(57)【要約】  本開示は一般に、それを必要とする対象において、特にＬＭＢＲ１Ｌ（リム領域１様）を阻害することによって免疫抑制療法を提供する方法に関する。また、このような方法において使用され得る組成物およびキットも本明細書において提供される。
2021530457.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
過剰または過活動免疫系に関連する状態の処置における使用のためのリム領域１様（ＬＭＢＲ１Ｌ）のアンタゴニストであって、好ましくは前記状態が、炎症性疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病または同種移植片拒絶から選択される、リム領域１様（ＬＭＢＲ１Ｌ）のアンタゴニスト。
【請求項２】
過剰または過活動免疫系に関連する状態の処置において有用なアンタゴニストを同定する方法であって、試験化合物のＬＭＢＲ１Ｌへの結合を判定すること、およびＬＭＢＲ１Ｌの活性が対照と比較して前記試験化合物によって低減されることを判定することを含み、好ましくは前記状態が、炎症性疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病または同種移植片拒絶から選択される、方法。
【請求項３】
ＬＭＢＲ１Ｌアンタゴニストを用いた処置に好適である、過剰または過活動免疫系に関連する状態を有する個体を同定する方法であって、個体から得た試料中のＬＭＢＲ１Ｌの活性または量を決定することを含み、対照と比較した活性または量の増加が、前記個体がＬＭＢＲ１Ｌアンタゴニストを用いた処置に好適であることを示し、好ましくは前記状態が、炎症性疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病または同種移植片拒絶から選択される、方法。
【請求項４】
それを必要とする対象においてリム領域１様（ＬＭＢＲ１Ｌ）を阻害し、それにより免疫応答を抑制することを含む、免疫抑制療法を提供する方法。
【請求項５】
前記阻害することが、前記対象におけるリンパ球系共通前駆細胞および／またはリンパ球の数を低減することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記リンパ球が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫおよびＮＫ  Ｔ細胞の１つまたは複数を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記対象が、炎症性疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病または同種移植片拒絶を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、橋本甲状腺炎、グレーブス病、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症および／または関節リウマチである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤の有効量を前記対象に投与することを含み、前記ＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤がＬＭＢＲ１Ｌ、好ましくはＬＭＢＲ１Ｌの細胞外ドメインに結合する、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
それを必要とする対象へのＬＭＢＲ１Ｌをコードする核酸を含む、免疫不全障害を処置するための組成物。
【請求項１１】
それを必要とする対象にＬＭＢＲ１Ｌをコードする核酸を導入することを含む、免疫不全障害を処置するための方法。
【請求項１２】
ＬＭＢＲ１Ｌアンタゴニストの治療有効量を対象に投与することを含む、過剰または過活動免疫系に関連する状態を有する前記対象においてリンパ球新生を低減する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年６月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／６８９，９０７号に基づく優先権および利益を主張し、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【０００２】
本開示は一般に、それを必要とする対象において、特にリム領域１様（ｌｉｍｂ  ｒｅｇｉｏｎ  １  ｌｉｋｅ）（ＬＭＢＲ１Ｌ）を阻害することによって免疫抑制療法を提供する方法に関する。また、このような方法において使用され得る組成物およびキットも本明細書において提供される。
【背景技術】
【０００３】
炎症性および自己免疫疾患などの過剰または過活動免疫系に関連する疾患は、米国において最も一般的な疾患であり、２３５０万を超える人々に影響を与えている。一部の炎症性および自己免疫疾患は、生命を脅かし、大部分は衰弱性で生涯の処置を必要とする。多数の治療アプローチにもかかわらず、炎症性または自己免疫関連疾患を有する人の割合は、２０３０年より前に少なくとも３７％まで増加すると予測されている。
【０００４】
宿主組織の外来物としての異常な認識によって生じる過剰な炎症、または炎症性プロセスの長期化により、喘息、糖尿病、動脈硬化、白内障、再灌流傷害およびがんなどの多様な自己免疫または炎症性疾患、感染性髄膜炎においてなどの感染後症候群ならびに、全身性エリテマトーデスおよび関節リウマチなどのリウマチ性疾患が引き起こされる場合がある。これらの様々な疾患における免疫応答の中心は、免疫系、疾患処置の重要な構成成分を制御することである。異常な炎症性応答は、副腎皮質ステロイド、免疫抑制剤、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ＣＯＸ−２阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤などの抗炎症剤によって調節され得るが、これらの薬剤の多くは、著しい副作用を有する。例えば、副腎皮質ステロイドは、クッシング様の特性、皮膚の菲薄化、感染症の易罹患性の増加、および視床下部・下垂体・副腎皮質系の抑制を誘導する場合がある。また、炎症性および自己免疫疾患がしばしば慢性であることから、それらは、一般に生涯の処置およびモニタリングを必要とする。したがって、炎症性および自己免疫疾患を処置するために有効な方法および組成物に対する必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００５】
本明細書において、対象においてリム領域１様（ＬＭＢＲ１Ｌ）を阻害することを含む、それを必要とする対象において疾患（例えば、炎症性疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病または同種移植片拒絶）を処置するための免疫抑制療法を提供する方法が開示される。方法は、それを必要とする対象において免疫応答を抑制するまたは低減することを含み、方法は、それを必要とする対象においてＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫおよび／またはＮＫ  Ｔ細胞のレベルを減少させることに関する。また、このような方法において使用され得る組成物およびキットも本明細書において提供される。
【０００６】
一態様では、それを必要とする対象においてリム領域１様（ＬＭＢＲ１Ｌ）を阻害し、それにより免疫応答を抑制することを含む、免疫抑制療法を提供する方法が提供される。
【０００７】
一部の実施形態では、前記阻害することは、対象におけるリンパ球系共通前駆細胞および／またはリンパ球の数を低減することを含む。リンパ球は、例えばＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫおよびＮＫ  Ｔ細胞の１つまたは複数を含み得る。
【０００８】
対象は、炎症性疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病または同種移植片拒絶を有する場合がある。一部の実施形態では、自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス（systematic lupus erythematosus）（ＳＬＥ）、橋本甲状腺炎、グレーブス病、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症および／または関節リウマチである場合がある。
【０００９】
種々の実施形態では、方法は、ＬＭＢＲ１Ｌの細胞外ドメインなどのＬＭＢＲ１Ｌに結合する、抗ＬＭＢＲ１Ｌ抗体またはその抗原結合性断片などのＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤の有効量を対象に投与することをさらに含み得る。
【００１０】
別の態様は、リム領域１様（ＬＭＢＲ１Ｌ）、好ましくはＬＭＢＲ１Ｌの細胞外ドメインに結合する、抗ＬＭＢＲ１Ｌ抗体またはその抗原結合性断片などのＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤に関する。
【００１１】
さらなる態様は、本明細書において開示される抗体またはその抗原結合性断片などのＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤および薬学的に許容される担体を含む、免疫抑制のための医薬組成物に関する。
【００１２】
本明細書において、免疫応答を抑制するまたは低減するための医薬の製造のための、本明細書において開示される抗ＬＭＢＲ１Ｌ抗体またはその抗原結合性断片などのＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤の使用も開示される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ−１Ｒ】マウスにおいてＬＭＢＲ１Ｌ欠損によって引き起こされる遺伝性リンパ球減少症を示した図である。（Ａ）マンハッタンプロット。影響を受けた系統で同定された変異の染色体位置に対してプロットした−ｌｏｇ１０Ｐ値。（挿入図）野生型（ＷＴ）およびＳｔｒａｗｂｅｒｒｙマウスにおけるＢ２２０＋およびＣＤ３＋末梢血リンパ球の代表的なフローサイトメトリープロット。（Ｂ）ＬＭＢＲ１Ｌトポロジー。この概略図は、Ｌｍｂｒ１ｌ点変異の位置を示しており、これによりＬＭＢＲ１Ｌタンパク質の未熟終止コドンのシステイン２１２の置換（Ｃ２１２＊）が引き起こされる。（Ｃ〜Ｊ、Ｍ、Ｎ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系によって生成された１２週齢Ｌｍｂｒ１ｌ−／−またはＣｅｒｓ５−／−マウスの末梢血におけるＴ（Ｃ−Ｆ）、Ｂ（Ｈ−Ｊ）、ＮＫ（Ｍ）およびＮＫ１．１＋Ｔ（Ｎ）細胞の頻度および表面マーカーの発現。（Ｋ）モデル抗原β−ｇａｌをコードする組換えＳＦＶベクター（ｒＳＦＶ−βＧａｌ）による１２週齢Ｌｍｂｒ１ｌ−／−またはＣｅｒｓ５−／−マウスの免疫処置１４日後のＴ細胞依存性β−ｇａｌ特異的抗体。データは４５０ｎｍでの吸光度として表された。（Ｌ）ＮＰ−Ｆｉｃｏｌｌを用いた１３週齢Ｌｍｂｒ１ｌ−／−またはＣｅｒｓ５−／−マウスの免疫処置６日後のＴ細胞非依存性ＮＰ特異的抗体。データは４５０ｎｍでの吸光度として表された。（Ｏ）ｒＳＦＶ−βＧａｌで免疫処置されたＬｍｂｒ１ｌ−／−マウスにおけるβ−ｇａｌ特異的細胞傷害性Ｔ細胞殺滅応答の定量的分析。ＩＣＰＭＹＡＲＶ（配列番号１）ペプチド（Ｈ−２ｄハプロタイプを有するマウスではβ−ｇａｌ特異的ＭＨＣ  Ｉエピトープ）でパルスしたＣＦＳＥｈｉおよびパルスしていないＣＦＳＥｌｏ脾細胞の等量混合物を、免疫処置されたマウスに後眼窩注射によって養子移植した。養子移植の４８時間後にマウスから採血し、ＣＦＳＥ標識された標的細胞の殺滅をフローサイトメトリーによって分析した。（Ｐ）Ｌｍｂｒ１ｌ−／−マウスでは、水酸化アルミニウム沈殿卵白アルブミン（ＯＶＡ／アルミニウム）に対する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は低減した。Ｌｍｂｒ１ｌ−／−および野生型同腹仔を０日目にＯＶＡ／アルミニウムで免疫処置した。総および記憶Ｋｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２）テトラマー陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＤ４４およびＣＤ６２Ｌ表面マーカーを使用したフローサイトメトリーによって１４日目に分析した。（Ｑ）Ｌｍｂｒ１ｌ−／−マウスにおけるＭＨＣクラスＩ欠損（Ｂ２ｍ−／−）標的細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害性。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ標識Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｖｉｏｌｅｔｌｏ）およびＢ２ｍ−／−（Ｖｉｏｌｅｔｈｉ）細胞の等量混合物をレシピエントマウスに移植し、注射の４８時間後に標的細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害性をフローサイトメトリーによって分析した。（Ｒ）ＭＣＭＶスミス株１．５×１０５ｐｆｕによる感染５日後のＬｍｂｒ１ｌ−／−マウスの肝臓におけるウイルスＤＮＡコピー。各記号は、個々のマウスを表している（Ｃ〜Ｒ）。Ｐ値は、一元ＡＮＯＶＡおよびダネットの多重比較（Ｃ〜Ｏ、Ｑ、Ｒ）またはスチューデントのｔ検定（Ｐ）によって判定した。データは、遺伝子型当たり５〜２４匹のマウスを用いた２回の独立した実験（Ｃ〜Ｊ、Ｍ、Ｎ）または１回の実験（Ｋ、Ｌ、Ｏ〜Ｒ）を表している。エラーバーはＳ．Ｄ．を示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図２Ａ−２Ｍ】細胞内因性のリンパ球発達不全を示した図である。（Ａ〜Ｄ）ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ（ＣＤ４５．２）もしくは野生型（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ；ＣＤ４５．１）骨髄によって再構成された照射野生型（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ；ＣＤ４５．１）およびｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ（ＣＤ４５．２）レシピエントまたはＬｍｂｒ１ｌｓｔ／ｓｔ（ＣＤ４５．２）および野生型（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ；ＣＤ４５．１）骨髄の１：１混合物によって再構成されたＲａｇ２−／−レシピエントの１２週間後の脾臓（Ａ、Ｂ）、胸腺（Ｃ）および骨髄（Ｄ）におけるリンパ球の再増殖。ＢおよびＴ細胞（Ａ）、ＮＫ細胞（Ｂ）、胸腺細胞（Ｃ）ならびに骨髄Ｂ細胞の代表的なフローサイトメトリー散布図。ＭＲ：成熟再循環Ｂ細胞、Ｔｒａｎｓ．：移行期Ｂ細胞、Ｉｍｍ．：未熟Ｂ細胞。輪郭で囲われた領域または４分割された部分に隣接している数字（Ａ〜Ｄ）は、それぞれの細胞のパーセントを示す。（Ａ、Ｂ、Ｅ〜Ｇ）移植して１２週間後のドナー由来細胞によるレシピエントの脾臓におけるＢ（Ａ、Ｅ）、Ｔ（Ａ、Ｆ）およびＮＫ（Ｂ、Ｇ）細胞の再構成。（Ｃ、Ｄ、Ｈ〜Ｋ）致死的照射からレスキューされたレシピエントの胸腺におけるドナー由来Ｔ細胞サブセット（Ｃ、Ｈ、Ｉ）および骨髄におけるＢ細胞サブセット（Ｄ、Ｊ、Ｋ）の再増殖。（Ｌ、Ｍ）フローサイトメトリーによって判定した、Ｌｍｂｒ１ｌ−／−および野生型同腹仔の骨髄におけるＬＳＫ＋およびＬＫ＋区画の大腿骨当たりの幹細胞および前駆細胞サブセットの頻度（Ｌ）および総数（Ｍ）。各記号は個々のマウスを表す（Ｅ〜Ｍ）。Ｐ値は、一元ＡＮＯＶＡおよびダネットの多重比較（Ｅ〜Ｋ）またはスチューデントのｔ検定（Ｌ、Ｍ）によって判定した。データは、遺伝子型当たり６〜７匹のマウスを用いた２回の独立した実験を表している。エラーバーはＳ．Ｄ．を示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図３Ａ−３Ｍ】ＬＭＢＲ１Ｌ欠損Ｔ細胞は、増大シグナルに応答して死滅することを示した図である。（Ａ）ＬＭＢＲ１Ｌ欠損末梢Ｔ細胞は活性化されている。１２週齢Ｌｍｂｒ１ｌ−／−および野生型同腹仔の胸腺および脾臓におけるＴ細胞でのＣＤ４４発現のフローサイトメトリー分析。（Ｂ）Ｌｍｂｒ１ｌ−／−または野生型同腹仔からプールされたＣＤ８＋Ｔ細胞の全細胞溶解物（ＴＣＬ）におけるＴＣＦ１／７、ＬＥＦ１、Ａｋｔ、ホスホ−Ａｋｔ、Ｓ６、ホスホ−Ｓ６、ホスホ−ｐ７０Ｓ６Ｋ、ホスホ−ｐ４４／ｐ４２  ＭＡＰＫおよびＧＡＰＤＨのイムノブロット分析。（Ｃ）１４週齢の野生型またはＳｔｒａｗｂｅｒｒｙマウスから得られた末梢血中のＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞のアネキシンＶ染色。（Ｄ）１２週齢のＬｍｂｒ１ｌ−／−および野生型同腹仔から得られた末梢血におけるＣＤ３＋Ｔ細胞でのＩＬ−７Ｒαの発現。（Ｅ〜Ｇ）ＬＭＢＲ１Ｌ欠損Ｔ細胞の抗原特異的増大の障害。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ標識Ｌｍｂｒ１ｌ−／−（ＣＤ４５．２）およびＦａｒ  Ｒｅｄ染色野生型ＯＴ−Ｉ  Ｔ細胞（ＣＤ４５．２）の１：１混合物を、野生型宿主（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ；ＣＤ４５．１）に養子移植した。可溶性ＯＶＡまたは対照として滅菌ＰＢＳ（媒体）で免疫処置して４８または７２時間後に、野生型（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ；ＣＤ４５．１）宿主の脾臓から採取したＣｅｌｌＴｒａｃｅ  ＶｉｏｌｅｔまたはＦａｒ  Ｒｅｄ陽性の野生型またはＬｍｂｒ１ｌ−／−ＯＴ−Ｉ  Ｔ細胞の代表的なフローサイトメトリー散布図（Ｅ）およびヒストグラム（Ｆ）および総数の定量化（Ｇ）。（Ｈ〜Ｍ）ＬＭＢＲｌＬ欠損Ｔ細胞の恒常性増大の障害。Ｌｍｂｒ１ｌ−／−または野生型同腹仔の脾臓（Ｈ〜Ｊ）または成熟単一陽性胸腺細胞（Ｋ〜Ｍ）から単離されたＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ標識またはＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｆａｒ  Ｒｅｄ染色汎Ｔ細胞の等量混合物を、致死量以下で照射された（８．５Ｇｙ）野生型宿主（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ；ＣＤ４５．１）に養子移植した。移植して４日または７日後の、致死量以下で照射された、または未照射の野生型宿主の脾臓から採取したＣｅｌｌＴｒａｃｅ  ＶｉｏｌｅｔまたはＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｆａｒ  Ｒｅｄ陽性細胞の代表的なフローサイトメトリー散布図（Ｈ、Ｋ）およびヒストグラム（Ｉ、Ｌ）および総数の定量化。（Ｊ、Ｍ）輪郭を囲った領域に隣接している数字は、各±ＳＤを有する細胞のパーセントを示す。各記号は個々のマウスを表している（Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｊ、Ｍ）。Ｐ値は、スチューデントのｔ検定（Ａ、Ｃ、Ｄ）または一元ＡＮＯＶＡおよびダネットの多重比較（Ｇ、Ｊ、Ｍ）によって判定した。データは、遺伝子型または群当たり４〜２９匹のマウスを用いた２回の独立した実験を表している。エラーバーはＳ．Ｄ．を示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図４Ａ−４Ｃ】ＬＭＢＲ１Ｌは、Ｗｎｔシグナル伝達経路を負に制御することを示した図である。（Ａ、Ｂ）ＬＭＢＲ１Ｌは、Ｗｎｔシグナル伝達経路の構成成分と物理的に相互作用する。（Ａ）ヒトタンパク質マイクロアレイによって、ＬＭＢＲ１ＬとＧＳＫ−３βタンパク質との間の結合が明らかになった。Ｎ末端をＦＬＡＧタグ化し、Ｃ末端をＶ５タグ化したヒトＬＭＢＲ１Ｌを発現している構築物をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロースビーズを使用して組換えタンパク質を精製した。組換えヒトＬＭＢＲ１Ｌとマイクロアレイスライド上に２連で写し取られた精製ヒトタンパク質との間の結合を、抗Ｖ５−Ａｌｅｘａ６４７抗体でプロービングした。（Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＦＬＡＧタグ化ＧＳＫ−３β、β−カテニン、ＺＮＲＦ３、ＲＮＦ４３、ＦＺＤ６、ＬＲＰ６、ＤＶＬ２または空のベクター（ＥＶ）のいずれかおよびＨＡタグ化ＬＭＢＲ１Ｌをトランスフェクトした。続いて、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロースを使用して溶解物を免疫沈降させ、ＨＡまたはＦＬＡＧに対する抗体でイムノブロットした。（Ｃ）Ｌｍｂｒ１ｌ−／−または野生型同腹仔からプールされたＣＤ８＋Ｔ細胞のＴＣＬにおけるβ−カテニン、ホスホ−β−カテニン、ＡＸＩＮ１、ＤＶＬ２、ＧＳＫ−３α／β、ホスホ−ＧＳＫ−３β、ＣＫ１、β−ＴｒＣＰ、ｃ−Ｍｙｃ、ｐ５３、ｐ２１、カスパーゼ−３、切断カスパーゼ−３、カスパーゼ−９、切断カスパーゼ−９およびＧＡＰＤＨのイムノブロット分析。データは、３〜５回の独立した実験を表している。
【図５Ａ−５Ｇ】ＬＭＢＲ１Ｌ−ＧＰ７８−ＵＢＡＣ２複合体は、ＥＲ内のＷｎｔ受容体の成熟を制御することを示した図である。（Ａ）１２週齢Ｌｍｂｒ１ｌ−／−または野生型同腹仔の脾臓から単離されプールされたＣＤ＋８Ｔ細胞の膜およびＴＣＬにおける示されたタンパク質のイムノブロット。ＦＺＤ６またはＬＲＰ６の上のバンド（赤い矢頭）は成熟型であり、下のバンド（青い矢頭）はＦＺＤ６またはＬＲＰ６のＥＲ型である（Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆにも適用される）。ＧＲＰ９４またはＢｉＰの発現は、ＫＤＥＬ抗体で判定した。ＧＡＰＤＨは添加対照として使用した。＊、発現が変化していない未知のＫＤＥＬ陽性タンパク質。（Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＦＬＡＧタグ化ＦＺＤ６およびＨＡタグ化ＬＭＢＲ１Ｌ、ＵＢＡＣ２、ＧＰ７８または空のベクターのいずれかをトランスフェクトした。ＴＣＬは、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロースビーズを使用して免疫沈降し、ＦＬＡＧ、ＨＡおよびユビキチン（ＵＢ）に対する抗体でイムノブロットした。ＧＡＰＤＨは添加対照として使用した。（Ｃ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＦＬＡＧタグ化ＬＲＰ６およびＨＡタグ化ＬＭＢＲ１Ｌ、ＵＢＡＣ２または空のベクターをトランスフェクトした。ＴＣＬは、示した抗体を使用してイムノブロットした。（Ｄ）ＬＭＢＲ１Ｌ−ＦＬＡＧノックイン（ＫＩ）または親ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＷＴ）からＥＲまたは形質膜タンパク質を単離した。次に、内因性ＬＭＢＲ１Ｌ発現を、ＦＬＡＧ抗体を使用したイムノブロッティングによって分析した。カルネキシン、Ｅ−カドヘリンまたはα−チューブリンの発現は、それぞれＥＲ、形質膜または細胞基質の添加対照として使用した。（Ｅ）６週齢Ｇｐ７８−／−または野生型マウスの脾臓から単離されプールされたＣＤ８＋Ｔ細胞のＴＣＬにおける示されたタンパク質のイムノブロット。（Ｆ）ＦＬＡＧタグ化ＬＲＰ６およびＨＡタグ化ＬＭＢＲ１Ｌをコードする構築物をＧｐ７８−／−または親ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。ＴＣＬは、示した抗体を使用してイムノブロットした。（Ｇ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＦＬＡＧタグ化β−カテニンおよびＨＡタグ化ＬＭＢＲ１Ｌ、ＵＢＡＣ２、ＧＰ７８または空のベクターのいずれかをトランスフェクトした。ＴＣＬは、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロースビーズを使用して免疫沈降し、ＦＬＡＧ、ＨＡおよびユビキチン（ＵＢ）に対する抗体でイムノブロットした。ＧＡＰＤＨは添加対照として使用した。データは、２〜５回の独立した実験を表している。
【図６Ａ−６Ｂ】ＬＭＢＲ１ＬはＧＳＫ−３βを安定化することを示した図である。（Ａ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＦＬＡＧタグ化ＧＳＫ−３βおよびＨＡタグ化ＬＭＢＲ１Ｌまたは空のベクターのいずれかをトランスフェクトした。ＴＣＬは、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロースビーズを使用して免疫沈降し、ｐ−ＧＳＫ−３β、ＦＬＡＧおよびＨＡに対する抗体でイムノブロットした。ＧＡＰＤＨは添加対照として使用した。（Ａ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＦＬＡＧタグ化ＧＳＫ−３βおよびＨＡタグ化ＬＭＢＲ１Ｌまたは空のベクターのいずれかをトランスフェクトした。細胞をトランスフェクションの１４時間後にシクロヘキシミド（ＣＨＸ）で処置し、処置後の様々な時間で採取した。ＴＣＬは、示した抗体でイムノブロットした。２つの主要な抗体（抗ＨＡおよびＧＡＰＤＨ）を同時インキュベートして、ＬＭＢＲ１Ｌ（赤い矢頭）およびＧＡＰＤＨ（青い矢頭、添加対照）を１つの膜上で可視化した。データは、３回の独立した実験を表している。
