(57)【要約】組織足場が記載される。上記組織足場は、合成ポリマー、ならびにエラスチン、フィブリンおよびコラーゲンから選択される１種またはこれより多くの天然ポリマーを含む。上記合成ポリマーは、少なくとも１種の天然ポリマーでコーティングされた繊維状マトリクスの形態にあり得る。本発明は、合成および天然ポリマーを有する組織足場、このような組織足場を形成するための方法、ならびにこのような組織足場の、例えば、組織工学および組織再生における適用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成ポリマー、ならびにフィブリン、コラーゲンおよびエラスチンから選択される少なくとも１種の天然ポリマーを含む組織足場であって、ここで：
ａ）前記少なくとも１種の天然ポリマーは、フィブリンと：  ｉ）エラスチン；および／もしくはｉｉ）コラーゲンとを含む；
ｂ）前記合成ポリマーは、繊維状マトリクスの形態にあり、前記マトリクスは、前記少なくとも１種の天然ポリマーでコーティングされる；ならびに／または
ｃ）前記少なくとも１種の天然ポリマーは、エラスチンを含み、前記エラスチンは、未分画であり、かつ可溶性エラスチンを含む、
組織足場。
【請求項２】
前記少なくとも１種の天然ポリマーは、フィブリンと：  ｉ）エラスチン；および／またはｉｉ）コラーゲンとを含む、請求項１に記載の組織足場。
【請求項３】
前記少なくとも１種の天然ポリマーは、フィブリンおよびエラスチンを含む、請求項２に記載の組織足場。
【請求項４】
前記少なくとも１種の天然ポリマーは、エラスチンを含み、前記エラスチンは、未分画であり、かつ可溶性エラスチンを含む、前述のいずれかの請求項に記載の組織足場。
【請求項５】
乾燥しているかまたは実質的に水を含まない、前述のいずれかの請求項に記載の組織足場。
【請求項６】
凍結乾燥されている、前述のいずれかの請求項に記載の組織足場。
【請求項７】
前記合成ポリマーは、マトリクスの形態にあり、必要に応じて前記マトリクスは繊維状である、前述のいずれかの請求項に記載の組織足場。
【請求項８】
前記マトリクスは、前記天然ポリマーまたは各天然ポリマーでコーティングされる、請求項７に記載の組織足場。
【請求項９】
ナノファイバーを含み、必要に応じて前記合成ポリマーは、ナノファイバーのマトリクスの形態にある、前述のいずれかの請求項に記載の組織足場。
【請求項１０】
電界紡糸された繊維を含み、必要に応じて前記合成ポリマーは、電界紡糸されたマトリクスの形態にある、前述のいずれかの請求項に記載の組織足場。
【請求項１１】
フィブリン、コラーゲンおよびエラスチンを含む、前述のいずれかの請求項に記載の組織足場。
【請求項１２】
前記合成ポリマーは、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）を含む、前述のいずれかの請求項に記載の組織足場。
【請求項１３】
少なくとも１つの細胞との組み合わせにある、前述のいずれかの請求項に記載の組織足場。
【請求項１４】
前記少なくとも１個の細胞は、幹細胞を含み、必要に応じて前記幹細胞は、ｈＡＤＳＣである、請求項１３に記載の組織足場。
【請求項１５】
エキソビボまたはインビトロにある、前述のいずれかの請求項に記載の組織足場。
【請求項１６】
合成ポリマーならびに、エラスチン、コラーゲンおよびフィブリンから選択される１種もしくはこれより多くの天然ポリマーを有する組織足場を形成するための方法であって、前記方法は、
ａ）前記合成ポリマーと前記１種もしくはこれより多くの天然ポリマーとを接触させる工程であって、ここで前記１種もしくはこれより多くの天然ポリマーは、フィブリンと：ｉ）エラスチン；および／もしくはｉｉ）コラーゲンとを含む工程；
ｂ）前記合成ポリマーを前記１種またはこれより多くの天然ポリマーでコーティングする工程であって、ここで前記合成ポリマーは、繊維状マトリクスの形態にある工程；ならびに／または
ｃ）前記合成ポリマーと前記１種もしくはこれより多くの天然ポリマーとを接触させる工程であって、ここで前記１種またはこれより多くの天然ポリマーは、エラスチンを含み、前記エラスチンは、未分画であり、かつ可溶性エラスチンを含む工程、
を包含する方法。
【請求項１７】
前記合成ポリマーは、マトリクスの形態にあり、必要に応じて前記マトリクスは、繊維状である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記マトリクスは、ナノファイバーを含み、前記ポリマーマトリクスは、電界紡糸によって形成されているか、または前記方法は、前記合成ポリマーを含む溶液を電界紡糸する工程を包含する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記マトリクスを前記１種またはこれより多くの天然ポリマーでコーティングする工程を包含する、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記マトリクスと、前記１種またはこれより多くの天然ポリマーを含む溶液または懸濁物とを接触させる工程を包含する、請求項１７〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記マトリクスを、前記１種またはこれより多くの天然ポリマーを含む溶液または懸濁物中に浸漬する工程を包含する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記１種またはこれより多くの天然ポリマーと接触された前記合成ポリマーを乾燥させる、好ましくは前記１種またはこれより多くの天然ポリマーと接触された前記合成ポリマーを凍結乾燥させる工程を包含する、請求項１６〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記合成ポリマーは、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）を含む、請求項１６〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記溶液または懸濁物は、エラスチンを含み、前記エラスチンは、未分画であって、かつ可溶性エラスチンを含み、必要に応じて前記エラスチンは、不溶性エラスチンを含む、請求項１６〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記合成ポリマーは、いかなる細胞も存在せずに、前記１種またはこれより多くの天然ポリマーと接触されるか、または接触された、請求項１６〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記足場を、１またはこれより多くの細胞とともに、エキソビボで播種する工程を包含する、請求項１６〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記１またはこれより多くの細胞は、幹細胞、必要に応じてヒト脂肪由来幹細胞を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１６〜２７のいずれかに規定されるとおりの方法によって得られるかまたは得ることができる、組織足場。
【請求項２９】
請求項１〜１５のいずれかに規定されるとおりの組織足場を含む組織または細胞培養物。
【請求項３０】
医薬としての使用のための、請求項１〜１５のいずれかに記載の組織足場。
【請求項３１】
組織治癒、再生または修復を促進することにおける使用のための、請求項１〜１５のいずれかに記載の組織足場。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、合成および天然ポリマーを有する組織足場、このような組織足場を形成するための方法、ならびにこのような組織足場の、例えば、組織工学および組織再生における適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
現代の再建手術において、組織工学アプローチを使用することによって、人工材料（ａｌｌｏｐｌａｓｔｉｃ）組織修復および組織移植の制限を克服するパラダイムシフトが起こりつつある（１）。組織工学の概念は、３０年前に始まり、臨床的治療のために生体材料から製作された足場および細胞／幹細胞の組み合わせを使用する。
【０００３】
足場は、細胞が新組織形成による組織再生およびリモデリングを達成するための最初の構造的マトリクスとして作用する。その構造様式および組成は、細胞の挙動に影響を与え、従って、細胞が機能的組織へ分化することを促進する（２，３）。ポリマー足場は、天然または合成ポリマーいずれかの供給源から製作され、両方のアプローチには、それらの利点および欠点がある。天然ポリマーは、自己分解性部分とともに生物学的におよび免疫学的に認識されるが、それらは、機械的に弱い構造であり得る（４）。対照的に、合成ポリマーは、生物学的特性としてはより弱く、機械的特性としてはより強いが、それらの機械的特性は、加水分解による分解に際して変化する（５，６）。組織再生目的に理想的なポリマーそれ自体は、ない。
【０００４】
ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）は、触媒の存在下でのε−カプロラクトンの開環重合プロセスによって製作される場合、脂肪族オリゴエステルポリマーである（７）。それは、生体適合性であり、生分解性であり、ＦＤＡが承認している。ＰＣＬはまた、他の脂肪族ポリマー（例えば、ポリ乳酸（ＰＬＡ）およびポリグリコール酸（ＰＧＡ）と比較して種々の利点を示す：１）ＰＣＬは、ＰＬＡ、例えば、ポリ−Ｌ−乳酸（ＰＬＬＡ）、ポリ−Ｄ−乳酸（ｐｏｌｙ−Ｄ−ｌａｃｔｉｄｅ  ａｃｉｄ）（ＰＤＬＡ）、ポリ−ＤＬ−乳酸（ＰＤＬＬＡ）のような異性体を有しない；２）その融解点は、ＰＬＡおよびＰＧＡのものより低く、それは、ＰＣＬに、天然の組織を模倣する広い範囲の機械的および粘弾性特性を与える（８）。しかし、それは、不十分な濡れ性および細胞接着を引き起こす疎水性という欠点を有する。さらに、それは、分解速度が遅い（８，９）。
【０００５】
機能的組織構築物をインビボで移植するか、または天然模倣組織をインビトロで生成するために、足場は、関連する細胞を住まわせて、細胞シグナル伝達機構を介して組織リモデリングを加速し得る。よって、細胞を播種した足場は、新組織形成のためのテンプレートとして作用する（１０，  １１）。幹細胞およびそれらの多能性という特性が、損傷した組織を修復し、その機能を回復させる能力を有することは、十分に確立されている。幹細胞は、骨髄、末梢血、羊水、臍帯、胚および脂肪供給源に由来し得る。また、体細胞は、幹細胞を人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）として形成するように操作され得る。脂肪由来の間葉性幹細胞（ＭＳＣ）は、それらが、低罹病率および最大収量のために最小限に侵襲性の方法によって採取されることから、有利である（１２）。さらに、ＭＳＣは、自身を自己再生することによってそれらの多能性を維持し得るが、外部の化学的および／または機械的刺激の際に、それらは、脂肪生成、骨形成性、軟骨形成性、筋形成性などのような種々の細胞系統へと分化され得る（１３）。
本発明者らは、ＰＣＬのような合成ポリマーの使用と関連する欠点が、どのようにして低減または排除され得るか、ならびに合成ポリマーに基づく足場が、それらの物理的および生物学的特性を増強して、種々の組織再生用途を促進するためにどのように改変され得るかを認識している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Hollister  SJ.  Porous  scaffold  design  for  tissue  engineering.  Nature  materials.  2005;4(7):518-24.
【非特許文献２】Yoon  DM,  Fisher  JP.  Natural  and  Synthetic  Polymeric  Scaffolds.  In:  Narayan  R,  editor.  Biomedical  Materials.  Boston,  MA:  Springer  US;  2009.  p.  415-42.
【非特許文献３】Davison  NL,  Barrere-de  Groot  F,  Grijpma  DW.  Chapter  6  -  Degradation  of  Biomaterials.    Tissue  Engineering  (Second  Edition).  Oxford:  Academic  Press;  2014.  p.  177-215.
【非特許文献４】Bhatia  S.  Natural  Polymers  vs  Synthetic  Polymer.  In:  Bhatia  S,  editor.  Natural  Polymer  Drug  Delivery  Systems:  Nanoparticles,  Plants,  and  Algae.  Cham:  Springer  International  Publishing;  2016.  p.  95-118.
【非特許文献５】Gunatillake  P,  Mayadunne  R,  Adhikari  R.  Recent  developments  in  biodegradable  synthetic  polymers.  Biotechnol  Annu  Rev.  2006;12:301-47.
【非特許文献６】Gunatillake  PA,  Adhikari  R.  Biodegradable  synthetic  polymers  for  tissue  engineering.  Eur  Cell  Mater.  2003;5:1-16;  discussion
【非特許文献７】Hoskins  JN,  Grayson  SM.  Synthesis  and  Degradation  Behavior  of  Cyclic  Poly(ε-caprolactone).  Macromolecules.  2009;42(17):6406-13.
【非特許文献８】Cipitria  A,  Skelton  A,  Dargaville  TR,  Dalton  PD,  Hutmacher  DW.  Design,  fabrication  and  characterization  of  PCL  electrospun  scaffolds-a  review.  Journal  of  Materials  Chemistry.  2011;21(26):9419-53.
