(57)【要約】人工多能性幹細胞（Ｉｐｓｃ）技術により、エクスビボでのパーキンソン病（ＰＤ）に関連する生きた脳組織の生成及び研究が可能になる。ＰＤ患者由来の細胞株を利用することで、インビトロで観察された細胞の表現型を実際の臨床データと結び付ける強力な発見システムが実現する。患者由来のｉＰＳＣをドーパミン作動性（ＤＡ）神経運命に向けて分化させることにより、これらの細胞が、ＰＤ患者の黒質で著しく変性することが観察されるＤＡニューロンの分子的及び機能的特性をインビトロで呈することが明らかになった。他の関連する細胞型の生成を駆動する臨床症状も、ＰＤを有する患者のための新しい治療手段につながる可能性のある、インビトロでの新規のＰＤ特異的表現型をもたらし得る。これらの患者からの分化した神経組織は、患者らの早期発症及び非家族性起源に起因して、ニューロンサブタイプ特異的な病態形成機序を発見するため、また重要なことに、ＰＤへの感受性における患者らの遺伝的背景の寄与を調査するための重要な機会を提供する。2021523700.tif 000005
2021523700.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物のスクリーニング方法であって、
ある量のニューロンを１つ以上の試験化合物と接触させること、
１つ以上のパラメータを測定すること、及び
測定された前記１つ以上のパラメータに基づいて１つ以上の試験化合物を選択すること
を含み、前記ニューロンが、血球由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化したものである、前記方法。
【請求項２】
前記ニューロンが中脳ニューロンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記中脳ニューロンがドーパミン作動性ニューロンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記１つ以上のパラメータがＰＫＣ活性化を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記１つ以上のパラメータが、ＴＦＥＢ活性化及びＺＫＳＣＡＮ３不活性化のうちの少なくとも一方を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記１つ以上のパラメータがα−シヌクレインタンパク質レベルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記１つ以上のパラメータが、ＬＡＭＰ１、ＧＣａｓｅ、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、及びドーパミンの活性のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記１つ以上のパラメータが、ＬＡＭＰ、ＧＣａｓｅ、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、及びドーパミンの発現レベルのうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記血球由来のｉＰＳＣが、
ある量の血球を、再プログラミング因子をコードする１つ以上のｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１ベクターと接触させること、
ある量の再プログラミング因子を前記血球内に送達すること、及び
前記血球を再プログラミング培地中で培養すること
を含む方法によって作製され、前記再プログラミング因子の送達及び再プログラミング培地中での培養によって血球由来のｉＰＳＣが生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ある量の血球が、神経変性疾患に罹患しているヒト対象から得られる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記神経変性疾患がパーキンソン病である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記パーキンソン病が早期発症型パーキンソン病である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ニューロンが、
ある量の血球由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を提供すること、
形質転換成長因子（ＴＧＦ）−ベータ阻害剤及びアクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）阻害剤の存在下で前記ｉＰＳＣを培養すること、
スムーズンドアゴニスト、ＲＨＯキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、及び少なくとも２つの成長因子の存在下でさらに培養すること、
レチノイン酸の存在下でさらに培養すること、ならびに
少なくとも３つの追加の成長因子の存在下で培養を継続すること
を含む方法によって血球由来のｉＰＳＣから分化したものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記形質転換成長因子（ＴＧＦ）−ベータ阻害剤がＬＤＮ−１９３１８９を含み、前記アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）阻害剤がＳＢ４３１５４２を含み、前記スムーズンドアゴニストがプルモルファミンを含み、前記少なくとも２つの成長因子がソニックヘッジホッグ及び線維芽細胞成長因子８を含み、前記ＲＯＣＫ阻害剤がＣＨＩＲ９９０１２を含み、前記少なくとも３つの追加の成長因子が、脳由来神経栄養因子、グリア由来神経栄養因子、及びＴＧＦ−ベータ３を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
診断方法であって、
パーキンソン病に罹患している疑いのある対象における１つ以上のバイオマーカーをアッセイすること、
前記対象からの前記１つ以上のバイオマーカーの発現レベルを、パーキンソン病を有しない健康な対象に由来する前記１つ以上のバイオマーカーのベースラインと比較すること、及び
前記対象のパーキンソン病を診断すること
を含む、前記方法。
【請求項１６】
予後診断方法であって、
パーキンソン病に罹患している疑いのある対象における１つ以上のバイオマーカーをアッセイすること、
前記対象からの前記１つ以上のバイオマーカーの発現レベルを、パーキンソン病を有しない健康な対象に由来する前記１つ以上のバイオマーカーのベースラインと比較すること、及び
前記対象のパーキンソン病を予後診断すること
を含む、前記方法。
【請求項１７】
治療レジメンを選択する方法であって、
パーキンソン病に罹患している疑いのある対象における１つ以上のバイオマーカーをアッセイすること、
前記対象からの前記１つ以上のバイオマーカーの発現レベルを、パーキンソン病を有しない健康な対象に由来する１つ以上のバイオマーカーのベースラインと比較すること、及び
前記対象の治療レジメンを選択すること
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府支援の研究に関する声明文
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈから授与されたＮＳ１０５７０３のもと、政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
パーキンソン病に関連するものを含む中脳ニューロンの生成に関連する方法及び組成物が本明細書に記載されている。
【背景技術】
【０００３】
背景
パーキンソン病（ＰＤ）は、二番目に多く診断される神経変性疾患であり、現在の老齢人口の間で相当な経済的負担となっている。ＰＤにおける古典的に関連付けられる病理は、黒質緻密部におけるドーパミン作動性ニューロン（ＤａＮ）の進行性の消失、ならびにレビー小体及びレビー神経突起として知られる細胞質内封入体の存在を特徴とする。これらの封入体は、主にタンパク質α−シヌクレインで構成される。α−シヌクレインをコードする遺伝子（ＳＮＣＡ）の変異または三重化は、これらの特定の家族性ＰＤ症例の原因である。その本来の状態では、α−シヌクレインは、ヒトの脳全体のニューロンのシナプス前終末に見られ、小胞輸送、神経伝達物質の放出及び再取り込みにおいて機能を果たす。
【０００４】
