(57)【要約】粒子を含む試料を特徴づける方法および装置（１００、２００、３００）が開示される。方法は、第１粒子特性評価技術を用いて、試料について第１測定を実施することと、第１粒子特性評価技術から粒子分離装置に試料を流すことと、粒子分離装置により試料を分離することと、分離された試料について第２測定を実施することと、を含む。装置（１００、２００、３００）は、方法を実施するように構成され、第１粒子特性評価技術（１０４、１０５、１０６）に従って測定を実施する測定システムと、粒子を含む試料を分離する粒子分離装置（１０２）と、を含む。【選択図】図３
2021505899.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子を含む試料の特徴を評価する方法であって、
第１粒子特性評価技術を用いて、試料について第１測定を実施することと、
前記第１粒子特性評価技術から粒子分離装置へ前記試料を流すことと、
前記粒子分離装置により前記試料を分離することと、
前記分離された試料について第２測定を実施することと、
前記第１測定と前記第２測定を比較して、前記試料の粒子全てが前記分離装置を通過したかを判断することと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記粒子分離装置はクロマトグラフィーカラムを含み、任意で、該クロマトグラフィーカラムはサイズ排除クロマトグラフィーカラムである、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料の粒子特性分布を決定することを更に含み、任意で、該粒子特性は、粒子質量又は粒径である、
請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記分離装置から前記第１粒子特性評価技術に前記試料を戻すように流すことを更に含む、
請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記第２測定を実施することは、前記第１粒子特性評価技術を用いて前記試料について前記第２測定を実施することを含む、
先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記粒子分離装置で前記試料を分離する前、及び／又は、後に、前記試料について追加の測定を実施することを更に含む、
先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記追加の測定を実施することは、前記第１粒子特性評価技術を用いて前記試料について追加の測定を実施すること、又は、第２粒子特性評価技術を用いて前記試料について追加の測定を実施すること、を含み、該第２粒子特性評価技術は前記第１粒子特性評価技術とは異なる、
請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記第１測定と前記第２測定とを比較することは、
前記第２測定が前記第１測定と一致するかを判断することと、
前記第２測定が前記第１測定と一致する場合には、前記試料の粒子全てが前記分離装置を通過したと判断することと、
前記第２測定が前記第１測定と一致しない場合には、前記試料の粒子全てが前記分離装置を通過したわけではないと判断することと、を含む、
先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記第１粒子特性評価技術から前記粒子分離装置に前記試料を流すことは、前記第１粒子特性評価技術から前記粒子分離装置に前記試料を方向付けるように、弁を操作することを含む、
先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１粒子特性評価技術及び／又は第２粒子特性評価技術は、１つ以上のアンサンブル粒子特性評価技術を含む、
先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記１つ以上のアンサンブル粒子特性評価技術は、ＵＶ分光、動的光散乱、静的光散乱、テイラー分散分析、及びＵＶ測光を含むグループから選定される、
請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
第１粒子特性評価技術に従って測定を実施する測定システムと、
粒子を含む試料を分離する粒子分離装置と、
を含む粒子特性評価プラットフォームであって、
前記粒子特性評価プラットフォームは、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法を実施するように構成される、
粒子特性評価プラットフォーム。
【請求項１３】
前記粒子分離装置は、クロマトグラフィーカラムを含み、任意で、該クロマトグラフィーカラムは、サイズ排除クロマトグラフィーカラムである、
請求項１２に記載の粒子特性評価プラットフォーム。
【請求項１４】
前記測定システムは、第２粒子特性評価技術に従って測定を実施するように更に構成される、
請求項１２又は１３に記載の粒子特性評価プラットフォーム。
【請求項１５】
前記粒子特性評価プラットフォームは、前記第１測定を実施するために前記測定システムに試料を流し、その後、前記試料を分離するために前記粒子分離装置に前記試料を流し、そしてその後、前記第２測定を実施するために前記測定システムに前記試料を戻すように流すように構成される、
請求項１２から１４のいずれか一項に記載の粒子特性評価プラットフォーム。
【請求項１６】
前記測定システムは第１測定システムであり、前記粒子特性装置は第２測定システムを含み、前記粒子特性評価プラットフォームは、試料を、前記第１測定を実施するために前記第１測定システムに流し、その後、前記試料を分離するために前記粒子分離装置に前記試料を流し、そしてその後、前記第２測定を実施するために前記第２測定システムに前記試料を流すように構成される、
請求項１２から１４のいずれか一項に記載の粒子特性評価プラットフォーム。
【請求項１７】
前記第１測定は、ＵＶ測光と光散乱を含む、
請求項１２から１６のいずれか一項に記載の粒子特性評価プラットフォーム。
【請求項１８】
前記第２測定は、ＵＶ測光と光散乱を含む、
請求項１２から１７のいずれか一項に記載の粒子特性評価プラットフォーム。
【請求項１９】
前記装置は、
ｉ）対象の粒子の相対分子量の大きさに応じたモノマー、
ｉｉ）前記モノマーよりも小さい粒径又は分子量を持つ粒子、
ｉｉｉ）モノマーのオリゴマー、又は、モノマーより大きい粒径又は分子量を持ち、前記第２測定から排除される粒径又は分子量までの粒子、及び
ｉｖ）第２測定から排除される粒子を含む大きな凝集体、
のカテゴリにおいて、前記試料の比率の定量分析を提供するように構成される、
請求項１２から１８のいずれか一項に記載の粒子特性評価プラットフォーム。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、粒子特性を決定する方法と装置に関する。
［背景技術］
新規のバイオ医薬品は、凝集プロファイリングを用いて一般的に分析される。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、粒径又は質量に基づいて試料を分離するのによく用いられる。しかし、ＳＥＣカラムからの試料は、その試料を正しく表現しないことがある。比較的大きな粒子又は粒子の凝集体は、ＳＥＣカラムの通過を阻止されることがあり、その場合、粒径／質量分布分析から抜け落ちることとなる。この問題を是正するために、ＳＥＣ測定は、他の方法、一般的には分析用超遠心（ＡＵＣ）よって検証されなければならないであろう。ＡＵＣは、難しく、高額であり、且つ、時間のかかる技術である。
【０００２】
粒子の凝集特性の調査には、広範囲に渡る粒径の調査が要求され得る。従来、広い範囲に渡る粒径のカバレッジを提供するために、異なる測定モダリティを持つ様々な装置を用いて、複数の分析が実施されてきている。
［発明の概要］
本発明の第一の局面において、粒子を含む試料の特徴を評価する方法が提供される。この方法は、第１粒子特性評価技術を用いて試料について第１測定を実施することと、第１粒子特性評価技術から粒子分離装置に試料を流すことと、粒子分離装置により試料を分離することと、分離された試料について第２測定を実施することと、を含む。
【０００３】
