEQ ID NO 6、112〜114、7、および115〜117を開示する。
【図２７】図27は選択されたアプタマーを用いた結合研究を示す。アプタマーCD3.CD28.A1はPBMC中のCD3+集団への優先的結合を示す。
【図２８】図28は、予測TCBA.1二次構造（左）および結合定数（右）を示す。TCBA.1、TCBA.1-tr1、およびTCBA.1-tr2を、0.1〜25nMの濃度の範囲のCD3およびCD28抗体の存在において、PBMCとともに4℃で30分間インキュベートした。TCBA.1はPBMC中のCD3+集団への結合について1〜2nMの間のkDを有し、CD3+CD28-に対する最大結合がより高い。TCBA.1-tr1はより低い親和性で結合し、TCBA.1-tr2はまったく結合しない（データ非表示）。TCBA.1はH9、Jurkat、Jurkat/CD3KO、およびJurkat/CD28KO細胞に結合しない。図28はSEQ ID NO:118を開示する。
【図２９】図29は、アプタマーTCBA.1の81塩基対アプタマー配列および平衡確率をともなう4Cでの予測される二次構造を示す。図29はSEQ ID NO:64を開示する。
【図３０】図30は、TCBA.1と接触しているT細胞のプルダウンアッセイの結果を示す。5×106個のPBMCを100nMのTCBA.1-ビオチンアプタマーとともに4℃で30分間インキュベートし、続いて、これに抗ビオチン磁気ビーズを加え、これを洗浄し、磁気分離カラムにアプライした。収集した細胞をCD4、CD8、CD2の抗体染色およびTCBA.1-FITCアプタマーの結合について解析した。
【図３１】図31は、CD8がTCBA.1結合に対する受容体であることを示す。CD8+T細胞を3日間活性化し、次いで、これにNSまたはCD8 siRNAをヌクレオフェクトした。24時間後に、抗CD8抗体およびTCBA.1アプタマーの結合のフローサイトメトリー研究を行った。
【図３２】図32は、抗CD8抗体対TCBA.1アプタマーのPBMC分離の比較を示す。PBMCを抗CD8-ビオチン抗体（REA734）またはTCBA.1-ビオチンおよび抗ビオチン磁気ビーズとともにインキュベートし、その後、これをMSカラムにアプライした。フロースルー（FT）およびプルダウン（PD）細胞を結合CD8抗体およびTCBA.1アプタマーについてフローサイトメトリーによって解析した。TCBA.1プルダウンは、抗CD8 Abプルダウンよりも高いCD8+細胞の純度を示し、TCBA.1でプルダウンされた85％細胞がCD8陽性であった。
【図３３】図33はCD8+細胞のアプタマーベースの分離の概略図を示す。工程は以下の通りである：（1）ビオチン化アプタマーでPBMC混合物を標識する工程、（2）標識された細胞を磁気ストレプトアビジンビーズで分離する工程、および（3）無標識細胞を特異的に放出する工程。
【図３４】図34はアプタマーの結合を反転させるための相補DNA鎖の使用を示す。アンチドートの二次構造予測（左）を配列（上部）とともに示す。アンチドートを加えて、または加えずに、10および25nMのTCBA.1とともにCD8+T細胞を異なる3温度でインキュベートした。アンチドートとのコインキュベーションは、90％まで結合を低減し、より高い温度ではさらに大きく低減する。60％までの結合の低減が37℃で達成された。図34は出現順にそれぞれSEQ ID NO 8および118を開示する。
【図３５】図35は、A3tアプタマー選択のための10×拮抗薬を用いた、CD8低（CD8lo）対CD8loおよびCD8高（CD8hi）細胞の溶出の例を示す。
【図３６】図36は、2つのクラスのT細胞（例えば、CD4+およびCD8+）の単離のための2種のアプタマーおよび拮抗薬を用いた連続的溶出の方法をさらに図示するための概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００８２】
詳細な説明
本明細書に記載される組成物および方法は、核酸アプタマーが、関心対象の細胞（限定されないが、T細胞を含める）に選択的に結合することができ、これを相補的拮抗薬を用いて可逆的に除去して、関心対象の複数種の細胞を単離することができるという発見に部分的に関連する。核酸アプタマーおよび拮抗薬の選択および特性評価を含む方法および組成物も本明細書に記載される。可逆的なアプタマーベースの細胞選択は、しっかりした、費用効率の高い大規模な細胞単離手順を可能にする。さらに、本明細書に記載されるものなどのアプタマーは拮抗薬を用いて細胞表面から容易に除去され、これは、単一の装置から複数の細胞選択を可能にし得る完全合成システムに向けた重要な技術進歩である。本明細書に記載される方法および組成物は、癌、HIV、または細胞療法による処置に適している他の疾患の処置のために、その天然形態で有用である、または治療的もしくは産業的目的（例えば、CAR T細胞およびCD8 T細胞、樹状細胞ワクチン、もしくは他の細胞性治療剤）のために細胞を改変する方法で有用である細胞を単離する能力を強化することができる。
【００８３】
以下は、当業者による本明細書に記載される技術の実施を容易にするために考慮すべき事柄を記載する。
【００８４】
定義
本明細書において使用する場合、用語「関心対象の細胞を単離する」は、他の細胞、細胞クラスの細胞タイプを含む試料からの標的細胞、細胞タイプまたはクラスの細胞の選択的な分離または濃縮であって、その結果、特定の細胞マーカー（例えば、CD8陽性T細胞に対するCD8）によって決定した場合に、そのような分離によって生じる細胞集団が、高い細胞純度を有する選択的な分離または濃縮を指す。
【００８５】
低いよりも高い細胞純度が好ましいが、用語が本明細書において使用される場合、細胞「単離」は、得られた細胞集団の100％の純度を要求しない。標的細胞またはそれらの集団は、これらが、本明細書に記載される単離方法によって得られた標的細胞集団の少なくとも60％、好ましくは、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％またはそれ以上を構成するならば、用語が本明細書において使用される場合「単離された」と一般に考えられるであろう。
【００８６】
「複数」は、少なくとも2メンバーを含む。特定の場合には、複数は、少なくとも10、少なくとも100、少なくとも1000、少なくとも10,000、少なくとも100,000、または少なくとも1,000,000またはそれ以上のメンバーを有し得る。本明細書において使用する場合、「複数の細胞タイプ」は、細胞表面マーカーもしくはそれらの組成物および／または生理機能が異なる細胞を含む生物試料を指す。
【００８７】
本明細書において使用する場合、関心対象の標的細胞または細胞画分もしくは集団「に特異的な」表面マーカーは、その標的細胞または細胞画分と異なる標的細胞または細胞画分の表面で発現しており、それによって、本明細書に記載される方法を使用してT細胞または細胞画分を特定および単離することを可能にする、ポリペプチドまたは他の分子である。いくつかの態様では、単一表面マーカーが標的細胞を特定するのに十分であり、例えば、CD8aはCD8+T細胞を特定する。他の態様では、2種以上のマーカーが一緒に標的細胞または細胞集団または画分を特定することができる。他の態様では、単一マーカーが標的細胞のクラスを特定することができ、例えば、CD3はT細胞を1つのクラスとして本質的に特定する。他の態様では、細胞表面マーカーは、膜脂質、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である。
【００８８】
本明細書において使用する場合、用語「生物試料を接触させる」は、本明細書に記載されるアプタマーまたは核酸の文脈で使用される場合、細胞の細胞表面または細胞外基質の標的部分またはマーカーへのアプタマーの特異的または選択的結合を可能にする条件下での、生物試料へのアプタマーの添加を指す。
【００８９】
本明細書において使用する場合、用語「アプタマー結合細胞の形成を可能にする条件」は、25mMグルコース、5.5mM MgCl2六水和物、様々な量のウシ血清アルブミン（BSA）が補充され、7.5のpHを有する、0.1mg/ml tRNA、0.1g/L CaCl2、0.2g/L KCl、0.2g/L KH2PO4、8.0g/L NaCl、2.1716 Na2HPO4七水和物を含む結合緩衝液中で、4℃で30分間細胞をインキュベートすること、またはこれらの状態下で許される結合と実質的に同等である結合を提供する条件を指す。この文脈では、実質的に同等は、これらの条件下で許される結合の±10％を意味する。
【００９０】
本明細書において使用する場合、用語「核酸」は以下の1つまたは複数のタイプを含む：ポリデオキシリボヌクレオチド（2-デオキシ-D-リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（D-リボースを含む）、およびプリンもしくはピリミジン塩基のN-グリコシド、または修飾されたプリンもしくはピリミジン塩基（非塩基部位を含む）である任意の他のタイプのポリヌクレオチド。本明細書において使用する場合、用語「核酸」は、典型的にはサブユニット間のホスホジエステル結合によってであるが、場合によっては、ホスホロチオエート、メチルホスホネートなどによって共有結合している、リボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオシドのポリマーも含む。「核酸」は、一本鎖および二本鎖のDNA、ならびに一本鎖および二本鎖のRNAを含む。例示的な核酸としては、非限定的に、gDNA；hnRNA；mRNA；rRNA、tRNA、マイクロRNA（miRNA）、低分子干渉RNA（siRNA）、核小体低分子RNA（snORNA）、核内低分子RNA（snRNA）、および小分子RNA（stRNA）など、ならびにこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【００９１】
本明細書に記載される場合、「代償性変化」は、予測される二次構造および／またはアプタマーの標的結合を維持する、ヌクレオシドまたは核酸塩基対の変化を指す。代償性変化の非限定例としては、例えば核酸のステムループ構造における、C:G塩基対へのG:C塩基対の変化、またはT:A塩基対へのA:T塩基対の変化が挙げられる。A:T塩基対とC:G塩基対の間の水素結合特性の違いのために、A:T塩基対をC:G塩基対と置き換えることは、二次構造の安定性を変化させること、すなわち、その安定性を高めることが予想されるであろう。したがって、本明細書に記載される代償性変化はそのような変化をさらに含むことができる。C:GまたはG:C塩基対からA:TまたはT:A塩基対への変化は、二次構造または標的結合特性に有意に影響を及ぼすことなく、許容され得ることもあることが考えられる。しかし、このタイプの代償性変化は、アプタマーの全体的なステム安定性との関連において考慮されるべきである。本明細書に記載される場合、アプタマーのヌクレオチド配列の代償性変化は、適切な場合には、限定されないが、表1に記載される核酸塩基またはヌクレオシドより選択される修飾ヌクレオシドを含むことができる。
【００９２】
本明細書において使用する場合、用語「ポリペプチド」は、単数形の「ポリペプチド（polypeptide）」および複数形の「ポリペプチド（polypeptides）」を包含し、2つ以上のアミノ酸の任意の鎖または複数の鎖を含むことが意図される。したがって、本明細書において使用する場合、限定されないが、「ペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「タンパク質」、「酵素」、「アミノ酸鎖」、および「連続的アミノ酸配列」を含む用語はすべて「ポリペプチド」の定義内に包含され、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかの代わりに、またはこれらの用語と互換的に使用することができる。本用語は、例えば、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、誘導体化、タンパク質分解性切断、翻訳後プロセシング、または1つもしくは複数の非天然アミノ酸の含有による修飾を含めた1つまたは複数の翻訳後修飾を受けたポリペプチドをさらに含む。ポリヌクレオチドおよびポリペプチド構造について、慣例的な命名法が当技術分野に存在する。例えば、アミノ酸を記載するために、以下の1文字および3文字の省略形が広く用いられている：アラニン（A；Ala）、アルギニン（R；Arg）、アスパラギン（N；Asn）、アスパラギン酸（D；Asp）、システイン（C；Cys）、グルタミン（Q；Gln）、グルタミン酸（E；Glu）、グリシン（G；Gly）、ヒスチジン（H；His）、イソロイシン（I；Ile）、ロイシン（L；Leu）、メチオニン（M；Met）、フェニルアラニン（F；Phe）、プロリン（P；Pro）、セリン（S；Ser）、スレオニン（T；Thr）、トリプトファン（W；Trp）、チロシン（Y；Tyr）、バリン（V；Val）、およびリジン（K；Lys）。本明細書に記載されるアミノ酸残基は、「L」異性体型であることが好ましい。しかし、ポリペプチドの望ましい特質が保持されている限り、「D」異性体型の残基を任意のL-アミノ酸残基の代わりに用いることができる。
【００９３】
本明細書に記載される場合、「固体支持体」は、標的細胞との接触のための1種または複数種のアプタマーがその上に提示され得る構造物である。固体支持体は、結合した標的細胞を混合物または懸濁液から単離するまたは取り出すための迅速な手段を提供する。固体支持体は、例えば、粒子、ビーズ、フィルター、またはシート、樹脂、スキャフォールド、マトリックス、またはカラムの形態であり得る。固体支持体が含むことができる材料の非限定なクラスとしては、ポリマー、金属、セラミック、ゲル、紙、またはガラスを挙げることができる。材料としては、限定されないが、ポリスチレン、アガロース、ゼラチン、酸化鉄、ステンレス鋼、ポリカーボネート、ポリジメチルシロキサン、ポリエチレン、アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン、シクロ−オレフィンポリマー、およびシクロ−オレフィンコポリマーを挙げることができる。
【００９４】
本明細書に記載される場合、「相変化作用物質」は、あるセットの条件下では水溶液に可溶性であるが、別のセットの条件下では不溶性の沈殿形態にさせられる作用物質である。可溶性形態と不溶性形態の両方についての条件は、標的細胞の生存率を維持するのに適合しなければならない。相を変える条件の非限定例としては、温度、pHおよび塩または溶質濃度が挙げられる。相変化作用物質の例としては、ある温度で可溶性であり、次いで、異なる温度で溶液から沈殿するポリ（N-イソプロピルアクリルアミド）相変化作用ポリマーが挙げられる。
【００９５】
本明細書において使用する場合、用語「親和性対」は、一般に低マイクロモル濃度からピコモル濃度の範囲の高親和性で特異的に互いに結合する部分の対を指す。親和性対の1つのメンバーが第1の要素にコンジュゲートし、対のもう1つのメンバーが第2の要素にコンジュゲートしている場合は、親和性対のメンバーの相互作用によって、第1および第2の要素が結び付けられると考えられる。アプタマーまたは固体支持体にコンジュゲートすることができる親和性対の非限定例としては、数ある中でも、リガンド−受容体対、抗体−抗原対、およびより小さな対、例えば、ビオチン−アビジン、またはビオチン−アビジン変異体、例えばビオチンストレプトアビジン、またはビオチン-ニュートラアビジンが挙げられる。ほんの一例として、ビオチン-ストレプトアビジンの相互作用は、10-14〜10-15モル濃度のKdを有する。
【００９６】
本明細書において使用する場合、用語「にコンジュゲートした」は、限定されないが、架橋結合作用物質を介する架橋結合を含めた共有結合による、またはコンジュゲートが使用される条件下で維持される強い非共有結合相互作用による、アプタマーと固体支持体、相変化作用物質、または親和性対のメンバーとの結合を包含する。
【００９７】
本明細書において使用する場合、用語「ハイブリダイズする」は、一本鎖核酸またはその領域が、別の一本鎖核酸もしくはその領域（分子間ハイブリダイゼーション）または同じ核酸の別の一本鎖領域（分子内ハイブリダイゼーション）のいずれかと水素結合性塩基対相互作用を形成する現象を指す。拮抗薬とアプタマーの間のハイブリダイゼーションは、アプタマーの二次構造の不安定化よって、標的へのアプタマーの結合を破壊することが可能になり、これにより、可逆的細胞選択を生じさせることが可能になる。ハイブリダイゼーションは関与する塩基配列によって支配され、相補的核酸塩基が水素結合を形成し、任意のハイブリッドの安定性は塩基対の同一性（例えば、G:C塩基対はA:T塩基対よりも強い）および連続的塩基対の数によって決定され、相補的塩基のより長いストレッチはより安定なハイブリッドを形成する。
【００９８】
本明細書において使用する場合、「磁気応答性ビーズ」は、磁気装置または磁場に引きつけられ得る固体支持粒子を指す。アプタマーでコーティングされた、またはそうでなければアプタマーにコンジュゲートした磁気応答性ビーズは、アプタマー結合細胞を生物試料から分離するために使用することができる。用語「ビーズ」は球形の形態を暗示するが、これは、非アプタマー結合細胞からアプタマー結合細胞を分離するために使用することができる磁気応答性固体支持体の形状に関する制限ではない。形状は、不規則でもよく、または球形のある種の変形、楕円形、立方形などでもよい。様々な態様では、磁気応答性ビーズは、例えば架橋結合反応を介して共有結合的にアプタマーにコンジュゲートすることができ、または、例えば親和性対のメンバーの相互作用を介して非共有結合的にコンジュゲートすることができる。
【００９９】
本明細書において使用する場合、用語「発現」は、遺伝子の核酸配列に基づいてポリペプチドが生成されるプロセスを指す。本プロセスは転写と翻訳の両方を含む。
【０１００】
本明細書において使用する場合、「細胞画分」は、所与の特性、例えば、ある特定のマーカーまたは一連のマーカーの発現を共に有する、試料集団中の細胞のサブセットを指す。標的細胞画分は1つより多い細胞タイプを含むことができ、ほんの一例として、T細胞が細胞画分である場合、その画分は、例えば、数ある中でも、CD4+T細胞およびCD8+T細胞を含むことができる。いくつかの態様では、標的細胞画分は単一の細胞タイプを含む。T細胞は、他の細胞と同様に、表面抗原分類（CD）マーカー、またはケモカイン受容体（CCR）によって特定することができる。T細胞マーカーの非限定例としては、CD8、CD19、CD4、CD3、CD28、CD45、CD62、CD31、CD27、またはCCR-7が挙げられる。
【０１０１】
本明細書において使用する場合、用語「細胞表面マーカーに特異的に結合する」は、本明細書に記載されるアプタマーが、哺乳動物細胞の生存率を維持する条件下で所与の標的細胞またはその上の細胞表面マーカーに結合し、その結果、アプタマーが、他のマーカーまたは所与のマーカーを発現しない他の細胞に結合するよりも有意に大きな程度まで所与の標的細胞表面マーカーに結合する能力を指す。最小で、細胞表面マーカーに特異的に結合するアプタマーは、1マイクロモル濃度以下のKdでそのマーカーに結合し、無関係の細胞表面マーカーに結合するよりも少なくとも100×大きい親和性で標的マーカーに結合する。
【０１０２】
本明細書において使用する場合、用語「小分子」は、限定はされないが、ペプチド、ペプチド模倣物、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、アプタマー、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、または1モルあたり約10,000グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物（例えば、ヘテロ有機および有機金属化合物が含まれる）、1モルあたり約5,000グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、1モルあたり約1,000グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、1モルあたり約500グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、ならびに細胞上の細胞表面マーカーからアプタマーを放出するのに有効な拮抗薬の濃度で細胞生存率に適合する、そのような化合物の塩、エステルおよび他の形態を含むことができる化学作用物質を指す。
【０１０３】
本明細書において定義される場合、「フローサイトメトリー」は、極微の粒子、例えば細胞および染色体を流体の流れに懸濁させ、電子検出装置を通過させることによって、それらをカウントする、および調べるための技法を指す。フローサイトメトリーは、1秒あたり何千もの粒子までの物理的および／または化学的パラメーター、例えば蛍光パラメーターの同時の多パラメーター解析を可能にする。現代のフローサイトメトリー機器は、通常、複数のレーザーおよび蛍光検出器を有する。レーザーおよび検出器の数を増加させると、複数の抗体による標識が可能になり、それらのフェノタイプマーカーによって標的集団をより正確に特定することができる。ある特定のフローサイトメトリー機器は、個々の細胞のデジタル画像を撮ることができ、これによって、細胞内のまたは細胞の表面上の蛍光シグナルの位置の解析が可能になる。
【０１０４】
本明細書において使用する場合、用語「免疫療法」は、癌性の、またはそうでなければ有害なタンパク質、細胞、または組織に対して、適応免疫または先天免疫を（能動的に、または受動的に）誘発または増幅するための、対象の免疫系の刺激、誘導、破壊、模倣、強化、増強、または任意の他のモジュレーションを介する、疾患の処置を指す。免疫療法（すなわち、免疫療法剤）としては、既存の癌を処置する、もしくは癌の発生を防止するために設計されているか、または癌の再発の可能性を低減するためにアジュバントの設定で使用するために設計されているかに関わらず、癌ワクチン、免疫調節物質、「抗体ベースの免疫療法」またはモノクローナル抗体（例えば、ヒト化モノクローナル抗体）、免疫刺激剤、細胞ベースの療法、例えば、養子T細胞療法または樹状細胞免疫療法または樹状細胞ワクチン、およびウイルス療法が挙げられる。
【０１０５】
本明細書において使用する場合、用語「トーホールド」は、一本鎖であり、拮抗薬のある領域に相補的であるように設計されている、アプタマーの5〜15塩基対の突出領域を説明する。トーホールドの相補的性質は、拮抗薬が一本鎖領域へ容易にハイブリダイズすることを可能にし、アプタマーの隣接する二本鎖領域に相補的な拮抗薬の残部が隣接する二本鎖領域で鎖置換を開始するのを容易にする。したがって、トーホールドは、一般に、アプタマー中でステム構造であると一般に考えられる、破壊するかまたは置換することを望む二本鎖配列の領域に隣接するように設計されるかまたは選ばれる。トーホールドは、拮抗薬がハイブリダイゼーションおよび鎖置換を開始して、それによって、その細胞表面マーカー標的へのアプタマーの結合を効率的に破壊するための速度論的利点を提供する。トーホールドは、必ずではないが、一般に、アプタマーが望ましい標的に結合することがいったん見出されれば、アプタマーに加えられる。別の方法として、アプタマーライブラリーのすべてのメンバーが、例えば、一端またはもう一端にトーホールドとしての役割を果たすであろう同じ配列を有することができる。したがって、構造予測下で塩基対形成していない、アプタマーの内部領域は、トーホールド配列として働くことができる。トーホールドは、例えば、より低いGC含量の配列と比較して、その相補体へのハイブリダイゼーションについての鎖置換速度定数の向上をもたらすために比較的高いGC含量を含むことができる。
【０１０６】
本明細書において使用する場合、用語「含む（comprising）」または「含む（comprises）」は、主張する技術に必須の組成物、方法、およびそれらのそれぞれの成分に関連して使用されるが、依然として、必須であるかどうかを問わず、明記されていない要素を含有するための余地がある。
【０１０７】
本明細書において使用する場合、用語「から本質的になる」は、所与の態様に必要とされる要素を指す。本用語は、本発明のその態様の基本的および新規または機能的な特性に著しく影響を及ぼさないさらなる要素の存在を許可する。
【０１０８】
用語「からなる」は、本明細書に記載される組成物、方法、およびそれらのそれぞれの成分を指し、これらは、態様のその説明に列挙されていないいかなる要素も含めない。
【０１０９】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈において別段明記しない限り、複数形の言及を含む。したがって、例えば、「方法（the method）」への言及は、本明細書に記載される、および／または本開示を読む際に当業者に明らかとなるであろうタイプの1つまたは複数の方法、および／または工程などを含む。
【０１１０】
核酸アプタマー組成物
標的分子に結合することができる一本鎖オリゴヌクレオチドである核酸アプタマーは、細胞選択にとって、抗体の魅力的な代替物である。アプタマーは、抗体に匹敵する、または抗体よりもさらに高い結合親和性を有し得る。重要なことに、アプタマーは、詳細に明らかにされた、長い貯蔵安定性を有する変動性の低い生成物として合成的に生成される。アプタマーは、試験管内進化法（systematic evolution of ligands by exponential enrichment）（SELEX）として公知のライブラリー選択方法によって発見することができ、化学的安定性についてさらに最適化することができる。その好都合な属性の故に、アプタマーの適用分野は、ここ四半世紀で段階的に拡大して、感知、精製、診断、薬物送達、および治療剤を含めた領域を包含している。
【０１１１】
