(57)【要約】  ＴＲＥＭ−１に特異的に結合してＴＲＥＭ−１シグナル伝達を阻害する抗体またはその抗原結合部分が本明細書で提供され、これらの抗体は、１つ以上のＦｃγＲに結合せず、炎症性サイトカインを産生するようにミエロイド細胞を誘導しない。治療適用、例えば、自己免疫性疾患の処置における、かかる抗体またはその抗原結合部分の使用もまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）およびＩｇＧ１重鎖定常領域を含む、ミエロイド細胞に発現するトリガー受容体−１（ＴＲＥＭ−１）に特異的に結合する単離された抗体であって、前記ＩｇＧ１重鎖定常領域が、野生型ＩｇＧ１重鎖定常領域（配列番号９）と比較して、１つ以上のアミノ酸置換を含む、抗体。
【請求項２】
重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）およびＩｇＧ１重鎖定常領域を含む、ＴＲＥＭ−１を遮断するための結合についてｍＡｂ  ０３１８と交差競合する単離された抗体であって、前記ＩｇＧ１重鎖定常領域が、野生型ＩｇＧ１重鎖定常領域（配列番号９）と比較して、１つ以上のアミノ酸置換を含む、抗体。
【請求項３】
ｍＡｂ  ０３１８と同じＴＲＥＭ−１エピトープに結合する、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
配列番号１のＤ３８、Ｖ３９、Ｋ４０、Ｃ４１、Ｄ４２、Ｙ４３、Ｔ４４、Ｌ４５、Ｅ４６、Ｋ４７、Ｆ４８、Ａ４９、Ｓ５０、Ｓ５１、Ｑ５２、Ｋ５３、Ａ５４、Ｗ５５、Ｑ５６、Ｙ９０、Ｈ９１、Ｄ９２、Ｈ９３、Ｇ９４、Ｌ９５およびＬ９６からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸残基を含むＴＲＥＭ−１エピトープに特異的に結合する、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項５】
配列番号１のアミノ酸Ｄ３８〜Ｌ４５、Ｅ４６〜Ｑ５６および／またはＹ９０〜Ｌ９６を含むＴＲＥＭ−１エピトープに特異的に結合する、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項６】
前記ＩｇＧ１重鎖定常領域が、ＥＵ番号付けに従って、Ｋ２１４Ｒ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ｄ３５６ＥおよびＬ３５８Ｍからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項７】
前記ＩｇＧ１重鎖定常領域が、ＥＵ番号付けに従って、Ｋ２１４Ｒ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｄ３５６ＥおよびＬ３５８Ｍからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項８】
前記ＩｇＧ１重鎖定常領域が、ＥＵ番号付けに従って、Ｋ２１４Ｒ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９ＳおよびＰ２３８Ｓからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項９】
前記ＩｇＧ１重鎖定常領域が、ＥＵ番号付けに従って、Ｓ１３１Ｃ、Ｋ１３３Ｒ、Ｇ１３７Ｅ、Ｇ１３８Ｓ、Ｑ１９６Ｋ、Ｉ１９９Ｔ、Ｎ２０３Ｄ、Ｋ２１４Ｒ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９ＳおよびＰ２３８Ｓからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項１０】
重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体であって、前記重鎖ＣＤＲ３が、ＤＭＧＩＲＲＱＦＡＹ（配列番号２６）または１つもしくは２つの置換を除いたＤＭＧＩＲＲＱＦＡＹ（配列番号２６）を含む、抗体。
【請求項１１】
前記重鎖ＣＤＲ３が、ＤＱＧＩＲＲＱＦＡＹ（配列番号７２）を含む、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体であって、前記重鎖ＣＤＲ２が、ＲＩＲＴＫＳＳＮＹＡＴＹＹＡＡＳＶＫＧ（配列番号２５）または１つもしくは２つの置換を除いたＲＩＲＴＫＳＳＮＹＡＴＹＹＡＡＳＶＫＧ（配列番号２５）を含む、抗体。
【請求項１３】
重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体であって、前記重鎖ＣＤＲ１が、ＴＹＡＭＨ（配列番号２４）または１つもしくは２つの置換を除いたＴＹＡＭＨ（配列番号２４）を含む、抗体。
【請求項１４】
重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体であって、前記軽鎖ＣＤＲ１が、ＲＡＳＱＳＶＤＴＦＤＹＳＦＬＨ（配列番号２７）または１つもしくは２つの置換を除いたＲＡＳＱＳＶＤＴＦＤＹＳＦＬＨ（配列番号２７）を含む、抗体。
【請求項１５】
重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体であって、前記軽鎖ＣＤＲ２が、ＲＡＳＮＬＥＳ（配列番号２８）または１つもしくは２つの置換を除いたＲＡＳＮＬＥＳ（配列番号２８）を含む、抗体。
【請求項１６】
重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体であって、前記軽鎖ＣＤＲ３が、ＱＱＳＮＱＤＰＹＴ（配列番号２９）または１つもしくは２つの置換を除いたＱＱＳＮＱＤＰＹＴ（配列番号２９）を含む、抗体。
【請求項１７】
前記ＶＨが、配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１８】
前記ＶＬが、配列番号１５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１９】
重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の抗体であって、前記ＶＨが配列番号１４を含み、前記ＶＬが配列番号１５を含む、抗体。
【請求項２０】
重鎖および軽鎖を含む、請求項１９に記載の抗体であって、前記重鎖が、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２または配列番号５３を含む、抗体。
【請求項２１】
重鎖および軽鎖を含む、請求項２０に記載の抗体であって、前記軽鎖が、配列番号５４を含む、抗体。
【請求項２２】
重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３；軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３；およびＩｇＧ１重鎖定常領域を含む、ＴＲＥＭ−１に特異的に結合する単離された抗体であって、
前記重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれＴＹＡＭＨ（配列番号２４）、ＲＩＲＴＫＳＳＮＹＡＴＹＹＡＡＳＶＫＧ（配列番号２５）およびＤＭＧＩＲＲＱＦＡＹ（配列番号２６）を含み；
前記軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれＲＡＳＱＳＶＤＴＦＤＹＳＦＬＨ（配列番号２７）、ＲＡＳＮＬＥＳ（配列番号２８）およびＱＱＳＮＱＤＰＹＴ（配列番号２９）を含み；
前記ＩｇＧ１重鎖定常領域が、ＥＵ番号付けに従って、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＥおよびＧ２３７Ａからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、
抗体。
【請求項２３】
重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３；軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３；およびＩｇＧ１重鎖定常領域を含む、ＴＲＥＭ−１に特異的に結合する単離された抗体であって、
前記重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれＴＹＡＭＨ（配列番号２４）、ＲＩＲＴＫＳＳＮＹＡＴＹＹＡＡＳＶＫＧ（配列番号２５）およびＤＭＧＩＲＲＱＦＡＹ（配列番号２６）を含み；
前記軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれＲＡＳＱＳＶＤＴＦＤＹＳＦＬＨ（配列番号２７）、ＲＡＳＮＬＥＳ（配列番号２８）およびＱＱＳＮＱＤＰＹＴ（配列番号２９）を含み；
前記ＩｇＧ１重鎖定常領域が、ＥＵ番号付けに従って、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、
抗体。
【請求項２４】
重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３；軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３；およびＩｇＧ１重鎖定常領域を含む、ＴＲＥＭ−１に特異的に結合する単離された抗体であって、
前記重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれＴＹＡＭＨ（配列番号２４）、ＲＩＲＴＫＳＳＮＹＡＴＹＹＡＡＳＶＫＧ（配列番号２５）およびＤＭＧＩＲＲＱＦＡＹ（配列番号２６）を含み；
前記軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれＲＡＳＱＳＶＤＴＦＤＹＳＦＬＨ（配列番号２７）、ＲＡＳＮＬＥＳ（配列番号２８）およびＱＱＳＮＱＤＰＹＴ（配列番号２９）を含み；
前記ＩｇＧ１重鎖定常領域が、ＥＵ番号付けに従って、Ｋ２１４Ｒ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９ＳおよびＰ２３８Ｓからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、
抗体。
【請求項２５】
重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３；軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３；およびＩｇＧ１重鎖定常領域を含む、ＴＲＥＭ−１に特異的に結合する単離された抗体であって、
前記重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれＴＹＡＭＨ（配列番号２４）、ＲＩＲＴＫＳＳＮＹＡＴＹＹＡＡＳＶＫＧ（配列番号２５）およびＤＭＧＩＲＲＱＦＡＹ（配列番号２６）を含み；
前記軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれＲＡＳＱＳＶＤＴＦＤＹＳＦＬＨ（配列番号２７）、ＲＡＳＮＬＥＳ（配列番号２８）およびＱＱＳＮＱＤＰＹＴ（配列番号２９）を含み；
前記ＩｇＧ１重鎖定常領域が、ＥＵ番号付けに従って、Ｓ１３１Ｃ、Ｋ１３３Ｒ、Ｇ１３７Ｅ、Ｇ１３８Ｓ、Ｑ１９６Ｋ、Ｉ１９９Ｔ、Ｎ２０３Ｄ、Ｋ２１４Ｒ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９ＳおよびＰ２３８Ｓからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、
抗体。
【請求項２６】
ＴＲＥＭ−１が、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２７】
配列番号７６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号５４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗体と比較して、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）、またはそれらの任意の組み合わせに対する減少した結合親和性を有する、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２８】
配列番号７６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号５４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗体と比較して、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）に対する、２分の１以下、３分の１以下、４分の１以下、５分の１以下、６分の１以下、７分の１以下、８分の１以下、９分の１以下または１０分の１以下に減少した結合親和性を有する、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２９】
配列番号７６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号５４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗体と比較して、免疫原性が低い、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３０】
ＴＲＥＭ−１への結合の際に、刺激因子の非存在下で、ＴＲＥＭ−１シグナル伝達をアゴナイズしない、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３１】
未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）を前記抗体の存在下かつ刺激因子の非存在下でインキュベートした場合に、配列番号７６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号５４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗体と比較して、前記細胞における炎症性サイトカインの発現を誘導しない、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３２】
細胞を前記抗体および刺激因子の両方の存在下で活性化した場合に、前記細胞における炎症性サイトカインの産生を遮断する、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３３】
前記刺激因子がＴＲＥＭ−１リガンドである、請求項３０〜３１のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３４】
前記炎症性サイトカインが、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−８、ＩＬ−１β、ＩＬ−１２、キチナーゼ−３様タンパク質１（ＣＨＩ３Ｌ１）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３１または３２に記載の抗体。
【請求項３５】
ｐＨ依存的様式で、ヒトＦｃＲｎ、カニクイザルＦｃＲｎおよび／またはマウスＦｃＲｎに結合する、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３６】
キャピラリー示差走査熱量計（ＣＡＰ−ＤＳＣ）によって測定した場合に、配列番号７６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号５４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む参照抗体と比較して、より熱的に安定である、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３７】
前記抗体の約１０％〜２０％、約２０％〜３０％（例えば、２４％）または約３０％〜４０％が、７７℃に加熱した場合に可逆的である、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３８】
配列番号７６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号５４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗体と比較して、より高い融解温度（Ｔｍ）を有する、請求項３６または３７に記載の抗体。
【請求項３９】
８０ｍｇ／ｍＬの濃度で、５ｃＰ未満、４ｃＰ未満、３ｃＰ未満、２．５ｃＰ未満、２．４ｃＰ未満、２．３ｃＰ未満、２．２ｃＰ未満、２．１ｃＰ未満、２ｃＰ未満、１．９ｃＰ未満、１．８ｃＰ未満、１．７ｃＰ未満、１．６ｃＰ未満、１．５ｃＰ未満、１．４ｃＰ未満、１．３ｃＰ未満、１．２ｃＰ未満、１．１ｃＰ未満、１．０ｃＰ未満、０．９ｃＰ未満、０．８ｃＰ未満、０．７ｃＰ未満、０．６ｃＰ未満、０．５ｃＰ未満、０．４ｃＰ未満、０．３ｃＰ未満、０．２ｃＰ未満または０．１ｃＰ未満の粘度を有する、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４０】
１３０ｍｇ／ｍＬの濃度で、１０ｃＰ未満（例えば、９ｃＰ）の粘度を有する、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４１】
Ｂｉａｃｏｒｅによって測定した場合に、４ｎＭ未満（例えば、３．４ｎＭ）のＫDでヒトＴＲＥＭ−１に結合する、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４２】
Ｂｉａｃｏｒｅによって測定した場合に、１ｎＭ未満（例えば、０．９１ｎＭ）のＫDでカニクイザルＴＲＥＭ−１に結合する、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４３】
サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）によって観察した場合に、モノマーである、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４４】
２次元液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（２Ｄ−ＬＣ／ＭＳ）、または液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ／ＭＳ）を使用するインタクト質量分析によって観察した場合に、断片化の最小のリスクを示す、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４５】
８〜９（例えば、８．７５）の等電点を有する、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４６】
ヒスチジン、スクロース、アルギニンおよびＮａＣｌを含む製剤中で安定である、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４７】
２０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのスクロース、２５ｍＭのアルギニンおよび５０ｍＭのＮａＣｌを含む製剤中で少なくとも２ヶ月間にわたって安定である、請求項４６に記載の抗体。
【請求項４８】
前記製剤が、６．０のｐＨである、および／または前記製剤が、４℃、２５℃もしくは４０℃で貯蔵される、請求項４６または４７に記載の抗体。
【請求項４９】
第２の結合特異性を有する分子に連結された請求項１〜４８のいずれか１項に記載の抗体を含む二特異性分子。
【請求項５０】
請求項１〜４８のいずれか１項に記載の抗体をコードする核酸。
【請求項５１】
請求項５０に記載の核酸を含むベクター。
【請求項５２】
請求項５１に記載のベクターを含む細胞。
【請求項５３】
薬剤に連結された請求項１〜４８のいずれか１項に記載の抗体を含むイムノコンジュゲート。
【請求項５４】
請求項１〜４８のいずれか１項に記載の抗体、請求項４９に記載の二特異性分子、請求項５０に記載の核酸、請求項５１に記載のベクター、請求項５２に記載の細胞または請求項５３に記載のイムノコンジュゲート、および担体を含む、組成物。
【請求項５５】
請求項１〜４８のいずれか１項に記載の抗体、請求項４９に記載の二特異性分子、請求項５０に記載の核酸、請求項５１に記載のベクター、請求項５２に記載の細胞または請求項５３に記載のイムノコンジュゲート、および使用のための指示書を含む、キット。
【請求項５６】
請求項１〜４８のいずれか１項に記載の抗体、請求項４９に記載の二特異性分子、請求項５０に記載の核酸、請求項５１に記載のベクター、請求項５２に記載の細胞または請求項５３に記載のイムノコンジュゲートを対象に投与するステップを含む、それを必要とする対象においてＴＲＥＭ−１活性を阻害する方法。
【請求項５７】
請求項１〜４８のいずれか１項に記載の抗体、請求項４９に記載の二特異性分子、請求項５０に記載の核酸、請求項５１に記載のベクター、請求項５２に記載の細胞または請求項５３に記載のイムノコンジュゲートを対象に投与するステップを含む、それを必要とする対象において炎症性疾患または自己免疫性疾患を処置する方法。
【請求項５８】
前記炎症性疾患または前記自己免疫性疾患が、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、過敏性腸症候群、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、乾癬性関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、血管炎、敗血症、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、Ｉ型糖尿病、グレーブス病、多発性硬化症（ＭＳ）、自己免疫性心筋炎、川崎病、冠動脈疾患、慢性閉塞性肺疾患、間質性肺疾患、自己免疫性甲状腺炎、強皮症、全身性硬化症、変形性関節症、アトピー性皮膚炎、白斑、移植片対宿主病、シェーグレン症候群、自己免疫性腎炎、グッドパスチャー症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、アレルギー、喘息、急性炎症または慢性炎症のいずれかの結果である他の自己免疫性疾患、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
１つ以上のさらなる治療薬を投与するステップをさらに含む、請求項５６〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記さらなる治療薬が、抗ＩＰ−１０抗体または抗ＴＮＦ−α抗体である、請求項５９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出された配列表の参照
本出願と共に提出された、ＡＳＣＩＩテキストファイル（名称：３３３８＿０９２ＰＣ０１＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ；サイズ：１０６，１６２バイト；および作成日：２０１９年３月２７日）で電子的に提出された配列表の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
ＴＲＥＭ−１は、単球、マクロファージおよび好中球上で発現される活性化受容体である。これらの細胞は、炎症を駆動するサイトカインおよび他のメディエーターを放出することによって、慢性炎症性疾患において中心的な役割を果たす。ＴＲＥＭ−１のｍＲＮＡおよびタンパク質発現は、関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｉｃ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）（ＲＡ）および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を有する患者において上方調節され、ＴＲＥＭ−ｌ陽性細胞は、疾患の重症度と相関して、炎症の部位において蓄積する。Bouchon et al., Nature 410:1103-1107 (2001)；Schenk et al., Clin Invest 117:3097-3106 (2007)；およびKuai et al., Rheumatology 48:1352-1358 (2009)を参照のこと。活性化された好中球によって主に発現されるペプチドグリカン認識タンパク質１（ＰＧＬＹＲＰ１）は、ＴＲＥＭ−１のリガンドであり、結合の際にＴＲＥＭ−１シグナル伝達を媒介する。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＴＲＥＭ−１の結合は、ＴＮＦ、ＩＬ−８および単球走化性タンパク質−１を含む炎症促進性サイトカインの分泌を誘発する。さらに、ＴＲＥＭ−１シグナル伝達は、複数のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）と相乗して、炎症促進性シグナルをさらにブーストする。次に、これは、ＴＲＥＭ−１の発現を上方調節して、炎症を増幅する悪循環をもたらす。Bouchon et al., J Immunol 164:4991-4995 (2000)を参照のこと。ますます多くの証拠が、ＴＬＲが、慢性炎症性疾患、例えば、ＲＡおよびＩＢＤの発症および進行に寄与することを示している。
【０００３】
ヒトおよびカニクイザルの両方のＴＲＥＭ−１の機能を阻害するヒト化抗ＴＲＥＭ−１  ｍＡｂは、他の場所に開示されている。ＷＯ２０１３／１２０５５３およびＷＯ２０１６／００９０８６を参照のこと。しかし、かかる抗体は、製造プロセスを妨害し得る粘度プロファイルを有するか、それらの治療潜在力を制限し得る他の問題点（例えば、サイトカインストームおよびＡＤＣＣ）を有するかのいずれかである。Shire et al., J. Pharm. Sci. 93:1390-1402 (2004)；およびWarncke et al., J Immunol. 188:4405-11 (2012)を参照のこと。従って、ＴＲＥＭ−１に特異的に結合してＴＲＥＭ−１機能を阻害することができるが、初期の抗ＴＲＥＭ−１抗体の問題点を有さない、抗ＴＲＥＭ−１抗体が必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
ミエロイド細胞に発現するトリガー受容体−１（ＴＲＥＭ−１）に特異的に結合し、望ましい機能的特性を有する、単離された抗体、例えば、モノクローナル抗体、特に、ヒト（例えば、モノクローナル）抗体が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、この抗体は、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）およびＩｇＧ１重鎖定常領域を含み、このＩｇＧ１重鎖定常領域は、野生型ＩｇＧ１重鎖定常領域（配列番号９）と比較して、１つ以上のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、この抗体は、ＴＲＥＭ−１を遮断するための結合についてｍＡｂ  ０３１８と交差競合し、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）およびＩｇＧ１重鎖定常領域を含み、このＩｇＧ１重鎖定常領域は、野生型ＩｇＧ１重鎖定常領域（配列番号９）と比較して、１つ以上のアミノ酸置換を含む。
一部の実施形態では、この抗体は、ｍＡｂ  ０３１８と同じＴＲＥＭ−１エピトープ（ｅｐｔｉｏｐｅ）に結合する。一部の実施形態では、この抗体は、配列番号１のＤ３８、Ｖ３９、Ｋ４０、Ｃ４１、Ｄ４２、Ｙ４３、Ｔ４４、Ｌ４５、Ｅ４６、Ｋ４７、Ｆ４８、Ａ４９、Ｓ５０、Ｓ５１、Ｑ５２、Ｋ５３、Ａ５４、Ｗ５５、Ｑ５６、Ｙ９０、Ｈ９１、Ｄ９２、Ｈ９３、Ｇ９４、Ｌ９５およびＬ９６からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸残基を含むＴＲＥＭ−１エピトープに特異的に結合する。一部の実施形態では、この抗体は、配列番号１のアミノ酸Ｄ３８〜Ｌ４５、Ｅ４６〜Ｑ５６および／またはＹ９０〜Ｌ９６を含むＴＲＥＭ−１エピトープに特異的に結合する。
【０００５】
一部の実施形態では、本明細書で開示される抗体のＩｇＧ１重鎖定常領域は、ＥＵ番号付けに従って、Ｋ２１４Ｒ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ｄ３５６ＥおよびＬ３５８Ｍからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、このＩｇＧ１重鎖定常領域は、ＥＵ番号付けに従って、Ｋ２１４Ｒ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｄ３５６ＥおよびＬ３５８Ｍからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、このＩｇＧ１重鎖定常領域は、ＥＵ番号付けに従って、Ｋ２１４Ｒ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９ＳおよびＰ２３８Ｓからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、このＩｇＧ１重鎖定常領域は、ＥＵ番号付けに従って、Ｓ１３１Ｃ、Ｋ１３３Ｒ、Ｇ１３７Ｅ、Ｇ１３８Ｓ、Ｑ１９６Ｋ、Ｉ１９９Ｔ、Ｎ２０３Ｄ、Ｋ２１４Ｒ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９ＳおよびＰ２３８Ｓからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。
【０００６】
一部の実施形態では、本明細書で開示される抗体は、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、この重鎖ＣＤＲ３は、ＤＭＧＩＲＲＱＦＡＹ（配列番号２６）または１つもしくは２つの置換を除いたＤＭＧＩＲＲＱＦＡＹ（配列番号２６）を含む。一部の実施形態では、この重鎖ＣＤＲ３は、ＤＱＧＩＲＲＱＦＡＹ（配列番号７２）を含む。
一部の実施形態では、本明細書で開示される抗体は、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、この重鎖ＣＤＲ２は、ＲＩＲＴＫＳＳＮＹＡＴＹＹＡＡＳＶＫＧ（配列番号２５）または１つもしくは２つの置換を除いたＲＩＲＴＫＳＳＮＹＡＴＹＹＡＡＳＶＫＧ（配列番号２５）を含む。
一部の実施形態では、本明細書で開示される抗体は、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、この重鎖ＣＤＲ１は、ＴＹＡＭＨ（配列番号２４）または１つもしくは２つの置換を除いたＴＹＡＭＨ（配列番号２４）を含む。
【０００７】
一部の実施形態では、本明細書で開示される抗体は、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、この軽鎖ＣＤＲ１は、ＲＡＳＱＳＶＤＴＦＤＹＳＦＬＨ（配列番号２７）または１つもしくは２つの置換を除いたＲＡＳＱＳＶＤＴＦＤＹＳＦＬＨ（配列番号２７）を含む。一部の実施形態では、この軽鎖ＣＤＲ２は、ＲＡＳＮＬＥＳ（配列番号２８）または１つもしくは２つの置換を除いたＲＡＳＮＬＥＳ（配列番号２８）を含む。一部の実施形態では、この軽鎖ＣＤＲ３は、ＱＱＳＮＱＤＰＹＴ（配列番号２９）または１つもしくは２つの置換を除いたＱＱＳＮＱＤＰＹＴ（配列番号２９）を含む。
【０００８】
一部の実施形態では、本明細書で開示される抗体のＶＨは、配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で開示される抗体のＶＬは、配列番号１５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨおよびＶＬは、それぞれ配列番号１４および１５を含む。
一部の実施形態では、本開示の抗体は、重鎖および軽鎖を含み、この重鎖は、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２または配列番号５３を含む。一部の実施形態では、この軽鎖は、配列番号５４を含む。
【０００９】
重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３；軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３；およびＩｇＧ１重鎖定常領域を含む、ＴＲＥＭ−１に特異的に結合する単離された抗体であって、この重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれＴＹＡＭＨ（配列番号２４）、ＲＩＲＴＫＳＳＮＹＡＴＹＹＡＡＳＶＫＧ（配列番号２５）およびＤＭＧＩＲＲＱＦＡＹ（配列番号２６）を含み；軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれＲＡＳＱＳＶＤＴＦＤＹＳＦＬＨ（配列番号２７）、ＲＡＳＮＬＥＳ（配列番号２８）およびＱＱＳＮＱＤＰＹＴ（配列番号２９）を含み；ＩｇＧ１重鎖定常領域が、ＥＵ番号付けに従って、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＥおよびＧ２３７Ａからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、抗体が、本明細書で提供される。
【００１０】
重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３；軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３；およびＩｇＧ１重鎖定常領域を含む、ＴＲＥＭ−１に特異的に結合する単離された抗体であって、この重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれＴＹＡＭＨ（配列番号２４）、ＲＩＲＴＫＳＳＮＹＡＴＹＹＡＡＳＶＫＧ（配列番号２５）およびＤＭＧＩＲＲＱＦＡＹ（配列番号２６）を含み；軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれＲＡＳＱＳＶＤＴＦＤＹＳＦＬＨ（配列番号２７）、ＲＡＳＮＬＥＳ（配列番号２８）およびＱＱＳＮＱＤＰＹＴ（配列番号２９）を含み；ＩｇＧ１重鎖定常領域が、ＥＵ番号付けに従って、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、抗体が、本明細書で提供される。
【００１１】
重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３；軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３；およびＩｇＧ１重鎖定常領域を含む、ＴＲＥＭ−１に特異的に結合する単離された抗体であって、この重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれＴＹＡＭＨ（配列番号２４）、ＲＩＲＴＫＳＳＮＹＡＴＹＹＡＡＳＶＫＧ（配列番号２５）およびＤＭＧＩＲＲＱＦＡＹ（配列番号２６）を含み；軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれＲＡＳＱＳＶＤＴＦＤＹＳＦＬＨ（配列番号２７）、ＲＡＳＮＬＥＳ（配列番号２８）およびＱＱＳＮＱＤＰＹＴ（配列番号２９）を含み；ＩｇＧ１重鎖定常領域が、ＥＵ番号付けに従って、Ｋ２１４Ｒ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９ＳおよびＰ２３８Ｓからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、抗体が、本明細書で提供される。
【００１２】
重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３；軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３；およびＩｇＧ１重鎖定常領域を含む、ＴＲＥＭ−１に特異的に結合する単離された抗体であって、この重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれＴＹＡＭＨ（配列番号２４）、ＲＩＲＴＫＳＳＮＹＡＴＹＹＡＡＳＶＫＧ（配列番号２５）およびＤＭＧＩＲＲＱＦＡＹ（配列番号２６）を含み；軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれＲＡＳＱＳＶＤＴＦＤＹＳＦＬＨ（配列番号２７）、ＲＡＳＮＬＥＳ（配列番号２８）およびＱＱＳＮＱＤＰＹＴ（配列番号２９）を含み；ＩｇＧ１重鎖定常領域が、ＥＵ番号付けに従って、Ｓ１３１Ｃ、Ｋ１３３Ｒ、Ｇ１３７Ｅ、Ｇ１３８Ｓ、Ｑ１９６Ｋ、Ｉ１９９Ｔ、Ｎ２０３Ｄ、Ｋ２１４Ｒ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９ＳおよびＰ２３８Ｓからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、抗体が、本明細書で提供される。
