(57)【要約】本発明は、操作されたガラクトースオキシダーゼ（ＧＯアーゼ）酵素、ＧＯアーゼ活性を有するポリペプチド、およびこれらの酵素をコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含むベクターおよび宿主細胞を提供する。ＧＯアーゼ酵素を産生する方法も提供される。本発明は、ＧＯアーゼ酵素を含む組成物、および操作されたＧＯアーゼ酵素を使用する方法を、さらに提供する。本発明は、医薬化合物および他の化合物の産生に特に使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、４、１６６、２７２、９２８、９３２、１２６４、１４１６、１５９８、１８６６、１９１２、２０８０、２３００および／または２４２４に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含む操作されたガラクトースオキシダーゼであって、前記ポリペプチド配列に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号２、４、１６６、２７２、９２８、９３２、１２６４、１４１６、１５９８、１８６６、１９１２、２０８０、２３００および／または２４２４を基準にして番号が付けられている、操作されたガラクトースオキシダーゼ。
【請求項２】
前記ポリペプチド配列が、配列番号２に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有し、前記操作されたガラクトースオキシダーゼが、３３１／４０６／４０７／４６５および３３１／４０６／４６５から選択される前記ポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号２を基準にして番号が付けられている、請求項１に記載の操作されたガラクトースオキシダーゼ。
【請求項３】
前記ポリペプチド配列が、配列番号４に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有し、前記操作されたガラクトースオキシダーゼが、１７０、１７１、１７３、１９１、１９２、１９３、１９４、１９７、１９８、１９９、２０２、２０４、２０５、２２０、２２７、２４３、２４７、２４８、２５２、２６９、２９４、２９６、３２４、３３２、４０７、４６３、４６５、４６６、４９３、５１５、５１７、５２０、５２１および５２２から選択される前記ポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号４を基準にして番号が付けられている、請求項１に記載の操作されたガラクトースオキシダーゼ。
【請求項４】
前記ポリペプチド配列が、配列番号４に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有し、前記操作されたガラクトースオキシダーゼが、１７１、１７３、１８８、１９２、１９７、１９９、２０３、２２０、２２３、２４３、２５２、２９４、２９５、２９６、３３２、４０７、４６５、４６６、４９３、５１５、５１７、５２０および５２１から選択される前記ポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号４を基準にして番号が付けられている、請求項１に記載の操作されたガラクトースオキシダーゼ。
【請求項５】
前記ポリペプチド配列が、配列番号１６６に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有し、前記操作されたガラクトースオキシダーゼが、１７１／２２０／２４３／４０７／４６５、１７１／２２０／２９５／２９６／４０７、１７１／２２０／２９６／４０７／５２０、１７１／２２０／３３２／４０７、１７１／２２０／４０７、１７１／２２０／４６５／５２０、１７１／２４３／２９６／３３２、１７１／２９５／２９６／３３２／４６５、１７１／２９５／３３２、１７１／２９６／４０７、１７１／２９６／４０７／４６５、１７１／３３２、１７１／４０７、１７１／４０７／５２０、１７３、１７３／１９２／２４３／４６５、１７３／４６５、１９２／２２０／２９５／２９６／３３２／５２１、１９２／２２０／２９５／５２０／５２１、１９２／２２０／２９６／３３２／５２０、１９２／２２０／４０７、１９２／２９４／４６５／５１５、１９２／２９５／２９６、１９２／２９５／２９６／３３２、１９２／２９５／２９６／５２０／５２１、１９２／２９６、１９８／２９４／２９６、１９８／２９５、１９８／２９５／２９６、２０４、２０４／２４３／４６５／５１７／５２１、２２０、２２０／２４３、２２０／２４３／２９５／２９６／３３２／４０７／５２１、２２０／２４３／２９５／２９６／４０７、２２０／２４３／４０７、２２０／２４３／４０７／４６５、２２０／２４３／４０７／５２０／５２１、２２０／２５２／３３２／４０７、２２０／２９５／２９６、２２０／２９５／２９６／３３２、２２０／２９５／２９６／３３２／４０７／４６５／５２１、２２０／２９５／２９６／３３２／４０７／５２０、２２０／２９５／２９６／３３２／４０７／５２１、２２０／２９５／２９６／４０７、２２０／２９５／２９６／４６５／５２０、２２０／２９５／３３２、２２０／２９５／３３２／４６５／５２０／５２１、２２０／２９５／４０７／４６５、２２０／２９５／４０７／５２０／５２１、２２０／２９５／４０７／５２１、２２０／２９５／４６５／５２０、２２０／２９５／４６５／５２１、２２０／２９６、２２０／２９６／３３２／４０７、２２０／２９６／３３２／４０７／５２０／５２１、２２０／２９６／４０７、２２０／２９６／４６５、２２０／２９６／４６５／５２１、２２０／３３２／４０７／４６５／５２１、２２０／４０７、２２０／４０７／５２０、２２０／４６５、２２０／４６５／５１７、２２０／４６５／５２０、２２１／２２７／２４３／４６５、２２７、２４３／２９５、２４３／２９５／４０７、２４３／５１５／５１７、２７７／２９６／４０７／５２０／５２１、２８４／２９５／２９６、２９４／２９６／４０７、２９４／４６５、２９４／４６５／５１５、２９４／５２１、２９５／２９６、２９５／２９６／３３２／４０７、２９５／２９６／４０７、２９５／２９６／４０７／５２１、２９５／２９６／５２１、２９５／３３２／４０７／４６５、２９５／３３２／４０７／５２１、２９５／３３２／５２０／５２１、２９５／４０７、２９６、２９６／３３２／４０７／５２０、２９６／３３２／４０７／５２１、２９６／４０７、２９６／５２０／５２１、３３２／４０７、３３２／４０７／５２０／５２１、３３２／４０７／５２１、４０７、４０７／４６５、４０７／５２０、４６５、４６５／５１５、４６５／５１５／５１７／５２１、４６５／５１７／５２１、および５１７から選択される前記ポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号１６６を基準にして番号が付けられている、請求項１に記載の操作されたガラクトースオキシダーゼ。
【請求項６】
前記ポリペプチド配列が、配列番号２７２に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有し、前記操作されたガラクトースオキシダーゼが、４、８、８／２９／９２／１９６／２５８／４２６、８／４６／９２／２７９／２９６／４２６／５４９／５５３／５９７、８／５６／１９２／１９４／４６０／５７１／５９８、８／５６／２４３／５６０／５９８、８／９２／２５８／３６３／５４９／５５３／５６７、８／１９２／１９４／２４３／４６０／５５３／５６０、８／１９２／４６０／５６０／５９８、８／２５８／３６３／４２６／５５３／５９７、１６、１６／２４／４３／５６／１０３／２２０／２９５／２９６／４９９／５４９、１６／４３／５６／１０３／１４８／２２０／２９５／２９６／４９９／５４９、１６／４３／６３／１０３／２９５／３０４／４９９／５４９、１６／４３／６３／１４８／２９５／４９９、１６／４３／１０３／１４８／２２０／２９５／４２６／５４９、１６／４３／１４８／２２０／２９５／４９９、１６／４３／２９５／２９６／５４９、１６／４３／４２６／５４９、１６／５６／６３／１４８／２９５／２９６／３０４／４２６、１６／５６／２９６、１６／５６／４２６／４９９、１６／６３／１０３／２２０／２９５／４２６／５４９、１６／１０３／２２０／２９６／４６５／５４９、１６／１０３／２２０／４６５、１６／１４８／２２０／２９５／２９６／３０４／４９９、１６／１４８／２２０／２９５／４２６／４９９／５４９、１６／１４８／２２０／２９６／５４９、１６／１４８／２９５／４２６／５４９、１６／２２０／４９９、１６／２９５／２９６／４２６／４９９／５４９、１６／２９５／４２６／４６５／４９９／５４９、２４、２４／３６、２４／３６／４３／１４８／３１９／５６０／６３７、２４／３６／９２／１４８、２４／３６／９２／２２２／５６０／６３７、２４／３６／９２／２７９／３１９／３６３／６３７、２４／３６／１４８／２２２／２７９／５６０／６３７、２４／３６／３６３／４６５／６３７、２４／４３／９２／２７９／３６３／５６０／６３７、２４／４３／９２／２７９／４９９、２４／４３／１４８／２９５／５６０、２４／４３／１４８／３６３、２４／４３／１４８／５６０、２４／４３／２２２、２４／９２／１４８／２７９／３６３、２４／９２／２７９／３６３／４６５／４９９／５６０／６３７、２４／１４８／３１９／４６５／６３７、２４／１４８／６３７、２４／６３７、２９、２９／４６／９２／１９６／２５８／２７９／３６３／４２６／４８１／５６７／５９７、３６、３６／４３／９２／１４８／２２２／２７９／２９５／４９９／５６０／６３７、３６／９２／１４８／２７９／３１９／３６３／５６０／６３７、３６／９２／１４８／４９９／６３７、３６／９２／３１９／３６３／６３７、３６／９２／５６０、３６／１４８／２２２／３１９／４６５／４９９、３６／２２２／２７９／３１９／３６３／５６０、４３、４３／５６／２２０／２９６／４２６／４９９／５４９、４３／５６／２２０／４２６／５４９、４３／９２／１４８／２２２／２７９／４９９／５６０、４３／９２／２２２／４６５／４９９／６３７、４３／１４８／２７９／２９５／５６０、４３／１４８／５４９、４３／２２２／２７９、４３／２９５／４９９、４６、４６／１９６／２２８／２７９／２９６／４６５／５５３、５６、６３、９２、９２／１４８／２９５／３１９／４６５／６３７、９２／２７９／４６５／６３７、１０３、１３４、１４８、１４８／２９５／４６５、１９２／２４３、１９４、１９６、１９６／２５８／３６３／４２６／４６５／５４９／５９７、２２０、２２０／２９５／５２０、２２０／２９５／５２１、２２０／２９６／３０４／４２６／５４９、２２２、２５７、２５８、２７９、２７９／５６０／６３７、２９５、２９６、３０４、３１９、３６３、３６３／４２６／４８１／５５３、４２６、４６５、４９９、５４９、５５３、５６０、５６７、５９７、および６３７から選択される前記ポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号２７２を基準にして番号が付けられている、請求項１に記載の操作されたガラクトースオキシダーゼ。
【請求項７】
前記ポリペプチド配列が、配列番号２７２に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有し、前記操作されたガラクトースオキシダーゼが、４／８／５６／５９８、４／５６／１９２／１９４／２５７／５７１／５９８、４／５６／１９４／３２９／５９８、４／１９４／２４３／５４９／５９８、８／２９／４６／１９６／３６３／４８１／５４９／５５３、８／５６、８／５６／１９２／１９４／２４３／３２９、８／５６／１９２／１９４／２４３／３２９／４６０／５６０、８／５６／１９２／１９４／２４３／４６０／５６０／５９８、８／５６／１９２／２４３／４６０、８／５６／１９２／２４３／５９８、８／５６／１９４／２５７／４６０／５４９／５６０／５９８、８／９２／１９６／２５８／４２６／５９７、８／９２／１９６／４８１／５９７、８／１９２／１９４／２４３／３２９／４６０／５６０、８／１９６／２５８／２７９／４８１／５４９／５５３、８／２４３／４６０／５６０／５７１／５９８、８／２５７／４６０／５６０／５９８、８／２５８／３６３／４２６／５４９、８／２７９／３６３／４２６／４８１／５４９／５５３、１６／４３／６３／１０３／２９５／２９６／４９９、１６／４３／１０３／１４８／２９５／４２６／４９９／５４９、１６／４３／１０３／３０４／４９９／５４９、１６／４３／１４８／２９５／２９６／３０４／４９９／５４９、１６／４３／１４８／２９６／４２６／４９９、１６／４３／２９５／２９６／４９９、１６／５６／１０３／２２０／２９５、１６／５６／１０３／２２０／２９５／２９６、１６／５６／１０３／２９５／５４９、１６／５６／１４８／２９５／２９６／３０４／４２６／５４９、１６／５６／２２０／２９５、１６／５６／２２０／４９９／５４９、１６／５６／２９５、１６／５６／２９５／２９６／５４９、１６／５６／２９５／４９９、１６／５６／４９９／５４９、１６／６３／１０３／１４８／４２６／４９９／５４９、１６／６３／１０３／４２６／４９９／５４９、１６／６３／１４８／２２０／２９５／２９６／４２６／４９９、１６／６３／１４８／４９９／５４９、１６／１０３、１６／１０３／１４８、１６／１０３／１４８／２２０／４９９、１６／１０３／１４８／２９５／４２６／４９９／５４９、１６／１０３／２２０／２９５、１６／１４８／２２０／２９５／４２６／４９９、１６／１４８／２９５／４２６、１６／１４８／２９５／５４９、１６／１４８／４２６／５４９、１６／２２０／２９５／２９６、１６／３０４／４２６／４９９、１６／３０４／４９９／５４９、２４／３６／９２／２７９／２９５／３６３／４９９、２４／４３／９２／１４８／２７９／２９５／３１９／６３７、２４／４３／９２／２２２／２７９、２４／４３／２２２／３１９、２４／４３／３６３／６３７、２４／９２、２４／９２／１４８／２７９、２４／９２／２２２／２７９／３１９／６３７、２４／２２２／６３７、２４／２７９／３１９、２９／４６／９２／１９６／４２６／４８１／５４９／５９７、２９／４６／４８１／５４９／５５３／５９７、２９／４２６／５４９、２９／５４９／５５３、３６／４３／２２２／２７９／３６３／５６０、３６／９２／１４８／２２２／２７９／３１９／３６３／４９９／５６０／６３７、３６／９２／２２２／６３７、３６／１４８／２７９／３１９／４９９、４３／１４８／２２２／２７９／５６０／６３７、４３／２２０／２９５／５４９、５６／１４８／２２０／２９５／４９９、５６／１９４／２４３／２５７／３２９／４６０、５６／２４３、６３／１０３／１４８／２２０／２９５／５４９、６３／２２０／２９５／３０４／４２６／４９９／５４９、６３／２２０／２９５／３０４／５４９、９２、９２／２２２／２７９／４９９／５６０／６３７、９２／２５８／３６３／４２６／４８１／５４９／５９７、１０３／２９５／４９９／５４９、１４８／２２０／３０４、１４８／２２２、１４８／２２２／５６０／６３７、１４８／２７９／３１９／４９９、１９４／２４３／３２９／４６０、１９４／２４３／３２９／５６０／５７１／５９８、２２０／２９５／５４９、２７９／２９６／４８１／５４９／５５３／５６７／５９７、２７９／５６０／６３７、２９５／２９６／４２６／５４９、２９５／２９６／５４９、２９５／４９９／５６０／６３７、２９６／３６３／４２６／４８１／５４９、３１９／５６０、３１９／６３７、および３６３／５６０から選択される前記ポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号２７２を基準にして番号が付けられている、請求項１に記載の操作されたガラクトースオキシダーゼ。
【請求項８】
前記ポリペプチド配列が、配列番号９２８に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有し、前記操作されたガラクトースオキシダーゼが、４／４３／４６／５６／６３／２７９／２９５／３１９／５６７／５９８、４／４３／４６／２９５／３１９／５４９／５６０、４／４３／４６／４２６／５４９／５６０、４／４３／１４８／１９６／２７９／３１９／３６３／５６０、１６、１６／２４／２９、１６／２４／２９／９２／２２０／２７９／５９７／５９８、１６／２４／２９／２７９／５４９、１６／２４／２９／２７９／６３７、１６／２４／４３／９２／５４９、１６／２４／４３／１９２／２２０／２７９／５４９、１６／２９／３６／１９２／３１９／５４９／５９７／５９８／６３７、１６／２９／３６／２７９／５４９、１６／２９／４３／９２／１９２／３１９、１６／２９／４３／１９２／２２２／３１９／５４９／６３７、１６／２９／４３／２２２／２７９／５４９、１６／２９／９２／１９２／５４９／６３７、１６／２９／９２／２２０／２２２／３１９／５４９／５９８、１６／２９／９２／２７９／５４９、１６／２９／９２／３１９／５４９、１６／２９／９２／５４９／６３７、１６／２９／１９２／２２０／５４９、１６／２９／１９２／２２０／５４９／５９７、１６／２９／１９２／２２２／２７９／５４９、１６／２９／１９２／２２２／６３７、１６／２９／１９２／５４９、１６／２９／２２０／２２２／２７９／５４９／６３７、１６／２９／２２０／２２２／５９７／５９８、１６／２９／２２２／５４９／５９８／６３７、１６／２９／５４９／６３７、１６／３６／４３／１９２／５９７／６３７、１６／３６／９２／２２０／２２２／２７９／５４９、１６／３６／１９２／５４９／５９７／５９８／６３７、１６／３６／３１９／５４９／５９７／５９８／６３７、１６／４３／５６／１９２／５４９／５９７／５９８／６３７、１６／４３／９２／２２２／５９７／５９８、１６／４３／１９２／５４９、１６／４３／２２０／５４９／６３７、１６／４３／２７９／３１９／５９７、１６／４３／２７９／５４９／５９７、１６／４３／３１９／５４９／５９８、１６／４３／５９７、１６／９２／１９２／２７９／３１９／５４９／６３７、１６／９２／１９２／２７９／６３７、１６／９２／２２０／５４９、１６／９２／３１９／５９７／６３７、１６／１９２／３１９／５４９／６３７、１６／１９２／５４９、１６／２２０／２２２／２７９／５４９／５９８／６３７、１６／２２０／２７９／５４９、１６／２２０／３１９／５４９／５９７／５９８、１６／２２２／３１９／５９７／５９８、１６／２２２／６３７、１６／２７９／３１９／５４９／５９７／６３７、１６／２７９／５４９／５９７／５９８／６３７、１６／２７９／５９７、１６／３１９／５９７、１６／３１９／５９７／５９８、１６／５４９、１６／５４９／５９８、１６／５９７、２９／６３／１３４／５２０／５９７／５９８、２９／６３／５２０／５３７／５３８／５９８、２９／１３４／２３７／５３７／５３８／５６７／５７１、２９／２３７／５２０、２９／２３７／５２０／５３８、２９／２３７／５６７／５９８、２９／２３７／５９７、２９／５９７／５９８、３６／９２／５４９、３６／１３４／２３７／５２０／５３７／５３８／５７１、３６／１３４／２３７／５６７／５７１／５９７／５９８、３６／５２０／５３７／５３８／５９７、４３／４６／５６／１４８／２５８／２７９／３６３／５４９／５７１、４３／４６／６３／２５８／２９５／４２６／５６０／５６７／５７１、４３／４６／１９６／３１９／５４９／５６０／５６７、４３／２７９／５４９／５６０／５６７、４６／２９５／３１９／４２６、４６／５６０、９５、１３４／２３７／５２０／５９７、１３４／５２０／５９７／５９８、２２０／２２２／５９７／６３７、２２０／２９６／４０７／４６５、２２４、２３７／５２０、２３７／５２０／５３７／５３８／５９８、２３７／５２０／５３７／５９８、２３７／５２０／５３８／５９７、２３７／５２０／５６７／５７１／５９７、２３７／５２０／５９７／５９８、２３７／５３８／５９７／５９８、２３７／５７１、２３７／５９７／５９８、２７９／３１９／５６０、２９４、２９５／５４９／５６０、３４３、４３３、４６５、４８３、４８６、５２０／５７１／５９８、５２０／５９７／５９８、５４９／５９８、５５６、５６４、５６７／５７１／５９７、５６８、および６０９から選択される前記ポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号９２８を基準にして番号が付けられている、請求項１に記載の操作されたガラクトースオキシダーゼ。
【請求項９】
前記ポリペプチド配列が、配列番号９２８に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有し、前記操作されたガラクトースオキシダーゼが、４／４３／４６／４２６／５４９／５６０、３６／６３／５２０、９５、３９４、４８３、５２０／５９７、５５６、５６２、５６８および５９８から選択される前記ポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号９２８を基準にして番号が付けられている、請求項１に記載の操作されたガラクトースオキシダーゼ。
【請求項１０】
前記ポリペプチド配列が、配列番号９２８に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有し、前記操作されたガラクトースオキシダーゼが、６３／１９６、１７３、１８９、１９４、１９６、１９７、１９８、１９８／４４７、２２０／２９４／２９６／３３２、２２０／２９４／４６５、２９０、２９２、２９４／４０７／４６５、３２７、４０７／４６５および６３８から選択される前記ポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号９２８を基準にして番号が付けられている、請求項１に記載の操作されたガラクトースオキシダーゼ。
【請求項１１】
前記ポリペプチド配列が、配列番号９３２に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有し、前記操作されたガラクトースオキシダーゼが、１６／４３／２２０／２５８／５３８／６３７、１６／２５８／４２６／４６５／５３８／５４９／６３７、１８、２４／２２２／２３７／５２０／５３８、２４／２２２／５２０、４３／２２２／２３７／２５８／４２６／５９７、４３／２５８／４０７／４２６／４６５／５３８／５４９／６３７、６３、６３／９５／１７３／３４３／５６４／５６８／６０９、９５／１７３／２５８／４２６／５５６／５６４、９５／１７３／５５６／６０９、１７３／５５６、１９４、２２０／２９４／２９５／３１９／４０７／４２６／４６５／５３８／５４９／６３７、２２２／２３７、２２２／５２０／５９７、２３７／２５８／５４９／５９７、２３７／２６５／２７９、２５８／２６７、２５８／３１９／４２６／４６５／５４９／６３７、２５８／４２６、および２５８／５３８／５４９／６３７から選択される前記ポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号９３２を基準にして番号が付けられている、請求項１に記載の操作されたガラクトースオキシダーゼ。
【請求項１２】
前記ポリペプチド配列が、配列番号１２６４に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有し、前記操作されたガラクトースオキシダーゼが、１８／９５／３２７／５４８、２８、３６、４３、４３／４６／５６／６３／１９１、４３／２３７／２７９／５３８／５９７／５９８、４３／２３７／２９４／５３８、４３／２３７／５２０、４３／２３７／５２０／５４９／５９８、４３／２３７／５２０／５９７、４３／２７９／２９４、４３／５３８、４３／５４９／５９７、５１／５５／１１１／１５０／３６７／５６４、５５、６１、９５／３２７／５４８、９９、１８３、１９８、２２４、２２９、２３７／５２０／５３８／５９７、２４３、２５２、２５８、２９１、２９５、３１２、３３５、３４２、３４３、３６７／３７１／５６４／５９４、３７１、３８４、４６８、４８５、５２０、５４４、５４９、５６４／６０４、５６７、５６８、５７０、５９４、５９６、６０４、６３５、および６３７から選択される前記ポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号１２６４を基準にして番号が付けられている、請求項１に記載の操作されたガラクトースオキシダーゼ。
【請求項１３】
前記ポリペプチド配列が、配列番号１２６４に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有し、前記操作されたガラクトースオキシダーゼが、２８、２８／９９／５２０／６３７、５５／２９５、５５／３４２、５５／５６８、５５／５６８／５９４、５５／５６８／６３７、６１／２２４／３４３／５２０／６３７、９９／３４３／６３７、９９／５２０／６３７、９９／６３７、２２４／５２０／６３７、２９５／３４２、２９５／３４２／５６８、３４２／５６８、３４２／５９４、３４３／５２０／６３７、４０３／５２０／６３７、５２０／６３７、５６８／６３７、５９４、および６３７から選択される前記ポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号１２６４を基準にして番号が付けられている、請求項１に記載の操作されたガラクトースオキシダーゼ。
【請求項１４】
前記ポリペプチド配列が、配列番号１４１６に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有し、前記操作されたガラクトースオキシダーゼが、１３、１３／２６／１５６／２７４／３５９／４２９、１３／１５６／２６２／２７４／３１５、１３／１５６／２６２／３１５／４２９／４３７、１３／１５６／２７４／４３７／５６８／６０６、１３／２６２、１３／２６２／２７４／３８０、１３／２６２／２７４／５９５、１３／２６２／４３７／４８８、１３／２７４、１３／２７４／３１５／４３７、１３／２７４／３７３／４３７、１３／３２８／４３７、１３／３７３、１３／４３７、１３／４３７／５４１、２６／２６２／２７４／３１５／４３７、３５、３７、３７／８９、３７／８９／２７４、３７／２６３／２７４／３８０／５５９／５６１、３７／３８０、４５、４５／２６２／２７４／３７３／４３７、８９、８９／２６３／２７４／３８０、８９／２６３／５５９、８９／２７４／３８０、１０５、１５４、１５６、１５６／２７４／３１５、２００、２１７、２１７／２７４／３８０／５６１、２１７／２７４／４７８、２１７／３５４／３８０、２１７／３８０、２２４、２３９、２４１、２５３、２６２、２６２／２７４、２６２／２７４／３１５、２６２／２７４／４３７、２６２／３７３／５９５、２６２／３８０、２６２／４３７、２６２／５４１、２６３、２６３／２７４、２６３／２７４／３８０、２６３／３５４／３８０／５５９、２６３／３８０、２６３／３８０／４４１、２７４、２７４／３２８、２７４／３５４、２７４／３５９、２７４／３７３／４３７、２７４／３８０、２７４／３８０／４４１、２７４／３８０／５５９、２７４／３９３／４３７、２７４／４３７、２７４／４３７／５４１、２７４／４３７／５６８、３１５、３２８、３３６、３５４、３５４／３８０、３５９、３６６、３７３、３７３／５９５、３７５、３８０、３８０／４３７、３８０／５５９／５６１、３９３、４２９、４３７、４３８、４３９、４４１、４７８、４７８／５６１、４８８、５４１、５５０、５５９、５６１、５６８、５９５、６０５、６２７、および６４１から選択される前記ポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号１４１６を基準にして番号が付けられている、請求項１に記載の操作されたガラクトースオキシダーゼ。
【請求項１５】
前記ポリペプチド配列が、配列番号１５９８に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有し、前記操作されたガラクトースオキシダーゼが、１３／９９／１５６／２６２／４３７／５５９／６４１、１３／９９／１５６／３８０／４３７、１３／９９／１５６／３８０／４３７／５５９／５６３／６４１、１３／９９／２５７／２６２／２６３／５５９、１３／９９／２６２／２６３／３８０／４３７／５６３／６４１、１３／９９／２６３、１３／９９／２６３／３８０、１３／９９／２６３／３８０／４３７、１３／９９／２６３／３８０／４３７／６４１、１３／９９／３８０／４３７／５５９、１３／９９／４３７／５６３、１３／９９／５６３／６４１、１３／１５６／２６２／２６３／４３７／５５９、１３／１５６／２６３／４３７、１３／１５６／３８０、１３／２６２、１３／２６２／２６３、１３／２６２／２６３／３８０／４３７／５５９、１３／３８０／４３７、１３／３８０／４３７／５５９、１３／４３７、１３／４７０／５５９／５６３、２９、３０、４３／４６／５６／６３／９９／１５６／２６２／２６３／４０３／５５９／５６３、６２、９９、９９／１５６／２６２、９９／１５６／２６２／２６３／３８０／４３７／５５９、９９／１５６／２６２／２６３／４３７、９９／１５６／２６２／２６３／５５９、９９／１５６／２６３／５５９、９９／１５６／３８０、９９／１５６／３８０／４３７、９９／１５６／４３７、９９／２６２／２６３／４３７／５５９／６４１、９９／２６２／４３７／５５９、９９／２６３／４３７／５６３、９９／３８０／４３７／５５９／６４１、９９／３８０／５６３、９９／４３７、１０８、１４９、１７５、１７７、１８４、１９４、１９７、２０８、２３４、２５１、２５４、２６２、２６２／２６３、２６２／２６３／４３７／５５９、２６２／２６３／５５９／５６３、２６２／４３７／６４１、２６３／３８０、２６３／４３７／５５９／５６３、２７８、２８０、２８７、３５６、３７３、３８０、４０７、４０９、４６３、４６６、４８９、５５９／６４１、５６５、５６９、５９２、５９６、６０１、６１０、および６１５から選択される前記ポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号１５９８を基準にして番号が付けられている、請求項１に記載の操作されたガラクトースオキシダーゼ。
【請求項１６】
前記ポリペプチド配列が、配列番号１８６６に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有し、前記操作されたガラクトースオキシダーゼが、２９／１４９／４６３／６０１、２９／１７７／１９７／５９２、２９／１７７／４６３、２９／１９７／５９２、２９／４６３、６２／２０８／４１７／６１５、６２／２８６／６１５、６２／３７３／４６６、６２／４６６、６２／４６６／５９７、１４９、１４９／２０８／６１５、１４９／４６３、１７７／１９４／１９７／４６３／５６５、１７７／１９７／４６３／５６５、１７７／２８０／４６３／５９４／６０１、１７７／４６３／５６５、１７７／４６３／５９２、１８４、１９７、１９７／２８０／４６３、１９７／４６３／５９２、１９７／４６６／５６９／５９６、２０８／２５１／２５９／２７８、２３４、２３４／３８４、２５１、２５１／３９９／６１５、２７８、３７３／４６６、３８４／５６９、３９９／６１５、４１７／６１５、４６３／５６５、４６６、５４６、５６９、および５６９／５９７から選択される前記ポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号１８６６を基準にして番号が付けられている、請求項１に記載の操作されたガラクトースオキシダーゼ。
【請求項１７】
前記ポリペプチド配列が、配列番号１９１２に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有し、前記操作されたガラクトースオキシダーゼが、３、４、９、１８、２６、２９、３０、３８、４０、４２、４３、４４、４８、５０、７５、７９、１３５、１３６、１４２、１５６、１５９、１６１、１９７、４８６および６０１から選択される前記ポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号１９１２を基準にして番号が付けられている、請求項１に記載の操作されたガラクトースオキシダーゼ。
【請求項１８】
前記ポリペプチド配列が、配列番号１９１２に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有し、前記操作されたガラクトースオキシダーゼが、２９、２９／３０／５０／７９／１３６／１９７、２９／３０／５０／７９／１９７／４０７、２９／３０／７９／１３６／１５６／１９７、２９／３０／７９／１９７、２９／３０／７９／１９７／４０７、２９／３０／１３６／１９７／４０７／４８６、２９／３０／１３６／４０７、２９／３０／１９７、２９／３０／１９７／４０７、２９／５０／１９７／４０７／４８６、２９／１９７／４０７、２９／１９７／４０７／４８６、３０、３０／５０／７９／１３６／１５６／１９７、４３／１９７／４０７、５０／１３６／１９７／４８６、６５、７９、７９／１３６／１９７／４０７、７９／１５６／１９７／４０７、１３６、１３６／１９７／４０７、１３６／１９７／４８６、１５６／１６１／４８６、１９７、１９７／４０７、１９７／４８６、２７９／２９１／３７５／４２０／４２９／４３６／４５３／４６５、２７９／２９１／３７５／４６５／５３６／５３８、２７９／２９１／４６５、２７９／２９１／４６５／５３６、２７９／３７５／４２０／４２９／４５３／４６５／４７２／５３８、２７９／３７５／４２０／４６５、２７９／４６５、２９１／３７５／４２０／４３０／４６５／５３８、２９１／３７５／４３６／４６５／５３８、２９１／３７５／４５３／４６５、２９１／４２０／４６５／４８１／５３８、２９１／４２９／４６５、２９１／４５３／４６５／５３６／５３８、２９１／４６５、２９１／４６５／５３８、３７５／４２０／４６５、３７５／４２９／４５３／４６５、３７５／４６５、４２０／４３６／４６５、４２９／４６５、４５３／４６５、４５３／４６５／４７８／４８１、４６５、４６５／５３６／５３８、４８６、および６１５から選択される前記ポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号１９１２を基準にして番号が付けられている、請求項１に記載の操作されたガラクトースオキシダーゼ。
【請求項１９】
前記ポリペプチド配列が、配列番号２０８０に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有し、前記操作されたガラクトースオキシダーゼが、２４、４７、６３、７８、９５、１１９、１２１、１９７、２０７、２１４、２１９、２２０、２４９、２９４、３２４、３６５、４０８、４１４、４３７、４８０、４８５、５２０、５５６、５７１、５９８、６００、および６２６から選択される前記ポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号２０８０を基準にして番号が付けられている、請求項１に記載の操作されたガラクトースオキシダーゼ。
【請求項２０】
前記ポリペプチド配列が、配列番号２０８０に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有し、前記操作されたガラクトースオキシダーゼが、１４／１３０／２５７／４７２、１４／２５７、２４、２９、２９／１３６、２９／１３６／１９７／４３６、２９／１３６／４３６、２９／１３６／４３６／４５３、２９／１９７、２９／１９７／３４２／４３６、２９／１９７／４３６、２９／１９７／４３６／４５３、２９／１９７／４５３、２９／４３６、２９／４３６／４７２、２９／４５３、２９／４７２、４３、６３、９５、１１９、１３０／４２１、１３６、１３６／１９７／４３６、１３６／１９７／４３６／４５３、１３６／４３６、１４４、１９７、１９７／４３６、１９７／４３６／４５３、１９７／４３６／４７２、１９７／４５３、２１４、２１９、２４９、２５７、２５７／４７２、２９７、３５９、４３６、４３７、４６０、４８５、４９５、５２０、５５６、５６０、５６７、および５９２から選択される前記ポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号２０８０を基準にして番号が付けられている、請求項１に記載の操作されたガラクトースオキシダーゼ。
【請求項２１】
前記ポリペプチド配列が、配列番号２３００に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有し、前記操作されたガラクトースオキシダーゼが、２４、２４／５１／６３／１９７／３５９、２４／１１９／１９７、２４／１９７／２４９／４３７、４３／１９７／３５９、４３／２４９、６３、６３／６７／１９７／５７１、６３／６７／２１４／５５６、６３／１１９／１９７、６３／１１９／１９７／２０７／２１４、６３／１１９／１９７／３３９／３４１、６３／１１９／１９７／５５６、６３／１１９／１９７／５５６／５７１、６３／１１９／５５６、６３／１９７、６３／１９７／２０７／５５６、６３／１９７／２０７／５５６／５７１、６３／１９７／２１４／５７１、６３／１９７／２４９／４９５、６３／１９７／５５６／５７１、９５／１９７、９５／２１９／３５９、１１９、１１９／１９７、１１９／１９７／２０７／５７１、１１９／１９７／２１４、１１９／１９７／２１４／５５６、１１９／１９７／２１４／５７１、１１９／１９７／３３９、１１９／１９７／５５６、１１９／１９７／５５６／５７１、１１９／１９７／５７１、１１９／２０７／５５６／５７１、１９７、１９７／２０７、１９７／２０７／２１４／４７１、１９７／２１４、１９７／２１９、１９７／３３９／５５６／５７１、１９７／５５６、１９７／５５６／５７１、１９７／５７１、２１４／２４９／３５９、２１９、および５５６から選択される前記ポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号２３００を基準にして番号が付けられている、請求項１に記載の操作されたガラクトースオキシダーゼ。
【請求項２２】
前記ポリペプチド配列が、配列番号２３００に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有し、前記操作されたガラクトースオキシダーゼが、１９４／３３０／４９５、１９６、２４６／４０８／４４２／４６２、２４６／４４２、２９２、３２７、３２７／３２９、３３０、４０７、４４２、４４２／４６２／５１５、４６２／５８３、４６５、４９８、および５８３から選択される前記ポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号２３００を基準にして番号が付けられている、請求項１に記載の操作されたガラクトースオキシダーゼ。
【請求項２３】
前記ポリペプチド配列が、配列番号２４２４に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有し、前記操作されたガラクトースオキシダーゼが、１４、１４／２４／３６／９６、１４／２４／３６／２９６／４２４／５６０、１４／２４／７８／１２０／２５８、１４／２４／９２／９６／９９／４０８、１４／２４／９６／２５８／６２６、１４／２４／２５８／５６０、１４／７８／１２０／２５８／４８８／５６０／６２６、１４／９２／９６／９９、１４／９２／９６／９９／１２０／５３７、１４／９２／９６／１２０／３７６、１４／９２／９９／１２０／５３７、１４／９５／１２０／２９６／４８０／５６０、１４／１２０／４８０／６２６、１４／２５８、１４／２５８／２９６／５６０、１４／３７６／５６０、１４／４０８、２３／３６／９２／９５／９６、２３／３６／９２／９５／９９／４０８／５９６、２３／３６／４０８／４２８、２３／３６／５３７／５９６、２３／２１８／５３７、２３／４０８／５９６、２４、２４／３６／４６／９９／４２６／５３２／５４９、２４／３６／９５／９６、２４／３６／９５／９９／４０４／４２６／４８５、２４／３６／９６／９９／５３２／５４９、２４／３６／９９／４０４／４２６／５３２／５４９／６００、２４／３６／１２０／２９６／４８０／５６０、２４／３６／４０４／４２６／５３２、２４／３６／４０４／４８０／４８５／５３２／５６０／６００、２４／４６／９２／４０４／４２６／５３２、２４／４６／９２／４２６／５３２、２４／４６／９２／４２６／５４９、２４／４６／９５／９９／４２６／５３２、２４／４６／９９／４２６／５４９／６００、２４／４６／４０４／４２６／４８５／５３２、２４／９６／４０４／４２６、２４／９９、２４／９９／４０４／４８５／５３２／６００、２４／２９６、２４／２９６／３２４／４８０、２４／４０４／４２６／５３２、２４／４０４／４８０／４８５、２４／４０４／４８０／５３２／５４９／５６０、３６、３６／９２／９５／９９／４０４／４２６／５６０、３６／９２／９５／４２８／５９６、３６／９２／９６／４０８／４２８／５４０／５９６、３６／９２／４８５、３６／２５８／２９６、３６／２５８／２９６／３２４／４３３／６２６、３６／４０４、３６／４０４／４２６／５４９／６００、３６／４０８／５３７／５９６、３６／４０８／５９６、３６／４２６／４８５／６００、４６、４６／９２／５６０、９２、９２／９５／４８５／５３２／５４９／５６０、９２／９９／２１８／５６０、９５、９５／１２０／２９６／６２６、９５／４０４／４２６／５３２、９６、９６／９９、９６／２５８／５６０／６２６、９９、９９／４０４／４２６／５６０、９９／４２６／４８０／４８５、１２０、１２０／３２４／４８０／５６０、２１８、２１８／４０８、２９６／３２４、２９６／３２４／５６０、３２４／５６０、４０４、４０４／４８５／６００、４０８、４８０、４８５、５３２、５３７、５３７／６４０、５４９、５４９／５６０、５６０、５９６、および６００から選択される前記ポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号２４２４を基準にして番号が付けられている、請求項１に記載の操作されたガラクトースオキシダーゼ。
【請求項２４】
前記ポリペプチド配列が、配列番号２４２４に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有し、前記操作されたガラクトースオキシダーゼが、１４、１４／２４／３６／９６、１４／２４／３６／２９６／４２４／５６０、１４／２４／７８／１２０／２５８、１４／２４／９９／２１８／４０８／５３７／５６０、１４／２４／２５８／５６０、１４／４６／４７／３７６、１４／４６／９６／９９／５６０、１４／９２／９６／９９／３７６／５６０、１４／９２／９６／１２０／３７６、１４／９２／９６／３７６、１４／９２／９９／１２０／２１８／４０８、１４／９２／９９／１２０／５３７、１４／９２／９９／２１８／４０８、１４／９２／２１８／４０８、１４／９５／１２０／２９６／４８０／５６０、１４／３７６、１４／３７６／５３７、１４／３７６／５６０、１４／４０８、１４／５３７、２３／３６、２３／３６／９２／９５／９６、２３／３６／９２／９５／９９／４０８／５９６、２３／３６／９６／４０８／５９６／６４０、２３／３６／４０８／４２８、２３／３６／５３７／５４０／６４０、２３／３６／５３７／５９６、２３／２１８／５９６／６４０、２４、２４／３６／４６／９９／４２６／５３２／５４９、２４／３６／９５／９６、２４／３６／９５／９９／４０４／４２６／４８５、２４／３６／９６／９９／５３２／５４９、２４／３６／１２０／２９６／４８０／５６０、２４／３６／４０４／４２６／５３２、２４／３６／４０４／４８０／４８５／５３２／５６０／６００、２４／４６／９２／４０４／４２６／５３２、２４／４６／９２／４２６／５３２、２４／４６／９２／４２６／５４９、２４／４６／９５／９９／４２６／５３２、２４／４６／９９／４２６／５４９／６００、２４／４６／４０４／４２６／４８５／５３２、２４／９６／４０４／４２６、２４／９６／４０４／４２６／５６０、２４／９９、２４／２９６、２４／４０４／４２６／５３２、２４／４０４／４８０／４８５、２４／５３２、３６、３６／９２／９５／４２８／５９６、３６／９５／９６、３６／９９／４２６／４８５／６００、３６／２５８／２９６、３６／２５８／２９６／３２４／４３３／６２６、３６／４０４、３６／４０４／４２６／５４９／６００、３６／４０８、３６／４０８／５３７／５９６、３６／４２６／４８５／６００、４６／９２／５６０、７８、９２、９２／９５／４８５／５３２／５４９／５６０、９２／９６、９２／９９／１２０、９２／９９／２１８／５６０、９２／２１８、９２／４０４、９５、９６、９６／９９、９９、９９／４２６／４８０／４８５、９９／６４０、１２０、１２０／３２４／４８０／５６０、１２０／３７６、２１８／５３７／５９６、２１８／５９６、２５８、２９６、２９６／３２４、２９６／３２４／５６０、２９６／４８０／５６０、３２４、３６１、４０４、４０４／４２６／４８５、４０８／５９６、４２４、４２６／４８５、４２６／５３２／５４９、４８０、５３２、５３７／６４０、５４９、５４９／５６０、５６０、６００、６２６、および６４０から選択される前記ポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号２４２４を基準にして番号が付けられている、請求項１に記載の操作されたガラクトースオキシダーゼ。
【請求項２５】
表４．１、５．１、６．１、７．１、１１．１、１２．１、１３．１、１４．１、１４．２、１５．１、１６．１、１７．１、１８．１、１９．１、２２．１、２３．１、２５．１、２６．１、２７．１、２８．１、２９．２、３０．１および／または３１．１で示される少なくとも１つの操作されたガラクトースオキシダーゼ改変体の配列と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高度に同一であるポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の操作されたガラクトースオキシダーゼ。
【請求項２６】
配列番号２、４、１６６、２７２、９２８、９３２、１２６４、１４１６、１５９８、１８６６、１９１２、２０８０、２３００および／または２４２４で示される少なくとも１つの操作されたガラクトースオキシダーゼ改変体の配列と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高度に同一であるポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の操作されたガラクトースオキシダーゼ。
【請求項２７】
配列番号４、１６６、２７２、９２８、９３２、１２６４、１４１６、１５９８、１８６６、１９１２、２０８０、２３００および／または２４２４で示される改変体の操作されたポリペプチドである、請求項１に記載の操作されたガラクトースオキシダーゼ。
【請求項２８】
配列番号４〜２８６０のうちの偶数番号の配列で示される少なくとも１つの操作されたガラクトースオキシダーゼ改変体の配列と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高度に同一であるポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の操作されたガラクトースオキシダーゼ。
【請求項２９】
配列番号４〜２８６０のうちの偶数番号の配列で示されるポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の操作されたガラクトースオキシダーゼ。
【請求項３０】
野生型Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｉｕｍガラクトースオキシダーゼと比較して少なくとも１つの改善された特性を含む、請求項１に記載の操作されたガラクトースオキシダーゼ。
【請求項３１】
前記改善された特性が、基質に対する改善された活性を含む、請求項３０に記載の操作されたガラクトースオキシダーゼ。
【請求項３２】
前記基質が、第一級アルコールを含む、請求項３１に記載の操作されたガラクトースオキシダーゼ。
【請求項３３】
野生型Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｉｕｍガラクトースオキシダーゼと比較して改善された立体選択性を含む、請求項１に記載の操作されたガラクトースオキシダーゼ。
【請求項３４】
精製されている、請求項１に記載の操作されたガラクトースオキシダーゼ。
【請求項３５】
請求項１に記載の少なくとも１つの操作されたガラクトースオキシダーゼを含む組成物。
【請求項３６】
請求項１に記載の少なくとも１つの操作されたガラクトースオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項３７】
少なくとも１つの操作されたガラクトースオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列であって、配列番号１、３、１６５、２７１、９２７、９３１、１２６３、１４１５、１５９７、１８６５、１９１１、２０７９、２２９９および／または２４２３に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を含み、前記操作されたガラクトースオキシダーゼの前記ポリヌクレオチド配列が、１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換を含む、ポリヌクレオチド配列。
【請求項３８】
配列番号１、３、１６５、２７１、９２７、９３１、１２６３、１４１５、１５９７、１８６５、１９１１、２０７９、２２９９および／もしくは２４２３に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を含む、少なくとも１つの操作されたガラクトースオキシダーゼまたはその機能的断片をコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項３９】
制御配列に作動可能に連結している、請求項３６に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項４０】
コドン最適化されている、請求項３６に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項４１】
配列番号１〜２８５９のうちの奇数番号の配列を含む、請求項３６に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項４２】
請求項３６に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項４３】
請求項４２に記載の少なくとも１つの発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項４４】
請求項３６に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞。
【請求項４５】
宿主細胞において操作されたガラクトースオキシダーゼを産生する方法であって、請求項４４に記載の宿主細胞を、好適な条件下で、少なくとも１つの操作されたガラクトースオキシダーゼが産生されるように培養するステップを含む方法。
【請求項４６】
培養物および／または宿主細胞から少なくとも１つの操作されたガラクトースオキシダーゼを回収するステップをさらに含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記少なくとも１つの操作されたガラクトースオキシダーゼを精製するステップをさらに含む、請求項４５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１８年７月９日に出願した米国仮特許出願第６２／６９５，５７０号および２０１９年３月２２日に出願した米国仮特許出願第６２／８２２，２８６号の優先権を主張するものであり、前記仮出願の両方は、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、操作されたガラクトースオキシダーゼ（ＧＯアーゼ）酵素、ＧＯアーゼ活性を有するポリペプチド、およびこれらの酵素をコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含むベクターおよび宿主細胞を提供する。ＧＯアーゼ酵素を産生する方法も提供される。本発明は、ＧＯアーゼ酵素を含む組成物、および操作されたＧＯアーゼ酵素を使用する方法を、さらに提供する。本発明は、医薬化合物および他の化合物の産生に特に使用される。
【０００３】
配列表、表またはコンピュータプログラムへの言及
配列表の公式コピーは、ファイル名が「ＣＸ２−１７６ＷＯ２＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」であり、作成日が２０１９年７月２日であり、サイズが１１，５０９キロバイトである、ＡＳＣＩＩ形式のテキストファイルとして、本明細書と同時にＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で提出されている。ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で出願したこの配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
アルコールのアルデヒドへの酸化は、合成有機化学で必要とされる肝要な変換である。このタイプの反応を行うことができるいくつかの化学試薬があるが、これらの方法の使用にはいくつかの欠点が付随する。化学的酸化経路は、使用の際に標的とされない反応基の保護を必要とする非化学選択的方法である。これらの酸化方法は、一部の化学試薬が標的アルコールを過度に酸化し得るので、酸化状態に関して制御することが難しい。加えて、酸化条件下で実行される反応は、爆発、人員への深刻な身体的危害および資産への深刻な物理的損害を招くこともある、危険な状況をもたらす。酸化試薬は、環境に有害である反応性種、およびそれらの副産物である。したがって、選択的酸化化学を遂行することができ、その上、これらの深刻な欠点を低減させることまたは無くすことができる、制御された薬剤の生産が、当技術分野において依然として必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、操作されたガラクトースオキシダーゼ（ＧＯアーゼ）酵素、対応するアルデヒドを生じさせる結果となるエナンチオ選択的様式での第一級アルコールに対する弱い酸化活性を有するポリペプチド、およびこれらの酵素をコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含むベクターおよび宿主細胞を提供する。ＧＯアーゼ酵素を産生する方法も提供される。本発明は、ＧＯアーゼ酵素を含む組成物、および操作されたＧＯアーゼ酵素を使用する方法を、さらに提供する。本発明は、医薬化合物および他の化合物の産生に特に使用される。
