(57)【要約】  一実施形態では、本発明は、鉄欠乏症およびその関連する貧血を治療するための治療剤としてのエンテロバクチン（Ｅｎｔ）、および／またはＥｎｔアナログの使用に関する。好ましい実施形態では、Ｅｎｔおよび／またはＥｎｔアナログは、鉄関連疾患状態を治療するために、宿主生物、例えば、ヒト対象に送達され得る。このような実施形態では、Ｅｎｔおよび／またはＥｎｔアナログは、薬学的組成物を介して、および／または遺伝子操作細菌、またはプロバイオティクス生物を介して、それを必要とするヒト対象に送達され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
鉄欠乏症の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、治療有効量のエンテロバクチン（Ｅｎｔ）、またはまたはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記治療有効量のＥｎｔは単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記治療有効量のＥｎｔは、前記治療有効量のＥｎｔアナログを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｅｎｔアナログは、ＴＲＥＮＣＡＭ、ＳＥＲＳＡＭ、ＳＥＲ（３Ｍ）ＳＡＭ、ＴＲＥＮＳＡＭおよびＴＲＥＮ（３Ｍ）ＳＡＭからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｅｎｔまたは前記Ｅｎｔアナログが、薬学的に許容される担体と混ぜ合わせられる、請求項１または４に記載の方法。
【請求項６】
前記薬学的に許容される担体は、栄養補助食品である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記鉄欠乏症は、鉄欠乏性貧血を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記鉄欠乏症の治療を必要とする前記対象が、ヒト対象を含む、請求項１および７に記載の方法。
【請求項９】
鉄欠乏症の予防を必要とする対象においてそれを行う方法であって、予防有効量のエンテロバクチン（Ｅｎｔ）、またはまたはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法。
【請求項１０】
前記治療有効量のＥｎｔは単離される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記治療有効量のＥｎｔは、前記治療有効量のＥｎｔアナログを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｅｎｔアナログは、ＴＲＥＮＣＡＭ、ＳＥＲＳＡＭ、ＳＥＲ（３Ｍ）ＳＡＭ、ＴＲＥＮＳＡＭおよびＴＲＥＮ（３Ｍ）ＳＡＭからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｅｎｔまたは前記Ｅｎｔアナログが、薬学的に許容される担体と混ぜ合わせられる、請求項９または１４に記載の方法。
【請求項１４】
前記薬学的に許容される担体は、栄養補助食品である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記鉄欠乏症は、鉄欠乏性貧血を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記鉄欠乏症の予防を必要とする前記対象が、ヒト対象を含む、請求項９および１５に記載の方法。
【請求項１７】
対象における鉄欠乏症の治療のための治療剤であって、以下の一般式（Ｉ）で表される活性成分
【化１】
2021530515.tif 000012
と、薬学的に許容される担体とを含む、治療剤。
【請求項１８】
前記治療有効量の前記式Ｉの化合物は単離される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記治療有効量の前記式Ｉの化合物は、前記治療有効量の前記式Ｉの化合物のアナログを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記式Ｉの化合物の前記アナログは、
【化２】
2021530515.tif 000013
2021530515.tif 000014
からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記式Ｉ〜ＶＩの化合物が、薬学的に許容される担体と混ぜ合わせられる、請求項１７または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記薬学的に許容される担体は、栄養補助食品である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記鉄欠乏症は、鉄欠乏性貧血を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記鉄欠乏症の予防を必要とする前記対象が、ヒト対象を含む、請求項１７および２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記栄養補助食品が、プロバイオティクス細菌を含む、請求項６、１４および２２に記載の方法。
【請求項２６】
鉄欠乏症の治療を必要とする対象においてそれを行うための遺伝子組換えプロバイオティクス細菌であって、エンテロバクチン（Ｅｎｔ）の生合成のための１つ以上の遺伝子をコードするプロモータに作動可能に連結された異種ヌクレオチドを発現するように構成されたプロバイオティクス細菌を含む、遺伝子組換えプロバイオティクス細菌。
【請求項２７】
前記プロバイオティクス細菌は、エンテロバクタープロバイオティクス細菌を含む、請求項２６に記載の遺伝子組換え細菌。
【請求項２８】
Ｅｎｔの生合成のための１つ以上の遺伝子をコードするプロモータに作動可能に連結された前記異種ヌクレオチドは、ｅｎｔＡ  ｅｎｔＢ、ｅｎｔＣ、ｅｎｔＤ、ｅｎｔＥ、ｅｎｔＦからなる群から選択される遺伝子のうちの１つ以上をコードするプロモータに作動可能に連結された異種ヌクレオチドを含む、請求項２６に記載の遺伝子組換え細菌。
【請求項２９】
Ｅｎｔの生合成のための１つ以上の遺伝子をコードするプロモータに作動可能に連結された前記異種ヌクレオチドは、配列番号１〜６からなる群から選択されるアミノ酸配列のうちの１つ以上をコードするプロモータに作動可能に連結された異種ヌクレオチドを含む、実施形態２６に記載の遺伝子組換え細菌。
【請求項３０】
前記鉄欠乏症の治療を必要とする前記対象がヒト対象である、請求項２６に記載の遺伝子組換え細菌。
【請求項３１】
前記鉄欠乏症は、鉄欠乏性貧血を含む、請求項３０に記載の遺伝子組換え菌。
【請求項３２】
鉄欠乏症の治療を必要とする対象においてそれを行うための栄養補給組成物であって、エンテロバクチン（Ｅｎｔ）の生合成のための１つ以上の遺伝子をコードするプロモータに作動可能に連結された異種ヌクレオチドを発現するように構成されたプロバイオティクス細菌と、賦形剤と、を含む、栄養組成物。
【請求項３３】
前記プロバイオティクス細菌は、エンテロバクタープロバイオティクス細菌を含む、請求項３２に記載の栄養組成物。
【請求項３４】
Ｅｎｔの生合成のための１つ以上の遺伝子をコードするプロモータに作動可能に連結された前記異種ヌクレオチドは、ｅｎｔＡ  ｅｎｔＢ、ｅｎｔＣ、ｅｎｔＤ、ｅｎｔＥ、ｅｎｔＦからなる群から選択される遺伝子の１つ以上をコードするプロモータに作動可能に連結された異種ヌクレオチドを含む、請求項３２に記載の栄養組成物。
【請求項３５】
Ｅｎｔの生合成のための１つ以上の遺伝子をコードするプロモータに作動可能に連結された前記異種ヌクレオチドは、配列番号１〜６からなる群から選択されるアミノ酸配列のうちの１つ以上をコードするプロモータに作動可能に連結された異種ヌクレオチドを含む、請求項３２に記載の遺伝子組換え細菌。
【請求項３６】
前記鉄欠乏症の治療を必要とする対象がヒト対象である、請求項３２に記載の栄養組成物。
【請求項３７】
前記鉄欠乏症は、鉄欠乏性貧血を含む、請求項３６に記載の栄養組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この国際ＰＣＴ出願は、２０１８年７月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／７００，４８０号の利益および優先権を主張する。上に参照された出願の明細書および図面全体が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、宿主動物における個々の微生物叢由来の分子の新規な利点に関する。例えば、細菌分泌するエンテロバクチン（Ｅｎｔ）は、宿主に悪影響があると推定される鉄除去型のシデロホアである。しかしながら、ヒト腸内のＥｎｔ産生共生細菌の高罹患率は、鉄代謝に関連する疾患状態、特に、鉄欠乏症を治療するためにＥｎｔを有益に使用するための潜在的な宿主機構を示す。新規かつ独自のアッセイによって、本願発明者らは、例示的な真核宿主生物における成長および不安定な鉄プールを補助する上でＥｎｔの予測されない顕著な役割を発見した。本願発明者らは、Ｅｎｔが、驚くべきことに、ミトコンドリアの内側でＡＴＰシンターゼとは独立して作用するＡＴＰシンターゼαサブユニットに結合することによって、ミトコンドリアの鉄取り込みを促進し、これを行うことを示した。本願発明者らはまた、哺乳動物細胞においてこの機構が保存されていることを示した。この研究は、共生細菌とその宿主との間の「鉄の取り合い（ｉｒｏｎ  ｔｕｇ−ｏｆ−ｗａｒ）」の新しいパラダイムと、ミトコンドリアの鉄取り込みおよび恒常性のための重要な機構を明らかにする。
【背景技術】
【０００３】
鉄欠乏症は、最も高頻度で起こる栄養失調障害であり、貧血の最も一般的な原因であり、世界保健機関（ＷＨＯ）および他の文献（Ｓｔｅｖｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、２０１３；ＷＨＯ、２０１５）による分析に基づき、世界人口の４分の１より多く、特に、女性および子供に影響を及ぼしている。貧血はまた、世界の身体障害の約９％を占めている。重要なことに、この障害の主な治療である経口鉄分補給には、重大な問題がある。第１に、経口鉄分補給は、一部には鉄取り込みをブロックするホルモン変化（ヘプシジンの増加）を誘発するため、有効性が非常に低い（Ｍｕｃｋｅｎｔｈａｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２０１７）（ＣｏｏｋおよびＲｅｄｄｙ、１９９５；Ｍｏｒｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．、２０１５）。第２に、この治療は、特に他の疾患を有する人々の死亡率の増加につながり得る周知の有害な副作用を有する（Ｓａｚａｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．、２００６）。例えば、経口鉄分補給は、いくつかの有害な副作用の原因となり得るフリーラジカルおよびヒト微生物叢組成物の好ましくない変化を誘導することによって、炎症を促進することが既知である（Ｊａｅｇｇｉ  ｅｔ  ａｌ．、２０１５；Ｋｏｒｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２０１５；Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９；Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２０１７）。貧血が、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）などの一般的なＧＩ疾患を有する人々の間で非常に高頻度で起こることも既知である（米国では、５０％を超えるＩＢＤ患者が貧血でもある）（Ｋｏｕｔｒｏｕｂａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、２０１５）。他のＧＩ疾患に罹患している患者を含め、多くの貧血患者は、経口鉄分補給に完全には耐えることができず、健康リスクおよび副作用との関連でも周知である静脈内注入を必要とする（ＡｕｅｒｂａｃｈおよびＭａｃｄｏｕｇａｌｌ、２０１７；Ｍｕｎｏｚ  ｅｔ  ａｌ．、２００９）。鉄トラフィッキング系における欠陥は、特定の鉄欠乏性貧血の原因であり（Ｂｒｉｓｓｏｔ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１）、鉄取り込み効率の増加は、ほとんどの貧血患者のための変革的な治療の鍵となり得る。
【０００４】
以下で詳細に説明するように、本願発明者らは、エンテロバクチン（Ｅｎｔ）が、高レベルの経口鉄分補給およびその関連する副作用がなく、鉄吸収の効率を増加させる可能性があることを示す。実際、この知見の予期されない臨床的意義は、一流雑誌における専門家の解説で認識された（Ａｎｄｅｒｓｏｎ、２０１８）。例えば、２０１８年１１月のＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＮＥＪＭ）中の記事は、本願発明者らの基礎研究の新規かつ予期されない臨床的意味合いを強調し、ヒトにおけるいくつかの細胞型においてＥｎｔが鉄をミトコンドリアに入れる予想される能力を強調した（Ｇｒｅｇｏｒｙ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ：「Ｉｒｏｎ  Ｗａｒｓ−Ｔｈｅ  Ｈｏｓｔ  Ｓｔｒｉｋｅｓ  Ｂａｃｋ」ＮＥＪＭ  ２０１８）（図１７）。特に、Ｅｎｔは、環境から鉄を除去するためにエンテロバクテリアによってほぼ排他的に産生されるカテコレートシデロホアである。シデロホアが病原体の主要な毒性媒介物であることが既知であることを考慮すると、Ｅｎｔの除去役割は、宿主における鉄恒常性および特定の細胞プロセスに悪影響を与えると予想される。宿主細胞から鉄を除去するためにＥｎｔに依存する病原性細菌の成長を阻害するために、哺乳動物の免疫系は、Ｅｎｔを隔離するＥｎｔ結合タンパク質リポカリン２を産生する。このような防御系は、宿主の鉄プールおよび動物の機能に悪影響を及ぼし得る。より重要なことに、この機構は、宿主動物が、非感染性腸微生物叢の豊富なＥｎｔにどのように対処するかを説明するものではなく、その中でエンテロバクテリアは、ヒトおよびＣ．ｅｌｅｇａｎｓの両方で最も一般的な共生微生物である。共生Ｅ．ｃｏｌｉと宿主との間の共生関係を考慮すると、宿主の鉄恒常性のために細菌Ｅｎｔを使用するために、動物において進化した未知の有益な機構が存在する可能性がある。
【０００５】
ミトコンドリアへの鉄輸送は、鉄恒常性における重要な事象であり、細胞の不安定な鉄不足の多くが、ヘムおよびＦｅ−Ｓ複合体に組み込まれるミトコンドリアに輸送される（Ｍｕｃｋｅｎｔｈａｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２０１７）。ヒトにおいて、通常の条件下では、鉄の約７０％がヘモグロビンで見出される（Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｅｎｎｓ、２００９）。ヘム生合成の鉄結合工程はミトコンドリアで行われるため、ミトコンドリアへの鉄輸送は、ヘモグロビン産生または赤血球形成に重要である。ヘモグロビン数が低い貧血状態では、さらにより高い割合の鉄をミトコンドリアに輸送する必要がある。
【０００６】
実際、細菌によって使用されるＥｎｔ補給には、いくつかの有益な効果が存在する可能性がある。一実施形態では、このことは、Ｅｎｔを利用する細菌（主にヒトにおけるＥ．ｃｏｌｉ）の有病率を高め得る、より多くのＥｎｔを有することを含んでいてもよく、場合によっては、優れた治療効果を有する場合がある。実際、共生Ｅ．ｃｏｌｉが少なすぎると、貧血または他の不健康な状態の原因となることがある。共生Ｅ．ｃｏｌｉの有病率は、集合体間で異なる。別の例では、腸微生物叢組成の（不健康なものへの）変化は、経口鉄分補助食品を摂取することの非常に有意な負の副作用であることが現在周知である。Ｅｎｔを摂取することにより、有効な鉄補助食品の用量を劇的に減らすことが可能な場合、患者は、腸微生物叢組成の望ましくない変化を潜在的に最小限にすることによって、強力な全体的利益を得る可能性がより高い。
【０００７】
これに加えて、哺乳動物宿主免疫応答の一部として、リポカリン２発現は、病原体の攻撃によって誘導され、特定の感染性細菌の増殖から利益を受けることから、Ｅｎｔおよびその結合した鉄を捕捉する目的で、Ｅｎｔに結合することが既知である。したがって、この感染条件下でより多くのＥｎｔを添加すると、これらの細菌との戦いにおけるリポカリン２の役割を妨げる可能性がある。しかしながら、この懸念は、貧血を治療するためのＥｎｔの潜在的な治療的使用に対する重大な障害とはならない可能性がある。第１に、リポカリン２の抗感染効果は、細菌のための低鉄環境を実際に作り出すことであるため、経口補給によって高レベルの鉄を摂取することは、貧血患者におけるリポカリン２による計画を譲歩させるという点で、Ｅｎｔよりも鉄飢餓状態の感染性細菌に利益をもたらす強い効果を有する可能性がある。細菌が、Ｅｎｔに依存しない様式で鉄を取り込むことができ、低鉄条件下で細菌のみがＥｎｔを必要とすることを忘れないようにする必要がある。したがって、この観点で、Ｅｎｔの潜在的な副作用は、経口鉄を摂取する必要がある貧血患者において、既に存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、細菌のＥｎｔ分子生物学に関与する分子成分および宿主相互作用の同定および特性決定のための当技術分野での実質的な必要性が依然として存在する。特に、動物およびヒトにおける鉄に関連する疾患状態を調節し、治療するために使用され得る、Ｅｎｔに基づく療法および薬学的組成物の開発のための新規なシステム、方法および組成物の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
一実施形態では、本願発明者らは、動物発育に対するＥ．ｃｏｌｉ遺伝子の影響を試験するための独自かつ感度の高いアッセイを示す。特に、本願発明者らは、共生細菌によって産生されるシデロホア（エンテロバクチン、またはＥｎｔ）が宿主生理学に及ぼす影響に関する新しいパラダイムを特定した。本願発明者らは、Ｅｎｔが、宿主動物におけるミトコンドリア鉄レベルを促進し、宿主発育に有益な影響を与えることを発見した。Ｅｎｔは、宿主ミトコンドリアＡＴＰシンターゼのαサブユニットに結合することによってこの機能を実施し、この結合は、ＡＴＰシンターゼ複合体全体とは独立している。この以前には未知の機構は、細菌Ｅｎｔの除去の役割と、宿主の不安定な鉄プールに対するその影響と対立する場合があり（図７）、この機能は、微生物と動物との間の共生関係を強化すべきである。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓとヒトとの間のこの機能の保存に起因して、本発明は、両動物種の腸内のエンテロバクテリアの高罹患率、および哺乳動物における共存Ｅ．ｃｏｌｉがＥｎｔを産生する能力と一致し得る。この新規な本発明技術は、微生物と宿主細胞との間の競争（鉄の「取り合い」）に関する新しいパラダイムを示し、このことは、病原性細菌に対する防御機構としてＥｎｔに結合する十分に研究された哺乳動物リポカリン２の機能とは異なる（図７）。
【００１０】
鉄欠乏症は、世界中の多くの子供および女性の群の健康を脅かす、最も高頻度で起こる栄養障害の１つである（ＷＨＯ、２００２）。種々の鉄に結合するシデロホアを産生するヒト腸微生物叢の組成および挙動は、この障害の発生および治療に高い影響を及ぼし得る。本発明は、Ｅｎｔ、ならびに動物およびヒトモデルにおけるＥｎｔの補給が、低鉄条件下および高鉄条件下の両方での鉄取り込みおよび成長を容易にすることを示し、このことは、ひいては、腸内の鉄レベルが、通常は腸微生物叢からのＥｎｔ産生の完全な抑制を引き起こす高さには達しないことを示唆している。追加のＥｎｔ補給が、鉄欠乏条件下での鉄レベルおよび動物成長に及ぼす顕著な影響（図２Ｇ）は、微生物叢の組成破壊が、ヒトの鉄欠乏症の障害に著しく寄与し得ることと、本発明の特定の一実施形態として、この広範囲に広がるヒトの健康問題に対する治療としてのＥｎｔ補給の可能性を示唆する。
【００１１】
本願発明者らは、ＡＴＰシンターゼα−サブユニットが、共輸送モデルによるミトコンドリアの鉄取り込みを容易にする可能性が低いという実験的な証拠も提供しており、ここで、Ｅｎｔ−Ｆｅは、ＡＴＰシンターゼα−サブユニットがミトコンドリアに運ばれるときに単純にそれに乗せられ得る。その代わりに、本発明の一実施形態では、輸送の保持モデルを示し、ミトコンドリア内のＡＴＰシンターゼα−サブユニットが、Ｅｎｔ−Ｆｅに結合してこれを保持し、このことは、Ｅｎｔ−Ｆｅが、受動的な機構またはタンパク質輸送体を伴うシステムを介してミトコンドリアに出入りし得ることを暗示している。最近の哺乳動物細胞における研究は、Ｅｎｔが、浸透によって哺乳動物細胞に入ることができることを示唆したが、一方、酵母における研究は、Ｅｎｔを真菌細胞にトラフィッキングすることができる輸送体を示した。一実施形態では、この保持モデル下で、Ｅｎｔ−Ｆｅも、ＡＴＰシンターゼα−サブユニットと相互作用することなくミトコンドリアを出るため、受動的な拡散は、より単純であると思われる。
【００１２】
本発明の技術は、さらに、ミトコンドリアの鉄保持におけるＡＴＰシンターゼα−サブユニットの役割が、ＡＴＰシンターゼとは独立している可能性が高いことを示し、他のサブユニットとの相互作用も、その酵素活性も必要としない。したがって、Ｅｎｔ−Ｆｅ３＋は、ミトコンドリア内に局在化するが、ＡＴＰシンターゼとは物理的に切り離されているＡＴＰシンターゼα−サブユニットと相互作用することができるだろう。しかしながら、一実施形態では、α−サブユニットが、野生型動物においてＡＴＰシンターゼから離れた部位に局在化する場合があり、その結果、Ｅｎｔがβ−サブユニット非存在下でα−サブユニットと相互作用することが可能であっても、Ｅｎｔは、通常条件下でＡＴＰシンターゼと会合するα−サブユニットに依然として結合し得る。
【００１３】
ミトコンドリアへの鉄の取り込みは、不安定な鉄プールレベルの調節に重大に寄与するが、このプロセスの機構はまだ理解されていない。本願発明者らのＣ．ｅｌｅｇａｎｓの分析において、不安定な鉄レベルに対するＥｎｔおよびＡＴＰ−１の影響は、かなり顕著である（図２および４）。これらの影響は、ＥｎｔおよびＡＴＰシンターゼα−サブユニットを伴うこの新たに発見されたシステムが、ミトコンドリアへの鉄の取り込みの根底にある重要な機構を表すことを示しており、Ｅｎｔ産生エンテロバクテリアがＣ．ｅｌｅｇａｎｓおよびヒトの両方において最も一般的な共生微生物であることがわかっている。これに加えて、本明細書に記載の本発明技術の特定の実施形態は、ミトコンドリアへの鉄トラフィッキングに関与する他の系の理解に重大な影響を及ぼし得る機構を示し得る。例えば、保持モデルは、哺乳動物のシデロホアを含む他の鉄担体の機能にも関与し得る。本明細書に記載の本発明技術は、さらに、宿主生理学および動物と腸微生物叢との間の共生関係に対する個々の微生物叢が生成した代謝産物の影響を調べるためにＣ．ｅｌｅｇａｎｓを使用する価値を示し、また、鉄欠乏症に関連する疾患状態に罹患し得るか、またはそのリスクがあるヒトおよび動物におけるＥｎｔの治療的補給を提供する。
【００１４】
したがって、本発明は、動物における鉄レベルおよび成長の主要な調節因子として細菌Ｅｎｔを同定し、特性決定する。本発明の１つの目的は、動物の成長および鉄レベル（複数可）を支えることにおける細菌Ｅｎｔの役割を明らかにする例示的な真核生物モデル生物（この場合はＣ．ｅｌｅｇａｎｓ）における新規アッセイのためのシステム、方法、および組成物を含み得る。
【００１５】
本発明の別の態様は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓおよび哺乳動物の両方においてミトコンドリアの鉄取り込みを容易にする、ＥｎｔとＡＴＰシンターゼαサブユニットとの間の相互作用を示すシステム、方法、および組成物を含む。
【００１６】
本発明のさらに別の態様は、ＡＴＰシンターゼα−サブユニットとの相互作用を介して宿主の鉄恒常性を促進するＥｎｔの使用を含む。この好ましい実施形態では、Ｅｎｔ補給は、１つ以上の鉄欠乏症に関連する疾患状態を治療するための治療剤として利用され得る。この好ましい実施形態では、治療有効量のＥｎｔ補給を、それを必要とする対象に導入してもよい。Ｅｎｔの送達は、薬学的組成物を介して、または外因性、修飾された、および／または内因性Ｅｎｔを産生／過剰産生するように構成された遺伝子操作されたプロバイオティクスおよび／または共生細菌の導入を介して行われてもよい。
【００１７】
本発明の別の態様は、鉄欠乏症に関連する状態およびそれらに関連する貧血を治療するシステム、方法および組成物をさらに含み得る。１つの好ましい実施形態では、鉄欠乏症に関連する状態およびそれらに関連する貧血を治療し、および／または予防的に予防するそのようなシステム、方法および組成物は、本明細書に記載のＥｎｔ補給を含んでいてもよい。
【００１８】
本発明のさらなる態様は、鉄関連疾患状態のバイオマーカーとしてのＥｎｔおよび／またはＡＴＰ−１の使用のためのシステム、方法および組成物、ならびに鉄欠乏関連疾患状態を診断するための診断バイオマーカー、および／または鉄欠乏症に関連する疾患状態に対する対象の感受性を診断するための診断バイオマーカーを含んでいてもよい。
【００１９】
本発明の追加の態様は、以下の実施形態のうちの１つ以上を含んでいてもよい。
１．鉄欠乏症の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、治療有効量のエンテロバクチン（Ｅｎｔ）、またはまたはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法。
２．上述の治療有効量のＥｎｔは単離される、実施形態１に記載の方法。
３．上述の治療有効量のＥｎｔは、上述の治療有効量のＥｎｔアナログを含む、実施形態１に記載の方法。
４．上述のＥｎｔアナログは、ＴＲＥＮＣＡＭ、ＳＥＲＳＡＭ、ＳＥＲ（３Ｍ）ＳＡＭ、ＴＲＥＮＳＡＭおよびＴＲＥＮ（３Ｍ）ＳＡＭからなる群から選択される、実施形態３に記載の方法。
５．上述のＥｎｔまたは上述のＥｎｔアナログが、薬学的に許容される担体と混ぜ合わせられる、実施形態１または４に記載の方法。
６．上述の薬学的に許容される担体は、栄養補助食品である、実施形態５に記載の方法。
