(57)【要約】  配列番号１９または４３を含むかまたはそれから本質的になる、ＣＤ４４Ｖ６またはｖ９エピトープに特異的な抗体または抗原結合性断片が提供される。また、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、抗体または抗原結合性断片を含む他の誘導体、それをコードする核酸分子、それを作製する方法、それを含む医薬組成物、およびその疾患の処置または診断におけるその使用も提供される。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたＣＤ４４ｖ６エピトープに特異的な、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片であって、前記ＣＤ４４ｖ６エピトープは配列番号１９（例えば、配列番号１９に加えて配列番号１９のＮ末端における１もしくは２つの残基、配列番号１９に加えて配列番号１９のＣ末端における１もしくは２つの残基、または配列番号１９に加えて配列番号１９のＮ末端およびＣ末端の両方における１もしくは２つの残基からなるエピトープ）を含む／それから本質的になるか、または配列番号１９からなり、好ましくは、前記抗体またはその抗原結合性断片は、前記単離されたＣＤ４４ｖ６エピトープに対して産生されるか、または前記単離されたＣＤ４４ｖ６エピトープおよび担体タンパク質（例えば、アルブミン、好ましくはＢＳＡもしくはオボアルブミン、またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ））を含む融合タンパク質またはその化学的コンジュゲートに対して産生される、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２】
前記モノクローナル抗体が、
（１）配列番号１のＨＣＶＲ  ＣＤＲ１配列、配列番号２のＨＣＶＲ  ＣＤＲ２配列および配列番号３のＨＣＶＲ  ＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）；
（２）配列番号１０のＬＣＶＲ  ＣＤＲ１配列、配列番号１１のＬＣＶＲ  ＣＤＲ２配列および配列番号１２のＬＣＶＲ  ＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）
を含む、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項３】
ＣＤ４４ｖ６エピトープが、配列番号１９である、請求項１または２に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項４】
ＣＤ４４ｖ６エピトープが、配列番号１９（例えば、配列番号１９に加えて配列番号１９のＮ末端における１もしくは２つの残基、配列番号１９に加えて配列番号１９のＣ末端における１もしくは２つの残基、または配列番号１９に加えて配列番号１９のＮ末端およびＣ末端の両方における１もしくは２つの残基からなるエピトープ）から本質的になる、請求項１または２に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項５】
ＣＤ４４ｖ６エピトープが、配列番号２４（ＨＥＧＹＲＱＴＰＫＥＤＳ）である、請求項４に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項６】
（ｉ）ＨＣＶＲが、配列番号７〜９の１つまたは複数をさらに含み；および／または
（ｉｉ）ＬＣＶＲが、配列番号１３〜１８の１つまたは複数をさらに含む、請求項２〜５のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項７】
前記ＣＤ４４ｖ６エピトープまたは前記ＣＤ４４ｖ６エピトープを有する細胞に、約１０ｎＭ、約５ｎＭまたは約２ｎＭ以下のＫＤで結合する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項８】
ヒト−マウスキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ＣＤＲ移植抗体または再表面化抗体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項９】
前記その抗原結合性断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖ＦｖもしくはｓｃＦｖ、ジスルフィドで連結されたＦｖ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、ＩｇＮａｒ、イントラボディ、ＩｇＧΔＣＨ２、ミニボディ、Ｆ（ａｂ’）３、テトラボディ、トリアボディ、ダイアボディ、単一ドメイン抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ、Ｆｃａｂ、ｍＡｂ２、（ｓｃＦｖ）２またはｓｃＦｖ−Ｆｃである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１０】
単離されたＣＤ４４ｖ９エピトープに特異的な単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片であって、前記ＣＤ４４ｖ９エピトープは、配列番号４３（例えば、配列番号４３に加えて配列番号４３のＮ末端における１もしくは２つの残基、配列番号４３に加えて配列番号４３のＣ末端における１もしくは２つの残基、または配列番号４３に加えて配列番号４３のＮ末端およびＣ末端の両方における１もしくは２つの残基からなるエピトープ）を含む／それから本質的になるか、または配列番号４３からなり；好ましくは、前記抗体またはその抗原結合性断片は、前記単離されたＣＤ４４ｖ９エピトープに対して産生されるか、または前記単離されたＣＤ４４ｖ９エピトープおよび担体タンパク質（例えば、アルブミン、好ましくはＢＳＡもしくはオボアルブミン、またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ））を含む融合タンパク質またはその化学的コンジュゲートに対して産生される、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１１】
前記モノクローナル抗体が、
（１）配列番号２５のＨＣＶＲ  ＣＤＲ１配列、配列番号２６のＨＣＶＲ  ＣＤＲ２配列および配列番号２７のＨＣＶＲ  ＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）；
（２）配列番号３４のＬＣＶＲ  ＣＤＲ１配列、配列番号３５のＬＣＶＲ  ＣＤＲ２配列および配列番号３６のＬＣＶＲ  ＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）
を含む、請求項１０に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１２】
ＣＤ４４ｖ９エピトープが、配列番号４３である、請求項１０または１１に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１３】
ＣＤ４４ｖ９エピトープが、配列番号４３（例えば、配列番号４３に加えて配列番号４３のＮ末端における１もしくは２つの残基、配列番号４３に加えて配列番号４３のＣ末端における１もしくは２つの残基、または配列番号４３に加えて配列番号４３のＮ末端およびＣ末端の両方における１もしくは２つの残基からなるエピトープ）から本質的になる、請求項１０または１１に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１４】
ＣＤ４４ｖ９エピトープが、配列番号４４（ＳＨＥＧＬＥＥＤＫＤＨ）である、請求項１３に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１５】
（ｉ）ＨＣＶＲが、配列番号２８〜３３の１つまたは複数をさらに含み；および／または
（ｉｉ）ＬＣＶＲが、配列番号３７〜４２の１つまたは複数をさらに含む、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１６】
前記ＣＤ４４ｖ９エピトープまたは前記ＣＤ４４ｖ９エピトープを有する細胞に、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ以下のＫＤで結合する、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１７】
ヒト−マウスキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ＣＤＲ移植抗体または再表面化抗体である、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１８】
前記その抗原結合性断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖ＦｖもしくはｓｃＦｖ、ジスルフィドで連結されたＦｖ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、ＩｇＮａｒ、イントラボディ、ＩｇＧΔＣＨ２、ミニボディ、Ｆ（ａｂ’）３、テトラボディ、トリアボディ、ダイアボディ、単一ドメイン抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ、Ｆｃａｂ、ｍＡｂ２、（ｓｃＦｖ）２またはｓｃＦｖ−Ｆｃである、請求項１０〜１７のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１９】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のＨＣＶＲおよび／またはＬＣＶＲを含むポリペプチド。
【請求項２０】
融合タンパク質（例えば、キメラ抗原Ｔ細胞受容体）である、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
請求項１０〜１８のいずれか一項に記載のＨＣＶＲおよび／またはＬＣＶＲを含むポリペプチド。
【請求項２２】
融合タンパク質（例えば、キメラ抗原Ｔ細胞受容体）である、請求項２１に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
請求項１９または２０のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２４】
請求項２１または２２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２５】
請求項２３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２６】
発現ベクター（例えば、哺乳動物発現ベクター、酵母発現ベクター、昆虫発現ベクターまたは細菌発現ベクター）である、請求項２５に記載のベクター。
【請求項２７】
請求項２４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２８】
発現ベクター（例えば、哺乳動物発現ベクター、酵母発現ベクター、昆虫発現ベクターまたは細菌発現ベクター）である、請求項２７に記載のベクター。
【請求項２９】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、請求項１９もしくは２０に記載のポリペプチド、請求項２３に記載のポリヌクレオチド、または請求項２５もしくは２６に記載のベクターを含む細胞。
【請求項３０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、または請求項１９もしくは２０に記載のポリペプチドを発現する、請求項２９に記載の細胞。
【請求項３１】
ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞またはＣＯＳ細胞である、請求項２９または３０に記載の細胞。
【請求項３２】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、または請求項１９もしくは２０に記載のポリペプチドを細胞表面に含む、請求項２９に記載の細胞。
【請求項３３】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、または請求項１９もしくは２０に記載のポリペプチドを含むキメラ抗原受容体を有するＴ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）である、請求項３２に記載の細胞。
【請求項３４】
請求項１０〜１８のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、請求項２１もしくは２２に記載のポリペプチド、請求項２４に記載のポリヌクレオチド、または請求項２７もしくは２８に記載のベクターを含む細胞。
【請求項３５】
請求項１０〜１８のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、または請求項２１もしくは２２に記載のポリペプチドを発現する、請求項３４に記載の細胞。
【請求項３６】
ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞またはＣＯＳ細胞である、請求項３４または３５に記載の細胞。
【請求項３７】
請求項１０〜１８のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、または請求項２１もしくは２２に記載のポリペプチドを細胞表面に含む、請求項３４に記載の細胞。
【請求項３８】
請求項１０〜１８のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、または請求項２１もしくは２２に記載のポリペプチドを含むキメラ抗原受容体を有するＴ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）である、請求項３７に記載の細胞。
【請求項３９】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、または請求項１９もしくは２０に記載のポリペプチドを生成する方法であって、
（ａ）請求項２９、３０または３１の細胞を培養するステップと；
（ｂ）前記抗体、その抗原結合性断片またはポリペプチドを前記培養細胞から単離するステップと
を含む方法。
【請求項４０】
前記細胞が、真核細胞である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
請求項１０〜１８のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、または請求項２１もしくは２２に記載のポリペプチドを生成する方法であって、
（ａ）請求項３４、３５または３６の細胞を培養するステップと；
（ｂ）前記抗体、その抗原結合性断片またはポリペプチドを前記培養細胞から単離するステップと
を含む方法。
【請求項４２】
前記細胞が、真核細胞である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
以下の式：
Ａｂ−［−Ｌ−Ｄ］ｎ、
を有するイムノコンジュゲート（または抗体−薬物コンジュゲートもしくはＡＤＣ）であって、式中、
Ａｂは、リンカー−薬物部分−［−Ｌ−Ｄ］の１つまたは複数の単位に共有結合している、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、または請求項１９もしくは２０に記載のそのポリペプチドであり、式中、Ｌはリンカーであり、Ｄは細胞傷害薬であり；
ｎは、１〜２０（例えば、１〜１２）の整数であり；
各リンカー−薬物部分は、同じかまたは異なるリンカーＬまたは細胞傷害薬Ｄを有することができる、イムノコンジュゲート。
【請求項４４】
各リンカー−薬物部分−［−Ｌ−Ｄ］が、Ｌｙｓの側鎖アミノ基を介してＡｂに共有結合している、請求項４３に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項４５】
各リンカー−薬物部分−［−Ｌ−Ｄ］が、Ｃｙｓの側鎖チオール基を介してＡｂに共有結合している、請求項４３に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項４６】
各リンカー−薬物部分−［−Ｌ−Ｄ］が、部位特異的に組み込まれた非天然アミノ酸を介してＡｂに共有結合している、請求項４３に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項４７】
各リンカーＬが、ペプチド単位を含む、請求項４３〜４６のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項４８】
ペプチド単位が、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２〜１０または２〜５アミノ酸残基を含む、請求項４７に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項４９】
リンカーＬが、プロテアーゼ（例えば、カテプシン）によって切断されない、請求項４３〜４８のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項５０】
リンカーＬが、プロテアーゼ（例えば、カテプシン）、酸性環境または酸化還元状態の変更によって切断可能である切断可能なリンカーである、請求項４３〜４８のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項５１】
細胞傷害薬が、ＤＮＡ挿入剤、微小管結合剤、トポイソメラーゼＩ阻害剤またはＤＮＡ副溝結合剤である、請求項４３〜５０のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項５２】
細胞傷害薬が、オーリスタチンクラス、例えば、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）およびＭＭＡＦ、マイタンシンクラス、例えば、ＤＭ−１、ＤＭ−３、ＤＭ−４、カリケアマイシン、例えば、オゾガマイシン、ＳＮ−３８、またはＰＢＤ（ピロロベンゾジアゼピン）である、請求項５１に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項５３】
以下の式：
Ａｂ−［−Ｌ−Ｄ］ｎ、
を有するイムノコンジュゲート（または抗体−薬物コンジュゲートもしくはＡＤＣ）であって、式中、
Ａｂは、リンカー−薬物部分−［−Ｌ−Ｄ］の１つまたは複数の単位に共有結合している、請求項１０〜１８のいずれか一項およびｘａに記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、または請求項２１もしくは２２に記載のそのポリペプチドであり、式中、Ｌはリンカーであり、Ｄは細胞傷害薬であり；
ｎは、１〜２０（例えば、１〜１２）の整数であり；
各リンカー−薬物部分は、同じかまたは異なるリンカーＬまたは細胞傷害薬Ｄを有することができる、イムノコンジュゲート。
【請求項５４】
各リンカー−薬物部分−［−Ｌ−Ｄ］が、Ｌｙｓの側鎖アミノ基を介してＡｂに共有結合している、請求項５３に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項５５】
各リンカー−薬物部分−［−Ｌ−Ｄ］が、Ｃｙｓの側鎖チオール基を介してＡｂに共有結合している、請求項５３に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項５６】
各リンカー−薬物部分−［−Ｌ−Ｄ］が、部位特異的に組み込まれた非天然アミノ酸を介してＡｂに共有結合している、請求項５３に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項５７】
各リンカーＬが、ペプチド単位を含む、請求項５３〜５６のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項５８】
ペプチド単位が、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２〜１０または２〜５アミノ酸残基を含む、請求項５７に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項５９】
リンカーＬが、プロテアーゼ（例えば、カテプシン）によって切断されない、請求項５３〜５８のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項６０】
リンカーＬが、プロテアーゼ（例えば、カテプシン）、酸性環境または酸化還元状態の変更によって切断可能である切断可能なリンカーである、請求項５３〜５８のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項６１】
細胞傷害薬が、ＤＮＡ挿入剤、微小管結合剤、トポイソメラーゼＩ阻害剤またはＤＮＡ副溝結合剤である、請求項５３〜６０のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項６２】
細胞傷害薬が、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、ＤＭ−１、ＤＭ−３、ＤＭ−４またはＰＢＤ（ピロロベンゾジアゼピン）である、請求項６１に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項６３】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、または請求項１９もしくは２０に記載のポリペプチド、または請求項４３〜５２のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項６４】
請求項１０〜１８のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、または請求項２１もしくは２２に記載のポリペプチド、または請求項５３〜６２のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項６５】
ＣＤ４４ｖ６を発現する細胞の増殖を阻害する方法であって、細胞を、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、または請求項１９もしくは２０に記載のポリペプチド、または請求項４３〜５２のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート、または請求項６３に記載の医薬組成物と接触させるステップを含む方法。
【請求項６６】
前記細胞が、腫瘍細胞である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記腫瘍細胞が、肺がん（ＮＳＣＬＣなど）に由来する、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記腫瘍細胞が、結腸直腸がん、乳がん、頭頸部がん、卵巣がん、膀胱がん、膵臓がんまたは脳の転移がんに由来する、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
ＣＤ４４ｖ９を発現する細胞の増殖を阻害する方法であって、細胞を、請求項１０〜１８のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、または請求項２１もしくは２２に記載のポリペプチド、または請求項５３〜６２のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート、または請求項６４に記載の医薬組成物と接触させるステップを含む方法。
【請求項７０】
前記細胞が、腫瘍細胞である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記腫瘍細胞が、肺がん（ＮＳＣＬＣなど）に由来する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記腫瘍細胞が、結腸直腸がん、乳がん、肝臓がん、頭頸部がん、卵巣がん、膀胱がん、膵臓がんまたは脳の転移がんに由来する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
がんの細胞がＣＤ４４ｖ６を発現するがんを有する対象を処置する方法であって、前記対象に、ＣＤ４４ｖ６抗体またはその抗原結合性断片を含むＣＤ４４ｖ６のアンタゴニストの治療的有効量を投与するステップを含む方法。
【請求項７４】
対象における細胞増殖性障害を処置する方法であって、前記細胞増殖性障害の細胞は、ＣＤ４４ｖ６を発現し、前記方法は、前記対象に、ＣＤ４４ｖ６抗体またはその抗原結合性断片を含むＣＤ４４ｖ６のアンタゴニストの治療的有効量を投与するステップを含む、方法。
【請求項７５】
ＣＤ４４ｖ６のアンタゴニストは請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、または請求項１９もしくは２０に記載のポリペプチド、または請求項４３〜５２のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート、または請求項６３に記載の医薬組成物を含む、請求項７３または７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記がんが、乳房、肺、肝臓、結腸直腸、頭頸部、食道、膵臓、卵巣、膀胱、胃、皮膚、子宮内膜、卵巣、精巣、食道、前立腺または腎臓起源を含む上皮癌腫；骨肉腫、軟骨肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫（ＭＦＨ）、平滑筋肉腫などの骨軟部腫瘍；ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫または白血病などの造血悪性腫瘍；末梢神経腫瘍、星状細胞腫またはメラノーマなどの神経外胚葉性腫瘍；または中皮腫である、請求項７３または７５に記載の方法。
【請求項７７】
がんの細胞がＣＤ４４ｖ９を発現するがんを有する対象を処置する方法であって、前記対象に、ＣＤ４４ｖ９抗体またはその抗原結合性断片を含むＣＤ４４ｖ９のアンタゴニストの治療的有効量を投与するステップを含む方法。
【請求項７８】
対象における細胞増殖性障害を処置する方法であって、前記細胞増殖性障害の細胞は、ＣＤ４４ｖ９を発現し、前記方法は、前記対象に、ＣＤ４４ｖ９抗体またはその抗原結合性断片を含むＣＤ４４ｖ９のアンタゴニストの治療的有効量を投与するステップを含む、方法。
【請求項７９】
ＣＤ４４ｖ９のアンタゴニストが、請求項１０〜１８のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、または請求項２１もしくは２２に記載のポリペプチド、または請求項５３〜６２のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート、または請求項６４に記載の医薬組成物を含む、請求項７７または７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記がんが、乳房、肺、肝臓、結腸直腸、頭頸部、食道、膵臓、卵巣、膀胱、胃、皮膚、子宮内膜、卵巣、精巣、食道、前立腺または腎臓起源を含む上皮癌腫；骨肉腫、軟骨肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫（ＭＦＨ）、平滑筋肉腫などの骨軟部腫瘍；ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫または白血病などの造血悪性腫瘍；末梢神経腫瘍、星状細胞腫またはメラノーマなどの神経外胚葉性腫瘍；または中皮腫である、請求項７７または７９に記載の方法。
【請求項８１】
対象からの試料におけるＣＤ４４ｖ６の存在および／または存在度を判定する方法であって、試料を請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片と接触させるステップを含む方法。
【請求項８２】
対象からの試料におけるＣＤ４４ｖ９の存在および／または存在度を判定する方法であって、試料を請求項１０〜１８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片と接触させるステップを含む方法。
【請求項８３】
がんの細胞がＣＤ４４ｖ６を発現するがんを有する対象を診断および処置する方法であって、
（１）がん試料においてＣＤ４４ｖ６を発現する対象を同定するために、請求項８１に記載の方法を使用して、対象からのがん試料におけるＣＤ４４ｖ６の存在および／または存在度を判定するステップと；
（２）請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、または請求項１９もしくは２０に記載のポリペプチド、または請求項４３〜５２のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート、または請求項６３に記載の医薬組成物の治療的有効量を前記対象に投与するステップと
を含み、それによって、がんを有する対象を診断および処置する、方法。
【請求項８４】
がんの細胞がＣＤ４４ｖ９を発現するがんを有する対象を診断および処置する方法であって、
（１）がん試料においてＣＤ４４ｖ９を発現する対象を同定するために、請求項８２に記載の方法を使用して、対象からのがん試料におけるＣＤ４４ｖ９の存在および／または存在度を判定するステップと；
（２）請求項１０〜１８のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、または請求項２１もしくは２２に記載のポリペプチド、または請求項５３〜６２のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート、または請求項６４に記載の医薬組成物の治療的有効量を前記対象に投与するステップと
を含み、それによって、がんを有する対象を診断および処置する、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ＣＤ４４は、ホモタイプ細胞、細胞マトリックスおよび細胞−細胞骨格相互作用に関与する膜貫通糖タンパク質のファミリーである。ＣＤ４４の細胞外ドメインは、以下の多数のマトリックス置換基に結合する：ヒアルロン酸、エズリン、ラディキシン、モエシンおよびマーリン、ヘパリン親和性増殖因子、血管内皮細胞増殖因子、ｐ１８５ＨＥＲ２、上皮増殖因子および肝細胞増殖因子。その細胞内ドメインは細胞骨格置換基アンキリンに結合し、このように、細胞および組織の構造上の形態を決定する（Ｂｏｕｒｇｕｉｇｎｏｎら、１９９８年、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．３：Ｄ６３７〜６４９頁；Ｗｅｌｃｈら、１９９５年、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１６４：６０５〜６１２頁）。
【０００２】
第１１染色体にマッピングされるＣＤ４４遺伝子は、６０ｋｂにわたる２０エクソンを含有し、５つの構造ドメインに細分化することができる。２０エクソンのうちのエクソン１〜５および１６〜２０の１０個は、ＣＤ４４の標準形態（ＣＤ４４ｓまたはＣＤ４４ｓｔｄ）を構成する。この最小のＣＤ４４アイソフォーム（ＣＤ４４ｓ）は上皮細胞を含む異なる組織において遍在的に発現されるが、ある特定のＣＤ４４スプライス変異体（ＣＤ４４ｖ、ＣＤ４４ｖａｒ）は上皮細胞のサブセットの上だけで発現される。
【０００３】