【図７Ａ−７Ｃ】β−カテニン（Ｃｔｎｎｂ１）の欠如は、ＬＭＢＲ１Ｌ欠損によって引き起こされるアポトーシスを減衰させることを示した図である。（Ａ〜Ｃ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系によって生成されたＬｍｂｒ１ｌ−／−、Ｃｔｎｎｂ１−／−およびＬｍｂｒ１ｌ−／−；Ｃｔｎｎｂ１−／−ＥＬ４細胞（ｎ＝３〜５クローン／遺伝子型）ならびに親野生型（ＷＴ）ＥＬ４細胞の増殖曲線（Ａ）およびアネキシンＶ／ＰＩ染色（Ｂ）。輪郭で囲った領域に隣接している数字（Ｂ）は、それぞれにおける細胞のパーセントを示す。（Ｃ）生存可能な、アポトーシスした、および壊死したＬｍｂｒ１ｌ−／−、Ｃｔｎｎｂ１−／−、Ｌｍｂｒ１ｌ−／−；Ｃｔｎｎｂ１−／−または親ＷＴ  ＥＬ４細胞のパーセンテージの定量化。各記号は個々の細胞クローンを表している。Ｐ値は、一元ＡＮＯＶＡおよびダネットの多重比較によって判定した。データは、３回の独立した実験を表している。エラーバーはＳ．Ｄ．を示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１。
【図８Ａ−８Ｃ】マウスの重度のリンパ球減少症の原因としてのＬｍｂｒ１ｌにおける変異の同定を示した図である。Ｃｅｒｓ５対Ｌｍｂｒ１ｌにおける変異の効果を区別するために、Ｃｅｒｓ５およびＬｍｂｒ１ｌの変異についてヘテロ接合性である単一のＥＮＵ変異誘発雄マウスの第３世代（Ｇ３）子孫を交配して、２つのＥＮＵ誘導点変異を分離した。示された遺伝子型を有する子孫の末梢血リンパ球をフローサイトメトリーによって分析した。（Ａ）１２週齢マウスの末梢血におけるＣＤ３＋およびＢ２２０＋細胞の代表的なフローサイトメトリー分析。（Ｂ）末梢血のＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面での活性化マーカー（ＣＤ４４およびＣＤ６２Ｌ）の発現。（Ｃ）ＢおよびＴ細胞の末梢血における頻度、ならびにＣＤ６２ＬおよびＣＤ４４の発現に基づいた、ナイーブ、セントラルメモリー（ＣＭ）およびエフェクターメモリー（ＥＭ）ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の定量化。各記号は個々のマウスを表している。Ｐ値は、一元ＡＮＯＶＡおよびダネットの多重比較によって判定した。データは、遺伝子型当たり４〜９匹のマウスを用いた３回の独立した実験を表している。エラーバーはＳ．Ｄ．を示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図９Ａ−９Ｈ】１２週齢Ｌｍｂｒ１ｌ−／−および野生型同腹仔の全血白血球数を示した図である。各記号は個々のマウスを表している。Ｐ値は、スチューデントのｔ検定によって判定した。データは、遺伝子型当たり１２〜１４匹のマウスを用いた３回の独立した実験を表している。エラーバーはＳ．Ｄ．を示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．００１；ｎｓはＰ＞０．０５で有意差無し。
【図１０Ａ−１０Ｎ】ＥＮＵで誘導したＬｍｂｒ１ｌ変異を有するマウスにおいて観察された表現型の概要を示した図である。（Ａ〜Ｈ、Ｋ、Ｌ）野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（ＷＴ）マウスまたはＬｍｂｒ１ｌのＲＥＦ（＋／＋）、ＨＥＴ（ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ／＋）もしくはＶＡＲ（ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ／ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ）遺伝子型を有する単一のＥＮＵ変異誘発雄マウスのＧ３子孫の系統の末梢血におけるＴ（Ａ〜Ｄ）、Ｂ（Ｆ〜Ｈ）、ＮＫ（Ｋ）、およびＮＫ  Ｔ（Ｌ）細胞の頻度および表面マーカーの発現。（Ｉ、Ｊ）それぞれｒＳＦＶ−βＧａｌまたはＮＰ−Ｆｉｃｏｌｌで免疫処置した後の、Ｌｍｂｒ１ｌについて示された遺伝子型を有するＧ３マウスにおけるＴ細胞依存性（Ｉ）またはＴ細胞非依存性（Ｊ）抗体応答。データは、４５０ｎｍでの吸光度として表した。（Ｍ、Ｎ）養子移植４８時間後のＬｍｂｒ１ｌについて示された遺伝子型を有するＧ３マウスにおける、ｒＳＦＶ−βＧａｌでコードされたモデル抗原であるβ−Ｇａｌでパルスされた標的細胞に対するｉｎ  ｖｉｖｏ細胞傷害性Ｔリンパ球活性（Ｍ）、またはＭＨＣクラスＩ欠損（Ｂ２ｍ−／−）標的細胞に対するＮＫ細胞傷害性（Ｎ）。各記号は個々のマウスを表している。遺伝子型間の差の有意性は、一元ＡＮＯＶＡおよびダネットの多重比較によって判定した。データは、遺伝子型当たり６〜２２匹のマウスを用いた３回の独立した実験（Ａ〜Ｌ）または１つの実験（Ｍ、Ｎ）を表している。エラーバーはＳ．Ｄ．を示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１１Ａ−１１Ｏ】Ｌｍｂｒ１ｌ−／−および野生型同腹仔の脾臓における胸腺細胞および免疫細胞の発達のフローサイトメトリーによる定量化を示した図である。（Ａ〜Ｅ）胸腺細胞は、フローサイトメトリーによってＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、およびＣＤ４４表面マーカーを分析した。（Ｆ〜Ｏ）脾細胞は、フローサイトメトリーによって主要な免疫細胞系列：Ｂ２２０、ＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１９、ＣＤ４３、Ｆ４／８０およびＮＫ１．１を包含する表面マーカーを分析した。各記号は個々のマウスを表している。Ｐ値は、スチューデントのｔ検定によって判定した。データは、遺伝子型当たり８匹のマウスを用いた２回の独立した実験を表している。エラーバーはＳ．Ｄ．を示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；ＮＳはＰ＞０．０５で有意差無し。
【図１２Ａ−１２Ｃ】Ｌｍｂｒ１ｌ−／−マウスにおいて抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の低減を示した図である。Ｌｍｂｒ１ｌ−／−、野生型同腹仔およびＯＴ−Ｉマウスは、０日目に水酸化アルミニウム沈殿卵白アルブミン（ＯＶＡ／ａｌｕｍ）で免疫処置した。総（Ａ、Ｃ）および記憶（Ｂ、Ｃ）Ｋｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬテトラマー陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度は、ＣＤ４４およびＣＤ６２Ｌ表面マーカーを使用したフローサイトメトリーによって１４日目に分析した。ＣＭ，セントラルメモリー；ＥＭ，エフェクターメモリー。各記号は個々のマウスを表している（Ｃ、ｎ＝４／遺伝子型）。Ｐ値は、スチューデントのｔ検定によって判定した。データは、２回の独立した実験を表している。エラーバーはＳ．Ｄ．を示す＊＊＊Ｐ＜０．００１；ＮＳはＰ＞０．０５で有意差無し。
【図１３Ａ−１３Ｊ】Ｌｍｂｒ１ｌの発現プロファイルおよび刺激に応答したＬｍｂｒ１ｌ−／−腹腔マクロファージ（ＰＭ）による正常なサイトカイン分泌を示した図である。（Ａ〜Ｂ）Ｌｍｂｒ１ｌ転写産物のレベルは、８週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝１２）の様々な組織（Ａ）および免疫細胞（Ｂ）においてＧａｐｄｈ  ｍＲＮＡに正規化した。ＨＳＰＣ：造血幹／前駆細胞。（Ｃ〜Ｊ）Ｌｍｂｒ１ｌ−／−および野生型同腹仔のＰＭは、Ｐａｍ３ＣＳＫ４（ＴＬＲ２／１リガンド；Ｃ）、ポリ（Ｉ：Ｃ）（ＴＬＲ３リガンド；Ｄ）、リポ多糖（ＬＰＳ；ＴＬＲ４リガンド；Ｅ）、Ｒ８４８（ＴＬＲ７リガンド；Ｆ）、ＣｐＧ−オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ−ＯＤＮ；ＴＬＲ９リガンド；Ｇ）、ｄｓＤＮＡ（Ｈ）、ニゲリシン（インフラマソーム；Ｉ）およびフラジェリン（ＴＬＲ５リガンド；Ｊ）によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、材料および方法において示した濃度で刺激した。培地中のＩＦＮ−α、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αは、４時間後にＥＬＩＳＡによって測定した。各記号は個々のマウスを表している。Ｐ値は、スチューデントのｔ検定によって判定した。データは、遺伝子型当たり４〜６匹のマウスを用いた２回の独立した実験を表している。エラーバーはＳ．Ｄ．を示す。ＮＳはＰ＞０．０５で有意差無し。
【図１４Ａ−１４Ｂ】Ｌｍｂｒ１ｌ−／−由来の造血幹細胞は、競合性骨髄キメラにおけるリンパ球系多能性前駆細胞（ＬＭＰＰ）およびリンパ球系共通前駆細胞（ＣＬＰ）の再増殖に不利であることを示した図である。（Ａ〜Ｂ）競合性骨髄キメラにおける造血幹細胞および前駆細胞集団の再増殖。（Ａ）Ｌｍｂｒ１ｌ＋／＋ＢＭ（ＣＤ４５．２）およびコンジェニックＷＴ  ＢＭ（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ；ＣＤ４５．１）競合細胞の１：１混合物を、致死的に照射されたＲａｇ２−／−レシピエントに注射した。（Ｂ）Ｌｍｂｒ１ｌ−／−ＢＭ（ＣＤ４５．２）およびコンジェニックＷＴ  ＢＭ（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ；ＣＤ４５．１）競合細胞の１：１混合物を、致死的に照射されたＲａｇ２−／−レシピエントに注射した。末梢血のドナーキメラ化のレベルは、移植して８週間後にコンジェニックＣＤ４５マーカーを使用して評価した。各記号は個々のマウスを表している（ｎ＝４〜６／群）。Ｐ値は、スチューデントのｔ検定によって判定した。エラーバーはＳ．Ｄ．を示す＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１５Ａ−１５Ｃ】抗原特異的または恒常性増大シグナルに応答したＬｍｂｒ１ｌ−／−またはＬｍｂｒ１ｌｓｔ／ｓｔＣＤ８＋Ｔ細胞のアポトーシスを示した図である。（Ａ）可溶性ＯＶＡを注射して４８時間後に、野生型（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ；ＣＤ４５．１）レシピエントマウスの脾臓から単離した養子移植した野生型ＯＴ−ＩまたはＬｍｂｒ１ｌ−／−ＯＴ−Ｉ  Ｔ細胞のアネキシンＶ染色。（Ｂ）移植の４日後に、致死量以下で照射された（８．５Ｇｙ）野生型宿主（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ；ＣＤ４５．１）の脾臓から単離した養子移植した野生型またはＬｍｂｒ１ｌｓｔ／ｓｔＣＤ３＋Ｔ細胞のアネキシンＶ染色。（Ｃ）移植の４日後に、致死量以下で照射された（８．５Ｇｙ）野生型宿主（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ；ＣＤ４５．１）の脾臓から単離した養子移植した野生型またはＬｍｂｒ１ｌ−／−成熟単一陽性（ＳＰ）胸腺細胞のアネキシンＶ染色。各記号は個々のマウスを表している。Ｐ値は、スチューデントのｔ検定によって判定した。データは、遺伝子型当たり６匹のマウスを用いた２回の独立した実験を表している。エラーバーはＳ．Ｄ．を示す。＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１６Ａ−１６Ｂ】Ｌｍｂｒ１ｌ−／−ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、二次リンパ器官にホーミングすることはできるが、恒常性増大シグナルに応答した増殖性が欠如していることを示した図である。（Ａ）脾臓から単離されたＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ標識（Ｌｍｂｒ１ｌ−／−）またはＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｆａｒ  Ｒｅｄ標識（Ｌｍｂｒ１ｌ＋／＋）汎Ｔ細胞の１０：１混合物を、致死量以下で照射された（８．５Ｇｙ）野生型宿主（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ；ＣＤ４５．１）に養子移植した。移植して７日後の、致死量以下で照射された、または未照射の野生型宿主の脾臓から採取した細胞におけるＣｅｌｌＴｒａｃｅ  ＶｉｏｌｅｔまたはＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｆａｒ  Ｒｅｄ希釈物の代表的なフローサイトメトリー散布図（Ａ）およびヒストグラム（Ｂ）。データは、群当たり５〜７匹のマウスを用いた２回の独立した実験を表している。
【図１７Ａ−１７Ｅ】刺激に応答したＬｍｂｒ１ｌｓｔ／ｓｔＴ細胞における内因性および外因性カスパーゼ活性化の増強を示した図である。（Ａ、Ｂ）ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ；Ａ）またはＦａｓＬ（２５ｎｇ／ｍｌ；Ｂ）で０．５、１、２、４時間刺激した、または未処置のままのＬｍｂｒ１ｓｔ／ｓｔまたはＷＴ同腹仔からプールされた脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞の溶解物におけるＰＡＲＰのカスパーゼプロセシングまたは切断のイムノブロット分析。（Ｃ、Ｄ、Ｅ）１２週齢Ｌｍｂｒ１ｌ−／−；Ｔｎｆ−／−（Ｃ）、Ｌｍｂｒ１ｌ−／−；Ｆａｓｌｐｒ／ｌｐｒ（Ｄ）、Ｌｍｂｒ１ｌ−／−；Ｃａｓｐ３−／−（Ｅ）、または示された遺伝子型を有する同腹仔の末梢血におけるＣＤ３＋およびＢ２２０＋細胞の代表的なフローサイトメトリー分析。データは、遺伝子型当たり３〜７匹のマウスを用いた３回の独立した実験を表している。
【図１８Ａ−１８Ｃ】ＬＣＮ３欠損は、マウスにおけるリンパ球の発達に影響を与えないことを示した図である。ＬＭＢＲ１Ｌは、ヒトリポカリン−１の受容体として同定された（１３、１４）。リポカリンがリンパ球新生において重要な役割を果たすかどうかを判定するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用して、ヒトリポカリン−１のマウスオルソログであるＬＣＮ３を欠損したマウスを生成した。（Ａ）１２週齢Ｌｃｎ３−／−またはＷＴ同腹仔の末梢血におけるＣＤ３＋およびＢ２２０＋細胞の代表的なフローサイトメトリー分析。（Ｂ）末梢血におけるＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面での活性化マーカー（ＣＤ４４およびＣＤ６２Ｌ）の発現。（Ｃ）ＣＤ４４およびＣＤ６２Ｌの発現に基づいた、ＢおよびＴ細胞の末梢血における頻度、ならびにナイーブ、セントラルメモリー（ＣＭ）およびエフェクターメモリー（ＥＭ）ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の定量化。各記号は個々のマウスを表している。Ｐ値は、スチューデントのｔ検定によって判定した。データは、遺伝子型当たり４〜７匹のマウスを用いた２回の独立した実験を表している。エラーバーはＳ．Ｄ．を示す。ＮＳはＰ＞０．０５で有意差無し。
【図１９Ａ−１９Ｄ】ＬＭＢＲ１Ｌは、小胞体関連分解（ＥＲＡＤ）系の構成成分と物理的に相互作用することを示した図である。（Ａ、Ｂ）ＦＬＡＧタグ化ＵＢＡＣ２、ＵＢＸＤ８、ＶＣＰまたは空のベクターのいずれかを発現している構築物は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＨＡタグ化ＬＭＢＲ１ＬまたはＵＢＡＣ２とともに発現した。続いて、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロースを使用して細胞溶解物を免疫沈降させ、ＨＡまたはＦＬＡＧに対する抗体でイムノブロットした。（Ｃ、Ｄ）ＦＬＡＧタグ化ＧＰ７８または空のベクターのいずれかを発現する構築物は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＨＡタグ化ＬＭＢＲ１ＬまたはＵＢＡＣ２とともに発現した。（Ａ、Ｂ）に記載されているように、免疫沈降およびイムノブロットを実行した。データは、２回の独立した実験を表している。
【図２０Ａ−２０Ｃ】ＬＭＢＲ１Ｌ欠損は、β−カテニンの核蓄積を引き起こすことを示した図である。（Ａ）Ｌｍｂｒ１ｌ−／−または野生型同腹仔の胸腺細胞サブセットにおける細胞内β−カテニン。（Ｂ）Ｌｍｂｒ１ｌ−／−およびＷＴ同腹仔の脾臓からプールされた成熟単一陽性胸腺細胞、ナイーブ汎Ｔ細胞および汎Ｔ細胞の全細胞溶解物中におけるβ−カテニンのイムノブロット分析。（Ｃ）Ｌｍｂｒ１ｌ−／−またはＷＴ同腹仔からプールされたＣＤ８＋Ｔ細胞の全細胞溶解物ならびに細胞基質および核抽出物中におけるβ−カテニンのイムノブロット分析。ＧＡＰＤＨおよびヒストンＨ３は、細胞基質および核画分の純度についてのマーカーとして使用した。各記号は個々のマウスを表している。Ｐ値は、スチューデントのｔ検定によって判定した。データは、遺伝子型当たり６匹のマウスを用いた２回の独立した実験を表している。エラーバーはＳ．Ｄ．を示す。＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図２１Ａ−２１Ｂ】ＣＤ４＋ＴおよびＢ細胞のＷｎｔ構成成分のイムノブロット分析を示した図である。Ｌｍｂｒ１ｌ−／−またはＷＴ同腹仔からプールされたＣＤ４＋Ｔ（Ａ）または汎Ｂ（Ｂ）細胞の全細胞溶解物におけるＬＲＰ６、ホスホ−ＬＲＰ６、β−カテニン、ホスホ−β−カテニン、ＡＸＩＮ１、ＤＶＬ２、ＣＫ１、β−ＴｒＣＰ、ｃ−Ｍｙｃ、カスパーゼ−３、切断カスパーゼ−３、カスパーゼ−９、切断カスパーゼ−９およびＧＡＰＤＨのイムノブロット分析。
【図２２Ａ−２２Ｅ】Ｌｍｂｒ１ｌ−／−小腸および結腸における正常な増殖およびβ−カテニン活性化を示した図である。（Ａ、Ｂ）野生型およびＬｍｂｒ１ｌ−／−の腸をβ−カテニン（Ａ）またはＫｉ−６７（Ｂ）で染色した。スケールバー：５０μｍ。ｎ＝３〜４マウス／遺伝子型；代表的な画像を示す。（Ｃ）β−カテニン平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を得るために、マウス当たり１０個の視野を平均化した。（Ｄ）Ｌｍｂｒ１ｌ−／−および野生型同腹仔の陰窩当たりの増殖細胞（Ｋｉ−６７＋）の定量化。（Ｅ）野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ＷＴ）またはＬｍｂｒ１ｌのＲＥＦ（＋／＋）、ＨＥＴ（ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ／＋）もしくはＶＡＲ（ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ／ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ）遺伝子型を有する単一ＥＮＵ変異誘発雄マウスのＧ３子孫の系統の飲料水の１．５％ＤＳＳ処置の１０日目の初期体重のパーセンテージ。各記号は個々のマウスを表している。ｎ＝６〜２２マウス／遺伝子型。Ｐ値は、スチューデントのｔ検定（Ｃ、Ｄ）または一元ＡＮＯＶＡおよびダネットの多重比較（Ｅ）によって判定した。エラーバーはＳ．Ｄ．を示す。ＮＳはＰ＞０．０５で有意差無し。
【図２３】ＬＭＢＲ１Ｌは、ＥＲでのＦｒｉｚｚｌｅｄ−６（ＦＺＤ６）の保持を誘導し、細胞表面での発現を阻害することを示した図である。ガラス底の８ウェルガラスチャンバーで培養したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の共焦点蛍光生細胞画像。細胞は、ＦＺＤ６−ＧＦＰと一緒に空のベクター（上のパネル）またはＬＭＢＲ１Ｌ−ＨＡ（下のパネル）でトランスフェクトした。画像を取り込む１６時間前に、トランスフェクトした細胞にＣｅｌｌＬｉｇｈｔ  ＥＲ−ＲＦＰバキュロウイルス（ＲＦＰ−ＫＤＥＬ）を感染させることによってＥＲを可視化した。青い矢印は、形質膜でのＦＺＤ−ＧＦＰの発現を示している。スケールバー：１０μｍ。画像は、３回の独立した実験を表しており、それぞれはトランスフェクション／バキュロウイルス感染条件当たり２つのウェルである。３つの視野は、実験当たり各ウェルから取り込んだ。
【図２４Ａ−２４Ｂ】休止中のＵｂａｃ２−／−またはＧｐ７８−／−細胞におけるＷｎｔ構成成分の発現を示した図である。（Ａ）親ＷＴ、Ｕｂａｃ２−／−またはＧｐ７８−／−ＨＥＫ２９３Ｔ（Ａ）またはＥＬ４細胞（Ｂ）の全細胞溶解物におけるＦＺＤ６、ＬＲＰ６、β−カテニン、ＵＢＡＣ２、ＧＰ７８、ＧＡＰＤＨおよびα−チューブリンのイムノブロット分析（Ｂ）。赤い矢頭は成熟型を示し、青い矢頭は未熟型を示す。データは３回の独立した実験を表している。
【図２５】ＬＭＢＲ１Ｌ媒介ＦＺＤ６成熟に対するＵＢＡＣ２の影響を示した図である。ＦＬＡＧタグ化ＦＺＤ６およびＥＧＦＰをコードする構築物は、親ＨＥＫ２９３ＴおよびＵｂａｃ２−／−細胞で同時発現し、ＨＡタグ化ＬＭＢＲ１Ｌの量を増加させた。全細胞溶解物は、示した抗体を使用してイムノブロットした。赤い矢頭は成熟型を示し、青い矢頭はＦＺＤ６のＥＲ型を示す。データは、３回の独立した実験を表している。
【図２６Ａ−２６Ｂ】ＧＰ７８は、β−カテニンと物理的に相互作用することを示した図である。（Ａ）ＦＬＡＧタグ化β−カテニン構築物は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＨＡタグ化ＧＰ７８または空のＨＡベクターのいずれかで発現した。続いて、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロースを使用して細胞溶解物を免疫沈降させ、ＨＡまたはＦＬＡＧに対する抗体でイムノブロットした。データは、２回の独立した実験を表している。（Ｂ）ＦＬＡＧタグ化β−カテニンをコードする構築物をＧｐ７８−／−または親ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。全細胞溶解物は、示した抗体を使用してイムノブロットした。
【図２７】分解複合体タンパク質の発現に対するＬＭＢＲ１Ｌの影響を示した図である。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ＦＬＡＧタグ化Ａｘｉｎ１、ＤＶＬ２もしくはＧＳＫ−３βおよびＨＡタグ化ＬＭＢＲ１Ｌまたは空のベクターをコードする構築物で同時トランスフェクトした。全細胞溶解物は、示した抗体を使用してイムノブロットした。
【図２８】リンパ球新生におけるＬＭＢＲ１Ｌ機能のモデルを示した図である。ＬＭＢＲ１Ｌは、血漿およびＥＲ膜で発現した膜貫通タンパク質である。これは、Ｗｎｔシグナル伝達の負のフィードバック制御因子として機能する。リンパ球のＥＲには、ＬＭＢＲ１Ｌ、ＧＰ７８およびＵＢＡＣ２からなる第２のＷｎｔ／β−カテニン経路分解複合体が存在している。ＧＰ７８は、ＥＲ膜に固定されたＥ３ユビキチンリガーゼであり、ＥＲＡＤを介してミスフォールディングされたタンパク質の蓄積を防ぐ。ＧＰ７８複合体の中心的な要素であるＵＢＡＣ２は、そのＣ末端に機能的なポリＵＢ結合ドメイン（ＵＢＡ）を含有している。ＬＭＢＲ１Ｌ−ＧＰ７８−ＵＢＡＣ２複合体は、リンパ球のＥＲ内でＦＺＤ６およびＷｎｔ共受容体ＬＲＰ６をユビキチン化して成熟を妨害し、この複合体はまた、β−カテニンのユビキチン化および分解を制御することができる。この第２の分解複合体がないと、ＦＺＤ６およびＬＲＰ６が形質膜に蓄積し、増強されたＷｎｔシグナル伝達がカノニカル分解複合体を圧倒し、β−カテニンが核に溢れる原因となる。さらに、ＬＭＢＲ１Ｌは、ＧＳＫ−３βを含む分解複合体のいくつかの構成成分と物理的に相互作用する。これらの相互作用は、リン酸化によるβ−カテニンの持続的な不活性化に必要なＧＳＫ−３βを安定化するのを助け、カノニカルＷｎｔシグナル伝達を減衰させる。ＬＭＢＲ１Ｌ欠損リンパ球では、分解複合体タンパク質の発現低減がＧＳＫ−３βの不活性（リン酸化）型の量の増加とともに認められ、複合体の不安定化が示唆される。その結果、高レベルのリン酸化されていないβ−カテニンが蓄積し、リンパ球活性化に応答したアポトーシスの誘因となる。
【図２９】ヒト（配列番号３）およびマウスＬＭＢＲ１Ｌ（配列番号４）のアミノ酸配列アラインメントを示した図である。同一の残基は赤で強調表示し、類似の残基は黄色で強調表示している。ヒトＬＭＢＲ１ＬのＮＣＢＩ遺伝子受託番号はＮＰ＿０６０５８３．２であり、マウスＬＭＢＲ１ＬはＮＰ＿０８３３７４．１である。
【図３０Ａ】４から６ヵ月齢Ｌｍｂｒ１ｌ＋／＋（ｎ＝６）、Ｌｍｂｒ１ｌ−／−（ｎ＝４）、Ｌｍｂｒ１ｌ＋／＋；Ｂｃｌ２−Ｔｇ（ｎ＝１１）、Ｌｍｂｒ１ｌ−／−；Ｂｃｌ２−Ｔｇ（ｎ＝３）および６ヵ月齢のＮＺＢ／ＮＺＷＦ１ハイブリッド雌（ｎ＝４）における血清ｄｓＤＮＡ特異的ＩｇＧレベルを示した図である。
【図３０Ｂ】４から５ヵ月齢Ｌｍｂｒ１ｌ＋／＋（ｎ＝６）、Ｌｍｂｒ１ｌ−／−（ｎ＝５）、Ｌｍｂｒ１ｌ＋／＋；Ｂｃｌ２−Ｔｇ（ｎ＝６）およびＬｍｂｒ１ｌ−／−；Ｂｃｌ２−Ｔｇ（ｎ＝７）マウスにおける末梢血Ｂ細胞数を示した図である。各記号は、個々のマウスを表している。エラーバーはＳ．Ｄ．を示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
前述の一般的な記載および以下の詳細な記載の両方が例示および説明のみであり、本開示の組成物および方法の限定ではないことを理解されたい。
【００１５】
本明細書において、炎症性疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病または同種移植片拒絶などの免疫系が過剰または過活動である状態を有する対象において、ＬＭＢＲ１Ｌ（リム領域１様）を阻害することに関連する組成物および方法、ならびにこのような方法において使用され得るキットが開示される。本開示の一態様は、ＬＭＢＲ１Ｌ中の変異またはＬＭＢＲ１Ｌのノックアウトが、末梢血中のＣＤ３＋Ｔ細胞の頻度の減少、ＣＤ４＋のＣＤ８＋に対する比の増加、表面糖タンパク質ＣＤ４４およびＣＤ６２Ｌの増加、Ｂ細胞発達の障害、Ｔ細胞依存性およびＴ細胞非依存性液性免疫応答の減少、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）殺滅活性の減少およびナチュラルキラー（ＮＫ）およびＮＫ  Ｔ細胞の頻度の低減が挙げられる、免疫不全によって特徴付けられる表現型を生じるとの驚くべき発見に関する。したがって、ＬＭＢＲ１Ｌは、リンパ球新生に不可欠である。抗体などのＬＭＢＲ１Ｌの阻害剤は、それを必要とする対象において免疫応答を低減または抑制するために使用され得る。
【００１６】