試料を粒子分離装置にて分離する前に第１測定技術を用いて第１測定を実施することにより、粒子分離装置を通過する実際の試料の真の試料組成を表すことができる。これは、分離中に何らかの試料が失われるかを、例えば、比較的大きな粒子が粒子分離装置を通過することが阻まれるかを、判断するために用いられ得る。例えば、第１測定は、試料の何らかの粒子が失われているかを判断するために、第２測定、及び／又は追加の測定と比較され得る。例えば、第１測定から決定される粒径又は粒子質量分布は、第２測定又は追加の測定から決定された粒径又は粒子質量分布と比較され得る。
【０００４】
試料の真の表現が粒子分離装置により分離されているかを判断することにより、ＡＵＣなどの高価な検証技術の必要性が回避され得る。
【０００５】
第２測定は、粒子分離装置そのものにより実施されてもよい。例えば、粒子分離装置は、分離された試料を測定する試料測定装置を含んでもよい。代替的に又は追加的に、第２測定は、粒子分離装置からの試料出力を測定するように構成される分離装置により実施されてもよい。
【０００６】
第２測定は、時間の関数として分離された試料の特性を決定してもよく、例えば、分離された試料内の粒子の粒子特性の径時的な変化を示すことができる。粒子分離装置により、粒子は、粒子特性に基づき時間的に分離され得る（例えば、異なる粒径又は吸着剤に対する異なる吸着相互作用度合いを持つ粒子は、溶出時間が異なるようになる）。第２測定は、第１粒子特性評価技術又は代替の粒子特性評価技術を用いてもよい。第２測定は、第１測定用に使用されるものと同じ装置を用いてもよい。
【０００７】
第１粒子特性評価技術へ、又は、そこから試料を流すことへの言及は、第１粒子特性評価技術による測定が実施され得る場所へ、又は、そこから試料を流すことを意味すると、解釈されるものとする。
【０００８】
第１粒子特性評価技術を用いて第１測定を実施することは、複数の第１測定を実施することを含み得て、複数の第１測定のそれぞれは、各粒子特性評価技術を用いて実施され得る。
【０００９】
粒子分離装置は、分画装置であってもよい。粒子分離装置は、例えばサイズ排除クロマトグラフィーカラムのようなクロマトグラフィーカラムを含んでもよい。粒子分離装置は、次のような、試料混合物を１つ以上の個別の集団に分離するのに使用され得る他の技術を実施してもよい。
【００１０】
−サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、ゲル浸透クロマトグラフィー又はゲルろ過クロマトグラフィー）、
−フィールドフローフラクショネーション、及び非対称流フィールドフローフラクショネーション（ＡＦ４）などの関連する変形、
−アフィニティ（親和性）、イオン交換、疎水性相互作用、モノリシック、マイクロピラーアレーカラムを含む、他の液体クロマトグラフィーカラム（分析及び分取の両方）、
−ハイドロダイナミッククロマトグラフィ、
−決定論的横置換（ＤＬＤ）装置、
−シリカなど充填ビーズベッド、及び
−１つ以上の粒径カットフィルタを使うことを含むフィルタ。
【００１１】
第２測定は、例えば、ＵＶ光測定など、光度測定であってもよく、又は光度測定を含んでもよい。
【００１２】
本方法は、例えば粒子質量分布や粒径分布など、試料の粒子特性分布を決定することを更に含んでもよい。
【００１３】
いくつかの実施形態において、本方法は、分離装置から第１粒子特性評価技術に試料を戻すように流すことを更に含んでもよい。第１粒子特性評価技術を使う他の測定がその後実施されることで、何らかの粒子が失われたかが判断可能となってもよい。本他の測定は、試料全体についてのアンサンブル測定であってよく、又は、分離された試料についての時間依存測定であってもよい。
【００１４】
いくつかの実施形態は、粒子分離装置を用いて試料を分離する前、及び／又は、分離した後に、試料について追加の測定を実施することを含んでもよい。追加の測定の実施は、例えば、上述したように、試料を粒子分離装置から第１測定技術に流すことにより、第１粒子特性評価技術を用いて試料について追加の測定を実施することを含んでもよい。代替的に又は追加的に、試料について追加の測定を実施することは、第１粒子特性評価技術とは異なる第２粒子特性評価技術を用いて試料について追加の測定を実施することを含んでもよい。
【００１５】
本方法は、試料の粒子全てが分離装置を通過したかを判断するために、第１測定と第２測定を比較することを更に含んでもよい。一実施形態において、第１測定と第２測定との比較は、第２測定が第１測定と一致するかを判断することを含む。第２測定が第１測定と一致する場合、試料の粒子全てが分離装置を通過したと判断される。第２測定が第１測定と一致しない場合、試料の粒子全てが分離装置を通過したわけではないと判断される。
【００１６】
いくつかの実施形態において、本方法は、試料の粒子全てが分離装置を通過したかを判断するために、第１測定と追加の測定とを比較することを更に含んでもよい。特に、第１測定と追加の測定との比較は、追加の測定が第１測定と一致するかを判断することを含んでもよい。追加の測定が第１測定と一致する場合、本方法は、試料の粒子全てが分離装置を通過したと判断することを含んでもよい。追加の測定が第１測定と一致しない場合、本方法は、試料の粒子全てが分離装置を通過したわけではないと判断することを含んでもよい。
【００１７】
いくつかの実施形態において、第２測定及び／又は追加の測定が第１測定と一致するかを判断することは、第２測定及び／又は追加の測定から抽出された粒径が第１測定から抽出された粒径と一致するかを判断すること含む。粒径は平均粒径であってもよい。粒径は平均流体力学的半径であってもよい。
【００１８】
代替的に又は追加的に、第２測定及び／又は追加の測定が第１測定と一致するかを判断することは、第２測定及び／又は追加の測定から抽出された粒子濃度が第１測定から抽出された粒子濃度と一致するかを判断すること含んでもよい。更に他の実施形態において、第２測定及び／又は追加の測定が第１測定と一致するかを判断することは、第２測定及び／又は追加の測定から抽出された粒径分布が第１測定から抽出された粒径分布と一致するかを判断すること含んでもよい。
【００１９】
粒径分布の抽出は、非負最小二乗（ＮＮＬＳ）フィットを実施することを含んでもよい。
【００２０】
いくつかの実施形態において、第１粒子特性評価技術から粒子分離装置に試料を流すことは、第１粒子特性評価技術から粒子分離装置に試料を方向付けるための１つの弁（又は複数の弁）を操作することを含んでもよい。例えば、第１粒子特性評価技術から粒子分離装置に試料を流すことは、第１粒子特性評価技術の出力を粒子分離装置の入力に接続するために弁を操作することを含んでもよい。弁は、レオダイン切換弁であってもよい。
【００２１】
試料が粒子分離装置から第１粒子特性評価技術に戻るように流される実施形態において、粒子分離装置から第１粒子特性評価技術に試料を流すことは、粒子分離装置から第１粒子特性評価技術に試料を方向付けるために弁を操作することを含んでもよく、また、粒子分離装置の出力を第１粒子特性評価技術の入力に接続するために弁を操作することを含んでもよい。
【００２２】
いくつかの実施形態において、第１粒子特性評価技術及び／又は第２粒子特性評価技術は、アンサンブル粒子特性評価技術である。粒子特性評価技術は、ＵＶ分光、動的光散乱、静的光散乱、テイラー分散分析、及びＵＶ測光を含むグループから選択されてもよい。
【００２３】
粒子特性評価技術がテイラー分散分析（ＴＤＡ）である、又は、それを含む場合、粒子特性評価測定の出力は、濃度分布（テイラーグラム）であり、又は、それを含む。
【００２４】
第２測定及び／又は追加の測定が第１測定と一致するかを判断することは、１つ以上のパラメトリックモデル関数を用いてテイラーグラムをフィッティングして粒径を抽出することを含んでもよい。１つ以上のパラメトリックモデルは、時間依存のガウス関数であってもよく、又は、それを含んでもよい。
【００２５】
代替的に又は追加的に、第２測定及び／又は追加の測定が第１測定と一致するかを判断することは、１つ以上のパラメトリックモデル関数を用いてテイラーグラムにＮＮＬＳフィッティングを実施して粒径分布を抽出することを含んでもよい。１つ以上のパラメトリックモデルは、時間依存のガウス関数であってもよく、又は、それを含んでもよい。
【００２６】