７．上述の鉄欠乏症は、鉄欠乏性貧血を含む、実施形態１に記載の方法。
８．上述の鉄欠乏症の治療を必要とする上述の対象が、ヒト対象を含む、実施形態１および７に記載の方法。
９．鉄欠乏症の予防を必要とする対象においてそれを行う方法であって、予防有効量のエンテロバクチン（Ｅｎｔ）、またはまたはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法。
１０．上述の治療有効量のＥｎｔは単離される、実施形態９に記載の方法。
１１．上述の治療有効量のＥｎｔは、上述の治療有効量のＥｎｔアナログを含む、実施形態９に記載の方法。
１２．上述のＥｎｔアナログは、ＴＲＥＮＣＡＭ、ＳＥＲＳＡＭ、ＳＥＲ（３Ｍ）ＳＡＭ、ＴＲＥＮＳＡＭおよびＴＲＥＮ（３Ｍ）ＳＡＭからなる群から選択される、実施形態１１に記載の方法。
１３．上述のＥｎｔまたは上述のＥｎｔアナログが、薬学的に許容される担体と混ぜ合わせられる、実施形態９または１４に記載の方法。
１４．上述の薬学的に許容される担体は、栄養補助食品である、実施形態１３に記載の方法。
１５．上述の鉄欠乏症は、鉄欠乏性貧血を含む、実施形態９に記載の方法。
１６．上述の鉄欠乏症の予防を必要とする上述の対象が、ヒト対象を含む、実施形態９および１５に記載の方法。
１７．対象における鉄欠乏症の治療のための治療剤であって、以下の一般式（Ｉ）で表される活性成分
【化１】
2021530515.tif 000002
と、薬学的に許容される担体とを含む、治療剤。
１８．上述の治療有効量の式Ｉの化合物は単離される、実施形態１７に記載の方法。
１９．上述の治療有効量の式Ｉの化合物は、上述の治療有効量の式Ｉの化合物のアナログを含む、実施形態１７に記載の方法。
２０．式Ｉの化合物の上述のアナログは、
【化２】
2021530515.tif 000003
2021530515.tif 000004
からなる群から選択される、実施形態１９に記載の方法。
２１．上述の式Ｉ〜ＶＩの化合物が、薬学的に許容される担体と混ぜ合わせられる、実施形態１７または２０に記載の方法。
２２．上述の薬学的に許容される担体は、栄養補助食品である、実施形態２１に記載の方法。
２４．上述の鉄欠乏症は、鉄欠乏性貧血を含む、実施形態１７に記載の方法。
２５．上述の鉄欠乏症の治療を必要とする上述の対象が、ヒト対象を含む、実施形態１７および２４に記載の方法。
２６．上述の栄養補助食品が、プロバイオティクス細菌を含む、実施形態６、１４および２２に記載の方法。
２７．鉄欠乏症の治療を必要とする対象においてそれを行うための遺伝子組換えプロバイオティクス細菌であって、エンテロバクチン（Ｅｎｔ）の生合成のための１つ以上の遺伝子をコードするプロモータに作動可能に連結された異種ヌクレオチドを発現するように構成されたプロバイオティクス細菌を含む、遺伝子組換えプロバイオティクス細菌。
２８．上述のプロバイオティクス細菌は、エンテロバクタープロバイオティクス細菌を含む、実施形態２７に記載の遺伝子組換え細菌。
２９．Ｅｎｔの生合成のための１つ以上の遺伝子をコードするプロモータに作動可能に連結された上述の異種ヌクレオチドは、ｅｎｔＡ  ｅｎｔＢ、ｅｎｔＣ、ｅｎｔＤ、ｅｎｔＥ、ｅｎｔＦからなる群から選択される遺伝子のうちの１つ以上をコードするプロモータに作動可能に連結された異種ヌクレオチドを含む、実施形態２７に記載の遺伝子組換え細菌。
３１．Ｅｎｔの生合成のための１つ以上の遺伝子をコードするプロモータに作動可能に連結された上述の異種ヌクレオチドは、配列番号１〜６からなる群から選択されるアミノ酸配列のうちの１つ以上をコードするプロモータに作動可能に連結された異種ヌクレオチドを含む、実施形態２７に記載の遺伝子組換え細菌。
３１．鉄欠乏症の治療を必要とする上述の対象がヒト対象である、実施形態２７に記載の遺伝子組換え細菌。
３２．上述の鉄欠乏症は、鉄欠乏性貧血を含む、実施形態３１に記載の遺伝子組換え菌。
３３．鉄欠乏症の治療を必要とする対象においてそれを行うための栄養補給組成物であって、エンテロバクチン（Ｅｎｔ）の生合成のための１つ以上の遺伝子をコードするプロモータに作動可能に連結された異種ヌクレオチドを発現するように構成されたプロバイオティクス細菌と、賦形剤と、を含む、栄養組成物。
３４．上述のプロバイオティクス細菌は、エンテロバクタープロバイオティクス細菌を含む、実施形態３３に記載の栄養組成物。
３５．Ｅｎｔの生合成のための１つ以上の遺伝子をコードするプロモータに作動可能に連結された上述の異種ヌクレオチドは、ｅｎｔＡ、ｅｎｔＢ、ｅｎｔＣ、ｅｎｔＤ、ｅｎｔＥ、ｅｎｔＦからなる群から選択される遺伝子の１つ以上をコードするプロモータに作動可能に連結された異種ヌクレオチドを含む、実施形態３３に記載の栄養組成物。
３６．Ｅｎｔの生合成のための１つ以上の遺伝子をコードするプロモータに作動可能に連結された上述の異種ヌクレオチドは、配列番号１〜６からなる群から選択されるアミノ酸配列のうちの１つ以上をコードするプロモータに作動可能に連結された異種ヌクレオチドを含む、実施形態３３に記載の遺伝子組換え細菌。
３７．上述の鉄欠乏症の治療を必要とする対象がヒト対象である、実施形態３３に記載の栄養組成物。
３８．上述の鉄欠乏症は、鉄欠乏性貧血を含む、実施形態３７に記載の栄養組成物。
【００２０】
本出願は、様々な雑誌記事、および他の刊行物を参照し、その全てが、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、本明細書に記載される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、詳細な説明、図、実施例、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
添付の図面と併せて解釈される以下の詳細な説明から、本開示の上述および他の態様、特徴および利点がよりよく理解され、これらの全ては単なる例示として与えられ、本明細書に開示される実施形態を限定するものではない。
【００２２】
【図１】微生物代謝産物であるエンテロバクチン（Ｅｎｔ）は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの発育を補助する。（Ａ）微量の生存細菌が、熱殺菌Ｅ．ｃｏｌｉを供給された虫（ワーム；ｗｏｒｍ）の胚後成長を補助することを示すイラスト図、顕微鏡画像および棒グラフ。虫の体積を、幼虫をプレート上に配置した４日後に測定した。（Ｂ〜Ｃ）細菌変異体スクリーニングは、宿主発育（虫の身体体積の減少によって示される）を補助するエンテロバクチン（Ｅｎｔ）生合成経路における５つの遺伝子を、アッセイ条件下でこれら５つの変異体それぞれを供給したときに同定した。赤色の酵素（Ｃ）を、スクリーニング（Ｂ）において同定した。（Ｄ）ｅｎｔＡ−またはｅｎｔＦ−生存Ｅ．ｃｏｌｉ変異体を供給することによって引き起こされる成長欠陥は、熱殺菌Ｅ．ｃｏｌｉと共に、Ｅｎｔによる餌補給によって完全に抑制された。代表的な顕微鏡画像を図８Ａに示す。（Ｅ）２，３−ＤＨＢＡによる補給は、ｅｎｔＡ−変異体細菌を供給された虫の成長を助けたが、ｅｎｔＦ−変異体細菌を供給された虫の成長を助けず、このことは、最終産物であるＥｎｔのみが、虫成長にとって有益であることを確認する。（Ｆ）熱殺菌Ｅ．ｃｏｌｉと共にｅｎｔ−生存Ｅ．ｃｏｌｉ変異体を供給することによって引き起こされる成長欠陥は、Ｅ．ｃｏｌｉ鉄Ｅｎｔ受容体をコードする遺伝子であるｆｅｐＡの変異によって表現型模写されず、このことは、Ｅｎｔが、細菌の鉄除去におけるその役割を介して虫の成長に利益をもたらさないことを示している。ｆｅｐＡの役割および虫の画像については、図８Ｂおよび８Ｃも参照。（Ｇ）他のシデロホア（ピオベルジンおよびフェリクローム）の補給は、熱殺菌餌と共にｅｎｔＦ−変異体が供給された虫の成長を助けなかった。これらのシデロホアの毒性試験を図８Ｆ〜Ｈに示す。（Ｈ）ｅｎｔＦ−変異体細菌が供給された虫におけるＥｎｔレベルが、野生型細菌が供給された虫におけるレベルよりも有意に低いことを示す、全虫溶解物のＣＡＳ染色結果。（Ｉ）生存ｅｎｔＡ−またはｅｎｔＦ−Ｅ．ｃｏｌｉ株のみ（細菌の芝生）が供給された虫の幼虫が、親の野生型Ｅ．ｃｏｌｉが供給された虫と比較して、成長速度の低下を示すことを示し、このことが、この供給条件下で絶対的に必要とはされなかったにもかかわらず、Ｅｎｔから宿主発育への著しい利益を示す、供給条件のイラスト図、棒グラフおよび統計解析。全てのパネルについて、「ｎ」＝スコアリングされた虫の数。データは平均±ＳＥＭとして表される。＊＊＊Ｐ＜０．００１。全てのデータは、少なくとも３つの別々の実験の代表である。
【図２】細菌エンテロバクチンは宿主の鉄プールを促進する。（Ａ〜Ｅ）宿主の鉄レベルおよびｐｆｔｎ−２：：ＧＦＰ発現に対する供給条件の影響を示す、供給条件のイラスト図、蛍光画像および棒グラフ。（Ａ）熱殺菌Ｅ．ｃｏｌｉと共にｅｎｔＡ−またはｅｎｔＦ−Ｅ．ｃｏｌｉが供給された虫は、カルセイン−ＡＭ蛍光における劇的な増加を示し（不安定な鉄レベルの低下を示す）、この変化は、Ｅｎｔの餌補給によって完全に抑制された。（Ｂ）鉄応答性レポーターｐｆｔｎ−２：：ＧＦＰの発現は、熱殺菌Ｅ．ｃｏｌｉと混ぜ合わされたｅｎｔＡ−またはｅｎｔＦ−Ｅ．ｃｏｌｉが供給された虫において減少した。（ＣおよびＤ）熱殺菌Ｅ．ｃｏｌｉにＥｎｔを補給すると、成長を救うことなく、成長が停止した虫において、鉄レベルが回復し（カルセインＡＭ蛍光およびｐｆｔｎ−２：：ＧＦＰの両方によって示される）、このことは、（Ａ）における宿主の鉄プールに対するＥｎｔの効果が、虫の遅い成長速度の間接的な影響に起因する可能性が低かったことを示している。（Ｅ）カルセイン−ＡＭ蛍光強度は、ｅｎｔＡ−またはｅｎｔＦ−生存細菌のみが供給された虫において増加し、このことは、宿主の鉄レベル増加に対するＥｎｔの利益が、（Ａ）に図示される供給条件に限定されないことを示している。（Ｆ）Ｅｎｔ産生を抑制すると予想される野生型Ｅ．ｃｏｌｉ源へのＦｅＣｌ３の添加が、熱殺菌Ｅ．ｃｏｌｉが供給された虫の成長を阻害したことを示す、イラスト図および棒グラフ。しかしながら、この成長は、Ｅｎｔ補給によって、大部分が回復した。代表的な虫の画像を図Ｄに示す。（Ｇ）ＣａＥＤＴＡ治療を伴う鉄欠乏条件下、虫は、成長の遅れを示した。虫におけるカルセイン−ＡＭ蛍光は、ＦｅＣｌ３（用量に依存する様式で）またはＥｎｔのいずれかを補給すると、減少する（鉄レベルが増加する）。蛍光レベルの減少に対するＥｎｔ補給の効果は、１０ｕｌのＦｅＣｌ３（１７５ｕｇ／ｕｌ）を補給するのと同等である。「ｎ」＝スコアリングされた虫の数。データは平均±ＳＥＭとして表される。＊＊＊Ｐ＜０．００１。全てのデータは、少なくとも３つの別々の実験の代表である。
【図３】細菌エンテロバクチンは、ＡＴＰシンターゼのαサブユニットに結合する。（Ａ）ビオチンコンジュゲート化Ｅｎｔを用いたアフィニティクロマトグラフィーによって、全虫溶解物からＥｎｔ結合タンパク質を同定するための手順の概略図。保持されたタンパク質を、質量分光分析によって同定した。２つの独立した実験で同定された２つのタンパク質が示される。（Ｂ）Ｅｎｔ補給により、ａｔｐ−１（ＲＮＡｉ）で治療した動物の成長を助けることができなかったことを示す、供給条件のイラスト図、顕微鏡画像および棒グラフ。ｃｔｌ−２  ＲＮＡｉは、Ｅｎｔ補給の利益を変えなかった。（Ｃ）ＡＴＰ−１に対するＥｎｔ結合のインビボ試験。ビオチン−Ｅｎｔを使用して、全虫溶解物から相互作用するタンパク質をプルダウンし、その後、ストレプトアビジン−ビーズ精製を行った。抗ＡＴＰ５Ａ１抗体を用いたウェスタンブロット分析（抗体特異性については図１０Ａを参照）により、ＩＰにおいてＡＴＰ−１を検出する。（Ｄ〜Ｅ）ＡＴＰ−１に対するＥｎｔ結合のインビトロ試験。ＡＴＰ−１：：Ｈｉｓタグ化タンパク質をビオチン−Ｅｎｔに結合し（Ｄ）、タンパク質濃度を増加させることによって結合が増加し、過剰な非ビオチン標識Ｅｎｔを加えることによって結合が減少した（Ｅ）。（Ｆ）Ｅｎｔが、鉄結合アッセイにおいて、Ｆｅ３＋とＡＴＰ−１との間の相互作用に介在することを示すイラストおよび棒グラフ。全虫溶解物を５５ＦｅＣｌ３＋／−シデロホア（Ｅｎｔ、フェリクロームまたはピオベルジン）で処理し、その後、抗ＡＴＰ５Ａ１で免疫沈降させた。相対的な鉄レベルは、放射能を測定することによって決定した。Ｅｎｔが存在すると、ＡＴＰ−１−ＩＰと会合した５５Ｆｅが１０倍より多く増加した。データは平均±ＳＥＭとして表される。＊＊＊Ｐ＜０．００１。全てのデータは、ＤおよびＥ（２つの独立した実験）を除いて、少なくとも３つの別々の実験の代表である。
【図４】宿主の鉄レベルを促進する際のＥｎｔの役割に、ＡＴＰシンターゼではなく、ＡＴＰ−１が必要である。（Ａ〜Ｄ）宿主の鉄レベルに対する供給条件の影響を示す、供給条件のイラスト図、カルセイン−ＡＭ染色の蛍光画像、および定量データの棒グラフ。（Ａ）宿主の鉄レベルは、通常の供給条件下で、ａｔｐ−１機能喪失（ｌｆ）ホモ接合動物（１００％Ｌ１停止した、ｎ＞５０）において減少し、鉄レベルは減少するが、成長が停止しないもの（１００％、ｎ＞５０）は、導入遺伝子からＡＴＰ結合欠陥ＡＴＰ−１変異体タンパク質［Ｐｒｐｌ２８：：ａｔｐ−１（ｄｅｌ）］を発現することによって、効果的に抑制された。データは平均±ＳＥＭとして表される。（Ｂ）ＡＴＰシンターゼの３つの他のサブユニットの各々ではなく、ａｔｐ−１のＲＮＡｉノックダウンは、通常の供給条件下で虫において鉄レベルの低下を引き起こした。データは平均±ＳＤとして表される。（Ｃ）動物をａｔｐ−１  ＲＮＡｉで前治療すると、動物にｅｎｔＦ−変異体細菌を供給したときに、Ｅｎｔ補給の利点がなくなり、このことは、ＡＴＰ−１に対するＥｎｔの役割の依存性を示している。データは平均±ＳＥＭとして表される。（Ｄ）動物をａｔｐ−１  ＲＮＡｉで前治療すると、動物に熱殺菌細菌のみを供給したときに、Ｅｎｔ補給の利点がなくなった。データは平均±ＳＥＭとして表される。（Ｅ）ＡＴＰ結合ドメインの８ＡＡ（ＤＲＱＴＧＫＴＡ）の欠失は、図３Ｄと同様のインビトロ結合アッセイにおいて、Ｅｎｔに対するＡＴＰ−１の結合を変えなかった。「ｎ」＝スコアリングされた虫の数。＊＊＊Ｐ＜０．００１。全てのデータは、少なくとも３つの別々の実験の代表である。
【図５】ミトコンドリアにおけるＥｎｔ−ＡＴＰ−１相互作用は、ミトコンドリアにおける鉄レベルの増加を促進する。（Ａ）イラストによる説明およびインビボミトコンドリア鉄取り込みアッセイからのデータ。虫に５５ＦｅＣｌ３＋／−Ｅｎｔを供給した。ミトコンドリアをこれらの虫から抽出し、各ＲＮＡｉ処理のための２つの試料間の相対的な５５Ｆｅレベルを決定した。Ｅｎｔが存在すると、ミトコンドリアにおける５５Ｆｅレベルが約３倍増加し、Ｅｎｔの効果は、ａｔｐ−１のＲＮＡｉによってなくなったが、他のＡＴＰシンターゼ遺伝子のＲＮＡｉによってはなくならなかった。（Ｂ）ｅｎｔＦ−変異体細菌が供給された虫において、有意に低いミトコンドリアシデロホアレベルを示すＣＡＳ染色アッセイ。（Ｃ）ａｔｐ−１  ＲＮＡｉは、ミトコンドリアシデロホアレベルの低下を引き起こした。（Ｄ）インビトロミトコンドリア鉄取り込みアッセイ。ミトコンドリアを、第１に、虫溶解物から精製し、その後、５５ＦｅＣｌ３＋／−Ｅｎｔと共にインキュベートし、各ＲＮＡｉ処理のための２つの試料間の相対的な５５Ｆｅレベルの測定を行った。Ｅｎｔが存在すると、ミトコンドリアにおける５５Ｆｅレベルが１０倍を超えて増加し、この効果は、ａｔｐ−１のＲＮＡｉによって有意に減少したが、他のＡＴＰシンターゼ遺伝子のＲＮＡｉによっては有意に減少しなかった。（ＥおよびＦ）Ｅｎｔ補給によって、Ｆｅ−Ｓクラスター含有酵素の活性が増加し、Ｅｎｔ欠乏餌が供給された虫において、ミトコンドリアアコニターゼ（Ｅ）およびコハク酸デヒドロゲナーゼ（Ｆ）の活性増加によって示される。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。データは平均±ＳＤとして表される。全てのデータは、少なくとも３つの別々の実験の代表である。
【図６】Ｅｎｔはまた、ＡＴＰシンターゼのα−サブユニットと相互作用することによって、哺乳動物細胞におけるミトコンドリア鉄レベルを促進する。（Ａ）Ｅｎｔ補給により、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてシデロホアレベルが増加したことを示す、ＣＡＳ染色。データは平均±ＳＤとして表される。（Ｂ）＋／−ビオチン−Ｅｎｔを培養したヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来の全タンパク質抽出物を用いたインビボＥｎｔ−ビオチンプルダウンアッセイ、およびウェスタンブロットが、Ｅｎｔ結合タンパク質としてＡＴＰ５Ａ１を同定した。（Ｃ）哺乳動物ＡＴＰ５Ａ１に対するＥｎｔ結合のインビトロ試験。ＡＴＰ５Ａ１：：Ｈｉｓタグ化タンパク質をビオチン−Ｅｎｔに結合し、この結合が、過剰な非ビオチン標識Ｅｎｔによって競合した。（Ｄ）Ｅｎｔが、ＡＴＰ５Ａ１と鉄との間の相互作用に介在することを示す棒グラフ。ＨＥＫ２９３Ｔ全細胞溶解物を５５ＦｅＣｌ３＋／−Ｅｎｔで処理し、続いて抗ＡＴＰ５Ａ１で免疫沈降し、放射能の測定を行った。データは平均±ＳＤとして表される。（Ｅ）Ｅｎｔ補給が、ミトコンドリアへのＦｅ３＋取り込みを有意に増加させ、この増加が、ＡＴＰ５Ａ１のｓｉＲＮＡノックダウンによってなくなったことを示す、インビボミトコンドリア鉄取り込みアッセイの結果（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓについての図５Ａと同様）。ｓｉＲＮＡの有効性を図１３Ａに示す。データは平均±ＳＤとして表される。（Ｆ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞からのミトコンドリアの鉄取り込みに対するＥｎｔのＡＴＰ５Ａ１依存性の影響を示す、インビトロミトコンドリア鉄取り込みアッセイの結果。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ（図５Ｄ）と同様に、Ｅｎｔの添加は、ミトコンドリアへの鉄の取り込みを増強し、この利益は、ＡＴＰ５Ａ１のｓｉＲＮＡノックダウンによって急激に低下した。データは平均±ＳＤとして表される。（Ｇ）蛍光ミトコンドリア鉄指示薬ＲＰＡで染色したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の蛍光画像および定量データ。Ｅｎｔ供給によって、染色が有意に低下し（鉄の増加を示している）、これは、ＡＴＰ５Ａ１をノックダウンすることによってなくなった。データは平均±ＳＥＭとして表される。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。全てのデータは、少なくとも３つの別々の実験の代表である。
【図７】共生細菌と宿主動物との間の鉄の「取り合い」についての提案された新しいパラダイム。（Ａ）リポカリン２（ｌｃｎ２）の役割の発見によって、病原性細菌と宿主免疫系との間の鉄の「取り合い」の古典的概念が得られた。感染すると、ｌｃｎ２は、Ｅｎｔ−Ｆｅ３＋に結合するように誘導され、細菌成長のために宿主細胞から鉄を得る際のＥｎｔの役割をブロックする（ＢａｕｍｌｅｒおよびＳｐｅｒａｎｄｉｏ、２０１６；ＥｌｌｅｒｍａｎｎおよびＡｒｔｈｕｒ、２０１７；Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．、２０１７）。この捕捉機構は、細菌の成長を阻害するが、宿主の鉄恒常性および他の生理学的役割には利益をもたらさない場合がある。（Ｂ）ミトコンドリア鉄濃度を促進する際のＥｎｔ−ＡＴＰシンターゼα−サブユニットの驚くべき有益な役割は、鉄恒常性に対するＥｎｔの既知の負の影響に対抗するように進化した新しい機構を指摘するものであり、したがって、腸の細菌と動物との間の共生関係を強化する。
【図８】細菌エンテロバクチンは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの発育を促進する。（Ａ）ｅｎｔＡ−またはｅｎｔＦ−変異体Ｅ．ｃｏｌｉのいずれかと混ぜあわせられた熱殺菌Ｅ．ｃｏｌｉが供給された虫の成長が遅く、この欠陥が、Ｅｎｔ補給によって完全に抑制されたことを示す供給条件のイラスト図、および顕微鏡画像。定量データを図１Ｄに示す。（Ｂ）Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＥｎｔ−Ｆｅ３＋複合体の取り込みを容易にする細菌外側膜上の鉄エンテロバクチン受容体ＦｅｐＡのイラスト図。（Ｃ）ｆｅｐＡ−変異体Ｅ．ｃｏｌｉと混ぜあわせられた熱殺菌Ｅ．ｃｏｌｉが供給された虫が、ｅｎｔＡ−またはｅｎｔＦ−変異体を供給した場合とは異なり、成長の欠陥を示さなかったことを示す、供給条件のイラスト図、および顕微鏡画像。定量データを図１Ｆに示す。（Ｄ）ｅｎｔＡ−またはｅｎｔＦ−変異体Ｅ．ｃｏｌｉ株は、親の野生型株であるＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２−ＢＷ２５１１３と同様の成長速度を示した。（Ｅ）ｅｎｔＡ−またはｅｎｔＦ−変異体Ｅ．ｃｏｌｉ株は、親の野生型株と同様に効率的に宿主腸管をコロニー形成した。（Ｆ）熱殺菌餌と野生型生存Ｅ．ｃｏｌｉが供給された虫において、ピオベルジンもフェリクロームも明らかな成長欠陥を引き起こさなかったことを示す、供給条件のイラスト図、顕微鏡画像、および棒グラフ。（Ｇ）（Ｆ）と同じ供給条件下でｍｔＧＦＰを含有する虫の蛍光顕微鏡検査。３つのシデロホアの各々の補給は、本発明のアッセイ系におけるミトコンドリア形態に影響を及ぼさなかった。（Ｈ）液体培養物において、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａが産生するシデロホアであるピオベルジンは、宿主ミトコンドリアを損傷するため、虫にとって毒性である（ｍｔＧＦＰ網目パターンは断片化され、大きな点状体へと減らされる）（Ｋｉｒｉｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．、２０１５）。しかしながら、Ｅｎｔは、ミトコンドリア形態を破壊しない。（Ｉ）熱殺菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＯＰ５０へのＥｎｔ補給が、宿主の発育を助けなかったことを示し、このことが、虫の成長を助けるために、生存細菌からの複数の細菌が生成した代謝産物が必要であるという考え（Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．、２０１７）を裏付けている、供給条件のイラスト図、顕微鏡画像、および棒グラフ。「ｎ」＝スコアリングされた虫の数。データは平均±ＳＥＭとして表される。＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図９】Ｅｎｔ、鉄濃度、および虫成長との間の機能的関係。（Ａ）熱殺菌餌にさらに多くのＦｅ３＋（ＦｅＣｌ３）を添加しても、Ｅｎｔ欠乏により引き起こされる成長欠陥（Ａ）を抑制しなかったことを示す、供給条件のイラスト図、顕微鏡画像、および棒グラフ（図１Ｂを参照）。データは平均±ＳＤとして表される。（Ｂ）Ｅｎｔ補給とは異なり、さらに多くのＦｅ３＋を添加しても、熱殺菌Ｅ．ｃｏｌｉが供給された虫において鉄レベルを上昇させなかったことを示す、カルセイン−ＡＭ染色。データは平均±ＳＥＭとして表される。（Ｃ）餌にさらに多くのヘミンを添加しても、Ｅｎｔ欠乏により引き起こされる成長欠陥を抑制しなかった。データは平均±ＳＥＭとして表される。（Ｄ）新規アッセイ系において野生型Ｅ．ｃｏｌｉにさらに多くの塩化第二鉄を添加すると、虫の成長を阻害したことを示す、顕微鏡画像。成長欠陥は、Ｅｎｔ補給によって回復した。定量データを図２Ｆに示す。「ｎ」＝スコアリングされた虫の数。
【図１０】ＡＴＰ−１のＥｎｔ結合配列のインビトロマッピング。（Ａ）哺乳動物ＡＴＰ−１シンターゼα−サブユニットに対する抗体によって、単一のバンドが全虫抽出物中で検出され、そのバンド強度は、ａｔｐ−１（ＲＮＡｉ）で処理した試料中で劇的に低下し、このことは、虫タンパク質ＡＴＰ−１に対するこの抗体の特異性を裏付けている。（Ｂ〜Ｃ）鉄が結合したＥｎｔとＡＴＰ−１との間の結合についてのインビトロ試験。ＡＴＰ  １：：Ｈｉｓタグ化タンパク質の濃度を増加させると、ビオチン−Ｆｅ−Ｅｎｔに対する結合が増加した（Ｂ）。この結合は、過剰な非ビオチン標識Ｅｎｔを加えることによって減少した（Ｃ）。データは平均±ＳＥＭとして表される。（Ｄ）全長ＡＴＰ−１タンパク質配列を３つのセグメントに分割し、次いで、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させた。精製タンパク質を用いたインビトロ結合アッセイは、中間セグメントがＥｎｔ結合能力を保持していることを示した。（Ｅ）ＡＴＰ−１の中間セグメントをカバーする８個のペプチド（Ｄで特定される）を、結合について試験し、インビトロ結合アッセイにおいてＥｎｔに結合するのに十分な２１個のアミノ酸ペプチド（ＦＣＩＹＶＡＶＧＱＫＲＳＴＶＡＱＩＶＫＲＬ）を明らかにした。（Ｆ）この２１個のアミノ酸配列が欠失したＡＴＰ−１タンパク質は、Ｅｎｔ結合能力を失っていた。したがって、この２１残基ペプチドは、その鉄取り込み機能にとっては十分ではない場合もあるが、Ｅｎｔ結合に必須であり、かつ十分である。
【図１１】Ｅｎｔに対するＡＴＰ−１の結合は、ＡＴＰシンターゼのβ−サブユニットとは独立しており、ＡＴＰ−１とヒトＡＴＰ５Ａ１との配列比較。（Ａ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で、α−サブユニットがＡＴＰシンターゼのβ−サブユニットと共局在化することを示す免疫染色。（Ｂ）ａｔｐ−１（ＲＮＡｉ）は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて遅い成長表現型を示した。（Ｃ）Ｅｎｔに対するＡＴＰ−１の結合が、ＡＴＰシンターゼのβ−サブユニット（ＡＴＰ−２）とは独立していることを示すウェスタンブロット。対照またはａｔｐ−２（ＲＮＡｉ）で治療した虫にビオチン−Ｅｎｔを供給し、全タンパク質抽出物を単離し、その後、ストレプトアビジン−ビーズ精製を行った。ＡＴＰ−１タンパク質は、ＡＴＰシンターゼのα−サブユニットに対する抗体を使用したウェスタンブロットによって、両試料で検出された。虫は、ａｔｐ−２（ＲＮＡｉ）治療の後、遅く成長し、このことは、ＲＮＡｉがａｔｐ−２をノックダウンするのに有効であることを示している。（Ｄ）Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓおよびヒトからのＡＴＰシンターゼのα−サブユニットのタンパク質配列アラインメント。予想ＡＴＰおよびＥｎｔ結合部位を示す。