α−シヌクレインなどの多くの遺伝子及びタンパク質がＰＤに関連付けられているが、患者から生きたニューロンを抽出できないこと、及び効果的なＰＤモデルがないことから、疾患の開始及び進行に関する未解決の問題が残っている。患者由来の細胞をｉＰＳＣに再プログラミングすることで、疾患の進行及び病理学的表現型を分子レベルで観察することができる。興味深いことに、より大きな非家族性（孤発性）集団に関する以前のｉＰＳＣ研究において、対照個体に由来するものと比較した場合、明白な違いが示されていない。このため、パーキンソン病の病理を裏打ちする複雑な生物学的背景を表すｉＰＳＣ疾患モデルが、当該技術分野において強く必要とされている。
【０００５】
パーキンソン病をモデル化及び治療するための組成物及び方法が本明細書に記載される。重要なことに、中脳ニューロンの生成、発達を忠実に反映した様式での底板誘導により、神経変性につながる細胞キューを特定することができ、これには、ｉＰＳＣモデルでまだ十分に活用されていない孤発性ＰＤ症例の背後にある複雑な病因が含まれる。そのようなモデルを確立したところ、本発明者らは、本明細書において、ＰＫＣによって一部媒介されるものとして、α−シヌクレイン及びリソソーム分解機能障害のこれまで未知であった役割を特定した。アゴニストを介してＰＫＣをターゲティングすることで、測定可能な結果が改善され、これにより、パーキンソン病の新しい治療手段が提案された。
【発明の概要】
【０００６】
ある量のニューロンを１つ以上の試験化合物と接触させることと、１つ以上のパラメータを測定することと、測定された１つ以上のパラメータに基づいて１つ以上の試験化合物を選択することと、を含む方法が本明細書に記載され、ここで、ニューロンは、血球由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化したものである。他の実施形態では、ニューロンは中脳ニューロンである。他の実施形態では、中脳ニューロンはドーパミン作動性ニューロンである。他の実施形態では、１つ以上のパラメータは、ＰＫＣ活性化を含む。他の実施形態では、１つ以上のパラメータは、ＴＦＥＢ活性化及びＺＫＳＣＡＮ３不活性化のうちの少なくとも一方を含む。他の実施形態では、１つ以上のパラメータはα−シヌクレインタンパク質レベルを含む。他の実施形態では、１つ以上のパラメータは、ＬＡＭＰ１、ＧＣａｓｅ、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、及びドーパミンの活性のうちの少なくとも１つを含む。他の実施形態では、１つ以上のパラメータは、ＬＡＭＰ、ＧＣａｓｅ、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、及びドーパミンの発現レベルのうちの少なくとも１つを含む。他の実施形態では、ある量の血球を、再プログラミング因子をコードする１つ以上のｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１ベクターと接触させること；ある量の再プログラミング因子を血球内に送達すること；及び血球を再プログラミング培地中で培養すること、を含む方法であって、再プログラミング因子の送達及び再プログラミング培地中での培養によって血球由来のｉＰＳＣが生成される、方法によって、血球由来のｉＰＳＣが作製される。他の実施形態では、前記ある量の血球は、神経変性疾患に罹患しているヒト対象から得られる。他の実施形態では、神経変性疾患はパーキンソン病である。他の実施形態では、パーキンソン病は早期発症型パーキンソン病である。他の実施形態では、ニューロンは、ある量の血球由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を提供すること；形質転換成長因子（ＴＧＦ）−ベータ阻害剤及びアクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）阻害剤の存在下でｉＰＳＣを培養すること；スムーズンドアゴニスト、ＲＨＯキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、及び少なくとも２つの成長因子の存在下でさらに培養すること；レチノイン酸の存在下でさらに培養すること；ならびに、少なくとも３つの追加の成長因子の存在下で培養を継続することを含む方法によって、血球由来のｉＰＳＣから分化したものである。他の実施形態では、形質転換成長因子（ＴＧＦ）−ベータ阻害剤はＬＤＮ−１９３１８９を含み、アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）阻害剤はＳＢ４３１５４２を含み、スムーズンドアゴニストはプルモルファミンを含み、少なくとも２つの成長因子はソニックヘッジホッグ及び線維芽細胞成長因子８を含み、ＲＯＣＫ阻害剤はＣＨＩＲ９９０１２を含み、少なくとも３つの追加の成長因子は、脳由来神経栄養因子、グリア由来神経栄養因子、及びＴＧＦ−ベータ３を含む。
【０００７】
パーキンソン病に罹患している疑いのある対象における１つ以上のバイオマーカーをアッセイすることと、対象からの１つ以上のバイオマーカーの発現レベルを、パーキンソン病を有しない健康な対象に由来する１つ以上のバイオマーカーのベースラインと比較することと、対象のパーキンソン病を診断することと、を含む、診断方法も、本明細書に記載される。
【０００８】
また、パーキンソン病に罹患している疑いのある対象における１つ以上のバイオマーカーをアッセイすることと、対象からの１つ以上のバイオマーカーの発現レベルを、パーキンソン病を有しない健康な対象に由来する１つ以上のバイオマーカーのベースラインと比較することと、対象のパーキンソン病を予後診断することと、を含む、予後診断方法が本明細書に記載される。
【０００９】
さらに、パーキンソン病に罹患している疑いのある対象における１つ以上のバイオマーカーをアッセイすることと、対象からの１つ以上のバイオマーカーの発現レベルを、パーキンソン病を有しない健康な対象に由来する１つ以上のバイオマーカーのベースラインと比較することと、対象の治療レジメンを選択することと、を含む、治療レジメンを選択する方法が本明細書に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＰＤ患者データ。
【図２−１】分化スキーム（ａ）。ＴＨの発現及び形態を示す代表的な画像（ｂ）。分化効率を示すフローサイトメトリーデータであり、各点は、独立した分化の３つの別個のウェルの平均を表す（ｃ）。
【図２−２】総ドーパミン含有量のＨＰＬＣ検出（ｄ）。株ごとに分化効率で正規化したドーパミン含有量のＨＰＬＣ検出（ｅ）。３０日齢のＤａＮにおけるｂＡＣＴ（ハウスキーピング）及びシヌクレインの発現を示すウエスタンブロット（ｆ）。各点は別個の分化からのバンドであり、色はｉｐｓｃ株を示し、データは各分化について０２ｉ対照で正規化した、複数のウエスタンブロットからの相対強度（ｇ）。３０日齢のＤａＮにおけるｑＰＣＲによるＳＮＣＡ発現（ｈ）。
【図３−１】ＲＮＡ−Ｓｅｑ及びプロテオミクスの組み合わせからの重複した転写物及びタンパク質の複合検出（ａ）。一致するトランスクリプトームデータ及びプロテオミクスデータのＰＣＡプロット（ｂ）。ＰＤにおいて上方調節されたＰＣ１成分のＧＳＥＡ分析（ｃ）。
【図３−２】ＰＤにおいて下方調節されたＰＣ１成分のＧＳＥＡ分析（ｄ）。
【図４−１】シクロヘキシミドによる阻害下でのシヌクレイン分解を示す代表的なウエスタンブロット（ａ）。０２ｉ対照及び１９０ｉＰＤ細胞からの３つの別個の分化のウエスタンブロットの平均強度であり、時間＝０のシヌクレイン（ｂ）、シナプトフィジン（ｃ）、及びＴＨ（ｄ）に対する変化倍率として提示する。
【図４−２】２４時間のＭＧ１３２プロテアソーム阻害剤下でのシヌクレイン分解を示すウエスタンブロット（ｅ）。ＰＤ  ＤａＮにおけるＬＡＭＰ１タンパク質の減少を示すウエスタンブロット（ｆ）。ＧＣａｓｅ活性であり、各点は、単一の分化からの３つの別個のウェルの平均である。データは、各分化について０２ｉ対照で正規化し、変化倍率として表した（ｇ）。Ｄ３０  ＤａＮ溶解物からの酸化ドーパミンのＮＩＲＦ検出（ｈ）。
【図５−１】ＰＤ株におけるリソソームアゴニストによる処理及びｐ−ＰＫＣａの上昇。指定の化合物で７２時間処理したｄ３０  ＤａＮのウエスタンブロット及び相対バンド定量化（ａ）。ｄ３０  ＤａＮにおけるｐ−ＰＫＣａのベースラインレベル（ｂ）。
【図５−２】複数のＰＤ株及び対照株からの、ＰＥＰで処理した３０日目のＤａＮ（ｃ）。ＰＥＰ処理のタイムコースおよびシヌクレインレベル（ｄ）。
【図５−３】ＳＮＣＡ（ｅ）およびＴＨ（ｆ）の遺伝子発現のＰＥＰ処理のタイムコース。
【図５−４】追加の対照株及びＰＤ株におけるシヌクレイン及びｐ−ＰＫＣａの上昇の確認（ｇ）。