【非特許文献９】Place  ES,  George  JH,  Williams  CK,  Stevens  MM.  Synthetic  polymer  scaffolds  for  tissue  engineering.  Chemical  Society  Reviews.  2009;38(4):1139-51.
【非特許文献１０】Howard  D,  Buttery  LD,  Shakesheff  KM,  Roberts  SJ.  Tissue  engineering:  strategies,  stem  cells  and  scaffolds.  Journal  of  Anatomy.  2008;213(1):66-72.
【非特許文献１１】O'Brien  FJ.  Biomaterials  &  scaffolds  for  tissue  engineering.  Materials  Today.  2011;14(3):88-95.
【非特許文献１２】Frese  L,  Dijkman  PE,  Hoerstrup  SP.  Adipose  Tissue-Derived  Stem  Cells  in  Regenerative  Medicine.  Transfusion  Medicine  and  Hemotherapy.  2016;43(4):268-74.
【非特許文献１３】Augello  A,  De  Bari  C.  The  regulation  of  differentiation  in  mesenchymal  stem  cells.  Hum  Gene  Ther.  2010;21(10):1226-38.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によれば、合成ポリマー（または人工ポリマー）および１種またはこれより多くの天然ポリマー（または生体ポリマー）を含む組織足場、ならびにこのような足場を作製するための方法が、提供され得る。このような組織足場の選択肢的なさらなる特徴、およびこのような足場を形成するための選択肢的なさらなる方法の工程は、以下に記載される。
【０００８】
上記合成ポリマーは、ポリカプロラクトンであり得る。しかし、組織工学における使用に適した他の合成ポリマーも適用可能であり得る（例えば、ポリエステル、ポリ無水物、ポリホスファゼン、ポリウレタン、およびポリ（グリセロールセバケート））。適切なポリエステルとしては、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、およびそれらのコポリマー、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）およびポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）が挙げられる。
【０００９】
上記少なくとも１種の天然ポリマーは、エラスチン、コラーゲンおよびフィブリンから選択される１種またはこれより多くの天然ポリマーを含み得る。本発明者らは、これらの天然ポリマーのうちの１種、上記天然ポリマーのうちの２種、またはこれらの天然ポリマーのうちの３種全てを使用することが、異なる用途に有益であり得る異なる特性を生じ得ることを認識している。
【００１０】
上記足場は、合成ポリマーマトリクスと：
ｉ）フィブリン（Ｆ）；
ｉｉ）エラスチン（Ｅ）；
ｉｉｉ）コラーゲン（Ｃ）；
ｉｖ）フィブリンおよびエラスチン（ＦＥ）；
ｖ）フィブリンおよびコラーゲン（ＦＣ）；
ｖｉ）エラスチンおよびコラーゲン（ＥＣ）；または
ｖｉｉ）エラスチンおよびコラーゲンおよびフィブリン（ＥＣＦ）
とを含み得る。
【００１１】
上記天然ポリマーは、天然供給源から抽出され得るか、または天然供給源に由来し得る。例えば、上記天然ポリマーは、哺乳動物供給源に由来し得る。あるいは、上記天然ポリマーは組換えであり得る。
【００１２】
エラスチンは、ウシ供給源（例えば、ウシ首靱帯）、またはヒト供給源から得られ得る。コラーゲンは、齧歯類供給源（例えば、ラット尾部）から得られ得る。
【００１３】
上記天然ポリマーは、上記合成ポリマーと接触させる前に処理され得る。例えば、上記ポリマーは、本明細書で記載される方法により従いやすくするために、可溶化または酵素処理され得る。フィブリンの場合、これは、フィブリノゲンとトロンビンとを接触させることによって形成され得る。上記ポリマーがどのように処理または形成され得るかについてのより多くの詳細は、以下に提供される。
【００１４】
本発明によれば、合成ポリマー、ならびにフィブリンと：  ｉ）コラーゲン；および／またはｉｉ）エラスチンから選択される天然ポリマーを含む組織足場が提供され得る。
【００１５】
本発明によれば、合成ポリマーと、フィブリンと：  ｉ）コラーゲン；および／またはｉｉ）エラスチンから選択される天然ポリマーとを接触させる工程を包含する、組織足場を形成するための方法が、提供され得る。
【００１６】
上記合成ポリマーは、マトリクスの形態にあり得る。上記マトリクスは、繊維状であり得る。例えば、それは、繊維状マットの形態にあり得る。上記繊維は、ランダムに配向され得る。上記繊維は、整列され得る。上記足場は、ナノファイバーを含み得る（例えば、上記マトリクスは、１０００ナノメートル（ｎｍ）未満またはこれに等しい直径を有するナノファイバーを含み得る）。しかし、上記足場は、マイクロファイバーを含み得る（例えば、上記マトリクスは、マイクロファイバーを含み得る）。上記マトリクスは、発泡体の形態になくてもよい。
【００１７】
上記繊維は、１ミリメートル未満もしくはこれに等しい、５００マイクロメートル（μｍ）未満もしくはこれに等しい、５０μｍ未満もしくはこれに等しい、または１０μｍ未満もしくはこれに等しい、１μｍ未満もしくはこれに等しい、７５０ｎｍ未満もしくはこれに等しい、５００ｎｍ未満もしくはこれに等しい、２５０ｎｍ未満もしくはこれに等しい、または１００ｎｍ未満もしくはこれに等しい、最大直径を有し得る。
【００１８】
上記繊維は、１ミリメートル未満もしくはこれに等しい、５００マイクロメートル（μｍ）未満もしくはこれに等しい、５０μｍ未満もしくはこれに等しい、または１０μｍ未満もしくはこれに等しい、１μｍ未満もしくはこれに等しい、７５０ｎｍ未満もしくはこれに等しい、５００ｎｍ未満もしくはこれに等しい、２５０ｎｍ未満もしくはこれに等しい、または１００ｎｍ未満もしくはこれに等しい、平均直径を有し得る。
【００１９】
上記繊維は、１０ｎｍ〜５００μｍの平均または最大直径を有し得る。上記繊維は、１００ｎｍ〜１００μｍの平均または最大直径を有し得る。上記繊維は、１μｍ〜２５０μｍの平均または最大直径を有し得る。上記繊維は、２５０ｎｍ〜１０μｍの平均または最大直径を有し得る。
【００２０】
上記マトリクスは、電界紡糸によって形成され得る。有利なことには、電界紡糸は、細胞外マトリクス微小構造のサイズ範囲にある繊維直径を生じ得る。足場は、上記合成ポリマーを含む溶液または融解物を電界紡糸することによって形成され得る。これは、１種またはこれより多くの天然ポリマーと接触させる前に起こり得る。あるいは、足場は、合成ポリマーおよび天然ポリマー（またはフィブリノゲンのような天然ポリマー前駆体）を含む溶液、懸濁物または融解物を電界紡糸することによって形成され得る。
【００２１】
足場は、粒子浸出（ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  ｌｅａｃｈｉｎｇ）、および熱誘導性相分離のような他の技術を使用して、または固体自由形状加工技術（ｓｏｌｉｄ  ｆｒｅｅｆｏｒｍ  ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）（例えば、３Ｄプリント立体リソグラフィー（３Ｄ−ｐｒｉｎｔｉｎｇ  ｓｔｅｒｅｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ）、粉末焼結積層法（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｌａｓｅｒ  ｓｉｎｔｅｒｉｎｇ）、溶融樹脂積層法（ｆｕｓｅｄ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ）／３Ｄプロットまたは直接書き込み（ｄｉｒｅｃｔ  ｗｒｉｔｉｎｇ）によって形成され得るが、上記足場が、これら技術のうちの１またはこれより多くを利用しないことによって製作され得ることが企図される。
【００２２】
足場は、１種またはこれより多くの天然ポリマーでコーティングされ得るマトリクスを含み得る。例えば、上記組織足場は、上記１種またはこれより多くの天然ポリマーを含む溶液または懸濁物中に、上記合成ポリマーマトリクスを浸漬することによって形成され得る。これは、上記１種またはこれより多くの天然ポリマーで、好ましくは実質的に均質に、コーティングされたマトリクスを含む足場を生じ得る。他の適切な方法は、上記マトリクスに、上記エラスチン、コラーゲンおよび／またはフィブリンを含む溶液または懸濁物をスプレーする工程を包含し得る。予め形成されたまたは予め製作されたマトリクスは、１種またはこれより多くの天然ポリマーによって接触され得る。上記合成ポリマーマトリクス上での１種またはこれより多くの天然ポリマーのコーティングは、事後コーティングと言及され得る。上記足場は、例えば、上記合成ポリマーを上記１種またはこれより多くの天然ポリマーに架橋するために、いかなる化学的架橋もなしに形成され得る。
【００２３】
本明細書で記載される明白に有益な物理的特性に加えて、合成ポリマーマトリクスの事後コーティングは、組織足場を形成するために、より融通性のある、便利かつそれほど高価でない方法を提供し得る。例えば、それは、適切な足場が既存の、いつでも購入できる合成ポリマーマトリクスを使用して製造されることを可能にし得る。
【００２４】
本発明によれば、エラスチン、フィブリンおよびコラーゲンから選択される少なくとも１種の天然ポリマーでコーティングされた繊維状合成ポリマーマトリクスを含む組織足場が、提供され得る。
【００２５】
本発明によれば、組織足場を形成するための方法であって、上記方法は、繊維状合成ポリマーマトリクスを、フィブリン、コラーゲンおよびエラスチンから選択される１種またはこれより多くの天然ポリマーでコーティングする工程を包含する方法が、提供され得る。
【００２６】
事後コーティングの代替として、上記足場は、上記合成ポリマーおよび上記少なくとも１種の天然ポリマーを含むマトリクスを形成することによって製造され得る。例えば、上記足場は、上記合成ポリマーおよび上記少なくとも１種の天然ポリマーを含む繊維を形成することによって製造され得る。これは、例えば、繊維を、上記合成ポリマーおよび上記少なくとも１種の天然ポリマーの両方を含む溶液または懸濁物から形成することによって達成され得る。上記繊維は、電界紡糸、またはガス吹き込み（ｇａｓ−ｂｌｏｗｉｎｇ）もしくはガスブラッシング（ｇａｓ−ｂｒｕｓｈｉｎｇ）のような他の技術によって形成され得る。
【００２７】
フィブリンの溶液または懸濁物は、フィブリノゲンとトロンビンとを接触させることによって形成され得る。例えば、フィブリノゲン溶液（例えば、２％  フィブリノゲン溶液）は、ＰＢＳ中で、トロンビンとともに溶解され得る。従って、フィブリンの形成は、上記マトリクスとの接触前に起こり得る。しかし、本発明の組織足場が、上記マトリクスと、フィブリノゲンを含む溶液または懸濁物とを接触させることによって形成され得ることは、認識される。次いで、フィブリンの形成は、トロンビンの添加によって、上記マトリクスに対してインサイチュで起こり得る。上記フィブリンは、ヒドロゲルの形態になくてもよい。
【００２８】