【０００６】
本発明は、配列番号２、４、１６６、２７２、９２８、９３２、１２６４、１４１６、１５９８、１８６６、１９１２、２０８０、２３００および／または２４２４に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含む操作されたガラクトースオキシダーゼを提供する。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、ポリペプチド配列に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２、４、１６６、２７２、９２８、９３２、１２６４、１４１６、１５９８、１８６６、１９１２、２０８０、２３００および／または２４２４を基準にして番号が付けられている。操作されたガラクトースオキシダーゼについての一部の追加の実施形態では、ポリペプチド配列は、配列番号２に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有する。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、３３１／４０６／４０７／４６５および３３１／４０６／４６５から選択されるポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、３３１Ｒ／４０６Ｙ／４０７Ｑ／４６５Ａ、３３１Ｒ／４０６Ｙ／４６５Ａ、および３３１Ｒ／４０６Ｙ／４６５Ｑから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、Ｋ３３１Ｒ／Ｆ４０６Ｙ／Ｅ４０７Ｑ／Ｆ４６５Ａ、Ｋ３３１Ｒ／Ｆ４０６Ｙ／Ｆ４６５Ａ、およびＫ３３１Ｒ／Ｆ４０６Ｙ／Ｆ４６５Ｑから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２を基準にして番号が付けられている。
【０００７】
一部の追加の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、配列番号４に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたガラクトースオキシダーゼは、１７０、１７１、１７３、１９１、１９２、１９３、１９４、１９７、１９８、１９９、２０２、２０４、２０５、２２０、２２７、２４３、２４７、２４８、２５２、２６９、２９４、２９６、３２４、３３２、４０７、４６３、４６５、４６６、４９３、５１５、５１７、５２０、５２１および５２２から選択されるポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号４を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、１７０Ｌ、１７１Ａ、１７１Ｃ、１７１Ｌ、１７３Ｃ、１７３Ｓ、１９１Ａ、１９２Ｉ、１９２Ｍ、１９２Ｑ、１９３Ｔ、１９４Ｖ、１９７Ｋ、１９７Ｓ、１９８Ａ、１９８Ｇ、１９８Ｔ、１９９Ｇ、１９９Ｒ、１９９Ｔ、２０２Ｃ、２０２Ｔ、２０４Ｑ、２０４Ｓ、２０４Ｖ、２０５Ａ、２２０Ｅ、２２０Ｐ、２２０Ｒ、２２７Ｌ、２４３Ｃ、２４３Ｖ、２４７Ｇ、２４８Ｅ、２４８Ｔ、２５２Ｔ、２６９Ｑ、２６９Ｙ、２９４Ｋ、２９４Ｎ、２９４Ｓ、２９６Ａ、２９６Ｌ、２９６Ｓ、２９６Ｗ、３２４Ｇ、３２４Ｓ、３３２Ｒ、４０７Ｖ、４６３Ｋ、４６３Ｒ、４６３Ｖ、４６５Ｇ、４６６Ｒ、４９３Ｇ、５１５Ｔ、５１７Ｄ、５１７Ｅ、５１７Ｌ、５１７Ｍ、５１７Ｓ、５２０Ｇ、５２０Ｌ、５２０Ｐ、５２０Ｓ、５２０Ｖ、５２１Ｇ、５２１Ｐ、５２１Ｓ、５２１Ｖ、および５２２Ｓから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号４を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、Ｉ１７０Ｌ、Ｖ１７１Ａ、Ｖ１７１Ｃ、Ｖ１７１Ｌ、Ａ１７３Ｃ、Ａ１７３Ｓ、Ｒ１９１Ａ、Ｎ１９２Ｉ、Ｎ１９２Ｍ、Ｎ１９２Ｑ、Ｄ１９３Ｔ、Ａ１９４Ｖ、Ｇ１９７Ｋ、Ｇ１９７Ｓ、Ｓ１９８Ａ、Ｓ１９８Ｇ、Ｓ１９８Ｔ、Ｐ１９９Ｇ、Ｐ１９９Ｒ、Ｐ１９９Ｔ、Ｉ２０２Ｃ、Ｉ２０２Ｔ、Ｌ２０４Ｑ、Ｌ２０４Ｓ、Ｌ２０４Ｖ、Ｔ２０５Ａ、Ｖ２２０Ｅ、Ｖ２２０Ｐ、Ｖ２２０Ｒ、Ｍ２２７Ｌ、Ｔ２４３Ｃ、Ｔ２４３Ｖ、Ｄ２４７Ｇ、Ａ２４８Ｅ、Ａ２４８Ｔ、Ｓ２５２Ｔ、Ｖ２６９Ｑ、Ｖ２６９Ｙ、Ｇ２９４Ｋ、Ｇ２９４Ｎ、Ｇ２９４Ｓ、Ｆ２９６Ａ、Ｆ２９６Ｌ、Ｆ２９６Ｓ、Ｆ２９６Ｗ、Ａ３２４Ｇ、Ａ３２４Ｓ、Ｓ３３２Ｒ、Ｅ４０７Ｖ、Ｉ４６３Ｋ、Ｉ４６３Ｒ、Ｉ４６３Ｖ、Ａ４６５Ｇ、Ｅ４６６Ｒ、Ｖ４９３Ｇ、Ｌ５１５Ｔ、Ｇ５１７Ｄ、Ｇ５１７Ｅ、Ｇ５１７Ｌ、Ｇ５１７Ｍ、Ｇ５１７Ｓ、Ｔ５２０Ｇ、Ｔ５２０Ｌ、Ｔ５２０Ｐ、Ｔ５２０Ｓ、Ｔ５２０Ｖ、Ｔ５２１Ｇ、Ｔ５２１Ｐ、Ｔ５２１Ｓ、Ｔ５２１Ｖ、およびＮ５２２Ｓから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号４を基準にして番号が付けられている。
【０００８】
一部のさらなる実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、配列番号４に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたガラクトースオキシダーゼは、１７１、１７３、１８８、１９２、１９７、１９９、２０３、２２０、２２３、２４３、２５２、２９４、２９５、２９６、３３２、４０７、４６５、４６６、４９３、５１５、５１７、５２０および５２１から選択されるポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号４を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、１７１Ａ、１７３Ｓ、１８８Ｔ、１９２Ｑ、１９７Ｋ、１９７Ｓ、１９７Ｔ、１９９Ａ、１９９Ｎ、１９９Ｓ、２０３Ｖ、２２０Ｃ、２２０Ｅ、２２０Ｍ、２２０Ｐ、２２０Ｓ、２２３Ｈ、２２３Ｌ、２２３Ｍ、２２３Ｎ、２４３Ａ、２４３Ｓ、２５２Ｍ、２５２Ｒ、２５２Ｔ、２５２Ｖ、２９４Ｅ、２９４Ｑ、２９４Ｓ、２９５Ｅ、２９５Ｇ、２９５Ｎ、２９５Ｒ、２９５Ｓ、２９６Ｓ、３３２Ｑ、４０７Ｆ、４０７Ｉ、４０７Ｍ、４６５Ｇ、４６５Ｍ、４６５Ｔ、４６６Ｇ、４６６Ｒ、４９３Ｔ、５１５Ｖ、５１７Ｄ、５１７Ｋ、５１７Ｓ、５２０Ａ、５２０Ｓ、５２１Ａ、５２１Ｇ、５２１Ｑ、５２１Ｖ、および５２１Ｙから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号４を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、Ｖ１７１Ａ、Ａ１７３Ｓ、Ｓ１８８Ｔ、Ｎ１９２Ｑ、Ｇ１９７Ｋ、Ｇ１９７Ｓ、Ｇ１９７Ｔ、Ｐ１９９Ａ、Ｐ１９９Ｎ、Ｐ１９９Ｓ、Ｔ２０３Ｖ、Ｖ２２０Ｃ、Ｖ２２０Ｅ、Ｖ２２０Ｍ、Ｖ２２０Ｐ、Ｖ２２０Ｓ、Ｔ２２３Ｈ、Ｔ２２３Ｌ、Ｔ２２３Ｍ、Ｔ２２３Ｎ、Ｔ２４３Ａ、Ｔ２４３Ｓ、Ｓ２５２Ｍ、Ｓ２５２Ｒ、Ｓ２５２Ｔ、Ｓ２５２Ｖ、Ｇ２９４Ｅ、Ｇ２９４Ｑ、Ｇ２９４Ｓ、Ｖ２９５Ｅ、Ｖ２９５Ｇ、Ｖ２９５Ｎ、Ｖ２９５Ｒ、Ｖ２９５Ｓ、Ｆ２９６Ｓ、Ｓ３３２Ｑ、Ｅ４０７Ｆ、Ｅ４０７Ｉ、Ｅ４０７Ｍ、Ａ４６５Ｇ、Ａ４６５Ｍ、Ａ４６５Ｔ、Ｅ４６６Ｇ、Ｅ４６６Ｒ、Ｖ４９３Ｔ、Ｌ５１５Ｖ、Ｇ５１７Ｄ、Ｇ５１７Ｋ、Ｇ５１７Ｓ、Ｔ５２０Ａ、Ｔ５２０Ｓ、Ｔ５２１Ａ、Ｔ５２１Ｇ、Ｔ５２１Ｑ、Ｔ５２１Ｖ、およびＴ５２１Ｙから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号４を基準にして番号が付けられている。
【０００９】
さらに一部のさらなる実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、配列番号１６６に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたガラクトースオキシダーゼは、１７１／２２０／２４３／４０７／４６５、１７１／２２０／２９５／２９６／４０７、１７１／２２０／２９６／４０７／５２０、１７１／２２０／３３２／４０７、１７１／２２０／４０７、１７１／２２０／４６５／５２０、１７１／２４３／２９６／３３２、１７１／２９５／２９６／３３２／４６５、１７１／２９５／３３２、１７１／２９６／４０７、１７１／２９６／４０７／４６５、１７１／３３２、１７１／４０７、１７１／４０７／５２０、１７３、１７３／１９２／２４３／４６５、１７３／４６５、１９２／２２０／２９５／２９６／３３２／５２１、１９２／２２０／２９５／５２０／５２１、１９２／２２０／２９６／３３２／５２０、１９２／２２０／４０７、１９２／２９４／４６５／５１５、１９２／２９５／２９６、１９２／２９５／２９６／３３２、１９２／２９５／２９６／５２０／５２１、１９２／２９６、１９８／２９４／２９６、１９８／２９５、１９８／２９５／２９６、２０４、２０４／２４３／４６５／５１７／５２１、２２０、２２０／２４３、２２０／２４３／２９５／２９６／３３２／４０７／５２１、２２０／２４３／２９５／２９６／４０７、２２０／２４３／４０７、２２０／２４３／４０７／４６５、２２０／２４３／４０７／５２０／５２１、２２０／２５２／３３２／４０７、２２０／２９５／２９６、２２０／２９５／２９６／３３２、２２０／２９５／２９６／３３２／４０７／４６５／５２１、２２０／２９５／２９６／３３２／４０７／５２０、２２０／２９５／２９６／３３２／４０７／５２１、２２０／２９５／２９６／４０７、２２０／２９５／２９６／４６５／５２０、２２０／２９５／３３２、２２０／２９５／３３２／４６５／５２０／５２１、２２０／２９５／４０７／４６５、２２０／２９５／４０７／５２０／５２１、２２０／２９５／４０７／５２１、２２０／２９５／４６５／５２０、２２０／２９５／４６５／５２１、２２０／２９６、２２０／２９６／３３２／４０７、２２０／２９６／３３２／４０７／５２０／５２１、２２０／２９６／４０７、２２０／２９６／４６５、２２０／２９６／４６５／５２１、２２０／３３２／４０７／４６５／５２１、２２０／４０７、２２０／４０７／５２０、２２０／４６５、２２０／４６５／５１７、２２０／４６５／５２０、２２１／２２７／２４３／４６５、２２７、２４３／２９５、２４３／２９５／４０７、２４３／５１５／５１７、２７７／２９６／４０７／５２０／５２１、２８４／２９５／２９６、２９４／２９６／４０７、２９４／４６５、２９４／４６５／５１５、２９４／５２１、２９５／２９６、２９５／２９６／３３２／４０７、２９５／２９６／４０７、２９５／２９６／４０７／５２１、２９５／２９６／５２１、２９５／３３２／４０７／４６５、２９５／３３２／４０７／５２１、２９５／３３２／５２０／５２１、２９５／４０７、２９６、２９６／３３２／４０７／５２０、２９６／３３２／４０７／５２１、２９６／４０７、２９６／５２０／５２１、３３２／４０７、３３２／４０７／５２０／５２１、３３２／４０７／５２１、４０７、４０７／４６５、４０７／５２０、４６５、４６５／５１５、４６５／５１５／５１７／５２１、４６５／５１７／５２１、および５１７から選択されるポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１６６を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、１７１Ｃ／２２０Ｅ／２９５Ｅ／２９６Ｖ／４０７Ｑ、１７１Ｃ／２２０Ｅ／４０７Ｖ、１７１Ｃ／２２０Ｍ／２９６Ｖ／４０７Ｖ／５２０Ａ、１７１Ｃ／２２０Ｓ／２４３Ｖ／４０７Ｑ／４６５Ｔ、１７１Ｃ／２２０Ｓ／３３２Ｑ／４０７Ｖ、１７１Ｃ／２４３Ｖ／２９６Ｖ／３３２Ｑ、１７１Ｃ／２９５Ｅ／３３２Ｑ、１７１Ｃ／２９６Ｖ／４０７Ｖ／４６５Ｔ、１７１Ｃ／３３２Ｑ、１７１Ｃ／４０７Ｖ、１７１Ｃ／４０７Ｖ／５２０Ａ、１７１Ｌ／２２０Ｅ／４６５Ｔ／５２０Ａ、１７１Ｌ／２９５Ｅ／２９６Ｖ／３３２Ｑ／４６５Ｔ、１７１Ｌ／２９６Ｖ／４０７Ｉ、１７３Ｓ、１７３Ｓ／１９２Ｑ／２４３Ａ／４６５Ｇ、１７３Ｓ／４６５Ｇ、１９２Ｑ／２９４Ｓ／４６５Ｇ／５１５Ｖ、１９２Ｔ／２２０Ｅ／２９５Ｅ／２９６Ｖ／３３２Ｑ／５２１Ｇ、１９２Ｔ／２２０Ｅ／２９５Ｅ／５２０Ａ／５２１Ｇ、１９２Ｔ／２２０Ｅ／４０７Ｖ、１９２Ｔ／２２０Ｍ／２９６Ｖ／３３２Ｑ／５２０Ａ、１９２Ｔ／２９５Ｅ／２９６Ｖ、１９２Ｔ／２９５Ｇ／２９６Ｖ／３３２Ｑ、１９２Ｔ／２９５Ｇ／２９６Ｖ／５２０Ａ／５２１Ｇ、１９２Ｔ／２９６Ｖ、１９８Ａ／２９４Ｅ／２９６Ｓ、１９８Ｒ／２９５Ｎ、１９８Ｒ／２９５Ｓ／２９６Ｓ、２０４Ａ／２４３Ａ／４６５Ｇ／５１７Ｒ／５２１Ｑ、２０４Ｓ、２２０Ｃ／４６５Ｇ、２２０Ｃ／４６５Ｇ／５１７Ｒ、２２０Ｅ、２２０Ｅ／２４３Ｖ／２９５Ｅ／２９６Ｖ／３３２Ｑ／４０７Ｖ／５２１Ｇ、２２０Ｅ／２４３Ｖ／２９５Ｇ／２９６Ｖ／４０７Ｖ、２２０Ｅ／２４３Ｖ／４０７Ｉ、２２０Ｅ／２４３Ｖ／４０７Ｖ／４６５Ｔ、２２０Ｅ／２５２Ｖ／３３２Ｑ／４０７Ｉ、２２０Ｅ／２９５Ｅ／２９６Ｖ／３３２Ｑ／４０７Ｖ／５２０Ａ、２２０Ｅ／２９５Ｅ／２９６Ｖ／４６５Ｔ／５２０Ａ、２２０Ｅ／２９５Ｅ／４６５Ｔ／５２１Ｇ、２２０Ｅ／２９５Ｇ／４０７Ｖ／４６５Ｔ、２２０Ｅ／２９６Ｖ／４０７Ｖ、２２０Ｅ／３３２Ｑ／４０７Ｑ／４６５Ｔ／５２１Ｇ、２２０Ｅ／４０７Ｉ、２２０Ｅ／４０７Ｖ、２２０Ｅ／４０７Ｖ／５２０Ａ、２２０Ｅ／４６５Ｔ／５２０Ａ、２２０Ｍ／２４３Ｖ／４０７Ｖ／５２０Ａ／５２１Ｇ、２２０Ｍ／２９５Ｅ／３３２Ｑ、２２０Ｍ／２９５Ｅ／４６５Ｔ／５２０Ａ、２２０Ｓ／２４３Ｖ、２２０Ｓ／２４３Ｖ／４０７Ｑ／５２０Ａ／５２１Ｇ、２２０Ｓ／２９５Ｅ／２９６Ｖ、２２０Ｓ／２９５Ｅ／２９６Ｖ／３３２Ｑ／４０７Ｑ／５２１Ｇ、２２０Ｓ／２９５Ｅ／３３２Ｑ／４６５Ｔ／５２０Ａ／５２１Ｇ、２２０Ｓ／２９５Ｅ／４０７Ｉ／５２１Ｇ、２２０Ｓ／２９５Ｇ／２９６Ｖ／３３２Ｑ、２２０Ｓ／２９５Ｇ／２９６Ｖ／３３２Ｑ／４０７Ｉ／４６５Ｔ／５２１Ｇ、２２０Ｓ／２９５Ｇ／２９６Ｖ／４０７Ｖ、２２０Ｓ／２９５Ｇ／４０７Ｉ／５２０Ａ／５２１Ｇ、２２０Ｓ／２９６Ｖ、２２０Ｓ／２９６Ｖ／３３２Ｑ／４０７Ｖ、２２０Ｓ／２９６Ｖ／３３２Ｑ／４０７Ｖ／５２０Ａ／５２１Ｇ、２２０Ｓ／２９６Ｖ／４６５Ｔ、２２０Ｓ／２９６Ｖ／４６５Ｔ／５２１Ｇ、２２０Ｓ／４０７Ｉ、２２１Ｉ／２２７Ｎ／２４３Ａ／４６５Ｇ、２２７Ｎ、２４３Ａ／５１５Ｖ／５１７Ｒ、２４３Ｖ／２９５Ｅ、２４３Ｖ／２９５Ｅ／４０７Ｉ、２７７Ｔ／２９６Ｖ／４０７Ｉ／５２０Ａ／５２１Ｇ、２８４Ｉ／２９５Ｅ／２９６Ｖ、２９４Ｅ／２９６Ｓ／４０７Ｍ、２９４Ｓ／４６５Ｇ、２９４Ｓ／４６５Ｇ／５１５Ｖ、２９４Ｓ／５２１Ｑ、２９５Ｅ／２９６Ｖ、２９５Ｅ／２９６Ｖ／３３２Ｑ／４０７Ｉ、２９５Ｅ／２９６Ｖ／４０７Ｑ、２９５Ｅ／２９６Ｖ／５２１Ｇ、２９５Ｅ／３３２Ｑ／４０７Ｖ／４６５Ｔ、２９５Ｅ／３３２Ｑ／４０７Ｖ／５２１Ｇ、２９５Ｅ／３３２Ｑ／５２０Ａ／５２１Ｇ、２９５Ｅ／４０７Ｉ、２９５Ｇ／２９６Ｖ／４０７Ｉ／５２１Ｇ、２９６Ｓ／４０７Ｍ、２９６Ｖ、２９６Ｖ／３３２Ｑ／４０７Ｖ／５２０Ａ、２９６Ｖ／３３２Ｑ／４０７Ｖ／５２１Ｇ、２９６Ｖ／５２０Ａ／５２１Ｇ、３３２Ｑ／４０７Ｉ、３３２Ｑ／４０７Ｖ、３３２Ｑ／４０７Ｖ／５２０Ａ／５２１Ｇ、３３２Ｑ／４０７Ｖ／５２１Ｇ、４０７Ｉ、４０７Ｉ／５２０Ａ、４０７Ｑ／４６５Ｔ、４０７Ｖ、４０７Ｖ／５２０Ａ、４６５Ｇ／５１５Ｖ、４６５Ｇ／５１５Ｖ／５１７Ｒ／５２１Ｑ、４６５Ｇ／５１７Ｈ／５２１Ｑ、４６５Ｍ、および５１７Ｎから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１６６を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、Ｖ１７１Ｃ／Ｖ２２０Ｅ／Ｒ２９５Ｅ／Ｆ２９６Ｖ／Ｅ４０７Ｑ、Ｖ１７１Ｃ／Ｖ２２０Ｅ／Ｅ４０７Ｖ、Ｖ１７１Ｃ／Ｖ２２０Ｍ／Ｆ２９６Ｖ／Ｅ４０７Ｖ／Ｔ５２０Ａ、Ｖ１７１Ｃ／Ｖ２２０Ｓ／Ｔ２４３Ｖ／Ｅ４０７Ｑ／Ａ４６５Ｔ、Ｖ１７１Ｃ／Ｖ２２０Ｓ／Ｓ３３２Ｑ／Ｅ４０７Ｖ、Ｖ１７１Ｃ／Ｔ２４３Ｖ／Ｆ２９６Ｖ／Ｓ３３２Ｑ、Ｖ１７１Ｃ／Ｒ２９５Ｅ／Ｓ３３２Ｑ、Ｖ１７１Ｃ／Ｆ２９６Ｖ／Ｅ４０７Ｖ／Ａ４６５Ｔ、Ｖ１７１Ｃ／Ｓ３３２Ｑ、Ｖ１７１Ｃ／Ｅ４０７Ｖ、Ｖ１７１Ｃ／Ｅ４０７Ｖ／Ｔ５２０Ａ、Ｖ１７１Ｌ／Ｖ２２０Ｅ／Ａ４６５Ｔ／Ｔ５２０Ａ、Ｖ１７１Ｌ／Ｒ２９５Ｅ／Ｆ２９６Ｖ／Ｓ３３２Ｑ／Ａ４６５Ｔ、Ｖ１７１Ｌ／Ｆ２９６Ｖ／Ｅ４０７Ｉ、Ａ１７３Ｓ、Ａ１７３Ｓ／Ｎ１９２Ｑ／Ｔ２４３Ａ／Ａ４６５Ｇ、Ａ１７３Ｓ／Ａ４６５Ｇ、Ｎ１９２Ｑ／Ｇ２９４Ｓ／Ａ４６５Ｇ／Ｌ５１５Ｖ、Ｎ１９２Ｔ／Ｖ２２０Ｅ／Ｒ２９５Ｅ／Ｆ２９６Ｖ／Ｓ３３２Ｑ／Ｔ５２１Ｇ、Ｎ１９２Ｔ／Ｖ２２０Ｅ／Ｒ２９５Ｅ／Ｔ５２０Ａ／Ｔ５２１Ｇ、Ｎ１９２Ｔ／Ｖ２２０Ｅ／Ｅ４０７Ｖ、Ｎ１９２Ｔ／Ｖ２２０Ｍ／Ｆ２９６Ｖ／Ｓ３３２Ｑ／Ｔ５２０Ａ、Ｎ１９２Ｔ／Ｒ２９５Ｅ／Ｆ２９６Ｖ、Ｎ１９２Ｔ／Ｒ２９５Ｇ／Ｆ２９６Ｖ／Ｓ３３２Ｑ、Ｎ１９２Ｔ／Ｒ２９５Ｇ／Ｆ２９６Ｖ／Ｔ５２０Ａ／Ｔ５２１Ｇ、Ｎ１９２Ｔ／Ｆ２９６Ｖ、Ｓ１９８Ａ／Ｇ２９４Ｅ／Ｆ２９６Ｓ、Ｓ１９８Ｒ／Ｒ２９５Ｎ、Ｓ１９８Ｒ／Ｒ２９５Ｓ／Ｆ２９６Ｓ、Ｌ２０４Ａ／Ｔ２４３Ａ／Ａ４６５Ｇ／Ｇ５１７Ｒ／Ｔ５２１Ｑ、Ｌ２０４Ｓ、Ｖ２２０Ｃ／Ａ４６５Ｇ、Ｖ２２０Ｃ／Ａ４６５Ｇ／Ｇ５１７Ｒ、Ｖ２２０Ｅ、Ｖ２２０Ｅ／Ｔ２４３Ｖ／Ｒ２９５Ｅ／Ｆ２９６Ｖ／Ｓ３３２Ｑ／Ｅ４０７Ｖ／Ｔ５２１Ｇ、Ｖ２２０Ｅ／Ｔ２４３Ｖ／Ｒ２９５Ｇ／Ｆ２９６Ｖ／Ｅ４０７Ｖ、Ｖ２２０Ｅ／Ｔ２４３Ｖ／Ｅ４０７Ｉ、Ｖ２２０Ｅ／Ｔ２４３Ｖ／Ｅ４０７Ｖ／Ａ４６５Ｔ、Ｖ２２０Ｅ／Ｓ２５２Ｖ／Ｓ３３２Ｑ／Ｅ４０７Ｉ、Ｖ２２０Ｅ／Ｒ２９５Ｅ／Ｆ２９６Ｖ／Ｓ３３２Ｑ／Ｅ４０７Ｖ／Ｔ５２０Ａ、Ｖ２２０Ｅ／Ｒ２９５Ｅ／Ｆ２９６Ｖ／Ａ４６５Ｔ／Ｔ５２０Ａ、Ｖ２２０Ｅ／Ｒ２９５Ｅ／Ａ４６５Ｔ／Ｔ５２１Ｇ、Ｖ２２０Ｅ／Ｒ２９５Ｇ／Ｅ４０７Ｖ／Ａ４６５Ｔ、Ｖ２２０Ｅ／Ｆ２９６Ｖ／Ｅ４０７Ｖ、Ｖ２２０Ｅ／Ｓ３３２Ｑ／Ｅ４０７Ｑ／Ａ４６５Ｔ／Ｔ５２１Ｇ、Ｖ２２０Ｅ／Ｅ４０７Ｉ、Ｖ２２０Ｅ／Ｅ４０７Ｖ、Ｖ２２０Ｅ／Ｅ４０７Ｖ／Ｔ５２０Ａ、Ｖ２２０Ｅ／Ａ４６５Ｔ／Ｔ５２０Ａ、Ｖ２２０Ｍ／Ｔ２４３Ｖ／Ｅ４０７Ｖ／Ｔ５２０Ａ／Ｔ５２１Ｇ、Ｖ２２０Ｍ／Ｒ２９５Ｅ／Ｓ３３２Ｑ、Ｖ２２０Ｍ／Ｒ２９５Ｅ／Ａ４６５Ｔ／Ｔ５２０Ａ、Ｖ２２０Ｓ／Ｔ２４３Ｖ、Ｖ２２０Ｓ／Ｔ２４３Ｖ／Ｅ４０７Ｑ／Ｔ５２０Ａ／Ｔ５２１Ｇ、Ｖ２２０Ｓ／Ｒ２９５Ｅ／Ｆ２９６Ｖ、Ｖ２２０Ｓ／Ｒ２９５Ｅ／Ｆ２９６Ｖ／Ｓ３３２Ｑ／Ｅ４０７Ｑ／Ｔ５２１Ｇ、Ｖ２２０Ｓ／Ｒ２９５Ｅ／Ｓ３３２Ｑ／Ａ４６５Ｔ／Ｔ５２０Ａ／Ｔ５２１Ｇ、Ｖ２２０Ｓ／Ｒ２９５Ｅ／Ｅ４０７Ｉ／Ｔ５２１Ｇ、Ｖ２２０Ｓ／Ｒ２９５Ｇ／Ｆ２９６Ｖ／Ｓ３３２Ｑ、Ｖ２２０Ｓ／Ｒ２９５Ｇ／Ｆ２９６Ｖ／Ｓ３３２Ｑ／Ｅ４０７Ｉ／Ａ４６５Ｔ／Ｔ５２１Ｇ、Ｖ２２０Ｓ／Ｒ２９５Ｇ／Ｆ２９６Ｖ／Ｅ４０７Ｖ、Ｖ２２０Ｓ／Ｒ２９５Ｇ／Ｅ４０７Ｉ／Ｔ５２０Ａ／Ｔ５２１Ｇ、Ｖ２２０Ｓ／Ｆ２９６Ｖ、Ｖ２２０Ｓ／Ｆ２９６Ｖ／Ｓ３３２Ｑ／Ｅ４０７Ｖ、Ｖ２２０Ｓ／Ｆ２９６Ｖ／Ｓ３３２Ｑ／Ｅ４０７Ｖ／Ｔ５２０Ａ／Ｔ５２１Ｇ、Ｖ２２０Ｓ／Ｆ２９６Ｖ／Ａ４６５Ｔ、Ｖ２２０Ｓ／Ｆ２９６Ｖ／Ａ４６５Ｔ／Ｔ５２１Ｇ、Ｖ２２０Ｓ／Ｅ４０７Ｉ、Ｔ２２１Ｉ／Ｍ２２７Ｎ／Ｔ２４３Ａ／Ａ４
６５Ｇ、Ｍ２２７Ｎ、Ｔ２４３Ａ／Ｌ５１５Ｖ／Ｇ５１７Ｒ、Ｔ２４３Ｖ／Ｒ２９５Ｅ、Ｔ２４３Ｖ／Ｒ２９５Ｅ／Ｅ４０７Ｉ、Ａ２７７Ｔ／Ｆ２９６Ｖ／Ｅ４０７Ｉ／Ｔ５２０Ａ／Ｔ５２１Ｇ、Ｖ２８４Ｉ／Ｒ２９５Ｅ／Ｆ２９６Ｖ、Ｇ２９４Ｅ／Ｆ２９６Ｓ／Ｅ４０７Ｍ、Ｇ２９４Ｓ／Ａ４６５Ｇ、Ｇ２９４Ｓ／Ａ４６５Ｇ／Ｌ５１５Ｖ、Ｇ２９４Ｓ／Ｔ５２１Ｑ、Ｒ２９５Ｅ／Ｆ２９６Ｖ、Ｒ２９５Ｅ／Ｆ２９６Ｖ／Ｓ３３２Ｑ／Ｅ４０７Ｉ、Ｒ２９５Ｅ／Ｆ２９６Ｖ／Ｅ４０７Ｑ、Ｒ２９５Ｅ／Ｆ２９６Ｖ／Ｔ５２１Ｇ、Ｒ２９５Ｅ／Ｓ３３２Ｑ／Ｅ４０７Ｖ／Ａ４６５Ｔ、Ｒ２９５Ｅ／Ｓ３３２Ｑ／Ｅ４０７Ｖ／Ｔ５２１Ｇ、Ｒ２９５Ｅ／Ｓ３３２Ｑ／Ｔ５２０Ａ／Ｔ５２１Ｇ、Ｒ２９５Ｅ／Ｅ４０７Ｉ、Ｒ２９５Ｇ／Ｆ２９６Ｖ／Ｅ４０７Ｉ／Ｔ５２１Ｇ、Ｆ２９６Ｓ／Ｅ４０７Ｍ、Ｆ２９６Ｖ、Ｆ２９６Ｖ／Ｓ３３２Ｑ／Ｅ４０７Ｖ／Ｔ５２０Ａ、Ｆ２９６Ｖ／Ｓ３３２Ｑ／Ｅ４０７Ｖ／Ｔ５２１Ｇ、Ｆ２９６Ｖ／Ｔ５２０Ａ／Ｔ５２１Ｇ、Ｓ３３２Ｑ／Ｅ４０７Ｉ、Ｓ３３２Ｑ／Ｅ４０７Ｖ、Ｓ３３２Ｑ／Ｅ４０７Ｖ／Ｔ５２０Ａ／Ｔ５２１Ｇ、Ｓ３３２Ｑ／Ｅ４０７Ｖ／Ｔ５２１Ｇ、Ｅ４０７Ｉ、Ｅ４０７Ｉ／Ｔ５２０Ａ、Ｅ４０７Ｑ／Ａ４６５Ｔ、Ｅ４０７Ｖ、Ｅ４０７Ｖ／Ｔ５２０Ａ、Ａ４６５Ｇ／Ｌ５１５Ｖ、Ａ４６５Ｇ／Ｌ５１５Ｖ／Ｇ５１７Ｒ／Ｔ５２１Ｑ、Ａ４６５Ｇ／Ｇ５１７Ｈ／Ｔ５２１Ｑ、Ａ４６５Ｍ、およびＧ５１７Ｎから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１６６を基準にして番号が付けられている。
【００１０】
一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、配列番号２７２に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたガラクトースオキシダーゼは、４、８、８／２９／９２／１９６／２５８／４２６、８／４６／９２／２７９／２９６／４２６／５４９／５５３／５９７、８／５６／１９２／１９４／４６０／５７１／５９８、８／５６／２４３／５６０／５９８、８／９２／２５８／３６３／５４９／５５３／５６７、８／１９２／１９４／２４３／４６０／５５３／５６０、８／１９２／４６０／５６０／５９８、８／２５８／３６３／４２６／５５３／５９７、１６、１６／２４／４３／５６／１０３／２２０／２９５／２９６／４９９／５４９、１６／４３／５６／１０３／１４８／２２０／２９５／２９６／４９９／５４９、１６／４３／６３／１０３／２９５／３０４／４９９／５４９、１６／４３／６３／１４８／２９５／４９９、１６／４３／１０３／１４８／２２０／２９５／４２６／５４９、１６／４３／１４８／２２０／２９５／４９９、１６／４３／２９５／２９６／５４９、１６／４３／４２６／５４９、１６／５６／６３／１４８／２９５／２９６／３０４／４２６、１６／５６／２９６、１６／５６／４２６／４９９、１６／６３／１０３／２２０／２９５／４２６／５４９、１６／１０３／２２０／２９６／４６５／５４９、１６／１０３／２２０／４６５、１６／１４８／２２０／２９５／２９６／３０４／４９９、１６／１４８／２２０／２９５／４２６／４９９／５４９、１６／１４８／２２０／２９６／５４９、１６／１４８／２９５／４２６／５４９、１６／２２０／４９９、１６／２９５／２９６／４２６／４９９／５４９、１６／２９５／４２６／４６５／４９９／５４９、２４、２４／３６、２４／３６／４３／１４８／３１９／５６０／６３７、２４／３６／９２／１４８、２４／３６／９２／２２２／５６０／６３７、２４／３６／９２／２７９／３１９／３６３／６３７、２４／３６／１４８／２２２／２７９／５６０／６３７、２４／３６／３６３／４６５／６３７、２４／４３／９２／２７９／３６３／５６０／６３７、２４／４３／９２／２７９／４９９、２４／４３／１４８／２９５／５６０、２４／４３／１４８／３６３、２４／４３／１４８／５６０、２４／４３／２２２、２４／９２／１４８／２７９／３６３、２４／９２／２７９／３６３／４６５／４９９／５６０／６３７、２４／１４８／３１９／４６５／６３７、２４／１４８／６３７、２４／６３７、２９、２９／４６／９２／１９６／２５８／２７９／３６３／４２６／４８１／５６７／５９７、３６、３６／４３／９２／１４８／２２２／２７９／２９５／４９９／５６０／６３７、３６／９２／１４８／２７９／３１９／３６３／５６０／６３７、３６／９２／１４８／４９９／６３７、３６／９２／３１９／３６３／６３７、３６／９２／５６０、３６／１４８／２２２／３１９／４６５／４９９、３６／２２２／２７９／３１９／３６３／５６０、４３、４３／５６／２２０／２９６／４２６／４９９／５４９、４３／５６／２２０／４２６／５４９、４３／９２／１４８／２２２／２７９／４９９／５６０、４３／９２／２２２／４６５／４９９／６３７、４３／１４８／２７９／２９５／５６０、４３／１４８／５４９、４３／２２２／２７９、４３／２９５／４９９、４６、４６／１９６／２２８／２７９／２９６／４６５／５５３、５６、６３、９２、９２／１４８／２９５／３１９／４６５／６３７、９２／２７９／４６５／６３７、１０３、１３４、１４８、１４８／２９５／４６５、１９２／２４３、１９４、１９６、１９６／２５８／３６３／４２６／４６５／５４９／５９７、２２０、２２０／２９５／５２０、２２０／２９５／５２１、２２０／２９６／３０４／４２６／５４９、２２２、２５７、２５８、２７９、２７９／５６０／６３７、２９５、２９６、３０４、３１９、３６３、３６３／４２６／４８１／５５３、４２６、４６５、４９９、５４９、５５３、５６０、５６７、５９７、および６３７から選択されるポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２７２を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、４Ｑ、８Ｉ／２９Ｔ／９２Ｖ／１９６Ｄ／２５８Ｌ／４２６Ｐ、８Ｉ／４６Ｖ／９２Ｖ／２７９Ｔ／２９６Ｔ／４２６Ｐ／５４９Ｇ／５５３Ｓ／５９７Ｄ、８Ｉ／９２Ｖ／２５８Ｌ／３６３Ｅ／５４９Ｇ／５５３Ｓ／５６７Ｍ、８Ｉ／２５８Ｌ／３６３Ｅ／４２６Ｐ／５５３Ｓ／５９７Ｄ、８Ｖ、８Ｖ／５６Ｉ／１９２Ｑ／１９４Ｇ／４６０Ｑ／５７１Ａ／５９８Ｅ、８Ｖ／５６Ｉ／２４３Ｓ／５６０Ｔ／５９８Ｅ、８Ｖ／１９２Ｑ／１９４Ｅ／２４３Ｓ／４６０Ｑ／５５３Ｓ／５６０Ｔ、８Ｖ／１９２Ｑ／４６０Ａ／５６０Ｔ／５９８Ｅ、１６Ｅ、１６Ｅ／４３Ｅ／４２６Ｌ／５４９Ｗ、１６Ｅ／５６Ｆ／４２６Ｌ／４９９Ｖ、１６Ｅ／１０３Ｉ／２２０Ｅ／２９６Ｅ／４６５Ｆ／５４９Ｗ、１６Ｅ／１０３Ｉ／２２０Ｅ／４６５Ｆ、１６Ｅ／１４８Ｒ／２２０Ｅ／２９５Ｔ／４２６Ｌ／４９９Ｖ／５４９Ｗ、１６Ｅ／２２０Ｅ／４９９Ｖ、１６Ｅ／２９５Ｑ／４２６Ｌ／４６５Ｆ／４９９Ｖ／５４９Ｗ、１６Ｓ、１６Ｓ／２４Ａ／４３Ｅ／５６Ｆ／１０３Ｉ／２２０Ｅ／２９５Ｔ／２９６Ｌ／４９９Ｖ／５４９Ｗ、１６Ｓ／４３Ｅ／５６Ｆ／１０３Ｉ／１４８Ｒ／２２０Ｅ／２９５Ｓ／２９６Ｅ／４９９Ｖ／５４９Ｗ、１６Ｓ／４３Ｅ／６３Ｖ／１０３Ｉ／２９５Ｑ／３０４Ｃ／４９９Ｖ／５４９Ｗ、１６Ｓ／４３Ｅ／６３Ｖ／１４８Ｒ／２９５Ｑ／４９９Ｖ、１６Ｓ／４３Ｅ／１０３Ｉ／１４８Ｒ／２２０Ｅ／２９５Ｑ／４２６Ｌ／５４９Ｗ、１６Ｓ／４３Ｅ／１４８Ｒ／２２０Ｅ／２９５Ｓ／４９９Ｖ、１６Ｓ／４３Ｅ／２９５Ｔ／２９６Ｅ／５４９Ｗ、１６Ｓ／５６Ｆ／６３Ｖ／１４８Ｒ／２９５Ｔ／２９６Ｅ／３０４Ｃ／４２６Ｌ、１６Ｓ／５６Ｆ／２９６Ｅ、１６Ｓ／６３Ｖ／１０３Ｉ／２２０Ｅ／２９５Ｑ／４２６Ｌ／５４９Ｗ、１６Ｓ／１４８Ｒ／２２０Ｅ／２９５Ｑ／２９６Ｅ／３０４Ｃ／４９９Ｖ、１６Ｓ／１４８Ｒ／２２０Ｅ／２９６Ｅ／５４９Ｗ、１６Ｓ／１４８Ｒ／２９５Ｑ／４２６Ｌ／５４９Ｗ、１６Ｓ／２９５Ｑ／２９６Ｅ／４２６Ｌ／４９９Ｖ／５４９Ｗ、２４Ａ、２４Ｅ、２４Ｐ、２４Ｐ／３６Ｐ、２４Ｐ／３６Ｐ／４３Ａ／１４８Ａ／３１９Ｒ／５６０Ｗ／６３７Ｌ、２４Ｐ／３６Ｐ／９２Ｄ／１４８Ａ、２４Ｐ／３６Ｐ／９２Ｄ／２２２Ｄ／５６０Ｗ／６３７Ｌ、２４Ｐ／３６Ｐ／９２Ｄ／２７９Ｌ／３１９Ｒ／３６３Ｌ／６３７Ｌ、２４Ｐ／３６Ｐ／１４８Ａ／２２２Ｄ／２７９Ｌ／５６０Ｗ／６３７Ｌ、２４Ｐ／３６Ｐ／３６３Ｌ／４６５Ｆ／６３７Ｌ、２４Ｐ／４３Ａ／９２Ｄ／２７９Ｌ／４９９Ｆ、２４Ｐ／４３Ａ／１４８Ａ／２９５Ｅ／５６０Ｗ、２４Ｐ／４３Ａ／１４８Ａ／３６３Ｌ、２４Ｐ／４３Ａ／１４８Ａ／５６０Ｗ、２４Ｐ／４３Ａ／２２２Ｄ、２４Ｐ／４３Ｑ／９２Ｄ／２７９Ｌ／３６３Ｌ／５６０Ｗ／６３７Ｌ、２４Ｐ／９２Ｄ／１４８Ａ／２７９Ｌ／３６３Ｌ、２４Ｐ／９２Ｄ／２７９Ｌ／３６３Ｌ／４６５Ｆ／４９９Ｆ／５６０Ｗ／６３７Ｌ、２４Ｐ／１４８Ａ／３１９Ｓ／４６５Ｆ／６３７Ｌ、２４Ｐ／１４８Ａ／６３７Ｌ、２４Ｐ／６３７Ｌ、２４Ｑ、２９Ｔ／４６Ｖ／９２Ｖ／１９６Ｄ／２５８Ｌ／２７９Ｔ／３６３Ｅ／４２６Ｐ／４８１Ｄ／５６７Ｍ／５９７Ｄ、２９Ｙ、３６Ｐ、３６Ｐ／４３Ｑ／９２Ｄ／１４８Ａ／２２２Ｄ／２７９Ｌ／２９５Ｄ／４９９Ｆ／５６０Ｗ／６３７Ｌ、３６Ｐ／９２Ｄ／１４８Ａ／２７９Ｌ／３１９Ｓ／３６３Ｌ／５６０Ｗ／６３７Ｌ、３６Ｐ／９２Ｄ／１４８Ａ／４９９Ｆ／６３７Ｌ、３６Ｐ／９２Ｄ／３１９Ｒ／３６３Ｌ／６３７Ｌ、３６Ｐ／９２Ｄ／５６０Ｗ、３６Ｐ／１４８Ａ／２２２Ｄ／３１９Ｓ／４６５Ｆ／４９９Ｆ、３６Ｐ／２２２Ｄ／２７９Ｌ／３１９Ｓ／３６３Ｌ／５６０Ｗ、４３Ａ、４３Ａ／９２Ｄ／１４８Ａ／２２２Ｄ／２７９Ｌ／４９９Ｆ／５６０Ｗ、４３Ａ／１４８Ａ／２７９Ｌ／２９５Ｄ／５６０Ｗ、４３Ａ／２２２Ｄ／２７９Ｌ、４３Ｅ／５６Ｆ／２２０Ｅ／２９６Ｅ／４２６Ｌ／４９９Ｖ／５４９Ｗ、４３Ｅ／５６Ｆ／２２０Ｅ／４２６Ｌ／５４９Ｗ、４３Ｅ／１４８Ｒ／５４９Ｗ、４３Ｅ／２９５Ｑ／４９９Ｖ、４３Ｑ、４３Ｑ／９２Ｄ／２２２Ｙ／４６５Ｆ／４９９Ｆ／６３７Ｌ、４６Ｖ、４６Ｖ／１９６Ｄ／２２８Ｗ／２７９Ｔ／２９６Ｔ／４６５Ｆ／５５３Ｓ、５６Ｉ、６３Ｖ、９２Ｄ／１４８Ａ／２９５Ｅ／３１９Ｓ／４６５Ｆ／６３７Ｌ、９２Ｄ／２７９Ｌ／４６５Ｆ／６３７Ｌ、９２Ｖ、１０３Ｉ、１３４Ｈ、１４８Ａ、１４８Ｒ、１４８Ｒ／２９５Ｑ／４６５Ｆ、１９２Ｑ／２４３Ｓ、１９４Ｅ、１９６Ｄ、１９６Ｄ／２５８Ｌ／３６３Ｅ／４２６Ｐ／４６５Ｆ／５４９Ｇ／５９７Ｄ、２２０Ｅ、２２０Ｅ／２９５Ｅ／５２０Ａ、２２０Ｅ／２９５Ｅ／５２１Ｇ、２２０Ｅ／２９６Ｅ／３０４Ｃ／４２６Ｌ／５４９Ｗ、２２２Ｄ、２２２Ｔ、２２２Ｙ、２５７Ｄ、２５８Ｌ、２７９Ｌ／５６０Ｗ／６３７Ｌ、２７９Ｔ、２９５Ｅ、２９５Ｑ、２９５Ｓ、２９５Ｔ、２９６Ｅ、２９６Ｔ、３０４Ｃ、３１９Ｓ、３６３Ｅ、３６３Ｅ／４２６Ｐ／４８１Ｄ／５５３Ｓ、４２６Ａ、４２６Ｌ、４６５Ｇ、４９９Ｆ、４９９Ｖ、５４９Ｇ、５４９Ｑ、５５３Ｓ、５６０Ｗ、５６７Ｍ、５９７Ｄ、および６３７Ｌから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２７２を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、Ａ４Ｑ、Ｓ８Ｉ／Ｎ２９Ｔ／Ｓ９２Ｖ／Ｅ１９６Ｄ／Ｓ２５８Ｌ／Ｓ４２６Ｐ、Ｓ８Ｉ／Ａ４６Ｖ／Ｓ９２Ｖ／Ｍ２７９Ｔ／Ｖ２９６Ｔ／Ｓ４２６Ｐ／Ｒ５４９Ｇ／Ｑ５５３Ｓ／Ｎ５９７Ｄ、Ｓ８Ｉ／Ｓ９２Ｖ／Ｓ２５８Ｌ／Ｓ３６３Ｅ／Ｒ５４９Ｇ／Ｑ５５３Ｓ／Ｓ５６７Ｍ、Ｓ８Ｉ／Ｓ２５８Ｌ／Ｓ３６３Ｅ／Ｓ４２６Ｐ／Ｑ５５３Ｓ／Ｎ５９７Ｄ、Ｓ８Ｖ、Ｓ８Ｖ／Ｙ５６Ｉ／Ｎ１９２Ｑ／Ａ１９４Ｇ／Ｒ４６０Ｑ／Ｋ５７１Ａ／Ｎ５９８Ｅ、Ｓ８Ｖ／Ｙ５６Ｉ／Ｔ２４３Ｓ／Ｒ５６０Ｔ／Ｎ５９８Ｅ、Ｓ８Ｖ／Ｎ１９２Ｑ／Ａ１９４Ｅ／Ｔ２４３Ｓ／Ｒ４６０Ｑ／Ｑ５５３Ｓ／Ｒ５６０Ｔ、Ｓ８Ｖ／Ｎ１９２Ｑ／Ｒ４６０Ａ／Ｒ５６０Ｔ／Ｎ５９８Ｅ、Ａ１６Ｅ、Ａ１６Ｅ／Ｆ４３Ｅ／Ｓ４２６Ｌ／Ｒ５４９Ｗ、Ａ１６Ｅ／Ｙ５６Ｆ／Ｓ４２６Ｌ／Ｉ４９９Ｖ、Ａ１６Ｅ／Ｓ１０３Ｉ／Ｓ２２０Ｅ／Ｖ２９６Ｅ／Ｔ４６５Ｆ／Ｒ５４９Ｗ、Ａ１６Ｅ／Ｓ１０３Ｉ／Ｓ２２０Ｅ／Ｔ４６５Ｆ、Ａ１６Ｅ／Ｑ１４８Ｒ／Ｓ２２０Ｅ／Ｒ２９５Ｔ／Ｓ４２６Ｌ／Ｉ４９９Ｖ／Ｒ５４９Ｗ、Ａ１６Ｅ／Ｓ２２０Ｅ／Ｉ４９９Ｖ、Ａ１６Ｅ／Ｒ２９５Ｑ／Ｓ４２６Ｌ／Ｔ４６５Ｆ／Ｉ４９９Ｖ／Ｒ５４９Ｗ、Ａ１６Ｓ、Ａ１６Ｓ／Ｓ２４Ａ／Ｆ４３Ｅ／Ｙ５６Ｆ／Ｓ１０３Ｉ／Ｓ２２０Ｅ／Ｒ２９５Ｔ／Ｖ２９６Ｌ／Ｉ４９９Ｖ／Ｒ５４９Ｗ、Ａ１６Ｓ／Ｆ４３Ｅ／Ｙ５６Ｆ／Ｓ１０３Ｉ／Ｑ１４８Ｒ／Ｓ２２０Ｅ／Ｒ２９５Ｓ／Ｖ２９６Ｅ／Ｉ４９９Ｖ／Ｒ５４９Ｗ、Ａ１６Ｓ／Ｆ４３Ｅ／Ｔ６３Ｖ／Ｓ１０３Ｉ／Ｒ２９５Ｑ／Ｓ３０４Ｃ／Ｉ４９９Ｖ／Ｒ５４９Ｗ、Ａ１６Ｓ／Ｆ４３Ｅ／Ｔ６３Ｖ／Ｑ１４８Ｒ／Ｒ２９５Ｑ／Ｉ４９９Ｖ、Ａ１６Ｓ／Ｆ４３Ｅ／Ｓ１０３Ｉ／Ｑ１４８Ｒ／Ｓ２２０Ｅ／Ｒ２９５Ｑ／Ｓ４２６Ｌ／Ｒ５４９Ｗ、Ａ１６Ｓ／Ｆ４３Ｅ／Ｑ１４８Ｒ／Ｓ２２０Ｅ／Ｒ２９５Ｓ／Ｉ４９９Ｖ、Ａ１６Ｓ／Ｆ４３Ｅ／Ｒ２９５Ｔ／Ｖ２９６Ｅ／Ｒ５４９Ｗ、Ａ１６Ｓ／Ｙ５６Ｆ／Ｔ６３Ｖ／Ｑ１４８Ｒ／Ｒ２９５Ｔ／Ｖ２９６Ｅ／Ｓ３０４Ｃ／Ｓ４２６Ｌ、Ａ１６Ｓ／Ｙ５６Ｆ／Ｖ２９６Ｅ、Ａ１６Ｓ／Ｔ６３Ｖ／Ｓ１０３Ｉ／Ｓ２２０Ｅ／Ｒ２９５Ｑ／Ｓ４２６Ｌ／Ｒ５４９Ｗ、Ａ１６Ｓ／Ｑ１４８Ｒ／Ｓ２２０Ｅ／Ｒ２９５Ｑ／Ｖ２９６Ｅ／Ｓ３０４Ｃ／Ｉ４９９Ｖ、Ａ１６Ｓ／Ｑ１４８Ｒ／Ｓ２２０Ｅ／Ｖ２９６Ｅ
／Ｒ５４９Ｗ、Ａ１６Ｓ／Ｑ１４８Ｒ／Ｒ２９５Ｑ／Ｓ４２６Ｌ／Ｒ５４９Ｗ、Ａ１６Ｓ／Ｒ２９５Ｑ／Ｖ２９６Ｅ／Ｓ４２６Ｌ／Ｉ４９９Ｖ／Ｒ５４９Ｗ、Ｓ２４Ａ、Ｓ２４Ｅ、Ｓ２４Ｐ、Ｓ２４Ｐ／Ｋ３６Ｐ、Ｓ２４Ｐ／Ｋ３６Ｐ／Ｆ４３Ａ／Ｑ１４８Ａ／Ｎ３１９Ｒ／Ｒ５６０Ｗ／Ｒ６３７Ｌ、Ｓ２４Ｐ／Ｋ３６Ｐ／Ｓ９２Ｄ／Ｑ１４８Ａ、Ｓ２４Ｐ／Ｋ３６Ｐ／Ｓ９２Ｄ／Ｖ２２２Ｄ／Ｒ５６０Ｗ／Ｒ６３７Ｌ、Ｓ２４Ｐ／Ｋ３６Ｐ／Ｓ９２Ｄ／Ｍ２７９Ｌ／Ｎ３１９Ｒ／Ｓ３６３Ｌ／Ｒ６３７Ｌ、Ｓ２４Ｐ／Ｋ３６Ｐ／Ｑ１４８Ａ／Ｖ２２２Ｄ／Ｍ２７９Ｌ／Ｒ５６０Ｗ／Ｒ６３７Ｌ、Ｓ２４Ｐ／Ｋ３６Ｐ／Ｓ３６３Ｌ／Ｔ４６５Ｆ／Ｒ６３７Ｌ、Ｓ２４Ｐ／Ｆ４３Ａ／Ｓ９２Ｄ／Ｍ２７９Ｌ／Ｉ４９９Ｆ、Ｓ２４Ｐ／Ｆ４３Ａ／Ｑ１４８Ａ／Ｒ２９５Ｅ／Ｒ５６０Ｗ、Ｓ２４Ｐ／Ｆ４３Ａ／Ｑ１４８Ａ／Ｓ３６３Ｌ、Ｓ２４Ｐ／Ｆ４３Ａ／Ｑ１４８Ａ／Ｒ５６０Ｗ、Ｓ２４Ｐ／Ｆ４３Ａ／Ｖ２２２Ｄ、Ｓ２４Ｐ／Ｆ４３Ｑ／Ｓ９２Ｄ／Ｍ２７９Ｌ／Ｓ３６３Ｌ／Ｒ５６０Ｗ／Ｒ６３７Ｌ、Ｓ２４Ｐ／Ｓ９２Ｄ／Ｑ１４８Ａ／Ｍ２７９Ｌ／Ｓ３６３Ｌ、Ｓ２４Ｐ／Ｓ９２Ｄ／Ｍ２７９Ｌ／Ｓ３６３Ｌ／Ｔ４６５Ｆ／Ｉ４９９Ｆ／Ｒ５６０Ｗ／Ｒ６３７Ｌ、Ｓ２４Ｐ／Ｑ１４８Ａ／Ｎ３１９Ｓ／Ｔ４６５Ｆ／Ｒ６３７Ｌ、Ｓ２４Ｐ／Ｑ１４８Ａ／Ｒ６３７Ｌ、Ｓ２４Ｐ／Ｒ６３７Ｌ、Ｓ２４Ｑ、Ｎ２９Ｔ／Ａ４６Ｖ／Ｓ９２Ｖ／Ｅ１９６Ｄ／Ｓ２５８Ｌ／Ｍ２７９Ｔ／Ｓ３６３Ｅ／Ｓ４２６Ｐ／Ｑ４８１Ｄ／Ｓ５６７Ｍ／Ｎ５９７Ｄ、Ｎ２９Ｙ、Ｋ３６Ｐ、Ｋ３６Ｐ／Ｆ４３Ｑ／Ｓ９２Ｄ／Ｑ１４８Ａ／Ｖ２２２Ｄ／Ｍ２７９Ｌ／Ｒ２９５Ｄ／Ｉ４９９Ｆ／Ｒ５６０Ｗ／Ｒ６３７Ｌ、Ｋ３６Ｐ／Ｓ９２Ｄ／Ｑ１４８Ａ／Ｍ２７９Ｌ／Ｎ３１９Ｓ／Ｓ３６３Ｌ／Ｒ５６０Ｗ／Ｒ６３７Ｌ、Ｋ３６Ｐ／Ｓ９２Ｄ／Ｑ１４８Ａ／Ｉ４９９Ｆ／Ｒ６３７Ｌ、Ｋ３６Ｐ／Ｓ９２Ｄ／Ｎ３１９Ｒ／Ｓ３６３Ｌ／Ｒ６３７Ｌ、Ｋ３６Ｐ／Ｓ９２Ｄ／Ｒ５６０Ｗ、Ｋ３６Ｐ／Ｑ１４８Ａ／Ｖ２２２Ｄ／Ｎ３１９Ｓ／Ｔ４６５Ｆ／Ｉ４９９Ｆ、Ｋ３６Ｐ／Ｖ２２２Ｄ／Ｍ２７９Ｌ／Ｎ３１９Ｓ／Ｓ３６３Ｌ／Ｒ５６０Ｗ、Ｆ４３Ａ、Ｆ４３Ａ／Ｓ９２Ｄ／Ｑ１４８Ａ／Ｖ２２２Ｄ／Ｍ２７９Ｌ／Ｉ４９９Ｆ／Ｒ５６０Ｗ、Ｆ４３Ａ／Ｑ１４８Ａ／Ｍ２７９Ｌ／Ｒ２９５Ｄ／Ｒ５６０Ｗ、Ｆ４３Ａ／Ｖ２２２Ｄ／Ｍ２７９Ｌ、Ｆ４３Ｅ／Ｙ５６Ｆ／Ｓ２２０Ｅ／Ｖ２９６Ｅ／Ｓ４２６Ｌ／Ｉ４９９Ｖ／Ｒ５４９Ｗ、Ｆ４３Ｅ／Ｙ５６Ｆ／Ｓ２２０Ｅ／Ｓ４２６Ｌ／Ｒ５４９Ｗ、Ｆ４３Ｅ／Ｑ１４８Ｒ／Ｒ５４９Ｗ、Ｆ４３Ｅ／Ｒ２９５Ｑ／Ｉ４９９Ｖ、Ｆ４３Ｑ、Ｆ４３Ｑ／Ｓ９２Ｄ／Ｖ２２２Ｙ／Ｔ４６５Ｆ／Ｉ４９９Ｆ／Ｒ６３７Ｌ、Ａ４６Ｖ、Ａ４６Ｖ／Ｅ１９６Ｄ／Ｆ２２８Ｗ／Ｍ２７９Ｔ／Ｖ２９６Ｔ／Ｔ４６５Ｆ／Ｑ５５３Ｓ、Ｙ５６Ｉ、Ｔ６３Ｖ、Ｓ９２Ｄ／Ｑ１４８Ａ／Ｒ２９５Ｅ／Ｎ３１９Ｓ／Ｔ４６５Ｆ／Ｒ６３７Ｌ、Ｓ９２Ｄ／Ｍ２７９Ｌ／Ｔ４６５Ｆ／Ｒ６３７Ｌ、Ｓ９２Ｖ、Ｓ１０３Ｉ、Ｎ１３４Ｈ、Ｑ１４８Ａ、Ｑ１４８Ｒ、Ｑ１４８Ｒ／Ｒ２９５Ｑ／Ｔ４６５Ｆ、Ｎ１９２Ｑ／Ｔ２４３Ｓ、Ａ１９４Ｅ、Ｅ１９６Ｄ、Ｅ１９６Ｄ／Ｓ２５８Ｌ／Ｓ３６３Ｅ／Ｓ４２６Ｐ／Ｔ４６５Ｆ／Ｒ５４９Ｇ／Ｎ５９７Ｄ、Ｓ２２０Ｅ、Ｓ２２０Ｅ／Ｒ２９５Ｅ／Ｔ５２０Ａ、Ｓ２２０Ｅ／Ｒ２９５Ｅ／Ｔ５２１Ｇ、Ｓ２２０Ｅ／Ｖ２９６Ｅ／Ｓ３０４Ｃ／Ｓ４２６Ｌ／Ｒ５４９Ｗ、Ｖ２２２Ｄ、Ｖ２２２Ｔ、Ｖ２２２Ｙ、Ｓ２５７Ｄ、Ｓ２５８Ｌ、Ｍ２７９Ｌ／Ｒ５６０Ｗ／Ｒ６３７Ｌ、Ｍ２７９Ｔ、Ｒ２９５Ｅ、Ｒ２９５Ｑ、Ｒ２９５Ｓ、Ｒ２９５Ｔ、Ｖ２９６Ｅ、Ｖ２９６Ｔ、Ｓ３０４Ｃ、Ｎ３１９Ｓ、Ｓ３６３Ｅ、Ｓ３６３Ｅ／Ｓ４２６Ｐ／Ｑ４８１Ｄ／Ｑ５５３Ｓ、Ｓ４２６Ａ、Ｓ４２６Ｌ、Ｔ４６５Ｇ、Ｉ４９９Ｆ、Ｉ４９９Ｖ、Ｒ５４９Ｇ、Ｒ５４９Ｑ、Ｑ５５３Ｓ、Ｒ５６０Ｗ、Ｓ５６７Ｍ、Ｎ５９７Ｄ、およびＲ６３７Ｌから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２７２を基準にして番号が付けられている。
【００１１】
一部の追加の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、配列番号２７２に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたガラクトースオキシダーゼは、４／８／５６／５９８、４／５６／１９２／１９４／２５７／５７１／５９８、４／５６／１９４／３２９／５９８、４／１９４／２４３／５４９／５９８、８／２９／４６／１９６／３６３／４８１／５４９／５５３、８／５６、８／５６／１９２／１９４／２４３／３２９、８／５６／１９２／１９４／２４３／３２９／４６０／５６０、８／５６／１９２／１９４／２４３／４６０／５６０／５９８、８／５６／１９２／２４３／４６０、８／５６／１９２／２４３／５９８、８／５６／１９４／２５７／４６０／５４９／５６０／５９８、８／９２／１９６／２５８／４２６／５９７、８／９２／１９６／４８１／５９７、８／１９２／１９４／２４３／３２９／４６０／５６０、８／１９６／２５８／２７９／４８１／５４９／５５３、８／２４３／４６０／５６０／５７１／５９８、８／２５７／４６０／５６０／５９８、８／２５８／３６３／４２６／５４９、８／２７９／３６３／４２６／４８１／５４９／５５３、１６／４３／６３／１０３／２９５／２９６／４９９、１６／４３／１０３／１４８／２９５／４２６／４９９／５４９、１６／４３／１０３／３０４／４９９／５４９、１６／４３／１４８／２９５／２９６／３０４／４９９／５４９、１６／４３／１４８／２９６／４２６／４９９、１６／４３／２９５／２９６／４９９、１６／５６／１０３／２２０／２９５、１６／５６／１０３／２２０／２９５／２９６、１６／５６／１０３／２９５／５４９、１６／５６／１４８／２９５／２９６／３０４／４２６／５４９、１６／５６／２２０／２９５、１６／５６／２２０／４９９／５４９、１６／５６／２９５、１６／５６／２９５／２９６／５４９、１６／５６／２９５／４９９、１６／５６／４９９／５４９、１６／６３／１０３／１４８／４２６／４９９／５４９、１６／６３／１０３／４２６／４９９／５４９、１６／６３／１４８／２２０／２９５／２９６／４２６／４９９、１６／６３／１４８／４９９／５４９、１６／１０３、１６／１０３／１４８、１６／１０３／１４８／２２０／４９９、１６／１０３／１４８／２９５／４２６／４９９／５４９、１６／１０３／２２０／２９５、１６／１４８／２２０／２９５／４２６／４９９、１６／１４８／２９５／４２６、１６／１４８／２９５／５４９、１６／１４８／４２６／５４９、１６／２２０／２９５／２９６、１６／３０４／４２６／４９９、１６／３０４／４９９／５４９、２４／３６／９２／２７９／２９５／３６３／４９９、２４／４３／９２／１４８／２７９／２９５／３１９／６３７、２４／４３／９２／２２２／２７９、２４／４３／２２２／３１９、２４／４３／３６３／６３７、２４／９２、２４／９２／１４８／２７９、２４／９２／２２２／２７９／３１９／６３７、２４／２２２／６３７、２４／２７９／３１９、２９／４６／９２／１９６／４２６／４８１／５４９／５９７、２９／４６／４８１／５４９／５５３／５９７、２９／４２６／５４９、２９／５４９／５５３、３６／４３／２２２／２７９／３６３／５６０、３６／９２／１４８／２２２／２７９／３１９／３６３／４９９／５６０／６３７、３６／９２／２２２／６３７、３６／１４８／２７９／３１９／４９９、４３／１４８／２２２／２７９／５６０／６３７、４３／２２０／２９５／５４９、５６／１４８／２２０／２９５／４９９、５６／１９４／２４３／２５７／３２９／４６０、５６／２４３、６３／１０３／１４８／２２０／２９５／５４９、６３／２２０／２９５／３０４／４２６／４９９／５４９、６３／２２０／２９５／３０４／５４９、９２、９２／２２２／２７９／４９９／５６０／６３７、９２／２５８／３６３／４２６／４８１／５４９／５９７、１０３／２９５／４９９／５４９、１４８／２２０／３０４、１４８／２２２、１４８／２２２／５６０／６３７、１４８／２７９／３１９／４９９、１９４／２４３／３２９／４６０、１９４／２４３／３２９／５６０／５７１／５９８、２２０／２９５／５４９、２７９／２９６／４８１／５４９／５５３／５６７／５９７、２７９／５６０／６３７、２９５／２９６／４２６／５４９、２９５／２９６／５４９、２９５／４９９／５６０／６３７、２９６／３６３／４２６／４８１／５４９、３１９／５６０、３１９／６３７、および３６３／５６０から選択されるポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２７２を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、４Ｑ／８Ｖ／５６Ｉ／５９８Ｌ、４Ｑ／５６Ｉ／１９２Ｑ／１９４Ｇ／２５７Ｎ／５７１Ａ／５９８Ｅ、４Ｑ／５６Ｉ／１９４Ｅ／３２９Ａ／５９８Ｅ、４Ｑ／１９４Ｇ／２４３Ｓ／５４９Ｇ／５９８Ｅ、８Ｉ／２９Ｙ／４６Ｖ／１９６Ｄ／３６３Ｅ／４８１Ｄ／５４９Ｇ／５５３Ｓ、８Ｉ／９２Ｖ／１９６Ｄ／２５８Ｌ／４２６Ｐ／５９７Ｄ、８Ｉ／９２Ｖ／１９６Ｄ／４８１Ｄ／５９７Ｄ、８Ｉ／１９６Ｄ／２５８Ｌ／２７９Ｔ／４８１Ｄ／５４９Ｇ／５５３Ｓ、８Ｉ／２５８Ｌ／３６３Ｅ／４２６Ｐ／５４９Ｇ、８Ｉ／２７９Ｔ／３６３Ｅ／４２６Ｐ／４８１Ｄ／５４９Ｇ／５５３Ｓ、８Ｖ／５６Ｉ、８Ｖ／５６Ｉ／１９２Ｑ／１９４Ｅ／２４３Ｓ／３２９Ａ／４６０Ａ／５６０Ｔ、８Ｖ／５６Ｉ／１９２Ｑ／１９４Ｅ／２４３Ｓ／４６０Ａ／５６０Ｔ／５９８Ｅ、８Ｖ／５６Ｉ／１９２Ｑ／１９４Ｇ／２４３Ｓ／３２９Ａ、８Ｖ／５６Ｉ／１９２Ｑ／２４３Ｓ／４６０Ｑ、８Ｖ／５６Ｉ／１９２Ｑ／２４３Ｓ／５９８Ｅ、８Ｖ／５６Ｉ／１９４Ｇ／２５７Ｄ／４６０Ａ／５４９Ｇ／５６０Ｔ／５９８Ｌ、８Ｖ／１９２Ｑ／１９４Ｇ／２４３Ｓ／３２９Ａ／４６０Ｑ／５６０Ｔ、８Ｖ／２４３Ｓ／４６０Ｑ／５６０Ｔ／５７１Ａ／５９８Ｌ、８Ｖ／２５７Ｄ／４６０Ｑ／５６０Ｔ／５９８Ｅ、１６Ｅ／４３Ｅ／１０３Ｉ／１４８Ｒ／２９５Ｑ／４２６Ｌ／４９９Ｖ／５４９Ｗ、１６Ｅ／４３Ｅ／１０３Ｉ／３０４Ｃ／４９９Ｖ／５４９Ｗ、１６Ｅ／４３Ｅ／２９５Ｔ／２９６Ｅ／４９９Ｖ、１６Ｅ／５６Ｆ／１０３Ｉ／２２０Ｅ／２９５Ｔ／２９６Ｅ、１６Ｅ／５６Ｆ／１０３Ｉ／２９５Ｔ／５４９Ｗ、１６Ｅ／５６Ｆ／１４８Ｒ／２９５Ｑ／２９６Ｅ／３０４Ｃ／４２６Ｌ／５４９Ｗ、１６Ｅ／５６Ｆ／２９５Ｑ／２９６Ｅ／５４９Ｗ、１６Ｅ／６３Ｖ／１４８Ｒ／２２０Ｅ／２９５Ｑ／２９６Ｅ／４２６Ｌ／４９９Ｖ、１６Ｅ／１０３Ｉ／２２０Ｅ／２９５Ｑ、１６Ｅ／１４８Ｒ／２２０Ｅ／２９５Ｓ／４２６Ｌ／４９９Ｖ、１６Ｅ／１４８Ｒ／２９５Ｑ／４２６Ｌ、１６Ｅ／１４８Ｒ／２９５Ｑ／５４９Ｗ、１６Ｅ／１４８Ｒ／４２６Ｌ／５４９Ｗ、１６Ｅ／２２０Ｅ／２９５Ｑ／２９６Ｅ、１６Ｅ／３０４Ｃ／４９９Ｖ／５４９Ｗ、１６Ｓ／４３Ｅ／６３Ｖ／１０３Ｉ／２９５Ｑ／２９６Ｅ／４９９Ｖ、１６Ｓ／４３Ｅ／１４８Ｒ／２９５Ｑ／２９６Ｅ／３０４Ｃ／４９９Ｖ／５４９Ｗ、１６Ｓ／４３Ｅ／１４８Ｒ／２９６Ｅ／４２６Ｌ／４９９Ｖ、１６Ｓ／５６Ｆ／１０３Ｉ／２２０Ｅ／２９５Ｓ、１６Ｓ／５６Ｆ／２２０Ｅ／２９５Ｓ、１６Ｓ／５６Ｆ／２２０Ｅ／４９９Ｖ／５４９Ｗ、１６Ｓ／５６Ｆ／２９５Ｑ、１６Ｓ／５６Ｆ／２９５Ｔ／４９９Ｖ、１６Ｓ／５６Ｆ／４９９Ｖ／５４９Ｗ、１６Ｓ／６３Ｖ／１０３Ｉ／１４８Ｒ／４２６Ｌ／４９９Ｖ／５４９Ｗ、１６Ｓ／６３Ｖ／１０３Ｉ／４２６Ｌ／４９９Ｖ／５４９Ｗ、１６Ｓ／６３Ｖ／１４８Ｒ／４９９Ｖ／５４９Ｗ、１６Ｓ／１０３Ｉ、１６Ｓ／１０３Ｉ／１４８Ｒ、１６Ｓ／１０３Ｉ／１４８Ｒ／２２０Ｅ／４９９Ｖ、１６Ｓ／１０３Ｉ／１４８Ｒ／２９５Ｓ／４２６Ｌ／４９９Ｖ／５４９Ｗ、１６Ｓ／３０４Ｃ／４２６Ｌ／４９９Ｖ、２４Ｐ／３６Ｐ／９２Ｄ／２７９Ｌ／２９５Ｅ／３６３Ｌ／４９９Ｆ、２４Ｐ／４３Ａ／９２Ｄ／１４８Ａ／２７９Ｌ／２９５Ｄ／３１９Ｓ／６３７Ｌ、２４Ｐ／４３Ａ／９２Ｄ／２２２Ｙ／２７９Ｌ、２４Ｐ／４３Ａ／２２２Ｙ／３１９Ｒ、２４Ｐ／４３Ａ／３６３Ｌ／６３７Ｌ、２４Ｐ／９２Ｄ、２４Ｐ／９２Ｄ／１４８Ａ／２７９Ｌ、２４Ｐ／９２Ｄ／２２２Ｄ／２７９Ｌ／３１９Ｓ／６３７Ｌ、２４Ｐ／２２２Ｄ／６３７Ｌ、２４Ｐ／２７９Ｌ／３１９Ｒ、２９Ｔ／４６Ｖ／９２Ｖ／１９６Ｄ／４２６Ｐ／４８１Ｄ／５４９Ｇ／５９７Ｄ、２９Ｔ／４６Ｖ／４８１Ｄ／５４９Ｇ／５５３Ｓ／５９７Ｄ、２９Ｔ／５４９Ｇ／５５３Ｓ、２９Ｙ／４２６Ｐ／５４９Ｇ、３６Ｐ／４３Ｑ／２２２Ｙ／２７９Ｌ／３６３Ｌ／５６０Ｗ、３６Ｐ／９２Ｄ／１４８Ａ／２２２Ｄ／２７９Ｌ／３１９Ｓ／３６３Ｌ／４９９Ｆ／５６０Ｗ／６３７Ｌ、３６Ｐ／９２Ｄ／２２２Ｄ／６３７Ｌ、３６Ｐ／１４８Ａ／２７９Ｌ／３１９Ｓ／４９９Ｆ、４３Ｅ／２２０Ｅ／２９５Ｓ／５４９Ｗ、４３Ｑ／１４８Ａ／２２２Ｄ／２７９Ｌ／５６０Ｗ／６３７Ｌ、５６Ｆ／１４８Ｒ／２２０Ｅ／２９５Ｑ／４９９Ｖ、５６Ｉ／１９４Ｇ／２４３Ｓ／２５７Ｎ／３２９Ａ／４６０Ａ、５６Ｉ／２４３Ｓ、６３Ｖ／１０３Ｉ／１４８Ｒ／２２０Ｅ／２９５Ｓ／５４９Ｗ、６３Ｖ／２２０Ｅ／２９５Ｔ／３０４Ｃ／４２６Ｌ／４９９Ｖ／５４９Ｗ、６３Ｖ／２２０Ｅ／２９５Ｔ／３０４Ｃ／５４９Ｗ、９２Ｄ、９２Ｄ／２２２Ｄ／２７９Ｌ／４９９Ｆ／５６０Ｗ／６３７Ｌ、９２Ｖ／２５８Ｌ／３６３Ｅ／４２６Ｐ／４８１Ｄ／５４９Ｇ／５９７Ｄ、１０３Ｉ／２９５Ｔ／４９９Ｖ／５４９Ｗ、１４８Ａ／２２２Ｄ、１４８Ａ／２２２Ｄ／５６０Ｗ／６３７Ｌ、１４８Ａ／２７９Ｌ／３１９Ｓ／４９９Ｆ、１４８Ｒ／２２０Ｅ／３０４Ｃ、１９４Ｅ／２４３Ｓ／３２９Ａ／５６０Ｔ／５７１Ａ／５９８Ｅ、１９４Ｇ／２４３Ｓ／３２９Ａ／４６０Ｑ、２２０Ｅ／２９５Ｔ／５４９Ｗ、２７９Ｌ／５６０Ｗ／６３７Ｌ、２７９Ｔ／２９６Ｔ／４８１Ｄ／５４９Ｇ／５５３Ｓ／５６７Ｍ／５９７Ｄ、２９５Ｄ／４９９Ｆ／５６０Ｗ／６３７Ｌ、２９５Ｑ／２９６Ｅ／４２６Ｌ／５４９Ｗ、２９５Ｓ／２９６Ｅ／５４９Ｗ、２９６Ｔ／３６３Ｅ／４２６Ｐ／４８１Ｄ／５４９Ｇ、３１９Ｒ／６３７Ｌ、３１９Ｓ／５６０Ｗ、および３６３Ｌ／５６０Ｗから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２７２を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、Ａ４Ｑ／Ｓ８Ｖ／Ｙ５６Ｉ／Ｎ５９８Ｌ、Ａ４Ｑ／Ｙ５６Ｉ／Ｎ１９２Ｑ／Ａ１９４Ｇ／Ｓ２５７Ｎ／Ｋ５７１Ａ／Ｎ５９８Ｅ、Ａ４Ｑ／Ｙ５６Ｉ／Ａ１９４Ｅ／Ｌ３２９Ａ／Ｎ５９８Ｅ、Ａ４Ｑ／Ａ１９４Ｇ／Ｔ２４３Ｓ／Ｒ５４９Ｇ／Ｎ５９８Ｅ、Ｓ８Ｉ／Ｎ２９Ｙ／Ａ４６Ｖ／Ｅ１９６Ｄ／Ｓ３６３Ｅ／Ｑ４８１Ｄ／Ｒ５４９Ｇ／Ｑ５５３Ｓ、Ｓ８Ｉ／Ｓ９２Ｖ／Ｅ１９６Ｄ／Ｓ２５８Ｌ／Ｓ４２６Ｐ／Ｎ５９７Ｄ、Ｓ８Ｉ／Ｓ９２Ｖ／Ｅ１９６Ｄ／Ｑ４８１Ｄ／Ｎ５９７Ｄ、Ｓ８Ｉ／Ｅ１９６Ｄ／Ｓ２５８Ｌ／Ｍ２７９Ｔ／Ｑ４８１Ｄ／Ｒ５４９Ｇ／Ｑ５５３Ｓ、Ｓ８Ｉ／Ｓ２５８Ｌ／Ｓ３６３Ｅ／Ｓ４２６Ｐ／Ｒ５４９Ｇ、Ｓ８Ｉ／Ｍ２７９Ｔ／Ｓ３６３Ｅ／Ｓ４２６Ｐ／Ｑ４８１Ｄ／Ｒ５４９Ｇ／Ｑ５５３Ｓ、Ｓ８Ｖ／Ｙ５６Ｉ、Ｓ８Ｖ／Ｙ５６Ｉ／Ｎ１９２Ｑ／Ａ１９４Ｅ／Ｔ２４３Ｓ／Ｌ３２９Ａ／Ｒ４６０Ａ／Ｒ５６０Ｔ、Ｓ８Ｖ／Ｙ５６Ｉ／Ｎ１９２Ｑ／Ａ１９４Ｅ／Ｔ２４３Ｓ／Ｒ４６０Ａ／Ｒ５６０Ｔ／Ｎ５９８Ｅ、Ｓ８Ｖ／Ｙ５６Ｉ／Ｎ１９２Ｑ／Ａ１９４Ｇ／Ｔ２４３Ｓ／Ｌ３２９Ａ、Ｓ８Ｖ／Ｙ５６Ｉ／Ｎ１９２Ｑ／Ｔ２４３Ｓ／Ｒ４６０Ｑ、Ｓ８Ｖ／Ｙ５６Ｉ／Ｎ１９２Ｑ／Ｔ２４３Ｓ／Ｎ５９８Ｅ、Ｓ８Ｖ／Ｙ５６Ｉ／Ａ１９４Ｇ／Ｓ２５７Ｄ／Ｒ４６０Ａ／Ｒ５４９Ｇ／Ｒ５６０Ｔ／Ｎ５９８Ｌ、Ｓ８Ｖ／Ｎ１９２Ｑ／Ａ１９４Ｇ／Ｔ２４３Ｓ／Ｌ３２９Ａ／Ｒ４６０Ｑ／Ｒ５６０Ｔ、Ｓ８Ｖ／Ｔ２４３Ｓ／Ｒ４６０Ｑ
／Ｒ５６０Ｔ／Ｋ５７１Ａ／Ｎ５９８Ｌ、Ｓ８Ｖ／Ｓ２５７Ｄ／Ｒ４６０Ｑ／Ｒ５６０Ｔ／Ｎ５９８Ｅ、Ａ１６Ｅ／Ｆ４３Ｅ／Ｓ１０３Ｉ／Ｑ１４８Ｒ／Ｒ２９５Ｑ／Ｓ４２６Ｌ／Ｉ４９９Ｖ／Ｒ５４９Ｗ、Ａ１６Ｅ／Ｆ４３Ｅ／Ｓ１０３Ｉ／Ｓ３０４Ｃ／Ｉ４９９Ｖ／Ｒ５４９Ｗ、Ａ１６Ｅ／Ｆ４３Ｅ／Ｒ２９５Ｔ／Ｖ２９６Ｅ／Ｉ４９９Ｖ、Ａ１６Ｅ／Ｙ５６Ｆ／Ｓ１０３Ｉ／Ｓ２２０Ｅ／Ｒ２９５Ｔ／Ｖ２９６Ｅ、Ａ１６Ｅ／Ｙ５６Ｆ／Ｓ１０３Ｉ／Ｒ２９５Ｔ／Ｒ５４９Ｗ、Ａ１６Ｅ／Ｙ５６Ｆ／Ｑ１４８Ｒ／Ｒ２９５Ｑ／Ｖ２９６Ｅ／Ｓ３０４Ｃ／Ｓ４２６Ｌ／Ｒ５４９Ｗ、Ａ１６Ｅ／Ｙ５６Ｆ／Ｒ２９５Ｑ／Ｖ２９６Ｅ／Ｒ５４９Ｗ、Ａ１６Ｅ／Ｔ６３Ｖ／Ｑ１４８Ｒ／Ｓ２２０Ｅ／Ｒ２９５Ｑ／Ｖ２９６Ｅ／Ｓ４２６Ｌ／Ｉ４９９Ｖ、Ａ１６Ｅ／Ｓ１０３Ｉ／Ｓ２２０Ｅ／Ｒ２９５Ｑ、Ａ１６Ｅ／Ｑ１４８Ｒ／Ｓ２２０Ｅ／Ｒ２９５Ｓ／Ｓ４２６Ｌ／Ｉ４９９Ｖ、Ａ１６Ｅ／Ｑ１４８Ｒ／Ｒ２９５Ｑ／Ｓ４２６Ｌ、Ａ１６Ｅ／Ｑ１４８Ｒ／Ｒ２９５Ｑ／Ｒ５４９Ｗ、Ａ１６Ｅ／Ｑ１４８Ｒ／Ｓ４２６Ｌ／Ｒ５４９Ｗ、Ａ１６Ｅ／Ｓ２２０Ｅ／Ｒ２９５Ｑ／Ｖ２９６Ｅ、Ａ１６Ｅ／Ｓ３０４Ｃ／Ｉ４９９Ｖ／Ｒ５４９Ｗ、Ａ１６Ｓ／Ｆ４３Ｅ／Ｔ６３Ｖ／Ｓ１０３Ｉ／Ｒ２９５Ｑ／Ｖ２９６Ｅ／Ｉ４９９Ｖ、Ａ１６Ｓ／Ｆ４３Ｅ／Ｑ１４８Ｒ／Ｒ２９５Ｑ／Ｖ２９６Ｅ／Ｓ３０４Ｃ／Ｉ４９９Ｖ／Ｒ５４９Ｗ、Ａ１６Ｓ／Ｆ４３Ｅ／Ｑ１４８Ｒ／Ｖ２９６Ｅ／Ｓ４２６Ｌ／Ｉ４９９Ｖ、Ａ１６Ｓ／Ｙ５６Ｆ／Ｓ１０３Ｉ／Ｓ２２０Ｅ／Ｒ２９５Ｓ、Ａ１６Ｓ／Ｙ５６Ｆ／Ｓ２２０Ｅ／Ｒ２９５Ｓ、Ａ１６Ｓ／Ｙ５６Ｆ／Ｓ２２０Ｅ／Ｉ４９９Ｖ／Ｒ５４９Ｗ、Ａ１６Ｓ／Ｙ５６Ｆ／Ｒ２９５Ｑ、Ａ１６Ｓ／Ｙ５６Ｆ／Ｒ２９５Ｔ／Ｉ４９９Ｖ、Ａ１６Ｓ／Ｙ５６Ｆ／Ｉ４９９Ｖ／Ｒ５４９Ｗ、Ａ１６Ｓ／Ｔ６３Ｖ／Ｓ１０３Ｉ／Ｑ１４８Ｒ／Ｓ４２６Ｌ／Ｉ４９９Ｖ／Ｒ５４９Ｗ、Ａ１６Ｓ／Ｔ６３Ｖ／Ｓ１０３Ｉ／Ｓ４２６Ｌ／Ｉ４９９Ｖ／Ｒ５４９Ｗ、Ａ１６Ｓ／Ｔ６３Ｖ／Ｑ１４８Ｒ／Ｉ４９９Ｖ／Ｒ５４９Ｗ、Ａ１６Ｓ／Ｓ１０３Ｉ、Ａ１６Ｓ／Ｓ１０３Ｉ／Ｑ１４８Ｒ、Ａ１６Ｓ／Ｓ１０３Ｉ／Ｑ１４８Ｒ／Ｓ２２０Ｅ／Ｉ４９９Ｖ、Ａ１６Ｓ／Ｓ１０３Ｉ／Ｑ１４８Ｒ／Ｒ２９５Ｓ／Ｓ４２６Ｌ／Ｉ４９９Ｖ／Ｒ５４９Ｗ、Ａ１６Ｓ／Ｓ３０４Ｃ／Ｓ４２６Ｌ／Ｉ４９９Ｖ、Ｓ２４Ｐ／Ｋ３６Ｐ／Ｓ９２Ｄ／Ｍ２７９Ｌ／Ｒ２９５Ｅ／Ｓ３６３Ｌ／Ｉ４９９Ｆ、Ｓ２４Ｐ／Ｆ４３Ａ／Ｓ９２Ｄ／Ｑ１４８Ａ／Ｍ２７９Ｌ／Ｒ２９５Ｄ／Ｎ３１９Ｓ／Ｒ６３７Ｌ、Ｓ２４Ｐ／Ｆ４３Ａ／Ｓ９２Ｄ／Ｖ２２２Ｙ／Ｍ２７９Ｌ、Ｓ２４Ｐ／Ｆ４３Ａ／Ｖ２２２Ｙ／Ｎ３１９Ｒ、Ｓ２４Ｐ／Ｆ４３Ａ／Ｓ３６３Ｌ／Ｒ６３７Ｌ、Ｓ２４Ｐ／Ｓ９２Ｄ、Ｓ２４Ｐ／Ｓ９２Ｄ／Ｑ１４８Ａ／Ｍ２７９Ｌ、Ｓ２４Ｐ／Ｓ９２Ｄ／Ｖ２２２Ｄ／Ｍ２７９Ｌ／Ｎ３１９Ｓ／Ｒ６３７Ｌ、Ｓ２４Ｐ／Ｖ２２２Ｄ／Ｒ６３７Ｌ、Ｓ２４Ｐ／Ｍ２７９Ｌ／Ｎ３１９Ｒ、Ｎ２９Ｔ／Ａ４６Ｖ／Ｓ９２Ｖ／Ｅ１９６Ｄ／Ｓ４２６Ｐ／Ｑ４８１Ｄ／Ｒ５４９Ｇ／Ｎ５９７Ｄ、Ｎ２９Ｔ／Ａ４６Ｖ／Ｑ４８１Ｄ／Ｒ５４９Ｇ／Ｑ５５３Ｓ／Ｎ５９７Ｄ、Ｎ２９Ｔ／Ｒ５４９Ｇ／Ｑ５５３Ｓ、Ｎ２９Ｙ／Ｓ４２６Ｐ／Ｒ５４９Ｇ、Ｋ３６Ｐ／Ｆ４３Ｑ／Ｖ２２２Ｙ／Ｍ２７９Ｌ／Ｓ３６３Ｌ／Ｒ５６０Ｗ、Ｋ３６Ｐ／Ｓ９２Ｄ／Ｑ１４８Ａ／Ｖ２２２Ｄ／Ｍ２７９Ｌ／Ｎ３１９Ｓ／Ｓ３６３Ｌ／Ｉ４９９Ｆ／Ｒ５６０Ｗ／Ｒ６３７Ｌ、Ｋ３６Ｐ／Ｓ９２Ｄ／Ｖ２２２Ｄ／Ｒ６３７Ｌ、Ｋ３６Ｐ／Ｑ１４８Ａ／Ｍ２７９Ｌ／Ｎ３１９Ｓ／Ｉ４９９Ｆ、Ｆ４３Ｅ／Ｓ２２０Ｅ／Ｒ２９５Ｓ／Ｒ５４９Ｗ、Ｆ４３Ｑ／Ｑ１４８Ａ／Ｖ２２２Ｄ／Ｍ２７９Ｌ／Ｒ５６０Ｗ／Ｒ６３７Ｌ、Ｙ５６Ｆ／Ｑ１４８Ｒ／Ｓ２２０Ｅ／Ｒ２９５Ｑ／Ｉ４９９Ｖ、Ｙ５６Ｉ／Ａ１９４Ｇ／Ｔ２４３Ｓ／Ｓ２５７Ｎ／Ｌ３２９Ａ／Ｒ４６０Ａ、Ｙ５６Ｉ／Ｔ２４３Ｓ、Ｔ６３Ｖ／Ｓ１０３Ｉ／Ｑ１４８Ｒ／Ｓ２２０Ｅ／Ｒ２９５Ｓ／Ｒ５４９Ｗ、Ｔ６３Ｖ／Ｓ２２０Ｅ／Ｒ２９５Ｔ／Ｓ３０４Ｃ／Ｓ４２６Ｌ／Ｉ４９９Ｖ／Ｒ５４９Ｗ、Ｔ６３Ｖ／Ｓ２２０Ｅ／Ｒ２９５Ｔ／Ｓ３０４Ｃ／Ｒ５４９Ｗ、Ｓ９２Ｄ、Ｓ９２Ｄ／Ｖ２２２Ｄ／Ｍ２７９Ｌ／Ｉ４９９Ｆ／Ｒ５６０Ｗ／Ｒ６３７Ｌ、Ｓ９２Ｖ／Ｓ２５８Ｌ／Ｓ３６３Ｅ／Ｓ４２６Ｐ／Ｑ４８１Ｄ／Ｒ５４９Ｇ／Ｎ５９７Ｄ、Ｓ１０３Ｉ／Ｒ２９５Ｔ／Ｉ４９９Ｖ／Ｒ５４９Ｗ、Ｑ１４８Ａ／Ｖ２２２Ｄ、Ｑ１４８Ａ／Ｖ２２２Ｄ／Ｒ５６０Ｗ／Ｒ６３７Ｌ、Ｑ１４８Ａ／Ｍ２７９Ｌ／Ｎ３１９Ｓ／Ｉ４９９Ｆ、Ｑ１４８Ｒ／Ｓ２２０Ｅ／Ｓ３０４Ｃ、Ａ１９４Ｅ／Ｔ２４３Ｓ／Ｌ３２９Ａ／Ｒ５６０Ｔ／Ｋ５７１Ａ／Ｎ５９８Ｅ、Ａ１９４Ｇ／Ｔ２４３Ｓ／Ｌ３２９Ａ／Ｒ４６０Ｑ、Ｓ２２０Ｅ／Ｒ２９５Ｔ／Ｒ５４９Ｗ、Ｍ２７９Ｌ／Ｒ５６０Ｗ／Ｒ６３７Ｌ、Ｍ２７９Ｔ／Ｖ２９６Ｔ／Ｑ４８１Ｄ／Ｒ５４９Ｇ／Ｑ５５３Ｓ／Ｓ５６７Ｍ／Ｎ５９７Ｄ、Ｒ２９５Ｄ／Ｉ４９９Ｆ／Ｒ５６０Ｗ／Ｒ６３７Ｌ、Ｒ２９５Ｑ／Ｖ２９６Ｅ／Ｓ４２６Ｌ／Ｒ５４９Ｗ、Ｒ２９５Ｓ／Ｖ２９６Ｅ／Ｒ５４９Ｗ、Ｖ２９６Ｔ／Ｓ３６３Ｅ／Ｓ４２６Ｐ／Ｑ４８１Ｄ／Ｒ５４９Ｇ、Ｎ３１９Ｒ／Ｒ６３７Ｌ、Ｎ３１９Ｓ／Ｒ５６０Ｗ、およびＳ３６３Ｌ／Ｒ５６０Ｗから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２７２を基準にして番号が付けられている。
【００１２】