本方法は、第１測定からの結果、及び／又は、第２測定からの結果に１つ以上のパラメトリックモデル関数をフィッティングすることを含んでもよい。パラメトリックモデル関数は、時間依存のガウス関数を含んでもよい。
【００２７】
本方法は、以下のカテゴリにおいて試料の比率の定量分析を実施することを含んでもよい。
【００２８】
ｉ）対象の粒子の相対分子量の大きさに対応するモノマー、
ｉｉ）モノマーより小さい粒径又は分子量を持つ粒子（このカテゴリはＬＭＷとして言及されてもよい）、
ｉｉｉ）モノマーのオリゴマー、又は、モノマーより大きい粒径又は分子量を持つ粒子であり、第２測定から排除される粒径又は分子量未満である（このカテゴリはＨＭＷ又は凝集体として言及されてもよい）、
ｉｖ）大きな凝集体であり、第２測定から排除されるのに十分な大きさを有する粒子を含む（このカテゴリはＶＨＭＷとして言及されてもよい）。
【００２９】
本発明の第二局面において、第１粒子特性評価技術に従って測定を実施するための測定システムと、粒子を含む試料を分離するための粒子分離装置とを含む、粒子特性評価プラットフォームが提供される。粒子特性評価プラットフォームは、第一の局面の任意の実施形態の方法を実施するように構成される。
【００３０】
いくつかの実施形態において、粒子分離装置は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーカラムなど、クロマトグラフィーカラムを含んでもよい。
【００３１】
いくつかの実施形態において、測定システムは、第２粒子特性評価技術に従って測定を実施するように更に構成されてもよい。
【００３２】
粒子特性評価プラットフォームは、第１測定を実施するために測定システムに試料を流し、その後、試料を分離するために粒子分離装置に試料を流し、そしてその後、第２測定を実施するために測定システムに戻すように試料を流すように構成されてもよい。 
【００３３】
測定システムは第１測定システムであってよく、粒子特性装置は、第２測定システムを含んでもよい。粒子特性評価プラットフォームは、第１測定を実施するために第１測定システムに試料を流し、その後、試料を分離するために粒子分離装置に試料を流し、そしてその後、第２測定を実施するために第２測定システムに試料を流すように構成されてもよい。 
【００３４】
第１測定はＵＶ測光と静的光散乱とを含んでもよい。第２測定は、ＵＶ測光と静的光散乱とを含んでもよい。
【００３５】
本装置は、以下のカテゴリにおいて試料の比率の定量分析を実施するように構成されてもよい。 
【００３６】
ｉ）対象の粒子の相対分子量の大きさに対応するモノマー、
ｉｉ）モノマーより小さい粒径又は分子量を持つ粒子（このカテゴリはＬＭＷとして言及されてもよい）、
ｉｉｉ）モノマーのオリゴマー、又は、モノマーより大きい粒径又は分子量を持つ粒子であり、第２測定から排除される粒径又は分子量未満である（このカテゴリはＨＭＷ又は凝集体として言及されてもよい）、
ｉｖ）より大きな凝集体であり、第２測定から排除されるのに十分な大きさを有する粒子を含む（このカテゴリはＶＨＭＷとして言及されてもよい）。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
本発明は、例示により、添付の図面を参照して、更に詳細に以下に記載される。
【図１】複数の測定方法に適用可能な粒径範囲を図示する。
【図２】粒子特性評価プラットフォームの模式図である。
【図３】代替の粒子特性評価プラットフォームの模式図である。
【図４ａ】更に代替の粒子特性評価プラットフォームでの切換弁の動作を図示する。
【図４ｂ】更に代替の粒子特性評価プラットフォームでの切換弁の動作を図示する。
【図５】一般的な試料の粒径分布を図示する。
【図６】テイラー分散測定を図示する。
【図７】ＳＥＣとテイラー分散分析を組み合わせる粒子特性評価プラットフォームの模式図である。
【図８ａ】第１試験試料の粒子分離前及び後に取得されたシミュレートテイラー分散測定をそれぞれ示す。
【図８ｂ】第１試験試料の粒子分離前及び後に取得されたシミュレートテイラー分散測定をそれぞれ示す。
【図９ａ】第２試験試料の粒子分離前及び後に取得されたシミュレートテイラー分散測定をそれぞれ示す。
【図９ｂ】第２試験試料の粒子分離前及び後に取得されたシミュレートテイラー分散測定をそれぞれ示す。
【図１０ａ】第３試験試料の粒子分離前及び後に取得されたシミュレートテイラー分散測定をそれぞれ示す。
【図１０ｂ】第３試験試料の粒子分離前及び後に取得されたシミュレートテイラー分散測定をそれぞれ示す。
【図１１ａ】図８ａのシミュレーションデータから取得された粒径分布を示す。
【図１１ｂ】図８ｂのシミュレーションデータから取得された粒径分布を示す。
【図１２ａ】図９ａのシミュレーションデータから取得された粒径分布を示す。
【図１２ｂ】図９ｂのシミュレーションデータから取得された粒径分布を示す。
【図１３ａ】図１０ａのシミュレーションデータから取得された粒径分布を示す。
【図１３ｂ】図１０ｂのシミュレーションデータから取得された粒径分布を示す。
【図１４】一実施形態によるプラットフォームの模式図である。
【図１５】第１及び第２測定から生成された組み合わせ測定の一例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
［発明の詳細な説明］
凝集研究は、非常に小さい場合があるモノマーフラグメント（モノマー断片）と、非常に大きな凝集粒子を含む凝集粒子と、の両方を考慮する必要がある。タンパク質モノマーは直径が数ナノメーターであり得て、タンパク質フラグメントはそれよりも小さい。凝集体は、１００ミクロン（又はそれ以上に大きい）程の大きさの目に見える粒子を形成し得る。図１に示されるように、凝集研究用の範囲の小さい側の端の粒子を調査するには、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ（粒径排除／高性能液体クロマトグラフィー）を用いることができる。しかし、より大きな凝集体を調査するには、マイクロフローデジタルイメージングや光散乱（動的又は静的）など代替の測定方法が必要とされる。
【００３９】
よって、凝集を調査する従来のワークフローには複数の装置が含まれ、様々な異なる測定を実施するこれら装置に試料の異なる部分が提供される。例えば、ＳＥＣ−ＨＰＬＣは、タンパク質フラグメント、モノマー、及びタンパク質オリゴマーを調査するのに使用され得る。ＤＬＳなどの光散乱技法は、調査される粒子のサイズを拡張してより大きな粒子を含むようにするために使用され得る。イメージング技法は、非常に大きな粒子を調査するのに使用され得る。
【００４０】
このように複数の測定方法を使用することは時間がかかる。試料の準備は、装置ごとに別々に実施されなければならず、各測定の累積稼働時間が大きくなり、結果、この種の調査の処理能力（スループット）を制限し得る。更に、異なる測定方法からの結果は、複数の調査結果を集約して提供するために、しばしば手動で、処理、組み合わせ、及び合成されなければならない。異なるタイプの分析が試料の異なる部分に実施され、結果、整合性に欠け、比較的大量の試料を消費することとなる。本開示の実施形態は、これら問題の少なくとも幾つかに対応し得る。
【００４１】
図２は、本開示による粒子特性評価プラットフォーム１００の模式図を示す。プラットフォーム１００は、それぞれ第１粒子特性評価技術を実施するように構成される複数の第１測定システム１０１と、粒子分離装置１０２とを含む。配管等の連結により、試料は、複数の第１測定システム１０１のそれぞれの間で流れることが可能となり、その後、粒子分離装置１０２に流れることが可能となる。
【００４２】
この図示された例において、複数の第１測定システム１０１は、試料についてＤＬＳ測定を実施する動的光散乱（ＤＬＳ）システム１０４と、試料についてＴＤＡ測定を実施するテイラー分散分析（ＴＤＡ）システム１０５と、試料についてＵＶ分光測定（例えば、１つ以上の波長でのＵＶ吸収）を実施する紫外線（ＵＶ）光度計１０６と、を含む。いくつかの実施形態では、複数の異なる測定システムではなく、単一の第１測定システム（例えば、これら上述したものの１つ）があってもよい。
【００４３】