ＬＭＢＲ１Ｌは、以前は機能が未知であった、複数回貫通型形質膜タンパク質である。予想外に、本明細書に開示されるように、ＬＭＢＲ１Ｌの非存在下で、すべてのリンパ球依存性免疫は、強く抑制され、リンパ系細胞は、典型的には増殖を生じる刺激によってアポトーシスへと向かった。また、驚くべきことに、本開示の実験は、ＬＭＢＲ１Ｌがすべての系列のリンパ球においてＷｎｔシグナル伝達経路の不可欠な構成成分であることも実証している。β−カテニン活性が恒常的に高く、分解複合体が関与できなかった（すなわち、細胞膜でＦＲＩＺＺＬＥＤ−６が高く上方制御されるようになり、ＺＮＲＦ３が下方制御された）ことから、Ｗｎｔ経路を介するシグナル伝達は、ＬＭＢＲ１Ｌノックアウトマウスにおいて異常であった。本開示のデータは、ＬＭＢＲ１Ｌが、ＧＳＫ３β、β−カテニン、ＺＮＲＦ３、ＲＮＦ４３およびＦＲＩＺＺＬＥＤ−６を含むリンパ球におけるＷｎｔシグナル伝達経路のいくつかの構成成分と相互作用できることを示している。さらに、全身性エリテマトーデスおよび他の自己免疫疾患に対する特異的で敏感な指標である自己抗体（ｄｓＤＮＡ特異的ＩｇＧ）の産生などの自己免疫応答をＬＭＢＲ１Ｌ欠損が阻害することが予想外に発見された。
【００１７】
したがって、抗体および小分子アンタゴニストなどのＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤は、免疫系が過剰または過活動である状態、例えば、炎症性疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病または同種移植片拒絶を有する対象における免疫応答を低減するまたは抑制するために使用され得る。
【００１８】
定義
簡便さのために、明細書、実施例および添付の特許請求の範囲において使用される特定の用語は、ここにまとめられている。他に定義されない限り、本明細書において用いられるすべての技術的および科学的用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。以下の参考文献は、本開示において使用される多数の用語の一般的定義を含む技能を提供する、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｏｒｒｉｓ（Ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１ｓｔｅｄ．，１９９２）；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（ｒｅｖｉｓｅｄ  ｅｄ．，２０００）；Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉｃ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｋｕｍａｒ（Ｅｄ．），Ａｎｍｏｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．（２００２）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（３ｒｄｅｄ．，２００２）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｈｕｎｔ（Ｅｄ．），Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅ（１ｓｔｅｄ．，１９９９）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｈｌｅｒ（Ｅｄ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｔｅｌｏｓ  （１９９４）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｋｕｍａｒ  ａｎｄ  Ａｎａｎｄａｎｄ  （Ｅｄｓ．），Ａｎｍｏｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．（２００２）；およびＡ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐａｐｅｒｂａｃｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ），Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｈｉｎｅ（Ｅｄｓ．），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（４ｔｈｅｄ．，２０００）。本開示に具体的に適用されるこれらの用語の一部のさらなる明確化が本明細書において提供される。
【００１９】
本明細書において使用される場合、冠詞「ａ（１つの）」および「ａｎ（１つの）」は、冠詞の文法的目的語の１つまたは１つより多く、例えば、少なくとも１つを参照する。語「ａ（１つの）」または「ａｎ（１つの）」の使用は、本明細書において用語「含む」と併せて使用される場合、「１つ」を意味する場合があるが、「１つまたは複数」、「少なくとも１つ」および「１つまたは１つより多く」の意味と矛盾しない。
【００２０】
本明細書において使用される場合、「約」および「およそ」は、測定の性質または正確度を考慮した、測定された量についての誤差の許容可能な程度を一般に意味する。誤差の例示的な程度は、値の所与の範囲の２０パーセント（％）以内、典型的には１０％以内、さらに典型的には、５％以内である。用語「実質的に」は、５０％より多く、好ましくは８０％より多く、最も好ましくは９０％または９５％より多くを意味する。
【００２１】
ＬＩＭＲとしても知られている、「Ｌｍｂｒ１ｌ」および「ＬＭＢＲ１Ｌ」は互換的に用いられ、リム領域１様を指し、他に記す場合を除いて、「Ｌｍｂｒ１ｌ」が一般に遺伝子またはｍＲＮＡを指し、「ＬＭＢＲ１Ｌ」がタンパク質産物を指す。用語が、完全な遺伝子、ｃＤＮＡ配列、完全なアミノ酸配列またはこれらの任意の断片もしくはバリアントを含むことは理解されるべきである。一部の実施形態では、ＬＭＢＲ１ＬはヒトＬＭＢＲ１Ｌである。
【００２２】
本明細書において使用される場合、用語「ＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤」は、ＬＭＢＲ１Ｌ活性を阻害、下方調節、抑制または下方制御する治療剤を含むことが意図される。用語は、小分子阻害剤またはアンタゴニストなどの化合物および生物学的薬剤（例えば、抗体）、干渉ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）、遺伝子編集／サイレンシングツール（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ）などを含むことが意図される。
【００２３】
「抗ＬＭＢＲ１Ｌ抗体」は、ＬＭＢＲ１Ｌ（例えば、その細胞外ドメイン）に免疫特異的に結合する抗体である。抗体は、単離された抗体であってよい。ＬＭＢＲ１Ｌへのこのような結合は、例えば、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、または５０ｎＭ以下の値のＫｄを示す。Ｋｄは表面プラズモン共鳴アッセイまたは細胞結合アッセイなどの当業者に知られている任意の方法によって測定され得る。抗ＬＭＢＲ１Ｌ抗体は、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片であってよい。
【００２４】
本明細書において使用される場合、「抗体」は、標的エピトープに結合する結合ドメインを含む１つまたは複数のポリペプチドからなるタンパク質である。抗体という用語は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖分子を含むモノクローナル抗体、単一重鎖可変ドメイン抗体ならびに、モノクローナルおよび単一重鎖可変ドメイン抗体のキメラバリアントを含むこれらのバリアントおよび誘導体を含む。結合ドメインは、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的にコードされており、ここでタンパク質は、抗原に免疫特異的に結合する。認められる免疫グロブリン遺伝子として、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子ならびに多数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかに分類される。重鎖は、次に免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥをそれぞれ決める、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンとして分類される。ヒトおよびマウス種を含む大部分の脊椎動物生物について、典型的な免疫グロブリン構造単位は、各対が１つの「軽」（約２５ｋＤ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有するポリペプチド鎖の２つの同一の対からなる四量体を含む。「ＶＬ」および「ＶＨ」は、これらの軽鎖および重鎖それぞれの可変ドメインを指す。「ＣＬ」および「ＣＨ」は、軽鎖および重鎖の定常ドメインを指す。β鎖のループは、ＶＬおよびＶＨにそれぞれ３個が、抗原への結合に関与しており、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と称される。「Ｆａｂ」（断片、抗原結合）領域は抗体の各重鎖および軽鎖由来の、１つの定常および１つの可変ドメイン、すなわち、ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ、およびＣＨ１を含む。
【００２５】
抗体は、未処置免疫グロブリンおよびその抗原結合性断片を含む。用語「抗原結合性断片」は、抗原に結合するまたは抗原結合（すなわち、特異的結合）について未処置抗体と（すなわち、それらが由来する未処置抗体と）競合する抗体のポリペプチド断片を指す。抗原結合性断片は、当技術分野において周知である組換えまたは生化学方法によって産生され得る。例示的抗原結合性断片として、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、ＣＤＲ、パラトープおよび１本鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）が挙げられ、ここでＶＨおよびＶＬ鎖は、連続したポリペプチドを形成するように併せて一緒に接続されている（直接またはペプチドリンカーを通じて）。
【００２６】
抗体として、バリアント、キメラ抗体およびヒト化抗体も挙げられる。本明細書において使用される場合、用語「抗体バリアント」は、重鎖および／または軽鎖中に単一のまたは複数の変異を有する抗体を指す。一部の実施形態では、変異は、可変領域に存在する。一部の実施形態では、変異は定常領域に存在する。「キメラ抗体」は、重鎖および軽鎖の各アミノ酸配列の一部が特定の種に由来するまたは特定のクラスに属する抗体中の対応する配列に相同性である一方で、鎖の残りのセグメントが別の対応する配列に相同性である抗体を指す。典型的には、これらのキメラ抗体において、軽鎖および重鎖両方の可変領域は、哺乳動物の１つの種由来の抗体の可変領域を模倣し、一方定常部分は、別のもの由来の抗体における配列に相同性である。このようなキメラ形態の１つの明らかな利点は、例えば、可変領域が、容易に利用可能な非ヒト宿主生物由来のハイブリドーマまたはＢ細胞を使用して現在知られている供給源から、例えばヒト細胞調製物由来の定常領域と組み合わせて簡便に導かれ得ることである。可変領域が調製の容易さの利点を有する一方で、特異性はその供給源に影響されず、ヒトである定常領域は、抗体が注射された場合に、非ヒト供給源由来の定常領域よりもヒト対象からの免疫応答をあまり誘発しない。しかし、定義は、この具体的な例に限定されない。「ヒト化」抗体は、非ヒト種由来の免疫グロブリンに実質的に由来する抗原結合部位を有し、分子の残りの免疫グロブリン構造がヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づく分子を指す。抗原結合部位は、定常ドメインに融合された完全な可変ドメインまたは、可変ドメイン中の適切なフレームワーク領域に移植された相補性決定領域（ＣＤＲ）のみのいずれかを含む場合がある。抗原結合部位は野生型であってよく、または１つもしくは複数のアミノ酸置換によって改変されていてよい、例えば、ヒト免疫グロブリンにさらに密接に類似するように改変されてよい。ヒト化抗体の一部の形態は、すべてのＣＤＲ配列を保存している（例えば、マウス抗体由来の６個すべてのＣＤＲを含有するヒト化マウス抗体）。ヒト化抗体の他の形態は、元の抗体に対して変更されており、１つまたは複数のＣＤＲに「由来する」１つまたは複数のＣＤＲとも称される１つまたは複数のＣＤＲ（１、２、３、４、５または６個）を有する。
【００２７】
本明細書に記載される通り、抗体のアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔの一般的番号付けに従って番号付けられてよい（Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）。
【００２８】
ＶＨＨなどの抗体と標的としてのＬＭＢＲ１Ｌのエピトープとの間の結合の文脈において、本明細書において使用される場合、用語「結合」は、分子間の非共有結合相互作用のプロセスを指す。好ましくは、前記結合は特異的である。抗体の特異性は、親和性に基づいて決定され得る。特異的抗体は、結合親和性またはそのエピトープについて１０−７Ｍ未満、好ましくは１０−８Ｍ未満の解離定数Ｋｄを有し得る。
【００２９】
用語「親和性」は抗体の結合ドメインとエピトープとの間の結合反応の強さを指す。それは、結合ドメインとエピトープとの間に作用する引力と反発力との合計である。本明細書において使用される場合、用語、親和性は、解離定数、Ｋｄを指す。
【００３０】
用語「抗原」は、抗体などの選択的結合剤によって結合され得る分子または分子の一部を指し、抗原のエピトープに結合できる抗体を産生する動物においても追加的に使用され得る。抗原は、１つまたは複数のエピトープを有し得る。
【００３１】
用語「エピトープ」は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合できる任意の決定因子、好ましくはポリペプチド決定因子を含む。ある特定の実施形態では、エピトープ決定因子は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニルなどの分子の化学的に活性な表面基を含み、ある特定の実施形態では、特異的な三次元構造的特徴および／または特異的な電荷特徴を有する場合がある。エピトープは、抗体によって結合される抗原の領域である。ある特定の実施形態では、抗体は、タンパク質および／または高分子の複合混合物においてその標的抗原を優先的に認識する場合に、抗原に特異的に結合すると称される。エピトープマッピングのための方法は、Ｘ線共結晶解析、アレイベースオリゴペプチドスキャンニング、部位特異的変異導入、ハイスループット変異導入マッピングおよび水素重水素交換など、当技術分野において周知である。
【００３２】
エピトープに結合する抗体上の部位は、「パラトープ」と称され、結合するとエピトープに近接近するアミノ酸残基を典型的には含む。Ｓｅｌａ−Ｃｕｌａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３；４：３０２を参照されたい。
【００３３】
「免疫組織化学」または「ＩＨＣ」は、生物学的組織において目的の抗原を免疫特異的に認識する抗体の結合および続く検出を可能にする、組織切片の細胞において抗原を検出するプロセスを指す。ＩＨＣ技術の概説に関して、例えば、引用することにより本明細書の一部をなすものとする、Ｒａｍｏｓ−Ｖａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１４  ｖｏｌ．５１  ｎｏ．１，４２−８７を参照されたい。ＩＨＣ結果を評価するために、さまざまな定性的および半定量的スコア化システムが開発されている。例えば引用することにより本明細書の一部をなすものとする、Ｆｅｄｃｈｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０１４；９：２２１を参照されたい。一例は、可能値３００で、細胞の百分率と染色強度順序値（ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｏｒｄｉｎａｌ  ｖａｌｕｅ）（「シグナルなし」に対する０から「強いシグナル」に対する３までスコア化される）との乗算の結果を加算することによって決定されるＨ−スコアである。
【００３４】
「免疫特異的」または「免疫特異的に」（「特異的に」と互換的に使用される場合もある）は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的にコードされるドメインを介して目的のタンパク質の１つまたは複数のエピトープに結合するが、抗原性分子の混合集合物を含有する試料中の他の分子を実質的に認識および結合しない抗体を指す。典型的には、抗体は、表面プラズモン共鳴アッセイまたは細胞結合アッセイによって測定される５０ｎＭ以下の値のＫｄで同族抗原に免疫特異的に結合する。このようなアッセイの使用は、当技術分野において周知である。
【００３５】
用語「免疫応答」は、Ｔ細胞媒介性応答、Ｂ細胞媒介性免疫応答および／またはＮＫ細胞媒介性応答ならびにＴ、Ｂおよび／またはＮＫ細胞の数および／または発達における変化（例えば、リンパ球系共通前駆細胞を制御することによる）を含む。また、免疫応答という用語は、Ｔ細胞活性化によって間接的に影響を受ける免疫応答、例えば、抗体産生（液性応答）およびサイトカイン応答性細胞、例えばマクロファージの活性化を含む。
【００３６】
本明細書において使用される場合、用語「リンパ球新生」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、Ｂ、ＴおよびＮＫ細胞などのリンパ球の生成を指す。したがって、用語「Ｔ細胞リンパ球新生」は、Ｔ細胞（すなわちＴリンパ球）の生成を指す。
【００３７】
用語「自己免疫疾患」は、対象の免疫系が対象自身の細胞を攻撃する抗体を産生し、悪化ならびに一部の場合では細胞および／または組織の破壊を生じる、対象における過活動性免疫応答から生じる疾患を指す。自己免疫疾患の例として、非限定的に、１型糖尿病、多発性硬化症、セリアック病、エリテマトーデス、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群、チャーグ・ストラウス症候群、橋本甲状腺炎、グレーブス病、特発性血小板減少性紫斑病、関節リウマチ（ＲＡ）、強直性脊椎炎、クローン病、皮膚筋炎、グットパスチャー症候群、ギランバレー症候群（ＧＢＳ）、混合性結合組織病、重症筋無力症、ナルコレプシー、尋常性天疱瘡、悪性貧血、乾癬、乾癬性関節炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、再発性多発軟骨炎、側頭動脈炎、潰瘍性大腸炎、血管炎およびウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。本明細書において使用される場合、用語「炎症性疾患」は、過剰な炎症性応答（または炎症性過剰反応）から生じる障害として定義される。炎症性疾患は、不適当な抗原に対する不適当で過剰な応答の結果である。炎症性疾患の例として、これに限定されないが、アレルギー、喘息、自己免疫疾患、セリアック病、糸球体腎炎、肝炎、炎症性腸疾患、関節リウマチ、ループス、再灌流傷害（preperfusion injury）、移植片拒絶、アジソン病、円形脱毛症、ジストロフィー型表皮水疱症、精巣上体炎、血管炎、白斑、粘液水腫、悪性貧血および潰瘍性大腸炎が特に挙げられる。炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、２つの主な種類、すなわちクローン病（ＣＤ）および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）を含む。
【００３８】
用語「薬剤」は、炎症性疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病または同種移植片拒絶などの免疫系が過活動である状態を有する対象における免疫応答を低減または抑制できる任意の分子、ペプチド、抗体または他の薬剤を含み得る。種々の薬剤は、本明細書に記載される組成物および方法において有用である。
【００３９】
用語「交差競合する」、「交差競合」、「交差遮断する」、「交差遮断される」および「交差遮断」は、直接または、本開示の抗ＬＭＢＲ１Ｌ抗体のアロステリック調節を通じて間接的に、標的ＬＭＢＲ１Ｌへの結合を干渉する抗体またはその断片の能力を意味して本明細書において互換的に用いられる。抗体またはその断片が別のものの標的への結合を干渉できる程度、およびそれにより、それが本開示による交差遮断するまたは交差競合すると称され得るかどうかは、競合結合アッセイを使用して判定され得る。１つの特に好適な定量的交差競合アッセイは、標的へのそれらの結合に関して標識化（例えば、Ｈｉｓタグ化、ビオチン化または放射標識）抗体またはその断片と他の抗体またはその断片との間の競合を測定するためのＦＡＣＳまたはＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎに基づくアプローチを使用する。一般に、交差競合する抗体またはその断片は、例えば、アッセイの際および二次抗体またはその断片の存在下で、本開示による免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドの記録された置き換えが、所与の量で存在する、試験される潜在的に交差遮断する抗体またはその断片による最大の理論的置き換え（例えば、交差遮断される必要があるコールド（例えば、未標識）抗体またはその断片による置き換え）の１００％に至る（例えば、ＦＡＣＳベース競合アッセイにおいて）ように、交差競合アッセイにおいて標的に結合できるものである。好ましくは、交差競合する抗体またはその断片は、１０％と１００％の間、より好ましくは５０％から１００％の間である記録された置き換えを有する。
【００４０】
用語、「抑制する」、「抑制」、「阻害する」、「阻害」、「中和する」、「中和」は、本明細書において互換的に使用され、活性の完全な遮断を含む、生物学的活性（例えば、ＬＭＢＲ１Ｌ活性）における任意の統計的に有意な減少を指す。例えば「阻害」は、生物学的活性における約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の減少を指し得る。
【００４１】
用語「対象」または「患者」は、予防的または治療的処置のいずれかを受けるヒトまたは他の哺乳動物を含む。
【００４２】
本明細書において使用される場合、用語「処置する」、「処置すること」および「処置」は、本明細書に記載されるものなどの治療的または予防的手段を指す。「処置」の方法は、患者、例えば、炎症性疾患、移植片対宿主病、同種移植片拒絶または自己免疫疾患（例えば、橋本甲状腺炎、グレーブス病、Ｉ型インスリン依存性糖尿病、関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症（ＭＳ））などの免疫系が過活動である状態を有する患者への、免疫系が過剰もしくは過活動である状態を有する患者において１つもしくは複数の症状を予防、治癒、遅延、重症度の低減もしくは回復させるための、またはこのような処置を欠くときに予測されるものを超えた患者の生存の延長のための本明細書において提供されるＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤の投与を使用する。
【００４３】
本明細書において使用される場合、用語「有効量」は、患者に投与された場合に、免疫系が過剰または過活動である状態、例えば、炎症性疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病、もしくは同種移植片拒絶を有する患者において免疫応答を低減または抑制するために十分である、および／または炎症性疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病または同種移植片拒絶の処置、予後または診断に影響を与える、ＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤、例えば、抗ＬＭＢＲ１Ｌ抗体などの薬剤の量を指す。治療有効量は、処置される患者および疾患状態、患者の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与の様式などに応じて変動し、当業者によって容易に決定され得る。投与のための投薬量は、本明細書において提供される抗体またはその抗原結合部分の例えば約１ｎｇから約１０，０００ｍｇ、約５ｎｇから約９，５００ｍｇ、約１０ｎｇから約９，０００ｍｇ、約２０ｎｇから約８，５００ｍｇ、約３０ｎｇから約７，５００ｍｇ、約４０ｎｇから約７，０００ｍｇ、約５０ｎｇから約６，５００ｍｇ、約１００ｎｇから約６，０００ｍｇ、約２００ｎｇから約５，５００ｍｇ、約３００ｎｇから約５，０００ｍｇ、約４００ｎｇから約４，５００ｍｇ、約５００ｎｇから約４，０００ｍｇ、約１μｇから約３，５００ｍｇ、約５μｇから約３，０００ｍｇ、約１０μｇから約２，６００ｍｇ、約２０μｇから約２，５７５ｍｇ、約３０μｇから約２，５５０ｍｇ、約４０μｇから約２，５００ｍｇ、約５０μｇから約２，４７５ｍｇ、約１００μｇから約２，４５０ｍｇ、約２００μｇから約２，４２５ｍｇ、約３００μｇから約２，０００、約４００μｇから約１，１７５ｍｇ、約５００μｇから約１，１５０ｍｇ、約０．５ｍｇから約１，１２５ｍｇ、約１ｍｇから約１，１００ｍｇ、約１．２５ｍｇから約１，０７５ｍｇ、約１．５ｍｇから約１，０５０ｍｇ、約２．０ｍｇから約１，０２５ｍｇ、約２．５ｍｇから約１，０００ｍｇ、約３．０ｍｇから約９７５ｍｇ、約３．５ｍｇから約９５０ｍｇ、約４．０ｍｇから約９２５ｍｇ、約４．５ｍｇから約９００ｍｇ、約５ｍｇから約８７５ｍｇ、約１０ｍｇから約８５０ｍｇ、約２０ｍｇから約８２５ｍｇ、約３０ｍｇから約８００ｍｇ、約４０ｍｇから約７７５ｍｇ、約５０ｍｇから約７５０ｍｇ、約１００ｍｇから約７２５ｍｇ、約２００ｍｇから約７００ｍｇ、約３００ｍｇから約６７５ｍｇ、約４００ｍｇから約６５０ｍｇ、約５００ｍｇまたは約５２５ｍｇから約６２５ｍｇの範囲であり得る。投薬は、例えば、毎週、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、５週間ごとまたは６週間ごとであってよい。投薬レジメンは、最適な治療反応をもたらすために調整され得る。有効量は、薬剤のいかなる毒性もしくは有害作用（副作用）も最小化され、および／または有益な効果が上回るものでもある。投与は、静脈内に、１週間に正確にもしくは約６ｍｇ／ｋｇもしくは１２ｍｇ／ｋｇまたは２週間に正確にもしくは約１２ｍｇ／ｋｇもしくは２４ｍｇ／ｋｇであってよい。追加的投薬レジメンは、以下に記載される。