【図１２】ＡＴＰ−１は、Ｍｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒと共局在化する。ＡＴＰ−１がＭｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒと共局在化することを示す、解剖された腸の免疫染色画像。ａｔｐ−１  ＲＮＡｉ治療によって、免疫染色が低下する。
【図１３】ｓｉＲＮＡは、ＡＴＰ５Ａ１のレベルを効果的に低下させた。ｓｉＲＮＡ  ＡＴＰ５Ａ１で治療した細胞において、ＡＴＰ５Ａ１タンパク質レベルは減少した。
【図１４】マウスは、ｅｎｔＦ−細菌コロニー形成を伴い、ゆっくりと成長する。５週間齢の無菌マウスを、野生型またはｅｎｔＦ−（エンテロバクチン欠損）細菌でコロニー形成させた。コロニー形成後、マウスは４週間で成長した。体重を毎週測定し、体重増加を計算した。
【図１５】エンテロバクチンの２Ｄ化学構造。（配位酸素原子を赤色で示す）。
【図１６】エンテロバクチンおよびその合成アナログ：カテコレートＴＲＥＮＣＡＭおよびサリチレートＳＥＲＳＡＭ、ＳＥＲ（３Ｍ）ＳＡＭ、ＴＲＥＮＳＡＭおよびＴＲＥＮ（３Ｍ）ＳＡＭリガンド。（配位酸素原子を赤色で示す）。
【図１７】Ｇ．Ｊ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ．「Ｉｒｏｎ  Ｗａｒｓ−Ｔｈｅ  Ｈｏｓｔ  Ｓｔｒｉｋｅｓ  Ｂａｃｋ」Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１８年１１月２２日から得た、第二鉄結合化合物Ｅｎｔを分泌する腸管腔における例示的なＥ．ｃｏｌｉ微生物を示す概略図。
【図１８】Ｅｎｔ添加は、鉄キレート剤を有する培地中のヒトＨＥＫ２９３細胞における鉄の取り込みを増加させる。鉄キレート剤であるデフェロキサミン（ＤＦＯ）を培地に添加すると、カルセインＡＭ染色蛍光の増加によって示されるように、鉄レベルが細胞内で有意に減少した。鉄レベルは、培地にＥｎｔ（１．５ｕＭ）を添加することによってほとんど回復した。Ｅｎｔ添加によるカルセインＡＭ蛍光の減少（４５％）は、ＤＦＯを使用しない試験よりも強い。
【図１９】ＥｎｔおよびＡＴＰＳαは、リポソームの脂質二重層を横断する鉄トラフィッキングを促進する。（Ａ）実験条件のイラスト図およびカルセインＡＭ染色のグラフによる定量化。カルセインＡＭ染料をリポソーム＋／−ＡＴＰＳαに添加し、リポソームの蛍光強度を測定した。（Ｂ）実験条件のイラスト図および鉄取り込みのグラフによる定量化。リポソームを放射性標識Ｆｅ３＋（５５ＦｅＣｌ３）と共にインキュベートし、リポソームの放射能（相対ＣＰＭ）を測定した。
【図２０】経口摂取によるＥｎｔ補給によって、貧血マウスモデル（食事性貧血）においてヘモグロビンおよび脾臓鉄レベルが増加した。３週齢の雌マウスに鉄欠乏餌（ＩＤＤ）（または対照餌）を６週間供給し、貧血を誘導した（ヘモグロビン測定により確認）。次いで、マウス（１群あたり５匹）を、２週間にわたる経口摂取（２日に１回）によって、＋／−Ｅｎｔ（２濃度）または＋／−ＦｅＳＯ４で治療した。
【図２１】飲料水（自由摂取）によって補給されたＥｎｔによって、貧血マウスモデル（食事性貧血）においてヘモグロビンレベルが増加した。３週齢の雄マウスに鉄欠乏餌（ＩＤＤ）（または対照餌）を５週間供給し、貧血を誘導した。次いで、飲料水に加えたＩＤＤ＋／−Ｅｎｔをさらに２週間供給した。新鮮なＥｎｔ希釈水溶液を週に１回提供した。
【図２２】飲料水（自由摂取）によって補給されるＥｎｔは、対照（十分な鉄）餌が供給されたマウスの成長を促進する。４．５週齢の雄マウスを、鉄欠乏餌（ＩＤＤ）についての一致した対照である図２０および図２１で使用される鉄を十分に含む対照餌（ＣＤ）で治療した。
【図２３】Ｅｎｔは、単一のＥ．ｃｏｌｉ株でコロニー形成されたマウスにおけるマウス成長を促進する。図１４を補足し、本願発明者らは、（Ａ）を示す。５週齢の雌無菌（ＧＦ）マウスを、単一の非病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｋ１２）株、野生型またはｅｎｔＦ−でコロニー形成した。マウスの成長（体重増加）を次の４週間測定した。ＥｎｔＦ−Ｅ．ｃｏｌｉでコロニー形成された無菌（ＧＦ）マウスは、野生型Ｅ．ｃｏｌｉでコロニー形成されたマウスと比較して遅い成長を示した。興味深いことに、体重増加の差は、コロニー形成後の最初の２週間で最大であった。（ＢおよびＣ）最終的なマウスの鉄レベルは、脾臓のみで有意に低かった（約３５％）が、肝臓または他の組織では有意に低くなく、このことは、図２０でみられる結果と一致している。鉄レベルを測定した。（Ｄ）Ｅｎｔ補給は、ｅｎｔＦ−Ｅ．ｃｏｌｉでコロニー形成したＧＦマウスにおける成長の遅れを克服する。ｅｎｔＦ−細菌でコロニー形成したＧＦ雌マウスに、Ｅｎｔを補給した［週に１回、飲料水（ｐＨ５．５）に２濃度を添加］。
【図２４】動物の発育促進におけるエンテロバクチン（Ｅｎｔ）の影響は、他のシデロホアではみられない。新たに孵化したＣ．ｅｌｅｇａｎｓ幼虫に、野生型Ｋ１２  Ｅ．ｃｏｌｉ、または示したシデロホアを補給したｅｎｔＦ−Ｅ．ｃｏｌｉを供給した。
【図２５】異なる溶媒およびｐＨ条件のＥｎｔ安定性試験。（Ａ）Ｅｎｔ安定性を、ＣＡＳ液体アッセイ（Ａｒｏｒａ＆Ｖｅｒｍａ  ２０１７から適応させた）によって測定した。分解は、吸光度の増加によって示される。Ｈ２Ｏ（ｐＨ５．５）（１０％ＤＭＳＯを含む）中で希釈したＥｎｔは、最初の６０分以内に急速に分解した。これとは対照的に、１００％ＤＭＳＯで希釈したＥｎｔは、アッセイ期間中にほとんど変化を示さなかった。（Ｂ）様々なｐＨでのＨ２Ｏ中のＥｎｔの安定性を、ＣＡＳ液体アッセイによって測定した。Ｈ２Ｏ（ｐＨ６．５／７）で希釈したＥｎｔは、酸性および塩基性Ｈ２Ｏ中の他の希釈物よりも安定していた。（Ｃ）Ｅｎｔ対Ｆｅ−Ｅｎｔの安定性を、ＮＧＡＬ蛍光アッセイ（Ｇｏｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．、２００２から適応させた）によって測定し、線形傾向線を用いてグラフ化した。ＥｎｔおよびＦｅ−Ｅｎｔを同じ濃度および同じ緩衝液中で調製した。分解は、相対蛍光の増加によって示される。Ｆｅ−Ｅｎｔは、Ｅｎｔ単独よりも安定していた。全ての試験では、希釈液を室温に保ち、光にさらした。誤差は、平均の標準偏差である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、対象における鉄欠乏症をためのＥｎｔ、および／またはＥｎｔアナログの治療投与のための新規なシステム、方法および組成物を含み得る。上述のように、エンテロバクチン（Ｅｎｔ）（図１５）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、サルモネラ、およびクレブシエラを含むＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅのグラム陰性種によって生合成されるカノニカルシデロホアである。エンテロバクチン生合成および配位化学に関連する何十年もの探求は、その細胞輸送および治療に関与するタンパク質の調査に加えて、このキレートが細菌の鉄恒常性およびコロニー形成にどのように寄与するかについての詳細な分子および生理学的理解を提供する（Ｒａｙｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ２００３、１００、３５８４−３５８８）。エンテロバクチン合成酵素は、４つのタンパク質ＥｎｔＢＤＥＦから構成され、Ｌ−セリンおよび２，３−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）からのエンテロバクチンの産生に関与する。生合成の後、Ｅｎｔは、細胞外空間に運び出され、そこでＦｅ３を除去する。エンテロバクチンは、Ｋａ約１０４９Ｍ−１で、その３つのカテコール酸基によってＦｅ３を配位する。
【００２４】
例えば、本発明の一態様は、鉄欠乏症、好ましくは鉄欠乏性貧血の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、本方法が、治療有効量のＥｎｔ、およびその薬学的に許容される担体、および／またはその薬学的に許容される塩、および／またはその薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法に関する。この実施形態では、Ｅｎｔは、精製され、実質的に精製され、および／または単離されたＥｎｔを含んでいてもよく、これをさらに薬学的に許容される組成物、例えば、賦形剤と混ぜ合わされてもよい。
【００２５】
本発明の別の態様は、鉄欠乏症、好ましくは鉄欠乏性貧血の予防を必要とする対象においてそれを行う方法であって、本方法が、予防有効量のＥｎｔおよび／またはＥｎｔアナログ、およびその薬学的に許容される担体、および／またはその薬学的に許容される塩、および／またはその薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法に関する。
【００２６】
別の例では、本発明の一態様は、鉄欠乏症の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、本方法が、プロバイオティクスおよび／または共生送達ベクターの導入により、治療有効量のＥｎｔを対象に投与することを含む、方法に関する。別の例では、本発明の一態様は、鉄欠乏症の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、本方法が、プロバイオティクスおよび／または共生送達ベクターの導入により、予防有効量のＥｎｔを対象に投与することを含む、方法に関する。
【００２７】
例えば、本発明の一態様は、鉄欠乏症、好ましくは鉄欠乏性貧血の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、本方法が、非病原性の共生および／またはプロバイオティクス細菌により、治療有効量のＥｎｔ、またはそのアナログを対象に投与することを含む、方法に関する。この実施形態では、本発明は、レシピエント宿主においてＥｎｔを発現および／または過剰発現するように構成され得る、遺伝子組換えされた非病原性の共生および／またはプロバイオティクスドナー細菌を含んでいてもよい。一実施形態では、遺伝子組換えされた非病原性の共生および／またはプロバイオティクスドナー細菌は、Ｅｎｔ生合成に関与する１つ以上の遺伝子を発現および／または過剰発現するように構成され得る。例えば、この好ましい実施形態では、Ｅｎｔ生合成に関与する１つ以上の遺伝子は、発現カセットの一部であってもよく、発現制御配列（複数可）にさらに作動可能に連結されてもよい。好ましい実施形態では、このプロモータは、構成的プロモータであってもよい。
【００２８】
一実施形態では、上に参照される遺伝子操作されたプロバイオティクスおよび／または共生細菌の１つ以上は、薬学的組成物および／または栄養組成物の一部であってもよい。追加の実施形態では、単離されたＥｎｔ、および／または上に参照される遺伝子操作されたプロバイオティクスおよび／または共生細菌の１つ以上は、ある疾患状態を治療するために治療有効量を投与し得る食品または飲料添加物の一部であってもよい。別の実施形態では、単離されたＥｎｔ、および／または上に参照される遺伝子操作されたプロバイオティクスおよび／または共生細菌の１つ以上は、補助食品の一部であってもよく、食用の鉄補助食品などの食用の補助食品とさらに組み合わされてもよい。
【００２９】
ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列は、発現制御配列がこのポリヌクレオチド配列の転写および／または翻訳を制御し、調節するとき、「発現制御配列に作動可能に連結する」か、または（例えば、プロモータ、任意選択でエンハンサー）である。本明細書で使用される場合、「遺伝子産物」という用語は、ＲＮＡ分子またはタンパク質を指す。さらに、「遺伝子」という用語は、時に、遺伝子配列、その遺伝子の転写され、場合によっては修飾されたｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡの翻訳されたタンパク質を指していてもよい。
【００３０】
このようなＥｎｔ生合成遺伝子の例としては、ｅｎｔＢ、ｅｎｔＤ、ｅｎｔＥ、および／またはｅｎｔＦを挙げることができる。追加の実施形態は、ｅｎｔＣ、ｅｎｔＢ、およびｅｎｔＡを含め、Ｅｎｔ前駆体の生合成に関与する遺伝子を含んでいてもよい。このような遺伝子は、対象にとって異種であってもよく、および／または内在性であってもよく、それらの全てのホモログおよびオルソログを含む。上述の参照遺伝子の核酸およびアミノ酸配列は、当業者の知識の範囲内であり、参照により本明細書に具体的に組み込まれることに留意すべきである。本明細書で使用される場合、「プロバイオティクス」という用語は、一般に、治療有効量のＥｎｔを標的宿主に送達するのに十分な時間、上述の標的宿主をコロニー形成し得る細菌を指す。
【００３１】
「精製された」、「実質的に精製された」、および「単離された」という用語は、本発明において有用な化合物であって、その化合物がその自然状態で通常会合している他の異なる化合物を含まず、その結果、その化合物が、所与の試料または組成物の少なくとも０．５重量％、１重量％、５重量％、１０重量％、２０重量％、５０重量％、７５重量％、８０重量％、８５重量％、９０重量％、９５重量％、９６重量％、９７重量％、９８重量％、９９重量％、９９．５重量％、または９９．９重量％含まれる、化合物を指す。一実施形態では、これらの用語は、所与の試料または組成物の少なくとも９５重量％、９８重量％、９９重量％、または９９．９重量％含まれる化合物を指す。
【００３２】
「薬学的に許容される塩」という用語は、合理的な医学的判断の範囲内で、過度な毒性、刺激、アレルギー反応などがなく、かつ妥当な利益／リスク比に相応しい、ヒトおよび他の動物の組織と接触して使用するのに好適な塩を指す。薬学的に許容される塩は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．は、参照により本明細書に組み込まれるＪ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１９７７、６６、１−１９に薬学的に許容される塩を詳細に記載する。本発明の化合物の薬学的に許容される塩には、好適な無機および有機の酸および塩基に由来するものが含まれる。塩は、化合物の最終的な単離および精製中に、または遊離塩基の形態の適切な化合物を好適な酸と反応させることによって別個に調製することができる。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、Ｌ−アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩（ベシル酸塩）、重硫酸塩、酪酸塩、樟脳、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、ジグルコン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、ゲンチン酸塩、グルタミン酸塩、グリセロリン酸塩、グリコール酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、馬尿酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩（イセチオン酸塩）、乳酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、ＤＬ−マンデル酸塩、メシチレンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、ナフチレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ホスホン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ピログルタミン酸塩、コハク酸塩、スルホン酸塩、酒石酸塩、Ｌ−酒石酸塩、トリクロロ酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、リン酸塩、グルタミン酸塩、重炭酸塩、パラ−トルエンスルホン酸塩（ｐ−トシル酸塩）、およびウンデカン酸塩が挙げられる。また、本明細書に開示される化合物中の塩基性基は、メチル、エチル、プロピル、およびブチルの塩化物、臭化物、およびヨウ化物；硫酸ジメチル、硫酸ジエチル、硫酸ジブチル、および硫酸ジアミル；デシル、ラウリル、ミリスチル、およびステリルの塩化物、臭化物、およびヨウ化物；ならびに臭化ベンジルおよび臭化フェネチルで四級化することができる。治療に許容される塩を形成するために使用可能な酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、およびリン酸などの無機酸、ならびにシュウ酸、マレイン酸、コハク酸、およびクエン酸などの有機酸が挙げられる。「塩基性付加塩」は、適切な塩基に由来する塩を指し、これらの塩は、アルカリ金属、アルカリ土類金属、および第４級アミン塩を含む。したがって、本発明は、本明細書に開示される化合物のナトリウム、カリウム、マグネシウム、およびカルシウム塩などを想定する。塩基性付加塩は、多くの場合、カルボキシル基を、金属カチオンの水酸化物、炭酸塩、もしくは重炭酸塩などの好適な塩基と、またはアンモニアもしくは有機一級、二級、もしくは三級アミンと反応させることによって、化合物の最終的な単離および精製中に調製することができる。治療に許容される塩のカチオンとしては、リチウム、ナトリウム（例えば、ＮａＯＨを使用することによる）、カリウム（例えば、ＫＯＨを使用することによる）、カルシウム（例えば、Ｃａ（ＯＨ）２を使用することによる）、マグネシウム（例えば、Ｍｇ（ＯＨ）２および酢酸マグネシウムを使用することによる）、亜鉛（例えば、Ｚｎ（ＯＨ）２および酢酸亜鉛を使用することによる）、およびアルミニウム、ならびに非毒性の四級アミンカチオン、例えば、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジエチルアミン、エチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルホリン、ジシクロヘキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルフェネチルアミン、１−エフェナミン、およびＮ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミンが挙げられる。塩基付加塩の形成に有用な他の代表的な有機アミンとしては、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペリジン、ピペラジン、水酸化コリン、ヒドロキシエチルモルホリン、ヒドロキシエチルピロリドン、イミダゾール、ｎ−メチル−ｄ−グルカミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ジエチルエタノールアミン、Ｎ，Ｎ’−ジメチルエタノールアミン、トリエタノールアミン、およびトロメタミンが挙げられる。塩基性アミノ酸（例えば、１−グリシンおよび１−アルギニン）、ならびに中性ｐＨで両性イオンであり得るアミノ酸（例えば、ベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン））も想定される。
【００３３】
「投与する」、「投与すること」、または「投与」という用語は、薬学的組成物の一部であってもよいＥｎｔを注射、移植、吸収、摂取すること、または本明細書に記載されるようにＥｎｔを産生するように構成されたプロバイオティクス細菌を摂取すること、またはその薬学的組成物中のプロバイオティクス細菌を摂取することを指す。
【００３４】
「治療」、「治療する」、および「治療すること」という用語は、本明細書に記載される「病的な状態」（例えば、疾患、障害、もしくは状態、またはその１つ以上の徴候もしくは症状）逆行させること、軽減させること、その発症を遅らせること、または阻害することを指す。いくつかの実施形態では、治療は、１つ以上の徴候または症状が発生した後、または観察された後に、行われてもよい。他の実施形態では、治療は、疾患または状態の徴候または症状が存在しない状態で行われてもよい。例えば、治療は、症状の発症前に（例えば、症状の既往の観点で、および／または遺伝的もしくは他の感受性因子の観点で）感受性の個体に行われてもよい。また、治療は、例えば、再発を遅らせるか、または予防するために、症状が回復した後にも継続されてもよい。好ましい実施形態では、治療は、鉄欠乏性貧血など、鉄欠乏に関連する障害を対象としてもよい。
【００３５】
本発明の化合物、好ましくはＥｎｔまたはＥｎｔアナログ、またはその薬学的組成物の「治療有効量」は、疾患の治療における治療効果を提供するのに十分な量、または疾患に関連する１つ以上の症状を遅らせるか、または最小限にするのに十分な量である。化合物の治療有効量は、単独で、または他の療法と組み合わせて、状態の治療に治療的利益を提供する治療薬の量を意味する。「治療有効量」という用語は、全体的な療法を改善する、状態の症状もしくは原因を軽減もしくは回避する、および／または別の治療薬の治療有効性を増強する量を包含することができる。「治療有効量」はまた、本発明の化合物の「予防有効量」を意味していてもよく、予防有効量は、疾患またはその状態に関連する１つ以上の症状を予防するか、またはその再発を予防するのに十分な量である。化合物の予防有効量は、単独で、または他の療法と組み合わせて、状態の予防に予防的利益を提供する治療薬の量を意味する。「予防有効量」という用語は、全体的な予防を改善するか、または別の予防剤の予防有効性を増強する量を包含することができる。
【００３６】
本明細書に記載される薬学的組成物は、薬理学分野で既知の任意の方法によって調製され得る。一般に、そのような調製方法は、化合物ＥｎｔもしくはＥｎｔアナログもしくはＥｎｔコンジュゲート、またはＥｎｔ（すなわち、「活性成分」）を産生するか、および／または過剰産生するように構成されたプロバイオティクス細菌を、担体もしくは賦形剤、および／または１つ以上の他の補助成分と会合させる工程と、次いで、必要および／または望ましい場合、生成物を所望の単回または複数回投与単位に成形し、および／または包装する工程を含む。薬学的組成物または栄養組成物は、単一の単位用量として、および／または複数の単一の単位用量として、バルクで調製され、包装され、および／または販売されていてもよい。「単位用量」は、所定量の活性成分を含む薬学的組成物の別個の量である。活性成分の量は、一般に、対象に投与されるであろう活性成分の投薬量、および／またはこのような投薬量の好都合な一部、例えば、このような投薬量の２分の１または３分の１に等しい。
【００３７】
本発明の薬学的組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤、および／または任意の追加の成分の相対量は、治療される対象の属性、大きさ、および／または状態に応じて、さらに組成物が投与される経路に応じて変化するであろう。組成物は、０．１％〜１００％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
【００３８】
提供される薬学的組成物の製造に使用される薬学的に許容される賦形剤としては、不活性希釈剤、分散剤および／または造粒剤、表面活性剤および／または乳化剤、崩壊剤、結合剤、防腐剤、緩衝剤、滑沢剤、および／または油が挙げられる。カカオバターおよび坐剤ワックスなどの賦形剤、着色剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、および香料剤も組成物中に存在し得る。
【００３９】
例示的な希釈剤としては、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム乳糖、スクロース、セルロース、微結晶セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、コーンスターチ、粉末糖、およびそれらの混合物が挙げられる。
【００４０】
例示的な造粒剤および／または分散剤としては、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン、タピオカデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、クレイ、アルギン酸、グアーガム、柑橘類果肉、寒天、ベントナイト、セルロース、および木製品、天然スポンジ、陽イオン交換樹脂、炭酸カルシウム、ケイ酸塩、炭酸ナトリウム、架橋ポリ（ビニル−ピロリドン）（クロスポビドン）、カルボキシメチルデンプンナトリウム（デンプングリコール酸ナトリウム）、カルボキシメチルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム（クロスカルメロース）、メチルセルロース、アルファデンプン（デンプン１５００）、微結晶デンプン、水不溶性デンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（Ｖｅｅｇｕｍ）、ラウリル硫酸ナトリウム、第四級アンモニウム化合物、ならびにそれらの混合物が挙げられる。
【００４１】