【図６ａ】４段階のタイムコース（ａ）および成熟（ｂ）を含む分化プロトコル。
【図６ｂ】図６ａの続きを示す。
【図７】パーキンソン病の症状の早期発症（ＤａＴｓｃａｎによって確認）を呈する３人の患者ボランティアを、Ｃｅｄａｒｓ  Ｓｉｎａｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒで評価した。いずれの患者もパーキンソン病の家族歴を報告しなかったため、孤発性疾患起源が示される。詳細な臨床評価及び患者の病歴データが記録されており、インビトロの疾患モデリング研究が将来行われるため、重要な臨床情報を提供し続ける。３人の患者全員がホーン・ヤールスケールで１を呈し、片側の関与及び最小限の機能障害が示される。  末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｙａｍａｎａｋａ再プログラミング転写因子ＯＣＴ４、ＫＬＦ、ＳＯＸ２、ＭＹＣ、及びＬｉｎ２８を含む４つのプラスミドを伴うエピソームヌクレオフェクション技法を使用して再プログラミングした。トランスフェクション効率を高めるために、ＥＢＮＡ１も含めた。マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）のベッドを含むゼラチンコーティングした組織培養プレートに細胞を播種し、１８〜２６日間おいた。３つの株すべてでｉＰＳＣコロニー形成が発生し、複数のクローンを収集して、複数の継代にわたって増殖させた。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）染色（２０×）により、未分化組織を示す患者株の細胞膜におけるレベルの上昇が明らかになった。（Ｂ）多能性遺伝子Ｏｃｔ４発現を示す免疫細胞化学（２０×）。ヒト特異的細胞表面抗原マーカーＳＳＥＡ４も発現しており、多能性細胞と一致する分子プロファイルが示されている。  患者由来のｉＰＳＣは、ドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロンに分化させることができる。画像は、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）を発現し、典型的なニューロン形態を示す４０日齢の培養物を示す。これらの細胞は、パーキンソン病を有する患者のレビー小体にも見られるα−シヌクレインを内因的に発現する。２０倍の倍率で撮影した画像。
【図８】正常に凍結バンクされたＤＡＮ（０２ｉ対照）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
本明細書で引用されるすべての参考文献は、完全に記載されているのと同じように、全体が参照により組み込まれる。別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３ｒｄ  ｅｄ．，Ｒｅｖｉｓｅｄ，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  ２００６）、及びＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ４ｔｈ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  ２０１２）は、本出願で使用されている用語の多くに対する一般的なガイドを当業者に提供する。
【００１２】
当業者であれば、本発明の実施に使用することができる、本明細書に記載されるものと同様または同等である多くの方法及び材料を認識するであろう。実際に、本発明は、記載されている方法及び材料に決して限定されるものではない。
【００１３】
説明したように、患者由来の細胞をｉＰＳＣに再プログラミングすると、疾患の進行及び病理学的表現型を分子レベルで観察することができる。ドナーと遺伝的に同一であるｉＰＳＣは、インビボで臨床像に関係することが分かっている遺伝的背景を保有する、インビトロでのパーキンソン病の組織特異的モデルを提供するＤａＮに分化させることができる。近年、同様のｉＰＳＣモデリング技法を使用してＰＤの始まり及び進行におけるα−シヌクレインの役割を解明するために、多大な努力が払われている。いくつかの研究では、ＳＮＣＡの三重化ならびにＬＲＲＫ２及びＧＢＡ１遺伝子の変異を含む単一遺伝子変異を有するＰＤ患者に由来するｉＰＳＣが用いられている。これらのｉＰＳＣ株に由来するＤＡニューロンは、いくらかの表現型異常を示し、α−シヌクレインの蓄積を実証するが、家族性単一遺伝子変異はＰＤ患者のごく少数にしか存在せず、これらの症例の病態生理は容易にはＰＤ集団全体と関連しない。興味深いことに、より大きな非家族性（孤発性）集団に関する以前のｉＰＳＣ研究において、対照個体に由来するものと比較した場合、明白な違いが示されていない。
【００１４】
本明細書では、本発明者らは、早期発症型孤発性ＰＤ（ＥＯＳＰＤ）患者のコホートからのｉＰＳＣ株を生成する。本発明者らは、早期発症型孤発性の患者が、より侵攻性の疾患形態に影響し得る未知の遺伝的危険因子を有し得るため、これらの株が孤発性ＰＤをよりよく理解するための有望な機会を示すと仮定した。本発明者らは、ＥＯＳＰＤ患者株及び非罹患対照株のいずれかからの分化ＤａＮを比較することにより、α−シヌクレインタンパク質の異常な蓄積が実際にＰＤ患者コホートにおいて特異的に再現されることを示す。プロテオミクスアッセイ、全トランスクリプトームアッセイ、及び酵素活性アッセイを含むこれらの組織の分子的及び生理学的プロファイリングにより、分解経路の調節不全が見出され、ＥＯＳＰＤ培養における以前に報告されていないリン酸化ＰＫＣ−αの上方調節が示唆される。最後に、この経路を標的とすることにより、本発明者らは、インビトロ及びインビボの両方での小分子ＰＥＰ００５による処理後のα−シヌクレイン蓄積の逆転を観察する。本明細書に記載のｉＰＳＣベースのモデルにより、ＰＤに寄与する孤発性ＰＤの遺伝的起源の証拠が得られ、可能性のある臨床診断及びＥＯＳＰＤ患者のための新しい治療標的の開発用のプラットフォームが得られる。
【００１５】
ある量のニューロンを１つ以上の試験化合物と接触させることと、１つ以上のパラメータを測定することと、測定された１つ以上のパラメータに基づいて１つ以上の試験化合物を選択することと、を含む、化合物をスクリーニングする方法が本明細書に記載され、ここで、ニューロンは、血球由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化したものである。他の実施形態では、ニューロンは中脳ニューロンである。他の実施形態では、中脳ニューロンはドーパミン作動性ニューロンである。他の実施形態では、１つ以上のパラメータは、ＰＫＣ活性化を含む。他の実施形態では、１つ以上のパラメータは、ＴＦＥＢ活性化及びＺＫＳＣＡＮ３不活性化のうちの少なくとも一方を含む。他の実施形態では、１つ以上のパラメータはα−シヌクレインタンパク質レベルを含む。他の実施形態では、１つ以上のパラメータは、ＬＡＭＰ１、ＧＣａｓｅ、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、及びドーパミンの活性のうちの少なくとも１つを含む。他の実施形態では、１つ以上のパラメータは、ＬＡＭＰ、ＧＣａｓｅ、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、及びドーパミンの発現レベルのうちの少なくとも１つを含む。他の実施形態では、１つ以上のパラメータは、ある量の血管細胞をわたる試験化合物の透過性、細胞の電気生理学的特性の変化、例えば神経伝達物質の産生及び放出を含む細胞の代謝プロファイルの変化を含む。他の実施形態では、ある量の血球を、再プログラミング因子をコードする１つ以上のｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１ベクターと接触させること；ある量の再プログラミング因子を血球内に送達すること；及び血球を再プログラミング培地中で培養すること、を含む方法であって、前記ある量の血球が、神経変性疾患に罹患しているヒト対象から得られ、さらに、再プログラミング因子の送達及び再プログラミング培地中での培養によって血球由来のｉＰＳＣが生成される、方法によって、ｉＰＳＣが作製される。
【００１６】