【００４４】
本明細書において使用される場合、組換え核酸技術、微生物学、免疫学、抗体工学ならびに分子および細胞生物学の分野において使用される他の用語は、適用される分野の当業者によって一般に理解される。例えば、従来の技術は、組換えＤＮＡを調製するため、オリゴヌクレオチド合成を実施するためならびに組織培養および形質転換（例えば、電気穿孔法、トランスフェクションまたはリポフェクション）を実行するために使用され得る。酵素反応および精製技術は、製造者の仕様書に従って、または当技術分野において一般に達成される通り、また本明細書に記載される通り実施され得る。前述の技術および手順は、当技術分野において周知の従来の方法に従って、ならびに本明細書全体を通じて引用および考察される種々の一般的およびさらに具体的な参考文献に記載される通り、一般に実施され得る。例えば、任意の目的に関して引用することにより本明細書の一部をなすものとする、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい。具体的な定義が提供される場合を除いて、本明細書に記載される分析化学、合成有機化学ならびに医薬品化学および製薬化学の実験手順および技術との関連で利用される命名法は、当技術分野において周知であり、一般に使用されている。標準的技術は、化学合成、化学分析、医薬品調製、製剤および送達ならびに患者の処置のために使用され得る。
【００４５】
本明細書において使用される場合、用語「含んでいる」または「含む」は、所与の実施形態において示される組成物、方法およびこれらそれぞれの構成成分を参照して使用され、未指定の要素の含有にさらに開かれている。
【００４６】
本明細書において使用される場合、用語「から本質的になる」は、所与の実施形態のために必要な要素を指す。用語は、本開示の実施形態の基礎的および新規のまたは機能的特徴に実質的に影響を与えない追加的要素の存在を許容する。
【００４７】
用語「からなる」は、本明細書に記載される組成物、方法およびこれらそれぞれの構成成分を指し、実施形態の記載に列挙されていない要素を除外する。
【００４８】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」および「ｔｈｅ（その）」は、内容がそうでないと明確に示す場合を除いて複数の参照物を含む。したがって、例えば、「方法」を参照することは、本明細書に記載される種類のおよび／または本開示の読解において当業者に明らかになる、１つまたは複数の方法および／またはステップを含む。
【００４９】
種々の態様および実施形態は、続くサブセクションにおいてさらに詳細に記載される。
【００５０】
ＬＭＢＲ１Ｌ
リム領域１様（ＬＭＢＲ１Ｌ）は、９回膜貫通細胞表面タンパク質であり、本明細書において開示される通りＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫおよびＮＫ  Ｔ細胞を含むすべてのリンパ球系列の正常な機能のために必要である。ＬＭＢＲ１Ｌは、低分子分泌タンパク質、ヒトリポカリン（Liopcalin）−１（ＰＭＩＤ：２３９６４６８５）に対する受容体として同定された。ヒトＬＭＢＲ１Ｌの全長遺伝子配列は、長さ１４，９８５ｂｐである（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ番号ＮＣ＿００００１２．１２）。本開示に先立って、ＬＭＢＲ１Ｌタンパク質は、複数の先天性四肢奇形と遺伝的に関連付けられた。しかし、ヒトおよびマウス遺伝子座のさらなる研究は、ＬＭＢＲ１Ｌのイントロン内に位置する長い範囲のＳＨＨエンハンサーの破壊が原因で、四肢欠損との元来の関連は偶発的であったことを示した（Ｄｏｌｅｚａｌ，Ｄ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１５  Ｎｏｖ  １０；１１２（４５）：１３９２８−１３９３３）。本開示より前には、ＬＭＢＲ１Ｌの機能は明らかにされていなかった。
【００５１】
本明細書に記載される通り、表現型は、マウスにおけるすべてのリンパ球系列の細胞自律不全（ｃｅｌｌ  ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ  ｆａｉｌｕｒｅ）と関連してフォワードジェネティクススクリーニングにおいて検出された。原因となる変異は、免疫においてそれ以前に記載された機能を有さない９回貫通膜タンパク質をコードするＬｍｂｒ１ｌにおいて同定された。Ｔ細胞におけるＬＭＢＲ１Ｌ欠損は、Ｗｎｔ共受容体ｆｒｉｚｚｌｅｄ−６（ＦＺＤ６）および低密度リポタンパク質受容体−関連タンパク質６（ＬＲＰ６）の発現を増加させ、刺激でのＷｎｔ／β−カテニン経路およびアポトーシス性細胞死の異常な活性化を生じる。ＬＭＢＲ１Ｌとユビキチン関連ドメイン含有２（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ２）（ＵＢＡＣ２）および糖タンパク質７８（ＧＰ７８）との相互作用は、小胞体内のユビキチン化を通じてＦＺＤ６およびＬＲＰ６の成熟を妨げることによってリンパ球におけるＷｎｔシグナル伝達の下方制御をもたらす。したがって、本開示は、Ｗｎｔ／β−カテニン経路の負の制御因子として作用する、リンパ球新生およびリンパ系の活性化の際のＬＭＢＲ１Ｌについて不可欠な機能を証明する。
【００５２】
また、本明細書においてＬＭＢＲ１Ｌ相互作用タンパク質も開示される。４個のタンパク質は、ユビキチン関連ドメイン含有２（ＵＢＡＣ２）、移行型小胞体ＡＴＰａｓｅ（ＴＥＲＡ、ＶＣＰとして知られている）、ＵＢＸドメイン含有タンパク質８（ＵＢＸＤ８、ＦＡＦ２として知られている）および糖タンパク質７８（ＧＰ７８；ＡＭＦＲとして知られている）を含む、小胞体関連分解（ＥＲＡＤ）経路の不可欠な構成成分である。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の構成成分も、ジンクおよびリングフィンガー３（ＺＮＲＦ３）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）、β−カテニン、グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３α（ＧＳＫ３α）およびＧＳＫ３βを含む推定ＬＭＢＲ１Ｌ相互作用物質として本明細書において同定されている。追加的分析は、ＬＭＢＲ１ＬがＷｎｔおよびＥＲＡＤ構成成分それぞれと相互作用することを確認し（図３Ｂおよび１３）、ＬＭＢＲ１Ｌが、ＥＲＡＤおよびＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の重要な構成成分である可能性があることを示唆している。実際に、ＬＭＢＲ１Ｌは、本明細書においてＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の新規の負の制御因子として同定された。ＬＭＢＲ１Ｌは、ＧＰ７８−ＵＢＡＣ２複合体中に存在し、ＥＲ内でＷｎｔ共受容体成熟を阻害することによってＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を減弱する。
【００５３】
本明細書における知見は、リンパ球においてＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を制御する、以前は認識されていなかった経路の存在を実証する。Ｔ細胞の過剰なアポトーシスは、ＬＭＢＲ１Ｌ欠損マウスにおいてＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の異常な活性化から生じるリンパ球減少症をもたらす。ＬＭＢＲ１Ｌの非存在下で、Ｗｎｔ共受容体の成熟形態は、高度に上方制御され、分解複合体の構成成分は下方制御される。これらの変化は、核に侵入し、ｃ−Ｍｙｃ、ｐ５３およびＣＤ４４などの標的遺伝子の転写を促進するβ−カテニンの蓄積に寄与する。このシグナル伝達カスケードは、内在性および外因性のカスパーゼカスケード依存性の様式でアポトーシスを支持する。
【００５４】
このように、ＬＭＢＲ１Ｌを阻害することによって、免疫抑制は達成され得る。これは、対象の免疫系が過活動である疾患または状態を処置するために特に有用である。ＬＭＢＲ１Ｌを阻害し、それにより免疫系が過剰または過活動である状態を有する対象において免疫応答を低減または抑制するための組成物も提供される。組成物は、本明細書に開示される１つまたは複数の抗ＬＭＢＲ１Ｌ抗体またはその抗原結合性断片を含み得る。一部の実施形態では、小分子化合物などの他のＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤もＬＭＢＲ１Ｌの１つまたは複数の活性を阻害するために使用され得る。
【００５５】
さらに、ＬＭＢＲ１Ｌ欠損は、以前は明らかにされていなかった汎リンパ系免疫不全障害における潜在的な原因として示された。したがって、免疫不全障害を処置するための組成物および方法は、ＬＭＢＲ１Ｌをコードする導入遺伝子などの核酸（ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）を、それを必要とする対象に導入することを含み得る。
【００５６】
ＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤およびその使用
ＬＭＢＲ１Ｌの阻害は、炎症性疾患、移植片対宿主病、同種移植片拒絶または自己免疫疾患（例えば、橋本甲状腺炎、グレーブス病、Ｉ型インスリン依存性糖尿病、関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症（ＭＳ））などの免疫系が過剰または過活動である状態を有する対象において免疫応答を低減または抑制できる。このように、ＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤は、免疫抑制療法において有効な薬剤として使用され得る。理論に束縛されることなく、ＬＭＢＲ１Ｌ欠損または阻害が、Ｔ細胞などのリンパ球のアポトーシス、および自己抗体（例えば、ｄｓＤＮＡ−特異的ＩｇＧ）の産生などの自己免疫応答の阻害をもたらし得ると考えられる。ＬＭＢＲ１Ｌは、Ｗｎｔ／β−カテニン経路の負の制御因子として作用し、リンパ球新生およびリンパ系活性化の際の不可欠な機能を有する。
【００５７】
種々のＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤は、本開示に含まれる。例として、例えば、ウエスタンブロット分析またはＺＮＲＦ３、ＦＲＩＺＺＬＥＤ−６、β−カテニンおよび／もしくはｃ−Ｍｙｃ発現アッセイにおいて測定される、ＬＭＢＲ１Ｌに結合でき、その活性を阻害または減少させる小分子阻害剤および生物学的薬剤（例えば、抗体）などの化学物質が挙げられる。Ｌｍｂｒ１ｌ遺伝子またはその制御配列を標的化するように特異的に設計されている、干渉ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）および遺伝子編集／サイレンシングツール（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ）などの、Ｌｍｂｒ１ｌ遺伝子発現レベルを制御する薬剤も含まれる。
【００５８】
一部の実施形態では、細胞と試験剤とを接触させることを含み得る、ＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤を同定するための方法が提供され、試験剤と接触していない対照細胞と比較したＦＲＩＺＺＬＥＤ−６、β−カテニン、および／もしくはｃ−Ｍｙｃの発現の増加、ならびに／またはＺＮＲＦ３の発現の減少が、試験剤がＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤であることを示す。
【００５９】
一部の実施形態では、ＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤は、ＬＭＢＲ１Ｌを発現する細胞の増殖の少なくとも部分的な阻害（例えば、対照と比較して少なくとも１０％まで）によって特徴付けられ得る。
【００６０】
ある特定の実施形態では、ＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤は、抗ＬＭＢＲ１Ｌ抗体、例えば、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片である。ある特定の実施形態では、抗ＬＭＢＲ１Ｌ抗体は、改変抗体、例えば、マウス抗ＬＭＢＲ１Ｌ抗体由来のキメラまたはヒト化抗体であり得る。改変抗体を作製するための方法は、当技術分野において知られている。一部の実施形態では、抗ＬＭＢＲ１Ｌ抗体は、ヒトＬＭＢＲ１Ｌタンパク質に存在するエピトープ、例えば、細胞外外部ドメイン、またはその一部に結合する抗体またはその抗原結合性断片である。
【００６１】
さらに別の実施形態では、抗ＬＭＢＲ１Ｌ抗体などのＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤は、ＬＭＢＲ１Ｌの異なるエピトープにそれぞれ結合する２つ以上の抗ＬＭＢＲ１Ｌ抗体の混合物またはカクテルを含み得る。一実施形態では、混合物またはカクテルは、ＬＭＢＲ１Ｌ上の異なるエピトープにそれぞれ結合する３種の抗ＬＭＢＲ１Ｌ抗体を含む。
【００６２】
別の実施形態では、ＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤は、ＬＭＢＲ１Ｌの発現または活性を阻害するＲＮＡ分子などの核酸分子を含み得る。ＬＭＢＲ１Ｌの発現および／または活性を特異的に阻害するｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡなどの、ＬＭＢＲ１Ｌに特異的な干渉ＲＮＡは、当技術分野において知られる方法により設計され得る。
【００６３】
一態様では、炎症性疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病または同種移植片拒絶、などの免疫系が過剰または過活動である状態を有する対象において免疫応答を低減または抑制する医薬の製造のためのＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤の使用が提供される。別の態様では、炎症性疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病または同種移植片拒絶などの免疫系が過剰または過活動である状態を有する患者において免疫応答を抑制する方法が提供され、方法は、ＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤の有効量を患者に投与することを含む。
【００６４】
抗ＬＭＢＲ１Ｌ抗体の調製
抗ＬＭＢＲ１Ｌ抗体は、当技術分野において一般に知られている種々の方法を使用して作製され得る。例えば、ファージディスプレイ技術は、治療用の完全ヒトモノクローナル抗体を産生するためにヒト抗体ライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。高親和性結合剤は、中和研究のための候補と見なされ得る。代替的に、マウスまたはウサギがヒトタンパク質を用いて免疫処置され、候補結合剤が同定および試験され、ヒト抗体をコードする配列に重鎖および軽鎖を組み合わせる部位を移植することによって最終的にヒト化抗体が産生される、従来のモノクローナルアプローチが使用され得る。
【００６５】
典型的には抗体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対を含み、各対は、１つの全長「軽」鎖（典型的には、約２５ｋＤａの分子量を有する）および１つの全長「重」鎖（典型的には、約５０〜７０ｋＤａの分子量を有する）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、典型的には抗原認識に関与する約１００から１１０またはこれを超えるアミノ酸の可変領域を典型的には含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能に関与する定常領域を典型的には画定する。重鎖および軽鎖のそれぞれの可変領域は、相補性決定領域またはＣＤＲとも称される３個の高頻度可変領域によって接続された４個の比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）を含む同じ一般構造を典型的には示す。典型的には各対の２本の鎖由来のＣＤＲはフレームワーク領域によってアラインされ、そのアラインメントが特定のエピトープへの結合を可能にする。Ｎ末端からＣ末端に、軽鎖および重鎖可変領域の両方が、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４ドメインを典型的には含む。各ドメインへのアミノ酸の帰属は、Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８７  ａｎｄ  １９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．），Ｃｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７またはＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３）の定義に典型的には従う。
【００６６】
抗体は、モノクローナル抗体の開発で医薬品として有用で、興味の対象になった。モノクローナル抗体は、培養物中で連続細胞株によって抗体分子を産生する任意の方法を使用して産生される。モノクローナル抗体を調製するために好適な方法の例は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７）のハイブリドーマ法ならびにヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ，１９８４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１；およびＢｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．５１−６３）を含む。
【００６７】
モノクローナル抗体は、治療法としての使用のために改変され得る。一例は、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種由来または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同性である一方で、鎖（複数可）の残部が、別の種由来または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同性である、「キメラ」抗体である。他の例は、所望の生物学的活性を示す限り、このような抗体の断片である。米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５を参照されたい。関連する開発は、抗体が特定の種由来のまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む一方で、抗体鎖（複数可）の残部が別の種由来または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同性である、「ＣＤＲ移植」抗体である。
【００６８】
別の開発は、「ヒト化」抗体である。非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当技術分野において周知である（米国特許第５，５８５，０８９号および第５，６９３，７６２号を参照されたい；ラマ抗体のヒト化についてＣｅｃｉｌｅ  Ｖｉｎｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００９；２８４：３２７３−３２８４も参照されたい）。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト動物によって産生され、次いである特定のアミノ酸残基、典型的には、抗体の非抗原認識部分が、対応するアイソタイプのヒト抗体中の前記残基に相同性であるように改変される。ヒト化は、例えば、当技術分野において記載される方法（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６）を使用して、げっ歯類可変領域の少なくとも一部をヒト抗体の対応する領域に関して置換することによって、実施され得る。
【００６９】
ヒトへの抗原の曝露を行わないヒト抗体（「完全ヒト抗体」）が近年開発された。内在性マウス免疫グロブリン産生の非存在下で、ヒト抗体のレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を使用して、このような抗体は、抗原（典型的には、少なくとも６近接アミノ酸を有する）、任意選択で担体にコンジュゲートされている、を用いた免疫処置によって産生される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１−２５５５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８；およびＢｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３を参照されたい。これらの方法の一例では、トランスジェニック動物は、マウス重および軽免疫グロブリン鎖をコードしている内在性マウス免疫グロブリン遺伝子座を無能力化し、ヒト重鎖および軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座をそのゲノムに挿入することによって産生される。すべてではない改変を有する部分的に改変された動物は、次に、すべての所望の免疫系改変を有する動物を得るために交雑される。これらのトランスジェニック動物は、免疫原を投与されると、可変領域を含んでこれらの抗原に免疫特異的で、ヒト（マウスではなく）アミノ酸配列を有する抗体を産生する。引用することにより本明細書の一部をなすものとするＰＣＴ公開第ＷＯ９６／３３７３５号および第ＷＯ９４／０２６０２号を参照されたい。追加的な方法は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする米国特許第５，５４５，８０７号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／１０７４１号、第ＷＯ９０／０４０３６号ならびにＥＰ５４６０７３Ｂ１およびＥＰ５４６０７３Ａ１に記載されている。ヒト抗体は、本明細書に記載される通り、宿主細胞における組換えＤＮＡの発現によって、またはハイブリドーマ細胞における発現によっても産生され得る。
【００７０】
一部の実施形態では、ファージディスプレイ技術は、治療用抗体をスクリーニングするために使用され得る。ファージディスプレイでは、抗体レパートリーは、糸状バクテリオファージの表面に提示され、構築されたライブラリーは、免疫原に結合するファージについてスクリーニングされ得る。抗体ファージは、バクテリオファージの遺伝子工学ならびに抗原ガイド選択（ａｎｔｉｇｅｎ−ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）およびファージ増殖の反復ラウンドに基づく。本技術は、ＬＭＢＲ１Ｌモノクローナル抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択を可能にする。ファージディスプレイプロセスは、抗体ライブラリー調製で始まり、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）ＰＣＲ産物のファージディスプレイベクターへのライゲーションが続き、結果的にモノクローナル抗体のクローンの分析になる。抗体レパートリーを表すＶＨおよびＶＬ  ＰＣＲ産物は、Ｍ１３バクテリオファージに元は由来した大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の糸状バクテリオファージのｐＩＩＩマイナーカプシドタンパク質に融合されたｓｃＦｖとしてＶＨおよびＶＬを発現するために操作される、ファージディスプレイベクター（例えば、ファージミドｐＣｏｍｂ３Ｘ）にライゲーションされる。しかし、ファージディスプレイベクターｐＣｏｍｂ３Ｘは、大腸菌において完全なバクテリオファージをコードするために必要な他の遺伝子をすべては有していない。これらの遺伝子のために、ファージディスプレイベクターライブラリーを用いて形質転換される大腸菌にヘルパーファージが加えられる。それぞれ、その表面にＬＭＢＲ１Ｌモノクローナル抗体を発現し、それぞれのヌクレオチド配列をその中に有するベクターを保有しているファージのライブラリーが生じる。ファージディスプレイは、ある特定の株の大腸菌においてＬＭＢＲ１Ｌモノクローナル抗体それ自体（ファージカプシドタンパク質に付着していない）を産生するためにも使用され得る。ファージディスプレイベクター中の追加的ｃＤＮＡは、産生されるｍＡｂの特徴付けおよび精製を可能にするためにＶＬおよびＶＨ配列の後で操作される。具体的には、組換え抗体は、溶液からの容易な精製を可能にするためにヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープタグおよびポリヒスチジンを有し得る。
【００７１】
多様な抗体ファージライブラリーは、ヘルパーファージを感染させた約１０８個の独立した大腸菌形質転換体から産生される。バイオパニングを使用して、ライブラリーは、モノクローナル抗体の表面発現を通じて、上に列挙される免疫原配列またはその断片に結合するファージについてスクリーニングされ得る。周期的なパニングは、潜在的に非常にまれな抗原結合クローンを引き出すことを可能にし、大腸菌中のファージ結合剤の、抗原（ＥＬＩＳＡプレートに固定されている、または細胞表面で溶液中）へのファージ結合、洗浄、溶出および再増幅の複数ラウンドからなる。各ラウンドの際に、特異的結合剤は非結合剤を洗浄除去し、結合ファージクローンを選択的に溶出することによってプールから選択される。３または４回後、それらの表面ＬＭＢＲ１Ｌモノクローナル抗体を通じたファージクローンの高度に特異的な結合は、固定された免疫原での方向付けられた選択に特徴的である。
【００７２】