例示的な表面活性剤および／または乳化剤としては、天然乳化剤（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、コンドルークス（ｃｈｏｎｄｒｕｘ）、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂、コレステロール、ワックス、およびレシチン）、コロイド状クレイ（例えば、ベントナイト（ケイ酸アルミニウム）およびＶｅｅｇｕｍ（ケイ酸アルミニウムマグネシウム））、長鎖アミノ酸誘導体、高分子量アルコール（例えば、ステアリルアルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、トリアセチンモノステアレート、エチレングリコールジステアレート、グリセリルモノステアレート、およびプロピレングリコールモノステアレート、ポリビニルアルコール）、カルボマー（例えば、カルボキシポリメチレン、ポリアクリル酸、アクリル酸ポリマー、およびカルボキシビニルポリマー）、カラギーナン、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、粉末セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）、ポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０）、ソルビタンモノパルミテート（Ｓｐａｎ（登録商標）４０）、ソルビタンモノステアレート（Ｓｐａｎ（登録商標）６０）、ソルビタントリステアレート（Ｓｐａｎ（登録商標）６５）、グリセリルモノオレエート、ソルビタンモノオレエート（Ｓｐａｎ（登録商標）８０）、ポリオキシエチレンエステル（例えば、ポリオキシエチレンモノステアレート（Ｍｙｒｊ（登録商標）４５）、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油、ポリエトキシル化ヒマシ油、ポリオキシメチレンステアレート、およびＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標））、スクロース脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えば、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標））、ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）３０））、ポリ（ビニル−ピロリドン）、ジエチレングリコールモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸エチル、オレイン酸、ラウリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−６８、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ  Ｐ−１８８、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ドクサートナトリウム、および／またはそれらの混合物が挙げられる。
【００４２】
例示的な結合剤としては、デンプン（例えば、コーンスターチおよびデンプンペースト）、ゼラチン、糖（例えば、スクロース、グルコース、デキストロース、デキストリン、糖蜜、ラクトース、ラクチトール、マンニトールなど）、天然および合成ガム（例えば、アカシア、アルギン酸ナトリウム、アイルランド苔の抽出物、パンワーガム、ガッティガム、イサポールの殻の粘着物、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶セルロース、酢酸セルロース、ポリ（ビニル−ピロリドン）、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（Ｖｅｅｇｕｍ（登録商標））、およびカラマツのアラボガラクタン）、アルギン酸塩、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、無機カルシウム塩、ケイ酸、ポリメタクリレート、ワックス、水、アルコール、および／またはそれらの混合物が挙げられる。
【００４３】
例示的な防腐剤としては、酸化防止剤、キレート剤、抗真菌防腐剤、抗真菌防腐剤、抗原虫防腐剤、アルコール防腐剤、酸性防腐剤、および他の防腐剤が挙げられる。特定の実施形態では、防腐剤は、酸化防止剤である。他の実施形態では、防腐剤は、キレート剤である。
【００４４】
例示的な酸化防止剤としては、アルファトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ亜硫酸カリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウム、および亜硫酸ナトリウムが挙げられる。
【００４５】
例示的なキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびその塩および水和物（例えば、エデト酸ナトリウム、エデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、エデト酸カルシウム二ナトリウム、エデト酸二カリウムなど）、クエン酸およびその塩および水和物（例えば、クエン酸一水和物）、フマル酸およびその塩および水和物、リンゴ酸およびその塩および水和物、リン酸およびその塩および水和物、ならびに酒石酸およびその塩および水和物が挙げられる。例示的な抗真菌防腐剤としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、およびチメロサールが挙げられる。
【００４６】
例示的な抗真菌防腐剤としては、ブチルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、およびソルビン酸が挙げられる。
【００４７】
例示的なアルコール防腐剤としては、エタノール、ポリエチレングリコール、フェノール、フェノール化合物、ビスフェノール、クロロブタノール、ヒドロキシベンゾエート、およびフェニルエチルアルコールが挙げられる。
【００４８】
例示的な酸性防腐剤としては、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ベータカロテン、クエン酸、酢酸、デヒドロ酢酸、アスコルビン酸、ソルビン酸、およびフィチン酸が挙げられる。
【００４９】
他の防腐剤としては、トコフェロール、酢酸トコフェロール、メシル酸デテロキシム（ｄｅｔｅｒｏｘｉｍｅ  ｍｅｓｙｌａｔｅ）、セトリミド、ブチル化ヒドロキシアニゾール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン化（ＢＨＴ）、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）、亜硫酸水素ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、メタ亜硫酸カリウム、Ｇｌｙｄａｎｔ（登録商標）Ｐｌｕｓ、Ｐｈｅｎｏｎｉｐ（登録商標）、メチルパラベン、Ｇｅｒｍａｌｌ（登録商標）１１５、Ｇｅｒｍａｂｅｎ（登録商標）ＩＩ、Ｎｅｏｌｏｎｅ（登録商標）、Ｋａｔｈｏｎ（登録商標）、およびＥｕｘｙｌ（登録商標）が挙げられる。
【００５０】
例示的な緩衝剤として、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、塩化アンモニウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、グルセプト酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、Ｄ−グルコン酸、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、プロパン酸、レブリン酸カルシウム、ペンタン酸、リン酸二塩基カルシウム、リン酸、三塩基リン酸カルシウム、水酸化リン酸カルシウム、酢酸カリウム、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、カリウム混合物、リン酸二塩基カリウム、リン酸一塩基カリウム、リン酸カリウム混合物、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、二塩基リン酸ナトリウム、一塩基リン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム混合物、トロメタミン、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、アルギン酸、発熱性物質除去水、等張水、Ｒｉｎｇｅｒ溶液、エチルアルコール、およびそれらの混合物が挙げられる。
【００５１】
例示的な滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、タルク、麦芽、ベヘン酸グリセリル、水素化植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ラウリル硫酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物が挙げられる。
【００５２】
例示的な天然油としては、アーモンド、杏仁、アボカド、ババス、ベルガモット、ブラックカラントシード、ルリジサ、ケード、カモミール、キャノーラ、キャロウェイ、カルナウバ、ヒマシ、シナモン、ココアバター、ココナッツ、鱈の肝臓、コーヒー、トウモロコシ、綿実、エミュー、ユーカリ、イブニングプリムローズ、魚、フラックスシード、ゲラニオール、ゴード、グレープシード、ヘーゼルナッツ、ヒソップ、ミリスチン酸イソプロピル、ホホバ、ククイナッツ、ラバンジン、ラベンダー、レモン、アオモジ、マカデミアナッツ、マロー、マンゴーシード、メドフォームシード、ミンク、ナッツメグ、オリーブ、オレンジ、オレンジラフィー、パーム、パーム核、桃仁、ピーナッツ、ポピーシード、カボチャシード、菜種、米ヌカ、ローズマリー、サフラワー、サンダルウッド、サスカワナ、サバ、シーバックソーン、ゴマ、シアバター、シリコーン、大豆、サフラワー、ティーツリー、アザミ、ツバキ、ベチバー、クルミ、および胚芽の油が挙げられる。例示的な合成油としては、限定されないが、ステアリン酸ブチル、カプリルトリグリセリド、カプリントリグリセリド、シクロメチコン、セバシン酸ジエチル、ジメチコン３６０、ミリスチン酸イソプロピル、鉱物油、オクチルドデカノール、オレイルアルコール、シリコーン油、およびそれらの混合物が挙げられる。
【００５３】
経口および非経口投与のための液体剤形としては、薬学的に許容されるエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシル剤が挙げられ、好ましくは、単位用量のＥｎｔ、またはＥｎｔを発現および／または過剰発現するように構成された単位用量のプロバイオティクス細菌を含有する。活性成分に加えて、液体剤形は、当該技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（例えば、綿実油、花実油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物を含んでもよい。不活性希釈剤に加えて、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味剤、香味剤、および香料剤などのアジュバントを含んでもよい。非経口投与のためのある特定の実施形態では、本発明のコンジュゲートは、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）、アルコール、油、改質油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、およびそれらの混合物などの可溶化と混合される。
【００５４】
注射可能な調製物、例えば、滅菌注射可能な水性または油性懸濁液は、好適な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して、既知の技術に従って製剤化され得る。滅菌注射可能な調製物は、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液として、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射可能な溶液、懸濁液、またはエマルションであり得る。使用することができる許容されるビヒクルおよび溶媒の中には、水、Ｒｉｎｇｅｒ溶液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．および等張塩化ナトリウム溶液がある。さらに、無菌の固定油は、従来、溶媒または懸濁媒体として用いられる。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む、任意の商品名の固定油を用いることができる。さらに、注射剤の調製には、オレイン酸などの脂肪酸が使用される。
【００５５】
注射可能な製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通して濾過することによって、または使用前に滅菌水もしくは他の滅菌注射用媒体に溶解もしくは分散することができる滅菌固体組成物の形態の滅菌剤を組み込むことによって、滅菌することができる。
【００５６】
薬物の効果を延長するために、多くの場合、皮下または筋肉内注射からの薬物の吸収を遅らせることが望ましい。これは、水溶性が低い結晶性または非晶質材料の液体懸濁液の使用によって達成され得る。次いで、薬物の吸収速度は、その溶解速度に依存し、ひいては、結晶サイズおよび結晶形態に依存し得る。あるいは、非経口投与された薬物形態の吸収遅延は、薬物を油ビヒクル中に溶解または懸濁させることによって達成され得る。
【００５７】
経口投与のための固体剤形は、カプセル、錠剤、丸薬、粉末、および顆粒を含む。そのような固体剤形において、活性成分は、少なくとも１つの不活性で薬学的に許容される賦形剤もしくは担体、例えば、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウム、および／または（ａ）充填剤もしくは増量剤、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸、（ｂ）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、スクロース、およびアカシア、（ｃ）湿潤剤、例えば、グリセロール、（ｄ）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウム、（ｅ）溶液遅延剤、例えば、パラフィン、（ｆ）吸収促進剤、例えば、第四級アンモニウム化合物、（ｇ）湿潤剤、例えば、セチルアルコールおよびグリセロールモノステアレート、（ｈ）吸収剤、例えば、カオリンおよびベントナイトクレイ、および（ｉ）滑沢剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、ならびにそれらの混合物と混合される。カプセル、錠剤、および丸薬の場合、剤形は緩衝剤を含んでよい。
【００５８】
同様の種類の固体組成物は、ラクトースまたは乳糖などの賦形剤、ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどを使用して、軟質および硬質充填ゼラチンカプセル中の充填剤として使用することができる。錠剤、糖衣錠、カプセル、丸薬、および顆粒の固体剤形は、薬理学の技術分野で周知である腸溶性コーティングおよび他のコーティングなどのコーティングおよびシェルで調製することができる。それらは、任意選択で不透明化剤を含んでもよく、それらが活性成分（複数可）のみを放出する組成物であってもよく、または好ましくは、腸管の特定の部分において、任意選択で、遅延様式で放出する組成物であってもよい。使用され得るカプセル化組成物の例としては、高分子物質およびワックスが挙げられる。同様の種類の固体組成物は、ラクトースまたは乳糖などの賦形剤、ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどを使用して、軟質および硬質充填ゼラチンカプセル中の充填剤として使用することができる。
【００５９】
活性成分は、上述の１つ以上の賦形剤を有するマイクロカプセル化形態であり得る。錠剤、糖衣錠、カプセル、丸薬、および顆粒の固体剤形は、医薬品製剤学の技術分野で周知である腸溶性コーティング、放出制御コーティングおよび他のコーティングなどのコーティングおよびシェルで調製することができる。このような固体剤形において、活性成分は、スクロース、ラクトース、またはデンプンなどの少なくとも１つの不活性希釈剤と混合することができる。このような剤形は、通常の実施として、不活性希釈剤以外の追加の物質、例えば、錠剤滑沢剤、およびステアリン酸マグネシウムおよび微結晶セルロースなどの他の錠剤化補助剤を含んでもよい。カプセル、錠剤、および丸薬の場合、剤形は緩衝剤を含んでもよい。それらは、任意選択で不透明化剤を含んでもよく、それらが活性成分（複数可）のみを放出する組成物であってもよく、または好ましくは、腸管の特定の部分において、任意選択で、遅延様式で放出する組成物であってもよい。使用され得るカプセル化剤の例としては、高分子物質およびワックスが挙げられる。
【００６０】
本明細書に提供される化合物および組成物は、経腸（例えば、経口）、非経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、皮下、脳室内、経皮、皮内、直腸、膣内、腹腔内、局所（粉末、軟膏、クリーム、および／または滴下によって）、粘膜、経鼻、口腔、舌下を含む任意の経路によって、気管内滴下、気管支滴下、および／または吸入によって、ならびに／または経口スプレー、鼻腔スプレー、および／またはエアロゾルとして投与され得る。本明細書に開示される化合物および組成物の具体的に想定される投与経路は、吸入および鼻腔内投与、皮下投与、粘膜投与、および皮膚間投与である。一般に、最も適切な投与経路は、薬剤の性質（例えば、胃腸管の環境におけるその安定性）、および／または対象の状態（例えば、対象が経口投与に耐えることができるかどうか）を含む様々な因子に依存するであろう。
【００６１】
有効量を達成するために必要とされる「活性成分」の実際の量は、例えば、対象の種族、年齢、および一般状態、副作用または障害の重症度、特定の化合物の属性、投与様式などに応じて、対象によって異なるであろう。所望の投薬量は、１日３回、１日２回、１日１回、隔日、３日毎、１週間毎、２週間毎、３週間毎、または４週間毎に送達することができる。特定の実施形態では、所望の投薬量は、複数回の投与（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、またはさらに多い投与）を使用して送達することができる。
【００６２】
特定の実施形態では、７０ｋｇの成人に１日に１回以上投与するための化合物の有効量は、単位剤形あたり、約０．０００１ｍｇ〜約３０００ｍｇ、約０．０００１ｍｇ〜約２０００ｍｇ、約０．０００１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、約０．００１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、約１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、約１ｍｇ〜約１００ｍｇ、約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇ、または約１００ｍｇ〜約１０００ｍｇの化合物を含んでいてもよい。
【００６３】
また、キット（例えば、医薬パック）が、本発明に包含される。提供されるキットは、Ｅｎｔの化合物または組成物（例えば、薬学的組成物または診断組成物）と、容器（例えば、バイアル、アンプル、ボトル、シリンジ、および／またはディスペンサーパッケージ、または他の好適な容器）とを含んでもよい。提供されるキットは、エンテロバクチンに選択的に結合する抗体または組成物（例えば、薬学的組成物または診断組成物）と、容器（例えば、バイアル、アンプル、ボトル、シリンジ、および／またはディスペンサーパッケージ、または他の好適な容器）とを含んでもよい。いくつかの実施形態では、提供されるキットは、任意選択で、本発明の薬学的組成物または化合物を希釈または懸濁させるための賦形剤（例えば、薬学的に許容される賦形剤）を含む第２の容器をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、第１の容器および第２の容器に提供されるＥｎｔの化合物または組成物を混ぜあわせて、１つの単位剤形を形成する。別の態様では、本発明は、化合物Ｅｎｔを使用して産生される抗体、すなわち、エンテロバクチンに選択的に結合する抗体を含む第１の容器を含むキットを提供する。
【００６４】
「対象」という用語は、任意の動物を指す。特定の実施形態では、対象は、哺乳動物である。特定の実施形態では、対象は、ヒト（例えば、男性、女性、または子供）である。ヒトは、どちらかの性別であってもよく、発達の任意の段階であってもよい。特定の実施形態では、対象は、治療される状態または疾患を有すると診断されている。他の実施形態では、対象は、その状態または疾患を発症するリスクがある。特定の実施形態では、対象は、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、または霊長類）である。実験動物は、遺伝子操作され得る。特定の実施形態では、対象は、飼育動物（例えば、イヌ、ネコ、トリ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、またはニワトリ）である。
【実施例】
【００６５】
実施例１：細菌変異体スクリーニングは、宿主発育に対するＥ．ｃｏｌｉ産生エンテロバクチンの利点を特定する。
本発明技術の一実施形態では、本願発明者らは、宿主動物の成長および発育に利益をもたらす微生物代謝産物の同定を容易にするための独自のアッセイを作製した。本願発明者らによる以前の研究は、熱殺菌（ＨＫ）Ｅ．ｃｏｌｉが、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの幼虫の成長に総合的に必要とされる特定の分子を欠いていることを明らかにした。ＨＫ  Ｅ．ｃｏｌｉプレートに、単独では虫の成長を補助することができなかった生存Ｅ．ｃｏｌｉを微量追加したとき、幼虫の成長が回復し（図１Ａ）、このことは、微量の生存細菌が、ＨＫフードを使用可能にする代謝産物を生成したことを示唆している。この独自の供給条件を使用して、潜在的に宿主動物に利益をもたらすために特定の代謝産物を提供することができないことに起因して、正常な虫の成長を補助することができないＥ．ｃｏｌｉ変異体を検索した。Ｅ．ｃｏｌｉ単一遺伝子ノックアウトライブラリ（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋｅｉｏ集合）をスクリーニングした後、本願発明者らは、エンテロバクチン（Ｅｎｔ）生合成が破壊された５つのＥ．ｃｏｌｉ変異体のいずれかを微量供給された虫が、顕著に遅く成長することがわかった（図１Ｂ、Ｃ）。驚くべきことに、本願発明者らは、虫の成長欠陥が、Ｅｎｔの餌補給によって完全に克服されることを観察した（図１Ｄおよび図８Ａ）。さらに、代謝中間体２，３−ＤＨＢＡを補給すると、ｅｎｔＡ−Ｅ．ｃｏｌｉに対する虫の成長を助けたが、ｅｎｔＦ−Ｅ．ｃｏｌｉに対する虫の成長を助けず（図１Ｃ、Ｅ）、このことは、最終産物であるＥｎｔのみが、虫に対してこの利益をもたらすことができることを確認する。
【００６６】
本願発明者らはさらに、虫成長のためのＥｎｔのこの有益な役割は、シデロホアとしてのＥｎｔの細菌使用とは独立している可能性が高いことを示した。具体的には、鉄ＥｎｔのためのＥ．ｃｏｌｉ外膜受容体をコードするｆｅｐＡを破壊すると（図８Ｂ）、虫の発育に影響を与えなかった（図１Ｆおよび図８Ｃ）。本願発明者らはまた、ｅｎｔＡ−変異体細菌およびｅｎｔＦ−変異体細菌が、概説された培養条件下での成長または虫の腸コロニー形成において明らかな欠陥を示さないことを示した（図８ＤおよびＥ）。
【００６７】
他の２つのシデロホア（ピオベルジンおよびフェリクローム）の補給は、虫成長に対して同様の影響をもたらすことができず（図１Ｇおよび図８Ｆ）、このことは、観察されたＥｎｔの役割の特異性を示している。以前の研究では、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａによって産生されたシデロホアであるピオベルジンが、液体培養物中の宿主ミトコンドリアに損傷を与えることによってＣ．ｅｌｅｇａｎｓに毒性があることが示されており（Ｋｉｒｉｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．、２０１５）、ピオベルジンまたはフェリクロームを用いた負の結果が、主にこれらのシデロホアの毒性に起因するものであったかどうかの疑問が生じている。したがって、本願発明者らは、固体培地を用いる確認された培養条件下で、野生型Ｅ．ｃｏｌｉが供給され、ピオベルジンおよびフェリクロームが補給されたＣ．ｅｌｅｇａｎｓにおける成長（図８Ｆ）またはミトコンドリア形態（図８Ｇ）に明らかな欠陥がないことを試験し、観察した。加えて、本願発明者らは、Ｅｎｔ補給が、液体培地中であってもミトコンドリア形態を破壊しないことを見出し（図８Ｈ）、これはピオベルジンの効果とは異なるものである。
【００６８】
確立されたアッセイ（ＳｃｈｗｙｎおよびＮｅｉｌａｎｄｓ、１９８７）を修正して、虫全体におけるシデロホアレベルを評価し、本願発明者らは、野生型Ｅ．ｃｏｌｉが供給された虫が、ｅｎｔＦ−変異体Ｅ．ｃｏｌｉが供給された虫よりも有意に高いレベルのシデロホアを含有していることを見出した（図１Ｈ）。この培養条件下でのＥ．ｃｏｌｉからのＥｎｔの産生は、高い鉄レベルがＥｎｔ生合成を抑制することが既知である（Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９６）ことを考慮すると、参照実験における比較的低い鉄培地と一致している。
【００６９】
Ｅｎｔの補給だけでは、ＨＫ細菌のみが供給された虫の発育にいかなる顕著な効果ももたらさなかった（図８Ｉ）。このことは、ＨＫ細菌が、Ｅｎｔまたは任意の１つの特定の代謝産物を欠くというだけではないことを示している（Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．、２０１７）。これとは逆に、豊富な生存ｅｎｔＡ−またはｅｎｔＦ−変異体細菌が供給された虫は、より遅い速度で増殖を続け（図１Ｉ）、このことは、新規な感度の高いアッセイ系によって顕著に検出された、宿主細胞に対するＥｎｔの有意な利益を確認するものであった（図１ＢＤ）。動物成長に対するＥｎｔのこのような利点は、特定の自然環境においても顕著な場合がある。
【００７０】
実施例２：細菌エンテロバクチンは宿主中の鉄プールを促進する。
Ｅｎｔは、Ｆｅ３＋に対する高い親和性を有するため、鉄の恒常性に影響を与えることによって宿主動物の成長および発育に潜在的に利益をもたらし得る。本願発明者らは、一般的に使用される蛍光細胞透過性染料であるカルセインＡＭを使用し、その放射が鉄の結合によって消光され、既に記載されているように生存虫に適用し、宿主中の全鉄レベルを推定した。ｅｎｔＡ−またはｅｎｔＦ−変異体細菌が供給された虫は、蛍光強度が劇的に増加したことによって明らかにされるように、かなり低い鉄レベルを有し、その鉄レベルは、Ｅｎｔ補給によって回復した（図２Ａ）。本願発明者らは、鉄貯蔵タンパク質フェリチンのＣ．ｅｌｅｇａｎｓホモログをコードする鉄応答性遺伝子ｆｔｎ−２の発現も調べた（Ｒｏｍｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１）。ｐｆｔｎ−２：：ＧＦＰレポーターの発現は、ｅｎｔＡ−またはｅｎｔＦ−変異体細菌が供給された虫において、劇的に減少した（図２Ｂ）。したがって、細菌Ｅｎｔは、宿主Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて、鉄レベルを上昇させる。