他の実施形態では、ある量の血球を、再プログラミング因子をコードする１つ以上のｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１ベクターと接触させること；ある量の再プログラミング因子を血球内に送達すること；及び血球を再プログラミング培地中で培養することを含む方法であって、再プログラミング因子の送達及び再プログラミング培地中での培養によって血球由来のｉＰＳＣが生成される、方法によって、血球由来のｉＰＳＣが作製される。他の実施形態では、前記ある量の血球は、神経変性疾患に罹患しているヒト対象から得られる。他の実施形態では、神経変性疾患はパーキンソン病である。他の実施形態では、神経変性疾患は、家族性、孤発性、及び早期発症型ＰＤを含む、パーキンソン病（ＰＤ）である。他の実施形態では、パーキンソン病は、早期発症型パーキンソン病である。ｉＰＳＣ再プログラミングに関するさらなる情報は、Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｌｉａｂｌｅ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１４  Ｄｅｃ；３（１２）：１４２９−３４に見出され、これは参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【００１７】
他の実施形態では、ニューロンは、ある量の血球由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を提供すること；形質転換成長因子（ＴＧＦ）−ベータ阻害剤及びアクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）阻害剤の存在下でｉＰＳＣを培養すること；スムーズンドアゴニスト、ＲＨＯキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、及び少なくとも２つの成長因子の存在下でさらに培養すること；レチノイン酸の存在下でさらに培養すること；ならびに、少なくとも３つの追加の成長因子の存在下で培養を継続することを含む方法によって、血球由来のｉＰＳＣから分化したものである。他の実施形態では、形質転換成長因子（ＴＧＦ）−ベータ阻害剤はＬＤＮ−１９３１８９を含み、アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）阻害剤はＳＢ４３１５４２を含み、スムーズンドアゴニストはプルモルファミンを含み、少なくとも２つの成長因子はソニックヘッジホッグ及び線維芽細胞成長因子８を含み、ＲＯＣＫ阻害剤はＣＨＩＲ９９０１２を含み、少なくとも３つの追加の成長因子は、脳由来神経栄養因子、グリア由来神経栄養因子、及びＴＧＦ−ベータ３を含む。様々な実施形態において、前述の薬剤の濃度は、表１に示すとおりである。他の実施形態では、ある量の血球を、再プログラミング因子をコードする１つ以上のベクターと接触させること；ある量の再プログラミング因子を血球内に送達すること；及び血球を再プログラミング培地中で培養することを含むプロセスによって、ｉＰＳＣが作製される。他の実施形態では、１つ以上のベクターはｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１ベクターである。他の実施形態では、ｉＰＳＣの培養は約３日間である。他の実施形態では、さらなる培養は約４日間である。他の実施形態では、追加の培養は約４日間である。他の実施形態では、培養の継続は、少なくとも３日間である。他の実施形態では、供給及び培地の取替を含む分化スケジュールは、表１及び図６に従う。追加情報は、米国仮出願第６２／６５３，６９７号及び同第６２／７５５，２８２号、米国仮出願第６２／６５３，６９７号、米国仮出願第６２／７５５，２８２号、米国仮出願第６２／８１６，７８５号、米国仮出願第６２／６６４，８８８号、米国仮出願第６２／６６４，８２７号、米国仮出願第６２／８１６，７９５号、米国仮出願第６２／６６４，９４２号、米国仮出願第６２／７５５，３６５号に見出されることができ、これらは参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【００１８】
パーキンソン病に罹患している疑いのある対象における１つ以上のバイオマーカーをアッセイすることと、対象からの１つ以上のバイオマーカーの発現レベルを、パーキンソン病を有しない健康な対象に由来する１つ以上のバイオマーカーのベースラインと比較することと、対象のパーキンソン病を診断することと、を含む、診断方法も、本明細書に記載される。
【００１９】
また、パーキンソン病に罹患している疑いのある対象における１つ以上のバイオマーカーをアッセイすることと、対象からの１つ以上のバイオマーカーの発現レベルを、パーキンソン病を有しない健康な対象に由来する１つ以上のバイオマーカーのベースラインと比較することと、対象のパーキンソン病を予後診断することと、を含む、予後診断方法が本明細書に記載される。
【００２０】
さらに、パーキンソン病に罹患している疑いのある対象における１つ以上のバイオマーカーをアッセイすることと、対象からの１つ以上のバイオマーカーの発現レベルを、パーキンソン病を有しない健康な対象に由来する１つ以上のバイオマーカーのベースラインと比較することと、対象の治療レジメンを選択することと、を含む、治療レジメンを選択する方法が本明細書に記載される。
【００２１】
予後診断、診断、または治療法選択の支援のための様々な方法において、バイオマーカーは、ドーパミンなどの神経伝達物質を含む代謝酵素である。様々な実施形態において、バイオマーカーは、転写産物及びタンパク質レベルを含む、α−シヌクレイン発現レベルを含む。様々な実施形態において、バイオマーカーはＰＫＣ活性化を含む。他の実施形態では、バイオマーカーは、ＴＦＥＢ活性化及びＺＫＳＣＡＮ３不活性化のうちの少なくとも一方を含む。他の実施形態では、１つ以上のパラメータは、α−シヌクレインタンパク質レベルを含む。他の実施形態では、バイオマーカーは、ＬＡＭＰ１、ＧＣａｓｅ、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、及びドーパミンの活性のうちの少なくとも１つを含む。他の実施形態では、バイオマーカーは、ＬＡＭＰ、ＧＣａｓｅ、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、及びドーパミンの発現レベルのうちの少なくとも１つを含む。様々な実施形態において、バイオマーカーは、リソソーム機能不全などの異常なタンパク質分解のマーカーを含む。様々な実施形態において、バイオメーカーは、なかでも、ネスチン、Ｔｕｊ１、ＭＡＰ２、ＧＦＡＰ、Ｓ１００Ｂ、ＣＤ１１Ｂ、ＰＵ．１、ＧＬＵＴＡ−１、ＺＯ−１、ＳＭＩ３１／Ｉｓｌ１、ＴＨ／ＰＩＴＸ３、ホスホ−ＴＤＰ、ＦＡＳリガンド、及びＳＯＤ１を含む。
【００２２】
前述の様々な実施形態において、神経変性疾患由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）及びその分化細胞は、健康な対照に由来するｉＰＳＣとは異なる分子シグネチャを有する。様々な実施形態において、当該分子シグネチャは、代謝経路及び代謝産物の差異を含む。例えば、これには、例えば、Ｌ−キヌレニン、トランスアコニット酸、アデニン、イノシン、及びｌ−チロシンのうちの１つ以上の濃縮など、代謝産物が含まれる。
【００２３】
分化ｉＰＳＣの凍結保存の方法が本明細書に記載される。様々な実施形態において、分化ｉＰＳＣは、培養培地で処理され、タンパク質分解剤及びコラーゲン分解剤で処理され、分化ｉＰＳＣを凍結防止剤に入れ、分化ｉＰＳＣを開始温度に曝露し、分化ｉＰＳＣを冷却し、分化ｉＰＳＣを固相に過冷却し、分化ｉＰＳＣを加熱し、分化ｉＰＳＣ固相の温度を低下させる。他の実施形態では、凍結防止剤は血清を含む。他の実施形態では、開始温度は約−４℃〜約４０℃である、他の実施形態では、開始温度は約２℃〜約２０℃である。他の実施形態では、開始温度は約−１℃〜約１５℃である。他の実施形態では、開始温度は約３℃〜約７℃である。他の実施形態では、分化ｉＰＳＣを冷却することは、約−５〜−１５℃の温度に到達させることを含む。他の実施形態では、分化ｉＰＳＣを冷却することは、約−３〜−７℃の温度に到達させることを含む。他の実施形態では、分化ｉＰＳＣを冷却することは、約−５℃の温度に到達させることを含む。他の実施形態では、分化ｉＰＳＣを過冷却することは、約−２０〜−９０℃の温度に到達させることを含む。他の実施形態では、ＢＭＥＣを過冷却することは、約−４０〜−７５℃の温度に到達させることを含む。他の実施形態では、分化ｉＰＳＣを過冷却することは、約−５８℃の温度に到達させることを含む。他の実施形態では、過冷却は、約−２０〜−６０℃／分の速度である。他の実施形態では、過冷却は、約−４５℃／分の速度である。他の実施形態では、分化ｉＰＳＣを加熱することは、約−２３℃の温度に到達させることを含む。他の実施形態では、分化ｉＰＳＣを加熱することは、約＋１０℃／分〜約−２６℃及び／または＋３℃／分〜約−２３℃の速度である。他の実施形態では、分化ｉＰＳＣ固相の温度を低下させることは、約−３０℃〜約−５０℃の温度に到達させることを含む。他の実施形態では、分化ｉＰＳＣ固相の温度を低下させることは、約−４０℃の温度に到達させることを含む。他の実施形態では、分化ｉＰＳＣ固相の温度を低下させることは、約−３〜−０．０５℃／分の速度である。他の実施形態では、分化ｉＰＳＣ固相の温度を低下させることは、約−０．８℃／分の速度である。他の実施形態では、低温の急速冷却は、約−１０℃／分〜約−１００℃及び／または約−３５℃／分〜約−１６０℃の速度で、ｉＰＳＣ固相を分化させた。他の実施形態では、本方法は、分化ｉＰＳＣの液体窒素への移動を含む。様々な実施形態において、培養培地はニューロン成熟培地である。様々な実施形態において、培養培地は、ＲＯＣＫ阻害剤を含む。様々な実施形態において、タンパク質分解剤及びコラーゲン分解剤はアキュターゼである。