使用において、試料は、入力１０３から、この例ではＤＬＳシステム１０４である第１測定システムに流れる。試料は、ポンプ（図２で図示せず）により入力１０３に圧送されてもよい。ポンプは、試料をプラットフォーム１００全体に流すのに十分な圧力を提供し得るものでもよい。ＤＬＳシステム１０４は、試料についてＤＬＳ測定を実施する。試料内の粒子の粒径分布に関する情報、従って、試料内の粒子の任意の凝集に関する情報は、ＤＬＳ測定から決定され得る。
【００４４】
試料は、その後、試料についてＴＤＡ測定を実施するＴＤＡシステム１０５に流される。粒径、分散特性、異なる構成要素の相対濃度、及び凝集（特に、試料内の任意の比較的大きい凝集体の）の少なくとも１つに関する情報が、ＴＤＡ測定から決定され得る。
【００４５】
試料は、その後、例えば２８０ｎｍで試料についてＵＶ光測定を実施するＵＶ光度計１０６に流される。例えば、試料の全粒子／タンパク質濃度に関する情報は、ＵＶ測定から決定され得る。
【００４６】
ＵＶ測定に引き続き、第１測定システム１０１により測定された試料全体は、粒子分離装置１０２に提供される。粒子分離装置１０２は、粒径など粒子特性に基づいて試料を分離する。例えば、比較的大きな粒子は、比較的小さい粒子とは異なる速度（例えば、より速い速度）で粒子分離装置１０２を通過し得る。よって、粒子が分離装置１０２から溶出する時間は、そのサイズによって決定され得る。粒子分離装置１０２は、ＵＶ光度計などの試料測定装置を更に含み、溶出する粒子の濃度の指標を時間の関数として提供する。このことから、試料内の異なる粒子径の相対的な比率が決定され得て、例えば、試料内のモノマー、二量体、三量体、及びより大きな凝集体の量を確認できる（濃度−時間曲線の各ピークの面積に対応する濃度と、粒径に対応する各ピークの溶出時間により）。
【００４７】
図示された例において、粒子分離装置１０２は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラムを含む。試料内のある粒子は、ＳＥＣカラムを全く通過できない程に大きい場合がある。このように、分離された試料について実施される凝集測定（従来のシステムのように溶出後）は、ＳＥＣカラムに捕捉されてしまっているであろう、より大きな凝集体の存在を示さないことがある。
【００４８】
しかし、本発明では、粒子分離装置１０２（例えば、ＳＥＣ装置）からの測定は、独立して行われない。第１測定システム１０１から得た第１測定は、粒子分離装置１０２に流される試料と全く同じ試料の粒子分布についての情報を提供する（そして、その測定は、例えば、５分未満の遅れという最少の時間遅延で順次実施される）。粒子分離装置１０２を通過しなかった任意の凝集体は、第１測定で確認され得るが、分離された試料の測定では確認されないであろう。このように、第１測定を分離された試料の測定と比較することにより、試料内の構成要素が失われているか又は維持されているかが判断され、結果、正しい試料の組成を確認できる。
【００４９】
図示された例において、粒子分離装置１０２を通過した後、試料は、任意の追加測定システム１０７に流される。追加測定システム１０７は、試料について追加の測定を実施する。その後、追加の測定は第１測定の１つ以上と比較されることで、試料全体が粒子分離装置１０２を通過したかを確認してもよい。特に、追加測定システム１０７は、第１測定システム１０１の１つ（又はそれ以上）と同じ粒子特定評価技術を用いてもよく、それによって、追加の測定を対応する第１測定と直接比較することが可能となる。例えば、追加測定システム１０７は、ＵＶ光度計１０６と類似の（同様に構成された）ＵＶ光度計であってもよい。ＵＶ光度計は、試料内の全タンパク質濃度を示してもよい。特にタンパク質（又はその凝集体）の中には、粒子分離装置１０２を通過できない程に大きいものもある。その場合、追加のＵＶ光測定は、第１ＵＶ光測定と比較されることで、粒子分離装置１０２によるタンパク質の喪失（又は、測定プラットフォーム１００内での維持）の迅速な判断を可能とし得る。
【００５０】
追加の測定が実施された後、試料は、プラットフォーム出力１０８に流され、収集又は廃棄され得る。
【００５１】
図２に図示されるプラットフォーム１００において、追加測定システム１０７は、第１測定システム１０１とは別の測定システムである。しかし、代替の実施形態において、追加の測定は、第１測定システム１０１の１つによって実施されてもよい。図３は、そのようなプラットフォーム２００のそのような一例を示す。
【００５２】
プラットフォーム２００は、第１測定システム２０１と粒子分離装置２０２とを含み、これらは、プラットフォーム１００に関連して上述された対応する特徴と類似している。試料は、プラットフォーム入力２０３から、それぞれ第１測定を実施する第１測定システム２０４〜２０６のそれぞれをとおって、その後、粒子分離装置２０２に流される。プラットフォーム１００とは対照的に、プラットフォーム２００では、試料は、粒子分離装置から複数の第１測定システム２０１の１つ（又はそれ以上）に戻るように流される。この一例において、試料は、ＵＶ光度計２０６に戻るように流されるが、測定システムのいずれの組み合わせに戻るように流されてもよい。ＵＶ光度計２０６は、分離された試料について追加の測定を実施し、試料は、その後、プラットフォーム出口２０８に流される。ＵＶ光度計２０６によって実施された第１測定は、ＵＶ光度計２０６によって実施された追加の測定と直接比較され、粒子又は粒子凝集体が試料から消失しているかを判断してもよい。
【００５３】
プラットフォーム１００、２００を通した試料の流れは、弁によって制御されてもよい。例えば、測定中にプラットフォーム１００、２００の特定のシステム又は装置内で試料を維持し、且つ、測定それぞれが実施されたときに試料を放出するために、少なくとも１つのバルブを使用してもよい。この少なくとも１つの弁は、手動又は自動で操作されてよい。
【００５４】
図４Ａ及び４Ｂは、レオダイン切換弁３０３を含むプラットフォーム３００を図示する。レオダイン切換弁３０３は、プラットフォーム３００を通した試料の流れを制御する。図４Ａは第１構成の切換弁を示し、図４Ｂは第２構成の切換弁を示す。
【００５５】
切換弁は、最初、第１構成に位置する。試料は、インジェクタ３０１によってプラットフォームに注入され、ポンプ３０２によりプラットフォームを回って圧送される。試料は、インジェクタ３０１から切換弁３０３の連結部１にチューブを介して流れ、この連結部１は、第１構成の連結部６に連通している。試料は、連結部６から第１測定システム３０４、３０５に流れる。図示された一例において、第１測定システム３０４、３０５は、ＵＶ光度計３０４と光散乱システム３０５、又は、ＵＶ光度計３０４とテイラー分散分析システム３０５（毛細管ループを含む）含んでもよい。光散乱システム３０５は、試料が光散乱システム３０５を通過するときに、試料について動的又は静的光散乱測定を実施してもよい。第１測定システム３０４、３０５は、プラットフォーム１００に関連して上述されたものと類似の第１測定を試料について実施する。
【００５６】
試料は、その後、切換弁３０３の連結部３に流れ、この連結部３は、第１構成の連結部２に連通している。その後、試料は、粒子分離装置３０６に流れる。粒子分離装置３０６は、ＳＥＣ装置であってもよく、プラットフォーム１００に関連して上述されるように試料を分離且つ測定する。
【００５７】
試料が粒子分離装置３０６から溶出する前に、切換弁３０３は、図４Ｂに示されるその第２構成に移される。試料は、粒子分離装置３０６から切換弁３０３の連結部５に流れる。この連結部５は、第２構成の連結部６と連通している。この連通により、試料は、第１測定システム３０４、３０５に戻され、ここで、試料について追加の測定が実施される。これら追加の測定は、上述したように、比較的大きな粒子が試料から失われているかを判断するのに用いられてもよい。試料は、第１測定システム３０４、３０４から切換弁３０３の連結部３に流され、そこから、切換弁３０３の連結部４を介してプラットフォーム出口３０７に流される。
【００５８】
上述した例において、第１測定システムは、２つ又は３つの別個のシステムを有した。代替の実施形態において、任意の数の第１測定システムを用いてもよく、特に、唯一の第１測定システムを用いてもよい。このように、追加の測定が第１測定システムで実施される実施形態において、プラットフォームは、試料の流れを方向付けるのに必要な管と弁と共に、唯１つの第１測定システムと１つの粒子分離装置を有してもよい。同様に、いくつの追加の測定が、プラットフォームの第１測定システムと同じか又は同じでない任意の数の追加測定システムによって実施されてもよい。 