【００７１】
虫の成長状態が、Ｅｎｔが促進する鉄レベル上昇に及ぼす影響を除外するために、本願発明者らは、両鉄マーカーを使用して、ＨＫ  Ｅ．Ｃｏｌｉが供給された虫が、より低い鉄レベルを示し、このような欠陥が、Ｅｎｔ補給によって抑制されること（図２Ｃ、Ｄ）を示し、一方、虫は、両条件下で停止したままであった。これとは逆に、鉄レベルは、豊富な生存ｅｎｔＡ−またはｅｎｔＦ−変異体細菌のみが供給された虫では低く（図２Ｅ）、速度は低いものの、虫は成長を続けた（図１Ｈ）。したがって、宿主の鉄レベルに対してＥｎｔが及ぼす影響は、他の供給条件および虫の成長とは独立している。ＨＫ餌のみを供給して得られた結果（図２Ｃ、Ｄ）は、有益なＥｎｔの効果が、Ｅｎｔの細菌使用の二次的効果に起因するものではないという追加の証拠を提供した。
【００７２】
餌としてのＥ．ｃｏｌｉを播種した典型的な虫成長培地（ＮＧＭプレート）は、そのレシピと、細菌中のＥｎｔ生合成が鉄が豊富な条件下で抑制されるという事実に基づき、低鉄環境に存在すると思われる。餌に多くのＦｅ３＋（ＦｅＣｌ３）添加すると、Ｅｎｔが欠乏する餌を供給された動物において、成長の欠陥を抑制せず（図９Ａ）、細胞の鉄レベルも上昇しなかった（図９Ｂ）。ヘミンの添加も、動物の成長に影響を与えなかった（図９Ｃ）。したがって、Ｅｎｔは、餌中の鉄レベルにかかわらず、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの最適な鉄取り込みおよび成長を促進し得る。最適なＣ．ｅｌｅｇａｎｓの成育にＥｎｔが必要な場合、本発明の新規なアッセイ系において、野生型Ｅ．ｃｏｌｉに多くの塩化第二鉄を添加すると（図２Ｆ）、生存Ｅ．ｃｏｌｉ源においてＥｎｔ産生を阻害し、その結果、虫の成長を遅らせることが予想される。実際、本願発明者らは、生存Ｅ．ｃｏｌｉに塩化第二鉄を添加して虫の成長欠陥を観察し、この成長欠陥が、Ｅｎｔ補給によって抑制された（図２Ｆ、９Ｄ）。このことは、鉄が豊富な環境であってもＥｎｔが必要であることを裏付けており、ひいては、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの腸内の鉄レベルが、通常は腸微生物叢からのＥｎｔ産生の完全な抑制を引き起こす高さには達しないことを示唆し得る。
【００７３】
さらに、以前の研究では、虫がＣａＥＤＴＡで治療された鉄欠乏条件下で、虫において鉄レベルおよび成長速度が減少することが示された（Ｋｌａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２０１４）（図２Ｇ）。しかしながら、両方の欠陥が、より多くのＦｅＣｌ３を添加するか、またはＥｎｔ補給のいずれかによって抑制された（図２Ｇ）。驚くべきことに、１０倍のＦｅＣｌ３を補給すると、ＣａＥＤＴＡが供給された虫における鉄レベルが、ＣａＥＤＴＡと追加のＥｎｔが供給された虫において観察されるレベルまで回復し（図２Ｇ）、このことは、Ｅｎｔが介在する鉄取り込みが、この条件下、虫において少なくとも１０倍の鉄レベル上昇の原因となり得ることを間接的に示唆している。この結果は、鉄欠乏条件下での宿主鉄恒常性に対するＥｎｔの顕著な影響を示す。
【００７４】
実施例３：細菌エンテロバクチンは、宿主ＡＴＰシンターゼα−サブユニットに結合する。
虫の鉄恒常性に対するＥｎｔの影響の根底にある機構を理解するために、本願発明者らは、固定されたＥｎｔを用いたアフィニティクロマトグラフィー、その後に質量分光分析を使用して、虫におけるＥｎｔ結合タンパク質を同定した（図３Ａ）。２つの独立した実験（図３Ａおよび表１）の両方において、２つの候補タンパク質ＣＴＬ−２およびＡＴＰ−１のみが捕捉された。ＣＴＬ−２は、鉄に結合することが既知であるカタラーゼのホモログである。ＡＴＰ−１は、鉄の生物学における役割は未知のミトコンドリアＡＴＰシンターゼのα−サブユニットである（ＪｕｎｇｅおよびＮｅｌｓｏｎ、２０１５）。次いで、本願発明者らは、動物の成長に対するＥｎｔの影響について、各タンパク質の必要性を試験した。ａｔｐ−１のＲＮＡｉは、ｃｔｌ−２とは異なり、Ｅｎｔ補給による虫の成長の救出を防止し（図３Ｂ）、このことは、ＡＴＰ−１が、ＣＴＬ−２とは異なり、宿主における観察されたＥｎｔ機能を媒介する際に潜在的に重要な役割をはたし得ることを示唆している。
【００７５】
次いで、本願発明者らは、ＡＴＰ−１に対するＥｎｔの結合を確認するために３つの追加の実験を実施した。第１に、インビボアッセイにおいて、虫に細菌＋／−ビオチン−Ｅｎｔを供給し、全タンパク質抽出物を単離し、その後、ストレプトアビジン−ビーズ精製およびＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＡＴＰ−１タンパク質は、哺乳動物のＡＴＰシンターゼのα−サブユニットに対する抗体を用いるウェスタンブロッティングによって明確に検出され（図３Ｃおよび図１０Ａ）、このことは、ＥｎｔとＡＴＰ−１との間の相互作用を示している。第２に、インビトロ結合アッセイにおいて、本願発明者らは、ビオチン−Ｅｎｔ（鉄を含まない）がＡＴＰ−１−Ｈｉｓに効率的に結合し（図３Ｄ）、この結合が、過剰なＥｎｔによって破られ得ることを発見した（図３Ｅ）。鉄を含まないビオチン−Ｅｎｔと同様に、鉄が結合したビオチン−ＥｎｔもＡＴＰ−１タンパク質に結合した（図１０Ｂ、Ｃ）。
【００７６】
最後に、本願発明者らは、ＥｎｔがＡＴＰ−１と鉄との間の相互作用を媒介する能力を試験した。本願発明者らは、虫溶解物に放射性標識した鉄（５５ＦｅＣｌ３）を添加し、次いで、免疫沈降ＡＴＰ−１を添加した。ＡＴＰ−１−ＩＰ試料において放射能を測定することによって、本願発明者らは、Ｅｎｔの添加が（２つの他のシデロホアではなく）、５５Ｆｅに対するＡＴＰ−１の結合を劇的に増加させることを見出し（図３Ｆ）、このことは、ＡＴＰ−１と鉄との間の相互作用を媒介する際のＥｎｔの特定の役割を裏付けている。追加の分析は、ＡＴＰ−１の２１アミノ酸配列がＥｎｔ結合に重要に関与していることを示す（図１０Ｄ〜Ｆ）。（特に、図１１Ｄに関し、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのＡＴＰ−１アミノ酸配列は、本明細書では配列番号７として同定され、一方、ヒトＡＴＰ−１アミノ酸配列は、本明細書では配列番号８として同定される。）まとめると、これらの結果は、細菌Ｅｎｔが、真核生物ＡＴＰ−１に直接的に結合し、鉄とのＡＴＰ−１相互作用を促進することを示す。
【００７７】
実施例４：ＡＴＰ−１は、宿主の鉄レベルのエンテロバクチン依存性の促進に必要である。
次に、本願発明者らは、ＥｎｔがＥｎｔ−ＡＴＰ−１複合体を介して宿主の鉄プールを促進するかどうかを試験した。本願発明者らは、第１に、カルセイン−ＡＭ蛍光の増加によって示されるように、ＡＴＰ−１機能喪失（ｌｆ）Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ変異体、またはａｔｐ−１（ＲＮＡｉ）で治療された野生型虫において鉄レベルが劇的に減少したことを示すことによって、鉄恒常性におけるＡＴＰ−１の役割を決定した（図４Ａ、Ｂ）。次いで、本願発明者らは、ａｔｐ−１のＲＮＡｉが、ｅｎｔＦ−変異体細菌に対するＥｎｔ補給で見られる鉄レベルの上昇を排除したため、虫において鉄レベルを促進する際のＥｎｔの効果が、ＡＴＰ−１に依存すると判断した（図４Ｃ）。成長が停止した動物に対するＨＫ  Ｅ．ｃｏｌｉ＋／−Ｅｎｔの効果（図２Ｃ）も、ａｔｐ−１に依存することが見出された（図４Ｄ）。最後に、宿主の鉄レベルは、ＡＴＰシンターゼの３つの他のサブユニットの各々のＲＮＡｉノックダウンによって有意に変化せず（図４Ｂ）、このことは、鉄レベルに対するＡＴＰの影響が、ＡＴＰシンターゼ機能を破壊する間接的な効果に起因する可能性が低いことを示唆している。したがって、細菌Ｅｎｔは、ＡＴＰシンターゼα−サブユニットとの相互作用によって、宿主の鉄恒常性を促進する。
【００７８】
実施例５：観察されたＡＴＰ−１機能は、ＡＴＰシンターゼにおけるその役割とは独立している。
ＡＴＰシンターゼα−サブユニットとして、ＡＴＰ−１は、この大きな酵素複合体のβおよび他のサブユニットと相互作用すると予想される。免疫染色を使用して、本願発明者らは、ミトコンドリアにおける哺乳動物ＡＴＰシンターゼのα−サブユニット（ＡＴＰ５Ａ１）およびβ−サブユニット（ＡＴＰ５Ｂ）の同時局在化を観察した（図１１Ａ）。ＡＴＰシンターゼの本質的な役割と一致して、ａｔｐ−１およびａｔｐ−２の両方における機能喪失変異は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおけるＬ１停止表現型を示す（図４Ａ）。ａｔｐ−１またはａｔｐ−２のＲＮＡｉは、成長欠陥も示した（図１１Ｂ、Ｃ）。したがって、宿主の鉄プールを促進する際のＡＴＰ−１機能がＡＴＰシンターゼの他のサブユニットに依存するかどうかを試験した。Ｅｎｔに対するＡＴＰ−１の結合が、ＡＴＰシンターゼのβ−サブユニットのＲＮＡｉ（ＡＴＰ−２）によって影響を受けないことを見出し（図１１Ｃ）、図４Ｂに示すように、ａｔｐ−１（ＲＮＡｉ）によって生じる鉄レベルの低下は、β、ｂおよびＯサブユニットについての遺伝子のＲＮＡｉで治療された虫ではみられなかった。したがって、ＡＴＰ−１のこの役割は、他のＡＴＰシンターゼサブユニットとは独立している。
【００７９】
ＡＴＰに対する結合は、ＡＴＰシンターゼにおけるαサブユニットの役割の重要な部分であるため、本願発明者らは、ＡＴＰ結合ドメインがＥｎｔ相互作用に必要であるかどうか、および鉄レベルを促進する際のその役割を決定したいと考えた。したがって、本願発明者らは、ＡＴＰ−１タンパク質配列から残基１９８〜２０５（ＤＲＱＴＧＫＴＡ）を欠失させ（図１１Ｄ）、インビトロ結合アッセイによって、この欠失が、このタンパク質がＥｎｔに結合する能力を低下させないことを見出し（図４Ｅ）、このことは、ＡＴＰ−１−Ｅｎｔ結合が、ＡＴＰ−１−ＡＴＰ結合とは独立していることを示唆している。次に、本願発明者らは、このＡＴＰ−１（ｄｅｌ）タンパク質のトランスジェニック発現が、Ｅｎｔが介在する鉄取り込みにおいてＡＴＰ−１として機能するのに十分であるかどうかを試験した。図４Ａに示すように、［Ｐｒｐｌ−２８：：ａｔｐ−１（ｄｅｌ）］導入遺伝子由来のリボソーム遺伝子プロモータの背後にあるこのタンパク質の発現は、ａｔｐ−１（ｌｆ）変異によって引き起こされる鉄レベルの低下を有意に抑制した。したがって、ＡＴＰ−１機能は、Ｅｎｔとの相互作用および鉄取り込みの促進の両方において、ＡＴＰ結合におけるその役割とは独立している。
【００８０】
実施例６：エンテロバクチン−ＡＴＰ−１相互作用は、宿主ミトコンドリアにおける鉄レベルを促進する。
ミトコンドリアへの鉄輸送は、不安定な鉄プールおよび全体的な鉄の恒常性に重大な影響を及ぼすため、本願発明者らは、細菌Ｅｎｔおよびその宿主ＡＴＰ−１との相互作用がミトコンドリアにおいて鉄レベルを促進するかどうかを決定したいと考えた。本願発明者らは、第１に、ミトコンドリアにおけるＡＴＰ−１機能と一致する、腸内のＡＴＰ−１とＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒマーカーの共局在化を観察した（図１２Ａ）。次いで、本願発明者らは、哺乳動物細胞の公開されたプロトコル（Ｄｅｖｉｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０）から改変されたインビボアッセイを実施し、ミトコンドリアの鉄レベルの促進におけるＥｎｔ−ＡＴＰ−１相互作用の役割を調べた。虫をＲＮＡｉで治療し、５５ＦｅＣｌ３＋／−Ｅｎｔを供給し、続いてミトコンドリアの単離および放射能の測定（５５Ｆｅ）を行った。ミトコンドリア鉄（５５Ｆｅ）は、Ｅｎｔを補給すると３倍に増加し、この増加は、ＡＴＰ−１に依存したが、他のＡＴＰシンターゼサブユニットには依存しなかった（図５Ａ）。これに加えて、本願発明者らは、野生型Ｅ．ｃｏｌｉが供給された虫から単離されたミトコンドリアが、ｅｎｔＦ−変異体細菌が供給された虫よりも有意に高レベルのシデロホアを含有することを示し、このことは、Ｅｎｔもミトコンドリアに入り（図５Ｂ）、ＡＴＰ−１がＲＮＡｉによって減少したときに、ミトコンドリアにおけるＥｎｔのレベルが有意に減少した（図５Ｃ）ことを示している。したがって、細菌Ｅｎｔは、宿主ミトコンドリアの鉄レベルの増加を容易にし、このプロセスは、宿主ミトコンドリアにおけるＡＴＰ−１の新規なＡＴＰシンターゼに依存しない機能を必要とする。
【００８１】
実施例７：ＡＴＰ−１は、ミトコンドリア内で作用し、ミトコンドリアにおけるＥｎｔ−Ｆｅ３＋レベルの増加を促進する；
ＡＴＰシンターゼα−サブユニットは、ミトコンドリアマトリックス内に存在し、このタンパク質は、十分に特性決定されたミトコンドリアタンパク質輸送機構によってミトコンドリアに輸送される。したがって、ＡＴＰ−１が、輸送前にＡＴＰ−１がＥｎｔに結合することを必要とする「共輸送」モデルによって、Ｅｎｔ−Ｆｅ３＋をミトコンドリアに入り込ませることを容易にする可能性がある。このモデルを試験するために、本願発明者らは、ＡＴＰ−１合成またはミトコンドリアへのシャトルが存在しない、精製されたミトコンドリアにおけるＥｎｔおよびＡＴＰ−１の役割を観察することが可能であるかどうかを決定したいと考えた。
【００８２】
哺乳動物細胞の公開されたプロトコル（Ｄｅｖｉｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０、参照により本明細書に組み込まれる）から改変されたこのインビトロアッセイにおいて、本願発明者らは、第１に、ＲＮＡｉ治療された虫からミトコンドリアを抽出し、次いで、５５ＦｅＣｌ３＋／−Ｅｎｔを加え、その後、５５Ｆｅの定量化を行った。Ｅｎｔの添加は、ミトコンドリアにおける鉄（５５Ｆｅ）レベルを１０倍劇的に増加させ、この増加は、虫をａｔｐ−１のＲＮＡｉで治療したときに大幅に減少したが、３つの他のＡＴＰシンターゼサブユニットを標的とするＲＮＡｉで治療された虫では大幅に減少しなかった（図５Ｄ）。この結果は、ミトコンドリアの鉄レベルを促進する際に、残りのＡＴＰシンターゼとは異なり、ＥｎｔおよびＡＴＰ−１の役割をさらに裏付ける。アッセイ混合物において新しいＡＴＰ−１タンパク質を作製することができなかったため、このアッセイの結果は、潜在的な「共輸送」モデルを除外する可能性が高く、ＡＴＰ−１が、ミトコンドリア内のＥｎｔに結合することによってミトコンドリアのＥｎｔ−Ｆｅの入り込みを容易にすることを示唆し得る。この「保持」モデルは、次いで、Ｅｎｔ−Ｆｅ３＋が他の手段によってミトコンドリアに入り、ＡＴＰ−１相互作用を用いずに出ていく傾向が高い可能性があることを示唆しており、Ｅｎｔが受動的な透過によって哺乳動物細胞に入ることができるという仮説と一致する可能性がある。インビボアッセイ（図５Ａ）と比較して、インビトロアッセイ（図５Ｄ）において観察された強いＥｎｔ効果は、インビトロアッセイ条件下での溶液上にあるミトコンドリア環境に対するＥｎｔのより強い親和性に起因する可能性がある。
【００８３】
ミトコンドリアの鉄レベルにおけるＥｎｔが介在する増加の機能的影響を観察するために、本願発明者らは、本願発明者らの培養条件下、虫における鉄依存性ミトコンドリア酵素に対するＥｎｔの効果を試験した。２つのミトコンドリアＦｅ−Ｓクラスター酵素であるアコニターゼおよびコハク酸デヒドロゲナーゼの活性が、Ｅｎｔ補給によって有意に増加することが見出され（図５Ｅ、Ｆ）、このことは、Ｆｅ−Ｓクラスターおよびミトコンドリア内の他の鉄含有分子に対して鉄を供給する際のＥｎｔ−ＡＴＰ−１複合体の役割を裏付けている。
【００８４】
実施例８：Ｅｎｔは、ＡＴＰ５Ａ１と相互作用して、哺乳動物細胞へのミトコンドリアの鉄取り込みを促進する。
配列アラインメントは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ由来のＡＴＰシンターゼα−サブユニット（ＡＴＰ−１、Ｗｏｒｍｂａｓｅ；配列番号７）とヒト由来のＡＴＰシンターゼα−サブユニット（ＡＴＰ５Ａ１、ＮＣＢＩ；配列番号８）との間の７８％の同一性を示す（図１１Ｄ）。ＣＡＳ染色を用い、本願発明者らは、培地に補給されたＥｎｔが、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞に入ることができることを観察した（図６Ａ）。このＥｎｔ−ＡＴＰ−１機能が哺乳動物において保存されているかどうかを試験するために、本願発明者らは、＋／−ビオチン−Ｅｎｔを培養したヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来の全タンパク質抽出物を用い、既に記載したビオチン−Ｅｎｔプルダウンアッセイ（図３Ａ）を繰り返した。ＡＴＰ５Ａ１が明確に検出され（図６Ｂ）、このことは、Ｅｎｔが、哺乳動物細胞中でＡＴＰ５Ａ１にも結合することを裏付けている。インビトロ結合アッセイでは、ビオチン−Ｅｎｔがヒトタンパク質ＡＴＰ５Ａ１に直接結合し、この結合が、過剰な遊離Ｅｎｔの存在によって、効率的に競合した（図６Ｃ）。第３のアッセイにおいて、本願発明者らは、細胞溶解物＋／−Ｅｎｔに放射性標識した鉄（５５ＦｅＣｌ３）を添加し、次いで、ＡＴＰ５Ａ１抗体を用い、ＩＰを行った。Ｅｎｔの存在により、ＡＴＰ５Ａ１−ＩＰ試料における５５Ｆｅレベルが増加した（図６Ｄ）。まとめると、これらのデータは、ＥｎｔとＡＴＰシンターゼα−サブユニットとの間の相互作用が哺乳動物細胞において保存されていることを示している。
【００８５】
ミトコンドリアの鉄取り込みを促進する際のＥｎｔ−ＡＴＰ−１複合体の機能がヒト細胞においても保存されているかどうかを試験するために、本願発明者らは、インビボおよびインビトロの両方でのミトコンドリアの鉄取り込みアッセイを行い、両方のアッセイにおいて、Ｅｎｔの添加がミトコンドリアにおける鉄レベルを顕著に増加させることを見出した（図６Ｅ、Ｆ）。さらに、ｓｉＲＮＡノックダウン（図１３Ａ）を使用して、本願発明者らは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのアッセイと同様の方法で（図５Ａ、Ｄ）、このＥｎｔが介在する増加がＡＴＰ５Ａ１に依存していることを観察した（図６Ｅ、Ｆ）。本願発明者らはまた、鉄が結合してその蛍光を消光させる蛍光ミトコンドリア鉄指示薬ＲＰＡを使用することによって、細胞におけるミトコンドリア鉄レベルを測定した。Ｅｎｔの補給は、細胞におけるミトコンドリア鉄レベルを増加させ、この鉄増強効果は、ＡＴＰ５Ａ１  ｓｉＲＮＡｉで治療された細胞ではみられなかった（図６Ｇ）。熱殺菌餌が供給された虫における差と比較して、培養した細胞では比較的小さな変化がみられ（図２）、これは、この細胞培養条件下での高いベース鉄レベルに起因する可能性がある。これらのデータは、Ｅｎｔが、哺乳動物のミトコンドリア鉄レベルに影響を与え、ＡＴＰ５Ａ１に依存する様式で影響を与えることを裏付けている。
【００８６】
実施例９：Ｅｎｔ添加は、鉄キレート剤を有する培地中のヒトＨＥＫ２９３細胞における鉄の取り込みを増加させる。
図２Ｇにおいて、本願発明者らは、鉄欠乏条件下で鉄を生存Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓに移動させるための強力なＥｎｔの効果を示した（鉄キレート剤を添加した）。ここで、ヒトＨＥＫ２９３細胞において同様の試験を行った。鉄キレート剤であるデフェロキサミン（ＤＦＯ）を培地に添加すると、カルセインＡＭ染色蛍光の増加によって示されるように、鉄レベルが細胞内で有意に減少した。鉄レベルは、培地にＥｎｔ（１．５ｕＭ）を添加することによってほとんど回復した。Ｅｎｔ添加によるカルセインＡＭ蛍光の減少（４５％）は、図６Ｇに示されるＤＦＯを使用しない試験よりも強く、このことは、低鉄条件が、Ｅｎｔの存在に対して、より感度が高いことを示唆している。この結果は、鉄（低レベルの遊離イオンまたはＤＦＯに結合した鉄）を細胞に移動させる際のＥｎｔの有効性を示す。
【００８７】
実施例１０：ＥｎｔおよびＡＴＰＳαは、リポソームの脂質二重層を横断する鉄トラフィッキングを促進する。
本願発明者は、合成リポソームを使用して、Ｅｎｔが鉄を脂質二重層を横断して移動させる能力をインビトロで試験している。簡潔に述べると、ＦｅＣｌ３＋／−Ｅｎｔ（１．５ｕＭ）を、市販脂質（Ａｖａｎｔｉ  Ｌｉｐｉｄｓ）から形成された新鮮なリポソームに添加した。確立された方法によって、ＡＴＰＳα（ＡＴＰ−１またはＡＴＰ５Ａ１）をリポソームに添加した。図１９に示すように、リポソームに会合するＦｅ３＋のレベルを、以下の２つの方法によって測定した。（Ａ）カルセインＡＭ染色。カルセインＡＭ染料をリポソーム＋／−ＡＴＰＳαに添加し、リポソームの蛍光強度を測定した。（Ｂ）リポソームを放射性標識Ｆｅ３＋（５５ＦｅＣｌ３）と共にインキュベートし、リポソームの放射能（相対ＣＰＭ）を測定した。方法（Ａ）は、カルセインＡＭがリポソーム内部にのみあるため、リポソーム内の鉄を測定する。方法（Ｂ）は、リポソームの外側の鉄を除外しない場合がある、より単純な方法である。各試験において、Ｅｎｔの存在は、（Ａ）内部または（Ｂ）リポソームと会合したいずれかの鉄のレベルを明らかに増強した。
【００８８】
実施例１１：経口摂取によるＥｎｔ補給によって、貧血マウスモデル（食事性貧血）においてヘモグロビンおよび脾臓鉄レベルが増加した。
本願発明者らは、３週齢の雌マウスに鉄欠乏餌（ＩＤＤ）（または対照餌）を６週間供給し、貧血を誘導した（ヘモグロビン測定により確認）。次いで、マウス（１群あたり５匹）を、２週間にわたる経口摂取（２日に１回）によって、＋／−Ｅｎｔ（２濃度）または＋／−ＦｅＳＯ４で処理した。一般に図２０Ａ〜Ｂに示すように、ＩＤＤを供給すると、ヘモグロビンおよび鉄レベルが両方とも劇的に低下した。Ｅｎｔ補給は、エラーバーは大きいものの、ヘモグロビンレベルを部分的にではあるが有意に回復し、このことは、重度の貧血状態での鉄取り込み効率の向上におけるＥｎｔの役割の可能性を示唆している。Ｅｎｔ添加により、脾臓では鉄レベルが上昇したが、肝臓では上昇しなかった。市販のキット（ＢｉｏＡｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ）を使用して、ヘモグロビンレベルを得た。通常の条件下では、腸から吸収された鉄の約７０％がヘモグロビンを生成するために使用され、鉄が過剰である場合、わずかな割合のみが肝臓または他の体細胞組織に貯蔵され得る。貧血条件下では、ミトコンドリアに入った鉄（次いでヘムに結合）の大きな割合が赤血球形成につぎこまれ得る。したがって、Ｅｎｔ補給が肝臓の鉄レベル（鉄貯蔵）に与える影響がほとんどみられなかったことは予想外であった。
【００８９】
実施例１２：飲料水（自由摂取）によって補給されたＥｎｔによって、貧血マウスモデル（食事性貧血）においてヘモグロビンレベルが増加した。
本願発明者らは、３週齢の雄マウスに鉄欠乏餌（ＩＤＤ）（または対照餌）を５週間供給し、貧血を誘導した。次いで、飲料水に加えたＩＤＤ＋／−Ｅｎｔをさらに２週間供給した。新鮮なＥｎｔ希釈水溶液を週に１回提供した。一般的に図２１に示されるように、鉄を十分に含む対照餌（ＣＤ）を連続的に供給したマウスを対照として含めた。ヘモグロビンレベルを、Ｈｅｍａｖｅｔ  Ｂｌｏｏｄ  Ａｎａｌｙｚｅｒによって測定した。平均値±ＳＤを示す。Ｅｎｔ補給は、貧血マウスにおけるヘモグロビンレベルを有意に改善した。その後、試験で使用した脱イオン水（ｐＨ５．５）においてＥｎｔが非常に不安定であることが判明したため（図２５参照）、この試験ではＥｎｔの効果が低下した可能性が高い。今後の試験では、ｐＨ調整水にＥｎｔを投与し、安定性を確保するためにＥｎｔのより頻繁な新鮮な希釈を含む。
【００９０】
実施例１３：飲料水（自由摂取）によって補給されるＥｎｔは、対照（十分な鉄）餌が供給されたマウスの成長を促進する。
本願発明者らは、４．５週齢の雄マウスを、鉄欠乏餌（ＩＤＤ）についての一致した対照である、上述の鉄を十分に含む対照餌（ＣＤ）で治療した。上の図２０および２１に示すように、この食事を供給したマウスは、相対的に正常なヘモグロビンおよび鉄レベルを有していた。図２２にさらに示すように、飲料水（ｐＨ５．５）においてＥｎｔを補給するとき、マウスは増加した成長速度を有していた。この実験は、ヘモグロビンおよび鉄レベルを測定しなかったため不完全であり、これを繰り返す予定である。しかしながら、本願発明者らは、ＥｎｔがＣ．ｅｌｅｇａｎｓにおける幼虫の成長に顕著な役割を有すること、その効果が、動物における鉄レベルの増加を促進する能力に起因することを既に示しているため（図１および２）、体重増加データは依然として意義がある。
【００９１】
実施例１４：Ｅｎｔは、単一のＥ．ｃｏｌｉ株でコロニー形成されたマウスのマウス成長を促進する。
一般的に図２３に示されるように、（Ａ）５週齢の雌無菌（ＧＦ）マウスを、単一の非病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｋ１２）株、野生型またはｅｎｔＦ−（Ｅｎｔ欠乏Ｅ．ｃｏｌｉ）でコロニー形成した。マウスの成長（体重増加）を次の４週間測定した。ＥｎｔＦ−Ｅ．ｃｏｌｉでコロニー形成された無菌（ＧＦ）マウスは、野生型Ｅ．ｃｏｌｉでコロニー形成されたマウスと比較して遅い成長を示した。興味深いことに、体重増加の差は、コロニー形成後の最初の２週間で最大であった。（ＢおよびＣ）最終的なマウスの鉄レベルは、脾臓のみで有意に低かった（約３５％）が、肝臓または他の組織では有意に低くなく、このことは、図２０でみられる結果と一致している。鉄レベルを測定した。（Ｄ）Ｅｎｔ補給は、ｅｎｔＦ（−）Ｅ．ｃｏｌｉでコロニー形成したＧＦマウスにおける成長の遅れを克服する。ｅｎｔＦ−細菌でコロニー形成したＧＦ雌マウスに、Ｅｎｔを補給した［週に１回、飲料水（ｐＨ５．５）に２濃度を添加］。
【００９２】