【００２４】
様々な実施形態において、分化したｉＰＳＣは中脳ニューロンである。様々な実施形態において、分化したｉＰＳＣは底板細胞である。様々な実施形態において、分化したｉＰＳＣは、チロシンヒドロキシラーゼ及び／またはドーパミンを産生する。様々な実施形態において、分化したｉＰＳＣは、健康な対象に由来する対照と比較して、より高いレベルのα−シヌクレインを発現する。様々な実施形態において、分化したｉＰＳＣは、リソソーム機能不全を含む異常なタンパク質分解を呈する。様々な実施形態において、分化した細胞は、ＬＡＭＰ１及び／またはＧｃａｓｅの異常なレベルまたは活性を呈する。前述の方法によって調製された分化細胞の凍結保存された溶液が本明細書に記載される。
【実施例】
【００２５】
実施例１
早期発症型孤発性パーキンソン病患者（ＥＯ−ｓＰＤ）からのｉＰＳＣの生成
ＰＤの家族歴が報告されていない３０〜３９歳の早期発症型孤発性パーキンソン病患者３人を、ｉＰＳＣ産生のために選択した（図１）。ＮｅｕｒｏＸプラットフォームによる分析に基づくと、患者株において、ＥＩＦＧ１、ＰＡＲＫ２、ＬＲＲＫ２、ＧＢＡ、ＳＮＣＡ、ＰＩＮＫ１、ＰＡＲＫ７、ＶＳＰ３５、ＡＴＰ１３Ａ２の単一遺伝子変異、またはＳＮＣＡ遺伝子座の増幅は検出されなかった。３人の患者全員が、ＰＤの診断と一致して、線条体のＤＡＴ（フェニルトロパン）シグネチャの減少を示した（図１）。比較のために、収集時に神経疾患のない正常な個体から３つの対照株を生成した。
【００２６】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を収集し、続いて非組み込み型エピソーム技法を使用してｉＰＳＣに再プログラムした（図１）。すべてのｉＰＳＣ株は、核型が正常であり、典型的な多能性マーカーを発現した。
【００２７】
実施例２
ＥＯＳＰＤ  ｉＰＳＣからＤＡＮへの効率的な分化
ＰＤの決定的な特徴は黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの特定の消失であるため、この細胞系譜に沿ってｉＰＳＣを分化させることは関心を引くものである。ＰＤ患者と対照患者の両方からのｉＰＳＣ株を、表１、図２Ａ及び図６に記載のプロトコルを使用してドーパミン作動性ニューロンに分化させた。
【００２８】
端的には、ｉＰＳＣ株を、改変した二重ＳＭＡＤ阻害ベースの底板誘導プロトコルに供した。ＬＤＮ／ＳＢ、続いてＳＨＨ／パルモルファミン／ＦＧＦ８及びＣＨＩＲ９９０２１に曝露させ、その後、ＳＢの除去及びレチノイン酸の追加を含めると、中脳ＦＰ及びＤＡニューロンの産生が支援される（図１ｄを参照）。ＡＡ、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＴＧＦβ３、及びｄｂｃＡＭＰを補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７培地中でさらなる成熟を行った。レチノイン酸を含めること、分化の初期段階からはレチノイン酸を除外することは、いずれの他の既知の技法とも異なる。注目すべきことに、報告されているプロトコルはドーパミン産生細胞を産生するのに８０〜１３０日かかり得るところ、前述の技法では、わずか３０日での産生が可能である。
【００２９】
（表１）分化プロトコル：培地
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2021523700.tif 000004
【００３０】
３０日目に、分化した細胞は、ＴＨ、Ｎｕｒｒ１、及びＧＲＩＫ２を含むドーパミンニューロンのマーカーを発現し、細胞の約１５％がＴＨを発現した（補足図２ａ）（図２ｂ、ｃ）。フローサイトメトリーを使用してＴＨ発現細胞の数を計数することにより、全体的な分化効率を６つの株すべてで比較した（図２ｃ）。ＰＤ株のうちの２つは、対照で見られるものと同様の数のＤＡニューロンを示した。しかしながら、１９０ｉＰＤ株の分化ではＴＨ陽性ニューロンの産生が少なく、これらの細胞では、底板前駆マーカーであるＦＯＸＡ２及びＬＭＸ１Ａの発現はより少なかったが、成熟神経マーカーであるＧＲＩＫ２及びＮＥＦＨの発現はより多かった。
【００３１】
発達中のニューロンにおけるドーパミンのレベルがＴＨ酵素によって変わるかどうかを判定するために、３０日齢のＤＡＮを溶解し、ドーパミン産生についてＨＰＬＣで分析した。総ドーパミンの違いは株ごとに存在し、またもや１９０ｉＰＤ株においてドーパミンの生成が少なく、ＷＰ３ｉ対照株ではより多く生成された。しかしながら、ＴＨ発現ニューロンの数で正規化すると、すべての株が同等のレベルでドーパミンを生成した（図２ｄ、ｅ）。発達中のニューロンの電気生理学的機能及び可能性のある疾患シグネチャを決定するために、多電極アレイの記録を培養中に経時的に行った。分化の２０日目に自発的活動が観察され、３０日目までにＰＤ細胞と対照細胞の両方が活動の同期バーストを生じた。すべての株にわたって活動を定量化すると、疾患ＤａＮ培養と対照ＤａＮ培養との間で同様のレベルの自発的スパイクが観察された。まとめると、これらのデータは、ＥＯＳＰＤ患者由来のｉＰＳＣが、罹患していない患者株と同様の神経活動を保有する機能的なドーパミン作動性ニューロンに効率的に分化したことを示す。
【００３２】
実施例３
α−シヌクレインはＥＯＳＰＤ  ＤＡＮにおいて特異的に蓄積する
あらゆる形態のパーキンソン病においてα−シヌクレインタンパク質がレビー小体内に異常蓄積し、ＳＮＣＡ遺伝子の二重化または三重化を通した蓄積によってＰＤが生じることが知られている。しかしながら、孤発性ＰＤにおけるその正確な役割は依然として不明であり、これまでの研究では、成人発症型孤発性ＰＤにおける一貫した違いは示されていない。早期発症型孤発性ＰＤ起源の培養物においてα−シヌクレインタンパク質が蓄積するかどうかを判定するために、６つの株を３０日間分化させて、ウエスタンブロットにより可溶性α−シヌクレインについて調査した。
【００３３】
驚くべきことに、３つすべてのＥＯＳＰＤ  ＤＡＮ溶解物は、対照と比較した場合、α−シヌクレインタンパク質のレベルの増加を呈した（図２ｆ、ｇ）。α−シヌクレインの蓄積を検証するために、培地上清と細胞溶解物との両方にＥＬＩＳＡを行った。上清中のα−シヌクレイン濃度は検出限界を下回り、細胞溶解物は罹患株におけるα−シヌクレインタンパク質の有意な増加を裏付けた。ｉＰＳＣステージにある株からのタンパク質溶解物は、α−シヌクレインの増加を呈さず、蓄積は分化した培養物に特異的であったことが示された。
【００３４】
タンパク質の増加がＳＮＣＡ遺伝子の転写の増加に起因し得るかどうかを判定するために、３０日目のＤＡＮ培養物についてＱＰＣＲを行った（図２ｈ）。これらのデータは、ＥＯＳＰＤ株のうちの２つである１９０ｉＰＤ及び２００ｉＰＤは対照株と比較してＳＮＣＡ発現の増加を呈するが、３つ目の１９４ｉＰＤは呈さないことを示しており、転写の増加だけがα−シヌクレイン蓄積の唯一の原因ではなかったことを示唆している。
【００３５】
実施例４
ＥＯＳＰＤ  ＤＡＮにおいてリソソームタンパク質が異常調節される
ＳＮＣＡ遺伝子の転写の増加はＥＯＳＰＤに特異的なα−シヌクレインタンパク質の蓄積を完全には説明できないため、本発明者らは次に、同じ培養ウェルに由来する対になった試料セットのＲＮＡシーケンシング及びプロテオミクスの両方を通して、この効果に寄与し得る他の要因を決定することを試みた。全トランスクリプトームＲＮＡシーケンス（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）によって２７３８４個のユニークな転写産物が検出され、一方でプロテオミクス分析では、再現性閾値を満たす２４７８個のタンパク質が得られた。ピアソン相関係数は、試料複製間で高い一貫性を示した。