コラーゲンの溶液または懸濁物は、コラーゲン（例えば、ラット尾部コラーゲン）と、１０×最小必須培地とを混合し、水酸化ナトリウム溶液を添加することで中和することによって形成され得る。
【００２９】
エラスチンの溶液または懸濁物は、エラスチンを可溶化することによって形成され得る。可溶化したエラスチン、または可溶性エラスチンはまた、加水分解エラスチンまたはエラスチンペプチドと言及され得る。
【００３０】
エラスチンを可溶化する一般的方法は、エラスチンを、１００℃の０．２５Ｍ  シュウ酸で処理するか、またはエラスチンを、８０％  エタノール中の１Ｍ  ＫＯＨで処理することを含む。さらに、弾性繊維を分解し得るタンパク質分解酵素（多角形白血球に由来するセリンタイプエラスターゼおよび単球／マクロファージ起源のいくつかのメタロエラスターゼを含む）はまた、可溶化エラスチンを生じる。エラスチンの加水分解形態の例は、以下の表に示される。
【表２】
2021533908.tif 000002
【００３１】
シュウ酸での加水分解後に得られるエラスチンペプチドは、１０ｍＭ  酢酸ナトリウム中で、酢酸でｐＨ５．５に設定した１０ｍＭ  ＮａＣｌとともに懸濁し、続いて、加熱および３７℃での遠心分離後にコアセルベートになり得る。この結果として、２つの画分が形成される（α−エラスチン（粘性のコアセルベート）およびβ−エラスチン（上清中にある）。
【００３２】
従来の組織工学用途は、可溶性の分画したエラスチンを使用することに焦点を当てていたが、本発明者らは、適切なエラスチン組成物が、エラスチンの画分を分離または単離する（例えば、α−エラスチンおよびβ−エラスチンを分離または単離する）要求なしに、エラスチンを可溶化剤に単に曝露することによって、およびその工程の生成物を使用することによって形成され得ることを驚くべきことに見出した。得られるエラスチンは、従って、粗製または未分画と考えられ得る。有利なことには、本発明は、α−エラスチン画分を単離することに付随する時間、不便および費用を回避し得る。本発明はまた、α−エラスチンおよびβ−エラスチンを分離する工程が回避され得ることから、総収量を改善し得る。
【００３３】
結論として、上記合成ポリマーマトリクスと接触されるエラスチンは、未分画であり得、かつ可溶性エラスチンを含み得る。必要に応じて、上記エラスチンはまた、不溶性エラスチンを含み得る。上記未分画エラスチンは、従って、１もしくはこれより多くのエラスチン画分の精製（ｐｕｒｉｆｙｃａｔｉｏｎ）、単離、分離または精製（ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ）が存在していない粗製エラスチン、またはエラスチンと可溶化剤との接触から生じるエラスチンの１もしくはこれより多くの異なる形態であり得る。例えば、１もしくはこれより多くの可溶性エラスチン画分の単離、または可溶性エラスチン画分からの不溶性エラスチン画分の分離はされていなくてもよい。結論として、上記組成物は、エラスチンの異なる可溶性形態を含み得る。上記組成物は、可溶化されていないエラスチンを含み得る。上記組成物は、従って、可溶性および不溶性両方の形態のエラスチンを含み得る。例えば、可溶化剤との接触後に、上記エラスチンは、遠心分離に供されなくてもよい。可溶化剤との接触後のエラスチンの分画、精製（ｐｕｒｉｆｙｃａｔｉｏｎ）、単離、分離または精製（ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ）はなくてもよい。
【００３４】
上記エラスチンは、酸、最も好ましくはシュウ酸と接触させることによって可溶化されてもよいし、または可溶化されていてもよい。上記エラスチンは、１００℃未満の温度、好ましくは５０℃未満もしくはこれに等しい温度で、より好ましくは１５〜３０℃の温度（例えば、室温）で可溶化され得る。
【００３５】
上記酸、好ましくはシュウ酸は、１Ｍ未満、好ましくは０．７５Ｍ未満、より好ましくは０．５Ｍで、または０．５Ｍ未満であり得る。上記酸は、少なくとも０．２５Ｍであり得る。例えば、上記酸は、０．２Ｍ〜１Ｍ、例えば、０．２５Ｍ〜０．７５Ｍであり得る。
【００３６】
エラスチンの可溶化、またはエラスチンと酸（好ましくはシュウ酸）との接触は、少なくとも３０秒間、より好ましくは少なくとも１分間起こり得る。例えば、上記可溶化、または酸との接触は、約１〜３分間起こり得る。上記可溶化、または酸との接触は、最大５分間起こり得る。これは、代表的には約１時間起こる、シュウ酸でのエラスチンの従来の処理と対照をなす。
【００３７】
本発明によれば、合成ポリマー、およびエラスチンを含む少なくとも１種の天然ポリマーを含む組織足場であって、ここで上記エラスチンは、未分画でありかつ可溶性エラスチンを含む組織足場が、提供され得る。
【００３８】
本発明によれば、組織足場を形成するための方法であって、上記方法は、合成ポリマーと、エラスチンを含む少なくとも１種の天然ポリマーとを接触させる工程であって、ここで上記エラスチンは、未分画でありかつ可溶性エラスチンを含む工程を包含する方法が、提供される。
【００３９】
本発明の足場は、好ましくはヒドロゲルではないか、またはヒドロゲルを含まない。上記足場は、乾燥していてもよく、従って、実質的には水を含まなくてもよい。５％もしくはこれ未満（重量で）の水、３％もしくはこれ未満（重量で）の水、２％もしくはこれ未満（重量で）の水、または１％もしくはこれ未満（重量で）の水が存在し得る。
【００４０】
上記足場は、凍結乾燥されていてもよいし、任意の他の適切な手段で乾燥されていてもよい。凍結乾燥は、少なくとも２４時間（例えば、少なくとも４８時間）起こり得る。
【００４１】
上記マトリクスは、１種またはこれより多くの天然ポリマーと、いかなる細胞も存在せずに、接触されてもよいし、接触させられていてもよい。上記マトリクスが上記１種またはこれより多くの天然ポリマーと一旦接触させられると、その得られる足場は、１またはこれより多くの細胞が播種され得る。上記足場の播種は、インビトロまたはエキソビボで起こり得る。結論としては、本発明は、１またはこれより多くの細胞との組み合わせにおいて本発明の足場を提供し得る。被験体への付与の前に、上記足場に細胞を播種すると、組織リモデリングの加速が補助され得る。上記細胞は、幹細胞であり得る。適切な幹細胞としては、ヒト脂肪由来幹細胞（ｈＡＤＳＣ）が挙げられる。
【００４２】
本発明によれば、本明細書で記載されるとおりの組織足場を含む組織または細胞培養物が、提供され得る。
【００４３】
上記足場は、１２０μｍもしくはこれ未満の平均孔直径を有し得る。足場は、１００μｍもしくはこれ未満の平均孔直径を有し得る。足場は、１０μｍもしくはこれより大きい平均孔直径を有し得る。足場は、２０μｍもしくはこれより大きい平均孔直径を有し得る。例えば、足場は、１０〜１５０μｍの平均孔直径を有し得る。足場は、１０〜１００μｍの平均孔直径を有し得る。足場は、１〜７５μｍ（例えば、１〜５０μｍ）の平均孔直径を有し得る。
【００４４】
有利なことには、孔サイズ分布は、天然ポリマーの異なる組み合わせを含めることによって調節され得る。これは、例えば、図５に示される。いくつかの足場（例えば、エラスチン；コラーゲン＆エラスチン；  コラーゲン＆フィブリン；  エラスチン＆フィブリン；  およびコラーゲン、エラスチン＆フィブリンを含むもの）は、１〜５０μｍの直径を有するものがそれらの孔のうちの少なくとも５０％あってもよい。いくつかの足場（例えば、エラスチン；  コラーゲン＆フィブリン；  エラスチン＆フィブリンを含むもの）は、１〜５０μｍの直径を有するものがそれらの孔のうちの少なくとも少なくとも７５％あってもよい。
【００４５】
上記足場は、１〜１００μｍの直径を有するものがそれらの孔のうちの少なくとも５０％あってもよい。
【００４６】
足場の特徴（例えば、孔サイズおよび多孔性）は、適切な容易に利用可能なソフトウェアを使用して計算され得る。例えば、ＮＤ（「Ｎｅａｒｅｓｔ  Ｄｉｓｔａｎｃｅ」）は、平均サイズおよび孔間の距離および多孔性足場におけるそれらの最も近くにある隣り合うものを計算するために開発されたＩｍａｇｅＪプラグインである。ＤｉａｍｅｔｅｒＪは、孔パラメーターを測定するために使用され得るＩｍａｇｅＪプラグインの別の例である。足場の肉眼画像（例えば、ＳＥＭ画像）は、入力として使用され得る。
【００４７】
足場の多孔性は、少なくとも２０％であり得る。上記足場の多孔性は、少なくとも４０％であり得る。上記足場の多孔性は、８０％未満であり得る。上記多孔性は、使用される天然ポリマーの具体的組み合わせに依存して変動し得る。これは、例えば、図５に示される。
【００４８】
上記足場は、無菌であり得る。上記足場は、例えば、密封されたパッケージの中にパッケージされ得る。
【００４９】
本発明の足場は、多層足場（例えば、合成ポリマーおよび少なくとも１種の天然ポリマーの交互の層から形成される足場）でなくてもよい。例えば、上記足場は、上記少なくとも１種の天然ポリマーと接触される、合成ポリマーマトリクスの単層を含み得る。
【００５０】
上記組織足場は、医薬としての使用のためのものであり得る。上記組織足場は、ヒト被験体に投与または付与され得る。
【００５１】
上記組織足場は、組織工学における使用のためのものであり得る。上記組織足場は、組織治癒、再生または修復を促進することにおける使用のためのものであり得る。
【００５２】
本発明によれば、組織再生、組織治癒または組織修復を促進するための方法であって、上記方法は、本明細書で記載されるとおりの組織足場を必要性のある患者に投与する工程を包含する方法が提供され得る。
【００５３】
上記足場は、治療用途における使用のためのものであり得る。上記足場は、非治療用途または方法（例えば、化粧用の用途または方法）において使用されなくてもよい。例えば、上記足場は、組織または器官（例えば、皮膚）の外見を改善するために使用され得る。
【００５４】
本発明によれば、組織再生、組織治癒または組織修復を促進するための医薬の製造における、本明細書で記載されるとおりの組織足場の使用が提供され得る。
【００５５】
いくつかの足場は、他よりある種のタイプの組織再生により適切であり得る。例えば、足場は、天然の組織の再生能力に合わせて作られ得る。
【００５６】
分解に対してあまり耐性のない足場は、強い再生能および修復能を有する傾向にある大きな器官操作（例えば、皮膚および肝臓）に、より適用可能であり得る。例えば、エラスチンおよびエラスチンおよびフィブリンを含む足場は、適切であり得る。
【００５７】
分解に対してより耐性である足場は、より弱い再生特性を有する傾向にある軟性の結合組織工学（例えば、腱および靱帯）に対してより適用可能であり得る。例えば、コラーゲン；フィブリノゲン；コラーゲン＆エラスチン；コラーゲン、エラスチン＆フィブリンを含む足場は、適切であり得る。
【００５８】
いくつかの足場は、他より血管新生促進性であり得る。例えば、フィブリンまたはフィブリン＆コラーゲンを含む足場は、特に血管新生促進性であり得る。エラスチン、またはエラスチンおよびコラーゲンを含む足場は、中程度に血管新生促進性であり得るのに対して、エラスチンおよびフィブリンを含む足場は、特に血管新生促進性でなくてもよい。血管新生を促進する能力は、他よりいくつかの組織工学用途にとってより重大であり得る。
【００５９】
上記足場の機械的特性はまた、それらの潜在的用途に対する挙動を有し得る。例えば、より強い足場は、整形外科的組織工学にとって潜在的可能性を有し得る。より強い足場は、コラーゲンおよびフィブリンを含み得る。より弱い足場は、軟組織工学に適用可能であり得る（これは、エラスチン；  コラーゲン＆エラスチン；エラスチン＆フィブリン；コラーゲン、エラスチン＆フィブリンを含む足場を含み得る）。
【００６０】
本発明に従い得る例は、以下の番号付けした箇条に列挙される。
１．  合成ポリマー、ならびにフィブリン、コラーゲンおよびエラスチンから選択される１種またはこれより多くの天然ポリマーを含む組織足場