一部の実施形態では、ＴＲＥＭ−１は、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号７のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、本開示の抗体は、配列番号７６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号５４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗体と比較して、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）、またはそれらの任意の組み合わせに対する減少した結合親和性を有する。一部の実施形態では、この抗体は、配列番号７６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号５４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗体と比較して、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）に対する、２分の１以下、３分の１以下、４分の１以下、５分の１以下、６分の１以下、７分の１以下、８分の１以下、９分の１以下または１０分の１以下に減少した結合親和性を有する。
【００１３】
一部の実施形態では、本明細書で開示される抗体は、配列番号７６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号５４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗体と比較して、免疫原性が低い。一部の実施形態では、この抗体は、ＴＲＥＭ−１への結合の際に、刺激因子の非存在下で、ＴＲＥＭ−１シグナル伝達をアゴナイズしない。一部の実施形態では、この抗体は、未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）をこの抗体の存在下かつ刺激因子の非存在下でインキュベートした場合に、配列番号７６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号５４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗体と比較して、この細胞における炎症性サイトカインの発現を誘導しない。
一部の実施形態では、本明細書で開示される抗体は、細胞をこの抗体および刺激因子の両方の存在下で活性化した場合に、この細胞における炎症性サイトカインの産生を遮断する。一部の実施形態では、この刺激因子は、ＴＲＥＭ−１リガンドである。一部の実施形態では、この炎症性サイトカインは、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−８、ＩＬ−１β、ＩＬ−１２、キチナーゼ−３様タンパク質１（ＣＨＩ３Ｌ１）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１４】
一部の実施形態では、本開示の抗体は、ｐＨ依存的様式で、ヒトＦｃＲｎ、カニクイザルＦｃＲｎおよび／またはマウスＦｃＲｎに結合する。一部の実施形態では、本明細書で開示される抗体は、キャピラリー示差走査熱量計（ＣＡＰ−ＤＳＣ）によって測定した場合に、配列番号７６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号５４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む参照抗体と比較して、より熱的に安定である。一部の実施形態では、この抗体の約１０％〜２０％、約２０％〜３０％（例えば、２４％）または約３０％〜４０％は、７７℃に加熱した場合に可逆的である。一部の実施形態では、この抗体は、配列番号７６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号５４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗体と比較して、より高い融解温度（Ｔｍ）を有する。
【００１５】
一部の実施形態では、本明細書で開示される抗体は、８０ｍｇ／ｍＬの濃度で、５ｃＰ未満、４ｃＰ未満、３ｃＰ未満、２．５ｃＰ未満、２．４ｃＰ未満、２．３ｃＰ未満、２．２ｃＰ未満、２．１ｃＰ未満、２ｃＰ未満、１．９ｃＰ未満、１．８ｃＰ未満、１．７ｃＰ未満、１．６ｃＰ未満、１．５ｃＰ未満、１．４ｃＰ未満、１．３ｃＰ未満、１．２ｃＰ未満、１．１ｃＰ未満、１．０ｃＰ未満、０．９ｃＰ未満、０．８ｃＰ未満、０．７ｃＰ未満、０．６ｃＰ未満、０．５ｃＰ未満、０．４ｃＰ未満、０．３ｃＰ未満、０．２ｃＰ未満または０．１ｃＰ未満の粘度を有する。一部の実施形態では、この抗体は、１３０ｍｇ／ｍＬの濃度で、１０ｃＰ未満（例えば、９ｃＰ）の粘度を有する。
一部の実施形態では、この抗体は、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定した場合に、４ｎＭ未満（例えば、３．４ｎＭ）のＫDでヒトＴＲＥＭ−１に結合する。一部の実施形態では、この抗体は、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定した場合に、１ｎＭ未満（例えば、０．９１ｎＭ）のＫDでカニクイザルＴＲＥＭ−１に結合する。
【００１６】
一部の実施形態では、この抗体は、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）によって観察した場合に、モノマーである。一部の実施形態では、この抗体は、２次元液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（２Ｄ−ＬＣ／ＭＳ）、または液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ／ＭＳ）を使用するインタクト質量分析（ｉｎｔａｃｔ  ｍａｓｓ  ａｎａｌｙｓｉｓ）によって観察した場合に、断片化の最小のリスクを示す。一部の実施形態では、この抗体は、８〜９（例えば、８．７５）の等電点を有する。
【００１７】
一部の実施形態では、この抗体は、ヒスチジン、スクロース、アルギニンおよびＮａＣｌを含む製剤中で安定である。一部の実施形態では、この抗体は、２０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのスクロース、２５ｍＭのアルギニンおよび５０ｍＭのＮａＣｌを含む製剤中で少なくとも２ヶ月間にわたって安定である。一部の実施形態では、この製剤は、６．０のｐＨである、および／またはこの製剤は、４℃、２５℃もしくは４０℃で貯蔵される。
第２の結合特異性を有する分子に連結された本開示の抗ＴＲＥＭ−１抗体を含む二特異性分子もまた、本明細書で提供される。
本明細書で開示される抗体をコードする核酸、この核酸を含むベクター、およびこのベクターで形質転換された細胞が、本明細書で提供される。
薬剤に連結された本明細書で開示される抗ＴＲＥＭ−１抗体を含むイムノコンジュゲートが、本明細書で提供される。
【００１８】
本明細書に記載される抗ＴＲＥＭ−１抗体もしくはその抗原結合部分、二特異性分子またはイムノコンジュゲート、および担体を含む、組成物が、本明細書で提供される。本明細書に記載される抗ＴＲＥＭ−１抗体もしくはその抗原結合部分、二特異性分子またはイムノコンジュゲート、および使用のための指示書を含む、キットもまた、本明細書で提供される。
本開示の抗ＴＲＥＭ−１抗体、二特異性分子、核酸、ベクター、細胞またはイムノコンジュゲートを投与するステップを含む、それを必要とする対象においてＴＲＥＭ−１活性を阻害する方法が、本明細書で提供される。
【００１９】
本開示の抗ＴＲＥＭ−１抗体、二特異性分子、核酸、ベクター、細胞またはイムノコンジュゲートを投与するステップを含む、それを必要とする対象において炎症性疾患または自己免疫性疾患を処置する方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、この炎症性疾患または自己免疫性疾患は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、過敏性腸症候群、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、乾癬性関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、血管炎、敗血症、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、Ｉ型糖尿病、グレーブス病、多発性硬化症（ＭＳ）、自己免疫性心筋炎、川崎病、冠動脈疾患、慢性閉塞性肺疾患、間質性肺疾患、自己免疫性甲状腺炎、強皮症、全身性硬化症、変形性関節症、アトピー性皮膚炎、白斑、移植片対宿主病、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｇｒｅｎｓ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、自己免疫性腎炎、グッドパスチャー症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、アレルギー、喘息、急性炎症または慢性炎症のいずれかの結果である他の自己免疫性疾患、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。一部の実施形態では、この方法は、１つ以上のさらなる治療薬を投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、このさらなる治療薬は、抗ＩＰ−１０抗体または抗ＴＮＦ−α抗体である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】図１Ａおよび１Ｂは、全てのｍＡｂ  ０３１８バリアントが、元のｍＡｂ  ０３１８抗体（ＩｇＧ４）と類似の親和性でヒトおよびカニクイザルＴＲＥＭ−１に結合することを示す。図１Ａは、ヒト（上の横列）およびカニクイザル（下の横列）の両方のＴＲＥＭ−１に対する、３１８−ＩｇＧ１．３ｆバリアントについての結合親和性データを示す。
【図１Ｂ】図１Ａおよび１Ｂは、全てのｍＡｂ  ０３１８バリアントが、元のｍＡｂ  ０３１８抗体（ＩｇＧ４）と類似の親和性でヒトおよびカニクイザルＴＲＥＭ−１に結合することを示す。図１Ｂは、ヒトＴＲＥＭ−１に対するいくつかの異なるｍＡｂ  ０３１８バリアントについての結合親和性データを示す。示された異なるバリアントには、以下が含まれる：（ｉ）３１８−ＩｇＧ１．１ｆ、（ｉｉ）３１８−ＩｇＧ１．３ｆ、（ｉｉｉ）３１８−ＩｇＧ４−Ａｂａ、（ｉｖ）３１８−ＩｇＧ１−Ａｂａおよび（ｖ）３１８−ＩｇＧ１．１ｆ（ＭからＱへの変異体）。ｍＡｂ  ０３１８抗体（ＩｇＧ４  ＡおよびＢ）についての結合親和性データを、図１Ｂ中に比較目的で提供した。
【図２Ａ】図２Ａおよび２Ｂは、ＴＲＥＭ−１結合後の種々の時点における、ＣＤ１４＋単球上に発現されたＴＲＥＭ−１への結合の際のｍＡｂ  ０３１８−ＩｇＧ１．３ｆの内在化を示す。図２Ａでは、ＴＲＥＭ−１受容体発現を、結合の０、６および２４時間後に分析した。
【図２Ｂ】図２Ａおよび２Ｂは、ＴＲＥＭ−１結合後の種々の時点における、ＣＤ１４＋単球上に発現されたＴＲＥＭ−１への結合の際のｍＡｂ  ０３１８−ＩｇＧ１．３ｆの内在化を示す。図２Ｂでは、ＴＲＥＭ−１受容体発現を、結合の０、４および２０時間後に分析した。図２Ｂは、ＴＲＥＭ−１への結合について０３１８抗体バリアントと競合しないＴＲＥＭ２６抗体を使用したデータもまた提供する。ＴＲＥＭ２６抗体は、それが内在化された後のＴＲＥＭ−１受容体の運命（例えば、それが分解されるか、表面にリサイクルされて戻されるか）を評価するために使用した。
【図３】図３は、ＣＨＯ−ＣＤ３２あり（「両方」）またはＣＨＯ−ＣＤ３２なし（「ＢＷＺ  ３６のみ」）でレポーター細胞株をインキュベートしたとき、ＢＷＺ／ｈＴＲＥＭ−１レポーター細胞アッセイによって測定した場合に、ｍＡｂ  ０３１８バリアントがＴＲＥＭ−１シグナル伝達をアゴナイズしないことを示す。示されたバリアント抗体には、以下が含まれる：（ｉ）３１８−ＩｇＧ１．１ｆ（「ＩｇＧ１．１ｆ」）、（ｉｉ）３１８−ＩｇＧ１．３ｆ（「ＩｇＧ１．３ｆ」）、（ｉｉｉ）３１８−ＩｇＧ４−Ａｂａ（「ＦｃＡｂａ−４」）、（ｉｖ）３１８−ＩｇＧ１−Ａｂａ（「ＦｃＡｂａ−１」）。ＴＲＥＭ−１シグナル伝達の公知のアゴニストであるＭＡＢ１２７８抗体を、陽性対照抗体として使用した（挿入された囲みを参照のこと）。５Ｃ８（アイソタイプコントロール）抗体を、陰性対照として使用した。
【図４】図４は、異なるヒト細胞による炎症性サイトカインのＴＲＥＭ−１媒介性産生を遮断する際の、異なるｍＡｂ  ０３１８バリアントのポテンシーを示す。図４に示されるｍＡｂ  ０３１８抗体バリアントは、異なるヒト細胞型：ＰＢＭＣ、単球、好中球およびＲＢＣ沈降全血（即ち、赤血球の大部分が、実施例に記載されるデキストランベースＲＢＣ沈降プロトコールを使用して除去された）からの、炎症性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６またはＩＬ−８）のＴＲＥＭ−１媒介性放出を阻害する。炎症性サイトカインを産生するために、細胞を、プレート結合したＰＧＲＰ１およびＴＬＲ２活性を欠く可溶性ペプチドグリカン（「ＰＧＲＰ＋ＰＧＮ−Ｅｃｎｄｓｓ」）、またはホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）刺激したＰＧＲＰ１発現好中球（「ＰＭＡ刺激好中球内因性ＰＧＲＰ」）のいずれかで刺激した。示されたバリアント抗体には、以下が含まれる：（ｉ）０３１８−ＩｇＧ４、（ｉｉ）０３１８−ＩｇＧ１．３ｆ、（ｉｉｉ）０３１８−ＩｇＧ１．１ｆ、（ｉｖ）０３１８−ＩｇＧ１−Ａｂａおよび（ｖ）３１８−ＩｇＧ４−Ａｂａ。「Ｎ／Ｄ」は、特定の炎症性サイトカインの発現レベルが決定されなかったことを示す。
【図５Ａ】図５Ａおよび５Ｂは、ＮＯＤ２阻害剤の存在下で、ＰＧＲＰ１ありまたはなしでのＰＧＮによる刺激後の、全血からのＩＬ−８産生を遮断するｍＡｂ  ０３１８−ＩｇＧ１．３ｆのポテンシーを示す。図５Ａは、実施例に記載される全血薬力学アッセイを使用して生成された阻害データを提供する。
【図５Ｂ】図５Ａおよび５Ｂは、ＮＯＤ２阻害剤の存在下で、ＰＧＲＰ１ありまたはなしでのＰＧＮによる刺激後の、全血からのＩＬ−８産生を遮断するｍＡｂ  ０３１８−ＩｇＧ１．３ｆのポテンシーを示す。図５Ｂは、実施例に記載される全血細胞内サイトカインアッセイを使用して生成された阻害データを提供する。
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｃは、変動する濃度のｍＡｂ  ０３１８−ＩｇＧ１．３ｆ（０〜１ｎＭ）の存在下で刺激した全血からのキチナーゼ−３様タンパク質１（「ＣＨＩ３Ｌ１」）（図６Ａ）、ＩＬ−１β（図６Ｂ）およびＩＬ−６（図６Ｃ）のＲＮＡ発現レベルを示す。全血を、３人の異なるドナー（１２６番、２９０番および３２２番）から収集し、可溶性ＰＧＲＰ１およびＴＬＲ２活性を欠く可溶性ペプチドグリカン（「可溶性ＰＧＲＰ＋可溶性ＰＧＮ−Ｅｃｎｄｓｓ」）で刺激した。図６Ａ〜６Ｃの各々において、ＲＮＡ発現レベル（ｙ軸）は、％阻害（右の縦列）およびΔΔＣｔ（参照遺伝子の値と試験サンプルの値との間の差異）（左の縦列）の両方として示される。０３１８−ＩｇＧ１．３ｆ抗体の異なる濃度が、ｘ軸上に示される。
【図６Ｂ】図６Ａ〜６Ｃは、変動する濃度のｍＡｂ  ０３１８−ＩｇＧ１．３ｆ（０〜１ｎＭ）の存在下で刺激した全血からのキチナーゼ−３様タンパク質１（「ＣＨＩ３Ｌ１」）（図６Ａ）、ＩＬ−１β（図６Ｂ）およびＩＬ−６（図６Ｃ）のＲＮＡ発現レベルを示す。全血を、３人の異なるドナー（１２６番、２９０番および３２２番）から収集し、可溶性ＰＧＲＰ１およびＴＬＲ２活性を欠く可溶性ペプチドグリカン（「可溶性ＰＧＲＰ＋可溶性ＰＧＮ−Ｅｃｎｄｓｓ」）で刺激した。図６Ａ〜６Ｃの各々において、ＲＮＡ発現レベル（ｙ軸）は、％阻害（右の縦列）およびΔΔＣｔ（参照遺伝子の値と試験サンプルの値との間の差異）（左の縦列）の両方として示される。０３１８−ＩｇＧ１．３ｆ抗体の異なる濃度が、ｘ軸上に示される。
【図６Ｃ】図６Ａ〜６Ｃは、変動する濃度のｍＡｂ  ０３１８−ＩｇＧ１．３ｆ（０〜１ｎＭ）の存在下で刺激した全血からのキチナーゼ−３様タンパク質１（「ＣＨＩ３Ｌ１」）（図６Ａ）、ＩＬ−１β（図６Ｂ）およびＩＬ−６（図６Ｃ）のＲＮＡ発現レベルを示す。全血を、３人の異なるドナー（１２６番、２９０番および３２２番）から収集し、可溶性ＰＧＲＰ１およびＴＬＲ２活性を欠く可溶性ペプチドグリカン（「可溶性ＰＧＲＰ＋可溶性ＰＧＮ−Ｅｃｎｄｓｓ」）で刺激した。図６Ａ〜６Ｃの各々において、ＲＮＡ発現レベル（ｙ軸）は、％阻害（右の縦列）およびΔΔＣｔ（参照遺伝子の値と試験サンプルの値との間の差異）（左の縦列）の両方として示される。０３１８−ＩｇＧ１．３ｆ抗体の異なる濃度が、ｘ軸上に示される。
【図７】図７は、３１８−ＩｇＧ１．１ｆ（四角）および３１８−ＩｇＧ１．３ｆ（丸）バリアント抗体の両方の粘度−濃度プロファイルを示す。粘度プロファイルを、一定温度で各ポイントについて３ポイント剪断スイープ（ｓｗｅｅｐ）を使用して、Ｒｈｅｏｓｅｎｓｅ  ｍ−ＶＲＯＣダイナミック粘度計を使用して、希釈スキームから生成した。実線は、示されたデータについての最良の非線形曲線フィットを提供する。点線は、効力のための最大の許容可能な粘度レベルを提供する。
【図８】図８は、３１８−ＩｇＧ１．１ｆおよび３１８−ＩｇＧ１．３ｆバリアント抗体の両方が、免疫原性について低い〜中間のリスクを有することを示す。ＶＬ６（免疫原性ＩＬ−２１Ｒ  ｍＡｂ）およびＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）を、陽性対照として使用した。Ａｖａｓｔｉｎを、陰性対照として使用した。
【図９Ａ】図９Ａおよび９Ｂは、全てのｍＡｂ  ０３１８バリアントが、ｐＨ依存的様式で、ＦｃＲｎ（ヒト（黒色）、カニクイザル（白色）およびマウス（灰色））に結合することが可能であることを示す。図９Ａは、ＦｃＲｎ結合を％Ｒｍａｘ（最大ＦｃＲｎ結合能）として提供する。
【図９Ｂ】図９Ａおよび９Ｂは、全てのｍＡｂ  ０３１８バリアントが、ｐＨ依存的様式で、ＦｃＲｎ（ヒト（黒色）、カニクイザル（白色）およびマウス（灰色））に結合することが可能であることを示す。図９Ｂは、ＦｃＲｎ結合をセンサーグラムとして提供する。示された０３１８抗体バリアントには、以下が含まれる：（ｉ）ＩｇＧ１−Ａｂａ、（ｉｉ）ＩｇＧ４−Ａｂａ、（ｉｉｉ）ＩｇＧ１．１ｆおよび（ｉｖ）ＩｇＧ１．３ｆ。ｍＡｂ  ０３１８（ＩｇＧ４）抗体もまた、比較目的のために示される。
【図１０Ａ】図１０Ａおよび１０Ｂは、全てのｍＡｂ  ０３１８抗体バリアントが、ヒトＦｃγＲ（即ち、ＣＤ６４、ＣＤ３２ａ−Ｈ１３１バリアント、ＣＤ３２ａ−Ｒ１３１バリアント、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ１６ａ−Ｖ１５８バリアントおよびＣＤ１６Ｂ−ＮＡ２バリアント）のうち１つ以上への減少した結合を実証することを示す。図１０Ａは、結合親和性を％Ｒｍａｘ（最大ＦｃγＲ能）として示す。
【図１０Ｂ】図１０Ａおよび１０Ｂは、全てのｍＡｂ  ０３１８抗体バリアントが、ヒトＦｃγＲ（即ち、ＣＤ６４、ＣＤ３２ａ−Ｈ１３１バリアント、ＣＤ３２ａ−Ｒ１３１バリアント、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ１６ａ−Ｖ１５８バリアントおよびＣＤ１６Ｂ−ＮＡ２バリアント）のうち１つ以上への減少した結合を実証することを示す。図１０Ｂは、センサーグラムを示す。示された０３１８抗体バリアントには、以下が含まれる：（ｉ）ＩｇＧ１−Ａｂａ、（ｉｉ）ＩｇＧ４−Ａｂａ、（ｉｉｉ）ＩｇＧ１．１ｆおよび（ｉｖ）ＩｇＧ１．３ｆ。ｍＡｂ  ０３１８（ＩｇＧ４）抗体は、比較目的のために示される。複数のＦｃγＲに結合することが公知の１Ｆ４−ｈＩｇＧ１ｆ抗体を、対照として使用した。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜１１Ｉは、０３１８バリアント抗体が、未成熟樹状細胞と共に培養したとき、異なる炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１２）の放出によって測定した場合に、それら自体では（即ち、刺激の非存在下では）アゴニスト性でないことを示す。図１１Ａ、１１Ｂおよび１１Ｃは、それぞれドナーＤ１７９、Ｄ２７６およびＤ３４１から単離された未成熟樹状細胞について産生されたＩＬ−６の量を提供する。示された０３１８抗体バリアントには、以下が含まれる：（ｉ）ＩｇＧ１．１ｆ、（ｉｉ）ＩｇＧ１．３ｆおよび（ｉｉｉ）ＩｇＧ１−Ａｂａ。使用した抗体の投薬量（μｇ／ｍＬ）は、丸括弧中に示される。未成熟樹状細胞を、膜ＣＤ３２ａを発現するＣＨＯ細胞（Ｆｃ架橋結合を刺激するため）ありおよびなしで、抗ＴＲＥＭ−１抗体バリアントと共に培養した。ＰＧＲＰ＋ＰＧＮ、ＣＤ４０Ｌトリマー（「トリマー」）およびＰｆｉｚｅｒの抗ＣＤ４０アゴニスト抗体（「ＣＰ８７０」）を、陽性対照として使用した。アイソタイプ抗体（「ＣＨＩＬ−６」）を、陰性対照として使用した。点線は、アッセイについての検出下限を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｉは、０３１８バリアント抗体が、未成熟樹状細胞と共に培養したとき、異なる炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１２）の放出によって測定した場合に、それら自体では（即ち、刺激の非存在下では）アゴニスト性でないことを示す。図１１Ａ、１１Ｂおよび１１Ｃは、それぞれドナーＤ１７９、Ｄ２７６およびＤ３４１から単離された未成熟樹状細胞について産生されたＩＬ−６の量を提供する。示された０３１８抗体バリアントには、以下が含まれる：（ｉ）ＩｇＧ１．１ｆ、（ｉｉ）ＩｇＧ１．３ｆおよび（ｉｉｉ）ＩｇＧ１−Ａｂａ。使用した抗体の投薬量（μｇ／ｍＬ）は、丸括弧中に示される。未成熟樹状細胞を、膜ＣＤ３２ａを発現するＣＨＯ細胞（Ｆｃ架橋結合を刺激するため）ありおよびなしで、抗ＴＲＥＭ−１抗体バリアントと共に培養した。ＰＧＲＰ＋ＰＧＮ、ＣＤ４０Ｌトリマー（「トリマー」）およびＰｆｉｚｅｒの抗ＣＤ４０アゴニスト抗体（「ＣＰ８７０」）を、陽性対照として使用した。アイソタイプ抗体（「ＣＨＩＬ−６」）を、陰性対照として使用した。点線は、アッセイについての検出下限を示す。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜１１Ｉは、０３１８バリアント抗体が、未成熟樹状細胞と共に培養したとき、異なる炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１２）の放出によって測定した場合に、それら自体では（即ち、刺激の非存在下では）アゴニスト性でないことを示す。図１１Ａ、１１Ｂおよび１１Ｃは、それぞれドナーＤ１７９、Ｄ２７６およびＤ３４１から単離された未成熟樹状細胞について産生されたＩＬ−６の量を提供する。示された０３１８抗体バリアントには、以下が含まれる：（ｉ）ＩｇＧ１．１ｆ、（ｉｉ）ＩｇＧ１．３ｆおよび（ｉｉｉ）ＩｇＧ１−Ａｂａ。使用した抗体の投薬量（μｇ／ｍＬ）は、丸括弧中に示される。未成熟樹状細胞を、膜ＣＤ３２ａを発現するＣＨＯ細胞（Ｆｃ架橋結合を刺激するため）ありおよびなしで、抗ＴＲＥＭ−１抗体バリアントと共に培養した。ＰＧＲＰ＋ＰＧＮ、ＣＤ４０Ｌトリマー（「トリマー」）およびＰｆｉｚｅｒの抗ＣＤ４０アゴニスト抗体（「ＣＰ８７０」）を、陽性対照として使用した。アイソタイプ抗体（「ＣＨＩＬ−６」）を、陰性対照として使用した。点線は、アッセイについての検出下限を示す。
【図１１Ｄ】図１１Ａ〜１１Ｉは、０３１８バリアント抗体が、未成熟樹状細胞と共に培養したとき、異なる炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１２）の放出によって測定した場合に、それら自体では（即ち、刺激の非存在下では）アゴニスト性でないことを示す。図１１Ｄ、１１Ｅおよび１１Ｆは、それぞれドナーＤ１７９、Ｄ２７６およびＤ３４１から単離された未成熟樹状細胞について産生されたＴＮＦ−αの量を提供する。示された０３１８抗体バリアントには、以下が含まれる：（ｉ）ＩｇＧ１．１ｆ、（ｉｉ）ＩｇＧ１．３ｆおよび（ｉｉｉ）ＩｇＧ１−Ａｂａ。使用した抗体の投薬量（μｇ／ｍＬ）は、丸括弧中に示される。未成熟樹状細胞を、膜ＣＤ３２ａを発現するＣＨＯ細胞（Ｆｃ架橋結合を刺激するため）ありおよびなしで、抗ＴＲＥＭ−１抗体バリアントと共に培養した。ＰＧＲＰ＋ＰＧＮ、ＣＤ４０Ｌトリマー（「トリマー」）およびＰｆｉｚｅｒの抗ＣＤ４０アゴニスト抗体（「ＣＰ８７０」）を、陽性対照として使用した。アイソタイプ抗体（「ＣＨＩＬ−６」）を、陰性対照として使用した。点線は、アッセイについての検出下限を示す。
【図１１Ｅ】図１１Ａ〜１１Ｉは、０３１８バリアント抗体が、未成熟樹状細胞と共に培養したとき、異なる炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１２）の放出によって測定した場合に、それら自体では（即ち、刺激の非存在下では）アゴニスト性でないことを示す。図１１Ｄ、１１Ｅおよび１１Ｆは、それぞれドナーＤ１７９、Ｄ２７６およびＤ３４１から単離された未成熟樹状細胞について産生されたＴＮＦ−αの量を提供する。示された０３１８抗体バリアントには、以下が含まれる：（ｉ）ＩｇＧ１．１ｆ、（ｉｉ）ＩｇＧ１．３ｆおよび（ｉｉｉ）ＩｇＧ１−Ａｂａ。使用した抗体の投薬量（μｇ／ｍＬ）は、丸括弧中に示される。未成熟樹状細胞を、膜ＣＤ３２ａを発現するＣＨＯ細胞（Ｆｃ架橋結合を刺激するため）ありおよびなしで、抗ＴＲＥＭ−１抗体バリアントと共に培養した。ＰＧＲＰ＋ＰＧＮ、ＣＤ４０Ｌトリマー（「トリマー」）およびＰｆｉｚｅｒの抗ＣＤ４０アゴニスト抗体（「ＣＰ８７０」）を、陽性対照として使用した。アイソタイプ抗体（「ＣＨＩＬ−６」）を、陰性対照として使用した。点線は、アッセイについての検出下限を示す。
【図１１Ｆ】図１１Ａ〜１１Ｉは、０３１８バリアント抗体が、未成熟樹状細胞と共に培養したとき、異なる炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１２）の放出によって測定した場合に、それら自体では（即ち、刺激の非存在下では）アゴニスト性でないことを示す。図１１Ｄ、１１Ｅおよび１１Ｆは、それぞれドナーＤ１７９、Ｄ２７６およびＤ３４１から単離された未成熟樹状細胞について産生されたＴＮＦ−αの量を提供する。示された０３１８抗体バリアントには、以下が含まれる：（ｉ）ＩｇＧ１．１ｆ、（ｉｉ）ＩｇＧ１．３ｆおよび（ｉｉｉ）ＩｇＧ１−Ａｂａ。使用した抗体の投薬量（μｇ／ｍＬ）は、丸括弧中に示される。未成熟樹状細胞を、膜ＣＤ３２ａを発現するＣＨＯ細胞（Ｆｃ架橋結合を刺激するため）ありおよびなしで、抗ＴＲＥＭ−１抗体バリアントと共に培養した。ＰＧＲＰ＋ＰＧＮ、ＣＤ４０Ｌトリマー（「トリマー」）およびＰｆｉｚｅｒの抗ＣＤ４０アゴニスト抗体（「ＣＰ８７０」）を、陽性対照として使用した。アイソタイプ抗体（「ＣＨＩＬ−６」）を、陰性対照として使用した。点線は、アッセイについての検出下限を示す。
【図１１Ｇ】図１１Ａ〜１１Ｉは、０３１８バリアント抗体が、未成熟樹状細胞と共に培養したとき、異なる炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１２）の放出によって測定した場合に、それら自体では（即ち、刺激の非存在下では）アゴニスト性でないことを示す。図１１Ｇ、１１Ｈおよび１１Ｉは、それぞれドナーＤ１７９、Ｄ２７６およびＤ３４１から単離された未成熟樹状細胞について産生されたＩＬ−１２の量を提供する。示された０３１８抗体バリアントには、以下が含まれる：（ｉ）ＩｇＧ１．１ｆ、（ｉｉ）ＩｇＧ１．３ｆおよび（ｉｉｉ）ＩｇＧ１−Ａｂａ。使用した抗体の投薬量（μｇ／ｍＬ）は、丸括弧中に示される。未成熟樹状細胞を、膜ＣＤ３２ａを発現するＣＨＯ細胞（Ｆｃ架橋結合を刺激するため）ありおよびなしで、抗ＴＲＥＭ−１抗体バリアントと共に培養した。ＰＧＲＰ＋ＰＧＮ、ＣＤ４０Ｌトリマー（「トリマー」）およびＰｆｉｚｅｒの抗ＣＤ４０アゴニスト抗体（「ＣＰ８７０」）を、陽性対照として使用した。アイソタイプ抗体（「ＣＨＩＬ−６」）を、陰性対照として使用した。点線は、アッセイについての検出下限を示す。
【図１１Ｈ】図１１Ａ〜１１Ｉは、０３１８バリアント抗体が、未成熟樹状細胞と共に培養したとき、異なる炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１２）の放出によって測定した場合に、それら自体では（即ち、刺激の非存在下では）アゴニスト性でないことを示す。図１１Ｇ、１１Ｈおよび１１Ｉは、それぞれドナーＤ１７９、Ｄ２７６およびＤ３４１から単離された未成熟樹状細胞について産生されたＩＬ−１２の量を提供する。示された０３１８抗体バリアントには、以下が含まれる：（ｉ）ＩｇＧ１．１ｆ、（ｉｉ）ＩｇＧ１．３ｆおよび（ｉｉｉ）ＩｇＧ１−Ａｂａ。使用した抗体の投薬量（μｇ／ｍＬ）は、丸括弧中に示される。未成熟樹状細胞を、膜ＣＤ３２ａを発現するＣＨＯ細胞（Ｆｃ架橋結合を刺激するため）ありおよびなしで、抗ＴＲＥＭ−１抗体バリアントと共に培養した。ＰＧＲＰ＋ＰＧＮ、ＣＤ４０Ｌトリマー（「トリマー」）およびＰｆｉｚｅｒの抗ＣＤ４０アゴニスト抗体（「ＣＰ８７０」）を、陽性対照として使用した。アイソタイプ抗体（「ＣＨＩＬ−６」）を、陰性対照として使用した。点線は、アッセイについての検出下限を示す。
【図１１Ｉ】図１１Ａ〜１１Ｉは、０３１８バリアント抗体が、未成熟樹状細胞と共に培養したとき、異なる炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１２）の放出によって測定した場合に、それら自体では（即ち、刺激の非存在下では）アゴニスト性でないことを示す。図１１Ｇ、１１Ｈおよび１１Ｉは、それぞれドナーＤ１７９、Ｄ２７６およびＤ３４１から単離された未成熟樹状細胞について産生されたＩＬ−１２の量を提供する。示された０３１８抗体バリアントには、以下が含まれる：（ｉ）ＩｇＧ１．１ｆ、（ｉｉ）ＩｇＧ１．３ｆおよび（ｉｉｉ）ＩｇＧ１−Ａｂａ。使用した抗体の投薬量（μｇ／ｍＬ）は、丸括弧中に示される。未成熟樹状細胞を、膜ＣＤ３２ａを発現するＣＨＯ細胞（Ｆｃ架橋結合を刺激するため）ありおよびなしで、抗ＴＲＥＭ−１抗体バリアントと共に培養した。ＰＧＲＰ＋ＰＧＮ、ＣＤ４０Ｌトリマー（「トリマー」）およびＰｆｉｚｅｒの抗ＣＤ４０アゴニスト抗体（「ＣＰ８７０」）を、陽性対照として使用した。アイソタイプ抗体（「ＣＨＩＬ−６」）を、陰性対照として使用した。点線は、アッセイについての検出下限を示す。
【図１２】図１２は、皮下投与後のカニクイザルにおける単回用量ｍＡｂ  ０３１８−ＩｇＧ１．３ｆバリアントの薬物動態を示す。動物の各々は、以下の用量のうち１つを受けた：（ｉ）０．１ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝４）（「１」）、（ｉｉ）０．５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝４）（「２」）、（ｉｉｉ）２ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝３）（「３」）または（ｉｖ）１０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝４）（「４」）。データは、平均±標準偏差として示される。
【図１３】図１３は、カニクイザルにおける薬物動態（ＰＫ）、薬力学（ＰＤ）および受容体占有率（ＲＯ）データを記載するために使用した標的介在性薬物動態模式図を示す。
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂは、カニクイザルにおけるｍＡｂ  ０３１８−ＩｇＧ１．３ｆバリアントの単回用量（皮下（ｓｃ）または静脈内（ｉｖ）投与）後の、単球（図１４Ａ）および顆粒球（図１４Ｂ）上の総ＴＲＥＭ−１受容体密度を示す。ＴＲＥＭ−１受容体密度は、抗体の投与前のＴＲＥＭ−１受容体密度のパーセンテージとして示される。動物の各々は、以下の用量のうち１つを受けた：（ａ）０．１ｍｇ／ｋｇ（ｓｃ）（ｎ＝４）（「Ａ」）、（ｂ）０．５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝４）（ｓｃ）（「Ｂ」）、（ｃ）２ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝３）（ｓｃ）（「Ｃ」）、（ｄ）２ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝３）（ｉｖ）（「Ｄ」）または（ｅ）１０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝４）（ｓｃ）（「Ｅ」）。データは、平均±標準偏差として示される。
【図１５】図１５Ａおよび１５Ｂは、カニクイザルにおけるｍＡｂ  ０３１８−ＩｇＧ１．３ｆバリアントの単回用量後の、単球（図１５Ａ）および顆粒球（図１５Ｂ）上のＴＲＥＭ−１受容体占有率を示す。受容体占有率データは、細胞上に発現された総ＴＲＥＭ−１受容体のパーセンテージとして示される。動物の各々は、以下の用量のうち１つを受けた：（ａ）０．１ｍｇ／ｋｇ（ｓｃ）（ｎ＝４）（「Ａ」）、（ｂ）０．５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝４）（ｓｃ）（「Ｂ」）、（ｃ）２ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝３）（ｓｃ）（「Ｃ」）、（ｄ）２ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝３）（ｉｖ）（「Ｄ」）または（ｅ）１０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝４）（ｓｃ）（「Ｅ」）。データは、平均±標準偏差として示される。点線は、８５％の受容体占有率を示す。
【図１６Ａ】図１６Ａおよび１６Ｂは、中央コンパートメントにおけるＴＭＤＤを用いた２−コンパートメントＰＫモデルによって記載される、カニクイザルにおけるｍＡｂ  ０３１８−ＩｇＧ１．３ｆバリアントの単回用量後の、観察された（白抜き丸）およびモデル予測された（実線）ＰＫ（左上パネル）、ＰＤ（右上パネル）、ＲＯ（左下パネル）、および総表面ＴＲＥＭ−１受容体発現（右下パネル）を示す。図１６Ａでは、サルの各々は、単回用量の０．１ｍｇ／ｋｇの抗体を皮下で受けた。
【図１６Ｂ】図１６Ａおよび１６Ｂは、中央コンパートメントにおけるＴＭＤＤを用いた２−コンパートメントＰＫモデルによって記載される、カニクイザルにおけるｍＡｂ  ０３１８−ＩｇＧ１．３ｆバリアントの単回用量後の、観察された（白抜き丸）およびモデル予測された（実線）ＰＫ（左上パネル）、ＰＤ（右上パネル）、ＲＯ（左下パネル）、および総表面ＴＲＥＭ−１受容体発現（右下パネル）を示す。図１６Ｂでは、動物は、単回用量の１０ｍｇ／ｋｇの抗体を皮下で受けた。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本記載がより容易に理解できるように、ある特定の用語を最初に定義する。さらなる定義は、詳細な説明の至る所に示される。
【００２２】
用語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」実体は、その実態のうち１つ以上を指すことに留意すべきである；例えば、「１つの（ａ）ヌクレオチド配列」は、１つ以上のヌクレオチド配列を示すと理解される。このように、用語「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）、「１つ以上」および「少なくとも１つ」は、本明細書で相互交換可能に使用され得る。
【００２３】
さらに、「および／または」は、本明細書で使用する場合、他方を伴うまたは伴わない、２つの特定された特色または構成要素の各々の具体的な開示として解釈すべきである。従って、用語「および／または」は、本明細書の「Ａおよび／またはＢ」などの語句において使用する場合、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）および「Ｂ」（単独）を含む意図である。同様に、用語「および／または」は、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」などの語句において使用する場合、以下の態様の各々を包含する意図である：Ａ、ＢおよびＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）。
態様が言葉「含む」を用いて本明細書に記載される場合には、「〜からなる」および／または「本質的に〜からなる」という言い回しで記載される他の点では類似した態様もまた提供されることが理解される。
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が関する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press；The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press；およびOxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Pressは、当業者に、本開示で使用される用語の多くの、一般的な辞書を提供する。
【００２４】
単位、接頭辞および記号は、それらの国際単位系（ＳＩ）で認められた形態で示される。数値範囲は、その範囲を定義する数を含む。特に示さない限り、ヌクレオチド配列は、左から右に、５’から３’の配向で書かれる。アミノ酸配列は、左から右に、アミノからカルボキシの配向で書かれる。本明細書で提供される見出しは、全体として本明細書を参照して得ることができる本開示の種々の態様の限定ではない。従って、すぐ下で定義した用語は、本明細書をその全体で参照して、より完全に定義される。
用語「約」は、およそ、大まかに、おおよそ、またはその辺りであることを意味するために、本明細書で使用される。用語「約」が数値範囲と併せて使用される場合、これは、示された数値の上および下の境界を拡張させることによって、その範囲を修飾する。一般に、用語「約」は、例えば、１０パーセント上または下（より高いまたはより低い）の相違分、述べられた値の上および下の数値を修飾することができる。