核酸アプタマーとしては、標的分子に特異的に結合することができる、RNA、DNA、および／または合成核酸類似体（例えば、PNA）が挙げられる。アプタマーは、細胞表面マーカーに対するその高レベルの特異性および親和性のために、細胞選択にとって、抗体の魅力的な代替物である。合成アプタマーは、SzostakグループおよびGoldグループによって1990年代に最初に開発され、アプタマーは、抗体に匹敵する、または抗体よりもさらに高い結合親和性を有し得ることが発見された。
【０１１２】
細胞選択のための機能的核酸アプタマーを生成するための方法および組成物が本明細書に提供される。核酸アプタマーの組成物は、限定はされないが、表1（以下）に記載される核酸塩基を含むことができ、DNA、RNA、または合成核酸類似体、例えば、PNAまたはBNAに特徴的である骨格または核酸塩基構造の1つまたは複数の組み合わせを含むことができる。
【０１１３】
（表１）ヌクレオシドおよび核酸塩基
2021530230.tif 000003
2021530230.tif 000004
【０１１４】
アプタマーは、典型的には長さが20〜80ヌクレオチドに及ぶ、例えば、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、少なくとも50ヌクレオチド、少なくとも60ヌクレオチド、少なくとも70ヌクレオチド、少なくとも80ヌクレオチドまたはそれ以上の、比較的短いオリゴヌクレオチドから一般になる。アプタマーは、例えば、アプタマーの一端またはもう一端でより長い配列に付着させることができるが、アプタマーの二次構造に影響を及ぼす付加された配列は、アプタマーの機能に影響を及ぼす可能性がある。
【０１１５】
アプタマーの機能活性、すなわち、所与の標的分子への結合は、アプタマー中の部分または要素と標的分子上の部分または要素との間の相互作用を必要とする。相互作用は、例えば、疎水性／親水性相互作用、電荷または静電相互作用、水素結合などを含むことができ、所与のアプタマーと所与の標的の特異的相互作用は、アプタマーの配列、ならびに結合条件下でのその配列によって想定される二次および三次構造によって決定される。したがって、アプタマー中の分子内塩基対形成の発生は、アプタマー構造、したがって、アプタマーの機能における主要な要因である。分子内塩基対形成は、例えば、二本鎖ステム構造、ステムループ構造、および標的分子との結合相互作用に関与し得るアプタマーの様々な要素の曝露をもたらし得る。機能的形状に分子をフォールドする、相補的配列の領域間の分子内塩基対の存在を含めて、アプタマーの二次構造がその配列によって規定される場合、ステム構造内で生じる、または分子内塩基対形成に対する新しいオプションを導入する、アプタマー配列の変化は、分子のコンフォメーションを破壊し、それによって、その機能を破壊する可能性があることを理解されたい。そうは言ったものの、塩基対形成したステム構造における1ヌクレオチドの変化が、塩基対形成能力を維持する、相補的なヌクレオチドにおける代償性変化をともなう場合は、アプタマーの構造を維持することができ、それによって、アプタマーの機能を維持することができる。すなわち、いくつかのアプタマーは、ある程度の配列変化を許容することができ、依然として結合活性を保持することができる。さらに、トランケーションがアプタマーの二次構造に必要な分子内塩基対形成を変化させないという条件で、本明細書に記載されるアプタマーのトランケートされたまたは部分的な配列も結合活性を保持することができる。特に、本明細書に記載されるアプタマーの5’または3’末端からある種の配列を除去することによって、結合活性を保持するアプタマー分子をもたらすことができることが考えられる。実際、いくつかの変化は結合活性を向上させることができる。当然ながら、これは、所与の標的に結合し、高親和性で結合するアプタマーを特定するために使用される反復性選択アプローチのための1つの基礎である。本明細書における実施例は、所与の標的に特異的に結合するアプタマーの選択のワーキングデモンストレーションを提供する。
【０１１６】
本明細書に記載される場合、アプタマーは、核酸塩基（当技術分野において単に「塩基」と称されることが多い）修飾または置換を、さらにまたは代わりに含むことができる。そのような置換は、例えば、酵素的もしくは化学的な分解への感受性を低減させることによって、アプタマーもしくは拮抗薬の安定性を改変することができ、または限定されないが塩基対形成相互作用を含めた分子内もしくは分子間相互作用を改変する（増大させるもしくは低下させる）ことができる。アプタマーおよび拮抗薬の核酸塩基は、プリン塩基のアデニン（A）およびグアニン（G）ならびにピリミジン塩基のチミン（T）、シトシン（C）およびウラシル（U）、またはこれらの修飾もしくは関連形態を含む。修飾核酸塩基としては、非限定例として、他の合成および天然核酸塩基、例えば、数ある中でも5-メチルシトシン（5-me-C）、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニルウラシルおよびシトシン、6-アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラシル（シュードウラシル）、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシルおよび他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよび他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザアデニンおよび3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニンが挙げられる。これらの核酸塩基の塩基対形成の挙動および選好性は当技術分野において公知である。
【０１１７】
アプタマーを含む合成オリゴヌクレオチドとしては、限定されないが、ペプチド核酸（PNA）、架橋核酸（BNA）、モルホリノ、ロックド核酸（LNA）、グリコール核酸（GNA）、トレオース核酸（TNA）、または当技術分野において説明される任意の他のゼノ核酸（XNA）を挙げることができる。
【０１１８】
優れたハイブリダイゼーション特質を有することが示された1つのそのようなオリゴヌクレオチド、すなわちオリゴヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸（PNA）と称される。PNA化合物では、オリゴヌクレオチドの糖骨格が、アミド含有骨格、具体的にはアミノエチルグリシン骨格に置き換えられている。核酸塩基は保持され、骨格のアミド部分の原子に直接的または間接的に結合している。
【０１１９】
核酸アプタマーの二次構造および細胞ターゲティング
本明細書に記載されるアプタマーは、特定の標的と相互作用する2次元（2D）および3次元（3D）構造にフォールドする能力を有する。アプタマーは、一般に、限定されないが、静電相互作用、疎水性相互作用、および／またはそれらの相補的形状を含めた、標的細胞表面マーカーとの非共有結合相互作用を介して、特定の標的に結合する。
【０１２０】
平衡確率および安定性などの特質を明らかにするためのいくつかの方法のうちのいずれかによってアプタマーの2-Dおよび3-D構造を予測することができることが当業者に理解されるであろう。NUPACKウェブアプリケーションは、アプタマー配列の予測二次構造を生成するために使用することができる44。アプタマー構造の予測方法のさらなる非限定例としては、インシリコモデル、例えば、UNPACK、APTANI、3D-DART、ModeRNA、もしくはUnified Nucleic Acid Folding and hybridizationパッケージ（UNAFold）、または当技術分野において公知である任意の他のオリゴヌクレオチド構造予測インシリコモデルが挙げられる。
【０１２１】
異なる構造予測モデルが異なる予測構造を生成することができ、同じモデルでさえも、異なるベースラインパラメーター、例えば、温度、イオン強度などを使用すれば、異なる予測構造を生成することができる。
【０１２２】
実施例に記載されているアプタマーの逆配列、相補配列、逆相補配列、またはトランケート配列を細胞の単離のために使用することができることが考えられ、これは、これらの配列はアプタマーの二次構造を維持するであろうことが考えられるからである。これらの配列は、例えば、SEQ ID NO:9〜63に記載されている。さらに、アプタマーライブラリーは、SEQ ID NO:64のものなどのさらなるアプタマーの選択を可能にし得る45ヌクレオチドのライブラリーを含むことができる。さらなる改変は、例えば、アプタマーへのトーホールド配列の付加を含むことができ、グアニンの数が異なるトーホールドを含む例をSEQ ID NO:65〜66に提供する。
【０１２３】
任意の所与の二次構造予測モデルについて、予測構造に基づいて改変、例えば、代償性または非代償性変化がなされる場合の、アプタマーのその標的への結合の維持または向上は、実験的に試験されるべきである。
【０１２４】
アプタマーの標的は、本明細書に記載される細胞選択方法より前に、公知でもよく、または公知でなくてもよい。関心対象の細胞についての公知の表面受容体は、細胞の特定の画分を標的とするために使用することができる。（例えば、CD4+細胞に特異的な）他の細胞特異的アプタマー配列の例は、SEQ IN NO 67〜77に記載されている。
【０１２５】
本明細書に記載される方法を使用して、リンパ球および白血球以外の他の細胞タイプも核酸アプタマーにより標的とすることができる。アプタマーの細胞表面標的は、限定されないが、膜脂質、ペプチド、ポリペプチド、または細胞性もしくは細胞外マトリックスタンパク質を含むことができることが考えられる。アプタマーおよび拮抗薬を本明細書に記載されるように使用して、表面に曝露されたマーカーを含む生物試料の他の成分（例えば、エキソソーム、小胞など）を単離することができることが、本明細書においてさらに考えられる。
【０１２６】
一態様では、膜脂質は、リン脂質、スフィンゴ脂質、ステロール、糖脂質、脂肪酸、またはホスホグリセリドである。
【０１２７】
公知の細胞表面マーカーに加えて、細胞の集団または混合物内の関心対象の細胞の特定の突然変異または変異体の細胞選択のために、細胞表面マーカーを遺伝子改変することができる。実施例1で詳しく述べるように、本明細書に記載されるアプタマーを使用して、遺伝子改変細胞を標的とすることができる。
【０１２８】
一態様では、アプタマーは、細胞表面レセプターまたは抗原を標的とする。T細胞に対する細胞表面マーカーの非限定例としては、T細胞受容体（TCR）、表面抗原分類（CD）抗原マーカー、またはケモカイン受容体（CCR）が挙げられる。B細胞に対する細胞表面マーカーの非限定例としては、表面抗原分類（CD）マーカー（例えば、19または20）および主要組織適合抗原複合体（MHC）分子が挙げられる。
【０１２９】
一態様では、細胞表面マーカーは、表面抗原分類抗原、例えば、数ある中でもCD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CD10、CD11、CD13、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD27、CD28、CD31、CD33、CD34、CD36、CD37、CD38、CD40、CD41、CD42、CD44、CD45、CD45RA、CD45RO、CD52、CD54、CD56、CD57、CD60、CD61、CD62L、CD64、CD71、CD79、CD80、CD83、CD90、CD95、CD103、CD117、CD122、CD127、CD133、CD134、CD137、CD138またはCD152、CD154、CD272、CD276、およびCD278を含む。
【０１３０】
いくつかの態様では、細胞表面マーカーは免疫チェックポイント調節因子である。そのような細胞表面マーカーの例としては、限定されないが、数ある中でもCTLA4、プログラム死1（PD-1）、アデノシンA2A受容体、VTCN1、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（KIR）、T細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン3（TIM-3）、IgおよびITIMドメインを有するT細胞免疫受容体（TIGIT）、ならびにT細胞活性化のV-ドメインIg抑制因子（VISTA）が挙げられる。
【０１３１】
一態様では、細胞表面マーカーは、7回膜貫通型受容体または7TM受容体としても公知であるGタンパク質共役型受容体（GPCR）を含む。例えば、該受容体は、ムスカリン性アセチルコリン受容体、アデノシン受容体、アドレナリン受容体、GABA-B受容体、アンギオテンシン受容体、カンナビノイド受容体、コレシストキニン受容体、ドーパミン受容体、グルカゴン受容体、ヒスタミン受容体、嗅覚受容体、オピオイド受容体、ロドプシン受容体、セクレチン受容体、セロトニン受容体、またはソマトスタチン受容体を含むことができる。
【０１３２】
一態様では、細胞表面マーカーは、増殖因子受容体、例えば、ErbBまたは上皮増殖因子受容体（EGFR）ファミリーのメンバー、例えば、EGFR（ErbB1）、HER2（ErbB2）、HER3（ErbB3）、およびHER4（ErbB4）である。
【０１３３】
一態様では、細胞表面マーカーとしては、限定されないが、チロシンキナーゼ受容体、例えばエリスロポエチン受容体、インスリン受容体、ホルモン受容体、またはサイトカイン受容体が挙げられる。好ましいチロシンキナーゼとしては、維芽細胞増殖因子（FGF）受容体、血小板由来増殖因子（PDGF）受容体、神経成長因子（NGF）受容体、脳由来神経栄養因子（BDNF）受容体、ならびにニューロトロフィン-3（NT-3）受容体およびニューロトロフィン-4（NT-4）受容体が挙げられる。受容体は、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP）および他のナトリウム利尿ペプチドの受容体であるGC-A & GC-Bなどのグアニリルシクラーゼ受容体、またはグアニリン受容体であるGC-Cを含むことができる。
【０１３４】
一態様では、細胞表面マーカーはイオンチャネル（例えば、NaV1.7）、トランスポーター（例えば、CFTR）、インテグリン、タリン、ビンキュリン、アルファ−アクチニン、またはフィラミンである。
【０１３５】
一態様では、細胞表面マーカーは、疾患、好ましくは、ヒトまたは動物の疾患と相関する。例えば、マーカーは、癌、例えば乳癌または卵巣癌と関連し得る。適切な癌細胞マーカーとしては、上述の受容体もしくはCD抗原、またはCA-125（MUC-16）もしくはCA19-9などのさらなる癌細胞特異的マーカーを挙げることができる。多数の腫瘍抗原が当技術分野において公知である。
【０１３６】
本明細書に記載される細胞表面マーカーのいずれかについて、細胞を「陽性」もしくは「高い」、「弱い（dim）」もしくは「低い」、または「陰性」と指定することができ、そのような指定は、本明細書に記載されるアッセイおよび細胞単離方法の実施に有用であり得る。細胞表面マーカーに特異的に結合する抗体またはアプタマーと細胞を接触させ、続いて、そのような接触させた細胞のフローサイトメトリー解析を行って、抗体が細胞に結合しているかどうかを決定するなどの当業者に公知の方法を使用して検出するのに十分である量で、細胞が、その細胞表面上でマーカーを発現する場合、細胞は、細胞表面マーカーについて「陽性」とみなされる。細胞は細胞表面マーカーの伝令RNAを発現する可能性があるが、本明細書に記載されるアッセイおよび方法について陽性とみなすためには、細胞がその表面上でそれを発現しなければならないことを理解されたい。細胞表面マーカーに特異的に結合する抗体と細胞を接触させ、続いて、そのような接触させた細胞のフローサイトメトリー解析を行って、抗体が細胞に結合しているかどうかを決定するなどの当業者に公知の方法を使用して検出するのに十分である量で、細胞が、その細胞表面上でマーカーを発現するが、より高いレベルでそのマーカーを発現し、例えばフローサイトメトリーを使用して解析した場合に識別可能な少なくとも2つの集団を生じさせる、別の異なる細胞集団が存在する場合、細胞は、細胞表面マーカーについて「弱い」または「低い」とみなされる。同様に、細胞表面マーカーに特異的に結合する抗体と細胞を接触させ、続いて、そのような接触させた細胞のフローサイトメトリー解析を行って、抗体が細胞に結合しているかどうかを決定するなどの当業者に公知の方法を使用して検出するのに十分である量で、細胞が、その細胞表面上でマーカーを発現しない場合、細胞は、細胞表面マーカーについて「陰性」とみなされる。
【０１３７】
核酸アプタマーの合成および改変
本明細書に記載されるアプタマーは、非限定例として、ヌクレオシドホスホラミダイトアプローチを使用して、化学的合成することができる。さらに、アプタマーは、DNAまたはRNA抽出方法によって、生物試料から単離することができる。これらの方法としては、限定されないが、カラム精製、エタノール沈殿、フェノール−クロロホルム抽出、または酸性グアニジニウムチオシアネート−フェノールクロロホルム抽出（AGPC）が挙げられる。
【０１３８】
抽出または合成に続いて、液体クロマトグラフィー、質量分析、次世代シークエンシング、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、ゲル電気泳動、またはヌクレオシド配列、二次構造、化学組成、発現、熱力学、結合、もしくは機能を特定する任意の他の方法によって、本明細書に記載されるアプタマーを特性評価することができる。実施例に記載されているように、アプタマー細胞結合アッセイ、フローサイトメトリー、またはインビボの機能によって、細胞-SELEXによって特定されたアプタマーをさらに特性評価することができる。
【０１３９】
本明細書に記載されるアプタマーはまた、細胞選択および細胞処理のために、改変する、または固体支持体または相変化作用物質にコンジュゲートすることができる。コンジュゲーション方法の非限定例としては、アプタマーが非結合の細胞または生物試料からアプタマー結合細胞の分離を可能にする、アプタマーへの化学的、熱力学的、または構造的改変が挙げられる。
【０１４０】
ある特定の態様では、本明細書に記載されるアプタマーを標識することができる。標識の非限定例としては、例えば、フルオロフォアおよびまたは親和性対のメンバーを挙げることができる。アプタマーにコンジュゲートすることができる親和性対の非限定例としては、例えば、ビオチン：アビジン、ビオチン：ストレプトアビジン、ビオチン：ニュートラアビジン（またはビオチンに結合するアビジンの他の変異体）が挙げられる。
【０１４１】
固体支持体
ある特定の態様では、アプタマーは固体支持体に直接的または間接的に結合している。
【０１４２】
本明細書に記載されるアプタマー結合固体支持体は、プラットフォーム、カラム、フィルターまたはシート、ディッシュ、マイクロ流体捕捉装置、キャプラリーチューブ、電気化学応答性プラットフォーム、スキャフォールド、カートリッジ、樹脂、マトリックス、ビーズ、または当技術分野において公知である別の固体支持体の形態で存在することができる。
【０１４３】
いくつかの態様では、固体支持体は、限定されないが、ポリマー、金属、セラミック、ゲル、紙、またはガラスを含む材料を含む。固体支持体の材料は、非限定例として、ポリスチレン、アガロース、ゼラチン、アルギネート、酸化鉄、ステンレス鋼、金ナノビーズまたは粒子、銅、塩化銀、ポリカーボネート、ポリジメチルシロキサン、ポリエチレン、アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン、シクロ−オレフィンポリマーもしくはシクロ−オレフィンコポリマー、またはSepharose（商標）樹脂をさらに含むことができる。
【０１４４】
アプタマー結合固体支持体は、磁気応答性ビーズなどの磁気応答性要素をさらに含むことができる。いくつかの態様では、磁気応答性要素またはビーズは、球、立方体、長方形、円柱、円錐、または当技術分野において説明される任意の他の形状の形態である。磁気応答性ビーズに結合したアプタマーは、アプタマーがコンジュゲートしたビーズと細胞の懸濁液を相互作用させ、次いで、試料を磁場に供することによって非結合細胞からアプタマー結合細胞を分離する簡単な方法を提供する。アプタマー結合細胞を有するビーズは磁気源に引きつけられ、例えばピペットによる非結合細胞の除去を可能にする。結合細胞を有するビーズを洗浄し、再度磁場に供して、単離された細胞画分の相対純度を高めることができる。
【０１４５】
いくつかの態様では、磁気応答性要素は、マグネタイト、酸化鉄（III）、サマリウム−コバルト、ターフェノール（terfenol）-D、または当技術分野において説明される任意の他の磁気要素を含む。
【０１４６】
いくつかの態様では、固体支持体は細胞外マトリックスタンパク質または組成物と接触している。非限定例としては、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ポリ-L-リジン、マトリゲル（商標）、ビトロネクチン、テネイシン、フィブリリン、ブレビカン、エラスチン、または当技術分野において公知である他の細胞外マトリックスタンパク質または組成物が挙げられる。
【０１４７】
代替の態様では、相変化作用物質を固体支持体の代わりに使用することができる。相変化作用物質は、所与のセットの条件下で相を変えるまたは沈殿させることができ、それによって、アプタマー非結合細胞からアプタマー結合細胞の分離を容易にすることができる。
【０１４８】
いくつかの態様では、相変化作用物質はアプタマーに結合することができる。例えば、相変化作用物質はあるセットの条件下では水溶液に可溶性であり得るが、別のセットの条件下では不溶性の沈殿形態にさせられる。相変化を含むことができるさらなる例示的な条件としては、温度、pH、塩もしくは溶質濃度、光（例えば、紫外線もしくは蛍光）、または機械力が挙げられる。例えば、ポリ（N-イソプロピルアクリルアミド）は、ある温度で可溶性であり、次いで、異なる温度で溶液から沈殿する、相変化作用ポリマーである。相変化作用物質が、紫外光によって活性化されるリボフラビンと同様な方法で働くことができることも考えられる。
【０１４９】
アプタマーに結合した固体支持体は、標識を含むこともできる。いくつかの態様では、標識は異種タンパク質である。いくつかの態様では、異種タンパク質は蛍光タンパク質などのタグである。そのようなタンパク質は、アプタマーの追跡および／または可視化を容易にすることができる。蛍光タンパク質の例としては、限定されないが、クラゲのオワンクラゲ（Aequorea victoria）由来の緑色蛍光タンパク質（GFP）；異なる色の蛍光を発するGFPの突然変異体バージョン（例えば、BFP、青色蛍光タンパク質；YFP、黄色蛍光タンパク質；およびCFP、シアン蛍光タンパク質）；dsRed蛍光タンパク質（dsRed2FP）；サンゴイソギンチャク（Entacmaea quadricolor）から単離された赤色蛍光タンパク質であるeqFP611；アネモニア・マジャノ（Anemonia majano）から単離され、最初はamFP486という名前であったシアン蛍光タンパク質である、AmCyan1；アザミサンゴ科（Galaxeidae）から単離された明るい蛍光タンパク質である、Azami Green；スナギンチャク属（Zoanthus）から単離された蛍光タンパク質である、ZSGREEN（商標）；または当技術分野において説明される任意の他の蛍光タンパク質または要素が挙げられる。
【０１５０】
核酸アプタマーのSELEXライブラリー選択
アプタマーは、SELEX（試験管内進化法）として公知のライブラリー選択方法によって発見することができ、化学的安定性についてさらに最適化することができる。その好都合な属性の故に、アプタマーの適用分野は、ここ四半世紀で段階的に拡大して、感知、精製、診断、薬物送達、および治療剤を含めた領域を包含している。
【０１５１】
従来のタンパク質-SELEXを使用して特定の疾患に対する膜タンパク質アプタマーを開発するためには、タンパク質標的の事前知識が必要である。しかし、翻訳後修飾またはその欠如が理由で、原核生物またはいくつかの真核生物系において発現する膜タンパク質は、生理的条件下で形成される正確な3D構造にフォールドできないことが多い。これは、インビトロ発現系によって発現される膜タンパク質の低溶解度および低収率を引き起こし、このことによって、それらの適用が制限される。
【０１５２】
細胞-SELEXは、精製された組換え膜タンパク質を得ることにおける困難に打ち勝つ。細胞-SELEXでは、アプタマーは、分子標的の事前知識を必要とせずに、細胞表面上の分子に対して開発される。したがって、選択より前にタンパク質精製も必要でない。
【０１５３】
以下は、強力な結果を提供するアプタマー細胞SELEXアプローチの態様を記載する。変更される可能性があるパラメーターは全体にわたって言及される。細胞-SELEXの主な工程は、インキュベーション、区分化、および増幅工程を含む従来のSELEXと類似している。細胞-SELEXのためのプロトコールはSefahらによって改変され、概略図は、実施例1詳しく述べる本明細書に記載される方法に従って、図1にハイライトされている。
【０１５４】
本明細書に記載される細胞SELEXプロセスで使用されるssDNAライブラリーは、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によって精製することができる。他の長さのアプタマーを選択することができるが、一態様では、ssDNAライブラリーは2つの18bp不変領域が隣接する52塩基対（bp）のランダム配列を含むことができる。いくつかの態様では、本明細書に記載されるアプタマーを特定するためのライブラリーのssDNAランダム配列は、20塩基対以上、25塩基対以上、30塩基対以上、35塩基対以上、40塩基対以上、45塩基対以上、50塩基対以上、55塩基対以上、60塩基対以上、65塩基対以上、70塩基対以上、75塩基対以上、80塩基対以上、85塩基対以上、90塩基対以上、95塩基対以上、または100塩基対以上およびそれを超えるものを含むことができる。45塩基対ライブラリーより選択されたアプタマーの例も本明細書に記載される。