一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、配列番号９２８に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたガラクトースオキシダーゼは、４／４３／４６／５６／６３／２７９／２９５／３１９／５６７／５９８、４／４３／４６／２９５／３１９／５４９／５６０、４／４３／４６／４２６／５４９／５６０、４／４３／１４８／１９６／２７９／３１９／３６３／５６０、１６、１６／２４／２９、１６／２４／２９／９２／２２０／２７９／５９７／５９８、１６／２４／２９／２７９／５４９、１６／２４／２９／２７９／６３７、１６／２４／４３／９２／５４９、１６／２４／４３／１９２／２２０／２７９／５４９、１６／２９／３６／１９２／３１９／５４９／５９７／５９８／６３７、１６／２９／３６／２７９／５４９、１６／２９／４３／９２／１９２／３１９、１６／２９／４３／１９２／２２２／３１９／５４９／６３７、１６／２９／４３／２２２／２７９／５４９、１６／２９／９２／１９２／５４９／６３７、１６／２９／９２／２２０／２２２／３１９／５４９／５９８、１６／２９／９２／２７９／５４９、１６／２９／９２／３１９／５４９、１６／２９／９２／５４９／６３７、１６／２９／１９２／２２０／５４９、１６／２９／１９２／２２０／５４９／５９７、１６／２９／１９２／２２２／２７９／５４９、１６／２９／１９２／２２２／６３７、１６／２９／１９２／５４９、１６／２９／２２０／２２２／２７９／５４９／６３７、１６／２９／２２０／２２２／５９７／５９８、１６／２９／２２２／５４９／５９８／６３７、１６／２９／５４９／６３７、１６／３６／４３／１９２／５９７／６３７、１６／３６／９２／２２０／２２２／２７９／５４９、１６／３６／１９２／５４９／５９７／５９８／６３７、１６／３６／３１９／５４９／５９７／５９８／６３７、１６／４３／５６／１９２／５４９／５９７／５９８／６３７、１６／４３／９２／２２２／５９７／５９８、１６／４３／１９２／５４９、１６／４３／２２０／５４９／６３７、１６／４３／２７９／３１９／５９７、１６／４３／２７９／５４９／５９７、１６／４３／３１９／５４９／５９８、１６／４３／５９７、１６／９２／１９２／２７９／３１９／５４９／６３７、１６／９２／１９２／２７９／６３７、１６／９２／２２０／５４９、１６／９２／３１９／５９７／６３７、１６／１９２／３１９／５４９／６３７、１６／１９２／５４９、１６／２２０／２２２／２７９／５４９／５９８／６３７、１６／２２０／２７９／５４９、１６／２２０／３１９／５４９／５９７／５９８、１６／２２２／３１９／５９７／５９８、１６／２２２／６３７、１６／２７９／３１９／５４９／５９７／６３７、１６／２７９／５４９／５９７／５９８／６３７、１６／２７９／５９７、１６／３１９／５９７、１６／３１９／５９７／５９８、１６／５４９、１６／５４９／５９８、１６／５９７、２９／６３／１３４／５２０／５９７／５９８、２９／６３／５２０／５３７／５３８／５９８、２９／１３４／２３７／５３７／５３８／５６７／５７１、２９／２３７／５２０、２９／２３７／５２０／５３８、２９／２３７／５６７／５９８、２９／２３７／５９７、２９／５９７／５９８、３６／９２／５４９、３６／１３４／２３７／５２０／５３７／５３８／５７１、３６／１３４／２３７／５６７／５７１／５９７／５９８、３６／５２０／５３７／５３８／５９７、４３／４６／５６／１４８／２５８／２７９／３６３／５４９／５７１、４３／４６／６３／２５８／２９５／４２６／５６０／５６７／５７１、４３／４６／１９６／３１９／５４９／５６０／５６７、４３／２７９／５４９／５６０／５６７、４６／２９５／３１９／４２６、４６／５６０、９５、１３４／２３７／５２０／５９７、１３４／５２０／５９７／５９８、２２０／２２２／５９７／６３７、２２０／２９６／４０７／４６５、２２４、２３７／５２０、２３７／５２０／５３７／５３８／５９８、２３７／５２０／５３７／５９８、２３７／５２０／５３８／５９７、２３７／５２０／５６７／５７１／５９７、２３７／５２０／５９７／５９８、２３７／５３８／５９７／５９８、２３７／５７１、２３７／５９７／５９８、２７９／３１９／５６０、２９４、２９５／５４９／５６０、３４３、４３３、４６５、４８３、４８６、５２０／５７１／５９８、５２０／５９７／５９８、５４９／５９８、５５６、５６４、５６７／５７１／５９７、５６８、および６０９から選択されるポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号９２８を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、４Ｑ／４３Ｑ／４６Ｖ／５６Ｆ／６３Ｖ／２７９Ｌ／２９５Ｔ／３１９Ｓ／５６７Ｍ／５９８Ｅ、４Ｑ／４３Ｑ／４６Ｖ／２９５Ｑ／３１９Ｓ／５４９Ｇ／５６０Ｗ、４Ｑ／４３Ｑ／４６Ｖ／４２６Ｌ／５４９Ｇ／５６０Ｗ、４Ｑ／４３Ｑ／１４８Ａ／１９６Ｄ／２７９Ｌ／３１９Ｓ／３６３Ｌ／５６０Ｗ、１６Ｅ、１６Ｅ／２４Ｐ／２９Ｔ／９２Ｄ／２２０Ｅ／２７９Ｔ／５９７Ｄ／５９８Ｌ、１６Ｅ／２４Ｐ／２９Ｔ／２７９Ｔ／５４９Ｗ、１６Ｅ／２４Ｐ／２９Ｔ／２７９Ｔ／６３７Ｌ、１６Ｅ／２４Ｐ／２９Ｙ、１６Ｅ／２４Ｐ／４３Ｅ／９２Ｄ／５４９Ｗ、１６Ｅ／２４Ｐ／４３Ｅ／１９２Ｎ／２２０Ｅ／２７９Ｔ／５４９Ｗ、１６Ｅ／２９Ｔ／３６Ｐ／１９２Ｎ／３１９Ｒ／５４９Ｗ／５９７Ｄ／５９８Ｌ／６３７Ｌ、１６Ｅ／２９Ｔ／３６Ｐ／２７９Ｔ／５４９Ｗ、１６Ｅ／２９Ｔ／４３Ａ／９２Ｄ／１９２Ｎ／３１９Ｒ、１６Ｅ／２９Ｔ／４３Ｅ／２２２Ｄ／２７９Ｔ／５４９Ｗ、１６Ｅ／２９Ｔ／９２Ｄ／２２０Ｅ／２２２Ｄ／３１９Ｒ／５４９Ｗ／５９８Ｌ、１６Ｅ／２９Ｔ／９２Ｄ／２７９Ｔ／５４９Ｗ、１６Ｅ／２９Ｔ／１９２Ｎ／２２０Ｅ／５４９Ｗ、１６Ｅ／２９Ｔ／１９２Ｎ／２２０Ｅ／５４９Ｗ／５９７Ｄ、１６Ｅ／２９Ｔ／１９２Ｎ／２２２Ｄ／６３７Ｌ、１６Ｅ／２９Ｔ／１９２Ｎ／５４９Ｗ、１６Ｅ／２９Ｔ／２２０Ｅ／２２２Ｄ／２７９Ｔ／５４９Ｗ／６３７Ｌ、１６Ｅ／２９Ｔ／２２２Ｄ／５４９Ｗ／５９８Ｌ／６３７Ｌ、１６Ｅ／２９Ｙ／４３Ｅ／１９２Ｎ／２２２Ｄ／３１９Ｒ／５４９Ｗ／６３７Ｌ、１６Ｅ／２９Ｙ／９２Ｄ／３１９Ｒ／５４９Ｗ、１６Ｅ／２９Ｙ／１９２Ｎ／２２２Ｄ／２７９Ｔ／５４９Ｗ、１６Ｅ／２９Ｙ／１９２Ｎ／５４９Ｗ、１６Ｅ／２９Ｙ／２２０Ｅ／２２２Ｄ／５９７Ｄ／５９８Ｌ、１６Ｅ／２９Ｙ／５４９Ｗ／６３７Ｌ、１６Ｅ／３６Ｐ／４３Ａ／１９２Ｎ／５９７Ｄ／６３７Ｌ、１６Ｅ／３６Ｐ／９２Ｄ／２２０Ｅ／２２２Ｄ／２７９Ｔ／５４９Ｗ、１６Ｅ／３６Ｐ／１９２Ｎ／５４９Ｗ／５９７Ｄ／５９８Ｌ／６３７Ｌ、１６Ｅ／３６Ｐ／３１９Ｒ／５４９Ｗ／５９７Ｄ／５９８Ｌ／６３７Ｌ、１６Ｅ／４３Ａ／９２Ｄ／２２２Ｄ／５９７Ｄ／５９８Ｌ、１６Ｅ／４３Ａ／２２０Ｅ／５４９Ｗ／６３７Ｌ、１６Ｅ／４３Ａ／２７９Ｔ／５４９Ｗ／５９７Ｄ、１６Ｅ／４３Ｅ／５６Ｖ／１９２Ｎ／５４９Ｗ／５９７Ｄ／５９８Ｌ／６３７Ｌ、１６Ｅ／４３Ｅ／１９２Ｎ／５４９Ｗ、１６Ｅ／４３Ｅ／２７９Ｔ／３１９Ｒ／５９７Ｄ、１６Ｅ／４３Ｅ／５９７Ｄ、１６Ｅ／９２Ｄ／１９２Ｎ／２７９Ｔ／３１９Ｒ／５４９Ｗ／６３７Ｌ、１６Ｅ／９２Ｄ／２２０Ｅ／５４９Ｗ、１６Ｅ／１９２Ｎ／３１９Ｒ／５４９Ｗ／６３７Ｌ、１６Ｅ／１９２Ｎ／５４９Ｗ、１６Ｅ／２２０Ｅ／２２２Ｄ／２７９Ｔ／５４９Ｗ／５９８Ｌ／６３７Ｌ、１６Ｅ／２２０Ｅ／２７９Ｔ／５４９Ｗ、１６Ｅ／２２０Ｅ／３１９Ｒ／５４９Ｗ／５９７Ｄ／５９８Ｌ、１６Ｅ／２２２Ｄ／３１９Ｒ／５９７Ｄ／５９８Ｌ、１６Ｅ／２２２Ｄ／６３７Ｌ、１６Ｅ／２７９Ｔ／３１９Ｒ／５４９Ｗ／５９７Ｄ／６３７Ｌ、１６Ｅ／２７９Ｔ／５９７Ｄ、１６Ｅ／３１９Ｒ／５９７Ｄ、１６Ｅ／３１９Ｒ／５９７Ｄ／５９８Ｌ、１６Ｅ／５４９Ｗ、１６Ｅ／５４９Ｗ／５９８Ｌ、１６Ｅ／５９７Ｄ、１６Ｓ／２９Ｔ／９２Ｄ／５４９Ｗ／６３７Ｌ、１６Ｓ／２９Ｙ／９２Ｄ／１９２Ｎ／５４９Ｗ／６３７Ｌ、１６Ｓ／４３Ｅ／３１９Ｒ／５４９Ｗ／５９８Ｌ、１６Ｓ／９２Ｄ／１９２Ｎ／２７９Ｔ／６３７Ｌ、１６Ｓ／９２Ｄ／３１９Ｒ／５９７Ｄ／６３７Ｌ、１６Ｓ／２７９Ｔ／５４９Ｗ／５９７Ｄ／５９８Ｌ／６３７Ｌ、２９Ｈ／６３Ｖ／１３４Ａ／５２０Ａ／５９７Ｄ／５９８Ｅ、２９Ｈ／６３Ｖ／５２０Ａ／５３７Ｇ／５３８Ｄ／５９８Ｅ、２９Ｈ／１３４Ａ／２３７Ｄ／５３７Ｇ／５３８Ｄ／５６７Ｍ／５７１Ａ、２９Ｈ／２３７Ｄ／５２０Ａ、２９Ｈ／２３７Ｄ／５２０Ａ／５３８Ｄ、２９Ｈ／２３７Ｄ／５６７Ｍ／５９８Ｅ、２９Ｈ／２３７Ｄ／５９７Ｄ、２９Ｈ／５９７Ｄ／５９８Ｅ、３６Ｐ／９２Ｄ／５４９Ｗ、３６Ｖ／１３４Ａ／２３７Ｄ／５２０Ａ／５３７Ｇ／５３８Ｄ／５７１Ａ、３６Ｖ／１３４Ａ／２３７Ｄ／５６７Ｍ／５７１Ａ／５９７Ｄ／５９８Ｅ、３６Ｖ／５２０Ａ／５３７Ｇ／５３８Ｄ／５９７Ｄ、４３Ｑ／４６Ｖ／５６Ｆ／１４８Ａ／２５８Ｌ／２７９Ｌ／３６３Ｌ／５４９Ｇ／５７１Ａ、４３Ｑ／４６Ｖ／６３Ｖ／２５８Ｌ／２９５Ｑ／４２６Ｌ／５６０Ｗ／５６７Ｍ／５７１Ａ、４３Ｑ／４６Ｖ／１９６Ｄ／３１９Ｓ／５４９Ｇ／５６０Ｗ／５６７Ｍ、４３Ｑ／２７９Ｌ／５４９Ｇ／５６０Ｗ／５６７Ｍ、４６Ｖ／２９５Ｔ／３１９Ｓ／４２６Ｌ、４６Ｖ／５６０Ｗ、９５Ｅ、１３４Ａ／２３７Ｄ／５２０Ａ／５９７Ｄ、１３４Ａ／５２０Ａ／５９７Ｄ／５９８Ｅ、２２０Ｅ／２２２Ｄ／５９７Ｄ／６３７Ｌ、２２０Ｅ／２９６Ｓ／４０７Ｉ／４６５Ｇ、２２４Ｄ、２３７Ｄ／５２０Ａ、２３７Ｄ／５２０Ａ／５３７Ｇ／５３８Ｄ／５９８Ｅ、２３７Ｄ／５２０Ａ／５３７Ｇ／５９８Ｅ、２３７Ｄ／５２０Ａ／５３８Ｄ／５９７Ｄ、２３７Ｄ／５２０Ａ／５６７Ｍ／５７１Ａ／５９７Ｄ、２３７Ｄ／５２０Ａ／５９７Ｄ／５９８Ｅ、２３７Ｄ／５３８Ｄ／５９７Ｄ／５９８Ｅ、２３７Ｄ／５７１Ａ、２３７Ｄ／５９７Ｄ／５９８Ｅ、２７９Ｌ／３１９Ｓ／５６０Ｗ、２９４Ｅ、２９５Ｑ／５４９Ｇ／５６０Ｗ、３４３Ｇ、４３３Ｇ、４６５Ｇ、４８３Ｒ、４８６Ｐ、５２０Ａ／５７１Ａ／５９８Ｅ、５２０Ａ／５９７Ｄ／５９８Ｅ、５４９Ｇ／５９８Ｅ、５５６Ａ、５５６Ｓ、５５６Ｖ、５６４Ｄ、５６４Ｅ、５６４Ｔ、５６４Ｗ、５６７Ｍ／５７１Ａ／５９７Ｄ、５６８Ｅ、５６８Ｐ、および６０９Ｄから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号９２８を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、Ａ４Ｑ／Ｆ４３Ｑ／Ａ４６Ｖ／Ｉ５６Ｆ／Ｔ６３Ｖ／Ｍ２７９Ｌ／Ｒ２９５Ｔ／Ｎ３１９Ｓ／Ｓ５６７Ｍ／Ｎ５９８Ｅ、Ａ４Ｑ／Ｆ４３Ｑ／Ａ４６Ｖ／Ｒ２９５Ｑ／Ｎ３１９Ｓ／Ｒ５４９Ｇ／Ｒ５６０Ｗ、Ａ４Ｑ／Ｆ４３Ｑ／Ａ４６Ｖ／Ｓ４２６Ｌ／Ｒ５４９Ｇ／Ｒ５６０Ｗ、Ａ４Ｑ／Ｆ４３Ｑ／Ｑ１４８Ａ／Ｅ１９６Ｄ／Ｍ２７９Ｌ／Ｎ３１９Ｓ／Ｓ３６３Ｌ／Ｒ５６０Ｗ、Ａ１６Ｅ、Ａ１６Ｅ／Ｓ２４Ｐ／Ｎ２９Ｔ／Ｓ９２Ｄ／Ｓ２２０Ｅ／Ｍ２７９Ｔ／Ｎ５９７Ｄ／Ｎ５９８Ｌ、Ａ１６Ｅ／Ｓ２４Ｐ／Ｎ２９Ｔ／Ｍ２７９Ｔ／Ｒ５４９Ｗ、Ａ１６Ｅ／Ｓ２４Ｐ／Ｎ２９Ｔ／Ｍ２７９Ｔ／Ｒ６３７Ｌ、Ａ１６Ｅ／Ｓ２４Ｐ／Ｎ２９Ｙ、Ａ１６Ｅ／Ｓ２４Ｐ／Ｆ４３Ｅ／Ｓ９２Ｄ／Ｒ５４９Ｗ、Ａ１６Ｅ／Ｓ２４Ｐ／Ｆ４３Ｅ／Ｑ１９２Ｎ／Ｓ２２０Ｅ／Ｍ２７９Ｔ／Ｒ５４９Ｗ、Ａ１６Ｅ／Ｎ２９Ｔ／Ｋ３６Ｐ／Ｑ１９２Ｎ／Ｎ３１９Ｒ／Ｒ５４９Ｗ／Ｎ５９７Ｄ／Ｎ５９８Ｌ／Ｒ６３７Ｌ、Ａ１６Ｅ／Ｎ２９Ｔ／Ｋ３６Ｐ／Ｍ２７９Ｔ／Ｒ５４９Ｗ、Ａ１６Ｅ／Ｎ２９Ｔ／Ｆ４３Ａ／Ｓ９２Ｄ／Ｑ１９２Ｎ／Ｎ３１９Ｒ、Ａ１６Ｅ／Ｎ２９Ｔ／Ｆ４３Ｅ／Ｖ２２２Ｄ／Ｍ２７９Ｔ／Ｒ５４９Ｗ、Ａ１６Ｅ／Ｎ２９Ｔ／Ｓ９２Ｄ／Ｓ２２０Ｅ／Ｖ２２２Ｄ／Ｎ
３１９Ｒ／Ｒ５４９Ｗ／Ｎ５９８Ｌ、Ａ１６Ｅ／Ｎ２９Ｔ／Ｓ９２Ｄ／Ｍ２７９Ｔ／Ｒ５４９Ｗ、Ａ１６Ｅ／Ｎ２９Ｔ／Ｑ１９２Ｎ／Ｓ２２０Ｅ／Ｒ５４９Ｗ、Ａ１６Ｅ／Ｎ２９Ｔ／Ｑ１９２Ｎ／Ｓ２２０Ｅ／Ｒ５４９Ｗ／Ｎ５９７Ｄ、Ａ１６Ｅ／Ｎ２９Ｔ／Ｑ１９２Ｎ／Ｖ２２２Ｄ／Ｒ６３７Ｌ、Ａ１６Ｅ／Ｎ２９Ｔ／Ｑ１９２Ｎ／Ｒ５４９Ｗ、Ａ１６Ｅ／Ｎ２９Ｔ／Ｓ２２０Ｅ／Ｖ２２２Ｄ／Ｍ２７９Ｔ／Ｒ５４９Ｗ／Ｒ６３７Ｌ、Ａ１６Ｅ／Ｎ２９Ｔ／Ｖ２２２Ｄ／Ｒ５４９Ｗ／Ｎ５９８Ｌ／Ｒ６３７Ｌ、Ａ１６Ｅ／Ｎ２９Ｙ／Ｆ４３Ｅ／Ｑ１９２Ｎ／Ｖ２２２Ｄ／Ｎ３１９Ｒ／Ｒ５４９Ｗ／Ｒ６３７Ｌ、Ａ１６Ｅ／Ｎ２９Ｙ／Ｓ９２Ｄ／Ｎ３１９Ｒ／Ｒ５４９Ｗ、Ａ１６Ｅ／Ｎ２９Ｙ／Ｑ１９２Ｎ／Ｖ２２２Ｄ／Ｍ２７９Ｔ／Ｒ５４９Ｗ、Ａ１６Ｅ／Ｎ２９Ｙ／Ｑ１９２Ｎ／Ｒ５４９Ｗ、Ａ１６Ｅ／Ｎ２９Ｙ／Ｓ２２０Ｅ／Ｖ２２２Ｄ／Ｎ５９７Ｄ／Ｎ５９８Ｌ、Ａ１６Ｅ／Ｎ２９Ｙ／Ｒ５４９Ｗ／Ｒ６３７Ｌ、Ａ１６Ｅ／Ｋ３６Ｐ／Ｆ４３Ａ／Ｑ１９２Ｎ／Ｎ５９７Ｄ／Ｒ６３７Ｌ、Ａ１６Ｅ／Ｋ３６Ｐ／Ｓ９２Ｄ／Ｓ２２０Ｅ／Ｖ２２２Ｄ／Ｍ２７９Ｔ／Ｒ５４９Ｗ、Ａ１６Ｅ／Ｋ３６Ｐ／Ｑ１９２Ｎ／Ｒ５４９Ｗ／Ｎ５９７Ｄ／Ｎ５９８Ｌ／Ｒ６３７Ｌ、Ａ１６Ｅ／Ｋ３６Ｐ／Ｎ３１９Ｒ／Ｒ５４９Ｗ／Ｎ５９７Ｄ／Ｎ５９８Ｌ／Ｒ６３７Ｌ、Ａ１６Ｅ／Ｆ４３Ａ／Ｓ９２Ｄ／Ｖ２２２Ｄ／Ｎ５９７Ｄ／Ｎ５９８Ｌ、Ａ１６Ｅ／Ｆ４３Ａ／Ｓ２２０Ｅ／Ｒ５４９Ｗ／Ｒ６３７Ｌ、Ａ１６Ｅ／Ｆ４３Ａ／Ｍ２７９Ｔ／Ｒ５４９Ｗ／Ｎ５９７Ｄ、Ａ１６Ｅ／Ｆ４３Ｅ／Ｉ５６Ｖ／Ｑ１９２Ｎ／Ｒ５４９Ｗ／Ｎ５９７Ｄ／Ｎ５９８Ｌ／Ｒ６３７Ｌ、Ａ１６Ｅ／Ｆ４３Ｅ／Ｑ１９２Ｎ／Ｒ５４９Ｗ、Ａ１６Ｅ／Ｆ４３Ｅ／Ｍ２７９Ｔ／Ｎ３１９Ｒ／Ｎ５９７Ｄ、Ａ１６Ｅ／Ｆ４３Ｅ／Ｎ５９７Ｄ、Ａ１６Ｅ／Ｓ９２Ｄ／Ｑ１９２Ｎ／Ｍ２７９Ｔ／Ｎ３１９Ｒ／Ｒ５４９Ｗ／Ｒ６３７Ｌ、Ａ１６Ｅ／Ｓ９２Ｄ／Ｓ２２０Ｅ／Ｒ５４９Ｗ、Ａ１６Ｅ／Ｑ１９２Ｎ／Ｎ３１９Ｒ／Ｒ５４９Ｗ／Ｒ６３７Ｌ、Ａ１６Ｅ／Ｑ１９２Ｎ／Ｒ５４９Ｗ、Ａ１６Ｅ／Ｓ２２０Ｅ／Ｖ２２２Ｄ／Ｍ２７９Ｔ／Ｒ５４９Ｗ／Ｎ５９８Ｌ／Ｒ６３７Ｌ、Ａ１６Ｅ／Ｓ２２０Ｅ／Ｍ２７９Ｔ／Ｒ５４９Ｗ、Ａ１６Ｅ／Ｓ２２０Ｅ／Ｎ３１９Ｒ／Ｒ５４９Ｗ／Ｎ５９７Ｄ／Ｎ５９８Ｌ、Ａ１６Ｅ／Ｖ２２２Ｄ／Ｎ３１９Ｒ／Ｎ５９７Ｄ／Ｎ５９８Ｌ、Ａ１６Ｅ／Ｖ２２２Ｄ／Ｒ６３７Ｌ、Ａ１６Ｅ／Ｍ２７９Ｔ／Ｎ３１９Ｒ／Ｒ５４９Ｗ／Ｎ５９７Ｄ／Ｒ６３７Ｌ、Ａ１６Ｅ／Ｍ２７９Ｔ／Ｎ５９７Ｄ、Ａ１６Ｅ／Ｎ３１９Ｒ／Ｎ５９７Ｄ、Ａ１６Ｅ／Ｎ３１９Ｒ／Ｎ５９７Ｄ／Ｎ５９８Ｌ、Ａ１６Ｅ／Ｒ５４９Ｗ、Ａ１６Ｅ／Ｒ５４９Ｗ／Ｎ５９８Ｌ、Ａ１６Ｅ／Ｎ５９７Ｄ、Ａ１６Ｓ／Ｎ２９Ｔ／Ｓ９２Ｄ／Ｒ５４９Ｗ／Ｒ６３７Ｌ、Ａ１６Ｓ／Ｎ２９Ｙ／Ｓ９２Ｄ／Ｑ１９２Ｎ／Ｒ５４９Ｗ／Ｒ６３７Ｌ、Ａ１６Ｓ／Ｆ４３Ｅ／Ｎ３１９Ｒ／Ｒ５４９Ｗ／Ｎ５９８Ｌ、Ａ１６Ｓ／Ｓ９２Ｄ／Ｑ１９２Ｎ／Ｍ２７９Ｔ／Ｒ６３７Ｌ、Ａ１６Ｓ／Ｓ９２Ｄ／Ｎ３１９Ｒ／Ｎ５９７Ｄ／Ｒ６３７Ｌ、Ａ１６Ｓ／Ｍ２７９Ｔ／Ｒ５４９Ｗ／Ｎ５９７Ｄ／Ｎ５９８Ｌ／Ｒ６３７Ｌ、Ｎ２９Ｈ／Ｔ６３Ｖ／Ｎ１３４Ａ／Ｔ５２０Ａ／Ｎ５９７Ｄ／Ｎ５９８Ｅ、Ｎ２９Ｈ／Ｔ６３Ｖ／Ｔ５２０Ａ／Ｓ５３７Ｇ／Ｎ５３８Ｄ／Ｎ５９８Ｅ、Ｎ２９Ｈ／Ｎ１３４Ａ／Ｎ２３７Ｄ／Ｓ５３７Ｇ／Ｎ５３８Ｄ／Ｓ５６７Ｍ／Ｋ５７１Ａ、Ｎ２９Ｈ／Ｎ２３７Ｄ／Ｔ５２０Ａ、Ｎ２９Ｈ／Ｎ２３７Ｄ／Ｔ５２０Ａ／Ｎ５３８Ｄ、Ｎ２９Ｈ／Ｎ２３７Ｄ／Ｓ５６７Ｍ／Ｎ５９８Ｅ、Ｎ２９Ｈ／Ｎ２３７Ｄ／Ｎ５９７Ｄ、Ｎ２９Ｈ／Ｎ５９７Ｄ／Ｎ５９８Ｅ、Ｋ３６Ｐ／Ｓ９２Ｄ／Ｒ５４９Ｗ、Ｋ３６Ｖ／Ｎ１３４Ａ／Ｎ２３７Ｄ／Ｔ５２０Ａ／Ｓ５３７Ｇ／Ｎ５３８Ｄ／Ｋ５７１Ａ、Ｋ３６Ｖ／Ｎ１３４Ａ／Ｎ２３７Ｄ／Ｓ５６７Ｍ／Ｋ５７１Ａ／Ｎ５９７Ｄ／Ｎ５９８Ｅ、Ｋ３６Ｖ／Ｔ５２０Ａ／Ｓ５３７Ｇ／Ｎ５３８Ｄ／Ｎ５９７Ｄ、Ｆ４３Ｑ／Ａ４６Ｖ／Ｉ５６Ｆ／Ｑ１４８Ａ／Ｓ２５８Ｌ／Ｍ２７９Ｌ／Ｓ３６３Ｌ／Ｒ５４９Ｇ／Ｋ５７１Ａ、Ｆ４３Ｑ／Ａ４６Ｖ／Ｔ６３Ｖ／Ｓ２５８Ｌ／Ｒ２９５Ｑ／Ｓ４２６Ｌ／Ｒ５６０Ｗ／Ｓ５６７Ｍ／Ｋ５７１Ａ、Ｆ４３Ｑ／Ａ４６Ｖ／Ｅ１９６Ｄ／Ｎ３１９Ｓ／Ｒ５４９Ｇ／Ｒ５６０Ｗ／Ｓ５６７Ｍ、Ｆ４３Ｑ／Ｍ２７９Ｌ／Ｒ５４９Ｇ／Ｒ５６０Ｗ／Ｓ５６７Ｍ、Ａ４６Ｖ／Ｒ２９５Ｔ／Ｎ３１９Ｓ／Ｓ４２６Ｌ、Ａ４６Ｖ／Ｒ５６０Ｗ、Ｔ９５Ｅ、Ｎ１３４Ａ／Ｎ２３７Ｄ／Ｔ５２０Ａ／Ｎ５９７Ｄ、Ｎ１３４Ａ／Ｔ５２０Ａ／Ｎ５９７Ｄ／Ｎ５９８Ｅ、Ｓ２２０Ｅ／Ｖ２２２Ｄ／Ｎ５９７Ｄ／Ｒ６３７Ｌ、Ｓ２２０Ｅ／Ｖ２９６Ｓ／Ｅ４０７Ｉ／Ｔ４６５Ｇ、Ｋ２２４Ｄ、Ｎ２３７Ｄ／Ｔ５２０Ａ、Ｎ２３７Ｄ／Ｔ５２０Ａ／Ｓ５３７Ｇ／Ｎ５３８Ｄ／Ｎ５９８Ｅ、Ｎ２３７Ｄ／Ｔ５２０Ａ／Ｓ５３７Ｇ／Ｎ５９８Ｅ、Ｎ２３７Ｄ／Ｔ５２０Ａ／Ｎ５３８Ｄ／Ｎ５９７Ｄ、Ｎ２３７Ｄ／Ｔ５２０Ａ／Ｓ５６７Ｍ／Ｋ５７１Ａ／Ｎ５９７Ｄ、Ｎ２３７Ｄ／Ｔ５２０Ａ／Ｎ５９７Ｄ／Ｎ５９８Ｅ、Ｎ２３７Ｄ／Ｎ５３８Ｄ／Ｎ５９７Ｄ／Ｎ５９８Ｅ、Ｎ２３７Ｄ／Ｋ５７１Ａ、Ｎ２３７Ｄ／Ｎ５９７Ｄ／Ｎ５９８Ｅ、Ｍ２７９Ｌ／Ｎ３１９Ｓ／Ｒ５６０Ｗ、Ｇ２９４Ｅ、Ｒ２９５Ｑ／Ｒ５４９Ｇ／Ｒ５６０Ｗ、Ｋ３４３Ｇ、Ｓ４３３Ｇ、Ｔ４６５Ｇ、Ｔ４８３Ｒ、Ｋ４８６Ｐ、Ｔ５２０Ａ／Ｋ５７１Ａ／Ｎ５９８Ｅ、Ｔ５２０Ａ／Ｎ５９７Ｄ／Ｎ５９８Ｅ、Ｒ５４９Ｇ／Ｎ５９８Ｅ、Ｋ５５６Ａ、Ｋ５５６Ｓ、Ｋ５５６Ｖ、Ｓ５６４Ｄ、Ｓ５６４Ｅ、Ｓ５６４Ｔ、Ｓ５６４Ｗ、Ｓ５６７Ｍ／Ｋ５７１Ａ／Ｎ５９７Ｄ、Ｓ５６８Ｅ、Ｓ５６８Ｐ、およびＳ６０９Ｄから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号９２８を基準にして番号が付けられている。
【００１３】
一部の追加の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、配列番号９２８に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたガラクトースオキシダーゼは、４／４３／４６／４２６／５４９／５６０、３６／６３／５２０、９５、３９４、４８３、５２０／５９７、５５６、５６２、５６８および５９８から選択されるポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号９２８を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、４Ｑ／４３Ｑ／４６Ｖ／４２６Ｌ／５４９Ｇ／５６０Ｗ、３６Ｖ／６３Ｖ／５２０Ａ、９５Ｖ、３９４Ａ、４８３Ｒ、５２０Ａ／５９７Ｄ、５５６Ｖ、５６２Ｄ、５６８Ｄ、５６８Ｐおよび５９８Ｅから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号９２８を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、Ａ４Ｑ／Ｆ４３Ｑ／Ａ４６Ｖ／Ｓ４２６Ｌ／Ｒ５４９Ｇ／Ｒ５６０Ｗ、Ｋ３６Ｖ／Ｔ６３Ｖ／Ｔ５２０Ａ、Ｔ９５Ｖ、Ｋ３９４Ａ、Ｔ４８３Ｒ、Ｔ５２０Ａ／Ｎ５９７Ｄ、Ｋ５５６Ｖ、Ｔ５６２Ｄ、Ｓ５６８Ｄ、Ｓ５６８ＰおよびＮ５９８Ｅから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号９２８を基準にして番号が付けられている。
【００１４】
一部の追加の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、配列番号９２８に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたガラクトースオキシダーゼは、６３／１９６、１７３、１８９、１９４、１９６、１９７、１９８、１９８／４４７、２２０／２９４／２９６／３３２、２２０／２９４／４６５、２９０、２９２、２９４／４０７／４６５、３２７、４０７／４６５および６３８から選択されるポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号９２８を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、６３Ａ／１９６Ｌ、１７３Ｓ、１７３Ｖ、１８９Ａ、１９４Ｒ、１９４Ｖ、１９４Ｗ、１９６Ａ、１９６Ｇ、１９６Ｉ、１９６Ｌ、１９６Ｑ、１９６Ｒ、１９６Ｖ、１９７Ａ、１９７Ｅ、１９７Ｐ、１９７Ｑ、１９７Ｒ、１９８Ｇ、１９８Ｔ、１９８Ｔ／４４７Ｉ、２２０Ｅ／２９４Ｅ／２９６Ｓ／３３２Ｑ、２２０Ｍ／２９４Ｅ／４６５Ｇ、２９０Ａ、２９０Ｇ、２９２Ｇ、２９４Ｅ／４０７Ｍ／４６５Ｇ、３２７Ｒ、４０７Ｖ／４６５Ｇ、および６３８Ａから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号９２８を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、Ｔ６３Ａ／Ｅ１９６Ｌ、Ａ１７３Ｓ、Ａ１７３Ｖ、Ｓ１８９Ａ、Ａ１９４Ｒ、Ａ１９４Ｖ、Ａ１９４Ｗ、Ｅ１９６Ａ、Ｅ１９６Ｇ、Ｅ１９６Ｉ、Ｅ１９６Ｌ、Ｅ１９６Ｑ、Ｅ１９６Ｒ、Ｅ１９６Ｖ、Ｇ１９７Ａ、Ｇ１９７Ｅ、Ｇ１９７Ｐ、Ｇ１９７Ｑ、Ｇ１９７Ｒ、Ｓ１９８Ｇ、Ｓ１９８Ｔ、Ｓ１９８Ｔ／Ｖ４４７Ｉ、Ｓ２２０Ｅ／Ｇ２９４Ｅ／Ｖ２９６Ｓ／Ｓ３３２Ｑ、Ｓ２２０Ｍ／Ｇ２９４Ｅ／Ｔ４６５Ｇ、Ｓ２９０Ａ、Ｓ２９０Ｇ、Ｓ２９２Ｇ、Ｇ２９４Ｅ／Ｅ４０７Ｍ／Ｔ４６５Ｇ、Ｑ３２７Ｒ、Ｅ４０７Ｖ／Ｔ４６５Ｇ、およびＶ６３８Ａから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号９２８を基準にして番号が付けられている。
【００１５】
一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、配列番号９３２に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたガラクトースオキシダーゼは、１６／４３／２２０／２５８／５３８／６３７、１６／２５８／４２６／４６５／５３８／５４９／６３７、１８、２４／２２２／２３７／５２０／５３８、２４／２２２／５２０、４３／２２２／２３７／２５８／４２６／５９７、４３／２５８／４０７／４２６／４６５／５３８／５４９／６３７、６３、６３／９５／１７３／３４３／５６４／５６８／６０９、９５／１７３／２５８／４２６／５５６／５６４、９５／１７３／５５６／６０９、１７３／５５６、１９４、２２０／２９４／２９５／３１９／４０７／４２６／４６５／５３８／５４９／６３７、２２２／２３７、２２２／５２０／５９７、２３７／２５８／５４９／５９７、２３７／２６５／２７９、２５８／２６７、２５８／３１９／４２６／４６５／５４９／６３７、２５８／４２６、および２５８／５３８／５４９／６３７から選択されるポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号９３２を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、１６Ｅ／４３Ａ／２２０Ｍ／２５８Ｓ／５３８Ｄ／６３７Ｌ、１６Ｅ／２５８Ｓ／４２６Ｓ／４６５Ｇ／５３８Ｄ／５４９Ｗ／６３７Ｌ、１８Ｋ、２４Ｐ／２２２Ｄ／２３７Ｄ／５２０Ａ／５３８Ｄ、２４Ｐ／２２２Ｄ／５２０Ａ、４３Ａ／２５８Ｓ／４０７Ｉ／４２６Ｓ／４６５Ｇ／５３８Ｄ／５４９Ｗ／６３７Ｌ、４３Ｅ／２２２Ｄ／２３７Ｄ／２５８Ｓ／４２６Ｓ／５９７Ｄ、６３Ｔ、６３Ｔ／９５Ｅ／１７３Ｓ／３４３Ｇ／５６４Ｄ／５６８Ｐ／６０９Ｄ、９５Ｅ／１７３Ｓ／５５６Ｖ／６０９Ｄ、９５Ｖ／１７３Ｓ／２５８Ｓ／４２６Ｓ／５５６Ｖ／５６４Ｗ、１７３Ｓ／５５６Ｖ、１９４Ｒ、２２０Ｍ／２９４Ｅ／２９５Ｓ／３１９Ｓ／４０７Ｉ／４２６Ｓ／４６５Ｇ／５３８Ｄ／５４９Ｗ／６３７Ｌ、２２２Ｄ／２３７Ｄ、２２２Ｄ／５２０Ａ／５９７Ｄ、２３７Ｄ／２５８Ｓ／５４９Ｇ／５９７Ｄ、２３７Ｄ／２６５Ｓ／２７９Ｌ、２５８Ｓ／２６７Ｔ、２５８Ｓ／３１９Ｓ／４２６Ｓ／４６５Ｇ／５４９Ｗ／６３７Ｌ、２５８Ｓ／４２６Ｓ、および２５８Ｓ／５３８Ｄ／５４９Ｗ／６３７Ｌから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号９３２を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、Ａ１６Ｅ／Ｑ４３Ａ／Ｓ２２０Ｍ／Ｌ２５８Ｓ／Ｎ５３８Ｄ／Ｒ６３７Ｌ、Ａ１６Ｅ／Ｌ２５８Ｓ／Ｌ４２６Ｓ／Ｔ４６５Ｇ／Ｎ５３８Ｄ／Ｒ５４９Ｗ／Ｒ６３７Ｌ、Ｔ１８Ｋ、Ｓ２４Ｐ／Ｖ２２２Ｄ／Ｎ２３７Ｄ／Ｔ５２０Ａ／Ｎ５３８Ｄ、Ｓ２４Ｐ／Ｖ２２２Ｄ／Ｔ５２０Ａ、Ｑ４３Ａ／Ｌ２５８Ｓ／Ｅ４０７Ｉ／Ｌ４２６Ｓ／Ｔ４６５Ｇ／Ｎ５３８Ｄ／Ｒ５４９Ｗ／Ｒ６３７Ｌ、Ｑ４３Ｅ／Ｖ２２２Ｄ／Ｎ２３７Ｄ／Ｌ２５８Ｓ／Ｌ４２６Ｓ／Ｎ５９７Ｄ、Ｖ６３Ｔ、Ｖ６３Ｔ／Ｔ９５Ｅ／Ａ１７３Ｓ／Ｋ３４３Ｇ／Ｓ５６４Ｄ／Ｓ５６８Ｐ／Ｓ６０９Ｄ、Ｔ９５Ｅ／Ａ１７３Ｓ／Ｋ５５６Ｖ／Ｓ６０９Ｄ、Ｔ９５Ｖ／Ａ１７３Ｓ／Ｌ２５８Ｓ／Ｌ４２６Ｓ／Ｋ５５６Ｖ／Ｓ５６４Ｗ、Ａ１７３Ｓ／Ｋ５５６Ｖ、Ａ１９４Ｒ、Ｓ２２０Ｍ／Ｇ２９４Ｅ／Ｑ２９５Ｓ／Ｎ３１９Ｓ／Ｅ４０７Ｉ／Ｌ４２６Ｓ／Ｔ４６５Ｇ／Ｎ５３８Ｄ／Ｒ５４９Ｗ／Ｒ６３７Ｌ、Ｖ２２２Ｄ／Ｎ２３７Ｄ、Ｖ２２２Ｄ／Ｔ５２０Ａ／Ｎ５９７Ｄ、Ｎ２３７Ｄ／Ｌ２５８Ｓ／Ｒ５４９Ｇ／Ｎ５９７Ｄ、Ｎ２３７Ｄ／Ｐ２６５Ｓ／Ｍ２７９Ｌ、Ｌ２５８Ｓ／Ｍ２６７Ｔ、Ｌ２５８Ｓ／Ｎ３１９Ｓ／Ｌ４２６Ｓ／Ｔ４６５Ｇ／Ｒ５４９Ｗ／Ｒ６３７Ｌ、Ｌ２５８Ｓ／Ｌ４２６Ｓ、およびＬ２５８Ｓ／Ｎ５３８Ｄ／Ｒ５４９Ｗ／Ｒ６３７Ｌから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号９３２を基準にして番号が付けられている。
【００１６】
一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、配列番号１２６４に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたガラクトースオキシダーゼは、１８／９５／３２７／５４８、２８、３６、４３、４３／４６／５６／６３／１９１、４３／２３７／２７９／５３８／５９７／５９８、４３／２３７／２９４／５３８、４３／２３７／５２０、４３／２３７／５２０／５４９／５９８、４３／２３７／５２０／５９７、４３／２７９／２９４、４３／５３８、４３／５４９／５９７、５１／５５／１１１／１５０／３６７／５６４、５５、６１、９５／３２７／５４８、９９、１８３、１９８、２２４、２２９、２３７／５２０／５３８／５９７、２４３、２５２、２５８、２９１、２９５、３１２、３３５、３４２、３４３、３６７／３７１／５６４／５９４、３７１、３８４、４６８、４８５、５２０、５４４、５４９、５６４／６０４、５６７、５６８、５７０、５９４、５９６、６０４、６３５、および６３７から選択されるポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１２６４を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、１８Ｋ／９５Ｅ／３２７Ｒ／５４８Ｍ、２８Ｐ、２８Ｓ、３６Ｎ、４３Ｅ、４３Ｅ／２３７Ｄ／２７９Ｌ／５３８Ｄ／５９７Ｄ／５９８Ｅ、４３Ｅ／２３７Ｄ／２９４Ｅ／５３８Ｄ、４３Ｅ／２３７Ｄ／５２０Ａ、４３Ｅ／２３７Ｄ／５２０Ａ／５４９Ｇ／５９８Ｅ、４３Ｅ／２３７Ｄ／５２０Ａ／５９７Ｄ、４３Ｅ／２７９Ｌ／２９４Ｅ、４３Ｅ／５３８Ｄ、４３Ｅ／５４９Ｇ／５９７Ｄ、４３Ｆ／４６Ａ／５６Ｙ／６３Ｔ／１９１Ｖ、５１Ｐ／５５Ｗ／１１１Ｑ／１５０Ｐ／３６７Ｉ／５６４Ｄ、５５Ｍ、５５Ｒ、６１Ｅ、９５Ｅ／３２７Ｒ／５４８Ｍ、９９Ｈ、１８３Ｄ、１９８Ｒ、２２４Ｇ、２２９Ｓ、２３７Ｄ／５２０Ａ／５３８Ｄ／５９７Ｄ、２４３Ｋ、２４３Ｌ、２５２Ｇ、２５８Ｈ、２９１Ｖ、２９５Ｔ、３１２Ｔ、３３５Ｒ、３４２Ｒ、３４２Ｓ、３４３Ｓ、３６７Ｉ／３７１Ｄ／５６４Ｄ／５９４Ｑ、３７１Ａ、３７１Ｐ、３８４Ｇ、４６８Ｎ、４８５Ｌ、５２０Ｅ、５２０Ｎ、５４４Ｐ、５４９Ｅ、５４９Ｇ、５６４Ｋ／６０４Ｇ、５６７Ｇ、５６８Ａ、５７０Ｋ、５９４Ｃ、５９６Ｇ、６０４Ｍ、６３５Ｋ、６３７Ｎ、および６３７Ｗから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１２６４を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、Ｔ１８Ｋ／Ｖ９５Ｅ／Ｑ３２７Ｒ／Ｔ５４８Ｍ、Ｃ２８Ｐ、Ｃ２８Ｓ、Ｋ３６Ｎ、Ｑ４３Ｅ、Ｑ４３Ｅ／Ｎ２３７Ｄ／Ｍ２７９Ｌ／Ｎ５３８Ｄ／Ｎ５９７Ｄ／Ｎ５９８Ｅ、Ｑ４３Ｅ／Ｎ２３７Ｄ／Ｇ２９４Ｅ／Ｎ５３８Ｄ、Ｑ４３Ｅ／Ｎ２３７Ｄ／Ｔ５２０Ａ、Ｑ４３Ｅ／Ｎ２３７Ｄ／Ｔ５２０Ａ／Ｒ５４９Ｇ／Ｎ５９８Ｅ、Ｑ４３Ｅ／Ｎ２３７Ｄ／Ｔ５２０Ａ／Ｎ５９７Ｄ、Ｑ４３Ｅ／Ｍ２７９Ｌ／Ｇ２９４Ｅ、Ｑ４３Ｅ／Ｎ５３８Ｄ、Ｑ４３Ｅ／Ｒ５４９Ｇ／Ｎ５９７Ｄ、Ｑ４３Ｆ／Ｖ４６Ａ／Ｉ５６Ｙ／Ｖ６３Ｔ／Ｒ１９１Ｖ、Ｋ５１Ｐ／Ｔ５５Ｗ／Ｔ１１１Ｑ／Ｓ１５０Ｐ／Ｋ３６７Ｉ／Ｗ５６４Ｄ、Ｔ５５Ｍ、Ｔ５５Ｒ、Ｋ６１Ｅ、Ｖ９５Ｅ／Ｑ３２７Ｒ／Ｔ５４８Ｍ、Ｓ９９Ｈ、Ｒ１８３Ｄ、Ｓ１９８Ｒ、Ｋ２２４Ｇ、Ｃ２２９Ｓ、Ｎ２３７Ｄ／Ｔ５２０Ａ／Ｎ５３８Ｄ／Ｎ５９７Ｄ、Ｓ２４３Ｋ、Ｓ２４３Ｌ、Ｓ２５２Ｇ、Ｓ２５８Ｈ、Ｆ２９１Ｖ、Ｑ２９５Ｔ、Ｓ３１２Ｔ、Ｈ３３５Ｒ、Ｋ３４２Ｒ、Ｋ３４２Ｓ、Ｋ３４３Ｓ、Ｋ３６７Ｉ／Ｋ３７１Ｄ／Ｗ５６４Ｄ／Ｔ５９４Ｑ、Ｋ３７１Ａ、Ｋ３７１Ｐ、Ｃ３８４Ｇ、Ｓ４６８Ｎ、Ｙ４８５Ｌ、Ｔ５２０Ｅ、Ｔ５２０Ｎ、Ｒ５４４Ｐ、Ｒ５４９Ｅ、Ｒ５４９Ｇ、Ｗ５６４Ｋ／Ｓ６０４Ｇ、Ｍ５６７Ｇ、Ｓ５６８Ａ、Ｓ５７０Ｋ、Ｔ５９４Ｃ、Ｔ５９６Ｇ、Ｓ６０４Ｍ、Ｔ６３５Ｋ、Ｒ６３７Ｎ、およびＲ６３７Ｗから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１２６４を基準にして番号が付けられている。
【００１７】
一部の追加の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、配列番号１２６４に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたガラクトースオキシダーゼは、２８、２８／９９／５２０／６３７、５５／２９５、５５／３４２、５５／５６８、５５／５６８／５９４、５５／５６８／６３７、６１／２２４／３４３／５２０／６３７、９９／３４３／６３７、９９／５２０／６３７、９９／６３７、２２４／５２０／６３７、２９５／３４２、２９５／３４２／５６８、３４２／５６８、３４２／５９４、３４３／５２０／６３７、４０３／５２０／６３７、５２０／６３７、５６８／６３７、５９４、および６３７から選択されるポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１２６４を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、２８Ｐ、２８Ｐ／９９Ｈ／５２０Ｅ／６３７Ｎ、５５Ｒ／２９５Ｔ、５５Ｒ／３４２Ｓ、５５Ｒ／５６８Ａ、５５Ｒ／５６８Ａ／５９４Ｃ、５５Ｒ／５６８Ａ／６３７Ｗ、６１Ｅ／２２４Ｇ／３４３Ｓ／５２０Ｅ／６３７Ｎ、９９Ｈ／３４３Ｓ／６３７Ｎ、９９Ｈ／５２０Ｅ／６３７Ｎ、９９Ｈ／６３７Ｎ、２２４Ｇ／５２０Ｅ／６３７Ｎ、２９５Ｔ／３４２Ｓ、２９５Ｔ／３４２Ｓ／５６８Ａ、３４２Ｓ／５６８Ａ、３４２Ｓ／５９４Ｃ、３４３Ｓ／５２０Ｅ／６３７Ｎ、４０３Ｐ／５２０Ｅ／６３７Ｎ、５２０Ｅ／６３７Ｎ、５６８Ａ／６３７Ｗ、５９４Ｃ、および６３７Ｗから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１２６４を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、Ｃ２８Ｐ、Ｃ２８Ｐ／Ｓ９９Ｈ／Ｔ５２０Ｅ／Ｒ６３７Ｎ、Ｔ５５Ｒ／Ｑ２９５Ｔ、Ｔ５５Ｒ／Ｋ３４２Ｓ、Ｔ５５Ｒ／Ｓ５６８Ａ、Ｔ５５Ｒ／Ｓ５６８Ａ／Ｔ５９４Ｃ、Ｔ５５Ｒ／Ｓ５６８Ａ／Ｒ６３７Ｗ、Ｋ６１Ｅ／Ｋ２２４Ｇ／Ｋ３４３Ｓ／Ｔ５２０Ｅ／Ｒ６３７Ｎ、Ｓ９９Ｈ／Ｋ３４３Ｓ／Ｒ６３７Ｎ、Ｓ９９Ｈ／Ｔ５２０Ｅ／Ｒ６３７Ｎ、Ｓ９９Ｈ／Ｒ６３７Ｎ、Ｋ２２４Ｇ／Ｔ５２０Ｅ／Ｒ６３７Ｎ、Ｑ２９５Ｔ／Ｋ３４２Ｓ、Ｑ２９５Ｔ／Ｋ３４２Ｓ／Ｓ５６８Ａ、Ｋ３４２Ｓ／Ｓ５６８Ａ、Ｋ３４２Ｓ／Ｔ５９４Ｃ、Ｋ３４３Ｓ／Ｔ５２０Ｅ／Ｒ６３７Ｎ、Ｓ４０３Ｐ／Ｔ５２０Ｅ／Ｒ６３７Ｎ、Ｔ５２０Ｅ／Ｒ６３７Ｎ、Ｓ５６８Ａ／Ｒ６３７Ｗ、Ｔ５９４Ｃ、およびＲ６３７Ｗから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１２６４を基準にして番号が付けられている。
【００１８】
一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、配列番号１４１６に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたガラクトースオキシダーゼは、１３、１３／２６／１５６／２７４／３５９／４２９、１３／１５６／２６２／２７４／３１５、１３／１５６／２６２／３１５／４２９／４３７、１３／１５６／２７４／４３７／５６８／６０６、１３／２６２、１３／２６２／２７４／３８０、１３／２６２／２７４／５９５、１３／２６２／４３７／４８８、１３／２７４、１３／２７４／３１５／４３７、１３／２７４／３７３／４３７、１３／３２８／４３７、１３／３７３、１３／４３７、１３／４３７／５４１、２６／２６２／２７４／３１５／４３７、３５、３７、３７／８９、３７／８９／２７４、３７／２６３／２７４／３８０／５５９／５６１、３７／３８０、４５、４５／２６２／２７４／３７３／４３７、８９、８９／２６３／２７４／３８０、８９／２６３／５５９、８９／２７４／３８０、１０５、１５４、１５６、１５６／２７４／３１５、２００、２１７、２１７／２７４／３８０／５６１、２１７／２７４／４７８、２１７／３５４／３８０、２１７／３８０、２２４、２３９、２４１、２５３、２６２、２６２／２７４、２６２／２７４／３１５、２６２／２７４／４３７、２６２／３７３／５９５、２６２／３８０、２６２／４３７、２６２／５４１、２６３、２６３／２７４、２６３／２７４／３８０、２６３／３５４／３８０／５５９、２６３／３８０、２６３／３８０／４４１、２７４、２７４／３２８、２７４／３５４、２７４／３５９、２７４／３７３／４３７、２７４／３８０、２７４／３８０／４４１、２７４／３８０／５５９、２７４／３９３／４３７、２７４／４３７、２７４／４３７／５４１、２７４／４３７／５６８、３１５、３２８、３３６、３５４、３５４／３８０、３５９、３６６、３７３、３７３／５９５、３７５、３８０、３８０／４３７、３８０／５５９／５６１、３９３、４２９、４３７、４３８、４３９、４４１、４７８、４７８／５６１、４８８、５４１、５５０、５５９、５６１、５６８、５９５、６０５、６２７、および６４１から選択されるポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１４１６を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、１３Ａ／２６Ｍ／１５６Ｖ／２７４Ｇ／３５９Ｆ／４２９Ｖ、１３Ａ／１５６Ｌ／２６２Ｖ／２７４Ｇ／３１５Ｇ、１３Ａ／１５６Ｌ／２７４Ｇ／４３７Ｋ／５６８Ｋ／６０６Ｓ、１３Ａ／１５６Ｖ／２６２Ｖ／３１５Ｇ／４２９Ｖ／４３７Ｖ、１３Ａ／２７４Ｇ、１３Ａ／２７４Ｇ／３１５Ｇ／４３７Ｖ、１３Ｈ、１３Ｋ、１３Ｋ／２６２Ｖ、１３Ｋ／２６２Ｖ／２７４Ｎ／３８０Ｈ、１３Ｋ／２６２Ｖ／２７４Ｎ／５９５Ｗ、１３Ｋ／２６２Ｖ／４３７Ｌ／４８８Ｌ、１３Ｋ／２７４Ｎ／３７３Ｔ／４３７Ｃ、１３Ｋ／３２８Ｒ／４３７Ｃ、１３Ｋ／３７３Ｔ、１３Ｋ／４３７Ｌ、１３Ｋ／４３７Ｌ／５４１Ｒ、２６Ｍ／２６２Ｖ／２７４Ｇ／３１５Ｇ／４３７Ｒ、３５Ｄ、３７Ｉ、３７Ｍ、３７Ｍ／８９Ｒ、３７Ｍ／８９Ｒ／２７４Ｎ、３７Ｖ／３８０Ｋ、３７Ｙ、３７Ｙ／２６３Ｓ／２７４Ｎ／３８０Ｋ／５５９Ｓ／５６１Ｔ、４５Ｖ、４５Ｖ／２６２Ｖ／２７４Ｎ／３７３Ｔ／４３７Ｃ、８９Ｒ、８９Ｒ／２６３Ｓ／２７４Ｎ／３８０Ｋ、８９Ｒ／２６３Ｓ／２７４Ｎ／３８０Ｒ、８９Ｒ／２６３Ｓ／５５９Ｓ、８９Ｒ／２７４Ｎ／３８０Ｒ、１０５Ｒ、１５４Ｈ、１５６Ｌ、１５６Ｖ、１５６Ｖ／２７４Ｇ／３１５Ｇ、２００Ａ、２１７Ｐ、２１７Ｐ／２７４Ｎ／３８０Ｋ／５６１Ｔ、２１７Ｐ／２７４Ｎ／４７８Ｍ、２１７Ｐ／３５４Ｔ／３８０Ｋ、２１７Ｐ／３８０Ｌ、２１７Ｐ／３８０Ｒ、２２４Ｗ、２３９Ｍ、２４１Ｉ、２５３Ｖ、２６２Ｖ、２６２Ｖ／２７４Ｇ／３１５Ｇ、２６２Ｖ／２７４Ｇ／４３７Ｒ、２６２Ｖ／２７４Ｎ、２６２Ｖ／３７３Ｔ／５９５Ｗ、２６２Ｖ／３８０Ｈ、２６２Ｖ／４３７Ｃ、２６２Ｖ／５４１Ｒ、２６３Ｓ、２６３Ｓ／２７４Ｎ、２６３Ｓ／２７４Ｎ／３８０Ｌ、２６３Ｓ／２７４Ｎ／３８０Ｒ、２６３Ｓ／３５４Ｔ／３８０Ｋ／５５９Ｓ、２６３Ｓ／３８０Ｋ、２６３Ｓ／３８０Ｋ／４４１Ｉ、２７４Ｇ、２７４Ｇ／３５９Ｆ、２７４Ｇ／４３７Ｖ／５６８Ｋ、２７４Ｎ、２７４Ｎ／３２８Ｌ、２７４Ｎ／３５４Ｔ、２７４Ｎ／３７３Ｔ／４３７Ｌ、２７４Ｎ／３８０Ｈ、２７４Ｎ／３８０Ｋ、２７４Ｎ／３８０Ｒ／４４１Ｉ、２７４Ｎ／３８０Ｒ／５５９Ｓ、２７４Ｎ／３９３Ｐ／４３７Ｌ、２７４Ｎ／４３７Ｌ、２７４Ｎ／４３７Ｌ／５４１Ｒ、３１５Ｇ、３２８Ｋ、３２８Ｌ、３２８Ｒ、３３６Ｐ、３５４Ｄ、３５４Ｔ、３５４Ｔ／３８０Ｋ、３５９Ｆ、３６６Ｔ、３７３Ｔ、３７３Ｔ／５９５Ｗ、３７５Ｌ、３８０Ｈ、３８０Ｈ／４３７Ｃ、３８０Ｋ、３８０Ｋ／５５９Ｓ／５６１Ｔ、３８０Ｌ、３８０Ｒ、３９３Ｄ、３９３Ｇ、３９３Ｐ、３９３Ｔ、４２９Ｖ、４３７Ｃ、４３７Ｇ、４３７Ｌ、４３７Ｒ、４３７Ｖ、４３８Ｓ、４３９Ｇ、４４１Ｉ、４７８Ｌ、４７８Ｍ、４７８Ｍ／５６１Ｔ、４８８Ｌ、４８８Ｔ、５４１Ｒ、５５０Ｓ、５５９Ｓ、５６１Ｓ、５６１Ｔ、５６８Ｋ、５９５Ｗ、６０５Ｌ、６２７Ｒ、および６４１Ｄから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１４１６を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、Ｎ１３Ａ／Ｎ２６Ｍ／Ｑ１５６Ｖ／Ｑ２７４Ｇ／Ｙ３５９Ｆ／Ｔ４２９Ｖ、Ｎ１３Ａ／Ｑ１５６Ｌ／Ｉ２６２Ｖ／Ｑ２７４Ｇ／Ｎ３１５Ｇ、Ｎ１３Ａ／Ｑ１５６Ｌ／Ｑ２７４Ｇ／Ｙ４３７Ｋ／Ｓ５６８Ｋ／Ｑ６０６Ｓ、Ｎ１３Ａ／Ｑ１５６Ｖ／Ｉ２６２Ｖ／Ｎ３１５Ｇ／Ｔ４２９Ｖ／Ｙ４３７Ｖ、Ｎ１３Ａ／Ｑ２７４Ｇ、Ｎ１３Ａ／Ｑ２７４Ｇ／Ｎ３１５Ｇ／Ｙ４３７Ｖ、Ｎ１３Ｈ、Ｎ１３Ｋ、Ｎ１３Ｋ／Ｉ２６２Ｖ、Ｎ１３Ｋ／Ｉ２６２Ｖ／Ｑ２７４Ｎ／Ｐ３８０Ｈ、Ｎ１３Ｋ／Ｉ２６２Ｖ／Ｑ２７４Ｎ／Ｌ５９５Ｗ、Ｎ１３Ｋ／Ｉ２６２Ｖ／Ｙ４３７Ｌ／Ｎ４８８Ｌ、Ｎ１３Ｋ／Ｑ２７４Ｎ／Ｑ３７３Ｔ／Ｙ４３７Ｃ、Ｎ１３Ｋ／Ｇ３２８Ｒ／Ｙ４３７Ｃ、Ｎ１３Ｋ／Ｑ３７３Ｔ、Ｎ１３Ｋ／Ｙ４３７Ｌ、Ｎ１３Ｋ／Ｙ４３７Ｌ／Ｌ５４１Ｒ、Ｎ２６Ｍ／Ｉ２６２Ｖ／Ｑ２７４Ｇ／Ｎ３１５Ｇ／Ｙ４３７Ｒ、Ｎ３５Ｄ、Ｄ３７Ｉ、Ｄ３７Ｍ、Ｄ３７Ｍ／Ｙ８９Ｒ、Ｄ３７Ｍ／Ｙ８９Ｒ／Ｑ２７４Ｎ、Ｄ３７Ｖ／Ｐ３８０Ｋ、Ｄ３７Ｙ、Ｄ３７Ｙ／Ｐ２６３Ｓ／Ｑ２７４Ｎ／Ｐ３８０Ｋ／Ｇ５５９Ｓ／Ｉ５６１Ｔ、Ｇ４５Ｖ、Ｇ４５Ｖ／Ｉ２６２Ｖ／Ｑ２７４Ｎ／Ｑ３７３Ｔ／Ｙ４３７Ｃ、Ｙ８９Ｒ、Ｙ８９Ｒ／Ｐ２６３Ｓ／Ｑ２７４Ｎ／Ｐ３８０Ｋ、Ｙ８９Ｒ／Ｐ２６３Ｓ／Ｑ２７４Ｎ／Ｐ３８０Ｒ、Ｙ８９Ｒ／Ｐ２６３Ｓ／Ｇ５５９Ｓ、Ｙ８９Ｒ／Ｑ２７４Ｎ／Ｐ３８０Ｒ、Ｓ１０５Ｒ、Ａ１５４Ｈ、Ｑ１５６Ｌ、Ｑ１５６Ｖ、Ｑ１５６Ｖ／Ｑ２７４Ｇ／Ｎ３１５Ｇ、Ｇ２００Ａ、Ｄ２１７Ｐ、Ｄ２１７Ｐ／Ｑ２７４Ｎ／Ｐ３８０Ｋ／Ｉ５６１Ｔ、Ｄ２１７Ｐ／Ｑ２７４Ｎ／Ｖ４７８Ｍ、Ｄ２１７Ｐ／Ａ３５４Ｔ／Ｐ３８０Ｋ、Ｄ２１７Ｐ／Ｐ３８０Ｌ、Ｄ２１７Ｐ／Ｐ３８０Ｒ、Ｇ２２４Ｗ、Ｑ２３９Ｍ、Ｖ２４１Ｉ、Ｌ２５３Ｖ、Ｉ２６２Ｖ、Ｉ２６２Ｖ／Ｑ２７４Ｇ／Ｎ３１５Ｇ、Ｉ２６２Ｖ／Ｑ２７４Ｇ／Ｙ４３７Ｒ、Ｉ２６２Ｖ／Ｑ２７４Ｎ、Ｉ２６２Ｖ／Ｑ３７３Ｔ／Ｌ５９５Ｗ、Ｉ２６２Ｖ／Ｐ３８０Ｈ、Ｉ２６２Ｖ／Ｙ４３７Ｃ、Ｉ２６２Ｖ／Ｌ５４１Ｒ、Ｐ２６３Ｓ、Ｐ２６３Ｓ／Ｑ２７４Ｎ、Ｐ２６３Ｓ／Ｑ２７４Ｎ／Ｐ３８０Ｌ、Ｐ２６３Ｓ／Ｑ２７４Ｎ／Ｐ３８０Ｒ、Ｐ２６３Ｓ／Ａ３５４Ｔ／Ｐ３８０Ｋ／Ｇ５５９Ｓ、Ｐ２６３Ｓ／Ｐ３８０Ｋ、Ｐ２６３Ｓ／Ｐ３８０Ｋ／Ｔ４４１Ｉ、Ｑ２７４Ｇ、Ｑ２７４Ｇ／Ｙ３５９Ｆ、Ｑ２７４Ｇ／Ｙ４３７Ｖ／Ｓ５６８Ｋ、Ｑ２７４Ｎ、Ｑ２７４Ｎ／Ｇ３２８Ｌ、Ｑ２７４Ｎ／Ａ３５４Ｔ、Ｑ２７４Ｎ／Ｑ３７３Ｔ／Ｙ４３７Ｌ、Ｑ２７４Ｎ／Ｐ３８０Ｈ、Ｑ２７４Ｎ／Ｐ３８０Ｋ、Ｑ２７４Ｎ／Ｐ３８０Ｒ／Ｔ４４１Ｉ、Ｑ２７４Ｎ／Ｐ３８０Ｒ／Ｇ５５９Ｓ、Ｑ２７４Ｎ／Ｖ３９３Ｐ／Ｙ４３７Ｌ、Ｑ２７４Ｎ／Ｙ４３７Ｌ、Ｑ２７４Ｎ／Ｙ４３７Ｌ／Ｌ５４１Ｒ、Ｎ３１５Ｇ、Ｇ３２８Ｋ、Ｇ３２８Ｌ、Ｇ３２８Ｒ、Ａ３３６Ｐ、Ａ３５４Ｄ、Ａ３５４Ｔ、Ａ３５４Ｔ／Ｐ３８０Ｋ、Ｙ３５９Ｆ、Ｖ３６６Ｔ、Ｑ３７３Ｔ、Ｑ３７３Ｔ／Ｌ５９５Ｗ、Ｎ３７５Ｌ、Ｐ３８０Ｈ、Ｐ３８０Ｈ／Ｙ４３７Ｃ、Ｐ３８０Ｋ、Ｐ３８０Ｋ／Ｇ５５９Ｓ／Ｉ５６１Ｔ、Ｐ３８０Ｌ、Ｐ３８０Ｒ、Ｖ３９３Ｄ、Ｖ３９３Ｇ、Ｖ３９３Ｐ、Ｖ３９３Ｔ、Ｔ４２９Ｖ、Ｙ４３７Ｃ、Ｙ４３７Ｇ、Ｙ４３７Ｌ、Ｙ４３７Ｒ、Ｙ４３７Ｖ、Ｆ４３８Ｓ、Ａ４３９Ｇ、Ｔ４４１Ｉ、Ｖ４７８Ｌ、Ｖ４７８Ｍ、Ｖ４７８Ｍ／Ｉ５６１Ｔ、Ｎ４８８Ｌ、Ｎ４８８Ｔ、Ｌ５４１Ｒ、Ｔ５５０Ｓ、Ｇ５５９Ｓ、Ｉ５６１Ｓ、Ｉ５６１Ｔ、Ｓ５６８Ｋ、Ｌ５９５Ｗ、Ｆ６０５Ｌ、Ａ６２７Ｒ、およびＧ６４１Ｄから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１４１６を基準にして番号が付けられている。
【００１９】
一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、配列番号１５９８に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたガラクトースオキシダーゼは、１３／９９／１５６／２６２／４３７／５５９／６４１、１３／９９／１５６／３８０／４３７、１３／９９／１５６／３８０／４３７／５５９／５６３／６４１、１３／９９／２５７／２６２／２６３／５５９、１３／９９／２６２／２６３／３８０／４３７／５６３／６４１、１３／９９／２６３、１３／９９／２６３／３８０、１３／９９／２６３／３８０／４３７、１３／９９／２６３／３８０／４３７／６４１、１３／９９／３８０／４３７／５５９、１３／９９／４３７／５６３、１３／９９／５６３／６４１、１３／１５６／２６２／２６３／４３７／５５９、１３／１５６／２６３／４３７、１３／１５６／３８０、１３／２６２、１３／２６２／２６３、１３／２６２／２６３／３８０／４３７／５５９、１３／３８０／４３７、１３／３８０／４３７／５５９、１３／４３７、１３／４７０／５５９／５６３、２９、３０、４３／４６／５６／６３／９９／１５６／２６２／２６３／４０３／５５９／５６３、６２、９９、９９／１５６／２６２、９９／１５６／２６２／２６３／３８０／４３７／５５９、９９／１５６／２６２／２６３／４３７、９９／１５６／２６２／２６３／５５９、９９／１５６／２６３／５５９、９９／１５６／３８０、９９／１５６／３８０／４３７、９９／１５６／４３７、９９／２６２／２６３／４３７／５５９／６４１、９９／２６２／４３７／５５９、９９／２６３／４３７／５６３、９９／３８０／４３７／５５９／６４１、９９／３８０／５６３、９９／４３７、１０８、１４９、１７５、１７７、１８４、１９４、１９７、２０８、２３４、２５１、２５４、２６２、２６２／２６３、２６２／２６３／４３７／５５９、２６２／２６３／５５９／５６３、２６２／４３７／６４１、２６３／３８０、２６３／４３７／５５９／５６３、２７８、２８０、２８７、３５６、３７３、３８０、４０７、４０９、４６３、４６６、４８９、５５９／６４１、５６５、５６９、５９２、５９６、６０１、６１０、および６１５から選択されるポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１５９８を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、１３Ｋ／９９Ｈ／１５６Ｌ／２６２Ｖ／４３７Ｃ／５５９Ｓ／６４１Ｄ、１３Ｋ／９９Ｈ／１５６Ｌ／３８０Ｋ／４３７Ｃ、１３Ｋ／９９Ｈ／１５６Ｌ／３８０Ｋ／４３７Ｖ／５５９Ｓ／５６３Ａ／６４１Ｄ、１３Ｋ／９９Ｈ／２５７Ｒ／２６２Ｖ／２６３Ｓ／５５９Ｓ、１３Ｋ／９９Ｈ／２６２Ｖ／２６３Ｓ／３８０Ｋ／４３７Ｒ／５６３Ａ／６４１Ｄ、１３Ｋ／９９Ｈ／２６３Ｓ、１３Ｋ／９９Ｈ／２６３Ｓ／３８０Ｋ、１３Ｋ／９９Ｈ／２６３Ｓ／３８０Ｋ／４３７Ｖ、１３Ｋ／９９Ｈ／２６３Ｓ／３８０Ｋ／４３７Ｖ／６４１Ｄ、１３Ｋ／９９Ｈ／３８０Ｋ／４３７Ｒ／５５９Ｓ、１３Ｋ／９９Ｈ／４３７Ｖ／５６３Ａ、１３Ｋ／９９Ｈ／５６３Ａ／６４１Ｄ、１３Ｋ／１５６Ｌ／２６２Ｖ／２６３Ｓ／４３７Ｃ／５５９Ｓ、１３Ｋ／１５６Ｌ／２６３Ｓ／４３７Ｃ、１３Ｋ／１５６Ｌ／３８０Ｋ、１３Ｋ／２６２Ｖ、１３Ｋ／２６２Ｖ／２６３Ｓ、１３Ｋ／２６２Ｖ／２６３Ｓ／３８０Ｋ／４３７Ｖ／５５９Ｓ、１３Ｋ／３８０Ｋ／４３７Ｃ、１３Ｋ／３８０Ｋ／４３７Ｖ／５５９Ｓ、１３Ｋ／４３７Ｒ、１３Ｋ／４３７Ｖ、１３Ｋ／４７０Ｌ／５５９Ｓ／５６３Ａ、２９Ｖ、３０Ｅ、４３Ｆ／４６Ａ／５６Ｙ／６３Ｔ／９９Ｈ／１５６Ｌ／２６２Ｖ／２６３Ｓ／４０３Ｐ／５５９Ｓ／５６３Ａ、６２Ｄ、６２Ｇ、６２Ｑ、９９Ｈ、９９Ｈ／１５６Ｌ／２６２Ｖ、９９Ｈ／１５６Ｌ／２６２Ｖ／２６３Ｓ／３８０Ｋ／４３７Ｃ／５５９Ｓ、９９Ｈ／１５６Ｌ／２６２Ｖ／２６３Ｓ／３８０Ｋ／４３７Ｖ／５５９Ｓ、９９Ｈ／１５６Ｌ／２６２Ｖ／２６３Ｓ／４３７Ｃ、９９Ｈ／１５６Ｌ／２６２Ｖ／２６３Ｓ／５５９Ｓ、９９Ｈ／１５６Ｌ／２６３Ｓ／５５９Ｓ、９９Ｈ／１５６Ｌ／３８０Ｋ、９９Ｈ／１５６Ｌ／３８０Ｋ／４３７Ｖ、９９Ｈ／１５６Ｌ／４３７Ｖ、９９Ｈ／２６２Ｖ／２６３Ｓ／４３７Ｖ／５５９Ｓ／６４１Ｄ、９９Ｈ／２６２Ｖ／４３７Ｖ／５５９Ｓ、９９Ｈ／２６３Ｓ／４３７Ｒ／５６３Ａ、９９Ｈ／３８０Ｋ／４３７Ｃ／５５９Ｓ／６４１Ｄ、９９Ｈ／３８０Ｋ／５６３Ａ、９９Ｈ／４３７Ｖ、１０８Ｆ、１４９Ｎ、１４９Ｒ、１７５Ｇ、１７７Ｌ、１８４Ｌ、１９４Ｑ、１９７Ａ、１９７Ｐ、２０８Ｆ、２０８Ｌ、２３４Ｌ、２５１Ｖ、２５４Ｌ、２６２Ｖ、２６２Ｖ／２６３Ｓ、２６２Ｖ／２６３Ｓ／４３７Ｃ／５５９Ｓ、２６２Ｖ／２６３Ｓ／５５９Ｓ／５６３Ａ、２６２Ｖ／４３７Ｖ／６４１Ｄ、２６３Ｓ／３８０Ｋ、２６３Ｓ／４３７Ｖ／５５９Ｓ／５６３Ａ、２７８Ｌ、２８０Ｍ、２８０Ｎ、２８７Ｌ、３５６Ｓ、３７３Ｄ、３７３Ｋ、３８０Ｋ、４０７Ｑ、４０９Ｈ、４０９Ｒ、４６３Ｖ、４６６Ｖ、４８９Ｉ、４８９Ｌ、５５９Ｓ／６４１Ｄ、５６５Ｓ、５６９Ｌ、５９２Ｇ、５９２Ｋ、５９６Ｓ、６０１Ｇ、６０１Ｌ、６１０Ｖ、および６１５Ｉから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１５９８を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、Ｎ１３Ｋ／Ｓ９９Ｈ／Ｑ１５６Ｌ／Ｉ２６２Ｖ／Ｌ４３７Ｃ／Ｇ５５９Ｓ／Ｇ６４１Ｄ、Ｎ１３Ｋ／Ｓ９９Ｈ／Ｑ１５６Ｌ／Ｐ３８０Ｋ／Ｌ４３７Ｃ、Ｎ１３Ｋ／Ｓ９９Ｈ／Ｑ１５６Ｌ／Ｐ３８０Ｋ／Ｌ４３７Ｖ／Ｇ５５９Ｓ／Ｉ５６３Ａ／Ｇ６４１Ｄ、Ｎ１３Ｋ／Ｓ９９Ｈ／Ｓ２５７Ｒ／Ｉ２６２Ｖ／Ｐ２６３Ｓ／Ｇ５５９Ｓ、Ｎ１３Ｋ／Ｓ９９Ｈ／Ｉ２６２Ｖ／Ｐ２６３Ｓ／Ｐ３８０Ｋ／Ｌ４３７Ｒ／Ｉ５６３Ａ／Ｇ６４１Ｄ、Ｎ１３Ｋ／Ｓ９９Ｈ／Ｐ２６３Ｓ、Ｎ１３Ｋ／Ｓ９９Ｈ／Ｐ２６３Ｓ／Ｐ３８０Ｋ、Ｎ１３Ｋ／Ｓ９９Ｈ／Ｐ２６３Ｓ／Ｐ３８０Ｋ／Ｌ４３７Ｖ、Ｎ１３Ｋ／Ｓ９９Ｈ／Ｐ２６３Ｓ／Ｐ３８０Ｋ／Ｌ４３７Ｖ／Ｇ６４１Ｄ、Ｎ１３Ｋ／Ｓ９９Ｈ／Ｐ３８０Ｋ／Ｌ４３７Ｒ／Ｇ５５９Ｓ、Ｎ１３Ｋ／Ｓ９９Ｈ／Ｌ４３７Ｖ／Ｉ５６３Ａ、Ｎ１３Ｋ／Ｓ９９Ｈ／Ｉ５６３Ａ／Ｇ６４１Ｄ、Ｎ１３Ｋ／Ｑ１５６Ｌ／Ｉ２６２Ｖ／Ｐ２６３Ｓ／Ｌ４３７Ｃ／Ｇ５５９Ｓ、Ｎ１３Ｋ／Ｑ１５６Ｌ／Ｐ２６３Ｓ／Ｌ４３７Ｃ、Ｎ１３Ｋ／Ｑ１５６Ｌ／Ｐ３８０Ｋ、Ｎ１３Ｋ／Ｉ２６２Ｖ、Ｎ１３Ｋ／Ｉ２６２Ｖ／Ｐ２６３Ｓ、Ｎ１３Ｋ／Ｉ２６２Ｖ／Ｐ２６３Ｓ／Ｐ３８０Ｋ／Ｌ４３７Ｖ／Ｇ５５９Ｓ、Ｎ１３Ｋ／Ｐ３８０Ｋ／Ｌ４３７Ｃ、Ｎ１３Ｋ／Ｐ３８０Ｋ／Ｌ４３７Ｖ／Ｇ５５９Ｓ、Ｎ１３Ｋ／Ｌ４３７Ｒ、Ｎ１３Ｋ／Ｌ４３７Ｖ、Ｎ１３Ｋ／Ｐ４７０Ｌ／Ｇ５５９Ｓ／Ｉ５６３Ａ、Ｎ２９Ｖ、Ｋ３０Ｅ、Ｑ４３Ｆ／Ｖ４６Ａ／Ｉ５６Ｙ／Ｖ６３Ｔ／Ｓ９９Ｈ／Ｑ１５６Ｌ／Ｉ２６２Ｖ／Ｐ２６３Ｓ／Ｓ４０３Ｐ／Ｇ５５９Ｓ／Ｉ５６３Ａ、Ｔ６２Ｄ、Ｔ６２Ｇ、Ｔ６２Ｑ、Ｓ９９Ｈ、Ｓ９９Ｈ／Ｑ１５６Ｌ／Ｉ２６２Ｖ、Ｓ９９Ｈ／Ｑ１５６Ｌ／Ｉ２６２Ｖ／Ｐ２６３Ｓ／Ｐ３８０Ｋ／Ｌ４３７Ｃ／Ｇ５５９Ｓ、Ｓ９９Ｈ／Ｑ１５６Ｌ／Ｉ２６２Ｖ／Ｐ２６３Ｓ／Ｐ３８０Ｋ／Ｌ４３７Ｖ／Ｇ５５９Ｓ、Ｓ９９Ｈ／Ｑ１５６Ｌ／Ｉ２６２Ｖ／Ｐ２６３Ｓ／Ｌ４３７Ｃ、Ｓ９９Ｈ／Ｑ１５６Ｌ／Ｉ２６２Ｖ／Ｐ２６３Ｓ／Ｇ５５９Ｓ、Ｓ９９Ｈ／Ｑ１５６Ｌ／Ｐ２６３Ｓ／Ｇ５５９Ｓ、Ｓ９９Ｈ／Ｑ１５６Ｌ／Ｐ３８０Ｋ、Ｓ９９Ｈ／Ｑ１５６Ｌ／Ｐ３８０Ｋ／Ｌ４３７Ｖ、Ｓ９９Ｈ／Ｑ１５６Ｌ／Ｌ４３７Ｖ、Ｓ９９Ｈ／Ｉ２６２Ｖ／Ｐ２６３Ｓ／Ｌ４３７Ｖ／Ｇ５５９Ｓ／Ｇ６４１Ｄ、Ｓ９９Ｈ／Ｉ２６２Ｖ／Ｌ４３７Ｖ／Ｇ５５９Ｓ、Ｓ９９Ｈ／Ｐ２６３Ｓ／Ｌ４３７Ｒ／Ｉ５６３Ａ、Ｓ９９Ｈ／Ｐ３８０Ｋ／Ｌ４３７Ｃ／Ｇ５５９Ｓ／Ｇ６４１Ｄ、Ｓ９９Ｈ／Ｐ３８０Ｋ／Ｉ５６３Ａ、Ｓ９９Ｈ／Ｌ４３７Ｖ、Ａ１０８Ｆ、Ａ１４９Ｎ、Ａ１４９Ｒ、Ａ１７５Ｇ、Ｉ１７７Ｌ、Ｖ１８４Ｌ、Ａ１９４Ｑ、Ｇ１９７Ａ、Ｇ１９７Ｐ、Ｗ２０８Ｆ、Ｗ２０８Ｌ、Ｍ２３４Ｌ、Ｔ２５１Ｖ、Ｙ２５４Ｌ、Ｉ２６２Ｖ、Ｉ２６２Ｖ／Ｐ２６３Ｓ、Ｉ２６２Ｖ／Ｐ２６３Ｓ／Ｌ４３７Ｃ／Ｇ５５９Ｓ、Ｉ２６２Ｖ／Ｐ２６３Ｓ／Ｇ５５９Ｓ／Ｉ５６３Ａ、Ｉ２６２Ｖ／Ｌ４３７Ｖ／Ｇ６４１Ｄ、Ｐ２６３Ｓ／Ｐ３８０Ｋ、Ｐ２６３Ｓ／Ｌ４３７Ｖ／Ｇ５５９Ｓ／Ｉ５６３Ａ、Ｔ２７８Ｌ、Ｓ２８０Ｍ、Ｓ２８０Ｎ、Ｉ２８７Ｌ、Ｎ３５６Ｓ、Ｑ３７３Ｄ、Ｑ３７３Ｋ、Ｐ３８０Ｋ、Ｅ４０７Ｑ、Ｓ４０９Ｈ、Ｓ４０９Ｒ、Ｉ４６３Ｖ、Ｅ４６６Ｖ、Ｐ４８９Ｉ、Ｐ４８９Ｌ、Ｇ５５９Ｓ／Ｇ６４１Ｄ、Ｔ５６５Ｓ、Ｉ５６９Ｌ、Ｐ５９２Ｇ、Ｐ５９２Ｋ、Ｔ５９６Ｓ、Ｎ６０１Ｇ、Ｎ６０１Ｌ、Ｄ６１０Ｖ、およびＬ６１５Ｉから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１５９８を基準にして番号が付けられている。
【００２０】
一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、配列番号１８６６に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたガラクトースオキシダーゼは、２９／１４９／４６３／６０１、２９／１７７／１９７／５９２、２９／１７７／４６３、２９／１９７／５９２、２９／４６３、６２／２０８／４１７／６１５、６２／２８６／６１５、６２／３７３／４６６、６２／４６６、６２／４６６／５９７、１４９、１４９／２０８／６１５、１４９／４６３、１７７／１９４／１９７／４６３／５６５、１７７／１９７／４６３／５６５、１７７／２８０／４６３／５９４／６０１、１７７／４６３／５６５、１７７／４６３／５９２、１８４、１９７、１９７／２８０／４６３、１９７／４６３／５９２、１９７／４６６／５６９／５９６、２０８／２５１／２５９／２７８、２３４、２３４／３８４、２５１、２５１／３９９／６１５、２７８、３７３／４６６、３８４／５６９、３９９／６１５、４１７／６１５、４６３／５６５、４６６、５４６、５６９、および５６９／５９７から選択されるポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１８６６を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、２９Ｖ／１４９Ｎ／４６３Ｖ／６０１Ｌ、２９Ｖ／１７７Ｌ／１９７Ｐ／５９２Ｇ、２９Ｖ／１７７Ｌ／４６３Ｖ、２９Ｖ／１９７Ｐ／５９２Ｇ、２９Ｖ／４６３Ｖ、６２Ｄ／４６６Ｖ、６２Ｄ／４６６Ｖ／５９７Ａ、６２Ｇ／２０８Ｆ／４１７Ｌ／６１５Ｉ、６２Ｇ／２８６Ｃ／６１５Ｉ、６２Ｑ／３７３Ｄ／４６６Ｖ、６２Ｑ／４６６Ｖ、６２Ｑ／４６６Ｖ／５９７Ａ、１４９Ｎ／４６３Ｖ、１４９Ｒ、１４９Ｒ／２０８Ｆ／６１５Ｉ、１７７Ｌ／１９４Ｑ／１９７Ｐ／４６３Ｖ／５６５Ｓ、１７７Ｌ／１９７Ｐ／４６３Ｖ／５６５Ｓ、１７７Ｌ／２８０Ｎ／４６３Ｖ／５９４Ｍ／６０１Ｌ、１７７Ｌ／４６３Ｖ／５６５Ｓ、１７７Ｌ／４６３Ｖ／５９２Ｇ、１８４Ｌ、１９７Ａ、１９７Ａ／４６６Ｖ／５６９Ｌ／５９６Ｓ、１９７Ｐ／２８０Ｎ／４６３Ｖ、１９７Ｐ／４６３Ｖ／５９２Ｇ、２０８Ｆ／２５１Ｖ／２５９Ｎ／２７８Ｌ、２３４Ｌ、２３４Ｌ／３８４Ｎ、２５１Ｖ、２５１Ｖ／３９９Ｖ／６１５Ｉ、２７８Ｌ、３７３Ｄ／４６６Ｖ、３８４Ｎ／５６９Ｌ、３９９Ｖ／６１５Ｉ、４１７Ｌ／６１５Ｉ、４６３Ｖ／５６５Ｓ、４６６Ｖ、５４６Ｅ、５６９Ｌ、および５６９Ｌ／５９７Ａから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１８６６を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、Ｎ２９Ｖ／Ａ１４９Ｎ／Ｉ４６３Ｖ／Ｎ６０１Ｌ、Ｎ２９Ｖ／Ｉ１７７Ｌ／Ｇ１９７Ｐ／Ｐ５９２Ｇ、Ｎ２９Ｖ／Ｉ１７７Ｌ／Ｉ４６３Ｖ、Ｎ２９Ｖ／Ｇ１９７Ｐ／Ｐ５９２Ｇ、Ｎ２９Ｖ／Ｉ４６３Ｖ、Ｔ６２Ｄ／Ｅ４６６Ｖ、Ｔ６２Ｄ／Ｅ４６６Ｖ／Ｎ５９７Ａ、Ｔ６２Ｇ／Ｗ２０８Ｆ／Ｉ４１７Ｌ／Ｌ６１５Ｉ、Ｔ６２Ｇ／Ｔ２８６Ｃ／Ｌ６１５Ｉ、Ｔ６２Ｑ／Ｑ３７３Ｄ／Ｅ４６６Ｖ、Ｔ６２Ｑ／Ｅ４６６Ｖ、Ｔ６２Ｑ／Ｅ４６６Ｖ／Ｎ５９７Ａ、Ａ１４９Ｎ／Ｉ４６３Ｖ、Ａ１４９Ｒ、Ａ１４９Ｒ／Ｗ２０８Ｆ／Ｌ６１５Ｉ、Ｉ１７７Ｌ／Ａ１９４Ｑ／Ｇ１９７Ｐ／Ｉ４６３Ｖ／Ｔ５６５Ｓ、Ｉ１７７Ｌ／Ｇ１９７Ｐ／Ｉ４６３Ｖ／Ｔ５６５Ｓ、Ｉ１７７Ｌ／Ｓ２８０Ｎ／Ｉ４６３Ｖ／Ｔ５９４Ｍ／Ｎ６０１Ｌ、Ｉ１７７Ｌ／Ｉ４６３Ｖ／Ｔ５６５Ｓ、Ｉ１７７Ｌ／Ｉ４６３Ｖ／Ｐ５９２Ｇ、Ｖ１８４Ｌ、Ｇ１９７Ａ、Ｇ１９７Ａ／Ｅ４６６Ｖ／Ｉ５６９Ｌ／Ｔ５９６Ｓ、Ｇ１９７Ｐ／Ｓ２８０Ｎ／Ｉ４６３Ｖ、Ｇ１９７Ｐ／Ｉ４６３Ｖ／Ｐ５９２Ｇ、Ｗ２０８Ｆ／Ｔ２５１Ｖ／Ｄ２５９Ｎ／Ｔ２７８Ｌ、Ｍ２３４Ｌ、Ｍ２３４Ｌ／Ｃ３８４Ｎ、Ｔ２５１Ｖ、Ｔ２５１Ｖ／Ｔ３９９Ｖ／Ｌ６１５Ｉ、Ｔ２７８Ｌ、Ｑ３７３Ｄ／Ｅ４６６Ｖ、Ｃ３８４Ｎ／Ｉ５６９Ｌ、Ｔ３９９Ｖ／Ｌ６１５Ｉ、Ｉ４１７Ｌ／Ｌ６１５Ｉ、Ｉ４６３Ｖ／Ｔ５６５Ｓ、Ｅ４６６Ｖ、Ｋ５４６Ｅ、Ｉ５６９Ｌ、およびＩ５６９Ｌ／Ｎ５９７Ａから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１８６６を基準にして番号が付けられている。
【００２１】
一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、配列番号１９１２に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたガラクトースオキシダーゼは、３、４、９、１８、２６、２９、３０、３８、４０、４２、４３、４４、４８、５０、７５、７９、１３５、１３６、１４２、１５６、１５９、１６１、１９７、４８６および６０１から選択されるポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１９１２を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、３Ｋ、４Ｋ、９Ｌ、１８Ｓ、２６Ｃ、２６Ｈ、２６Ｔ、２９Ａ、２９Ｍ、２９Ｔ、２９Ｖ、２９Ｙ、３０Ｌ、３０Ｎ、３０Ｒ、３８Ｍ、４０Ｐ、４２Ｆ、４３Ｄ、４３Ｇ、４３Ｐ、４３Ｔ、４４Ｈ、４８Ｃ、４８Ｐ、５０Ｄ、５０Ｈ、５０Ｉ、５０Ｔ、５０Ｖ、７５Ｎ、７９Ａ、７９Ｐ、７９Ｓ、１３５Ｄ、１３６Ａ、１３６Ｇ、１４２Ｃ、１４２Ｇ、１４２Ｈ、１４２Ｓ、１４２Ｖ、１５６Ｌ、１５６Ｔ、１５９Ｇ、１５９Ｋ、１５９Ｓ、１６１Ｑ、１６１Ｖ、１９７Ｄ、１９７Ｌ、４８６Ａ、４８６Ｉ、４８６Ｌ、４８６Ｐ、４８６Ｒ、４８６Ｖ、および６０１Ｌから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１９１２を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、Ｓ３Ｋ、Ａ４Ｋ、Ａ９Ｌ、Ｔ１８Ｓ、Ｎ２６Ｃ、Ｎ２６Ｈ、Ｎ２６Ｔ、Ｎ２９Ａ、Ｎ２９Ｍ、Ｎ２９Ｔ、Ｎ２９Ｖ、Ｎ２９Ｙ、Ｋ３０Ｌ、Ｋ３０Ｎ、Ｋ３０Ｒ、Ｔ３８Ｍ、Ｗ４０Ｐ、Ｔ４２Ｆ、Ｑ４３Ｄ、Ｑ４３Ｇ、Ｑ４３Ｐ、Ｑ４３Ｔ、Ｙ４４Ｈ、Ｇ４８Ｃ、Ｇ４８Ｐ、Ｐ５０Ｄ、Ｐ５０Ｈ、Ｐ５０Ｉ、Ｐ５０Ｔ、Ｐ５０Ｖ、Ｑ７５Ｎ、Ｑ７９Ａ、Ｑ７９Ｐ、Ｑ７９Ｓ、Ｇ１３５Ｄ、Ｑ１３６Ａ、Ｑ１３６Ｇ、Ａ１４２Ｃ、Ａ１４２Ｇ、Ａ１４２Ｈ、Ａ１４２Ｓ、Ａ１４２Ｖ、Ｑ１５６Ｌ、Ｑ１５６Ｔ、Ｌ１５９Ｇ、Ｌ１５９Ｋ、Ｌ１５９Ｓ、Ｒ１６１Ｑ、Ｒ１６１Ｖ、Ｐ１９７Ｄ、Ｐ１９７Ｌ、Ｋ４８６Ａ、Ｋ４８６Ｉ、Ｋ４８６Ｌ、Ｋ４８６Ｐ、Ｋ４８６Ｒ、Ｋ４８６Ｖ、およびＮ６０１Ｌから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１９１２を基準にして番号が付けられている。