２．  上記合成ポリマーは、マトリクスの形態にある、箇条１に記載の組織足場。
３．  繊維を含み、必要に応じて上記合成ポリマーは、繊維状マトリクスの形態にある、箇条１または箇条２に記載の組織足場。
４．  上記繊維は、１０ｎｍ〜５００μｍ、１００ｎｍ〜１００μｍ、１μｍ〜２５０μｍまたは２５０ｎｍ〜１０μｍの平均直径を有する、箇条３に記載の組織足場。
５．  上記繊維は、１０ｎｍ〜５００μｍ、１００ｎｍ〜１００μｍ、１μｍ〜２５０μｍまたは２５０ｎｍ〜１０μｍの最大直径を有する、箇条３または箇条４に記載の組織足場。
６．  ナノファイバーを含み、必要に応じて上記合成ポリマーは、ナノファイバーマトリクスの形態にある、前述のいずれかの箇条に記載の組織足場。
７．  電界紡糸された繊維を含み、必要に応じて上記合成ポリマーは、電界紡糸されたマトリクスの形態にある、前述のいずれかの箇条に記載の組織足場。
８．  上記マトリクスは、１種またはこれより多くの天然ポリマーでコーティングされる、箇条２〜５のいずれかに記載の組織足場。
９．  凍結乾燥されている、前述のいずれかの箇条に記載の組織足場。
１０．  エラスチンを含む、前述のいずれかの箇条に記載の組織足場。
１１．  上記エラスチンは、未分画でありかつ可溶性エラスチンを含む、箇条１０に記載の組織足場。
１２．  フィブリンを含む、前述のいずれかの箇条に記載の組織足場。
１３．  コラーゲンを含む、前述のいずれかの箇条に記載の組織足場。
１４．  上記合成ポリマーは、ＰＣＬを含む、前述のいずれかの箇条に記載の組織足場。
１５．  エキソビボまたはインビトロにある、前述のいずれかの箇条に記載の組織足場。
１６．  少なくとも１個の細胞との組み合わせにあり、好ましくは上記足場は、上記少なくとも１個の細胞が播種されている、前述のいずれかの箇条に記載の組織足場。
１７．  上記少なくとも１個の細胞は、幹細胞（例えば、ｈＡＤＳＣ）を含む、箇条１６に記載の組織足場。
１８．  １〜１５０μｍ、または１０〜１００μｍの平均孔直径を有する、前述のいずれかの箇条に記載の組織足場。
１９．  １〜１００μｍの直径を有するものがそれらの孔のうちの少なくとも５０％ある、前述のいずれかの箇条に記載の組織足場。
２０．  少なくとも２０％または少なくとも４０％の多孔性を有する、前述のいずれかの箇条に記載の組織足場。
２１．  組織足場を形成するための方法であって、上記方法は、合成ポリマーと、フィブリン、コラーゲンおよびエラスチンから選択される１種またはこれより多くの天然ポリマーとを接触させる工程を包含する方法。
２２．  合成ポリマーマトリクスを形成する工程を包含するか、または上記組織足場は合成ポリマーマトリクスの形態にある、箇条２１に記載の方法。
２３．  上記マトリクスを上記天然ポリマーのうちの１またはこれより多くでコーティングする工程を包含する、箇条２２に記載の方法。
２４．  上記マトリクスと、上記天然ポリマーのうちの１またはこれより多くを含む溶液または懸濁物とを接触させる工程を包含する、箇条２２または箇条２３に記載の方法。
２５．  上記合成ポリマーマトリクスを、上記天然ポリマーのうちの１またはこれより多くを含む溶液または懸濁物に浸漬する工程を包含する、箇条２４に記載の方法。
２６．  上記ポリマーマトリクスは、繊維状である、箇条２２〜２５のいずれかに記載の方法。
２７．  上記マトリクスは、ナノファイバーを含む、箇条２６に記載の方法。
２８．  上記ポリマーマトリクスは、電界紡糸することによって形成されているか、または上記方法は、上記合成ポリマーを含む溶液を電界紡糸する工程を包含する、箇条２６または２７に記載の方法。
２９．  上記合成ポリマーと、上記１種またはこれより多くの天然ポリマーとの接触後の凍結乾燥を含む、箇条２１〜２８のいずれかに記載の方法。
３０．  上記合成ポリマーは、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）を含む、箇条２１〜２９のいずれかに記載の方法。
３１．  上記１種またはこれより多くの天然ポリマーは、エラスチンを含む、箇条２１〜３０のいずれかに記載の方法。
３２．  上記エラスチンは、未分画であり、かつ可溶性エラスチンを含む箇条３１に記載の方法。
３３．  エラスチンを可溶化する工程を包含する、箇条３２に記載の方法。
３４．  上記エラスチンは、シュウ酸との接触によって可溶化されるかまたは可溶化されている、箇条３２または箇条３３に記載の方法。
３５．  上記エラスチンは、１００℃未満の温度で可溶化されるかまたは可溶化されている、箇条３２〜３４のいずれかに記載の方法。
３６．  上記エラスチンを可溶化する工程は、５０℃未満またはこれに等しい温度で行われるかまたは行われている、箇条３２〜３５のいずれかに記載の方法。
３７．  上記エラスチンを可溶化する工程は、１５〜３０℃の温度で行われるかまたは行われている、箇条３２〜３６のいずれかに記載の方法。
３８．  上記エラスチンは、３０秒〜５分間、必要に応じて１〜３分間の器官にわたって可溶化されるかまたは可溶化されている、箇条３２〜３７のいずれかに記載の方法。
３９．  上記エラスチンは、不溶性エラスチンを含む、箇条３１〜３８のいずれかに記載の方法。
４０．  上記１種またはこれより多くの天然ポリマーは、フィブリンを含む、箇条２１〜３９のいずれかに記載の方法。
４１．  上記１種またはこれより多くの天然ポリマーは、コラーゲンを含む、箇条２１〜４０のいずれかに記載の方法。
４２．  組織足場を形成するための方法であって、上記方法は、フィブリン、コラーゲンおよびエラスチンから選択される１種またはこれより多くの天然ポリマーと接触されている合成ポリマーマトリクスを凍結乾燥する工程を包含する方法。
４３．  上記マトリクスは、いかなる細胞も存在せずに、上記１種またはこれより多くの天然ポリマーと接触されるかまたは接触されている、箇条２１〜４２のいずれかに記載の方法。
４４．  上記足場は、インビトロまたはエキソビボで形成される、箇条２１〜４３のいずれかに記載の方法。
４５．  上記１種またはこれより多くの天然ポリマーと接触しているマトリクスに、１またはこれより多くの細胞をエキソビボで播種する工程を包含する、箇条２１〜４４のいずれかに記載の方法。
４６．  上記１またはこれより多くの細胞は、幹細胞（例えば、ｈＡＤＳＣ）を含む、箇条４５に記載の方法。
４７．  箇条２〜４６のいずれかに規定されるとおりの方法によって得られるかまたは得られ売る組織足場。
４８．  箇条１〜２０、または４７のいずれかに規定されるとおりの組織足場を含む組織または細胞培養物。
４９．  医薬としての使用のための、箇条１〜２０、または４７のいずれかに記載の組織足場。
５０．  組織治癒、再生または修復を促進することにおける使用のための、箇条１〜２０、または４７のいずれかに記載の組織足場。
５１．  組織再生、組織治癒または組織修復を促進するための方法であって、上記方法は、箇条１〜２０、または４７のいずれかに記載の組織足場を、必要性のある患者に付与する工程を包含する方法。
５２．  組織再生、組織治癒または組織修復を促進するための医薬の製造における、箇条１〜２０、または４７のいずれかに記載の組織足場の使用。
５３．  無菌である、箇条１〜２０、または４７のいずれかに記載の組織足場。
５４．  パッケージされている、箇条１〜２０、または４７のいずれかに記載の組織足場。
【００６１】
組織足場およびそれらの生成のための方法の具体例は、以下の図面を参照しながら提供される。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は、ＰＣＬベースの複合材足場の膨潤率を示す（＊＊＊＊  ｐ＜０．０００１  １０分間および２４時間に関するＰに対する有意性）；
【図２】図２は、ＰＣＬと他の７種のＰＣＬベースの複合材足場との間の水接触角を示す。
【図３】図３は、ＰＣＬベースの複合材足場の加速分解アッセイ肉眼画像（Ａ）および分解速度（Ｂ）を示す。
【図４】図４は、ＰＣＬベースの複合材足場の機械的特性を示す（＊＊＊  ｐ＜０．００１  Ｐに対する有意性）。
【図５】図５は、ＰＣＬベースの複合材足場（Ｐ（Ａ）、ＰＣ（Ｂ）、ＰＥ（Ｃ）、ＰＦ（Ｄ）、ＰＣＥ（Ｅ）、ＰＣＦ（Ｆ）、ＰＥＦ（Ｇ）、ＰＣＥＦ（Ｈ）（上記足場上の＋コラーゲン、＊エラスチンおよび＃フィブリン）のＳＥＭ画像を示す。孔サイズ分布（Ｉ）および全足場の多孔性（Ｊ））。
【図６】図６は、１日目、３日目および７日目の５７０ｎｍでのＰＣＬベースの複合材足場のＡｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ吸収を示す。＊、＋、＝、＃は、それぞれ、１日目からのｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、＝ｐ＜０．００１、ｐ＜０．０００１の統計的有意性を示す。
【図７】図７は、１日目、３日目および７日目のＰＣＬベースの複合材の生存／死滅アッセイおよび細胞挙動を示す。
【図８】図８は、Ｐ（Ａ）、ＰＣ（Ｂ）、ＰＥ（Ｃ）、ＰＦ（Ｄ）、ＰＢＳ、陰性コントロール（Ｅ）、ＰＣＥ（Ｆ）、ＰＣＦ（Ｇ）、ＰＥＦ（Ｈ）、ＰＣＥＦ（Ｉ）、ＶＥＧＦ陽性コントロール（Ｊ）および各足場の血管領域パーセンテージを各足場に関して（Ｋ）示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１  Ｐに対する有意性Ｐ）；
【図９】図９は、ＰＣＬベースの複合材足場Ｐ（Ａ）、ＰＣ（Ｂ）、ＰＥ（Ｃ）、ＰＦ（Ｄ）、ＰＣＥ（Ｅ）、ＰＣＦ（Ｆ）、ＰＥＦ（Ｇ）、ＰＣＥＦ（Ｈ）の分化経路研究を示す（１日目に対しておよび＃３日目に対して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１および＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【実施例】
【００６３】
実施例１  −  天然ポリマーの製剤化
コラーゲン：  −  コラーゲン溶液を、９０％  ラット尾部コラーゲン（Ｆｉｒｓｔ  Ｌｉｎｋ，  Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，  ＵＫ）を使用することによって作製し、これを、１０％  １０×最小必須培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｐａｉｓｌｅｙ，  ＵＫ）と混合し、５Ｍおよび１Ｍ  ＮａＯＨを滴下することによって中和した（１４）。
【００６４】
エラスチン：  −  エラスチン溶液を、１００ｍｇの不溶性エラスチン（Ｓｉｇｍａ，  ＵＫ）と１ｍｌの０．５Ｍ  シュウ酸（Ｃ２Ｈ２Ｏ４）（新しく調製）とを室温において混合することによって作製した。
【００６５】
フィブリン：  −  フィブリン溶液を、２％  フィブリノゲン（Ｓｉｇｍａ，  ＵＫ）を１ｍｌのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，  ＵＫ）中にトロンビン（Ｓｉｇｍａ，  ＵＫ）とともに溶解することによって形成した。
【００６６】
実施例２  −  ＰＣＬ−天然ポリマー複合材足場の製作
１．１±０．０４ｍｍ膜厚の特注の電界紡糸ＰＣＬ  ｍｉｍｅｔｉｘ（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｉｎｎｉｎｇ  ｃｏｍｐａｎｙ  Ｌｔｄ，  Ｄｉｄｃｏｔ，  ＵＫ）エアシート（ａｉｒ  ｓｈｅｅｔ）を、この研究において使用した。６×６ｃｍ２のセグメントを切断し、ｉ）コラーゲン（ＰＣ）、ｉｉ）エラスチン（ＰＥ）、ｉｉｉ）フィブリン（ＰＦ）、ｉｖ）コラーゲン／エラスチン（１：１）（ＰＣＥ）、ｖ）コラーゲン／フィブリン（１：１）（ＰＣＦ）、ｖｉ）エラスチン／フィブリン（１：１）（ＰＥＦ）、およびｖｉｉ）コラーゲン／エラスチン／フィブリン（１：１：１）（ＰＣＥＦ）の溶液に浸けることによってコーティングした。全てのコーティングしたサンプルおよびコントロールサンプルを、４８時間凍結乾燥して、ＰＣＬ−天然ポリマー複合材足場を形成した。