【００５９】
しかし、有利には、プラットフォーム１００、２００のように複数の第１測定システムを用いることにより、全体的な粒子特性測定ウィンドウをより幅広いものとすることができる。図５は、一般的な試料の３つの桁の粒径に渡る粒径分布４００を示す。分布４００の上にある横棒は、上述した粒子特性評価技術が測定を行い得る粒径ウィンドウを表す。ＤＬＳは広い範囲の粒径の粒子に敏感であり、ＳＥＣとＴＤＡはより小さな粒径に限定され、２８０ｎｍのＵＶ測光はより大きな粒径に限定される。プラットフォーム１００、２００のための上述した粒子特性評価技術の組み合わせにより、粒径の補完データが提供され、全粒径分布を決定することが可能となる。
【００６０】
分布４００は、試料中のモノマー、二量体、及びより大きな凝集体をそれぞれ表す明瞭なピーク４０１、４０２、及び４０３を有する。凝集体ピーク４０３内の凝集体の中には、直径が２００ｎｍよりも大きいものもある。これは、ＳＥＣカラム（ＳＥＣカラムに進入する最大粒径を制限するのに一般的に用いられる多多孔フリット、フリット限界を定義する）に進入できる粒子の最大サイズを限定する一般的なフリット限界よりも大きい。したがって、この試料中の最も大きい凝集体は、粒子分離装置１０２、２０２、３０２を通過することができないであろう。ＳＥＣ測定だけを採用する従来のシステムでは、このような大きな凝集体は確認され得ない。しかし、上述したプラットフォーム１００、２００、３００を用いると、大きな凝集体を第１測定により確認することが可能となり、粒子分離装置による粒子のいかなるロスも検知できる。
【００６１】
第１測定及び追加の測定に用いる粒子特性評価技術は、ＴＤＡ測定であってもよく、又はＴＤＡ測定を含んでもよい。
【００６２】
テイラー分散は、試料の効果的な拡散性を高めるためにせん断流を使用するプロセスである。毛細管内の層流は、半径方向位置に従って流速の変動をもたらす。毛細管の壁の近くでは、流れは実質的には静止しており、流速は、毛細管の中心において最大である。これにより、隣接する薄層がせん断される。これは、試料が毛細管に沿って進むときの試料の分散を高めるように働く。
【００６３】
一般的なＴＤＡ測定において、毛細管に沿う固定の窓位置に配置された１つ以上の検出器（試料の種に応じる）が、全ての検出器窓又は各検出器窓を通過する試料の各断面において試料の濃度を検出するのに使用される（一般的に、光吸収量測定により）。全ての検出器又は各検出器からの出力は、時間的に分解された濃度分布（テイラーグラム）である。測定窓までの毛細管に沿った移動時間が十分に長いので、その移動時間の間に、試料は十分に分散され、テイラーグラムプロファイルは、その幅（σ）が以下の式（１）により流体力学的半径（Ｒｈ）に比例するガウス分布に近似する。
【００６４】
【数１】
2021505899.tif 000003
ここで、ｋＢはボルツマン定数であり、Ｔは温度であり、ηは緩衝液粘度であり、ｒは毛細管の半径であり、τは毛細管（ガウシアンの略中央）における試料の滞留時間である。
【００６５】
図６は、毛細管に沿った２つの別の測定窓Ａ及びＢにて取得したテイラーグラムの例を示す。ここで、第２窓Ｂの滞留時間(τ２)は、第１窓Ａの滞留時間(τ１)よりも大きい。図６に示されるように、時間と共に毛細管に沿って更に分散するので、窓Ｂで取得したテイラーグラムの幅（σ２）は窓Ａで取得したテイラーグラムの幅（σ１）よりも大きい。この場合、Ｒｈは、以下の式（２）により、２つのガウシアンの幅σ１、σ２と滞留時間ｔ１、ｔ２に関係する。
【００６６】
【数２】
2021505899.tif 000004
上述した二窓解析は、非理想的初期試料プロファイル（ｔ＝０）に起因する一窓解析の不具合を説明するものと知られている。
【００６７】
試料内に１つより多い種又は群がある場合、所与の検出器窓で取得したテイラーグラムは、存在する種それぞれの濃度分布の重ね合わせを含む。
【００６８】
例えばプリセパレーションなど従来のＴＤＡにおいて、種それぞれの構成成分の滞留時間は同じである。取得したテイラーグラムの平均値Ｒｈは、１つのガウシアンをフィッティングして求めてもよい。しかし、これは、有り得る溶液の多様性により不正確となり得て、特に、成分分布それぞれの幅と振幅が、テイラーグラムがガウシアンによく近似しない程度まで異なる場合に、不正確となり得る。テイラーグラムの平均値Ｒｈを求めるよりロバストな方法とは、分布のモーメントを解析することである。これは本質的に、分布の二次及び一次モーメントを（積分により）計算することで、テイラーグラムの幅と中心の決定を含む。
【００６９】
テイラーグラムのゼロ次モーメントｄ（ｔ）は、次の面積積分であり、総濃度を生み出す。
【００７０】
【数３】
2021505899.tif 000005
面積（Ａｒｅａ）により除算された一次モーメントは、平均滞留時間を与える。
【００７１】
【数４】
2021505899.tif 000006
面積（Ａｒｅａ）により除算された二次モーメントは、平均分散を与える。
【００７２】
【数５】
2021505899.tif 000007
別々の種それぞれに対応する分布を抽出することは、例えば複数のガウシアンをフィッティングすることにより、種それぞれに対応する構成成分の合計として取得したテイラーグラムを分解することを一般的に含み、テイラーグラムを含む成分種それぞれのσ（故に、各種のＲｈ）を抽出する。しかし、例えばプリセパレーションなど従来のＴＤＡにおいて、多成分分析もまた、種それぞれの構成成分が同じ滞留時間を共有する場合に、有り得る溶液の多様性により不正確となり得る。例えば、Ｒｈ値が数ｎｍという小ささで異なる場合に、モノマーピークと二量体ピークを区別することが難しい場合がある。この問題は、試料が粒子分離装置１０２、２０２を通過した後にＴＤＡを実施することにより、つまり、ポストセパレーションにより、低減され得る。
【００７３】
試料が粒子分離装置１０２、２０２を通過した後にサイズにより粒子を分画する粒子分離装置において、それぞれサイズの異なる試料成分の滞留時間は、Ｒｈに伴う溶出時間の違いにより、同じではなくなるであろう。この場合、種／成分それぞれの成分ピークは、完全に又は少なくとも部分的に分解され得る。よって、粒子分離装置後にＴＤＡを実施することにより、種それぞれの信頼性のあるＲｈ値を抽出する能力が大いに改善される。
【００７４】
図７は、本発明の実施形態による粒子特性評価プラットフォーム４００の模式図である。プラットフォーム４００は、粒子分離装置４０２と、粒子分離装置４０２の上流側に位置する第１ＴＤＡ測定システム４０５と、粒子分離装置４０２の下流側に位置する第２ＴＤＡ測定システム４０５’とを含む。分光光度計や光度計などの他の測定システム（例えば、ＵＶ分光光度計や光度計）は、例えば粒子分離装置４０２を出た後すぐに種濃度を測定するのに（例えば、従来のＳＥＣ測定を実施するのに）具備されてもよい。
【００７５】
第１ＴＤＡ測定システム４０５は、毛細管４０５ａと、第１検出器窓Ａと、第２検出器窓Ｂとを含み、第２ＴＤＡ測定システム４０５’は、毛細管４０５ａ’と、第１検出器Ａ’と、第２検出器窓Ｂ’とを含む。使用時には、試料は、入力４０３から、第１プレセパレーション、ＴＤＡ測定が実施される第１ＴＤＡ測定システム４０５に流される。試料はその後、粒径などの粒子特性に基づいて試料を分離するために粒子分離装置４０２に流される。粒子分離装置４０２を通過した後、試料は、第２ポストセパレーション、ＴＤＡ測定を実施するために第２ＴＤＡ測定システム４０５’に流される。
【００７６】
分離測定システムとして図７に示されるが、第１及び第２ＴＤＡ測定システム４０５、４０５’は、同じ検出器を共有してもよい。例えば、毛細管４０５ａへは、第１ＴＤＡ測定システム４０５の検出器窓Ａ及びＢを介して戻ってもよい。図２及び３に示されるように、他の測定システムが粒子分離装置４０２の上流側と下流側に含まれてもよいことが理解されるであろう。
【００７７】