ＣＤ４４変異体は、タンパク質の細胞外部分の１０エクソン（ｖ１〜ｖ１０）の配列がＣＤ４４ｓにおいて完全に切除されるが、異なる組合せのより大きい変異体では出現することができる方法で、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）レベルで選択的スプライシングによって生成される（Ｓｃｒｅａｔｏｎら、１９９２年；Ｔｏｌｇら、１９９３年；Ｈｏｆｍａｎｎら、１９９１年）。変異体は、異なるアミノ酸配列がタンパク質の細胞外部分のある特定の部位に挿入されるという点で異なる。理論的には、ＣＤ４４変異体（ＣＤ４４ｖ）アイソフォームのために、１０００を超える潜在的なペプチドドメインの組合せがある。全ての変異体エクソンの包含は、分子量２３０ｋＤのタンパク質を与えるだろうが、ほとんどの変異体アイソフォームは１２０ｋＤ未満である。より長い変異体アイソフォーム（ＣＤ４４ｖ１〜１０）は、スプライシングされたエクソン６〜１５の１つまたは複数を含むが、ヒトにおいて、エクソン６（ｖ１）は発現されない。
【０００４】
一部のスプライス変異体は、正常な上皮細胞によって組織特異的に発現される。例えば、ＣＤ４４ｖ１０は正常なリンパ球によって発現される（Ｏｋａｍｏｔｏら、１９９８年、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９０：３０７〜３１５頁）。
【０００５】
しかし、最近、非転移性のラット膵臓腺癌細胞系ならびに非転移性のラット線維肉腫細胞系のいわゆる自発的な転移性挙動を引き起こすために、ある特定のＣＤ４４変異体の発現が必要十分であることが示された（Ｇｕｎｔｈｅｒｔら、１９９１年）。そのような変異体は、様々なヒト腫瘍細胞ならびにヒト腫瘍組織において検出することができる。
【０００６】
例えば、Ｏｋａｍｏｔｏら（Ｏｋａｍｏｔｏら、２００２年、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６０：４４１〜４４７頁；Ｏｋａｍｏｔｏら、２００１年、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５５：７５５〜７６２頁；Ｍｕｒａｋａｍｉら、２００３年、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：１５１１〜１５１６）は、いくつかのヒト腫瘍（前立腺がんを除く）において、ＣＤ４４の細胞質の一部に対する抗体を使用したウエスタンブロットによって、２５〜３０ｋＤの切断生成物が検出可能であることを示している。分子の細胞外部分に対する抗ＣＤ４４ｖモノクローナル抗体を使用して、１００〜１６０ｋＤの断片としてＣＤ４４の可溶性部分が血清で検出された（Ｇａｎｓａｕｇｅら、１９９７年、Ｃａｎｃｅｒ  ８０：１７３３〜１７３９頁）。循環に排出されたＣＤ４４アイソフォームのウエスタンブロット検出は、悪性腫瘍のための診断または予後の試験の役割をすることができる（Ｔａｙｌｏｒら、１９９６年、Ｊ．Ｓｏｃ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｉｎｖｅｓｔ．３：２８９〜２９４頁）。酵素結合血清イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を、タンパク質の高感度のより容易な検出のために次に開発することができる。ＣＤ４４ｖ６の増幅が、膵臓がんの転移表現型（ＲａｌｌおよびＲｕｓｔｇｉ、１９９５年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：１８３１〜１８３５頁）および増加するグレードの乳がん（Ｗｏｏｄｍａｎら、１９９６年、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４９：１５１９〜１５３０頁；Ｂｏｕｒｇｕｉｇｎｏｎら、１９９９年、Ｃｅｌｌ  Ｍｏｔｉｌ．Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ  ４３：２６９〜２８７頁）で注目される。多くの良性およびがん組織において、単一のまたは連続した変異体エクソンの包含がＲＴ−ＰＣＲおよびシークエンシングによって記載されている（Ｏｋａｍｏｔｏら、１９９８年、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９０：３０７〜３１５頁；Ｏｋａｍｏｔｏら、２００２年、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６０：４４１〜４４７頁；ＲａｌｌおよびＲｕｓｔｇｉ、１９９５年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：１８３１〜１８３５頁；Ｗｏｏｄｍａｎら、１９９６年、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４９：１５１９〜１５３０頁；Ｂｏｕｒｇｕｉｇｎｏｎら、１９９９年、Ｃｅｌｌ  Ｍｏｔｉｌ．Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ  ４３：２６９〜２８７頁；Ｒｏｃａら、１９９８年、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５３：１８３〜１９０頁；Ｆｒａｎｚｍａｎｎら、２００１年、Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．Ｈｅａｄ  Ｎｅｃｋ  Ｓｕｒｇ．１２４：４２６〜４３２頁；Ｔｅｒｐｅら、１９９６年、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４８：４５３〜４６３頁；Ｃｈｒｉｓｔら、２００１年、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６９：３４３〜３５２頁；Ｍｏｒｔｅｇａｎｉら、１９９９年、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５４：２９１〜３００頁；Ｍｉｙａｋｅら、１９９８年、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．１８：５６０〜５６４頁；Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、１９９６年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１４：１１２２〜１１２７頁）。
【０００７】
転移の間、腫瘍細胞は原発部位から離脱し、細胞外マトリックスに移動し、血液およびリンパ管に侵入する。転移部位での腫瘍増殖は、ＣＤ４４などの接着タンパク質を通した新しい細胞外マトリックスへの付着を必要とする。これは、多くのがんがＣＤ４４  ｍＲＮＡスプライシングを脱調節し、転移において役割をすることができる新規ＣＤ４４変異体アイソフォームの発現につながったという事実と一貫している。
【０００８】
実際、結腸直腸発がんの間のＣＤ４４変異体の発現が、近年調査されている（Ｈｅｉｄｅｒら、１９９３ａ）。ＣＤ４４変異体の発現は正常なヒト結腸上皮において不在であり、陰窩の増殖細胞において弱い発現だけが検出可能である。例えば腺癌における腫瘍進行の後期のステージでは、全ての悪性腫瘍はＣＤ４４の変異体を発現する。高レベルでの変異体ＣＤ４４の組織発現は、攻撃的な非ホジキンリンパ腫においても示されている（Ｋｏｏｐｍａｎら、１９９３年）。
【０００９】
エクソンｖ６は、特に転移性拡散の間に特別な役割を演ずるようである（Ｒｕｄｙら、１９９３年）。動物モデルでは、ｖ６特異的エピトープに対する抗体は、転移細胞の定着および転移の成長を阻止できた（Ｓｅｉｔｅｒら、１９９３年）。結腸癌腫では、ｖ６発現は、腫瘍進行と相関する（Ｗｉｅｌｅｎｇａら、１９９３年）。胃癌では、ｖ６発現は、腸タイプの腫瘍を散在タイプのものから区別するための重要な診断マーカーである（Ｈｅｉｄｅｒら、１９９３ｂ）。後者の２つの刊行物では、ｖ６発現は、ｖ６特異的エピトープに対する抗体を使用して決定されている。
【００１０】
ＣＤ４４ｖ６は、ヒト腫瘍および正常組織で良好な発現パターンを有する腫瘍関連抗原であることが示されているので（Ｈｅｉｄｅｒら、１９９５年；Ｈｅｉｄｅｒら、１９９６年）、それは、抗体ベースの診断および治療アプローチに付されている（Ｈｅｉｄｅｒら、１９９６年；国際公開第９５／３３７７１号；国際公開第９７／２１１０４号）。
【００１１】
他方、ＣＤ４４ｖ９の異常な発現は、胃がん、結腸がん、乳がん、肺がんおよび頭頸部扁平上皮癌と関連付けられている（米国特許出願公開第２０１７０１３７８１０号）。ＣＤ４４ｖ６およびＣＤ４４ｖ９は、結腸がんにおいて過剰発現されることが以前に実証された（Ｗｉｅｌｅｎｇａら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１９９９年、１５４：５１５〜５２３頁）。ＣＤ４４ｖ９は、胃がんにおいて過剰発現されることも見出されている（Ｕｅら、Ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ  ａｎｄ  ＣＤ４４ｖ９  ｉｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９９８年；７９：１２７〜１３２頁）。
【００１２】
ＣＤ４４ｖ９陽性細胞は、ＲＯＳの生成を抑制し、腫瘍の以降の治療抵抗性、再発および転移をもたらす、強化された能力を実証する（Ｉｓｈｉｍｏｔｏら、２０１１年；Ｔｓｕｇａｗａら、２０１２年；Ｙａｅら、２０１２年）。ＣＤ４４ｖ９が様々な腫瘍タイプにおけるがん幹細胞マーカーであることも報告されている（Ａｓｏら、２０１５年）。
【００１３】
ヒトにおける適用のために非ヒト抗体を使用するときに生じる１つの重大な問題は、それらが、患者における抗体の効能を低減し、投与の継続を害するヒト抗非ヒト応答を速やかに生じさせることである。その問題を克服するために、非ヒト抗体を「ヒト化する」という概念が、当技術分野で開発されている。第１のアプローチでは、非ヒト／ヒトキメラ抗体を構築することによって非ヒト抗体のヒト化の達成が試みられ、ここでは、非ヒト可変領域がヒト定常領域に連結される（Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ  Ｇ．Ｌ．、Ｈｏｚｕｍｉ  Ｎ．およびＳｈｕｌｍａｎ，Ｍ．Ｊ．（１９８４）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｍｏｕｓｅ／ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６４３頁）。このように生成されるキメラ抗体は、元の非ヒト抗体の結合特異性および親和性を保持する。
【００１４】
しかし、キメラ抗体は、マウス抗体よりかなり優れているが、ヒトにおいて抗キメラ応答をなお導き出すことができる（ＬｏＢｕｇｌｉｏ  Ａ．Ｆ．、Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ｒ．Ｈ．、Ｔｒａｎｇ  Ｊ．、Ｈａｙｎｅｓ  Ａ．、Ｒｏｇｅｒｓ  Ｋ．、Ｈａｒｖｅｙ  Ｅ．Ｂ．、Ｓｕｎ  Ｌ．、Ｇｈｒａｙｅｂ  Ｊ．およびＫｈａｚａｅｌｉ  Ｍ．Ｂ．（１９８９）Ｍｏｕｓｅ／ｈｕｍａｎ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ｍａｎ：Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：４２２０頁）。このアプローチは、非ヒト可変領域からヒト可変領域に相補性決定領域（ＣＤＲ）を接ぎ、次に、これらの「再構築されたヒト」可変領域をヒト定常領域に連結することによって、非ヒト配列の量をさらに低減することによって後に洗練された（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｌ．、Ｃｌａｒｋ  Ｍ．、Ｗａｌｄｍａｎｎ  Ｈ．およびＷｉｎｔｅｒ  Ｇ．（１９８８）Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３頁）。ＣＤＲを移植または再構築したヒト抗体は、マウス抗体から誘導されたと同定することができるタンパク質配列をほとんど含有しない。ＣＤＲ移植によってヒト化した抗体は、天然のヒト抗体でさえ見られる抗アロタイプまたは抗イディオタイプ応答などの多少の免疫反応を導き出すことがなおできるが、ＣＤＲ移植抗体はマウス抗体よりかなり免疫原性がなく、したがって、患者のより長期にわたる処置を可能にする。
【００１５】
しかし、ＣＤＲ移植だけでは十分な結合親和性を有する抗体を必ずしももたらすとは限らないことがすぐにわかった。例えばＣＤＲの中のそれらより多くのアミノ酸が抗原結合性に関与することができるので、ＣＤＲ移植抗体はそれらの親の非ヒト抗体と比較して比較的劣った結合特性を時に有する。その結果として、劣った結合親和性を有するＣＤＲ移植抗体は、療法において有益であるとみなされていない。したがって、ＣＤＲ移植抗体の低い免疫原性を非ヒト親抗体の優れた結合特性と組み合わせた抗体を作製する試みが実施された。ＣＤＲ移植に加えて、結合親和性を保持するために齧歯動物ドナー起源の残基として、ヒト化フレームワーク領域において１つから数個のアミノ酸が保持されなければならないとの概念が起こされた（Ｑｕｅｅｎら、（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：１００２９〜１００３３頁）。
【００１６】
診断および療法においてそのような抗体が有する可能性がある高い潜在的有用性のために、様々ながんなどのヒト疾患の処置のために好適である向上した特性を有する抗体の必要性がある。
【００１７】
本発明の根底にある１つの問題は、好ましくは公知のＣＤ４４ｖ６またはＣＤ４４ｖ９特異的抗体と比較してより優れた特性を有する、代替のＣＤ４４ｖ６またはＣＤ４４ｖ９特異的抗体を提供することであった。
【発明の概要】
【００１８】
本発明の一態様は、単離されたＣＤ４４ｖ６エピトープに特異的な、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を提供し、ここで、前記ＣＤ４４ｖ６エピトープは、配列番号１９（例えば、配列番号１９に加えて配列番号１９のＮ末端における１もしくは２つの残基、配列番号１９に加えて配列番号１９のＣ末端における１もしくは２つの残基、または配列番号１９に加えて配列番号１９のＮ末端およびＣ末端の両方における１もしくは２つの残基からなるエピトープ）を含む／それから本質的になるか、または配列番号１９からなり、好ましくは、前記抗体またはその抗原結合性断片は、前記単離されたＣＤ４４ｖ６エピトープに対して産生されるか、または前記単離されたＣＤ４４ｖ６エピトープおよび担体タンパク質（例えば、アルブミン、好ましくはＢＳＡもしくはオボアルブミン、またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ））を含む融合タンパク質またはその化学的コンジュゲートに対して産生される。
【００１９】
ある特定の実施形態では、モノクローナル抗体は：（１）配列番号１のＨＣＶＲ  ＣＤＲ１配列、配列番号２のＨＣＶＲ  ＣＤＲ２配列および配列番号３のＨＣＶＲ  ＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）；（２）配列番号１０のＬＣＶＲ  ＣＤＲ１配列、配列番号１１のＬＣＶＲ  ＣＤＲ２配列および配列番号１２のＬＣＶＲ  ＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。
【００２０】
ある特定の実施形態では、ＣＤ４４ｖ６エピトープは、配列番号１９である。
ある特定の実施形態では、ＣＤ４４ｖ６エピトープは、配列番号１９（例えば、配列番号１９に加えて配列番号１９のＮ末端における１もしくは２つの残基、配列番号１９に加えて配列番号１９のＣ末端における１もしくは２つの残基、または配列番号１９に加えて配列番号１９のＮ末端およびＣ末端の両方における１もしくは２つの残基からなるエピトープ）から本質的になる。
【００２１】
ある特定の実施形態では、ＣＤ４４ｖ６エピトープは、配列番号２４（ＨＥＧＹＲＱＴＰＫＥＤＳ）である。
ある特定の実施形態では、（ｉ）ＨＣＶＲは、配列番号７〜９の１つまたは複数をさらに含み；および／または（ｉｉ）ＬＣＶＲは、配列番号１３〜１８の１つまたは複数をさらに含む。
【００２２】
ある特定の実施形態では、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、前記ＣＤ４４ｖ６エピトープまたは前記ＣＤ４４ｖ６エピトープを有する細胞に、約１０ｎＭ、約５ｎＭまたは約２ｎＭ以下のＫＤで結合する。
【００２３】
ある特定の実施形態では、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、ヒト−マウスキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ＣＤＲ移植抗体または再表面化抗体である。
【００２４】
ある特定の実施形態では、その抗原結合性断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖ＦｖもしくはｓｃＦｖ、ジスルフィドで連結されたＦｖ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、ＩｇＮａｒ、イントラボディ、ＩｇＧΔＣＨ２、ミニボディ、Ｆ（ａｂ’）３、テトラボディ、トリアボディ、ダイアボディ、単一ドメイン抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ、Ｆｃａｂ、ｍＡｂ２、（ｓｃＦｖ）２またはｓｃＦｖ−Ｆｃである。
【００２５】
関連する態様では、本発明は、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を提供し、ここで、前記単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、参照モノクローナル抗体が結合するＣＤ４４ｖ６の同じエピトープに結合するか、またはＣＤ４４ｖ６の同じエピトープへの結合のために前記参照モノクローナル抗体と競合し、ここで、前記参照モノクローナル抗体は：（１）配列番号１のＨＣＶＲ  ＣＤＲ１配列、配列番号２のＨＣＶＲ  ＣＤＲ２配列および／または配列番号３のＨＣＶＲ  ＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）；（２）配列番号１０のＬＣＶＲ  ＣＤＲ１配列、配列番号１１のＬＣＶＲ  ＣＤＲ２配列および／または配列番号１２のＬＣＶＲ  ＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。
【００２６】
本発明の別の態様は、単離されたＣＤ４４ｖ９エピトープに特異的な単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を提供し、ここで、前記ＣＤ４４ｖ９エピトープは、配列番号４３（例えば、配列番号４３に加えて配列番号４３のＮ末端における１もしくは２つの残基、配列番号１９に加えて配列番号４３のＣ末端における１もしくは２つの残基、または配列番号４３に加えて配列番号４３のＮ末端およびＣ末端の両方における１もしくは２つの残基からなるエピトープ）を含む／それから本質的になるか、または配列番号４３からなり；好ましくは、前記抗体またはその抗原結合性断片は、前記単離されたＣＤ４４ｖ９エピトープに対して産生されるか、または前記単離されたＣＤ４４ｖ９エピトープおよび担体タンパク質（例えば、アルブミン、好ましくはＢＳＡもしくはオボアルブミン、またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ））を含む融合タンパク質またはその化学的コンジュゲートに対して産生される。
【００２７】
ある特定の実施形態では、モノクローナル抗体は：（１）配列番号２５のＨＣＶＲ  ＣＤＲ１配列、配列番号２６のＨＣＶＲ  ＣＤＲ２配列および配列番号２７のＨＣＶＲ  ＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）；（２）配列番号３４のＬＣＶＲ  ＣＤＲ１配列、配列番号３５のＬＣＶＲ  ＣＤＲ２配列および配列番号３６のＬＣＶＲ  ＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。
【００２８】
ある特定の実施形態では、ＣＤ４４ｖ９エピトープは、配列番号４３である。
ある特定の実施形態では、ＣＤ４４ｖ９エピトープは、配列番号４３（例えば、配列番号４３に加えて配列番号４３のＮ末端における１もしくは２つの残基、配列番号４３に加えて配列番号４３のＣ末端における１もしくは２つの残基、または配列番号４３に加えて配列番号４３のＮ末端およびＣ末端の両方における１もしくは２つの残基からなるエピトープ）から本質的になる。
【００２９】
ある特定の実施形態では、ＣＤ４４ｖ９エピトープは、配列番号４４（ＳＨＥＧＬＥＥＤＫＤＨ）である。
ある特定の実施形態では、（ｉ）ＨＣＶＲは、配列番号２８〜３３の１つまたは複数をさらに含み；および／または（ｉｉ）ＬＣＶＲは、配列番号３７〜４２の１つまたは複数をさらに含む。
【００３０】
ある特定の実施形態では、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、前記ＣＤ４４ｖ９エピトープまたは前記ＣＤ４４ｖ９エピトープを有する細胞に約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ以下のＫＤで結合する。
【００３１】
ある特定の実施形態では、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、ヒト−マウスキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ＣＤＲ移植抗体または再表面化抗体である。
【００３２】
ある特定の実施形態では、その抗原結合性断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖ＦｖもしくはｓｃＦｖ、ジスルフィドで連結されたＦｖ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、ＩｇＮａｒ、イントラボディ、ＩｇＧΔＣＨ２、ミニボディ、Ｆ（ａｂ’）３、テトラボディ、トリアボディ、ダイアボディ、単一ドメイン抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ、Ｆｃａｂ、ｍＡｂ２、（ｓｃＦｖ）２またはｓｃＦｖ−Ｆｃである。
【００３３】
関連する態様では、本発明は、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を提供し、ここで、前記単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、参照モノクローナル抗体が結合するＣＤ４４ｖ９の同じエピトープに結合するか、またはＣＤ４４ｖ９の同じエピトープへの結合のために前記参照モノクローナル抗体と競合し、ここで、前記参照モノクローナル抗体は：（１）配列番号２５のＨＣＶＲ  ＣＤＲ１配列、配列番号２６のＨＣＶＲ  ＣＤＲ２配列および／または配列番号２７のＨＣＶＲ  ＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）；（２）配列番号３４のＬＣＶＲ  ＣＤＲ１配列、配列番号３５のＬＣＶＲ  ＣＤＲ２配列および／または配列番号３６のＬＣＶＲ  ＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。
【００３４】
本発明の別の態様は、主題の抗ＣＤ４４ｖ６または抗ＣＤ４４ｖ９抗体またはその抗原結合性断片のいずれか１つのＨＣＶＲおよび／またはＬＣＶＲを含むポリペプチドを提供する。
【００３５】
ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、融合タンパク質（例えば、キメラ抗原Ｔ細胞受容体）である。
本発明の別の態様は、主題のポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００３６】
本発明の別の態様は、主題のポリヌクレオチドのいずれかを含むベクターを提供する。
ある特定の実施形態では、ベクターは、発現ベクター（例えば、哺乳動物発現ベクター、酵母発現ベクター、昆虫発現ベクターまたは細菌発現ベクター）である。
【００３７】
本発明の別の態様は、主題の抗ＣＤ４４ｖ６または抗ＣＤ４４ｖ９抗体またはその抗原結合性断片のいずれか、主題のポリペプチドのいずれか、主題のポリヌクレオチドのいずれか、または主題のベクターのいずれかを含む細胞を提供する。
【００３８】
ある特定の実施形態では、細胞は、主題の抗体もしくはその抗原結合性断片のいずれか、または主題のポリペプチドのいずれかを発現する。
ある特定の実施形態では、細胞は、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞またはＣＯＳ細胞である。
【００３９】
ある特定の実施形態では、細胞は、主題の抗ＣＤ４４ｖ６もしくは抗ＣＤ４４ｖ９抗体もしくはその抗原結合性断片のいずれか、または主題のポリペプチドのいずれかを細胞の表面に含む。
【００４０】
ある特定の実施形態では、細胞は、主題の抗体もしくはその抗原結合性断片のいずれか、または主題のポリペプチドのいずれかを含む、キメラ抗原受容体を有するＴ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）である。
【００４１】
本発明の別の態様は、配列番号１９（例えば、配列番号１９に加えて配列番号１９のＮ末端における１もしくは２つの残基、配列番号１９に加えて配列番号１９のＣ末端における１もしくは２つの残基、または配列番号１９に加えて配列番号１９のＮ末端およびＣ末端の両方における１もしくは２つの残基からなるエピトープ）を含む／それから本質的になるか、または配列番号１９からなる、単離されたＣＤ４４ｖ６エピトープを提供する。
【００４２】
本発明の別の態様は、請求項２８に記載の単離されたＣＤ４４ｖ６エピトープおよび担体タンパク質（例えば、アルブミン、好ましくはＢＳＡもしくはオボアルブミン、またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ））を含む融合タンパク質または化学的コンジュゲートを提供する。
【００４３】
本発明の別の態様は、配列番号４３（例えば、配列番号４３に加えて配列番号４３のＮ末端における１もしくは２つの残基、配列番号４３に加えて配列番号４３のＣ末端における１もしくは２つの残基、または配列番号４３に加えて配列番号４３のＮ末端およびＣ末端の両方における１もしくは２つの残基からなるエピトープ）を含む／それから本質的になるか、または配列番号４３からなる、単離されたＣＤ４４ｖ９エピトープを提供する。
【００４４】
本発明の別の態様は、請求項２８ａに記載の単離されたＣＤ４４ｖ９エピトープおよび担体タンパク質（例えば、アルブミン、好ましくはＢＳＡもしくはオボアルブミン、またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ））を含む融合タンパク質または化学的コンジュゲートを提供する。
【００４５】
本発明の別の態様は、主題の抗ＣＤ４４ｖ６もしくは抗ＣＤ４４ｖ９抗体もしくはその抗原結合性断片のいずれか、または主題のポリペプチドのいずれかを生成する方法であって、（ａ）主題の細胞のいずれかを培養するステップ；および（ｂ）前記抗体、その抗原結合性断片またはポリペプチドを前記培養細胞から単離するステップを含む方法を提供する。
【００４６】
ある特定の実施形態では、細胞は、真核細胞である。
本発明の別の態様は、以下の式を有するイムノコンジュゲート（または抗体−薬物コンジュゲートもしくはＡＤＣ）を提供し：Ａｂ−［−Ｌ−Ｄ］ｎ、式中：Ａｂは、リンカー−薬物部分−［−Ｌ−Ｄ］の１つまたは複数の単位に共有結合している、主題の抗ＣＤ４４ｖ６もしくは抗ＣＤ４４ｖ９抗体もしくはその抗原結合性断片のいずれか、またはその主題のポリペプチドのいずれかであり、Ｌはリンカーであり、Ｄは細胞傷害薬であり；ｎは、１〜２０（例えば、１〜１２）の整数であり；各リンカー−薬物部分は、同じかまたは異なるリンカーＬまたは細胞傷害薬Ｄを有することができる。
【００４７】
ある特定の実施形態では、各リンカー−薬物部分−［−Ｌ−Ｄ］は、Ｌｙｓの側鎖アミノ基を介してＡｂに共有結合している。
ある特定の実施形態では、各リンカー−薬物部分−［−Ｌ−Ｄ］は、Ｃｙｓの側鎖チオール基を介してＡｂに共有結合している。
【００４８】
ある特定の実施形態では、各リンカー−薬物部分−［−Ｌ−Ｄ］は、部位特異的に組み込まれた非天然アミノ酸を介してＡｂに共有結合している。
ある特定の実施形態では、各リンカーＬは、ペプチド単位を含む。
【００４９】
ある特定の実施形態では、ペプチド単位は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２〜１０または２〜５個のアミノ酸残基を含む。
ある特定の実施形態では、リンカーＬは、プロテアーゼ（例えば、カテプシン）によって切断されない。
【００５０】
ある特定の実施形態では、リンカーＬは、プロテアーゼ（例えば、カテプシン）、酸性環境または酸化還元状態の変更によって切断可能である切断可能なリンカーである。
ある特定の実施形態では、細胞傷害薬は、ＤＮＡ挿入剤、微小管結合剤、トポイソメラーゼＩ阻害剤またはＤＮＡ副溝結合剤である。
【００５１】
ある特定の実施形態では、細胞傷害薬は、オーリスタチンクラス、例えば、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）およびＭＭＡＦ、マイタンシンクラス、例えば、ＤＭ−１、ＤＭ−３、ＤＭ−４、カリケアマイシン、例えば、オゾガマイシン、ＳＮ−３８、またはＰＢＤ（ピロロベンゾジアゼピン）である。
【００５２】
本発明の別の態様は、主題の抗ＣＤ４４ｖ６もしくは抗ＣＤ４４ｖ９抗体もしくはその抗原結合性断片のいずれか、またはそのポリペプチド、またはそのイムノコンジュゲート、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００５３】
本発明の別の態様は、ＣＤ４４ｖ６を発現する細胞の増殖を阻害する方法であって、細胞を、主題の抗ＣＤ４４ｖ６抗体もしくはその抗原結合性断片、または主題のそのポリペプチド、または主題のそのイムノコンジュゲート、または主題のその医薬組成物のいずれかと接触させるステップを含む方法を提供する。
【００５４】
ある特定の実施形態では、細胞は、腫瘍細胞である。
ある特定の実施形態では、腫瘍細胞は、肺がん（ＮＳＣＬＣなど）に由来する。
ある特定の実施形態では、腫瘍細胞は、結腸直腸がん、乳がん、頭頸部がん、卵巣がん、膀胱がん、膵臓がんまたは脳の転移がんに由来する。
【００５５】
本発明の別の態様は、ＣＤ４４ｖ９を発現する細胞の増殖を阻害する方法であって、細胞を、主題の抗ＣＤ４４ｖ９抗体もしくはその抗原結合性断片、またはそのポリペプチド、またはそのイムノコンジュゲート、またはその医薬組成物のいずれかと接触させるステップを含む方法を提供する。
【００５６】
ある特定の実施形態では、細胞は、腫瘍細胞である。
ある特定の実施形態では、腫瘍細胞は、肺がん（ＮＳＣＬＣなど）に由来する。
ある特定の実施形態では、腫瘍細胞は、結腸直腸がん、乳がん、肝臓、頭頸部がん、卵巣がん、膀胱がん、膵臓がんまたは脳の転移がんに由来する。
【００５７】
本発明の別の態様は、がんの細胞がＣＤ４４ｖ６を発現するがんを有する対象を処置する方法であって、前記対象に、ＣＤ４４ｖ６抗体またはその抗原結合性断片を含むＣＤ４４ｖ６のアンタゴニストの治療的有効量を投与するステップを含む方法を提供する。
【００５８】
本発明の別の態様は、対象における細胞増殖性障害を処置する方法であって、前記細胞増殖性障害の細胞は、ＣＤ４４ｖ６を発現し、前記方法は、前記対象に、ＣＤ４４ｖ６抗体またはその抗原結合性断片を含むＣＤ４４ｖ６のアンタゴニストの治療的有効量を投与するステップを含む、方法を提供する。
【００５９】
ある特定の実施形態では、ＣＤ４４ｖ６のアンタゴニストは、主題の抗ＣＤ４４ｖ６抗体もしくはその抗原結合性断片、または主題のそのポリペプチド、または主題のそのイムノコンジュゲート、または主題のその医薬組成物のいずれかを含む。