別の方法は、親和性クロマトグラフィーによる精製のために好適なＣ末端Ｈｉｓタグを上に列挙された免疫原配列に加えることである。精製されたタンパク質は、好適なアジュバントと共にマウスに接種され得る。ハイブリドーマにおいて産生されたモノクローナル抗体は、免疫原への結合について試験されてよく、陽性結合剤は、本明細書のアッセイにおいて記載される通りスクリーニングされてよい。
【００７３】
完全ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーからも産生され得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１；およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１に開示される通り）。これらのプロセスは、糸状バクテリオファージの表面での抗体レパートリーの提示、および選択した抗原へのそれらの結合によるファージの続く選択を通じて免疫選択を模倣する。１つのこのような技術は、引用することにより本明細書の一部をなすものとするＰＣＴ公開第ＷＯ９９／１０４９４号に記載されており、このようなアプローチを使用したＭＰＬ−およびｍｓｋ−受容体についての高親和性および機能性アゴニスト性抗体の単離を記載している。
【００７４】
一部の実施形態では、ヒトＬＭＢＲ１Ｌの細胞外ドメインは、免疫原として使用され得る。ヒトＬＭＢＲ１Ｌは、５個の細胞外ドメインを有する（図１Ｂ）。これらの細胞外ドメインは、
（１）ＭＥＡＰＤＹＥＶＬＳＶＲＥＱＬＦＨＥＲＩＲ（配列番号５）；
（２）ＳＮＥＶＬＬＳＬＰＲＮＹＹＩＱＷＬＮＧＳＬＩＨＧＬＷＮ（配列番号６）；
（３）ＶＤＫＮＫＡＮＲＥＳＬＹＤＦＷＥＹＹＬＰＹ（配列番号７）；
（４）ＤＥＡＡＭＰＲＧＭＱＧＴＳＬＧＱＶＳＦＳＫＬＧＳ（配列番号８）；および
（５）ＳＲＴＬＧＬＴＲＦＤＬＬＧＤＦＧＲＦＮＷＬＧ（配列番号９）
を含む。
【００７５】
ヒトＬＭＢＲ１Ｌ細胞外ドメインの断片または部分は、免疫原としても使用され得る。モノクローナル抗体は、１つまたは複数の免疫原を使用して産生され得る。有望な治療用抗ＬＭＢＲ１Ｌ抗体が生成され得る。
【００７６】
一例では、マウスＬｍｂｒ１ｌ遺伝子にノックされたヒトＬＭＢＲ１Ｌの１つまたは複数の細胞外ドメインを有するマウスモデルおよびヒトＴ細胞（Ｊｕｒｋａｔまたはヒトドナー由来初代Ｔ細胞）を使用して、ノックアウト変異を表現型コピーしたモノクローナル抗体は、有望な抗ＬＭＢＲ１Ｌ抗体候補として試験および同定され得る。ノックアウト変異を表現型コピーしたモノクローナル抗体は、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋）、Ｂ細胞、ＮＫおよび／またはＮＫ  Ｔ細胞の数の低減などの表現型を提示できる。このような試験として、例えば、ウエスタンブロットで検出されるＦＲＩＺＺＬＥＤ−６、ＺＮＲＦ３、β−カテニンおよび／またはｃ−Ｍｙｃタンパク質発現の増大などのエンドポイント（複数可）のスクリーニングが挙げられる。スクリーニング後、完全ヒトモノクローナル抗体は前臨床試験のために、生じさせることができ、次いでヒト臨床治験において安全性および有効性について試験され得る。このような抗体は、炎症性疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病もしくは同種移植片拒絶などの免疫系が過剰または過活動である状態を有する対象において免疫応答を低減もしくは抑制できる、および／または免疫抑制療法を改善できる（例えば、リンパ球の数を減少させることによって）臨床的候補であり得る。
【００７７】
上記抗体をコードするヌクレオチド配列は、決定され得る。その後、キメラ、ＣＤＲ移植、ヒト化および完全ヒト抗体は、組換え法によっても産生され得る。抗体をコードする核酸は、当技術分野において一般に知られている材料および手順を使用して宿主細胞に導入および発現され得る。
【００７８】
本開示は、ＬＭＢＲ１Ｌに対する１つまたは複数のモノクローナル抗体を提供する。好ましくは、抗体は、ヒトＬＭＢＲ１Ｌの１つもしくは複数の細胞外ドメインまたはその断片に結合する。好ましい実施形態では、本開示は、重鎖および軽鎖免疫グロブリン分子、特にそれらの可変領域に対応する配列をコードするヌクレオチド配列およびそれを含むアミノ酸配列を提供する。好ましい実施形態では、ＣＤＲ、具体的には、ＣＤＲ１からＣＤＲ３に対応する配列が提供される。追加的な実施形態では、本開示は、このような免疫グロブリン分子を発現するハイブリドーマ細胞株およびそれから産生されるモノクローナル抗体、好ましくは、ヒトＬＭＢＲ１Ｌに対する精製されたヒトモノクローナル抗体を提供する。
【００７９】
本開示の抗ＬＭＢＲ１Ｌ抗体の軽鎖および重鎖可変領域のＣＤＲは、同じまたは別の種由来のフレームワーク領域（ＦＲ）に移植され得る。ある特定の実施形態では、抗ＬＭＢＲ１Ｌ抗体の軽鎖および重鎖可変領域のＣＤＲは、コンセンサスヒトＦＲに移植され得る。コンセンサスヒトＦＲを創出するために、数個のヒト重鎖または軽鎖アミノ酸配列由来のＦＲは、コンセンサスアミノ酸配列を同定するためにアラインされる。抗ＬＭＢＲ１Ｌ抗体重鎖または軽鎖のＦＲは、異なる重鎖または軽鎖由来のＦＲを用いて置き換えられ得る。抗ＬＭＢＲ１Ｌ抗体の重鎖および軽鎖のＦＲ中のまれなアミノ酸は、典型的には置き換えられない一方で、残りのＦＲアミノ酸は、置き換えられる場合がある。まれなアミノ酸は、ＦＲ中で通常見出されない位置にある特定のアミノ酸である。本開示の抗ＬＭＢＲ１Ｌ抗体から移植された可変領域は、抗ＬＭＢＲ１Ｌ抗体の定常領域とは異なる定常領域と共に使用され得る。代替的に、移植された可変領域は１本鎖Ｆｖ抗体の一部である。ＣＤＲ移植は、任意の目的のため引用することにより本明細書の一部をなすものとする、例えば、米国特許第６，１８０，３７０号、第５，６９３，７６２号、第５，６９３，７６１号、第５，５８５，０８９号および第５，５３０，１０１号に記載されている。
【００８０】
一部の実施形態では、本開示の抗体は、ハイブリドーマ株によって産生され得る。これらの実施形態では、本開示の抗体は、ＬＭＢＲ１Ｌにおよそ４ｐＭから１μＭの間の解離定数（Ｋｄ）で結合する。本開示のある特定の実施形態では、抗体は、ＬＭＢＲ１Ｌに約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満または約１０ｎＭ未満のＫｄで結合する。
【００８１】
好ましい実施形態では、本開示の抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４アイソタイプのものであり、ＩｇＧ１アイソタイプが最も好ましい。本開示の好ましい実施形態では、抗体は、ヒトカッパ軽鎖およびヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４重鎖を含む。具体的な実施形態では、抗体の可変領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４アイソタイプについての定常領域以外の定常領域にライゲーションされる。ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、哺乳動物細胞における発現のためにクローニングされた。
【００８２】
代替的実施形態では、本開示の抗体は、ハイブリドーマ細胞株以外の細胞株において発現され得る。これらの実施形態では、具体的な抗体をコードする配列は、好適な哺乳動物宿主細胞の形質転換のために使用され得る。これらの実施形態により、形質転換は、例えば、ポリヌクレオチドをウイルスに（または、ウイルスベクターに）パッケージングし、宿主細胞にウイルス（もしくはベクター）を形質導入すること、または当技術分野において知られているトランスフェクション手順によるものを含む、宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための任意の知られている方法を使用して達成され得る。このような手順は、米国特許第４，３９９，２１６号、第４，９１２，０４０号、第４，７４０，４６１号および第４，９５９，４５５号（すべて、任意の目的のために引用することにより本明細書の一部をなすものとする）によって例示される。一般に、使用される形質転換手順は、形質転換される宿主に依存する場合がある。異種性ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に導入するための方法は、当技術分野において周知であり、これだけに限らないが、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔法、リポソーム中へのポリヌクレオチド（複数可）の封入および核へのＤＮＡの直接微量注入が挙げられる。
【００８３】
本開示の方法のある特定の実施形態により、本開示のＬＭＢＲ１Ｌ抗体の重鎖定常領域、重鎖可変領域、軽鎖定常領域または軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする核酸分子は、標準的ライゲーション技術を使用して適切な発現ベクターに挿入される。好ましい実施形態では、ＬＭＢＲ１Ｌ重鎖または軽鎖定常領域は、適切な可変領域のＣ末端に付加され、発現ベクターにライゲーションされる。ベクターは、使用される具体的な宿主細胞において機能性である（すなわち、ベクターが、遺伝子の増幅および／または遺伝子の発現が生じ得るように、宿主細胞機構に適合性である）ように、典型的には選択される。発現ベクターの概説について、Ｇｏｅｄｄｅｌ（ｅｄ．），１９９０，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｖｏｌ．１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．Ｎ．Ｙ．を参照されたい。
【００８４】
典型的には、任意の宿主細胞において使用される発現ベクターは、プラスミドの維持のため、ならびに外来性ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための配列を含有し得る。このような配列は、プロモーター、１つもしくは複数のエンハンサー配列、複製開始点、転写終結配列、ドナーおよびアクセプタースプライス部位を含有する完全イントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコードしている核酸を挿入するためのポリリンカー領域ならびに選択可能マーカーエレメント、の１つまたは複数のヌクレオチド配列を典型的には含む。これらの配列は、当技術分野において周知である。
【００８５】
本開示の発現ベクターは、商業的に入手できるベクターなどの出発ベクターから構築されてもよい。このようなベクターは、所望の隣接配列のすべてを含有してもしなくてもよい。本明細書に記載される隣接配列の１つまたは複数がベクターにまだ存在しない場合、それらは、個々に得られ、ベクターにライゲートされてもよい。それぞれの隣接配列を得るために使用される方法は、当業者に周知である。
【００８６】
ベクターが構築され、抗ＬＭＢＲ１Ｌ抗体を含む軽鎖もしくは重鎖または軽鎖および重鎖をコードする核酸分子がベクターの適切な位置に挿入された後、完成したベクターは、増幅および／またはポリペプチド発現のために好適な宿主細胞に挿入され得る。抗ＬＭＢＲ１Ｌ抗体についての発現ベクターの選択された宿主細胞への形質転換は、トランスフェクション、感染、リン酸カルシウム共沈殿、電気穿孔法、微量注入、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクションまたは他の知られている技術が挙げられる周知の方法によって達成され得る。選択された方法は、一部は、使用される宿主細胞の種類の機能である。これらの方法および他の好適な方法は、当業者に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，上記に記載されている。
【００８７】
適切な条件下で培養される場合、宿主細胞は、抗ＬＭＢＲ１Ｌ抗体を合成し、続いてそれは、培養培地から（宿主細胞がそれを培地に分泌する場合）またはそれを産生する宿主細胞から直接（分泌されない場合）収集され得る。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性のために望ましいまたは必要であるポリペプチド修飾（グリコシル化またはリン酸化など）および生物学的に活性な分子へのフォールディングの容易さなどの種々の要因に依存する。
【００８８】
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当技術分野において周知であり、これに限定されないがチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）および多数の他の細胞株が挙げられるＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多数の不死化細胞株をこれだけに限らないが含む。ある特定の実施形態では、どの細胞株が高発現レベルを有し、構成的なＬＭＢＲ１Ｌ結合特性を有する抗体を産生するのかを決定することによって細胞株を選択できる。別の実施形態では、それ自体の抗体を作製しないが、異種性抗体を作製および分泌する能力を有するＢ細胞系列（例えば、マウス骨髄腫細胞株ＮＳ０およびＳＰ２／０）から細胞株を選択できる。
【００８９】
医薬組成物およびその使用
別の態様では、本明細書において開示される方法において使用され得る医薬組成物、すなわち、炎症性疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病もしくは同種移植片拒絶などの免疫系が過剰もしくは過活動である状態を有する対象において免疫応答を低減するもしくは抑制する、および／または免疫抑制療法を改善する（例えば、リンパ球の数を減少させることによって）ための医薬組成物が提供される。
【００９０】
一部の実施形態では、医薬組成物は、ＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤および薬学的に許容される担体を含む。ＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤は、薬学的に許容される担体と共に医薬組成物に製剤化され得る。追加的に、医薬組成物は、例えば、免疫系が過活動である状態を有する対象において免疫応答を低減するもしくは抑制する、および／または免疫抑制療法を改善するための患者の処置のための組成物の使用のための説明書を含み得る。
【００９１】
一実施形態では、ＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤は、抗ＬＭＢＲ１Ｌ抗体またはその抗原結合性断片であってよい。
【００９２】
本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、生理学的適合性である任意のおよびすべての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤、緩衝剤ならびに他の賦形剤を含む。好ましくは、担体は、非経口、経口または局所投与のために好適である。投与の経路に依存して、活性化合物、例えば小分子または生物学的製剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃ  ａｇｅｎｔ）は、酸および化合物を不活性化する可能性がある他の天然条件の作用から化合物を保護するために材料でコーティングされ得る。
【００９３】
薬学的に許容される担体として、滅菌水溶液または分散剤および滅菌注射可能な溶液または分散剤の即時調製のための滅菌粉剤、ならびに錠剤、丸剤、カプセルなどの調製のための従来の賦形剤が挙げられる。薬学的活性物質の製剤化のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野において知られている。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、本明細書において提供される医薬組成物におけるその使用は、適合性である。補助的活性化合物も組成物に組み入れられ得る。
【００９４】
薬学的に許容される担体として、薬学的に許容される抗酸化物質が挙げられる。薬学的に許容される抗酸化物質の例として、（１）水溶性抗酸化物質、例えば、アルコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、二亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；（２）油溶性抗酸化物質、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、プロピルガレート、アルファトコフェロールなど；および（３）金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが挙げられる。
【００９５】
本明細書において提供される医薬組成物において使用され得る好適な水性および非水性担体の例は、水、エタノール、ポリオール（グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）およびこれらの好適な混合物ならびに注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルを含む。必要に応じて、適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材の使用によって、分散剤の場合は必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。多くの場合に、等張剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを組成物中に含むことは有用である場合がある。注射可能な組成物の吸収の延長は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含むことによってもたらされ得る。
【００９６】
これらの組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などの機能的賦形剤も含有する場合がある。
【００９７】
治療用組成物は、典型的には、滅菌、非系統学的（non-phylogenic）ならびに製造および保存の条件下で安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロ乳剤、リポソームまたは高い薬物濃度に好適な他の秩序構造として製剤化され得る。
【００９８】
滅菌注射可能な溶液は、活性化合物を必要に応じて上に列挙した成分の１つまたは組合せを含んで適切な溶媒中に必要な量で組み入れることに続いて、滅菌、例えば精密濾過によって調製され得る。一般に分散剤は、活性化合物を、基本的な分散媒および上に列挙したものから必要な他の成分を含有する滅菌媒体に組み入れることによって調製される。滅菌注射可能な溶液の調製のための滅菌粉剤の場合では、調製方法として、あらかじめ滅菌濾過された溶液から活性成分に加えて任意の追加的な所望の成分の粉剤をもたらす、真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）が挙げられる。活性剤（複数可）は、滅菌状態下で追加的な薬学的に許容される担体（複数可）と、および任意の保存剤、緩衝剤または必要に応じて噴霧剤と混合され得る。
【００９９】
微生物の存在の予防は、上記の滅菌手順によって、ならびに種々の抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの含有によっての両方で確実にされ得る。糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に含むことが望ましい場合もある。加えて、注射可能な薬学的形態の持続的な吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤の含有によってもたらされ得る。
【０１００】
ＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤を含む医薬組成物は、単独または組合せ療法で投与され得る。例えば、組合せ療法は、ＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤および当技術分野において知られており、下でさらに詳細に考察される１つまたは複数の化学療法剤などの少なくとも１つまたは複数の追加的治療剤を含む本明細書において提供される組成物を含み得る。医薬組成物は、放射線療法および／または手術と併せて投与されてもよい。
【０１０１】
投薬レジメンは、最適な望ましい応答（例えば、治療応答）をもたらすように調整される。例えば、単一ボーラスは投与されてよく、数回に分けられた用量が経時的に投与されてよく、または用量は、治療の状況の緊急性によって示される通り比例的に低減もしくは増加されてもよい。
【０１０２】
抗体の投与についての例示的な投薬量範囲は、１０〜１０００ｍｇ（抗体）／ｋｇ（患者の体重）、１０〜８００ｍｇ／ｋｇ、１０〜６００ｍｇ／ｋｇ、１０〜４００ｍｇ／ｋｇ、１０〜２００ｍｇ／ｋｇ、３０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、３０〜８００ｍｇ／ｋｇ、３０〜６００ｍｇ／ｋｇ、３０〜４００ｍｇ／ｋｇ、３０〜２００ｍｇ／ｋｇ、５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、５０〜８００ｍｇ／ｋｇ、５０〜６００ｍｇ／ｋｇ、５０〜４００ｍｇ／ｋｇ、５０〜２００ｍｇ／ｋｇ、１００〜１０００ｍｇ／ｋｇ、１００〜９００ｍｇ／ｋｇ、１００〜８００ｍｇ／ｋｇ、１００〜７００ｍｇ／ｋｇ、１００〜６００ｍｇ／ｋｇ、１００〜５００ｍｇ／ｋｇ、１００〜４００ｍｇ／ｋｇ、１００〜３００ｍｇ／ｋｇおよび１００〜２００ｍｇ／ｋｇを含む。例示的な投薬スケジュールとして、３日に１回、５日に１回、７日に１回（すなわち、１週間に１回）、１０日に１回、１４日に１回（すなわち、２週間に１回）、２１日に１回（すなわち、３週間に１回）、２８日に１回（すなわち、４週間に１回）および１カ月に１回が挙げられる。
【０１０３】
投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、非経口組成物を単位投与形態に製剤化することは、有利である場合がある。本明細書において使用される場合、単位投与形態は、処置される患者のための単位投薬量として適している物理的に分けられた単位を指し、各単位は、任意の必要な医薬用担体と併せて所望の治療効果を生じるように算出されたあらかじめ決められた量の活性剤を含有する。単位投与形態についての仕様は、（ａ）活性化合物の固有の特徴および達成される具体的な治療効果、ならびに（ｂ）個体での感受性の処置のための活性化合物の調剤技術に内在する制限、に応じて決定され、それに直接依存する。
【０１０４】
本明細書において開示される医薬組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、患者に毒性であることなく、具体的な患者、組成物および投与の様式について所望の治療応答を達成するために有効である活性成分の量を得るために変動する場合がある。投与の文脈で本明細書において使用される場合、「非経口」は、通常注射による、経腸的および局所投与以外の投与様式を意味し、非限定的に、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）ならびに注入が挙げられる。
【０１０５】
本明細書において使用される場合、句「非経口投与」および「非経口的に投与」は、通常注射または注入による、経腸的（すなわち、消化管を介する）および局所投与以外の投与様式を指し、非限定的に、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射ならびに注入が挙げられる。静脈内注射および注入は、しばしば（しかし、排他的ではなく）抗体投与のために使用される。
【０１０６】
本明細書において提供される薬剤が医薬としてヒトまたは動物に投与される場合、それらは単独または、例えば、０．００１から９０％（例えば、０．００５から７０％、例えば、０．０１から３０％）の活性成分を薬学的に許容される担体との組合せで含有する医薬組成物として与えられてよい。
【０１０７】
ある特定の実施形態では、免疫系が過剰もしくは過活動である状態を有する対象において免疫応答を低減するまたは抑制するため、および／または免疫抑制療法を改善する（例えば、リンパ球の数を減少させることによって）ための本明細書において提供される方法および使用は、ＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤およびＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤ではない少なくとも１つの追加的薬剤の投与を含み得る。
【０１０８】
一態様では、本開示による組合せの有効性の改善は、治療的相乗効果を達成することによって実証され得る。
【０１０９】
用語「治療的相乗効果」は、所与の用量での２つの産物の組合せが、同じ用量での２つの産物単独のそれぞれの最良よりもさらに効果的である場合に使用される。一例では、治療的相乗効果は、パラメーター、腫瘍体積について反復測定（例えば、時間的要因）を用いた二元配置分散分析から得られる概算を使用して、組合せを最良の単一の薬剤と比較することによって評価され得る。
【０１１０】
用語「相加的」は、所与の用量での２つ以上の産物の組合せが、２つ以上の産物それぞれを用いて得られた効果の合計と同等に有効である場合を指し、一方、用語「優加法的（ｓｕｐｅｒａｄｄｉｔｉｖｅ）」は、組合せが、２つ以上の産物それぞれを用いて得られる有効性の合計よりもさらに有効である場合を指す。
【０１１１】
免疫系が過活動である状態を有する対象において免疫応答を低減するまたは抑制するための組成物および方法が本明細書において開示される。方法は、それを必要とする対象においてＬＭＢＲ１Ｌを阻害することを含む。ある特定の実施形態では、ＬＭＢＲ１Ｌを阻害することは、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋）、Ｂ細胞、ＮＫおよび／またはＮＫ  Ｔ細胞の数を低減でき、それにより免疫抑制療法を提供する。ＬＭＢＲ１Ｌ阻害（例えば、抗ＬＭＢＲ１Ｌ抗体）は、例えば、対象におけるリンパ球の数を低減することによってスタンドアロン免疫抑制療法として使用され得る。一部の実施形態では、ＬＭＢＲ１Ｌ阻害は、他の治療と併せて使用され得る。
【０１１２】
種々の実施形態では、本明細書において開示される方法は、抗ＬＭＢＲ１Ｌ抗体またはその抗原結合性断片などのＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤の有効量を対象に投与することを含み得る。一般に有効量は、治療的および／または予防的に投与され得る。