以下では、上記に提案された方法を立証するのに、プリセパレーションテイラーグラムとポストセパレーションのテイラーグラムが、様々な試料混合物についてシミュレートされる。シミュレーションにおいて、粒子分離装置４０２はＳＥＣカラムであると仮定され、種それぞれのテイラーグラムはガウス分布を呈すると仮定される。この例において、検出窓Ａ、Ｂと、検出窓Ａ’、Ｂ’とは、７２０秒というそれぞれの滞留時間における差で分けられる。相対ＳＥＣカラム滞留時間（又は溶出時間）ｔは、ｔ＝ａ＋ｂＲｈ３によりＲｈ３（故に分子量）と相関すると仮定される。ここで、ａは２７０３と任意に設定され、ｂは−２．１と設定される（実際の測定条件の設定に実験則で一致することは、この関数又は他の幾つかの関数を用いて、実験により決定され得る）。シミュレーティングされたテイラーグラムは、各検出器窓Ａ、Ｂ、Ａ’、Ｂ’で実施される吸光度測定を表す。
【００７８】
図８ａは、平均粒径が３．８±０．２ｎｍであるモノマー状のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む試験試料１用の第１ＴＤＡ測定システム４０５の窓Ａ及びＢで取得したｐｒｅ−ＳＥＣテイラーグラムを示す。図８ｂは、第２ＴＤＡ測定システム４０５’の窓Ａ’及びＢ’で取得した対応するｐｏｓｔ−ＳＥＣテイラーグラムを示す。試料中には種が一つだけ存在するので、ｐｒｅ−ＳＥＣテイラーグラムとｐｏｓｔ−ＳＥＣテイラーグラムの両方とも、１つの分布を示す。
【００７９】
図９ａと９ｂは、８０：１５：５の相対比率で、ＢＳＡ（３．８±０．２ｎｍ）と５．４ｎｍと１０ｎｍの大きさの溶出した凝集体との混合物を含む試験試料２のｐｒｅ−ＳＥＣテイラーグラムとｐｏｓｔ−ＳＥＣテイラーグラムをそれぞれ示す。プリセパレーションでは、唯一のピークが各検出窓で分解される（図８ａ参照）。図９ｂに図示するように、ポストセパレーションテイラーグラムＡ’とＢ’では、１つ以上の追加的な凝集体に対応して、より短い滞留時間で追加的なピークが分解される。
【００８０】
図１０ａと１０ｂは、同じ８０：１５：５の相対比率で、ＢＳＡ（３．８±０．２ｎｍ）と５．４ｎｍと６０ｎｍの大きさの溶出した凝集体との混合物を含む試験試料３のシミュレーション結果を示す。この場合、ＳＥＣカラムは、６０ｎｍの粒子を排除し、短い滞留時間ピークが観察されない。ｐｏｓｔ−ＳＥＣテイラーグラムＡ’とＢ’では、ＢＳＡと５．４ｎｍの凝集体の個々の分布は、重畳されて分解されない。
【００８１】
【表１】
2021505899.tif 000008
算出されたモーメントの相対変化（式３及び４）ｐｏｓｔ−ＳＥＣは、平均値Ｒｈを与え、これは、平均値Ｒｈｐｒｅ−ＳＥＣと比較され得る（ｐｏｓｔ−ＳＥＣでは、標準偏差／二次モーメントが分離により間違っていたり過大評価されたりし得るため、モーメント法は、単一の窓に作用できない。しかし、２つの窓での値の差は、分離とは無関係である。）。
【００８２】
上記の表１は、式２〜４におけるモーメント解析を用いた各試験試料のプレ及びポスト粒子分離シミュレーションから取得した、Ｒｈの加重平均値とテイラーグラムの下での面積（粒子の濃度に比例する）とを示す。示されるように、試験試料１と２のＲｈのｐｒｅ−ＳＥＣ加重平均値及びｐｏｓｔ−ＳＥＣ加重平均値は、よく一致する。これは、分離中に粒子が失われていないことを示す指標となる。ｐｒｅ−ＳＥＣ面積とｐｏｓｔ−ＳＥＣ面積の比較は、これを確認する追加的又は代替的指標となる。対照的に、６０ｎｍというより大きい粒子を含んだ試験試料３のＲｈと面積のｐｒｅ−ＳＥＣとｐｏｓｔ−ＳＥＣ加重平均値は、一致しない。これは、粒子が分離中に失われていることを示す指標となる。
【００８３】
（例えば、モーメントを用いて）平均Ｒｈ値を決めること、又は、複数のガウシアンをフィッティングすることにより各構成成分のＲｈ値を決めること、に追加して又はその代わりに、テイラーグラムの非負最小二乗（ＮＮＬＳ）解析を用いて、試料中に存在する全ての種又はそれぞれの種の粒径分布を抽出してもよい。有利には、ポスト粒子分離テイラーグラムのＮＮＬＳ解析もまた、以下に実証されるように、より分解された粒子分布をもたらし得る。
【００８４】
ＮＮＬＳ法は、以下の式に設定される非負値解を見つけることが目的であるフィッティング法である。
【００８５】
【数６】
2021505899.tif 000009
ここでは、Ａは、行列Ｆを構成する任意関数ｆの係数（又は比率）の配列である。行列乗算の結果は、合成分配ｄである。よって、Ｆがｍ×ｎ行列（つまり、長さの変数ｍのｎ個の関数がある）の場合に、Ａはｎ×１配列で、ｄはｍ×１配列である。一般的に、式５の厳密解は見つけられない。よって、代わりに、最適解が、Ａの構成要素がゼロ以上である（つまり、非負）ことを条件に、残差||F*A-d||2のノルムを最小化することによって取得される。
【００８６】
この場合、ｄは時間依存テイラーグラムである。試料が十分に分散されるパルステイラーグラムの場合、関数Ｆは、次の形式の時間依存ガウシアンを含む。
【００８７】
【数７】
2021505899.tif 000010
ここで、ｔは測定時間であり、τは滞留時間であり、σは（例えば、式１又は２から）試料のＲｈを求める幅である。Ａは、テイラーグラムｄに関数Ｆが寄与する時間依存ガウシアンそれぞれの係数の配列である。そういうわけで、Ａは粒径分布として知られている。以下に、２成分テイラーグラムの一例を示す。
【００８８】
【数８】
2021505899.tif 000011
関数Ｆの各列は、テイラーグラムの各成分の時間依存ガウシアンである（つまり、試料内に存在する各種）。式５（又は７）は、逆Ｆを左側から両辺に掛けることでＡについて解いてもよい。
【００８９】
【数９】
2021505899.tif 000012
ＴＤＡ測定の従来のプリセパレーションＮＮＬＳ解析において、全ての関数Ｆは、例えば、τ１、τ２＝τのように、同じ滞留時間を有すると仮定される。一方、ポストセパレーション解析では、各関数Ｆは、例えば、τ１≠τ２という異なる滞留時間を有すると仮定される。
【００９０】
ＮＮＬＳフィッティング処理において、実験データに対する式５又は７の最も適合するもの（ベストフィット）を決定するために、Ｒｈは、ある範囲の値に渡って走査される。特定の滞留時間に走査されるＲｈ値の数と範囲は、ユーザー定義であってもよいが、事前に推定してもよい。図７に示されるもののような理想的実験セットアップにおいて、テイラーグラム幅と滞留時間との間には周知の先験的な相関関係があり、これは、特定の滞留時間に走査されるＲｈの範囲を限定するのに用いられる。例えば、ＳＥＣでは、分子量と滞留時間との間に相関関係がある。この相関関係は、周知であるか、又は、初期の校正段階から決定されてもよく、これにより、ある範囲の周知のＲｈを持つ試料がその滞留時間を決定するのに解析される。続く結果にて、相関関係ｔ＝ａ＋ｂＲｈ３が仮定される（初期シミュレーション用に使用されたように）。
【００９１】
図１１ａと１１ｂは、図８ａと８ｂ（試験試料１）のテイラーグラムから、ＮＮＬＳ法を用いて抽出したｐｒｅ−ＳＥＣ粒径分布とｐｏｓｔ−ＳＥＣ粒径分布とをそれぞれ示す。窓Ａ’とＢ’でのテイラーグラムは、同じ結果（図示無し）をもたらす。ｐｒｅ−ＳＥＣ粒径分布とｐｏｓｔ−ＳＥＣ粒径分布の両方が約３．８ｎｍでピークを示し、ＢＳＡの大きさと良好に一致する。図１２ａと１２ｂは、図９ａと９ｂのテイラーグラム（試験試料２）から抽出した対応するｐｒｅ−ＳＥＣ粒径分布とｐｏｓｔ−ＳＥＣ粒径分布とをそれぞれ示す。図１２ａに見られるように、ｐｒｅ−ＳＥＣ粒径分布において、約１０ｎｍでピークが分解されるが、ＢＳＡ（３．８ｎｍ）と５．４ｎｍ粒子の分布は、互いに区別されない。対照的に、ｐｏｓｔ−ＳＥＣ粒子分布では、ＢＳＡ（３．８ｎｍ）と５．４ｎｍ粒子用に異なるピークが明確に分解される。
【００９２】
図１３ａと１３ｂは、図１０ａと１０ｂ（試験試料３）のテイラーグラムから抽出したｐｒｅ−ＳＥＣ粒径分布とｐｏｓｔ−ＳＥＣ粒径分布とをそれぞれ示す。ｐｒｅ−ＳＥＣ粒径分布（図１３ａ）では、約６０ｎｍでピークが分解されるが、ＢＳＡ（３．８ｎｍ）と５．４ｎｍのピークは、互いに区別されない。ｐｏｓｔ−ＳＥＣ粒子分布では、試験試料２の結果と同様、ＢＳＡ（３．８ｎｍ）と５．４ｎｍ粒子のピークは明確に分解される。しかし、この場合、６０ｎｍ粒子がＳＥＣカラムで排除されているので、６０ｎｍではピークが観測されない。
【００９３】