【００６０】
ある特定の実施形態では、がんは、乳房、肺、肝臓、結腸直腸、頭頸部、食道、膵臓、卵巣、膀胱、胃、皮膚、子宮内膜、卵巣、精巣、食道、前立腺または腎臓起源を含む上皮癌腫；骨肉腫、軟骨肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫（ＭＦＨ）、平滑筋肉腫などの骨軟部腫瘍；ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫または白血病などの造血悪性腫瘍；末梢神経腫瘍、星状細胞腫またはメラノーマなどの神経外胚葉性腫瘍；または中皮腫である。
【００６１】
本発明の別の態様は、がんの細胞がＣＤ４４ｖ９を発現するがんを有する対象を処置する方法であって、前記対象に、ＣＤ４４ｖ９抗体またはその抗原結合性断片を含むＣＤ４４ｖ９のアンタゴニストの治療的有効量を投与するステップを含む方法を提供する。
【００６２】
本発明の別の態様は、対象における細胞増殖性障害を処置する方法であって、前記細胞増殖性障害の細胞は、ＣＤ４４ｖ９を発現し、前記方法は、前記対象に、ＣＤ４４ｖ９抗体またはその抗原結合性断片を含むＣＤ４４ｖ９のアンタゴニストの治療的有効量を投与するステップを含む、方法を提供する。
【００６３】
ある特定の実施形態では、ＣＤ４４ｖ９のアンタゴニストは、主題の抗ＣＤ４４ｖ９抗体もしくはその抗原結合性断片、またはそのポリペプチド、またはそのイムノコンジュゲート、またはその医薬組成物のいずれかを含む。
【００６４】
ある特定の実施形態では、がんは、乳房、肺、肝臓、結腸直腸、頭頸部、食道、膵臓、卵巣、膀胱、胃、皮膚、子宮内膜、卵巣、精巣、食道、前立腺または腎臓起源を含む上皮癌腫；骨肉腫、軟骨肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫（ＭＦＨ）、平滑筋肉腫などの骨軟部腫瘍；ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫または白血病などの造血悪性腫瘍；末梢神経腫瘍、星状細胞腫またはメラノーマなどの神経外胚葉性腫瘍；または中皮腫である。
【００６５】
本発明の別の態様は、対象からの試料におけるＣＤ４４ｖ６の存在および／または存在度を判定する方法であって、試料を、主題の抗ＣＤ４４ｖ６抗体またはその抗原結合性断片のいずれかと接触させるステップを含む方法を提供する。
【００６６】
本発明の別の態様は、対象からの試料におけるＣＤ４４ｖ９の存在および／または存在度を判定する方法であって、試料を、主題の抗ＣＤ４４ｖ９抗体またはその抗原結合性断片のいずれかと接触させるステップを含む方法を提供する。
【００６７】
本発明の別の態様は、がんの細胞がＣＤ４４ｖ６を発現するがんを有する対象を診断および処置する方法であって、（１）がん試料においてＣＤ４４ｖ６を発現する対象を同定するために、主題の方法を使用して、対象からのがん試料におけるＣＤ４４ｖ６の存在および／または存在度を判定するステップ；（２）主題の抗ＣＤ４４ｖ６抗体もしくはその抗原結合性断片、またはそのポリペプチド、またはそのイムノコンジュゲート、またはその医薬組成物のいずれかの治療的有効量を前記対象に投与するステップを含み、それによって、がんを有する対象を診断および処置する、方法を提供する。
【００６８】
本発明の別の態様は、がんの細胞がＣＤ４４ｖ９を発現するがんを有する対象を診断および処置する方法であって、（１）がん試料においてＣＤ４４ｖ９を発現する対象を同定するために、主題の方法を使用して、対象からのがん試料におけるＣＤ４４ｖ９の存在および／または存在度を判定するステップ；（２）主題の抗ＣＤ４４ｖ９抗体もしくはその抗原結合性断片、またはそのポリペプチド、またはそのイムノコンジュゲート、またはその医薬組成物のいずれかの治療的有効量を前記対象に投与するステップを含み、それによって、がんを有する対象を診断および処置する、方法を提供する。
【００６９】
明示的に否定されるか不適切でない限り、実施例にだけ記載されるものおよび本発明の１つの態様だけに記載されるものを含む、本明細書に記載される実施形態のいずれも、１つまたは複数の他の実施形態と組み合わせることができることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１Ａは、ＣＤ４４ｖ６またはＣＤ４４ｖ９モノクローナル抗体ｍＡｂ１１９またはｍＡｂ１１６を単離するための生細胞ＭａｂＡｒｒａｙの略図である。具体的には、ＭａｂＡｒｒａｙを生成するためにＡｒｒａｙｊｅｔプリンターを使用して、約６×１０４個の異なるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、４つのガラスアルデヒドチップ（７５×２５ｍｍ）の上に印刷した。ＭａｂＡｒｒａｙチップを一晩１０％ＢＳＡで次にブロックし、その後実験を実行した。生きている肺がん細胞系ＰＣ９細胞を緑色蛍光核酸染色ＳＹＴＯ１４（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で標識し、ＰＢＳ中に１×１０７細胞数／ｍＬの密度でチップと一緒に１時間インキュベートした。ＭａｂＡｒｒａｙチップを次に静かにＰＢＳで洗浄し、Ｇｅｎｅｐｉｘスキャナでスキャンした。図１Ｂは、４つの独立したＰＣ９生細胞ＭａｂＡｒｒａｙ実験における、ｍＡｂ１１９および対照ｍＡｂの像を示す。生きているＰＣ９細胞は、ＭａｂＡｒｒａｙチップの上でｍＡｂ１１９によって捕捉した。
【図２】図２は、ＰＣ９細胞の上のｍＡｂ１１９のＦＡＣｓ分析の結果を示す。ｍＡｂ１１９のＰＣ９  ＦＡＣＳ滴定は、ＰＣ９細胞を氷上でｍＡｂ１１９の段階希釈（３００００ｐＭ〜０．１ｐＭ、３倍段階希釈）と一緒に３０分間インキュベートし、その後細胞をＡｌｅｘａ４８８コンジュゲート抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂ）で３０分間染色することによって実行した。ＭＦＩは、ＢＤ  Ｃ６を使用して分析した。親和性ＫＤは、約２ｎＭであると判定された。
【図３】図３は、ＰＣ９細胞が結合したｍＡｂ１１９を内在化したことを示す。生きているＰＣ細胞をカバースリップの上で培養し、１０μｇ／ｍＬのｍＡｂ１１９と氷上で１時間インキュベートし、その後細胞をＰＢＳで３回洗浄した。細胞を３７℃で０時間、２時間または４時間次に培養し、その後４％ＰＦＡによって固定し、その後ＦＡＣｓによりＦＩＴＣコンジュゲート二次抗体で検出した。ＰＣ９細胞は、ｍＡｂ１１９（緑色蛍光色素Ａｌｅｘａ４８８によって標識）および抗ＬＡＭＰ１（赤色蛍光色素Ａｌｅｘａ５９５によって標識）によって次に共染色した。具体的には、ＰＣ９細胞を０．１％ＴｒｉｔｏｎＸで透過性化し、ｍＡｂ１１９およびウサギ抗ＬＡＭＰ１抗体（１：２００、Ａｂｃａｍ）、およびｍＡｂ１１９と１時間インキュベートした。抗体は、Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲート抗マウス抗体およびＡｌｅｘａ５９５コンジュゲート抗ウサギ抗体でそれぞれ次に標識した。リソソーム関連膜タンパク質１（ＬＡＭＰ１）は、主にリソソーム膜を越えて発現される糖タンパク質である。ｍＡｂ１１９および抗ＬＡＭＰ１シグナルの共存は、ＰＣ９細胞によるリソソームコンパートメントへのｍＡｂ１１９の内在化を示す黄色シグナルをもたらす。ｍＡｂ１１９は、０時間時でＬＡＭＰ１とのいかなる共存無しで、細胞表面で最初に観察された。ｍＡｂ１１９およびＬＡＭＰ１の共存は、２時間時および４時間時で観察された。表面蛍光に基づくＦＡＣｓ分析は、ＰＣ９細胞でのｍＡｂ１１９内在化を示す（データは示されない）。具体的には、生きているＰＣ９細胞を１０μｇ／ｍＬのｍＡｂ１１９と氷上で０．５時間インキュベートし、その後ＰＢＳで３回洗浄した。細胞を３７℃で０時間、２時間または４時間次に培養し、その後４％ＰＦＡによって固定した。細胞は、次にＡｌｅｘａ４８８コンジュゲート抗マウス抗体で染色し、表面ＭＦＩを計算することによってＦＡＣｓで分析した。ｍＡｂ１１９の表面局在化を表す表面ＭＦＩは、３７℃で２時間および４時間のインキュベーションの後にそれぞれ７０％および８０％低減した。ＦＡＣｓデータの定量化は、ＰＣ９細胞における平均のパーセント内在化±ＳＥＭ（ｎ＝３）で表されることを示す。縦軸は、相対的表面蛍光（％）を表す。データは、ｍＡｂ１１９がＰＣ９細胞の膜抗原に結合し、内在化される可能性を示す。
【図４】図４は、ｍＡｂ１１９の間接的な細胞傷害性が抗原発現依存性であることを示す。ＰＣ９またはＴＥ１細胞を、９６ウェルプレートに２０００細胞／ウェルの集密で一晩培養した。細胞は、ｍＡｂ１１９の段階希釈と２μｇ／ｍＬのＭＭＡＥコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ抗体によって７２時間処理した。次に、細胞数をＣＣＫ８（ｄｏｊｉｎｄｏ）によって計算した。ＴＥ１およびＰＣ９細胞において異なる細胞傷害性が観察された。抗体カクテルは、１８ｐＭのＩＣ５０でＰＣ９の増殖を阻害したが、同じ抗体カクテルはＴＥ１細胞の増殖を阻害しなかった。ＴＥ１およびＰＣ９細胞に由来する、平均パーセント増殖阻害±ＳＥＭ（ｎ＝３）で表される代表的データが示される。  ２つの細胞系におけるｍＡｂ１１９抗原の発現も、ＦＡＣｓによって判定した。側に挿入したパネルは、ｍＡｂ１１９によって標識したＴＥ１（上パネル）およびＰＣ９（下パネル）のＦＡＣｓ分析を示す。結果は、ＴＥ１細胞でなくＰＣ９細胞がｍＡｂ１１９抗原を発現することを示唆する。したがって、間接的な細胞傷害性は、抗原発現と正に相関していた。
【図５Ａ】図５Ａおよび５Ｂは、ｍＡｂ１１９がヒトＣＤ４４  ｖ６エクソンを標的にすることを示す。ヒトＣＤ４４  ｖ６エピトープを標的にする４つの異なるｓｉＲＮＡの混合物または対照ｓｉＲＮＡで、ＰＣ９を４８時間トランスフェクトした。トランスフェクト細胞は次にｍＡｂ１１９で染色し、ＦＡＣｓによって分析したか、または総タンパクを抽出し、ｍＡｂ１１９抗原の存在度をウエスタンブロッティングによって評価した。ＣＤ４４ｖ６のノックダウンは、ＦＡＣｓにおいてｍＡｂ１１９表面染色強度を低下させた（図５Ａ、ＦＡＣｓデータはＣＤ４４ｖ６  ｓｉＲＮＡ（Ｖ６．ｓｉ）がｍＡｂ１１９の表面シグナルを抑制することを示す（ｎ＝３を代表する））。ＣＤ４４ｖ６のノックダウンは、ｍＡｂ１１９抗原のタンパク質発現レベルも低下させた（図５Ｂ、ウエスタンブロッティングデータはＣＤ４４ｖ６  ｓｉＲＮＡ（Ｖ６．ｓｉ）がｍＡｂ１１９抗原のタンパク質発現を抑制することを示す（ｎ＝３を代表する））。データは、ｍＡｂ１１９がＣＤ４４ｖ６を標的にすることを示唆する。
【図５Ｂ】図５Ａおよび５Ｂは、ｍＡｂ１１９がヒトＣＤ４４  ｖ６エクソンを標的にすることを示す。ヒトＣＤ４４  ｖ６エピトープを標的にする４つの異なるｓｉＲＮＡの混合物または対照ｓｉＲＮＡで、ＰＣ９を４８時間トランスフェクトした。トランスフェクト細胞は次にｍＡｂ１１９で染色し、ＦＡＣｓによって分析したか、または総タンパクを抽出し、ｍＡｂ１１９抗原の存在度をウエスタンブロッティングによって評価した。ＣＤ４４ｖ６のノックダウンは、ＦＡＣｓにおいてｍＡｂ１１９表面染色強度を低下させた（図５Ａ、ＦＡＣｓデータはＣＤ４４ｖ６  ｓｉＲＮＡ（Ｖ６．ｓｉ）がｍＡｂ１１９の表面シグナルを抑制することを示す（ｎ＝３を代表する））。ＣＤ４４ｖ６のノックダウンは、ｍＡｂ１１９抗原のタンパク質発現レベルも低下させた（図５Ｂ、ウエスタンブロッティングデータはＣＤ４４ｖ６  ｓｉＲＮＡ（Ｖ６．ｓｉ）がｍＡｂ１１９抗原のタンパク質発現を抑制することを示す（ｎ＝３を代表する））。データは、ｍＡｂ１１９がＣＤ４４ｖ６を標的にすることを示唆する。
【図６】図６Ａは、ｍＡｂ１１９−ＡＤＣ（ＡＭＴ１１９）の構造の略図である。ｍＡｂ１１９は、ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥとコンジュゲートさせた。図６Ｂは、ＡＭＴ１１９のＨＰＬＣ−ＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィー）のグラフである。平均薬物−抗体比（ＤＡＲ）は、約６であった。
【図７】図７は、ＰＣ９およびＴＥ１細胞における、ＡＭＴ１１９の細胞傷害性を示す。グラフは、ＰＣ９およびＴＥ１細胞に由来する、ＡＭＴ１１９の平均パーセント増殖阻害±ＳＥＭ（ｎ＝３）を示す代表的データである。ＩＣ５０値は、ＰＣ９およびＴＥ１細胞でそれぞれ２，６００ｐＭおよび３９，０００ｐＭであった。差は、２つの細胞系におけるＣＤ４４ｖ６の異なる発現レベルと一貫していた（図４を参照する）。
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、ヒト非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ、図８Ａの右パネル）および正常な肺組織（図８Ａの左パネル）におけるＣＤ４４ｖ６の発現を示す。ｍＡｂ１１９抗体を使用したＣＤ４４ｖ６タンパク質のＩＨＣ（免疫組織化学）検出が一連の正常およびがん組織から示され、ＣＤ４４ｖ６が腫瘍特異的に上方制御されたことを示している。顕微鏡写真像は、０、１＋、２＋および３＋の染色強度を代表する腫瘍組織を表す（図８Ａの右パネル）。図８Ｂは、ＮＳＣＬＣの異なるサブタイプにおけるＣＤ４４ｖ６の発生率を示す。ＳＣＣ、扁平上皮癌；ＬＣＣ、大きな細胞癌腫。
【図９】図９は、ＰＣ９細胞の上のｍＡｂ１１６のＦＡＣｓ分析の結果を示す。ｍＡｂ１１６のＰＣ９  ＦＡＣＳ滴定は、ＰＣ９細胞を氷上でｍＡｂ１１６の段階希釈（３００００ｐＭ〜０．１ｐＭ、３倍段階希釈）と一緒に３０分間インキュベートし、その後細胞をＡｌｅｘａ４８８コンジュゲート抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂ）で３０分間染色することによって実行した。ＭＦＩは、ＢＤ  Ｃ６を使用して分析した。親和性ＫＤは、約９８０ｐＭ（または０．９８ｎＭ）であると判定された。
【図１０】図１０は、ＰＣ９細胞が結合したｍＡｂ１１６を内在化したことを示す。生きているＰＣ細胞をカバースリップの上で培養し、１０μｇ／ｍＬのｍＡｂ１１６と氷上で１時間インキュベートし、その後細胞をＰＢＳで３回洗浄した。細胞を３７℃で０時間、２時間または４時間次に培養し、その後４％ＰＦＡによって固定し、その後ＦＡＣｓによりＦＩＴＣコンジュゲート二次抗体で検出した。ＰＣ９細胞は、ｍＡｂ１１６（緑色蛍光色素Ａｌｅｘａ４８８によって標識）および抗ＬＡＭＰ１（赤色蛍光色素Ａｌｅｘａ５９５によって標識）によって次に共染色した。具体的には、ＰＣ９細胞を０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘで透過性化し、ｍＡｂ１１６およびウサギ抗ＬＡＭＰ１抗体（１：２００、Ａｂｃａｍ）、およびｍＡｂ１１６と１時間インキュベートした。抗体は、Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲート抗マウス抗体およびＡｌｅｘａ５９５コンジュゲート抗ウサギ抗体でそれぞれ次に標識した。ｍＡｂ１１６および抗ＬＡＭＰ１シグナルの共存は、ＰＣ９細胞によるリソソームコンパートメントへのｍＡｂ１１６の内在化を示す黄色シグナルをもたらす。ｍＡｂ１１６は、０時間時でＬＡＭＰ１とのいかなる共存無しで、細胞表面で最初に観察された。ｍＡｂ１１６およびＬＡＭＰ１の共存は、２時間時および４時間時で観察された。  表面蛍光に基づくＦＡＣｓ分析は、ＰＣ９細胞でのｍＡｂ１１６内在化を示す（データは示されず）。具体的には、生きているＰＣ９細胞を１０μｇ／ｍＬのｍＡｂ１１６と氷上で０．５時間インキュベートし、その後ＰＢＳで３回洗浄した。細胞を３７℃で０時間、２時間または４時間次に培養し、その後４％ＰＦＡによって固定した。細胞は、次にＡｌｅｘａ４８８コンジュゲート抗マウス抗体で染色し、表面ＭＦＩを計算することによってＦＡＣｓで分析した。ｍＡｂ１１６の表面局在化を表す表面ＭＦＩは、３７℃で４時間のインキュベーションの後に約９０％低減した。ＰＣ９細胞における平均のパーセント内在化±ＳＥＭ（ｎ＝３）で表される、ＦＡＣｓデータの定量化を示す。縦軸は、相対的表面蛍光（ＭＦＩ、％）を表す。データは、ｍＡｂ１１６がＰＣ９細胞の膜抗原に結合し、内在化される可能性を示す。
【図１１】図１１は、ｍＡｂ１１６および対照ＩｇＧの間接的細胞傷害性を示す。ＰＣ９細胞を、９６ウェルプレートに２０００細胞／ウェルの集密で一晩培養した。細胞は、次にｍＡｂ１１６またはＩｇＧの段階希釈と２μｇ／ｍＬのＭＭＡＥコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ抗体によって７２時間処理した。次に、細胞数をＣＣＫ８（ｄｏｊｉｎｄｏ）によって計算した。ｍＡｂ１１６抗体カクテルは、約３０ｐＭのＩＣ５０でＰＣ９の増殖を阻害したが、ＩｇＧカクテルはいかなる影響も及ぼさなかった。ＰＣ９細胞に由来する、平均パーセント増殖阻害±ＳＥＭ（ｎ＝３）で表される代表的データが示される。
【図１２Ａ】図１２Ａおよび１２Ｂは、ｍＡｂ１１６がヒトＣＤ４４  ｖ９エクソンを標的にすることを示す。ヒトＣＤ４４  Ｖ９エピトープを標的にするｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡで、ＰＣ９を４８時間トランスフェクトした。トランスフェクト細胞は次にｍＡｂ１１６で染色し、ＦＡＣｓによって分析したか、または総タンパクを抽出し、ｍＡｂ１１６抗原の存在度をウエスタンブロッティングによって評価した。ＣＤ４４ｖ９のノックダウンは、ＦＡＣｓにおいてｍＡｂ１１６表面染色強度を低下させた（図１２Ａ、ＦＡＣｓデータはＣＤ４４ｖ９  ｓｉＲＮＡ（Ｖ９．ｓｉ）がｍＡｂ１１６の表面シグナルを抑制することを示す（ｎ＝３を代表する））。ＣＤ４４ｖ９のノックダウンは、ｍＡｂ１１６抗原のタンパク質発現レベルも低下させた（図１２Ｂ）。データは、ｍＡｂ１１６がヒトＣＤ４４ｖ９を標的にすることを示唆する。
【図１２Ｂ】図１２Ａおよび１２Ｂは、ｍＡｂ１１６がヒトＣＤ４４ｖ９エクソンを標的にすることを示す。ヒトＣＤ４４Ｖ９エピトープを標的にするｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡで、ＰＣ９を４８時間トランスフェクトした。トランスフェクト細胞は次にｍＡｂ１１６で染色し、ＦＡＣｓによって分析したか、または総タンパクを抽出し、ｍＡｂ１１６抗原の存在度をウエスタンブロッティングによって評価した。ＣＤ４４ｖ９のノックダウンは、ＦＡＣｓにおいてｍＡｂ１１６表面染色強度を低下させた（図１２Ａ、ＦＡＣｓデータはＣＤ４４ｖ９ｓｉＲＮＡ（Ｖ９．ｓｉ）がｍＡｂ１１６の表面シグナルを抑制することを示す（ｎ＝３を代表する））。ＣＤ４４ｖ９のノックダウンは、ｍＡｂ１１６抗原のタンパク質発現レベルも低下させた（図１２Ｂ）。データは、ｍＡｂ１１６がヒトＣＤ４４ｖ９を標的にすることを示唆する。
【図１３】図１３Ａは、ｍＡｂ１１６−ＡＤＣ（ＡＭＴ１１６）の構造の略図である。ｍＡｂ１１６は、ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥとコンジュゲートさせた。図１３Ｂは、ＡＭＴ１１６のＨＰＬＣ−ＨＩＣのグラフである。平均薬物−抗体比（ＤＡＲ）は、約４．２３であった。
【図１４】図１４は、ＰＣ９およびＫＹＳＥ−１５０（食道癌腫細胞系）細胞におけるＡＭＴ１１６の細胞傷害性を示す。グラフは、ＰＣ９およびＫＹＳＥ−１５０細胞に由来する、ＡＭＴ１１６およびＩｇＧ対照の平均パーセント増殖阻害±ＳＥＭ（ｎ＝３）を示す代表的データである。ＡＭＴ１１６のＩＣ５０値は、ＰＣ９およびＫＹＳＥ−１５０細胞でそれぞれ１３４ｐＭおよび６７０．２ｐＭであった。
【図１５】図１５は、ＡＭＴ１１６のｉｎ  ｖｉｖｏ効能を示す。約５×１０６個のＫＹＳＥ−１５０細胞を１：１のマトリゲルに懸濁し、その後、雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（８〜１０週、２０〜２２ｇ）の右側腹部に注射した。腫瘍体積（０．５×長さ×幅２によって測定した）および体重は、少なくとも週２回判定した。マウスは、投与の前にそれらの最初の腫瘍サイズ（概ね２５０〜５００ｍｍ３の中間腫瘍体積）に基づいてランダムに分類した（ｎ＝５／群）。ビヒクル（ＰＢＳ）、ＡＭＴ１１６または対照ＡＤＣを、ｉ．ｖ．注入（３ｍｇ／ｋｇ、ｑ３ｄ×３）によって投与した。群平均（±ＳＥＭ）の腫瘍体積を、試験期間にわたってプロットした。
【図１６】図１６Ａおよび１６Ｂは、ヒト非小細胞肺がん（図１６Ａの右パネル）および正常な肺組織（図１６Ａの左パネル）におけるＣＤ４４ｖ９の発現を示す。ｍＡｂ１１６抗体を使用したＣＤ４４ｖ９タンパク質のＩＨＣ検出が一連の正常およびがん組織から示され、ＣＤ４４ｖ９が腫瘍特異的に上方制御されたことを示している。顕微鏡写真像は、０、１＋、２＋および３＋の染色強度を代表する腫瘍組織を表す（図１６Ａの右パネル）。図１６Ｂは、ＮＳＣＬＣの異なるサブタイプにおけるＣＤ４４ｖ９の発生率を示す。ＳＣＣ、扁平上皮癌；ＬＣＣ、大きな細胞癌腫。
【図１７】図１７は、複数の腫瘍タイプにおけるＣＤ４４ｖ９の過剰発現を示す。ｍＡｂ１１６抗体を使用したＣＤ４４ｖ９タンパク質のＩＨＣ検出が一連の正常およびがん組織から示され、ＣＤ４４ｖ９が腫瘍特異的に上方制御されたことを示している。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
１．概要
本明細書に記載される本発明は、本明細書に記載されるものなどのある特定の抗ＣＤ４４ｖ６または抗ＣＤ４４ｖ９抗体が、がんなどの疾患を処置するのに有効であるとの知見に一部基づく。
【００７２】
したがって、本発明の一態様は、単離されたＣＤ４４ｖ６エピトープに特異的な、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片であって、ここで、前記ＣＤ４４ｖ６エピトープは：（１）配列番号１９（例えば、配列番号１９に加えて配列番号１９のＮ末端における１もしくは２つの残基、配列番号１９に加えて配列番号１９のＣ末端における１もしくは２つの残基、または配列番号１９に加えて配列番号１９のＮ末端およびＣ末端の両方における１もしくは２つの残基からなるエピトープ）を含む／それから本質的になるか、または（２）配列番号１９からなる、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
【００７３】
例えば、本発明の抗体または抗原結合性断片は、当技術分野で公知である方法によって、単離されたＣＤ４４ｖ６エピトープに対して産生するか、または前記単離されたＣＤ４４ｖ６エピトープおよび担体タンパク質を含む融合タンパク質またはその化学的コンジュゲートに対して産生することができる（下を参照する）。
【００７４】
ある特定の実施形態では、抗ＣＤ４４ｖ６モノクローナル抗体は、（１）配列番号１のＨＣＶＲ  ＣＤＲ１配列、配列番号２のＨＣＶＲ  ＣＤＲ２配列および／または配列番号３のＨＣＶＲ  ＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）；および／または（２）配列番号１０のＬＣＶＲ  ＣＤＲ１配列、配列番号１１のＬＣＶＲ  ＣＤＲ２配列および／または配列番号１２のＬＣＶＲ  ＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。
【００７５】
ある特定の実施形態では、ＣＤ４４ｖ６エピトープは、配列番号１９である。
ある特定の実施形態では、ＣＤ４４ｖ６エピトープは、配列番号１９（例えば、配列番号１９に加えて配列番号１９のＮ末端における１もしくは２つの残基、配列番号１９に加えて配列番号１９のＣ末端における１もしくは２つの残基、または配列番号１９に加えて配列番号１９のＮ末端およびＣ末端の両方における１もしくは２つの残基からなるエピトープ）から本質的になる。配列番号１９のＮ末端および／またはＣ末端の追加された／余分の残基は、野生型ＣＤ４４ｖ６に天然に存在してもよいか、または人工的であってもよい。
【００７６】
ある特定の実施形態では、ＣＤ４４ｖ６エピトープは、配列番号２４（ＨＥＧＹＲＱＴＰＫＥＤＳ）である。
ある特定の実施形態では、（ｉ）ＨＣＶＲは、配列番号７〜９の１つまたは複数をさらに含み；および／または（ｉｉ）ＬＣＶＲは、配列番号１３〜１８の１つまたは複数をさらに含む。
【００７７】
ある特定の実施形態では、単離された抗ＣＤ４４ｖ６モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、前記ＣＤ４４ｖ６エピトープまたは前記ＣＤ４４ｖ６エピトープを有する細胞に、約１０ｎＭ、約５ｎＭまたは約２ｎＭ以下のＫＤで結合する。
【００７８】
ある特定の実施形態では、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、ヒト−マウスキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ＣＤＲ移植抗体または再表面化抗体である。
【００７９】
ある特定の実施形態では、その抗原結合性断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖ＦｖもしくはｓｃＦｖ、ジスルフィドで連結されたＦｖ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、ＩｇＮａｒ、イントラボディ、ＩｇＧΔＣＨ２、ミニボディ、Ｆ（ａｂ’）３、テトラボディ、トリアボディ、ダイアボディ、単一ドメイン抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ、Ｆｃａｂ、ｍＡｂ２、（ｓｃＦｖ）２またはｓｃＦｖ−Ｆｃである。
【００８０】
関連する態様では、本発明は、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を提供し、ここで、前記単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、参照モノクローナル抗体が結合するＣＤ４４ｖ６の同じエピトープに結合するか、またはＣＤ４４ｖ６の同じエピトープへの結合のために前記参照モノクローナル抗体と競合し、ここで、前記参照モノクローナル抗体は：（１）配列番号１のＨＣＶＲ  ＣＤＲ１配列、配列番号２のＨＣＶＲ  ＣＤＲ２配列および／または配列番号３のＨＣＶＲ  ＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）；（２）配列番号１０のＬＣＶＲ  ＣＤＲ１配列、配列番号１１のＬＣＶＲ  ＣＤＲ２配列および／または配列番号１２のＬＣＶＲ  ＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。
【００８１】
本発明の別の態様は、単離されたＣＤ４４ｖ９エピトープに特異的な単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を提供し、ここで、前記ＣＤ４４ｖ９エピトープは：（１）配列番号４３（例えば、配列番号４３に加えて配列番号４３のＮ末端における１もしくは２つの残基、配列番号１９に加えて配列番号４３のＣ末端における１もしくは２つの残基、または配列番号４３に加えて配列番号４３のＮ末端およびＣ末端の両方における１もしくは２つの残基からなるエピトープ）を含む／それから本質的になるか、または（２）配列番号４３からなる。
【００８２】
ある特定の実施形態では、抗ＣＤ４４ｖ９抗体またはその抗原結合性断片は、前記単離されたＣＤ４４ｖ９エピトープに対して産生されるか、または前記単離されたＣＤ４４ｖ９エピトープおよび担体タンパク質（例えば、アルブミン、好ましくはＢＳＡもしくはオボアルブミン、またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ））を含む融合タンパク質またはその化学的コンジュゲートに対して産生される。
【００８３】
ある特定の実施形態では、モノクローナル抗体は：（１）配列番号２５のＨＣＶＲ  ＣＤＲ１配列、配列番号２６のＨＣＶＲ  ＣＤＲ２配列および／または配列番号２７のＨＣＶＲ  ＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）；および／または（２）配列番号３４のＬＣＶＲ  ＣＤＲ１配列、配列番号３５のＬＣＶＲ  ＣＤＲ２配列および／または配列番号３６のＬＣＶＲ  ＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。
【００８４】
ある特定の実施形態では、ＣＤ４４ｖ９エピトープは、配列番号４３である。
ある特定の実施形態では、ＣＤ４４ｖ９エピトープは、配列番号４３（例えば、配列番号４３に加えて配列番号４３のＮ末端における１もしくは２つの残基、配列番号４３に加えて配列番号４３のＣ末端における１もしくは２つの残基、または配列番号４３に加えて配列番号４３のＮ末端およびＣ末端の両方における１もしくは２つの残基からなるエピトープ）から本質的になる。配列番号４３のＮ末端および／またはＣ末端の追加された／余分の残基は、野生型ＣＤ４４ｖ９に天然に存在してもよいか、または人工的であってもよい。
【００８５】
ある特定の実施形態では、ＣＤ４４ｖ９エピトープは、配列番号４４（ＳＨＥＧＬＥＥＤＫＤＨ）である。
ある特定の実施形態では、（ｉ）ＨＣＶＲは、配列番号２８〜３３の１つまたは複数をさらに含み；および／または（ｉｉ）ＬＣＶＲは、配列番号３７〜４２の１つまたは複数をさらに含む。
【００８６】
ある特定の実施形態では、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、前記ＣＤ４４ｖ９エピトープまたは前記ＣＤ４４ｖ９エピトープを有する細胞に約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ以下のＫＤで結合する。
【００８７】
ある特定の実施形態では、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、ヒト−マウスキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ＣＤＲ移植抗体または再表面化抗体である。
【００８８】
ある特定の実施形態では、その抗原結合性断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖ＦｖもしくはｓｃＦｖ、ジスルフィドで連結されたＦｖ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、ＩｇＮａｒ、イントラボディ、ＩｇＧΔＣＨ２、ミニボディ、Ｆ（ａｂ’）３、テトラボディ、トリアボディ、ダイアボディ、単一ドメイン抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ、Ｆｃａｂ、ｍＡｂ２、（ｓｃＦｖ）２またはｓｃＦｖ−Ｆｃである。
【００８９】
関連する態様では、本発明は、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を提供し、ここで、前記単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、参照モノクローナル抗体が結合するＣＤ４４ｖ９の同じエピトープに結合するか、またはＣＤ４４ｖ９の同じエピトープへの結合のために前記参照モノクローナル抗体と競合し、ここで、前記参照モノクローナル抗体は：（１）配列番号２５のＨＣＶＲ  ＣＤＲ１配列、配列番号２６のＨＣＶＲ  ＣＤＲ２配列および／または配列番号２７のＨＣＶＲ  ＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）；（２）配列番号３４のＬＣＶＲ  ＣＤＲ１配列、配列番号３５のＬＣＶＲ  ＣＤＲ２配列および／または配列番号３６のＬＣＶＲ  ＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。
【００９０】
本発明の別の態様は、主題の抗ＣＤ４４ｖ６または抗ＣＤ４４ｖ９抗体またはその抗原結合性断片のいずれか１つのＨＣＶＲおよび／またはＬＣＶＲを含むポリペプチドを提供する。