【０１１３】
処置は、このようながんを罹患している、有する、罹患しやすいまたは発症するリスクがある対象、特にヒトに適切に投与され得る。これらの「リスクがある」対象の判定は、診断試験または対象もしくは医療提供者の所見（例えば、遺伝的試験、酵素またはタンパク質マーカー、家族歴など）による任意の客観的または主観的判定によって行われ得る。このような処置を必要とする対象を同定することは、対象または医療従事者の判断であってよく、主観的（例えば、所見）または客観的（例えば、試験もしくは診断法によって測定可能）であってよい。
【０１１４】
製剤の投与
これだけに限らないが、再構成されたおよび液体の製剤を含む本開示の製剤は、本明細書において開示されるＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤を用いた処置を必要とする哺乳動物、好ましくはヒトに、ボーラスなどの静脈内投与、または一定期間にわたる持続注入によって、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内（intracerobrospinal）、皮下、関節内、滑膜内（ｉｎｔｒａｓｙｎｏｖｉａｌ）、くも膜下腔内、経口、局所、または吸入経路によってなどの知られている方法により投与される。
【０１１５】
好ましい実施形態では、製剤は、哺乳動物に皮下投与によって（すなわち、皮膚の下に）投与される。このような目的のために、製剤は、シリンジを使用して注射され得る。しかし、製剤の投与のための他のデバイス、例えば、注射デバイス（例えば、ＩＮＪＥＣＴ−ＥＡＳＥ（商標）およびＧＥＮＪＥＣＴ（商標）デバイス）；注射ペン（ＧＥＮＰＥＮ（商標）など）；オートインジェクターデバイス、無針デバイス（例えば、ＭＥＤＩＪＥＣＴＯＲ（商標）およびＢＩＯＪＥＣＴＯＲ（商標））；ならびに皮下パッチ送達システムは利用可能である。
【０１１６】
具体的な実施形態では、本開示は、単一用量投与単位のためのキットを対象とする。このようなキットは単一または複数のチャンバーがあるあらかじめ充填されたシリンジを含む、治療用タンパク質または抗体の水性製剤の容器を含む。例示的なあらかじめ充填されたシリンジは、Ｖｅｔｔｅｒ  ＧｍｂＨ、Ｒａｖｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能である。
【０１１７】
タンパク質の適切な投薬量（「治療有効量」）は、例えば、処置される状態、状態の重症度および経過、タンパク質が予防的または治療的目的のために投与されるかどうか、以前の治療、患者の病歴およびＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤への応答、使用される製剤の形式ならびに主治医の判断に依存する。ＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤は、１回または処置の経過にわたって患者に適切に投与され、診断以降の任意の時期に患者に投与され得る。ＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤は、唯一の処置として、または課題の状態を処置することに有用な他の薬物もしくは治療と併せて投与され得る。
【０１１８】
ＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤について、開始候補投薬量は、患者への投与のために約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲であってよく、１つまたは複数に分かれた投与の形態をとる場合がある。しかし、他の投薬レジメンが有用である場合もある。このような治療の進行は、従来の技術によって容易にモニターされる。
【０１１９】
本開示のある特定の実施形態により、複数用量のＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤（または、ＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤および本明細書において述べられる任意の追加的な治療活性剤の組合せを含む医薬組成物）は、定められた時間経過にわたって対象に投与され得る。本開示の本態様による方法は、本開示の抗ＬＭＢＲ１Ｌ抗体などのＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤の複数用量を対象に連続的に投与することを含む。本明細書において使用される場合、「連続的に投与する」は、異なる時点、例えば、あらかじめ定められた期間（例えば、数時間、数日または数カ月）離された異なる日に、各用量のＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤が対象に投与されることを意味する。本開示は、患者に単一の初回用量のＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤に続いて、１つまたは複数の二次用量のＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤に続いて、任意選択で１つまたは複数の三次用量のＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤を連続的に投与することを含む方法を含む。ＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤は、０．１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇの間の用量で投与され得る。
【０１２０】
用語「初回用量」、「二次用量」および「三次用量」は、本開示のＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤の投与の時間的な連続を指す。したがって、「初回用量」は、処置レジメンの開始時に投与される用量（「ベースライン用量」とも称される）であり；「二次用量」は初回用量後に投与される用量であり；「三次用量」は、二次用量後に投与される用量である。初回、二次および三次用量は、すべて同じ量のＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤を含有する場合があるが、一般に、投与の頻度に関して互いに異なっている場合がある。しかし、ある特定の実施形態では、初回、二次および／または三次用量に含有されるＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤の量は、処置の経過の際に互いに変動する（例えば、上方にまたは下方に適切に調整される）。ある特定の実施形態では、２以上（例えば、２、３、４または５）の用量は、処置レジメンの開始時に「初回負荷量」として投与され、少ない頻度を基に投与される次の用量（例えば、「維持用量」）が続く。
【０１２１】
本開示のある特定の例示的実施形態では、二次および／または三次用量それぞれは、直前の用量の１から２６（例えば、１、１１／２、２、２１／２、３、３１／２、４、４１／２、５、５１／２、６、６１／２、７、７１／２、８、８１／２、９、９１／２、１０、１０１／２、１１、１１１／２、１２、１２１／２、１３、１３１／２、１４、１４１／２、１５、１５１／２、１６、１６１／２、１７、１７１／２、１８、１８１／２、１９、１９１／２、２０、２０１／２、２１、２１１／２、２２、２２１／２、２３、２３１／２、２４、２４１／２、２５、２５１／２、２６、２６１／２、またはこれを超える）週間後に投与される。本明細書において使用される場合、句「直前の用量」は、複数投与の連続において、介在する用量を伴わずに連続における次の用量の投与に先行して患者に投与される、ＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤の用量を意味する。
【０１２２】
本開示の本態様による方法は、患者にＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤の任意の数の二次および／または三次用量を投与することを含み得る。例えば、ある特定の実施形態では、単一の二次用量のみが患者に投与される。他の実施形態では、２以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８またはこれを超える）二次用量が患者に投与される。同様に、ある特定の実施形態では、単一の三次用量のみが患者に投与される。他の実施形態では、２以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８またはこれを超える）三次用量が患者に投与される。
【０１２３】
複数の二次用量を含む実施形態では、各二次用量は、他の二次用量と同じ頻度で投与され得る。例えば、各二次用量は、直前の用量の１から２週間または１から２カ月後に患者に投与され得る。同様に、複数の三次用量を含む実施形態では、各三次用量は、他の三次用量と同じ頻度で投与され得る。例えば、各三次用量は、直前の用量の２から１２週間後に患者に投与され得る。本開示のある特定の実施形態では、二次および／または三次用量が患者に投与される頻度は、処置レジメンの経過にわたって変動する場合がある。投与の頻度は、臨床検査後に個々の患者の必要に応じて医師によって処置の経過の際に調整され得る。
【０１２４】
本開示は、２から６回の初回負荷量が第１の頻度（例えば、１週間に１回、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、４週間ごとに１回、１カ月に１回、２カ月ごとに１回など）で患者に投与され、少ない頻度を基に患者への２回以上の維持用量の投与が続く投与レジメンを含む。例えば、本開示の態様により、初回負荷量が、例えば１カ月に１回の頻度で投与される場合（例えば、１カ月に１回投与される２、３、４またはこれを超える初回負荷量）、次いで維持用量は、患者に５週間ごとに１回、６週間ごとに１回、７週間ごとに１回、８週間ごとに１回、１０週間ごとに１回、１２週間ごとに１回など）投与され得る。
【０１２５】
治療的使用および方法
本明細書において開示される組成物（例えば、ＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤）は、例えば、免疫系が過剰または過活動応答を示す状態または疾患の処置が挙げられる多数の治療的有用性を有する。本開示は、炎症性疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病または同種移植片拒絶などの免疫系が過剰または過活動である状態を有する対象において免疫応答を低減するまたは抑制するための方法を特に提供する。例示的な方法は、例えば、免疫抑制療法を提供するために本明細書に記載されるいずれかのＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤の治療有効量を対象に投与することを含む。
【０１２６】
免疫抑制療法の例示的な適用例として、同種免疫疾患、自己免疫疾患、アレルギーおよび他の炎症性疾患が挙げられる。同種免疫疾患として、臓器移植片拒絶、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）（例えば、同種造血幹細胞移植後、ＨＳＣＴ）および同種幹細胞移植（ＳＣＴ）後ＧＶＨＤが挙げられる。
【０１２７】
自己免疫疾患は、免疫系が自分自身のタンパク質、細胞および組織を攻撃する疾患である。自己免疫疾患の包括的な表および概説は、Ｔｈｅ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（Ｒｏｓｅ  ａｎｄ  Ｍａｃｋａｙ，２０１４，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）に見出すことができる。処置され得る例示的な自己免疫疾患として、１型糖尿病、多発性硬化症、セリアック病、エリテマトーデス、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群、チャーグ・ストラウス症候群、橋本甲状腺炎、グレーブス病、特発性血小板減少性紫斑病、関節リウマチ（ＲＡ）、強直性脊椎炎、クローン病、皮膚筋炎、グットパスチャー症候群、ギランバレー症候群（ＧＢＳ）、混合性結合組織病、重症筋無力症、ナルコレプシー、尋常性天疱瘡、悪性貧血、乾癬、乾癬性関節炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、再発性多発軟骨炎、側頭動脈炎、潰瘍性大腸炎、血管炎およびウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。
【０１２８】
炎症性疾患は、炎症によって特徴付けられる多数の障害および状態を広く定義するために使用され得る。例として、とりわけ、アレルギー、喘息、自己免疫疾患、セリアック病、糸球体腎炎、肝炎、炎症性腸疾患、関節リウマチ、ループス、再灌流傷害、移植片拒絶、アジソン病、円形脱毛症、ジストロフィーの表皮水疱症、精巣上体炎、血管炎、白斑、粘液水腫、悪性貧血および潰瘍性大腸炎が挙げられる。炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、２つの主な種類、すなわちクローン病（ＣＤ）および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）を含む。
【実施例】
【０１２９】
実施された実験および達成された結果を含む以下の実施例は、例示のみを目的として提供されており、本開示を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１３０】
［実施例１］
ＬＭＢＲ１Ｌは、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達によるリンパ球新生を制御する
要約：免疫系の発達には、Ｗｎｔシグナル伝達の正確な統御が必要である。本明細書では、リム領域１様（Ｌｍｂｒ１ｌ）にＮ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア誘導変異が引き起こされ、以前に説明された免疫における機能を備えていない膜貫通タンパク質をコードしているマウスにおいて、全リンパ系列の重度の発達障害を検出した。ＬＭＢＲ１Ｌと糖タンパク質７８（ＧＰ７８）およびユビキチン関連ドメイン含有２（ＵＢＡＣ２）との相互作用は、小胞体内でのユビキチン化によるＦＺＤ６およびＬＲＰ６の成熟を妨害し、分解複合体タンパク質を安定化させることによって、リンパ球でのＷｎｔシグナル伝達を減衰させた。ＬＭＢＲ１Ｌ欠損Ｔ細胞は、Ｗｎｔ／β−カテニン活性化の特徴を示し、増殖性刺激に応答してアポトーシス細胞死を起こした。ＬＭＢＲ１Ｌは、リンパ球新生およびリンパ球活性化において不可欠な機能を有し、Ｗｎｔ／β−カテニン経路の負の制御因子として作用する。
【０１３１】
序論：造血系は、特殊な機能を備えた多くの細胞種からなる。リンパ系または骨髄系のいずれかに由来する血液細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）から生成される。ＨＳＣは、一連の系列に限定されたステップを通じて血液細胞種全てを継続的に補充し、これらの機構のバランスを取って、生物の生涯を通じて定常状態の造血を維持する。過去２０年間で、カノニカルＷｎｔシグナル伝達（Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達としても知られている）および非カノニカルＷｎｔシグナル伝達（例えば、平面細胞極性経路およびＷｎｔ−Ｃａ２＋シグナル伝達）は、ＨＳＣの自己複製、ＴおよびＢ細胞の発達ならびにＴ細胞活性化を制御することによって、免疫系の重要な制御因子として浮上してきた（１〜４）。リンパ球では、Ｗｎｔタンパク質は成長促進因子として機能するが、アポトーシスや静止を含む細胞運命の決定にも影響を及ぼす（５）。大腸腺腫症（Ａｐｃ）の欠如によるＴ細胞系列のＷｎｔ／β−カテニン経路の異常な活性化は、末梢における成熟Ｔ細胞の自発的な活性化およびのアポトーシスの結果としてＴ細胞リンパ球減少症を引き起こす（６）。
【０１３２】
その広範な重要性を考えると、いくつかのフィードバック制御機構が、適切なＷｎｔシグナル伝達を統御するのに役立っている。これらには、負のフィードバック制御因子であるジンクおよびリングフィンガー３（ＺＮＲＦ３）ならびにその同族リングフィンガー４３（ＲＮＦ４３）が含まれる（７）。これらの膜貫通Ｅ３リガーゼは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄタンパク質（ＦＺＤ）の細胞質ループのリジン残基のユビキチン化を特異的に促進し、ＦＺＤをリソソーム分解させ、それによってＷｎｔシグナル伝達を減衰させる（８、９）。最近、ディシュベルト（ＤＶＬ）がＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３媒介ＦＺＤのユビキチン化および分解の重要な中間体として示唆されている。（１０）。ＺＮＲＦ３およびＲＮＦ４３の発現の喪失は、Ｗｎｔ刺激に過敏反応を引き起こすことが予測され、ＺＮＲＦ３およびＲＮＦ４３における変異は、ヒトにおける種々のがんにおいて認められている（７，９）。免疫におけるＷｎｔシグナル伝達の重要性にもかかわらず、リンパ球新生を特異的に統御する負のフィードバック制御因子は不明のままである。本明細書では、リンパ球のＷｎｔシグナル伝達の負の制御におけるＬＭＢＲ１Ｌの機能および作用機序について説明する。
【０１３３】
Ｌｍｂｒ１ｌ変異によって引き起こされる免疫不全
リンパ球新生および免疫の非冗長性制御因子を発見するために、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＥＮＵ）で変異を誘導したマウスにおいてフォワード遺伝子スクリーニングを実施した。末梢血においてＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセンテージが低い、ＥＮＵ処置を受けた共通の初代の子孫である何匹かのマウスを同定した（図１Ａの挿入図）。ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ（ｓｔ）と称した表現型は、劣性形質として伝達された。系統の遺伝子型対表現型の関連を分析する方法である単一系統マッピングによって（１１）、ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ表現型はＬｍｂｒ１１およびＣｅｒｓ５における変異と相関していた（図１Ａ）。Ｌｍｂｒ１ｌは、免疫における機能が未知の膜貫通タンパク質であるリム領域１様（ＬＭＢＲ１Ｌ）をコードし、Ｃｅｒｓ５は、セラミド合成における酵素であるセラミドシンターゼ５（ＣＥＲＳ５）をコードする。Ｌｍｂｒ１ｌとＣｅｒｓ５の変異によって引き起こされる影響に関しては当初よくわからなかったが、Ｌｍｂｒ１ｌを優先して遺伝的に解決された（図８Ａ〜図８Ｃ）。ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙマウスにおけるＬｍｂｒ１ｌ変異は、ＬＭＢＲ１Ｌの第５の膜貫通ヘリックスに早期停止を伴うシステイン２１２の置換（Ｃ２１２＊）を引き起こす（図１Ｂ）。この変異は、推定上のヌル対立遺伝子と考えられた。Ｃｅｒｓ５およびＬｍｂｒ１ｌの両方のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的ノックアウト変異が生成され、Ｌｍｂｒ１ｌにおける変異が観察された表現型に単独で関与していることが確認された（図１Ｃ）。
【０１３４】
Ｌｍｂｒ１ｌ変異によって引き起こされた免疫学的欠陥をさらに特徴付けるために、全血球数（ＣＢＣ）試験、血液細胞のフローサイトメトリー分析、免疫処置ならびに抗体応答および記憶形成の分析、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＮＫおよびＣＴＬ媒介細胞傷害性試験およびマウスサイトメガロウイルス感染によってマウスの免疫表現型を決定した。（図１Ｃ〜１Ｒ、９Ａ〜１２Ｃ）。Ｌｍｂｒ１ｌ−／−マウスは、白血球、リンパ球および単球の数が低減している血球減少症であった（図９Ａ〜９Ｈ）。末梢血細胞数と一致して、Ｌｍｂｒ１ｌ−／−およびｓｔｒａｗｂｅｒｒｙマウスは、野生型同腹仔と比較して末梢血におけるＣＤ３＋Ｔ細胞の頻度が減少していた（図１Ｃ、１０Ａ）。ＣＤ４＋対ＣＤ８＋Ｔ細胞比は、Ｌｍｂｒ１１−／−およびｓｔｒａｗｂｅｒｒｙマウスで増加していた（図１Ｄ、１０Ｂ）。増大するＴ細胞集団に豊富に存在する表面糖タンパク質ＣＤ４４およびＣＤ６２Ｌの発現が増加していた（図１Ｅ、１Ｆ、１０Ｃ、１０Ｄ）。Ｂ細胞対Ｔ細胞の比も増加していた（図１Ｇ、１０Ｅ）。野生型マウスと比較して、Ｌｍｂｒ１ｌ−／−またはｓｔｒａｗｂｅｒｒｙホモ接合体の末梢血では、ＩｇＧ発現の増加（図１Ｊ、１０Ｈ）を伴って表面Ｂ２２０（図１Ｈ、１０Ｆ）およびＩｇＤ（図１ｌ、１０Ｇ）発現が低下していた。これは、Ｌｍｂｒ１ｌ変異がＢ細胞発達に影響を及ぼしたことを示唆している。Ｌｍｂｒ１ｌ−／−マウスは、野生型マウスと比較してわずかに小さい胸腺を有していた（図１１Ａ）。ダブルネガティブ（ＤＮ）胸腺細胞の数は、Ｌｍｂｒ１ｌ−／−および野生型マウスの間で同等であった（図１１Ｂ）。しかし、Ｌｍｂｒ１ｌ−／−マウスでは、ダブルポジティブ（ＤＰ）およびシングルポジティブ（ＳＰ）胸腺細胞の減少が認められた（図１１Ｃ〜１１Ｅ）。脾細胞の総数は同程度であったが、野生の脾臓と比較してＬｍｂｒ１ｌ−／−の脾臓では全リンパ球の数が著しく低減していた（図１１Ｆ〜１１Ｋ）。組換えセムリキ森林ウイルスにコードされたβ−ガラクトシダーゼ（ｒＳＦＶ−βｇａｌ）および４−ヒドロキシ−３−ニトロフェニルアセチル−Ｆｉｃｏｌｌ（ＮＰ−Ｆｉｃｏｌｌ）に対するＴ細胞依存性および非依存性液性免疫応答は、それぞれ少なくなっていた（図１Ｋ、１Ｌ、１０Ｉ、１０Ｊ）。免疫処置されたＬｍｂｒ１１−／−またはｓｔｒａｗｂｅｒｒｙマウスにおける抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）殺滅活性も、野生型同腹仔と比較して減少していた（図１０、１０Ｍ）。免疫処置されたＬｍｂｒ１ｌ−／−マウスの脾臓におけるＫｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬ−テトラマー陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の総数（図１Ｐ）および頻度の低減（図１２Ａから図１２Ｃ）によって示されたように、Ｌｍｂｒ１ｌ−／−マウスでは野生型マウスと比較して、水酸化アルミニウム沈殿卵白アルブミン（ＯＶＡ）による免疫処置に対する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は弱かった。ナチュラルキラー細胞（ＮＫ；図１Ｍ、１０Ｋ、１１Ｉ）およびＮＫ１．１＋Ｔ細胞（図１Ｎ、１０Ｌ、１１Ｊ）の頻度および数は、Ｌｍｂｒ１ｌ−／−またはｓｔｒａｗｂｅｒｒｙマウスで低減し、同時にＮＫ細胞標的殺滅も減少していた（図１Ｑ、１０Ｎ）。さらに、Ｌｍｂｒ１ｌ−／−���ウスは、致死量以下の用量のＭＣＭＶに曝露した後の肝臓でのウイルス力価の上昇によって判定されるように、マウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）に対する感受性を示した（図１Ｒ）。Ｌｍｂｒ１ｌｍＲＮＡは様々なマウス組織および免疫細胞で検出され、骨髄、胸腺、脾臓およびリンパ球でより高い発現を示した（図１３Ａおよび図１３Ｂ）。しかし、ＬＭＢＲ１Ｌ欠損は、骨髄細胞の発達（図１１Ｎおよび図１１Ｏ）、または種々の刺激に応答したＩＦＮ−α、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−α分泌によって判定したように、それらの機能（図１３Ｃ〜１３Ｊ）には影響を及ぼさなかった。したがって、ＬＭＢＲ１Ｌはリンパ球新生に不可欠である。
【０１３５】
細胞内因性のリンパ球新生不全
細胞由来のＬｍｂｒ１ｌに関連する欠陥を決定するために、照射された野生型（ＣＤ４５．１）またはＲａｇ２−／−（ＣＤ４５．２）レシピエントを混合していない野生型（Ｌｍｂｒ１ｌ＋／＋；ＣＤ４５．２）骨髄、Ｌｍｂｒ１ｌ変異体（ＣＤ４５．２）骨髄または変異体（ＣＤ４５．２）および野生型（ＣＤ４５．１）骨髄細胞の等量混合物で再構成した。競合の有無にかかわらず、ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙドナーの骨髄細胞は、野生型ドナーから得られた細胞ほど効率的に、照射されたレシピエントの脾臓においてＢ２２０＋（図２Ａ、２Ｅ）、ＣＤ３＋Ｔ（図２Ａ、２Ｆ）およびＮＫ細胞（図２Ｂ、２Ｇ）などのリンパ系列の細胞を再増殖させることはできなかった。野生型マウスの骨髄を投与されたものと比較して、ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ骨髄を投与されたマウスの胸腺では、ＤＮ細胞の頻度が増加し、ＤＰ細胞の頻度が減少しており（図２Ｃ、２Ｈ、２Ｉ）、Ｌｍｂｒ１ｌ変異は胸腺におけるＴ細胞分化に軽度の影響を与えることを示唆している。
【０１３６】
骨髄では、野生型ドナー（Ｂ２２０＋ＩｇＭ＋ＩｇＤ−；図２Ｄ、２Ｊ）と比較して、ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙドナーから得られた再増殖したＢ細胞、および成熟再循環Ｂ細胞段階に進行したｓｔｒａｗｂｅｒｒｙドナーから得られたＢ細胞のごく一部（Ｂ２２０＋ＩｇＭ＋ＩｇＤ＋；図２Ｄ、２Ｋ）で、未熟Ｂ細胞が増加していた。この発達停止は、競合に関係なく、照射された野生型およびＲａｇ２−／−レシピエントの両方で生じた。ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙホモ接合体およびＬｍｂｒ１ｌ−／−マウスの末梢血Ｂ細胞において、Ｂ２２０およびＩｇＤの発現減少ならびにＩｇＭの発現増加も検出された（図１Ｈ〜図１Ｊ、１０Ｆ〜１０Ｈ）。したがって、Ｌｍｂｒ１ｌ変異はＢ細胞発達も障害した。
【０１３７】