データは、成長の有意な回復を示す。最初の２週間でＥｎｔ効果がより明らかになった。ｐＨが低い水におけるＥｎｔの不安定性のため、ここでのＥｎｔ効果は限定され得ることに留意されたい。追加の実施形態は、ｐＨ調整水にＥｎｔを投与し、安定性を確保するためにＥｎｔのより頻繁な新鮮な希釈をさらに含んでもよい。Ｅｎｔは、それらの成長を支えるためにＥ．ｃｏｌｉによって使用されるため、Ｅｎｔがない腸内のコロニー形成が減少する可能性があり、最初の２週間の発育の遅れは、腸内の少ないＥ．ｃｏｌｉの間接的な効果に起因する可能性がある。しかしながら、このような大きな重量は、Ｅ．ｃｏｌｉのコロニー形成における潜在的な差に起因する可能性は低い。より重要なことに、本願発明者らは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの発育を促進する際のＥｎｔの役割は、Ｅｎｔの細菌使用とは独立しており（図１Ｆを参照）、Ｅｎｔ生合成が、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおける腸内コロニー形成に明らかな影響を及ぼさないことを既に示している（ＱｉおよびＨａｎ、２０１８）。１〜２週目と３〜４週目との間の体重増加の差は、迅速な成長がさらに多くの鉄取得を必要とする初期段階でのＥｎｔ（またはＥ．ｃｏｌｉ）のより顕著な役割を示唆している可能性がある。あるいは、マウスは、後半の２週間にいくつかの適応的／補償的変化を有する可能性がある（Ｅｎｔに依存しない）。
【００９３】
実施例１５：動物の発育促進におけるエンテロバクチン（Ｅｎｔ）の影響は、他のシデロホアではみられない。
本願発明者らの確立されたアッセイ（ＱｉおよびＨａｎ、２０１８）に従って、図２４に示されるように、新たに孵化したＣ．ｅｌｅｇａｎｓ幼虫に、野生型Ｋ１２  Ｅ．ｃｏｌｉ、または示したシデロホアを補給したｅｎｔＦ−Ｅ．ｃｏｌｉを供給した。このアッセイでは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの成長を支えるためにＥｎｔが必要である。虫の体積を３日後に測定した（図１に記載の実験について行ったように）。エンテロバクチン補給は、ｅｎｔＦ−でみられる成長欠陥を回復するが、試験した他の５つのシデロホアは、効果を示すことができない（図１Ｇの他の結果と一致する）。したがって、鉄輸送および動物発育を促進するためのＥｎｔの役割は、Ｅｎｔに固有である。
【００９４】
実施例１６：材料および方法
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ株および管理。線虫のストックを、細菌（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＯＰ５０）を播種した線虫成長培地（ＮＧＭ）プレート上で、２０℃で維持した。以下の株／対立遺伝子は、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＧＣ）から得た。Ｎ２  Ｂｒｉｓｔｏｌ（野生型と呼ばれる）、ＶＣ２８２４：Ｈ２８Ｏ１６．１（ｏｋ２２０３）Ｉ／ｈＴ２［ｂｌｉ−４（ｅ９３７）ｌｅｔ−？（ｑ７８２）ｑＩｓ４８］（Ｉ；ＩＩＩ）。ＸＡ６９０１：ｑａＥｘ６９０１［ｆｔｎ−２ｐ：：ｐｅｓ−１０：：ＧＦＰ：：ｈｉｓ＋ｌｉｎ−１５（＋）］、ＳＪ４１０３：ｚｃＩｓ１４［ｍｙｏ−３：：ＧＦＰ（ｍｉｔ）］。Ｐｒｐｌ−２８：ａｔｐ−１（ｄｅｌ）導入遺伝子について、ＡＴＰ結合配列（残基１９８〜２０５：ＤＲＱＴＧＫＴＡ）を欠失した全コード領域をｐＰＤ９５．７７にクローニングし、ユビキタスＲＰＬ２８プロモータによって駆動し、次いで、５ｎｇ／ｕｌ注射マーカー（ｐＣＦＪ９０）を有する１０ｎｇ／ｕｌプラスミドをａｔｐ−１（ｌｆ）変異体（ＶＣ２８２４）に注入した。
【００９５】
細胞株。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＡＴＣＣから得て、５％ＣＯ２、３７℃で、加湿キャビネット内で維持した。細胞を、１０％ＦＢＳ、４ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＬあたりペニシリン１００単位、１ｍＬあたりストレプトマイシン１００μｇ、および１ｍＬあたりアンホテリシンＢ０．２５μｇを補給したＤＭＥＭで培養した。
【００９６】
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋｅｉｏ集合のスクリーニング。熱殺菌（ＨＫ）ＯＰ５０プレートの調製は、既に記載された手順に従った（Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．、２０１７）。ＬＢブロス中で成長させたＥ．ｃｏｌｉ  ＯＰ５０の標準的な一晩培養物を１／１０体積になるまで濃縮し、次いで７５℃の水浴中で９０分間、熱殺菌した。１５０μｌのＨＫ−ＯＰ５０をＮＧＭプレートの片側に広げた。細菌変異体アッセイプレートの調製のために、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋｅｉｏ（Ｂａｂａ  ｅｔ  ａｌ．、２００６）変異体を、１０ｍｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地中、３７℃で一晩成長させた。０．２ｕＬの細菌培養物（ＯＤ６００）をＨＫ  ＯＰ５０プレートの反対側に播種した。約３００匹の同期させたＬ１虫をスクリーニングプレートに添加し、２０℃で培養し、次いで、３日目および４日目に虫の大きさについてスコアを付けた。ライブラリ全体を一次スクリーニングに使用し、各細菌変異体を１回スクリーニングした。二次スクリーニングのために、２００個の候補変異体をスクリーニングし（３回ずつ繰り返し）、遅い成長表現型を確認した。
【００９７】
培養プレートの化学物質補給。化学物質補給のために、各化学物質を水またはＤＭＳＯ中に溶解させ、ストックを生成した。ストック溶液をＨＫ  ＯＰ５０に添加し、次にＮＧＭプレート上にスポッティングした。各化学物質に使用される化学物質名、ベンダー、ストック濃度および容積を以下に列挙する。２，３−ＤＨＢＡ（Ｓｉｇｍａ  １２６２０９−５Ｇ、３００ｍＭ、５ｕｌ）、エンテロバクチン（Ｓｉｇｍａ  Ｅ３９１０−１ＭＧ、１ｍｇ／ｍｌ、５μｌ）、ピオベルジン（Ｓｉｇｍａ  Ｐ８１２４−１ＭＧ、０．５ｍｇ／ｍｌ、５μｌ）、フェリクローム（Ｓｉｇｍａ  Ｆ８０１４−１ＭＧ、０．５ｍｇ／ｍｌ、５μｌ）、ヘルミン（Ｓｉｇｍａ  ５１２８０、１ｍｇ／ｍｌ、５ｕｌ）、ＦｅＣｌ３（Ｓｉｇｍａ  ２３６４８９、１７５ｕｇ／ｕｌ、アッセイで示される容積）。ＣａＥＤＴＡ補給（Ｋｌａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２０１４）のために、５０ｕｌのＣａＥＤＴＡ（５０ｕｇ／ｕｌ）を、ＯＰ５０を播種したＮＧＭプレートの中心に広げ、次いで、様々な容積のＦｅＣｌ３［１７５ｕｇ／ｕｌ］（０ｕｌ、１ｕｌ、５ｕｌ、１０ｕｌ、５０ｕｌ）または２０ｕｌのＥｎｔ（０．５ｍｇ／ｍｌ）を、細菌の芝生の中心に添加した。
【００９８】
細菌の成長分析。一晩培養物を、２００μＬのＮＧＭ液体培地中で最終ＯＤ６００＝０．０１になるまで希釈した。細菌を、３７℃で１７時間、Ｓｙｎｅｒｇｙ２プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）中で振盪させながら９６ウェルプレート中で成長させた。ＯＤ６００を２０分間隔で記録した。
【００９９】
虫アッセイにおける細菌のコロニー形成。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの細菌コロニー形成を、公開されている手順（Ｐｏｒｔａｌ−ＣｅｌｈａｙａｎｄＢｌａｓｅｒ、２０１２）から適応させた方法を使用して決定した。簡潔に述べると、Ｌ３期の虫をＮＧＭプレートから収集し、１０ｍＬのＭ９緩衝液で３回、広範囲にすすいだ。次いで、この動物を、１００ｍｇ／ｍＬのアンピシリンを含む空のＮＧＭプレート上に１時間置き、表面細菌を除去した。１０匹の虫をＭ９緩衝液中に個別に採取し、超音波処理によって均質化した。次いで、混合物の一部または全てをＬＢプレート上に播種した。３７℃で一晩インキュベートした後、細菌コロニーの数を決定した。
【０１００】
シデロホアの定量化。ＣＡＳ寒天プレートを、公開された方法（ＳｃｈｗｙｎおよびＮｅｉｌａｎｄｓ、１９８７）に従って調製した。虫に、野生型またはｅｎｔＦ−変異体Ｅ．ｃｏｌｉを供給し、次いで収集し、１０ｍＬのＭ９で５回洗浄し、次いで、虫を１０ｍＬのＭ９中で一晩かけて飢餓状態にして、腸内細菌を消化させ、排泄させた。次いで、虫を超音波処理により均質化し、上清のタンパク質濃度を、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、２３２２５）によって測定した。タンパク質のインプットをタンパク質濃度に基づいて正規化した。上清をＣＡＳ寒天プレート上に配置し、室温で一晩インキュベートし、オレンジ色のハロ形成について監視し、色強度をＩｍａｇｅ  Ｊによって定量化した。ＣＡＳは、鉄と複合体状態であるときに、特徴的な青色を与える。鉄がシデロホアによってキレート化されると、試料の周囲にオレンジ色のハロが発生する。ハロ形成の強度は、シデロホアの濃度に正比例する。
【０１０１】
虫の大きさを測定することによる幼虫の成長の分析。同期させたＬ１虫を、示したＮＧＭプレート上に播種し、示した時間になるまで成長させた。写真を撮影し、各写真における虫の体積をＷｏｒｍＳｉｚｅｒソフトウェアによって測定した（Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１３）。
【０１０２】
虫における鉄の決定。虫における鉄の生存撮像を、既に記載されているように行った（Ｊａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、２０１５）。簡潔に述べると、虫を異なる培養条件で収集し、次いで、０．０５ｕｇ／ＭＬのカルセイン−ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にＭ９中で１時間共培養し、次いで１ｍｌのＭ９中で３回洗浄した。次いで、蛍光顕微鏡のために試料を取り付けた。
【０１０３】
ウェスタンブロット。ＡＴＰシンターゼα−サブユニットのレベルを測定するために、ＲＮＡｉで治療したワームまたはｓｉＲＮＡで治療した細胞を標準的なウェスタンブロット法によって分析し、ローディング対照として抗ＡＴＰシンターゼα−サブユニット（希釈＝１：５０００；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、４３−９８００）および抗アクチン（希釈＝１：５０００；Ｓｉｇｍａ−Ａ２０６６）でプローブした。
【０１０４】
ビオチン−ＩＰおよびＬＣ−ＭＳによるエンテロバクチン結合タンパク質の単離全タンパク質を、成長期が混合した虫から抽出し、次いで、１００ｕｌのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０ストレプトアビジンを添加することによって３回、前洗浄した。次いで、等しい体積のこれらの全タンパク質抽出物を、２つのチューブに分離した。ビオチン−Ｅｎｔ（５ｕｇ）をＩＰ用の１つのチューブに添加し、ビオチン単独（５ｕｇ）を対照として別のチューブに添加し、両方とも４℃で一晩インキュベートした。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０ストレプトアビジンと共に２時間インキュベートした後、ビーズを１ｍＬのＰＢＳで少なくとも３回洗浄した。次いで、ＰＢＳをビーズから除去し、２００ｕＬの０．１Ｍ重炭酸アンモニウム（ＡＢＣ）／０．００１％デオキシコール酸（ＤＣＡ）を添加した。６０℃で３０分間、５ｍＭ（最終）のＴＣＥＰを使用して試料を還元し、室温で１５ｍＭのヨードアセトアミドを使用して２０分間アルキル化した。０．５ｕｇのトリプシンを各試料に添加し、一晩インキュベートした。次いで、７ｕＬのギ酸を使用して、試料を酸性化した。ＤＣＡを、酢酸エチルを用いた相移動によって試料から除去した。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃ１８スピンカラムを使用して試料を脱塩し、遠心濃縮機を使用して乾燥させた。試料を１０μＬの緩衝液Ａ（０．１％ギ酸水溶液）中で再構成し、そのうち５μＬをＬＣ−ＭＳＭＳ分析にかけた。
【０１０５】
エンテロバクチンおよびＡＴＰ−１タンパク質相互作用アッセイ。インビボ結合アッセイ：虫を、Ｅｎｔ−ビオチン（５ｕｇ／ｍｌ）の餌補給で成長させ、次いで、ストレプトアビジン−ビーズＩＰを行った。ウェスタンブロットを実施して、哺乳動物ＡＴＰシンターゼα−サブユニット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ４３−９８００）に対する抗体を使用して、ＡＴＰ−１を検出した。
【０１０６】
インビトロ結合アッセイ。（ａ）全タンパク質のＥｎｔ−ビオチンプルダウン：Ｅｎｔ−ビオチンおよびストレプトアビジンビーズを使用して、虫全タンパク質抽出物から、相互作用するタンパク質をプルダウンした（Ｅｎｔ結合タンパク質についての初期スクリーニングと同じ方法）。ウェスタンブロットを実施して、ＡＴＰ−１（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ４３−９８００）を検出した。（ｂ）精製ＡＴＰ−１：：ＨＩＳタグ化タンパク質に対するＥｎｔ−ビオチンの結合：精製したタンパク質を、アッセイ緩衝液（５０ｍＭの２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ））中のＥｎｔ−ビオチン（１ｕｇ／ｕＬ；ＤＭＳＯ中の１ｍｇ／ｍｌストック）＋／−Ｅｎｔ（１ｕｇ／ｕｌ）で、３０℃で１時間処理し、全アッセイ容積は２０ｕＬであった。次いで、アッセイを標準の５倍ＳＤＳ−ＰＡＧＥ＿ローディング緩衝液（還元）でクエンチした。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜に移した。膜を、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）を含むトリスバッファー生理食塩水（ＴＢＳ）中の５％ＢＳＡを用い、室温で１時間ブロックした後、ＴＢＳＴ中の西洋ワサビペルオキシダーゼストレプトアビジン（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ＿Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３９９９Ｓ）と共に１時間インキュベートした。ＴＢＳＴ中で１５分ごとに変化を伴う４回の洗浄後、ビオチン化タンパク質を強化化学発光によって可視化した（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＲＰＮ２２３２  ）。Ｋａは、Ｅｎｔに対する結合が最大レベルの１／２であったときのＡＴＰ−１−Ｈｉｓタンパク質の濃度として計算した。（ｃ）ＡＴＰ−１が鉄と相互作用するためのＥｎｔの依存性：放射性標識した鉄（５５ＦｅＣｌ３、１ｕＣｉ）または５５ＦｅＣｌ３（１ｕＣｉ）＋Ｅｎｔ（２ｕｇ）を虫溶解物に添加し、次いで、ＡＴＰ−１に対する抗体（希釈＝１：５０００；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、４３  ９８００）を用いて免疫沈降させた。ＩＰ後、５５Ｆｅの量を液体シンチレーションによって決定した。
【０１０７】
免疫蛍光。抗体染色を、既に記載されているように行った（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００７）。簡潔に述べると、Ｌ１野生型虫（Ｎ２）を、ａｔｐ−１  ＲＮＡｉを供給することによって治療し、Ｌ４期まで成長させた。抗体染色前に、１μｇ／ｍｌのＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ番号９０８２）を補給したＮＧＭ寒天上、２０℃で１日間、虫を成長させた。解剖した虫を、６ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．２）および７５％メタノールを含む３％ホルムアルデヒドで、−２０℃で１０分間かけて固定した。固定された虫を、ＰＢＳで３回すすぎ、０．５％のＢＳＡおよび０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで、室温で１時間かけてブロックした。抗ＡＴＰシンターゼα−サブユニット（１：２００で希釈）および抗ウサギ抗体（１：４００で希釈）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１１０１１）を、それぞれ一次抗体および二次抗体として使用した。
【０１０８】
ＲＮＡｉ処理。Ｌ１虫に、第１世代にわたってＲＮＡｉ（Ａｈｒｉｎｇｅｒ、Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ、ＷｏｒｍＢｏｏｋ  ２００６）を供給することによって治療し、成虫になるまで成長させた。次いで、それらを漂白し、Ｍ９緩衝液中で１８時間孵化させた。同期させたＬ１虫を、ｅｎｔＦ−細菌を含む熱殺菌ＯＰ５０プレートまたはＥｎｔを補給した熱殺菌ＯＰ５０プレートに播種した。４日後、虫の大きさを測定した。虫における鉄レベルに対する異なるＡＴＰシンターゼサブユニットの役割を評価するために、Ｌ１虫を、ＲＮＡｉを供給して治療し、若い成虫になるまで成長させた。同じ成長段階で、虫について鉄レベルを測定した。インビトロ／インビボでのミトコンドリア鉄取り込みのために、Ｌ１虫を、示されているＡＴＰシンターゼサブユニットを標的とするＲＮＡｉで治療し、さらなる手順を受ける前に、若い成虫になるまで成長させた。
【０１０９】
哺乳動物細胞におけるｓｉＲＮＡ治療。ＡＴＰ５Ａ１  ｓｉＲＮＡは、Ｓｉｇｍａ（ＳＡＳＩ＿Ｈｓ０１＿００１１９７３５）から購入した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１３７７８０７５）を、製造業者に指示に従って、ｓｉＲＮＡをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に送達するために使用した。ノックダウン効率を免疫ブロッティングによって評価した。
【０１１０】
ミトコンドリア鉄取り込みアッセイ。インビトロミトコンドリア鉄取り込みアッセイについて、本願発明者らは、哺乳動物細胞の分析のために公開されている手順（Ｄｅｖｉｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０）を改変した。具体的には、１ｕＣｉの５５ＦｅＣｌ３を、２ｕｇの鉄を含まないＥｎｔ（ＤＭＳＯ中の１ｍｇ／ｍｌ）またはＤＭＳＯと共に室温で３時間インキュベートし、その後、異なるＲＮＡｉで治療された虫、またはｓｉＲＮＡで治療された細胞からの精製ミトコンドリアを添加した。試料を室温で４時間インキュベートし、溶解したミトコンドリア中の５５Ｆｅの量を液体シンチレーションによって決定した。
【０１１１】
インビボミトコンドリア鉄取り込みアッセイも、公開された手順（Ｄｅｖｉｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０）に基づいて改変された。具体的には、１ｕＣｉの５５ＦｅＣｌ３を、２ｕｇの鉄を含まないＥｎｔ（ＤＭＳＯ中の１ｍｇ／ｍｌ）またはＤＭＳＯと共に室温で３時間インキュベートした。５５ＦｅＣｌ３＋ＤＭＳＯまたは５５ＦｅＣｌ３＋エンテロバクチンを、第１世代にわたってＲＮＡｉで治療された若い成虫に添加した。虫を一晩成長させた後、それらをＭ９で洗浄した。次いで、ミトコンドリアを単離し、続いて、液体シンチレーションによって、組み込まれた５５Ｆｅの量を測定した。
【０１１２】
哺乳動物細胞におけるミトコンドリアの鉄測定。ミトコンドリア鉄プールを記載のように決定した（Ｍｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．、２０１５）。簡潔に述べると、細胞を、２μＭのミトコンドリア鉄キレート剤ローダミンＢ−［（１，１０−フェナントロリン−５−イル）アミノカルボニル］ベンジルエステル（ＲＰＡ）と共に、３７℃で２０分間ロードした。洗浄後、細胞を蛍光顕微鏡により撮像した。
【０１１３】
ミトコンドリア抽出。Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ｃｅｌｌｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、８９８７４）を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞からミトコンドリアを抽出した。Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｔｉｓｓｕｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、８９８０１）を使用して、虫からミトコンドリアを抽出した。
【０１１４】
酵素活性。スクシン酸デヒドロゲナーゼ（ＭＡＫ１９７、Ｓｉｇｍａ）およびアコニターゼ（ＭＡＫ０５１、Ｓｉｇｍａ）の酵素活性を、製造業者のプロトコルに従ってキットを使用して測定した。簡潔に述べると、Ｌ１虫をアッセイプレート＋／−Ｅｎｔに播種した。４８時間培養後、虫を、プロテアーゼを補給した、キットで提供される溶解緩衝液を使用して、氷冷条件下で溶解させた。酵素活性アッセイに等量のタンパク質を使用した。
【０１１５】
顕微鏡検査。蛍光の分析を、Ｚｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＣａｍ  ＭＲｍ  ＣＣＤカメラを用いたＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ２顕微鏡で、Ｎｏｍａｒｓｋｉ光学系の下で行った。プレート表現型を、Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｃ４７４２−９５  ＣＣＤカメラを用いたＬｅｉｃａ  ＭＺ１６Ｆ解剖顕微鏡を用いて観察した。
【０１１６】
定量化。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを、Ｅｎｔ−タンパク質結合アッセイのためのカルセイン−ＡＭ染色およびウェスタンブロットを定量化するために使用した。カルセイン−ＡＭ染色のために、ＧＦＰチャンネルで撮影された元の画像を使用して、強度を測定した。染色強度の値を、カルセイン−ＡＭ染色した腸からバックグラウンド強度を引き算することによって決定した。
【０１１７】
統計解析。全ての統計解析は、カイ二乗検定を用いることによって解析された図１Ｉ、２Ｇおよび１１Ｂを除き、ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定を使用して行い、ｐ＜０．０５が有意差とみなされた。
表
【表１】
2021530515.tif 000005
参考文献
以下の参照文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
［１］Ｂａｂａ，Ｔ．，Ａｒａ，Ｔ．，Ｈａｓｅｇａｗａ，Ｍ．，Ｔａｋａｉ，Ｙ．，Ｏｋｕｍｕｒａ，Ｙ．，Ｂａｂａ，Ｍ．，Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．Ａ．，Ｔｏｍｉｔａ，Ｍ．，Ｗａｎｎｅｒ，Ｂ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｍｏｒｉ，Ｈ．（２００６）．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ｉｎ−ｆｒａｍｅ，ｓｉｎｇｌｅ−ｇｅｎｅ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｕｔａｎｔｓ：ｔｈｅ  Ｋｅｉｏ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｓｙｓｔ  Ｂｉｏｌ  ２，２００６  ０００８．
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［８］Ｃｈａｒｂｏｎｎｅａｕ，Ｍ．Ｒ．，Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ｄ．，Ｂｌａｎｔｏｎ，Ｌ．Ｖ．，Ｔｏｔｔｅｎ，Ｓ．Ｍ．，Ｄａｖｉｓ，Ｊ．Ｃ．，Ｂａｒｒａｔｔ，Ｍ．Ｊ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｊ．，Ｇｕｒｕｇｅ，Ｊ．，Ｔａｌｃｏｔｔ，Ｍ．，Ｂａｉｎ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）．Ｓｉａｌｙｌａｔｅｄ  Ｍｉｌｋ  Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  Ｐｒｏｍｏｔｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｉｎｆａｎｔ  Ｕｎｄｅｒｎｕｔｒｉｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  １６４，８５９−８７１．
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［１７］Ｇａｒｃｉａ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ａ．Ｐ．，Ｒｉｔｔｅｒ，Ａ．Ｄ．，Ｓｈｒｅｓｔｈａ，Ｓ．，Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｅ．Ｃ．，Ｙｉｌｍａｚ，Ｌ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｗａｌｈｏｕｔ，Ａ．Ｊ．Ｍ．（２０１７）．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  Ａｆｆｅｃｔｓ  ｔｈｅ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｃｅｌｌ  １６９，４３１−４４１  ｅ４３８．
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［２０］Ｈａｎ，Ｂ．，Ｓｉｖａｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｐ．，Ｌｉｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｎｅｖｅ，Ｉ．Ａ．Ａ．，Ｈｅ，Ｊ．，Ｔａｙ，Ｌ．Ｗ．Ｒ．，Ｓｏｗａ，Ｊ．Ｎ．，Ｓｉｚｏｖｓ，Ａ．，Ｄｕ，Ｇ．，Ｗａｎｇ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｔｕｎｅｓ  Ｈｏｓｔ  Ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ．Ｃｅｌｌ  １６９，１２４９−１２６２  ｅ１２１３．