【００６７】
実施例３  −  膨潤率
ＰＣＬおよび７種の複合材足場の膨潤率（ＳＲ）を、以下に与える式を用いて乾燥質量および湿質量から測定した：
【数１】
2021533908.tif 000003
ここでＭｄは乾燥質量であり、Ｍｗは、上記足場の湿質量である（１５）
【００６８】
上記足場の湿質量を、上記サンプルを、２ｍｌの蒸留水（ＥＬＧＡ  ＰＵＲＥＬＡＢ  Ｏｐｔｉｏｎ）に浸漬することによって獲得し、この次に、上記足場質量をデジタルスケール（ＸＳ２０５  Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ（登録商標））で測定した。蒸留水へと、室温で１０分間および３７℃で２４時間、ならびに５％  ＣＯ２で浸漬した足場のＳＲを、式を使用して計算した。
【００６９】
水性溶媒が溶媒の部分として吸収されるので足場を水の中に置き、その後、上記足場の膨潤を引き起こした。この定常状態において、足場の膨潤率は、ＰＣＬに対するコーティングポリマーの架橋の程度に正比例する。室温で１０分後のＰＣＬの膨潤率は、６６．０２±５．９４％であり、それは、３７℃で２４時間後に８１．６２±２．２３％へと有意に増大した。ＰＣＬが天然ポリマーでコーティングされた場合、膨潤率は、１０分間の溶媒との相互作用において７８．７３％〜８５．６８％の範囲において有意に高かった（ｐ＜０．０００１）（図１）。足場を、３７℃において５％  ＣＯ２で２４時間にわたってインキュベーターの中に入れた場合、その計算した膨潤率は、８１．６０％〜８８．１９％の範囲にあった。膨潤率におけるこの変化は、その疎水性が原因でＰＣＬを除いて、１０分間と比較して、わずか（ｍａｒｇｉｎａｌ）であった。膨潤の程度は、上記足場と水性媒体との間の相互作用を示し、それは、溶媒が上記足場を浸透によって希釈しようとする結果である。しかし、このエントロピー増大は、温度、時間および圧力の変動によって影響を及ぼされなかった。
【００７０】
実施例４  −  動的水接触角
上記足場のぬれ性を、動的水接触角（ｄＷＣＡ）測定を使用して調査した。各足場のｄＷＣＡを、３０μＬ  蒸留水液滴を各足場上に分与した実験設定で決定した一方で、ｄＷＣＡに対する変更を、動画として記録した（１６）。ｄＷＣＡを、０〜５秒間の時間間隔にわたって、各秒で撮影したスクリーンショットを使用して測定した。０秒の時点を、水滴と、上記足場上で発達したプロフィールとの最初の接触とみなした。各足場に関するｄＷＣＡの測定を、ＩｍａｇｅＪ（１．８．０＿１１２）ソフトウェア（ＮＩＨ，  ＵＳ）の助けを借りて手動で行った。ｄＷＣＡを、ヤングの式の原則を使用して測定し、ここでその角を、４００％倍率において、水−足場界面から水滴の境界に対する接線まで角度ツールを使用して測定した。ミリ秒内で上記足場に吸収された水滴、および明確に規定されたプロフフィールのない水滴は、ゼロｄＷＣＡを有するとみなした。
【００７１】
ｄＷＣＡは、水−材料相互作用を示す：より高いｄＷＣＡは、水と材料との間のより弱い相互作用に正比例する。ＰＣＬのｄＷＣＡは、１３２．７１±３．２８°であり、５秒後には、それは、１３４．０４±３．４０°であった。これは、ＰＣＬの疎水性の性質を示す。しかし、ＰＣＬを天然ポリマーでコーティングした場合、時間０においてｄＷＣＡは減少した（ＰＣ  ７０．４５±８．１５°、ＰＥ  ７７．８５±２．１１°、ＰＦ  ５４．７５±１３．３３°、ＰＣＥ  ４６．２７±１８．７４°、ＰＣＦ  ５８．２８±１．０６°、ＰＥＦ  ６９．２８±１．７１°、ＰＣＥＦ  ６５．５０±１１．９５°）。１秒では、ｄＷＣＡは、０°に低下した。これは、コーティングした足場の完全なぬれ性を示す（図２）。全ての足場の中で、ＰＣＥ足場は最も親水性である一方で、ＰＣＬは最小であった。
【００７２】
実施例５  −  インビトロ加速分解試験
異なる足場の初期重量を、ＸＳ２０５  Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ（登録商標）デジタルスケールを使用して測定した。上記足場を、２４ウェルプレートの中に１Ｍ  水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  ＵＫ）とともに入れ、３７℃でインキュベートした。各時点で、足場を蒸留水（ＥＬＧＡ  ＰＵＲＥＬＡＢ  Ｏｐｔｉｏｎ）中で洗浄し、凍結乾燥した。各足場の分解後重量を、各時点について測定し、顕微鏡画像および肉眼画像の両方を、立体顕微鏡（０．７×［ズーム］，  ＧＸ顕微鏡）およびデジタルカメラ（Ｃａｎｏｎ  ＰｏｗｅｒＳｈｏｔ  ＳＸ４００  ＩＳ）で得た。
【００７３】
インビトロ加速分解結果は、全ての足場が異なる速度で分解することを示した。分解前および分解後の各生体材料の正味重量の変化を、分解のパラメーターのうちの１つとして測定した（図３Ｂ）。正味重量の減少を、１日目の全ての足場に関して観察した。５日目までに、最も分解した足場はＰＥ（９５％）であった。ＰＣＦが最も少なかった（７０％）が、Ｐ、ＰＣ、ＰＦ、ＰＣＥ、ＰＥＦ、ＰＣＥＦは、７０％〜７５％の範囲で分解した。７日目までに、ＰＥは、１００％分解され、続いて、ＰＥＦが９８％であったが、ＰＣＦはなおも、最も少なく分解された（８５％）足場であった。しかし、１２日目の最後まで、Ｐ、ＰＣ、ＰＦ、ＰＣＦを除いて、上記足場の残りは、１００％分解され、１４日目までに、ＰＣＦ（１．１６％）、Ｐ（１．０５％）およびＰＣ（０．０２％）が、わずかに存在した。肉眼観察から、初期の組織化された幾何学的形状への時間依存性の形態変化が明らかになった（図３Ａ）。
【００７４】
実施例６  −  機械的特性
全てのＰＣＬベースの足場を、試験速度３０ｍｍ／分でＺｗｉｃｋ／Ｒｏｅｌｌ（Ｚ００５  ｍｏｄｅｌ  Ｕｌｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して故障するまで試験した。領域入力を計算し、故障するまで力を印加した。破断強さ出力を、ｔｅｓｔＸｐｅｒｔ  Ｖ１０．０ソフトウェア（Ｚｗｉｃｋ，  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ，  Ｕｌｍ  Ｇｅｒｍａｎｙ）によって生成した。
【００７５】
足場の機械的特性を研究して、ＰＣＬを天然ポリマーでコーティングする効果を分析した。Ｐのヤング率（１．０６±０．１０ＭＰａ）は、ＰＣのもの（１．０６±０．０８ＭＰａ）に類似であった。他方で、他の足場（ＰＥ  ０．６６±０．０１ＭＰａ、ＰＣＥ  ０．７７±０．２１ＭＰａ、ＰＥＦ  ０．７４±０．１２ＭＰａ、ＰＣＥＦ  ０．７３±０．２０ＭＰａ）については、ヤング率は減少した一方で、ＰＦについては増大した（１．２８±０．０２ＭＰａ）（図４）。しかしこの差異は、わずかであった（ｐ＞０．０５）（図４）。しかし、ＰＣＦは、有意であり（Ｐ＜０．０５）、全てのポリマーの中で最も強い（１．９９±０．１１ＭＰａ）足場であった。これは、天然ポリマーでのＰＣＬのコーティングが、ＰＣＬの機械的強度に影響を与えることを示す。
【００７６】
実施例７  −  走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）
全てのＰＣＬベースの複合材を、脱イオン水で洗浄して、過剰な塩および結合していないポリマーを除去した。全てのサンプルを、標準的なプロトコールで慣用的に調製し、カーボンコーターでのスパッターコーティング後にスタブに取り付けた。全ての画像を、Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＸＬ  ３０  Ｆｉｅｌｄ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ＳＥＭ（５ｋＶで操作）における二次電子検出器を使用して得、平均作動距離は、１０ｍｍであった。足場の多孔性パーセンテージおよび孔直径範囲を測定するために、全てのＳＥＭ画像を、６４ビットＪａｖａ（登録商標）１．６．０（ＮＩＨ，  ＵＳＡ）を搭載したＩｍａｇｅＪを使用して定量的に分析した。閾値周波数を、全ての孔を可視化するために調節した。領域割合関数を、多孔性を計算するために使用し、粒子分析関数を、各々の直径を決定するために使用した。
【００７７】
全ての足場は、ポリマーでのコーティング後の孔特性におけるバリエーションを示した。予測されるように、最も多孔性の足場（図５Ｊ）は、Ｐ（８０．３３％）であり、孔直径のほぼ７５％が、１００μｍ〜２０１＋μｍの間で分布した（図５Ｉ）。これらの孔特性は、ＰＣＬを天然ポリマーでコーティングした場合に減少した：  ＰＣ（５７．１６％  多孔性）については、孔のうちの８０％が、１〜１００μｍ範囲の中にあり、ＰＥ（６４．７８％  多孔性）については、孔のうちの８５％が、１〜１００μｍの範囲の中にあり、ＰＦ（５２．１６％  多孔性）については、９５％  孔が、１〜１５０μｍの範囲の中にあった。しかし、孔特性は、天然ポリマーの２成分層および３成分層がＰＣＬ足場に添加された場合にさらに変化した：  ＰＣＥ（５１．１８％  多孔性）、ＰＥＦ（５０．４１％  多孔性）およびＰＣＥＦ（４７．４６％  多孔性）についての計算した孔分布パーセンテージは、孔のうちの９０％が１〜１００μｍの範囲の中にあった（図５）。全ての足場の中で、ＰＣＦの多孔性（２２．８６％）が最も低く、孔のうちの９７％が０〜５０μｍの範囲の中にあった。
【００７８】
実施例８  −  細胞培養
上記足場の有効性および生物学的活性を評価するために、ヒト脂肪由来幹細胞（ｈＡＤＳＣ）（ＡＴＣＣ，ＵＫ）を、標準的な培養条件、すなわち、２％  ＭｅｓｅｎＰＲＯ  ＲＳＴＭ増殖補充物質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，  ＵＫ）および１％  ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  ＵＫ）を補充したＭｅｓｅｎＰＲＯ  ＲＳＴＭ基礎細胞培養培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，  ＵＫ）中で、３７℃において５％  ＣＯ２でインキュベートした。細胞を、８０％  コンフルエントで寛容用的に継代し、全ての実験を、３または４継代目に行った。
【００７９】
実施例９  −  細胞増殖および生存性アッセイ
レサズリンベースのＡｌａｍａｒ  ｂｌｕｅアッセイを、増殖の定量的尺度として、細胞の還元力について行った。合計で１０５の細胞を、ＰＣＬ複合材足場上に播種し、１日間、３日間および７日間培養した。１：１０（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）  （ＢＩＯ−ＲＡＤ，  ＵＫ）試薬を、上記細胞に直接添加し、３７℃において５％  ＣＯ２で３時間インキュベートした。ダブルビームＵＶ／可視光分光光度計（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｃａｍｓｐｅｃ  Ｌｔｄ，  Ｇａｒｆｏｒｔｈ，  ＵＫ）を使用することによって、参照波長として５７０ｎｍおよび６００ｎｍで吸光度を測定した。細胞生存性に関しては、二重線染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ＵＫ）を、生細胞および死細胞の蛍光ベースの染色のために利用した。０．２％  （Ｖ／Ｖ）  カルセイン−ＡＭおよび０．１％  （Ｖ／Ｖ）  ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の溶液を、ＰＢＳ中で調製した。このアッセイ溶液を、上記足場に添加し、３７℃において５％  ＣＯ２で３０分間インキュベートした。生細胞および死細胞を、蛍光画像化および共焦点顕微鏡法（Ｌｅｉｃａ  ＤＭ  ＩＲＥ２共焦点顕微鏡）によって可視化した。