【００２５】
用語「ミエロイド細胞に発現するトリガー受容体１」（ＴＲＥＭ１、ＴＲＥＭ−１およびＣＤ３５４としても公知）は、単球、マクロファージおよび好中球上で発現される受容体を指す。ＴＲＥＭ−１の主なリガンドには、ペプチドグリカン（ＰＧＮ）結合タンパク質（ＰＧＲＰ）のファミリーに属するペプチドグリカン認識タンパク質１（ＰＧＬＹＲＰ１）が含まれる。活性化されると、ＴＲＥＭ−１は、ＩＴＡＭ含有シグナル伝達アダプタータンパク質ＤＡＰ１２と会合する。下流のシグナル伝達には、炎症促進性サイトカイン産生の上方調節を引き起こす、ＮＦＡＴ転写因子の活性化が含まれ得る。用語「ＴＲＥＭ−１」は、細胞によって天然に発現されるＴＲＥＭ−１の任意のバリアントまたはアイソフォームを含む。従って、一部の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ヒト以外の種由来のＴＲＥＭ−１（例えば、カニクイザルＴＲＥＭ−１）と交差反応できる。
【００２６】
ヒトＴＲＥＭ−１の３つのアイソフォームが同定されている。アイソフォーム１（アクセッション番号ＮＰ＿０６１１１３．１；配列番号１）は、２３４アミノ酸からなり、カノニカル配列を示す。アイソフォーム２（アクセッション番号ＮＰ＿００１２２９５１８．１；配列番号２）は、２２５アミノ酸からなり、アミノ酸残基２０１〜２３４においてカノニカル配列とは異なる。これらのアミノ酸残基は、膜貫通ドメインの一部および細胞質側ドメインをコードする。アイソフォーム３（アクセッション番号ＮＰ＿００１２２９５１９；配列番号３）は、１５０アミノ酸からなり、可溶性である。これは、膜貫通ドメイン、細胞質側ドメイン、および細胞外ドメインの一部をコードするアミノ酸残基１５１〜２３４を欠く。アミノ酸残基１３８〜１５０もまた、上記カノニカル配列とは異なる。
【００２７】
以下は、３つの公知のヒトＴＲＥＭ−１アイソフォームのアミノ酸配列である。
（Ａ）ヒトＴＲＥＭ−１アイソフォーム１（アクセッション番号ＮＰ＿０６１１１３．１；配列番号１；アクセッション番号ＮＭ＿０１８６４３を有するヌクレオチド配列；配列番号４によってコードされる）：
ＭＲＫＴＲＬＷＧＬＬＷＭＬＦＶＳＥＬＲＡＡＴＫＬＴＥＥＫＹＥＬＫＥＧＱＴＬＤＶＫＣＤＹＴＬＥＫＦＡＳＳＱＫＡＷＱＩＩＲＤＧＥＭＰＫＴＬＡＣＴＥＲＰＳＫＮＳＨＰＶＱＶＧＲＩＩＬＥＤＹＨＤＨＧＬＬＲＶＲＭＶＮＬＱＶＥＤＳＧＬＹＱＣＶＩＹＱＰＰＫＥＰＨＭＬＦＤＲＩＲＬＶＶＴＫＧＦＳＧＴＰＧＳＮＥＮＳＴＱＮＶＹＫＩＰＰＴＴＴＫＡＬＣＰＬＹＴＳＰＲＴＶＴＱＡＰＰＫＳＴＡＤＶＳＴＰＤＳＥＩＮＬＴＮＶＴＤＩＩＲＶＰＶＦＮＩＶＩＬＬＡＧＧＦＬＳＫＳＬＶＦＳＶＬＦＡＶＴＬＲＳＦＶＰ（シグナル配列は下線付きである）；
（Ｂ）ヒトＴＲＥＭ−１アイソフォーム２（アクセッション番号ＮＰ＿００１２２９５１８．１；配列番号２；アクセッション番号ＮＭ＿００１２４２５８９を有するヌクレオチド配列；配列番号５によってコードされる）：
ＭＲＫＴＲＬＷＧＬＬＷＭＬＦＶＳＥＬＲＡＡＴＫＬＴＥＥＫＹＥＬＫＥＧＱＴＬＤＶＫＣＤＹＴＬＥＫＦＡＳＳＱＫＡＷＱＩＩＲＤＧＥＭＰＫＴＬＡＣＴＥＲＰＳＫＮＳＨＰＶＱＶＧＲＩＩＬＥＤＹＨＤＨＧＬＬＲＶＲＭＶＮＬＱＶＥＤＳＧＬＹＱＣＶＩＹＱＰＰＫＥＰＨＭＬＦＤＲＩＲＬＶＶＴＫＧＦＳＧＴＰＧＳＮＥＮＳＴＱＮＶＹＫＩＰＰＴＴＴＫＡＬＣＰＬＹＴＳＰＲＴＶＴＱＡＰＰＫＳＴＡＤＶＳＴＰＤＳＥＩＮＬＴＮＶＴＤＩＩＲＹＳＦＱＶＰＧＰＬＶＷＴＬＳＰＬＦＰＳＬＣＡＥＲＭ（シグナル配列は下線付きである）；
（Ｃ）ヒトＴＲＥＭ−１アイソフォーム３（アクセッション番号ＮＰ＿００１２２９５１９；配列番号３；アクセッション番号ＮＭ＿００１２４２５９０を有するヌクレオチド配列；配列番号６によってコードされる）：
ＭＲＫＴＲＬＷＧＬＬＷＭＬＦＶＳＥＬＲＡＡＴＫＬＴＥＥＫＹＥＬＫＥＧＱＴＬＤＶＫＣＤＹＴＬＥＫＦＡＳＳＱＫＡＷＱＩＩＲＤＧＥＭＰＫＴＬＡＣＴＥＲＰＳＫＮＳＨＰＶＱＶＧＲＩＩＬＥＤＹＨＤＨＧＬＬＲＶＲＭＶＮＬＱＶＥＤＳＧＬＹＱＣＶＩＹＱＰＰＫＥＰＨＭＬＦＤＲＩＲＬＶＶＴＫＧＦＲＣＳＴＬＳＦＳＷＬＶＤＳ（シグナル配列は下線付きである）。
【００２８】
カニクイザルＴＲＥＭ−１タンパク質（アクセッション番号ＸＰ＿００１０８２５１７；配列番号７）は、以下のアミノ酸配列を有すると予測される：
ＭＲＫＴＲＬＷＧＬＬＷＭＬＦＶＳＥＬＲＡＴＴＥＬＴＥＥＫＹＥＹＫＥＧＱＴＬＥＶＫＣＤＹＡＬＥＫＹＡＮＳＲＫＡＷＱＫＭＥＧＫＭＰＫＩＬＡＫＴＥＲＰＳＥＮＳＨＰＶＱＶＧＲＩＴＬＥＤＹＰＤＨＧＬＬＱＶＱＭＴＮＬＱＶＥＤＳＧＬＹＱＣＶＩＹＱＨＰＫＥＳＨＶＬＦＮＰＩＣＬＶＶＴＫＧＳＳＧＴＰＧＳＳＥＮＳＴＱＮＶＹＲＴＰＳＴＴＡＫＡＬＧＰＲＹＴＳＰＲＴＶＴＱＡＰＰＥＳＴＶＶＶＳＴＰＧＳＥＩＮＬＴＮＶＴＤＩＩＲＶＰＶＦＮＩＶＩＩＶＡＧＧＦＬＳＫＳＬＶＦＳＶＬＦＡＶＴＬＲＳＦＧＰ（シグナル配列は下線付きである）。
本開示は、ＴＲＥＭ−１に特異的に結合しその機能を遮断する抗体に関する。これらの抗体は、ＴＲＥＭ−１活性化および下流のシグナル伝達を低減／遮断することによって、ＴＲＥＭ−１機能を遮断する。
【００２９】
本開示の抗ＴＲＥＭ−１抗体は、ＴＲＥＭ−１を直接的または間接的に遮断するいくつかの異なる機構のうち１つまたはその組み合わせによって、ＴＲＥＭ−１シグナル伝達を遮断する。一実施形態では、これらの抗体は、ＴＲＥＭ−１の天然リガンドであるペプチドグリカン認識タンパク質１（ＰＧＬＹＲＰ１）が、ＴＲＥＭ−１との機能的複合体を創出するのを防止する。別の実施形態では、これらの抗体は、個々のＴＲＥＭ−１分子がダイマーもマルチマーも形成しないように防止することによって、ＴＲＥＭ−１を遮断する。一部の実施形態では、ＴＲＥＭ−１のダイマー化またはマルチマー化は、さもなくばＴＲＥＭ−１ダイマーの界面中に存在するＴＲＥＭ−１の一部分に結合し、それによって、個々のＴＲＥＭ−１分子が互いに会合するのを防止することが可能な抗ＴＲＥＭ−１抗体によって、低減または防止される。他の実施形態では、ＴＲＥＭ−１のダイマー化またはマルチマー化は、ＴＲＥＭ−１とそのリガンドとの相互作用を妨害する抗ＴＲＥＭ−１抗体によって低減または防止される。
【００３０】
一部の実施形態では、抗ＴＲＥＭ−１抗体は、ＴＲＥＭ−１の、ＰＧＬＹＲＰ１誘導性の活性化を遮断できる。ＰＧＬＹＲＰ１は、シグナルペプチドおよびペプチドグリカン結合ドメインからなる、高度に保存された１９６アミノ酸長のタンパク質であり、好中球において発現され、それらの活性化の際に放出される。ＰＧＬＹＲＰ１のアミノ酸配列（アクセッション番号ＮＰ＿００５０８２．１；配列番号８）は、以下に提供される：
ＭＳＲＲＳＭＬＬＡＷＡＬＰＳＬＬＲＬＧＡＡＱＥＴＥＤＰＡＣＣＳＰＩＶＰＲＮＥＷＫＡＬＡＳＥＣＡＱＨＬＳＬＰＬＲＹＶＶＶＳＨＴＡＧＳＳＣＮＴＰＡＳＣＱＱＱＡＲＮＶＱＨＹＨＭＫＴＬＧＷＣＤＶＧＹＮＦＬＩＧＥＤＧＬＶＹＥＧＲＧＷＮＦＴＧＡＨＳＧＨＬＷＮＰＭＳＩＧＩＳＦＭＧＮＹＭＤＲＶＰＴＰＱＡＩＲＡＡＱＧＬＬＡＣＧＶＡＱＧＡＬＲＳＮＹＶＬＫＧＨＲＤＶＱＲＴＬＳＰＧＮＱＬＹＨＬＩＱＮＷＰＨＹＲＳＰ（シグナル配列は下線付きである）。
【００３１】
従って、一部の実施形態では、本開示の抗ＴＲＥＭ−１抗体は、ミエロイド細胞（例えば、樹状細胞および単球）からの炎症促進性サイトカインの放出を下方調節または遮断する。一部の実施形態では、これらの抗ＴＲＥＭ−１抗体は、本明細書で開示されるように、マクロファージ、好中球、滑膜組織細胞および／またはレポーター細胞からのＴＮＦ−α、ＭＩＰ−１ベータ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−６および／またはＩＬ−８の放出を遮断する。
【００３２】
外来抗原に応答した炎症性サイトカインの制御された放出は、有益であり得るが（例えば、有効な適応免疫応答を開始させる）、過度の炎症性サイトカイン放出は、悲惨な結果を有し得る。例えば、細胞表面免疫受容体に対するある特定の抗体（例えば、抗ヒトＣＤ３抗体、例えばＯＫＴ３）のｉｎ  ｖｉｖｏ投与で観察された１つの一般的な毒性の臨床的合併症は、循環中への種々のサイトカイン（例えば、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマおよびＩＬ−２）の過剰な放出と関連するサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）である。ＣＲＳは、そのコグネート抗原（例えば、Ｔ細胞上のＣＤ３）（抗体の可変領域を介して）ならびにアクセサリー細胞（例えば、抗原提示細胞）上のＦｃ受容体（例えば、ＦｃγＲ）および／または補体受容体（抗体の定常領域を介して）への抗体の同時結合の結果として生じ得る。この相互作用は、細胞（例えば、Ｔ細胞および／またはアクセサリー細胞）の活性化、ならびに低血圧、発熱（ｐｙｒｅｘｉａ）および悪寒（ｒｉｇｏｒｓ）を特徴とする全身性炎症応答を生じる種々のサイトカインの放出を生じる。ＣＲＳの他の症状には、発熱（ｆｅｖｅｒ）、悪寒（ｃｈｉｌｌ）、悪心、嘔吐および呼吸困難が含まれる。
【００３３】
炎症性サイトカインの、ＰＧＬＹＲＰ１誘導性の産生を遮断することに加えて、一実施形態では、本開示の抗ＴＲＥＭ−１抗体は、それを必要とする対象に投与された場合に、サイトカイン放出症候群の発生率を低減させる、またはその発生率を生じさせない。一部の実施形態では、これらの抗ＴＲＥＭ−１抗体は、細胞（例えば、樹状細胞）を抗体単独の存在下でインキュベートした場合に、配列番号７６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号５４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗体と比較して、これらの細胞による炎症性サイトカインの発現を誘導しない。一部の実施形態では、これらの抗ＴＲＥＭ−１抗体は、１つ以上のＦｃγＲへの減少した結合を有し、これが、ＣＳＲの発生の低減を補助し得る。
【００３４】
一部の実施形態では、本開示の抗ＴＲＥＭ−１抗体は、ヒトＴＲＥＭ−１および別の種由来のＴＲＥＭ−１の両方に結合する。従って、用語「ＴＲＥＭ−１」は、本明細書で使用する場合、任意の適切な生物に由来し得るＴＲＥＭ−１の任意の天然に存在する形態を包含する。例えば、本明細書に記載される使用のためのＴＲＥＭ−１は、脊椎動物ＴＲＥＭ−１、例えば、哺乳動物ＴＲＥＭ−１、例えば、霊長類（例えば、ヒト、チンパンジー、カニクイザルまたはアカゲザル）；げっ歯類（例えば、マウスまたはラット）、ウサギ類（例えば、ウサギ）または偶蹄類（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタまたはラクダ）由来のＴＲＥＭ−１であり得る。ある特定の実施形態では、ＴＲＥＭ−１は、配列番号１（ヒトＴＲＥＭ−１、アイソフォーム１）である。このＴＲＥＭ−１は、ＴＲＥＭ−１の成熟形態、例えば、適切な細胞内で翻訳後プロセシングを受けたＴＲＥＭ−１タンパク質であり得る。かかる成熟ＴＲＥＭ−１タンパク質は、例えば、グリコシル化され得る。このＴＲＥＭ−１は、全長ＴＲＥＭ−１タンパク質であり得る。
【００３５】
一部の実施形態では、本開示の抗ＴＲＥＭ−１抗体は、Ｂリンパ球の単一クローンに直接的または間接的に由来するという意味で、モノクローナル抗体である。一部の実施形態では、これらの抗ＴＲＥＭ−１抗体は、例えば、国際出願公開番号ＷＯ２０１３／１２０５５３の実施例に記載される方法を使用して、産生、スクリーニングおよび精製される。簡潔に述べると、適切なマウス、例えば、ＴＲＥＭ−１またはＴＲＥＭ−ｌ／ＴＲＥＭ−３ノックアウト（ＫＯ）マウスが、ＴＲＥＭ−１、ＴＲＥＭ−１発現細胞、または両方の組み合わせによって免疫される。別の実施形態では、これらの抗ＴＲＥＭ−１抗体は、本明細書で開示されるモノクローナル抗体の混合物であるという意味で、ポリクローナル抗体である。
【００３６】
一部の実施形態では、本開示の抗ＴＲＥＭ−１抗体は、原核生物細胞または真核生物細胞において組換え発現される。一部の実施形態では、この原核生物細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。ある特定の実施形態では、この真核生物は、酵母、昆虫または哺乳動物細胞、例えば、霊長類（例えば、ヒト、チンパンジー、カニクイザルまたはアカゲザル）、げっ歯類（例えば、マウスまたはラット）、ウサギ類（例えば、ウサギ）または偶蹄類（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタまたはラクダ）である生物に由来する細胞である。適切な哺乳動物細胞株には、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞およびＨＥＬＡ細胞が含まれるがこれらに限定されない。本明細書で開示される抗ＴＲＥＭ−１抗体は、当業者に公知の他の方法、例えば、ファージディスプレイまたは酵母ディスプレイによっても産生され得る。産生されると、抗体は、国際出願公開番号ＷＯ２０１３／１２０５５３の実施例に記載された方法を使用して、例えば、全長ＴＲＥＭ−１またはその変異体への結合についてスクリーニングされ得る。
【００３７】
用語「抗体」は、本明細書で使用する場合、抗原（ＴＲＥＭ−１）またはその一部分に特異的に結合することが可能な、生殖系列免疫グロブリン配列に由来するタンパク質を指す。この用語は、任意のクラスまたはアイソタイプ（即ち、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよび／またはＩｇＹ）の全長抗体およびそれらの任意の単一の鎖または断片を含む。抗原またはその部分に特異的に結合する抗体は、その抗原もしくはその部分に排他的に結合し得、または限定数の相同な抗原もしくはその部分に結合し得る。全長抗体は通常、ジスルフィド結合によって相互連結された、少なくとも４つのポリペプチド鎖：２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む。医薬的に特に目的とされる１つの免疫グロブリンサブクラスは、ＩｇＧファミリーである。ヒトでは、ＩｇＧクラスは、それらの重鎖定常領域の配列に基づいて、４つのサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に下位分割され得る。軽鎖は、それらの配列組成における差異に基づいて、２つの型、カッパおよびラムダへと分割され得る。ＩｇＧ分子は、２つ以上のジスルフィド結合によって連結された２つの重鎖、および１つのジスルフィド結合によって重鎖に各々結合された２つの軽鎖から構成される。重鎖は、１つの重鎖可変領域（ＶＨ）および最大で３つの重鎖定常（ＣＨ）領域：ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含み得る。軽鎖は、１つの軽鎖可変領域（ＶＬ）および１つの軽鎖定常領域（ＣＬ）を含み得る。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が介在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域へとさらに下位分割され得る。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、典型的には、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順で配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の超可変領域は、抗原と相互作用することが可能な結合ドメインを形成するが、抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞（エフェクター細胞）、Ｆｃ受容体および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）が含まれるがこれらに限定されない宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。本発明の抗体は、単離され得る。用語「単離された抗体」は、それが産生された環境中の他の構成要素から分離および／もしくは回収された、ならびに／またはそれが産生された環境中に存在する構成要素の混合物から精製された、抗体を指す。抗体の抗原結合機能が全長抗体の断片によって果たされ得ることが示されているので、抗体のある特定の抗原結合断片は、本発明に照らして適切であり得る。
【００３８】
抗体の「抗原結合部分」という用語は、本明細書に記載される、抗原、例えば、ＴＲＥＭ−１に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。抗原結合断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）Ｓ、Ｆｖ（典型的には、抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメイン）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ；例えば、Bird et al., Science  242:42S-426 (1988)；Huston et al., PNAS 85: 5879-5883 (1988)を参照のこと）、ｄｓＦｖ、Ｆｄ（典型的には、ＶＨおよびＣＨ１ドメイン）、およびｄＡｂ（典型的には、ＶＨドメイン）断片；ＶＨ、ＶＬ、ＶｈＨおよびＶ−ＮＡＲドメイン；単一のＶＨおよび単一のＶＬ鎖を含む一価分子；ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ディアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）およびカッパボディ（ｋａｐｐａ  ｂｏｄｙ）（例えば、Ill et al., Protein Eng 10:949-57 (1997)を参照のこと）；ラクダＩｇＧ；ＩｇＮＡＲ；ならびに、単離されたＣＤＲまたは抗原結合残基もしくはポリペプチドが、機能的抗体断片を形成するように一緒に会合または連結され得る、１つ以上の単離されたＣＤＲまたは機能的パラトープ、が含まれる。種々の型の抗体断片は、例えば、Holliger and Hudson, Nat Biotechnol 2S :1126-1136 (2005)；国際出願公開番号ＷＯ２００５／０４０２１９、ならびに米国特許出願公開第２００５／０２３８６４６号および同第２００２／０１６１２０１号において記載または概説されている。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技術を使用して取得され得、これらの断片は、インタクトな抗体と同じ様式で、有用性についてスクリーニングされ得る。
【００３９】
「ヒト」抗体（ＨｕＭＡｂ）は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域の両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を指す。さらに、抗体が定常領域を含む場合、この定常領域も、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。本明細書に記載される抗ＴＲＥＭ−１抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、ランダムもしくは部位特異的変異誘発によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで、または体細胞変異によってｉｎ  ｖｉｖｏで導入された変異）を含み得る。しかし、用語「ヒト抗体」は、本明細書で使用する場合、別の哺乳動物種、例えばマウスの生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列にグラフトされた抗体は含まない意図である。用語「ヒト」抗体および「完全ヒト」抗体は、同義語として使用される。
【００４０】
「ヒト化」抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する１つ以上の配列（ＣＤＲ領域またはその一部）を含むヒト／非ヒトキメラ抗体を指す。従って、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が少なくとも、所望の特異性、親和性、配列組成および機能性を有する、非ヒト種由来の、例えば、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類由来の抗体（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基で置き換えられた、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の場合には、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。かかる改変の例は、典型的にはドナー抗体に由来するアミノ酸残基である、１つ以上のいわゆる逆変異の導入である。抗体のヒト化は、当業者に公知の組換え技術を使用して実施され得る（例えば、Antibody Engineering, Methods in Molecular Biology, vol. 248, edited by Benny K. C. Loを参照のこと）。軽鎖および重鎖の両方の可変ドメインに適切なヒトレシピエントフレームワークは、例えば、配列または構造的相同性によって同定され得る。あるいは、固定されたレシピエントフレームワークが、例えば、構造、生物物理学的および生化学的特性の知識に基づいて、使用され得る。レシピエントフレームワークは、生殖系列由来であり得る、または成熟抗体配列に由来し得る。ドナー抗体由来のＣＤＲ領域は、ＣＤＲグラフティングによって移入され得る。ＣＤＲグラフトされたヒト化抗体は、ドナー抗体由来のアミノ酸残基の再導入（逆変異）がヒト化抗体の特性に対して有益な影響を有する重要なフレームワーク位置の同定によって、例えば、親和性、機能性および生物物理学的特性についてさらに最適化され得る。ドナー抗体由来の逆変異に加えて、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域またはフレームワーク領域中の生殖系列残基の導入、免疫原性エピトープの排除、部位特異的変異誘発、親和性成熟などによって操作され得る。
【００４１】
さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中にもドナー抗体中にも見出されない残基を含み得る。これらの改変は、抗体の性能をさらに洗練させるために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインを含み、ここで、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ残基の全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的には、ヒト免疫グロブリンのものもまた、任意に含み得る。用語「ヒト化抗体誘導体」は、ヒト化抗体の任意の改変された形態、例えば、抗体と別の薬剤または抗体とのコンジュゲートを指す。
【００４２】
用語「組換えヒト抗体」は、本明細書で使用する場合、組換え手段によって調製、発現、創出または単離された全てのヒト抗体、例えば、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックもしくはトランスクロモソーマル（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）な動物（例えば、マウス）またはそれから調製されたハイブリドーマから単離された抗体、（ｂ）抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマ（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａ）から単離された抗体、（ｃ）組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、および（ｄ）他のＤＮＡ配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングが関与する任意の他の手段によって調製、発現、創出または単離された抗体、を含む。かかる組換えヒト抗体は、生殖系列遺伝子によってコードされる特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列を利用する可変領域および定常領域を含むが、例えば抗体の成熟化の間に生じる引き続く再編成および変異を含む。当該分野で公知のように（例えば、Lonberg Nature Biotech. 23(9): 1117- 1125 (2005)を参照のこと）、可変領域は、外来抗原に対して特異的な抗体を形成するように再編成される種々の遺伝子によってコードされる抗原結合ドメインを含む。再編成に加えて、可変領域は、外来抗原に対する抗体の親和性を増加させるために、複数の単一アミノ酸変化（体細胞変異または高頻度変異と呼ばれる）によってさらに改変され得る。定常領域は、抗原にさらに応答して変化する（即ち、アイソタイプスイッチ）。従って、抗原に応答して再編成され体細胞変異された、軽鎖および重鎖免疫グロブリンポリペプチドをコードする核酸分子は、元の核酸分子に対する配列同一性は有し得ないが、その代わり、実質的に同一または類似である（即ち、少なくとも８０％の同一性を有する）。
「キメラ抗体」は、可変領域が１つの種に由来し、定常領域が別の種に由来する抗体、例えば、可変領域がマウス抗体に由来し、定常領域がヒト抗体に由来する抗体を指す。
【００４３】
一実施形態では、本開示の抗ＴＲＥＭ−１抗体は、ＩｇＧ抗体である。「ＩｇＧ抗体」、例えば、ヒトＩｇＧ１は、本明細書で使用する場合、ある特定の実施形態では、天然に存在するＩｇＧ抗体の構造を有する、即ち、同じサブクラスの天然に存在するＩｇＧ抗体と同じ数の重鎖および軽鎖ならびにジスルフィド結合を有する。例えば、ＴＲＥＭ−１  ＩｇＧ１抗体は、２つの重鎖（ＨＣ）および２つの軽鎖（ＬＣ）からなり、これら２つの重鎖および軽鎖は、天然に存在するＩｇＧ１抗体中に存在するジスルフィド架橋と同じ数および位置のジスルフィド架橋によって連結される（抗体がジスルフィド架橋を改変するように変異していない限り）。
本明細書で使用する場合、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＥ抗体）を指す。
【００４４】
「アロタイプ」は、特定のアイソタイプ群内の天然に存在するバリアントを指し、これらのバリアントは、いくつかのアミノ酸が異なる（例えば、Jefferis et al., mAbs 1:1 (2009)を参照のこと）。本明細書に記載される抗ＴＲＥＭ−１抗体は、任意のアロタイプのものであり得る。一部の実施形態では、これらの抗ＴＲＥＭ−１抗体は、野生型ＩｇＧ１アイソタイプ（例えば、配列番号９）と比較して、ＥＵ番号付けに従って、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＥおよびＧ２３７Ａからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む「ＩｇＧ１．３ｆ」アロタイプのものである。他の実施形態では、これらの抗ＴＲＥＭ−１抗体は、野生型ＩｇＧ１アイソタイプ（例えば、配列番号９）と比較して、ＥＵ番号付けに従って、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む「ＩｇＧ１．１ｆ」アロタイプのものである。ある特定の実施形態では、これらの抗ＴＲＥＭ−１抗体は、野生型ＩｇＧ１アイソタイプ（例えば、配列番号９）と比較して、ＥＵ番号付けに従って、Ｋ２１４Ｒ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９ＳおよびＰ２３８Ｓからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む「ＩｇＧ１−Ａｂａ」アロタイプのものである。さらなる実施形態では、これらの抗ＴＲＥＭ−１抗体は、野生型ＩｇＧ４アイソタイプ（例えば、配列番号１０）のＣＨ１ドメインならびにＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む「ＩｇＧ４−Ａｂａ」アロタイプのものである。一部の実施形態では、このＩｇＧ４−Ａｂａアロタイプ抗体は、野生型ＩｇＧ１アイソタイプ（例えば、配列番号９）と比較して、ＥＵ番号付けに従って、Ｓ１３１Ｃ、Ｋ１３３Ｒ、Ｇ１３７Ｅ、Ｇ１３８Ｓ、Ｑ１９６Ｋ、Ｉ１９９Ｔ、Ｎ２０３Ｄ、Ｋ２１４Ｒ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９ＳおよびＰ２３８Ｓからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。
語句「抗原を認識する抗体」および「抗原に対して特異的な抗体」は、本明細書で、用語「抗原に特異的に結合する抗体」と相互交換可能に使用される。
「単離された抗体」は、本明細書で使用する場合、それが産生された環境中の他の構成要素から分離および／もしくは回収された、ならびに／またはそれが産生された環境中に存在する構成要素の混合物から精製された、抗体を指す意図である。
【００４５】
「エフェクター機能」は、抗体Ｆｃ領域とＦｃ受容体もしくはリガンドとの相互作用、またはそれから生じる生化学的事象を指す。例示的な「エフェクター機能」には、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、ＦｃγＲ媒介性エフェクター機能、例えば、ＡＤＣＣおよび抗体依存性細胞媒介性ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）、ならびに細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方調節が含まれる。かかるエフェクター機能は、一般に、Ｆｃ領域が結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わされることを必要とする。一実施形態では、本開示の抗ＴＲＥＭ−１抗体は、１つ以上のＦｃγＲに結合しないＦｃ領域を含み、従って、エフェクター機能を欠く（即ち、エフェクターなし）。
【００４６】
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、免疫グロブリンのＦｃ領域に結合する受容体である。ＩｇＧ抗体に結合するＦｃＲは、それらの受容体の対立遺伝子バリアントおよび選択的スプライシングされた形態を含む、ＦｃγＲファミリーの受容体を含む。ＦｃγＲファミリーは、３つの活性化受容体（マウスではＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃγＲＩＶ；ヒトではＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡ）および１つの阻害性受容体（ＦｃγＲＩＩＢ）からなる。ヒトＦｃγＲの種々の特性は、当該分野で公知である。自然エフェクター細胞型の大部分は、１つ以上の活性化ＦｃγＲおよび阻害性ＦｃγＲＩＩＢを共発現するが、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、１つの活性化Ｆｃ受容体（マウスではＦｃγＲＩＩＩ、ヒトではＦｃγＲＩＩＩＡ）を選択的に発現し、マウスおよびヒトでは阻害性ＦｃγＲＩＩＢを発現しない。ヒトＩｇＧ１は、ほとんどのヒトＦｃ受容体に結合し、それが結合する活性化Ｆｃ受容体の型に関して、マウスＩｇＧ２ａと等価とみなされる。
「Ｆｃ領域」（結晶性断片領域）または「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ」は、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）上に位置するＦｃ受容体への結合または古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）への結合を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介する、抗体の重鎖のＣ末端領域を指す。従って、Ｆｃ領域は、第１の定常領域免疫グロブリンドメイン（例えば、ＣＨ１またはＣＬ）を除外した、抗体の定常領域を含む。
【００４７】
ＩｇＧでは、Ｆｃ領域は、免疫グロブリンドメインＣＨ２およびＣＨ３ならびにＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間のヒンジを含む。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界の定義は、本明細書で定義されるように変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１についてはアミノ酸残基Ｄ２２１、ＩｇＧ２についてはＶ２２２、ＩｇＧ３についてはＬ２２１およびＩｇＧ４についてはＰ２２４から、重鎖のカルボキシ末端まで延びると定義され、ここで、番号付けは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインは、アミノ酸２３７からアミノ酸３４０まで延び、ＣＨ３ドメインは、Ｆｃ領域中でＣＨ２ドメインのＣ末端側に位置付けられる、即ち、ＣＨ３ドメインは、ＩｇＧのアミノ酸３４１からアミノ酸４４７または４４６（Ｃ末端リジン残基が存在しない場合）もしくは４４５（Ｃ末端グリシンおよびリジン残基が存在しない場合）まで延びる。本明細書で使用する場合、Ｆｃ領域は、任意のアロタイプバリアントを含むネイティブ配列Ｆｃ、またはバリアントＦｃ（例えば、天然に存在しないＦｃ）であり得る。Ｆｃは、切り離された、または、「Ｆｃ融合タンパク質」とも呼ばれる、Ｆｃ含有タンパク質ポリペプチド、例えば、「Ｆｃ領域を含む結合タンパク質」（例えば、抗体またはイムノアドヘシン（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｏｎ））との関連での、この領域もまた指し得る。
【００４８】
「ネイティブ配列Ｆｃ領域」または「ネイティブ配列Ｆｃ」は、天然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。ネイティブ配列ヒトＦｃ領域には、ネイティブ配列ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域；ネイティブ配列ヒトＩｇＧ２  Ｆｃ領域；ネイティブ配列ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域；およびネイティブ配列ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域、ならびにそれらの天然に存在するバリアントが含まれる。ネイティブ配列Ｆｃには、種々のアロタイプのＦｃが含まれる（例えば、Jefferis et al., mAbs 1: 1 (2009)を参照のこと）。
【００４９】
「バリアント配列Ｆｃ領域」または「天然に存在しないＦｃ」は、その機能的特性、例えば、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、タンパク質安定性および／もしくは抗原依存性細胞性細胞傷害のうち１つ以上を典型的には変更するための改変、またはとりわけ、それらの欠如を含む。一部の実施形態では、本開示の抗ＴＲＥＭ−１抗体は、抗体の１つ以上の機能的特性を再度変更するために、化学的に改変され得る（例えば、１つ以上の化学的部分が抗体に結合され得る）、またはそのグリコシル化を変更するように改変され得る。一実施形態では、この抗ＴＲＥＭ−１抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプであり、それぞれ、ある特定のＦｃ受容体に対する減少した親和性を生じる変異（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＥおよびＧ２３７Ａ）および低減されたＣ１ｑ媒介性補体結合を生じる変異（Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ）のうち１つ以上、おそらくは全てを含む、改変されたＦｃドメインを保有する（ＥＵインデックスに従う残基番号付け）。
【００５０】
用語「ヒンジ」、「ヒンジドメイン」、「ヒンジ領域」および「抗体ヒンジ領域」は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに接合させる重鎖定常領域のドメインを指し、ヒンジの上、中央および下の部分を含む（Roux et al., J Immunol 161:4083 (1998)）。ヒンジは、抗体の結合領域とエフェクター領域との間の変動するレベルの可動性を提供し、２つの重鎖定常領域間の分子間ジスルフィド結合のための部位もまた提供する。本明細書で使用する場合、ヒンジは、全てのＩｇＧアイソタイプのＧｌｕ２１６で始まり、Ｇｌｙ２３７で終わる（Roux et al., J Immunol 161:4083 (1998)）。野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４ヒンジの配列は、当該分野で公知である（例えば、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１７／０８７６７８）。一実施形態では、抗ＴＲＥＭ−１抗体のＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が変更される、例えば、増加または減少されるように、改変される。このアプローチは、例えば、米国特許第５，６７７，４２５号にさらに記載されている。