［２１］Ｈｉｄｅｒ，Ｒ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｋｏｎｇ，Ｘ．（２０１０）．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅｓ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｄ  Ｒｅｐ  ２７，６３７−６５７．
［２２］Ｊａｍｅｓ，Ｓ．Ａ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｂ．Ｒ．，Ｈａｒｅ，Ｄ．Ｊ．，ｄｅ  Ｊｏｎｇｅ，Ｍ．Ｄ．，Ｂｉｒｃｈａｌｌ，Ｉ．Ｅ．，Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｎ．Ｌ．，Ｃｈｅｒｎｙ，Ｒ．Ａ．，Ｂｕｓｈ，Ａ．Ｉ．，ａｎｄ  ＭｃＣｏｌｌ，Ｇ．（２０１５）．Ｄｉｒｅｃｔ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｆｅｒｒｏｕｓ  ｉｒｏｎ  ｄｙｓｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  ａｇｅｉｎｇ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ．Ｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  ６，２９５２−２９６２．
［２３］Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．Ｃ．，Ｄｅａｎ，Ｄ．Ｒ．，Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｍ．Ｋ．（２００５）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｒｏｎ−ｓｕｌｆｕｒ  ｃｌｕｓｔｅｒｓ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ７４，２４７−２８１．
［１４］Ｊｕｎｇｅ，Ｗ．，ａｎｄ  Ｎｅｌｓｏｎ，Ｎ．（２０１５）．ＡＴＰ  ｓｙｎｔｈａｓｅ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ８４，６３１−６５７．Ｋａｋｈｌｏｎ，Ｏ．，ａｎｄ  Ｃａｂａｎｔｃｈｉｋ，Ｚ．Ｉ．（２００２）．Ｔｈｅ  ｌａｂｉｌｅ  ｉｒｏｎ  ｐｏｏｌ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ，ａｎｄ  ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ（１）．Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  ３３，１０３７−１０４６．
［１５］Ｋｉｒｉｅｎｋｏ，Ｎ．Ｖ．，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｒｕｖｋｕｎ，Ｇ．（２０１５）．Ｍｉｔｏｐｈａｇｙ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ｂｙ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １１２，１８２１−１８２６．
［１６］Ｋｉｒｉｅｎｋｏ，Ｎ．Ｖ．，Ｋｉｒｉｅｎｋｏ，Ｄ．Ｒ．，Ｌａｒｋｉｎｓ−Ｆｏｒｄ，Ｊ．，Ｗａｈｌｂｙ，Ｃ．，Ｒｕｖｋｕｎ，Ｇ．，ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（２０１３）．Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｄｉｓｒｕｐｔｓ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  ｉｒｏｎ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ，ｃａｕｓｉｎｇ  ａ  ｈｙｐｏｘｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｎｄ  ｄｅａｔｈ．Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  １３，４０６−４１６．
［１７］Ｋｌａｎｇ，Ｉ．Ｍ．，Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ，Ｂ．，Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｓａｈｕ，Ａ．Ｋ．，Ｋａｐａｈｉ，Ｐ．，Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｊ．Ｋ．，Ｓｗｏｂｏｄａ，Ｐ．，Ｋｉｌｌｉｌｅａ，Ｄ．Ｗ．，Ｇｉｂｓｏｎ，Ｂ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｌｉｔｈｇｏｗ，Ｇ．Ｊ．（２０１４）．Ｉｒｏｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ａｇｉｎｇ  ｉｎ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ．Ａｇｉｎｇ（Ａｌｂａｎｙ  ＮＹ）  ６，９７５−９９１．
［１８］Ｋｏｐｐｅｌ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｂａｌｓｋｕｓ，Ｅ．Ｐ．（２０１６）．Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ．Ｃｅｌｌ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ２３，１８−３０．
［１９］Ｋｏｒｔｍａｎ，Ｇ．Ａ．，Ｄｕｔｉｌｈ，Ｂ．Ｅ．，Ｍａａｔｈｕｉｓ，Ａ．Ｊ．，Ｅｎｇｅｌｋｅ，Ｕ．Ｆ．，Ｂｏｅｋｈｏｒｓｔ，Ｊ．，Ｋｅｅｇａｎ，Ｋ．Ｐ．，Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｆ．Ｇ．，Ｂｅｔｌｅｙ，Ｊ．，Ｗｅｉｒ，Ｊ．Ｃ．，Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ，Ｚ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  Ｓｈｉｆｔｓ  Ｔｏｗａｒｄｓ  ａｎＡｄｖｅｒｓｅ  Ｐｒｏｆｉｌｅ  ｗｉｔｈ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｉｒｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＴＩＭ−２  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｌｏｎ．Ｆｒｏｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６，１４８１．
［２０］Ｋｕｎｄｕ，Ｐ．，Ｂｌａｃｈｅｒ，Ｅ．，Ｅｌｉｎａｖ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ，Ｓ．（２０１７）．Ｏｕｒ  Ｇｕｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ：Ｔｈｅ  Ｅｖｏｌｖｉｎｇ  Ｉｎｎｅｒ  Ｓｅｌｆ．Ｃｅｌｌ  １７１，１４８１−１４９３．
［２１］Ｋｗｏｎ，Ｏ．，Ｈｕｄｓｐｅｔｈ，Ｍ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｍｅｇａｎａｔｈａｎ，Ｒ．（１９９６）．Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｔＣ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｔｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｍｅｎａｑｕｉｎｏｎｅ（ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ２）  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７８，３２５２−３２５９．
［２２］Ｌｅｕｌｉｅｒ，Ｆ．，ＭａｃＮｅｉｌ，Ｌ．Ｔ．，Ｌｅｅ，Ｗ．Ｊ．，Ｒａｗｌｓ，Ｊ．Ｆ．，Ｃａｎｉ，Ｐ．Ｄ．，Ｓｃｈｗａｒｚｅｒ，Ｍ．，Ｚｈａｏ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｓ．Ｊ．（２０１７）．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ：Ａｔ  ｔｈｅ  Ｃｒｏｓｓｒｏａｄｓ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ，Ａｎｉｍａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｅａｌｔｈ．Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ  ２５，５２２−５３４．
［２３］Ｌｉｕ，Ｊ．，Ｒｕｔｚ，Ｊ．Ｍ．，Ｆｅｉｘ，Ｊ．Ｂ．，ａｎｄ  Ｋｌｅｂｂａ，Ｐ．Ｅ．（１９９３）．Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｌａｒｇｅ  ｇａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｆｅｒｒｉｃ  ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＦｅｐＡ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９０，１０６５３−１０６５７．
［２４］Ｌｌｏｙｄ−Ｐｒｉｃｅ，Ｊ．，Ｍａｈｕｒｋａｒ，Ａ．，Ｒａｈｎａｖａｒｄ，Ｇ．，Ｃｒａｂｔｒｅｅ，Ｊ．，Ｏｒｖｉｓ，Ｊ．，Ｈａｌｌ，Ａ．Ｂ．，Ｂｒａｄｙ，Ａ．，Ｃｒｅａｓｙ，Ｈ．Ｈ．，ＭｃＣｒａｃｋｅｎ，Ｃ．，Ｇｉｇｌｉｏ，Ｍ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）．Ｓｔｒａｉｎｓ，ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ．Ｎａｔｕｒｅ  ５５０，６１−６６．
［２５］Ｍｅｉｓｅｌ，Ｊ．Ｄ．，Ｐａｎｄａ，Ｏ．，Ｍａｈａｎｔｉ，Ｐ．，Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ｆ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｋｉｍ，Ｄ．Ｈ．（２０１４）．Ｃｈｅｍｏｓｅｎｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｏｆ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ．Ｃｅｌｌ  １５９，２６７−２８０．
［２６］Ｍｅｎａ，Ｎ．Ｐ．，Ｇａｒｃｉａ−Ｂｅｌｔｒａｎ，Ｏ．，Ｌｏｕｒｉｄｏ，Ｆ．，Ｕｒｒｕｔｉａ，Ｐ．Ｊ．，Ｍｅｎａ，Ｒ．，Ｃａｓｔｒｏ−Ｃａｓｔｉｌｌｏ，Ｖ．，Ｃａｓｓｅｌｓ，Ｂ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｎｕｎｅｚ，Ｍ．Ｔ．（２０１５）．Ｔｈｅ  ｎｏｖｅｌ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｉｒｏｎ  ｃｈｅｌａｔｏｒ  ５−（（ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｍｅｔｈｙｌ）−８−ｈｙｄｒｏｘｙｑｕｉｎｏｌｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｄａｍａｇｅ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｄｅａｔｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ４６３，７８７−７９２．
［２７］Ｍｏｏｒｅ，Ｂ．Ｔ．，Ｊｏｒｄａｎ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｂａｕｇｈ，Ｌ．Ｒ．（２０１３）．ＷｏｒｍＳｉｚｅｒ：ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｎｅｍａｔｏｄｅ  ｓｉｚｅ  ａｎｄ  ｓｈａｐｅ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８，ｅ５７１４２．
［２８］Ｍｕｃｋｅｎｔｈａｌｅｒ，Ｍ．Ｕ．，Ｒｉｖｅｌｌａ，Ｓ．，Ｈｅｎｔｚｅ，Ｍ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｇａｌｙ，Ｂ．（２０１７）．Ａ  Ｒｅｄ  Ｃａｒｐｅｔ  ｆｏｒ  Ｉｒｏｎ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｃｅｌｌ  １６８，３４４−３６１．
［２９］Ｐｏｒｔａｌ−Ｃｅｌｈａｙ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｂｌａｓｅｒ，Ｍ．Ｊ．（２０１２）．Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｓｉｌｉｅｎｃｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｆｏｕｎｄｅｒ  ａｎｄ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  ｇｕｔ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ８０，１２８８−１２９９．
［３０］Ｐｏｓｔｌｅｒ，Ｔ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｇｈｏｓｈ，Ｓ．（２０１７）．Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｈｏｌｏｂｉｏｎｔ：Ｈｏｗ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  Ａｆｆｅｃｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｓｈａｐｅ  ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ  ２６，１１０−１３０．
［３１］Ｑｉ，Ｂ．，Ｋｎｉａｚｅｖａ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｈａｎ，Ｍ．（２０１７）．Ａ  ｖｉｔａｍｉｎ−Ｂ２−ｓｅｎｓｉｎｇ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｔｈａｔ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｇｕｔ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｉｍｐａｃｔ  ａｎｉｍａｌ’ｓ  ｆｏｏｄ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ａｎｄ  ｇｒｏｗｔｈ．Ｅｌｉｆｅ  ６．
［３２］Ｒａｎｇａｎ，Ｋ．Ｊ．，Ｐｅｄｉｃｏｒｄ，Ｖ．Ａ．，Ｗａｎｇ，Ｙ．Ｃ．，Ｋｉｍ，Ｂ．，Ｌｕ，Ｙ．，Ｓｈａｈａｍ，Ｓ．，Ｍｕｃｉｄａ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｈａｎｇ，Ｈ．Ｃ．（２０１６）．Ａ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  ｅｎｔｅｒｉｃ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５３，１４３４−１４３７．
［３３］Ｒａｕｅｎ，Ｕ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ａ．，Ｗｅｉｓｈｅｉｔ，Ｄ．，Ｐｅｔｒａｔ，Ｆ．，Ｋｏｒｔｈ，Ｈ．Ｇ．，ｄｅ  Ｇｒｏｏｔ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｓｕｓｔｍａｎｎ，Ｒ．（２００７）．Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｈｅｌａｔａｂｌｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｉｒｏｎ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｒｏｎ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｉｒｏｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ．Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ  ８，３４１−３５２．
［３４］Ｒａｙｍｏｎｄ，Ｋ．Ｎ．，Ｄｅｒｔｚ，Ｅ．Ａ．，ａｎｄ  Ｋｉｍ，Ｓ．Ｓ．（２００３）．Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｉｎ：ａｎ  ａｒｃｈｅｔｙｐｅ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｉｒｏｎ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １００，３５８４−３５８８．
［３５］Ｒｏｍｎｅｙ，Ｓ．Ｊ．，Ｎｅｗｍａｎ，Ｂ．Ｓ．，Ｔｈａｃｋｅｒ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｌｅｉｂｏｌｄ，Ｅ．Ａ．（２０１１）．ＨＩＦ−１  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｉｒｏｎ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  ｂｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｉｒｏｎ  ｕｐｔａｋｅ  ａｎｄ  ｓｔｏｒａｇｅ．ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ  ７，ｅ１００２３９４．
［３６］Ｓａｈａ，Ｐ．，Ｙｅｏｈ，Ｂ．Ｓ．，Ｏｌｖｅｒａ，Ｒ．Ａ．，Ｘｉａｏ，Ｘ．，Ｓｉｎｇｈ，Ｖ．，Ａｗａｓｔｈｉ，Ｄ．，Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｂ．Ｃ．，Ｃｈｅｎ，Ｑ．，Ｄｉｋｓｈｉｔ，Ｍ．，Ｗａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅｓ  Ｈｉｊａｃｋ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９８，４２９３−４３０３．
［３７］Ｓａｍｕｅｌ，Ｂ．Ｓ．，Ｒｏｗｅｄｄｅｒ，Ｈ．，Ｂｒａｅｎｄｌｅ，Ｃ．，Ｆｅｌｉｘ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ  Ｒｕｖｋｕｎ，Ｇ．（２０１６）．Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｆｒｏｍ  ｉｔｓ  ｎａｔｕｒａｌ  ｈａｂｉｔａｔｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １１３，Ｅ３９４１−３９４９．
［３８］Ｓｃｈｗｙｎ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｎｅｉｌａｎｄｓ，Ｊ．Ｂ．（１９８７）．Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅｓ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １６０，４７−５６．
［４０］Ｓｃｏｔｔ，Ｔ．Ａ．，Ｑｕｉｎｔａｎｅｉｒｏ，Ｌ．Ｍ．，Ｎｏｒｖａｉｓａｓ，Ｐ．，Ｌｕｉ，Ｐ．Ｐ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｍ．Ｐ．，Ｌｅｕｎｇ，Ｋ．Ｙ．，Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，Ｌ．，Ｓｕｄｉｗａｌａ，Ｓ．，Ｐｅｓｓｉａ，Ａ．，Ｃｌａｙｔｏｎ，Ｐ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）．Ｈｏｓｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｃｏｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  Ｄｉｃｔａｔｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｉｎ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ．Ｃｅｌｌ  １６９，４４２−４５６  ｅ４１８．
［４１］Ｓｅａｒｌｅ，Ｌ．Ｊ．，Ｍｅｒｉｃ，Ｇ．，Ｐｏｒｃｅｌｌｉ，Ｉ．，Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｓ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｌｕｃｃｈｉｎｉ，Ｓ．（２０１５）．Ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｃｒｏｓｓ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  ｆａｅｃａｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  １０，ｅ０１１７９０６．
［４１］Ｓｔｉｅｒｎａｇｌｅ，Ｔ．（２００６）．Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ．ＷｏｒｍＢｏｏｋ，１−１１．Ｔｅｎａｉｌｌｏｎ，Ｏ．，Ｓｋｕｒｎｉｋ，Ｄ．，Ｐｉｃａｒｄ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｄｅｎａｍｕｒ，Ｅ．（２０１０）．Ｔｈｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｃｏｍｍｅｎｓａｌ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ８，２０７−２１７．
［４２］Ｔｓａｎｇ，Ｗ．Ｙ．，ａｎｄ  Ｌｅｍｉｒｅ，Ｂ．Ｄ．（２００３）．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＡＴＰ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｌａｒｖａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｎｏｎａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙ  ｉｎ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ．Ｄｅｖ  Ｄｙｎ  ２２６，７１９−７２６．
［４３］Ｖｕｏｎｇ，Ｈ．Ｅ．，Ｙａｎｏ，Ｊ．Ｍ．，Ｆｕｎｇ，Ｔ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｈｓｉａｏ，Ｅ．Ｙ．（２０１７）．Ｔｈｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  ａｎｄ  Ｈｏｓｔ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ４０，２１−４９．ＷＨＯ（２００２）．Ｉｒｏｎ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ａｎｅｍｉａ：ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ，ｐｒｅｖｅｎｔｉｉｏｎ，ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ；  ａ  ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｒ  ｍａｎａｇｅｒｓ．Ｇｅｎｅｖａ．ｓ．
［４４］Ｗｉｅｄｅｍａｎｎ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｐｆａｎｎｅｒ，Ｎ．（２０１７）．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｍａｃｈｉｎｅｒｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｍｐｏｒｔ  ａｎｄ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ８６，６８５−７１４．
［４５］Ｗｉｌｓｏｎ，Ｂ．Ｒ．，Ｂｏｇｄａｎ，Ａ．Ｒ．，Ｍｉｙａｚａｗａ，Ｍ．，Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｔｓｕｊｉ，Ｙ．（２０１６）．Ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅｓ  ｉｎ  Ｉｒｏｎ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：Ｆｒｏｍ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｔｏ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ２２，１０７７−１０９０．