【００２２】
一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、配列番号１９１２に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたガラクトースオキシダーゼは、２９、２９／３０／５０／７９／１３６／１９７、２９／３０／５０／７９／１９７／４０７、２９／３０／７９／１３６／１５６／１９７、２９／３０／７９／１９７、２９／３０／７９／１９７／４０７、２９／３０／１３６／１９７／４０７／４８６、２９／３０／１３６／４０７、２９／３０／１９７、２９／３０／１９７／４０７、２９／５０／１９７／４０７／４８６、２９／１９７／４０７、２９／１９７／４０７／４８６、３０、３０／５０／７９／１３６／１５６／１９７、４３／１９７／４０７、５０／１３６／１９７／４８６、６５、７９、７９／１３６／１９７／４０７、７９／１５６／１９７／４０７、１３６、１３６／１９７／４０７、１３６／１９７／４８６、１５６／１６１／４８６、１９７、１９７／４０７、１９７／４８６、２７９／２９１／３７５／４２０／４２９／４３６／４５３／４６５、２７９／２９１／３７５／４６５／５３６／５３８、２７９／２９１／４６５、２７９／２９１／４６５／５３６、２７９／３７５／４２０／４２９／４５３／４６５／４７２／５３８、２７９／３７５／４２０／４６５、２７９／４６５、２９１／３７５／４２０／４３０／４６５／５３８、２９１／３７５／４３６／４６５／５３８、２９１／３７５／４５３／４６５、２９１／４２０／４６５／４８１／５３８、２９１／４２９／４６５、２９１／４５３／４６５／５３６／５３８、２９１／４６５、２９１／４６５／５３８、３７５／４２０／４６５、３７５／４２９／４５３／４６５、３７５／４６５、４２０／４３６／４６５、４２９／４６５、４５３／４６５、４５３／４６５／４７８／４８１、４６５、４６５／５３６／５３８、４８６、および６１５から選択されるポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１９１２を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、２９Ａ、２９Ａ／３０Ｎ／７９Ｅ／１３６Ｇ／１５６Ｃ／１９７Ｄ、２９Ａ／３０Ｒ／５０Ｖ／７９Ｓ／１３６Ｇ／１９７Ｄ、２９Ｉ、２９Ｉ／３０Ｎ／７９Ｓ／１９７Ｄ、２９Ｉ／３０Ｎ／７９Ｓ／１９７Ｄ／４０７Ｄ、２９Ｉ／３０Ｒ／１９７Ｄ／４０７Ｄ、２９Ｓ、２９Ｓ／３０Ｎ／５０Ｖ／７９Ｓ／１９７Ｄ／４０７Ｄ、２９Ｓ／３０Ｒ／７９Ｓ／１９７Ｄ、２９Ｓ／３０Ｒ／７９Ｓ／１９７Ｄ／４０７Ｄ、２９Ｓ／３０Ｒ／１３６Ｇ／１９７Ｄ／４０７Ｄ／４８６Ｓ、２９Ｓ／３０Ｒ／１３６Ｇ／４０７Ｄ、２９Ｓ／３０Ｒ／１９７Ｄ、２９Ｓ／５０Ｖ／１９７Ｄ／４０７Ｄ／４８６Ｓ、２９Ｓ／１９７Ｄ／４０７Ｄ、２９Ｓ／１９７Ｄ／４０７Ｄ／４８６Ｓ、２９Ｔ、３０Ｎ／５０Ｔ／７９Ｓ／１３６Ｇ／１５６Ｃ／１９７Ｄ、３０Ｒ、４３Ｄ／１９７Ｄ／４０７Ｄ、５０Ｖ／１３６Ｇ／１９７Ｄ／４８６Ｉ、６５Ａ、７９Ｓ、７９Ｓ／１３６Ｇ／１９７Ｄ／４０７Ｄ、７９Ｓ／１５６Ｃ／１９７Ｄ／４０７Ｄ、１３６Ｇ、１３６Ｇ／１９７Ｄ／４０７Ｄ、１３６Ｇ／１９７Ｄ／４８６Ｉ、１５６Ｍ／１６１Ａ／４８６Ａ、１９７Ｄ、１９７Ｄ／４０７Ｄ、１９７Ｄ／４８６Ｓ、２７９Ｌ／２９１Ｙ／３７５Ｄ／４２０Ｉ／４２９Ｖ／４３６Ｍ／４５３Ｖ／４６５Ｇ、２７９Ｌ／２９１Ｙ／３７５Ｄ／４６５Ｌ／５３６Ｎ／５３８Ｄ、２７９Ｌ／２９１Ｙ／４６５Ｌ、２７９Ｌ／２９１Ｙ／４６５Ｌ／５３６Ｎ、２７９Ｌ／３７５Ｄ／４２０Ｉ／４２９Ｖ／４５３Ｖ／４６５Ｌ／４７２Ｌ／５３８Ｄ、２７９Ｌ／３７５Ｄ／４２０Ｉ／４６５Ｇ、２７９Ｌ／４６５Ｇ、２７９Ｌ／４６５Ｌ、２９１Ｙ／３７５Ｄ／４２０Ｉ／４３０Ｉ／４６５Ｇ／５３８Ｄ、２９１Ｙ／３７５Ｄ／４３６Ｍ／４６５Ｇ／５３８Ｄ、２９１Ｙ／３７５Ｄ／４５３Ｖ／４６５Ｌ、２９１Ｙ／４２０Ｉ／４６５Ｌ／４８１Ｔ／５３８Ｄ、２９１Ｙ／４２９Ｖ／４６５Ｌ、２９１Ｙ／４５３Ｖ／４６５Ｌ／５３６Ｎ／５３８Ｄ、２９１Ｙ／４６５Ｌ、２９１Ｙ／４６５Ｌ／５３８Ｄ、３７５Ｄ／４２０Ｉ／４６５Ｇ、３７５Ｄ／４２０Ｉ／４６５Ｌ、３７５Ｄ／４２９Ｖ／４５３Ｖ／４６５Ｇ、３７５Ｄ／４６５Ｇ、３７５Ｄ／４６５Ｌ、４２０Ｉ／４３６Ｍ／４６５Ｌ、４２９Ｖ／４６５Ｇ、４５３Ｖ／４６５Ｇ、４５３Ｖ／４６５Ｇ／４７８Ｆ／４８１Ｔ、４５３Ｖ／４６５Ｌ、４６５Ｇ、４６５Ｇ／５３６Ｎ／５３８Ｄ、４８６Ｓ、および６１５Ｉから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１９１２を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、Ｎ２９Ａ、Ｎ２９Ａ／Ｋ３０Ｎ／Ｑ７９Ｅ／Ｑ１３６Ｇ／Ｑ１５６Ｃ／Ｐ１９７Ｄ、Ｎ２９Ａ／Ｋ３０Ｒ／Ｐ５０Ｖ／Ｑ７９Ｓ／Ｑ１３６Ｇ／Ｐ１９７Ｄ、Ｎ２９Ｉ、Ｎ２９Ｉ／Ｋ３０Ｎ／Ｑ７９Ｓ／Ｐ１９７Ｄ、Ｎ２９Ｉ／Ｋ３０Ｎ／Ｑ７９Ｓ／Ｐ１９７Ｄ／Ｑ４０７Ｄ、Ｎ２９Ｉ／Ｋ３０Ｒ／Ｐ１９７Ｄ／Ｑ４０７Ｄ、Ｎ２９Ｓ、Ｎ２９Ｓ／Ｋ３０Ｎ／Ｐ５０Ｖ／Ｑ７９Ｓ／Ｐ１９７Ｄ／Ｑ４０７Ｄ、Ｎ２９Ｓ／Ｋ３０Ｒ／Ｑ７９Ｓ／Ｐ１９７Ｄ、Ｎ２９Ｓ／Ｋ３０Ｒ／Ｑ７９Ｓ／Ｐ１９７Ｄ／Ｑ４０７Ｄ、Ｎ２９Ｓ／Ｋ３０Ｒ／Ｑ１３６Ｇ／Ｐ１９７Ｄ／Ｑ４０７Ｄ／Ｋ４８６Ｓ、Ｎ２９Ｓ／Ｋ３０Ｒ／Ｑ１３６Ｇ／Ｑ４０７Ｄ、Ｎ２９Ｓ／Ｋ３０Ｒ／Ｐ１９７Ｄ、Ｎ２９Ｓ／Ｐ５０Ｖ／Ｐ１９７Ｄ／Ｑ４０７Ｄ／Ｋ４８６Ｓ、Ｎ２９Ｓ／Ｐ１９７Ｄ／Ｑ４０７Ｄ、Ｎ２９Ｓ／Ｐ１９７Ｄ／Ｑ４０７Ｄ／Ｋ４８６Ｓ、Ｎ２９Ｔ、Ｋ３０Ｎ／Ｐ５０Ｔ／Ｑ７９Ｓ／Ｑ１３６Ｇ／Ｑ１５６Ｃ／Ｐ１９７Ｄ、Ｋ３０Ｒ、Ｑ４３Ｄ／Ｐ１９７Ｄ／Ｑ４０７Ｄ、Ｐ５０Ｖ／Ｑ１３６Ｇ／Ｐ１９７Ｄ／Ｋ４８６Ｉ、Ｎ６５Ａ、Ｑ７９Ｓ、Ｑ７９Ｓ／Ｑ１３６Ｇ／Ｐ１９７Ｄ／Ｑ４０７Ｄ、Ｑ７９Ｓ／Ｑ１５６Ｃ／Ｐ１９７Ｄ／Ｑ４０７Ｄ、Ｑ１３６Ｇ、Ｑ１３６Ｇ／Ｐ１９７Ｄ／Ｑ４０７Ｄ、Ｑ１３６Ｇ／Ｐ１９７Ｄ／Ｋ４８６Ｉ、Ｑ１５６Ｍ／Ｒ１６１Ａ／Ｋ４８６Ａ、Ｐ１９７Ｄ、Ｐ１９７Ｄ／Ｑ４０７Ｄ、Ｐ１９７Ｄ／Ｋ４８６Ｓ、Ｍ２７９Ｌ／Ｆ２９１Ｙ／Ｎ３７５Ｄ／Ｌ４２０Ｉ／Ｔ４２９Ｖ／Ｌ４３６Ｍ／Ｔ４５３Ｖ／Ｔ４６５Ｇ、Ｍ２７９Ｌ／Ｆ２９１Ｙ／Ｎ３７５Ｄ／Ｔ４６５Ｌ／Ｄ５３６Ｎ／Ｎ５３８Ｄ、Ｍ２７９Ｌ／Ｆ２９１Ｙ／Ｔ４６５Ｌ、Ｍ２７９Ｌ／Ｆ２９１Ｙ／Ｔ４６５Ｌ／Ｄ５３６Ｎ、Ｍ２７９Ｌ／Ｎ３７５Ｄ／Ｌ４２０Ｉ／Ｔ４２９Ｖ／Ｔ４５３Ｖ／Ｔ４６５Ｌ／Ｆ４７２Ｌ／Ｎ５３８Ｄ、Ｍ２７９Ｌ／Ｎ３７５Ｄ／Ｌ４２０Ｉ／Ｔ４６５Ｇ、Ｍ２７９Ｌ／Ｔ４６５Ｇ、Ｍ２７９Ｌ／Ｔ４６５Ｌ、Ｆ２９１Ｙ／Ｎ３７５Ｄ／Ｌ４２０Ｉ／Ｖ４３０Ｉ／Ｔ４６５Ｇ／Ｎ５３８Ｄ、Ｆ２９１Ｙ／Ｎ３７５Ｄ／Ｌ４３６Ｍ／Ｔ４６５Ｇ／Ｎ５３８Ｄ、Ｆ２９１Ｙ／Ｎ３７５Ｄ／Ｔ４５３Ｖ／Ｔ４６５Ｌ、Ｆ２９１Ｙ／Ｌ４２０Ｉ／Ｔ４６５Ｌ／Ｑ４８１Ｔ／Ｎ５３８Ｄ、Ｆ２９１Ｙ／Ｔ４２９Ｖ／Ｔ４６５Ｌ、Ｆ２９１Ｙ／Ｔ４５３Ｖ／Ｔ４６５Ｌ／Ｄ５３６Ｎ／Ｎ５３８Ｄ、Ｆ２９１Ｙ／Ｔ４６５Ｌ、Ｆ２９１Ｙ／Ｔ４６５Ｌ／Ｎ５３８Ｄ、Ｎ３７５Ｄ／Ｌ４２０Ｉ／Ｔ４６５Ｇ、Ｎ３７５Ｄ／Ｌ４２０Ｉ／Ｔ４６５Ｌ、Ｎ３７５Ｄ／Ｔ４２９Ｖ／Ｔ４５３Ｖ／Ｔ４６５Ｇ、Ｎ３７５Ｄ／Ｔ４６５Ｇ、Ｎ３７５Ｄ／Ｔ４６５Ｌ、Ｌ４２０Ｉ／Ｌ４３６Ｍ／Ｔ４６５Ｌ、Ｔ４２９Ｖ／Ｔ４６５Ｇ、Ｔ４５３Ｖ／Ｔ４６５Ｇ、Ｔ４５３Ｖ／Ｔ４６５Ｇ／Ｖ４７８Ｆ／Ｑ４８１Ｔ、Ｔ４５３Ｖ／Ｔ４６５Ｌ、Ｔ４６５Ｇ、Ｔ４６５Ｇ／Ｄ５３６Ｎ／Ｎ５３８Ｄ、Ｋ４８６Ｓ、およびＬ６１５Ｉから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１９１２を基準にして番号が付けられている。
【００２３】
一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、配列番号２０８０に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたガラクトースオキシダーゼは、２４、４７、６３、７８、９５、１１９、１２１、１９７、２０７、２１４、２１９、２２０、２４９、２９４、３２４、３６５、４０８、４１４、４３７、４８０、４８５、５２０、５５６、５７１、５９８、６００および６２６から選択されるポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２０８０を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、２４Ｒ、４７Ｄ、４７Ｌ、６３Ｔ、７８Ｌ、９５Ｒ、１１９Ｑ、１２１Ｇ、１９７Ｅ、１９７Ｇ、１９７Ｈ、１９７Ｌ、１９７Ｍ、１９７Ｑ、１９７Ｒ、１９７Ｓ、１９７Ｗ、２０７Ｑ、２１４Ｌ、２１９Ｖ、２２０Ｑ、２２０Ｒ、２４９Ｎ、２９４Ｋ、３２４Ｇ、３６５Ｈ、４０８Ａ、４１４Ｌ、４３７Ｎ、４３７Ｒ、４８０Ｌ、４８５Ｌ、５２０Ｌ、５５６Ｓ、５７１Ｓ、５９８Ｔ、６００Ｄ、および６２６Ｗから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２０８０を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、Ｓ２４Ｒ、Ｎ４７Ｄ、Ｎ４７Ｌ、Ｖ６３Ｔ、Ｎ７８Ｌ、Ｖ９５Ｒ、Ｔ１１９Ｑ、Ｐ１２１Ｇ、Ｐ１９７Ｅ、Ｐ１９７Ｇ、Ｐ１９７Ｈ、Ｐ１９７Ｌ、Ｐ１９７Ｍ、Ｐ１９７Ｑ、Ｐ１９７Ｒ、Ｐ１９７Ｓ、Ｐ１９７Ｗ、Ｓ２０７Ｑ、Ｉ２１４Ｌ、Ｔ２１９Ｖ、Ｓ２２０Ｑ、Ｓ２２０Ｒ、Ｋ２４９Ｎ、Ｇ２９４Ｋ、Ａ３２４Ｇ、Ｄ３６５Ｈ、Ｄ４０８Ａ、Ｎ４１４Ｌ、Ｌ４３７Ｎ、Ｌ４３７Ｒ、Ｅ４８０Ｌ、Ｙ４８５Ｌ、Ｅ５２０Ｌ、Ｖ５５６Ｓ、Ａ５７１Ｓ、Ｎ５９８Ｔ、Ｇ６００Ｄ、およびＳ６２６Ｗから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２０８０を基準にして番号が付けられている。
【００２４】
一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、配列番号２０８０に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたガラクトースオキシダーゼは、１４／１３０／２５７／４７２、１４／２５７、２４、２９、２９／１３６、２９／１３６／１９７／４３６、２９／１３６／４３６、２９／１３６／４３６／４５３、２９／１９７、２９／１９７／３４２／４３６、２９／１９７／４３６、２９／１９７／４３６／４５３、２９／１９７／４５３、２９／４３６、２９／４３６／４７２、２９／４５３、２９／４７２、４３、６３、９５、１１９、１３０／４２１、１３６、１３６／１９７／４３６、１３６／１９７／４３６／４５３、１３６／４３６、１４４、１９７、１９７／４３６、１９７／４３６／４５３、１９７／４３６／４７２、１９７／４５３、２１４、２１９、２４９、２５７、２５７／４７２、２９７、３５９、４３６、４３７、４６０、４８５、４９５、５２０、５５６、５６０、５６７、および５９２から選択されるポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２０８０を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、１４Ｋ／２５７Ｅ、１４Ｔ／１３０Ｍ／２５７Ｑ／４７２Ｌ、１４Ｔ／２５７Ｑ、２４Ｑ、２９Ｉ、２９Ｉ／１３６Ｇ、２９Ｉ／１３６Ｇ／１９７Ｄ／４３６Ｍ、２９Ｉ／１３６Ｇ／４３６Ｍ、２９Ｉ／１９７Ｄ、２９Ｉ／１９７Ｄ／３４２Ｒ／４３６Ｍ、２９Ｉ／１９７Ｄ／４３６Ｍ、２９Ｉ／１９７Ｄ／４３６Ｍ／４５３Ｔ、２９Ｉ／１９７Ｄ／４５３Ｔ、２９Ｉ／４３６Ｍ、２９Ｓ／１３６Ｇ／１９７Ｄ／４３６Ｍ、２９Ｓ／１３６Ｇ／４３６Ｍ／４５３Ｔ、２９Ｓ／１９７Ｄ、２９Ｓ／１９７Ｄ／４３６Ｍ、２９Ｓ／１９７Ｄ／４３６Ｍ／４５３Ｔ、２９Ｓ／４３６Ｍ、２９Ｓ／４３６Ｍ／４７２Ｌ、２９Ｓ／４５３Ｔ、２９Ｓ／４７２Ｌ、４３Ｇ、６３Ｅ、６３Ｔ、９５Ｒ、１１９Ｍ、１３０Ｖ／４２１Ｎ、１３６Ｇ、１３６Ｇ／１９７Ｄ／４３６Ｍ、１３６Ｇ／１９７Ｄ／４３６Ｍ／４５３Ｔ、１３６Ｇ／４３６Ｍ、１４４Ｖ、１９７Ｄ、１９７Ｄ／４３６Ｍ、１９７Ｄ／４３６Ｍ／４５３Ｔ、１９７Ｄ／４３６Ｍ／４７２Ｌ、１９７Ｄ／４５３Ｔ、１９７Ｅ、１９７Ｇ、１９７Ｈ、１９７Ｌ、１９７Ｍ、１９７Ｑ、１９７Ｒ、１９７Ｓ、１９７Ｗ、２１４Ａ、２１９Ｖ、２４９Ｎ、２５７Ａ、２５７Ａ／４７２Ｌ、２９７Ｔ、３５９Ｌ、４３６Ｍ、４３７Ｇ、４３７Ｒ、４３７Ｙ、４６０Ｇ、４８５Ｒ、４９５Ｔ、５２０Ｙ、５５６Ｓ、５６０Ｇ、５６０Ｉ、５６７Ｓ、および５９２Ｈから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２０８０を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、Ｎ１４Ｋ／Ｓ２５７Ｅ、Ｎ１４Ｔ／Ｉ１３０Ｍ／Ｓ２５７Ｑ／Ｆ４７２Ｌ、Ｎ１４Ｔ／Ｓ２５７Ｑ、Ｓ２４Ｑ、Ｎ２９Ｉ、Ｎ２９Ｉ／Ｑ１３６Ｇ、Ｎ２９Ｉ／Ｑ１３６Ｇ／Ｐ１９７Ｄ／Ｌ４３６Ｍ、Ｎ２９Ｉ／Ｑ１３６Ｇ／Ｌ４３６Ｍ、Ｎ２９Ｉ／Ｐ１９７Ｄ、Ｎ２９Ｉ／Ｐ１９７Ｄ／Ｋ３４２Ｒ／Ｌ４３６Ｍ、Ｎ２９Ｉ／Ｐ１９７Ｄ／Ｌ４３６Ｍ、Ｎ２９Ｉ／Ｐ１９７Ｄ／Ｌ４３６Ｍ／Ｖ４５３Ｔ、Ｎ２９Ｉ／Ｐ１９７Ｄ／Ｖ４５３Ｔ、Ｎ２９Ｉ／Ｌ４３６Ｍ、Ｎ２９Ｓ／Ｑ１３６Ｇ／Ｐ１９７Ｄ／Ｌ４３６Ｍ、Ｎ２９Ｓ／Ｑ１３６Ｇ／Ｌ４３６Ｍ／Ｖ４５３Ｔ、Ｎ２９Ｓ／Ｐ１９７Ｄ、Ｎ２９Ｓ／Ｐ１９７Ｄ／Ｌ４３６Ｍ、Ｎ２９Ｓ／Ｐ１９７Ｄ／Ｌ４３６Ｍ／Ｖ４５３Ｔ、Ｎ２９Ｓ／Ｌ４３６Ｍ、Ｎ２９Ｓ／Ｌ４３６Ｍ／Ｆ４７２Ｌ、Ｎ２９Ｓ／Ｖ４５３Ｔ、Ｎ２９Ｓ／Ｆ４７２Ｌ、Ｑ４３Ｇ、Ｖ６３Ｅ、Ｖ６３Ｔ、Ｖ９５Ｒ、Ｔ１１９Ｍ、Ｉ１３０Ｖ／Ｇ４２１Ｎ、Ｑ１３６Ｇ、Ｑ１３６Ｇ／Ｐ１９７Ｄ／Ｌ４３６Ｍ、Ｑ１３６Ｇ／Ｐ１９７Ｄ／Ｌ４３６Ｍ／Ｖ４５３Ｔ、Ｑ１３６Ｇ／Ｌ４３６Ｍ、Ｉ１４４Ｖ、Ｐ１９７Ｄ、Ｐ１９７Ｄ／Ｌ４３６Ｍ、Ｐ１９７Ｄ／Ｌ４３６Ｍ／Ｖ４５３Ｔ、Ｐ１９７Ｄ／Ｌ４３６Ｍ／Ｆ４７２Ｌ、Ｐ１９７Ｄ／Ｖ４５３Ｔ、Ｐ１９７Ｅ、Ｐ１９７Ｇ、Ｐ１９７Ｈ、Ｐ１９７Ｌ、Ｐ１９７Ｍ、Ｐ１９７Ｑ、Ｐ１９７Ｒ、Ｐ１９７Ｓ、Ｐ１９７Ｗ、Ｉ２１４Ａ、Ｔ２１９Ｖ、Ｋ２４９Ｎ、Ｓ２５７Ａ、Ｓ２５７Ａ／Ｆ４７２Ｌ、Ｅ２９７Ｔ、Ｙ３５９Ｌ、Ｌ４３６Ｍ、Ｌ４３７Ｇ、Ｌ４３７Ｒ、Ｌ４３７Ｙ、Ｑ４６０Ｇ、Ｙ４８５Ｒ、Ａ４９５Ｔ、Ｅ５２０Ｙ、Ｖ５５６Ｓ、Ｗ５６０Ｇ、Ｗ５６０Ｉ、Ｍ５６７Ｓ、およびＧ５９２Ｈから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２０８０を基準にして番号が付けられている。
【００２５】
一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、配列番号２３００に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたガラクトースオキシダーゼは、２４、２４／５１／６３／１９７／３５９、２４／１１９／１９７、２４／１９７／２４９／４３７、４３／１９７／３５９、４３／２４９、６３、６３／６７／１９７／５７１、６３／６７／２１４／５５６、６３／１１９／１９７、６３／１１９／１９７／２０７／２１４、６３／１１９／１９７／３３９／３４１、６３／１１９／１９７／５５６、６３／１１９／１９７／５５６／５７１、６３／１１９／５５６、６３／１９７、６３／１９７／２０７／５５６、６３／１９７／２０７／５５６／５７１、６３／１９７／２１４／５７１、６３／１９７／２４９／４９５、６３／１９７／５５６／５７１、９５／１９７、９５／２１９／３５９、１１９、１１９／１９７、１１９／１９７／２０７／５７１、１１９／１９７／２１４、１１９／１９７／２１４／５５６、１１９／１９７／２１４／５７１、１１９／１９７／３３９、１１９／１９７／５５６、１１９／１９７／５５６／５７１、１１９／１９７／５７１、１１９／２０７／５５６／５７１、１９７、１９７／２０７、１９７／２０７／２１４／４７１、１９７／２１４、１９７／２１９、１９７／３３９／５５６／５７１、１９７／５５６、１９７／５５６／５７１、１９７／５７１、２１４／２４９／３５９、２１９、および５５６から選択されるポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２３００を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、２４Ｑ、２４Ｑ／５１Ｑ／６３Ｔ／１９７Ｒ／３５９Ｌ、２４Ｑ／１１９Ｍ／１９７Ｒ、２４Ｑ／１９７Ｑ／２４９Ｎ／４３７Ｒ、４３Ｇ／１９７Ｒ／３５９Ｌ、４３Ｇ／２４９Ｎ、６３Ｔ、６３Ｔ／６７Ｋ／１９７Ｓ／５７１Ｓ、６３Ｔ／６７Ｋ／２１４Ａ／５５６Ｇ、６３Ｔ／１１９Ｍ／１９７Ｇ／５５６Ｇ、６３Ｔ／１１９Ｍ／１９７Ｌ／２０７Ｄ／２１４Ａ、６３Ｔ／１１９Ｍ／１９７Ｌ／３３９Ｖ／３４１Ｒ、６３Ｔ／１１９Ｍ／１９７Ｓ、６３Ｔ／１１９Ｍ／１９７Ｓ／５５６Ｇ／５７１Ｓ、６３Ｔ／１１９Ｍ／５５６Ｇ、６３Ｔ／１９７Ｇ、６３Ｔ／１９７Ｍ／５５６Ｇ／５７１Ｓ、６３Ｔ／１９７Ｒ／２４９Ｎ／４９５Ｔ、６３Ｔ／１９７Ｓ、６３Ｔ／１９７Ｓ／２０７Ｄ／５５６Ｇ、６３Ｔ／１９７Ｓ／２０７Ｄ／５５６Ｇ／５７１Ｓ、６３Ｔ／１９７Ｓ／２１４Ａ／５７１Ｓ、９５Ｒ／１９７Ｒ、９５Ｒ／２１９Ｖ／３５９Ｌ、１１９Ｍ、１１９Ｍ／１９７Ｇ／２０７Ｄ／５７１Ｓ、１１９Ｍ／１９７Ｇ／２１４Ａ／５５６Ｇ、１１９Ｍ／１９７Ｌ／２１４Ａ／５５６Ｇ、１１９Ｍ／１９７Ｌ／５７１Ｓ、１１９Ｍ／１９７Ｍ、１１９Ｍ／１９７Ｍ／２１４Ａ／５７１Ｓ、１１９Ｍ／１９７Ｍ／３３９Ｖ、１１９Ｍ／１９７Ｍ／５５６Ｇ、１１９Ｍ／１９７Ｓ、１１９Ｍ／１９７Ｓ／２１４Ａ、１１９Ｍ／１９７Ｓ／５５６Ｇ、１１９Ｍ／１９７Ｓ／５５６Ｇ／５７１Ｓ、１１９Ｍ／１９７Ｓ／５７１Ｓ、１１９Ｍ／２０７Ｄ／５５６Ｇ／５７１Ｓ、１９７Ｇ／２０７Ｄ／２１４Ａ／４７１Ｉ、１９７Ｈ／２１４Ａ、１９７Ｌ、１９７Ｌ／２０７Ｄ、１９７Ｌ／５５６Ｇ、１９７Ｍ、１９７Ｍ／２１４Ａ、１９７Ｍ／３３９Ｖ／５５６Ｇ／５７１Ｓ、１９７Ｍ／５５６Ｇ／５７１Ｓ、１９７Ｒ／２１９Ｖ、１９７Ｓ、１９７Ｓ／２１４Ａ、１９７Ｓ／２１９Ｉ、１９７Ｓ／５５６Ｇ、１９７Ｓ／５５６Ｇ／５７１Ｓ、１９７Ｓ／５７１Ｓ、２１４Ａ／２４９Ｎ／３５９Ｌ、２１９Ｖ、および５５６Ｇから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２３００を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、Ｓ２４Ｑ、Ｓ２４Ｑ／Ｋ５１Ｑ／Ｖ６３Ｔ／Ｄ１９７Ｒ／Ｙ３５９Ｌ、Ｓ２４Ｑ／Ｔ１１９Ｍ／Ｄ１９７Ｒ、Ｓ２４Ｑ／Ｄ１９７Ｑ／Ｋ２４９Ｎ／Ｌ４３７Ｒ、Ｑ４３Ｇ／Ｄ１９７Ｒ／Ｙ３５９Ｌ、Ｑ４３Ｇ／Ｋ２４９Ｎ、Ｖ６３Ｔ、Ｖ６３Ｔ／Ｎ６７Ｋ／Ｄ１９７Ｓ／Ａ５７１Ｓ、Ｖ６３Ｔ／Ｎ６７Ｋ／Ｉ２１４Ａ／Ｖ５５６Ｇ、Ｖ６３Ｔ／Ｔ１１９Ｍ／Ｄ１９７Ｇ／Ｖ５５６Ｇ、Ｖ６３Ｔ／Ｔ１１９Ｍ／Ｄ１９７Ｌ／Ｓ２０７Ｄ／Ｉ２１４Ａ、Ｖ６３Ｔ／Ｔ１１９Ｍ／Ｄ１９７Ｌ／Ｆ３３９Ｖ／Ｗ３４１Ｒ、Ｖ６３Ｔ／Ｔ１１９Ｍ／Ｄ１９７Ｓ、Ｖ６３Ｔ／Ｔ１１９Ｍ／Ｄ１９７Ｓ／Ｖ５５６Ｇ／Ａ５７１Ｓ、Ｖ６３Ｔ／Ｔ１１９Ｍ／Ｖ５５６Ｇ、Ｖ６３Ｔ／Ｄ１９７Ｇ、Ｖ６３Ｔ／Ｄ１９７Ｍ／Ｖ５５６Ｇ／Ａ５７１Ｓ、Ｖ６３Ｔ／Ｄ１９７Ｒ／Ｋ２４９Ｎ／Ａ４９５Ｔ、Ｖ６３Ｔ／Ｄ１９７Ｓ、Ｖ６３Ｔ／Ｄ１９７Ｓ／Ｓ２０７Ｄ／Ｖ５５６Ｇ、Ｖ６３Ｔ／Ｄ１９７Ｓ／Ｓ２０７Ｄ／Ｖ５５６Ｇ／Ａ５７１Ｓ、Ｖ６３Ｔ／Ｄ１９７Ｓ／Ｉ２１４Ａ／Ａ５７１Ｓ、Ｖ９５Ｒ／Ｄ１９７Ｒ、Ｖ９５Ｒ／Ｔ２１９Ｖ／Ｙ３５９Ｌ、Ｔ１１９Ｍ、Ｔ１１９Ｍ／Ｄ１９７Ｇ／Ｓ２０７Ｄ／Ａ５７１Ｓ、Ｔ１１９Ｍ／Ｄ１９７Ｇ／Ｉ２１４Ａ／Ｖ５５６Ｇ、Ｔ１１９Ｍ／Ｄ１９７Ｌ／Ｉ２１４Ａ／Ｖ５５６Ｇ、Ｔ１１９Ｍ／Ｄ１９７Ｌ／Ａ５７１Ｓ、Ｔ１１９Ｍ／Ｄ１９７Ｍ、Ｔ１１９Ｍ／Ｄ１９７Ｍ／Ｉ２１４Ａ／Ａ５７１Ｓ、Ｔ１１９Ｍ／Ｄ１９７Ｍ／Ｆ３３９Ｖ、Ｔ１１９Ｍ／Ｄ１９７Ｍ／Ｖ５５６Ｇ、Ｔ１１９Ｍ／Ｄ１９７Ｓ、Ｔ１１９Ｍ／Ｄ１９７Ｓ／Ｉ２１４Ａ、Ｔ１１９Ｍ／Ｄ１９７Ｓ／Ｖ５５６Ｇ、Ｔ１１９Ｍ／Ｄ１９７Ｓ／Ｖ５５６Ｇ／Ａ５７１Ｓ、Ｔ１１９Ｍ／Ｄ１９７Ｓ／Ａ５７１Ｓ、Ｔ１１９Ｍ／Ｓ２０７Ｄ／Ｖ５５６Ｇ／Ａ５７１Ｓ、Ｄ１９７Ｇ／Ｓ２０７Ｄ／Ｉ２１４Ａ／Ｖ４７１Ｉ、Ｄ１９７Ｈ／Ｉ２１４Ａ、Ｄ１９７Ｌ、Ｄ１９７Ｌ／Ｓ２０７Ｄ、Ｄ１９７Ｌ／Ｖ５５６Ｇ、Ｄ１９７Ｍ、Ｄ１９７Ｍ／Ｉ２１４Ａ、Ｄ１９７Ｍ／Ｆ３３９Ｖ／Ｖ５５６Ｇ／Ａ５７１Ｓ、Ｄ１９７Ｍ／Ｖ５５６Ｇ／Ａ５７１Ｓ、Ｄ１９７Ｒ／Ｔ２１９Ｖ、Ｄ１９７Ｓ、Ｄ１９７Ｓ／Ｉ２１４Ａ、Ｄ１９７Ｓ／Ｔ２１９Ｉ、Ｄ１９７Ｓ／Ｖ５５６Ｇ、Ｄ１９７Ｓ／Ｖ５５６Ｇ／Ａ５７１Ｓ、Ｄ１９７Ｓ／Ａ５７１Ｓ、Ｉ２１４Ａ／Ｋ２４９Ｎ／Ｙ３５９Ｌ、Ｔ２１９Ｖ、およびＶ５５６Ｇから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２３００を基準にして番号が付けられている。
【００２６】
一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、配列番号２３００に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたガラクトースオキシダーゼは、１９４／３３０／４９５、１９６、２４６／４０８／４４２／４６２、２４６／４４２、２９２、３２７、３２７／３２９、３３０、４０７、４４２、４４２／４６２／５１５、４６２／５８３、４６５、４９８、および５８３から選択されるポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２３００を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、１９４Ｇ／３３０Ｈ／４９５Ｓ、１９６Ｑ、１９６Ｒ、２４６Ｑ／４０８Ｎ／４４２Ｙ／４６２Ａ、２４６Ｑ／４４２Ｙ、２４６Ｓ／４４２Ｙ、２９２Ｒ、３２７Ｋ、３２７Ｒ、３２７Ｒ／３２９Ｗ、３３０Ｈ、４０７Ｋ、４０７Ｒ、４４２Ｙ、４４２Ｙ／４６２Ａ／５１５Ｍ、４６２Ａ／５８３Ａ、４６５Ｒ、４９８Ｃ、５８３Ｇ、および５８３Ｓから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２３００を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、Ａ１９４Ｇ／Ｙ３３０Ｈ／Ａ４９５Ｓ、Ｅ１９６Ｑ、Ｅ１９６Ｒ、Ｎ２４６Ｑ／Ｄ４０８Ｎ／Ｆ４４２Ｙ／Ｇ４６２Ａ、Ｎ２４６Ｑ／Ｆ４４２Ｙ、Ｎ２４６Ｓ／Ｆ４４２Ｙ、Ｓ２９２Ｒ、Ｑ３２７Ｋ、Ｑ３２７Ｒ、Ｑ３２７Ｒ／Ｌ３２９Ｗ、Ｙ３３０Ｈ、Ｑ４０７Ｋ、Ｑ４０７Ｒ、Ｆ４４２Ｙ、Ｆ４４２Ｙ／Ｇ４６２Ａ／Ｌ５１５Ｍ、Ｇ４６２Ａ／Ｔ５８３Ａ、Ｌ４６５Ｒ、Ｓ４９８Ｃ、Ｔ５８３Ｇ、およびＴ５８３Ｓから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２３００を基準にして番号が付けられている。
【００２７】
一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、配列番号２４２４に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたガラクトースオキシダーゼは、１４、１４／２４／３６／９６、１４／２４／３６／２９６／４２４／５６０、１４／２４／７８／１２０／２５８、１４／２４／９２／９６／９９／４０８、１４／２４／９６／２５８／６２６、１４／２４／２５８／５６０、１４／７８／１２０／２５８／４８８／５６０／６２６、１４／９２／９６／９９、１４／９２／９６／９９／１２０／５３７、１４／９２／９６／１２０／３７６、１４／９２／９９／１２０／５３７、１４／９５／１２０／２９６／４８０／５６０、１４／１２０／４８０／６２６、１４／２５８、１４／２５８／２９６／５６０、１４／３７６／５６０、１４／４０８、２３／３６／９２／９５／９６、２３／３６／９２／９５／９９／４０８／５９６、２３／３６／４０８／４２８、２３／３６／５３７／５９６、２３／２１８／５３７、２３／４０８／５９６、２４、２４／３６／４６／９９／４２６／５３２／５４９、２４／３６／９５／９６、２４／３６／９５／９９／４０４／４２６／４８５、２４／３６／９６／９９／５３２／５４９、２４／３６／９９／４０４／４２６／５３２／５４９／６００、２４／３６／１２０／２９６／４８０／５６０、２４／３６／４０４／４２６／５３２、２４／３６／４０４／４８０／４８５／５３２／５６０／６００、２４／４６／９２／４０４／４２６／５３２、２４／４６／９２／４２６／５３２、２４／４６／９２／４２６／５４９、２４／４６／９５／９９／４２６／５３２、２４／４６／９９／４２６／５４９／６００、２４／４６／４０４／４２６／４８５／５３２、２４／９６／４０４／４２６、２４／９９、２４／９９／４０４／４８５／５３２／６００、２４／２９６、２４／２９６／３２４／４８０、２４／４０４／４２６／５３２、２４／４０４／４８０／４８５、２４／４０４／４８０／５３２／５４９／５６０、３６、３６／９２／９５／９９／４０４／４２６／５６０、３６／９２／９５／４２８／５９６、３６／９２／９６／４０８／４２８／５４０／５９６、３６／９２／４８５、３６／２５８／２９６、３６／２５８／２９６／３２４／４３３／６２６、３６／４０４、３６／４０４／４２６／５４９／６００、３６／４０８／５３７／５９６、３６／４０８／５９６、３６／４２６／４８５／６００、４６、４６／９２／５６０、９２、９２／９５／４８５／５３２／５４９／５６０、９２／９９／２１８／５６０、９５、９５／１２０／２９６／６２６、９５／４０４／４２６／５３２、９６、９６／９９、９６／２５８／５６０／６２６、９９、９９／４０４／４２６／５６０、９９／４２６／４８０／４８５、１２０、１２０／３２４／４８０／５６０、２１８、２１８／４０８、２９６／３２４、２９６／３２４／５６０、３２４／５６０、４０４、４０４／４８５／６００、４０８、４８０、４８５、５３２、５３７、５３７／６４０、５４９、５４９／５６０、５６０、５９６、および６００から選択されるポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２４２４を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、１４Ａ／２４Ｖ／３６Ｐ／９６Ｇ、１４Ａ／２４Ｖ／３６Ｐ／２９６Ｒ／４２４Ｗ／５６０Ｍ、１４Ａ／２４Ｖ／７８Ｉ／１２０Ｌ／２５８Ｖ、１４Ａ／２４Ｖ／９６Ｇ／２５８Ｖ／６２６Ｇ、１４Ａ／２４Ｖ／２５８Ｖ／５６０Ｍ、１４Ａ／７８Ｉ／１２０Ｌ／２５８Ｖ／４８８Ｔ／５６０Ｍ／６２６Ｇ、１４Ａ／９５Ｒ／１２０Ｌ／２９６Ｒ／４８０Ｒ／５６０Ｍ、１４Ａ／１２０Ｌ／４８０Ｒ／６２６Ｇ、１４Ａ／２５８Ｖ、１４Ａ／２５８Ｖ／２９６Ｒ／５６０Ｍ、１４Ｌ、１４Ｌ／９２Ｖ／９６Ｓ／９９Ｌ、１４Ｌ／９２Ｖ／９６Ｓ／９９Ｌ／１２０Ｓ／５３７Ｃ、１４Ｌ／９２Ｖ／９６Ｓ／１２０Ｓ／３７６Ｍ、１４Ｒ、１４Ｒ／２４Ｐ／９２Ｃ／９６Ｓ／９９Ｌ／４０８Ｒ、１４Ｒ／９２Ｖ／９９Ｌ／１２０Ｓ／５３７Ｃ、１４Ｒ／３７６Ｍ／５６０Ｉ、１４Ｒ／４０８Ｑ、２３Ａ／３６Ｌ／９２Ｃ／９５Ｆ／９６Ｇ、２３Ａ／３６Ｌ／９２Ｃ／９５Ｆ／９９Ｆ／４０８Ｌ／５９６Ｖ、２３Ａ／３６Ｌ／４０８Ｌ／４２８Ｈ、２３Ａ／３６Ｌ／５３７Ｗ／５９６Ｑ、２３Ａ／２１８Ｇ／５３７Ｗ、２３Ａ／４０８Ｌ／５９６Ｖ、２４Ｐ、２４Ｐ／３６Ｌ／４６Ｅ／９９Ｖ／４２６Ｗ／５３２Ｇ／５４９Ｌ、２４Ｐ／３６Ｌ／９５Ｓ／９９Ｖ／４０４Ａ／４２６Ｗ／４８５Ｃ、２４Ｐ／３６Ｌ／９６Ｍ／９９Ｖ／５３２Ｇ／５４９Ｌ、２４Ｐ／３６Ｌ／９９Ｖ／４０４Ａ／４２６Ｗ／５３２Ｇ／５４９Ｌ／６００Ｎ、２４Ｐ／３６Ｌ／４０４Ａ／４２６Ｗ／５３２Ｇ、２４Ｐ／３６Ｌ／４０４Ａ／４８０Ｌ／４８５Ｃ／５３２Ｇ／５６０Ｅ／６００Ｎ、２４Ｐ／４６Ｅ／９２Ｇ／４０４Ａ／４２６Ｗ／５３２Ｇ、２４Ｐ／４６Ｅ／９２Ｇ／４２６Ｗ／５３２Ｇ、２４Ｐ／４６Ｅ／９２Ｇ／４２６Ｗ／５４９Ｌ、２４Ｐ／４６Ｅ／９５Ｓ／９９Ｖ／４２６Ｗ／５３２Ｇ、２４Ｐ／４６Ｅ／９９Ｖ／４２６Ｗ／５４９Ｌ／６００Ｎ、２４Ｐ／４６Ｅ／４０４Ａ／４２６Ｗ／４８５Ｃ／５３２Ｇ、２４Ｐ／９６Ｍ／４０４Ａ／４２６Ｗ、２４Ｐ／９９Ｖ、２４Ｐ／９９Ｖ／４０４Ａ／４８５Ｃ／５３２Ｇ／６００Ｎ、２４Ｐ／４０４Ａ／４２６Ｗ／５３２Ｇ、２４Ｐ／４０４Ａ／４８０Ｌ／４８５Ｃ、２４Ｐ／４０４Ａ／４８０Ｌ／５３２Ｇ／５４９Ｌ／５６０Ｅ、２４Ｖ／３６Ｐ／９５Ｒ／９６Ｇ、２４Ｖ／３６Ｐ／１２０Ｌ／２９６Ｒ／４８０Ｒ／５６０Ｍ、２４Ｖ／２９６Ｒ、２４Ｖ／２９６Ｒ／３２４Ｆ／４８０Ｒ、３６Ｌ、３６Ｌ／９２Ｃ／９５Ｆ／４２８Ｈ／５９６Ｑ、３６Ｌ／９２Ｃ／９６Ｇ／４０８Ｌ／４２８Ｈ／５４０Ｒ／５９６Ｖ、３６Ｌ／９２Ｇ／９５Ｓ／９９Ｖ／４０４Ａ／４２６Ｗ／５６０Ｅ、３６Ｌ／９２Ｇ／４８５Ｃ、３６Ｌ／４０４Ａ、３６Ｌ／４０４Ａ／４２６Ｗ／５４９Ｌ／６００Ｎ、３６Ｌ／４０８Ｌ／５３７Ｗ／５９６Ｑ、３６Ｌ／４０８Ｌ／５９６Ｑ、３６Ｌ／４２６Ｗ／４８５Ｃ／６００Ｎ、３６Ｐ／２５８Ｖ／２９６Ｒ、３６Ｐ／２５８Ｖ／２９６Ｒ／３２４Ｆ／４３３Ｇ／６２６Ｇ、４６Ｐ、４６Ｐ／９２Ｖ／５６０Ｉ、９２Ｃ、９２Ｇ、９２Ｇ／９５Ｓ／４８５Ｃ／５３２Ｇ／５４９Ｌ／５６０Ｅ、９２Ｖ、９２Ｖ／９９Ｌ／２１８Ｍ／５６０Ｉ、９５Ａ、９５Ｆ、９５Ｒ／１２０Ｌ／２９６Ｒ／６２６Ｇ、９５Ｓ／４０４Ａ／４２６Ｗ／５３２Ｇ、９６Ｇ、９６Ｌ／２５８Ｖ／５６０Ｍ／６２６Ｇ、９６Ｍ、９６Ｓ、９６Ｓ／９９Ｌ、９９Ｌ、９９Ｖ、９９Ｖ／４０４Ａ／４２６Ｗ／５６０Ｅ、９９Ｖ／４２６Ｗ／４８０Ｌ／４８５Ｃ、１２０Ｌ／３２４Ｆ／４８０Ｒ／５６０Ｍ、１２０Ｓ、２１８Ｇ／４０８Ｌ、２１８Ｍ、２９６Ｒ／３２４Ｆ、２９６Ｒ／３２４Ｆ／５６０Ｍ、３２４Ｆ／５６０Ｍ、４０４Ａ、４０４Ａ／４８５Ｃ／６００Ｎ、４０８Ｌ、４０８Ｑ、４８０Ｌ、４８０Ｒ、４８５Ｃ、５３２Ｇ、５３７Ｃ、５３７Ｗ／６４０Ｒ、５４９Ｌ、５４９Ｌ／５６０Ｅ、５６０Ｉ、５９６Ｖ、および６００Ｎから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２４２４を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、Ｎ１４Ａ／Ｓ２４Ｖ／Ｋ３６Ｐ／Ｎ９６Ｇ、Ｎ１４Ａ／Ｓ２４Ｖ／Ｋ３６Ｐ／Ｖ２９６Ｒ／Ｇ４２４Ｗ／Ｗ５６０Ｍ、Ｎ１４Ａ／Ｓ２４Ｖ／Ｎ７８Ｉ／Ｒ１２０Ｌ／Ｓ２５８Ｖ、Ｎ１４Ａ／Ｓ２４Ｖ／Ｎ９６Ｇ／Ｓ２５８Ｖ／Ｓ６２６Ｇ、Ｎ１４Ａ／Ｓ２４Ｖ／Ｓ２５８Ｖ／Ｗ５６０Ｍ、Ｎ１４Ａ／Ｎ７８Ｉ／Ｒ１２０Ｌ／Ｓ２５８Ｖ／Ｎ４８８Ｔ／Ｗ５６０Ｍ／Ｓ６２６Ｇ、Ｎ１４Ａ／Ｖ９５Ｒ／Ｒ１２０Ｌ／Ｖ２９６Ｒ／Ｅ４８０Ｒ／Ｗ５６０Ｍ、Ｎ１４Ａ／Ｒ１２０Ｌ／Ｅ４８０Ｒ／Ｓ６２６Ｇ、Ｎ１４Ａ／Ｓ２５８Ｖ、Ｎ１４Ａ／Ｓ２５８Ｖ／Ｖ２９６Ｒ／Ｗ５６０Ｍ、Ｎ１４Ｌ、Ｎ１４Ｌ／Ｓ９２Ｖ／Ｎ９６Ｓ／Ｓ９９Ｌ、Ｎ１４Ｌ／Ｓ９２Ｖ／Ｎ９６Ｓ／Ｓ９９Ｌ／Ｒ１２０Ｓ／Ｓ５３７Ｃ、Ｎ１４Ｌ／Ｓ９２Ｖ／Ｎ９６Ｓ／Ｒ１２０Ｓ／Ｒ３７６Ｍ、Ｎ１４Ｒ、Ｎ１４Ｒ／Ｓ２４Ｐ／Ｓ９２Ｃ／Ｎ９６Ｓ／Ｓ９９Ｌ／Ｄ４０８Ｒ、Ｎ１４Ｒ／Ｓ９２Ｖ／Ｓ９９Ｌ／Ｒ１２０Ｓ／Ｓ５３７Ｃ、Ｎ１４Ｒ／Ｒ３７６Ｍ／Ｗ５６０Ｉ、Ｎ１４Ｒ／Ｄ４０８Ｑ、Ｑ２３Ａ／Ｋ３６Ｌ／Ｓ９２Ｃ／Ｖ９５Ｆ／Ｎ９６Ｇ、Ｑ２３Ａ／Ｋ３６Ｌ／Ｓ９２Ｃ／Ｖ９５Ｆ／Ｓ９９Ｆ／Ｄ４０８Ｌ／Ｔ５９６Ｖ、Ｑ２３Ａ／Ｋ３６Ｌ／Ｄ４０８Ｌ／Ｎ４２８Ｈ、Ｑ２３Ａ／Ｋ３６Ｌ／Ｓ５３７Ｗ／Ｔ５９６Ｑ、Ｑ２３Ａ／Ｒ２１８Ｇ／Ｓ５３７Ｗ、Ｑ２３Ａ／Ｄ４０８Ｌ／Ｔ５９６Ｖ、Ｓ２４Ｐ、Ｓ２４Ｐ／Ｋ３６Ｌ／Ｖ４６Ｅ／Ｓ９９Ｖ／Ｓ４２６Ｗ／Ｎ５３２Ｇ／Ｒ５４９Ｌ、Ｓ２４Ｐ／Ｋ３６Ｌ／Ｖ９５Ｓ／Ｓ９９Ｖ／Ｐ４０４Ａ／Ｓ４２６Ｗ／Ｙ４８５Ｃ、Ｓ２４Ｐ／Ｋ３６Ｌ／Ｎ９６Ｍ／Ｓ９９Ｖ／Ｎ５３２Ｇ／Ｒ５４９Ｌ、Ｓ２４Ｐ／Ｋ３６Ｌ／Ｓ９９Ｖ／Ｐ４０４Ａ／Ｓ４２６Ｗ／Ｎ５３２Ｇ／Ｒ５４９Ｌ／Ｇ６００Ｎ、Ｓ２４Ｐ／Ｋ３６Ｌ／Ｐ４０４Ａ／Ｓ４２６Ｗ／Ｎ５３２Ｇ、Ｓ２４Ｐ／Ｋ３６Ｌ／Ｐ４０４Ａ／Ｅ４８０Ｌ／Ｙ４８５Ｃ／Ｎ５３２Ｇ／Ｗ５６０Ｅ／Ｇ６００Ｎ、Ｓ２４Ｐ／Ｖ４６Ｅ／Ｓ９２Ｇ／Ｐ４０４Ａ／Ｓ４２６Ｗ／Ｎ５３２Ｇ、Ｓ２４Ｐ／Ｖ４６Ｅ／Ｓ９２Ｇ／Ｓ４２６Ｗ／Ｎ５３２Ｇ、Ｓ２４Ｐ／Ｖ４６Ｅ／Ｓ９２Ｇ／Ｓ４２６Ｗ／Ｒ５４９Ｌ、Ｓ２４Ｐ／Ｖ４６Ｅ／Ｖ９５Ｓ／Ｓ９９Ｖ／Ｓ４２６Ｗ／Ｎ５３２Ｇ、Ｓ２４Ｐ／Ｖ４６Ｅ／Ｓ９９Ｖ／Ｓ４２６Ｗ／Ｒ５４９Ｌ／Ｇ６００Ｎ、Ｓ２４Ｐ／Ｖ４６Ｅ／Ｐ４０４Ａ／Ｓ４２６Ｗ／Ｙ４８５Ｃ／Ｎ５３２Ｇ、Ｓ２４Ｐ／Ｎ９６Ｍ／Ｐ４０４Ａ／Ｓ４２６Ｗ、Ｓ２４Ｐ／Ｓ９９Ｖ、Ｓ２４Ｐ／Ｓ９９Ｖ／Ｐ４０４Ａ／Ｙ４８５Ｃ／Ｎ５３２Ｇ／Ｇ６００Ｎ、Ｓ２４Ｐ／Ｐ４０４Ａ／Ｓ４２６Ｗ／Ｎ５３２Ｇ、Ｓ２４Ｐ／Ｐ４０４Ａ／Ｅ４８０Ｌ／Ｙ４８５Ｃ、Ｓ２４Ｐ／Ｐ４０４Ａ／Ｅ４８０Ｌ／Ｎ５３２Ｇ／Ｒ５４９Ｌ／Ｗ５６０Ｅ、Ｓ２４Ｖ／Ｋ３６Ｐ／Ｖ９５Ｒ／Ｎ９６Ｇ、Ｓ２４Ｖ／Ｋ３６Ｐ／Ｒ１２０Ｌ／Ｖ２９６Ｒ／Ｅ４８０Ｒ／Ｗ５６０Ｍ、Ｓ２４Ｖ／Ｖ２９６Ｒ、Ｓ２４Ｖ／Ｖ２９６Ｒ／Ａ３２４Ｆ／Ｅ４８０Ｒ、Ｋ３６Ｌ、Ｋ３６Ｌ／Ｓ９２Ｃ／Ｖ９５Ｆ／Ｎ４２８Ｈ／Ｔ５９６Ｑ、Ｋ３６Ｌ／Ｓ９２Ｃ／Ｎ９６Ｇ／Ｄ４０８Ｌ／Ｎ４２８Ｈ／Ｎ５４０Ｒ／Ｔ５９６Ｖ、Ｋ３６Ｌ／Ｓ９２Ｇ／Ｖ９５Ｓ／Ｓ９９Ｖ／Ｐ４０４Ａ／Ｓ４２６Ｗ／Ｗ５６０Ｅ、Ｋ３６Ｌ／Ｓ９２Ｇ／Ｙ４８５Ｃ、Ｋ３６Ｌ／Ｐ４０４Ａ、Ｋ３６Ｌ／Ｐ４０４Ａ／Ｓ４２６Ｗ／Ｒ５４９Ｌ／Ｇ６００Ｎ、Ｋ３６Ｌ／Ｄ４０８Ｌ／Ｓ５３７Ｗ／Ｔ５９６Ｑ、Ｋ３６Ｌ／Ｄ４０８Ｌ／Ｔ５９６Ｑ、Ｋ３６Ｌ／Ｓ４２６Ｗ／Ｙ４８５Ｃ／Ｇ６００Ｎ、Ｋ３６Ｐ／Ｓ２５８Ｖ／Ｖ２９６Ｒ、Ｋ３６Ｐ／Ｓ２５８Ｖ／Ｖ２９６Ｒ／Ａ３２４Ｆ／Ｓ４３３Ｇ／Ｓ６２６Ｇ、Ｖ４６Ｐ、Ｖ４６Ｐ／Ｓ９２Ｖ／Ｗ５６０Ｉ、Ｓ９２Ｃ、Ｓ９２Ｇ、Ｓ９２Ｇ／Ｖ９５Ｓ／Ｙ４８５Ｃ／Ｎ５３２Ｇ／Ｒ５４９Ｌ／Ｗ５６０Ｅ、Ｓ９２Ｖ、Ｓ９２Ｖ／Ｓ９９Ｌ／Ｒ２１８Ｍ／Ｗ５６０Ｉ、Ｖ９５Ａ、Ｖ９５Ｆ、Ｖ９５Ｒ／Ｒ１２０Ｌ／Ｖ２９６Ｒ／Ｓ６２６Ｇ、Ｖ９５Ｓ／Ｐ４０４Ａ／Ｓ４２６Ｗ／Ｎ５３２Ｇ、Ｎ９６Ｇ、Ｎ９６Ｌ／Ｓ２５８Ｖ／Ｗ５６０Ｍ／Ｓ６２６Ｇ、Ｎ９６Ｍ、Ｎ９６Ｓ、Ｎ９６Ｓ／Ｓ９９Ｌ、Ｓ９９Ｌ、Ｓ９９Ｖ、Ｓ９９Ｖ／Ｐ４０４Ａ／Ｓ４２６Ｗ／Ｗ５６０Ｅ、Ｓ９９Ｖ／Ｓ４２６Ｗ／Ｅ４８０Ｌ／Ｙ４８５Ｃ、Ｒ１２０Ｌ／Ａ３２４Ｆ／Ｅ４８０Ｒ／Ｗ５６０Ｍ、Ｒ１２０Ｓ、Ｒ２１８Ｇ／Ｄ４０８Ｌ、Ｒ２１８Ｍ、Ｖ２９６Ｒ／Ａ３２４Ｆ、Ｖ２９６Ｒ／Ａ３２４Ｆ／Ｗ５６０Ｍ、Ａ３２４Ｆ／Ｗ５６０Ｍ、Ｐ４０４Ａ、Ｐ４０４Ａ／Ｙ４８５Ｃ／Ｇ６００Ｎ、Ｄ４０８Ｌ、Ｄ４０８Ｑ、Ｅ４８０Ｌ、Ｅ４８０Ｒ、Ｙ４８
５Ｃ、Ｎ５３２Ｇ、Ｓ５３７Ｃ、Ｓ５３７Ｗ／Ｑ６４０Ｒ、Ｒ５４９Ｌ、Ｒ５４９Ｌ／Ｗ５６０Ｅ、Ｗ５６０Ｉ、Ｔ５９６Ｖ、およびＧ６００Ｎから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２４２４を基準にして番号が付けられている。
【００２８】
一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、配列番号２４２４に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたガラクトースオキシダーゼは、１４、１４／２４／３６／９６、１４／２４／３６／２９６／４２４／５６０、１４／２４／７８／１２０／２５８、１４／２４／９９／２１８／４０８／５３７／５６０、１４／２４／２５８／５６０、１４／４６／４７／３７６、１４／４６／９６／９９／５６０、１４／９２／９６／９９／３７６／５６０、１４／９２／９６／１２０／３７６、１４／９２／９６／３７６、１４／９２／９９／１２０／２１８／４０８、１４／９２／９９／１２０／５３７、１４／９２／９９／２１８／４０８、１４／９２／２１８／４０８、１４／９５／１２０／２９６／４８０／５６０、１４／３７６、１４／３７６／５３７、１４／３７６／５６０、１４／４０８、１４／５３７、２３／３６、２３／３６／９２／９５／９６、２３／３６／９２／９５／９９／４０８／５９６、２３／３６／９６／４０８／５９６／６４０、２３／３６／４０８／４２８、２３／３６／５３７／５４０／６４０、２３／３６／５３７／５９６、２３／２１８／５９６／６４０、２４、２４／３６／４６／９９／４２６／５３２／５４９、２４／３６／９５／９６、２４／３６／９５／９９／４０４／４２６／４８５、２４／３６／９６／９９／５３２／５４９、２４／３６／１２０／２９６／４８０／５６０、２４／３６／４０４／４２６／５３２、２４／３６／４０４／４８０／４８５／５３２／５６０／６００、２４／４６／９２／４０４／４２６／５３２、２４／４６／９２／４２６／５３２、２４／４６／９２／４２６／５４９、２４／４６／９５／９９／４２６／５３２、２４／４６／９９／４２６／５４９／６００、２４／４６／４０４／４２６／４８５／５３２、２４／９６／４０４／４２６、２４／９６／４０４／４２６／５６０、２４／９９、２４／２９６、２４／４０４／４２６／５３２、２４／４０４／４８０／４８５、２４／５３２、３６、３６／９２／９５／４２８／５９６、３６／９５／９６、３６／９９／４２６／４８５／６００、３６／２５８／２９６、３６／２５８／２９６／３２４／４３３／６２６、３６／４０４、３６／４０４／４２６／５４９／６００、３６／４０８、３６／４０８／５３７／５９６、３６／４２６／４８５／６００、４６／９２／５６０、７８、９２、９２／９５／４８５／５３２／５４９／５６０、９２／９６、９２／９９／１２０、９２／９９／２１８／５６０、９２／２１８、９２／４０４、９５、９６、９６／９９、９９、９９／４２６／４８０／４８５、９９／６４０、１２０、１２０／３２４／４８０／５６０、１２０／３７６、２１８／５３７／５９６、２１８／５９６、２５８、２９６、２９６／３２４、２９６／３２４／５６０、２９６／４８０／５６０、３２４、３６１、４０４、４０４／４２６／４８５、４０８／５９６、４２４、４２６／４８５、４２６／５３２／５４９、４８０、５３２、５３７／６４０、５４９、５４９／５６０、５６０、６００、６２６、および６４０から選択されるポリペプチド配列の１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２４２４を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、１４Ａ／２４Ｖ／３６Ｐ／９６Ｇ、１４Ａ／２４Ｖ／３６Ｐ／２９６Ｒ／４２４Ｗ／５６０Ｍ、１４Ａ／２４Ｖ／７８Ｉ／１２０Ｌ／２５８Ｖ、１４Ａ／２４Ｖ／２５８Ｖ／５６０Ｍ、１４Ａ／９５Ｒ／１２０Ｌ／２９６Ｒ／４８０Ｒ／５６０Ｍ、１４Ｌ／９２Ｃ／２１８Ｍ／４０８Ｑ、１４Ｌ／９２Ｖ／９６Ｓ／１２０Ｓ／３７６Ｍ、１４Ｌ／９２Ｖ／９９Ｌ／１２０Ｓ／２１８Ｍ／４０８Ｒ、１４Ｌ／３７６Ｍ、１４Ｌ／３７６Ｍ／５３７Ｃ、１４Ｌ／３７６Ｍ／５６０Ｉ、１４Ｒ、１４Ｒ／２４Ｐ／９９Ｌ／２１８Ｍ／４０８Ｑ／５３７Ｃ／５６０Ｉ、１４Ｒ／４６Ｐ／４７Ｐ／３７６Ｍ、１４Ｒ／４６Ｐ／９６Ｓ／９９Ｌ／５６０Ｉ、１４Ｒ／９２Ｃ／９６Ｓ／３７６Ｍ、１４Ｒ／９２Ｖ／９６Ｓ／９９Ｌ／３７６Ｍ／５６０Ｉ、１４Ｒ／９２Ｖ／９９Ｌ／１２０Ｓ／５３７Ｃ、１４Ｒ／９２Ｖ／９９Ｌ／２１８Ｍ／４０８Ｑ、１４Ｒ／４０８Ｑ、１４Ｒ／５３７Ｃ、２３Ａ／３６Ｌ、２３Ａ／３６Ｌ／９２Ｃ／９５Ｆ／９６Ｇ、２３Ａ／３６Ｌ／９２Ｃ／９５Ｆ／９９Ｆ／４０８Ｌ／５９６Ｖ、２３Ａ／３６Ｌ／９６Ｇ／４０８Ｌ／５９６Ｖ／６４０Ｒ、２３Ａ／３６Ｌ／４０８Ｌ／４２８Ｈ、２３Ａ／３６Ｌ／５３７Ｗ／５４０Ｒ／６４０Ｒ、２３Ａ／３６Ｌ／５３７Ｗ／５９６Ｑ、２３Ａ／２１８Ｇ／５９６Ｑ／６４０Ｒ、２４Ｐ、２４Ｐ／３６Ｌ／４６Ｅ／９９Ｖ／４２６Ｗ／５３２Ｇ／５４９Ｌ、２４Ｐ／３６Ｌ／９５Ｓ／９９Ｖ／４０４Ａ／４２６Ｗ／４８５Ｃ、２４Ｐ／３６Ｌ／９６Ｍ／９９Ｖ／５３２Ｇ／５４９Ｌ、２４Ｐ／３６Ｌ／４０４Ａ／４２６Ｗ／５３２Ｇ、２４Ｐ／３６Ｌ／４０４Ａ／４８０Ｌ／４８５Ｃ／５３２Ｇ／５６０Ｅ／６００Ｎ、２４Ｐ／４６Ｅ／９２Ｇ／４０４Ａ／４２６Ｗ／５３２Ｇ、２４Ｐ／４６Ｅ／９２Ｇ／４２６Ｗ／５３２Ｇ、２４Ｐ／４６Ｅ／９２Ｇ／４２６Ｗ／５４９Ｌ、２４Ｐ／４６Ｅ／９５Ｓ／９９Ｖ／４２６Ｗ／５３２Ｇ、２４Ｐ／４６Ｅ／９９Ｖ／４２６Ｗ／５４９Ｌ／６００Ｎ、２４Ｐ／４６Ｅ／４０４Ａ／４２６Ｗ／４８５Ｃ／５３２Ｇ、２４Ｐ／９６Ｍ／４０４Ａ／４２６Ｗ、２４Ｐ／９６Ｍ／４０４Ａ／４２６Ｗ／５６０Ｅ、２４Ｐ／９９Ｖ、２４Ｐ／４０４Ａ／４２６Ｗ／５３２Ｇ、２４Ｐ／４０４Ａ／４８０Ｌ／４８５Ｃ、２４Ｐ／５３２Ｇ、２４Ｖ、２４Ｖ／３６Ｐ／９５Ｒ／９６Ｇ、２４Ｖ／３６Ｐ／１２０Ｌ／２９６Ｒ／４８０Ｒ／５６０Ｍ、２４Ｖ／２９６Ｒ、３６Ｌ、３６Ｌ／９２Ｃ／９５Ｆ／４２８Ｈ／５９６Ｑ、３６Ｌ／９５Ｆ／９６Ｇ、３６Ｌ／９９Ｖ／４２６Ｗ／４８５Ｃ／６００Ｎ、３６Ｌ／４０４Ａ、３６Ｌ／４０４Ａ／４２６Ｗ／５４９Ｌ／６００Ｎ、３６Ｌ／４０８Ｌ、３６Ｌ／４０８Ｌ／５３７Ｗ／５９６Ｑ、３６Ｌ／４２６Ｗ／４８５Ｃ／６００Ｎ、３６Ｐ／２５８Ｖ／２９６Ｒ、３６Ｐ／２５８Ｖ／２９６Ｒ／３２４Ｆ／４３３Ｇ／６２６Ｇ、４６Ｐ／９２Ｖ／５６０Ｉ、７８Ｉ、９２Ｇ、９２Ｇ／９５Ｓ／４８５Ｃ／５３２Ｇ／５４９Ｌ／５６０Ｅ、９２Ｇ／４０４Ａ、９２Ｖ／９６Ｓ、９２Ｖ／９９Ｌ／１２０Ｓ、９２Ｖ／９９Ｌ／２１８Ｍ／５６０Ｉ、９２Ｖ／２１８Ｍ、９５Ａ、９５Ｆ、９６Ｇ、９６Ｍ、９６Ｓ／９９Ｌ、９９Ｌ／６４０Ｒ、９９Ｖ、９９Ｖ／４２６Ｗ／４８０Ｌ／４８５Ｃ、１２０Ｌ、１２０Ｌ／３２４Ｆ／４８０Ｒ／５６０Ｍ、１２０Ｓ／３７６Ｍ、２１８Ｇ／５３７Ｗ／５９６Ｖ、２１８Ｇ／５９６Ｑ、２５８Ｖ、２９６Ｒ、２９６Ｒ／３２４Ｆ、２９６Ｒ／３２４Ｆ／５６０Ｍ、２９６Ｒ／４８０Ｒ／５６０Ｍ、３２４Ｆ、３６１Ｐ、４０４Ａ、４０４Ａ／４２６Ｗ／４８５Ｃ、４０８Ｌ／５９６Ｑ、４２４Ｗ、４２６Ｗ／４８５Ｃ、４２６Ｗ／５３２Ｇ／５４９Ｌ、４８０Ｌ、４８０Ｒ、５３２Ｇ、５３７Ｗ／６４０Ｒ、５４９Ｌ、５４９Ｌ／５６０Ｅ、５６０Ｍ、６００Ｎ、６２６Ｇ、および６４０Ｒから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２４２４を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、Ｎ１４Ａ／Ｓ２４Ｖ／Ｋ３６Ｐ／Ｎ９６Ｇ、Ｎ１４Ａ／Ｓ２４Ｖ／Ｋ３６Ｐ／Ｖ２９６Ｒ／Ｇ４２４Ｗ／Ｗ５６０Ｍ、Ｎ１４Ａ／Ｓ２４Ｖ／Ｎ７８Ｉ／Ｒ１２０Ｌ／Ｓ２５８Ｖ、Ｎ１４Ａ／Ｓ２４Ｖ／Ｓ２５８Ｖ／Ｗ５６０Ｍ、Ｎ１４Ａ／Ｖ９５Ｒ／Ｒ１２０Ｌ／Ｖ２９６Ｒ／Ｅ４８０Ｒ／Ｗ５６０Ｍ、Ｎ１４Ｌ／Ｓ９２Ｃ／Ｒ２１８Ｍ／Ｄ４０８Ｑ、Ｎ１４Ｌ／Ｓ９２Ｖ／Ｎ９６Ｓ／Ｒ１２０Ｓ／Ｒ３７６Ｍ、Ｎ１４Ｌ／Ｓ９２Ｖ／Ｓ９９Ｌ／Ｒ１２０Ｓ／Ｒ２１８Ｍ／Ｄ４０８Ｒ、Ｎ１４Ｌ／Ｒ３７６Ｍ、Ｎ１４Ｌ／Ｒ３７６Ｍ／Ｓ５３７Ｃ、Ｎ１４Ｌ／Ｒ３７６Ｍ／Ｗ５６０Ｉ、Ｎ１４Ｒ、Ｎ１４Ｒ／Ｓ２４Ｐ／Ｓ９９Ｌ／Ｒ２１８Ｍ／Ｄ４０８Ｑ／Ｓ５３７Ｃ／Ｗ５６０Ｉ、Ｎ１４Ｒ／Ｖ４６Ｐ／Ｎ４７Ｐ／Ｒ３７６Ｍ、Ｎ１４Ｒ／Ｖ４６Ｐ／Ｎ９６Ｓ／Ｓ９９Ｌ／Ｗ５６０Ｉ、Ｎ１４Ｒ／Ｓ９２Ｃ／Ｎ９６Ｓ／Ｒ３７６Ｍ、Ｎ１４Ｒ／Ｓ９２Ｖ／Ｎ９６Ｓ／Ｓ９９Ｌ／Ｒ３７６Ｍ／Ｗ５６０Ｉ、Ｎ１４Ｒ／Ｓ９２Ｖ／Ｓ９９Ｌ／Ｒ１２０Ｓ／Ｓ５３７Ｃ、Ｎ１４Ｒ／Ｓ９２Ｖ／Ｓ９９Ｌ／Ｒ２１８Ｍ／Ｄ４０８Ｑ、Ｎ１４Ｒ／Ｄ４０８Ｑ、Ｎ１４Ｒ／Ｓ５３７Ｃ、Ｑ２３Ａ／Ｋ３６Ｌ、Ｑ２３Ａ／Ｋ３６Ｌ／Ｓ９２Ｃ／Ｖ９５Ｆ／Ｎ９６Ｇ、Ｑ２３Ａ／Ｋ３６Ｌ／Ｓ９２Ｃ／Ｖ９５Ｆ／Ｓ９９Ｆ／Ｄ４０８Ｌ／Ｔ５９６Ｖ、Ｑ２３Ａ／Ｋ３６Ｌ／Ｎ９６Ｇ／Ｄ４０８Ｌ／Ｔ５９６Ｖ／Ｑ６４０Ｒ、Ｑ２３Ａ／Ｋ３６Ｌ／Ｄ４０８Ｌ／Ｎ４２８Ｈ、Ｑ２３Ａ／Ｋ３６Ｌ／Ｓ５３７Ｗ／Ｎ５４０Ｒ／Ｑ６４０Ｒ、Ｑ２３Ａ／Ｋ３６Ｌ／Ｓ５３７Ｗ／Ｔ５９６Ｑ、Ｑ２３Ａ／Ｒ２１８Ｇ／Ｔ５９６Ｑ／Ｑ６４０Ｒ、Ｓ２４Ｐ、Ｓ２４Ｐ／Ｋ３６Ｌ／Ｖ４６Ｅ／Ｓ９９Ｖ／Ｓ４２６Ｗ／Ｎ５３２Ｇ／Ｒ５４９Ｌ、Ｓ２４Ｐ／Ｋ３６Ｌ／Ｖ９５Ｓ／Ｓ９９Ｖ／Ｐ４０４Ａ／Ｓ４２６Ｗ／Ｙ４８５Ｃ、Ｓ２４Ｐ／Ｋ３６Ｌ／Ｎ９６Ｍ／Ｓ９９Ｖ／Ｎ５３２Ｇ／Ｒ５４９Ｌ、Ｓ２４Ｐ／Ｋ３６Ｌ／Ｐ４０４Ａ／Ｓ４２６Ｗ／Ｎ５３２Ｇ、Ｓ２４Ｐ／Ｋ３６Ｌ／Ｐ４０４Ａ／Ｅ４８０Ｌ／Ｙ４８５Ｃ／Ｎ５３２Ｇ／Ｗ５６０Ｅ／Ｇ６００Ｎ、Ｓ２４Ｐ／Ｖ４６Ｅ／Ｓ９２Ｇ／Ｐ４０４Ａ／Ｓ４２６Ｗ／Ｎ５３２Ｇ、Ｓ２４Ｐ／Ｖ４６Ｅ／Ｓ９２Ｇ／Ｓ４２６Ｗ／Ｎ５３２Ｇ、Ｓ２４Ｐ／Ｖ４６Ｅ／Ｓ９２Ｇ／Ｓ４２６Ｗ／Ｒ５４９Ｌ、Ｓ２４Ｐ／Ｖ４６Ｅ／Ｖ９５Ｓ／Ｓ９９Ｖ／Ｓ４２６Ｗ／Ｎ５３２Ｇ、Ｓ２４Ｐ／Ｖ４６Ｅ／Ｓ９９Ｖ／Ｓ４２６Ｗ／Ｒ５４９Ｌ／Ｇ６００Ｎ、Ｓ２４Ｐ／Ｖ４６Ｅ／Ｐ４０４Ａ／Ｓ４２６Ｗ／Ｙ４８５Ｃ／Ｎ５３２Ｇ、Ｓ２４Ｐ／Ｎ９６Ｍ／Ｐ４０４Ａ／Ｓ４２６Ｗ、Ｓ２４Ｐ／Ｎ９６Ｍ／Ｐ４０４Ａ／Ｓ４２６Ｗ／Ｗ５６０Ｅ、Ｓ２４Ｐ／Ｓ９９Ｖ、Ｓ２４Ｐ／Ｐ４０４Ａ／Ｓ４２６Ｗ／Ｎ５３２Ｇ、Ｓ２４Ｐ／Ｐ４０４Ａ／Ｅ４８０Ｌ／Ｙ４８５Ｃ、Ｓ２４Ｐ／Ｎ５３２Ｇ、Ｓ２４Ｖ、Ｓ２４Ｖ／Ｋ３６Ｐ／Ｖ９５Ｒ／Ｎ９６Ｇ、Ｓ２４Ｖ／Ｋ３６Ｐ／Ｒ１２０Ｌ／Ｖ２９６Ｒ／Ｅ４８０Ｒ／Ｗ５６０Ｍ、Ｓ２４Ｖ／Ｖ２９６Ｒ、Ｋ３６Ｌ、Ｋ３６Ｌ／Ｓ９２Ｃ／Ｖ９５Ｆ／Ｎ４２８Ｈ／Ｔ５９６Ｑ、Ｋ３６Ｌ／Ｖ９５Ｆ／Ｎ９６Ｇ、Ｋ３６Ｌ／Ｓ９９Ｖ／Ｓ４２６Ｗ／Ｙ４８５Ｃ／Ｇ６００Ｎ、Ｋ３６Ｌ／Ｐ４０４Ａ、Ｋ３６Ｌ／Ｐ４０４Ａ／Ｓ４２６Ｗ／Ｒ５４９Ｌ／Ｇ６００Ｎ、Ｋ３６Ｌ／Ｄ４０８Ｌ、Ｋ３６Ｌ／Ｄ４０８Ｌ／Ｓ５３７Ｗ／Ｔ５９６Ｑ、Ｋ３６Ｌ／Ｓ４２６Ｗ／Ｙ４８５Ｃ／Ｇ６００Ｎ、Ｋ３６Ｐ／Ｓ２５８Ｖ／Ｖ２９６Ｒ、Ｋ３６Ｐ／Ｓ２５８Ｖ／Ｖ２９６Ｒ／Ａ３２４Ｆ／Ｓ４３３Ｇ／Ｓ６２６Ｇ、Ｖ４６Ｐ／Ｓ９２Ｖ／Ｗ５６０Ｉ、Ｎ７８Ｉ、Ｓ９２Ｇ、Ｓ９２Ｇ／Ｖ９５Ｓ／Ｙ４８５Ｃ／Ｎ５３２Ｇ／Ｒ５４９Ｌ／Ｗ５６０Ｅ、Ｓ９２Ｇ／Ｐ４０４Ａ、Ｓ９２Ｖ／Ｎ９６Ｓ、Ｓ９２Ｖ／Ｓ９９Ｌ／Ｒ１２０Ｓ、Ｓ９２Ｖ／Ｓ９９Ｌ／Ｒ２１８Ｍ／Ｗ５６０Ｉ、Ｓ９２Ｖ／Ｒ２１８Ｍ、Ｖ９５Ａ、Ｖ９５Ｆ、Ｎ９６Ｇ、Ｎ９６Ｍ、Ｎ９６Ｓ／Ｓ９９Ｌ、Ｓ９９Ｌ／Ｑ６４０Ｒ、Ｓ９９Ｖ、Ｓ９９Ｖ／Ｓ４２６Ｗ／Ｅ４８０Ｌ／Ｙ４８５Ｃ、Ｒ１２０Ｌ、Ｒ１２０Ｌ／Ａ３２４Ｆ／Ｅ４８０Ｒ／Ｗ５６０Ｍ、Ｒ１２０Ｓ／Ｒ３７６Ｍ、Ｒ２１８Ｇ／Ｓ５３７Ｗ／Ｔ５９６Ｖ、Ｒ２１８Ｇ／Ｔ５９６Ｑ、Ｓ２５８Ｖ、Ｖ２９６Ｒ、Ｖ２９６Ｒ／Ａ３２４Ｆ、Ｖ２９６Ｒ／Ａ３２４Ｆ／Ｗ５６０Ｍ、Ｖ２９６Ｒ／Ｅ４８０Ｒ／Ｗ５６０Ｍ、Ａ３２４Ｆ、Ｓ３６１Ｐ、Ｐ４０４Ａ、Ｐ４０４Ａ／Ｓ４２６Ｗ／Ｙ４８５Ｃ、Ｄ４０８Ｌ／Ｔ５９６Ｑ、Ｇ４２４Ｗ、Ｓ４２６Ｗ／Ｙ４８５Ｃ、Ｓ４２６Ｗ／Ｎ５３２Ｇ／Ｒ５４９Ｌ、Ｅ４８０Ｌ、Ｅ４８０Ｒ、Ｎ５３２Ｇ、Ｓ５
３７Ｗ／Ｑ６４０Ｒ、Ｒ５４９Ｌ、Ｒ５４９Ｌ／Ｗ５６０Ｅ、Ｗ５６０Ｍ、Ｇ６００Ｎ、Ｓ６２６Ｇ、およびＱ６４０Ｒから選択される少なくとも１つの置換または置換のセットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２４２４を基準にして番号が付けられている。
【００２９】
さらに一部の追加の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、表４．１、５．１、６．１、７．１、１１．１、１２．１、１３．１、１４．１、１４．２、１５．１、１６．１、１７．１、１８．１、１９．１、２２．１、２３．１、２５．１、２６．１、２７．１、２８．１、２９．２、３０．１および／または３１．１で示される少なくとも１つの操作されたガラクトースオキシダーゼ改変体の配列と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高度に同一であるポリペプチド配列を含む。さらに一部のさらなる実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、配列番号２、４、１６６、２７２、９２８、９３２、１２６４、１４１６、１５９８、１８６６、１９１２、２０８０、２３００および／または２４２４で示される少なくとも１つの操作されたガラクトースオキシダーゼ改変体の配列と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高度に同一であるポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、配列番号２、４、１６６、２７２、９２８、９３２、１２６４、１４１６、１５９８、１８６６、１９１２、２０８０、２３００および／または２４２４で示される改変体の操作されたポリペプチドである。一部のさらなる実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、配列番号２〜２８６０のうちの偶数番号の配列で示される少なくとも１つの操作されたガラクトースオキシダーゼ改変体の配列と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高度に同一であるポリペプチド配列を含む。さらに一部の追加の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、配列番号２〜２８６０のうちの偶数番号の配列で示されるポリペプチド配列を含む。一部のさらなる実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、野生型Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｉｕｍガラクトースオキシダーゼと比較して少なくとも１つの改善された特性を含む。一部の実施形態では、改善された特性は、基質に対する改善された活性を含む。一部の追加の実施形態では、基質は、第一級アルコールを含む。一部のさらなる実施形態では、改善された特性は、改善された立体選択性を含む。さらに一部の追加の実施形態では、操作されたガラクトースオキシダーゼは、精製されている。
【００３０】
本発明は、本明細書で提供される少なくとも１つの操作されたガラクトースオキシダーゼを含む組成物も提供する。一部の実施形態では、組成物は、本明細書で提供される１つの操作されたガラクトースオキシダーゼを含む。
【００３１】
本発明は、本明細書で提供される操作されたガラクトースオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列も提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、本明細書で提供される操作されたガラクトースオキシダーゼのうちの１つより多くをコードする。本発明は、少なくとも１つの操作されたガラクトースオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列であって、配列番号１、３、１６５、２７１、９２７、９３１、１２６３、１４１５、１５９７、１８６５、１９１１、２０７９、２２９９および／または２４２３に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を含み、操作されたガラクトースオキシダーゼのポリヌクレオチド配列が、１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換を含む、ポリヌクレオチド配列も提供する。一部の追加の実施形態では、少なくとも１つの操作されたガラクトースオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１、３、１６５、２７１、９２７、９３１、１２６３、１４１５、１５９７、１８６５、１９１１、２０７９、２２９９および／もしくは２４２３またはその機能的断片に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を含む。一部のさらなる実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、制御配列に作動可能に連結している。一部の追加の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。さらに一部のさらなる実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１〜２８５９のうちの奇数番号の配列を含む。本発明は、本明細書で提供される少なくとも１つのガラクトースオキシダーゼをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターも提供する。本発明は、本明細書で提供される少なくとも１つの発現ベクターを含む宿主細胞も提供する。本発明は、本明細書で提供される少なくとも１つガラクトースオキシダーゼをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞も提供する。
【００３２】
本発明は、宿主細胞において操作されたガラクトースオキシダーゼを産生する方法であって、宿主細胞を、好適な条件下で、本明細書で提供される少なくとも１つの操作されたガラクトースオキシダーゼが産生されるように培養するステップを含む方法も提供する。一部の実施形態では、方法は、培養物および／または宿主細胞から少なくとも１つの操作されたガラクトースオキシダーゼを回収するステップをさらに含む。一部の追加の実施形態では、方法は、本明細書で提供される少なくとも１つの操作されたガラクトースオキシダーゼを精製するステップをさらに含む。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明は、操作されたガラクトースオキシダーゼ（ＧＯアーゼ）酵素、第一級アルコール（例えば、２−エチニルグリセロール）に対する選択的酸化活性を有するポリペプチド、およびこれらの酵素をコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含むベクターおよび宿主細胞を提供する。これらのＧＯアーゼ改変体は、選択的様式で作用し、これにより、標的とされないアルコールに対する官能基保護操作の必要性が最小限となり、ならびに所望のアルデヒド立体異性体（例えば、Ｒ−エナンチオマー）が得られる。ＧＯアーゼ酵素を産生する方法も提供される。本発明は、ＧＯアーゼ酵素を含む組成物、および操作されたＧＯアーゼ酵素を使用する方法を、さらに提供する。本発明は、医薬化合物および他の化合物の産生に特に使用される。