上述したＮＮＬＳ法は、成分のポストセパレーション滞留時間とＲｈとの間の相関の先験的知識に依存する。これは、上述したように、基準測定により校正されてもよい。追加的に、ある特定の滞留時間で予測されるテイラーグラム幅は、カラムの形状のため、従来のプリセパレーションＴＤＡで予測されるものと同じではないであろう。この効果も、基準測定から決定される必要がある。対照的に、複数のガウシアンをフィッティングして複数成分のポストセパレーションテイラーグラムを解析することは、比較的容易であり、且つ、テイラーグラム幅と滞留時間との間の相関関係の先験的知識を必要としない。
【００９４】
代替的に又は追加的に、滞留時間は、２つの連続する測定窓（例えば、窓Ａ’とＢ’）の間で観測される分散が一致するように調整され得る。
【００９５】
上記例は、提案された方法の利点を実証する。プレ及びポストセパレーションＴＤＡは、ＳＥＣ測定の結果を立証又は増大するのに使用され得る直交する結果を提供する。上記例は、ｐｒｅ−ＳＥＣ及びｐｏｓｔ−ＳＥＣＴＤＡ測定を解析及び比較するが、これは、粒子分離前に実施される第１測定を粒子分離後に実施される第２測定と比較することの単なる一例であると解釈されるであろう。例えば、ＵＶ測光及びＤＬＳなどの他の測定技術でも、同様の結果が得られ得る。特に、上記のＮＮＬＳフィッティング法は、粒子分離の前及び後に実施されるＤＬＳ測定にも適応され得る。
【００９６】
いくつかの実施形態において、第１粒子特性評価技術はＵＶ分光と静的光散乱を含み、粒子分離装置はクロマトグラフィーカラム（例えば、ＳＥＣカラム）を含み、第２粒子特性評価技術は、ＵＶ分光と静的光散乱とを含み得る。
【００９７】
例えば、第一特性評価技術及び第二特性評価技術を実現するのに、Ｏｍｎｉｓｅｃ  Ｒｅｓｏｌｖｅ又は同様の装置を用いてもよい。Ｏｍｎｉｓｅｃ  Ｒｅｓｏｌｖｅのセンシングモダリティは、以下の４つの検出タイプを含む。原則、屈折率検出器と粘度計の一方又は両方は省略されてもよい。
【００９８】
＜検出器１＞
検出器：      光散乱
測定原理：    散乱角９０度での直角度光散乱（ＲＡＬＳ）、散乱角７度での低角度光散乱（ＬＡＬＳ）
光源：        ６４０ｎｍレーザー
＜検出器２＞
検出器：      示差屈折率
測定原理：    偏向
セル体積：    １２μＬ 
＜検出器３＞
検出器：      粘度計
測定原則：    自動平衡機構とユーザーにより取り換え可能な毛細管を有する４−毛細管ホイートストンブリッジ
＜検出器４＞
検出器：      ダイオードアレイに基づく紫外可視（ＵＶ／Ｖｉｓ）光度計
波長：        １９０〜９００ｎｍ
波長数：      １０２４
波長精度：    ＜１ｎｍ
波長分解能:    ０．６ｎｍ
多くの異なる測定タイプを実施するのに、４つの異なる型の検出器を使用してもよい。
【００９９】
＜測定タイプ１＞
測定タイプ：    絶対分子量
測定領域：      ２００−＞１０７ｇ／ｍｏｌ
定量可能な最小質量：  ＴＨＦ内の分子量１００ｋＤａのポリスチレン１００ｎｇ
測定原則：      光散乱（ＬＡＬＳ又はＲＡＬＳ）

＜測定タイプ２＞
測定タイプ：      固有粘度
定量可能な最小質量：  ＴＨＦ内の分子量１００ｋＤａのポリスチレン１μｇ
測定原則：      ４−毛細管ホイートストンブリッジ
＜測定タイプ３＞
測定タイプ：      濃度
定量可能な最小質量：  ＴＨＦ内の分子量１００ｋＤａのポリスチレン１００ｎｇ
測定原則：      示差屈折率検出
粒子分離装置は、クロマトグラフィーカラムを有するＯｍｎｉｓｅｃ  Ｒｅｖｅａｌを含んでもよい。これにより、クロマトグラフィーを用いる粒子分離用の自動ＨＰＬＣシステムが実現する。他の実施形態において、粒子分離用にいかなるクロマトグラフィーシステムを用いても良い（例えば、４０ＭＰａより高い圧力を有する液体クロマトグラフィーシステム）。
【０１００】
別々のＳＥＣ分析、光散乱分析、及び光学顕微鏡分析を含む混合ワークフローは、試料がＳＥＣカラムを介して流れる前及び後に、光散乱と紫外可視（ＵＶ−Ｖｉｓ）分光測定（例えば、吸光測定）が同じ試料に実施される自動システムと比較され得る。
【０１０１】
一実施形態について測定を実施して、結果を組み合わせるのに要する時間は、一般的な複合ワークフローよりも約５倍速い。
【０１０２】
多くのカテゴリそれぞれにおける粒子の量比が決定され得る。そのカテゴリは、
ＬＭＷ／フラグメント（モノマーより小さい粒径又は分子量を持つ粒子）と、
モノマーと、
ＨＭＷ／凝集体（二量体、三量体、及び他の多量体など、モノマーより大きい粒径又は分子量を持つ）と、
ＶＨＭＷ（高分子量粒子又は粒径の非常に大きい粒子）と、
を含んでもよい。
【０１０３】
量比は、粒子質量に基づく濃度（例えば、吸収率に基づく）を含んでもよい。
【０１０４】
ＶＨＭＷ量は、分離の前と後の全吸収の差から（例えば、分離前の吸収ピーク下の面積から、分離装置／ＳＥＣカラムを介して溶出した後の吸収ピーク下の総面積をマイナスしたものから）推定され得る。
【０１０５】
ＬＭＷ、モノマー、及びＨＭＷの比率は、光散乱（分離された試料が光散乱検出器を通過するときの分離された試料の各成分の粒径又は分子量についての情報を提供する）とＵＶ光度測定の組み合わせから推定されてもよい。これにより、各成分の濃度の定量的測定が実現される。例えば、溶出時間測定と光散乱測定の組み合わせは、溶出ＵＶ光度測定において各ピークをＬＭＷ、モノマー、又はＨＭＷに属すると分類するのに使用されてもよい。分離の前と後の総濃度の差は、ＶＨＭＷ濃度を提供するのに使用されてもよい。
【０１０６】
最も簡単なものとして、ＵＶ光度測定は、上述したカテゴリそれぞれにおいて様々な比率を推定するのに使用されてもよい。モノマーの溶出時間が既知の場合、これより早く溶出されたピークはＬＭＷと分類され、これより後のピークはＨＭＷと分類できる（予測される溶出時間でのピークがモノマーである）。いかなる「失われている」濃度（分離前には存在したが後には存在しない吸収）は、ＶＨＭＷに起因し得る。
【０１０７】
いくつかの情報は、他の測定モダリティ無しでもＶＨＭＷについての推測を可能とし得る（分離前後のＵＶ吸収以外）。例えば、ＶＨＭＷ粒子の粒径は、分離装置に通過を許可されないように、又は、分離装置を通過しないように、十分な大きさを有していなければならない。これにより、最小粒径が推定可能となる（例えば、カラム入力でのフリットサイズに基づいて）。
【０１０８】
しかし、試料のＶＨＭＷ成分の特徴、例えば、この成分の平均粒径（例えば、Ｄｖ５０）、多分散性、又は粒径分布などについて、より多くの情報を得ることができることが好ましいであろう。分離の前及び後に実施される光散乱測定（例えば、静的光散乱又は動的光散乱）は、これが達成され得る一つの方法である。分離前の散乱光の特徴は、分離後の散乱光の特徴と比較され得る。ＬＭＷ、モノマー及びＨＭＷ成分についての情報は、第２測定から推定され得る（分離後）。ＬＭＷ、モノマー及びＨＭＷ成分の散乱寄与が分かると、ＶＨＭＷ成分の散乱寄与が推定できる。そして、この散乱寄与は、ＶＨＭＷ成分を特徴付けるのに（例えば、ＶＨＭＷ成分の平均粒径、多分散性、又は粒径分布を提供するのに）使用できる。
【０１０９】
これら原則に基づいて実施された実験が実施され、従来技術のハイブリッド測定方法と比較され、よく一致することが分かった。
【０１１０】
図１４は、一実施形態による粒子特性評価プラットフォームの一実施形態を図示する。この粒子特性評価プラットフォームは、オートサンプラ６０１と、第１測定システム６１１と、第１フィルタ６２１と、ＳＥＣカラム６０２と、第２フィルタ６２２と、第２測定システム６１２とを含む。
【０１１１】
オートサンプラ６０１は、ＨＰＬＣガラス瓶やマイクロタイタープレートなど、複数の試料を受けるように構成され、且つ、第１測定システム６１１を介してカラムに試料を自動的に注入し、液体クロマトグラフィーを実施するために溶離液により試料を溶出するように構成される。
【０１１２】
第１測定システム６１１と第２測定システム６１２は、ＵＶ光度計と散乱光検出器（例えば、直角散乱又は小角散乱）とを含む。プラットフォーム６００は、第１測定システム６１１、ＳＥＣカラム６０２、その後に第２測定システム６１２を介して試料を流すように構成される。幾つかの実施形態において、ＳＥＣカラム６０２の出力は、第２測定用に第１測定システム６１１に戻るように導かれてもよい（そして、第２測定システム６１２は省略される）。
【０１１３】