【０１５５】
いくつかの態様では、ssDNAライブラリーはRNAライブラリーでもよい。したがって、可変性のサイズと異なる核酸の両方が細胞選択に有用なアプタマーの結果をもたらすことができる。
【０１５６】
本明細書に記載される細胞-SELEX ssDNAまたはRNAライブラリーの18bpの不変領域が5bp以上、10bp以上、20bp以上、30bp以上、40bp以上、50bp以上およびそれを超えるものを含むことができることも考えられる。
【０１５７】
Integrated DNA Technologies（IDT）改変コードを有する、SELEXのラウンド間のライブラリー増幅のためのプライマーは、例えば以下のものでもよい：フォワード
2021530230.tif 000005
およびリバース
2021530230.tif 000006
。
他のプライマー配列も過度の実験なしで、生成し、使用することができる。個々に合成されたssDNAアプタマーの例を表5に列挙する。
【０１５８】
IDTコードFAMは、大抵の蛍光検出器に適合する、オリゴヌクレオチド用の蛍光色素アタッチメントと定義される。これはプロトン化され、pH7未満で蛍光が減少し；これは、典型的にはpH範囲7.5〜8.5で使用される。FAMは、オリゴヌクレオチドの5'または3’末端に付着させることができる。IDTコード5BiosGはビオチンアタッチメントと定義される。
【０１５９】
いくつかの態様では、アプタマーは、本明細書に記載される別の標識またはタンパク質にコンジュゲートされる。
【０１６０】
細胞-SELEXによるアプタマー選択のための例示的な条件を、表2にハイライトする。
【０１６１】
ラウンド1について、非ストリンジェントな正の選択を行うことができ、死細胞が枯渇した、関心対象の公知の細胞（T細胞を含むことができる）を、例えば、40ナノモル濃度のssDNAライブラリー（約1016個の個々の配列）とともに4℃で1時間インキュベートする。この処理工程は、細胞選択方法の正の細胞-SELEXまたはラウンド1と定義される。ライブラリーのモル量または濃度、時間、および温度は、当業者が変えることができる。
【０１６２】
正の細胞-SELEXのラウンド1では、関心対象の細胞は、限定はされないが、幹細胞、癌細胞、白血球、リンパ球、T細胞、またはCD8発現細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、CD8+T細胞、CD3+T細胞、CD2+T細胞、CD4+T細胞、またはCD28+T細胞、またはT細胞の任意の他のタイプ、例えば、メモリーT細胞、細胞傷害性キラーT細胞、ヘルパーT細胞、エフェクターT細胞、調節性T細胞（Treg）、調節性B細胞（Breg）、B-1細胞、メモリーB細胞、形質細胞、リンパ形質細胞様細胞、辺縁帯B細胞、濾胞性B細胞、または任意の他のタイプの血液細胞を含めた、任意の生物試料由来であり得る。
【０１６３】
例えば、固形組織の細胞が、コラゲナーゼまたは他の酵素的もしくは物理的処置処理を介して解離され得るという条件で、関心対象の細胞は、脳、心臓、皮膚、骨、肺、消化管、肝臓、骨格筋、神経系、循環器系、膵臓、生殖器官、眼、耳、内分泌系を含めた任意の他の器官もしくは系、または当技術分野において公知である任意の他の生物試料由来であり得る。
【０１６４】
ラウンド1の生物試料は、関心対象のヒトまたは任意の他の動物種由来であり得る。生物試料は、本明細書に記載される細胞タイプのいずれかの組み合わせを含めた、細胞の組み合わせを含むことができる。
【０１６５】
いくつかの態様では、正の選択のラウンド1に使用される細胞の数としては、1×103細胞以上、1×104細胞以上、1×105細胞以上、1×106細胞以上、1×107細胞以上、1×108細胞以上、1×109細胞以上、1×1010細胞以上、1×1011細胞以上、1×1012細胞以上またはそれを超えるものが挙げられる。
【０１６６】
様々なパラメーター、例えば、温度、イオン強度などが、アプタマーの結合特質に影響を及ぼす可能性があるが、細胞生存率を維持する条件下でアプタマーが結合しなければならないことに留意すべきである。温度、イオン強度などは、生細胞、または細胞選択後に解凍され、生存可能になることができる細胞によって許容される範囲内のみで変えられるべきである。
【０１６７】
細胞-SELEXのラウンド2〜5については、前のラウンドから生成された濃縮および増幅されたssDNAのプールを、死細胞が枯渇した関心対象の生物試料（例えば、PBMCとしても公知である末梢血単核球）からの細胞の混合物とともにインキュベートすることができ、これは、「競合的選択」と呼ばれる処理工程である。細胞-SELEXの5ラウンドが実施例2に記載されているが、一般に2ラウンド以上、例えば、3ラウンド、4ラウンド、5ラウンドまたはそれ以上が有利であり得る。
【０１６８】
いくつかの態様では、生物試料は、全血、バフィーコート、または単離された単核細胞を含む。
【０１６９】
いくつかの態様では、生物試料は、限定されないが、筋肉、平滑筋（例えば、血管平滑筋、細気管支など）、心筋、骨髄、軟骨、胃腸器官、眼、耳、生殖器官、腎臓、膵臓、肝臓、皮膚、または当技術分野において公知である任意の他の器官を含めた組織からの細胞を含むことができる。
【０１７０】
例えば、3回の洗浄後に、市販の細胞単離キットまたは抗体抽出方法を使用して、望ましい細胞サブセットおよび結合ssDNA配列を濃縮することができる。関心対象の細胞（例えば、T細胞）をボイルすることによって溶解させることができ、ssDNA配列を浄化された上清中に抽出することができる。
【０１７１】
各ラウンドにおける負の選択の形態として、例えば、関心対象の表面マーカーがない1×106個の負の選択細胞（例えば、CD3-CD8-J.RT3-T3.5細胞）とともにssDNAのプールを4℃でインキュベートすることができ、非結合ssDNA配列をPCR増幅することができ、次のラウンドで使用することができる。選択のストリンジェンシーを増大させ、非特異的結合体を最小限にするために、ラウンドを通して、使用するssDNA、PBMC、およびBSAの量、ならびにインキュベーションの時間を減らすことができる。
【０１７２】
いくつかの態様では、関心対象の細胞表面マーカーを欠く負の選択細胞の数は、1×103以上、1×104以上、1×105以上、1×106以上、1×107以上、1×108以上、1×109以上、1×1010以上およびそれを超えるものであり得る。
【０１７３】
いくつかの態様では、負の細胞-SELEXの引き続くラウンドのインキュベーション時間としては、5分以上、10分以上、20分以上、30分以上、60分以上、90分以上、または120分以上を挙げることができる。
【０１７４】
ラウンド間で、例えば、0.02U/マイクロリットル（μL）のPhusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（NEB）、1×Phusion GC緩衝液、500nMの本明細書に記載されるフォワードプライマーとリバースプライマーの両方、および200μMのdNTPs（98℃で10秒、56℃で30秒、72℃で30秒）を使用して、残存ssDNA配列をPCRによって増幅することができる。200マイクロリットル（μL）のssDNAを使用する大規模の2ミリリットル（mL）の調製用PCR反応の前に、10マイクロリットル（μL）のssDNAおよび2％アガロースゲル電気泳動を使用する、小規模の100マイクロリットル（μL）の分析的PCR反応を行って、大きな非特異的アンプリコンが現れる前の最適サイクル数を決定することができる。SELEXの引き続くラウンドとフローサイトメトリーラウンド結合アッセイの両方で使用するためのFAM標識されたssDNAは、High Capacity Neutravidinアガロース樹脂、1モル濃度（M）のNaOH、および脱塩illustra NAP-5カラム（GE）を用いて生成される。ssDNAの量は、例えば、NanoDrop 2000c分光測光（Thermo Scientific）によって定量化することができ、例えば、Savant ISS110 SpeedVac drying（Thermo Scientific）によって濃縮することができる。本明細書に記載される方法は、異なる濃度のPCR試薬を含むように改変することができる。
【０１７５】
SELEXのすべてのラウンドおよび結合アッセイで使用する洗浄緩衝液調合物は、25ミリモル濃度（mM）の終濃度のための2.25グラムのグルコース、および5.5ミリモル濃度（mM）MgCl2の終濃度のための2.5mLの1モル濃度（M）の塩化マグネシウム（MgCl2）が補充された、カルシウムおよびマグネシウムを有する、0.22マイクロメートル（μm）で濾過した500ミリリットル（mL）のリン酸緩衝溶液（Corning）であり得る。結合緩衝液調合物は洗浄緩衝液と同じでもよいが、濾過した後の0.1ミリグラム／ミリリットル（mg/mL）の酵母tRNA（Invitrogen）およびウシ血清アルブミン（BSA、Miltenyi、SELEXについては変動し、結合アッセイについては1％である）がさらに補充されてもよい。標識されたssDNAのプールまたは個々のアプタマーは、例えば、洗浄緩衝液中で1マイクロモル濃度（μM）に再構成してから、95℃で5分間の変性および氷上での即座の冷却によってフォールドさせることができる。次いで、フォールドしたssDNAのプールまたは個々のアプタマーを結合緩衝液中に希釈してから、SELEXのラウンドまたは結合アッセイにおいて細胞とともにインキュベートする。
【０１７６】
本明細書に記載される細胞-SELEX方法に加えて、アプタマーの選択は、他のアプローチ、例えば、数ある中でも、Ouellet et al., Biotechnol Bioeng (2015)によって記載されたハイフィデリティー（Hi-Fi）SELEX方法を用いて行うこともできることが考えられる。
【０１７７】
アプタマーオリゴヌクレオチドの特定の他の方法とともに次世代シークエンシングを使用することができる。
【０１７８】
出発ナイーブライブラリーおよびSELEXの各ラウンドからのssDNAのプールは、製造者の指示書に従って、MiSeq試薬キットv2（300サイクル）およびMiSeqシステム（Illumina）を使用してシークエンシングした後に、例えば表2に列挙するバーコードプライマーを用いて、PCR増幅することができる。エキスポートされたFASTAファイルは、FASTAptamerソフトウェアを用いて解析することができる。特に、FASTAptamer-Countを使用して、各配列についてランクおよび100万リードあたりのリード数（reads per million）（RPM）を決定することができ、その後、FASTAptamer-Compareを次いで使用して、隣接するラウンド間で配列のRPMのペアワイズ比較を行い、それにより、倍数濃縮（fold enrichment）を計算することができる（表4）。系統樹作成のためのFigTreeソフトウェア（tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/）とモチーフ予測のためのMEME Suiteソフトウェアの両方によって、競合的細胞-SELEXのラウンド2〜4からの上位100の配列をさらに解析することができる。必要ならば、競合的細胞-SELEXのさらなるラウンドを使用して、望ましい細胞生成物の単離を可能にするアプタマーを単離することができる。
【０１７９】
可逆的細胞選択のための拮抗薬
拮抗薬は、アプタマーの構造を破壊し、それによって、アプタマーが結合している細胞もしくは分子の放出を引き起こす分子、またはアプタマーと結合し、それによって、細胞結合親和性を低減させる分子を含む。いくつかの態様では、拮抗薬は、所与の配列モチーフまたは構造を共に有する1つまたは限られた数のアプタマーに特異的であるが、他の態様では、拮抗薬はアプタマー構造を非特異的に破壊し、その結果、1つの拮抗薬をいくつかの異なるアプタマーのいずれにも使用することができる。そのような非特異的拮抗薬としては、限定されないが、例えば、ポリアニオン、例えば、デキストラン硫酸、ヘパリン硫酸、フィチン酸、またはポリリン酸が挙げられる。他の態様では、拮抗薬が、アプタマーのフォールドした構造に結合し、その構造に影響を及ぼし、それによって、結合した標的分子または細胞の放出を引き起こす小分子を含むことができるように、関心対象のアプタマーを小分子結合アプタマーと融合することができる。別の例では、拮抗薬は、アプタマーの二次構造を促進する必須のイオンに結合するキレーターでもよい。小分子拮抗薬は、アプタマーとどのように相互作用するかに応じて、非特異的でもよく、または特異的でもよい。例えば、使用することができる小分子としては、限定されないが、ATP、アンピシリン、テトラサイクリン、ドーパミン、およびスルホローダミンBが挙げられる。アプタマーに結合する小分子のさらなる例は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、McKeague and DeRosa, J Nucleic Acids. Vol. 2012, Article ID No. 748913 (2102)に記載されている。
【０１８０】
他の態様では、拮抗薬は、二本鎖ステム構造を形成するアプタマーの一部に相補的な配列を含む、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド模倣物（PNA、LNA、BNAなど）を含むことができる。オリゴヌクレオチド拮抗薬の、アプタマー中のその相補体へのハイブリダイゼーションはアプタマーの構造を破壊し、アプタマーの標的分子の放出を引き起こす。オリゴヌクレオチド拮抗薬は、アプタマーの非二本鎖領域に相補的な配列を含むこともできる。1つのそのようなオリゴヌクレオチド拮抗薬の構成は、標的アプタマーの一本鎖部分に相補的な配列要素および標的アプタマーの隣接する二本鎖部分に相補的な配列要素を含む。この構成では、オリゴヌクレオチド拮抗薬は、アプタマーの一本鎖部分へのハイブリダイゼーションを効率的に開始することができ、次いで、アプタマーの隣接する二本鎖部分を鎖置換して、その標的からのアプタマーの放出を促進することができる。
【０１８１】
小分子拮抗薬は、例えば、アミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、またはペプチドもしくはタンパク質の断片；核酸（例えば、アンチセンス；DNA；RNA；またはペプチド核酸、PNA）；炭水化物もしくは多糖、または有機もしくは無機化合物（例えば、ヘテロ有機および有機金属化合物が含まれる）などを含むことができる小分子のライブラリーより選択することができる。ライブラリーの各メンバーは、単独でもよく、または混合物（例えば、圧縮ライブラリー）の一部でもよい。ライブラリーは、精製された化合物を含むことができ、または「汚れた状態」（すなわち、有意な量の不純物を含む）でもよい。市販のライブラリーは、例えば、数ある中でもAffymetrix、ArQule、Neose Technologies、Sarco、Ciddco、Oxford Asymmetry、Maybridge、Aldrich、Panlabs、Pharmacopoeia、Sigma、またはTriposeから購入することができる。
【０１８２】
拮抗薬の使用は、可逆的なタグなし細胞選択を可能にする。この方法におけるアプタマー結合細胞の放出の利点は、単離された細胞は、それに結合しているアプタマーが比較的少ないと考えられることである。これは、細胞を単離するための抗体の使用と対照的であり、抗体の使用は、細胞を単離した後に細胞から抗体を解離させることが困難である。細胞をアプタマーとどのようにインキュベートするか、例えば、アプタマーを初めに固体支持体に結合させるか、または最初に溶液中でインキュベートし、次いで、親和性対を介してプルダウンするかどうか、および細胞を拮抗薬とどのようにインキュベートするか（例えば、拮抗薬の濃度、タイミングなど）に応じて、反転後に、単離された細胞に結合したままのアプタマーの量は、結合に使用されたアプタマーの、例えば、50％以下、40％以下、30％以下、20％以下、10％以下、またはさらに5％以下であり得る。
【０１８３】
本明細書に記載される場合、オリゴヌクレオチド拮抗薬は、核酸塩基（当技術分野において単に「塩基」と称されることが多い）修飾または置換をさらに、または代わりに含むことができる。本明細書において使用する場合、アプタマーおよび拮抗薬の核酸塩基としては、プリン塩基のアデニン（A）およびグアニン（G）、ならびにピリミジン塩基のチミン（T）、シトシン（C）およびウラシル（U）が挙げられる。修飾核酸塩基としては、他の合成および天然核酸塩基、例えば、5-メチルシトシン（5-me-C）、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニルウラシルおよびシトシン、6-アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラシル（シュードウラシル）、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシルおよび他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよび他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザアデニンならびに3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニンが挙げられる。
【０１８４】
拮抗薬の合成オリゴヌクレオチドとしては、限定されないが、ペプチド核酸（PNA）、架橋核酸（BNA）、モルホリノ、ロックド核酸（LNA）、グリコール核酸（GNA）、トレオース核酸（TNA）、または当技術分野において説明される任意の他のゼノ核酸（XNA）を挙げることができる。
【０１８５】
オリゴヌクレオチド拮抗薬は、本明細書に記載される核酸アプタマーの合成に使用される同じ方法によって合成することができる。
【０１８６】
オリゴヌクレオチド拮抗薬は、一般に、典型的には8〜50核酸塩基の長さに及ぶ短いオリゴヌクレオチド鎖からなるが、標的アプタマーと同じかまたはそれ以上の長さでもよい。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチド拮抗薬は、8以上、10以上、20以上、30以上、40以上、50以上、60以上、70以上、80以上、90以上、100以上のおよびそれを超えるポリヌクレオチド長を含むことができる。
【０１８７】
拮抗薬選択は、アプタマーの3’末端（実施例1の表5も参照されたい）に、または分子内塩基対形成に関与することが公知であるか、もしくは予想されるアプタマーの任意の領域に相補的なオリゴヌクレオチド配列を設計することを含むことができる。
【０１８８】
いくつかの態様では、5nMのアプタマーとの関心対象の細胞の結合は、二次蛍光ストレプトアビジン標識を用いて行うことができる。標識された細胞は、1％（重量／体積）BSAを有する洗浄緩衝液中の例えば200マイクロリットル（μL）の拮抗薬中で、様々な倍数過剰（使用するアプタマーの量を超える）で、様々な時間および温度にわたってインキュベートすることができる。細胞を洗浄緩衝液および1％（重量／体積）BSAで2回洗浄して、溶出されたアプタマーを除去し、続いて、固定、および／またはフローサイトメトリー解析を行うことができる。
【０１８９】
いくつかの態様では、細胞の混合物に加えられる拮抗薬の濃度は、1ナノモル濃度以上、10ナノモル濃度以上、100ナノモル濃度以上、1マイクロモル濃度以上、10マイクロモル濃度以上、100マイクロモル濃度以上、1ミリモル濃度以上およびそれを超えるものである。拮抗薬は、アプタマー濃度の0.1倍〜100倍過剰であり得る。
【０１９０】
いくつかの態様では、アプタマーのトーホールド領域は、選ばれたアプタマーの二次構造を破壊する拮抗薬のハイブリダイゼーションを容易にすることができる。トーホールド領域は、予測される二次構造に応じて、アプタマーの末端でもよく、または一本鎖領域のアプタマーの内部でもよい。
【０１９１】
アプタマーの細胞結合の特性評価
本明細書に記載される細胞-SELEX方法によって、または当技術分野において公知である別の方法によって特定された核酸アプタマーを、限定されないが、アプタマー結合アッセイ、次世代シークエンシング、遺伝子プロファイリング、機能アッセイ、例えば、細胞毒性アッセイ、サイトカイン放出アッセイ、および例えばアプタマーの使用を介して単離した天然または改変細胞の、動物またはヒトモデルへのインビボ送達を含めたいくつかのアプローチによって特性評価することができる。上記の方法は、本明細書に記載される組成物および細胞選択方法の品質管理としての役割を果たし得る。
【０１９２】
標的細胞または関心対象の細胞へのアプタマーの結合を特性評価するために、インビトロ結合アッセイを例えば以下のように行うことができる。2×105個以上の関心対象の細胞（例えば、T細胞）を含む集団をフォールドしたFAM標識ssDNAのプールまたはFAM/ビオチン標識された個々のアプタマーとともに、本明細書に記載される結合緩衝液中で、様々な濃度のアプタマーで、4℃で30分間インキュベートする。
【０１９３】
いくつかの態様では、アプタマーはビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、アガロース、またはニュートラアビジンで標識される。
【０１９４】
いくつかの態様では、アプタマーはフルオロフォアで標識される。フルオロフォアの非限定例としては、数ある中でも、フルオレセイン、ローダミン、オレゴングリーン、エオシン、テキサスレッド、シアニン、例えばCy5.5が挙げられる。
【０１９５】
インキュベーションに続いて、例えば100μlの全量で、例えば、1％（重量／体積）BSAが補充された200μLの洗浄緩衝液中で細胞を2回洗浄して、過剰なアプタマーを除去する。使用するアプタマーがビオチン化されていた場合、細胞を100μLの蛍光標識されたストレプトアビジンまたはニュートラアビジン二次標識とともに、1％BSAを有する洗浄緩衝液中で、4℃で20分間第2のインキュベーションにかけてから、再度2回洗浄することができる。染色された細胞を、例えば、1％BSA（重量／体積）および0.1％（重量／体積）パラホルムアルデヒド（PFA）を有する200μLの洗浄緩衝液中で固定してから、フローサイトメトリーによって解析する。
【０１９６】
最低でも、所与の標的細胞または細胞表面マーカーに特異的に結合するアプタマーは、そのマーカーを発現しない細胞へのアプタマーの結合よりも少なくとも100×大きい親和性で、好ましくは、少なくとも200×大きい親和性、少なくとも300×大きい親和性、少なくとも500×大きい親和性、少なくとも600×大きい親和性、少なくとも700×大きい親和性、少なくとも800×大きい親和性、少なくとも900×大きい親和性、少なくとも1,000×大きい親和性またはそれ以上で、そのマーカーを発現する細胞に結合する。
【０１９７】
親和性は、解離定数、またはKdに換算して表すことができる。細胞表面マーカーに選択的に結合するアプタマーは、一般に、1マイクロモル濃度（1μM）より低いKdで結合すると考えられる。アプタマーは、ピコモル濃度（pM）範囲のKdでその標的に結合すると説明されている。しかし、細胞選択に有用なアプタマーは、1μM〜10pM、1μM〜100pM、1μM〜200pM、1μM〜300pM、1μM〜400pM、1μM〜500pM、1μM〜600pM、1μM〜700pM、1μM〜800pM、1μM〜900pM、1μM〜1nM、1μM〜10nM、1μM〜50nM、1μM〜100nM、1μM〜150nM、1μM〜200nM、1μM〜250nM、1μM〜300nM、1μM〜350nM、1μM〜400nM、1μM〜450nM、1μM〜500nM、1μM〜550nM、1μM〜600nM、1μM〜650nM、1μM〜700nM、1μM〜750nM、1μM〜800nM、1μM〜850nM、1μM〜900nM、1μM〜950nM、500nM未満〜10pM、450nM未満〜10pM、400nM未満〜10pM、350nM未満〜10pM、300nM未満〜10pM、250nM未満〜10pM、200nM未満〜10pM、150nM未満〜10pM、100nM未満〜10pM、50nM未満〜10pM、100nM未満〜900pM、100nM未満〜800pM、100nM未満〜700pM、100nM未満〜600pM、100nM未満〜500pM、100nM未満〜400pM、100nM未満〜300pM、100nM未満〜200pM、100nM未満〜100pM、100nM未満〜50pM、または100nM未満〜10pMの範囲で結合することができる。
【０１９８】
アプタマーのその標的への結合に対するKdを決定するための様々な方法が当技術分野において公知である。参照により本明細書に組み入れられる、Jing & Bowser, Anal. Chim. Acta 686: 9-18は、様々なアプローチを概説している。本明細書に記載される実施例は、フローサイトメトリーベースのアッセイを提供する。例えば、実施例1ならびに図6Dおよび図6Dの説明を参照されたい。
【０１９９】
細胞選択したアプタマープールを使用した、細胞選択の品質管理およびトレースのない細胞選択方法
細胞特定のための他の方法とともにフローサイトメトリー解析を、アプタマー／細胞相互作用および所与のアプタマーまたはアプタマーの組み合わせを使用して標的細胞を選択する能力を評価するために使用することができる。必要に応じて、OneComp eBeads（Invitrogen）を使用して、代償のための単色対照を調製することができる。染色された生物試料は、例えば、MACSQuant Analyzer 10（Miltenyi）、Attune NxT（Invitrogen）、またはBD LSRFortessa（BD Biosciences）フローサイトメーターを使用して解析することができる。