Ｂ、ＴおよびＮＫ細胞を含むリンパ球は、リンパ球系多能性前駆細胞（ＬＭＰＰ）およびＬＭＰＰから発達すると考えられているリンパ球系共通前駆細胞（ＣＬＰ）に由来する。したがって、骨髄における造血幹細胞および前駆細胞の集団を調べた。ＬＭＢＲ１Ｌ欠損は、野生型同腹仔と比較してＬＳＫ＋細胞の割合および数の増加を引き起こした（図２Ｌ、２Ｍ）。ＬＳＫ区画の組成は、Ｌｍｂｒ１ｌ−／−骨髄では少し変化していて、ＬＭＰＰおよびＣＬＰの割合の低減が生じていた（図２Ｌ）。対照的に、長期造血幹細胞（ＬＴ−ＨＳＣ）、短期（ＳＴ）−ＨＳＣおよび多能性前駆細胞（ＭＰＰ）の数は、野生型マウスと比較してＬｍｂｒ１ｌ−／−骨髄で増加していた（図２Ｍ）。ＬＭＢＲ１Ｌ欠損は、骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）、巨核球−赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）または顆粒球−マクロファージ前駆細胞（ＧＭＰ；図２Ｌ、２Ｍ）を含むＬＫ＋細胞の組成および数にそれほど影響を与えなかった。さらに、これらの前駆細胞集団の相対的な適応度を評価するために、Ｌｍｂｒ１ｌ−／−（ＣＤ４５．２）および野生型（ＣＤ４５．１）骨髄の１：１混合物を使用して、競合性骨髄キメラを作製した。移植して８週間後に、Ｌｍｂｒ１ｌ−／−由来造血細胞は、ＬＳＫ、ＳＴ−ＨＳＣ、ＭＰＰ、ＣＭＰおよびＭＥＰの再増殖には有利であったが、ＬＭＰＰ、ＣＬＰおよびＧＭＰの再増殖には不利であることが示された（図１４Ａ〜１４Ｂ）。Ｌｍｂｒ１ｌ−／−マウスで観察されたＨＳＣ表現型は、発現低下したＡｐｃ変異を有するマウスにおいてＷｎｔシグナル伝達が適度に増加している場合のＨＳＣ表現型に対応している（１２）。これは、細胞自律的であるリンパ系列の関わり合いに対してＬＭＢＲ１Ｌ欠損が特異的に影響を及ぼすことを示唆している。
【０１３８】
Ｌｍｂｒ１ｌ変異は、ＤＰ細胞の減少と共にＤＮ細胞の割合の増加によって示されるように、胸腺において異常な細胞性を引き起こしたが（図２Ｈ、２Ｉ）、残存するＤＰ細胞は胸腺選択を生き延び、成熟ＳＰ細胞に発達することができた（図２Ｃ）。末梢血Ｔ細胞と同様に、Ｌｍｂｒ１ｌ−／−マウスの脾臓におけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、表面糖タンパク質ＣＤ４４の発現増加を示し、最近に活性化され増大している記憶表現型の細胞を包含している（図３Ａ）。ＣＤ４４発現の増加は、発達している胸腺細胞では明らかではなかった（図３Ａ）。Ｌｍｂｒ１ｌ−／−マウスのＣＤ８＋Ｔ細胞のイムノブロット分析によって、活性化エフェクターＴ細胞で以前に認められた表現型であるＴ細胞因子−１（ＴＣＦ−１）およびリンパ系エンハンサー結合因子１（ＬＥＦ−１）の下方制御が明らかになった（図３Ｂ）（１３）。さらに、リン酸化によって活性化される、Ａｋｔ、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ）、ｐ７０Ｓ６Ｋ（ｍＴＯＲＣ１基質）およびリボソームタンパク質Ｓ６（ｐ７０Ｓ６Ｋ基質）は、Ｌｍｂｒ１ｌ−／−マウスのＣＤ８＋Ｔ細胞において基本的条件下で構成的にリン酸化された（図３Ｂ）。ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙホモ接合体のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の高いパーセンテージは、野生型同腹仔と比較して、定常状態でアネキシンＶに陽性であった（図３Ｃ）。野生型同腹仔と比較して、Ｌｍｂｒ１ｌ−／−マウスの末梢Ｔ細胞では、ＩＬ−７Ｒαの発現が低いことが認められた（図３Ｄ）。したがって、Ｌｍｂｒ１ｌ変異マウスの末梢Ｔ細胞は、アポトーシスの素因となる可能性のある活性化状態で存在すると考えられたので、増大シグナルに対する増殖性応答を調査することにした。
【０１３９】
抗原特異的Ｔ細胞増殖を調べるために、ＯＶＡ特異的野生型（ＣＤ４５．２）およびＬｍｂｒ１ｌ−／−ＯＴ−Ｉ  Ｔ細胞（ＣＤ４５．２）の等量混合物を野生型レシピエント（ＣＤ４５．１）に移植し、その後、可溶性ＯＶＡで免疫処置した。野生型ＯＴ−Ｉ  Ｔ細胞は予測通りに増殖したが、免疫処置して２または３日後に脾臓で検出されたＬｍｂｒ１ｌ−／−ＯＴ−Ｉ  Ｔ細胞は、有意に少なかった（図３Ｅ〜３Ｇ）。過剰なＬｍｂｒ１ｌ−／−ＯＴ−Ｉ  Ｔ細胞は、アネキシンＶ染色によって示されるように、アポトーシス性であることが見いだされた（図１５Ａ）。Ｌｍｂｒ１ｌ変異のＴ細胞増殖に対する影響をさらに試験するために、恒常性増殖シグナルに対する応答を調べた。野生型およびホモ接合体ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ脾臓Ｔ細胞の等量混合物を、致死量以下で照射された野生型マウスに養子移植した。野生型Ｔ細胞は広範囲に増殖したが、ホモ接合体ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙＴ細胞は照射されたレシピエントでは増殖できず（図３Ｈ〜３Ｊ）、野生型Ｔ細胞と比較してアネキシンＶ染色の高い頻度を示した（図１５Ｂ）。
【０１４０】
二次リンパ器官へのＴ細胞ホーミングが障害されているかどうかに取り組むために、野生型およびＬｍｂｒ１ｌ−／−色素標識汎Ｔ細胞の混合物を照射されたレシピエントに移植した。野生型およびＬｍｂｒ１ｌ−／−Ｔ細胞の有意な数が、養子移植後の照射されたレシピエントの脾臓で検出され、ホーミング欠陥の可能性は排除され、Ｌｍｂｒ１ｌ−／−ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞には増殖欠陥があることがさらに支持された（図１６Ａ、１６Ｂ）。これらの結果は、抗原特異的または恒常性増大シグナルに応答して、Ｌｍｂｒ１ｌ変異体またはＬｍｂｒ１ｌ−／−Ｔ細胞がアポトーシスされることを示している。Ｌｍｂｒ１ｌ−／−Ｔ細胞の活性化状態（ＣＤ４４ｈｉ）がそれらの細胞をアポトーシスさせる素因があるかどうかを調べるために、成熟ＳＰ胸腺細胞（ＣＤ４４ｌｏ；図３Ａ）を単離し、それらを刺激して恒常性増大シグナルに応答して増殖させた。脾臓Ｔ細胞と同様に、Ｌｍｂｒ１ｌ−／−マウスの成熟ＳＰ胸腺細胞も増殖することができず、アポトーシス細胞のパーセンテージの増加を示した（図３Ｋ〜図３Ｍおよび１５Ｃ）。したがって、ＬＭＢＲ１Ｌ欠損Ｔ細胞は、活性化状態に関係なく、増大シグナルに応答して死滅する。
【０１４１】
末梢では、活性化（エフェクター）Ｔ細胞の増大とその後の免疫応答の終了中の消失とのバランスは、外因性細胞死受容体およびカスパーゼ依存性アポトーシス、内因性ミトコンドリアおよびカスパーゼ依存性アポトーシスまたはカスパーゼ非依存性細胞死によって統御されている。野生型またはＬｍｂｒ１ｌ変異ＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αまたはＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）などの外因性細胞死受容体のリガンドによる処置は、外因性アポトーシス経路のカスパーゼ（例えば、カスパーゼ−８、−３、−７およびＰＡＲＰ）のタンパク質溶解プロセシングを増強した。切断カスパーゼのレベルは、野生型Ｔ細胞と比較してＬｍｂｒ１ｌ変異Ｔ細胞で増加した（図１７Ａ、１７Ｂ）。さらに、内因性経路の主要な担い手であるカスパーゼ−９の過剰な切断が、外因性のアポトーシス誘導因子で処置した後のＬｍｂｒ１ｌ−／−細胞で検出された（図１７Ａ、１７Ｂ）。したがって、外因性および内因性の両方のカスパーゼカスケードは、ＬＭＢＲ１Ｌ欠損Ｔ細胞アポトーシスにおいて役割を果たすものと考えられる。特に、ＴＮＦ−α（図１７Ｃ）、Ｆａｓ（図１７Ｄ）またはカスパーゼ−３（図１７Ｅ）の欠損は、Ｌｍｂｒ１ｌ−／−マウスのＴ細胞欠損をレスキューすることはできなかった。Ｆａｓ−、ＴＮＦＲ−およびカスパーゼ−３媒介アポトーシス経路も、Ｌｍｂｒ１ｌ−／−Ｔ細胞の死に全く関与していなかった。
【０１４２】
Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の負の制御因子としてのＬＭＢＲ１Ｌの同定
ＬＭＢＲ１Ｌは最初、リガンドの内部移行および分解を媒介する親油性化合物の細胞外スカベンジャー／担体であるヒトリポカリン−１（ＬＣＮ１）の受容体として同定された（１４〜１８）。その後の発見によって、ＬＭＢＲ１Ｌはヒトにおける主要な食品由来アレルゲンであるウシリポカリンβ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）の内部移行を媒介し（１９）、ＬＭＢＲ１Ｌは走化性阻害特性を有するウテログロビン（ＵＧ）と相互作用することが示唆された（２０）。ヒトＬＣＮ１のマウスオルソログであるＬｃｎ３の標的化ヌル対立遺伝子を有するマウスを生成し、ＬＣＮ３欠損マウスは明らかに正常であり、リンパ球発達の欠陥を示さないことを観察した。したがって、リンパ球新生におけるＬＭＢＲ１Ｌの機能は、ＬＣＮ３との相互作用とは無関係である（図１８Ａ〜図１８Ｃ）。
【０１４３】
共免疫沈降（ｃｏ−ＩＰ）を質量分析（ＭＳ）と組み合わせて使用してＬＭＢＲ１Ｌ−相互作用タンパク質を同定することによって、ＬＭＢＲＬ１の免疫機能を理解しようとした。推定ＬＭＢＲ１Ｌ相互作用物質（データセットＳ１）として同定された１６２３個の候補タンパク質のうち２５個のタンパク質は、空のベクター対照と比較してＬＭＢＲ１Ｌｃｏ−ＩＰ産物において５０倍超豊富であった（表１）。
【０１４４】
【表１】
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【０１４５】
これらのタンパク質のうち４つは、ユビキチン関連ドメイン含有２（ＵＢＡＣ２；２９７倍上昇）、移行型小胞体ＡＴＰアーゼ（ＶＣＰとして知られているＴＥＲＡ；１２０倍上昇）、ＵＢＸドメイン含有タンパク質８（ＵＢＸＤ８、ＦＡＦ２として知られている；７１倍上昇）（２１）および糖タンパク質７８（ＧＰ７８；ＡＭＦＲとして知られている；５１倍上昇）を含むＥＲＡＤ経路に不可欠な構成成分であった。ジンクおよびリングフィンガー３（ＺＮＲＦ３）、低密度リポタンパク質受容体関連性タンパク質６（ＬＲＰ６）、β−カテニン、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３α（ＧＳＫ３α）およびＧＳＫ３βを含む、ＬＭＢＲ１Ｌｃｏ−ＩＰにおいてのみ見いだされた７６４個のタンパク質の中にあるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の多数の構成成分も同定した。ＬＭＢＲ１Ｌ相互作用タンパク質を同定するための第２の公平なアプローチとして、タンパク質マイクロアレイ分析も実行した。ＧＳＫ−３βは、ＬＭＢＲ１Ｌへの結合親和性について９４８３個のヒトタンパク質のうち８番目にランク付けされた（図４Ａ、データセットＳ２）。ＬＭＢＲ１Ｌは、ＣＫ１α、γ、δおよびεを含むカゼインキナーゼ１（ＣＫ１）アイソフォームならびにβ−カテニンに対して結合親和性を示した。ＬＭＢＲ１ＬとＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達またはＥＲＡＤ経路の構成成分との相互作用を確認するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＨＡタグ化ＬＭＢＲ１ＬおよびＦＬＡＧタグ化ＧＳＫ−３β、β−カテニン、ＺＮＲＦ３、リングフィンガー４３（ＲＮＦ４３、Ｗｎｔ受容体プロセシングにおいて冗長機能を備えたＺＮＲＦ３のホモログ）、ＦＺＤ６、ＬＲＰ６またはＤＶＬ２を同時トランスフェクトした。ＬＭＢＲ１Ｌは、ＦＬＡＧタグ化タンパク質のそれぞれと共免疫沈降させた（図４Ｂ）。さらに、ｃｏ−ＩＰおよびイムノブロット分析によって、ＬＭＢＲ１ＬがＵＢＡＣ２、ＵＢＸＤ８、ＶＣＰおよびＧＰ７８を含むＥＲＡＤ構成成分のそれぞれと相互作用することが確認された（図１９Ａ〜１９Ｄ）。したがって、ＬＭＢＲ１ＬはＷｎｔ／β−カテニンおよびＥＲＡＤシグナル伝達経路の重要な構成成分である可能性がある。
【０１４６】
Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達とＬＭＢＲ１Ｌとの関係を判定するために、Ｌｍｂｒ１ｌ−／−および野生型マウスのＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を調べた。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路における重要な制御ステップには、リン酸化、ユビキチン化およびその後のＷｎｔ下流エフェクタータンパク質であるβ−カテニンの分解が含まれる（２２）。ＬＭＢＲ１Ｌ欠損によってβ−カテニンの蓄積が引き起こされるとともに野生型細胞に比べてリン酸化β−カテニンのレベルが減少した（図４Ｃ）。β−カテニンの蓄積は、胸腺細胞の発達（ＤＮ１−４、ＤＰ、ＳＰ４、ＳＰ８；図２０Ａ、２０Ｂ）ならびに末梢におけるナイーブおよび成熟Ｔ細胞（図２０Ｂ）において観察された。β−カテニンの局在化に変化があったかどうかを判定するために、核および細胞基質抽出物をＬｍｂｒ１ｌ−／−ＣＤ８＋Ｔ細胞から単離した。イムノブロッティングによって、野生型細胞と比較して、Ｌｍｂｒ１ｌ−／−ＣＤ８＋Ｔ細胞の核画分におけるβ−カテニンレベルの増加が明らかになった（図２０Ｃ）。持続的なβ−カテニンの不活性化には、足場タンパク質Ａｘｉｎ１およびＤＶＬ２から構成される完全な分解複合体内のＧＳＫ−３α／βおよびＣＫ１によるβ−カテニンのリン酸化、それに続くＥ３ユビキチンリガーゼβ−ＴｒＣＰによって媒介されるユビキチン化が必要である（５、２２）。Ｌｍｂｒ１ｌ−／−ＣＤ８＋Ｔ細胞は、総ＧＳＫ−３α／βおよびＣＫ１レベルの減少と共にＧＳＫ−３β不活性型（リン酸化ＧＳＫ−３β；図４Ｃ）レベルの増加を示した。さらに、Ａｘｉｎ１、ＤＶＬ２およびβ−ＴｒＣＰレベルは、野生型細胞と比較して、Ｌｍｂｒ１ｌ−／−ＣＤ８Ｔ細胞において低減していた（図４Ｃ）。Ｗｎｔ活性化によるβ−カテニンの核蓄積は、ＣＤ４４およびｃ−Ｍｙｃを含むその標的遺伝子の上方制御を促進する。Ｌｍｂｒ１ｌ−／−ＣＤ８＋Ｔ細胞の核画分におけるβ−カテニンレベルの増加と一致して、全細胞溶解物におけるｃ−Ｍｙｃ発現の増加が見いだされた（図４Ｃ）。ｃ−Ｍｙｃ誘導性アポトーシスはｐ５３依存性である。抗アポトーシス細胞周期停止タンパク質ｐ２１はｐ５３の標的であり、ｃ−Ｍｙｃによって転写的に抑制される（２３）。ＬＭＢＲ１Ｌ欠損はｐ５３発現を増加させ、ｐ２１を抑制し、カスパーゼ−３および−９切断を増加させた（図４Ｃ）。ＬＭＢＲ１Ｌ欠損は、ＣＤ４＋ＴおよびＢ細胞において同様の効果を生じた（図２１Ａ〜２１Ｂ）。
【０１４７】
腸上皮における異常なＷｎｔ活性化は、腺腫の形成および結腸がんを引き起こす（９）。しかし、Ｌｍｂｒ１ｌ−／−腸上皮は、β−カテニンの蓄積（図２２Ａ、２２Ｃ）、Ｋｉ−６７染色によって判定された陰窩の顕著な増大（図２２Ｂ、２２Ｄ）またはデキストラン硫酸ナトリウムの経口投与後の腸の恒常的な異常を示さなかった（ＤＳＳ；図２２Ｅ）。ＬＧＲ５＋腸幹細胞におけるＬｍｂｒ１ｌｍＲＮＡ発現の欠如と一致して（２４）、我々の発見は、β−カテニン活性を制御するためのその他の系が腸細胞環境においてＬＭＢＲ１Ｌと重複していることを示唆している。これらの結果によって、ＬＭＢＲ１ＬはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達のリンパ球特異的な負の制御因子として確立される。
【０１４８】
ＬＭＢＲ１Ｌ−ＧＰ７８−ＵＢＡＣ２複合体は、ＥＲ内のＷｎｔ受容体の成熟を制御し、ＧＳＫ−３βを安定化する
Ｗｎｔタンパク質は、２つの分子、ＦＺＤおよびＬＲＰ６の受容体複合体に結合する（５）。本発明者らの知見は、ＬＭＢＲ１ＬがＷｎｔ経路の負の制御因子として作用することを示唆している。したがって、ＬＭＢＲ１ＬがＷｎｔ共受容体の発現および／または分解複合体の安定化を制御できるかどうかを調べた。野生型細胞と比較して、Ｌｍｂｒ１ｌ−／−ＣＤ８＋Ｔ細胞の膜画分においてＦＺＤ６の成熟（グリコシル化）型のレベル増加が検出された（図５Ａ）。ＦＺＤ６およびＬＲＰ６の成熟型と未熟型の両方が、野生型ＣＤ８＋Ｔ細胞と比較してＬｍｂｒ１ｌ−／−ＣＤ８＋Ｔ細胞の全細胞溶解物（ＴＣＬ）中で増加していた（図５Ａ）。
【０１４９】
ＺＮＲＦ３およびＲＮＦ４３は、Ｗｎｔ経路の負の制御因子である。ＺＮＲＦ３およびＲＮＦ４３は、ＦＺＤの細胞質ループのリジンを選択的にユビキチン化し、形質膜で分解するためにＦＺＤを標的とする（８）。さらに、ＤＶＬタンパク質は、ＦＺＤのＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３媒介ユビキチン化および分解の中間体として作用する（１０）。ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３レベルは、野生型細胞におけるレベルと比較して、Ｌｍｂｒ１−／−ＣＤ８＋Ｔ細胞の膜画分で変化していることが見いだされた。ＴＣＬでは、ＺＮＲＦ３レベルは変化していないが、ＲＮＦ４３レベルはわずかに増加していた（図５Ａ）。
【０１５０】
ＵＢＡＣ２は、ＥＲ膜で発現したＧＰ７８ユビキチンリガーゼ複合体のコア構成成分である。ＵＢＡＣ２は、ＥＲＡＤ中の基質抽出に関与するタンパク質であるＵＢＸＤ８と物理的に相互作用し、ポリＵＢ鎖を付加する（２１、２５）。ＬＭＢＲ１ＬとＵＢＡＣ２、ＧＰ７８およびＵＢＸＤ８との相互作用が、ＦＺＤおよび／またはＬＲＰ６に対するＧＰ７８ユビキチンリガーゼ複合体の活性を制御する可能性があると仮定した。ＦＬＡＧタグ化ＦＺＤ６およびＨＡタグ化ＬＭＢＲ１ＬまたはＵＢＡＣ２でＨＥＫ２９３Ｔ細胞を一過性同時トランスフェクションすることによって、成熟ＦＺＤ６の総レベルの減少が引き起こされた（図５Ｂ）。ＦＬＡＧタグ化ＦＺＤ６およびＨＡタグ化ＧＰ７８の同時発現は、ＦＺＤ６の成熟型および未熟型の両方を大幅に減少させた。ＬＭＢＲ１Ｌとは対照的に、ＵＢＡＣ２およびＧＰ７８はＦＺＤ６のユビキチン化を大幅に促進した（図５Ｂ）。さらに、ＧＦＰタグ化ＦＺＤ６はＨＥＫ２９３Ｔ細胞の形質膜およびＥＲの両方に局在していたが、ＬＭＢＲ１ＬとＦＺＤ６−ＧＦＰとの同時発現は、ＦＺＤ６−ＧＦＰの局在を変化させ、ＥＲにおける蓄積を引き起こし、形質膜での発現を阻害した（図２３）。野生型細胞と比較して、結合免疫グロブリンタンパク質（ＢｉＰ）およびグルコース制御タンパク質９４（ＧＲＰ９４）の発現増加によって示されるように、ＥＲストレスがＬｍｂｒ１ｌ−／−ＣＤ８＋Ｔ細胞で観察された（図５Ａ）。ＬＭＢＲ１Ｌ発現は成熟ＬＲＰ６を優先的に減少させたのに対し、ＵＢＡＣ２は成熟および未熟ＬＲＰ６の両方を減少させたことが見いだされた（図５Ｃ）。機能ドメインが今までに報告されていないＬＭＢＲ１Ｌは、形質膜に局在することが知られている（１７、１８）。しかし、我々のデータは、ＬＭＢＲ１ＬがＧＰ７８−ＵＢＡＣ２ユビキチンリガーゼ複合体のコア構成成分として機能して、ＬＭＢＲ１Ｌが媒介するＷｎｔ共受容体の成熟がＥＲ内で制御される可能性があることを示唆している。
【０１５１】
この仮説を試験するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の内因性ＬＭＢＲ１Ｌタンパク質のＣ末端に付加されたＦＬＡＧタグのＣＲＩＳＰＲベースのノックインを作製した。ほとんどのＬＭＢＲ１Ｌ−ＦＬＡＧはこれらの細胞のＥＲで発現しており、形質膜に局在するのはごく一部であった（図５Ｄ）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（図２４Ａ）およびマウスＴ細胞株ＥＬ４（図２４Ｂ）においてＵｂａｃ２またはＧｐ７８もノックアウトした。親ＨＥＫ２９３ＴまたはＥＬ４細胞と比較して、Ｕｂａｃ２−／−およびＧｐ７８−／−細胞の両方でＦＺＤ６およびＬＲＰ６の増加が検出された（図２４Ａ、２４Ｂ）。初代ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＬＭＢＲ１Ｌ欠損と同様に、ＨＥＫ２９３ＴまたはＥＬ４細胞のＧＰ７８欠損もβ−カテニンの蓄積を引き起こした（図２４Ａ、２４Ｂ）。さらに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的Ｇｐ７８ノックアウトマウスを作製し、初代ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＧＰ７８欠損がＦＺＤ６およびＬＲＰ６発現の増加ならびにβ−カテニン蓄積を引き起こすことを確認するために使用した（図５Ｅ）。Ｕｂａｃ２−／−または親ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＦＬＡＧタグ化ＦＺＤ６、ＨＡタグ化ＬＭＢＲ１ＬおよびＥＧＦＰを一過性トランスフェクションした後、ＬＭＢＲ１Ｌによって媒介されるＦＺＤ６成熟に対するＵＢＡＣ２の影響も調べた。ＬＭＢＲ１Ｌの量を増加させると、野生型ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＥＧＦＰ発現に影響を及ぼすことなく、成熟ＦＺＤ６の量が大幅に低減し、未熟ＦＺＤ６の量が増加した（図２５）。しかし、Ｕｂａｃ２−／−細胞においてＬＭＢＲ１Ｌの量を増加させると、野生型細胞ほど効率的にＦＺＤ６成熟を阻害することはできなかった（図２５）。さらに、野生型細胞で観察されたＬＭＢＲ１Ｌによる成熟ＬＲＰ６の優先的阻害は、Ｇｐ７８−／−細胞において部分的にレスキューされ、ＬＲＰ６の総発現は著しく高くなった（図５Ｆ）。同様に、ＦＬＡＧタグ化β−カテニンおよびＨＡタグ化ＬＭＢＲ１Ｌ、ＵＢＡＣ２またはＧＰ７８によるＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性同時トランスフェクションによって、空のベクター対照と比較してβ−カテニンの総レベルの減少が引き起こされた（図５Ｇ）。ｃｏ−ＩＰを使用して、ＧＰ７８とβ−カテニンとの間の物理的相互作用が確認された（図２６Ａ）。ＦＬＡＧタグ化β−カテニンおよびＨＡタグ化ＧＰ７８の同時発現は、β−カテニンのユビキチン化を大幅に促進した（図５Ｇ）。逆に、ＦＬＡＧタグ化β−カテニンの一過性トランスフェクション後に、親ＨＥＫ２９３Ｔ細胞と比較して、Ｇｐ７８−／−細胞ではβ−カテニン発現の増加が観察された（図２６Ｂ）。したがって、ＬＭＢＲ１Ｌ−ＧＰ７８−ＵＢＡＣ２複合体は、リンパ球のＥＲ内でのＦＺＤ６およびＷｎｔ共受容体ＬＲＰ６の成熟を妨害するようである。さらに、ＬＭＢＲ１Ｌ−ＧＰ７８−ＵＢＡＣ２複合体は、β−カテニンのユビキチン化および分解を制御することができる。
【０１５２】
Ｌｍｂｒ１ｌ−／−Ｔ細胞で観察されたもう１つの顕著な違いは、足場タンパク質Ａｘｉｎ１、ＤＶＬ２、キナーゼＧＳＫ−３α／βおよびＣＫ１、ならびにＥ３リガーゼβ−ＴｒＣＰを含む分解複合体のいくつかの構成成分が、野生型細胞よりも低いレベルで発現したことであった（図４Ｃ）。さらに、Ｌｍｂｒ１ｌ−／−Ｔ細胞は、リン酸化β−カテニンおよびリン酸化ＬＲＰ６の発現の減少（それぞれ図４Ｃおよび図５Ａ）、リン酸化ＧＳＫ−３βの増加（図４Ｃ）ならびにリン酸化によってＧＳＫ−３βを不活性化するＡｋｔおよびｐ７０Ｓ６Ｋなどのキナーゼの活性化（図３Ｂ）を示した。したがって、ＬＭＢＲ１Ｌ−ＧＰ７８−ＵＢＡＣ２複合体は、β−カテニンおよびＬＲＰ６をそれぞれリン酸化することによってＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達において阻害および刺激の両方の役割を有しているＧＳＫ−３βなどの分解複合体構成成分の安定性を制御することができると仮定した（２６）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＦＬＡＧタグ化Ａｘｉｎ１、ＤＶＬ２またはＧＳＫ−３βとＨＡタグ化ＬＭＢＲ１Ｌまたは空のベクター対照による一過性同時トランスフェクションによって、空のベクター対照と比較してＨＡ−ＬＭＢＲ１Ｌの存在下でＦＬＡＧタグ化Ａｘｉｎ１タンパク質の総レベルの減少が引き起こされた。しかし、ＬＭＢＲ１Ｌは、ＤＶＬ２またはＧＳＫ−３βの発現（図２７）にも、リン酸化ＧＳＫ−３βのレベル（図６Ａ）にも影響を及ぼさなかった。ＧＳＫ−３βの半減期に対するＬＭＢＲ１Ｌの影響を測定するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＦＬＡＧタグ化ＧＳＫ−３βおよびＨＡタグ化ＬＭＢＲ１Ｌまたは空のベクターをトランスフェクトした。トランスフェクションの１４時間後、細胞を翻訳阻害剤であるシクロヘキシミド（ＣＨＸ）で処置し、処置後様々な時間で採取した。ＬＭＢＲ１Ｌの存在下では、ＣＨＸ処置４時間後までＧＳＫ−３βの検出可能な減少は観察されず、ＬＭＢＲ１ＬがＧＳＫ−３βを安定化させることが示唆された（図６Ｂ）。
【０１５３】
次々と得られた証拠によると、ＬＭＢＲ１ＬがＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の負の制御因子として働くことが示唆される。観察された表現型が経路に依存するかどうかを試験するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用してＥＬ４細胞においてＬｍｂｒ１ｌ、β−カテニン（Ｃｔｎｎｂ１）またはＬｍｂｒ１ｌおよびＣｔｎｎｂ１をノックアウトした。初代Ｌｍｂｒ１ｌ−／−ＣＤ８＋Ｔ細胞で観察された表現型と同様に、Ｌｍｂｒ１ｌ−／−ＥＬ４細胞は、通常の培養条件下であっても増殖に深刻な欠陥を示した（図７Ａ）。アネキシンＶおよびＰＩ染色は、Ｌｍｂｒ１ｌ−／−ＥＬ４細胞の大部分がアポトーシス性であることを示した（図７Ｂ：右上、７Ｃ）。親の野生型ＥＬ４細胞と比較して、Ｃｔｎｎｂ１−／−ＥＬ４細胞で壊死細胞の頻度の増加が検出されたが（図７Ｂ：左下、７Ｃ）、それらの増殖は正常であった（図７Ａ）。Ｌｍｂｒ１ｌ−／−ＥＬ４細胞におけるＣｔｎｎｂ１の欠如は、Ｌｍｂｒ１ｌ−／−ＥＬ４細胞と比較して、増殖能を実質的に回復させ、アポトーシスを減少させたが（図７Ａ、Ｂ：右下、７Ｃ）、増殖およびアポトーシスは、親の野生型Ｃｔｎｎｂ１−／−ＥＬ４細胞で観察されたレベルには達しなかった（図７Ａ、７Ｂ）。これらの結果は、β−カテニンがマウスＴリンパ球形質転換細胞株においてＬＭＢＲ１Ｌの下流にあるという遺伝的証拠であり、ＬＭＢＲ１Ｌ欠損Ｔ細胞で観察された表現型がＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達に大きく依存していることを示唆している。
【０１５４】
ＬＭＢＲ１Ｌ欠損は、マウスにおける自己抗体産生およびＢ細胞生存を阻害する
自己抗体（ｄｓＤＮＡ特異的ＩｇＧ）の産生は、その他の自己免疫疾患と比較して、全身性エリテマトーデスについての最も特異的で感度の高い指標である。自己免疫疾患におけるＬＭＢＲ１Ｌの制御についての洞察を深めるために、Ｌｍｂｒ１ｌ−／−マウスを、Ｔ細胞で発現せずＢ細胞系列に限定されているヒトＢ細胞リンパ腫２（ＢＣＬ２）ｃＤＮＡを含有する導入遺伝子を発現しているＴｇ（ＢＣＬ２）２２Ｗｅｈｉ／Ｊマウス株（以下、Ｂｃｌ２−Ｔｇ）と交配した。Ｂ細胞におけるヒトＢＣＬ２導入遺伝子の発現は、細胞の生存を増強し、自己抗体産生を促進することが知られていた。