【００８０】
結果は、全ての足場上で細胞の継続した生存性および増殖を示した（図６および７）。１日目の全ての足場に関する５７０ｎｍでのＡｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ吸光度は、１．１７〜１．３９の範囲の中にあった（図６）。ＰＥおよびＰＦにおける細胞付着は、他の足場より低く、細胞は、凝集しない形態を示した。これは、Ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ吸光度（１．１７±０．０２  ＰＥ，  １．２４±０．０３  ＰＦ）に相関した。Ｐ、ＰＣ、ＰＣＥ、ＰＣＦ、ＰＥＦ、ＰＣＥＦに関する細胞形態は、紡錘様で細長く、ＰＣ（１．３７±０．０４）、ＰＣＥ（１．３４±０．０３）、ＰＣＦ（１．３１±０．１）、ＰＥＦ（１．３４±１．０４）、およびＰＣＥＦ（１．３８±０．５）と比較して、有意な増殖活性を示した。３日目までに、全ての足場は、最低の吸光度（１．２１±０．０２）を示したＰＥを除いて、吸光度の増大を示した。ＰＣは、最高の吸光度（１．５２±０．０６）を示した一方で、他の足場（Ｐ、ＰＦ、ＰＣＥ、ＰＣＦ、ＰＥＦおよびＰＣＥＦ）の吸光度は、１．３１〜１．４９の範囲の中にあった。ＰＥ、ＰＥＦおよびＰＣＥＦに関する細胞形態は、特有で凝集しなかったが、ＰＣ上の細胞は、凝集した形態を示した（図７）。７日目までに、Ｐ、ＰＣ、ＰＦ、ＰＣＥ、ＰＥＦおよびＰＣＥＦのような足場上の細胞は、凝集した形態を示した。ＰＥ、ＰＣＦ足場上の細胞は、特有の紡錘形の形態を示した。全ての足場の中で、ＰＣ上の細胞は、最も多く増殖し、ＰＥ上の細胞は、最も少なく増殖した。
【００８１】
実施例１０  −  血管新生応答
病原体なしの受精卵を、商業的供給業者から得、３８℃において４０〜４５％  湿度で３日間インキュベートした。胎生３日目（ＥＤ  ３）で、卵を、用意したガラスボウルの中に割り入れた（１７）。エキソオボ(ex  ovo)培養物を、３７．５℃において３％  ＣＯ２および８０〜８５％の範囲の平均湿度で維持した。ＥＤ  ９で、全ての足場およびコントロール（フィルターディスクを陰性コントロールとしてＰＢＳに浸け、ＶＥＧＦは、陽性コントロールであった）を、発生中の漿尿膜（ＣＡＭ）上に移植して、血管の浸潤を可能にした。培養物を、ＥＤ  １３まで維持し、ここで胚を、ＵＫ内務省の規制に従って安楽死させた。上記ＣＡＭを、４％  パラホルムアルデヒド中で１５分間固定し（切除後の出血を回避するため）、足場を切除した。全ての肉眼画像を、立体顕微鏡（０．７×［ズーム］、ＧＸ顕微鏡）によって得、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して分析した。血管領域パーセンテージを、２成分の画像および領域率関数を使用して、各足場に関して計算した。
【００８２】
血管新生応答を調査するために、全ての足場を、ＥＤ１３にＣＡＭから切除し、血管系を各足場に関して研究した（図８Ａ〜Ｊ）。Ｐの血管領域（６．８６±０．５４％）は、全ての足場の中で最低であり、１本の血管によって特徴づけられ、その領域の大部分は、血管化していないままであった。ＰＣ足場（９．６２±１．８７％）は、多くの毛細集網とともに２本の大きな血管があった。ＰＦの血管侵襲（２５．９４±１．１７％）は、全ての足場の中で最高であり、大きな血管とともに次々に繋がる毛細管があった。ＰＣＥ（１５．０９±２．６３  ％）は、大きな血管の浸潤と最小限の毛細集網とを示した。ＰＥ（１３．８６±４．７３％）では、吻合が存在したが、ＰＥＦ（７．５９±２．１０％）は、低い血管系を有した。他方で、ＰＣＦ（２３．１３±２．５６）は、３本の大きな血管および多くの毛細集網とともに高い血管系を有した。ＰＣＥＦの血管系は、大きな血管および密集した毛細管を伴って１５．７０±３．４７％であった。これらの結果を、陰性コントロールであるＰＢＳの血管領域（５．６８±０．４８％）および陽性コントロールであるＶＥＧＦ（１６．８９±１．６５％）と比較した（図８Ｋ）。
【００８３】
実施例１１  −  分化研究
ＲＮＡを、培養の１日目、３日目および７日目にＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｐａｉｓｌｅｙ，  ＵＫ）法によって単離し、収量を分光光度計によって定量した（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｃａｍｓｐｅｃ  Ｌｔｄ，  Ｇａｒｆｏｒｔｈ，  ＵＫ）。ｃＤＮＡ合成を、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｎａｎｏｓｃｒｉｐｔ  ２逆転写キット（Ｐｒｉｍｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎ，  Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ，  ＵＫ）を使用して行い、定量的ＰＣＲを、ｈＡＤＳＣの分化経路の分析のために特注で設計および合成したプライマー（表１）（Ｐｒｉｍｅｒ  ｄｅｓｉｇｎ，  Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ，  ＵＫ）で行った。遺伝子発現を、Ｃｔ値の逆数として表した。β−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、グリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）およびペプチジルプロリルイソメラーゼＡ（ＰＰＩＡ）を、参照遺伝子として使用した。
【００８４】
【表１−１】
2021533908.tif 000004
【表１−２】
2021533908.tif 000005
【００８５】
ＭＳＣマーカー（ＯＣＴ４およびＲＥＸ１）および間葉系統特異的分化マーカー−脂肪生成（ＣＥＢＰＡおよびＰＰＡＲＧ）、骨形成性（ＲＵＮＸ２）、筋形成性（ＭＹＯＤ１）および軟骨形成性（ＳＯＸ９）−の遺伝子発現を、細胞を播種した足場において研究した。組織培養プラスチック上に播種したｈＡＤＳＣを、コントロールとして使用した。使用した３種のハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ、Ｂ２ＭおよびＰＰＩＡ）のＣｔ値は、３つの時点の間で有意な変動を示すことが注目された。よって、候補遺伝子の相対的発現は、理想的な参照遺伝子がなかったことから正確に計算できなかった。あるいは、結果は、Ｃｔ値の逆数として表されている。２５〜４０の範囲のＣｔ値が、それぞれ、０．０４〜０．０２５のＣｔ値逆数に相当する。
【００８６】
足場関連遺伝子発現プロフィールを、図９に図示している。全ての遺伝子は、１日目に最高の発現を示すことが観察された。１日目の全ての遺伝子（ＳＯＸ９を除く）の発現の全範囲は、Ｐにおいて最高であることが観察された（０．０３７〜０．０３９）（図９Ａ）。直ぐ次にＰＣＥＦ（０．０３４〜０．０３７）が続いた（図９Ｈ）。残りの足場の中で、ＰＣ（図９Ｂ）、ＰＦ（図９Ｄ）、ＰＣＦ（図９Ｆ）およびＰＥＦ（図９Ｇ）は、１日目に、０．０３０〜０．０３４の範囲の中程度の発現を示した。興味深いことに、ＰＥ（図９Ｃ）およびＰＣＥ（図９Ｅ）は、最低の範囲の発現を示した（０．０２７〜０．０３３）。ここでＣＥＢＰＡを除く遺伝子全て（ＰＥにおいて０．０２９およびＰＣＥにおいて０．０２７）は、０．０３０より大きい発現を示した。
【００８７】
筋形成性系統マーカーＭＹＯＤ１は、３日目に、Ｐ、ＰＣ、ＰＣＦおよびＰＣＥＦにおいて有意なダウンレギュレーションを示した（ｐ＜０．０５）が、７日目に同じレベル（０．０３１〜０．０３３）のままであった。ＰＥ、ＰＦ、ＰＣＥおよびＰＥＦは、時点間で発現にいかなる有意差も示さず、０．０３１〜０．０３２で一貫したままであった。脂肪生成系統マーカーＰＰＡＲＧおよびＣＥＢＰＡは、対照をなすプロフィールを示した。ＰＰＡＲＧは、例外なく全ての足場において、３日目および７日目に０．０３２〜０．０３３で一定のままであった。他方で、ＣＥＢＰＡは、ＰＣＦ、ＰＣＥおよびＰＥＦにおいて７日目に無視できる程度のレベル（０．０２５）にダウンレギュレートされた；しかし、ＰおよびＰＦにおいて３日目に無視できる程度のレベル（０．０２５）から７日目に０．０２８へと有意なアップレギュレーション（ｐ＜０．００１）を示した。骨形成性系統マーカーＲＵＮＸ２は、ＰＦ、ＰＥ、ＰＣＥおよびＰＣＥＦにおいて、進行性のダウンレギュレーション傾向を示した。ＰおよびＰＣにおいて、それは、３日目に無視できる程度（０．０２５，  ｐ＜０．０００１）にダウンレギュレートされたが、７日目に有意なアップレギュレーション（０．０２８．  ｐ＜０．０００１）を示した。それは、ＰＣＦおよびＰＥＦにおいて３日目および７日目に０．０２７〜０．０２８で一定のままであった。軟骨形成性系統マーカーＳＯＸ９は、全ての時点において全体的に無視できる程度の発現を示した（０．０２６〜０．０２５）。ＯＣＴ４（これは、幹細胞の自己再生能力の維持を担う）は、全ての足場において一貫しかつ一定のダウンレギュレーションパターンを示した。しかし、幹細胞の多能性を担うＲＥＸ１は、３日目に完全にダウンレギュレートされた（０．０２５）が、足場の大部分（Ｐ、ＰＣ、ＰＣＦ、ＰＣＥおよびＰＣＥＦ）において、７日目に有意にアップレギュレートされた（０．０２８〜０．０２９，  ｐ＜０．０００１）。残りの足場の中で、それは、３日目および７日目に無視できる程度のレベル（０．０２５）へと低減されたＰＦを除いて、７日目に０．０２７〜０．０２８のままであった（ＰＥおよびＰＥＦ）。
【００８８】
考察
本発明者らは、合成ポリマー（例えば、ＰＣＬ）を、ヒト組織のＥＣＭに存在する天然ポリマー（例えば、コラーゲン、フィブリンおよびエラスチン）と組み合わせて、足場を形成し得ることを認識した。驚くべきことに、本発明者らは、合成および天然両方のポリマーのある種の利点が保持され得ると同時に、ある種の欠点が打ち消され得ることを見出した。この概念は、「共生関係」であると考えられ得る。
【００８９】
ｄＷＣＡ＞９０を有する任意の材料は、疎水性と考えられる。合成ポリマー（例えば、ＰＣＬ）が疎水性であり、これが、より弱い細胞付着を生じ得ることは、十分に確立されている。これは、ＰＣＬを血漿、ＵＶ、化学的コーティング、または照射で処理することによって改善され得る（８）が、これらの処理は、ＰＣＬの物理的および生物学的活性に影響を及ぼし得るより弱い水結合親和性を示す（１８）。この問題に対処するために、本発明者らは、ＰＣＬを天然ポリマーでコーティングしたところ、得られた足場は、１秒以内にｄＷＣＡ＝００によって示されるように、表面の化学的性質を疎水性から親水性へと変換することによって液体に対して強い親和性を示した。全ての複合材足場において、水に対して高い結合力が存在し、よって、残留する水滴は存在せず、足場は、完全な濡れ性および疎水性から親水性への特性の変化を獲得した。液体の結合力および水親和性というこの概念は、Ｙｏｕｎｇの小論（１９，  ２０）において記載される。
【００９０】