【０２００】
細胞-SELEXアプタマープールを使用するトレースのない細胞選択方法が本明細書に記載され、実施例で実証される。1つのアプローチでは、各競合的細胞-SELEX生物試料（例えば、PBMC）について、抗ビオチン磁気応答性ミクロビーズ（Miltenyi）の100マイクロリットル（μL）の2つのアリコートを、細胞または細胞マーカー、例えばCD8に特異的な5nMアプタマーを有する結合緩衝液中で500マイクロリットル（μL）にそれぞれ希釈し、穏やかな回転下で4℃で15分間インキュベートする。
【０２０１】
いくつかの態様では、ミクロビーズを、例えば本明細書に記載されるような別の固体支持体と換えることができる。
【０２０２】
いくつかの態様では、細胞選択のために細胞とともにインキュベートするアプタマーの量は、1ピコモル（pM）以上、1ナノモル（nM）以上、1マイクロモル（μM）以上である。
【０２０３】
結合緩衝液におけるtRNAまたは別の非特異的核酸の存在は、tRNAまたは他の非特異的核酸が、アプタマーまたは存在する場合はオリゴヌクレオチド拮抗薬の非特異的結合をブロックするのに役立ち得るので、細胞選択工程中に有用であり得る。
【０２０４】
いくつかの態様では、次いで、結合緩衝液は、例えば、25mMグルコース、5.5mM MgCl2六水和物、様々な量のウシ血清アルブミン（BSA）が補充され、7.5のpHを有する、0.1mg/ml tRNA、0.1g/L CaCl2、0.2g/L KCl、0.2g/L KH2PO4、8.0g/L NaCl、2.1716 Na2HPO4 七水和物を含むことができる。
【０２０５】
細胞選択のために、アプタマー標識またはコンジュゲートされたビーズの懸濁液を例えば、200×106個の新しく単離された細胞（例えば、PBMC）に加え、穏やかな回転下で4℃で15分間インキュベートさせる。インキュベーション時間の長さ、温度、および細胞の数は、当業者が変えることができる。様々なパラメーター、例えば、温度、イオン強度などが、アプタマーの結合特質に影響を及ぼす可能性があるが、細胞生存率を維持する条件下でアプタマーが結合しなければならないことに留意すべきである。温度、イオン強度などは、生細胞、または細胞選択後に解凍することができ、生存可能になる細胞が許容する範囲内のみで変えられるべきである。いくつかの態様では、生物試料は全血、バフィーコート、または単離された単核細胞を含むことができる。
【０２０６】
磁気分離は、例えば、Miltenyi MACS細胞分離システム（例えば、QUADROMACS（商標））を使用して行うことができる。結合細胞を0.5％（重量／体積）BSAを有する10ミリリットル（mL）のautoMACS緩衝液で洗浄して、過剰なビーズを除去し、0.5％（重量／体積）BSAを有するautoMACS緩衝液中に再懸濁し、製造者の指示書に従って磁気分離器のLSカラムにアプライする。
【０２０７】
細胞の最初のアプライ、および例えば、引き続く3回の3mLカラム洗浄からのフロースルーを含む、フロースルー（FT）画分を単離することができる。
【０２０８】
5ミリリットル（mL）のカラムフラッシュ（CF）を使用して、磁石から除去された場合に、CD8ミクロビーズ標識細胞をカラムから取り出すことができる。0.5％（重量／体積）BSAおよび5ミリモル濃度（mM）の塩化マグネシウム（MgCl2）を有するautoMACS緩衝液中の1mLの500ナノモル濃度（nM）の拮抗薬（100倍過剰）を磁石上のカラムにアプライすることができ、その結果、磁石によって捕捉されたアプタマー結合細胞がアプタマー機能化ビーズから懸濁液中に放出される。
【０２０９】
拮抗薬の濃度は、作用物質（例えば、小分子対オリゴヌクレオチド）の性質およびアプタマーとのその結合キネティクスに応じて、変動し得る。
【０２１０】
おおよそ600〜700マイクロリットル（μL）の拮抗薬溶液をカラムを通過させてから、室温での10分のインキュベーションまたは機能的拮抗薬の使用を可能にする任意の条件にわたって、M/F Luer Lock Plug（Smiths Medical）でこれに栓をすることができる。栓を除去すると、0.5％（重量／体積）BSAおよび5ミリモル濃度（mM）のエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を有する3ミリリットル（mL）のautoMACS緩衝液でカラムを3回洗浄することができ、これは拮抗薬溶出（RAE）画分を構成する。
【０２１１】
拮抗薬によって溶出された細胞を直ちにスピンダウンし、新しい緩衝液中に再懸濁して、いかなる残存拮抗薬も除去することができる。カラム上の残存細胞を、本明細書に記載されるようにカラムフラッシュで取り出すことができる。
【０２１２】
アプタマー結合に基づいて選択された細胞の使用
特定の細胞タイプの大規模な調製または製造は、細胞ベースの療法にとってますます有用になりつつある。細胞療法の非限定例としては、数ある中でも、いくつかの細胞前駆体タイプのいずれかを使用する幹細胞療法（例えば、脊髄損傷、心筋梗塞などの処置）、癌処置のための免疫療法、および糖尿病のための同種細胞療法が挙げられる。本明細書に記載される方法および組成物は、これらのおよび他の使用のための大規模な細胞単離のために容易にスケールアップされる、特定の標的細胞タイプの単離のための効率的なアプローチを提供する。
【０２１３】
本明細書に記載される方法は、関心対象の特定の細胞タイプについて、細胞の発達の所与の段階を示す細胞表面マーカーに特異的なアプタマーを用いて細胞を単離することによって幹細胞分化を向上させるために使用することができることも考えられる。したがって、本明細書に記載される細胞単離方法は、幹細胞療法のための品質管理工程としての役割を果たし得る。
【０２１４】
いくつかの態様では、本明細書に記載されるように選択された細胞は、疾患の治療的処置ために、または疾患の症状を和らげるために、それらの天然形態で使用することができる。したがって、アプタマーによって選択された細胞は、そのような細胞で治療可能な疾患または障害について、動物、例えば哺乳動物、例えばヒトを処置するのに有用であり得る。他の態様では、細胞は、患者に導入するより前に操作および／または拡大される。細胞は、患者に対して自家であってもよく、同種異系であってもよく、またはさらに異種であってもよい。操作としては、非限定例として、さらなる細胞ソーティング、抗原による刺激、分化の誘導、および／または遺伝子改変を挙げることができる。操作された細胞は、必ずではないが、投与より前に拡大することができる。
【０２１５】
一態様では、細胞療法は、癌処置、または例えば、ウイルス、例えば限定されないがヒト免疫不全ウイルス（HIV）による感染の処置に有用である。
【０２１６】
現在、自家CAR T細胞癌療法の生成および投与は、T細胞を採取し、遺伝子操作してから、操作された細胞を患者に再導入して戻すことを含む。キメラ抗原受容体（CAR）は、それを発現するように改変されたT細胞が腫瘍細胞上の特定のタンパク質（抗原）を認識できるようにする組換えタンパク質である。CAR T細胞と称される、CARを発現するように操作されたT細胞は、研究室で拡大され、次いで、患者に注入される。注入の後、T細胞は、その操作された受容体からのガイダンスにより、患者の体内で増殖し、その表面上に抗原を提示する癌細胞を認識し、殺す。
【０２１７】
プロセスの最初の工程、すなわち細胞採取は、望ましい細胞集団の高純度の単離を必要とする。例えば、定められた1:1のCD4+対CD8+の細胞集団を有するCAR T細胞が、白血病の動物モデルにおいて、純粋（CD4+またはCD8+のみ）および非選択集団のいずれかよりも効力があり、ALLについてのヒト臨床試験においても非常に有効であることが、当技術分野において公知である。
【０２１８】
T細胞は、白血球アフェレーシスによって収集された末梢血単核球（PBMC）から典型的には単離される。臨床規模のT細胞単離のための主な方法は、(i)望ましくない細胞の免疫枯渇、それに続く、抗体コンジュゲート化磁気ビーズ（例えば、CliniMACS）を使用する、T細胞集団の選択、および(ii)磁気ビーズ上に固定化された抗原結合性断片（Fab）コンストラクトに基づくStreptamer技術を使用する「トレースのない」選択を含む。最初の方法は、抗体でコーティングされた磁気ビーズに依然として結合している最終的な細胞集団をもたらし、標的細胞の収率および純度が低い可能性がある。Streptamer方法は、操作されたストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズに可逆的に結合するペプチドタグと融合したFabを介して、この結果を部分的に回避する。Fabは、高親和性D-ビオチンとの競合によってビーズから放出され得るので、これらが、いったん一価の形態で放出されれば細胞から急速に解離するように、比較的低い受容体結合親和性で操作されなければならない。固体支持体から放出された後の、細胞中へのFabの内部移行の程度は不明であるが、比較的低い受容体結合で操作されたFabは細胞表面に有意に保持されない。しかし、この方法は、依然として標的細胞の収率が悪く、各選択工程で平均50％の細胞喪失がある。さらに、前述の方法の両方とも、生物学的に生成された抗体またはFabを使用するので、かなりの費用をともなう。
【０２１９】
T細胞療法の臨床的影響は、急性リンパ性白血病（ALL）およびびまん性大細胞B細胞リンパ腫を処置するCAR T細胞療法に関する最近の2つのFDA承認、ならびに臨床試験における多くの有望な結果により、急速に実現されている。
【０２２０】
本明細書に記載される方法および組成物を使用して調製される細胞を使用して処置することができる癌の例としては、限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病が挙げられる。そのような癌のより特定の例としては、限定されないが、基底細胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脳およびCNSの癌；乳癌；腹膜癌；子宮頸癌；胆管癌腫；絨毛上皮腫；結腸および直腸癌；結合組織癌；消化器系の癌；子宮内膜癌；食道癌；眼癌；頭頸部の癌；胃癌（胃腸癌を含める）；膠芽腫；肝癌；ヘパトーム；上皮内新生物；腎臓癌または腎癌；喉頭癌；白血病；肝臓癌；肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、および肺の扁平上皮癌）；ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫を含めたリンパ腫；黒色腫；骨髄腫；神経芽腫；口腔癌（例えば、唇、舌、口、および咽頭）；卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；直腸癌；呼吸器系の癌；唾液腺癌；肉腫；皮膚癌；扁平上皮細胞癌；胃癌；奇形癌；精巣癌；甲状腺癌；子宮癌または子宮内膜癌；泌尿器系の癌；外陰癌；ならびに他の癌腫および肉腫；ならびにB細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（NHL）；小リンパ球性（SL）NHL；中悪性度／濾胞性NHL；中悪性度びまん性NHL；高悪性度免疫芽球性NHL；高悪性度リンパ芽球性NHL；高悪性度小型非切れ込み核細胞性NHL；巨大腫瘤病変NHL；マントル細胞リンパ腫；エイズ関連リンパ腫；およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症を含める）；慢性リンパ性白血病（CLL）；急性リンパ性白血病（ALL）；ヘアリーセル白血病；慢性骨髄芽球性白血病；および移植後リンパ増殖性障害（PTLD）、ならびに母斑症と関係がある異常な血管増殖、浮腫（例えば、脳腫瘍と関係があるもの）、原始起源の腫瘍、ならびにメグズ症候群が挙げられる。
【０２２１】
CD19腫瘍抗原を標的とするCAR-T細胞の生成は本明細書の実施例に記載されており、いくつかの方法が当技術分野において公知である。これおよび本質的に任意の他の抗原に特異的なCAR-T細胞を生成するための自家または同種異系のT細胞は、T細胞の望ましいサブセット上のマーカーに特異的に結合する任意のアプタマーまたはそれらの組み合わせ、および本明細書に記載される方法および組成物を使用して、単離することができる。例えば、細胞内ドメインの様々な組み合わせを含む、数々の異なるキメラ抗原受容体コンストラクトが当技術分野において公知であり、それらのうちのいずれか、またはそれ以降に現れるそれらの任意の変形物を、本明細書に記載される方法に従って、単離した細胞に導入することができる。導入は、例えば、ウイルスベクター、プラスミド、ネイキッドDNA、または細胞への核酸の導入を可能にする任意の他のアプローチを介することができる。出発T細胞を単離するために本明細書に記載されるアプタマーベースの方法を使用してCAR-T細胞を調製することができるだけでなく、アプタマーベースの細胞選択方法は、例えば、CARそれ自体の細胞外ドメイン上の、またはCARコンストラクトで発現する代用マーカー、例えばEGFR上の決定基への特異的結合のために選択されたアプタマーの使用を介して、その表面でCARを首尾よく発現するT細胞を選択するのに適用することもできる。
【０２２２】
本明細書に記載される方法および組成物は、CARマクロファージのアプタマーベースの選択に使用することもできる。CARマクロファージは、食作用のために固形腫瘍細胞を標的とすることが当技術分野において説明されている（Morrissey et al. eLife. 2018; Alvey et al. Journal of Leukocyte Biology. 2017; Lim et al, Cell 1995を参照されたい）。CARマクロファージの調製用のマクロファージを単離するための表面マーカーとしては、限定されないが、Megf10、Bai1、MerTK、およびCD47が挙げられる。CARマクロファージへ首尾よく形質転換されたマクロファージは、CARそれ自体への、またはCARコンストラクトで発現する代用マーカー、例えばEGFRへのアプタマーの結合を介して、培養より選択することもできる。代用細胞表面マーカーに結合するアプタマーを有する改変コンストラクトにコードされる代用細胞表面マーカーを標的とする能力は、幅広い他の細胞改変および単離適用のいずれかにおいて用途を見出す。
【０２２３】
癌に加えて、CAR T細胞は潜在的な抗HIV療法として生成されている。Hale et al., 2017による最近の研究によって、高親和性広域中和抗体（bNAb）に由来する単鎖可変断片（scFv）に基づくCARを利用し、第2世代の共刺激性ドメインを含むT細胞は、HIVからの遺伝的防御と並行して、CCR5を破壊し、HIVに感染した細胞を効果的に標的にすることができることが示された。
【０２２４】
別の細胞ベースの癌の治療的アプローチは、T細胞に抗原を導入し、それによって、抗腫瘍免疫応答を誘発するようにプライムされた樹状細胞の使用を含む。いわゆる樹状細胞ワクチンは、活性化された抗原提示樹状細胞を患者に再導入する前に、インビトロで単球を樹状細胞に分化させ、特異的な腫瘍抗原、または患者の腫瘍に由来する調製物で樹状細胞を刺激することによって調製される。樹状細胞に分化することができる単球に対するマーカーは公知であり、樹状細胞ワクチン調製物のための自家細胞を提供するために、本明細書に記載される方法に従って、アプタマーにより標的とすることができる。
【０２２５】
いくつかの態様では、本明細書に記載される方法に従ってアプタマーを使用して単離した細胞は、CRISPR/Cas9、RNAi、トランスフェクション、または当技術分野において公知である遺伝子改変の任意の他のタイプを使用して改変することもできる。アプタマーベースの細胞単離は、コンストラクトの生成物に結合するアプタマー、または同じコンストラクトにコードされる代用細胞表面マーカーに結合するアプタマーのいずれかを使用して、外来性コンストラクトで首尾よく形質転換された細胞を単離するために使用することもできる。
【０２２６】
いくつかの態様では、選択される細胞は幹細胞または前駆細胞である。そのような細胞の非限定例としては、造血幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞、心臓幹細胞、胚性幹細胞、または当技術分野において公知である任意の他の幹細胞が挙げられる。選択される幹細胞は、アプタマーによって標的にされる細胞表面マーカーの選択に応じて、それらの分化のいずれかの段階であり得ることが考えられる。本明細書に記載されるアプタマーベースの細胞単離アプローチは、例えば、多能性幹細胞マーカーに特異的なアプタマーへの再プログラミングレジメンから生じた幹細胞の結合による人工多能性幹細胞の単離に適用することもできる。マーカーOct4およびNanogは多能性のマーカーであるが、生細胞においてアプタマーに必ずしも接触可能であるとは限らないと考えられる細胞内タンパク質である。多能性の細胞表面マーカーとしては、例えば、数ある中でもSSEA3、SSEA4、およびCD9が挙げられる。
【０２２７】
幹細胞の治療的使用は、数ある中でも、心疾患（例えば、心筋梗塞）、糖尿病、外傷性脳損傷、神経変性疾患（例えば、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、脊髄損傷、血管疾患、血液疾患（例えば、再生不良性貧血）、視力障害、および不妊症の処置における使用を含む。本明細書に記載されるアプタマーベースの細胞単離方法は、例えば、幹細胞マーカー発現に基づいて幹細胞を単離することと、幹細胞由来の細胞または組織の調製が望ましい場合に、例えば、関心対象の細胞タイプの分化特異的マーカーへの可逆的なアプタマーの結合に基づいて幹細胞の分化産物を単離することの両方に使用することができる。したがって、選択される細胞は、限定されないが、創傷を治すための、骨、筋肉、靱帯、腱、神経、または皮膚の生成を含めて、細胞または組織の再生、補充、または交換にも使用することができることも考えられる。
【０２２８】
細胞ベースの治療剤の投与
いくつかの局面では、本明細書に提供される方法は、複数種のアプタマー選択細胞またはそれらの後代もしくは分化産物細胞を宿主組織に送達することを含む。本明細書に記載されるように、本明細書に記載される方法に従って、アプタマーによって単離または選択された細胞は、対象への投与、例えば、対象の組織または器官へのインビボ送達に適した薬学的組成物中に組み込むことができる。
【０２２９】
関心対象の細胞を含む組成物の投薬量範囲は、望ましい効果、例えば、望ましい遺伝子産物（例えば抗体）の発現、または疾患、例えば癌の処置をもたらすのに十分なほど多い量を含む。投薬量は、許容できない有害な副作用を引き起こすほど多くてはならない。一般に、投薬量は、関心対象の細胞の特定の特性、ならびに患者の年齢、状態、および性別によって変化すると考えられる。投薬量は当業者が決定することができ、従来の細胞療法と異なり、任意の合併症の場合には、個々の医師が調整することもできる。
【０２３０】
いくつかの態様では、関心対象の細胞は、繰り返されるまたは限られた時間にわたって送達される。いくつかの態様では、用量は1日1回、または1日複数回与えられる。治療期間は、対象の臨床的進行および療法への応答性に依存する。
【０２３１】
関心対象のアプタマー選択細胞を含む組成物は、外科移植、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、四肢灌流（任意で、下肢および／もしくは上肢の分離式肢灌流；例えば、Arruda et al., (2005) Blood 105: 3458-3464を参照されたい）、ならびに／または直接筋肉内注射によって、標的細胞または組織に送達することができる。筋肉（例えば、横隔膜）への投与は、静脈内投与、動脈内投与、および／または腹腔内投与を含めた任意の適切な方法によることができる。
【０２３２】
いくつかの態様では、疾患の症状を緩和するために、またはそうでなければ、投与される細胞の機能を補助もしくは支持するために、1種または複数種のさらなる化合物を関心対象の細胞とともに含むことができる。
【０２３３】
いくつかの態様では、さらなる化合物は治療的作用物質でもよい。治療的作用物質は、治療目的に適した任意のクラスより選択することができる。換言すれば、治療的作用物質は、処置目的および望ましい生物学的作用に従って、選択することができる。さらに、治療的作用物質の活性成分は、賦形剤などの任意の薬学的添加剤または薬学的に許容され、かつ活性成分に適合する担体と混合することができる。
【０２３４】
治療的作用物質として送達される関心対象の細胞は、関心対象の組織へのターゲティング部分をさらに含むことができる。例えば、ターゲティング部分は、標的細胞の特定の望ましい分子を天然に認識する受容体を含めた受容体分子を含むことができる。そのような受容体分子としては、標的分子との相互作用の特異性を高めるように改変された受容体、受容体によって天然に認識されない望ましい標的分子と相互作用するように改変された受容体、およびそのような受容体の断片が挙げられる（例えば、Skerra, 2000, J. Molecular Recognition, 13:167-187を参照されたい）。他の態様では、ターゲティング部分は、例えば標的細胞上の特定の望ましい受容体を天然に認識するリガンドを含めたリガンド分子を含むことができる。そのようなリガンド分子としては、標的受容体との相互作用の特異性を高めるように改変されたリガンド、リガンドによって天然に認識されない望ましい受容体と相互作用するように改変されたリガンド、およびそのようなリガンドの断片が挙げられる。
【０２３５】
他の態様では、ターゲティング部分は、本明細書に記載される最初の細胞選択で使用されていないアプタマーを含むことができる。
【０２３６】
前述の詳細な説明および以下の実施例は例示に過ぎず、本発明の範囲に対する限定として解釈されるべきではないことが理解されよう。当業者に明らかであると考えられる、開示される態様への様々な変更および改変は、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく行うことができる。さらに、特定されるすべての特許、特許出願、および刊行物は、例えば、本発明に関連して使用され得る、そのような刊行物に記載されている方法体系を記載および開示する目的で、参照により本明細書に明確に組み入れられる。これらの刊行物は、単にその開示が本出願の出願日より前であるという理由で提供される。この点に関するいかなるものも、先行発明によって、または任意の他の理由で、本発明者らがそのような開示に先立つ権利を与えられないことの承認として解釈されるべきでない。これらの文献の日付に関する記載または内容に関する表現のすべては、出願人らが入手可能な情報に基づいており、これらの文献の日付または内容の正確性に関していかなる承認もなすものではない。
【０２３７】
本明細書に記載される方法および組成物のいくつかの態様は、以下の番号付けされた段落のいずれかに従って定義され得る：
１．
複数の細胞タイプを含む生物試料から関心対象の細胞を単離するための方法であって、
a. アプタマー結合細胞の形成を可能にする条件下で、関心対象の該細胞に特異的な細胞表面マーカーに特異的に結合するアプタマーと該生物試料を接触させる工程；
b. 該アプタマーに結合していない細胞から該アプタマー結合細胞を分離する工程；および
c. 該細胞表面マーカーへの該アプタマーの結合を破壊することによって、関心対象の該細胞を回収する工程
を含み、それにより、関心対象の該細胞が該生物試料から単離される、方法。
２．
関心対象の前記細胞が生存可能である、段落1の方法。
３．
関心対象の前記細胞が白血球である、段落1または段落2の方法。
４．
関心対象の前記細胞がリンパ球または単球である、段落1〜3のいずれか一つの方法。
５．
関心対象の前記細胞がT細胞である、段落1〜4のいずれか一つの方法。
６．
関心対象の前記細胞がCD3+細胞、CD4+細胞、CD8+細胞である、段落1〜5のいずれか一つの方法。
７．
前記アプタマーが標識を含む、段落1〜6のいずれか一つの方法。
８．
分離工程(b)が第1の固体支持体または相変化作用物質の使用を含む、段落1〜7のいずれか一つの方法。
９．
前記アプタマーが、(i)第1の固体支持体にコンジュゲートもしくは固定化されている、および／または(ii)親和性対の第1のメンバーで標識されている、段落1〜8のいずれか一つの方法。
１０．
前記分離工程(b)が、
(i)前記アプタマーを介して前記第1の固体支持体に結合しているアプタマー結合細胞を前記生物試料から取り出すこと、または
(ii)前記親和性対の第2のメンバーを有する第2の固体支持体を加えて、前記親和性対の前記第1および第2のメンバーの相互作用を介して該第2の固体支持体への前記アプタマーの物理的結合を可能にし、アプタマー結合細胞を前記生物試料から取り出すこと
のいずれかを含む、段落9の方法。
１１．
前記アプタマーが相変化作用物質にコンジュゲートしている、段落9または段落10の方法。
１２．
前記接触工程(a)が、前記相変化作用物質が溶液相にある条件下で行われ、
前記分離工程が、(b)前記相変化作用物質を該溶液から沈殿させ、それにより、アプタマー結合細胞を前記生物試料から取り出すことを含む、
段落9〜11のいずれか一つの方法。
１３．
前記第1および／または第2の固体支持体が磁気応答性ビーズを含む、段落8〜12のいずれか一つの方法。
１４．
前記第1および／または第2の固体支持体が、ポリマー、金属、セラミック、ガラス、ハイドロゲル、または樹脂を含む、段落8〜12のいずれか一つの方法。
１５．
前記分離工程が、前記試料を磁場に供することを含み、それにより、アプタマー結合細胞を含む固体支持体が前記生物試料から分離される、段落13の方法。
１６．
拮抗薬が、
ポリアニオン；小分子；または前記アプタマーにハイブリダイズし、それによって、前記細胞表面マーカーへの前記アプタマーの結合を破壊するのに十分なほど前記アプタマーの配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド模倣物