【００５１】
定常領域は、例えば、二価抗体が２つの一価ＶＨ−ＶＬ断片へと分離するリスクを低減させるために、抗体を安定化するように改変され得る。例えば、ＩｇＧ４定常領域では、残基Ｓ２２８（ＥＵインデックスに従う残基番号付け）は、ヒンジにおける重鎖間ジスルフィド架橋形成を安定化するために、プロリン（Ｐ）残基に変異され得る（例えば、Angal et al., Mol Immunol. 30: 105-8(1995)を参照のこと）。抗体またはその断片は、それらの相補性決定領域（ＣＤＲ）の観点からも定義され得る。用語「相補性決定領域」または「超可変領域」は、本明細書で使用する場合、抗原結合に関与するアミノ酸残基が位置する抗体の領域を指す。超可変性の領域またはＣＤＲは、抗体可変ドメインのアミノ酸アラインメントにおいて最も高い可変性を有する領域として同定することができる。データベース、例えば、Ｋａｂａｔデータベースが、ＣＤＲ同定のために使用され得、ＣＤＲは、例えば、軽鎖可変ドメインのアミノ酸残基２４〜３４（ＣＤＲ１）、５０〜５９（ＣＤＲ２）および８９〜９７（ＣＤＲ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の３１〜３５（ＣＤＲ１）、５０〜６５（ＣＤＲ２）および９５〜１０２（ＣＤＲ３）を含むと定義される（Kabat et al. 1991 ; Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242）。あるいは、ＣＤＲは、「超可変ループ」由来の残基（軽鎖可変ドメイン中の残基２６〜３３（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 196 : 901-917 (1987)）として定義され得る。典型的には、この領域中のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al.、上記に記載される方法によって実施される。本明細書の「Ｋａｂａｔ位置」、「Ｋａｂａｔ残基」および「Ｋａｂａｔに従う」などの語句は、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインについての、この番号付けシステムを指す。このＫａｂａｔ番号付けシステムを使用して、ペプチドの実際の線状アミノ酸配列は、可変ドメインのフレームワーク（ＦＲ）もしくはＣＤＲの短縮に対応するより少ないもしくはさらなるアミノ酸、またはその中への挿入を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、ＣＤＲ  Ｈ２の残基５２の後に、アミノ酸挿入（Ｋａｂａｔに従って残基５２ａ、５２ｂおよび５２ｃ）を含み得、重鎖ＦＲ残基８２の後に、挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔに従って残基８２ａ、８２ｂおよび８２ｃなど）を含み得る。残基のＫａｂａｔ番号付けは、「標準的な」Ｋａｂａｔ番号付けされた配列との、その抗体の配列の相同性の領域におけるアラインメントによって、所与の抗体について決定され得る。
【００５２】
用語「エピトープ」または「抗原決定基」は、例えば、それを同定するために使用した具体的な方法によって定義される、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する抗原（例えば、ＴＲＥＭ−１）上の部位を指す。エピトープは、連続アミノ酸（通常は、線状エピトープ）、またはタンパク質の三次フォールディングによって隣接した非連続アミノ酸（通常は、コンフォメーションエピトープ）の両方から形成され得る。連続アミノ酸から形成されたエピトープは、変性溶媒への曝露の際に、常にではないが典型的には保持され、一方で、三次フォールディングによって形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒による処理の際に失われる。エピトープは、典型的には、独自の空間的コンフォメーション中に、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸を含む。どのエピトープが所与の抗体によって結合されるかを決定するための方法（即ち、エピトープマッピング）は、当該分野で周知であり、これには、例えば、イムノブロッティングおよび免疫沈降アッセイが含まれ、ここで、（例えば、ＴＲＥＭ−１由来の）重複するまたは連続するペプチドは、所与の抗体（例えば、抗ＴＲＥＭ−１抗体）との反応性について試験される。エピトープの空間的コンフォメーションを決定する方法には、当該分野のおよび本明細書に記載される技術、例えば、ｘ線結晶解析、抗原変異分析、２次元核磁気共鳴およびＨＤＸ−ＭＳが含まれる（例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)を参照のこと）。
【００５３】
２つ以上の抗体に言及して、「同じエピトープに結合する」という用語は、それらの抗体が、所与の方法によって決定した場合に、アミノ酸残基の同じセグメントに結合することを意味する。抗体が本明細書に記載される抗体と「ＴＲＥＭ−１上の同じエピトープ」に結合するかどうかを決定するための技術には、例えば、エピトープマッピング法、例えば、エピトープの原子分解を提供する抗原：抗体複合体の結晶のｘ線分析、および水素／重水素交換質量分析（ＨＤＸ−ＭＳ）が含まれる。他の方法が、抗原断片または抗原の変異バリエーションへの抗体の結合をモニタリングし、ここで、抗原配列内のアミノ酸残基の改変に起因する結合の喪失は、エピトープ構成要素の現れとしばしばみなされる。さらに、エピトープマッピングのための計算的コンビナトリアル法もまた使用され得る。これらの方法は、目的の抗体が、コンビナトリアルファージディスプレイペプチドライブラリーから、特異的な短いペプチドを親和性単離する能力に依存する。同じＶＨおよびＶＬまたは同じＣＤＲ１、２および３配列を有する抗体は、同じエピトープに結合すると予測される。
【００５４】
「標的への結合について別の抗体と競合する」抗体は、標的への他の抗体の結合を（部分的または完全に）阻害する抗体を指す。２つの抗体が標的への結合について互いに競合するかどうか、即ち、一方の抗体が標的への他方の抗体の結合を阻害するかどうかおよびその程度は、公知の競合実験、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析を使用して決定され得る。ある特定の実施形態では、抗体は、標的への別の抗体の結合と競合し、それを少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害する。阻害または競合のレベルは、どちらの抗体が「遮断抗体」（即ち、標的と最初にインキュベートされる寒冷抗体）であるかに依存して異なり得る。競合アッセイは、例えば、Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harb Protoc ; 2006; doi: 10.1101/pdb.prot4277またはChapter 11 of "Using Antibodies" by Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA 1999に記載されるように実施され得る。２つの抗体が、互いに双方向で少なくとも５０％遮断する場合、即ち、一方の抗体が競合実験において抗原と最初に接触するか他方の抗体が競合実験において抗原と最初に接触するかにかかわらず、これらの抗体は、「交差競合する」。
【００５５】
本明細書で使用する場合、用語「特異的結合」、「選択的結合」、「選択的に結合する」および「特異的に結合する」は、所定の抗原上のエピトープへの抗体結合を指す。典型的には、抗体は、（ｉ）例えば、分析物として所定の抗原、例えば組換えヒトＴＲＥＭ−１を使用し、リガンドとして抗体を使用するＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００機器における表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）テクノロジーによって、または抗原陽性細胞への抗体の結合のＳｃａｔｃｈａｒｄ分析によって決定した場合に、およそ１０-7Ｍ未満、例えば、およそ１０-8Ｍ、１０-9Ｍもしくは１０-10Ｍ未満またはさらに低い平衡解離定数（ＫD）で結合する、および（ｉｉ）所定の抗原または密接に関連した抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合についてのその親和性よりも少なくとも２倍大きい親和性で、所定の抗原に結合する。従って、「ヒトＴＲＥＭ−１に特異的に結合する」抗体は、１０-7Ｍ以下、例えば、およそ１０-8Ｍ、１０-9Ｍもしくは１０-10Ｍ未満またはさらに低いＫDで、可溶性または細胞結合型ヒトＴＲＥＭ−１に結合する抗体を指す。「カニクイザルＴＲＥＭ−１と交差反応する」抗体は、１０-7Ｍ以下、例えば、およそ１０-8Ｍ、１０-9Ｍもしくは１０-10Ｍ未満またはさらに低いＫDで、カニクイザルＴＲＥＭ−１に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、非ヒト種由来のＴＲＥＭ−１と交差反応しないかかる抗体は、標準的な結合アッセイにおいて、これらのタンパク質に対する本質的に検出不能な結合を示す。
【００５６】
本明細書の用語「結合特異性」は、分子、例えば、抗体またはその断片と、単一の排他的な抗原または限定数の高度に相同な抗原（もしくはエピトープ）との相互作用を指す。対照的に、ＴＲＥＭ−１に特異的に結合することが可能な抗体は、非類似の分子に結合することが不可能である。本発明に従う抗体は、ナチュラルキラー細胞ｐ４４関連タンパク質Ｎｋｐ４４に結合することが不可能であり得る。
相互作用の特異性および平衡結合定数の値は、周知の方法によって直接的に決定され得る。リガンド（例えば、抗体）がそれらの標的に結合する能力を評価するための標準的なアッセイは、当該分野で公知であり、これには、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ＲＩＡおよびフローサイトメトリー分析が含まれる。抗体の結合速度論および結合親和性もまた、当該分野で公知の標準的なアッセイ、例えばＳＰＲによって評価され得る。
【００５７】
２つの抗体が結合について競合または交差競合するかどうかを決定するための競合的結合アッセイには、以下が含まれる：例えば、実施例に記載されるようなフローサイトメトリーによる、ＴＲＥＭ−１を発現するミエロイド細胞への結合についての競合。他の方法には、以下が含まれる：ＳＰＲ（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標））、固相直接または間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接または間接酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983)を参照のこと）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986)を参照のこと）；固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)を参照のこと）；１−１２５標識を使用する固相直接標識ＲＩＡ（Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988)を参照のこと）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Cheung et al., Virology 176:546 (1990)）；および直接標識ＲＩＡ（Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990)）。
【００５８】
本明細書で使用する場合、用語「ビン」は、参照抗体を使用して定義される。第２の抗体が、参照抗体と同時に抗原に結合することができない場合、この第２の抗体は、参照抗体と同じ「ビン」に属すると言われる。この場合、参照抗体および第２の抗体は、抗原の同じ部分に競合的に結合し、「競合抗体」と呼ばれる。第２の抗体が、参照抗体と同時に抗原に結合することが可能である場合、この第２の抗体は、別々の「ビン」に属すると言われる。この場合、参照抗体および第２の抗体は、抗原の同じ部分に競合的に結合せず、「非競合抗体」と呼ばれる。
【００５９】
抗体「ビニング」は、エピトープについての直接的な情報を提供しない。競合抗体、即ち、同じ「ビン」に属する抗体は、同一のエピトープ、重複するエピトープまたはさらには別々のエピトープを有し得る。後者は、抗原上のそのエピトープに結合した参照抗体が、第２の抗体が抗原上のそのエピトープに接触するのに必要とされる空間を占める場合に当てはまる（「立体障害」）。非競合抗体は、一般に、別々のエピトープを有する。
本明細書の用語「結合親和性」は、２つの分子間、例えば、抗体またはその断片と抗原との間の非共有結合相互作用の強度の尺度を指す。用語「結合親和性」は、一価相互作用（固有の活性）を記載するために使用される。
一価相互作用を介した、２つの分子間、例えば、抗体またはその断片と抗原との間の結合親和性は、平衡解離定数（ＫD）の決定によって定量化され得る。次に、ＫDは、例えば、ＳＰＲ法による、複合体の形成および解離の速度論の測定によって決定され得る。一価複合体の会合および解離に対応する速度定数は、それぞれ、会合速度定数ｋa（またはｋon）および解離速度定数ｋd（またはｋ0ff）と呼ばれる。ＫDは、方程式ＫD＝ｋd／ｋaを介して、ｋaおよびｋdと関連付けられる。上記定義によれば、異なる分子相互作用と関連する結合親和性、例えば、所与の抗原に対する異なる抗体の結合親和性の比較は、個々の抗体／抗原複合体についてのＫD値の比較によって比較され得る。
【００６０】
本明細書で使用する場合、ＩｇＧ抗体について「高い親和性」という用語は、標的抗原に対する１０-8Ｍ以下、１０-9Ｍ以下または１０-10Ｍ以下のＫDを有する抗体を指す。しかし、「高い親和性」の結合は、他の抗体アイソタイプについて変動し得る。例えば、ＩｇＭアイソタイプについての「高い親和性」の結合は、１０-10Ｍ以下または１０-8Ｍ以下のＫDを有する抗体を指す。
抗体またはその抗原結合断片を使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイとの関連での「ＥＣ50」という用語は、最大応答の５０％、即ち、最大応答とベースラインとの間の中間である応答を誘導する、抗体またはその抗原結合部分の濃度を指す。
用語「天然に存在する」は、目的語に適用して本明細書で使用する場合、目的語が天然に見出され得るという事実を指す。例えば、天然の供給源から単離され得、実験室において人によって故意に改変されていない、生物（ウイルスを含む）中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。
【００６１】
「ポリペプチド」は、少なくとも２つの連続して連結されたアミノ酸残基を含む鎖を指し、鎖の長さについて上限はない。タンパク質中の１つ以上のアミノ酸残基が、例えば、グリコシル化、リン酸化またはジスルフィド結合形成であるがこれらに限定されない改変を含み得る。「タンパク質」は、１つ以上のポリペプチドを含み得る。
用語「核酸分子」は、本明細書で使用する場合、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含む意図である。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得、ｃＤＮＡであり得る。
【００６２】
「保存的アミノ酸置換」は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基による、アミノ酸残基の置換を指す。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。ある特定の実施形態では、抗ＴＲＥＭ−１抗体中の予測された非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置き換えられる。抗原結合を排除しないヌクレオチドおよびアミノ酸の保存的置換を同定する方法は、当該分野で周知である（例えば、Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993)；Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999)；およびBurks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997)を参照のこと）。
【００６３】
核酸について、用語「実質的な相同性」は、２つの核酸またはそれらの指定された配列が、最適にアラインおよび比較された場合に、適切なヌクレオチド挿入または欠失を伴って、ヌクレオチドの少なくとも約８０％、ヌクレオチドの少なくとも約９０％〜９５％または少なくとも約９８％〜９９．５％が同一であることを示す。あるいは、セグメントが、選択的ハイブリダイゼーション条件下でその鎖の相補体にハイブリダイズする場合に、実質的な相同性が存在する。
ポリペプチドについて、用語「実質的な相同性」は、２つのポリペプチドまたはそれらの指定された配列が、最適にアラインおよび比較された場合に、適切なアミノ酸挿入または欠失を伴って、アミノ酸の少なくとも約８０％、アミノ酸の少なくとも約９０％〜９５％または少なくとも約９８％〜９９．５％が同一であることを示す。
【００６４】
２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、それらの配列によって共有される同一の位置の数の関数である（即ち、％相同性＝同一の位置の数／位置の総数×１００）。２つの配列間の配列の比較およびパーセント同一性の決定は、以下の非限定的な例に記載されるように、数学アルゴリズムを使用して達成され得る。
【００６５】
２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス、ならびに４０、５０、６０、７０または８０のギャップウェイトおよび１、２、３、４、５または６のレングスウェイトを使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム（ｗｏｒｌｄｗｉｄｅｗｅｂ．ｇｃｇ．ｃｏｍにおいて入手可能）を使用して決定され得る。２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のパーセント同一性はまた、ＰＡＭ１２０ウェイト残基テーブル（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、１２のギャップレングスペナルティおよび４のギャップペナルティを使用して、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）中に組み込まれたE. Meyers and W. Miller (CABIOS, 4: 11-17 (1989))のアルゴリズムを使用して決定され得る。さらに、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップウェイトおよび１、２、３、４、５または６のレングスウェイトを使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム（ｗｏｒｌｄｗｉｄｅｗｅｂ．ｇｃｇ．ｃｏｍにおいて入手可能）中に組み込まれたNeedleman and Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970))アルゴリズムを使用して決定され得る。
【００６６】
本明細書に記載される核酸およびタンパク質配列は、例えば、関連配列を同定するために公のデータベースに対して検索を実施するための「クエリー配列」として、さらに使用され得る。かかる検索は、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施され得る。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本明細書に記載される核酸分子に対して相同なヌクレオチド配列を取得するために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワードレングス＝１２を用いて実施され得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本明細書に記載されるタンパク質分子に対して相同なアミノ酸配列を取得するために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワードレングス＝３を用いて実施され得る。比較目的のためにギャップ付きアラインメントを取得するために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴが、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載されるように利用され得る。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターが使用され得る。ｗｏｒｌｄｗｉｄｅｗｅｂ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと。
【００６７】
核酸は、全細胞中に、細胞溶解物中に、または部分的に精製された形態でもしくは実質的に純粋な形態で、存在し得る。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当該分野で周知の他のものを含む標準的な技術によって、他の細胞性構成要素または他の混入物、例えば、他の細胞性核酸（例えば、染色体の他の部分）またはタンパク質から精製された場合、「単離された」または「実質的に純粋にされた」。F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)を参照のこと。
【００６８】
核酸、例えばｃＤＮＡは、遺伝子配列を提供するために、標準的な技術に従って変異され得る。コード配列について、これらの変異は、所望によりアミノ酸配列に影響を与え得る。特に、本明細書に記載されるネイティブＶ、Ｄ、Ｊ、定常、スイッチおよび他のかかる配列に対して実質的に相同なまたはそれに由来するＤＮＡ配列が企図される（ここで、「由来する」は、配列が、別の配列と同一であることまたは別の配列から改変されていることを示す）。
【００６９】
用語「ベクター」は、本明細書で使用する場合、それが連結された別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す意図である。１つの型のベクターは、「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントがその中にライゲーションされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の型のベクターは、ウイルスベクターであり、ここで、さらなるＤＮＡセグメントは、ウイルスゲノム中にライゲーションされ得る。ある特定のベクターは、それらが中に導入された宿主細胞において自律複製が可能である（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中への導入の際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ得、それによって、宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、ある特定のベクターは、それらが作動可能に連結された遺伝子の発現を指示することが可能である。かかるベクターは、本明細書で「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。プラスミドは、ベクターの最も一般に使用される形態であるので、本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」は、相互交換可能に使用され得る。しかし、等価な機能を果たす他の形態の発現ベクター、例えば、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）もまた含まれる。
【００７０】
用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、本明細書で使用する場合、細胞中には天然に存在しない核酸を含む細胞を指す意図であり、組換え発現ベクターが中に導入された細胞であり得る。かかる用語は、特定の対象細胞だけでなく、かかる細胞の子孫もまた指す意図であることを理解すべきである。ある特定の改変が、変異または環境的影響のいずれかに起因して、引き続く世代において生じ得るので、かかる子孫は、実際には、親細胞と同一ではあり得ないが、本明細書で使用する場合、用語「宿主細胞」の範囲内になおも含まれる。
本明細書で使用する場合、用語「連結された」は、２つ以上の分子の会合を指す。連結は、共有結合的または非共有結合的であり得る。連結はまた、遺伝的（即ち、組換え融合された）であり得る。かかる連結は、広範な種々の当該分野で認識された技術、例えば、化学的コンジュゲーションおよび組換えタンパク質産生を使用して達成され得る。
【００７１】
本明細書で使用する場合、「投与すること」は、当業者に公知の種々の方法および送達系のいずれかを使用した、治療剤を含む組成物の、対象への物理的導入を指す。本明細書に記載される抗ＴＲＥＭ−１抗体のための異なる経路の投与には、例えば、注射または注入による、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、脊髄または他の非経口経路の投与が含まれる。語句「非経口投与」は、本明細書で使用する場合、通常は注射による、経腸および外用投与以外の投与の様式を意味し、これには、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、リンパ内、病巣内、嚢内、眼窩内、心臓内、真皮内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌ）の注射および注入、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏエレクトロポレーションが含まれるがこれらに限定されない。あるいは、本明細書に記載される抗体は、非−非経口（ｎｏｎ−ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）経路、例えば、外用、表皮または粘膜経路の投与を介して、例えば、鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下または外用で投与され得る。投与することはまた、例えば、１回、複数回、および／または１つ以上の延長された期間にわたって、実施され得る。
【００７２】
本明細書で使用する場合、用語「阻害する」または「遮断する」（例えば、細胞上のＴＲＥＭ−１へのＴＲＥＭ−１リガンドの結合の阻害／遮断を指す）は、相互交換可能に使用され、部分的および完全な阻害／遮断の両方を包含する。一部の実施形態では、抗ＴＲＥＭ−１抗体は、例えば、本明細書にさらに記載されるように決定した場合に、ＴＲＥＭ−１へのＴＲＥＭ−１リガンドの結合を、少なくとも約５０％、例えば、約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％阻害する。一部の実施形態では、抗ＴＲＥＭ−１抗体は、例えば、本明細書にさらに記載されるように決定した場合に、ＴＲＥＭ−１へのＴＲＥＭ−１リガンドの結合を、５０％以下、例えば、約４０％、３０％、２０％、１０％、５％または１％阻害する。
【００７３】
用語「処置する」、「処置すること」および「処置」は、本明細書で使用する場合、疾患と関連する症状、合併症、状態もしくは生化学的兆候の進行、発症、重症度もしくは再発を、逆転、軽減、寛解、阻害または減速もしくは予防すること、あるいは全生存を増強することを目的として、対象に対して実施される任意の型の介入もしくはプロセス、または対象に活性薬剤を投与することを指す。処置は、疾患を有する対象または疾患を有さない対象（例えば、予防のため）の処置であり得る。
【００７４】
用語「有効用量」または「有効投薬量」は、所望の効果を達成するまたは少なくとも部分的に達成するのに十分な量として定義される。薬物または治療剤の「治療有効量」または「治療有効投薬量」は、単独でまたは別の治療剤と組み合わせて使用した場合に、疾患症状の重症度における減少、疾患症状なし期間の頻度および持続時間における増加、または疾患の苦痛に起因する機能障害もしくは能力障害の予防によって明らかな疾患退縮を促進する、薬物の任意の量である。薬物の治療有効量または投薬量は、「予防有効量」または「予防有効投薬量」を含み、これは、単独でまたは別の治療剤と組み合わせて、疾患を発症するリスクがある対象または疾患の再発に罹患するリスクがある対象に投与した場合に、疾患の発症または再発を阻害する、薬物の任意の量である。治療剤が疾患退縮を促進する能力または疾患の発症もしくは再発を阻害する能力は、例えば、臨床試験の間にヒト対象において、ヒトでの効力を予測する動物モデル系において、当業者に公知の種々の方法を使用して、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて薬剤の活性をアッセイすることによって、評価され得る。
用語「患者」は、予防的処置または治療的処置のいずれかを受けるヒトおよび他の哺乳動物対象を含む。
本明細書で使用する場合、用語「対象」は、任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。例えば、本明細書に記載される方法および組成物は、がんを有する対象を処置するために使用され得る。用語「非ヒト動物」は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。
本明細書で使用する場合、用語「ｕｇ」および「ｕＭ」は、それぞれ、「μｇ」および「μΜ」と相互交換可能に使用される。
本明細書に記載される種々の態様は、以下のサブセクションにさらに詳細に記載される。
【００７５】
Ｉ．抗ＴＲＥＭ−１抗体
特定の機能的特色または特性を特徴とする抗体、例えば、完全ヒト抗体が、本明細書に記載される。例えば、本開示の抗体は、ヒトＴＲＥＭ−１、より具体的には、ヒトＴＲＥＭ−１の細胞外ドメイン内の特定のドメイン（例えば、機能的ドメイン）に、特異的に結合する。一実施形態では、これらの抗体は、ＴＲＥＭ−１リガンド（例えば、ＰＧＬＹＲＰ１）が結合するＴＲＥＭ−１上の部位に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、これらの抗体は、アンタゴニスト抗体である、即ち、これらは、細胞、例えば、単球、マクロファージおよび好中球上のＴＲＥＭ−１の活性を阻害または抑制する（即ち、結合の際にアゴナイズしない）。一部の実施形態では、これらの抗ＴＲＥＭ−１抗体は、１つ以上の非ヒト霊長類由来のＴＲＥＭ−１、例えば、カニクイザルＴＲＥＭ−１と交差反応する。一部の実施形態では、これらの抗ＴＲＥＭ−１抗体は、活性化の際に、細胞（例えば、マクロファージ、樹状細胞、好中球）による炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−８、ＩＬ−１β、ＩＬ−１２、およびそれらの組み合わせ）の産生を遮断する。他の実施形態では、これらの抗ＴＲＥＭ−１抗体は、１つ以上のＦｃγＲに結合しないＦｃ領域を含む。さらなる実施形態では、これらの抗ＴＲＥＭ−１抗体は、ミエロイド細胞（例えば、樹状細胞）による炎症促進性サイトカインの放出を誘導せず、それによって、それを必要とする対象への抗ＴＲＥＭ−１抗体の投与後の、炎症性サイトカインストームの発生を低減または予防する。
【００７６】
一部の実施形態では、本明細書に記載される特定の抗ＴＲＥＭ−１抗体は、ヒトＴＲＥＭ−１への結合についてｍＡｂ  ０３１８と交差競合する抗体、例えば、モノクローナル、組換えおよび／またはヒト抗体である。一部の実施形態では、これらの抗ＴＲＥＭ−１抗体は、カニクイザルＴＲＥＭ−１への結合についても、ｍＡｂ  ０３１８と交差競合する。言い換えれば、本開示の抗ＴＲＥＭ−１抗体は、ある特定の実施形態では、ｍＡｂ  ０３１８と同じ「ビン」に属する。
ｍＡｂ  ０３１８抗体は、配列番号１４を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号１５を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を有する。国際出願公開番号２０１６／００９０８６を参照のこと。ｍＡｂ  ０３１８はまた、それぞれ配列番号１４のアミノ酸３１〜３５、５０〜６８および１０１〜１１０に対応する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有する。ｍＡｂ  ０３１８抗体の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、配列番号１５のアミノ酸２４〜３８、５４〜６０および９３〜１０１に対応する。
【００７７】
従って、一部の実施形態では、本開示の抗ＴＲＥＭ−１抗体は、それぞれ配列番号１４および１５のＶＨおよびＶＬを含む。別の実施形態では、この抗ＴＲＥＭ−１抗体のＶＨは、配列番号１４のアミノ酸３１〜３５（ＴＹＡＭＨ）のＣＤＲ１配列を含み、これらのアミノ酸のうち１つは、異なるアミノ酸によって置換され得る。ある特定の実施形態では、この抗ＴＲＥＭ−１抗体のＶＨは、配列番号１４のアミノ酸５０〜６８（ＲＩＲＴＫＳＳＮＹＡＴＹＹＡＡＳＶＫＧ）のＣＤＲ２配列を含み、これらのアミノ酸のうち１つ、２つまたは３つは、異なるアミノ酸によって置換され得る。一部の実施形態では、この抗ＴＲＥＭ−１抗体のＶＨは、配列番号１４のアミノ酸１０１〜１１０（ＤＭＧＩＲＲＱＦＡＹ）のＣＤＲ３配列を含み、これらのアミノ酸のうち１つ、２つまたは３つは、異なるアミノ酸によって置換され得る。
【００７８】
一部の実施形態では、この抗ＴＲＥＭ−１抗体のＶＬは、配列番号１５のアミノ酸２４〜３８（ＱＱＳＮＱＤＰＹＴ）のＣＤＲ１配列を含み、これらのアミノ酸のうち１つ、２つまたは３つは、異なるアミノ酸によって置換され得る。他の実施形態では、この抗ＴＲＥＭ−１抗体のＶＬは、配列番号１５のアミノ酸５４〜６０（ＲＡＳＮＬＥＳ）のＣＤＲ２配列を含み、これらのアミノ酸のうち１つまたは２つは、異なるアミノ酸によって置換され得る。一部の実施形態では、この抗ＴＲＥＭ−１抗体のＶＬは、配列番号１５のアミノ酸９３〜１０１（ＱＱＳＮＱＤＰＹＴ）のＣＤＲ３配列を含み、これらのアミノ酸のうち１つまたは２つは、異なるアミノ酸によって置換され得る。
【００７９】
抗体のＣＤＲ中のメチオニン残基は酸化され得、抗体の潜在的な化学的分解、および結果として生じる、そのポテンシーにおける低減を生じる。従って、本明細書で開示される抗ＴＲＥＭ−１抗体は、重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ中の１つ以上のメチオニン残基が、酸化的分解を受けないアミノ酸残基で置き換えられていてもよい。一部の実施形態では、重鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ３内のメチオニン残基は、酸化的分解を受けないアミノ酸残基（例えば、グルタミンまたはロイシン）で置き換えられる。従って、一実施形態では、この抗ＴＲＥＭ−１抗体のＶＨは、配列番号８１のアミノ酸１０１〜１１０（ＤＱＧＩＲＲＱＦＡＹ）または配列番号８２のアミノ酸１０１〜１１０（ＤＬＧＩＲＲＱＦＡＹ）のＣＤＲ３配列を含む。他の実施形態では、この抗ＴＲＥＭ−１抗体のＶＨは、配列番号８３のアミノ酸３１〜３５（ＴＹＡＱＨ）または配列番号８４のアミノ酸３１〜３５（ＴＹＡＬＨ）のＣＤＲ１配列を含む。同様に、一部の実施形態では、脱アミド部位は、特にＣＤＲ中で、抗ＴＲＥＭ−１抗体から除去され得る。
【００８０】
一部の実施形態では、この抗ＴＲＥＭ−１抗体のＶＨおよびＶＬは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際出願公開番号ＷＯ２０１７／１５２１０２に開示される抗ＴＲＥＭ−１抗体のＶＨおよびＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、この抗ＴＲＥＭ−１抗体のＶＬは、ＷＯ２０１７／１５２１０２の配列番号９〜２７からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、ＷＯ２０１７／１５２１０２の配列番号２８〜４０からなる群から選択されるＣＤＲ２配列および／またはＷＯ２０１７／１５２１０２の配列番号４１〜１１９からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む。一実施形態では、この抗ＴＲＥＭ−１抗体のＶＨは、ＷＯ２０１７／１５２１０２の配列番号１２０〜１４３からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、ＷＯ２０１７／１５２１０２の配列番号１４４〜１７２からなる群から選択されるＣＤＲ２配列および／またはＷＯ２０１７／１５２１０２の配列番号１７３〜２４７からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む。
一部の実施形態では、本開示の抗ＴＲＥＭ−１抗体は、ｍＡｂ  ０３１８抗体のＣＤＲおよび／または可変領域配列に対して少なくとも８０％の同一性（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の同一性）を有するＣＤＲおよび／または可変領域配列を含む。
【００８１】