【０１５５】
本明細書では、Ｌｍｂｒ１ｌ−／−；Ｂｃｌ２−Ｔｇマウスは、Ｌｍｂｒ１ｌ＋／＋；Ｂｃｌ２−Ｔｇマウスと比較して、血清中のｄｓＤＮＡ特異的ＩｇＧレベルが有意に低いことが見いだされた（図３０Ａ）。６ヵ月齢ＮＺＢ／ＮＺＷＦ１雑種雌の血清を、ｄｓＤＮＡ特異的抗体測定の陽性対照として用いた。この結果は、ＬＭＢＲ１Ｌ欠損が自己免疫応答を阻害することを示唆している。さらに、Ｌｍｂｒ１ｌ＋／＋；Ｂｃｌ２−ＴｇおよびＬｍｂｒ１ｌ−／−；Ｂｃｌ２−Ｔｇマウスにおける末梢血Ｂ細胞の定量によって、ＬＭＢＲ１Ｌ欠損がマウスにおけるＢ細胞の生存を有意に阻害することが明らかになった（図３０Ｂ）。
【０１５６】
結論
本発明者らの知見は、リンパ球におけるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を制御する経路の存在を示している。ＬＭＢＲ１Ｌ欠損マウスにおいてリンパ球減少症を引き起こすＴ細胞の過剰なアポトーシスは、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の異常な活性化によって生じる。ＬＭＢＲ１Ｌがない場合、Ｗｎｔ共受容体の成熟型およびリン酸化ＧＳＫ−３βの発現は高度に上方制御されたが、複数の分解複合体タンパク質の発現は低減した。これらの変化は、核に進入し、Ｍｙｃ、Ｔｒｐ５３およびＣｄ４４などの標的遺伝子の転写を促進するβ−カテニンの蓄積に寄与した。このシグナル伝達カスケードは、内因性および外因性のカスパーゼカスケードに依存したアポトーシスに有利である。
【０１５７】
本明細書では、リガンド結合とは無関係にＷｎｔ受容体利用性を制御することによってリンパ球のＷｎｔシグナル伝達活性を統御する、ＬＭＢＲ１Ｌ、ＧＰ７８およびＵＢＡＣ２を含むＥＲにおける第２の「分解複合体」を報告する（図２８）。さらに、ＬＭＢＲ１Ｌは、β−カテニンの分解およびＬＲＰ６の活性化に必要なＧＳＫ−３βを含むカノニカル分解複合体の発現および／または安定化を支持する。ヒトおよびマウスのＬＭＢＲ１Ｌオルソログは９６％同一性を共有しているので（図２９）、同じ機構がヒトリンパ球細胞およびその前駆細胞で作動すると考えられる。ＬＭＢＲ１Ｌ欠損は、原因不明の汎リンパ系免疫不全障害の病因となる可能性があると考えられる。
【０１５８】
材料および方法
マウス
Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した８から１０週齢の純粋なＣ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドの雄を、以前に記載されたようにＮ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＥＮＵ）で変異誘発した（２７）。変異誘発したＧ０雄をＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌と繁殖させ、得られたＧ１雄をＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌と交配してＧ２マウスを作出した。Ｇ２雌はＧ１雄親と戻し交配してＧ３マウスを生成し、表現型をスクリーニングした。全エキソーム配列決定およびマッピングは記載されたように実行した（１１）。Ｃ５７ＢＬ／６．ＳＪＬ（ＣＤ４５．１）、Ｒａｇ２−／−、Ｔｎｆ−α−／−、Ｃａｓｐ３−／−、Ｆａｓｌｐｒ、Ｂ２ｍｔｍ１Ｕｎｃ（Ｂ２ｍ−／−）およびＴｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）１１００Ｍｊｂ（ＯＴ−Ｉ）トランスジェニックマウスは、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。ＣＤ４５．１；Ｌｍｂｒ１ｌｓｔ／ｓｔ、Ｌｍｂｒ１ｌ−／−；Ｔｎｆ−α−／−、Ｌｍｂｒ１ｌ−／−；Ｃａｓｐ３−／−、Ｌｍｂｒ１ｌ−／−；Ｆａｓｌｐｒ／ｌｐｒ、Ｌｍｂｒ１ｌ−／−；ＯＴ−Ｉマウスは、マウス種を交雑することによって作出した。マウスは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒで特定の病原体を含まない条件下に収容し、実験手法は全て、制度によって承認された手順に従って実行した。
【０１５９】
骨髄キメラ
レシピエントマウスは、ガンマ線照射によって（Ｘ−ＲＡＤ３２０、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘ−ｒａｙ  Ｉｎｃ．）１３Ｇｙで致死的に照射された。マウスは、それぞれのドナーの脛骨および大腿骨から得られた骨髄細胞５×１０６個の静脈内注射を受けた。移植後４週間、マウスを抗生物質で維持した。骨髄移植の１２週間後、キメラを安楽死させて、骨髄、胸腺および脾臓における免疫細胞の発達をフローサイトメトリーによって評価した。キメラ化は、コンジェニックＣＤ４５マーカーを使用して評価した。
【０１６０】
フローサイトメトリー
骨髄細胞、胸腺細胞、脾細胞または末梢血細胞を単離し、赤血球細胞（ＲＢＣ）溶解緩衝液を添加してＲＢＣを除去した。細胞は、抗マウスＣＤ１６／３２抗体の存在化で、主要な免疫細胞系列：Ｂ２２０、ＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１９、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、Ｆ４／８０、ＩｇＤ、ＩｇＭおよびＮＫ１．１を包含するマウス細胞表面マーカーに特異的な１５個のマウス蛍光色素がコンジュゲートしたモノクローナル抗体の１：２００希釈物で、４℃で１時間染色した。染色後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。
【０１６１】
造血前駆細胞区画を染色するために、骨髄を単離し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００がコンジュゲートした系列マーカー（Ｂ２２０、ＣＤ３、ＣＤ１１ｂ、Ｌｙ−６Ｇ／６ＣおよびＴｅｒ−１１９）、ＣＤ１６／３２、ＣＤ３４、ＣＤ１３５、ｃ−Ｋｉｔ、ＩＬ−７ＲαおよびＳｃａ−１で、４℃で１時間染色した。染色後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。
【０１６２】
Ｈ−２Ｋｂ（Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  ＭｅｄｉｃｉｎｅのＭＨＣ  Ｔｅｔｒａｍｅｒ  Ｃｏｒｅ）によって提示された卵白アルブミンエピトープペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬに特異的な試薬であるＰＥがコンジュゲートしたＫｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬテトラマーを使用して、水酸化アルミニウム沈殿卵白アルブミンで免疫したマウスにおける抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答および記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞形成を検出した。
【０１６３】
細胞内β−カテニンを検出するために、胸腺をホモジナイズして単一細胞懸濁液を作製し、表面のＣＤ３、ＣＤ２５およびＣＤ４４を染色した。次に、ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキットを使用して細胞を透過処理し、その後細胞内β−カテニンを染色した。データは、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ細胞分析器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）で分析した。
【０１６４】
免疫処置
１２から１６週齢のＧ３マウスまたはＬｍｂｒ１ｌ−／−、Ｃｅｒｓ５−／−および野生型同腹仔をＴ細胞依存性抗原（ＴＤ）水酸化アルミニウム沈殿卵白アルブミン（ＯＶＡ／ａｌｕｍ；２００μｇ；Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）で０日目に免疫処置した（ｉ．ｍ．）。ＯＶＡ／ａｌｕｍ免疫処置の１４日後に、血液をＭｉｎｉＣｏｌｌｅｃｔチューブ（Ｍｅｒｃｅｄｅｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ）に収集し、１，５００×ｇで遠心分離して、ＥＬＩＳＡ分析のために血清を分離した。採血して３日後、以前に記載されたように（２９）、マウスを０日目に別のＴＤ抗原、ｒＳＦＶ−βＧａｌ（２×１０６ＩＵ；（２８））で、８日目にＴ細胞非依存性抗原（ＴＩ）ＮＰ５０−ＡＥＣＭ−Ｆｉｃｏｌｌ（５０μｇ；Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で免疫処置した（ｉ．ｐ．）。ＮＰ５０−ＡＥＣＭ−Ｆｉｃｏｌｌで免疫処置して６日後に、血液をＥＬＩＳＡ分析のために収集した。
【０１６５】
ｉｎ  ｖｉｖｏＣＴＬおよびＮＫ細胞傷害性
細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞エフェクター機能は、標準的なｉｎ  ｖｉｖｏ細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）アッセイによって判定した。簡単に説明すると、脾細胞をナイーブマウスから単離し、半分に分けた。確立された方法（３０）に従って、半分はＣＦＳＥ５μＭ（ＣＦＳＥｈｉ）で染色し、半分はＣＦＳＥ０．５μＭ（ＣＦＳＥｌｏ）で標識した。ＣＦＳＥｈｉ細胞は、Ｈ−２ｂハプロタイプ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ；（３１））を有するマウスのためにＥ．ｃｏｌｉβ−ガラクトシダーゼＭＨＣＩエピトープを有するＩＣＰＭＹＡＲＶペプチド５μＭでパルスした。ＣＦＳＥｌｏ細胞は刺激しなかった。ＣＦＳＥｈｉおよびＣＦＳＥｌｏ細胞を（１：１）で混合し、２×１０６個の細胞を後眼窩注射によってナイーブマウスおよびｒＳＦＶ−βｇａｌで免疫処置したマウスに投与した。養子移植の２４時間後に血液を収集し、フローサイトメトリーによって各集団のＣＦＳＥ強度を評価した。標的（ＣＦＳＥｈｉ）細胞の溶解は溶解％＝［１−（比対照マウス／比ワクチン接種したマウス）］×１００；比＝パーセントＣＦＳＥｌｏ／パーセントＣＦＳＥｈｉとして計算した。
【０１６６】
ＮＫ細胞媒介殺滅を測定するために、対照Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｖｉｏｌｅｔ０．５μＭ；Ｖｉｏｌｅｔｌｏ）およびＢ２ｍ−／−マウス（Ｖｉｏｌｅｔ５μＭ；Ｖｉｏｌｅｔｈｉ）の脾細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔで染色した。ＶｉｏｌｅｔｈｉおよびＶｉｏｌｅｔｌｏ細胞の同数を後眼窩注射によって移植した。移植の２４時間後に血液を収集し、フローサイトメトリーによって各集団のＶｉｏｌｅｔ強度を評価した。溶解％＝［１−（標的細胞／対照細胞）／（Ｂ２ｍ−／−における標的細胞／対照細胞）］×１００。
【０１６７】
ＭＣＭＶ曝露
前述したように（３２）、腹腔内注射によってマウスにＭＣＭＶ（Ｓｍｉｔｈ株；１．５×１０５ｐｆｕ／体重２０ｇ）を感染させた。ウイルス負荷を判定するために、ＭＣＭＶ曝露の５日後にマウスを安楽死させた。個々のマウスの脾臓から抽出された全ＤＮＡを使用して、ＭＣＭＶ前初期１（ＩＥ１）遺伝子および対照ＤＮＡ配列（β−アクチン）のコピー数を測定した。ウイルス力価は、β−アクチンに対するＭＣＭＶ  ＩＥ１のコピー数比として表している。
【０１６８】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＴ細胞活性化
脾臓ＣＤ４５．２＋ＯＴ−ＩおよびＬｍｂｒ１−／−；ＯＴ−Ｉ  Ｔ細胞は、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）マウスＣＤ８＋Ｔ細胞単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して精製した。フローサイトメトリーによって試験したところ、純度は全実験において９５％を上回っていた。細胞はＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｆａｒ  Ｒｅｄ（ＣＤ４５．２＋ＯＴ−Ｉ）５μＭまたはＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ（Ｌｍｂｒ１−／−；ＯＴ−Ｉ）５μＭで標識し、染色した細胞の同数（２×１０６）を後眼窩経路によって野生型ＣＤ４５．１マウスに注射した。翌日、レシピエントにＰＢＳ２００μｌに溶かした可溶性ＯＶＡ１００μｇまたは対照として滅菌ＰＢＳ２００μｌのいずれかを注射した。抗原（ＯＶＡ）特異的Ｔ細胞活性化は、４８時間および７２時間後の分裂中のＯＴ−Ｉ細胞のＦａｒ  ＲｅｄまたはＶｉｏｌｅｔ強度に基づいて分析した。
【０１６９】
恒常性増殖シグナルに応答したＴ細胞の増殖能を評価するために、それぞれビオチン化抗ＣＤ２４ｍＡｂ  Ｍ１／６９（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用したＥａｓｙＳｅｐ（商標）マウス汎Ｔ細胞単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＤｙｎａｌネガティブ選択を使用することによって、脾臓汎Ｔ細胞または成熟ＳＰ胸腺細胞（ＣＤ２４−）を単離した。Ｌｍｂｒ１ｌ−／−、Ｌｍｂｒ１ｌｓｔ／ｓｔまたは野生型同腹仔から単離した汎Ｔまたは成熟ＣＤ２４−胸腺細胞は、それぞれ５μＭのＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔまたはＣｅｌｌＴｒａｃｅＦａｒＲｅｄで染色した。標識されたＬｍｂｒ１ｌ−／−または野生型細胞の１：１または１０：１混合物を、６時間前に致死量以下で照射された（８Ｇｙ）Ｃ４５．１＋マウスまたは照射されていない対照に移植した。養子移植の４または７日後に、脾細胞を調製し、表面をＣＤ４５．１、ＣＤ４５．２について、ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８と一緒に染色し、その後フローサイトメトリーによってＦａｒ  ＲｅｄまたはＶｉｏｌｅｔ色素の希釈を分析した。
【０１７０】
アポトーシスの検出
アネキシンＶ／ＰＩ標識および検出は、ＦＩＴＣ−アネキシンＶアポトーシス検出キットＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、製造業者の指示に従って実行した。
【０１７１】
質量分析
以下に記載したように、Ｌｍｂｒ１ｌ相互作用タンパク質を同定するために共免疫沈降法および質量分析を実行した。トランスフェクションは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）において、リポフェクタミン２０００試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、Ｆｌａｇタグ化ヒトＬｍｂｒ１ｌまたは空のベクター対照をコードするプラスミドを用いて実行した。トランスフェクションの４８時間後、細胞をＮＰ−４０溶解緩衝液中に４℃で４５分間採取した。免疫沈降は、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アフィニティーゲル（Ｓｉｇｍａ）を使用して４℃で２時間実行し、ビーズはＮＰ−４０溶解緩衝液で６回洗浄した。タンパク質は、ＳＤＳ試料緩衝液で溶出し、９５℃で１０分間加熱した。溶解物を１２％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに添加し、分離ゲルに約１ｃｍ泳動させた。ゲルをクーマシーブルー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で染色し、染色した列全てについて前述したように（３３）質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を行った。
【０１７２】
タンパク質アレイ
ＰｒｏｔｏＡｒｒａｙヒトタンパク質マイクロアレイＶ５．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、製造業者の指示に従って、ヒトＬｍｂｒ１ｌ相互作用タンパク質を同定した。簡潔には、Ｆｌａｇ（Ｎ末端）およびＶ５（Ｃ末端）タグ化組換えヒトＬｍｂｒ１ｌタンパク質をトランスフェクションによってＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現させ、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アフィニティーゲル（Ｓｉｇｍａ）で精製した。タンパク質におけるＦｌａｇおよびＶ５タグの存在は、標準的なイムノブロットによって確認した。
【０１７３】
精製した組換えＦｌａｇ−ヒトＬＭＢＲ１Ｌ−Ｖ５を最終濃度５０μｇ／ｍｌで使用して、ヒトＶ５．１ＰｒｏｔｏＡｒｒａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をプロービングした。アレイの組換えタンパク質の結合は、Ｐｒｏｔｏａｒｒａｙブロッキング緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１：１，０００に希釈したストレプトアビジンＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７を用いて検出した。アレイは、ＧｅｎｅＡｒｒａｙ４０００Ｂスキャナー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して６３５ｎｍでスキャンした。結果は複数のＴＩＦＦファイルとして保存し、Ｇｅｎｅｐｉｘ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒソフトウェア、バージョン７を使用して分析した。
【０１７４】
形質膜または小胞体の単離
形質膜または小胞体のタンパク質は、Ｐｉｅｒｃｅ細胞表面タンパク質単離キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）または小胞体濃縮抽出キット（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）をそれぞれ使用して、製造業者の指示に従って単離した。
【０１７５】
統計学的解析
群間の差の統計学的有意差は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して示した統計学的検定を実行することによって解析した。群間の生値における差は、Ｐ＜０．０５のとき統計学的に有意と見なした。Ｐ値は、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１によって示され；ＮＳはＰ＞０．０５で有意差無しである。
【０１７６】
参考文献： 
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【０１７７】
［実施例２］
ＬＭＢＲ１Ｌモノクローナル抗体の生成
ＮＣＢＩマウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／７４７７５）Ｌｍｂｒ１ｌおよびヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／５５７１６）（図２）ＬＭＢＲ１Ｌに基づいて、ＥＳＴライブラリーは、３個（ＮＰ＿０８３３７４．１、ＸＰ＿０１１２４４０６０．１およびＸＰ＿０１７１７２２６２．１）および１５個（ＮＰ＿０６０５８３．２、ＮＰ＿００１２８７６７９．１、ＮＰ＿００１２８７６８０．１、ＮＰ＿００１３３９０９０．１、ＮＰ＿００１３３９０９１．１、ＮＰ＿００１３３９０９２．１、ＮＰ＿００１３３９０９３．１、ＮＰ＿００１３３９０９４．１、ＮＰ＿００１３３９０９６．１、ＸＰ＿０１６８７５１１７、ＸＰ＿０１６８７５１１８、ＸＰ＿０１６８７５１１６、ＸＰ＿０１６８７５１１５、ＸＰ＿０１６８７５１２０およびＸＰ＿０１１５３６８６６）の断片はそれぞれ代替スプライシング翻訳物として予測されると判定した。ヒトＮＰ＿０６０５８３．２およびマウスＮＰ＿０８３３７４．１はカノニカルＬＭＢＲ１Ｌタンパク質として、９個の膜貫通ドメインを有する４８９残基の長さである。ヒトＬＭＢＲ１Ｌタンパク質は、マウスＬＭＢＲ１Ｌタンパク質と９７％同一性を有する（図２０）。図１Ｂでは、カノニカルヒトＬＭＢＲ１Ｌの５個の細胞外ドメインに印をつけた。この分析に基づくと、ＬＭＢＲ１Ｌ抗体などの抗ヒトＬＭＢＲ１Ｌ阻害剤の候補である５個の標的化可能な細胞外ペプチド配列が存在する。
【０１７８】
５個の細胞外ドメイン（それぞれアミノ酸１〜２１、８８〜１１４、１７６〜１９６、３２７〜３５０および４１０〜４３１、図１Ｂを参照のこと）のいずれか１つまたは複数の一部は、完全長とは対照的に、免疫源として使用することもできる。当技術分野で知られている様々な方法および本明細書で開示した方法を使用して、モノクローナル、完全ヒトまたはヒト化抗ＬＭＢＲ１Ｌ抗体を生成することができる。例えば、前述のように、完全ヒトＬＭＢＲ１Ｌ抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーから産生することができる。ヒト化抗ＬＭＢＲ１Ｌ抗体は、ハイブリドーマから得られたヒト化モノクローナル抗体によって調製することができる。
【０１７９】
アプローチ例には、以下を含めることができる。
１．ＬＭＢＲ１Ｌタンパク質の細胞外ループと反応する結合抗体を同定するためにファージディスプレイを使用して、リポソームでタンパク質を発現させることによってディスプレイすること。
２．このような結合抗体を発見したら、ヒトリンパ球細胞を使用してＬＭＢＲ１Ｌ活性の阻害を再スクリーニングすること。抗体を添加した後で核β−カテニンおよび細胞内のｃ−Ｍｙｃの上昇を測定することによって、活性の阻害を検出する。
３．抗体ＦａｂまたはＩｇＧ分子を産生するために親和性および操作を最適化すること。
【０１８０】
ＬＭＢＲ１Ｌタンパク質は、ヒトおよびマウスの間で強く保存されている（図２０）。ファージディスプレイを使用すると、両種と反応する試薬を生成しやすく、前臨床および臨床試験に有用である。
【０１８１】
別の実施例では、アフィニティクロマトグラフィによる精製に好適なＣ末端Ｈｉｓタグを免疫原に付加することができる。精製したタンパク質は、好適なアジュバントと一緒にマウスに接種することができる。ハイブリドーマで産生されたモノクローナル抗体は、免疫原への結合を試験することでき、陽性結合剤は、前述のアッセイでヒトリンパ球細胞におけるβ−カテニン、ＦＲＩＺＺＬＥＤ−６、ＺＮＲＦ３および／またはｃ−Ｍｙｃ発現に影響を与える能力について（例えば、Ｔ細胞依存性およびＴ細胞非依存性抗体応答の減少、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞およびＮＫ  Ｔ細胞の減少）スクリーニングすることができる。したがって、抗体は前臨床および臨床試験のためにヒト化することができる。
【０１８２】
細胞表面分子として、ＬＭＢＲ１Ｌは抗体による阻害を利用しやすい。これによって変異の効果を模倣できることがかなり期待されるだろう。ＬＭＢＲ１Ｌの抗体阻害剤は、例えば、移植片対宿主病、同種移植片拒絶または全身性エリテマトーデス、橋本甲状腺炎、グレーブス病、糖尿病Ｉ型、多発性硬化症および関節リウマチを含む（ただしこれらに限定されない）自己免疫疾患を阻止するために使用することができよう。
【０１８３】
核への活性β−カテニンの放出によってＷｎｔ受容体が解離すると、プログラム細胞死を介してＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞およびＮＫ  Ｔ細胞（それほど活性化されていない細胞）を含む活性化リンパ球細胞全ての急速な死をもたらすので、このような抗体の投与が疾患発症後に効果的であると期待することも合理的である。離乳年齢で観察されるホモ接合体の数が予想より少ないため、ＬＭＢＲ１Ｌには発達上の要件がいくつか存在する可能性があるが、免疫異常以外の成熟したホモ接合型ノックアウトマウスの異常は不明であり、Ｗｎｔシグナル伝達経路のこの構成成分は、少なくとも発達後はおそらくその作用は免疫特異的であることが示唆される。ＬＭＢＲ１Ｌに対する抗体は、シクロホスファミドなどの化学的細胞減少試薬または抗リンパ球グロブリンなどの抗体よりも選択性が高いだろう。
【０１８４】
その他の実施形態
本開示の種々の態様は、単独で、組み合わせで、または前述の実施形態で具体的に論じられていない様々な配置で使用することができ、したがって、その適用において、前記の説明で記載されている、または図面に示されている構成成分の詳細および配置に限定されない。例えば、一実施形態で記載された態様は、その他の実施形態で記載された態様とどのような方法によっても組み合わせることができる。
【０１８５】
本開示の具体的な実施形態が論じられているが、上記の明細書は例示的であり、限定的ではない。本明細書を検討することによって当業者には本開示には多くの変更が明らかになるであろう。開示の全範囲は、同等物の全範囲とともにクレームを、そのような変更とともに明細書を参照することにより決定するべきである。
【０１８６】
引用による組み込み
本明細書で参照されている刊行物、特許および特許出願全ては、個々の刊行物、特許または特許出願が参照によりそのように組み込まれることが具体的に示された場合と同じ程度に、全目的のためにその全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
2021530457.tif 000031
【図２４】
2021530457.tif 000032
【図２５】
2021530457.tif 000033
【図２６】
2021530457.tif 000034
【図２７】
2021530457.tif 000035
【図２８】
2021530457.tif 000036
【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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