【００３４】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての専門および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を一般に有する。一般に、本明細書で使用される命名法、ならびに下記の細胞培養、分子遺伝学、微生物学、有機化学、分析化学および核酸化学の実験手順は、当技術分野において周知かつ一般に利用されているものである。そのような技術は、周知であり、当業者に周知の非常に多くの教科書および参考文献に記載されている。標準的な技術またはそれらの改良形態が、化学合成および化学分析に使用される。本明細書において上記および下記両方で言及される全ての特許、特許出願、論文および刊行物は、これにより参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【００３５】
本明細書に記載のものと同様または同等の任意の好適な方法および材料が本発明の実施の際に使用されるが、一部の方法および材料が本明細書に記載される。本発明が、記載される特定の方法論、プロトコールおよび試薬に限定されないことは、これらの方法論、プロトコールおよび試薬はそれらが当業者によって使用される状況に依存して変わり得るので、理解されるはずである。したがって、直ぐ下で定義される用語は、本発明に総じて言及することによりさらに十分に説明される。
【００３６】
上述の概要および下記の詳細な説明の両方が、例示的かつ説明的なものに過ぎず、本発明を制限するものでないことを、理解されたい。本明細書で使用される節の見出しは、構成を目的としたものに過ぎず、記載される主題を限定するものと見なすべきでない。数値範囲は、範囲を規定する数を含む。したがって、本明細書で開示されるあらゆる数値範囲は、そのようなより広い数値範囲内に入るあらゆるより狭い数値範囲を、そのようなより狭い数値範囲が全て本明細書に明確に記載されているかのごとく包含するように意図されている。本明細書で開示されるあらゆる最大（または最小）数値限度は、あらゆる数値下（上）限を、そのような数値下（上）限が本明細書に明確に記載されているかのごとく含むことも、意図されている。
【００３７】
略号
遺伝子コードされるアミノ酸について使用される略号は、従来通りであり、以下の通りである：アラニン（ＡｌａまたはＡ）、アルギニン（ＡｒｅまたはＲ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、リシン（ＬｙｓまたはＫ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、およびバリン（ＶａｌまたはＶ）。
【００３８】
３文字略号が使用されるとき、特に、「Ｌ」もしくは「Ｄ」が先行する場合または略号が使用される文脈から明らかである場合を除き、アミノ酸は、α炭素（Ｃα）についてＬ立体配置であってもよく、またはＤ立体配置であってもよい。例えば、「Ａｌａ」は、α炭素についての立体配置の指定のないアラニンを示すが、「Ｄ−Ａｌａ」および「Ｌ−Ａｌａ」は、それぞれ、Ｄ−アラニンおよびＬ−アラニンを示す。１文字略号が使用されるとき、大文字は、α炭素についてＬ−立体配置のアミノ酸を示し、小文字は、α炭素についてＤ−立体配置のアミノ酸を示す。例えば「Ａ」は、Ｌ−アラニンを示し、「ａ」は、Ｄ−アラニンを示す。ポリペプチド配列が一連の１文字または３文字略号（またはその混合形）として提示されるとき、配列は、一般的な慣習に従ってアミノ（Ｎ）からカルボキシ（Ｃ）への方向で提示される。
【００３９】
遺伝子コードされるヌクレオシドについて使用される略号は、従来通りであり、次の通りである：アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、シチジン（（Ｃ）、チミジン（Ｔ）、およびウリジン（Ｕ）。詳しい説明が特にない場合は、略記されたヌクレオシドは、リボヌクレオシドであることもあり、または２’−デオキシリボヌクレオシドであることもある。ヌクレオシドは、個別にまたは集合的に、リボヌクレオシドまたは２’−デオキシリボヌクレオシドのどちらかであると指定されることがある。核酸配列が、一連の１文字略号として提示されるとき、配列は、一般的な慣例に従って５’から３’方向に提示され、リン酸は示されない。
【００４０】
定義
本発明に関して、本明細書での説明に使用される専門および科学用語は、別段の特別な定義がない限り、当業者によって一般に理解されている意味を有することとする。したがって、以下の用語は、以下の意味を有するように意図されている。
【００４１】
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、別段の文脈による明確な指示がない限り、複数の言及対象を含む。したがって、例えば、「ポリペプチド（ａ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」は、１つより多くのポリペプチドを含む。
【００４２】
同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、置き換え可能であり、限定することを意図したものではない。したがって、本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」およびその同語源語は、それらの包括的な意味で使用される（すなわち、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」およびその対応する同語源語と同等である）。
【００４３】
様々な実施形態の説明が用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を使用する場合、一部の具体的な事例では、実施形態が、その代わりに「から本質的になる」または「からなる」という言葉を使用して説明されることがあることは、当業者に理解されるであろう。
【００４４】
本明細書で使用される場合、用語「約」は、特定の値についての許容される誤差を意味する。一部の事例では、「約」は、所与の値範囲の０．０５％、０．５％、１．０％または２．０％以内を意味する。一部の事例では、「約」は、所与の値の１標準偏差、２標準偏差、３標準偏差または４標準偏差以内を意味する。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「ＥＣ」番号は、国際生化学・分子生物学連合の命名法委員会（ｔｈｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（ＮＣ−ＩＵＢＭＢ）の酵素命名法をいう。ＩＵＢＭＢ生化学分類は、酵素についての、それらが触媒する化学反応に基づく、数値分類体系である。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「ＡＴＣＣ」は、米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を指し、そのバイオレポジトリーコレクションは、遺伝子および株を含む。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「ＮＣＢＩ」は、米国国立生物学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）およびそこで提供されている配列データベースを指す。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「ガラクトースオキシダーゼ」（「ＧＯアーゼ」；ＥＣ１．１．３．９）酵素は、二分子酸素の存在下で第一級アルコールの対応するアルデヒドへの酸化を触媒する、銅依存性酵素である。それらは、位置特異的様式およびエナンチオ特異的様式の両方で選択的に作用し、それ故、官能基保護をほとんどまたは全く必要とせずに所望の立体異性体を生じさせる合成手法をもたらす。この酸化様式は、弱く、制御されており、したがって、活性がアルコールのその対応するカルボン酸への過度の酸化を招かない。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「ホースラディッシュペルオキシダーゼ」（ＨＲＰ、ＥＣ１．１１．１．７）酵素は、正常なＧＯアーゼ触媒サイクリング中に生じる活性部位の不活性酸化還元状態を酸化することによりＧＯアーゼ触媒活性を活性化し、維持する、鉄依存性酵素である。Ｉ型ＨＲＰは、本明細書に含まれる実施例では特に触媒様式で利用されるが、これは、この役割において排他的であることを意図したものではない。なぜなら、この役割を果たすことができるこの酵素クラスの他のアイソフォームおよび化学試薬があるからである。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「カタラーゼ」は、ＧＯアーゼ酸化の副産物である過酸化水素に対して作用する鉄依存性酵素（ＥＣ１．１１．１．６）を指し、ある特定のレベルを超える過酸化水素は、ＧＯアーゼを不活性にし得る。カタラーゼは、本明細書における実施例では特に触媒維持酵素として利用されるが、一部の実施形態では、それを過酸化水素の電気化学的分解などの他の方法によって置き換えることができるだろう。
【００５１】
「アミノ酸」は、本明細書では、それらの一般に公知の３文字記号、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会により推奨される１文字記号のどちらかによって言及される。ヌクレオチドは、同様に、それらの一般に受け入れられている１文字コードによって言及され得る。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「親水性アミノ酸または残基」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇらの正規化コンセンサス疎水性尺度（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １７９：１２５−１４２  ［１９８４］）に従ってゼロ未満の疎水性を示す側鎖を有するアミノ酸または残基を指す。遺伝子コードされる親水性アミノ酸としては、Ｌ−Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ−Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｌ−Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｌ−Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ−Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｌ−Ａｓｐ（Ｄ）、Ｌ−Ｌｙｓ（Ｋ）およびＬ−Ａｒｇ（Ｒ）を含む。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「酸性アミノ酸または残基」は、アミノ酸がペプチドまたはポリペプチドに含まれているときに約６未満のｐＫａ値を示す側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を指す。酸性アミノ酸は、典型的には、水素イオンの喪失に起因して生理ｐＨで負荷電側鎖を有する。遺伝子コードされる酸性アミノ酸としては、Ｌ−Ｇｌｕ（Ｅ）およびＬ−Ａｓｐ（Ｄ）を含む。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「塩基性アミノ酸または残基」は、アミノ酸がペプチドまたはポリペプチドに含まれているときに約６より大きいｐＫａ値を示す側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を指す。塩基性アミノ酸は、典型的には、ヒドロニウムイオンとの会合に起因して生理ｐＨで正荷電側鎖を有する。遺伝子コードされる塩基性アミノ酸としては、Ｌ−Ａｒｇ（Ｒ）およびＬ−Ｌｙｓ（Ｋ）を含む。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「極性アミノ酸または残基」は、生理ｐＨで非荷電である側鎖を有するが、この側鎖が、２個の原子によって一般に共有される電子対がこれらの原子の一方により接近して保持されている少なくとも１つの結合を有する、親水性アミノ酸または残基を指す。遺伝子コードされる極性アミノ酸としては、Ｌ−Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ−Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）およびＬ−Ｔｈｒ（Ｔ）を含む。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「疎水性アミノ酸または残基」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇらの正規化コンセンサス疎水性尺度（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １７９：１２５−１４２  ［１９８４］）に従ってゼロより大きい疎水性を示す側鎖を有するアミノ酸または残基を指す。遺伝子コードされる疎水性アミノ酸としては、Ｌ−Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｌ−Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌ−Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌ−Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｌ−Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｌ−Ａｌａ（Ａ）およびＬ−Ｔｙｒ（Ｙ）を含む。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「芳香族アミノ酸または残基」は、少なくとも１つの芳香族またはヘテロ芳香族環を含む側鎖を有する親水性または疎水性アミノ酸または残基を指す。遺伝子コードされる芳香族アミノ酸としては、Ｌ−Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｌ−Ｔｙｒ（Ｙ）およびＬ−Ｔｒｐ（Ｗ）を含む。そのヘテロ芳香族窒素原子のｐＫａのせいで、Ｌ−Ｈｉｓ（Ｈ）、それは、塩基性残基として分類されることもあり、またはその側鎖がヘテロ芳香族環を含むので芳香族残基として分類されることもあるが、本明細書では、ヒスチジンは、親水性残基として、または「拘束残基」（下記参照）として分類される。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「拘束アミノ酸または残基」は、拘束された幾何形状を有するアミノ酸または残基を指す。本明細書では、拘束残基としては、Ｌ−Ｐｒｏ（Ｐ）およびＬ−Ｈｉｓ（Ｈ）を含む。ヒスチジンは、比較的小さいイミダゾール環を有するので、拘束された幾何形状を有する。プロリンは、これもまた５員環を有するので、拘束された幾何形状を有する。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「非極性アミノ酸または残基」は、生理ｐＨで非荷電である側鎖を有し、この側鎖が、２個の原子によって一般に共有される電子対がこれら２個の原子の各々によって一般に均等に保持されている結合を有する（すなわち、側鎖が極性でない）、疎水性アミノ酸または残基を指す。遺伝子コードされる非極性アミン酸としては、Ｌ−Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｌ−Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌ−Ｍｅｔ（Ｍ）およびＬ−Ａｌａ（Ａ）を含む。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「脂肪族アミノ酸または残基」は、脂肪族炭化水素側鎖を有する疎水性アミノ酸または残基を指す。遺伝子コードされる脂肪族アミノ酸としては、Ｌ−Ａｌａ（Ａ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｌｅｕ（Ｌ）およびＬ−Ｉｌｅ（Ｉ）を含む。システイン（または「Ｌ−Ｃｙｓ」または「［Ｃ］」）は、他のＬ−Ｃｙｓ（Ｃ）アミノ酸または他のスルファニル含有もしくはスルフヒドリル含有アミノ酸とジスルフィド架橋を形成することができる点で稀であることに留意されたい。「システイン様残基」は、ジスルフィド架橋の形成に利用可能であるスルフヒドリル部分を含有する、システインおよび他のアミノ酸を含む。Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）（および−ＳＨ含有側鎖を有する他のアミノ酸）が、ペプチド中に、還元された遊離−ＳＨ形態または酸化されたジスルフィド架橋形態のどちらかで存在できることは、Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）が、ペプチドに対する正味の疎水性に寄与するのか、または正味の親水性に寄与するのかに影響を与える。Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇの正規化コンセンサス尺度（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４、上掲）に従って０．２９の疎水性を示すが、本開示の目的では、Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）がそれ自体の固有の群に大別されることを理解されたい。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「小さいアミノ酸または残基」は、合計３個またはそれ未満の炭素および／またはヘテロ原子（α炭素および水素を除く）で構成されている側鎖を有するアミノ酸または残基を指す。小さいアミノ酸または残基を、上記定義に従って、脂肪族、非極性、極性または酸性の小さいアミノ酸または残基としてさらに大別することができる。遺伝子コードされる小さいアミノ酸としては、Ｌ−Ａｌａ（Ａ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｌ−Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ−Ｔｈｒ（Ｔ）およびＬ−Ａｓｐ（Ｄ）を含む。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「ヒドロキシル含有アミノ酸または残基」は、ヒドロキシル（−ＯＨ）部分を含有するアミノ酸を指す。遺伝子コードされるヒドロキシル含有アミノ酸としては、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）  Ｌ−Ｔｈｒ（Ｔ）およびＬ−Ｔｙｒ（Ｙ）を含む。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、共有結合で互いに連結されている２つまたはそれより多くのヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドは、完全にリボヌクレオチド（すなわち、ＲＮＡ）から構成されることもあり、完全に２’デオキシリボヌクレオチド（すなわち、ＤＮＡ）から構成されることもあり、またはリボヌクレオチドと２’デオキシリボヌクレオチドの混合物から構成されることもある。ヌクレオシドは、典型的には、標準的なホスホジエステル連結によって互いに連結されているが、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の非標準的連結を含むこともある。ポリヌクレオチドは、一本鎖状もしくは二本鎖状であることもあり、または一本鎖領域と二本鎖領域両方を含むこともある。さらに、ポリヌクレオチドは、典型的には、天然に存在するコード核酸塩基（すなわち、アデニン、グアニン、ウラシル、チミンおよびシトシン）で構成されているが、例えばイノシン、キサンチン、ヒポキサンチンなどのような、１つまたは複数の修飾および／または合成核酸塩基を含むこともある。一部の実施形態では、そのような修飾または合成核酸塩基は、アミノ酸配列をコードする核酸塩基である。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「コード配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸（例えば、遺伝子）のその部分を指す。
【００６５】
本明細書で使用される場合、用語「生体触媒作用」、「生体触媒（の）」、「生体内変換」および「生合成」は、有機化合物に対する化学反応を行うための酵素の使用を指す。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「野生型」および「天然に存在する」は、自然界に見られる形態を指す。例えば、野生型ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、生物に存在する配列であって、自然界の供給源から単離することができ、ヒトによる操作によって意図的に修飾されていない、配列である。
【００６７】
本明細書で使用される場合、細胞、核酸またはポリペプチドに関して使用されるときの「組換え」、「操作された」、「改変体」および「天然に存在しない」は、そうしなければ自然界に存在しない様式で修飾されている物質またはこの物質の天然もしくはネイティブ形態に対応する物質を指す。一部の実施形態では、細胞、核酸またはポリペプチドは、天然に存在する細胞、核酸またはポリペプチドと同一であるが、合成物質からおよび／または組換え技術を使用する操作により産生または誘導される。非限定的な例としては、数ある中でも特に、ネイティブ（非組換え）形態の細胞内に見られない遺伝子を発現する、またはそうしなければ異なるレベルで発現されるネイティブ遺伝子を発現する、組換え細胞が挙げられる。
【００６８】
用語「配列同一性パーセント（％）」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の比較を指すために本明細書で使用され、比較ウィンドウにわたって２つの最適にアラインメントされた配列を比較することにより決定され、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、これら２つの配列の最適なアラインメントのために参照配列と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことがある。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列に出現する位置の数を決定してマッチした位置の数を得、マッチした位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性パーセンテージを得ることによって計算することができる。あるいは、パーセンテージは、同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基のいずれかが両方の配列に出現する位置の数または核酸塩基もしくはアミノ酸残基がギャップを用いてアラインメントされる位置の数を決定してマッチした位置の数を得、マッチした位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性パーセンテージを得ることによって計算することができる。２配列のアラインメントに利用可能な多数の確立されたアルゴリズムがあることは、当業者には理解される。比較のための配列の最適なアラインメントは、当技術分野において公知であるように、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．，  ２：４８２  ［１９８１］）を含むがこれに限定されない、任意の好適な方法により、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの相同性アラインメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ４８：４４３  ［１９７０］）により、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似性検索方法（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：２４４４  ［１９８８］）により、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）により、または目視検査により、行うことができる。配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントの決定に好適であるアルゴリズムの例としては、これらに限定されないが、Ａｌｔｓｃｈｕｌらによって記載されているＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムが挙げられる（それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２１５：  ４０３−４１０  ［１９９０］；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３３８９−３４０２  ［１９７７］を参照されたい）。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、米国国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のウェブサイトを通して公的に入手できる。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントしたときにマッチするか何らか正の値の閾スコアＴを満たす、���い合わせ配列中の長さＷの短いワードを特定することによって、高スコアの配列対（ＨＳＰ）を先ず特定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．、上掲を参照されたい）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシードとしての役割を果す。次いで、ワードヒットが、累積アラインメントスコアを増加することができる限り、各配列に沿って両方向に拡大される。累積スコアは、ヌクレオチド配列についてはパラメーターＭ（マッチする残基対についての報酬スコア、常に＞０）およびＮ（ミスマッチの残基についてのペナルティスコア、常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列については、累積スコアを計算するためにスコア行列が使用される。各方向のワードヒットの拡大は、累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ低下すると、停止され；累積スコアが、１つもしくは複数の負のスコアの残基アラインメントの累積に起因してゼロもしくはそれ未満になると、停止され；またはどちらかの配列の末端に達すると停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列についてのＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列を使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：１０９１５  ［１９８９］を参照されたい）。配列アラインメントおよび配列同一性％の例示的決定は、提供されているデフォルトパラメーターを使用して、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）のＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプログラムを利用することができる。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「参照配列」は、配列および／または活性比較の基準として使用される定義された配列を指す。参照配列は、より大きい配列のサブセット、例えば、完全長遺伝子またはポリペプチド配列のセグメントであることもある。一般に、参照配列は、核酸またはポリペプチドの長さ少なくとも２０ヌクレオチドまたはアミノ酸残基、長さ少なくとも２５残基、長さ少なくとも５０残基、長さ少なくとも１００残基または完全長である。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、各々、（１）２配列間で類似している配列（すなわち、完全配列の一部分）を含むことがあり、かつ（２）２配列間で相違する配列をさらに含むことがあるので、２つの（またはそれより多くの）ポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列比較は、配列類似性の局所領域を同定し、比較するために、「比較ウィンドウ」にわたって２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を比較することによって典型的に行われる。一部の実施形態では、「参照配列」は、一次アミノ酸配列に基づくことがあり、この場合、参照配列は、一次配列の１つまたは複数の変化を有し得る配列である。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「比較ウィンドウ」は、少なくとも約２０の連続するヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念上のセグメントであって、少なくとも２０個の連続するヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と配列を比較することができ、比較ウィンドウ内のその配列の部分が、２配列の最適なアラインメントのために参照配列（付加も欠失も含まない）と比較して２０パーセントまたはそれ未満の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る、セグメントを指す。比較ウィンドウは、２０個の連続する残基より長いこともあり、必要に応じて３０、４０、５０、１００またはそれより長いウィンドウを含む。
【００７１】
本明細書で使用される場合、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の番号付けの文脈で使用されるときの「〜に対応する」、「〜への言及」および「〜と比較して」は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列が参照配列と比較されるときの指定参照配列の残基の番号付けを指す。言い換えると、所与のポリマーの残基番号または残基位置は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の番号の位置によるのではなく、参照配列に対して示される。例えば、所与のアミノ酸配列、例えば、操作されたガラクトースオキシダーゼのアミノ酸配列は、２配列間の残基マッチを最適化するためにギャップを導入することによって参照配列とアラインメントすることができる。これらの場合、ギャップが存在するが、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列中の残基の番号付けは、それがアラインメントされた参照配列に対して行われる。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「実質的同一性」は、少なくとも２０残基位置の比較ウィンドウにわたって、多くの場合、少なくとも３０〜５０残基のウィンドウにわたって、参照配列と比較して少なくとも８０パーセントの配列同一性、少なくとも８５パーセントの同一性、少なくとも８９〜９５パーセントの間の配列同一性、またはより通常は少なくとも９９パーセントの配列同一性を有する、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を指し、この配列同一性パーセンテージは、合計で参照配列の２０パーセントまたはそれ未満となる欠失または付加を含む配列と参照配列を比較ウィンドウにわたって比較することによって計算される。ポリペプチドに適用される一部の具体的な実施形態では、用語「実質的同一性」は、２つのポリペプチド配列が、最適にアラインメントされたとき、例えば、デフォルトギャップ重みを使用してプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴにより最適にアラインメントされたとき、少なくとも８０パーセントの配列同一性、好ましくは、少なくとも８９パーセントの配列同一性、少なくとも９５パーセントの配列同一性またはそれより高い配列同一性（例えば、９９パーセントの配列同一性）を共有することを意味する。一部の実施形態では、比較される配列中の同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換が異なる。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸相違」および「残基相違」は、参照配列中の対応する位置におけるアミノ酸残基と比較した、ポリペプチド配列の位置におけるアミノ酸残基の相違を指す。一部の場合には、参照配列は、ヒスチジンタグを有するが、番号付けは、ヒスチジンタグのない同等の参照配列と比較して維持される。アミノ酸相違の位置は、本明細書では一般に「Ｘｎ」と呼ばれ、この場合のｎは、残基相違の基準となる参照配列中の対応する位置を指す。例えば、「配列番号４と比較してＸ９３位における残基相違」は、配列番号４の９３位に対応するポリペプチド位置におけるアミノ酸残基の相違を指す。したがって、配列番号４の参照ポリペプチドが９３位にセリンを有する場合には、「配列番号４と比較してＸ９３位における残基相違」は、配列番号４の９３位に対応するポリペプチドの位置におけるセリン以外の任意の残基のアミノ酸置換。本明細書におけるほとんどの事例では、ある位置における特定のアミノ酸残基相違は、「ＸｎＹ」として示され、この場合、「Ｘｎ」は、上記の通り対応する位置を指定し、「Ｙ」は、操作されたポリペプチドに見られるアミノ酸（すなわち、参照ポリペプチド中のものとは異なる残基）の１文字識別子である。一部の事例では（例えば、実施例で提示される表において）、本発明は、従来表記「ＡｎＢ」により示される特定のアミノ酸相違も提供し、この場合、Ａは、参照配列中の残基の１文字識別子であり、「ｎ」は、参照配列中の残基位置の番号であり、Ｂは、操作されたポリペプチドの配列中の残基置換の１文字識別子である。一部の事例では、本発明のポリペプチドは、参照配列と比較して１つまたは複数のアミノ酸残基相違を含み、これは、参照配列と比較して残基相違が存在する特定の位置のリストにより示される。一部の実施形態では、１個より多くのアミノ酸をポリペプチドの特定の残基位置に使用することができる場合、使用することができる様々なアミノ酸残基は、「／」によって隔てられている（例えば、Ｘ３０７Ｈ／Ｘ３０７ＰまたはＸ３０７Ｈ／Ｐ）。スラッシュは、所与の改変体内の複数の置換（すなわち、１つより多くの置換が所与の配列に、例えば組合せ改変体に、存在すること）を示すためにも使用され得る。一部の実施形態では、本発明は、保存的または非保存的アミノ酸置換を含む１つまたは複数のアミノ酸相違を含む操作されたポリペプチド配列を含む。一部の追加の実施形態では、本発明は、保存的アミノ酸置換と非保存的アミノ酸置換の両方を含む操作されたポリペプチド配列を提供する。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」は、類似の側鎖を有する異なる残基での残基の置換を指し、したがって、アミノ酸の同じまたは類似の定義されたクラス内のアミノ酸でのポリペプチド中のアミノ酸の置換を典型的には含む。例として、限定ではなく、一部の実施形態では、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は、別の脂肪族アミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン）で置換され；ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸は、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、セリンおよびトレオニン）で置換され；芳香族側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびヒスチジン）で置換され；塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性側鎖（ｂａｓｉｓ  ｓｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）を有する別のアミノ酸（例えば、リシンおよびアルギニン）で置換され；酸性側鎖を有するアミノ酸は、酸性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）で置換され；および／または疎水性もしくは親水性アミノ酸は、それぞれ、別の疎水性もしくは親水性アミノ酸で置き換えられる。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「非保存的置換」は、有意に異なる側鎖特性を有するアミノ酸でのポリペプチド中のアミノ酸の置換を指す。非保存的置換は、定義された群内ではなく定義された群間のアミノ酸を使用することがあり、（ａ）置換（例えば、プロリンでのグリシンの置換）の領域内のペプチド骨格の構造、（ｂ）電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩に影響を与える。例として、限定ではなく、例示的非保存的置換は、塩基性または脂肪族アミノ酸で置換された酸性アミノ酸；小さいアミノ酸で置換された芳香族アミノ酸；および疎水性アミノ酸で置換された親水性アミノ酸であり得る。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「欠失」は、参照ポリペプチドからの１個または複数のアミノ酸の除去によるポリペプチドの修飾を指す。欠失は、操作されたガラクトースオキシダーゼ酵素の酵素活性を保持しながら、および／または改善された特性を保持しながら、参照酵素を構成する１個もしくはそれより多くのアミノ酸、２個もしくはそれより多くのアミノ酸、５個もしくはそれより多くのアミノ酸、１０個もしくはそれより多くのアミノ酸、１５個もしくはそれより多くのアミノ酸、または２０個もしくはそれより多くのアミノ酸、アミノ酸の総数の最大１０％、またはアミノ酸の総数の最大２０％の欠失を含むことができる。欠失は、ポリペプチドの内部部分および／または末端部分に関することがある。様々な実施形態では、欠失は、連続するセグメントを含むこともあり、または不連続であることもある。欠失は、典型的には、アミノ酸配列の中で「−」によって示される。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「挿入」は、参照ポリペプチドからの１個または複数のアミノ酸の付加によるポリペプチドの修飾を指す。挿入は、ポリペプチドの内部部分におけるものであることもあり、またはカルボキシもしくはアミノ末端へのものであることもある。本明細書で使用される場合の挿入は、当技術分野において公知であるような融合タンパク質を含む。挿入は、天然に存在するポリペプチド中のアミノ酸の連続したセグメントであることもあり、またはアミノ酸の１個もしくは複数によって隔てられていることもある。
【００７８】
用語「アミノ酸置換のセット」または「置換のセット」は、参照配列と比較して、ポリペプチド配列中のアミノ酸置換の群を指す。置換のセットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれより多くのアミノ酸置換を有することがある。一部の実施形態では、置換のセットは、実施例で提供される表に収載される改変体ガラクトースオキシダーゼのいずれかに存在するアミノ酸置換のセットを指す。
【００７９】
「機能的断片」および「生物活性断片」は、アミノ末端および／もしくはカルボキシ末端欠失ならびに／または内部欠失を有するが、残りのアミノ酸配列は、それが比較される配列（例えば、本発明の完全長操作されたガラクトースオキシダーゼ）中の対応する位置と同一である、ポリペプチドであって、完全長ポリペプチドの活性の実質的に全てを保持するポリペプチドを指すために、本明細書では同義的に使用される。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「単離されたポリペプチド」は、天然にそれに付随する他の夾雑物（例えば、タンパク質、脂質およびポリヌクレオチド）から実質的に分離されているポリペプチドを指す。この用語は、それらの天然に存在する環境または発現系から除去または精製された（例えば、宿主細胞内のまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成による）ポリペプチドを包含する。組換えガラクトースオキシダーゼポリペプチドは、細胞内に存在することもあり、細胞培地に存在することもあり、または溶解物もしくは単離された調製物などの様々な形態で調製されることもある。したがって、一部の実施形態では、組換えガラクトースオキシダーゼポリペプチドは、単離されたポリペプチドであることがある。
【００８１】
本明細書で使用される場合、「実質的に純粋なポリペプチド」または「精製されたタンパク質」は、ポリペプチド種が、存在する優勢種である（すなわち、モル濃度または重量ベースで、それが組成物中のいずれの他の個々の高分子種より存在量が多い）組成物を指し、一般に、目的種が、存在する高分子種のモルまたは重量％で少なくとも約５０パーセントを構成する場合には実質的に精製された組成物である。しかし、一部の実施形態では、ガラクトースオキシダーゼを含む組成物は、５０％未満純粋（例えば、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、または約５０％）であるガラクトースオキシダーゼを含む。一般に、実質的に純粋なガラクトースオキシダーゼ組成物は、組成物中に存在する全高分子種のモルまたは重量％で約６０％またはそれより高い％、約７０％またはそれより高い％、約８０％またはそれより高い％、約９０％またはそれより高い％、約９５％またはそれより高い％、および約９８％またはそれより高い％を構成する。一部の実施形態では、目的種は、組成物が単一の高分子種から本質的になる本質的均質まで精製される（すなわち、従来の検出法により夾雑種を組成物中で検出することができない）。溶媒種、小分子（＜５００ダルトン）、および元素イオン種は、高分子種と見なされない。一部の実施形態では、単離された組換えガラクトースオキシダーゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「改善された酵素特性」は、酵素の少なくとも１つの改善された特性を指す。一部の実施形態では、本発明は、参照ガラクトースオキシダーゼポリペプチドおよび／または野生型ガラクトースオキシダーゼポリペプチドおよび／または別の操作されたガラクトースオキシダーゼポリペプチドと比較して任意の酵素特性の改善を示す、操作されたガラクトースオキシダーゼポリペプチドを提供する。したがって、「改善」のレベルは、野生型はもちろん操作されたガラクトースオキシダーゼも含む、様々なガラクトースオキシダーゼポリペプチド間で、決定および比較され得る。改善された特性は、これらに限定されないが、タンパク質発現の増加、熱活性の増加、熱安定性の増大、ｐＨ活性の増加、安定性の増大、酵素活性の増加、基質特異性のまたは親和性の増大、比活性の増加、基質または最終産物阻害に対する耐性の増大、化学的安定性の増大、化学選択性の改善、溶媒安定性の改善、酸性ｐＨに対する耐性の増大、タンパク質分解活性に対する耐性の増大（すなわち、タンパク質分解に対する感受性の低下）、凝集の低減、溶解度の増加、および温度プロファイルの変更のような特性を含む。追加の実施形態では、この用語は、ガラクトースオキシダーゼ酵素の少なくとも１つの改善された特性に関して使用される。一部の実施形態では、本発明は、参照ガラクトースオキシダーゼポリペプチドおよび／または野生型ガラクトースオキシダーゼポリペプチドおよび／または別の操作されたガラクトースオキシダーゼポリペプチドと比較して任意の酵素特性の改善を示す、操作されたガラクトースオキシダーゼポリペプチドを提供する。したがって、「改善」のレベルは、野生型はもちろん操作されたガラクトースオキシダーゼも含む、様々なガラクトースオキシダーゼポリペプチド間で、決定および比較され得る。
【００８３】
本明細書で使用される場合、「酵素活性の増加」および「触媒活性の増強」は、参照酵素と比較して比活性（例えば、産生される産物／時間／タンパク質重量）の増加または基質の産物への変換パーセント（例えば、指定量の酵素を使用する指定期間内の出発量の基質の産物への変換パーセント）の上昇によって表され得る、操作されたポリペプチドの改善された特性を指す。一部の実施形態では、これらの用語は、参照ガラクトースオキシダーゼ酵素と比較して比活性（例えば、産生される産物／時間／タンパク質重量）の増加または基質の産物への変換パーセント（例えば、指定量のガラクトースオキシダーゼを使用する指定期間内の出発量の基質の産物への変換パーセント）の上昇によって表され得る、本明細書で提供される操作されたガラクトースオキシダーゼポリペプチドの改善された特性を指す。一部の実施形態では、これらの用語は、本明細書で提供される改善されたガラクトースオキシダーゼ酵素に関して使用される。本発明の操作されたガラクトースオキシダーゼの酵素活性を決定するための例示的方法は、実施例で提供される。Ｋｍ、Ｖｍａｘまたはｋｃａｔ（これらの変化は酵素活性の増加につながり得る）の古典的酵素特性を含む、酵素活性に関係する任意の特性が、影響を受け得る。例えば、酵素活性の改善は、対応する野生型酵素の酵素活性の約１．１倍から、ガラクトースオキシダーゼポリペプチドが誘導された天然に存在するガラクトースオキシダーゼまたは別の操作されたガラクトースオキシダーゼの２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍ほどものまたはそれよりも高い酵素活性までであり得る。
【００８４】
本明細書で使用される場合、「変換」は、基質の対応する産物への酵素的変換（または生体内変換）を指す。「変換パーセント」は、指定条件下で期間内に産物に変換される基質のパーセントを指す。したがって、ガラクトースオキシダーゼポリペプチドの「酵素活性」または「活性」は、特定の期間内の産物への基質の「変換パーセント」として表すことができる。
【００８５】
「ゼネラリスト（ｇｅｎｅｒａｌｉｓｔ）特性」を有する酵素（または「ゼネラリスト酵素」）は、親配列と比較して、広範な基質に対して改善された活性を示す酵素を指す。ゼネラリスト酵素は、あらゆる可能な基質に対して改善された活性を必ずしも実証しない。一部の実施形態では、本発明は、広範な立体的および電子的に多様な基質に対して親遺伝子と比較して同様のまたは改善された活性を示すことからゼネラリスト特性を有する、ガラクトースオキシダーゼ改変体を提供する。加えて、本明細書で提供されるゼネラリスト酵素は、代謝物／産物の生成を増加させるために広範な多様な分子にわたって改善されるように操作された。
【００８６】
用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、核酸ハイブリッドが安定している条件を指すために本明細書では使用される。当業者には公知であるように、ハイブリッドの安定性は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）に反映される。一般に、ハイブリッドの安定性は、イオン強度、温度、Ｇ／Ｃ含量、およびカオトロピック剤の存在の関数である。ポリヌクレオチドのＴｍ値は、融解温度を予測するための公知の方法を使用して計算することができる（例えば、Ｂａｌｄｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １６８：７６１−７７７  ［１９８９］；Ｂｏｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ４８：１３９０  ［１９６２］；Ｂｒｅｓｓｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３：８８９３−８８９７  ［１９８６］；Ｆｒｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３：９３７３−９３７７  ［１９８６］；Ｋｉｅｒｚｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２５：７８４０−７８４６  ［１９８６］；Ｒｙｃｈｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，    Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １８：６４０９−６４１２  ［１９９０］（誤植、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １９：６９８  ［１９９１］）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、上掲；Ｓｕｇｇｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１，  ｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｇｅｎｅｓ，  Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．［ｅｄｓ．］，  ｐｐ．  ６８３−６９３，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ  ［１９８１］；およびＷｅｔｍｕｒ，  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２６：２２７−２５９  ［１９９１］を参照されたい）。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書で開示されるポリペプチドをコードし、中等度にストリンジェントまたは高度にストリンジェントな条件などの定義された条件下で、本発明の操作されたガラクトースオキシダーゼ酵素をコードする配列の相補配列とハイブリダイズする。
【００８７】
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーションストリンジェンシー」は、核酸のハイブリダイゼーションの際の、洗浄条件などの、ハイブリダイゼーション条件を指す。一般に、ハイブリダイゼーション反応は、より低度のストリンジェンシーの条件下で行われ、これに様々な、しかしより高度な、ストリンジェンシーの洗浄が続く。用語「中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、標的ＤＮＡが、標的ＤＮＡに対して約６０％の同一性、好ましくは、約７５％の同一性、約８５％の同一性とともに標的ポリヌクレオチドに対して約９０％より高い同一性を有する相補的核酸に結合することを可能にする条件を指す。例示的な中等度にストリンジェントな条件は、５０％ホルムアミド、５×デンハート液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中、４２℃でのハイブリダイゼーション、続いて０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中、４２℃での洗浄に相当する条件である。「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」は、定義されたポリヌクレオチド配列についての溶液条件下で決定された熱融解温度Ｔｍから約１０℃またはそれ未満である条件を一般に指す。一部の実施形態では、高ストリンジェンシー条件は、０．０１８Ｍ  ＮａＣｌ中、６５℃で安定したハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す（すなわち、ハイブリッドが、０．０１８Ｍ  ＮａＣｌ中、６５℃で、安定しない場合、それは、本明細書で企図されるような高ストリンジェンシー条件下で安定しないことになる）。高ストリンジェンシー条件は、例えば、０．１×ＳＳＰＥ、および０．１％ＳＤＳ中、６５℃での洗浄が続く、４２℃で５０％ホルムアミド、５×デンハート液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳに相当する条件でのハイブリダイゼーションによって、提供され得る。別の高ストリンジェンシー条件は、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含有する５×ＳＳＣ中、６５℃でのハイブリダイゼーションおよび０．１％ＳＤＳを含有する０．１×ＳＳＣ中、６５℃での洗浄に相当する条件でのハイブリダイゼーションである。他の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、および中等度にストリンジェントな条件は、上記の参考文献に記載されている。
【００８８】
本明細書で使用される場合、「コドン最適化された」は、コードされたタンパク質が目的の生物において効率的に発現されるような、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンの、特定の生物において優先的に使用されるコドンへの変化を指す。遺伝コードは、大部分のアミノ酸が、「シノニム」または「同義」コドンと呼ばれるいくつかのコドンによって表されることから縮重しているが、特定の生物によるコドン使用頻度がランダムでなく、特定のコドントリプレットに偏っていることは、周知である。このコドン使用頻度の偏りは、所与の遺伝子、共通の機能または祖先起源の遺伝子、低コピー数タンパク質に対して高度に発現されるタンパク質、および生物のゲノムの凝集タンパク質コード領域に関して、より高度であり得る。一部の実施形態では、ガラクトースオキシダーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドは、発現に選択された宿主生物における最適な産生のためにコドン最適化され得る。