【００９１】
ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、融合タンパク質（例えば、キメラ抗原Ｔ細胞受容体）である。
キメラ抗原Ｔ細胞受容体（ＣＡＲ−Ｔ）は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、キメラ免疫受容体、キメラＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体としても知られる。それは、免疫エフェクターＴ細胞の上に恣意的な特異性を移植する工学操作受容体である。一般的に、これらの受容体は、Ｔ細胞の上にモノクローナル抗体の特異性を移植するために使用され、それらのコード配列の移入はレトロウイルスベクターによって促進される。受容体は、それらが異なる供給源からの部品で構成されるので、キメラと呼ばれる。ＣＡＲ−Ｔは、Ｔ細胞が患者から取り出され、それらが患者の特定のがんに特異的である受容体、例えばがん細胞の上で発現されるＣＤ４４ｖ６またはＣＤ４４ｖ９を発現するように改変される、養子細胞移入を使用したがんの処置において使用することができる。がん細胞を次に認識して死滅させることができるＴ細胞は、患者に再導入される。患者以外のドナーから供給されるＴ細胞の改変を、同様に使用することもできる。
【００９２】
ある特定の実施形態では、対象発明のＣＡＲ−Ｔは、膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ３ゼータ膜貫通ドメイン）およびエンドドメイン（例えば、ＣＤ３ゼータエンドドメイン）に融合している、主題のモノクローナル抗ＣＤ４４ｖ６または抗ＣＤ４４ｖ９抗体のいずれかに由来する主題の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の融合である。
【００９３】
ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、小胞体に新生タンパク質を誘導するためのシグナルペプチドおよび以降の表面発現の後にある。任意の真核生物のシグナルペプチド配列を使用することができる。ある特定の実施形態では、アミノ末端に生来付着しているシグナルペプチドが使用される（例えば、軽鎖−リンカー−重鎖の配向を有するｓｃＦｖにおいて、軽鎖の天然のシグナルが使用される）。
【００９４】
ある特定の実施形態では、最適な抗原結合を可能にするために異なる方向にｓｃＦｖが配向されるように、フレキシブルスペーサーが加えられる。好ましくは、スペーサーは、抗原認識を促進するために異なる方向に抗原結合性ドメインが配向されるのに十分フレキシブルである。ある特定の実施形態では、ＩｇＧ１からのヒンジ領域がスペーサーとして使用される。ある特定の実施形態では、免疫グロブリンのＣＨ２ＣＨ３領域およびＣＤ３の一部がスペーサーとして使用される。ほとんどのｓｃＦｖベースの構築物では、ＩｇＧ１ヒンジで通常十分である。
【００９５】
ある特定の実施形態では、構築物は、細胞内に突き出て所望のシグナルを伝達するシグナル伝達エンドドメインの元の分子に由来する一般的な疎水性アルファヘリックスである膜貫通ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ＣＤ３ゼータ膜貫通ドメインなどの、エンドドメインの最も膜近位の構成成分からの膜貫通ドメインが使用される。
【００９６】
ある特定の実施形態では、エンドドメインは、３つのＩＴＡＭを含有するＣＤ３ゼータエンドドメインであり、それは、抗原に本発明の抗原結合性断片が結合した後にＴ細胞に活性化シグナルを伝達する。
【００９７】
ある特定の実施形態では、エンドドメインは、追加のシグナルをＴ細胞に提供するために、構築物の細胞質テール（ＣＤ３ゼータドメインのＮ末端またはＣ末端）に融合した共刺激タンパク質受容体（例えば、ＣＤ２８、４１ＢＢ、ＩＣＯＳのそれ）からの細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む。
【００９８】
ある特定の実施形態では、効力を増強するためかまたは増殖／生存シグナルを伝達するために、エンドドメインはＣＤ３ｚ−ＣＤ２８−４１ＢＢまたはＣＤ３ｚ−ＣＤ２８−ＯＸ４０などの複数のシグナル伝達ドメインを組み合わせる。
【００９９】
ある特定の実施形態では、本発明のキメラ抗原受容体は、迅速な精製のための同定マーカーを有する工学操作Ｔ細胞を提供するために、Ｓｔｒｅｐ−タグＩＩ配列（ストレプトアビジンへの内因性の親和性を示す８残基最小ペプチド配列（Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ））をさらに含む。
【０１００】
本発明の別の態様は、主題のポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。
本発明の別の態様は、主題のポリヌクレオチドのいずれかを含むベクターを提供する。
【０１０１】
ある特定の実施形態では、ベクターは、発現ベクター（例えば、哺乳動物発現ベクター、酵母発現ベクター、昆虫発現ベクターまたは細菌発現ベクター）である。
本発明の別の態様は、主題の抗ＣＤ４４ｖ６または抗ＣＤ４４ｖ９抗体またはその抗原結合性断片のいずれか、主題のポリペプチドのいずれか、主題のポリヌクレオチドのいずれか、または主題のベクターのいずれかを含む細胞を提供する。
【０１０２】
ある特定の実施形態では、細胞は、主題の抗体もしくはその抗原結合性断片のいずれか、または主題のポリペプチドのいずれかを発現する。
ある特定の実施形態では、細胞は、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞またはＣＯＳ細胞である。
【０１０３】
ある特定の実施形態では、細胞は、主題の抗ＣＤ４４ｖ６もしくは抗ＣＤ４４ｖ９抗体もしくはその抗原結合性断片のいずれか、または主題のポリペプチドのいずれかを細胞の表面に含む。
【０１０４】
ある特定の実施形態では、細胞は、主題の抗体もしくはその抗原結合性断片のいずれか、または主題のポリペプチドのいずれかを含む、キメラ抗原受容体を有するＴ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）である。
【０１０５】
ある特定の実施形態では、主題のＣＡＲ−Ｔ構築物を有する導入遺伝子を宿主細胞ゲノムに組み入れるために、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、またはトランスポゾンを使用することができる。
【０１０６】
ある特定の実施形態では、非組み入れベクターまたはエピソームＤＮＡ／ＲＮＡ構築物、例えばプラスミドまたはｍＲＮＡを代用することができる。
ある特定の実施形態では、挿入突然変異および遺伝子毒性のリスク無しで長期の導入遺伝子発現を可能にするために、ゲノムに組み入れられずにＴ細胞の中で安定して維持されるベクターが使用される。
【０１０７】
本発明の別の態様は、配列番号１９（例えば、配列番号１９に加えて配列番号１９のＮ末端における１もしくは２つの残基、配列番号１９に加えて配列番号１９のＣ末端における１もしくは２つの残基、または配列番号１９に加えて配列番号１９のＮ末端およびＣ末端の両方における１もしくは２つの残基からなるエピトープ）を含む／それから本質的になるか、または配列番号１９からなる、単離されたＣＤ４４ｖ６エピトープを提供する。
【０１０８】
本発明の別の態様は、請求項２８に記載の単離されたＣＤ４４ｖ６エピトープおよび担体タンパク質（例えば、アルブミン、好ましくはＢＳＡもしくはオボアルブミン、またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ））を含む融合タンパク質または化学的コンジュゲートを提供する。
【０１０９】
本発明の別の態様は、配列番号４３（例えば、配列番号４３に加えて配列番号４３のＮ末端における１もしくは２つの残基、配列番号４３に加えて配列番号４３のＣ末端における１もしくは２つの残基、または配列番号４３に加えて配列番号４３のＮ末端およびＣ末端の両方における１もしくは２つの残基からなるエピトープ）を含む／それから本質的になるか、または配列番号４３からなる、単離されたＣＤ４４ｖ９エピトープを提供する。
【０１１０】
本発明の別の態様は、請求項２８ａに記載の単離されたＣＤ４４ｖ９エピトープおよび担体タンパク質（例えば、アルブミン、好ましくはＢＳＡもしくはオボアルブミン、またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ））を含む融合タンパク質または化学的コンジュゲートを提供する。
【０１１１】
当技術分野で公知であるように、担体タンパク質は、それ自体で免疫応答を誘導して抗体を生成するのに十分に大きくも複雑でもないペプチドまたは他のハプテンとのカップリングのために使用される任意のタンパク質である。担体タンパク質は大きく、複雑であるので、コンジュゲートハプテンに免疫原性を付与し、ハプテンおよび担体の上のエピトープに対する抗体の生成をもたらす。
【０１１２】
多くのタンパク質を担体として使用することができ、免疫原性、溶解性、およびハプテンとのコンジュゲーションを達成することができる有益な官能基の利用可能性に基づいて選択される。ある特定の実施形態では、本発明において使用される担体タンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）またはアルブミン、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはオボアルブミンである。
【０１１３】
本発明において使用することができる多くのそのような担体タンパク質は市販されている、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｍｊｅｃｔ  Ｍａｒｉｃｕｌｔｕｒｅキーホールリンペットヘモシアニン（ｍｃＫＬＨ）；青色担体＊タンパク質（ＫＬＨと同じ免疫原性特性のほとんどを示すＣｏｎｃｈｏｌｅｐａｓ  ｃｏｎｃｈｏｌｅｐａｓヘモシアニン（ＣＣＨ）の精製調製物）；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｍｊｅｃｔ  ＢＳＡ（高度精製（すなわち、分画Ｖ）ウシ血清アルブミン）；カチオン化ウシ血清アルブミン（ｃＢＳＡ）（過剰なエチレンジアミンによって天然のＢＳＡを改変し、全ての負電荷カルボキシル基を正電荷の一級アミンによって実質的にキャッピングし、天然のＢＳＡと比較して有意に増加した免疫原性を有する高度正電荷タンパク質（ｐＩ＞１１）をもたらすことによって調製される）；およびオボアルブミン。
【０１１４】
本発明のＣＤ４４ｖ６およびＣＤ４４ｖ９エピトープは、担体タンパク質に融合させることができるか、担体タンパク質の表面原発性アミン基のいずれか一つまたはより多くを介して担体タンパク質に、例えば、化学的にコンジュゲートした。
【０１１５】
ハプテン／エピトープで利用可能な官能基、要求されるハプテン／エピトープ配向および担体からの距離、ならびに生物学的および抗原特性に及ぼすコンジュゲーションの可能な影響によって、担体タンパク質にハプテン／ペプチドエピトープをコンジュゲートするために異なるアプローチが利用可能である。例えば、一級アミン（リシン残基のＮ末端および側鎖）、カルボキシル基（アスパラギン酸およびグルタミン酸のＣ末端または側鎖）およびスルフヒドリル（システイン残基の側鎖）を有するエピトープは、そのような基を使用してコンジュゲーションの標的にすることができる。一般的に、架橋試薬を介してハプテンをカップリングするために使用されるのは、担体タンパク質中の多くの一級アミンである。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、タンパク質−担体およびペプチド−担体コンジュゲーションは、カルボジイミド架橋剤ＥＤＣ（すなわち、カルボキシルおよびアミン架橋を通したＥＤＣコンジュゲーション）を使用して実行される。
【０１１７】
ある特定の実施形態では、タンパク質−担体およびペプチド−担体コンジュゲーションは、マレイミドコンジュゲーション（すなわち、スルフヒドリル架橋）を使用して実行される。
【０１１８】
ある特定の実施形態では、タンパク質−担体およびペプチド−担体コンジュゲーションは、グルタルアルデヒドコンジュゲーション（アミンからアミンへの架橋）を使用して実行される。
【０１１９】
本発明の別の態様は、主題の抗ＣＤ４４ｖ６もしくは抗ＣＤ４４ｖ９抗体もしくはその抗原結合性断片のいずれか、または主題のポリペプチドのいずれかを生成する方法であって、（ａ）主題の細胞のいずれかを培養するステップ；および（ｂ）前記抗体、その抗原結合性断片またはポリペプチドを前記培養細胞から単離するステップを含む方法を提供する。
【０１２０】
ある特定の実施形態では、細胞は、真核細胞である。
本発明の別の態様は、以下の式を有するイムノコンジュゲート（または抗体−薬物コンジュゲートもしくはＡＤＣ）を提供し：Ａｂ−［−Ｌ−Ｄ］ｎ、式中：Ａｂは、リンカー−薬物部分−［−Ｌ−Ｄ］の１つまたは複数の単位に共有結合している、主題の抗ＣＤ４４ｖ６もしくは抗ＣＤ４４ｖ９抗体もしくはその抗原結合性断片のいずれか、またはその主題のポリペプチドのいずれかであり、Ｌはリンカーであり、Ｄは細胞傷害薬であり；ｎは、１〜２０（例えば、１〜１２）の整数であり；各リンカー−薬物部分は、同じかまたは異なるリンカーＬまたは細胞傷害薬Ｄを有することができる。
【０１２１】
ある特定の実施形態では、各リンカー−薬物部分−［−Ｌ−Ｄ］は、Ｌｙｓの側鎖アミノ基を介してＡｂに共有結合している。
ある特定の実施形態では、各リンカー−薬物部分−［−Ｌ−Ｄ］は、Ｃｙｓの側鎖チオール基を介してＡｂに共有結合している。
【０１２２】
ある特定の実施形態では、各リンカー−薬物部分−［−Ｌ−Ｄ］は、部位特異的に組み込まれた非天然アミノ酸を介してＡｂに共有結合している。
ある特定の実施形態では、各リンカーＬは、ペプチド単位を含む。
【０１２３】
ある特定の実施形態では、ペプチド単位は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２〜１０または２〜５個のアミノ酸残基を含む。
ある特定の実施形態では、リンカーＬは、プロテアーゼ（例えば、カテプシン）によって切断されない。
【０１２４】
ある特定の実施形態では、リンカーＬは、プロテアーゼ（例えば、カテプシン）、酸性環境または酸化還元状態の変更によって切断可能である切断可能なリンカーである。
ある特定の実施形態では、細胞傷害薬は、ＤＮＡ挿入剤、微小管結合剤、トポイソメラーゼＩ阻害剤またはＤＮＡ副溝結合剤である。
【０１２５】
ある特定の実施形態では、細胞傷害薬は、オーリスタチンクラス、例えば、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）およびＭＭＡＦ、マイタンシンクラス、例えば、ＤＭ−１、ＤＭ−３、ＤＭ−４、カリケアマイシン、例えば、オゾガマイシン、ＳＮ−３８、またはＰＢＤ（ピロロベンゾジアゼピン）である。
【０１２６】
関連した態様では、Ｄ部分は、それ自体は薬物分子でないが、そのアダプター分子に特異的である遍在性のＣＡＲ−Ｔがタイトに結合することができるアダプター分子（ＦＩＴＣなど）である。本発明のこの態様により、ＦＩＴＣなどのアダプター分子に非常に高い親和性で結合する単一の遍在性のＣＡＲ−Ｔ細胞は、二重特異的ＳＭＤＣ（小分子薬物コンジュゲート）アダプター分子と同時投与されるときに様々ながんタイプを処置するために使用される。これらの特異な二重特異的アダプターは、アダプター、例えばＦＩＴＣ分子、および腫瘍ホーミング分子、例えば主題の抗ＣＤ４４ｖ６または抗ＣＤ４４ｖ９抗体の抗原結合性断片で構築されて、遍在性のＣＡＲ−Ｔ細胞をがん細胞と正確に架橋し、局所的なＴ細胞活性化を引き起こす。遍在性のＣＡＲ−Ｔ細胞および正しい抗原特異的アダプター分子が存在するときだけ、抗腫瘍活性は誘導される。抗腫瘍活性および毒性は、投与されるアダプター分子の投薬を調整することによってさらに制御することができる。抗原性が不均一な腫瘍の処置は、所望の抗原特異的アダプターの混合物の投与によって達成することができる。
【０１２７】
本発明の別の態様は、主題の抗ＣＤ４４ｖ６もしくは抗ＣＤ４４ｖ９抗体もしくはその抗原結合性断片のいずれか、またはそのポリペプチド、またはそのイムノコンジュゲート、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【０１２８】
本発明の別の態様は、ＣＤ４４ｖ６を発現する細胞の増殖を阻害する方法であって、細胞を、主題の抗ＣＤ４４ｖ６抗体もしくはその抗原結合性断片、または主題のそのポリペプチド、または主題のそのイムノコンジュゲート、または主題のその医薬組成物のいずれかと接触させるステップを含む方法を提供する。
【０１２９】
ある特定の実施形態では、細胞は、腫瘍細胞である。
ある特定の実施形態では、腫瘍細胞は、肺がん（ＮＳＣＬＣなど）に由来する。
ある特定の実施形態では、腫瘍細胞は、結腸直腸がん、乳がん、頭頸部がん、卵巣がん、膀胱がん、膵臓がんまたは脳の転移がんに由来する。
【０１３０】
本発明の別の態様は、ＣＤ４４ｖ９を発現する細胞の増殖を阻害する方法であって、細胞を、主題の抗ＣＤ４４ｖ９抗体もしくはその抗原結合性断片、またはそのポリペプチド、またはそのイムノコンジュゲート、またはその医薬組成物のいずれかと接触させるステップを含む方法を提供する。
【０１３１】
ある特定の実施形態では、細胞は、腫瘍細胞である。
ある特定の実施形態では、腫瘍細胞は、肺がん（ＮＳＣＬＣなど）に由来する。
ある特定の実施形態では、腫瘍細胞は、結腸直腸がん、乳がん、肝臓、頭頸部がん、卵巣がん、膀胱がん、膵臓がんまたは脳の転移がんに由来する。
【０１３２】
本発明の別の態様は、がんの細胞がＣＤ４４ｖ６を発現するがんを有する対象を処置する方法であって、前記対象に、ＣＤ４４ｖ６抗体またはその抗原結合性断片を含むＣＤ４４ｖ６のアンタゴニストの治療的有効量を投与するステップを含む方法を提供する。
【０１３３】
本発明の別の態様は、対象における細胞増殖性障害を処置する方法であって、前記細胞増殖性障害の細胞は、ＣＤ４４ｖ６を発現し、前記方法は、前記対象に、ＣＤ４４ｖ６抗体またはその抗原結合性断片を含むＣＤ４４ｖ６のアンタゴニストの治療的有効量を投与するステップを含む方法を提供する。
【０１３４】
ある特定の実施形態では、ＣＤ４４ｖ６のアンタゴニストは、主題の抗ＣＤ４４ｖ６抗体もしくはその抗原結合性断片、または主題のそのポリペプチド、または主題のそのイムノコンジュゲート、または主題のその医薬組成物のいずれかを含む。
【０１３５】
ある特定の実施形態では、がんは、乳房、肺、肝臓、結腸直腸、頭頸部、食道、膵臓、卵巣、膀胱、胃、皮膚、子宮内膜、卵巣、精巣、食道、前立腺または腎臓起源を含む上皮癌腫；骨肉腫、軟骨肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫（ＭＦＨ）、平滑筋肉腫などの骨軟部腫瘍；ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫または白血病などの造血悪性腫瘍；末梢神経腫瘍、星状細胞腫またはメラノーマなどの神経外胚葉性腫瘍；または中皮腫である。
【０１３６】
本発明の別の態様は、がんの細胞がＣＤ４４ｖ９を発現するがんを有する対象を処置する方法であって、前記対象に、ＣＤ４４ｖ９抗体またはその抗原結合性断片を含むＣＤ４４ｖ９のアンタゴニストの治療的有効量を投与するステップを含む方法を提供する。
【０１３７】
本発明の別の態様は、対象における細胞増殖性障害を処置する方法であって、前記細胞増殖性障害の細胞は、ＣＤ４４ｖ９を発現し、前記方法は、前記対象に、ＣＤ４４ｖ９抗体またはその抗原結合性断片を含むＣＤ４４ｖ９のアンタゴニストの治療的有効量を投与するステップを含む、方法を提供する。
【０１３８】
ある特定の実施形態では、ＣＤ４４ｖ９のアンタゴニストは、主題の抗ＣＤ４４ｖ９抗体もしくはその抗原結合性断片、またはそのポリペプチド、またはそのイムノコンジュゲート、またはその医薬組成物のいずれかを含む。
【０１３９】
ある特定の実施形態では、がんは、乳房、肺、肝臓、結腸直腸、頭頸部、食道、膵臓、卵巣、膀胱、胃、皮膚、子宮内膜、卵巣、精巣、食道、前立腺または腎臓起源を含む上皮癌腫；骨肉腫、軟骨肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫（ＭＦＨ）、平滑筋肉腫などの骨軟部腫瘍；ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫または白血病などの造血悪性腫瘍；末梢神経腫瘍、星状細胞腫またはメラノーマなどの神経外胚葉性腫瘍；または中皮腫である。
【０１４０】
本発明の別の態様は、対象からの試料におけるＣＤ４４ｖ６の存在および／または存在度を判定する方法であって、試料を、主題の抗ＣＤ４４ｖ６抗体またはその抗原結合性断片のいずれかと接触させるステップを含む方法を提供する。
【０１４１】
本発明の別の態様は、対象からの試料におけるＣＤ４４ｖ９の存在および／または存在度を判定する方法であって、試料を、主題の抗ＣＤ４４ｖ９抗体またはその抗原結合性断片のいずれかと接触させるステップを含む方法を提供する。
【０１４２】
本発明の別の態様は、がんの細胞がＣＤ４４ｖ６を発現するがんを有する対象を診断および処置する方法であって、（１）がん試料においてＣＤ４４ｖ６を発現する対象を同定するために、主題の方法を使用して、対象からのがん試料におけるＣＤ４４ｖ６の存在および／または存在度を判定するステップ；（２）主題の抗ＣＤ４４ｖ６抗体もしくはその抗原結合性断片、またはそのポリペプチド、またはそのイムノコンジュゲート、またはその医薬組成物のいずれかの治療的有効量を前記対象に投与するステップを含み、それによって、がんを有する対象を診断および処置する、方法を提供する。
【０１４３】
本発明の別の態様は、がんの細胞がＣＤ４４ｖ９を発現するがんを有する対象を診断および処置する方法であって、（１）がん試料においてＣＤ４４ｖ９を発現する対象を同定するために、主題の方法を使用して、対象からのがん試料におけるＣＤ４４ｖ９の存在および／または存在度を判定するステップ；（２）主題の抗ＣＤ４４ｖ９抗体もしくはその抗原結合性断片、またはそのポリペプチド、またはそのイムノコンジュゲート、またはその医薬組成物のいずれかの治療的有効量を前記対象に投与するステップを含み、それによって、がんを有する対象を診断および処置する方法を提供する。
【０１４４】
本発明は上で全般的に記載されたが、本発明のある特定の具体的な態様または実施形態は、下のセクションにおいてさらに記載される。
２．定義
用語「抗体」、「抗体分子」および「抗体タンパク質」は本明細書において互換的に使用され、同等であるとみなされるものとする。それらには、免疫グロブリン分子の軽鎖および／または重鎖可変領域の中の少なくとも１つの抗原認識部位を介して、標的分子、例えばタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質または上述の組合せを認識し、特異的に結合する免疫グロブリン分子が含まれる。本明細書で使用されるように、用語「抗体」は、インタクトなポリクローナル抗体、インタクトなモノクローナル抗体を包含し、略記号として、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）突然変異体、多重特異的抗体、例えば二重特異的抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原決定部分を含む融合タンパク質、および抗体が所望の生物活性を示す限り、抗原認識部位を含む任意の他の改変免疫グロブリン分子を含むことができる。抗体は、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューとそれぞれ呼ばれるそれらの重鎖定常ドメインのアイデンティティに基づいて、免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、またはそのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）のいずれかであってよい。免疫グロブリンの異なるクラスは、異なる周知のサブユニット構造および三次元構成を有する。抗体は、裸であってもよいか、または毒素、放射性同位体等の他の分子にコンジュゲートしてもよい。
【０１４５】
一部の実施形態では、抗体は、天然に存在しない、組換えで生成された抗体である。一部の実施形態では、抗体は、天然の構成成分から精製される。一部の実施形態では、抗体は、組換えで生成される。一部の実施形態では、抗体は、ハイブリドーマによって生成されるか、または抗体のライブラリーにおいて生成される。
【０１４６】
「モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）」は、ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ（参照により本明細書に組み込まれる、ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７頁）に関連してＫａｂａｔ（参照により本明細書に組み込まれる、Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．、Ｗｕ  Ｔ．Ｔ．、Ｐｅｒｒｙ  Ｈ．Ｍ．、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ  Ｋ．Ｓ．およびＦｏｅｌｌｅｒ  Ｃ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（第５版）ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１〜３２４２号。Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．）による、特異的抗原結合に関与するアミノ酸配列であると理解される。
【０１４７】
本明細書で使用されるように、用語「フレームワーク改変」は、個々の相補性決定領域を囲んでいる可変領域における、単一または複数のアミノ酸の交換、欠失または付加を指す。フレームワーク改変は、抗体タンパク質の免疫原性、生産性または結合特異性に影響を及ぼすことができる。
【０１４８】
本明細書で使用されるように、「抗原結合性断片」、「抗原結合性部分」または略して「断片」は、それが完全長配列より短い核酸分子によってコードされるが、その抗体結合活性（例えば、実質的に同じ結合特異性であるが、Ｋｄによる測定でわずかにより悪い結合親和性であってよい）をなお保持することを特徴とする、抗体分子の短縮版、すなわち任意のポリペプチドサブセットを指す。
【０１４９】
これらの用語はインタクトな抗体の部分を指し、インタクトな抗体の抗原性決定可変領域を指す。抗体断片の例には、限定されずに、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片、線状抗体、単鎖抗体、および抗体断片から形成される多重特異的抗体が含まれる。抗体の「抗原結合性断片」という用語には、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたは複数の断片が含まれる。抗体の抗原結合性機能は、完全長抗体のある特定の断片によって発揮することができることがわかっている。抗体の「抗原結合性断片」という用語に包含される結合性断片の例には、（限定されずに）以下のものが含まれる：（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片（例えば、パパインによって消化される抗体は３つの断片を与える：２つの抗原結合性Ｆａｂ断片および抗原に結合しない１つのＦｃ断片）；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結される２つのＦａｂ断片を含む二価の断片（例えば、ペプシンによって消化される抗体は２つの断片を与える；二価の抗原結合性Ｆ（ａｂ’）２断片、および抗原に結合しないｐＦｃ’断片）、およびその関連したＦ（ａｂ’）の一価の単位；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片（すなわち、Ｆａｂに含まれる重鎖の部分）；（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、ならびに関連したジスルフィド連結Ｆｖ；（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ（ドメイン抗体）またはｓｄＡｂ（単一のドメイン抗体）断片（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４〜５４６頁、１９８９年）；ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）。
【０１５０】
抗体断片の生成のために、様々な技術が公知である。伝統的に、これらの断片は、インタクトな抗体のタンパク分解を介して誘導される（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７〜１１７頁、１９９３年；Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１頁、１９８５年）。ある特定の実施形態では、抗体断片は、組換えで生成される。Ｆａｂ、ＦｖおよびｓｃＦｖ抗体断片は、全て大腸菌または他の宿主細胞において発現させ、それから分泌させることができ、このように、これらの断片の大量生産を可能にする。そのような抗体断片は、抗体ファージライブラリーから単離することもできる。抗体断片は、例えば米国特許第５，６４１，８７０号に記載される線状抗体であってもよく、単一特異的または二重特異的であってもよい。抗体断片を生成するための他の技術は、熟練した技術者にとって明らかと予想される。
【０１５１】
「モノクローナル抗体」は、単一の抗原決定基またはエピトープの高度に特異的な認識および結合に関与する均一な抗体集団を指す。これは、異なる抗原決定基に対して誘導される異なる抗体を一般的に含むポリクローナル抗体と対照的である。用語「モノクローナル抗体」は、インタクトおよび完全長のモノクローナル抗体、ならびに抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、単鎖（ｓｃＦｖ）突然変異体、抗体の一部を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含んでいる任意の他の改変免疫グロブリン分子を包含する。さらに、「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現およびトランスジェニック動物を限定されずに含むいかなる数の様式で作製されるそのような抗体を指す。
【０１５２】
モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５頁に記載されるものなどの、ハイブリドーマ方法を使用して調製することができる。ハイブリドーマ方法を使用して、リンパ球による免疫抗原に特異的に結合する抗体の生成を導き出すために、マウス、ハムスターまたは他の適当な宿主動物が免疫化される。リンパ球は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫化することもできる。免疫化の後、リンパ球を単離し、例えばポリエチレングリコールを使用して好適な骨髄腫細胞系と融合させてハイブリドーマ細胞を形成し、それは次に未融合のリンパ球および骨髄腫細胞と区別して選択することができる。免疫沈降、イムノブロッティングまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）；酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ））によって判定される通り、選択された抗原に対して特異的に誘導されるモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマは、次に標準の方法を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養で（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６年）、または動物における腹水腫瘍としてｉｎ  ｖｉｖｏで増殖させることができる。ポリクローナル抗体に関して記載されるように、モノクローナル抗体は、次に培地または腹水液から精製することができる。