を含む、段落1〜15のいずれか一つの方法。
１７．
前記アプタマー結合細胞が、前記アプタマーが結合しているマーカーを含む選択されたマーカー対に対して二重陽性である細胞を含む、段落1〜16のいずれか一つの方法。
１８．
細胞の単離画分が、前記アプタマーが結合しているマーカーを含む選択されたマーカー対に対して二重陽性である細胞を含む、段落1〜17のいずれか一つの方法。
１９．
複数の細胞画分を生物試料から単離する方法であって、
a. アプタマー結合細胞の形成を可能にする条件下で、複数の異なる関心対象細胞に特異的な細胞表面マーカーに特異的に結合する複数種のアプタマーと生物試料を接触させる工程、
b. 非アプタマー結合細胞からアプタマー結合細胞の集団を分離する工程、
c. 複数種の細胞表面マーカーのうちの1種または複数種への該複数種のアプタマーのうちの1種または複数種の結合を破壊する複数種の拮抗薬を、工程(b)で分離した該アプタマー結合細胞に連続して加え、それにより、連続して加えられた拮抗薬のそれぞれが、工程(b)で分離した細胞の該集団から異なる細胞画分を溶出し、それによって、複数の異なる細胞画分を生物試料から単離する工程
を含む、方法。
２０．
前記複数種の拮抗薬が、
ポリアニオン；小分子；前記アプタマーにハイブリダイズし、それによって、その細胞表面マーカーへの前記アプタマーの結合を破壊するのに十分なほど前記複数種のアプタマーのうちの1種のアプタマーの配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド模倣物；またはこれらの組み合わせ
を含む、段落19の方法。
２１．
前記複数種のアプタマーが1種または複数種の固体支持体または相変化作用物質に結合している、段落19または20の方法。
２２．
前記固体支持体が磁気応答性ビーズを含む、段落21の方法。
２３．
前記固体支持体が、ポリマー、金属、セラミック、ガラス、ハイドロゲル、または樹脂を含む、段落21または22の方法。
２４．
前記複数の異なるアプタマーに結合している細胞集団を含む前記固体支持体が、前記試料を磁場に供することによって生物試料から分離される、段落21〜23のいずれか一つの方法。
２５．
前記アプタマー結合細胞が白血球である、段落19〜24のいずれか一つの方法。
２６．
前記アプタマー結合細胞がリンパ球である、段落19〜25のいずれか一つの方法。
２７．
前記アプタマー結合細胞がT細胞である、段落19〜26のいずれか一つの方法。
２８．
前記アプタマー結合細胞がCD3、CD8、および／またはCD4を発現する、段落19〜27のいずれか一つの方法。
２９．
1対の標的細胞マーカーに対して二重陽性である細胞について濃縮された細胞画分を生物試料から単離する方法であって、
a. アプタマー結合細胞の形成を可能にする条件下で、第1の標的細胞表面マーカーに特異的に結合する第1のアプタマーと生物試料を接触させる工程；
b. 非アプタマー結合細胞からアプタマー結合細胞の集団を分離する工程；
c. 工程(b)で分離した該細胞への該第1のアプタマーの結合を破壊する第1の拮抗薬と、工程(b)で分離したアプタマー結合細胞の該集団を接触させ、それによって、該第1の標的細胞表面マーカーについて陽性の細胞の集団を単離する工程；
d. アプタマー結合細胞の形成を可能にする条件下で、第2の標的細胞表面マーカーに特異的に結合する第2のアプタマーと、工程(c)で単離した該集団を接触させる工程；
e. 工程(d)で形成したアプタマー結合細胞の集団を非アプタマー結合細胞から分離する工程；および
f. 工程(e)で分離した該細胞への該第2のアプタマーの結合を破壊する第2の拮抗薬と、工程(e)で分離したアプタマー結合細胞の該集団を接触させ、それによって、該第1および第2の標的細胞表面マーカーに陽性の細胞の集団を単離する工程
を含む、方法。
３０．
前記拮抗薬が、
小分子；ポリアニオン；前記アプタマーにハイブリダイズし、それによって、前記細胞表面マーカーへの前記アプタマーの結合を破壊するのに十分なほどそれぞれのアプタマーの配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド模倣物；またはこれらの組み合わせ
を含む、段落29の方法。
３１．
前記第1および／または第2のアプタマーが、1種または複数種の固体支持体または相変化作用物質に固定化されているか、またはコンジュゲートしている、段落29または段落30の方法。
３２．
前記固体支持体が、磁気応答性ビーズ、ポリマー、金属、セラミック、ガラス、ハイドロゲル、または樹脂を含む、段落31の方法。
３３．
前記固体支持体が磁気応答性ビーズを含み、前記第1および／または第2のアプタマーに結合している細胞集団が、該細胞集団を磁場に供することによって分離される、段落31または段落32の方法。
３４．
前記アプタマー結合細胞がリンパ球を含む、段落29〜33のいずれか一つの方法。
３５．
前記アプタマー結合細胞がT細胞を含む、段落29〜34のいずれか一つの方法。
３６．
工程(f)で単離した前記細胞が、CD3+T細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、CD3+CD4+T細胞、またはCD3+CD8+T細胞を含む、段落29〜35のいずれか一つの方法。
３７．
細胞表面マーカーの発現の程度に基づいて生物試料中の関心対象の細胞を分離する方法であって、
a. アプタマー結合細胞の形成を可能にする条件下で、関心対象の該細胞に特異的な細胞表面マーカーに特異的に結合するアプタマーと該生物試料を接触させる工程；
b. 該アプタマーに結合していない細胞から該アプタマー結合細胞を分離する工程；および
c. 該細胞表面マーカーへの該アプタマーの結合を破壊する漸増濃度の拮抗薬と、段階的にまたは勾配としてのいずれかで、工程(b)で分離した該アプタマー結合細胞を接触させる工程
を含み、
それにより、該細胞表面マーカーの発現の程度に基づいて該生物試料中の関心対象の該細胞が分離され、その結果、マーカー発現がより低い（マーカーlo）該試料中の細胞が、より低い濃度の拮抗薬で該アプタマーから溶出され、マーカー発現がより高い（マーカーhi）集団中の細胞が、より高い濃度の拮抗薬で溶出される、方法。
３８．
前記拮抗薬が、
ポリアニオン；小分子；前記アプタマーにハイブリダイズし、それによって、前記細胞表面マーカーへの前記アプタマーの結合を破壊するのに十分なほどアプタマーの配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド模倣物；またはそれらの組み合わせ
を含む、段落37の方法。
３９．
細胞表面マーカーの発現の程度に基づいて生物試料中の関心対象の細胞を分離する方法であって、
a. アプタマー結合細胞の形成を可能にする条件下で、関心対象の該細胞に特異的な細胞表面マーカーに特異的に結合するアプタマーと該生物試料を接触させる工程；
b. 該アプタマーに結合していない細胞からアプタマー結合細胞を分離する工程；および
c. 置換のキネティクスまたはアプタマー親和性が異なる複数種の拮抗薬と工程(b)で分離した該アプタマー結合細胞を連続して接触させる工程であって、置換の相対的キネティクスまたは相対的アプタマー親和性が増大する順で拮抗薬を加える、工程
を含み、
それにより、該細胞表面マーカーの発現の程度に基づいて該生物試料中の関心対象の該細胞が分離され、その結果、マーカー発現がより低い（マーカーlo）該試料中の細胞が、置換の相対的キネティクスがより遅い、または相対的アプタマー親和性がより低い拮抗薬によって、該アプタマーから溶出され、マーカー発現がより高い（マーカーhi）該集団中の細胞が、置換の相対的キネティクスがより速い、または相対的アプタマー親和性がより高い拮抗薬によって溶出される、方法。
４０．
前記拮抗薬が、
ポリアニオン；小分子；前記アプタマーにハイブリダイズし、それによって、前記細胞表面マーカーへの前記アプタマーの結合を破壊するのに十分なほど前記アプタマーの配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド模倣物；またはそれらの組み合わせ
を含む、段落39の方法。
４１．
関心対象の前記細胞が白血球である、段落37〜40のいずれか一つの方法。
４２．
関心対象の前記細胞がリンパ球である、段落37〜41のいずれか一つの方法。
４３．
関心対象の前記細胞がT細胞である、段落37〜42のいずれか一つの方法。
４４．
関心対象の前記細胞がCD8発現細胞である、段落37〜43のいずれか一つの方法。
４５．
前記アプタマーが、1種または複数種の固体支持体または相変化作用物質に結合している、段落37〜44のいずれか一つの方法。
４６．
前記1種または複数種の固体支持体または相変化作用物質が磁気応答性ビーズを含む、段落45の方法。
４７．
前記1種または複数種の固体支持体が、ポリマー、金属、セラミック、ガラス、ハイドロゲル、または樹脂を含む、段落45または46の方法。
４８．
前記分離工程(b)が、前記試料を磁場に供することを含み、それにより、前記複数の異なるアプタマーに結合している細胞集団を含む前記固体支持体が前記生物試料から分離される、段落45〜47のいずれか一つの方法。
４９．
SEQ ID NO:1〜6、10〜14、17〜22、27〜30、33〜48、または52〜77のいずれか1つの配列を含む核酸分子であって、ヒトCD8ポリペプチドに選択的に結合する、核酸分子。
５０．
ヌクレオチド3および75、4および74、5および73、6および72、7および71、8および70、9および69、10および68、13および54、14および53、15および52、16および51、17および50、18および49、19および48、25および47、26および46、27および45、28および44、29および43、30および42、31および41、32および40、33および39、または34および38からなる群より選択されるヌクレオチド対に代償性変化を含み、SEQ ID NO:1の核酸分子と比較して、CD8ポリペプチドへの選択的結合を保持する、段落49の核酸分子。
５１．
ヌクレオチド3および75、4および74、5および73、6および72、7および71、8および70、9および69、10および68、13および54、14および53、15および52、16および51、17および50、18および49、19および48、25および47、26および46、27および45、28および44、29および43、30および42、31および41、32および40、33および39、または34および38からなる群より選択される2つ以上のヌクレオチド対に代償性変化を含み、SEQ ID NO:3の核酸分子と比較して、CD8ポリペプチドへの選択的結合を保持する、段落49の核酸分子。
５２．
DNA分子、RNA分子、またはPNA分子である、段落49の核酸分子。
５３．
修飾ヌクレオシドを含む、段落49〜52のいずれか一つの核酸分子。
５４．
前記修飾ヌクレオシドが表1より選択される、段落53の核酸分子。
５５．
段落49〜54のいずれか一つの核酸分子を含む、固体支持体。
５６．
磁気応答性ビーズである、段落55の固体支持体。
５７．
前記固体支持体が、ポリマー、金属、セラミック、ガラス、ハイドロゲル、または樹脂を含む、段落56の固体支持体。
５８．
前記核酸分子を介してCD8+T細胞に結合している、段落55〜57のいずれか一つの固体支持体。
５９．
標識を含む、段落49〜54のいずれか一つの核酸。
６０．
前記標識がビオチン標識および蛍光標識より選択される、段落59の核酸。
６１．
段落49〜54のいずれか一つの核酸に結合したCD8+ヒトT細胞を含む組成物。
６２．
それぞれ、段落49〜54のいずれか一つの核酸の少なくとも8つの連続的なヌクレオチドに相補的な配列を含む核酸を含む拮抗薬にハイブリダイズする、段落49〜54のいずれか一つの核酸。
６３．
段落49〜54のいずれか一つの核酸に相補的な少なくとも8つの連続的なヌクレオチドを含む配列を含む核酸分子を含む拮抗薬であって、それぞれ、ヒトCD8ポリペプチドへの段落49〜54のいずれか一つの核酸の結合を阻害する、拮抗薬。
６４．
前記核酸分子が、段落49〜54のいずれか一つの核酸に相補的な少なくとも8つの連続的なヌクレオチドを含む配列を含む、段落63の拮抗薬。
６５．
段落49〜54のいずれか一つの核酸と、または段落55〜57のいずれか一つの固体支持体と、ヒトCD8+T細胞を含む生物試料を接触させる工程を含む、生物試料からCD8+T細胞を単離する方法であって、該接触が該核酸へのCD8+T細胞の選択的結合を可能にする、方法。
６６．
前記生物試料が、全血、バフィーコート、または単離された単核細胞を含む、段落65の方法。
６７．
段落49〜54のいずれか一つの核酸または段落55〜57のいずれか一つの固体支持体と前記生物試料を接触させる工程の後に、段落49〜54のいずれか一つの核酸に相補的な少なくとも8つの連続的なヌクレオチドの配列を含む核酸分子を含む拮抗薬と前記試料を接触させる工程をさらに含み、
前記拮抗薬が、ヒトCD8ポリペプチドへの段落49〜54のいずれか一つの前記核酸の結合を阻害し、それによって、前記CD8+T細胞の放出を可能にする、
段落65の方法。
６８．
段落55〜57のいずれか一つの固体支持体と前記試料を接触させ、前記試料をさらに磁場に供し、それによって、前記試料中の他の細胞から前記固体支持体に結合したCD8+T細胞を分離することを可能にする、段落67の方法。
６９．
関心対象の標的細胞タイプまたはクラスの細胞の集団を生物試料から調製する方法であって、
a. アプタマー結合細胞の形成を可能にする条件下で、関心対象の該標的細胞またはクラスの細胞に特異的な細胞表面マーカーに特異的に結合するアプタマーと該生物試料を接触させる工程；
b. 該アプタマーに結合していない細胞からアプタマー結合細胞を分離する工程；および
c. 関心対象の該細胞への該アプタマーの結合を破壊することによって、関心対象の細胞の該集団を回収する工程
を含む、方法。
７０．
関心対象の特定の細胞タイプまたはクラスの細胞に結合するアプタマー配列を選択する方法であって、
i. 関心対象のタイプまたはクラスの細胞を20〜85ヌクレオチドの所与の長さのランダム化配列を含む一本鎖DNAライブラリーとともにインキュベートする工程；
ii. 関心対象の該細胞に結合した一本鎖DNAを単離する工程；
iii. 工程iiからの単離した一本鎖DNA配列を関心対象のタイプまたはクラスの細胞を含む細胞タイプの混合物とともにインキュベートする工程；
iv. 抗体および抗体特異的支持カラムを用いて工程iiiの該インキュベーションから関心対象のタイプまたはクラスの細胞を単離する工程；
v. 工程ivで単離した細胞から結合一本鎖DNAを抽出する工程；
vi. 工程vからの結合一本鎖DNA配列をPCR増幅する工程；
vii. 工程viからの一本鎖DNA配列を関心対象の表面受容体を欠く細胞タイプとともにインキュベートする工程；
viii. 非結合一本鎖DNAを工程viiの該細胞から分離する工程；
ix. 工程viiiからの非結合一本鎖DNA配列をPCR増幅する工程；
x. 工程iii〜ixを少なくとも2回反復する工程；および
xi. 残存一本鎖DNAをシークエンシングする工程
を含む、方法。
７１．
関心対象のタイプまたはクラスの細胞が白血球である、段落70の方法。
７２．
関心対象のタイプまたはクラスの細胞がリンパ球である、段落70または71の方法。
７３．
関心対象のタイプまたはクラスの細胞が、CD2+T細胞、CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞またはCD28+T細胞である、段落70〜72のいずれか一つの方法。
７４．
関心対象のタイプまたはクラスの細胞が、段落73の2種以上の細胞表面マーカーの組み合わせを発現する、段落70〜72のいずれか一つの方法。
７５．
関心対象のタイプまたはクラスの細胞が造血幹細胞である、段落70〜72のいずれか一つの方法。
７６．
前記方法が、関心対象の細胞集団の大規模選択に使用されるか、または複数の関心対象の細胞が単離される、段落1、19、29、37、39、69、または70のいずれか一つの方法。
７７．
段落1、16、25、26、55、または56のいずれか一つの方法によって単離した細胞の組成物を投与する工程を含む、疾患または障害を処置する方法であって、細胞の該組成物が疾患の少なくとも1つの症状を少なくとも10％低減する、方法。
７８．
前記疾患または障害が癌である、段落77の方法。
７９．
前記疾患または障害が免疫疾患である、段落77の方法。
８０．
前記疾患または障害がHIV感染症である、段落77の方法。
８１．
段落1〜18のいずれか一つの方法によって単離された、細胞の組成物。
８２．
段落19〜28のいずれか一つの方法によって単離された、細胞画分の組成物。
８３．
段落29〜36のいずれか一つの方法によって単離された、細胞画分の組成物。
８４．
段落37〜38のいずれか一つの方法によって分離された、細胞の組成物。
８５．
段落39〜48のいずれか一つの方法によって分離された、細胞の組成物。
８６．
段落65〜68のいずれか一つの方法によって単離された、CD8+T細胞の組成物。
８７．
段落69の方法によって調製された、細胞の組成物。
８８．
段落70の方法によって選択されたアプタマーに特異的に結合する細胞の組成物。
【実施例】
【０２３８】
以下は、本明細書に記載される技術を実証し、支持する非限定的実施例を提供する。
【０２３９】
本明細書に記載される方法および組成物は、CD8に対するいくつかの高親和性DNAアプタマーが改変細胞SELEX手順を使用して特定され、選択されたアプタマーの結合特性が検証されたことを詳述する。アプタマーは、標準的な方法に匹敵する効率で、末梢血単核球（PBMC）からCD8+T細胞を単離する。第2に、相補的なオリゴヌクレオチド配列を使用してアプタマーの結合を反転させて、アプタマーのフォールディングを破壊し、このアプローチを使用して、高い収率および純度で、アプタマーが固定化された支持体からCD8+細胞が放出され得ることを示すように、方法を開発した。最後に、可逆的アプタマー選択アプローチおよび標準的な抗体ベースのCD8ミクロビーズからCAR T細胞を生成し、十分に特性評価した。トレースのないアプタマー選択を使用して単離したCAR T細胞は、抗体を使用して単離されたものとフェノタイプ的に類似しており、かつインビトロとインビボの両方でほとんど同一のエフェクター機能を示した。したがって、このアプタマーベースの選択アプローチは、潜在的な臨床規模の細胞療法適用のための、T細胞の高効率で無標識の選択を可能にする。将来のアプタマー開発により、この技法は、複数のT細胞集団の連続的または並行的選択のために、容易に拡大することができる。
【０２４０】
実施例1：T細胞結合アプタマーの特定
T細胞療法の臨床的影響は、急性リンパ性白血病（ALL）およびびまん性大細胞B細胞リンパ腫を処置するキメラ抗原受容体（CAR）T細胞療法に対する最近の2つのFDA承認（それぞれ、NovartisのKymriahおよびGilead-KiteのYescarta）ならびに臨床試験における多くの有望な結果により、急速に実現されている1〜4。癌に加えて、CAR T細胞は、潜在的な抗HIV療法として生成されている5、6。現在、自家CAR T細胞療法の生成および投与は、T細胞を採取し、遺伝子操作してから、操作された細胞を患者に再導入して戻すことを含む。プロセスの最初の工程、すなわち細胞採取は、望ましい細胞集団の高純度の単離を必要とする。例えば、Turtleと共同研究者は、定められた1:1のCD4+対CD8+の細胞集団を有するCAR T細胞が、白血病の動物モデルにおいて、純粋（CD4+またはCD8+のみ）および非選択集団のどちらよりも効力があり、ALLについてのヒト臨床試験においても非常に有効であることを実証した7、8。
【０２４１】
CAR T細胞の製造のためのT細胞は、白血球アフェレーシスによって収集された末梢血単核球（PBMC）から典型的には単離される。臨床規模のT細胞単離で使用するために報告された1つの方法は、免疫磁気陽性濃縮（immunomagnetic positive enrichment）（例えば、CliniMACS）によってCD8+およびCD4+T細胞をアフェレーシス産物から連続して単離することである9。このアプローチは高い純度および収率の恩恵を受けることができるが、(i)生物学的に生成された抗体にともなう高い費用、(ii)抗体でコーティングされた磁気ビーズに依然として結合している可能性がある最終的な細胞集団に起因する潜在的な安全性への懸念、および(iii)複数の選択装置を順番に必要とすることによる低スループットに悩まされる可能性がある10。さらに、細胞上に保持される磁気ビーズは、療法に有利であり得る細胞サブセットの下流の選択を妨害する可能性がある。望ましくない細胞集団を免疫枯渇させる臨床的選択ストラテジーは、元のままの細胞の単離および特定の細胞サブセットの下流の正の選択を可能にするが、これはまた、(i)枯渇のために抗体の大きなパネルに依拠することによって、より多くの費用をもたらし、(ii)CD4+T細胞とCD8+T細胞の両方の別々のサブセットを得るためにアフェレーシス産物を分割しないといけないので、収率を半分に低減させ、かつ(iii)低純度の標的細胞を有する可能性がある11、12。
【０２４２】
Streptamerベースの細胞選択技術が報告されており、これは、操作されたストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズに可逆的に結合するペプチドタグと融合した抗原結合性断片（Fab）コンストラクトを介して、これらの望ましくない結果のいくつかを回避する13〜15。Fabは、高親和性D-ビオチンとの競合によってビーズから放出され得、したがって、これらが、いったん一価の形態で放出されれば細胞から急速に解離するように、比較的低い受容体結合親和性で操作されなければならない14〜17。固体支持体から放出された後の、細胞中へのFabの内部移行の程度は不明であるが、比較的低い受容体結合で操作されたFabは細胞表面に有意に保持されない16。しかし、この方法は、生物学的に生成された操作されたストレプトアビジンおよび改変されたFabに依拠するので、依然として費用がかかる。さらに、前述のアプローチのすべては、CD4+T細胞およびCD8+T細胞の単離について、低スループットであり、供給必要量が高く、順番にまたは並行に複数の選択装置に依拠する。したがって、細胞選択の技術的進歩にもかかわらず、合理的な収率および純度を維持しながら、包括的に、低費用、トレースのない選択、およびハイスループットを有するアプローチは、実現しにくいままである。
【０２４３】
標的分子に結合することができる一本鎖オリゴヌクレオチドである、核酸アプタマーは、細胞選択にとって、抗体およびFabの魅力的な代替物である。Szostak、GoldグループおよびJoyceグループによって1990年代に最初に開発されており18〜20、アプタマーは、抗体に匹敵する、または抗体よりもさらに高い結合親和性を有し得る。重要なことに、アプタマーは、詳細に明らかにされた、長い貯蔵安定性を有する変動性の低い生成物として合成的に生成され、それにより、安価で、製造しやすいものになる21〜23。アプタマーは、一般に、SELEX（試験管内進化法）として公知のライブラリー選択方法によって発見され、化学的安定性についてさらに最適化することができる。その好都合な属性の故に、アプタマーの適用分野は、ここ四半世紀で段階的に拡大して、感知、精製、診断、薬物送達、および治療剤を含めた領域を包含している24。
【０２４４】
無標識CD8+T細胞の単離のための可逆的アプタマー選択技術を本明細書に記載する。本研究の3つの主な様相を提示する。第1に、CD8に特異的ないくつかの高親和性DNAアプタマーを改変細胞-SELEX手順を使用して特定し、選択されたアプタマーの結合特性を検証した。磁気活性化細胞ソーティング（MACS）を、アプタマーのうちの1つを用いて、臨床的に使用される抗体ベースのCD8ミクロビーズ系システムと比較し、磁気活性化細胞ソーティングは、アプタマーが標準的な方法に匹敵する効率でPBMCからCD8+T細胞を単離することが分かった。第2に、相補的オリゴヌクレオチド拮抗薬を使用してアプタマーの結合を反転させて、アプタマーのフォールディングを破壊し、このアプローチを使用して、高い収率および純度で、アプタマーが固定化された支持体からCD8+細胞が放出され得ることを示すように、方法を開発した。最後に、本明細書に記載される可逆的アプタマー選択アプローチと標準的な抗体ベースの選択の両方からCAR T細胞を生成し、十分に特性評価した。トレースのないアプタマー選択を使用して単離したCAR T細胞は、抗体を使用して単離されたものとフェノタイプ的に類似しており、かつインビトロとインビボの両方でほとんど同一のエフェクター機能を示した。したがって、このアプタマーベースの選択アプローチは、潜在的な臨床規模の細胞療法適用のための、T細胞の高効率で無標識の安価な選択を可能にする。他のT細胞特異的アプタマー、例えばCD4アプタマーの将来の発見により、この技法は、アプタマーおよび対応する拮抗薬のパネルを使用して、単一の装置からの複数のT細胞集団のハイスループットな連続的選択のために、容易に拡大することができる。
【０２４５】
競合的選択および対抗選択を組み入れる細胞SELEXによるT細胞結合アプタマーの特定