【００８９】
本明細書で使用される場合、単独でまたは組み合わせて使用されるときの、「好ましい」コドン、「最適な」コドンおよび「高度のコドン使用頻度の偏り」コドンは、同義語として、同じアミノ酸をコードする他のコドンより高頻度でタンパク質コード領域において使用されるコドンを指す。好ましいコドンは、単一の遺伝子、共通の機能または起源の遺伝子のセット、高度に発現される遺伝子におけるコドン使用頻度に関して決定されることもあり、生物全体の凝集タンパク質コード領域におけるコドン頻度に関して決定されることもあり、関連生物の凝集タンパク質コード領域におけるコドン頻度に関して決定されることもあり、またはこれらの組合せに関して決定されることもある。頻度が遺伝子発現レベルに伴って増加するコドンは、典型的には発現に最適なコドンである。例えば、クラスター解析または対応解析を使用する、多変量解析を含む、特定の生物におけるコドン頻度（例えば、コドン使用頻度、相対同義コドン使用頻度）およびコドン選好を決定するための様々な方法、ならびに遺伝子において使用されるコドンの有効数を決定するための様々な方法が、公知である（例えば、ＧＣＧ  ＣｏｄｏｎＰｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ；  ＣｏｄｏｎＷ，  Ｐｅｄｅｎ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ；  ＭｃＩｎｅｒｎｅｙ，  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．，  １４：３７２−７３  ［１９９８］；Ｓｔｅｎｉｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２２２４３７−４６  ［１９９４］；およびＷｒｉｇｈｔ，  Ｇｅｎｅ  ８７：２３−２９  ［１９９０］を参照されたい）。多くの異なる生物についてのコドン使用頻度表が入手可能である（例えば、Ｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２０：２１１１−２１１８  ［１９９２］；Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２８：２９２  ［２０００］；Ｄｕｒｅｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  上掲；Ｈｅｎａｕｔ  ａｎｄ  Ｄａｎｃｈｉｎ，  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，  Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），  ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，  ｐ．  ２０４７−２０６６  ［１９９６］を参照されたい）。コドン使用頻度を得るためのデータ源は、タンパク質をコードすることができる任意の利用可能なヌクレオチド配列に依拠す得る。これらのデータセットは、発現されるタンパク質（例えば、完全タンパク質コード配列−ＣＤＳ）をコードすること、発現される配列タグ（ＥＳＴＳ）をコードすること、またはゲノム配列の予測コード領域をコードすることが実際に公知である核酸配列を含む（例えば、Ｍｏｕｎｔ，  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ８，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．  ［２００１］；Ｕｂｅｒｂａｃｈｅｒ，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  ２６６：２５９−２８１  ［１９９６］；およびＴｉｗａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｓｃｉ．，  １３：２６３−２７０  ［１９９７］を参照されたい）。
【００９０】
本明細書で使用される場合、「制御配列」は、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現に必要または有利である全ての成分を含む。各制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列にとってネイティブのものであってもよいし、または外来のものであってもよい。そのような制御配列としては、これらに限定されないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター配列、シグナルペプチド配列、開始配列および転写ターミネーターを含む。少なくとも、制御配列は、プロモーター、ならびに転写および翻訳停止シグナルを含む。制御配列は、制御配列とポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域とのライゲーションを助長する特異的制限部位を導入するためにリンカーを備えていることもある。
【００９１】
「作動可能に連結した」は、本明細書では、制御配列が、目的のポリヌクレオチドに対して相対的な位置に、制御配列が目的のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を指令または調節するように適切に（すなわち、機能的関係で）配置されている構成と定義される。
【００９２】
「プロモーター配列」は、目的のポリヌクレオチドの発現について宿主細胞により認識される核酸配列、例えばコード配列を指す。プロモーター配列は、目的のポリヌクレオチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、変異体、切断型およびハイブリッドプロモーターを含む、選ばれる宿主細胞において転写活性を示す任意の核酸配列であり得、プロモーターを、宿主細胞にとって同種または異種のどちらかの細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
【００９３】
「好適な反応条件」という句は、本発明のガラクトースオキシダーゼポリペプチドが所望の産物化合物に基質を変換することができる、酵素的変換反応溶液における条件（例えば、酵素負荷量、基質負荷量、温度、ｐＨ、緩衝剤、共溶媒などの範囲）を指す。一部の例示的な「好適な反応条件」が本明細書で提供される。
【００９４】
本明細書で使用される場合、「化合物負荷量」または「酵素負荷量」などにおける「負荷量」は、反応開始時の反応混合物中の成分の濃度または量を指す。
【００９５】
本明細書で使用される場合、酵素的変換反応プロセスの文脈での「基質」は、本明細書で提供される操作された酵素（例えば、操作されたガラクトースオキシダーゼポリペプチド）による作用を受ける化合物または分子を指す。
【００９６】
本明細書で使用される場合、反応からの産物（例えば、３−エチニルグリセルアルデヒド［ＥＧＡ］のＲ−エナンチオマー）の収量の「増加」は、反応中に存在する特定の成分（例えば、ガラクトースオキシダーゼ酵素）が、目的の成分の非存在下だが同じ基質および他の置換基を用いて同じ条件下で行われた反応と比較して、より多くの産物を産生させる場合に起こる。
【００９７】
反応は、反応を触媒することに関与する他の酵素と比較して特定の酵素の量が約２％、約１％または約０．１％（ｗｔ／ｗｔ）未満であった場合、特定の酵素が「実質的にない」と言われる。
【００９８】
本明細書で使用される場合、液体（例えば、培養ブロス）を「分画すること」は、所望のタンパク質が初期液体産物中より溶液中でのほうが全タンパク質に対して高いパーセンテージを構成する溶液を得るために分離プロセス（例えば、塩析、カラムクロマトグラフィー、サイズ排除、濾過）またはそのようなプロセスの組合せを適用することを意味する。
【００９９】
本明細書で使用される場合、「出発組成物」は、少なくとも１つの基質を含む任意の組成物を指す。一部の実施形態では、出発組成物は、任意の好適な基質を含む。
【０１００】
本明細書で使用される場合、酵素的変換プロセスの文脈での「産物」は、基質に対する酵素ポリペプチドの作用の結果として生じる化合物または分子を指す。
【０１０１】
本明細書で使用される場合、本明細書で使用される場合の「平衡」は、立体異性体の相互変換を含む、化学または酵素反応（例えば、２つの種ＡおよびＢの相互変換）において、化学または酵素反応の順方向速度定数および逆方向速度定数により決定して、化学種の定常状態濃度に至るプロセスを指す。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、「補因子」は、反応を触媒する際に酵素と一緒に動作する非タンパク質化合物を指す。
【０１０３】
本明細書で使用される場合、「アルキル」は、直鎖状または分岐状どちらかの、炭素原子数１〜１８（両端の値を含む）、より好ましくは炭素原子数１〜８（両端の値を含む）、最も好ましくは炭素原子数１〜６（両端の値を含む）の、飽和炭化水素基を指す。指定数の炭素原子を有するアルキルは、カッコ内に示される（例えば、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルは、炭素原子数１〜４のアルキルを指す）。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、「アルケニル」は、少なくとも１つの二重結合を含有するが、必要に応じて１つより多くの二重結合を含有する、直鎖または分岐状どちらかの、炭素原子数２〜１２（両端の値を含む）の基を指す。
【０１０５】
本明細書で使用される場合、「アルキニル」は、少なくとも１つの三重結合を含有するが、必要に応じて１つより多くの三重結合を含有し、加えて必要に応じて１つまたは複数の二重結合部分を含有する、直鎖または分岐状どちらかの、炭素原子数２〜１２（両端の値を含む）の基を指す。
【０１０６】
本明細書で使用される場合、「ヘテロアルキル」、「ヘテロアルケニル」および「ヘテロアルキニル」は、炭素原子のうちの１個または複数が、各々独立して、同じまたは異なるヘテロ原子またはヘテロ原子基で置き換えられている、本明細書で定義される通りのアルキル、アルケニルおよびアルキニルを指す。炭素原子を置き換えることができるヘテロ原子および／またはヘテロ原子基としては、これらに限定されないが、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｏ−、−ＮＲα−、−ＰＨ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）ＮＲα−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲα−などが、これらの組合せを含めて挙げられ、ここでの各Ｒαは、独立して、水素、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールから選択される。
【０１０７】
本明細書で使用される場合、「アルコキシ」は、基−ＯＲβ（式中のＲβは、上で定義された通りのアルキル基であり、このアルキル基は、同じく本明細書で定義される通りの、必要に応じて置換されているアルキル基を含む）を指す。
【０１０８】
本明細書で使用される場合、「アリール」は、単一の環（例えば、フェニル）または複数の縮合環（例えば、ナフチルもしくはアントリル）を有する、炭素原子数６〜１２（両端の値を含む）の不飽和芳香族炭素環式基を指す。例示的なアリールとしては、フェニル、ピリジル、ナフチルなどが挙げられる。
【０１０９】
本明細書で使用される場合、「アミノ」は、基−ＮＨ２を指す。置換アミノは、基−ＮＨＲδ、ＮＲδＲδおよびＮＲδＲδＲδ（式中の各Ｒδは、独立して、置換または非置換アルキル、シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アシル、アルコキシカルボニル、スルファニル、スルフィニル、スルホニルなどから選択される）を指す。典型的なアミノ基としては、これらに限定されないが、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、メチルスルホニルアミノ、フラニル−オキシ−スルファミノなどが挙げられる。
【０１１０】
本明細書で使用される場合、「オキソ」は、＝Ｏを指す。
【０１１１】
本明細書で使用される場合、「オキシ」は、二価の基−Ｏ−を指し、この基は、エーテルおよびエステルを含む異なるオキシ基を形成するために、様々な置換基を有することがある。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、「カルボキシ」は、−ＣＯＯＨを指す。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、「カルボニル」は、−Ｃ（Ｏ）−を指し、これは、酸、酸ハロゲン化物、アルデヒド、アミド、エステルおよびケトンを含む異なるカルボニル基を形成するために、様々な置換基を有することがある。
【０１１４】
本明細書で使用される場合、「アルコキシカルボニル」は、−Ｃ（Ｏ）ＯＲε（式中、Ｒεは、必要に応じて置換されていることがある、本明細書で定義される通りのアルキル基である）を指す。
【０１１５】
本明細書で使用される場合、「アミノカルボニル」は、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２を指す。置換アミノカルボニルは、−Ｃ（Ｏ）ＮＲδＲδ（式中のアミノ基ＮＲδＲδは、本明細書で定義される通りである）を指す。
【０１１６】
本明細書で使用される場合、「ハロゲン」および「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを指す。
【０１１７】
本明細書で使用される場合、「ヒドロキシ」は、−ＯＨを指す。
【０１１８】
本明細書で使用される場合、「シアノ」は、−ＣＮを指す。
【０１１９】
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリール」は、炭素原子数が１〜１０（両端の値を含む）であり、環内の酸素、窒素および硫黄から選択されるヘテロ原子の数が１〜４（両端の値を含む）である、芳香族ヘテロ環式基を指す。そのようなヘテロアリール基は、単一の環（例えば、ピリジルもしくはフリル）または複数の縮合環（例えば、インドリジニルもしくはベンゾチエニル）を有することがある。
【０１２０】
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリールアルキル」は、好ましくは、アルキル部分に１〜６個（両端の値を含む）の炭素原子を有し、ヘテロアリール部分に５〜１２個（両端の値を含む）の環原子を有する、ヘテロアリールで置換されているアルキル（すなわち、ヘテロアリール−アルキル基）を指す。そのようなヘテロアリールアルキル基は、ピリジルメチルなどによって例示される。
【０１２１】
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリールアルケニル」は、好ましくは、アルケニル部分に２〜６個（両端の値を含む）の炭素原子を有し、ヘテロアリール部分に５〜１２個（両端の値を含む）の環原子を有する、ヘテロアリールで置換されているアルケニル（すなわち、ヘテロアリール−アルケニル基）を指す。
【０１２２】
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリールアルキニル」は、好ましくは、アルキニル部分に２〜６個（両端の値を含む）の炭素原子を有し、ヘテロアリール部分に５〜１２個（両端の値を含む）の環原子を有する、ヘテロアリールで置換されているアルキニル（すなわち、ヘテロアリール−アルキニル基）を指す。
【０１２３】
本明細書で使用される場合、「複素環」、「複素環式」、および同義的に「ヘテロシクロアルキル」は、炭素環原子数が２〜１０（両端の値を含む）であり、環内の窒素、硫黄または酸素から選択されるヘテロ環原子の数が１〜４（両端の値を含む）である、単一の環または複数の縮合環を有する飽和または不飽和基を指す。そのような複素環式基は、単一の環（例えば、ピペリジニルもしくはテトラヒドロフリル）または複数の縮合環（例えば、インドリニル、ジヒドロベンゾフランもしくはキヌクリジニル）を有することがある。複素環の例としては、これらに限定されないが、フラン、チオフェン、チアゾール、オキサゾール、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチルピリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロリン、イソチアゾール、フェナジン、イソオキサゾール、フェノキサジン、フェノチアジン、イミダゾリジン、イミダゾリン、ピペリジン、ピペラジン、ピロリジン、インドリンなどが挙げられる。
【０１２４】
本明細書で使用される場合、「員環」は、任意の環状構造体を包含することを意図したものである。用語「員」の前の数は、環を構成する骨格原子の数を示す。したがって、例えば、シクロへキシル、ピリジン、ピランおよびチオピランは、６員環であり、シクロペンチル、ピロール、フランおよびチオフェンは、５員環である。
【０１２５】
別段の指定がない限り、上述の基の中の水素により占有される位置は、ヒドロキシ、オキソ、ニトロ、メトキシ、エトキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、トリフルオロメトキシ、ハロアルコキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、ハロ、メチル、エチル、プロピル、ブチル、アルキル、アルケニル、アルキニル、置換アルキル、トリフルオロメチル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、チオ、アルキルチオ、アシル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、カルボキサミド、置換カルボキサミド、アルキルスルホニル、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニルアミノ、スルホンアミド、置換スルホンアミド、シアノ、アミノ、置換アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、アシルアミノ、アミジノ、アミドキシモ、ヒドロキサモイル、フェニル、アリール、置換アリール、アリールオキシ、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ピリジル、イミダゾリル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロへキシル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルキルオキシ、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリノ、複素環、（複素環）オキシ、および（複素環）アルキルによって例示されるがこれらに限定されない置換基で、さらに置換されていることがあり、好ましいヘテロ原子は、酸素、窒素および硫黄である。自由原子価がこれらの置換基上に存在する場合、それらの置換基が、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールおよび／または複素環基でさらに置換され得ること、これらの自由原子価が炭素上に存在する場合、それらの炭素が、ハロゲンにより、および酸素結合置換基、窒素結合置換基または硫黄結合置換基により、さらに置換され得ること、ならびに複数のそのような自由原子価が存在する場合、これらの基が、結合の直接形成または新しいヘテロ原子、好ましくは酸素、窒素もしくは硫黄への結合の形成のどちらかにより環を形成するように接続され得ることが、理解される。水素の置換基での置き換えが、本発明の分子に対して許容し難い不安定性を導入しないこと、および他の点で化学的に妥当であることを条件に、上記置換を行うことができることが、さらに理解される。
【０１２６】
本明細書で使用される場合、用語「培養すること」は、任意の好適な条件下で（例えば、液体、ゲルまたは固体培地を使用して）微生物細胞の集団を増殖させることを指す。
【０１２７】
組換えポリペプチドは、当技術分野において公知の任意の好適な方法を使用して産生することができる。目的の野生型ポリペプチドをコードする遺伝子をプラスミドなどのベクター内にクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉなどの所望の宿主に発現させることができる。組換えポリペプチドの改変体を当技術分野において公知の様々な方法により生成することができる。実際、当業者に周知の多種多様な異なる変異誘発技術がある。加えて、変異誘発キットも、多くの商業的分子生物学供給業者から入手することができる。定義されたアミノ酸における特異的置換（部位指向性）、遺伝子の局所領域における特異的もしくはランダム変異（位置特異的）、または遺伝子全体にわたってのランダム変異誘発（例えば、飽和変異誘発）を行う方法を利用することができる。ＰＣＲを使用する一本鎖ＤＮＡもしくは二本鎖ＤＮＡの部位指向性変異誘発、カセット変異誘発、遺伝子合成、エラープローンＰＣＲ、シャフリング、および化学的飽和変異誘発、または当技術分野において公知の任意の他の好適な方法を含むがこれらに限定されない、酵素改変体を生成するための非常に多数の好適な方法が、当業者に公知である。発現させること、スクリーニングすることおよびアッセイすることができる改変体ライブラリーを生成するために、酵素をコードするポリヌクレオチドに変異誘発および定向進化方法を容易に適用することができる。任意の好適な変異誘発および定向進化方法が本発明において使用され、当技術分野において周知である（例えば、米国特許第５，６０５，７９３、５，８１１，２３８、５，８３０，７２１、５，８３４，２５２、５，８３７，４５８、５，９２８，９０５、６，０９６，５４８、６，１１７，６７９、６，１３２，９７０、６，１６５，７９３、６，１８０，４０６、６，２５１，６７４、６，２６５，２０１、６，２７７，６３８、６，２８７，８６１、６，２８７，８６２、６，２９１，２４２、６，２９７，０５３、６，３０３，３４４、６，３０９，８８３、６，３１９，７１３、６，３１９，７１４、６，３２３，０３０、６，３２６，２０４、６，３３５，１６０、６，３３５，１９８、６，３４４，３５６、６，３５２，８５９、６，３５５，４８４、６，３５８，７４０、６，３５８，７４２、６，３６５，３７７、６，３６５，４０８、６，３６８，８６１、６，３７２，４９７、６，３３７，１８６、６，３７６，２４６、６，３７９，９６４、６，３８７，７０２、６，３９１，５５２、６，３９１，６４０、６，３９５，５４７、６，４０６，８５５、６，４０６，９１０、６，４１３，７４５、６，４１３，７７４、６，４２０，１７５、６，４２３，５４２、６，４２６，２２４、６，４３６，６７５、６，４４４，４６８、６，４５５，２５３、６，４７９，６５２、６，４８２，６４７、６，４８３，０１１、６，４８４，１０５、６，４８９，１４６、６，５００，６１７、６，５００，６３９、６，５０６，６０２、６，５０６，６０３、６，５１８，０６５、６，５１９，０６５、６，５２１，４５３、６，５２８，３１１、６，５３７，７４６、６，５７３，０９８、６，５７６，４６７、６，５７９，６７８、６，５８６，１８２、６，６０２，９８６、６，６０５，４３０、６，６１３，５１４、６，６５３，０７２、６，６８６，５１５、６，７０３，２４０、６，７１６，６３１、６，８２５，００１、６，９０２，９２２、６，９１７，８８２、６，９４６，２９６、６，９６１，６６４、６，９９５，０１７、７，０２４，３１２、７，０５８，５１５、７，１０５，２９７、７，１４８，０５４、７，２２０，５６６、７，２８８，３７５、７，３８４，３８７、７，４２１，３４７、７，４３０，４７７、７，４６２，４６９、７，５３４，５６４、７，６２０，５００、７，６２０，５０２、７，６２９，１７０、７，７０２，４６４、７，７４７，３９１、７，７４７，３９３、７，７５１，９８６、７，７７６，５９８、７，７８３，４２８、７，７９５，０３０、７，８５３，４１０、７，８６８，１３８、７，７８３，４２８、７，８７３，４７７、７，８７３，４９９、７，９０４，２４９、７，９５７，９１２、７，９８１，６１４、８，０１４，９６１、８，０２９，９８８、８，０４８，６７４、８，０５８，００１、８，０７６，１３８、８，１０８，１５０、８，１７０，８０６、８，２２４，５８０、８，３７７，６８１、８，３８３，３４６、８，４５７，９０３、８，５０４，４９８、８，５８９，０８５、８，７６２，０６６、８，７６８，８７１、９，５９３，３２６，および全ての関連米国特許、ならびにＰＣＴおよび非米国対応特許；Ｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２５４（２）：１５７−７８  ［１９９７］；Ｄａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ５７：３６９−７４  ［１９９６］；Ｓｍｉｔｈ，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．，  １９：４２３−４６２  ［１９８５］；Ｂｏｔｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２２９：１１９３−１２０１  ［１９８５］；Ｃａｒｔｅｒ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．，  ２３７：１−７  ［１９８６］；Ｋｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ，  ３８：８７９−８８７  ［１９８４］；Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  ３４：３１５−３２３  ［１９８５］；Ｍｉｎｓｈｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．，  ３：２８４−２９０  ［１９９９］；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １７：２５９−２６４  ［１９９９］；Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３９１：２８８−２９１  ［１９９８］；Ｃｒａｍｅｒｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １５：４３６−４３８  ［１９９７］；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ９４：４５０４−４５０９  ［１９９７］；Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １４：３１５−３１９  ［１９９６］；Ｓｔｅｍｍｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３７０：３８９−３９１  ［１９９４］；Ｓｔｅｍｍｅｒ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９１：１０７４７−１０７５１  ［１９９４］；ＷＯ９５／２２６２５；ＷＯ９７／００７８；ＷＯ９７／３５９６６；ＷＯ９８／２７２３０；ＷＯ００／４２６５１；ＷＯ０１／７５７６７；およびＷＯ２００９／１５２３３６を参照されたく、これらの全てが、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１２８】
一部の実施形態では、変異誘発処理後に得られる酵素クローンは、酵素調製物を既定の温度（または他のアッセイ条件）に付すこと、および熱処理または他の好適なアッセイ条件後に残存する酵素活性の量を測定することによって、スクリーニングされる。次いで、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するクローンは、遺伝子から単離され、ヌクレオチド配列変化（もしあれば）を同定するためにシークエンシングされ、宿主細胞において酵素を発現させるために使用される。発現ライブラリーからの酵素活性の測定は、当技術分野において公知の任意の好適な方法（例えば、ＨＰＬＣ分析などの標準的な生化学技術）を使用して行うことができる。
【０１２９】
改変体が産生された後、それらを任意の所望の特性（例えば、高い活性もしくは活性の増加、または低い活性もしくは活性の低下、熱活性の増加、熱安定性の増大、および／または酸性ｐＨ安定性など）についてスクリーニングすることができる。一部の実施形態では、「組換えガラクトースオキシダーゼポリペプチド」（本明細書では「操作されたガラクトースオキシダーゼポリペプチド」、「改変体ガラクトースオキシダーゼ酵素」、「ガラクトースオキシダーゼ改変体」、および「ガラクトースオキシダーゼ組合せ改変体」とも呼ばれる）が使用される。一部の実施形態では、「組換えガラクトースオキシダーゼポリペプチド」（「操作されたガラクトースオキシダーゼポリペプチド」、「改変体ガラクトースオキシダーゼ酵素」、「ガラクトースオキシダーゼ改変体」、および「ガラクトースオキシダーゼ組合せ改変体」とも呼ばれる）が使用される。
【０１３０】
本明細書で使用される場合、「ベクター」は、ＤＮＡ配列を細胞に導入するためのＤＮＡ構築物である。一部の実施形態では、ベクターは、ＤＮＡ配列にコードされたポリペプチドの好適な宿主における発現を果たすことができる好適な制御配列に作動可能に連結した発現ベクターである。一部の実施形態では、「発現ベクター」は、宿主細胞における発現を駆動するためのＤＮＡ配列（例えば、導入遺伝子）に作動可能に連結したプロモーター配列を有し、一部の実施形態では、転写ターミネーター配列も含む。
【０１３１】
本明細書では、用語「発現」は、転写、転写後修飾、翻訳、および翻訳後修飾を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドの産生に関与する任意のステップを含む。一部の実施形態では、この用語は、細胞からのポリペプチドの分泌も包含する。
【０１３２】
本明細書で使用される場合、用語「産生する」は、細胞によるタンパク質および／または他の化合物の産生を指す。この用語は、転写、転写後修飾、翻訳、および翻訳後修飾を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドの産生に関与する任意のステップを包含することが意図されている。一部の実施形態では、この用語は、細胞からのポリペプチドの分泌も包含する。
【０１３３】
本明細書で使用される場合、アミノ酸またはヌクレオチド配列（例えば、プロモーター配列、シグナルペプチド、ターミネーター配列など）は、この配列が作動可能に連結した別の配列にとって、それら２つの配列が天然に会合していない場合、「異種」である。例えば、「異種ポリヌクレオチド」は、実験技術により宿主細胞に導入される任意のポリヌクレオチドであり、宿主細胞から除去され、実験操作に付され、そしてその後、宿主細胞に再導入されるポリヌクレオチドを含む。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」および「宿主株」は、本明細書で提供されるＤＮＡ（例えば、ガラクトースオキシダーゼ改変体をコードするポリヌクレオチド）を含む発現ベクターのための好適な宿主を指す。一部の実施形態では、宿主細胞は、当技術分野において公知の組換えＤＮＡ技術を使用して構築されたベクターが形質転換されたまたはトランスフェクトされた真核または原核細胞である。
【０１３５】
用語「類似体」は、参照ポリペプチドと７０％より高い配列同一性、しかし１００％未満の配列同一性（例えば、７５％、７８％、８０％、８３％、８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を超える配列同一性）を有する、ポリペプチドを意味する。一部の実施形態では、類似体は、天然に存在するアミノ酸ばかりでなく、ホモアルギニン、オルニチンおよびノルバリンを含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の天然に存在しないアミノ酸も含有する、ポリペプチドを意味する。一部の実施形態では、類似体はまた、１つまたは複数のＤ−アミノ酸残基、および２つまたはそれより多くのアミノ酸残基間の非ペプチド連結を含む。
【０１３６】
用語「有効量」は、所望の結果を生じさせるのに十分な量を意味する。当業者は、日常的な実験を使用することにより何が有効量を決定することができる。
【０１３７】
用語「単離された」および「精製された」は、それが天然に会合している少なくとも１つの他の成分から除去されている分子（例えば、単離された核酸、ポリペプチドなど）または他の成分を指すために使用される。用語「精製された」は、絶対純度を必要とせず、むしろ、相対的定義として意図されている。
【０１３８】
本明細書で使用される場合、「立体選択性」は、化学または酵素反応における１つの立体異性体の別の立体異性体に対する優先的形成を指す。立体選択性は、１つの立体異性体が他の立体異性体より選好される場合、部分的であり得、または１つの立体異性体のみが形成される場合、完全であり得る。立体異性体がエナンチオマーである場合、立体選択性は、エナンチオ選択性と呼ばれ、これは、両方のエナンチオマーの和における一方のエナンチオマーの分率（典型的にはパーセンテージとして報告される）である。これは、一般に、当技術分野ではその代わりに、そこから式［主エナンチオマー−副エナンチオマー］／［主エナンチオマー＋副エナンチオマー］に従って計算されるエナンチオマー過剰率（「ｅ．ｅ．」）として（典型的にはパーセンテージとして）報告される。立体異性体がジアステレオ異性体である場合、立体選択性は、ジアステレオ選択性と呼ばれ、これは、２つのジアステレオマーの混合物中の一方のジアステレオマーの分率（典型的にはパーセンテージとして報告される）であり、一般に、その代わりに、ジアステレオマー過剰率（「ｄ．ｅ．」）として報告される。エナンチオマー過剰率およびジアステレオマー過剰率は、立体異性体過剰率の種類である。
【０１３９】
本明細書で使用される場合、「位置選択性」および「位置選択的反応」は、結合生成または切断の１つの方向が、全ての他の可能な方向より優先的に起こる反応を指す。反応は、識別が完全であり、実質的に位置選択的（少なくとも７５％）である場合、完全（１００％）位置選択的であり得、または１つの部位での反応の産物が他の部位での反応の産物より優勢である場合、部分的位置選択的（ｘ％、この場合のパーセンテージは、目的の反応に依存して設定される）であり得る。
【０１４０】
本明細書で使用される場合、「化学選択性」は、化学または酵素反応における１つの産物の別の産物に対する優先的形成を指す。
【０１４１】
本明細書で使用される場合、「ｐＨ安定性の」は、ある期間（例えば、０．５〜２４時間）の高または低ｐＨ（例えば、４．５〜６または８〜１２）への曝露後に、未処理酵素と比較して同様の活性（例えば、６０％〜８０％より高い）を維持する、ガラクトースオキシダーゼポリペプチドを指す。
【０１４２】
本明細書で使用される場合、「熱安定性の」は、ある期間（例えば、０．５〜２４時間）の高温（例えば、４０〜８０℃）への曝露後に、同じ高温に曝露された野生型酵素と比較して同様の活性（例えば、６０％〜８０％より高い）を維持する、ガラクトースオキシダーゼポリペプチドを指す。
【０１４３】
本明細書で使用される場合、「溶媒安定性の」は、ある期間（例えば、０．５〜２４時間）の様々な濃度（例えば、５〜９９％）の溶媒（エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド［ＤＭＳＯ］、テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフラン、アセトン、トルエン、酢酸ブチル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルなど）への曝露後に、同じ濃度の同じ溶媒に曝露された野生型酵素と比較して同様の活性（例えば、６０％〜８０％より高い）を維持する、ガラクトースオキシダーゼポリペプチドを指す。
【０１４４】
本明細書で使用される場合、「熱および溶媒安定性の」は、熱安定性でもあり、溶媒安定性でもある、ガラクトースオキシダーゼポリペプチドを指す。
【０１４５】
本明細書で使用される場合、「必要に応じた」および「必要に応じて」は、その後に記載される事象または状況が、起こることもありまたは起こらないこともあること、およびその記載が、事象または状況が起こる事例と、それが起こらない事例とを含むことを意味する。１つまたは複数の必要に応じた置換を含有すると記載される任意の分子に関して、立体的に現実的なおよび／または合成により実現可能な化合物のみが含まれるように意図されていることが、当業者には理解されるであろう。
【０１４６】
本明細書で使用される場合、「必要に応じて置換されている」は、化学基という用語または一連の化学基における全ての後続の修飾語句を指す。例えば、用語「必要に応じて置換されているアリールアルキル」では、分子の「アルキル」部分および「アリール」部分は、置換されていることもあり、または置換されていないこともあり、一連の「必要に応じて置換されているアルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリール」については、アルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリール基は、互いに独立して、置換されていることもあり、または置換されていないこともある。
【０１４７】
本明細書で使用される場合、「保護基」は、分子中の反応性官能基に結合されたときに官能基の反応性を遮蔽、低減または防止する原子の基を指す。典型的には、保護基は、合成の過程で所望に応じて選択的に除去され得る。保護基の例は、当技術分野において周知である。保護基を有することができる官能基としては、これらに限定されないが、ヒドロキシ、アミノおよびカルボキシ基が挙げられる。代表的なアミノ保護基としては、これらに限定されないが、ホルミル、アセチル、トリフルオロアセチル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニル（「ＣＢＺ」）、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（「Ｂｏｃ」）、トリメチルシリル（「ＴＭＳ」）、２−トリメチルシリル−エタンスルホニル（「ＳＥＳ」）、トリチルおよび置換トリチル基、アリルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（「ＦＭＯＣ」）、ニトロベラトリルオキシカルボニル（「ＮＶＯＣ」）などが挙げられる。代表的なヒドロキシル保護基としては、これらに限定されないが、ヒドロキシル基が、アシル化されるもの（例えば、メチルおよびエチルエステル、酢酸もしくはプロピオン酸基またはグリコールエステル）またはアルキル化されるもの、例えばベンジルおよびトリチルエーテル、のいずれか、ならびにアルキルエーテル、テトラヒドロピラニルエーテル、トリアルキルシリルエーテル（例えば、ＴＭＳまたはＴＩＰＰＳ基）およびアリルエーテルが挙げられる。他の保護基は、本明細書で述べられる参考文献において見つけることができる。
【０１４８】
発明の詳細な説明
本発明は、操作されたガラクトースオキシダーゼ（ＧＯアーゼ）酵素、ＧＯアーゼ活性を有するポリペプチド、およびこれらの酵素をコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含むベクターおよび宿主細胞を提供する。ＧＯアーゼ酵素を産生する方法も提供される。本発明は、ＧＯアーゼ酵素を含む組成物、および操作されたＧＯアーゼ酵素を使用する方法を、さらに提供する。本発明は、医薬化合物および他の化合物の産生に特に使用される。
【０１４９】
Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｉｕｍからのガラクトースオキシダーゼ（ＧＯアーゼ）は、弱い反応条件下で第一級アルコール含有基質に対する酸化を行うことができる、天然に存在する銅依存性酵素である。銅に加えて、酵素は、翻訳後に形成される補因子に依拠し、これは、活性部位残基チロシンおよびシステインの結合している銅および分子酸素によって媒介される架橋の結果である。したがって、酵素は、活性となり、酸素を還元することにより第一級アルコールの酸化を触媒することができ、ラジカル機構によってアルデヒドおよび過酸化水素を生じさせることができる。
スキーム１：ガラクトースオキシダーゼによる第一級アルコールの酸化  
【化１】
2021530982.tif 000002
【０１５０】
対応するアルデヒドを生成するために３−エチニルグリセロール（ＥＧＯ）に対する選択性および活性を改善させたＧＯアーゼ改変体を進化させることに重点を置いた初期の定向進化への取り組みを行った。進化させた最初の改変体は、３−エチニルグリセルアルデヒド（ＥＧＡ）のＳ−エナンチオマーのわずかな濃縮しか実証しなかった。この酵素を、Ｒ−エナンチオマーの形成に有利に働くエナンチオ選択性を有する改変体にさらに進化させた（スキーム２を参照されたい）。Ｒ−エナンチオ選択性をさらに増強し、プロセス条件での酸化活性を改善するために、追加の定向進化が必要であった。
スキーム２：ガラクトースオキシダーゼによる３−エチニルグリセロールの酸化
【化２】
2021530982.tif 000003
【０１５１】
対応するリン酸化アルデヒド（化合物Ｐ）を生成するためにエチニルグリセロールホスフェート（ＥＧＰ）に対する活性を改善させたＧＯアーゼ改変体を進化させることに重点を置いたさらなる定向進化への取り組みを行った（スキーム３を参照されたい）。
スキーム３：ガラクトースオキシダーゼによるエチニルグリセロールホスフェートの酸化
【化３】
2021530982.tif 000004
【０１５２】
操作されたＧＯアーゼポリペプチド  
本発明は、操作されたＧＯアーゼポリペプチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチドを調製する方法、およびポリペプチドを使用する方法を提供する。説明がポリペプチドに関する場合、その説明がポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも説明することを理解されたい。一部の実施形態では、本発明は、野生型ＧＯアーゼ酵素と比較して改善された特性を有する、操作された、天然に存在しないＧＯアーゼ酵素を提供する。任意の好適な反応条件が本発明において使用される。一部の実施形態では、方法は、酸化反応を行うための操作されたポリペプチドの改善された特性を分析するために使用される。一部の実施形態では、反応条件は、下記でおよび実施例でさらに説明されるように、操作されたＧＯアーゼの濃度もしくは量、基質、緩衝剤、溶媒、補因子、ｐＨ、温度および反応時間を含む条件、ならびに／または固体支持体上に固定化された操作されたＧＯアーゼポリペプチドに伴う条件に関して改良される。
【０１５３】
一部の実施形態では、反応条件を補足するために追加の反応成分または追加の技術が利用される。一部の実施形態では、これらは、酵素を安定化するまたは酵素の不活性化を防止するための手段、産物阻害を低減させるための手段、反応の平衡を所望の産物形成にシフトさせるための手段を講じることを含む。
【０１５４】
一部のさらなる実施形態では、基質化合物の産物化合物への変換のための上記のいずれのプロセスも、産物化合物の抽出、単離、精製、結晶化、濾過および／または凍結乾燥から選択される１つまたは複数のステップをさらに含むことがある。本明細書で提供されるプロセスにより産生される生体触媒反応混合物から産物を抽出、単離、精製および／または結晶化するための方法、技術およびプロトコールは、当業者に公知であり、および／または日常的な実験によって入手される。加えて、例示的な方法が、下記の実施例で提供される。
【０１５５】
操作されたポリペプチドをコードする操作されたＧＯアーゼポリヌクレオチド、発現ベクターおよび宿主細胞
本発明は、本明細書に記載の操作された酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現させることができる組換えポリヌクレオチドを作出するために遺伝子発現を制御する１つまたは複数の異種調節配列に動作可能に連結している。一部の実施形態では、操作された酵素ポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含有する発現構築物は、対応する酵素ポリペプチドを発現させるために適切な宿主細胞に導入される。
【０１５６】
当業者には明らかであるように、タンパク質配列と様々なアミノ酸に対応するコドンについての知識とが得られることによって、対象ポリペプチドをコードすることができる全てのポリヌクレオチドについての説明が得られる。同じアミノ酸が代替または同義コドンによりコードされる遺伝コードの縮重は、全てが操作された酵素（例えば、ＧＯアーゼ）ポリペプチドをコードするものである極めて多数の核酸を作製することを可能にする。したがって、本発明は、可能なコドン選択肢に基づいて組合せを選択することによって本明細書に記載の酵素ポリペプチドをコードするものにされ得る酵素ポリヌクレオチドのありとあらゆる可能なバリエーションの産生のための方法および組成物を提供し、全てのそのようなバリエーションは、実施例で（例えば、様々な表で）提示されるアミノ酸配列を含む、本明細書に記載の任意のポリペプチドについて考えられ、具体的に開示されることになる。
【０１５７】
一部の実施形態では、コドンは、好ましくは、タンパク質産生のための選択された宿主細胞による利用のために最適化される。例えば、細菌において使用される好ましいコドンは、細菌における発現のために典型的に使用される。それ故、操作された酵素ポリペプチドをコードするコドン最適化ポリヌクレオチドは、完全長コード領域中のコトン位置の約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９０％より多くに好ましいコドンを含有する。
【０１５８】
一部の実施形態では、酵素ポリヌクレオチドは、酵素活性と本明細書で開示される特性とを有する操作されたポリペプチドであって、本明細書で提供される配列番号から選択される参照配列に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い同一性を有するアミノ酸配列、または任意の改変体（例えば、実施例で提供されるもの）のアミノ酸配列と、参照ポリヌクレオチドまたは実施例で開示される任意の改変体のアミノ酸配列と比較して１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０カ所もしくはそれより多くのアミノ酸残基位置）の残基相違とを含む、操作されたポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、参照ポリペプチド配列は、配列番号２、４、１６６、２７２、９２８、９３２、１２６４、１４１６、１５９８、１８６６、１９１２、２０８０、２３００、および／または２４２４から選択される。
【０１５９】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書で提供される任意のポリヌクレオチド配列から選択される参照ポリヌクレオチド配列、もしくはその相補配列、または本明細書で提供される改変体酵素ポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド配列と、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる。一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、参照配列と比較して１つまたは複数の残基相違を有するアミノ酸配列を含む酵素ポリペプチドをコードする。
【０１６０】
一部の実施形態では、本明細書における操作された酵素ポリペプチドのいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドは、酵素ポリペプチドの発現を助長するように様々な方法で操作される。一部の実施形態では、酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、１つまたは複数の制御配列が、酵素ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を調節するために存在する、発現ベクターを含む。ベクターへのその挿入の前の単離されたポリヌクレオチドの操作は、利用される発現ベクターに依存して望ましいまたは必要であることがある。組換えＤＮＡ法を利用してポリヌクレオチドおよび核酸配列を修飾する技術は、当技術分野において周知である。一部の実施形態では、制御配列は、数ある中でも特に、プロモーター、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターを含む。一部の実施形態では、好適なプロモーターは、宿主細胞選択に基づいて選択される。細菌宿主細胞について、本開示の核酸構築物の転写を指令するのに好適なプロモーターとしては、これらに限定されないが、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃオペロン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓマルトース生成アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓアルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、ならびに原核生物ベータ−ラクタマーゼ遺伝子から得られるプロモーター（例えば、Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７５：  ３７２７−３７３１  ［１９７８］を参照されたい）、ならびにｔａｃプロモーター（例えば、ＤｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０：  ２１−２５  ［１９８３］を参照されたい）が挙げられる。糸状真菌宿主細胞についての例示的プロモーターとしては、これらに限定されないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性アルファ−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ酸安定性アルファ−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られるプロモーター（例えば、ＷＯ９６／００７８７を参��されたい）、ならびにＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性アルファ−アミラーゼの遺伝子からのプロモーターとＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子からのプロモーターのハイブリッド）、ならびにこれらの変異体、切断型およびハイブリッドプロモーターが挙げられる。例示的な酵母細胞プロモーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ３−ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子に由来し得る遺伝子に由来し得る。酵母宿主細胞についての他の有用なプロモーターは、当技術分野において公知である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｙｅａｓｔ  ８：４２３−４８８  ［１９９２］を参照されたい）。
【０１６１】
一部の実施形態では、制御配列は、好適な転写ターミネーター配列（すなわち、転写を終結させるために宿主細胞により認識される配列）でもある。一部の実施形態では、ターミネーター配列は、酵素ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結している。選ばれる宿主細胞において機能性である任意の好適なターミネーターが、本発明において使用される。糸状真菌宿主細胞についての例示的な転写ターミネーターは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒアルファ−グルコシダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞についての例示的なターミネーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシトクロムＣ（ＣＹＣ１）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞についての他の有用なターミネーターは、当技術分野において公知である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．、上掲を参照されたい）。
【０１６２】
一部の実施形態では、制御配列は、好適なリーダー配列（すなわち、宿主細胞による翻訳にとって重要であるｍＲＮＡの非翻訳領域）でもある。一部の実施形態では、リーダー配列は、酵素ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動可能に連結している。選ばれる宿主細胞において機能性である任意の好適なリーダー配列が、本発明において使用される。糸状真菌宿主細胞についての例示的リーダーは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞に好適なリーダーは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ因子、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られる。
【０１６３】