【００３６】
プロテオミクス及びＲＮＡ−Ｓｅｑの両方のデータセットに共通するタンパク質及び転写産物の組み合わせ分析により、２つの分析モード間で２４３７個の一致した遺伝子が得られた（図３ａ）。一致した遺伝子セットの教師なし主成分分析（ＰＣＡ）により、トランスクリプトームとプロテオミクスの両方のデータセットからのＰＣ１に沿ったＰＤ細胞と対照との間の明確な線引きが明らかになった（図３ｂ）。ＲＮＡ−Ｓｅｑデータセット全体を分析すると、同様のＰＣＡが得られた。この分離に寄与した重要な経路を決定するために、ｍＲＮＡまたはプロテオミクスの両方のＰＣＡ分析からのＰＣ１遺伝子重み付けによって、すべての一致した遺伝子をランク付けした。次に、ランク付けした各リストの個別のＧＳＥＡ分析をマージして、ＰＤ細胞と対照細胞との間で有意に異常調節されている共通経路を明らかにした（図３ｃ）。α−シヌクレイン、ならびにシナプシン（ＳＹＰ）、シナプス小胞２Ａ（ＳＶ２Ａ）、及びＳＮＡＰ２５などのドーパミン放出に関連する他のシナプス小胞遺伝子が、そのターム、ならびにＧＯ＿ＥＸＯＣＹＴＩＣ＿ＶＥＳＩＣＬＥなどの一般的なシナプス機構及び機能に関連するタームにおいて有意に濃縮された（図３ｃ）。ＫＥＧＧ＿ＯＸＩＤＡＴＩＶＥ＿ＰＨＯＳＰＨＯＲＹＬＡＴＩＯＮに含まれる代謝遺伝子も、ＥＳＯＰＤ株において有意に上方調節されていた。加えて、ＰＤ、アルツハイマー病、及びハンチントン病などの神経変性疾患に関連するタームがＰＤ  ＤＡＮにおいて有意に上方調節されており、神経変性の重要な側面が培養系で捕捉されたことが示唆された（図３ｃ）。有意に下方調節されたタームであるＧＯ＿ＬＹＳＯＳＯＭＡＬ＿ＬＵＭＥＮ及びＧＯ＿ＥＮＤＯＰＬＡＳＭＩＣ＿ＲＥＴＩＣＵＬＵＭ＿ＬＵＭＥＮは、非罹患対照と比較したタンパク質形成及びリソソームタンパク質分解の欠陥を示した（図３ｆ）。
【００３７】
実施例５
α−シヌクレインの分解はＰＤ  ＤＡＮにおいて損なわれる
ＥＯＳＰＤ  ＤＡＮにおけるリソソームタンパク質の減少により、α−シヌクレインの蓄積が分解機能の低下の結果であったかどうかを判定するに至った。全体的な分解速度を試験するために、ＤＡＮにおいてシクロヘキシミド処理を介して転写機能全体を４８時間阻害し、α−シヌクレインタンパク質を経時的に定量化した（図４ａ、ｂ）。対照株０２ｉ対照では、α−シヌクレインは４８時間の処理の過程で分解され、約１０時間の半減期が観察された（図４ｂ）。しかしながら、最も重篤なＥＯＳＰＤ株（１９０ｉＰＤ）では、α−シヌクレインはむしろこの処理の期間にわたって蓄積した。この著しい二分により、α−シヌクレインの特異的分解における根本的な欠陥が示唆された。これは、ＴＨ（図４ａ、ｃ）またはシナプトフィジン（図４ａ、ｄ）などの他のタンパク質の対照細胞とＰＤ細胞との間の同様の分解プロファイルによって裏付けられる。
【００３８】
タンパク質分解は、主にプロテアソーム分解経路とオートファジー／リソソーム分解経路とに分けられる。プロテアソーム分解がα−シヌクレインのタンパク質分解の原因であることを判定するために、ＤａＮ培養物をプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２で２４時間処理したところ、典型的にはプロテアソーム手段を介して分解されるタンパク質であるＰ５３が蓄積したが、α−シヌクレインレベルには実質的な変化がなかった（図４ｅ）。この結果は、プロテアソーム分解が、ＤＡＮ培養におけるα−シヌクレインの分解の重要な一因ではなかったことを示す。
【００３９】
α−シヌクレイン分解におけるリソソームの関与を判定するために、本発明者らは、グルコセレブロシダーゼまたはＧＣａｓｅの活性及び総ＬＡＭＰ１タンパク質について調査した。本発明者らは、プロテオミクス分析と一致して、３つのＥＯＳＰＤ株すべてでＬＡＭＰ１の量の減少を観察した（図４ｆ）。ＧＣａｓｅは、一部のＰＤ患者の末梢血において活性の低下が報告されているリソソーム加水分解酵素のクラスである。ＥＯＳＰＤ患者からの３０日齢のＤａＮでは、対照と比較してＧＣａｓｅ活性の有意な低下が観察された（図４ｆ）。他の研究者らは、ｉＰＳＣ由来のＤａＮにおけるＧＣａｓｅ活性の低下が、酸化ドーパミンの増加によって引き起こされることを見出した。しかしながら、酸化ドーパミンの同様の増加は、本発明者らの３０日齢のＰＤ  ＤａＮでは見られなかった（図４ｈ）。リソソーム経路タンパク質の有意な下方調節を考慮すると、これらの結果により、ＥＯＳＰＤ  ＤＡＮにおけるα−シヌクレイン蓄積の推定原因として、リソソーム分解の機能不全の証拠がもたらされた。
【００４０】
実施例６
ＰＫＣシグナル伝達の調節によりＥＯＳＰＤ表現型が救済される
本発明者らは、リソソーム特異的経路の活性化を通して本発明者らのＥＯＳＰＤ  ＤＡＮのシヌクレインレベルを低下させ得るかどうかを試験するために、３つのリソソームアゴニストを選択した。本発明者らが選択した化合物は、ＰＫＣアゴニストであり、ＨＥＰ１４薬物の構造類似体であるＰＥＰ００５、ＰＣ１２細胞モデルでハンチントン及びα−シヌクレイン凝集体を減少させることが示されている小分子ＴＦＥＢアゴニストであるＳＭＥＲ２８、ならびにα−シヌクレインのクリアランスを促進することが示されている別の生体化合物であるトレハロースであった。２７日目から、ＤａＮを上記のリソソームアゴニストで３日間処理した。トレハロースではなく、ＰＥＰ００５での処理及びＳＭＥＲ２８での処理の両方で、対照株からのＤａＮにおいてα−シヌクレインタンパク質の量が有意に減少した（図５ａ）。しかしながら、ＥＳＯＰＤ  ＤａＮでは、ＰＫＣアゴニストＰＥＰ００５のみが有意にシヌクレインレベルを低下させた。興味深いことに、対照及びＰＤ両方のＤａＮにおいて、ＰＥＰ００５処理により、存在するＴＨ酵素量の増加も生じた（図５ａ）。
【００４１】
ＰＥＰ００５に応答して対照及びＰＤ両方のＤＡＮでシヌクレインレベルを低下させながら同時にＴＨ発現を増加させるという興味深い複合効果により、薬物の作用機序を調査するに至った。ＰＥＰ００５は、確立されたＰＫＣδアゴニストであり、ＰＫＣリン酸化の短期バースト、それに続くより長期的なリン酸化されたＰＫＣの強力な減少を生じさせる。この研究の終点で、本発明者らは、未処理の１９０ｉＰＤ  ＤａＮにおける基礎レベルのＰＫＣαリン酸化の増加を観察し（図５ａ）、ＰＥＰ００５処理は、このシグナルを対照及びＰＤ両方のＤａＮにおいて完全に除去した（図５ａ、ｃ）。
【００４２】
１９０ｉＰＤ株におけるベースラインのリン酸化ＰＫＣａの増加を観察した後、本発明者らは、この観察が複数の株にわたって実証されるかどうかを確かめるために、すべての追加のＤＡＮを確認した。本発明者らは、３つのＥＯＳＰＤ株すべてからの３０日目のＤＡＮにおいてより高いレベルのｐ−ＰＫＣａを見出した（図５ｂ）。本発明者らはまた、３つの追加の新たに誘導したＥＯＳＰＤ株（１７２ｉＰＤ、１８３ｉＰＤ、１９２ｉＰＤ）、３つの追加の対照（０７７１ｉ対照、１０３４ｉ対照、１１８５ｉ対照）、及び通常発症型ＰＤ株（７８ｉＰＤ、発症時６７歳、ＰＤの家族歴）を、α−シヌクレインの蓄積及びｐ−ＰＫＣａの増加の両方について確認した（図５ｇ）。
【００４３】
ＰＫＣａのリン酸化の上昇は未分化のｉＰＳＣには存在せず、分化したＤａＮへの特異性を示す個々の患者からの末梢血において明確なパターンはなかった。ＰＫＣａのリン酸化の上昇は、すべてのｉＰＳＣ株からのＤａＮに１ｕＭのＰＥＰ００５を３日間添加することにより、明らかに除去される（図５ｃ）。この除去は処理したすべての株におけるシヌクレインの減少と相関するが、ＬＡＭＰ１もＬＣ３も、ＰＤ細胞におけるＰＥＰ処理に応答しないように見受けられ（図５ｃ）、ＰＤ細胞における作用機序がリソソームタンパク質の典型的な上方調節とは異なり得ることが示される。対照及びＰＤのＤａＮにおけるＰＥＰ処理のタイムコースは、ｐ−ＰＫＣａとα−シヌクレインとの両方が約２４時間以内に薬物処理に反応して分解されることを示す（図５ｄ）。この同じタイムコースは、ＰＤ細胞に存在する切断されたカスパーゼ３（ＣＣ３）の著しい減少も示す。この同じタイムコースに沿った対になった試料からの遺伝子発現データは、ＳＮＣＡがＰＥＰ処理の４時間後に下方調節され（図５ｅ）、ＴＨが最初の曝露の約８時間後に上方調節されることを示す（図５ｆ）。
【００４４】
実施例７
ＷＴマウスにおけるα−シヌクレインのインビボでの減少
インビボで、ＰＥＰはシヌクレインの分解を刺激する。０．３、３、及び３０ｕＭのＰＥＰの投与量研究を、ＷＴマウスの脳室に注入した。注射後１及び５日目のマウス線条体におけるシヌクレインの減少及びＴＨの増加。
【００４５】
実施例８
考察