一部の実施形態では、これらの抗ＴＲＥＭ−１抗体は、それぞれ配列番号１４および１５を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、これらの抗ＴＲＥＭ−１抗体は、重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）を含み、このＨＣは、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２または配列番号５３を含む。一部の実施形態では、このＬＣは、配列番号５４を含む。
一部の実施形態では、本開示の抗ＴＲＥＭ−１抗体は、ＷＯ２０１７／１５２１０２の配列番号３９６〜４７５からなる群から選択される重鎖可変領域（ＶＨ）および／またはＷＯ２０１７／１５２１０２の配列番号３１６〜３９５からなる群から選択される軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【００８２】
一部の実施形態では、この抗ＴＲＥＭ−１抗体は、重鎖および軽鎖を含み、この重鎖および軽鎖は、表７に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、この抗ＴＲＥＭ−１抗体は、重鎖および軽鎖を含み、この重鎖は、配列番号５０に示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号５４に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、この抗ＴＲＥＭ−１抗体は、重鎖および軽鎖を含み、この重鎖は、配列番号５１に示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号５４に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、この抗ＴＲＥＭ−１抗体は、重鎖および軽鎖を含み、この重鎖は、配列番号５２に示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号５４に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、この抗ＴＲＥＭ−１抗体は、重鎖および軽鎖を含み、この重鎖は、配列番号５３に示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号５４に示されるアミノ酸配列を含む。
【００８３】
本明細書に示される重鎖または軽鎖のいずれか、例えば、配列番号５０〜５４に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一なアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖が、所望の特徴を有する抗ＴＲＥＭ−１抗体、例えば、本明細書にさらに記載されるものを形成するために使用され得る。
一部の実施形態では、本開示の抗ＴＲＥＭ−１抗体は、重鎖および軽鎖を含み、この重鎖は、配列番号５０、５１、５２または５３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号５４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。
【００８４】
一部の実施形態では、この抗ＴＲＥＭ１抗体は、重鎖定常領域を含み、この重鎖定常領域は、ＥＵ番号付けに従って、Ｋ２１４Ｒ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、この抗ＴＲＥＭ−１抗体は、重鎖定常領域を含み、この重鎖定常領域は、ＥＵ番号付けに従って、Ｋ２１４Ｒ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、この抗ＴＲＥＭ−１抗体は、重鎖定常領域を含み、この重鎖定常領域は、ＥＵ番号付けに従って、Ｋ２１４Ｒ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｐ２３８Ｓ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、この抗ＴＲＥＭ−１抗体は、重鎖定常領域を含み、この重鎖定常領域は、ＥＵ番号付けに従って、Ｓ１３１Ｃ、Ｋ１３３Ｒ、Ｇ１３７Ｅ、Ｇ１３８Ｓ、Ｑ１９６Ｋ、Ｉ１９９Ｔ、Ｎ２０３Ｄ、Ｋ２１４Ｒ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｐ２３８Ｓ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。
一実施形態では、この抗ＴＲＥＭ−１抗体は、例えば、表面プラズモン共鳴を使用して決定した場合に、ヒトＴＲＥＭ−１のバリアント（例えば、ＴＲＥＭ−１アイソフォーム２および３、それぞれ、配列番号２および３）に結合することが可能である。別の実施形態では、この抗ＴＲＥＭ−１抗体は、例えば、表面プラズモン共鳴を使用して決定した場合に、カニクイザルＴＲＥＭ−１（配列番号７）に結合することが可能である。
【００８５】
一部の実施形態では、本明細書に記載される抗ＴＲＥＭ−１抗体は、高い親和性で、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）（例えば、実施例に記載される）によって決定した場合に、１０-7Ｍ以下、１０-8Ｍ以下、１０-9Ｍ（１ｎＭ）以下、１０-10Ｍ以下、１０-11Ｍ以下、１０-12Ｍ以下、１０-12Ｍ〜１０-7Ｍ、１０-11Ｍ〜１０-7Ｍ、１０-10Ｍ〜１０-7Ｍまたは１０-9Ｍ〜１０-7ＭのＫDで、ヒトＴＲＥＭ−１に結合する。一部の実施形態では、本明細書に記載される抗ＴＲＥＭ−１抗体は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）（例えば、実施例に記載される）によって決定した場合に、１０-7Ｍ以下、１０-8Ｍ以下、１０-9Ｍ以下、１０-10Ｍ以下、１０-11Ｍ以下、１０-12Ｍ以下、１０-12Ｍ〜１０-7Ｍ、１０-11Ｍ〜１０-7Ｍ、１０-10Ｍ〜１０-7Ｍまたは１０-9Ｍ〜１０-7ＭのＫDで、カニクイザルＴＲＥＭ−１に結合する。
【００８６】
一実施形態では、本開示の抗体は、ｍＡｂ  ０３１８抗体と同じエピトープのうち１つ以上において、抗ＴＲＥＭ−１に結合する。一部の実施形態では、この抗ＴＲＥＭ−１抗体は、ヒトＴＲＥＭ−１（例えば、アイソフォーム１、配列番号１）の、（ｉ）Ａ２１、Ｔ２２、Ｋ２３、Ｌ２４、Ｔ２５、Ｅ２６、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基、ならびに（ｉｉ）Ａ４９、Ｓ５０、Ｓ５１、Ｑ５２、Ｋ５３、Ａ５４、Ｗ５５、Ｑ５６、１５７、１５８、Ｒ５９、Ｄ６０、Ｇ６１、Ｅ６２、Ｍ６３、Ｐ６４、Ｋ６５、Ｔ６６、Ｌ６７、Ａ６８、Ｃ６９、Ｔ７０、Ｅ７１、Ｒ７２、Ｐ７３、Ｓ７４、Ｋ７５、Ｎ７６、Ｓ７７、Ｈ７８、Ｐ７９、Ｖ８０、Ｑ８１、Ｖ８２、Ｇ８３、Ｒ８４、１８５、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基、ならびに（ｉｉｉ）Ｃ１１３、Ｖ１１４、１１１５、Ｙ１１６、Ｑ１１７、Ｐ１１８、Ｐ１１９、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に、特異的に結合することが可能である。ＷＯ２０１６／００９０８６を参照のこと。
【００８７】
一実施形態では、この抗ＴＲＥＭ−１抗体は、例えば、ＨＸ−ＭＳまたはＸ線回折を使用して決定した場合に、配列番号１（ヒトＴＲＥＭ−１）のアミノ酸Ｄ３８〜Ｆ４８に特異的に結合することが可能である。一部の実施形態では、この抗ＴＲＥＭ−１抗体は、例えば、ＨＸ−ＭＳまたはＸ線回折を使用して決定した場合に、配列番号１（ヒトＴＲＥＭ−１）のアミノ酸残基Ｄ３８、Ｖ３９、Ｋ４０、Ｃ４１、Ｄ４２、Ｙ４３、Ｔ４４およびＬ４５のうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは全てならびに配列番号１（ヒトＴＲＥＭ−１）のＥ４６、Ｋ４７およびＦ４８からなる群から選択されるアミノ酸残基のうち１つ、２つまたは全てを含むエピトープを有する。ある特定の実施形態では、この抗ＴＲＥＭ−１抗体は、ＴＲＥＭ−１のバリアントおよび表面プラズモン共鳴を使用して決定した場合に、配列番号１（ヒトＴＲＥＭ−１）のＤ４２、Ｅ４６、Ｄ９２およびＨ９３からなる群から選択されるアミノ酸残基のうち１つ、２つ、３つまたは全てを含むエピトープを有する。
【００８８】
一実施形態では、本開示の抗ＴＲＥＭ−１抗体は、ＴＲＥＭ−１のバリアントおよび表面プラズモン共鳴を使用して決定した場合に、配列番号１（ヒトＴＲＥＭ−１）の少なくともアミノ酸残基Ｅ４６および／またはＤ９２を含むエピトープを有する。別の実施形態では、この抗ＴＲＥＭ−１抗体は、配列番号１（ヒトＴＲＥＭ−１）のＬ３１、１８６およびＶ１０１からなる群から選択されるアミノ酸残基のうち１つ、２つまたは全てを含む。ある特定の実施形態では、この抗ＴＲＥＭ−１抗体は、例えば、ＨＸ−ＭＳまたはＸ線回折を使用して決定した場合に、カニクイザルＴＲＥＭ−１（配列番号７）のアミノ酸残基Ｅ１９〜Ｌ２６を含むポリペプチドに特異的に結合することが可能である。
一実施形態では、この抗ＴＲＥＭ−１抗体は、ヒトＴＲＥＭ−１に特異的に結合することが可能であり、この抗体のエピトープは、配列番号１のＶ３９、Ｋ４０、Ｃ４１、Ｄ４２、Ｙ４３、Ｌ４５、Ｅ４６、Ｋ４７、Ｆ４８およびＡ４９からなる群から選択されるアミノ酸残基のうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは全てを含む。
【００８９】
一実施形態では、この抗ＴＲＥＭ−１抗体は、ヒトＴＲＥＭ−１に特異的に結合することが可能であり、この抗体のエピトープは、配列番号１のＤ４２を含む。他の実施形態では、この抗ＴＲＥＭ−１抗体は、ヒトＴＲＥＭ−１に特異的に結合することが可能であり、この抗体のエピトープは、配列番号１のＥ４６を含む。一部の実施形態では、この抗体のエピトープは、配列番号１のＶ３９、Ｃ４１、Ｄ４２、Ｙ４３、Ｌ４５を含み得る。さらなる実施形態では、この抗体のエピトープは、配列番号１のＥ４６、Ｋ４７およびＡ４９を含み得る。具体的な実施形態では、この抗ＴＲＥＭ−１抗体のエピトープは、配列番号１のＦ４８をさらに含み得る。
【００９０】
一部の実施形態では、この抗ＴＲＥＭ−１抗体は、ｍＡｂ  ０３１８抗体のものと類似の粘度プロファイルを有する。一部の実施形態では、本開示の抗ＴＲＥＭ−１抗体は、８０ｍｇ／ｍＬの濃度で、５ｃＰ未満、４ｃＰ未満、３ｃＰ未満、２．５ｃＰ未満、２．４ｃＰ未満、２．３ｃＰ未満、２．２ｃＰ未満、２．１ｃＰ未満、２ｃＰ未満、１．９ｃＰ未満、１．８ｃＰ未満、１．７ｃＰ未満、１．６ｃＰ未満、１．５ｃＰ未満、１．４ｃＰ未満、１．３ｃＰ未満、１．２ｃＰ未満、１．１ｃＰ未満、１．０ｃＰ未満、０．９ｃＰ未満、０．８ｃＰ未満、０．７ｃＰ未満、０．６ｃＰ未満、０．５ｃＰ未満、０．４ｃＰ未満、０．３ｃＰ未満、０．２ｃＰ未満または０．１ｃＰ未満の粘度を有する。一部の実施形態では、この抗ＴＲＥＭ−１抗体は、１３０ｍｇ／ｍＬの濃度で、１０ｃＰ未満（例えば、９ｃＰ）の粘度を有する。
【００９１】
一部の実施形態では、本開示の抗ＴＲＥＭ−１抗体は、抗体の軽鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ３領域中の１つ以上の負に荷電した残基が非荷電の残基で置換される変異を含む。一部の実施形態では、この抗ＴＲＥＭ−１抗体は、配列番号１５のアミノ酸残基Ｄ１、Ｄ３０、Ｄ３３、Ｄ７４、Ｄ９８、Ｅ２７およびＥ９７のうち１つ以上において、グリシン、アラニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、システインおよびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸残基による置換を含む。これらの変異は、本明細書で「電荷パッチ（ｃｈａｒｇｅ  ｐａｔｃｈ）」変異と呼ばれる。
【００９２】
一部の実施形態では、本開示の抗ＴＲＥＭ−１抗体は、Ｆａｂ−Ｆａｂダイマー化を低減させるために、配列番号１４のＦａｂ−Ｆａｂ相互作用領域中に変異を含む。抗体は２つのＦａｂを含むので、マルチマー化が粘度に影響を与え得ることが、ｍＡｂ  ０３１８抗体で以前に示されている。これらの変異は、「Ｆａｂ−Ｆａｂ相互作用」変異と呼ばれる。ある特定の実施形態では、この抗ＴＲＥＭ−１抗体は、配列番号１４の残基Ｙ３２、Ｒ５２、Ｓ５５、Ｓ５６、Ｎ５７、Ａ５９、Ｍ１０２、Ｉ１０４およびＲ１０６または配列番号１５のＦ３２、Ｄ３３、Ｙ３４、Ｙ５３、Ｒ５４およびＤ９８のうちいずれか１つにおいて、グリシン、アラニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、システイン、リジン、アルギニン、トリプトファン、ヒスチジンおよびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸残基による変異を含む。
【００９３】
一実施形態では、本明細書で開示される抗ＴＲＥＭ−１抗体は、配列番号１５の位置３２において変異を含み、ここで、フェニルアラニンが、アミノ酸残基グリシン、セリン、スレオニン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびメチオニンから選択されるアミノ酸に変異される。かかる変異は、配列番号１の位置Ｙ９０におけるＡｌａ置換が、ＴＲＥＭ−１に対する配列番号３の親和性を改善したという観察に基づく。Ｙ９０は、配列番号１５のフェニルアラニン残基と相互作用することが見出された。Ｆａｂ−ＴＲＥＭ−１相互作用を改善するための配列番号１５の変異は、「Ｆａｂ−ＴＲＥＭ−１相互作用」変異と呼ばれる。その可変領域がＦｃ、例えば、任意のアロタイプまたはイソアロタイプ、例えば、ＩｇＧ１については：Ｇ１ｍ、Ｇ１ｍ１（ａ）、Ｇ１ｍ２（ｘ）、Ｇ１ｍ３（ｆ）、Ｇ１ｍ１７（ｚ）；ＩｇＧ２については：Ｇ２ｍ、Ｇ２ｍ２３（ｎ）；ＩｇＧ３については：Ｇ３ｍ、Ｇ３ｍ２１（ｇ１）、Ｇ３ｍ２８（ｇ５）、Ｇ３ｍ１１（ｂ０）、Ｇ３ｍ５（ｂ１）、Ｇ３ｍ１３（ｂ３）、Ｇ３ｍ１４（ｂ４）、Ｇ３ｍ１０（ｂ５）、Ｇ３ｍ１５（ｓ）、Ｇ３ｍ１６（ｔ）、Ｇ３ｍ６（ｃ３）、Ｇ３ｍ２４（ｃ５）、Ｇ３ｍ２６（ｕ）、Ｇ３ｍ２７（ｖ）；およびＫについては：Ｋｍ、Ｋｍ１、Ｋｍ２、Ｋｍ３のものであり得るＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４  Ｆｃなどに連結された（例えば、共有結合的に連結されたまたは融合された）抗ＴＲＥＭ−１抗体が、本明細書で提供される（例えば、Jeffries et al. (2009) mAbs 1:1を参照のこと）。一部の実施形態では、本明細書で開示される抗ＴＲＥＭ−１抗体の可変領域は、エフェクターなしまたはほぼエフェクターなしのＦｃ、例えば、ＩｇＧ１に連結される。一部の実施形態では、これらの抗ＴＲＥＭ−１抗体の可変領域は、１つ以上のＦｃγＲへの低減された結合を有するまたは１つ以上のＦｃγＲに結合することが不可能なＦｃに連結される。
【００９４】
一実施形態では、本明細書に記載される抗ＴＲＥＭ−１抗体のＶＨドメインは、例えば、本明細書にさらに記載される、天然に存在するまたは改変されたヒトＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の定常ドメイン（即ち、Ｆｃ）に融合され得る。例えば、ＶＨドメインは、ヒトＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、定常領域、例えば、以下の野生型ヒトＩｇＧ１定常ドメインアミノ酸配列：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号９）または以下のアミノ酸配列：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号７７；アロタイプ特異的なアミノ酸残基は、太字かつ下線付きである）を有する配列番号９のアロタイプバリアントのアミノ酸配列に融合された、本明細書に記載される任意のＶＨドメインのアミノ酸配列を含み得る。
【００９５】
一実施形態では、本明細書に記載される抗ＴＲＥＭ−１抗体のＶＨドメインは、エフェクターなし定常領域、例えば、以下のエフェクターなしヒトＩｇＧ１定常ドメインアミノ酸配列：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＥＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号７８；ＥＵ番号付けに従う、下線付きの置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを含む「ＩｇＧ１．１ｆ」）または
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＥＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号７９；ＥＵ番号付けに従う、下線付きの置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＥおよびＧ２３７Ａを含む「ＩｇＧ１．３ｆ」）に融合された、本明細書に記載される任意のＶＨドメインのアミノ酸配列を含み得る。
【００９６】
例えば、ＩｇＧ１のアロタイプバリアントは、配列番号７７〜７９中のものに従って番号付けして、Ｋ９７Ｒ、Ｄ２３９Ｅおよび／またはＬ２４１Ｍ（上で下線付きかつ太字）を含む。全長重鎖領域内で、ＥＵ番号付けに従うと、これらのアミノ酸置換は、Ｋ２１４Ｒ、Ｄ３５６ＥおよびＬ３５８Ｍと番号付けされる。一部の実施形態では、抗ＴＲＥＭ−１抗体の定常領域は、配列番号７７〜７９中と同様に番号付けしてアミノ酸Ｌ１１７、Ａ１１８、Ｇ１２０、Ａ２１３およびＰ２１４（上で下線付き）、またはＥＵ番号付けに従ってＬ２３４、Ａ２３５、Ｇ２３７、Ａ３３０およびＰ３３１において、１つ以上の変異または置換をさらに含む。さらなる実施形態では、この抗ＴＲＥＭ−１抗体の定常領域は、配列番号７７〜７９のアミノ酸Ｌ１１７Ａ、Ａ１１８Ｅ、Ｇ１２０Ａ、Ａ２１３ＳおよびＰ２１４Ｓ、またはＥＵ番号付けに従ってＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓにおいて、１つ以上の変異または置換を含む。この抗ＴＲＥＭ−１抗体の定常領域はまた、配列番号９のＬ１１７Ａ、Ａ１１８ＥおよびＧ１２０Ａ、またはＥＵ番号付けに従ってＬ２３４Ａ、Ｌ２３５ＥおよびＧ２３７Ａにおいて、１つ以上の変異または置換を含み得る。
【００９７】
一部の実施形態では、本明細書に記載される抗ＴＲＥＭ−１抗体のＶＨドメインは、以下のアミノ酸配列：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＳＰＰＳＰＡＰＥＬＬＧＧＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１１；ＥＵ番号付けに従って、下線付きの置換Ｋ２１４Ｒ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９ＳおよびＰ２３８Ｓを含む「ＩｇＧ１−Ａｂａ」）；または
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＳＰＰＳＰＡＰＥＬＬＧＧＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１２；ＥＵ番号付けに従って、下線付きの置換Ｓ１３１Ｃ、Ｋ１３３Ｒ、Ｇ１３７Ｅ、Ｇ１３８Ｓ、Ｑ１９６Ｋ、Ｉ１９９Ｔ、Ｎ２０３Ｄ、Ｋ２１４Ｒ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９ＳおよびＰ２３８Ｓを含む「ＩｇＧ４−Ａｂａ」）を含むＩｇＧ１定常ドメインに融合された、本明細書に記載される任意のＶＨドメインのアミノ酸配列を含む。
【００９８】
本明細書に記載されるＶＬドメインは、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖の定常ドメインに融合され得る。例えば、抗ＴＲＥＭ−１抗体のＶＬドメインは、以下のヒトＩｇＧ１カッパ軽鎖アミノ酸配列：
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１３）に融合された、本明細書に記載される任意のＶＬドメインのアミノ酸配列を含み得る。
【００９９】
ある特定の実施形態では、この重鎖定常領域は、Ｃ末端においてリジンまたは別のアミノ酸を含む、例えば、以下の最後のアミノ酸：重鎖中のＬＳＰＧＫ（配列番号４８）を含む。ある特定の実施形態では、この重鎖定常領域は、Ｃ末端において１つ以上のアミノ酸を欠いており、例えば、Ｃ末端配列ＬＳＰＧ（配列番号４９）またはＬＳＰを有する。
一実施形態では、この抗ＴＲＥＭ−１抗体の可変領域は、エフェクターなしまたはほぼエフェクターなしのＦｃに連結される。ある特定の実施形態では、この抗ＴＲＥＭ−１抗体の可変領域は、本明細書に記載されるように、ＩｇＧ１．１ｆ、ＩｇＧ１．３ｆ、ＩｇＧ１−ＡｂａおよびＩｇＧ４−Ａｂａからなる群から選択されるＦｃに連結される。
【０１００】
一般に、本明細書に記載される可変領域は、抗体の１つ以上の機能的特性、例えば、Ｆｃ受容体結合、炎症性サイトカイン放出、血清半減期、補体結合および／または抗原依存性細胞性細胞傷害を典型的には変更するための１つ以上の改変を含むＦｃに連結され得る。さらに、本明細書に記載される抗体は、抗体の１つ以上の機能的特性を変更するために、化学的に改変され得（例えば、１つ以上の化学的部分が、抗体に結合され得る）、またはそのグリコシル化を変更するように改変され得る。これらの実施形態の各々は、以下にさらに詳細に記載される。Ｆｃ領域中の残基の番号付けは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスのものである。
Ｆｃ領域は、定常領域の断片、アナログ、バリアント、変異体または誘導体を含む、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ならびに他のクラス、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭ）の定常領域に由来するドメインを包含する。免疫グロブリンの定常領域は、免疫グロブリンＣ末端領域に対して相同な、天然に存在するまたは合成により産生されたポリペプチドとして定義され、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインまたはＣＨ４ドメインを、別々にまたは組み合わせて含み得る。
【０１０１】
Ｉｇ分子は、複数のクラスの細胞性受容体と相互作用する。例えば、ＩｇＧ分子は、ＩｇＧクラスの抗体に対して特異的な３つのクラスのＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）、即ち、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩと相互作用する。ＩｇＧのＦｃγＲ受容体への結合にとって重要な配列は、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン中に位置すると報告されている。抗体の血清半減期は、その抗体がＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合する能力によって影響される。
一実施形態では、これらの抗ＴＲＥＭ−１抗体のＦｃ領域は、バリアントＦｃ領域、例えば、望ましい構造的特色および／または生物学的活性を提供するために、親Ｆｃ配列（例えば、バリアントを生成するために引き続いて改変される未改変のＦｃポリペプチド）と比較して、（例えば、アミノ酸の置換、欠失および／または挿入によって）改変されたＦｃ配列である。
【０１０２】
例えば、親Ｆｃと比較して、（ａ）増加もしくは減少した抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有する、（ｂ）増加もしくは減少した補体媒介性細胞傷害（ＣＤＣ）を有する、（ｃ）Ｃ１ｑに対する増加もしくは減少した親和性を有する、および／または（ｄ）Ｆｃ受容体に対する増加もしくは減少した親和性を有するＦｃバリアントを生成するために、Ｆｃ領域中に改変を行うことができる。かかるＦｃ領域バリアントは、一般に、Ｆｃ領域中に少なくとも１つのアミノ酸改変を含む。アミノ酸改変を組み合わせることが、特に望ましいと考えられる。例えば、バリアントＦｃ領域は、その中に、例えば、本明細書で同定された具体的なＦｃ領域位置の、２つ、３つ、４つ、５つなどの置換を含み得る。
【０１０３】
バリアントＦｃ領域は、ジスルフィド結合形成に関与するアミノ酸が除去されたまたは他のアミノ酸で置き換えられた配列変更もまた含み得る。かかる除去は、本明細書に記載される抗ＴＲＥＭ−１抗体を産生するために使用される宿主細胞中に存在する他のシステイン含有タンパク質との反応を回避し得る。システイン残基が除去された場合であっても、単鎖Ｆｃドメインは、非共有結合的に一緒に維持されるダイマーＦｃドメインをなおも形成できる。他の実施形態では、Ｆｃ領域は、選択された宿主細胞とより適合性になるように改変され得る。例えば、典型的なネイティブＦｃ領域のＮ末端近傍の、Ｅ．ｃｏｌｉにおける消化酵素、例えば、プロリンイミノペプチダーゼによって認識され得るＰＡ配列を除去することができる。他の実施形態では、Ｆｃドメイン内の１つ以上のグリコシル化部位が除去され得る。典型的にはグリコシル化される残基（例えば、アスパラギン）が、細胞溶解応答を付与し得る。かかる残基は、欠失され得、またはグリコシル化されていない残基（例えば、アラニン）で置換され得る。他の実施形態では、補体との相互作用に関与する部位、例えば、Ｃ１ｑ結合部位が、Ｆｃ領域から除去され得る。例えば、ヒトＩｇＧ１のＥＫＫ配列を欠失または置換することができる。ある特定の実施形態では、Ｆｃ受容体への結合に影響を与える部位、好ましくは、サルベージ受容体結合部位以外の部位が除去され得る。他の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＡＤＣＣ部位を除去するために改変され得る。ＡＤＣＣ部位は、当該分野で公知である；ＩｇＧ１中のＡＤＣＣ部位に関しては、例えば、Sarmay et al., Molec. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992)を参照のこと。バリアントＦｃドメインの具体的な例は、例えば、ＷＯ９７／３４６３１およびＷＯ９６／３２４７８に開示されている。
【０１０４】
一実施形態では、Ｆｃのヒンジ領域は、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が変更される、例えば、増加または減少されるように改変される。このアプローチは、Ｂｏｄｍｅｒらによる米国特許第５，６７７，４２５号にさらに記載されている。Ｆｃのヒンジ領域中のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖および重鎖のアセンブリを促進するため、または抗体の安定性を増加もしくは減少させるために、変更される。一実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域は、抗体の生物学的半減期を減少させるために変異される。より具体的には、抗体が、ネイティブＦｃ−ヒンジドメインＳｐＡ結合と比較して、損なわれたブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｙｌ）プロテインＡ（ＳｐＡ）結合を有するように、１つ以上のアミノ酸変異が、Ｆｃ−ヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面領域中に導入される。このアプローチは、Ｗａｒｄらによる米国特許第６，１６５，７４５号に、さらに詳細に記載されている。
【０１０５】
なお他の実施形態では、Ｆｃ領域は、抗体のエフェクター機能を変更するために、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置き換えることによって変更される。例えば、抗体が、エフェクターリガンドに対する変更された親和性を有するが、親抗体の抗原結合能を保持するように、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０、３２２、３３０および／または３３１から選択される１つ以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸残基で置き換えられ得る。それに対する親和性が変更されるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分であり得る。このアプローチは、共にＷｉｎｔｅｒによる米国特許第５，６２４，８２１号および同第５，６４８，２６０号に、さらに詳細に記載されている。
【０１０６】
別の例では、抗体が変更されたＣ１ｑ結合および／または低減もしくは消失した補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を有するように、アミノ酸残基３２９、３３１および３２２から選択される１つ以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸残基で置き換えられ得る。このアプローチは、Ｉｄｕｓｏｇｉｅらによる米国特許第６，１９４，５５１号に、さらに詳細に記載されている。
別の例では、アミノ酸位置２３１および２３９内の１つ以上のアミノ酸残基が、抗体が補体を固定する能力をそれによって変更するために変更される。このアプローチは、ＢｏｄｍｅｒらによるＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／２９３５１に、さらに記載されている。
【０１０７】
なお別の例では、Ｆｃ領域は、以下の位置：２３４、２３５、２３６、２３８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６２、２６３、２６４、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１３、３１５、３２０、３２２、３２４、３２５、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８または４３９において１つ以上のアミノ酸を改変することによって、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を減少させるためおよび／またはＦｃγ受容体に対する親和性を減少させるために改変され得る。例示的な置換には、２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６８Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｅ、２６８Ｆ、３２４Ｔ、３３２Ｄおよび３３２Ｅが含まれる。例示的なバリアントには、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３６Ａ／２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６８Ｆ／３２４Ｔ、２６７Ｅ／２６８Ｆ、２６７Ｅ／３２４Ｔおよび２６７Ｅ／２６８Ｆ／３２４Ｔが含まれる。ＦｃγＲおよび補体との相互作用を増強するための他の改変には、置換２９８Ａ、３３３Ａ、３３４Ａ、３２６Ａ、２４７１、３３９Ｄ、３３９Ｑ、２８０Ｈ、２９０Ｓ、２９８Ｄ、２９８Ｖ、２４３Ｌ、２９２Ｐ、３００Ｌ、３９６Ｌ、３０５１および３９６Ｌが含まれるがこれらに限定されない。これらおよび他の改変は、Strohl, 2009, Current Opinion in Biotechnology 20:685-691に概説されている。
【０１０８】
Ｆｃに対してなされ得る他のＦｃ改変は、ＦｃγＲおよび／または補体タンパク質への結合を低減または消失させ、それによって、Ｆｃ媒介性エフェクター機能、例えば、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよびＣＤＣを低減または消失させるためのものである。例示的な改変には、２３４位、２３５位、２３６位、２３７位、２６７位、２６９位、３２５位、３２８位、３３０位および／または３３１位（例えば、３３０位および３３１位）における置換、挿入および欠失が含まれるがこれらに限定されず、ここで、番号付けは、ＥＵインデックスに従う。例示的な置換には、２３４Ａ、２３５Ｅ、２３６Ｒ、２３７Ａ、２６７Ｒ、２６９Ｒ、３２５Ｌ、３２８Ｒ、３３０Ｓおよび３３１Ｓ（例えば、３３０Ｓおよび３３１Ｓ）が含まれるがこれらに限定されず、ここで、番号付けは、ＥＵインデックスに従う。Ｆｃバリアントは、２３６Ｒ／３２８Ｒを含み得る。ＦｃγＲおよび補体との相互作用を低減させるための他の改変には、置換２９７Ａ、２３４Ａ、２３５Ａ、２３７Ａ、３１８Ａ、２２８Ｐ、２３６Ｅ、２６８Ｑ、３０９Ｌ、３３０Ｓ、３３１Ｓ、２２０Ｓ、２２６Ｓ、２２９Ｓ、２３８Ｓ、２３３Ｐおよび２３４Ｖ、ならびに変異的もしくは酵素的手段による、またはタンパク質をグリコシル化しない細菌などの生物における産生による、２９７位におけるグリコシル化の除去が含まれる。これらおよび他の改変は、Strohl, 2009, Current Opinion in Biotechnology 20:685-691に概説されている。
【０１０９】
任意に、Ｆｃ領域は、当業者に公知のさらなるおよび／または代替的な位置において、天然に存在しないアミノ酸残基を含み得る（例えば、米国特許第５，６２４，８２１号；同第６，２７７，３７５号；同第６，７３７，０５６号；同第６，１９４，５５１号；同第７，３１７，０９１号；同第８，１０１，７２０号；国際出願公開番号ＷＯ００／４２０７２；ＷＯ０１／５８９５７；ＷＯ０２／０６９１９；ＷＯ０４／０１６７５０；ＷＯ０４／０２９２０７；ＷＯ０４／０３５７５２；ＷＯ０４／０７４４５５；ＷＯ０４／０９９２４９；ＷＯ０４／０６３３５１；ＷＯ０５／０７０９６３；ＷＯ０５／０４０２１７、ＷＯ０５／０９２９２５およびＷＯ０６／０２０１  １４を参照のこと）。
【０１１０】
そのリガンドに対するＦｃ領域の親和性および結合特性は、平衡法（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏａｂｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）（ＥＬＩＳＡ）またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））または速度論（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ分析）、ならびに他の方法、例えば、間接的結合アッセイ、競合的阻害アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、ゲル電気泳動およびクロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過）が含まれるがこれらに限定されない、当該分野で公知の種々のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ法（生化学的または免疫学的ベースアッセイ）によって決定され得る。これらおよび他の方法は、試験されている構成要素のうち１つ以上の上の標識を利用し得る、および／または発色、蛍光、発光もしくは同位体標識が含まれるがこれらに限定されない種々の検出法を使用し得る。結合親和性および速度論の詳細な記載は、抗体−免疫原相互作用に焦点を当てた、Paul, W. E., ed., Fundamental immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999)中に見出すことができる。
【０１１１】
ある特定の実施形態では、本開示の抗ＴＲＥＭ−１抗体は、ＦｃγＲへの低減された結合を有するまたはＦｃγＲに結合することが不可能なＦｃを含む。一部の実施形態では、この抗ＴＲＥＭ−１抗体は、配列番号７６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号５４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗体と比較して、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）、またはそれらの任意の組み合わせに対する減少した結合親和性を有する。一部の実施形態では、この抗ＴＲＥＭ−１抗体は、配列番号７６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号５４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗体と比較して、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）に対する、２分の１以下、３分の１以下、４分の１以下、５分の１以下、６分の１以下、７分の１以下、８分の１以下、９分の１以下または１０分の１以下に減少した結合親和性を有する。
【０１１２】
一部の実施形態では、これらの抗ＴＲＥＭ−１抗体は、以下を含むＩｇＧ１  Ｆｃバリアントを含む：（ａ）ＥＵ番号付けに従って、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換；（ｂ）ＥＵ番号付けに従って、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換；（ｃ）ＥＵ番号付けに従って、Ｋ２１４Ｒ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｐ２３８Ｓ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換；または（ｄ）ＥＵ番号付けに従って、Ｓ１３１Ｃ、Ｋ１３３Ｒ、Ｇ１３７Ｅ、Ｇ１３８Ｓ、Ｑ１９６Ｋ、Ｉ１９９Ｔ、Ｎ２０３Ｄ、Ｋ２１４Ｒ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｐ２３８Ｓ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換。