一実施形態において取得されるクロマトグラム５００の一例が図１５に模試的に図示される。この一例において、クロマトグラム信号は、ＵＶ吸収と仮定され、試料の全ての成分（分離工程に対応しない任意の大きい粒子を含む）を含むプリセパレーションピーク５０１を含む。クロマトグラム５００は、信号ピーク５０２ポストセパレーションを更に含む。これらポストセパレーションピークそれぞれは、試料の成分に対応する。第１測定がＵＶ測光と散乱測光の両方を含む例において、測定データは、２つのクロマトグラムを含み得る。１つはＵＶ吸収用（つまり、ＵＶクロマトグラム）であり、もう１つは散乱強度（散乱クロマトグラムと呼ばれ得る）である。
【０１１４】
異なるカテゴリにおける試料中の粒子の比率の定量分析に関する例示的なワークフローを、以下に記載する。
【０１１５】
ＵＶクロマトグラムは、演算オーバーヘッドを低減するために、最初にサブサンプリングされてもよい。これは必須ではないが、事を早める。サブサンプリングは、ベースラインをデータに合わせ、ピークを認識するのに要する時間を減らすのに役に立つ。正確性を維持するために、ピーク面積を決定するのにフルデータセットを使用してもよい。
【０１１６】
ベースラインはデータにフィッティングされ得て、且つ、顕著なピークが認識され得る（例えば、データ内の極大値を見つけることによって）。クロマトグラムの活性領域は、最大ピークの位置を参照して決定されてもよく、凝集研究では、対象のモノマーに対応すべきである。活性領域は、最大ピークの位置及び幅を参照して決定されてもよく、解析されるモノマーの特徴に応答できる。例えば、活性領域は、最大ピークから所定の数の最大ピーク幅を差し引いた位置で始まり、最大ピークに所定の数の最大ピーク幅を足した位置で終わってもよい。
【０１１７】
活性領域内のデータは、時間的に隔たりのある疑似ガウスプロファイルをデータにフルフィットするデコンボリューションアルゴリズムに送信され得る。
【０１１８】
【数１０】
2021505899.tif 000013
未知数は、データに対するベストフィットが見つかるまで様々な中心時刻Ｃｎでプロファイルをフィッティングすること解かれる振幅Ａｎと幅σｎである。これは、以下の行列方程式を解く非負最小二乗フィットにより達成され得る。
【０１１９】
【数１１】
2021505899.tif 000014
ここで、この表現において、Ｔは幅と中心時刻の選択された組み合わせを有する単位振幅疑似ガウシアンの行列であり、ｙはクロマトグラムデータであり、Ａは解かれる振幅ベクトルである。
【０１２０】
走査される中心時刻と幅は、事前に選択されてもよい。演算時間を速めるために、認識されたモノマーピークの半分の幅で離間された中心時刻を分解に用いてもよい。幅アレイの初期推定値は、１√８×モノマー幅から２×モノマー幅まで対数的に離間し得る。
【０１２１】
モノマー、フラグメント、及び凝集体に対応するクロマトグラムの領域は、フィッティングされた溶液から決定可能である。モノマーピークのいずれかの側の第１の顕著なショルダーは、モノマー領域の端点と認識され得る。
【０１２２】
顕著なショルダーは、以下の場合に認識され得る。
ｉ．    勾配中の転換点の突起が最大突起の０．５％より大きい、又は
ｉｉ．  転換点が、最大の０．１％より大きい突起を持つブロードなピークであり、推定されるモノマー幅の５分の１より大きい半幅を有する、又は、
ｉｉｉ．（ｉ）と（ｉｉ）の条件のいずれかが満たされ、ショルダーがモノマーピーク最大値から１．２×モノマー幅の距離より大きい。これは、最大値付近のスプリアスショルダーが拾い上げられないことを確実にするためである。
【０１２３】
各領域内のピークが認識されフィッティングされると、各領域内の面積の合計を決定することは容易であり、且つ、これを、試料内の各部分の濃度を反映する割合に転換することも容易である。
【０１２４】
ＵＶクロマトグラフを使用して、クロマトグラフの領域（つまり、試料のこれら成分に対応する溶出時間）を認識し、且つ、その後にこれらを散乱クロマトグラムに適用することは有利であり得る。
【０１２５】
各ピーク（試料成分に対応する）について、ＵＶクロマトグラフと散乱クロマトグラフの面積の比率は、そのピークの粒径／相対分子量を予測するために演算され得る。
【０１２６】
プリセパレーション測定データは、リニアフィット（ベースラインを除去するため）と、プリセパレーションＵＶ吸収ピークにフィッティングされた疑似ガウシアン（例えば、時間依存ガウシアン）と、の組み合わせとして扱うことができる。
【０１２７】
このピーク下の面積が、ポストセパレーションＵＶ吸収ピーク下の総面積と比較されることで、試料内に存在する任意の有り得るＶＨＭＷ成分についての情報が提供されてもよい。セパレーション前の総ＵＶ吸収とセパレーション後の総ＵＶ吸収との不一致は、試料内のＶＨＭＷ含有量に常に起因するわけではない。場合によっては、分離装置／ＳＥＣカラム内における、凝集体、モノマー、又はフラグメントの損失があり得る。これは、ＶＨＭＷ粒子に起因しない、分離前の総吸収と分離後の総吸収との差につながり得る。
【０１２８】
ＶＨＭＷ粒子の誤認識を回避するために、ＶＨＭＷ粒子用に二次的な指標を使用してもよい。二次的な指標は、合計信号（例えば、ＵＶ吸収又は散乱）の誤差についての閾値を含んでもよい。ＵＶ吸収における少なくとも５％又は少なくとも１０％という誤差は、ＶＨＭＷ粒子を示唆し得る。全散乱光における誤差（つまり、分離前と後の散乱光強度信号下の面積の違い）もまた、ＶＨＭＷ粒子を示唆し得る。大きい粒子はより強く光を散乱するので、光散乱はより大きい粒子に対してより敏感である。また、ＶＨＭＷ粒子が存在する場合、比較的大きな誤差（例えば、４０％より大きい又は５０％より大きい）が分離前と後の光散乱において確認され得る。ＵＶ吸収誤差と全散乱誤差とを組み合わせることにより、比較的信頼性を持ってＶＨＭＷ粒子の示唆をすることができる。例えば、ＵＶ吸収における誤差が５％以上あり、且つ、全散乱における誤差が４０％又は４５％以上ある場合、ＶＨＭＷ粒子が関与していることが高い信頼性を持って推測され得る。 
【０１２９】
ＶＨＭＷ粒子が、プレセパレーション測定及びポストセパレーション測定における全信号（例えば、吸収又は散乱）に誤差を引き起こしていることを立証するための代替的な二次的な指標は、プレセパレーション解析及びポストセパレーション解析から決定される平均分子量を調べることである。ある特定の閾値を超える平均分子量における誤差は、ＶＨＭＷ粒子を示唆し得る。閾値は、例えば２又は２．２である。
【０１３０】
二次的な指標が存在する場合、分離前と分離後のＵＶ吸収における差は、ＶＨＭＷ粒子を含む試料の質量比率を予測するために使用されてもよい。ＶＨＭＷ粒子の二次的な指標が伴わないＵＶ吸収（及び、第２測定ポストセパレーションにだけ基づくフラグメント、モノマー、及び凝集体の比率）における誤差は、無視されてもよい。
【０１３１】
添付の特許請求の範囲で定義された発明の範囲内には、他の実施形態も存在することが意図される。
【図１】
2021505899.tif 000015
【図２】
2021505899.tif 000016
【図３】
2021505899.tif 000017
【図４ａ】
2021505899.tif 000018
【図４ｂ】
2021505899.tif 000019
【図５】
2021505899.tif 000020
【図６】
2021505899.tif 000021
【図７】
2021505899.tif 000022
【図８ａ】
2021505899.tif 000023
【図８ｂ】
2021505899.tif 000024
【図９ａ】
2021505899.tif 000025
【図９ｂ】
2021505899.tif 000026
【図１０ａ】
2021505899.tif 000027
【図１０ｂ】
2021505899.tif 000028
【図１１ａ】
2021505899.tif 000029
【図１１ｂ】
2021505899.tif 000030
【図１２ａ】
2021505899.tif 000031
【図１２ｂ】
2021505899.tif 000032
【図１３ａ】
2021505899.tif 000033
【図１３ｂ】
2021505899.tif 000034
【図１４】
2021505899.tif 000035
【図１５】
2021505899.tif 000036
【国際調査報告】
2021505899.tif 000037
2021505899.tif 000038