本発明者らは、早期発症型孤発性ＰＤ患者のｉＰＳＣから分化したドーパミン作動性ニューロンにおけるパーキンソニズムのシグネチャを探すためにこの研究を開始した。本発明者らは、無作為に選択された家族歴のない早期発症ＰＤ患者中３人の個体からのＰＢＭＣを再プログラムした。結果として得られたｉＰＳＣ株は、遺伝的に正常であり、既知の単一遺伝子ＰＤ変異の多くを欠いていた。これを評価するために使用したゲノムチップアッセイは、神経変性疾患に関連する約２６０，０００個の既知のＳＮＰを網羅する。可能性は非常に低いとしても、ＰＤ  ｉＰＳＣを生成するために使用した３人の特発性個体が、ＮｅｕｒｏＸスクリーンで見逃された未だ知られていない単一遺伝子変異をすべて有することは可能である。いずれにせよ、これらのＥＯＳＰＤ  ｉＰＳＣの複雑な背景遺伝学により、わずか３０日齢のＤａＮにおいてα−シヌクレインの蓄積が生じた。これは、孤発性パーキンソン病患者に由来するｉＰＳＣにおいて最初に特定された表現型である。
【００４６】
次に、本発明者らは、トランスクリプトーム及びプロテオミクス両方の技法を使用するこれらの分化した細胞の詳細な分析の完了に移った。トランスクリプトーム分析により、ＰＤ細胞における多くのシナプス及びエキソサイトーシス転写産物の発現の増加が明らかになった。これらの転写産物の増加は、翻訳されて、ＰＤ  ＤａＮにおけるタンパク質レベルの上昇に直接的につながり、これはシナプス機構の過剰を示している。しかしながら、より多くのシナプス機構の存在にもかかわらず、ＭＥＡ記録もライブカルシウムイメージングも、ＰＤ  ＤａＮと対照ＤａＮとの間の活性の違いを示さなかった。逆に、プロテオミクスデータは、ＰＤ  ＤａＮにおけるリソソーム内腔タンパク質の量の減少を示す。この減少は、このシグナル伝達経路の断絶を示す同じ細胞のＲＮＡには反映されなかった。タンパク質は少ないが、細胞はより多く作製するという応答はしない。このリソソームタンパク質の減少は、ＰＤ  ＤａＮにおけるＧＣａｓｅ活性の減少、ウエスタンブロットによるＬＡＭＰ１タンパク質の減少、及びシクロヘキシミドによる阻害下でのα−シヌクレインの蓄積によってさらに確認され、これらのすべてが、ＰＤ  ＤａＮにおけるタンパク質分解のなんらかの欠損を指摘する。また、プロテアソーム分解の阻害がα−シヌクレインレベルの変化をもたらさなかったので、この欠損はリソソーム分解経路に特異的であると思われる。
【００４７】
本発明者らは次に、この観察された欠損を補正するように、一連のリソソームアゴニストを選択した。試験した３つのアゴニストのうち、ＰＥＰ００５小分子のみが、対照及びＰＤ両方のＤａＮにおいてα−シヌクレインレベルを低下させた。興味深いことに、ＰＥＰ処理により、対照及びＰＤ両方のＤａＮの処理済み培養物に存在するＴＨの量の増加も生じた。ここで観察された細胞内α−シヌクレインレベルの低下及びＴＨの増加という二重の効果により、ＰＥＰ００５は、可能性のある治療薬として非常に魅力的な候補となる。
【００４８】
ＰＥＰ００５（インゲノール−３−アンゲレート）は、抗白血病活性も有し、かつ潜伏ＨＩＶの再活性化に役割を果たし得る、光線性角化症の局所治療用のＦＤＡ承認薬である。これは、インゲノール−３−アンゲレート及びインゲノールメブテートとしても知られ、チャボタイゲキ（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ  ｐｅｐｌｕｓ）植物の樹液から最初に抽出された最も研究されているインゲノール誘導体である。この小分子はナノモル以下の親和性でＰＫＣ  Ｃ１ドメインに結合し、インビトロで個々のＰＫＣアイソフォームに対する選択性を示さないものの、ＰＥＰ００５によって誘導されるＰＫＣアイソフォームの移行及び下方調節のパターンは、ときに細胞株依存的な様式で、異なり得る。本研究では、これを、ＭＴＯＲ経路とは無関係にＴＦＥＢアゴニストとして作用する、Ｌｉ及び同僚によって特定されたＨＥＰ１４（５β−Ｏ−アンゲレート−２０−デオキシインゲノール）化合物と同じチャボタイゲキ植物に由来する構造類似体として選択した。
【００４９】
ＰＥＰ００５で処理した対照細胞において、本発明者らは、リソソームのマスター調節因子ＴＦＥＢの活性化と一致するリソソームタンパク質ＬＡＭＰ１の増加を観察したが、この増加は、薬物で処理したＰＤ  ＤａＮにおいて再現されるようには見えない。ＰＥＰは、アポトーシス促進性ＰＫＣδの活性化因子とＰＫＣαの阻害因子の両方として説明される。ＰＥＰ００５は、様々ながん細胞株及び原発性急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞の増殖を阻害すると説明されている。白血病細胞株及び原発性ＡＭＬ細胞において、ＰＥＰ００５は、ＰＫＣδを活性化し、続いてＥＲＫ１／２の持続的な活性化を誘導することによって、アポトーシスを誘導する。
【００５０】
本発明者らは、自身のＤａＮ培養において、強力なＰＫＣδシグナルを観察せず、また本発明者らが細胞死を誘発していた場合に予想され得るような薬物治療におけるＬＤＨの増加も見ることはなかった。実際、本発明者らは薬物治療における活性なカスパーゼ３の量の減少を観察したものの、この効果は、初めから切断されたカスパーゼ３のレベルが高いＰＤ  ＤａＮにおいて最も容易に観察されたものであった。本発明者らの分化したニューロンは主に有糸分裂後のものであるのに対し、ＰＥＰの毒性は高度に増殖性の細胞により特異的である可能性が高い。
【００５１】
本発明者らのＤａＮにおけるＰＥＰ００５小分子の作用機序を調査すると、本発明者らは、ＰＤ  ＤａＮにおけるリン酸化ＰＫＣαのレベルの増加を観察した。シヌクレインは、ＴＦＥＢ活性化に関与する典型的な１４−３−３タンパク質に結合してそれと相同性を共有するだけでなく、ＰＫＣαにも結合することが示唆されており、本発明者らの観察したシヌクレイン蓄積、リソソーム生合成、及びＰＫＣアゴニストＰＥＰ００５の間の関連性が示唆される。ＰＫＣは、ＴＦＥＢ転写因子の活性化とＺＫＳＣＡＮ３転写抑制因子の不活性化とを、２つの並行したシグナル伝達カスケードを介して繋げる。活性化したＰＫＣは、ＧＳＫ３を不活性化させて、ＴＦＥＢのリン酸化、核移行、及び活性化を減少させるが、ＰＫＣは、ＺＫＳＣＡＮ３をリン酸化して、これを核外への移行により不活性化させる。したがって、ＰＫＣの活性化は、凝集タンパク質のクリアランスを含む多くの細胞外キューへのリソソーム適応を媒介し、それにより、本明細書で概説するパーキンソン病の機序などのリソソームネクサスによる疾患及び障害の実行可能な治療選択肢を提供する。
【００５２】
α−シヌクレイン分解には議論の余地があるが、ニューロン細胞系における少なくとも単量体ＷＴα−シヌクレインの分解の大部分は、シャペロン媒介オートファジー（ＣＭＡ）及びマクロオートファジーのリソソーム経路を介して発生するように見える。これらの分解経路の機能異常はＰＤ病因の要因となり得る。本明細書では、ＰＫＣのターゲティングは、内因性分解系による過剰なα−シヌクレインのクリアランスの亢進を促進するための戦略の実行可能性を実証し、α−シヌクレインがその機能に与える異常な影響も緩和できるという利点を有し得る。
【００５３】
この研究は、早期発症患者からのｉＰＳＣにおける孤発性パーキンソン病の分子シグネチャを特定した最初のものである。本発明者らは、これらの細胞がα−シヌクレインを蓄積し、リソソームの生合成及び機能の調節異常を有しており、またより重度にリン酸化されたＰＫＣαを示すことを見出した。これらの３つのバイオマーカーを総合すると、ＰＤの根本的な機序に影響を与え得る新しい治療薬をスクリーニングするためのプラットフォームが得られる。本発明者らは、このシグネチャを排除し、対照及びＰＤ両方の細胞において細胞内α−シヌクレインを減少させる、ＰＤにおける新規薬物の特定に乗り出した。これらの発見は、ＰＤの根本的な機序のうちのいくつかを最終的に治療する機会を提示する特異的かつ新規な創薬可能な経路を示唆する。
【００５４】
実施例９
凍結プロトコル
本発明者らは、ドーパミン作動性ニューロン細胞の凍結保存技法を開発した。そのような技法により、前述のスクリーニング技法及び他の用途のために細胞を調製することが可能になる。
【００５５】
凍結プロトコル：
ＤＡニューロン（中脳培養）プロトコルの１４日目：
１．培養物をＤＡニューロン成熟培地（ＤＡＮ  ＭＡＴ）＋ＲＯＣＫｉ（１：１０００）で３０分間処理する。
２．処理中、アキュターゼを室温で解凍し、氷上に置く。
３．ＲＯＣＫｉ  ＤＡＮ  ＭＡＴをアキュターゼと交換し、３７℃で２０〜３０分間（細胞が浮遊するまで）インキュベートする。
４．３ｍｌのステージＤＡＮ  ＭＡＴを各ウェルに加え、細胞を取り出し、１５ｍｌのコニカルチューブの中に置く。
５．細胞を１０６０ＲＰＭ（３００ｇ）で５分間遠沈する。
６．上清を取り除き、Ｃｏｌｄ  ＣｒｙｏＳｔｏｒ保管培地と交換する。