細胞単離適用は、特異的なアプタマーの発見および使用に依存する。組換えタンパク質を用いる従来のタンパク質-SELEXまたは操作された細胞株を用いる細胞-SELEXのいずれかを使用してT細胞特異的アプタマーを特定するための最初の努力は不成功に終わり、特異性が悪いアプタマーがもたらされ、T細胞特異的アプタマーを発見するためには、細胞-SELEXによってもたらされる細胞表面上の受容体のネイティブな提示と競合的選択によって与えられる選択のストリンジェンシーの増大の両方が必要であるという仮説が立てられた。Tanグループの細胞-SELEXプロトコールを、競合的選択（適切な望ましくない細胞の存在下における選択）と対抗選択（望ましくない標的に結合するアプタマーの枯渇）の両方を含むように改変した（図1）。52塩基対のランダムな領域（1016個の変異体）を含む一本鎖DNAライブラリーを使用した、T細胞に対する正の選択の第1ラウンドの後、選択されたアプタマープールを複数ラウンドの競合的対抗選択にかけた。各ラウンドは、アプタマープールを末梢血単核球（PBMC）とともにインキュベートし、その後、元のままのT細胞の単離および結合アプタマーの抽出を行うことによる、T細胞結合アプタマーの競合的選択を含んでいた。次いで、収集したアプタマーを、CD3-CD4loCD8-ヒトT細胞白血病株であるJ.RT3-T3.5とともにインキュベーションすることによって、対抗選択に供して、他のT細胞発現表面タンパク質に結合するアプタマーを除去した。5つの選択ラウンドのそれぞれの選択ストリンジェンシーを表2（以下）に概説するように増大させた。
【０２４６】
（表２）次第にストリンジェントになるラウンドにわたるT細胞SELEXの実験条件
2021530230.tif 000007
【０２４７】
細胞選択の進行をフローサイトメトリーによってモニターした（図2）。T細胞のサブセットへの結合は、ラウンド3によって観察され、ラウンド5まで増大した。ラウンド5で観察された、対抗選択細胞への非特異的結合が理由で、5ラウンド後に選択を停止した。
【０２４８】
選択の各ラウンドからのアプタマープールおよび元のアプタマーライブラリーを表3（以下）で詳述するプライマーを使用して、次世代シークエンシング（NGS）によって確認し、FASTAptamerを使用して解析した。表3のプライマーは、SEQ ID NO:78〜84に見出すこともできる。
【０２４９】
（表３）ナイーブライブラリー（NL）およびT細胞SELEXのラウンド1〜5の次世代シークエンシングに使用されるプライマー
2021530230.tif 000008
【０２５０】
Figtreeソフトウェアを使用して上位100のアプタマーの系統樹を作成し、MEME解析31を使用してコンセンサスモチーフを特定した（図3）。アプタマー配列は、ラウンド4で、2つの重複モチーフ（モチーフ1および2）を有する2つの主な枝に分かれた。ラウンド5では、新しいモチーフ、モチーフ3およびモチーフ1と重複するモチーフ4が出現した。表4（以下）は、出現率（prevalence）、予測されるモチーフ、および連続的なラウンドにおける各アプタマーの濃縮の順で、ラウンド5から特定された上位20のアプタマーを示す。表4の配列はSEQ ID NO85〜104に見出すこともできる。
【０２５１】
（表４）T細胞SELEXのラウンド間の、上位20のラウンド5（R5）アプタマー配列の濃縮
2021530230.tif 000009
2021530230.tif 000010
2021530230.tif 000011
*パーセント表示は、配列の100万リードあたりのリード数（RPM）をパーセンテージに変換することによって計算され、一方で倍数濃縮は、あるラウンドからの配列のRPMを前のラウンドの値で割ることによって計算される。
【０２５２】
5つのアプタマー（表4のランクに従って名付けられ、かつ表5（以下）に列挙される）を、それらの存在量、モチーフ、ラウンド間の濃縮、および系統樹上のファミリー表示、ならびにそれらの二次構造の低エネルギー状態（図4）に基づいて、一次T細胞および対抗選択J.RT3-T3.5細胞を用いる結合研究のために選択した。表5のアプタマー配列はSEQ ID NO:1〜7に見出すことができる。
【０２５３】
（表５）実験で使用するアプタマーおよび拮抗薬の配列
2021530230.tif 000012
*スラッシュ「/」内のテキストはIDT改変コードを示し、下線が引かれた塩基対は、PCR反応をプライムするために使用される不変領域を示す。
【０２５４】
フルオレセイン標識されたアプタマーA1、A3、およびA8は混合T細胞のサブセットに特異的結合を示したが、A2およびA7は、ナイーブライブラリーからランダムに選ばれたアプタマー（RN）と比較して、T細胞とJ.RT3-T3.5細胞の両方への全集団の結合を示した（図5）。興味深いことに、A1、A3、およびA8ではなく、A2およびA7が、ラウンド5で現れるユニークなモチーフ3に属し、バルクアプタマープールでJ.RT3-T3.5細胞へ非特異的結合が観察された場合はラウンド4と5の間で有意な濃縮（>100倍）示した。
【０２５５】
T細胞結合アプタマーの特性評価
アプタマーA1、A3およびA8は、それらの重複モチーフが理由で、同じ受容体に結合すると思われる。さらに、このタンパク質が対抗選択細胞株で発現しておらず、CD8:CD4 T細胞の比は健常ドナーの汎T細胞単離体において低く、観察された20〜30％の混合T細胞集団結合と一致するので（図5）、該アプタマーはCD8に結合することが疑われた。したがって、CD4およびCD8抗体標識を用いた混合ヒトT細胞へのアプタマーの結合を解析し、この結果は、3種のアプタマーすべてがCD8+T細胞に結合するが、CD4+T細胞には結合しないことを示し、これは、アプタマーがヒトCD8に結合することを示唆する（図6A）。しかし、マウス脾細胞に対する同様の結合研究は、Tリンパ球サブセットへのいかなる結合も示さず、これは、アプタマーは、CD8抗体のように、マウスCD8に結合しないことを示唆する（図7A）。アプタマーA1、A3、およびA8はアカゲザルPBMCのCD8+T細胞にも結合し、これは、多くの抗ヒトCD8抗体クローンで観察されるアカゲザル交差反応性と一致する（図7B）。これらのアプタマーが、以下の3つの技法によって、細胞で発現させたヒトCD8アルファ鎖アイソフォーム（CD8a）に結合することがさらに確証された：CD8特異的抗体を用いる競合的結合、T細胞におけるCD8aのsiRNAノックダウン、およびCD8-細胞における強制的CD8a発現。漸増濃度の非標識CD8特異的抗体（クローンRPA-T8）は、コインキュベーション中に、CD8+T細胞への結合について3種のアプタマーすべてを頑強に打ち負かしたが、CD3特異的抗体はそうではなかった（図8）。一次CD8+T細胞におけるsiRNAによるCD8aのノックダウン（75％）（表6、以下）は、抗体染色によって確証され、3種のアプタマーすべての結合の73〜77％の低減と相関した（図6B）。
【０２５６】
（表６）CD8のノックダウンに使用されるsiRNA二本鎖
2021530230.tif 000013
【０２５７】
CD8-Jurkat不死化ヒトリンパ球細胞におけるGFPレポータープラスミドからのCD8aの一過的発現により、GFP+細胞に特異的に結合するアプタマーを導入した（図6C）。CD8aタンパク質それ自体へのアプタマーの結合の検証のために、バイオレイヤー干渉法（BLI）による結合および解離キネティクスを測定し、組換え細胞外CD8aタンパク質（Ser22〜Asp182）の段階希釈物をストレプトアビジンでコーティングされたBLIセンサー上に固定化されたアプタマーに対してスクリーニングした。RNアプタマー陰性対照はCD8aタンパク質との検出可能な結合を示さなかったが（データ非表示）、A1、A3、およびA8アプタマーは、それぞれ、20.1±0.2、14.7±0.1、および5.59±0.11nMの結合親和性（KD）で該タンパク質と結合した（図6Dおよび表7）。興味深いことに、A3アプタマーは、「見かけの」、3種のアプタマーの中の最高の結合速度定数（Kon）と最高の速度定数解離（Kdis）の両方を有していたが、A8は最も遅いKdisを有していた。CD8+T細胞に結合するアプタマーのKDもフローサイトメトリーによって評価し、A1、A3、およびA8アプタマーは、それぞれ、18.3±4.6、1.9±0.8、および2.4±0.9nMの見かけのKDを有する（図6E）。2つの方法によって決定された結合親和性値の観察された違いは予想されるものである。BLIには存在しないが、静止したウェルで細胞を染色する場合に存在する物質輸送の制限は再結合に好都合であると思われ、それによって解離を制限し、他のアプタマーと比較してより速く解離するA3の見かけのKDを改善する。さらに、十分な時間が得られた場合（すなわち定常状態か、または定常状態近くでの結合）、高いKonに起因する結合の利点が減少する飽和濃度のアプタマーでは、A8アプタマーは、A3と比べて結合の増大を示し、これは、2種のアプタマー間のKoff大きな違いと一致する。とにかく、3種のアプタマーすべてが、モノクローナル抗体に匹敵するKD値で、CD8aタンパク質およびCD8+T細胞に高い結合親和性を有する。
【０２５８】
（表７）バイオレイヤー干渉法（BLI）により組換えCD8aタンパク質へのA1、A3、およびA8アプタマーの結合の親和性およびキネティクスを測定した
2021530230.tif 000014
データは、平均±s.d.であり、1:1結合モデルに対して、図6Eの結合曲線データの全体的適合を行うことにより計算した。解離速度定数（Kdis）と結合速度定数（Kon）の間の比により、平衡解離定数（KD）を得る。適合度は、換算（reduced）カイ二乗（χ2）および1に近づくR2値によって評価した。
【０２５９】
相補的なオリゴヌクレオチドを用いたアプタマー結合の反転
アプタマーベースの親和性作用物質を使用してトレースのない細胞単離を達成するために、細胞へのアプタマーの結合を反転させるための方法が細胞回収工程で必要とされる。アプタマーの結合は、アプタマーのヌクレアーゼ媒介性分解、加えられた力、競合的結合、または熱もしくは相補的なオリゴヌクレオチドの結合のいずれかを介する二次構造の変性によって、破壊することができる。これらの前述の方法のうち、相補的なオリゴヌクレオチド置換が、（例えば、熱または力と比較して）穏やかであり、（例えば、競合的結合と比較して）収率が高く、（例えば、ヌクレアーゼ分解と比較して）費用が比較的低いというその利点が理由で、好ましい方法である。したがって、相補的な置換鎖（「拮抗薬」）と結合することにより細胞から放出され得るCD8結合アプタマーを設計した。
【０２６０】
選択アプタマーの設計および拮抗薬の設計における2つの主な考慮すべき事柄は、第1に、選択アプタマーによる標的細胞への高親和性結合、第2に、拮抗薬による、受容体結合に重要なアプタマー二次構造の急速な破壊である。したがって、A3アプタマーは、CD8+T細胞に対するその低い見かけのKDによってだけでなく、CD8aタンパク質に対するその高いKonおよびKoffによっても細胞選択のために選ばれた。選択媒体におけるアプタマーの多価提示は、たとえ少数のアプタマーが解離しても、細胞結合を保持するためにアプタマーがシスに存在するので、受動的細胞解離を潜在的に軽減すると考えられるため、より速い結合キネティクスは細胞単離により重要である可能性があるであろうことが考えられた。さらに、高いKoffは、安定性が低い結合を暗示し、相補的なオリゴヌクレオチド置換によってアプタマーの結合を反転させるためのストラテジーがより成功する可能性があることを示唆する。文献で報告されたCD8アプタマーも試験した41、42が、前述の結合条件において、低い結合が観察された（図9）。
【０２６１】
トーホールド領域を、次いで、元のA3配列の3’末端で延ばして（A3t）、相補的拮抗薬による細胞放出の開始を容易にした（図10Aおよび表5）。トーホールドは、鎖置換として公知の方法によって、相補的配列結合および事前に対形成した塩基に取って代わることを可能にする、一本鎖配列である。この場合、拮抗薬は、トーホールドを介して鎖置換を受けて、その二次構造に必要であるアプタマーの鎖内塩基対形成を抑止するであろう。ZhangおよびWinfreeは、鎖置換の速度定数はトーホールドの長さに依存し、最大6桁にわたって変動し、6塩基の長さを超えるトーホールドで最大速度に達することを報告した。したがって、記載されるCD8-アプタマー選択作用物質において8-merのトーホールドを使用した。拮抗薬（RA）は、結合の際の二次構造の予測される変化に基づいて、36塩基の長さになるように設計した（図10Bおよび表5）。
【０２６２】
フローサイトメトリー解析で蛍光標識アプタマーを使用して、RAによる細胞からの有効かつ急速なアプタマー放出が実証された。放出に必要な条件を決定するために、RAの様々な濃度（25〜100倍過剰の範囲）、インキュベーションの温度（4℃、室温、および37℃）ならびに時間（5、10、および20分）を評価した（図11A〜B）。すべての条件で70％を超えるA3tアプタマーの放出が観察されたが、90％の放出は、100倍過剰のRAとの室温で10分のインキュベーションでのみ達成することができた。したがって、無標識単離ストラテジーのためにこれらのパラメーターを選んだ。
【０２６３】
トレースのないT細胞単離のためのアプタマーベースのストラテジー
A3tアプタマーを細胞選択プロセスに適用する前に、PBMCの状況の中でアプタマーがT細胞に選択的に結合するということを確実にすることが必要であった。細胞単離に使用される濃度（5nM）で、CD3-CD56-CD14+単球およびCD3-CD56-CD19+B細胞への最小の結合が観察され、これらの細胞集団への結合はRNアプタマー対照を超えなかった（図12）。B細胞への結合は特に低く（0％に近い）、これは、CARでの単一の非常にコンピテントな白血病B細胞の形質導入が、療法に対して抵抗性を誘導することが最近示された48ことを考えれば、望ましい形質である。CD3+CD56-T細胞の他にも、A3tアプタマーはまた、CD8を発現するサブセットを有することが公知であるCD3+CD56+NKT細胞およびCD3-CD56+NK細胞にかなりの結合を、予想通り示した。NKT細胞はCAR T細胞療法を向上させることが分かっているので49、この細胞への結合は有利であるとみなされた。重要なことに、A3t陽性の単球、B細胞、およびNK細胞におけるアプタマー結合の蛍光強度中央値（MFI）は、A3t陽性のT細胞およびNKT細胞と比較して非常に低く、これは、結合イベントがこのアプタマー濃度で混入細胞を最小限にしか捕捉しないであろうことを示唆する。
【０２６４】
選択アプタマーA3tおよびその同族RAを使用して、完全な合成系でトレースのないT細胞単離を達成することができ、それにより、固定化されたアプタマーを使用して、T細胞を単離し、続いて、結合のためのアプタマーの二次構造を破壊するRAの添加によりそれを放出させる（図13A）。アプタマーの固定化のために免疫磁気の抗ビオチンミクロビーズ（Miltenyi Biotec）を使用することによってこのストラテジーを用い、このストラテジーを、3つの健常ドナーPBMC集団から高い純度および収率でCD8+T細胞を単離する能力について、市販の抗体ベースのCD8ミクロビーズ（Miltenyi Biotec）と比較し、これは、CD8ミクロビーズが、臨床規模のCAR T製造のために承認された現在唯一の選択技術であるからである。アプタマーの結合またはRA鎖置換を妨げるであろう任意のビーズ由来立体障害を減らすために、A3tアプタマーを、可動性18炭素リンカーを用いて3’末端でビオチン化した。アプタマーを抗ビオチンミクロビーズにプレロードし、これを、推奨されるビーズの半分のみを使用した（10uL/107細胞）ことを除いて市販のCD8ミクロビーズに使用されるものと同一のプロトコールを使用して、PBMCとともにインキュベートした。次いで、機能化したPBMCを磁場の下でカラムにアプライし、フロースルー（FT）画分を収集した。次いで、抗体で単離された細胞をカラムフラッシュ（CF）を使用してカラムから取り出した一方で、アプタマーで単離された細胞をカラム上で100倍過剰のRAに10分間曝露した。次いで、カラムの栓を抜き、カラムを洗浄し、これは、拮抗薬溶出（RAE）画分を構成した。カラム上のいかなる残存細胞もCFを使用して取り出した。両方の単離方法の画分をフローサイトメトリーによって計数し、解析した（図14A〜14B）。
【０２６５】
アプタマーをロードしたミクロビーズを使用して、抗体ベースのCD8ミクロビーズに匹敵する、CD8+細胞の完全に近い枯渇がFT画分から観察され、これは、RAEおよびCF画分におけるCD8+細胞の濃縮に対応した（図13B）。RAE画分におけるCD8+細胞のさらなる解析によって、これらの細胞は主としてCD3+T細胞（>97％）であり、集団のごく一部だけがCD8loCD16+単球およびNK細胞であることが示された（図13C）。この純度解析は、CD3+CD16+NKT細胞を考慮しないので、控え目である。平均して、アプタマーベースの単離のRAEおよびCFを組み合わせると、抗体ベースの単離に匹敵する97.5％のCD8+T細胞を出発PBMC集団から得て、トレースのない単離単独（RAE画分）は72.3％を得た（図13D）。混入CD8-細胞を含めると、RAE画分におけるCD8+T細胞の平均純度は95.6％であり、これは、A3tアプタマーがPBMCにおけるCD8-細胞への最小の非特異的結合を示すことを例示する（図13E）。RPA-T8抗体クローンを用いた、RAE画分におけるアプタマーで単離されたCD8+T細胞のCD8染色は、出発PBMC集団におけるCD8+T細胞のものに匹敵したが、抗体で単離されたCD8+T細胞のものは低かった（図13F）。抗体ベースの方法がほとんどすべてのCD8+T細胞集団を枯渇させること（図13Bおよび図13D）を考えれば、より低いCD8染色は、使用した染色抗体クローンの結合を邪魔する、細胞に結合したCD8ミクロビーズの結果である（図13F）。これは、RA鎖置換のトレースのない性質のある特定の利点をさらに強調し、この利点は、染色抗体クローンを最適化する必要なしに、捕捉抗原の正確な下流のフェノタイピングを可能にすると考えられる。RAEにおいて剥離されなかった、CF画分におけるアプタマーで単離されたCD8+T細胞は、CD8発現がより高く、これは、CD8発現がより高い、それにより、アプタマー−ビーズ標識がより高い細胞は、カラムから取り出すことがより困難である可能性があることを示す（図13F）。
【０２６６】
アプタマーで単離された細胞が抗体で単離された細胞と類似していることを確証するために、フローサイトメトリーフェノタイピング、およびNanoString（商標）nCounter（登録商標）転写産物プロファイリングを使用して、CD8+T細胞を、アプタマーベースの単離のRAE画分と抗体ベースの単離のものにおいて比較した。アプタマーで単離されたRAE画分中のCD8+T細胞はPBMC中のものとフェノタイプ的に同一であったが、抗体で単離されたCD8+T細胞は、わずかに大きなパーセンテージの、二重CD45RA/RO発現の移行段階にある細胞を含み、これは、エフェクターメモリー細胞のわずかな低減と一致した（図15A）。しかし、転写的に、アプタマーで単離された細胞と抗体で単離された細胞は同一であり、大きくまたは有意に差次的に発現する遺伝子転写産物はなく、これは、高RA濃度に細胞を短時間曝露することに即座の副作用がないことを示唆する（図15B）。
【０２６７】
アプタマーベースのトレースのない細胞単離体からのCAR T細胞の生成
単離直後に、アプタマーで単離された細胞と抗体で単離された細胞の間にほとんど違いが観察されなかったが、これが、これらの異なる単離方法を使用して生成された最終的なCAR T細胞生成物にあてはまるかどうかを確証することが必要であった。図13D〜Fに示す抗体で単離された細胞およびトレースのないアプタマーで単離された細胞（RAE画分）の両方からCD8+CAR T細胞を生成し、それらの増殖、フェノタイプ、遺伝子発現、およびエフェクター機能を十分に比較した。抗体で単離されたCD4+T細胞は、異なる方法から単離されたCD8+T細胞間のいかなる違いも巻き込まないために、これらの研究に含めなかった。進行中の臨床試験で使用されている第2世代のCD19scFv-41BB-CD3ζCAR（およびEGFRt代用形質導入マーカー）をコードするPLAT-02レンチウイルスベクター（図16A）で細胞を形質導入した。CD19 CAR T細胞は、図17に概説されるように、0日目（S1D0）から14日目（S1D14）までの連続的な2週間の刺激ビーズ増殖、および照射されたCD19+フィーダー細胞を用いたS1R1D0からS1R1D14までの2週間の急速拡大プロトコール（REP）を使用して製造した。形質導入後、さらなる選択なしで、高いEGFRtレポーター発現（>60％）がS1D9で観察され、これは、機能アッセイを実施する前に、REP期間にわたって、免疫磁気濃縮を使用して、S1R1D13で少なくとも94％にさらに増大した（図16B）。EGFRt MFIによって示されるように、形質導入コピー数は非常に変わりやすかったが、抗体で単離された細胞とアプタマーで単離された細胞の間に平均MFIの違いはなかった（図16B）。
【０２６８】
2週間の刺激期間にわたって、形質導入していない抗体で単離されたモックT細胞と形質導入していないアプタマーで単離されたモックT細胞の間に増殖の違いは観察されなかった（図16C）。これは、2週間の刺激増殖の終わりにモックと異なる単離方法由来のCD19 CAR T細胞の両方の間で見られた同様のKi-67発現と一致し（図16D）、当然、細胞はREPにわたって等しく増殖した（図18）。活性化と消耗の両方のマーカーであるPD1、TIM3、およびLAG3の共発現に対するS1D14での染色によって、2週間の刺激増殖の終わりに、異なる単離方法由来の細胞間で、これらのマーカーの蓄積のわずかな違いが明らかになった（図16Eおよび図19）。アプタマーで単離されたCD19 CAR T細胞は、抗体で単離された細胞と比較して、単独のTIM3+PD1-TIM3-細胞の喪失およびPD1+TIM3+細胞の獲得を認めたが、2つの単離方法間で、モック細胞において反対の傾向が見られ、これは、これらの違いがおそらく形質導入および刺激プロセスのアーティファクトであり、単離ストラテジーではないことを示唆する。消耗／活性化データと一致して、同じ日の、アプタマーで単離されたCD19 CAR T細胞は、CD45RA-CD62L+の比率がより大きいことによって示されるように、抗体で単離された細胞よりも多くの分化を示したが、2つの単離方法のモック細胞は同等に分化した（図16F左、および図20）。しかし、2週間のREPプロセス後に、アプタマーで単離されたCD19 CAR T細胞は、抗体で単離された細胞に比べてあまり最終分化せず、一方でモックは同じままであり、これは、単離ストラテジーがこれらのわずかな違いの主因ではないことを再度示唆する（図16F、右および図20）。免疫関連遺伝子のNanoString（商標）nCounter（登録商標）転写産物プロファイリングによって、０個の遺伝子が、機能的試験の前のREPの終わりで、アプタマーで単離されたモックおよびCD19 CAR T細胞と抗体で単離されたモックおよびCD19 CAR T細胞の間で非常にまたは有意に差次的に発現しており、これらの違いは非常に小さいことがさらに再確認された（図21）。これらの結果は、アプタマー選択ストラテジーがCAR T細胞の適応度（fitness）に対していかなる永続的な長期の副作用も有していなかったことを再確認する。
【０２６９】
それぞれCD3およびCARの結合のためにOKT3 FabおよびCD19を安定して発現するように形質導入された骨髄性白血病K562細胞株と中程度のレベルのCD19を構成的に発現するBリンパ腫Raji細胞の両方に対して、抗腫瘍エフェクター機能を評価した（図22）。インビトロでの腫瘍チャレンジの際に、アプタマーで単離されたCD19 CAR T細胞は、抗体で単離された細胞と同程度まで3つの細胞タイプすべてを溶解し、同量のエフェクターサイトカインTNFαおよびIFNγを分泌した（図16G〜16H）。したがって、アプタマーベースのトレースのない単離ストラテジーに由来するCAR T細胞は、広く使用されている抗体ベースの単離に由来する細胞の水準までインビトロで機能する。
【０２７０】
全身的Raji腫瘍マウスモデルにおけるアプタマーで単離されたCAR T細胞の性能
CAR T細胞を用いるインビトロ細胞毒性の結果は、必ずしもインビボの結果を裏付けるとは限らない。したがって、インビトロにおいて、抗体で単離されたCD8+CAR T細胞とアプタマーで単離されたCD8+CAR T細胞のエフェクター機能の違いがほとんど観察されなかったにもかかわらず、これがインビボにつながるであろうことをさらに示すことは重要であった。この目的のために、前述のCAR T細胞ストレス試験のより低いストリンジェントバージョンを使用し、REPの終わり（S1R1D14）に、異なる単離方法由来の非治癒的用量のCD8+CD19 CAR T細胞でRaji担持NSGマウスを処置した。5×105個のGFP-ffluc CD19+Raji細胞をマウスに注射し、7日後に、このマウスを、前述のように、107個の抗体で単離されたまたはアプタマーで単離されたS1R1D14のCAR T細胞で処置した。両方の単離方法由来のCD8+モックT細胞をプラセボ対照として含めた。
【０２７１】
2×107個のCD8+CAR T細胞の投与は、療法の持続に重要なCD4+CAR T細胞サブセットを欠くので、このモデルを用いて、長期的に50％しか治癒的ではないことが以前に示された52。本研究のCD8+CAR T細胞は、2週間のビーズ刺激および2週間のREPの両方によっても拡大され、それにより、他の刊行物50、51に記載されている1週間または2週間拡大されたCAR T細胞よりも著しく多くの消耗および分化を示した。したがって、同じモデルで107個のCD8+CD19 CAR T細胞のみを使用した未発表の研究は、おおよそ10週間の最大生存で、非治癒的であることが分かった。
【０２７２】
したがって、本明細書に提供されるT細胞ストレス研究設計は、抗体で単離されたCAR T細胞とアプタマーで単離されたCAR T細胞の間の抗腫瘍エフェクター機能のいかなる違いも厳密に特定することができると考えられる。しかし、インビボで、抗体で単離されたCD8+CAR T細胞とアプタマーで単離されたCD8+CAR T細胞の両方の間で同一の抗腫瘍活性が存在することが頻繁に観察された。腫瘍の光子束によって測定した場合の、腫瘍の退縮および再発のキネティクスは、複数のドナーにわたって、異なる単離方法に由来するCAR T細胞が与えられたマウス間で重複した（図23A）。療法は、両方のCAR T細胞処置群に対して非治癒的であり、好結果のストレス試験モデルを示すが、生物学的有意性（生存期間中央値）およびログランク統計的有意性の両方によって決定した場合に、アプタマーで単離されたCAR T細胞が与えられたマウスは、抗体で単離されたCAR T細胞が与えられたマウスと比較して、同様の長期の生存を示した（図23B）。これらの結果は、鎖置換をともなうトレースのないアプタマーベースの細胞単離は、CAR T細胞療法の最初の生成工程における抗体ベースの単離の実行可能な代替法であり、最終的な細胞生成物の質に対して無視できるほどの下流の影響しかないことをさらに例示する。