ＰＣＬの生分解速度は、他のポリラクチドより劣っている。なぜならそれは、頻繁なエステル結合があり、これは、ＰＣＬの分解を、これらのエステル基の加水分解によって２〜４年まで妨げるからである（２１）。理想的には、ＰＣＬの分解速度は、新組織形成と同期化されるべきである。なぜならより遅い分解速度は、細胞増殖および組織修復を妨害すると同時に、より速い分解は、組織形成の障害を生じるからである（２２〜２５）。従って、それは、あらゆる組織の適正レベルが異なることから、全ての組織再生用途においてＰＣＬを使用することが可能であると考えられていない。驚くべきことに、この研究において、本発明者らは、ＰＣＬを天然ポリマーでコーティングすることによって、それらは、天然の組織の再生力に相当する足場の分解に合わせて作られ得、例えば、ＰＥ、ＰＥＦは、より弱い再生特性を有する腱および靱帯のような軟性の結合組織工学に使用され得るＰ、ＰＣ、ＰＦ、ＰＣＥ、ＰＣＥＦのような足場とは対照的に、強い再生／修復能力を有する皮膚および肝臓のような大きな組織の操作のために使用され得る（２６）ことを示した。
【００９１】
組織における酸素の拡散は、１００〜２００ｍｍに制限される。従って、それを超えて新組織を再生するために、次々に繋がる血管が必要とされる（２７）。よって、足場は、栄養素／廃棄生成物の流れおよび細胞移動を確実にするために、血管新生の理想的な孔サイズ範囲を要する。ＣＡＭアッセイは、上記足場上の血管新生を研究するために、エキソビボバイオリアクターとして作用した。血管新生の理想的な孔サイズは、文献中で未だなお明確ではないが、研究の大部分は、血管新生のための本質的により高い孔サイズおよび孔範囲を示唆する。本発明者らの研究において、Ｐは最も多孔性（８０．３３％）であり、最大の孔サイズ（１００〜２００μｍの間で７５％孔）の足場であったが、それは、血管ネットワークを引き寄せるために不適切な表面トポロジー特性を有した（６．８６％）。しかし、天然ポリマーでの事後コーティングによって親水性に変換することで、それは、上記足場上に強い血管侵襲を引き寄せることが驚くべきことに見出された。フィブリンコ−ティングした足場が、既存の血管系から新しい血管の最大の延びを有したことが注目されるべきである（例えば、ＰＦ）。これは、中程度の多孔性（５２．１６％）、１〜１００μｍの範囲で８０％孔、および最高の血管ネットワーク領域（２５．９４％）を有した。また、９７％孔が０〜５０μｍの範囲のそれほど多孔性でない足場様ＰＣＦ（２２．８６％）は、高い血管ネットワークを有した（２３．１３％）。単にフィブリンまたはフィブリンおよびコラーゲンとＰＣＬとの組み合わせは、血管新生促進性であると判明し、エラスチンは、単独でまたはコラーゲンとともに、中程度に血管新生促進性であるが、エラスチンおよびフィブリンの組み合わせは、それほど血管新生促進性ではない（例えば、ＰＥＦ）。これは、フィブリンおよびフィブリン−コラーゲン複合材の血管新生促進効果についての以前の知見に相関され得る（２８，  ２９）。これは、組織修復の初期ステージにおいて、孔サイズおよび多孔性のみならず、材料のトポロジー特性および表面の化学的性質も、血管ネットワークの形成において極めて重要な役割を果たすことを示す。
【００９２】
足場の微小構造は、細胞とＥＣＭとの間の動的相互作用を反映する。よって、足場の機械的特性は、新組織が形成されるまで解剖学的部位に合っているべきである（３０）。しかし、大きな孔サイズは、大きな空隙容積に起因して、上記足場の機械的強度を損なう一方で、小さな孔がベースの足場は、機械的により強い（３１）。これは、孔のうちの９７％が０〜５０μｍの範囲にある、ＰＣＦの増強された機械的特性と相関され得る。ＰＣＦのような足場は、機械的により強い組織であることから、整形外科的な組織工学の潜在的可能性を有し、ＰＥ、ＰＣＥ、ＰＥＦ、ＰＣＥＦのような足場は、軟性の組織工学の候補であり得る。
【００９３】
材料の特性および基本的な細胞−材料相互作用を調査するとともに、ＰＣＬ、および天然のＥＣＭ構成要素とのその複合材の分化能力を評価した。ＰＣＬ足場上に播種したｈＡＤＳＣの分化は、増殖因子／化学的刺激、表面トポロジー、機械的特性、材料の多孔性および孔サイズ勾配のような因子の組み合わせによって影響を及ぼされる（１６，  ３２−３４）。
【００９４】
ｈＡＤＳＣを播種した３Ｄ足場で行われる分化研究の大部分は、特異的分化培地のような外部の化学的刺激で行われる。対照的に、この研究は、物理的刺激として材料特性によって誘導されるｈＡＤＳＣの分化経路を評価した。ｈＡＤＳＣ主流系統傾向のマーカー、すなわち、脂肪生成、骨形成性、軟骨形成性および筋形成性を、スクリーニングした。最も一般的なハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨは、本来参照として使用されたが、異なる足場にわたって、発現において非常に高い変動および変わりやすさを示した。この観察は、８種の一般的ハウスキーピング遺伝子を間葉系幹細胞においてそれらの安定性および信頼性に関して比較した報告と相関する。この研究によれば、Ｂ２ＭおよびＰＰＩＡは、最も安定な参照遺伝子であった（３５）。にも関わらず、これら２つの参照は、ＧＡＰＤＨと類似の挙動を示した。これは、同じ細胞の遺伝子発現が、単層培養と３Ｄ培養との間で変動し、その後、それらの形態および機能性に影響を与えるという知見によって説明され得る（３６）。ｈＡＤＳＣは、単層培養においてＢ２ＭおよびＰＰＩＡの安定な発現を示すと考えられるが、３Ｄ足場上に播種されたｈＡＤＳＣについての矛盾する報告が存在する。ＭＳＣの単層培養において少なくとも安定であると主張されたＴＡＴＡボックスタンパク質（３５）は、３Ｄ足場上に播種した骨髄由来ＭＳＣにおいてスクリーニングされた３１種の参照遺伝子の中で最も安定であることが示されている（３７）。これは、ｈＡＤＳＣを播種したＰＣＬおよびそれらの複合材足場における参照遺伝子のスクリーニングを個々に必要とするが、これは、各足場がそれ自体安定なハウスキーピング遺伝子を有し、その研究において他の足場と比較できなくすることから、実現可能ではない。よって、目的の遺伝子の相対的発現は、至適基準（ｄｄＣｔ／倍率変化）として表すことはできなかった。従って、本発明者らは、Ｃｔの逆数を使用して、遺伝子発現を表す新規方法を報告している。なぜならＣｔ値は、遺伝子発現に反比例するからである。この表現方法は、多数の足場比較においてアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションの一般的傾向の尺度を提供する。それは絶対的な尺度ではないものの、特定の系統に向かう一般的傾向の決定を容易にする。
【００９５】
上記遺伝子は全て、全ての足場において１日目に高発現を示した。これは、これらの遺伝子発現における高まりをもたらして、細胞が新たな環境に慣れることを可能にする、細胞の構築環境における突然の変化に起因し得る（３８）。外部の化学的刺激の非存在下では、細胞は、さらなる分化を続行するとは予測できない。しかし、３日目および７日目に系統マーカーのその後の持続またはダウンレギュレーションは、細胞が他の系統を超えて特定の系統に向かいつつあることを示唆する（３９）。全ての足場は、ＭＹＯＤ１の持続した発現を示し（＞０．０３０）、これは、全てのＰＣＬベースの足場が、筋形成性分化の理想的な候補であることを示唆する。実際に、複合材足場の孔の大部分は、筋形成性分化に極めて重要な＜１０５μｍのサイズを有する（４０）。
【００９６】
５００μｍ〜８５０μｍの間の孔サイズは、ＭＳＣにおいて骨形成性応答を誘導した（４１）が、本発明者らの研究では、Ｐ、ＰＣ、ＰＣＦおよびＰＥＦは、７日目に骨形成性マーカーＲＵＮＸ２の有意な発現を示したものの、これらの足場の孔サイズは、＜５００μｍである。これは、孔サイズとは別に、足場組成がまた、骨形成性分化に影響を与えることを示唆する。軟骨形成性マーカーＳＯＸ９の発現は、＞３００μｍの至適未満の孔サイズのせいで全ての足場において３つの時点全てで無視できる程度である。なぜなら３００μｍの平均孔サイズは、より小さい孔サイズ（９４μｍ、１３０μｍ）と比較して、軟骨形成性遺伝子発現および軟骨様マトリクス沈着を刺激する（３９，  ４２）からである。脂肪生成マーカーに関しては、ＰＰＡＲＧは、７日目の最後に全ての足場で一貫して発現されていたが、ＣＥＢＰＡ発現は、３日目にダウンレギュレートされた。しかし、７日目に、有意なアップレギュレーションが、３日目との比較において観察された（ＰＣＦおよびＰＣＥＦを除く）。ＰＰＡＲＧは、十分に確立された脂肪生成マーカーであり、ＣＥＢＰＡ誘導性脂肪生成を活性化するために必須である。ＰＰＡＲＧは、ＣＥＢＰＡの非存在下で脂肪生成分化を成功裡に誘導すると報告されている一方で、ＣＥＢＰＡは、ＰＰＡＲＧの非存在下で脂肪生成促進性ではない（４３，  ４４）。さらに、ＣＥＢＰＡは、脂肪生成において後期に発現されると報告されている、すなわち、それは、脂肪前駆細胞ステージまで発現されず（４５）、白色脂肪組織の発生に対してのみである。これは、一貫して発現されるＰＰＡＲＧと比較して、ＣＥＢＰＡが足場において存在しないまたは低レベルであることを説明する。これは、ＰＣＬベースの複合材が、脂肪生成に有益であり得ることを示唆する（４６）。
【００９７】
Ｐおよび全てのコラーゲン含有足場において、多能性マーカーＲＥＸ１は、７日目にアップレギュレーション傾向を示している。他方で、ＯＣＴ４（これは、幹細胞の自己再生を確実にする重要な転写因子である）は、７日目までに全ての足場において常にダウンレギュレートされる。これは、多能性特徴をなおも維持しながら、ＡＤＳＣの幹細胞らしさを徐々に低減することを示唆する。なぜなら細胞は、未だ未分化であるか、または分化に向かって動き始めている最中だからである。
【００９８】
天然ポリマーと合成ポリマー（例えば、ＰＣＬ）との間の「共生関係」は、組織および器官再生にとって重要な足場の特性（例えば、機械的強度、多孔性、濡れ性、血管新生能力、細胞―材料相互作用など）に合わせて作るための経済的にかつ技術的に効率的な方法を促進する。さらに、これらの足場は、系統特異的分化能力を示した。これは、これらの足場におけるＡＤＳＣの長期培養が、機械的または化学的誘導のような外部刺激の非存在下ですら、効果的な細胞分化をもたらし得るという実質的な証拠を提供する。
【００９９】
参考文献
1.  Hollister  SJ.  Porous  scaffold  design  for  tissue  engineering.  Nature  materials.  2005;4(7):518-24.
2.  Yoon  DM,  Fisher  JP.  Natural  and  Synthetic  Polymeric  Scaffolds.  In:  Narayan  R,  editor.  Biomedical  Materials.  Boston,  MA:  Springer  US;  2009.  p.  415-42.
3.  Davison  NL,  Barrere-de  Groot  F,  Grijpma  DW.  Chapter  6  -  Degradation  of  Biomaterials.    Tissue  Engineering  (Second  Edition).  Oxford:  Academic  Press;  2014.  p.  177-215.
4.  Bhatia  S.  Natural  Polymers  vs  Synthetic  Polymer.  In:  Bhatia  S,  editor.  Natural  Polymer  Drug  Delivery  Systems:  Nanoparticles,  Plants,  and  Algae.  Cham:  Springer  International  Publishing;  2016.  p.  95-118.
5.  Gunatillake  P,  Mayadunne  R,  Adhikari  R.  Recent  developments  in  biodegradable  synthetic  polymers.  Biotechnol  Annu  Rev.  2006;12:301-47.