一部の実施形態では、制御配列は、ポリアデニル化配列（すなわち、核酸配列の３’末端に作動可能に連結した配列であって、転写されたとき、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加させるためのシグナルとして宿主細胞により認識される配列）でもある。選ばれる宿主細胞において機能性である任意の好適なポリアデニル化配列が、本発明において使用される。糸状真菌宿主細胞についての例示的なポリアデニル化配列としては、これらに限定されないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒアルファ−グルコシダーゼの遺伝子が挙げられる。酵母宿主細胞についての有用なポリアデニル化配列は公知である（例えば、Ｇｕｏ  ａｎｄ  Ｓｈｅｒｍａｎ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １５：５９８３−５９９０  ［１９９５］を参照されたい）。
【０１６４】
一部の実施形態では、制御配列は、シグナルペプチド（すなわち、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードし、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に方向付ける、コード領域）でもある。一部の実施形態では、核酸配列のコード配列の５’末端は、分泌されるポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと翻訳リーディングフレーム内で天然で連結されるシグナルペプチドコード領域を本質的に含有する。あるいは、一部の実施形態では、コード配列の５’末端は、コード配列にとって外来のシグナルペプチドコード領域を含有する。発現されたポリペプチドを選ばれる宿主細胞の分泌経路に方向付ける任意の好適なシグナルペプチドコード領域が、操作されたポリペプチドの発現に使用される。細菌宿主細胞についての有効なシグナルペプチドコード領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ＮＣＩＢ  １１８３７マルトース生成アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓアルファ−アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓサブチリシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓベータ−ラクタマーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｐｒｓＡの遺伝子からのものを含むがこれらに限定されない、シグナルペプチドコード領域である。さらなるシグナルペプチドは、当技術分野において公知である（例えば、Ｓｉｍｏｎｅｎ  ａｎｄ  Ｐａｌｖａ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．，  ５７：１０９−１３７  ［１９９３］を参照されたい）。一部の実施形態では、糸状真菌宿主細胞についての有効なシグナルペプチドコード領域としては、これらに限定されないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓセルラーゼ、およびＨｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域が挙げられる。酵母宿主細胞についての有用なシグナルペプチドとしては、これらに限定されないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼの遺伝子からのものが挙げられる。
【０１６５】
一部の実施形態では、制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域でもある。結果として得られるポリペプチドは、「プロ酵素」、「プロポリペプチド」または「チモーゲン」と呼ばれる。プロポリペプチドは、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的または自己触媒的切断によって成熟活性ポリペプチドに変換され得る。プロペプチドコード領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ因子、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、およびＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａラクターゼの遺伝子を含むがこれらに限定されない、任意の好適な供給源から得ることができる（例えば、ＷＯ９５／３３８３６を参照されたい）。シグナルペプチド領域とプロペプチド領域の両方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端の隣に位置し、シグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のアミノ末端の隣に位置する。
【０１６６】
一部の実施形態では、調節配列も利用される。これらの配列は、宿主細胞の増殖に関連してポリペプチドの発現の調節を助長する。調節系の例は、調節化合物の存在を含む、化学的または物理的刺激に応答して遺伝子発現をオンまたはオフにさせるものである。原核生物宿主細胞において、好適な調節配列としては、これらに限定されないが、ｌａｃ、ｔａｃおよびｔｒｐオペレータ系が挙げられる。酵母宿主細胞において、好適な調節配列としては、これらに限定されないが、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系が挙げられる。糸状真菌において、好適な調節配列としては、これらに限定されないが、ＴＡＫＡアルファ−アミラーゼプロモーター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼプロモーター、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅグルコアミラーゼプロモーターが挙げられる。
【０１６７】
別の態様では、本発明は、操作された酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、導入されることになる宿主の種類に依存して、プロモーターおよびターミネーター、複製起点などのような１つまたは複数の発現調節領域とを含む、組換え発現ベクターに関する。一部の実施形態では、本明細書に記載の様々な核酸および制御配列は、１つまたは複数の便利な制限部位を、そのような部位での酵素ポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換を可能にするために含む、組換え発現ベクターを生じさせるために一緒に連結される。あるいは、一部の実施形態では、本発明の核酸配列は、核酸配列またはその配列を含む核酸構築物を発現のための適切なベクターに挿入することによって発現される。発現ベクターの作出を含む一部の実施形態では、コード配列は、ベクター内に、コード配列が発現のための適切な制御配列と作動可能に連結するように位置する。
【０１６８】
組換え発現ベクターは、便利に組換えＤＮＡ手順に付すことができ、酵素ポリヌクレオチド配列の発現を生じさせることができる、任意の好適なベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。ベクターの選択は、ベクターとベクターが導入されることになる宿主細胞との適合性に典型的に依存する。ベクターは、直鎖状プラスミドであってもよく、または閉環状プラスミドであってもよい。
【０１６９】
一部の実施形態では、発現ベクターは、自己複製ベクター（すなわち、染色体外実体として存在し、その複製が染色体複製に依存しないベクター、例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体）である。ベクターは、自己複製を確実にするための任意の手段を含有し得る。一部の代替実施形態では、ベクターは、宿主細胞に導入されたとき、ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体とともに複製されるものであり得る。さらに、一部の実施形態では、単一のベクターもしくはプラスミド、または宿主細胞のゲノムにおよび／もしくはトランスポゾンに導入されることになる全ＤＮＡを一緒に含有する２つもしくはそれより多くのベクターもしくはプラスミドが、利用される。
【０１７０】
一部の実施形態では、発現ベクターは、形質転換細胞の容易な選択を可能にする、１つまたは複数の選択可能なマーカーを含有する。「選択可能なマーカー」は、その産物が、殺生物剤またはウイルス抵抗性を、重金属に対する耐性を、栄養要求株に原栄養性を、およびこれらに類するものをもたらす、遺伝子である。細菌の選択可能なマーカーの例としては、これらに限定されないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓからのｄａｌ遺伝子、またはアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールもしくはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を付与するマーカーが挙げられる。酵母宿主細胞についての好適なマーカーとしては、これらに限定されないが、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１およびＵＲＡ３が挙げられる。糸状真菌宿主細胞において使用するための選択可能なマーカーとしては、これらに限定されないが、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ；例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡ．ｏｒｚｙａｅからのもの）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ；例えば、Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓからのもの）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ；例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡ．ｏｒｚｙａｅからのもの）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびにこれらの等価物が挙げられる。
【０１７１】
別の態様では、本発明は、本発明の少なくとも１つの操作された酵素ポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、ポリヌクレオチドが、宿主細胞における操作された酵素（単数／複数）の発現のために１つまたは複数の制御配列に動作可能に連結している、宿主細胞を提供する。本発明の発現ベクターによりコードされるポリペプチドを発現させる際の使用に好適な宿主細胞は、当技術分野において周知であり、これらに限定されないが、細菌細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｌｕｖｉａｌｉｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞；真菌細胞、例えば、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣ受託番号２０１１７８））；昆虫細胞、例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９細胞；動物細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、２９３およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞；ならびに植物細胞を含む。例示的な宿主細胞は、様々なＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株（例えば、Ｗ３１１０（ΔｆｈｕＡ）およびＢＬ２１）も含む。細菌の選択可能なマーカーの例としては、これらに限定されないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓからのｄａｌ遺伝子、またはアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールおよび／もしくはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を付与するマーカーが挙げられる。
【０１７２】
一部の実施形態では、本発明の発現ベクターは、宿主細胞のゲノムへのベクターの組み込みを可能にする、またはゲノムに依存しない細胞におけるベクターの自己複製を可能にする、エレメントを含有する。宿主細胞ゲノムへの組み込みを含む一部の実施形態では、ベクターは、ポリペプチドをコードする核酸配列、または相同もしくは非相同組換えによるゲノムへのベクターの組み込みのためのベクターの任意の他のエレメントに依拠する。
【０１７３】
一部の代替実施形態では、発現ベクターは、相同組換えによる宿主細胞のゲノムへの組み込みを指令するための追加の核酸配列を含有する。追加の核酸配列は、宿主細胞ゲノムの染色体内の正確な位置にベクターを組み込むことを可能にする。正確な位置への組み込みの尤度を増加させるために、組み込みエレメントは、好ましくは、相同組換えの確率を向上させるために対応する標的配列と高度に相同である十分な数のヌクレオチド、例えば、１００〜１０，０００塩基対、好ましくは４００〜１０，０００塩基対、最も好ましくは８００〜１０，０００塩基対のヌクレオチドを含有する。組み込みエレメントは、宿主細胞のゲノム内の標的配列と相同である任意の配列であり得る。さらに、組み込みエレメントは、非コード核酸配列であってもよく、またはコード核酸配列であってもよい。その一方で、ベクターは、非相同組換えにより宿主細胞のゲノムに組み込まれることもある。
【０１７４】
自己複製のために、ベクターは、問題の宿主細胞におけるベクターの自己複製を可能にする複製起点をさらに含み得る。細菌の複製起点の例は、Ｐ１５Ａ  ｏｒｉ、またはＥ．ｃｏｌｉにおける複製を可能にするプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７（このプラスミドは、Ｐ１５Ａ  ｏｒｉを有する）もしくはｐＡＣＹＣ１８４、およびＢａｃｉｌｌｕｓにおける複製を可能にするｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４またはｐＴＡ１０６０の複製起点である。酵母宿主細胞において使用するための複製起点の例は、２ミクロン複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３の組合せ、およびＡＲＳ４とＣＥＮ６の組合せである。複製起点は、宿主細胞におけるその機能を温度感受性にする変異を有するものであることもある（例えば、Ｅｈｒｌｉｃｈ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７５：１４３３  ［１９７８］を参照されたい）。
【０１７５】
一部の実施形態では、本発明の核酸配列の１つより多くのコピーが、遺伝子産物の産生を増加させるために宿主細胞に挿入される。核酸配列のコピー数の増加は、宿主細胞ゲノムに配列の少なくとも１つの追加のコピーを組み込むことによって達成されることがあり、または核酸配列を有する増幅可能な選択可能なマーカー遺伝子を含めることによって達成されることもあり、この場合、選択可能なマーカー遺伝子の増幅されたコピーを含有し、かつそれによって核酸配列の追加のコピーを含有する細胞が、これらの細胞を適切な選択可能な薬剤の存在下で培養することによって選択され得る。
【０１７６】
本発明において使用するための発現ベクターの多くが市販されている。好適な市販の発現ベクターとしては、これに限定されないが、ＣＭＶプロモーター、および哺乳動物宿主細胞における発現のためのｈＧＨポリアデニル化部位、およびｐＢＲ３２２複製起点、およびＥ．ｃｏｌｉにおける増幅のためのアンピシリン耐性マーカーを含む、ｐ３ｘＦＬＡＧＴＭ（商標）発現ベクター（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）が挙げられる。他の好適なベクターとしては、これらに限定されないが、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）およびｐＢＫ−ＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、およびｐＢＲ３２２に由来するプラスミド（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ｐＵＣに由来するプラスミド（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ｐＲＥＰ４に由来するプラスミド、ｐＣＥＰ４に由来するプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＰｏｌｙに由来するプラスミド（例えば、Ｌａｔｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ５７：１９３−２０１  ［１９８７］を参照されたい）が挙げられる。
【０１７７】
したがって、一部の実施形態では、少なくとも１つの改変体ガラクトースオキシダーゼをコードする配列を含むベクターは、ベクターの伝播および改変体ガラクトースオキシダーゼの発現を可能にするために宿主細胞に形質転換される。一部の実施形態では、改変体ガラクトースオキシダーゼは、シグナルペプチドを除去するように翻訳後修飾され、一部の場合には分泌後に切断され得る。一部の実施形態では、上記の形質転換細胞は、改変体ガラクトースオキシダーゼの発現を可能にする条件下、好適な栄養培地で培養される。宿主細胞の培養に有用な任意の好適な培地が本明細書で使用され、そのような培地には、これらに限定されないが、適切なサプリメントを含有する最少または複合培地が含まれる。一部の実施形態では、宿主細胞は、ＨＴＰ培地で増殖される。好適な培地は、様々な商業的供給業者から入手することができ、または公開レシピ（例えば、米国培養細胞系統保存機関のカタログにおけるもの）に従って調製することができる。
【０１７８】
別の態様では、本発明は、本明細書で提供される改善されたガラクトースオキシダーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、ポリヌクレオチドが、宿主細胞におけるガラクトースオキシダーゼ酵素の発現のために１つまたは複数の制御配列に動作可能に連結している、宿主細胞を提供する。本発明の発現ベクターによりコードされるガラクトースオキシダーゼポリペプチドを発現させる際に使用するための宿主細胞は、当技術分野において周知であり、これらに限定されないが、細菌細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞；真菌細胞、例えば、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣ受託番号２０１１７８））；昆虫細胞、例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９細胞；動物細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、２９３およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞；ならびに植物細胞が含まれる。上記宿主細胞についての適切な培養培地および増殖条件は、当技術分野において周知である。
【０１７９】
ガラクトースオキシダーゼの発現のためのポリヌクレオチドを当技術分野において公知の様々な方法により細胞に導入することができる。技術は、数ある中でも特に、電気穿孔、微粒子銃による粒子衝突（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、リポソーム媒介性トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクション、およびプロトプラスト融合を含む。細胞にポリヌクレオチドを導入するための様々な方法が当業者に公知である。
【０１８０】
一部の実施形態では、宿主細胞は、真核細胞である。好適な真核宿主細胞としては、これらに限定されないが、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞および植物細胞が挙げられる。好適な真菌宿主細胞としては、これらに限定されないが、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ、Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ、Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔａ、Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ、Ｆｕｎｇｉ  ｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉが挙げられる。一部の実施形態では、真菌宿主細胞は、酵母細胞および糸状真菌細胞である。本発明の糸状真菌宿主細胞は、ＥｕｍｙｃｏｔｉｎａおよびＯｏｍｙｃｏｔａ亜門の全ての糸状体を含む。糸状真菌は、キチン、セルロースおよび他の複合多糖で構成されている細胞壁を有する栄養菌糸体により特徴付けられる。本発明の糸状真菌宿主細胞は、形態学的に酵母とは明確に異なる。
【０１８１】
本発明の一部の実施形態では、糸状真菌宿主細胞は、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍｅｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、および／もしくはＶｏｌｖａｒｉｅｌｌａ、ならびに／またはこれらの有性世代もしくは無性世代、および異名、バシオニム（ｂａｓｉｏｎｙｍ）、もしくは分類学的同等物を含むがこれらに限定されない、任意の好適な属および種のものである。
【０１８２】
本発明の一部の実施形態では、宿主細胞は、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、ＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓまたはＹａｒｒｏｗｉａ種の細胞を含むがこれらに限定されない、酵母細胞である。本発明の一部の実施形態では、酵母細胞は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｄａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｑｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、またはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａである。
【０１８３】
本発明の一部の実施形態では、宿主細胞は、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）およびＰｈｏｒｍｉｄｉｕｍ（Ｐ．ｓｐ．ＡＴＣＣ２９４０９）などの、藻類細胞である。
【０１８４】
一部の他の実施形態では、宿主細胞は、原核細胞である。好適な原核細胞としては、これらに限定されないが、グラム陽性菌細胞、グラム陰性菌細胞およびグラム不定性菌細胞が挙げられる。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｂｕｃｈｎｅｒａ、Ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ｃａｍｐｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ、Ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｘｙｌｅｌｌａ、ＹｅｒｓｉｎｉａおよびＺｙｍｏｍｏｎａｓを含むがこれらに限定されない、任意の好適な細菌生物が、本明細書で使用される。一部の実施形態では、宿主細胞は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｃｈｎｅｒａ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、またはＺｙｍｏｍｏｎａｓの種である。一部の実施形態では、細菌宿主株は、ヒトに対して非病原性である。一部の実施形態では、細菌宿主株は、工業用株である。非常に多くの細菌工業用株が公知であり、本発明において好適である。本発明の一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（例えば、Ａ．ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ、Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ、およびＡ．ｒｕｂｉ）である。本発明の一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ種（例えば、Ａ．ａｕｒｅｓｃｅｎｓ、Ａ．ｃｉｔｒｅｕｓ、Ａ．ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ、Ａ．ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ、Ａ．ｍｙｓｏｒｅｎｓ、Ａ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ、Ａ．ｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ、Ａ．ｐｒｏｔｏｐｈｏｎｎｉａｅ、Ａ．ｒｏｓｅｏｐａｒｑｆｆｉｎｕｓ、Ａ．ｓｕｌｆｕｒｅｕｓ、およびＡ．ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）である。本発明の一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種（例えば、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｅｎｓｉｓ、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ、Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｌａｕｔｕｓ、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｂ．ｆｉｒｍｕｓ、Ｂ．ａｌｋａｏｐｈｉｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ、およびＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、またはＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓを含むがこれらに限定されない、工業用Ｂａｃｉｌｌｕｓ株である。一部の実施形態では、Ｂａｃｉｌｌｕｓ宿主細胞は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、および／またはＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓである。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種（例えば、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ  Ｅ８８、Ｃ．ｌｉｔｕｓｅｂｕｒｅｎｓｅ、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、およびＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍおよびＣ．ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｅｒｗｉｎｉａ種（例えば、Ｅ．ｕｒｅｄｏｖｏｒａ、Ｅ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、Ｅ．ａｎａｎａｓ、Ｅ．ｈｅｒｂｉｃｏｌａ、Ｅ．ｐｕｎｃｔａｔａ、およびＥ．ｔｅｒｒｅｕｓ）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｐａｎｔｏｅａ種（例えば、Ｐ．ｃｉｔｒｅａ、およびＰ．ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉ、およびＰ．ｓｐ．Ｄ−０１  １０）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種（例えば、Ｓ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｅｓ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、およびＳ．ｕｂｅｒｉｓ）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種（例えば、Ｓ．ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ、Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ、およびＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ、およびＺ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である。
【０１８５】
本発明において使用される多くの原核生物および真核生物株は、米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）、有限会社ドイツ微生物細胞培養コレクション（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）（ＤＳＭ）、オランダ微生物株保存センター（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  Ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）（ＣＢＳ）、および米国農業研究局特許培養株保存機関（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、北部研究センター（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）（ＮＲＲＬ）などの、いくつかの培養物コレクションから公共に対して容易に入手できる。
【０１８６】
一部の実施形態では、宿主細胞は、タンパク質分泌、タンパク質安定性、ならびに／またはタンパク質の発現および／もしくは分泌に望ましい他の特性を改善する特徴を有するように遺伝子修飾されている。遺伝的修飾は、遺伝子操作技術および／または古典的な微生物学的技術（例えば、化学的またはＵＶ変異誘発およびその後の選択）によって達成することができる。実際、一部の実施形態では、宿主細胞を産生するために、組換え修飾技術と古典的選択技術の組合せが使用される。組換え技術を使用して、宿主細胞および／または培養培地中のガラクトースオキシダーゼ改変体の収量の増加をもたらす様式で、核酸分子を導入、欠失、阻害または修飾することができる。例えば、Ａｌｐ１機能のノックアウトは、プロテアーゼが欠損している細胞をもたらし、ｐｙｒ５機能のノックアウトは、ピリミジン欠損表現型を有する細胞をもたらす。１つの遺伝子操作手法では、相同組換えは、コードされたタンパク質の発現を抑制するために、ｉｎ  ｖｉｖｏで遺伝子を特異的に標的化することにより標的化された遺伝子修飾を誘導するために使用される。代替手法では、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスおよび／またはリボザイム技術が遺伝子発現の阻害に使用される。タンパク質をコードする遺伝子の全てまたは一部の欠失、および遺伝子産物の発現または活性を妨げるための部位特異的変異誘発を含むがこれらに限定されない、細胞におけるタンパク質の発現を低減させるための様々な方法が、当技術分野において公知である。（例えば、Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２８：２２  ｅ９７  ［２０００］；Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃ．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ．，  １９：７−１５  ［２００６］；Ｍａｒｕｙａｍａ  ａｎｄ  Ｋｉｔａｍｏｔｏ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．，  ３０：１８１１−１８１７  ［２００８］；Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｏｍ．，  ２７２：  ３４４−３５２  ［２００４］；およびＹｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  １９１：６１５−６２２  ［２００９］を参照されたく、これらの全てが参照により本明細書に組み込まれる）。ランダム変異誘発、続いての所望の変異についてのスクリーニングも使用される（例えば、Ｃｏｍｂｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．，  ２２０：１４１−８  ［２００３］；およびＦｉｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｋａｒｙ．  Ｃｅｌｌ  ２：２４７−５５  ［２００３］を参照されたく、これらの両方が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１８７】
宿主細胞へのベクターまたはＤＮＡ構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、ＰＥＧ媒介性形質転換、電気穿孔、または当技術分野において公知の他の一般的な技術を含むがこれらに限定されない、当技術分野において公知の任意の好適な方法を使用して果たすことができる。一部の実施形態では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ発現ベクターｐＣＫ１００９００ｉ（これにより参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，７１４，４３７号を参照されたい）が使用される。
【０１８８】
一部の実施形態では、本発明の操作された宿主細胞（すなわち、「組換え宿主細胞」）は、プロモーターを活性化するために、形質転換体を選択するために、またはガラクトースオキシダーゼポリヌクレオチドを増幅するために適宜修飾された、従来の栄養培地で培養される。温度、ｐＨなどのような培養条件は、発現のために選択される宿主細胞に関して以前に使用されたものであり、当業者に周知である。述べたような多くの標準的参考文献および教科書が、細菌、植物、動物（特に、哺乳動物）および古細菌起源の細胞を含む、多くの細胞の培養および産生のために利用可能である。
【０１８９】
一部の実施形態では、本発明の改変体ガラクトースオキシダーゼポリペプチドを発現する細胞は、回分または連続発酵条件下で増殖される。古典的な「回分発酵」は、培地の組成が発酵の開始時に設定され、発酵中に人工的変更を受けない、閉鎖系である。回分系の変形形態が「流加発酵」であり、これもまた本発明で使用される。この変形形態では、基質は、発酵が進行するにつれて徐々に添加される。流加系は、異化抑制が細胞の代謝を阻害する可能性が高いとき、および培地中に限られた量の基質を有することが望ましい場合、有用である。回分および流加発酵は、当技術分野において一般的かつ周知である。「連続発酵」は、既定発酵培地がバイオリアクターに連続的に添加され、同時に同量の馴化培地が処理のために除去される、開放系である。連続発酵は、一般に、培養物を一定した高密度で維持し、この場合、細胞は主として対数増殖期にある。連続発酵系は、定常状態増殖条件を維持することを目指す。連続発酵プロセスのための栄養素および増殖因子をモジュレートする方法、ならびに産物形成速度を最大にする技術は、工業微生物学の技術分野において周知である。
【０１９０】
本発明の一部の実施形態では、無細胞転写／翻訳系が、改変体ガラクトースオキシダーゼの産生に使用される。いくつかの系が市販されており、方法は、当業者に周知である。
【０１９１】
本発明は、改変体ガラクトースオキシダーゼポリペプチドまたはその生物活性断片を作製する方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、配列番号２、７０、１２２、５１４、４２６に対して、少なくとも約７０％（または少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％）の配列同一性を含みかつ本明細書で提供されるような少なくとも１つの変異を含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞を提供するステップ；形質転換された宿主細胞を、培養培地において、コードされた改変体ガラクトースオキシダーゼポリペプチドを宿主細胞が発現する条件下で培養するステップ；ならびに必要に応じて、発現された改変体ガラクトースオキシダーゼポリペプチドを回収もしくは単離するステップ、および／または発現された改変体ガラクトースオキシダーゼポリペプチドを含有する培養培地を回収もしくは単離するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、必要に応じて、コードされたガラクトースオキシダーゼポリペプチドを発現した後の形質転換された宿主細胞を溶解するステップ、ならびに必要に応じて、発現された改変体ガラクトースオキシダーゼポリペプチドを細胞溶解物から回収および／または単離するステップを、さらに提供する。本発明は、改変体ガラクトースオキシダーゼポリペプチドを作製する方法であって、改変体ガラクトースオキシダーゼポリペプチドで形質転換された宿主細胞を改変体ガラクトースオキシダーゼポリペプチドの産生に好適な条件下で培養するステップ、および改変体ガラクトースオキシダーゼポリペプチドを回収するステップを含む方法を、さらに提供する。典型的に、ガラクトースオキシダーゼポリペプチドの回収および単離は、本明細書に記載のものを含む、当技術分野において周知であるタンパク質回収技術を使用して、宿主細胞培養培地、宿主細胞、または両方からである。一部の実施形態では、宿主細胞は、遠心分離により収集され、物理的または化学的手段により破壊され、得られた粗抽出物がさらなる精製のために保持される。タンパク質の発現に利用される微生物細胞は、凍結融解サイクリング、超音波処理、機械的破壊、および／または細胞溶解剤の使用を含むがこれらに限定されない、任意の従来の方法、ならびに当業者に周知の多くの他の好適な方法によって破壊することができる。
【０１９２】
宿主細胞に発現された操作されたガラクトースオキシダーゼ酵素は、数ある中でも特に、リゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、超遠心分離およびクロマトグラフィーを含む、タンパク質精製のための当技術分野において公知の技術のいずれか１つまたは複数を使用して、細胞および／または培養培地から回収することができる。溶解、およびＥ．ｃｏｌｉなどの細菌からのタンパク質の高効率抽出に好適な溶液は、商品名ＣｅｌＬｙｔｉｃ  Ｂ（商標）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で市販されている。したがって、一部の実施形態では、得られたポリペプチドは、当技術分野において公知のいくつかの方法のうちのいずれかによって、回収／単離され、必要に応じて精製される。例えば、一部の実施形態では、ポリペプチドは、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性相互作用、等電点電気泳動、およびサイズ排除）、または沈殿を含むがこれらに限定されない、従来の手順によって、栄養培地から単離される。一部の実施形態では、成熟タンパク質の構造を完成する際に、所望に応じて、タンパク質リフォールディングステップが使用される。加えて、一部の実施形態では、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が最終精製ステップで利用される。例えば、一部の実施形態では、当技術分野において公知の方法が本発明に使用される（例えば、Ｐａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．，  ３５３：１１７  ［２００１］；およびＨｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ７３：１３３１  ［２００７］を参照されたく、これらの両方が、参照により本明細書に組み込まれる）。実際、当技術分野において公知の任意の好適な精製方法が本発明で使用される。
【０１９３】
ガラクトースオキシダーゼポリペプチドの単離のためのクロマトグラフィー技術としては、これらに限定されないが、逆相クロマトグラフィー  高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、および親和性クロマトグラフィーを含む。正味電荷、疎水性、親水性、分子量、分子形状などのような因子に一部は依存することになる、特定の酵素を精製するための条件は、当業者に公知である。
【０１９４】
一部の実施形態では、親和性技術が、改善されたガラクトースオキシダーゼ酵素の単離に使用される。親和性クロマトグラフィー精製には、ガラクトースオキシダーゼポリペプチドに特異的に結合する任意の抗体を使用することができる。抗体の産生のために、ウサギ、マウス、ラットなどを含むがこれらに限定されない様々な宿主動物を、ガラクトースオキシダーゼの注射によって免疫することができる。ガラクトースオキシダーゼポリペプチドは、側鎖官能基によって、または側鎖官能基に結合しているリンカーによって、ＢＳＡなどの好適な担体に結合させることができる。免疫応答を増大させるために、フロイント（完全および不完全）、鉱物ゲル、例えば水酸化アルミニウム、界面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニック（登録商標）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびに潜在的に有用なヒトアジュバント、例えば、ＢＣＧ（カルメットゲラン桿菌）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍを含むがこれらに限定されない様々なアジュバントを、宿主種に依存して使用することができる。
【０１９５】
一部の実施形態では、ガラクトースオキシダーゼ改変体は、酵素を発現する細胞の形態で、粗抽出物として、または単離もしくは精製された調製物として、調製され使用される。一部の実施形態では、ガラクトースオキシダーゼ改変体は、凍結乾燥物として、粉末形態（例えば、アセトン粉末）で調製されるか、または酵素溶液として調製される。一部の実施形態では、ガラクトースオキシダーゼ改変体は、実質的に純粋な調製物の形態である。
【０１９６】
一部の実施形態では、ガラクトースオキシダーゼポリペプチドは、任意の好適な固体基材に結合される。固体基材は、これらに限定されないが、固相、表面、および／または膜を含む。固体支持体は、これらに限定されないが、有機ポリマー、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、およびポリアクリルアミド、ならびにこれらのコポリマーおよびグラフトを含む。固体支持体は、無機のもの、例えば、ガラス、シリカ、細孔制御ガラス（ＣＰＧ）、逆相シリカまたは金属、例えば金もしくは白金であることもある。基材の構成は、ビーズ、球体、粒子、顆粒、ゲル、膜または表面の形であることがある。表面は、平面、略平面または非平面であることもある。固体支持体は、多孔質または非多孔質であることがあり、膨潤特徴または非膨潤特徴を有することがある。固体支持体は、ウェル、くぼみ、または他の入れ物、容器、特徴または位置の形で構成されることもある。複数の支持体が、試薬のロボットによる送達に対応可能な様々な位置のアレイ上に構成されることもあり、または検出方法および／もしくは計器によって構成されることもある。
【０１９７】
一部の実施形態では、ガラクトースオキシダーゼ改変体を精製するために免疫学的方法が使用される。１つの手法では、従来の方法を使用して改変体ガラクトースオキシダーゼポリペプチドに対して（例えば、配列番号２、７０、１２２、５１４および／もしくは４２６のいずれかを含むポリペプチド、ならびに／またはその免疫原性断片に対して）生じた抗体が、ビーズ上に固定化され、改変体ガラクトースオキシダーゼが結合される条件下で細胞培養培地と混合され、沈着される。関連手法では、免疫クロマトグラフィーが使用される。
【０１９８】
一部の実施形態では、改変体ガラクトースオキシダーゼは、非酵素部分を含む融合タンパク質として発現される。一部の実施形態では、改変体ガラクトースオキシダーゼ配列は、精製助長ドメインに融合される。本明細書で使用される場合、用語「精製助長ドメイン」は、それが融合されたポリペプチドの精製を媒介するドメインを指す。好適な精製ドメインは、これらに限定されないが、金属キレートペプチド、固定化された金属での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュール、グルタチオンに結合する配列（例えば、ＧＳＴ）、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ（インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに相当する；例えば、Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ３７：７６７  ［１９８４］を参照されたい）、マルトース結合タンパク質配列、ＦＬＡＧＳ伸長／親和性精製システム（例えば、Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐから入手可能なシステム）において利用されるＦＬＡＧエピトープなどを含む。本明細書に記載の組成物および方法における使用が企図される１つの発現ベクターは、エンテロキナーゼ切断部位によって分離されたポリヒスチジン領域に融合されている本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質の発現をもたらす。ヒスチジン残基は、ＩＭＩＡＣ（固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー；例えば、Ｐｏｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔ．  Ｅｘｐ．  Ｐｕｒｉｆ．，  ３：２６３−２８１  ［１９９２］を参照されたい）での精製を助長し、その一方で、エンテロキナーゼ切断部位は、改変体ガラクトースオキシダーゼポリペプチドを融合タンパク質から分離するための手段を提供する。ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、外来ポリペプチドをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させることもできる。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、それらを、リガンド−アガロースビーズ（例えば、ＧＳＴ融合体の場合はグルタチオン−アガロース）への吸着、続いて、遊離リガンドの存在下での溶出によって、溶解細胞から容易に精製することができる。
【０１９９】
したがって、別の態様では、本発明は、操作された酵素ポリペプチドを産生する方法であって、操作された酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現することができる宿主細胞を、ポリペプチドの発現に好適な条件下で培養するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、本明細書に記載されるような、酵素ポリペプチドを単離および／または精製するステップを、さらに含む。
【０２００】
宿主細胞についての適切な培養培地および増殖条件は、当技術分野において周知である。酵素ポリペプチドの発現のためにポリヌクレオチドを細胞に導入するための任意の好適な方法が本発明で使用されることが、企図される。好適な技術としては、これらに限定されないが、電気穿孔、微粒子銃による粒子衝突、リポソーム媒介性トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクション、およびプロトプラスト融合が挙げられる。
【０２０１】
説明に役立つことを意図したものであり、限定を意図したものではない、以下の代表的実施例で、本発明の様々な特徴および実施形態が例証される。
【実施例】
【０２０２】
実験
遂行した実験および結果を含む以下の実施例は、説明に役立つことを目的として提供するものに過ぎず、本発明を限定するものと解釈すべきでない。実際、下記の試薬および機器の多くには様々な好適な供給元がある。本発明をいずれかの試薬または機器物品についていずれかの特定の供給元に限定することを意図していない。
【０２０３】
下の実験の開示では、以下の略語が適用される：Ｍ（モル濃度）；ｍＭ（ミリモル濃度）、ｕＭおよびμΜ（マイクロモル濃度）；ｎＭ（ナノモル濃度）；ｍｏｌ（モル）；ｇｍおよびｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｕｇおよびμｇ（マイクログラム）；Ｌおよびｌ（リットル）；ｍｌおよびｍＬ（ミリリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；ｕｍおよびμｍ（マイクロメートル）；ｓｅｃ．（秒）；ｍｉｎ（分）；ｈおよびｈｒ（時）；Ｕ（単位）；ＭＷ（分子量）；ｒｐｍ（毎分回転数）；ｐｓｉおよびＰＳＩ（ポンド毎平方インチ）；℃（摂氏度）；ＲＴおよびｒｔ（室温）；ＲＨ（相対湿度）；ＣＶ（変動係数）；ＣＡＭおよびｃａｍ（クロラムフェニコール）；ＰＭＢＳ（ポリミキシンＢ硫酸塩）；ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）；ＬＢ（ルリアブロス）；ＴＢ（テリフィックブロス）；ＳＦＰ（振盪フラスコ粉末）；ＣＤＳ（コード配列）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ＲＮＡ（リボ核酸）；ｎｔ（ヌクレオチド；ポリヌクレオチド）；ａａ（アミノ酸；ポリペプチド）；Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ［ＣＧＳＣ］、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、ＣＴから入手可能な、一般に使用されている実験室Ｅ．ｃｏｌｉ株）；ＨＴＰ（ハイスループット）；ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー）；ＨＰＬＣ−ＵＶ（ＨＰＬＣ−紫外可視検出器）；１Ｈ  ＮＭＲ（プロトン核磁気共鳴分光法）；ＦＩＯＰＣ（陽性対照に対する改善倍率）；ＳｉｇｍａおよびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）；Ｄｉｆｃｏ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）；Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｗｅｓｔｗｏｏｄ、ＭＡ）；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの一部、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）；Ａｍｒｅｓｃｏ（Ａｍｒｅｓｃｏ，ＬＬＣ、Ｓｏｌｏｎ、ＯＨ）；Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ，Ｌｔｄ．、Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ、ＵＫ）；Ｖａｒｉａｎ（Ｖａｒｉａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）；Ａｇｉｌｅｎｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）；Ｉｎｆｏｒｓ（Ｉｎｆｏｒｓ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．、Ａｎｎａｐｏｌｉｓ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ、ＭＤ）；およびＴｈｅｒｍｏｔｒｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｈｏｌｌａｎｄ、ＭＩ）。
【０２０４】
（実施例１）
ＥＧＡのエナンチオ選択的産生のための配列番号２に対するＧＯＡ改善