【０１１３】
一部の実施形態では、本明細書で開示される抗ＴＲＥＭ−１抗体は、（ａ）ＩｇＧ１アイソタイプを有し、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｄ２７０Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｐ２３８Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｐ２３８Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ａ３２７Ｇ、Ｐ３２９Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３３１Ｓ、Ｔ３９４Ｄ、Ａ３３０Ｌ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｌ３２８Ｅ、Ｐ２３８Ｄ、Ｓ２６７Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ｅ２３３Ｄ、Ｇ２３７Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、Ａ３３０Ｒ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸残基において、Ｆｃ領域中に１つ以上のアミノ酸置換を含み、ここで、残基の番号付けは、ＥＵもしくはＫａｂａｔ番号付けに従い、またはグリシン２３６に対応する位置において、Ｆｃ領域中にアミノ酸欠失を含む；（ｂ）ＩｇＧ２アイソタイプを有し、Ｐ２３８Ｓ、Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｈ２６８Ａ、Ｈ２６８Ｑ、Ｈ２６８Ｅ、Ｖ３０９Ｌ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｃ２３２Ｓ、Ｃ２３３Ｓ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸残基において、Ｆｃ領域中に１つ以上のアミノ酸置換を含み、ここで、残基の番号付けは、ＥＵもしくはＫａｂａｔ番号付けに従う；あるいは（ｃ）ＩｇＧ４アイソタイプを有し、Ｅ２３３Ｐ、Ｆ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ａ／Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３６Ｅ、Ｓ２４１Ｐ、Ｌ２４８Ｅ、Ｔ３９４Ｄ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸残基において、Ｆｃ領域中に１つ以上のアミノ酸置換を含み、ここで、残基の番号付けは、ＥＵもしくはＫａｂａｔ番号付けに従う。一部の実施形態では、（ａ）Ｆｃ領域は、Ａ３３０Ｌ、Ｌ２３４Ｆ；Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３３１Ｓ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸残基において、１つ以上のさらなるアミノ酸置換をさらに含み、ここで、残基の番号付けは、ＥＵもしくはＫａｂａｔ番号付けに従う；（ｂ）Ｆｃ領域は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される位置において、１つ以上のさらなるアミノ酸置換をさらに含み、ここで、残基の番号付けは、ＥＵもしくはＫａｂａｔ番号付けに従う；または（ｃ）Ｆｃ領域は、ＥＵもしくはＫａｂａｔ番号付けに従って、Ｓ２２８Ｐアミノ酸置換をさらに含む。ＷＯ２０１７／１５２１０２を参照のこと。
ある特定の実施形態では、低減された補体結合を有するＦｃが選択される。低減された補体結合を有する例示的なＦｃ、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃは、以下の２つのアミノ酸置換を有する：Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ。
【０１１４】
ある特定の実施形態では、エフェクター機能を本質的に有さないＦｃが選択される、即ち、かかるＦｃは、ＦｃγＲへの低減された結合および低減された補体結合を有する。エフェクターなしの例示的なＦｃ、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃは、以下の５つの変異を含む：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ。
【０１１５】
ＩＩ．抗体の物理的特性
抗ＴＲＥＭ−１抗体、例えば、本明細書に記載されるものは、本明細書に記載される特異的抗ＴＲＥＭ−１抗体の物理的特徴、例えば、実施例に記載される特徴の、一部または全てを有する。
特に可変領域内のグリコシル化部位は、抗体の増加した免疫原性、または変更された抗原結合に起因する抗体のｐＫの変更を生じ得る（Marshall et al., (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702；Gala and Morrison (2004) J. Immunol 172:5489-94；Wallick et al., (1988) J Exp Med 168: 1099-109；Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R；Parekh et al., (1985) Nature 316:452-7；Mimura et al., (2000) Mol Immunol 37:697-706）。グリコシル化は、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を含むモチーフにおいて生じることが公知である。一部の実施形態では、本開示の抗ＴＲＥＭ−１抗体は、可変領域グリコシル化を含まない、または低減された可変領域グリコシル化を有する。これは、可変領域中にグリコシル化モチーフを含まない抗体を選択すること、またはグリコシル化領域内の残基を変異させることによって、達成され得る。従って、一部の実施形態では、本明細書で開示される抗ＴＲＥＭ−１抗体は、配列番号７６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号５４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗体と比較して、免疫原性が低い。
一部の実施形態では、これらの抗ＴＲＥＭ−１抗体は、アスパラギン異性部位を含まない。アスパラギンの脱アミドは、Ｎ−ＧまたはＤ−Ｇ配列上で生じ得、ポリペプチド鎖中にねじれを導入し、その安定性を減少させるイソアスパラギン酸残基の創出を生じる（イソアスパラギン酸効果）。
【０１１６】
各抗体は、一般には６と９．５との間のｐＨ範囲に入る、独自の等電点（ｐｉ）を有する。ＩｇＧ１抗体についてのｐｉは、典型的には、７〜９．５のｐＨ範囲内に入り、ＩｇＧ４抗体についてのｐｉは、典型的には、６〜８のｐＨ範囲内に入る。正常範囲の外側のｐｉを有する抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で、いくらかのアンフォールディングおよび不安定性を有し得ると推論される。従って、本明細書で開示される抗ＴＲＥＭ−１抗体は、正常範囲（例えば、８〜９）に入るｐｉ値を含み得る。これは、正常範囲内のｐｉを有する抗体を選択すること、または荷電した表面残基を変異させることによって、達成され得る。
【０１１７】
各抗体は、特徴的な融解温度を有し、より高い融解温度は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのより高い全体的安定性を示す（Krishnamurthy R and Manning M C (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71）。一般に、ＴMｉ（初期アンフォールディングの温度）は、６０℃よりも高い、６５℃よりも高い、または７０℃よりも高い場合がある。一部の実施形態では、本開示の抗ＴＲＥＭ−１抗体は、配列番号７６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号５４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗体と比較して、より高い融解温度を有する。従って、一部の実施形態では、本開示の抗ＴＲＥＭ−１抗体は、例えば、キャピラリー示差走査熱量計（ＣＡＰ−ＤＳＣ）によって測定した場合に、配列番号７６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号５４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む参照抗体と比較して、熱的に安定である。抗体の融点は、示差走査熱量測定（Chen et al., (2003) Pharm Res 20: 1952-60；Ghirlando et al.,(1999) Immunol Lett 68:47-52）または円二色性（Murray et al., (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9）を使用して測定され得る。一部の実施形態では、抗体の約１０％〜２０％、約２０％〜３０％（例えば、２４％）または約３０％〜４０％は、７７℃に加熱した場合に可逆的である。
一部の実施形態では、本開示の抗ＴＲＥＭ−１抗体は、迅速には分解しない。抗体の分解は、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）およびＭＡＬＤＩ−ＭＳを使用して測定され得る（Alexander A J and Hughes D E (1995) Anal Chem 67:3626-32）。
【０１１８】
一部の実施形態では、本明細書で開示される抗ＴＲＥＭ−１抗体は、望ましくない免疫応答および／または変更されたもしくは好ましくない薬物動態特性の誘発をもたらし得る最小の凝集効果を有する。一般に、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下または５％以下の凝集を有する抗体が許容される。凝集は、サイズ排除カラム（ＳＥＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および動的光散乱（ＤＬＳ）を含むいくつかの技術によって測定され得る。一部の実施形態では、本開示の抗ＴＲＥＭ−１抗体は、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）によって観察した場合に、モノマーである。一部の実施形態では、これらの抗ＴＲＥＭ−１抗体は、２次元液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（２Ｄ−ＬＣ／ＭＳ）、または液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ／ＭＳ）を使用するインタクト質量分析によって観察した場合に、断片化の最小のリスクを示す。
【０１１９】
ＩＩＩ．核酸、ベクターおよび細胞
本明細書に記載される別の態様は、本明細書に記載される抗ＴＲＥＭ−１抗体をコードする核酸分子に関する。これらの核酸は、全細胞中に、細胞溶解物中に、または部分的に精製された形態でもしくは実質的に純粋な形態で、存在し得る。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、制限酵素、アガロースゲル電気泳動および当該分野で周知の他のものを含む標準的な技術によって、他の細胞性構成要素または他の混入物、例えば、他の細胞性核酸（例えば、他の染色体ＤＮＡ、例えば、単離されたＤＮＡに事実上連結された染色体ＤＮＡ）またはタンパク質から精製された場合、「単離された」または「実質的に純粋にされた」。F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New Yorkを参照のこと。本明細書に記載される核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、イントロン配列を含んでも含まなくてもよい。一部の実施形態では、この核酸は、ｃＤＮＡ分子である。
【０１２０】
本明細書に記載される核酸は、標準的な分子生物学の技術を使用して取得され得る。ハイブリドーマ（例えば、以下にさらに記載される、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスから分離されたハイブリドーマ）によって発現される抗体について、ハイブリドーマによって作製される抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準的なＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術によって取得され得る。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから（例えば、ファージディスプレイ技術を使用して）取得される抗体について、この抗体をコードする核酸は、ライブラリーから回収され得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載される核酸は、本開示の抗ＴＲＥＭ−１抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列をコードする核酸である。ＶＨ配列およびＶＬ配列をコードする例示的なＤＮＡ配列は、それぞれ、配列番号５８〜６１および６２〜６５に示される。
本明細書で開示される抗ＴＲＥＭ−１抗体を作製するための方法は、シグナルペプチドと共に、重鎖および軽鎖をコードするヌクレオチド配列、例えば、それぞれ、配列番号５８〜６１および６２〜６５を含む細胞株において、重鎖および軽鎖を発現させるステップを含み得る。これらのヌクレオチド配列を含む宿主細胞は、本明細書に包含される。
【０１２１】
ＶＨセグメントおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が取得されると、これらのＤＮＡ断片は、例えば、可変領域遺伝子を、全長抗体鎖遺伝子に、Ｆａｂ断片遺伝子に、またはｓｃＦｖ遺伝子に変換するために、標準的な組換えＤＮＡ技術によってさらに操作され得る。これらの操作では、ＶＬコードＤＮＡ断片またはＶＨコードＤＮＡ断片は、別のタンパク質、例えば、抗体定常領域または可動性リンカーをコードする別のＤＮＡ断片に、作動可能に連結される。用語「作動可能に連結された」は、この文脈で使用する場合、２つのＤＮＡ断片が、２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームのままになるように接合されることを意味する意図である。
【０１２２】
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨコードＤＮＡを、重鎖定常領域（ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結させることによって、全長重鎖遺伝子に変換され得る。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当該分野で公知であり（例えば、Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照のこと）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅によって取得され得る。この重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域、例えば、ＩｇＧ２および／またはＩｇＧ４定常領域であり得る。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子について、ＶＨコードＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に、作動可能に連結され得る。
【０１２３】
ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＬコードＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結させることによって、全長軽鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換され得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当該分野で公知であり（例えば、Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照のこと）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅によって取得され得る。この軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ定常領域であり得る。
【０１２４】
本明細書に記載される別の態様は、本明細書に記載される抗ＴＲＥＭ−１抗体を（例えば、組換え）発現する細胞（例えば、宿主細胞）、ならびに関連のポリヌクレオチドおよび発現ベクターに関する。抗ＴＲＥＭ−１抗体またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含むベクターもまた、本明細書で提供される。一部の実施形態では、これらのベクターは、宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞において、本明細書に記載される抗ＴＲＥＭ−１抗体を組換え発現するために使用され得る。一部の実施形態では、これらのベクターは、遺伝子治療に使用され得る。
本開示に適切なベクターには、発現ベクター、ウイルスベクターおよびプラスミドベクターが含まれる。一部の実施形態では、このベクターは、ウイルスベクターである。
本明細書で使用する場合、発現ベクターは、適切な宿主細胞中に導入された場合の、挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要なエレメント、またはＲＮＡウイルスベクターの場合には、複製および翻訳に必要なエレメントを含む、任意の核酸構築物を指す。発現ベクターには、プラスミド、ファージミド、ウイルス、およびそれらの誘導体が含まれ得る。
【０１２５】
本開示の発現ベクターは、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合部分をコードするポリヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分のコード配列は、発現制御配列に動作可能に連結される。本明細書で使用する場合、２つの核酸配列が、各構成要素核酸配列がその機能性を保持するのを可能にするような方法で共有結合的に連結されている場合、それらは、動作可能に連結されている。コード配列および遺伝子発現制御配列が、コード配列の発現または転写および／もしくは翻訳を遺伝子発現制御配列の影響下または制御下に配置するような方法で共有結合的に連結されている場合、それらは、動作可能に連結されていると言われる。５’遺伝子発現配列中のプロモーターの誘導が、コード配列の転写を生じる場合、および２つのＤＮＡ配列間の連結の性質が、（１）フレームシフト変異の導入を生じない場合、（２）コード配列の転写を指示するプロモーター領域の能力を妨害しない場合、または（３）タンパク質へと翻訳される対応するＲＮＡ転写物の能力を妨害しない場合、これら２つのＤＮＡ配列は、動作可能に連結されていると言われる。従って、得られた転写物が所望の抗体またはその抗原結合部分へと翻訳されるように、遺伝子発現配列がそのコード核酸配列の転写をもたらすことが可能であった場合、この遺伝子発現配列は、コード核酸配列に動作可能に連結されている。
【０１２６】
ウイルスベクターには、以下のウイルス由来の核酸配列が含まれるがこれらに限定されない：レトロウイルス、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルスおよびラウス肉腫ウイルス；レンチウイルス；アデノウイルス；アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタイン・バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；ならびにＲＮＡウイルス、例えば、レトロウイルス。当該分野で周知の他のベクターを容易に使用することができる。ある特定のウイルスベクターは、非必須遺伝子が目的の遺伝子で置き換えられた非細胞変性真核生物ウイルスに基づく。非細胞変性ウイルスには、レトロウイルスが含まれ、その生活環には、ＤＮＡへのゲノムウイルスＲＮＡの逆転写と、宿主細胞性ＤＮＡ中への引き続くプロウイルス組込みが関与する。レトロウイルスは、ヒト遺伝子治療試験のために承認されている。複製欠損（即ち、所望のタンパク質の合成を指示することは可能であるが、感染性粒子を製造することが不可能である）レトロウイルスが、最も有用である。かかる遺伝子変更されたレトロウイルス発現ベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子の高い効率の形質導入のために、一般的な有用性を有する。複製欠損レトロウイルスを産生するための標準的なプロトコール（プラスミド中への外因性遺伝子材料の取り込み、プラスミドによるパッケージング細胞株のトランスフェクション、パッケージング細胞株による組換えレトロウイルスの産生、組織培養培地からのウイルス粒子の収集、およびウイルス粒子による標的細胞の感染のステップを含む）は、Kriegler, M., Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, W.H. Freeman Co., New York (1990)およびMurry, E. J., Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J. (1991)に提供されている。
【０１２７】
一部の実施形態では、このウイルスは、二本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノ随伴ウイルスである。アデノ随伴ウイルスは、複製欠損であるように操作され得、広範な細胞型および種に感染することが可能である。これは、熱および脂質溶媒安定性；造血細胞を含む多様な系譜の細胞における高い形質導入頻度；ならびに複数の一連の形質導入を可能にする重複感染阻害の欠如などの利点をさらに有する。報告によれば、アデノ随伴ウイルスは、部位特異的様式でヒト細胞性ＤＮＡ中に組み込まれ得、それによって、レトロウイルス感染に特徴的な挿入変異誘発の可能性および挿入された遺伝子の発現の可変性を最小化する。さらに、野生型アデノ随伴ウイルス感染は、選択圧の非存在下で１００継代よりも長きにわたって、組織培養物中で追跡されており、これは、アデノ随伴ウイルスのゲノム組込みが比較的安定な事象であることを暗示している。アデノ随伴ウイルスは、染色体外様式でも機能し得る。
【０１２８】
ＩＶ．イムノコンジュゲート
本開示は、本明細書で開示される抗ＴＲＥＭ−１抗体のいずれかを含むイムノコンジュゲートもまた提供する。一部の実施形態では、このイムノコンジュゲートは、薬剤に連結された抗体または抗原結合部分を含む。一部の実施形態では、このイムノコンジュゲートは、薬剤（例えば、治療剤または診断剤としての）に連結された本明細書で開示される二特異性分子を含む。
【０１２９】
診断目的のために、適切な薬剤は、全身画像化のための放射性同位体、ならびに放射性同位体、酵素、蛍光標識およびサンプル試験のための他の適切な抗体タグが含まれる検出可能な標識である。本明細書に記載される任意の抗ＴＲＥＭ−１抗体に連結され得る検出可能な標識は、金属ゾル、例えば、コロイド金を含む粒状標識、同位体、例えば、Ｎ2Ｓ2、Ｎ3ＳまたはＮ4型のペプチド性キレート剤に例えば提示されるＩ125またはＴｃ99、蛍光マーカー、発光マーカー、リン光マーカーなどを含む発色団、ならびに所与の基質を検出可能なマーカーに変換する酵素標識、およびポリメラーゼ連鎖反応などによる増幅後に明らかになるポリヌクレオチドタグを含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断学の分野で現在使用されている種々の型のいずれかであり得る。適切な酵素標識には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどが含まれる。例えば、標識は、１，２ジオキセタン基質、例えば、アダマンチルメトキシホスホリルオキシフェニルジオキセタン（ＡＭＰＰＤ）、３−（４−（メトキシスピロ｛ｌ，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ｛３．３．１．１３，７｝デカン｝−４−イル）フェニルリン酸二ナトリウム（ＣＳＰＤ）、ならびにＣＤＰおよびＣＤＰ−ＳＴＡＲ（登録商標）の変換後の化学発光の存在または形成を測定することによって検出される酵素アルカリホスファターゼ、または当業者に周知の他の発光基質、例えば、適切なランタニド、例えば、テルビウム（ＩＩＩ）およびユーロピウム（ＩＩＩ）のキレートであり得る。検出手段は、選択された標識によって決定される。標識またはその反応産物の外観は、標識が粒状であり、適切なレベルで蓄積される場合には、肉眼を使用して達成され得、または全て標準的な実務に従って、分光光度計、ルミノメーター、蛍光光度計などの機器を使用して達成され得る。
【０１３０】
一部の実施形態では、コンジュゲーション法は、実質的に（またはほとんど）非免疫原性である連結、例えば、ペプチド連結（即ち、アミド連結）、スルフィド連結、（立体障害される）、ジスルフィド連結、ヒドラゾン連結およびエーテル連結を生じる。これらの連結は、ほとんど非免疫原性であり、血清内で合理的な安定性を示す（例えば、Senter, P. D., Curr. Opin. Chem. Biol. 13 (2009) 235-244；ＷＯ２００９／０５９２７８；ＷＯ９５／１７８８６を参照のこと）。
【０１３１】
部分および抗体の生化学的性質に依存して、異なるコンジュゲーション戦略が使用され得る。この部分が、５０アミノ酸〜５００アミノ酸の間の、天然に存在するまたは組換えである場合、当業者が容易に従うことができる、タンパク質コンジュゲートの合成のための化学を記載する教科書中に、標準的な手順が存在する（例えば、Hackenberger, C. P. R., and Schwarzer, D., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 47 (2008) 10030-10074を参照のこと）。一部の実施形態では、マレイミド（ｍａｌｅｉｎｉｍｉｄｏ）部分と、抗体または部分内のシステイン残基との反応が、使用される。これは、例えば、抗体のＦａｂまたはＦａｂ’断片が使用される場合、特に適したカップリング化学である。あるいは、一部の実施形態では、抗体または部分のＣ末端へのカップリングが実施される。タンパク質、例えば、Ｆａｂ断片のＣ末端改変は、記載されるように実施され得る（Sunbul, M. and Yin, J., Org. Biomol. Chem. 7 (2009) 3361-3371）。
【０１３２】
一般に、部位特異的反応および共有結合カップリングは、天然のアミノ酸を、存在する他の官能基の反応性に対してオルソゴナルな反応性を有するアミノ酸へと変形させることに基づく。例えば、まれな配列コンテクスト内の特定のシステインは、アルデヒドへと酵素的に変換され得る（Frese, M. A., and Dierks, T., ChemBioChem. 10 (2009) 425-427を参照のこと）。ある特定の酵素と所与の配列コンテクスト中の天然のアミノ酸との特異的酵素反応性を利用することによっても、所望のアミノ酸改変を取得することが可能である（例えば、Taki, M. et al., Prot. Eng. Des. Sel. 17 (2004) 119-126；Gautier, A. et al. Chem. Biol. 15 (2008) 128-136を参照のこと；プロテアーゼ触媒されるＣ−Ｎ結合形成が、Bordusa, F., Highlights in Bioorganic Chemistry (2004) 389-403によって使用される）。部位特異的反応および共有結合カップリングは、末端アミノ酸と適切な改変試薬との選択的反応によっても達成され得る。
Ｎ末端システインとベンゾニトリルとの反応性（Ren, H. et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48 (2009) 9658-9662を参照のこと）が、部位特異的共有結合カップリングを達成するために使用され得る。
ネイティブの化学的ライゲーションもまた、Ｃ末端システイン残基に依存し得る（Taylor, E. Vogel; Imperiali, B, Nucleic Acids and Molecular Biology (2009), 22 (Protein Engineering), 65-96）。
米国特許第６４３７０９５号は、負に荷電したアミノ酸のストレッチ内のシステインと、正に荷電したアミノ酸のストレッチ中に位置するシステインとのより速い反応に基づくコンジュゲーション法を記載している。
【０１３３】
この部分はまた、合成ペプチドまたはペプチド模倣物であり得る。ポリペプチドが化学的に合成される場合、オルソゴナルな化学反応性を有するアミノ酸が、かかる合成の間に取り込まれ得る（例えば、de Graaf, A. J. et al., Bioconjug. Chem. 20 (2009) 1281-1295を参照のこと）。多種多様なオルソゴナル官能基が関連し、それらは合成ペプチド中に導入することができるので、かかるペプチドのリンカーへのコンジュゲーションは、標準的な化学である。
【０１３４】
モノ標識されたポリペプチドを取得するために、１：１の化学量論を有するコンジュゲートが、クロマトグラフィーによって、他のコンジュゲーション副産物から分離され得る。この手順は、色素標識された結合対メンバーおよび荷電したリンカーを使用することによって促進され得る。この種の標識され高度に負に荷電した結合対メンバーを使用することによって、モノコンジュゲートされたポリペプチドは、非標識ポリペプチドおよび１つよりも多くのリンカーを保有するポリペプチドから容易に分離されるが、それは、電荷および分子量における差異が分離のために使用できるからである。蛍光色素は、標識された一価バインダーなどの未結合の構成要素から複合体を精製するために、有用であり得る。
一部の実施形態では、抗ＴＲＥＭ−１抗体に結合される部分は、結合部分、標識化部分および生物学的に活性な部分からなる群から選択される。
【０１３５】
本明細書に記載される抗ＴＲＥＭ−１抗体はまた、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）などのイムノコンジュゲートを形成するために、治療剤にコンジュゲートされ得る。適切な治療剤には、代謝拮抗物質、アルキル化剤、ＤＮＡ副溝バインダー、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡクロスリンカー、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、核外輸送阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼＩまたはＩＩ阻害剤、ヒートショックタンパク質阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗生物質および抗有糸分裂剤が含まれる。ＡＤＣでは、抗体および治療剤は、好ましくは、切断可能なリンカー、例えば、ペプチジル、ジスルフィドまたはヒドラゾンリンカーを介してコンジュゲートされる。一部の実施形態では、このリンカーは、ペプチジルリンカー、例えば、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ（配列番号８０）、Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ、Ｃｉｔ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ、ＳｅｒまたはＧｌｕである。ＡＤＣは、米国特許第７，０８７，６００号；同第６，９８９，４５２号；および同第７，１２９，２６１号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ０２／０９６９１０；ＷＯ０７／０３８６５８；ＷＯ０７／０５１０８１；ＷＯ０７／０５９４０４；ＷＯ０８／０８３３１２；およびＷＯ０８／１０３６９３；米国特許出願公開第２００６００２４３１７号；同第２００６０００４０８１号；および同第２００６０２４７２９５号に記載されるように調製され得る。
【０１３６】
抗ＴＲＥＭ−１抗体、例えば、本明細書に記載されるものは、ＴＲＥＭ−１、例えば、ヒトＴＲＥＭ−１、例えば、組織または組織サンプル中のヒトＴＲＥＭ−１を検出するためにも使用され得る。これらの抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイまたはフローサイトメトリーにおいて使用され得る。一部の実施形態では、抗ＴＲＥＭ−１抗体は、特異的結合が生じるのに適切な時間にわたって、細胞、例えば、組織中の細胞と接触され、次いで、試薬、例えば、抗ＴＲＥＭ−１抗体を検出する抗体が添加される。例示的なアッセイは、実施例に提供される。この抗ＴＲＥＭ−１抗体は、完全ヒト抗体であり得、またはキメラ抗体、例えば、ヒト可変領域およびマウス定常領域もしくはそれらの一部分を有する抗体であり得る。サンプル（細胞または組織サンプル）中のＴＲＥＭ−１、例えば、ヒトＴＲＥＭ−１を検出するための例示的な方法は、（ｉ）サンプル中のＴＲＥＭ−１への抗ＴＲＥＭ−１抗体の特異的結合を可能にするのに十分な時間にわたって、サンプルを抗ＴＲＥＭ−１抗体と接触させるステップ、および（２）サンプルを、検出試薬、例えば、抗ＴＲＥＭ−１抗体、例えば、抗ＴＲＥＭ−１抗体のＦｃ領域に特異的に結合する抗体と接触させ、それによって、抗ＴＲＥＭ−１抗体が結合したＴＲＥＭ−１を検出するステップ、を含む。洗浄ステップが、抗体および／または検出試薬とのインキュベーション後に含められ得る。別々の検出剤を使用することができるので、これらの方法における使用のための抗ＴＲＥＭ−１抗体は、標識または検出剤に連結される必要はない。
例えば、単独療法または併用療法としての、抗ＴＲＥＭ−１抗体についての他の使用は、本明細書の他の場所、例えば、併用処置に関するセクションに提供される。
【０１３７】
Ｖ．二特異性分子
本明細書に記載される抗ＴＲＥＭ−１抗体は、二特異性分子を形成するために使用され得る。抗ＴＲＥＭ−１抗体またはその抗原結合部分は、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する二特異性分子を生成するために、誘導体化され得る、または別の機能的分子、例えば、別のペプチドもしくはタンパク質（例えば、受容体に対する別の抗体またはリガンド）に連結され得る。例えば、抗ＴＲＥＭ−１抗体は、併用処置のための潜在的な標的として使用され得る任意のタンパク質、例えば、本明細書に記載されるタンパク質に特異的に結合する抗体またはｓｃＦｖ（例えば、ＩＰ−１０またはＴＮＦ−αに対する抗体）に連結され得る。本明細書に記載される抗体は、実際に、２つよりも多くの異なる結合部位および／または標的分子に結合する多特異性分子を生成するために、誘導体化され得、または１つよりも多くの他の機能的分子に連結され得る；本明細書で使用する場合、かかる多特異性分子もまた、用語「二特異性分子」によって包含される意図である。本明細書に記載される二特異性分子を創出するために、本明細書に記載される抗体は、二特異性分子が生じるように、１つ以上の他の結合分子、例えば、別の抗体、抗体断片、ペプチドまたは結合性模倣物に、（例えば、化学的カップリング、遺伝的融合、非共有結合的会合または他の方法によって）機能的に連結され得る。
従って、ＴＲＥＭ−１に対する少なくとも１つの第１の結合特異性および第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性を含む二特異性分子が、本明細書で提供される。二特異性分子が多特異性である本明細書に記載される一部の実施形態では、この分子は、第３の結合特異性をさらに含み得る。
【０１３８】
一部の実施形態では、本明細書に記載される二特異性分子は、結合特異性として、少なくとも１つの抗体、または例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖもしくは単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含むその抗体断片を含む。この抗体はまた、軽鎖もしくは重鎖ダイマー、またはそれらの任意の最小断片、例えば、Ｌａｄｎｅｒらの米国特許第４，９４６，７７８号に記載されるような、Ｆｖもしくは単鎖構築物であり得る。