6.  Gunatillake  PA,  Adhikari  R.  Biodegradable  synthetic  polymers  for  tissue  engineering.  Eur  Cell  Mater.  2003;5:1-16;  discussion  
7.  Hoskins  JN,  Grayson  SM.  Synthesis  and  Degradation  Behavior  of  Cyclic  Poly(ε-caprolactone).  Macromolecules.  2009;42(17):6406-13.
8.  Cipitria  A,  Skelton  A,  Dargaville  TR,  Dalton  PD,  Hutmacher  DW.  Design,  fabrication  and  characterization  of  PCL  electrospun  scaffolds-a  review.  Journal  of  Materials  Chemistry.  2011;21(26):9419-53.
9.  Place  ES,  George  JH,  Williams  CK,  Stevens  MM.  Synthetic  polymer  scaffolds  for  tissue  engineering.  Chemical  Society  Reviews.  2009;38(4):1139-51.
10.  Howard  D,  Buttery  LD,  Shakesheff  KM,  Roberts  SJ.  Tissue  engineering:  strategies,  stem  cells  and  scaffolds.  Journal  of  Anatomy.  2008;213(1):66-72.
11.  O'Brien  FJ.  Biomaterials  &  scaffolds  for  tissue  engineering.  Materials  Today.  2011;14(3):88-95.
12.  Frese  L,  Dijkman  PE,  Hoerstrup  SP.  Adipose  Tissue-Derived  Stem  Cells  in  Regenerative  Medicine.  Transfusion  Medicine  and  Hemotherapy.  2016;43(4):268-74.
13.  Augello  A,  De  Bari  C.  The  regulation  of  differentiation  in  mesenchymal  stem  cells.  Hum  Gene  Ther.  2010;21(10):1226-38.
14.  Brown  RA,  Wiseman  M,  Chuo  CB,  Cheema  U,  Nazhat  SN.  Ultrarapid  Engineering  of  Biomimetic  Materials  and  Tissues:  Fabrication  of  Nano-  and  Microstructures  by  Plastic  Compression.  Advanced  Functional  Materials.  2005;15(11):1762-70.
15.  Eke  G,  Mangir  N,  Hasirci  N,  MacNeil  S,  Hasirci  V.  Development  of  a  UV  crosslinked  biodegradable  hydrogel  containing  adipose  derived  stem  cells  to  promote  vascularization  for  skin  wounds  and  tissue  engineering.  Biomaterials.  2017;129:188-98.
16.  Fu  W,  Liu  Z,  Feng  B,  Hu  R,  He  X,  Wang  H,  et  al.  Electrospun  gelatin/PCL  and  collagen/PLCL  scaffolds  for  vascular  tissue  engineering.  Int  J  Nanomedicine.  2014;9:2335-44.
17.  Auerbach  R,  Kubai  L,  Knighton  D,  Folkman  J.  A  simple  procedure  for  the  long-term  cultivation  of  chicken  embryos.  Developmental  biology.  1974;41(2):391-4.
18.  Augustine  R,  Saha  A,  Jayachandran  VP,  Thomas  S,  Kalarikkal  N.  Dose-Dependent  Effects  of  Gamma  Irradiation  on  the  Materials  Properties  and  Cell  Proliferation  of  Electrospun  Polycaprolactone  Tissue  Engineering  Scaffolds.  International  Journal  of  Polymeric  Materials  and  Polymeric  Biomaterials.  2015;64(10):526-33.
19.  Law  K-Y.  Definitions  for  Hydrophilicity,  Hydrophobicity,  and  Superhydrophobicity:  Getting  the  Basics  Right.  The  Journal  of  Physical  Chemistry  Letters.  2014;5(4):686-8.
20.  Young  T.  III.  An  essay  on  the  cohesion  of  fluids.  Philosophical  Transactions  of  the  Royal  Society  of  London.  1805;95:65-87.
21.  Woodruff  MA,  Hutmacher  DW.  The  return  of  a  forgotten  polymer-Polycaprolactone  in  the  21st  century.  Progress  in  Polymer  Science.  2010;35(10):1217-56.
22.  Yildirimer  L,  Seifalian  AM.  Three-dimensional  biomaterial  degradation  -  Material  choice,  design  and  extrinsic  factor  considerations.  Biotechnol  Adv.  2014;32(5):984-99.
23.  Raghunath  J,  Georgiou  G,  Armitage  D,  Nazhat  SN,  Sales  KM,  Butler  PE,  et  al.  Degradation  studies  on  biodegradable  nanocomposite  based  on  polycaprolactone/polycarbonate  (80:20%)  polyhedral  oligomeric  silsesquioxane.  Journal  of  Biomedical  Materials  Research  Part  A.  2009;91A(3):834-44.
24.  Lewandrowski  K-U,  Gresser  JD,  Wise  DL,  Trantolo  DJ,  Hasirci  V.  Tissue  responses  to  molecularly  reinforced  polylactide-co-glycolide  implants.  Journal  of  Biomaterials  Science,  Polymer  Edition.  2000;11(4):401-14.
25.  Malikmammadov  E,  Tanir  TE,  Kiziltay  A,  Hasirci  V,  Hasirci  N.  PCL  and  PCL-based  materials  in  biomedical  applications.  J  Biomater  Sci  Polym  Ed.  2017:1-31.
26.  Yang  G,  Rothrauff  BB,  Tuan  RS.  Tendon  and  Ligament  Regeneration  and  Repair:  Clinical  Relevance  and  Developmental  Paradigm.  Birth  defects  research  Part  C,  Embryo  today  :  reviews.  2013;99(3):203-22.
27.  Carmeliet  P,  Jain  RK.  Angiogenesis  in  cancer  and  other  diseases.  Nature.  2000;407(6801):249-57.
28.  Dvorak  HF,  Harvey  VS,  Estrella  P,  Brown  LF,  McDonagh  J,  Dvorak  AM.  Fibrin  containing  gels  induce  angiogenesis.  Implications  for  tumor  stroma  generation  and  wound  healing.  Laboratory  investigation;  a  journal  of  technical  methods  and  pathology.  1987;57(6):673-86.
29.  Yang  YI,  Seol  DL,  Kim  HI,  Cho  MH,  Lee  SJ.  Composite  fibrin  and  collagen  scaffold  to  enhance  tissue  regeneration  and  angiogenesis.  Current  Applied  Physics.  2007;7:e103-e7.
30.  Loh  QL,  Choong  C.  Three-dimensional  scaffolds  for  tissue  engineering  applications:  role  of  porosity  and  pore  size.  Tissue  engineering  Part  B,  Reviews.  2013;19(6):485-502.
31.  Karageorgiou  V,  Kaplan  D.  Porosity  of  3D  biomaterial  scaffolds  and  osteogenesis.  Biomaterials.  2005;26(27):5474-91.
32.  Capkin  M,  Cakmak  S,  Kurt  FO,  Gumusderelioglu  M,  Sen  BH,  Turk  BT,  et  al.  Random/aligned  electrospun  PCL/PCL-collagen  nanofibrous  membranes:  comparison  of  neural  differentiation  of  rat  AdMSCs  and  BMSCs.  Biomedical  Materials.  2012;7(4).
33.  Ruminski  S,  Ostrowska  B,  Jaroszewicz  J,  Skirecki  T,  Wlodarski  K,  Swieszkowski  W,  et  al.  Three-dimensional  printed  polycaprolactone-based  scaffolds  provide  an  advantageous  environment  for  osteogenic  differentiation  of  human  adipose-derived  stem  cells.  Journal  of  Tissue  Engineering  and  Regenerative  Medicine.  2018;12(1):E473-E85.
34.  Safaeijavan  R,  Soleimani  M,  Divsalar  A,  Eidi  A,  Ardeshirylajimi  A.  Comparison  of  random  and  aligned  PCL  nanofibrous  electrospun  scaffolds  on  cardiomyocyte  differentiation  of  human  adipose-derived  stem  cells.  Iranian  Journal  of  Basic  Medical  Sciences.  2014;17(11):903-11.
35.  Li  XY,  Yang  QW,  Bai  JP,  Xuan  YL,  Wang  YM.  Identification  of  appropriate  reference  genes  for  human  mesenchymal  stem  cell  analysis  by  quantitative  real-time  PCR.  Biotechnology  Letters.  2015;37(1):67-73.
36.  Frith  JE,  Thomson  B,  Genever  PG.  Dynamic  Three-Dimensional  Culture  Methods  Enhance  Mesenchymal  Stem  Cell  Properties  and  Increase  Therapeutic  Potential.  Tissue  Engineering  Part  C-Methods.  2010;16(4):735-49.
37.  Rauh  J,  Jacobi  A,  Stiehler  M.  Identification  of  Stable  Reference  Genes  for  Gene  Expression  Analysis  of  Three-Dimensional  Cultivated  Human  Bone  Marrow-Derived  Mesenchymal  Stromal  Cells  for  Bone  Tissue  Engineering.  Tissue  Engineering  Part  C-Methods.  2015;21(2):192-206.
38.  Cao  J,  Luo  Z,  Cheng  Q,  Xu  Q,  Zhang  Y,  Wang  F,  et  al.  Three-dimensional  regulation  of  transcription.  Protein  &  Cell.  2015;6(4):241-53.
39.  Lien  S-M,  Ko  L-Y,  Huang  T-J.  Effect  of  pore  size  on  ECM  secretion  and  cell  growth  in  gelatin  scaffold  for  articular  cartilage  tissue  engineering.  Acta  Biomaterialia.  2009;5(2):670-9.
40.  Kim  TH,  Oh  SH,  Kwon  EB,  Lee  JY,  Lee  JH.  In  vitro  evaluation  of  osteogenesis  and  myogenesis  from  adipose-derived  stem  cells  in  a  pore  size  gradient  scaffold.  Macromolecular  Research.  2013;21(8):878-85.
41.  Vissers  CAB,  Harvestine  JN,  Leach  JK.  Pore  size  regulates  mesenchymal  stem  cell  response  to  Bioglass-loaded  composite  scaffolds.  Journal  of  Materials  Chemistry  B.  2015;3(44):8650-8.
42.  Matsiko  A,  Gleeson  JP,  O'Brien  FJ.  Scaffold  mean  pore  size  influences  mesenchymal  stem  cell  chondrogenic  differentiation  and  matrix  deposition.  Tissue  engineering  Part  A.  2015;21(3-4):486-97.
43.  Wu  ZD,  Rosen  ED,  Brun  R,  Hauser  S,  Adelmant  G,  Troy  AE,  et  al.  Cross-regulation  of  C/EBP  alpha  and  PPAR  gamma  controls  the  transcriptional  pathway  of  adipogenesis  and  insulin  sensitivity.  Molecular  Cell.  1999;3(2):151-8.
44.  Rosen  ED,  Hsu  CH,  Wang  X,  Sakai  S,  Freeman  MW,  Gonzalez  FJ,  et  al.  C/EBPalpha  induces  adipogenesis  through  PPARgamma:  a  unified  pathway.  Genes  &  development.  2002;16(1):22-6.
45.  Darlington  GJ,  Ross  SE,  MacDougald  OA.  The  role  of  C/EBP  genes  in  adipocyte  differentiation.  Journal  of  Biological  Chemistry.  1998;273(46):30057-60.
46.  Braennmark  C,  Paul  A,  Ribeiro  D,  Magnusson  B,  Brolen  G,  Enejder  A,  et  al.  Increased  Adipogenesis  of  Human  Adipose-Derived  Stem  Cells  on  Polycaprolactone  Fiber  Matrices.  PLoS  ONE.  2014;9(11):e113620.
【図１】
2021533908.tif 000006
【図２】
2021533908.tif 000007
【図３】
2021533908.tif 000008
【図４】
2021533908.tif 000009
【図５】
2021533908.tif 000010
【図６】
2021533908.tif 000011
【図７】
2021533908.tif 000012
【図８】
2021533908.tif 000013
【図９】
2021533908.tif 000014
【配列表】
2021533908000001.app
【国際調査報告】
2021533908.tif 000015
2021533908.tif 000016
2021533908.tif 000017