【０１５３】
あるいは、モノクローナル抗体は、米国特許第４，８１６，５６７号に記載される組換えＤＮＡ法を使用して作製することもできる。モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドは、例えば抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲによって成熟Ｂ細胞またはハイブリドーマ細胞から単離され、それらの配列は従来の手順を使用して判定される。重鎖および軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドは、次に好適な発現ベクターにクローニングされ、それらは、さもなければ免疫グロブリンタンパク質を生成しない大腸菌細胞、サルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトされると、宿主細胞によってモノクローナル抗体が生成される。さらに、記載されるように、所望の種の組換えモノクローナル抗体またはその断片は、所望の種のＣＤＲを発現するファージディスプレイライブラリーから単離することができる（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２〜５５４頁、１９９０年；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４〜６２８頁、１９９１年；およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１〜５９７頁、１９９１年）。
【０１５４】
代替の抗体を生成するために、モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチド（複数可）は、組換えＤＮＡ技術を使用したいくつかの異なる様式でさらに改変することができる。一部の実施形態では、例えばマウスモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の定常ドメインを、１）キメラ抗体を生成するために、例えばヒト抗体のそれらの領域に、または２）融合抗体を生成するために、非免疫グロブリンポリペプチドに置換することができる。一部の実施形態では、モノクローナル抗体の所望の抗体断片を生成するために、定常領域はトランケーションされるかまたは除去される。モノクローナル抗体の特異性、親和性等を最適化するために、可変領域の部位特異的または高密度突然変異誘発を使用することができる。
【０１５５】
用語「ヒト化抗体」は、最小限の非ヒト（例えば、マウス）配列を含有する、特異的免疫グロブリン鎖、キメラ免疫グロブリンまたはその断片である、非ヒト（例えば、マウス）抗体の形態を指す。一般的に、ヒト化抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する非ヒトの種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター）のＣＤＲからの残基によって置き換えられる、ヒト免疫グロブリンである（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２〜５２５頁、１９８６年；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２７頁、１９８８年；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４〜１５３６頁、１９８８年）。
【０１５６】
非ヒトまたはヒト抗体を工学的に操作するか、ヒト化するか、または再表面化させるための方法を使用することもでき、当技術分野で周知である。ヒト化されたか、再表面化されたか、または同様に工学操作された抗体は、非ヒトである、例えば、限定されずに、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類または他の哺乳動物である供給源からの、１つまたは複数のアミノ酸残基を有することができる。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「インポート」残基としばしば呼ばれる残基によって置き換えられ、それらは公知のヒト配列の「インポート」可変、定常または他のドメインから一般的にとられる。
【０１５７】
そのような移入される配列は、免疫原性を低減するために、または結合性、親和性、会合速度、解離速度、結合力、特異性、半減期もしくは当技術分野で公知である任意の他の好適な特徴を低減、強化もしくは改変するために使用することができる。一般に、ＣＤＲ残基は、ＣＤ４４ｖ６またはＣＤ４４ｖ９結合に及ぼす影響に直接的に、および最も実質的に関与する。したがって、可変および定常領域の非ヒト配列はヒトまたは他のアミノ酸で置き換えることができるが、非ヒトまたはヒトのＣＤＲ配列の一部または全体は維持される。
【０１５８】
抗体は、任意選択で、抗原ＣＤ４４ｖ６またはＣＤ４４ｖ９への高い親和性および他の良好な生物学的特性を保持して工学的に操作された、ヒト化されたか、再表面化されたか、工学操作されたか、またはヒト抗体であってもよい。この目標を達成するために、ヒト化（またはヒト）または工学操作された抗ＣＤ４４ｖ６または抗ＣＤ４４ｖ９抗体および再表面化された抗体は、任意選択で、親の、工学操作されたおよびヒト化された配列の三次元モデルを使用した、親の配列ならびに様々な概念上のヒト化および工学操作生成物の分析工程によって調製することができる。三次元免疫グロブリンモデルは一般に入手でき、当業者によく知られている。選択される候補免疫グロブリン配列の可能な三次元立体配置構造を図示し、提示する、コンピュータプログラムが利用できる。これらの提示の検査は、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち、ＣＤ４４ｖ６またはＣＤ４４ｖ９などのその抗原に結合する候補免疫グロブリンの能力に影響する残基の分析を可能にする。この方法で、所望の抗体特性、例えば標的抗原（複数可）への増加した親和性が達成されるように、コンセンサスおよびインポート配列からフレームワーク（ＦＲ）残基を選択し、組み合わせることができる。
【０１５９】
本発明の抗体のヒト化、再表面化または工学操作は、任意の公知の方法、例えば、限定されずに、その各々は、その中の引用文献を含めて、参照により本明細書に完全に組み込まれる、Ｗｉｎｔｅｒ（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２頁、１９８６年；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３頁、１９８８年；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４頁、１９８８年、Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６頁、１９９３年；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１頁、１９８７年、Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：４２８５頁、１９９２年；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３頁、１９９３年；Ｒａｇｕｓｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１（３）：９６９〜９７３頁、１９９４年；米国特許第５，６３９，６４１号、５，７２３，３２３号；５，９７６，８６２号；５，８２４，５１４号；５，８１７，４８３号；５，８１４，４７６号；５，７６３，１９２号；５，７２３，３２３号；５，７６６，８８６号；５，７１４，３５２号；６，２０４，０２３号；６，１８０，３７０号；５，６９３，７６２号；５，５３０，１０１号；５，５８５，０８９号；５，２２５，５３９号；４，８１６，５６７号；ＰＣＴ／：ＵＳ９８／１６２８０；ＵＳ９６／１８９７８；ＵＳ９１／０９６３０；ＵＳ９１／０５９３９；ＵＳ９４／０１２３４；ＧＢ８９／０１３３４；ＧＢ９１／０１１３４；ＧＢ９２／０１７５５；ＷＯ９０／１４４４３；ＷＯ９０／１４４２４；ＷＯ９０／１４４３０；ＥＰ２２９２４６；７，５５７，１８９；７，５３８，１９５；および７，３４２，１１０、に記載されるものを使用して実行することができる。
【０１６０】
ある特定の代替の実施形態では、ＣＤ４４ｖ６またはＣＤ４４ｖ９に対する抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知である様々な技術を使用して直接的に調製することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫化されるか、または標的抗原に対して誘導される抗体を生成する免疫化された個体から単離される、不死化されたヒトＢリンパ球を生成することができる（例えば、Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７頁（１９８５）；Ｂｏｅｍｅｒら、１９９１年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４７（１）：８６〜９５頁；および米国特許第５，７５０，３７３号を参照）。さらに、例えば、Ｖａｕｇｈａｎら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０９〜３１４頁、１９９６年、Ｓｈｅｅｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：６１５７〜６１６２頁、１９９８年、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１頁、１９９１年およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１頁、１９９１年に記載されるように、ファージライブラリーからヒト抗体を選択することができ、ここで、そのファージライブラリーはヒト抗体を発現する。抗体ファージライブラリーの生成および使用の技術は、米国特許第５，９６９，１０８号、６，１７２，１９７号、５，８８５，７９３号、６，５２１，４０４号；６，５４４，７３１号；６，５５５，３１３号；６，５８２，９１５号；６，５９３，０８１号；６，３００，０６４号；６，６５３，０６８号；６，７０６，４８４号；および７，２６４，９６３号；およびＲｏｔｈｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｍｂ．２００７．１２．０１８、２００７年（これらの各々は参照により完全に組み込まれる）にも記載される。親和性成熟戦略および鎖シャフリング戦略（参照により全体が組み込まれる、Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９〜７８３頁、１９９２年）は当技術分野で公知であり、高親和性ヒト抗体を生成するために用いることができる。
【０１６１】
ヒト化抗体は、内在性免疫グロブリンの生成の不在下で、免疫化の後にヒト抗体の完全なレパートリーを生成することが可能であるヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するトランスジェニックマウスにおいて作製することもできる。このアプローチは、米国特許第５，５４５，８０７号；５，５４５，８０６号；５，５６９，８２５号；５，６２５，１２６号；５，６３３，４２５号；および５，６６１，０１６号に記載される。
【０１６２】
一部の場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、所望の特異性、親和性および能力を有する非ヒト種からの抗体における対応する残基で置き換えられる。ヒト化抗体は、抗体特異性、親和性および／または能力を洗練および最適化するために、Ｆｖフレームワーク領域におけるおよび／または置き換えられた非ヒト残基の中での追加の残基の置換によってさらに改変することができる。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに対応するＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てを含有する、少なくとも１つの、および一般的に２つまたは３つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のそれらである。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Ｆｃ）、一般的にヒト免疫グロブリンのそれの少なくとも一部を含むこともできる。ヒト化抗体を生成するために使用される方法の例は、米国特許第５，２２５，５３９号および第５，６３９，６４１号、Ｒｏｇｕｓｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１（３）：９６９〜９７３頁、１９９４年；およびＲｏｇｕｓｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．９（１０）：８９５〜９０４頁、１９９６年（全ては参照により本明細書に組み込まれる）に記載される。一部の実施形態では、「ヒト化抗体」は、再表面化した抗体である。一部の実施形態では、「ヒト化抗体」は、ＣＤＲ移植抗体である。
【０１６３】
抗体の「可変領域」は、単独のまたは組合せた、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を指す。重鎖および軽鎖の可変領域は、超可変領域としても知られる３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって接続されている４つのフレームワーク領域（ＦＲ）から各々なる。各鎖のＣＤＲはＦＲによって非常に近接して一緒に保持され、他方の鎖のＣＤＲと一緒に抗体の抗原結合性部位の形成に寄与する。ＣＤＲを判定するための少なくとも２つの技術がある：（１）異種間配列変動性に基づくアプローチ（すなわち、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、１９９１年、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．）；および（２）抗原抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ（Ａｌ−ｌａｚｉｋａｎｉら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７〜９４８頁、１９９７年）。さらに、ＣＤＲを判定するために、これらの２つのアプローチの組合せが当技術分野で時には使用される。
【０１６４】
Ｋａｂａｔの番号付けシステムは、一般的に可変ドメインの残基（概ね軽鎖の残基１〜１０７および重鎖の残基１〜１１３）に言及するときに使用される（例えば、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１））。
【０１６５】
Ｋａｂａｔにおけるアミノ酸位置番号付けは、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１）（参照により本明細書に組み込まれる）における、抗体の編集の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインのために使用される番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを使用して、実際の線状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＣＤＲの短縮またはそれへの挿入に対応するより少ないかまたは追加のアミノ酸を含有することができる。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入断片（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）、および重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂおよび８２ｃ等）を含むことができる。抗体の配列の相同領域における「標準の」Ｋａｂａｔ番号付け配列とのアラインメントによって、所与の抗体のために残基のＫａｂａｔ番号付けを判定することができる。Ｃｈｏｔｈｉａは、代わりに構造ループの位置に言及する（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７頁、１９８７年）。Ｋａｂａｔの番号付け規則を使用して番号付けしたとき、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲ−Ｈ１ループの末端は、ループの長さに応じてＨ３２とＨ３４の間で変化する。この理由は、Ｋａｂａｔの番号付けスキームがＨ３５ＡおよびＨ３５Ｂに挿入を置くからである−３５Ａも３５Ｂも存在しない場合、ループは３２のところで終わる；３５Ａだけが存在する場合、ループは３３のところで終わる；３５Ａと３５Ｂの両方が存在する場合、ループは３４のところで終わる。ＡｂＭ超可変領域はＫａｂａｔのＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａの構造ループの間の妥協に相当し、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ  ＡｂＭ抗体モデル化ソフトウェアによって使用される。
【０１６６】
【表１】
2021519608.tif 000003
【０１６７】
用語「ヒト抗体」は、ヒトによって生成される抗体、または当技術分野で公知の任意の技術を使用して作製される、ヒトによって生成される抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体を意味する。ある特定の実施形態では、ヒト抗体は、非ヒト配列を有しない。ヒト抗体のこの定義は、インタクトまたは完全長の抗体、またはその抗原結合性断片を含む。
【０１６８】
用語「キメラ抗体」は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が２つ以上の種から誘導される抗体を指す。一般的に、軽鎖および重鎖の両方の可変領域は、所望の特異性、親和性および能力を有する１種の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ等）から誘導される抗体の可変領域に対応するが、定常領域は別の種（通常ヒト）から誘導される抗体中の配列に相同性があり、そのため、その種（例えば、ヒト）における免疫応答を導き出す可能性を回避または低減する。ある特定の実施形態では、キメラ抗体は、少なくとも１つのヒト重鎖および／または軽鎖ポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合性断片、例えば、マウスの軽鎖およびヒトの重鎖ポリペプチドを含む抗体を含むことができる。
【０１６９】
本発明の目的のために、改変された抗体が、ヒトＣＤ４４ｖ６またはＣＤ４４ｖ９のポリペプチドとの抗体の会合を可能にする任意のタイプの可変領域を含むことができることを認識するべきである。この点に関しては、可変領域は、体液性応答を開始して、所望の腫瘍関連抗原に対して免疫グロブリンを生成するように誘導することができる任意のタイプの哺乳動物を含むことまたはそれから誘導することができる。このように、改変された抗体の可変領域は、例えば、ヒト、マウス、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル、マカク等）またはルペンを起源とすることができる。一部の実施形態では、改変された免疫グロブリンの可変領域および定常領域は両方ともヒトである。他の実施形態では、適合する抗体（通常、非ヒト供給源に由来する）の可変領域は、分子の結合特性を向上させるかまたは免疫原性を低減するように工学操作するかまたは特異的に仕立てることができる。これに関して、本発明において有益な可変領域は、ヒト化されていてもよいし、またはそれ以外の方法で移入されたアミノ酸配列の包含を介して変更されてもよい。
【０１７０】
ある特定の実施形態では、重鎖および軽鎖の両方における可変ドメインは、１つまたは複数のＣＤＲの少なくとも部分的置き換えによって、および必要に応じて、部分的フレームワーク領域置き換えおよび配列交換によって変更される。ＣＤＲは、フレームワーク領域が由来する抗体と同じクラスまたはさらにサブクラスの抗体から誘導することができるが、ＣＤＲが異なるクラスの抗体から、およびある特定の実施形態では、異なる種の抗体から誘導されることが想定される。１つの可変ドメインの抗原結合能を別のドメインに導入するために、ＣＤＲの全てをドナー可変領域からの完全なＣＤＲによって置き換える必要がない場合もある。むしろ、抗原結合性部位の活性を維持するのに必要である残基を導入することだけが必要な場合もある。米国特許第５，５８５，０８９号、５，６９３，７６１号および５，６９３，７６２号に示される説明があれば、免疫原性の低減した機能的抗体を得ることは、慣例的な実験を実行することまたは試行錯誤の試験によって、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１７１】
可変領域への変更にもかかわらず、当業者は、本発明の改変された抗体が、定常領域ドメインの１つまたは複数の少なくとも一部分が欠失しているか、またはそれ以外の方法で所望の生化学特性、例えば、天然または変更されていない定常領域を含んでいる概ね同じ免疫原性の抗体と比較したとき、増加した腫瘍局在化または低減した血清半減期を提供するように変更されている抗体（例えば、完全長抗体またはその免疫反応性断片）を含むことを理解すると予想される。一部の実施形態では、改変された抗体の定常領域は、ヒトの定常領域を含む。本発明に適合する定常領域への改変には、１つまたは複数のドメインにおける１つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失または置換が含まれる。すなわち、本明細書に開示される改変された抗体は、３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）および／または軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）の１つまたは複数への変更または改変を含むことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数のドメインが部分的または完全に欠失している改変された定常領域が企図される。一部の実施形態では、改変された抗体は、全体のＣＨ２ドメインが除去されたドメイン欠失構築物または変異体（ＡＣＨ２構築物）を含む。一部の実施形態では、省略された定常領域ドメインは、不在の定常領域によって一般的に付与される分子屈曲性の一部を提供する短いアミノ酸スペーサー（例えば、１０残基）と置き換えられる。
【０１７２】
ある特定の実施形態では、改変される抗体は、ＣＨ３ドメインをそれぞれの改変される抗体のヒンジ領域に直接的に融合させるように工学的に操作することができることが注目される。他の構築物では、ヒンジ領域と改変されるＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインの間にペプチドスペーサーを提供することが望ましい場合もある。例えば、ＣＨ２ドメインが欠失し、残りのＣＨ３ドメイン（改変または未改変の）が５〜２０アミノ酸スペーサーによってヒンジ領域に連結されて、適合する構築物を発現させることができる。そのようなスペーサーは、例えば、定常ドメインの調節エレメントがフリーでアクセス可能なままであるかまたはヒンジ領域がフレキシブルなままであることを確実にするために加えることができる。しかし、アミノ酸スペーサーは、一部の場合には、免疫原性であることが証明され、構築物に対して望ましくない免疫応答を導き出すことがあることに注意すべきである。したがって、ある特定の実施形態では、構築物に加えられる任意のスペーサーは比較的非免疫原性であるか、または改変される抗体の所望の生化学的品質を維持するために完全に省略されさえする。
【０１７３】
完全な定常領域ドメインの欠失の他に、本発明の抗体は、少数のまたはさらに単一のアミノ酸の部分的欠失または置換によって提供することができることが理解される。例えば、Ｆｃ結合を実質的に低減し、それによって腫瘍局在化を増加させるために、ＣＨ２ドメインの選択された領域における単一アミノ酸の突然変異が十分である可能性もある。同様に、１つまたは複数の定常領域ドメインの、エフェクター機能（例えば、相補体Ｃ１Ｑ結合）をモジュレートするのを制御する部分を単に欠失させることが望ましい場合もある。定常領域のそのような部分的欠失は、主題の定常領域ドメインに関連した他の望ましい機能をインタクトなままにしつつ、抗体の選択された特徴（血清中半減期）を向上させることができる。さらに、上記のように、開示される抗体の定常領域は、例えば、結果として生じる構築物のプロファイルを強化することができる、１つまたは複数のアミノ酸の突然変異または置換を介して改変することができる。これに関して、改変される抗体の構成および免疫原性プロファイルを実質的に維持しつつ、保存された結合性部位（例えば、Ｆｃ結合性）によって提供される活性を破壊することが可能な場合もある。エフェクター機能を低下もしくは増加させることなどの望ましい特徴を強化するか、またはより多くの細胞毒素もしくは炭水化物付着を提供するために、ある特定の実施形態は、定常領域への１つまたは複数のアミノ酸の付加を含むことができる。そのような実施形態では、選択された定常領域ドメインに由来する特異的配列を挿入または複製することが望ましい場合もある。
【０１７４】
本発明は、本明細書に示される、キメラの、ヒト化された、およびヒトの抗体またはその抗体断片に実質的に相同性である変異体および同等物をさらに包含する。これらは、例えば、保存的な置換突然変異、すなわち、類似のアミノ酸による１つまたは複数のアミノ酸の置換を含有することができる。例えば、保存的置換は、同じ一般的なクラスの中の別のアミノ酸によるアミノ酸の置換、例えば、別の酸性アミノ酸による１つの酸性アミノ酸、別の塩基性アミノ酸による１つの塩基性アミノ酸、または別の中性アミノ酸による１つの中性アミノ酸の置換を指す。保存的アミノ酸置換が意図するものは、上に規定されるものなど、当技術分野で周知である。
【０１７５】
用語「エピトープ」または「抗原決定基」は、本明細書において互換的に使用され、特定の抗体が認識し、特異的に結合することが可能な抗原の一部を指す。抗原がポリペプチドである場合、エピトープは、タンパク質の三次フォールディングによって並置される連続アミノ酸および非連続アミノ酸の両方から形成することができる。連続アミノ酸から形成されるエピトープはタンパク質変性の後にも一般的に保持されるが、三次フォールディングによって形成されるエピトープはタンパク質変性の後に一般的に失われる。エピトープは、特異空間高次構造に少なくとも３つ、より普通には少なくとも５つまたは８〜１０個のアミノ酸を一般的に含む。
【０１７６】
「結合親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）の間の非共有相互作用の合計の強度を一般的に指す。特に明記しない限り、本明細書で使用されるように、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原）の間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。そのパートナーＹへの分子Ｘの親和性は、解離定数（Ｋｄ）または最大半減有効濃度（ＥＣ５０）によって一般的に表すことができる。親和性は、本明細書に記載されるものを含む当技術分野で公知の一般方法によって測定することができる。低親和性抗体は抗原に一般に遅く結合し、容易に解離する傾向があるが、高親和性抗体は抗原に一般により速く結合し、結合をより長く保つ傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法が当技術分野で公知であり、そのいずれも本発明の目的のために使用することができる。具体的な例示的実施形態が、本明細書に記載される。
【０１７７】
本明細書で使用される語句「実質的に同様」または「実質的に同じ」は、２つの数値（一般的に、１つは本発明の抗体と関連し、他は参照／コンパレーター抗体と関連する）の間の十分に高い類似度を表し、そのため、当業者は、２つの値の間の差を前記値（例えば、Ｋｄ値）で測定される生物学的特性の面で生物学的および／または統計的にほとんど有意でないとみなすだろう。前記２つの値の間の差は、参照／コンパレーター抗体の値に応じて、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満または約１０％未満である。
【０１７８】
「単離された」ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、天然に見出されない形態のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物である。単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または組成物には、それらが天然に見出される形態にそれらがもはやない程度まで精製されているものが含まれる。一部の実施形態では、単離される抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または組成物は、実質的に純粋である。
【０１７９】
抗体および他のタンパク質を精製するための当技術分野で公知の方法には、例えば、その各々はここに参照により本明細書に完全に組み込まれる、米国特許出願公開第２００８／０３１２４２５号、２００８／０１７７０４８号および２００９／０１８７００５号に記載されるものも含まれる。
【０１８０】
本明細書で使用されるように、「実質的に純粋」は、少なくとも５０％純粋である（すなわち、混入物を含まない）か、少なくとも９０％純粋であるか、少なくとも９５％純粋であるか、少なくとも９８％純粋であるかまたは少なくとも９９％純粋である材料を指す。
【０１８１】
本発明による抗体分子の「機能的変異体」は、本発明による抗体分子と実質的に類似した生物活性（機能的または構造的な）、すなわち実質的に類似した基質特異性または基質の切断を有する抗体分子である。
【０１８２】
用語「機能的変異体」には、「断片」、「対立遺伝子変異体」「機能的変異体」、「変性核酸コードに基づく変異体」または「化学的誘導体」も含まれる。そのような「機能的変異体」は、１つまたはいくつかの点突然変異、コード配列中の１つまたはいくつかの核酸交換、欠失または挿入または１つまたはいくつかのアミノ酸交換、欠失または挿入を有することができる。前記機能的変異体は、抗体結合活性などのその生物活性を、少なくとも一部、またはさらに前記生物活性の向上と一緒になお保持している。
【０１８３】
本発明による抗体分子の「機能的変異体」は、本発明による抗体分子と実質的に類似した生物活性（機能的または構造的な）、すなわち実質的に類似した標的分子結合性活性を有する抗体分子を含むこともできる。
【０１８４】
「対立遺伝子変異体」は、対立遺伝子の変異、例えばヒトの２つの対立遺伝子における差による変異体である。前記変異体は、抗体標的結合活性などのその生物活性を、少なくとも一部、またはさらに前記生物活性の向上と一緒になお保持している。