ヒトモノクローナル抗体が好ましいが、本明細書に記載される二特異性分子において使用され得る他の抗体は、マウス、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体である。
【０１３９】
本明細書に記載される二特異性分子は、構成成分の結合特異性を、当該分野で公知の方法を使用してコンジュゲートすることによって、調製され得る。例えば、二特異性分子の各結合特異性は、別々に生成され得、次いで、互いにコンジュゲートされ得る。結合特異性がタンパク質またはペプチドである場合、種々のカップリングまたは架橋結合剤が、共有結合コンジュゲーションのために使用され得る。架橋結合剤の例には、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン（ｃｙｃｌｏｈａｘａｎｅ）−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）が含まれる（例えば、Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160: 1686；Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648を参照のこと）。他の方法には、Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132；Brennan et al. (1985) Science 229:81-83およびGlennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375に記載されるものが含まれる。一部のコンジュゲート剤は、ＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣであり、これらは共に、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から入手可能である。
結合特異性が抗体である場合、これらは、２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合を介してコンジュゲートされ得る。一部の実施形態では、ヒンジ領域は、コンジュゲーション前に、奇数の、好ましくは１つのスルフヒドリル残基を含むように改変される。
【０１４０】
あるいは、両方の結合特異性が、同じベクター中にコードされ得、同じ宿主細胞中で発現およびアセンブルされ得る。この方法は、二特異性分子がｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ、ｍＡｂ×（ｓｃＦｖ）2、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）2またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に、特に有用である。二特異性抗体は、各重鎖のＣ末端にｓｃＦｖを含む抗体を含み得る。本明細書に記載される二特異性分子は、１つの単鎖抗体および１つの結合決定基を含む単鎖分子、または２つの結合決定基を含む単鎖二特異性分子であり得る。二特異性分子は、少なくとも２つの単鎖分子を含み得る。二特異性分子を調製するための方法は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号；米国特許第５，４５５，０３０号；米国特許第４，８８１，１７５号；米国特許第５，１３２，４０５号；米国特許第５，０９１，５１３号；米国特許第５，４７６，７８６号；米国特許第５，０１３，６５３号；米国特許第５，２５８，４９８号；および米国特許第５，４８２，８５８号に記載されている。
【０１４１】
それらの特異的標的への二特異性分子の結合は、当該分野で認識された方法、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ（例えば、成長阻害）またはウエスタンブロットアッセイを使用して確認され得る。これらのアッセイの各々は、一般に、目的の複合体に対して特異的な標識された試薬（例えば、抗体）を使用することによって、特に目的のタンパク質−抗体複合体の存在を検出する。
【０１４２】
ＶＩ．キット
本明細書に記載される１つ以上の抗ＴＲＥＭ−１抗体もしくはその抗原結合部分、それらの二特異性分子またはイムノコンジュゲートを含むキットが、本明細書で提供される。一部の実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物の成分のうち１つ以上、例えば、本明細書で提供される１つ以上の抗体またはその抗原結合部分が満たされた１つ以上の容器、任意の、使用のための指示を含む、医薬パックまたはキットが、本明細書で提供される。一部の実施形態では、これらのキットは、本明細書に記載される医薬組成物および任意の予防剤または治療剤、例えば、本明細書に記載されるものを含む。
【０１４３】
ＶＩＩ．組成物および製剤
本明細書で開示される抗ＴＲＥＭ−１抗体（抗ＴＲＥＭ−１抗体をコードおよび／または発現するポリヌクレオチド、ベクターおよび細胞を含む）のうち１つ以上を含む組成物（例えば、医薬組成物）および製剤が、本明細書でさらに提供される。例えば、一実施形態では、本開示は、薬学的に許容される担体と一緒に製剤化された、本明細書で開示される１つ以上の抗ＴＲＥＭ−１抗体を含む医薬組成物を提供する。
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合性の、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。一部の実施形態では、この担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（例えば、注射または注入による）に適切である。投与の経路に依存して、活性化合物、即ち、抗体、イムノコンジュゲートまたは二特異性分子は、化合物を不活性化し得る酸および他の天然の条件の作用から化合物を保護するための材料でコーティングされ得る。
【０１４４】
従って、本開示の１つの目的は、抗ＴＲＥＭ−１抗体の安定性を改善し、従って、それらの長期貯蔵を可能にする、医薬製剤を提供することである。一部の実施形態では、本明細書で開示される医薬製剤は、以下を含む：（ａ）抗ＴＲＥＭ−１抗体；（ｂ）緩衝剤；（ｃ）安定化剤；（ｄ）塩；（ｅ）増量剤（ｂｕｌｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）；および／または（ｆ）界面活性剤。一部の実施形態では、この医薬製剤は、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも１年間、少なくとも２年間、少なくとも３年間、少なくとも５年間またはそれ以上にわたって、安定である。一部の実施形態では、この製剤は、４℃、２５℃または４０℃で貯蔵された場合に安定である。
【０１４５】
緩衝剤
本発明のために有用な緩衝剤は、別の酸または塩基の添加後に、溶液の酸性度（ｐＨ）を、選択された値の近傍に維持するために使用される、弱酸または弱塩基であり得る。適切な緩衝剤は、製剤のｐＨ制御を維持することによって、医薬製剤の安定性を最大化し得る。適切な緩衝剤はまた、生理的適合性を確実にし得るまたは溶解度を最適化し得る。レオロジー、粘度および他の特性もまた、製剤のｐＨに依存し得る。一般的な緩衝剤には、ヒスチジン、シトレート、サクシネート、アセテートおよびホスフェートが含まれるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、緩衝剤は、等張剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃｉｔｙ  ａｇｅｎｔ）と共にヒスチジン（例えば、Ｌ−ヒスチジン）を含み、潜在的に、当該分野で公知の酸または塩基によるｐＨ調整を伴う。ある特定の実施形態では、この緩衝剤は、Ｌ−ヒスチジンである。ある特定の実施形態では、製剤のｐＨは、約２と約１０との間または約４と約８との間に維持される。
【０１４６】
安定化剤
安定化剤が、その製品を安定化させるために、医薬製品に添加される。かかる薬剤は、いくつかの異なる方法でタンパク質を安定化することができる。一般的な安定化剤には、アミノ酸、例えば、グリシン、アラニン、リジン、アルギニンもしくはスレオニン、炭水化物、例えば、グルコース、スクロース、トレハロース、ラフィノース（ｒａｆｆｍｏｓｅ）もしくはマルトース、ポリオール、例えば、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、シクロデキストリンもしくは任意の種類および分子量のデキストラン（ｄｅｓｔｒａｎ）、またはＰＥＧが含まれるがこれらに限定されない。本発明の一態様では、この安定化剤は、凍結乾燥された調製物中のＦＩＸポリペプチドの安定性を最大化するために選択される。ある特定の実施形態では、この安定化剤は、スクロースおよび／またはアルギニンである。
増量剤
増量剤は、製品に体積および質量を付加し、それによって、その正確な計量および取り扱いを促進するために、医薬製品に添加され得る。一般的な増量剤としては、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、ソルビトール、炭酸カルシウムまたはステアリン酸マグネシウムが含まれるがこれらに限定されない。
【０１４７】
界面活性剤
界面活性剤は、親液性基および疎液性基を有する両親媒性物質である。界面活性剤は、アニオン性、カチオン性、双性イオン性または非イオン性であり得る。非イオン性界面活性剤の例には、アルキルエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アミンエトキシレート、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、脂肪アルコール、例えば、セチルアルコールもしくはオレイルアルコール、コカミドＭＥＡ、コカミドＤＥＡ、ポリソルベート、またはドデシルジメチルアミンオキシドが含まれるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、この界面活性剤は、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。
【０１４８】
一部の実施形態では、本開示の医薬製剤は、
（ａ）約０．２５ｍｇ／ｍＬ〜２５０ｍｇ／ｍＬ（例えば、１０〜２００ｍｇ／ｍＬ）の抗ＴＲＥＭ−１抗体；
（ｂ）約２０ｍＭのヒスチジン；
（ｃ）約１５０ｍＭのスクロース；
（ｄ）約２５ｍＭのアルギニン；および
（ｅ）約５０ｍＭのＮａＣｌ
を含む。
この製剤は、緩衝系、防腐剤、等張化剤、キレート剤、安定剤および／または界面活性剤のうち１つ以上、ならびにそれらの種々の組み合わせをさらに含み得る。医薬組成物における防腐剤、等張剤、キレート剤、安定剤および界面活性剤の使用は、当業者に周知である。Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995が参照され得る。
【０１４９】
一部の実施形態では、この医薬製剤は、水性製剤である。かかる製剤は、典型的には、溶液または懸濁物であるが、これにはコロイド、分散物、エマルジョンおよび多相材料もまた含まれ得る。用語「水性製剤」は、少なくとも５０質量％の水を含む製剤として定義される。同様に、用語「水性溶液」は、少なくとも５０質量％の水を含む溶液として定義され、用語「水性懸濁物」は、少なくとも５０質量％の水を含む懸濁物として定義される。
一部の実施形態では、この医薬製剤は、医師または患者が使用前にそれに溶媒および／または希釈剤を添加する、フリーズドライ製剤である。
【０１５０】
本明細書に記載される医薬組成物はまた、併用療法において、即ち、他の薬剤と組み合わせて、投与され得る。例えば、併用療法は、少なくとも１つの他の治療剤と組み合わせた、本明細書に記載される抗ＴＲＥＭ−１抗体を含み得る。併用療法において使用され得る治療剤の例には、疾患または障害（例えば、炎症性障害）の処置のために使用される他の化合物、薬物および／または薬剤が含まれ得る。かかる化合物、薬物および／または薬剤には、例えば、炎症性サイトカインの産生を遮断または低減させる抗炎症性薬物または抗体が含まれ得る。一部の実施形態では、治療剤には、抗ＩＰ−１０抗体、抗ＴＮＦ−α抗体（例えば、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））、ゴリムマブ（ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標））、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））、セルトリズマブペゴル（ＣＩＭＺＩＡ（登録商標）））、インターフェロンベータ−１ａ（例えば、ＡＶＯＮＥＸ（登録商標）、ＲＥＢＩＦ（登録商標））、インターフェロンベータ−１ｂ（例えば、ＢＥＴＡＳＥＲＯＮ（登録商標）、ＥＸＴＡＶＩＡ（登録商標））、酢酸グラチラマー（例えば、ＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標）、ＧＬＡＴＯＰＡ（登録商標））、ミトキサントロン（例えば、ＮＯＶＡＮＴＲＯＮＥ（登録商標））、非ステロイド性抗炎症薬物（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛薬、コルチコステロイド、およびそれらの組み合わせが含まれ得る。
【０１５１】
本明細書に記載される医薬化合物は、１つ以上の薬学的に許容される塩を含み得る。「薬学的に許容される塩」は、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、所望されない毒物学的影響を少しも与えない、塩を指す（例えば、Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19を参照のこと）。かかる塩の例には、酸付加塩および塩基付加塩が含まれる。酸付加塩には、非毒性無機酸、例えば、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などに由来するもの、ならびに非毒性有機酸、例えば、脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換されたアルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などに由来するものが含まれる。塩基付加塩には、アルカリ土類金属、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどに由来するもの、ならびに非毒性有機アミン、例えば、Ν，Ν’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどに由来するものが含まれる。
【０１５２】
本明細書に記載される医薬組成物は、薬学的に許容される抗酸化剤もまた含み得る。薬学的に許容される抗酸化剤の例には、以下が含まれる：（１）水溶性抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；（２）油溶性抗酸化剤、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなど；および（３）金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸など。
本明細書に記載される医薬組成物において使用され得る適切な水性および非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適切な混合物、植物油、例えばオリーブ油、ならびに注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチルが含まれる。適切な流動性は、例えば、コーティング材料、例えばレシチンの使用によって、分散物の場合には必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持され得る。
【０１５３】
これらの組成物は、補助剤、例えば、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤もまた含み得る。微生物の存在の予防は、上記無菌化手順、ならびに種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを含めることの両方によって、確実にされ得る。等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを組成物中に含めることもまた望ましい場合があり得る。さらに、注射可能な医薬形態の延長された吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによって、もたらされ得る。
【０１５４】
薬学的に許容される担体には、無菌の水性溶液または分散物、および無菌の注射可能な溶液または分散物の即時調製のための無菌粉末が含まれる。医薬的に活性な物質のためのかかる媒体および薬剤の使用は、当該分野で公知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合性である場合を除き、本明細書に記載される医薬組成物におけるその使用が企図される。医薬組成物は、防腐剤を含み得る、または防腐剤を欠き得る。補足的活性化合物が、この組成物中に取り込まれ得る。
【０１５５】
治療的組成物は、典型的には、無菌であり、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならない。この組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高い薬物濃度に適切な他の秩序だった構造として製剤化され得る。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物を含む、溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング、例えばレシチンの使用によって、分散物の場合には必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持され得る。多くの場合、これらの組成物は、組成物中に等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを含み得る。注射可能な組成物の延長された吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを含めることによって、もたらされ得る。
【０１５６】
無菌の注射可能な溶液は、上述の成分のうち１つまたは組み合わせと共に、適切な溶媒中に必要な量で活性化合物を取り込み、その後、必要に応じて無菌化精密濾過を行うことによって、調製され得る。一般に、分散物は、活性化合物を、基礎的分散媒および本明細書で述べたものからの必要な他の成分を含む無菌ビヒクル中に取り込むことによって、調製される。無菌の注射可能な溶液の調製のための無菌粉末の場合、調製の一部の方法は、前もって無菌濾過されたその溶液から、活性成分プラス任意のさらなる所望の成分の粉末を得る、真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）である。
単一の投薬形態を産生するために担体材料と組み合わされ得る活性成分の量は、処置されている対象、および投与の特定の様式に依存して変動する。単一の投薬形態を産生するために担体材料と組み合わされ得る活性成分の量は、一般に、治療効果を生じる組成物の量である。一般に、１００パーセントのうち、この量は、薬学的に許容される担体と組み合わせて、約０．０１パーセント〜約９９パーセントの活性成分、約０．１パーセント〜約７０パーセントまたは約１パーセント〜約３０パーセントの活性成分の範囲である。
【０１５７】
投薬レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するために調整される。例えば、単一のボーラスが投与され得、いくつかの分割された用量が経時的に投与され得、または用量は、治療状況の緊急の要求によって示される場合、比例的に低減または増加され得る。投与の容易さおよび投薬量の一様性のために、非経口組成物を投薬単位形態で製剤化することが、特に有利である。投薬単位形態は、本明細書で使用する場合、処置される対象のための単位投薬量として適切な物理的に別個の単位を指す；各単位は、必要な医薬担体と関連して、所望の治療効果を生じるための計算された所定の量の活性化合物を含む。本明細書に記載される投薬単位形態の仕様は、（ａ）活性化合物の独自の特徴および達成すべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体における感受性の処置のためにかかる活性化合物を配合する分野における固有の制限、によって決定され、それらに直接的に依存する。
【０１５８】
例えば本明細書に記載される、抗ＴＲＥＭ−１抗体の投与のために、投薬量は、宿主体重１ｋｇ当たり約０．０００１〜１００ｍｇ、より通常は０．０１〜５または１０ｍｇの範囲である。例えば、投薬量は、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重であり得、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。例示的な処置レジームは、１週間に１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、１ヶ月に１回、３ヶ月毎に１回、または３〜６ヶ月毎に１回の投与を必要とする。本明細書に記載される抗ＴＲＥＭ−１抗体のための例示的な投薬レジメンには、静脈内投与を介した１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重が含まれ、この抗体は、以下の投薬スケジュールのうち１つを使用して与えられる：（ｉ）６回の投薬量については４週間毎、次いで、３ヶ月毎；（ｉｉ）３週間毎；（ｉｉｉ）３ｍｇ／ｋｇ体重を１回、その後３週間毎に１ｍｇ／ｋｇ体重。
一部の実施形態では、この抗ＴＲＥＭ−１抗体は、フラット用量（フラット用量レジメン）で投与される。他の実施形態では、この抗ＴＲＥＭ−１抗体は、別の抗体と共に固定された用量で投与される。ある特定の実施形態では、この抗ＴＲＥＭ−１抗体は、体重に基づいた用量で投与される。
一部の方法では、異なる結合特異性を有する２つ以上のモノクローナル抗体が同時に投与され、この場合、投与される各抗体の投薬量は、示された範囲内に入る。抗体は通常、複数の機会に投与される。単一投薬量間の間隔は、例えば、毎週、毎月、３ヶ月毎または毎年であり得る。間隔はまた、患者における標的抗原に対する抗体の血中レベルを測定することによって示される場合、不規則であり得る。一部の方法では、投薬量は、約１〜１０００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度、一部の方法では、約２５〜３００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度を達成するために調整される。
【０１５９】
抗体は、徐放性製剤として投与され得、この場合、あまり頻繁な投与は必要とされない。投薬量および頻度は、患者における抗体の半減期に依存して変動する。一般に、ヒト抗体は、最も長い半減期を示し、ヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト抗体が後に続く。投与の投薬量および頻度は、その処置が予防的であるか治療的であるかに依存して変動し得る。予防的適用では、比較的低い投薬量が、長い期間にわたって、比較的まれな間隔で投与される。一部の患者は、残りの生涯にわたって処置を受け続ける。治療的適用では、比較的短い間隔での比較的高い投薬量が、時折、疾患の進行が低減もしくは終結されるまで、または患者が疾患の症状の部分的もしくは完全な寛解を示すまで、必要とされる。その後、患者には、予防レジームが投与され得る。
【０１６０】
本明細書に記載される医薬組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、患者にとって毒性であることなしに、特定の患者、組成物、および投与の様式について、所望の治療応答を達成するのに有効な活性成分の量を得るために、変動され得る。選択された投薬量レベルは、使用される本明細書に記載される特定の組成物またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与の経路、投与の時間、使用されている特定の化合物の排泄の速度、処置の持続時間、使用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または材料、処置されている患者の年齢、性別、体重、状態、総体的な健康および以前の医療歴などの、医学分野で周知の因子を含む種々の薬物動態因子に依存する。
【０１６１】
本明細書に記載される組成物は、当該分野で公知の種々の方法のうち１つ以上を使用して、投与の１つ以上の経路を介して投与され得る。当業者に理解されるように、投与の経路および／または様式は、所望の結果に依存して変動する。本明細書に記載される抗ＴＲＥＭ−１抗体のための投与の経路には、例えば、注射または注入による、静脈内、筋肉内、真皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経口経路の投与が含まれ得る。語句「非経口投与」は、本明細書で使用する場合、通常は注射による、経腸および外用投与以外の投与の様式を意味し、これには、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、真皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内の注射および注入が含まれるがこれらに限定されない。
あるいは、本明細書に記載される抗体は、潜在的に、非−非経口経路、例えば、外用、表皮または粘膜経路の投与を介して、例えば、鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下または外用で投与され得る。
【０１６２】
活性化合物は、移植物、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤など、迅速な放出に対して化合物を保護する担体を用いて調製され得る。生分解性の生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸が使用され得る。かかる製剤の調節のための多くの方法は、特許されているか、または当業者に一般に公知である。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照のこと。
【０１６３】
治療的組成物は、当該分野で公知の医療用デバイスを用いて投与され得る。例えば、特定の実施形態では、本明細書に記載される治療的組成物は、無針皮下注射デバイス、例えば、米国特許第５，３９９，１６３号；同第５，３８３，８５１号；同第５，３１２，３３５号；同第５，０６４，４１３号；同第４，９４１，８８０号；同第４，７９０，８２４号；または同第４，５９６，５５６号に開示されるデバイスを用いて投与され得る。本明細書に記載される抗ＴＲＥＭ−１抗体との使用のための周知の移植物およびモジュールの例には、以下が含まれる：制御された速度で薬物療法を分配するための移植可能な微量注入ポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号；皮膚を介して医薬を投与するための治療的デバイスを開示する米国特許第４，４８６，１９４号；正確な注入速度で薬物療法を送達するための薬物療法注入ポンプを開示する米国特許第４，４４７，２３３号；連続した薬物送達のための変流移植可能注入装置を開示する米国特許第４，４４７，２２４号；マルチチャンバーコンパートメントを有する浸透圧薬物送達系を開示する米国特許第４，４３９，１９６号；および浸透圧薬物送達系を開示する米国特許第４，４７５，１９６号。これらの特許は、参照により本明細書に組み込まれる。多くの他のかかる移植物、送達系およびモジュールが、当業者に公知である。
【０１６４】
一部の実施形態では、本明細書に記載される抗ＴＲＥＭ−１抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの適切な分布を確実にするために製剤化され得る。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多くの高度に親水性の化合物を排除する。本明細書に記載される治療的化合物がＢＢＢを横切ることを確実にするために（所望により、例えば、脳がんのために）、これらは、例えば、リポソーム中に製剤化され得る。リポソームを製造する方法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号；同第５，３７４，５４８号；および同第５，３９９，３３１号を参照のこと。リポソームは、特定の細胞または臓器中に選択的に輸送される１つ以上の部分を含み得、そうして、標的化された薬物送達を増強する（例えば、V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685を参照のこと）。例示的な標的化部分には、葉酸またはビオチン（例えば、Ｌｏｗらに対する米国特許第５，４１６，０１６号を参照のこと）；マンノシド（Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038）；抗体（P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357: 140；M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180）；サーファクタントプロテインＡ受容体（Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134）；ｐｌ２０（Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090）が含まれる；K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346: 123；J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273もまた参照のこと。
【０１６５】
ＶＩＩＩ．使用および方法
本開示の抗ＴＲＥＭ−１抗体およびかかる抗体を含む組成物（例えば、医薬組成物、製剤、ポリヌクレオチド、ベクターおよび細胞）は、（例えば、ＴＲＥＭ−１活性を阻害することによる）炎症性疾患の処置のために使用され得る。
【０１６６】
従って、一態様では、本開示は、治療有効用量の抗ＴＲＥＭ−１抗体を対象に投与するステップを含む、それを必要とする対象において炎症性疾患を処置するための方法を提供する。本発明の抗ＴＲＥＭ−１抗体で処置され得る炎症性疾患の例には、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、過敏性腸症候群、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、乾癬性関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、Ｉ型糖尿病、グレーブス病、多発性硬化症（ＭＳ）、自己免疫性心筋炎、川崎病、冠動脈疾患、慢性閉塞性肺疾患、間質性肺疾患、自己免疫性甲状腺炎、強皮症、全身性硬化症、変形性関節症、アトピー性皮膚炎、白斑、移植片対宿主病、シェーグレン症候群、自己免疫性腎炎、グッドパスチャー症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、アレルギー、喘息、および急性炎症または慢性炎症のいずれかの結果である他の自己免疫性疾患が含まれるがこれらに限定されない。
【０１６７】
一実施形態では、これらの抗ＴＲＥＭ−１抗体は、炎症性腸疾患を有する個体の処置における使用に適切である。炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、口から肛門までの胃腸管のいずれの部分にも影響を与え得、広範な種々の症状を引き起こす疾患である。ＩＢＤは、腹部疼痛、下痢（血性である場合がある）、嘔吐または体重減少を主に引き起こすが、胃腸管の外側での合併症、例えば、皮疹、関節炎、眼の炎症、疲労および集中力の欠如もまた引き起こし得る。ＩＢＤを有する患者は、２つの主要なクラス：潰瘍性大腸炎（ＵＣ）を有する患者およびクローン病（ＣＤ）を有する患者に分割され得る。ＣＤは一般に、回腸および結腸に影響し、腸のいずれの領域にも影響を与え得るが、しばしば非連続性である（腸の至る所に広がった、疾患の集中した領域）。ＵＣは常に、直腸（結腸）に影響し、より連続性である。ＣＤでは、炎症は、全層性であり、膿瘍、瘻孔および狭窄を生じるが、ＵＣでは、炎症は、典型的には、粘膜に限定される。クローン病については、医薬的治癒も外科的治癒も公知ではないが、ＵＣを有する一部の患者は、結腸の外科的除去によって治癒され得る。処置選択肢は、症状の制御、軽快の維持および再燃の予防に限定される。診療所における炎症性腸疾患における効力は、ＣＤについてのクローン病活動性指数（ＣＤＡＩ）スコアにおける低減として測定され得、この指数は、実験室試験および生活の質質問票に基づくスコアリングスケールである。動物モデルでは、効力は、体重増加およびまた疾患活動性指数（ＤＡＩ）によって大部分は測定され、この指数は、便の硬さ、体重および血便の組み合わせである。
【０１６８】
一実施形態では、本開示の抗ＴＲＥＭ−１抗体は、関節リウマチを有する個体の処置における使用に適切である。関節リウマチ（ＲＡ）は、身体の全てではないがほぼ全てに影響を与える全身性疾患であり、関節炎の最も一般的な形態の１つである。これは、疼痛、こわばり、温感、発赤および腫脹を引き起こす、関節の炎症を特徴とする。この炎症は、関節に浸潤する炎症性細胞の結果であり、これらの炎症性細胞は、骨および軟骨を消化し得る酵素を放出する。結果として、この炎症は、他の生理学的影響の中でも、重症の骨および軟骨損傷ならびに関節の悪化および重症の疼痛をもたらし得る。影響された関節は、その形状およびアラインメントを喪失し得、疼痛および動きの喪失を生じる。関節リウマチについていくつかの動物モデルが、当該分野で公知である。例えば、コラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）モデルでは、マウスは、ヒト関節リウマチと似た炎症性関節炎を発症する。ＣＩＡは、ＲＡと類似の免疫学的および病理学的特色を共有するので、このことにより、このモデルは、潜在的なヒト抗炎症性化合物をスクリーニングするための適切なモデルになっている。このモデルにおける効力は、関節腫脹における減少によって測定される。診療所におけるＲＡにおける効力は、関節腫脹、赤血球沈降速度、Ｃ反応性タンパク質レベル、および血清因子、例えば抗シトルリン化タンパク質抗体のレベルの組み合わせとして測定される患者における症状を低減させる能力によって測定される。
【０１６９】
一実施形態では、本明細書で開示される抗ＴＲＥＭ−１抗体は、乾癬を有する個体の処置における使用に適切である。乾癬は、かなりの不快感を引き起こし得る皮膚のＴ細胞媒介性炎症性障害である。これは、現在治癒が存在しない疾患であり、全ての年齢の人に影響を与える。軽度の乾癬を有する個体は、外用剤によって自身の疾患を制御することができる場合が多いが、世界中で１００万人よりも多い患者が、紫外線光処置または全身性免疫抑制療法を必要とする。残念ながら、紫外線照射の不便さおよびリスクならびに多くの治療薬の毒性が、それらの長期使用を制限している。さらに、患者は通常、乾癬の再発を有し、一部の場合には、免疫抑制療法を停止した直後にリバウンドする。ＣＤ４＋Ｔ細胞の移入に基づく乾癬の最近開発されたモデルは、ヒト乾癬の多くの局面を模倣し、従って、乾癬の処置における使用に適切な化合物を同定するために使用され得る（Davenport et al., Internat. Immunopharmacol 2 : 653-672, 2002）。このモデルにおける効力は、スコアリングシステムを使用して、皮膚病理における低減によって測定される。同様に、患者における効力は、皮膚病理における減少によって測定される。
【０１７０】
一実施形態では、これらの抗ＴＲＥＭ−１抗体は、乾癬性関節炎を有する個体の処置における使用に適切である。乾癬性関節炎（ＰＡ）は、乾癬を有する患者のサブセットにおいて生じる炎症性関節炎の１つの型である。これらの患者では、皮膚の病理／症状に、関節リウマチにおいて見られるものと類似の関節腫脹が伴う。これは、鱗屑化を伴う、皮膚炎症の斑状の隆起した赤い領域を特色とする。乾癬は、肘および膝の先端、頭皮、臍、ならびに生殖器部または肛門の周囲に影響を与える場合が多い。乾癬を有する患者のおよそ１０％は、関節の関連する炎症もまた発症する。
【０１７１】
本開示に関して、予防的、対症的（ｐａｌｌｉａｔｉｖｅ）、対症的（ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ）および／または治癒的処置は、本開示の別々の態様を示し得る。本発明の抗体は、非経口、例えば、静脈内、例えば、筋肉内、例えば、皮下投与され得る。あるいは、本発明の抗体は、非−非経口経路を介して、例えば、経口的にまたは外用で投与され得る。本発明の抗体は、予防的に投与され得る。本発明の抗体は、（要求により）治療的に投与され得る。
以下の実施例は、例示目的で提供されるのであって、限定目的ではない。本出願を通じて引用される全ての参考文献の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【実施例】
【０１７２】
（実施例１）
表面プラズモン共鳴によるヒトおよびカニクイザルの両方のＴＲＥＭ−１に対する３１８抗体バリアントについての相互作用速度論の分析