【０２７３】
概要：
CAR T細胞療法の課題は、臨床的生成物の製造にともなう時間および費用である。最近の文献によって、療法のための異なるT細胞サブセットの選択は、不均一なPBMCから出発する不確定生成物と比較して、向上しかつ一貫した臨床転帰をもたらすことができることが示されたので、これらの新しい治療用組成物の要求を満たすために、効率的かつ費用対効果が大きい選択アプローチが開発されることは、ますます避けられない7、8。現在、CD8+およびCD4+T細胞は、(i)出発白血球アフェレーシス産物を分割し、さらなる下流の正の選択のために、望ましくない細胞を免疫磁気によって枯渇させる工程、または(ii)免疫磁気の正の選択を使用して白血球アフェレーシス産物から連続して単離する工程のいずれかによって、選択される。両方のアプローチは決して完璧ではなく、前者は、細胞を分割するという性質により出発集団中の細胞の一部を無駄にするが、並行的単離で時間を節約し、一方で、後者は各工程で全集団を使用することにより時間がかかる。さらに、細胞上の残存標識は、さらなる選択を妨害し、かつ患者への臨床への橋渡しについての規制上の障壁をもたらす。最近の2つの報告は、複数の細胞集団を単離するために、DNA標識された抗体、それに続く鎖置換を使用したが、抗体およびDNAタグは、選択された細胞に付着したままである53、54。Streptamer（商標）技術および結合活性に依拠する同様のFab多量体化ストラテジーの出現は、無標識単離を可能にすることにより、これらの問題を部分的に軽減したが、これらのアプローチは、依然として、高価な、生物学的に生成された選択作用物質に依拠し、純粋な別々の細胞サブセットを単離するために、2つ以上の装置を順番に必要とする16、17。さらに、これらの技術は消滅しやすく（perishable）、消耗品の供給業者が独占的であることが多く、これは、難治性疾患の患者に対して時間的制限があることが多い細胞療法の製造プロセスに供給連鎖の危険性を加える10。DNAアプタマーおよび拮抗薬を用いた相補鎖置換は、養子細胞療法で使用するためのT細胞の選択を向上させるためのまたとない機会を与える。アプタマーは合成であり、それにより、大規模で生成するのにあまり費用がかからない。さらに、その製造は多くの利用可能な企業のうちの1つに外注に出すことができる。その長い貯蔵寿命に加えて、これは、最低限の供給連鎖の危険性しか有さない。複数の標的に対して高親和性DNAアプタマーを開発することができ、アプタマー特異的鎖置換のためにユニークなトーホールドおよびステムを含めるように、それらの配列をSELEX後にさらに改変することができる。したがって、多様なT細胞抗原に対するアプタマーのパネルを、同じカラムから異なる細胞サブセットを連続的に無標識単離するための対応するユニークな拮抗薬を用いて開発することができる。一例として、ユニークなトーホールドおよび配列を有するCD4アプタマーおよびCD8アプタマーがロードされたミクロビーズを、1つの白血球アフェレーシス産物全体に同時に加えることができ、CD4+T細胞およびCD8+T細胞を、対応する拮抗薬との連続的なインキュベーションによって、1つのカラムから連続的に溶出することができる。CD4アプタマーまたはCD8アプタマーのいずれかと組み合わせてCD3アプタマーを使用して、同様の結���を達成することができる。あるいは、CD8特異的なアプタマー、ならびにそれぞれ単球、B細胞、およびNK細胞に結合する他のアプタマーを使用して、CD8+T細胞および他の望まれない細胞サブセットを枯渇させることができる。次いで、元のままのCD4+T細胞をフロースルー画分中に濃縮することができ、CD8アプタマーに特異的な拮抗薬を使用してCD8+T細胞をカラムから選択的に溶出することができる。これらのストラテジーを実行するための鍵は、非常に細胞特異的なアプタマーの特定である。
【０２７４】
高親和性CD8a特異的なアプタマーの発見、およびトレースのないCD8+T細胞単離システムにおける、拮抗薬を用いる1つのアプタマーの好結果の適用が、本明細書に記載される。アプタマー単独で用いると、広く使用されている抗体ベースのアプローチと比較して、同等のCD8+T細胞選択をもたらす。無標識溶出のための拮抗薬を用いると、CD8+T細胞の70％を超える選択収率および95％を超える純度が観察された。ALL患者からの350〜450mLのアフェレーシス産物が3〜9×109個のT細胞を有し、1:1 CD4+:CD8+CAR T細胞療法を製造するために200〜600×106個のCD8+T細胞しか必要とされないことを考えれば、より低い収率とこのアプローチによる高純度、より低い費用、および無標識選択との交換は、重大性はほとんどないが、多くの恩恵がある。重要なことに、小規模でのこのシステムの最大能力の事例観察に基づくと、信頼できる臨床規模の単離のために、約＄5〜10のアプタマーしか必要とされないであろう。無標識の、アプタマーで単離された細胞から製造されたCD19指向性CAR T細胞も、抗腫瘍エフェクター機能を測定するように設計されたアッセイにおいて、抗体で選択された細胞から生成されたCAR T細胞と同一の性能を示し、これは、アプタマーベースのトレースのない細胞単離が、CAR T細胞療法のための実用的な選択ストラテジーであることを示す。
【０２７５】
実施例で提供する競合的SELEXアプローチは、CD8特異的なアプタマーを選択するのに特に有効であった。元のままのCD4+一次T細胞またはCD8-Jurkat T細胞株を使用するSELEXストラテジーは、CD3またはCD4のような別のT細胞抗原に結合するアプタマーの特定において恩恵を与える可能性がある。さらに、改変DNAライブラリーの使用は、非改変DNAライブラリーを使用した高親和性アプタマーの発見に適しているタンパク質の範囲を拡大することができる。そのような標的について、ライブラリー設計に1つまたは2つの修飾塩基対を含めることで化学的多様性を増大させることにより、高親和性結合体を成功裏に区分化することを容易にすることができる55。
【０２７６】
アフィニティークロマトグラフィー分離のための固体支持体に付着させるために、アプタマーを容易に機能化することができ、したがって、その結果、組換えタンパク質、磁気の支持、および選択作用物質とのプレインキュベーションの必要がない、純粋に合成の単離システムがもたらされる。細胞放出効率は、さらなる配列最適化（より高いトーホールドGC含量、アプタマートランケーション）ならびにアプタマーおよび拮抗薬の化学修飾（例えば、ロックド核酸）を介して、アプタマーと拮抗薬の間の鎖置換キネティクスを改良することによって、向上させることができる47、56。T細胞マーカーCD3およびCD4に対するアプタマーのさらなる発見によって、単一カラムからトレースなしで複数の細胞サブセットを単離することができる連続的選択ストラテジーが可能になり得る。これらの改良で、アプタマーおよび拮抗薬ベースの単離アプローチをプロセスエンジニアリングストラテジーに安価に適用して、連続フロー方法によって、操作されたCD4+T細胞およびCD8+T細胞を調製することができ、したがって、T細胞免疫療法の利用しやすさを増すことができることが考えられる。
【０２７７】
実施例2：材料および方法
オリゴヌクレオチド
研究したすべてのオリゴヌクレオチドは、Integrated DNA Technologiesにより合成された。T細胞SELEXプロセスで使用したssDNAライブラリーは、HPLC精製されており、2つの18bp不変領域が隣接する52塩基対（bp）のランダム配列からなっていた。IDT改変コードを有する、SELEXのラウンド間のライブラリー増幅に使用されるプライマーは以下の通りである：フォワード
2021530230.tif 000015
およびリバース
2021530230.tif 000016
。個々に合成されたssDNAアプタマーを表5に列挙する。
【０２７８】
抗体およびフローサイトメトリー
以下の色素、抗体、および二次的なものを使用して、細胞を染色した：Zombie Violet（100μL/1e6細胞において1:500、BioLegend）、Zombie Yellow（100μL/1e6細胞において1:500、BioLegend）、APC抗ヒトCD4（1:100、300514、BioLegend）、PerCP/Cy5.5抗ヒトCD8a（1:100、301031、BioLegend）、APC抗ヒトCD8a（1:100、301014、BioLegend）、CD8-ビオチン（1:100、130-098-556、Miltenyi）、抗マウスCD16/CD32 Fcブロック（1:100、14-0161-86、eBioscience）、BV421抗マウスCD8a（1:50、100737、BioLegend）、FITC抗マウスCD3e（1:50、100305、BioLegend）、精製抗ヒトCD3（クローンUCHT1、300402、BioLegend）、精製抗ヒトCD8a（クローンRPA-T8、301002、BioLegend）、Super Bright 600抗ヒトCD19（1:20、63-0198-42、eBioscience）、Super Bright702抗ヒトCD56（1:100、67-0566-42、eBioscience）、PE抗ヒトCD3（1:100、300308、BioLegend）、APC/Cy7抗ヒトCD14、FITC抗ヒトCD16（1:50、302006、BioLegend）、Alexa Fluor 700抗ヒトCD3（1:50、300424、BioLegend）、Brilliant Violet 785抗ヒトCD4（1:50、317442、BioLegend）、PE/Cy7抗ヒトCD8a（1:200、300914、BioLegend）、BUV737マウス抗ヒトCD45RA（1:25、564442、BD Biosciences）、BUV395マウス抗ヒトCD45RO（1:25、564291、BD Biosciences）、PE抗ヒトCD62L（1:400、304806、BioLegend）、Brilliant Violet 421抗ヒトCCR7（1:25、353208、BioLegend）、Erbitux-ビオチン（1:500、Jensen Lab）、PE-Cy7マウス抗Ki-67（1:20、561283、BD Biosciences）、BUV737マウス抗ヒトPD-1（1:20、565299、BD Biosciences）、Brilliant Violet 785抗ヒトTIM-3（1:20、345032、BioLegend）、PEマウス抗ヒトLAG-3（1:20、565616、BD Biosciences）、Brilliant Violet 785抗ヒトCD45RA（1:160、304140、BioLegend）、NeutrAvidin Protein DyLight 633（1:500、22844、Invitrogen）、Alexa Fluor 647ストレプトアビジン（1:500、405237、BioLegend）、およびPEストレプトアビジン（1:500、405204、BioLegend）。必要に応じて、OneComp eBeads（Invitrogen）を使用して、代償のための単色対照を調製した。染色した試料は、MACSQuant Analyzer 10（Miltenyi）、Attune NxT（Invitrogen）、またはBD LSRFortessa（BD Biosciences）フローサイトメーターのいずれかを用いて解析した。
【０２７９】
細胞株の培養およびPBMCの単離
それぞれ対抗選択およびヌクレオフェクションに使用するJ.RT3-T3.5およびJurkat（クローンE6-1）細胞株は、ATCCから購入した。T細胞の急速拡大プロトコール（REP）で使用する、エプスタイン‐バーウイルスで形質転換されたリンパ芽球様細胞株（TM-LCL）は、以前に述べられたように43、単核細胞から作製した。機能アッセイに使用するCD19+およびOKT3+ K562細胞は、CD19またはOKT3を発現するコンストラクトを親のK562親細胞（ATCC）にレンチウイルスで形質導入することによって生成した。Raji親細胞もATCCから購入した。上記の細胞株のすべては、10％の熱失活FBS（Life TechおよびVWR）を含むRPMI1640培地（Gibco）中で培養した。末梢血単核球（PBMC）は、Ficoll-Paque密度勾配遠心（GE）を使用して、Leukocyte Reduction System（LRS）cones（Bloodworks Northwest）から単離した。非単離実験で使用する混合またはCD8+T細胞は、Juno Therapeuticsから寛大にも贈られたものであった。
【０２８０】
T細胞枯渇を用いる競合的細胞SELEX
SELEX手順の概略図を図1に示し、それぞれのラウンドで使用する条件を表2に概説する。SELEXプロトコールは、Sefahら23から適合させた。概括的に言えば、ラウンド1について、非ストリンジェントな正の選択を行い、死細胞が枯渇した4,000万個の解凍した混合T細胞（Miltenyi）を40nmolのssDNAライブラリー（約1016個の個々の配列）とともに4℃で1時間インキュベートした。ラウンド2〜5については、前のラウンドから生成された濃縮および増幅されたssDNAのプールを死細胞が枯渇した解凍したPBMCとともにインキュベートし、すなわち、これは競合的選択と呼ばれるプロセスである。3回の洗浄後に、次いで、Pan T細胞単離キット（Miltenyi）を使用して、望ましいT細胞サブセットおよび結合ssDNA配列を濃縮した。これらのT細胞をボイルすることによって溶解し、ssDNA配列を浄化された上清中に抽出した。次いで、各ラウンドにおける負の選択の形態として、106個のCD3-CD8-J.RT3-T3.5細胞とともにssDNAのプールを4℃でインキュベートし、非結合ssDNA配列をPCR増幅し、次のラウンドで使用した。選択のストリンジェンシーを増大させ、非特異的結合体を最小限にするために、ラウンドを通して、使用するssDNA、PBMC、およびBSAの量、ならびにインキュベーションの時間を減らした。
【０２８１】
ラウンド間で、0.02U/μLのPhusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（NEB）、1×Phusion GC緩衝液、500nMの上述したフォワードとリバースプライマーの両方、および200μMのdNTPs（98℃で10秒、56℃で30秒、72℃で30秒）を使用して、残存ssDNA配列をPCRによって増幅した。200uLのssDNAを使用する大規模の2mLの調製用PCR反応の前に、10μLのssDNAおよび2％アガロースゲル電気泳動を使用する、小規模の100μLの分析的PCR反応を常に行って、大きな非特異的アンプリコンが現れる前の最適サイクル数を決定した。SELEXの引き続くラウンドとフローサイトメトリーラウンド結合アッセイの両方で使用するためのFAM標識されたssDNAは、High Capacity Neutravidin アガロース樹脂（Thermo Scientific）、1M NaOH、および脱塩illustra NAP-5カラム（GE）を用いて生成した。ssDNAの量をNanoDrop 2000c分光測光（Thermo Scientific）によって定量化し、Savant ISS110 SpeedVac drying（Thermo Scientific）によって濃縮した。
【０２８２】
SELEXのすべてのラウンドおよび結合アッセイで使用する洗浄緩衝液調合物は、2.25gのグルコース（最終25mM）および2.5mLの1M MgCl2（DPBS中の量を含めて最終5.5mM Mg++）が補充された、カルシウムおよびマグネシウムを有する0.22μmで濾過した500mL DPBS（Corning）であった。使用する結合緩衝液調合物は、濾過した後の0.1mg/mLの酵母tRNA（Invitrogen）およびBSA（Miltenyi、SELEXについては変動し、結合アッセイについては1％である）がさらに補充された、同じ洗浄緩衝液であった。標識されたssDNAのプールまたは個々のアプタマーを洗浄緩衝液中で1uMに再構成してから、95℃で5分間の変性および氷上での即座の冷却によってフォールドさせた。次いで、フォールドしたssDNAのプールまたは個々のアプタマーを結合緩衝液中で指定の濃度に希釈してから、SELEXのラウンドまたは結合アッセイにおいて細胞とともにインキュベートした。
【０２８３】
アプタマー結合アッセイ
細胞（200,000個）を100μLのフォールドしたFAM標識されたssDNAのプールまたはFAM/ビオチン標識された個々のアプタマーとともに、指定の濃度の結合緩衝液中で、4℃で30分間インキュベートした。抗体競合および抗体によるマルチカラーフローサイトメトリー染色のために、アプタマーとの一次インキュベーション中に抗体を加えた。1％（重量／体積）BSAが補充された200μLの洗浄緩衝液中で細胞を2回洗浄して、過剰なアプタマーを除去した。使用するアプタマーがビオチン化されていた場合、1％（重量／体積）BSAを有する洗浄緩衝液中で、細胞を100μLの蛍光標識されたストレプトアビジンまたはニュートラアビジン二次とともに4℃で20分間、第2のインキュベーションにかけ、2回洗浄した。染色された細胞を、1％（重量／体積）BSAおよび0.1％PFAを有する200μLの洗浄緩衝液中で固定してから、フローサイトメトリーによって解析した。
【０２８４】
次世代シークエンシングおよびデータ解析
出発ナイーブライブラリーおよびSELEXの各ラウンドからのssDNAのプールを、製造者の指示書に従って、MiSeq試薬キットv2（300サイクル）およびMiSeqシステム（Illumina）を使用してシークエンシングするために、表2に列挙するバーコードプライマーを用いて、PCR増幅した。エキスポートされたFASTAファイルをFASTAptamerソフトウェア24を用いて解析した。特に、FASTAptamer-Countを最初に使用して、各配列についてランクおよび100万リードあたりのリード数（RPM）を決定し、その後、FASTAptamer-Compareを使用して、隣接するラウンド間で配列のRPMのペアワイズ比較を行い、それにより、倍数濃縮を計算した（表4）。系統樹作成のためのFigTreeソフトウェア（tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/）とモチーフ予測のためのMEME Suiteソフトウェアの両方によって、ラウンド2〜4からの上位100の配列をさらに解析した26。NUPACKウェブアプリケーションを使用して、アプタマー配列の予測二次構造を生成した44。
【０２８５】
siRNAノックダウン
100U/mLのrhIL-2（Miltenyi、NIBSC較正値）が補充された完全RPMI中で、Dynabeads Human T-activator CD3/CD28（Life Tech）を用いて、10e6個の解凍したCD8+T細胞を1.5e6細胞/mLで3日間活性化した。3日目に、製造者の指示書に従って、プログラムT-023でHuman T Cell Nucleofectorキット（Lonza）を使用して、表5に列挙する50pmolのCD8aを標的とする二本鎖siRNA（DsiRNA）1と2の両方、または100pmolのスクランブル化されたDsiRNA（IDT）を3e6個の活性化T細胞にヌクレオフェクトした。アプタマーおよび抗CD8抗体染色は、以前のセクションで述べられたように、24時間後に行い、およびフローサイトメトリーによって解析した。
【０２８６】
プラスミドノックイン
CD8a-hnRNP-M-EGFPはAddgene（プラスミド#86054）からのものであった45。製造者の指示書に従って、プログラムX-001でNucleofectorキットV（Lonza）を使用して、2e6個のCD8-Jurkat細胞に2μgのプラスミドをヌクレオフェクトした（Lonza）。フローサイトメトリーによって、GFP発現と抗CD8抗体およびアプタマーの結合との両方について、24時間後に細胞を解析した。
【０２８７】
マウス脾細胞の単離および染色
C57BL/6×DBA/2Jマウスをアバチンで安楽死させ、20mLのPBSで灌流して、凝固を制限した46。脾臓を採取し、ハサミで細かく切り、40μmの細胞ストレーナー（Falcon）上で分離させた。ACK溶解緩衝液（Gibco）とともにインキュベートすることによって赤血球（RBC）を除去し、抗mCD3および抗mCD8抗体ならびにアプタマーの両方で細胞を染色した。
【０２８８】
バイオレイヤー干渉法
BLI研究は、1000rpmで試料を撹拌しながら、ForteBio Octet Red96機器で25℃で行った。すべての工程に使用する試料緩衝液は、0.01％のtween-20を有する結合緩衝液から構成されていた。すべてのセンサー（参照を除く）が0.5nmの捕捉閾値に達するまで、ストレプトアビジンでコーティングされたバイオセンサーに50nMのビオチン化アプタマーをロードした。100秒間のリンスおよび緩衝液単独でのベースライン工程の後に、150nM〜5.56nMに及ぶ1:3希釈系列の組換えヒトCD8aタンパク質（Sino Biological）にセンサーを曝露した。タンパク質との結合を1200秒間モニターし、緩衝液のみの中で600秒間解離を行った。データ解析は、Octet Data Analysis 9.0ソフトウェア（ForteBio）を使用して行った。速度定数は、1:1結合モデルに対して、タンパク質希釈系列からのいくつかの処理された結合および解離曲線の全体的適合を行うことによって計算した。適合の質は、R2およびχ2値によって評価した。
【０２８９】
以前に報告されたアプタマーとの比較
Wangらによって記載されているCD8Ap17sを、配列
2021530230.tif 000017
を用いて合成した36。記載される結合緩衝液（T-BB）およびフォールディング条件に加えて、CD8Ap17sの結合緩衝液（A-BB）およびフォールディング条件も使用したことを除いて、CD8+T細胞への結合をA3tアプタマー（表5）と比較した。CD8Ap17sの条件については、それらの洗浄緩衝液（40mM HEPES、150mM NaCl、5mM KCl、1mM MgCl2、1mM CaCl2、pH7.5）における95℃で5分間の変性および37℃への冷却によって、1μMの各アプタマーをフォールドさせた。結合は、上で詳しく述べる通りであるが、5％FBSが補充された洗浄緩衝液から構成されるCD8Ap17s結合緩衝液中で、同様に行い、解析した。
【０２９０】
拮抗薬の最適化
アプタマーA3tの3’末端に相補的な36bpの拮抗薬を設計した（表5）。上述したように、二次蛍光ストレプトアビジン標識を用いて、5nMアプタマーA3tでのCD8+T細胞への結合を最初に行った。次いで、標識された細胞を1％（重量／体積）BSAを有する洗浄緩衝液中の様々な倍数過剰（使用するアプタマーの量を超える）の200μLの拮抗薬とともに、様々な時間および温度にわたってインキュベートした。細胞は、洗浄緩衝液1％（重量／体積）BSAで2回洗浄して溶出されたアプタマーを除去し、固定し、およびフローサイトメトリーによって解析した。
【０２９１】
PBMCからのCD8+T細胞のトレースのない選択
各PBMCドナーについて、抗ビオチンミクロビーズ（Miltenyi）の2つの100μLアリコートを5nMのアプタマーA3tを有する結合緩衝液中で500μLにそれぞれ希釈し、穏やかな回転下で4℃で15分間インキュベートした。この工程の間、結合緩衝液中のtRNAは重要であり、これは、細胞の有効な下流溶出のために拮抗薬の非特異的結合をブロックするのにtRNAが必要とされるからである（データ非表示）。次いで、アプタマー標識されたビーズ懸濁液を組み合わせ、200×106個の新しく単離されたPBMCに加え、穏やかな回転下で15分間4℃でさらにインキュベートした。並行して、製造者の指示書に従って、抗体ベースのCD8ミクロビーズ（Miltenyi）400μLを、0.5％（重量／体積）BSAが補充されたautoMACS Rinsing Solution（Miltenyi）中で2mLに希釈し、これを、同じドナー由来の別の200e6個のPBMCに加え、同じ時間にわたってインキュベートした。0.5％（重量／体積）BSAを有する10mLのautoMACS緩衝液で、すべての細胞を洗浄して、過剰なビーズを除去し、0.5％（重量／体積）BSAを有するautoMACS緩衝液中に再懸濁し、製造者の指示書に従ってQuadroMACS分離器（Miltenyi）のLSカラムにアプライした。トレースのない選択プロトコールが、100×106個のPBMCで最適化されたので（データ非表示）、アプタマー機能化ミクロビーズで標識された200×106個のPBMCを2つのLSカラムに分割し、一方で、CD8ミクロビーズで標識されたPBMCは1つのLSカラムで流した。各単離方法について、細胞の最初のアプライおよび引き続く3回の3mLカラム洗浄からのフロースルーを含むフロースルー（FT）画分を収集した。5mLのカラムフラッシュ（CF）を使用して、磁石から除去された場合に、CD8ミクロビーズ標識細胞をカラムから除去したが、0.5％（重量／体積）BSAおよび5mM MgCl2を有するautoMACS緩衝液中の1mLの500nM拮抗薬（100倍過剰）を、アプタマー機能化ミクロビーズで標識された細胞を含む、磁石上のカラムにアプライした。おおよそ600〜700μLの拮抗薬溶液をカラムを通過させてから、室温で10分間のインキュベーションのために、M/F Luer Lock Plug（Smiths Medical）でこれに栓をした。栓を除去すると、0.5％（重量／体積）BSAおよび5mM EDTAを有する3mLのautoMACS緩衝液でカラムを3回洗浄し、これは、拮抗薬溶出（RAE）画分を構成した。RAE細胞を直ちにスピンダウンし、新しい緩衝液中に再懸濁して、いかなる拮抗薬も除去した。製造者の指示書に従って、カラム上の残存細胞をカラムフラッシュ（CF）で取り出した。