【０１８５】
「遺伝子コードの変性に基づく変異体」は、ある特定のアミノ酸をいくつかの異なるヌクレオチドトリプレットがコードすることができるという事実による変異体である。前記変異体は、抗体結合活性などのその生物活性を、少なくとも一部、またはさらに前記生物活性の向上と一緒になお保持している。
【０１８６】
「融合分子」は、例えば放射性標識、毒素もしくは蛍光標識などの化学分子、または当技術分野で公知の任意の他の分子などのリポーターに融合した、本発明による抗体分子であってよい。
【０１８７】
本明細書で使用されるように、本発明による「化学的誘導体」は、化学改変されたか、または通常はその分子の一部でない追加の化学部分を含有している、本発明による抗体分子である。そのような部分は、標的破壊（例えば、腫瘍細胞を死滅させること）などの分子の活性を向上させることができるか、またはその溶解性、吸収、生物学的半減期等を向上させることができる。
【０１８８】
両方の分子が実質的に類似している構造または生物活性を有するならば、分子は別の分子と「実質的に類似している」。したがって、２つの分子が類似した活性を有する限り、それらは変異体であると考えられるが、その理由は、分子のうちの１つの構造が他の分子で見出されない場合でも、またはアミノ酸残基の配列が同一でない場合でもその用語が本明細書で使用されるからである。
【０１８９】
本発明の「試料」または「生体試料」は、具体的な実施形態では、例えば真核生物からの生物起源である。一部の実施形態では、試料はヒト試料であるが、動物試料を使用することもできる。本発明で使用するための試料の非限定的な供給源には、例えば、固体組織、生検吸引液、腹水、流体抽出物、血液、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚の外側部分、呼吸、腸および尿生殖器の管、涙、唾液、乳、腫瘍、臓器、細胞培養および／または細胞培養構成成分が含まれる。「がん性／腫瘍試料」は、がん細胞を含有する試料である。本方法は、異なるタイプの細胞または組織を比較すること、異なる発達段階を比較すること、および疾患もしくは異常の存在および／またはタイプを検出もしくは判定することを限定されずに含む、ＣＤ４４ｖ６もしくはＣＤ４４ｖ９の発現の態様または試料の状態を調べるために使用することができる。
【０１９０】
本発明による抗体の多くの使用のために、可能な限り小さい抗原結合性、すなわち、ＣＤ４４ｖ６またはＣＤ４４ｖ９結合性単位を有することが望ましい。したがって、別の好ましい実施形態では、本発明による抗体タンパク質は、Ｆａｂ断片（抗原結合性断片＝Ｆａｂ）である。本発明によるこれらのＣＤ４４ｖ６特異的抗体タンパク質は、隣接した定常領域によって一緒に保持される両方の鎖の可変領域からなる。これらはプロテアーゼ消化、例えばパパインによって従来の抗体から形成することができるが、類似したＦａｂ断片を当面は遺伝子操作によって生成することもできる。別の好ましい実施形態では、本発明による抗体タンパク質はＦ（ａｂ’）２断片であり、それは、ペプシンによるタンパク分解性切断によって調製することができる。
【０１９１】
遺伝子操作方法を使用して、重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域だけからなる短縮された抗体断片を生成することが可能である。これらは、Ｆｖ断片（可変断片＝可変部分の断片）と呼ばれる。別の好ましい実施形態では、本発明によるＣＤ４４ｖ６またはＣＤ４４ｖ９特異的抗体分子は、そのようなＦｖ断片である。これらのＦｖ断片は定常鎖のシステインによる２つの鎖の共有結合を欠いているので、Ｆｖ断片はしばしば安定化する。重鎖および軽鎖の可変領域を、例えば１０〜３０アミノ酸、好ましくは１５アミノ酸の短いペプチド断片で連結するのが有利である。この方法で、ペプチドリンカーによって連結されるＶＨおよびＶＬからなる、単一のペプチド鎖が得られる。この種類の抗体タンパク質は、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる。先行技術から知られるこの種のｓｃＦｖ抗体タンパク質の例は、Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８年、ＰＮＡＳ  １６：５８７９〜５８８３頁）に記載される。したがって、別の好ましい実施形態では、本発明によるＣＤ４４ｖ６またはＣＤ４４ｖ９特異的抗体タンパク質は、単鎖Ｆｖタンパク質（ｓｃＦｖ）である。
【０１９２】
近年、多量体の誘導体としてｓｃＦｖを調製するための様々な戦略が開発されている。これは、特に向上した薬物動態学的および体内分布特性、ならびに増加した結合親和性を有する組換え抗体をもたらすことが意図されている。ｓｃＦｖの多量体化を達成するために、多量体化ドメインを有する融合タンパク質としてｓｃＦｖを調製した。多量体化ドメインは、例えばＩｇＧのＣＨ３領域またはコイルドコイル構造（ヘリックス構造）、例えばロイシンジッパードメインであってよい。しかし、ｓｃＦｖのＶＨ／ＶＬ領域間の相互作用が多量体化（例えばジ、トリおよびペンタボディ）のために使用される戦略もある。したがって、別の実施形態では、本発明による抗体タンパク質は、ＣＤ４４ｖ６またはＣＤ４４ｖ９特異的ダイアボディ抗体断片である。ダイアボディによって、当業者は二価ホモダイマーｓｃＦｖ誘導体を意味する（Ｈｕら、１９９６年、ＰＮＡＳ  １６：５８７９〜５８８３頁）。ｓｃＦｖ分子のリンカーの５〜１０アミノ酸への短縮は、鎖間ＶＨ／ＮＬ重ね合せが起こるホモダイマーの形成につながる。ダイアボディは、ジスルフィド架橋の組込みによってさらに安定させることができる。先行技術からのダイアボディ抗体タンパク質の例は、Ｐｅｒｉｓｉｃら（１９９４年、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１２１７〜１２２６頁）に見出すことができる。
【０１９３】
ミニボディによって、当業者は、二価のホモダイマーｓｃＦｖ誘導体を意味する。それは、免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧ、最も好ましくはＩｇＧ１のＣＨ３領域を、ヒンジ領域（例えば、同じくＩｇＧ１から）およびリンカー領域を介してｓｃＦｖに接続される二量体化領域として含有する融合タンパク質からなる。ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋は、ほとんどの場合より高等な細胞において形成され、原核生物では形成されない。別の好ましい実施形態では、本発明による抗体タンパク質は、ＣＤ４４ｖ６特異的ミニボディ抗体断片である。先行技術からのミニボディ抗体タンパク質の例は、Ｈｕら（１９９６年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：３０５５〜６１頁）に見出すことができる。
【０１９４】
トリアボディにより、当業者は、三価ホモトリマーｓｃＦｖ誘導体（Ｋｏｒｔｔら、１９９７年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０：４２３〜４３３頁）を意味する。リンカー配列無しでＶＨ−ＶＬが直接的に融合するＳｃＦｖ誘導体は、トリマーの形成につながる。
【０１９５】
当業者は、二価、三価または四価の構造を有し、ｓｃＦｖから誘導されるいわゆるミニ抗体にも精通しているだろう。多量体化は、二量体、三量体または四量体のコイルドコイル構造で実行される（Ｐａｃｋら、１９９３年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＩＩ：、１２７１〜１２７７頁；Ｌｏｖｅｊｏｙら、１９９３年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１２８８〜１２９３頁；Ｐａｃｋら、１９９５年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４６：２８〜３４頁）。
【０１９６】
したがって、一実施形態では、本発明による抗体タンパク質は、上述の抗体断片に基づくＣＤ４４ｖ６またはＣＤ４４ｖ９特異的多量体化分子であり、例えば、トリアボディ、四価のミニ抗体またはペンタボディであってよい。
【０１９７】
ヒト化ＣＤ４４ｖ６またはＣＤ４４ｖ９特異的抗体タンパク質は、当技術分野で公知の分子生物学の方法によって生成することができる。
本発明の抗体タンパク質の可変領域は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、一般的にはヒト免疫グロブリンのそれの少なくとも一部に一般的に連結される。ヒト定常領域ＤＮＡ配列は、様々なヒト細胞から、しかし好ましくは不死化Ｂ細胞から、周知の手順によって単離することができる（上記、Ｋａｂａｔら、および国際公開第８７／０２６７１号を参照する）。したがって、本発明の抗体タンパク質は、それらがＣＤ４４ｖ６またはＣＤ４４ｖ９抗原に特異的結合性を示す限り、定常領域の全部または一部だけを含有することができる。定常領域のタイプおよび範囲の選択は、補体結合または抗体依存性細胞毒性のようなエフェクター機能が所望されるかどうか、ならびに抗体タンパク質の所望の薬理特性に依存する。本発明の抗体タンパク質は、２つの軽鎖／重鎖の組からなる四量体に一般的になるが、二量体であってもよく、すなわち軽鎖／重鎖の組、例えばＦａｂまたはＦｖ断片からなってもよい。
【０１９８】
したがって、さらなる実施形態では、本発明は、それらが可変軽鎖領域および可変重鎖領域を有し、各々はヒト定常領域に連結されることを特徴とする、本発明による抗体タンパク質に関する。詳細には、軽鎖の可変領域はヒトカッパ定常領域に連結され、重鎖の可変領域はヒトガンマ−１定常領域に連結された。軽鎖および重鎖をキメラ化するための他のヒト定常領域も利用可能である。
【０１９９】
マウス抗体の可変領域のヒト化は、当技術分野で公知の方法を用いて達成することができる。ＥＰ０２３９４００は、ヒト可変領域のフレームワークへのマウス可変領域のＣＤＲの移植を開示する。国際公開第９０／０７８６１号は、追加のフレームワーク改変を導入することによってＣＤＲ移植可変領域を再構築する方法を開示する。国際公開第９２／１１０１８号は、ドナーＣＤＲをドナーフレームワークとの高い相同性を有するアクセプターフレームワークと組み合わせているヒト化Ｉｇの生成方法を開示する。国際公開第９２／０５２７４号は、マウス抗体から出発する、フレームワーク突然変異抗体の調製を開示する。マウスモノクローナル抗体のヒト化に関するさらなる先行技術の参考文献は、ＥＰ０３６８６８４；ＥＰ０４３８３１０；国際公開第９２／０７０７５号または国際公開第９２／２２６５３号である。全ては参照により本明細書に組み込まれる。
【０２００】
別の実施形態では、本発明は、軽鎖の前記可変領域および重鎖領域の前記可変領域の各々がヒト定常領域に別々に連結されることを特徴とする、本発明による抗体分子に関する。
【０２０１】
別の実施形態では、本発明は、軽鎖の前記ヒト定常領域がヒトカッパ定常領域である、本発明による抗体分子に関する。
別の実施形態では、本発明は、重鎖の前記ヒト定常領域がヒトＩｇＧ１定常領域である、本発明による抗体タンパク質に関する。
【０２０２】
本発明の抗体タンパク質は、ＣＤ４４ｖ６またはＣＤ４４ｖ９抗原を治療剤の標的にさせるための高特異的ツールを提供する。したがって、さらなる態様では、本発明は、本発明による抗体タンパク質に関係し、ここで、前記抗体タンパク質は、任意選択でリンカーを介して、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の形で、治療剤にコンジュゲートしている。当技術分野で公知の多くの治療剤のうち、放射性同位体、毒素、トキソイド、炎症原性剤、酵素、アンチセンス分子、ペプチド、サイトカインおよび化学療法剤からなる群から選択される治療剤が好ましい。放射性同位体の中では、ガンマ、ベータおよびアルファ放出放射性同位体を、治療剤として使用することができる。β放出放射性同位体が、治療用放射性同位体として好ましい。局所照射および悪性腫瘍細胞の破壊を達成するために、１８６レニウム、１８８レニウム、１３１ヨウ素および９０イットリウムが特に有益なβ放出同位体であることが証明された。したがって、本発明の抗体タンパク質にコンジュゲートした治療剤として、１８６レニウム、１８８レニウム、１３１ヨウ素および９０イットリウムからなる群から選択される放射性同位体が特に好ましい。例えば、本発明の抗体の放射性ヨウ素化のために、国際公開第９３／０５８０４号に開示される方法を用いることができる。
【０２０３】
本明細書で使用される用語「イムノコンジュゲート」、「コンジュゲート」または「ＡＤＣ」は、細胞結合剤（すなわち、抗ＣＤ４４ｖ６または抗ＣＤ４４ｖ９抗体またはその断片）に連結される化合物またはその誘導体を指し、一般式：Ａ−Ｌ−Ｃによって規定され、式中、Ｃ＝細胞毒素、Ｌ＝リンカー、およびＡ＝細胞結合剤（ＣＢＡ）、例えば、抗ＣＤ４４ｖ６または抗ＣＤ４４ｖ９抗体または抗体断片である。イムノコンジュゲートは、逆順の一般式：Ｃ−Ｌ−Ａによって規定することもできる。
【０２０４】
「リンカー」は、化合物、通常は本明細書に記載される細胞傷害剤などの薬物を、抗ＣＤ４４ｖ６もしくは抗ＣＤ４４ｖ９抗体またはその断片などの細胞結合剤に、安定した共有結合様式で連結することが可能である任意の化学部分である。リンカーは、化合物または抗体が活性なままである条件下で、酸誘発切断、光誘発切断、ペプチダーゼ誘発切断、エステラーゼ誘発切断およびジスルフィド結合切断に感受性であっても実質的に抵抗性であってもよい。好適なリンカーは当技術分野で周知であり、例えば、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸に不安定な基、光解離性基、ペプチダーゼに不安定な基およびエステラーゼに不安定な基が含まれる。本明細書に記載されるように、および当技術分野で公知であるように、リンカーには、荷電したリンカーおよびその親水性形態も含まれる。
【０２０５】
用語「がん細胞」、「腫瘍細胞」および文法上の同等物は、腫瘍細胞集団の大部分を占める非腫瘍形成性細胞と腫瘍形成性の幹細胞（がん幹細胞）の両方を含む、腫瘍または前がん性の病変に由来する細胞の全体の集団を指す。本明細書で使用されるように、用語「腫瘍細胞」は、更新および分化する能力を欠いており、がん幹細胞からそれらの腫瘍細胞が区別される腫瘍細胞だけを指すとき、用語「非腫瘍形成性」によって修飾される。
【０２０６】
用語「対象」は、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類などを限定されずに含む、特定の処置のレシピエントになる予定の任意の動物（例えば、哺乳動物）を指す。一般的に、用語「対象」および「患者」は、ヒト対象を指すために本明細書で互換的に使用される。
【０２０７】
１つまたは複数のさらなる治療剤「と組み合わせた」投与は、同時（並行）および任意の順序での連続投与を含む。
用語「医薬製剤」は、有効成分の生物活性を有効にさせるような形態であり、製剤が投与されるだろう対象に許容されないほど毒性である追加の構成成分を含有しない調製物を指す。そのような製剤は、無菌であってよい。
【０２０８】
本明細書に開示される抗体またはイムノコンジュゲートの「有効量」は、具体的に明記される目的を実行するのに十分な量である。明記された目的に関して、「有効量」は経験的に、および慣例的な方法で決定することができる。
【０２０９】
用語「治療的有効量」は、対象または哺乳動物で疾患または障害を「処置する」のに有効な抗体または他の薬物の量を指す。がんの場合、薬物の治療的有効量は、がん細胞の数を低減すること；腫瘍サイズを低減すること；末梢器官へのがん細胞の浸潤を阻害すること（すなわち、ある程度遅らせること、およびある特定の実施形態では、停止すること）；腫瘍転移を阻害すること（すなわち、ある程度遅らせること、およびある特定の実施形態では、停止すること）；腫瘍増殖をある程度阻害すること；がんに関連する症状の１つまたは複数をある程度軽減すること；および／または良好な応答、例えば、増加した無進行生存（ＰＦＳ）、無病生存（ＤＦＳ）または全体的生存（ＯＳ）、完全寛解（ＣＲ）、部分寛解（ＰＲ）をもたらすこと、または一部の場合には、安定疾患（ＳＤ）、減少した進行性疾患（ＰＤ）、低減した進行までの時間（ＴＴＰ）、またはその任意の組合せをもたらすことができる。「処置すること」の本明細書の定義を参照する。薬物が増殖を阻止することおよび／または既存のがん細胞を死滅させることができる限り、それは細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性であることができる。
【０２１０】
「予防的有効量」は、必要な投薬量および期間で、所望の予防結果を達成するのに有効な量を指す。一般的に、しかし必ずしもそうとは限らないが、予防的用量は疾患の前かまたはより初期の段階で対象において使用されるので、予防的有効量は治療的有効量より少ない。
【０２１１】
「化学療法剤」は、作用機構に関係なく、がんの処置において有益な化合物である。「処置する」または「処置」、または「処置すること」または「緩和する」または「緩和すること」などの用語は、診断された病理学的状態または障害の症状を治療、鈍化、減らす、および／またはその進行を停止させる治療手段を指す。したがって、処置を必要とする者には、障害を既に診断された者が含まれ、最小限の残留性疾患、または抵抗性疾患、または再発疾患を有する者を含めることもできる。ある特定の実施形態では、患者が以下の１つまたは複数を示す場合、対象は本発明の方法によりがんを首尾よく「処置される」：がん細胞の数の低減またはその完全な不在；腫瘍サイズの低減；軟組織および骨へのがんの拡散を例えば含む、末梢器官へのがん細胞浸潤の阻害または不在；腫瘍転移の阻害または不在；腫瘍増殖の阻害または不在；特異的がんに関連した１つまたは複数の症状の軽減；低減した罹病率および死亡率；生活の質の改善；腫瘍の腫瘍原性、腫瘍形成頻度または腫瘍形成能力の低減；腫瘍におけるがん幹細胞の数または頻度の低減；非腫瘍形成状態への腫瘍形成性細胞の分化；増加した無進行生存（ＰＦＳ）、無病生存（ＤＦＳ）または全体的生存（ＯＳ）、完全寛解（ＣＲ）、部分寛解（ＰＲ）、安定疾患（ＳＤ）、減少した進行性疾患（ＰＤ）、低減した進行までの時間（ＴＴＰ）、またはその任意の組合せ。
【０２１２】
本明細書で互換的に使用される、「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、改変されたヌクレオチドもしくは塩基、および／またはそれらの類似体、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによってポリマーに組み込むことができる任意の基質であってもよい。ポリヌクレオチドは、改変されたヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチドおよびそれらの類似体を含むことができる。存在する場合、ヌクレオチド構造の改変は、ポリマーのアセンブリーの前後に付与することができる。ヌクレオチドの配列には、非ヌクレオチド構成成分が割り込むことができる。ポリヌクレオチドは、例えば標識構成成分とのコンジュゲーションによって、重合の後にさらに改変されてもよい。他のタイプの改変には、例えば、「キャップ」、天然に存在するヌクレオチドの１つまたは複数の類似体による置換、ヌクレオチド間改変、例えば非荷電結合によるもの（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カバメート等）、および荷電結合によるもの（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）、ペンダント部分、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ｐｌｙ−Ｌ−リシン等）を含有するもの、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレン等）を有するもの、キレーター（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化性金属等）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、改変された連結を有するもの（例えば、アルファアノマー核酸等）、ならびにポリヌクレオチド（複数可）の未改変の形態が含まれる。さらに、糖に通常存在するヒドロキシル基のいずれも、例えばホスホネート基、リン酸基と置き換えるか、標準の保護基によって保護するか、または追加のヌクレオチドへの追加の連結を用意するために活性化するか、または固体支持体にコンジュゲートすることができる。５’および３’末端のＯＨは、リン酸化するか、または炭素原子数１から２０のアミンもしくは有機キャップ形成基部分で置換することができる。他のヒドロキシルを、標準の保護基に誘導体化することもできる。ポリヌクレオチドは、例えば、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジドリボース、炭素環式糖類似体、アルファアノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロースまたはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体および無塩基ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドを含む、当技術分野で一般的に公知であるリボースまたはデオキシリボース糖の類似した形態を含有することもできる。１つまたは複数のホスホジエステル結合を、代替の連結基と置き換えてもよい。これらの代替の連結基には、限定されずに、リン酸がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ＊、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）で置き換えられる実施形態が含まれ、ここで、各ＲまたはＲは独立してＨであるか、またはエーテル（−Ｏ−）結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはアラルジルを任意選択で含有する置換型もしくは非置換型のアルキル（１〜２０Ｃ）である。ポリヌクレオチドの全ての連結が同一である必要があるとは限らない。上の記載は、本明細書において言及されるＲＮＡおよびＤＮＡを含む全てのポリヌクレオチドに適用される。
【０２１３】
用語「ベクター」は、宿主細胞において目的の１つまたは複数の遺伝子または配列を送達および発現することが可能である構築物を意味する。ベクターの例には、限定されずに、ウイルスベクター、裸のＤＮＡもしくはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン性縮合剤に関連したＤＮＡもしくはＲＮＡ発現ベクター、リポソームに封入されたＤＮＡもしくはＲＮＡ発現ベクター、および産生細胞などのある特定の真核細胞が含まれる。
【０２１４】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は本明細書で互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは線状または分枝状であってもよく、それは改変アミノ酸を含むことができ、アミノ酸以外のものが割り込んでもよい。本用語は、天然にまたは介入；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変、例えば標識構成成分とのコンジュゲーションによって改変されているアミノ酸ポリマーも包含する。例えば、アミノ酸の１つまたは複数の類似体（例えば、非天然アミノ酸等を含む）ならびに当技術分野で公知の他の改変を含有するポリペプチドも、この定義の中に含まれる。本発明のポリペプチドは抗体に基づいているので、ある特定の実施形態では、ポリペプチドは単一の鎖または会合した鎖として存在することができるものと理解される。一部の実施形態では、ポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質は、天然に存在しない。一部の実施形態では、ポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質は、他の天然に存在する構成成分から精製される。一部の実施形態では、ポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質は、組換えで生成される。
【０２１５】
２つ以上の核酸またはポリペプチドとの関連で、用語「同一の」または「同一性」パーセントは、いかなる保存的アミノ酸置換も配列同一性の一部と考えずに、最大の対応のために比較および整列させたとき（必要に応じてギャップを導入して）、同じであるか、または同じであるヌクレオチドもしくはアミノ酸残基の特定の百分率を有する、２つ以上の配列または部分配列を指す。同一性パーセントは、配列比較ソフトウェアもしくはアルゴリズムを使用して、または目視検査によって測定することができる。アミノ酸またはヌクレオチド配列のアラインメントを得るために使用することができる様々なアルゴリズムおよびソフトウェアが、当技術分野で公知である。配列アラインメントアルゴリズムのそのような非限定的な一例は、Ｋａｒｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：５８７３〜５８７７頁、１９９３年、に改変された、ＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２頁、１９９１年）に組み込まれている、Ｋａｒｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：２２６４〜２２６８頁、１９９０年、に記載されるアルゴリズムである。ある特定の実施形態では、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２頁、１９９７年、に記載の通りにＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを使用することができる；ＢＬＡＳＴ−２、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２６６：４６０〜４８０頁、１９９６年）、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）は、配列を整列させるために使用することができる追加の公開されているソフトウェアプログラムである。ある特定の実施形態では、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアの中のＧＡＰプログラムを使用して判定される（例えば、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスおよび４０、５０、６０、７０または９０のギャップウェイトおよび１、２、３、４、５または６のレングスウェイトを使用する）。ある特定の代替の実施形態では、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４〜４５３頁、１９７０年）のアルゴリズムを組み込むＧＣＧソフトウェアパッケージの中のＧＡＰプログラムは、２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントを判定するために使用することができる（例えば、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップウェイトおよび１、２、３、４、５のレングスウェイトを使用する）。あるいは、ある特定の実施形態では、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ、４：１１〜１７頁、１９８９年）のアルゴリズムを使用して判定される。例えば、同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）を使用して、ならびにＰＡＭ１２０を残基表、１２のギャップレン���スペナルティおよび４のギャップペナルティと使用して判定することができる。特定のアラインメントソフトウェアによる最大アラインメントのための適当なパラメータは、当業者が判定することができる。ある特定の実施形態では、アラインメントソフトウェアのデフォルトパラメータが使用される。ある特定の実施形態では、第２のアミノ酸配列に対する第１のアミノ酸配列の同一性百分率「Ｘ」は１００×（Ｙ／Ｚ）で計算され、ここで、Ｙは第１および第２の配列のアラインメント（目視検査または特定の配列アラインメントプログラムによって整列される）における同一性マッチとして評価されるアミノ酸残基の数であり、Ｚは、第２の配列における残基の総数である。第１の配列の長さは第２の配列より長い場合、第２の配列に対する第１の配列の同一性パーセントは第１の配列に対する第２の配列の同一性パーセントより長くなる。
【０２１６】
非限定的な例として、任意の特定のポリヌクレオチドが参照配列とある特定の配列同一性百分率を有する（例えば、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、および一部の実施形態では、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である）かどうかは、ある特定の実施形態では、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｕｎｉｘ用のバージョン８、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ５３７１１）を使用して判定することができる。Ｂｅｓｔｆｉｔは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２〜４８９頁、１９８１年、のローカルホモロジーアルゴリズムを使用して、２つの配列間の相同性の最良のセグメントを見出す。特定の配列が、例えば、本発明による参照配列と９５％同一であるかどうかについて判定するためにＢｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列アラインメントプログラムを使用する場合、パラメータは、同一性百分率が参照ヌクレオチド配列の全長にわたって計算され、参照配列中のヌクレオチドの総数の最高５％の相同性におけるギャップが可能になるように設定される。
【０２１７】
一部の実施形態では、本発明の２つの核酸またはポリペプチドは実質的に同一であり、そのことは、配列比較アルゴリズムを使用して、または目視検査によって測定したときに、最大の対応について比較および整列させたとき、それらが少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％の、および一部の実施形態では少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基同一性を有することを意味する。ある特定の実施形態では、同一性は、長さが少なくとも約１０、約２０、約４０〜６０残基もしくはその間の任意の整数値である配列の領域にわたって、または６０〜８０残基より長い領域、少なくとも約９０〜１００残基にわたって存在するか、または配列は、比較される配列、例えばヌクレオチド配列のコード領域の全長にわたって実質的に同一である。
【０２１８】