ヒトＴＲＥＭ−ｌ−Ｆｃ（ｈＴＲＥＭ−１）およびカニクイザルＴＲＥＭ−ｌ−Ｆｃ（ｃＴＲＥＭ−１）に対するｍＡｂ  ０３１８バリアントの結合速度論を決定した。結合研究を、表面プラズモン共鳴を介してリアルタイムで分子相互作用を測定するＰｒｏｔｅＯｎ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）で実施した。実験を２５℃で実施し、サンプルを、サンプルコンパートメント中で１５℃で貯蔵した。ＰｒｏｔｅＯｎによって報告されたシグナル（ＲＵ、応答単位）は、６個の並行フローセルにおける個々のセンサーチップ表面上の質量と直接的に相関する。ＢｉａｃｏｒｅのヒトまたはマウスＦｃ捕捉キットからの抗ヒトＦｃモノクローナル抗体または抗マウスＦｃポリクローナル抗体を、製造業者の指示に従って、ＧＬＭセンサーチップのフローセル上に水平方向で固定化した。捕捉抗体の最終固定化レベルは、各実験においておよそ２６００〜６０００ＲＵであった。精製されたモノクローナルマウスまたは組換え発現された抗ｈＴＲＥＭ−１抗体の捕捉を、ランニング緩衝液（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ  ０、１５ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％の界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）中に５〜１０ｎＭになるように抗体を希釈し、その後６０秒間にわたって３０μｌ／分で垂直方向で注入し、抗Ｆｃ抗体のみが固定化された、全てのフローセルに隣接する参照インタースポット（ｉｎｔｅｒｓｐｏｔ）を創出することによって実施した。これは、典型的には、およそ１００〜３００ＲＵの試験抗体の最終捕捉レベル、および３０〜９０ＲＵの分析物のＲｍａｘ値を生じた。ｈＴＲＥＭ−１またはｃＴＲＥＭ−１タンパク質の結合を、水平方向で全てのフローセルに分析物（抗原）を注入することによって実施して、参照インタースポットへの結合と比較した、異なる捕捉された抗ＴＲＥＭ−１抗体への結合の比較分析を可能にした。ｈＴＲＥＭ−１またはｃＴＲＥＭ−１タンパク質を、１．２〜１００ｎＭになるように、またはランニング緩衝液中に、１：３で段階希釈し、１００μｌ／分で２５０秒間にわたって注入し、６００秒間解離させた。ＧＬＭ表面を、１００μｌ／分での、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１．７および５０ｍＭのＮａＯＨの２回の１８秒間注入を介して、分析物の各注入サイクル後に再生させた。この再生ステップは、固定化された捕捉抗体表面から抗ＴＲＥＭ−１抗体および任意の結合したＴＲＥＭ−１タンパク質を除去し、次の相互作用サンプル対の引き続く結合を可能にした。再生手順は、チップ表面から、直接的に固定化された抗Ｆｃ捕捉抗体を除去しなかった。
【０１７３】
抗体と抗原との間の結合親和性を、複合体の形成および解離の速度論の測定によって決定される平衡解離定数（ＫD）の決定によって定量化した。一価複合体の会合および解離に対応する速度定数、例えば、ｋa（会合速度）およびｋd（解離速度）を、データ分析のためにＰｒｏｔｅＯｎ評価ソフトウェアを使用して１：１  Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルにデータをフィットさせることによって取り出した。ＫDは、方程式ＫD＝ｋd／ｋaを介して、ｋaおよびｋdと関連付けられる。
結合曲線を、データ分析前に、二重参照（捕捉された抗ＴＲＥＭ−１抗体についての、参照表面シグナルおよびブランク緩衝液注入の減算）によって処理した。これは、サンプル注入の間の機器ノイズ、バルクシフトおよびドリフトについての補正を可能にした。
図１Ａおよび１Ｂに示されるように、ｍＡｂ  ０３１８バリアント（即ち、３１８−ＩｇＧ１．１ｆ、３１８−ＩｇＧ１．３ｆ、３１８−ＩｇＧ４−Ａｂａおよび３１８−ＩｇＧ１−Ａｂａ）は全て、ｍＡｂ０３１８−ＩｇＧ４と類似の、ヒトＴＲＥＭ−ｌ−Ｆｃに対する親和性を有することが見出された。０３１８−ＩｇＧ１．３ｆバリアントは、ヒトＴＲＥＭ−１と比較してわずかに低減された親和性ではあるが、カニクイザルＴＲＥＭ−１にも結合した。図１Ａを参照のこと。
【０１７４】
（実施例２）
ＴＲＥＭ−１受容体への結合の際のｍＡｂ  ０３１８−ＩｇＧ１．３ｆの内在化分析
ｍＡｂ  ０３１８−ＩｇＧ１．３ｆバリアント抗体を、レーザー走査型共焦点顕微鏡（データ示さず）およびＡｍｎｉｓ  ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ（登録商標）Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓの両方を使用して、初代ヒト単球におけるその内在化について試験した。図２Ａに示されるように、０時間では、ＴＲＥＭ−１は、単球の表面上に主に発現される。しかし、抗体結合の２４時間後までに、顕著なパーセンテージ（約３６％）のＴＲＥＭ−１受容体（０３１８−ＩｇＧ１．３ｆ染色によって明らか）が内在化され、これは、ｍＡｂ  ０３１８−ＩｇＧ１．３ｆ抗体結合の際に、抗体−受容体複合体全体が細胞内に内在化されることを示唆している。
【０１７５】
次に、内在化された後のＴＲＥＭ−１受容体の運命を決定するために、ＴＲＥＭ２６抗体（カタログ番号３１４９０２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；米国特許出願公開第２０１５０２７４８２５号の［０００５］段落を参照のこと）を、比較のために使用した。ＴＲＥＭ２６抗体は、本開示に記載される０３１８抗体バリアントと競合しない。図２Ｂに示されるように、０時間と比較して、２０時間の時点で、ＴＲＥＭ２６＋発現における顕著な低減（約５１％）が存在した。（ｍＡｂ  ０３１８−ＩｇＧ１．３ｆ処理後）２０時間の時点で、ＴＲＥＭ２６＋ＭＦＩ（平均蛍光インデックス）における顕著な低減（４分の１）もまた存在し、これは、ＴＲＥＭ−１受容体が内在化の際に分解されることを示唆している。しかし、一度抗体が除去されると、抗体曝露の際のＴＲＥＭ−１受容体発現のこの喪失は、可逆的である（データ示さず）。
【０１７６】
（実施例３）
ＢＷＺ／ｈＴＲＥＭ−１レポーター細胞アッセイを使用した、ＴＲＥＭ−１活性化を効率的に遮断するｍＡｂ  ０３１８バリアントの分析
抗ＴＲＥＭ−１  ｍＡｂ  ０３１８バリアントがヒトＴＲＥＭ−１シグナル伝達を阻害する能力を、例えば、米国特許第９，５５０，８３０号および国際出願公開番号ＷＯ２０１６／００９０８６に記載されるように、ＢＷＺ．３６／ｈＴＲＥＭ−１ＤＡＰ１２：ＮＦＡＴ−ＬａｃＺ細胞株（本明細書で「ＢＷＺ／ｈＴＲＥＭ−１レポーター細胞」とも呼ぶ）アッセイを使用して決定した。簡潔に述べると、およそ４０，０００個のｈＴＲＥＭ−１／ＢＷＺ．３６細胞／ウェルを、最大下の陽性シグナルを提供するために２．５μｇ／ｍｌのＰＧＮ−ＥＣｎｄｉ（カタログ番号ｔｌｒｌ−ｋｉｐｇｎ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）と共に７５ｎｇ／ｍｌのＰＧＬＹＲＰ１（配列番号８）の存在下で、あるいは、陽性シグナルを提供するために最大下レベル（１μｇ／ｍｌ）のプラスチック吸着された抗ＴＲＥＭ−１モノクローナル抗体（カタログ番号ＭＡＢ１２７８、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎ．、ＵＳＡ）の存在下で、透明底の黒色９６ウェルプレートにプレートした。
【０１７７】
ｍＡｂ  ０３１８バリアント（即ち、０３１８−ＩｇＧ１．３ｆ；０３１８−ＩｇＧ１．１ｆ；０３１８−ＩｇＧ１−Ａｂａ；および０３１８−ＩｇＧ４−Ａｂａ）を、１０μｇ／ｍｌで開始して５回の段階２倍希釈でアッセイ中に滴定した。このアッセイを、３７℃で一晩インキュベートし、Ｂｅｔａ  Ｇｌｏプロトコールに従ってＢｅｔａ  Ｇｌｏ（カタログ番号Ｅ４７４０、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．、ＵＳＡ）で引き続いて発色させ、発光を記録した。データをプロットして、Ｂｅｔａ  Ｇｌｏ相対発光単位  対  試験抗体濃度を示した。非中和陰性対照ｍＩｇＧ１（カタログ番号ＭＡＢ００２、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎ．、ＵＳＡ）および中和陽性対照ポリクローナルヤギ抗ｈＰＧＬＹＲＰ１抗体（カタログ番号ＡＦ２５９０、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎ．、ＵＳＡ）を、各アッセイプレート上に流した。ＴＲＥＭ−１シグナル伝達の公知のアゴニストであるＭＡＢ１２７８抗体（カタログ番号ＭＡＢ１２７８、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；米国特許出願公開２０１５０２７４８２５号の［０００５］段落を参照のこと）もまた、陽性対照として使用した（挿入された囲み図を参照のこと）。
図３に示されるように、全てのｍＡｂ  ０３１８バリアントは、国際出願公開番号ＷＯ２０１６／００９０８６においてｍＡｂ  ０３１８  ＩｇＧ４抗体で以前に観察されたように、ヒトＴＲＥＭ−１シグナル伝達を阻害するにあたり強力であった。
【０１７８】
（実施例４）
異なる初代ヒト細胞による炎症性サイトカインのＴＲＥＭ−１媒介性産生を阻害する際の、ｍＡｂ  ０３１８抗体バリアントのポテンシーのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析
抗ＴＲＥＭ−１  ｍＡｂ  ０３１８バリアントのアンタゴニスト特性をさらに評価するために、活性化されたヒト初代細胞からの種々の炎症性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６またはＩＬ−８）の放出を遮断するそれらのポテンシーを評価した。初代単球、好中球および末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、ヒト全血から単離し、プレート結合したＰＧＲＰ１および可溶性ペプチドグリカン（ＰＧＮ−ＥＣｎｄｓｓ；ＴＬＲ２活性を有さないペプチドグリカンの一形態）で刺激した。
【０１７９】
図４に示されるように、全てのｍＡｂ  ０３１８バリアント（即ち、ＩｇＧ１．３ｆ、ＩｇＧ１．１ｆ、ＩｇＧ１−ＡｂａおよびＩｇＧ４−Ａｂａ）は全て、ＰＢＭＣおよび単球からのＴＮＦ−αのＴＲＥＭ−１媒介性放出を阻害するにあたり強力であった（約１０〜２０ｐＭの範囲のＩＣ50値）。これらのｍＡｂ  ０３１８バリアントのポテンシーは、ｍＡｂ  ０３１８−ＩｇＧ４抗体で観察されたものと類似であった。ｍＡｂ  ０３１８−ＩｇＧ１．３ｆ抗体は、ＩＬ−６産生を阻害するにあたっても強力であった（約３２ｐＭのＩＣ50値）。好中球について、ｍＡｂ  ０３１８−ＩｇＧ１．３ｆバリアントは、好中球からのＴＲＥＭ−１媒介性ＩＬ−８産生を遮断するにあたり、ｍＡｂ  ０３１８−ＩｇＧ４抗体と比較してより良好であるようであった（図４を参照のこと）。
【０１８０】
抗ＴＲＥＭ−１  ｍＡｂ  ０３１８抗体バリアントのアンタゴニスト特性のさらなる実証として、単球−好中球共培養アッセイもまた使用した。単球と共培養した場合、好中球関連ＰＧＲＰ１は、ＴＲＥＭ−１受容体を結合することができ、単球由来のＴＮＦ−α産生を生じる。図４に示されるように、全てのｍＡｂ  ０３１８抗体バリアントは、この内因性の活性化を有効に遮断した（１９〜４４ｐＭの範囲のＩＣ50値）。類似の結果がＲＢＣ沈降全血で観察された（図４を参照のこと）。
【０１８１】
（実施例５）
刺激された全血からのＩＬ−８産生を遮断するｍＡｂ  ０３１８−ＩｇＧ１．３ｆのポテンシーのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析
抗ＴＲＥＭ−１抗体バリアントのアンタゴニスト特性を測定するための全血薬力学（ＰＤ）アッセイの開発に対する主要な課題の１つは、ＰＧＮ刺激から生じる高い背景である。この問題への取り組みを助けるために、全血を、ＮＯＤ２阻害剤（ＰＧＮによるＮＯＤ２刺激によって生じる背景サイトカインを遮断するため）の存在下で、予め複合体化させたＰＧＲＰ１＋ＰＧＮで刺激した。ＩＬ−８レベルを、標準的なリガンド結合薬力学アッセイ（ＨＴＲＦ（登録商標））（図５Ａ）または細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイ（図５Ｂ）を使用して測定した。
【０１８２】
図５Ａおよび５Ｂに示されるように、０３１８−ＩｇＧ１．３ｆ抗体は、約６０〜９０％の範囲のパーセント阻害で、ＴＲＥＭ−１媒介性ＩＬ−８産生を有効に遮断した（図５Ａを参照のこと）。観察されたＩＣ５０値（ＨＴＲＦでは１２ｐＭの、ＩＣＳでは１９．６ｐＭの平均値）は、他の機能的アッセイで観察されたものと類似であった（例えば、実施例４を参照のこと）。
【０１８３】
（実施例６）
刺激された全血における異なる炎症性メディエーターのｍＲＮＡ発現を遮断するｍＡｂ  ０３１８−ＩｇＧ１．３ｆのポテンシーのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析
ｍＡｂ  ０３１８−ＩｇＧ１．３ｆのアンタゴニスト特性をさらに実証するために、選択された炎症性メディエーター（即ち、キチナーゼ−３様タンパク質１（「ＣＨＩ３Ｌ１」）、ＩＬ１βおよびＩＬ６）の発現レベルを、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって測定した。簡潔に述べると、３人の正常な健康なボランティア（ドナー番号１２６、２９０および３２２）からＥＤＴＡチューブ中に収集したヒト全血を、変動する濃度のｍＡｂ  ０３１８−ＩｇＧ１．３ｆ（０〜１ｎＭ）の存在下で、予め複合体化させたｈＰＧＲＰ１（５０μｇ／ｍｌ）およびＰＧＮ−ＥＣｎｄｓｓ（１０μｇ／ｍｌ）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ  ｔｌｒｌ−ｋｓｓｐｇｎ）で一晩刺激した。刺激後、血漿を回収し、サイトカイン測定のために凍結した。ｍＲＮＡを、製造業者のプロトコールに従ってＭａｇＭａｘ−９６  Ｂｌｏｏｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＡＭ１８３７）を使用して、サンプルから単離した。次いで、単離されたｍＲＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  １１７５５２５０）を利用して、ｃＤＮＡに変換した。次に、ｑＰＣＲを、以下のプローブを使用して実施した：ＨＰＲＴ１（Ｈｓ９９９９９９０９＿ｍ１）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ４３５１３７０）、ＣＨＩ３Ｌ１（Ｈｓ０１０７２２２８＿ｍ１）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ４３３１１８２）、ＩＬ１β（Ｈｓ００１７４０９７＿ｍ１）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ４３３１１８２）およびＩＬ６（Ｈｓ００９８５６３９＿ｍ１）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ４３３１１８２）ならびにＴａｑＭａｎ  Ｆａｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（２×）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ４３６６０７２）。遺伝子発現値を、ＨＰＲＴ１に対して標準化し、ΔΔＣＴ値を生成した。次いで結果をプロットし、ＩＣ50値を決定した。
【０１８４】
図６Ａ〜６Ｃに示されるように、また上述の実施例と一致して、ｍＡｂ  ０３１８−ＩｇＧ１．３ｆは、ヒト全血における異なる炎症性メディエーターのＴＲＥＭ−１媒介性発現を阻害することができた。この阻害は、用量依存的のようであった。ＩＣ５０値は、以下の表１に示される。
集合的に、上記結果は、本開示に記載されるｍＡｂ  ０３１８抗体バリアントが、アンタゴニスト的であり、種々のヒト細胞からの炎症性サイトカインのＴＲＥＭ−１媒介性産生を有効に遮断できることを実証している。
【０１８５】
【表１】
2021519594.tif 000002
【０１８６】
（実施例７）
ｍＡｂ  ０３１８バリアントの粘度
サンプルを、緩衝液交換し、最適な製剤（２０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのスクロース、２５ｍＭのアルギニン、５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０）中に透析し、その後、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ遠心分離分子量カットオフフィルターを使用して濃縮した。サンプルの凝集状態を、濃縮の際のモノマー性（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃｉｔｙ）における潜在的な変化について制御するために、サイズ排除クロマトグラフィーによって測定したが、そのような変化は観察されなかった。濃度依存的粘度を、測定した各濃度について、３ポイント上行剪断スイープを使用して、ＲｈｅｏＳｅｎｓｅ  ｍ−ＶＲＯＣ溶液粘度計を使用して決定した。濃度を、希釈シリーズおよび外挿を使用してｎａｎｏＤｒｏｐによって２８０ｎｍにおける吸光度を測定することによって決定した。
【０１８７】
図７に示されるように、３１８−ＩｇＧ１．１ｆバリアントおよび３１８−ＩｇＧ１．３ｆバリアントは共に、類似の粘度プロファイルを有した。約１３０ｍｇ／ｍＬの濃度では、０３１８−ＩｇＧ１．３ｆバリアントは、約９ｃＰの粘度値を有した。かかる粘度プロファイルは、ｍＡｂ  ０３１８−ＩｇＧ４で以前に観察されたものと酷似していた（国際出願公開番号ＷＯ２０１６／００９０８６を参照のこと）。
【０１８８】
（実施例８）
ｍＡｂ  ０３１８バリアントの免疫原性潜在力
図８および表２（以下）に示されるように、３１８−ＩｇＧ１．１ｆおよび３１８−ＩｇＧ１．３ｆバリアントは、ヒト患者において免疫原性の低い〜中間のリスクを有した。ドナーの約２２〜３０％のみが、これらの抗体に対する免疫原性応答（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＣＤ４+Ｔ細胞増殖によって測定される）を有した。０３１８−ＩｇＧ１−Ａｂａおよび０３１８−ＩｇＧ４−Ａｂａバリアントに対する免疫原性は、それぞれ１０％および４２．５％であった。表２（以下）を参照のこと。対照的に、ｍＡｂ  ０３１８−ＩｇＧ４は、ヒト患者においてさらに免疫原性であった（５５％）。陽性対照として使用したＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）およびＶＬ６（ＩＬ−２１Ｒ  ｍＡｂ）は、ヒト患者において高度に免疫原性であった（それぞれ１００％および４０％）。
【表２】
2021519594.tif 000003
【０１８９】
（実施例９）
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用したＦｃＲｎへのｍＡｂ  ０３１８バリアントの結合分析
異なるｍＡｂ  ０３１８バリアントがＦｃＲｎに結合できるかどうかを決定するために、ＦｃＲｎ受容体（マウス、ヒトおよびカニクイザル）を、アミンカップリングを介して、４００応答単位（ＲＵ）のレベルになるように、ＢＩＡｃｏｒｅ  ＣＭ５−バイオセンサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）上に固定化した。このアッセイを、ランニングおよび希釈緩衝液としてＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０（商標）ｐＨ６．０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、室温で実施した。異なるｍＡｂ  ０３１８バリアント（２００ｎＭ）を、室温でｐＨ６．０で５０μＬ／分の流速で注入した。会合時間は１８０秒間であり、解離段階（これもまたｐＨ６．０）は、３６０秒間かかった。ベースラインに戻すチップ表面の再生を、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０および１５０ｍＭのＮａＣｌの短時間の注入によって達成した。ＳＰＲデータの評価を、注入の１８０秒後および注入の３００秒後における生物学的応答シグナルの高さの比較によって実施した。対応するパラメーターは、ＲＵ  ｍａｘレベル（注入の１８０秒後）および後期安定性（注入の終了の３００秒後）である。
【０１９０】
図９Ａおよび９Ｂに示されるように、ｍＡｂ  ０３１８抗体バリアント（ＩｇＧ１−Ａｂａ  ｍｏｄ、ＩｇＧ４−Ａｂａ  ｍｏｄ、ＩｇＧ１．１ｆおよびＩｇＧ１．３ｆ）は全て、ｐＨ依存的様式でヒト、マウスおよびカニクイザルＦｃＲｎに結合できた。これは、ｍＡｂ  ０３１８抗体（ＩｇＧ４）についても当てはまった。
【０１９１】
（実施例１０）
１つ以上のＦｃγＲへのｍＡｂ  ０３１８バリアントの結合分析
既に議論したように、ある特定の細胞表面免疫受容体に対する抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ投与は、サイトカイン放出を誘導する潜在力を有し、これは、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）として公知の一般的な毒性の臨床的合併症の誘導を生じ得る。ＦｃγＲ結合が架橋結合を介して潜在的なＴＲＥＭ−１アゴニスト性活性をもたらし得るという懸念に起因して、ｍＡｂ  ０３１８−ＩｇＧ４を、本開示に記載されるバリアントフォーマット（即ち、ＩｇＧ１．１ｆ、ＩｇＧ１．３ｆ、ＩｇＧ１−ＡｂａまたはＩｇＧ４−Ａｂａ）のうち１つへと再操作した。次いで、０３１８抗体バリアントが異なるＦｃγＲに結合する能力を評価した。
【０１９２】
図１０Ａおよび１０Ｂに示されるように、３１８−ＩｇＧ１．１ｆおよび３１８−ＩｇＧ１．３ｆバリアントは、ＦｃγＲ（即ち、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２ａ−Ｈ１３１およびＣＤ３２ａ−Ｒ１３１バリアント）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ−Ｖ１５８バリアント）およびＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ−ＮＡ２バリアント））の全てに対して最小の結合を有した。３１８−ＩｇＧ１−Ａｂａおよび３１８−ＩｇＧ４−Ａｂａバリアントは、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＢに結合しなかったが、ＦｃγＲＩには結合した。対照的に、ｍＡｂ  ０３１８（ＩｇＧ４）は、全てのＦｃγＲへの顕著な結合を示した。
【０１９３】
（実施例１１）
ｍＡｂ  ０３１８バリアントによる炎症性サイトカインの誘導の分析
ｍＡｂ  ０３１８バリアントによるｉｎ  ｖｉｖｏ処置がサイトカイン放出症候群のリスクをもたらすかどうかをさらに決定するために、８人のヒトドナーから全血を収集し、単球を単離した。次いで、単球（４×１０6細胞／ウェル）をプレートし、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）を含む分化培地中でそれらを培養することによって、これらの単球を未成熟樹状細胞へと分化させた。プレートしたおおよそ２〜３日後に、分化培地のおよそ半分を、新鮮な培地で置き換えた。７日目に、細胞を収集し、分化効率を、フローサイトメーターを使用して細胞上のＣＤ１４発現を分析することによって評価した。次に、未成熟樹状細胞を、平底プレート上にプレートし（０．８×１０5細胞／ウェル）、ｍＡｂ  ０３１８バリアントをそれぞれのウェルに添加した（ＣＨＯ−ＣＤ３２ａありまたはなしで）。ＰＧＲＰ＋ＰＧＮで刺激した未成熟樹状細胞を、陽性対照として使用した。次いで、これらの細胞を、３７℃で一晩インキュベートした。次の日、上清をウェルから収集し、産生されたＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＩＬ−１２の量を、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して評価した。
【０１９４】
代表的なドナーからの結果は、図１１Ａ〜１１Ｉに示される。異なるｍＡｂ  ０３１８バリアント（０３１８−ＩｇＧ１．１ｆ、０３１８−ＩｇＧ１．３ｆおよび０３１８−ＩｇＧ１．１  Ａｂａ）の添加は、未成熟樹状細胞による最小のＩＬ−６（図１１Ａ、１１Ｂおよび１１Ｃ）、ＴＮＦ−α（図１１Ｄ、１１Ｅおよび１１Ｆ）およびＩＬ−１２（図１１Ｇ、１１Ｈおよび１１Ｉ）産生を生じた。これらの結果は、実施例９の結果と共に、本明細書で開示される抗ＴＲＥＭ−１抗体が、患者にｉｎ  ｖｉｖｏで投与された場合に、サイトカイン放出症候群を誘導する低いリスクを有することを実証している。
【０１９５】
（実施例１２）
ｍＡｂ  ０３１８バリアントのさらなる特徴
０３１８−ＩｇＧ１．３ｆバリアントの生物物理学的特徴は、表３（以下）に提供される。
【表３】
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【０１９６】
ｍＡｂ  ０３１８−ＩｇＧ１．３ｆバリアントの生物物理学的特性は、臨床開発に有益である。抗体の正体を、質量分析（インタクト質量分析およびペプチドマッピング）によって確認した。抗体は、サイズ排除クロマトグラフィーによって試験した場合に、＞９６％モノマーであった。単一のＮ−グリコシル化部位が、ＣＨＯ発現されるモノクローナル抗体のグリカンプロファイル（Ｇ０Ｆ、Ｇ１ＦおよびＧ２Ｆ）と一致するグリカンプロファイルで、重鎖上のＮ３０１において確認された。ｍＡｂ  ０３１８−ＩｇＧ１．３ｆの熱安定性（Ｔm１＝６６．２℃；Ｔm２＝７８．４℃；Ｔm３＝８３．２℃）および熱可逆性（７７℃で２４％）は、典型的なヒトＩｇＧ１．３モノクローナル抗体についての範囲内であった。
【０１９７】
ｍＡｂ  ０３１８−ＩｇＧ１．３ｆバリアントの安定性特徴は、表４（以下）に提供される。
【表４】
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【０１９８】
記載された製剤（２０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのスクロース、５０ｍＭの塩化ナトリウム、２５ｍＭのアルギニン、ｐＨ６．０）中１５０ｍｇ／ｍＬで、凍結−解凍ストレス（３サイクル）の間に、物理的安定性の問題は観察されなかった。１５０ｍｇ／ｍＬでの研究製剤における強制分解研究を、４、２５および４０℃（最大で３ヶ月間）に設定した。ＣＤＲの化学的改変は、ＳＰＲによって決定した場合に、全ての温度条件を通じて低いままであり、活性に対して影響を与えなかった。ＶＳＮＫ脱アミドは、ＩｇＧ１．３ｆフレームワークの他のモノクローナル抗体と比較して、予測を下回り（４０℃での貯蔵で３％／月の増加）、それに対する変化は、時間および温度依存的であった。全ての他の化学的改変（酸化、脱アミド、異性化）もまた、安定性研究の間モニタリングした場合に、低いままであった。注目すべきことに、４０℃での貯蔵は、ＨＭＷバリアントおよびＬＭＷバリアントの両方の形成を示す（それぞれ１．２％／月および２．４％／月を実証する）。観察された変化は、時間および温度依存的であり、研究期間にわたる４℃での貯蔵下で、ＨＭＷは０．２５％／月増加し、ＬＭＷは未変化のままであった。４０℃での貯蔵下での低いＬＭＷ形成は、高分解能の正確な質量測定を有する２Ｄ−ＬＣ／ＭＳによって、１つのＦａｂの喪失の累積種、ならびに推定では上部ヒンジ領域中の保存された配列におけるＦａｂアームとして特徴付けられた。
【０１９９】
（実施例１３）
カニクイザルにおけるｍＡｂ  ０３１８−ＩｇＧ１．３ｆバリアントについてのＰＫ／ＴＫ／ＰＤ研究
抗ＴＲＥＭ−１  ０３１８−ＩｇＧ１．３ｆ抗体についての単回用量薬物動態（ＰＫ）、毒物動態学（ＴＫ）および薬力学（ＰＤ）研究を、カニクイザルにおいて実施した。動物の一部は、２ｍｇ／ｋｇの０３１８−ＩｇＧ１．３ｆ抗体を静脈内で受けた（ｎ＝３）。他の動物は、以下の用量のうち１つの０３１８−ＩｇＧ１．３ｆ抗体を皮下で受けた：（ｉ）０ｍｇ／ｋｇ（即ち、対照）（ｎ＝４）、（ｉｉ）０．１ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝４）、（ｉｉｉ）０．５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝４）、（ｉｖ）２ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝３）または（ｖ）１０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝４）。抗体投与の際に、薬物動態、抗薬物抗体（ＡＤＡ）、ＴＲＥＭ−１受容体占有率（ＲＯ）およびｅｘ  ｖｉｖｏ薬力学応答を、所定の時点で試験した。
【０２００】
薬物動態（ＰＫ）
薬物動態を評価するために、０３１８−ＩｇＧ１．３ｆ抗体の血清濃度を、捕捉試薬としてビオチン化組換えＴＲＥＭ−１タンパク質を使用し、検出試薬として市販のポリクローナルヤギ抗ＴＲＥＭ−１抗体を使用するリガンド結合アッセイを用いて、動物において評価した。
図１２に示されるように、０３１８−ＩｇＧ１．３ｆ抗体の薬物動態は、標的媒介性のクリアランス（即ち、ＴＲＥＭ−１受容体への結合の際の抗体の内在化および分解；実施例２を参照のこと）に主に起因して、０．１ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇとの間で非線形であることが決定された。
【０２０１】
非コンパートメント分析ベースＰＫパラメーターは、表５（静脈内投与）および表６（皮下投与）に示される。簡潔に述べると、用量における１００倍の増加は、血清曝露（ＡＵＣ）における８３０倍の増加を生じた。表６を参照のこと。２ｍｇ／ｋｇのＩＶ用量後のクリアランスは、サルにおいて０．１±０．０２ｍＬ／時間／ｋｇであり、他のＩｇＧ１ベースｍＡｂと類似していた。表４を参照のこと。３６±５ｍＬ／ｋｇにおけるＶｓｓは、血漿容積と類似であり、これは、限定的な血管外分布を示している。０３１８−ＩｇＧ１．３ｆ抗体の半減期は、０．１ｍｇ／ｋｇ用量についての２日間から、２および１０ｍｇ／ｋｇにおける１０日間まで増加した（単回皮下用量投与）。表６を参照のこと。皮下投与（２ｍｇ／ｋｇ）後の０３１８−ＩｇＧ１．３ｆ抗体のバイオアベイラビリティは、８４％で高かった。
【０２０２】
【表５】
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【０２０３】
【表６】
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【０２０４】
抗薬物抗体（ＡＤＡ）
血清ＡＤＡは、単回用量後に（投与の経路にかかわらず）ほとんどのサル（１８匹のうち１６匹）において検出されたが、０３１８−ＩｇＧ１．３ｆ抗体の曝露およびＴＲＥＭ−１受容体占有率（ＲＯ）は、ＡＤＡ陽性動物の大部分において損なわれなかった。表４および表５を参照のこと。ＡＤＡの形成を伴う０３１８−ＩｇＧ１．３ｆ抗体の終末曝露における加速した減衰は、２匹のサルでのみ観察された（１匹は７日目に０．１ｍｇ／ｋｇ用量群中、１匹は２１日目に０．５ｍｇ／ｋｇ用量群中）。ＡＤＡは、終末期におけるこれら２匹のサルにおける曝露に影響を与えたので、対応するデータポイントは、ＰＫ分析については排除した。
【０２０５】
ＴＲＥＭ−１受容体占有率（ＲＯ）および総ＴＲＥＭ−１受容体レベル
次に、末梢血単球および顆粒球上で発現されるＴＲＥＭ−１受容体の占有率を評価した。図１５Ａおよび１５Ｂに示されるように、試験した全ての用量について、占有された（即ち、抗ＴＲＥＭ−１抗体に結合した）ＴＲＥＭ−１受容体のパーセンテージは、単球と顆粒球との間で類似であった。さらに、受容体占有率の持続時間は、動物に投与した０３１８−ＩｇＧ１．３ｆ抗体の用量に依存するようであった。０．５ｍｇ／ｋｇでは、抗体投与後最大で２週間にわたり、≧８５％のＲＯが観察された。対照的に、２および１０ｍｇ／ｋｇでは、ＴＲＥＭ−１受容体の≧８５％が、投与後少なくとも１ヶ月間にわたって、占有されたままであった。
０３１８−ＩｇＧ１．３ｆ抗体投薬後、総ＴＲＥＭ−１受容体レベルは、単球および顆粒球の両方上で低減された。図１４Ａおよび１４Ｂを参照のこと。既に議論したように、この低減は、抗体結合後の増加した受容体ターンオーバーにおそらくは起因する。表面ＴＲＥＭ−１受容体発現における減少は可逆的であり、表面受容体喪失の持続時間は、少なくとも試験した用量レベルにおいては、受容体占有率の持続時間と相関した。
【０２０６】
可溶性ＴＲＥＭ−１（ｓＴＲＥＭ−１）のレベルは、試験した全ての用量群で、ｍＡｂ  ０３１８  ｍＡｂ−ＩｇＧ１．３ｆバリアントの単回用量後に１０倍〜５０倍増加するようであった（データ示さず）。ｓＴＲＥＭ−１レベルにおける増加が抗ＴＲＥＭ−１抗体投与と関連するか、研究の過程の間の動物の全般的な取り扱いに関連するかは、不明である。いずれの場合にも、薬物濃度はｓＴＲＥＭ−１レベルをはるかに超えた（＞１０００倍）ので、可溶性標的は、細胞表面ＴＲＥＭ−１へのｍＡｂ  ０３１８  ｍＡｂ−ＩｇＧ１．３ｆバリアントの結合をもたらさないと見込まれる。
【０２０７】
（実施例１４）
中央コンパートメントにおけるＴＭＤＤを用いた２−コンパートメントＰＫモデルによって記載される、カニクイザルにおけるｍＡｂ  ０３１８−ＩｇＧ１．３ｆバリアントについてのＰＫ／ＴＫ／ＰＤ研究
サルのＰＫ、ＲＯ、総受容体レベルおよびＰＤデータを、観察された非線形ＰＫに適応させた中央コンパートメントにおける飽和可能な標的介在性薬物動態（ＴＭＤＤ）を用いた２−コンパートメントＰＫモデルを使用して記載した（実施例１２および図１３を参照のこと）。直接効果阻害性モデルを使用して、ＰＤ応答を記載した。このモデルは、サルにおいて観察されたＰＫ／ＲＯ／ＰＤの時間経過を有効に捕捉できた。観察された（白抜き丸）およびモデル予測されたエンドポイント（実線）は、図１６Ａ（０．１ｍｇ／ｋｇの皮下投薬）および図１６Ｂ（１０ｍｇ／ｋｇの皮下投薬）に提供される。表７は、推定されたＰＫ／ＰＤパラメーターを提供する。ｍＡｂ０３１８−ＩｇＧ１．３ｆバリアントの血清曝露およびＴＲＥＭ−１のＲＯデータを全てのサルからプールしたところ、ＲＯにおける濃度依存的増加が観察された。図１６Ａおよび図１６Ｂを参照のこと。濃度−ＲＯ関係を記載するために使用したＥｍａｘモデルは、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＲＯ  ＥＣ50を１．６±０．２ｎＭと推定した。
【０２０８】
【表７】
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【０２０９】
【表８】
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本ＰＣＴ出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年４月２日出願の米国仮特許出願第６２／６５１，６０５号の優先権の利益を主張する。
【図１Ａ】
2021519594.tif 000011
【図１Ｂ】
2021519594.tif 000012
【図２Ａ】
2021519594.tif 000013
【図２Ｂ】
2021519594.tif 000014
【図３】
2021519594.tif 000015
【図４】
2021519594.tif 000016
【図５Ａ】
2021519594.tif 000017
【図５Ｂ】
2021519594.tif 000018
【図６Ａ】
2021519594.tif 000019
【図６Ｂ】
2021519594.tif 000020
【図６Ｃ】
2021519594.tif 000021
【図７】
2021519594.tif 000022
【図８】
2021519594.tif 000023
【図９Ａ】
2021519594.tif 000024
【図９Ｂ】
2021519594.tif 000025
【図１０Ａ】
2021519594.tif 000026
【図１０Ｂ】
2021519594.tif 000027
【図１１Ａ】
2021519594.tif 000028
【図１１Ｂ】
2021519594.tif 000029
【図１１Ｃ】
2021519594.tif 000030
【図１１Ｄ】
2021519594.tif 000031
【図１１Ｅ】
2021519594.tif 000032
【図１１Ｆ】
2021519594.tif 000033
【図１１Ｇ】
2021519594.tif 000034
【図１１Ｈ】
2021519594.tif 000035
【図１１Ｉ】
2021519594.tif 000036
【図１２】
2021519594.tif 000037
【図１３】
2021519594.tif 000038
【図１４】
2021519594.tif 000039
【図１５】
2021519594.tif 000040
【図１６Ａ】
2021519594.tif 000041
【図１６Ｂ】
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【配列表】
2021519594000001.app
【国際調査報告】
2021519594.tif 000043
2021519594.tif 000044
2021519594.tif 000045
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