【０２９２】
すべての画分は、以下の2つの抗体パネルを用いるフローサイトメトリーによって計数し、解析した：(i)CD3、CD8、およびCD16の発現について染色する収率パネル、ならびに(ii)CD3、CD4、CD8、CD45RA、CD45RO、CCR7、およびCD62Lの発現について染色するフェノタイプパネル。さらに、NanoString（商標）nCounter（登録商標）解析のために、抗体で単離されたCF画分およびアプタマーで単離されたRAE画分の両方からの1e6個の細胞のペレットをドライアイスおよびエタノールで急速凍結した。下流のCAR T細胞の生成のために残存細胞を保存した。
【０２９３】
CD19 CAR T細胞の製造
各ドナーからの両方の単離方法のCD8+T細胞を解凍し、12ウェルプレートにおいて、50U/μLのrhIL-2（Miltenyi）および0.5ng/mLのrhIL-15（Miltenyi）を有する4mLの完全RPMI中で、モックとCD19 CAR T細胞生成の両方のための3.3e6個の細胞をDynabeads Human T-Activator CD3/CD28（Invitrogen）で1:1で刺激した。2日後（S1D2）、CAR T細胞生成のために指定された細胞を、32℃で800×gの30分間のスピノキュレーションを介して、40μg/mLの硫酸プロタミンとともに0.3の感染多重度（MOI）の臨床グレードのPLAT-02 CD19 CARレンチウイルス（City of Hopeから贈られた）で形質導入した。その後、2〜3日ごとに半分または全部の培地交換を行って、サイトカインを補給し、細胞濃度が1.5〜2e6細胞/mLに達すると、より大きな培養容器に細胞を移した。アクチベータービーズをS1D9と呼ばれる刺激後9日目に除去し、EGFRtレポーター発現について染色して、形質導入効率を評価した。EGFRt発現のために、製造者の指示書に従ってビオチン化Erbitux抗体および抗ビオチンミクロビーズ（Miltenyi）を使用して、刺激後12日目（S1D12）に細胞を磁気により濃縮した。刺激後14日目（S1D14）に、以下の3つの小規模の抗体パネルを用いるフローサイトメトリーによって細胞を解析した：(i)Ki-67について染色する活性化／増殖パネル、(ii)PD1、TIM3、およびLAG3について染色する消耗／活性化パネル、ならびに(iii)CD62LおよびCD45RAについて染色する分化パネル。
【０２９４】
前述47のように、2週間の急速拡大プロトコール（REP）を使用して、2週間刺激したT細胞をさらに拡大した。手短に言えば、T-25フラスコ（Corning）において、前述のサイトカイン濃度が補充された25mLの完全RPMI中で、1.5e6個のCD19 CAR T細胞を、10.5e6個の照射されたCD19+TM-LCLフィーダー細胞とともにコインキュベートした。同様に、T-25フラスコ（Corning）において、前述のサイトカイン濃度および30ng/mLのOKT3が補充された25mLの完全RPMI中で、1.5e6個のモックT細胞を、10e6個の照射されたCD19+TM-LCLフィーダー細胞および50e6個の照射されたドナー不一致PBMCフィーダー細胞とともにコインキュベートした。PBMCおよびTM-LCL細胞は、セシウム源照射器を使用して、それぞれ3500および8000radsで照射した。2週間の刺激拡大にわたって行ったように、2〜3日ごとにサイトカインを補充し（OKT3は2日目のみ交換した）、細胞濃度が1.5〜2e6細胞/mLに達すると、より大きな培養容器に細胞を移した。REP後13日目（S1R1D13）に、CD19 CAR T細胞をEGFRtレポーター発現について染色して、磁気選択およびREP後のCAR+細胞の濃縮および純度を評価した。REP後14日目（S1R1D14）に、CD45RAおよびCD62Lの発現について染色された分化パネルで細胞を再度特性評価し、下流のNanoString（商標）nCounter（登録商標）解析のために、各細胞ロットの1e6個の細胞のペレットを急速凍結した。残存細胞は機能アッセイで使用したか、または保存した。
【０２９５】
NanoString（商標）nCounter（登録商標）遺伝子プロファイリング
解凍した細胞ペレットをβ-メルカプトエタノールを有するRLT溶解バッファー中に3,500細胞/μLで再懸濁し、製造者の指示書に従って、nCounter（登録商標）免疫学パネル（ヒトV2）レポーターコードセットおよび捕捉プローブセットとの一晩のハイブリダイゼーション反応を実施した。試料をnCounter（登録商標）SPRINT Profiler（登録商標）（NanoString）で流し、ペアワイズ変動統計量を最小限にするハウスキーピング遺伝子を選択するAdvanced Analysis 2.0（登録商標）ソフトウェア（NanoString）を使用して、mRNAカウントを日および細胞タイプ（D0、S1R1D14のモック、S1R1D14のCD19 CAR）ごとに群で正規化した。各群は、6試料、抗体ベースの単離について3回の生物学的反復、およびアプタマーベースの単離について3回の生物学的反復を有する。Excel（Microsoft）を使用して、群において50％より多くの試料（すなわち4以上の試料）について25未満の正規化されたカウントを与えたmRNAプローブは、大抵バックグラウンド未満であることが理由で、解析から除去した。Excelの対応のある両側t検定を使用して、抗体で単離された細胞に対するアプタマーで単離された細胞のプローブカウントのLOG2倍数変化の未調整P値を決定し、RソフトウェアのBenjamini-Yekutieli多重検定補正を使用して、有意性に対する閾値を計算した。
【０２９６】
抗腫瘍細胞毒性アッセイ
K562+OKT3、K562+CD19、およびRaji親標的細胞を、12ウェルプレートのウェル中の4mLの完全RPMI中にそれぞれ5e6個の細胞で播種し、75μLのCr-51（Perkin Elmer）を、細胞を有する各ウェルに加えた。1日後に細胞を採取し、これを5,000細胞／ウェルで、96ウェルプレート中に100μLで播種した。100μLのS1R1D14のCD8+モックおよびCD19 CARエフェクターT細胞を、1:1〜30:1に及ぶ様々なエフェクター対標的（E:T）比で、標的細胞に加えた。細胞を有さないまたは2％SDSを有する培地も、それぞれ最小および最大溶解対照として、標的細胞を有するウェルに加えた。標的細胞とエフェクター細胞の混合物を、2分間700rpmで軽くペレットにしてから、インキュベーター中で37℃で4時間インキュベートした。次いで、50μLの上清をLUMAプレート（Perkin Elmer）中に採取し、一晩乾燥させた。TopCount NXTマイクロプレートシンチレーションおよびルミネッセンスカウンター（Perkin Elmer）によって、プレートを解析した。
【０２９７】
抗腫瘍サイトカイン放出アッセイ
K562+OKT3、K562+CD19、およびRaji親標的細胞を、50,000細胞/ウェルで96ウェルプレート中に、100μLでプレーティングした。S1R1D14のCD8+モックおよびCD19 CARエフェクターT細胞を、100μLの100,000細胞/ウェルで標的細胞に加え、24時間コインキュベートした。次いで、細胞を3分間1200rpmでペレットにし、120μLの上清を収集し、解析する準備ができるまで-80℃で凍結した。解凍した上清をFBSを有さないRPMI中で1:5または1:20に希釈し、製造者の指示書に従って、平らな磁気プレートを備えた3-plex Bio-Plexカスタムキット（Bio-Rad）を使用して、上清中のIL-2、IFNγ、およびTNFα、ならびに標準（Bio-Rad）を捕捉し、磁気ビーズ上で蛍光検出した。Bio-Plex 200システム（Bio-Rad）を使用して、捕捉されたサイトカインを有するビーズを解析した。
【０２９８】
T細胞ストレス試験のマウスモデル
8〜12週齢のNOD/SCID/IL-2Rγヌル（NSG）雌マウス（Jackson Laboratory）に、200μL PBS中の5×105個のGFP-ffluc Raji細胞を尾静脈注射によって接種し、続いて、7日後に、このマウスに、107個のS1R1D14の抗体またはアプタマーで単離されたCD8+モックまたはCD19 CAR T細胞を接種した。インビトロ研究からの同じ3ドナーを試験し、評価する4つのT細胞集団のそれぞれについて、ドナーあたり3匹のマウス（すべてのドナーにわたって各処置群で合計で9匹のマウス）を使用した。生物発光イメージングのために、PBS中の150μLのD-ルシフェリン（PerkinElmer）（マウスあたり4.29mg）をマウスに皮下注射し、中または小規模のビニングおよび30秒〜1分の取得時間を使用して、Xenogen IVISイメージングシステム（PerkinElmer）で飽和していない画像を7および10分後に取得した。光子束はLiving Imageソフトウェア（PerkinElmer）を使用して解析した。このマウス研究は、機関の動物飼育および使用委員会によって承認されたプロトコール下で行った。腫瘍接種後6日目に、事前に確立した全身的腫瘍の平均光子束がすべての群にわたっておおよそ等しくなるように、各ドナーおよび処置群についてマウスを3匹ずつのマウスの群に配置した。したがって、無作為化または盲検方法は使用しなかった。後肢の麻痺を発生したマウスは二酸化炭素によって安楽死させた。ログランク検定はPrism 7.0ソフトウェア（GraphPad）を使用して行った。
【０２９９】
統計解析
データは、平均±s.dとして表し、生物学的および技術的反復の数は図の説明文中に示す。2集団のみを比較する場合に、仮説検定に両側t検定を使用し、そうでなければ、2集団より多く比較する場合に、分散分析またはANOVAを仮説検定に使用した。対応のある仮説検定は、大きなドナー間変動性を考慮するためにしばしば実行した。多重比較を行う場合は、すべての平均をすべての他の平均または対照の平均と比較する場合に、それぞれTukey検定またはDunnett検定を使用してP値を調整したが、独立性を仮定して、選択されたセットの平均を比較する場合に、Sidak補正を使用してP値を調整した。比較が互いに独立していると仮定することができない場合、Sidak補正の代わりにBonferroni補正を使用してP値を調整した。Benjamini-Yekutieli補正は、異なる遺伝子の発現間の依存関係を上手に処理するので、NanoStringデータの解析に使用した。任意の調整後にP<0.05である場合、違いを有意とみなした。グラフ化および統計的検定は、別段の記載がない限りPrism 7.0ソフトウェア（GraphPad）を使用して行った。
【０３００】
実施例3：さらなるアプタマー特性評価
実施例1に記載されているアプタマーA1、A2、A3、A7、およびA8は、図4に示すように、代替の二次構造でも存在し得る。予測されたアプタマー拮抗薬を、図4のそれらの対応するアプタマーを用いて、異なる塩基対長についても試験した。52塩基対の一本鎖DNAライブラリーを使用して、CD8+T細胞に特異的なアプタマーを特定した。試験した拮抗薬はA1アプタマーについて40塩基対の長さ、A3アプタマーについて42塩基対、およびA8アプタマーについて37塩基対であった（図24A）。アプタマーおよび対応する拮抗薬を用いるコインキュベーション実験は、実施例2に記載されているプロトコールを使用して、アプタマーの結合の有意な低減をもたらした（図24A、下部）。さらに、アプタマーの塩基対長は、20塩基対から85塩基対までの長さのアプタマーA3に最適化することができる（図24B）。実施例1に記載されるA3アプタマーについて、さらなる二次構造を予測した。理論上のA3アプタマーを図25に示す。実施例1に記載されるアプタマーA3tについて、図26にいくつかのA3tアプタマー二次構造予測が記載されている。これらのアプタマーは、4つのグアニン（図26、中央の構造）または6つのグアニン（図26、右の構造）でアプタマーのトーホールド内のグアニンヌクレオチドの数を変動させる、トランケートされたA3t（図26、左の構造）を含む。
【０３０１】
実施例4：TCBA.1アプタマー
T細胞特異的結合に特異的なアプタマーをさらに特定するために、45ヌクレオチドssDNAライブラリーを用いるさらなるSELEXをT細胞に対して実行し、ラウンドをシークエンシングして、T細胞サブセットに選択的に結合するアプタマーを特定した（図27）。アプタマーCD3.CD28.A1は、CD3+CD28-細胞への最高レベルの結合で、PBMC中のCD3+集団への優先的結合を示す。CD3.CD28.A1アプタマーは、図28〜32において、TCBA.1（T細胞結合アプタマー）に名前が変えられた。TCBA.1の二次構造を、配列のトランケーション（TCBA.1-tr1、塩基対3〜75）および（TCBA.1-tr2、塩基対13〜54）とともに予測した（図28）。フローサイトメトリー解析によって結合定数を決定した（図28）。TCBA.1はPBMC中のCD3+集団への結合について1〜2nMの間のkDを有し、CD3+CD28-に対する最大結合がより高く、TCBA.1-tr1はより低い親和性で結合し、TCBA.1-tr2はまったく結合しない（データ非表示）。さらに、TCBA.1は、H9、Jurkat、Jurkat/CD3KO、およびJurkat/CD28KO細胞に結合しない。
【０３０２】
52塩基対のssDNAライブラリーに加えて、45ヌクレオチドのライブラリーをT細胞アプタマーを特定するために使用することもできる。45ヌクレオチドのライブラリーおよびSELEXストラテジーを使用して、アプタマーTCBA.1をさらに最適化した（図29）。予測TCBA.1二次構造は、<www.unpack.org>におけるhttpに従ってワールドワイドウェブで利用可能なUNPACKによって、本明細書に記載されるさらなるアプタマーとともに、4Cで決定した。
【０３０３】
TCBA.1の活性化および選択を決定するために、PBMCを100nMのTCBA.1-ビオチンアプタマーとともに4Cで30分間インキュベートし、続いて、これに抗ビオチン磁気ビーズを加え、これを洗浄し、磁気分離カラムにアプライした。収集した細胞をCD4、CD8、CD2の抗体染色、およびTCBA.1-FITCアプタマーの結合について解析した（図30）。TCBA.1アプタマーはCD8+細胞をプルダウンする。
【０３０４】
以前の結果に基づいて、TCBA.1に対する潜在的な受容体としてCD8を評価した（図31）。抗CD8抗体およびTCBA.1アプタマーの結合のフローサイトメトリー研究は、CD8 siRNAでの細胞のヌクレオトランスフェクションから24時間後に行った。CD8受容体の84％KDとアプタマー結合の60.4％の低減の間に正相関があった。
【０３０５】
CD8+T細胞のPBMC分離について抗CD8およびTCBA.1アプタマーを比較した（図32）。PBMCを、抗CD8-ビオチン抗体（REA734）またはTCBA.1-ビオチンおよび抗ビオチン磁気ビーズとともにインキュベートし、その後、MSカラムにアプライした。フロースルー（FT）およびプルダウン（PD）細胞を、結合CD8抗体およびTCBA.1アプタマーについて、フローサイトメトリーによって解析した。TCBA.1でプルダウンされた85％細胞がCD8陽性であることが観察された。したがって、TCBA.1とCD8の両方のプルダウン細胞は高いTCBA.1結合を示す。
【０３０６】
図33で詳しく述べるように、TCBA.1アプタマーでCD8+細胞を分離する方法を決定した。PBMCをビオチン化アプタマーで標識した。次いで、これらの細胞を磁気ストレプトアビジンビーズで標識した。標識工程の後に、無標識細胞を鎖置換で特異的に放出した。このアプローチの利点としては、分離作用物質を有する細胞の混入がないこと、および連続的選択方法が挙げられる。
【０３０７】
図34に記載されるアンチドートを用いて、アプタマーの結合を反転させるために相補DNA鎖を使用することを探究した。アンチドートの二次構造（図34）および配列（図34、上部）も図34に示す。アンチドートを加えて、または加えずに、10および25nMのTCBA.1とともにCD8+T細胞を異なる3つの温度でインキュベートした。温度が高くなるともにアプタマー結合の低減が観察された。アンチドートとのコインキュベーションは、90％まで結合を低減し、より高い温度ではさらに大きく低減する。60％までの結合の低減が37℃で達成され、これはより低い結合、より不安定なアプタマー構造の組み合わせの結果であると思われる。二次構造に対する将来の変更は、トーホールドのためのアンチドートのグリップ領域の増大さおよび様々な温度（例えば、4℃または>37℃）でのアプタマーへの結合を含むであろう。
【０３０８】
実施例5：loおよびhi CD8 T細胞の単離ならびに2種のアプタマーを用いる単離
発現勾配の関心対象のT細胞を単離するために、低および高CD8マーカーの溶出を決定した（図35）。CD8発現細胞の溶出は、拮抗薬（RA）のインキュベーションのアプタマー濃度、時間、および温度に依存する。図35のプロットは、5nMのA3tアプタマーを用いた選択の間の、37Cでの様々な拮抗薬過剰を示す。より低いCD8発現体（CD8lo）を得るために、拮抗薬の濃度を10×過剰未満にする必要がある。図35に提示する結果は、低CD8発現T細胞（CD8lo）および高CD8発現（CD8hi）T細胞の単離を可能にする。
【０３０９】
2種のアプタマーを用いた連続的溶出をどのようにして達成することができるかに関する概略図を図36に示す。ユニークなトーホールドおよび配列を有するCD4アプタマーおよびCD8アプタマーで標識されたPBMCは、CD4拮抗薬を用いた溶出によってアプタマー非結合細胞から分離され、CD4陽性T細胞のみが得られると考えられる。前の図で確認されるCD8拮抗薬を用いた連続的な溶出は、CD8陽性T細胞の分離を可能にするであろう。この細胞単離方法は、大規模で、特異的な、タグなしの、可逆的な細胞単離を可能にすることによって、前述の他のT細胞単離技法と比較していくつかの利点を有する。
【０３１０】
実施例6：Jurkat結合DNAアプタマーの特性評価
一本鎖DNAアプタマーは、その合成の容易さ、均一な活性、および比較的小さなサイズのために、様々な生物学的用途において、抗体の実行可能な代替物であり得る。総合すると、これらの特性は、より低い生成費用だけでなく、組織浸透の向上にも寄与する。本明細書では、T細胞の白血病Jurkat細胞株に優先的に結合する一本鎖DNAアプタマーを特定した。正の選択のための野生型Jurkat細胞、および対抗選択のための派生突然変異体J.RT3-T3.5細胞株（CD3、CD28、およびT細胞受容体アルファ／ベータヘテロ二量体について陰性）を使用して、サブトラクティブな細胞-SELEXアプローチを用いた。選択の8ラウンド後に、対抗選択細胞株よりもJurkat細胞への選択的結合が観察された。次世代Illuminaシークエンシングによって、すべてのラウンドにおけるアプタマープールの内容物を決定した。系統樹解析を行い、潜在的なコンセンサス結合部位を特定した。ラウンド8で最も広く認められるアプタマーは、そのJBA8.1を示し、100nMより下の結合親和性を有する。二次構造予測アルゴリズムを使用し、これは、このアプタマーの同様の結合親和性を維持するトランケートバージョンを作製した。このアプタマーは、それぞれT細胞リンパ腫およびB細胞リンパ腫に由来するH9およびRaji細胞株、ならびに活性化されたヒトT細胞にも結合する。本研究は、受容体の特定および腫瘍送達のための治療的カーゴの評価を含む。
【０３１１】
実施例7：CAR T細胞療法のための可逆的なアプタマーベースの選択によるCD8+T細胞のトレースのない単離
定められた生成物組成を利用するCAR T細胞療法の臨床試験の数の増加は、特定のT細胞サブセットの選択のための、しっかりした費用効率の高い方法の継続的な開発の必要性を強調する。細胞-SELEXの改変方法を使用して、ヒト細胞障害性T細胞マーカーCD8に優先的に結合する新しいDNAアプタマーを特定した。そうしたアプタマーのうちの1つを、アプタマーを用いたトーホールド媒介性鎖置換を受け、それによって、捕捉された細胞の無標識溶出のためにその二次構造を破壊する相補的オリゴヌクレオチド拮抗薬を用いるトレースのない細胞単離ストラテジーに適用した。このアプローチがCD8+T細胞の高い収率をもたらすこと、およびこれらの細胞から製造されたCAR T細胞が、増殖、フェノタイプ、エフェクター機能、およびインビボにおける抗腫瘍活性において、抗体で単離されたCAR T細胞に匹敵することが観察された。これらの発見は、T細胞選択のための完全合成システムに向けた重要な技術進歩を示す。
【０３１２】
参考文献
2021530230.tif 000018
2021530230.tif 000019
2021530230.tif 000020
2021530230.tif 000021
2021530230.tif 000022
【０３１３】
配列
2021530230.tif 000023
2021530230.tif 000024
2021530230.tif 000025
2021530230.tif 000026
2021530230.tif 000027
2021530230.tif 000028
2021530230.tif 000029
2021530230.tif 000030
2021530230.tif 000031
【図１】
2021530230.tif 000033
【図２】
2021530230.tif 000034
【図３】
2021530230.tif 000035
【図４−１】
2021530230.tif 000036
【図４−２】
2021530230.tif 000037
【図５】
2021530230.tif 000038
【図６Ａ】
2021530230.tif 000039
【図６Ｂ】
2021530230.tif 000040
【図６Ｃ】
2021530230.tif 000041
【図６Ｄ】
2021530230.tif 000042
【図６Ｅ】
2021530230.tif 000043
【図７】
2021530230.tif 000044
【図８Ａ】
2021530230.tif 000045
【図８Ｂ】
2021530230.tif 000046
【図９】
2021530230.tif 000047
【図１０Ａ】
2021530230.tif 000048
【図１０Ｂ】
2021530230.tif 000049
【図１１】
2021530230.tif 000050
【図１２Ａ】
2021530230.tif 000051
【図１２Ｂ】
2021530230.tif 000052
【図１３−１】
2021530230.tif 000053
【図１３−２】
2021530230.tif 000054
【図１３−３】
2021530230.tif 000055
【図１４Ａ】
2021530230.tif 000056
【図１４Ｂ】
2021530230.tif 000057
【図１５Ａ】
2021530230.tif 000058
【図１５Ｂ】
2021530230.tif 000059
【図１６Ａ】
2021530230.tif 000060
【図１６Ｂ】
2021530230.tif 000061
【図１６Ｃ】
2021530230.tif 000062
【図１６Ｄ】
2021530230.tif 000063
【図１６Ｅ】
2021530230.tif 000064
【図１６Ｆ】
2021530230.tif 000065
【図１６Ｇ】
2021530230.tif 000066
【図１６Ｈ】
2021530230.tif 000067
【図１７】
2021530230.tif 000068
【図１８】
2021530230.tif 000069
【図１９】
2021530230.tif 000070
【図２０−１】
2021530230.tif 000071
【図２０−２】
2021530230.tif 000072
【図２１】
2021530230.tif 000073
【図２２】
2021530230.tif 000074
【図２３Ａ】
2021530230.tif 000075
【図２３Ｂ】
2021530230.tif 000076
【図２４Ａ】
2021530230.tif 000077
【図２４Ｂ−１】
2021530230.tif 000078
【図２４Ｂ−２】
2021530230.tif 000079
【図２５】
2021530230.tif 000080
【図２６−１】
2021530230.tif 000081
【図２６−２】
2021530230.tif 000082
【図２７】
2021530230.tif 000083
【図２８−１】
2021530230.tif 000084
【図２８−２】
2021530230.tif 000085
【図２９】
2021530230.tif 000086
【図３０】
2021530230.tif 000087
【図３１】
2021530230.tif 000088
【図３２】
2021530230.tif 000089
【図３３】
2021530230.tif 000090
【図３４−１】
2021530230.tif 000091
【図３４−２】
2021530230.tif 000092
【図３５】
2021530230.tif 000093
【図３６】
2021530230.tif 000094
【配列表】
2021530230000001.app
【国際調査報告】
2021530230.tif 000095
2021530230.tif 000096
2021530230.tif 000097