７．標準的な過冷却プロトコルを使用する制御速度冷凍庫を使用する。
【００５６】
解凍プロトコル：
１．バイアルをＬＮ２から取り出し、解凍するまでドライアイス上で保管する。
２．水浴に入れ、ほぼ完全に解凍するまで図８に移動させる。
３．Ｐ１０００を使用して、すべての細胞をバイアルから取り出し、１５ｍｌコニカルの中に置く。コニカルあたりのバイアルは２つ以下である。
ａ．約３００μｌをゆっくりと一度トリチュレートし戻し（ｂａｃｋ  ｏｕｔ）、再収集して、バイアルの底に付着したあらゆる細胞を払い落す。
４．すべてのバイアルがコニカルの中に入ったら、１：１ｖｏｌ：ｖｏｌのＤＡＮ成熟培地（ＤＡＮ  ＭＡＴ）をすべてのコニカルに加え、一緒に振盪して、混合を確実にする。
ａ．例：１バイアル５００ｕｌで加えた場合は、５００μｌのＤＡＮ  ＭＡＴを加える。２つのバイアルが合計１ｍｌの細胞である場合は、１ｍｌのＤＡＮ  ＭＡＴを加える。
５．各コニカルに戻り、１：２ｖｏｌ：ｖｏｌを加え、混合を繰り返す。コニカルの先端が混合されるように注意するが、１５秒以上かけない。
ａ．例：１バイアルの場合、１ｍｌを加える。
６．最後に、１：２ｖｏｌ：ｖｏｌのＤＡＮ  ＭＡＴを加える。すべてのキャップを元どおり締め、一度反転させる。遠心分離機に置き、１０６０ＲＰＭを５分間遠沈する。
ａ．例：合計２ｍｌとなった１バイアルの場合、４ｍｌを加えて合計６ｍｌにする。
７．上清を取り出し、所望の体積のＤＡＮ  ＭＡＴ＋ＲＯＣＫｉ（１：２０００）で懸濁させる。
８．播種密度を高くする必要がある（９６ウェルプレートの場合は３００，０００、またはチップの場合は１２Ｅ６／ｍｌ）。
【００５７】
上記の種々の方法及び手法は、本発明を実施する多数の手段を提供する。当然、記載の目的または利点の必ずしもすべてが、本明細書に記載の任意の特定の実施形態に従って達成されるわけではないことを理解すべきである。したがって、例えば、方法が、本明細書で教示または示唆され得るように、他の目的または利点を必ずしも達成することなく、本明細書に教示の１つの利点または利点群を達成または最適化する仕方で実施することができることを、当業者らは認識するであろう。様々な有利及び不利な代替物が、本明細書で述べられる。好ましい実施形態の一部が、１つの、別の、またはいくつかの有利な特徴を具体的に含む一方、他のものは、１つの、別の、またはいくつかの不利な特徴を具体的に除外するが、さらに他のものは、１つの、別の、またはいくつかの有利な特徴を含むことにより、本不利な特徴を具体的に軽減することが理解されるべきである。
【００５８】
さらに、当業者は、異なる実施形態の種々の特徴の適用性を認識するであろう。同様に、上述した種々の要素、特徴、及びステップ、ならびにそのような要素、特徴、またはステップそれぞれのための他の既知の等価物は、本明細書に記載の原理に従って方法を実施するために、当該技術分野の当業者が組み合わせ、一致させることができる。多様な実施形態では、種々の要素、特徴、及びステップ中に、一部が具体的に含まれ、残りのものが具体的に除外されるであろう。
【００５９】
本発明は、特定の実施形態及び実施例の文脈で開示されるが、本発明の実施形態が、具体的に開示された実施形態を超えて、他の代替実施形態及び／または使用ならびにその修正及び等価物にまで及ぶことは、当業者らに理解されるであろう。
【００６０】
本発明の実施形態では、多くの変形及び代替要素が開示されている。さらに別の変形及び代替要素は、当業者には明らかであろう。これらの変形には、限定されないが、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に関連する組成物及び方法、中脳ニューロン、底板ニューロン、ドーパミン作動性ニューロンを含む分化したｉＰＳＣ、前述の組成物の使用に関連した方法及び組成物、それらに使用される技法及び組成物及び溶液の使用、ならびに本発明の教示により作製される生成物の特定の使用がある。本発明の種々の実施形態は、これらの変形または要素のいずれかを具体的に含むか、または除外し得る。
【００６１】
一部の実施形態では、本発明の特定の実施形態を説明及び特許請求するために使用される成分の量、濃度などの特性、反応条件などの特性を表す数字は、一部の場合、「約」という用語で修飾されるものとして理解されるべきである。したがって、一部の実施形態では、書面による説明及び添付の特許請求の範囲に記載の数値パラメータは、特定の実施形態により得られることが求められる所望の特性に応じて変動し得る近似値である。一部の実施形態では、数値パラメータは、報告された有効桁数の数を考慮してかつ通常の丸め手法を適用することにより解釈されるべきである。本発明の一部の実施形態の広い範囲について記載する数値範囲及びパラメータは、近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に記載される数値は、実行可能な限り正確に報告される。本発明の一部の実施形態で提示される数値は、それぞれの試験測定値に見出される標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を含み得る。
【００６２】
一部の実施形態では、本発明の特定の実施形態を説明する文脈で（特に、以下の特許請求の範囲の特定の文脈で）使用される「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という用語ならびに類似の指示対象は、単数形及び複数形の両方を網羅すると解釈することができる。本明細書の値の範囲の列挙は単に、範囲内に入るそれぞれの別々の値を個々に指す簡単な方法として役立つことが意図される。本明細書で別途指示のない限り、各個別値は、本明細書で個別に列挙されているかのように、本明細書に組み込まれる。本明細書に記載のすべての方法は、本明細書で別途指示のない限り、または別途文脈により明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施することができる。本明細書で特定の実施形態に関して提供される任意の及びすべての例の使用、または例示的な言語（例えば、「など」）は、本発明をより適切に表すことが意図され、別途特許請求される本発明の範囲に制限を課さない。本明細書の言語は、本発明の実施に必須の、特許請求されていない任意の要素を示すと解釈されるべきではない。
【００６３】
本明細書に開示されている本発明の代替要素または実施形態のグループ化は、制限として解釈されるべきではない。各グループメンバーは、個別に、またはグループの他のメンバーもしくは本明細書に見られる他の要素と任意の組み合わせで、参照して、特許請求することができる。グループの１つ以上のメンバーは、便宜上の及び／または特許性の理由により、グループに含まれるか、またはグループから削除され得る。そのような任意の包含または削除が生じた場合、本明細書は、本明細書にこのように修正されたグループを含有するとみなされ、添付の特許請求の範囲で使用されるすべてのＭａｒｋｕｓｈグループの書面による説明を満たす。
【００６４】
本発明を実施するための本発明者に既知の最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載される。それらの好ましい実施形態の変形は、上述の説明を読むと当業者らに明らかになるであろう。当業者らが、必要に応じて、そのような変形を用い得ることが企図され、本発明は、本明細書に具体的に記載される以外で実施することができる。したがって、本発明の多くの実施形態は、適用法により許可されるように、本明細書に添付された特許請求の範囲に列挙された主題のすべての修正及び同等物を含む。さらに、そのすべての可能な変形における上記の要素の任意の組み合わせは、本明細書に別途指示のない限り、または文脈により明らかに矛盾しない限り、本発明に包含される。
【００６５】
さらに、本明細書を通して、特許及び印刷された出版物に対して、多数の参照がなされている。上記で引用された参考文献及び印刷された刊行物のそれぞれは、全体が参照により本明細書に個々に組み込まれる。
【００６６】
最後に、本明細書に開示の本発明の実施形態は、本発明の原理の例示であることを理解すべきである。用いることができる他の修正は、本発明の範囲内であり得る。したがって、限定ではなく例として、本発明の代替構成を、本明細書の教示に従って利用することができる。したがって、本発明の実施形態は、厳密に示され記載されるものに限定されない。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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