本発明の改変体を産生するために使用したＧＯＡ（配列番号２）酵素の親遺伝子をＥ．ｃｏｌｉにおける発現のためにコドン最適化し、合成し、ｐＥＴ−３０ａベクターにクローニングした。ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、ＧＯＡコード遺伝子を含有するそれぞれのプラスミドで形質転換し、１％グルコースと５０μｇ／ｍＬのカナマイシン（ＫＡＮ）とを含有するルリアブロス（ＬＢ）寒天プレートにプレーティングし、３７℃で一晩増殖させた。モノクローナルコロニーを採取し、９６ウェルシャローウェルマイクロタイタープレート中の１％グルコースと５０μｇ／ｍＬのＫＡＮとを含有する１８０μＬのＬＢに接種した。プレートをＯ２透過性シールで封止し、培養物を、３０℃、２００ｒｐｍおよび８５％相対湿度（ＲＨ）で一晩増殖させた。次いで、細胞培養物の各々の１０μＬを、３９０μＬのＴＢと５０μｇ／ｍＬのＫＡＮと０．５ｍＭのＣｕＳＯ４とを含有する９６ウェルディープウェルプレートのウェルに移した。ディープウェルプレートをＯ２透過性シールで封止し、０．６〜０．８のＯＤ６００に達するまで３０℃、２５０ｒｐｍおよび８５％ＲＨでインキュベートした。次いで、細胞培養物を１ｍＭの最終濃度までのイソプロピルチオグリコシド（ＩＰＴＧ）によって誘導し、２５℃、２７０ｒｐｍで一晩インキュベートした。次いで、４０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を使用して細胞をペレット化した。上清を廃棄し、溶解の前にペレットを−８０℃で凍結させた。
【０２０５】
５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ＮａＰｉ）緩衝剤、ｐＨ７．４、１ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、０．５ｍｇ／ｍＬのＰＭＢＳ、１７ｍｇ／ｍｌのホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）および１７ｍｇ／ｍｌのカタラーゼを含有する２００μＬの溶解緩衝液で凍結ペレットを溶解した。溶解混合物を室温（ＲＴ）で２．５時間振盪した。次いで、プレートを１０分間、４０００ｒｐｍおよび４℃で遠心分離した。次いで、上清を清澄化溶解物として生体触媒反応に使用して、活性レベルを決定した。
【０２０６】
十分に確立されている技術（例えば、以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して、配列番号２のライブラリーを産生した。各遺伝子によりコードされるポリペプチドをＨＴＰで産生し、清澄化溶解物を上記の通りに生成した。
【０２０７】
９６ウェルディープウェル（体積２ｍＬ）プレートにおいて、５０μＬの清澄化溶解物溶液、５０ｇ／Ｌの化合物Ｘ（２−エチルグリセロール、ＥＧＯ）、５０ｍＭのＮａＰｉ緩衝剤、５０μＭのＣｕＳＯ４を用いて、ｐＨ７．４で各１００μＬ反応を行った。プレートをＯ２透過性シールで封止し、３０℃でインキュベートし、８５％ＲＨで２０時間維持した５０ｍｍ行程のＩｎｆｏｒｓシェーカーにおいて３００ｒｐｍで一晩撹拌した。
【０２０８】
５０μＬのアリコートを取り、１０μＬの（Ｒ）−（＋）−１−アミノ−２−（メトキシメチル）ピロリジン（Ｒ−ＡＭＰ）を添加し、９６ウェル丸底（体積０．３ｍＬ）プレート中で約３０分間、ＲＴで振盪しながらインキュベートすることによって、プレートウェルを誘導体化した。２００μＬのアセトニトリル（ＭｅＣＮ）を添加し、短時間振盪して混合することによって試料をクエンチし、４０００ｒｐｍで、４℃で５分間、遠心分離した。上清を９６ウェルシャローウェルプレートに移し、分析法８．１による分析のためにヒートシールした。
【０２０９】
配列番号２の活性と比べた改変体活性を、対応する配列番号２のＳＩＭ  ＭＳ産物ピーク存在量と比較したデータ試料についてのＳＩＭ  ＭＳ（２２７．３ｍ／ｚ）における２−エチニルグリセルアルデヒド（ＥＧＡ）ピーク存在量によって決定した。分析法８．１を使用してＭＳでのＥＧＡの標準用量応答曲線を使用して計算した係数をＭＳ産物ピークの面積に掛けることによって、ＥＧＡの量を定量化した。産物産生の改善が最も高度であった１０個の試料を選択して、分析法９．１を使用して分析して、エナンチオ選択性が改善された改変体を同定した。
【０２１０】
配列番号２と比べたエナンチオ選択性を、対応する配列番号２のエナンチオマー過剰率％ｅｅ  Ｒに対する形成されたＥＧＡのＲ−エナンチオマーについてのエナンチオマー過剰率（％ｅｅ  Ｒ−化合物Ｙ）として計算した。ＥＧＡのＳ−エナンチオマー（化合物Ｚ）から化合物Ｙを引き、その差を、ＨＰＬＣ分析により決定したＲ−エナンチオマー産物ピークとＳ−エナンチオマー産物ピークの和で割ることによって、エナンチオ選択性を定量化した。
【表４−１】
2021530982.tif 000005
【表４−２】
2021530982.tif 000006
【０２１１】
（実施例２）
ガラクトースオキシダーゼ（ＧＯＡ）湿潤細胞ペレットの調製
本発明の改変体を産生するために使用したＧＯＡ（配列番号２）酵素の親遺伝子をＥ．ｃｏｌｉにおける発現のためにコドン最適化し、合成し、ｐＣＫ９００ベクター（例えば、これにより参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，７１４，４３７号を参照されたい）にクローニングした。Ｗ３１１０  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、ＧＯＡコード遺伝子を含有するそれぞれのプラスミドで形質転換し、１％グルコースと３０μｇ／ｍＬのＣＡＭとを含有するＬＢ）寒天プレートにプレーティングし、３７℃で一晩増殖させた。モノクローナルコロニーを採取し、９６ウェルシャローウェルマイクロタイタープレート中の１％グルコースと３０μｇ／ｍＬのＣＡＭとを含有する１８０μＬのＬＢに接種した。プレートをＯ２透過性シールで封止し、培養物を、３０℃、２００ｒｐｍおよび８５％ＲＨで一晩増殖させた。次いで、細胞培養物の各々の１０μＬを、３９０μＬのＴＢと３０μｇ／ｍＬのＣＡＭとを含有する９６ウェルディープウェルプレートのウェルに移した。ディープウェルプレートをＯ２透過性シールで封止し、０．６〜０．８のＯＤ６００に達するまで３０℃、２５０ｒｐｍおよび８５％ＲＨでインキュベートした。次いで、細胞培養物を１ｍＭの最終濃度までのＩＰＴＧによって誘導し、３０℃、２５０ｒｐｍで一晩インキュベートした。次いで、４０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を使用して細胞をペレット化した。上清を廃棄し、溶解の前にペレットを−８０℃で凍結させた。
【０２１２】
（実施例３）
ＨＴＰ  ＧＯＡ含有細胞溶解物の調製
実施例２で詳細に述べた通りに調製した凍結ペレットを、５０ｍＭのＮａＰｉ緩衝剤、ｐＨ７．４、１ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、０．５ｍｇ／ｍＬのＰＭＢＳを含有する４００μＬの溶解緩衝液で溶解した。溶解混合物をＲＴで２時間振盪した。次いで、プレートを１５分間、４０００ｒｐｍおよび４℃で遠心分離した。次いで、下で説明する実験で上清を清澄化溶解物として生体触媒反応に使用して、活性レベルを決定した。
【０２１３】
（実施例４）
再試験ＧＯＡ含有細胞溶解物の調製
実施例２で詳細に述べたように調製した凍結ペレットを、５０ｍＭのＮａＰｉ緩衝剤、ｐＨ７．４、１ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、０．５ｍｇ／ｍＬのＰＭＢＳを含有する１５０μＬの溶解緩衝液で溶解した。溶解混合物をＲＴで２時間振盪した。次いで、プレートを１５分間、４０００ｒｐｍおよび４℃で遠心分離した。次いで、下で説明する実験で上清を清澄化溶解物として生体触媒反応に使用して、活性レベルを決定した。
【０２１４】
（実施例５）
化合物Ｙのエナンチオ選択的産生のための配列番号４に対するＧＯＡ改善
配列番号４を次の定向進化ラウンドのための親酵素として選択した。十分に確立されている技術（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によりコードされるポリペプチドを実施例２で説明した通りにＨＴＰで産生し、実施例３で説明した通りに清澄化溶解物を生成した。
【０２１５】
９６ウェルディープウェル（体積２ｍＬ）プレートにおいて、５０μＬの清澄化溶解物、２０ｇ／Ｌの化合物Ｘ、５０ｍＭのＮａＰｉ緩衝剤、２５μＭのＣｕＳＯ４、０．２５ｇ／Ｌのホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、０．２５ｇ／Ｌのカタラーゼを用いて、ｐＨ７．４で、各１００μＬ反応を行った。プレートをＯ２透過性シールで封止し、３０℃でインキュベートし、８５％ＲＨで維持した５０ｍｍ行程のＫｕｈｎｅｒシェーカーにおいて３００ｒｐｍで一晩撹拌した。
【０２１６】
５０μＬのアリコートを取り、１０μＬの（Ｒ）−（＋）−１−アミノ−２−（メトキシメチル）ピロリジン（Ｒ−ＡＭＰ）を添加し、９６ウェルハーフディープウェル（体積１ｍＬ）プレート中で約３０分間、ＲＴで振盪しながらインキュベートすることによって、プレートウェル内の改変体を誘導体化した。２００μＬのアセトニトリル（ＭｅＣＮ）を添加し、短時間振盪して混合することによって試料をクエンチし、４０００ｒｐｍで、４℃で５分間、遠心分離した。上清を９６ウェルシャローウェルプレートに移し、実施例８で説明する通りの分析法８．１による分析のためにヒートシールした。
【０２１７】
配列番号４の活性と比べた各改変体の活性を、対応する配列番号４の変換パーセント当たりの、形成された産物（化合物Ｙ＋Ｚ）の変換％として計算した。分析法８．１を使用してＨＰＬＣでの化合物Ｙの標準用量応答曲線を使用して計算した係数をＨＰＬＣ産物ピークの面積に掛けることによって、変換パーセントを定量化した。０．７より大きい陽性対照（ＦＩＯＰ）に対する改善倍率を有する活性がある改変体を選択して、実施例９で説明する通りの分析法９．１を使用して分析して、エナンチオ選択性が改善された改変体を同定した。
【０２１８】
配列番号４と比べた各改変体についてのエナンチオ選択性を、対応する配列番号４のエナンチオマー過剰率％ｅｅ  Ｒに対する形成された化合物Ｙ産物についてのエナンチオマー過剰率として計算した。化合物Ｚから化合物Ｙを引き、その差を、ＨＰＬＣ分析により決定したＹ産物ピークとＺ産物ピークの和で割ることによって、エナンチオ選択性を定量化した。結果を下に提供する。
【表５−１】
2021530982.tif 000007
【表５−２】
2021530982.tif 000008
【０２１９】
（実施例６）
化合物Ｙのエナンチオ選択的産生のための配列番号４に対するＧＯＡ改善
配列番号４をこの定向進化ラウンドのための親酵素として選択した。十分に確立されている技術（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によりコードされるポリペプチドを実施例２で説明した通りにＨＴＰで産生し、実施例４で説明した通りに清澄化溶解物を生成した。
【０２２０】
９６ウェルディープウェルプレートにおいて、５０μＬの清澄化溶解物、２０ｇ／Ｌの化合物Ｘ、５０ｍＭのＮａＰｉ緩衝剤、２５μＭのＣｕＳＯ４、０．２５ｇ／ＬのＨＲＰ、０．２５ｇ／Ｌのカタラーゼを用いて、ｐＨ７．４で、各１００μＬ反応を行った。プレートをＯ２透過性シールで封止し、３０℃でインキュベートし、８５％ＲＨで維持した５０ｍｍ行程のＫｕｈｎｅｒシェーカーにおいて３００ｒｐｍで一晩撹拌した。
【０２２１】
５０μＬのアリコートを取り、１０μＬのＲ−ＡＭＰを添加し、９６ウェルハーフディープウェルプレート中で約３０分間、ＲＴで振盪しながらインキュベートすることによって、プレートウェル内の酵素改変体を誘導体化した。２００μＬのＭｅＣＮを添加し、短時間振盪して混合することによって試料をクエンチし、４０００ｒｐｍで、４℃で５分間、遠心分離した。上清を９６ウェルシャローウェルプレートに移し、分析法８．１による分析のためにヒートシールした。
【０２２２】
配列番号４の活性と比べた各酵素改変体の活性を、対応する配列番号４の変換パーセント当たりの、形成された産物（化合物Ｙ＋Ｚ）の変換％として計算した。分析法８．１を使用してＨＰＬＣでの化合物Ｙの標準用量応答曲線を使用して計算した係数をＨＰＬＣ産物ピークの面積に掛けることによって、変換パーセントを定量化した。０．７より大きいＦＩＯＰを有する活性がある改変体を選択して、分析法９．１を使用して分析して、エナンチオ選択性が改善された改変体を同定した。
【０２２３】
配列番号４と比べた各改変体についてのエナンチオ選択性を、実施例５の場合のように、対応する配列番号４の形成された％ｅｅ  Ｒ  ＥＧＡに対する％ｅｅ  Ｒ  ＥＧＡとして計算した。結果を下に提供する。
【表６−１】
2021530982.tif 000009
【表６−２】
2021530982.tif 000010
【表６−３】
2021530982.tif 000011
【０２２４】
（実施例７）
化合物Ｙのエナンチオ選択的産生のための配列番号１６６に対するＧＯＡ改善
配列番号１６６をこの定向進化ラウンドのための親酵素として選択した。十分に確立されている技術（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によりコードされるポリペプチドを実施例２で説明した通りにＨＴＰで産生し、実施例４で説明した通りに清澄化溶解物を生成した。
【０２２５】
９６ウェルディープウェルプレートにおいて、４５μＬの清澄化溶解物、２０ｇ／Ｌの化合物Ｘ、５０ｍＭのＮａＰｉ緩衝剤、５０μＭのＣｕＳＯ４、０．２５ｇ／ＬのＨＲＰ、０．２５ｇ／Ｌのカタラーゼを用いて、ｐＨ７．４で、各１００μＬ反応を行った。プレートをＯ２透過性シールで封止し、３０℃でインキュベートし、８５％ＲＨで維持した５０ｍｍ行程のＫｕｈｎｅｒシェーカーにおいて３００ｒｐｍで一晩撹拌した。
【０２２６】
５０μＬのアリコートを取り、１０μＬのＲ−ＡＭＰを添加し、９６ウェルハーフディープウェルプレート中で約３０分間、ＲＴで振盪しながらインキュベートすることによって、プレートウェル内の酵素改変体を誘導体化した。分析法１０．１（実施例１０で説明する通り）によって分析した試料の場合、６０μＬのエタノールを添加し、その後、混合し、さらにその後、１２０μＬの水を含有する９６ウェルシャローウェルプレートに２０μＬの希釈された試料を移すことによって、試料をクエンチした。プレートを短時間撹拌し、次いで分析した。
【０２２７】
分析法８．１によって分析した試料の場合、２００μＬのＭｅＣＮを添加し、短時間振盪して混合することによって試料をクエンチし、４０００ｒｐｍで、４℃で５分間、遠心分離した。上清を９６ウェルシャローウェルプレートに移し、分析のためにヒートシールした。
【０２２８】
配列番号１６６の活性と比べた各改変体の活性を、分析法１０．１を使用して対応する配列番号１６６のＵＶ２４７吸光度当たりの形成されたＲＡＭＰ誘導産物の２４７ｎｍでの紫外（ＵＶ）吸光度として計算した。０．７５より大きいＦＩＯＰを有する活性がある改変体を選択して、分析法９．１（実施例９）を使用して分析して、エナンチオ選択性が改善された改変体を同定した。
【０２２９】
配列番号１６６と比べた各改変体についてのエナンチオ選択性を、実施例５の場合のように、対応する配列番号１６６の形成された％ｅｅ  Ｒ  ＥＧＡに対する％ｅｅ  Ｒ  ＥＧＡとして計算した。
【表７−１】
2021530982.tif 000012
【表７−２】
2021530982.tif 000013
【表７−３】
2021530982.tif 000014
【０２３０】
（実施例８）
Ｒ−ＡＭＰから誘導した２−エチニルグリセルアルデヒドの分析的検出
実施例１、５、６、７、１１、１４および１６に記載のデータは、表８．１の分析法を使用して収集した。本明細書で提供する方法は、本発明を使用して産生される改変体の分析に使用される。しかし、本明細書で提供する改変体および／または本明細書で提供する方法を使用して産生される改変体の分析に適用可能である他の好適な方法が当技術分野において公知であるので、本発明を本明細書に記載の方法に限定することを意図していない。
【表８】
2021530982.tif 000015
【０２３１】
（実施例９）
Ｒ−ＡＭＰから誘導した２−エチニルグリセルアルデヒドのエナンチオマーの分析的検出
実施例１、５、６、７、１１、１４、１５、１７および１８に記載のデータは、表９．１で提供する分析法を使用して収集した。本明細書で提供する方法は、本発明を使用して産生される改変体の分析に使用される。しかし、本明細書で提供する改変体および／または本明細書で提供する方法を使用して産生される改変体の分析に適用可能である他の好適な方法が当技術分野において公知であるので、本発明を本明細書に記載の方法に限定することを意図していない。
【表９】
2021530982.tif 000016
【０２３２】
（実施例１０）
Ｒ−ＡＭＰから誘導した２−エチニルグリセルアルデヒドの分光光度分析的検出
実施例７に記載のデータは、表１０．１で提供する分析法を使用して収集した。本明細書で提供する方法は、本発明を使用して産生される改変体の分析に使用される。しかし、本明細書で提供する改変体および／または本明細書で提供する方法を使用して産生される改変体の分析に適用可能である他の好適な方法が当技術分野において公知であるので、本発明を本明細書に記載の方法に限定することを意図していない。
【表１０】
2021530982.tif 000017
【０２３３】
（実施例１１）
化合物Ｙのエナンチオ選択的産生のための配列番号２７２に対するＧＯＡ改善
配列番号２７２をこの定向進化ラウンドのための親酵素として選択した。十分に確立されている技術（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によりコードされるポリペプチドを実施例２で説明した通りにＨＴＰで産生し、実施例４で説明した通りに清澄化溶解物を生成した。
【０２３４】
９６ウェルディープウェルプレートにおいて、５０μＬの清澄化溶解物、２０ｇ／Ｌの化合物Ｘ、５０ｍＭのＮａＰｉ緩衝剤、２５μＭのＣｕＳＯ４、０．２５ｇ／ＬのＨＲＰ、０．２５ｇ／Ｌのカタラーゼを用いて、ｐＨ７．４で、各１００μＬ反応を行った。プレートをＯ２透過性シールで封止し、３０℃でインキュベートし、８５％ＲＨで維持した５０ｍｍ行程のＫｕｈｎｅｒシェーカーにおいて３００ｒｐｍで一晩撹拌した。
【０２３５】
５０μＬのアリコートを取り、１００ｇ／ＬのＲ−ＡＭＰ水溶液１０μＬを添加し、９６ウェルハーフディープウェルプレート中で約３０分間、ＲＴで振盪しながらインキュベートすることによって、プレートウェル内の酵素改変体を誘導体化した。２００μＬのＭｅＣＮを添加し、短時間振盪して混合することによって試料をクエンチし、４０００ｒｐｍで、４℃で５分間、遠心分離した。上清を９６ウェルシャローウェルプレートに移し、分析法８．１による分析のためにヒートシールした。
【０２３６】
配列番号２７２の活性と比べた各酵素改変体の活性を、対応する配列番号２７２の変換パーセント当たりの、形成された産物（化合物Ｙ＋Ｚ）の変換％として計算した。分析法８．１を使用してＨＰＬＣでの化合物Ｙの標準用量応答曲線を使用して計算した係数をＨＰＬＣ産物ピークの面積に掛けることによって、変換パーセントを定量化した。０．７より大きいＦＩＯＰを有する活性がある改変体を選択して、分析法９．１を使用して分析して、エナンチオ選択性が改善された改変体を同定した。
【０２３７】
配列番号２７２と比べた各改変体についてのエナンチオ選択性を、実施例５の場合のように、対応する配列番号２７２の形成された％ｅｅ  Ｒ  ＥＧＡに対する％ｅｅ  Ｒ  ＥＧＡとして計算した。結果を下に提供する。
【表１１−１】
2021530982.tif 000018
【表１１−２】
2021530982.tif 000019
【表１１−３】
2021530982.tif 000020
【表１１−４】
2021530982.tif 000021
【０２３８】
（実施例１２）
化合物Ｙのエナンチオ選択的産生のための配列番号２７２に対するＧＯＡ改善
配列番号２７２をこの定向進化ラウンドのための親酵素として選択した。十分に確立されている技術（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によりコードされるポリペプチドを実施例２で説明した通りにＨＴＰで産生し、実施例４で説明した通りに清澄化溶解物を生成した。
【０２３９】
９６ウェルディープウェルプレートにおいて、５０μＬの清澄化溶解物、２０ｇ／Ｌの化合物Ｘ、５０ｍＭのＮａＰｉ緩衝剤、２５μＭのＣｕＳＯ４、０．２５ｇ／ＬのＨＲＰ、０．２５ｇ／Ｌのカタラーゼを用いて、ｐＨ７．４で、各１００μＬ反応を行った。プレートをＯ２透過性シールで封止し、３０℃でインキュベートし、８５％ＲＨで維持した５０ｍｍ行程のＫｕｈｎｅｒシェーカーにおいて３００ｒｐｍで一晩撹拌した。
【０２４０】
５０μＬのアリコートを取り、１００ｍｇ／ｍＬのＲ−ＡＭＰ水溶液１０μＬを添加し、９６ウェルハーフディープウェルプレート中で約３０分間、ＲＴで振盪しながらインキュベートすることによって、プレートウェル内の酵素改変体を誘導体化した。分析法２０．１（実施例２０で説明する通り）によって分析した試料の場合、６０μＬのエタノールを添加し、その後、混合し、さらにその後、１２０μＬの水を含有する９６ウェルシャローウェルプレートに２０μＬの希釈された試料を移すことによって、試料をクエンチした。プレートを短時間撹拌し、次いで分析した。
【０２４１】
配列番号２７２の活性と比べた各改変体の活性を、分析法２０．１を使用して対応する配列番号２７２のＵＶ３４０吸光度当たりの形成されたＲＡＭＰ誘導産物の３４０ｎｍでの紫外（ＵＶ）吸光度として計算した。
【表１２−１】
2021530982.tif 000022
【表１２−２】
2021530982.tif 000023
【表１２−３】
2021530982.tif 000024
【０２４２】
（実施例１３）
化合物Ｙのエナンチオ選択的産生のための配列番号９２８に対するＧＯＡ改善
この定向進化ラウンドでは、ｓｔｒｅｐタグを配列番号９０８のＣ末端から除去し、Ｈｉｓタグを付加させた。得られた配列番号９２８をこの定向進化ラウンドのための親酵素として選択した。十分に確立されている技術（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によりコードされるポリペプチドを実施例２で説明した通りにＨＴＰで産生し、実施例４で説明した通りに清澄化溶解物を生成した。
【０２４３】
９６ウェルディープウェルプレートにおいて、１０μＬの清澄化溶解物、３０ｇ／Ｌの化合物Ｘ、５０ｍＭのＭＥＳ緩衝剤、２００μＭのＣｕＳＯ４、０．２０ｇ／ＬのＨＲＰ、０．２０ｇ／Ｌのカタラーゼを用いて、ｐＨ７．４で、各１００μＬ反応を行った。プレートをＯ２透過性シールで封止し、３０℃でインキュベートし、８５％ＲＨで維持した５０ｍｍ行程のＫｕｈｎｅｒシェーカーにおいて３００ｒｐｍで一晩撹拌した。
【０２４４】
５０μＬのアリコートを取り、１００ｍｇ／ｍＬのＲ−ＡＭＰ水溶液１０μＬを添加し、９６ウェルハーフディープウェルプレート中で約３０分間、ＲＴで振盪しながらインキュベートすることによって、プレートウェル内の酵素改変体を誘導体化した。分析法２０．１（実施例２０で説明する通り）によって分析した試料の場合、６０μＬのエタノールを添加し、その後、混合し、さらにその後、１２０μＬの水を含有する９６ウェルシャローウェルプレートに２０μＬの希釈された試料を移すことによって、試料をクエンチした。試料を分析プレート中でさらに希釈して１００倍最終希釈物にした。プレートを短時間撹拌し、次いで分析した。
【０２４５】
配列番号９２８の活性と比べた各改変体の活性を、分析法２０．１を使用して対応する配列番号９２８のＵＶ３４０吸光度当たりの形成されたＲＡＭＰ誘導産物の３４０ｎｍでの紫外（ＵＶ）吸光度として計算した。
【表１３−１】
2021530982.tif 000025
【表１３−２】
2021530982.tif 000026
【表１３−３】
2021530982.tif 000027
【表１３−４】
2021530982.tif 000028
【０２４６】
（実施例１４）
化合物Ｙのエナンチオ選択的産生のための配列番号９２８に対するＧＯＡ改善
配列番号９２８をこの定向進化ラウンドのための親酵素として選択した。十分に確立されている技術（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によりコードされるポリペプチドを実施例２で説明した通りにＨＴＰで産生し、実施例４で説明した通りに清澄化溶解物を生成した。
【０２４７】
９６ウェルディープウェルプレートにおいて、１５μＬの清澄化溶解物、２１ｇ／Ｌの化合物Ｘ、９ｇ／Ｌの化合物Ｙ、５０ｍＭのＭＥＳ緩衝剤、２００μＭのＣｕＳＯ４、０．２０ｇ／ＬのＨＲＰ、０．２０ｇ／Ｌのカタラーゼを用いて、ｐＨ７．４で、各１００μＬ反応を行った。プレートをＯ２透過性シールで封止し、３０℃でインキュベートし、８５％ＲＨで維持した５０ｍｍ行程のＫｕｈｎｅｒシェーカーにおいて３００ｒｐｍで一晩撹拌した。
【０２４８】
４０ｕＬのアセトニトリルを含有する９６ウェルシャローウェルプレートに２０ｕＬの反応物を添加することにより、プレートウェル内の酵素改変体をアセトニトリルで３倍希釈した。この３倍希釈反応物の２０ｕＬを、アセトニトリル中の１００ｇ／ＬのＲ−ＡＭＰ溶液１０ｕＬを添加することおよび９６ウェルハーフディープウェルプレート中で約４５分間、３０℃で振盪しながらインキュベートすることによって誘導体化した。１７０μＬのＭｅＣＮを添加し、短時間振盪して混合することによって試料をクエンチし、４０００ｒｐｍで、４℃で５分間、遠心分離した。上清を９６ウェルシャローウェルプレートに移し、分析法８．１（表１４．１）または９．１（表１４．２）による分析のためにヒートシールした。
【表１４−１】
2021530982.tif 000029
【表１４−２】
2021530982.tif 000030
【表１４−３】
2021530982.tif 000031
【０２４９】
（実施例１５）
化合物Ｙのエナンチオ選択的産生のための配列番号９３２に対するＧＯＡ改善
配列番号９３２をこの定向進化ラウンドのための親酵素として選択した。十分に確立されている技術（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によりコードされるポリペプチドを実施例２で説明した通りにＨＴＰで産生し、実施例４で説明した通りに清澄化溶解物を生成した。
【０２５０】
９６ウェルディープウェルプレートにおいて、２００ｕＬの総溶解物体積からの７．５μＬの清澄化溶解物、３０ｇ／Ｌの化合物Ｘ、５０ｍＭのＭＥＳ緩衝剤、２００μＭのＣｕＳＯ４、５ｇ／ＬのＨＲＰ、０．２ｇ／Ｌのカタラーゼを用いて、ｐＨ７．４で、各１００μＬ反応を行った。プレートをＯ２透過性シールで封止し、３０℃でインキュベートし、８５％ＲＨで維持した５０ｍｍ行程のＫｕｈｎｅｒシェーカーにおいて３００ｒｐｍで一晩撹拌した。
【０２５１】
４０ｕＬのアセトニトリルを含有する９６ウェルシャローウェルプレートに２０ｕＬの反応物を添加することにより、プレーウェル内の酵素改変体をアセトニトリルで３倍希釈した。この３倍希釈反応物の２０ｕＬを、アセトニトリル中の１００ｇ／ＬのＲ−ＡＭＰ溶液１０ｕＬを添加することおよび９６ウェルハーフディープウェルプレート中で約４５分間、３０℃で振盪しながらインキュベートすることによって誘導体化した。１７０μＬのＭｅＣＮを添加し、短時間振盪して混合することによって試料をクエンチし、４０００ｒｐｍで、４℃で５分間、遠心分離した。上清を９６ウェルシャローウェルプレートに移し、分析法９．１による分析のためにヒートシールした。
【０２５２】
配列番号９３２と比べた各改変体についてのエナンチオ選択性を、実施例５の場合のように、対応する配列番号９３２の形成された％ｅｅ  Ｒ  ＥＧＡに対する％ｅｅ  Ｒ  ＥＧＡとして計算した。結果を下に提供する。
【表１５】
2021530982.tif 000032
【０２５３】
（実施例１６）
化合物Ｙのエナンチオ選択的産生のための配列番号１２６４に対するＧＯＡ改善
配列番号１２６４をこの定向進化ラウンドのための親酵素として選択した。十分に確立されている技術（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によりコードされるポリペプチドを実施例２で説明した通りにＨＴＰで産生し、ウェル当たり３００ｕｌの溶解物体積を使用したことを除いて、実施例４で説明した通りに清澄化溶解物を生成した。
【０２５４】
９６ウェルディープウェルプレートにおいて、３００ｕＬの溶解物総体積からの５０μＬの清澄化溶解物、１８ｇ／Ｌの化合物Ｘ、１２ｇ／Ｌの化合物Ｙ、約８０ｍＭのＮａＰｉ緩衝剤、２００μＭのＣｕＳＯ４、０．２０ｇ／ＬのＨＲＰ、０．２０ｇ／Ｌのカタラーゼを用いて、ｐＨ７．４で、各１００μＬ反応を行った。プレートをＯ２透過性シールで封止し、３０℃でインキュベートし、８５％ＲＨで維持した５０ｍｍ行程のＫｕｈｎｅｒシェーカーにおいて３００ｒｐｍで一晩撹拌した。
【０２５５】
３５ｕＬのアセトニトリルを含有する９６ウェルシャローウェルプレートに３５ｕＬの反応物を添加することにより、プレートウェル内の酵素改変体をアセトニトリルで２倍希釈した。この２倍希釈反応物の２０ｕＬを、アセトニトリル中の１００ｇ／ＬのＲ−ＡＭＰ溶液１０ｕＬを添加することおよび９６ウェルハーフディープウェルプレート中で約４５分間、３０℃で振盪しながらインキュベートすることによって誘導体化した。２００μＬのＭｅＣＮを添加し、短時間振盪して混合することによって試料をクエンチし、４０００ｒｐｍで、４℃で５分間、遠心分離した。上清を９６ウェルシャローウェルプレートに移し、分析法８．１による分析のためにヒートシールした。
【表１６−１】
2021530982.tif 000033
【表１６−２】
2021530982.tif 000034
【０２５６】
（実施例１７）
化合物Ｙのエナンチオ選択的産生のための配列番号１２６４に対するＧＯＡ改善
配列番号１２６４をこの定向進化ラウンドのための親酵素として選択した。十分に確立されている技術（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によりコードされるポリペプチドを実施例２で説明した通りにＨＴＰで産生し、ウェル当たり２００ｕＬの溶解物体積を使用したことを除いて、実施例４で説明した通りに清澄化溶解物を生成した。
【０２５７】
９６ウェルディープウェルプレートにおいて、２００ｕＬの溶解物総体積からの１０μＬの清澄化溶解物、３０ｇ／Ｌの化合物Ｘ、約１００ｍＭのＮａＰｉ緩衝剤、２００μＭのＣｕＳＯ４、５ｇ／ＬのＨＲＰ、０．２０ｇ／Ｌのカタラーゼを用いて、ｐＨ７．４で、各１００μＬ反応を行った。プレートをＯ２透過性シールで封止し、３０℃でインキュベートし、８５％ＲＨで維持した５０ｍｍ行程のＫｕｈｎｅｒシェーカーにおいて３００ｒｐｍで一晩撹拌した。
【０２５８】
３５ｕＬのアセトニトリルを含有する９６ウェルシャローウェルプレートに３５ｕＬの反応物を添加することにより、プレートウェル内の酵素改変体をアセトニトリルで２倍希釈した。この２倍希釈反応物の２０ｕＬを、アセトニトリル中の１００ｇ／ＬのＲ−ＡＭＰ溶液１０ｕＬを添加することおよび９６ウェルハーフディープウェルプレート中で約４５分間、３０℃で振盪しながらインキュベートすることによって誘導体化した。２００μＬのＭｅＣＮを添加し、短時間振盪して混合することによって試料をクエンチし、４０００ｒｐｍで、４℃で５分間、遠心分離した。上清を９６ウェルシャローウェルプレートに移し、分析法９．１による分析のためにヒートシールした。
【表１７】
2021530982.tif 000035
【０２５９】
（実施例１８）
化合物Ｙのエナンチオ選択的産生のための配列番号１４１６に対するＧＯＡ改善
配列番号１４１６をこの定向進化ラウンドのための親酵素として選択した。十分に確立されている技術（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によりコードされるポリペプチドを実施例２で説明した通りにＨＴＰで産生し、ウェル当たり２００ｕＬの溶解物体積を使用したことを除いて、実施例４で説明した通りに清澄化溶解物を生成した。
【０２６０】
９６ウェルディープウェルプレートにおいて、２００ｕＬの溶解物総体積からの４０μＬの清澄化溶解物、３０ｇ／Ｌの化合物Ｘ、約２００ｍＭのＮａＰｉ緩衝剤、２００μＭのＣｕＳＯ４、０．２ｇ／ＬのＨＲＰ、０．２０ｇ／Ｌのカタラーゼを用いて、ｐＨ６．５で、各１００μＬ反応を行った。プレートをヒートシールし、３０℃でインキュベートし、８５％ＲＨで維持した５０ｍｍ行程のＫｕｈｎｅｒシェーカーにおいて３００ｒｐｍで４時間撹拌した。
【０２６１】
３５ｕＬのアセトニトリルを含有する９６ウェルシャローウェルプレートに３５ｕＬの反応物を添加することにより、プレートウェル内の酵素改変体をアセトニトリルで２倍希釈した。この２倍希釈反応物の２０ｕＬを、アセトニトリル中の１００ｇ／ＬのＲ−ＡＭＰ溶液１０ｕＬを添加することおよび９６ウェルハーフディープウェルプレート中で約４５分間、３０℃で振盪しながらインキュベートすることによって誘導体化した。２００μＬのＭｅＣＮを添加し、短時間振盪して混合することによって試料をクエンチし、４０００ｒｐｍで、４℃で５分間、遠心分離した。上清を９６ウェルシャローウェルプレートに移し、分析法９．１による分析のためにヒートシールした。
【表１８−１】
2021530982.tif 000036
【表１８−２】
2021530982.tif 000037
【表１８−３】
2021530982.tif 000038
【表１８−４】
2021530982.tif 000039
【０２６２】
（実施例１９）
化合物Ｙのエナンチオ選択的産生のための配列番号１５９８に対するＧＯＡ改善
配列番号１５９８をこの定向進化ラウンドのための親酵素として選択した。十分に確立されている技術（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によりコードされるポリペプチドを実施例２で説明した通りにＨＴＰで産生し、実施例４で説明した通りに清澄化溶解物を生成した。
【０２６３】
９６ウェルディープウェルプレートにおいて、２００ｕＬの溶解物総体積からの４０μＬの清澄化溶解物、３０ｇ／Ｌの化合物Ｘ、約２００ｍＭのＮａＰｉ緩衝剤、２００μＭのＣｕＳＯ４、０．２ｇ／ＬのＨＲＰ、０．２０ｇ／Ｌのカタラーゼを用いて、ｐＨ６．５で、各１００μＬ反応を行った。プレートをＯ２透過性シールで封止し、３０℃でインキュベートし、８５％ＲＨで維持した５０ｍｍ行程のＫｕｈｎｅｒシェーカーにおいて３００ｒｐｍで４時間撹拌した。
【０２６４】
３５ｕＬのアセトニトリルを含有する９６ウェルシャローウェルプレートに３５ｕＬの反応物を添加することにより、プレートウェル内の酵素改変体をアセトニトリルで２倍希釈した。この２倍希釈反応物の２０ｕＬを、アセトニトリル中の１００ｇ／ＬのＳ−ＡＭＰ溶液１０ｕＬを添加することおよび９６ウェルハーフディープウェルプレート中で約４５分間、３０℃で振盪しながらインキュベートすることによって誘導体化した。２００μＬのＭｅＣＮを添加し、短時間振盪して混合することによって試料をクエンチし、４０００ｒｐｍで、４℃で５分間、遠心分離した。上清を９６ウェルシャローウェルプレートに移し、分析法２１．１による分析のためにヒートシールした。
【表１９−１】
2021530982.tif 000040
【表１９−２】
2021530982.tif 000041
【表１９−３】
2021530982.tif 000042
【０２６５】
（実施例２０）
Ｒ−ＡＭＰから誘導した２−エチニルグリセルアルデヒドの分光光度分析的検出
実施例１２および１３に記載のデータは、表２０．１で提供する分析法を使用して収集した。本明細書で提供する方法は、本発明を使用して産生される改変体の分析に使用される。しかし、本明細書で提供する改変体および／または本明細書で提供する方法を使用して産生される改変体の分析に適用可能である他の好適な方法が当技術分野において公知であるので、本発明を本明細書に記載の方法に限定することを意図していない。
【表２０】
2021530982.tif 000043
【０２６６】
（実施例２１）
Ｒ−ＡＭＰから誘導した２−エチニルグリセルアルデヒドのエナンチオマーの分析的検出
実施例１９、２２、２８および３０に記載のデータは、表２１．１で提供する分析法を使用して収集した。本明細書で提供する方法は、本発明を使用して産生される改変体の分析に使用される。しかし、本明細書で提供する改変体および／または本明細書で提供する方法を使用して産生される改変体の分析に適用可能である他の好適な方法が当技術分野において公知であるので、本発明を本明細書に記載の方法に限定することを意図していない。
【表２１】
2021530982.tif 000044
【０２６７】
（実施例２２）
化合物Ｙのエナンチオ選択的産生のための配列番号１８６６に対するＧＯＡ改善
配列番号１８６６をこの定向進化ラウンドのための親酵素として選択した。十分に確立されている技術（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によりコードされるポリペプチドを実施例２で説明した通りにＨＴＰで産生し、実施例４で説明した通りに清澄化溶解物を生成した。
【０２６８】
９６ウェルディープウェルプレートにおいて、２００ｕＬの溶解物総体積からの４０μＬの清澄化溶解物、３０ｇ／Ｌの化合物Ｘ、約２００ｍＭのＮａＰｉ緩衝剤、２００μＭのＣｕＳＯ４、０．２ｇ／ＬのＨＲＰ、０．２０ｇ／Ｌのカタラーゼを用いて、ｐＨ６．５で、各１００μＬ反応を行った。プレートをＯ２透過性シールで封止し、３０℃でインキュベートし、８５％ＲＨで維持した５０ｍｍ行程のＫｕｈｎｅｒシェーカーにおいて３００ｒｐｍで４時間撹拌した。
【０２６９】
３５ｕＬのアセトニトリルを含有する９６ウェルシャローウェルプレートに３５ｕＬの反応物を添加することにより、プレートウェル内の酵素改変体をアセトニトリルで２倍希釈した。この２倍希釈反応物の２０ｕＬを、アセトニトリル中の１００ｇ／ＬのＳ−ＡＭＰ溶液１０ｕＬを添加することおよび９６ウェルハーフディープウェルプレート中で約４５分間、３０℃で振盪しながらインキュベートすることによって誘導体化した。２００μＬのＭｅＣＮを添加し、短時間振盪して混合することによって試料をクエンチし、４０００ｒｐｍで、４℃で５分間、遠心分離した。上清を９６ウェルシャローウェルプレートに移し、分析法２１．１による分析のためにヒートシールした。
【表２２−１】
2021530982.tif 000045
【表２２−２】
2021530982.tif 000046
【０２７０】
（実施例２３）
化合物Ｙのエナンチオ選択的産生のための配列番号１９１２に対するＧＯＡ改善
配列番号１９１２をこの定向進化ラウンドのための親酵素として選択した。十分に確立されている技術（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によりコードされるポリペプチドを実施例２で説明した通りにＨＴＰで産生し、実施例４で説明した通りに清澄化溶解物を生成した。
【０２７１】
９６ウェルディープウェルプレートにおいて、２００ｕＬの溶解物総体積からの２０μＬの清澄化溶解物、３０ｇ／Ｌの化合物Ｘ、約２００ｍＭのＮａＰｉ緩衝剤、２００μＭのＣｕＳＯ４、０．２ｇ／ＬのＨＲＰ、０．２０ｇ／Ｌのカタラーゼを用いて、ｐＨ６．５で、各１００μＬ反応を行った。プレートをＯ２透過性シールで封止し、３０℃でインキュベートし、８５％ＲＨで維持した５０ｍｍ行程のＫｕｈｎｅｒシェーカーにおいて３００ｒｐｍで４時間撹拌した。
【０２７２】
アセトニトリル中の０．０４％ＴＦＡ  １８０ｕＬを含有する９６ディープウェルプレートに２０ｕＬの反応物を添加することにより、プレートウェル内の酵素改変体をアセトニトリル中の０．０４％ＴＦＡで１０倍希釈した。試料を４０００ｒｐｍで、４℃で５分間、遠心分離した。１５０ｕＬの脱イオン（ＤＩ）水を含有する９６シャローウェルプレートに５０ｕＬの上清を添加することにより、上清をＤＩ水で４倍希釈した。プレートを分析法２４．１による分析のためにヒートシールした。
【表２３−１】
2021530982.tif 000047
【表２３−２】
2021530982.tif 000048
【表２３−３】
2021530982.tif 000049
【０２７３】
（実施例２４）
化合物Ｘの化合物Ｙへの変換の分析的検出
実施例２３、２５、２６、２７および３１に記載のデータは、表２４．１で提供する分析法を使用して収集した。本明細書で提供する方法は、本発明を使用して産生される改変体の分析に使用される。しかし、本明細書で提供する改変体および／または本明細書で提供する方法を使用して産生される改変体の分析に適用可能である他の好適な方法が当技術分野において公知であるので、本発明を本明細書に記載の方法に限定することを意図していない。
【表２４】
2021530982.tif 000050
【０２７４】
（実施例２５）
化合物Ｙのエナンチオ選択的産生のための配列番号１９１２に対するＧＯＡ改善
配列番号１９１２をこの定向進化ラウンドのための親酵素として選択した。十分に確立されている技術（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によりコードされるポリペプチドを実施例２で説明した通りにＨＴＰで産生し、実施例４で説明した通りに清澄化溶解物を生成した。
【０２７５】
９６ウェルディープウェルプレートにおいて、２００ｕＬの溶解物総体積からの６０μＬの清澄化溶解物、３０ｇ／Ｌの化合物Ｘ、約２００ｍＭのＮａＰｉ緩衝剤、２００μＭのＣｕＳＯ４、０．２ｇ／ＬのＨＲＰ、０．２０ｇ／Ｌのカタラーゼを用いて、ｐＨ６．５で、各１００μＬ反応を行った。プレートをＯ２透過性シールで封止し、３０℃でインキュベートし、８５％ＲＨで維持した５０ｍｍ行程のＫｕｈｎｅｒシェーカーにおいて３００ｒｐｍで２２時間撹拌した。
【０２７６】
アセトニトリル中の０．０４％ＴＦＡ  １８０ｕＬを含有する９６ディープウェルプレートに２０ｕＬの反応物を添加することにより、プレートウェル内の酵素改変体をアセトニトリル中の０．０４％ＴＦＡで１０倍希釈した。試料を４０００ｒｐｍで、４℃で５分間、遠心分離した。１５０ｕＬのＤＩ水を含有する９６シャローウェルプレートに５０ｕＬの上清を添加することにより、上清をＤＩ水で４倍希釈した。プレートを分析法２４．１による分析のためにヒートシールした。
【表２５−１】
2021530982.tif 000051
【表２５−２】
2021530982.tif 000052
【０２７７】
（実施例２６）
化合物Ｙのエナンチオ選択的産生のための配列番号２０８０に対するＧＯＡ改善
配列番号２０８０をこの定向進化ラウンドのための親酵素として選択した。十分に確立されている技術（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によりコードされるポリペプチドを実施例２で説明した通りにＨＴＰで産生し、実施例４で説明した通りに清澄化溶解物を生成した。
【０２７８】
９６ウェルディープウェルプレートにおいて、２００ｕＬの溶解物総体積からの３０μＬの清澄化溶解物、３０ｇ／Ｌの化合物Ｘ、約２００ｍＭのＮａＰｉ緩衝剤、２００μＭのＣｕＳＯ４、０．２ｇ／ＬのＨＲＰ、０．２０ｇ／Ｌのカタラーゼを用いて、ｐＨ６．５で、各１００μＬ反応を行った。プレートをＯ２透過性シールで封止し、３０℃でインキュベートし、８５％ＲＨで維持した５０ｍｍ行程のＫｕｈｎｅｒシェーカーにおいて３００ｒｐｍで２時間撹拌した。
【０２７９】
アセトニトリル中の０．０４％ＴＦＡ  １８０ｕＬを含有する９６ディープウェルプレートに２０ｕＬの反応物を添加することにより、プレートウェル内の酵素改変体をアセトニトリル中の０．０４％ＴＦＡで１０倍希釈した。試料を４０００ｒｐｍで、４℃で５分間、遠心分離した。１５０ｕＬのＤＩ水を含有する９６シャローウェルプレートに５０ｕＬの上清を添加することにより、上清をＤＩ水で４倍希釈した。プレートを分析法２４．１による分析のためにヒートシールした。
【表２６−１】
2021530982.tif 000053
【表２６−２】
2021530982.tif 000054
【０２８０】
（実施例２７）
化合物Ｙのエナンチオ選択的産生のための配列番号２０８０に対するＧＯＡ改善
配列番号２０８０をこの定向進化ラウンドのための親酵素として選択した。十分に確立されている技術（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によりコードされるポリペプチドを実施例２で説明した通りにＨＴＰで産生し、実施例４で説明した通りに清澄化溶解物を生成した。
【０２８１】
９６ウェルディープウェルプレートにおいて、２００ｕＬの溶解物総体積からの６０μＬの清澄化溶解物、３０ｇ／Ｌの化合物Ｘ、約２００ｍＭのＮａＰｉ緩衝剤、２００μＭのＣｕＳＯ４、０．２ｇ／ＬのＨＲＰ、０．２０ｇ／Ｌのカタラーゼを用いて、ｐＨ６．５で、各１００μＬ反応を行った。プレートをＯ２透過性シールで封止し、３０℃でインキュベートし、８５％ＲＨで維持した５０ｍｍ行程のＫｕｈｎｅｒシェーカーにおいて３００ｒｐｍで２２時間撹拌した。
【０２８２】
アセトニトリル中の０．０４％ＴＦＡ  １８０ｕＬを含有する９６ディープウェルプレートに２０ｕＬの反応物を添加することにより、プレートウェル内の酵素改変体をアセトニトリル中の０．０４％ＴＦＡで１０倍希釈した。試料を４０００ｒｐｍで、４℃で５分間、遠心分離した。１５０ｕＬのＤＩ水を含有する９６シャローウェルプレートに５０ｕＬの上清を添加することにより、上清をＤＩ水で４倍希釈した。プレートを分析法２４．１による分析のためにヒートシールした。
【表２７−１】
2021530982.tif 000055
【表２７−２】
2021530982.tif 000056
【表２７−３】
2021530982.tif 000057
【０２８３】
（実施例２８）
化合物Ｙのエナンチオ選択的産生のための配列番号２３００に対するＧＯＡ改善
配列番号２３００をこの定向進化ラウンドのための親酵素として選択した。十分に確立されている技術（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によりコードされるポリペプチドを実施例２で説明した通りにＨＴＰで産生し、実施例４で説明した通りに清澄化溶解物を生成した。
【０２８４】
９６ウェルディープウェルプレートにおいて、２００ｕＬの溶解物総体積からの６０μＬの清澄化溶解物、３０ｇ／Ｌの化合物Ｘ、約２００ｍＭのＮａＰｉ緩衝剤、２００μＭのＣｕＳＯ４、０．２ｇ／ＬのＨＲＰ、０．２０ｇ／Ｌのカタラーゼを用いて、ｐＨ６．５で、各１００μＬ反応を行った。プレートをＯ２透過性シールで封止し、３０℃でインキュベートし、８５％ＲＨで維持した５０ｍｍ行程のＫｕｈｎｅｒシェーカーにおいて３００ｒｐｍで２２時間撹拌した。
【０２８５】
３５ｕＬのアセトニトリルを含有する９６ウェルシャローウェルプレートに３５ｕＬの反応物を添加することにより、プレートウェル内の酵素改変体をアセトニトリルで２倍希釈した。この２倍希釈反応物の２０ｕＬを、アセトニトリル中の１００ｇ／ＬのＳ−ＡＭＰ溶液１０ｕＬを添加することおよび９６ウェルハーフディープウェルプレート中で約４５分間、３０℃で振盪しながらインキュベートすることによって誘導体化した。２００μＬのＭｅＣＮを添加し、短時間振盪して混合することによって試料をクエンチし、４０００ｒｐｍで、４℃で５分間、遠心分離した。上清を９６ウェルシャローウェルプレートに移し、分析法２１．１による分析のためにヒートシールした。
【表２８−１】
2021530982.tif 000058
【表２８−２】
2021530982.tif 000059
【０２８６】
（実施例２９）
化合物Ｐの改善された産生のための配列番号２３００に対するＧＯＡ改善
対応するリン酸化アルデヒド（化合物Ｐ）（上記のスキーム３を参照されたい）を生成するためにエチニルグリセロールホスフェート（ＥＧＰ）に対する活性を改善させたＧＯアーゼ改変体を進化させることに重点を置いた定向進化への取り組みを行った。
【０２８７】
配列番号２３００をこの定向進化ラウンドのための親酵素として選択した。十分に確立されている技術（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によりコードされるポリペプチドを実施例２で説明した通りにＨＴＰで産生し、実施例４で説明した通りに清澄化溶解物を生成した。
【０２８８】
９６ウェルディープウェルプレートにおいて、２００ｕＬの溶解物総体積からの２０μＬの２倍希釈された清澄化溶解物、１０ｇ／Ｌのエチニルグリセロールホスフェート、２００μＭのＣｕＳＯ４、１ｇ／ＬのＨＲＰ、０．２０ｇ／Ｌのカタラーゼ、５０ｍＭのＰＩＰＥＳ緩衝剤を用いて、ｐＨ７．０で、各１００μＬ反応を行った。プレートをヒートシールし、４００ｒｐｍで、３０℃で３時間振盪した。
【０２８９】
３時間後、試料を２００μＬの５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．５で希釈した。別個のプレートの中に５０μＬの希釈された試料を移し、メタノール中の１０ｇ／ＬのＯ−ベンジルヒドロキシルアミン（Ｏ−ｂｅｎｚｙｌｈｙｄｒｏｚｙｌａｍｉｎｅ）溶液１５０μＬと混合した。プレートを封止し、４００ｒｐｍで、２５℃で２０〜３０分間振盪した。誘導体化された試料をメタノールで２倍希釈した後、表２９．１に記載するようにＵＰＬＣ分析した。
【表２９−１】
2021530982.tif 000060
【表２９−２】
2021530982.tif 000061
【表２９−３】
2021530982.tif 000062
【０２９０】
（実施例３０）
化合物Ｙのエナンチオ選択的産生のための配列番号２４２４に対するＧＯＡ改善
配列番号２４２４をこの定向進化ラウンドのための親酵素として選択した。十分に確立されている技術（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によりコードされるポリペプチドを実施例２で説明した通りにＨＴＰで産生し、実施例４で説明した通りに清澄化溶解物を生成した。
【０２９１】
９６ウェルディープウェルプレートにおいて、２００ｕＬの溶解物総体積からの６０μＬの清澄化溶解物、３０ｇ／Ｌの化合物Ｘ、５０ｍＭのＰＩＰＥＳ緩衝剤、２００μＭのＣｕＳＯ４、０．２ｇ／ＬのＨＲＰ、０．２０ｇ／Ｌのカタラーゼを用いて、ｐＨ６．５で、各１００μＬ反応を行った。プレートをＯ２透過性シールで封止し、３０℃でインキュベートし、８５％ＲＨで維持した５０ｍｍ行程のＫｕｈｎｅｒシェーカーにおいて３００ｒｐｍで２２時間撹拌した。
【０２９２】
３５ｕＬのアセトニトリルを含有する９６ウェルシャローウェルプレートに３５ｕＬの反応物を添加することにより、プレートウェル内の酵素改変体をアセトニトリルで２倍希釈した。この２倍希釈反応物の２０ｕＬを、アセトニトリル中の１００ｇ／ＬのＳ−ＡＭＰ溶液１０ｕＬを添加することおよび９６ウェルハーフディープウェルプレート中で約４５分間、３０℃で振盪しながらインキュベートすることによって誘導体化した。２００μＬのＭｅＣＮ：ヘプタン（１：１）混合物を添加し、短時間振盪して混合することによって試料をクエンチし、４０００ｒｐｍで、４℃で５分間、遠心分離した。上清を９６ウェルシャローウェルプレートに移し、分析法２１．１による分析のためにヒートシールした。
【表３０−１】
2021530982.tif 000063
【表３０−２】
2021530982.tif 000064
【表３０−３】
2021530982.tif 000065
【表３０−４】
2021530982.tif 000066
【０２９３】
（実施例３１）
化合物Ｙのエナンチオ選択的産生のための配列番号２４２４に対するＧＯＡ改善
配列番号２４２４をこの定向進化ラウンドのための親酵素として選択した。十分に確立されている技術（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して、操作された遺伝子のライブラリーを産生した。各遺伝子によりコードされるポリペプチドを実施例２で説明した通りにＨＴＰで産生し、実施例４で説明した通りに清澄化溶解物を生成した。
【０２９４】
９６ウェルディープウェルプレートにおいて、２００ｕＬの溶解物総体積からの６０μＬの清澄化溶解物、３０ｇ／Ｌの化合物Ｘ、５０ｍＭのＰＩＰＥＳ緩衝剤、２００μＭのＣｕＳＯ４、０．２ｇ／ＬのＨＲＰ、０．２０ｇ／Ｌのカタラーゼを用いて、ｐＨ６．５で、各１００μＬ反応を行った。プレートをＯ２透過性シールで封止し、３０℃でインキュベートし、８５％ＲＨで維持した５０ｍｍ行程のＫｕｈｎｅｒシェーカーにおいて３００ｒｐｍで２２時間撹拌した。
【０２９５】
アセトニトリル中の０．０４％ＴＦＡ  １８０ｕＬを含有する９６ディープウェルプレートに２０ｕＬの反応物を添加することにより、プレートウェル内の酵素改変体をアセトニトリル中の０．０４％ＴＦＡで１０倍希釈した。試料を４０００ｒｐｍで、４℃で５分間、遠心分離した。１５０ｕＬのＤＩ水を含有する９６シャローウェルプレートに５０ｕＬの上清を添加することにより、上清をＤＩ水で４倍希釈した。プレートを分析法２４．１による分析のためにヒートシールした。
【表３１−１】
2021530982.tif 000067
【表３１−２】
2021530982.tif 000068
【表３１−３】
2021530982.tif 000069
【表３１−４】
2021530982.tif 000070
【０２９６】
本願に引用する全ての刊行物、特許、特許出願および他の文献は、個々の刊行物、特許、特許出願および他の文献の各々があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれると個々に示されている場合と同程度に、あらゆる目的でそれら全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる。
【０２９７】
様々な具体的な実施形態を例証し、説明してきたが、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく様々な変化を加えることができることが理解されるであろう。
【配列表】
2021530982000001.app
【国際調査報告】
2021530982.tif 000071
2021530982.tif 000072
2021530982.tif 000073