［４６］Ｘｉａｏ，Ｘ．，Ｙｅｏｈ，Ｂ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｖｉｊａｙ−Ｋｕｍａｒ，Ｍ．（２０１７）．Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ  ２：Ａｎ  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｐｌａｙｅｒ  ｉｎ  Ｉｒｏｎ  Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｎｕｔｒ  ３７，１０３−１３０．
［４７］Ｙｕ，Ｄ．Ｊ．，Ｈｕ，Ｊ．，Ｈｕａｎｇ，Ｙ．，Ｓｈｅｎ，Ｈ．Ｂ．，Ｑｉ，Ｙ．，Ｔａｎｇ，Ｚ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｙａｎｇ，Ｊ．Ｙ．（２０１３）．
ＴａｒｇｅｔＡＴＰｓｉｔｅ：ａ  ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｆｒｅｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｍａｇｅ  ｓｐａｒｓｅ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ  ｅｎｓｅｍｂｌｅ．Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｃｈｅｍ  ３４，９７４−９８５．
［４８］Ｚｈａｎｇ，Ｌ．，Ｄｉｎｇ，Ｌ．，Ｃｈｅｕｎｇ，Ｔ．Ｈ．，Ｄｏｎｇ，Ｍ．Ｑ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｓｅｗｅｌｌ，Ａ．Ｋ．，Ｌｉｕ，Ｘ．，Ｙａｔｅｓ，Ｊ．Ｒ．，３ｒｄ，ａｎｄ  Ｈａｎ，Ｍ．（２００７）．Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｍｉＲＩＳＣ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｍｉＲＮＡｓ，ａｎｄ  ｍＲＮＡ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｂｙ  ｔｈｅｉｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ＧＷ１８２  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ＡＩＮ−１  ａｎｄ  ＡＩＮ−２．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２８，５９８−６１３．
［４９］Ｚｈｅｎｇ，Ｔ．，Ｂｕｌｌｏｃｋ，Ｊ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｎｏｌａｎ，Ｅ．Ｍ．（２０１２）．Ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃａｒｇｏ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ：ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ  ｏｆ  ｍｏｎｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｉｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ａｎｄ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｉｎ−ｃａｒｇｏ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｕｐｔａｋｅ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １３４，１８３８８−１８４００．
［５０］Ａｂｅｒｇｅｌ，Ｒｅｂｅｃｃａ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．“Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｉｎ  Ｐｒｏｔｏｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｒｏｎ  Ｒｅｌｅａｓｅ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓａｌｉｃｙｌａｔｅ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ  Ｓｈｉｆｔ  ｉｎ  Ｆｅｒｒｉｃ  Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｉｎ．”  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２８．２７（２００６）：８９２０−８９３１．ＰＭＣ．Ｗｅｂ．１７  Ｊｕｌｙ  ２０１８．
［５１］Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ｊ．（２０１８）．Ｉｒｏｎ  Ｗａｒｓ  −Ｔｈｅ  Ｈｏｓｔ  Ｓｔｒｉｋｅｓ  Ｂａｃｋ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３７９，２０７８−２０８０．
［５２］Ａｒｏｒａ  ＮＫ  ａｎｄ  Ｖｅｒｍａ  Ｍ．（２０１７）．Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｂａｃｔｅｒｉａ．３  Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：３８１．
［５３］Ａｕｅｒｂａｃｈ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｍａｃｄｏｕｇａｌｌ，Ｉ．（２０１７）．Ｔｈｅ  ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｉｒｏｎ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ：Ｈｉｓｔｏｒｙ，ｅｆｆｉｃａｃｙ，ａｎｄ  ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ．Ｈｅｍｏｄｉａｌ  Ｉｎｔ  ２１  Ｓｕｐｐｌ  １，Ｓ８３−Ｓ９２．
［５４］Ｂｒｉｓｓｏｔ，Ｐ．，Ｂａｒｄｏｕ−Ｊａｃｑｕｅｔ，Ｅ．，Ｊｏｕａｎｏｌｌｅ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｌｏｒｅａｌ，Ｏ．（２０１１）．Ｉｒｏｎ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｏｒｉｇｉｎ：ａ  ｃｈａｎｇｉｎｇ  ｗｏｒｌｄ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １７，７０７−７１３．
［５５］Ｃｏｏｋ，Ｊ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｒｅｄｄｙ，Ｍ．Ｂ．（１９９５）．Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｗｅｅｋｌｙ  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｄａｉｌｙ  ｉｒｏｎ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  ６２，１１７−１２０．
［５６］Ｇｏｅｔｚ  Ｄ．Ｈ．，Ｈｏｌｍｅｓ  Ｍ．Ａ．，Ｂｏｒｒｅｇａａｒｄ，Ｎ．，Ｂｌｕｈｍ  Ｍ．Ｅ．，Ｒａｙｍｏｎｄ  Ｋ．Ｎ．，Ｓｔｒｏｎｇ  Ｒ．Ｋ．（２００２）  Ｔｈｅ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｌｉｐｏｃａｌｉｎ  ＮＧＡＬ  ｉｓ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃ  ａｇｅｎｔ  ｔｈａｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｓ  ｗｉｔｈ  ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｒｏｎ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．２００２．１０：１０３３−４３．
［５７］Ｊａｅｇｇｉ，Ｔ．，Ｋｏｒｔｍａｎ，Ｇ．Ａ．，Ｍｏｒｅｔｔｉ，Ｄ．，Ｃｈａｓｓａｒｄ，Ｃ．，Ｈｏｌｄｉｎｇ，Ｐ．，Ｄｏｓｔａｌ，Ａ．，Ｂｏｅｋｈｏｒｓｔ，Ｊ．，Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｈ．Ｍ．，Ｓｗｉｎｋｅｌｓ，Ｄ．Ｗ．，Ｔｊａｌｓｍａ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．Ｉｒｏｎ  ｆｏｒｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｄｖｅｒｓｅｌｙ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｔｈｅ  ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ，ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ａｂｕｎｄａｎｃｅ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｋｅｎｙａｎ  ｉｎｆａｎｔｓ．Ｇｕｔ  ６４，７３１−７４２．
［５８］Ｋｏｒｔｍａｎ，Ｇ．Ａ．，Ｄｕｔｉｌｈ，Ｂ．Ｅ．，Ｍａａｔｈｕｉｓ，Ａ．Ｊ．，Ｅｎｇｅｌｋｅ，Ｕ．Ｆ．，Ｂｏｅｋｈｏｒｓｔ，Ｊ．，Ｋｅｅｇａｎ，Ｋ．Ｐ．，Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｆ．Ｇ．，Ｂｅｔｌｅｙ，Ｊ．，Ｗｅｉｒ，Ｊ．Ｃ．，Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ，Ｚ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  Ｓｈｉｆｔｓ  Ｔｏｗａｒｄｓ  ａｎ  Ａｄｖｅｒｓｅ  Ｐｒｏｆｉｌｅ  ｗｉｔｈ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｉｒｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＴＩＭ−２  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｌｏｎ．Ｆｒｏｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６，１４８１．
［５９］Ｋｏｕｔｒｏｕｂａｋｉｓ，Ｉ．Ｅ．，Ｒａｍｏｓ−Ｒｉｖｅｒｓ，Ｃ．，Ｒｅｇｕｅｉｒｏ，Ｍ．，Ｋｏｕｔｒｏｕｍｐａｋｉｓ，Ｅ．，Ｃｌｉｃｋ，Ｂ．，Ｓｃｈｏｅｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｈａｓｈａｓｈ，Ｊ．Ｇ．，Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｍ．，Ｓｗｏｇｅｒ，Ｊ．，Ｂａｉｄｏｏ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  ｏｒ  Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  Ａｎｅｍｉａ  Ｉｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｗｉｔｈ  Ｓｅｖｅｒｅ  ａｎｄ  Ｄｉｓａｂｌｉｎｇ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｌｉｎ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ  １３，１７６０−１７６６．
［６０］Ｌｕｎｄ，Ｅ．Ｋ．，Ｗｈａｒｆ，Ｓ．Ｇ．，Ｆａｉｒｗｅａｔｈｅｒ−Ｔａｉｔ，Ｓ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｉ．Ｔ．（１９９９）．Ｏｒａｌ  ｆｅｒｒｏｕｓ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｔｈｅ  ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌ−ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｏｆ  ｆｅｃｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  ６９，２５０−２５５．
［６１］Ｍｏｒｅｔｔｉ，Ｄ．，Ｇｏｅｄｅ，Ｊ．Ｓ．，Ｚｅｄｅｒ，Ｃ．，Ｊｉｓｋｒａ，Ｍ．，Ｃｈａｔｚｉｎａｋｏｕ，Ｖ．，Ｔｊａｌｓｍａ，Ｈ．，Ｍｅｌｓｅ−Ｂｏｏｎｓｔｒａ，Ａ．，Ｂｒｉｔｔｅｎｈａｍ，Ｇ．，Ｓｗｉｎｋｅｌｓ，Ｄ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｍ．Ｂ．（２０１５）．Ｏｒａｌ  ｉｒｏｎ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｈｅｐｃｉｄｉｎ  ａｎｄ  ｄｅｃｒｅａｓｅ  ｉｒｏｎ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｄａｉｌｙ  ｏｒ  ｔｗｉｃｅ−ｄａｉｌｙ  ｄｏｓｅｓ  ｉｎ  ｉｒｏｎ−ｄｅｐｌｅｔｅｄ  ｙｏｕｎｇ  ｗｏｍｅｎ．Ｂｌｏｏｄ  １２６，１９８１−１９８９．
［６２］Ｍｕｃｋｅｎｔｈａｌｅｒ，Ｍ．Ｕ．，Ｒｉｖｅｌｌａ，Ｓ．，Ｈｅｎｔｚｅ，Ｍ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｇａｌｙ，Ｂ．（２０１７）．Ａ  Ｒｅｄ  Ｃａｒｐｅｔ  ｆｏｒ  Ｉｒｏｎ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｃｅｌｌ  １６８，３４４−３６１．
［６３］Ｍｕｎｏｚ，Ｍ．，Ｇｏｍｅｚ−Ｒａｍｉｒｅｚ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｇａｒｃｉａ−Ｅｒｃｅ，Ｊ．Ａ．（２００９）．Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｉｒｏｎ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  １５，４６６６−４６７４．
［６４］Ｑｉ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｈａｎ，Ｍ．（２０１８）．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅ  Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｉｎ  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｉｒｏｎ  Ｕｐｔａｋｅ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｏｓｔ  ｖｉａ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＡＴＰ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ．Ｃｅｌｌ  １７５，５７１−５８２  ｅ５１１．
［６５］Ｒｉｅｍｅｒ，Ｊ．，Ｈｏｅｐｋｅｎ，Ｈ．Ｈ．，Ｃｚｅｒｗｉｎｓｋａ，Ｈ．，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｓ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｄｒｉｎｇｅｎ，Ｒ．（２００４）．Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｆｅｒｒｏｚｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｒｏｎ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｅｌｌｓ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３３１，３７０−３７５．
［６６］Ｓａｚａｗａｌ，Ｓ．，Ｂｌａｃｋ，Ｒ．Ｅ．，Ｒａｍｓａｎ，Ｍ．，Ｃｈｗａｙａ，Ｈ．Ｍ．，Ｓｔｏｌｔｚｆｕｓ，Ｒ．Ｊ．，Ｄｕｔｔａ，Ａ．，Ｄｈｉｎｇｒａ，Ｕ．，Ｋａｂｏｌｅ，Ｉ．，Ｄｅｂ，Ｓ．，Ｏｔｈｍａｎ，Ｍ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（２００６）．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｒｏｕｔｉｎｅ  ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｒｏｎ  ａｎｄ  ｆｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｏｎ  ａｄｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｏ  ｈｏｓｐｉｔａｌ  ａｎｄ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｐｒｅｓｃｈｏｏｌ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｉｎ  ａ  ｈｉｇｈ  ｍａｌａｒｉａ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｓｅｔｔｉｎｇ：ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−ｂａｓｅｄ，ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ，ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ  ３６７，１３３−１４３．
［６７］Ｓｈｅｎ，Ｃ．，Ｒａｔｈｏｒｅ，Ｓ．Ｓ．，Ｙｕ，Ｈ．，Ｇｕｌｂｒａｎｓｏｎ，Ｄ．Ｒ．，Ｈｕａ，Ｒ．，Ｚｈａｎｇ，Ｃ．，Ｓｃｈｏｐｐａ，Ｎ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｓｈｅｎ，Ｊ．（２０１５）．Ｔｈｅ  ｔｒａｎｓ−ＳＮＡＲＥ−ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｕｎｃ１８−１  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｔｏ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ．Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ６，８８５２．
［６８］Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｇ．Ａ．，Ｆｉｎｕｃａｎｅ，Ｍ．Ｍ．，Ｄｅ−Ｒｅｇｉｌ，Ｌ．Ｍ．，Ｐａｃｉｏｒｅｋ，Ｃ．Ｊ．，Ｆｌａｘｍａｎ，Ｓ．Ｒ．，Ｂｒａｎｃａ，Ｆ．，Ｐｅｎａ−Ｒｏｓａｓ，Ｊ．Ｐ．，Ｂｈｕｔｔａ，Ｚ．Ａ．，Ｅｚｚａｔｉ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｉｍｐａｃｔ  Ｍｏｄｅｌ  Ｓｔｕｄｙ，Ｇ．（２０１３）．Ｇｌｏｂａｌ，ｒｅｇｉｏｎａｌ，ａｎｄ  ｎａｔｉｏｎａｌ  ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｏｔａｌ  ａｎｄ  ｓｅｖｅｒｅ  ａｎａｅｍｉａ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ａｎｄ  ｐｒｅｇｎａｎｔ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｐｒｅｇｎａｎｔ  ｗｏｍｅｎ  ｆｏｒ  １９９５−２０１１：ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ−ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ  ｄａｔａ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｇｌｏｂ  Ｈｅａｌｔｈ  １，ｅ１６−２５．
［６９］Ｔａｎｇ，Ｍ．，Ｆｒａｎｋ，Ｄ．Ｎ．，Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓ，Ａ．Ｅ．，Ｉｒ，Ｄ．，Ｅｓａｍａｉ，Ｆ．，Ｌｉｅｃｈｔｙ，Ｅ．，Ｈａｍｂｉｄｇｅ，Ｋ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｋｒｅｂｓ，Ｎ．Ｆ．（２０１７）．Ｉｒｏｎ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｐｏｗｄｅｒ  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ａｎ  Ｕｎｆａｖｏｒａｂｌｅ  Ｇｕｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｉｎ  Ｋｅｎｙａｎ  Ｉｎｆａｎｔｓ．Ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ  ９．
［７０］ＷＨＯ（２０１５）．Ｔｈｅ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ａｎａｅｍｉａ．
［７１］Ｙｕ，Ｈ．，Ｒａｔｈｏｒｅ，Ｓ．Ｓ．，Ｓｈｅｎ，Ｃ．，Ｌｉｕ，Ｙ．，Ｏｕｙａｎｇ，Ｙ．，Ｓｔｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｓｈｅｎ，Ｊ．（２０１５）．Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｎｇ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｌｅ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ：Ｔｈｅ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｒｏｗｄｉｎｇ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １３７，１２８７３−１２８８３．
［７２］Ｚｈａｎｇ，Ａ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｅｎｎｓ，Ｃ．Ａ．（２００９）．Ｉｒｏｎ  Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ：Ｒｅｃｅｎｔｌｙ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｐｒｏｖｉｄｅ  Ｉｎｓｉｇｈｔ  ｉｎｔｏ  Ｎｏｖｅｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８４，７１１−７１５．
配列同定情報
【化３】
2021530515.tif 000006
【化４】
2021530515.tif 000007
【化５】
2021530515.tif 000008
【化６】
2021530515.tif 000009
【化７】
2021530515.tif 000010
【化８】
2021530515.tif 000011
【図１】
2021530515.tif 000015
【図２】
2021530515.tif 000016
【図３】
2021530515.tif 000017
【図４】
2021530515.tif 000018
【図５】
2021530515.tif 000019
【図６】
2021530515.tif 000020
【図７】
2021530515.tif 000021
【図８】
2021530515.tif 000022
【図９】
2021530515.tif 000023
【図１０】
2021530515.tif 000024
【図１１】
2021530515.tif 000025
【図１２】
2021530515.tif 000026
【図１３】
2021530515.tif 000027
【図１４】
2021530515.tif 000028
【図１５】
2021530515.tif 000029
【図１６】
2021530515.tif 000030
【図１７】
2021530515.tif 000031
【図１８】
2021530515.tif 000032
【図１９】
2021530515.tif 000033
【図２０】
2021530515.tif 000034
【図２１】
2021530515.tif 000035
【図２２】
2021530515.tif 000036
【図２３】
2021530515.tif 000037
【図２４】
2021530515.tif 000038
【図２５】
2021530515.tif 000039
【配列表】
2021530515000001.app
【国際調査報告】
2021530515.tif 000040
2021530515.tif 000041
2021530515.tif 000042
2021530515.tif 000043