「保存的なアミノ酸置換」は、１アミノ酸残基が類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基で置き換えられるものである。塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、無極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝状側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当技術分野で規定されている。例えば、チロシンのためのフェニルアラニンの置換は、保存的な置換である。ある特定の実施形態では、本発明のポリペプチドおよび抗体の配列における保存的な置換は、抗原（複数可）、すなわちポリペプチドまたは抗体が結合するＣＤ１２３／ＩＬ−３Ｒαへの、アミノ酸配列を含有するポリペプチドまたは抗体の結合を排除しない。抗原結合性を排除しないヌクレオチドおよびアミノ酸の保存的な置換を同定する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１１８０〜１１８７頁、１９９３年；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１２（１０）：８７９〜８８４頁、１９９９年；およびＢｕｒｋｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：４１２〜４１７頁、１９９７年を参照）。
【０２１９】
本発明の別の態様は、治療剤に連結されている、本発明による抗体タンパク質を提供し、ここで、前記治療剤は、放射性同位体、毒素、トキソイド、プロドラッグおよび化学療法剤からなる群から選択される治療剤である。
【０２２０】
ある特定の実施形態では、治療剤は、ＭＡＧ−３（米国特許第５，０８２，９３０号、欧州特許第０２４７８６６号（２頁第５５〜５６行〜３頁第１〜２３行））；ＭＡＧ−２  ＧＡＢＡ（米国特許第５，６８１，９２７号、欧州特許第０２８４０７１号（６頁第９〜２９行））；およびＮ２Ｓ２（（＝フェンチオエート）米国特許第４，８９７，２５５号、５，２４２，６７９号、欧州特許第０１８８２５６号（２頁、第３８行〜３頁、第１８行））、（Ａｃ）Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ、６−マレイミドヘキサン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、６−キノキサリンカルボン酸、２，３−ビス（ブロモメチル）−Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＰＮＰ、Ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ、Ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＯＨ、の群から選択されるリンカーを介して抗体タンパク質に連結され、全ては参照により本明細書に組み込まれる。
【０２２１】
ある特定の実施形態では、放射性同位体は、１８６レニウム、１８８レニウム、１３１ヨウ素および９０イットリウムからなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、本発明による抗体タンパク質は、標識される。そのようなＣＤ４４ｖ６またはＣＤ４４ｖ９特異的標識抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＤ４４ｖ６／ＣＤ４４ｖ９抗原の局在化および／または検出を可能にする。
【０２２２】
標識は、直接的または間接的に検出可能であるマーカーと規定される。間接マーカーは、単独で検出することができないが、間接マーカーに特異的であるさらなる直接的に検出可能なマーカーを必要とするマーカーと規定される。本発明を実施するための好ましい標識は、検出可能なマーカーである。多種多様な検出可能なマーカーから、検出可能なマーカーは、酵素、色素、放射性同位体、ジゴキシゲニンおよびビオチンからなる群から選択することができる。
【０２２３】
ある特定の実施形態では、標識は、検出可能なマーカー、例えば、酵素、色素、放射性同位体、ジゴキシゲニンおよびビオチンからなる群から選択されるものである。
ある特定の実施形態では、本発明による抗体タンパク質は、画像形成可能な薬剤にコンジュゲートされる。多種多様な画像形成可能な薬剤、特に放射性同位体は、最新技術から利用可能である。ある特定の実施形態では、画像形成可能な薬剤は、１２５ヨウ素などのガンマ放出同位体である。ある特定の実施形態では、抗体タンパク質は、約０．５〜約１５ｍＣｉ／ｍｇ、または約０．５〜約１４ｍＣｉ／ｍｇ、または約１〜約１０ｍＣｉ／ｍｇ、または約１〜約５ｍＣｉ／ｍｇ、および約２〜６ｍＣｉ／ｍｇまたは１〜３ｍＣｉ／ｍｇの比活性を有する。
【０２２４】
３．組成物および医薬組成物
本発明は、本明細書に記載される主題の抗体またはその抗原結合性断片またはそのイムノコンジュゲート、および担体（例えば、薬学的に許容される担体）を含む組成物（例えば、医薬組成物）を含む。本発明は、主題の抗体またはその抗原結合性断片、またはそのコンジュゲート、および担体（薬学的に許容される担体）を含み、および第２の治療剤をさらに含む組成物（例えば、医薬組成物）も含む。本組成物は、哺乳動物（例えば、ヒト）における異常な細胞増殖を阻害するか、または血液がん、白血病またはリンパ腫を含む増殖性障害を処置するのに有益である。
【０２２５】
詳細には、本発明は、本明細書に記載されるＣＤ４４ｖ６またはＣＤ４４ｖ９結合剤またはそのイムノコンジュゲートの１つまたは複数を含む医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容されるビヒクルをさらに含む。これらの医薬組成物は、ヒト患者において腫瘍増殖を阻害すること、および血液がん、白血病またはリンパ腫を含むがんを処置することにおいて有用である。
【０２２６】
ある特定の実施形態では、製剤は、本発明で精製された抗体またはそのイムノコンジュゲートを、薬学的に許容されるビヒクル（例えば担体、賦形剤）と組み合わせることによって、保存および使用のために調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  第２０版  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２０００年）。好適な薬学的に許容されるビヒクルには、限定されずに、リン酸、クエン酸および他の有機酸などの無毒の緩衝液；塩化ナトリウムなどの塩；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量ポリペプチド（例えば、約１０アミノ酸残基未満）；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンなどのアミノ酸；単糖、二糖、グルコース、マンノースまたはデキストリンなどの炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成性対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；およびＴＷＥＥＮ（登録商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。
【０２２７】
薬学的に許容される担体は、例えばＡＭＰＡグルタミン酸受容体アゴニスト、アンタゴニストまたはモジュレータの吸収を安定化または増加させる作用をする、生理的に許容される化合物を含有することができる。そのような生理的に許容される化合物には、例えば、炭水化物、例えばグルコース、スクロースもしくはデキストラン、抗酸化剤、例えばアスコルビン酸もしくはグルタチオン、キレート化剤、低分子量タンパク質または他の安定剤もしくは賦形剤が含まれる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）、第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌ．、Ｅａｓｔｏｎも参照する）。生理的に許容される化合物を含む薬学的に許容される担体の選択は、例えば、組成物の投与経路に依存することを、当業者は知っているだろう。
【０２２８】
好適な薬学的に許容される担体、希釈剤および賦形剤は一般的に周知であり、臨床状況が正当化するものとして当業者が決定することができる。好適な担体、希釈剤および／または賦形剤の例には：（１）ダルベッコのリン酸緩衝食塩水、ｐＨ約７．４、約１ｍｇ／ｍＬ〜２５ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンを含有するか含有しない、（２）０．９％食塩水（０．９ｗ／ｖ％  ＮａＣｌ）、および（３）５％（ｗ／ｖ）デキストロース；が含まれ、さらにトリプタミンなどの抗酸化剤およびＴｗｅｅｎ２０などの安定化剤を含有することもできる。
【０２２９】
本明細書に記載される医薬組成物は、局所または全身処置のために、任意の数の方法で投与することができる。投与は、局所（例えば、膣および直腸送達を含む粘膜への）、例えば、経皮パッチ、軟膏、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、ドロップ剤、坐薬、噴霧剤、液剤および散剤；肺（例えば、ネブライザーによるものを含む、散剤またはエアゾールの吸入またはガス注入による；気管内、鼻腔内、表皮および経皮）；経口；または静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内の注射もしくは注入を含む非経口；または頭蓋内（例えば、クモ膜下または脳室内）投与であってよい。一部の特定の実施形態では、投与は静脈内である。本明細書に記載される医薬組成物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、またはｅｘ  ｖｉｖｏで使用することもできる。
【０２３０】
動物またはヒトの体では、処置する疾患または問題、例えば腫瘍のタイプおよび起源によって、上記の医薬組成物を目的の組織または臓器に静脈内または他の経路を介して、例えば全身的に、局所的にまたは表面に適用することが有利であることを証明することができる。例えば、例えば全身性自己免疫性疾患、またはアレルギー、または外来の臓器もしくは組織の移植、または散在性であるかもしくは突き止めるのが困難である腫瘍におけるように、異なる臓器または臓器系が処置を必要とするとき、全身性作用様式が所望される。例えば局所腫瘍などの新生物または免疫作用の局所の発現症状だけが予想されるとき、局所の作用様式が考慮されるだろう。
【０２３１】
本発明の抗体タンパク質を含む医薬組成物は、専門家に公知である異なる適用経路によって、特に静脈内注射または標的組織への直接注入によって適用することができる。全身適用のためには、静脈内、血管内、筋肉内、動脈内、腹腔内、経口またはクモ膜下経路が好まれる。より局所の適用は、皮下、皮内、心臓内、葉内、髄内、肺内で、または処置する組織（結合織、骨、筋肉、神経、上皮の組織）もしくはその近くで直接的に実行することができる。処置の所望の期間および効果によって、医薬抗体組成物は一度または数回、さらに断続的に、例えば、数日、数週または数カ月の間毎日、および異なる投薬量で投与することができる。
【０２３２】
上記の適用のための抗体調製物を含む好適な医薬組成物を調製するために、公知の注射可能な生理的に許容される無菌の溶液を使用することができる。非経口注射または注入のためのすぐ使用できる溶液を調製するために、等張性水溶液、例えば食塩水または対応する血漿タンパク質溶液が直ちに利用できる。医薬組成物は凍結乾燥物または乾燥調製物として存在することができ、それは、例えば構成材のキットとして、無菌条件下で使用直前に公知の注射溶液によって再構成することができる。本発明による精製された抗体を、公知の担体物質または／および添加剤（例えば、血清アルブミン、デキストロース、亜硫酸水素ナトリウム、ＥＤＴＡ）を追加することができる無菌の生理的に許容される溶液と混合することによって、本発明の抗体組成物の最終調製物は注射、注入またはかん流のために調製される。
【０２３３】
適用される抗体の量は、疾患の性質に依存する。がん患者では、本発明による医薬組成物に含まれる「裸の」抗体の適用用量は、体表面積１ｍ２あたり１回の適用につき０．１〜１００ｍｇ、５〜５０ｍｇ、１０ｍｇ〜約４０ｍｇ、１０ｍｇ〜約３０ｍｇ、さらに２０ｍｇ〜約３０ｍｇ、および約２５ｍｇであってよい。１ｍ２の体表面積あたり約５０ｍｇの抗体タンパク質用量を使用することもできる。
【０２３４】
１回の投与あたりの患者に適用される放射能の線量は有効であるために十分高くなければならないが、線量制限毒性（ＤＬＴ）未満でなければならない。例えば１８６レニウムによる放射標識抗体を含む医薬組成物のために、治療場面で超えてはならない最大許容線量（ＭＴＤ）を決定しなければならない。がん患者に対する放射標識抗体の適用は、次にＭＴＤ未満の線量の反復（毎月または毎週の）静脈内注入によって実行することができる（例えば、Ｗｅｌｔら（１９９４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１２：１１９３〜１２０３頁を参照する）。一般的に週単位の間隔での、複数回の投与が好まれる；しかし、放射標識された材料はより長い間隔で、すなわち、４〜２４週離れて、好ましくは１２〜２０週離れて投与するべきである。しかし、熟練者は、投与を２回以上の適用に分割することを選択することができ、それらは、互いから直後に、または例えば１日から１週までのなんらかの他の所定の間隔で適用することができる。
【０２３５】
さらに、適用される放射能線量は、下で概説されるガイドラインに従う。一般に、投与あたりの放射能線量は、１ｍ２の体表面積（ＢＳＡ）につき３０〜７５ｍＣｉである。したがって、患者に適用される本発明による医薬組成物中の、１８６レニウム、１８８レニウム、９９ｍテクネチウム、１３３ヨウ素または９０イットリウムによって標識された、好ましくは１８６レニウムで標識された放射標識抗体の量は、１０、２０、３０、４０、５０または６０ｍＣｉ／ｍ２、好ましくは５０ｍＣｉ／ｍ２である。一実施形態では、本発明は医薬組成物に関し、ここで、本発明による前記放射標識抗体の線量はＭＴＤ、５０ｍＣｉ／ｍ２である。
【０２３６】
ある特定の実施形態では、本発明による医薬組成物は、アスコルビン酸、ゲンチシン酸、還元酸、エリソルビン酸（erythrorbic）、ｐ−アミノ安息香酸（aninobenzoic）、４ヒドロキシ安息香酸、ニコチン酸、ニコチンアミド、２−５−ジヒドロキシ−１，４−ベンゼン二スルホン酸、ポビドン、イノシトールおよび／またはクエン酸塩の群から選択される１つまたは複数の放射線防護剤をさらに含む。ある特定の実施形態では、放射線防護剤はアスコルビン酸である。
【０２３７】
本発明の抗体またはイムノコンジュゲートは、併用療法として医薬組合せ製剤または投与レジメンにおいて第２の化合物、例えば、目的の疾患または障害の処置で有効であることが知られているものと組み合わせることができる。一部の実施形態では、第２の化合物は、抗がん剤である。一部の実施形態では、本方法は、単独のイムノコンジュゲートの投与と比較して優れた効能をもたらす、第２の化合物および本発明のイムノコンジュゲートの投与を包含する。第２の化合物は、例えば、表面、肺、経口、非経口または頭蓋内投与を含む、任意の数の方法を介して投与することができる。一部の実施形態では、投与は、経口である。一部の実施形態では、投与は、静脈内である。一部の実施形態では、投与は、経口および静脈内の両方である。
【０２３８】
抗体またはイムノコンジュゲートは、併用療法として医薬組合せ製剤または投与レジメンにおいて鎮痛薬または他の医薬品と組み合わせることもできる
抗体またはイムノコンジュゲートは、併用療法として医薬組合せ製剤または投与レジメンにおいて抗がん特性を有する第２の化合物と組み合わせることができる。医薬組合せ製剤または投与レジメンの第２の化合物は、それらが互いに不利な影響を及ぼさないように、組合せのＡＤＣに補完的な活性を有することができる。ＣＤ４４ｖ６またはＣＤ４４ｖ９結合性薬剤および第２の抗がん剤を含む医薬組成物も提供される。
【０２３９】
ある特定の実施形態では、主題の抗体またはその抗原結合性断片、または本明細書に記載されるイムノコンジュゲート、またはその組成物の治療的有効量は、単独で、または第２の治療剤と組み合わせて、正常な造血幹細胞（ＨＳＣ）と比べて白血病幹細胞（ＬＳＣ）、白血病前駆体（ＬＰ）および／または白血病芽球の増殖を優先的に阻害する。ある特定の実施形態では、上記の主題の薬剤の、白血病幹細胞（ＬＳＣ）、白血病前駆体（ＬＰ）および／または白血病芽球の増殖を阻害するＩＣ５０値または最大半減濃度は、正常な造血幹細胞（ＨＳＣ）のそれより少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、３００、５００倍またはそれ以上低い。
【０２４０】
４．処置の方法
本発明は、哺乳動物（例えば、ヒト）における異常な細胞増殖を阻害するか、または増殖性障害を処置する方法であって、前記哺乳動物に、主題の抗体またはその抗原結合性断片、または本明細書に記載されるイムノコンジュゲート、またはその組成物の治療的有効量を、単独で、または第２の治療剤と組み合わせて投与するステップを含む方法を含む。
【０２４１】
本発明の別の態様は、がんの処置のための医薬の製造における、本発明による抗体タンパク質の使用である。本発明の別の態様は、がんの処置のための、上記の治療剤にコンジュゲートしている、本発明による抗体タンパク質の使用に関する。がんには、固形腫瘍、肉腫および白血病などの悪性の増殖に関連したいかなる疾患も含まれる。そのような疾患のための必要な前提条件は、ＣＤ４４ｖ６またはＣＤ４４ｖ９の発現である。
【０２４２】
本発明は、選択された細胞集団において細胞死を誘導するための方法であって、標的細胞または標的細胞を含有する組織を、主題の抗体もしくはその抗原結合性断片、または本発明のイムノコンジュゲートの有効量と接触させるステップを含む方法も提供する。標的細胞は、コンジュゲートの細胞結合性薬剤が結合することができる細胞である。
【０２４３】
選択された細胞集団において細胞死を誘導するための、細胞増殖を阻害するための、および／またはがんを処置するための本発明の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで実施することができる。臨床上のｉｎ  ｖｉｖｏ使用のために、本発明の細胞傷害性化合物またはコンジュゲートは、無菌性およびエンドトキシンレベルについて検査される溶液または凍結乾燥粉末として供給される。
【０２４４】
ある特定の実施形態では、哺乳動物における異常な細胞増殖または増殖性障害は、がんなどの、ＣＤ４４ｖ６またはＣＤ４４ｖ９の発現と関連するかまたはそれによって特徴付けられる疾患または状態である。
【０２４５】
例えば、がんは、以下からなる群から選択することができる：乳房、肺、肝臓、結腸直腸、頭頸部、食道、膵臓、卵巣、膀胱、胃、皮膚、子宮内膜、卵巣、精巣、食道、前立腺および腎臓起源を含む上皮癌腫；骨肉腫、軟骨肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫（ＭＦＨ）および平滑筋肉腫を含む骨軟部腫瘍；リンパ腫および白血病を含む造血悪性腫瘍；末梢神経腫瘍、星状細胞腫およびメラノーマを含む神経外胚葉性腫瘍、ならびに中皮腫。
【０２４６】
本発明によるがんは、限定されずに以下をさらに含むことができる：１）乳房、肺、肝臓、結腸直腸、頭頸部、食道、膵臓、卵巣、膀胱、胃、皮膚、子宮内膜、卵巣、精巣、食道、前立腺および腎臓起源を含む上皮癌腫の処置；２）骨軟部腫瘍：骨肉腫、軟骨肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫（ＭＦＨ）、平滑筋肉腫；３）造血悪性腫瘍：ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫、白血病；４）神経外胚葉性腫瘍：末梢神経腫瘍、星状細胞腫、メラノーマ；５）中皮腫。
【０２４７】
固形腫瘍と関連するがん性疾患状態の例には、限定されずに、以下が含まれる：結腸直腸がん、非小細胞肺がん、乳がん、頭頸部がん、卵巣がん、肺がん、膀胱がん、膵臓がんおよび脳の転移がん。
【０２４８】
ある特定の実施形態では、がんは、少なくとも１つの負の予後因子を有する。
本発明の別の態様は、がんの処置のための医薬の製造における、上で規定される本発明による抗体タンパク質の使用に関し、ここで、１回の適用あたりの抗体タンパク質の量は、１ｍ２の体表面積あたり、０．１〜１００ｍｇ、５〜５０ｍｇ、１０ｍｇ〜約４０ｍｇ、１０ｍｇ〜約３０ｍｇ、または２０ｍｇ〜約３０ｍｇ、または約２５ｍｇ、または約５０ｍｇである。
【０２４９】
ある特定の実施形態では、上で規定される本発明による放射性同位体にコンジュゲートした抗体タンパク質は、がんの処置のための医薬の製造において使用され、ここで、投与あたりの放射能線量は、１ｍ２の体表面積（ＢＳＡ）につき３０〜７５ｍＣｉである。ある特定の実施形態では、本発明による抗体タンパク質は、１８６レニウム、１８８レニウム、９９ｍテクネチウム、１３１ヨウ素または９０イットリウム、例えば１８６レニウムで放射標識される。さらに別の実施形態では、本発明は、がんの処置のための医薬の製造における、上で規定される本発明による放射性同位体にコンジュゲートしている抗体タンパク質の使用に関し、ここで、抗体用量は、１０、２０、３０、４０、５０または６０ｍＣｉ／ｍ２、または５０ｍＣｉ／ｍ２である。
【０２５０】
ある特定の実施形態では、上で規定される本発明による放射性同位体にコンジュゲートした抗体タンパク質は、がんの処置のための医薬の製造において使用され、ここで、抗体タンパク質は、約０．５〜約１５ｍＣｉ／ｍｇ、または約０．５〜約１４ｍＣｉ／ｍｇ、好ましくは約１〜約１０ｍＣｉ／ｍｇ、好ましくは約１〜約５ｍＣｉ／ｍｇ、最も好ましくは２〜６ｍＣｉ／ｍｇまたは１〜３ｍＣｉ／ｍｇの比活性を有する。
【０２５１】
がんの処置のための医薬の製造における、上で規定される本発明による放射性同位体にコンジュゲートしている抗体タンパク質の使用も好ましく、ここで、前記抗体または抗体誘導体は、約７〜約８のｐＨ、および約０．５〜約２．０ｍｇ／ｍｌの濃度の水溶液の状態である。
【０２５２】
本発明は、がん処置の方法にさらに関し、ここで、本発明による抗体タンパク質は、それを必要とする個体に１回から数回投与され、前記抗体タンパク質はＣＤ４４ｖ６またはＣＤ４４ｖ９に選択的に結合し、抗体タンパク質に連結される治療剤を介して腫瘍細胞を破壊し、治療奏効がモニタリングされる。前記抗体タンパク質は、裸の／未改変の抗体タンパク質、改変された抗体タンパク質、例えば融合タンパク質、または治療剤にコンジュゲートされる抗体タンパク質として存在することができ、それは、腫瘍を前記抗体の有効量と接触させることを含む。上記の腫瘍処置方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで効果を発揮することができる。がんは、上記の任意のがんである。
【０２５３】
がん療法およびそれらの投薬量、投与経路および推奨される用法は、当技術分野で公知であり、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＰＤＲ）などの文献に記載されている。ＰＤＲは、様々ながんの処置において使用されている薬剤の投薬量を開示する。治療的に有効であるこれらの前記化学療法薬の投与レジメンおよび投薬量は、処置される特定のがん、疾患の程度、および当分野の熟練医師が熟知している他の因子に依存し、医師が決定することができる。ＰＤＲの内容は、参照により完全に本明細書に明示的に組み込まれる。当業者は、本発明の教示に従って使用することができる化学療法剤およびコンジュゲートの投与レジメンおよび投薬量を決定するために、以下のパラメータの１つまたは複数を使用してＰＤＲを検討することができる。これらのパラメータには、以下が含まれる：総合索引；製造業者；製品（会社のまたは商標登録された薬物名による）；カテゴリー索引；一般／化学索引（非商標登録一般薬物名）；医薬品のカラー画像；製品情報、ＦＤＡラベリングと一貫している；化学情報；機能／作用；適応症と禁忌症；治験研究、副作用、注意。
【０２５４】
適用される抗体の量は、疾患の性質に依存する。がん患者では、「裸の」抗体の適用用量は、１ｍ２の体表面積あたり、１回の適用につき０．１〜１００ｍｇ、５〜５０ｍｇ、１０ｍｇ〜約４０ｍｇ、１０ｍｇ〜約３０ｍｇ、さらに２０ｍｇ〜約３０ｍｇ、および約２５ｍｇ、または約５０ｍｇであってよい。
【０２５５】
１回の投与あたりの患者に適用される放射能の線量は有効であるために十分高くなければならないが、線量制限毒性（ＤＬＴ）未満でなければならない。例えば１８６レニウムによる放射標識抗体のために、治療場面で超えてはならない最大許容線量（ＭＴＤ）を決定しなければならない。がん患者に対する放射標識抗体の適用は、次にＭＴＤ未満の線量の反復（毎月または毎週の）静脈内注入によって実行することができる（例えば、Ｗｅｌｔら（１９９４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１２：１１９３〜１２０３頁を参照する）。一般的に週単位の間隔の、複数回の投与が好まれる；しかし、放射標識された材料はより長い間隔で、すなわち、４〜２４週離れて、または１２〜２０週離れて投与するべきである。しかし、熟練者は、投与を２回以上の適用に分割することを選択することができ、それらは、互いから直後に、または例えば１日から１週までのなんらかの他の所定の間隔で適用することができる。
【０２５６】
さらに、本発明（上を参照する）によるがん処置の方法も提供され、ここで、上で規定される本発明による放射性同位体にコンジュゲートした抗体タンパク質は、約０．５〜約１５ｍＣｉ／ｍｇ、または約０．５〜約１４ｍＣｉ／ｍｇ、好ましくは約１〜約１０ｍＣｉ／ｍｇ、好ましくは約１〜約５ｍＣｉ／ｍｇ、最も好ましくは２〜６ｍＣｉ／ｍｇまたは１〜３ｍＣｉ／ｍｇの比活性を有する。
【０２５７】
さらに、本発明（上を参照する）によるがん処置の方法も提供され、ここで、上で規定される本発明による放射性同位体にコンジュゲートした抗体タンパク質は、約７〜約８のｐＨ、および約０．５〜約２．０ｍｇ／ｍｌの濃度の水溶液の状態である。
【０２５８】
ある特定の実施形態では、がんは、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、乳がん、頭頸部がん、卵巣がん、肺がん、膀胱がん、膵臓がんまたは脳の転移がんである。
本発明の方法は、がん細胞などの細胞を死滅させる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法も提供する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用の例には、病的または悪性の細胞を死滅させるための、同じ患者への移植前の自家骨髄の処置：コンピテントＴ細胞を死滅させ、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を予防するための移植前の骨髄の処置；標的抗原を発現しない所望の変異体を除く全ての細胞を死滅させるための、または望ましくない抗原を発現する変異体を死滅させるための細胞培養の処置が含まれる。
【０２５９】
非臨床のｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用の条件は、当業者によって容易に決定される。
臨床上のｅｘ  ｖｉｖｏ使用の例は、がん処置もしくは自己免疫性疾患の処置における自家移植の前に骨髄から腫瘍細胞もしくはリンパ系細胞を除去すること、またはＧＶＨＤを予防するために移植前に自家のもしくは同種異系の骨髄もしくは組織からＴ細胞および他のリンパ系細胞を除去することである。処置は、以下の通りに実行することができる。患者または他の個体から骨髄を採収し、その後、約１０μΜ〜１ｐＭの濃度の本発明の細胞傷害剤を加えた血清含有培地に、約３７℃で約３０分〜約４８時間インキュベートする。濃度およびインキュベーション時間の正確な条件、すなわち用量は、当業者によって容易に決定される。インキュベーションの後、骨髄細胞を血清含有培地で洗浄し、公知の方法によって患者へ静注で戻す。髄の収集時間と処置細胞の自家輸血の間に破壊的化学療法または全身照射のクールなどの他の処置を患者が受ける状況では、処置骨髄細胞は、標準の医療機器を使用して液体窒素の中で冷凍保存する。
【０２６０】
５．核酸
本発明のさらなる態様は、本発明による抗体またはタンパク質をコードすることを特徴とする核酸である。前記核酸は、ＲＮＡまたは好ましくはＤＮＡであってよい。前記ＤＮＡ分子は、化学的に合成されてもよい。先ず、好適なオリゴヌクレオチドは、合成遺伝子を生成するために使用することができる、当技術分野で公知の方法（例えば、Ｇａｉｔ、Ｍ．Ｊ．、１９８４年、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）で合成することができる。合成遺伝子を生成する方法は当技術分野で公知である（例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒら、１９９５年、Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｅｎｔｉｒｅ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｆｒｏｍ  ｌａｒｇｅ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、Ｇｅｎｅ  １６４（１）：４９〜５３頁；Ｙｅら、１９９２年、Ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｆｏｒ  ｐｕｍｐ、ａ  ｈｕｍａｎ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １８６（１）：１４３〜９頁；ＨａｙｄｅｎおよびＭａｎｄｅｃｋｉ  １９８８年、Ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｙ  ｓｅｒｉａｌ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、ＤＮＡ  ７（８）：５７１〜７頁）。これらの方法は、本出願に開示される任意のＤＮＡ分子を合成するために使用することができる。
【０２６１】
本発明による核酸は、５’または３’の、または５’および３’の非翻訳領域を含有することができる。本発明による核酸は、上流および／または下流の他の非翻訳領域を含有することができる。非翻訳領域は、調節エレメント、例えば転写開始単位（プロモーター）またはエンハンサーを含有することができる。前記プロモーターは、例えば、構成的、誘導可能または発達制御プロモーターであってよい。ある特定の実施形態では、および他の公知のプロモーターを除外すること無しに、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の構成的プロモーター、ならびにシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）および単純ヘルペスプロモーター。本発明による誘導可能なプロモーターは、抗生物質耐性プロモーター、ヒートショックプロモーター、ホルモン誘導型「乳房腫瘍ウイルスプロモーター」およびメタロチオネインプロモーターを含む。本発明による核酸は、本発明による抗体タンパク質の断片をコードすることができる。これは、本発明によるポリペプチドの一部を指す。
【０２６２】
６．ベクター
本発明の別の重要な態様は、本発明による核酸を含有することを特徴とする組換えＤＮＡベクターである。例は、例えばワクシニア、セムリキ森林熱ウイルスおよびアデノウイルスなどのウイルスベクターである。ＣＯＳ細胞で使用するためのベクターは、ＳＶ４０の複製開始点を有し、プラスミドの高いコピー数を達成することを可能にする。昆虫細胞で使用するためのベクターは、例えば、大腸菌のトランスファーベクターであり、例えば、プロモーターとしてポリヘドリンをコードするＤＮＡを含有する。
【０２６３】
本発明の別の態様は、発現ベクターであることを特徴とする、本発明による組換えＤＮＡベクターである。
本発明の別の態様は、ベクターｐＡＤ−ＣＭＶまたはその機能的誘導体であることを特徴とする、本発明による組換えＤＮＡベクターである。そのような誘導体は、例えば、ｐＡＤ−ＣＭＶ１、ｐＡＤ−ＣＭＶ１９またはｐＡＤ−ＣＭＶ２５である。
【０２６４】
ベクターは、本発明によるヌクレオチド配列を含む、米国特許第５，６４８，２６７号または５，７３３，７７９号に開示されるものであってよい。本発明の別の態様は、ベクターＮ５ＫＧ１Ｖａｌまたはその誘導体であることを特徴とする、本発明による組換えＤＮＡベクターである。
【０２６５】
７．細胞または宿主細胞
別の態様は、本発明によるベクターを含有することを特徴とする宿主である。
別の態様は、真核生物の宿主細胞であることを特徴とする、本発明による宿主である。本発明による真核生物の宿主細胞には、例えばＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、酵母、分裂酵母、トリコデルマなどの真菌、昆虫細胞（例えばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  ＳＦ−９から、バキュロウイルス発現系と一緒の）、例えばタバコからの植物細胞、哺乳動物細胞、例えばＣＯＳ細胞、ＢＨＫ、ＣＨＯもしくは骨髄腫細胞が含まれる。
【０２６６】
抗体タンパク質が我々の体内でも形成される免疫系細胞の後代では、本発明による抗体タンパク質は、特によくフォールディングされ、グリコシル化される。哺乳動物の宿主細胞、好ましくはＣＨＯまたはＣＯＳ細胞、例えばＣＨＯ  ＤＧ４４（ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７７（７）：４２１６〜２０頁（１９８０））、またはＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）細胞が好ましい。したがって、別の態様は、ＢＨＫ、ＣＨＯまたはＣＯＳ細胞、最も好ましくはＣＨＯ  ＤＧ４４またはＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）細胞であることを特徴とする、本発明による宿主である。
【０２６７】
ある特定の実施形態では、宿主は、バクテリオファージである。
ある特定の実施形態では、宿主は、原核生物の宿主細胞である。原核生物の宿主細胞の例は、大腸菌、枯草菌、ストレプトミセス属またはプロテウス・ミラビリスである。
【０２６８】
本発明は、以下のステップ：本発明による宿主は、前記抗体タンパク質が前記宿主細胞によって発現される条件下で培養されるステップ、および前記抗体タンパク質が単離されるステップを含むことを特徴とする、本発明による抗体タンパク質を調製するための方法にさらに関する。本発明による抗体は、以下の通りに生成することができる。軽鎖および重鎖をコードする核酸分子は、標準の方法によって化学的におよび酵素的に合成することができる。先ず、好適なオリゴヌクレオチドを、当技術分野で公知の方法（詳細は上記の通り）で合成することができる。オリゴヌクレオチドから合成遺伝子を生成する方法は、当技術分野で公知である（詳細は上記の通り）。抗体の重鎖および軽鎖をコードするこれらの核酸分子は、発現ベクターに（両方の鎖を１つのベクター分子に、または各鎖を別個のベクター分子に）クローニングすることができ、それは次に宿主細胞に導入される。宿主細胞は、哺乳動物の宿主細胞（詳細は上記の通り）、例えばＣＯＳ、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）またはＢＨＫ細胞であってよい。宿主細胞は、抗体が生成される条件下で好適な培地において次に培養され、抗体は標準の手順によって培養から次に単離される。宿主細胞の中の組換えＤＮＡおよびそれぞれの発現ベクターからの抗体の生成の手順は、当技術分野で周知である（例えば、国際公開第９４／１１５２３号、国際公開第９７／９３５１号、ＥＰ０４８１７９０を参照する）。
【０２６９】
本発明は、宿主が哺乳動物細胞、好ましくはＣＨＯまたはＣＯＳ細胞であるプロセスにも関する。
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、軽鎖または重鎖のための発現単位を有する２つのプラスミドでコトランスフェクトされる。
【実施例】
【０２７０】
以下の実施例は、本発明をさらに例示するのに役立つが、それは本明細書に開示される本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきでない。
実施例１
抗ＣＤ４４ｖ６モノクローナル抗体ｍＡｂ１１９および抗ＣＤ４４ｖ９モノクローナル抗体ｍＡｂ１１６の生細胞ＭａｂＡｒｒａｙ単離
図１Ａに示すように、ＭａｂＡｒｒａｙを生成するためにＡｒｒａｙｊｅｔプリンターを使用して、約６×１０４個の異なるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を４つのガラスアルデヒドチップ（７５×２５ｍｍ）の上に印刷した。ＭａｂＡｒｒａｙチップを一晩１０％ＢＳＡで次にブロックし、その後実験を実行した。生きている肺がん細胞系ＰＣ９細胞を緑色蛍光核酸染色ＳＹＴＯ１４（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で標識し、ＰＢＳ中に１×１０７細胞数／ｍＬの密度でチップと一緒に１時間インキュベートした。ＭａｂＡｒｒａｙチップを次に静かにＰＢＳで洗浄し、Ｇｅｎｅｐｉｘスキャナでスキャンした。
【０２７１】
図１Ｂは、４つの独立したＰＣ９生細胞ＭａｂＡｒｒａｙ実験における、ｍＡｂ１１９および対照ｍＡｂの像を示す。生きているＰＣ９細胞は、ＭａｂＡｒｒａｙチップの上でｍＡｂ１１９によって捕捉した。
【０２７２】
実施例２
ｍＡｂ１１９抗原はＰＣ９細胞の表面に発現され、ＰＣ９細胞によって内在化される
図２は、ＰＣ９細胞の上のｍＡｂ１１９のＦＡＣｓ分析の結果を示す。ｍＡｂ１１９のＰＣ９  ＦＡＣＳ滴定は、ＰＣ９細胞を氷上でｍＡｂ１１９の段階希釈（３００００ｐＭ〜０．１ｐＭ、３倍段階希釈）と一緒に３０分間インキュベートし、その後細胞をＡｌｅｘａ４８８コンジュゲート抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂ）で３０分間染色することによって実行した。ＭＦＩは、ＢＤ  Ｃ６を使用して分析した。親和性ＫＤは、約２ｎＭであると判定された。
【０２７３】
図３は、ＰＣ９細胞が結合したｍＡｂ１１９を内在化したことを示す。生きているＰＣ細胞をカバースリップの上で培養し、１０μｇ／ｍＬのｍＡｂ１１９と氷上で１時間インキュベートし、その後細胞をＰＢＳで３回洗浄した。細胞を３７℃で０時間、２時間または４時間次に培養し、その後４％ＰＦＡによって固定し、その後ＦＡＣｓによりＦＩＴＣコンジュゲート二次抗体で検出した。ＰＣ９細胞は、ｍＡｂ１１９（緑色蛍光色素Ａｌｅｘａ４８８によって標識）および抗ＬＡＭＰ１（赤色蛍光色素Ａｌｅｘａ５９５によって標識）によって次に共染色した。具体的には、ＰＣ９細胞を０．１％ＴｒｉｔｏｎＸで透過性化し、ｍＡｂ１１９およびウサギ抗ＬＡＭＰ１抗体（１：２００、Ａｂｃａｍ）、およびｍＡｂ１１９と１時間インキュベートした。抗体は、Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲート抗マウス抗体およびＡｌｅｘａ５９５コンジュゲート抗ウサギ抗体でそれぞれ次に標識した。リソソーム関連膜タンパク質１（ＬＡＭＰ１）は、主にリソソーム膜を越えて発現される糖タンパク質である。ｍＡｂ１１９および抗ＬＡＭＰ１シグナルの共存は、ＰＣ９細胞によるリソソームコンパートメントへのｍＡｂ１１９の内在化を示す黄色シグナルをもたらす。ｍＡｂ１１９は、０時間時にＬＡＭＰ１とのいかなる共存無しで、細胞表面で最初に観察された。ｍＡｂ１１９およびＬＡＭＰ１の共存は、２時間時および４時間時で観察された。
【０２７４】
表面蛍光に基づくＦＡＣｓ分析は、ＰＣ９細胞でのｍＡｂ１１９内在化を示す（データは示さず）。具体的には、生きているＰＣ９細胞を１０μｇ／ｍＬのｍＡｂ１１９と氷上で０．５時間インキュベートし、その後ＰＢＳで３回洗浄した。細胞を３７℃で０時間、２時間または４時間次に培養し、その後４％ＰＦＡによって固定した。細胞は、次にＡｌｅｘａ４８８コンジュゲート抗マウス抗体で染色し、表面ＭＦＩを計算することによってＦＡＣｓで分析した。ｍＡｂ１１９の表面局在化を表す表面ＭＦＩは、３７℃で２時間および４時間のインキュベーションの後にそれぞれ７０％および８０％低減した。ＦＡＣｓデータの定量化は、ＰＣ９細胞における平均のパーセント内在化±ＳＥＭ（ｎ＝３）で表されることを示す。縦軸は、相対的表面蛍光（％）を表す。データは、ｍＡｂ１１９がＰＣ９細胞の膜抗原に結合し、内在化される可能性を示す。
【０２７５】
実施例３
ｍＡｂ１１９の間接的な細胞傷害性は抗原発現依存性である
図４は、ｍＡｂ１１９の間接的な細胞傷害性が抗原発現依存性であることを示す。ＰＣ９またはＴＥ１細胞を、９６ウェルプレートに２０００細胞／ウェルの集密で一晩培養した。細胞は、ｍＡｂ１１９の段階希釈と２μｇ／ｍＬのＭＭＡＥコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ抗体によって７２時間処理した。次に、細胞数をＣＣＫ８（ｄｏｊｉｎｄｏ）によって計算した。ＴＥ１およびＰＣ９細胞において異なる細胞傷害性が観察された。抗体カクテルは、１８ｐＭのＩＣ５０でＰＣ９の増殖を阻害したが、同じ抗体カクテルはＴＥ１細胞の増殖を阻害しなかった。ＴＥ１およびＰＣ９細胞に由来する、平均パーセント増殖阻害±ＳＥＭ（ｎ＝３）で表される代表的データが示される。
【０２７６】
２つの細胞系におけるｍＡｂ１１９抗原の発現も、ＦＡＣｓによって判定した。側に挿入したパネルは、ｍＡｂ１１９によって標識したＴＥ１（上パネル）およびＰＣ９（下パネル）のＦＡＣｓ分析を示す。結果は、ＴＥ１細胞でなくＰＣ９細胞がｍＡｂ１１９抗原を発現することを示唆する。したがって、間接的な細胞傷害性は、抗原発現と正に相関していた。
【０２７７】
実施例４
ｍＡｂ１１９はヒトＣＤ４４ｖ６エクソンを標的にする
図５Ａおよび５Ｂは、ｍＡｂ１１９がヒトＣＤ４４ｖ６エクソンを標的にすることを示す。ヒトＣＤ４４ｖ６エピトープを標的にする４つの異なるｓｉＲＮＡの混合物または対照ｓｉＲＮＡで、ＰＣ９を４８時間トランスフェクトした。トランスフェクト細胞は次にｍＡｂ１１９で染色し、ＦＡＣｓによって分析したか、または総タンパクを抽出し、ｍＡｂ１１９抗原の存在度をウエスタンブロッティングによって評価した。ＣＤ４４ｖ６のノックダウンは、ＦＡＣｓにおいてｍＡｂ１１９表面染色強度を低下させた（図５Ａ、ＦＡＣｓデータはＣＤ４４ｖ６  ｓｉＲＮＡ（Ｖ６．ｓｉ）がｍＡｂ１１９の表面シグナルを抑制することを示す（ｎ＝３を代表する））。ＣＤ４４ｖ６のノックダウンは、ｍＡｂ１１９抗原のタンパク質発現レベルも低下させた（図５Ｂ、ウエスタンブロッティングデータはＣＤ４４ｖ６  ｓｉＲＮＡ（Ｖ６．ｓｉ）がｍＡｂ１１９抗原のタンパク質発現を抑制することを示す（ｎ＝３を代表する））。データは、ｍＡｂ１１９がＣＤ４４ｖ６を標的にすることを示唆する。
【０２７８】
抗体−薬物コンジュゲートは、抗原結合性部分としてｍＡｂ１１９を使用して調製された。図６Ａは、ｍＡｂ１１９−ＡＤＣ（ＡＭＴ１１９）の構造の略図を示し、ここで、ｍＡｂ１１９はＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥにコンジュゲートされた。ＡＭＴ１１９のＨＰＬＣ−ＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィー）は、平均の薬物−抗体比（ＤＡＲ）が約６であったことを示す。図６Ｂ。
【０２７９】
図７は、ＰＣ９およびＴＥ１細胞におけるＡＭＴ１１９の細胞傷害性を示す。グラフは、ＰＣ９およびＴＥ１細胞に由来する、ＡＭＴ１１９の平均パーセント増殖阻害±ＳＥＭ（ｎ＝３）を示す代表的データである。ＩＣ５０値は、ＰＣ９およびＴＥ１細胞でそれぞれ２，６００ｐＭおよび３９，０００ｐＭであった。差は、２つの細胞系におけるＣＤ４４ｖ６の異なる発現レベルと一貫していた（図４を参照する）。
【０２８０】
実施例５
ヒト非小細胞肺がんにおけるＣＤ４４ｖ６の発現
図８Ａおよび８Ｂは、ヒト非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ、図８Ａの右パネル）および正常な肺組織（図８Ａの左パネル）におけるＣＤ４４ｖ６の発現を示す。ｍＡｂ１１９抗体を使用したＣＤ４４ｖ６タンパク質のＩＨＣ（免疫組織化学）検出が一連の正常およびがん組織から示され、ＣＤ４４ｖ６が腫瘍特異的に上方制御されたことを示している。顕微鏡写真像は、０、１＋、２＋および３＋の染色強度を代表する腫瘍組織を表す（図８Ａの右パネル）。図８Ｂは、ＮＳＣＬＣの異なるサブタイプにおけるＣＤ４４ｖ６の発生率を示す。ＳＣＣ、扁平上皮癌；ＬＣＣ、大きな細胞癌腫。
【０２８１】
実施例６
ｍＡｂ１１６抗原はＰＣ９細胞の表面に発現され、ＰＣ９細胞によって内在化される
図９は、ＰＣ９細胞の上のｍＡｂ１１６のＦＡＣｓ分析の結果を示す。ｍＡｂ１１６のＰＣ９  ＦＡＣＳ滴定は、ＰＣ９細胞を氷上でｍＡｂ１１６の段階希釈（３００００ｐＭ〜０．１ｐＭ、３倍段階希釈）と一緒に３０分間インキュベートし、その後細胞をＡｌｅｘａ４８８コンジュゲート抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂ）で３０分間染色することによって実行した。ＭＦＩは、ＢＤ  Ｃ６を使用して分析した。親和性ＫＤは、約９８０ｐＭ（または０．９８ｎＭ）であると判定された。
【０２８２】
図１０は、ＰＣ９細胞が結合したｍＡｂ１１６を内在化したことを示す。生きているＰＣ細胞をカバースリップの上で培養し、１０μｇ／ｍＬのｍＡｂ１１６と氷上で１時間インキュベートし、その後細胞をＰＢＳで３回洗浄した。細胞を３７℃で０時間、２時間または４時間次に培養し、その後４％ＰＦＡによって固定し、その後ＦＡＣｓによりＦＩＴＣコンジュゲート二次抗体で検出した。ＰＣ９細胞は、ｍＡｂ１１６（緑色蛍光色素Ａｌｅｘａ４８８によって標識）および抗ＬＡＭＰ１（赤色蛍光色素Ａｌｅｘａ５９５によって標識）によって次に共染色した。具体的には、ＰＣ９細胞を０．１％ＴｒｉｔｏｎＸで透過性化し、ｍＡｂ１１６およびウサギ抗ＬＡＭＰ１抗体（１：２００、Ａｂｃａｍ）、およびｍＡｂ１１６と１時間インキュベートした。抗体は、Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲート抗マウス抗体およびＡｌｅｘａ５９５コンジュゲート抗ウサギ抗体でそれぞれ次に標識した。ｍＡｂ１１６および抗ＬＡＭＰ１シグナルの共存は、ＰＣ９細胞によるリソソームコンパートメントへのｍＡｂ１１６の内在化を示す黄色シグナルをもたらす。ｍＡｂ１１６は、０時間時でＬＡＭＰ１とのいかなる共存無しで、細胞表面で最初に観察された。ｍＡｂ１１６およびＬＡＭＰ１の共存は、２時間時および４時間時で観察された。
【０２８３】
表面蛍光に基づくＦＡＣｓ分析は、ＰＣ９細胞でのｍＡｂ１１６内在化を示す（データは示さず）。具体的には、生きているＰＣ９細胞を１０μｇ／ｍＬのｍＡｂ１１６と氷上で０．５時間インキュベートし、その後ＰＢＳで３回洗浄した。細胞を３７℃で０時間、２時間または４時間次に培養し、その後４％ＰＦＡによって固定した。細胞は、次にＡｌｅｘａ４８８コンジュゲート抗マウス抗体で染色し、表面ＭＦＩを計算することによってＦＡＣｓで分析した。ｍＡｂ１１６の表面局在化を表す表面ＭＦＩは、３７℃で４時間のインキュベーションの後に約９０％低減した。ＰＣ９細胞における平均のパーセント内在化±ＳＥＭ（ｎ＝３）で表される、ＦＡＣｓデータの定量化を示す。縦軸は、相対的表面蛍光（ＭＦＩ、％）を表す。データは、ｍＡｂ１１６がＰＣ９細胞の膜抗原に結合し、内在化される可能性を示す。
【０２８４】
実施例７
ｍＡｂ１１６の間接的な細胞傷害性は抗原発現依存性である
図１１は、ｍＡｂ１１６および対照ＩｇＧの間接的細胞傷害性を示す。ＰＣ９細胞を、９６ウェルプレートに２０００細胞／ウェルの集密で一晩培養した。細胞は、ｍＡｂ１１６またはＩｇＧの段階希釈と２μｇ／ｍＬのＭＭＡＥコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ抗体によって７２時間処理した。次に、細胞数をＣＣＫ８（ｄｏｊｉｎｄｏ）によって計算した。ｍＡｂ１１６抗体カクテルは、約３０ｐＭのＩＣ５０でＰＣ９の増殖を阻害したが、ＩｇＧカクテルはいかなる影響も及ぼさなかった。ＰＣ９細胞に由来する、平均パーセント増殖阻害±ＳＥＭ（ｎ＝３）で表される代表的データが示される。
【０２８５】
実施例８
ｍＡｂ１１６はヒトＣＤ４４  ｖ９エクソンを標的にする
図１２Ａおよび１２Ｂは、ｍＡｂ１１６がヒトＣＤ４４  ｖ９エクソンを標的にすることを示す。ヒトＣＤ４４  Ｖ９エピトープを標的にするｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡで、ＰＣ９を４８時間トランスフェクトした。トランスフェクト細胞は次にｍＡｂ１１６で染色し、ＦＡＣｓによって分析したか、または総タンパクを抽出し、ｍＡｂ１１６抗原の存在度をウエスタンブロッティングによって評価した。ＣＤ４４ｖ９のノックダウンは、ＦＡＣｓにおいてｍＡｂ１１６表面染色強度を低下させた（図１２Ａ、ＦＡＣｓデータはＣＤ４４ｖ９  ｓｉＲＮＡ（Ｖ９．ｓｉ）がｍＡｂ１１６の表面シグナルを抑制することを示す（ｎ＝３を代表する））。ＣＤ４４ｖ９のノックダウンは、ｍＡｂ１１６抗原のタンパク質発現レベルも低下させた（図１２Ｂ）。データは、ｍＡｂ１１６がＣＤ４４ｖ９を標的にすることを示唆する。
【０２８６】
抗体−薬物コンジュゲートは、抗原結合性部分としてｍＡｂ１１６を使用して調製された。図１３Ａは、ｍＡｂ１１６−ＡＤＣ（ＡＭＴ１１６）の構造の略図を示し、ここで、ｍＡｂ１１６は、ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥにコンジュゲートされた。ＡＭＴ１１６のＨＰＬＣ−ＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィー）は、平均の薬物−抗体比（ＤＡＲ）が約４．２３であったことを示す。図１３Ｂ。
【０２８７】
図１４は、ＰＣ９およびＫＹＳＥ−１５０（食道癌腫細胞系）細胞におけるＡＭＴ１１６の細胞傷害性を示す。グラフは、ＰＣ９およびＫＹＳＥ−１５０細胞に由来する、ＡＭＴ１１６およびＩｇＧ対照の平均パーセント増殖阻害±ＳＥＭ（ｎ＝３）を示す代表的データである。ＡＭＴ１１６のＩＣ５０値は、ＰＣ９およびＫＹＳＥ−１５０細胞でそれぞれ１３４ｐＭおよび６７０．２ｐＭであった。
【０２８８】
図１５は、ＡＭＴ１１６のｉｎ  ｖｉｖｏ効能を示す。約５×１０６個のＫＹＳＥ−１５０細胞を１：１のマトリゲルに懸濁し、その後、雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（８〜１０週、２０〜２２ｇ）の右側腹部に注射した。腫瘍体積（０．５×長さ×幅２によって測定した）および体重は、少なくとも週２回判定した。マウスは、投与の前にそれらの最初の腫瘍サイズ（概ね２５０〜５００ｍｍ３の中間腫瘍体積）に基づいてランダムに分類した（ｎ＝５／群）。ビヒクル（ＰＢＳ）、ＡＭＴ１１６または対照ＡＤＣを、ｉ．ｖ．注入（３ｍｇ／ｋｇ、ｑ３ｄ×３）によって投与した。群平均（±ＳＥＭ）の腫瘍体積を、試験期間にわたってプロットした。
【０２８９】
実施例９
ヒト非小細胞肺がんおよび他のがんにおけるＣＤ４４ｖ９の発現
図１６Ａおよび１６Ｂは、ヒト非小細胞肺がん（図１６Ａの右パネル）および正常な肺組織（図１６Ａの左パネル）におけるＣＤ４４ｖ９の発現を示す。ｍＡｂ１１６抗体を使用したＣＤ４４ｖ９タンパク質のＩＨＣ検出が一連の正常およびがん組織から示され、ＣＤ４４ｖ９が腫瘍特異的に上方制御されたことを示している。顕微鏡写真像は、０、１＋、２＋および３＋の染色強度を代表する腫瘍組織を表す（図１６Ａの右パネル）。図１６Ｂは、ＮＳＣＬＣの異なるサブタイプにおけるＣＤ４４ｖ９の発生率を示す。ＳＣＣ、扁平上皮癌；ＬＣＣ、大きな細胞癌腫。
【０２９０】
図１７は、複数の腫瘍タイプにおけるＣＤ４４ｖ９の過剰発現を示す。ｍＡｂ１１６抗体を使用したＣＤ４４ｖ９タンパク質のＩＨＣ検出が一連の正常およびがん組織から示され、ＣＤ４４ｖ９が腫瘍特異的に上方制御されたことを示している。
【０２９１】
実施例１０
抗体配列
ｍＡｂ１１９およびｍＡｂ１１６モノクローナル抗体の様々な領域／ドメインの配列が、下に掲載される。
【０２９２】
【表２】
2021519608.tif 000004
【０２９３】
【表３】
2021519608.tif 000005
【０２９４】
ＨＥＧＹＲＱＴＰＫＥ（配列番号１９）−主題の抗ＣＤ４４ｖ６抗体を産生するために使用されたＣＤ４４ｖ６エピトープ配列。
ＨＥＧＹＲＱＴＰＫＥＤＳ（配列番号２４）
【０２９５】
【表４】
2021519608.tif 000006
【０２９６】
ＳＨＥＧＬＥＥＤＫＤ（配列番号４３）−主題の抗ＣＤ４４ｖ９抗体を産生するために使用されたＣＤ４４ｖ９エピトープ配列。
ＳＨＥＧＬＥＥＤＫＤＨ（配列番号４４）
【図１】
2021519608.tif 000007
【図２】
2021519608.tif 000008
【図３】
2021519608.tif 000009
【図４】
2021519608.tif 000010
【図５Ａ】
2021519608.tif 000011
【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
2021519608.tif 000013
【図６】
2021519608.tif 000014
【図７】
2021519608.tif 000015
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2021519608.tif 000019
【図１２Ａ】
2021519608.tif 000020
【図１２Ｂ】
2021519608.tif 000021
【図１３Ａ】
2021519608.tif 000022
【図１３】
2021519608.tif 000023
【図１４】
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【図１５】
2021519608.tif 000025
【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
2021519608000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年2月18日(2021.2.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたＣＤ４４ｖ９エピトープに特異的な単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片であって、前記ＣＤ４４ｖ９エピトープは、配列番号４３（例えば、配列番号４３に加えて配列番号４３のＮ末端における１もしくは２つの残基、配列番号４３に加えて配列番号４３のＣ末端における１もしくは２つの残基、または配列番号４３に加えて配列番号４３のＮ末端およびＣ末端の両方における１もしくは２つの残基からなるエピトープ）を含む／それから本質的になるか、または配列番号４３からなり；好ましくは、前記抗体またはその抗原結合性断片は、前記単離されたＣＤ４４ｖ９エピトープに対して産生されるか、または前記単離されたＣＤ４４ｖ９エピトープおよび担体タンパク質（例えば、アルブミン、好ましくはＢＳＡもしくはオボアルブミン、またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ））を含む融合タンパク質またはその化学的コンジュゲートに対して産生される、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２】
前記モノクローナル抗体が、
（１）配列番号２５のＨＣＶＲ  ＣＤＲ１配列、配列番号２６のＨＣＶＲ  ＣＤＲ２配列および配列番号２７のＨＣＶＲ  ＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）；
（２）配列番号３４のＬＣＶＲ  ＣＤＲ１配列、配列番号３５のＬＣＶＲ  ＣＤＲ２配列および配列番号３６のＬＣＶＲ  ＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）
を含む、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項３】
ＣＤ４４ｖ９エピトープが、配列番号４３である、請求項１または２に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項４】
ＣＤ４４ｖ９エピトープが、配列番号４３（例えば、配列番号４３に加えて配列番号４３のＮ末端における１もしくは２つの残基、配列番号４３に加えて配列番号４３のＣ末端における１もしくは２つの残基、または配列番号４３に加えて配列番号４３のＮ末端およびＣ末端の両方における１もしくは２つの残基からなるエピトープ）から本質的になる、請求項１または２に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項５】
ＣＤ４４ｖ９エピトープが、配列番号４４（ＳＨＥＧＬＥＥＤＫＤＨ）である、請求項４に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項６】
（ｉ）ＨＣＶＲが、配列番号２８〜３３の１つまたは複数をさらに含み；および／または
（ｉｉ）ＬＣＶＲが、配列番号３７〜４２の１つまたは複数をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項７】
前記ＣＤ４４ｖ９エピトープまたは前記ＣＤ４４ｖ９エピトープを有する細胞に、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ以下のＫＤで結合する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項８】
ヒト−マウスキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ＣＤＲ移植抗体または再表面化抗体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項９】
前記その抗原結合性断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖ＦｖもしくはｓｃＦｖ、ジスルフィドで連結されたＦｖ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、ＩｇＮａｒ、イントラボディ、ＩｇＧΔＣＨ２、ミニボディ、Ｆ（ａｂ’）３、テトラボディ、トリアボディ、ダイアボディ、単一ドメイン抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ、Ｆｃａｂ、ｍＡｂ２、（ｓｃＦｖ）２またはｓｃＦｖ−Ｆｃである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のＨＣＶＲおよび／またはＬＣＶＲを含むポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１０のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、請求項１０に記載のポリペプチド、請求項１１に記載のポリヌクレオチド、または請求項１２に記載のベクターを含む細胞。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、または請求項１０に記載のポリペプチドを生成する方法であって、
（ａ）請求項１３の細胞を培養するステップと；
（ｂ）前記抗体、その抗原結合性断片またはポリペプチドを前記培養細胞から単離するステップと
を含む方法。
【請求項１５】
以下の式：
Ａｂ−［−Ｌ−Ｄ］ｎ、
を有するイムノコンジュゲート（または抗体−薬物コンジュゲートもしくはＡＤＣ）であって、式中、
Ａｂは、リンカー−薬物部分−［−Ｌ−Ｄ］の１つまたは複数の単位に共有結合している、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、または請求項１０に記載のそのポリペプチドであり、式中、Ｌはリンカーであり、Ｄは細胞傷害薬であり；
ｎは、１〜２０（例えば、１〜１２）の整数であり；
各リンカー−薬物部分は、同じかまたは異なるリンカーＬまたは細胞傷害薬Ｄを有することができる、イムノコンジュゲート。
【請求項１６】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、または請求項１０に記載のポリペプチド、または請求項１５に記載のイムノコンジュゲート、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１７】
ＣＤ４４ｖ９を発現する細胞の増殖を阻害するための医薬組成物であって、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、または請求項１０に記載のポリペプチド、または請求項１５に記載のイムノコンジュゲートを含む前記医薬組成物。
【請求項１８】
がんの細胞がＣＤ４４ｖ９を発現するがんを有する対象を処置するための医薬組成物であって、請求項１〜９のいずれか一項記載のＣＤ４４ｖ９抗体またはその抗原結合性断片、請求項１０に記載のポリペプチド、請求項１５に記載のイムノコンジュゲート、または請求項１６に記載の医薬組成物を含む、治療的有効量のＣＤ４４ｖ９のアンタゴニストを含む、前記医薬組成物。
【請求項１９】
対象における細胞増殖性障害を処置するための医薬組成物であって、前記細胞増殖性障害の細胞はＣＤ４４ｖ９を発現し、前記医薬組成物は、請求項１〜９のいずれか一項記載のＣＤ４４ｖ９抗体またはその抗原結合性断片、請求項１０に記載のポリペプチド、請求項１５に記載のイムノコンジュゲート、または請求項１６に記載の医薬組成物を含む、治療的有効量のＣＤ４４ｖ９のアンタゴニストを含む、前記医薬組成物。
【請求項２０】
対象からの試料におけるＣＤ４４ｖ９の存在および／または存在度を判定する方法であって、試料を請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片と接触させるステップを含む方法。
【請求項２１】
がんの細胞がＣＤ４４ｖ９を発現するがんを有する対象を診断ための指標を提供する方法であって、
（１）がん試料においてＣＤ４４ｖ９を発現する対象を同定するために、請求項２０に記載の方法を使用して、対象からのがん試料におけるＣＤ４４ｖ９の存在および／または存在度を判定するステップ；
を含み、それによって、がんを有する対象を診断ための指標を提供する、前記方法。
【請求項２２】
単離されたＣＤ４４ｖ６エピトープに特異的な、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片であって、前記ＣＤ４４ｖ６エピトープは配列番号１９（例えば、配列番号１９に加えて配列番号１９のＮ末端における１もしくは２つの残基、配列番号１９に加えて配列番号１９のＣ末端における１もしくは２つの残基、または配列番号１９に加えて配列番号１９のＮ末端およびＣ末端の両方における１もしくは２つの残基からなるエピトープ）を含む／それから本質的になるか、または配列番号１９からなり、好ましくは、前記抗体またはその抗原結合性断片は、前記単離されたＣＤ４４ｖ６エピトープに対して産生されるか、または前記単離されたＣＤ４４ｖ６エピトープおよび担体タンパク質（例えば、アルブミン、好ましくはＢＳＡもしくはオボアルブミン、またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ））を含む融合タンパク質またはその化学的コンジュゲートに対して産生される、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【国際調査報告】
2021519608.tif 000028
2021519608.tif 000029
2021519608.tif 000030
2021519608.tif 000031
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